(57)【要約】本開示は、変異型光応答性ポリペプチド、及び光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本開示は、本開示の変異型光応答性ポリペプチドを発現する細胞の活性を制御する方法、デバイス、及びシステムを提供する。【選択図】図４−１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸に対し少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対しＥ１６３Ｓ置換を含むアミノ酸を含み、配列番号１の光活性化ポリペプチドと比較して少なくとも５倍の反応速度増加を示す、変異型光活性化ポリペプチド。
【請求項２】
異種メンブレントラフィックシグナルを含む、請求項１に記載の変異型光活性化ポリペプチド。
【請求項３】
前記異種メンブレントラフィックシグナルが、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮ（配列番号６２）を含む、請求項１に記載の変異型光活性化ポリペプチド。
【請求項４】
小胞体（ＥＲ）輸送シグナルを含む、請求項１に記載の変異型光活性化ポリペプチド。
【請求項５】
前記ＥＲ輸送シグナルが、アミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号６１）を含む、請求項４に記載の変異型光活性化ポリペプチド。
【請求項６】
配列番号３に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の変異型光活性化ポリペプチド。
【請求項７】
配列番号４または配列番号６に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の変異型光活性化ポリペプチド。
【請求項８】
真核細胞内に存在しかつ６００ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光により活性化された場合に、５Ｈｚ〜２０Ｈｚの周波数で活動電位を誘起する、請求項１に記載の変異型光活性化ポリペプチド。
【請求項９】
配列番号１の光活性化ポリペプチドに対して少なくとも１０倍の反応速度増加を示す、請求項１に記載の変異型光活性化ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれか１項に記載の変異型光活性化ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド配列が、真核細胞内で機能する転写制御エレメントに対し作動可能に連結している、請求項１０に記載の核酸。
【請求項１２】
前記転写制御エレメントが構成的プロモーターである、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
前記転写制御エレメントが誘導的プロモーターである、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１４】
前記転写制御エレメントがニューロン特異的プロモーターである、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１５】
請求項１０から１４のいずれか１項に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
【請求項１６】
前記発現ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１３に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１７】
細胞膜内に請求項１から９のいずれか１項に記載の変異型光活性化ポリペプチドを含む哺乳類細胞であって、前記変異型光活性化ポリペプチドが光に応答性であり、前記細胞が約６００ｎｍ〜約７００ｎｍの波長の光で照射されたときに、前記変異型光活性化ポリペプチドが前記細胞内の脱分極性電流を媒介することができる、前記哺乳類細胞。
【請求項１８】
ニューロン細胞である、請求項１７に記載の哺乳類細胞。
【請求項１９】
光刺激に応答して哺乳類細胞の電位を調整する方法であって、細胞の形質膜内に請求項１から９のいずれか１項に記載の変異型光活性化ポリペプチドを含む哺乳類細胞を曝露することを含み、光刺激への曝露に応答して前記細胞の電位が調整される、前記方法。
【請求項２０】
前記細胞が、ニューロン細胞、心臓細胞、または幹細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏである、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｖｏである、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記光が６００ｎｍ〜７００ｎｍの波長を有する、請求項１９から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１から９のいずれか１項に記載の変異型光活性化ポリペプチドを含む哺乳類細胞の活性を調整する方法であって、前記変異型光活性化ポリペプチドを光で活性化させることを含む、前記方法。
【請求項２５】
前記光が６００ｎｍ〜７００ｎｍの波長を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が、ニューロン細胞、心臓細胞、または幹細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｖｏである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞が、遺伝子コード型カルシウム指示物質（ＧＥＣＩ）を発現する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＧＥＣＩが、配列番号７〜２８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が、過分極性光応答性ポリペプチドをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記過分極性光応答性ポリペプチドが、配列番号４２〜４８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
デバイスであって、
ａ）請求項１から９のいずれか１項に記載の変異型光応答性ポリペプチド、請求項１０から１４のいずれか１項に記載の核酸、または請求項１５または１６に記載の組換えベクターを含む容器と、
ｂ）光源と、
を備える、前記デバイス。
【請求項３３】
前記デバイスが移植可能である、請求項３２に記載のデバイス。
【請求項３４】
前記光源が光ファイバーである、請求項３２または請求項３３に記載のデバイス。
【請求項３５】
システムであって、
ａ）請求項１から９のいずれか１項に記載の変異型光応答性ポリペプチド、請求項１０から１４のいずれか１項に記載の核酸、または請求項１５または１６に記載の組換えベクターを含む容器と、
ｂ）ターゲットとする組織構造に対し、移植後、前記ターゲットとする組織構造に隣接する位置において光を送達するように構成された移植可能な光学アプリケーターと、
ｃ）前記移植可能な光学アプリケーターに対し作動可能に結合した光源と、
ｄ）コントローラーと、
ｅ）電源と、
ｆ）移植可能な照度センサーと、を備え、
前記コントローラーにより、前記電源が前記光源に電流を流して、前記移植可能な照度センサーからの出力シグナルに少なくとも部分的に基づいて、移植可能な光アクチュエーターに光子放出をもたらし、
前記移植可能な照度センサーが、前記移植可能な光学アプリケーターにより前記ターゲットとする組織構造に向けられた前記光子の少なくとも一部をキャプチャーするように位置付けられるように構成された、前記システム。
【請求項３６】
前記移植可能な照度センサーが、光起電力セル、フォトダイオード、焦電センサー、フォトレジスター、光導電体、フォトトランジスター、及び光ガルバニセンサーからなる群から選択される、請求項３５に記載のシステム。
【請求項３７】
前記移植可能な入力センサーが、光起電力セル、フォトダイオード、焦電センサー、フォトレジスター、光導電体、フォトトランジスター、及び光ガルバニセンサーからなる群から選択される、請求項３５に記載のシステム。
【請求項３８】
前記ターゲットとする組織構造への光の入力に応答して少なくとも部分的に変動すると考えられる生理学的パラメーターに関連付けられた出力シグナルを産生するように構成された生理学的センサーをさらに備える、請求項３５に記載のシステム。
【請求項３９】
前記生理学的センサーが、筋電センサー、神経電気センサー、脳波センサー、心電センサー、圧力センサー、温度センサー、計量化学センサー、運動センサー、加速度計、ジャイロスコープ、ひずみセンサー、インピーダンスセンサー、及び静電容量センサーからなる群から選択される、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４０】
必要とする個体におけるターゲット細胞または組織に活性化波長の光を送達することを含む処置方法であって、前記ターゲット細胞または組織が、前記ターゲット細胞または前記ターゲット組織中の細胞の形質膜内に請求項１から９のいずれか１項に記載の変異型光活性化ポリペプチドを含み、前記送達が、前記変異型光活性化ポリペプチドを活性化し、前記ターゲット細胞または前記ターゲット組織中の細胞を脱分極する、前記処置方法。
【請求項４１】
前記脱分極が、前記個体における神経系の疾患または障害を処置する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
個体のターゲット組織を照射する方法であって、前記ターゲットとする組織構造が、前記ターゲットとする組織中の細胞の形質膜内に請求項１から９のいずれか１項に記載の変異型光活性化ポリペプチドを含み、前記方法が、
ａ）前記ターゲット組織に対し、移植後、前記ターゲット組織に隣接する位置において光を送達するように構成された移植可能な光学アプリケーターを準備することと、
ｂ）前記移植可能な光学アプリケーターを、光源、コントローラー、電源、及び移植可能な照度センサーに作動可能に結合させることであって、その結果、前記コントローラーにより前記電源が前記光源に電流を流して、前記移植可能な照度センサーからの出力シグナルに少なくとも部分的に基づいて、移植可能な光アクチュエーターに光子放出をもたらす、前記結合させることと、を含み、前記移植可能な照度センサーが、前記移植可能な光アプリケーターにより前記ターゲット組織に向けられた前記光子の少なくとも一部をキャプチャーするように位置付けられる、前記方法。
【請求項４３】
前記移植可能な光学アプリケーターの照度に関連付けられた出力シグナルを、前記ターゲット組織と交差する前の光子放出位置で産生するように構成された、移植可能な入力センサーを提供することをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記コントローラーを前記移植可能な入力センサーに作動可能に結合させて、前記出力信号を前記移植可能な入力センサー及び前記移植可能な照度センサーの両方と比較して、予期しない損失が経験されているかどうかを判定することをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記移植可能な照度センサーが、光起電力セル、フォトダイオード、焦電センサー、フォトレジスター、光導電体、フォトトランジスター、及び光ガルバニセンサーからなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記移植可能な入力センサーが、光起電力セル、フォトダイオード、焦電センサー、フォトレジスター、光導電体、フォトトランジスター、及び光ガルバニセンサーからなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
哺乳類対象における文脈記憶想起を誘発する方法であって、６００ｎｍ〜７００ｎｍの波長を有する光を、前記哺乳類対象におけるニューロンの単シナプス性前頭前野−海馬間突起に送達することを含み、前記突起が、請求項１から９のいずれか１項に記載の変異型光応答性ポリペプチドを含み、光を前記突起に送達することが、前記突起を脱分極し文脈記憶想起を誘発する、前記方法。
【請求項４８】
前記前頭前野−海馬間突起が前頭前野−海馬間突起である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記前頭前野−海馬間突起が前帯状回−海馬間突起である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記突起が海馬の錐体ＣＡ３／ＣＡ１細胞に対するものである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記前帯状回のニューロンが変異型光応答性ポリペプチドを含む、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１５年９月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／２１８，９７１号による利益を主張し、当該仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
テキストファイルとして提供された配列表の参照による組み込み
【０００２】
配列表は、２０１５年９月１４日に作成された１７２ＫＢのサイズのテキストファイル「ＳＴＡＮ−１２５０ＰＲＶ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」として本明細書と共に提供される。このテキストファイルの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
序論
オプトジェネティクスは、様々な波長の光に曝露した際にニューロンのような興奮性細胞の膜電位を変化させるために光活性化タンパク質を使用することを含む。ニューロン内では、膜の脱分極により一過性の電気シグナル活性化（活動電位または「スパイク」とも呼ばれる）がもたらされ、これが神経の情報伝達の基盤となっている。逆に、膜の過分極は、このようなシグナルの抑制をもたらす。ニューロンまたは他の興奮性細胞内で、膜電位を変化させる光活性化タンパク質を発現させることにより、光は、抑制または興奮を誘導するためのトリガー手段として利用することができる。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、変異型光応答性ポリペプチド、及び光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本開示は、本開示の変異型光応答性ポリペプチドを発現する細胞の活性を制御する方法、デバイス、及びシステムを提供する。
【０００５】
本開示は、配列番号１に記載のアミノ酸に対し少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ配列番号１に記載のアミノ酸配列に対しＥ１６３Ｓ置換を含むアミノ酸を含み、配列番号１の光活性化ポリペプチドと比較して少なくとも５倍の反応速度増加を示す、変異型光活性化ポリペプチドを提供する。本開示は、配列番号５に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異型光活性化ポリペプチドを提供する。一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、異種メンブレントラフィックシグナルを含む。一部の場合において、異種メンブレントラフィックシグナルは、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮ（配列番号６２）を含む。一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、小胞体（ＥＲ）輸送シグナルを含む。一部の場合において、ＥＲ輸送シグナルは、アミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号６１）を含む。一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、メンブレントラフィックシグナル及びＥＲ輸送シグナルを含む。一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけての順に以下のものを含む：ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する変異型光応答性ポリペプチド；ｂ）メンブレントラフィックシグナル；及びｃ）ＥＲ輸送シグナル。一部の場合において、本開示の変異型光活性化ポリペプチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合において、本開示の変異型光活性化ポリペプチドは、配列番号４及び配列番号６に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合において、本開示の変異型光活性化ポリペプチドは、真核細胞内に存在しかつ６００ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光により活性化された場合に、５Ｈｚ〜２０Ｈｚの周波数で活動電位を誘起する。一部の場合において、本開示の変異型光活性化ポリペプチドは、配列番号１の光活性化ポリペプチドに対して少なくとも１０倍の反応速度増加を示す。
【０００６】
本開示は、上記または本明細書の他の箇所に記載の変異型光活性化ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、単離された核酸）を提供する。一部の場合において、ヌクレオチド配列は、真核細胞内で機能する転写制御エレメントに対し作用可能に連結している。一部の場合において、転写制御エレメントは、構成的プロモーターである。一部の場合において、転写制御エレメントは、誘導的プロモーターである。一部の場合において、転写制御エレメントは、ニューロン特異的プロモーターである。
【０００７】
本開示は、上記または本明細書の他の箇所に記載の核酸を含む組換え発現ベクターであって、本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組換え発現ベクターを提供する。一部の場合において、当該発現ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターである。
【０００８】
本開示は、上記または本明細書の他の箇所に記載の変異型光活性化ポリペプチドを含む哺乳類細胞であって、変異型光活性化ポリペプチドが細胞膜内に存在し、変異型光活性化ポリペプチドが光に応答性であり、変異型光活性化ポリペプチドが、細胞が赤色光（例えば、約６００ｎｍ〜約７００ｎｍの波長の光）で照射されたときに、細胞内の脱分極性電流を媒介することができる、哺乳類細胞を提供する。一部の場合において、当該細胞は、ニューロン細胞である。
【０００９】
本開示は、光刺激に応答して哺乳類細胞の電位を調整する方法であって、細胞の形質膜内に上記または本明細書の他の箇所に記載の変異型光活性化ポリペプチドを含む哺乳類細胞を曝露することを含み、光刺激への曝露に応答して細胞の電位が調整される、方法を提供する。一部の場合において、当該細胞は、ニューロン細胞である。一部の場合において、当該細胞は、心臓細胞である。一部の場合において、当該細胞は、幹細胞である。一部の場合において、当該細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏである。一部の場合において、当該細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏである。一部の場合において、光は、６００ｎｍ〜７００ｎｍの波長を有する。
【００１０】
本開示は、上記または本明細書の他の箇所に記載の変異型光活性化ポリペプチドを含む哺乳類細胞の活性を調整する方法であって、変異型光活性化ポリペプチドを光（例えば、赤色光）で活性化させること、を含む方法を提供する。一部の場合において、光は、６００ｎｍ〜７００ｎｍの波長を有する。一部の場合において、当該細胞は、ニューロン細胞、心臓細胞、または幹細胞である。一部の場合において、当該細胞はｉｎ  ｖｉｖｏである。一部の場合において、当該細胞は、遺伝子コード型カルシウム指示指示物質（ＧＥＣＩ）を発現する。一部の場合において、ＧＥＣＩは、配列番号７〜２８に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合において、細胞は、過分極性光応答性ポリペプチドをさらに含む。一部の場合において、過分極性光応答性ポリペプチドは、配列番号４２〜４８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１１】
