(57)【要約】  いくつかの実施形態によって、誘導神経幹細胞（ｉＮＳＣ）を産生する方法が本明細書に提供され、その方法は、体細胞を提供するステップと；前記体細胞にＳｏｘ２をコードしている核酸を導入し（例えば、トランスフェクトまたは形質導入による）、それにより前記細胞にＳｏｘ２を発現させるステップと；その後前記体細胞を分化転換させ（例えば、神経前駆細胞用培地中で細胞を成長させることによる）、それにより前記誘導神経幹細胞を作製するステップとのうちの１つまたは複数を含むことができる。いくつかの実施形態において、分化転換は、１〜１０日間、１〜５日間、１〜３日間、または１２〜２４時間もしくは４８時間実施される。
2018508216.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体細胞を提供するステップと、
前記体細胞に、Ｓｏｘ２をコードしている核酸をトランスフェクトまたは形質導入し、それにより前記体細胞がＳｏｘ２を発現するステップと、
その後、前記体細胞を分化転換させるステップと、ここで、前記分化転換が、神経前駆細胞用培地中で前記体細胞を成長させることにより実施され、それにより誘導神経幹細胞を作製する、
を含む、誘導神経幹細胞を作製する方法。
【請求項２】
前記分化転換が、１〜１０日間実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分化転換が、１〜５日間実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記分化転換が、１〜３日間実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記体細胞が、繊維芽細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記体細胞が、皮膚繊維芽細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記誘導神経幹細胞が、ネスチンを発現し、かつ／または、ＮａｎｏｇもしくはＯＣＴ３／４を発現しない、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記誘導神経幹細胞が、神経／アストロサイト細胞に分化できる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記方法が、前記体細胞に、Ｓｏｘ２をコードしている前記核酸を含むレンチウイルスベクターを形質導入するステップを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記分化転換が、フィーダー細胞なしで実施される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記神経前駆細胞用培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２補助剤、インスリン、ニューロベーサル培地、Ｂ２７補助剤、非必須アミノ酸、ｂＭＥ、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ１９３１８９、レチノイン酸、ＢＳＡ、ＣＨＩＲ９９０２１、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウムおよびｃＡＭＰからなる群から選択される成分の１つまたは複数を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、前記体細胞に、ＴＥＲＴ（例えば、ｈＴＥＲＴ）をコードしている核酸をトランスフェクトまたは形質導入するステップを更に含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、前記誘導神経幹細胞に治療薬および／またはレポータ分子を導入するステップを更に含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記導入が、前記誘導神経幹細胞に、治療薬を産生できる核酸をトランスフェクトまたは形質導入するステップを含み、前記治療薬が、酵素／プロドラッグ治療に有用なタンパク質毒素、腫瘍崩壊性ウイルス、アポトーシス促進性薬剤または酵素である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
治療薬を産生できる前記核酸およびＳｏｘ２をコードしている前記核酸が、同じベクター上に提供される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が、前記誘導神経幹細胞を増殖させて、誘導神経幹細胞の集団を形成するステップを更に含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、ヒドロゲルに前記誘導神経幹細胞を封入する、または足場上に前記誘導神経幹細胞を播種するステップを更に含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が、それを必要とする対象に前記誘導神経幹細胞を投与するステップを更に含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記誘導神経幹細胞が、前記対象にとって同種異系、同系または自己由来である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象がヒト対象である、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象が、脳がんの処置を必要としている、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記脳がんが膠芽腫である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記投与が、脳腫瘍の少なくとも一部の外科的除去後に腔内投与によって実施される、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記誘導神経幹細胞が、前記対象にとって自己由来であり、前記投与が、体細胞を提供する前記ステップの１〜１４日または２１日後に実施される、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、２０１５年３月４日出願の米国特許仮出願第６２／１２８，２４７号の利益を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書の一部をなすものとする。
【背景技術】
【０００２】
脳のがんは、依然として処置が最も難しい腫瘍の１つである。毎年１００００人以上の患者が、最も一般的な原発性脳腫瘍である膠芽腫（ＧＢＭ）と診断される。ＧＢＭは、手術および化学放射線治療で一般に処置されるが、現在の処置の選択肢の下では残念ながら疾患は通常致命的である。再発までの平均期間は、わずか６カ月であり、ＧＢＭ患者は、平均１２〜１５カ月間しか生存できない。
【０００３】
神経幹細胞（ＮＳＣ）は、固形およびびまん性ＧＢＭ沈着物へホーミングする固有の生来の能力を有しており、様々な細胞毒性物質により処理されたＮＳＣが、ＧＢＭ異種移植片を７０〜９０％減少させ、担腫瘍マウスの生存を有意に延長することが示されている。脳内にはわずかな数のＮＳＣが天然に存在しているが、それらは皮質内の深部にある。
【０００４】
細胞再プログラムの出現は、細胞治療に新たな道を切り開いたが、制約がある。例えば、繊維芽細胞の、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）への脱分化、その後の所望の治療用細胞型への再分化は時間のかかる過程であり、ｉＰＳＣ生成の効率は低く、移植したｉＰＳＣまたはその派生細胞によるがん性奇形腫の形成の点で安全に重大な懸念が残る。
【０００５】
分化転換（ＴＤ）は、細胞を、中間ｉＰＳＣ段階を経ることなく異なる系統の分化した体細胞へと直接変換する方法である。ＴＤによるこの直接変換は、ｉＰＳＣ状態と関連する安全上の懸念を取り除き、所望の治療用細胞型をより速く生成できるようになる。
【０００６】
神経幹細胞はＴＤによって作製され、誘導神経幹細胞（ｉＮＳＣ）と称されてきた。２０１２年に、Ｍａｔｓｕｉらは、４つの山中因子を使用してヒト繊維芽細胞をｉＰＳＣへと部分的に再プログラムすることにより、ｈ−ｉＮＳＣ生成を２０日間で達成し得ることを実証した。ｈ−ｉＮＳＣ生成は、繊維芽細胞においてＳｏｘ２を発現させることによっても実現されたが、この戦略は、増殖および継代用としてのｈ−ｉＮＳＣを得るのに特定のフィーダー細胞上で４０日間培養する必要があった。
【０００７】
細胞ベースの治療における使用のために操作されたＮＳＣを、迅速に提供し得る別の方法が依然として必要である。
【発明の概要】
【０００８】
いくつかの実施形態によって、誘導神経幹細胞（ｉＮＳＣ）を産生する方法が本明細書において提供され、その方法は、以下の１つまたは複数のステップを含むことができる：体細胞を提供するステップと；前記体細胞にＳｏｘ２をコードしている核酸を（例えば、トランスフェクトまたは形質導入により）導入するステップと、それにより前記細胞にＳｏｘ２を発現させ；その後、前記体細胞を（例えば、神経前駆細胞用培地中で細胞を成長させることにより）分化転換させるステップと、それにより前記誘導神経幹細胞を作製する。いくつかの実施形態において、分化転換は、１〜１０日間、１〜５日間、１〜３日間、または１２〜２４時間もしくは４８時間実施される。
