(57)【要約】本発明は、方法を提供し、この方法は、腸内毒素症を有する対象を治療し、この方法は、腸内毒素症を有する対象の腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルを決定することと、対象に、アシダミノコッカス・インテスティナリス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、バクテロイデス・オヴァタス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ブラウティア属種（Ｂｌａｕｔｉａ  ｓｐ．）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、コリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ユーバクテリウム・デスモランス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｓｍｏｌａｎｓ）、ユーバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ）、ユーバクテリウム・リモスム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）、ラクノスピラ・ペクチノシザ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ  ｐｅｃｔｉｎｏｓｈｉｚａ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、パラバクテロイデス・ディスタソニス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）、ロゼブリア・フェカリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ロゼブリア・インテスティナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、ルミノコッカス属種（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ルミノコッカス属種（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、及びルミノコッカス・トルクエス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｏｒｑｕｅｓ）からなる群から選択される、少なくとも１つの菌種を含む組成物を投与することにより、対象の腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルを、対象の腸内マイクロバイオームの第２の代謝プロファイルに変更することと、を含み、組成物が、腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルを腸内マイクロバイオームの第２の代謝プロファイルに変更するのに十分な、治療有効量で投与される。
2018526374.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸内毒素症を有する対象を治療する方法であって、前記方法が、
ａ．腸内毒素症を有する対象の腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルを決定することと、
ｂ．前記対象に、アシダミノコッカス・インテスティナリス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）１４ＬＧ、バクテロイデス・オヴァタス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ）５ＭＭ、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）２０ＭＲＳ、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ブラウティア属種（Ｂｌａｕｔｉａ  ｓｐ．）２７ＦＭ、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）２１ＦＡＡ、コリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）３ＦＭ４ｉ、ユーバクテリウム・デスモランス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｓｍｏｌａｎｓ）４８ＦＡＡ、ユーバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ）Ｆ１ＦＡＡ、ユーバクテリウム・リモスム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ）１３ＬＧ、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）４０ＦＡＡ、ラクノスピラ・ペクチノシザ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ  ｐｅｃｔｉｎｏｓｈｉｚａ）３４ＦＡＡ、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）２５ＭＲＳ、パラバクテロイデス・ディスタソニス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）５ＦＭ、ロゼブリア・フェカリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｆａｅｃａｌｉｓ）３９ＦＡＡ、ロゼブリア・インテスティナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）３１ＦＡＡ、ルミノコッカス属種（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）１１ＦＭ、ルミノコッカス属種（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、及びルミノコッカス・トルクエス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｏｒｑｕｅｓ）３０ＦＡＡからなる群から選択される、少なくとも１つの菌株を含む組成物を投与することにより、前記対象の前記腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルを、前記対象の腸内マイクロバイオームの第２の代謝プロファイルに変更することと、を含み、
前記組成物が、前記腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルを前記腸内マイクロバイオームの第２の代謝プロファイルに変更するのに十分な、治療有効量で投与され、
前記腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルが、前記腸内毒素症の結果であり、前記腸内マイクロバイオームの第２の代謝プロファイルが、前記腸内毒素症を有する前記対象を治療する、方法。
【請求項２】
前記組成物が、前記対象の腸内にコロニーを形成するのに十分な、治療有効量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物が、１６−６−Ｉ  ２１  ＦＡＡ  ９２％クロストリジウム・コクレアタム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｃｌｅａｔｕｍ）、１６−６−Ｉ  ２  ＭＲＳ  ９５％ブラウティア・ルティ（Ｂｌａｕｔｉａ  ｌｕｔｉ）、１６−６−Ｉ  ３４  ＦＡＡ  ９５％ラクノスピラ・ペクチノスチザ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ  ｐｅｃｔｉｎｏｓｃｈｉｚａ）、３２−６−Ｉ  ３０  Ｄ６  ＦＡＡ  ９６％クロストリジウム・グリシルリジニリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎｉｌｙｔｉｃｕｍ）、及び３２−６−Ｉ  ２８  Ｄ６  ＦＡＡ  ９４％クロストリジウム・ラクタチフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌａｃｔａｔｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）からなる群から選択される、少なくとも１つの菌株を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記腸内毒素症が、胃腸炎に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記胃腸炎が、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、憩室疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、及び不確定大腸炎からなる群から選択される、少なくとも１つの疾患の結果である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記腸内毒素症が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記腸内毒素症が、食中毒である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記腸内毒素症が、化学療法関連腸内毒素症である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
腸内毒素症を有する対象を治療する方法であって、前記方法が、
ａ．腸内毒素症を有する対象の腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルを決定することと、
ｂ．前記対象に、アシダミノコッカス・インテスティナリス、バクテロイデス・オヴァタス、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ブラウティア属種、クロストリジウム属種、コリンセラ・アエロファシエンス、エシェリキア・コリ、ユーバクテリウム・デスモランス、ユーバクテリウム・エリゲンス、ユーバクテリウム・リモスム、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ、ラクノスピラ・ペクチノシザ、ラクトバチルス・カゼイ、パラバクテロイデス・ディスタソニス、ロゼブリア・フェカリス、ロゼブリア・インテスティナリス、ルミノコッカス属種、ルミノコッカス属種、及びルミノコッカス・トルクエスからなる群から選択される、少なくとも１つの菌種を含む組成物を投与することにより、前記対象の前記腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルを、前記対象の腸内マイクロバイオームの第２の代謝プロファイルに変更することと、を含み、
前記組成物が、前記腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルを前記腸内マイクロバイオームの第２の代謝プロファイルに変更するのに十分な、治療有効量で投与され、
前記腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルが、前記腸内毒素症の結果であり、前記腸内マイクロバイオームの第２の代謝プロファイルが、前記腸内毒素症を有する前記対象を治療する、方法。
【請求項１０】
前記組成物が、前記対象の腸内にコロニーを形成するのに十分な、治療有効量で投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が、クロストリジウム・コクレアタム、ブラウティア・ルティ、ラクノスピラ・ペクチノスチザ、クロストリジウム・グリシルリジニリチカム、及びクロストリジウム・ラクタチフェルメンタンスからなる群から選択される、少なくとも１つの菌種を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記腸内毒素症が、胃腸炎に関連する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記胃腸炎が、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、憩室疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、及び不確定大腸炎からなる群から選択される、少なくとも１つの疾患の結果である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記腸内毒素症が、クロストリジウム・ディフィシル感染症である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記腸内毒素症が、食中毒である、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記腸内毒素症が、化学療法関連腸内毒素症である、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮出願、２０１５年８月２４日に出願され、「ＯＰＴＩＭＩＺＩＮＧ  ＳＴＯＯＬ  ＳＵＢＳＴＩＴＵＴＥ  ＴＲＡＮＳＰＬＡＮＴ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＥＲＡＤＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＣＬＯＳＴＲＩＤＩＵＭ  ＤＩＦＦＩＣＩＬＥ  ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ  ＵＳＩＮＧ  ＷＨＯＬＥ  ＧＥＮＯＭＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ」の表題が付いた、米国特許出願第６２／２０９，１４９号の優先権を主張し、その全体がすべての目的で本明細書に参照により組み入れられる。
【０００２】
本発明の分野は、胃腸障害を治療するための療法に関する。特に、本発明は、胃腸障害を治療するための療法として使用される糞便由来細菌集団を含む組成物を特徴付けるためのシステム及び方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は、ヒト腸内でのその過多が毒素の産生及びクロストリジウム・ディフィシル感染症（ＣＤＩ）という大腸炎症状を引き起こす、毒素産生性グラム陽性桿菌である。ＣＤＩは、すべての抗生物質関連下痢症例の１５〜２５％を占める、胃腸管の日和見細菌性疾患である。ヒト腸内の生態学的な細菌の均衡を崩す、広域全身性抗微生物薬の使用の増加によって、ＣＤＩは、医療分野において増え続ける合併症となっている。
