(57)【要約】  未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法であって、（ａ）液体及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の混合物を、未修飾のポリマー基板の上に与えるステップとを含み、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの標識によって伝えられる物理吸着を介して未修飾のポリマー基板の上に固定化され、さらに、固定化のための標識は、オリゴヌクレオチドに共有結合している、方法；並びに、この方法によって達成されるマイクロアレイ。本発明は、さらに、物理吸着によって未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化することに対する、オリゴヌクレオチドに結合する標識の使用に関する。さらに、本発明は、アッセイに対する、本明細書において記載される方法によって達成されたマイクロアレイの使用、及び、そのようなマイクロアレイを含む診断キットに関する。
2018501803.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法であって、
（ａ）液体及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記混合物を、未修飾のポリマー基板の上に与えるステップと、
を含み、
前記オリゴヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの標識によって伝えられる物理吸着を介して前記未修飾のポリマー基板の上に固定化され、さらに、固定化のための前記標識は、前記オリゴヌクレオチドに共有結合している、方法。
【請求項２】
前記ポリマー基板は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリノルボルネン、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、フッ素化ポリイミド、ポリスチレン（ＰＳ）、スチレンブタジエンコポリマー（ＳＢＣ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、スチレンアクリロニトリル（ＳＡＮ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）及びポリスルホンを含む群から選択され、好ましくは、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの化学基が結合するオリゴヌクレオチドを含み、前記化学基は、物理吸着を介して前記未修飾のポリマー基板に前記標識されたオリゴヌクレオチドを固定化するのに適している、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの化学基が結合するオリゴヌクレオチドを含み、前記化学基は、好ましくは、０．１から１０００ｋＤａ、０．１から５０ｋＤａ、０．１から１．５ｋＤａ、０．１５から１ｋＤａ、０．２から０．８ｋＤａの分子量を有する、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記化学基は、ビオチン又はスルホローダミン１０１酸クロリド（ＣＡＳ  ｎｕｍｂｅｒ８２３５４−１９−６；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）を含む群から好ましくは選択される化学基である、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記標識されたオリゴヌクレオチドの長さは、約２から２０００、約２から５００、約２から約２００ヌクレオチド、約２から約１００ヌクレオチド、約２から約５０ヌクレオチドである、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＵＶ曝露のステップを含まず、前記オリゴヌクレオチドは前記基板に共有結合しない、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｂ）の後で、前記基板のインキュベーションステップが続く、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１乃至７に記載の方法のステップの後で、基板乾燥ステップが続く、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９に記載の方法のステップの後で、前記基板を洗浄するステップが続く、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステップ（ａ）の前記混合物を、未修飾のポリマー基板の上に与えるステップは、コンタクトプリンティング又はノンコンタクトプリンティングによって、好ましくは、ノンコンタクトプリンティングによって行われる、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
未修飾のポリマー基板の上に関心のある分子を固定化する方法であって、請求項１乃至１１に記載の標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法のステップを含み、ステップ（ａ）において提供される前記標識されたオリゴヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドに結合する関心のある分子をさらに含む、方法。
【請求項１３】
未修飾のポリマー基板の上に関心のある分子を固定化する方法であって、請求項１乃至１１に記載の標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法のステップを含み、加えて、少なくとも、
（ｃ）前記関心のある分子が結合するオリゴヌクレオチドをハイブリダイズするステップ、
を含む、方法。
【請求項１４】
物理吸着によって未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化することに対する、オリゴヌクレオチドに結合する標識の使用。
【請求項１５】
請求項１乃至１３に記載の方法によって達成されるマイクロアレイ。
【請求項１６】
未修飾のポリマー基板と、
標識されたオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドの標識を介して前記ポリマー基板の上に固定化された標識されたオリゴヌクレオチドと、
を含むマイクロアレイであって、
前記オリゴヌクレオチドと前記未修飾のポリマー基板との間に共有結合は存在せず、さらに、前記オリゴヌクレオチドの標識が前記オリゴヌクレオチドに共有結合している、マイクロアレイ。
【請求項１７】
前記標識されたオリゴヌクレオチドは、前記標識されたオリゴヌクレオチドに結合する関心のある分子をさらに含む、請求項１６に記載のマイクロアレイ。
【請求項１８】
関心のある分子が結合するオリゴヌクレオチドをさらに含み、該オリゴヌクレオチドは、前記ポリマー基板の上に固定化された前記標識されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる、請求項１６に記載のマイクロアレイ。
【請求項１９】
請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法に従って固定化されたオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイ、及び、規定された量の既知の標識された核酸であり、前記固定化されたオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに相補的な核酸を含有する制御プローブを含む診断キット。
【請求項２０】
ハイブリダイゼーションアッセイ、表面増幅、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子の定量的及び／又は多重検出、発現分析、比較ゲノムハイブリダイゼーション、一塩基多型の検出又はゲノム選択に基づく配列決定に対する、請求項１５乃至１８に記載のマイクロアレイの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
未修飾の基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法であって：（ａ）液体及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の混合物を未修飾のポリマー基板の上に与えるステップとを含み、オリゴヌクレオチドは、物理吸着を介して未修飾のポリマー基板の上に固定化される、方法。本発明は、この方法によって達成されるマイクロアレイにも関する。本発明は、さらに、物理吸着によって未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化することに対する、オリゴヌクレオチドに結合する標識の使用に関する。さらに、本発明は、アッセイに対する、本明細書において記載される方法によって達成されたマイクロアレイの使用、及び、そのようなマイクロアレイを含む診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオチップ又は生物学的マイクロアレイ、特にＤＮＡマイクロアレイが、現代の分子生物学及び医学において重要なツールになってきている。典型的には、チップは、整列させられた一連の多数の顕微鏡レベルのオリゴヌクレオチドのスポットから成り、各々が少量の特定の核酸配列を含有している。これは、例えば、捕獲プローブと対応する標的との結合を可能にする条件下でｃＤＮＡ又はｃＲＮＡ試料（標的）をハイブリダイズさせるための捕獲プローブとして使用される遺伝子又は他のＤＮＡ要素の短い部分であり得る。
【０００３】
プラスチックは、低コストで大規模生産に使用することができるため、使い捨ての基板の製造に使用されることが多くある。核酸の検出のための生化学アッセイに対しては、ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブが、これらの基板上に固定化される必要がある。環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）等のプラスチック（すなわちポリマー）基板上にＤＮＡオリゴヌクレオチドを固定化するためのいくつかの方法が公開されてきた。ほとんどの場合、プラスチックベースのマイクロアレイは、オリゴヌクレオチドの結合を可能にするための修飾された／官能性を持たされた表面を有する。他の固定化方法は、（リンカーにより）修飾されたオリゴヌクレオチドの、未修飾のポリマー基板の上への結合を述べている。簡潔なＵＶ曝露が、ポリ（Ｔ）及び／又はポリ（Ｃ）タグを含有するＤＮＡオリゴヌクレオチドを様々な未修飾のポリマー基板上に固定化する（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。
