(57)【要約】対象における血管肉腫を治療するための組成物及び方法が提供される。カプシドと核酸発現カセットを含むベクターゲノムとを含む組換えＡＡＶが提供される。この発現カセットは、プロモーター、抗ＶＥＧＦ抗体重鎖免疫グロブリンに作動可能に連結された第一のシグナルペプチド、リンカー配列、及び抗ＶＥＧＦ軽鎖免疫グロブリンに作動可能に連結された第二のシグナルペプチドをコードする配列を含み、当該発現カセットは、鎖が組み立てられて機能的抗ＶＥＧＦ抗体となることを可能にする条件下で、宿主細胞中において免疫グロブリン鎖を発同時現する。１つの実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はキメラ抗体である。【選択図】図１
2018526003.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１５の抗ＶＥＧＦ抗体重鎖免疫グロブリン及び／または配列番号１４の抗ＶＥＧＦ抗体軽鎖免疫グロブリンを含む、イヌＶＥＧＦと結合する機能的抗ＶＥＧＦ抗体をコードする核酸配列、及び前記免疫グロブリン鎖の発現を、宿主細胞中において、前記鎖が組み立てられて機能性抗体となることができる条件下で指示する発現制御配列、を含む少なくとも１つの核酸発現カセットを含むウイルスベクター。
【請求項２】
プロモーター、抗ＶＥＧＦ抗体重鎖免疫グロブリンに作動可能に連結された第一のシグナルペプチド、リンカー配列、及び抗ＶＥＧＦ抗体軽鎖免疫グロブリンに作動可能に連結された第二のシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの核酸発現カセットを含むウイルスベクターであって、前記発現カセットが、前記免疫グロブリン鎖を、宿主細胞中で、前記鎖が組み立てられて、配列番号１４及び／または配列番号１５を含む機能性キメラ抗ＶＥＧＦ抗体となることができる条件下で同時発現する、前記ウイルスベクター。
【請求項３】
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである請求項１または２に記載のウイルスベクター。
【請求項４】
前記ベクターがＡＡＶ８カプシドを有する請求項３に記載のウイルスベクター。
【請求項５】
前記リンカー配列が、ＩＲＥＳ配列、２Ａペプチド配列及びフリン部位の１つ以上を含む請求項２に記載のウイルスベクター。
【請求項６】
前記キメラ抗ＶＥＧＦ抗体が、モノクローナル抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ）３、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、イムノアドヘシン、または単鎖可変断片抗体から選択される請求項１〜４のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
【請求項７】
前記抗体がキメラモノクローナル抗体である請求項５に記載のウイルスベクター。
【請求項８】
抗ＶＥＧＦ抗体重鎖可変領域をコードする核酸配列が、配列番号６またはそのコドン最適化変異体を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
【請求項９】
抗ＶＥＧＦ抗体重鎖定常領域をコードする核酸配列が、配列番号８またはそのコドン最適化変異体を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
【請求項１０】
抗ＶＥＧＦ抗体軽鎖可変領域をコードする前記核酸配列が、配列番号７またはそのコドン最適化変異体を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
【請求項１１】
抗ＶＥＧＦ抗体軽鎖定常領域をコードする前記核酸配列が、配列番号９またはそのコドン最適化変異体を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
【請求項１２】
前記プロモーターがＣＭＶプロモーターである請求項１〜４のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
【請求項１３】
前記発現制御配列が構成的プロモーターを含む請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項１４】
さらに、イントロン、コザック配列、ポリＡ、及び転写後調節エレメントのうちの１つ以上を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
【請求項１５】
ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ８、ｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶ９、ＡＡＶｈｕ．３７またはｒｈ１０及びこれらの変異体から選択される請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項１６】
医薬上許容される担体及び請求項１〜１５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶを含む医薬組成物。
【請求項１７】
癌を治療する方法であって、請求項１６に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む前記方法。
【請求項１８】
前記組成物が約１×１０１２ＧＣ／ｋｇの投与量で投与される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
配列番号１４及び配列番号１５を含むキメラ抗ＶＥＧＦ抗体。
【請求項２０】
前記抗体をコードする核酸配列が、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９の少なくとも１つ、またはこれらのコドン最適化変異体を含む請求項１９に記載のキメラ抗体。
【請求項２１】
当該ベクターを必要とする対象における癌の治療のための請求項１〜１５のいずれか１項に記載のウイルスベクターの使用。
【請求項２２】
当該ベクターを必要とする対象において癌を治療するために使用する請求項１〜１５のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子形式で提出されたデータの参照による援用
本出願人は、本明細書とともに電子形式で出願された配列表データを、本明細書により参照することにより援用する。このファイルは「１５−７４７３＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ＿ＳＴ２５」と名前がついている。
【背景技術】
【０００２】
血管肉腫（ＨＳＡ）は、米国において年間２５万匹を超える犬が罹患している。ＨＳＡは、通常、脾臓または肝臓に見出される血管腫瘍である。現在、ＨＳＡは治癒することができず、標準的な治療は、典型的には、手術と、その後のドキソルビシンの化学療法レジメンである。この治療法は、通常、６，０００ドルを超える費用がかかり、生存期間をさらに３〜４ヶ月延長し得る。いずれの年齢及び品種の犬も血管肉腫に罹患し得るが、中年過ぎの（６歳超の）犬、とり分け、ゴールデンレトリーバー、ジャーマンシェパードドッグ、ポーチュギーズウォータードッグ、バーニーズマウンテンドッグ、フラットコーテッドレトリーバー、ボクサー、スカイテリア等の品種により起こりやすい。２０００年に発表されたゴールデンレトリーバーの健康調査によると、この品種における血管肉腫の推定生涯リスクは５分の１であり、この問題の大きさを示している。
【０００３】
犬において、血管肉腫の一般的な原発部位は、脾臓、心臓の右心房、及び皮膚の下の組織である皮下組織である。これらの腫瘍の増殖のパターンは、腫瘍を取り囲む正常組織への浸潤及び転移を伴う。
【０００４】
ＨＳＡ腫瘍はまた、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及びＶＥＧＦ受容体を発現し、これらは腫瘍が血管新生増殖によって血管新生及び細胞増殖するのを助ける。犬または他のペットに現在利用可能なＶＥＧＦを標的とする療法はない。
【０００５】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、その安全性プロファイル及びインビボでの長期遺伝子発現能力のために、治療遺伝子を送達するのに望ましいベクターである。組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）は、以前よりインビボで一本鎖及び全長抗体を発現するためにこれまで使用されている。ＡＡＶの導入遺伝子パッケージング能力が限られているため、全長抗体を生成するために単一のＡＡＶベクターを用いて抗体の重鎖及び軽鎖を発現させる厳格に制御された系を有することが技術的課題となっている。
【０００６】
従って、対象、特にペットにおけるＶＥＧＦを標的するのに有用な組成物が求められている。
【発明の概要】
【０００７】
新規な操作されたキメライヌ抗ＶＥＧＦ抗体構築物が提供される。これらの構築物は、いくつかの経路を介して、特に組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター等の組換えベクターの媒介によるインビボでの発現によって、それを必要とする対象に送達することができる。１つの実施形態では、対象はペット、例えばイヌまたはネコである。
【０００８】
１つの態様において、ウイルスベクターが提供される。１つの実施形態では、ウイルスベクターは、宿主細胞におけるＶＥＧＦ抗体の発現を指示する発現制御配列に作動可能に連結されたキメライヌ血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）抗体をコードする配列を含む少なくとも１つの核酸発現カセットを含む。
【０００９】
別の実施形態では、ウイルスベクターは、プロモーター、キメライヌ抗ＶＥＧＦ抗体重鎖免疫グロブリンに作動可能に連結された第一のシグナルペプチド、リンカー配列、及びキメライヌ抗ＶＥＧＦ軽鎖免疫グロブリンに作動可能に連結された第二のシグナルペプチドをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸発現カセットを含み、当該発現カセットは、免疫グロブリン鎖を、宿主細胞中において、これらの鎖が組み立てられて機能的キメライヌ抗ＶＥＧＦ抗体となることができる条件下で同時発現する。
【００１０】
別の態様では、ウイルスベクターは、配列番号１５の抗ＶＥＧＦ抗体重鎖免疫グロブリン及び／または配列番号１４の抗ＶＥＧＦ抗体軽鎖免疫グロブリンを含むイヌＶＥＧＦと結合する機能的抗ＶＥＧＦ抗体をコードする核酸配列、及び免疫グロブリン鎖の発現を、宿主細胞中において、これらの鎖が組み立てられて機能性抗体となることができる条件下で指示する発現制御配列を含む少なくとも１つの核酸発現カセットを含む。
【００１１】
別の実施形態では、ウイルスベクターは、５’ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、任意のエンハンサーを有するプロモーター、キメライヌ抗ＶＥＧＦ抗体重鎖免疫グロブリンに作動可能に連結された第一のシグナルペプチド、リンカー配列、抗ＶＥＧＦ軽鎖免疫グロブリンに作動可能に連結された第二のシグナルペプチド、及び３’ＡＡＶ ＩＴＲをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸発現カセットを含み、当該発現カセットは、免疫グロブリン鎖を、宿主細胞中において、これらの鎖が組み立てられて機能的イヌキメラ抗ＶＥＧＦ抗体となることができる条件下で同時発現する。また、ウイルスベクターから産生されたキメラ抗ＶＥＧＦ抗体も提供される。１つの実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、マウス可変鎖がイヌ定常ドメインに連結されているキメラ抗体である。１つの実施形態では、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクターである。別の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ８、ｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶ９、ＡＡＶｈｕ．３７またはｒｈ１０及びその変異体から選択されるカプシドを有するｒＡＡＶである。１つの実施形態では、カプシドはＡＡＶ８カプシドまたはその変異体である。