【０００４】
ＣＤＩは、１０〜１４日間、メトロニダゾールまたは経口バンコマイシンで治療される。しかしながら、治療を受ける患者の５％〜３５％が再発する。再発性ＣＤＩ（ＲＣＤＩ）は、適切な療法によりＣＤＩが完全に治癒し、治療を終了した後、感染症が再発することと定義される。医療コミュニティでは、ＲＣＤＩは、必ずしも病原体そのものではなく、正常な腸内細菌を再構築することができないことによっても引き起こされると広く考えられている。
【０００５】
糞便由来細菌集団を含む組成物は、ＣＤＩ、及び腸内毒素症を引き起こす他の原因を治療するのに使用され得る。
【０００６】
本発明は、いくつかの図全体を通して同様の構造が同様の記号により示される、添付の図面を参照してさらに説明される。示されている図面は、必ずしも縮尺通りではなく、それよりも本発明の原理を説明することを通常は重視している。さらに、いくつかの特徴は、特定の要素を詳細に示すために誇張される場合がある。
【０００７】
また、図面に示されているいずれの測定値、仕様等も、制限ではなく、例示を目的としている。したがって、本明細書において開示されている特定の構造的及び機能的詳細は、限定的ではなく、当業者に本発明をさまざまに使用することを教示するための、単に代表的なものとして解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる配列比較を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる配列比較を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる配列比較を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる配列比較を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる配列比較を示す。
【図１Ｆ】図１Ｆは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる配列比較を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる配列アラインメント図を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる配列アラインメント図を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる配列アラインメント図を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる配列アラインメント図を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる配列アラインメント図を示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる配列アラインメント図を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる比較のために使用されるいくつかの散布図を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる比較のために使用されるいくつかの散布図を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる比較のために使用されるいくつかの散布図を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる種の一致を確認するためのいくつかの比較を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる種の一致を確認するためのいくつかの比較を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる種の一致を確認するためのいくつかの比較を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる種の一致を確認するためのいくつかの比較を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイを確認するのに使用されるＫＥＧＧパスウェイマップを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイを確認するのに使用されるＫＥＧＧパスウェイマップを示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイを確認するのに使用されるＫＥＧＧパスウェイマップを示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイを確認するのに使用されるＫＥＧＧパスウェイマップを示す。
【図５Ｅ】図５Ｅは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイを確認するのに使用されるＫＥＧＧパスウェイマップを示す。
【図５Ｆ】図５Ｆは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイを確認するのに使用されるＫＥＧＧパスウェイマップを示す。
【図５Ｇ】図５Ｇは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイを確認するのに使用されるＫＥＧＧパスウェイマップを示す。
【図５Ｈ】図５Ｈは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイを確認するのに使用されるＫＥＧＧパスウェイマップを示す。
【図６Ａ】図６Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる１つ以上の種の代謝パスウェイマップを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる１つ以上の種の代謝パスウェイマップを示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる１つ以上の種の代謝パスウェイマップを示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる１つ以上の種の代謝パスウェイマップを示す。
【図６Ｅ】図６Ｅは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる１つ以上の種の代謝パスウェイマップを示す。
【図６Ｆ】図６Ｆは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる１つ以上の種の代謝パスウェイマップを示す。
【図６Ｇ】図６Ｇは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる１つ以上の種の代謝パスウェイマップを示す。
【図６Ｈ】図６Ｈは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる１つ以上の種の代謝パスウェイマップを示す。
【図７Ａ】図７Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。
【図７Ｅ】図７Ｅは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。
【図７Ｆ】図７Ｆは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。
【図７Ｇ】図７Ｇは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。
【図７Ｈ】図７Ｈは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。
【図７Ｉ】図７Ｉは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。
【図７Ｊ】図７Ｊは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。
【図７Ｋ】図７Ｋは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。
【図７Ｌ】図７Ｌは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。
【図７Ｍ】図７Ｍは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。
【図７Ｎ】図７Ｎは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。
【図７Ｏ】図７Ｏは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。
【図７Ｐ】図７Ｐは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。
【図７Ｑ】図７Ｑは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。
【図８Ａ】図８Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる２２の種を比較するためのパスウェイマップを示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる２２の種を比較するためのパスウェイマップを示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる２２の種を比較するためのパスウェイマップを示す。
【図８Ｄ】図８Ｄは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる２２の種を比較するためのパスウェイマップを示す。
【図８Ｅ】図８Ｅは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる２２の種を比較するためのパスウェイマップを示す。
【図８Ｆ】図８Ｆは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる２２の種を比較するためのパスウェイマップを示す。
【図８Ｇ】図８Ｇは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる２２の種を比較するためのパスウェイマップを示す。
【図８Ｈ】図８Ｈは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる２２の種を比較するためのパスウェイマップを示す。
【図９】図９は、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる単一段階ケモスタット容器を示す。
【図１０】図１０は、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる単一段階ケモスタット容器を示す。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
いくつかの実施形態では、本発明は、腸内毒素症を有する対象を治療する方法であって、その方法が、腸内毒素症を有する対象の腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルを決定することと、対象に、アシダミノコッカス・インテスティナリス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）１４ＬＧ、バクテロイデス・オヴァタス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ）５ＭＭ、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）２０ＭＲＳ、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ブラウティア属種（Ｂｌａｕｔｉａ  ｓｐ．）２７ＦＭ、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）２１ＦＡＡ、コリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）３ＦＭ４ｉ、ユーバクテリウム・デスモランス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｓｍｏｌａｎｓ）４８ＦＡＡ、ユーバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ）Ｆ１ＦＡＡ、ユーバクテリウム・リモスム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ）１３ＬＧ、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）４０ＦＡＡ、ラクノスピラ・ペクチノシザ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ  ｐｅｃｔｉｎｏｓｈｉｚａ）３４ＦＡＡ、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）２５ＭＲＳ、パラバクテロイデス・ディスタソニス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）５ＦＭ、ロゼブリア・フェカリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｆａｅｃａｌｉｓ）３９ＦＡＡ、ロゼブリア・インテスティナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）３１ＦＡＡ、ルミノコッカス属種（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）１１ＦＭ、ルミノコッカス属種（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、及びルミノコッカス・トルクエス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｏｒｑｕｅｓ）３０ＦＡＡからなる群から選択される、少なくとも１つの菌株を含む組成物を投与することにより、対象の腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルを、対象の腸内マイクロバイオームの第２の代謝プロファイルに変更することと、を含み、組成物が、腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルを腸内マイクロバイオームの第２の代謝プロファイルに変更するのに十分な、治療有効量で投与され、腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルが、腸内毒素症の結果であり、腸内マイクロバイオームの第２の代謝プロファイルが、腸内毒素症を有する対象を治療する、方法を提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、組成物は、対象の腸内にコロニーを形成するのに十分な、治療有効量で投与される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、組成物は、１６−６−Ｉ  ２１  ＦＡＡ  ９２％クロストリジウム・コクレアタム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｃｌｅａｔｕｍ）、１６−６−Ｉ  ２  ＭＲＳ  ９５％ブラウティア・ルティ（Ｂｌａｕｔｉａ  ｌｕｔｉ）、１６−６−Ｉ  ３４  ＦＡＡ  ９５％ラクノスピラ・ペクチノスチザ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ  ｐｅｃｔｉｎｏｓｃｈｉｚａ）、３２−６−Ｉ  ３０  Ｄ６  ＦＡＡ  ９６％クロストリジウム・グリシルリジニリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎｉｌｙｔｉｃｕｍ）、及び３２−６−Ｉ  ２８  Ｄ６  ＦＡＡ  ９４％クロストリジウム・ラクタチフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌａｃｔａｔｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）からなる群から選択される、少なくとも１つの菌株を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本発明は、腸内毒素症を有する対象を治療する方法であって、その方法が、腸内毒素症を有する対象の腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルを決定することと、対象に、アシダミノコッカス・インテスティナリス、バクテロイデス・オヴァタス、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ブラウティア属種、クロストリジウム属種、コリンセラ・アエロファシエンス、エシェリキア・コリ、ユーバクテリウム・デスモランス、ユーバクテリウム・エリゲンス、ユーバクテリウム・リモスム、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ、ラクノスピラ・ペクチノシザ、ラクトバチルス・カゼイ、パラバクテロイデス・ディスタソニス、ロゼブリア・フェカリス、ロゼブリア・インテスティナリス、ルミノコッカス属種、ルミノコッカス属種、及びルミノコッカス・トルクエスからなる群から選択される、少なくとも１つの菌種を含む組成物を投与することにより、対象の腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルを、対象の腸内マイクロバイオームの第２の代謝プロファイルに変更することと、を含み、組成物が、腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルを腸内マイクロバイオームの第２の代謝プロファイルに変更するのに十分な、治療有効量で投与され、腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルが、腸内毒素症の結果であり、腸内マイクロバイオームの第２の代謝プロファイルが、腸内毒素症を有する対象を治療する、方法を提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、組成物は、対象の腸内にコロニーを形成するのに十分な、治療有効量で投与される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、組成物は、クロストリジウム・コクレアタム、ブラウティア・ルティ、ラクノスピラ・ペクチノスチザ、クロストリジウム・グリシルリジニリチカム、及びクロストリジウム・ラクタチフェルメンタンスからなる群から選択される、少なくとも１つの菌種を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、腸内毒素症は、胃腸炎に関連する。いくつかの実施形態では、胃腸炎は、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、憩室疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、または不確定大腸炎である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、腸内毒素症は、クロストリジウム・ディフィシル感染症である。いくつかの実施形態では、腸内毒素症は、食中毒である。いくつかの実施形態では、腸内毒素症は、化学療法関連腸内毒素症である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
開示されている利益及び改良の中で、本発明の他の目的及び利点は、添付の図面と併せて下記の説明から明らかとなるだろう。本発明の詳細な説明は、本明細書において開示されているが、開示されている実施形態は、さまざまな形態で具現化され得る本発明の単なる例示であることが理解されるべきである。また、本発明のさまざまな実施形態に関連して与えられる例の各々は、制限ではなく、例示を目的としている。
【００１８】
説明全体を通して、下記の用語は、特に文脈で明らかな指示がない限り、本明細書において明示的に関連した意味をとる。本明細書において使用されている「１つの実施形態では」及び「いくつかの実施形態では」という句は、必ずしも同じ実施形態を指すわけではないが、そうであってもよい。さらに、本明細書において使用されている「別の実施形態では」及び「いくつかの他の実施形態では」という句は、必ずしも異なる実施形態を指すわけではないが、そうであってもよい。よって、下に記載されているように、本発明のさまざまな実施形態は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、容易に組み合わされ得る。
【００１９】
また、本明細書において使用されている「または」という用語は、包括的「ｏｒ」演算子であり、特に文脈で明らかな指示がない限り、「及び／または」という用語に等しい。「に基づく」という用語は、排他的ではなく、特に文脈で明らかな指示がない限り、記載されていない追加の要素に基づくことを可能にする。また、明細書全体を通して、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味は、複数の参照物を含む。「ｉｎ」の意味は、「ｉｎ」及び「ｏｎ」を含む。
【００２０】
本明細書において使用されている「腸内毒素症」という用語は、対象の腸内マイクロバイオームの不均衡を指す。
【００２１】
本明細書において使用されている「マイクロバイオーム」という用語は、コミュニティ中のすべての微生物を指す。非限定的な例として、ヒト腸内マイクロバイオームは、ヒトの腸内のすべての微生物を含む。
【００２２】
本明細書において使用されている「化学療法関連腸内毒素症」という用語は、対象の腸内マイクロバイオームの不均衡をもたらす、対象者の特定の疾患を標的として使用されるいずれかの介入を指す。
【００２３】
本明細書において使用されている「糞便細菌療法」という用語は、ドナーの便がレシピエントの腸内に注入され、正常細菌マイクロバイオータを再構築する治療を指す。糞便細菌療法は、予備研究において、これまでに発表された１００件の症例中９０％近い成功率で、有望な結果を示している。理論により縛られることなく、これは、反復的な抗生物質使用のサイクルを断ち、Ｃ・ディフィシルの成長を抑制する均衡のとれた生態系を再構築することによって作用すると考えられている。
【００２４】
本明細書において使用されている「キーストーン種」という用語は、ヒト便試料中に一貫して見られる細菌の種である。
【００２５】
本明細書において使用されている「ＯＴＵ」という用語は、これに限定されないが、１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含む、核酸配列における類似性を介して種、または種の群を定義する、操作的分類単位を指す。
【００２６】
糞便由来細菌集団
いくつかの実施形態では、本発明は、腸内毒素症を有する対象を治療する方法であって、その方法が、腸内毒素症を有する対象の腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルを決定することと、対象に、アシダミノコッカス・インテスティナリス１４ＬＧ、バクテロイデス・オヴァタス５ＭＭ、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス２０ＭＲＳ、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ブラウティア属種２７ＦＭ、クロストリジウム属種２１ＦＡＡ、コリンセラ・アエロファシエンス、エシェリキア・コリ３ＦＭ４ｉ、ユーバクテリウム・デスモランス４８ＦＡＡ、ユーバクテリウム・エリゲンスＦ１ＦＡＡ、ユーバクテリウム・リモスム１３ＬＧ、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ４０ＦＡＡ、ラクノスピラ・ペクチノシザ３４ＦＡＡ、ラクトバチルス・カゼイ２５ＭＲＳ、パラバクテロイデス・ディスタソニス５ＦＭ、ロゼブリア・フェカリス３９ＦＡＡ、ロゼブリア・インテスティナリス３１ＦＡＡ、ルミノコッカス属種１１ＦＭ、ルミノコッカス属種、及びルミノコッカス・トルクエス３０ＦＡＡからなる群から選択される、少なくとも１つの菌株を含む組成物を投与することにより、対象の腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルを、対象の腸内マイクロバイオームの第２の代謝プロファイルに変更することと、を含み、組成物が、腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルを腸内マイクロバイオームの第２の代謝プロファイルに変更するのに十分な、治療有効量で投与され、腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルが、腸内毒素症の結果であり、腸内マイクロバイオームの第２の代謝プロファイルが、腸内毒素症を有する対象を治療する、方法を提供する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、組成物は、対象の腸内にコロニーを形成するのに十分な、治療有効量で投与される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、組成物は、１６−６−Ｉ  ２１  ＦＡＡ  ９２％クロストリジウム・コクレアタム、１６−６−Ｉ  ２  ＭＲＳ  ９５％ブラウティア・ルティ、１６−６−Ｉ  ３４  ＦＡＡ  ９５％ラクノスピラ・ペクチノスチザ、３２−６−Ｉ  ３０  Ｄ６  ＦＡＡ  ９６％クロストリジウム・グリシルリジニリチカム、及び３２−６−Ｉ  ２８  Ｄ６  ＦＡＡ  ９４％クロストリジウム・ラクタチフェルメンタンスからなる群から選択される、少なくとも１つの菌株を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本発明は、腸内毒素症を有する対象を治療する方法であって、その方法が、腸内毒素症を有する対象の腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルを決定することと、対象に、アシダミノコッカス・インテスティナリス、バクテロイデス・オヴァタス、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ブラウティア属種、クロストリジウム属種、コリンセラ・アエロファシエンス、エシェリキア・コリ、ユーバクテリウム・デスモランス、ユーバクテリウム・エリゲンス、ユーバクテリウム・リモスム、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ、ラクノスピラ・ペクチノシザ、ラクトバチルス・カゼイ、パラバクテロイデス・ディスタソニス、ロゼブリア・フェカリス、ロゼブリア・インテスティナリス、ルミノコッカス属種、ルミノコッカス属種、及びルミノコッカス・トルクエスからなる群から選択される、少なくとも１つの菌種を含む組成物を投与することにより、対象の腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルを、対象の腸内マイクロバイオームの第２の代謝プロファイルに変更することと、を含み、組成物が、腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルを腸内マイクロバイオームの第２の代謝プロファイルに変更するのに十分な、治療有効量で投与され、腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルが、腸内毒素症の結果であり、腸内マイクロバイオームの第２の代謝プロファイルが、腸内毒素症を有する対象を治療する、方法を提供する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、組成物は、対象の腸内にコロニーを形成するのに十分な、治療有効量で投与される。
【００３１】
いくつかの実施形態では、組成物は、クロストリジウム・コクレアタム、ブラウティア・ルティ、ラクノスピラ・ペクチノスチザ、クロストリジウム・グリシルリジニリチカム、及びクロストリジウム・ラクタチフェルメンタンスからなる群から選択される、少なくとも１つの菌種を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、腸内毒素症は、胃腸炎に関連する。いくつかの実施形態では、胃腸炎は、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、憩室疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、または不確定大腸炎である。
【００３３】
いくつかの実施形態では、腸内毒素症は、クロストリジウム・ディフィシル感染症である。いくつかの実施形態では、腸内毒素症は、食中毒である。いくつかの実施形態では、腸内毒素症は、化学療法関連腸内毒素症である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細菌種は、その全体が本明細書に参照により組み入れられる、‘Ｓｔｏｏｌ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：‘ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｕｔ’，ｂｙ  Ｐｅｔｒｏｆ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）において開示されている。
