(57)【要約】本発明は、治療有効量の式Ｉまたは式ＩＩの少なくとも１つの化合物を、それを必要とする対象に投与することによって、虚血性脳卒中を処置する方法に関し、ここで、上記化合物は、式Ｉもしくは式ＩＩを有するか；または（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の塩もしくはエステルであり；式中、ＸはＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシル、１８Ｆ、または１９Ｆであり；ＹおよびＺは独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシル、ハロゲン、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アミン、１８Ｆ、１９Ｆ、またはＨから選択され；ｎは１、２、または３である。2018538273.tif 000009
2018538273.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血性脳卒中を処置する方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の式Ｉまたは式ＩＩの少なくとも１つの化合物を投与することを含み、前記化合物は式Ｉもしくは式ＩＩ：
【化３】
2018538273.tif 000008
を有するか、または（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の塩もしくはエステルであり、式中、
Ｘは、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシル、１８Ｆ、または１９Ｆであり；
ＹおよびＺは独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシル、ハロゲン、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アミン、１８Ｆ、１９Ｆ、またはＨから選択され；
ｎは１、２、または３である、
方法。
【請求項２】
Ｘが１８Ｆまたは１９Ｆであり；ＹおよびＺが独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシル、ハロゲン、１８Ｆ、１９Ｆ、またはＨから選択され；ｎが１、２、または３である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
式Ｉにおいて、ＹとＺが共にＨであり、ｎ＝１であるとき、ＸがＯＨでない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１種の追加の薬物を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記追加の薬物が、肥満細胞阻害剤、抗炎症薬、または血管処置薬である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記追加の薬物がイブプロフェンである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物および前記追加の薬物が、同時にまたは連続して投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物がクロモリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物がクロモリンナトリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物が吸入により投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物が、平均粒子径１０ミクロン未満の粒子に微細化される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物が、平均粒子径５ミクロン未満の粒子に微細化される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
約５〜２０ｍｇの量の前記化合物が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物が、約１７．１ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物が１日２回投与される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年１１月２３に出願された米国仮出願番号第６２／２５８，８８２号の利益を主張しており、本明細書によって参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、それを必要とする対象にクロモリンおよび／またはその誘導体、ならびに任意選択で他の肥満細胞阻害剤を投与することによって、虚血性脳卒中を処置する方法を包含する。本発明の方法はさらに、虚血性脳卒中を患う対象に対する、処置のための肥満細胞阻害剤と組み合わせ、または臨床処置に対するアジュバントとしての抗炎症薬および血管処置薬の投与を包含する。本方法は、脳卒中後の神経炎症、グリアの活性化、および神経細胞の脱落を含むがこれらに限定されない虚血性脳卒中後の脳病理に対する肥満細胞媒介性の有害作用を阻害して、認知低下を遅らせ、または停止させることを含み得る。本発明は、認知障害患者における虚血性脳卒中後（ＰＳＣＩ−脳卒中後の認知障害）の処置のために潜在的に効果的なアジュバントも包含し得る。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
脳卒中は、米国疾病管理予防センターによると米国の死因第５位であり、米国における身体障害の主要原因である。毎年、約７９５，０００人の米国人が虚血性または出血性の初回または再発性脳卒中を患っている（American  Heart  Association、Heart  Disease  and  Stroke  Statistics  -  2015  Update、A  Report  From  the  American  Heart  Association、Circulation、（２０１５年）１３１巻：４３４〜４４１頁）。これらのうち、約６１０，０００例が初回イベントであり、１８５，０００例が再発性脳卒中イベントである。
【０００４】
虚血性脳卒中は、虚血および炎症によって媒介される一次および二次侵襲の結果として損傷を引き起こす。梗塞組織における神経細胞は初期傷害の結果として死亡するが、周辺部の細胞は、免疫細胞、活性酸素種、および有害な炎症性メディエーターの急速な流入によって影響を受ける。
【０００５】
脳卒中生存者は、内科的合併症、ならびに麻痺、視覚障害、会話／言語障害、行動スタイルの変化、および記憶喪失などの長期の身体障害を発症することが多い。脳卒中生存者が、血管性、変性型および混合型認知症を含めて、脳卒中後の認知症を患う割合は高い（約３０％）。（Kaseら、「Intellectual  Decline  After  Stroke  The  Framingham  Study」、Stroke、（１９９８年）、２９巻：８０５〜８１２頁；Leesら、「Test  Accuracy  of  Cognitive  Screening  Tests  for  Diagnosis  of  Dementia  and  Multidomain  Cognitive  Impairment  in  Stroke」、Stroke、（２０１４年）、４５巻：３００８〜３０１８頁；Del  Serら、「Evolution  of  Cognitive  Impairment  After  Stroke  and  Risk  Factors  for  Delayed  Progression」、Stroke、（２００５年）、３６巻：２６７０〜２６７５頁；Mokら、「Cognitive  impairment  and  functional  outcome  after  stroke  associated  with  small」、２００４年）を参照のこと。脳卒中後の認知症および軽度認知障害（ＭＣＩ）の発生率は様々である（Nysら、「Restrictions  of  the  Mini-Mental  State  Examination  in  acute  stroke」、Arch  Clin  Neuropsychol、（２００５年）、２０巻：６２３〜９頁；Madureiraら、「Dementia  and  cognitive  impairment  three  months  after  stroke」、Eur  J  Neurol、（２００１年）、８巻（６号）：６２１〜６２７頁；Ihle-Hansenら、「Incidence  and  subtypes  of  MCI  and  dementia  1  year  after  first-ever  stroke  in  patients  without  pre-existing  cognitive  impairment」、Dement  Geriatr  Cogn  Disord、（２０１１年）、３２巻：４０１〜４０７頁）。しかし、脳卒中後の認知障害は、血管性認知障害（ＶＣＩ）に起因するだけでなく、アルツハイマー病（ＡＤ）の病態発生にも起因すると考えられ（Sunら、「Post-stroke  cognitive  impairment:  epidemiology,  mechanisms  and  management」、Ann  Transl  Med、（２０１４年）、２巻（８号）：８０頁）、脳卒中後の認知症症例の約１／３に寄与する（Desmondら、「Frequency  and  clinical  determinants  of  dementia  after  ischemic  stroke」、Neurology、（２０００年）、５４巻：１１２４〜１１３１頁）。剖検による研究によれば、認知症の約５０％はＶＣＩとＡＤの両方に起因する（Jellinger,  KA.、「Alzheimer  disease  and  cerebrovascular  pathology:  an  update」、J  Neural  Transm、（２００２年）、１０９巻：８１３〜８３６頁）。