【００１２】
別の実施形態では、ウイルスベクターは、別のウイルスベクターから選択される。他の適切なベクターとしては、アデノウイルス、ＲＮＡベクター（例えば、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプマウイルス、フレンド、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）等のレトロウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明で使用される「レトロウイルスベクター」は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−２、並びにヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ免疫不全ウイルス（ＥＩＶ）及び他のクラスのレトロウイルス等のレンチウイルス科レトロウイルス、リポソーム、カチオン性脂質、レンチウイルスベクター並びにトランスポゾンに由来するベクターも含むことができる。別の実施形態において、ウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルスである。
【００１３】
別の態様では、薬学上許容される担体及び本明細書に記載のウイルスベクターを含む医薬組成物が提供される。別の実施形態において、医薬組成物は、ウイルスベクター及び担体、希釈剤、賦形剤及び／またはアジュバントを含む懸濁液である。
【００１４】
別の態様では、癌、例えば血管肉腫の治療方法が提供される。１つの実施形態では、この方法は、本明細書に記載のウイルスベクター含有組成物を投与することを含む。
【００１５】
別の態様では、キメラ抗ＶＥＧＦ抗体が提供される。１つの実施形態では、キメラ抗体は、マウス及びイヌ免疫グロブリンドメインを含む。別の態様では、キメラ抗ＶＥＧＦ抗体
を薬学上許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物が提供される。別の実施形態では、医薬組成物は、キメライヌ抗ＶＥＧＦ抗体及び担体、希釈剤、賦形剤及び／またはアジュバントを含む。
【００１６】
本発明の他の態様及び利点は、本発明の以下の詳細な説明から容易に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】精製されたキメラマウス−イヌ抗ＶＥＧＦ抗体を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。ラダーはＰａｇｅｒｕｌｅｒ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。
【図２】ＡＡＶ８ベクターで処置した３匹のイヌにおける血清抗ＶＥＧＦ抗体濃度を示すグラフである。
【図３】実施例１で使用した発現構築物の概略マップである。
【図４】図３及び実施例１の構築物の発現カセットのレイアウトを示す概略マップである。
【図５】本発明の一実施形態のキメラ抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖（上、配列番号１４）及び重鎖（下、配列番号１５）を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）には下線が引かれている。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
宿主細胞においてＶＥＧＦ抗体の発現を指示する発現制御配列に作動可能に連結されたキメラ抗ＶＥＧＦ血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）抗体をコードする配列を含む少なくとも１つの核酸発現カセットを含むウイルスベクターが本明細書に記載される。また、本明細書に記載の構築物を用いて産生された、イヌ及びマウス領域の両方を含有するキメラ抗ＶＥＧＦ抗体も提供される。ＡＡＶ８ベクターによって発現される構築物の例を用いて、本発明者らは、インビボ試験において１１０日以上の持続的な抗体発現を実証した。
【００１９】
１つの実施形態では、ウイルスベクターは、プロモーター、キメライヌ抗ＶＥＧＦ抗体重鎖免疫グロブリンに作動可能に連結された第一のシグナルペプチド、リンカー配列、及びキメライヌ抗ＶＥＧＦ軽鎖免疫グロブリンに作動可能に連結された第二のシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの核酸発現カセットを含み、当該発現カセットは、免疫グロブリン鎖を、宿主細胞中において、鎖が組み立てられて機能的キメラ抗ＶＥＧＦ抗体となることができる条件下で同時発現させる（図４）。別の実施形態では、ウイルスベクターは、５’ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、任意のエンハンサーを有するプロモーター、キメライヌ抗ＶＥＧＦ重鎖免疫グロブリンに作動可能に連結された第一のシグナルペプチド、リンカー配列、キメライヌ抗ＶＥＧＦ軽鎖免疫グロブリンに作動可能に連結された第二のシグナルペプチド、及び３’ＡＡＶ  ＩＴＲをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの核酸発現カセットを含み、当該発現カセットは、キメライヌ免疫グロブリン鎖を、宿主細胞中において、鎖が組み立てられて機能的抗ＶＥＧＦ抗体となることができる条件下で同時発現する。本明細書中で使用される場合、「機能的抗体」は、保護（例えば、受動免疫）または治療（例えば、ＶＥＧＦを中和する）であり得る、所望の生理学的結果を達成するのに十分な結合親和性で選択された標的（例えば、ＶＥＧＦ）に結合する抗体または免疫グロブリンであり得る。
【００２０】
１つの実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はキメラである。本明細書中で使用される場合、「キメラ」とは、２種以上のタンパク質由来の領域を組み込んで、「親」タンパク質のそれぞれ由来の特性を、得られるキメラ抗体に付与する、抗体を指す。１つの実施形態では、抗体はマウス免疫グロブリンドメインを含む。１つの実施形態では、抗体はイヌ免疫グロブリンドメインを含む。１つの実施形態では、抗体はマウス可変領域を含む。別の実施形態では、抗体は、別の種に由来する可変鎖領域を含む。１つの実施形態では、抗体は、マ
ウス抗体由来の可変領域及びイヌ由来の定常鎖領域を含み、得られた抗体は「キメラ」と呼ばれる。別の実施形態では、抗体は、抗体の投与が最終的に意図される同じ対象種に由来する定常鎖領域を含む。１つの実施形態では、Ｆｃ領域はイヌ配列である。別の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、マウス抗ＶＥＧＦ抗体の可変領域及びイヌＶＥＧＦ  ＩｇＧＡ／カッパ定常領域を含む。１つの実施形態では、マウス可変領域はマウスモノクローナル抗体ａ４．６．１由来である（Ｇｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｉｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ＶＥＧＦ−Ａ  ｍａｙ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＰＮＡＳ，１０４（９）：３４７８−８３
２００７、参照により援用）。１つの実施形態では、抗体は、配列番号１４及び配列番号１５の配列を含む。別の実施形態において、抗体は、図５に示されるマウスＣＤＲを含むキメライヌ抗体である。この実施形態では、残りの抗体配列はイヌ由来である。 
【００２１】
本明細書で提供されるＡＡＶベクターは、１つ以上の免疫グロブリンドメインを発現する１つまたは２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み得る。本明細書で使用される場合、「免疫グロブリンドメイン」は、従来の全長抗体に関して定義される抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。より詳細には、全長抗体は、１つのＮ末端可変（ＶＨ）領域及び３つのＣ末端定常（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）領域を含む４つのドメインを含む重鎖（Ｈ）ポリペプチド、及び１つのＮ末端可変（ＶＬ）領域及び１つのＣ末端定常（ＣＬ）領域の２つのドメインを含む軽（Ｌ）鎖ペプチドを含む。Ｆａｂ領域は、重鎖及び軽鎖のそれぞれに対して１つの定常ドメイン及び１つの可変ドメインを含み得る。
【００２２】
「免疫グロブリン」という用語は、本明細書では、上記のように、抗体及びその機能的断片（免疫グロブリンドメインを含む）を含むように使用される。本明細書に記載の抗ＶＥＧＦ抗体は、様々な形態で存在してもよく、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、細胞内抗体（「イントラボディー」）、組換え抗体、多重特異性抗体（二重特異性）、抗体断片、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ）３、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、免疫接着、一本鎖可変断片抗体（ｓｃＦｖ）、タンデム／ビス−ｓｃＦｖ，Ｆｃ，ｐＦｃ’，ｓｃＦｖＦｃ（またはｓｃＦｖ−Ｆｃ）、ジスルフィドＦｖ（ｄｓｆｖ）、ＢｉＴＥ抗体などの二重特異性抗体（ｂｃ−ｓｃＦｖ）、ラクダ抗体、表面再構成抗体、ヒト抗体、完全ヒト抗体、イヌ化抗体、完全イヌ抗体、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）としても知られている）、キメラ抗体、少なくとも１つのイヌ定常領域等を含むキメラ抗体などが含まれるが、これらに限定されない。「抗体断片」は、その標的、例えばＶＥＧＦに結合する免疫グロブリンの可変領域の少なくとも一部を指す。１つの実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧである。しかしながら、他のタイプの免疫グロブリンを選択することもできる。
【００２３】
１つの実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、キメラモノクローナル抗体である。１つの実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体重鎖免疫グロブリンは、可変鎖配列（ＶＨ）を含む。１つの実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体重鎖免疫グロブリンは、可変鎖配列（ＶＨ）及び少なくとも１つのイヌ定常鎖配列（ＣＨ）を含む。さらなる実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体重鎖免疫グロブリンは、可変鎖配列（ＶＨ）及び３つの全ての定常鎖配列（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を含む。１つの実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体可変重鎖免疫グロブリンアミノ酸配列は配列番号１である。１つの実施形態では、定常重鎖アミノ酸配列は配列番号２である。１つの実施形態では、抗ＶＥＧＦ軽鎖免疫グロブリンは可変鎖配列（ＶＬ）を含む。１つの実施形態では、抗ＶＥＧＦ軽鎖免疫グロブリンは、可変鎖配列（ＶＬ）及び少なくとも１つのイヌ定常鎖配列（ＣＬ）を含む。１つの実施形態では、抗ＶＥＧＦ軽鎖可変免疫グロブリンアミノ酸配列は配列番号３である。１つの実施形態では、抗ＶＥＧＦ軽鎖定常免疫グロブリンアミノ酸配列は配列番号４である。１つの実施形態では、キメラ 抗