本開示は、ａ）上記もしくは本明細書の他の箇所に記載の変異型光応答ポリペプチド、変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、または変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクターを含む容器と、ｂ）光源と、を備えるデバイスを提供する。一部の場合において、当該デバイスは移植可能である。一部の場合において、当該光源は光ファイバーである。
【００１２】
本開示は、ａ）上記もしくは本明細書の他の箇所に記載の変異型光応答性ポリペプチド、変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、または変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクターを含む容器と、ｂ）ターゲットとする組織構造に対し、移植後、ターゲットとする組織構造に隣接する位置において光を送達するように構成された、移植可能な光学アプリケーターと、ｃ）移植可能な光学アプリケーターに対し作動可能に結合した光源と、ｄ）コントローラーと、ｅ）電源と、ｆ）移植可能な照度センサーと、を備えるシステムであって、コントローラーにより電源が光源に電流を流して、移植可能な照度センサーからの出力シグナルに少なくとも部分的に基づいて、移植可能な光アクチュエーターに光子放出をもたらし、移植可能な照度センサーが、移植可能な光アプリケーターにより、ターゲットとする組織に向けられた光子の少なくとも一部をキャプチャーするように位置付けられるように構成された、システムを提供する。一部の場合において、移植可能な照度センサーは、光起電力セル、フォトダイオード、焦電センサー、フォトレジスター、光導電体、フォトトランジスター、及び光ガルバニセンサーからなる群から選択される。一部の場合において、移植可能な入力センサーは、光起電力セル、フォトダイオード、焦電センサー、フォトレジスター、光導電体、フォトトランジスター、及び光ガルバニセンサーからなる群から選択される。一部の場合において、当該システムは、ターゲットとする組織構造への光の入力に応答して少なくとも部分的に変動すると考えられる生理学的パラメーターに関連付けられた出力シグナルを産生するように構成された生理学的センサーを含む。一部の場合において、生理学的センサーは、筋電センサー、神経電気センサー、脳波センサー、心電センサー、圧力センサー、温度センサー、計量化学センサー、動作センサー、加速度計、ジャイロスコープ、ひずみセンサー、インピーダンスセンサー、及び静電容量センサーからなる群から選択される。
【００１３】
本開示は、必要とする個体におけるターゲット細胞またはターゲット組織に活性化波長の光を送達することを含む処置方法であって、ターゲット細胞またはターゲット組織が、ターゲット細胞またはターゲット組織中の細胞の形質膜内に上記または本明細書の他の箇所に記載の変異型光活性化ポリペプチドを含み、送達が、変異型光活性化ポリペプチドを活性化し、ターゲット細胞またはターゲット組織中の細胞を脱分極する、処置方法を提供する。一部の場合において、前記脱分極は、個体における神経系の疾患または障害を処置する。
【００１４】
本開示は、個体のターゲット組織を照射する方法であって、ターゲットとする組織構造が、ターゲットとする組織中の細胞の形質膜内に上記または本明細書の他の箇所に記載の変異型光応答性ポリペプチドを含み、当該方法が、ａ）ターゲット組織に対し、移植後、ターゲット組織に隣接する位置において光を送達するように構成された移植可能な光学アプリケーターを準備することと、ｂ）移植可能な光学アプリケーターを、光源、コントローラー、電源、及び移植可能な照度センサーに作動可能に結合させることであって、その結果、コントローラーにより電源が光源に電流を流して、移植可能な照度センサーからの出力シグナルに少なくとも部分的に基づいて、移植可能な光アクチュエーターに光子放出をもたらす、結合させることとを含み、移植可能な照度センサーが、移植可能な光アプリケーターによりターゲット組織に向けられた光子の少なくとも一部をキャプチャーするように位置付けられる、方法を提供する。一部の場合において、当該方法は、移植可能な光学アプリケーターの照度に関連付けられた出力シグナルを、ターゲット組織と交差する前の光子放出位置で産生するように構成された、移植可能な入力センサーを提供することをさらに含む。一部の場合において、当該方法は、コントローラーを移植可能な出力センサーに作動可能に結合させて、出力信号を移植可能な入力センサー及び移植可能な照度センサーの両方と比較して、予期しない損失が経験されているかどうかを判定することをさらに含む。一部の場合において、移植可能な照度センサーは、光起電力セル、フォトダイオード、焦電センサー、フォトレジスター、光導電体、フォトトランジスター、及び光ガルバニセンサーからなる群から選択される。一部の場合において、移植可能な入力センサーは、光起電力セル、フォトダイオード、焦電センサー、フォトレジスター、光導電体、フォトトランジスター、及び光ガルバニセンサーからなる群から選択される。
【００１５】
本開示は、哺乳類対象における文脈記憶想起を誘発する方法であって、６００ｎｍ〜７００ｎｍの波長を有する光を、哺乳類対象におけるニューロンの単シナプス性前頭前野−海馬間突起に送達することを含み、当該突起が上記または本明細書の他の箇所に記載の変異型光応答性ポリペプチドを含み、当該突起に光を送達することが当該突起を脱分極し文脈記憶想起を誘発する、方法を提供する。一部の場合において、当該前頭前野−海馬間突起は、前頭前野−海馬間突起である。一部の場合において、当該前頭前野−海馬間突起は、前帯状回−海馬間突起である。一部の場合において、当該突起は、海馬の錐体ＣＡ３／ＣＡ１細胞に対するものである。一部の場合において、前帯状回のニューロンは変異型光応答性ポリペプチドを含む。本開示は、文脈記憶想起を調整する方法であって、光を、哺乳類対象におけるニューロンの単シナプス性前頭前野−海馬間突起に送達することを含み、前記突起が、ｉ）第１の活性化波長の光（例えば、赤色光）を当該突起に送達することが当該突起を脱分極し文脈記憶想起を誘発する上記または本明細書の他の箇所に記載の変異型光応答性ポリペプチドと、ｉｉ）第２の活性化波長の光を当該突起に送達することが文脈記憶想起を低減する（例えば、抑制する）過分極性オプシンとを含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１−１】図１Ａから図１Ｅは、ｂＲｅａＣｈＥ−Ｓの設計及び特徴づけを示す。
【図１−２】同上。
【図２】図２Ａから図２Ｂは、内側前頭前皮質の注入部位付近の細胞体におけるオプシン発現及び扁桃体の下流の軸索線維におけるオプシン発現の共焦点画像を示す。
【図３−１】図３Ａから図３ＦはｂＲｅａｃｈＥＳの全細胞記録分析を示す。
【図３−２】同上。
【図４−１】図４Ａから図４ＦはＲｅａＣｈＲ及び変異型光応答性ポリペプチド（例えば、ｂＲｅａｃｈＥＳ）のアミノ酸配列を提示する。
【図４−２】同上。
【図５−１】図５Ａから図５Ｓはシングル蛍光タンパク質遺伝子コード型カルシウム指示物質のアミノ酸配列を提示する。
【図５−２】同上。
【図５−３】同上。
【図５−４】同上。
【図５−５】同上。
【図５−６】同上。
【図５−７】同上。
【図５−８】同上。
【図５−９】同上。
【図６−１】図６Ａから図６Ｃはマルチ蛍光タンパク質遺伝子コード型カルシウム指示物質のアミノ酸配列を提供する。
【図６−２】同上。
【図７−１】図７Ａから図７Ｕは様々な変異型光応答性ポリペプチドのアミノ酸配列を提供する。
【図７−２】同上。
【図７−３】同上。
【図７−４】同上。
【図７−５】同上。
【図７−６】同上。
【図７−７】同上。
【図８】光刺激システムの第１の例を提供する。
【図９】光刺激システムの第２の例を提供する。
【図１０】光刺激システムの第３の例を提供する。
【図１１−１】図１１Ａから図１１ＪはＡＣ−ＣＡ単シナプス性突起の特徴づけを示す。
【図１１−２】同上。
【図１２】図１２Ａから図１２ＣはＡＣ−ＣＡ突起の解剖学的特徴づけを示す。
【図１３−１】図１３Ａから図１３ＧはＡＣ−ＣＡ突起のオプトジェネティクス的操作を示す。
【図１３−２】同上。
【図１３−３】同上。
【図１３−４】同上。
【図１３−５】同上。
【図１４−１】図１４Ａから図１４ＬはＡＣ−ＣＡ突起が記憶想起に及ぼす影響を示す。
【図１４−２】同上。
【図１４−３】同上。
【図１４−４】同上。
【図１４−５】同上。
【図１４−６】同上。
【図１４−７】同上。
【図１４−８】同上。
【図１４−９】同上。
【図１５−１】図１５Ａから図１５Ｌは記憶形成が、文脈に相当する高度に関連付けられたＨＣニューロンを生成することを示す。
【図１５−２】同上。
【図１５−３】同上。
【図１５−４】同上。
【図１６−１】図１６Ａから図１６ＦはＧＣａＭＰ６ｍ発現ＣＡ３ニューロンの生理学的特性を示す。
【図１６−２】同上。
【図１７−１】図１７Ａから図１７Ｆは記憶想起中に、ＡＣ−ＣＡ突起がＨＣニューロンを優先的に動員することを示す。
【図１７−２】同上。
【図１７−３】同上。
【図１７−４】同上。
【図１８−１】図１８Ａから図１８Ｆは３Ｄ海馬ボリュームにおける神経アンサンブルのリアルタイムイメージングを示す。
【図１８−２】同上。
【図１８−３】同上。
【図１９−１】図１９Ａから図１９Ｊは想起中の海馬における恐怖及びニュートラルのネットワークの細胞集団及びグラフ特性を示す。
【図１９−２】同上。
【図１９−３】同上。
【図２０Ａ】恐怖対ニュートラルの文脈で出現する恐怖文脈定義のＨＣニューロンにおける機能的関係を示す。
【図２０Ｂ】同上。
【図２０Ｃ】同上。
【図２１】図２１Ａから図２１ＣはＨＣニューロンの空間的及び時間的組織化を示す。
【図２２】図２２Ａから図２２Ｅは高速非負デコンボリューション（ｆａｓｔ  ｎｏｎ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）及び相関ペア解析（ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  ｐａｉｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いた事象発生の推定を示す。
【図２３−１】図２３Ａから図２３Ｅは恐怖対ニュートラルの文脈における集団軌跡のＰＣＡを示す。
【図２３−２】同上。
【図２４−１】図２４Ａから図２４ＬはｂＲｅａＣｈＥ−Ｓの設計及び特徴づけを示す。
【図２４−２】同上。
【図２４−３】同上。
【図２４−４】同上。
【００１７】
定義
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、及び「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、またこれらの用語は、利用される文脈に応じてそれぞれの複数形も含み得る。これらの用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指し、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）もしくはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）、またはこれらのアナログのいずれかである。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有し得、また既知または未知の任意の機能を実行し得る。以下に挙げるのは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義される遺伝子座（単数または複数）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、枝分かれポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ（Ａ、Ｂ、及びＺ構造）、ＰＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ＴＮＡ（トレオース核酸）、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。ＬＮＡ（インアクセシブルＲＮＡと呼ばれることも多い）は、修飾ＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’及び４’炭素を接続する付加的な架橋で修飾される。この架橋は、Ａ型のＤＮＡまたはＲＮＡでしばしば見られる３’−エンド構造の立体配座におけるリボースを「ロック」するものであり、熱安定性を顕著に向上させることができる。
【００１８】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。このポリマーは、直鎖状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸により中断されてもよい。また、これらの用語は、修飾されたアミノ酸ポリマーも含み、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または標識構成要素とのコンジュゲートのような任意の他の操作を含む。本明細書で使用する「アミノ酸」という用語は、天然及び／または非天然もしくは合成のアミノ酸を指し、これにはグリシン及びＤ型またはＬ型両方の光学異性体、ならびにアミノ酸アナログ及びペプチド模倣体が含まれる。
【００１９】
本明細書で使用する、２つの核酸配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」とは、２つの配列において、特定の比較ウインドウを介して最大に一致するようにアライメントした場合に同じである残基の特定のパーセンテージについて言及するものであり、配列比較アルゴリズムまたは目視検査により測定される。配列同一性のパーセンテージがタンパク質に関して使用される場合、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換による相違であることが多い点を認識されたい。保存的アミノ酸置換の場合、アミノ酸残基は、類似する化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基の代わりに用いられるため、分子の機能的特性を変化させない。配列が保存的置換において相違する場合、パーセント配列同一性は、置換の保存的性質に関して補正するように上方修正することができる。このような保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言う。この調整のために任意の好適な手段を使用することができる。この調整は、保存的置換を完全なミスマッチとしてではなく部分的ミスマッチとしてスコア付けすることによるパーセンテージ配列同一性の増加を含み得る。したがって、例えば、同一のアミノ酸に１のスコアを付ける場合、非保存的置換にはゼロのスコアを付け、保存的置換にはゼロから１の間のスコアを付ける。保存的置換のスコア付けは、例えばＰＣ／ＧＥＮＥのプログラム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．）に実装されるように算出される。
【００２０】
本明細書で使用する「配列同一性のパーセンテージ」とは、２つの最適アラインメント配列を比較ウインドウを介して比較することにより決定する値を意味し、このとき比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適アラインメントのための（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。パーセンテージの算出は、両方の配列において同一な核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウインドウにおける位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより、行われる。
【００２１】
比較のための配列アラインメントには任意の好適な方法が用いられ得る。したがって、任意の２つの配列間におけるパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて遂行され得る。このような数学的アルゴリズムの例には、以下のものがある：参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ，４：１１（１９８８）のアルゴリズム；参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２（１９８１）の局所ホモロジーアルゴリズム；参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，４８：４４３（１９７０）のホモロジーアラインメントアルゴリズム；参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法；参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４（１９９０）のアルゴリズム；参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＫａｒｈｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３（１９９３）における修正版。
【００２２】
これらの数学的アルゴリズムのコンピューター実装は、配列同一性を決定するための配列比較に利用することができる。このような実装としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ＰＣ／ＧｅｎｅプログラムにおけるＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能）；ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）ならびにＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン８におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡから入手可能）。これらのプログラムを用いたアラインメントは、デフォルトパラメーターを用いて実施することができる。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムについては、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，７３：２３７（１９８８），Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１（１９８９）；Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：１０８８１（１９８８）；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＡＢＩＯＳ，８：１５５（１９９２）；及びＰｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４：３０７（１９９４）により十分に説明されており、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＡＬＩＧＮプログラムは、上記にあるＭｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズムに基づいている。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２１５：４０３（１９９０）；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９（１９９０）のＢＬＡＳＴプログラムは、上記にあるＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズムに基づいている。
【００２３】
ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ；ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を通じて公開されている。
【００２４】
