(57)【要約】例えば核酸ガイド化ヌクレアーゼをベースとした系を使用することによる、核酸の捕捉のための方法および組成物が本明細書で提供される。目的の核酸配列の選択的捕捉を可能にする方法および組成物が、本明細書で提供される。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含有することができる。本明細書で提供される方法および組成物は、複合核酸試料を扱うのに特に有用である。一態様では、本発明は、標的核酸配列を捕捉する方法であって、（ａ）アダプターにライゲートされた複数の核酸を含む試料を提供するステップであって、前記核酸は一方の末端で第１のアダプターにライゲートされており、他方の末端で第２のアダプターにライゲートされている、ステップを含む、方法を提供する。
2018529326.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列を捕捉する方法であって、
（ａ）アダプターにライゲートされた複数の核酸を含む試料を提供するステップであって、前記核酸は一方の末端で第１のアダプターにライゲートされており、他方の末端で第２のアダプターにライゲートされている、ステップ；
（ｂ）前記試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体と接触させ、それによって一方の末端で第１または第２のアダプターにライゲートされ、他方の末端にアダプターがない複数の核酸断片を生成するステップであって、前記ｇＮＡは前記核酸のサブセットに含有される目的の標的化部位に相補的である、ステップ；および
（ｃ）前記複数の核酸断片を第３のアダプターと接触させ、それによって、一方の末端で前記第１または第２のアダプターに、他方の末端で前記第３のアダプターにライゲートした複数の核酸断片を生成するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼがＣＡＳクラスＩタイプＩ、ＣＡＳクラスＩタイプＩＩＩ、ＣＡＳクラスＩタイプＩＶ、ＣＡＳクラスＩＩタイプＩＩおよびＣＡＳクラスＩＩタイプＶからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼがＣａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ−ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｃｓｆ１、Ｃ２ｃ２およびＮｇＡｇｏからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｇＮＡがｇＲＮＡである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ｇＮＡがｇＤＮＡである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体と接触させるステップが、前記核酸のサブセットに含有される目的の前記標的化部位を切断し、それによって一方の末端に第１または第２のアダプターを含み、他方の末端にアダプターがない複数の核酸断片を生成する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
第１または第２および第３のアダプターに特異的なＰＣＲを使用してステップ（ｃ）の生成物を増幅するステップをさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸が、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドからなる群より選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸が二本鎖ＤＮＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸がゲノムＤＮＡからのものである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ゲノムＤＮＡがヒトのものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
アダプターにライゲートされる前記核酸が２０ｂｐから５０００ｂｐの長さである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
目的の前記標的化部位が一塩基多型（ＳＮＰ）、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
増幅される生成物がクローニング、配列決定または遺伝子型決定のために使用される、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記アダプターが２０ｂｐから１００ｂｐの長さである、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記アダプターがプライマー結合部位を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記アダプターが配列決定アダプターまたは制限部位を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
目的の前記標的化部位が前記試料中の全核酸の５０％未満を占める、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１および第２のアダプターが同一である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１および第２のアダプターが異なる、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料が配列決定ライブラリーを含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
目的の標的化部位に標識ヌクレオチドを導入する方法であって、
（ａ）複数の核酸断片を含む試料を提供するステップ；
（ｂ）前記試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ−ｇＮＡ複合体と接触させ、それによって目的の前記標的化部位で複数のニック入りの核酸断片を生成するステップであって、前記ｇＮＡは前記核酸断片中の目的の標的化部位に相補的である、ステップ；および
（ｃ）前記複数のニック入りの核酸断片を、ニック入りの部位で核酸合成を開始することが可能な酵素および標識ヌクレオチドと接触させ、それによって目的の前記標的化部位において標識ヌクレオチドを含む複数の核酸断片を生成するステップ
を含む、方法。
【請求項２６】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、ＣＡＳクラスＩタイプＩニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩタイプＩＩＩニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩタイプＩＶニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩＩタイプＩＩニッカーゼおよびＣＡＳクラスＩＩタイプＶニッカーゼからなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃｐｆ１ニッカーゼ、Ｃａｓ３ニッカーゼ、Ｃａｓ８ａ−ｃニッカーゼ、Ｃａｓ１０ニッカーゼ、Ｃｓｅ１ニッカーゼ、Ｃｓｙ１ニッカーゼ、Ｃｓｎ２ニッカーゼ、Ｃａｓ４ニッカーゼ、Ｃｓｍ２ニッカーゼ、Ｃｍ５ニッカーゼ、Ｃｓｆ１ニッカーゼ、Ｃ２Ｃ２ニッカーゼ、ＣＰＦ１ニッカーゼおよびＮｇＡｇｏニッカーゼからなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ｇＮＡがｇＲＮＡである、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ｇＮＡがｇＤＮＡである、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸断片が、一本鎖ＤＮＡ断片、二本鎖ＤＮＡ断片、一本鎖ＲＮＡ断片、二本鎖ＲＮＡ断片およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド断片からなる群より選択される、請求項２５から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸断片が二本鎖ＤＮＡ断片である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
二本鎖ＤＮＡ断片がゲノムＤＮＡからのものである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ゲノムＤＮＡがヒトのものである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸断片が２０ｂｐから５０００ｂｐの長さである、請求項２５から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
目的の前記標的化部位が一塩基多型（ＳＮＰ）、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である、請求項２５から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
目的の前記標的化部位が前記試料中の全核酸の５０％未満を占める、請求項２５から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる、請求項２５から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記標識ヌクレオチドがビオチン化ヌクレオチドである、請求項２５から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記標識ヌクレオチドが抗体コンジュゲート対の一部である、請求項２５から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
ビオチン化ヌクレオチドを含む前記核酸断片をアビジンまたはストレプトアビジンと接触させ、それによって目的の前記標的化部位を捕捉するステップをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
ニック入りの部位で核酸合成を開始することが可能な前記酵素が、ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片、ＴＡＱポリメラーゼまたはＢｓｔＤＮＡポリメラーゼである、請求項２５から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが前記核酸断片の５’末端にニックを入れる、請求項２５から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記核酸断片が２０ｂｐから５０００ｂｐの長さである、請求項２５から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる、請求項２５から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
目的の標的核酸配列を捕捉する方法であって、
（ａ）アダプターにライゲートされた複数の核酸を含む試料を提供するステップであって、前記核酸は一方の末端で第１のアダプターにライゲートされており、他方の末端で第２のアダプターにライゲートされている、ステップ；および
（ｂ）前記試料を複数の触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体と接触させるステップであって、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼはトランスポザーゼに融合されており、ｇＲＮＡは前記核酸のサブセットに含有される目的の標的化部位に相補的であり、一方の末端に第１または第２のアダプターを含み、他方の末端に第３のアダプターを含む複数の核酸断片を生成するために、前記複合体に複数の第３のアダプターを負荷する、ステップ
を含む、方法。
【請求項４６】
第１または第２および第３のアダプターに特異的なＰＣＲを使用してステップ（ｂ）の生成物を増幅するステップをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に由来する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に由来する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが、不活性なＣＡＳクラスＩタイプＩ、不活性なＣＡＳクラスＩタイプＩＩＩ、不活性なＣＡＳクラスＩタイプＩＶ、不活性なＣＡＳクラスＩＩタイプＩＩおよび不活性なＣＡＳクラスＩＩタイプＶからなる群より選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが、ｄＣａｓ９、ｄＣｐｆ１、ｄＣａｓ３、ｄＣａｓ８ａ−ｃ、ｄＣａｓ１０、ｄＣｓｅ１、ｄＣｓｙ１、ｄＣｓｎ２、ｄＣａｓ４、ｄＣｓｍ２、ｄＣｍｒ５、ｄＣｓｆ１、ｄＣ２Ｃ２およびｄＮｇＡｇｏからなる群より選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記ｇＮＡがｇＲＮＡである、請求項４５から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ｇＮＡがｇＤＮＡである、請求項４５から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
核酸配列がゲノムＤＮＡからのものである、請求項４５から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ゲノムＤＮＡがヒトのものである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが前記トランスポザーゼのＮ末端に融合されている、請求項４５から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが前記トランスポザーゼのＣ末端に融合されている、請求項４５から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
アダプターにライゲートされる前記核酸が２０ｂｐから５０００ｂｐの長さである、請求項４５から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
（ｂ）の接触させるステップが標的化核酸配列への前記第２のアダプターの挿入を可能にする、請求項４５から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
目的の前記標的化部位が一塩基多型（ＳＮＰ）、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である、請求項４５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
増幅される生成物がクローニング、配列決定または遺伝子型決定のために使用される、請求項４６に記載の方法。
【請求項６１】
前記アダプターが２０ｂｐから１００ｂｐの長さである、請求項４５から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記アダプターがプライマー結合部位を含む、請求項４５から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記アダプターが配列決定アダプターまたは制限部位を含む、請求項４５から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
目的の前記標的化部位が前記試料中の全核酸の５０％未満を占める、請求項４５から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる、請求項４５から６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
目的の標的核酸配列を捕捉する方法であって、
（ａ）アダプターにライゲートされた複数の核酸を含む試料を提供するステップであって、前記核酸は５’末端および３’末端で前記アダプターにライゲートされている、ステップ；
（ｂ）前記試料を複数の触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体と接触させ、それによって触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体に結合した、５’および３’末端でアダプターにライゲートされた複数の核酸を生成するステップであって、前記ｇＮＡは前記核酸のサブセットに含有される目的の標的化部位に相補的である、ステップ；および
（ｃ）前記試料を複数の触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体と接触させ、それによって５’または３’末端のうち一方のみでアダプターにライゲートされた、目的外の核酸配列を含む複数の核酸断片を生成するステップであって、前記ｇＮＡは前記核酸中の目的の標的化部位と目的外の標的化部位の両方に相補的である、ステップ
を含む、方法。
【請求項６７】
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが不活性なＣＡＳクラスＩタイプＩ、不活性なＣＡＳクラスＩタイプＩＩＩ、不活性なＣＡＳクラスＩタイプＩＶ、不活性なＣＡＳクラスＩＩタイプＩＩおよび不活性なＣＡＳクラスＩＩタイプＶからなる群より選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが、ｄＣａｓ９、ｄＣｐｆ１、ｄＣａｓ３、ｄＣａｓ８ａ−ｃ、ｄＣａｓ１０、ｄＣｓｅ１、ｄＣｓｙ１、ｄＣｓｎ２、ｄＣａｓ４、ｄＣｓｍ２、ｄＣｍ５、ｄＣｓｆ１、ｄＣ２Ｃ２、ｄＣＰＦ１およびｄＮｇＡｇｏからなる群より選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
前記ｇＮＡがｇＲＮＡである、請求項６６から７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記ｇＮＡがｇＤＮＡである、請求項６６から７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
（ｃ）の接触させるステップが、ステップ（ｂ）の触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体に結合した、５’および３’末端でアダプターにライゲートされた複数の前記核酸を置換しない、請求項６６から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
（ｄ）の接触させるステップが、前記核酸のサブセットに含有される目的外の前記標的化部位を切断し、それによって、５’または３’末端のうち一方のみでアダプターにライゲートされた、目的外の核酸配列を含む複数の核酸断片を生成する、請求項６６から７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記結合した触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体を除去し、アダプターに特異的なＰＣＲを使用して（ｂ）の生成物を増幅するステップをさらに含む、請求項６６から７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記核酸が、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドからなる群より選択される、請求項６６から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記核酸が二本鎖ＤＮＡである、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記核酸がゲノムＤＮＡからのものである、請求項６６から７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記ゲノムＤＮＡがヒトのものである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記５’末端および３’末端でアダプターにライゲートされた前記核酸が２０ｂｐから５０００ｂｐである、請求項６６から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
目的の前記標的化部位が一塩基多型（ＳＮＰ）、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である、請求項６６から８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
増幅される生成物がクローニング、配列決定または遺伝子型決定のために使用される、請求項７５に記載の方法。
【請求項８３】
前記アダプターが２０ｂｐから１００ｂｐの長さである、請求項６６から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記アダプターがプライマー結合部位を含む、請求項６６から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記アダプターが配列決定アダプターまたは制限部位を含む、請求項６６から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
目的の前記標的化部位が前記試料中の全核酸の５０％未満を占める、請求項６６から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる、請求項６６から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
目的の標的核酸配列を捕捉する方法であって、
（ａ）複数の核酸配列を含む試料を提供するステップであって、前記核酸配列はメチル化ヌクレオチドを含み、前記核酸配列は５’および３’末端でアダプターにライゲートされている、ステップ；
（ｂ）前記試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ−ｇＮＡ複合体と接触させ、それによって前記核酸配列のサブセットで目的の複数のニック入りの部位を生成するステップであって、前記ｇＮＡは前記核酸配列のサブセットの目的の標的化部位に相補的であり、そして前記標的核酸配列は５’および３’末端でアダプターにライゲートされている、ステップ；
（ｃ）前記試料をニック入りの部位でＤＮＡ合成を開始することが可能な酵素およびメチル化されていないヌクレオチドと接触させ、それによって、目的の前記標的化部位にメチル化されていないヌクレオチドを含む複数の核酸配列を生成するステップであって、前記核酸配列は５’および３’末端でアダプターにライゲートされている、ステップ；および
（ｄ）前記試料を、メチル化核酸を切断することが可能な酵素と接触させ、それによってメチル化核酸を含む複数の核酸断片を生成するステップであって、メチル化核酸を含む複数の前記核酸断片は５’および３’末端のうち最大１つでアダプターにライゲートされている、ステップ
を含む、方法。
【請求項８９】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、ＣＡＳクラスＩタイプＩニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩタイプＩＩＩニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩタイプＩＶニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩＩタイプＩＩニッカーゼおよびＣＡＳクラスＩＩタイプＶニッカーゼからなる群より選択される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃｐｆ１ニッカーゼ、Ｃａｓ３ニッカーゼ、Ｃａｓ８ａ−ｃニッカーゼ、Ｃａｓ１０ニッカーゼ、Ｃｓｅ１ニッカーゼ、Ｃｓｙ１ニッカーゼ、Ｃｓｎ２ニッカーゼ、Ｃａｓ４ニッカーゼ、Ｃｓｍ２ニッカーゼ、Ｃｍｒ５ニッカーゼ、Ｃｓｆ１ニッカーゼ、Ｃ２Ｃ２ニッカーゼおよびＮｇＡｇｏニッカーゼからなる群より選択される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記ｇＮＡがｇＲＮＡである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９２】
前記ｇＮＡがｇＤＮＡである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９３】
前記ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡである、請求項８８から９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記二本鎖ＤＮＡがゲノムＤＮＡからのものである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記ゲノムＤＮＡがヒトのものである、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記ＤＮＡ配列が２０ｂｐから５０００ｂｐの長さである、請求項８８から９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
目的の前記標的化部位が一塩基多型（ＳＮＰ）、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である、請求項８８から９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
目的の前記標的化部位が前記試料中の全ＤＮＡの５０％未満を占める、請求項８８から９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる、請求項８８から９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
