(57)【要約】血液試料からの核酸精製のためのシステム、キット、及び方法を提供する。より詳細には、乾燥血液試料などの血液試料からの核酸の高収量精製のための、試薬（例えば、サルコシンを含む溶解バッファー）、並びにそのような試薬を用いる方法を提供する。また、全血試料から核酸を精製するためのシステムであって、グアニジン及びリン酸水素二ナトリウムを含む溶解バッファーを含むシステムも請求する。核酸を捕捉するための固体支持体として磁気粒子が提案される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）界面活性剤を含む溶解バッファー；
ｂ）タンパク質変性剤を含むライシスバッファー；及び
ｃ）核酸捕捉固体支持体；
を含む、システム。
【請求項２】
前記溶解バッファーがキレート剤及び塩基をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記ライシスバッファーが塩をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記核酸捕捉固体支持体が、磁気ビーズ又は常磁性ビーズを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記界面活性剤がイオン性界面活性剤を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記イオン性界面活性剤が、サルコシン由来のイオン性界面活性剤を含む、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
前記界面活性剤がＮ−ラウロイルサルコシンを含む、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記界面活性剤が［ドデカノイル（メチル）アミノ］酢酸ナトリウムを含む、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
前記界面活性剤が、０．０５〜１０体積％で溶解バッファー中に存在する、請求項１から８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１０】
前記界面活性剤が、３％体積％で溶解バッファー中に存在する、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記タンパク質変性剤がプロテイナーゼＫを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
試料から核酸を精製する方法であって、
試料を請求項１から１１のいずれか１項に記載の溶解バッファーと接触させて溶解試料を作成する；及び
前記溶解試料を前記ライシスバッファーと接触させる；
工程を有してなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、その内容が、ここに参照することによってその全体が本願に援用される、２０１５年９月１１日出願の米国仮特許出願第６２／２１７，１４４号の優先権の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
血液試料からの核酸精製のための組成物、システム、キット、バッファー及び方法を提供する。より詳細には、乾燥血液試料などの血液試料から核酸を高収量で精製するための試薬、及びそのような試薬を使用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
新生児スクリーニングは、誕生後の乳幼児の生存又は健康に影響を及ぼす問題を発見するためのアッセイである。毎年米国において数百万もの新生児が規定通りその検査を受けている（アメリカ疾病管理予防センター（ＣＤＣ）政府ウェブサイト、新生児スクリーニングのページ）。新生児のかかとからの血液を誕生後２４時間〜７日に専用の濾紙（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｇｕｔｈｒｉｅにより１９６３年に導入され、１９７０年代に使用が開始された技術である）によって採取し、代謝産物及び酵素活性の分析のために研究所に送られる。殆どの新生児スクリーニングに関して、全血試料から代謝産物及び酵素活性を調べる。フェニールケトン尿症、鎌状赤血球病、及びリソソーム貯蔵障害などの、代謝機能障害、遺伝的障害、又は聴力損失を、このスクリーニングにより検出できる（Gelb MH et al., 2006; Guthrie R and SusiA, 1963; Giordano PC, 2009; Michlitsch J et al., 2009; Streetlyet al., 2008；参照によりその全体が取り込まれる）。最近、ＣＤＣは、嚢胞性線維症、糖尿病、及び先天性異常などの、新生児スクリーニングプログラムのためのゲノム関連検査の拡大に尽力している。ますます多くの新生児スクリーニング研究所が、疾患の陽性結果の確証検査、及び疾患検査の拡大を含めて、ＤＮＡを用いた検査を追加している。
【０００４】
そのような取り組みを用いるには、乾燥血液試料から核酸を抽出し、さらに分析の前に増幅させる必要がある。従って、抽出されるゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の質及び量をＰＣＲ又は他の増幅技術の要求に適合させる必要がある。メタノール−、ＣＨＥＬＥＸ−１００−、及びトリス−ＥＤＴＡ−に基づく方法のような、様々なプロトコルが、下流の適用のためにｇＤＮＡを抽出するのに開発された。表１は、乾燥血液及び全血試料からｇＤＮＡを精製するための既存の製品のいくつかの例示を記載する。
【０００５】
中でも、これら製品は、スピンカラム及び磁気ビーズに基づく精製を用いるものであり、そのいくつかは自動化できる。磁気ビーズに基づくやり方は、遠心分離の必要性を低減できる。
【０００６】
【表１】
2018526021.tif 000002
【０００７】
核酸精製のより高い質を有するために、ブーム（Ｂｏｏｍ）らは、１９９０年にシリカと共にグアニジンチオシアン酸塩に基づくバッファーシステムを開発した（非特許文献１；参照によりその全体が取り込まれる）（８．３Ｍ  グアニジンチオシアン酸塩、８２ｍＭ  トリス、３６ｍＭ  ＥＤＴＡ、２％トリトン  Ｘ−１００）。シリカは、高濃度のグアニジンチオシアン酸塩の存在下で、血清、尿、又は細菌試料から核酸を結合させることができ、かつ低塩条件下で核酸を遊離させる。ブームのプロトコルに基づき、シュネーベルガー（Ｓｃｈｎｅｅｂｅｒｇｅｒ）のグループも、乾燥血液スポット（ＤＢＳ）試料からのＤＮＡ精製のための新規かつ特定のバッファーシステムを開発した（ライシスバッファーＩ：１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＣａｌ、２％ＳＤＳ；ライシスバッファーＩＩ：２２ｍｌの０．２Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）及び２．６ｇのトリトン  Ｘ−１００を有する１００ｍｌの０．１Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．４）中の１２０ｇのＧｕＳＣＮ）。シュネーベルガーの精製（非特許文献２）に示されるように、より多くのＤＮＡが精製され、その品質は下流のＰＣＲ適用のために十分であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J. Rapid and simple method for purification of 核酸s. J Clin Microbiol.1990 Mar; 28(3): 495-503
【非特許文献２】Schneeberger C, Kury F, Larsen J, Speiser P, Zeillinger R.simple method for extraction of DNA from Guthrie cards. PCR Methods Appl. 1992; 2: 177-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これらの取り組み及び改善にもかかわらず、血液試料からＤＮＡを精製するためのさらに改善された組成物及び方法に対する要求がまだ存在する。特に、単一試料から実施されるべき検査数が多くなるにつれ、現代の分析技術において使用される下流の分析工程に適用できる多量で、高品質のＤＮＡが必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
血液試料からの核酸精製のための組成物、システム、バッファー、キット及び方法をここに提供する。より詳細には、乾燥血液試料などの血液試料から核酸を高収量で精製するためのバッファー、並びにそのようなバッファーを使用する方法をここに提供する。
【００１１】
例えば、ある実施形態において、試料から核酸を精製するための１つ以上のバッファー又は他の構成要素を含むシステムをここに提供する。そのシステムは、例えばキットの形態で、一連の試薬を含んでいてよい。キットは、バッファーを収納する１つ以上の保存又は輸送容器（例えば、チューブ、バイアルなど）、及びその保存又は輸送容器を収納する入れ物（例えば箱）を、ここに記載されている方法で使用できる他の構成要素（例えば、使用指示書、磁石、撹拌部材など）と共に含んでいてよい。
【００１２】
ある実施形態において、システムは、ａ）溶解バッファー（dissolving buffer）；ライシスバッファー（lysis buffer）；及びｃ）核酸捕捉固体支持体（例えば、表面、樹脂、カラム、ビーズ（例えば、常磁性ビーズなどの磁気ビーズ））の１つ以上又はそれぞれを含む。ある実施形態において、溶解バッファーは界面活性剤を含む。ある実施形態において、溶解バッファーは、界面活性剤、キレート剤、及び塩基を含む。ある実施形態において、ライシスバッファーは、タンパク質変性剤及び／又は塩を含む。ある実施形態において、固体支持体は、規定された条件下（例えば、電荷、溶解性など）において、核酸分子を結合させる。ある実施形態において、固体支持体は、アフィニティ捕捉分子を含む。ある実施形態では、固体支持体はアフィニティ捕捉分子を含まない。
【００１３】