【０００４】
ポリマー基板の必要な修飾のために、これらの方法は費用も時間もかかる。さらに、これらの方法は、検出プロセスに悪影響を及ぼし得る。特に、ＵＶ光で核酸を照射することは、典型的に、核酸分子に対するダメージをもたらし、これは、相補的配列とハイブリダイズする分子の能力に影響を及ぼす可能性があり、従って、マイクロアレイシステムにおけるその有用性を損なう恐れがある。従って、マイクロアレイを用いて実行されるアッセイの品質を損なわないこれらのマイクロアレイのコスト及び生産時間が削減された改善された方法の開発が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｙ．Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１２）４０２：７４１−７４８
【非特許文献２】Ｄ．Ｓａｂｏｕｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ．（２０１０）１２：６７３−６８１
【非特許文献３】Ｎ．  Ｋｉｍｕｒａ，ＢＢＲＣ  ３４７（２００６）４７７−４８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、マイクロアレイを用いて実行されるアッセイの品質を損なわないこれらのマイクロアレイを生産するための、あまり時間も費用もかからない方法の必要性に取り組む。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の目的は、未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法であって：（ａ）液体及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の混合物を、未修飾の基板の上に与えるステップとを含み、オリゴヌクレオチドは、物理吸着を介して未修飾の基板の上に固定化される、方法によって成し遂げられる。
【０００８】
特定の実施形態において、ポリマー基板は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリノルボルネン、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、フッ素化ポリイミド、ポリスチレン（ＰＳ）、スチレンブタジエンコポリマー（ＳＢＣ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、スチレンアクリロニトリル（ＳＡＮ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）及びポリスルホンを含む群から選択される。
【０００９】
好ましい実施形態において、ポリマー基板は、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）である。
【００１０】
別の好ましい実施形態において、標識されたオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＬＮＡである。
【００１１】
さらなる好ましい実施形態において、標識されたオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＬＮＡである。
【００１２】
追加の好ましい実施形態において、標識されたオリゴヌクレオチドは、ｓｓＤＮＡ又はｓｓＬＮＡである。
【００１３】
別の好ましい実施形態において、標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの化学基が結合するオリゴヌクレオチドを含み、化学基は、未修飾の基板に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化するのに適している。
【００１４】
別の実施形態において、標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの化学基が結合するオリゴヌクレオチドを含み、化学基は、好ましくは、０．１から１０００ｋＤａ、０．１から５０ｋＤａ、０．１から１．５ｋＤａ、０．１５から１ｋＤａ、０．２から０．８ｋＤａの分子量を有する。
【００１５】
さらなる実施形態において、化学基は、ビオチン又はスルホローダミン１０１酸クロリド（ＣＡＳ  ｎｕｍｂｅｒ８２３５４−１９−６；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）を含む群から好ましくは選択される化学基である。
【００１６】
別の実施形態において、標識されたオリゴヌクレオチドの長さは、約２から約２０００ヌクレオチド、約２から５００、約２から約２００ヌクレオチド、約２から約１００、約２から５０ヌクレオチドである。
【００１７】
さらなる実施形態において、当該方法はＵＶ曝露のステップを含まず、オリゴヌクレオチドは基板に共有結合しない。
【００１８】
さらに別の実施形態において、ステップ（ｂ）の後で、基板のインキュベーションステップが続く。
【００１９】
追加の実施形態において、上記の方法のステップの後で、基板乾燥ステップが続く。
【００２０】
さらなる実施形態において、上記の方法のステップの後で、基板を洗浄するステップが続き、その後で、任意で、基板を乾燥するステップが続く。
【００２１】
本発明の別の態様は、物理吸着によって未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化することに対する、オリゴヌクレオチドに結合する標識の使用に関する。
【００２２】
本発明の追加の態様は、上記の方法によって達成されるマイクロアレイを指す。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、未修飾のポリマー基板と、該基板の上に固定化された標識されたオリゴヌクレオチドとを含むマイクロアレイに関し、オリゴヌクレオチドと未修飾のポリマー基板との間に共有結合は存在しない。
【００２４】
一実施形態において、標識されたオリゴヌクレオチドは、標識されたオリゴヌクレオチドに結合する関心のある分子をさらに含む。
【００２５】
さらなる実施形態は、未修飾のポリマー基板と、該基板の上に固定化された標識されたオリゴヌクレオチドと、関心のある分子が結合するオリゴヌクレオチドとを含むマイクロアレイを指し、上記のオリゴヌクレオチドは、ポリマー基板の上に固定化された標識されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ、さらに、基板の上に固定化された標識されたオリゴヌクレオチドと未修飾のポリマー基板との間に共有結合は存在しない。
【００２６】
本発明の一実施形態において、標識されたオリゴヌクレオチドは、物理吸着によって未修飾の基板の上に固定化される。
【００２７】
本発明のさらなる態様は、本明細書において記載される方法に従って固定化されたオリゴヌクレオチドのアレイと、規定された量の既知の標識された核酸であり、上記の固定化されたオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに相補的な核酸を含有する制御プローブとを含む診断キットに関する。
【００２８】
本発明の追加の態様は、ハイブリダイゼーションアッセイ、表面増幅、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子の定量的及び／又は多重検出、発現分析、比較ゲノムハイブリダイゼーション、一塩基多型の検出又はゲノム選択に基づく配列決定に対する、上記のマイクロアレイの使用を指す。
【００２９】
本発明の別の態様は、未修飾のポリマー基板の上に関心のある分子を固定化する方法に関し、当該方法は、本明細書において記載された標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法のステップを含み、ステップ（ａ）において提供される標識されたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに結合する関心のある分子をさらに含む。
【００３０】
本発明の別の態様は、未修飾のポリマー基板の上に関心のある分子を固定化する方法に関し、当該方法は、本明細書において記載される標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法のステップを含み、加えて、少なくとも、（ｃ）関心のある分子が結合するオリゴヌクレオチドをハイブリダイズするステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】未修飾のオリゴヌクレオチドのスポットが印刷されたＣＯＣ基板を用いたアッセイの結果を表示した図であり、標的とのハイブリダイゼーション及びナノ粒子を用いた標識後のいかなる可視のスポットも表示していない。
【図２】ＴｅｘａｓＲｅｄにより修飾されたオリゴヌクレオチドのスポットが印刷されたＣＯＣ基板の結果を示した図であり、ハイブリダイゼーション後の明白に可視のスポットを有している。
【図３】ビオチンにより修飾されたオリゴヌクレオチドのスポットが印刷されたＣＯＣ基板の結果を示した図であり、ハイブリダイゼーション後の明白に可視のスポットを有している。
【図４】実施例２のハイブリダイゼーションアッセイの概略図を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は特定の実施形態に関して記載されることになるけれども、この記載は、限定的な意味で解釈されることはない。
【００３３】
本発明の例証的な実施形態を詳細に記載する前に、本発明を理解するのに重要な定義が与えられる。
【００３４】
本明細書及び付随の特許請求の範囲において使用される場合、不定冠詞を有する単数形は、その前後で何か他に明確に指示していない限り、それぞれの複数形も含む。
【００３５】
本発明に関連して、「約」及び「ほぼ」という用語は、くだんの特徴の技術的効果を依然として保証すると当業者が理解するであろう正確さの差を示している。この用語は、典型的に、±２０％、好ましくは±１５％、より好ましくは±１０％、及び、さらにより好ましくは±５％の示された数値からの偏差を示している。
【００３６】
「含む」という用語は限定的ではないということが理解されたい。本発明の解釈上、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は、「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｏｆ）」という用語の好ましい具体化であると考慮される。以後、群が少なくとも特定数の具体化を含むよう規定される場合、これは、好ましくはこれらの具体化から成る群のみを包含するとも意味する。