【０００９】
いくつかの実施形態において、前記細胞は、他の分化転換因子をトランスフェクトまたは形質導入されない。
【００１０】
いくつかの実施形態において、前記体細胞は繊維芽細胞（例えば、皮膚繊維芽細胞）である。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本方法は、前記体細胞に、Ｓｏｘ２をコードしている前記核酸を含むレンチウイルスベクターを形質導入するステップを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本方法は、誘導神経幹細胞に治療薬またはレポータ分子を導入するステップを更に含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本方法は、誘導神経幹細胞を、ヒドロゲルもしくは生分解性足場マトリックスに封入するか、または足場上に播種するステップを更に含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本方法は、それを必要とする対象（例えば、ヒト対象）に前記誘導神経幹細胞を投与するステップを更に含む。いくつかの実施形態において、誘導神経幹細胞は、前記対象にとって同種異系である。いくつかの実施形態において、誘導神経幹細胞は、前記対象にとって同系である。いくつかの実施形態において、誘導神経幹細胞は、前記対象にとって自己由来である。いくつかの実施形態において、対象は脳がんの処置を必要としている。
【００１５】
いくつかの実施形態において、誘導神経幹細胞は、前記対象にとって自己由来であり、前記投与は、体細胞を提供する前記ステップの１、２、３または４〜７、１０、１４または２１日後に実施される。
【００１６】
本明細書に教示される誘導神経幹細胞の、脳がんを処置するための使用が、更に提供される。本明細書に教示される誘導神経幹細胞の、脳がんの処置薬の調製における使用も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】診断および治療用ｉＮＳＣの生成および特徴づけ。（Ａ）ｈ−ｉＮＳＣの治療用および診断バリアントを作製するために使用した戦略の概略画である。ヒト繊維芽細胞に、Ｓｏｘ２を形質導入し、ＮＳＣ誘導性の神経前駆細胞用培地（ＮＳＣ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｍｅｄｉａ）中に置いた。４日後に、ｈ−ｉＮＳＣを増殖させて、光学的レポータまたは腫瘍破壊性導入遺伝子を形質導入した。（Ｂ）単層、神経幹細胞塊として成長させた、またはネスチンに対する抗体で染色したヒト繊維芽細胞ならびにｈ−ｉＮＳＣの白色光および蛍光顕微鏡写真である。（Ｃ）ｈ−ｉＮＳＣ生成誘導後の異なる日におけるネスチンの発現を示す総括グラフである。（Ｄ）ＮＳＣマーカーであるネスチンのｈ−ｉＮＳＣ−ＧＦＰにおける発現を明らかにする免疫蛍光染色を示す図である。ＧＦＡＰ＋のアストロサイトおよびＴｕｊ１＋のニューロンが、マイトジェン除去により、ｈ−ｉＮＳＣ−ＧＦＰから分化した。一方、多能性マーカーであるＴＲＡ−１６０またはＯＣＴ４に対する染色は観察されなかった。二次抗体チャネルだけを示す蛍光画像を、下段に示す。（Ｅ）正常ヒト繊維芽細胞、ｈ−ｉＮＳＣおよびｈ−ｉＰＳＣにおけるネスチン、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＯＣＴ３／４発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。
【図２】ＧＢＭにホーミングする操作されたｈ−ｉＮＳＣ。（Ａ）ｈ−ｉＮＳＣ−ＧＦＰＦＬを、ｍＣｈｅｒｒｙを発現するヒトＧＢＭ細胞から５００μｍ離して播種し、蛍光インキュベータ顕微鏡内に置いた。経時的蛍光画像を１０分毎に２４時間取り込み、それを使用してリアルタイムでのｉＮＳＣの遊走が明らかになる動画を構築した。（Ｂ）培養０時間および２４時間後における、Ｕ８７−ｍＣＦＬに向かうｈ−ｉＮＳＣ−ＧＦＰＦＬまたはヒト親繊維芽細胞の遊走を示す概略画像である。（Ｃ）２４時間にわたるｈ−ｉＮＳＣ−ＧＦＰＦＬの、ＧＢＭへの指向性がある遊走の経路を示している単一細胞の追跡を示す図である。追加の画像は、ヒト親繊維芽細胞の限定的な遊走を示す。点線は、ＧＢＭ播種の部位を示す。（Ｄ〜Ｆ）リアルタイム運動分析から決定した、ＧＢＭ細胞へのｈ−ｉＮＳＣまたは繊維芽細胞遊走の指向性（Ｄ）、距離（Ｅ）および速度（Ｆ）を示す総括グラフである。（Ｇ〜Ｈ）固形ＧＢＭへのｈ−ｉＮＳＣ遊走を評価するために、Ｕ８７  ＧＢＭスフェロイドを、３次元浮遊系でｈ−ｉＮＳＣと共培養した図である（Ｇ）。蛍光イメージングは、Ｕ８７スフェロイド内へのｈ−ｉＮＳＣ−ＧＦＰＦＬの遊走および腫瘍スフェロイドの中心への経時的侵入を示した（Ｈ）。
【図３】マウス脳に移植したｉＮＳＣのインビボ特徴づけ。（Ａ）未改変ｈ−ｉＮＳＣおよびｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬｕｃを発現するように操作されたｈ−ｉＮＳＣの増殖を示す総括グラフである。（Ｂ〜Ｃ）ｈ−ｉＮＳＣをマウスの前頭葉に移植し、連続生物発光イメージングを使用して３週間にわたってそれらの残存を監視した図である。総括グラフは、ｈ−ｉＮＳＣが徐々に消失するものの、脳内に２５日間残存することを実証した（Ｂ）。脳への移植１４日後におけるｈ−ｉＮＳＣの免疫蛍光分析は、ネスチン＋およびＴｕｊ＋の細胞を示したが、ｈ−ｉＮＳＣと多能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＲＡ−１６０との共局在化は観察されなかった（Ｃ）。
【図４】固形ＧＢＭに対するｈ−ｉＮＳＣ媒介ＴＲＡＩＬ治療。（Ａ〜Ｂ）アポトーシス促進性薬剤であるＴＲＡＩＬを分泌するように操作し、単層（Ａ）でまたは浮動神経幹細胞塊（Ｂ）として成長させたｈ−ｉＮＳＣの成長を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。（Ｃ）１：２または１：２の比で治療用ｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲもしくは対照細胞と混合したｍＣｈｅｒｒｙ＋ヒトＵ８７ＧＢＭスフェロイドの生存率を示す３次元懸濁培養の画像および概要データを示す図である。ＧＢＭスフェロイド生存率を、処置４８時間後にルシフェラーゼイメージングによって決定した。（Ｄ）固形ＧＢＭのｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲ治療を、ＳＣＩＤマウスの脳実質にｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲとＵ８７ＧＢＭ細胞との混合物を異種移植することにより実行した図である。（Ｅ〜Ｆ）対照処置マウスと比較してｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲ治療によって固形Ｕ８７ＧＢＭ進行が阻害されたことを実証している代表的なＢＬＩ画像（Ｅ）および概要データ（Ｆ）を示す図である。（Ｇ）ｈ−ｉＮＳＣ対照と比較してｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲ処置動物における生存の延長を実証しているカプランマイアー曲線を示す図である。（Ｈ）治療後のｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲにおける細胞毒性、分化および多能性マーカーの発現を実証している代表的な画像である。動物のサブセットを治療１４日後に屠殺し、脳切片をネスチン、ＴＲＡＩＬ、ＧＦＡＰ、Ｔｕｊ−１、Ｏｃｔ−４またはＴＲＡ−１６０に対する抗体で染色し、染色とＧＦＰ＋ｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲとの共局在化を可視化した。