ある実施形態において、界面活性剤は、イオン性界面活性剤を含む、からなる、又は本質的にからなる。ある実施形態では、イオン性界面活性剤は、Ｎ−ラウロイルサルコシンなどのサルコシン由来のイオン性界面活性剤を含む、からなる、又は本質的にからなる。ある実施形態において、Ｎ−ラウロイルサルコシンは、［ドデカノイル（メチル）アミノ］酢酸ナトリウムなどの塩として提供される。任意の有用な濃度の界面活性剤を用いることができ、それは特定の種類の試料に適応させるのに望ましいように変更してよい。ある実施形態において、界面活性剤は、体積％で、０．０５〜１０％（例えば、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、或いはそれらの間の任意の値又は範囲、例えば、２．１、２．２、２．３；例えば、２〜３、３〜４、２．５〜４など）で第１のバッファー中に存在する。ある実施形態において、界面活性剤の濃度は、約３％又は３％である。本明細書で用いる場合、別途特定がない限り、「約」は記載の値の＋／−１０％を意味する。
【００１４】
ある実施形態において、塩基は、第一級アミンを含む、からなる、又は本質的にからなる。ある実施形態において、塩基はトリスを含む、からなる、又は本質的にからなる。任意の有用な濃度の塩基を用いることができ、それは特定の種類の試料に適応させるのに望ましいように変更してよい。ある実施形態において、塩基は１〜２０ｍＭ（例えば、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、或いはそれらの間の任意の値又は範囲、例えば、８．１、８．２、８．３；例えば、８〜１１、９〜１２、８．５〜２０など）の濃度で、第１のバッファー中に存在する。ある実施形態において、その濃度は約１０ｍＭ又は１０ｍＭである。
【００１５】
ある実施形態において、キレート剤は、ＥＤＴＡを含む、からなる、又は本質的にからなる。ある実施形態において、キレート剤は、例えば、ＥＤＴＡ・２Ｎａ又はＥＤＴＡ・４Ｎａなどの塩として提供される。任意の有用な濃度のキレート剤を用いることができ、それは特定の種類の試料に適応させるのに望ましいように変更してよい。ある実施形態において、キレート剤は、０．０５〜２．０ｍＭ（例えば、０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、或いはそれらの間の任意の値又は範囲、例えば、０．８１、０．８２、０．８３；例えば、０．０５〜１．１、０．９〜２．０、０．１〜１．０など）の濃度で、第１のバッファー中に存在する。ある実施形態において、その濃度は約１．０ｍＭ又は１．０ｍＭである。
【００１６】
ある実施形態において、溶解バッファーは、タンパク質などの不所望な夾雑物(contaminant)を変性又は破壊させる１つ以上の成分をさらに含む。ある実施形態において、そのような成分はプロテアーゼである。ある実施形態では、プロテアーゼはプロテイナーゼＫである。ある実施形態において、溶解バッファーは、一体化した溶解／ライシスバッファーである。
【００１７】
ある実施形態において、ライシスバッファーのタンパク質変性剤は、カオトロピック剤を含む、からなる、又は本質的にからなる。ある実施形態において、カオトロピック剤は、グアニジンチオシアン酸塩（ＧＩＴＣ）、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣＬ）、又はそれらの組合せを含む、からなる、又は本質的にからなる。任意の有用な濃度のタンパク質変性剤を用いることができ、それは特定の種類の試料に適応させるのに望ましいように変更してよい。ある実施形態において、タンパク質変性剤は、２〜６Ｍ（例えば、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、或いはそれらの間の任意の値又は範囲、例えば、４．１、４．２、４．３；例えば、２〜５、４〜６、４．５〜５など）の濃度で、ライシスバッファー中に存在する。ある実施形態において、その濃度は約５．０Ｍ又は５．０Ｍである。
【００１８】
ある実施形態において、ライシスバッファーの塩は、バッファーのｐＨを所望の値又は範囲に調整するのに有用な塩を含む、からなる、又は本質的にからなる。ある実施形態において、ライシスバッファーの塩は、リン酸塩を含む、からなる、又は本質的にからなる。ある実施形態において、リン酸塩はリン酸ナトリウムである。ある実施形態では、リン酸ナトリウムは、リン酸二ナトリウムである。ある実施形態において、リン酸二ナトリウムは、リン酸二ナトリウム水和物である。任意の有用な濃度の塩を用いることができ、それは特定の種類の試料に適応させるのに望ましいように変更してよい。ある実施形態において、塩は、９０〜１１０ｍＭ（例えば、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１０４ｍＭ、１１０ｍＭ、或いはそれらの間の任意の値又は範囲、例えば、１０３、１０４、１０５；例えば、９０〜１０５、１００〜１１０、１０２．５〜１１０など）の濃度で、第２のバッファー中に存在する。ある実施形態において、その濃度は約１０４ｍＭ又は１０４ｍＭである。
【００１９】
ある実施形態において、システムは、グアニジンチオシアン酸塩及び／又はリン酸水素二ナトリウムを含むライシスバッファー；並びに固体支持体（例えば、常磁性ビーズ）を含む、からなる、又は本質的にからなる。ある実施形態では、システムは、界面活性剤、キレート剤、及び塩基を含むライシスバッファーをさらに含む。
【００２０】
ある実施形態において、システムは、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩を含む溶解バッファー；及びグアニジンチオシアン酸塩を含むライシスバッファーを含む、からなる、又は本質的にからなる。ある実施形態において、溶解バッファーは、塩基及びキレート剤をさらに含む。ある実施形態では、溶解バッファーは、タンパク質を変性又は破壊する１つ以上の成分をさらに含む。ある実施形態において、ライシスバッファーは、塩をさらに含む。ある実施形態において、システムは、核酸捕捉固体支持体（例えば、ビーズ（例えば、常磁性ビーズなどの磁気ビーズ））をさらに含む。
【００２１】
ある実施形態において、前記のシステムは、１つ以上の洗浄バッファーをさらに含む。ある実施形態では、洗浄バッファーの１つ以上はアルコールを含む。ある実施形態において、アルコールはエタノールである。ある実施形態において、アルコールは、イソプロパノール（ＩＰＡ）である。ある実施形態において、洗浄バッファーの１つ以上は、アルコール（例えば、エタノール、イソプロパノールなど）及びライシスバッファーを含む。ある実施形態では、洗浄バッファーの１つ以上は、アルコール（例えば、エタノール、イソプロパノールなど）、ライシスバッファー、及び溶解バッファーを含む。ある実施形態において、洗浄バッファーの１つ以上は、水及びエタノールからなる。ある実施形態において、エタノールは、体積％で、６０〜８０％（例えば、６０％、７０％、８０％、或いはそれらの間の任意の値又は範囲、例えば、７１、７２、７３；例えば、６０〜７５、７０〜８０、６５．５〜７５．５など）で存在する。ある実施形態において、その濃度は約７０％又は７０％である。ある実施形態において、洗浄バッファーは、ＧｕＨＣｌ、ＥＤＴＡ、トリス、及びイソプロパノールを含む（例えば、Ｗ１Ａバッファー：３．９８Ｍ  ＧｕＨＣｌ、２６ｍＭ  ＥＤＴＡ・４Ｎａ、２０ｍＭ  トリス、１０％ＩＰＡ）。
【００２２】
ある実施形態において、システムは、磁気ビーズを磁気により単離する装置または構成要素をさらに含む。ある実施形態において、そのような装置又は構成要素は磁石を含む。各種のスタンド、プレート、器具、又は市販されている他の装置の任意のものを使用することができる。
【００２３】
ある実施形態において、システムは、試験試料（すなわち、精製すべき核酸を含有する又は含有する疑いのある試料）をさらに含む。ある実施形態において、試験試料は血液試料である。ある実施形態において、血液試料は乾燥血液試料である。ある実施形態では、試験試料は、濾紙に血液を含む。（例えば、濾紙上で乾燥させた血液スポット）。ある実施形態において、システムは、１つ以上の対照試料（例えば、陽性又は陰性対照試料）を含む。陽性対照試料として、限定はされないが、核酸を含むことが分かっている試料、血液試料、適切な保存バッファー中の精製核酸などが挙げられる。精製核酸試料を、裁判、診断、研究、又は他の適応のために分析すべき場合、陽性対照は、その後の分析において陽性対照として有用である特定の核酸を含んでいてよい（例えば、変異を含む遺伝子配列；感染症の核酸；疾患のバイオマーカーなど）。ある実施形態において、１つ以上の陽性対照試料は、試験試料中の核酸の量の定量化に役立つように、或いは特定のアッセイの検出限界を評価するために、既知濃度の核酸を有するものとして提供される。陰性対照試料として、限定はされないが、核酸を欠く試料が挙げられる。
【００２４】
ある実施形態において、システムは、例えば、１つ以上のバッファー及び／又は他の構成要素（例えば、ビーズ）と組み合わせた全血などの試験試料又は対照試料（例えば、陽性又は陰性対照試料）のような、反応混合物を含む。
【００２５】
さらに、試料から核酸を精製する方法を提供する。ある実施形態において、その方法は、試料から核酸を精製するために、上記のバッファー又は他のシステム構成要素の任意のものを単独で又は所望の組合せで使用することを含む。ある実施形態において、試料をライシスバッファーと接触させる（例えば、混合によって）。ある実施形態では、試料をまず溶解バッファーと接触させて溶解試料を作成する。次に、その溶解試料をライシスバッファーと接触させる。ある実施形態において、試料は血液試料（例えば、乾燥血液試料又は全血試料）である。ある実施形態において、その方法は、試料を固体支持体（例えば、常磁性ビーズ）で処理して支持体結合核酸を作成する工程をさらに含む。ある実施形態において、その方法は、支持体結合核酸を１つ以上の洗浄溶液で洗浄する工程をさらに含む。ある実施形態では、１つ以上の洗浄溶液を用いて複数回の洗浄を行う。ある実施形態において、最初の及び／又は後続の洗浄は、溶解及び／又はライシスバッファーの少なくとも一部、並びにエタノールを含む溶液を用いる。ある実施形態において、洗浄バッファーは、カオトロピック剤及びアルコールを含む（例えば、Ｗ１Ａバッファー）。ある実施形態において、後の洗浄は、アルコール溶液を用いる。ある実施形態において、アルコール溶液はエタノール（例えば、６０〜８０％エタノール）を含む。磁気ビーズが用いられる場合、核酸を含むビーズを反応容器中に保持するために、洗浄工程の間ビーズを磁石によって抑制してもよい。ある実施形態において、その方法は、支持体結合核酸を溶出バッファー（例えば、ＴＥバッファー）と接触させて核酸を溶出させる工程をさらに含む。ある実施形態において、その方法は、高収量の精製核酸を得る。例えば、ある実施形態において、その方法は、直径３ｍｍの乾燥血液スポットの開始試料から、少なくとも４０ｎｇ（例えば、少なくとも５０ｎｇ、少なくとも６０ｎｇ、少なくとも７０ｎｇ、少なくとも８０ｎｇ、少なくとも９０ｎｇ、又はそれらの間の任意の値又は範囲；例えば、４０〜９０ｎｇなど）のｇＤＮＡを得る。