ＶＥＧＦ軽鎖配列は配列番号１４である。１つの実施形態では、キメラ抗ＶＥＧＦ重鎖配列は配列番号１５である。
【００２４】
「異種」という用語は、タンパク質または核酸に関して使用される場合、タンパク質または核酸が、２つ以上の配列または部分配列を、自然ではそれらが互いに取ることの見られない関連性で含んでいることを指す。例えば、発現カセットは、典型的には、組換えにより製造され、新たな機能的核酸を作るように配置された無関係の遺伝子由来の配列を２つ以上有する。例えば、１つの実施形態では、核酸は、異なる遺伝子に由来するコード配列の発現を指示するように配置された１つの遺伝子由来のプロモーターを有する。従って、免疫グロブリンコード配列に関して、プロモーターは異種である。同様に、ＡＡＶカプシドに関して、免疫グロブリンコード配列は異種である。
【００２５】
ベクター内にパッケージングされた核酸分子によって運ばれる１つ以上のＯＲＦ（複数可）は、２つの発現カセットから発現され得、その一方または両方が２シストロニン性であり得る。従って、発現カセットまたは発現カセットを含むベクターを参照する場合、所望の抗ＶＥＧＦ抗体配列を発現するために２つ以上の発現カセットが使用される別の実施形態が企図される。
【００２６】
別の態様では、本明細書に記載の抗体領域アミノ酸配列をコードする核酸配列も提供される。選択された免疫グロブリンドメイン（例えば、重鎖（複数可）及び／または軽鎖（複数可））のコード配列は、得られ得る及び／または合成され得るか、或いは本明細書に記載され得る。 アミノ酸を配列決定するための方法は、当業者に公知である。一旦アミノ酸の配列が分かると、ウェブベース及び市販のコンピュータプログラム、並びにアミノ酸配列を核酸コード配列に逆翻訳するサービスベースの企業が存在する。例えば、
ＥＭＢＯＳＳのｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／、
Ｇｅｎｅ  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｉｎｆｉｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｓｍｓ／ｓｍｓ＿ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）、
ＥｘＰａｓｙ（ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／）を参照のこと。
【００２７】
１つの実施形態では、ＲＮＡ及び／またはｃＤＮＡコード配列は、イヌ細胞において最適に発現するように設計される。核酸を合成する方法は、当業者に公知であり、本明細書に記載の核酸構築物のすべてまたは一部に利用することができる。１つの実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体重鎖可変領域をコードする核酸配列は、配列番号６またはそのコドン最適化変異体を含む。１つの実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体軽鎖可変領域をコードする核酸配列は、配列番号７またはそのコドン最適化変異体を含む。１つの実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体重鎖定常領域をコードする核酸配列は配列番号８またはそのコドン最適化変異体を含む。１つの実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体軽鎖定常領域をコードする核酸配列は、配列番号９またはそのコドン最適化変異体を含む。
【００２８】
別の実施形態では、記載される免疫グロブリンドメインのいずれかをコードする核酸配列は、本明細書に記載の配列（例えば、配列番号６、７、８または９）と少なくとも５０％の同一性を共有する。別の実施形態では、記載される免疫グロブリンドメインのいずれかをコードする核酸配列は、本明細書に記載の配列（例えば、配列番号６、７、８または９）と少なくとも６０％の同一性を共有する。他の実施形態では、記載される免疫グロブリンドメインのいずれかをコードする核酸配列は、本明細書に記載の配列（例えば、配列番号６、７、８または９）と少なくとも７０％の同一性を共有する。別の実施形態では、記載される免疫グロブリンドメインのいずれかをコードする核酸配列は、本明細書に記載の配列（例えば、配列番号６、７、８または９）と少なくとも８０％の同一性を共有する。
別の実施形態では、記載される免疫グロブリンドメインのいずれかをコードする核酸配列は、本明細書に記載の配列（例えば、配列番号６、７、８または９）と少なくとも９０％の同一性を共有する。
【００２９】
別の実施形態では、配列番号１の抗ＶＥＧＦ抗体重鎖可変領域をコードする核酸配列が提供される。別の実施形態では、配列番号２の抗ＶＥＧＦ抗体重鎖定常領域をコードする核酸配列が提供される。別の実施形態では、配列番号３の抗ＶＥＧＦ抗体軽鎖可変領域をコードする核酸配列が提供される。別の実施形態では、配列番号４の抗ＶＥＧＦ抗体軽鎖定常領域をコードする核酸配列が提供される。記載されるポリペプチド配列をコードするすべての核酸が包含され、その核酸には所望の標的対象における発現のために（例えば、コドン最適化によって）最適化された核酸配列が含まれることが意図される。
【００３０】
コドン最適化コード領域は、様々な異なる方法によって設計することができる。この最適化は、オンラインで利用可能な方法（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ）、公開されている方法、または、例えばＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）等のコドン最適化サービスを提供する会社を利用して行うことができる。１つのコドン最適化アルゴリズムは、例えば、国際特許公開番号ＷＯ２０１５／０１２９２４に記載されており、これは本明細書中に参照により援用される。また、例えば、米国特許公開第二０１４／００３２１８６号及び米国特許公開第二００６／０１３６１８４号も参照のこと。製品のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長が適切に改変される。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＯＲＦの断片のみ（例えば、個々の免疫グロブリンドメインの１つ以上）を改変することができる。これらの方法の１つを用いることにより、任意の所与のポリペプチド配列に出現頻度を適用し、ポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域の核酸断片を産生することができる。
【００３１】
コドンへの実際の変化を実行するため、または本明細書に記載のように設計されたコドン最適化コード領域を合成するために、多くの選択肢が利用可能である。そのような改変または合成は、当業者に周知の標準的及び日常的な分子生物学的操作を用いて行うことができる。１つのアプローチでは、長さがそれぞれ８０〜９０ヌクレオチドであり、所望の配列の長さにわたる一連の相補的なオリゴヌクレオチド対を標準的な方法によって合成する。これらのオリゴヌクレオチド対は、アニーリングの際に、凝集末端を含む８０〜９０塩基対の二本鎖断片を形成するように合成される、例えば、対の各オリゴヌクレオチドは、対の中の他のオリゴヌクレオチドに相補的な領域を超えて３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の塩基を伸長するように合成される。オリゴヌクレオチドの各対の一本鎖末端は、オリゴヌクレオチドの別の対の一本鎖末端とアニールするように設計されている。オリゴヌクレオチド対をアニールさせ、次いで約５〜６個のこれらの二本鎖断片を、凝集一本鎖末端を介して一緒にアニールさせ、その後これらを一緒に連結し、標準的な細菌クローニングベクター、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．から入手できるＴＯＰＯ（登録商標）ベクター、にクローニングする。次いで、構築物を標準的な方法によって配列決定する。一緒に連結された８０〜９０塩基対断片の５〜６個の断片、すなわち約５００塩基対の断片、からなるこれらの構築物のいくつかは、所望の配列全体が一連のプラスミド構築物中に再現されるように調製される。次いで、これらのプラスミドのインサートを適切な制限酵素で切断し、一緒に連結して最終構築物を形成する。次いで、最終構築物を標準的な細菌クローニングベクターにクローニングし、配列決定する。さらなる方法は、当業者には直ぐに明らかであろう。さらに、遺伝子合成は商業的に容易に入手可能である。
【００３２】
任意に、免疫グロブリンドメイン核酸またはアミノ酸配列への置換が、発現、標的化を向上させるため、または他の理由のために、天然の配列または本明細書で提供される配列からなされ得る。そのような整列を作製するための方法及びコンピュータプログラムは、利
用可能であり、当業者に周知である。置換はまた、（一文字コードで識別されるアミノ酸）−位置番号−（一文字コードで識別されるアミノ酸）と書くこともでき、これによって第一のアミノ酸は置換されたアミノ酸であり、第二のアミノ酸は指定された位置の置換するアミノ酸である。本明細書で使用される「置換」及び「アミノ酸の置換」及び「アミノ酸置換」という用語は、アミノ酸配列中のアミノ酸の別のものとの置換（後者は置換されるアミノ酸とは異なっている）を指す。アミノ酸を置換するための方法は、当業者に周知であり、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の突然変異を含むが、これに限定されない。ＩｇＧにおけるアミノ酸置換を作製する方法は、例えば、ＷＯ２０１３／０４６７０４に記載されており、これは、アミノ酸修飾技術の考察のために参考により援用される。
【００３３】
別の態様では、キメラ抗ＶＥＧＦ抗体及びそのドメインが提供される。１つの実施形態では、キメラ抗ＶＥＧＦ抗体は、マウス可変領域及びイヌ定常領域を含む。１つの実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体重鎖免疫グロブリンドメインは、可変鎖配列及び少なくとも１つの定常鎖配列を含む。別の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体重鎖可変断片免疫グロブリンアミノ酸配列は配列番号１である（ＣＤＲに下線を付す）。
2018526003.tif 000003
別の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体重鎖可変断片免疫グロブリンは、配列番号１と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を共有する配列を有する。別の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体重鎖免疫グロブリンをコードする核酸配列が提供される。別の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、上で下線を付したＣＤＲを含む。
【００３４】
別の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖定常断片免疫グロブリンのアミノ酸配列は、配列番号２である。
2018526003.tif 000004
別の実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体重鎖イヌ定常領域免疫グロブリンは、配列番号２と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を共有する配列を有する。別の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体イヌ重鎖定常領域免疫グロブリンをコードする核酸配列が提供される。
【００３５】