【図５】ヒト患者由来ＧＢＭのｈ−ｉＮＳＣプロドラッグ／酵素治療。（Ａ〜Ｄ）ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ治療の抗腫瘍効果を、異なる２つの３次元培養モデルで決定した図である。ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫを、ＧＦＰ＋ＧＢＭ４患者由来ＧＢＭ細胞と混合（Ａ、Ｂ）または確立したＧＢＭ４スフェロイドに隣接して播種し（Ｃ、Ｄ）、ＧＣＶを添加して腫瘍死滅を開始した。連続蛍光画像は、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ／ＧＣＶ治療によるＧＢＭ４スフェロイド体積の時間依存的な低下を示した。（Ｅ）ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ／ＧＣＶ治療による、７日間にわたるＧＢＭ４スフェロイド体積の減少を実証する総括グラフである。（Ｆ〜Ｊ）ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ治療について、その１０日前にマウスの脳内に確立したＧＢＭ４腫瘍に対してｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ細胞を注射することによりインビボで評価した図である（Ｆ）。連続ＢＬＩは、ＧＢＭ４腫瘍の進行が、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ／ＧＣＶ治療により有意に阻害されたことを示した（Ｇ）。ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ／ＧＣＶ治療または対照ｈ−ｉＮＳＣで処置したＧＢＭ４腫瘍を持つマウスの生存を実証しているカプラン−マイヤー生存曲線を示す図である（Ｈ）。（Ｉ〜Ｊ）確立したＧＢＭ４腫瘍にｈ−ｉＮＳＣ対照（Ｉ）またはｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ（Ｊ）を送達した２１日後におけるＧＢＭ４体積およびｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ分布を示す、脳全体ならびに高倍率の代表的な画像である。対照処置した動物には大きなＧＢＭ４腫瘍が存在し、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ処置した脳には小さなＧＢＭ４病巣しか検出されなかった。
【図６】外科的に切除したびまん性ＧＢＭの腔内ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ治療。（Ａ〜Ｃ）３次元懸濁培養を使用して、患者由来ＧＢＭ８スフェロイド（Ａ）に対する合成細胞外マトリックス（ｓＥＣＭ）に封入したｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫの遊走および抗腫瘍有効性を決定した図である。ｓＥＣＭ内に封入したｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫは、マトリックスから遊走し、播種３日後にＧＢＭ８スフェロイドに定着することが判明した図である。ｓＥＣＭ内に封入したｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫが、対照処置スフェロイドと比較してＧＢＭ８スフェロイドの体積を有意に減少させることを実証した代表的な画像および概要データである（Ｃ）。（Ｄ）外科的に切除したＧＢＭの臨床的ｈ−ｉＮＳＣ治療を模倣するために、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫをｓＥＣＭ内に封入し、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬｕｃを発現しているびまん性患者由来ＧＢＭ８腫瘍を切除した後の外科的腔に移植した図である。（Ｅ）術後のわずかなＧＢＭ８腫瘍に対する腔内ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ治療後の腫瘍再発の有意な阻害を実証している、連続イメージングの代表的な画像および概要データを示す図である。（Ｆ）びまん性ＧＢＭ８患者由来腫瘍細胞の外科的切除を受け、ｓＥＣＭ内に封入し外科的腔に移植した対照ｈ−ｉＮＳＣまたはｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫで処置したマウスのカプラン−マイヤー生存曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書に引用される特許文献の開示の全ては、本明細書に示される開示と一致する範囲で参照により本明細書に組み込まれる。本明細書では本発明および添付の請求項の説明において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上別途明らかな指示がない限り、複数形も同様に含むものとする。
【００１９】
本明細書で使用される「神経幹細胞」とは、ニューロン、アストロサイトおよび／またはオリゴデンドロサイト等の中枢神経系細胞に分化できる多能性細胞のことを指す。
【００２０】
「分化転換」または「分化転換する」は、分化した体細胞が、多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）段階を経ることなく異なる系統の分化した体細胞または中間的な多能性体細胞に直接変換される方法である。分化転換は、１つまたは複数の分化転換因子に細胞を曝露するおよび／または所望の細胞型への分化転換を促進する培地中で細胞を成長させることによって実施できる。分化転換の監視は、分化した体細胞および／または幹細胞の指標となるマーカー発現を監視する等、当業者に公知の方法を使用して実行できる。
【００２１】
分化した体細胞は、組織、体液（例えば、血液、尿）等、任意の利用しやすい供給源から採取することができる。いくつかの実施形態において、体細胞は、皮膚繊維芽細胞等の繊維芽細胞である。例えば、皮膚細胞は、例えば同時に行う外科的手順の間に術創の縁から、または独立した手順である伝統的な皮膚パンチを使用して採取することができる。皮膚は、頭皮または前腕由来の収集を含むがこれに限定されない任意の領域から採取することができる。
【００２２】
本明細書に教示されるいくつかの実施形態において、分化転換は、１、２もしくは３〜８、９もしくは１０日間、１、２もしくは４〜５、６もしくは７日間、１もしくは２〜３日間、または１２〜２４、４８もしくは７２時間実施される。
【００２３】
本明細書では「分化転換因子」は、ある体細胞型の、別の型への直接変換を促進する転写因子等のタンパク質である。例としては、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１ｌ、Ｏｌｉｇ２、Ｚｉｃ１等があるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、分化転換の方法は、分化転換因子を１つだけ使用する単一因子分化転換である。
【００２４】
「Ｓｏｘ２」は、転写因子であるＳｏｘファミリーのメンバーであり、神経管内の発達細胞および中枢神経系の増殖性前駆細胞において発現される。いくつかの実施形態において、Ｓｏｘ２は、教示される方法において分化転換因子として使用される。いくつかの実施形態において、Ｓｏｘ２を使用して、単一因子分化転換が実施される。
【００２５】
「ネスチン」は、中枢神経系の幹細胞において顕著に発現し、その発現は、分化した中枢神経細胞には一般に存在しない。「ＧＦＡＰ」または「グリア線維性酸性タンパク質」は、アストロサイトを含めた中枢神経系細胞により発現される中間フィラメントタンパク質である。「Ｔｕｊ−１」または「βＩＩＩチューブリン」は、神経マーカーである。
【００２６】
「Ｎａｎｏｇ」および「ＯＣＴ３／４」は、公知の幹細胞マーカーである。
【００２７】
本明細書に教示されるいくつかの実施形態において、分化転換は、フィーダー細胞を使用せずに、例えば神経前駆細胞用培地中で実施される。当業者に公知の通り、フィーダー細胞とは、しばしば細胞成長を支持するための層（例えば、培養ディッシュ上のマウス繊維芽細胞層）として同じ培養ディッシュまたは容器内で成長される追加の細胞である。
【００２８】
本明細書において、「神経前駆細胞用培地」は、神経幹細胞（「誘導」神経幹細胞）への体細胞の分化転換（ＴＤ）を促進する１または複数の培地である。いくつかの実施形態において、神経前駆細胞用培地は、成長促進因子および／または栄養混合物を含有する細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＭＥＭ／Ｄ−バリン、ニューロベーサル培地等、その混合物を含める）；ホルモン類、タンパク質、ビタミンおよび／またはアミノ酸を含有する培地補助剤（例えば、Ｎ２補助剤、Ｂ２７補助剤、非必須アミノ酸［ＮＥＡＡ］、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ、ＢＳＡ、インスリン、全てのトランスレチノイン酸等、その混合物を含める）；ならびに任意選択で小分子阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２［ＢＭＰ阻害剤］、ＬＤＮ１９３１８９［ＴＧＦ−β１阻害剤］、ＣＨＩＲ９９０２１［ＧＳＫ３β阻害剤］等、その混合物を含める）から選択される成分の１つまたは複数を含む。成分は、β−メルカプトエタノール、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、およびｃＡＭＰのうちの１つまたは複数を含むこともできる。これら成分のそれぞれの適当な濃度は、当業技術者に公知であり、および／または経験的に決定することができる。成分の濃度例は、以下の実施例２においても提供される。いくつかの実施形態において、神経前駆細胞用培地は、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）  Ｎｅｕｒａｌ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ［商標］  Ｔｅｃｈｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ、カナダ）等、あらかじめ作製された培地である。