【００３７】
さらに、本明細書及び特許請求の範囲において「第１」、「第２」、「第３」、又は、「（a）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」等の用語は、類似の要素を区別するために使用され、必ずしも順番又は時系列順を記述するために使用されているのではない。そのように使用されている用語は、適切な状況下で交換可能であり、本明細書において記述されている本発明の実施形態は、本明細書において記述又は例示された順序以外の順序で作動させることができるということが理解されたい。
【００３８】
「第１」、「第２」、「第３」、又は、「（a）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」等の用語が方法又は使用のステップに関する場合、ステップ間の時間又は時間間隔の一貫性はなく、すなわち、ステップは、同時に実行することができるか、又は、本明細書において以下に定められるように本願において示されていない限り、そのようなステップ間には秒、分、時、日、週、月、若しくは年さえの時間間隔があってもよい。
【００３９】
本発明は、本明細書において記載される特定の方法論、プロトコル、試薬等は変わり得るためこれらに限定されないということが理解されたい。本明細書において使用される用語法は特定の実施形態を記載する目的のみにあり、付随の特許請求の範囲によってのみ限定されることになる本発明の範囲を限定すると意図されないということも理解されたい。他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００４０】
本発明の一態様は、未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法を指し、当該方法は：液体及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、その混合物を、未修飾のポリマー基板の上に与えるステップとを含み、オリゴヌクレオチドは、物理吸着を介して未修飾のポリマー基板の上に固定化される。
【００４１】
本明細書において使用される場合「未修飾」及び「修飾されていない」という用語は、例えば、ポリエチレングリコール、アミン、エポキシド、イソチオシアネート、ポリ−Ｌ−リジン、アビジン又はストレプトアビジンのような官能基を有するシラン層によって修飾されていないか又は官能性を持たされていないポリマー基板を意味する。これは、とりわけ、ポリマー基板が、アルキル鎖から形成される疎水性の単層、又は、ポリエチレングリコール若しくはオリゴエチレングリコール鎖から形成される親水性の層、エポキシ基含有ポリマー層、アミノシランで処理した表面等、修飾されたか又は官能性を持たされた表面を有さず、さらに、アミン、グアジニウム基、アミジニウム基、イミダゾリウム基、アルデヒド、アルコール若しくはホルムアミド等、非電荷Ｈ−結合供与体、又は、ＳｉＯ２、ＴｉＯ２、ＡｌＯ２等、非電荷無機Ｈ−結合供与体等、リン酸結合を促進する物質で被覆されていないということを意味する。この用語は、さらに、ポリマー基板が、例えば、ポリマー基板の表面の全て又は一部を覆う有機薄膜と接触していないということを意味する。ポリマー基板には、反応基又は官能基は結合しない。特に、「未修飾」および「修飾されていない」という用語は、基板の結合特性が変化しないということを意味する。より具体的には、いかなる分子、特にオリゴヌクレオチドの結合を増強する分子もポリマー基板に添加されていないということ、又は、ポリマー基板の結合基は活性化されていないということを意味する。
【００４２】
「未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する」という用語は、例えば洗浄、すすぎ又は化学的ハイブリダイゼーションのステップの間のオリゴヌクレオチドの脱離を妨げる分子相互作用を介した未修飾のポリマー基板への標識されたオリゴヌクレオチドの会合に関する。本発明の方法においては、そのような分子相互作用は共有化学結合に基づくものではなく、基板と、固定化されることになる標識されたオリゴヌクレオチドとの吸着、特に物理吸着に基づくものである。ヌクレオチドを基板に結合させる吸着力は、水素結合、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用又はその組み合わせを含む群から選択されてもよい。
【００４３】
基板とオリゴヌクレオチドとの吸着は、標識されたオリゴヌクレオチドの標識によって伝えられる。これは、図１乃至図３から明らかになり、図は、標識のないオリゴヌクレオチドは、ＣＯＣ基板の上に固定化されず（図１）、オリゴヌクレオチドが、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（図２）又はビオチン（図３）で標識されている場合には、いくつかの標識されたオリゴヌクレオチドを含む明白なスポットを検出することができるということを示しており、標識されたオリゴヌクレオチドは、基板の上に固定化されているということを示している。これは、本明細書において記載される標識を有するオリゴヌクレオチドのみが、ＣＯＣ等のポリマー基板の上に固定化されるということを明白に示している。
【００４４】
従って、本発明において、標識されたオリゴヌクレオチドの固定化は、未修飾のポリマー基板への標識されたオリゴヌクレオチドの標識の吸着によって媒介される。
【００４５】
本明細書において使用される場合「標的」又は「標的分子」は、本明細書において先に記載された特定の相互作用を可能にするあらゆる適した分子であり得る。標的分子の例は、核酸、タンパク質、ペプチド、あらゆる形状及び形態のリガンド、抗体、抗原、例えば炭水化物若しくは糖等、有機、無機若しくは有機及び無機の構造体の混合物のような小分子、ポリマー、例えばバクテリア細胞若しくはその断片、真核細胞若しくはその断片、ウイルス粒子若しくはウイルス等、細胞又は細胞片若しくは細胞の一部のような実体、又は、上記のあらゆる誘導体若しくはその組み合わせである。
【００４６】
本明細書において使用される場合「与える」という用語は、コンタクトプリンティング又はノンコンタクトプリンティング等、液体堆積のあらゆる方法を意味する。好ましい実施形態においては、ノンコンタクトプリンティングが、未修飾の基板の上にステップ（ａ）の混合物を与えるために使用される。
【００４７】
本明細書において使用される場合「ノンコンタクトプリンティング」という用語は、インクジェット印刷、スポッティング又はディスペンシング等、ポリマー基板の上にオリゴヌクレオチドを含む混合物を印刷するのに適した当技術分野におけるあらゆる非接触の印刷方法を意味する。ノンコンタクトプリンティングに対しては、ｓｃｉＦＬＥＸＡＲＲＡＹＥＲ  Ｓ１１（Ｓｃｉｅｎｉｏｎ）等のスポッターが利用されてもよい。
【００４８】
本発明の特定の実施形態は、未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法を指し、当該方法は：液体及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、未修飾のポリマー基板の上に混合物をノンコンタクトプリンティングするステップとを含み、オリゴヌクレオチドは、物理吸着を介して未修飾のポリマー基板の上に固定化される。
【００４９】
本明細書において使用される場合「基板」という用語は、当業者に既知のあらゆる適した基板を意味する。基板は、あらゆる適した形状又は形態を有してもよく、例えば、平らであってもよく、例えば向かって凸状若しくは凹状に曲がる等、曲がっていてもよく、カールしていてもよく、又は、波状の形態を含んでもよい。アレイは、捕獲分子を含む磁性粒子をさらに含んでもよい。本明細書において使用される場合基板という用語は、固体のスライド、チャンバ又は固体のマイクロ流体デバイス等の固体の物体、並びに、例えばスライドのコーティング層、チャンバのコーティング層又はマイクロ流体デバイスのコーティング層等のコーティング層を含んでもよい。一実施形態において、基板は、固体の物体を意味する。特定の実施形態において、基板は、固体のスライド又は固体のチャンバを意味する。
【００５０】
本発明の一実施形態において、ポリマー基板は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリノルボルネン、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、フッ素化ポリイミド、ポリスチレン（ＰＳ）、スチレンブタジエンコポリマー（ＳＢＣ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、スチレンアクリロニトリル（ＳＡＮ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）及びポリスルホンを含む群から選択される。
【００５１】
好ましい実施形態において、ポリマー基板は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリノルボルネン、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、フッ素化ポリイミド、スチレンブタジエンコポリマー（ＳＢＣ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、スチレンアクリロニトリル（ＳＡＮ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）及びポリスルホンを含む群から選択される。
【００５２】
より好ましい実施形態において、ポリマー基板は、ポリノルボルネン、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、フッ素化ポリイミド、スチレンブタジエンコポリマー（ＳＢＣ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、スチレンアクリロニトリル（ＳＡＮ）、ポリエチレン（ＰＥ）及びポリスルホンを含む群から選択される。本発明のさらにより好ましい実施形態において、ポリマー基板は、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）である。
【００５３】
別の好ましい実施形態において、標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの化学基が結合するオリゴヌクレオチドを含み、化学基は、未修飾の基板に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化するのに適している。