ニック入りの部位で核酸合成を開始することが可能な前記酵素が、ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片、ＴＡＱポリメラーゼまたはＢｓｔＤＮＡポリメラーゼである、請求項８８から９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが前記ＤＮＡ配列の５’末端にニックを入れる、請求項８８から１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
メチル化ＤＮＡを切断することが可能な前記酵素がＤｐｎＩである、請求項８８から１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
目的の標的ＤＮＡ配列を捕捉する方法であって、
（ａ）前記試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ−ｇＮＡ複合体と接触させ、それによって目的の領域に隣接する部位で複数のニック入りのＤＮＡを生成するステップであって、前記ｇＮＡが、前記ＤＮＡ配列のサブセット中の目的の前記領域に隣接する目的の標的化部位に相補的である、ステップ；
（ｂ）前記試料を６５℃まで加熱し、それによって、近接するニックに二本鎖切断を起こすステップ；
（ｃ）前記二本鎖切断を耐熱性のリガーゼと接触させ、それによってこれらの部位にのみアダプター配列のライゲーションを可能にするステップ；および
（ｄ）ステップａ〜ｃを反復して、第２のアダプターを目的の前記領域の反対側に置き、こうして目的の前記領域の濃縮を可能にするステップ
を含む、方法。
【請求項１０４】
前記ｇＮＡがｇＲＮＡである、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ｇＮＡがｇＤＮＡである、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼがＣＡＳクラスＩタイプＩニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩタイプＩＩＩニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩタイプＩＶニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩＩタイプＩＩニッカーゼおよびＣＡＳクラスＩＩタイプＶニッカーゼからなる群より選択される、請求項１０３から１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼがＣａｓ９ニッカーゼ、Ｃｐｆ１ニッカーゼ、Ｃａｓ３ニッカーゼ、Ｃａｓ８ａ−ｃニッカーゼ、Ｃａｓ１０ニッカーゼ、Ｃｓｅ１ニッカーゼ、Ｃｓｙ１ニッカーゼ、Ｃｓｎ２ニッカーゼ、Ｃａｓ４ニッカーゼ、Ｃｓｍ２ニッカーゼ、Ｃｍｒ５ニッカーゼ、Ｃｓｆ１ニッカーゼ、Ｃ２Ｃ２ニッカーゼおよびＮｇＡｇｏニッカーゼからなる群より選択される、請求項１０３から１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡである、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０９】
前記二本鎖ＤＮＡがゲノムＤＮＡからのものである、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記ゲノムＤＮＡがヒトのものである、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ＤＮＡ配列が２０ｂｐから５０００ｂｐの長さである、請求項１０３から１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
目的の前記標的化部位が一塩基多型（ＳＮＰ）、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である、請求項１０３から１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
目的の前記標的化部位が前記試料中の全ＤＮＡの５０％未満を占める、請求項１０３から１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる、請求項１０３から１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記二本鎖切断を接触させることが可能な耐熱性の前記リガーゼが耐熱性の５’Ａｐｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼまたはＴ４  ＲＮＡリガーゼである、請求項１０３から１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが前記ＤＮＡ配列の５’末端にニックを入れる、請求項１０３から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
目的の配列について試料を濃縮する方法であって、
（ａ）目的の配列および枯渇のための標的化配列を含む試料を提供するステップであって、目的の前記配列は前記試料の５０％未満を構成する、ステップ；および
（ｂ）複数の核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼ−ｇＲＮＡ複合体または複数の核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼ−ｇＤＮＡ複合体と前記試料を接触させるステップであって、前記ｇＲＮＡおよびｇＤＮＡは前記標的化配列に相補的であり、それによって前記標的化配列が切断される、ステップ
を含む、方法。
【請求項１１８】
目的の前記配列および枯渇のための前記標的化配列を前記試料から抽出するステップをさらに含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
抽出される前記配列を断片化するステップをさらに含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
切断される前記標的化配列がサイズ排除によって除去される、請求項１１７から１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料のいずれか１つである、請求項１１７から１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記試料が、枯渇のために標的化される宿主核酸配列および目的の非宿主核酸配列を含む、請求項１１７から１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記非宿主核酸配列が微生物の核酸配列を含む、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記微生物核酸配列が、細菌、ウイルスまたは真核寄生生物の核酸配列である、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記ｇＲＮＡおよびｇＤＮＡが、リボソームＲＮＡ配列、スプライシングされた転写物、スプライシングされていない転写物、イントロン、エクソンまたは非コードＲＮＡに相補的である、請求項１１７から１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
抽出される前記核酸が、一本鎖または二本鎖のＲＮＡを含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２７】
抽出される前記核酸が、一本鎖または二本鎖のＤＮＡを含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２８】
目的の前記配列が抽出される前記核酸の１０％未満を構成する、請求項１１７から１２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼがＣ２ｃ２を含む、請求項１１７から１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記Ｃ２ｃ２が触媒活性がない、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＮｇＡｇｏを含む、請求項１１７から１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記ＮｇＡｇｏが触媒活性がない、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記試料が、全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織および生検材料から選択される、請求項１１７から１３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
試料を濃縮する方法であって、
（ａ）宿主核酸および非宿主核酸を含む試料を提供するステップ；
（ｂ）複数の核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼ−ｇＲＮＡ複合体または複数の核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼ−ｇＤＮＡ複合体と前記試料を接触させるステップであって、前記ｇＲＮＡおよびｇＤＮＡは前記宿主核酸の標的化部位に相補的である、ステップ、ならびに
（ｃ）非宿主核酸について前記試料を濃縮するステップ
を含む、方法。
【請求項１３５】
前記核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼがＣ２ｃ２を含む、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
前記核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼが触媒活性がないＣ２ｃ２を含む、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３７】
前記核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＮｇＡｇｏを含む、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３８】
前記核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼが触媒活性がないＮｇＡｇｏを含む、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３９】
前記宿主が、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、サル、イヌ、ネコ、スナネズミ、トリ、マウスおよびラットからなる群より選択される、請求項１３４から１３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
前記非宿主が原核生物である、請求項１３４から１３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記非宿主が、真核生物、ウイルス、細菌、真菌および原生動物からなる群より選択される、請求項１３４から１３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
アダプターにライゲートされた前記宿主核酸および非宿主核酸が５０ｂｐから１０００ｂｐの範囲内である、請求項１３４から１４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
前記非宿主核酸が前記試料中の全核酸の５０％未満を構成する、請求項１３４から１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料のいずれか１つである、請求項１３４から１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
ステップ（ｃ）がステップ（ｂ）の生成物をｃＤＮＡに逆転写することを含む、請求項１３４から１４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４６】
ステップ（ｃ）がサイズ排除によって前記宿主核酸を除去することを含む、請求項１３４から１４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４７】
ステップ（ｃ）がビオチンの使用によって前記宿主核酸を除去することを含む、請求項１３４から１４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４８】
前記試料が、全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織および生検材料から選択される、請求項１３４から１４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４９】
核酸断片、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ−ｇＮＡ複合体および標識ヌクレオチドを含む組成物。
【請求項１５０】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、ＣＡＳクラスＩタイプＩニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩタイプＩＩＩニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩタイプＩＶニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩＩタイプＩＩニッカーゼおよびＣＡＳクラスＩＩタイプＶニッカーゼからなる群より選択される、請求項１４９に記載の組成物。
【請求項１５１】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃｐｆ１ニッカーゼ、Ｃａｓ３ニッカーゼ、Ｃａｓ８ａ−ｃニッカーゼ、Ｃａｓ１０ニッカーゼ、Ｃｓｅ１ニッカーゼ、Ｃｓｙ１ニッカーゼ、Ｃｓｎ２ニッカーゼ、Ｃａｓ４ニッカーゼ、Ｃｓｍ２ニッカーゼ、Ｃｍｒ５ニッカーゼ、Ｃｓｆ１ニッカーゼ、Ｃ２Ｃ２ニッカーゼおよびＮｇＡｇｏニッカーゼからなる群より選択される、請求項１４９に記載の組成物。
【請求項１５２】
前記ｇＮＡがｇＲＮＡである、請求項１４９から１５１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５３】
前記ｇＮＡがｇＤＮＡである、請求項１４９から１５１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５４】
前記核酸断片がＤＮＡを含む、請求項１４９から１５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５５】
前記核酸断片がＲＮＡを含む、請求項１４９から１５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５６】
前記ヌクレオチドがビオチンで標識される、請求項１４９から１５５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５７】
前記ヌクレオチドが抗体コンジュゲート対の一部である、請求項１４９から１５６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５８】
核酸断片および触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体を含む組成物であって、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼはトランスポザーゼに融合されている、組成物。
【請求項１５９】
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが、不活性なＣＡＳクラスＩタイプＩ、不活性なＣＡＳクラスＩタイプＩＩＩ、不活性なＣＡＳクラスＩタイプＩＶ、不活性なＣＡＳクラスＩＩタイプＩＩおよび不活性なＣＡＳクラスＩＩタイプＶからなる群より選択される、請求項１５８に記載の組成物。
【請求項１６０】
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが、ｄＣａｓ９、ｄＣｐｆ１、ｄＣａｓ３、ｄＣａｓ８ａ−ｃ、ｄＣａｓ１０、ｄＣｓｅ１、ｄＣｓｙ１、ｄＣｓｎ２、ｄＣａｓ４、ｄＣｓｍ２、ｄＣｍｒ５、ｄＣｓｆ１、ｄＣ２Ｃ２およびｄＮｇＡｇｏからなる群より選択される、請求項１５８に記載の組成物。
【請求項１６１】
前記ｇＮＡがｇＲＮＡである、請求項１５８、１５９または１６０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６２】
前記ｇＮＡがｇＤＮＡである、請求項１５８から１６１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６３】
前記核酸断片がＤＮＡを含む、請求項１５８から１６２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６４】
前記核酸断片がＲＮＡを含む、請求項１５８から１６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６５】
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが前記トランスポザーゼのＮ末端に融合されている、請求項１５８から１６４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６６】
前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが前記トランスポザーゼのＣ末端に融合されている、請求項１５８から１６５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６７】
メチル化ヌクレオチドを含む核酸断片、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ−ｇＮＡ複合体および非メチル化ヌクレオチドを含む組成物。
【請求項１６８】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、ＣＡＳクラスＩタイプＩニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩタイプＩＩＩニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩタイプＩＶニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩＩタイプＩＩニッカーゼおよびＣＡＳクラスＩＩタイプＶニッカーゼからなる群より選択される、請求項１６７に記載の組成物。
【請求項１６９】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃｐｆ１ニッカーゼ、Ｃａｓ３ニッカーゼ、Ｃａｓ８ａ−ｃニッカーゼ、Ｃａｓ１０ニッカーゼ、Ｃｓｅ１ニッカーゼ、Ｃｓｙ１ニッカーゼ、Ｃｓｎ２ニッカーゼ、Ｃａｓ４ニッカーゼ、Ｃｓｍ２ニッカーゼ、Ｃｍｒ５ニッカーゼ、Ｃｓｆ１ニッカーゼ、Ｃ２Ｃ２ニッカーゼおよびＮｇＡｇｏニッカーゼからなる群より選択される、請求項１６７に記載の組成物。
【請求項１７０】
前記ｇＮＡがｇＲＮＡである、請求項１６７、１６８または１６９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７１】
前記ｇＮＡがｇＤＮＡである、請求項１６７から１７０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７２】
前記核酸断片がＤＮＡを含む、請求項１６７から１７１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７３】
前記核酸断片がＲＮＡを含む、請求項１６７から１７１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７４】
前記ヌクレオチドがビオチンで標識される、請求項１６７から１７３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７５】
前記ヌクレオチドが抗体コンジュゲート対の一部である、請求項１６７から１７４のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１５年８月１９日に出願された米国仮出願第６２／２０７，３５９号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムの特異的領域の標的化配列決定は、特に臨床状況において、研究者の関心事であり続けている。遺伝病、がんおよび多くの研究プロジェクトの臨床診断は、配列決定の費用を低減しつつも標的化部位の広い適用範囲の配列決定を可能にするために、標的化配列決定に依存している。現在、この目的のために使用される主な方法は、１）ハイブリダイゼーションをベースとした濃縮、および２）多重ＰＣＲである。前者のアプローチでは、ライブラリーから目的の配列を「取り出す」ために、ビオチンで標識された短いオリゴヌクレオチドプローブが使用される。このプロセスは時間と費用がかかり、多くの実地の工程を必要とする可能性がある。さらに、結果として生じる生成物中に、一部の「標的外」の配列がしばしば残存することがある。多重ＰＣＲをベースとしたアプローチはより迅速かもしれないが、標的数が制限され、費用が高くなる可能性がある。容易であり、特異的であり、迅速であり、かつ安価である目的の核酸領域の効率的な捕捉のための方法が必要である。この必要性に対処する方法および組成物が、本明細書で提供される。
【０００３】
本明細書で引用される全ての特許、特許出願、公報、文書、ウェブリンクおよび論文は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
目的の核酸配列の選択的捕捉を可能にする方法および組成物が、本明細書で提供される。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含有することができる。本明細書で提供される方法および組成物は、複合核酸試料を扱うのに特に有用である。
【０００５】
一態様では、本発明は、標的核酸配列を捕捉する方法であって、（ａ）アダプターにライゲートされた複数の核酸を含む試料を提供するステップであって、前記核酸は一方の末端で第１のアダプターにライゲートされており、他方の末端で第２のアダプターにライゲートされている、ステップ；（ｂ）前記試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体と接触させ、それによって一方の末端で第１または第２のアダプターにライゲートされ、他方の末端にアダプターがない複数の核酸断片を生成するステップであって、前記ｇＮＡは前記核酸のサブセットに含有される目的の標的化部位に相補的である、ステップ；および（ｃ）前記複数の核酸断片を第３のアダプターと接触させ、それによって、一方の末端で前記第１または第２のアダプターに、他方の末端で前記第３のアダプターにライゲートした複数の核酸断片を生成するステップを含む、方法を提供する。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼがＣＡＳクラスＩタイプＩ、ＣＡＳクラスＩタイプＩＩＩ、ＣＡＳクラスＩタイプＩＶ、ＣＡＳクラスＩＩタイプＩＩおよびＣＡＳクラスＩＩタイプＶからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼがＣａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ−ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、Ｃｍ５、Ｃｓｆ１、Ｃ２ｃ２およびＮｇＡｇｏからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記ｇＮＡがｇＲＮＡである。一つの実施形態では、前記ｇＮＡがｇＤＮＡである。一つの実施形態では、複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体と接触させるステップが、前記核酸のサブセットに含有される目的の前記標的化部位を切断し、それによって一方の末端に第１または第２のアダプターを含み、他方の末端にアダプターがない複数の核酸断片を生成する。一つの実施形態では、方法は、第１または第２および第３のアダプターに特異的なＰＣＲを使用してステップ（ｃ）の生成物を増幅するステップをさらに含む。一つの実施形態では、前記核酸が、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記核酸が二本鎖ＤＮＡである。一つの実施形態では、前記核酸がゲノムＤＮＡからのものである。一つの実施形態では、前記ゲノムＤＮＡがヒトのものである。一つの実施形態では、前記核酸のアダプターにライゲートされる末端が２０ｂｐから５０００ｂｐの長さである。一つの実施形態では、目的の前記標的化部位が一塩基多型（ＳＮＰ）、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である。一つの実施形態では、増幅される生成物がクローニング、配列決定または遺伝子型決定のために使用される。一つの実施形態では、前記アダプターが２０ｂｐから１００ｂｐの長さである。一つの実施形態では、前記アダプターがプライマー結合部位を含む。一つの実施形態では、前記アダプターが配列決定アダプターまたは制限部位を含む。一つの実施形態では、目的の前記標的化部位が前記試料中の全核酸の５０％未満を占める。一つの実施形態では、前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる。一つの実施形態では、前記第１および第２のアダプターが同一である。一つの実施形態では、前記第１および第２のアダプターが異なる。一つの実施形態では、前記試料が配列決定ライブラリーを含む。
【０００６】