【０００６】
脳卒中後の認知障害の機序は、脳卒中によって起こる神経解剖学的病変（Zekryら、「The  vascular  lesions  in  vascular  and  mixed  dementia:  the  weight  of  functional  neuroanatomy」、Neurobiol  Aging、（２００３年）、２４巻：２１３〜２１９頁；Szaboら、「Hippocampal  lesion  patterns  in  acute  posterior  cerebral  artery  stroke:  clinical  and  MRI  findings」、Stroke、（２００９年）、４０巻：２０４２〜２０４５頁）、脳微小出血（Greenbergら、「Cerebral  microbleeds:  a  guide  to  detection  and  interpretation」、Lancet  Neurol、（２００９年）、８巻：１６５〜１７４頁；Parkら、「Pathogenesis  of  cerebral  microbleeds:  In  vivo  imaging  of  amyloid  and  subcortical  ischemic  small  vessel  disease  in  226  individuals  with  cognitive  impairment」、Ann  Neurol、（２０１３年）、７３巻：５８４〜５９３頁）、および脳卒中を伴う混合型ＡＤを含む。
【０００７】
現在、脳卒中を伴うＶＣＩを含めたＶＣＩに対する特異的処置で、米国ＦＤＡによって承認されたものはない（Gorelickら、「Vascular  Contributions  to  Cognitive  Impairment  and  Dementia,  A  Statement  for  Healthcare  Professionals  From  the  American  Heart  Association/American  Stroke  Association」、Stroke、（２０１１年）、４２巻：００〜００頁）。ＶＣＩの予防は、脳卒中および心血管系疾患の伝統的な危険因子の検出および調節に焦点をおいている。血管性認知症における認知、全体、および日常の機能における、コリンエステラーゼ阻害剤（ドネペジル、リバスチグミン（rivastigamine）、およびガランタミンなど）ならびにメマンチンの効力が研究されている。
【０００８】
炎症は、虚血性脳卒中および虚血性脳傷害の他の形態の病態形成において重要な役割を果たす。実験的および臨床的に、脳は、在住細胞（ミクログリアなど）の急速活性化、炎症促進性メディエーターの産生、および（好中球、Ｔ細胞の様々なサブタイプ、単球／マクロファージ、および他の細胞を含めて）様々なタイプの炎症細胞の虚血性脳組織への浸潤を特徴とする、急性および長期炎症過程を示す虚血傷害に応答する（Jinら、「Inflammatory  mechanisms  in  ischemic  stroke:  role  of  inflammatory  cells」、J  Leukoc  Biol、（２０１０年）、８７巻（５号）：７７９〜７８９頁）。虚血性脳傷害には、これらの細胞イベントが協同的に寄与している（Bonaら、「Chemokine  and  inflammatory  cell  response  to  hypoxia-ischemia  in  immature  rats」、Pediatr  Res、（１９９９年）、４５巻：５００〜５０９頁；Silversteinら、「Cytokines  and  perinatal  brain  injury」、Neurochem  Int、（１９９７年）、３０巻：３７５〜３８３頁；Cowellら、「Hypoxic-ischemic  injury  induces  macrophage  inflammatory  protein-1alpha  expression  in  immature  rat  brain」、Stroke、（２００２年）、３３巻：７９５〜８０１頁）。
【０００９】
脳の在住マクロファージであるミクログリア細胞は、脳傷害に応答して急速に活性化される（Aloisi  F、「Immune  function  of  microglia」、Glia、（２００１年）、３６巻：１６５〜１７９頁；Nakajimaら、「Microglia:  activation  and  their  significance  in  the  central  nervous  system」、J  Biochem、（２００１年）、１３０巻：１６９〜１７５頁）。在住ミクログリアは、虚血発症後何分か以内に活性化され、炎症促進性メディエーターを産生し、これは組織損傷を憎悪させる（Banatiら、「Cytotoxicity  of  microglia」、Glia、１９９３年、７巻：１１１〜１１８頁；Baroneら、「Tumor  necrosis  factor-α:  a  mediator  of  focal  ischemic  brain  injury」、Stroke、（１９９７年）、２８巻：１２３３〜１２４４頁；Rothwellら、「The  role  of  interleukin  1  in  acute  neurodegeneration  and  stroke:  pathophysiological  and  therapeutic  implications」、J  Clin  Invest、（１９９７年）、１００巻：２６４８〜２６５２頁）が、脳を虚血性および興奮毒性傷害から保護することもできることが示されてきた（Mattsonら、「Cellular  signaling  roles  of  TGFβ,  TNF  α  and  β  APP  in  brain  injury  responses  and  Alzheimer’s  disease」、Brain  Res  Brain  Res  Rev.、（１９９７年）、２３巻：４７〜６１頁；Raivichら、「Neuroglial  activation  repertoire  in  the  injured  brain:  graded  response,  molecular  mechanisms  and  cues  to  physiological  function.」、Brain  Res  Brain  Res  Rev、（１９９９年）、３０巻：７７〜１０５頁；Hallenbeck,  JM.、「The  many  faces  of  tumor  necrosis  factor  in  stroke」、Nat  Med、（２００２年）、８巻：１３６３〜１３６８頁）。虚血後のミクログリア増殖は、局所脳虚血後４８〜７２時間でピークに達し、初期傷害後数週間持続することがある（Lalancette-Hebertら、「Selective  ablation  of  proliferating  microglial  cells  exacerbates  ischemic  injury  in  the  brain」、J  Neurosci、（２００７年）、２７巻：２５９６〜２６０５頁；Denesら、「Proliferating  resident  microglia  after  focal  cerebral  ischaemia  in  mice」、J  Cereb  Blood  Flow  Metab、（２００７年）、２７巻：１９４１〜１９５３頁）。在住ミクログリアの急速な応答とは対照的に、血液由来の白血球は、通常何時間から数日の遅れで脳組織に動員される（Yilmazら、「Role  of  T  lymphocytes  and  interferon-γ  in  ischemic  stroke」、Circulation、（２００６年）、１１３巻：２１０５〜２１１２頁；Schillingら、「Microglial  activation  precedes  and  predominates  over  macrophage  infiltration  in  transient  focal  cerebral  ischemia:  a  study  in  green  fluorescent  protein  transgenic  bone  marrow  chimeric  mice」、Exp  Neurol、（２００３年）、１８３巻：２５〜３３頁；Tanakaら、「Migration  of  enhanced  green  fluorescent  protein  expressing  bone  marrow-  derived  microglia/macrophage  into  the  mouse  brain  following  permanent  focal  ischemia.」、Neuroscience、（２００３年）、１１７巻：５３１〜５３９頁）。