【００５４】
「結合する」という用語は、共有結合及び非共有結合を意味する。好ましくは、「結合する」とは、固定化のための標識がオリゴヌクレオチドに共有結合しているということを意味する。好ましくは、「結合する」とは、関心のある分子がオリゴヌクレオチドに共有結合しているということを意味する。
【００５５】
「標識されたオリゴヌクレオチドを固定化するのに適している」とは、少なくとも１つの化学基と未修飾の基板との間に吸着力、特に物理吸着力が確立されるため、標識されたオリゴヌクレオチドが基板に固定化されるものと理解されることになる。これは、とりわけ、試験されることになる化学基で標識されたオリゴヌクレオチドを使用して、実施例１乃至３のプロトコルに従って試験することができる。例えば図２及び図３に示されているようなスポットの形成は、化学基が標識されたオリゴヌクレオチドを基板に固定化するのに適しているということを示している。対照的に、例えば図１に示されているようなスポットの欠如は、化学基が、標識されたオリゴヌクレオチドを基板に固定化するのに適していないということを示している。このように、磁性ビーズを有するプローブを試料にハイブリダイズさせ、漏れ全反射（ｆ−ＴＩＲ）によりビーズを検出することによって、基板に固定化されたオリゴヌクレオチドの適性を試験することができる。しかし、プローブの標識を検出するのに適した検出方法と組み合わせて、異なる標識でマークされた他のプローブも検出に使用することができる。
【００５６】
別の実施形態において、標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの化学基が結合するオリゴヌクレオチドを含み、化学基は、好ましくは、０．１から１０００ｋＤａ、０．１から５０ｋＤａ、０．１から１．５ｋＤａ、０．１５から１ｋＤａ、０．２から０．８ｋＤａの分子量を有する。
【００５７】
さらなる実施形態において、少なくとも１つの化学基は疎水性の化学基である。特定の実施形態において、例えば、疎水性の化学基は、疎水性の発色団、長い疎水性の鎖、コレステリル、ＰＥＧ又はビオチンであってもよい。
【００５８】
「疎水性」という用語は、本明細書において使用される場合、水に容易に溶解しない（すなわち会合しない）傾向を意味する。一部分が、他の疎水性の部分又は分子と結合又は会合するのを好んで、その結果、水分子を排除することによって疎水性であってもよい。
【００５９】
好ましい実施形態において、化学基は、フルオレセイン又はその誘導体若しくはローダミン又はその誘導体等、シアニン誘導体、ナフタレン誘導体、オキサジアゾール誘導体、アントラセン誘導体、ピレン誘導体、オキサジン誘導体、アクリジン誘導体、アリールメチン誘導体又はテトラピロール誘導体、好ましくはキサンテン誘導体等のタンパク質又は非タンパク質の有機フルオロフォアである。
【００６０】
好ましい実施形態において、化学基は、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）及びそのイソチオシアネート誘導体（ＴＲＩＴＣ）並びにスルホローダミン１０１及びスルホローダミン１０１クロリド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）等、ローダミン又はその誘導体である。
【００６１】
好ましい実施形態において、化学基は、ビオチン又はスルホローダミン１０１酸クロリド（ＣＡＳ  ｎｕｍｂｅｒ８２３５４−１９−６；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）を含む群から選択される。
【００６２】
化学基は、オリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端にて結合することができる。
【００６３】
好ましい実施形態において、標識されたオリゴヌクレオチドは、標識されたＲＮＡ、標識されたＬＮＡ又は標識されたＤＮＡである。さらにより好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標識されたＤＮＡ又は標識されたＬＮＡである。
【００６４】
標識されたオリゴヌクレオチドはまた、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー又はＬＮＡアプタマー等のヌクレオチドアプタマーを含んでもよい。
【００６５】
本発明の好ましい実施形態に従って固定化されることになるオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ又はＡＮＡであってもよい。ＤＮＡは、例えばＡ−ＤＮＡ、Ｂ−ＤＮＡ又はＺ−ＤＮＡの形であってもよい。ＲＮＡは、例えば、ｐ−ＲＮＡ、すなわちピラノシル−ＲＮＡの形、又は、ヘアピンＲＮＡ若しくはステムループＲＮＡのような構造的に改変された形であってもよい。
【００６６】
「ＰＮＡ」という用語は、生物学的研究及び医学的処置において使用されるが、自然に発生するとは知られていないペプチド核酸、すなわち、ＤＮＡ又はＲＮＡに類似する人工的に合成されたポリマーに関する。ＰＮＡの主鎖は、典型的には、ペプチド結合によって連結された繰返しＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位で構成される。様々なプリン塩基及びピリミジン塩基は、メチレンカルボニル結合によって主鎖に連結する。ＰＮＡは、一般的に、ペプチドのように描かれ、Ｎ−末端は第１（左）の位置に、Ｃ−末端は右にある。
【００６７】
「ＣＮＡ」という用語は、アミノシクロヘキシルエタン酸核酸に関する。さらに、この用語は、シクロペンタン核酸、すなわち、例えば、２’−デオキシカルバグアノシンを含む核酸分子に関する。
【００６８】
「ＨＮＡ」という用語は、ヘキシトール核酸、すなわち標準的な核酸塩基及びリン酸化１，５−アンヒドロヘキシトール主鎖から構築されたＤＮＡ類似体に関する。
【００６９】
「ＬＮＡ」という用語は、ロックド核酸に関する。典型的には、ロックド核酸は、修飾された、従ってアクセス不能なＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’及び４’の炭素を接続する余分なブリッジで修飾することができる。そのようなブリッジは、リボースを３’末端立体構造にロックする。ロックされたリボースの立体構造は、塩基の積み重ね及び主鎖の事前構築を強化する。これは、熱安定性、すなわちオリゴヌクレオチドの融解温度を有意に上げ得る。
【００７０】
「ＡＮＡ」という用語は、アラビノ酸核酸又はその誘導体に関する。本発明に関連して好ましいＡＮＡ誘導体は、２’−デオキシ−２’−フルオロ−ベータ−Ｄ−アラビノヌクレオシド（２’Ｆ−ＡＮＡ）である。
【００７１】
さらなる好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ及びＡＮＡのうちいずれか１つの組み合わせを含んでもよい。特に好ましいのは、ＬＮＡヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮＡ塩基との混合物である。
【００７２】
別の好ましい実施形態において、本明細書において先に記載したオリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖であってもよく、又は、一本鎖及び二本鎖の区間の組み合わせで構成されてもよい。「一本鎖核酸」という用語は、単一の糖−リン酸主鎖を含み、及び／又は、らせんの形に構築されていないオリゴヌクレオチドに関する。好ましくは、これらのオリゴヌクレオチドは二次構造又は分子間会合を示さない。「二本鎖核酸」という用語は、２つの糖−リン酸主鎖を含む核酸分子に関する。好ましい実施形態において、二本鎖核酸は、二重らせんの形に構築されている。さらなる好ましい実施形態において、本発明による二本鎖核酸は、例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ、ＤＮＡ及びＰＮＡ、ＤＮＡ及びＣＮＡ、ＤＮＡ及びＨＮＡ、ＤＮＡ及びＬＮＡ、ＤＮＡ及びＡＮＡ、又は、ＲＮＡ及びＣＮＡ、ＲＮＡ及びＰＮＡ、ＲＮＡ及びＣＮＡ、ＲＮＡ及びＨＮＡ、ＲＮＡ及びＬＮＡ、ＲＮＡ及びＡＮＡ、又は、ＰＮＡ及びＣＮＡ、ＰＮＡ及びＨＮＡ、ＰＮＡ及びＬＮＡ、ＰＮＡ及びＡＮＡ、又は、ＣＮＡ及びＨＮＡ、ＣＮＡ及びＬＮＡ、ＣＮＡ及びＡＮＡ、又は、ＨＮＡ及びＬＮＡ、ＨＮＡ及びＡＮＡ、又は、ＬＮＡ及びＡＮＡ等の異なるタイプの核酸分子で構成されてもよい。或いは、本発明による二本鎖核酸はまた、上記のヌクレオチド変異体のいずれかの区間の組み合わせで構成されてもよい。最も好ましいのは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）又は一本鎖ＬＮＡ（ｓｓＬＮＡ）である。
【００７３】
オリゴヌクレオチドは、標的分子に対する結合親和性を有してもよい。
【００７４】
オリゴヌクレオチドは、標的分子に対する結合親和性を有さないスペーサーを含み得る。スペーサーは、オリゴヌクレオチド、又は、例えば糖鎖等の異なるポリマーであってもよい。スペーサーは、例えば少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド又は少なくとも５０ヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドであってもよい。スペーサーは、少なくとも４ｎｍ、６ｎｍ又は１５ｎｍの長さを有する糖鎖等のポリマーであってもよい。スペーサーは、標識されたオリゴヌクレオチドを基板に固定化するのに適した化学基で標識されたオリゴヌクレオチドの末端にあってもよく、従って、スペーサーは、基板の近くにあるオリゴヌクレオチドの末端にあってもよい。
【００７５】
１つの特定の実施形態は、未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法を指し、当該方法は：液体及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、その混合物を未修飾のポリマー基板の上に与えるステップとを含み、オリゴヌクレオチドは、物理吸着を介して未修飾のポリマー基板の上に固定化され、さらに、標識されたオリゴヌクレオチドは、標識されたｓｓＤＮＡである。
【００７６】
１つの特定の実施形態は、未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法を指し、当該方法は：液体及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、その混合物を未修飾のポリマー基板の上に与えるステップとを含み、オリゴヌクレオチドは、物理吸着を介して未修飾のポリマー基板の上に固定化され、さらに、標識されたオリゴヌクレオチドは、標識されたｓｓＬＮＡである。
【００７７】
