(57)【要約】  本発明は、標的動物に対するＩＢＤＶ由来のＶＰ２遺伝子およびＮＤＶ由来のＦ遺伝子を含む組換えＨＶＴを含む新規かつ改良ＨＶＴベクターＮＤ−ＩＢＤワクチンに関する。該組換えＨＶＴは家禽用ワクチンにおいて使用可能であり、それは、先行技術の構築物と比べて良好なウイルスベクター複製、ＮＤＶ  ＦおよびＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子の有効な発現、ＮＤおよびＩＢＤに対する改良された免疫防御、ならびに改良された遺伝的安定性を示した。【選択図】図１
2018501792.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．マウスサイトメガロウイルス前初期１遺伝子（ｍＣＭＶ−ＩＥ１）プロモーター、
ｂ．伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）ウイルスタンパク質２（ＶＰ２）遺伝子、
ｃ．転写ターミネーター、
ｄ．ヒトサイトメガロウイルス前初期１遺伝子（ｈＣＭＶ−ＩＥ１）プロモーター、
ｅ．ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）融合（Ｆ）タンパク質遺伝子
を５’から３’への方向で且つこの順序で含む組換えＤＮＡ発現カセット。
【請求項２】
ｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターは完全プロモーターである；ＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子は古典的なタイプのＩＢＤＶからのＶＰ２タンパク質をコードする；転写ターミネーターはターミネーター領域およびポリＡ領域の両方を含む；転写ターミネーターはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来する；ｈＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターはコアプロモーターである；ＮＤＶ  Ｆ遺伝子は長潜伏期性ＮＤＶ株に由来する；発現カセットは、ＮＤＶ  Ｆ遺伝子の下流に位置する追加的転写ターミネーターを含む；ならびに追加的転写ターミネーターはｈＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子に由来することからなる群から選択される条件の１以上または全部が適用される、請求項１記載の組換えＤＮＡ発現カセット。
【請求項３】
請求項１または２のいずれか１項記載の組換えＤＮＡ発現カセットを含む組換えＤＮＡ分子。
【請求項４】
請求項１または２のいずれか１項記載の組換えＤＮＡ発現カセットを含む組換えシチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴ）であって、該発現カセットが組換えＨＶＴのゲノムのＵｓ領域内に挿入されている、組換えシチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴ）。
【請求項５】
請求項４記載の組換えＨＶＴを含む宿主細胞。
【請求項６】
請求項１または２のいずれか１項記載の組換えＤＮＡ発現カセットを組換えＨＶＴのゲノムのＵｓ領域内に挿入することを含む、請求項４記載の組換えＨＶＴの構築のための方法。
【請求項７】
請求項４記載の組換えＨＶＴおよび／または請求項５記載の宿主細胞と医薬上許容される担体とを含む家禽用ワクチン。
【請求項８】
少なくとも１つの追加的免疫活性成分を含む、請求項７記載のワクチン。
【請求項９】
・請求項４記載の組換えＨＶＴを宿主細胞に感染させ、
・感染宿主細胞を回収し、
・回収感染宿主細胞を医薬上許容される担体と混合する工程を含む、請求項７記載のワクチンの製造方法。
【請求項１０】
家禽用ワクチンにおける使用のための、請求項４記載の組換えＨＶＴ。
【請求項１１】
請求項１または２のいずれか１項記載の発現カセット、請求項３記載の組換えＤＮＡ分子、請求項４記載の組換えＨＶＴ、請求項５記載の宿主細胞またはそれらの任意の組合せの、家禽用ワクチンの製造のための使用。
【請求項１２】
ＩＢＤＶおよび／もしくはＮＤＶによる感染または疾患の関連徴候を予防または軽減するための、請求項７または８のいずれか１項記載のワクチンの使用。
【請求項１３】
請求項７または８のいずれか１項記載のワクチンを家禽に投与することを含む、ＩＢＤＶおよび／もしくはＮＤＶによる感染または疾患の関連徴候を予防または軽減するための方法。
【請求項１４】
請求項７または８のいずれか１項記載のワクチンを家禽に接種する工程を含む、家禽のワクチン接種の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は獣医用ワクチンの分野、すなわち、ウイルスベクターとしての組換えシチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴ）に基づく、ＮＤおよびＩＢＤに対する家禽用ワクチンに関する。特に、本発明は組換えＤＮＡ発現カセット、該組換えＤＮＡ発現カセットを含む組換えＨＶＴ、該組換えＨＶＴに基づく又は該組換えＨＶＴを含む宿主細胞に基づく家禽用ワクチンに関する。更に、本発明は、該ワクチンの製造および使用のための、該発現カセット、該組換えＨＶＴおよび該宿主細胞の使用および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マレック病（ＭＤ）は、世界中で発生している、家禽の高感染性疾患であり、幾つかの器官および神経におけるＴ細胞リンパ腫の存在により特徴づけられる。これは種々の症状、とりわけ、麻痺および死を招く。新たに生まれたニワトリは免疫母体からの母体由来抗体（ＭＤＡ）により防御されうる。ＭＤは、アルファヘルペスウイルス科およびマルディウイルス属に属するマレック病ウイルス（ＭＤＶ）により引き起こさる。そのビリオンは包膜されており、約１６０ｎｍのサイズを有する。カプシド内には１００〜２００ｋｂｐのサイズの線状二本鎖ＤＮＡの大きなゲノムが含まれる。
【０００３】
種々のＭＤＶ血清型が存在し、それぞれは異なる特徴を有する。ＭＤＶ血清型１（ＭＤＶ１）およびＭＤＶ２は家禽に対して病原性であるが、ＭＤＶ３はそうではない。ＭＤＶ３は、シチメンチョウヘルペスウイルス１、七面鳥ヘルペスウイルスとして、より一般に公知であるが、典型的にはシチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴ）として公知である。ＨＶＴは、ニワトリに対して非病原性であるシチメンチョウヘルペスウイルスとして１９７０年に記載された（Ｗｉｔｔｅｒら，１９７０，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．３１，ｐ．５２５）。それ以来、ＰＢ１またはＦＣ−１２６のようなＨＶＴ株が、ＭＤＶ１またはＭＤＶ２により引き起こされるＭＤに対してニワトリにワクチン接種するために一般的に使用されてきた。より高い病原性のＭＤＶ１変異体に対する防御が必要な場合には、ＨＶＴはＭＤＶ２ワクチン株、例えばＮｏｂｉｌｉｓ（商標）Ｍａｒｅｘｉｎｅ  ＣＡ１２６＋ＳＢ１（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）または弱毒化ＭＤＶ１ワクチン株、例えばＲｉｓｐｅｎｓ、例えばＮｏｂｉｌｉｓ（商標）ＲＩＳＭＡＶＡＣ＋ＣＡ１２６（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）におけるものと組合せて使用される。
【０００４】
ＨＶＴはトリ末梢血リンパ球（ＰＢＬ）において複製され、したがって、主に細胞性免疫系を対象とする長期間の免疫応答を誘導する全身性ウイルスである。
【０００５】
ＨＶＴワクチンは凍結ＨＶＴ感染細胞として商業的に入手可能であり、若い齢のニワトリに適用されうる。なぜなら、それは、例えばＭＤＡの場合のように、ＨＶＴに対する抗体に比較的に非感受性だからである。新生ニワトリはその最初の日からＭＤＶの感染の圧力に直面し、したがって、ＨＶＴワクチンがニワトリに可能な限り早く、例えば卵からのその孵化の日（第１日）または更にはまだ卵内に存在する孵化前に接種される。この最後のアプローチはいわゆる「卵内ワクチン接種」と称され、孵化の約３日前の、胚発生（ＥＤ）の第１８日に一般に適用される胚ワクチン接種の一形態である。
【０００６】
ワクチン自体として使用されることに加えて、ＨＶＴは家禽への種々の免疫原性タンパク質の発現および運搬のためのウイルスベクターワクチンとしても使用される（例えば、ＷＯ  ８７／０４４６３を参照されたい）。典型的には、発現される遺伝子は、ワクチン接種が要求される、家禽に病原性である微生物の防御抗原（の一部）をコードしている。長年にわたり、例えばニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）（Ｓｏｎｄｅｒｍｅｉｊｅｒら，１９９３，Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ．１１，ｐ．３４９−３５８）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）（Ｄａｒｔｅｉｌら，１９９５，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２１１，ｐ．４８１−４９０）からの及び寄生虫抗原（Ｃｒｏｎｅｎｂｅｒｇら，１９９９，Ａｃｔａ  Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．４３，ｐ．１９２−１９７）の多数の異種遺伝子がＨＶＴベクターにおいて発現されている。
【０００７】
したがって、家禽へのＨＶＴベクターワクチンの投与は発現異種遺伝子に対する及びＭＤから防御するＨＶＴに対する免疫応答を生成する。これは種々の市販のＨＶＴベクターワクチン製品、例えば、ＮＤＶＦタンパク質遺伝子：Ｉｎｎｏｖａｘ（商標）−ＮＤ（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）およびＶｅｃｔｏｒｍｕｎｅ（商標）ＨＶＴ−ＮＤＶ（Ｃｅｖａ）、またはＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子：Ｖａｘｘｉｔｅｋ（商標）ＨＶＴ＋ＩＢＤ（Ｍｅｒｉａｌ；旧称Ｇａｌｌｉｖａｃ（商標）ＨＶＴ−ＩＢＤ）およびＶｅｃｔｏｒｍｕｎｅ（商標）ＨＶＴ−ＩＢＤ（Ｃｅｖａ）において適用される。
【０００８】
あるいは、ＨＶＴベクターは、ニワトリの免疫応答を操作するために、治療用タンパク質、例えばサイトカインの発現および運搬のために使用されうる（ＷＯ  ２００９／１５６．３６７；Ｔａｒｐｅｙら，２００７，Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ．２５，ｐ．８５２９−８５３５）。
【０００９】
ＨＶＴのゲノムヌクレオチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）からＡＦ２９１８６６（株ＦＣ−１２６）として入手可能である。異種遺伝子をＨＶＴ内に挿入するための幾つかの方法が記載されており、例えば、異種組換え（Ｓｏｎｄｅｒｍｅｉｊｅｒら，前掲）、コスミド再生（ＵＳ  ５，９６１，９８２）またはバクミド（細菌人工染色体）（Ｂａｉｇｅｎｔら，２００６，Ｊ．ｏｆ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．８７，ｐ．７６９−７７６）の使用が挙げられる。
【００１０】
ＨＶＴゲノムへの異種遺伝子構築物の挿入のための多数の遺伝的位置が研究されており、幾つかの適切な非必須遺伝子座が記載されており、例えば、ＨＶＴゲノムのユニーク短（Ｕｓ）領域（ＥＰ  ４３１．６６８）またはＨＶＴユニーク長（ＵＬ）領域（ＥＰ７９４．２５７）におけるものが挙げられる。
【００１１】
ＨＶＴ用の発現カセットにおける異種遺伝子の発現を駆動するために種々のプロモーターが使用されており、例えば、ＰＲＶ  ｇｐＸプロモーター（ＷＯ  ８７／０４４６３）、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーター、ニワトリベータアクチン遺伝子プロモーター（ＥＰ  １．２９８．１３９）、またはヒトサイトメガロウイルス由来の前初期１遺伝子プロモーター（ｈＣＭＶ  ＩＥ１）（例えば、ニワトリベータ）もしくはマウスサイトメガロウイルス由来の前初期１遺伝子プロモーター（ｍＣＭＶ  ＩＥ１）が挙げられる（ＥＰ  ７２８．８４２を参照されたい）。最近、ＮＤＶおよびＩＢＤＶの両方からの抗原を単一構築物から発現するＨＶＴベクターワクチンが記載された（ＷＯ  ２０１３／０５７．２３５）。
【００１２】
組換えベクターの構築の場合、ベクターゲノム内に挿入されるべき異種核酸は、通常、抗原（の少なくとも免疫原性部分）をコードする少なくとも１つの異種遺伝子またはコード領域を含む。また、構築物は、異種遺伝子の発現を駆動するためのプロモーター配列、および調節シグナル、例えばエンハンサーまたは転写ターミネーターを含みうる。そのような組合されたインサートは、しばしば、「発現カセット」と称される。
【００１３】
ベクターのゲノム内への発現カセットの挿入の効果は、それが挿入される位置および様態によって異なる。ゲノム上の最終結果が遺伝物質の付加であるのか、置換であるのか、または欠失であるのかによって、ベクターゲノムは、サイズが、それぞれ、より大きく、同じに、またはより小さくなりうる。また、ゲノムのコード化、非コード化または調節領域内に配置される場合、挿入の位置が影響を及ぼしうる。とりわけ、これらの選択は、得られるベクターワクチンの特性に、その複製および発現の能力ならびにその遺伝的安定性に関して影響を及ぼす。
【００１４】
厳密な構築物が何であるにせよ、挿入される発現カセットは、生組換えウイルスベクターがその安定性および有効性に対する幾つかの生物学的ストレスを克服することを可能にするものでなければならない。第１に、異種インサートを受容した後に複製し、後代を生成する能力が挙げられる。これは、組換えベクターウイルス自体が、そのゲノム内への挿入にもかかわらず、尚も生存可能であることを示す。第２に、異種インサートの複製および発現を正確かつ完全に維持しながら、多数のサイクルにわたって宿主細胞系においてインビトロで複製する能力が挙げられる。これは、組換え体がその挿入によっては複製において減弱されず、挿入発現カセットが安定に維持され、発現されることを示す。第３に、インビボでの複製および発現が挙げられる。これは、組換えウイルスが、生きた動物において、例えばその免疫系によって課される、強い選択圧を克服しうること示す。この環境においては、ベクターによる異種遺伝子の発現の消失は、動物における、より速い複製に有利であろう。そのような「エスケープ突然変異体」は外来遺伝子内またはその調節配列内に突然変異または大きな欠失を獲得していた可能性があり、この突然変異体は無傷ウイルスベクターよりもよく増殖しうるであろう。最後に、最も重要なことに、標的におけるベクターの複製および異種遺伝子の発現は、ベクターが発現する異種インサートのドナーであった微生物に対する有効な免疫応答を生成しうることが必要である。