【００３５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細菌種は、その全体が本明細書に参照により組み入れられる、Ｋｕｒｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｃｏｍｍｏｎｌｙ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｅｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅｓ”，（２００７）ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４：１６９−１８１において開示されている。
【００３６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細菌種は、米国特許出願公開第２０１５／００４４１７３号において開示されている。あるいは、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細菌種は、米国特許出願第２０１４／０３６３３９７号において開示されている。あるいは、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細菌種は、米国特許出願第２０１４／００８６８７７号において開示されている。あるいは、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細菌種は、米国特許第８，９０６，６６８号において開示されている。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、Ｔａｋａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）“Ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｂａｔｃｈ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｓｉｍｕｌａｔｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ”ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  １１（８）：ｅ０１６０５３３において開示されている方法に従って少なくとも１つの細菌を評価することを含むことができる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細菌種は、健康な患者から誘導される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細菌種は、米国特許出願公開第２０１４／０３４２４３８号において開示されている方法に従って健康な患者から誘導される。
【００３９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細菌種及び／または株は、患者から、
ａ．排泄されたての便試料を入手し、試料を嫌気性チャンバ（９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、及び５％Ｈ２の雰囲気中）に配置することと、
ｂ．便試料をバッファに浸軟させることにより、糞便スラリーを生成することと、
ｃ．遠心分離により食品粒子を除去し、浮遊物を保持することと、を含む、方法により誘導される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、米国公開第２０１４／０３４２４３８号の方法に従って、浮遊物を使用し、ケモスタットに播種する。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態に従った培養方法
【００４２】
腸内毒素症を有する対象の腸内マイクロバイオームの第１の代謝プロファイルを決定する方法の有効性は、例えば、方法の感度のような要素により限定され得る（すなわち、方法は、特定の細菌株が閾値レベルを超えて存在する場合のみ、その株を検出することができる）。
【００４３】
腸内マイクロバイオームの第２の代謝プロファイルを決定する方法の有効性は、例えば、方法の感度のような要素により限定され得る（すなわち、方法は、特定の細菌株が閾値レベルを超えて存在する場合のみ、その株を検出することができる）。
【００４４】
いくつかの実施形態では、閾値レベルは、検出方法の感度に依存している。よって、いくつかの実施形態では、検出方法の感度に応じて、対象に十分にコロニーが形成されているかを決定するのに、より大きな量の少なくとも１つの細菌種が必要となる。
【００４５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細菌株は、ケモスタット容器中で培養される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細菌株は、アシダミノコッカス・インテスティナリス１４ＬＧ、バクテロイデス・オヴァタス５ＭＭ、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス２０ＭＲＳ、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ブラウティア属種２７ＦＭ、クロストリジウム属種２１ＦＡＡ、コリンセラ・アエロファシエンス、エシェリキア・コリ３ＦＭ４ｉ、ユーバクテリウム・デスモランス４８ＦＡＡ、ユーバクテリウム・エリゲンスＦ１ＦＡＡ、ユーバクテリウム・リモスム１３ＬＧ、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ４０ＦＡＡ、ラクノスピラ・ペクチノシザ３４ＦＡＡ、ラクトバチルス・カゼイ２５ＭＲＳ、パラバクテロイデス・ディスタソニス５ＦＭ、ロゼブリア・フェカリス３９ＦＡＡ、ロゼブリア・インテスティナリス３１ＦＡＡ、ルミノコッカス属種１１ＦＭ、ルミノコッカス属種、ルミノコッカス・トルクエス３０ＦＡＡ、及びこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択され、ケモスタット容器中で培養される。
【００４６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細菌株は、１６−６−Ｉ  ２１  ＦＡＡ  ９２％クロストリジウム・コクレアタム、１６−６−Ｉ  ２  ＭＲＳ  ９５％ブラウティア・ルティ、１６−６−Ｉ  ３４  ＦＡＡ  ９５％ラクノスピラ・ペクチノスチザ、３２−６−Ｉ  ３０  Ｄ６  ＦＡＡ  ９６％クロストリジウム・グリシルリジニリチカム、３２−６−Ｉ  ２８  Ｄ６  ＦＡＡ  ９４％クロストリジウム・ラクタチフェルメンタンス、及びこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択され、ケモスタット容器中で培養される。いくつかの実施形態では、ケモスタット容器は、米国特許出願公開第２０１４／０３４２４３８号において開示されている容器である。ある実施形態では、ケモスタット容器は、図９及び１０において記載されている容器である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ケモスタット容器は、凝縮器を遮断し、窒素ガスを培養物に通して発泡させることにより、発酵系からケモスタットに変換された。いくつかの実施形態では、圧力は、廃棄物を設定された高さで金属管（以前は試料採取管）から押し出し、ケモスタット培養物の所定の作業体積の維持を可能にする。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ケモスタット容器は、濾過窒素ガスをケモスタット容器に通して発泡させることにより、嫌気的に保持される。いくつかの実施形態では、温度及び圧力は、自動的に制御及び維持される。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ケモスタット培養物の培養ｐＨは、５％（体積／体積）ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）及び５％（重量／体積）ＮａＯＨ（Ｓｉｇｍａ）を使用して維持される。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ケモスタット容器の培地は頻繁に交換される。いくつかの実施形態では、交換は、遠位腸内の滞留時間に等しい一定の時間にわたって行われる。結果として、いくつかの実施形態では、培地は、４００ｍＬ／日（１６．７ｍＬ／時間）の割合で連続的にケモスタット容器に供給され、遠位腸内の滞留時間を模倣するように設定された値である２４時間の滞留時間が得られる。代替の滞留時間は、６５時間（約１４８ｍＬ／日、６．２ｍＬ／時間）とすることができる。いくつかの実施形態では、滞留時間は、１２時間と短くすることができる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、培地は、米国特許出願公開第２０１４／０３４２４３８号において開示されている培地である。
【００５２】
材料及び方法
ゲノム配列
【００５３】
この研究のデータは、３３の細菌株のドラフトゲノム配列（コンティグ形態）を含み、これは表４に開示されている。細菌ゲノムは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑプラットフォームを使用して配列決定された。種は、全長１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の比較による最も近い一致に従って名付けられ、細菌の真の種分化を反映しない場合があり、簡潔に第Ｉ部において使用される細菌には株Ａまたは株Ｂとは別の同一性が与えられており、表１はこれらの株の真の同定を提供する。
【００５４】
研究デザイン
【００５５】
この研究は３つの段階を含む。第１の段階は、どの株ペアがＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ研究（Ｐｅｔｒｏｆ  ｅｔ  ａｌ．）（「元のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅプロトタイプ」または「元のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系」とも称される）に含まれていたか、種のゲノムを比較することに重点を置いた。全長１６Ｓ配列アラインメントによりぴったりと一致した６つの種株ペアのゲノムを、冗長性を探すために比較した。これらの細菌の複数の株が、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系に含めるために、培養細菌における形態及び挙動の相違に基づき、まず選択された。プロジェクトのこの部分の目標は、複数の株の使用は冗長であったか、または生態的均衡の維持のために両方の株を含める生物学的必要性を確証する真の遺伝的な相違があるかを決定することであった。
【００５６】
プロジェクトの第２の段階は、ＫＥＧＧパスウェイの遺伝的カバレッジを決定するための広域なパイプラインを開発することに重点を置いた。ＫＥＧＧとは、京都遺伝子ゲノム百科事典を表し、パスウェイ解析に一般的に使用されているリソースであり、パスウェイ、遺伝子、ゲノム、化合物、及び反応情報に関連するデータを含有する。レポートの第ＩＩ部は、キーストーン細菌種及びパスウェイ、ならびに生化学的に冗長であり得る種を探して、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系全体のＫＥＧＧパスウェイを比較することに焦点を合わせる。
【００５７】
プロジェクトの第３の段階は、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅに含まれる細菌遺伝子が、高レベルの遺伝的冗長性なく、必要な生化学パスウェイの十分なカバレッジを提供するかを決定することに重点を置いた。レポートの第ＩＩＩ部は、「健康な」ヒトマイクロバイオームのそれと比較した、ＫＥＧＧパスウェイのＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅコミュニティ全体のカバレッジを示す。これは、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅコミュニティがヒト腸内の真のマイクロバイオータをどれくらい忠実に模倣するかを決定する、ＫＥＧＧパスウェイの全体的なカバレッジの調査を可能にした。
【００５８】
第Ｉ部：株ペア内の冗長性
方法
Ｍａｕｖｅアラインメント
元のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅプロトタイプ生態系は、２つの別の株を有する６つの細菌種、合計１２の細菌株を含んでいた。これらの６つの細菌種の両方の株についての全ゲノムデータを比較し、冗長性を試験した。ゲノムアラインメント可視化ツールＭａｕｖｅの漸進的Ｍａｕｖｅ機能を使用して、ゲノムのペアを整列及び比較した。得られたアラインメント骨格ファイルをＲにロードし、パッケージｇｅｎｏＰｌｏｔＲ（疑似コードが提供されている）を使用して、Ｍａｕｖｅにより提供されるものよりダイナミックな画像を作成した（図２）。アラインメント後、各種の株を、比較結果のさらなる解析を簡略化するために、株Ａまたは株Ｂのいずれかに割り当てた（表１）。
【００５９】
図２は、第Ｉ部において解析された６つの種についての株ペアのアラインメントを示し、Ｍａｕｖｅ及びＲパッケージｇｅｎｏＰｌｏｔＲを使用して作成された、Ｍａｕｖｅアラインメントの配列アラインメント図を示す。図２Ａは、株Ａ対株Ｂのビフィドバクテリウム・アドレッセンティス配列比較を示す。図２Ｂは、株Ａ対株Ｂのビフィドバクテリウム・ロンガム配列比較を示す。図２Ｃは、株Ａ対株Ｂのドレア・ロンギカテナ配列比較を示す。図２Ｄは、株Ａ対株Ｂのラクトバチルス・カゼイ配列比較を示す。図２Ｅは、株Ａ対株Ｂのルミノコッカス・トルクエス配列比較を示す。図２Ｆは、株Ａ対株Ｂのルミノコッカス・オベウム配列比較を示す。
【００６０】
表１は、特に株ペア内の冗長性を決定する、第Ｉ部についての株指定を示す。６つの種のペアワイズ比較の各々について株Ａ及び株Ｂと称される株の同定について、２つの株は元のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系に含まれていた。表中の名称はＲＡＳＴサーバー上で与えられる名称を示し、括弧内の数字はＲＡＳＴゲノムＩＤ番号を示す。
【００６１】
【表１】
2018526374.tif 000003
【００６２】
ＳＥＥＤビューアを使用する比較
