(57)【要約】  本開示は、ｐＨ感受性の蛍光標識を用いてＲＰＥ細胞と視細胞前駆細胞の機能を試験するための、新規なファゴサイトーシスアッセイを提供する。
2018516535.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファゴサイトーシス活性を評価するための方法であって、
細胞が視細胞外節（ＰＯＳ）を貪食するのに十分な時間と温度で、細胞をＰＯＳとインキュベートすること、ここで、ＰＯＳは、より高いｐＨよりも酸性ｐＨにおいてより強く蛍光を発する、および
インキュベーション後に細胞の蛍光強度を検出すること、ここで、コントロールと比較した蛍光の増加は、細胞によるＰＯＳのファゴサイトーシスを示す、
を含む、前記方法。
【請求項２】
細胞が、およそ室温〜約３７℃、またはおよそ室温〜約４０℃の範囲の温度で、ＰＯＳとインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞が、およそ室温、およそ生理学的温度、または約３７℃で、ＰＯＳとインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞が、約１６〜２０時間の間、ＰＯＳとインキュベートされる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
細胞が、細胞培養として提供される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
細胞が、コンフルエントな細胞培養である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
細胞が、ＲＰＥ細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
細胞が、ヒトＲＰＥ細胞である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
細胞が、視細胞前駆細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞が、ヒト視細胞前駆細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＰＯＳが、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ色素により標識されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
コントロールが、室温未満でＰＯＳとインキュベートされた細胞である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
コントロールが、４℃でＰＯＳとインキュベートされた細胞である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
蛍光が、フローサイトメトリーにより検出される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
蛍光が、プレートリーダーを用いて検出される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ファゴサイトーシス活性を評価するための方法であって、
細胞内の低ｐＨコンパートメントへファゴサイトーシスにより取り込まれたときに、細胞外に存在するときの蛍光シグナルに対して相対的に変化した蛍光シグナルを有する、蛍光標識により、標識された視細胞外節（ＰＯＳ）を提供すること；
試験細胞を、標識されたＰＯＳのファゴサイトーシスが可能な条件下で、標識されたＰＯＳとインキュベートすること；ならびに
標識されたＰＯＳとのインキュベーション後に試験細胞において変化した蛍光があれば検出すること、およびそこから試験細胞のファゴサイトーシス活性を定量化すること
を含む、前記方法。
【請求項１７】
変化した蛍光シグナルが、蛍光標識が細胞外に存在するときに対して相対的な、蛍光シグナル強度の増加である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
変化した蛍光シグナルが、フローサイトメトリーにより検出可能である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
変化した蛍光シグナルが、ファゴサイトーシスにより取り込まれた標識されたＰＯＳと、試験細胞の表面に結合しているが取り込まれていない標識されたＰＯＳとを区別する、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
試験細胞中で検出される変化した蛍光シグナルが、試験細胞のファゴサイトーシス活性を定量化するために、標識されたＰＯＳとインキュベートされたコントロール細胞集団と比較される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
コントロール細胞集団が、室温未満で、標識されたＰＯＳとインキュベートされる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
試験細胞が、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を含む、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
試験細胞が、視細胞前駆細胞を含む、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
試験細胞が、ヒト細胞である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
試験細胞が、多能性幹細胞のインビトロ分化により産生される、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
試験細胞が、凍結保存され、使用前に解凍されたものである、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
蛍光標識が、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄである、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ＰＯＳが、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）ＲｅｄおよびｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓで標識されている、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
試験細胞集団のファゴサイトーシス活性を評価するための、標識された視細胞外節（ＰＯＳ）調製物であって、
ＰＯＳが、蛍光標識により標識されており、該蛍光標識が、細胞内の低ｐＨコンパートメントへファゴサイトーシスにより取り込まれたときに、蛍光標識が細胞外に存在するときの蛍光シグナルに対して相対的に変化した蛍光シグナルを有する、
前記調製物。
【請求項３０】
変化した蛍光シグナルが、細胞外に存在するときに対して相対的な、蛍光シグナル強度の増加である、請求項２９に記載の調製物。
【請求項３１】
変化した蛍光シグナルが、フローサイトメトリーにより検出可能である、請求項２９または３０に記載の調製物。
【請求項３２】
蛍光標識が、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄである、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項３３】
ＰＯＳが、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）ＲｅｄおよびｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓにより標識されている、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項３４】
細胞集団中のファゴサイトーシス活性を測定するための方法であって、
非ＦＩＴＣ蛍光標識された視細胞外節（ＰＯＳ）と接触した試験細胞集団における試験蛍光を測定すること、および
測定された試験蛍光をコントロール蛍光と比較すること、
を含み、
ここで、非ＦＩＴＣ蛍光標識されたＰＯＳは、酸性ｐＨにおいて蛍光を発するが、より高いｐＨにおいては、蛍光を発しないか最小限の蛍光を発する、
前記方法。
【請求項３５】
試験細胞集団が、およそ室温〜およそ生理学的温度、またはおよそ室温〜約４０℃の範囲の温度で、非ＦＩＴＣ蛍光標識されたＰＯＳと接触する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
コントロール蛍光が、室温未満で、非ＦＩＴＣ蛍光標識されたＰＯＳと接触した細胞集団の蛍光である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
試験細胞集団が、約１５〜４０℃の温度または生理学的温度で、非ＦＩＴＣ蛍光標識されたＰＯＳと接触する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
コントロール蛍光が、４℃で、非ＦＩＴＣ蛍光標識されたＰＯＳと接触した細胞集団の蛍光である、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ファゴサイトーシス活性を測定するための方法であって、
（１）ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ色素で標識された、蛍光標識された視細胞外節（ＰＯＳ）と、およそ室温〜およそ生理学的温度、またはおよそ室温〜約４０℃の範囲の温度で、インキュベートされた細胞集団の、第一の分割量における試験蛍光を測定すること、および
（２）ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ色素で標識された、蛍光標識されたＰＯＳと、室温未満でインキュベートされた細胞集団の、第二の分割量におけるコントロール蛍光を測定すること、を含み、
ここで、コントロール蛍光よりも強い試験蛍光は、細胞集団のファゴサイトーシス活性を示す、
前記方法。
【請求項４０】
細胞集団が、ＲＰＥ細胞集団である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
細胞集団が、視細胞前駆細胞集団である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
ファゴサイトーシス活性を測定するための方法であって、
（１）ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄで標識された視細胞外節（ＰＯＳ）単独と、もしくはｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓと共にｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄで標識された視細胞外節（ＰＯＳ）と、およそ室温〜およそ生理学的温度、またはおよそ室温〜約４０℃の範囲の温度で、インキュベートされた細胞集団の、第一の分割量における試験蛍光を測定すること、および
（２）ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ色素で蛍光標識された視細胞外節（ＰＯＳ）単独と、もしくはｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓと共にｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄで標識された視細胞外節（ＰＯＳ）と、室温未満でインキュベートされた細胞集団の、第二の分割量におけるコントロール蛍光を測定すること、を含み、
ここで、コントロール蛍光よりも強い試験蛍光は、細胞集団のファゴサイトーシス活性を示す、
前記方法。
【請求項４３】
細胞集団が、ＲＰＥ細胞集団である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
細胞集団が、ヒトＲＰＥ細胞集団である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
細胞集団が、視細胞前駆細胞集団である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
細胞集団が、ヒト視細胞前駆細胞集団である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
細胞、細胞集団、試験細胞または試験細胞集団が、使用前に酵素で消化されている、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
細胞、細胞集団、試験細胞または試験細胞集団が、付着細胞集団として提供される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
ＰＯＳが、断片化されたＰＯＳである、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
ＰＯＳが、超音波処理されたＰＯＳである、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
細胞集団のファゴサイトーシス活性を評価するための方法であって、
細胞集団中の細胞が視細胞外節（ＰＯＳ）を貪食するのに十分な時間と温度で、付着細胞集団をＰＯＳとインキュベートすること、ここで、ＰＯＳは、より高いｐＨよりも酸性ｐＨにおいてより強く蛍光を発する、および
インキュベーション後に細胞集団の蛍光強度を検出すること、ここで、コントロールと比較した蛍光の増加は、細胞によるＰＯＳのファゴサイトーシスを示す、を含み、
任意に、細胞集団は、単層として、さらに任意にはコンフルエントな単層として、提供される、
前記方法。
【請求項５２】
細胞集団が、約１７〜４０℃、または約２５〜４０℃、または約３４〜４０℃の範囲の温度で、あるいは約３７℃の温度で、ＰＯＳとインキュベートされる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
細胞が、ＲＰＥ細胞または視細胞前駆細胞である、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
細胞が、ヒト細胞である、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
ＰＯＳが、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ色素により標識されている、請求項５１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
コントロールが、約１２〜１５℃の温度でＰＯＳとインキュベートされた細胞集団である、請求項５１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