【００２９】
いくつかの実施形態において、神経幹細胞にＴＥＲＴ（テロメラーゼ逆転写酵素）を導入して、その寿命を促進し、および／または細胞培養により、増殖による拡大を受ける能力を強化する。いくつかの実施形態において、ＴＥＲＴは、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（「ｈＴＥＲＴ」）である。
【００３０】
本明細書では「処置する」または「処置」とは、がん、神経変性障害または神経外傷等の疾患もしくは障害に罹患した患者に、患者の状態（例えば、１つまたは複数の症状）の改善、疾患の進行の遅延、疾患の出現または再発の遅延等を含めた利益をもたらす任意の型の処置のことを指す。
【００３１】
本発明は、主にヒト対象の処置に関するが、本発明は、動物対象、特に獣医学的目的、ならびに薬物スクリーニングおよび／または薬物開発目的のためにマウス、ラット、イヌ、ネコ、家畜およびウマ等の哺乳動物対象に実施することもできる。対象は、乳幼児、若年、青年、成人および老人対象を含めた任意の年齢であり得る。いくつかの実施形態において、誘導神経幹細胞は、対象にとって同種異系または自己由来である。
【００３２】
処置しようとするがんには、脳がんが含まれ、脳がんは原発性であっても続発性であってもよい。「原発性脳がん」は、中枢神経系細胞の頭蓋内がんである。脳がんのタイプには、膠腫（例えば、膠芽腫または多形膠芽腫［ＧＢＭ］）、髄膜腫、髄芽腫、下垂体腺腫および神経鞘腫瘍があるが、これに限定されない。「続発性脳がん」は、身体の他の領域から転移した細胞、例えば、乳がん、黒色腫、肺がん、前立腺がん等を含む中枢神経系に位置するがんである。
【００３３】
いくつかの実施形態において、本明細書に教示される神経幹細胞に、治療薬、レポータ分子および／または同じものを発現できる核酸を導入（ｌｏａｄ）する（すなわち、含有させる）。いくつかの実施形態において、治療薬は、タンパク質毒素（例えば、細菌エンドトキシンまたは外毒素）、腫瘍崩壊性ウイルス（例えば、条件付きに複製可能な腫瘍崩壊性アデノウイルス、レオウイルス、麻疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス［例えば、ＨＳＶ１７１６］、ニューカッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス等）またはアポトーシス促進性薬剤（例えば、分泌可能な腫瘍壊死因子［ＴＮＦ］関連アポトーシス誘導リガンド［Ｓ−ＴＲＡＩＬ］）である。例えば、Ｗｅｉｓｓら、ＷＯ  １９９４０／１６７１８；Ｓｈａｈら、ＷＯ  ２０１４／０１８１１３；Ｍａｒｔｕｚａら、ＷＯ  ２００９／１４８４８８；Ｓｕｂｂｉａｈら、米国特許出願公開第２００９／０１７５８２６号を参照のこと。
【００３４】
いくつかの実施形態において、治療薬はインターロイキン、サイトカインまたは抗体等の炎症誘発性タンパク質である。
【００３５】
いくつかの実施形態において、治療薬は、酵素／プロドラッグ治療に有用な酵素（例えば、チミジンキナーゼ［例えば、ガンシクロビルプロドラッグと］、カルボキシルエステラーゼ［例えば、ＣＴＰ−１１と］、シトシンデアミナーゼ等）である。
【００３６】
いくつかの実施形態において、治療薬は、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ等のＲＮＡｉ分子である。
【００３７】
いくつかの実施形態において、神経幹細胞に、ナノ粒子／薬物コンジュゲートが導入される。
【００３８】
レポータ分子は当業者に公知であり、緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子があるが、これに限定されない。例えば、Ｐｏｍｐｅｒら、米国特許出願公開第２０１３／０２６３２９６号を参照のこと。
【００３９】
神経幹細胞への導入は、細胞に、治療用またはレポータタンパク質を産生できる核酸をトランスフェクトする、細胞にウイルスベクターを形質導入する、細胞に治療薬および／またはレポータ分子を脂質に基づいてもしくはポリマーによって導入する等、当業者に公知の方法を使用して達成することができる。
【００４０】
「トランスフェクトする」は、細胞への異種遺伝物質の移入であり、しばしばベクター（すなわち、別の細胞へ外来遺伝物質を運ぶ媒体として使用される分子）を介して行う。真核細胞にトランスフェクトする方法は公知であり、エレクトロポレーション、陽イオン性リポソームに基づく試薬の使用、ナノ粒子ポリマーリポソーム等があり得るが、これに限定されない。
【００４１】
「形質導入する」は、ウイルスによる細胞への異種遺伝物質の移入である。そのようなウイルスベクターは公知であり、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター等があり得るが、これに限定されない。
【００４２】
神経幹細胞の投与は、当業者に公知の方法を使用して実行できる。例えば、細胞の頭蓋内投与、好ましくは腫瘍内投与を脳がんの処置に実行することができ、または脳腫瘍の少なくとも一部の外科的除去後に腔内投与を実行することができる。
【００４３】
いくつかの実施形態において、細胞は、ヒドロゲルマトリックス（例えば、合成細胞外マトリックス）等のマトリックスに封入される、および／または足場上に播種され、その後その細胞を、例えば頭蓋内に投与または移植することができる。例えば、Ｓｈａｈ、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ  ２０１４／０３５４７４；Ｓｈａｈ、米国特許出願公開第２０１４／００８６９０７号を参照のこと。それぞれ参照により本明細書の一部をなすものとする。
【００４４】
本発明は、以下の非限定的な例においてより詳細に説明される。
【実施例】
【００４５】
［実施例１：ヒト皮膚細胞の迅速な分化転換］
ヒト皮膚からｈ−ｉＮＳＣを迅速に生成する能力により、がんを処置するための患者特異的治療が可能になり得る。他の細胞再プログラム戦略よりもｉＮＳＣ生成の効率が有意に高く、このことは、多数のｈ−ｉＮＳＣを少量の皮膚から生成できることを示唆している。患者特異的派生物は、免疫拒絶を回避して、腫瘍死滅を最大化し、処置を持続させることができる。
【００４６】
急速進行性がんの患者を処置するには、細胞ベースの薬物担体は速やかに生成されなければならず、ｈ−ｉＮＳＣは数週間で作製することができる。また、ｉＰＳＣとは異なり、ｈ−ｉＮＳＣは、移植後に奇形腫を形成しない。
【００４７】
本研究において、ＴＤ由来ｈ−ｉＮＳＣ治療の潜在性を、ヒト患者に対する自己由来ＧＢＭ治療として調査した。これらの方法は、これまでの方法より６倍速くヒト皮膚をｈ−ｉＮＳＣに変換することができ、時間は、ＧＢＭ患者治療にとって優先事項であることから、これは重要である。この戦略を使用して、細胞毒性物質および光学的レポータで操作した第１のｈ−ｉＮＳＣを作製した。リアルタイム分子イメージング、３次元細胞培養および複数のヒトＧＢＭ異種移植片モデルの組み合わせを使用して、固形ならびに外科的に切除したＧＢＭに対するｈ−ｉＮＳＣ治療の運命、腫瘍特異的ホーミングおよび有効性を調査した。
【００４８】
［材料および方法］
＜細胞株＞
Ｕ８７、ＧＢＭ８、ＧＢＭ４、２９３Ｔおよびヒト繊維芽細胞（ＣＣＤ−１０９９Ｓｋ、他）を、これまでに記載されている通り成長させた（Ｈｉｎｇｔｇｅｎら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２８、８３２〜８４１頁、２０１０年；Ｗａｋｉｍｏｔｏら、Ｃａｎｓｅｒ  Ｒｅｓ  ６９、３４７２〜３４８１頁、２００９年）。ｈＴＥＲＴおよびＳｏｘ２をコードしているレンチウイルスベクター（ＬＶ）を、Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。全てのｃＤＮＡは、テトラサイクリンプロモーターの制御下にあった。
【００４９】
ヒトｉＮＳＣ（ｈ−ｉＮＳＣ）を、単一因子Ｓｏｘ２、およびフィーダーを含まない方法にしたがって生成した。簡潔には、ヒト繊維芽細胞２０００００個を６ウェルプレートに播種し、硫酸プロタミン（５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を含有する培地中にｈＴＥＲＴおよびＳｏｘ２を含有するＬＶカクテルを形質導入した。感染２日後に、培地を、ドキシサイクリン（１０μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を含有するＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）  Ｎｅｕｒａｌ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、カナダ）と交換した。培地を、３日毎に交換した。神経幹細胞塊形成を、低付着性フラスコ内での培養により誘導した。
