(57)【要約】  バイオプリンタは一以上の分注ユニットを備える。各分注ユニットは、（ｉ）出口オリフィスを有する中空のボディと、前記ボディ内を移動する寸法に形成されたプランジャと、を含むシリンジと、（ｉｉ）前記プランジャの近位端部と接触するアクチュエータと、  （ｉｉｉ）前記アクチュエータを動かすコントローラと、（ｉｖ）ノズルと、を含み、前記ノズルは、前記ノズルのインレットから前記ノズルのアウトレットへと延びる流路を画定する壁を有する。前記ノズルのインレットは、前記シリンジの前記ボディの前記出口オリフィスと流体連通している。前記ノズルは、流体源及び前記流路と流体連通した流体通路を含む。前記バイオプリンタは、前記バイオプリンタの一以上の分注ユニットからバイオインクをプレート上に分注することを含む、マイクロ組織を準備する方法に用いることができる。マイクロ組織は、軟骨細胞又は腫瘍細胞又は肝細胞を含んでもよい。【選択図】図１
2018529334.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一以上の分注ユニットを備えたバイオプリンタであって、
各分注ユニットが、
（ｉ）出口オリフィスを有する中空のボディと、前記ボディ内を移動する寸法に形成されたプランジャと、を含むシリンジと、
（ｉｉ）前記プランジャの近位端部と接触するアクチュエータと、
（ｉｉｉ）前記アクチュエータの直線の動きを制御するコントローラと、
（ｉｖ）ノズルと、を含み、
前記ノズルは、前記ノズルのインレットから前記ノズルのアウトレットへと延びる流路を画定する壁を有し、
前記ノズルのインレットは、前記シリンジの前記ボディの前記出口オリフィスと流体連通しており、
前記ノズルは、流体源及び前記流路と流体連通した流体通路を含む、
ことを特徴とするバイオプリンタ。
【請求項２】
前記コントローラが、前記シリンジの前記ボディからバイオインクを分注するために前記プランジャの前記近位端部に向かって前記アクチュエータを駆動させるために、前記コントローラ内のコンピュータから受信されたプログラムを実行する、ことを特徴とする請求項１に記載のバイオプリンタ。
【請求項３】
前記シリンジの前記ボディを囲む温度コントローラをさらに備えた、ことを特徴とする請求項１に記載のバイオプリンタ。
【請求項４】
前記ノズルの前記アウトレットからのバイオインクを受けるための温度制御プレートをさらに備える、ことを特徴とする請求項１に記載のバイオプリンタ。
【請求項５】
前記温度制御プレートに隣接した湿度制御ゾーンを作製するための加湿器をさらに備えた、ことを特徴とする請求項４に記載のバイオプリンタ。
【請求項６】
前記流通路からの流体により、分注された材料の液滴が分離され、前記分注された材料の液滴が、前記ノズルの前記アウトレットから出される、ことを特徴とする請求項１に記載のバイオプリンタ。
【請求項７】
各前記液滴の体積が、１０ナノリットルから１５マイクロリットルの範囲内である、ことを特徴とする請求項６に記載のバイオプリンタ。
【請求項８】
前記流体源が、流体を供給するための制御可能バルブを備えた、ことを特徴とする請求項１に記載のバイオプリンタ。
【請求項９】
前記制御可能バルブが、第二コントローラによって制御される、ことを特徴とする請求項８に記載のバイオプリンタ。
【請求項１０】
前記流体源が、パルス流体を供給するための制御可能バルブを備えた、ことを特徴とする請求項１に記載のバイオプリンタ。
【請求項１１】
前記流体源が、パルス空気を供給するための制御可能バルブを備えた、ことを特徴とする請求項１に記載のバイオプリンタ。
【請求項１２】
前記流体源が、ミリ秒のパルス空気を供給するための制御可能バルブを備えた、ことを特徴とする請求項１に記載のバイオプリンタ。
【請求項１３】
各前記分注ユニットが、非接触分注ユニットである、ことを特徴とする請求項１に記載のバイオプリンタ。
【請求項１４】
前記ノズルが、前記シリンジのボディと一体である、ことを特徴とする請求項１に記載のバイオプリンタ。
【請求項１５】
前記ノズルが、前記シリンジのボディと別体である、ことを特徴とする請求項１に記載のバイオプリンタ。
【請求項１６】
前記ノズルの前記アウトレットの内径が、１００マイクロメートルから３ミリメートルである、ことを特徴とする請求項１に記載のバイオプリンタ。
【請求項１７】
前記バイオプリンタが、前記分注ユニットを複数備えた、ことを特徴とする請求項１に記載のバイオプリンタ。
【請求項１８】
各前記分注ユニットが、ＸＹＺモーションシステム上に搭載されている、ことを特徴とする請求項１に記載のバイオプリンタ。
【請求項１９】
マイクロ組織を準備する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の前記バイオプリンタの前記一以上の分注ユニットからバイオインクをプレート上に分注することを含む、
ことを特徴とするマイクロ組織を準備する方法。
【請求項２０】
前記マイクロ組織が軟骨細胞を備えた、ことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記マイクロ組織が、腫瘍細胞、腫瘍間質細胞、及び内皮細胞を備えた、ことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記マイクロ組織が肝細胞を備えた、ことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
骨欠損または軟骨欠損を修復する方法であって、
（ａ）軟骨細胞を備えたマイクロ組織を作製するために、請求項１に記載の前記バイオプリンタの前記一以上の分注ユニットからバイオインクを分注することと、
（ｂ）前記骨欠損または前記軟骨欠損内に、前記マイクロ組織を移植することと、を含む、
ことを特徴とする骨欠損または軟骨欠損を修復する方法。
【請求項２４】
創薬のための高スループットスクリーニングの方法であって、
（ａ）複数のマイクロ組織サンプルを作製するために、請求項１に記載の前記バイオプリンタの前記一以上の分注ユニットからバイオインクを分注することと、
（ｂ）前記複数のマイクロ組織サンプルの少なくとも一部を薬剤候補化合物と接触させることと、を含む、
ことを特徴とする創薬のための高スループットスクリーニングの方法。
【請求項２５】
前記マイクロ組織サンプルが腫瘍細胞を備えた、ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
一以上の分注ユニットを備えたバイオプリンタであって、
各分注ユニットが、
（ｉ）出口オリフィスを有する中空のボディと、前記ボディ内を移動する寸法に形成されたプランジャと、を含むシリンジと、
（ｉｉ）前記プランジャの近位端部と接触するアクチュエータと、
（ｉｉｉ）前記アクチュエータを動かすためのコントローラと、
（ｉｖ）ノズルと、を含み、
前記ノズルは、前記ノズルのインレットから前記ノズルのアウトレットへと延びる流路を画定する壁を有し、
前記ノズルのインレットは、前記シリンジの前記ボディの前記出口オリフィスと流体連通しており、
前記シリンジは、前記シリンジの前記ボディの前記出口オリフィスと前記プランジャの遠位端部との間にバルブを含まない、
ことを特徴とするバイオプリンタ。
【請求項２７】