１つの実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体軽鎖免疫グロブリンドメインは、可変鎖配列及び少なくとも１つのイヌ定常鎖配列を含む。１つの実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体軽鎖可変断片免疫グロブリンアミノ酸配列は、配列番号３である（ＣＤＲに下線を付す）。
2018526003.tif 000005
別の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体軽鎖可変領域は、配列番号３と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または以上の同一性を共有する配列を有する。別の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体軽鎖可変領域をコードする核酸配列が提供される。別の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、上記で下線を付したＣＤＲを含む。
【００３６】
１つの実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体軽鎖イヌ定常領域免疫グロブリンアミノ酸配列は、配列番号４である。
2018526003.tif 000006
別の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体軽鎖定常領域は、配列番号４と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を共有する配列を有する。別の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体軽鎖長領域をコードする核酸配列が提供される。
【００３７】
１つの実施形態では、キメラ抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４の１つ以上を含む。別の実施形態では、キメラ抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４の１つ以上と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を共有する１つ以上の配列を含む。
【００３８】
上記の「アミノ酸置換」という用語及びその同義語は、アミノ酸を別の置換アミノ酸で置換することによるアミノ酸配列の修飾を包含することが意図される。置換は、所望の結果に応じて、保存的または非保存的置換であり得る。「保存的」という用語は、２つのアミノ酸に言及する際、アミノ酸が当業者によって認識される共通の性質を共有することを意味することが意図される。「非保存的」という用語は、２つのアミノ酸に言及する際、当業者によって認識される少なくとも１つの性質に差異を有するアミノ酸を意味することが意図される。例えば、このような性質としては、疎水性の非酸側鎖を有するアミノ酸、疎水性側鎖を有するアミノ酸（酸性または非酸性としてさらに区別され得る）、脂肪族疎水性側鎖を有するアミノ酸、芳香族疎水性側鎖を有するアミノ酸、極性中性側鎖を有するアミノ酸、電荷を帯びた側鎖を有するアミノ酸、電荷を帯びた酸性側鎖を有するアミノ酸、及び電荷を帯びた塩基性側鎖を有するアミノ酸が挙げられる。天然に存在するアミノ酸及び天然に存在しないアミノ酸の両方が、当技術分野で周知であり、実施形態において置換するアミノ酸として使用され得る。従って、保存的アミノ酸置換は、疎水性側鎖を有する第一のアミノ酸を、疎水性側鎖を有する異なるアミノ酸で変化させることを含み得、一方非保存的アミノ酸置換は、酸性疎水性側鎖を有する第一のアミノ酸を、異なる側鎖、例えば塩基性疎水性側鎖または親水性側鎖を有する異なるアミノ酸で変えることを含み得る。さらに他の保存的または非保存的変化が、当業者によって決定され得る。さらに他の実施形態では、所与の位置での置換は、本明細書において特定される目的を達成するため、当業者に明らかであるアミノ酸またはアミノ酸グループの１つに対する置換である。本明細書中で使用される場合、「同一性％」という用語は、特定の数のアミノ酸置換を指し得る。例えば、１２４個のアミノ酸を有する配列番号１の場合、「少なくとも９０％の同一性」を共有する配列は、天然配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、
１１または１２個のアミノ酸置換を有し得る。そのような定義が、本明細書において企図される。
【００３９】
選択された免疫グロブリンドメインを発現させるために、選択された哺乳動物種、例えばイヌ、において免疫グロブリンドメインポリペプチドの最適な発現のために選択されたコドンを含む核酸分子を設計することができる。さらに、核酸分子は、選択された抗体の重鎖及び軽鎖それぞれの異種リーダー配列を含み得る。１つの実施形態では、リーダー配列は、可変領域及び定常領域からなる重鎖ポリペプチドの上流に融合したＩＬ−２リーダーペプチド、及び可変領域及び定常領域からなる軽鎖ポリペプチドの上流に融合した第二リーダーＩＬ−２リーダーペプチドをコードする。１つの実施形態では、第一及び第二のリーダー配列は同じである。別の実施形態では、第一及び第二リーダー配列は異なる。１つの実施形態では、リーダー配列は配列番号５：Ｍ Ｙ Ｒ Ｍ Ｑ Ｌ Ｌ Ｓ Ｃ Ｉ Ａ Ｌ Ｓ
Ｌ Ａ Ｌ Ｖ Ｔ Ｎ Ｓである。しかしながら、別の異種リーダー配列で、ＩＬ−２シグナル／リーダーペプチドの一方または両方を置換してもよい。シグナル／リーダーペプチドは、重鎖及び軽鎖免疫グロブリンドメイン構築物のそれぞれについて同じであっても異なっていてもよい。これらは、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）において天然に見出されるシグナル配列であってもよく、または異種の供給源に由来するものもよい。そのような異種の供給源は、とりわけ、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ１２、ＩＬ１８など）、インスリン、アルブミン、β-グルクロニダーゼ、アルカリプロテアーゼまたはフィブロネクチン分泌シグナルペプチド、または、組織特異的分泌タンパク質由来の配列であり得る。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「発現カセット」とは、免疫グロブリン遺伝子（複数可）（例えば、免疫グロブリン可変領域、免疫グロブリン定常領域、全長軽鎖、全長重鎖または免疫グロブリン構築物の別の断片）、プロモーターを含み、またそのための他の調節配列（即ち、カセットを、遺伝子エレメント（例えば、プラスミド）を介してパッケージング宿主細胞に送達し、ウイルスベクターのカプシド（例えば、ＡＡＶまたは他のパルボウイルス粒子）またはエンベロープウイルスのエンベロープにパッケージングすることができる調節配列）を含み得る。典型的には、ウイルスベクターを生成するためのそのような発現カセットは、ウイルスゲノム及び他の発現制御配列のパッケージングシグナルが隣に配置された、本明細書に記載の免疫グロブリン配列を含む。そのような配列は、本明細書中では、共に、ベクターゲノムと呼ぶことができる。しかしながら、「発現カセット」及び「ベクターゲノム」という用語は区別なく使用されることを意図される。１つの実施形態では、発現カセットは、少なくとも第一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及び任意に第二のＯＲＦを含む。ＯＲＦは、１、２、３又は４個の抗体ドメインを含み得る。例えば、ＯＲＦは全長重鎖を含むことができる。あるいは、ＯＲＦは、１つまたは２つの抗体ドメインを含み得る。例えば、ＯＲＦは、重鎖可変ドメイン及び単一重鎖定常ドメインを含み得る。別の例において、ＯＲＦは、重鎖可変ドメイン及び３つの重鎖定常ドメインを含み得る。別の例において、ＯＲＦは、軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含み得る。従って、発現カセットは、２シストロン性であるように、すなわち、共有の調節配列由来のＯＲＦをその上に発現することを指示する調節配列を含むように、設計され得る。この場合、２つのＯＲＦは、典型的にはリンカーによって分離される。内部リボザイム結合部位（ＩＲＥＳ）及び／またはフリン−２ａ自己切断ペプチドリンカー（Ｆ２ａ）［例えば、Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ及びＭｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００４），１１，１６７３−１６７４を参照］などの適切なリンカーが、当該技術分野で公知である。１つの実施形態では、リンカーはＩＲＥＳである。別の実施形態において、リンカーは、Ｆ２ａである。別の実施形態では、各ＯＲＦは別個の発現カセット内に含まれる。
【００４１】
好適には、ＯＲＦは、標的細胞において発現を指示する調節性制御配列に作動可能に連結
される。そのような調節性制御配列は、ポリＡ、プロモーター、及びエンハンサーを含み得る。ＡＡＶベクターからの同時発現を容易にするために、エンハンサー及び／またはポリＡ配列の少なくとも１つを第一及び第二のＯＲＦによって共有することができる。
【００４２】
少なくとも１つの抗ＶＥＧＦ免疫グロブリンドメイン（または抗ＶＥＧＦ抗体全体）をコードする配列に加えて、発現カセットは、宿主細胞におけるＶＥＧＦドメイン／抗体の発現を指示する配列を含む。適切な調節性制御配列は、様々な供給源から選択され、得られ得る。１つの実施形態では、ベクターはプロモーターを含む。１つの実施形態では、プロモーターは構成的プロモーターである。抗体ドメインの発現を制御するのに適した構成的プロモーターの例としては、ニワトリβ-アクチン（ＣＢ）または他の種由来のベータアクチンプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の初期プロモーター及び後期プロモーター、Ｕ６プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ユビキチンプロモーター、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーター（Ｓｃｈａｒｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４６２６−４６３０（１９９１）、アデノシンデアミナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ピルビン酸キナーゼプロモーター、ホスホグリセロールムターゼプロモーター、β-アクチンプロモーター（Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１０００６−１００１０）、ＵｂＢ、ＵｂＣ、モロニー白血病ウイルス及び他のレトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター、及び当業者に公知の他の構成的プロモーターが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明での使用に適した組織特異的または細胞特異的プロモーターの例としては、内皮細胞に特異的なエンドセリンＩ（ＥＴ−Ｉ）及びＦｌｔ−Ｉ、並びにＦｏｘＪ１（繊毛細胞を標的とする）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
あまり望ましくないが、外因性因子（例えば薬理学的因子）または生理学的合図に応答するプロモーターを含む抗体ドメインの発現を制御するのに適した誘導性プロモーターを利用することができる。これらの応答要素としては、ＨＩＦ−１α及びβと結合する低酸素応答要素（ＨＲＥ）、Ｍａｙｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２，Ｃｅｌｌ  ２９：９９−１０８）、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）及びＳｅａｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１４８０−１４８９）に記載されているような金属イオン応答要素、またはＮｏｕｅｒ  ｅｔ