【００５０】
＜レンチウイルスベクター＞
再プログラムベクターに加えて、レンチウイルスベクター：ＬＶ−ＧＦＰ−ＦＬ、ＬＶ−ＧＦＰ−ＲＬｕｃ、ＬＶ−ｍＣ−ＦＬ、ＬＶ−ｓＴＲ、ＬＶ−ｄｉＴＲおよびＬＶ−ｍＲＦＰ−ｈＲＬｕｃ−ｔｔｋを、本研究に使用した。ＧＦＰ−ＲＬｕｃおよびＧＦＰ−ＦＬを、ルシフェラーゼ−ｐｃＤＮＡ３およびｐＡＣ−ｈＲｌｕｃ（Ａｄｄｇｅｎｅ）ベクターを使用してウミシイタケルシフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼをコードしているｃＤＮＡを増幅することにより、それぞれ構築した。制限部位をプライマーに組み込み、得られた断片をＢｇｌＩＩおよびＳａｌＩで消化し、ＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ消化したｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）にフレームを一致させてライゲートした。ＧＦＰ−ＦＬまたはＧＦＰ−ＲＬｕｃ断片をＡｇｅＩ（平滑化）およびＳａｌＩで消化し、ＢａｍＨＩ（平滑化）およびＸｈｏＩで消化したｐＴＫ４０２（Ｔａｌ  Ｋａｆｒｉ博士、ＵＮＣ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｃｅｎｔｅｒ、により提供された）にライゲートして、ＬＶ−ＧＦＰＦＬまたはＬＶ−ＧＦＰ−ＲＬｕｃを作製した。同様に、ｍＣＦＬを、ルシフェラーゼ−ｐｃＤＮＡ３からホタルルシフェラーゼをコードしているｃＤＮＡを増幅し、ＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ消化したｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にライゲートし、平滑／ＸｈｏＩ部位を使用してｐＴＫ４０２  ＬＶ骨格にｍＣ−ＦＬ断片をライゲートすることにより作製した。ＬＶ−ｓＴＲおよびＬＶ−ｄｉＴＲを作製するために、ｓＴＲまたはｄｉＴＲをコードしているｃＤＮＡ配列を、注文合成したオリゴヌクレオチド鋳型（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してＰＣＲ増幅した。制限部位をプライマーに組み込み、得られた断片をＢａｍＨ１およびＸｈｏＩで消化し、ＢａｍＨ１／ＸｈｏＩ消化したｐＬＶＸプラスミドにフレームを一致させてライゲートした。ＬＶ−ｓＴＲとＬＶ−ｄｉＴＲの両方は、骨格中にＩＲＥＳ−ＧＦＰ（内部リボソーム侵入部位−緑色蛍光タンパク質）エレメントおよびＣＭＶ駆動されるピューロマイシンエレメントを有する。全てのＬＶ構築物を、これまでに記述されている通りヘルパーウイルスを含まないパッケージング系（Ｓｅｎａ−Ｅｓｔｅｖｅｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  １２２、１３１〜１３９頁、２００４年）を使用して２９３Ｔ細胞にＬＶベクターとしてパッケージングした。ｈ−ｉＮＳＣおよびＧＢＭ細胞を、５μｇ／ｍＬ硫酸プロタミン（Ｓｉｇｍａ）を含有する培養培地中でビリオンをインキュベートすることにより様々な感染多重度（ＭＯＩ）で、ＬＶを形質導入し、細胞を、蛍光顕微鏡により蛍光タンパク質発現について可視化した。
【００５１】
＜細胞生存率および継代数＞
改変したならびに未改変のｈ−ｉＮＳＣの増殖および継代数を評価するために、ＧＦＰ−ＦＬ、ｓＴＲを発現しているｈ−ｉＮＳＣまたは未改変の細胞を、９６ウェルプレートに播種した。細胞生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して播種２、３、４、５、８および１０日後に評価した。最大継代数を、ｉＮＳＣ、ｉＮＳＣ−ｓＴＲまたはＷＴ−ＮＳＣが、形態、成長速度もしくは形質導入効率を変えずに二次培養された回数を監視することにより評価した。
【００５２】
＜免疫組織化学およびインビトロ分化＞
ｈ−ｉＮＳＣ分化に対するＬＶ導入の効果を決定するために、ｈ−ｉＮＳＣをＬＶ−ＧＦＰ−ＦＬまたはＬＶ−ｓＴＲを形質導入した。改変したまたは未改変の細胞を固定し、透過化処理し、抗ネスチンポリクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ３５３、１：５００、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）と１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、適当な二次抗体（Ｂｉｏｔｉｕｍ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）と１時間インキュベートした。細胞を、その後洗浄し、封入し、蛍光共焦点顕微鏡を使用して撮像した。分化の場合、改変操作したまたは形質導入していないｈ−ｉＮＳＣを、ドキシサイクリン、ＥＧＦおよびＦＧＦを除いたＮ３培地中で１２日間培養した。細胞を、ネスチン、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ３４０５、１：２５０）、またはＴｕｊ−１（Ｓｉｇｍａ、Ｔ８５７８、１：１０００）に対して作った抗体でその後染色し、適当な二次抗体（Ｂｉｏｔｉｕｍ）で検出した。核を、ヘキスト３３３４２で対比染色し、結果を、ＦＶ１２００レーザー共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ）を使用して分析した。
【００５３】
＜３次元組織培養＞
３次元浮遊細胞培養は、Ｂｉｏ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  Ｋｉｔ（Ｎａｎｏ３Ｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）を使用して行われた。コンフルエント状態のＧＢＭまたはｈ−ｉＮＳＣの６ウェルプレートを、磁気ナノ粒子アセンブリ（８μＬｃｍ−２細胞培養表面積または５０μＬｍＬ−１培地、ＮａｎｏＳｈｕｔｔｌｅ［ＮＳ］、Ｎａｎｏ３Ｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに終夜インキュベーションして、ナノ粒子に細胞を結合させた。ＮＳを、酸化鉄および細胞取り込みを促進するためのポリ−ｌ−リシンと架橋した金ナノ粒子を混合することにより製作した。（Ｓｏｕｚａ，Ｇ．Ｒ．ら  「Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｅｖｉｔａｔｉｏｎ」  Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５、２９１頁、２０１０年）。処理したＧＢＭおよびｈ−ｉＮＳＣを、その後トリプシンで分離し、再懸濁し、培地２ｍＬを含む超低付着６ウェルプレート中で異なる比（１：１および１：０．５）で混合した。６ウェルプレートおよびプラスチック中蓋インサート用に設計した磁界強度５０Ｇを持つ６個のネオジム磁石の磁気駆動体をウェルプレートの上に置いて、気相液相界面に細胞を浮遊させた。４μｇ／ｍＬのＧＣＶを含有する培地を、ＧＢＭとｔｔｋを発現しているｈ−ｉＮＳＣとの共培養に添加した。蛍光画像を経時的に撮影して、両方の集団（あらかじめ、異なる蛍光で標識した）の細胞生存率を追跡した。３次元細胞培養のＢＬＩの場合、Ｆｌｕｃ基質貯蔵試薬１００μＬ／ウェルを培地に添加し、ＩＶＩＳ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して５分間の取り込み時間で撮像した。画像を処理し、光子放射を、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して定量化した。
【００５４】
＜リアルタイムイメージングおよび運動分析＞
遊走を、新規の２次元および３次元培養系で評価した。
【００５５】
＜２次元遊走＞
ＲＦＰを発現しているｈ−ｉＮＳＣを、２チャンバー細胞カルチャーインサート（ｉｂｉｄｉ、Ｖｅｒｏｎａ、ＷＩ、ＵＳＡ）を使用してガラスボトムマイクロウェルディッシュ（ＭａｔＴｅｋ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）中のマイクロカルチャーインサートに播種した。ＧＦＰを発現しているＵ８７膠腫細胞を隣接するウェル（０．５ｍｍ距離間隔）に平板培養したか、またはウェルを空のままにした。平板培養の２４時間後に、細胞をＶｉｖａＶｉｅｗ生細胞イメージングシステム（Ｏｌｙｍｐｕｓ）内に置き、平衡化させた。インサートを取り外し、細胞を、３つの独立した実験においてウェル当たり６箇所で（充分な細胞数を監視するため）、１０×倍率で２０分毎に３６時間撮像した。ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅをその後使用して動画を生成し、両方で遊走速度、遊走した総距離、および遊走の指向性を決定した。
【００５６】
＜３次元遊走＞
ＧＢＭスフェロイドへのｈ−ｉＮＳＣ遊走を、上記の浮遊培養を使用してｈ−ｉＮＳＣおよびＧＢＭスフェロイドを作製することにより３次元培養系で評価した。ｈ−ｉＮＳＣおよびＧＢＭスフェロイドを、浮遊系で共培養した。リアルタイムイメージングを実行して、浮遊培養でのｈ−ｉＮＳＣによるＧＢＭスフェロイドの侵入を可視化した。