【００１５】
したがって、組換えベクターワクチンは、標的において防御免疫応答を誘導し維持するためには、インビトロおよびインビボの両方におけるベクターおよびそのインサートの良好な複製ならびにインビボにおける異種遺伝子の有効な発現（好ましくは、高レベルで経時的に一貫した発現）をもたらす必要がある。
【００１６】
特徴のこの組合せは、接種標的動物においてベクターワクチンが複製している場合、大規模生産に必要な並びに挿入外来遺伝子の連続的な発現および宿主免疫系に対する提示に必要な広範なインビトロ複製ラウンドを可能にするであろう。また、政府機関または規制当局から販売許可を得た後で市販品として現場に導入される組換えウイルスが満たさなければならない非常に高い安全性基準および生物学的安定性に適合するためには、複製および発現におけるこの安定性がベクターワクチンに要求される。
【００１７】
ニューカッスル病（ＮＤ）および伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤ）は、世界中で発生する家禽の重要な疾患であり、動物愛護および経済運営の点で家禽産業に深刻な悪影響を及ぼしうる。これは、例えば、‘Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｍａｎｕａｌ（２０１０，１０ｔｈ  ｅｄ．，２０１０，Ｃ．Ｍ．Ｋａｈｎ編，ＩＳＢＮ：０９１１９１０９３Ｘ）および‘Ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｆ  ｐｏｕｌｔｒｙ’（２００８，１２ｔｈ  ｅｄ．，Ｙ．Ｓａｉｆ編，Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖ．ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ−１０：０８１３８０７１８２）のようなハンドブックに記載されている。
【００１８】
ＮＤは、モノネガウイルス目、特にパラミクソウイルス科に属するニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）により引き起こされ、それらの病原性に応じて異なる病原型に分類されうる。非病原性の長潜伏期型ＮＤＶは家禽においてほとんど症状を引き起こさない。これとは対照的に、亜病原性（中程度の病原性）および短潜伏期性（高病原性）ＮＤＶ株は広範な疾患および致死を引き起こし、したがって、多数の国では届出伝染病である。疾患症状には呼吸器および神経異常が含まれ、最も顕著な徴候としては喘鳴および「甲状腺炎」が挙げられる。
【００１９】
商業的家禽業においては、病原性ＮＤＶ株により引き起こされる感染および／または疾患に対する防御は、典型的には孵化日における、生長潜伏期性ＮＤＶ株、例えばＮｏｂｉｌｉｓ（商標）ＮＤ  Ｃｌｏｎｅ  ３０（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）での家禽の通常のワクチン接種により達成される。
【００２０】
ＮＤＶは非セグメント化マイナスセンス一本鎖ＲＮＡゲノムを有し、これは約１５ｋｂのサイズであり、６つの遺伝子を含有し、その代表例としては融合（Ｆ）糖タンパク質の遺伝子が挙げられる。Ｆタンパク質は宿主細胞へのＮＤＶの付着および侵入に関与し、免疫優性タンパク質として、それはＮＤＶに対する有効な免疫応答の基礎となりうる。ＮＤＶ  Ｆタンパク質は天然Ｆ０タンパク質として発現され、これは細胞外ペプチダーゼによる切断の際に活性化される。
【００２１】
ＩＢＤは、ビルナウイルス科のメンバーである、「ガンボロ病ウイルス」とも称される伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）により引き起こされる。これらのウイルスは、二本鎖ＲＮＡの２つのセグメント（ＡおよびＢ）からなるゲノムを有する。大きいほうのセグメントＡは１１０ｋＤａのポリタンパク質をコードしており、ついでこれは自己タンパク質分解により切断されて成熟ウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を形成する。これらのうち、ＶＰ２およびＶＰ３はビリオンの構造カプシドタンパク質であり、ＶＰ２は主要宿主防御免疫原である。
【００２２】
ＩＢＤＶの場合、血清型１および２の２つの血清型が存在する．それらの２つの血清型はウイルス中和（ＶＮ）試験により区別されうる。血清型１ウイルスはニワトリに対して病原性であることが示されており、血清型２  ＩＢＤＶはシチメンチョウにおいて亜急性疾患を引き起こすに過ぎない。
【００２３】
歴史的には、ＩＢＤＶ血清型１ウイルスは、「古典的」ＩＢＤウイルスとして公知の１つの型のみからなるものであった。その後、いわゆる「変異体」ＩＢＤＶ株が出現し、これは、モノクローナル抗体のパネルを使用するウイルス中和試験により又はＲＴ−ＰＣＲにより特定され識別されうる。これはＷｕら（２００７，Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｖｏｌ．５１，ｐ．５１５−５２６）により概説されている。よく知られている古典的ＩＢＤＶ株はＤ７８、ファラグハー（Ｆａｒａｇｈｅｒ）５２／７０、およびＳＴＣである。
【００２４】
ＩＢＤＶは、鳥類の必須免疫器官であるファブリキウス嚢をその主要標的として、鳥類リンパ組織の急性高感染性ウイルス感染を引き起こす。感受性群における罹患率は高く、急激な体重減少および中等度ないし高度の死亡率を伴う。この疾患から回復する鳥類はファブリキウス嚢（の一部）の破壊による免疫不全を有しうる。このため、それらは二次感染を受けやすくなる。
【００２５】
ＩＢＤに対して通常のワクチン接種は、弱毒化ＩＢＤＶ株を使用して家禽の一生における可能な限り早い時期に行われるが、これらは、ＩＢＤＶに対するＭＤＡのレベルが十分に減少した時（これは一般には孵化後１５〜２０日の間のあたりである）にのみ適用可能である。多数の「生」または不活化ＩＢＤＶワクチンが商業的に入手可能である（例えば、Ｎｏｂｉｌｉｓ（商標）Ｇｕｍｂｏｒｏ  Ｄ７８（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）のような「生」ワクチン）。
【００２６】
費用効率を達成するための一般的なアプローチは、抗原の組合せを含む獣医用ワクチンを設計することである。このようにして、１回のワクチン接種ラウンドで一度に多数の疾患に対して動物を免疫することができる。これにより、時間および労力が節約できるだけでなく、そうでなければ反復ワクチン接種を受けなければならないことから生じるワクチン接種動物への不快感およびストレスも軽減される。これは、個々の注射により投与される必要があるワクチン（例えば、ウイルスベクターとしての組換えＨＶＴに基づくワクチン）に、より一層よく当てはまり、したがって、この場合の組合せワクチンも非常に望ましく、ＨＶＴベクター自体からのＭＤＶ防御に加えて、幾つかの異なる疾患に対して一度で防御可能であることは大きな利点となろう。しかし、従来、単一の異種遺伝子インサートを含有する２つの別々のＨＶＴベクターの単なる組合せは失敗に終わっている。複製ベクター間の干渉がワクチン接種標的において一方または他方を抑制状態にした。したがって、研究は単一組換えＨＶＴベクターからの２以上の異種抗原の組合された発現および運搬に焦点を合わせている。
【００２７】
幾つかの刊行物は、多遺伝子インサートを含むＨＶＴベクター構築物を記載している。例えば、ＷＯ  ９３／０２５．６６５およびＷＯ  ９６／００５．２９１は二価および三価「ワクチン」を記載している（同様に、ＥＰ  ７１９．８６４およびＥＰ  １．０２６．２４６も）。しかし、記載されている多遺伝子構築物のほとんどは単に示唆されているに過ぎず、複数のインサートを含有する組換えベクターの幾つかだけが実際に構築され単離されたに過ぎない。ニワトリにおいてこれまでに試験されたのは非常に少数である。全体としては、複製の際のそれらの安定性または外来遺伝子発現レベルに関する結果は示されておらず、ましてや、標的動物における有効な免疫防御の誘導に関するデータは全く示されていない。
【００２８】
実際、十分に試験されており、３以上のトリ病原体に対する有効なベクターワクチンであることが実証されている構築物としては、多遺伝子ＨＶＴベクターワクチンに関する多数の先行技術文献からは、ＷＯ  ２０１３／０５７．２３５に記載されている、ＮＤＶ  Ｆ遺伝子およびＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子を含むＨＶＴ構築物、ならびにＷＯ  ２０１３／０５７．２３６に記載されているＨＶＴベクターＩＬＴ−ＮＤワクチンが挙げられるに過ぎない。
【００２９】
残念ながら、製品開発中の長期試験では、ＨＶＰ３０９と称される、ＷＯ  ２０１３／０５７．２３５に記載されている主要構築物の１つは、適切な遺伝的安定性および異種インサートの持続的発現を示さなかった。このＨＶＰ３０９組換えＨＶＴベクターは、ヒトサイトメガロウイルス前初期１遺伝子コアプロモーターにより駆動されるＮＤＶ  Ｆ遺伝子、およびその下流に続く、ニワトリベータアクチン遺伝子コアプロモーターにより駆動されるＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子を含有する発現カセットを含む。
【００３０】
ＨＶＰ３０９ベクター構築物の不安定性はインビトロおよびインビボでのその複製の後で明らかになった。ＨＶＰ３０９ウイルスの１〜３％が、それらが異種遺伝子の一方または両方をもはや発現しないことを示したのである。これはワクチン有効性の観点からは望ましくなく、政府当局から販売認可を得る場合に障害となる。したがって、一貫した信頼性のある遺伝的安定性を有する、ＮＤおよびＩＢＤの両方に対する安全かつ有効なＨＶＴベクターワクチンは現在のところ尚も存在しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
本発明の目的は、該分野におけるこの要求に応えることであり、ＮＤおよびＩＢＤに対する家禽の有効な免疫化を可能にする、一貫した信頼性のある遺伝的安定性を有する組換えＨＶＴベクターワクチンを初めて提供することである。
【００３２】
当初、本発明者らは、ＨＶＰ３０９構築物が、その異種遺伝子インサートの発現の喪失を招くこの固有の遺伝的不安定性を有することを知って失望した。ワクチン有効性およびウイルス複製レベルを維持しながらこの不安定性を克服するための方法に関する先行技術からの指針は無く、本発明者らはベクターワクチンを完全に再設計する必要があった。
【００３３】
これは全く容易ではなく、非自明な選択および採用を行うことを要した。これは、作製および試験はされたが好ましい特性の所望の組合せを示さなかった多数の組換えＨＶＴ構築物から明らかである。時には、新規構築物の１つが挿入遺伝子の１つの発現レベルまたはウイルス血症のような特定の態様においては良好であったが、ついでこれは他の特性を欠いていることが判明し、または適度な遺伝的安定性を有していなかった。具体例は後記に記載されている。
【００３４】
したがって、本発明者らは、１つの特定の組換えＨＶＴワクチンが、良好なウイルスベクター複製、持続的なＮＤＶ  ＦおよびＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子発現ならびにＮＤおよびＩＢＤに対する有効な免疫防御を示し、先行技術の構築物と比べて改善した遺伝的安定性を有することを見出して驚いた。実際、現在では安定性は、細胞培養内で１５回の連続継代の後でさえも、そしてトリにおいて１回の継代の後でも、非発現ウイルスプラークがもはや見出され得ないほどのものである。また、ＮＤおよびＩＢＤＶに対するワクチン有効性のレベルは従来のベクター構築物と比べて少し（ＮＤ）または更には相当に（ＩＢＤＶ）改善された。
【００３５】
そのようなベクターワクチンが家禽生産業において使用されうる潜在的に大きな規模を考慮すると、これらの効果および改善は顕著であり、大きな商業的重要性を有する驚くべき技術的効果に相当する。したがって、このように、本発明の目的が達成可能であり、その結果、従来技術の欠点が克服されうる。
【００３６】
該新規組換えＨＶＴベクターＮＤ−ＩＢＤワクチンが改善された有効性および改善された安定性特性を有する理由は現在のところ公知ではない。
【００３７】
本発明者らは、これらの観察を説明しうるいずれの理論またはモデルにも拘束されることを望まないが、新規組換えＨＶＴベクターがインビトロまたはインビボで複製する一方で異種遺伝子の発現に更に良好に適合することを、使用される要素の選択およびこのＨＶＴウイルスに含まれる発現カセットにおけるそれらの具体的な設計が何らかの方法で可能にする、と本発明者らは考えている。これこそが、新規ベクターを遺伝的に安定にし免疫学的に有効にするものでありうる。
【課題を解決するための手段】
【００３８】
したがって、第１の態様において、本発明は、
ａ．マウス（ネズミ）サイトメガロウイルス前初期１遺伝子（ｍＣＭＶ−ＩＥ１）プロモーター、
ｂ．伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）ウイルスタンパク質２（ＶＰ２）遺伝子、
ｃ．転写ターミネーター、
ｄ．ヒトサイトメガロウイルス前初期１遺伝子（ｈＣＭＶ−ＩＥ１）プロモーター、
ｅ．ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）融合（Ｆ）タンパク質遺伝子
を５’から３’への方向で且つこの順序で含む組換えＤＮＡ発現カセットに関する。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明の組換えＤＮＡ発現カセットは組換えＨＶＴベクターウイルスワクチンの製造に使用可能であり、これは、ＩＢＤＶおよびＮＤＶによる感染または疾患の関連徴候の予防または軽減に有効であり、インビトロで継代された場合およびインビボで継代された場合の両方において一貫した且つ信頼しうる遺伝的安定性を有する。
【００４０】
「組換え体」は、核酸分子または微生物の遺伝物質がその出発状態または天然状態と比べて修飾されていて、それが元々有していなかった遺伝的構成が生じている、核酸分子または微生物である。
【００４１】
本発明における「発現カセット」は、本明細書に記載され定義されている遺伝子および調節要素を含む。所望により、発現カセットは、分子クローニングを可能にする、その作製および操作を補助しうる他のＤＮＡ要素（例えば、ＰＣＲプライマーまたは制限酵素認識のための部位）を含有していてもよい。発現カセットはＤＮＡまたはＲＮＡ形態で存在しうるが、ＨＶＴベクターにおけるその意図される使用を考慮すると、発現カセットはＤＮＡとして使用される。
【００４２】
当業者に明らかなとおり、発現カセットは自己完結型発現モジュールであり、したがって、ベクターウイルスゲノムにおけるその配向は一般に重要ではない。それは、該カセットが全体として、例えば、ＨＶＴゲノムのＵｓ領域内に２つの配向（すなわち、ＴＲに向かう又はＩＲに向かう読取り）のいずれかで組込まれうることを意味する。その点に関して、図１は、これらの２つの可能な配向の１つを示しているに過ぎない。しかし、特定の配向が望まれる場合には、発現カセットはベクターのゲノムからのフランキング部分と共に使用可能であり、該フランキング部分は、ベクターのゲノムの特定の遺伝子座における及び所望の配向でのその組込みを導きうる。