ａｌ．（ｉｎ：Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ｅｄ．Ｎｏｕｅｒ，Ｌ．，ＣＲＣ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，ｐｐ．１６７−２２０，１９９１）によって記載されているような熱ショック応答要素が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
１つの実施形態では、オープンリーディングフレームの発現は、ＯＲＦ（遺伝子）の転写を厳密に制御する調節型プロモーター、例えば薬理学的作用物質、または薬理学的作用物質によって活性化される転写因子、或いはこれらに代わる実施形態では、生理的合図、を厳密に制御する調節型プロモーターによって制御される。使用され得るリガンド依存性転写因子複合体である調節型プロモーターの例としては、それらのそれぞれのリガンド（例えば、グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲスチン、レチノイド、エクジソン、及びそれらの類似体及び模倣物）によって活性化される核内受容体スーパーファミリーのメンバー、及びテトラサイクリンによって活性化されるｒＴＴＡが挙げられるが、これらに限定されるものではない。そのような系の例としては、ＡＲＧＥＮＴ（商標）転写技術（ＡＲＩＡＤ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）が挙げられるが、これに限定されない。そのようなプロモーター系の例は、例えば、ＷＯ２０
１２／１４５５７２に記載されており、これは参照により本明細書に援用される。他の実施形態では、小型ＲＮＡベースのスイッチが、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／２５６０５３８０に記載されている。
【００４５】
さらに他のプロモーターとしては、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリモウイルスプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）またはグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）潜伏期関連プロモーター（ＬＡＰ）、ロウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーター、ニューロン特異的プロモーター（ＮＳＥ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、ｈＳＹＮ、メラニン濃縮ホルモン（ＭＣＨ）プロモーター、ＣＢＡ、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、マトリックスメタロプロテインプロモーター（ＭＰＰ）、及びニワトリβ-アクチンプロモーターが挙げられる。プロモーターは、各発現カセットについて同一であっても異なっていてもよい。
【００４６】
一実施形態において、１つ以上のＯＲＦのそれぞれの発現は、同じプロモーターによって制御される（例えば、ＩＲＥＳなどのリンカーと共に使用される場合）。別の実施形態において、各ＯＲＦの発現は、別個のプロモーターによって制御される。各プロモーターは、本明細書の記載に基づいて別に選択されてもよい。
【００４７】
１つの実施形態では、最小プロモーター及び／または最小ポリＡを、サイズを保存するために利用することができる。本明細書中で使用される場合、「最小プロモーター」という用語は、発現を制御するために調節エレメントが添加される転写開始部位を特定する働きをする、ＴＡＴＡボックス及び他の配列からなる短いＤＮＡ配列を意味する。１つの実施形態では、プロモーターは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御することができる調節エレメントに加えて最小プロモーターを含むヌクレオチド配列を指す。この種類のプロモーター配列は、近位及びより遠位の上流要素からなり、後者の要素はしばしばエンハンサーと呼ばれる。１つの実施形態では、最小プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最小プロモーターである。別の実施形態では、最小プロモーターは、ｈＣＭＶ最初期プロモーター由来最小プロモーター等のヒトＣＭＶ（ｈＣＭＶ）由来である（ＵＳ２０１４０１２７７４９、及びＧｏｓｓｅｎ及びＢｕｊａｒｄ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９：５５４７−５５５１）を参照、これらは参照により本明細書に援用される）。別の実施形態では、最小プロモーターは、例えば、ＳＶ４０初期または後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーター等のウイルス源に由来するか、或いは、例えばベータアクチンプロモーター（Ｎｇ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１７：６０１−６１５，１９８９；Ｑｕｉｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：９５３９−９５４５，１９８９），ＧＡＤＰＨプロモーター（ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５０９２−５０９６，１９８８，Ｅｒｃｏｌａｎｉ，Ｌ.   ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５３３５−１５３４１，１９８８）、ＴＫ−１（チミジンキナーゼ）プロモーター、ＨＳＰ（熱ショックタンパク質）プロモーター、ＵｂＢまたはＵｂＣプロモーター、ＰＧＫ、Ｅｆ１−アルファプロモーターまたはＴＡＴＡボックスを含む任意の真核生物プロモーター（米国公開出願第二０１４／００９４３９２号）等の真核細胞プロモーターに由来する。別の実施形態では、最小プロモーターは、米国公開出願第二０１４／００６５６６６号に記載されているＣＬＤＮ５ミニプロモーターのようなミニプロモーターを含む。別の実施形態では、最小プロモーターはチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターである。１つの実施形態では、最小プロモーターは、筋細胞特異的プロモーター最小ＴｎＩＳｌｏｗプロモーター、最小ＴｎＩＦａｓｔプロモーターまたは筋クレアチンキナーゼプロモーターの１つのような特異的組織である（米国公開出願第２０１２／０２８２
６９５号）。これらの文書のそれぞれは、参照により本明細書に援用される。
【００４８】
１つの実施形態では、ポリアデニル化シグナルが含まれる。１つの実施形態では、野生型または合成ポリＡを選択することができる。別の実施形態では、ポリアデニル化（ポリ（Ａ））シグナルは最小ポリ（Ａ）シグナル、すなわち効率的なポリアデニル化に必要な最小配列である。一実施形態において、最小ポリ（Ａ）は、Ｌｅｖｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１９８９  Ｊｕｌ，３（７）：１０１９−２５、及びＸｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２  Ｏｃｔ；  ２０（１０）：１００６−１０．Ｅｐｕｂ  ２００２  Ｓｅｐ１６等に記載されているような合成ポリ（Ａ）である。別の実施形態では、ポリ（Ａ）は、ウサギベーター−グロビンポリ（Ａ）に由来する。１つの実施形態では、ポリＡは双方向的に作用する（Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＰＮＡＳ、１０３（４９）：１８６６２−１８６６７）。１つの実施形態では、ポリＡは、ＳＶ４０初期ポリＡシグナル配列に由来する。１つの実施形態では、ポリ（Ａ）は、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル配列に由来する。これらの各文献は、参照により本明細書に援用される。
【００４９】
任意に、単一のエンハンサーまたは同じエンハンサーが、プラスミド構築物中の複数の異種遺伝子（すなわち、重鎖免疫グロブリン及び軽鎖免疫グロブリン）の転写を調節し得る。本発明において使用に適した種々のエンハンサーは、当該技術分野で公知であり、例えば、ＣＭＶ初期エンハンサー、Ｈｏｘｃ８エンハンサー、ｎＰＥ１及びｎＰＥ２が挙げられる。本明細書で有用なさらなるエンハンサーは、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１４  Ｍａｒｃｈ，５０７（７４９３）：４５５−６１に記載されており、これは参照により本明細書に援用される。さらに他のエンハンサー要素としては、例えば、アポリポタンパク質エンハンサー、ゼブラフィッシュエンハンサー、ＧＦＡＰエンハンサー要素、及び、ＷＯ２０１３／１５５５２２２に記載されているような組織特異的エンハンサー、ウッドチャックポスト肝炎後転写調節要素を挙げられる。さらに、または代替に、他の、例えば、ハイブリッドヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）−前初期（ＩＥ）−ＰＤＧＲプロモーターまたは他のプロモーター−エンハンサー要素を選択することができる。発現を増強するために、他の要素はイントロン（プロメガイントロンまたはキメラチキングロビン−ヒト免疫グロブリンイントロン等のような）であり得る。本明細書で有用な他のエンハンサーは、ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｍｏｔｅｒ．ｃｄｂ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／にあるＭａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅに見出すことができる。
【００５０】
本明細書中に記載される構築物は、さらに、例えば、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列などの他の発現制御または調節配列；イントロン；スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルのような効率的ＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を増強する配列；及び所望により、コードされた産物の分泌を増強する配列、を含む。
【００５１】
これらの制御配列は、免疫グロブリン構築物遺伝子配列に「作動可能に連結」されている。本明細書中で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、目的の遺伝子と隣接する発現制御配列、及びトランスまたはある距離にあって目的の遺伝子を制御するように作用する発現制御配列の両方を指す。
【００５２】
１つの実施形態では、各プロモーターは、エンハンサー配列に隣接して（左または右（または５’または３’）のいずれかに）位置し、そしてポリＡ配列はＩＴＲに隣接して配置され、その間にＯＲＦがある。１つの実施形態では、重鎖配列が最初に発現されるが、ＯＲＦの順序は変化し得、それによってコードされる免疫グロブリンドメインも同様であり
得る。例えば、軽鎖の定常及び可変配列は、リンカーの左側に位置し、重鎖は、リンカーの右側に位置するＯＲＦによってコードされ得る。あるいは、重鎖はリンカーの左側に位置し、リンカーの右側のＯＲＦは軽鎖をコードしてもよい。あるいは、反対の構成も可能である。１つの実施形態では、発現カセットは、プロモーターをコードする配列、続く重鎖をコードする配列、続くＦ２Ａ配列、続く軽鎖をコードする配列を含む。この構成の実例は、配列番号１１及び配列番号１２に記載のプラスミド配列に見出すことができる。別の実施形態では、発現カセットは、プロモーターをコードする配列、続く軽鎖をコードする配列、続くＩＲＥＳ配列、続く重鎖をコードする配列を含む。この構成の具体例は、配列番号１３に記載のプラスミド配列に見出すことができる。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、選択されたＡＡＶカプシド内にパッケージングされ、核酸分子は、５’ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、プロモーター、マウスＶＥＧＦ免疫グロブリン可変重鎖及びイヌＶＥＧＦ定常重鎖に作動可能に連結されたシグナルペプチド、ＩＲＥＳ、マウスＶＥＧＦ可変軽鎖に作動可能に連結されたシグナルペプチド、及び３’ＡＡＶ  ＩＴＲを含む。１つの実施形態では、ＡＡＶカプシドはＡＡＶ８である。さらなる実施形態において、ＩＴＲはＡＡＶ２由来であるか、またはＡＡＶカプシド供給源とは異なる、異なる供給源である。