【００１０】
最近の研究では、脳虚血および出血の病態生理における脳肥満細胞の役割が強調された（Jinら、「Mast  cell  stabilization  limits  hypoxic-ischemic  brain  damage  in  the  immature  rat」、Dev  Neurosci、（２００７年）、２９巻（４〜５号）：３７３〜８４頁；Strbianら、「An  emerging  role  of  mast  cells  in  cerebral  ischemia  and  hemorrhage」、Ann  Med、（２００９年）、４１巻（６号）：４３８〜５０頁）。Jinら（Jin、２００７年、Jinら、「Mast  cells  are  early  responders  after  hypoxia-ischemia  in  immature  rat  brain」、Stroke、（２００９年）、４０巻（９号）：３１０７〜１２頁）は、未熟脳において低酸素虚血中、肥満細胞の動員および肥満細胞の活性化が、神経細胞、グリア、および内皮細胞の応答より２〜４時間前に起こることを示した。肥満細胞の早期活性化は、新生仔虚血動物モデルにおける脳のヒスタミン蓄積および損傷に寄与することが示唆され、これによって、肥満細胞が新生仔脳傷害において果たす役割がさらに裏付けられた。さらに、肥満細胞は、実験的虚血性脳卒中後にｔＰＡ媒介性脳出血においてある役割を果たし、脳内出血後に血腫および浮腫の膨張に関与すると思われる（Strbianら、「Cerebral  mast  cells  regulate  early  ischemic  brain  swelling  and  neutrophil  accumulation」、J  Cereb  Blood  Flow  Metab、（２００６年）、２６巻：６０５〜６１２頁；Strbianら、「Mast  cell  stabilization  reduces  hemorrhage  formation  and  mortality  after  administration  of  thrombolytics  in  experimental  ischemic  stroke」、Circulation、（２００７年）、１１６巻：４１１〜４１８頁）。肥満細胞の安定化は、実験的虚血性脳卒中において血栓溶解薬の投与後に出血性変化および死亡率を低減すると報告された（Strbian、２００７年）。さらに、この肥満細胞の早期応答をクロモグリケートによって阻害すると、動物モデルにおける長期保護が実現されることが明らかになった（Strbian、２００９年）。
【００１１】
最近の研究では、脳虚血および出血の病態生理における脳肥満細胞の役割が強調された（Jin、２００７年、Strbian、２００９年）。Jinら（Jin、２００７年、Jin、２００９年）は、未熟脳において低酸素虚血中、肥満細胞の動員および肥満細胞の活性化が、神経細胞、グリア、および内皮細胞の応答より２〜４時間前に起こることを示した。肥満細胞の早期活性化は、別の新生仔虚血モデルにおける脳のヒスタミン蓄積および損傷に寄与することが示唆され、これによって、新生仔脳傷害において肥満細胞が担う役割がさらに裏付けられた。さらに、肥満細胞は、実験的虚血性脳卒中後にｔＰＡ媒介性脳出血においてある役割を果たし、脳内出血後に血腫および浮腫の膨張に関与すると思われる（Strbian、２００６年、２００７年）。肥満細胞の安定化は、実験的虚血性脳卒中において血栓溶解薬の投与後に出血性変化および死亡率を低減すると報告された（Strbian、２００７年）。さらに、この肥満細胞の早期応答を阻害すると、長期保護が実現されることが明らかになった。
【００１２】
肥満細胞は、低酸素虚血侵襲における脳損傷に寄与すると報告された（Strbian、２００６年、２００７年）。実験的脳虚血／再灌流において、肥満細胞は、血液脳関門の浸透性、脳浮腫形成、および局所好中球浸潤の強度を制御した。重要なことに、肥満細胞安定化薬のクロモグリケートは、実験動物の脳病理および生存改善に対する肥満細胞媒介性の有害作用を阻害した（Jin、２００９年）。
クロモリンは、１９７０年代以降、喘息およびアレルギー性鼻炎の処置に使用されることが承認されたものであるが、新生仔ラットの一側低酸素虚血モデルにおいて、肥満細胞の遊走および脱顆粒、グリアの活性化、ならびに神経細胞死を阻害する肥満細胞安定薬であることが明らかになった（Jin、２００７年）。成体ラットにおける最近の研究は、クロモリンの脳内注射によって、一過性中大脳動脈閉塞後の早期脳浮腫および好中球蓄積が低減され（Strbian、２００６年）、ｔＰａ処置後の出血形成が阻害される（Strbian、２００７年）ことを示した。新生仔ラットの一側低酸素虚血のモデルを使用して、低酸素期の終わりにクロモリンを投与すると、４８時間で評価して肥満細胞の遊走／脱顆粒、グリアの活性化、および神経細胞の脱落が限定された（Jin、２００７年）。さらに、神経保護が長時間持続することが、Jinらによって明らかになった（Jin、２００９年）。最初の２４時間における肥満細胞の安定化によって、さらに肥満細胞の脳への遊走が著しく限定され、４週間に及ぶ回復により神経保護が実現した（Jin、２００９年）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】American  Heart  Association、Heart  Disease  and  Stroke  Statistics  -  2015  Update、A  Report  From  the  American  Heart  Association、Circulation、（２０１５年）１３１巻：４３４〜４４１頁
【非特許文献２】Zekryら、「The  vascular  lesions  in  vascular  and  mixed  dementia:  the  weight  of  functional  neuroanatomy」、Neurobiol  Aging、（２００３年）、２４巻：２１３〜２１９頁
【非特許文献３】Szaboら、「Hippocampal  lesion  patterns  in  acute  posterior  cerebral  artery  stroke:  clinical  and  MRI  findings」、Stroke、（２００９年）、４０巻：２０４２〜２０４５頁
【非特許文献４】Greenbergら、「Cerebral  microbleeds:  a  guide  to  detection  and  interpretation」、Lancet  Neurol、（２００９年）、８巻：１６５〜１７４頁
【非特許文献５】Parkら、「Pathogenesis  of  cerebral  microbleeds:  In  vivo  imaging  of  amyloid  and  subcortical  ischemic  small  vessel  disease  in  226  individuals  with  cognitive  impairment」、Ann  Neurol、（２０１３年）、７３巻：５８４〜５９３頁
【非特許文献６】Zekryら、「The  vascular  lesions  in  vascular  and  mixed  dementia:  the  weight  of  functional  neuroanatomy」、Neurobiol  Aging、（２００３年）、２４巻：２１３〜２１９頁
【非特許文献７】Szaboら、「Hippocampal  lesion  patterns  in  acute  posterior  cerebral  artery  stroke:  clinical  and  MRI  findings」、Stroke、（２００９年）、４０巻：２０４２〜２０４５頁