【００４３】
本発明の組換えＤＮＡ発現カセットの、および本明細書に記載されている他の遺伝的要素の作製、構築および集合は、クローニング、トランスフェクション、組換え、選択および増幅を含む良く知られた分子生物学的技術により行われうる。これらの及び他の技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”（２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；ＩＳＢＮ：０８７９６９５７７３）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ，ＮＹ，２００３，ＩＳＢＮ：０４７１５０３３８Ｘ）；Ｃ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ＆  Ｇ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ：“ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”（ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０８７９６９６５４０）；およびＪ．ＢａｒｔｌｅｔｔおよびＤ．Ｓｔｉｒｌｉｎｇ，“ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｈｕｍａｎａ  ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ：０８９６０３６４２１）のような標準的なテキストに非常に詳細に説明されている。
【００４４】
本明細書中で用いる「含む」なる語（ならびに「含み」、「含まれ」および「含んで」のような変形）は、この用語が用いられている本文、段落、特許請求の範囲などに包含され又は含まれる、本発明に関して考えられる全ての要素および任意の可能な組合せに関するものであり、そのような要素または組合せが明示的に列挙されていない場合であっても、そのような要素または組合せはいずれも除外されないと意図される。
【００４５】
したがって、いずれかのそのような本文、段落、特許請求の範囲などは、「含む」（またはその変形）なる語が「からなる」または「からなり」または「から実質的になる」のような語により置き換えられている１以上の実施形態に関するものでありうる。
【００４６】
「５’から３’への方向」なる語は「下流方向」としても公知であり、当技術分野でよく知られている。「この順序で」なる語と一緒になって、それは、本発明の発現カセットを含む組換えＨＶＴが複製され発現される宿主細胞の遺伝子発現装置を用いた場合に機能的となるために、その前または後にまとめて挙げられている要素が有することを要するお互いに対する相対的配向を示すものとして用いられる。当業者が認識するとおり、この方向は、「コード鎖」であるＨＶＴの二本鎖ＤＮＡゲノムからのＤＮＡ鎖に関するものであり、それは、「＋」または「センス」配向であるコード化ｍＲＮＡ分子に関するものである。
【００４７】
それにもかかわらず、そして前記に対して偏見を持つことなく、ＨＶＴ  ｄｓＤＮＡゲノムの相補鎖（「鋳型」鎖）上では、挙げられている要素の相対的順序は同じであるが、そのＤＮＡ鎖上では、これらの要素の方向は３’から５’である。
【００４８】
「遺伝子」なる語は、タンパク質をコードしうるＤＮＡの部分を示すために用いられる。本発明の遺伝子は、好ましくは、完全なタンパク質をコードする。しかし、遺伝子はタンパク質の一部分をコードすることも可能であり、例えば、タンパク質の成熟形態（すなわち、「リーダー」、「アンカー」または「シグナル配列」を有さないもの）のみをコードしうる。その点において、本明細書中で用いる遺伝子はオープンリーディングフレームまたはＯＲＦに対応する。遺伝子は、タンパク質の特定の部分、例えば、免疫防御エピトープを含む部分をもコードしうる。
【００４９】
この点において、本発明における「タンパク質」はアミノ酸の分子鎖である。タンパク質は、天然もしくは成熟タンパク質、プレ−もしくはプロ−タンパク質、またはタンパク質の機能的断片でありうる。とりわけ、ペプチド、オリゴペプチドおよびポリペプチドがタンパク質の定義内に含まれる。
【００５０】
本発明における「プロモーター」は、下流コード領域の転写を指令する、生物のゲノム上の機能的領域であることがよく知られている。したがって、プロモーターは遺伝子の上流に位置する。
【００５１】
プロモーターにより指令されるｍＲＮＡ合成は「転写開始部位」（ＴＳＳ）から始まる。産生されたｍＲＮＡは今度は、遺伝子の開始コドンから始まるタンパク質へと翻訳され、該開始コドンはオープンリーディングフレームにおける最初のＡＴＧ配列（ｍＲＮＡにおける最初のＡＵＧ）である。典型的には、ＴＳＳは開始コドンの３０〜４０ヌクレオチド上流に位置する。ＴＳＳは、例えばＲＡＣＥ技術により、遺伝子のｍＲＮＡの５’末端を配列決定することにより決定されうる。
【００５２】
一般に、プロモーターは開始コドンのＡの位置（これは一般にＡ＋１として示される）の約１０００ヌクレオチド上流に含まれ、ほとんどのプロモーターはヌクレオチド−５００とＡ＋１との間に位置する。
【００５３】
プロモーターの命名法は、一般に、それが発現を制御する遺伝子に基づく。例えば、「ｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーター」なる語は、ｍＣＭＶからのＩＥ１遺伝子の発現を本質的に駆動し、したがってその遺伝子の直上流に位置するプロモーターを意味する。ＩＥ１−遺伝子は詳細に記載されており、明確に認識可能な遺伝子であるため、そして幾つかのｍＣＭＶのゲノムは（全体的または部分的に）配列決定されているため、そのようなプロモーターは通常の技術により容易に特定されうる。例えば、基本的なプロトコールにおいては、プロモーターは、２つの連続する遺伝子の間の領域（例えば、上流遺伝子のポリＡシグナルから下流遺伝子のＴＳＳまで）を大雑把にサブクローニングによって容易に得られうる。ついで、プロモーターは標準的な試験により特定可能であり、例えば、プロモーターと疑われる部分を徐々に小さくしたものによりマーカー遺伝子を発現させることにより特定されうる。
【００５４】
一般に、プロモーターは、転写の時間、持続時間、条件およびレベルに影響を及ぼす調節因子の結合に関与する幾つかの認識可能な調節領域、例えばエンハンサー領域を含有する。エンハンサー領域は一般に上流に位置するが、プロモーターは、転写因子の結合およびＲＮＡポリメラーゼ自体の指令に関与する、より下流の領域をも含有する。この下流領域は、一般に、幾つかの保存されたプロモーター配列要素、例えばＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴボックスおよびＧＣボックスを含有する。
【００５５】
エンハンサー領域と下流領域との両方を含むプロモーターは「完全」プロモーターと称され、下流領域のみを含むプロモーターは「コア」プロモーターと称される。
【００５６】
（ウイルス）ベクターにおける（異種）遺伝子の発現のためのプロモーターは、その下流のコード領域の転写を有効に駆動できる必要がある。これは、遺伝子に「機能的に連結された」プロモーターと称され、その場合、該遺伝子は該プロモーターの「制御下」にあり、または該プロモーター「により駆動」される。これは、発現カセットにおいて、プロモーターおよび遺伝子が有効に接近して同一ＤＮＡ上で連結されており、それらの間に、有効な転写を妨げるシグナルまたは配列が存在しないことを一般に意味する。
【００５７】
したがって、本発明の組換えＤＮＡ発現カセットにおいては、本発明におけるｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターおよびｈＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターは、それらの下流遺伝子、それぞれＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子およびＮＤＶ  Ｆ遺伝子に「機能的に連結」されている。
【００５８】
「転写ターミネーター」は、ＲＮＡへのコード領域の転写の終結に関与する調節ＤＮＡ要素である。一般に、そのような要素は、ＲＮＡポリメラーゼ複合体に転写を停止させうる二次構造、例えばヘアピンを有する部分をコードする。したがって、転写ターミネーターは、翻訳されるべき領域からの終止コドンの下流（３’非翻訳領域）に常に位置する。ターミネーターはポリアデニル化シグナルまたはポリＡシグナルをも含みうる。これは、ｍＲＮＡ分子の輸送および安定性に関連した、ほとんどの真核生物ｍＲＮＡで生じるポリアデニル化を誘導する。
【００５９】
本発明においては、２つの異種遺伝子の間での転写ターミネーターの使用はそれらの発現の有効な分離をもたらして、ＲＮＡ転写の生じうるリードスルーを防ぐ。
【００６０】
本発明においては、ある遺伝子が、それを運搬する組換えＨＶＴベクターに対して「異種」であると言えるのは、その遺伝子が、該組換えＨＶＴベクターを作製するのに使用された親ＨＶＴに存在しない場合である。
【００６１】
ｍＣＭＶ−ＩＥ１またはｈＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターは当技術分野でよく知られており、種々の商業的供給源、例えば、クローニングおよび発現のための市販プラスミドの供給者から容易に入手可能である。ＩＥ１遺伝子は「主要ＩＥ遺伝子」とも称される。
【００６２】
ｍＣＭＶ−ＩＥ１タンパク質はｐｐ８９とも称される。ｍＣＭＶ  ＩＥ１遺伝子プロモーターは１９８５年に記載された（Ｋ．Ｄｏｒｓｃｈ−Ｈａｓｌｅｒら，１９８５，ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．８２，ｐ．８３２５）。異種発現におけるこのプロモーターの使用はＷＯ  ８７／０３．９０５およびＥＰ  ７２８．８４２に記載されている。完全なｍＣＭＶ  ＩＥ遺伝子座のヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋからアクセッション番号Ｌ０６８１６．１として入手可能である（２００４年３月以降）。ｍＣＭＶ自体は当初からアクセッション番号ＶＲ−１９４としてＡＴＣＣから入手可能であり、最近になって、これはアクセッション番号ＶＲ−１３９９として継続されている。
【００６３】
完全形態のｈＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターは約１．５ｋｂのサイズであり、エンハンサー、コアプロモーターおよびイントロンからなり、それにより、プロモーター活性はイントロン領域へと進む。Ｋｏｅｄｏｏｄら（１９９５、Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．６９，ｐ．２１９４−２２０７）を参照されたい。
【００６４】
ｈＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターは、通常の分子生物学的手段および方法を用いて、ＩＥ１遺伝子に先行するゲノム領域をサブクローニングすることにより、ｈＣＭＶウイルスのゲノム（これは広範に入手可能である）から入手可能である。あるいは、プロモーターは、例えば、Ｃｏｘら（２００２，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．５５，ｐ．１４−２３）により記載されているｐＩ１７のような発現型プラスミド、または哺乳類発現ベクター、例えばｐＣＭＶ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）もしくはｐＣＭＶ−ＭＣＳ系列（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；ＧｅｎＢａｎｋ（商標）アクセッション番号ＡＦ３６９９６６）に由来する。
【００６５】
ｈＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターから、多数の非常に類似した形態（例えば、ＧｅｎＢａｎｋからのもの）が公知である。そのようなホモログおよび変異体は本発明の範囲内である。
【００６６】
本発明における「ＮＤＶ  Ｆタンパク質遺伝子」はよく知られており、配列情報は先行技術において広範に利用可能である。Ｆタンパク質遺伝子は、一般的に入手可能な種々のプラスミド構築物から得られうる。あるいは、それは、ＲＮＡウイルスを操作するための通常の技術を用いて、天然から単離されたＮＤＶから得られうる。ＮＤＶは、血清学または分子生物学を用いて容易に特定されうる。
【００６７】
本発明においては、ＮＤＶ  Ｆタンパク質遺伝子のホモログ、および例えば長潜伏期、亜病原または短潜伏期型ＮＤＶからの変異体が同等に適用可能であろう。なぜなら、Ｆタンパク質遺伝子配列自体がこれらの種々のＮＤＶ病原型において高度に保存されているからである。
【００６８】
本発明の発現カセットの１つの実施形態においては、ｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターは、ｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子のためのエンハンサー領域とコアプロモーター領域との両方を含む完全プロモーターである。完全ｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターは約１．４ｋｂのサイズである。
【００６９】
当業者によく知られているとおり、ｍＣＭＶ  ＩＥ１遺伝子プロモーターの長さだけでなく、本発明の組換えＤＮＡ発現カセットを構成するその他の要素の長さにおいても、幾らかの変動が生じうる。これは、クローニングおよび構築のために用いられる厳密な条件の相違（例えば、異なる制限酵素部位、ＰＣＲクローニングプライマー、または使用されるクローニング分子の末端を適合させるための異なる条件の使用）から生じうる。その結果、全体的な発現カセットの安定性および有効性に影響を及ぼすことなく、構成要素の長さにおける幾らかの変動（より短い又はより長い）が生じうる。その場合、これらの長さの相違は重要ではなく、本発明の範囲内である。
【００７０】
したがって、本発明におけるｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターに関しては、「約１．４ｋｂ」は１．４ｋｂ±約２５％、好ましくは±約２０、１５、１２、１０、８、６、５、４、３、２または更には±約１％（その順に好ましくなる）である。
【００７１】
同様に、同等に有効であり安定である、プロモーター要素のホモログまたは変異体が使用されうる。
【００７２】