【００２６】
精製標的核酸（例えば、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ））を１つ以上の分析技術を用いて分析してよく、或いは、治療、診断、研究、又は他の所望の適応のために使用してもよい。ある実施形態において、精製核酸のその後の使用は、限定はされないが、増幅（例えば、ＰＣＲ、ＴＡＱＭＡＮ、又は他の増幅技術による）、シーケンシング（例えば、次世代シーケンシング法又は他のシーケンシング技術による）、ハイブリダイゼーション分析（例えば、ＦＩＳＨなどのｉｎ  ｓｉｔｕ法、マイクロアレイ解析、又は他のプローブに基づくハイブリダイゼーション技術による）、質量分析、或いは他の所望の技術などの技術を含む。
【００２７】
本明細書において、「含んでいる」、「含む」、「有する」、及び他の開放型用語が用いられる場合、実施形態は、そのシステム、装置、又は方法が、記載されている構成要素からなる又は本質的にからなる場合も意図されていることが理解されるべきである。
【００２８】
方法が記載されている場合、別途又は必然的に指定されていない限り、記載されている方法の工程は、任意の順序で又は同時に実施できると理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ＤＢＳからのｇＤＮＡの精製方法の実施形態を示すフローチャート
【図２】図１に示される方法の概略図（Ａ〜Ｇ）
【図３】本明細書に記載されている技術の実施形態を用いた全血からのｇＤＮＡ精製のフローチャート
【図４】図３に示される方法の概略図
【図５】商業的に利用できる業者からの技術に対して、本明細書に記載されている技術（ＣＲＣＴ）の実施形態を用いて乾燥血液スポット（ＤＢＳ）試料から得られたＤＮＡのＤＮＡ収量（ナノグラム）を比較したグラフ
【図６】商業的に利用できる業者からの技術に対して、本明細書に記載されている技術（ＣＲＣＴ）の実施形態を用いて全血試料から得られたＤＮＡのＤＮＡ収量（ナノグラム）を比較したグラフ
【図７】異なる界面活性剤を比較した、実施例４に記載されている技術の実施形態を用いた核酸精製から得られたデータ
【図８】異なる界面活性剤及びアルコール濃度を比較した、実施例４に記載されている技術の実施形態を用いた核酸精製から得られたデータ
【図９】異なる界面活性剤及びアルコールを比較した、実施例４に記載されている技術の実施形態を用いた核酸精製から得られたデータ（Ａ及びＢ）
【図１０】異なる相対的バッファー濃度を比較した、実施例４に記載されている技術の実施形態を用いた核酸精製から得られたデータ
【図１１】ＧｕＳＣＮ及びエタノールの異なる濃度を比較した、実施例４に記載されている技術の実施形態を用いた核酸精製から得られたデータ
【図１２】異なるバッファー組成を比較した、実施例４に記載されている技術の実施形態を用いた核酸精製から得られたデータ
【図１３】結合バッファーの異なるｐＨ値を比較した、実施例４に記載されている技術の実施形態を用いた核酸精製から得られたデータ
【図１４】異なるバッファー組成及び処理工程を比較した、実施例４に記載されている技術の実施形態を用いた核酸精製から得られたデータ
【発明を実施するための形態】
【００３０】
血液試料からの核酸精製のための組成物、システム、バッファー、キット、及び方法を提供する。詳細には、乾燥血液試料などの血液試料から核酸を高収量で精製するためのバッファー、並びにそのようなバッファーを使用する方法を提供する。
【００３１】
例えば、現在販売されている業界最先端の製品よりも優れている、バッファーシステム、ビーズに基づく核酸の単離、並びに洗浄及び溶出バッファーを用いる組成物及び方法を提供する。本明細書において並んで実施されている実験は、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）の収量よりも２倍高く、及びＤＮＡ  ＩＱ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の収量よりも約５倍高い、乾燥血液試料からの精製ｇＤＮＡの収量を示す。得られた核酸は高品質であり、下流の分析法で使用でき、そのプロセスは、自動化しやすく、遠心分離又は真空工程無しで実施できるため費用効率が高い。
【００３２】
ある実施形態において、乾燥血液試料からを含む、血液試料などの試料から、高品質、高収量のＤＮＡを得るためのバッファーシステムを提供する。ある実施形態において、乾燥血液試料を用いる場合、バッファーシステムは、乾燥血液スポットを含む濾紙からの試料の取り出しを容易にするために、溶解バッファーを含む。そのような実施形態において、バッファーシステムは、試料の他の成分からの核酸の遊離を促進するためにライシスバッファーをさらに含んでいてよい。ある実施形態において、試料が全血の場合、溶解バッファーを省いてよく、試料をライシスバッファーで直接処理してよい。
【００３３】
ある実施形態において、所望の核酸を試料（例えば、濾紙中の乾燥血液）から遊離させ、さらに、溶解又はライシスバッファー中の１つ以上の夾雑物除去剤（例えば、プロテイナーゼＫのようなプロテアーゼ、グアニジンチオシアン酸塩のような変性剤など）により、不所望な成分（例えば、タンパク質）を破壊する（例えば、消化する）。
【００３４】
ある実施形態において、組成物及び方法は、核酸の精製のために固体支持体（例えば、ビーズ、樹脂、カラム、表面など）の使用を含む。ある実施形態において、固体支持体は常磁性ビーズを含む、から本質的になる、又はからなる。ある実施形態において、ビーズは、常磁性シリカビーズである。ある実施形態において、結合バッファーは、（例えば、乾燥血液スポット又は全血試料からの）核酸への常磁性シリカビーズの結合能を高める。ある実施形態において、結合バッファーは、溶解バッファー及び／又はライシスバッファーと、エタノールなどのアルコールとの混合物から構成される。
【００３５】
ある実施形態において、夾雑物（例えば、タンパク質、細胞破片など）を除去するため及び／又は塩を除去するため、１つ以上の洗浄バッファーを用いて１以上の洗浄工程を実施する。ある実施形態において、１回以上の最初の洗浄は、アルコール（例えば、エタノール）と共に溶解バッファー及び／又はライシスバッファーを含む洗浄溶液を用いる。ある実施形態において、洗浄バッファーは、カオトロピック剤及びアルコールを含む（例えば、Ｗ１Ａバッファー）。ある実施形態において、１以上のその後の洗浄工程は、アルコール（例えば、エタノール）及び水からなる洗浄バッファーを使用する。
【００３６】
ある実施形態において、ビーズに付着した精製核酸を溶出させるために溶出バッファーを用いる。その後、精製核酸を所望の目的のために用いることができる。
【００３７】
図１は、乾燥血液スポット１１（ＤＢＳ、ある実施形態において、図２を参照）から核酸を精製するのに使用するための例示のプロトコル１００を示す。図２Ａ〜Ｇは、図１に示す方法の概略図である。図１及び図２を一緒に説明する。
【００３８】
最初の工程１０において、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５など）の乾燥血液試料１１（実施形態において、図２に示すように複数の濾紙片上に乾燥させてよく、実施形態は１枚の濾紙上にあってもよい）を、溶解バッファー２１と共に反応容器１７に添加する。図１に示す実施形態において、溶解バッファー２１は、濾紙から乾燥血液を分離する。工程１０において、試料、すなわちＤＢＳ１１を、溶解バッファー２１中においてある期間１０ｔ（例えば、３０分間）インキュベートする。或いは、バッファー（例えば、溶解バッファー）を濾紙にかけて通過させ、所望の試料を取り出してもよい。
【００３９】
実施形態において、図１の工程２０及び図２Ｂの２０に示すように、任意選択的なライシスバッファー３１を用いてよい。実施形態において、ライシスバッファー３１は、ライシス成分を添加した溶解バッファー２１であってよい。或いは、実施形態において、溶解バッファー２１を工程１０と工程２０の間に除去し、そしてライシスバッファー３１を容器１７に添加してもよい。これは、容器１７の内容物を遠沈し、上清を除去し、さらに得られたペレットを別のライシスバッファー３１中に再懸濁させることにより達成することができる。ライシス成分は、タンパク質又は他の細胞成分などの不所望な物質又は夾雑物１２を消化する。ライシスバッファーを用いる場合２０（図２Ｂ）、その後、ある期間２０ｔ（例えば３０分）の間、ライシスバッファー３１中においてインキュベートする。
【００４０】
次に、図２Ｃに示すように、結合工程３０を実施する。実施形態において、結合バッファーは、工程１０の溶解バッファー２１、又は工程２０の任意選択的なライシスバッファー３１に、アルコールを添加することにより形成される。核酸捕捉固体支持体１４（磁気又は常磁性ビーズであってよい）も結合バッファー２２に添加する。図１及び図２Ｃの工程３０に示すように、結合バッファー２２は、細胞成分、標的１３、タンパク質などの細胞破片のような不所望物質１２、結合バッファー２２に加えて、核酸捕捉固体支持体１４（実施形態において、磁気ビーズ又は常磁性ビーズであってよい）を含む。試料を期間３０ｔの間インキュベートして、標的１３、すなわち目的の核酸をビーズ１４に結合させる。
【００４１】