オリゴヌクレオチドは、自然に発生した又は人工的に調製された核酸分子に起源を有してもよく、コード領域及び／又は非コード領域を含み得る。本発明によると、オリゴヌクレオチドは、約２から約２０００ヌクレオチド、より好ましくは約２から約５００ヌクレオチド、又は、約２から２００、特に好ましくは約２から約１００ヌクレオチドの長さを有してもよい。また、好ましい長さは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０ヌクレオチドである。
【００７８】
特に、本発明は、特に１００ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドの結合に対して、吸着力はあまり効果的ではないという問題を克服する。ヌクレオチドと基板との吸着力を増加させる基板及び方法は、オリゴヌクレオチドが二本鎖を形成する能力又はマイクロアレイへの非特異的標的結合を促進する能力を妨げる。吸着、特に物理吸着によりオリゴヌクレオチドをポリマー基板に結合させるのに適した少なくとも１つの化学基が結合するオリゴヌクレオチドの使用によって、この問題は克服された。
【００７９】
本発明の方法は、ＵＶ曝露等の光化学的架橋のステップを含まない。本発明の方法はまた、化学的架橋のステップを利用しない。当該方法は、ポリマー基板の電荷を変更することを含まないため、ポリマー基板の表面は特定の電荷を有する。
【００８０】
特定の実施形態において、未修飾のポリマー基板の上に与えられる混合物は、液体及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む。液体は、水、又は、ＰＢＳ、炭酸緩衝液、酢酸緩衝液及びクエン酸緩衝液等の緩衝液等、基板の上に与える及び固定化するためにオリゴヌクレオチドを溶解するのに適したあらゆる液体であってもよい。緩衝液は、例えば、スクロース、トリメチルグリシン（ベタイン）、トレハロース、グリセロール、Ｔｗｅｅｎ、Ｓａｒｋｏｓｙｌ、ＰＶＡ及び／又はＰＥＧを含み得る。好ましい実施形態において、緩衝液は、スクロース及びベタインを含む。
【００８１】
特定の実施形態において、液体は、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、オクチルジメチルアミン（ＯＤＡ）等のカチオン性界面活性剤様化合物を含まなくてもよい。別の特定の実施形態において、液体は、ＣＴＡＢ、ＥＤＣ又はＯＤＡを含まなくてもよい。
【００８２】
スクロースの濃度は、１％から５０％、５％から４０％、１０％から３０％、好ましくは２０％であり得る。トリメチルグリシンの濃度は、１ｍＭから５０ｍＭ、５ｍＭから３０ｍＭ、１０ｍＭから２０ｍＭ、好ましくは１５ｍＭであり得る。
【００８３】
特定の実施形態において、緩衝液は、ＰＢＳ、スクロース及びトリメチルグリシンを含む。
【００８４】
本発明の特定の実施形態は、未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法を指し、当該方法は：緩衝液及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、その混合物を未修飾のポリマー基板の上に与えるステップとを含み、オリゴヌクレオチドは、物理吸着を介して未修飾のポリマー基板の上に固定化される。
【００８５】
本発明の特定の実施形態は、未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法を指し、当該方法は：緩衝液及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、その混合物を未修飾のポリマー基板の上にノンコンタクトプリンティングするステップとを含み、オリゴヌクレオチドは、物理吸着を介して未修飾のポリマー基板の上に固定化される。
【００８６】
本発明の別の実施形態は、未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法を指し、当該方法は：液体及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、その混合物を未修飾のポリマー基板の上に与えるステップとを含み、オリゴヌクレオチドは、物理吸着を介して未修飾のポリマー基板の上に固定化され、さらに、当該方法はＵＶ曝露のステップを含まず、オリゴヌクレオチドは基板に共有結合していない。
【００８７】
本発明の別の実施形態は、未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法を指し、当該方法は：緩衝液及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、その混合物を未修飾のポリマー基板の上にノンコンタクトプリンティングするステップとを含み、オリゴヌクレオチドは、物理吸着を介して未修飾のポリマー基板の上に固定化され、さらに、当該方法はＵＶ曝露のステップを含まず、オリゴヌクレオチドは基板に共有結合していない。
【００８８】
本発明の別の実施形態は、未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法を指し、当該方法は：液体及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、その混合物を未修飾のポリマー基板の上に与えるステップとを含み、オリゴヌクレオチドは、物理吸着を介して未修飾のポリマー基板の上に固定化され、未修飾のポリマー基板はＣＯＣであり、標識されたオリゴヌクレオチドは、ビオチン又はスルホローダミン１０１酸クロリド（ＣＡＳ  ｎｕｍｂｅｒ８２３５４−１９−６；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）等の有機非タンパク質フルオロフォアである化学基を含み、さらに、当該方法はＵＶ曝露のステップを含まず、オリゴヌクレオチドは基板に共有結合していない。
【００８９】
本発明の別の実施形態は、未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法を指し、当該方法は：緩衝液及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、その混合物を未修飾のポリマー基板の上にノンコンタクトプリンティングするステップとを含み、オリゴヌクレオチドは、物理吸着を介して未修飾のポリマー基板の上に固定化され、未修飾のポリマー基板はＣＯＣであり、標識されたオリゴヌクレオチドは、ビオチン又はスルホローダミン１０１酸クロリド（ＣＡＳ  ｎｕｍｂｅｒ８２３５４−１９−６；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）等の有機非タンパク質フルオロフォアである化学基を含み、さらに、当該方法はＵＶ曝露のステップを含まず、オリゴヌクレオチドは基板に共有結合していない。
【００９０】
本発明の別の実施形態は、未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法を指し、当該方法は：液体及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、その混合物を未修飾のポリマー基板の上に与えるステップとを含み、オリゴヌクレオチドは、物理吸着を介して未修飾のポリマー基板の上に固定化され、標識されたオリゴヌクレオチドはｓｓＤＮＡであり、未修飾のポリマー基板はＣＯＣであり、標識されたオリゴヌクレオチドは、ビオチン又はスルホローダミン１０１酸クロリド（ＣＡＳ  ｎｕｍｂｅｒ８２３５４−１９−６；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）等の有機非タンパク質フルオロフォアである化学基を含み、さらに、当該方法はＵＶ曝露のステップを含まず、オリゴヌクレオチドは基板に共有結合していない。
【００９１】
本発明の別の実施形態は、未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法を指し、当該方法は：緩衝液及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、その混合物を未修飾のポリマー基板の上にノンコンタクトプリンティングするステップとを含み、オリゴヌクレオチドは、物理吸着を介して未修飾のポリマー基板の上に固定化され、標識されたオリゴヌクレオチドはｓｓＤＮＡであり、未修飾のポリマー基板はＣＯＣであり、標識されたオリゴヌクレオチドは、ビオチン又はスルホローダミン１０１酸クロリド（ＣＡＳ  ｎｕｍｂｅｒ８２３５４−１９−６；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）等の有機非タンパク質フルオロフォアである化学基を含み、さらに、当該方法はＵＶ曝露のステップを含まず、オリゴヌクレオチドは基板に共有結合していない。
【００９２】
本発明の別の実施形態は、未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法を指し、当該方法は：液体及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、その混合物を未修飾のポリマー基板の上に与えるステップと、ポリマー基板のインキュベーションステップとを含み、オリゴヌクレオチドは、物理吸着を介して未修飾のポリマー基板の上に固定化される。
【００９３】
ポリマー基板のインキュベーションは、例えば１８℃から２５℃、好ましくは２０℃から２２℃等の室温で、３０秒から５時間、５分から４時間、１０分から３時間、１５分から１時間、好ましくは３０分間発生してもよい。
【００９４】
インキュベーションは、１０％から９０％、２０％から８０％、３０％から７０％、４０％から６０％、好ましくは５０％の相対湿度で発生してもよい。
【００９５】
本発明の別の実施形態は、未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法を指し、当該方法は：液体及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、その混合物を未修飾のポリマー基板の上に与えるステップと、基板乾燥のステップとを含み、オリゴヌクレオチドは、物理吸着を介して未修飾のポリマー基板の上に固定化される。
【００９６】
本発明の別の実施形態は、未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法を指し、当該方法は：液体及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、その混合物を未修飾のポリマー基板の上に与えるステップと、基板のインキュベーションステップと、基板乾燥のステップとを含み、オリゴヌクレオチドは、物理吸着を介して未修飾のポリマー基板の上に固定化される。