一態様では、本発明は、目的の標的化部位に標識ヌクレオチドを導入する方法であって、（ａ）複数の核酸断片を含む試料を提供するステップ；（ｂ）前記試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ−ｇＮＡ複合体と接触させ、それによって目的の前記標的化部位で複数のニック入りの核酸断片を生成するステップであって、前記ｇＮＡは前記核酸断片中の目的の標的化部位に相補的である、ステップ；および（ｃ）前記複数のニック入りの核酸断片を、ニック入りの部位で核酸合成を開始することが可能な酵素および標識ヌクレオチドと接触させ、それによって目的の前記標的化部位において標識ヌクレオチドを含む複数の核酸断片を生成するステップを含む、方法を提供する。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、ＣＡＳクラスＩタイプＩニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩタイプＩＩＩニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩタイプＩＶニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩＩタイプＩＩニッカーゼおよびＣＡＳクラスＩＩタイプＶニッカーゼからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃｐｆ１ニッカーゼ、Ｃａｓ３ニッカーゼ、Ｃａｓ８ａ−ｃニッカーゼ、Ｃａｓ１０ニッカーゼ、Ｃｓｅ１ニッカーゼ、Ｃｓｙ１ニッカーゼ、Ｃｓｎ２ニッカーゼ、Ｃａｓ４ニッカーゼ、Ｃｓｍ２ニッカーゼ、Ｃｍ５ニッカーゼ、Ｃｓｆ１ニッカーゼ、Ｃ２Ｃ２ニッカーゼおよびＮｇＡｇｏニッカーゼからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記ｇＮＡがｇＲＮＡである。一つの実施形態では、前記ｇＮＡがｇＤＮＡである。一つの実施形態では、前記核酸断片が、一本鎖ＤＮＡ断片、二本鎖ＤＮＡ断片、一本鎖ＲＮＡ断片、二本鎖ＲＮＡ断片およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド断片からなる群より選択される。一つの実施形態では、前記核断片が二本鎖ＤＮＡ断片である。一つの実施形態では、二本鎖ＤＮＡ断片がゲノムＤＮＡからのものである。一つの実施形態では、前記ゲノムＤＮＡがヒトのものである。一つの実施形態では、前記核酸断片が２０ｂｐから５０００ｂｐの長さである。一つの実施形態では、目的の前記標的化部位が一塩基多型（ＳＮＰ）、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である。一つの実施形態では、目的の前記標的化部位が前記試料中の全核酸の５０％未満を占める。一つの実施形態では、前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる。一つの実施形態では、前記標識ヌクレオチドがビオチン化ヌクレオチドである。一つの実施形態では、前記標識ヌクレオチドが抗体コンジュゲート対の一部である。一つの実施形態では、方法は、ビオチン化ヌクレオチドを含む前記核酸断片をアビジンまたはストレプトアビジンと接触させ、それによって目的の前記標的化核酸部位を捕捉するステップをさらに含む。一つの実施形態では、ニック入りの部位で核酸合成を開始することが可能な前記酵素が、ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片、ＴＡＱポリメラーゼまたはＢｓｔＤＮＡポリメラーゼである。一つの実施形態では、前記Ｃａｓ９ニッカーゼが前記核酸断片の５’末端にニックを入れる。一つの実施形態では、前記核酸断片が２０ｂｐから５０００ｂｐの長さである。一つの実施形態では、前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる。
【０００７】
一態様では、本発明は、目的の標的核酸配列を捕捉する方法であって、（ａ）アダプターにライゲートされた複数の核酸を含む試料を提供するステップであって、前記核酸は一方の末端で第１のアダプターにライゲートされており、他方の末端で第２のアダプターにライゲートされている、ステップ；および（ｂ）前記試料を複数の触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体と接触させるステップであって、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼはトランスポザーゼに融合されており、ｇＲＮＡは前記核酸のサブセットに含有される目的の標的化部位に相補的であり、一方の末端に第１または第２のアダプターを含み、他方の末端に第３のアダプターを含む複数の核酸断片を生成するために、前記複合体に複数の第３のアダプターを負荷する、ステップを含む、方法を提供する。一つの実施形態では、方法は、第１または第２および第３のアダプターに特異的なＰＣＲを使用してステップ（ｂ）の生成物を増幅するステップをさらに含む。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に由来する。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に由来する。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが、不活性なＣＡＳクラスＩタイプＩ、不活性なＣＡＳクラスＩタイプＩＩＩ、不活性なＣＡＳクラスＩタイプＩＶ、不活性なＣＡＳクラスＩＩタイプＩＩおよび不活性なＣＡＳクラスＩＩタイプＶからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが、ｄＣａｓ９、ｄＣｐｆ１、ｄＣａｓ３、ｄＣａｓ８ａ−ｃ、ｄＣａｓ１０、ｄＣｓｅ１、ｄＣｓｙ１、ｄＣｓｎ２、ｄＣａｓ４、ｄＣｓｍ２、ｄＣｍ５、ｄＣｓｆ１、ｄＣ２Ｃ２およびｄＮｇＡｇｏからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記ｇＮＡがｇＲＮＡである。一つの実施形態では、前記ｇＮＡがｇＤＮＡである。一つの実施形態では、核酸配列がゲノムＤＮＡからのものである。一つの実施形態では、前記ゲノムＤＮＡがヒトのものである。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが前記トランスポザーゼのＮ末端に融合されている。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが前記トランスポザーゼのＣ末端に融合されている。一つの実施形態では、前記アダプターにライゲートされる核酸が２０ｂｐから５０００ｂｐである。一つの実施形態では、（ｂ）の接触させるステップが標的化核酸配列への前記第２のアダプターの挿入を可能にする。一つの実施形態では、目的の前記標的化部位が一塩基多型（ＳＮＰ）、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である。一つの実施形態では、増幅される生成物がクローニング、配列決定または遺伝子型決定のために使用される。一つの実施形態では、前記アダプターが２０ｂｐから１００ｂｐの長さである。一つの実施形態では、前記アダプターがプライマー結合部位を含む。一つの実施形態では、前記アダプターが配列決定アダプターまたは制限部位を含む。一つの実施形態では、目的の前記標的化部位が前記試料中の全核酸の５０％未満を占める。一つの実施形態では、前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる。
【０００８】
一態様では、本発明は、目的の標的核酸配列を捕捉する方法であって、（ａ）アダプターにライゲートされた複数の核酸を含む試料を提供するステップであって、前記核酸は５’末端および３’末端で前記アダプターにライゲートされている、ステップ；（ｂ）前記試料を複数の触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体と接触させ、それによって触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体に結合した、５’および３’末端でアダプターにライゲートされた複数の核酸を生成するステップであって、前記ｇＮＡは前記核酸のサブセットに含有される目的の標的化部位に相補的である、ステップ；および（ｃ）前記試料を複数の触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体と接触させ、それによって５’または３’末端のうち一方のみでアダプターにライゲートされた、目的外の核酸配列を含む複数の核酸断片を生成するステップであって、前記ｇＮＡは前記核酸中の目的の標的化部位と目的外の標的化部位の両方に相補的である、ステップを含む、方法を提供する。一つの実施形態では、（ｃ）の接触させるステップが、ステップ（ｂ）のＣＡＳ９−ｇＲＮＡ複合体に結合した、５’および３’末端でアダプターにライゲートされた複数の前記核酸を置換しない。一つの実施形態では、（ｄ）の接触させるステップが、前記核酸のサブセットに含有される目的外の前記標的化部位を切断し、それによって、５’または３’末端のうち一方のみでアダプターにライゲートされた、目的外の核酸配列を含む複数の核酸断片を生成する。一つの実施形態では、前記結合したＣＡＳ９−ｇＲＮＡ複合体を除去し、アダプターに特異的なＰＣＲを使用して（ｂ）の生成物を増幅するステップをさらに含む。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが不活性なＣＡＳクラスＩタイプＩ、不活性なＣＡＳクラスＩタイプＩＩＩ、不活性なＣＡＳクラスＩタイプＩＶ、不活性なＣＡＳクラスＩＩタイプＩＩおよび不活性なＣＡＳクラスＩＩタイプＶからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが、ｄＣａｓ９、ｄＣｐｆ１、ｄＣａｓ３、ｄＣａｓ８ａ−ｃ、ｄＣａｓ１０、ｄＣｓｅ１、ｄＣｓｙ１、ｄＣｓｎ２、ｄＣａｓ４、ｄＣｓｍ２、ｄＣｍ５、ｄＣｓｆ１、ｄＣ２Ｃ２、ｄＣＰＦ１およびｄＮｇＡｇｏからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記ｇＮＡがｇＲＮＡである。一つの実施形態では、前記ｇＮＡがｇＤＮＡである。一つの実施形態では、前記核酸が、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記核酸が二本鎖ＤＮＡである。一つの実施形態では、前記核酸がゲノムＤＮＡからのものである。一つの実施形態では、前記ゲノムＤＮＡがヒトのものである。一つの実施形態では、前記５’末端および３’末端でアダプターにライゲートされた前記核酸が２０ｂｐから５０００ｂｐの長さである。一つの実施形態では、目的の前記標的化部位が一塩基多型（ＳＮＰ）、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である。一つの実施形態では、増幅される生成物がクローニング、配列決定または遺伝子型決定のために使用される。一つの実施形態では、前記アダプターが２０ｂｐから１００ｂｐの長さである。一つの実施形態では、前記アダプターがプライマー結合部位を含む。一つの実施形態では、前記アダプターが配列決定アダプターまたは制限部位を含む。一つの実施形態では、目的の前記標的化部位が前記試料中の全核酸の５０％未満を占める。一つの実施形態では、前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる。
【０００９】
一態様では、本発明は、目的の標的ＤＮＡ配列を捕捉する方法であって、（ａ）複数の核酸配列を含む試料を提供するステップであって、前記核酸配列はメチル化ヌクレオチドを含み、前記核酸配列は５’および３’末端でアダプターにライゲートされている、ステップ；（ｂ）前記試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ−ｇＮＡ複合体と接触させ、それによって前記核酸配列のサブセットで目的の複数のニック入りの部位を生成するステップであって、前記ｇＮＡは前記核酸配列のサブセットの目的の標的化部位に相補的であり、そして前記標的核酸配列は５’および３’末端でアダプターにライゲートされている、ステップ；（ｃ）前記試料をニック入りの部位でＤＮＡ合成を開始することが可能な酵素およびメチル化されていないヌクレオチドと接触させ、それによって、目的の前記標的化部位にメチル化されていないヌクレオチドを含む複数の核酸配列を生成するステップであって、前記核酸配列は５’および３’末端でアダプターにライゲートされている、ステップ；および（ｄ）前記試料を、メチル化核酸を切断することが可能な酵素と接触させ、それによってメチル化核酸を含む複数の核酸断片を生成するステップであって、メチル化核酸を含む複数の前記核酸断片は５’および３’末端のうち最大１つでアダプターにライゲートされている、ステップを含む、方法を提供する。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、ＣＡＳクラスＩタイプＩニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩタイプＩＩＩニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩタイプＩＶニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩＩタイプＩＩニッカーゼおよびＣＡＳクラスＩＩタイプＶニッカーゼからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃｐｆ１ニッカーゼ、Ｃａｓ３ニッカーゼ、Ｃａｓ８ａ−ｃニッカーゼ、Ｃａｓ１０ニッカーゼ、Ｃｓｅ１ニッカーゼ、Ｃｓｙ１ニッカーゼ、Ｃｓｎ２ニッカーゼ、Ｃａｓ４ニッカーゼ、Ｃｓｍ２ニッカーゼ、Ｃｍ５ニッカーゼ、Ｃｓｆ１ニッカーゼ、Ｃ２ｃ２ニッカーゼおよびＮｇＡｇｏニッカーゼからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記ｇＮＡがｇＲＮＡである。一つの実施形態では、前記ｇＮＡがｇＤＮＡである。一つの実施形態では、前記ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡである。一つの実施形態では、前記二本鎖ＤＮＡがゲノムＤＮＡからのものである。一つの実施形態では、前記ゲノムＤＮＡがヒトのものである。一つの実施形態では、前記ＤＮＡ配列が２０ｂｐから５０００ｂｐの長さである。一つの実施形態では、目的の前記標的化部位が一塩基多型（ＳＮＰ）、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である。一つの実施形態では、目的の前記標的化部位が前記試料中の全ＤＮＡの５０％未満を占める。一つの実施形態では、前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる。一つの実施形態では、ニック入りの部位で核酸合成を開始することが可能な前記酵素が、ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片、ＴＡＱポリメラーゼまたはＢｓｔＤＮＡポリメラーゼである。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが前記ＤＮＡ配列の５’末端にニックを入れる。一つの実施形態では、メチル化ＤＮＡを切断することが可能な前記酵素がＤｐｎＩである。
【００１０】
一態様では、本発明は、目的の標的ＤＮＡ配列を捕捉する方法であって、（ａ）前記試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ−ｇＮＡ複合体と接触させ、それによって目的の領域に隣接する部位で複数のニック入りのＤＮＡを生成するステップであって、前記ｇＮＡが、前記ＤＮＡ配列のサブセット中の目的の前記領域に隣接する目的の標的化部位に相補的である、ステップ；（ｂ）６５℃まで加熱して、近接するニックに二本鎖切断を起こすステップ；（ｃ）これらの二本鎖切断を耐熱性のリガーゼと接触させ、それによってこれらの部位にのみアダプター配列のライゲーションを可能にするステップ；および（ｄ）これらの３ステップを反復して、第２のアダプターを目的の前記領域の反対側に置き、こうして目的の前記領域の濃縮を可能にするステップを含む、方法を提供する。一つの実施形態では、前記ｇＮＡがｇＲＮＡである。一つの実施形態では、前記ｇＮＡがｇＤＮＡである。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼがＣＡＳクラスＩタイプＩニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩタイプＩＩＩニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩタイプＩＶニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩＩタイプＩＩニッカーゼおよびＣＡＳクラスＩＩタイプＶニッカーゼからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼがＣａｓ９ニッカーゼ、Ｃｐｆ１ニッカーゼ、Ｃａｓ３ニッカーゼ、Ｃａｓ８ａ−ｃニッカーゼ、Ｃａｓ１０ニッカーゼ、Ｃｓｅ１ニッカーゼ、Ｃｓｙ１ニッカーゼ、Ｃｓｎ２ニッカーゼ、Ｃａｓ４ニッカーゼ、Ｃｓｍ２ニッカーゼ、Ｃｍ５ニッカーゼ、Ｃｓｆ１ニッカーゼ、Ｃ２Ｃ２ニッカーゼおよびＮｇＡｇｏニッカーゼからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡである。一つの実施形態では、前記二本鎖ＤＮＡがゲノムＤＮＡからのものである。一つの実施形態では、前記ゲノムＤＮＡがヒトのものである。一つの実施形態では、前記ＤＮＡ配列が２０ｂｐから５０００ｂｐの長さである。一つの実施形態では、目的の前記標的化部位が一塩基多型（ＳＮＰ）、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異または調節領域である。一つの実施形態では、目的の前記標的化部位が前記試料中の全ＤＮＡの５０％未満を占める。一つの実施形態では、前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料から得られる。一つの実施形態では、前記二本鎖切断を接触させることが可能な前記リガーゼが耐熱性の５’Ａｐｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼまたはＴ４  ＲＮＡリガーゼである。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが前記ＤＮＡ配列の５’末端にニックを入れる。一つの実施形態では、メチル化ＤＮＡを切断することができる酵素は、ＤｐｎＩである。
【００１１】
一態様では、本発明は、目的の配列について試料を濃縮する方法であって、（ａ）目的の配列および枯渇のための標的化配列を含む試料を提供するステップであって、目的の前記配列は前記試料の５０％未満を構成する、ステップ；および（ｂ）複数の核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼ−ｇＲＮＡ複合体または複数の核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼ−ｇＤＮＡ複合体と前記試料を接触させるステップであって、前記ｇＲＮＡおよびｇＤＮＡは前記標的化配列に相補的であり、それによって前記標的化配列が切断される、ステップを含む、方法を提供する。一つの実施形態では、方法は、目的の前記配列および枯渇のための前記標的化配列を前記試料から抽出するステップをさらに含む。一つの実施形態では、方法は、抽出される前記配列を断片化するステップをさらに含む。一つの実施形態では、切断される前記標的化配列がサイズ排除によって除去される。一つの実施形態では、前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料のいずれか１つである。一つの実施形態では、前記試料が、枯渇のために標的化される宿主核酸配列および目的の非宿主核酸配列を含む。一つの実施形態では、前記非宿主核酸配列が微生物の核酸配列を含む。一つの実施形態では、前記微生物核酸配列が、細菌、ウイルスまたは真核寄生生物の核酸配列である。一つの実施形態では、前記ｇＲＮＡおよびｇＤＮＡが、リボソームＲＮＡ配列、スプライシングされた転写物、スプライシングされていない転写物、イントロン、エクソンまたは非コードＲＮＡに相補的である。一つの実施形態では、抽出される前記核酸が、一本鎖または二本鎖のＲＮＡを含む。一つの実施形態では、抽出される前記核酸が、一本鎖または二本鎖のＤＮＡを含む。一つの実施形態では、目的の前記配列が抽出される前記核酸の１０％未満を構成する。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼがＣ２ｃ２を含む。一つの実施形態では、前記Ｃ２ｃ２が触媒活性がない。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＮｇＡｇｏを含む。一つの実施形態では、前記ＮｇＡｇｏが触媒活性がない。一つの実施形態では、前記試料が、全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織および生検材料から選択される。
【００１２】
別の態様では、本発明は、試料を濃縮する方法であって、（ａ）宿主核酸および非宿主核酸を含む試料を提供するステップ；（ｂ）複数の核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼ−ｇＲＮＡ複合体または複数の核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼ−ｇＤＮＡ複合体と前記試料を接触させるステップであって、前記ｇＲＮＡおよびｇＤＮＡは前記宿主核酸の標的化部位に相補的である、ステップ、ならびに（ｃ）非宿主核酸について前記試料を濃縮するステップを含む、方法。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼがＣ２ｃ２を含む。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼが触媒活性がないＣ２ｃ２を含む。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＮｇＡｇｏを含む。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼが触媒活性がないＮｇＡｇｏを含む。一つの実施形態では、前記宿主が、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、サル、イヌ、ネコ、スナネズミ、トリ、マウスおよびラットからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記非宿主が原核生物である。一つの実施形態では、前記非宿主が、真核生物、ウイルス、細菌、真菌および原生動物からなる群より選択される。一つの実施形態では、アダプターにライゲートされた前記宿主核酸および非宿主核酸が５０ｂｐから１０００ｂｐの長さの範囲内である。一つの実施形態では、前記非宿主核酸が前記試料中の全核酸の５０％未満を構成する。一つの実施形態では、前記試料が生物学的試料、臨床試料、法医学試料または環境試料のいずれか１つである。一つの実施形態では、ステップ（ｃ）がステップ（ｂ）の生成物をｃＤＮＡに逆転写することを含む。一つの実施形態では、ステップ（ｃ）がサイズ排除によって前記宿主核酸を除去することを含む。一つの実施形態では、ステップ（ｃ）がビオチンの使用によって前記宿主核酸を除去することを含む。一つの実施形態では、前記試料が、全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織および生検材料から選択される。
【００１３】
別の態様では、本発明は、標識された触媒活性がない核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼタンパク質を使用して、ＲＮＡ試料中の標的について濃縮するために、核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼを使用する方法を提供する。一部の実施形態では、核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼタンパク質は血液ＲＮＡ試料中のＨＩＶ  ＲＮＡを標的にし、宿主ＲＮＡは洗い流される。一部の実施形態では、核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃ２ｃ２である。
【００１４】
別の態様では、本発明は、核酸断片、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ−ｇＮＡ複合体および標識ヌクレオチドを含む組成物を提供する。一つの実施形態では、前記核酸はＤＮＡを含む。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、ＣＡＳクラスＩタイプＩニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩタイプＩＩＩニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩタイプＩＶニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩＩタイプＩＩニッカーゼおよびＣＡＳクラスＩＩタイプＶニッカーゼからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃｐｆ１ニッカーゼ、Ｃａｓ３ニッカーゼ、Ｃａｓ８ａ−ｃニッカーゼ、Ｃａｓ１０ニッカーゼ、Ｃｓｅ１ニッカーゼ、Ｃｓｙ１ニッカーゼ、Ｃｓｎ２ニッカーゼ、Ｃａｓ４ニッカーゼ、Ｃｓｍ２ニッカーゼ、Ｃｍ５ニッカーゼ、Ｃｓｆ１ニッカーゼ、Ｃ２Ｃ２ニッカーゼおよびＮｇＡｇｏニッカーゼからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記ｇＮＡがｇＲＮＡである。一つの実施形態では、前記ｇＮＡがｇＤＮＡである。一つの実施形態では、前記核酸断片がＤＮＡを含む。一つの実施形態では、前記核酸断片がＲＮＡを含む。一つの実施形態では、前記ヌクレオチドがビオチンで標識される。一つの実施形態では、前記ヌクレオチドが抗体コンジュゲート対の一部である。
【００１５】