蛍光が、プレートリーダーを用いて検出される、請求項５１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
ファゴサイトーシス活性を評価するための方法であって、
細胞内の低ｐＨコンパートメントへファゴサイトーシスにより取り込まれたときに、細胞外に存在するときの蛍光シグナルに対して相対的に変化した蛍光シグナルを有する、蛍光標識により、標識された視細胞外節（ＰＯＳ）を提供すること；
付着試験細胞を、標識されたＰＯＳのファゴサイトーシスが可能な条件下、標識されたＰＯＳと約１７〜４０℃の範囲の温度でインキュベートすること；ならびに
標識されたＰＯＳとのインキュベーション後に付着試験細胞において変化した蛍光があれば検出すること、およびそこから付着試験細胞のファゴサイトーシス活性を定量化すること
を含む、前記方法。
【請求項５９】
付着試験細胞が、約２５〜４０℃、または約３４〜４０℃の範囲の温度で、あるいは約３７℃の温度で、標識されたＰＯＳとインキュベートされる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
付着試験細胞中で検出される変化した蛍光シグナルが、試験細胞のファゴサイトーシス活性を定量化するために、標識されたＰＯＳと約１２〜１５℃の範囲の温度でインキュベートされたコントロール細胞集団と比較される、請求項５８または５９に記載の方法。
【請求項６１】
付着試験細胞が、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞または視細胞前駆細胞を含む、請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
付着試験細胞が、ヒト細胞である、請求項５８〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
付着試験細胞が、多能性幹細胞のインビトロ分化により産生される、請求項５８〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
蛍光標識が、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄである、請求項５８〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
ＰＯＳが、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）ＲｅｄおよびｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓである、請求項５８〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
付着細胞集団中のファゴサイトーシス活性を測定するための方法であって、
非ＦＩＴＣ蛍光標識された視細胞外節（ＰＯＳ）と接触した付着試験細胞集団における試験蛍光を測定すること、および
測定された試験蛍光をコントロール蛍光と比較すること、
を含み、
ここで、非ＦＩＴＣ蛍光標識されたＰＯＳは、酸性ｐＨにおいて蛍光を発するが、より高いｐＨにおいては、蛍光を発しないか最小限の蛍光を発する、
前記方法。
【請求項６７】
試験細胞集団が、約１７〜４０℃、または約２５〜４０℃、または約３４〜４０℃の範囲の温度で、あるいは約３７℃の温度で、非ＦＩＴＣ蛍光標識されたＰＯＳと接触する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
コントロール蛍光が、約１２〜１５℃の温度で、非ＦＩＴＣ蛍光標識されたＰＯＳと接触した付着細胞集団の蛍光である、請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項６９】
ファゴサイトーシス活性を測定するための方法であって、
（１）ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ色素で標識された、蛍光標識された視細胞外節（ＰＯＳ）と、約１７〜４０℃、または約２５〜４０℃、または３４〜４０℃の範囲の温度で、あるいは３７℃の温度で、インキュベートされた付着細胞集団の、第一の分割量における試験蛍光を測定すること、および
（２）ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ色素で標識された、蛍光標識されたＰＯＳと、約１２〜１５℃の範囲の温度で、インキュベートされた付着細胞集団の、第二の分割量におけるコントロール蛍光を測定すること、を含み、
ここで、コントロール蛍光よりも強い試験蛍光は、細胞集団のファゴサイトーシス活性を示す、
前記方法。
【請求項７０】
ファゴサイトーシス活性を測定するための方法であって、
（１）ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ色素で標識された視細胞外節（ＰＯＳ）単独と、もしくはｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓと共にｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ色素で標識された視細胞外節（ＰＯＳ）と、約１７〜４０℃、または約２５〜４０℃、または３４〜４０℃の範囲の温度で、あるいは、約３７℃の温度でインキュベートされた付着細胞集団の、第一の分割量における試験蛍光を測定すること、および
（２）ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄで標識された視細胞外節（ＰＯＳ）単独と、もしくはｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓと共にｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄで標識された視細胞外節（ＰＯＳ）と、約１２〜１５℃の範囲の温度でインキュベートされた付着細胞集団の、第二の分割量におけるコントロール蛍光を測定すること、を含み、
ここで、コントロール蛍光よりも強い試験蛍光は、細胞集団のファゴサイトーシス活性を示す、
前記方法。
【請求項７１】
細胞、細胞集団、試験細胞、または試験細胞集団が、使用前に酵素で消化されている、請求項５１〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
ＰＯＳが、断片化されたＰＯＳである、請求項５１〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
ＰＯＳが、超音波処理されたＰＯＳである、請求項５１〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年３月２３日に出願された「IMPROVED ASSAYS FOR POTENCY OF HUMAN RPE CELLS AND PHOTORECEPTOR PROGENITORS（ヒトＲＰＥ細胞および視細胞前駆細胞の能力に関する改善されたアッセイ）」と題する米国仮特許出願第62/136,660号の米国特許法１１９条(e)に基づく利益を主張し、その全体が参照により組み込まれる。
技術分野
【０００２】
本発明は、視細胞桿体外節のファゴサイトーシス（phagocytosis）を測定するためのインビトロでの細胞に基づいた方法の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
網膜色素上皮（retinal pigment epithelium）（ＲＰＥ）は、下層の脈絡膜（網膜背後の血管層）と、それに重なる網膜視細胞（visual cell）（例えば、視細胞（photoreceptor）の桿体および錐体）の間の、神経感覚網膜の外部にある色素性（pigmented）細胞層である。ＲＰＥは、視細胞の機能と健康および網膜にとって重要である。ＲＰＥは、光色素を再循環させ、ビタミンＡを送達、代謝および貯蔵し、桿体視細胞外節を貪食し、網膜と脈絡膜の間で鉄および小型分子を輸送し、ブルッフ膜を維持し、ならびに迷光を吸収して、より良い画像分解能を可能にすることにより、視細胞機能を維持する。例えば、WO2009/051671；Engelmann and Valtink (2004)”RPE Cell Cultivation.” Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology 242(1):65-67;Irina Klimanskaya, Retinal Pigment Epithelium Derived From Embryonic Stem Cells, STEM CELL ANTHOLOGY 335-346 (Bruce Carlson ed., 2009)を参照。
【０００４】
ＲＰＥの変性は、先天性脈絡膜欠如（choroideremia）、糖尿病性網膜症、（加齢性黄斑変性、ＡＭＤを含む）黄斑変性、およびスタルガルト黄斑変性（ＳＭＤ）などの視細胞損傷と失明をもたらす、視覚を変化させる数々の疾患と関連付けられている、網膜剥離、網膜異形成、または網膜萎縮を引き起こし得るが、後者の２つは、それぞれ世界的に成人および若年性失明原因のトップ２である。どちらも現在は治療不可能であるが、黄斑変性の前臨床モデルにおいては、ｈＥＳＣ由来ＲＰＥの移植が、視細胞を救済して視力喪失を阻止し得ることが証明されている（Lund RD, Wang S, Klimanskaya I, et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic rats. Cloning and Stem Cells 2006; 8,189-199; Lu B, Malcuit C, Wang S, et al.  Long-term safety and function of RPE from human embryonic stem cells in preclinical models of macular degeneration. Stem Cells 2009; 21, 2125-2135)。
【０００５】
また、有糸分裂後（post-mitotic）神経細胞のさらなる喪失も、上記疾患の一部に関与している。これらの網膜疾患には、桿体もしくは錐体ジストロフィー、網膜変性、網膜色素変性症（ＲＰ）、糖尿病性網膜症、黄斑変性、レーバー先天性黒内障およびスタルガルト病（黄色斑眼底）が挙げられる。網膜変性の多くの症例においては、細胞の喪失は主に、桿体および錐体視細胞を含む外核層（ＯＮＬ）に生じる。
【０００６】
視細胞（photoreceptor cell）の潜在的な代替ソースとしては幹細胞が含まれる。初期の研究では、失われた視細胞に対する代替細胞の可能なソースとして、マウス細胞、マウス幹細胞、または網膜前駆細胞の異種集団が評価されていた。これらの初期研究は、生後１日のマウス網膜由来の視細胞前駆細胞（photoreceptor precursor cell）の移植（Maclaren et al. Nature 444(9):203-207, 2006)、マウス胚性幹細胞からのインビトロにおける網膜前駆細胞の作製（Ikeda et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 102(32):11331-11336, 2005）、生後１日のマウス網膜からの網膜前駆細胞の作製（Klassen et al. Invest. Ophthal. Vis. Sci. 45(11):4167-4175, 2004）、網膜変性ＲＣＳラットモデルにおける骨髄間葉幹細胞の移植（Inoue et al. Exp. Eye Res. 8(2):234-241, 2007）、Ｈ１ヒト胚性幹細胞株からの、神経節細胞、アマクリン細胞、全細胞中の０．０１％がＳ−オプシンもしくはロドプシンを発現する視細胞、双極細胞および水平細胞を含む、網膜前駆細胞の産生（Lamba et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 10(34):12769-12774, 2006）、ならびにヒト繊維芽細胞から誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳ）の、網膜前駆細胞を産生するための誘導（Lamba et al. PLoS ONE 5(1):e8763. doi:10.1371/ journal.pone.0008763）について記載されていた。
【０００７】
これらアプローチのいずれも、移植のために均一集団の視細胞前駆細胞または視細胞を産生していない。これらアプローチのいずれも、均一集団の、インビボにおける（例えば、視力の改善をもたらすことにより検出できる）桿体もしくは錐体機能を示す視細胞前駆細胞または視細胞を産生していない。視細胞や視細胞前駆細胞が単離され得るドナー由来の組織の供給（死体や胎児組織および生存動物などの）は限られている。
【０００８】
幹細胞は、増殖させて、インビトロで無限に拡大することが可能であり、ヒトの治療のための非ドナー由来細胞の潜在的非枯渇性ソースを提供する。均一集団の視細胞前駆細胞や視細胞への幹細胞の分化は、網膜疾患の移植および処置のための非ドナー由来細胞の十分な供給を提供し得る。視細胞前駆細胞は貪食活性を持っていてもよい。
【０００９】
ＲＰＥ細胞を作製する方法、ＲＰＥ細胞組成物、およびＲＰＥ細胞に関する（ファゴサイトーシスアッセイを含む）リリースアッセイを含む特定の主題は、２０１０年１１月１７日に出願された、共有の米国特許出願第13/510,426号およびPCT US2012/65091に開示されており、かかる教示は参照により本明細書に組み込まれる。視細胞前駆細胞を作製する方法、ならびに、視細胞前駆細胞組成物および機能を試験する方法（ファゴサイトーシスアッセイを含む）を含む特定の主題は、共有のPCT US2014/029790に開示されており、かかる教示は参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【００１０】
要約
ＦＩＴＣ標識された視細胞外節（Photoreceptor Outer Segment）（ＯＳ）（通常、ウシまたはブタ）は、インビトロにおける網膜色素上皮（ＲＰＥ）によるファゴサイトーシスを研究するために用いられてきた。しかしながら、ファゴサイトーシスの評価（ＦＡＣＳ、蛍光プレートリーダー）に用いられる定量的方法の多くは、表面に結合した粒子と取り込まれた粒子とを区別しないため、ファゴサイトーシスにおける表面受容体の結合および取り込みの段階に関与するメカニズムに具体的に対処することを可能にしない。加えて、リソソームおよびリソソームに融合したファゴソームのｐＨが５未満である一方で、ＦＩＴＣ蛍光はｐＨ感受性であり、ｐＨ６未満で顕著に減少する。したがって、ＦＩＴＣ標識されたＯＳは、取り込まれたＯＳの量を正確には表さないかもしれない。
【００１１】
本明細書においては、視細胞外節が取り込まれるファゴサイトーシスの検出、ＲＰＥ細胞および視細胞前駆細胞の重要な機能測定、ならびに、結果として桿体もしくは錐体ジストロフィー、網膜変性、網膜色素変性症、先天性脈絡膜欠如、糖尿病性網膜症、黄斑変性（加齢性黄斑変性および近視性黄斑変性を含む）、レーバー先天性黒内障およびスタルガルト病（黄色斑眼底）などの網膜疾患を処置するのに用いられる、ＲＰＥ細胞および視細胞前駆細胞についての重要なリリース基準のための、より感受性かつ正確なアッセイが提供される。例えば、WO2009/051671を参照。
