(57)【要約】  組換えＩＬ−１１をペグ化して、血清中で改善された半減期を達成する一方で、望ましい治療活性を有し、副作用が少ない組成物および方法を提示する。最も好ましくは、ＩＬ−１１は、Ｎ末端がトランケートされたヒトまたはヒト化ＩＬ−１１であり、２０Ｋｄまたは４０Ｋｄの分枝ＰＥＧ成分、Ｙ状または櫛状の、特に、Ｎ末端アミノ基に結合したものを有する。そのような化合物は、血清中での安定性が増大し、そして生物学的活性は維持される一方で、有意に減少した血漿増量を示すことを特徴とする。
2018508580.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０〜５０Ｋｄの平均分子量を有し、異なる第一および第二ＰＥＧ部分を有するＰＥＧ成分に共有結合したＩＬ−１１ポリペプチド鎖を含み、
前記ＰＥＧ成分がＮ末端アミノ酸に共有結合し、ＩＬ−１１ポリペプチド鎖のＰＥＧ成分に対するモル比が１：１〜０．８：１の範囲であり、
前記ＩＬ−１１ポリペプチド鎖がヒトまたはヒト化ポリペプチド鎖である、改変インターロイキン１１（ＩＬ−１１）化合物。
【請求項２】
前記ＩＬ−１１ポリペプチド鎖が、ヒトＩＬ−１１ポリペプチド鎖である請求項１に記載の改変化合物。
【請求項３】
前記ＩＬ−１１ポリペプチド鎖が、Ｎ末端プロリンの欠失によって短縮されている請求項１または２に記載の改変化合物。
【請求項４】
前記ＩＬ−１１ポリペプチド鎖が、配列番号１の配列を有する請求項１に記載の改変化合物。
【請求項５】
前記ＰＥＧ成分が、２０Ｋｄまたは４０Ｋｄの平均分子量を有する請求項１に記載の改変化合物。
【請求項６】
前記ＰＥＧ成分が、Ｙ字型を有する請求項１に記載の改変化合物。
【請求項７】
ポリペプチド鎖のＰＥＧ成分に対するモル比が約１：１である請求項１に記載の改変化合物。
【請求項９】
前記ＰＥＧ成分が、アミン結合により前記Ｎ末端アミノ酸に共有結合している請求項１に記載の改変化合物。
【請求項１０】
薬剤的に許容される担体と組み合わせた治療有効量の請求項１に記載のＩＬ−１１化合物を含む医薬組成物。
【請求項１１】
注射用に製剤された請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ＩＬ−１１化合物が、小児または成人患者に対して１０〜１００μｇ／ｋｇの投与単位を提供する量で存在する請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
凍結乾燥された請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
第二薬剤的活性化合物をさらに含む請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記第二薬剤的活性化合物が、ステロイド、骨髄における血小板産生を刺激する薬剤、抗体、鎮痛剤、または、抗炎症剤である請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
医薬組成物の製造における請求項１に記載のＩＬ−１１化合物の使用。
【請求項１７】
前記医薬組成物が、（ａ）原発事故／放射線誘発性骨および胃腸障害、（ｂ）化学療法誘発性骨および胃腸障害、（ｃ）熱傷誘発性血小板減少症および胃腸障害、（ｄ）化学療法誘発性血小板減少症、（ｅ）外傷誘発性、癌誘発性、もしくは、感染誘発性胃腸障害または炎症性腸疾患、（ｆ）フリーラジカル誘発性肺障害、ならびに（ｇ）心血管疾患からなる群から選択される状態の治療のためのものである請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
注射用に製剤された請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】
凍結乾燥された請求項１６に記載の使用。
【請求項２０】
インターロイキン１１（ＩＬ−１１）化合物の血清半減期を増加させる方法であって、
ＩＬ−１１ポリペプチド鎖をＰＥＧ成分に共有結合させることを含み、前記ＰＥＧ成分が１０〜５０Ｋｄの平均分子量を有し、そして異なる第一および第二ＰＥＧ部分を有し、
前記ＰＥＧ成分がＮ末端アミノ酸に共有結合し、
ＩＬ−１１ポリペプチド鎖のＰＥＧ成分に対するモル比が１：１〜０．８：１の範囲であり、
前記ＩＬ−１１ポリペプチド鎖がヒトまたはヒト化ポリペプチド鎖である、方法。
【請求項２１】
前記ＩＬ−１１ポリペプチド鎖が、ヒトＩＬ−１１ポリペプチド鎖である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＩＬ−１１ポリペプチド鎖が、Ｎ末端プロリンの欠失によって短くなっている請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＩＬ−１１ポリペプチド鎖が、配列番号１の配列を有する請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＰＥＧ成分が、２０Ｋｄまたは４０Ｋｄの平均分子量を有する請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＰＥＧ成分が、Ｙ字型を有する請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
ポリペプチド鎖のＰＥＧ成分に対するモル比が、約１：１である請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＩＬ−１１ポリペプチド鎖中のアミノ基により第二ＰＥＧ成分を共有結合させる工程をさらに含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＰＥＧ成分が、アミン結合によりＮ末端アミノ酸に共有結合している請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
ＩＬ−１１の投与に応答して状態を治療する方法であって、請求項１０に記載の医薬組成物を治療有効量でそれを必要とする患者に投与する工程を含む方法。
【請求項３０】
前記状態が、（ａ）原発事故／放射線誘発性骨および胃腸障害、（ｂ）化学療法誘発性骨および胃腸障害、（ｃ）熱傷誘発性血小板減少症および胃腸障害、（ｄ）化学療法誘発性血小板減少症、（ｅ）外傷誘発性、癌誘発性、もしくは感染誘発性胃腸障害または炎症性腸疾患、（ｆ）フリーラジカル誘発性肺障害、および（ｇ）心血管疾患からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記医薬組成物が、ＩＬ−１１  Ｉ４０ＮＹまたはＩ２０ＮＹを含む請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＩＬ−１１が、１０〜１００μｇ／ｋｇの投与量で投与される請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＩＬ−１１が、皮下投与される請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１５年３月３日に出願され、本発明者らの同時係属米国特許仮出願第６２／１２７７４８号の優先権を主張し、この出願は参照により本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明の分野は、特に、ペグ化インターロイキン１１（ＩＬ−１１）に関する医薬組成物および方法である。
【背景技術】
【０００３】
背景の記載は、本発明の理解に役立つ可能性のある情報を含む。本明細書中で提供する情報のいずれも本発明の先行技術または関連技術であることを認めるものではない、あるいは具体的または暗に参照される刊行物のいずれをも先行技術であることを認めるものではない。本明細書中の全ての刊行物は、それぞれの刊行物または特許出願があたかも具体的かつ個別に参照により組み入れられることを表示するのと同様に参照により組み込まれる。組み込まれた参考文献中の用語の定義または使用が、本明細書中で提供されるその語の定義と矛盾するかまたは反対である場合、本明細書中で提供されるその語の定義が適用され、参考文献中のその語の定義は適用されない。
【０００４】
現行の治療レジメンは血小板の輸血を採用し、血小板の輸血は供給が不足し、かつウイルス汚染の危険が伴う可能性があるので、化学療法誘発性血小板減少症は依然として満たされていない医学的ニーズである。その一方で、組換えヒトＩＬ−１１を患者に投与して血小板産生を刺激することができる。しかしながら、ＩＬ−１１投与は毎日投与する必要があり、臨床効果が低くなり、血漿増量に至る。
【０００５】
ＩＬ−１１はサイトカインであり、造血において、そして特に巨核球成熟の刺激において、主なシグナル伝達物質として作用する。ＩＬ−１１の作用は、典型的にはＩＬ−１１受容体および糖タンパク質ｇｐｌ３０によって媒介され、続いてｇｐｌ３０のリン酸化／活性化が起こる。ＩＬ−１１の臨床用途には、化学療法に関連する副作用の治療が含まれ、これは巨核球形成を増強し、そして血小板数を増加させると考えられる。組換えヒトＩＬ−１１は、ＮＥＵＭＥＧＡ（登録商標）（Ｏｐｒｅｌｖｅｋｉｎ，  Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）として市販され、重度の血小板減少症の危険性が高い非骨髄性悪性腫瘍の成人患者において骨髄抑制化学療法後の重度の血小板減少症の予防および血小板輸血の必要性の低減のために承認されている。ＮＥＵＭＥＧＡ（登録商標）は、典型的には、１ｍＬの注射用滅菌水で再構成される凍結乾燥粉末として５ｍｇのＩＬ−１１を含む単回使用バイアルで供給される（２５〜５０μｇ／ｋｇ／日の用量で投与）。ＮＥＵＭＥＧＡ（商標）に関連する最も頻度の高い有害事象は、命を脅かす心房性不整脈、失神、呼吸困難、鬱血性心不全、および肺水腫に至る血漿増量である。
【０００６】