別の態様では、本発明は、核酸断片および触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体を含む組成物であって、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼはトランスポザーゼに融合されている、組成物を提供する。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが、不活性なＣＡＳクラスＩタイプＩ、不活性なＣＡＳクラスＩタイプＩＩＩ、不活性なＣＡＳクラスＩタイプＩＶ、不活性なＣＡＳクラスＩＩタイプＩＩおよび不活性なＣＡＳクラスＩＩタイプＶからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが、ｄＣａｓ９、ｄＣｐｆ１、ｄＣａｓ３、ｄＣａｓ８ａ−ｃ、ｄＣａｓ１０、ｄＣｓｅ１、ｄＣｓｙ１、ｄＣｓｎ２、ｄＣａｓ４、ｄＣｓｍ２、ｄＣｍ５、ｄＣｓｆ１、ｄＣ２Ｃ２およびｄＮｇＡｇｏからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記ｇＮＡがｇＲＮＡである。一つの実施形態では、前記ｇＮＡがｇＤＮＡである。一つの実施形態では、前記核酸断片がＤＮＡを含む。一つの実施形態では、前記核酸断片がＲＮＡを含む。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが前記トランスポザーゼのＮ末端に融合されている。一つの実施形態では、前記触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼが前記トランスポザーゼのＣ末端に融合されている。一つの実施形態では、組成物は、ＤＮＡ断片およびｄＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を含み、ｄＣａｓ９はトランスポゾンに融合されている。
【００１６】
一態様では、本発明は、メチル化ヌクレオチドを含む核酸断片、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ−ｇＮＡ複合体および非メチル化ヌクレオチドを含む組成物を提供する。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、ＣＡＳクラスＩタイプＩニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩタイプＩＩＩニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩタイプＩＶニッカーゼ、ＣＡＳクラスＩＩタイプＩＩニッカーゼおよびＣＡＳクラスＩＩタイプＶニッカーゼからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼが、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃｐｆ１ニッカーゼ、Ｃａｓ３ニッカーゼ、Ｃａｓ８ａ−ｃニッカーゼ、Ｃａｓ１０ニッカーゼ、Ｃｓｅ１ニッカーゼ、Ｃｓｙ１ニッカーゼ、Ｃｓｎ２ニッカーゼ、Ｃａｓ４ニッカーゼ、Ｃｓｍ２ニッカーゼ、Ｃｍ５ニッカーゼ、Ｃｓｆ１ニッカーゼ、Ｃ２Ｃ２ニッカーゼおよびＮｇＡｇｏニッカーゼからなる群より選択される。一つの実施形態では、前記ｇＮＡがｇＲＮＡである。一つの実施形態では、前記ｇＮＡがｇＤＮＡである。一つの実施形態では、前記核酸断片がＤＮＡを含む。一つの実施形態では、前記核酸断片がＲＮＡを含む。一つの実施形態では、前記ヌクレオチドがビオチンで標識される。一つの実施形態では、前記ヌクレオチドが抗体コンジュゲート対の一部である。一つの実施形態では、組成物は、メチル化ヌクレオチドを含むＤＮＡ断片、ニッカーゼであるＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体および非メチル化ヌクレオチドを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ヒトゲノムＤＮＡのライブラリーからの標的核酸の捕捉のための第１のプロトコールを図示する。
【００１８】
【図２】図２は、核酸混合物からの標的核酸（例えば、ＤＮＡ）の捕捉のためのプロトコールをさらに図示する。標的核酸は核酸ガイド化ヌクレアーゼで切断され、その後、新たに利用可能な平滑末端にアダプターがライゲートされる。
【００１９】
【図３】図３は、Ｃａｓ９切断と、続くアダプターのライゲーションが、標的ＤＮＡの特異的増幅を可能にすることを図示する。
【００２０】
【図４】図４は、増幅されたＤＮＡの配列決定を行った後、アダプターのライゲーションがガイドＲＮＡによって指定された位置だけで起こったことを図示する。
【００２１】
【図５】図５は、図１の方法が、いずれの所与のライブラリーにおいても過少に示されるＤＮＡを効率的に増幅することを図示する。
【００２２】
【図６】図６は、捕捉のための第２のプロトコールを図示する：さらなる捕捉および精製を可能にする、標的核酸（例えば、ＤＮＡ）を標識する核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼの使用。
【００２３】
【図７】図７は、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼの代わりとして制限ニッカーゼを使用する原理実験の証明を図示する。
【００２４】
【図８】図８は、図７に図示する実験（Ｃａｓ９−ニッカーゼを使用する）のための、概ね５０倍の試験ＤＮＡの濃縮を図示する。
【００２５】
【図９】図９は、捕捉のための第３のプロトコールを図示する：特異的ＳＮＰの濃縮を可能にする、ヒトゲノムライブラリーにアダプターを挿入するための触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−トランスポザーゼ融合物の使用。
【００２６】
【図１０】図１０は、捕捉のための第４のプロトコールを図示する：目的領域の濃縮を可能にする、核酸ガイド化ヌクレアーゼによる以降の断片化から標的化部位を保護するための不活性な核酸ガイド化ヌクレアーゼの使用。
【００２７】
【図１１】図１１は、捕捉のための第５のプロトコールを図示する：メチル化されていないＤＮＡでメチル化ＤＮＡを置き換えることによって、任意の標的化領域、例えばＳＮＰまたはＳＴＲを、例えばヒトゲノムＤＮＡから保護し、次に濃縮するための、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼの使用。
【００２８】
【図１２】図１２は、第５のプロトコールにおける試験ＤＮＡのメチル化が、それをＤｐｎＩ媒介切断に感受性にすることを図示する。
【００２９】
【図１３】図１３は、捕捉のための第６のプロトコールを図示する：アダプターの３’一本鎖ライゲーションおよび以降の濃縮を可能にする、目的領域を正確に示す２つの二本鎖切断を導入するための、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼの使用。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
定義
本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、この発明が属する分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるそれらに類似するまたは同等であるいかなる方法および材料も本発明の実施または試験で使用することができるが、好ましい方法および材料を記載する。
【００３１】
本明細書で提供される見出しは、本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではない。したがって、これ以降に定義される用語は、明細書全体を参照することによってより詳細に定義される。
【００３２】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、この発明が属する分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４年）およびＨａｌｅおよびＭａｒｋｈａｍ、ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、Ｎ．Ｙ．（１９９１年）は、本明細書で使用される用語の多くの一般的意味を当業者に提供する。なお、明瞭性および参照の容易さのために、特定の用語が下で定義される。
【００３３】
数値範囲は、その範囲を規定する数を含む。
【００３４】
本明細書で使用する用語「試料」は、その限りではないが一般的に、１つまたは複数の目的分析物を含有する液状の材料または材料の混合物に関する。
【００３５】
本明細書で使用する用語「核酸試料」は、核酸を含有する試料を表す。本明細書で使用される核酸試料は、それらが配列を有する複数の異なる分子を含有するという点で、複合体であってもよい。哺乳動物からのゲノムＤＮＡは、一種の複合試料である。複合試料は、１０４、１０５、１０６または１０７個より多くの異なる核酸分子を有することができる。ＤＮＡ標的は、任意の供給源、例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは人工ＤＮＡ構築物を起源とすることができる。核酸を含有する任意の試料、例えば組織培養細胞から作製されるゲノムＤＮＡまたは組織試料を、本明細書で用いることができる。
【００３６】
用語「ヌクレオチド」は、公知のプリンおよびピリミジン塩基だけでなく、改変された他の複素環塩基も含有する部分を含むものである。そのような改変には、メチル化されたプリンまたはピリミジン、アシル化されたプリンまたはピリミジン、アルキル化されたリボースまたは他の複素環が含まれる。さらに、用語「ヌクレオチド」にはハプテンまたは蛍光標識を含有する部分が含まれ、従来のリボースおよびデオキシリボース糖だけでなく、他の糖も同様に含有することができる。改変ヌクレオシドまたはヌクレオチドには、例えば、ヒドロキシル基の１つまたは複数がハロゲン原子または脂肪族基で置き換えられるか、エーテル、アミンなどとして官能基化される、糖部分の改変も含まれる。
【００３７】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書において互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドで構成される、任意の長さ、例えば、約２塩基より大きい、約１０塩基より大きい、約１００塩基より大きい、約５００塩基より大きい、１０００塩基より大きい、最高約１０，０００またはそれより多くの塩基の核酸ポリマーを記載するために使用され、酵素的または合成的に生成することができ（例えば、米国特許第５，９４８，９０２号およびその中の引用文献に記載されるＰＮＡ）、それは２つの天然に存在する核酸のそれに類似した配列特異的方法で天然に存在する核酸とハイブリダイズすることができ、例えば、ワトソン−クリック型塩基対形成相互作用に関与することができる。天然に存在するヌクレオチドには、グアニン、シトシン、アデニンおよびチミン（それぞれＧ、Ｃ、ＡおよびＴ）が含まれる。ＤＮＡおよびＲＮＡはデオキシリボースおよびリボース糖骨格をそれぞれ有するが、ＰＮＡの骨格は、ペプチド結合によって連結されている反復するＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位で構成される。ＰＮＡでは、様々なプリンおよびピリミジン塩基がメチレンカルボニル結合によって骨格に連結される。しばしばアクセス不可能なＲＮＡと呼ばれるロックト核酸（ＬＮＡ）は、改変ＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’酸素および４’炭素を接続する余分の橋で改変される。橋は３’−エンド（北（ｎｏｒｔｈ））コンフォメーションでリボースを「ロック」し、それはＡ形二重鎖でしばしば見出される。所望のときはいつでも、ＬＮＡヌクレオチドがオリゴヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡ残基と混合していてもよい。用語「非構造化核酸」または「ＵＮＡ」は、低い安定性で互いに結合する非天然ヌクレオチドを含有する核酸である。例えば、非構造化核酸は、Ｇ’残基およびＣ’残基を含有することができ、ここで、これらの残基は、低い安定性で互いと塩基対を形成するが、天然に存在するＣおよびＧの残基とそれぞれ塩基対を形成する能力を保持する、ＧおよびＣの天然に存在しない形、すなわち類似体に対応する。非構造化核酸は米国特許出願公開第２００５０２３３３４０号に記載され、それはＵＮＡの開示のために参照により本明細書に組み込まれる。
【００３８】
本明細書で使用するように、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドの一本鎖多量体を表す。
【００３９】
特に明記しない限り、核酸は左から右に５’から３’の向きで記述される。アミノ酸配列は、左から右にそれぞれアミノからカルボキシの向きで記述される。
【００４０】
本明細書で使用するように、用語「切断する」は、二本鎖ＤＮＡ分子の両方の鎖における２つの隣接したヌクレオチドの間のホスホジエステル結合を切断し、それによってＤＮＡ分子において二本鎖切断をもたらす反応を指す。
【００４１】
本明細書で使用するように、用語「切断部位」は、二本鎖ＤＮＡ分子が切断された部位を指す。
【００４２】
「核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体」は、核酸ガイド化ヌクレアーゼタンパク質とガイド核酸（ｇＮＡ、例えばｇＲＮＡまたはｇＤＮＡ）とを含む複合体を指す。例えば、「Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体」は、Ｃａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む複合体を指す。核酸ガイド化ヌクレアーゼは、野生型核酸ガイド化ヌクレアーゼ、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼまたは核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼを非限定的に含む、任意のタイプの核酸ガイド化ヌクレアーゼであってよい。
【００４３】
用語「核酸ガイド化ヌクレアーゼ関連ガイドＮＡ」は、ガイド核酸（ガイドＮＡ）を指す。核酸ガイド化ヌクレアーゼ関連ガイドＮＡは、単離された核酸として、または核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体、例えばＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の一部として存在することができる。
【００４４】
用語「捕捉」および「濃縮」は、本明細書で互換的に使用され、目的の配列、目的の標的化部位、目的外の配列または目的外の標的化部位を含有する核酸領域を選択的に単離するプロセスを指す。
【００４５】
用語「ハイブリダイゼーション」は、当技術分野で公知のように、核酸鎖が塩基対形成を通して相補鎖と結合するプロセスを指す。その２つの配列が中等度から高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の下でお互いと特異的にハイブリダイズするならば、核酸は参照核酸配列と「選択的にハイブリダイゼーションが可能である」と考えられる。中等度および高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は公知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ１９９５年およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、２００１年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照）。高ストリンジェンシー条件の１つの例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性担体ＤＮＡ中で約４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて、室温での２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳにおける２回の洗浄と４２℃での０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳにおける２回の追加の洗浄を含む。
【００４６】
本明細書で使用する用語「二重鎖」または「二重鎖の（ｄｕｐｌｅｘｅｄ）」は、塩基対を形成した、すなわち一緒にハイブリダイズした２つの相補的ポリヌクレオチドを記載する。
【００４７】
本明細書で使用するように用語「増幅する」は、鋳型として標的核酸を使用して標的核酸の１つまたは複数のコピーを生成することを指す。
【００４８】
本明細書で使用するように、用語「ゲノム領域」は、ゲノム、例えば動物または植物のゲノム、例えばヒト、サル、ラット、魚類または昆虫または植物のゲノムの領域を指す。ある特定の場合には、本明細書に記載される方法で使用されるオリゴヌクレオチドは、参照ゲノム領域、すなわち、公知のヌクレオチド配列のゲノム領域、例えば、その配列は例えばＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベースまたは他のデータベースに寄託される染色体領域を使用して設計することができる。
【００４９】
本明細書で使用するように、用語「ゲノム配列」は、ゲノムに存在する配列を指す。ＲＮＡはゲノムから転写されるので、この用語は、生物体の核ゲノムに存在する配列、ならびにそのようなゲノムから転写されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のｃＤＮＡコピーに存在する配列を包含する。
【００５０】
本明細書で使用するように、用語「ゲノム断片」は、ゲノム、例えば動物または植物のゲノム、例えばヒト、サル、ラット、魚類または昆虫または植物のゲノムの領域を指す。ゲノム断片は、染色体全体または染色体の断片であってもよい。ゲノム断片は、アダプターでライゲートされても（この場合、それは断片の片方もしくは両方の末端に、または分子の少なくとも５’末端にライゲートされたアダプターを有する）、またはアダプターでライゲートされなくてもよい。
【００５１】
ある特定の場合には、本明細書に記載される方法で使用されるオリゴヌクレオチドは、参照ゲノム領域、すなわち、公知のヌクレオチド配列のゲノム領域、例えば、その配列は例えばＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベースまたは他のデータベースに寄託される染色体領域を使用して設計することができる。そのようなオリゴヌクレオチドは、試験ゲノムを含有する試料を使用するアッセイにおいて用いることができ、ここで試験ゲノムはオリゴヌクレオチドのための結合部位を含有する。
【００５２】
本明細書で使用するように、用語「ライゲートする」は、第１のＤＮＡ分子の５’末端の末端ヌクレオチドと第２のＤＮＡ分子の３’末端の末端ヌクレオチドとの、酵素によって触媒される結合を指す。
【００５３】
２つの核酸が「相補的である」場合は、核酸のうち１つの各塩基は他の核酸の中の対応するヌクレオチドと塩基対を形成する。用語「相補的な」および「完全に相補的な」は、本明細書において同義的に使用される。
【００５４】
本明細書で使用するように、用語「分離する」は、２つのエレメントの（例えば、サイズまたは親和性等による）物理的分離、ならびに１つのエレメントが分解し、他はインタクトなまま残ることを指す。例えば、切断された標的化配列を含む核酸を分離するために、サイズ排除を用いることができる。
【００５５】
細胞では、ＤＮＡは通常二本鎖の形態で存在し、このように、本明細書において「トップ」および「ボトム」鎖と呼ばれる２つの相補的な核酸鎖を有する。ある特定の場合には、染色体領域の相補鎖は、「プラス」および「マイナス」鎖、「第１」および「第２」の鎖、「コード」および「非コード」鎖、「ワトソン」および「クリック」鎖または「センス」および「アンチセンス」鎖と呼ぶことができる。トップまたはボトム鎖への鎖の割り当ては恣意的であり、いかなる特定の配向、機能または構造も意味しない。それらが共有結合するまで、第１および第２の鎖は別個の分子である。記載の容易さのために、トップおよびボトム鎖が共有結合している二本鎖核酸の「トップ」および「ボトム」鎖は、「トップ」および「ボトム」鎖としてなお記載される。言い換えると、この開示のために、二本鎖ＤＮＡのトップおよびボトム鎖は分離された分子である必要はない。いくつかの例示的な哺乳動物の染色体領域（例えば、ＢＡＣ、アセンブリー、染色体等）の第１の鎖のヌクレオチド配列が公知であり、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベースに見出すことができる。
【００５６】
本明細書で使用する用語「トップ鎖」は、核酸の両方の鎖でなく核酸のいずれかの鎖を指す。オリゴヌクレオチドまたはプライマーが「トップ鎖だけに」結合またはアニールするとき、それは１つの鎖だけに結合し、他には結合しない。本明細書で使用する用語「ボトム鎖」は、「トップ鎖」に相補的である鎖を指す。オリゴヌクレオチドが「１本の鎖だけに」結合またはアニールするとき、それは１本の鎖だけ、例えば第１または第２の鎖だけに結合し、他の鎖には結合しない。オリゴヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡの両方の鎖に結合またはアニールする場合は、オリゴヌクレオチドは２つの領域を有することができ、第１の領域は二本鎖ＤＮＡのトップ鎖とハイブリダイズし、第２の領域は二本鎖ＤＮＡのボトム鎖とハイブリダイズする。
【００５７】
用語「二本鎖ＤＮＡ分子」は、トップおよびボトム鎖が共有結合していない二本鎖ＤＮＡ分子、ならびにトップおよびボトム鎖が共有結合している二本鎖ＤＮＡ分子の両方を指す。二本鎖ＤＮＡのトップおよびボトム鎖は、ワトソン−クリック相互作用により互いと塩基対を形成する。
【００５８】
本明細書で使用するように、用語「変性する」は、適する変性条件に二重鎖を置くことによる、核酸二重鎖の塩基対の少なくとも一部の分離を指す。変性条件は、当技術分野で周知である。一実施形態では、核酸二重鎖を変性させるために、二重鎖を二重鎖のＴｍより上の温度に曝露させ、それによって二重鎖の１本の鎖を他から解放することができる。ある特定の実施形態では、適する時間（例えば、少なくとも３０秒から３０分まで）、少なくとも９０℃の温度にそれを曝露させることによって、核酸を変性させることができる。ある特定の実施形態では、二重鎖の塩基対を完全に分離するために、完全変性条件を使用することができる。他の実施形態では、二重鎖のある特定の部分の塩基対を分離するために（例えば、Ａ−Ｔ塩基対が濃縮された領域は分離することができ、Ｇ−Ｃ塩基対が濃縮された領域は対を形成したままでいることができる）、部分的変性条件（例えば、完全変性条件より低い温度による）を使用することができる。核酸は、化学的に変性させることもできる（例えば、尿素またはＮａＯＨを使用する）。
【００５９】
本明細書で使用するように、用語「遺伝子型決定」は、核酸配列の任意のタイプの分析を指し、配列決定、多型（ＳＮＰ）分析および再配列を同定するための分析を含む。
【００６０】
本明細書で使用するように、用語「配列決定」は、ポリヌクレオチドの連続するヌクレオチドの同一性が得られる方法を指す。
【００６１】
用語「次世代配列決定」は、いわゆる並行化された合成による配列決定またはライゲーションによる配列決定プラットホーム、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓおよびＲｏｃｈｅ等によって現在用いられるものを指す。次世代配列決定方法は、ナノポア配列決定方法または電子検出に基づく方法、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって商品化されたＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ技術を含むこともできる。
【００６２】
用語「相補的ＤＮＡ」またはｃＤＮＡは、ＲＮＡの（ランダムヘキサマーまたはオリゴｄＴプライマーなどのプライマーを使用した）逆転写と、続くＲＮａｓｅＨによるＲＮＡの消化およびＤＮＡポリメラーゼによる合成による第２の鎖の合成によってＲＮＡ試料から生成された二本鎖ＤＮＡ試料を指す。
【００６３】
用語「ＲＮＡプロモーターアダプター」は、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ、例えば、バクテリオファージＴ３、Ｔ７、ＳＰ６などからのＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含有するアダプターである。
【００６４】
用語の他の定義は、明細書全体で出現することがある。
【００６５】
本発明の例示的方法
本明細書に記載されるように、本発明は、核酸の捕捉のための例示的なプロトコールおよびこれらのプロトコールで使用するための組成物を提供する。例示的なプロトコールは、それぞれ図１、６、９、１０、１１および１３で、ならびに実施例のセクションで例示される。全体で、様々な使用が企図される。このセクションで言及する特定の用語は、以降のセクションにおいてより詳細に記載される。
【００６６】
一実施形態では、本発明は、図１〜５に提供される捕捉方法（プロトコール１として表される）を提供する。この実施形態では、この方法は標的核酸配列を捕捉するために使用される。図１に関しては、本方法は、抽出プロトコール１０１（例えば、ＤＮＡ抽出プロトコール）に供されて、＞９９％の標的外の配列および＜１％の標的配列を含む試料１０２をもたらす試料またはライブラリー１００を提供するステップを含む。試料はライブラリー構築プロトコール１０３に供されて、配列決定指数化アダプター１０４を含む核酸ライブラリーをもたらし、アダプターにライゲートされた複数の核酸をもたらし、ここで、核酸は一方の末端で第１のアダプターにライゲートされており、他方の末端で第２のアダプターにライゲートされている。標的特異的ガイドＮＡ（例えばｇＲＮＡ）のライブラリーを生成するために、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター１１１、特異的塩基対領域１１２（例えば、２０塩基対領域）、および核酸ガイド化ヌクレアーゼ１１３のためのステムループ結合部位１１３を各々含む標的特異的ｇＮＡ前駆体１１０のライブラリーをｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写１１４に供し、標的特異的ガイドＲＮＡ１１５のライブラリーを得た。核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体のライブラリーを与えるために、標的特異的ガイドＮＡのライブラリーを、核酸ガイド化ヌクレアーゼタンパク質１１６と次に組み合わせた。核酸ガイド化ヌクレアーゼ−が対応する標的核酸配列を切断し、他の核酸を未切断のままにするために１１７、核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体を核酸ライブラリーと次に組み合わせた。第２のアダプター１１８を付加し、切断された核酸１１９の５’リン酸化平滑末端に特異的にライゲートした。これは、下流への適用、例えば、アダプターに特異的なＰＣＲ１２０を使用して、一方の末端に第１または第２のアダプターを含み、他方の末端に第３のアダプターを含む核酸断片を増幅することを可能にする。