【００１２】
本明細書において記載されるＲＰＥ細胞は、移植後も機能性である。この目的を達成するため、ＲＰＥ細胞は、移植細胞を受け取る対象（または患者）における感覚神経網膜と脈絡膜の間の単層を形成する。ＲＰＥ細胞はまた、隣接する視細胞に栄養を供給してもよく、ファゴサイトーシスにより脱落した視細胞外節を処理してもよい。
【００１３】
移植に適したＲＰＥ細胞は、ファゴサイトーシス活性に限定されないがこれを含む、数々の機能的および／または表現型特性に基づき選択されてもよい。例えば、移植に適したＲＰＥ細胞は、そのファゴサイトーシス活性およびその増殖能にしたがって評価されてもよい。例えば、ＲＰＥ細胞は、眼球ドナー（eye donor）由来の細胞よりも優れた増殖能を有してもよい（例えば、ＲＰＥ細胞は、眼球ドナーのＲＰＥ細胞よりも「若い」）。これにより、本明細書に記載されているＲＰＥ細胞は、眼球ドナー由来の細胞よりも長い有用な寿命を有することが可能になる。
【００１４】
臨床的状況におけるＰＲＥ細胞の有効性に対する重要なパラメータの一つは、ＲＰＥ細胞の医薬製剤の視細胞外節ファゴサイトーシス活性の定量的測定である。外節のファゴサイトーシスは、ＲＰＥ細胞中の低ｐＨコンパートメントにおける貪食された細胞断片の蓄積をもたらす。本発明は、分光光度シグナルを提供するように分光光度法で検出可能である検出可能なマーカーに関連付け（すなわち、共有結合的にまたは非共有結合的に）されている視細胞外節を提供し、検出可能なマーカーは、中性ｐＨまたは生理学的ｐＨ、すなわちｐＨ７〜７．５において存在するときは第一の分光光度シグナルを、およびリソソーム、ファゴソーム、エンドソームなどの、低ｐＨ環境の細胞内コンパートメントに存在するときは第二の分光光度シグナルを、有するように選択性である。第一および第二の分光光度シグナル間の違いは、蛍光発光の程度の一種以上（中性ｐＨに対して相対的な低ｐＨにおける増加した強度）、中性ｐＨおよび低ｐＨ間の蛍光発光波長における変化、中性ｐＨおよび低ｐＨ間の蛍光励起波長における変化などであってもよい。
【００１５】
特定の態様においては、検出可能なマーカーは蛍光色素（fluorescent dye）などの蛍光ｐＨセンサーであり得る。本発明において用いることが可能な典型的な蛍光色素は、ｐＨ感受性インジケーター（indicator）部分としてアミノ基（脂肪族または芳香族）を有する蛍光色素部分、すなわち、ＲＰＥ細胞と外節とが一緒にインキュベートされる培養培地のｐＨ（すなわち、中性または生理学的ｐＨ）において非プロトン化され、ファゴサイトーシスによりＲＰＥ細胞などの細胞によって外節が吸収される細胞内コンパートメントのｐＨにおいてプロトン化されるアミンであり得る。このような色素が光子を吸収すると、励起電子状態を生じ、アミノ基の非共有電子対が励起により空になった軌道に移動する。光誘起電子移動（ＰＥＴ）と呼ばれるこのような電子移動は、励起された分子が発光遷移することを阻み、したがって、色素の蛍光が消光する。アミノ基のプロトン化は、電子対の軌道の性質およびエネルギーを変化させ、ＰＥＴを停止させる。結果として、蛍光レポーター部分は、ｐＨの変化に反応する。アミノ基のプロトン化は、消光を打ち消すため、ＰＥＴに基づくセンサーは、ｐＨが減少するにつれより蛍光を発する。
【００１６】
特定の態様においては、蛍光色素は、WO2005/098437に記載されているような、ローダミンに基づいたｐＨ感受性色素である。このような色素は、キサンテン部分に対するオルト位が−ＯＨもしくは−ＳＨ（またはその脱プロトン化形態）により置換されたベンゼン環を有する。このような色素は、アミンＰＥＴインジケーターに類似したｐＨ依存性を示すが、ｐＨが６未満である細胞コンパートメントを標的とするｐＨセンサーに対する認識された必要性に基づいて、６未満のｐＫａ値を有するように設計されている。
【００１７】
他の典型的態様においては、蛍光マーカーは、ｐＨ感受性蛍光ナノ粒子である。ｐＨ感受性蛍光ナノ粒子は、主に、小分子ｐＨ感受性色素に結合したポリマー(Srikun, D., J. Chem. Sci. 2011, 2, 1156; Benjaminsen, R. V., ACS Nano 2011, 5, 5864; Albertazzi, L., J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 18158; Urano, Y., Nat. Med. 2009, 15, 104)、またはｐＨ非感受性色素に結合したｐＨ感受性リンカーの使用(Li, C, Adv. Fund. Mater. 2010, 20, 2222; Almutairi, J. Am. Chem. Soc. 2007, 130, 444.)を採用している。さらに説明すると、WO2013152059は、本アッセイにおける使用に適用可能な、ｐＨ可変性の（pH-tunable）高度に活性化可能な多色蛍光ナノプラットフォーム（nanoplatform）を記載している。
【００１８】
したがって、本明細書では、一つの側面において、ファゴサイトーシス活性を評価するための方法であって、細胞が視細胞外節（ＰＯＳ）を貪食するのに十分な時間と温度で、細胞をＰＯＳとインキュベートすること、ここで、ＰＯＳは、より高いｐＨよりも酸性ｐＨにおいてより強く蛍光を発する、および、インキュベーション後に細胞の蛍光強度を検出すること、ここで、コントロールと比較した蛍光の増加は、細胞によるＰＯＳのファゴサイトーシスを示す、を含む前記方法が提供される。
【００１９】
いくつかの態様においては、細胞は、およそ室温〜約３７℃、またはおよそ室温〜約４０℃の範囲の温度で、ＰＯＳとインキュベートされる。いくつかの態様においては、細胞は、およそ室温、およそ生理学的温度、または約３７℃で、ＰＯＳとインキュベートされる。
いくつかの態様においては、コントロールは、室温未満でＰＯＳとインキュベートされた細胞である。いくつかの態様においては、コントロールは、４℃でＰＯＳとインキュベートされた細胞である。
【００２０】
また、本明細書においては、付着細胞集団（adherent cell population）のファゴサイトーシス活性を評価するための方法であって、細胞集団中の細胞が視細胞外節（ＰＯＳ）を貪食するのに十分な時間と温度で、付着細胞集団をＰＯＳとインキュベートすること、ここで、ＰＯＳは、より高いｐＨよりも酸性ｐＨにおいてより強く蛍光を発する、および、インキュベーション後に細胞集団の蛍光強度を検出すること、ここで、コントロールと比較した蛍光の増加は、細胞によるＰＯＳのファゴサイトーシスを示す、を含む前記方法も提供される。
【００２１】
いくつかの態様において、付着細胞集団は、約１７〜４０℃、または約２５〜４０℃、または約３４〜４０℃の範囲の温度で、あるいは約３７℃の温度で、ＰＯＳとインキュベートされる。いくつかの態様において、コントロールは、約１０〜１６℃の温度でＰＯＳとインキュベートされた細胞集団である。いくつかの態様において、コントロールは、約１２〜１５℃の温度でＰＯＳとインキュベートされた細胞集団である。
【００２２】
また、本明細書においては、ファゴサイトーシス活性を評価するための方法であって、細胞内の低ｐＨコンパートメントへファゴサイトーシスにより取り込まれたときに、細胞外に存在するときの蛍光シグナルに対して相対的に変化した蛍光シグナル（altered fluorescence signal）を有する、蛍光標識により、標識された視細胞外節（ＰＯＳ）を提供すること；試験細胞を、標識されたＰＯＳのファゴサイトーシスが可能な条件下で、標識されたＰＯＳとインキュベートすること；ならびに、標識されたＰＯＳとのインキュベーション後に試験細胞において変化した蛍光があれば検出すること、およびそこから試験細胞のファゴサイトーシス活性を定量化すること、を含む前記方法も提供される。
【００２３】
いくつかの態様において、（標識が、低ｐＨコンパートメントへファゴサイトーシスにより取り込まれたときに）変化した蛍光シグナルは、蛍光標識が細胞外に存在するときに対して相対的な、蛍光シグナル強度の増加である。いくつかの態様において、（標識が、低ｐＨコンパートメントへファゴサイトーシスにより取り込まれたときに）変化した蛍光シグナルは、フローサイトメトリーにより検出可能である。いくつかの態様においては、変化した蛍光シグナルは、ファゴサイトーシスにより取り込まれた標識されたＰＯＳと、試験細胞の表面に結合しているが取り込まれていない標識されたＰＯＳとを区別する。いくつかの態様においては、試験細胞中で検出される変化した蛍光シグナルが、試験細胞のファゴサイトーシス活性を定量化するために、標識されたＰＯＳとインキュベートされたコントロール細胞集団と比較される。
【００２４】
いくつかの態様において、試験細胞は、およそ室温で、およそ生理学的温度で、約３７℃で、約１５〜４０℃で、あるいは室温〜３７℃の間で、または室温〜４０℃の間で、標識されたＰＯＳとインキュベートされる。
いくつかの態様においては、コントロール細胞集団は、約４℃を含む室温未満で、標識されたＰＯＳとインキュベートされる。
【００２５】
ファゴサイトーシス活性を評価するための方法であって、細胞内の低ｐＨコンパートメントへファゴサイトーシスにより取り込まれたときに、細胞外に存在するときの蛍光シグナルに対して相対的に変化した蛍光シグナルを有する、蛍光標識により、標識された視細胞外節（ＰＯＳ）を提供すること；付着試験細胞を、標識されたＰＯＳのファゴサイトーシスが可能な条件下で、標識されたＰＯＳとインキュベートすること；ならびに、標識されたＰＯＳとのインキュベーション後に付着試験細胞において変化した蛍光があれば検出すること、およびそこから付着試験細胞のファゴサイトーシス活性を定量化すること、を含む前記方法もまた、提供される。
【００２６】
いくつかの態様において、試験細胞は、約１７〜４０℃、または約２５〜４０℃、または約３４〜４０℃の範囲の温度で、あるいは約３７℃の温度で、ＰＯＳとインキュベートされる。いくつかの態様において、付着試験細胞中で検出される変化した蛍光シグナルは、試験細胞のファゴサイトーシス活性を定量化するために、細胞の生存能力は維持されるがファゴサイトーシスを低い程度に惹起するかもしくは全く惹起しない温度（任意に、そのような温度は、約１２〜１５℃の範囲であってもよい）で、標識されたＰＯＳとインキュベートされたコントロール細胞集団と比較される。いくつかの態様において、コントロール細胞集団は、約１０〜１６℃の温度でＰＯＳとインキュベートされる。
【００２７】
本明細書においては、試験細胞集団のファゴサイトーシス活性を評価するための、標識された視細胞外節（ＰＯＳ）調製物であって、ＰＯＳが蛍光標識により標識されており、該蛍光標識が、細胞内の低ｐＨコンパートメントへファゴサイトーシスにより取り込まれたときに、蛍光標識が細胞外に存在するときの蛍光シグナルに対して相対的に変化した蛍光シグナルを有する、前記調製物もまた提供される。いくつかの態様において、（標識が、低ｐＨコンパートメントへファゴサイトーシスにより取り込まれたときに）変化した蛍光シグナルは、細胞外に存在するときに対して相対的な、蛍光シグナル強度の増加である。いくつかの態様において、（標識が、低ｐＨコンパートメントへファゴサイトーシスにより取り込まれたときに）変化した蛍光シグナルは、フローサイトメトリーにより検出可能である。いくつかの態様において、蛍光標識は、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄである。いくつかの態様において、ＰＯＳは、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）ＲｅｄおよびｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓにより標識されている。
【００２８】
また本明細書においては、細胞集団中のファゴサイトーシス活性を測定するための方法であって、非ＦＩＴＣ蛍光標識された視細胞外節（ＰＯＳ）と接触した試験細胞集団における試験蛍光を測定すること、および測定された試験蛍光をコントロール蛍光と比較すること、を含み、ここで、非ＦＩＴＣ蛍光標識されたＰＯＳは、酸性ｐＨにおいて蛍光を発するが、より高いｐＨにおいては、蛍光を発しないか最小限の蛍光を発する、前記方法も提供される。
【００２９】
いくつかの態様において、試験細胞集団は、例えば３７℃を含むおよそ室温〜およそ生理学的温度（すなわち、およそ室温〜約３７℃）、またはおよそ室温〜約４０℃の範囲の温度で、非ＦＩＴＣ蛍光標識されたＰＯＳと接触する。いくつかの態様において、試験細胞集団は、例えば約３７℃を含む、約１５〜４０℃の間の温度またはおよそ生理学的温度で、非ＦＩＴＣ蛍光標識されたＰＯＳと接触する。いくつかの態様において、コントロール蛍光は、室温未満で、非ＦＩＴＣ蛍光標識されたＰＯＳと接触した細胞集団の蛍光である。いくつかの態様において、コントロール蛍光は、４℃で、非ＦＩＴＣ蛍光標識されたＰＯＳと接触した細胞集団の蛍光である。
【００３０】
本明細書においてはまた、付着細胞集団中のファゴサイトーシス活性を測定するための方法であって、非ＦＩＴＣ蛍光標識された視細胞外節（ＰＯＳ）と接触した付着試験細胞集団における試験蛍光を測定すること、および測定された試験蛍光をコントロール蛍光と比較すること、を含み、ここで、非ＦＩＴＣ蛍光標識されたＰＯＳは、酸性ｐＨにおいて蛍光を発するが、より高いｐＨにおいては、蛍光を発しないか最小限の蛍光を発する、前記方法も提供される。
【００３１】
いくつかの態様において、試験細胞集団は、約１７〜４０℃、または約２５〜４０℃、または約３４〜４０℃の範囲の温度で、あるいは約３７℃の温度で、非ＦＩＴＣ蛍光標識されたＰＯＳと接触する。いくつかの態様において、コントロール蛍光は、約１２〜１５℃の温度で、非ＦＩＴＣ蛍光標識されたＰＯＳと接触した付着細胞集団の蛍光である。いくつかの態様において、コントロール蛍光は、約１０〜１６℃の温度で、非ＦＩＴＣ蛍光標識されたＰＯＳと接触した付着細胞集団の蛍光である。
【００３２】
本明細書においてはまた、ファゴサイトーシス活性を測定するための方法であって、（１）ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ色素で標識された、蛍光標識された視細胞外節（ＰＯＳ）と、例えば３７℃を含むおよそ室温〜およそ生理学的温度、またはおよそ室温〜約４０℃の範囲の温度で、インキュベートされた細胞集団の、第一の分割量（first aliquot）における試験蛍光を測定すること、および（２）ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ色素で標識された、蛍光標識されたＰＯＳと、室温未満でインキュベートされた細胞集団の、第二の分割量（second aliquot）におけるコントロール蛍光を測定すること、を含み、ここで、コントロール蛍光よりも強い試験蛍光は、細胞集団のファゴサイトーシス活性を示す、前記方法も提供される。
【００３３】