【非特許文献８】Greenbergら、「Cerebral  microbleeds:  a  guide  to  detection  and  interpretation」、Lancet  Neurol、（２００９年）、８巻：１６５〜１７４頁
【非特許文献９】Parkら、「Pathogenesis  of  cerebral  microbleeds:  In  vivo  imaging  of  amyloid  and  subcortical  ischemic  small  vessel  disease  in  226  individuals  with  cognitive  impairment」、Ann  Neurol、（２０１３年）、７３巻：５８４〜５９３頁
【非特許文献１０】Gorelickら、「Vascular  Contributions  to  Cognitive  Impairment  and  Dementia,  A  Statement  for  Healthcare  Professionals  From  the  American  Heart  Association/American  Stroke  Association」、Stroke、（２０１１年）、４２巻：００〜００頁
【非特許文献１１】Jinら、「Inflammatory  mechanisms  in  ischemic  stroke:  role  of  inflammatory  cells」、J  Leukoc  Biol、（２０１０年）、８７巻（５号）：７７９〜７８９頁
【非特許文献１２】Bonaら、「Chemokine  and  inflammatory  cell  response  to  hypoxia-ischemia  in  immature  rats」、Pediatr  Res、（１９９９年）、４５巻：５００〜５０９頁
【非特許文献１３】Silversteinら、「Cytokines  and  perinatal  brain  injury」、Neurochem  Int、（１９９７年）、３０巻：３７５〜３８３頁
【非特許文献１４】Cowellら、「Hypoxic-ischemic  injury  induces  macrophage  inflammatory  protein-1alpha  expression  in  immature  rat  brain」、Stroke、（２００２年）、３３巻：７９５〜８０１頁
【非特許文献１５】Aloisi  F、「Immune  function  of  microglia」、Glia、（２００１年）、３６巻：１６５〜１７９頁
【非特許文献１６】Nakajimaら、「Microglia:  activation  and  their  significance  in  the  central  nervous  system」、J  Biochem、（２００１年）、１３０巻：１６９〜１７５頁
【非特許文献１７】Banatiら、「Cytotoxicity  of  microglia」、Glia、１９９３年、７巻：１１１〜１１８頁
【非特許文献１８】Baroneら、「Tumor  necrosis  factor-α:  a  mediator  of  focal  ischemic  brain  injury」、Stroke、（１９９７年）、２８巻：１２３３〜１２４４頁
【非特許文献１９】Rothwellら、「The  role  of  interleukin  1  in  acute  neurodegeneration  and  stroke:  pathophysiological  and  therapeutic  implications」、J  Clin  Invest、（１９９７年）、１００巻：２６４８〜２６５２頁
【非特許文献２０】Mattsonら、「Cellular  signaling  roles  of  TGFβ,  TNF  α  and  β  APP  in  brain  injury  responses  and  Alzheimer’s  disease」、Brain  Res  Brain  Res  Rev.、（１９９７年）、２３巻：４７〜６１頁
【非特許文献２１】Raivichら、「Neuroglial  activation  repertoire  in  the  injured  brain:  graded  response,  molecular  mechanisms  and  cues  to  physiological  function.」、Brain  Res  Brain  Res  Rev、（１９９９年）、３０巻：７７〜１０５頁
【非特許文献２２】Hallenbeck,  JM.、「The  many  faces  of  tumor  necrosis  factor  in  stroke」、Nat  Med、（２００２年）、８巻：１３６３〜１３６８頁
【非特許文献２３】Lalancette-Hebertら、「Selective  ablation  of  proliferating  microglial  cells  exacerbates  ischemic  injury  in  the  brain」、J  Neurosci、（２００７年）、２７巻：２５９６〜２６０５頁
【非特許文献２４】Denesら、「Proliferating  resident  microglia  after  focal  cerebral  ischaemia  in  mice」、J  Cereb  Blood  Flow  Metab、（２００７年）、２７巻：１９４１〜１９５３頁
【非特許文献２５】Yilmazら、「Role  of  T  lymphocytes  and  interferon-γ  in  ischemic  stroke」、Circulation、（２００６年）、１１３巻：２１０５〜２１１２頁
【非特許文献２６】Schillingら、「Microglial  activation  precedes  and  predominates  over  macrophage  infiltration  in  transient  focal  cerebral  ischemia:  a  study  in  green  fluorescent  protein  transgenic  bone  marrow  chimeric  mice」、Exp  Neurol、（２００３年）、１８３巻：２５〜３３頁
【非特許文献２７】Tanakaら、「Migration  of  enhanced  green  fluorescent  protein  expressing  bone  marrow-  derived  microglia/macrophage  into  the  mouse  brain  following  permanent  focal  ischemia.」、Neuroscience、（２００３年）、１１７巻：５３１〜５３９頁
【非特許文献２８】Jinら、「Mast  cell  stabilization  limits  hypoxic-ischemic  brain  damage  in  the  immature  rat」、Dev  Neurosci、（２００７年）、２９巻（４〜５号）：３７３〜８４頁
【非特許文献２９】Strbianら、「An  emerging  role  of  mast  cells  in  cerebral  ischemia  and  hemorrhage」、Ann  Med、（２００９年）、４１巻（６号）：４３８〜５０頁）。
【非特許文献３０】Jin、２００７年、Jinら、「Mast  cells  are  early  responders  after  hypoxia-ischemia  in  immature  rat  brain」、Stroke、（２００９年）、４０巻（９号）：３１０７〜１２頁
【非特許文献３１】Strbianら、「Cerebral  mast  cells  regulate  early  ischemic  brain  swelling  and  neutrophil  accumulation」、J  Cereb  Blood  Flow  Metab、（２００６年）、２６巻：６０５〜６１２頁
【非特許文献３２】Strbianら、「Mast  cell  stabilization  reduces  hemorrhage  formation  and  mortality  after  administration  of  thrombolytics  in  experimental  ischemic  stroke」、Circulation、（２００７年）、１１６巻：４１１〜４１８頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の要旨
本発明は、虚血性脳卒中を処置する方法を包含し、この方法は、それを必要とする対象に治療有効量の式Ｉまたは式ＩＩの少なくとも１つの化合物を投与することを含み、化合物は式Ｉもしくは式ＩＩ
【化１】
2018538273.tif 000003
を有し、