次に、図２Ｄに示すように、工程４０において、結合バッファー２２、標的１３、不所望物質１２、及び磁気又は常磁性ビーズ１４を含む反応容器１７を、（例えば、磁石１８からの）磁場の近くに置いて、ビーズ１４を、不所望物質１２（例えば、細胞破片、タンパク質など）を含む試料の残りから分離する。試料をある期間４０ｔ（例えば５分）の間インキュベートする。
【００４２】
次に、図２Ｅに示すように、工程５０において、洗浄バッファーを容器１７に添加する。容器中に含まれる液体を除去してもよい。不所望物質１２を洗浄バッファー２４中に懸濁させ、一方核酸捕捉固体支持体又は磁気ビーズ１４に結合した標的物質は、磁石１８の存在により容器１７の側面に留まるであろう。不所望物質１２を除去するためにこの洗浄工程を数回繰り返してよい。
【００４３】
次に、図２Ｆに示すように、工程６０において、溶出バッファーを添加して、核酸捕捉固体支持体又はビーズから精製された標的又は核酸を解離させる。この溶出工程は、標的物質１３の溶出を完了するために、ある期間６０ｔ（例えば、５分）の間インキュベートしてよい。
【００４４】
次に、図２Ｇに示すように、工程７０において、溶液を遠沈し、標的ＤＮＡを含む上清を取り出す。核酸捕捉固体支持体又はビーズ１４はペレットを形成し、再利用されるか又は破棄されるであろう。図２Ｇに示すように、プロトコルの結果は、単離された標的ＤＮＡ１３である。得られた溶液は精製核酸生成物を提供する。
【００４５】
図３は、全血から核酸を精製するのに使用するための例示的プロトコルを示すフローチャートであり、図４Ａ〜Ｆは、図３に示す方法の概略図である。図３及び図４を一緒に説明する。全血から核酸を精製する場合、乾燥血液を有する濾紙又は他の基材は必要なく、従って、基材から乾燥血液を溶解させる工程は必要ない。従って、最初の工程、すなわち図１および図２Ａに示す工程１０は必要ない。その代わりに、全血細胞を溶かすライシス工程がこの実施形態の出発点である。
【００４６】
図３及び図４に示すように、最初の工程２０及び図４Ａにおいて、ライシスバッファーと共に全血を反応容器１７に添加する。試料を、第１の期間２０ｔ（例えば、５分）の間インキュベートして、その時間の間にタンパク質などの不所望な夾雑物１２を消化し、さらに標的核酸１３をバッファー中に遊離させる。
【００４７】
次に、図３の工程３０及び図４Ｂに示すように、結合工程を実施する。実施形態において、ライシスバッファーにアルコールを添加して、結合バッファー２２を形成する。核酸捕捉固体支持体（この実施形態では磁気ビーズ１４の形態である）も添加する。試料を第２の期間３０ｔ（例えば、５分）の間インキュベートして、目的の核酸１３をビーズ１４と結合させる。
【００４８】
次に、図３の工程４０及び図４Ｃに示すように、反応容器１７を、（例えば、磁石１８からの）磁場の近くに置いて、ビーズを、不所望物質１２（例えば、細胞破片、タンパク質など）を含む試料の残りから分離する。試料を第３の期間４０ｔ（例えば５分）の間インキュベートする。
【００４９】
次に、図３の工程５０及び図４Ｄに示されるように、洗浄バッファー２４で試料を洗浄し、ビーズ１４と結合していない不所望物質を除去する。洗浄工程を繰り返してよい。
【００５０】
次に、図３の工程６０及び図４Ｅに示すように、溶出バッファー２５を添加して、精製標的核酸１３をビーズ１４から解離させる。溶出バッファー溶液を、ある期間５０ｔ（例えば、５分）の間インキュベートする。
【００５１】
次に、図３の工程７０及び図４Ｆに示すように、解離した精製標的核酸１３を含む溶出バッファーを取り出して、容器１７から分離する。得られた溶液は、純粋な標的核酸生成物１３を提供する。
【００５２】
例示的バッファー及びバッファー成分：
ある実施形態において、溶解バッファー２１を提供する。溶解バッファー２１は、例えば、乾燥血液試料（例えば、物質中に存在する乾燥血液）を処理するのに使用される。ある実施形態において、溶解バッファー２１は、水（例えば、蒸留水、ｄｄＨ２Ｏ）に構成材料を添加することにより調製される。
【００５３】
ある実施形態において、溶解バッファー２１は塩基を含む。ある実施形態において、塩基は、第一級アミンを含む。ある実施形態において、塩基は、トリス（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール）である。実施形態において、塩基（例えば、トリス）は、１〜２０ｍＭの濃度（例えば、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ、３．５ｍＭ、４ｍＭ、４．５ｍＭ、５ｍＭ、５．５ｍＭ、６ｍＭ、６．５ｍＭ、７ｍＭ、７．５ｍＭ、８ｍＭ、８．５ｍＭ、９ｍＭ、９．５ｍＭ、１０ｍＭ、１０．５ｍＭ、１１ｍＭ、１１．５ｍＭ、１２ｍＭ、１２．５ｍＭ、１３ｍＭ、１３．５ｍＭ、１４ｍＭ、１４．５ｍＭ、１５ｍＭ、１５．５ｍＭ、１６ｍＭ、１６．５ｍＭ、１７ｍＭ、１７．５ｍＭ、１８ｍＭ、１８．５ｍＭ、１９ｍＭ、１９．５ｍＭ、２０ｍＭ、又はそれら値の間の任意の濃度又は範囲）でバッファー中に存在する。
【００５４】
ある実施形態において、溶解バッファー２１はキレート剤を含む。ある実施形態において、キレート剤は、２−（｛２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］エチル｝（カルボキシメチル）アミノ）酢酸（エチレンジアミン四酢酸；ＥＤＴＡ）である。ある実施形態において、ＥＤＴＡは、０．０５〜２．０ｍＭの濃度（例えば、０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、又はそれら値の間の任意の濃度又は範囲）でバッファー中に存在する。ある実施形態において、ＥＤＴＡは塩として提供される。例えば、ある実施形態において、ＥＤＴＡは、ＥＤＴＡ二ナトリウム塩（Ｃ１０Ｈ１４Ｎ２Ｎａ２Ｏ８・２Ｈ２Ｏ）又はＥＤＴＡ・４Ｎａ（Ｃ１０Ｈ１２Ｎ２Ｎａ４Ｏ８、４Ｈ２Ｏ）として提供される。トリス及びＥＤＴＡの両方が提供される場合、バッファーはＴＥバッファーと称される。
【００５５】
ある実施形態において、溶解バッファー２１は界面活性剤を含む。ある実施形態において、界面活性剤はイオン性界面活性剤である。ある実施形態において、界面活性剤は、サルコシン由来のイオン性（例えば、陰イオン性）界面活性剤である。ある実施形態において、界面活性剤は、Ｎ−ラウロイルサルコシン（別名サルコシル）であり、例えば、ナトリウム塩（［ドデカノイル（メチル）アミノ］酢酸ナトリウム）として提供される。ある実施形態において、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩は、体積％で、１〜１０％の濃度（例えば、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、又はそれら値の間の任意の濃度又は範囲）でバッファー中に存在する。ある実施形態において、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩は、ｐＨ８．０で提供される。ある実施形態において、界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。ある実施形態において、ＳＤＳは、体積％で、０．０５〜１０％の濃度（例えば、０．０５％、０．１％、０．３％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、又はそれら値の間の任意の濃度又は範囲）でバッファー中に存在する。ある実施形態において、界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。ある実施形態において、界面活性剤はトリトンＸ−１００（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）である。ある実施形態において、トリトンＸ−１００は、体積％で、０．０５〜１０％の濃度（例えば、０．０５％、０．１％、０．５％、０．６％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、又はそれら値の間の任意の濃度又は範囲）でバッファー中に存在する。ある実施形態において、界面活性剤はＴＸ−１１４（トリトンＸ−１１４；ｔ−オクチルフェノキシポリ（エトキシエタノール））である。ある実施形態において、ＴＸ−１１４は、体積％で、０．０５〜１０％の濃度（例えば、０．０５％、０．１％、０．５％、０．６％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、又はそれら値の間の任意の濃度又は範囲）でバッファー中に存在する。
【００５６】
ある実施形態において、溶解バッファー２１は、タンパク質などの不所望な夾雑物を変性又は破壊する１つ以上のライシス成分を含む。ある実施形態において、その成分は、プロテアーゼである。ある実施形態において、プロテアーゼはプロテイナーゼＫである。ある実施形態において、プロテイナーゼＫは、５０〜５０００μｇ／ｍｌの濃度（例えば、５０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、９０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌ、２０００μｇ／ｍｌ、３０００μｇ／ｍｌ、４０００μｇ／ｍｌ、５０００μｇ／ｍｌ、又はそれら値の間の任意の濃度又は範囲）でバッファー中に存在する。ある実施形態において、その成分は、変性剤又は還元剤である。ある実施形態において、還元剤は２−メルカプトエタノールである。ある実施形態において、２−メルカプトエタノールは、１００〜１０００ｍＭの濃度（例えば、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ、６００ｍＭ、７００ｍＭ、８００ｍＭ、９００ｍＭ、１０００ｍＭ、又はそれら値の間の任意の濃度又は範囲）でバッファー中に存在する。
【００５７】
実施形態において、溶解バッファー２１は、塩基、キレート剤、界面活性剤、及び任意選択的に１つ以上のライシス成分を、個々で又は組み合わせて含んでよい。
【００５８】