本明細書においては、ファゴサイトーシス活性を測定するための方法であって、（１）ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ色素で標識された、蛍光標識された視細胞外節（ＰＯＳ）と、インキュベートされた付着細胞集団の、第一の分割量における試験蛍光を測定すること、および（２）ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ色素で標識された、蛍光標識されたＰＯＳと、インキュベートされた付着細胞集団の、第二の分割量におけるコントロール蛍光を測定すること、を含み、ここで、コントロール蛍光よりも強い試験蛍光は、細胞集団のファゴサイトーシス活性を示す、前記方法もまた提供される。
【００３４】
いくつかの態様において、付着細胞集団の第一の分割量は、約１７〜４０℃、または約２５〜４０℃、または約３４〜４０℃の範囲の温度で、あるいは約３７℃の温度で、標識されたＰＯＳと接触する。いくつかの態様において、付着細胞集団の第二の分割量は、約１０〜１６℃または約１２〜１５℃の範囲の温度で、標識されたＰＯＳとインキュベートされる。
【００３５】
本明細書においては、ファゴサイトーシス活性を測定するための方法であって、（１）ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄで標識された視細胞外節（ＰＯＳ）単独と、もしくはｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓと共にｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄで標識された視細胞外節（ＰＯＳ）と、３７℃を含むおよそ室温〜およそ生理学的温度、またはおよそ室温〜約４０℃の範囲の温度で、インキュベートされた細胞集団の、第一の分割量における試験蛍光を測定すること、および（２）ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄで標識された視細胞外節（ＰＯＳ）単独と、もしくはｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓと共にｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄで標識された視細胞外節（ＰＯＳ）と、４℃を含む室温未満でインキュベートされた細胞集団の、第二の分割量におけるコントロール蛍光を測定すること、を含み、ここで、コントロール蛍光よりも強い試験蛍光は、細胞集団のファゴサイトーシス活性を示す、前記方法もまた提供される。
【００３６】
また本明細書においては、ファゴサイトーシス活性を測定するための方法であって、（１）ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄで標識された視細胞外節（ＰＯＳ）単独と、もしくはｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓと共にｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄで標識された視細胞外節（ＰＯＳ）と、約１７〜４０℃、または約２５〜４０℃、または約３４〜４０℃の範囲の温度で、あるいは約３７℃の温度で、インキュベートされた付着細胞集団の、第一の分割量における試験蛍光を測定すること、および（２）ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄで標識された視細胞外節（ＰＯＳ）単独と、もしくはｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓと共にｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄで標識された視細胞外節（ＰＯＳ）と、約１０〜１６℃または約１２〜１５℃の範囲の温度で、インキュベートされた付着細胞集団の、第二の分割量におけるコントロール蛍光を測定すること、を含み、ここで、コントロール蛍光よりも強い試験蛍光は、細胞集団のファゴサイトーシス活性を示す、前記方法も提供される。
【００３７】
種々の態様は、上記側面のいずれかおよび全てに対して均等に適用される。これは下記に列挙される。
いくつかの態様において、細胞、細胞集団、試験細胞、または試験細胞集団は、ＰＯＳと、およそ室温で、およそ生理学的温度で、約３７℃で、またはおよそ室温〜４０℃、またはおよそ室温〜３７℃、または約１５〜４０℃で、インキュベートされる。いくつかの態様においては、コントロール細胞集団は、約４℃を含む室温未満で、標識されたＰＯＳとインキュベートされる。いくつかの態様において、細胞、細胞集団、試験細胞、または試験細胞集団は、約１７〜４０℃、または約２５〜４０℃、または約３４〜４０℃の範囲の温度で、あるいは約３７℃の温度で、標識されたＰＯＳとインキュベートされる。
【００３８】
いくつかの態様において、コントロール細胞、コントロール細胞集団、コントロール試験細胞、またはコントロール試験細胞集団は、ＰＯＳと、室温未満で、約１０〜１６℃、もしくは約１２〜１５℃の範囲の温度で、または約４℃の温度で、インキュベートされる。
【００３９】
いくつかの態様において、細胞、細胞集団、試験細胞、または試験細胞集団は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を含む。いくつかの態様において、細胞、細胞集団、試験細胞、または試験細胞集団は、視細胞前駆細胞を含む。いくつかの態様において、細胞、細胞集団、試験細胞、または試験細胞集団は、ヒト細胞である。
いくつかの態様において、細胞、細胞集団、試験細胞、または試験細胞集団は、多能性幹細胞のインビトロ分化により産生される。
いくつかの態様において、細胞、細胞集団、試験細胞、または試験細胞集団は、凍結保存され、使用前に解凍される。
【００４０】
いくつかの態様において、細胞、細胞集団、試験細胞、または試験細胞集団は、コンフルエントな単層として提供される。
いくつかの態様において、細胞、細胞集団、試験細胞、または試験細胞集団は、使用前に酵素で消化されている。
いくつかの態様において、細胞、細胞集団、試験細胞、または試験細胞集団は、付着細胞集団として提供される。
いくつかの態様において、ＰＯＳは、断片化されたＰＯＳである。いくつかの態様において、ＰＯＳは、超音波処理されたＰＯＳである。
【００４１】
いくつかの態様において、蛍光標識は、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄである。したがって、いくつかの態様においては、ＰＯＳは、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ色素により標識される。いくつかの態様において、ＰＯＳは、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）ＲｅｄおよびｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓにより標識される。いくつかの態様において、細胞は、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄで標識されたＰＯＳおよびｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓとインキュベートされる。
【００４２】
いくつかの態様において、蛍光は、フローサイトメトリーにより検出される。いくつかの態様において、蛍光は、プレートリーダーを用いて検出される。
いくつかの態様において、細胞は、ＰＯＳと、約１５〜３０時間、または１６〜２０時間、または２０〜２８時間の間インキュベートされる。
いくつかの態様において、細胞は、細胞培養として提供される。いくつかの態様において、細胞は、コンフルエントな細胞培養である。
試験およびコントロール細胞は、同じ細胞集団の異なる分割量（aliquot）であり得ることが理解されるべきである。
【００４３】
他の側面において、本開示は、同等数の初代細胞のＰＯＳのファゴサイトーシス速度よりも少なくとも５０％速い、視細胞外節（ＰＯＳ）のファゴサイトーシス速度を有することとして特徴づけられる、単離された細胞集団を提供する。いくつかの態様において、細胞集団はＲＰＥ細胞集団である。いくつかの態様において、細胞集団は、多能性幹細胞のインビトロ分化により得られるＲＰＥ細胞集団であり、初代細胞は、単離された成人眼球由来のＲＰＥ細胞である。いくつかの態様において、細胞集団は、視細胞前駆細胞である。
これらおよび種々の他の側面および態様は、本明細書においてより詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１Ａ−Ｃ】ＲＰＥによるファゴサイトーシスのＦＡＣＳ解析（Ａ）ＦＩＴＣで標識されたＲＯＳ。（Ｂ）ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）で標識されたＲＯＳ。ＲＯＳが加えられていないコントロール、ＲＯＳが加えられ細胞が４℃でインキュベートされたコントロール、およびＲＯＳが加えられ細胞が３７℃でインキュベートされた試験（test）のプロットが示される。（Ｃ）ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）で標識されたＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓ（バクテリア断片）。粒子が加えられていないコントロール、粒子が加えられ細胞が４℃でインキュベートされたコントロール、および粒子が加えられ細胞が３７℃でインキュベートされた試験のプロットが示される。本明細書においては、ＰＯＳとＲＯＳは、視細胞桿体外節を言及するのに交換可能に用いられることが理解されるべきである。
【００４５】
【図２Ａ−Ｂ】ＦＩＴＣ（Ａ）およびｐＨｒｏｄｏ（登録商標）（Ｂ）で標識されたＲＯＳの蛍光のｐＨ依存性。中性ｐＨと酸性ｐＨにおける蛍光がプロットされている。
【００４６】
【図３Ａ−Ｆ】単層のＡＲＰＥ１９細胞による蛍光標識されたＲＯＳのファゴサイトーシスのＦＡＣＳ解析。細胞単層において、２４時間、ＡＲＰＥ−１９と、異なる濃度の蛍光標識されたＲＯＳをインキュベートしたときは、用量依存的なファゴサイトーシス反応は観察されなかった。（Ａ）３７℃で、６ｘ１０６個のｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄで標識されたＲＯＳとインキュベートされたＡＲＰＥ−１９。（Ｂ）３７℃で、３ｘ１０６個のｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄで標識されたＲＯＳとインキュベートされたＡＲＰＥ−１９。（Ｃ）３７℃で、１．５ｘ１０６個のｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄで標識されたＲＯＳとインキュベートされたＡＲＰＥ−１９。（Ｄ）１５℃で、６ｘ１０６個のｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄで標識されたＲＯＳとインキュベートされたＡＲＰＥ−１９。（Ｅ）１５℃で、３ｘ１０６個のｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄで標識されたＲＯＳとインキュベートされたＡＲＰＥ−１９。（Ｆ）１５℃で、１．５ｘ１０６個のｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄで標識されたＲＯＳとインキュベートされたＡＲＰＥ−１９。それぞれにおいて、ＲＯＳなしでインキュベートされた細胞およびＲＯＳとインキュベートされた細胞のプロットが示される。
【００４７】
【図４Ａ−Ｆ】ｈＥＳＣ由来ＲＰＥ細胞による蛍光標識されたＲＯＳのファゴサイトーシスのＦＡＣＳ解析。細胞単層において、３７℃で２４時間、ＲＰＥ細胞と、異なる濃度の蛍光標識されたＲＯＳをインキュベートしたときは、用量依存的なファゴサイトーシス反応は観察されなかった。再構成（reconstitution）の間の蛍光標識されたＲＯＳのパルス超音波処理（pulse sonication）によりファゴサイトーシスが約１０％増加した。（Ａ）超音波処理なしで再構成された３．７５ｘ１０６個のｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄにより標識されたＲＯＳと、インキュベートされたＲＰＥ細胞。（Ｂ）超音波処理なしで再構成された５ｘ１０６個のｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄにより標識されたＲＯＳと、インキュベートされたＲＰＥ細胞。（Ｃ）超音波処理なしで再構成された７．５ｘ１０６個のｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄにより標識されたＲＯＳと、インキュベートされたＲＰＥ細胞。（Ｄ）超音波処理なしで再構成された１０ｘ１０６個のｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄにより標識されたＲＯＳと、インキュベートされたＲＰＥ細胞。（Ｅ）超音波処理で再構成された１０ｘ１０６個のｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄにより標識されたＲＯＳと、インキュベートされたＲＰＥ細胞。（Ｆ）超音波処理で再構成された１３．５ｘ１０６個のｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄにより標識されたＲＯＳと、インキュベートされたＲＰＥ細胞。
【００４８】
詳細な説明
ファゴサイトーシス（能力アッセイ）は、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ色素（Life Technologies, Molecular Probes）により標識された視細胞外節（ＰＯＳ）に暴露されたＲＰＥ培養物の、定量的蛍光活性化セルソーティング（cell sorting）(ＦＡＣＳ)解析により評価されてもよい。
ファゴサイトーシスは、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ色素（Life Technologies, Molecular Probes）により標識されたＰＯＳを用いたＦＡＣＳに基づくアッセイにより評価されてもよい。そのように標識された色素およびＰＯＳは、細胞内ファゴソームの減少したｐＨ環境に取り込まれたときに蛍光を発する。ＰＯＳは、本明細書において記載されたように標識されてもよい。
【００４９】
いくつかの態様において、ＲＰＥ細胞培養は、コンフルエントである。例として、コンフルエントなＲＰＥは、マルチウェルプレート中で培養されてもよく、任意にＣＯ２非依存性培地（Invitrogen）の存在下で、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ色素で標識されたＰＯＳとインキュベートされてもよい。インキュベーションは、ＲＰＥ細胞が、ＰＯＳを貪食するのに十分なあらゆる時間で行われ得る。例としては、インキュベーションは、１６〜２０時間行われてもよい。アッセイは、ＲＰＥ細胞が、ＰＯＳを貪食するのに十分な温度で行われる。いくつかの態様において、アッセイは、およそ生理学的温度または約３７℃で行われる。いくつかの態様において、アッセイは、室温で行われる。いくつかの態様において、コントロール（またはネガティブコントロール（negative control））プレートは、４℃でインキュベートされる。細胞は、顕微鏡下で観察されてもよく、蛍光はプレートリーダーを用いて測定されてもよく、ならびに／または、細胞は酵素消化（例えば、トリプシン消化）の後に回収されてもよく、およびフローサイトメトリーにより解析されてもよい
