(57)【要約】  本発明は概して、医学および薬理学の分野に関する。より具体的には、本発明は、ガラニンの新規の類似体および治療でのその使用に関する。提供されるのはガラニンの環状ペプチド類似体であり、このガラニン類似体は（メチル）ランチオニン架橋を含み、この類似体は一般式「Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−」またはＸ１および／もしくは最大１１個のＣ末端残基を欠いているそのトランケート型多様体を有し、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０およびＸ１３〜Ｘ１９からなる群から選択される２個の残基は、構造Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａのランチオニン架橋または構造Ａｂｕ−Ｓ−ＡｌａもしくはＡｌａ−Ｓ−Ａｂｕのメチルランチオニン架橋を一緒に形成する。【選択図】図２
2018509157.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラニンの環状ペプチド類似体において、前記ガラニン類似体は（メチル）ランチオニン架橋を含み、前記類似体は一般式「Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２またはＸ１および／もしくは最大１１個のＣ末端残基を欠いているそのトランケート型多様体を有し、
Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０およびＸ１３〜Ｘ１９からなる群から選択される２個の残基は、構造Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａのランチオニン架橋または構造Ａｂｕ−Ｓ−ＡｌａもしくはＡｌａ−Ｓ−Ａｂｕのメチルランチオニン架橋を一緒に形成し、
Ｘ１はｐＥ、Ｇ、Ｎ、ＲＧＲＧ、ＲＧＲＧＮまたはＲＧＲＧＧであり
Ｘ２はＷＮまたはＷＴであり
Ｘ３はＬ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ａ、Ｄ、Ｖ、Ｋ、Ｑ、Ｎであり
Ｘ４はＮ、Ｔ、Ｑまたは（ｍｅ）ｌａｎであり
Ｘ５はＳまたはＡであり
Ｘ６はＡまたは（ｍｅ）ｌａｎであり
Ｘ７はＧ、（ｍｅ）ｌａｎ、ＡまたはＫであり
Ｘ８はＹであり
Ｘ９はＬであり
Ｘ１０はＬ、（ｍｅ）ｌａｎまたはＡであり
Ｘ１１はＧ、Ａ、（ｍｅ）ｌａｎであり
Ｘ１２はＰまたはＡまたは（ｍｅ）ｌａｎであり
Ｘ１３はＨ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ｖ、Ｑ、Ｐ、Ｑ、Ｅ、Ｋ、Ａであり
Ｘ１４はＡ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ｌ、Ｑ、Ｐ、Ｈ、Ｋ、Ｉであり
Ｘ１５はＶ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ｐ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ａであり
Ｘ１６は（ｍｅ）ｌａｎ、Ｐ、Ｆ、Ｌ、ＮまたはＧであり
Ｘ１７はＮ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ｐ、Ｇ、Ｓ、ＡまたはＨであり
Ｘ１８はＨ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ａ、Ｌ、Ｐ、ＡまたはＲであり
Ｘ１９はＲ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ａであり
Ｘ２０はＲ、Ａであり、
Ｘ２１はＬであり、および
Ｘ２２はＡであり、
ｐＥはピログルタメートを意味しており、
（ｍｅ）ｌａｎはＬａｎまたはｍｅＬａｎを意味しており、Ｌａｎはランチオニン（Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａ）のＮ末端ハーフまたはＣ末端ハーフを表し、ｍｅＬａｎはメチルランチオニン（Ａｂｕ−Ｓ−ＡｌａまたはＡｌａ−Ｓ−Ａｂｕ）のＮ末端ハーフまたはＣ末端ハーフを表し、
但し、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０Ｘ１１およびＸ１３〜Ｘ１９のうちの２個以下は、（メチル）ランチオニン架橋を一緒に形成する（ｍｅ）ｌａｎであり、前記（メチル）ランチオニン架橋はサイズｉ、ｉ＋３またはｉ、ｉ＋４またはｉ、ｉ＋５であることを特徴とするガラニンの環状ペプチド類似体。
【請求項２】
請求項１に記載のガラニン類似体において、式Ｘ１−Ｘ１２、Ｘ１−Ｘ１３、Ｘ１−Ｘ１４、Ｘ１−Ｘ１５、Ｘ１−Ｘ１６、Ｘ１−Ｘ１７、Ｘ１−Ｘ１８、Ｘ１−Ｘ１９、Ｘ１−Ｘ２０、Ｘ１−Ｘ２１またはＸ１−Ｘ２２を特徴とするガラニン類似体。
【請求項３】
請求項２に記載のガラニン類似体において、Ｘ１はｐＥまたはＧであることを特徴とするガラニン類似体。
【請求項４】
請求項１に記載のガラニン類似体において、式Ｘ２−Ｘ１２、Ｘ２−Ｘ１３、Ｘ２−Ｘ１４、Ｘ２−Ｘ１５、Ｘ２−Ｘ１６、Ｘ２−Ｘ１７、Ｘ２−Ｘ１８、Ｘ２−Ｘ１９、Ｘ２−Ｘ２０、Ｘ２−Ｘ２１またはＸ２−Ｘ２２を特徴とするガラニン類似体。
【請求項５】
請求項１乃至４の何れか１項に記載のガラニン類似体において、Ｘ２はＷＮであることを特徴とするガラニン類似体。
【請求項６】
請求項１乃至５の何れか１項に記載のガラニン類似体において、Ｘ３はＬであり、Ｘ４はＮであり、Ｘ５はＡであり、Ｘ６はＡであり、Ｘ７はＧであり、Ｘ１０はＬであり、Ｘ１１はＧであり、Ｘ１２はＰであり、Ｘ１３はＨであり、および／またはＸ１４はＡであることを特徴とするガラニン類似体。
【請求項７】
請求項１乃至６の何れか１項に記載のガラニン類似体において、Ｃ末端がアミド化されていることを特徴とするガラニン類似体。
【請求項８】
請求項１乃至７の何れか１項に記載のガラニン類似体において、Ｘ２０−Ｘ２２は存在しないおよび／または配列Ｘ１３−Ｘ１９のうちの２個の残基は（ｍｅ）ランチオニン架橋を一緒に形成することを特徴とするガラニン類似体。
【請求項９】
請求項１乃至８の何れか１項に記載のガラニン類似体において、下記の特性
（ｉ）ガラニンＲ１受容体を発現する細胞中でのホルスコリン誘導型のｃＡＭＰ産生を阻害することができる、
（ｉｉ）ガラニンＲ１受容体を発現する細胞中でのベータアレスチン動員を誘導することができる、
（ｉｉｉ）ガラニンＲ２受容体を発現する細胞中でのベータアレスチン動員を誘導することができる、
（ｉｖ）ガラニンＲ２受容体を発現する細胞中でのカルシウム流出を誘導することができる、
（ｖ）ガラニン受容体の内部移行に関連するベータアレスチンを誘導することができるが、このガラニン受容体の経路に連動する他の受容体の刺激を誘導する能力と比較して低下している、
のうちの１つまたは複数を有することを特徴とするガラニン類似体。
【請求項１０】
請求項１乃至９の何れか１項に記載のガラニン類似体において、ＧａｌＲ１と比較してＧａｌＲ２を刺激する能力が増強されていることを特徴とするガラニン類似体。
【請求項１１】
請求項１乃至１０の何れか１項に記載のガラニン類似体において、
ＧＷＮｍｅｌａｎＮＡｍｅｌａｎＧＹＬＬＧＰＨＡＶＧＮＨＲ
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ＧＷＮＬＤＡＡＧＹＬＬＧＡｍｅｌａｎＡＶｍｅｌａｎＮＨＲ
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からなる群から選択されることを特徴とするガラニン類似体。
【請求項１２】
請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の少なくとも１種のガラニン類似体を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１乃至１１のいずれか１項に記載のガラニン類似体において、薬剤としての使用を特徴とするガラニン類似体。
【請求項１４】
請求項１３に記載のガラニン類似体において、多発性硬化症、アルツハイマー病の処置での使用、または抗不安薬、抗うつ薬、抗けいれん薬としてもしくは神経保護を目的としての使用を特徴とするガラニン類似体。
【請求項１５】
請求項１１に記載の環状ガラニン類似体を製造する方法において、
（ｉ）下記からなる群
ＧＷＮＴＮＡＣＧＹＬＬＧＰＨＡＶＧＮＨＲ
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ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＳＡＶＣ
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ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＴＡＶＣおよび
ＱＷＴＬＮＡＡＴＹＬＬＣ
から選択されるペプチドを準備するステップと、
（ｉｉ）前記ペプチドのＳｅｒ残基またはＴｈｒ残基の脱水を誘導するステップと、
（ｉｉｉ）前記脱水したＳｅｒまたはＴｈｒを前記ペプチドのＣｙｓ残基のチオール基に連結させることにより閉環を誘導するステップと、
（ｉｖ）任意選択で、Ｎ末端のＱをｐＥに変換するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法において、ステップ（ｉｉｉ）は化学的手段または酵素的手段により閉環を誘導することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載のペプチドをコードすることを特徴とする単離核酸配列。
【請求項１８】
請求項１７に記載の単離核酸配列を含むベクターにおいて、前記核酸はランチペプチドリーダー配列をコードする核酸配列に遺伝的に融合されていることを特徴とするベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載のベクターを含み、好ましくはランチオニン導入酵素を更に含むことを特徴とする食品グレードの細菌宿主細胞、好ましくはＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１９に記載の宿主細胞の使用において、腸内でのランチ−ガラニン産生用の経口送達システムとして使用することを特徴とする使用。