【００６７】
プロトコール１の例示的描写では、図１に関して、この方法は標的核酸配列を捕捉するために使用される。本方法は、アダプターにライゲートされた複数の核酸を含む試料またはライブラリーを提供するステップであって、核酸は一方の末端で第１のアダプターにライゲートされており、他方の末端で第２のアダプターにライゲートされている、ステップを含む。この後に、試料を複数のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と接触させ、ここで、ｇＲＮＡは核酸のサブセットに含有される目的の標的化部位に相補的である。接触させるステップは目的の標的化部位を切断し、それによって、一方の末端で第１または第２のアダプターにライゲートされ、他方の末端にはアダプターなしの複数の核酸断片を生成する。このステップに続いて、結果として生じる複数の核酸断片を第３のアダプターにライゲートし、それによって、一方の末端で第１または第２のアダプターに、他方の末端で第３のアダプターにライゲートした複数の核酸断片を生成する。これは、下流への適用、例えば、アダプターに特異的なＰＣＲを使用して、一方の末端に第１または第２のアダプターを含み、他方の末端に第３のアダプターを含む核酸断片を増幅することを可能にする。
【００６８】
一実施形態では、本発明は、図６〜８に提供される捕捉方法（プロトコール２として表される）を提供する。この実施形態では、本方法は、目的の標的化部位に標識ヌクレオチドを導入するために使用される。本方法は、複数の二本鎖核酸断片６０１（例えば、二本鎖ＤＮＡ）を含む試料を提供するステップ；試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ−ｇＮＡ複合体と接触させるステップを含む。ニッカーゼ核酸ガイド化ヌクレアーゼ６０３は、標的特異的ガイドＮＡ６０４によって誘導され、ここで、ｇＮＡは核酸断片中の目的の標的化部位に相補的であり、それによって目的の標的化部位で複数のニック入りの核酸断片を生成する。ニッカーゼは、標的配列６０５にニックを入れるために使用される。ニッカーゼ−核酸ガイド化ヌクレアーゼは、標的配列で切断する。単一鎖の切れ目（ニック）は、ニックの下流のＤＮＡをビオチン標識ＤＮＡ６０６で置き換えるために使用することができる、ＤＮＡポリメラーゼＩのための基質である。
【００６９】
プロトコール２の例示的な描写では、図６に関し、本方法は、目的の標的化部位に標識ヌクレオチドを導入するために使用される。本方法は、複数の核酸断片を含む試料を提供するステップ；試料を複数のＣａｓ９ニッカーゼ−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップであって、ｇＲＮＡは核酸断片中の目的の標的化部位に相補的であり、それによって目的の標的化部位で複数のニック入りの核酸断片を生成する、ステップ；続いて、複数のニック入りの核酸断片をニック入りの部位で核酸合成を開始することが可能な酵素および標識ヌクレオチドと接触させ、それによって目的の標的化部位において標識ヌクレオチドを含む複数の核酸断片を生成するステップを含む。
【００７０】
一実施形態では、本発明は、図９に提供される捕捉方法（プロトコール３として表される）を提供する。この実施形態では、本方法は目的の標的核酸配列９０１を捕捉するために使用される。本方法は、アダプターにライゲートされた複数の核酸９０２を含む試料を先ず提供するステップであって、核酸は一方の末端で第１のアダプターにライゲートされており、他方の末端で第２のアダプターにライゲートされている、ステップを含む。この後に、試料を複数の触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体と接触させるステップが続き、ここで、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼはトランスポザーゼ９０３に融合し、ｇＮＡ９０４は核酸のサブセットに含有される目的の標的化部位に相補的であり、ここで、一方の末端に第１または第２のアダプターを含み、他方の末端に第３のアダプターを含む複数の核酸断片９０６を生成するために、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡトランスポザーゼ複合体に、複数の第３のアダプター９０５を負荷する。これらの断片は、アダプター配列を使用して次に増幅することができ９０７、次に配列決定をすることができる９０８。
【００７１】
プロトコール３の例示的描写では、図９に関して、本方法は目的の標的核酸配列を捕捉するために使用される。本方法は、アダプターにライゲートされた複数の核酸を含む試料を先ず提供するステップであって、核酸は一方の末端で第１のアダプターにライゲートされており、他方の末端で第２のアダプターにライゲートされている、ステップを含む。この後に、試料を複数のｄＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と接触させ、ここで、ｄＣａｓ９はトランスポザーゼに融合されており、ｇＲＮＡは核酸のサブセットに含有される目的の標的化部位に相補的であり、ここで、一方の末端に第１または第２のアダプターを含み、他方の末端に第３のアダプターを含む複数の核酸断片を生成するために、ｄＣａｓ９−ｇＲＮＡトランスポザーゼ複合体に、複数の第３のアダプターを負荷する。
【００７２】
一実施形態では、本発明は、例えば図１０に提供される捕捉方法（プロトコール４として表される）を提供する。この実施形態では、本方法は、目的の標的核酸配列１００１を捕捉するために使用される。本方法は、アダプターにライゲートされた複数の核酸１００２を含む試料を先ず提供するステップであって、核酸は５’末端および３’末端でアダプターにライゲートされている、ステップを含む。本方法は、試料を複数の触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体１００３と接触させるステップを次に含み、ここで、ｇＮＡ１００４は核酸のサブセットに含有される目的の標的化部位に相補的であり、それによって、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体１００５に結合している、５’および３’末端でアダプターにライゲートされた複数の核酸を生成する。この後に、試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体１００６と接触させるステップが続き、ここで、ｇＮＡ１００７は核酸の目的の標的化部位と目的外の標的化部位の両方に相補的であり、それによって、５’または３’末端のうち一方のみでアダプターにライゲートされた、目的外の核酸配列を含む複数の核酸断片１００８を生成する。この方法では、第２の接触ステップの場合、複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体と接触させるステップは、ステップ（ｂ）の触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体に結合した、５’および３’末端でアダプターにライゲートされた複数の核酸を置換しない。
【００７３】
プロトコール４の例示的描写では、図１０に関して、本方法は目的の標的核酸配列を捕捉するために使用される。本方法は、アダプターにライゲートされた複数の核酸を含む試料を先ず提供するステップであって、核酸は５’末端および３’末端でアダプターにライゲートされている、ステップを含む。本方法は、試料を複数の不活性な核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体（例えば、ｄＣａｓ９−ｇＲＮＡ）と接触させるステップを次に含み、ここで、ｇＮＡは核酸のサブセットに含有される目的の標的化部位に相補的であり、それによって、不活性な核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体（例えば、ｄＣＡＳ９−ｇＲＮＡ複合体）に結合している、５’および３’末端でアダプターにライゲートされた複数の核酸を生成する。この後に、試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体（例えば、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体）と接触させるステップが続き、ここで、ｇＮＡは核酸の目的の標的化部位と目的外の標的化部位の両方に相補的であり、それによって、５’または３’末端のうち一方のみでアダプターにライゲートされた、目的外の核酸配列を含む複数の核酸断片を生成する。この方法では、第２の接触ステップで、複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体（例えば、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体）と接触させるステップは、ステップ（ｂ）の不活性な核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体（例えば、ｄＣＡＳ９−ｇＲＮＡ複合体）に結合している、５’および３’末端でアダプターにライゲートされた複数の核酸を置換しない。
【００７４】
一実施形態では、本発明は、例えば図１１および図１２に提供される捕捉方法（プロトコール５として表される）を提供する。この実施形態では、本方法は、目的の標的核酸配列１１０１を捕捉するために使用される。本方法は、複数の配列１１０２を含む試料を先ず提供するステップであって、配列はメチル化ヌクレオチド（例えば、Ｄａｍメチルトランスフェラーゼで処理される）を含み、配列は５’および３’末端でアダプターにライゲートされている、ステップを含む。本方法は、試料を複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ−ｇＮＡ複合体１１０３と先ず接触させるステップを次に含み、ここで、ｇＮＡ１１０４は配列のサブセットの目的の標的化部位に相補的であり、それによって目的の標的化部位で複数のニック入りの核酸配列１１０５を生成し、核酸配列は、５’および３’末端でアダプターにライゲートされている。核酸がＤＮＡである場合、単一鎖の切れ目（ニック）は、例えば、ニックの下流のＤＮＡをメチル化されていないＤＮＡで置き換える、ＤＮＡポリメラーゼＩの基質であってよい。この後に、試料をニック部位でＤＮＡ合成を開始することが可能な酵素およびメチル化されていないヌクレオチドと次に接触させ、それによって、目的の標的化部位でメチル化されていないヌクレオチド１１０６を含む複数のＤＮＡを生成することができ、ここで、ＤＮＡ配列は、５’および３’末端でアダプターにライゲートされている。この後に、メチル化ＤＮＡを切断することが可能な酵素（例えば、ＤｐｎＩ）と試料を接触させ１１０７、それによってメチル化ＤＮＡを含む複数のＤＮＡ断片を生成し、ここで、メチル化ＤＮＡを含む複数のＤＮＡ断片は、５’および３’末端のうち一方のみでアダプターにライゲートされている。残りのインタクトな核酸は増幅させて、配列決定をすることができる１１０８。図１２は、例えば、このプロトコールによって実行された実験からの結果を示す。ゲル上の第１のカラムは１ｋｂラダーを示し、第２のカラムはＤａｍメチルトランスフェラーゼで処理し、次にＤｐｎＩで消化した試験ＤＮＡを示し、第３のカラムはＤｐｎＩで消化した試験ＤＮＡを示す。第２のカラムはＤｐｎＩ消化ＤＮＡに対応するバンドを示し、第３のカラムは未切断の試験ＤＮＡに対応するバンドを示す。
【００７５】
プロトコール５の例示的描写では、図１１〜１２に関して、本方法は目的の標的ＤＮＡ配列を捕捉するために使用される。本方法は、複数のＤＮＡ配列を含む試料を先ず提供するステップであって、ＤＮＡ配列はメチル化ヌクレオチドを含み、ＤＮＡ配列は５’および３’末端でアダプターにライゲートされている、ステップを含む。本方法は、試料を複数のＣａｓ９ニッカーゼ−ｇＲＮＡ複合体と先ず接触させるステップを次に含み、ここで、ｇＲＮＡはＤＮＡ配列のサブセットの目的の標的化部位に相補的であり、それによって目的の標的化部位で複数のニック入りのＤＮＡを生成し、ＤＮＡは、５’および３’末端でアダプターにライゲートされている。この後に、試料をニック部位でＤＮＡ合成を開始することが可能な酵素およびメチル化されていないヌクレオチドと次に接触させ、それによって、目的の標的化部位でメチル化されていないヌクレオチドを含む複数のＤＮＡを生成することが続き、ここで、ＤＮＡ配列は、５’および３’末端でアダプターにライゲートされている。この後に、メチル化ＤＮＡを切断することが可能な酵素と試料を接触させ、それによってメチル化ＤＮＡを含む複数のＤＮＡ断片を生成し、ここで、メチル化ＤＮＡを含む複数のＤＮＡ断片は、５’および３’末端のうち一方のみでアダプターにライゲートされている。
【００７６】
一実施形態では、本発明は、図１３に提供される捕捉方法（プロトコール６として表される）を提供する。この方法の目的は、例えば図１３に表されるように、任意の供与源（例えば、ライブラリー１３０２、ゲノムまたはＰＣＲ）から核酸１３０１の領域を濃縮することである。核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ１３０３は、２つのガイドＮＡ１３０４および１３０５を使用して近位部位に標的化され、各位置１３０６で核酸のニッキングをもたらすことができる。あるいは、アダプターは１つの側だけでライゲートし、次にフィルインされ、その後アダプターを反対側でライゲートすることができる。２つのニックが互いに近接していてもよい（例えば、１０〜１５ｂｐ以内）。標的外の分子に、単一のニックを生成させてもよい。２つのニック部位が近接しているため、反応を例えば６５℃に加熱すると１３０７、二本鎖切断が起こり、長い（例えば、１０〜１５ｂｐ）３’オーバーハングをもたらすことができる。これらのオーバーハングは、一本鎖アダプターの部位特異的ライゲーション１３０８を可能にするために、耐熱性の一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼによって認識することができる。リガーゼは、例えば、長い３’オーバーハングだけを認識することができ、このように、アダプターが他の部位でライゲートされないことを確実にする。このプロセスは、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼおよび目的の領域の反対側を標的にするガイドＮＡを使用して繰り返し、その後第２の一本鎖アダプターを使用して上のようにライゲーションを続けることができる。２つのアダプターが目的の領域のいずれかの側にライゲートされると、領域を増幅させること、または直接的に配列決定をすることができる１３０９。
【００７７】
プロトコール６の例示的な描写では、図１３に関して、本方法は、任意のＤＮＡ供与源（例えば、ライブラリー、ゲノムまたはＰＣＲ）からＤＮＡの領域を濃縮することである。Ｃａｓ９ニッカーゼは、２つのガイドＲＮＡを使用して近位部位に標的化され、各位置でＤＮＡのニッキングをもたらすことができる。あるいは、アダプターは１つの側だけでライゲートし、次にフィルインされ、その後アダプターを反対側でライゲートすることができる。２つのニックが互いに近くにあってよい（例えば、１０〜１５ｂｐ以内）。標的外の分子に、単一のニックを生成することができる。２つのニック部位が近接するため、反応を例えば６５℃に加熱したとき、二本鎖切断が起こり、長い（例えば、１０〜１５ｂｐ）３’オーバーハングをもたらすことができる。これらのオーバーハングは、一本鎖アダプターの部位特異的ライゲーションを可能にするために、耐熱性の一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、例えば耐熱性の５’Ａｐｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼによって認識することができる。リガーゼは、例えば、長い３’オーバーハングだけを認識することができ、このように、アダプターが他の部位でライゲートされないことを確実にする。このプロセスは、Ｃａｓ９ニッカーゼおよび目的の領域の反対側を標的にするガイドＲＮＡを使用して繰り返し、その後第２の一本鎖アダプターを使用して上のようにライゲーションを続けることができる。２つのアダプターが目的の領域のいずれかの側にライゲートされると、領域を増幅させること、または直接的に配列決定をすることができる。
【００７８】
一実施形態では、本明細書で、目的の配列について試料を濃縮する方法であって、（ａ）目的の配列および枯渇のための標的化配列を含む試料を提供するステップであって、目的の配列は試料の５０％未満を構成するステップ；および（ｂ）複数の核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼ−ｇＲＮＡ複合体または複数の核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼ−ｇＤＮＡ複合体と試料を接触させるステップであって、ｇＲＮＡおよびｇＤＮＡは標的化配列に相補的である、ステップ、を含む方法が提供される。一部の実施形態では、標的化配列は、それによって切断される。一実施形態では、核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃ２ｃ２である。一実施形態では、Ｃ２ｃ２は触媒活性がない。一実施形態では、核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＮｇＡｇｏ（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉからのアルゴノート）である。一実施形態では、ＮｇＡｇｏは触媒活性がない。
【００７９】
一実施形態では、本明細書で、試料を濃縮する方法であって、（ａ）宿主核酸および非宿主核酸を含む試料を提供するステップ；（ｂ）複数の核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼ−ｇＲＮＡ複合体または複数の核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼ−ｇＤＮＡ複合体と試料を接触させるステップであって、ｇＮＡは宿主核酸の標的化部位に相補的である、ステップ、ならびに（ｃ）非宿主核酸について試料を濃縮するステップを含む方法が提供される。一実施形態では、核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃ２ｃ２である。一実施形態では、Ｃ２ｃ２は触媒活性がない。一実施形態では、核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＮｇＡｇｏである。一実施形態では、ＮｇＡｇｏは触媒活性がない。
【００８０】
核酸、試料
本発明の核酸（捕捉のために標的化される）は、任意のＤＮＡ、任意のＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、人工ＤＮＡ、人工ＲＮＡ、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡおよびＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドであってよい。
【００８１】
本発明の核酸は、ゲノムの領域を含むゲノム断片、または全ゲノムそれ自体であってよい。一実施形態では、ゲノムはＤＮＡゲノムである。別の実施形態では、ゲノムはＲＮＡゲノムである。
【００８２】
本発明の核酸は、真核生物または原核生物の生物体から；哺乳動物の生物体または非哺乳動物の生物体から；動物または植物から；細菌またはウイルスから；動物寄生生物から；または病原体から得ることができる。
【００８３】
本発明の核酸は、任意の哺乳動物の生物体から得ることができる。一実施形態では、哺乳動物はヒトである。別の実施形態では、哺乳動物は畜産動物、例えばウマ、ヒツジ、ウシ、ブタまたはロバである。別の実施形態では、哺乳動物の生物体は、家庭用ペット、例えばネコ、イヌ、スナネズミ、マウス、ラットである。別の実施形態では、哺乳動物はサルの一種である。
【００８４】
本発明の核酸は、任意のトリまたは鳥類の生物体から得ることができる。鳥類の生物体には、ニワトリ、シチメンチョウ、カモおよびガチョウが限定されずに含まれる。
【００８５】
本発明の核酸は、植物から得ることができる。一実施形態では、植物は、イネ、トウモロコシ、コムギ、バラ、ブドウ、コーヒー、果実、トマト、ジャガイモまたはワタである。
【００８６】
一部の実施形態では、本発明の核酸は、細菌の種から得られる。一実施形態では、細菌は、結核を引き起こす細菌である。
【００８７】
一部の実施形態では、本発明の核酸は、ウイルスから得られる。
【００８８】
一部の実施形態では、本発明の核酸は、真菌類の種から得られる。
【００８９】
一部の実施形態では、本発明の核酸は、藻類の種から得られる。
【００９０】
一部の実施形態では、本発明の核酸は、任意の哺乳動物寄生生物から得られる。
【００９１】
一部の実施形態では、本発明の核酸は、任意の哺乳動物寄生生物から得られる。一実施形態では、寄生生物は虫である。別の実施形態では、寄生生物は、マラリアを引き起こす寄生生物である。別の実施形態では、寄生生物は、リーシュマニア症を引き起こす寄生生物である。別の実施形態では、寄生生物はアメーバである。
【００９２】
一部の実施形態では、病原体は、非哺乳動物の病原体である（非哺乳動物生物体において病原性である）。
【００９３】
一実施形態では、本発明の核酸には、同じ試料中のｇＮＡの標的である核酸およびｇＮＡの標的でない核酸が含まれる。
【００９４】
一実施形態では、本発明の核酸には、同じ試料中のｇＲＮＡの標的である核酸およびｇＲＮＡの標的でない核酸が含まれる。
【００９５】
一実施形態では、本発明の核酸には、同じ試料中のｇＤＮＡの標的である核酸およびｇＤＮＡの標的でない核酸が含まれる。
【００９６】
一実施形態では、本発明の核酸には、試料からの標的核酸（ｇＮＡの標的）および目的の核酸（ｇＮＡによって標的化されない）が含まれる。
【００９７】
一実施形態では、本発明の核酸には、試料からの標的核酸（ｇＲＮＡの標的）および目的の核酸（ｇＲＮＡによって標的化されない）が含まれる。
【００９８】
一実施形態では、本発明の核酸には、試料からの標的核酸（ｇＤＮＡの標的）および目的の核酸（ｇＤＮＡによって標的化されない）が含まれる。
【００９９】
一実施形態では、標的ＤＮＡ（ｇＮＡ、ｇＲＮＡ、ｇＤＮＡの標的）はヒト非ミトコンドリアＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）であってよく、目的の（捕捉のための）ＤＮＡはヒトミトコンドリアＤＮＡであってよく、ヒトミトコンドリアＤＮＡは、非ミトコンドリアヒトＤＮＡを標的にすることによって濃縮される。
【０１００】
一実施形態では、捕捉される核酸は、ゲノムのマッピング不能領域であってよく；さらなる分析／配列決定／クローニングのために保持される核酸は、ゲノムのマッピング可能な領域であってよい。一実施形態では、捕捉されて除去される（ｃａｐｔｕｒｅｄ  ｏｕｔ）核酸は、ゲノムのマッピング可能な領域であってよく；さらなる分析／配列決定／クローニングのために保持される核酸は、ゲノムのマッピング不能領域であってよい。マッピング不能領域の例には、テロメア、動原体またはマッピングするのがより困難である特徴を有する他のゲノム領域が含まれる。
【０１０１】
一実施形態では、本発明の核酸は、生物学的試料から得られる。核酸が得られる生物学的試料には、限定されずに、全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織および生検材料が含まれる。生物学的試料には、歯、骨、指の爪などの法医学試料が含まれてよい。生物学的試料には、組織、組織生検材料、例えば切除された肺組織が含まれてよい。生物学的試料には、臨床試料が含まれてよく、それは臨床場面、例えば病院またはクリニックで得られる試料を指す。
【０１０２】
一実施形態では、本発明の核酸は、環境試料から、例えば、水、土壌、空気または岩石から得られる。
【０１０３】
一実施形態では、本発明の核酸は、法医学試料、例えば、犯行現場で個体から、証拠品から、死後に、継続中の調査などの一部として得られる試料から得られる。
【０１０４】
一実施形態では、本発明の核酸は、ライブラリーで提供される。
【０１０５】
本発明の核酸は、試料から提供または抽出されてよい。抽出は、実質的に全ての核酸配列を検体から抽出することができる。
【０１０６】
本発明の方法は、捕捉される核酸対捕捉されない核酸を、９９．９９９：０．００１から０．００１：９９．９９９の間のいずれかの比で生成することができる。本発明の方法は、標的化核酸および目的の核酸を、９９．９９９：０．００１から０．００１：９９．９９９の間のいずれかの比で生成することができる。本発明の方法は、捕捉される核酸対保持／分析／配列決定される核酸を、９９．９９９：０．００１から０．００１：９９．９９９の間のいずれかの比で生成することができる。これらの実施形態では、比は９９．９９９：０．００１から０．００１：９９．９９９の間のいずれかと等しいかまたはその範囲のどこかに入り得、例えば、比は、９９：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５、５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５および１：９９であってよい。
【０１０７】
捕捉の後、増幅、配列決定などのために各抽出される核酸の長さをより管理可能な長さに低減するために、捕捉または保持される核配列を断片化することができる。
【０１０８】
本明細書で提供されるように、出発核酸材料の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％を捕捉することができる。この捕捉は、１０分以下、１５分以下、２０分以下、３０分以下、４５分以下、６０分以下、７５分以下、９０分以下、１０５分以下、１２０分以下、１５０分以下、１８０分以下または２４０分以下で達成することができる。
【０１０９】
一部の場合には、目的の標的化部位は、試料中の全ＤＮＡの９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満または１０％未満を占める。
【０１１０】
アダプター