【００５０】
非限定的な典型的アッセイは以下のとおりである：
すでに記載されているとおり多能性幹細胞（ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞などであるが、これらに限定されない）から作製されたＲＰＥを、その貪食能力について試験する。凍結保存されたＲＰＥは、あらかじめ凍結されていて、使用前に解凍してもよい。ＲＰＥ細胞のファゴソームの酸性環境における取り込みの際に蛍光を発する、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ色素で標識されたＰＯＳを貪食する能力を試験する前に、ＲＰＥ細胞は、適切な培地中での培養下で播種し、コンフルエントになるまで増殖させて、培養下で維持する。ＲＰＥ細胞は、ファゴサイトーシスが可能となるように３７℃で、またはネガティブコントロールとして４℃で、標識されたＰＯＳとインキュベートされる。蛍光強度のシフトは、３７℃でインキュベートされた細胞についてフローサイトメトリーにより検出してもよく、これは標識されたＰＯＳのファゴサイトーシスを示す。ピークの統計的統合は、各ロットのＲＰＥ細胞とインキュベーション温度についてのファゴサイトーシス陽性細胞の割合をもたらす。
【００５１】
本開示により理解されるとおり、ファゴサイトーシスは、酸性ファゴソーム環境下で赤色スペクトルにおいて蛍光を発する標識されたＰＯＳと、ＲＰＥ細胞をインキュベートすることにより検出される。ファゴサイトーシス陽性細胞の割合は、フローサイトメトリーにより検出されるように、３７℃または４℃（ネガティブコントロール）でインキュベートされた細胞について示される。
【００５２】
得られたＲＰＥ細胞集団は、本明細書において提供される方法によりそのファゴサイトーシス活性に基づいて特徴づけられてもよい。ファゴサイトーシス速度を決定し、それによってＲＰＥ細胞を特徴づけし得る。例えば、ＲＰＥ細胞は、単離された成人眼球の同等数のＲＰＥ細胞についての視細胞外節（ＰＯＳ）のファゴサイトーシス速度よりも少なくとも５０％速い、あるいは、単離された成人眼球の同等数のＲＰＥ細胞についてのＰＯＳのファゴサイトーシス速度よりも少なくとも７５、１００、１５０または２００％速い、ＰＯＳのファゴサイトーシス速度を有することとして特徴づけられ得る。代替的にまたは加えて、ＲＰＥ細胞は、２４時間後において視細胞外節（ＰＯＳ）の総濃度の少なくとも２０％である、あるいは、２４時間後においてＰＯＳの総濃度の少なくとも２５、３０、２５、４０または５０％である、ＰＯＳのファゴサイトーシス速度により特徴づけられ得る。
【００５３】
したがって、本明細書に記載の方法を用いることにより、単離された成人眼球（すなわち、２５〜８０歳のヒト成人患者、より好ましくは、５０〜８０歳の成人）の同等数のＲＰＥ細胞についての視細胞外節（ＰＯＳ）のファゴサイトーシス速度よりも少なくとも５０％速い、およびより好ましくは、少なくとも７５、１００、１５０または２００％速い、ＰＯＳのファゴサイトーシス速度を有するＲＰＥ細胞集団が実現された。
【００５４】
本明細書に記載の方法を用いることにより、２４時間後において視細胞外節（ＰＯＳ）の総濃度の少なくとも２０％である、およびより好ましくは、２４時間後においてＰＯＳの総濃度の少なくとも２５、３０、２５、４０または５０％である、ＰＯＳのファゴサイトーシス速度を有するＲＰＥ細胞集団が実現された。
【００５５】
このように、本開示は、一つの側面において、非ＦＩＴＣ蛍光標識された、蛍光標識された視細胞外節（ＰＯＳ）と接触したＲＰＥ細胞（またはＲＰＥ細胞集団）中の蛍光（試験蛍光または一般的に「試験」とみなされる）を検出または測定すること、ならびに検出または測定された蛍光をコントロール（コントロール蛍光または一般的に「コントロール」とみなされる）と比較することを含む方法を提供する。試験は、およそ室温、または約１５〜４０℃の温度、またはおよそ生理学的温度（例えば、約３７℃）である温度で行われ得る。コントロールは、４℃で行われ得る。したがって、コントロール蛍光は、非ＦＩＴＣ標識されたＰＯＳとの４℃でのＲＰＥ細胞のインキュベーションに続いて検出または測定された蛍光であり得る。非ＦＩＴＣ蛍光標識されたＰＯＳは、ＦＩＴＣでない蛍光色素分子（fluorophore）で標識されたＰＯＳである。非ＦＩＴＣ蛍光標識は、ファゴソーム、および特にＲＰＥ細胞のファゴソームのｐＨなどの酸性ｐＨで蛍光を発する標識であり、特に中性ｐＨ（または細胞外環境ｐＨ）などのより高いｐＨにおいては、蛍光を発しないか最小限の蛍光を発する。非ＦＩＴＣ蛍光標識は、表面の標識と取り込まれた標識とを区別するのに有用である。かかる蛍光色素分子の例は、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ色素（Life Technologies, Molecular Probes）である。試験におけるより高い程度のファゴサイトーシスは、コントロールと比べてより強い蛍光により示される。
【００５６】
したがって、他の側面においては、本開示は、
（１）ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ色素で標識された、蛍光標識された視細胞外節（ＰＯＳ）と、３７℃で、接触した（およびインキュベートされた）ＲＰＥ細胞（またはＲＰＥ細胞集団）の、第一の分割量における蛍光（試験蛍光、または一般的に「試験」とみなされる）を検出または測定すること、および
（２）ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ色素で標識された、蛍光標識されたＰＯＳと、４℃で、接触した（およびインキュベートされた）ＲＰＥ細胞（またはＲＰＥ細胞集団）付着細胞集団の、第二の分割量における蛍光（コントロール蛍光、または一般的に「コントロール」とみなされる）を検出または測定すること、および
（３）任意に、試験およびコントロール蛍光を比較、決定および／または定量化すること、ここで、コントロール蛍光よりも強い試験蛍光は、ＲＰＥ細胞（または細胞集団）のファゴサイトーシス活性の指標である、
を含む方法を開示する。
【００５７】
本明細書において記載される方法は、視細胞前駆（progenitor（またはprecursor））細胞におけるファゴサイトーシス活性をアッセイするのにもまた用いられ得ることが理解されるべきである。
ある態様においては、ＲＰＥおよび視細胞前駆細胞は、単独のｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ視細胞外節、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓまたはその両方を貪食する能力といった、ファゴサイトーシス活性を有しており、本明細書において提供される方法は、これらの機能の１種以上をアッセイする。
【００５８】
本開示は、一側面において、複数の網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞または視細胞前駆細胞；および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物の能力を決定するアッセイを提供する。一つの態様において、前記複数のＲＰＥ細胞の平均メラニン含量は、８ｐｇ／細胞未満である。前記ＲＰＥ細胞または視細胞前駆細胞は、懸濁液、ゲル、コロイド、マトリックス、基質、足場（scaffold）、または移植片中に含有されてもよい。
【００５９】
前記薬学的に許容し得る担体は、約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、または約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇまたは約３０５ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する無菌溶液を含み得る。前記薬学的に許容し得る担体は、緩衝塩溶液（balanced salt solution）を含んでもよい。前記緩衝塩溶液は、１ｍＬあたり、水中に、塩化ナトリウム７．１４ｍｇ、塩化カリウム０．３８ｍｇ、塩化カルシウム二水和物０．１５４ｍｇ、塩化マグネシウム六水和物０．２ｍｇ、二塩基性リン酸ナトリウム０．４２ｍｇ、炭酸水素ナトリウム２．１ｍｇ、デキストロース０．９２ｍｇ、グルタチオンジスルフィド（酸化型グルタチオン）０．１８４ｍｇ、および（ｐＨを約７．４に調節するための）塩酸および／または水酸化ナトリウムを含んでもよく、これらからなってもよく、またはこれらから本質的になってもよい。
【００６０】
前記医薬組成物の体積は、約１００μＬ〜１０００μＬであってもよく、または少なくとも約１５０μＬであってもよい。前記医薬組成物は、約１，０００〜約１×１０９の生存ＲＰＥ細胞を含み得る。前記医薬組成物は、約３３３生存ＲＰＥ細胞／μＬ〜約２，０００生存ＲＰＥ細胞／μＬ、約４４４生存ＲＰＥ細胞／μＬ〜約１７６６生存ＲＰＥ細胞／μＬ、約３３３生存ＲＰＥ細胞／μＬ、約４４４生存ＲＰＥ細胞／μＬ、約６６６生存ＲＰＥ細胞／μＬ、約８８８生存ＲＰＥ細胞／μＬ、約９９９生存ＲＰＥ細胞／μＬ、または約１，３３３生存ＲＰＥ細胞／μＬで含んでいてもよい。
【００６１】
前記医薬組成物中のＲＰＥ細胞濃度は、前記ＲＰＥ細胞の約３０％以下が６０分以内に生存能力を喪失し、および任意に前記ＲＰＥ細胞の約１０％以下が４時間以内で生存能力を喪失する程度に十分に高くてもよい。前記ＲＰＥ細胞濃度は、少なくとも約１，０００細胞／μＬ、少なくとも約２，０００細胞／μＬ、約１，０００〜１０，０００細胞／μＬ、または約２，０００〜５，０００個の細胞／μＬであってもよい。
医薬品は、約２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％、０．５％、０．１％、０．０１％、０．００１％、または０．０００１％未満の、ＲＰＥ細胞でなくてもよい細胞を含み得る。
【００６２】
前記ＲＰＥ細胞の平均メラニン含量は、８ｐｇ／細胞未満、７ｐｇ／細胞未満、６ｐｇ／細胞未満、５ｐｇ／細胞未満、４ｐｇ／細胞未満、３ｐｇ／細胞未満、２ｐｇ／細胞未満、および少なくとも０．１ｐｇ／細胞、および任意に少なくとも０．５ｐｇ／細胞または１ｐｇ／細胞；０．１〜８ｐｇ／細胞、０．１〜７ｐｇ／細胞，０．１〜６ｐｇ／細胞，０．１〜５ｐｇ／細胞、０．１〜４ｐｇ／細胞、０．１〜３ｐｇ／細胞、０．１〜２ｐｇ／細胞、０．１〜１ｐｇ／細胞、１〜７ｐｇ／細胞、０．５〜６ｐｇ−細胞、または１〜５ｐｇ／細胞であってもよい。
【００６３】
前記医薬組成物中の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％の細胞は、ベストロフィン＋であってもよい。前記医薬組成物中の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の細胞は、ＰＡＸ６＋および／またはＭＩＴＦ＋であってもよい。前記医薬組成物中の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の細胞は、ＰＡＸ６＋および／またはベストロフィン＋であってもよい。前記医薬組成物中の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の細胞は、ＺＯ−１＋であってもよい。医薬組成物中の少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％の細胞は、ＰＡＸ６＋およびベストロフィン＋であってもよい。前記医薬組成物中の少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の細胞は、ＰＡＸ６＋であってもよい。
【００６４】
典型的な態様において、前記医薬組成物中の細胞１００万個あたり約１個以下の細胞、および任意選に細胞９００万個あたり２個以下の細胞は、ＯＣＴ−４およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）発現の両方が陽性であってもよい。
【００６５】
針または注射カニューレは、前記ＲＰＥ細胞の少なくとも一部を含有し得る。前記ＲＰＥ細胞の濃度は、前記針または注射カニューレへロードする（loading）際に、約４４４生存細胞／μＬ〜約１，７６６生存細胞／μＬであり得る。前記針または注射カニューレから送達される生存ＲＰＥ細胞の濃度は、約３３３生存細胞／μＬ〜約１，３３３生存細胞／μＬであり得る。前記針または注射カニューレの直径は、約０．３ｍｍ〜約０．９であり得る。前記針または注射カニューレの直径は、約０．５〜約０．６ｍｍであり得る。前記針または注射カニューレは、約０．０９ｍｍ〜約０．１５ｍｍの直径を有するチップ（tip）を含んでいてもよい。前記カニューレは、ＭＥＤＯＮＥ  ＰＯＬＹＴＩＰ（登録商標）カニューレ２５／３８ｇ（０．１２ｍｍ（３８ｇ）×５ｍｍチップが付いた０．５０ｍｍ（２５ｇ）×２８ｍｍカニューレ）またはＳｙｎｅｒｇｅｔｉｃｓ  Ａｎｇｌｅｄ  ３９ｇ注射カニューレであってもよい。
【００６６】
前記ＲＰＥ細胞は、冷凍保存されて解凍されたＲＰＥ細胞を含んでもよい。
前記ＲＰＥ細胞は、ヒトのものであってもよい。
ヒトＲＰＥ細胞などの前記ＲＰＥ細胞は、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell）などの多能性細胞、ならびに成人ドナー組織もしくは胎児組織を含む、あらゆるソースから産生され得る。前記多能性幹細胞は、ＯＣＴ−４、アルカリホスファターゼ、Ｓｏｘ２、ＴＤＧＦ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、および／またはＴＲＡ−１−８０を含み得る、１種以上のマーカーの発現について陽性であってもよい。前記多能性細胞は、培養中で色素性上皮細胞が出現するのに十分な時間、多層集団または胚様体中において培養されてもよい、ヒト多能性細胞であり得る。前記培養中に色素性上皮細胞が出現するのに十分な前記時間は、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、または少なくとも約７週間、少なくとも約８週間を含み得る。
【００６７】