アミノ酸配列におけるアミノ酸置換は、参照アミノ酸配列に対して「保存的」であっても「非保存的」であってもよく、このような置換されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによりコードされたものであってもそうでなくてもよい。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基を、化学的に類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換える（すなわち、塩基性の側鎖を所持するアミノ酸を、塩基性の側鎖を有する別のアミノ酸で置換する）置換である。「非保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基を、化学的に異なった側鎖を有するアミノ酸残基で置き換える（すなわち、塩基性の側鎖を有するアミノ酸を、芳香族の側鎖を有するアミノ酸で置換する）置換である。標準的な（コードされた）２０種のアミノ酸は、側鎖の化学的特性に基づいた化学ファミリーに分類される。これらのファミリーには、塩基性の側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性の側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、極性無電荷側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族基を有する側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。
【００２５】
「遺伝子修飾」という用語は、細胞内に異種核酸（例えば、その細胞にとって外因的な核酸）を導入した後にその細胞で誘発される、永続的または過渡的な遺伝子変化を指す。遺伝子変化（「修飾」）は、異種核酸を宿主細胞のゲノムに組み込むか、または異種核酸を染色体外要素として一時的もしくは安定的に維持することにより、遂行することができる。細胞が真核細胞である場合、永続的な遺伝子変化は、細胞のゲノム内に核酸を導入することにより達成することができる。遺伝子修飾に適した方法としては、ウイルス感染、トランスフェクション、コンジュゲート、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿法、直接微量注入などが挙げられる。
【００２６】
本明細書で使用する「プロモーター」という用語は、遺伝子の発現（転写）を指示するＤＮＡの配列を指す。プロモーターは、原核生物遺伝子または真核生物遺伝子の発現（転写）を指示することができる。プロモーターは、誘導作用物質に応答して転写を開始する「誘導的（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）」な場合もあれば、対照的に、誘導作用物質が転写の割合を調節しない「構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）」な場合もある。プロモーターは、特定の組織タイプ（単数または複数）における作動可能に連結したコード領域の転写でのみ活性であるように、組織特異的または組織優先的な様式で調節され得る。
【００２７】
「作動可能に連結した」という用語は、調節配列とコード配列との間の機能的な連結を指す。したがって、そのように記載された諸構成要素は、意図された様式で機能することが可能な関係にある。例えば、コード配列をプロモーターの調節制御下に置くことは、コード配列の発現がプロモーターによって制御されるようにコード配列を位置付けることを意味する。
【００２８】
本明細書で使用する「個体」、「対象」、または「患者」とは、ヒトを含めた哺乳類であり得る。哺乳類としては、有蹄動物、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、非ヒト霊長類、ウサギ目動物、及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられるが、これらに限定されない。一態様において、個体とは、ヒトである。別の態様において、個体とは、非ヒト哺乳類である。
【００２９】
本明細書で使用する「処置」または「処置する」とは、有益なまたは望ましい結果（臨床的結果を含む）を得ることを指す。本開示の目的に関して、有益なまたは望ましい臨床的結果としては、以下のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない：疾患に起因する症状の減少（有害な症状の改善）、疾患にかかっている者のクオリティーオブライフの上昇、疾患の処置に要する他の医薬品における用量の減少、疾患進行の遅延、及び／または疾患を有する個体の生存期間の延長。
【００３０】
本発明についてさらに記載する前に、本発明が、記載される特定の実施形態に限定されないということを理解されたい。というのも、そのような実施形態は、当然ながら変動し得るためである。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、本明細書の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになるため、こうした用語が限定的であるようには意図されていないことも理解されたい。
【００３１】
値の範囲が示されている場合、その間に存在する各値（その範囲の上限と下限との間において、文脈による別段の指示が明確にない限り、下限の１０分の１の単位まで）、及びその記述された値または間に存在する値は、本発明に含まれることを理解されたい。これらのより小さな範囲における上限及び下限は、独立してその小さな範囲に含めることができ、これらは本発明にも含まれ、記述範囲における任意の特定的に除外された制限を受ける。記述範囲が上限下限の一方または両方を含む場合、この含まれた上限下限の一方または両方を除外する範囲も、本発明に含まれる。
【００３２】
別途定義されない限り、本明細書で使用する技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明の実施または試験を行う際には、本明細書に記載の方法及び材料に類似したまたは同等の、任意の方法及び材料を使用することもできるが、ここでは好ましい方法及び材料について説明する。本明細書で言及する全ての刊行物は、これらの刊行物の引用に関連した方法及び／または材料を開示及び説明するため、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３３】
本明細書及び付属の請求項で使用する単数形「ａ（１つの、１種の）」、「ａｎ（１つの、１種の）」、及び「ｔｈｅ（その、当該）」は、文脈による別段の明確な定めがない限り、複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「１つの光活性化ポリペプチド（ａ  ｌｉｇｈｔ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」と言及した場合、複数のこのようなポリペプチドが含まれ、「当該ＧＥＣＩ（ｔｈｅ  ＧＥＣＩ）」と言及した場合、１つ以上のＧＥＣＩ及び当業者に公知の相当物への言及が含まれる、などとなる。さらに、請求項がいかなる任意選択の要素も除外するように立案され得ることにも留意されたい。そのため、本記載は、請求項の要素の列挙に関連して、「単に（ｓｏｌｅｌｙ）」、「〜のみ（ｏｎｌｙ）」のような排他的用語の使用、または「否定的な」限定の使用のための先行的記載としての役目を果たすよう意図されている。
【００３４】
本発明のあるいくつかの特徴は、明快にするために別々の実施形態の文脈で記載されているが、これらを組み合わせて単一の実施形態で提供してもよいことを理解されたい。逆に、本発明の様々な特徴は、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で記載されているが、これらは別々に提供することも任意の好適な部分組合せで提供することもできる。本発明に関係する実施形態における全ての組合せは、本発明が明確に包含するものであり、また、この全ての組合せは、あらゆる組合せが個別かつ明示的に開示されているかのごとく、本明細書で開示されている。加えて、様々な実施形態及びその要素における全ての部分組合せも、本発明が明確に包含するものであり、また、この全ての部分組合せは、あらゆるこのような部分組合せが個別かつ明示的に本明細書で開示されているかのごとく、本明細書で開示されている。
【００３５】
本明細書で論じられている刊行物は、単に本願の出願日より前にそれらが開示されていたために提供されている。本明細書のいかなる内容も、本発明が先発明によってこのような刊行物に先行する権利を有しないことを承認するものとして解釈すべきではない。さらに、示される公開日は実際の公開日と異なる可能性があり、実際の公開日は独立して確認する必要があり得る。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本開示は、変異型光応答性ポリペプチド、及び光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本開示は、本開示の変異型光応答性ポリペプチドを発現する細胞の活性を制御する方法、デバイス、及びシステムを提供する。
【００３７】
変異型光活性化ポリペプチド
本開示は、変異型光応答性ポリペプチドを提供する。本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、「変異型光活性化ポリペプチド」とも称される。本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、真核細胞（例えば、哺乳類細胞；例えば、ニューロン細胞のような興奮性細胞）で発現し、活性化波長の光に曝露されたときに、細胞膜の脱分極を誘発する。
【００３８】
本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、配列番号１の光活性化ポリペプチドと比較して少なくとも５倍の反応速度増加を示す。配列番号１（図１Ａに示される）の光活性化ポリペプチドは、ＲｅａＣｈＲと称される。ＲｅａＣｈＲのチャネル閉鎖は、培養ラット海馬ニューロンにおける測定で、６８２ミリ秒（ｍｓ）の単一指数関数的反応速度のタウ値を有する。これに対し、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、培養ラット海馬ニューロンで測定した場合に、３００ｍｓ未満、２００ｍｓ未満、または１００ｍｓ未満のタウ値を有するチャネル閉鎖を示す。本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、ＲｅａＣｈＲのチャネル閉鎖の反応速度よりも少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも７倍、少なくとも１０倍、少なくとも１３倍、少なくとも１５倍速いチャネル閉鎖の反応速度を有するチャネル閉鎖を示す。
【００３９】
例えば、一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、培養ラット海馬ニューロンで測定した場合に、約２５ｍｓ〜約５０ｍｓ、約５０ｍｓ〜約７５ｍｓ、約７５ｍｓ〜約１００ｍｓ、約１００ｍｓ〜約１２５ｍｓ、約１２５ｍｓ〜約１５０ｍｓ、約１５０ｍｓ〜約２００ｍｓ、約１５０ｍｓ〜約２００ｍｓ、約２００ｍｓ〜約２５０ｍｓ、または約２５０ｍｓ〜約３００ｍｓのタウ値を有するチャネル閉鎖を示す。一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、培養ラット海馬ニューロンで測定した場合に、約２５ｍｓ〜約５０ｍｓ、約５０ｍｓ〜約７５ｍｓ、または約７５ｍｓ〜約１００ｍｓのタウ値を有するチャネル閉鎖を示す。一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、培養ラット海馬ニューロンで測定した場合に、約４０ｍｓ〜約６０ｍｓのタウ値を有するチャネル閉鎖を示す。
【００４０】
本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、例えば、哺乳類ニューロンで発現させたとき、活性化波長の光に曝露されたときに、ＲｅａＣｈＲにより誘起される活動電位の周波数より高い周波数で活動電位を誘起する。ＲｅａＣｈＲは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養ラット海馬ニューロンにおいて、１〜２ヘルツ（Ｈｚ）の周波数でニューロン発火を誘発する（活動電位を誘起する）。本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、活性化波長の光に曝露されたときに、変異型光応答性ポリペプチドを発現する細胞において、２Ｈｚ超、５Ｈｚ超、１０Ｈｚ超、１５Ｈｚ超、または２０Ｈｚ超の周波数で活動電位を誘起することができる。例えば、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、活性化波長の光に曝露されたときに、３Ｈｚ〜５Ｈｚ、５Ｈｚ〜７Ｈｚ、７Ｈｚ〜１０Ｈｚ、１０Ｈｚ〜１２Ｈｚ、１２Ｈｚ〜１５Ｈｚ、１５Ｈｚ〜１７Ｈｚ、１７Ｈｚ〜２０Ｈｚ、または２０Ｈｚ超の周波数で活動電位を誘起することができる。一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、活性化波長の光に曝露されたときに、１５Ｈｚ〜２０Ｈｚの周波数で活動電位を誘起することができる。
【００４１】
本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、活性化波長の光、例えば、６００ｎｍ〜７００ｎｍの波長を有する光により活性化され、例えば、６００ｎｍ〜６２５ｎｍ、６２５ｎｍ〜６５０ｎｍ、６５０ｎｍ〜６７５ｎｍ、または６７５ｎｍ〜７００ｎｍの波長を有する光により活性化される。一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、６２５ｎｍ〜６５０ｎｍの波長を有する光により活性化される。一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、６３０ｎｍの波長を有する光により活性化される。
【００４２】
本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところの１６３位にグルタミン酸−セリン置換を含む。
【００４３】
一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸５２〜３４５に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところの１６３位にグルタミン酸−セリン置換を含む。
【００４４】
一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２に記載され図４Ｂで示されるアミノ酸配列のナンバリングに基づくところの１６３位にセリンを含む。
【００４５】
一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列のシグナル配列に対し修飾が行われる。例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列のシグナル配列は、ＭＶＳＲＲＰＷＬＬＡＬＡＬＡＶＡＬＡＡＧＳＡＧＡＳＴＧＳＤＡＴＶＰＶＡＴＱＤＧＰＤＹＶＦＨＲＡＨＥＲ（配列番号５０）である。一部の場合において、シグナル配列は別のシグナル配列に置き換えられる。例えば、シグナル配列は、ＭＤＹＧＧＡＬＳＡＶＧ（配列番号５１）であってもよい。したがって、例えば、一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、配列番号３に記載され図４Ｃに示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところの１２３位にセリンを有する。
【００４６】
一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、配列番号５に記載され図４Ｅに示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところの１１２位にセリンを有する。一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、配列番号５に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところの１１２位にセリンを有し、以下のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または全てを含む：ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸４８位におけるＶａｌ；ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸７９位におけるＧｌｕ；ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸９０位におけるＧｌｕ；ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸１０６位におけるＶａｌ；ｅ）配列番号５に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸１２３位におけるＨｉｓ；ｆ）配列番号５に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸２３１位におけるＰｒｏ；ｇ）配列番号５に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸２３５位におけるＡｌａ；及びｈ）配列番号５に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸２４７位におけるＡｓｎ。一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、配列番号５に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところの１１２位にセリンを有し、以下のものを含む：ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸４８位におけるＶａｌ；ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸７９位におけるＧｌｕ；ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸９０位におけるＧｌｕ；ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸１０６位におけるＶａｌ；ｅ）配列番号５に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸１２３位におけるＨｉｓ；ｆ）配列番号５に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸２３１位におけるＰｒｏ；ｇ）配列番号５に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸２３５位におけるＡｌａ；及びｈ）配列番号５に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸２４７位におけるＡｓｎ。一部の場合において、変異型光応答性ポリペプチドは、シグナル配列（例えば、ＭＤＹＧＧＡＬＳＡＶＧ（配列番号５１）または他の好適なシグナル配列）を含む。一部の場合において、変異型光応答性ポリペプチドは、ＥＲ輸送シグナルを含む。一部の場合において、変異型光応答性ポリペプチドは、ＥＲ輸送シグナル及びメンブレントラフィックシグナルを含む。
【００４７】