【００１５】
または（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の塩もしくはエステルであり；式中、
【００１６】
Ｘは、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシル、１８Ｆ、または１９Ｆであり；
【００１７】
ＹおよびＺは独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシル、ハロゲン、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アミン、１８Ｆ、１９Ｆ、またはＨから選択され；
【００１８】
ｎは１、２、または３である。一実施形態では、本発明は、Ｘが１８Ｆまたは１９Ｆであり、ＹおよびＺが独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシル、ハロゲン、１８Ｆ、１９Ｆ、またはＨから選択され；ｎが１、２、または３である、方法を包含する。別の実施形態では、本発明は、式Ｉにおいて、ＹとＺが共にＨであり、ｎ＝１である場合、ＸはＯＨでない、方法を包含する。別の実施形態では、化合物はクロモリンである。さらに別の実施形態では、この化合物はクロモリンナトリウムである。
【００１９】
本発明は、少なくとも１種の追加の薬物を投与することをさらに含む方法も包含する。追加の薬物は、肥満細胞阻害剤、抗炎症薬、または血管処置薬であり得る。一実施形態では、追加の薬物はイブプロフェンである。別の実施形態では、化合物および追加の薬物を同時にまたは連続して投与することができる。
【００２０】
本発明は、式Ｉまたは式ＩＩの化合物が吸入により投与される、方法を包含する。一実施形態は、化合物が平均粒子径１０ミクロン未満の粒子に微細化される場合を包含する。別の実施形態は、化合物が平均粒子径５ミクロン未満の粒子に微細化される、方法を包含する。さらに別の実施形態は、約５〜２０ｍｇの量の化合物が投与される、方法を包含する。一実施形態は、化合物が約１７．１ｍｇ／ｋｇの量で投与される、方法を包含する。別の実施形態は、化合物が１日２回投与される、方法を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ナノモル濃度のクロモリンのＡβ（Ａβ４０およびＡβ４２）凝集に対する阻害作用を例示する。左側パネル：ＤＭＳＯ（上方パネル）またはクロモリンナトリウム（５ｎＭ、５０ｎＭおよび５００ｎＭ、下方パネル）の添加後のＡβ線維形成中におけるチオフラビンＴ蛍光増加の代表的曲線。合成Ａβ４０（左側欄）またはＡβ４２（右側欄）ペプチドの線維形成が１時間にわたって続いた。対応するＶｍａｘ指標（ミリ単位／分）をそれぞれのグラフに示す。右側パネル：Ａβ４０（上方グラフ）およびＡβ４２（下方グラフ）の線維形成の概要を示す棒グラフ。Ａβ４２線維形成プロセスに関して認められた作用はより小さかったものの、Ａβ４０およびＡβ４２の線維形成はクロモリンナトリウムの存在下で著しく減少する。
【００２２】
【図２】図２は、オリゴマーへのＡβアミロイドペプチド重合の概略図を例示する。
【００２３】
【図３】図３Ａ〜Ｂは、構造データのモデリングに基づいて、Ａβ−４２アミロイドペプチド（ベータシートリボン構造）に結合しているクロモリン薬の図を例示する。
【００２４】
【図４】図４は、ＡＬＺＴ−ＯＰ１処置ＰＳ１トランスジェニックマウスのスイミング迷路記憶試験の結果を例示する。
【００２５】
【図５Ａ−Ｃ】図５Ａ〜Ｃは、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳におけるクロモリンナトリウムの１週間の急性投与による可溶性モノマーのＡβ（オリゴマーのＡβではない）の低減を例示する。
【００２６】
【図６Ａ−Ｂ】図６は、ミクログリアの取り込みに対するクロモリンナトリウムの作用を例示する。
【００２７】
【図７】図７は、マウスにおける放射標識クロモリンの生体内分布を例示する。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
脳卒中後の神経炎症、グリアの活性化、および神経細胞の脱落を含めて、虚血性脳卒中後の脳病理に対する肥満細胞媒介性の有害作用を阻害する化合物および製剤は、脳卒中によって起こる認知低下を遅らせ、または停止させるのに役立つ。虚血性脳卒中においては、脳の一部分への血液供給が減少し、その領域における脳組織の機能障害を招く。これが起こり得る理由は、血栓症、塞栓症、全身性低灌流、または脳静脈洞血栓症の４つである。脳梗塞は、血液を脳に供給する血管が遮断される結果起こる１つのタイプの虚血性脳卒中であり、この血液供給の損失の結果は、その領域における組織の死亡である。
【００２９】
本発明は、虚血性脳卒中後の治療におけるアジュバント処置を包含する。ある特定の実施形態では、クロモリンは吸入により投与されて、虚血性脳卒中後の脳病理およびグリアの活性化に対する肥満細胞媒介性の有害作用を阻害し、神経変性に至る発症カスケードを遮断することが期待される。虚血性脳卒中から回復するヒトにおいて、クロモリンのアジュバント投与を行って、虚血性脳卒中後の脳病理に対する肥満細胞媒介性の有害作用を阻害する。
【００３０】
本発明の方法は、脳病理に対するこの作用およびその有害な作用に、虚血性脳卒中および脳内出血における脳傷害の潜在的な治療および予防のための肥満細胞安定化の役割を果たすクロモリンおよび／またはその誘導体ならびに他の肥満細胞阻害剤の投与によって対処しようとする。
【００３１】
本発明は、虚血性脳卒中を患う対象を処置する方法であって、治療有効量のクロモリンまたは式Ｉの化合物を対象に投与することを含む方法を包含する。この方法は、少なくとも１つの肥満細胞阻害剤、抗炎症薬、血管処置薬をクロモリンまたは式Ｉの化合物と組み合わせて投与することをさらに包含する。
【００３２】
特に、本発明は、それを必要とする対象に微細化した形態のクロモリンを投与して、虚血性脳卒中の作用を処置し、同時に大粒子のクロモリンおよびその誘導体と関連する毒性作用を回避することによって、虚血性脳卒中後の脳病理に対する肥満細胞媒介性の有害作用を阻害する方法を包含する。
【００３３】
クロモリンは、臨床検査においてナノモル濃度でアミロイドβ（Ａβ）ペプチドに結合し、オリゴマー化を阻害することが示された。クロモリンのＡβモノマーおよびダイマーとの結合は、それらのオリゴマーおよびより高次の凝集体への重合を妨げる（Horiら、「FDA  approved  asthma  therapeutic  agent  impacts  Aβ  in  the  brain  in  a  transgenic  model  of  Alzheimer's  disease」、J  Biol  Chem.、（２０１５年）、２９０巻（４号）：１９６６〜７８頁；Elmalehら、「Evaluation  of  F-18  Radiolabeled  Cromolyn  as  a  Potential  Aβ  Polymerization  Inhibitor  and  PET  Tracer」、Poster  at  Human  Amyloid  Image  （HAI）  Conference、Miami、Florida、２０１４年１月、２．３節を参照のこと）。
【００３４】
本発明者らの研究は、クロモリンがミクログリアの効率的な使用（ｅｃｏｎｏｍｙ）に影響することを示唆する。以下に説明し、図６に例示するように、クロモリンは、ミクログリアのＡβクリアランスを促進する。クロモリンと式ＩまたはＩＩに記載される肥満細胞阻害剤を組み合わせた作用機序によって、これらの薬物が虚血性脳卒中や血管性認知症などの脳傷害を処置するための候補薬剤となる。
【００３５】
クロモリンに加え、本発明の化合物は、以下の式Ｉおよび式ＩＩで示され：
【化２】
2018538273.tif 000004
【００３６】
または（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の塩もしくはエステルであり；式中、
【００３７】
Ｘは、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシル、１８Ｆ、または１９Ｆであり；
【００３８】
ＹおよびＺは独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシル、ハロゲン、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アミン、１８Ｆ、１９Ｆ、またはＨから選択され；
【００３９】
ｎは１、２または３であり；
【００４０】
式Ｉにおいて、ＹとＺが共にＨであり、ｎ＝１である場合、ＸはＯＨでない。
【００４１】
好ましくは、式（Ｉ）および（ＩＩ）で表わされる化合物は、式中、Ｘが１８Ｆまたは１９Ｆであり；ＹおよびＺが独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシル、ハロゲン、１８Ｆ、１９Ｆ、またはＨから選択され；ｎが１、２、または３であり；式Ｉにおいて、ＹとＺが共にＨであり、ｎ＝１であるとき、ＸはＯＨでない化合物を含む。
【００４２】