【００９７】
本明細書において使用される場合「基板乾燥」という用語は、約２５℃から７０℃、約３０℃から４５℃、好ましくは約３５℃から３９℃、より好ましくは約３７℃の温度での基板のインキュベーションを意味する。その結果、混合物の液体は蒸発する。このステップの間、標識された核酸と基板との架橋は発生しない。
【００９８】
基板乾燥のステップは、例えば３０分から３６時間、１時間から３０時間、１０から２２時間等、当業者には既知のあらゆる適した期間行うことができる。基板乾燥は、例えば乾燥チャンバ若しくはオーブン又はインキュベータ等、当業者には既知のあらゆる適した手段によって行うことができる。温度に加えて、湿度、通気又は換気のような他のパラメータも、当業者には既知の適した値に調整することができる。
【００９９】
未修飾の基板は、例えば従来の蒸気滅菌（オートクレーブ）又はガンマ線照射によって滅菌することができる。好ましくは、未修飾の基板はガンマ線処理される。
【０１００】
本発明の別の実施形態は、未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法を指し、当該方法は：液体及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、その混合物を未修飾の基板の上に与えるステップと、基板のインキュベーションステップと、基板乾燥のステップと、基板を洗浄するステップとを含み、オリゴヌクレオチドは、物理吸着を介して未修飾の基板の上に固定化される。
【０１０１】
本発明の別の実施形態は、未修飾の基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法を指し、当該方法は：液体及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、その混合物を未修飾の基板の上に与えるステップと、基板乾燥のステップと、基板を洗浄するステップとを含み、オリゴヌクレオチドは、物理吸着を介して未修飾の基板の上に固定化される。
【０１０２】
本発明の別の実施形態は、未修飾の基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法を指し、当該方法は：液体及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、その混合物を未修飾の基板の上に与えるステップと、基板のインキュベーションステップと、基板を洗浄するステップとを含み、オリゴヌクレオチドは、物理吸着を介して未修飾の基板の上に固定化される。
【０１０３】
本発明の別の実施形態は、未修飾の基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法を指し、当該方法は：液体及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、その混合物を未修飾の基板の上に与えるステップと、基板を洗浄するステップとを含み、オリゴヌクレオチドは、物理吸着を介して未修飾の基板の上に固定化される。
【０１０４】
基板を洗浄するために、ＰＢＳ及びＴｗｅｅｎ２０を含有する洗浄緩衝液が使用されてもよい。緩衝液は、例えば、０．５ｘＰＢＳ及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０であってもよい。
【０１０５】
基板は、１秒から１時間、１０秒から３０分間、３０秒から１０分間、４５秒から５分間、好ましくは１分間、洗浄緩衝液中に置くことができる。
【０１０６】
洗浄緩衝液は、ドライキャビネット内に基板を置く等、当業者には既知の方法によって基板から除去することができる。
【０１０７】
本発明の別の実施形態は、未修飾の基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法を指し、当該方法は：液体及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、その混合物を未修飾の基板の上に与えるステップと、基板のインキュベーションステップと、基板乾燥のステップと、基板を洗浄するステップと、基板から洗浄緩衝液を除去するステップとを含み、オリゴヌクレオチドは、物理吸着を介して未修飾の基板の上に固定化される。
【０１０８】
本発明の別の実施形態は、未修飾の基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法を指し、当該方法は：液体及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、その混合物を未修飾の基板の上に与えるステップと、基板のインキュベーションステップと、基板乾燥のステップと、基板を洗浄するステップと、基板から洗浄緩衝液を除去するステップとを含み、オリゴヌクレオチドは、物理吸着を介して未修飾の基板の上に固定化される。
【０１０９】
本発明の別の態様は、物理吸着によって未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化することに対する、オリゴヌクレオチドに結合する標識の使用に関する。
【０１１０】
基板とオリゴヌクレオチドとの吸着は、標識されたオリゴヌクレオチドの標識によって伝えられる。これは、図１乃至図３から明らかになり、図は、標識のないオリゴヌクレオチドは、ＣＯＣ基板の上に固定化されず（図１）、オリゴヌクレオチドが、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（図２）又はビオチン（図３）で標識されている場合には、いくつかの標識されたオリゴヌクレオチドを含む明白なスポットを検出することができるということを示しており、標識されたオリゴヌクレオチドは、基板の上に固定化されているということを示している。これは、本明細書において記載される標識を有するオリゴヌクレオチドのみが、ＣＯＣ等のポリマー基板の上に固定化されるということを明白に示している。
【０１１１】
従って、本発明において、標識されたオリゴヌクレオチドの固定化は、未修飾のポリマー基板への標識されたオリゴヌクレオチドの標識の吸着によって媒介される。
【０１１２】
本発明の追加の態様は、本明細書において記載される方法によって達成されるマイクロアレイを指す。
【０１１３】
本明細書において使用される場合「マイクロアレイ」という用語は、アレイ内の捕獲分子と、例えば培地、反応溶液、好ましくはハイブリダイゼーション溶液等、周囲環境におけるあり得る相互作用物質との相互作用に対して提示される順序付けられた又はランダムなアレイを意味する。マイクロアレイは、アドレス可能領域のあらゆる２次元又は３次元の配列、好ましくは２次元の配列を含んでもよい。典型的なマイクロアレイは、多数のスポット、特徴、個々の固定化の領域又は個々の分子自己認識の領域を含有し得る。例えば、アレイは、２、５、１０、５０、１００、５００、７５０、１０００、１５００、３０００、５０００、１０，０００、２０，０００、４０，０００、５０，０００、７０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、７５０，０００、８００，０００、１，０００，０００、１，２００，０００、１，５００，０００、１，７５０，０００、２，０００，０００又は２，１００，０００を超えるスポット、特徴、捕獲分子、又は、個々の固定化の領域若しくは個々の分子自己認識の領域を含有し得る。これらの領域は、約２０ｃｍ２未満、約１０ｃｍ  ２未満、約５ｃｍ２未満、約１ｃｍ２未満、約１ｍｍ２未満、約１００μｍ２未満の領域に含まれてもよい。さらなる実施形態において、マイクロアレイ内のスポットサイズは、例えば１０、５０、１００、１５０、２００若しくは２５０μｍのサイズを有する、又は、上記の値の間のいかなる適した値も有する等、約１から３００μｍの範囲内であり得る。さらなる実施形態において、プローブ（オリゴヌクレオチド）密度は、必要に応じて異なり得る。プローブ密度の例は、例えば１平方μｍあたり２０００、１０，０００、５０，０００、７５，０００又は１，０００，０００プローブのプローブ密度等、１平方μｍあたり１０００から５，０００，０００プローブの密度である。
【０１１４】
特定の実施形態において、そのようなスポット、特徴又は個々の固定化の領域は、例えば１つ以上の特定の配列又はゲノム若しくはゲノムの一部の１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の被覆度等、あらゆる適した被覆度を含んでもよい。従って、マイクロアレイは、例えば、同じ捕獲分子の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のコピーを含んでもよい。或いは又は加えて、マイクロアレイは、例えばミスマッチバリアント等の捕獲分子の異形、一塩基多型又は多塩基多型（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を有する異形、異なるバージョンの一塩基多型又は多塩基多型、例えばタグ、プライマー結合部位、エンドヌクレアーゼ認識部位等、異なる開始又は終結配列を有するが同一のコア部分等を有する捕獲分子を含んでもよい。
【０１１５】
本明細書において述べられるマイクロアレイは、「１種以上」のオリゴヌクレオチド分子、又は、オリゴヌクレオチド分子に結合した「１種以上」の関心のある分子を含んでもよく、すなわち、１つ以上の異なるタイプの分子が、マイクロアレイ内に存在してもよい。或いは、「１種以上」という用語は、例えばＤＮＡ等、同じカテゴリーの、又は、同じ形状若しくは形態を有するが、例えば配列等、その分子自己認識において同じではない若しくは類似ではないオリゴヌクレオチドにも関する。従って、本発明による反応ゾーン又は捕獲ゾーンは、異なるオリゴヌクレオチドを含んでもよい。異なる分子自己認識のオリゴヌクレオチド、特に核酸が、本発明に従って反応ゾーン又は捕獲ゾーンに存在する場合、これらのオリゴヌクレオチドは、部分的に同一であるか又は部分的に類似していてもよく、すなわち、特に核酸の場合に、配列の点から重複を有してもよく、又は、いかなる重複も有さなくてもよい。本発明によるオリゴヌクレオチドは、例えば、生物のゲノム、好ましくは哺乳動物のゲノム、より好ましくはヒトゲノムの少なくとも約０．００００１、０．００００５、０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７５、０．８、０．９、１、１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０又は３０％等、ゲノムの約０．００００１％から約３０％等、例えばゲノムのあらゆる適した領域又は割合の配列を含む、カバーする又は表し得る、及び／又は、そのような領域に相補的であり得る。そのような領域又は割合は、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、３５０、５００、７５０、１０００、１２００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、５０００又は５０００を超える遺伝子等、例えば約２から５，０００の遺伝子の群を含んでもよい。そのような遺伝子は、隣接するゲノム領域に局在していてもよく、又或いは、ゲノムを通じて分散していてもよい。また、遺伝子のサブグループ化、組み合わせ、例えば発現データ等から得られるパターン等のパターンが構想される。