したがって、１つの実施形態においては、本発明におけるｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターは、配列番号１のヌクレオチド６３０−２０２０の領域の全長に対して少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む約１．４ｋｂのＤＮＡ分子である。より好ましいのは、少なくとも９６、９７、９８または更には９９％（その順に好ましくなる）のヌクレオチド配列同一性である。
【００７３】
１つの実施形態においては、ｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターは配列番号１のヌクレオチド６３０−２０２０の領域である。
【００７４】
本発明の発現カセットの１つの実施形態においては、本発明におけるＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子は、古典的な型のものであるＩＢＤＶからのＶＰ２タンパク質をコードする。そのような遺伝子はよく知られており、それらの配列情報は先行技術において容易に入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ００８６９（Ｆ５２／７０）、Ｄ００４９９（ＳＴＣ）またはＡＦ４９９９２９（Ｄ７８）を参照されたい。あるいは、この遺伝子は、ビルナウイルスを操作するための通常の技術を用いて、天然から単離された古典的ＩＢＤＶのゲノムから得られうる。古典的な型のＩＢＤＶは、血清学または分子生物学を用いて容易に特定されうる。
【００７５】
ＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子のホモログまたは変異体は同等の有効性および安定性を有しうるため、１つの実施形態においては、本発明におけるＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド２０５２−３４１０の領域の全長に対して少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有し、好ましくは、少なくとも９２、９４、９５、９６、９７、９８または更には９９％（その順に好ましくなる）のヌクレオチド配列同一性を有する。
【００７６】
１つの実施形態においては、本発明におけるＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質遺伝子は古典的ＩＢＤＶ株Ｆａｒａｇｈｅｒ（ファラグハー）５２／７０に由来する。
【００７７】
１つの実施形態においては、本発明におけるＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質遺伝子は配列番号１のヌクレオチド２０５２−３４１０の領域である。
【００７８】
本発明の発現カセットにおいては、ＲＮＡ転写の有効なターミネーターが提供される限り、特定のタイプの転写ターミネーターの選択は重要ではない。
【００７９】
本発明の発現カセットの１つの実施形態においては、転写ターミネーターはターミネーター領域およびポリＡ領域の両方を含む。
【００８０】
１つの実施形態においては、転写ターミネーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、好ましくはＳＶ４０後期遺伝子に由来する。このターミネーターおよび異種発現におけるその使用は長年にわたって分子ウイルス学において適用されており、それらの「ｐＣＭＶβ」クローニングプラスミド（これは１９８０年代の終わりから商業的に入手可能である）と共にＣｌｏｎｔｅｃｈにより商品化された。
【００８１】
１つの実施形態においては、転写ターミネーターはＳＶ４０後期遺伝子に由来し、約０．２ｋｂのサイズである。
【００８２】
本発明における転写ターミネーターに関しては、厳密なサイズは重要ではないため、「約０．２ｋｂ」は０．２ｋｂ±約２５％、好ましくは±約２０、１５、１２、１０、８、６、５、４、３、２または更には±約１％（その順に好ましくなる）である。
【００８３】
１つの実施形態においては、ＳＶ４０後期遺伝子に由来し、約０．２ｋｂのサイズである転写ターミネーターは、配列番号１のヌクレオチド３４４１−３６５０の領域の全長に対して少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。より好ましいのは、少なくとも９６、９７、９８または更には９９％（その順に好ましくなる）のヌクレオチド配列同一性である。
【００８４】
１つの実施形態においては、ＳＶ４０後期遺伝子に由来する転写ターミネーターは配列番号１のヌクレオチド３４４１−３６５０の領域である。
【００８５】
本発明の発現カセットの１つの実施形態においては、ｈＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターはコアプロモーターである。そのようなコアプロモーターは、典型的には、１ｋｂのサイズより小さく、好ましくは約０．４ｋｂのサイズである。
【００８６】
記載されているとおり、本発明におけるｈＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子コアプロモーターに関しては、厳密なサイズは重要ではないため、「約０．４ｋｂ」は０．４ｋｂ±約２５％、好ましくは±約２０、１５、１２、１０、８、６、５、４、３、２または更には±約１％（その順に好ましくなる）である。
【００８７】
１つの実施形態においては、本発明におけるｈＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターは、配列番号１のヌクレオチド３７８９−４１４９の領域の全長に対して少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む約０．４ｋｂのＤＮＡ分子である。より好ましいのは、少なくとも９６、９７、９８または更には９９％（その順に好ましくなる）のヌクレオチド配列同一性である。
【００８８】
１つの実施形態においては、ｈＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子コアプロモーターは配列番号１のヌクレオチド３７８９−４１４９の領域である。
【００８９】
本発明の発現カセットの１つの実施形態においては、ＮＤＶ  Ｆタンパク質遺伝子は長潜伏期型のＮＤＶに由来する。
【００９０】
好ましくは、長潜伏期性ＮＤＶ株に由来するＮＤＶ  Ｆタンパク質遺伝子はＮＤＶ株クローン３０に由来する。
【００９１】
１つの実施形態においては、本発明におけるＮＤＶ  Ｆタンパク質遺伝子は配列番号１のヌクレオチド４１７４−５８３５の領域の全長に対して少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有し、好ましくは、少なくとも９２、９４、９５、９６、９７、９８または更には９９％（その順に好ましくなる）のヌクレオチド配列同一性を有する。
【００９２】
１つの実施形態においては、本発明におけるＮＤＶ  Ｆタンパク質遺伝子は配列番号１のヌクレオチド４１７４−５８３５の領域である。
【００９３】
１つの実施形態においては、本発明の発現カセットは、ＮＤＶ  Ｆタンパク質遺伝子の下流に位置する追加的な転写ターミネーターを含む。
【００９４】
適切な転写終結がもたらされ、安定性および発現が影響されない限り、ＮＤＶ  Ｆタンパク質遺伝子の下流に位置する追加的な転写ターミネーターは、本発明の発現カセット内にＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質遺伝子とｈＣＭＶ−ＩＥ１プロモーターとの間に存在する転写ターミネーターと同じ又は異なることが可能である。
【００９５】
１つの実施形態においては、該追加的転写ターミネーターはｈＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子に由来する。好ましくは、該追加的転写ターミネーターは約０．３ｋｂのサイズである。
【００９６】
ｈＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子に由来する追加的転写ターミネーターに関しては、厳密なサイズは重要ではないため、「約０．３ｋｂ」は０．３ｋｂ±約２５％、好ましくは±約２０、１５、１２、１０、８、６、５、４、３、２または更には±約１％（その順に好ましくなる）である。
【００９７】
１つの実施形態においては、ｈＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子に由来する約０．３ｋｂのサイズの追加的転写ターミネーターは、配列番号１のヌクレオチド５８４７−６１２７の領域の全長に対して少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。より好ましいのは、少なくとも９６、９７、９８または更には９９％（その順に好ましくなる）のヌクレオチド配列同一性である。
【００９８】
１つの実施形態においては、ｈＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子に由来する追加的転写ターミネーターは配列番号１のヌクレオチド５８４７−６１２７の領域である。
【００９９】
本発明の組換えＤＮＡ発現カセットの１つの実施形態においては、
・ｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターは完全プロモーターである、
・ＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子は古典的なタイプのＩＢＤＶからのＶＰ２タンパク質をコードする、
・転写ターミネーターはターミネーター領域およびポリＡ領域の両方を含む、
・転写ターミネーターはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来する、
・ｈＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターはコアプロモーターである、
・ＮＤＶ  Ｆ遺伝子は長潜伏期性ＮＤＶ株に由来する、
・発現カセットは、ＮＤＶ  Ｆ遺伝子の下流に位置する追加的転写ターミネーターを含む、ならびに
・追加的転写ターミネーターはｈＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子に由来する
ことからなる群から選択される条件の１以上または全部が適用される。
【０１００】
１つの実施形態においては、本発明の組換えＤＮＡ発現カセットは、ＨＶＴ由来の遺伝子からの５’および／または３’フランキング領域を含む。これらのフランキング領域は、所望の配向でのベクターゲノム上の標的遺伝的挿入遺伝子座への挿入を導く相同組換えを可能にする。
【０１０１】
好ましい実施形態においては、本発明の組換えＤＮＡ発現カセットは両側においてＨＶＴ  Ｕｓ２遺伝子の部分に隣接している。
【０１０２】
一例は、配列番号１に示されているＤＮＡ配列である。
【表１】
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【０１０３】
１つの実施形態においては、本発明の組換えＤＮＡ発現カセットは約５．５ｋｂのサイズである。記載されているとおり、本発明の組換えＤＮＡ発現カセットに関しては、厳密なサイズは重要ではないため、そのサイズは約５．５ｋｂであり、これは５．５ｋｂ±約２５％、好ましくは±約２０、１５、１２、１０、８、６、５、４、３、２または更には±約１％（その順に好ましくなる）を意味する。
【０１０４】
記載されているとおり、本発明の組換えＤＮＡ発現カセットの要素のホモログまたは変異体は同等に安全であり、安定しており、有効でありうる。
【０１０５】
したがって、１つの実施形態においては、本発明の組換えＤＮＡ発現カセットは、配列番号１のヌクレオチド６３０−６１２７の領域の全長に対して少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む約５．５ｋｂのＤＮＡ分子である。より好ましいのは、少なくとも９６、９７、９８または更には９９％（その順に好ましくなる）のヌクレオチド配列同一性である。
【０１０６】
１つの実施形態においては、本発明の組換えＤＮＡ発現カセットは配列番号１のヌクレオチド６３０−６１２７の領域である。
【０１０７】
本発明の組換えＤＮＡ発現カセットの簡便な構築、操作および使用を促進するために、これ自体がＤＮＡ分子内に含まれうる。
【０１０８】
したがって、もう１つの態様においては、本発明は、本発明の組換えＤＮＡ発現カセットを含む組換えＤＮＡ分子に関する。
【０１０９】
１つの実施形態においては、本発明の組換えＤＮＡ分子は、本発明の組換えＤＮＡ発現カセットを含むクローニングプラスミドからなる。一般的なクローニングプラスミドの例としては、例えば、ｐＢＲ３２２またはｐＵＣ系からのプラスミドが挙げられる。これらは広範に商業的に入手可能である。
【０１１０】
本発明の組換えＤＮＡ分子であるプラスミドの１つの実施形態においては、該プラスミドは、細菌における増幅の際のプラスミドのコピー数を小さな数に抑制する、大きなインサートの安定な維持を可能にする調節配列を含有しうる。大きなインサートのためのそのようなクローニングプラスミドはコスミドまたはバクミドとして一般に公知である。
【０１１１】
本発明の組換えＤＮＡ分子をトランスフェクション法において使用する場合、それは一般に「導入ベクター」、「シャトルベクター」または「供与（ドナー）プラスミド」と称される。この場合、本発明の組換えＤＮＡ分子は本発明の組換えＤＮＡ発現カセットを含み、該カセットは、両側において、挿入を導くベクターゲノム由来の配列に隣接していることが可能である。
【０１１２】
典型的には、トランスフェクションにおいて使用される導入ベクターはそれ自体はベクターのゲノム内に組込まれず、それは、それを運搬する発現カセットの組込みを促進するに過ぎない。
【０１１３】
１つの実施形態においては、本発明の組換えＤＮＡ分子は配列番号１のヌクレオチド６３０−６１２７の領域を含む。
【０１１４】
１つの実施形態においては、本発明の組換えＤＮＡ分子は、配列番号１に示されているＤＮＡ分子を含む。
【０１１５】
本発明の組換えＤＮＡ発現カセットは、好ましくは、組換えＨＶＴベクターウイルスワクチンの製造に使用される。
【０１１６】
したがって、もう１つの態様においては、本発明は、本発明の組換えＤＮＡ発現カセットを含む組換えシチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴ）であって、該発現カセットが組換えＨＶＴのゲノムのＵｓ領域内に挿入される、組換えＨＶＴに関する。
【０１１７】
「シチメンチョウヘルペスウイルス」（ＨＶＴ）なる語は、その分類群メンバーの特徴的特性、例えば形態学的特性、ゲノム特性および生化学的特性、ならびにその群の生物学的特徴、例えばそれらの生理学的、免疫学的または病理学的挙動を示すウイルス微生物を意味する。これはまた、例えば亜種、株、分離体、遺伝子型、変異体、サブタイプ、血清型、病原型またはサブグループなどとして、いずれかの方法で細分されたＨＶＴをも含む。