ＩＬ−１１は比較的急速に循環系から除去され、したがって頻回注射を必要とする。例えば、健常男性に皮下投与されたＮｅｕｍｅｇａ（商標）は約６．９時間の終末相半減期を有する（Ｎｅｕｍｅｇａ（商標）の添付文書）。迅速な腎排泄およびタンパク分解などの薬物動態が不良であること、またそれに関連する副作用のために、臨床的罹患率が低下することが多い。さらに、毎日の注射はまた、有害事象を管理するための入院を意味し、これは医療費を増やすだけでなく、患者の生活の質を損なう。その結果、血小板輸血は依然として化学療法誘発性血小板減少症（ＣＩＴ）を治療するための代表的な方法である。
【０００７】
そのような組成物の有益な治療可能性を維持しつつ、血清安定性を増加させるいくつかの試みが当該技術分野においてなされてきた。例えば、米国特許出願第２０１０／００９８６５８号（特許文献１）は、酸分解に対する耐性の増強と血清半減期の増加を示すポリマー（ＰＥＧ）と関連したＩＬ−１１アナログ（ｍＩＬ−１１）を報告している。ＩＬ−１１を安定化させる別の試みでは、米国特許第８１３３４８０号（特許文献２）で記載されているように、ＩＬ−１１のシステイン変異体を調製し、選択されたムテインをＰＥＧでさらに改変して血清安定性を増加させた。これらの修飾はＩＬ−１１の血清安定性または半減期を少なくともある程度まで改善したが、骨髄抑制動物における低い有効性、複雑な製法、反復投与、注射液への処方をはじめとする１つ以上の欠点が依然としてある。
【０００８】
ＩＬ−１１ではシステイン残基が欠失しているため、米国特許第８１３３４８０号（特許文献２）では、Ｃ末端アミノ酸配列中にシステイン残基を挿入し、官能基を付与して、チオール反応性ポリエチレングリコール鎖のコンジュゲーションを可能にすることを記載している。生物学的活性は保存されるが、システインの導入により分子間二量体が生じる可能性があり、昆虫細胞の産生収率は細菌生産よりも低い可能性がある。さらに、そのように改変されたＩＬ−１１の血清半減期は、オスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに静脈内投与した場合、４０ＫＤ  ＰＥＧ化について約５．６時間であり、あまり望ましくない。さらに、シクロホスファミドで治療したラットを使用した動物実験では、有効性はジ・アザ・デイ（ｔｈｅ−ｏｔｈｅｒ−ｄａｙ）投薬スキームではわずかであった。ＩＬ−１１のＮ末端がトランケートされた配列への２０ＫＤのＰＥＧを用いてアミンまたはアミド結合を介した別の採用されたＰＥＧコンジュゲーションがＵＳ２０１０／００９８６５８に記載された。Ｎ末端トランケーションはその生物学的活性を低下させないが、オスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに皮下投与された血清半減期は約８．５時間であり、ここでも望ましい安定性に及ばない。さらに、動物疾患モデルにおける有効性は不明であった。
【０００９】
ＩＬ−１１のアミン基にコンジュゲートした２０ＫＤの直線状または分枝ＰＥＧが報告され（Ｔａｋａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７，  “Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１１（ｒｈＩＬ１１）  ｂｙ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ．”Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１１９（３）：２７１−２７８（非特許文献１））、そのような非特異的コンジュゲーションの結果、リシン、ヒスチジン、およびチロシン残基ならびにＮ末端アミンとの反応により、しばしば多ＰＥＧ化が起こった。
【００１０】
他の報告は、Ｎ末端およびループなどのＩＬ−１１の「非コア」領域上のある炭水化物修飾が細胞刺激活性を増強したことを証明しており、このことは、これらの領域がおそらくはＩＬ−１１の生物学的活性を限定するように設計されていることを示唆する（Ｙａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．２０１１，“Ｎｏｎ−ｃｏｒｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１１  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ：ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｇｏｎｉｓｔ  ａｎｄ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｖａｒｉａｎｔｓ．”Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２８６：８０８５−８０９３（非特許文献２））。しかしながら、未改変ＩＬ−１１よりも高い安定性および活性を有する望ましい改変は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願第２０１０／００９８６５８号
【特許文献２】米国特許第８１３３４８０号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｔａｋａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７，  “Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１１（ｒｈＩＬ１１）  ｂｙ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ．”Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１１９（３）：２７１−２７８
【非特許文献２】Ｙａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．２０１１，“Ｎｏｎ−ｃｏｒｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１１  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ：ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｇｏｎｉｓｔ  ａｎｄ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｖａｒｉａｎｔｓ．”Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２８６：８０８５−８０９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、ＩＬ−１１を安定化させるいくつかの方法が当該技術分野で知られているが、全てまたはほとんど全ては、有効性が限られ、また反復投与が必要であるなどの１つ以上の欠点を有する。さらに重要なことには、改変形態においてさえも、ＩＬ−１１の悪影響（例えば、血漿増量）は軽減されなかった。したがって、ＩＬ−１１を安定化させる一方で同時に悪影響を軽減する、改善された組成物および方法が依然として必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の概要
発明の主題は、生物学的活性を維持し、かつ副作用を軽減しながら、血清中のＩＬ−１１の安定性および半減期を改善する化合物、組成物、および方法に関する。特に好ましい態様において、本発明者らは、アミノ酸位置、結合方法、およびＰＥＧの種類が、安定かつ生物学的に活性なペグ化ＩＬ−１１を製造するために重要であり、特に好ましいペグ化ＩＬ−１１は天然のヒトＩＬ−１１と同じ配列を有するが、Ｎ末端の最初のアミノ酸であるプロリンがないことを見出した。さらに、そのようなＩＬ−１１は、好ましくはＮ末端にて、ポリペプチド鎖内のあるリシン残基の可能な第二の部位で共有結合により改変される。最も典型的には、ＩＬ−１１とＩＬ−１１に結合するＰＥＧ化合物との平均モル比は１：１である。
【００１５】
本発明の主題の一態様において、本発明者らは、ＰＥＧ成分に共有結合したＩＬ−１１ポリペプチド鎖を含む改変インターロイキン１１（ＩＬ−１１）化合物であって、ＰＥＧ成分が１０〜５０Ｋｄの平均分子量を有し、かつ異なる第一および第二ＰＥＧ部分を有し、ＰＥＧ成分がＮ末端アミノ酸に共有結合し、ＩＬ−１１ポリペプチド鎖がヒトまたはヒト化ポリペプチド鎖である、改変インターロイキン１１（ＩＬ−１１）化合物を想定する。
【００１６】
最も一般的には、ＩＬ−１１ポリペプチド鎖はヒトＩＬ−１１ポリペプチド鎖である、および／またはＮ末端プロリンの欠失によって短縮されていてもよい。例えば、特に好適なＩＬ−１１ポリペプチド鎖は配列番号１の配列を有し得る。ＰＥＧ成分に関して、当該成分が２０Ｋｄまたは４０Ｋｄの平均分子量を有すること、および／またはＰＥＧ成分がＹ字型を有することが概して好ましい。発明の主題に限定されないが、ポリペプチド鎖のＰＥＧ成分に対するモル比は約１：１（例えば、０．９：１〜１：０．９、または０．８：１〜１：０．８）であることが好ましい。加えて、第二ＰＥＧ成分がＩＬ−１１ポリペプチド鎖のアミノ基を介して改変ＩＬ−１１に共有結合し得ることが想定される。さらに、ＰＥＧ成分がアミン結合（ただし、アミド結合も特に想定される）を介してＮ末端アミノ酸に共有結合することが概して好ましい。
【００１７】
別の視点から見ると、本発明者らはまた、治療有効量の発明の主題のＩＬ−１１化合物（例えば、上述のとおり）を薬剤的に許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物も想定する。望ましい場合、組成物は注射用に処方することができ、ＩＬ−１１化合物を含んでもよく、ＩＬ−１１化合物は小児または成人患者に対して１０〜１００μｇ／ｋｇの投与単位を提供する量で存在する。さらに、組成物は凍結乾燥することができるか、または注射もしくは点滴用液体形態であることが想定される。最も好適なものとして、医薬組成物はさらに、第二薬剤的活性化合物を別に含んでもよいか、またはＩＬ−１１化合物との混合物で含んでもよい。したがって、想定される医薬組成物を他の成分（例えば、ステロイド、骨髄における血小板産生を刺激する薬剤、抗体、鎮痛剤、もしくは抗炎症剤などの第二薬剤的活性化合物、または再構成用の溶媒）とともに含むキットも明らかに本明細書中で想定される。