【０１１６】
本発明のさらなる態様は、未修飾のポリマー基板及び基板の上に固定化された標識されたオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイに関し、オリゴヌクレオチドと未修飾のポリマー基板との間に共有結合は存在しない。
【０１１７】
本発明の一実施形態において、ポリマー基板は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリノルボルネン、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、フッ素化ポリイミド、ポリスチレン（ＰＳ）、スチレンブタジエンコポリマー（ＳＢＣ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、スチレンアクリロニトリル（ＳＡＮ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）及びポリスルホンを含む群から選択される。
【０１１８】
本発明の好ましい実施形態において、ポリマー基板は、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）である。
【０１１９】
別の好ましい実施形態において、標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの化学基が結合するオリゴヌクレオチドを含み、化学基は、未修飾の基板に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化するのに適している。
【０１２０】
特定の実施形態において、標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの化学基が結合するオリゴヌクレオチドを含み、化学基は、好ましくは、０．１から１０００ｋＤａ、０．１から５０ｋＤａ、０．１から１．５ｋＤａ、０．１５から１ｋＤａ、０．２から０．８ｋＤａの分子量を有する。
【０１２１】
さらなる実施形態において、化学基は、ビオチン又はスルホローダミン１０１酸クロリド（ＣＡＳ  ｎｕｍｂｅｒ８２３５４−１９−６；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）を含む群から好ましくは選択される化学基である。
【０１２２】
別の実施形態において、標識されたオリゴヌクレオチドの長さは、約２から約２０００、約２から５００、約２から約２００ヌクレオチド、約２から約１００ヌクレオチド、約２から約５０ヌクレオチドである。
【０１２３】
本発明の特定の態様は、未修飾のポリマー基板と、未修飾のポリマー基板の上に固定化された標識されたオリゴヌクレオチドとを含むマイクロアレイに関し、オリゴヌクレオチドと未修飾のポリマー基板との間に共有結合は存在せず、さらに、オリゴヌクレオチドは、吸着、特に物理吸着によって未修飾のポリマー基板の上に固定化される。
【０１２４】
本発明の特定の態様は、未修飾のポリマー基板と、未修飾のポリマー基板の上に固定化された標識されたオリゴヌクレオチドとを含むマイクロアレイに関し、オリゴヌクレオチドと未修飾のポリマー基板との間に共有結合は存在せず、さらに、標識されたオリゴヌクレオチドは、吸着、特に物理吸着によって、その標識を介して未修飾のポリマー基板の上に固定化される。
【０１２５】
本発明の特定の態様は、未修飾のＣＯＣ基板と、未修飾のＣＯＣ基板の上に固定化された標識されたオリゴヌクレオチドとを含むマイクロアレイに関し、オリゴヌクレオチドと未修飾のＣＯＣ基板との間に共有結合は存在しない。
【０１２６】
本発明の特定の態様は、未修飾のＣＯＣ基板と、未修飾のＣＯＣ基板の上に固定化された標識されたオリゴヌクレオチドとを含むマイクロアレイに関し、オリゴヌクレオチドと未修飾のＣＯＣ基板との間に共有結合は存在せず、さらに、標識されたオリゴヌクレオチドは、標識されたｓｓＤＮＡである。
【０１２７】
本発明の特定の態様は、未修飾のＣＯＣ基板と、未修飾のＣＯＣ基板の上に固定化された標識されたオリゴヌクレオチドとを含むマイクロアレイに関し、オリゴヌクレオチドと未修飾のＣＯＣ基板との間に共有結合は存在せず、さらに、オリゴヌクレオチドは、吸着、特に物理吸着によって未修飾のＣＯＣ基板の上に固定化される。
【０１２８】
本発明の特定の態様は、未修飾のＣＯＣ基板と、未修飾のＣＯＣ基板の上に固定化された標識されたオリゴヌクレオチドとを含むマイクロアレイに関し、オリゴヌクレオチドと未修飾のＣＯＣ基板との間に共有結合は存在せず、さらに、標識されたオリゴヌクレオチドは、吸着、特に物理吸着によって、その標識を介して未修飾のＣＯＣ基板の上に固定化される。
【０１２９】
本発明の特定の態様は、未修飾のＣＯＣ基板と、未修飾のＣＯＣ基板の上に固定化された標識されたオリゴヌクレオチドとを含むマイクロアレイに関し、オリゴヌクレオチドと未修飾のＣＯＣ基板との間に共有結合は存在せず、さらに、オリゴヌクレオチドは、標識されたオリゴヌクレオチドをＣＯＣの未修飾の基板に固定化するのに適した少なくとも１つの化学基で標識される。
【０１３０】
本発明の特定の態様は、未修飾のＣＯＣ基板と、未修飾のＣＯＣ基板の上に固定化された標識されたオリゴヌクレオチドとを含むマイクロアレイに関し、オリゴヌクレオチドと未修飾のＣＯＣ基板との間に共有結合は存在せず、さらに、オリゴヌクレオチドは、発色団又はビオチンを含む群から選択された少なくとも１つの化学基で標識される。
【０１３１】
本発明の特定の態様は、未修飾のＣＯＣ基板と、未修飾のＣＯＣ基板の上に固定化された標識されたオリゴヌクレオチドとを含むマイクロアレイに関し、オリゴヌクレオチドと未修飾のＣＯＣ基板との間に共有結合は存在せず、さらに、オリゴヌクレオチドは、スルホローダミン１０１酸クロリド（ＣＡＳ  ｎｕｍｂｅｒ８２３５４−１９−６；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）又はビオチンを含む群から選択された少なくとも１つの化学基で標識される。
【０１３２】
本発明の特定の態様は、未修飾のＣＯＣ基板と、未修飾のＣＯＣ基板の上に固定化された標識されたオリゴヌクレオチドとを含むマイクロアレイに関し、オリゴヌクレオチドと未修飾のＣＯＣ基板との間に共有結合は存在せず、オリゴヌクレオチドは、スルホローダミン１０１酸クロリド（ＣＡＳ  ｎｕｍｂｅｒ８２３５４−１９−６；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）又はビオチンを含む群から選択された少なくとも１つの化学基で標識され、さらに、標識されたオリゴヌクレオチドは、標識されたｓｓＤＮＡである。
【０１３３】
本発明の一実施形態において、標識されたオリゴヌクレオチドは、物理吸着によって未修飾の基板の上に固定化される。
【０１３４】
本発明のさらなる態様は、本明細書において記載される方法に従って固定化されたオリゴヌクレオチドのアレイと、規定された量の既知の標識された核酸であり、上記の固定化されたオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに相補的な核酸を含有する制御プローブとを含む診断キットに関する。
【０１３５】
本発明のさらなる態様は、本明細書において記載される方法に従って固定化されたオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイと、規定された量の既知の標識された核酸であり、上記の固定化されたオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに相補的な核酸を含有する制御プローブとを含む診断キットに関する。
【０１３６】
“規定された量の既知の標識された核酸であり、・・・相補的な核酸を含有する制御プローブ”という用語は、標識、好ましくは蛍光標識が提供され、且つ、アレイの形で存在する固定化されたオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを較正及び／又は試験する又は品質チェックするために使用される明確なオリゴヌクレオチドに関する。
【０１３７】
追加の実施形態は、ハイブリダイゼーションアッセイ、表面増幅、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子の定量的及び／又は多重検出、発現分析、比較ゲノムハイブリダイゼーション、一塩基多型の検出又はゲノム選択に基づく配列決定に対する、上記のマイクロアレイの使用を指す。
【０１３８】
本発明のマイクロアレイは、マイクロアレイ、サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ等のハイブリダイゼーションアッセイ、表面増幅等、核酸検出に特に適している。本発明の基板は磁性ビーズと組み合わせて使用することができる。
【０１３９】
以下の実施例及び図は、例示目的で提供される。従って、実施例及び図は、限定的であるとして解釈されることはないということが理解されたい。当業者は、本明細書において記載された原理のさらなる修正を明白に構想することができる。
【０１４０】
本発明の別の態様は、未修飾のポリマー基板の上に関心のある分子を固定化する方法に関し、当該方法は、本明細書において記載される標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法のステップを含み、ステップ（ａ）において提供される標識されたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに結合する関心のある分子をさらに含む。
【０１４１】
関心のある分子は、固定化のための標識が結合しているオリゴヌクレオチドの反対側に結合され得る。つまり、固定化のための標識がオリゴヌクレオチドの３’末端にて結合している場合、関心のある分子はオリゴヌクレオチドの５’末端に結合され得る。逆に、固定化のための標識がオリゴヌクレオチドの５’末端にて結合している場合、関心のある分子はオリゴヌクレオチドの３’末端に結合され得る。
【０１４２】
特定の実施形態において、関心のある分子が、固定化のための標識が結合するオリゴヌクレオチドに結合する場合、オリゴヌクレオチドは、標的分子に対する結合親和性を有さなくてもよい。この場合、オリゴヌクレオチドは、関心のある分子をポリマー基板に固定化するリンカーとして機能し、関心のある分子と標的分子との結合には関与しない。