一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、配列番号６に記載され図４Ｆに示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところの１１２位にセリンを有する。一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、配列番号６に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところの１１２位にセリンを有し、以下のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または全てを含む：ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸４８位におけるＶａｌ；ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸７９位におけるＧｌｕ；ｃ）配列番号６に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸９０位におけるＧｌｕ；ｄ）配列番号６に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸１０６位におけるＶａｌ；ｅ）配列番号６に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸１２３位におけるＨｉｓ；ｆ）配列番号６に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸２３１位におけるＰｒｏ；ｇ）配列番号６に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸２３５位におけるＡｌａ；及びｈ）配列番号６に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸２４７位におけるＡｓｎ。一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、配列番号６に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところの１１２位にセリンを有し、以下のものを含む：ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸４８位におけるＶａｌ；ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸７９位におけるＧｌｕ；ｃ）配列番号６に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸９０位におけるＧｌｕ；ｄ）配列番号６に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸１０６位におけるＶａｌ；ｅ）配列番号６に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸１２３位におけるＨｉｓ；ｆ）配列番号６に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸２３１位におけるＰｒｏ；ｇ）配列番号６に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸２３５位におけるＡｌａ；及びｈ）配列番号６に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸２４７位におけるＡｓｎ。
【００４８】
一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところの１６３位にグルタミン酸−セリン置換を含む。一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところの１６３位にグルタミン酸−セリン置換を含み、以下のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または全てを含む：ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸９９位におけるＶａｌ；ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸１３０位におけるＧｌｕ；ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸１４１位におけるＧｌｕ；ｄ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸１５７位におけるＶａｌ；ｅ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸１７４位におけるＨｉｓ；ｆ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸２８２位におけるＰｒｏ；ｇ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸２８６位におけるＡｌａ；及びｈ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸２９８位におけるＡｓｎ。一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところの１６３位にグルタミン酸−セリン置換を含み、以下のものを含む：配列番号１に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸９９位におけるＶａｌ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸１３０位におけるＧｌｕ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸１４１位におけるＧｌｕ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸１５７位におけるＶａｌ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸１７４位におけるＨｉｓ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸２８２位におけるＰｒｏ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸２８６位におけるＡｌａ、及び配列番号１に記載のアミノ酸配列のナンバリングに基づくところのアミノ酸２９８位におけるＡｓｎ。
【００４９】
本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、シグナルペプチド、小胞体（ＥＲ）輸送シグナル、メンブレントラフィックシグナル、及びＮ末端ゴルジ輸送シグナルからなる群から選択される、１つ以上のアミノ酸配列モチーフに融合することができる。哺乳類細胞の形質膜へのタンパク質運搬を強化する１つ以上のアミノ酸配列モチーフは、細胞の形質膜におけるタンパク質の最適な発現及び／または局在化を促進するために、タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはＮ及びＣ末端の両方に融合することができる。任意選択により、本開示の変異型光応答性ポリペプチド及び１つ以上のアミノ酸配列モチーフは、リンカーにより分離していてもよい。一部の実施形態において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、細胞の形質膜へのタンパク質運搬を強化するトラフィッキングシグナル（ｔｓ）の付加により修飾されてもよい。一部の実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ヒトの内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来し得る。他の実施形態において、トラフィッキングシグナルは、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５２）を含み得る。一部の実施形態において、異種メンブレントラフィックシグナルは、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮ（配列番号６２）を含み得る。
【００５０】
使用に適したトラフィッキング配列は、このようなヒトの内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のトラフィッキング配列（例えば、ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５２））のアミノ酸配列に対し、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００５１】
トラフィッキング配列は、約１０アミノ酸〜約５０アミノ酸の長さ、例えば、約１０アミノ酸〜約２０アミノ酸、約２０アミノ酸〜約３０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約４０アミノ酸、または約４０アミノ酸〜約５０アミノ酸の長さを有し得る。
【００５２】
使用に適したシグナル配列は、以下に挙げるもののうちの１つのようなアミノ酸配列に対し、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み得る：
【００５３】
１）ｈＣｈＲ２のシグナルペプチド（例えば、ＭＤＹＧＧＡＬＳＡＶＧＲＥＬＬＦＶＴＮＰＶＶＶＮＧＳ（配列番号５３））；
【００５４】
２）ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ２サブユニットシグナルペプチド（例えば、ＭＡＧＨＳＮＳＭＡＬＦＳＦＳＬＬＷＬＣＳＧＶＬＧＴＥＦ（配列番号５４））；
【００５５】
３）ニコチン性アセチルコリン受容体シグナル配列（例えば、ＭＧＬＲＡＬＭＬＷＬＬＡＡＡＧＬＶＲＥＳＬＱＧ（配列番号５５））；及び
【００５６】
４）ニコチン性アセチルコリン受容体シグナル配列（例えば、ＭＲＧＴＰＬＬＬＶＶＳＬＦＳＬＬＱＤ（配列番号５６））；
【００５７】
シグナル配列は、約１０アミノ酸〜約５０アミノ酸の長さ、例えば、約１０アミノ酸〜約２０アミノ酸、約２０アミノ酸〜約３０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約４０アミノ酸、または約４０アミノ酸〜約５０アミノ酸の長さを有し得る。
【００５８】
小胞体（ＥＲ）輸送配列は、本開示の変異型光応答性ポリペプチドとの使用に適しており、これには例えば、ＶＸＸＳＬ（Ｘは任意のアミノ酸である）（例えば、ＶＫＥＳＬ（配列番号５７）；ＶＬＧＳＬ（配列番号５８）など）；ＮＡＮＳＦＣＹＥＮＥＶＡＬＴＳＫ（配列番号５９）；ＦＸＹＥＮＥ（配列番号６０）（Ｘは任意のアミノ酸である）、例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号６１）；などが含まれる。ＥＲ輸送配列は、約５アミノ酸〜約２５アミノ酸の長さ、例えば、約５アミノ酸〜約１０アミノ酸、約１０アミノ酸〜約１５アミノ酸、約１５アミノ酸〜約２０アミノ酸、または約２０アミノ酸〜約２５アミノ酸の長さを有し得る。
【００５９】
本発明の変異型光応答性ポリペプチドは、１種以上の追加的ポリペプチドをさらに含むことができる。例えば、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、リンカー、エピトープタグ、蛍光タンパク質、精製を容易にするペプチド、切断可能なリンカーペプチドなどを含むことができる。
【００６０】
好適な蛍光タンパク質としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：緑色蛍光（ＧＦＰ）またはその変異体、ＧＦＰの青色蛍光変異体（ＢＦＰ）、ＧＦＰのシアン蛍光変異体（ＣＦＰ）、ＧＦＰの黄色蛍光変異体（ＹＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、高感度ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、高感度ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、エメラルド、トパーズ（ＴＹＦＰ）、ビーナス、シトリン、ｍシトリン、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ｍＣＦＰｍ、セルリアン、Ｔ−サファイア、ＣｙＰｅｔ、ＹＰｅｔ、ｍＫＯ、ＨｃＲｅｄ、ｔ−ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄモノマー、Ｊ−Ｒｅｄ、ダイマー２、ｔ−ダイマー２（１２）、ｍＲＦＰ１、ポシロポリン（ｐｏｃｉｌｌｏｐｏｒｉｎ）、レニラＧＦＰ、モンスターＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、カエデタンパク質及びキンドリング（ｋｉｎｄｌｉｎｇ）タンパク質、フィコビリンタンパク質及びフィコビリンタンパク質コンジュゲート（Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン及びアロフィコシアニンを含む）。蛍光タンパク質の他の例としては、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅ２、ｍＰｌｕｍ（Ｓｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２：９０５−９０９）などが挙げられる。Ａｎｔｈｏｚｏａｎ種由来の様々な蛍光タンパク質及び着色タンパク質（例えば、Ｍａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９６９−９７３に記載されているもの）は、いずれも使用に適している。
【００６１】
核酸、発現ベクター、及び宿主細胞
本開示は、本明細書に記載の主題のタンパク質（例えば、上述の変異型光応答性ポリペプチド）のうちの１種以上をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。また、本開示は、本開示の変異型光応答性ポリペプチドを含む核酸を含む組換え発現ベクターも提供する。また、本開示は、本開示の核酸または本開示の組換え発現ベクターを含むように遺伝子修飾された宿主細胞も提供する。
【００６２】
核酸及び組換え発現ベクター
本開示は、本明細書に記載の主題のタンパク質（例えば、上述の変異型光応答性ポリペプチド）のうちの１種以上をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。一部の実施形態において、主題のポリヌクレオチドは、ターゲット細胞内でポリヌクレオチドによりコードされる１種以上のタンパク質を発現させるのに利用される、複数の構成要素（例えば、複数のコード配列）を含有する発現カセットを含む。
【００６３】
一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、転写制御エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結している。ターゲット細胞内で機能する任意の好適なプロモーターが使用に適している。あるいくつかの実施形態において、プロモーターは、特定のターゲット細胞タイプまたは特定の組織タイプに対し特異的なプロモーター、例えば、特定のニューロンまたは汎ニューロン（ｐａｎ−ｎｅｕｒｏｎａｌ）のプロモーターである。特定の動物細胞におけるポリヌクレオチド発現の駆動に有用であるプロモーターの開始制御領域は、多数存在し、当業者に知られている。主題のポリヌクレオチドの発現を駆動可能なプロモーターは、実質的にいずれであっても使用され得る。一部の実施形態において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドの発現の駆動に使用するプロモーターは、Ｔｈｙ１プロモーターである（例えば、Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１６（１０）：１１６１−１１６６を参照）。一部の実施形態において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドの発現の駆動に使用するプロモーターは、ヒトシナプシン（ｈＳｙｎ）プロモーター、ヒト伸長因子１−α（ＥＦ１α）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーター、シナプシン−Ｉプロモーター（例えば、ヒトシナプシン−Ｉプロモーター）、ヒトシヌクレイン１プロモーター、ヒトＴｈｙ１プロモーター、カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩアルファ（ＣＡＭＫＩＩα）プロモーター、小胞γ−アミノ酪酸（ＶＧＡＴ）プロモーター、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、Ｐｅｔ１プロモーター、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）プロモーター、ソマトスタチン（ＳＳＴ）プロモーター、アルギニンバソプレシン（ＡＶＰ）プロモーター、ヒポクレチン（Ｈｃｒｔ）プロモーター、またはターゲット細胞内で本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を駆動できる任意の他のプロモーターである。
【００６４】
一部の場合において、好適なプロモーターは、誘導的プロモーターである。例えば、このプロモーターは、外因的に投与された薬物に応答するトランス作用因子により誘発され得る。誘導的プロモーターの例としては、テトラサイクリン−オンもしくはテトラサイクリン−オフプロモーター、またはタモキシフェン誘導的ＣｒｅＥＲが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
一部の場合において、好適なプロモーターは、構成的プロモーターである。このような構成的プロモーターは、全ての状況において活性であり、調節を受けない。
【００６６】
一部の実施形態において、主題のポリヌクレオチドは、同じ転写物から２種の別々のタンパク質を生成するのに使用され得るリボソームスキップ配列を含むことができる。このような場合において、主題のポリヌクレオチドは、典型的には、光活性化タンパク質に加えて応答タンパク質もコードするコード配列を含むことになる。これらの実施形態において、リボソームスキップ配列は、同じ転写物から２種の別個のタンパク質（すなわち、光活性化タンパク質及び応答タンパク質）を産生するために、２つのコード配列間に配置することができる。
【００６７】
また、本明細書では、（本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む）主題のポリヌクレオチドまたは本明細書に記載されるその任意の変異体を含む、組換え発現ベクターも提供される。本開示によるベクターは、ポリヌクレオチドから転写されたときにターゲット細胞の形質膜に本開示の変異型光応答性ポリペプチドが蓄積される結果をもたらすようなＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターも含む。使用され得るベクターとしては、レンチウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のベクターが挙げられるが、これらに限定されない。レンチウイルスベクターとしては、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、及びウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に基づいたベクターが挙げられるが、これらに限定されない。レンチウイルスは、他のウイルス（水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、バキュロウイルス、及びエボラウイルスを含むが、これらに限定されない）のエンベロープタンパク質でシュードタイプ化することができる。このようなベクターは、当技術分野における標準的方法を用いて調製することができる。レトロウイルスとしては、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、及びレトロウイルス由来のベクター（例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳房腫瘍ウイルス）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