この解析において使用されるドラフトゲノムは、以前アノテートされ、ＲＡＳＴサーバー上に保存されていた。ＲＡＳＴは、サブシステムベースのアノテーションを使用し、これは、タンパク質コード化、ｒＲＮＡ、及びｔＲＮＡ遺伝子を同定し、機能を遺伝子に割り当て、ゲノムにおいてどのサブシステムが示されるかを予測し、この情報を使用して代謝ネットワークを再構築する。サブシステムは、共に特定の生物学的プロセスまたは構造的複合体を実現する、機能的役割の集合体として定義される。サブシステムベースのアプローチは、ハイスループットアノテーション技術における精度向上への鍵は、一人のアノテーション熟練者に単一のゲノム中のすべての遺伝子をアノテートしようとさせるのではなく、複数の熟練者にゲノムの完全な集合体にわたる単一のサブシステムを各々アノテートさせることであるという原理に基づく。アノテートされたゲノムは、比較解析をサポートするＳＥＥＤ環境中に維持される。ゲノムペアアラインメント及び可視化後、各株ペアの機能及び配列比較は、ＲＡＳＴサーバーを通してアクセスされるＳＥＥＤビューアを使用して完了した。
【００６３】
機能比較を使用し、アノテートされたドラフト配列を使用してサブシステムベースの相違を確認した。提供される機能比較出力は、どのサブシステムが共有され、どれが一方の株のみに固有であったかを示す、確認されたサブシステムの表で構成される。６つの比較の各々の結果を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌにおいてタブ区切り形式の表にエクスポートし、考察した。次に、ＳＥＥＤビューアを使用して、タンパク質配列同一性を調査し、平均遺伝的類似性を決定し、配列比較を完了した。画像出力は、グラフィックス・インターチェンジ・フォーマット（ｇｉｆ）でダウンロードし、この比較のテキスト形式の結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌにおいてタブ区切り形式の表としてエクスポートし、考察した。タンパク質配列同一性を、仮想タンパク質データを含む場合及び含まない場合の両方で調査した。異なる株が使用された場合に結果がわずかに異なったため、配列比較は、参照としての株Ａ及び参照としての株Ｂの両方を使用して完了した。可能な場合、株は、タンパク質配列類似性を同じ属または種内の他の細菌株において見られるものと比較するために、入手可能な最も近い分類学的近隣種とも比較した（図４）。データは、ゲノムサイズ及びコンティグ数が、配列比較の結果において交絡因子となり得ることを示した。これを、Ｒでの線形モデルを使用して調査した。表６中のデータを、コンマ区切り形式のファイルとして保存し、Ｒにロードした。２つの線形モデルを当てはめ、平均タンパク質配列同一性をゲノムサイズ及びコンティグ数と比較した（疑似コードが提供されている）。
【００６４】
図４は、入手可能な最も近い種の一致についてのＳＥＥＤビューア配列比較図を示す。図４Ａは、参照ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス株Ａ対株Ｂ（外輪）及びビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（１６８０．３）（内円）の比較を示す。図４Ｂは、ビフィドバクテリウム・ロンガム株Ａ対株Ｂ（外輪）及びビフィドバクテリウム・ロンガムＤｊＯ１０Ａ（内輪）の配列比較を示す。図４Ｃは、ドレア・ロンギカテナ株Ａ対株Ｂ（外輪）、ドレア・フォルミシゲネランス（Ｄｏｒｅａ  ｆｏｒｍｉｃｉｇｅｎｅｒａｎｓ）ＡＴＣＣ２７７５５（中輪）、及びドレア・ロンギカテナＤＳＭ１３８１４（内輪）の配列比較を示す。図４Ｄは、ラクトバチルス・カゼイ株Ｂ対ラクトバチルス・カゼイ株Ａ（外輪）、ラクトバチルス・カゼイＡＴＣＣ３３４（中輪）、及びラクトバチルス・カゼイＢＬ２３（内輪）の配列比較を示す。ＳＥＥＤビューア上での比較目的に公然と利用可能なルミノコッカス属種はなかった。
【００６５】
表６は、株ペア内の冗長性を示す、第Ｉ部において解析された株についての要約統計を示す。表６は、塩基対数でのゲノムサイズ、使用されるドラフト配列中のコンティグ数、全長１６Ｓ配列アラインメントに基づく最も近い一致に対する類似性パーセント（ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ原著論文から推測）、ＳＥＥＤビューアを使用して確認されるサブシステム、コード配列、及びＲＮＡの合計数、ならびにＳＥＥＤビューアから得られるデータを使用してＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌにおいて計算される平均タンパク質配列同一性パーセントを含む（挙げられている株は、株ペアの比較のための参照株である）。
【００６６】
【表２】
2018526374.tif 000004
【００６７】
ＫＥＧＧパスウェイ解析
ＫＡＡＳ（ＫＥＧＧ自動アノテーションサーバー）を使用し、ＫＥＧＧ  ＧＥＮＥＳデータベース中の手動でキュレートされたオーソロググループのセットに対するＢＬＡＳＴ比較により、ドラフトゲノム（コンティグ）中の遺伝子の機能アノテーションを提供した。第Ｉ部において調査された１２のゲノムについてのアミノ酸ＦＡＳＴＡファイルをＫＡＡＳにアップロードし、ドラフトゲノムデータについて推奨されている、原核生物遺伝子データセット及び双方向ベストヒット割り当て法を使用してアノテートした。結果は、ＫＥＧＧオーソロジー（ＫＯ）割り当て及び自動生成されたＫＥＧＧパスウェイを含有する。ＫＯ割り当て（ＫＯ  ＩＤ）のリストをダウンロードし、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌにおいて比較した。株ペア間で共有されるＫＯ  ＩＤのリスト及び一方の株のみに特異的なＫＯ  ＩＤのリストを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌスプレッドシート表を使用して作成した。次にこれらのリストを使用し、ＫＥＧＧオーソロジー割り当ての複製物の数と一致した太さ、及びＩＤが共有されているかどうかにより決定された色（緑は共有、赤は株Ａ、青は株Ｂ）で、ＫＯ  ＩＤの最終リストを作成した。最終リスト（６つの種の各々に１つ）を次にプログラムｉＰａｔｈ２．０：インタラクティブ・パスウェイ・エクスプローラにインポートした。ｉＰａｔｈは、各種パスウェイマップの可視化、解析、及びカスタマイズのためのウェブベースのツールである。現行バージョンは、１４６ＫＥＧＧパスウェイを使用して構築され、生物系における完全な代謝の概要をもたらす代謝パスウェイのマップ、２２ＫＥＧＧ制御パスウェイを含む制御パスウェイマップ、及び５８ＫＥＧＧパスウェイを含有する二次代謝物の生合成マップを含む、３つの異なる包括的な概要マップを提供する。
【００６８】
作成されたＫＯ  ＩＤのリストを、マッピング前に、ｉＰａｔｈ２．０により使用される内部リストと一致させ、ｉＰａｔｈ２．０はマッピングプログラムにおいて利用可能なすべてのＫＯ  ＩＤを含むわけではないため、これによっていくつかのＫＯ  ＩＤが除去された。次に一致リストを使用し、６つの株比較の各々についてカスタムマップを作成した。異なる色または太さを有するＫＯ  ＩＤが同じパスウェイに含まれた競合のリストを、各株比較についてのマッピングプロセスを通して自動的に作成した。ｉＰａｔｈ２．０プログラムは、ランダム選択により、これらの競合を自動的に解決する。この解決方法はこの研究デザインにとっては理想的ではなく、代わりに競合を手動で解決した。色の競合は、パスウェイが共有され、したがって固有のものではないことを意味したので、いずれの色競合も緑にするように解決した。いずれの太さの競合も、単一のＫＯ  ＩＤが同じ太さの複数のＫＯ  ＩＤと競合する場合、平均太さ（最も近い整数に切り上げ）または最も競合の少ない太さをとることにより解決した。固有のＫＯ  ＩＤの最終マップ及びリストを次に分析し、どのパスウェイが一方の株に固有であったか、及び冗長性が除去され得るかを決定した。
【００６９】
結果
Ｍａｕｖｅアラインメント
アラインメントは、コンティグ数及び種株間の類似性の良好な可視化を提供した。アラインメントの可視化に基づき、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス株及びラクトバチルス・カゼイ株は、非常に類似して見えた。アラインメント可視化はまた、ルミノコッカス・オベウム株が、調査された他の５つの種と比べて似ていないという、早期の指摘を示した。アラインメントの相違は、真の株の相違を反映し得るが、ゲノム再編成で現れる、コンティグの誤った配列順序の結果でもあり得る。アラインメント図を図２に示す。
【００７０】
ＳＥＥＤビューアを使用する機能比較
表２は、ＳＥＥＤビューア機能比較結果を示す。サブシステムアノテーションに基づく６つの異なる細菌種からの細菌株ペアの機能比較の要約であり、数字は、株Ｂではなく株Ａに存在すること、株Ａではなく株Ｂに存在すること、または両方の株に存在することが確認されたサブシステム役割の数、及び各々の種比較について確認されたサブシステム役割の合計数を示す。
【００７１】
【表３】
2018526374.tif 000005
【００７２】
２つの異なる株を有する６つの細菌種についての株ベアの機能比較によって、比較的に、３つの種における非常に高い機能的冗長性、２つの種における高い機能的冗長性、及び１つの種における低い機能的冗長性が明らかとなった。最高レベルの機能的冗長性は、サブシステムベースの比較方法を使用して、ラクトバチルス・カゼイのペアの比較において見られた。機能的サブシステムにおける唯一の相違は、株Ａではなく株Ｂに存在し、ラクトース及びガラクトース摂取に関与することが確認された（表３）。最低レベルの冗長性は、ルミノコッカス・オベウム株ペアの比較において見られ、広範囲のサブシステム及びカテゴリにわたって、機能的サブシステム役割における２４７の相違が確認された。ルミノコッカス・トルクエス及びビフィドバクテリウム・アドレッセンティス株の両ペアの比較は、それぞれ株間の５つ及び６つのみの相違、ならびに比較的に非常に高レベルの冗長性を明らかにした（表３）。ビフィドバクテリウム・ロンガムの株ペアの比較は、わずかに低い冗長性を示し、株Ａと株Ｂとの間の機能的サブシステム役割において１９の相違があり、そのうちの１４はビフィドバクテリウム・ロンガム株ＢではなくＡに存在し、５つは株ＡではなくＢに存在した。ドレア・ロンギカテナ株ペアの比較は、株ＢではなくＡに存在する８つのサブシステム役割、及び株ＡではなくＢに存在する１７のサブシステムを明らかにした。ビフィドバクテリウム・ロンガム及びドレア・ロンギカテナ株ペアについての機能的サブシステムの比較における相違の完全なリストを、表８に示す。
【００７３】
【表４−１】
2018526374.tif 000006
【表４−２】
2018526374.tif 000007
【表４−３】
2018526374.tif 000008
【００７４】
表８は、ＳＥＥＤビューア機能比較の要約を示す。（Ａ）は、ビフィドバクテリウム・ロンガムを示す。（Ｂ）は、ドレア・ロンギカテナを示す。ビフィドバクテリウム・ロンガム及びドレア・ロンギカテナについての株ＡとＢとの間のサブシステムベースの機能的相違の要約は、確認されたカテゴリ、サブカテゴリ、サブシステム、及び役割を示す。「ファージ、プロファージ、転移因子、及びプラスミド」という行で示された部分は、ファージ因子に関連する相違を示す。
【００７５】
表３は、ＳＥＥＤビューア機能比較の要約を示す。ラクトバチルス・カゼイ、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、及びルミノコッカス・トルクエスについての株ＡとＢとの間のサブシステムベースの機能的相違の要約は、確認されたカテゴリ、サブカテゴリ、サブシステム、及び役割を示す。灰色で強調された部分は、ファージ因子に関連する相違を示す。
【００７６】
【表５】
2018526374.tif 000009
【００７７】
留意すべき重要な要素は、比較において存在するファージ関連タンパク質及びファージに関連する役割の数の多さである（表３及び表８において灰色テキストで強調されている）。ファージ関連タンパク質は、ビフィドバクテリウム・ロンガム及びドレア・ロンギカテナの一方の株のみに存在し、役割は異なるが、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス及びルミノコッカス・オベウムの両方の株に存在した。これらの要素は、これらの株ペア間の相違を説明するのに役立ち得る。一方の株にファージが感染し、もう一方が影響を受けないままであった場合、または株に異なるファージが感染した場合、これは、この解析において報告されている遺伝子及び機能性における相違のいくつかを引き起こし得る。ファージは、重要な遺伝子水平伝播（ＨＧＴ）メディエータ、及びヒト腸内マイクロバイオームへの遺伝子導入のための重要なパスウェイであるため、これは株分岐の優れた説明である。
【００７８】
ＳＥＥＤビューアを使用する配列比較
【００７９】
その２つの株が元のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系に含まれていた細菌種の株ペアについての配列比較によって、機能比較に類似した結果が明らかとなった。調査された６つの種のうちの５つが、それらのタンパク質配列において高い〜非常に高い冗長性を示した。ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ドレア・ロンギカテナ、ラクトバチルス・カゼイ、及びルミノコッカス・トルクエスについての株ペアの比較は、すべて９５％以上の平均タンパク質配列同一性パーセントを示した（表７参照）。ルミノコッカス・オベウム株比較は、対照的に、仮想タンパク質が比較に含まれていたかどうか、及びどの株が参照株として使用されたかに応じて、４５〜６２％のかなり低い平均タンパク質配列同一性パーセントを有した。タンパク質配列間の相違は、同じ種の株Ａが参照として使用される場合の６つの種の各々についての株Ｂのタンパク質配列同一性パーセントを示す図１において、はっきりと可視化することができる。最初の５つの種は明らかに、同定されたタンパク質配列の大部分について９０％以上の範囲に含まれ、ルミノコッカス・オベウム株は５０〜６０％の範囲の近くに現れる。
【００８０】
表７は、タンパク質配列同一性パーセントに基づく６つの異なる細菌種からの細菌株のペアのＳＥＥＤビューア配列比較の要約を示し、括弧内の数字は、仮想タンパク質を除いた比較を示す。表は、同定されたタンパク質の合計数、双方向及び単方向ヒットの数、ヒットなし（０％）のタンパク質の合計数、完全配列一致（１００％）のタンパク質の合計数、タンパク質配列同一性が高い（９５％〜９９％）タンパク質の数、タンパク質配列同一性が低い（５０％以下、ヒットなしのものを含まない）タンパク質の数、ならびに平均タンパク質配列同一性パーセントを含む。（Ａ）は、参照株としての株Ａとの配列比較をまとめる。（Ｂ）は、参照株としての株Ｂとの配列比較をまとめる。
【００８１】