【００１８】
したがって、本発明者らはまた、医薬組成物の製造における本発明の主題のＩＬ−１１化合物の使用も想定する。発明の主題に限定されないが、特に想定される治療としては、（ａ）原発事故／放射線誘発性骨および胃腸障害、（ｂ）化学療法誘発性骨および胃腸障害、（ｃ）熱傷誘発性血小板減少症および胃腸障害、（ｄ）化学療法誘発性血小板減少症、（ｅ）外傷誘発性、癌誘発性、もしくは感染誘発性胃腸障害または炎症性腸疾患、（ｆ）フリーラジカル誘発性肺障害、ならびに（ｇ）心血管疾患が挙げられる。上述のように、医薬組成物を注射用に処方すること、および／または医薬組成物を凍結乾燥することが、概して想定される。
【００１９】
したがって、発明の主題のさらなる態様において、本発明者らはまた、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）化合物の血清半減期を増加させる方法も想定する。好ましい方法には、ＩＬ−１１ポリペプチド鎖をＰＥＧ成分に共有結合させるステップであって、ＰＥＧ成分が１０〜５０Ｋｄの平均分子量を有し、かつ異なる第一および第二ＰＥＧ部分を有し、ＰＥＧ成分がＮ末端アミノ酸に共有結合し、ＩＬ−１１ポリペプチド鎖がヒトまたはヒト化ポリペプチド鎖であるステップが含まれる。最も一般的には、ＩＬ−１１ポリペプチド鎖はヒトＩＬ−１１ポリペプチド鎖である、および／またはＩＬ−１１ポリペプチド鎖はＮ末端プロリンの欠失によって短縮されている（例えば、配列番号１の配列を有する）。
【００２０】
さらなる想定される方法において、ＰＥＧ成分は２０Ｋｄまたは４０Ｋｄの平均分子量を有する、および／またはＹ字型を有し得る。望ましい場合、ポリペプチド鎖のＰＥＧ成分に対するモル比は約１：１であり、当該方法がＩＬ−１１ポリペプチド鎖中のアミノ基によって第二ＰＥＧ成分を共有結合させるステップをさらに含み得ることがさらに想定される。前述と同様に、ＰＥＧ成分をアミン結合によりＮ末端アミノ酸に共有結合させることが想定される。
【００２１】
さらなる想定される方法において、本発明者らは、ＩＬ−１１の投与に反応する状態を治療する方法を想定する。そのような方法は、典型的には、想定される医薬組成物を治療有効量で、それを必要とする患者に投与するステップを含む。例えば、好適な状態は、（ａ）原発事故／放射線誘発性骨および胃腸障害、（ｂ）化学療法誘発性骨および胃腸障害、（ｃ）熱傷誘発血小板減少症および胃腸障害、（ｄ）化学療法誘発性血小板減少症、（ｅ）外傷誘発性、癌誘発性、もしくは感染誘発性胃腸障害または炎症性腸疾患、（ｆ）フリーラジカル誘発性肺障害、ならびに（ｇ）心血管疾患からなる群から選択することができる。これらの方法についての例示的な好ましい医薬組成物は、ＩＬ−１１  Ｉ４０ＮＹまたはＩ２０ＮＹを含み得、ＩＬ−１１を１０〜１００μｇ／ｋｇの投与量で投与（例えば、皮下）することがさらに想定される。
【００２２】
発明の主題の様々な目的、特徴、態様および利点は、添付の図面と合わせて、以下の好ましい実施形態の詳細な説明からさらに明らかになり、図中、同じ数字は同じ成分を表す。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、Ｎ末端プロリンのないＩＬ−１１の一次配列を表す。
【図２】図２は、分子量マーカーおよび図示するようなＩＬ−１１の様々なペグ化形態を有するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像である。
【図３】図３は、単回静脈内投与後の様々なＩＬ−１１組成物の血漿濃度を表すグラフである。
【図４】図４は、様々なＩＬ−１１組成物の単回静脈内投与後の血小板増加を表すグラフである。
【図５】図５は、非コンジュゲート化ＩＬ−１１、Ｉ４０ＮＹおよびＩ４０ＫＹのトリプシン消化に関するペプチドマップを比較したクロマトグラフを表す。
【図６】図６は、様々なＩＬ−１１組成物の皮下投与（ＩＬ−１１については連続１４日間毎日注射、ペグ化対応物については毎週注射）後の血小板増加を表すグラフである。
【図７】図７は様々なＩＬ−１１組成物の皮下投与（ＩＬ−１１については連続１４日間毎日注射、ペグ化対応物については毎週注射）後のヘマトクリット減少を表すグラフである。
【図８】図８は最大血小板誘導とヘマトクリットの最大減少との間の相関関係を示唆するグラフである。
【図９】図９は、非コンジュゲート化ＩＬ−１１と比較した、７ＴＤ１アッセイにおけるペグ化化合物の細胞増殖活性を表すグラフである。
【図１０】図１０は、様々なローディング量でのＩ４０ＮＹの純度を示す銀染色での非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像である。
【図１１】図１１は、Ｉ４０ＮＹのモノペグ化構成要素の生成物純度を表すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１２】図１２は、非コンジュゲート化ＩＬ−１１の単回皮下投与と比較した、単回皮下投与後のＩ４０ＮＹの血漿濃度のカイネティックを表す薬物動態プロフィールである。
【図１３】図１３は、ＩＬ−１１およびＩ４０ＮＹの円二色性スペクトルのオーバーレイである。
【図１４】図１４は、温度の関数としてのＩＬ−１１およびＩ４０ＮＹについての楕円率プロットである。
【図１５】図１５は、骨髄抑制ラットの動物モデルにおいて想定される化合物の血小板産生を示す薬力学プロフィールである。
【図１６】図１６は、骨髄抑制ラットの動物モデルにおいて想定される化合物のヘマトクリット減少を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明者らは、ＰＥＧ化合物の種類、共有結合の位置、およびＩＬ−１１の一次配列がそのような改変ＩＬ−１１の安定性および活性に対する決定因子であることを見出した。特に好ましい予想外の態様において、本発明者らは、１つのアミノ酸によってＮ末端でトランケートされ、次いでＰＥＧ化される場合、実質的に改善された安定性を有することを見出した。さらに、本発明者らは、ＰＥＧ成分の特定の種類および分子量が以下でより詳細にさらに記載するように、安定性、活性、および毒性のさらなる決定因子であることも見出した。
【００２５】
想定される化合物
ＰＥＧの種類、分子量、およびＩＬ−１１に対する結合位置の影響を調査するために、本発明者らは、図１で示すような一次配列を有する組換えヒトＩＬ−１１（天然のヒトＩＬ−１１配列と同一であるが、Ｎ末端プロリンが欠失している）から様々なペグ化ＩＬ−１１分子を調製した。ＩＬ−１１タンパク質は、Ｎ末端がトランケートされているかまたは改変されたヒトＩＬ−１１であることが概して好ましい。例えば、特に好ましいトランケートされた形態には、少なくとも１個または２個または３個（またはそれ以上）のＮ末端アミノ酸が欠失しているＩＬ−１１分子が含まれる。あるいは、ＩＬ−１１はまた、ヒト未改変対応物とは異なるＮ末端アミノ酸を有するように改変されていてもよい。例えば、改変ＩＬ−１１は第一Ｎ末端アミノ酸が欠失していてもよく、未改変ヒトＩＬ−１１で見られる第二アミノ酸以外の第二アミノ酸を有し得る（例えば、Ｐが欠失し、ＶによってＧが置換されている）。最も一般的には、Ｎ末端アミノ酸はアミノ酸を安定化させ、したがって、特にＭ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＰを含み、さらなる想定される態様では、不安定化アミノ酸（例えば、Ｆ、Ｑ、Ｎ、Ｒなど）は安定化アミノ酸によって置換されていてもよい。Ｎ末端からの１個以上のアミノ酸の欠失は、通常、最初の１０個、または最初の５個、または最初の３個のアミノ酸に限定される。その一方で、あまり好ましくない態様では、１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のアミノ酸の欠失は、ＩＬ−１１成分のＣ末端でも起こり得る。一般的指針として、欠失は概して、生物学的活性および／または安定性に悪影響を及ぼさないかまたはごくわずかしか及ぼさないものに限定される（例えば、活性および／または安定性の喪失は２０％未満であり、さらに一般的には１０％未満である）。あるいは、またはさらに、想定されるＩＬ−１１分子はまた、ＩＬ−１１との融合タンパク質も含み、例示的な融合タンパク質としては、参照することにより本明細書中に組み込まれるＵＳ２０１０／０１４３９７３に記載されているものが含まれる。最も典型的には、ＩＬ−１１は組換えタンパク質であり、好適な発現系で、最も好ましくは原核細胞系（例えば、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ）または酵母系（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｅｕｒｉｓ）で発現される可能性がある。もちろん、ＩＬ−１１の特に好ましい形態が成熟形態（すなわち、リーダー配列がない）であることも理解されるべきである。
【００２６】
さらに、好適なＩＬ−１１分子は、ヒトＩＬ−１１である必要はなく、任意の他の（一般的には哺乳類）起源のものであり得ると理解すべきである。したがって、好適なＩＬ−１１源（組換えまたは天然）としては、霊長類、マウス、ブタ、ウマなどが挙げられる。これらの配列はしたがって、少なくとも部分的にヒト化されて、ヒトにおいて免疫原性が低下し得る、ならびに／または安定性および／もしくは活性が増加し得る。同様に、合成コンセンサス配列も本明細書中で想定される。
【００２７】