ある実施形態において、ライシスバッファー３１が提供される。図１及び図２Ａ〜Ｇに示されるように、試料の性質に依存して、溶解バッファー２１は、濾紙１９などの試料基材から試料を取り出すのに使用することができる。ある実施形態において、ライシス成分を溶解バッファー２１に添加して、一体化した溶解／ライシスバッファーを作成してよく、或いは、溶解バッファー２１をライシスバッファー３１で置き換えてもよい。或いは、図３及び図４Ａ〜Ｆに記載の実施形態において、試料が試料基材中に含まれていない場合、溶解バッファーは必要でなく、ライシスバッファー３１を用いてプロセスを開始してよい。
【００５９】
ある実施形態において、ライシスバッファー３１は、水（例えば、蒸留水、ｄｄＨ２Ｏ）にライシス成分を添加して調製することができる。ある実施形態において、ライシスバッファー３１はタンパク質変性剤を含む。ある実施形態において、タンパク質変性剤はカオトロピック剤である。ある実施形態において、カオトロピック剤はグアニジンチオシアン酸塩（Ｃ２Ｈ６Ｎ４Ｓ）（別名チオシアン酸グアニジン又はＧＩＴＣ）、又はグアニジン塩酸塩、或いはそれらの組合せである。実施形態において、カオトロピック剤は、２〜６Ｍの濃度（例えば、２Ｍ、２．５Ｍ、３Ｍ、３．５Ｍ、４Ｍ、４．５Ｍ、５Ｍ、５．５Ｍ、６Ｍ、又はそれら値の間の任意の濃度又は範囲）でバッファー中に存在する。
【００６０】
ある実施形態において、ライシスバッファー３１は塩を含む。ある実施形態において、塩はリン酸塩である。ある実施形態において、塩はリン酸ナトリウムである。ある実施形態において、リン酸ナトリウムはリン酸二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）である。ある実施形態において、リン酸二ナトリウムは水和物（例えば、Ｎａ２ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏ）として提供される。実施形態において、リン酸二ナトリウムは、９０〜１１０ｍＭの濃度（例えば、９０ｍＭ、９５ｍＭ、１００ｍＭ、１０４ｍＭ、１０５ｍＭ、１１０ｍＭ、又はそれら値の間の任意の濃度又は範囲）でバッファー中に存在する。ある実施形態において、リン酸二ナトリウムはｐＨ８．７で提供される。
【００６１】
実施形態において、ライシスバッファー３１は、タンパク質変性剤（カオトロピック剤であってよい）、塩又はそれらの組合せを含んでいてよい。
【００６２】
ある実施形態において、溶解バッファー２１を試料に添加し、その後、最初のバッファーのその間の除去なしに、ライシスバッファー３１を添加する。従って、ある実施形態において、溶解バッファー２１及びライシスバッファー３１の組合せ又は混合物であるバッファーが提供される。
【００６３】
ある実施形態において、遊離された核酸のビーズへの結合を促進させるために、ライシスバッファー３１、又は溶解バッファー２１とライシスバッファー３１との組合せに、アルコールを添加して結合バッファー２２を作成する。ある実施形態において、アルコールはエタノール（例えば、無水エタノール）である。ある実施形態において、アルコールの量は、結合バッファー２２中のアルコールの濃度が２０％〜７０％（例えば、２０％、２５％、３０％、３５％、５０％、７０％、又はそれら値の間の任意の濃度又は範囲）になるように添加される。
【００６４】
ある実施形態において、核酸捕捉固体支持体１４を提供する。実施形態において、核酸捕捉固体支持体は磁気ビーズ１４である。磁気ビーズ１４は、試料中の標的核酸１３を捕捉するために提供される。ある実施形態において、ビーズ１４は磁気ビーズである。ある実施形態において、ビーズは常磁性ビーズである。ある実施形態において、ビーズは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから入手できるＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）、ＴｕｒｂｏＢｅａｄｓ  ＬＬＣ、チューリッヒ、スイスから入手できるＴＵＲＢＯＢＥＡＤＳ（登録商標）、非同期性（asynchronous）磁気ビーズ、又はそれらの組合せである。ある実施形態において、ビーズは、常磁性のＱビーズ（ＭａｇＱｕ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）である。ＭａｇＱｕ  Ｃｏ．Ｌｔｄからの常磁性Ｑビーズは、直径約３μｍで、安定な磁性酸化鉄コア、高度に水溶性でかつ生体適合性のデキストラン被覆表面を有し、表面プローブへの共有結合を可能にする。
【００６５】
ある実施形態において、洗浄バッファー２４を提供する。洗浄バッファーは、ビーズに結合した核酸から夾雑物を除去するのに使用される。ある実施形態において、洗浄バッファーはアルコールを含む。ある実施形態において、アルコールはエタノールである。ある実施形態において、アルコールはイソプロパノールである。ある実施形態において、洗浄バッファーは、アルコール及びライシスバッファー及び／又は溶解バッファーを含む。そのような実施形態において、洗浄バッファーは、結合バッファーと同じ材料を含んでいてよい。ある実施形態において、洗浄バッファーは、アルコール及び水を含み、からなり、又はから本質的になる。ある実施形態において、アルコール（例えば、エタノール）は、体積％で、６０〜８０％（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、又はそれら値の間の任意の濃度又は範囲）で存在する。
【００６６】
ある実施形態において、溶出バッファー２５を提供する。溶出バッファー２５は、回収し及び下流の適用で使用するために標的核酸１３を取り出すのに使用される。ある実施形態において、溶出バッファー２５は塩基を含む。ある実施形態において、塩基は第一級アミンを含む。ある実施形態において、塩基はトリス（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール）である。実施形態において、塩基（例えば、トリス）は、１〜２０ｍＭの濃度（例えば、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ、３．５ｍＭ、４ｍＭ、４．５ｍＭ、５ｍＭ、５．５ｍＭ、６ｍＭ、６．５ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、８．５ｍＭ、９ｍＭ、９．５ｍＭ、１０ｍＭ、１０．５ｍＭ、１１ｍＭ、１１．５ｍＭ、１２ｍＭ、１２．５ｍＭ、１３ｍＭ、１３．５ｍＭ、１４ｍＭ、１４．５ｍＭ、１５ｍＭ、１５．５ｍＭ、１６ｍＭ、１６．５ｍＭ、１７ｍＭ、１７．５ｍＭ、１８ｍＭ、１８．５ｍＭ、１９ｍＭ、１９．５ｍＭ、２０ｍＭ、又はそれら値の間の任意の濃度又は範囲）でバッファー中に存在する。ある実施形態において、溶出バッファーはキレート剤を含む。ある実施形態において、キレート剤は、２−（｛２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］エチル｝（カルボキシメチル）アミノ）酢酸（エチレンジアミン四酢酸；ＥＤＴＡ）である。ある実施形態において、ＥＤＴＡは、０．０５〜２．０ｍＭの濃度（例えば、０．０５ｍＭ、０．０６ｍＭ、０．０７、ｍＭ、０．０８ｍＭ、０．０９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、又はそれら値の間の任意の濃度又は範囲）でバッファー中に存在する。ある実施形態において、溶出バッファーは、７．０〜８．０のｐＨ（例えば、ｐＨ８．０）で提供される。
【００６７】
実施形態において、１つ以上のバッファーを、濃縮物（例えば、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍濃縮物）として、容器（例えば、チューブ、バイアルなど）内にキットの形態で提供してもよい。例えば、バッファー成分が溶液中に０．１ｍＭの最終濃度を有することが望ましい場合、１ｍＭとして１０倍濃度を提供してもよい。１μＬの濃縮物を９μＬの液体に添加すると、目的の０．１ｍＭ濃度をもたらす。ある実施形態において、複数のバッファー成分を適切な相対濃度で単一溶液中に一緒に提供する。
【００６８】
態様（１）において、本開示は、ａ）界面活性剤を含む溶解バッファー；ｂ）タンパク質変性剤を含むライシスバッファー；及びｃ）核酸捕捉固体支持体；を含むシステムを提供する。別の態様（２）において、本開示は、前記溶解バッファーがキレート剤及び塩基をさらに含む、態様（１）に従うシステムを提供する。別の態様（３）では、本開示は、前記ライシスバッファーが塩をさらに含む、態様（１）に従うシステムを提供する。別の態様（４）では、本開示は、前記核酸捕捉固体支持体が常磁性ビーズを含む、態様（１）に従うシステムを提供する。別の態様（５）では、本開示は、前記界面活性剤がイオン性界面活性剤を含む、態様（１）に従うシステムを提供する。別の態様（６）では、本開示は、前記イオン性界面活性剤がサルコシン由来のイオン性界面活性剤を含む、態様（５）に従うシステムを提供する。別の態様（７）では、本開示は、前記界面活性剤がＮ−ラウロイルサルコシを含む、態様（６）に従うシステムを提供する。別の態様（８）では、本開示は、前記界面活性剤が［ドデカノイル（メチル）アミノ］酢酸ナトリウムを含む、態様（７）に従うシステムを提供する。別の態様（９）では、本開示は、前記界面活性剤が、０．０５〜１０体積％で溶解バッファー中に存在する、態様（１）〜（８）に従うシステムを提供する。別の態様（１０）では、本開示は、前記界面活性剤が、３体積％で溶解バッファー中に存在する、態様（９）に従うシステムを提供する。別の態様（１１）では、本開示は、前記溶解バッファーが、タンパク質を変性又は破壊させる１つ以上の成分をさらに含む、態様（１）に従うシステムを提供する。別の態様（１２）では、本開示は、前記タンパク質を変性又は破壊させる１つ以上の成分が、プロテイナーゼＫを含む、態様（１１）に従うシステムを提供する。
【００６９】
さらなる態様（１３）では、本開示は、ａ）ライシスバッファーであって、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、又はそれらの組合せと、リン酸水素二ナトリウムとを含むライシスバッファー；及びｂ）核酸捕捉固体支持体；を含むシステムを提供する。別の態様（１４）では、本開示は、界面活性剤、キレート剤、及び塩基を含むライシスバッファーをさらに含む、態様（１３）に従うシステムを提供する。
【００７０】