前記コントローラが、前記シリンジの前記ボディからバイオインクを分注するために前記プランジャの前記近位端部に向かって前記アクチュエータを駆動させるために、前記コントローラ内に格納されたプログラムを実行する、ことを特徴とする請求項２６に記載のバイオプリンタ。
【請求項２８】
前記シリンジの前記ボディを囲む温度コントローラをさらに備えた、ことを特徴とする請求項２６に記載のバイオプリンタ。
【請求項２９】
前記ノズルの前記アウトレットからのバイオインクを受けるための温度制御プレートをさらに備えた、ことを特徴とする請求項２６に記載のバイオプリンタ。
【請求項３０】
前記温度制御プレートに隣接した湿度制御ゾーンを作製するための加湿器をさらに備えた、ことを特徴とする請求項２９に記載のバイオプリンタ。
【請求項３１】
前記ノズルは、流体源及び前記流路と流体連通した流体通路を含み、
前記流通路からの流体により、分注された材料の液滴が分離され、前記分注された材料の液滴が、前記ノズルの前記アウトレットから出される、ことを特徴とする請求項２６に記載のバイオプリンタ。
【請求項３２】
各前記液滴の体積が、１０ナノリットルから１５マイクロリットルの範囲内である、ことを特徴とする請求項３１に記載のバイオプリンタ。
【請求項３３】
前記流体源が、流体を供給するための制御可能バルブを備えた、ことを特徴とする請求項３１に記載のバイオプリンタ。
【請求項３４】
前記制御可能バルブが、第二コントローラによって制御される、ことを特徴とする請求項３３に記載のバイオプリンタ。
【請求項３５】
前記流体源が、パルス流体を供給するための制御可能バルブを備えた、ことを特徴とする請求項３１に記載のバイオプリンタ。
【請求項３６】
前記流体源が、パルス空気を供給するための制御可能バルブを備えた、ことを特徴とする請求項３１に記載のバイオプリンタ。
【請求項３７】
前記流体源が、ミリ秒のパルス空気を供給するための制御可能バルブを備えた、ことを特徴とする請求項３１に記載のバイオプリンタ。
【請求項３８】
各前記分注ユニットが、非接触分注ユニットである、ことを特徴とする請求項３１に記載のバイオプリンタ。
【請求項３９】
前記ノズルが、前記シリンジのボディと一体である、ことを特徴とする請求項２６に記載のバイオプリンタ。
【請求項４０】
前記ノズルが、前記シリンジのボディと別体である、ことを特徴とする請求項２６に記載のバイオプリンタ。
【請求項４１】
前記ノズルの前記アウトレットの内径が、１００マイクロメートルから３ミリメートルである、ことを特徴とする請求項２６に記載のバイオプリンタ。
【請求項４２】
前記バイオプリンタが、前記分注ユニットを複数備えた、ことを特徴とする請求項２６に記載のバイオプリンタ。
【請求項４３】
各前記分注ユニットが、ＸＹＺモーションシステム上に搭載されている、ことを特徴とする請求項２６に記載のバイオプリンタ。
【請求項４４】
マイクロ組織を準備する方法であって、
（ａ）請求項２６に記載の前記バイオプリンタの前記一以上の分注ユニットからバイオインクをプレート上に分注することを含む、
ことを特徴とするマイクロ組織を準備する方法。
【請求項４５】
前記マイクロ組織が軟骨細胞を備えた、ことを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記マイクロ組織が腫瘍細胞を備えた、ことを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記マイクロ組織が肝細胞を備えた、ことを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
骨欠損または軟骨欠損を修復する方法であって、
（ａ）軟骨細胞を備えたマイクロ組織を作製するために、請求項２６に記載の前記バイオプリンタの前記一以上の分注ユニットからバイオインクを分注することと、
（ｂ）前記骨欠損または前記軟骨欠損内に、前記マイクロ組織を移植することと、を含む、
ことを特徴とする骨欠損または軟骨欠損を修復する方法。
【請求項４９】
創薬のための高スループットスクリーニングの方法であって、
（ａ）複数のマイクロ組織サンプルを作製するために、請求項２６に記載の前記バイオプリンタの前記一以上の分注ユニットからバイオインクを分注することと、
（ｂ）前記複数のマイクロ組織サンプルの少なくとも一部を薬剤候補化合物と接触させることと、を含む、
ことを特徴とする創薬のための高スループットスクリーニングの方法。
【請求項５０】
前記マイクロ組織サンプルが腫瘍細胞を備えた、ことを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願の相互参照＞  本出願は、２０１５年９月４日に出願された米国特許出願番号第６２／２１４，５５１号の優先権を主張する。
【０００２】
＜連邦政府の支援による研究に関する言明＞  該当無し。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、三次元バイオプリンティングに関し、具体的には、精密に制御されたマイクロスケールで正確なＸＹＺモーション及び体積測定ナノリットル分注能力（volumetric nanoliter dispensing capability）を有する生存マイクロ組織(live microtissues)を作製するコンピュータ制御のプログラム可能三次元（３Ｄ）バイオプリンタに関する。
【０００４】
バイオプリンタは、三次元組織をプリントするという課題に対応するために開発された。バイオプリンタは、「生物由来の接着剤（bio-glue）」の役割をする材料を用いた細胞の滴下的なプリントを介して構造を組み立てる。バイオプリンタは、建築材のサイズの小ささにつきもののスループットの遅さ及び堆積させなければならない建築ユニットの膨大な数により、制限される。バイオプリンティングの種々の応用について様々な技法及び技術が存在する。
【０００５】
接触バイオプリンティングは、細胞を用いないポリマープリンティングであり、Ｅｎｖｉｓｉｏｎｔｅｃ社製３Ｄ  Ｂｉｏｐｌｏｔｔｅｒ（登録商標）によって使用される。ポリマープリンティング法は、プラスチック状のポリマーを用いて足場をプリントするだけである。
【０００６】
生存細胞バイオプリンティングは、バルクサイズの接触生存細胞バイオプリンティングを用いる。この技法では、結果として得られる組織のサイズが数センチメートルであることから、マイクロ組織プリンティングはできない。接触生存細胞バイオプリンティングは、スループットの低いプリンティングしか実行できない。
【０００７】
非接触バルブベースバイオプリンティング技法により、細胞専用(cell only)バイオプリンティングが提供される。例えば、Faulkner-Jones, et al., "Development of a valve-based cell printer for the formation of human embryonic stem cell spheroid aggregates", Biofabrication 5.1 (2013):015013参照。非接触バルブベースバイオプリンティング技法は、また、細胞及びハイドロゲルバイオプリンティングを提供することができる。例えば、Moon, et al., "Layer by layer three-dimensional tissue epitaxy by cell-laden hydrogel droplets", Tissue Engineering Part C: Methods 16.1(2009):157-166参照。Moonらは液滴をより大きな要素へとプリントしたが、彼らのシステムは、細胞アーキテクチャ又は生態を有さないハイドロゲル内に懸濁した細胞を有する構造を作製することしかできない。他の市販のプリンタは、天然の組織に似たアーキテクチャ及び生態を有する組織をプリントすることはできない。