【請求項２１】
請求項１９に記載の生存宿主細胞と、薬学的に許容される担体、賦形剤または媒体とを含む医薬組成物において、好ましくは経口投与用に製剤化されていることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２２】
炎症性腸疾患と関連する症状を処置するまたは緩和する方法において、
請求項２１に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与するステップ
を含み、
好ましくは、前記腸疾患はクローン病または潰瘍性大腸炎（ＵＣ）である
ことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、医学および薬理学の分野に関する。より具体的には、本発明は、ガラニンの新規の類似体、この類似体を製造する方法および治療でのこの類似体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガラニンは、プレプロガラニンとして知られている１２３個のアミノ酸のタンパク質の切断から生成される２９〜３０個のアミノ酸の鎖からなる神経ペプチドであり、ＧＡＬ遺伝子によりコードされる。ガラニンは、ヒトおよび他の哺乳動物の脳中、脊髄中および腸中で広く発現される。ガラニンは、侵害受容、覚醒および睡眠の調節、認知、摂食調節、気分の調節、血圧の調節等の多くの生物学的に多様な機能に関与しており、栄養因子として作用するだけでなく発育における役割も有する。ガラニンは、アルツハイマー病、てんかん、ならびにうつ病、摂食障害およびがん等の多くの疾患と関連している。
【０００３】
ガラニンは３種の受容体サブタイプＧａｌＲ１、ＧａｌＲ２およびＧａｌＲ３を刺激する［Ｍｉｔｓｕｋａｗａ  Ｋ，２０１０  Ｇａｌａｎｉｎ，ｇａｌａｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｓ．ＥＸＳ  １０２，７−２３］。これらのサブタイプの間には分布および経路に差異が存在する。
【０００４】
ＧａｌＲ１は前脳基底核中、視床下部中、脊髄中および結腸上皮細胞中で発現され、これらではＧａｌＲ１は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の場合に上方制御される。ＧａｌＲ１の刺激後の効果についてはあまり知られていない。ＧａｌＲ１の刺激は摂食に関与していると思われる［Ｓａａｒ  Ｉ，２０１１  Ｎｏｖｅｌ  ｇａｌａｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｔｙｐｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｉｎ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｉｎｔ  ５８，７１４−２０］。
【０００５】
ＧａｌＲ２は脳中に広く分布しているが、脳下垂体中および末梢組織中にも生じる。ＧａｌＲ２の刺激は、ＭＳの場合［Ｗｒａｉｔｈ  ＤＣ，２００９  Ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｇａｌａｎｉｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ＰＮＡＳ  １０６，１５４６６−７１、Ｚｈａｎｇ  Ｌ，２０１２  Ｇａｌａｎｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｇａｌａｎｉｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｌｌｅｖｉａｔｅ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＭＳ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．７（３）：ｅ３３９０ｌ］およびアルツハイマーの場合に神経保護であると報告されており、かつ抗不安薬、抗うつ薬および抗けいれん薬の効果を有すると報告されている。
【０００６】
ＧａｌＲ３は低存在量で広く分布している［Ｌｕ  Ｘ，２００５  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇａｌａｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｅｉｚｕｒｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ３９，１４７−５２、Ｍｉｔｓｕｋａｗａ  Ｋ，２０１０  Ｇａｌａｎｉｎ，ｇａｌａｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｓ．ＥＸＳ  １０２，７−２３、Ｈｏｋｆｅｌｔ  Ｔ，２００８  Ｇａｌａｎｉｎ−２５  ｙｅａｒｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｕｌｔｉｔａｌｅｎｔｅｄ  ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６５，１７９３−５、Ｈｏｋｆｅｌｔ  Ｔ  ２００５  Ｇａｌａｎｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｔｈｉｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ，２１−２２  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００４．Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ３９，１２５、Ｋｕｔｅｅｖａ  Ｅ，２００８  Ｇａｌａｎｉｎ，ｇａｌａｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｌｉｋｅ  ｂｅｈａｖｉｏｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６５，１８５４−６３Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６５，１８４２−５３］。リガンド受容体Ｇａｌ３相互作用に関する入手可能な情報はごくわずかである［Ｓｏｌｌｅｎｂｅｒｇ  ＵＥ，２０１０  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｍ６１７  ａｎｄ  Ｍ８７１  ｔｏ  Ｇａｌａｎｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｐｅ  ３  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｇａｌａｎｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  １６，１７］。
【０００７】
まとめると、ＧａｌＲ１およびＧａｌＲ３の刺激の効果は不明と思われるまたは不利であるが、ＧａｌＲ２のアゴニスティックな刺激はＭＳの場合に有効であるように見える［Ｗｒａｉｔｈ  ＤＣ，２００９  Ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｇａｌａｎｉｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ．ＰＮＡＳ  １０６，１５４６６−７１、Ｚｈａｎｇ  Ｌ，２０１２  Ｇａｌａｎｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｇａｌａｎｉｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｌｌｅｖｉａｔｅ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＭＳ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．７（３）：ｅ３３９０ｌ］。
【０００８】
ＧａｌＲ２刺激により、神経保護［Ｅｌｌｉｏｔｔ−Ｈｕｎｔ  ＣＲ，２００７  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇａｌａｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２（ＧａｌＲ２）ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ｆｒｏｍ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄａｍａｇｅ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  １００，７８０−９］および抗けいれん活性［Ｌｕ  Ｘ，２０１０  ＧａｌＲ２−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ａｎｔｉｃｏｎｖｕｌｓａｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ．ＰＮＡＳ  １０７，１５２２９−３４］が引き起こされる。ガラニンは、異なる下流シグナル伝達カスケードにより、１型受容体および２型受容体の両方を介して、この抗けいれん効果を発現するように見える［Ｌｅｒｎｅｒ  ＪＴ，２００８  Ｇａｌａｎｉｎ  ａｎｄ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６５，１８６４−７１  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  １００，７８０−９］。マウスでは、Ｇ（ｏ）２に連結されたＧａｌＲ２は、Ｋ（ＡＴＰ）チャンネルおよびＣａ（２＋）チャンネルの両方を制御することにより、ガラニンによるインスリン放出の阻害を媒介する［Ｔａｎｇ  Ｇ，２０１２  Ｇｏ２  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｇａｌａｎｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  β  ｃｅｌｌｓ．ＰＮＡＳ  １０９，２６３６−４１］。安全性に関しては、ＧａｌＲ２に対するアゴニスト特異性とＧａｌＲ３に対するアゴニスト特異性の低下とが関連しているかもしれないと思われる。ＧＡＬＲ２の場合の主なシグナル伝達はホスホリパーゼＣ／プロテインキナーゼＣ経路を介するＧｑによるものであり、この経路はＧａｌＲ１またはＧａｌＲ３により刺激されない。しかしながら、ＧａｌＲ２が、ＧａｌＲ１およびＧａｌＲ３のように、Ｇｉタンパク質に連結してアデニル酸シクラーゼを阻害することもでき、かつＭＡＰＫを刺激することもできることが実証されている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは、必要に応じて、治療的に関連する経路を選択的に刺激することができるように、異なる経路活性化を示すガラニン類似体の必要性を認識した。従って、本発明者らは、新規の受容体サブタイプ選択的で全身的に活性なガラニン受容体リガンドの設計に着手した。より具体的には、本発明者らは、ＧａｌＲ２および／またはＧａｌＲ１によりアゴニスティックに作用するガラニンであるが、本発明者らの治療的関心に鑑みて、ＧａｌＲ３によりアンタゴニスティックに作用する、作用しない、または弱アゴニスティックに作用するガラニンを提供することを目的とした。加えて、受容体内部移行を誘導する能力が低下し、そのため（ｉｎ  ｖｉｖｏでの）効力が増強されるガラニンを有することが望ましいであろう。