本発明の化合物および製剤で使用される化合物を作製する方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，６１７，５１７号に記載されている。クロモリンは式Ｉで表わされ、式中、Ｘ＝ＯＨであり、ＹおよびＺはＨである。
【００４３】
本発明の方法は、虚血性脳卒中後の治療の間の対象の処置におけるクロモリンまたは式（Ｉ）および／もしくは（ＩＩ）の化合物の使用を含む。一部の患者は虚血性脳卒中後認知障害（ＰＳＣＩ）を患い得る。本発明者らの研究は、動物モデルにおいて、クロモリン（式（Ｉ）、式中、Ｘ＝ＯＨであり、ＹおよびＺはＨである）が血液脳関門を透過し、したがってクロモリン吸入後の血漿中バイオアベイラビリティは、脳においてＡβオリゴマー化および蓄積を妨げるのに十分な濃度になることを示した。
【００４４】
吸入後の血漿中クロモリンレベルは、対象内および対象間で大きなばらつきを示し、そしてまた喘息患者によるクロモリン取り込みが健常志願者によるより少なかったことを示すと報告されている（Richardsら、「Absorption  and  Disposition  Kinetics  of  Cromolyn  Sodium  and  the  Influence  of  Inhalation  Technique」、J.  Pharmacol.  Exp.  Therapeutics、（１９８７年）、２４１巻：１０２８〜１０３２頁；Kellerら、「Have  inadequate  delivery  systems  hampered  the  clinical  success  of  inhaled  disodium  cromoglycate?  Time  for  reconsideration」、（２０１１年）、８巻：１〜１７頁）。しかし、本発明の製剤は、この欠陥を活性成分の粒子サイズの適正化によって防止する。
【００４５】
様々な方法を使用して、本発明の製剤を投与することができるが、投与方法は、好ましくは、吸入による方法である。活性成分を吸入により送達するとき、５ミクロンまたはそれ未満の平均粒子径が実現されるように活性成分を微細化する。粒子が１０ミクロン未満であり、粒子の大部分が２〜５ミクロンの間に収まることは重要である。というのは、このことは、吸入後に気道の二次気管支への沈着が成功するのに必要であるからである。したがって、クロモリンまたは式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物を、約１〜１０μｍ未満、好ましくは５μｍ未満または５μｍ、より好ましくは３μｍ未満または３μｍのサイズに微細化する。例えば、吸入により送達される活性医薬成分（ＡＰＩ）は乾燥粉末であり、ＡＰＩはサイズ３μｍ未満または３μｍに微細化されている。さらに、吸入の製剤は、より効率的に肺に浸透するように製剤化することができる。あるいは、製剤は、経口丸剤を含むことができる。
【００４６】
活性医薬成分は、１種または複数の肥満細胞に影響を及ぼす薬物と組み合わせることができる。２種またはそれよりも多い薬物を、同時に（例えば、混合物として）または連続して（例えば、別個の２つの送達方法として）送達することができる。他の実施形態では、処置される損傷の効果を用量設定（ｔｉｔｒａｔｅ）するように用量を算出する。
【００４７】
本発明の化合物に加えて、本発明の製剤は、少なくとも１種の追加の薬物をさらに含む。これらの追加の薬物は、肥満細胞阻害剤、抗炎症薬、または血管処置薬を含むが、これらに限定されない。このリストは、一般的なタイプの薬物およびカテゴリーに収まる具体的薬物の第２のリストによるものであり得る。特定の一実施形態では、追加の薬物はイブプロフェンである。
【００４８】
用量として投与されるＡＰＩの量は、対象の様々な状態、とりわけ疾患の状態、健康、年齢、性別、体重などに依存する。吸入用の製剤を製剤化するとき、代表的には、単一用量におけるクロモリンまたは本発明の化合物の量は、約５〜約２０ｍｇ、好ましくは約１０〜１９ｍｇであり、より好ましくは、量は約１５〜１８ｍｇである。特定の一実施形態では、クロモリンまたは本発明の化合物の量は約１７．１ｍｇである。
【００４９】
例えば、製剤は、乾燥粉末吸入器デバイスを用いて使用するために調製されたクロモリン粉末ブレンドを含有することができる。各単位は、１７．１ｍｇのクロモリンおよび薬学的に許容される添加剤を含む。製剤を１日２回（３４．２ｍｇ）投与することができ、これは、現在喘息の処置に投与される１日４回の承認用量レベル（１日当たりクロモリン全量８０ｍｇ）によるクロモリン用量の５０％未満である。
【００５０】
連日投与では、代表的には、クロモリンまたは式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の量は約５ｍｇ〜約４５ｍｇであり得る。好ましくは、１日量は約２０ｍｇ〜約３８ｍｇであり得、より好ましくは、量は約３０ｇｍ〜約３６ｍｇであり得る。例えば、１日量３４．２ｍｇのクロモリン（１７．１ｍｇのクロモリン、乾燥粉末吸入器を使用して、朝晩１日２回吸入）は、脳卒中後の神経炎症を阻害し、肥満細胞の遊走／脱顆粒、グリアの活性化、および神経細胞の脱落を制限し、認知低下を潜在的に遅延し得る。
【００５１】
第２の活性成分と共に投与するとき、クロモリンまたは式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物をイブプロフェンと共に投与することができる。代表的には、クロモリンは約１７．１ｍｇの量が投与され、イブプロフェンは２０ｍｇ（１０ｍｇの用量を連続して２回経口投与など）が投与される。あるいは、クロモリンまたは式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物は３４．２ｍｇ（１７．１ｍｇの用量を２回連続吸入投与など）投与し、２０ｍｇのイブプロフェンを投与する。好ましくは、式（Ｉ）または（ＩＩ）のクロモリンまたは化合物の投与は、２分間を超えずに摂取される。
【００５２】
ヒト薬物動態データは、１７．１ｍｇの用量のクロモリンを吸入すると、血漿中クロモリン濃度が２３．３±１６．９分（範囲：５〜６０分）で４７．１±３３．６ｎｇ／ｍｌ（範囲：１４．０〜１３３ｎｇ／ｍｌ）の最高値に到達したことを示した。ＣＳＦによるクロモリン吸収は同様に速かった。ＣＳＦ中にクロモリンが存在することは、吸入２０分間〜２時間後で検出され、クロモリン濃度は測定時間中上昇した（腰椎穿刺カテーテルによるＣＳＦ収集の限界のため、試料を４時間より長く収集することはできなかった）。
【００５３】
１７．１ｍｇのクロモリン吸入４時間後のＣＳＦ中クロモリン濃度は、０．２４±０．０８ｎｇ／ｍｌ（範囲：０．１５〜０．３６ｎｇ／ｍｌ）であり、これは０．４６±０．１５ｎＭに相当する。このレベルは、虚血性脳卒中後の神経炎症性損傷を遅延するの十分であると推定される。
【００５４】
クロモリンの血漿クリアランスは速く、平均滞留時間は３．３±２．９時間（範囲：０．７９〜１２．１時間）であり、これは、半減期が約２．３時間であることに相当する。吸入１２時間後、血漿中クロモリン濃度は無視できる程度となる。同様のＣＳＦ中におけるクリアランス動態を想定して、クロモリン吸入１日２回の慢性レジメン（regiment）を選択して、血漿中およびＣＳＦ中クロモリン濃度を十分なレベルに日中維持した。
【００５５】
１日２回投与される提案された用量のクロモリンまたは式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の慢性吸入は、薬物の慢性使用による潜在的毒性に影響を及ぼすことなく、サイトカイン産生、ミクログリア活性化および肥満細胞増殖を用量設定および調節することによって、虚血性脳卒中後の神経炎症性損傷を遅延し、または停止させると推定される。
【００５６】
なぜなら、クロモリンは、粒子径分布が吸入に適しているとき（ｄ５０＜５μｍおよびｄ９０＜１０μｍ）、吸湿材となり得るからである。したがって、本発明の製剤は、製品性能および安定性が改善されるように少なくとも１種の疎水性添加剤を粉末製剤中に含むことができる。疎水性添加剤を加えることによって、湿気の悪影響に対する乾燥粉末吸入製剤の固有の抵抗性がそのような製剤にもたらされる。一例として、疎水性添加剤は、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）製品で商業的に使用されるのでステアリン酸マグネシウムである。さらに、その安全性プロファイルは、吸入製品で使用されるために、十分研究され、実証されている。ある特定の実施形態では、ラクトース一水和物を希釈剤としてさらに使用することができる。
【００５７】
本発明の製剤で使用される他の添加剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）を含むが、これに限定されない。好ましくは、添加剤は透明な＃３のＨＰＭＣである。
【００５８】
例示的な製剤を表１に示す。
【表１】
2018538273.tif 000005
【００５９】
ＲＳ０１は、気流抵抗に基づいた様々なバージョン、すなわち４０Ｌ、６０Ｌ、８０Ｌおよび１００Ｌバージョンで市販されている。４０Ｌおよび６０Ｌバージョンは高抵抗性デバイスであり、それらの使用は、正常な呼吸機能をもつ特定の患者集団範囲に限定され、高齢者、子供、および重度呼吸障害患者を除外することができる。