想定されるＩＬ−１１分子のＰＥＧ化は多くの方法で実施することができ、共有的ならびに非共有的方法が含まれる。しかしながら、ＰＥＧ化がＩＬ−１１に対する共有結合を使用することが概して好ましい。ＰＥＧ基をタンパク質に共有結合させるために当該技術分野で公知の多くの方法があり、好適な方法には、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボン酸基をＰＥＧ成分上の好適な反応性基（例えば、アルデヒド、マレイミド、酸塩化物など）、またはスルフヒドリル反応性基（例えば、マレイミド、ピリジルジスルフィド、ビニルスルホンなど）と反応させ、それによってシステイン基、またはリシンアミノ酸のε−アミノ基（例えば、ＮＨＳ−エステル、ＮＨＳ−カーボネート、トリアジン基など）と反応するアミノ反応性試薬に対するジスルフィド結合を可能にするものが含まれる。したがって、１個以上のアミノ酸をＮおよび／またはＣ末端に添加して、ＰＥＧ化基の結合に好適な反応性基を導入することができることも想定される。例えば、セリンまたはトレオニンを、Ｎ−アセチルガラクトサミンもしくはＰＥＧシアル酸誘導体（ｓｉａｌｉｃ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）を使用する酵素結合を可能にするために添加することができ、またはε−アミノ基に対する共有結合のためにリシン、またはヒドロキシル基に対する結合のためにフェニルアラニンもしくはトレオニン基を添加することができる。
【００２８】
本明細書中での使用に好適なＰＥＧ分子に関して、概して、ＰＥＧについて様々な分子量が適切であると考えられ、考えられる分子量は２Ｋｄ〜２００Ｋｄ（平均または公称分子量）である。しかしながら、特に好ましい分子量（平均または公称分子量）には、ＰＥＧ化成分において直鎖あたり１０〜５０Ｋｄのものが含まれる。さらに、ＰＥＧ成分は一本の直線状、またはＹ字型状のＰＥＧ成分を有するのが概して好ましく、そのようなＰＥＧ成分は２０〜４０Ｋｄの分子量を有するのがなお一層好ましい。あるいは、好適なＰＥＧ成分はまた樹状ＰＥＧ構造を含んでもよく、またＰＥＧ成分は二本より多い直鎖を有していてもよい。ＰＥＧ成分が一本より多い直線状ＰＥＧ鎖を有する場合、その鎖は実質的に同じ平均分子量を有するのが概して好ましい（平均分子量の差は１５％未満）。
【００２９】
さらに好ましい態様において、ＰＥＧ成分は、ＩＬ−１１のＮ末端アミノ基を介してＩＬ−１１に、および／または（任意選択的に）内部リシンのε−アミノ基またはヒスチジンの環窒素に共有結合している。Ｎ末端共有結合のために、ＩＬ−１１のＰＥＧ成分に対するモル比が、約１：１（例えば、０．９：１〜１：０．９、または０．８：１〜１：０．８など）であることが好ましい。加えて、中程度レベルのＰＥＧ化が内部アミノ酸残基で存在し得る（例えば、全ＩＬ−１１の１０％〜２０％、または１％〜１０％はさらなるペグ化内部アミノ酸を有し得る）ことは理解されるべきである。例えば、第二ＰＥＧ成分が内部リシンまたはヒスチジンのε−アミノ基と結合していてもよい。以下でより詳細にさらに示すように、ペグ化ＩＬ−１１の特に好ましい形態はＩ４０ＮＹであり、ヒトＩＬ−１１（Ｎ末端プロリンが欠如）を含み、４０Ｋｄの平均分子量を有するＹ字型状ＰＥＧ成分がＮ末端上で結合している。
【００３０】
さらに別の態様において、ＰＥＧ化は、ＰＥＧ成分の結合位置および／または結合の種類について混ぜることができると理解すべきである。したがって、ＩＬ−１１をランダムな非共有ＰＥＧ化およびＮ末端アミノ酸で部位特異的ＰＥＧ化に供することができる、またはＮ末端アミノ酸および内部アミノ酸で異なる部位特異的ＰＥＧ化に供することができる。例えば、そして最も好ましくは、ＩＬ−１１（またはその任意の改変形態）をＮ末端アミノ酸でペグ化することができ、そして任意選択的にＮ末端改変に加えて窒素原子（例えば、リシンまたはヒスチジン由来）を介して内部アミノ酸でペグ化することができる。
【００３１】
例えば、そして図１に示すようなトランケートされたＩＬ−１１を用いて、製造業者によって提供される実験プロトコルに従い、また以下でさらに詳細に記載するように、本発明者らは、表１（表中、ｎおよびｍは、化合物の分子量に応じて、独立して８０〜１０００の整数である）に示すようなＰＥＧ試薬を使用してＰＥＧ化を実施した。
【００３２】
【表１】
2018508580.tif 000003
【００３３】
トランケートされたＩＬ−１１のＰＥＧ化後に、そのようにして得られた化合物を以下でもさらに詳細に扱うようにして精製し、様々なペグ化ＩＬ−１１分子には表２で示すような以下の指定があった。
【００３４】
【表２】
2018508580.tif 000004
【００３５】
最も注目すべきことに、本発明者らは、ＰＥＧ成分の種類および結合部位（およびある程度までＩＬ−１１の配列）が生物学的活性およびインビボ安定性に対して予想外で実質的な影響を及ぼすことを見出した。下記実験データからより明らかなように、特に好ましいＰＥＧ化は、単一のＹ字型状ＰＥＧ成分を用いるＮ末端アミノ酸でのものであり、特にＩＬ−１１がトランケートされている場合である。
【００３６】
想定される組成物
想定される化合物の拡張された生物学的活性についての本発明者らの発見に基づいて、本発明の主題の化合物は、ＩＬ−１１の欠失に関連するかまたはＩＬ−１１での治療に対する治療反応によって特徴づけられる様々な疾患の治療のために処方することができることが、概して想定される。したがって、そして想定される他の使用のうち、本発明者らは特に、想定される化合物を含む医薬組成物が、（ａ）化学療法誘発性血小板減少症、（ｂ）原発事故／放射線誘発性骨および胃腸管（ＧＩ）障害、（ｃ）化学療法誘発性骨およびＧＩ障害、（ｄ）熱傷誘発性血小板減少症およびＧＩ障害、（ｅ）血小板減少症の他の原因、（ｆ）クローン病および潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患、ならびに偽膜性大腸炎をはじめとするＧＩ障害の他の原因、（ｇ）フリーラジカル誘発性肺障害、および／または（ｈ）心血管疾患の治療または予防のために有効であり得ると考え、この場合、想定される医薬組成物は、治療有効量の想定される化合物（またはその薬剤的に許容される塩、水和物、またはプロドラッグ）、および薬剤的に許容される担体を含む。例えば、発明の主題の一態様において、想定される組成物は、化学療法誘発性血小板減少症もしくはＧＩ障害または放射線誘発性骨および胃腸管（ＧＩ）障害の治療のために処方される。あるいは、またはさらに、急性期タンパク質を誘導するため、および／また抗原抗体反応を調節するために、想定される組成物を処方することができることも理解すべきである。
【００３７】
想定される化合物は、１つ以上の非毒性の薬剤的に許容される担体と配合される組成物中に含まれることが特に好ましい。好適な医薬組成物は、注射もしくは点滴用に処方されるか、または固体もしくは液体形態で経口投与用に処方されるのが好ましい。したがって、本発明の主題の医薬組成物をヒトおよび他の（通常は哺乳類）動物に対して、非経口、経口、腹腔内、および局所をはじめとする様々な経路を用いて投与することができると理解すべきである。
【００３８】
例えば、注射に好適な医薬組成物は、好ましくは薬剤的に許容される滅菌水性もしくは非水性溶液、分散液、エマルジョン、または懸濁液、ならびに使用前に滅菌注射液または分散液に再構成される滅菌粉末を含む。好適な水性および非水性担体、希釈剤、溶媒、または媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）の例としては、水、リンゲル液、および等張化塩化ナトリウム溶液、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物、油、および注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられる。想定される組成物はさらに、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および／または分散剤をはじめとする様々な不活性成分も含み得る。滅菌性は、抗菌剤および／または抗真菌剤（例えば、パラベン、フェノールソルビン酸、クロロブタノールなど）を含めることにより、またサブミクロンの膜（例えば、０．４５μΜまたは０．２２μΜの細孔径）を通した濾過、オートクレーブ処理または低温殺菌、および放射線（例えば、ガンマまたはＥ−ビーム）によって確実にすることができる。適切な場合には、浸透活性剤を含めることができる（例えば、糖、塩化ナトリウムなど）。本発明の主題に限定されないが、想定される注射用処方は、一般的には、３〜９、さらに一般的には６〜８、最も一般的には７．４＋／−０．３のｐＨ範囲内である。もちろん、全ての液体処方を様々な方法で保存して、長期貯蔵／備蓄を促進できることも理解されるべきである。例えば、想定される安定化法としては、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化、（好ましくは生体適合性または薬剤的に許容される）固体相上の吸着などを用いた水／溶媒の除去が挙げられる。
【００３９】
本発明の主題による組成物は、経口、非経口、吸入による、局所、直腸、経鼻、または移植されたレザバーを介するなど、様々な経路を使用して投与することができ、ここで、本明細書中で使用する「非経口」という語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、髄腔内、肝内、病巣内、および頭蓋内投与（一般的には注射または点滴）を含む。好ましくは、組成物を注射により、典型的には静脈内、さらに好ましくは皮下投与する。想定される医薬組成物は、また、特に、治療の標的が、眼、皮膚、下部腸管、または外科的介入の間露出する部分の疾患を含む、局所適用により容易にアクセス可能な部分または臓器を含む場合にも局所適用することができる。当該技術分野で公知の局所処方が多くあり、そのような処方の全ては本明細書における使用に好適であると考えられる。
【００４０】