【００１０】
驚くべきことに、これらの目標のうちの少なくともいくつかは、ガラニンペプチド中でのランチオニン環の導入により満たされ得ることを発見した。理論に拘束されることを望むものではないが、（メチル）ランチオニン構造による環化によって立体構造が制約され、この制約によりガラニン受容体サブタイプ相互作用が調節されると考えられる。（メチル）ランチオニンは、内因性ペプチド配列中の既存の残基を置き換えることによるだけでなくアミノ酸を挿入することによっても導入され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、典型的な類似体ＧａｌＭ５１がＧａｌＲ１によるβ−アレスチン動員を誘導したことを示すグラフである。
【図２】図２は、典型的な類似体ＧａｌＭ５４がＧａｌＲ２によるβ−アレスチン動員を優先的に刺激することを示すグラフである。
【図３】図３は、典型的な類似体ＧａｌＭ５１およびＧａｌＭ５２がＧａｌＲ１によるｃＡＭＰ産生を阻害することを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
従って、本発明はガラニンの環状ペプチド類似体を提供し、このガラニン類似体は（メチル）ランチオニン架橋を含み、この類似体は一般式「Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２またはＸ１および／もしくは最大１１個のＣ末端残基を欠いているそのトランケート型多様体（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｖａｒｉａｎｔ）を有し、
Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０およびＸ１３〜Ｘ１９からなる群から選択される２個の残基は、構造Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａのランチオニン架橋または構造Ａｂｕ−Ｓ−ＡｌａもしくはＡｌａ−Ｓ−Ａｂｕのメチルランチオニン架橋を一緒に形成し、
Ｘ１はｐＥ、Ｇ、Ｎ、ＲＧＲＧ、ＲＧＲＧＮまたはＲＧＲＧＧであり
Ｘ２はＷＮまたはＷＴであり
Ｘ３はＬ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ａ、Ｄ、Ｖ、Ｋ、ＱまたはＮであり
Ｘ４はＮ、Ｔ、Ｑまたは（ｍｅ）ｌａｎであり
Ｘ５はＳまたはＡであり
Ｘ６はＡまたは（ｍｅ）ｌａｎであり
Ｘ７はＧ、（ｍｅ）ｌａｎ、ＡまたはＫであり
Ｘ８はＹであり
Ｘ９はＬであり
Ｘ１０はＬ、（ｍｅ）ｌａｎまたはＡであり
Ｘ１１はＧ、Ａまたは（ｍｅ）ｌａｎであり
Ｘ１２はＰまたはＡまたは（ｍｅ）ｌａｎであり
Ｘ１３はＨ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ｖ、Ｑ、Ｐ、Ｑ、Ｅ、ＫまたはＡであり
Ｘ１４はＡ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ｌ、Ｑ、Ｐ、Ｈ、ＫまたはＩであり
Ｘ１５はＶ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ｐ、Ｆ、Ｇ、ＫまたはＡであり
Ｘ１６は（ｍｅ）ｌａｎ、Ｐ、Ｆ、Ｌ、ＮまたはＧであり
Ｘ１７はＮ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ｐ、Ｇ、Ｓ、ＡまたはＨであり
Ｘ１８はＨ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ａ、Ｌ、Ｐ、ＡまたはＲであり
Ｘ１９はＲ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ｌ、Ｍ、ＦまたはＡであり
Ｘ２０はＲ、Ａであり、
Ｘ２１はＬであり、および
Ｘ２２はＡであり、
ｐＥはピログルタメートを意味しており、
（ｍｅ）ｌａｎはＬａｎまたはｍｅＬａｎを意味しており、Ｌａｎはランチオニン（Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａ）のＮ末端ハーフまたはＣ末端ハーフを表し、ｍｅＬａｎはメチルランチオニン（Ａｂｕ−Ｓ−ＡｌａまたはＡｌａ−Ｓ−Ａｂｕ）のＮ末端ハーフまたはＣ末端ハーフを表し、
但し、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０Ｘ１１およびＸ１３〜Ｘ１９のうちの２個以下は、（メチル）ランチオニン架橋を一緒に形成する（ｍｅ）ｌａｎであり、前記（メチル）ランチオニン架橋はサイズｉ、ｉ＋３またはｉ、ｉ＋４またはｉ、ｉ＋５である。
【００１３】
別の実施形態では、本発明はガラニンの環状ペプチド類似体を提供し、このガラニン類似体は（メチル）ランチオニン架橋を含み、この類似体は一般式
「Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２」
（この一般式中、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０およびＸ１３〜Ｘ１９からなる群から選択される２個の残基は、構造Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａのランチオニン架橋または構造Ａｂｕ−Ｓ−ＡｌａもしくはＡｌａ−Ｓ−Ａｂｕのメチルランチオニン架橋を一緒に形成し、
Ｘ１はｐＥ、Ｇ、Ｎ、ＲＧＲＧ、ＲＧＲＧＮもしくはＲＧＲＧＧであり
Ｘ２はＷＮもしくはＷＴであり
Ｘ３はＬ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ａ、Ｄ、Ｖ、ＫもしくはＱであり
Ｘ４はＮ、Ｔもしくは（ｍｅ）ｌａｎであり
Ｘ５はＳもしくはＡであり
Ｘ６はＡもしくは（ｍｅ）ｌａｎであり
Ｘ７はＧ、（ｍｅ）ｌａｎ、ＡもしくはＫであり
Ｘ８はＹであり
Ｘ９はＬであり
Ｘ１０はＬ、（ｍｅ）ｌａｎもしくはＡであり
Ｘ１１はＧ、Ａもしくは（ｍｅ）ｌａｎであり、
Ｘ１２はＰもしくはＡであり
Ｘ１３はＨ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ｖ、Ｑ、Ｐ、Ｑ、Ｅ、ＫもしくはＡであり
Ｘ１４はＡ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ｌ、Ｑ、Ｐ、Ｈ、ＫもしくはＩであり
Ｘ１５はＶ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ｐ、Ｆ、Ｇ、ＫもしくはＡであり
Ｘ１６は（ｍｅ）ｌａｎ、Ｐ、Ｆ、ＬもしくはＧであり、
Ｘ１７はＮ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ｐ、Ｇ、ＳもしくはＡであり、
Ｘ１８はＨ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ａ、Ｌ、ＰもしくはＡであり、
Ｘ１９はＲ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ｌ、Ｍ、ＦもしくはＡであり
Ｘ２０はＲもしくはＡであり、
Ｘ２１はＬであり
Ｘ２２はＡである）
またはＸ１および／もしくは最大１０個のＣ末端残基を欠いているそのトランケート型多様体を有し、
ｐＥはピログルタメート（ｐＧｌｕ）を意味しており、（ｍｅ）ｌａｎはＬａｎまたはｍｅＬａｎを意味しており、Ｌａｎはランチオニン（Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａ）のＮ末端ハーフまたはＣ末端ハーフを表し、ｍｅＬａｎはメチルランチオニン（Ａｂｕ−Ｓ−ＡｌａまたはＡｌａ−Ｓ−Ａｂｕ）のＮ末端ハーフまたはＣ末端ハーフを表し、
但し、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１３〜Ｘ１９のうちの２個以下は、（メチル）ランチオニン架橋を一緒に形成する（ｍｅ）ｌａｎであり、前記（メチル）ランチオニン架橋はサイズｉ、ｉ＋３またはｉ、ｉ＋４またはｉ、ｉ＋５である。
【００１４】
ガラニンの環状ペプチド類似体は当分野で既知である。Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ他（Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９，３８，１５２９５）は、Ａｓｐ４およびＬｙｓ８の側鎖間にラクタム架橋を持つＧａｌ（１〜６）の環化類似体を構築した。これにより、ＧａｌＲ２受容体サブタイプに対する低いナノモル濃度の受容体結合親和性および低いナノモル濃度のＥＣ５０を示す類似体が得られた。
【００１５】
国際公開第０３／０９９８６３号パンフレットは、Ｓｅｒ６位およびＣｙｓ１０位で翻訳後ランチオニン環を導入するための典型的な前駆体として機能することができる改変ガラニンペプチド配列を開示する。得られた環状類似体の特性については何も述べられていない。
【００１６】