【００５７】
＜共培養生存率アッセイ＞
ｓＴＲまたは対照ＧＦＰ−ＲＬを発現しているｍＮＳＣ（５×１０３個）を、９６ウェルプレートに播種した。２４時間後に、Ｕ８７−ｍＣ−ＦＬ、ＬＮ１８−ｍＣ−ＦＬまたはＧＢＭ８−ｍＣ−ＦＬヒトＧＢＭ細胞（５×１０３個）を、ウェルに播種し、ＧＢＭ細胞生存率を、定量的インビトロ生物発光イメージングにより２４時間後に測定した。また、ＧＢＭ細胞を、カスパーゼ３／７で活性化可能なケージドＤＥＶＤ−アミノルシフェリン（カスパーゼ−Ｇｌｏ  ３／７、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）により、１８時間の時点でのカスパーゼ３／７活性について評価した。
【００５８】
＜インビボでのｈ−ｉＮＳＣ生存および運命＞
インビボでのｈ−ｉＮＳＣの生存を決定するために、ｍＣｈｅｒｒｙＦＬを発現しているｈ−ｉＮＳＣ（７．５×１０６個細胞／マウス）をＰＢＳに懸濁し、マウスの右前頭葉において定位に移植した（ｎ＝７）。ｈ−ｉＮＳＣ生存を、２０日間実行した連続生物発光イメージングによって決定した。細胞の解像度でｈ−ｉＮＳＣの運命を決定するために、動物を移植２１日後に屠殺し、脳を摘出し、切片にした。組織切片を、ネスチン、ＧＦＡＰ、Ｔｕｊ−１、Ｏｃｔ−４およびＴＲＡ−１６０に対する抗体で染色し、ＣＦ（商標）４８８で標識した二次抗体を使用して可視化した。
【００５９】
＜共培養生存率アッセイ＞
３次元浮遊培養を、３つの別々のインビトロ細胞毒性研究に使用した。２つの異なる細胞毒性物質を発現しているｈ−ｉＮＳＣを使用して、確立したＧＢＭ細胞株（Ｕ８７）１つと、患者由来のＧＢＭ株（ＧＢＭ４、ＧＢＭ８）２つを処置した。１）ＴＲＡＩＬ治療の細胞毒性を決定するために、ｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲまたはｈ−ｉＮＳＣ−ｍＣｈｅｒｒｙのスフェロイドを、ｉＮＳＣ：ＧＢＭ比＝１：２または１：１で、Ｕ８７−ＧＦＰ−ＦＬｕｃスフェロイドと浮遊状態で共培養した。ＧＢＭスフェロイドの生存率を、ＦＬｕｃイメージングにより４８時間後に決定した。２）患者由来ＧＢＭに対するプロドラッグ酵素治療の細胞毒性を決定するために、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫスフェロイドを、患者由来ＧＢＭ４−ＧＦＰ−ＦＬｕｃスフェロイドと浮遊状態で共培養、またはスフェロイド形成前にＧＢＭ細胞と混合した。スフェロイドを、ガンシクロビル（ＧＣＶ）の存在下または不在下で培養し、ＧＢＭスフェロイド生存率を、ＦＬｕｃイメージングによりプロドラッグ添加０、２、４または７日後に決定した。３）ｓＥＣＭに封入されたｉＮＳＣプロドラッグ／酵素治療の細胞毒性を決定するために、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫをｓＥＣＭ内に封入し、患者由来ＧＢＭ８−ＧＦＰ−ＦＬｕｃスフェロイドと共に浮遊培養系に置いた。生存率を、ＦＬｕｃイメージングにより決定した。
【００６０】
＜インビボでのｈ−ｉＮＳＣ治療の抗ＧＢＭ有効性＞
異なる３つの異種移植片研究を実行して、ｈ−ｉＮＳＣ治療の抗ＧＢＭ効果を評価した。ｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲおよびｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ治療を、固形（Ｕ８７）、患者由来のびまん性（ＧＢＭ８）、および外科的に切除した患者由来（ＧＢＭ４）異種移植片モデルに対して試験した。
【００６１】
１）固形ヒトＵ８７腫瘍に対するｈ−ｉＮＳＣ−ＴＲＡＩＬの治療効果を決定するために、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＲＡＩＬまたはｉＮＳＣ−ＧＦＰ−ＲＬｕｃ（７．５×１０５個細胞／マウス）の組み合わせを、Ｕ８７−ｍＣ−ＦＬ細胞（１×１０６個細胞／マウス）と一緒にマウスの右前頭葉において定位に移植した（ｎ＝７）。治療応答を、前述の通りＦＬ生物発光イメージングで腫瘍体積を追跡することによりその後決定した。簡潔には、マウスにＤ−ルシフェリン（生理食塩水１５０μＬ中に４．５ｍｇ／マウス）を腹腔内注射し、５分後に光子放射を、ＩＶＩＳ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して５分間の取り込み時間で決定した。画像を処理し、光子放射を、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して定量化した。更に、マウスを、生存について経時的に追跡した。
【００６２】
２）侵襲性の患者由来ＧＢＭに対するｈ−ｉＮＳＣプロドラッグ／酵素治療の有効性を調査するために、マウスに、ｍＣ−ＦＬを発現しているＧＢＭ８細胞（１．５×１０５個細胞／マウス）を右前頭葉において定位に移植した。３日後に、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ（ｎ＝７、７．５×１０５個細胞／マウス）またはｈ−ｉＮＳＣ−ｍＲＦＰ−ｈＲＬｕｃ（ｎ＝７、７．５×１０５個細胞／マウス）を、腫瘍移植部位に移植した。ＧＣＶを、１００ｍｇ／ｋｇの用量で２週間毎日腹腔内に注射した。腫瘍体積の変化を、上記の通りＦＬｕｃイメージングにより評価し、マウスを生存について経時的に追跡した。
【００６３】
３）術後のわずかなＧＢＭに対するｈ−ｉＮＳＣ治療の有効性を決定するために、これまでに報告されている戦略にしたがってマウスにおいて画像誘導ＧＢＭ切除を実行した。患者由来ＧＢＭ８−ＧＦＰ−ＦＬｕｃを、８０％集密度で回収し、右前頭葉において定位（ブレグマの横２ｍｍおよび硬膜から０．５ｍｍ）に移植した（５×１０５個細胞）。定位枠に固定した後、マウスを、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＭＶＸ−１０顕微鏡下に置いた。手術中の顕微白色光、ＧＦＰおよびＲＦＰ画像を、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  ＯＲＣＡ  ０３Ｇ  ＣＣＤ（高分解能）カメラおよびソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して手順の全体を通じて取り込んだ。正中切開を、頭蓋骨上の皮膚に加え、マウスの頭蓋を露出させた。頭蓋内異種移植片を、ＧＦＰ蛍光を使用して同定した。腫瘍を覆っている頭蓋骨のごく一部を、骨ドリルおよび鉗子を使用して外科的に除去し、被っている硬膜を、皮質表面から穏やかにはがし、腫瘍を露出させた。ＧＦＰ蛍光下で、ＧＢＭ８−ＧＦＰＦＬ腫瘍を、外科的切開と吸引の組み合わせを使用して外科的に切除し、ＧＦＰの画像を継続的に取り込んで、ＧＦＰ誘導外科的切除の精度を評価した。腫瘍除去後、得られた切除腔を十分に洗い流し、皮膚を７−０バイクリル縫合糸で閉じた。手順に関連する死亡数は観察されなかった。全ての実験プロトコルは、ノースカロライナ大学Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌの動物実験委員会により承認されており、マウスの飼育は、米国国立衛生研究所実験動物の管理と使用に関する指針、ＵＳＤＡ規則、および米国獣医師会により示される基準にしたがった。外科的切除の後、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫまたはｈ−ｉＮＳＣ−ｍＣ−ＦＬ（５×１０５個細胞）を、ヒアルロン酸ｓＥＣＭヒドロゲル（Ｓｉｇｍａ）に封入し、手術後のＧＢＭ腔に移植した。ＧＢＭの再発を、上記の通りＦＬｕｃイメージングにより可視化し、マウスを生存について追跡した。
【００６４】
＜組織処理＞
最後のイメージングセッションの直後に、マウスを屠殺し、ホルマリンで潅流し、脳を摘出した。組織を、ホルマリンに直ちに浸漬した。３０μｍの冠状切片を、振動ミクロトーム（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して生成した。ネスチン、ＧＦＡＰおよびＴｕｊ−１染色の場合、切片を、ブロッキング溶液（０．３％ＢＳＡ、８％ヤギ血清および０．３％トライトンＸ−１００）中で、室温で１時間インキュベートし、その後ブロッキング溶液に希釈した一次抗体（１）抗ヒトネスチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、（２）抗ＧＦＡＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、（３）抗ＴＲＡＩＬ（ＰｒｏＳｃｉ、Ｐｏｗａｙ、ＣＡ）および（４）抗Ｔｕｊ−１（Ｓｉｇｍａ）と４℃で終夜インキュベートした。切片を、ＰＢＳで３回洗浄し、適当な二次抗体中でインキュベートし、共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して可視化した。
【００６５】
［結果］
＜ヒト繊維芽細胞の、ｈ−ｉＮＳＣへの迅速な分化転換＞