【００５３】
１つの実施形態では、ベクターはアデノ随伴ウイルスベクターである。組換えＡＡＶベクター（ＡＡＶウイルス粒子）は、ＡＡＶカプシド内にパッケージングされ、本明細書に記載の機能性抗体を発現する核酸分子を含むことができる。発現カセットは、各発現カセット内のオープンリーディングフレーム（複数可）の調節エレメントを含むことができ、核酸分子は、任意にさらなる調節エレメントを含むことができる。
【００５４】
ＡＡＶベクターは、全長ＡＡＶ５'末端逆位反復配列（ＩＴＲ）及び完全長３’ＩＴＲを含み得る。ΔＩＴＲと呼ばれる５’ＩＴＲの短縮バージョンが記載されており、これはＤ−配列及び末端分割部位（ｔｒｓ）が欠失している。略語「ｓｃ」は、自己相補的を指す。「自己相補的ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列によって運ばれるコード領域が分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されている構築物を指す。感染の際、第二鎖の細胞仲介型合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補的半身が会合して、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成することになり、この単位は直ちに複製及び転写を行うことができる。Ｄ  Ｍ  ＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ．ａｌ．，“Ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  （ｓｃＡＡＶ）  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ  ２００１），Ｖｏｌ  ８，Ｎｕｍｂｅｒ  １６，Ｐａｇｅｓ  １２４８−１２５４を参照のこと。自己相補的ＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、７，１２５，７１７号、及び７，４５６，６８３号に記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される。別の実施形態では、自己相補性ＡＡＶが使用される。
【００５５】
偽型ＡＡＶが産生される場合、ＩＴＲはカプシドのＡＡＶ供給源とは異なる供給源から選択される。例えば、ＡＡＶ２  ＩＴＲが、選択された細胞受容体、標的組織またはウイルス標的に対して特定の効率を有するＡＡＶカプシドと共に使用するために選択され得る。１つの実施形態では、ＡＡＶ２またはその欠失バージョン（ΔＩＴＲ）に由来するＩＴＲ配列が、便宜のために、及び規制当局の承認を加速するために使用される。しかしながら、他のＡＡＶ源由来のＩＴＲを選択することができる。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２に由来し、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ供給源に由来する場合、得られるベクターは偽型と称することができる。しかしながら、他のＡＡＶ  ＩＴＲ源を利用することもできる。
【００５６】
様々なＡＡＶカプシドが記載されている。ＡＡＶベクターを作製する方法は、例えばＷＯ
２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、ＵＳ７５８８７７２Ｂ２等の文献及び特許文献に広く記載されている。ＡＡＶカプシドの供給源は、所望の組織を標的とするＡＡＶから選択することができる。例えば、適切なＡＡＶとしては、例えば、ＡＡＶ９［ＵＳ７，９０６，１１１、ＵＳ２０１１−０２３６３５３−Ａ１]、ｒｈ１０［ＷＯ２００３／０４２３９７］及び／またはｈｕ３７［例えば、ＵＳ７，９０６，１１１、ＵＳ２０１１−０２３６３５３−Ａ１］が挙げられる。しかしながら、他のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、［米国特許第７７９０４４９号、米国特許第７２８２１９９号］及びその変異体等のその他、が挙げられる。１つの実施形態では、ＡＡＶカプシドはＡＡＶ８カプシドまたはその変異体である。１つの実施形態では、ＡＡＶカプシドに言及する場合、「変異体」という用語は、指定されたＡＡＶカプシドと少なくとも約９０％の同一性、９５％の同一性、９７％の同一性、９８％の同一性、９９％の同一性、またはそれを超える同一性を共有するカプシドを指す。例えば、一実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＮＣＢＩ基準配列：ＹＰ＿０７７１８０．１によって特定されるＡＡＶ８カプシドであり、またはそれと少なくとも９５％の同一性を共有する配列である。しかしながら、ＡＡＶカプシド及び他のウイルス要素の他の供給源が選択されてよく、他の免疫グロブリン構築物及び他のベクター要素も同様であり得る。
【００５７】
一本鎖ＡＡＶウイルスベクターが提供される。対象への送達に適したＡＡＶウイルスベクターを作製し、単離するための方法は、当該技術分野で公知である。例えば、米国特許第７７９０４４９号、米国特許第７２８２１９９号、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、及びＵＳ７５８８７７２  Ｂ２を参照のこと。あるシステムでは、プロデューサー細胞株は、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子をコードする構築物、及びｒｅｐ及びｃａｐをコードする構築物で一時的に形質移入される。第二の系では、ｒｅｐ及びｃａｐを安定して供給するパッケージング細胞株に、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子をコードする構築物を一時的に形質移入する。これらの系の各々において、ＡＡＶビリオンが、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスの感染に応答して産生され、ｒＡＡＶの汚染ウイルスからの分離を必要とする。より最近では、ＡＡＶを回収するためにヘルパーウイルス感染を必要としない系が開発された。必要なヘルパー機能（すなわち、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ及びＥ４またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２及びＵＬ２９、及びヘルペスウイルスポリメラーゼ）も系によってトランスで供給される。これらの新しい系では、ヘルパー機能は、必要なヘルパー機能をコードする構築物で細胞を一過性に形質移入することによって供給することができ、またはヘルパー機能をコードする遺伝子を安定に含むように細胞を操作することができ、その発現は、転写または転写後のレベルで制御され得る。さらに別の系では、ＩＴＲ及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子が隣に配置された導入遺伝子を、バキュロウイルスベースのベクターによる感染によって昆虫細胞に導入する。これらの産生系の概説については、例えば、一般に、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０：９２２−９２９を参照のこと。その各内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。これら及び他のＡＡＶ産生系を作製及び使用する方法はまた、以下の米国特許に記載されており、その内容はその全体が参照により本明細書に援用される：５，１３９，９４１、５，７４１，６８３、６，０５７，１５２、６，２０４，０５９、６，２６８，２１３、６，４９１，９０７、６，６６０，５１４、６，９５１，７５３、７，０９４，６０４、７，１７２，８９３、７，２０１，８９８、７，２２９，８２３、及び７，４３９，０６５。
【００５８】
ＡＡＶウイルスベクター（例えば、組換え（ｒ）ＡＡＶ））の産生において使用するために、発現カセットは、パッケージング宿主細胞に送達される任意の適切なベクター（例え
ばプラスミド）上に担持され得る。本発明に有用なプラスミドは、それらが原核細胞、哺乳動物細胞、またはその両方において複製及びパッケージングに適するように操作され得る。適切な形質移入の手法及びパッケージング宿主細胞は公知であり、及び／または当業者によって容易に設計され得る。実施例において利用されるウイルスベクターを産生するために使用されるプラスミドの例を図３及び配列番号１０に示す。
【００５９】
ベクターとしての使用に適したＡＡＶを作製及び単離するための方法は、当該技術分野では公知である。一般的には、例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，“Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ａｓ  ａ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ
ｖｅｃｔｏｒ：  Ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９−１４５、Ｂｕｎｉｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，２００８，“Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．１０：７１７−７３３、及び下に引用される参考文献に記載されており、その各々は参照によりその全体が本明細書に援用される。ビリオンへの導入遺伝子のパッケージングのために、ＩＴＲは、発現カセットを含む核酸分子と同じ構築物において、シスに必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。ｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子は、トランスで供給することができる。
【００６０】
上述のように、「約」という用語は、特に断りのない限り、数値を修飾するために使用される場合、±１０％の変動を意味する。