図１Ａ及び１Ｂは、株ペアについてのＳＥＥＤビューア配列比較図を示す。図は、参照配列としての株Ａと株Ｂとの間の比較を示す。Ａ）株Ａ対株Ｂのビフィドバクテリウム・アドレッセンティス配列比較。Ｂ）株Ａ対株Ｂのビフィドバクテリウム・ロンガム配列比較。Ｃ）株Ａ対株Ｂのドレア・ロンギカテナ配列比較。Ｄ）株Ａ対株Ｂのラクトバチルス・カゼイ配列比較。Ｅ）株Ａ対株Ｂのルミノコッカス・トルクエス配列比較。Ｆ）株Ａ対株Ｂのルミノコッカス・オベウム配列比較。
【００８２】
【表６】
2018526374.tif 000010
【００８３】
平均タンパク質同一性パーセント対ゲノムサイズ及びコンティグ数の比較のために当てはめられた線形モデルは、これらの因子の両方がＳＥＥＤ配列比較についての結果をある程度交絡し得ることを示した。ゲノムサイズ対平均タンパク質配列同一性パーセントの比較のための線形モデルは、０．００６のｐ値を有し、有意な線形関係を示した。コンティグ数と平均タンパク質配列同一性パーセントとの間の線形関係も、０．０１６のｐ値で有意であった。これらの関係を表す散布図を図３に示す。
【００８４】
図３は、Ｒを使用する比較のための散布図を示す。プロットを、下に示す疑似コードの変形を使用して、Ｒで作成した。
【００８５】
2018526374.tif 000011
【００８６】
図３Ａは、第Ｉ部において解析された１２の細菌ゲノムについてのゲノムサイズ対平均タンパク質配列同一性パーセントの散布図を示し、線は両者間の線形相関を示す。線形モデルは、０．００６１４４のｐ値を有する。図３Ｂは、第Ｉ部において解析された１２の細菌ゲノムについてのコンティグ数対平均タンパク質配列同一性パーセントの散布図を示し、線は両者間の線形相関を示す。線形モデルは、０．０１６２９のｐ値を有する。図３Ｃは、３３の細菌ゲノムすべてについてのゲノムサイズ対コンティグ数の散布図を示す。外れ値は、ユーバクテリウム・レクターレ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ）１８ＦＡＡであり、配列決定でエラーがあったように見える。
【００８７】
ＫＥＧＧパスウェイ解析
【００８８】
ＫＥＧＧパスウェイ結果は、ＳＥＥＤビューアを使用する機能及び配列比較の結果を確認した。ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスについてのＫＥＧＧオーソロジーの比較は、ｉＰａｔｈ２．０内部リストとのＩＤマッチング及び競合解決後、株Ｂに存在し、株Ａには存在しなかった、パスウェイにおける３つのみの重要な相違を明らかにした。ビフィドバクテリウム・ロンガムＫＥＧＧ比較は、株ＡとＢとの間のＫＯ  ＩＤにおける４０の相違をまず明らかにしたが、マッチング及び競合解決後、株Ａに固有の５つのＩＤ及び株Ｂに固有の３つのＫＯ  ＩＤ、ならびに株Ａにおいて複製物の数が多い４つのＫＯ  ＩＤ及び株Ｂにおいて複製物の数が多い２つのＫＯ  ＩＤが見出された。ラクトバチルス・カゼイＫＥＧＧパスウェイ比較は、１つのみの相違、株Ｂに固有であったＫＯ  ＩＤを明らかにした。これは、この研究全体を通して見られるラクトバチルス・カゼイ株間の高レベルの冗長性と一貫している。ドレア・ロンギカテナ比較は、株Ａについて２つの固有のＫＯ  ＩＤ、及び株Ｂについて６つの固有のＫＯ  ＩＤを明らかにした。ルミノコッカス・トルクエスＫＥＧＧ比較は、各株について２つのみの固有のＫＯ  ＩＤを見出した。これらの５つの種についてのＫＥＧＧオーソロジー割り当てにおける相違、及びそれらがマッピングするパスウェイ要素の完全なリストを、表９に示す。ＫＥＧＧパスウェイ解析に基づくルミノコッカス・オベウム株の比較は、前節とほぼ同じ結果を示した。比較は、株Ａについて４３の固有のＩＤ及び株Ｂについて３２の固有のＩＤ、ならびに株Ａにおいて複製が多い５つのＩＤ及び株Ｂにおいて複製が多い３つのＩＤを見出した（図５）。これは、ＳＥＥＤビューア比較において見られる低レベルの冗長性と一貫し、ルミノコッカス・オベウムの両株の必要性を示している。これらの結果は、ＳＥＥＤビューア比較からの結果と組み合わされた場合、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ラクトバチルス・カゼイ、及びドレア・ロンギカテナの株Ａ、ならびにビフィドバクテリウム・ロンガム及びルミノコッカス・トルクエスの株Ｂが、機能的に冗長なようであり、生態学的な不均衡を引き起こすことなく、生態系から除去され得ることを示す。
【００８９】
図５Ａ〜Ｂは、ルミノコッカス・オベウムを比較するためのＫＥＧＧパスウェイマップを示す。図５Ａは、代謝パスウェイマップを示す。図５Ｂは、制御パスウェイマップを示す。ＫＥＧＧパスウェイマップは、ルミノコッカス・オベウム株Ａ対株Ｂの比較のために、ｉＰａｔｈ２．０を使用して生成した。緑線は共有パスウェイを表し、赤線は株Ａに固有の、または株Ａにおいて反復が多いパスウェイを表し、青線は株Ｂに固有の、または株Ｂにおいて反復が多いパスウェイを表す。線の太さは、ＫＯ  ＩＤの反復数により決定される。
【００９０】
表９は、第Ｉ部において比較された種のうちの５つについてのＫＥＧＧパスウェイにおける相違の要約を示す。表９は、ＫＯ  ＩＤ、マップ名（二次代謝物の生合成を含む）、及び一方の株に固有の特定のパスウェイ要素を含む。青の部分は、一方の株に固有のものではないが、示された株において複製物の数が多い、ＫＯ  ＩＤ及び要素を示す。
【００９１】
【表７−１】
2018526374.tif 000012
【表７−２】
2018526374.tif 000013
【００９２】
第ＩＩ部：ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系内の冗長性
【００９３】
方法
【００９４】
ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系内の冗長性を、上に記載されているＫＥＧＧパスウェイ比較とほぼ同じ方法だが、より大規模で調査した。ＫＡＡＳ（ＫＥＧＧ自動アノテーションサーバー）を使用し、第Ｉ部には含まれていないドラフトゲノム（２１のさらなるゲノム）中の遺伝子の機能アノテーションを提供した。各ゲノムについてのＫＯ割り当て（ＫＯ  ＩＤ）のリストをダウンロードし、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌの表において比較した。元のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系内の３３の種すべてについて見られたＫＯ  ＩＤのリスト、及びあるＫＯ  ＩＤが生態学全体内で見られた回数のリストを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌの表から作成した。次にこれらのリストを使用し、ＫＥＧＧオーソロジー割り当て（ＫＯ  ＩＤ）の複製物の数と一致した太さで、ＫＥＧＧ  ＩＤの最終リストを作成した。ＫＯ  ＩＤのリストを次にプログラムｉＰａｔｈ２．０：インタラクティブ・パスウェイ・エクスプローラにインポートし、マッピング前にｉＰａｔｈ２．０により使用される内部リストと一致させ、これによっていくつかのＫＯ  ＩＤが除去された。この３３の種すべてについての最終一致リストを第ＩＩＩ部において使用した。
【００９５】
この研究の第Ｉ部において冗長であると判明した８つの種株の除去後、更新されたリストを次に作成した（表４）。第２のリストは、２５のみの異なる細菌を含んでいた。このより小さい生態系についての一致ＫＯ  ＩＤのリストを、単一の種に特異的な、２つの種により共有される、３つの種により共有される、４つの種により共有される、及び５つ以上の種により共有されるＫＯ  ＩＤのリストと共に作成した。各ＫＯ  ＩＤについての複製物の数のリストも作成した。１、２、３、４、及び５つ以上の種により共有されるＫＯ  ＩＤのリストを、各々色分けし（それぞれ紫、青、緑、赤、及び黒）、ｉＰａｔｈ２．０にインポートした。色の競合を、競合している最も数の多い種の色として解決し、すなわち、パスウェイが赤（４つの種）と青（２つの種）との間の競合を有した場合、赤として解決した。最終代謝パスウェイマップを考察し（図６）、各色の間で共有されるノードの数を数えた。マップ中のノードは各種化合物に対応し、エッジは酵素反応の系列またはタンパク質複合体を表す。１、２、３、及び４つの種についてのマップも個別に作成し、それらのＫＯ  ＩＤがマッピングしたパスウェイ要素（エッジ）の数を求めた（表１０）。
【００９６】
表１０は、１、２、３、または４つの種により共有されるｉＰａｔｈ２．０ＫＥＧＧ比較パスウェイの要素数を示す。１、２、３、及び４つの種により共有されるパスウェイに注目する、第Ａ部についての冗長な株が除去された後のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ種の比較についての結果の要約である。３つのマップの各々についての選択されたパスウェイ要素の数、ならびに代謝マップ（図８）についての固有ノード及び共有ノードの数を含む。固有ノードは、ノードが示される数の種を含むパスウェイの一部のみであった場合に数え、４つより多い（＞４）種により共有されるノードは、１つ以上の色付き線及び黒線があるノードを共有した場合に数え、１／２／３／４つの種により共有されるノードは、２つの異なる色付き線、すなわち、青（２つの種）及び緑（３つの種）が、あるノードを共有した場合に数えた。
【００９７】
図６は、１、２、３、または４つの種により共有されるパスウェイのｉＰａｔｈ２．０ＫＥＧＧ比較のための代謝パスウェイマップを示す。第Ｉ部についての冗長な株が除去された後のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ種（２５の種を含む）の比較のための完全な代謝パスウェイマップであり、１、２、３、または４つの種により共有される代謝パスウェイを示す。紫線は単一の種により共有される固有パスウェイに対応し、青線は２つの種により共有される代謝パスウェイに対応し、緑線は３つの種により共有されるパスウェイに対応し、赤線は４つの種により共有されるパスウェイに対応し、黒線はシステム内のすべての他のパスウェイ（＞４種）である。線の太さは、可視化しやすさのために選択され、ＫＥＧＧオーソロジーＩＤのコピー数を反映しない。
【００９８】
【表８】
2018526374.tif 000014
【００９９】
単一の種に特異的なＫＯ  ＩＤのリストは、含まれた２５の細菌のうちの２２のみが固有のＫＯ  ＩＤを有したことを示し、３つの明らかに冗長な株としては、ドレア・ロンギカテナ４２ＦＡＡ、ユーバクテリウム・レクターレ２９ＦＡＡ、及びユーバクテリウム・ヴェントリオスム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ）４７ＦＡＡが挙げられた。これらの３つの種を除去し、これらの３つの種の除去を反映するように複製物の数を更新した。単一の種に特異的な一致ＫＯ  ＩＤのリストを次に使用し、固有の色を、その他の種により共有されていないＫＯ  ＩＤを有した各々の種に合わせる、色凡例を手動で作成した。次に色凡例を使用し、ＫＯ  ＩＤ及び合わせる色のリストを作成し、共有ＫＯ  ＩＤは黒とし、固有ＫＯ  ＩＤを有する各々の種は異なる色とした。このリストをｉＰａｔｈ２．０にインポートして使用し、カスタムマップを作成した。これは色競合のリストを作成した。いずれの色競合も、これはパスウェイが単一の細菌に固有のものではないことを意味したため、黒として解決した。例外は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｋ００１２９）についての唯一の固有ＫＯ  ＩＤとの競合であり、さらなる調査によって、この競合がＫＯ  ＩＤがマッピングした６つのパスウェイのうちの１つのみに影響を及ぼしたことが判明し、この競合は黒としてではなく、代わりにビフィドバクテリウム・ロンガムに特異的な色に合わせて解決した。
【０１００】
競合解決後、共有パスウェイは黒線、及び固有のＫＯ  ＩＤを有する各々の種は異なる色付き線で、最終マップを作成した（図７）。代謝及び二次代謝物の生合成マップを解析し、固有ノードの数及び接続ノードの最多数を求めた。細菌における多数の生化学及び代謝パスウェイは不明のままであるため、これらを調査し、したがってこれらの要素数は、考えられる基礎パスウェイについて、エッジを単独で調査するよりも良好な理解をもたらし得る（表１１）。
【０１０１】
表１１は、ｉＰａｔｈ２．０ＫＥＧＧパスウェイ解析の要素数を示す。固有ＫＯ  ＩＤを有する２２の種の名称、３つのマップの各々についてそれらのＫＯ  ＩＤがマッピングする固有パスウェイ要素（固有パスウェイ）の数、ならびに代謝及び二次代謝物の生合成マップについての固有ノードの数及び接続ノードの最多数を含む、第ＩＩ部：ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系内の冗長性の結果の要約である。固有ノードは、ノードが固有パスウェイの一部のみであり、その他のパスウェイにより共有されていない場合に数えた。括弧内の数字は、同様に固有パスウェイの一部であった共有ノードの数である。接続ノードは、固有パスウェイ要素により接続された固有ノードの最多数として数えた。括弧内の数字は、同様に固有パスウェイの一部である共有ノードが含まれる場合の固有パスウェイ要素により接続されたノードの最多数である。
【０１０２】
図７は、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ集団比較のためのＫＥＧＧパスウェイマップを示す。図７Ａは、単一の株に固有のすべてのパスウェイを示す、元のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系からの２５の種（冗長な株を除去）の比較のための完全な代謝パスウェイマップを示す。図７Ｂは、単一の株に固有のすべてのパスウェイを示す、元のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系からの２５の種（冗長な株を除去）すべての比較のための完全な制御パスウェイマップを示す。左の色凡例は、どの色がどの種に対応するかを示す。線の太さは、可視化しやすさのために選択され、ＫＥＧＧ  ＩＤのコピー数を反映しない。
【０１０３】
【表９】
2018526374.tif 000015
【０１０４】
固有ＫＯ  ＩＤ及び合わせる色コードでの、２２の種についての固有ＫＯ  ＩＤのみを含有する最終リストを使用し、固有パスウェイのみを示すマップを作成した（図８）。これらのマップを解析し、キーストーン種及びパスウェイを決定するのに役立てた（表１２）。２２の種についてのすべてのＫＯ  ＩＤの最終リストを、元の３３の種についてのＫＯ  ＩＤのリストと比較し、いずれかのＫＯ  ＩＤがプロセス中に失われたかを決定した。ＫＯ  ＩＤのコピー数を反映する太さのリストでの最終の２２の種についてのＫＯ  ＩＤのリストを、この研究の第ＩＩＩ部において再度使用した。データに対して、配列決定及びゲノムアセンブリにおいて明らかなエラーがないかを確認するシンプルな品質チェックも行った。３３のゲノムすべてについてのゲノムサイズ及びコンティグ数を、Ｒで作成された散布図（図３Ｃ）を使用して比較した。以前に記載したユーバクテリウム・レクターレ１８ＦＡＡにおけるエラーは明白であり、すべての他のゲノムは正常に見えた。