【０１１８】
新たな洞察が新たな又は異なる分類群への再分類をもたらして、本発明におけるＨＶＴ、ＭＤＶ、ＮＤＶまたはＩＢＤＶのような本明細書に記載の微生物の現在の分類学的分類はそのうち変更されうることが当業者に明らかであろう。しかし、これは微生物自体またはその生物学的挙動を変化させるものではなく、その科学的名称または分類のみを変更するものであるため、そのような再分類された微生物は依然として本発明の範囲内である。
【０１１９】
本発明においては、組換えＤＮＡ発現カセットを「含む」は、本発明の組換えＤＮＡ発現カセットの、ＨＶＴのゲノム内への挿入に関するものである。この挿入は、原理上は、任意の利用可能な技術により行われることが可能であり、ＨＶＴベクターのゲノムに対する挿入、置換または欠失をもたらしうる。ただし、生じる組換えＨＶＴは、安全で安定で有効な多価抗原発現のその好ましい効果を示しうるものでなければならない。詳細および実施例は後記に記載されている。
【０１２０】
本発明の組換えＨＶＴは、単一遺伝子座内およびユニーク短（Ｕｎｉｑｕｅ  ｓｈｏｒｔ）領域またはＵｓとして公知のそのゲノムの領域内に、本発明の組換えＤＮＡ発現カセットを含む。ＨＶＴのＵｓ領域はよく知られており、容易に特定可能である。それは、ＨＶＴゲノム内の２つのよく知られた反復要素（すなわち、ＩＲＳおよびＴＲＳ）の間に位置する。
【０１２１】
ＨＶＴ  Ｕｓ領域に関しては、幾つかの挿入遺伝子座が公知であり、原理上は、これらは全て、本発明における使用に適している。ただし、挿入された発現カセットおよび生じる組換えＨＶＴはそれらの安定で有効な特性を示しうるものでなければならない。
【０１２２】
１つの実施形態においては、本発明の組換えＨＶＴは、組換えＨＶＴのゲノムのＵｓ１０遺伝子内またはＵｓ２内に挿入された本発明の組換えＤＮＡ発現カセットを含む。
【０１２３】
本発明における特に安定で有効な組換えＨＶＴベクターは、本発明における単一遺伝子挿入遺伝子座としてＨＶＴゲノムのＵｓ２遺伝子を使用することにより製造可能である。
【０１２４】
したがって、本発明の組換えＨＶＴの１つの実施形態においては、本発明の組換えＤＮＡ発現カセットは組換えＨＶＴのゲノムのＵｓ２遺伝子内に挿入される。
【０１２５】
本発明においては、「Ｕｓ２遺伝子内」または「Ｕｓ１０遺伝子内」なる語は、それぞれＵｓ２またはＵｓ１０遺伝子を含むＨＶＴゲノムの領域内に挿入が行われたことを示すと意図される。これは該遺伝子のプロモーターまたはそのコード領域を意味しうる。また、ＨＶＴゲノムに対する挿入の正味の効果は、記載されているとおり、挿入、置換または欠失でありうる。そのような挿入の予想される結果は、生じた組換えＨＶＴにおいて、Ｕｓ１０遺伝子と比較した場合のＵｓ２遺伝子の正常なコード化機能が阻害され又は更には完全に阻止されることである。
【０１２６】
１つの実施形態においては、ＨＶＴ  Ｕｓ領域内の組換えＤＮＡ発現カセットの挿入は挿入である。すなわち、クローニングプロセスの結果として欠けている又は置換されている可能性のある少数のヌクレオチドは別として、Ｕｓゲノム領域内の実質的な欠失は生じない。したがって、このように、サイズの正味の増加と共に、生じる組換えＨＶＴは、その親のゲノムより大きなゲノムサイズを有する。
【０１２７】
１つの実施形態においては、本発明の組換えＨＶＴは、配列番号１のヌクレオチド６３０−６１２７の領域の全長に対して少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む約５．５ｋｂのＤＮＡ分子を含む。より好ましいのは、少なくとも９６、９７、９８または更には９９％（その順に好ましくなる）のヌクレオチド配列同一性である。
【０１２８】
１つの実施形態においては、本発明の組換えＨＶＴは配列番号１のヌクレオチド６３０−６１２７の領域を含む。
【０１２９】
１つの実施形態においては、本発明の組換えＨＶＴは、配列番号１に示されているヌクレオチド配列を含む。
【０１３０】
ワクチン用途に安全な本発明の組換えＨＶＴを製造するためには、組換えＨＶＴは、若いトリまたは胚への接種に適していることが知られており良く複製する樹立ＨＶＴワクチン株（例えば、ＨＶＴワクチン株ＰＢ１またはＦＣ−１２６）である親ＨＶＴに基づくものでありうる。これらは一般に入手可能である。ＦＣ−１２６はＡＴＣＣ（ＶＲ＃５８４−Ｃ）から入手可能であり、ＰＢ１は例えばＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈから商業的に入手可能である。本発明の組換えＤＮＡ発現カセットの組込みは親ＨＶＴのビルレンス（毒性）または病原性を増強しない。それどころか、ＨＶＴは自然では非病原性であるため、ビルレンスへの復帰は予想され得ない。
【０１３１】
したがって、１つの実施形態においては、本発明の組換えＨＶＴの製造に使用される親ＨＶＴはＨＶＴワクチン株、好ましくは、ＰＢ１のＨＶＴ株またはＦＣ−１２６株である。
【０１３２】
本発明の組換えＨＶＴは生組換え担体微生物または「ベクター」ウイルスであり、これは家禽のワクチン接種に有利に使用されうる。それは、ＮＤおよびＩＢＤに対する安全かつ有効なワクチンである特徴を兼ね備えており、そしてまた、遺伝的に安定である。
【０１３３】
本発明における「遺伝的に安定」であるは、本発明の組換えＨＶＴの遺伝的構成が後続のウイルス複製ラウンドにおいて変化しないこと、または少なくとも、検出可能な程度で変化しないことを意味する。あるいは、不安定な構築物は挿入異種遺伝子の一方または両方の発現の喪失を招きうる。この安定性は、通常の技術で、例えば、本発明の組換えＨＶＴを細胞培養内の後続の継代およびそれに続く動物における継代に付すことにより、簡便にモニターされうる。これらの工程中で再単離されたウイルスを細胞培養皿上にプレーティングし、寒天で覆い、ＨＶＴ特異的プラークが視認可能となるまでインキュベートすることが可能であり、これらは全て、通常の技術を用いて行われうる。つぎに、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）法において適当な抗体調製物ならびに適当な陽性および陰性対照を使用して、該プラークをＦまたはＶＰ２タンパク質の発現に関して染色することが可能である。蛍光を示さないプラークの数を記録することが可能であり、この場合、個々のサンプルの少なくとも１００個のプラークをモニターすべきである。
【０１３４】
本発明の組換えＨＶＴの遺伝的安定性に関する厳密な試験は、１５連続組織培養継代、ならびにそれに続く、標的動物への接種、再単離およびチャレンジ−感染を適用することである。詳細は後記に記載されている。
【０１３５】
驚くべきことに、前記の厳密な安定性試験における本発明の組換えＨＶＴは、試験したプラークの全てにおいて、そして１５細胞継代および１動物継代に関して、ＮＤＶ  ＦおよびＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質遺伝子の両方の存在および発現を維持することが判明した。詳細は実施例に記載されている。
【０１３６】
これは、従来のＨＶＴ組換え体で見出された結果に対する、そして本発明における実験の経過中に製造され試験された他の組換え体に対する大きな且つ非常に顕著な改善である。
【０１３７】
本発明の組換えＨＶＴは、一般的な技術により、主に初代ニワトリ細胞、典型的にはニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）のインビトロ培養における複製により増幅されうる。これらはニワトリ胚のトリプシン処理により調製可能であり、全て当技術分野でよく知られている。ＣＥＦを単層内にプレーティングし、ＨＶＴを感染させる。このプロセスは工業規模の製造まで大規模化されうる。
【０１３８】
一般に、組換えＨＶＴは、組換えＨＶＴをその細胞随伴形態で含有する感染宿主細胞を回収することにより収集される。凍結および保存中の安定化をもたらすために、これらの細胞を適当な担体組成物中に入れる。つぎに感染細胞を一般にはガラスアンプル内に充填し、それを密封し、凍結し、液体窒素中で保存する。
【０１３９】
ＨＶＴ細胞随伴凍結保存が好ましいが、液体窒素の使用が不可能な場合には、代替手段として凍結乾燥を用いる。これは、例えば全培養を使用する超音波処理またはフレンチプレスによる細胞破壊によりＨＶＴがその宿主細胞から単離されうるというＨＶＴの好ましい特徴を利用する。これを遠心分離により清澄化することが可能であり、ついで安定剤中に入れ、長期保存のたえに凍結乾燥する。
【０１４０】
したがって、もう１つの態様においては、本発明は、本発明の組換えＨＶＴを含む宿主細胞に関する。
【０１４１】
本発明における「宿主細胞」は、ＨＶＴによる感染および複製に感受性である細胞である。そのような細胞の例としては鳥類細胞、特にリンパ球または線維芽細胞が挙げられる。
【０１４２】
１つの実施形態においては、本発明の宿主細胞は初代鳥類細胞、すなわち、細胞系からではなく動物または動物器官から直接誘導された細胞である。典型的には、初代細胞は少数の限られた数の細胞分裂を行いうるに過ぎず、一方、細胞系からの細胞は有効に不死であり、適切な条件下で分裂し続けうる。
【０１４３】
１つの実施形態においては、本発明の初代鳥類宿主細胞は初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）である。
【０１４４】
１つの実施形態においては、本発明の宿主細胞は不死化鳥類細胞である。幾つかの不死化鳥類細胞が例えばＷＯ  ９７／０４４．４４３およびＷＯ  ９８／００６．８２４に記載されている。
【０１４５】
好ましい実施形態においては、本発明の不死化鳥類宿主細胞は不死化ＣＥＦ、好ましくは、ＥＰ  １４１９６３４５に記載されている不死化ＣＥＦである。
【０１４６】
クローニングおよびトランスフェクションの種々の方法により、本発明の組換えＤＮＡ発現カセットを使用して、組換えＨＶＴのゲノムのＵｓ領域内に安定に組込まれた発現カセットを含む本発明の組換えＨＶＴを得ることが可能である。
【０１４７】
したがって、本発明のもう１つの態様は、本発明の組換えＤＮＡ発現カセットを組換えＨＶＴのゲノムのＵｓ領域内に挿入することを含む、本発明の組換えＨＶＴの構築のための方法に関する。
【０１４８】
本発明の組換えＤＮＡ発現カセットをＨＶＴゲノム内に挿入して本発明の組換えＨＶＴを得ることは、全て当技術分野で公知の種々の方法で行われうる。１つの簡便な方法は、導入ベクターを使用することであり、１つの実施形態においては、これは本発明の組換えＤＮＡ分子でありうる。
【０１４９】
ＨＶＴゲノム内への本発明の組換えＤＮＡ発現カセットの直接的挿入は、本発明の組換えＨＶＴを製造するための好ましい方法である。しかし、そのような組換えＨＶＴが製造されうる２つのよく知られた方法が存在する。例えば、間接的挿入により、単一または複数のラウンドのトランスフェクションにおいて発現カセットの複数の部分をＨＶＴ内に挿入する。これらの部分は、全部分が組込まれたら全体的なインサートが完全発現カセットを形成するように（例えば、それらの部分の順序および配向を導くために重複領域を使用することにより）工夫されうる。別法は、ＥＰ  ９９６．７３８に記載されているバクミドの使用である。
【０１５０】
本発明の組換えＨＶＴを製造するための好ましい挿入技術は、例えばＷＯ  ９３／２５．６６５に記載されているとおり、コスミド再生を用いることによるものである。この技術は本質的には、ＨＶＴゲノムの大きな重複サブゲノム断片のセットを使用して、宿主細胞内へのコトランスフェクションにより完全ＨＶＴゲノムを再構築する。コスミドの１つは、本発明の組換えＤＮＡ発現カセットを含むようにされているため、これは組換えＨＶＴのゲノム内に安定に組込まれる。
【０１５１】
記載されているとおり、本発明の組換えＨＶＴの好ましい使用は家禽用ワクチンにおけるものである。
【０１５２】
したがって、もう１つの態様においては、本発明は、本発明の組換えＨＶＴおよび／または本発明の宿主細胞と医薬上許容される担体とを含む家禽用ワクチンに関する。
【０１５３】
「ワクチン」は、免疫学的に活性な化合物を医薬上許容される担体中に含む組成物であることがよく知られている。「免疫学的に活性な化合物」または「抗原」は、接種標的の免疫系により認識され免疫応答を誘導する分子である。該応答は先天性または後天性免疫系に由来するものであることが可能であり、細胞性および／または体液性タイプのものでありうる。
【０１５４】
本発明のワクチンは、ＮＤおよびＩＢＤに対するニワトリの安全で早期の防御をもたらす。この効果は、ＮＤＶまたはＩＢＤＶのそれらのそれぞれの標的器官における野外感染による増殖性感染の確立または拡散を予防または低減することにより得られる。これは、例えば、ウイルス負荷を低減すること又はウイルス複製の持続期間を短縮することにより達成される。そしてこれは、ウイルス感染により引き起こされる疾患の病変および関連臨床徴候の数、強度または重症度の、標的動物における低減を招く。そのようなワクチンはＮＤＶまたはＩＢＤＶ「に対する」ワクチンと口語的に称される。
【０１５５】
ＮＤおよびＩＢＤに対するワクチンの有効性に加えて、本発明のワクチンは、ＨＶＴ自体によるワクチン接種能ゆえに、ＭＤに対しても有効である。これはＵｓ領域内への本発明の組換えＤＮＡ発現カセットの挿入によっては低下しない。しかし、ある領域におけるＭＤＶ野外ウイルスの病原性に応じて、ＭＤＶに対するワクチンとして完全に有効にするためには、記載されているもう１つのＭＤワクチン成分を加えることが必要かもしれない。
【０１５６】
本発明のワクチンの有効性の決定は通常の実施者の技量の範囲内に十分に含まれ、例えば、ワクチン接種後に免疫応答をモニターし、またはチャレンジ感染後の臨床症状もしくは死亡の出現を試験し（例えば、標的の疾患徴候、臨床スコア、血清学的パラメータをモニターすることにより、またはチャレンジ病原体の再単離により）、模擬ワクチン接種動物において見られるワクチン接種−チャレンジ応答とこれらの結果を比較することにより行われうる。ＮＤに対するワクチン有効性を評価するためには、チャレンジ生存は簡便な尺度であり、ＩＢＤの場合、嚢における疾患の臨床徴候が簡便に使用されうる。
【０１５７】
本発明のワクチンの種々の実施形態、優先性および具体例（実施例）は後記に記載されている。
【０１５８】
本発明における「家禽」なる語は、獣医実施に関連したトリの種を意味し、それはＨＶＴ接種に感受性であり、好ましい家禽種はニワトリ、シチメンチョウおよびウズラである。ニワトリが最も好ましい種である。
【０１５９】
本発明においては家禽は任意のタイプ、品種または変種（例えば、産卵鶏、種鶏、ブロイラー、組合せ品種またはそのような品種のいずれかの親系統）のものでありうる。好ましいタイプはブロイラー、種鶏および産卵鶏である。最も好ましいのはブロイラーニワトリである。なぜなら、このタイプのトリの場合、ＮＤおよびＩＢＤに対する早期防御は生存、成長速度および飼料要求率の改善をもたらすからである。
【０１６０】