一部の場合において、好適なベクターは、組換えＡＡＶベクターである。ＡＡＶベクターは、比較的小さなサイズのＤＮＡウイルスであり、安定的及び部位特異的な様式で、感染対象の細胞のゲノムに一体化することができる。ＡＡＶベクターは、細胞増殖、形態、または分化に対し、いかなる影響も誘発することなく広範囲の細胞に感染することが可能であり、さらにＡＡＶベクターは、ヒトの病態に関与しないように思われる。ＡＡＶゲノムに対し、クローニング、シークエンシング、及び特徴づけが行われてきた。ＡＡＶゲノムは、およそ４７００の塩基を含み、各末端に、ＡＡＶウイルスの複製起点としての役目を果たす、およそ１４５塩基の逆位末端配列（ＩＴＲ）領域を含有する。ＡＡＶゲノムの残部は、キャプシド形成機能を保有する２つの重要な領域に分類され、ゲノムの左側部分は、ＡＡＶウイルスの複製及びウイルス遺伝子の発現に関わるｒｅｐ遺伝子を含有し、ゲノムの右側部分は、ＡＡＶウイルスのカプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含有する。
【００６９】
ＡＡＶベクターは、当技術分野における標準的方法を用いて調製することができる。任意の血清型のアデノ随伴ウイルスが適している（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗ，ｐｐ．１６５−１７４  ｏｆ  “Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ”  Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．（１９８８）；Ｒｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３：１，１９７４；Ｐ．Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ  “Ｔｈｅ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ”  Ｉｎ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（ＪＲ  Ｋｅｒｒ，ＳＦ  Ｃｏｔｍｏｒｅ．ＭＥ  Ｂｌｏｏｍ，ＲＭ  Ｌｉｎｄｅｎ，ＣＲ  Ｐａｒｒｉｓｈ，Ｅｄｓ．）ｐ５−１４，Ｈｕｄｄｅｒ  Ａｒｎｏｌｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ（２００６）；及び  ＤＥ  Ｂｏｗｌｅｓ，ＪＥ  Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，ＲＪ  Ｓａｍｕｌｓｋｉ  “Ｔｈｅ  Ｇｅｎｕｓ  Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ”  （ＪＲ  Ｋｅｒｒ，ＳＦ  Ｃｏｔｍｏｒｅ．ＭＥ  Ｂｌｏｏｍ，ＲＭ  Ｌｉｎｄｅｎ，ＣＲ  Ｐａｒｒｉｓｈ，Ｅｄｓ．）ｐ１５−２３，Ｈｕｄｄｅｒ  Ａｒｎｏｌｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ（２００６）を参照。これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ベクターの精製方法は、例えば、米国特許第６，５６６，１１８号、同第６，９８９，２６４号、及び同第６，９９５，００６号、ならびにＷＯ／１９９９／０１１７６４（標題“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｈｉｇｈ  Ｔｉｔｅｒ  Ｈｅｌｐｅｒ−ｆｒｅｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＡＡＶ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”）に見いだすことができ、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。バキュロウイルス系におけるＡＡＶベクターの調製方法は、例えばＷＯ２００８／０２４９９８に記載されている。ＡＡＶベクターは、自己相補的であっても一本鎖であってもよい。ハイブリッドベクターの調製は、例えば、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２７０９１号に記載されており、当該開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子を移行するためのＡＡＶ由来ベクターの使用については過去に説明されている（例えば、国際特許出願公開第９１／１８０８８及び第ＷＯ９３／０９２３９号、米国特許第４，７９７，３６８号、同第６，５９６，５３５号、及び同第５，１３９，９４１号、ならびに欧州特許第０４８８５２８号を参照。これらの全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。これらの刊行物は、ｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子が欠失し対象となる遺伝子に置き換えられた様々なＡＡＶ由来のコンストラクトや、対象となる遺伝子をｉｎ  ｖｉｔｒｏ（培養細胞へ）またはｉｎ  ｖｉｖｏ（直接生物へ）移行するためのこれらのコンストラクトの使用について説明している。本開示による複製欠損の組換えＡＡＶは、２つのＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）領域の間に対象となる核酸配列を含有するプラスミドと、ＡＡＶカプシド形成遺伝子（ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子）を保有するプラスミドとを、ヒトヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）に感染した細胞株に同時トランスフェクトすることにより、調製することが���きる。産生されたＡＡＶ組換え体は、次に標準的な手法によって精製される。
【００７０】
一部の実施形態において、本開示の方法で使用するためのベクター（複数可）は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６を含めるがこれらに限定されないＡＡＶウイルス粒子）にカプシド形成される。したがって、本開示は、本明細書に記載のベクターのいずれかを含む組換えウイルス粒子（組換えであるのは、組換えポリヌクレオチドを含有するためである）を含む。このような粒子を産生する方法は当技術分野において公知であり、米国特許第６，５９６，５３５号に記載されている。この開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００７１】
一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、哺乳類の脳における特定のニューロン集団をターゲットとする様々なプロモーターに作動可能に連結していてもよい。好適な組換え発現コンストラクトの非限定的な例としては、例えば、ＡＡＶ−ＣａｍＫＩＩ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ、ＡＡＶ−ｈＳｙｎ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ、ＡＡＶ−ｍＴｈｙ１−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ、ＡＡＶ−ｈＴｈｙ１−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ、ＡＡＶ−ＧＦＡＰ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ、ＡＡＶ−ＶＧＡＴ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ、ＡＡＶ−ＰＥＴ１−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ、ＡＡＶ−ＮＰＹ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ、ＡＡＶ−ＳＳＴ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ、ＡＡＶ−ＡＶＰ５．５−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ、ＡＡＶ−Ｅｆ１ａ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ、ＡＡＶ−ＦＬＥＸ−ｒｅｖ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ、ＡＡＶ−ＣＡＧ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ、ＡＡＶ−ＣＡＧ−ＦＬＥＸ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳが挙げられる（ここで、「ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ」は、本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、「ＣａｍＫＩＩ」はＣａｍＫＩＩプロモーターであり、「ｈＳｙｎ」はヒトシナプシンプロモーターであり、「ｍＴｈｙ１」はマウスＴｈｙ１プロモーターであり、「ｈＴｈｙ１」はヒトＴｈｙ１プロモーターであり、「ＧＦＡＰ」はグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターであり（例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｇｌｉａ  ５６：４８１を参照）、「ＶＧＡＴ」は小胞ガンマアミノ酪酸トランスポーター（ＶＧＡＴ）プロモーターであり、「ＰＥＴ１」はＰＥＴ１プロモーターであり（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：１１９０を参照）、「ＮＰＹ｝はニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）プロモーターであり、「ＳＳＴ」はソマトスタチン（ＳＳＴ）プロモーターであり、「ＡＶＰ５．５」はアルギニンバソプレシンプロモーターであり（例えば、Ｐａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）  １４８：３３７１を参照）、「Ｅｆ１ａ」はＥｆ１ａプロモーターであり、「ＣＡＧ」は、サイトメガロウイルス初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーターであり（例えば、Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  ＭＢＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：２を参照）、「ＦＬＥＸ−ｆｏｒ」はＦＬＥＸ−ｆｏｒスイッチであり、「ＦＬＥＸ−ｒｅｖ」はＦＬＥＸ−ｒｅｖスイッチである）。フリップ切除（ＦＬＥＸ）スイッチに関しては、例えば、Ａｔａｓｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２８：７０２５を参照。本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターは、蛍光タンパク質（ＸＦＰ）をコードするヌクレオチド配列も含むことができる。例えば、以下のアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）及びその構成要素を使用することができるが、これらに限定されない：ＡＡＶ−ＣａｍＫＩＩ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ、ＡＡＶ−ｈＳｙｎ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ、ＡＡＶ−ｍＴｈｙ１−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ、ＡＡＶ−ｈＴｈｙ１−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ、ＡＡＶ−ＧＦＡＰ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ、ＡＡＶ−ＶＧＡＴ−ｂＲ���ａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ、ＡＡＶ−ＰＥＴ１−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ、ＡＡＶ−ＮＰＹ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ、ＡＡＶ−ＳＳＴ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ、ＡＡＶ−ＡＶＰ５．５−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ、ＡＡＶ−Ｅｆ１ａ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ、ＡＡＶ−ＦＬＥＸ−ｒｅｖ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ、ＡＡＶ−ＣＡＧ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ、ＡＡＶ−ＣＡＧ−ＦＬＥＸ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ（ここで、「ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ」は、本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、「ＣａｍＫＩＩ」はＣａｍＫＩＩプロモーターであり、「ｈＳｙｎ」はヒトシナプシンプロモーターであり、「ｍＴｈｙ１」はマウスＴｈｙ１プロモーターであり、「ＧＦＡＰ」はＧＦＡＰプロモーターであり、「ＶＧＡＴ」はＶＧＡＴプロモーターであり、「ＰＥＴ１」はＰＥＴ１プロモーターであり、「ＮＰＹ」はＮＰＹプロモーターであり、「ＳＳＴ」はＳＳＴプロモーターであり、「ＡＶＰ５．５」はＡＶＰ５．５プロモーターであり、「Ｅｆ１ａ」はＥｆ１ａプロモーターであり、「ＣＡＧ」はＣＡＧプロモーターであり、「ＦＬＥＸ」はＦＬＥＸ−ｆｏｒスイッチであり、「ＦＬＥＸ−ｒｅｖ」はＦＬＥＸ−ｒｅｖスイッチである）。当該ポリヌクレオチドに関連して使用され得る他のＡＡＶベクターとしては、Ｃｒｅ及びＦｌｐのようなリコンビナーゼの制御下でのタンパク質の発現を可能にする二重ｌｏｘＰ導入逆方向リーディングフレーム（ｄｏｕｂｌｅ  ｆｌｏｘｅｄ  ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）（ＤＩＯ）を有するもの：ＡＡＶ−Ｅｆ１ａ−ＤＩＯ（Ｃｒｅ）−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ（Ｃｒｅ依存的発現）、ＡＡＶ−Ｅｆ１ａ−ＤＩＯ（Ｆｌｐ）−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ（Ｆｌｐ依存的発現）、ＡＡＶ−Ｅｆ１ａ−ＤＩＯ（Ｃｒｅ）−ＤＩＯ（Ｆｌｐ）−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ（Ｃｒｅ及びＦｌｐ依存的発現）、任意選択により、蛍光タンパク質（ＸＦＰ）をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結した、例えば、ＡＡＶ−Ｅｆ１ａ−ＤＩＯ（Ｃｒｅ）−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ（Ｃｒｅ依存的発現）、ＡＡＶ−Ｅｆ１ａ−ＤＩＯ（Ｆｌｐ）−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ（Ｆｌｐ依存的発現）、ＡＡＶ−Ｅｆ１ａ−ＤＩＯ（Ｃｒｅ）−ＤＩＯ（Ｆｌｐ）−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ（Ｃｒｅ及びＦｌｐ依存的発現）が挙げられる（ここで、「ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ」は、本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である）。
【００７２】
別の主要なウイルス形質導入システムは、以下の潜在的発現ベクターを含めたレンチウイルスを利用する。一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、様々なレンチウイルス発現プロモーターに作動可能に連結していてもよい。好適なレンチウイルス発現プロモーターの非限定的な例としては、例えば、ｐＬｅｎｔｉ−ＣａｍＫＩＩ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ、ｐＬｅｎｔｉ−Ｅｆ１ａ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ、ｐＬｅｎｔｉ−ｍＴｈｙ１−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ、ｐＬｅｎｔｉ−ｈＴｈｙ１−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ、ｐＬｅｎｔｉ−ｈＳｙｎ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ、ｐＬｅｎｔｉ−ＶＧＡＴ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ、ｐＬｅｎｔｉ−Ｈｃｒｔ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳが挙げられる（ここで、「ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ」は、本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、「ＣａｍＫＩＩ」はＣａｍＫＩＩプロモーターであり、「ｈＳｙｎ」はヒトシナプシンプロモーターであり、「ｍＴｈｙ１」はマウスＴｈｙ１プロモーターであり、「ｈＴｈｙ１」はヒトＴｈｙ１プロモーターであり、「ＶＧＡＴ」はＶＧＡＴプロモーターであり、「Ｅｆ１ａ」はＥｆ１ａプロモーターであり、「Ｈｃｒｔ」はヒポクレチンニューロペプチド（Ｈｃｒｔ）プロモーターである）。様々なレンチウイルス発現プロモーターに作動可能に連結した、本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、蛍光タンパク質（ＸＦＰ）をコードするヌクレオチド配列、例えば、ｐＬｅｎｔｉ−ＣａｍＫＩＩ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ、ｐＬｅｎｔｉ−Ｅｆ１ａ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ、ｐＬｅｎｔｉ−ｍＴｈｙ１−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ、ｐＬｅｎｔｉ−ｈＴｈｙ１−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ、ｐＬｅｎｔｉ−ｈＳｙｎ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ、ｐＬｅｎｔｉ−ＶＧＡＴ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ、ｐＬｅｎｔｉ−Ｈｃｒｔ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰをさらに含むことができる（ここで、「ＣａｍＫＩＩ」はＣａｍＫＩＩプロモーターであり、「ｈＳｙｎ」はヒトシナプシンプロモーターであり、「ｍＴｈｙ１」はマウスＴｈｙ１プロモーターであり、「ｈＴｈｙ１」はヒトＴｈｙ１プロモーターであり、「ＶＧＡＴ」はＶＧＡＴプロモーターであり、「Ｅｆ１ａ」はＥｆ１ａプロモーターであり、「Ｈｃｒｔ」はＨｃｒｔプロモーターである）。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、シナプス（順方向）を介し対象となるタンパク質を輸送するために利用することができ、以下の発現ベクターを含む：ＨＳＶ−ＥＦ１ａ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ及びＨＳＶ−ＥＦ１ａ−ＤＩＯ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ、任意選択により、蛍光タンパク質（ＸＦＰ）をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結した、例えば、ＨＳＶ−ＥＦ１ａ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ及びＨＳＶ−ＥＦ１ａ−ＤＩＯ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ（ここで、「ＥＦ１ａ」はＥＦ１ａプロモーターであり、「ＤＩＯ」は、ベクターが二重ｌｏｘＰ導入逆方向リーディングフレームを有するポリヌクレオチドを含むことを意味する）。狂犬病ウイルス及び仮性狂犬病ウイルスは、以下の発現ベクターを用いて、シナプスを介した逆行輸送に利用することができる：ＳＡＤ（ｄｅｌｔａ）Ｇ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ及びＳＡＤ（ｄｅｌｔａ）Ｇ−ＤＩＯ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ（ここで、「ＳＡＤ（ｄｅｌｔａ）Ｇ」はＧ遺伝子欠損組換え狂犬病ウイルスであり（例えば、Ｅｔｅｓｓａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１：２１４７−２１５３を参照）、「ＤＩＯ」は、ベクターが二重ｌｏｘＰ導入逆方向リーディングフレームを有するポリヌクレオチドを含むことを意味する）。他の哺乳類の発現ベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３．１−ＣＭＶ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ及びｐＣＡＧＧＳ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ、任意選択により、蛍光タンパク質（ＸＦＰ）をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結した、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１−ＣＭＶ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰ及びｐＣＡＧＧＳ−ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ−ＸＦＰが挙げられる（ここで、「ＣＭＶ」はＣＭＶプロモーターである）。