【０１０５】
表１２は、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系の固有のＫＥＧＧパスウェイの要約を示す。第Ｉ部において見出された冗長な株の除去後の固有ＫＯ  ＩＤを有する２２の細菌種についての代謝及び制御パスウェイならびに二次代謝物の生合成の要約である。マッチング及び競合解決後に固有ＫＯ  ＩＤを有する種の名称と共に、それらの固有ＫＯ  ＩＤ、及びそれらがマッピングするパスウェイを含む。色は、代謝及び制御パスウェイマップ（図７）に使用される色凡例を反映する。赤（３）のＫＯ  ＩＤは、第ＩＩ部におけるドレア・ロンギカテナ４２ＦＡＡ、ユーバクテリウム・レクターレ２９ＦＡＡ、及びユーバクテリウム・ヴェントリオスム４７ＦＡＡの除去後のみに見られる固有ＩＤである。青（１４）のＫＯ  ＩＤは、Ｋｕｒｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．データセットにおいても見られた。括弧内の数字は、そのＫＯ  ＩＤがマッピングする３つのマップの各々に含まれる要素の数を示す。
【０１０６】
図８は、単一の株に固有の制御パスウェイを示す、元のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系からの２２の種の比較のための制御パスウェイマップを示す。左の色凡例は、どの色がどの種に対応するかを示す。線の太さは、可視化しやすさのために選択され、ＫＯ  ＩＤのコピー数を反映しない。
【０１０７】
【表１０】
2018526374.tif 000016
【０１０８】
表４．ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ細菌種の要約。表は、元のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅプロトタイプに含まれる３３の種すべてを、ＲＡＳＴサーバー上に挙げられている名称で含む。種は、第Ｉ及びＩＩ部における解析に基づき、３つのカテゴリに分ける。第Ｉ部において見出された冗長な株の除去後に固有ＫＥＧＧパスウェイを有することが判明した２２の種は、最初の２つの列に入り、研究の第Ｉ部において冗長であると判明した８つの種及び第ＩＩ部において冗長であると判明した３つの種は、最後の列に入る。太字で挙げられている９つの種は、Ｋｕｒｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．のデータにも存在する固有ＫＯ  ＩＤを有する種であり、括弧内の数字は、ＫＯ  ＩＤの数を示す。  
【表１１】
2018526374.tif 000017
【０１０９】
結果
【０１１０】
１、２、３、または４つの種または株により共有される、固有及びほぼ固有のパスウェイ及びノードの比較は、いくつかの興味深いパターンを示した。（パスウェイは生態系にとって全体的に、固有ではないが、稀なものであるため）容易に除去することができない生態系内の冗長性について説明するために、２、３、及び４つの種により共有されるパスウェイの比較を行った。第Ｉ部における冗長な種の除去後に残った細菌コミュニティ内の２５の種のＫＥＧＧオーソロジー割り当て比較は、固有ＫＯ  ＩＤを有さず、生態系内のさらなる冗長性であるような３つの種（ドレア・ロンギカテナ４２ＦＡＡ、ユーバクテリウム・レクターレ２９ＦＡＡ、及びユーバクテリウム・ヴェントリオスム４７ＦＡＡ）を明らかにした。これらの３つの種についてのほぼ固有のパスウェイを調査した際も、ほぼ固有のパスウェイは少数のみであった。それぞれ２、３、及び４つの種により共有されるＫＯ  ＩＤを比較した場合、ユーバクテリウム・レクターレ２９ＦＡＡは、３、１、及び３つの共有ＫＯ  ＩＤを有し、ドレア・ロンギカテナ４２ＦＡＡは、３、５、及び３つの共有ＫＯ  ＩＤを有し、ユーバクテリウム・ヴェントリオスム４７ＦＡＡは、３、７、及び６つの共有ＫＯ  ＩＤを有した。これは、これらの３つの種が生態系内であまり重要ではなく、生態学的な均衡を崩すことなく除去され得る可能性があることを示す。
【０１１１】
ほぼ固有のＫＯ  ＩＤの比較はまた、生態系内のキーストーン種である可能性がある４つの種の重要性を明らかにした。ラオウルテラ属種（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｓｐ．）６ＢＦ７、バクテロイデス・オヴァタス５ＭＭ、エシェリキア・コリ３ＦＭ４ｉ、及びパラバクテロイデス・ディスタソニス５ＦＭはすべて、高レベルのほぼ固有のパスウェイを有し、その大部分はこれらの４つの種の間で共有されていた。ラオウルテラ属種６ＢＦ７及びエシェリキア・コリ３ＦＭ４ｉは特に、２つの種により共有されるＫＯ  ＩＤを見ると、非常に多数のＫＯ  ＩＤを共有した。４つの種により共有されるＫＯ  ＩＤを調べると、バクテロイデス・オヴァタス５ＭＭ及びパラバクテロイデス・ディスタソニス５ＦＭは、多数のＫＯ  ＩＤをラオウルテラ属種６ＢＦ７及びエシェリキア・コリ３ＦＭ４ｉと共有した。これは、これらの４つの種が生態系において相互作用し、重要な役割を果たし得ることを示す。２、３、または４つの種の比較について３つ以下の共有ＫＯ  ＩＤを有し、低レベルのほぼ固有のパスウェイを有するいくつかの種が同様に確認された（表５）。フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ４０ＦＡＡ、ラクノスピラ・ペクチノシザ３４ＦＡＡ、及びユーバクテリウム・レクターレ２９ＦＡＡは、３つの比較すべてにおいて低レベルの共有ＫＯ  ＩＤを有した。コリンセラ・アエロファシエンス、及びドレア・ロンギカテナ４２ＦＡＡも、３つの比較のうちの２つにおいて少ないＫＯ  ＩＤを有した。これは、これらの５つの種が、必要な低レベルの冗長性においていかなる主要な役割も果たし得ないことを示す。
【０１１２】
表５は、２、３、または４つの種により共有されるＫＥＧＧオーソロジー割り当ての比較の要約である。表５は、２、３、または４つの種の間で共有される３つ以下のＫＯ  ＩＤを有し、低レベルのほぼ固有のパスウェイを有することが判明した種をまとめる。太字テキストで強調されている種は、２つ以上の比較についてこのカテゴリに該当する。括弧内の数字は、（競合解決前に）共有されるＫＯ  ＩＤの数を示す。
【０１１３】
【表１２】
2018526374.tif 000018
【０１１４】
最終パスウェイ解析は、最初の３３の細菌のうち２２のみが、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ系内のその他の細菌によりカバーされない固有のパスウェイを有するという結果をもたらした。更新されたモデルに含まれる最終の２２の種のリストを表４に示す。これらの２２の重要な種についての固有のパスウェイを示すＫＥＧＧパスウェイマップを表７及び８に示し、これらのＫＯ  ＩＤがマッピングするパスウェイを列挙するチャートを表１２に示す。その株に固有のパスウェイが交差する各株についてのノード数の考慮は、存在すると考えられる未知の固有パスウェイについてのより良好な説明を可能にし、接続ノードの数が多いほどパスウェイが重要である可能性が高いので、接続ノードの最多数に注目することにより、我々はパスウェイの関連性についていくらかの理解を得る。このデータの調査は、バクテロイデス・オヴァタス５ＭＭ及びラクノスピラ・ペクチノシザ３４ＦＡＡの両方が、ほとんどの他の種より多くの固有ノード（それぞれ１２及び８）を有するが、接続ノードの最多数は両者についてわずか２であることを示した。これは未知のパスウェイが関与し得ることを示す。最も関連性のある種は、ラオウルテラ属種６ＢＦ７であると考えられ、４６の固有ノードを有し、接続パスウェイの最多数は１５である。これは、次に多くの接続ノードを有する種、すべて接続している３つの固有ノードを有するロゼブリア・インテスティナリス３１ＦＡＡよりも５倍多い（表１１）。
【０１１５】
元の３３の種についてのＫＯ  ＩＤのリストと比較した２２の重要な種についてのＫＯ  ＩＤの最終リストの比較は、第Ｉ部において冗長であると判明した８つの種株の除去から引き起こされる２つのＫＯ  ＩＤ（Ｋ０７７６８及びＫ１１６９５）の喪失を明らかにした。第１のＫＯ  ＩＤは、ユーバクテリウム・レクターレ１８ＦＡＡの除去の結果として失われた可能性がある。これは、比較的に小さいゲノムサイズについて過度に多数のコンティグを有し、ゲノムアセンブリにエラーが発生していたように見えた唯一の細菌種または株であった（図３Ｃ）。この株の真の重要性を決定するには、さらなる研究が必要である。失われたと考えられるＫＯ  ＩＤ（Ｋ０７７６８）は、シグナル伝達のための二成分系内の３つの制御パスウェイにマッピングするが、それらのパスウェイのうちの２つは、２２の種の生態系についてのＫＯ  ＩＤの最終リストにまだ存在する、別のＫＯ  ＩＤ（Ｋ０７７７６）によってもマッピングされる。これは、単一の小さなパスウェイのみが失われ、生態学的な均衡に影響を及ぼさない可能性があることを示す。冗長性除去のプロセスにおいて失われた第２のＫＯ  ＩＤ（Ｋ１１６９５）は、ペプチドグリカン生合成のための単一の代謝パスウェイにマッピングし、このパスウェイにマッピングする唯一のＫＯ  ＩＤである。このＫＯ  ＩＤは、ビフィドバクテリウム・ロンガム４ＦＭの除去の結果として失われた。このパスウェイの喪失が、生態系の持続可能性に悪影響を及ぼすかは不明であり、この細菌株が必要であり得るかを決定するにはさらなる研究が必要である。
【０１１６】
２２の種についての固有パスウェイを詳しく見ると、種の数のさらなる最適化が可能であり得ることがわかる。固有パスウェイを示すマップは、ユーバクテリウム・デスモランス４８ＦＡＡ、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ４０ＦＡＡ、ルミノコッカス属種（株Ａ）、及びルミノコッカス属種１１ＦＭという４つの細菌株が、非常に少ない固有パスウェイを有することを明らかにし、その各々は、単一のマップ要素のみ、及び１つまたは２つのパスウェイのみにマッピングする（表１２）。この証拠は、２、３、及び４つの種により共有されるパスウェイの比較（表５）から得られた情報と組み合わされ、ユーバクテリウム・デスモランス４８ＦＡＡ及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ４０ＦＡＡが、生態系における不均衡をもたらすことなく、除去され得る可能性があることを示す。ラクノスピラ・ペクチノシザ３４ＦＡＡ及びコリンセラ・アエロファシエンスも、ほぼ固有のパスウェイが非常に少なく（表５）、少数の固有ＫＯ  ＩＤ及びパスウェイ要素を有するのみである（表１２、それぞれ、３つのＫＯ  ＩＤ、６つの要素、及び２つのＫＯ  ＩＤ、２つの要素）。これらの４つの種の必要性を決定し、新たなプロトタイプのＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系におけるそれらの除去または包含を正当化するためには、さらなる研究が必要となるだろう。
【０１１７】
【表１３−１】
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【表１３−２】
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【表１３−３】
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【表１３−４】
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【表１３−５】
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【表１３−６】
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【表１３−７】
2018526374.tif 000025
【０１１８】
第ＩＩＩ部：ＫＥＧＧパスウェイカバレッジの比較
方法
第ＩＩ部において作成されたＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系内のＫＯ  ＩＤ複製物の数により決定される太さでの３３の種すべてについてのＫＯ  ＩＤのリストを、ｉＰａｔｈ２．０にロードして使用し、青に色付けした線、及び各ＫＯ  ＩＤについての複製物の数により決定される太さでカスタムマップを作成した。太さの競合は、競合する太さからランダムに選択するｉＰａｔｈ２．０により使用される自動的な方法を使用して解決した。同じプロセスを、固有ＫＯ  ＩＤを有する２２の種からなる最適化された生態系についてのＫＯ  ＩＤ及び更新された太さのリストについて完了し、このマップの線の色は黒とした。比較のための「健康な」ヒト腸内マイクロバイオームは、その全体が本明細書に参照により組み入れられる、Ｋｕｒｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．による研究から引用され、太さを伴うＫＯ  ＩＤの完全なリストは、ｉＰａｔｈウェブサイト上に提供される。Ｋｕｒｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．研究の目標は、ヒト腸内マイクロバイオームの一般的かつ可変なゲノム特性を同定することであった。その研究は、乳児を含む、様々な年齢の１３人の健康な日本人の個体からの糞便試料の大規模な比較代謝解析からなる。この研究からのデータは、ｉＰａｔｈ２．０の開発においてその能力の実演として以前使用されたことがあり、この比較には時間制限下での使いやすさのために選択された。Ｋｕｒｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．データについてのｉＰａｔｈ２．０マップを、カスタムマップ機能及び提供されているリストを使用して作成した。このリストの線の色は赤とする。次に３つのデータセットすべてについてのカスタムマップを、ポータブル・ドキュメント・フォーマット（ＰＤＦ）でダウンロードした。
【０１１９】