【００６１】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列にの文脈における、「同一の」または「同一性」パーセントという用語は、以下に記載するデフォルトパラメーターを使用してＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを用いて測定するか、または手動整列及び目視検査によって測定した（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトなどを参照））、同じ２つ以上の配列または部分配列、または指定されたパーセントでアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２つ以上の配列または部分配列を指す（すなわち、特定された領域にわたって、約７０％の同一性、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または以上の同一性（例えば、比較ウインドウまたは指定領域にわたって最大の一致のために比較及び整列されたときの、本明細書に提供されるＯＲＦのいずれか１つ）。別の例として、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦａｓｔａを用いてポリヌクレオチド配列を比較することができる。Ｆａｓｔａは、クエリー配列と検索配列との間の最良の重複領域のアラインメント及び配列同一性パーセントを提供する。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントは、ＧＣＧバージョン６．１（本明細書中で参考として援用される）で提供される、そのデフォルトパラメーター（語長６及びスコアリングマトリックスのＮＯＰＡＭファクター）を使用してＦａｓｔａを用いて決定することができる。一般に、これらのプログラムはデフォルト設定で使用されるが、当業者は必要に応じてこれらの設定を変更することができる。あるいは、当業者は、参照されるアルゴリズム及びプログラムによって提供されるものと、少なくとも同一性またはアライメントにおいてそのレベルを提供する別のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを利用することができる。この定義はまた、配列の相補性に言及するか、または配列の相補性に適用することができる。定義には、欠失及び／または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列も含まれる。後述のように、好ましいアルゴリズムはギャップ等を考慮することができる。好ましくは、同一性は、少なくとも約２５、５０、７５、１００、１５０、２００アミノ酸またはヌクレオチド長の領域、しばしば２２５、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００のアミノ酸またはヌクレオチド長の領域、またはアミノ酸または核酸配列の全長の領域にわたって存在する。
【００６２】
典型的には、アラインメントがアミノ酸配列に基づいて用意される場合、アラインメントは、基準ＡＡＶ配列に関して特定された挿入及び欠失を含み、アミノ酸残基の付番は、アラインメントのために提供される基準スケールに基づく。しかしながら、任意の所与のＡＡＶ配列は、基準スケールより少ないアミノ酸残基を有し得る。本発明において、親配列を考察する場合、「同じ位置」または「対応する位置」という用語は、整列した配列の基準スケールに対して、各配列中の同一の残基番号に位置するアミノ酸を指す。しかしながら、アラインメントから取り出された場合、各タンパク質は、これらのアミノ酸が異なる残基番号に位置し得る。アラインメントは、公的のまたは市販されている多様な複数配列アラインメントプログラムのいずれかを用いて行われる。配列アライメントプログラムは、アミノ酸配列に利用可能である、例えば「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」及び「Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ」プログラムである。一般に、これらのプログラムのいずれかがデフォルト設定で使用されるが、当業者は必要に応じてこれらの設定を変更することができる。あるいは、当業者は、参照されたアルゴリズム及びプログラムによって提供されるものと、少なくとも同一性またはアライメントにおいてそのレベルを提供する別のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを利用することができる。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２−２６９０（１９９９）を参照のこと。
【００６３】
１つの実施形態では、本明細書中に記載される発現カセットは、ウイルスベクター産生用のパッケージング宿主細胞に、上に担持された免疫グロブリン構築配列を移入する遺伝子エレメント（例えば、シャトルプラスミド）に操作導入される。一実施形態において、選択された遺伝子エレメントは、形質移入、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染及びプロトプラスト融合等の任意の適切な方法によってＡＡＶパッケージング細胞に送達され得る。安定したＡＡＶパッケージング細胞も作製することができる。あるいは、発現カセットは、ＡＡＶ以外のウイルスベクターを作製するために、またはインビトロで抗体の混合物を産生するために使用され得る。そのような構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に知られており、遺伝子工学、組換え工学、及び合成手法を含む。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｇｒｅｅｎ及びＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照のこと。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、ベクターは、宿主細胞に形質移入、形質導入または感染する任意の適切な遺伝的エレメントであり、機能的抗体に組み立てられる免疫グロブリンを発現する。このようなベクターは、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、パルボウイルスベクター、プラスミド、修飾ＲＮＡ、及びｍＲＮＡ及びＤＮＡがナノ粒子の形態であり得るＤＮＡ分子から選択され得る。
【００６５】
ベクターは、好ましくは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物患者への投与のために、生理学的に適合性のある担体に懸濁される。適切な担体は、移入ウイルスが向けられる適応症  を考慮して、当業者によって容易に選択され得る。例えば、１つの適切な担体は、様々な緩衝液（例えば、リン酸緩衝食塩水）で処方され得る生理食塩水を含む。他の担体の例としては、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、マルトース、及び水が挙げられる。任意で、本発明の組成物は、ｒＡＡＶ及び担体（複数可）に加えて、保存料または化学安定剤等の他の従来の医薬成分を含有することができる。
【００６６】
本明細書に記載のウイルスベクター構築物を含む組成物もまた提供される。本明細書に記載の医薬組成物は、それを必要とする対象に、任意の適切な経路または異なる経路の組み
合わせによって送達するように設計される。任意の適切な方法または経路を用いて、本明細書に記載のＡＡＶ含有組成物を投与し、任意に、本明細書に記載のＡＡＶ媒介抗体と組み合わせて他の活性薬剤または療法を同時に投与することができる。投与経路としては、例えば、全身、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内及び他の非経口経路が挙げられる。本明細書に記載のウイルスベクターは、単一の組成物または複数の組成物で送達することができる。任意に、２つ以上の異なるＡＡＶが送達されてもよく、または複数のウイルスが送達されてもよい［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４９３参照］。別の実施形態において、複数のウイルスは、異なる複製欠損ウイルス（例えば、ＡＡＶ及びアデノウイルス）を含み得る。
【００６７】
ＡＡＶウイルスベクターの場合、ゲノムコピー（「ＧＣ」）の定量を、製剤に含まれる用量の尺度として使用することができる。当該技術分野で公知の任意の方法を用いて、本発明の複製欠損ウイルス組成物のゲノムコピー（ＧＣ）数を決定することができる。ＡＡＶ
ＧＣ数測定を実施するための１つの方法は、以下の通りである。精製されたＡＡＶベクター試料をまずＤＮａｓｅで処理して、産生プロセスから非カプシド化ＡＡＶゲノムＤＮＡまたは混入プラスミドＤＮＡを除去する。その後、ＤＮａｓｅ耐性粒子を熱処理に供してカプシドからゲノムを放出させる。次いで、放出されたゲノムを、ウイルスゲノムの特定の領域（通常ポリＡシグナル）を標的とするプライマー／プローブセットを用いたリアルタイムＰＣＲによって定量する。他の適切な方法には、デジタルＰＣＴ、デジタル液滴ＰＣＲ、及び最適化されたｑＰＣＲが含まれる。
【００６８】
また、複製欠損ウイルス組成物は、約１．０×１０９ＧＣ〜約１．０×１０１５ＧＣの範囲内の量の複製欠損ウイルスを含む用量単位で処方することができる。別の実施形態において、この量のウイルスゲノムは分割用量で送達され得る。１つの実施形態では、投与量は、約５ｋｇの平均小型イヌ対象に対して約１．０×１０１０ＧＣ〜約１．０×１０１２ＧＣである。１つの実施形態では、投与量は、約２０ｋｇの平均中型イヌ対象に対して、約１．０×１０１１ＧＣ〜約５．０×１０１３ＧＣである。１つの実施形態では、投与量は、約５０ｋｇの平均大型イヌ対象に対して、約１．０×１０１２ＧＣ〜約１．０×１０１４ＧＣである。平均のイヌは、体重が約５〜約５０ｋｇの範囲にある。１つの実施形態では、投与量は約１．０×１０１２ＧＣ／ｋｇである。１つの実施形態では、投与量は、対象に対して約１．０×１０１１ＧＣ〜１．０×１０１４ＧＣである。別の実施形態では、約１×１０１３ＧＣの用量である。例えば、ＡＡＶウイルスの用量は、約１×１０１２ＧＣ、約５×１０１２ＧＣ、約１×１０１３ＧＣ、約５×１０１３ＧＣ、または約１．０×１０１４ＧＣであり得る。別の例において、構築物は、約０．００１ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｍＬの量で送達され得る。１つの実施形態では、構築物は、獣医学的対象に対して１μＬ〜約１００ｍＬの体積で送達され得る。種々の獣医動物への物質投与のための良好な実践の議論については、例えば、Ｄｉｅｈｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２１：１５−２３（２００１）を参照のこと。この文献は、参照により本明細書に援用される。本明細書で使用される場合、「投与量」という用語は、治療の過程で対象に送達される総投与量、または単回（複数のうちの）投与で送達される量を指す。
【００６９】
上記の組換えベクターは、公開された方法に従って宿主細胞に送達され得る。好ましくは生理学的に適合する担体、担体、希釈剤、賦形剤及び／またはアジュバント中に懸濁されたｒＡＡＶは、ネコ、イヌ、または他の非ヒト哺乳動物対象を含む（これらに限定されない）所望の対象に投与され得る。適切な担体は、移入ウイルスが向けられる適応症を考慮して、当業者によって容易に選択され得る。例えば、１つの適切な担体は、様々な緩衝液（例えば、リン酸緩衝食塩水）で処方され得る生理食塩水を含む。他の典型的な担体としては、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、及び水が挙げられる。担体の選択は、本発明を制限するものではない。
【００７０】
任意に、本発明の組成物は、ｒＡＡＶ及び／または変異体及び担体に加えて、保存料または化学安定剤などの他の従来の医薬成分を含有することができる。適切な保存料の例としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール及びパラクロロフェノールが挙げられる。適切な化学安定剤としては、ゼラチン及びアルブミンが挙げられる。
【００７１】
一態様では、本明細書で提供されるベクターは、約３ｍＬ以下、１ｍＬ以下、０．５ｍＬ以下、例えば約１００μＬ〜約２５０μＬの範囲の用量で送達される場合、有効なレベルの機能性抗体を発現する。従って、本明細書で提供されるベクターは、計量用量に都合のよい用量で、または予め測定された用量を含有する製品またはキットで、治療レベルの抗体を提供するのに非常に効率的である。
【００７２】
本明細書に記載のウイルスベクター及び他の構築物は、それを必要とする対象にキメラ抗ＶＥＧＦ抗体構築物を送達するための、及び／または対象の血管肉腫を治療するための、医薬の調製に使用することができる。従って、別の態様において、血管肉腫を治療する方法が提供される。本方法は、本明細書に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。１つの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の抗ＶＥＧＦ抗体発現カセットを含有するウイルスベクターを含んでいる。１つの実施形態では、対象は哺乳動物である。別の実施形態において、対象はイヌである。