【０００８】
空気駆動分注により、同軸ガス流ビード生成を提供することができる。この技法は、同軸構成された連続的な気流と連続的な分注材流を用いるが、各液滴の体積を制御することはできず、単一の液滴を分注することもできない。この技法は、通常、何千もの液滴を一度に分注するが、Ｎｉｓｃｏ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＡＧ製のシステムなどの市販のシステムでは、材料はアルギン酸塩に限定される。
【０００９】
細胞集合体非リアル３Ｄモデルでは、細胞集合体が、ハンギングドロップ法によって又は非接着性細胞培養表面から生成される。この技法は３Ｄ組織を再現しようと試みる人々により使用されており、市販の製品が入手可能である。しかしながら、集合体はただ単に細胞外基質を有さない二次元の細胞に積まれるだけである。例えば、細胞集合体の薬剤耐性メカニズムは二次元密集細胞と同じであることが示されている。例えば、Steadman, Kenneth, et al. "PolyHEMA spheroids are an inadequate model for the drug resistance of the intractable solid tumors." Cell Cycle 7.6 (2008): 818-829参照。また、二次元細胞培養はインビボの複雑な生物学的又は病理学的性質と類似していない。動物モデルは種差のためにヒト疾患に完全に類似しない。
【００１０】
臨床的な観点から、侵襲の少ないアプローチが関節及び多くの骨の手術において常に好ましい。ある人らは、組織欠損の修復を期待して膝から採取した軟骨細胞及び間充織幹細胞の注入を行った。しかしながら、脆弱な機械的性質、体積収縮及びインビボ成長に長時間かかることから、関節軟骨又は骨の修復には適切でない。
【００１１】
したがって、インビボのヒト細胞の性質と類似したヒト細胞を、インビトロでプリントする技術が所望される。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、一側面において、一以上の分注ユニットを備えたバイオプリンタを提供する。  各分注ユニットは、（ｉ）出口オリフィスを有する中空のボディと、前記ボディ内を移動する寸法に形成されたプランジャと、を含むシリンジと、（ｉｉ）前記プランジャの近位端部と接触するアクチュエータと、（ｉｉｉ）前記アクチュエータを動かすコントローラと、（ｉｖ）ノズルと、を含んでもよく、前記ノズルは、前記ノズルのインレットから前記ノズルのアウトレットへと延びる流路を画定する壁を有する。前記ノズルのインレットは、前記シリンジの前記ボディの前記出口オリフィスと流体連通している。前記ノズルは、流体源及び前記流路と流体連通した流体通路を含む。前記バイオプリンタは、マイクロ組織を準備する方法において用いることができ、前記方法は、バイオインクを前記バイオプリンタの一以上の分注ユニットからプレート上に分注することを含む。マイクロ組織は、幹細胞、骨細胞、軟骨細胞、肝細胞、腫瘍細胞、腫瘍間質細胞、内皮細胞、及びその他のタイプの細胞を備えてもよい。前記バイオプリンタは、骨欠損または軟骨欠損を修復する方法に用いることができ、前記方法は、軟骨細胞を備えたマイクロ組織を作製するために、バイオインクを前記バイオプリンタの一以上の分注ユニットから分注することと、前記骨欠損または前記軟骨欠損内に、前記マイクロ組織を移植することと、を含む。前記バイオプリンタは、創薬のための高スループットスクリーニングの方法に用いることができ、前記方法は、複数のマイクロ組織サンプルを作製するために、バイオインクを前記バイオプリンタの一以上の分注ユニットから分注することと、前記複数のマイクロ組織サンプルの少なくとも一部を薬剤候補化合物と接触させることと、を含む。マイクロ組織サンプルは腫瘍細胞を備えてもよい。
【００１３】
上記側面において、コントローラが、シリンジのボディからバイオインクを分注するためにプランジャの近位端部に向かってアクチュエータを駆動させるために、コントローラ内のコンピュータから受信されたプログラムを実行してもよい。バイオプリンタは、シリンジのボディを囲む温度コントローラ、ノズルのアウトレットからのバイオインクを受けるための温度制御プレート、温度制御プレートに隣接した湿度制御ゾーンを作製するための加湿器を、さらに備えてもよい。バイオプリンタにおいて、流通路からの流体が、分注された材料の液滴を分離することができ、分注された材料の液滴を、ノズルのアウトレットから出すように構成してもよい。バイオプリンタにおいて、各液滴の体積は、１０ナノリットルから１５マイクロリットルの範囲内でもよい。流体源は、流体を供給するための制御可能バルブを備えてもよい。制御可能バルブは、第二コントローラによって制御されてもよい。バイオプリンタの流体源は、パルス流体、パルス空気、ミリ秒パルス空気及びサブミリ秒パルス空気を供給するための制御可能バルブを備えてもよい。バイオプリンタにおいて、各分注ユニットは、非接触分注ユニットでもよく、ノズルは、シリンジのボディと一体でもよく、あるいはノズルは、シリンジのボディと別体でもよい。ノズルのアウトレットの内径は、１００マイクロメートルから３ミリメートルでもよい。バイオプリンタは、分注ユニットを複数備えてもよく、各分注ユニットが、ＸＹＺモーションシステム上に搭載されてもよい。
【００１４】
本発明は、別の側面において、一以上の分注ユニットを備えたバイオプリンタを提供する。各分注ユニットは、（ｉ）出口オリフィスを有する中空のボディと、ボディ内を移動する寸法に形成されたプランジャと、を含むシリンジと、（ｉｉ）プランジャの近位端部と接触するアクチュエータと、（ｉｉｉ）アクチュエータを動かすためのコントローラと、（ｉｖ）ノズルと、を含み、ノズルは、ノズルのインレットからノズルのアウトレットへと延びる流路を画定する壁を有してもよい。ノズルのインレットは、シリンジのボディの出口オリフィスと流体連通している。シリンジは、シリンジのボディの出口オリフィスとプランジャの近位端部との間にバルブを含まない。前記バイオプリンタは、マイクロ組織を準備する方法において用いることができ、前記方法は、バイオインクをバイオプリンタの一以上の分注ユニットからプレート上に分注することを含む。マイクロ組織は、幹細胞、骨細胞、軟骨細胞、肝細胞、腫瘍細胞及びその他のタイプの細胞を備えてもよい。バイオプリンタは、骨欠損または軟骨欠損を修復する方法に用いることができ、前記方法は、軟骨細胞を備えたマイクロ組織を作製するために、バイオインクをバイオプリンタの一以上の分注ユニットから分注することと、骨欠損または軟骨欠損内にマイクロ組織を移植することと、を含む。バイオプリンタは、創薬のための高スループットスクリーニングの方法に用いることができ、前記方法は、複数のマイクロ組織サンプルを作製するために、バイオインクを前記バイオプリンタの一以上の分注ユニットから分注することと、前記複数のマイクロ組織サンプルの少なくとも一部を、薬剤候補化合物を見つけるために薬剤ライブラリと接触させることと、を含む。マイクロ組織サンプルは腫瘍細胞を備えてもよい。