ｈ−ｉＮＳＣ治療の迅速かつ効果的な生成は、侵襲性がんの患者を処置するために必須である。新たな戦略として、ヒト繊維芽細胞に、Ｓｏｘ２を形質導入し、フィーダー細胞なしでｈ−ｉＮＳＣ生成を実行した。次いで、光学的レポータを発現する診断用ｈ−ｉＮＳＣまたは異なる細胞毒性物質を発現する治療用ｈ−ｉＮＳＣを生成した（図１Ａ）。最初に、フィーダーを含まない／Ｓｏｘ２戦略を使用してｈ−ｉＮＳＣを生成する動態を評価した。ヒト繊維芽細胞に、Ｓｏｘ２を形質導入し、ＮＳＣ誘導培地中で培養した（図１Ｂ）。細胞形態の変化を、Ｓｏｘ２発現を活性化している４８時間内で観察した。更に、広範なネスチン発現を検出し、ｈ−ｉＮＳＣは神経幹細胞塊形成を形成することができた。定量化は、ｈ−ｉＮＳＣにおけるネスチン発現が、２日目から１０日目まで一定のままであることを示した（図１Ｃ）。分化を誘導したとき、ｈ−ｉＮＳＣは、アストロサイトマーカーＧＦＡＰおよび神経マーカーＴｕｊ−１を発現した。染色により、細胞が、多能性マーカーＴＲＡ−１６０またはＯＣＴ４を発現しないことが明らかになった（図１Ｄ）。これらの発見を、ＲＴ−ＰＣＲ分析により確認した（図１Ｅ）。ｈ−ｉＮＳＣは、親繊維芽細胞またはヒトｉＰＳＣ（ｈ−ｉＰＳＣ）にはない高レベルのネスチン発現を示した。Ｓｏｘ２過剰発現を使用してｈ−ｉＮＳＣとｈ−ｉＰＳＣの両方の細胞株を生成したので、Ｓｏｘ２発現は、ｈ−ｉＮＳＣとｈ−ｉＰＳＣ両方で高かった。ｈ−ｉＰＳＣとは異なり、ｈ−ｉＮＳＣは、多能性マーカーＮａｎｏｇまたはＯＣＴ３／４を高レベルで発現しなかった。全体として、これらのデータは、単一因子Ｓｏｘ２発現を使用して４８時間以内に多能性ｈ−ｉＮＳＣを作製する能力を実証している。
【００６６】
＜ｈ−ｉＮＳＣは、選択的にＧＢＭへ遊走する＞
固形および侵襲性ＧＢＭ沈着物にホーミングする能力は、ＮＳＣに基づくがん治療で最も有益な特性の１つである。ｈ−ｉＮＳＣの腫瘍向性の性質を調査するために、ヒトＧＢＭ細胞と共培養したｈ−ｉＮＳＣのリアルタイム運動分析を使用した（図２Ａに概説した）。参照のために、ｈ−ｉＮＳＣ遊走を、それを得たヒト親繊維芽細胞と比較した。ｈ−ｉＮＳＣが、共培養したＧＢＭ細胞の方へ迅速に遊走し、２２時間で５００μｍの空隙を覆うことが判明した（図２Ｂ）。単一細胞の遊走経路分析は、ＧＢＭ細胞の存在が、ｈ−ｉＮＳＣを共培養しているＧＢＭ細胞の方への選択的遊走に誘導することを示した（図２Ｃ）。対照的に、ヒト繊維芽細胞は、ごくわずかな遊走しか実証しなかった（図２Ｂ）。ヒト繊維芽細胞の単一細胞遊走分析では、共培養したＧＢＭ細胞の方へごくわずかに移動するランダムな遊走パターンしか確認されなかった（図２Ｃ）。ｈ−ｉＮＳＣの遊走の指向性を、完全な単一方向の運動が１．０の比を与え、完全に無指向性の運動が０．０の比を与えるようにユークリッド距離と全体の累積距離の比を算出することにより分析した。この分析を使用して、ヒト繊維芽細胞（０．２８）よりｈ−ｉＮＳＣで有意に高い（０．６５）平均指向性比を算出した（図２Ｄ）。単一細胞遊走パターンの更なる分析により、ヒト繊維芽細胞（２００μｍ）と比較してｈ−ｉＮＳＣにより遊走された有意に増加した平均ユークリッド距離（３４０μｍ）が実証された（図２Ｅ）。ｈ−ｉＮＳＣによる平均細胞速度は、ヒト繊維芽細胞と比較してより低かった（０．４対０．６２）（図２Ｆ）。最後に、３次元遊走アッセイを実行して、ｈ−ｉＮＳＣの、ＧＢＭ病巣へのインビボ遊走を模倣した。ｍＣｈｅｒｒｙ＋ｈ−ｉＮＳＣスフェロイドを、ＧＦＰ＋ＧＢＭスフェロイドと共培養し、両方の細胞型を、磁力を使用して浮遊させた（図２Ｇ）。ｈ−ｉＮＳＣが、播種の数時間以内にＧＢＭスフェロイドに侵入し始めることを発見した。ｈ−ｉＮＳＣスフェロイドは、ＧＢＭスフェロイドに侵入し続け、８日以内に広範囲に共局在化した。全体として、これらの観察は、ｈ−ｉＮＳＣが腫瘍向性特性を保有し、ＧＢＭ細胞にホーミングするという結論を支持している。
【００６７】
＜ｈ−ｉＮＳＣの残存およびインビボ運命＞
次に操作したｈ−ｉＮＳＣを利用して、脳内におけるインビボでのこれら細胞の生存および運命を調査した。ＧＦＰＦＬおよびｍＣＦＬによってｈ−ｉＮＳＣを操作した後のインビトロ増殖に関する先行する研究は、操作していないｈ−ｉＮＳＣと有意差を示さなかった（図３Ａ）。インビボ研究の場合、ｍＣＦＬで操作したｈ−ｉＮＳＣを、マウスの脳内に定位に移植し、リアルタイム非侵襲イメージングを使用して、細胞生存を経時的に監視した。画像を定期的に取り込むことにより、ｈ−ｉＮＳＣが、移植後２０日間より長く生存することが判明した（図３Ｂ）。事後ＩＨＣにより、ｈ−ｉＮＳＣ−ｍＣＦＬのおよそ半分が、ＮＳＣマーカーであるネスチンを発現しており（図３Ｄ）、他の半分が、ニューロンマーカーＴｕｊ−１に陽性である（図３Ｄ）ことが明らかになった。アストロサイトマーカーＧＦＡＰは観察されなかった。追加のＩＨＣにより、移植したｈ−ｉＮＳＣが、多能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＤＲ−１６０を発現していないことが検証された。
【００６８】
＜殺腫瘍性ｉＮＳＣを使用する悪性および侵襲性ＧＢＭの有効な処置＞
ｈ−ｉＮＳＣに基づくＧＢＭ処置の治療効果を調査するために、ｈ−ｉＮＳＣを先ず操作して、ＩＲＥＳ−ＧＦＰエレメントの上流に、ガウシアルシフェラーゼとフレームが一致した、アポトーシス促進性分子ＴＮＦα関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ；ｄｉＴＲ）の分泌性バリアント（ｉＮＳＣ−ｄｉＴＲ）を発現させた。操作した細胞担体から送達された場合のＴＲＡＩＬの抗がん効果は、これまでに確立されており、したがってＴＲＡＩＬは、新たなｈ−ｉＮＳＣ送達媒体を特徴づけるのに理想的な殺腫瘍性分子である。ＧＦＰレポータの強力な発現が、ｈ−ｉＮＳＣの形質導入後に検出された（図４Ａ）。ｈ−ｉＮＳＣ−ｄｉＴＲは、浮遊状態で培養した場合に神経幹細胞塊を効率的に形成し（図４Ｂ）、未改変細胞と同等の増殖能および継代数を示すことを観察した（データ不掲載）。ネスチン発現および分化能力が、操作したおよび操作していないｈ−ｉＮＳＣにおいて観察された以前のそれと同じであったことは、ＴＲＡＩＬによるｈ−ｉＮＳＣの修飾が幹細胞としてのその特性に干渉しないことを示唆している。
【００６９】
操作したｈ−ｉＮＳＣの抗ＧＢＭ有効性を評価するために、ｈ−ｉＮＳＣ−ｄｉＴＲまたは対照ｉＮＳＣ−ＧＦＰＲＬを、ｍＣｈｅｒｒｙおよびホタルルシフェラーゼ（ｍＣ−ＦＬ）を発現しているヒトＧＢＭ細胞と異なる比で共培養した。インビボ特性を模倣するために、ＧＢＭとｈ−ｉＮＳＣを混合し、３次元浮遊系で４８時間培養した。蛍光およびＢＬＩにより、ｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲと共培養したＧＢＭの生存率における有意な減少が明らかになった。より高いｈ−ｉＮＳＣ：ＧＢＭ比を使用した場合、この減少は有意に一層大きかった（図４Ｃ）。
【００７０】
＜アポトーシス促進性薬剤のｈ−ｉＮＳＣ分泌は、固形ＧＢＭを減少させる＞
ｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲに基づく治療のインビボ有効性を試験するために、ヒト単独性ＧＢＭに対するｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲ処置の効果を決定した。ｍＣ−ＦＬを発現しているヒトＵ８７  ＧＢＭ細胞を、ｉＮＳＣ−ｓＴＲまたは対照ｉＮＳＣ−ＧＦＰと一緒に頭蓋内移植し（図Ｄ）、腫瘍体積を、連続生物発光イメージングを使用して追跡した。ｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲ処置は、３日目までに腫瘍成長の統計的に有意な減少を誘導し、２４日目までにＧＢＭ体積を５０分の１に低下させることが判明した（図４Ｆ）。加えて、対照動物は、わずか２５日間でＧＢＭ成長のため死んだが、ｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲ−処置動物は、５１日間より長く生存した（図４Ｇ）。マウス脳のＩＨＣ検査は、２週間後にｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲによるＴＲＡＩＬの強力な発現を示した。ＧＢＭ中のｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲは、ネスチンおよびＴｕｊ−１の発現について陽性であり、ＧＦＡＰならびに多能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＲＤ−１６０について陰性であった（図４Ｈ）。
【００７１】
＜殺腫瘍性ｉＮＳＣを使用する悪性および侵襲性ＧＢＭ  ＣＤ１３３＋の有効な処置＞