【００７３】
ニューロン特異的プロモーター及び他の制御エレメント（例えば、エンハンサー）は、当技術分野において公知である。好適なニューロン特異的制御配列としては、以下のものがが挙げられるが、これらに限定されない：ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（例えば、ＥＭＢＬ  ＨＳＥＮＯ２，Ｘ５１９５６を参照；また、米国特許第６，６４９，８１１号、米国特許第５，３８７，７４２号も参照）、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）プロモーター、ニューロフィラメントプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ＨＵＭＮＦＬ，Ｌ０４１４７を参照）、シナプシンプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ＨＵＭＳＹＮＩＢ，Ｍ５５３０１を参照）、ｔｈｙ−１プロモーター（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｃｅｌｌ  ５１：７−１９；及びＬｌｅｗｅｌｌｙｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１６：１１６１を参照）、セロトニン受容体プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｓ６２２８３を参照）、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター（ＴＨ）（例えば、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１５：２３６３−２３８４（１９８７）及びＮｅｕｒｏｎ  ６：５８３−５９４（１９９１）を参照）、ＧｎＲＨプロモーター（例えば、Ｒａｄｏｖｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：３４０２−３４０６（１９９１）を参照）Ｌ７プロモーター（例えば、Ｏｂｅｒｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：２２３−２２６（１９９０）を参照）、ＤＮＭＴプロモーター（例えば、Ｂａｒｔｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３６４８−３６５２（１９８８）を参照）、エンケファリンプロモーター（例えば、Ｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：３７９３−３８０５（１９８８）を参照）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター、ＣＭＶエンハンサー／血小板由来増殖因子βプロモーター（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１：５２−６０を参照）、モーターニューロン特異的遺伝子Ｈｂ９プロモーター（例えば、米国特許第７，６３２，６７９号及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１：３２９５−３３０６を参照）、Ｃａ（２＋）カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩのアルファサブユニット（ＣａＭＫＩＩα）プロモーター（例えば、Ｍａｙｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１３２５０を参照）、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）、Ｐａｘ６プロモーター、Ｎｋｘ６．１プロモーター、潜伏関連プロモーター２（ＬＡＰ２）プロモーター、ＥＴＳドメイン転写因子ＰＥＴ１プロモーター（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）  Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３（１０）：１１９０−１１９８を参照）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：１０３０−１０３７を参照）、小胞ＧＡＢＡトランスポーター（ＶＧＡＴ）プロモーター（例えば、Ｅｂｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１１０：１２６−１３９を参照）、ニューロペプチドチロシン（ＮＰＹ）プロモーター（例えば、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．５：２７−３６を参照）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）プロモーター（例えば、Ｇｒｏｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．５６６：２４１−２４６を参照）、アルギニンバソプレシン（ＡＶＰ）プロモーター（例えば、ＡＶＰ５．５プロモーター；例えば、Ｐａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１４８：３３７１−３３８２を参照）、延長因子１ａ（ＥＦ１ａ）プロモーター（例えば、Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１５２１：１９−２９を参照）、ヒポクレチンニューロペプチド前駆体（ＨＣＲＴ）プロモーター（例えば、Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）  Ｓｌｅｅｐ  Ｍｅｄ．１４：４８２−４８７を参照）など。
【００７４】
一部の場合において、本開示の組換え発現ベクターは、Ｃｒｅの存在下で作動可能に連結した遺伝子の発現を遺伝子の向きに応じて「オン」または「オフ」にする、Ｃｒｅ依存的遺伝子スイッチ（ＦＬＥＸスイッチ）のような制御エレメントを含むことができる（例えば、Ａｔａｓｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２８：７０２５−７０３０を参照）。一部の場合において、Ｃｒｅの存在下で、本開示のＦＬＥＸスイッチは、順方向である作動可能に連結した遺伝子の発現を「オン」にする（例えば、ＦＬＥＸ−ｆｏｒスイッチ）。他の場合において、Ｃｒｅの存在下で、本開示のＦＬＥＸスイッチは、逆方向である作動可能に連結した遺伝子の発現を「オフ」にする（例えば、ＦＬＥＸ−ｒｅｖスイッチ）。
【００７５】
一部の場合において、本開示の組換え発現ベクターは、本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、カルシウム指示物質（例えば、遺伝子コード型カルシウム指示物質（ＧＥＣＩ））をコードするヌクレオチド配列とを含むことができる。一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチド及びＧＥＣＩは、２つの別々の発現ベクター上でコードされる。
【００７６】
本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、脳領域間における機能的接続の効果的なマッピング用ツールとして使用することができる。一部の実施形態において、機能的接続の効果的なマッピングは、ＧＥＣＩとの組合せで達成される。概して、ＧＥＣＩは、カルシウムイオンの細胞内レベルに応答することができ、そのため様々な細胞タイプにおけるカルシウムシグナリングの研究（例えば、ニューロン活性）で幅広く使用することができる蛍光分子である。ＧＥＣＩは、特定の細胞タイプまたは細胞内区画を容易にターゲット化することができ、変異型光応答性ポリペプチドと共に発現すると、長期間にわたり反復的な細胞活性のｉｎ  ｖｉｖｏ測定値をもたらすことができる。ＧＥＣＩは、蛍光タンパク質、カルシウム結合ドメイン（例えば、カルモジュリン、トロポニンＣなど）、及びカルシウム結合ドメインに結合するドメイン（例えば、カルモジュリンに結合するミオシン軽鎖キナーゼのＭ１３ドメイン）を含む。ＧＥＣＩの例としては、Ｐｅｒｉｃａｍ、Ｃａｍｅｌｅｏｎ、ＧＣａＭＰ、ＴＮ−ＸＸＬ、及びＴｗｉｔｃｈが挙げられる。
【００７７】
ＧＥＣＩでの使用に適した蛍光タンパク質としては、以下のものが挙げられるがこれらに限定されない：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰの青色蛍光変異体（ＢＦＰ）、ＧＦＰのシアン蛍光変異体（ＣＦＰ）、ＧＦＰの黄色蛍光変異体（ＹＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、高感度ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、高感度ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ビーナス、ＧＦＰＳ６５Ｔ、エメラルド、トパーズ、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ｔ−ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔ−ダイマー２、ｔ−ダイマー２（１２）、ｍＲＦＰ１、ｍＥｏｓ、ポシロポリン（ｐｏｃｉｌｌｏｐｏｒｉｎ）、レニラＧＦＰ、モンスターＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、カエデタンパク質もしくはフィコビリンタンパク質、またはこれらのいずれかの生物学的に活性な変異体もしくは断片。
【００７８】
ＧＥＣＩは、１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の蛍光タンパク質（ＦＰ）に融合する、カルモジュリンまたはトロポニンＣのようなカルシウム結合ドメインを含む。単一ＦＰのＧＥＣＩでは、カルシウム結合すると、円順列置換ＦＰ（ｃｐＦＰ）の蛍光強度は、発色団環境におけるカルシウム結合依存的変化により調整され得る。複数ＦＰのＧＥＣＩ（例えば、２ＦＰのＧＥＣＩ、３ＦＰのＧＥＣＩ、４ＦＰのＧＥＣＩ）では、カルシウム結合することで、ＦＰ間のフェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が調整される。
【００７９】
例えば一部の場合において、単一ＦＰのＧＥＣＩは、変異型光応答性ポリペプチドと組み合わせて、脳領域間における機能的接続の効果的なマッピング用ツールとして使用することができる。本開示において使用する単一ＦＰのＧＥＣＩは、蛍光タンパク質、カルモジュリン、及びＭ１３ペプチド配列の融合産物（例えば、ＧＦＰカルモジュリン−Ｍ１３  ＧＥＣＩ（ＧＣａＭＰ））とすることができ、これには、ＧＣａＭＰＫ（配列番号７）、ＧＣａＭＰ２（配列番号８）、ＧＣａＭＰ２．１（配列番号９）、ＧＣａＭＰ２．２ａ（配列番号１０）、ＧＣａＭＰ２．２ｂ（配列番号１１）、ＧＣａＭＰ２．３（配列番号１２）、ＧＣａＭＰ２．４（配列番号１３）、ＧＣａＭＰ３（配列番号１４）、ＧＣａＭＰ５ｇ（配列番号１５）、ＧＣａＭＰ６ｍ（配列番号１６）、ＧＣａＭＰ６ｓ（配列番号１７）、ＧＣａＭＰ６ｆ（配列番号１８）などが含まれるが、これらに限定されない。本開示で使用される他の単一ＦＰのＧＥＣＩとしては、光学イメージング用遺伝子コード型カルシウム指示物質（ＧＥＣＯ）、例えば、緑色蛍光指示物質Ｇ−ＧＥＣＯ１（配列番号２３）、Ｇ−ＧＥＣＯ１．１（配列番号２４）、及びＧ−ＧＥＣＯ１．２（配列番号２５）、赤色蛍光指示物質Ｒ−ＧＥＣＯ１（配列番号２１）、青色蛍光指示物質Ｂ−ＧＥＣＯ１（配列番号２２）、発光比率測定指示物質ＧＥＭ−ＧＥＣＯ１（配列番号１９）、ならびに励起比率測定ＧＥＸ−ＧＥＣＯ１（配列番号２０）などが挙げられる。
【００８０】
使用に適した単一ＦＰのＧＥＣＩとしては、図５Ａ〜図５Ｓ（配列番号７〜２５）に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
例えば一部の場合において、複数ＦＰのＧＥＣＩ（例えば、２ＦＰのＧＥＣＩ、３ＦＰのＧＥＣＩ、４ＦＰのＧＥＣＩ）は、変異型光応答性ポリペプチドと組み合わせて、脳領域間における機能的接続の効果的なマッピング用ツールとして使用することができる。本開示で使用される複数ＦＰのＧＥＣＩとしては、ＴＮ−ＸＸＬ（配列番号２６）、Ｙｅｌｌｏｗ  Ｃａｍｅｌｅｏｎ（例えば、ＹＣ３．６（配列番号２７））、Ｄ３ＣＰＶｅｎｕｓ（配列番号２８）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
使用に適した複数ＦＰのＧＥＣＩは、図６（配列番号２６〜２８）に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８３】
宿主細胞
本開示は、本開示の核酸または本開示の組換え発現ベクターで遺伝子修飾された、遺伝子修飾宿主細胞（例えば、単離された遺伝子修飾宿主細胞、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子修飾宿主細胞、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子修飾宿主細胞）を提供する。一部の場合において、主題の単離された遺伝子修飾宿主細胞は、本開示の変異型光応答性ポリペプチドを産生することができる。一部の場合において、本開示の遺伝子修飾宿主細胞は、本開示の変異型光応答性ポリペプチドを産生して、変異型光応答性ポリペプチドが細胞膜内に存在するようにする。
【００８４】
好適な宿主細胞としては、真核細胞（例えば、哺乳類細胞、昆虫宿主細胞、酵母細胞）及び原核細胞（例えば、細菌細胞）が挙げられる。主題の核酸の宿主細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、または他の公知の方法によりもたらされ得る。
【００８５】
好適な哺乳類細胞としては、初代細胞及び不死化細胞株が挙げられる。一部の場合において、当該哺乳類細胞は、ニューロン、例えば、非不死化（初代）ニューロンである。他の場合において、当該哺乳類細胞は、不死化細胞株である。一部の場合において、当該細胞は、ヒト初代細胞である。一部の場合において、当該細胞は、ヒトニューロンである。一部の場合において、当該細胞は、心臓細胞である。一部の場合において、当該細胞は、幹細胞（例えば、ニューラル幹細胞、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚幹細胞）である。
【００８６】
好適な哺乳類細胞株としては、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）細胞株などが挙げられる。好適な哺乳類細胞株としては、ＨｅＬａ細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）  Ｎｏ．ＣＣＬ−２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）、Ｈｕｈ−７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ  細胞、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬＩ．３）、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