【表２】
2018538273.tif 000006
【００６０】
代替の製剤では、本発明の製剤は、単一用量乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）を用いて使用するためのカプセル剤などのカプセル剤である。ゼラチンまたはＨＰＭＣカプセルは、単一用量ＤＰＩ製品に商業的に使用されている。この目的のために、ＨＰＭＣカプセルは、ＲＳ０１  ＤＰＩ吸入器デバイスとの適合性が公知であるため好ましい実施形態で使用されている。好ましくは、カプセル製剤で使用される添加剤は、クロモリンナトリウムなどの感湿性薬物に好都合であるべきである。代表的には、５０％の相対湿度（ＲＨ）で含水量レベルを測定するとき、このカプセルは、ゼラチン同等物が代表的には１３％〜１６％であるのに比べて低く、代表的には約４％〜６％である低含水量レベルを有するべきである。
【００６１】
本発明の方法においてクロモリンまたは式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物を使用する一つの利点には、親油性（ＬｏｇＰ）および極性表面積が含まれる。例えば、クロモリンおよびそのフッ素類似体であるＦ類似体のＬｏｇＰ値はそれぞれ、１．３９および２．１である（表３）。ＬｏｇＰが３超の薬物は、血液脳関門（ＢＢＢ）を透過することが制限され、または透過しないと推定される。ＢＢＢ透過に影響を及ぼす他の因子は、分子サイズ、電荷および極性表面積（ＰＳＡ）である。クロモリンおよびそのＦ類似体はＰＳＡがそれぞれ１２５．４３および１２７．２０であり、良好な脳透過の範囲に入っている。
【表３】
2018538273.tif 000007
【実施例】
【００６２】
クロモリンのＡβアミロイドペプチドとの結合および（脳において捕捉されることになるであろう）そのより高次のオリゴマーへの凝集の阻害を、独立した複数のアッセイ方法で確認した。Ａβ重合をモニタリングするために最も慣用的に使用される手法の１つは、チオフラビンＴ結合アッセイ（Elmaleh、２０１４年；Hori、２０１５年）である。チオフラビンＴがアミロイド凝集体などのベータシートが豊富な構造に結合すると、色素はその発光スペクトルにおいて増強された蛍光および特徴的な赤色シフトを示す。５μＭのＡβペプチドを様々な濃度の薬物と共に、１０μＭのチオフラビンＴと混合した。薬物の非存在下で、Ａβ重合は、６０〜１８０分にわたって増加するチオフラビンＴ蛍光を示す。
【００６３】
チオフラビンＴはアミロイド線維構造にのみ結合することができるが、ＡＬＺＴ−ＯＰ１ａ（クロモリン）阻害剤は、ミスフォールドしたアミロイドベータペプチドのモノマーおよびミスフォールドした低次オリゴマー中間体に結合する（薬物なし、および有りの５μＭ  Ａβ；チオフラビン１０μＭ；ヘパリン０．５ｍｇ／ｍｌ、アッセイ量２００μｌ）（データは示さず）。ナノモル濃度のクロモリンの添加は、図１に示されているようにＡβ凝集の阻害を示した。図１の左側パネルは、ＤＭＳＯ（上方パネル）またはクロモリンナトリウム（５ｎＭ、５０ｎＭおよび５００ｎＭ、下方パネル）の添加後のＡβ線維形成中に増加したチオフラビンＴ蛍光の代表的曲線を示す。合成Ａβ４０（左側欄）またはＡβ４２（右側欄）ペプチドの線維形成が１時間にわたって追跡された。対応するＶｍａｘ指標（ミリ単位／分）をそれぞれのグラフに示す。図１の右側パネルにおいて、棒グラフで、Ａβ４０（上方グラフ）およびＡβ４２（下方グラフ）線維形成の概要を示した。Ａβ４２線維形成プロセスのほうに対して認められた作用はより小さかったものの、Ａβ４０およびＡβ４２線維形成はクロモリンナトリウムの存在下で著しく減少した。
【００６４】
ペプチドオリゴマー凝集
【００６５】
別個の４つのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって、クロモリンおよびそのフッ素化誘導体は、図２に示されているようにナノモル濃度でオリゴマーおよびより高次の凝集体へのＡβアミロイドペプチド重合を効果的に阻害する。図３は、アミロイドベータペプチドに結合しているクロモリンをモデリングするための構造データに基づく予備分析によって、そのクロモリンがアミロイドペプチドのベータ鎖の表面に結合していることが示唆されることを示す。構造データのモデリングに基づく、Ａβ−４２アミロイドペプチドに結合しているクロモリン薬（ベータシートリボン構造）の側方（最上部パネル）および最上部（最下部パネル）図。
【００６６】
サイトカイン産生に対する作用
【００６７】
クロモリンは、マウスにおける脳低酸素−虚血モデルで有効であることが示されている。腫瘍壊死アルファは、このモデルにおける一次メディエーターである。クロモリン処置マウスは、肥満細胞遊走の減少、脳損傷／神経細胞の脱落の低減、グリアの活性化の減少および脳萎縮の減少を示した。この研究は、クロモリンが肥満細胞を標的とし、サイトカイン産生を阻害し、したがって虚血性脳卒中後と関連する炎症応答を処置する際に追加の作用を有することを示した（Jin、２００９年）。
【００６８】
アルツハイマー病の動物モデル
【００６９】
モリス水ナビゲーション試験
【００７０】
３つのマウス群（それぞれ動物５匹）をモリス水ナビゲーション試験で試験した（未公開データ）。４月齢の若年ＡＰＰ／ＰＳ１マウス（ＡＤの動物モデルとして変異マウス）の２群を試験した。ＡＰＰ／ＰＳ１の１群は、クロモリンとイブプロフェンの組合せで６か月間、１週間に２回腹腔内投与により処置し（図４：中央パネルの群）、第２の群は、ＡＤ対照群として無処置とした（図４：左側パネルの群）。第３の群は、無処置の野生型（ＷＴ）正常対照とした（図４：右側パネル）。プラットホームの位置を記憶するように、マウスを７日間訓練した。８日目に、プラットホームを取り除き、プラットホーム領域を横切る時間を記録した。
【００７１】
ＡＬＺＴ−ＯＰ１処置ＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスは、薬物無処置ＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスの記憶迷路の経路認識の低下に比べて、ＷＴ正常対照と同じレベルの挙動を示した（図４）。
【００７２】
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのＯＬＺＴ−ＯＰ１ａでの短期処置
【００７３】
ｉｎ  ｖｉｖｏで可溶性Ａβの全レベルが、クロモリンナトリウムの末梢投与１週間後に５０％より大きく減少している（Ｈｏｒｉ、２０１５年）（図５）。追加の微小透析研究も、クロモリンナトリウムが脳における可溶性Ａβの半減期を減少させることを示す。クロモリンナトリウムを、７．５月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスに１週間毎日３回用量レベルで腹腔内注射した。図５、パネル（Ａ）：連日注射１週間後、トリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）可溶性Ａβｘ−４０（左側グラフ）およびＡβｘ−４２（右側グラフ）を、グアニジン（Ｇｄｎ）−ＨＣｌとプレインキュベーションした（黒色バー）またはしていない（白色バー）状態の下で、Ａβ  ＥＬＩＳＡを使用して測定した。Ｇｄｎ−ＨＣｌとのインキュベーションを受けた値は、全ＴＢＳ可溶性Ａβの濃度を示し、Ｇｄｎ−ＨＣｌとのインキュベーションのない値は、モノマーのＡβの濃度を示す。図５、パネル（Ｂ）：８２Ｅ１／８２Ｅ１  Ａβオリゴマー特異的ＥＬＩＳＡを使用して、ＴＢＳ可溶性脳抽出物中のオリゴマーのＡβを測定した。図５、パネル（Ｃ）は、抗Ａβ抗体（６Ｅ１０および８２Ｅ１）を用いたＴＢＳ可溶性脳抽出物の代表的イムノブロッティングを示す（左側パネル）。モノマーのＡβのデンシトメトリーを定量した（右側グラフ）。（ｎ＝３〜５／群；＊、Ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１）。これらのデータは、ＦＤＡ承認医薬品の末梢投与がＡβの効率的な使用に及ぼす明瞭で強力な効果を示唆し、ＡＤにおけるその潜在的な長期効力のさらなる調査を支持する（Hori、２０１５年）。
【００７４】
図６Ａ〜Ｂは、ＰＢＳまたはクロモリンナトリウム（３．１５ｍｇ／ｋｇ）で処置したＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳切片におけるＡβとミクログリアマーカーＩｂａ１との間における免疫染色を示す。染色間の重なりの系統的分析から、クロモリンナトリウムを投与した動物のほうが、アミロイドと重なるＩｂａ１免疫反応性の百分率が高い（上方パネル）ことが明らかになった。これは、化合物によって誘導された、プラークの周りのミクログリアの適度な動員増加を示している可能性がある。さらに、合成Ａβ４０およびＡβ４２ペプチドを、クロモリンナトリウムの存在下または非存在下でミクログリアのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に加えた。インキュベーション１６時間後に、クロモリンナトリウムの存在下でＡβ４０およびＡβ４２レベルの用量依存的減少が認められた。これは、クロモリンナトリウムのＡβ凝集機序に対する影響が、ミクログリアの取り込みによるＡβのクリアランスを促進することができることを示す（最下部パネル）。それらのｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの結果を組み合わせると、Ａβ線維形成を阻害することに加えて、クロモリンナトリウムは、ミクログリア活性化およびＡβのクリアランスにも影響を及ぼすことができるということを示唆している可能性がある。