【００１５】
上述したバージョンのバイオプリンタにおいては、コントローラが、シリンジのボディからバイオインクを分注するためにプランジャの近位端部に向かってアクチュエータを駆動させるために、コントローラ内に格納されたプログラムを実行してもよい。バイオプリンタは、シリンジのボディを囲む温度コントローラ、ノズルのアウトレットからのバイオインクを受けるための温度制御プレート、温度制御プレートに隣接した湿度制御ゾーンを作製するための加湿器を、さらに備えてもよい。バイオプリンタのノズルは、流体源及び流路と流体連通した流体通路を含んでもよい。流通路からの流体が、分注された材料の液滴を分離し、分注された材料の液滴をノズルのアウトレットから出してもよい。バイオプリンタにおいて、各液滴の体積は、１０ナノリットルから１５マイクロリットルの範囲内でもよい。流体源は、流体を供給するための制御可能バルブを備えてもよい。制御可能バルブは、第二コントローラによって制御されてもよい。バイオプリンタの流体源は、パルス流体、パルス空気、ミリ秒パルス空気及びサブミリ秒パルス空気を供給するための制御可能バルブを備えてもよい。バイオプリンタにおいて、各分注ユニットは、非接触分注ユニットでもよく、ノズルは、シリンジのボディと一体でもよく、あるいはノズルは、シリンジのボディと別体でもよい。ノズルのアウトレットの内径は、１００マイクロメートルから３ミリメートルでもよい。バイオプリンタは、分注ユニットを複数備えてもよく、各分注ユニットが、ＸＹＺモーションシステム上に搭載されてもよい。
【００１６】
本開示のバイオプリンタの位置バージョンは、精密に制御されたマイクロスケールで正確なＸＹＺモーションと体積ナノリットル分注性能を有する、生存マイクロ組織を生成するコンピュータ制御のプログラム可能３Ｄバイオプリンタである。
【００１７】
本開示のバイオプリンタの位置バージョンは、ヒト細胞と細胞外基質混合物を、培養皿やマイクロプレートなどの細胞培養容器の表面上に直接プリントする。プリントされた組織は、天然の組織の形態学及び機能を有する。バイオプリンタは二つのモードで動作する。即ち、（１）組織再生を目的として、大量のマイクロ組織をバイオプリントするのに用いられる高速プリンティングモードと、（２）薬剤スクリーニング及び個別治療目的のために、９６又は３８４ウェルプレートの各ウェル内に、一又は特定数のマイクロ組織をバイオプリントする精密プリントモードと、がある。
【００１８】
我々のバイオプリンタは、整列した分注ユニット（例えば、プリンティングヘッド）の位置及び動きを制御するコンピュータ制御のＸＹＺ直線モーションシステムを有する。各分注ユニットは、以下のメカニズムを用いて細胞または基質またはこれら二つの特定の混合物（バイオ−インク）を含む我々の関心組織を分注する。この分注ユニットは、（１）コンピュータによって制御されたリニアアクチュエータ駆動シリンジポンプと、（２）バイオ−インクを保持し、毎回ノズルから所定のナノリットル体積の材料を分注する分注シリンジと、から構成される。ノズルと分注された材料との間には接着力があるため、外力がないと、重力単体によって約５０マイクロリットルかそれ以上の大きな液滴しか生成することができない。我々は、ミリ秒パルス空気分注ユニットを用いて、シリンジのノズルからナノリットルレベルの分注された材料を吹き飛ばしてそれを上記表面上に分注する。短パルス気流は、非常に正確な位置決めを有し、すでに分注された液滴と干渉しない。
【００１９】
プリントされた組織は、薬剤スクリーニングのために高スループットフォーマットである。バイオプリンタは、組織再生及びモデリングのための生存及び機能的マイクロ組織を素早くプリントする。プリントされた組織は、（１）腫瘍細胞、肝細胞及び心筋細胞などのプライマリタイプの細胞(primary type of cells)と、（２）支持細胞と、（３）細胞外基質と、から構成することができ、組織の微小環境が再構成されたことで天然組織のように機能するようになっている。加えて、我々は、軟骨及び骨再生のための基質を有する幹細胞をバイオプリントすることができる。我々は、生きているうちに減少することでしわの原因となる分子であるエラスチンを生成可能な線維芽細胞をバイオプリントできるという理論を立てる。このことは、美容整形に重大な影響を与える。その他のさまざまな組織をプリントする能力は限界がない。
【００２０】
体積非接触分注ユニットは、既存の分注技術よりも優れている。体積分注ユニットは、細胞及び／又は基質混合物を、ナノリットルの分解能で分注ノズルから押し出し、この押し出しはリニアアクチュエータを介して達成される。押し出された細胞−基質混合物は、体積がナノリットルレベルの際は重力ではノズルから落下することができないことから、我々の分注ユニットは、分注を達成するためにノズルから上記混合物を吹き飛ばすために、ミリ秒空気パルスを用いる。バルブベースまたは圧電性のその他の非接触プリンタヘッドは、分注の体積を制御するためにタイミング又は圧力に頼る。これらは異なる粘性材料についキャリブレーションを必要とするが、これに対して我々のプリンタヘッドはこれらを必要としない。
【００２１】
我々は、天然組織に類似した形態学を有するマイクロ組織をプリントすることができる。これを達成するために、我々は、プリンティング中にプリントされたバイオ−インクを部分的に凝固させるためにバイオインクの液滴を温度制御された表面上にプリントし、プリントされたバイオインクが乾かないようにかつ高い細胞生存率を維持するために湿度を制御する。我々の正確な技術により、天然組織と形態学的に同等の組織系をプリントすることができる。
【００２２】
われわれのシステムは、パルス空気を届けるために同軸セットアップ又は非同軸セットアップを用いることができる。非同軸セットアップは、分注された材料の位置制御により優れている。
【００２３】
我々の結果は、天然組織と構成要素は同じである我々のプリントされた腫瘍マイクロ組織が、細胞集合体に比べて、化学療法薬に対する薬物耐性がより高い。加えて、多くのタイプの細胞が、一体にならず、従来の細胞凝集技法に適さない。我々は、それでも、我々のバイオプリンタ／技法を用いて、これらの非凝集組織をプリントすることができる。このことは、より現実的な検査シナリオを表す。
【００２４】
我々のバイオプリントされたマイクロ組織は、インビトロであらかじめ成長され機械的に促進された。インビボに注入された後、組織は、欠損を修復できる大きな組織融合体へと自己組織化する。
【００２５】
我々のバイオプリントされたマイクロ組織は、ヒト生命体への薬剤有効性又は投薬の予測における要求を満たす。
【００２６】
本発明の上記の及びその他の特徴、側面及び利点は、以下の記載、図面及び添付の特許請求の範囲を考慮することでより深く理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明に係わるバイオプリンタの斜視図であり、バイオプリンタの分注ユニットを示す部分分解部分が示されている。
【図２】図１のバイオプリンタの部分側面図であり、分注ユニットは断面で示されている。
【図２Ａ】図１及び図２のバイオプリンタのＸＹＺモーションシステムの斜視図である。