【０１４３】
本発明のさらなる態様は、未修飾のポリマー基板の上に関心のある分子を固定化する方法に関し、当該方法は、本明細書において記載された標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法のステップを含み、加えて、少なくとも、（ｃ）関心のある分子が結合するオリゴヌクレオチドをハイブリダイズするステップを含む。
【０１４４】
本明細書において使用される場合「関心のある分子」という用語は、例えば、タンパク質、ペプチド若しくは抗体、小分子、分子インプリントポリマー、タンパク質アプタマー又はペプチドアプタマーを意味する。「関心のある分子」は、標的分子に対する結合親和性を有し得る。
【実施例１】
【０１４５】
ＣＯＣ基板へのｓｓＤＮＡの固定化
室温（２１℃）及び約５０％の相対湿度の閉鎖環境において、Ｓｃｉｅｎｉｏｎ  ｓｃｉＦＬＥＸＡＲＲＡＹＥＲ  Ｓ１１インクジェットプリンタを用いて、ＴｅｘａｓＲｅｄが標識された若しくはビオチンが標識されたｓｓＤＮＡのオリゴヌクレオチド（４０ヌクレオチド）、又は、ビオチンが標識された、２０％スクロース及び１５ｍＭベタインを有する１ＸＰＢＳを含有するプリントバッファーが、ガンマ処理されたＣＯＣ基板の上に印刷される。印刷後、一晩乾燥させるために３７℃の温度のインキュベータに移される前に、基板は３０分間この環境において保たれる。翌日、これらの基板は、洗浄緩衝液を含有する水洗液（０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を有する０．５ｘＰＢＳ）において１分間それらをひっくり返して置くことによって静かに洗浄される。余分な液体は、ティッシュ上で基板を静かに叩くことによって除去され、さらに、基板は、ドライキャビネット（室温、相対湿度〜１０％）内に１時間置かれる。基板は、ここで、さらなる組み立ての準備ができており、４℃にて密閉パウチ内に保管され、１０％未満の湿度を維持して結露を最小限に抑えるためにシリカビーズが添加される。
【実施例２】
【０１４６】
サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ
スポットの品質を試験するために、サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイが、固定化された標識されたオリゴヌクレオチドを有した基板の上で行われる。プローブ及び標的オリゴで標識された磁性粒子（緩衝液に溶解した）と共に、ハイブリダイゼーションが行われる。サンドイッチハイブリダイゼーションは、特定の温度（４０℃から６０℃）にて緩衝溶液において磁気パルスを用いて磁性粒子を作動させることによって促進される。非結合の磁性粒子は磁石で洗い流される。図４は、磁性粒子がプローブを介してハイブリダイズされる、固定化されたＴｅｘａｓＲｅｄで標識されたオリゴヌクレオチドを有する基板を通る概略断面図を示している。この特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、３’末端にて２０ｎｔ長さのスペーサー領域、及び、プローブに対してその５’末端にて結合活性を有する２０ｎｔ長さの領域を含む。このように、プローブは、固定化されたオリゴヌクレオチド及び磁性粒子にハイブリダイズされる。
【実施例３】
【０１４７】
磁性粒子の検出
結合した磁性粒子は、ＣＣＤカメラを使用して漏れ全反射（ｆ−ＴＩＲ）によって画像化される。発光ダイオード（λ＝６２５ｎｍ）からの視準された光のビームは、全反射の状態でセンサ表面を照射する。いわゆるエバネッセント光場が基板／流体の境界面にて生成され、指数関数的に減衰し、さらに、サブ波長の距離だけ流体内に浸透する。磁性粒子が存在しない場合、光はエバネッセント光場から抽出されない（図１）。磁性ナノ粒子がセンサ表面にて存在する場合、粒子は光の一部を吸収して散乱させ、従って、全反射を妨げ、その結果、反射した光の強度を下げる（図２、図３）。基板表面は、ＣＣＤカメラ上に画像化される。
【図１】
2018501803.tif 000003
【図２】
2018501803.tif 000004
【図３】
2018501803.tif 000005
【図４】
2018501803.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成29年8月30日(2017.8.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法であって、
（ａ）液体及び標識されたオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記混合物を、未修飾のポリマー基板の上に与えるステップと、
を含み、
前記オリゴヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの標識によって伝えられる物理吸着を介して前記未修飾のポリマー基板の上に固定化され、さらに、固定化のための前記標識は、前記オリゴヌクレオチドに共有結合しており、前記ポリマー基板は、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）である、方法。
【請求項２】
前記標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの化学基が結合するオリゴヌクレオチドを含み、前記化学基は、物理吸着を介して前記未修飾のポリマー基板に前記標識されたオリゴヌクレオチドを固定化するのに適している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの化学基が結合するオリゴヌクレオチドを含み、前記化学基は、好ましくは、０．１から１０００ｋＤａ、０．１から５０ｋＤａ、０．１から１．５ｋＤａ、０．１５から１ｋＤａ、０．２から０．８ｋＤａの分子量を有し、
任意的に、前記化学基は、ビオチン又はスルホローダミン１０１酸クロリド（ＣＡＳ  ｎｕｍｂｅｒ８２３５４−１９−６；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）を含む群から好ましくは選択される化学基である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記標識されたオリゴヌクレオチドの長さは、約２から２０００、約２から５００、約２から約２００ヌクレオチド、約２から約１００ヌクレオチド、約２から約５０ヌクレオチドである、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＵＶ曝露のステップを含まず、前記オリゴヌクレオチドは前記基板に共有結合しない、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）の後で、前記基板のインキュベーションステップが続き、及び／又は、
請求項１乃至５に記載の方法のステップの後で、基板乾燥ステップが続き、及び／又は、
請求項１乃至５に記載の方法のステップの後で、前記基板を洗浄するステップが続く、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ステップ（ａ）の前記混合物を、未修飾のポリマー基板の上に与えるステップは、コンタクトプリンティング又はノンコンタクトプリンティングによって、好ましくは、ノンコンタクトプリンティングによって行われる、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
未修飾のポリマー基板の上に関心のある分子を固定化する方法であって、請求項１乃至７に記載の標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法のステップを含み、ステップ（ａ）において提供される前記標識されたオリゴヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドに結合する関心のある分子をさらに含む、方法。
【請求項９】
未修飾のポリマー基板の上に関心のある分子を固定化する方法であって、請求項１乃至７に記載の標識されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法のステップを含み、加えて、少なくとも、
（ｃ）前記関心のある分子が結合するオリゴヌクレオチドをハイブリダイズするステップ、
を含む、方法。
【請求項１０】
物理吸着によって未修飾のポリマー基板の上に標識されたオリゴヌクレオチドを固定化することに対する、オリゴヌクレオチドに結合する標識の使用であって、前記ポリマー基板は、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）である、使用。
【請求項１１】
請求項１乃至９に記載の方法によって達成されるマイクロアレイ。
【請求項１２】
未修飾のポリマー基板と、
標識されたオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドの標識を介して前記ポリマー基板の上に固定化された標識されたオリゴヌクレオチドと、
を含むマイクロアレイであって、
前記オリゴヌクレオチドと前記未修飾のポリマー基板との間に共有結合は存在せず、さらに、前記オリゴヌクレオチドの標識が前記オリゴヌクレオチドに共有結合しており、前記ポリマー基板は、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）である、マイクロアレイ。
【請求項１３】
前記標識されたオリゴヌクレオチドは、前記標識されたオリゴヌクレオチドに結合する関心のある分子をさらに含む、請求項１２に記載のマイクロアレイ。
【請求項１４】
関心のある分子が結合するオリゴヌクレオチドをさらに含み、該オリゴヌクレオチドは、前記ポリマー基板の上に固定化された前記標識されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる、請求項１２に記載のマイクロアレイ。
【請求項１５】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法に従って固定化されたオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイ、及び、規定された量の既知の標識された核酸であり、前記固定化されたオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに相補的な核酸を含有する制御プローブを含む診断キット。
【国際調査報告】
2018501803.tif 000007
2018501803.tif 000008
2018501803.tif 000009