【００７５】
図６では、パネルＡは、クロモリンナトリウム（３．１５ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳで７日間連日処置したマウスにおけるアミロイド沈着物（６Ｅ１０、緑色）およびミクログリア（Ｉｂａ１、赤色）の局在化の代表的画像を示す。クロモリンナトリウムで処置した後、Ｉｂａ１陽性プロセスによって占有されるアミロイドの百分率を各沈着物について算出し、ＡβとＩｂａ１の間の重なりが増加したことが示された（ＰＢＳの場合、ｎ＝マウス３匹、クロモリンナトリウムの場合、ｎ＝マウス５匹。各動物について、１０〜２０個の間のプラークを評価した）。スケールバー＝１０μｍ。
【００７６】
図６、パネルＢでは、ミクログリア細胞を、５０ｎＭの合成Ａβ４０またはＡβ４２および０、１０ｎＭ、１０μＭまたは１ｍＭのクロモリンナトリウムと共に１６時間培養およびインキュベートした。インキュベーション後に、培地中のＡβｘ−４０（左側パネル）、Ａβｘ−４２（右側パネル）の濃度を、Ａβ  ＥＬＩＳＡを使用して測定し、ミクログリア細胞数で、ＰＢＳ対照状態に従って正規化した。（ｎ＝３回実験；＊、Ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１）
【００７７】
安全性薬理試験
【００７８】
公式な安全性薬理試験は、クロモリンが承認された１９７０年代にはルーチンで実施されなかったので、公式の動物安全性薬理試験によって公式に報告されたデータは、これら２種のＡＰＩ構成成分のいずれについても見当たらなかった。しかし、これらの意図しない効果の可能性が、提案された臨床用量では全くありそうにないことを示す、広範なヒトに関するデータが存在する。
【００７９】
報告された研究によってまとめられた非ヒトの霊長類に関するいくつかの研究は、心電図（ＥＣＧ）および呼吸器の評価が実施されたことを示した（Beachら、「Cromolyn  Sodium  Toxicity  Studies  in  Primates」、Toxicol.  Appl.  Pharmacol.、（１９８１年）、５７巻、３６７〜４００頁）。吸入に関する研究における肺および心血管系（ＣＶ）機能の詳細な評価の結果は、処置効果がないことを示した（表３）。
【００８０】
マウスにおける放射標識クロモリンの生体内分布
【００８１】
クロモリンの様々な器官への分布をマウスにおいて調査した。放射標識クロモリンを静脈内（ＩＶ）注射した。図７は、ＩＶ注射５、３０、および６０分後における放射標識クロモリンの様々な器官への取り込み（グラフでそれぞれ青色、赤色、緑色のバー）を示す。脳組織に蓄積された放射標識クロモリンの量は、注射後１時間にわたるウォッシュアウト期間をほとんどまたは全く設けず、１％（１グラム当たりの用量）である。最高の器官蓄積を肺および肝臓において測定した。
【００８２】
ヒトにおける効果は、５５〜７５歳の間の年齢の正常な健常志願者間で研究され、単一吸入用量１７．１ｍｇのクロモリンを投与した（単一経口用量１０ｍｇのイブプロフェンを投与した）後の血漿およびＣＳＦ中のクロモリンの薬物動態（ＰＫ）によって例示される。さらに、３４．２ｍｇのクロモリンを投与した（吸入用量１７．１ｍｇを、２分間以下の間隔をあけて２回連続して投与、経口用量１０ｍｇのイブプロフェンカプセルを２回投与）後の血漿およびＣＳＦ中のクロモリンの薬物動態（ＰＫ）を５５〜７５歳の間の年齢の正常な健常志願者間で研究した。
【００８３】
これらの結果をAZTherapies'  Phase  I  Pharamcokinetic  Study  Report（AZTherapies、２０１５年）にまとめられている。
【００８４】
単一用量（１７．１ｍｇ）のクロモリンを吸入すると、血漿中クロモリン濃度が２３．３±１６．９分（範囲：５〜６０分）で４７．１±３３．６ｎｇ／ｍｌ（範囲：１４．０〜１３３ｎｇ／ｍｌ）の最高値に到達した。血漿中における平均滞留時間は、３．３±２．９時間（範囲：０．７９〜１２．１時間）であった。これは、速い〜中程度のクリアランスを示す。ＣＳＦ中のクロモリン濃度は、２から４時間上昇し続けた。単一用量吸入４時間後で、ＣＳＦ中のクロモリン濃度は０．２４±０．０８ｎｇ／ｍｌ（範囲：０．１５〜０．３６ｎｇ／ｍｌ）であった。
【００８５】
２倍用量（３４．２ｍｇに等しい）のクロモリンを吸入すると、クロモリンは、２２．２±１９．４分（範囲：５〜６０分）で９５．０±４５．５ｎｇ／ｍｌ（範囲：３６．１〜２３６ｎｇ／ｍｌ）の最高血漿中濃度に到達する。血漿中における平均滞留時間は、２．８±１．０時間（範囲：１．０〜５．４時間）であった。これは、速い〜中等度の血漿クリアランスを示す。
【００８６】
２倍用量吸入４時間後にＣＳＦ中のクロモリン濃度は、０．３６±０．１７ｎｇ／ｍｌ（範囲：０．１６〜０．６１ｎｇ／ｍｌ）であった。ＡＵＣ（血漿）は用量増加と共に、単一用量（１７．１ｍｇ）吸入の場合の１４７．５±６７．１ｎｇ／ｍｌ×時（範囲：４４．７〜２８７．０ｎｇ／ｍｌ×時）から２倍用量（３４．２ｍｇ）吸入の場合の２５４．４±９３．８ｎｇ／ｍｌ×時（範囲：１２２．１〜４４３．３ｎｇ／ｍｌ×時）まで増加した。クロモリン濃度は、薬物の慢性使用による毒性の増加を伴わずに、サイトカイン産生、ミクログリア活性化、および肥満細胞遊走を効果的に用量設定および調節すると推定される。
【００８７】
１７．１ｍｇの投与後観察されたＣＳＦ中のクロモリン濃度（０．４６ｎＭ）は、一例として８時間に及んで２倍濃度にまで外挿すると、推定１日当たり２２〜２７ｎｇ（２７ｎｇ／５１２  ＭＷ＝０．０６ｎＭ）のアミロイデートプラークおよび関連炎症反応を用量設定するのに必要とされる量より１桁超（１５倍）高くなる。
【００８８】
吸入されたクロモリンは、肺深部を経て、血液、脳およびＣＳＦに輸送された。クロモリンの脳からＣＳＦへの流れは遅く、高まるプロファイルを、カテーテルを取り付けた腰椎穿刺について４時間まで測定した。追加のＣＳＦ薬物動態研究によって、取り込みおよびウォッシュアウトのＣＳＦサンプリング曲線を完成するべきである。
【００８９】
クロモリンの血漿クリアランスは、半減期が１．７５±０．９時間（範囲：０．５〜３．７時間）であった。吸入１２時間後で、血漿中クロモリン濃度は無視できる程度であると予想される。同様のＣＳＦ中におけるクリアランス動態を想定して、クロモリン吸入１日２回の慢性レジメンは、血漿中およびＣＳＦ中クロモリン濃度を十分なレベルに日中維持すると予想される。
【００９０】
１日２回提案された用量１７．１ｍｇの慢性投与は、薬物の慢性使用による潜在的毒性に影響を及ぼすことなく、サイトカイン産生、ミクログリア活性化および肥満細胞増殖を用量設定および調節することによって、虚血性脳卒中後の神経炎症性損傷を遅延し、または停止させると推定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ−Ｃ】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年7月24日(2018.7.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
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【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
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【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５Ａ−Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５Ａ−Ｃ】
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【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６Ａ−Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６Ａ−Ｂ】
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【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
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【国際調査報告】
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