本明細書で提供されるように、本明細書で提供される方法の実行を助けるために、本発明の核酸（核酸または核酸断片と互換的に呼ばれる）は、アダプターにライゲートされている。
【０１１１】
アダプターにライゲートされる本発明の核酸は、サイズが２０ｂｐから５０００ｂｐの範囲内であってよい。例えば、アダプターにライゲートされる核酸は、少なくとも２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００または５０００ｂｐであってよい。具体的な一実施形態では、アダプターにライゲートされる核酸は、１００ｂｐである。具体的な一実施形態では、アダプターにライゲートされる核酸は、２００ｂｐである。具体的な一実施形態では、アダプターにライゲートされる核酸は、３００ｂｐである。具体的な一実施形態では、アダプターにライゲートされる核酸は、４００ｂｐである。具体的な一実施形態では、アダプターにライゲートされる核酸は、５００ｂｐである。
【０１１２】
アダプターは、５’および３’末端で、核酸または核酸断片の各々の各末端にライゲートすることができる。他の実施形態では、アダプターは、断片の各々の１つの末端だけにライゲートすることができるか、または、他の場合には、後のステップでアダプターをライゲートすることができる。一例では、アダプターは、二本鎖ＤＮＡ分子の両方の鎖にライゲーション可能な核酸である。様々な実施形態では、アダプターは、ヘアピンアダプター、例えば、それ自体で塩基対を形成して二本鎖のステムおよびループを有する構造を形成する１つの分子であってよく、ここで、分子の３’および５’末端は断片の二本鎖ＤＮＡ分子の５’および３’末端にそれぞれライゲートする。あるいは、アダプターは、ユニバーサルアダプターとも呼ばれる、断片の１つの末端または両末端にライゲートされるＹアダプターであってよい。あるいは、アダプターそれ自体は、お互いと塩基対を形成する２つの異なるオリゴヌクレオチド分子で構成されてよい。さらに、アダプターのライゲーション可能な末端は、制限酵素による切断によって作製されるオーバーハングに適合するように設計することができるか、または、それは平滑末端もしくは５’Ｔオーバーハングを有することができる。一般的に、アダプターは二本鎖ならびに一本鎖の分子を含むことができる。したがって、アダプターは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはこれら２つの混合物であってよい。ＲＮＡを含有するアダプターは、ＲＮアーゼ処理またはアルカリ加水分解によって切断可能であってよい。
【０１１３】
アダプターは長さが１０から１００ｂｐであってよいが、この範囲の外のアダプターは本発明から逸脱することなく使用可能である。具体的な実施形態では、アダプターは、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも１５ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも２５ｂｐ、少なくとも３０ｂｐ、少なくとも３５ｂｐ、少なくとも４０ｂｐ、少なくとも４５ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも５５ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも６５ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも７５ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも８５ｂｐ、少なくとも９０ｂｐまたは少なくとも９５ｂｐの長さである。
【０１１４】
さらなる例では、捕捉される核酸配列は、１つまたは複数のＤＮＡ配列決定ライブラリーに由来することができる。アダプターは、次世代配列決定プラットホームのために、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定プラットホームまたはＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔプラットホームの上での使用のために構成することができる。
【０１１５】
アダプターは、目的の制限部位またはプライマー結合部位を含有することができる。
【０１１６】
例示的なアダプターには、Ｐ５およびＰ７アダプターが含まれる。
【０１１７】
ガイド核酸（ｇＮＡ）
本明細書でガイド核酸（ｇＮＡ）が提供され、ここで、ｇＮＡは、核酸中の、例えば宿主からのゲノムＤＮＡ中の標的化部位または目的の配列、または目的外の配列に相補的である（選択的である、ハイブリダイズすることができる）。ｇＮＡは、核酸ガイド化ヌクレアーゼを核酸の特異的部位に誘導する。
【０１１８】
一部の実施形態では、ｇＮＡはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。他の実施形態では、ｇＮＡはガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）である。一部の実施形態では、ｇＮＡはｇＲＮＡおよびｇＤＮＡの混合物を含む。
【０１１９】
ｇＮＡが導かれる宿主は、動物、例えば、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、サル、イヌ、ネコ、スナネズミ、トリ、マウスまたはラットであってよい。宿主は、植物であってよい。非宿主は、原核生物、真核生物、ウイルス、細菌、真菌および原生動物であってよい。
【０１２０】
一実施形態では、本発明は、捕捉のために標的化される核酸配列とハイブリダイズするように構成される、ｇＮＡの収集物を含むガイド核酸（ｇＮＡ）ライブラリーを提供する。別の実施形態では、本発明は、捕捉のために標的化されない核酸配列とハイブリダイズするように構成される、ｇＮＡの収集物を含むガイドＮＡライブラリーを提供する。
【０１２１】
一実施形態では、本発明は、捕捉のために標的化される核酸配列とハイブリダイズするように構成される、ｇＲＮＡの収集物を含むガイドＲＮＡライブラリーを提供する。別の実施形態では、本発明は、捕捉のために標的化されない核酸配列とハイブリダイズするように構成される、ｇＲＮＡの収集物を含むガイドＲＮＡライブラリーを提供する。
【０１２２】
一実施形態では、本発明は、捕捉のために標的化される核酸配列とハイブリダイズするように構成される、ｇＤＮＡの収集物を含むガイドＤＮＡライブラリーを提供する。別の実施形態では、本発明は、捕捉のために標的化されない核酸配列とハイブリダイズするように構成される、ｇＤＮＡの収集物を含むガイドＤＮＡライブラリーを提供する。
【０１２３】
一実施形態では、ｇＮＡは試料中の標的核酸に選択的であるが、試料からの目的の配列に選択的でない。
【０１２４】
一実施形態では、ｇＮＡは、核酸配列を逐次的に捕捉するために使用される。
【０１２５】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、核酸ガイド化ヌクレアーゼが結合することができるＰｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列がその後に続く、標的核酸配列に選択的である。一部の実施形態では、ｇＮＡの配列は、核酸ガイド化ヌクレアーゼのタイプによって決定される。様々な実施形態では、ＰＡＭ配列は、核酸ガイド化ヌクレアーゼが由来する生物体の種によって異なる可能性があるので、ｇＮＡは、異なる核酸ガイド化ヌクレアーゼタイプに調整することができる。
【０１２６】
本発明のｇＮＡ（ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡ）は、サイズが５０〜２００塩基対の範囲内で異なることができる。例えば、本発明のｇＮＡは、少なくとも５０ｂｐ、５５ｂｐ、６０ｂｐ、６５ｂｐ、７０ｂｐ、７５ｂｐ、８０ｂｐ、８５ｂｐ、９０ｂｐ、９５ｂｐ、１００ｂｐ、１１０ｂｐ、１２０ｂｐ、１２５ｂｐ、１３０ｂｐ、１４０ｂｐ、１５０ｂｐ、１６０ｂｐ、１７０ｂｐ、１７５ｂｐ、１８０ｂｐ、１９０ｂｐまたは１９５ｂｐであってよい。具体的な実施形態では、ｇＮＡは、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐまたは１１０ｂｐである。一部の実施形態では、標的特異的ｇＮＡは、細菌種に由来する核酸ガイド化ヌクレアーゼタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）が結合することができるＰｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ隣接モチーフまたは（ＰＡＭ）配列が続く標的核酸中の所定部位に相補的であってよい塩基対配列を含む。具体的な実施形態では、標的核酸中の所定部位に相補的であるｇＮＡの塩基対配列は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０塩基対である。
【０１２７】
本発明は、ｇＮＡライブラリー（例えば、ｇＲＮＡライブラリーまたはｇＤＮＡライブラリー）も提供する。ｇＮＡライブラリーは、捕捉の標的である核酸配列、目的の核酸配列または目的外の核酸配列とハイブリダイズする（選択的である）ように構成される、いくつかの異なる種特異的ガイドＮＡ（例えば、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡ）エレメントを各々含むことができる。各ｇＮＡは、標的特異的ガイド配列、および核酸ガイド化ヌクレアーゼタンパク質に結合するように形成されるステムループ結合部位を含む。一部の実施形態では、ライブラリーは複数の異なるガイドＮＡを含むことができ、各々は、核酸ガイド化ヌクレアーゼタンパク質が結合することができる適当なＰＡＭ配列が続く、標的化される核酸中の異なる所定部位に相補的である異なる１５〜３０塩基対配列を有する。各ガイドＮＡについて、ＰＡＭ配列は目的の核酸の所定のＤＮＡまたはＲＮＡ標的配列に存在するが、対応する標的特異的ガイド配列に存在しない。
【０１２８】
一般的に、本発明により、所定の標的配列および続く適当なＰＡＭ配列を有する目的のゲノム中の任意の核酸配列は、ガイドＮＡライブラリーにおいて提供され、核酸ガイド化ヌクレアーゼが結合する対応するガイドＲＮＡがハイブリダイズすることができる。様々な実施形態では、ＰＡＭ配列は、核酸ガイド化ヌクレアーゼが由来する細菌の種によって異なる可能性があるので、ｇＮＡライブラリーは、異なる核酸ガイド化ヌクレアーゼタイプに調整することができる。しかし、一部のバリエーションでは、所定の標的配列の後にＰＡＭ配列が続かない。
【０１２９】
ｇＮＡ中の異なる標的特異的配列を生成することができる。これは、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ、例えば、バクテリオファージＴ３、Ｔ７、ＳＰ６などからのＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを使用して実行することができる。したがって、各異なるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、異なる標的核酸配列とハイブリダイズするのに適する異なる標的特異的配列を提供する。アニーリングおよび以降のＰＣＲ反応で使用できるフォワードプライマーの非限定的例示的セットは、下で提供される表１に掲載される。
【０１３０】
所望の捕捉結果に適するように、各異なるガイドＮＡエレメントの多数のコピーならびに多数の異なるガイドＮＡエレメントを含むように、ｇＮＡライブラリー（例えば、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡライブラリー）を増幅することができる。所与のガイドＮＡライブラリー中の特異なガイドＮＡエレメントの数は、１つの特異なガイドＮＡエレメントから３００，０００，０００個もの特異なガイドＮＡエレメントの範囲内であってよく、または、ヒトゲノム中の１０塩基対につき概ね１つの特異なガイドＮＡ配列であってよい。特異なｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡ）の数は、少なくとも約１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７または１０８個の特異なｇＮＡであってよい。特異なｇＮＡの数は、特異な核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体）のその数をもたらすことができる。
【０１３１】
理論に制約されることなく、ｇＮＡが約１００％の効能を提示する場合、標的核酸の＞９５％の切断に到達するｇＮＡの間の距離を計算することができる：これは、ライブラリーのサイズの分布を測定し、平均、Ｎおよび標準偏差ＳＤを決定することによって計算することができる；ライブラリーの＞９５％についてＮ−２ＳＤ＝最小サイズであり、＞９５％捕捉を確実にするためにこのサイズの断片につき１つのガイドＮＡがあることを確実にする。これは、ガイドＮＡの間の最大距離＝ライブラリーサイズの平均−２ｘ（ライブラリーサイズの標準偏差）と記載することもできる。
【０１３２】
本発明の様々な実施形態では、ｇＮＡは、一塩基多型（ＳＮＰ）、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、がん遺伝子、挿入断片、欠失、構造的異形、エクソン、遺伝子変異および調節領域を限定されずに含む、目的の様々な標的化部位に特異的であってよい。
【０１３３】
核酸ガイド化ヌクレアーゼ
試料からの核酸の捕捉のための組成物および方法が、本明細書で提供される。これらの組成物および方法は、核酸ガイド化ヌクレアーゼを利用する。本明細書で使用するように、「核酸ガイド化ヌクレアーゼ」は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを切断し、特異性を付与するために１つまたは複数の核酸ガイド核酸（ｇＮＡ）を使用する任意のエンドヌクレアーゼである。核酸ガイド化ヌクレアーゼには、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質ならびに非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が含まれる。
【０１３４】
本明細書で提供される核酸ガイド化ヌクレアーゼは、ＤＮＡによって誘導されるＤＮＡエンドヌクレアーゼ；ＤＮＡによって誘導されるＲＮＡエンドヌクレアーゼ；ＲＮＡによって誘導されるＤＮＡエンドヌクレアーゼ；またはＲＮＡによって誘導されるＲＮＡエンドヌクレアーゼであってよい。
【０１３５】
一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼは、核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。
【０１３６】
一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼは、核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼである。
【０１３７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の核酸ガイド化ヌクレアーゼ
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、本明細書で提供される実施形態で使用される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質には、ＣＲＩＳＰＲ  Ｉ型系、ＣＲＩＳＰＲ  ＩＩ型系およびＣＲＩＳＰＲ  ＩＩＩ型系からのタンパク質が含まれる。
【０１３８】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、任意の細菌または古細菌種からのものであってよい。
【０１３９】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、単離されるか、組換えで生成されるか、または合成のものである。
【０１４０】
一部の実施形態では、ＣＲＩＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ  ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ  ｇｌｏｂｕｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ  ｔａｆｆｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｏｂｉｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ  ａｌｏｃｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｕｔｅｒｅｌｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａからのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質からのものであるかそれに由来する。
【０１４１】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質の例は、天然に存在するものまたは操作されたバージョンであってよい。
【０１４２】
一部の実施形態では、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ＣＡＳクラスＩタイプＩ、ＩＩＩもしくはＩＶ、またはＣＡＳクラスＩＩタイプＩＩもしくはＶに属することができ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ−ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｃｓｆ１、Ｃ２ｃ２およびＣｐｆ１を含むことができる。
【０１４３】
例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃａｓ９を含む。
【０１４４】
「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＮＡ複合体」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質およびガイドＮＡ（例えば、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡ）を含む複合体を指す。ｇＮＡがｇＲＮＡである場合、ｇＲＮＡは２つの分子、すなわち標的とハイブリダイズし、配列特異性を提供する１つのＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）、およびｃｒＲＮＡとハイブリダイズすることが可能である１つのＲＮＡ「ｔｒａｃｒＲＮＡ」で構成することができる。あるいは、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含有する単一の分子（すなわち、ｇＲＮＡ）であってよい。
【０１４５】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％または９０％同一、少なくとも９５％同一または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一）であってよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質の全ての機能、または、結合活性、ヌクレアーゼ活性およびヌクレアーゼ活性を含む機能のうち１つもしくは一部だけを有することができる。
【０１４６】
用語「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質関連ガイドＮＡ」は、ガイドＮＡを指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質関連ガイドＮＡは、単離されたＮＡとして、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＮＡ複合体の一部として存在することができる。
【０１４７】
Ｃａｓ９
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質、核酸ガイド化ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９であるかまたはそれを含む。本発明のＣａｓ９は、単離されるか、組換えで生成されるか、または合成のものであってよい。
【０１４８】
本明細書の実施形態において使用することができるＣａｓ９タンパク質の例は、Ｆ．Ａ．  Ｒａｎ、Ｌ．  Ｃｏｎｇ、Ｗ．Ｘ．  Ｙａｎ、Ｄ．  Ａ．  Ｓｃｏｔｔ、Ｊ．Ｓ．  Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ、Ａ．Ｊ．  Ｋｒｉｚ、Ｂ．  Ｚｅｔｓｃｈｅ、Ｏ．  Ｓｈａｌｅｍ、Ｘ．  Ｗｕ、Ｋ．Ｓ．  Ｍａｋａｒｏｖａ、Ｅ．Ｖ．  Ｋｏｏｎｉｎ、Ｐ．Ａ．  ＳｈａｒｐおよびＦ．  Ｚｈａｎｇ；「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９」、Ｎａｔｕｒｅ５２０巻、１８６〜１９１頁（２０１５年４月９日）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４２９９、に見出すことができ、それは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４９】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ  ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ  ｇｌｏｂｕｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ  ｔａｆｆｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｏｂｉｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ  ａｌｏｃｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｕｔｅｒｅｌｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａに由来するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系である。
【０１５０】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系であり、ＰＡＭ配列は、標的特異的ガイド配列の３’末端に直に位置するＮＧＧである。例示的な細菌種からのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＰＡＭ配列は、以下を含むこともできる：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＮＧＧ）、Ｓｔａｐｈ  ａｕｒｅｕｓ（ＮＮＧＲＲＴ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮＮＮＮＧＡ  ＴＴ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＮＮＡＧＡＡ）およびＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（ＮＡＡＡＡＣ）、これらは全て本発明から逸脱することなく使用可能である。
【０１５１】
例示的な一実施形態では、Ｃａｓ９配列は、例えば、細菌で発現させ、組換え６Ｈｉｓタグ付きタンパク質を精製するために、ＰＣＲによって再増幅され、次にｐＥＴ３０（ＥＭＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）にクローニングされる、ｐＸ３３０プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅから入手可能）から得ることができる。
【０１５２】
「Ｃａｓ９−ｇＮＡ複合体」は、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＮＡを含む複合体を指す。Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質と、例えばＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質と少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一）であってよい。Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質の全ての機能、または、結合活性、ヌクレアーゼ活性およびヌクレアーゼ活性を含む機能のうち１つもしくは一部だけを有することができる。
【０１５３】
用語「Ｃａｓ９関連ガイドＮＡ」は、前記のようなガイドＮＡを指す。Ｃａｓ９関連ガイドＮＡは、単離されて、またはＣａｓ９−ｇＮＡ複合体の一部として存在することができる。
【０１５４】
非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の核酸ガイド化ヌクレアーゼ
一部の実施形態では、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、本明細書で提供される実施形態で使用される。
【０１５５】
一部の実施形態では、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、任意の細菌または古細菌種からのものであってよい。
【０１５６】
一部の実施形態では、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、単離されるか、組換えで生成されるか、または合成のものである。
【０１５７】
一部の実施形態では、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ  ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ  ｇｌｏｂｕｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ  ｔａｆｆｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｏｂｉｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ  ａｌｏｃｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｕｔｅｒｅｌｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａからのものであるかまたはそれに由来する。
【０１５８】
一部の実施形態では、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、天然に存在するものまたは操作されたバージョンであってよい。
【０１５９】
一部の実施形態では、天然に存在する非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ＮｇＡｇｏ（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉからのアルゴノート）である。
【０１６０】
「非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＮＡ複合体」は、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質およびガイドＮＡ（例えば、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡ）を含む複合体を指す。ｇＮＡがｇＲＮＡである場合、ｇＲＮＡは２つの分子、すなわち標的とハイブリダイズし、配列特異性を提供する１つのＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）、およびｃｒＲＮＡとハイブリダイズすることが可能である１つのＲＮＡ「ｔｒａｃｒＲＮＡ」で構成することができる。あるいは、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含有する単一の分子（すなわち、ｇＲＮＡ）であってよい。
【０１６１】
非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、野生型非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一）であってよい。非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、野生型非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質の全ての機能、または、結合活性、ヌクレアーゼ活性およびヌクレアーゼ活性を含む機能のうち１つもしくは一部だけを有することができる。
【０１６２】
用語「非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質関連ガイドＮＡ」は、ガイドＮＡを指す。非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質関連ガイドＮＡは、単離されたＮＡとして、または非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＮＡ複合体の一部として存在することができる。
【０１６３】
触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼの操作された例には、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の核酸ガイド化ヌクレアーゼまたは非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の核酸ガイド化ヌクレアーゼ）が含まれる。用語「触媒活性がない」は、不活性化ヌクレアーゼ、例えば、不活性化ＨＮＨおよびＲｕｖＣヌクレアーゼを有する核酸ガイド化ヌクレアーゼを一般的に指す。そのようなタンパク質は任意の核酸中の標的部位に結合することができるが（標的部位はガイドＮＡによって決定される）、タンパク質は核酸を切断することもニックを入れることもできない。
【０１６４】
したがって、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼは、未結合の核酸および触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼに結合した断片への混合物の分離を可能にする。不活性な核酸ガイド化ヌクレアーゼの使用は、例えば、図９および図１０のプロトコール３および４においてそれぞれ表される。例示的な一実施形態では、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体はｇＲＮＡ配列によって決定される標的に結合する。図１０に描写されるように、ｄＣａｓ９結合はＣａｓ９による切断を阻止できるが、他の操作は進行する。
【０１６５】
別の実施形態では、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼは、トランスポザーゼなどの別の酵素に融合させて、その酵素の活性を特異的部位に標的化させることができる。
【０１６６】
一部の実施形態では、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼは、ｄＣａｓ９、ｄＣｐｆ１、ｄＣａｓ３、ｄＣａｓ８ａ−ｃ、ｄＣａｓ１０、ｄＣｓｅ１、ｄＣｓｙ１、ｄＣｓｎ２、ｄＣａｓ４、ｄＣｓｍ２、ｄＣｍ５、ｄＣｓｆ１、ｄＣ２Ｃ２またはｄＮｇＡｇｏである。
【０１６７】
例示的な一実施形態では、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼタンパク質は、ｄＣａｓ９である。
【０１６８】
核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼの操作された例には、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ（ニッカーゼ−核酸ガイド化ヌクレアーゼと互換的に呼ばれる）が含まれる。
【０１６９】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼの操作された例には、単一の不活性触媒ドメインを含有する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ニッカーゼまたは非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ニッカーゼが含まれる。
【０１７０】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃｐｆ１ニッカーゼ、Ｃａｓ３ニッカーゼ、Ｃａｓ８ａ−ｃニッカーゼ、Ｃａｓ１０ニッカーゼ、Ｃｓｅ１ニッカーゼ、Ｃｓｙ１ニッカーゼ、Ｃｓｎ２ニッカーゼ、Ｃａｓ４ニッカーゼ、Ｃｓｍ２ニッカーゼ、Ｃｍ５ニッカーゼ、Ｃｓｆ１ニッカーゼ、Ｃ２Ｃ２ニッカーゼまたはＮｇＡｇｏニッカーゼである。
【０１７１】
一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼである。
【０１７２】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは、標的配列に結合するために使用することができる。１つの活性ヌクレアーゼドメインだけのため、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは、標的ＤＮＡの１本の鎖だけを切断し、一本鎖切断または「ニック」を生成する。どの変異体が使用されるかによって、ガイドＮＡとハイブリダイズした鎖またはハイブリダイズしていない鎖を切断することができる。反対側の鎖を標的にする２つのｇＮＡに結合した核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは、核酸において二本鎖切断を起こすことができる。この「二重ニッカーゼ」戦略は、両方の核酸ガイド化ヌクレアーゼ／ｇＮＡ複合体が、二本鎖切断が形成される前の部位で特異的に結合することを必要とするので、切断特異性を増加させる。
【０１７３】
例示的な実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、標的配列に結合するために使用することができる。用語「Ｃａｓ９ニッカーゼ」は、単一の不活性触媒ドメイン、すなわち、ＲｕｖＣ−またはＨＮＨ−ドメインを含有する、Ｃａｓ９タンパク質の改変バージョンを指す。１つの活性ヌクレアーゼドメインだけのため、Ｃａｓ９ニッカーゼは、標的ＤＮＡの１本の鎖だけを切断し、一本鎖切断または「ニック」を生成する。どの変異体が使用されるかによって、ガイドＲＮＡとハイブリダイズした鎖またはハイブリダイズしていない鎖を切断することができる。反対側の鎖を標的にする２つのｇＲＮＡに結合したＣａｓ９ニッカーゼは、ＤＮＡにおいて二本鎖切断を起こす。この「二重ニッカーゼ」戦略は、両方のＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が、二本鎖切断が形成される前の部位で特異的に結合することを必要とするので、切断特異性を増加することができる。
【０１７４】
ＤＮＡの捕捉は、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼを使用して実行することができる。これは、図６および図１１のプロトコール２および５においてそれぞれ図示される。例示的な一実施形態では、図６および１１に描写されるように、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは二本鎖核酸の１本の鎖を切断し、二本鎖の領域はメチル化ヌクレオチドを含む。
【０１７５】
解離可能および耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼ
一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼが本明細書で提供される方法で使用される（耐熱性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の核酸ガイド化ヌクレアーゼまたは耐熱性の非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の核酸ガイド化ヌクレアーゼ）。そのような実施形態では、反応温度が上昇し、タンパク質の解離を誘導する。反応温度は低下し、さらなる切断された標的配列の生成を可能にする。一部の実施形態では、少なくとも７５℃で少なくとも１分の間維持されるとき、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、少なくとも５０％の活性、少なくとも５５％の活性、少なくとも６０％の活性、少なくとも６５％の活性、少なくとも７０％の活性、少なくとも７５％の活性、少なくとも８０％の活性、少なくとも８５％の活性、少なくとも９０％の活性、少なくとも９５％の活性、少なくとも９６％の活性、少なくとも９７％の活性、少なくとも９８％の活性、少なくとも９９％の活性または１００％の活性を維持する。一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、少なくとも７５℃で、少なくとも８０℃で、少なくとも８５℃で、少なくとも９０℃で、少なくとも９１℃で、少なくとも９２℃で、少なくとも９３℃で、少なくとも９４℃で、少なくとも９５℃、９６℃で、少なくとも９７℃で、少なくとも９８℃で、少なくとも９９℃で、または少なくとも１００℃で少なくとも１分の間維持されるとき、少なくとも５０％の活性を維持する。一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、少なくとも７５℃で少なくとも１分、２分、３分、４分または５分の間維持されるとき、少なくとも５０％の活性を維持する。一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、温度を上昇させ、２５℃〜５０℃に低下させたとき、少なくとも５０％の活性を維持する。一部の実施形態では、温度は、２５℃に、３０℃に、３５℃に、４０℃に、４５℃に、または５０℃に低下させられる。例示的な一実施形態では、耐熱性酵素は、９５℃で１分間の後に少なくとも９０％の活性を保持する。
【０１７６】
一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、耐熱性Ｃａｓ９、耐熱性Ｃｐｆ１、耐熱性Ｃａｓ３、耐熱性Ｃａｓ８ａ−ｃ、耐熱性Ｃａｓ１０、耐熱性Ｃｓｅ１、耐熱性Ｃｓｙ１、耐熱性Ｃｓｎ２、耐熱性Ｃａｓ４、耐熱性Ｃｓｍ２、耐熱性Ｃｍ５、耐熱性Ｃｓｆ１、耐熱性Ｃ２Ｃ２または耐熱性ＮｇＡｇｏである。
【０１７７】
一部の実施形態では、耐熱性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、耐熱性Ｃａｓ９である。
【０１７８】
耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、単離すること、例えば、高温菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓのゲノムにおける配列相同性によって同定することができる。核酸ガイド化ヌクレアーゼ遺伝子は、発現ベクターに次にクローニングすることができる。例示的な一実施形態では、耐熱性のＣａｓ９タンパク質は単離される。
【０１７９】
別の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、非耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼのｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化によって得ることができる。核酸ガイド化ヌクレアーゼの配列は、その耐熱性を改善するために変異誘発させられ得る。
【０１８０】
本発明の例示的組成物
一実施形態では、核酸断片、ニッカーゼ核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体および標識ヌクレオチドを含む組成物が本明細書で提供される。例示的な一実施形態では、核酸断片、ニッカーゼＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体および標識ヌクレオチドを含む組成物が本明細書で提供される。そのような実施形態では、核酸はＤＮＡを含むことができる。ヌクレオチドは、例えばビオチンで標識することができる。ヌクレオチドは、抗体−コンジュゲート対の一部であってよい。
【０１８１】
一実施形態では、核酸断片および触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体を含む組成物であって、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼはトランスポザーゼに融合されている、組成物が本明細書で提供される。例示的な一実施形態では、ＤＮＡ断片およびｄＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を含む組成物であって、ｄＣａｓ９はトランスポザーゼに融合されている、組成物が本明細書で提供される。
【０１８２】
一実施形態では、メチル化ヌクレオチドを含む核酸断片、ニッカーゼ核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体、およびメチル化されていないヌクレオチドを含む組成物が本明細書で提供される。例示的な一実施形態では、メチル化ヌクレオチドを含むＤＮＡ断片、ニッカーゼＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体およびメチル化されていないヌクレオチドを含む組成物が本明細書で提供される。
【０１８３】
一実施形態では、核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼと複合体を形成したｇＤＮＡが本明細書で提供される。例示的な実施形態では、核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＮｇＡｇｏである。
【０１８４】
一実施形態では、核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼと複合体を形成したｇＤＮＡが本明細書で提供される。
【０１８５】
一実施形態では、核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼと複合体を形成したｇＲＮＡが本明細書で提供される。
【０１８６】
一実施形態では、核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼと複合体を形成したｇＲＮＡが本明細書で提供される。一実施形態では、核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃ２ｃ２を含む。
【０１８７】
キットおよび製造品
本出願は、アダプター、ｇＮＡ、ｇＤＮＡ、ｇＲＮＡ、ｇＮＡライブラリー、ｇＲＮＡライブラリー、ｇＤＮＡライブラリー、核酸ガイド化ヌクレアーゼ、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ、ニッカーゼ核酸ガイド化ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質、ニッカーゼＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質、触媒活性がないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、メチル化ヌクレオチド、標識ヌクレオチド、ビオチン化ヌクレオチド、アビジン、ストレプトアビジン、ニック部位で核酸合成を開始することが可能な酵素、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＴＡＱポリメラーゼ、ｂｓｔＤＮＡポリメラーゼ、メチル化ヌクレオチドを切断することが可能な酵素、Ｄｐｎ１酵素、およびＤＮＡをメチル化することが可能な酵素、例えばＤａｍ／Ｄｃｍ１メチルトランスフェラーゼ）を限定されずに含む、本明細書に記載される組成物のいずれか１つまたは複数を含むキットを提供する。
【０１８８】
一実施形態では、キットはｇＮＡの収集物またはライブラリーを含み、ここで、ｇＮＡはヒトゲノムＤＮＡ配列、例えば目的の特定の遺伝子（例えば、がん遺伝子）ＳＮＰ、ＳＴＲを標的にする。別の例示的実施形態では、キットはｇＮＡの収集物またはライブラリーを含み、ここで、ｇＮＡはヒト以外の哺乳動物のＤＮＡ配列を標的にする。別の例示的実施形態では、キットはｇＮＡの収集物またはライブラリーを含み、ここで、ｇＮＡはヒトのリボソームＲＮＡ配列を標的にする。別の例示的実施形態では、キットはｇＮＡの収集物またはライブラリーを含み、ここで、ｇＮＡはヒトのミトコンドリアＤＮＡ配列を標的にする。
【０１８９】
例示的一実施形態では、キットはｇＲＮＡの収集物またはライブラリーを含み、ここで、ｇＲＮＡはヒトゲノムＤＮＡ配列、例えば目的の特定の遺伝子（例えば、がん遺伝子）ＳＮＰ、ＳＴＲを標的にする。別の例示的実施形態では、キットはｇＲＮＡの収集物またはライブラリーを含み、ここで、ｇＲＮＡはヒト以外の哺乳動物のＤＮＡ配列を標的にする。別の例示的実施形態では、キットはｇＲＮＡの収集物またはライブラリーを含み、ここで、ｇＲＮＡはヒトのリボソームＲＮＡ配列を標的にする。別の例示的実施形態では、キットはｇＲＮＡの収集物またはライブラリーを含み、ここで、ｇＲＮＡはヒトのミトコンドリアＤＮＡ配列を標的にする。
【０１９０】
本出願は、本明細書に記載されるキットのいずれか１つを含む製造品も提供する。製造品の例には、バイアル（密封バイアルを含む）が含まれる。
【０１９１】
以下の実施例は例示目的のために含まれ、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１９２】
（実施例１：全ヒトゲノムＤＮＡからのミトコンドリアＤＮＡの捕捉（ＤＮＡの捕捉のためのプロトコール１））
概要
この方法の目的は、図１に表すように、ヒトゲノムＤＮＡのライブラリーからミトコンドリアＤＮＡを捕捉することであった。ヒト組織検体をＤＮＡ抽出プロトコールに供し、＞９９％のヒトＤＮＡおよび＜１％の標的配列を含むＤＮＡ試料をもたらした。ＤＮＡ試料を配列決定ライブラリー構築プロトコールに供し、配列決定指数化アダプターを含む核酸ライブラリーをもたらした。標的特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）のライブラリーを生成するために、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ヒト特異的２０塩基対領域、およびＣａｓ９のためのステムループ結合部位を各々含む標的特異的ｇＲＮＡ前駆体のライブラリーをｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に供し、標的特異的ガイドＲＮＡのライブラリーを得た。標的特異的ガイドＲＮＡのライブラリーをＣａｓ９タンパク質と次に組み合わせ、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体のライブラリーを得た。Ｃａｓ９が対応する標的ＤＮＡ配列を切断し、他のＤＮＡを未切断のままに残すように、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を核酸ライブラリーと次に組み合わせた。第２のアダプターを付加し、切断されたＤＮＡの５’リン酸化平滑末端に特異的にライゲートさせた。第１および第２のアダプターを使用して特異的に増幅するために、ＰＣＲを次に使用した。
【０１９３】
ミトコンドリアＤＮＡは、全ヒトゲノムＤＮＡの概ね０．１〜０．２％を構成する。Ｃａｓ９によるＤＮＡの正確な部位特異的切断および続くアダプターのライゲーションを試験するために、図２に関し、試験ＤＮＡ（例えば、プラスミド）２０１を第１の位置２０２または第２の位置２０３でＣａｓ９により切断し、第１の生成物２０４または第２の生成物２０５を得た（例えば、図２を参照）。アダプターを、新たに利用可能な平滑ＤＮＡ末端にライゲートした２０６。ＡＵＫ−Ｆ／Ｐ７またはＭＢ１ＯｒｉＲ／Ｐ７のためにＰＣＲ増幅を実行し、反応ごとに２つの別個の生成物を得た。第１の位置が切断された場合、生成物は２１２であり、サイズは１．９ｋであった。第２の位置が切断された場合、生成物は３５９であり、サイズは１．７５ｋであった。検証は、配列決定によって実行した。
【０１９４】
結果は、Ｃａｓ９切断と、続くアダプターのライゲーションが、標的ＤＮＡの特異的増幅を可能にすることを示した（例えば、図３を参照）。増幅されたＤＮＡの配列決定は、アダプターのライゲーションがガイドＲＮＡによって指定された位置だけで起こることを示した（例えば、図４を参照）。
【０１９５】
次に、主にヒト核ＤＮＡを含有する混合物からミトコンドリアＤＮＡを濃縮した。ミトコンドリアＤＮＡに特異的である２５個のガイドＲＮＡを使用し、次にＣａｓ９で切断し、アダプターとライゲートし、その後増幅が続いた。図５からわかるように、２つ別個の反応はミトコンドリアＤＮＡの増幅を可能にし、ガイドＲＮＡのない反応はいかなるＤＮＡも増幅せず、このように、この方法が任意の所与のライブラリーにおいて過少に示されるＤＮＡを効率的に増幅することを示す。
【０１９６】
ＤＮＡライブラリーの調製
平滑末端修復キット（ＮＥＢ）を２５℃で２０分の間使用して、５００ｎｇの断片化ヒトゲノムＤＮＡを末端修復することによって（ｄｓＤＮＡフラグメンターゼ、ＮＥＢ、３７℃で１時間処理した）、ヒトゲノムＤＮＡライブラリーを生成した。次に、７５℃で２０分の間反応を熱不活性化させ、２５℃に冷却し、次にＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を使用して２５℃で２時間、１５ピコモルのＰ５／Ｍｙｃアダプターにライゲートした。アダプターダイマー  （ａｄａｐｔｅｒ  ｄｉｍｍｅｒ）は、ＮＧＳクリーンアップキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して除去した。
【０１９７】
Ｃａｓ９の発現
Ｃａｓ９開始コドンの直ぐ上流にヘキサヒスチジンタグを挿入するために、Ｃａｓ９（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓから）をｐＥＴ３０発現ベクター（ＥＭＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にクローニングした。結果として生じたプラスミドをＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ＢＬ２１細菌株（ＥＭＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に形質転換させ、培養物の光学密度（６００ｎｍのＯＤ）が０．４に到達するまで、激しい通気により１ＬのＬＢ培地で増殖させた。温度を２５℃まで下げ、０．２ｍＭのＩＰＴＧを加え、培養物をさらに４時間増殖させた。細胞を次に遠心分離（４℃で２０分間の１，０００×ｇ）によって収集し、１０ｍｌ結合緩衝液（２０ｍＭトリスｐＨ８、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、０．０５％ＮＰ４０）に再懸濁させ、超音波処理（３０％パワーで７×１０秒間のバースト、ソニファイアー２５０、Ｂｒａｎｓｏｎ）によって溶解した。不溶性細胞残渣は、２０分間の１０，０００×ｇによる遠心分離によって除去した。可溶タンパク質を含有する上清を次に０．４ｍｌのＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）と混合して、カラムにロードした。４ｍｌの結合緩衝液でビーズを３回洗浄し、次に、２５０ｍＭのイミダゾールを補充した結合緩衝液の３×０．５ｍｌで溶出した。次に溶出した画分を３０，０００ＭＷＣＯタンパク質濃縮器（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して濃縮し、保存緩衝液（１０ｍＭトリスｐＨ８、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５０％グリセロール）で緩衝液を交換し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって検証し、その後Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ染色（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が続き、定量化し、次に後の使用のために−２０℃で保存した。