組成物中の想定される化合物の量に関して、特定の量は、典型的には特定の処方および所望の目的に依存すると認識されるべきである。したがって、想定される化合物の量は有意に変わると理解されるべきである。しかしながら、化合物はインビトロおよび／またはインビボで治療効果を送達するために有効な最小量で存在することが概して好ましい。
【００４１】
したがって、最も好ましい実施形態において、想定される化合物は、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの量で、さらに一般的には約１０μｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの量で、そして最も一般的には約５μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌで存在する。投与単位に関して、想定される化合物は、所望の治療効果を達成するために有効な投与量、一般的には１０〜１００μｇ／ｋｇ、さらに好ましくは３０〜７０μｇ／ｋｇで投与されると概して考えられる。しかしながら、隔日投与単位は、０．１〜１０μｇ／ｋｇ、または５０〜８０μｇ／ｋｇ、または８０〜１２０μｇ／ｋｇ、または１２０〜２００μｇ／ｋｇ、またはさらにはそれ以上であり得る。異なる視点からみると、想定される処方の単回使用単位は、約０．３ｍｇ〜３．０ｍｇのペグ化ＩＬ−１１、または約３ｍｇ〜７ｍｇのペグ化ＩＬ−１１、または約７ｍｇ〜１０ｍｇのペグ化ＩＬ−１１（最も一般的には７〜９×ｌ０６Ｕ／ｍｇの比活性を有する）を含み得ると理解されるべきである。文脈で別段の記載がない限り、本明細書中で記載する全ての範囲はそれらの終点を含むと解釈されるべきであり、オープンエンドの範囲は商業的に実施可能な値を含むと解釈されるべきである。同様に、値の全てのリストは、文脈で別段の記載がない限り、中間の値を含むとみなすべきである。
【００４２】
加えて、想定される処方は一種以上のさらなる薬剤的活性剤を含み得、これは同じ処方中で存在してもよいし、または別々に（異なる種類または同じ種類の処方中で）利用可能にすることもできるか、またはキットとして販売できることに留意されたい。例えば、好適なさらなる薬剤的活性剤としては、様々なステロイド（例えば、コルチコステロイド）、骨髄における血小板産生を刺激する薬剤（例えば、Ｌｉ２ＣＯ３、葉酸など）、抗体、鎮痛剤、および抗炎症剤が挙げられる。
【００４３】
想定される使用
想定される化合物は、（ａ）原発事故／放射線誘発性骨および胃腸管（ＧＩ）障害、（ｂ）化学療法誘発性骨およびＧＩ障害、（ｃ）熱傷誘発性血小板減少症およびＧＩ障害、（ｄ）血小板減少症の他の原因、（ｅ）クローン病および潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患、ならびに偽膜性大腸炎をはじめとするＧＩ障害の他の原因、（ｆ）フリーラジカル誘発性肺障害、および（ｇ）心血管疾患の治療で単独使用または併用するための治療薬として特に有用であり得る。
【００４４】
結果として、本発明者らは、（ａ）原発事故／放射線誘発性骨およびＧＩ障害、（ｂ）化学療法誘発性骨およびＧＩ障害、（ｃ）熱傷誘発性血小板減少症およびＧＩ障害、（ｄ）血小板減少症の他の原因、（ｅ）クローン病および潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患、ならびに偽膜性大腸炎をはじめとするＧＩ障害の他の原因、（ｆ）フリーラジカル誘発性肺障害、および（ｇ）心血管疾患の治療用薬物の製造のための本明細書中で提示した化合物の使用も想定する。
【００４５】
別の視点から見ると、本発明者らはまた、それを必要とするヒトにおける（ａ）原発事故／放射線誘発性骨およびＧＩ障害、（ｂ）化学療法誘発性骨およびＧＩ障害、（ｃ）熱傷誘発性血小板減少症およびＧＩ障害、（ｄ）血小板減少症の他の原因、（ｅ）クローン病および潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患、ならびに偽膜性大腸炎をはじめとするＧＩ障害の他の原因、（ｆ）フリーラジカル誘発性肺障害、および（ｇ）心血管疾患の治療法であって、想定される化合物を治療上有効量で投与する治療法を想定する。
【００４６】
実験および実験データ
材料：酵母由来の組換えヒトＩＬ−１１の精製バルクはＨａｎｇｚｈｏｕ  Ｊｉｕｙｕａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙから提供された（Ｌｏｔ＃  ２０１２１００５／１００６／１００７／１００８）。７ＴＤ１マウスハイブリドーマ細胞株はＤＳＭＺ（Ｎｏ．ＡＣＣ２３）から取得した。Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標）注射（一般名：カルボプラチン）１０ｍｇ／ｍＬ（ロット：５Ａ０３９３５）はＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ製であった。ウシ膵臓から改変した、シーケンシング等級のトリプシン（カタログ番号１１４１８０２５００１）はＲｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから購入した。マウスＩＬ−１１受容体アルファはＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ．（カタログ番号ＭＢＳ５５３２７６）から取得した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＭＴＳ）（カタログ番号Ｇ５４３０）は７ＴＤ１細胞アッセイのためにＰｒｏｍｅｇａから購入した。ヒトＩＬ−１１用のＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔキットはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．から購入した（カタログ番号ＤＹ２１８）。精製樹脂ＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰ（製品コード１７−５４４０−０１）はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから取得した。Ｐｒｅｃｉｓｅ  Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  ８〜１６％ポリアクリルアミドゲルをＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ＨＰＬＣ用トリフルオロ酢酸（カタログ番号３０２０３１）およびアセトニトリル（カタログ番号３４９６７）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【００４７】
カタログ番号ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＭＥ−１２０ＴＳ、ＭＥ−２００ＡＬ、ＧＬ２−４００ＴＳ、ＭＥ−０５０ＴＳ、ＧＬ４−４００ＡＬ３、ＧＬ２−２００ＡＬ３の様々な形態の一官能性ＰＥＧをＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入し、そしてＹ−ＰＡＬＤ−４０ＫはＪｅｎｋｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＵＳＡから購入した。ＰＥＧ試薬の分子構造は表１中で上記に示した。
【００４８】
Ｉ１２ＫＬ／Ｉ４０ＫＹ／Ｉ０５ＫＬ４の調製：５ｍｇ／ｍＬのタンパク質を１〜２倍のモル比の各ＰＥＧ試薬の混合物（Ｉ１２ＫＬについてはＮＯＦ／ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−１２０ＴＳ、Ｉ４０ＫＹについてはＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＴＳ）および５０ｍＭのＮａＨＣＯ３とともにｐＨ約８で導入した。Ｉ０５ＫＬ４（ＰＥＧ試薬：ＮＯＦ／ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−１２０ＴＳ）を、ＰＥＧのタンパク質に対するモル比を１２倍で添加する以外は、同じ方法で調製した。反応混合物を室温で２時間インキュベートし、続いて２ｍＭグリシンでクエンチした。ペグ化生成物を、以下のようなクロマトグラフィー精製手順を用いて単離した。ＰＥＧ分子をアミド結合によりタンパク質に結合させた。
【００４９】
Ｉ２０ＮＬ／Ｉ４０ＮＹ／Ｉ２０ＮＹ／Ｉ２０ＮＬ２／Ｉ２０ＮＹ２／Ｉ４０ＮＸの調製：５ｍｇ／ｍＬのタンパク質を、１〜２倍のモル比の各ＰＥＧ試薬の混合物（Ｉ２０ＮＬおよびＩ２０ＮＬ２についてはＮＯＦ／ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−２００ＡＬ、Ｉ４０ＮＹについてはＪｅｎｋｅｍ／Ｙ−ＰＬＡＤ−４０、Ｉ２０ＮＹおよびＩ２０ＮＹ２についてはＮＯＦ／ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−２００ＡＬ３、Ｉ４０ＮＸについてはＮＯＦ／ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ４−４００ＡＬ３）、１０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウムおよび５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４とともに導入した。２つの部位上へコンジュゲートするために、ＰＥＧのモル比を３．５〜５．５倍で添加した。ｐＨを約４．５〜５．０に調節した。反応混合物を室温で２４時間インキュベートし、続いて２ｍＭのグリシンでクエンチした。ＰＥＧ分子をより安定なアミン結合によってタンパク質に結合させた。ペグ化生成物を以下のようにクロマトグラフィー精製を使用して単離した。