さらなる態様（１５）において、本開示は、ａ）Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩を含む溶解バッファー；及びｂ）        グアニジンチオシアン酸塩を含むライシスバッファー；を含む、システムを提供する。別の態様（１６）では、本開示は、前記溶解バッファーが塩基及びキレート剤をさらに含む、態様（１５）に従うシステムを提供する。別の態様（１７）では、本開示は、前記溶解バッファーが、タンパク質を変性又は破壊させる１つ以上の成分をさらに含む、態様（１５）に従うシステムを提供する。別の態様（１８）では、本開示は、前記ライシスバッファーが塩をさらに含む、態様（１５）に従うシステムを提供する。別の態様（１９）では、本開示は、核酸捕捉固体支持体をさらに含む、態様（１５）に従うシステムを提供する。別の態様（２０）では、本開示は、前記核酸捕捉固体支持体が磁気ビーズ又は常磁性ビーズを含む、態様（１９）に従うシステムを提供する。
【００７１】
さらなる態様（２１）において、本開示は、１つ以上の洗浄バッファーをさらに含む、態様（１）〜（２０）のいずれかのシステムを提供する。さらなる態様（２２）において、本開示は、磁石をさらに含む、態様（１）〜（２１）のいずれかのシステムを提供する。さらなる態様（２３）において、本開示は、試験試料をさらに含む、態様（１）〜（２２）のいずれかのシステムを提供する。さらなる態様（２４）において、本開示は、血液試料をさらに含む、態様（２３）のシステムを提供する。さらなる態様（２５）において、本開示は、前記試験試料が乾燥血液試料を含む、態様（２４）のシステムを提供する。さらなる態様（２６）において、本開示は、前記試験試料が濾紙中または濾紙上に乾燥血液を含む、態様（２５）のシステムを提供する。さらなる態様（２７）において、本開示は、前記溶解バッファー又はその濃縮物を第１の容器中に提供し、かつ前記ライシスバッファー又はその濃縮物を第２の容器中に提供する、態様（１５）のシステムを提供する。さらなる態様（２８）において、本開示は、前記システムが反応混合物を含む、態様（１）〜（２７）のいずれか１つのシステムを提供する。さらなる態様（２９）において、本開示は、試料から核酸を精製する方法であって、試料を、態様（１）〜（２８）のいずれかのシステムの溶解及び／又はライシスバッファーと接触させる工程を含む方法を提供する。
【００７２】
さらなる態様（３０）において、本開示は、試料から核酸を精製する方法であって、試料を、態様（１）〜（１２）又は（１５）〜（２８）のいずれかの溶解バッファーと接触させて溶解試料を作成し；さらに前記溶解試料を前記ライシスバッファーと接触させる；工程を含む方法を提供する。
【００７３】
さらなる態様（３１）において、本開示は、試験試料をさらに含む、態様（１）〜（２２）のいずれか１つの方法を提供する。追加の態様（３２）では、本開示は、前記試料が血液試料、乾燥血液試料、又は全血試料である、態様（２９）又は（３０）の方法を提供する。追加の態様（３３）では、本開示は、前記試料を、前記核酸捕捉固体支持体又は磁気ビーズ又は常磁性ビーズと接触させて、支持体結合核酸を作成する工程をさらに含む、態様２９又は３０の方法を提供する。追加の態様（３４）では、本開示は、前記支持体結合核酸を洗浄溶液で洗浄する工程をさらに含む、態様（３３）の方法を提供する。態様（３４）において、洗浄溶液はエタノールを含んでいてよく、そのエタノールは７０体積％のエタノールであってよい。態様（３５）において、本開示は、前記支持体結合核酸を溶出バッファーと接触させて溶出された核酸をもたらす工程をさらに含む、態様（３１）の方法を提供する。態様（３６）では、態様（３５）の溶出バッファーはＴＥバッファーを含んでいてよい。
【００７４】
さらなる態様（３６）において、本開示は、前記溶出された核酸を分析する工程をさらに含む、前記態様のいずれか１つの方法を提供する。さらなる態様（３７）において、本開示は、前記核酸が、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡであってよい）を含む、前記態様のいずれか１つの方法を提供する。
【００７５】
例示：
ここに記載されている組成物及び方法は、多種多様な試料と共に使用される。ある実施形態において、試料は動物由来のものである。ある実施形態において、動物はヒト（例えば、成人、又は新生児）である。ある実施形態において、動物は非ヒト動物（例えば、コンパニオンアニマル、家畜、齧歯動物、病原媒介動物（infectious disease vector carrier）など）である。ある実施形態において、試料は生体試料である。ある実施形態において、試料は環境試料（例えば、水、土など）である。ある実施形態において、生体試料は組織又は液体試料である。ある実施形態において、液体試料は、血液、血液成分、又は血液製剤（例えば、血漿、血清など）である。ある実施形態において、血液試料は乾燥血液試料である。ある実施形態において、乾燥血液試料は乾燥血液スポット（ＤＢＳ）である。ある実施形態において、乾燥血液スポットは、濾紙又は他の任意の基材（例えば、ガスリーカード）上にブロット及び乾燥させた血液試料を含む。ある実施形態において、対照試料（例えば、陽性又は陰性対照）が提供され又は試験試料と一緒に処理される。
【００７６】
任意の適切な技術によって乾燥血液スポットを採取することができる。ある実施形態では、対象から（例えば、指、かかと、又は足指からランセットにより）出させた１〜数滴の血液を濾紙につけることによって乾燥血液スポットを採取する。血液を濾紙に染み込ませ、乾燥させる（例えば、風乾する）。乾燥剤を有する低ガス透過性プラスチック袋の中で試料を保存し、さらなる処理が可能な状態になるまで周囲温度に維持することができる。処理できる状態になると、技術者が、（例えば、自動または手動の穴あけ器を用いて）試料を含む紙の小さな部分（例えばディスク）を切り離す。その試料を含む小さな部分を容器（例えば、チューブ、バイアル、ディッシュなど）に加え、本明細書に記載されている方法により処理することができる。或いは、バッファー（例えば、溶解バッファー）を濾紙にかけて通過させ、所望の試料を取り出してもよい。乾燥血液スポット採取のための材料及び標準は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Hannon et al., (1997) Blood Collection on Filter Paper for Neonatal Screening Programs, 3rd edition, approved standard, National Committee for Clinical Laboratory Standards Document A4A3. National Committee for Clinical Laboratory Standards、Wayne, PAに記載されている。
【実施例】
【００７７】
実施例１
この実施例は、様々な種類の試料と共に使用するのに適した、本明細書に記載されている技術の実施形態を用いるプロトコルを提供する。これら特定の実施例は、乾燥血液スポット試料（実施例１Ａ）及び全血試料（実施例１Ｂ）を用いる。
【００７８】
実施例１Ａ）乾燥血液スポット試料：
１）１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブに、直径３ｍｍの乾燥血液スポットのパンチしたディスク３枚を置き、７５μｌの溶解バッファー（１０ｍＭ  トリス、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ・４Ｎａ、３％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、ｐＨ８．０）及び１．５μｌのプロテイナーゼＫを添加する。ボルテックスにより最大速度で激しく混和する。
２）５６℃で３０分間インキュベートする。１０分毎にボルテックスにより最大速度で３秒間激しく混和する。
３）溶液を遠沈させるために短時間遠心する。溶液を新しい１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブに回収する。
４）８５μｌのライシスバッファー（５Ｍ  グアニジンチオシアン酸塩、及び１０４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏ、ｐＨ８．７）を添加し、ボルテックスで混和する。
５）９５μｌの無水エタノールを添加し、ボルテックスで混和する。
６）ビーズを均一になるまで最大速度でボルテックスする（ビーズ溶液は沈殿しやすく、従って使用前にそれらが完全に混和しているようにする）。渦巻いている状態で、５μｌのビーズを溶液中に添加する。完全に混和するまで、少なくとも２０回ピペットで吸ったり吐いたりする。
７）ボルテックスにより最大速度で３秒間激しく混和し、さらに５分間インキュベートする。毎分５回チューブをひっくり返す。
８）溶液を遠沈させるために短時間遠心する。磁気スタンドを用いて、液体が全体的に透明になるまで液体からビーズを分離する。液体を注意深く除去する（できるだけビーズをばらばらにしないようにする）。
９）各反応のために以下のようにＤＢＳ洗浄バッファーを調製する。必要であれば容量をスケールアップする（それぞれの使用の前に新鮮なＤＢＳ洗浄バッファーを調製する）：
ＤＢＳ洗浄バッファー：３７．５μｌの溶解バッファー；４２．５μｌのライシスバッファー；４７．５μｌの無水エタノール。
１０）磁気スタンドからチューブを取り外し、１００μｌのＤＢＳ洗浄バッファーを添加する。完全に混和するまでボルテックスにより３秒間激しく混和する。
１１）磁気スタンド（磁石１８を有するスタンド）を用いて、液体が全体的に透明になるまで液体からビーズを分離する。透明な液体を注意深く除去する。
１２）磁気スタンドからチューブを取り外し、１００μｌの７０％エタノール洗浄バッファーを添加する。完全に混和するまでボルテックスにより３秒間激しく混和する。
１３） 磁気スタンドを用いて、液体が全体的に透明になるまで液体からビーズを分離する。透明な液体を注意深く除去する。
１４）全３回の洗浄のため、工程１２及び１３を２回繰り返す。溶液を遠沈させるために短時間遠心する。磁気スタンドを用いて、液体が全体的に透明になるまで液体からビーズを分離する。（できるだけ多く）液体を注意深く除去する。