「医薬上許容される担体」は、標的において無害で十分に許容される一方でワクチンの安定化および投与を補助すると意図される。そのような担体は例えば滅菌水または滅菌生理食塩水でありうる。より複雑な形態においては、担体は、例えば、安定剤または保存剤のような他の添加剤を含みうるバッファーでありうる。詳細および具体例は、例えば、よく知られたハンドブック、例えば“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ”（２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，ＵＳＡ，ＩＳＢＮ：６８３３０６４７２）および“Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ”（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｅｔら編，１９９７，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＩＳＢＮ  ０４４４８１９６８１）に記載されている。
【０１６１】
本発明においては、ワクチンが細胞随伴ＨＶＴである場合には、医薬上許容される担体は、好ましくは、培地および約１０％  血清および約６％  ＤＭＳＯの混合物である。血清は、細胞培養に通常使用される任意の血清、例えば胎児または新生ウシ血清でありうる。
【０１６２】
本発明のワクチンは、当業者によって容易に適用可能な本明細書に記載されている方法により、本発明の組換えＨＶＴから製造される。例えば、本発明の組換えＨＶＴを、トランスフェクションおよび組換えにより、本発明の組換え発現カセットの挿入により構築する。つぎに所望の組換えＨＶＴを選択し、より小さな又は大きな容量（好ましくはインビトロ細胞培養、例えばＣＥＦ）において工業的に増幅する。そのような培養から、該ウイルスを含む懸濁液を全感染細胞または無細胞調製物（細胞破壊により得られる）として回収する。この懸濁液をワクチンに製剤化し、最終製品をパッケージングする。ついで細胞随伴ワクチンを液体窒素中で保存し、ワクチンを−２０または＋４℃で凍結乾燥する。品質、量および無菌性に関する詳細な試験の後、ワクチン製品を発売する。
【０１６３】
ワクチン製剤に適用される一般的技術および考慮事項は当技術分野でよく知られており、例えば政府当局（薬局方）ならびに“Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ”および“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ”（共に前掲）に記載されている。
【０１６４】
１つの実施形態においては、本発明のワクチンは細胞随伴ワクチンである。
【０１６５】
「細胞随伴」は、本発明の組換えＨＶＴに感染した本発明の宿主細胞を含むことを意味する。したがって、このタイプのワクチンは、共に本発明の宿主細胞と組換えＨＶＴとの両方を含む。
【０１６６】
１つの実施形態においては、本発明のワクチンは無細胞ウイルスワクチンである。
【０１６７】
「無細胞」は、本発明の宿主細胞を実質的に含有することなく本発明の組換えＨＶＴを含むことを意味する。しかし、無細胞ワクチンは、細胞破壊プロセスから残存した（非常に）少量の宿主細胞断片を含有しうる。無細胞ワクチンは好ましくは凍結乾燥形態である。凍結乾燥のための方法は当業者に公知であり、種々の規模における凍結乾燥のための装置が商業的に入手可能である。
【０１６８】
したがって、１つの実施形態においては、本発明の無細胞ウイルスワクチンは凍結乾燥形態である。
【０１６９】
凍結乾燥ワクチンを再構成（還元）するためには、それを生理的に許容される希釈剤に懸濁させる。ワクチンの最良の品質を確保するために、これは一般に投与の直前に行われる。希釈剤は例えば滅菌水または生理食塩水でありうる。ワクチンの再構成に使用される希釈剤はそれ自体が追加的成分、例えばアジュバントを含有しうる。
【０１７０】
本発明の凍結乾燥無細胞ワクチンのもう１つの実施形態においては、ワクチン用希釈剤は、活性ワクチン組成物を含む凍結乾燥ケークとは別に供給される。この場合、凍結乾燥ワクチンおよび希釈剤組成物は、一緒になって本発明のワクチンを具現化するパーツのキットを構成する。
【０１７１】
したがって、本発明の凍結乾燥無細胞ワクチンの好ましい実施形態においては、ワクチンは、少なくとも２つのタイプの容器（１つの容器は凍結乾燥ワクチンを含み、１つの容器は水性希釈剤を含む）を伴うパーツのキットである。
【０１７２】
本発明のワクチンのための標的動物は原理上は健常動物または罹患動物であることが可能であり、ＮＤＶもしくはＩＢＤＶの存在に関して又はＮＤＶもしくはＩＢＤＶに対する抗体に関して陽性または陰性でありうる。また、該標的は、それがワクチン接種に感受性である任意の体重、性別または齢のものでありうる。しかし、健常未感染標的にワクチン接種すること、ならびに野外感染およびその続発症を予防するために可能な限り早くワクチン接種することが明らかに好ましい。
【０１７３】
したがって、本発明のワクチンは予防または治療または両方に使用されうる。なぜなら、それはＮＤＶまたはＩＢＤＶによる感染の確立および進行の両方を妨げるからである。
【０１７４】
その点において、本発明のワクチンによるウイルス負荷の低減のもう１つの有利な効果は、後代への垂直的ならびに群または集団内および地理的領域内の水平的の両方で、ウイルスの放出およびそれによる広がりの予防または低減である。その結果、本発明のワクチンの使用はＮＤＶまたはＩＢＤＶの罹患率の減少を招く。
【０１７５】
したがって、本発明の他の態様は、
・集団内または地理的領域内のＮＤＶまたはＩＢＤＶの罹患率を減少させるための本発明のワクチンの使用、および
・集団内または地理的領域内のＮＤＶまたはＩＢＤＶの罹患率を減少させるための本発明のワクチンである。
【０１７６】
接種された組換えＨＶＴが防御感染を確立しうる限り、本発明のワクチンは、原理上は、種々の適用経路により、そして一生における種々の時点で標的家禽に投与されうる。
【０１７７】
しかし、ＮＤＶまたはＩＢＤＶの感染は既に非常に若い齢で確立されうるため、可能な限り早く本発明のワクチンを適用することが有利である。したがって、本発明のワクチンは孵化の日（「第１日」）に又は卵内（例えば、１８日ＥＤ）に適用されうる。
【０１７８】
したがって、１つの実施形態においては、本発明のワクチンは卵内に投与される。
【０１７９】
工業規模での卵内へのワクチンの自動注射のための装置は商業的に入手可能である。これは労働コストを最小にする一方で可能な限り早い防御をもたらす。種々の卵内接種経路（例えば、卵黄嚢、胚または尿膜液腔内）が公知であり、これらは、必要に応じて最適化されうる。好ましくは、針が実際に胚に接触するように卵内接種を行う。
【０１８０】
１つの実施形態においては、本発明のワクチンは非経口経路、好ましくは筋肉内または皮下経路により投与される。
【０１８１】
本発明のワクチンは、所望の適用経路および所望の効果に適合する、家禽標的への投与に適した形態で製造されうる。
【０１８２】
好ましくは、本発明のワクチンは、卵内または非経口の注射に適した注射液（例えば、懸濁液、溶液、分散液または乳液）として製剤化される。
【０１８３】
本発明のワクチンの適用経路に応じて、ワクチンの組成を適合させる必要があるかもしれない。これは当業者の能力の範囲内に十分に含まれ、ワクチンの有効性または安全性の微調整を一般に含む。これは、別の形態または製剤中のワクチンを使用することによりワクチン用量、量、頻度、経路を適合させることにより、あるいはワクチンのその他の構成成分（例えば、安定剤またはアジュバント）を適合させることにより行われうる。
【０１８４】
例えば、卵内適用に適合させるためには、卵の孵化率を低下させないためにはワクチン組成物は非常に安全であることが要求される。しかし、それでも、例えば接種自体または感染などによる胚への機械的損傷から、孵化率の幾らかの低下が尚も生じうる。
【０１８５】
本発明のワクチンの動物用量当たりの本発明の組換えＨＶＴの厳密な量は不活化型ワクチンの場合ほど重要ではない。これは、組換えＨＶＴが複製可能であり、したがって、生物学的に持続可能なウイルス血症のレベルまで標的動物内で増幅しうるからである。原理上は、ワクチン用量は、そのような生産的感染を開始させるのに十分なものであることを要するに過ぎない。より高い接種物用量は、宿主において最適ウイルス血症感染に達するのに要する時間を短縮しない。したがって、非常に高い用量は有効ではなく、また、経済的理由からも魅力的ではない。
【０１８６】
したがって、好ましい接種物用量は動物用量当たり本発明の組換えＨＶＴの１×１０∧１〜１×１０∧５  プラーク形成単位（ｐｆｕ）、より好ましくは、１×１０∧２〜１×１０∧４  ｐｆｕ／用量、より一層好ましくは、５００〜５０００  ｐｆｕ／用量、最も好ましくは、約１０００〜約３０００  ｐｆｕ／用量である。
【０１８７】
本発明のワクチンが細胞随伴性である場合、これらの量の組換えＨＶＴは感染宿主細胞に含まれる。
【０１８８】
本発明の組換えＨＶＴのウイルス粒子を計数するための方法はよく知られている。
【０１８９】
本発明の組換えＨＶＴの動物用量当たりの体積は、意図される適用経路に応じて最適化されうる。卵内適用は一般に約０．０１〜約０．５ｍｌ／卵の用量で行われ、非経口注射は一般に約０．１〜約１ｍｌ／トリの用量で行われる。
【０１９０】
本発明のワクチンの免疫学的有効量の決定または用量当たりのワクチン体積の最適化は共に当業者の能力の範囲内に十分に含まれる。
【０１９１】
標的生物に本発明のワクチンを適用するための投与レジメンは、免疫学的に有効な量での、ワクチンの製剤化に適合した様態の、単一または複数用量のものであることが可能である。
【０１９２】
好ましくは、本発明のワクチンの投与のためのレジメンは、動物に対するストレスを軽減させ労働コストを低下させるために、標的家禽が要しうる他のワクチンの既存ワクチン接種スケジュールに組込まれる。これらの他のワクチンは、それらの正規使用に適合する様態で、同時、並行的または連続的に投与されうる。
【０１９３】
言うまでもなく、安定剤、担体、アジュバント、希釈剤、エマルションなどのような他の化合物を本発明のワクチンと混合することも本発明の範囲内である。そのような添加剤は“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ”および“Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ”（共に前掲）のようなよく知られたハンドブックに記載されている。
【０１９４】
このように、ＮＤ、ＩＢＤおよびＭＤに対して非常に若い齢での１回の接種で家禽を防御する本発明のワクチンの有効性は更に最適化されうる。
【０１９５】
本発明のワクチンは事実上はＮＤＶに関する及びＩＢＤＶに関する「マーカーワクチン」である。なぜなら、それが生成する免疫はこれらのウイルス由来の１つのタンパク質のみに対するものだからである。これは「感染動物およびワクチン接種動物の識別」（いわゆるＤＩＶＡアプローチ）を可能にする。これは血清学的アッセイ、例えばＥＬＩＳＡまたは免疫蛍光アッセイによって簡便に検出されうる。
【０１９６】
本発明のワクチンは、異種インサートの発現によりＮＤＶおよびＩＢＤＶに対する、そしてまた、ＨＶＴベクター自体によりＭＤＶに対する多重免疫を既にもたらしている。それでも、追加的免疫活性成分による更なる組合せを施すことが有利でありうる。これは、既に付与されている免疫防御を増強するように、または他の病原体に拡張するように働きうる。
【０１９７】
したがって、１つの実施形態においては、本発明のワクチンは少なくとも１つの追加的免疫活性成分を含む。
【０１９８】
そのような「追加的免疫活性成分」は抗原、免疫増強物質、サイトカイン、ワクチンまたはそれらの任意の組合せでありうる。これはコスト、効率および動物愛護に関する利点をもたらす。あるいは、本発明のワクチンはそれ自体がワクチンに加えされうる。
【０１９９】
１つの実施形態においては、前記の少なくとも１つの追加的免疫活性成分は免疫刺激性化合物、好ましくはサイトカインまたは免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチドである。
【０２００】
免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチドは、好ましくは、免疫刺激性非メチル化ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＩＮＯ）である。好ましいＩＮＯは鳥類Ｔｏｌｌ（トール）様受容体（ＴＬＲ）２１アゴニスト、例えばＷＯ  ２０１２／０８９．８００（Ｘ４ファミリー）、ＷＯ  ２０１２／１６０．１８３（Ｘ４３ファミリー）またはＷＯ  ２０１２／１６０．１８４（Ｘ２３ファミリー）に記載されているものである。
【０２０１】
１つの実施形態においては、前記の少なくとも１つの追加的免疫活性成分は、家禽に病原性である微生物に由来する抗原である。これは、任意の適当な様態で、例えば、家禽に病原性であるその微生物から、「生」弱毒化、不活化またはサブユニット抗原として「由来」しうる。
【０２０２】
家禽に病原性である微生物に由来する追加的抗原は、好ましくは、
・ウイルス：感染性気管支炎ウイルス、ＮＤＶ、アデノウイルス、産卵低下症候群ウイルス、ＩＢＤＶ、ニワトリ貧血ウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、鶏痘ウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、アヒルペストウイルス（アヒルウイルス性腸炎）、ハトポックスウイルス、ＭＤＶ、トリ白血病ウイルス、ＩＬＴＶ、トリニューモおよびレオウイルス；
・細菌：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、オルニトバクテリウム・リノトラケレ（Ｏｒｎｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ）、ヘモフィルス・パラガリナルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、エリシペラス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｓ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）；
・寄生虫：アイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）；ならびに
・真菌：アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）
からなる以上の群から選択される１以上の微生物に由来する。
【０２０３】
該追加的抗原はもう１つのＨＶＴベクターワクチンでありうる。
【０２０４】
本発明のワクチンの有効性、安全性および安定性が負の影響を受けない限り、全てのこれらの組合せが可能である。
【０２０５】
本発明のワクチンの１つの実施形態においては、家禽に病原性である微生物に由来する追加的抗原は「生」弱毒化ＭＤＶ、ＮＤＶまたはＩＢＤＶワクチン株である。これは本発明のワクチンの免疫原性を改善し拡大するように働き、これは、ＭＤＶ、ＮＤＶまたはＩＢＤＶの高病原性野外株が流行している場合または地理的領域において有利である。