一部の場合において、当該細胞は、ニューロン細胞またはニューロン様細胞である。当該細胞は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、もしくはラットを起源とするもの、またはヒト以外の哺乳類、非ヒト霊長類、ラット、もしくはマウスに由来するものであり得る。好適な細胞株としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ヒトグリオーマ細胞株、例えば、ＳＶＧｐ１２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８６２１）、ＣＣＦ−ＳＴＴＧ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７１８）、ＳＷ１０８８（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１２）、ＳＷ１７８３（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１３）、ＬＬＮ−１８（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６１０）、ＬＮＺＴＡ３ＷＴ４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１５４３）、ＬＮＺＴＡ３ＷＴ１１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１５４４）、Ｕ−１３８  ＭＧ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１６）、Ｕ−８７  ＭＧ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１４）、Ｈ４（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１４８）、及びＬＮ−２２９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６１１）；ヒト髄芽腫由来細胞株、例えば、Ｄ３４２  Ｍｅｄ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１８７）、Ｄａｏｙ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１８６）、Ｄ２８３  Ｍｅｄ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１８５）；ヒト腫瘍由来ニューロン様細胞、例えば、ＰＦＳＫ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２０６０）、ＳＫ−Ｎ−ＤＺ（ＡＴＣＣＣＲＬ−２１４９）、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２１３７）、ＳＫ−Ｎ−ＦＩ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２１４２）、ＩＭＲ−３２（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１２７）など；マウスニューロン細胞株、例えば、ＢＣ３Ｈ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４４３）、ＥＯＣ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２４６７）、Ｃ８−Ｄ３０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５３４）、Ｃ８−Ｓ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５３５）、Ｎｅｕｒｏ−２ａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１３１）、ＮＢ４１Ａ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１４７）、ＳＷ１０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２７６６）、ＮＧ１０８−１５（ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２３１７）；ラットニューロン細胞株、例えば、ＰＣ−１２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７２１）、ＣＴＸ  ＴＮＡ２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２００６）、Ｃ６（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０７）、Ｆ９８（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２３９７）、ＲＧ２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２４３３）、Ｂ３５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２７５４）、Ｒ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２７６４）、ＳＣＰ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７００）、ＯＡ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６５３８）。
【００８８】
好適な酵母細胞としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉなど。酵母細胞は、本開示の変異型光応答性ポリペプチドの産生に使用することができる。
【００８９】
好適な原核細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐ．などの様々な実験室株のいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｃａｒｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１７６−１１８１；米国特許第６，４４７，７８４号；及びＳｉｚｅｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：２９９−３０２を参照。本発明で用いられ得るサルモネラ属株の例としては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ及びＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍが挙げられるが、これらに限定されない。好適なシゲラ属株としては、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、及びＳｈｉｇｅｌｌａ  ｄｉｓｅｎｔｅｒｉａｅが挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、実験室株は、非病原性のものである。他の好適な細菌の非限定的な例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｄｉｔａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．などが挙げられるが、これらに限定されない。原核細胞は、本開示の核酸の増殖に使用することができる。
【００９０】
一部の場合において、本開示の遺伝子修飾哺乳類宿主細胞は、本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（または組換え発現ベクター）で遺伝子修飾され、及びＧＥＣＩ（ＧＥＣＩは上述されている）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（または組換え発現ベクター）でも遺伝子修飾されている。
【００９１】
一部の場合において、本開示の遺伝子修飾哺乳類宿主細胞は、本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（または組換え発現ベクター）で遺伝子修飾され、及び第２の光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（または組換え発現ベクター）でも遺伝子修飾されている。一部の場合において、第２の光応答性ポリペプチドは、脱分極性光応答性ポリペプチドである。一部の場合において、第２の光応答性ポリペプチドは、本開示の変異型光応答性ポリペプチドを活性化する光の波長と異なる波長の光に応答して活性化される、脱分極性光応答性ポリペプチドである。一部の場合において、第２の光応答性ポリペプチドは、過分極性光応答性ポリペプチドである。好適な第２の光応答性ポリペプチドについては、本明細書で後述する。
【００９２】
細胞の活性を調整する方法
本開示は、ターゲット細胞内の活動電位をオプトジェネティクス的に調整する方法を提供する。主題の方法は、概して、本開示の変異型光応答性ポリペプチドをターゲット細胞内に導入することと、ターゲット細胞を活性化波長の光で照射することとを含む。ターゲット細胞を活性化波長の光で照射することにより、光活性化チャネルタンパク質は、１種以上のカチオンによるターゲット細胞の形質膜が通過できるようにする。カチオンがターゲット細胞の形質膜を通過することで、例えば、形質膜の膜電位調整のような所望の効果がもたらされる。一部の場合において、カチオン種の形質膜通過は、患者における１つ以上の神経学的応答またはプロセスの調整に使用することができ、そのため患者における疾患または状態の処置に使用することができる。一部の場合において、主題の方法は、患者のある状態、例えば神経学的状態を、本明細書で提供されるシステム及びデバイスを用いて処置することを含む。主題の方法は、以下でより詳細に説明する。
【００９３】
一部の場合において、本開示のターゲット細胞の活性を調整する方法は、ターゲット細胞内に、本開示の変異型光応答性ポリペプチドを導入し、またはターゲット細胞内に本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（または組換え発現ベクター）を導入し、それにより変異型光応答性ポリペプチドを自らの形質膜内に含む修飾ターゲット細胞を生成することと、修飾ターゲット細胞を、光応答性ポリペプチドを活性化する波長の光（例えば、赤色光）に曝露することと、を含む。修飾ターゲット細胞は、６００ｎｍ〜７００ｎｍの範囲の波長を有する光、例えば６００ｎｍ〜６２５ｎｍ、６２５ｎｍ〜６５０ｎｍ、６５０ｎｍ〜６７５ｎｍ、または６７５ｎｍ〜７００ｎｍの波長を有する光に曝露される。一部の場合において、修飾ターゲット細胞は、６２５ｎｍ〜６５０ｎｍの波長を有する光に曝露される。一部の場合において、修飾ターゲット細胞は、６３０ｎｍの波長を有する光に曝露される。
【００９４】
一部の場合において、本開示のターゲット細胞の活性を調整する方法は、ターゲット細胞内に、本開示の変異型光応答性ポリペプチドを導入し、それにより変異型光応答性ポリペプチドを自らの形質膜内に含む修飾ターゲット細胞を生成することと、修飾ターゲット細胞を、変異型光応答性ポリペプチドを活性化する波長の光（例えば、６００ｎｍ〜７００ｎｍの範囲の波長を有する光、例えば、６２５ｎｍ〜６５０ｎｍの波長を有する光）に曝露することと、を含む。
【００９５】
一部の場合において、本開示のターゲット細胞の活性を調整する方法は、ターゲット細胞内に、本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入し、それにより変異型光応答性ポリペプチドを自らの形質膜内に含む修飾ターゲット細胞を生成することと、修飾ターゲット細胞を、変異型光応答性ポリペプチドを活性化する波長の光（例えば、６００ｎｍ〜７００ｎｍの範囲の波長を有する光、例えば、６２５ｎｍ〜６５０ｎｍの波長を有する光）に曝露することと、を含む。一部の場合において、ターゲット細胞はニューロンであり、ヌクレオチド配列はニューロン特異的プロモーターに作動可能に連結している。
【００９６】
一部の場合において、本開示のターゲット細胞の活性を調整する方法は、ターゲット細胞内に、本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを導入し、それにより変異型光応答性ポリペプチドを自らの形質膜内に含む修飾ターゲット細胞を生成することと、修飾ターゲット細胞を、変異型光応答性ポリペプチドを活性化する波長の光（例えば、６００ｎｍ〜７００ｎｍの範囲の波長を有する光、例えば、６２５ｎｍ〜６５０ｎｍの波長を有する光）に曝露することと、を含む。一部の場合において、ターゲット細胞は、ニューロンであり、当該ヌクレオチド配列は、ニューロン特異的プロモーターに作動可能に連結している。
【００９７】
一部の場合において、ターゲット細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞、例えば、多細胞生物（例えば、哺乳類）に存在する細胞である。哺乳類としては、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、ウサギ目動物（例えば、ウサギ））、有蹄動物（例えば、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ウシなど）、ネコ、イヌなどが挙げられる。一部の場合において、当該哺乳類は、ヒトである。一部の場合において、当該哺乳類は、非ヒト霊長類である。一部の場合において、当該哺乳類は、げっ歯類である。
【００９８】
ターゲット細胞がｉｎ  ｖｉｖｏ細胞、例えば、個体（例えば、哺乳類）に存在する細胞である場合、本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター（例えば、組換えウイルスベクター）は、組換え発現ベクターを個体に投与することにより送達され得る。組換え発現ベクターの投与は、組換え発現ベクターを含む組成物を個体に注入することにより行われ得る。例えば、組換え発現ベクターは、ターゲット細胞またはターゲット細胞を含むターゲット組織付近（例えば、約５ｃｍ以内、約４ｃｍ以内、約３ｃｍ以内、約２ｃｍ以内、約１ｃｍ以内、または約０．５ｃｍ以内）に注入され得る。一部の場合において、組換え発現ベクターの投与は、後述するように、組換え発現ベクターを含む組成物を含む容器を備えるデバイスまたはシステムを用いて行われ得る。当該容器は、シリンジであってもよい。当該容器は、個体内に完全にまたは部分的に移植されてもよい。ターゲットとする組織構造は、例えば、ウイルス媒介遺伝子送達、エレクトロポレーション、超音波、流体力学的送達、または直接注入による、もしくは追加的促進物質（例えば、カチオン脂質もしくはポリマー）により補完される、ネイキッドＤＮＡの導入により、本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子修飾され得る。
【００９９】
一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、ターゲット細胞のゲノム内に導入される。例えば、一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、ターゲット細胞のゲノム内に導入される。例えば、本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むドナーポリヌクレオチドは、Ｃａｓ９ポリペプチド及びガイドＲＮＡと組み合わせて使用して、当該変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の、ターゲット細胞のゲノム内への導入をもたらす。ドナーポリヌクレオチドは、例えば、ターゲット細胞におけるターゲット遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含み得ると考えられ、このとき、ＯＲＦ及び変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列内リボソーム進入部位または２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列により分離される。そして当該ガイドＲＮＡは、例えば、ターゲット細胞のゲノムにおけるＯＲＦに作動可能に連結したプロモーター配列の３’末端とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み得ると考えられる。一部の場合において、ドナーポリヌクレオチドは、例えば、ターゲット細胞のゲノムにおける非コード領域に対し相同の配列を含み得ると考えられ、それにより、ニューロン特異的プロモーターに作動可能に連結した本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、いかなる内在的遺伝子発現にも影響を及ぼすことなく、ターゲット細胞（例えば、ニューロン）内に導入される。
【０１００】
ターゲット細胞は、概して、神経細胞のような、電気インパルスを保有または送信する細胞である。ターゲット細胞には、ニューロン、心臓細胞、及び幹細胞が含まれる。一部の場合において、ターゲット細胞は、ニューロンである。一部の場合において、ターゲット細胞は、感覚ニューロン、運動ニューロン、または介在ニューロンである。ターゲット細胞には、中枢神経系の細胞及び／または末梢神経系の細胞が含まれ得る。ターゲット細胞は、ターゲット組織中に存在し得る。一部の場合において、ターゲット組織には、複数の神経線維、神経、神経細胞神経節、神経筋接合部、神経によって神経支配される組織（筋肉、皮膚、もしくは内分泌組織が含まれるが、これらに限定されない）、または解剖学的領域（例えば、脳もしくは脊髄の一部もしくはサブ部分）が含まれ得る。一部の場合において、ターゲット組織は、個々の細胞の一部、例えば、神経細胞の特定の軸索であり得る。
【０１０１】
ターゲット細胞における膜電位の調整
本開示は、ターゲット細胞（例えば、ターゲット哺乳類細胞）の活性を（例えば、ターゲット細胞における膜電位を調整することにより）調整する方法を開示する。一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードする核酸は、ターゲット細胞が変異型光応答性ポリペプチドを発現するようにターゲット細胞に導入され、例えばこのとき、変異型光応答性ポリペプチドは、ターゲット細胞の形質膜内で発現し、かつそこに存在する。次に、ターゲット細胞は、光生成デバイスを用いて活性化波長の光で照射される。変異型光応答性ポリペプチドを照射すると、結果として１種以上のカチオンが光に応答して細胞の形質膜を通る。一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドの光活性化は、変異型光応答性ポリペプチドを発現する細胞の脱分極をもたらす。あるいくつかの実施形態において、変異型光応答性ポリペプチドの活性化は、神経細胞膜の脱分極及び活動電位の誘発をもたらす。一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドの光活性化は、内在的電位開口型トランスポーター（例えば、ナトリウムチャネルまたはカルシウムチャネル）の活性化をもたらし、内在的電位開口型トランスポーターの活性化により活動電位（複数可）が誘起される。一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドの光活性化は、内在的電位開口型ナトリウムチャネルの活性化をもたらし、内在的電位開口型ナトリウムチャネルの活性化により活動電位（複数可）が誘起される。一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドの光活性化は、内在的電位開口型カルシウムチャネルの活性化をもたらし、内在的電位開口型カルシウムチャネルの活性化により活動電位（複数可）が誘起される。一部の実施形態において、本開示のターゲット細胞の活性を調整する方法は、本開示のシステムまたはデバイスの使用を含む。
【０１０２】
軸索突起を通る活性の特異的増加
一部の実施形態において、主題の方法は、神経細胞の一部を通る（例えば、神経細胞の軸索を通る、または神経細胞の軸索突起の末端における）活性を活性化及び／または増加させることを含む。一部の実施形態において、主題の方法は、神経細胞の一部を通る（例えば、神経細胞の軸索を通る、または神経細胞の軸索突起の末端における）活性を、主題のシステム及びデバイスを用いて、活性を活性化及び／または増加させることを含む。一部の場合において、本開示の方法は、神経細胞内に本開示の変異型光活性化ポリペプチドを導入することを含む。本開示の変異型光活性化ポリペプチドをコードする核酸（または組換え発現ベクター）を神経細胞内に導入すると、神経細胞により変異型光活性化ポリペプチドが発現し、神経細胞の形質膜内に挿入される。
【０１０３】
次に、光生成デバイスを起動したときに、神経細胞のターゲット部分（例えば、軸索、または神経細胞の軸索の一部）が活性化波長の光で照射されるように、光生成デバイスを位置付ける。次に、光生成デバイスを起動して所望の神経細胞またはその一部に光を送達することで、光活性化ポリペプチドがカチオンに神経細胞の形質膜を通過させるようにする。
【０１０４】
神経細胞の形質膜の脱分極は、活動電位を誘発する。したがって、主題の方法は、活性化波長の光を神経細胞または神経細胞の特定の部分に送達することにより、特定の神経細胞またはその一部（例えば、軸索もしくはその一部）における活動電位を誘発し及び／または増加させるために使用され得る。重要なことには、活動電位は、本開示の変異型光活性化ポリペプチドを活性化する波長の光で照射されていない神経細胞または軸索の他の部分にさらに伝播し正常なものとして挙動することができる。このようにして、ターゲット細胞またはその特定の部分における特異性が達成される。
【０１０５】
ターゲット細胞及び組織
上で概括されるように、本開示の態様には、本開示の変異型光活性化ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸または組換え発現ベクターをターゲット細胞に送達することが含まれる。ターゲット細胞は、概して、神経細胞のような、電気インパルスを保有または送信する細胞である。一部の場合において、ターゲット細胞は、感覚ニューロン、運動ニューロン、または介在ニューロンである。ターゲット細胞には、中枢神経系の細胞及び／または末梢神経系の細胞が含まれ得る。ターゲット細胞は、ターゲット組織中に存在し得る。一部の場合において、ターゲット組織には、複数の神経線維、神経、神経細胞神経節、神経筋接合部、神経によって神経支配される組織（筋肉、皮膚、もしくは内分泌組織が含まれるが、これらに限定されない）、または解剖学的領域（例えば、脳もしくは脊髄の一部もしくはサブ部分）が含まれ得る。一部の場合において、ターゲット組織は、個々の細胞の一部、例えば、神経細胞の特定の軸索であり得る。