Ｇｒｅｅｎ他（Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１３  Ｊａｎ  １；２１（１）：３０３−１０）は、生物活性ペプチドのヘリカル構造を安定化させるための戦略として炭化水素ステープリング（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｓｔａｐｌｉｎｇ）を使用した。開示されているのは、完全長ガラニンのＡｌａ−７およびＬｅｕ−１１が（Ｓ）−２−（４−）ペンテニル）アラニンに置換されたステープル型ガラニン類似体（ｓｔａｐｌｅｄ  ｇａｌａｎｉｎ  ａｎａｌｏｇ）である。この類似体はＧａｌＲ１およびＧａｌＲ２に対するアゴニスト活性を保持し、てんかんのマウスモデルにおいててんかん発作を抑制した。受容体特異性の変化は観察されなかった。
【００１７】
本発明の環状ガラニン類似体（本明細書において「ランチ−ガラニン」とも称される）は、（メチル）ランチオニン架橋を一緒に形成するＸ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１３〜Ｘ１９のうちの２個以下により形成される（メチル）ランチオニン構造を特徴とし、前記（メチル）ランチオニン架橋はサイズｉ、ｉ＋３またはｉ、ｉ＋４またはｉ、ｉ＋５である。
【００１８】
一実施形態では、ガラニン類似体は式Ｘ１〜Ｘ２２であり、即ち、本明細書において上記で定義したＸ１〜Ｘ２２の全てを含む。別の実施形態では、ガラニン類似体は、最大１０個のＣ末端残基を欠いているＣ末端トランケート型多様体である。例えば、ガラニン類似体は式Ｘ１〜Ｘ１２であり、Ｘ１３〜Ｘ２２の１０個の残基全てを欠いている。他のトランケート型多様体として、Ｘ１〜Ｘ１３、Ｘ１〜Ｘ１４、Ｘ１〜Ｘ１５、Ｘ１〜Ｘ１６、Ｘ１〜Ｘ１７、Ｘ１〜Ｘ１８、Ｘ１〜Ｘ１９、Ｘ１〜Ｘ２０およびＸ１〜Ｘ２１が挙げられる。当業者に理解され得るように、上記の注釈は、連続する残基のストレッチを含む類似体を意味しており、例えばＸ１〜Ｘ１３は、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３からなる類似体を意味する。残基Ｘ２０〜Ｘ２２を欠いている多様体が好ましい。
【００１９】
Ｘ１をｐＥ、Ｇ、Ｎ、ＲＧＲＧ、ＲＧＲＧＮおよびＲＧＲＧＧから選択することができる。好ましい態様ではＸ１はｐＥまたはＧであり、より好ましくはｐＥである。１位でのピログルタメートの導入により、この類似体をＮ末端加水分解から保護することができる。加えて、驚くべきことに、この類似体の生物活性が、Ｇａｌ２Ｒを介したシグナル伝達を優先させることにシフトされることを発見した。ピログルタミン酸（ＰＣＡ、５−オキソプロリン、ピドリン酸（ｐｉｄｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）またはピログルタミン酸の基本型のピログルタメートとしても知られている）は、グルタミン酸またはグルタミンの遊離アミノ基が環化してラクタムを形成する珍しいアミノ酸誘導体である。ピログルタミン酸は、５−オキソプロリナーゼによりグルタメートへと変換されるグルタチオンサイクルでの代謝産物である。ピログルタメートは、バクテリオロドプシン等の多くのタンパク質中で見出される。Ｎ末端のグルタミン酸およびグルタミン残基は、自発的に環化してピログルタメートになり得る。
【００２０】
別の実施形態では、このランチ−ガラニンは、任意選択で最大１０個の残基のＣ末端トランケーションと組み合わせて、Ｎ末端のＸ１を欠いている。従って、提供されるのは式Ｘ２〜Ｘ２２のガラニン類似体でもある。更なる態様では、本発明は、Ｘ２〜Ｘ１２、Ｘ２〜Ｘ１３、Ｘ２〜Ｘ１４、Ｘ２〜Ｘ１５、Ｘ２〜Ｘ１６、Ｘ２〜Ｘ１７、Ｘ２〜Ｘ１８、Ｘ２〜Ｘ１９、Ｘ２〜Ｘ２０、Ｘ２〜Ｘ２１を含む多様体を提供し、即ち、一般式Ｘ１〜Ｘ２２のＮ末端トランケーションおよびＣ末端トランケーションの両方を含む多様体を提供する。
【００２１】
Ｘ２はＷＮまたはＷＴである。
好ましくは、Ｘ２はＷＮである。
【００２２】
Ｘ３はＬ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ａ、Ｄ、Ｖ、Ｋ、Ｑである
Ｘ４はＮ、Ｔまたは（ｍｅ）ｌａｎである
Ｘ５はＳまたはＡである
Ｘ６はＡまたは（ｍｅ）ｌａｎである
Ｘ７はＧ、（ｍｅ）ｌａｎ、ＡまたはＫである
一態様では、Ｘ３はＬであり、Ｘ４はＮであり、Ｘ５はＡであり、Ｘ６はＡであり、および／またはＸ７はＧである。
【００２３】
Ｘ８は常にＹであり、かつＸ９は常にＬである
Ｘ１０はＬ、（ｍｅ）ｌａｎまたはＡである
Ｘ１１はＧ、Ａ、（ｍｅ）ｌａｎである、
Ｘ１２はＰまたはＡである
Ｘ１３はＨ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ｖ、Ｑ、Ｐ、Ｑ、Ｅ、Ｋ、Ａである
Ｘ１４はＡ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ｌ、Ｑ、Ｐ、Ｈ、Ｋ、Ｉである
例えば、Ｘ１０はＬであり、Ｘ１１はＧであり、Ｘ１２はＰであり、Ｘ１３はＨであり、および／またはＸ１４はＡである。
【００２４】
Ｘ１５はＶ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ｐ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ａである
Ｘ１６は（ｍｅ）ｌａｎ、Ｐ、Ｆ、ＬまたはＧである、
Ｘ１７はＮ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ｐ、Ｇ、Ｓ、Ａである、
Ｘ１８はＨ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ａ、Ｌ、Ｐ、Ａである、
Ｘ１９はＲ、（ｍｅ）ｌａｎ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ａである
【００２５】
Ｘ２０はＲ、Ａである、
Ｘ２１はＬである、
Ｘ２２はＡである。
【００２６】
本発明のランチ−ガラニンは、サイズｉ、ｉ＋３またはｉ、ｉ＋４またはｉ、ｉ＋５の（メチル）ランチオニン架橋を含む。そのため、環のサイズは、環形成に関与する残基が２個、３個または４個の残基のいずれかにより離間されているものに限定される。より大きな環のサイズは活性にとって有害であることが分かった。一実施形態では、（メチル）ランチオニン架橋はサイズｉ、ｉ＋３またはｉ、ｉ＋４である。特定の態様では、（メチル）ランチオニン架橋はサイズｉ、ｉ＋３である。例えば、この環は、残基Ｘ３およびＸ６、Ｘ４およびＸ７、Ｘ５およびＸ８、Ｘ６およびＸ９、Ｘ７およびＸ１０またはＸ８およびＸ１１の間で形成されている。
【００２７】
更に、驚くべきことに、野生型ガラニンと比較して受容体特異性の変化を可能にしつつ、活性を有意に喪失することなく１３位以降からの環の導入を行なうことができることを発見した。より具体的には、ペプチドのＣ末端ハーフ中での（メチル）ランチオニンの導入によりＧａｌＲ２優先へとシフトされることを発見した。従って、一実施形態では、Ｘ１３〜Ｘ１９からなる群から選択される２個の残基が（ｍｅ）ランチオニン架橋を一緒に形成する。環構造を形成する残基の適切な対として、Ｘ１３およびＸ１６、Ｘ１３およびＸ１７、Ｘ１４およびＸ１７、Ｘ１４およびＸ１８、Ｘ１５およびＸ１８ならびにＸ１５およびＸ１９が挙げられる。典型的な類似体はＧａｌＭ５０、ＧａｌＭ５１，ＧａｌＭ５２およびＧａｌＭ７５である。好ましい実施形態では、残基Ｘ２０〜Ｘ２２が存在せず、かつＸ１３〜Ｘ１９からなる群から選択される２個の残基が（ｍｅ）ランチオニン架橋を一緒に形成する。
【００２８】
本発明に係るガラニン類似体のＣ末端カルボキシル基は、遊離（ＣＯＯＨ）型またはアミド（ＣＯＮＨ２）型であることができる。一実施形態では、この類似体はＣ末端のアミド化により保護されている。本発明のガラニン類似体の構造に応じて、このガラニン類似体は１種または複数種の特定の生物活性を有することができる。一実施形態では、本発明は、ガラニンＲ１受容体（ＧａｌＲ１）を発現する細胞中でのｃＡＭＰ産生を阻害することができる類似体を提供する。好ましくは、ｃＡＭＰ産生は２００ｎＭ未満のＥＣ５０で阻害される。あるいは、このガラニン類似体は、４００ｎＭ未満のＥＣ５０で、ＧａｌＲ１を発現する細胞中でのベータアレスチン動員を誘導することができる。
【００２９】
このガラニン類似体は、１００ｎＭ未満のＥＣ５０で、ガラニンＲ２受容体を発現する細胞中でのカルシウム流出を誘導することができ、かつ５μＭ未満のＥＣ５０でベータアレスチン動員を誘導することができる。
【００３０】
好ましい実施形態では、本発明は、ＧａｌＲ１と比較してＧａｌＲ２を刺激する能力が増強されている環状ガラニン類似体を提供する。用語「ＧＡＬＲ２特異的アゴニスト」は、この物質によるＧＡＬＲ２の活性化の結果として細胞中での応答を引き起こすことができるが、ＧＡＬＲ１および／またはＧＡＬＲ３を活性化しない（または低い効力で活性化する）類似体を示す。ある化合物がガラニン受容体のアゴニストであるかどうかを確認する方法は当分野で既知であり、例えばＢｏｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０８  ３−１１およびＢａｒｂｌｉｖｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ６  １８４９−１８５２で既知である。典型的なＧａｌＲ２特異的類似体として、ＧａｌＭ５４およびＧａｌＭ５４ｔｒが挙げられる。この類似体は、０〜１００μＭの結合親和性でＧａｌＲ２に結合することができる、および／またはＧａｌＲ１と比べてＧｌＲ２に３０倍を超える特異性を有する。好ましくは、この類似体は、ＧａｌＲ１と比べてＧａｌＲ２に５０倍を超える特異性を有し、より好ましくはＧａｌＲ１と比べてＧａｌＲ２に１００倍を超える特異性を有する。
【００３１】
具体的な実施形態では、このガラニン類似体は、下記からなる群から選択される。
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【００３２】
特に好ましい類似体として下記が挙げられる。
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡｍｅｌａｎＨＡｍｅｌａｎＧＮＨＲ（ＧａｌＭ５０ｂ）、
ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡｍｅｌａｎＨＡｍｅｌａｎＧ（ＧａｌＭ８９）、
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡｍｅｌａｎＨＡｍｅｌａｎＧ（ＧａｌＭ８９ｂ）、
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡｍｅｌａｎＡＶｍｅｌａｎＮＨＲ（ＧａｌＭ５４）、
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡｍｅｌａｎＡＶｍｅｌａｎＮＨ（ＧａｌＭ５４ｔｒ）
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＨＡｍｅｌａｎＧＮｍｅｌａｎＲ（ＧａｌＭ７４ｂ）
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＨｍｅｌａｎＶＧｍｅｌａｎＨＲ（ＧａｌＭ８２）
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰｌａｎＡＶｌａｎ（４１７８Ｂ異性体Ｂ）および
ｐＥＷＴＬＮＡＡｌａｎＹＬＬｌａｎ（４１７９Ｂ異性体Ｂ）
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰｍｅｌａｎＡＶｍｅｌａｎ
ｐＥＷＴＬＮＡＡｍｅｌａｎＹＬＬｍｅｌａｎ
【００３３】
具体的な実施形態では、このガラニン類似体は、下記からなる群から選択される。
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡｍｅｌａｎＨＡｍｅｌａｎＧＮＨＲ（ＧａｌＭ５０ｂ）、
ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡｍｅｌａｎＨＡｍｅｌａｎＧ（ＧａｌＭ８９）、
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡｍｅｌａｎＨＡｍｅｌａｎＧ（ＧａｌＭ８９ｂ）、
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡｍｅｌａｎＡＶｍｅｌａｎＮＨＲ（ＧａｌＭ５４）、
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡｍｅｌａｎＡＶｍｅｌａｎＮＨ（ＧａｌＭ５４ｔｒ）
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＨＡｍｅｌａｎＧＮｍｅｌａｎＲ（ＧａｌＭ７４ｂ）
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＨｍｅｌａｎＶＧｍｅｌａｎＨＲ（ＧａｌＭ８２）
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰｌａｎＡＶｌａｎ（４１７８Ｂ異性体Ｂ）および
ｐＥＷＴＬＮＡＡｌａｎＹＬＬｌａｎ（４１７９Ｂ異性体Ｂ）
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰｍｅｌａｎＡＶｍｅｌａｎ
ｐＥＷＴＬＮＡＡｍｅｌａｎＹＬＬｍｅｌａｎ
【００３４】
また、提供されるのは、本発明に係る少なくとも１種のランチ−ガラニンを含む医薬組成物である。更なる実施形態は、薬剤として使用するための本発明に係るガラニン類似体に関する。更なる実施形態は、下記からなる群から選択されるガラニン類似体に関する。
薬剤として使用するための、ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡｍｅｌａｎＨＡｍｅｌａｎＧＮＨＲ（ＧａｌＭ５０ｂ）、
ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡｍｅｌａｎＨＡｍｅｌａｎＧ（ＧａｌＭ８９）、
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡｍｅｌａｎＨＡｍｅｌａｎＧ（ＧａｌＭ８９ｂ）、
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡｍｅｌａｎＡＶｍｅｌａｎＮＨＲ（ＧａｌＭ５４）、
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡｍｅｌａｎＡＶｍｅｌａｎＮＨ（ＧａｌＭ５４ｔｒ）
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＨＡｍｅｌａｎＧＮｍｅｌａｎＲ（ＧａｌＭ７４ｂ）
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＨｍｅｌａｎＶＧｍｅｌａｎＨＲ（ＧａｌＭ８２）
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰｌａｎＡＶｌａｎ（４１７８Ｂ異性体Ｂ）および
ｐＥＷＴＬＮＡＡｌａｎＹＬＬｌａｎ（４１７９Ｂ異性体Ｂ）、
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰｍｅｌａｎＡＶｍｅｌａｎ
ｐＥＷＴＬＮＡＡｍｅｌａｎＹＬＬｍｅｌａｎ
【００３５】
また、提供されるのは、下記からなる群から選択されるガラニン類似体を含む医薬組成物である。
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡｍｅｌａｎＨＡｍｅｌａｎＧＮＨＲ（ＧａｌＭ５０ｂ）、
ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡｍｅｌａｎＨＡｍｅｌａｎＧ（ＧａｌＭ８９）、
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡｍｅｌａｎＨＡｍｅｌａｎＧ（ＧａｌＭ８９ｂ）、
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡｍｅｌａｎＡＶｍｅｌａｎＮＨＲ（ＧａｌＭ５４）、
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡｍｅｌａｎＡＶｍｅｌａｎＮＨ（ＧａｌＭ５４ｔｒ）
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＨＡｍｅｌａｎＧＮｍｅｌａｎＲ（ＧａｌＭ７４ｂ）
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＨｍｅｌａｎＶＧｍｅｌａｎＨＲ（ＧａｌＭ８２）
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰｌａｎＡＶｌａｎ（４１７８Ｂ異性体Ｂ）および
ｐＥＷＴＬＮＡＡｌａｎＹＬＬｌａｎ（４１７９Ｂ異性体Ｂ）。
ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰｍｅｌａｎＡＶｍｅｌａｎ
ｐＥＷＴＬＮＡＡｍｅｌａｎＹＬＬｍｅｌａｎ
【００３６】
この薬剤は、脳の傷害、損傷または疾患の予防または処置のために有利に使用される。脳の傷害または損傷は下記のうちの１つにより引き起こされる：塞栓性、血栓性または出血性の脳卒中；脳または脊髄への直接的なまたは間接的な外傷または手術；心肺バイパス手術中でのまたは腎透析中での脳への虚血性または塞栓性の損傷；心筋梗塞後の再灌流脳損傷；脳疾患；免疫学的損傷、化学的損傷または放射線損傷。脳疾患は、アルツハイマー病、パーキン病、多発性硬化症または変異型クロイツフェルト・ヤコブ病のうちの１つであることができる。
【００３７】
例えば、ガラニン類似体は、抗不安薬、抗うつ薬、抗けいれん薬としてのまたは神経保護のための使用を見出す。処置すべき特に好ましい状態は多発性硬化症、アルツハイマー病および炎症性腸疾患である。
【００３８】
また、本明細書で提供されるのは、本発明に係る環状ガラニン類似体を製造する方法である。一実施形態では、このランチオニンガラニン類似体を、環状ジスルフィド架橋含有「親」類似体（特にジスルフィド架橋されたＤ−Ｃｙｓ−Ｌ−Ｃｙｓ類似体）の塩基補助型硫黄押し出しにより得ることができる。例えば、この親類似体はｐＥＷＮＬＮＡＡｄＣＹＬＬＣ、ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡｄＣＡＶＣ、ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＨｄＣＶＧＣまたはｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＨＡｄＣＧＮＣである。これらでは、ジスルフィド架橋はｄＣおよびＣ末端のＣにより形成される。
【００３９】
別の実施形態では、この方法は、
（ｉ）下記からなる群から選択されるペプチド（即ち直鎖状前駆体ペプチド）を準備するステップと、
ＧＷＮＴＮＡＣＧＹＬＬＧＰＨＡＶＧＮＨＲ、
ＧＷＮＴＮＡＣＧＹＬＬＧＰＨＡＶＧＮＨ、
ＧＷＮＬＮＡＡＴＹＬＣＧＰＨＡＶＧＮＨＲ、ＧＷＮＬＮＡＡＴＹＬＣＧＰＨＡＶＧＮＨ
ＧＷＮＬＮＡＡＳＹＬＬＣＧＰＨＡＶＧＮＨＲ、ＧＷＮＬＮＡＡＳＹＬＬＣＧＰＨＡＶＧＮＨ
ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣＮＨＲ、ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣＮＨ、
ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＳＡＶＣ、ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＳＡＶＣＮＨＲ、
ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＳＡＶＣＮＨ、ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＧＣＨＲ、
ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＳＡＶＧＣ、ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＳＡＶＧＣＨＲ、
ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＳＡＶＧＮＣＲ、ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＳＡＶＧＮＣ、
ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＳＡＶＧＮＨＣ、ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＨＴＶＧＣＨＲ、
ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＨＳＶＧＣ、ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＨＡＴＧＮＣＲ、
ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＨＡＳＧＮＣ、ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＳＡＶＧＮＨＣ、
ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣＮＨＲ、ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣＮＨ、
ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＳＡＶＣ、ＱＷＮＬＮＡＡＳＹＬＬＣ、
ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＨＴＶＧＣＨＲ、ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＴＨＡＣＧ、
ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＴＡＶＣ、ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡＴＨＡＣＧ、ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣ、ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡＴＨＡＣＧ、ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣ、
ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡＳＨＡＣＧ、ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡＴＨＡＣＧＮＨＲ、
ＧＷＮＬＮＡＡＴＹＬＣＧＰＨＡＶＧＮＨＲ、ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＨＡＴＧＮＣＲ、
ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡＴＨＡＣＧ、ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡＴＨＡＣＧ、
ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣ、ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣ、
ＧＷＮＶＮＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣＮＨＲ、ＧＷＮＤＮＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣＮＨＲ、
ＧＷＮＮＮＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣＮＨＲ、ＧＷＮＬＶＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣＮＨＲ、
ＧＷＮＬＫＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣＮＨＲ、ＧＷＮＬＤＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣＮＨＲ、
ＧＷＮＬＱＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣＮＨＲ、ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＴＡＶＣ、
ＱＷＴＬＮＡＡＴＹＬＬＣ、ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＳＡＶＣ、ＱＷＴＬＮＡＡＳＹＬＬＣ。
【００４０】
（ｉｉ）前記ペプチドのＳｅｒ残基またはＴｈｒ残基の脱水を誘導するステップと、
（ｉｉｉ）脱水したＳｅｒまたはＴｈｒを前記ペプチドのＣｙｓ残基のチオール基に連結させることにより閉環を誘導するステップと
を含む。ステップ（ｉｉｉ）は、化学的手段または酵素的手段により閉環を誘導することを含むことができる。好ましくは、ステップ（ｉｉｉ）は酵素的閉環を含む。例えば、当分野で既知の方法に従って（細菌）宿主細胞のランチペプチド酵素機構を利用することによる。
【００４１】
ペプチドのＮ末端残基がグルタミン（Ｑ）である場合、この方法は、好ましくは、例えばＲｉｎｋ他（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６１（２０１０）２１０−２１８）で説明されているように、当分野で既知の方法に従うＱのｐＥへの変換を更に含む。
【００４２】
ランチ−ガラニンを製造するための特に好ましい直鎖ペプチド配列として下記が挙げられる。
（例えばＧａｌＭ５０ｂを製造するための）ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡＴＨＡＣＧＮＨＲ、
（例えばＧａｌＭ８９を製造するための）ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡＴＨＡＣＧ、
（例えばＧａｌＭ８９ｂを製造するための）ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡＴＨＡＣＧ、
（例えばＧａｌＭ５４を製造するための）ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣＮＨＲ、
（例えばＧａｌＭ７４ｂを製造するための）ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＨＡＴＧＮＣＲ（例えばＧａｌＭ８２を製造するための）ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＨＴＶＧＣＨＲ、
（例えば４１７８Ｂ異性体Ｂを製造するための）ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＳＡＶＣおよび
（例えば４１７９Ｂ異性体Ｂを製造するための）ＱＷＴＬＮＡＡＳＹＬＬＣ。
（４１７８を製造するための）ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＴＡＶＣ
（４１７９を製造するための）ＱＷＴＬＮＡＡＴＹＬＬＣ
【００４３】
また、提供されるのは、上記した前駆体ペプチドをコードする単離核酸配列と、前記核酸配列を含むベクターにおいて、核酸が、ランチペプチド−リーダー配列をコードする核酸配列に遺伝的に融合されているベクターとである。
【００４４】
好ましい核酸配列は、下記のペプチド配列のうちの１つをコードするものである。
ＧＷＮＴＮＡＣＧＹＬＬＧＰＨＡＶＧＮＨＲ、ＧＷＮＴＮＡＣＧＹＬＬＧＰＨＡＶＧＮＨ、
ＧＷＮＬＮＡＡＴＹＬＣＧＰＨＡＶＧＮＨＲ、ＧＷＮＬＮＡＡＴＹＬＣＧＰＨＡＶＧＮＨ
ＧＷＮＬＮＡＡＳＹＬＬＣＧＰＨＡＶＧＮＨＲ、ＧＷＮＬＮＡＡＳＹＬＬＣＧＰＨＡＶＧＮＨ
ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣＮＨＲ、ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣＮＨ、
ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＳＡＶＣ、ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＳＡＶＣＮＨＲ、
ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＳＡＶＣＮＨ、ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＧＣＨＲ、
ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＳＡＶＧＣ、ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＳＡＶＧＣＨＲ、
ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＳＡＶＧＮＣＲ、ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＳＡＶＧＮＣ、
ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＳＡＶＧＮＨＣ、ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＨＴＶＧＣＨＲ、
ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＨＳＶＧＣ、ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＨＡＴＧＮＣＲ、
ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＨＡＳＧＮＣ、ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＳＡＶＧＮＨＣ、
ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣＮＨＲ、ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣＮＨ、
ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＳＡＶＣ、ＱＷＮＬＮＡＡＳＹＬＬＣ、
ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＨＴＶＧＣＨＲ、ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＴＨＡＣＧ、
ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＴＡＶＣ、ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡＴＨＡＣＧ、ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣ、ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡＴＨＡＣＧ、ｐＥＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣ、
ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡＳＨＡＣＧ、ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡＴＨＡＣＧＮＨＲ、
ＧＷＮＬＮＡＡＴＹＬＣＧＰＨＡＶＧＮＨＲ、ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＨＡＴＧＮＣＲ、
ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡＴＨＡＣＧ、ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡＴＨＡＣＧ、
ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣ、ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣ、
ＧＷＮＶＮＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣＮＨＲ、ＧＷＮＤＮＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣＮＨＲ、
ＧＷＮＮＮＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣＮＨＲ、ＧＷＮＬＶＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣＮＨＲ、
ＧＷＮＬＫＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣＮＨＲ、ＧＷＮＬＤＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣＮＨＲ、
ＧＷＮＬＱＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣＮＨＲ、ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＴＡＶＣ、
ＱＷＴＬＮＡＡＴＹＬＬＣ、ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＳＡＶＣ、ＱＷＴＬＮＡＡＳＹＬＬＣ
【００４５】
ランチ−ガラニンを製造するための直鎖ペプチド配列をコードする特に好ましい核酸として下記が挙げられる。
（例えばＧａｌＭ５０ｂを製造するための）ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡＴＨＡＣＧＮＨＲ、
（例えばＧａｌＭ８９を製造するための）ＧＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡＴＨＡＣＧ、
（例えばＧａｌＭ８９ｂを製造するための）ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＡＴＨＡＣＧ、
（例えばＧａｌＭ５４を製造するための）ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＡＴＡＶＣＮＨＲ、
（例えばＧａｌＭ７４ｂを製造するための）ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＨＡＴＧＮＣＲ
（例えばＧａｌＭ８２を製造するための）ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＨＴＶＧＣＨＲ
（例えば４１７８Ｂ異性体Ｂを製造するための）ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＳＡＶＣ
（例えば４１７９Ｂ異性体Ｂを製造するための）ＱＷＴＬＮＡＡＳＹＬＬＣ。
（４１７８を製造するための）ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰＴＡＶＣおよび
（４１７９を製造するための）ＱＷＴＬＮＡＡＴＹＬＬＣ
【００４６】
更なる実施形態は、本発明に係るベクターを含み、ランチオニン導入酵素を更に含む食品グレードの細菌宿主細胞（好ましくはＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）宿主細胞）に関する。例えば、この宿主細胞は、ランチビオティクス酵素機構を内因的に含む、または成熟酵素ＮｉｓＢおよびＮｉｓＣならびに転位酵素（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ）ＮｉｓＴをコードするプラスミドを有する。そのような宿主細胞は、腸内でのランチ−ガラニンのｉｎ  ｓｉｔｕ産生用の経口送達システムとして有利に使用される。
【００４７】
従って、本発明はまた、上記した前駆体ペプチドをコードする核酸配列を含む生存宿主細胞と、薬学的に許容される担体、賦形剤または媒体とを含む医薬組成物に関する。好ましくは、この組成物は経口投与用に製剤化されている。
【００４８】
ｉｎ  ｓｉｔｕでランチ−ガラニンを産生することができる宿主細胞は、炎症性腸疾患と関連する症状を処置するまたは緩和する方法で好適に使用され、例えば、この腸疾患はクローン病または潰瘍性大腸炎（ＵＣ）である。
【００４９】
本発明のＧａｌＲ１アンタゴニストおよびＧａｌＲ３アンタゴニストの治療的使用は下記の通りである。ガラニンは、ＩＢＤでは潜在的に重要な役割を果たすと考えられる。Ｇａｌ１Ｒは、結腸組織中で見出される唯一のｇａｌ受容体である。Ｇａｌ１Ｒ遺伝子のクローニングにより、炎症関連転写因子ＮＦカッパＢ用の複数の認識部位が明らかになっている。ＧａｌＲ１特異的アンタゴニストは、炎症に起因する下痢の処置のための新規の薬理学的治療をもたらすことができる［Ｇｒｏｓｓ  ２００７  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  １３，９１８−３２］。
【００５０】
ＧａｌＲ３の拮抗作用は膵炎を軽減することが報告されている［Ｂａｒｒｅｔｏ  ＳＧ，２０１１  Ｇａｌａｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｍｏｔｉｌ  ２３（３）：ｅｌ４１−５ｌ］。ＧａｌＲ３アンタゴニストは、更に抗うつ薬として作用するように思われる［Ｓｗａｎｓｏｎ  ＣＪ，２００５  Ａｎｘｉｏｌｙｔｉｃ−  ａｎｄ  ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇａｌａｎｉｎ−３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｇａｌ３）ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ＳＮＡＰ  ３７８８９  ａｎｄ  ＳＮＡＰ  ３９８２９９．ＰＮＡＳ  １０２，１７４８９−９４］。
【実施例】
【００５１】
実施例１：ランチオニン安定化ガラニン類似体（ランチ−ガラニン）の合成
例えばＫｌｕｓｋｅｎｓ  ２００５  Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ＮｉｓＢ，ｔｈｅ  Ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｎｉｓｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４，１２８２７−１２８３４、Ｋｌｕｓｋｅｎｓ  ２００９  Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−（１−７）ｗｉｔｈ  ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ−ｂｒｉｄｇｅ：ａｎ  ＡＣＥ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ，ｐｏｔｅｎｔ  Ａｎｇ−（ｌ−７）  ａｎａｌｏｇｕｅ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅｒ．３２８，８４９−８５４、Ｒｉｎｋ  ２００７ｃ  ＮｉｓＣ，ｔｈｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｎｉｓｉｎ，ｃａｎ  ｃａｔａｌｙｚｅ  ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｎｏｎ−ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６，１３１７９−１３１８９で説明されている確立された手順に従って、ランチオニン含有ガラニン多様体を製造した。
【００５２】