【図３】間充織幹細胞マイクロ組織をバイオプリンティングする本発明の３Ｄバイオプリンタの一形態と、バイオプリントされた間充織幹細胞マイクロ組織を概略的に示す図である。
【図４】マイクロ組織内の間充織幹細胞（ＭＳＣｓ）が、バイオプリンティング後（Ａ）、及び内径（Ｉ．Ｄ．）が１．４ミリメートル（ｍｍ）の針を介した射出後（Ｂ）に、高い細胞生存率(cell viability)を示すことを示している。スケールバーは１００μｍである。
【図５】高密度細胞及び細胞外基質（ＥＣＭ）の組織学的アーキテクチャを明らかにした共焦点像（Ａは３Ｄ；Ｂは断面(section）)を示す。スケールバーは１００μｍである。
【図６】ＭＳＣ（間充織幹細胞）組織の寸法が培養３日後に安定化したことを示し、この時点は移植のために選択されたものである。
【図７】位相画像撮像によって示されるようにＭＳＣ組織が周囲のハイドロゲルにまで大きく成長したことを示す。スケールバーは２５０μｍである。
【図８】Ｃｅｌｌｂｒｉｔｅ（登録商標）蛍光染料の赤色、緑色、青色で標識付けされ、個別のマイクロ組織にそれぞれバイオプリントされたＭＳＣｓを示す。これらが隣接して配置されたときに組織融合が観察された。スケールバーは５００μｍである。
【図９】プリントされたマイクロ組織がＩ．Ｄ．が１．４ｍｍの透明針を通過できることを示す。スケールバーは５００μｍである。マイクロ組織内のＭＳＣｓは、図４のＢに示すように、射出後、高い細胞生存率を示した。
【図１０】軟骨欠損（２．０ｍｍ、Ａの左側が欠損を示す）がブタ関節軟骨外植体において作製されたことを示す。欠損の立体画像（Ａの右側）及び蛍光顕微画像（Ｂ）は、ＭＳＣマイクロ組織の充填を示す。
【図１１】移植後二週間を示し、マイクロ組織で充填されたグループ（Ａ）では欠損が依然として完全に充填されており、これに比べて、ゲル収縮が原因で、ＭＳＣｓとハイドロゲルで充填されたグループ（Ｂ）では空隙が大半である。（Ｃ）は無処置グループである。
【図１２】移植後二週間に、（Ａ）に示す線に沿って外植体を垂直にスライスしたことを示す。スライスされた組織は、細胞生存率解析用染料で染色された。（Ｂ）は、断面界面の蛍光画像である（矢印は欠損の下部を指す）。緑の蛍光は、高い細胞性存率を示す。
【図１３】本発明の３Ｄバイオプリンタの概略図である。
【図１４】（Ａ）は、天然の腫瘍組織に似た形態学を有するバイオプリントされた腫瘍マイクロ組織（ＴＭＴ）のＨ＆Ｅ染色を示す（バー＝１００μｍ）。（Ｂ）は、共焦点顕微鏡法により画像化されたバイオプリントされたＴＭＴの３Ｄボリューム再構成画像を示す。（Ｃ）は、３８４ウェルプレートのウェル内のマイクロ腫瘍組織の代表的な画像を示し、緑の染色は生存細胞を示す（バー＝１００μｍ）。
【図１５】（Ａ）はＴＭＴの代表的な画像を示し、（Ｂ）はヒト内皮細胞で構成されたもの、（Ｃ）はヒト間充織幹細胞で構成されたもの、（Ｄ）はヒトがん細胞で構成されたものを示す（バー＝１００μｍ）。
【図１６】浸潤アッセイを示す。ＴＭＴは、一晩培養された後に周囲の基質に浸潤した。（Ｃ）における赤い領域（中央部）は１日目におけるＴＭＴの元の位置である（バー＝１００μｍ）。
【図１７】低酸素症領域を蛍光緑色に染めることができるＨｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ（登録商標）−Ｇｒｅｅｎキットで染色されたＴＭＴ切断片(ＴＭＴ sections)を示す。バイオプリントされたマイクロ腫瘍組織のコア内にて多数の低酸素細胞が観測された（バー＝１００μｍ）。
【図１８】バイオプリントされ、コラーゲン基質に埋め込まれた内皮マイクロ細胞を示す。バイオプリントされた腫瘍マイクロ組織（矢印）と共培養すると、内皮マイクロ組織の強い毛細管(robust capillary)が出現（急成長）した。ＴＭＴは、単独で又は血管内皮増殖因子の刺激をすると、内皮マイクロ組織よりも高いプロ血管新生効果(pro-angiogenic effect)を示す。
【図１９】３８４ウェルプレート内の二次元腫瘍細胞（Ａ）及びＴＭＴ（Ｂ）を用いた化学療法剤感受性分析を示す。薬物療法の７２時間後、Ｈｏｅｃｈｓｔ染料及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いた生存／死滅細胞染色が行われた。共焦点又は多光子励起顕微鏡を用いて、光学切断片(optical sections)を使用して細胞生存率分析及びＩＣ50の決定が行われた（バー＝５０μｍ）。
【図２０】ＣＡＭモデルを用いて行われた腫瘍マイクロ組織移植を示す。（Ａ）は移植における、（Ｂ）は移植後８日目における、立体顕微ビューを示す。（Ｃ）は、腫瘍組織が周囲の膜組織と共に外科的に除去された様子を示す（バー＝５００μｍ）。
【図２１】ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞及びヒト内皮細胞を用いてバイオプリントされた血管ヒトマイクロ肝組織を示す。血管マイクロ肝組織(vascularized micro liver tissues)は、非血管マイクロ肝細胞(non-vascularized micro liver tissues)（Ｃ：Ｈ＆Ｅ染色、Ｄ：生存−死滅染色）と比べて、有意な高い細胞密度（Ａ：はＨ＆Ｅ染色）及び生存率（Ｂ：生存−死滅染色、青色は生細胞を示し、紫色は死滅細胞を示す）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下の図面を参照した記載において、類似の構成要素には類似の参照符号を用いている。
【００２９】
図１及び図２を参照すると、本発明に係わるバイオプリンタ１０の非限定的な一例が示されている。バイオプリンタ１０は、複数の分注ユニット１２を含んでもよい。図及び説明の簡潔化のため、図１には一つの分注ユニット１２が示されている。分注ユニット１２は、シリンジ１４と、ノズル２５と、アクチュエーション機構３６と、温度コントローラ４３（図１にて点線で示す）と、を含む。
【００３０】
シリンジ１４は、シリンジ１４の中空内部空間１６を画定するボディ１５を有する。典型的には、ボディ１５は、ポリプロピレンなどの、不透明な、半透明な又は透明な高分子材料を含む。シリンジ１４の分注先端部２１によって画定される出口オリフィス２０に近づく方向及びその逆の離れる方向への移動のために、ディスク状の近位端部１８とディスク状の遠位端部１９とを有するプランジャ１７が、シリンジ１４の内部空間１６内に配置される。バイオインク２２が、シリンジ１４の内部空間１６内に含まれる。シリンジ１４のボディ１５の出口オリフィス２０とプランジャの遠位端部１９との間にはバルブは不要である。
【００３１】
ノズル２５は、側壁２６と、インレット２７と、内径が１００マイクロメートルから３ミリメートルでもよいアウトレット２８と、を有する。側壁２６は、インレット２７とアウトレット２８との間の、ノズル２５内の流路２９を画定する。ノズル２５は、ノズル２５内の流路２９と液体連通する流通路３２を画定する液体ポート３１を含む。流体導管３３によって、流体ポート３１の流通路３２が流体源３４と流体連通する。流体ポート３１の流通路３２へ流体を供給するために、制御可能バルブを、流体導管３３と流体源３４との間に配置してもよい。制御可能バルブは、流体源３４から流体ポート３１の流通路３２へとパルス流体(pulsed fluid)（例えば空気）を届けるために制御可能バルブを開閉させるコントローラによって、制御することができる。図示の実施形態の分注ユニット１２において、ノズル２５はシリンジ１４のボディ１５とは別体である。しかしながら、ノズル２５を、シリンジ１４のボディ１５と一体としてもよい。