【００５０】
クロマトグラフィー精製：タンパク質溶液のｐＨを１Ｍ酢酸で４〜５に調節し、続いて遠心分離またはろ過を行って粒状物質を除去した。４体積の水を導入した。２０ＫＤａを越えるＰＥＧを含むコンジュゲートについて、タンパク質溶液を、２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５を含む緩衝液Ａで平衡化したＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰカラム（１×６ｃｍ）上にロードした。２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５および１Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂのグラジエント溶出またはステップ溶出でタンパク質を溶出させた。２０ＫＤａより低いＰＥＧを含むコンジュゲートについて、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７を含む緩衝液Ａで平衡化したＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰカラム（１×６ｃｍ）上にタンパク質溶液をロードした。２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７および１Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂのグラジエント溶出またはステップ溶出でタンパク質を溶出させた。ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで分析した典型的な最終生成物は図２で見ることができる。ここで、左のレーンには分子量マーカーをロードし、ＩＬ−１１の様々なペグ化形態を残りのレーンにロードした。Ｉ４０ＮＹは、おそらくそのＰＥＧ成分のＹ字型状のために６０Ｋｄの推定されるものよりも大きな１００Ｋｄを越える見かけの分子量で流出したことに留意されたい。さらなる特に好ましい態様において、想定される化合物の精製はワンステップ精製プロセスとして実施し、これによって下流スケールアップにおける利点が追加される。
【００５１】
ＲＰ−ＨＰＬＣによる純度チェック：各ＰＥＧａｍｅｒの含有量を、ダイオードアレイ検出器と連結したＵＰＬＣを用いる逆相（ＲＰ）クロマトグラフィー−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００  Ｒａｐｉｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍｓを用いることによって分析した。クロマトグラフィー手順は以下のものを使用して実施した。カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×１５０ｍｍ、３００Å細孔径、ガードカートリッジを備える、移動相Ａ：５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル中０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ、移動相Ｂ：９５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル中０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ、流速：０．４ｍｌ／分、カラム温度：６５℃、検出：２１４ｎｍ、２０μｇを注入し、下記表３中のようなグラジエントで流す。
【００５２】
【表３】
2018508580.tif 000005
【００５３】
タンパク質含有量の測定：タンパク質含有量は、ＵＶ／Ｖｉｓマイクロプレートおよびキュベット分光光度計−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＭｕｌｔｉｓｋａｎ  ＧＯによって測定した。水中で測定した２８０ｎｍでの単位Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数は１７，９９０である。あるいは、タンパク質濃度は、０．１％（１ｍｇ／ｍｌ）溶液について０．９４４の吸光度値を使用して、波長２８０ｎｍでの紫外分光法によって直接測定する。２８０ｎｍでの吸光度を使用したタンパク質定量によって、トリプトファンおよびチロシンなどの芳香族アミノ酸の吸光度を測定し、ＰＥＧ成分は検出されないままである。その結果、本明細書中で記載する重量基準のタンパク質濃度はＰＥＧ分子を含まない。
【００５４】
健常ラットにおける薬物動態（ＰＫ）研究：３匹のオスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットで、１００〜１５０μｇ／ｋｇの投与レベルで静脈内または皮下経路によって想定される化合物を単回投与した後に、インビボ操作を実施した。血液サンプルを複数の時点でヘパリン管中に集め、続いて血漿を分離し、−２０℃で保管した。血漿サンプル中の免疫反応性ＩＬ−１１の濃度をヒトＩＬ−１１用のＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．カタログ番号ＤＹ２１８）によって測定した。ノンコンパートメントモデルを用いてＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  ５．３ソフトウェアで薬物動態のパラメータを得た。
【００５５】
健常ラットにおける薬力学（ＰＤ）研究：想定される化合物の各々を１００〜１５０μｇ／ｋｇの投薬強度で静脈内または皮下投与を使用して４匹のオスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットで薬力学評価を実施した。血液サンプルを複数の時点でヘパリン管中に集め、続いて血漿を分離し、−２０℃で保管した。血球計数をＣｅｌｌ−ＤＹＮ  ３５００血液分析器で実施した。
【００５６】
骨髄抑制ラットにおける薬力学（ＰＤ）研究：４匹のオスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、０日で４０ｍｇ／ｋｇのカルボプラチンの静脈内投与を使用して骨髄抑制を誘発することによって薬力学評価を実施した。想定される化合物を第一日に１５０μｇ／ｋｇで皮下注射した。血液サンプルを複数の時点でヘパリン管中に集め、続いて血漿を分離し、−２０℃で保存した。血球計数をＣｅｌｌ−ＤＹＮ３５００血液分析器で実施した。
【００５７】
トリプシンマッピング：２ｍｇ／ｍＬのタンパク質および１／５０（Ｗ／Ｗ）のトリプシンを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．３緩衝液中で反応溶液を調製した。室温で６時間インキュベートし、続いて等体積の０．２％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）溶液を添加した。粒状物質を遠心分離によって除去した後、ＨＰＬＣに注入した。クロマトグラフィー操作は以下を用いて実施した。カラム：Ｚｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ−Ｃ８、２．１×１５０ｍｍ、５μｍ、３００Å細孔径、移動相Ａ：０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ、移動相Ｂ：９５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル中の０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ、流速：０．２ｍｌ／分、検出：２１４ｎｍ、１０μｇを注入し、下記表４中のようなグラジエントで実施する。
【００５８】
【表４】
2018508580.tif 000006
【００５９】
タンパク質分解ペプチドの同定は、ＭＳ分光分析（Ｔｈｅｒｍｏ  ＬＣＱ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ）と連結したＨＰＬＣで実施した。
【００６０】
いくつかの実施形態において、発明のある実施形態を記載し主張するために使用される、成分の量、濃度などの特性、反応条件などを表す数は、いくつかの例では「約」という語により改変されると理解すべきである。したがって、いくつかの実施形態において、明細書および添付の特許請求の範囲で記載する数値パラメータは、特定の実施形態によって目標とする望ましい特性に応じて変わり得る近似値である。いくつかの実施形態において、数値パラメータは、報告された有効数字の数値の観点から、そして通常の丸める技術を適用することによって解析すべきである。本発明のいくつかの実施形態の広い範囲を記載する数値範囲およびパラメータは近似値であるが、特定の実施形態で記載される数値は実施可能な程度に正確であるとして報告される。本発明のいくつかの実施形態で提示されている数値は、それらの各々の試験測定で見いだされた標準偏差から必然的に生じるある誤差を含み得る。
【００６１】
ＰＥＧはそのコンジュゲートの血漿安定性を付与できることが一般的に知られているが、どのような結合の種類、鎖長、および分子構造が治療効果および／または薬理学的パラメータに関して特異的な結果をもたらすかを予想することはできない。第一の実施例において、様々なＰＥＧサイズのトランケートされたＩＬ−１１コンジュゲートを正常なラットにおいて血漿安定性に関して調査した。静脈内投与後、非ペグ化ＩＬ−１１の観察された血漿半減期は、そのペグ化対応物の血漿半減期（３．５〜１３．７時間）と比較して非常に短く、１０分未満であることが判明した。後者のうち、高分子量ＰＥＧほど以下の順で高い血漿安定性を付与した。Ｉ４０ＫＹ（１３．７ｈｒ）〜Ｉ４０ＮＹ（８．５時間）＞Ｉ２０ＮＬ（３．８時間）〜Ｉ１２ＫＬ（３．５時間）。図３は、単回静脈内投与後の様々な形態のペグ化ＩＬ−１１の血漿濃度を示す。各サンプルをラットにおいて１００μｇ／ｋｇで投与した。この実施例では、ＰＥＧ鎖が大きいほど、または長いほど、血清半減期が長くなると結論づけられた。