【０２０６】
これに関してはＭＤＶ１、ＭＤＶ２またはＨＶＴとのＨＶＴの組合せが公知であり、本発明においては、リスペンス（Ｒｉｓｐｅｎｓ）株（ＭＤＶ１）、ＳＢ１株（ＭＤＶ２）またはＦＣ−１２６もしくはＰＢ１株（ＨＶＴ）のＭＤＶが追加的免疫活性成分として好ましい。
【０２０７】
ＮＤＶに対する応答を改善するために、本発明の組換えＨＶＴは軽度生ＮＤＶワクチン株Ｃ２のようなＮＤＶワクチン株と組合されうる。
【０２０８】
同様に、ＩＢＤＶに対する応答を改善するために、本発明の組換えＨＶＴはＤ７８、ＰＢＧ９８、Ｃｕ−１、ＳＴ−１２または８９−０３のような軽度生ＩＢＤＶワクチンと組合されうる。
【０２０９】
当業者が理解するとおり、これらの「組合せ」はワクチンスケジュールをも含み、この場合、本発明の組換えＨＶＴおよび該追加的免疫活性成分は同時には適用されず、並行的または連続的に適用され、例えば、該組換えＨＶＴは卵内に適用され、ＮＤＶ  Ｃ２は第１日に適用され、ＩＢＤＶ  ８９−０３株は第１７日に適用されうる。
【０２１０】
したがって、少なくとも１つの追加的免疫活性成分を含む本発明のワクチンの１つの実施形態においては、前記の少なくとも１つの追加的免疫活性成分は、ＭＤＶ、ＮＤＶおよびＩＢＤＶまたはそれらの任意の組合せからのワクチン株からなる群から選択される微生物である。
【０２１１】
より好ましくは、該追加的免疫活性成分は、ＭＤＶ  リスペンス（Ｒｉｓｐｅｎｓ）、ＭＤＶ  ＳＢ１、ＮＤＶ  Ｃ２、ＩＢＤＶ  Ｄ７８およびＩＢＤＶ  ８９−０３からなる群から選択される。
【０２１２】
そのような組合せワクチンは、ウイルスもしくは宿主細胞の調製物またはこれらの混合物を組合せることにより、種々の方法で製造可能であり、全ては本発明の範囲内である。好ましい実施形態においては、そのような組合せワクチンの成分は別々に簡便に製造され、ついで、同じワクチン容器内に充填することにより組合される。
【０２１３】
前記の方法および後記で例示されている方法により、本発明のワクチンは製造されうる。
【０２１４】
したがって、本発明のもう１つの態様は、
・本発明の組換えＨＶＴを宿主細胞に感染させ、
・感染宿主細胞を回収し、
・回収感染宿主細胞を医薬上許容される担体と混合する工程を含む、本発明のワクチンの製造方法に関する。
【０２１５】
本発明における適当な宿主細胞および医薬上許容される担体は前記に記載されている。また、感染、培養および回収のための適当な方法は当技術分野でよく知られており、本明細書に記載され例示されている。
【０２１６】
前記で詳細に説明されているとおり、本発明の組換えＨＶＴは、ＭＤ、ＮＤおよびＩＢＤまたは疾患の関連徴候に対する安全で安定で有効なワクチン接種がもたらされるように家禽用ワクチンにおいて有利に適用可能であり、非常に若い齢の家禽に投与されうる。
【０２１７】
したがって、本発明のもう１つの態様は、家禽用ワクチンにおける使用のための、本発明の組換えＨＶＴに関する。
【０２１８】
本発明の組換えＨＶＴの「ワクチンにおける使用」の種々の態様および実施形態は前記に記載されており、家禽の接種のための種々のワクチン組成物における無細胞ウイルスまたは細胞随伴ウイルスとしての使用を含む。
【０２１９】
したがって、本発明の種々の態様および実施形態は、安全で安定で有効な家禽用ワクチンを製造するために有利に使用されうる。
【０２２０】
したがって、もう１つの態様においては、本発明は、全て本発明の発現カセット、組換えＤＮＡ分子、組換えＨＶＴもしくは宿主細胞またはそれらの任意の組合せの、家禽用ワクチンの製造のための使用に関する。
【０２２１】
前記のとおり、そして後記で例示されているとおり、本発明のワクチンは、非常に若い齢での１回の接種により、ＩＢＤＶおよび／もしくはＮＤＶによる感染または疾患の関連徴候を予防または軽減するために有利に使用されうる。
【０２２２】
したがって、本発明の他の態様としは以下のものが挙げられる。
【０２２３】
・ＩＢＤＶおよび／もしくはＮＤＶによる感染または疾患の関連徴候を予防または軽減するための、本発明のワクチンの使用、
・本発明のワクチンを家禽に投与することを含む、ＩＢＤＶおよび／もしくはＮＤＶによる感染または疾患の関連徴候を予防または軽減するための方法、
・本発明のワクチンを家禽に接種する工程を含む、家禽のワクチン接種の方法。
【０２２４】
家禽の接種による本発明のワクチンの使用に関する詳細、特に、日齢のニワトリの筋肉内または皮下接種による接種、あるいは１８日齢の胚の卵内接種は、前記に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【０２２５】
【図１】本発明の好ましい組換えＨＶＴであるＨＶＰ３６０を作製するために使用した、発現カセットおよびＵｓ２遺伝子フランキング配列を含む本発明の好ましい組換えＤＮＡ分子のインサート部分の概要図。発現カセットの要素が縮尺どおりに描かれている。略語（左から右へ）：５’ＵＳ２：ＨＶＴ  Ｕｓ２遺伝子からのフランキング上流配列；ｍｌＥ：マウスＣＭＶ  ＩＥ１遺伝子プロモーター；ＶＰ２：ＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子；ｔｅｒｍ：ＳＶ４０転写ターミネーター；ｈＩＥ：ヒトＣＭＶ  ＩＥ１遺伝子コアプロモーター；Ｆ：ＮＤＶ  Ｆ遺伝子；ｔｅｒｍ：ｈＣＭＶ  ＩＥ１遺伝子ターミネーター；３’ＵＳ２：ＨＶＴ  Ｕｓ２遺伝子からのフランキング下流配列。
【図２】試験した代表的な組換えＨＶＴ構築物の関連要素の図示（縮尺どおりには描かれていない）。比較のために、先行技術の構築物ＨＶＰ３０９も示されている。
【図３】１日齢ＳＰＦ産卵鶏のワクチン接種後の第１０日、第２４日および第３８日における種々のＨＶＴ組換え体のウイルス血症レベル（群当たりの平均として）。
【図４】１日齢ＳＰＦ産卵鶏のワクチン接種後の第３７日における種々のＨＶＴ組換え体により誘導された血清学的応答（群当たりの平均として）。
【０２２６】
つぎに以下の非限定的な実施例を参照して本発明を更に詳細に説明する。
【０２２７】
実施例
１．試験した種々の発現カセット挿入
ＮＤＶ  ＦおよびＩＢＤＶ  ＶＰ２の両方を発現する安定かつ有効な組換えＨＶＴの探索において、本発明者らは、種々の要素および配向を用いて、Ｕｓ２内に挿入された種々の発現カセットを含有する一連の組換えＨＶＴ構築物を構築した。図２に、試験した代表的な類似構築物の関連要素が図示されている（縮尺どおりには描かれていない）。比較のために、先行技術の構築物ＨＶＰ３０９も示されている。
【０２２８】
試験した変動はタンパク質遺伝子の順序、使用した種々のプロモーター、および使用した挿入遺伝子のタイプにおけるものであった。
【０２２９】
より詳細には、ＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子を以下のプロモーターに連結した：
・ｍＣＭＶ  ＩＥ１遺伝子プロモーター（エンハンサーおよびコア領域を含む）
・ラウス肉腫ウイルス（シュミット・ルピン（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｒｕｐｐｉｎ）Ｄ株）の３’末端からの長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、および
・ワクチン株バーサ（Ｂａｒｔｈａ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＫ００１７４４）からの仮性狂犬病ウイルス由来のｇＢ遺伝子プロモーター。
【０２３０】
また、ＨＶＴコドン表を使用して、天然形態およびコドン最適化形態においてＶＰ２遺伝子を試験した。
【０２３１】
更に、幾つかの構築物においては、異種遺伝子は互いに逆の順序であった。
【０２３２】
全てのこれらの種々の組換えＨＶＴを構築し、トランスフェクトし、増幅した。つぎにそれらを、ＣＥＦ細胞上のインビトロでの発現ならびに実験動物への接種によるインビボでの発現およびウイルス血症を試験することにより選択した。
【０２３３】
２．種々の組換えＨＶＴ構築物のウイルス血症および血清学
動物試験において、種々の組換えＨＶＴ構築物により誘発されたウイルス血症および血清学的応答を試験した。動物実験は、ＷＯ  ２０１３／０５７．２３５に記載されているのと実質的に同じ方法で行った。簡潔に説明すると、１日齢のＳＰＦ産卵鶏を筋肉内ワクチン接種に付し、陰圧下の隔離飼育器内で維持した。ワクチン接種後の第１０日、第２４日および第３８日に、ＨＶＴウイルスを脾臓（第１０日および第３８日）または血液サンプル（第２４日；末梢血リンパ球：ＰＢＬ）から再単離して、ウイルス血症を試験した。ワクチン接種後の第３７日に採取した血液サンプルにおいて血清学的応答を測定した。結果を表２ならびに図３および４に示す。
【表２】
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【０２３４】
全てのＨＶＴ組換え体が接種ニワトリにおいて複製された。ＨＶＰ３６４およびそのミラー構築物ＨＶＰ３６７のウイルス血症レベルは、その他の組換え体に比べて低かった。第１０日および第２４日のウイルス血症からの両方のウイルスのプラークの部分はＩＦアッセイにおいてＶＰ２および／またはＦの発現を示さなかった。したがって、第３８日のウイルス血症レベルは測定されず、ＨＶＰ３６４およびＨＶＰ３６７は更なる研究から除外された。全ての他の組換え体は、試験した全時点で全プラークにおいてＶＰ２およびＦの発現を示した。
【０２３５】
実験動物における接種に際して誘発された血清学的応答を測定した。ＮＤＶ  Ｆに関しては、ＥＬＩＳＡ値は特徴的ではなく、したがってＮＤＶ（クローン３０）に対する赤血球凝集（ＨＩ）を選択手段として用いた。ＩＢＤＶに関しては、Ｄ７８に対する中和（ＶＮ）を用いた（図４）。
【０２３６】
ＨＶＰ３６４およびＨＶＰ３６７が非発現性プラークを示した場合であっても、抗体誘導を測定した。組換えＨＶＴ  ＨＶＰ３６２は優れたウイルス血症を示したが、ＩＢＤＶ  ＶＰ２に対する血清応答を示さなかった。同様に、ＨＶＰ３６１およびＨＶＰ３６６はＮＤＶに対してはセロコンバージョンを示したが、ＩＢＤＶに対しては非常に僅かしか又は全く示さなかった。その結果、これらの３つの組換え体も更なる研究から除外した。驚くべきことに、ＨＶＰ３６０構築物のみが良好なウイルス血症および血清学レベルを示し、したがって、この組換えＨＶＴを更なる研究のために選択した。
【０２３７】
３．組換えＨＶＴ：ＨＶＰ３６０の特徴づけ
３．１．序論
ＨＶＰ３６０は本発明の組換えＨＶＴであり、ＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子およびＮＤＶ  Ｆ遺伝子の両方を発現する。ＨＶＴ  ＦＣ−１２６に基づくコスミドセットを使用して、その発現カセットをＨＶＴゲノム上のＵｓ遺伝子座内に挿入した。
【０２３８】
ＨＶＰ３６０においては、ＩＢＤＶのＶＰ２遺伝子を古典的なタイプのＦ５２／７０株から単離した。それはｍＣＭＶ株ＡＴＣＣ  ＶＲ−１９４からのＩＥ１遺伝子プロモーターにより駆動される。Ｆ遺伝子はＮＤＶワクチン株クローン３０に由来し、ｈＣＭＶ株ＡＤ１６９からのＩＥ１遺伝子プロモーターにより駆動される。また、ＨＶＰ３６０は、本明細書に記載されているＳＶ４０終結シグナルおよびｈＣＭＶ  ＩＥ１遺伝子ターミネーターを含有する。図１はＨＶＰ３６０における発現カセットの概要図を示し、全ての要素は縮尺どおりに描かれており、ＨＶＴ  Ｕｓ２遺伝子のフランキング配列が示されている。本実施例においては、ＨＶＰ３６０の構築および特徴づけを記載する。
【０２３９】
３．２．材料および方法
３．２．１．ＨＶＰ組換え体の構築
ＨＶＰ３６０の構築のために、ＷＯ  ２０１３／０５７．２３５に記載されているとおり、ＣＥＦ内へのトランスフェクションの後で感染性ウイルスを再生したＨＶＴワクチン株ＦＣ−１２６からの重複コスミド由来ＤＮＡ断片のセットを使用して、ＨＶＴ  Ｕｓ２遺伝子座内への組換えＤＮＡ発現カセットの挿入を行った。また、ｐＢＲ３２２に基づくプラスミドを導入ベクターとして使用した。可能なユニーク制限酵素消化部位を使用する場合、利用不可能な場合には、これらを、そのようなユニーク部位を含む合成リンカー配列のＰＣＲ誘発性挿入により導入した。
【０２４０】
該コスミドベクターからの及び該導入ベクターからのウイルスＤＮＡ断片を適当な制限酵素での消化により切り出した。ついで線状ＤＮＡ断片をリン酸カルシウム沈殿によりＣＥＦ細胞内にトランスフェクトした。ＤＮＡが該細胞内に進入した後、該ＤＮＡ断片の重複配列間の相同組換えにより感染性ＨＶＴウイルスを再生させ、それにより、Ｕｓ２内に該発現カセットを含む無傷ＨＶＴ  ＦＣ−１２６ゲノムを得た。このウイルス構築物をＨＶＴ３６０と命名した。
【０２４１】
該トランスフェクト化培養物の後代を新鮮なＣＥＦ上で１回増幅し、これらの抗原に対するモノクローナル抗血清を使用する免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）により、ＶＰ２およびＦを発現するＨＶＴの存在を確認した。組換えウイルスを単一プラーク精製により単離した。感染ＣＥＦの単層を培養内でアガロースで覆ったところ、ＨＶＴ  ＣＰＥが明らかに視認可能となった。幾つかのプラークを無作為に採取し、ＣＥＦ上で２回継代した後、回収し、細胞随伴ウイルス調製物として保存した。
【０２４２】
２つのＨＶＰ３６０並行プラーク単離物（Ａ１およびＢ１）のそれぞれを連続ＣＥＦ細胞培養内で１５回継代し、種々の継代レベルにおいてＩＦＡによりＶＰ２およびＦの発現に関してスクリーニングした。
【０２４３】
３．２．２．ＤＮＡ分析
ＨＶＰ３６０構築物の詳細な特徴づけのために、導入ベクターのプラスミドＤＮＡに関して、および共に並行単離物からのＦＣ−１２６またはＨＶＰ３６０継代５に感染したＣＥＦ培養の全ＤＮＡに関して、幾つかのＤＮＡ分析を行った。挿入カセットのコードヌクレオチド配列およびＨＶＴ  Ｕｓ２フランキング領域の配列分析およびサザンブロット分析を行って、Ｕｓ２内への適切な組込み、および継代の際の遺伝的安定性を確認した。また、ウイルスを再構築するために使用したコスミドセットからのＨＶＴ  ＤＮＡ断片の重複領域における適切な組換えを確認するために、ＨＶＰ３６０の全ゲノムに関してサザンブロット分析を行った。
【０２４４】
ＨＶ３６０または対照ＨＶＴ  ＦＣ−１２６（これは、ＨＶＰ３６０に使用したコスミドのセットから構築されたが、Ｕｓ２発現カセットを含有しておらず、後続実験における対照ウイルスとして使用され、ＨＶＴ  ＦＣ−１２６／４３５と命名された）に感染したＣＥＦ細胞培養からＨＶＴ  ＤＮＡを単離した。ウイルスストックをＣＥＦ上で１回継代し、Ｅａｓｙ−ＤＮＡ（商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して全ＤＮＡを単離した。導入ベクターのプラスミドＤＮＡを、該導入ベクターで形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養から単離し、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｐｒｅｐ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してＤＮＡを単離した。