前記多層集団または胚様体は、ＤＭＥＭを含んでもよい培地中で培養され得る。前記培地は、ＥＢ−ＤＭを含んでいてもよく、それから本質的になってもよく、またはそれからなってもよい。前記色素性上皮細胞は単離して培養してもよく、それによりＲＰＥ細胞集団を産生してもよい。前記単離は、培養から細胞または細胞塊を、酵素的、化学的、または物理的に分離すること、および色素性上皮細胞または色素性上皮細胞を含んでいてもよい細胞塊を選択することを含み得る。前記胚様体は、懸濁状態で、および／または付着培養として、培養されてもよい（例えば懸濁状態とそれに続く付着培養）。付着培養として培養される前記胚様体は、色素性上皮細胞を含む１種以上の生成物（outgrowth）を産生し得る。前記多能性幹細胞は、ＨＬＡ抗原多様性（complexity）が減少している。ＲＰＥ形成に先立ち、前記多能性細胞は、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、コラーゲン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩＩ、ヘパラン硫酸、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞由来の可溶性調製物）、ＣｅｌｌＳｔａｒｔ、ヒト基底膜抽出物、およびそれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択されてもよいマトリックス上で培養され得る。前記マトリックスは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞由来の可溶性調製物）を含み得る。
【００６８】
医薬組成物は、１種以上の胚性幹細胞マーカーの実質的発現が欠損している細胞を含んでもよい。前記１種以上の胚性幹細胞マーカーには、ＯＣＴ−４、ＮＡＮＯＧ、Ｒｅｘ−１、アルカリホスファターゼ、Ｓｏｘ２、ＴＤＧＦ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、および／またはＴＲＡ−１−８０が含まれ得る。
前記ＲＰＥ細胞は、１種以上のＲＰＥ細胞マーカーの発現について陽性であってもよい。前記１種以上のＲＰＥ細胞マーカーには、ＲＰＥ６５、ＣＲＡＬＢＰ、ＰＥＤＦ、ベストロフィン、ＭＩＴＦ、Ｏｔｘ２、ＰＡＸ２、ＰＡＸ６、ＺＯ−１、および／またはチロシナーゼが含まれ得る。
【００６９】
前記ＲＰＥ細胞は、前記平均メラニン含量に達するのに十分な時間、ＲＰＥ細
胞を静止細胞として維持することを含む方法により産生されてもよい。前記ＲＰＥ細胞は、前記ＲＰＥ細胞の少なくとも５０％においてベストロフィン発現を確立するのに十分な時間、ＲＰＥ細胞を静止細胞として維持することを含む方法により産生されてもよい。
前記医薬組成物は、マウス胚性支持細胞（feeder cell）（ＭＥＦ）およびヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）を実質的に含まなくてもよい。
【００７０】
ＲＰＥ細胞は、表１に列挙された基準の少なくとも１つを満たしてもよく、および／または、適正製造基準（Good Manufacturing Practices）（ＧＭＰ）にしたがって製造されてもよい。
前記の凍結保存された網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞または視細胞前駆細胞は、凍結保存組成物として提供されてもよい。
【００７１】
前記ＲＰＥ細胞は、単離された成人眼球由来の同等数のＲＰＥ細胞についての視細胞外節（ＰＯＳ）のファゴサイトーシス速度よりも少なくとも５０％速くてもよい、または、単離された成人眼球由来の同等数のＲＰＥ細胞についてのＰＯＳのファゴサイトーシス速度よりも少なくとも７５、１００、１５０もしくは２００％速くてもよい、ＰＯＳのファゴサイトーシス速度；あるいは、２４時間後において視細胞外節（ＰＯＳ）の総濃度の少なくとも２０％であってもよい、または、２４時間後においてＰＯＳの総濃度の少なくとも２５、３０、２５、４０もしくは５０％であってもよい、ＰＯＳのファゴサイトーシス速度を示し得る。前記視細胞前駆細胞は、単離された成人眼球由来の同等数の視細胞前駆細胞についての視細胞外節（ＰＯＳ）のファゴサイトーシス速度よりも少なくとも５０％速くてもよい、または、単離された成人眼球由来の同等数の視細胞前駆細胞についてのＰＯＳのファゴサイトーシス速度よりも少なくとも７５、１００、１５０もしくは２００％速くてもよい、ＰＯＳのファゴサイトーシス速度；あるいは、２４時間後において視細胞外節（ＰＯＳ）の総濃度の少なくとも２０％であってもよい、または、２４時間後においてＰＯＳの総濃度の少なくとも２５、３０、２５、４０もしくは５０％であってもよい、ＰＯＳのファゴサイトーシス速度を示し得る。ファゴサイトーシスの速度および程度は、インキュベーション時間および細胞の成熟度に依存し得る。ＰＯＳの結合および取り込みの速度は、細胞の成熟度および色素形成に基づいて異なり得る。ファゴサイトーシスが可能な細胞の割合は、細胞培養の成熟度に基づいて異なることもあり得る。
【００７２】
視細胞外節を、中性ｐＨでは非蛍光性であるかもしくは弱い蛍光を発するが酸性化に伴ってより強い蛍光を発するようになる色素で標識することにより、ファゴサイトーシスアッセイでの、ＲＰＥ細胞または視細胞前駆細胞における取り込まれたＰＯＳのより感受性の高い測定が可能である。ファゴサイトーシスの評価に用いられる定量的方法の多く（ＦＡＣＳ、蛍光プレートリーダー）は、取り込まれた蛍光粒子と表面に結合した蛍光粒子とを区別しない。加えて、ＦＩＴＣ蛍光は、ｐＨ感受性であって、リソソームおよびリソソームに融合したファゴソームのｐＨが５未満であるのにｐＨ６未満で顕著に減少する。したがって、ＦＩＴＣ標識されたＯＳの蛍光が、取り込まれたＯＳの実際の量を表さない場合がある。その製造者（Life Technologies, Molecular Probes）によれば、ｐＨ感受性ローダミンベースの（rhodamine-based）ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ色素は、中性ｐＨでは非蛍光性であり、酸性化に伴って明るい赤色になる。色素は、蛍光性でありかつｐＨ感受性でもあり、したがって、ファゴサイトーシスに続くファゴソームの酸性化が赤色蛍光により示されることによって、ファゴサイトーシス事象の特異的センサーとして用いることが可能である。
【００７３】
視細胞外節を標識するために、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）およびＣｙｐＨｅｒ５ＥＲｅｄ（これもまた酸性環境下で最大蛍光を発する）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの色素によるＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒなどの、中性ｐＨでは非蛍光性であるかもしくは弱い蛍光を発するが酸性化に伴ってより強い蛍光を発するようになる色素を用いることで、従来技術の方法および試薬を顕著に改善する。我々は、取り込まれた粒子を具体的に測定するためのウシＯＳを標識するのに、このｐＨ感受性ローダミンベースのｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ色素を用いた。
【００７４】
ＦＩＴＣ標識された視細胞外節、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）−ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓおよびｐＨｒｏｄｏ（登録商標）標識された視細胞外節を比較すると、４℃と比べて３７℃でのファゴサイトーシスアッセイにおいては、全て顕著な蛍光の増加を示した（図１Ａ−Ｃ）。しかしながら、定量的解析により、ファゴサイトーシスアッセイにおいては、ＦＩＴＣ標識された粒子とインキュベートされたとき、３７℃ではＲＰＥ細胞集団の約半分だけが、４℃のコントロールよりも蛍光の増加を示すこと、および、４℃のコントロールにおいてもまた、ＲＰＥ細胞集団の約半分が顕著な蛍光の増加を示すことが明らかになったが、これは恐らく、細胞表面に結合しているが取り込まれていない粒子の存在を示している。細胞表面のそのような粒子は、特異的および非特異的結合の両方を表している可能性がある。加えて、ＦＩＴＣ標識された視細胞外節ＦＡＣＳデータは、ＦＩＴＣ蛍光の一部が低ｐＨで失われ得るために、あまり正確ではなく（図２）、つまり、一旦、粒子が取り込まれてファゴソームがリソソームと融合すると、最終的な低ｐＨ（４．５〜５．５）では、ＦＩＴＣ蛍光の一部が失われる。したがって、測定されたとおりの蛍光は、取り込まれた粒子由来の一部のシグナルの喪失と細胞表面に非特異的に結合した粒子由来の付加的なシグナルとを含んでいる。ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）標識されたＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓおよびｐＨｒｏｄｏ（登録商標）標識された視細胞外節の両者は、４℃では全く蛍光の増加を示さないが（図１Ｂおよび１Ｃ）、３７℃では増加を示し、したがって、リソソームと融合している取り込まれた粒子のみの特異的測定を可能にする。
【００７５】
本明細書において記載されるとおり、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）標識されたＲＯＳは、低ｐＨで蛍光性であり、そのため、観察された蛍光のシフトは、取り込まれる粒子の指標となる。ＦＩＴＣまたは他の非ｐＨ感受性色素で標識されたＲＯＳの使用は、細胞表面に非特異的に結合した粒子、特異的に結合しているが取り込まれていないＰＯＳ、および／または取り込まれているがリソソームと融合していないＰＯＳを示す傾向にある。その蛍光が酸性度に対して逆相関を示す、従来用いられてきたＦＩＴＣの代わりに、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）または他のｐＨ感受性色素で視細胞外節を標識することで、あるいは、他のｐＨ感受性および／または非感受性色素と組み合わせてｐＨｒｏｄｏ（登録商標）標識されたＰＯＳを用いることで、ファゴサイトーシスアッセイの正確さが改善し、それにより、生理学的に関連した標的のファゴサイトーシスの測定が可能になり、ファゴサイトーシスメカニズムの詳細な解析が可能になる。
【００７６】
いくつかの態様においては、ＰＯＳは、目的の細胞と共に、使用前に断片化される。ＰＯＳは、例えば、超音波処理またはせん断、あるいは当該技術分野の他の方法を用いて断片化され得る。断片化されたＰＯＳは、細胞からのより高いファゴサイトーシス測定値をもたらす場合があることが見出されている。これは、コントロール活性から陽性活性を区別するのに有用であり得る。
【００７７】
ファゴサイトーシスアッセイは、単一の細胞懸濁液の細胞を用いて行ってもよく、単層の細胞を用いて行ってもよい。したがって、細胞は、細胞懸濁液として提供されてもよく、培養された単層を含む、単層として提供されてもよい。この後者の態様は、細胞が通常、単層として増殖する場合に特に有用であり、細胞が通常そのように存在する際に細胞のファゴサイトーシス活性を決定することを可能にする。細胞は、単層などの付着層として、標識されたＰＯＳとインキュベートされてもよく、次いで例えばフローサイトメトリーを用いて解析することが可能である単一の細胞集団にするために、その後酵素で消化されてもよい（トリプシン消化）。
【００７８】
いくつかの態様においては、細胞は、１７℃以上の、または１８℃以上、または１９℃以上、または２０℃以上の温度でＰＯＳとインキュベートされてもよい。温度範囲の上限は、４２℃以下、または４１℃以下、または４０℃以下、または３９℃以下、または３８℃以下、または３７℃以下であってもよい。試験ファゴサイトーシス活性は、これらの温度で測定されてもよい。細胞は、培養された単層を含む、単層として提供されてもよい。
【００７９】
いくつかの態様においては、試験細胞または試験細胞集団は、１７〜４０℃、または２０〜４０℃、または２５〜４０℃、または３０〜４０℃、または３５〜４０℃の範囲の温度で、あるいは３７℃の温度で、ＰＯＳとインキュベートされる。ネガティブコントロールは、約４〜１６℃、５〜１６℃、６〜１６℃、７〜１６℃、８〜１６℃、９〜１６℃、１０〜１６℃、１１〜１６℃、または１２〜１６℃の範囲の温度で、ＰＯＳとインキュベートされた細胞に対応し得る。ネガティブコントロールは、約４〜１５℃、５〜１５℃、６〜１５℃、７〜１５℃、８〜１５℃、９〜１５℃、１０〜１５℃、１１〜１５℃、または１２〜１５℃の範囲の温度で、ＰＯＳとインキュベートされた細胞に対応し得る。細胞は、培養された単層を含む、単層として提供されてもよい。
【００８０】
いくつかの態様においては、細胞は、あらかじめ凍結保存し、解凍して、単層を確立するために簡単に培養される。一旦、単層になれば、細胞のファゴサイトーシス活性は、本明細書において記載されたとおりに試験することができる。
いくつかの態様において、細胞は、一定時間、標識されていないＰＯＳに暴露し、次いで、蛍光標識されたＰＯＳに暴露して後者のＰＯＳについてファゴサイトーシスを測定する。このようにして、標識されたＰＯＳの導入に先だって、細胞を準備してもよい。
【００８１】
定義
本明細書に記載される本発明が十分に理解され得るよう、以下の詳細な説明を記載する。本発明の様々な態様が詳細に記載され、そして提供される例によってさらに例証されることもあり得る。
別に定義されていない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似のまたは同等の方法および材料を、本発明でまたは本発明の試験において使用し得るが、適切な方法および材料は下記に記載されている。材料、方法、および例は、例示に過ぎず、限定することは意図されていない。本明細書においては、以下の用語および定義が提供される。
【００８２】
本明細書の記載およびそれに続く特許請求の範囲全体で用いられるとおり、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の意味は、文脈が別に明確に指示しない限り、複数への言及を含む。また、本明細書の記載において用いられるとおり、文脈が別に明確に指示しない限り、「ｉｎ」の意味は、「ｉｎ」および「ｏｎ」を含む。
本明細書全体を通じて「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」なる語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのバリエーションは、記述される整数または整数群の包含を示唆するが、あらゆるその他の整数または整数群の排除を示唆しないと理解される。
【００８３】
「胚性幹細胞」（ＥＳ細胞）は、本明細書で用いられるとおり、細胞株として連続的に継代されている胚盤胞または桑実胚の内部細胞集団に由来する細胞について広く言及する。ＥＳ細胞は、精子による卵細胞の受精、もしくはＤＮＡ、核移植、単為生殖から得られてもよく、またはＨＬＡ領域のホモ接合性があるＥＳ細胞を作製する手段によって得られてもよい。ＥＳ細胞はまた、精子と卵細胞の融合によって生じる接合子、割球、もしくは胚盤胞段階の哺乳類胚、核移植、単為発生、またはクロマチンの再プログラミングと引き続く細胞産生のための再プログラムされたクロマチンの細胞膜への組み込みに由来する細胞にも言及し得る。胚性幹細胞は、それらのソースまたはそれらを産生するために用いられた特定の方法にかかわりなく、（ｉ）全ての三胚葉層の細胞へ分化させる能力、（ｉｉ）少なくともＯｃｔ−４およびアルカリホスファターゼの発現、および（ｉｉｉ）免疫不全動物に移植すると奇形腫を生じる能力、に基づいて同定することが可能である。
【００８４】