【０１９８】
変異体Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９のＤ１０Ａ変異体は、上記のようにＣａｓ９を生成するのに使用される同じ手法を使用して生成し、精製することができる。
【０１９９】
ｇＲＮＡ１およびｇＲＮＡ２の調製
３つのオリゴヌクレオチドＴ７−ガイドＲＮＡ１および２（５’から３’方向に、ＧＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＴＴＡＴＡＣＡＧＣＡＣＴＴＴＡＡおよびＧＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＣＴＴＴＴＴＧＧＴＣＣＴＣＧＡＡＧの配列）ならびにｓｔｌｇＲ（配列、ＧＴ  ＴＴＴ  ＡＧＡ  ＧＣＴ  ＡＧＡ  ＡＡＴ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＴＴＡ  ＡＡＡ  ＴＡＡ  ＧＧＣ  ＴＡＧ  ＴＣＣ  ＧＴＴ  ＡＴＣ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＡＡＡ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＣＧＡ  ＧＴＣ  ＧＧＴ  ＧＣＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＡＴ  ＧＣ）を注文し、合成した（ＩＤＴ）。ｓｔｌｇＲオリゴヌクレオチド（３００ピコモル）を、製造業者の説明書に従ってＴ４  ＰＮＫ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して逐次的に５’リン酸化し、次に５’アデニル化キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して５’アデニル化した。耐熱性の５’ＡｐｐＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を６５℃で１時間使用して、Ｔ７−ガイドＲＮＡオリゴヌクレオチド（５ピコモル）および５’アデニル化ｓｔｌｇＲ（１０ピコモル）を次にライゲートした。ライゲーション反応を９０℃で５分間熱不活性化させ、次にプライマーＦｏｒＴ７（配列ＧＣＣ  ＴＣＧ  ＡＧＣ  ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  Ｃ）およびｇＲＵ（配列ＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧ）によるＰＣＲ（ＯｎｅＴａｑ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、９５℃で３０秒、５７℃で２０秒、７２℃で２０秒の３０サイクルを使用）で増幅した。ＰＣＲクリーンアップキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＰＣＲ生成物を精製し、アガロースゲル電気泳動および配列決定によって検証した。検証された生成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型として次に使用した。
【０２００】
ガイドＲＮＡライブラリーの調製
Ｔ７−ガイドＲＮＡオリゴヌクレオチド（表１）および別のオリゴヌクレオチド、ｓｔｌｇＲ（配列、ＧＴ  ＴＴＴ  ＡＧＡ  ＧＣＴ  ＡＧＡ  ＡＡＴ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＴＴＡ  ＡＡＡ  ＴＡＡ  ＧＧＣ  ＴＡＧ  ＴＣＣ  ＧＴＴ  ＡＴＣ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＡＡＡ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＣＧＡ  ＧＴＣ  ＧＧＴ  ＧＣＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＡＴ  ＧＣ）を注文し、合成した（ＩＤＴ）。
【０２０１】
ｓｔｌｇＲオリゴヌクレオチド（３００ピコモル）を、製造業者の説明書に従ってＴ４  ＰＮＫ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して逐次的に５’リン酸化し、次に５’アデニル化キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して５’アデニル化した。耐熱性の５’ＡｐｐＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を６５℃で１時間使用して、Ｔ７−ガイドＲＮＡオリゴヌクレオチド（５ピコモル）および５’アデニル化ｓｔｌｇＲ（１０ピコモル）を次にライゲートした。ライゲーション反応を９０℃で５分間熱不活性化させ、次にプライマーＦｏｒＴ７（配列ＧＣＣ  ＴＣＧ  ＡＧＣ  ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  Ｃ）およびｇＲＵ（配列ＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧ）によるＰＣＲ（ＯｎｅＴａｑ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、９５℃で３０秒、５７℃で２０秒、７２℃で２０秒の３０サイクルを使用）で増幅した。ＰＣＲクリーンアップキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＰＣＲ生成物を精製し、アガロースゲル電気泳動および配列決定によって検証した。検証された生成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型として次に使用した。
【表１−１】
2018529326.tif 000003
【表１−２】
2018529326.tif 000004
【０２０２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写
検証された生成物は、ＨｉＳｃｒｉｂｅ  Ｔ７転写キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応のための鋳型として次に使用した。製造業者の説明書に従って、５００〜１０００ｎｇの鋳型を３７℃で終夜インキュベートした。ガイドライブラリーをガイドＲＮＡに転写するために、以下のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応混合物を組み立てた：１０μｌの精製ライブラリー（約５００ｎｇ）、６．５μｌのＨ２Ｏ、２．２５μｌのＡＴＰ、２．２５μｌのＣＴＰ、２．２５μｌのＧＴＰ、２．２５μｌのＵＴＰ、２．２５μｌの１０×反応緩衝液（ＮＥＢ）および２．２５μｌのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼミックス。反応を３７℃で２４時間インキュベートし、次にＲＮＡクリーンアップキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して精製し、１００μｌのＲＮアーゼ不含水に溶出し、定量化し、使用時まで−２０℃で保存した。
【０２０３】
ＤＮＡ特異的Ｃａｓ９−媒介断片化
試験ＤＮＡを切断するために、試験ガイドＲＮＡ１および２を別々に使用した。ヒトゲノムＤＮＡライブラリーからミトコンドリアＤＮＡを切断し、濃縮するために、ガイドＲＮＡシリーズ１および２を使用した。希釈したガイドＲＮＡ（１μｌ、２ピコモルと同等）を、３μｌの１０×Ｃａｓ９反応緩衝液（ＮＥＢ）、２０μｌのＨ２Ｏおよび１μｌの組換えＣａｓ９酵素（ＮＥＢ、１ピコモル／μｌ）と組み合わせた。以下の配列（５’−ＧＧＡＴＴＴＡＴＡＣＡＧＣＡＣＴＴＴＡＡ−３’）を標的にした対照ガイドＲＮＡを使用した対照反応を、同じパラメーターを使用して別々に実行した。この配列は、ヒト染色体でもミトコンドリアＤＮＡでも不在である。反応を３７℃で１５分間インキュベートし、次に５μｌの希釈されたＤＮＡライブラリー（５０ｐｇ／μｌ）を補充し、３７℃でのインキュベーションを９０分間継続した。１：１００の希釈でＲＮアーゼＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えることによって反応を終了し、次に、ＰＣＲクリーンアップキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＤＮＡを精製し、３０μｌの１０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ８で溶出した。次に反応を使用時まで−２０℃で保存した。
【０２０４】
アダプターのライゲーションおよびＰＣＲ分析
試験ＤＮＡのために、Ｃａｓ９消化の後の反応を１５ピコモルのＰ５／Ｐ７アダプターおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）と、２５℃で１時間インキュベートした。ライゲーションは、試験ＤＮＡ−Ｆプライマー（配列ＡＴＧＣＣＧＣＡＧＣＡＣＴＴＧＧ）およびＰ５プライマー（配列ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ）を使用したＰＣＲのための鋳型として次に使用した。切断およびライゲーションが標的ＤＮＡ配列で起こったことを示すために、試験ＤＮＡ−Ｆプライマー（ＥｌｉｍＢｉｏ）を使用して配列決定をしたアガロースゲル電気泳動によって、成功したＰＣＲ生成物を確認した。
【０２０５】
古い末端でライゲートされたアダプターの排除
ミトコンドリアＤＮＡの濃縮のために、Ｃａｓ９消化の後、反応を１５ピコモルのＦｌａｇ５／Ｐ７アダプターおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）と、２５℃で１時間インキュベートした。例えば酵素処理を用いた、元のライブラリーからの旧Ｐ５およびＰ７アダプターの末端のアダプターのライゲーションを排除するために、複数の分子生物学的方法を用いることができる。Ｐ７（配列ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ）およびＰ５プライマー（配列ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ）を使用したＰＣＲのための鋳型として、反応を次に使用した。成功したＰＣＲ生成物は、アガロースゲル電気泳動によって確認した。
【０２０６】
（実施例２：ＤＮＡ混合物から試験ＤＮＡを標識し、次に精製するための、Ｃａｓ９ニッカーゼの使用（ＤＮＡの捕捉のためのプロトコール２））
概要
この方法の目的は、例えば図６に表されるように、ヒトゲノムＤＮＡのライブラリーから目的の領域（例えば、ＳＮＰ、ＳＴＲ等）を捕捉することであった。このプロトコールを適用するために、標的特異的ガイドＲＮＡによって誘導されるニッキング酵素（ＮｔＡｌｗＩ（ＮＥＢ））のための部位を含有する試験ＤＮＡを、この部位を含有しない別のＤＮＡプールに１％または５％で混合した。ニッカーゼＣａｓ９は標的配列だけで切断し、ＤＮＡの１本の鎖を切断することしかしない。ニッカーゼは、標的配列にニックを入れるために使用した。単一鎖の切れ目（ニック）は、ニックの下流のＤＮＡをビオチン標識ＤＮＡで置き換えるために使用することができる、ＤＮＡポリメラーゼＩのための基質である。目的のビオチン化ＤＮＡを次に精製し、増幅し、配列決定をした。
【０２０７】
ニッキングの標的部位（例えば、ＧＧＡＴＣ）７０３を含むＤＮＡの混合物７０１およびそれを含まないＤＮＡの混合物７０２を、ＮｔＡｌｗＩを使用してニックを入れた７０４（例えば、図７を参照）。ニッカーゼ部位を有する目的のＤＮＡと比較して、ニッカーゼ部位を有しないＤＮＡは１００倍過剰に存在した。単一鎖の切れ目（ニック）は、ニックの下流のＤＮＡをビオチン標識ＤＮＡで置き換えるために使用される７０５、ＤＮＡポリメラーゼＩのための基質である。目的のビオチン標識ＤＮＡを、ストレプトアビジン結合および洗浄７０６によって単離した。ＰＣＲ増幅は特異的プライマー７０７で実行し、増幅された目的の領域７０８、および、例えば非特異的標識化または捕捉のために存在した、増幅された非標識配列７０９を得た。
【０２０８】
２つの特異的ＰＣＲ反応（１つは目的の領域を有する試験ＤＮＡのためであり、他は目的の領域のない他のＤＮＡのためである）は、試験ＤＮＡが概ね５０倍濃縮されたことを示した（例えば、図８を参照）。
【０２０９】
Ｃａｓ９ニッカーゼの発現および精製
変異体Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９のＤ１０Ａ変異体は、上記のようにＣａｓ９を生成するのに使用される同じ手法を使用して生成し、精製することができる。
【０２１０】
配列特異的Ｃａｓ９ニッカーゼ媒介ニッキング
以下の配列５’−ＧＧＡＴＴＴＡＴＡＣＡＧＣＡＣＴＴＴＡＡ−３’を標的にする希釈されたガイドＲＮＡ（１μｌ、２ピコモルに同等）を、３μｌの１０×Ｃａｓ９反応緩衝液（ＮＥＢ）、２０μｌのＨ２Ｏおよび１μｌの組換えＣａｓ９ニッカーゼ酵素（１０ピコモル／μｌ）と組み合わせた。この標的配列は、標的ＤＮＡ（全ＤＮＡの５％または１％を占める）の上にだけ存在する。反応を３７℃で１５分間インキュベートし、次に５μｌの希釈されたＤＮＡ（全１００ｎｇ）を補充し、３７℃でのインキュベーションを９０分間継続した。１：１００の希釈でＲＮアーゼＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えることによって反応を終了し、次に、ＰＣＲクリーンアップキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＤＮＡを精製し、３０μｌの１０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ８で溶出した。次に使用時まで反応を−２０℃で保存した。
【０２１１】
ビオチンニックトランスレーション
ニック入りのＤＮＡを、５’＞３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、ニックでＤＮＡ合成を開始することが可能であり、したがってそれがニック下流のヌクレオチドを標識ヌクレオチド（この手法の場合、ビオチン標識ヌクレオチド）で置き換えることを可能にする、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩとインキュベートした。ニック標識反応は、２５℃で３０分間、１単位のＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ（ＮＥＢ）ならびに各々０．０２ｍＭのｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、０．０１ｍＭのｄＡＴＰおよび０．０１ｍＭのビオチン−Ｃ１４標識ｄＡＴＰ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有する２０μｌのＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（ＮＥＢ）で実行した。反応は、１ｍＭのＥＤＴＡを加えることによって終了した。
【０２１２】
ビオチン標識ＤＮＡの濃縮
ストレプトアビジンＣ１ビーズ（反応につき５μｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１ｍｌの結合緩衝液（５０ｍＭのトリス−Ｃｌ  ｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）に再懸濁させ、磁気ラックに結合させ、結合緩衝液で２回洗浄した。次にビーズを３０μｌの結合緩衝液に再懸濁させ、ニックトランスレーション反応と混合し、次に２５℃で３０分の間インキュベートした。ビーズは磁気ラックを使用して捕捉し、０．５ｍｌ結合緩衝液で４回、次に０．５ｍｌの１０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ８で３回洗浄した。次にビーズを２０μｌの１０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ８に再懸濁させ、その後、試験ＤＮＡおよび他のＤＮＡの割合を決定するためにＰＣＲのための鋳型として使用した。
【０２１３】
（実施例３：ヒトゲノムライブラリーにアダプターを挿入し、続いて特異的ＳＮＰを濃縮するための触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−トランスポザーゼ融合物の使用（ＤＮＡの捕捉のためのプロトコール３））
この例では、Ｃａｓ９精製について記載されるように、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−トランスポザーゼ融合タンパク質（例えば、ｄＣａｓ９−トランスポザーゼ融合タンパク質）は、Ｅ．ｃｏｌｉから発現され、精製される。融合タンパク質はアダプター（Ｎｅｘｔｅｒａ）と、次に目的の領域（例えば、ヒトＳＮＰ）を標的にするガイドＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）と複合体を形成する。次に、複合体をヒトゲノムＤＮＡに付加する。目的の領域は触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼによって標的化され、トランスポザーゼ−アダプター複合体は目的の領域の近くに置かれ、アダプターの挿入を可能にする。次にヒトＳＮＰをＰＣＲによって増幅し、次にＭｉＳｅｑを使用して配列決定をすることができ、このように、ヒトＳＮＰをヒトゲノムＤＮＡから濃縮することができる。
【０２１４】
（実施例４：ミトコンドリアＤＮＡを保護し、ヒトゲノムＤＮＡライブラリーからの残りのヒト核ＤＮＡを消化するための、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼの使用（ＤＮＡの捕捉のためのプロトコール４））
臨床、法医学または環境試料からのＰ５／Ｐ７アダプターを含むヒトゲノムＤＮＡライブラリーを得る。ある特定の領域（例えば、ＳＮＰ）を濃縮するために、これらの領域を標的にするガイドＲＮＡを作製し、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ｄＣａｓ９）とインキュベートし、次に３７℃で２０分の間ヒトゲノムＤＮＡライブラリーに加える。次に、活性のある核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）と複合体を形成したヒトゲノムを網羅するガイドＮＡのライブラリーを加える。触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼは、標的位置に結合したままであり、目的の領域（例えば、ＳＮＰ）が切断されて、ＰＣＲ増幅不能および配列決定不能になることから保護する。したがって、目的のＤＮＡはインタクトなままであるが、全ての他のＤＮＡは切断され、排除される。ＰＣＲクリーンアップキットを使用して反応から目的のＤＮＡを回収し、ＰＣＲ増幅し、ＭｉＳｅｑを使用して配列決定をする。
【０２１５】
概念実証試験のために、全ヒトゲノムＤＮＡライブラリーからミトコンドリアＤＮＡを濃縮する。ミトコンドリア特異的ガイドＲＮＡをｄＣａｓ９に加え、次にライブラリーに加える。次に、Ｃａｓ９と複合体を形成したランダムガイドＲＮＡはアクセス不可能なものを除いて任意の配列を分解するが、その理由は、それらは既に結合したｄＣａｓ９によって保護されているからである。これは、元の０．１〜０．２％よりはるかに高いレベルへのミトコンドリアＤＮＡの濃縮を可能にする。
【０２１６】
（実施例５：メチル化ＤＮＡをメチル化されていないＤＮＡで置き換えることによってヒトゲノムＤＮＡからのＳＮＰを保護し、次に濃縮するための、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ）の使用（ＤＮＡの捕捉のためのプロトコール５））
概要
この方法の目的は、図１１に表すように、ヒトゲノムＤＮＡのライブラリーから目的の領域を捕捉することである。原理の証拠として、ニッキング酵素、ＮｔＢｂｖＣＩ（ＮＥＢ）のための部位を含有する試験ＤＮＡを、この部位を含有しない別のＤＮＡプールに１％または５％で混合した。メチル基を全てのＧＡＴＣ配列に付加するために、全体の混合物をＤａｍメチルトランスフェラーゼで次に処理した。試験ＤＮＡおよび他のＤＮＡの両方は、それらの配列にＧＡＴＣモチーフを含有する。次にＮｔＢｂｖＣＩを使用して混合物にニックを入れ、次にＤＮＡポリメラーゼＩおよび非標識のヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）とインキュベートし、次に７５℃で２０分の間熱不活性化した。次に、メチル化ＤＮＡだけを消化し、非メチル化または半メチル化ＤＮＡは消化しない、ＤｐｎＩで混合物を消化した。図１２は、試験ＤＮＡのメチル化が、それをＤｐｎＩ媒介切断に感受性にすることを示す。
【０２１７】
Ｃａｓ９ニッカーゼの発現および精製
変異体Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９のＤ１０Ａ変異体は、上記のようにＣａｓ９を生成するのに使用される同じ手法を使用して生成し、精製することができる。
【０２１８】
配列特異的Ｃａｓ９ニッカーゼ媒介ニッキング
以下の配列５’−ＧＧＡＴＴＴＡＴＡＣＡＧＣＡＣＴＴＴＡＡ−３’を標的にする希釈されたガイドＲＮＡ（１μｌ、２ピコモルに同等）を、３μｌの１０×Ｃａｓ９反応緩衝液（ＮＥＢ）、２０μｌのＨ２Ｏおよび１μｌの組換えＣａｓ９ニッカーゼ酵素（１０ピコモル／μｌ）と組み合わせた。この標的配列は、標的ＤＮＡの上にのみ存在する（全ＤＮＡの５％または１％を占める）。反応を３７℃で１５分間インキュベートし、次に５μｌの希釈されたＤＮＡ（全１００ｎｇ）を補充し、３７℃でのインキュベーションを９０分間継続した。１：１００の希釈でＲＮアーゼＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えることによって反応を終了し、次に、ＰＣＲクリーンアップキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＤＮＡを精製し、３０μｌの１０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ８で溶出した。次に使用時まで反応を−２０℃で保存した。
【０２１９】
非標識ＤＮＡニックトランスレーション
ニック入りのＤＮＡを、５’＞３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、ニックでＤＮＡ合成を開始することが可能であり、したがってそれがニック下流のヌクレオチドを標識ヌクレオチド（この手法の場合、ビオチン標識ヌクレオチド）で置き換えることを可能にする、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩとインキュベートした。ニック標識反応は、２５℃で３０分間、１単位のＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＮＥＢ）ならびに各々０．０２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを有する２０μｌのＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（ＮＥＢ）で実行した。反応は、７５℃で２０分間の熱不活性化によって終了する。
【０２２０】
ＤｐｎＩによる消化
次に、反応をＤｐｎＩ（ＮＥＢ）と３７℃で１時間インキュベートする。ＰＣＲクリーンアップキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＤＮＡを回収し、次に試験ＤＮＡ特異的プライマーを使用したＰＣＲの鋳型として使用する。
【０２２１】
（実施例６：目的の領域に隣接する長い３’オーバーハングを生成し、次にアダプターをこれらのオーバーハングにライゲートして標的ＤＮＡを濃縮するための、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ）の使用（ＤＮＡの捕捉のためのプロトコール６））
この方法の目的は、例えば図１３に表されるように、任意のＤＮＡ供与源（例えば、ライブラリー、ゲノムまたはＰＣＲ）からＤＮＡの領域を濃縮するために使用することができる。核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ）は、２つのガイドＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）を使用して近位部位に標的化され、各位置でＤＮＡのニッキングをもたらすことができる。あるいは、アダプターは１つの側だけでライゲートし、次にフィルインされ、その後アダプターを反対側でライゲートすることができる。２つのニックが互いに近くにあってよい（例えば、１０〜１５ｂｐ以内）。標的外の分子に、単一のニックを生成することができる。２つのニック部位が近接するため、反応を例えば６５℃に加熱したときに二本鎖切断を起こし、長い（例えば、１０〜１５ｂｐ）３’オーバーハングをもたらすことができる。これらのオーバーハングは、一本鎖アダプターの部位特異的ライゲーションを可能にするために、耐熱性の一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、例えば耐熱性の５’Ａｐｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼによって認識することができる。リガーゼは、例えば、長い３’オーバーハングだけを認識することができ、このように、アダプターが他の部位でライゲートされないことを確実にする。このプロセスは、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼおよび目的の領域の反対側を標的にするガイドＮＡを使用して繰り返し、その後第２の一本鎖アダプターを使用して上のようにライゲーションを続けることができる。２つのアダプターが目的の領域のいずれかの側にライゲートされると、領域を増幅させること、または直接的に配列決定をすることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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