３つのＰＤＦ画像をＧＩＭＰ２．８．１０（ＧＮＵ画像操作プログラム）に別々のレイヤーとしてロードし、Ｋｕｒｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．データ及びＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅパスウェイの両方のセットを可視化することができるように、αチャンネルに着色することにより透明度を操作した。これは、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系の各々が、天然ヒト腸内マイクロバイオームの例、及び互いにどれほど良く一致したかを視覚的に比較し、ＫＥＧＧパスウェイのカバレッジを決定するために行った。ＫＥＧＧ  ＩＤの３つのリスト（各マップに１つ）、及び第ＩＩ部において見出された固有ＫＥＧＧ  ＩＤのリストも、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌスプレッドシート表を使用して比較した。このプロセスを最適化するために、Ｋｕｒｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．ＫＯ  ＩＤを、ｉＰａｔｈ内部リストと一致させ、第ＩＩ部において他のリストを一致させたのと同じ方法でｉＰａｔｈ２．０パスウェイにマッピングしなかったいかなるＫＯ  ＩＤも除去した。
【０１２０】
結果
【０１２１】
完全な３３の種のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系についてのＫＯ  ＩＤの一致リストを、Ｋｕｒｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．ＫＯ  ＩＤの一致リストと比較し、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅデータセットにはＫｕｒｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．データセットに含まれない６３５のＫＯ  ＩＤが見られ、Ｋｕｒｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．データにはＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅに含まれない８６のＫＯ  ＩＤが見られることが明らかとなった。最適化プロセス中に除去された２つのＫＯ  ＩＤは、Ｋｕｒｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．データセットには含まれていなかった。Ｋｕｒｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．データまたはＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅのいずれかに固有のＫＯ  ＩＤのうち、６３のＫＯ  ＩＤは、他のデータセットからの固有パスウェイと共有されたパスウェイを有した。Ｋｕｒｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．データについての２７の固有ＫＯ  ＩＤは、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅについての固有ＫＯ  ＩＤと重複する少なくとも１つのパスウェイを有し、３６の固有のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ  ＫＯ  ＩＤは、Ｋｕｒｏｋａｗａデータからの固有ＫＯ  ＩＤにより共有される少なくとも１つのパスウェイを有した。健康な腸内マイクロバイオームを維持するためには存在すべきである、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系から失われた正確なパスウェイをより詳しく調べるには、さらなる解析が必要である。
【０１２２】
最適化された生態系の２２の種のうちの単一の種に固有のＫＯ  ＩＤのリストも、一致Ｋｕｒｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．データセットと比較した。同定された１１７の固有ＫＯ  ＩＤのうち、１４のみがＫｕｒｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．データにも含まれ、これらは表１２において青で強調されている。単一の種に固有のものであり、Ｋｕｒｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．データと一致した１４のＫＯ  ＩＤは、９つのみの種において見られ、これらの種が生態系において最も重要であり得ることを示した（表４参照）。
【０１２３】
３３または２２いずれかの種を含む２つのＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅバージョンの視覚的な比較は、データの明らかな喪失なく、ＫＯ  ＩＤの複製物の数における小さな相違のみを示した。ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅデータ及びＫｕｒｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．データの視覚的な比較は、Ｋｕｒｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．データと比較した場合の、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅデータ中の少数の代謝パスウェイの複製物の数におけるいくつかの明らかなずれを示した。これらの大部分は、生命に必要であり、したがってすべての細菌種に存在し、より多様な種についてより多数の複製物を有するだろう代謝領域において発生したので、これははるかに多数の細菌の存在による可能性が高い。制御パスウェイマップ内にも、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系におけるカバレッジが不足または欠乏していると考えられる領域がいくつかある。これらとしては、アミノアシル−ｔＲＮＡ生合成パスウェイ、ＡＢＣトランスポーターパスウェイ、二成分系、及び細菌分泌系の領域が特に挙げられる。これらの足りない要素の重要性を理解し、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ系がパスウェイを制御することができる種を組み入れるためのさらなる変更を要するかを確認するためには、さらなる研究が必要となるだろう。
【０１２４】
考察
このレポートにおいて概説されている研究デザインにはいくつかの制約がある。起こり得るエラーの主な要因の１つは、高レベルのデータセットの手動操作であり、これはヒューマンエラーの発生を助長している。競合を解決し、データを選別するのに選択された方法は理想的ではなく、将来的には、さらに自動化されたプログラミングベースのアプローチが、これらの考えられるエラー要因の多くを排除し、結果の妥当性を向上させるだろう。
【０１２５】
この研究のデザインにおける第２の大きな問題は、細菌の代謝及び生化学パスウェイについての一般的な知識の欠如である。重要な未知の細菌パスウェイの可能性の問題は、重要な種を正しく同定できないこと、及び冗長性の誤同定を助長する。解析におけるノード及びパスウェイの両方の調査によってこのエラー要因の修正を試みたが、これがすべての未知の可能性を説明するわけではない。同様に、プログラムｉＰａｔｈ２．０の使用も、プログラムが考えられるすべてのパスウェイを含むわけでも、すべての既知のＫＥＧＧオーソロジー割り当てを説明するわけでもないので、特定の未知の要素を導入することになる。このプロジェクトにおけるＫＥＧＧオーソロジー割り当ての比較は、簡潔さと理解しやすさの両方のために、ｉＰａｔｈ２．０プログラム内で使用されるもののみに注目した。しかしながら、これは、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系の３３のゲノムにおいて同定された４２１０のＫＯ  ＩＤのうち、比較に含まれたのは１５３６のみであり、この解析では２６７４のＫＯ  ＩＤを調査せずに残すことを意味した。
【０１２６】
したがって、細菌の代謝及び生化学パスウェイに関する我々の理解が向上すれば、これらのパスウェイに関するこの情報は、本発明の実施形態に組み入れられるだろう。
【０１２７】
このレポートの第ＩＩ部において概説されている解析は、３３の元の細菌株のうちの２２のみが固有のパスウェイにマッピングすることを明らかにした。これは、これらの種のいくつかまたはすべてが生態系内の「キーストーン」種であり得ること、及び他の種が冗長である可能性があり得ることを示す。この解析は、生態系内の特定のレベルの冗長性が必要であり得、調査されていない特定の細菌相互作用が生態学的に必要であり得、または未知の細菌パスウェイがコミュニティの生態学的均衡において役割を果たし得るという事実は説明しない。これらの種のうちの９つのみが「健康な」微生物コミュニティの例においても見られる固有ＫＯ  ＩＤを有していたことにも言及しておかなければならない。ヒト腸内の生態系内の均衡に必要な「キーストーン」種及びパスウェイを絶対的に定義するには、さらなる研究が必要である。
【０１２８】
ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系内の冗長性を探す最終比較は、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅプロジェクトの人工のコミュニティと比較して天然の「健康な」ヒト腸内細菌集団を調査するようにデザインした。「健康な」細菌集団はまだ明確に定義されていないので、これは困難であった。「健康な」ヒト腸内マイクロバイオームを表すために選択されたこの研究データは、時間制限のため選択され、そのデータは、容易に入手可能であり、既にこの研究において使用されるパスウェイ解析プログラムのための正しいフォーマットであった。しかしながら、データのソースは、全員日本人の祖先を持つ１３人のみの個体についてのデータを含有し、発達段階初期の腸内マイクロバイオームの動的な性質のためエラー要因となり得る、乳児のデータも含んでいたので、理想的ではなかった。すべての糞便試料が日本人の個体からのものであるという事実も、ヒト対象にわたる多様性の欠如及び日本人特有の食事の両方のため、データにおけるエラー要因となり得る。以前の研究は、日本人が、日本人の食事における高レベルの海藻及びこの食物源を分解する腸内細菌の要件のため、海洋細菌に由来する遺伝子をより豊富に有することを示している。導入されたこれらの海洋細菌遺伝子は、データセットにおいて見られるパスウェイに影響を及ぼし得る。もし時間が許したならば、より良好なデータソースはＨｕｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔまたは欧州主導のＭｅｔａＨｉｔであり、より典型的な北米人の腸内マイクロバイオームのデータソースを提供したであろう。
【０１２９】
例：細菌コミュニティの形成
ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系を最適化するプロセスにおける次のステップは、明らかに冗長な種及び株の除去によって生態学的な均衡が保たれているかを確認するための、培養おける、提案された細菌コミュニティの実際の形成を含む。この研究において用いられるメタゲノムアプローチは、同定された遺伝子が発現されているか、及びどのレベルにあるかを識別することができないので、メタトランスクリプトームアプローチによってコミュニティの実際の機能活性も調査されるべきである。メタトランスクリプトームは、相補的ＤＮＡに変換され、ハイスループットプラットフォームで配列決定された、コミュニティから単離されたメッセンジャーＲＮＡを使用する。このアプローチは、微生物生態系における遺伝子発現の特徴付けを可能にし、全体としてのコミュニティの相互作用のより良い理解をもたらすだろう。したがって、こうした細菌コミュニティの形成後、細菌コミュニティは、腸内毒素症（これらに限定されないが、例えば、ＩＢＤ、ＩＢＳ、ＵＣ、癌関連腸内毒素症、等）を患う患者に投与され、患者は胃腸病理の向上を示すだろう。
【０１３０】
結論
この研究の第Ｉ部において概説されている証拠は、調査された６つの種のうちの５つにおける冗長性を明確に示す。第ＩＩ部において概説されている証拠は、あまり明確ではないが、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系内でいくつかのさらに冗長な種が見られ得るといういくつかの徴候がある。第ＩＩＩ部における最終解析は、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅコミュニティが健康なヒト腸内マイクロバイオームの代謝及び制御パスウェイを非常に忠実に模倣することを示す。この比較は、元の３３ではなく２２の種からなる生態系が、機能性または生態学的な均衡を損なうことなく、より経済的な人工細菌コミュニティをもたらす可能性があることも示す。この理論を試験するには、細菌培養でのさらなる研究が必要である。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2018526374.tif 000032
【図５Ｃ】
2018526374.tif 000033
【図５Ｄ】
2018526374.tif 000034
【図５Ｅ】
2018526374.tif 000035
【図５Ｆ】
2018526374.tif 000036
【図５Ｇ】
2018526374.tif 000037
【図５Ｈ】
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【図６Ａ】
2018526374.tif 000039
【図６Ｂ】
2018526374.tif 000040
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７Ａ】
2018526374.tif 000047
【図７Ｂ】
2018526374.tif 000048
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図７Ｋ】
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【図７Ｌ】
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【図７Ｍ】
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【図７Ｎ】
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【図７Ｏ】
2018526374.tif 000061
【図７Ｐ】
2018526374.tif 000062
【図７Ｑ】
2018526374.tif 000063
【図８Ａ】
2018526374.tif 000064
【図８Ｂ】
2018526374.tif 000065
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
2018526374.tif 000067
【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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