【００３２】
分注ユニット１２のアクチュエーション機構３６は、コントローラ３７と、主ねじ３９及びディスク状の遠位端部セクション４１を有するアクチュエータ３８とを含む。コントローラ３７は、電装用ケーブル４２を介してアクチュエータ３８に接続されてもよい。シリンジ１４が分注ユニット１２内に設置されると、アクチュエータ３８の遠位端部セクション４１が、プランジャ１７の近位端部１８と接触する。アクチュエータ３８はリニアアクチュエータである。アクチュエータ３８はステッピングモータベースの装置である。アクチュエータ３８は、主ねじ３９及び回転ロッカー機構を介して、アクチュエータ３８内部のステッピングモータの回転を主ねじ３９の直線動作に変換する。遠位端部４１が移動する距離は、ステッピングモータの回転の度合いに依存する。回転の度合いは、コンピュータプログラムから送られる命令を受信するコントローラ３７によって制御される。主ねじ３９は、プランジャ１７の近位端部１８に向かって移動して、バイオインク２２をシリンジ１４のボディ１５から分注する。
【００３３】
分注ユニット１２の温度コントローラ４３は、ペルチェ冷却加熱素子などの温度制御素子４５を囲むハウジング４４を含む。温度コントローラ４３は、シリンジ１４及び分注ノズル２５を囲むために温度制御された筐体を提供する。温度制御された筐体の目的の一つは、バイオインク２２（例えば、細胞及び／又は基質）の温度を所望レベル、大抵は寒く、異なる用途によって時折温めてもよい、に制御することである。
【００３４】
再び図１、２を参照すると、バイオプリンタ１０は、分注ユニット１２から分注されたバイオインク２２を受けるための温度制御プレート５０を含む。温度制御プレート５０は、導線５１を介して電力を受ける抵抗加熱素子あるいはペルチェ冷却加熱素子を備えてもよい。バイオプリンタ１０は、筒状の導流器(flow director)５９を有する加湿器をも含む。加湿器５８は、温度制御プレート５０に隣接する湿度制御ゾーン６１を作製する。バイオインク２２の液滴６６は、ノズル２５のアウトレット２８から出て、温度制御プレート５０上にマイクロ組織６８を作製する。
【００３５】
図２Ａを見ると、バイオプリンタ１０は、支持体Ｘと、支持体Ｙ１と、支持体Ｙ２と、各々が図１に示す分注ユニット１２を収容するハウジングＺ１，Ｚ２，Ｚ３と、を有するＸＹＺモーションシステム８０を含む。駆動制御機構８５は、支持体Ｙ１及び支持体Ｙ２の、図２に示す方向Ａｙ及びＢｙへの互いに近づく及び離れるモーション（動き）を制御する。駆動制御機構８６は、支持体Ｘの、図２に示す方向Ａｘ及びＢｘへのモーション（動き）を制御する。駆動制御機構８７ａ，８７ｂ，８７ｃは、ハウジングＺ１，Ｚ２，Ｚ３の、図２に示す方向Ａｚ及びＢｚへのモーション（動き）を制御する。駆動制御機構８５，８６，８７ａ，８７ｂ，８７ｃは、ハウジングＺ１，Ｚ２，Ｚ３（各々が分注ユニット１２を収容する）のＸＹＺモーションを制御するために、プログラム可能コントローラと電気接続していてもよい。各分注ユニット１２はＺ軸に搭載される。
【００３６】
図２Ａにおいて、３つのＺ軸分注ユニットハウジングＺ１，Ｚ２，Ｚ３が示されているが、この数は非限定的な代表的な数である。分注ユニットの数に対する制限はなく、その数は特定のマイクロ組織のプリントに必要な構成要素の数に依存する。例えば、３つの分注ユニットを使用する場合、（ｉ）３つの分注ユニットが各々同じバイオインクを含むことができ、または（ｉｉ）２つの分注ユニットが同じバイオインクを含み、他の分注ユニットが異なるバイオインクを含むことができ、または（ｉｉｉ）３つの分注ユニットが各々異なるバイオインクを含むことができる。
【００３７】
バイオプリンタ１０の構成要素について記載してきたが、ここからは、バイオプリンタ１０の動作について説明する。ウェルのアレイ（例えば、３８４，１５３６又は３４５６ウェル）を含むマイクロプレートを、分注ユニット１２から分注されるバイオインク２２を受けるために温度制御プレート５０上に配置してもよい。あるいは、ウェルのアレイを有さない他の細胞培養容器（ペトリ皿又は単一ウェルプレートなど）を、温度制御プレート５０上に配置して、分注ユニット１２から分注されるバイオインク２２を直接受けることもできる。
【００３８】
同じ又は異なるバイオインクが充填されたシリンジ１４が、各分注ユニット１２内に設置され、コントローラ３７が、分注シーケンス用にプログラムされる。コントローラ３７は、各アクチュエータ３８の遠位端部セクション４１を、関連するプランジャ１７の近位端部１８に接触させる。ＸＹＺモーションシステム８０は、選択されたウェル（または温度制御プレート５０上の選択された箇所）にわたって分注ユニットを移動させる。コントローラによって各アクチュエータ３８がプレート５０に向かって駆動されると、バイオインク２２はノズル２５内の流路２９内に流れる。制御可能バルブが次に開閉してパルス流体（例えば空気）を流体源３４から流体ポート３１の流通路３２へと送る。パルス流体により、ノズル２５内の流路２９内のバイオインクの流れから分離した液滴６６が生成される。各液滴の体積は、１０ナノリットルから１５マイクロリットルの範囲内でもよい。液滴６６はプレート５０上（又はマイクロプレートのウェル内）に繰り返し配置されて、マイクロ組織サンプル６８（図２参照）が作製される。バイオプリンタ１０は、体積ベース分注を使用し、これは、分注の体積がプランジャ１７の移動距離に線形であることを意味する。
【００３９】
本発明について、説明を意図し限定は意図していない以下の例でさらに説明する。
【００４０】
＜例＞
［例１］
例１は、３Ｄバイオプリンティングを用いて軟骨欠損を修復するための注入可能な間充織幹細胞（ＭＳＣｓ）マイクロ組織の成長(development)を記述する。これは、我々の高速バイオプリンティングのための代表的なプロジェクトであり、このなかで、我々は、ヒト骨髄間充織幹細胞（ＭＳＣｓ）を用いて、マイクロ軟骨及び骨組織をバイオプリントする。我々は、軟骨及び骨再生のためのマイクロ骨組織及びＭＳＣ組み込み組織をバイオプリントすることに成功した。我々のバイオプリントされたマイクロ組織は、インビトロで予め成長され(predeveloped)機械的に増やされた(mechanically enhanced)。インビボに注入された後、組織は、欠損を修復できる大きな組織融合体へと自己組織化した。
【００４１】
・イントロダクション
関節軟骨は本来備わる修復能力が低く、組織工学は関節軟骨修復のための新たなアプローチである。骨髄間充織幹細胞（ＭＳＣｓ）及びバルクハイドロゲルは、観血的手術における軟骨欠損の修復に用いられてきた。関節手術においては最小限に侵襲的なアプローチが常に好ましく、注入可能な、組織工学によって作製された軟骨（以下、組織工学軟骨という）は、軟骨欠損の修復に対する解決法として理想的である。しかしながら、移植における空隙の原因となるハイドロゲルの体積収縮及び機械的性質の低さにより、ＭＳＣｓハイドロゲル注入の応用が制限される。この例では、３Ｄバイオプリンティングを用いて体積が安定したＭＳＣマイクロ組織を開発し、マイクロ組織の自己組織化を介して関節軟骨の欠損を修復することを目的とした。