【００６２】
第二の実施例において、１００μｇ／ｋｇで単回静脈内投与した後、静脈内経路にしたがって健常Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットで薬力学評価を実施して、血小板増加を測定した。図示するように、図４から、４０−ＫＤコンジュゲート（Ｉ４０ＮＹおよびＩ４０ＫＹ）はＩ２０ＮＬ（５０％）よりも多い血小板増加（６０〜７５％）を誘導し、ここで、ＹはＹ字型状ＰＥＧを表し、Ｌは直線状ＰＥＧを表す。結果はまた、短いＰＥＧコンジュゲートでのマルチプルが約２５％の血小板増加でごく限られた有効性しか有しないので、マルチプルコンジュゲーション（Ｉ０５ＫＬ４、４部位でコンジュゲートした５−ＫＤ  ＰＥＧ）がＮ末端上で長いＰＥＧ単一鎖よりも有効でないことも示唆する。この実施例では、１つの部位上のＰＥＧ鎖が長いほど、血小板誘導の点で有効性が高くなると結論づけられた。これは、組換えヒト成長ホルモンに対するＰＥＧ化の効果の反対であるように見える。
【００６３】
第三の実施例において、タンパク質分解ペプチドのＬＣ／ＭＳ同定と併用して、トリプシンマッピングによってコンジュゲーション部位を調べた。図５は、ＩＬ−１１（非コンジュゲート）、Ｉ４０ＮＹ、およびＩ４０ＫＹのトリプシンマップを表し、下記表５はトリプシンペプチドを提供する。
【００６４】
【表５】
2018508580.tif 000007
【００６５】
ここで、Ｔｌペプチドに相当するピークはＩ４０ＮＹおよびＩ４０ＫＹのトリプシンマップで著しく減少したことがわかる。このことは、Ｎ末端アミンが化学コンジュゲーションのための唯一の部位であるＴ１ペプチド上に、ＰＥＧでの両コンジュゲートが結合していたことを示す。その結果、Ｉ４０ＮＹおよびＩ４０ＫＹは両Ｎ末端に結合していたが、Ｉ４０ＮＹについてはアミン結合、そしてＩ４０ＫＹについてはアミド結合での化学結合である点のみが異なっていた。特に、Ｉ４０ＮＹおよびＩ４０ＫＹはどちらも静脈内投与により血清半減期および血小板誘導において同様の効果を示した。
【００６６】
アミン結合はアミド結合よりも安定であり、モノペグ化生成物の収率は、還元的アミノ化を用いた選択的ＰＥＧ化についてより均一であり、次の研究では、様々なＮ末端コンジュゲートを血小板産生における有効性に関して調査し、健常なラットにおいて皮下投与によるそれら各々の関連する副作用によって評価した。図６は、１５０μｇ／ｋｇで皮下投与したラットにおける６種のペグ化ＩＬ−１１コンジュゲートの薬力学研究の結果を示す。ＩＬ−１１を連続１４日間毎日投与し、その一方で、ペグ化ＩＬ−１１を毎週１回注射した。ＰＥＧ形状はコンジュゲートの機能に影響を及ぼし得る。特に、非直線状ＰＥＧ分子はその直線状対応物よりも良好な血漿安定性およびより高い有効性を付与する。図６で示されるように、Ｉ２０ＮＹはＩ２０ＮＬ（４６〜５５％）よりも大きな血小板増加（５８〜７０％）を誘導し、ここで、ＹはＹ字型状ＰＥＧを表し、Ｌは直線状ＰＥＧを表す。これらの結果は、Ｙ字型状ＰＥＧが同じ分子量の直線状形態よりも高い有効性を有することを示唆した。しかしながら、Ｉ４０ＮＹ（Ｙ字型状）およびＩ４０ＮＸ（４本の櫛状）は、どちらも約６５〜７０％まで増加したので血小板産生において同等であり、ＰＥＧ形状の影響は、ＰＥＧサイズが約４０ＫＤ以上である場合に飽和状態になったことを示唆した。Ｉ２０ＮＬ２（２つの部位上の直線状ＰＥＧ）およびＩ２０ＮＹ２（２つの部位上のＹ字型状ＰＥＧ）はそれらの単一ペグ化対応物よりも低い血小板産生を有していたので、特に、同じＰＥＧ長の二重ＰＥＧ化はインビボ有効性を低下させた。したがって、Ｉ４０ＮＹ、Ｉ４０ＮＸおよびＩ２０ＮＹは様々なＮ末端コンジュゲート化ＩＬ−１Ｉのなかでもより高い有効性を発揮したと結論づけられた。さらに、２回目の投与の影響は、コンジュゲーション部位の数に関係なく、２０−ＫＤのＰＥＧなどのより小さなＰＥＧコンジュゲートについて幾分下方調節されたことに留意する。その結果、Ｉ４０ＮＹおよびＩ４０ＮＸは所望の生物学的特性を有し、悪影響（特に血漿増量）が比較的少ない、予想外に有効な化合物であった。さらに、生物学的データはさらに、そのような改変ＩＬ−１１化合物を低頻度で、最も好ましくは１週間に２回、１週間に１回、またはそれ以下で投与できることを示唆する。そのようなスケジュールは、想定される化合物がより大きな集団（例えば放射線被曝にさらされた）における血小板減少症の治療において用いられる場合に特に関連する。
【００６７】
本発明者らはまた、健常なラットにおけるＩＬ−１１コンジュゲートに関連した副作用も研究した。患者は血漿増量のために希釈性貧血を経験する可能性があるので、ＩＬ−１１の臨床用途における副作用の評価のためにヘマトクリット状態を通常マーカーとして使用する。動物試験において、ＩＬ−１１を連続１４日間１５０μｇ／ｋｇで皮下投与し、その一方で、ペグ化ＩＬ−１１を同じ用量で１週間に１回注射した。図７に示すように、全ての薬物はヘマトクリットの減少をもたらしたが、Ｉ４０ＮＹは、ペグ化コンジュゲートの残りよりも高い活性を維持しつつ、低下が少ないことが判明した。Ｉ４０ＮＹの投与で緩和された希釈性貧血はコンジュゲート化および非コンジュゲート化ＩＬ−１１を使用した他の個々の動物実験と同じチャートで比較した場合、より顕著である。ヘマトクリットの減少によって示されるように、血小板産生と副作用との間の相関関係は、図８で実証され、様々な改変および未改変ＩＬ−１１をチャートでプロットした場合に増加する用量依存性有効性とともに副作用を増強する傾向が示唆される。様々な用量でのＩ４０ＮＹは明らかに右上側に位置し、このことは、同等の有効性の基準に基づいてある他の化合物および未改変ＩＬ−１１よりも少ない血漿増量を意味する。生成物特性解析の点で、本発明者らは、好ましい化合物であるＩ４０ＮＹの物理化学的および薬理学的特性を特性解析した。
【００６８】
ＩＬ−１１コンジュゲートの細胞系アッセイ：コンジュゲート化ＩＬ−１１の生物学的活性を、細胞増殖アッセイにおいて７ＴＤ１細胞株（ＤＳＭＺ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して試験した。簡単に説明すると、１ウェルあたり４，０００個の７ＴＤ１細胞を、２μｇ／ｍＬマウスＩＬ−１１受容体（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，ＵＳＡ，ＭＢＳ５５３２７６）の存在下で２日間様々なＩＬ−１１濃度に対して５％ＣＯ２の加湿雰囲気中３７℃にて増殖させた（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，  ３１８：４８９−４９５）。ＭＴＳを添加した後、ｙ軸上の４９０ｎｍの吸光度をｙ軸上のＩＬ−１１濃度に対してプロットし、グラフＰａｄソフトウェアＰｒｉｓｍ  ６でＳ字状用量応答曲線を適合させることによって、用量反応曲線のＥＣ５０を決定した。動物試験の前に、新たに合成したコンジュゲートの生物学的活性を、７ＴＤ１細胞株を使用して細胞増殖アッセイで試験した。全てのＰＥＧ化調製が同様の生成物をもたらすとは限らず、実際の生成物形成は、コンジュゲートされるＩＬ−１１のアミノ酸残基、および使用されるＰＥＧ分子のサイズおよび形状に依存する。７ＴＤ１細胞は、異なるコンジュゲート濃度に反応して増殖した。その化学シグナルが細胞数と線形関係を有する展開剤を添加した後、４９０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダーで読み取った。結果を図９に示した。
【００６９】
ＰＥＧ部分の立体障害のために、コンジュゲートは全て、以下の有効性の順序で非ペグ化ＩＬ−１１のものと比較して、細胞系アッセイにおいて予想どおり生物活性の低下を示した。ＩＬ−１１（１００％）＞Ｉ２０ＮＬ、Ｉ２０ＮＹ（どちらも約１６％）＞Ｉ４０ＮＹ、Ｉ４０ＮＸ（どちらも１１％）＞Ｉ４０ＫＹ（６％）＞Ｉ２０ＮＹ２（３％）。特に、立体障害はペグ化コンジュゲートの生物学的活性を測定する際の支配的因子であり、それらの全体的なＰＥＧ成分が２０ＫＤａより大きいコンジュゲートの生物活性における大幅な減少としてとらえることができる。一部の細胞系研究から、Ｎ末端配列などのＩＬ−１１分子の非コア領域での小さな炭化水素結合が、他の結合部位でのそれらのコンジュゲートと比較した場合、生物学的活性を増強させたことを示す報告があり（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ２８６，Ｎｏ．１０，ｐｐ８０８５−８０９３）、これはＩＬ−１１のＮ末端配列でのＰＥＧ分子による生物活性の減少が少ないことと一致した。Ｉ４０ＮＹのインビトロ生物活性は天然のＩＬ−ＩＩのわずか約１１％しか保持しないが、インビボ有効性は好影響を受け、インビトロ生物活性データから予想できなかった。下記表６は、未改変ＩＬ−１１に対して様々な化合物の生物活性比を概略的に示す。
【００７０】
【表６】
2018508580.tif 000008
【００７１】
ＰＥＧでのタンパク質の化学改変は確立された技術であり、タンパク質の溶解性および物理化学的安定性を増強するためにバイオ医薬品業界で応用されてきた。この化学反応は実施が容易である一方で、ＰＥＧａｍｅｒおよび位置異性体を含む異なるペグ化形態の複雑な混合物をもたらすことが多い。高い回収率で生成物を単離するために多数のクロマトグラフィー精製ステップが用いられる。費用および収率の点で商業的に実行可能なプロセスを開発するために、タンパク質濃度、ＰＥＧの質、タンパク質／ＰＥＧ比、反応温度、および緩衝液ｐＨなどの多くの因子、ならびに精製プロセスを最適化することが要求される。
【００７２】