本用語はまた、好ましくは残りの胚を破壊することなく、胚の１つ以上の割球から単離される細胞も含む（例えば、Chung et al., Cell Stem Cell.2008 Feb 7;2(2):113-7；米国特許第20060206953号明細書（付与前公表）；米国特許第2008/0057041号明細書（付与前公表）を参照。これらの各々は、内容全体が参照により組み込まれる）。この用語はまた、非胚細胞がプロセスにおいて用いられる場合であっても、体細胞核移植によって産生される細胞をも含む。ＥＳ細胞は、精子による卵細胞の受精、もしくはＤＮＡ、核移植、単為生殖から得られてもよく、またはＨＬＡ領域のホモ接合性があるＥＳ細胞を作製する手段によって得られてもよい。ＥＳ細胞はまた、精子と卵細胞の融合によって生じる接合子、割球、もしくは胚盤胞段階の哺乳類胚、核移植、単為発生、またはクロマチンの再プログラミングと引き続く細胞産生のための再プログラムされたクロマチンの細胞膜への組み込みに由来する細胞でもある。本開示のヒト胚性幹細胞としては、限定することなくＭＡ０１、ＭＡ０９、ＡＣＴ−４、Ｎｏ．３、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１４、およびＡＣＴ３０胚性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。特定の態様においては、ＲＰＥ細胞を産生するのに用いられるヒトＥＳ細胞は、ＧＭＰ基準にしたがって誘導され維持される。
【００８５】
「黄斑変性」は、本明細書において用いられるとおり、ブルッフ膜、神経網膜、および膜色素上皮の異常と関連付けられる、中心視野の進行性喪失によって特徴づけられる疾患について広く言及する。黄斑変性疾患としては、加齢性黄斑変性、ノースカロライナ黄斑ジストロフィー、ソースビー眼底ジストロフィー、スタルガルト病、パターンジストロフィー、ベスト病、マラチアレベンティニーズ、ドイン蜂巣状脈絡膜症、優性ドルーゼン、および放射状ドルーゼンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８６】
「多能性幹細胞」は、本明細書において用いられるとおり、それらの未分化状態を保ちながら長期的なまたは実質的に無限のインビトロでの増殖が可能であり、安定した（好ましくは正常な）核型を示し、適切な条件下で全ての三胚葉層（すなわち外胚葉、中胚葉、および内胚葉）に分化する能力を有する細胞について広く言及する。
【００８７】
「ＲＰＥ細胞」、「分化ＲＰＥ細胞」、「ＥＳ由来ＲＰＥ細胞」は、本明細書において用いられるとおり、例えば本明細書で開示される方法を用いて、多能性幹細胞から分化させたＲＰＥ細胞について広く言及するために全体を通じて交換可能に用いられ得る。用語は細胞成熟度のレベルにかかわりなく、分化ＲＰＥ細胞について一般的に言及するのに用いられ、したがって様々な成熟度レベルのＲＰＥ細胞を包含し得る。ＲＰＥ細胞は、それらの敷石状形態と初期の色素出現によって、視覚的に認識することが可能である。ＲＰＥ細胞はまた、Ｏｃｔ−４およびＮＡＮＯＧなどの胚性幹細胞マーカー発現の実質的欠損に基づいて、ならびにＲＰＥ６５、ＰＥＤＦ、ＣＲＡＬＢＰ、およびベストロフィンなどのＲＰＥマーカー発現に基づいて、分子的に同定することができる。例えば、細胞は、例えば核内に局在するＰＡＸ６、（細胞周辺の明確な線で、局在するベストロフィン染色を示す）多角形パターンで細胞膜に局在するベストロフィン、多角形パターンで細胞の輪郭を描く密着結合に存在するＺＯ−１染色、および核限定で検出されるＭＩＴＦ染色などの予測された染色パターンが観察されれば、あるマーカーについて陽性と見なしてもよい。別に特定されない限り、本明細書において用いられるとおり、ＲＰＥ細胞は、多能性幹細胞からインビトロで分化されたＲＰＥ細胞について言及する。
【００８８】
「成熟ＲＰＥ細胞」および「成熟分化ＲＰＥ細胞」は、本明細書において用いられるとおり、ＲＰＥ細胞の初期分化に続いて生じる変化について広く言及するために、全体を通じて交換可能に用いられ得る。具体的には、ＲＰＥ細胞は、色素の初期出現に基づいてある程度認識され得るが、分化後には、成熟ＲＰＥ細胞は、高度な色素形成に基づいて認識され得る。
【００８９】
「色素」は、本明細書において用いられるとおり、例えばＲＰＥ細胞がＥＳ細胞から分化する際における初期に生じる色素形成などの、あらゆるレベルの色素形成について広く言及する。色素形成は、分化ＲＰＥ細胞の細胞密度と成熟度によって変動することがある。ＲＰＥ細胞の色素形成は、ＲＰＥ細胞の最終分化後において、平均的ＲＰＥ細胞と同様であってもよい。ＲＰＥ細胞の色素形成は、ＲＰＥ細胞の最終分化後において、平均的ＲＰＥ細胞より強く色素形成されていてもよい。ＲＰＥ細胞の色素形成は、最終分化後に、平均的ＲＰＥ細胞より弱く色素形成されていてもよい。
【００９０】
「視細胞前駆細胞（photoreceptor progenitor）」は、胚性幹細胞から分化し得るか、または多能性幹細胞から誘導され得る、および、マーカーＰＡＸ６を発現する一方でマーカーＣＨＸ１０を発現しない（すなわち、ＣＨＸ１０（−））、神経網膜の細胞について言及する。これらの細胞は、網膜神経前駆細胞の段階では一過性にＣＨＸ１０を発現するが、細胞が視細胞前駆細胞の段階へ分化する際には、ＣＨＸ１０発現は消失する。視細胞前駆細胞により発現される他のマーカーには、Ｐａｘ６、Ｎｒ２ｅ３、Ｔｒβ２、Ｍａｓｈ１、ＲＯＲβ、およびＮＲＬが含まれ得る。また、「視細胞（photoreceptor）」は、胚性幹細胞から分化するか、または多能性幹細胞から誘導される、ならびに、細胞マーカーであるロドプシンもしくは３種の錐体オプシンのいずれかを発現し、および任意に桿体もしくは錐体ｃＧＭＰホスホジエステラーゼを発現する、有糸分裂後の細胞についても言及してもよい。視細胞はまた、視細胞で見出される、マーカーであるリカバリンを発現していてもよい。視細胞は、桿体および／または錐体視細胞であり得る。
【００９１】
細胞マーカー：発現について評価し得る典型的細胞マーカーは、下記：ＰＡＸ６、ＲＸ１、ＳＩＸ３、ＳＩＸ６、ＬＨＸ２、ＴＢＸ３、ＳＯＸ２、ＣＨＸ１０、ネスチン、ＴＲβ２、ＮＲ２Ｅ３、ＮＲＬ、ＭＡＳＨ１、ＲＯＲβ、リカバリン、オプシン、ロドプシン、桿体および錐体ｃＧＭＰホスホジエステラーゼを含み、これらは、タンパク質および／またはｍＲＮＡで評価してもよい（Fischer AJ, Reh TA, Dev Neurosci. 2001;23(4-5):268-76; Baumer et al., Development. 2003 Jul;130(13):2903-15, Swaroop et al., Nat Rev Neurosci. 2010 Aug;11(8):563-76, Agathocleous and Harris, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2009. 25:45-69を参照。これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。）。前記マーカー識別名は、文献および当該技術分野において、特に、遺伝子識別名が本明細書において列挙される文脈に関連した技術分野において、通常用いられ、これには、視細胞、桿体、錐体、視細胞分化、視細胞前駆細胞、神経分化、神経幹細胞、多能性幹細胞、および文脈により指示される他の分野に関連する文献が含まれ得る。加えて、例えば、文脈が別にそうでないと指示する場合を除き、マーカーは通常、ヒトのものである。細胞マーカーは、当業者に周知の技術である、標準的な免疫細胞化学的方法または標準的なＰＣＲ法を用いて同定することが可能である。
【００９２】
疾患の「徴候」は、本明細書において用いられるとおり、患者の検査において発見可能な、疾患を示すあらゆる異常；疾患の主観的指標である症状とは対照的な、疾患の客観的指標について、広く言及する。
疾患の「症状」は、本明細書において用いられるとおり、患者によって経験されて、疾患の指標である、あらゆる病的現象、または構造、機能、もしくは知覚における正常からの逸脱について、広く言及する。
【００９３】
「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」、「治療的（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本明細書において用いられるとおり、疾患またはその臨床症状の軽減を引き起こす、疾患の処置、疾患またはその臨床症状の進行の抑止または低減、および／または疾患の緩和について、広く言及する。治療は、疾患の、予防、抑制、処置、治癒、療法、低減、緩和、ならびに／または、疾患、徴候、および／もしくは症状の緩和の提供を包含する。治療は、進行中の疾患徴候および／または症状（例えば失明、網膜悪化）がある患者における、徴候および／または症状の緩和を包含する。治療はまた、「予防」および「抑制」も包含する。予防は、患者における疾患の処置に引き続いて生じる疾患を抑制すること、または、患者における疾患の発生率もしくは重症度を低減することを含む。用語「軽減された」は、治療目的で、徴候および／または症状における、臨床的に顕著な低減について広く言及する。治療は、再発または、再発性の徴候および／もしくは症状（例えば網膜変性、視力喪失）を処置することを含む。治療は、あらゆる時点における徴候および／または症状の出現を排除すること、ならびに、既存の徴候および／または症状を低減することおよび既存の徴候および／または症状を消失させることを包含するが、これらに限定されない。治療は、慢性疾患の処置（「維持」）および急性疾患の処置を含む。例えば、処置は、再発または徴候および／もしくは症状（例えば失明、網膜変性）の再現を、処置あるいは抑制することを含む。
【００９４】
調製物におけるＲＰＥまたは視細胞前駆細胞は、単離された成人眼球（すなわち、年齢２５〜８０歳のヒト成人患者、より好ましくは年齢５０〜８０歳の成人）由来の同等数のＲＰＥ細胞についての視細胞外節（ＰＯＳ）のファゴサイトーシス速度よりも、少なくとも５０％速い、およびより好ましくは、少なくとも７５、１００、１５０もしくはさらに２００％速い、ＰＯＳのファゴサイトーシス速度を有してもよい。調製物における視細胞前駆細胞は、単離された成人眼球（すなわち、年齢２５〜８０歳のヒト成人患者、より好ましくは年齢５０〜８０歳の成人）由来の同等数の視細胞前駆細胞についての視細胞外節（ＰＯＳ）のファゴサイトーシス速度よりも、少なくとも５０％速い、およびより好ましくは、少なくとも７５、１００、１５０もしくはさらに２００％速い、ＰＯＳのファゴサイトーシス速度を有してもよい。
【００９５】
調製物におけるＲＰＥまたは視細胞前駆細胞は、２４時間後において視細胞外節（ＰＯＳ）の総濃度の少なくとも２０％である、およびより好ましくは、２４時間後においてＰＯＳの総濃度の少なくとも２５、３０、２５、４０もしくはさらに５０％でる、ＰＯＳのファゴサイトーシス速度を示し得る。ＰＯＳファゴサイトーシスは、Bergmann et al. FASEB Journal March 2004 vol.18, 562-564頁に記載のプロトコールを用い、本明細書において記載されている非ＦＩＴＣ標識されたＰＯＳにより、例示的かつ非限定的な一例のように、測定することができる。
【００９６】
ＲＰＥまたは視細胞前駆細胞集団は、様々な成熟度レベルの分化したＲＰＥ細胞を含んでもよく、または、特定の成熟度レベルの分化したＲＰＥ細胞に関して実質的に純粋であってもよい。ＲＰＥ細胞は、様々な成熟度／色素形成レベルのＲＰＥ細胞を含む、実質的に精製された調製物であってもよい。
【００９７】
ＲＰＥ細胞の凍結保存調製物
ＲＰＥ細胞または視細胞前駆細胞は、当該技術分野で公知のあらゆる適切な方法（例えば低温凍結）によって保存されてもよく、細胞の保存に適切ないずれの温度で凍結されてもよい。これらの細胞を使用する前に、これらは、本発明のアッセイにおいて試験されてもよく、細胞のファゴサイトーシス活性および／または能力を決定する。
本発明のファゴサイトーシスアッセイにおいて能力を示す、ＲＰＥ細胞または視細胞前駆細胞は、網膜剥離、網膜異形成、網膜色素線条症、近視性黄斑変性または網膜萎縮による網膜変性疾患、あるいは、先天性脈絡膜欠如、糖尿病性網膜症、黄斑変性（例えば、加齢性黄斑変性）、網膜色素変性症およびスタルガルト病（黄色斑眼底）などの視細胞損傷と失明をもたらす、視覚を変化させる多くの疾患と関連付けられている網膜変性疾患を処置するために用いることができる。
【００９８】
本明細書で提供されるＲＰＥまたは視細胞前駆細胞は、ヒトＲＰＥまたは視細胞前駆細胞であってもよい。しかしながら、ヒト細胞は、ヒト患者と同様に動物モデルまたは動物患者においても用いることができることを言及しておく。例えば、ヒト細胞は、網膜変性のマウス、ラット、ネコ、イヌまたは非ヒト霊長類モデルにおいて試験され得る。加えて、ヒト細胞は、獣医学などのようにその必要がある動物を処置するために、治療的に用いることもできる。
【００９９】
スクリーニングアッセイ
本開示は、ＲＰＥ細胞または視細胞前駆細胞の貪食活性を調節する薬剤を同定するための方法を提供する。
【０１００】
例
ここで本発明を一般的に記載しているが、下記例（これは、本発明の特定の側面および態様を単に例証する目的で含まれるものであって、本発明を限定することは意図していない）を参照することによって、より容易に理解される。
【０１０１】
ＲＰＥ細胞は、先に記載されているとおり（Klimanskaya et al, 2004）、ヒト胚性幹細胞に由来し、色素性クラスターの分化培養から単離した継代２〜５代目で用いた。細胞は、コンフルエントに達するまでＥＧＭ−２培地（Lonza）中で培養し、その後は、ＲＰＥ維持培地（Klimanskaya et al, 2004）で培養した。実験で用いられる細胞は、六角形形態、様々なレベルの茶色色素、立方体状の細胞外観、極性形成および密着結合により特徴づけられる、分化ＲＰＥ表現型を確立していた。代替的には、細胞は、コンフルエントになった後、完全に成熟する前に実験で用いた。
InVision Bioresourcesから入手したウシ桿体外節（catalog # 98740）。Life Technologiesから入手したＦＩＴＣ異性体（catalog # F1906）Ｉ。Life Technologiesから入手したｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ  Phagocytosis Particle Labeling Kit（catalog # A10026)。
【０１０２】
ＦＩＴＣによるＰＯＳの標識
１バイアルのＦＩＴＣ異性体Ｉ  １０ｍｇを０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）中に２ｍｇ／ｍＬで再懸濁した。３０００ｇで１０分間遠沈し、希釈されなかった粒子を除いて、上清のみをウシＲＯＳを標識するのに用いた。ＲＯＳとして有効な２５個のウシ眼球を解凍し、５ｍＬの洗浄用緩衝液（５ｍＭタウリンを含む、１０％スクロース含有２０ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．２）中に再懸濁した。２ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ上清１．５ｍＬを、再懸濁したＲＯＳに加え、暗所で揺らしながら室温にて１時間インキュベートした。インキュベーション後、ＲＯＳ−ＦＩＴＣ分画を３０００ｇで遠沈し、１０ｍＬの洗浄用緩衝液中に再懸濁した。この洗浄ステップを全部で２回繰り返した。洗浄後、２．５％スクロース含有ＤＭＥＭ（Gibco # 11960）１０ｍＬ中に再懸濁し、再度３０００ｇで１０分間遠沈した。最後に、細胞を２．５％スクロース含有ＤＭＥＭ１０ｍＬ中に再懸濁し、血球計算板を用いてＲＯＳ−ＦＩＴＣ粒子を係数して、２．５％スクロース含有ＤＭＥＭ中、１×１０８粒子／ｍＬの濃度に調整し、粒子を−８０℃で凍結した。