１５）室温で５〜１０分間風乾する（収量が減るため長く乾燥しすぎない）。
１６）磁気スタンドからチューブを取り外し、５０〜１５０μｌの予熱溶出バッファー（ＴＥバッファー）を添加する。完全に混和するまで、ピペットで吸ったり吐いたりする。
１７）６５℃で５分間インキュベートする。
１８）溶液を遠沈させるために短時間遠心する。磁気スタンドを用いて、液体が全体的に透明になるまで液体からビーズを分離する。それに続く使用／分析のために新しいマイクロ遠心チューブに液体を確保し、又は後の使用のために−２０℃で保管する。
【００７９】
実施例１Ｂ）全血試料：
１）ボルテックスで、１〜２５μｌの新鮮な全血を、８５μｌのライシスバッファー（５Ｍ  グアニジンチオシアン酸塩、及び１０４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏ、ｐＨ８．７）と混和する。室温で５分間インキュベートする。
２）９５μｌの無水エタノールを添加し、すぐにボルテックスで混和する。
３）ビーズを均一になるまで最大速度でボルテックスする（ビーズ溶液は沈殿しやすく、従って使用前にそれらが完全に混和しているようにする）。渦巻いている状態で、１０μｌのビーズを溶液中に添加する。完全に混和するまで、少なくとも２０回ピペットで吸ったり吐いたりする。
４）ボルテックスにより最大速度で３秒間激しく混和し、さらに５分間インキュベートする。毎分５回チューブをひっくり返す。
５）溶液を遠沈させるために短時間遠心する。磁気スタンドを用いて、液体が全体的に透明になるまで液体からビーズを分離する。液体を注意深く除去する（できるだけビーズをばらばらにしないようにする）。
６）各反応のために以下のように全血洗浄バッファーを調製する。必要であれば容量をスケールアップする（それぞれの使用の前に新鮮な全血洗浄バッファーを調製する；結晶が形成された場合は調製しなおす）：
５１μｌのライシスバッファー；５７μｌの無水エタノール。
７）磁気スタンドからチューブを取り外し、１００μｌの全血洗浄バッファーを添加する。完全に混和するまでボルテックスで３秒間激しく混和する。
８）磁気スタンドを用いて、液体が全体的に透明になるまで液体からビーズを分離する。透明な液体を注意深く除去する。
９）磁気スタンドからチューブを取り外し、１００μｌの７０％エタノール洗浄バッファーを添加する。完全に混和するまでボルテックスにより３秒間激しく混和する。
１０）磁気スタンドを用いて、液体が全体的に透明になるまで液体からビーズを分離する。透明な液体を注意深く除去する。
１１）全３回の洗浄のため、工程９及び１０を２回繰り返す。溶液を遠沈させるために短時間遠心する。磁気スタンドを用いて、液体が全体的に透明になるまで液体からビーズを分離する。（できるだけ多く）液体を注意深く除去する。
１２）室温で５〜１０分間風乾する（収量が減るため長く乾燥しすぎない）。
１３）磁気スタンドからチューブを取り外し、５０〜１５０μｌの予熱溶出バッファー（ＴＥバッファー）を添加する。完全に混和するまで、ピペットで吸ったり吐いたりする。
１４）６５℃で５分間インキュベートする。
１５）溶液を遠沈させるために短時間遠心する。磁気スタンドを用いて、液体が全体的に透明になるまで液体からビーズを分離する。それに続く使用／分析のために新しいマイクロ遠心チューブに液体を確保し、又は後の使用のために−２０℃で保管する。
【００８０】
実施例２−ＤＢＳの分析
この実施例は、乾燥血液スポット試料を用いる最先端の市販の製品に対して、並んで実施した実験で、本明細書に記載されている技術の実施形態を比較する。本明細書に記載されている技術は、予測できない及び驚くべき収量の高品質核酸をもたらす。
【００８１】
実施例１Ａに記載されているプロトコルを用いてｇＤＮＡを精製した。ＱｉａｇｅｎからのＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ及びＰｒｏｍｅｇａからのＤＮＡ  ＩＱ  ｓｙｓｔｅｍを用いたベンチマーク比較を並行して実施した。直径３ｍｍのＤＢＳの３枚のパンチした小片を、５６℃で３０分間、７６．５μｌ溶解バッファー／プロテイナーゼＫ中においてインキュベートした（１０ｍＭ  トリス、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ・４Ｎａ、３％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、ｐＨ８．０）。より高いｇＤＮＡ収量を得るために１０分毎に激しく試料をボルテックスした。溶解溶液を８５μｌのライシスバッファー（５Ｍ  グアニジンチオシアン酸塩、及び１０４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏ、ｐＨ８．７）及び９５μｌの無水エタノールと組み合わせて、結合環境を達成した。次に、ＤＮＡ結合のために５μｌのＱビーズ（ＭａｇＱｕ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を試料と５分間混和させた。１００μｌのＤＢＳ洗浄バッファーで１回、及び１００μｌの７０％エタノールで３回、ビーズを洗浄した。その後、６５℃で５分間、５０μｌのＴＥバッファーでＤＮＡを溶出した。
【００８２】
ＤＮＡの濃度／収量をＱＵＢＩＴ（登録商標）ｄｓＤＮＡ  ＨＳ（Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ及びＱＵＢＩＴ２．０  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒにより特定し、さらにＰＣＲ及び定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により品質を確認した。結果は、本明細書に提供する技術が、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  ＫｉｔのｇＤＮＡ収量より２倍以上高い収量を有し、かつＤＮＡ  ＩＱ  Ｓｙｓｔｅｍの収量のほぼ５倍高い収量を有していたことを示した（図５）。大きなエラーバーは、ドナー間の違いによるものであった。その増加倍率はかなり一貫性があった。精製ｇＤＮＡを１％アガロースゲル電気泳動により分離した。データは、本明細書に提供する技術が、Ｐｒｏｍｅｇａ及びＱｉａｇｅｎのキットよりも、より純粋でかつ無傷なｇＤＮＡのバンドをもたらしたことを示す。
【００８３】
また、ＰＣＲを用いて１μｌの精製ｇＤＮＡ（１／５０溶出液）からＧＡＰＤＨ配列を増幅させ、１％アガロースゲル電気泳動により分離した。画像は、全てのキットからＧＡＰＤＨが増幅されたことを示した。ｇＤＮＡの品質をさらに確認するため、１μｌの精製ｇＤＮＡ（１／５０溶出液）を、ＰＣＲよりもより感度がよい増幅法であるリアルタイムＰＣＲにより分析した。結果は、本明細書に提供する技術が、他の２つのキットと比較して、最高の性能を有することを示した。
【００８４】
実施例３−全血試料の分析
この実施例は、全血試料を用いる最先端の市販の製品に対して、並んで実施した実験で、本明細書に記載されている技術の実施形態を比較する。実施例１Ｂに記載されているプロトコルを用いた。２つのベンチマークキットに対する並行比較も実施した。ＤＮＡの濃度／収量をＱＵＢＩＴ  ｄｓＤＮＡ  ＨＳ（Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ及びＱＵＢＩＴ２．０  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒにより特定し、さらにＰＣＲ及び定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により品質を確認した。結果は、本明細書に提供する技術が、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔに匹敵するｇＤＮＡ収量を有することを示した（図６）。精製ｇＤＮＡを１％アガロースゲル電気泳動により分離した。結果は、本明細書に記載の技術を用いて１μｌ程度の少量の全血試料からでさえｇＤＮＡが精製されたことを示した。ｇＤＮＡのバンドは、Ｐｒｏｍｅｇａのキットに匹敵する強度、及びＱｕａｇｅｎのキットよりもわずかに高い強度を示した。また、ＰＣＲを用いて１μｌの精製ｇＤＮＡ（１／５０溶出液）からＧＡＰＤＨ配列を増幅させ、１％アガロースゲル電気泳動により分離した。画像は、全てのキットからＧＡＰＤＨが増幅されたことを示した。ｇＤＮＡの品質をさらに確認するため、２０μｌの全血試料からの１μｌの精製ｇＤＮＡ（１／５０溶出液）を、リアルタイムＰＣＲにより分析した。結果は、本明細書に提供する技術が、他の２つのキットに匹敵する性能を有することを示した。
【００８５】
実施例４−バッファー性能
この実施例は、選択的なバッファー処方及びその性能を記載する。第１の実験において、１０ｍＭ  トリスと、選択的に３％サルコシル、１％トリトンＸ−１００、又は０．５％ＳＤＳとを用いて溶解バッファーを調製し、ベンチマークのＱｉａｇｅｎ及びＰｒｏｍｅｇａ製品と比較した。２．５Ｍ  グアニジンチオシアン酸塩（ＧｕＳＣＮ）、２５％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、及び選択的に、０．７５％サルコシル、０．２５％トリトンＸ−１００、又は０．１２５％ＳＤＳを含むライシス／結合バッファーを用いた。プロテイナーゼＫを用いて又は用いないで溶解バッファーを試験した。乾燥血液スポットからの精製核酸をＰＣＲにより増幅し、生成物をゲルにかけた。図７に、バンドをもたらす各試料と共に結果を示す。
【００８６】
第２の実験は、イソプロピルアルコールと組み合わせた選択的な溶解バッファーの界面活性剤及び塩基を試験した。以下の１３の反応のそれぞれを実施した（溶解バッファー、ライシスバッファー、及び結合バッファールコールの混合物を示す）：
（１）２．５Ｍ  ＧｕＳＣＮ＋０．３１％  ＳＤＳ＋３７．５％  ＩＰＡ；
（２）２．５Ｍ  ＧｕＳＣＮ＋０．２５％  ＳＤＳ＋５０％  ＩＰＡ；
（３）２．５ｍＭ  トリス＋２．５Ｍ  ＧｕＳＣＮ＋０．７５％  サルコシル＋２５％  ＩＰＡ；
（４）１．２５ｍＭ  トリス＋２．５Ｍ  ＧｕＳＣＮ＋０．３７５％  サルコシル＋３７．５％  ＩＰＡ；