コンジュゲーション化学（ＰＥＧ成分中のアルデヒドカップリング基の還元的アミノ化）によって駆動されるＮ末端アミンに対して比較的高い選択性で安定なアミン結合を形成するアミン上のＹ字型状ポリエチレングリコール鎖とのコンジュゲーションによってＩ４０ＮＹを構築した。Ｉ４０ＫＹは、その一方で、対応するアミド結合を形成するアクセス可能なアミン上でｐＨ８にて官能化されたＮＨＳ試薬を用いてコンジュゲートさせた。さらに詳細には、官能化されたアルデヒドはそのｐＫａが他の求核性物質よりも低いＮ末端α−アミンに対して非常に選択的であるので、Ｉ４０ＮＹは酸性条件下での部位特異性反応で産生されるモノペグ化ＩＬ−１１である。ＰＥＧのタンパク質に対する比、反応濃度、ｐＨおよびカイネティクスをコンジュゲーション反応で調査した。反応は、１０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下で体積約０．０５〜０．５ｍＬの小規模で室温（２２〜２７℃）にて２４時間行った。調査している各反応の収率をＲＰ−ＵＰＬＣによって測定した。選択された反応について異なるｐＨを使用して、最適コンジュゲーション収率はｐＨ４．５〜５．５でのものであった。加えて、本発明者らは、反応物質の濃度が生成物収率において重要な役割を果たすことに気づき、５ｍｇ／ｍＬより高い濃度でのＩＬ−１１とのコンジュゲーションが最適であることを見出した。同様に、ＰＥＧとタンパク質の比および還元剤の存在下で室温での５ｍｇ／ｍＬタンパク質との反応のコンジュゲーションカイネティクスを調査し、ＰＥＧのタンパク質に対する最適モル比が２で、モノＰＥＧ化に十分な１６時間まで反応を延長することが示唆された。
【００７３】
ペグ化タンパク質の精製は、通常、大規模調製においてイオン交換クロマトグラフィーを用いる。しかしながら、モノペグ化物をオリゴペグ化物から分離するための満足できる分解能は、従来型イオン交換体に樹脂１ｍＬあたり１ｍｇもの少ないローディング容量で反応生成物をロードする場合には達成されない。この樹脂の低い容量は、多くの場合、より大規模の製造のための用途を制限する。Ｎ末端モノペグ化ＩＬ−１１を高純度で単離するために、様々なカチオン交換樹脂を試験した。特に、高空隙率樹脂（例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰ）は、分解能を保持しつつ高い容量を提供し、高いロード条件でモノペグ化標的の高い純度および収率を提供した。精製プロセスは、１０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下で２モル比のアルデヒドで活性化された４０−ＫＤのＹ字型状ＰＥＧ試薬を含むリン酸ナトリウムｐＨ４．５〜５緩衝液中で５ｍｇ／ｍＬで調製された４００ｍｇのＩＬ−１１のバッチサイズで証明された。２Ｍのグリシンを添加し、続いて４×体積の脱イオン水で希釈することによって、反応溶液をクエンチした。０．２μｍ膜でろ過した後、結果として得られた粗物質をＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰカラム（２．６（直径）×１０（高さ）ｃｍ上に約７．５ｍｇ／ｍＬ樹脂のローディング容量で）上にロードした。装填後、１０カラム体積を越える２０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５緩衝液でカラムを洗浄し、続いて２０カラム体積を越える０．１ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５緩衝液でさらに洗浄した。生成物を、次いで０．３ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５緩衝液で溶出させた。Ｉ４０ＮＹを単離する全体的な収率は２６．６％であった。Ｉ４０ＮＹの生成物純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび逆相ＨＰＬＣによって調べ、そして図１０は、レーン上に示すようなＩ４０ＮＹの量の銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でのＩ４０ＮＹの純度を示す。モノペグ化ＩＬ−１１の純度は、図１１で表示するクロマトグラムとしてＣ１８−ＨＰＬＣによって測定すると９３％よりも高かった。
【００７４】
皮下経路によりＩ４０ＮＹの薬物動態パラメータを測定するために、３匹のオスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに０．１５ｍｇ／ｋｇのペグ化ＩＬ−１１を単回皮下投与により注射した。図１２は、単回皮下投与後にラットにおける免疫反応性ＩＬ−１１の血漿濃度を示した。コンジュゲート化ＩＬ−１１の血漿濃度は約１２時間で最大レベルに達し、そして投与後５０時間にわたって有効なままであった。それに対して、組換えヒトＩＬ−１１は約２時間で最大濃度に達し、血漿中の排出半減期は約１．３時間であるので、循環血流から急速に除去された。皮下経路によるＩ４０ＮＹの薬物動態パラメータを下記表７にまとめた。
【００７５】
【表７】
2018508580.tif 000009
【００７６】
円二色性を用いてＩ４０ＮＹの二次構造を調査した。遠紫外領域で分析した円二色性のクロマトグラムにおいて、本発明者らは、図１３で重ね合わせた両スペクトルからわかるように、Ｉ４０ＮＹがその未結合対応物と同じ二次構造を維持することを証明した。さらに、Ｉ４０ＮＹの熱安定性は、熱応力に反応したそれらの二次構造（平均残基楕円率）の変化を測定することによって円二色性により証明した。図１４は、温度増加に反応してＩ４０ＮＹについてより少ない構造変化を示した。
【００７７】
骨髄抑制ラットにおけるＩ４０ＮＹの有効性を、カルボプラチンで治療したラットにおいても証明した。オスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに静脈内投与により４０ｍｇ／ｋｇのカルボプラチンを注射して、骨髄の機能障害を誘発して血小板減少症に至らしめた。ＩＬ−１１の毎日注射（連続７日）または同じ０．１５ｍｇ／ｋｇ投与量でＩ４０ＮＹの単回投与を使用した医学的介入を、２４時間のカルボプラチン治療の直後に皮下により施した。血小板レベルを図１５に示した。治療をしなければ、対象は約２日の重度の血小板減少症（正常な血小板数の１／３未満）を経験し、未治療の場合は命を脅かす内出血の危険が高いことを意味する。毎日投与の最悪状態は重度の血小板減少症の閾値に非常に近いので、ＩＬ−１１治療の有効性は低い。それに対して、Ｉ４０ＮＹの単回投与は、重度の血小板減少症の発生を予防するだけでなく、血小板数が最初の数に戻るのが他の２群よりも１．３日早かったので、血小板レベルの回復も加速した。
【００７８】
一方、ヘマトクリットの減少に対して示される副作用も骨髄抑制モデルにおいて調査した。図１６において、ＩＬ−１１での治療によって、未治療群と比較して、急速にヘマトクリットが減少した。しかしながら、Ｉ４０ＮＹの単回投与は最悪の状態を軽減し、このことは、ＩＬ−１１を毎日投与するよりも副作用が弱いことを示唆する。したがって、Ｉ４０ＮＹは、化学療法により誘発された重度の血小板減少症の予防において有効であることが証明された一方で、血漿増量の症候群を軽減することを理解すべきである。
【００７９】
Ｉ４０ＮＹとペグ化ＩＬ−１１の別の形態（ＵＳ８１３３４８０に記載するとおり、データは示さない）とのさらなる比較データにより、想定される化合物、特にＩ２０ＮＹおよびＩ４０ＮＹは、‘４８０特許で記載するペグ化ＩＬ−１１の他の形態と比較して、インビボ有効性を有意に向上し、および副作用の症候群を軽減していたことが明らかになる。
【００８０】
本明細書における発明の概念から逸脱することなく、すでに記載したものに加えて多くのさらなる改変が可能であることは、当業者には明らかである。したがって、発明の主題は、添付の特許請求の範囲を除いて限定されるものではない。さらに、明細書および特許請求の範囲の両方を解釈する際に、全ての語は、文脈と一致して可能な限り最も広義で解釈されるべきである。特に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓおよびｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、要素、成分、またはステップに非排他的に言及し、言及される要素、成分、またはステップが存在し得る、または利用し得る、または明らかに言及されていない他の要素、成分、もしくはステップと組み合わせ得ることを示すと解釈されるべきである。明細書の特許請求の範囲が、Ａ、Ｂ、Ｃ．．．．およびＮからなる群から選択されるもののうちの少なくとも１つについて言及する場合、本文は、Ａ＋Ｎ、またはＢ＋Ｎなどではなく、群から１つだけの要素を要求すると解釈されるべきである。
【図１】
2018508580.tif 000010
【図２】
2018508580.tif 000011
【図３】
2018508580.tif 000012
【図４】
2018508580.tif 000013
【図５】
2018508580.tif 000014
【図６】
2018508580.tif 000015
【図７】
2018508580.tif 000016
【図８】
2018508580.tif 000017
【図９】
2018508580.tif 000018
【図１０】
2018508580.tif 000019
【図１１】
2018508580.tif 000020
【図１２】
2018508580.tif 000021
【図１３】
2018508580.tif 000022
【図１４】
2018508580.tif 000023
【図１５】
2018508580.tif 000024
【図１６】
2018508580.tif 000025
【配列表】
2018508580000001.app
【国際調査報告】
2018508580.tif 000026
2018508580.tif 000027
2018508580.tif 000028