【００７３】
別の実施形態では、イヌの血管肉腫を治療するための方法が提供される。本方法は、キメラ抗ＶＥＧＦ抗体をコードする配列を含む核酸分子を含むウイルスベクターを対象に投与することを含む。
【００７４】
別の実施形態では、対象における癌を治療するための方法が提供される。この方法は、抗ＶＥＧＦ抗体をコードする配列を含む核酸分子を含むウイルスベクターを対象に投与することを含む。一実施形態において、癌は、ＶＥＧＦが関与する、例えばＶＥＧＦを亢進させる、癌である。例えば、ＶＥＧＦは、血管新生、血管透過性及び腫瘍形成に関与すると考えられている。例えばＧｏｅｌ  ａｎｄ  Ｍｅｒｃｕｒｉｏ，ＶＥＧＦ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，１３：８７１−８２（２０１３）を参照のこと。別の実施形態では、癌は、ＶＥＧＦによって駆動される異常なレベルの血管新生が示される癌である。本明細書に記載される方法及び組成物の様々な実施形態において、癌としては、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、脳癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮頸癌、頭頸部癌、卵巣癌、黒色腫、急性及び慢性のリンパ球及び骨髄球性白血病、骨髄腫、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、並びに多剤耐性の癌が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、癌は薬物耐性癌である。１つの実施形態では、対象はイヌである。
【００７５】
別の実施形態では、対象における黄斑変性を治療するための方法が提供される。この方法は、抗ＶＥＧＦ抗体をコードする配列を含む核酸分子を含むウイルスベクターを対象に投与することを含む。１つの実施形態では、対象はイヌである。１つの実施形態では、黄斑変性症はＸ連鎖性黄斑変性症である。別の実施形態において、黄斑変性症は加齢性黄斑変性症である
【００７６】
治療の過程は、任意に、本明細書に記載の抗ＶＥＧＦ抗体を発現するのと同じウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ８ベクター）または異なるウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ８及びＡＡＶｒｈ１０）の繰り返し投与を含み得る。さらに他の組み合わせは、本明細書に記載のウイルスベクターを用いて選択することができる。任意に、本明細書に記載の組成物は、以下の１つ以上を含むレジメンにおいて組み合わせることができる：抗癌剤（例え
ば、ドキソルビシン、ビンクリスチン＋ドキソルビシン＋シクロホスファミド（ＶＡＣ）、または他の化学療法薬）、腫瘍を除去または減少させる手術、放射線、カルプロフェンを含む薬剤、デラコキシブ、ドキシサイクリン（Ｈａｍｍｅｒ  ＡＳ，Ｃｏｕｔｏ  ＣＧ，Ｆｉｌｐｐｉ  Ｊ、ｅｔ．ａｌ．Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ
ＶＡＣ  ｔｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ，ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ，ａｎｄｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）ｉｎ  ｄｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ．Ｊ  Ｖｅｔ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ；１９９１；５：１６０−１６６．、Ｓｏｒｅｎｍｏ  ＫＵ、Ｊｅｇｌｕｍ  ＫＡ，Ｈｅｌｆａｎｄ  ＳＣ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｉｎｅ  ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ  ｗｉｔｈ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ａｎｄ  ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ．Ｊ  Ｖｅｔ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １９９３；７：３７０−３７６．、及びＯｇｉｌｖｉｅ  ＧＫ，Ｐｏｗｅｒｓ  ＢＥ，Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  ＣＨ，ｅｔ．ａｌ．Ｓｕｒｇｅｒｙ  ａｎｄ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｉｎ  ｄｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ．Ｊ  Ｖｅｔ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １９９６；１０：３７９−３８４を参照、これらは参照によりその全体が本明細書に援用される）及びポリサッカロペプチド（ＰＳＰ）。任意に、本明細書に記載の組成物は、食餌レジメン及び運動レジメンを含む生活様式の変化を含むレジメンにおいて組み合わせることができる。
【００７７】
「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つ以上を指すことに留意されたい。従って、用「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では同義で使用される。
【００７８】
「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」、及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含んでいる）」という語は、排他的ではなく包括的に解釈されるものとする。「ｃｏｎｓｉｓｔ（からなる）」、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ（からなっている）」という語は、包括的ではなく、排他的に解釈されるものとする。本明細書の様々な実施形態が、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含んでいる）」という表現を用いて提示されるが、他の状況下では、関連する実施形態はまた、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（からなる）」または「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（本質的にからなる）」という表現で解釈され、その表現で記載されることが意図される。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特に規定がない限り、与えられた参照値から１０％の変動可能性を意味する。
【００８０】
本明細書で使用する「調節」という用語またはその変形は、生物学的経路の１つ以上の成分を阻害する組成物の能力を指す。
【００８１】
「対象」は、哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタまたは非ヒト霊長類、例えばサル、チンパンジー、ヒヒまたはゴリラ、である。１つの実施形態では、対象はイヌである。本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、「患者」と同義で使用される。
【００８２】
本明細書中で使用される場合、「疾患」、「障害」及び「状態」は、対象における異常な状態を示すために同義で使用される。
【００８３】
本明細書中特に記載がない限り、本明細書中使用される技術用語及び学術用語は、当該分野の当業者が一般的に認識するもの及び公開された文書を参照することにより認識されるものと同じ意味を有し、公開された文書は、当業者に、本明細書中使用される用語の多くに対して一般的な案内を提供するものである。
【００８４】
以下の実施例は、例示的なものに過ぎず、本発明を限定することを意図しない。
【実施例】
【００８５】
実施例１−ＶＥＧＦベクターの構築
イヌＩｇＧサブクラスＡ及びカッパ軽鎖のアミノ酸配列を、Ｇｅｎｂａｎｋから得た。マウス抗体Ａ．４．６．１の可変領域のアミノ酸配列をイヌＩｇＧＡ／カッパ定常領域と組み合わせて、ＶＥＧＦを標的とするキメライヌ抗体のアミノ酸配列を作製した。アミノ酸配列を逆翻訳し、コドン最適化し、続いてコザックコンセンサス配列、終止コドン、及びクローニング部位を追加した。配列は、ＧｅｎｅＡｒｔによって産生され、ＣＭＶまたはＣＢプロモーターを含む種々の発現ベクターにクローン化され、重鎖及び軽鎖の両方の発現が、ポリペプチド鎖間に２Ａペプチド配列及びフリン切断部位の包含により、またはＥＭＣＶ内部リボソーム侵入部位を使用する３’ポリペプチドの発現により、達成された。発現構築物は、隣にＡＡＶ２  ＩＴＲが配置された。ＣＭＶプロモーター含有発現ベクターの例を図３及び配列番号１０に示す。この構築物を、三重形質移入及びイオジキサノール勾配精製によってＡＡＶ血清型８カプシドにパッケージングし、Ｔａｑｍａｎ定量ＰＣＲによって測定した
【００８６】
実施例２−インビトロ発現及び抗原結合
ＣＭＶプロモーター、続いて抗体重鎖、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、及び抗体軽鎖を含む構築物を、リポフェクタミン２０００を用いたＨＥＫ２９３細胞の一過性形質移入によってインビトロで評価した。発現した抗体を、プロテインＧカラム（ＧＥ）を製造者の指示に従って用いて、上清から精製した。精製された抗体は、Ｓｙｐｒｏルビー染色でＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元することによって特性評価された（図１）。抗体をＥＬＩＳＡによりイヌＶＥＧＦへの結合について評価したが、その際、標的抗原は組換えイヌＶＥＧＦ（Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ  Ｂｉｏ）であり、結合した抗体はＨＲＰ結合ヤギ抗イヌ二次抗体（Ｐｅｉｒｃｅ）によって検出された。精製された抗体及び形質移入上清の両方が、ＥＬＩＳＡによりイヌＶＥＧＦへの結合を示した。
【００８７】
実施例３−イヌにおけるキメライヌ抗ＶＥＧＦ抗体のＡＡＶ介在型発現
３匹の正常なイヌを、キメラ抗体を発現する体重１キログラムあたり１０１２ゲノムコピー（ＧＣ／ｋｇ）のＡＡＶ８を単回筋肉内注射することにより処置した。示された時点で血清を採取し、ＶＥＧＦ結合ＥＬＩＳＡによって抗体発現について評価し、その際、精製された抗体を定量化の基準とした（図２）。
【００８８】
本明細書中、ならびに２０１５年８月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／２１２，１７０号に引用される全ての刊行物は、参照により本明細書に援用される。同様に、本明細書において参照され、添付の配列表で見られる配列番号は、参照により本明細書に援用される。本発明を特定の実施形態を参照して説明したが、本発明の精神から逸脱することなく改変を行うことができることは理解されよう。そのような経変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【図１】
2018526003.tif 000007
【図２】
2018526003.tif 000008
【図３】
2018526003.tif 000009
【図４】
2018526003.tif 000010
【図５】
2018526003.tif 000011
【配列表】
2018526003000001.app
【国際調査報告】
2018526003.tif 000012
2018526003.tif 000013