（５）２．５ｍＭ  トリス＋０．０２５ｍＭ  ＥＤＴＡ・４Ｎａ＋２．５Ｍ  ＧｕＳＣＮ＋０．７５％  サルコシル＋２５％  ＩＰＡ；
（６）１．２５ｍＭ  トリス＋０．０１２５ｍＭ  ＥＤＴＡ・４Ｎａ＋２．５Ｍ  ＧｕＳＣＮ＋０．３７５％  サルコシル＋３７．５％  ＩＰＡ；
（７）２．５ｍＭ  トリス＋２．５Ｍ  ＧｕＳＣＮ＋０．３７５％  サルコシル＋０．３７５％トリトンＸ−１００＋２５％  ＩＰＡ；
（８）１．２５ｍＭ  トリス＋２．５Ｍ  ＧｕＳＣＮ＋０．１８７５％  サルコシル＋３７．５％  ＩＰＡ；
（９）２．５ｍＭ  トリス＋２．５Ｍ  ＧｕＳＣＮ＋０．２５％  サルコシル＋０．２５％  トリトンＸ−１００＋０．２５％  ＳＤＳ＋２５％  ＩＰＡ；
（１０）１．２５ｍＭ  トリス＋２．５Ｍ  ＧｕＳＣＮ＋０．１２５％  サルコシル＋０．１２５％  トリトンＸ−１００＋０．１２５％  ＳＤＳ＋３７．５％  ＩＰＡ；
（１１）Ｐｒｏｍｅｇａキット（Ｐ）；
（１２）ＱＩＡＧＥＮキット（Ｑ）；及び
（１３）ＰＣＲ鋳型なし陰性対照。
【００８７】
乾燥血液スポットからの精製核酸をＰＣＲにより増幅し、生成物をゲルにかけた。結果を図８に示す。
【００８８】
第３の実験は、溶解バッファー中の異なる界面活性剤と共に、結合バッファーにおいて用いられるアルコールを比較した。ライシスバッファーにおいて４ＭのＧｕＳＣＮを用いた。選択的に０．５％ＳＤＳ、３％サルコシル、１％ＴＸ−１１４、又は１％トリトンＸ−１００を有する溶解バッファーを用いた。それぞれを、ＩＰＡ、エタノール（ＥｔＯＨ）、メタノール（ＭｅＯＨ）、イソアミルアルコール、又はイソブチルアルコールと共に試験した。乾燥血液スポットからの精製核酸をＰＣＲにより増幅し、生成物をゲルにかけた。図９Ａ及び９Ｂに、バンドをもたらす各試料と共に結果を示す。ＧｕＳＣＮ、サルコシル、エタノールの組合せが最も強いバンドをもたらした。
【００８９】
第４の実験は、Ｐｒｏｍｅｇａキットと比較して、溶解バッファー中のＴＥ−バッファーと組み合わせた異なる界面活性剤（０．５％ＳＤＳ、３％サルコシル、１％ＴＸ−１１４、１％トリトンＸ−１００）を比較した。乾燥血液スポットからの精製核酸を分析し、３％サルコシルが最も高い観察収量をもたらし、各試料は市販製品よりも高い収量であった。
【００９０】
第５の実験は、ＳＤＳ又はサルコシル界面活性剤のいずれか、及び異なるグアニジン化合物を有する結合バッファー中の、溶解バッファーと、ライシスバッファーと、アルコールとの異なる相対的レベルを比較した。図１０に乾燥血液スポット試料からの結果を示す（体積は順番に、溶解バッファー、ライシスバッファー、アルコール）。
【００９１】
第６の実験は、溶解バッファーとしてＴＥバッファーと共に３％サルコシルを用い、ライシスバッファー中のＧｕＳＣＮの濃度を変化させ、並びに結合バッファー中のエタノール（ＥｔＯＨ）濃度を変化させた。図１１に乾燥血液スポット試料からの結果を示す。核酸のＱＵＢＩＴ定量化は、３７．５％エタノールと組み合わせた１．６２５Ｍ  ＧｕＳＣＮが最も高い収量をもたらしたことを示した。
【００９２】
第７の実験は、プロテイナーゼＫ（ＰＫ）有り又は無しで、溶解バッファーとしてＴＥバッファーと共に３％サルコシル；塩（リン酸塩及びＺｎＣｌ２）有り又は無しで、ライシスバッファーにおいてＧｕＳＣＮ；及び結合バッファーにおいて＋／−エタノール（ＥｔＯＨ）を用いた。図１２に乾燥血液スポット試料からの結果を示す。核酸のＱＵＢＩＴ定量化は、プロテイナーゼＫを含む溶解バッファー、塩を含む又は含まないライシスバッファー、及びエタノールで、強い結果を示した。
【００９３】
第８の実験は、ライシス／結合工程のためのｐＨ条件をｐＨ３〜ｐＨ８まで変化させて、プロテイナーゼＫと共に、溶解バッファーとしてＴＥバッファーと一緒に３％サルコシルを用いた。図１３に乾燥血液スポット試料からの結果を示す。核酸のＱＵＢＩＴ定量化により示されるように、ｐＨ８が最も高い収量をもたらした。
【００９４】
第９の実験は、バッファー組成（サルコシル濃度；プロテイナーゼＫ対２−メルカプトエタノール；混合方法；洗浄方法（Ｗ１Ａバッファー；Ｗ２＝２８．５ｍＭ  酢酸ナトリウム、６６ｍＭ  酢酸アンモニウム、７０％エタノール洗浄；ＤＢＳＷ＝バッファー／アルコールの組合せで洗浄）；溶出バッファー（水対ＴＥバッファー））を変えて試験した。図１４に乾燥血液スポットからの結果を示す。核酸のＱＵＢＩＴ定量化は、溶解バッファー（ＴＥ−バッファー、３％サルコシル、プロテイナーゼＫ）とＴＥ−溶出バッファーの組合せで最高の収量を示した。
【００９５】
追加の実験は、異なる常磁性ビーズを比較した。ＱビーズをＭａｇｅｎビーズ（ＭａｇｅｎＴｅｃｈからのＭａｇＰｕｒｅ  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  ＤＡＮ  Ｋｉｔｔｓ  ＩＩ）と比較した。両方がうまくいった。しかしながら、Ｑビーズは乾燥血液スポット試料からの精製核酸のより高い収量をもたらした。
【００９６】
以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。
【００９７】
実施形態１
システムにおいて：
ａ）界面活性剤を含む溶解バッファー；
ｂ）タンパク質変性剤を含むライシスバッファー；及び
ｃ）核酸捕捉固体支持体；
を含む、システム。
【００９８】
実施形態２
前記溶解バッファーがキレート剤及び塩基をさらに含む、実施形態１記載のシステム。
【００９９】
実施形態３
前記ライシスバッファーが塩をさらに含む、実施形態１に記載のシステム。
【０１００】
実施形態４
前記核酸捕捉固体支持体が、磁気ビーズ又は常磁性ビーズを含む、実施形態１に記載のシステム。
【０１０１】
実施形態５
前記界面活性剤がイオン性界面活性剤を含む、実施形態１に記載のシステム。
【０１０２】
実施形態６
前記イオン性界面活性剤が、サルコシン由来のイオン性界面活性剤を含む、実施形態５に記載のシステム。
【０１０３】
実施形態７
前記界面活性剤がＮ−ラウロイルサルコシンを含む、実施形態６に記載のシステム。
【０１０４】
実施形態８
前記界面活性剤が［ドデカノイル（メチル）アミノ］酢酸ナトリウムを含む、実施形態７に記載のシステム。
【０１０５】
実施形態９
前記界面活性剤が、０．０５〜１０体積％で溶解バッファー中に存在する、実施形態１〜８のいずれかに記載のシステム。
【０１０６】
実施形態１０
前記界面活性剤が、３％体積％で溶解バッファー中に存在する、実施形態９に記載のシステム。
【０１０７】
実施形態１１
前記タンパク質変性剤がプロテイナーゼＫを含む、実施形態１に記載のシステム。
【０１０８】
実施形態１２
システムにおいて：
ａ）ライシスバッファーであって、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、又はそれらの組合せと、リン酸水素二ナトリウムとを含むライシスバッファー；及び
ｂ）核酸捕捉固体支持体；
を含む、システム。
【０１０９】
実施形態１３
界面活性剤、キレート剤、及び塩基を含む溶解バッファーをさらに含む、実施形態１２に記載のシステム。
【０１１０】
実施形態１４
システムにおいて：
ａ）Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩を含む溶解バッファー；及び
ｂ）グアニジンチオシアン酸塩を含むライシスバッファー；
を含む、システム。
【０１１１】
実施形態１５
前記溶解バッファーが塩基及びキレート剤をさらに含む、実施形態１４に記載のシステム。
【０１１２】
実施形態１６
前記溶解バッファーが、タンパク質を変性又は破壊する１つ以上の成分をさらに含む、実施形態１４に記載のシステム。
【０１１３】
実施形態１７
前記ライシスバッファーが塩をさらに含む、実施形態１４に記載のシステム。
【０１１４】
実施形態１８
核酸捕捉固体支持体をさらに含む、実施形態１４に記載のシステム。
【０１１５】
実施形態１９
前記核酸捕捉固体支持体が、磁気ビーズ又は常磁性ビーズを含む、実施形態１８に記載のシステム。
【０１１６】
実施形態２０
１つ以上の洗浄バッファーをさらに含む、実施形態１〜１９のいずれかに記載のシステム。
【０１１７】
実施形態２１
磁石をさらに含む、実施形態１〜２０のいずれかに記載のシステム。
【０１１８】
実施形態２２
前記試験試料が血液試料を含む、実施形態２１に記載のシステム。
【０１１９】
実施形態２３
前記試験試料が乾燥血液試料を含む、実施形態２２に記載のシステム。
【０１２０】
実施形態２４
前記試験試料が濾紙中に乾燥血液を含む、実施形態２２に記載のシステム。
【０１２１】
実施形態２５
試料から核酸を精製する方法において：
試料を実施形態１〜１２のいずれかに記載の溶解バッファーと接触させて溶解試料を作成する；及び
前記溶解試料を前記ライシスバッファーと接触させる
工程を有してなる、方法。
【符号の説明】
【０１２２】
１１  乾燥血液スポット（ＤＢＳ）
１２  不所望物質
１３  標的
１４  ビーズ
１７  容器
１８  磁石
２１  溶解バッファー
２２  結合バッファー
２４  洗浄バッファー
２５  溶出バッファー
３１  ライシスバッファー
【図１】
2018526021.tif 000003
【図２Ａ−２Ｇ】
2018526021.tif 000004
【図３】
2018526021.tif 000005
【図４Ａ−４Ｆ】
2018526021.tif 000006
【図５】
2018526021.tif 000007
【図６】
2018526021.tif 000008
【図７】
2018526021.tif 000009
【図８】
2018526021.tif 000010
【図９】
2018526021.tif 000011
【図１０】
2018526021.tif 000012
【図１１】
2018526021.tif 000013
【図１２】
2018526021.tif 000014
【図１３】
2018526021.tif 000015
【図１４】
2018526021.tif 000016
【国際調査報告】
2018526021.tif 000017
2018526021.tif 000018
2018526021.tif 000019
2018526021.tif 000020
2018526021.tif 000021