【０１０３】
ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）によるＰＯＳの標識
ＲＯＳとして有効な２５個のウシ眼球を、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液４．１６５ｍＬ中に再懸濁した。ＲＯＳをマイクロ遠心チューブ中へ７５０μＬずつ４つに分注した。チューブを１００００ＲＰＭで１分間遠心し、次いで再度、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液７５０μＬ中に再懸濁した。ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）色素は、ＤＭＳＯ中１０ｍＭの最終濃度になるように再懸濁した。０．５ｍＭの最終濃度になるようにｐＨｒｏｄｏ（登録商標）色素を重炭酸ナトリウム緩衝液中のＲＯＳに加え、暗所で４５分間インキュベートした。（キットの）「コンポーネントＣ」５００μＬを加え、１００００ＲＰＭで１分間遠心した。上清を吸引し、１００％メタノール１ｍＬに再懸濁した。チューブを３０秒間ボルテックスし、１００００ＲＰＭで１分間遠心した。メタノールを吸引し、（キットの洗浄用緩衝液）「コンポーネントＣ」１ｍＬに再懸濁して、再度１００００ＲＰＭで１分間遠心した。この洗浄ステップを全部で２回繰り返した。全粒子を総量２０ｍＬの（キットの）「バッファーＢ」に再懸濁した。ＲＯＳ−ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）を３０００ＲＰＭで１０分間遠沈して、２．５％スクロース含有ＤＭＥＭに再懸濁し、２．５％スクロース含有ＤＭＥＭ中、１×１０８粒子／ｍＬの濃度に調整し、粒子を−８０℃で凍結した。
【０１０４】
ＲＰＥ細胞は、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）結合ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓあるいは、ＦＩＴＣまたはｐＨｒｏｄｏ（登録商標）のどちらかで標識したウシ外節のいずれかと、３７℃で２〜２４時間、インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、トリプシン／解離緩衝液（１：１）を用いて回収して、遠心し、フローサイトメトリーにより解析した。ネガティブコントロールとして、細胞は、４℃で同一時間インキュベートした。
【０１０５】
加えて、ＦＩＴＣ標識されたＲＯＳ  ＦＡＣＳデータの解釈は、ＦＩＴＣ蛍光の一部が低ｐＨで失われ得るため、あまり正確ではなく（図２ＡおよびＢ）、つまり、一旦、粒子が取り込まれてファゴソームがリソソームと融合すると、最終的な低ｐＨ（４．５〜５．５）では、ＦＩＴＣ蛍光の一部が失われる。したがって、測定されたとおりの蛍光は、取り込まれた粒子由来の一部のシグナルの喪失と細胞表面に非特異的に結合した粒子由来の付加的なシグナルとを含んでいる。
【０１０６】
ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）は、ｐＨ感受性蛍光色素であり、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）標識されたＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓおよびＲＯＳの両者は、４℃では全く蛍光の増加を示さない（図１Ｂおよび１Ｃ）ので、リソソームと融合している取り込まれた粒子のみの特異的測定を可能にする。
ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）によるＲＯＳの標識は、ファゴサイトーシスアッセイの正確さを改善し、ファゴサイトーシスの複雑なメカニズムを詳細に解析するために、ＦＩＴＣ標識されたＲＯＳの代わりにまたはこれを補完するものとして、用いることができる。
【０１０７】
ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｅ．ｃｏｌｉ蛍光生体粒子による標識
細胞内ファゴソームの低下したｐＨ環境に取り込まれたとき蛍光を発する、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）  Ｅ．ｃｏｌｉ蛍光生体粒子（Invitrogen）を用いて、ファゴサイトーシスをＦＡＣＳベースのアッセイにより評価する。生体粒子は製造者の使用説明書にしたがって調製した。コンフルエントなＲＰＥは、ＣＯ２非依存性培地（Invitrogen）中で１６〜２０時間、３７℃にて、４ウェルプレートの１ウェルあたり生体粒子５０〜２００μＬとインキュベートした。ネガティブコントロールプレートは、４℃にてインキュベートした。細胞は、顕微鏡下で観察し、トリプシンにより回収して、Ｃ６フローサイトメーターで１０，０００イベントをカウントするＦＡＣＳにより解析した。
【０１０８】
【表１−１】
2018516535.tif 000003
【表１−２】
2018516535.tif 000004
【０１０９】
ＲＰＥ細胞によるｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ標識されたＲＯＳのファゴサイトーシス
ｈＥＳＣ由来ＲＰＥおよびＡＲＰＥ−１９細胞は、内皮細胞増殖培地（Endothelial Cell Growth Medium）（Lonza, cat# CC-3162, CC-3156）からなるＲＰＥ増殖培地（ＲＰＥ−ＧＭ）中で培養した。
【０１１０】
ファゴサイトーシスアッセイのために、ＲＰＥ細胞を、９６ウェルプレート（Becton-Dickinson）に５ｘ１０５細胞／ｃｍ２の密度で播種し、加湿インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２に維持した。最適なアッセイ測定値となるよう、ＲＰＥ細胞は、ファゴサイトーシス能力の評価に先立ってＲＰＥ−ＧＭ中で３〜５日間培養した。細胞が５日より長く培養される場合は、ＲＰＥ−ＧＭは、１０％ウシ胎仔血清、ＧｌｕｔａＭａｘおよびＮｏｒｍｏｃｉｎを補充したＤＭＥＭからなる、ＲＰＥ維持培地（RPE Maintenance Medium）（ＲＰＥ−ＭＭ）に切り替えた。培地は、十分な栄養が提供できるように２〜３日毎に交換した。ＲＰＥ細胞のファゴサイトーシス活性の決定には、ｐＨ感受性ローダミンベースのｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ標識された桿体外節（Rod Outer Segments）（ＲＯＳ）(InVision Bioresources, cat.# 98740)を用いた。ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Thermo Fisher Scientific, cat. # P35363）によるＲＯＳの標識は、既述されている。各ウェルのコンフルエントなＲＰＥ細胞は、１０％ＦＢＳおよびＮｏｒｍｏｃｉｎを含有するＤＭＥＭ培地０．１ｍＬと、１０％ＦＢＳおよびＮｏｒｍｏｃｉｎを補充されたＤＭＥＭ中で再構成された０．１ｍＬの標識されたＲＯＳと一緒に、播種した。
【０１１１】
ＲＰＥ細胞の最適ファゴサイトーシス能力を評価するため、９６ウェルプレートにおいて１．５ｘ１０６、３ｘ１０６、３．７５ｘ１０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７．５ｘ１０６、１０ｘ１０６および１３．５ｘ１０６ＲＯＳ／ウェルの異なるＲＯＳ濃度について試験した。ＲＯＳの凝集を減らし、ファゴサイトーシス効率を増加させるため、桿体外節の再構成の間、直接的パルス超音波処理ステップを導入した。ＲＰＥ細胞およびＲＯＳは、５％ＣＯ２および９５％空気雰囲気下で２０〜２８時間、試験サンプルについては３７℃で、ネガティブコントロールについては１２〜１５℃で、インキュベートした。翌日、ＲＯＳをＲＰＥ細胞の単層と２０〜２８時間インキュベートした後、培養培地を吸引し、各ウェルを０．２ｍＬのＣａ／Ｍｇ非含有ＰＢＳ（Gibco/Invitrogen #14190-250）で３回洗浄した。細胞解離緩衝液（Cell Dissociation Buffer）（Gibco/Invitrogen, cat. # 13151）をプラスした０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Sigma, cat. # T4049）０．２ｍＬを、それぞれのウェルに１：１の比で加え、各細胞懸濁液が可視化するまで（１０〜２０分）室温でインキュベートした。各サンプルの細胞懸濁液は、１０％ＦＢＳをプラスしたＤＭＥＭ２ｍＬを含有する、適切にラベルされた丸底ポリスチレンチューブに移して反応を中和させ、１６０ｇで５分間遠心した。約０．２〜０．２５ｍＬの液体を残して上清を静かに移した。サンプルチューブをボルテックスし、ＲＰＥ細胞によるＲＯＳの取り込みを既述したとおりBD Accuri C6 Flow Cytometerを用いて評価した。
【０１１２】
ファゴサイトーシス能力をさらに増加させるためには、単層中にある元来の（naive）ＲＰＥ細胞を、上記記載の手順に続いてｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ標識されたＲＯＳのファゴサイトーシスを実施する前に、回収（recovery）ステップを伴ってもしくは伴わずに、規定の期間にわたり非標識ＲＯＳに暴露することにより「コンピテント（competent）」にすることも可能である。
【０１１３】
参考文献
Schwartz SD, Hubschman JP, Heilwell G, Franco-Cardenas V, Pan CK, Ostrick RM, Mickunas E, Gay R, Klimanskaya I, Lanza R. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 2012 Feb 25;379(9817):713-20. doi:10.1016/S0140-6736(12)60028-2. Epub 2012 Jan 24. PubMed PMID: 22281388.
Klimanskaya I. Retinal pigment epithelium. Methods Enzymol. 2006;418:169-94. PubMed PMID: 17141036.
Lund RD, Wang S, Klimanskaya I, Holmes T, Ramos-Kelsey R, Lu B, Girman S, Bischoff N, Sauve Y, Lanza R. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 2006 Fall;8(3):189-99. PubMed PMID: 17009895.
Klimanskaya I, Hipp J, Rezai KA, West M, Atala A, Lanza R. Derivation and comparative assessment of retinal pigment epithelium from human embryonic stem cells using transcriptomics. Cloning Stem Cells. 2004;6(3):217-45. PubMed PMID:15671670.
Mao Y, Finnemann SC. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol Biol. 2013;935:285-95. doi:10.1007/978-1-62703-080-9_20. PubMed PMID: 23150376; PubMed Central PMCID:PMC3590840.
【０１１４】
Finnemann SC, Bonilha VL, Marmorstein AD, Rodriguez-Boulan E. Phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelial cells requires alpha(v)beta5 integrin for binding but not for internalization. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Nov 25;94(24):12932-7. PubMed PMID: 9371778; PubMed Central PMCID: PMC24241.
Miksa M, Komura H, Wu R, Shah KG, Wang P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. J Immunol Methods. 2009 Mar 15;342(1-2):71-7. doi: 10.1016/j.jim.2008.11.019. Epub 2009 Jan 9. PubMed PMID: 19135446; PubMed Central PMCID: PMC2675277.
Lu B, Malcuit C, Wang S, et al.  Long-term safety and function of RPE from human embryonic stem cells in preclinical models of macular degeneration. Stem Cells 2009; 21, 2125-2135.
Sparrow JR, Hicks D, Hamel CP. The retinal pigment epithelium in health and disease.  Curr Mol Med 2010; 10, 802-823.
Strauss O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev 2005; 85, 845-881.
【図１Ａ−Ｃ】
2018516535.tif 000005
【図２Ａ−Ｂ】
2018516535.tif 000006
【図３Ａ−Ｄ】
2018516535.tif 000007
【図３ＥＦ】
2018516535.tif 000008
【図４Ａ−Ｄ】
2018516535.tif 000009
【図４ＥＦ】
2018516535.tif 000010
【国際調査報告】
2018516535.tif 000011
2018516535.tif 000012
2018516535.tif 000013
2018516535.tif 000014