【００４２】
・方法
１）３Ｄバイオプリンティング
ヒトＭＳＣｓとハイドロゲルからなるバイオインクとの事前最適化組み合わせを備えたマイクロ組織を、本発明の我々のカスタム開発３Ｄバイオプリンタを用いて直接バイオプリントした（図３参照）。
【００４３】
２）細胞生存率
ＭＳＣマイクロ組織における生存／死滅細胞生存率アッセイを、バイオプリンティングの後に行った。
【００４４】
３）形態学
マイクロ組織の形態学を、ＨＥ染色及び共焦点顕微鏡法により調査した。
【００４５】
４）寸法変化
体積変化を分析するために、一連の時点においてマイクロ組織の直径を顕微鏡によって画像化した。
【００４６】
５）単一組織３Ｄ成長（out growth）
マイクロ組織を９６ウェルプレート内のハイドロゲルに埋め込み、倒立顕微鏡のもとで組織の成長を観察した。
【００４７】
６）多重組織融合／集合
ＭＳＣｓを、Ｃｅｌｌｂｒｉｔｅ（登録商標）蛍光染料（それぞれ、赤色、緑色、青色）で標識付けして、複数のマイクロ組織を超低接着表面上に配置して、異なる時点における組織融合を観察した。
【００４８】
７）注入性
媒体内に懸濁されたバイオプリントされたマイクロ組織を、１．４ｍｍＩ．Ｄ．を有する針に通過させ、生存／死滅染色によって細胞生存率を分析した。
【００４９】
８）軟骨外植体培養モデルにおける軟骨欠損修復
直径が２ｍｍの欠損を、ブタ関節軟骨外植体に作製した。欠損はＭＳＣマイクロ組織で充填されて、融合の結果(integration outcome)が評価された。ＭＳＣハイドロゲルを対照群として使用した。また、２週間の培養後の細胞生存率を調査するために、生存／死滅染色を行った。
【００５０】
・結果
図３は、間充織幹細胞マイクロ組織をバイオプリンティングする本発明の３Ｄバイオプリンタの一形態と、バイオプリントされた間充織幹細胞マイクロ組織を概略的に示す図である。
【００５１】
図４は、マイクロ組織内の間充織幹細胞（ＭＳＣｓ）が、（Ａ）バイオプリンティング後、及び（Ｂ）内径（Ｉ．Ｄ．）が１．４ミリメートル（ｍｍ）の針を介した射出後に、高い細胞生存率を示すことを示す。スケールバーは１００μｍである。
【００５２】
図５は、高密度細胞及びＥＣＭの組織学的アーキテクチャを明らかにした共焦点像（Ａは３Ｄ；Ｂは断面(section）)を示す。スケールバーは１００μｍである。
【００５３】
図６は、ＭＳＣ組織の寸法が培養３日後に安定化したことを示し、この時点は移植のために選択されたものである。
【００５４】
図７は、位相画像撮像によって示されるようにＭＳＣ組織が周囲のハイドロゲルにまで大きく成長したことを示す。スケールバーは２５０μｍである。
【００５５】
図８は、Ｃｅｌｌｂｒｉｔｅ（登録商標）蛍光染料の赤色、緑色、青色で標識付けされ、個別のマイクロ組織にそれぞれバイオプリントされたＭＳＣｓを示す。これらが隣接して配置されたときに組織融合が観察された。スケールバーは５００μｍである。
【００５６】
図９は、プリントされたマイクロ組織がＩ．Ｄ．が１．４ｍｍの透明針を通過できることを示す。スケールバーは５００μｍである。マイクロ組織内のＭＳＣｓは、図４（Ｂ）に示すように、射出後、高い細胞生存率を示した。
【００５７】
図１０は、軟骨欠損（２．０ｍｍ、（Ａ）の左側が欠損を示す）がブタ関節軟骨外植体において作製されたことを示す。欠損の立体画像（（Ａ）の右側）及び蛍光顕微画像（Ｂ）は、ＭＳＣマイクロ組織の充填を示す。
【００５８】
図１１は、移植後二週間を示し、マイクロ組織で充填されたグループ（Ａ）では欠損が依然として完全に充填されており、これに比べて、ゲル収縮が原因で、ＭＳＣｓとハイドロゲルで充填されたグループ（Ｂ）では空隙が大半である。（Ｃ）は無処置グループである。
【００５９】
図１２は、移植後二週間に、（Ａ）に示す線に沿って外植体を垂直にスライスしたことを示す。スライスされた組織は、細胞生存率解析用染料で染色された。（Ｂ）は、断面界面の蛍光画像である（矢印は欠損の下部を指す）。緑の蛍光は、高い細胞性存率を示す。
【００６０】
・結論
例１では、ＭＳＣマイクロ組織を作製するための３Ｄバイオプリンティングにおける新たなアプローチを開発することに成功し、これは、関節軟骨欠損を最小限に侵襲的に修復する見込みを示す。
【００６１】
［例２］
例２は、薬剤開発及び個別がん治療のための腫瘍マイクロ組織の高スループット３Ｄバイオプリンティングを記述する。
【００６２】
・イントロダクション
がんは、２０１４年の米国の全ての死亡の約２５％の原因となっている。インビトロ抗がん剤スクリーニングは、製薬業界及び患者への化学療法剤感受性試験において広く使用されている。しかしながら、これまでは、２Ｄアッセイ及びシンプルな３Ｄ培養モデルだけしか用いられていなかった。しかしながら、これらのモデルは、天然腫瘍の微小環境には類似しておらず、あるいは薬物感受性の予測が不正確であった。この例において、我々は、高スループットスクリーニングのための、天然腫瘍の特性に類似した、腫瘍マイクロ組織（ＴＭＴｓ）の新規の３Ｄバイオプリントモデルを報告する。我々は、様々な側面における３Ｄバイオプリント腫瘍の特性について述べる。
【００６３】
・方法
３Ｄバイオプリンティング
腫瘍細胞、間質細胞及びＥＣＭからなるバイオインクを、本発明の我々のカスタム開発３Ｄバイオプリンタ内に装填した。マイクロ腫瘍組織を、９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートの各ウェル内に直接バイオプリントした。生存／死滅染色を用いて、組織内の細胞の生存率を分析した。図１３は、３Ｄバイオプリンタの概略図を示す。
【００６４】
形態学的特徴
ＴＭＴｓを、低温切断(cryosectioned)又は光学切断(optical sectioned)し、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ又はＨＥ）染色、共焦点及び多光子顕微鏡法によりそれぞれ分析した。
【００６５】
低酸素微小環境分析
低酸素症領域を蛍光緑色で標識付けするＨｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ（登録商標）−Ｇｒｅｅｎキットを用いてＴＭＴ低温切断片を染色した。
【００６６】
浸潤アッセイ
ＴＭＴｓを最初にプリントし、細胞を含まない余分なバイオインクを腫瘍組織の周囲にプリントした。位相コントラスト又は蛍光イメージングを用いて、基質内への腫瘍の浸潤を分析した。
【００６７】
血管新生アッセイ
腫瘍組織によって分泌されたプロ血管新生生体分子を分析するため。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）のみからなるバイオプリントされたマイクロ組織及び基質が、コラーゲンハイドロゲル内に埋め込まれ、バイオプリントされたＴＭＴと共培養され、位相コントラスト及び蛍光顕微鏡法によって血管新生発芽(angiogenesis sprouting)を分析した。
【００６８】
化学療法剤感受性試験
３ＤバイオプリントＴＭＴ及び従来の２Ｄ細胞の化学療法剤感受性試験を決定するために、細胞及びＴＭＴｓを３８４ウェルプレートの各ウェルに入れられる(plated into each well)。薬剤が７２時間追加され、生存/死滅蛍光を行った。共焦点または多光子顕微鏡法を用いて、３Ｄと２Ｄのそれぞれにおける細胞生存率を分析した。