簡潔に言うと、２種のプラスミド系を含むラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）を使用した。第１のプラスミドは、（メチル）ランチオニン−ガラニンを目的とする前駆体ペプチドにＣ末端で遺伝的に融合しているランチビオティクスナイシンＭＳＴＫＤＦＮＬＤＬＶＳＶＳＫＫＤＳＧＡＳＰＲのリーダーペプチドをコードし、このペプチドは、［ｉ］位でセリン／トレオニンを含み、かつ［ｉ＋３］位、［ｉ＋４］位または［ｉ＋５］位でシステインを含む。ナイシンリーダーおよび（メチル）ランチオニンガラニン前駆体を含む融合ペプチドをコードするプラスミドを、成熟酵素ＮｉｓＢおよびＮｉｓＣならびに転位酵素ＮｉｓＴをコードする第２のプラスミドｐＩＬ３ＢＴＣプラスミドと共に、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）中で共発現させた。ＮｉｓＢがセリンまたはトレオニンを脱水し、デヒドロアラニンおよびデヒドロブチリンがそれぞれ生じた。その後、シクラーゼＮｉｓＣがデヒドロアミノ酸をシステインに共有結合的に連結し、ランチオニン（ｌａｎ）またはメチルランチオニン（ｍｅｌａｎ）がそれぞれ生じた。第２のプラスミドは、ナイシン改変および排出酵素（ｅｘｐｏｒｔ  ｅｎｚｙｍｅ）ＮｉｓＢＴＣをコードする。
【００５３】
改変ガラニン多様体の製造の実際の手順（Ｋｌｕｓｋｅｎｓ  ２００５  Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ＮｉｓＢ，ｔｈｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｎｉｓｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４，１２８２７−３４、Ｒｉｎｋ  ２００５  Ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｓ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｈａｔ  ｃａｎ  ｂｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ．４４，８８７３−８２）、単離の実際の手順および精製の実際の手順は下記の通りであった。
【００５４】
培養物ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＮＺ９０００  ｐＩＬ３ＢＴＣ  ｐＮＺ−ＧａｌＭ’Ｘ’を、０．５％のグルコースと抗生物質クロラムフェニコール（５μｇ／ｍｌ）およびエリスロマイシン（５μｇ／ｍｌ）とを補充したＭ１７ブロス（Ｄｉｆｃｏ）中で一晩増殖させた。翌日、培養物１ｍｌを、ナイシン（１μｇ／ｍｌ）を補充した最小培地１００ｍｌ（Ｊｅｎｓｅｎ  ＰＲ，Ｈａｍｍｅｒ  Ｋ．１９９３  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５９，４３６３−６、Ｒｉｎｋ  ２００５  Ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｓ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｈａｔ  ｃａｎ  ｂｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ．４４，８８７３−８２）で希釈した。この培養物を２４〜４８時間にわたり更に増殖させた。無細胞上清由来のペプチドを１０％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）中で沈殿させた。その後、３０℃での１８時間にわたるプロテアーゼファクターＸａ（５μｇ）による融合ペプチド（４０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ＝８）、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２に溶解させた）の消化により、リーダーペプチドからガラニンペプチドを遊離させた。この消化混合物を、ＨＰ１０５０  ＨＰＬＣシステムまたはＪＡＳＣＯ  ＰＵ−１５８０  ＨＰＬＣシステムを使用してＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃ１２  ２５０×４．６ｍｍ×４ミクロンカラムにアプライした。緩衝液Ａ（ｍｉｌｌｉＱ中の０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））および緩衝液Ｂ（アセトニトリル中の０．１％のＴＦＡ）を使用する勾配により、ペプチドを溶出させた。使用した勾配は、傾斜が１．１４％／分である１０％〜５０％の緩衝液Ｂであった。ピークを回収し、速度真空装置を使用して乾燥させた。ペプチドを、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）とのまたはＣＤＡＰなしのインキュベーション後に、質量分析により分析した。ＣＤＡＰの添加により＋２５ダルトンのシフトが起こり、かつ閉環がない場合に存在する（Ｒｉｎｋ．２００７ｃ  ＮｉｓＣ，ｔｈｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｎｉｓｉｎ，ｃａｎ  ｃａｔａｌｙｚｅ  ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｎｏｎ−ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６，１３１７９−１３１８９）。必要に応じて、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．６）中における５０℃での１８時間にわたる、Ｎ末端グルタミンを含む精製済ガラニンペプチドのインキュベーションにより、Ｎ末端ピログルタメート（ｐＥ）を導入した。別のＨＰＬＣランを実施して、Ｎ末端ピログルタメートを有するガラニン類似体を単離した。２８０ｎｍで検出したＨＰＬＣクロマトグラムでの化合物のピーク面積と既知量の参照ガラニン−（１−１５）のピーク面積とを比較することにより、精製済ガラニン多様体の定量化を実施した。メチルランチオニンを有するペプチドは、ＮｉｓＣにより立体特異的に環化された酵素的なＤ，Ｌであった。ペプチドへのランチオニン（ｌａｎ）の導入では、反応性に起因して高反応性のデヒドロアラニンの連結がＮｉｓＣによる触媒作用によってだけでなく自発的にも起こり得ることから、立体特異性は確立されていない。
【００５５】
実施例２：ランチオニン安定化ガラニン類似体（ランチ−ガラニン）の活性
（ランチ）ガラニンの生物活性を、ＧａｌＲ１受容体またはＧａｌＲ２受容体のいずれかを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株中で測定した。ＤｉｓｃｏｖｅｒＸからの市販のキットを使用して活性測定を実施して、アレスチン動員（ＧａｌＲ１、ＧａｌＲ２）およびｃＡＭＰ合成の阻害（ＧａｌＲ１）を測定した。加えて、ＧａｌＲ２受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞株をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓからの方法に使用して、カルシウム流出（ＧａｌＲ２）を測定している。
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【００５６】
結果
結果を表１にまとめる。値は、直鎖状ガラニン（１−１５）の場合に観測したＥＣ５０（１．０の値に設定している）と相対的に表す類似体のＥＣ５０を示す。ＮＤは「未決定」を示す。
【００５７】
驚くべきことに、ガラニンペプチドのＣ末端での（メチル）ランチオニンの導入によりＧａｌＲ２優先へとわずかにシフトされることを発見した。特にＧａｌＭ５０ｂ、ＧａｌＭ８９ｂ、ＧａｌＭ５４、ＧａｌＭ８７、ＧａｌＭ７４ｂはＧａｌＲ２の刺激を優先する。Ｎ末端でのｐＥの存在は、いくつかの類似体（例えばＧａｌＭ５０ｂ、ＧａｌＭ８９ｂ、ＧａｌＭ７４ｂ）のＧａｌＲ２の優先に寄与するが他（例えばＧａｌＭ７６ｂ）のＧａｌＲ２の優先には寄与しないと思われる。
【００５８】
更に、活性に関して好ましい環位置はＣ末端部分であるように見える。好ましくは、この環はＸ１２の後ろに位置する。ＧａｌＭ７３は、環をより中心に有するにもかかわらず、いくらかの活性を保持している。ＧａｌＭ８２は、その活性が低いにもかかわらず、血液脳関門（ＢＢＢ）の通過を容易にする可能性が最も高い小さくて疎水性であることから、特に興味深い。更に、Ｎ末端およびＣ末端の両方が保護されており、ＧａｌＭ８２を容易に化学的に合成することができる。
【００５９】
加えて、Ｌ４Ｖ置換およびＬ４Ｎ置換をそれぞれ有するＧａｌＭ９２およびＧａｌＭ９４は、ＧａｌＷｔｂのようにＧａｌＲ２により同等の効力を有する。
【００６０】
実施例３
ジスルフィド架橋多様体の塩基補助型硫黄押し出しにより得られたガラニンの化学的に合成されたランチオニン類似体：
下記の２種のペプチドを原料としてＰｅｐｓｃａｎで注文した：
１）Ｓｙｍ−４１７８：Ｈ−ＱＷＮＬＮＡＡＧＹＬＬＧＰｃＡＶＣ−ＯＨ
このペプチドはＧａｌ８７に関連している。しかしながら、生物学的に合成されたＧａｌＭ８７はおそらくＤ，Ｌランチオニン含有であるが、化学合成により異性体は複数種になる。興味深いことに、ランチオニン含有異性体のうちの１種４１７８Ｂ（表２）は非常に活性である。
【００６１】
２）Ｓｙｍ−４１７９：Ｈ−ＱＷＴＬＮＡＡｃＹＬＬＣ−ＯＨ
このペプチドはＧａｌＭ８２（表１）に関連している。しかしながら、生物学的に合成されたＧａｌＭ８２はおそらくＤ，Ｌランチオニン含有であるが、化学合成により異性体は複数種になる。最も興味深いことに、これらのうちの１種４１７９Ｂ（表２）は高い活性を有すると思われる。
【００６２】
ペプチドを０．３％のアンモニアに溶解させた。ジスルフィド架橋ペプチドの塩基補助型硫黄押し出しによるランチオニンの導入のために、ペプチドを３７℃にてｏ／ｎでインキュベートした。生物学的に製造されたペプチド用として使用したのと同じ方法が適用されるＨＰＬＣにより、様々な異性体を単離することができた。様々な異性体を精製して凍結乾燥させた。乾燥ペプチドを１００ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ＝７．６に溶解させ、ペプチドを５０℃にてｏ／ｎでインキュベートした。ＨＰＬＣ精製後、ｐＥ形成を有するペプチドを選択し、様々なガラニン受容体活性化アッセイで使用した。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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