【０２４５】
３．２．３．サザンブロットによる特徴づけ
ウイルス構築が厳密に意図どおりであり、意図しない挿入または欠失がウイルス再生中に生じなかったことを確認するために、ＨＶＰ３６０のゲノム構造の詳細分析のためにサザンブロットを行った。
【０２４６】
ＨＶＴウイルスＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩおよびＡａｔＩＩで又はＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。導入プラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩおよびＡａｔＩＩで消化した。
【０２４７】
消化後、ＤＮＡ断片を０．７％  アガロース／ＴＡＥゲル上の複数の平行レーン内にローディングし、電気泳動し、ニトロセルロース膜上に移した。ブロットを同じ小片に切断し、ＤＮＡサイズマーカー（Ｓｍａｒｔｌａｄｄｅｒ（商標），Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）を検出するプローブおよび３２Ｐ標識ＨＶＴプローブの１つで個々にハイブリダイズさせた。１６時間のインキュベーションの後、過剰なプローブを２回の洗浄工程で除去し、ブロットをＸ線フィルムにさらした。オートラジオグラムを現像した後、該プローブに特異的にハイブリダイズするＤＮＡ制限断片が視認可能であった。
【０２４８】
クローニングプラスミドのいずれかの部分が組換えＨＶＴ内に組込まれたかどうかを検出するために、プラスミドｐＢＲ３２２をより小さな断片へとＨａｅＩＩＩで消化することによりプローブを作製した。これらの断片を３２Ｐで標識した。ＨＶＴの再構築において使用した全てのクローニングベクターはｐＢＲ３２２の誘導体であり、ベクター配列が存在すれば、このプローブにより検出されるであろう。また、プラスミド配列の検出のための陽性対照として、サザンブロットの１つのレーンにおいてＨＶＰ３６０導入プラスミドを使用した。
【０２４９】
コスミドインサートの重複領域およびＨＶＴゲノムの反復領域における適切な構築を確認するために、これらの関連領域においてハイブリダイズするようにプライマーペアを設計し、感染ＣＥＦ細胞培養から調製されたＨＶＴ  ＦＣ−１２６ウイルスＤＮＡ上のＰＣＲによりプローブを得た。アンプリコンをＳａｕ３ＡＩで、より小さな断片へと消化し、３２Ｐで標識し、サザンブロットハイブリダイゼーションにおけるプローブとして使用した。
【０２５０】
つぎに、ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＢｇｌＩＩまたはＥｃｏＲＩで消化されたＨＶＰ３６０  ＤＮＡに種々のプローブをハイブリダイズさせた。
【０２５１】
サザンブロットにおいて検出された制限断片長を、ＨＶＴ株ＦＣ−１２６に関する公開配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２９１８６６）に基づいて予想されるものと比較した。
【０２５２】
３．２．４．配列分析による特徴づけ
コード配列の適切な挿入および安定性を確認するために、発現カセットおよびＨＶＴ  Ｕｓフランキング領域に関して完全ＤＮＡ配列分析を行った。
【０２５３】
ＤＮＡ配列決定を可能にするために、特異的プライマーを使用するＰＣＲによりＨＶＴの特異的ＤＮＡ断片を増幅した。Ｑｉａｑｕｉｃｋ（商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してアンプリコンを精製した。つぎに、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ｖ．３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者の説明に従い使用して、これらのアンプリコン上でＰＣＲ配列決定を行った。３５００シリーズＧｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して配列決定を行った。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）ｖ．５．０ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して配列読取を分析した。
【０２５４】
重複配列読取から隣接配列を集合させた。配列決定反応を繰返し、複数の配列読取をまとめることにより、曖昧さが有る場合にはそれを解明した。
【０２５５】
３．２．５．ＩＦＡによる発現の特徴づけ
トランスフェクション、プラーク精製および連続継代の後、継代レベル５、１０および１５からのＨＶＰ３６０の並行単離体の両方の単離体を挿入遺伝子の発現の維持に関してＩＦＡによりモニターした。ＣＥＦ単層に該組換え単離体を感染させ、それを、ＣＰＥが明らかに視認可能となるまで２〜３日間インキュベートし、ついで８０％  エタノールで固定した。ＩＢＤＶ  ＶＰ２またはＮＤＶ  Ｆの発現を第１試薬としてのモノクローナル抗体および２次抗体としてのフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）標識コンジュゲートで検出し、ＵＶ顕微鏡法により読取った。
【０２５６】
３．３．結果
３．３．１．サザンブロットハイブリダイゼーションの結果
特異的プローブを使用するサザンブロット分析により遺伝的均質性および安定性を確認した。株ＨＶＰ３６０およびＦＣ−１２６からの制限ＤＮＡを含有するレーン上でプラスミドｐＢＲ３２２プローブにハイブリダイズしたブロットは該プラスミドプローブでシグナルを与えなかった。しかし、該プラスミドプローブは、導入プラスミドからの制限ＤＮＡを含有するレーンと陽性に反応した。これは、予想どおりのプラスミドバックボーンに特異的な断片を示している。また、プラスミドプローブはＤＮＡサイズマーカーのバンドのほとんどに関して陽性であった。
【０２５７】
ついで同じブロットを、Ｕｓ２挿入遺伝子座に特異的なプローブでハイブリダイズさせたところ、再び、予想どおりの制限断片が示された。
【０２５８】
予想どおり、発現カセットが挿入されたゲノム領域に関しては、異なる予想バンドパターンが観察された。
【０２５９】
ＨＶＰ３６０のウイルスゲノムは適切に再集合し、親ＨＶＴコスミド再構築株ＦＣ−１２６／４３５に関して観察されたパターンに合致することを、ハイブリダイゼーションは示した。
【０２６０】
重複配列および反復領域を検出したプローブとのハイブリダイゼーションにおいては、ＨＶ３６０およびＦＣ−１２６に関するパターンはほぼ同一であることが判明したが、幾つかの領域においては、見出されたパターンは、ＨＶＴ  ＦＣ−１２６の公開ＤＮＡ配列に基づけば、ユニーク長領域と末端反復領域との間の連結部に関して、予想されたサザンブロットハイブリダイゼーションパターンと若干異なっていた。しかし、これらの領域内のパターンは組換え株および親ウイルス株の両方に関して同一である。
【０２６１】
したがって、これらの相違は親株ＨＶＴ  ＦＣ−１２６および公開配列のウイルスゲノムの配列における相違により引き起こされたのであり、コスミド再構築技術によるウイルスゲノムの集合中の再配列により引き起こされたのではない。
【０２６２】
３．３．２．配列分析による特徴づけの結果
使用した導入プラスミドの挿入カセットおよびフランキング領域の全ＤＮＡ配列をＰＣＲ配列決定により決定した。ＨＶＰ３６０のウイルスゲノムにおけるインサートのコンセンサス配列を単離物Ａ１およびＢ１の両方に関して整列させ、導入プラスミド内の配列および親株ＦＣ−１２６の挿入領域の配列と比較した。アライメントの結果は、ＨＶＰ３６０内に挿入された配列が単離物Ａ１およびＢ１に関して同一であることを証明している。
【０２６３】
また、この配列は導入プラスミドにおける元の発現カセットと同一であることが示された。また、ＨＶＰ３６０  Ａ１およびＢ１ならびにＦＣ−１２６の導入プラスミドのＵｓ２挿入遺伝子座のフランキング領域は全て、ＤＮＡ配列において同一であることが示された。
【０２６４】
３．３．３．ＩＦＡによる発現の特徴づけの結果
両方の並行単離物に関する並びに継代レベル５、１０および１５の３つ全てからのＨＶＰ３６０のプラーク精製ウイルスをＶＰ２およびＦの発現に関してＩＦＡによりスクリーニングした。試験した全てのプラークはＦおよびＶＰ２遺伝子の完全な発現を示した。これは（少なくとも）細胞継代レベル１５までのＶＰ２およびＦの機能的かつ安定な発現を証明した。
【０２６５】
３．４．結論
ＨＶＰ３６０は、ＩＢＤＶ  ＶＰ２およびＮＤＶ  Ｆの両方を発現する組換えＨＶＴである。ＩＦＡ、ウイルスＤＮＡに関するサザンブロット分析ならびにインサートおよびフランキング領域のＤＮＡ配列決定による詳細な特徴づけは、２つの独立したＨＶＰ３６０単離物Ａ１およびＢ１が共に、ＨＶＴ  ＦＣ−１２６のＵｓ２領域内に発現カセットを適切に組込んでおり、プラーク精製後のＣＥＦ細胞における後続の１５継代中にＣＥＦの感染培養においてＩＢＤＶ  ＶＰ２およびＮＤＶ  Ｆ遺伝子を機能的に発現することを証明した。
【０２６６】
ＨＶＰ３６０単離物Ａ１およびＢ１の発現カセットおよび全ゲノムは、一連のＨＶＴ特異的ゲノムプローブでのサザンブロットハイブリダイゼーションの後で得られた制限消化パターンにおいて欠失、再配列または追加的外来配列が検出されなかった点で適切である。該インサートのただ１つのコピーがＵｓ２領域内に組込まれる。
【０２６７】
Ｕｓ２挿入遺伝子座のフランキング領域および発現カセットの詳細な配列分析の後、ＨＶＰ３６０  Ａ１およびＢ１は、お互いに、および導入ベクター内の配列と、および親ウイルスＦＣ−１２６と同一であると結論づけた。
【０２６８】
４．ワクチン接種  −  ＨＶＰ３６０でのチャレンジ試験
組換えＨＶＴ  ＨＶＰ３６０を使用して、ワクチン接種−チャレンジ実験を行った。簡潔に説明すると、１日齢のＳＰＦ産卵鶏に並行単離物ＨＶＰ３６０  Ａ１またはＢ１のいずれかを皮下にワクチン接種した。ワクチン接種後の第３週または第４週に、ＩＢＤＶまたはＮＤＶのいずれかによる激しいチャレンジ感染に対する誘導防御を測定した。ＩＢＤＶチャレンジの場合、株ＣＳ８９を０．１ｍｌ中の３０００  ＣＩＤ５０で各眼への眼内経路により接種した。ＮＤＶの場合、株Ｈｅｒｔｓ  ３３／５６を０．２ｍｌ／動物で６Ｌｏｇ１０  ＥＬＤ５０でｉｍ経路により投与した。ワクチンおよび対照ウイルスのウイルス血症のレベルを接種動物の脾臓からのウイルス再単離により測定した。結果を表３に示す。
【０２６９】
チャレンジ防御のレベルを以下のとおりに決定した。
【０２７０】
ＮＤＶチャレンジの場合、３または４週ｐ．ｖ．のチャレンジの後の第２週に、生存動物と死亡動物との比を決定した。例えば、該群内の２０羽の動物のうちの１８羽の生存体は９０％のＮＤＶ防御スコアを与える。
【０２７１】
ＩＢＤＶチャレンジの場合、チャレンジの１０日後の剖検における嚢の臨床症状には、リンパ球欠乏の非存在から重度までを表す０〜５のスコアが与えられる。０〜２のスコアを有する動物は防御されているとみなされ、３〜５のスコアは防御されていない。ＩＢＤ防御は該群内の動物数に対する防御動物（嚢臨床スコア０〜２）の比率である。
【０２７２】
該結果は、この実験において、ＨＶＰ３６０でのｉｍワクチン接種が、ワクチン接種後の第３週に、ＮＤに対して１日齢のニワトリを５９〜７３％防御することを示した。第４週に、ＮＤ防御は７９〜９３％であった。ワクチン接種後の第３〜４週におけるＩＢＤに対する防御は９３〜１００％であった。
【表３】
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【０２７３】
５．ＮＤおよびＩＢＤに対する免疫の開始および持続
後続のワクチン接種−チャレンジ実験において、ワクチンとしてＨＶＰ３６０を使用し、ＮＤＶまたはＩＢＤＶでチャレンジして、免疫の開始および免疫の持続を測定した。ＨＶＰ３６０ワクチンウイルスは継代レベル１３におけるものであり、動物は１日齢のＳＰＦ産卵鶏であり、ワクチン接種経路は皮下であり、ワクチン接種用量は０．２ｍｌの動物用量当たり１５００〜２５００  ｐｆｕであった。チャレンジウイルスはＩＢＤＶ  ＣＳ８９またはＮＤＶ  Ｈｅｒｔｓ  ３３／５６のいずれかであった。対照動物にＨＶＴ  ＦＣ−１２６／４３５をｓｃ接種した。
【表４】
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【０２７４】
該結果は、ＨＶＰ３６０のワクチン接種の後、皮下経路による日齢におけるワクチン接種後の第４週におけるＮＤＶでのチャレンジに対して９０％以上の防御が得られることを示した。これは生ＮＤワクチンに関するＰｈＥｕｒ  ０４５０モノグラフ要件を満たしている。
【０２７５】
更に良かったことには、ＩＢＤＶでのチャレンジに対する防御が達成された。ＨＶＰ３６０でのワクチン接種後の第２週のチャレンジに対する９０％以上の防御が得られる。これはＩＢＤワクチンに関するＰｈＥｕｒ  ０５８７モノグラフ要件を満たしている。
【０２７６】
また、これらの結果は、免疫防御の持続が、ＮＤに対する及びＩＢＤに対する１００％防御のレベルで、ワクチン接種の（少なくとも）８週間後まで進むことを示している。
【０２７７】
６．ＮＤに対する用量応答および種々の投与経路の試験
動物試験において、種々の用量のＨＶＰ３６０のワクチン接種を適用し、種々の経路［卵内（ｉｏ）および皮下（ｓｃ）］を試験して、これらの用量からの応答およびＮＤＶのチャレンジ感染に対するこれらの経路を試験した。また、種々の処理群における接種動物からの再単離の際のＨＶＰ３６０ワクチンおよびＦＣ−１２６対照ウイルスのウイルス血症レベルを測定した。
【０２７８】
ＳＰＦ産卵鶏の１８日齢胚形成卵（ｉｏ）またはｓｃ経路による１日齢ＳＰＦ産卵鶏のワクチン接種の後、動物を３または４週齢でＮＤＶ  Ｈｅｒｔｓ  ３３／５６でチャレンジした。ワクチン／対照ウイルスを第４日、第１１日または第１７日に脾臓または血液サンプルから再単離して、到達したウイルス血症レベルを測定した。結果を表５に示す。ウイルス血症は以下の２つの方法で表される：その群内のトリの総数のうちのワクチン／対照ウイルス再単離に関して陽性のトリの数、および２×１０∧６個の脾臓細胞当たりの平均ウイルスｐｆｕ。
【０２７９】
「用量」の列に、ワクチン接種後の接種物の残余物の逆滴定により決定された実際の接種用量が示されている。
【表５】
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【０２８０】
皮下ワクチン接種は使用用量にはほとんど左右されないようである。５００〜２５００  ｐｆｕ／動物の用量は全て、満足しうる免疫防御レベルをもたらした。
【０２８１】
最終的に、両方の経路（ｉｏおよびｓｃ）は、第３週および第４週に、それぞれ６５〜７０％および８４〜９０％の同じ防御を惹起することが可能であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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