【００６９】
インビボ移植
しょう尿膜アッセイ（ＣＡＭ）を用いて、インビボで腫瘍原性を評価した。ＴＭＴｓを、発達８日目の成長期のＣＡＭｓの上部に移植した。１６日目に、立体顕微鏡を用いて各卵を画像化した。さらなる組織学的分析のために、腫瘍を周囲の膜と共に除去し、４％パラホルムアルデヒド内に固定した。
【００７０】
・結果
図１４の（Ａ）は、天然の腫瘍組織に似た形態学を有するバイオプリントされた腫瘍マイクロ組織（ＴＭＴ）のＨ＆Ｅ染色を示す（バー＝１００μｍ）。（Ｂ）は、共焦点顕微鏡法により画像化されたバイオプリントされたＴＭＴの３Ｄボリューム再構成画像を示す。（Ｃ）は、３８４ウェルプレートのウェル内のマイクロ腫瘍組織の代表的な画像を示し、緑の染色は生存細胞を示す（バー＝１００μｍ）。
【００７１】
図１５の（Ａ）はＴＭＴの代表的な画像を示し、（Ｂ）はヒト内皮細胞で構成されたもの、（Ｃ）はヒト間充織幹細胞で構成されたもの、（Ｄ）はヒトがん細胞で構成されたものを示す（バー＝１００μｍ）。
【００７２】
図１６は浸潤アッセイを示す。ＴＭＴは、一晩培養された後に周囲の基質に浸潤した。（Ｃ）における赤い領域（中央部）は１日目におけるＴＭＴの元の位置である（バー＝１００μｍ）。
【００７３】
図１７は、低酸素症領域を蛍光緑色に染めることができるＨｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ（登録商標）−Ｇｒｅｅｎキットで染色されたＴＭＴ切断片を示す。バイオプリントされたマイクロ腫瘍組織のコア内にて多数の低酸素細胞が観測された（バー＝１００μｍ）。
【００７４】
図１８は、バイオプリントされ、コラーゲン基質に埋め込まれた内皮マイクロ細胞を示す。バイオプリントされた腫瘍マイクロ組織（矢印）と共培養すると、内皮マイクロ組織の強い毛細管が出現（急成長）した。ＴＭＴは、単独で又は血管内皮増殖因子の刺激をすると、内皮マイクロ組織よりも高いプロ血管新生効果を示す。
【００７５】
図１９は、３８４ウェルプレート内の二次元腫瘍細胞（Ａ）及びＴＭＴ（Ｂ）を用いた化学療法剤感受性分析を示す。薬物療法の７２時間後、Ｈｏｅｃｈｓｔ染料及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いた生存／死滅細胞染色が行われた。共焦点又は多光子励起顕微鏡を用いて、光学切断片を使用して細胞生存率分析及びＩＣ50の決定が行われた（バー＝５０μｍ）。
【００７６】
図２０は、ＣＡＭモデルを用いて行われた腫瘍マイクロ組織移植を示す。（Ａ）は移植における、（Ｂ）は移植後８日目における、立体顕微ビューを示す。（Ｃ）は、腫瘍組織が周囲の膜組織と共に外科的に除去された様子を示す（バー＝５００μｍ）。
【００７７】
・結論
我々は、天然の腫瘍組織の特性の多くに類似した特性を有する腫瘍マイクロ組織をインビトロで作製するための高スループット３Ｄバイオプリンティングシステムの開発に成功した。したがって、このシステムは、抗がん剤のスクリーニング及び個別がん治療用の高感受性薬剤の選択のための有力なツールであることが示された。
【００７８】
［例３］
我々は、肝組織を３Ｄバイオプリントした。具体的には、我々は、ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞及びヒト内皮細胞を用いて血管ヒトマイクロ肝組織をバイオプリントすることに成功した。図２１に示すように、血管マイクロ肝組織は、非血管マイクロ肝細胞（（Ｃ）及び（Ｄ））と比べて、有意な高い細胞密度（（Ａ））及び生存率（（Ｂ））を示す。
【００７９】
したがって、本発明は、三次元マイクロ組織バイオプリンタと、三次元マイクロ組織バイオプリンタを用いるための方法を、提供する。我々は、精密に制御されたマイクロスケールで正確なＸＹＺモーションと体積ナノリットル分注性能を有する、生存マイクロ組織を生成するためのコンピュータ制御のプログラム可能３Ｄバイオプリンタを開示してきた。我々は、多能性幹細胞、骨髄由来間充織幹細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、ヒト内皮細胞、肝細胞、及び多くの異なる腫瘍細胞を含む多くの異なるタイプの細胞を有する多くのタイプの組織をプリントした。
【００８０】
我々は、高スループット薬剤スクリーニング及び治療目的のために、マイクロ腫瘍組織をバイオプリントした。我々は、形態学、機能、バイオマーカー、微小環境、３Ｄ構造、並びに浸潤及び薬剤感受性を含む、プリントされた腫瘍組織の多くの側面を特徴付けた。腫瘍のバイオプリンティングに経験があることから、細胞が異なるだけで同じ技術手法を必要とするマイクロ心臓及び肝組織プリンティングも成功すると予測される。我々は、肝組織を３Ｄバイオプリントした。
【００８１】
我々は、上述のように３Ｄバイオプリントされた腫瘍組織を用いて抗がん剤スクリーニングを行った。これは、化学療法薬及び放射線治療感受性増強薬を含む、しかしこれらに限定されない、新たな抗がん剤の開発のために製薬業界にとって望ましいサービスである。利点として、我々のシステムは、より著しく迅速なかつ顕著に低い開発コストでの開発（動物実験無し）をアシストすることができる点が挙げられる。さらに、バイオプリントされた組織の３Ｄ性質は、現在採用されている２Ｄ培養細胞スクリーニングより正確な評価を可能にするとともに、費用と時間が節約できる。
【００８２】
本発明は、個別がん治療に用いられてもよい。手術又は生検後に個々の患者から分離されたがん細胞を用いる三次元バイオプリンティング腫瘍組織を、化学療法薬及び放射線治療感受性増強薬を含む、しかしこれらに限定されない、個々の患者に対する（複数の）感受性薬剤又は感受性薬剤の（複数の）組み合わせの決定に用いることができる。３Ｄ腫瘍組織はインビボ状況にかなり類似することから、がん専門医が患者に対する最良の投薬計画をみつけるのをより正確に助けることができる。
【００８３】
本発明は、最小限に侵襲的な手術を介する軟骨及び骨組織再生に用いることができる。
【００８４】
本発明は、製薬業界のための薬物代謝検査に用いることができる。薬剤の代謝プロファイルの開発下にある薬剤を高スループットで検査するために、我々の３Ｄバイオプリントマイクロ肝組織を用いることができる。
【００８５】
本発明は、製薬業界のための薬物毒性スクリーニングに用いることができる。製薬業界において候補薬物の毒性をスクリーンするために、我々の３Ｄバイオプリントマイクロ肝及び心臓組織を用いることができる。
【００８６】
本発明は、本明細書において特定の実施形態を参照して詳細に記載されているが、本発明は、例示を目的とし限定を意図しない上記の実施形態以外によっても実施できることは、当業者に明らかである。したがって、本明細書に添付の特許請求の範囲は、本明細書に記載の実施形態に限定されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図２Ａ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【国際調査報告】
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