患者由来ＣＤ１３３＋ヒトＧＢＭ−始原細胞に対するｈ−ｉＮＳＣプロドラッグ／酵素治療の有効性を決定するために、ＧＦＰおよびホタルルシフェラーゼを発現しているＧＢＭ４細胞（ＧＢＭ４−ＧＦＰＦＬ）を、Ｒｌｕｃ、ＲＦＰおよびチミジンキナーゼ（ＴＫ）活性を含む三官能性キメラレポータを発現しているｈ−ｉＮＳＣと共培養して、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫを生成した。単純ヘルペスウイルスにコードされているチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）は、細胞自殺遺伝子治療の原理の最初の証明に使用され、今なお臨床的および実験的適用において最も広く使用されている系の１つである。ＧＢＭ４−ＧＦＰＦＬおよびｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫを、異なる２つのモデルで、３次元浮遊系で共培養した。第１のモデル（図５Ａ）において、２つの細胞型を混合し、細胞生存を蛍光により経時的に監視した（図５Ｂ）。第２のモデルにおいて、２つの細胞型を並べて培養して、確立されたＧＢＭの処置を模倣した（図５Ｃ）。細胞生存を、蛍光により経時的に監視した（図５Ｄ）。両方の場合において、ＧＢＭ生存の有意な減少が経時的に観察され、混合したモデルにおいてより有意であった（図５Ｅ）。
【００７２】
ＧＢＭ４−ＧＦＰＦＬがん細胞をマウスの実質に移植することにより、確立したＧＢＭ４に対するインビボでのｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ治療の有効性を次に決定した。３日後に、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫまたは対照細胞を、確立した腫瘍に直接投与した（図５Ｆ）。連続生物発光イメージングは、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ処置がＧＢＭ４腫瘍の進行を減衰させ、注射２８日後には腫瘍負荷量を、対照と比較して９分の１に減少させたことを示した（図５Ｇ）。ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ処置動物が、対照処置マウスにおけるわずか３７日間と比較して平均６７日間生存したので、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ治療は生存にも有意な延長をもたらした（図５Ｈ）。事後ＩＨＣにより、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ注射による腫瘍体積の有意な減少が検証された（図５Ｉ〜５Ｊ）。全体として、これらの結果は、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ治療が、悪性および侵襲性ＧＢＭに対して有意な治療効果を有し、坦腫瘍マウスの生存を著しく延ばすことを示している。
【００７３】
＜腔内ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ治療は、外科的に切除したＧＢＭの再発を阻害する＞
外科的切除は、ＧＢＭ患者に対する臨床的標準的ケアの一部である。ＧＢＭの再発を効果的に抑制するには、幹細胞の封入が、腔内治療に必要とされることを本発明者等はこれまでに発見した。合成細胞外マトリックス（ｓＥＣＭ）に封入したｈ−ｉＮＳＣ治療の有効性を決定するために、ＧＢＭ−８  ＧＦＰＦＬ（患者由来ＣＤ１３３＋ヒトＧＢＭ−始原細胞）を、ＨＬＡヒドロゲルに包埋したｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫと共培養した（図６Ａ）。ｍＣｈｅｒｒｙ＋ｈ−ｉＮＳＣが、ｓＥＣＭマトリックスから遊走し、３日以内にＧＦＰ＋ＧＢＭ８スフェロイドに定着することが判明した。更に、ｓＥＣＭ／ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ治療は、３日目にＧＢＭ８スフェロイドの生存率を激減させた。
【００７４】
外科的に切除したヒトＧＢＭ患者に対するｈ−ｉＮＳＣ治療を模倣するために、ＧＢＭ切除のマウスモデルにおいて、高度にびまん性の患者由来ＧＢＭ８細胞に対してｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ治療を試験した（図６Ｄ）。ＧＢＭ摘除後に、ＨＬＡ内に包埋したｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫを、外科的切除腔に移植した。連続生物発光イメージングは、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ治療がＧＢＭ８腫瘍の再発を減衰させ、移植１４日後には腫瘍負荷量を、対照と比較して３５０％減少させることを示した（図６Ｅ）。ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ処置動物が、対照処置マウスにおける４６日間と比較して平均５９日間生存したので、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ治療は生存にも有意な延長をもたらした（図６Ｅ）。
【００７５】
［実施例２：ヒト皮膚細胞の迅速な分化転換のための代替培地］
ヒト皮膚細胞の分化転換を、実施例１において上記の通り実行したが、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｎｅｕｒａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍの代わりに以下のＮ−２培地およびＢ−２７培地の１：１混合物で実行した。化学薬品は、示した通りＧｉｂｃｏ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）またはＳｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｔｅｘａｓ）から購入した。
Ｎ−２培地：
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ［登録商標］）
１×Ｎ２補助剤（Ｇｉｂｃｏ［登録商標］）
５μｇ／ｍＬインスリン（Ｓｉｇｍａ）
１ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ［登録商標］）
１ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ［登録商標］）
１００μＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）（Ｇｉｂｃｏ［登録商標］）
１００Ｍ  β−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）
Ｂ−２７培地：
ニューロベーサル培地（Ｇｉｂｃｏ［登録商標］）
１×Ｂ−２７補助剤（Ｇｉｂｃｏ［登録商標］）
２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ［登録商標］）
【００７６】
１：１の混合物に、終濃度５μｇ／ｍＬになるようにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）を添加した。
【００７７】
この培地を、終濃度１０μＭのＳＢ４３１５４２（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）；終濃度１００ｎＭのＬＤＮ１９３１８９（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）；終濃度１０μＭの全トランスレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）；および終濃度３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で補充した。
【００７８】
この培地を使用して、Ｓｏｘ２形質導入と共に使用した場合に、ネスチン＋ｉＮＳＣを生成した。
【００７９】
培地は、インスリン（２５μｇ／ｍＬ）、トランスフェリン（１００μｇ／ｍＬ）、亜セレン酸ナトリウム（３０ｎＭ）および／またはｃＡＭＰ（１００ｎｇ／ｍＬ）を含むように作製することもできる。
【００８０】
［実施例３：脳がんの処置におけるｉＮＳＣの使用］
患者が、脳がん（例えば、膠芽腫）と診断され、手術は、その後直ちに腫瘍を除去する予定である（例えば、１、２または３週間以内）。皮膚パンチを患者から取って、皮膚繊維芽細胞を得る。細胞を、本明細書に教示されるように誘導神経幹細胞へと分化転換させ、更に治療薬および／またはレポート分子を細胞に導入する。手術の間および腫瘍除去後に、導入を受けたｉＮＳＣを、腫瘍を除去して得られた腔内に投与する。ｉＮＳＣは、残ったがん細胞の方へ遊走し、その治療薬／レポート分子の有効導入量を送達する。
【００８１】
前述は、本発明の解説であり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。本発明は、以下の請求項により、そこに含まれる請求項の相当語句で定義される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【国際調査報告】
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