【０１０６】
主題のポリヌクレオチドがターゲット細胞または組織に送達されると、ポリヌクレオチドはターゲット細胞に進入し、発現する。一部の実施形態において、主題のポリヌクレオチドは、組織特異的プロモーターを含有し、この組織特異的プロモーターが活性である際にターゲット細胞でのみ発現が生じるようにする。このため、主題のポリヌクレオチドがターゲット細胞以外の細胞に送達された場合、組織特異的プロモーターがそのような細胞では不活性であるため、ポリヌクレオチドは非ターゲット細胞では発現しない。一部の実施形態において、主題のポリヌクレオチドは、誘導的プロモーターを含み、それにより、ポリヌクレオチドの発現が、外来的に投与された薬物が当該プロモーターを活性化する程度に十分な濃度で細胞内に存在する場合にのみ、生じるようにすることができる。
【０１０７】
追加的ポリペプチド
一部の場合において、本開示のターゲット細胞の活性を調整する方法は、ターゲット細胞内に、本開示の変異型光応答性ポリペプチドを導入し、または本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（または組換え発現ベクター）を導入し、それにより変異型光応答性ポリペプチドを発現する修飾ターゲット細胞を自らの細胞膜内に生成することと、修飾ターゲット細胞を、変異型光応答性ポリペプチドを活性化する波長の光（例えば、６００ｎｍ〜７００ｎｍの範囲の波長を有する光、例えば、６２５ｎｍ〜６５０ｎｍの波長を有する光）に曝露することであって、修飾ターゲット細胞が、追加的な異種のポリペプチド（例えば、ＧＥＣＩ、第２の光応答性ポリペプチドなど）を発現する、曝露することと、を含む。
【０１０８】
ＧＥＣＩ
一部の場合において、本開示のターゲット細胞の活性を調整する方法は、ターゲット細胞内に、本開示の変異型光応答性ポリペプチドを導入し、または本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（または組換え発現ベクター）を導入し、それにより変異型光応答性ポリペプチドを発現する修飾ターゲット細胞を自らの細胞膜内に生成することと、修飾ターゲット細胞を、変異型光応答性ポリペプチドを活性化する波長の光（例えば、６００ｎｍ〜７００ｎｍの範囲の波長を有する光、例えば、６２５ｎｍ〜６５０ｎｍの波長を有する光）に曝露することであって、修飾ターゲット細胞がＧＥＣＩを発現する、曝露することと、を含む。修飾ターゲット細胞がＧＥＣＩを発現する場合、当該方法は、修飾ターゲット細胞の細胞膜内に存在する光応答性ポリペプチドを光活性化した後に、修飾ターゲット細胞における細胞内カルシウムのレベルを検出することを含み得る。
【０１０９】
ＧＥＣＩは、蛍光タンパク質、カルシウム結合ドメイン（例えば、カルモジュリン、トロポニンＣなど）、及びカルシウム結合ドメインに結合するドメイン（例えば、カルモジュリンに結合するミオシン軽鎖キナーゼのＭ１３ドメイン）を含む。ＧＥＣＩの例としては、Ｐｅｒｉｃａｍ、Ｃａｍｅｌｅｏｎ、ＧＣａＭＰ、ＴＮ−ＸＸＬ、及びＴｗｉｔｃｈが挙げられる。
【０１１０】
ＧＥＣＩでの使用に適した蛍光タンパク質としては、以下のものが挙げられるがこれらに限定されない：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰの青色蛍光変異体（ＢＦＰ）、ＧＦＰのシアン蛍光変異体（ＣＦＰ）、ＧＦＰの黄色蛍光変異体（ＹＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、高感度ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、高感度ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ビーナス、ＧＦＰＳ６５Ｔ、エメラルド、トパーズ、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ｔ−ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔ−ダイマー２、ｔ−ダイマー２（１２）、ｍＲＦＰ１、ｍＥｏｓ、ポシロポリン（ｐｏｃｉｌｌｏｐｏｒｉｎ）、レニラＧＦＰ、モンスターＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、カエデタンパク質もしくはフィコビリンタンパク質、またはこれらのいずれかの生物学的に活性な変異体もしくは断片。
【０１１１】
ＧＥＣＩは、１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の蛍光タンパク質（ＦＰ）に融合する、カルモジュリンまたはトロポニンＣのようなカルシウム結合ドメインを含む。単一ＦＰのＧＥＣＩでは、カルシウム結合すると、円順列置換ＦＰ（ｃｐＦＰ）の蛍光強度は、発色団環境におけるカルシウム結合依存的変化により調整され得る。複数ＦＰのＧＥＣＩ（例えば、２ＦＰのＧＥＣＩ、３ＦＰのＧＥＣＩ、４ＦＰのＧＥＣＩ）では、カルシウム結合することで、ＦＰ間のフェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が調整される。
【０１１２】
例えば一部の場合において、単一ＦＰのＧＥＣＩは、変異型光応答性ポリペプチドと組み合わせて、脳領域間における機能的接続の効果的なマッピング用ツールとして使用することができる。本開示において使用する単一ＦＰのＧＥＣＩは、蛍光タンパク質、カルモジュリン、及びＭ１３ペプチド配列の融合産物（例えば、ＧＦＰカルモジュリン−Ｍ１３  ＧＥＣＩ（ＧＣａＭＰ））とすることができ、これには、ＧＣａＭＰＫ（配列番号７）、ＧＣａＭＰ２（配列番号８）、ＧＣａＭＰ２．１（配列番号９）、ＧＣａＭＰ２．２ａ（配列番号１０）、ＧＣａＭＰ２．２ｂ（配列番号１１）、ＧＣａＭＰ２．３（配列番号１２）、ＧＣａＭＰ２．４（配列番号１３）、ＧＣａＭＰ３（配列番号１４）、ＧＣａＭＰ５ｇ（配列番号１５）、ＧＣａＭＰ６ｍ（配列番号１６）、ＧＣａＭＰ６ｓ（配列番号１７）、ＧＣａＭＰ６ｆ（配列番号１８）などが含まれるが、これらに限定されない。本開示で使用される他の単一ＦＰのＧＥＣＩとしては、光学イメージング用遺伝子コード型カルシウム指示物質（ＧＥＣＯ）、例えば、緑色蛍光指示物質Ｇ−ＧＥＣＯ１（配列番号２３）、Ｇ−ＧＥＣＯ１．１（配列番号２４）、及びＧ−ＧＥＣＯ１．２（配列番号２５）、赤色蛍光指示物質Ｒ−ＧＥＣＯ１（配列番号２１）、青色蛍光指示物質Ｂ−ＧＥＣＯ１（配列番号２２）、発光比率測定指示物質ＧＥＭ−ＧＥＣＯ１（配列番号１９）、ならびに励起比率測定ＧＥＸ−ＧＥＣＯ１（配列番号２０）などが挙げられる。
【０１１３】
使用に適した単一ＦＰのＧＥＣＩとしては、図５Ａ〜図５Ｓ（配列番号７〜２５）に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１４】
例えば一部の場合において、複数ＦＰのＧＥＣＩ（例えば、２ＦＰのＧＥＣＩ、３ＦＰのＧＥＣＩ、４ＦＰのＧＥＣＩ）は、変異型光応答性ポリペプチドと組み合わせて、脳領域間における機能的接続の効果的なマッピング用ツールとして使用することができる。本開示で使用される複数ＦＰのＧＥＣＩとしては、ＴＮ−ＸＸＬ（配列番号２６）、Ｙｅｌｌｏｗ  Ｃａｍｅｌｅｏｎ（例えば、ＹＣ３．６（配列番号２７））、Ｄ３ＣＰＶｅｎｕｓ（配列番号２８）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
使用に適した複数ＦＰのＧＥＣＩは、図６（配列番号２６〜２８）に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１６】
光応答性ポリペプチド
一部の場合において、本開示のターゲット細胞の活性を調整する方法は、ターゲット細胞内に、本開示の変異型光応答性ポリペプチドを導入し、または本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（または組換え発現ベクター）を導入し、それにより変異型光応答性ポリペプチドを発現する修飾ターゲット細胞を自らの細胞膜内に生成することと、修飾ターゲット細胞を、変異型光応答性ポリペプチドを活性化する波長の光（例えば、６００ｎｍ〜７００ｎｍの範囲の波長を有する光、例えば、６２５ｎｍ〜６５０ｎｍの波長を有する光）に曝露することであって、修飾ターゲット細胞が、第２の光応答性ポリペプチドを発現するようにも遺伝子修飾される、曝露することと、を含む。一部の場合において、第２の光応答性ポリペプチドは、脱分極性光応答性ポリペプチドである。一部の場合において、第２の光応答性ポリペプチドは、本開示の変異型光応答性ポリペプチドを活性化する光の波長と異なる波長の光に応答して活性化される脱分極性光応答性ポリペプチドであり、このとき、例えば、第２の光応答性ポリペプチドは、青色光、黄色光、緑色光、オレンジ色光などにより活性化される脱分極性光応答性ポリペプチドである。一部の場合において、第２の光応答性ポリペプチドは、過分極性光応答性ポリペプチドである。一部の場合において、第２の光応答性ポリペプチドは、本開示の変異型光応答性ポリペプチドを活性化する光の波長と異なる波長の光に応答して活性化される過分極性光応答性ポリペプチドであり、このとき、例えば、第２の光応答性ポリペプチドは、青色光、黄色光、緑色光、オレンジ色光などにより活性化される過分極性応答性ポリペプチドである。
【０１１７】
一部の実施形態において、脱分極性光応答性ポリペプチドは、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のチャネルロドプシン（ＣｈＲ１−ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：５７２４５１８、ＣｈＲ２−ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：５７２７３７６）であり、このとき当該ポリペプチドは、細胞が光で照射されたときに、細胞膜を横断してカチオンを輸送することができる。Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来の光応答性カチオンチャネルタンパク質の活性化に使用する光は、約４６０から約４９５ｎｍの間の波長を有することができ、または約４８０ｎｍの波長を有することができる。加えて、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスを、光応答性タンパク質の活性化に使用することができる。一部の実施形態において、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスを伴うＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来の光応答性カチオンチャネルは、光応答性カチオンチャネルを発現する興奮性細胞（例えば、ニューロン）の脱分極をもたらすことができる。光応答性カチオンチャネルタンパク質は、さらに、ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含んで、光に対する感受性を増加もしくは減少、特定の波長の光に対する感受性を増加もしくは減少、及び／または光応答性カチオンチャネルタンパク質における、細胞の形質膜の分極状態を調節する能力を増加もしくは減少させることができる。加えて、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含むことができる。ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含有する光応答性プロトンポンプタンパク質は、細胞膜を横断してカチオンを輸送する能力を好適に保持する。一部の場合において、好適なチャネルロドプシンは、図７Ａ（配列番号２９）に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣｈＲ１ポリペプチドである。一部の場合において、好適なチャネルロドプシンは、図７Ｂ（配列番号３０）に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または１００％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣｈＲ２ポリペプチドである。
【０１１８】
他の実施形態において、光応答性ポリペプチドは、ＣｈＲ２のアミノ酸配列のレチナール結合ポケットにおける主要位置で特定のアミノ酸置換を有し得る、ステップ関数型オプシン（ＳＦＯ）タンパク質または安定化ステップ関数型オプシン（ＳＳＦＯ）タンパク質である。ＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質に関するさらなる開示は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／０５６９７０号に見いだすことができ、当該開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の場合において、好適なＣｈＲ２  ＳＦＯは、図７Ｃ（配列番号３１）に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合において、好適なＣｈＲ２  ＳＳＦＯは、図７Ｄ（配列番号３２）に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１９】
一部の実施形態において、好適な光応答性ポリペプチドは、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ由来のカチオンチャネル（ＶＣｈＲ１−ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９６１９５７０）であり、約５００ｎｍ〜約６００ｎｍの波長の光、例えば、約５２５ｎｍ〜５５０ｎｍ、例えば、５４５ｎｍの波長の光で照射することにより、活性化される。光応答性イオンチャネルタンパク質は、さらに、ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含んで、光に対する感受性を増加もしくは減少、特定の波長の光に対する感受性を増加もしくは減少、及び／または光応答性イオンチャネルタンパク質における、細胞の形質膜の分極状態を調節する能力を増加もしくは減少させることができる。加えて、光応答性イオンチャネルタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含むことができる。ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含有する光応答性イオンチャネルタンパク質は、光に応答して興奮性細胞の細胞膜を横断してイオンを輸送する能力を好適に保持する。一部の場合において、好適なＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ由来のカチオンチャネルは、図７Ｅ（配列番号３３）に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＣｈＲ１ポリペプチドである。
【０１２０】
他の実施形態において、光応答性ポリペプチドは、ＶＣｈＲ１に基づいたＳＦＯまたはＳＳＦＯである。一部の実施形態において、ＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質は、細胞が青色光で照射されたときに、細胞内の脱分極性電流を媒介することができる。一部の実施形態において、光は、約５６０ｎｍの波長を有する。加えて、一部の実施形態において、光は、ＳＦＯ及びＳＳＦＯの光電流の安定性持続のため、単一パルスの光または間を開けたパルスの光として送達される。一部の実施形態において、ＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質を単一パルスまたは間を開けたパルスの光で活性化することで、ＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質を発現する興奮性細胞（例えば、ニューロン）の脱分極がもたらされ得る。一部の実施形態において、開示されているステップ関数型オプシン及び安定化ステップ関数型オプシンタンパク質のそれぞれは、光に応答した興奮性細胞の膜の脱分極に使用するための特定の特性及び特色を有し得る。一部の場合において、好適なＶＣｈＲ１  ＳＦＯは、図７Ｆ（配列番号３４）に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合において、好適なＶＣｈＲ１  ＳＳＦＯは、図７Ｇ（配列番号３５）に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２１】
他の実施形態において、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉのＶＣｈＲ１タンパク質及びＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＣｈＲ１タンパク質に由来するＣ１Ｖ１キメラタンパク質であり、このとき当該タンパク質は、ＣｈＲ１の第１及び第２の膜貫通ヘリックスにより置き換えられた第１及び第２の膜貫通ヘリックスを少なくとも有するＶＣｈＲ１のアミノ酸配列を含み、及び光に応答性であり、及び細胞が光で照射されたときに、細胞内の脱分極性電流を媒介することができる。一部の実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、キメラ光応答性タンパク質の第２及び第３の膜貫通ヘリックス間に位置する細胞内ループドメイン内の置き換えをさらに含み、このとき当該細胞内ループドメインの少なくとも一部は、ＣｈＲ１からの対応部分により置き換えられている。別の実施形態において、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質の細胞内ループドメインの一部は、ＣｈＲ１のアミノ酸残基Ａ１４５まで及ぶＣｈＲ１からの対応部分で置き換えられ得る。他の実施形態において、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、キメラ光応答性タンパク質の第３の膜貫通ヘリックス内の置き換えをさらに含み、このとき第３の膜貫通ヘリックスの少なくとも一部は、ＣｈＲ１の対応配列により置き換えられている。また別の実施形態において、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質の細胞内ループドメインの一部は、ＣｈＲ１のアミノ酸残基Ｗ１６３まで及ぶＣｈＲ１からの対応部分で置き換えられ得る。
【０１２２】
一部の実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、細胞が緑色光で照射されたときに、細胞内の脱分極性電流を媒介する。一部の実施形態において、光は、約５４０ｎｍから約５６０ｎｍの間の波長を有する。一部の実施形態において、光は、約５４２ｎｍの波長を有し得る。一部の実施形態において、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、細胞が紫色光で照射されたときには、細胞内の脱分極性電流を媒介することができない。一部の実施形態において、当該キメラタンパク質は、細胞が約４０５ｎｍの波長を有する光で照射されたときには、細胞内の脱分極性電流を媒介することができない。加えて、一部の実施形態において、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスを、Ｃ１Ｖ１タンパク質の活性化に使用することができる。
【０１２３】
一部の態様において、好適な光応答性ポリペプチドは、前駆型Ｃ１Ｖ１キメラポリペプチドに特有の光活性化可能な性質を保持するがいくつかの特定の態様では変化した特性も所持し得る、置換または突然変異アミノ酸配列を含む。例えば、本明細書に記載の変異体光応答性Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、動物細胞内または動物細胞の形質膜上の両方における発現レベルの増加；異なる波長の光、特に赤色光に曝露されたときの応答性の変化；及び／または、キメラＣ１Ｖ１ポリペプチドが、他の光応答性カチオンチャネルとの交差活性化を最小化し、及び／または動物細胞内で強力に発現するための、低脱感作、高速な不活性化、低い紫色光活性化を所持する元となる形質の組合せ、を示すことができる。
【０１２４】
したがって、好適な光応答性タンパク質には、当該キメラポリペプチドにおけるＶＣｈＲ１部分のレチナール結合ポケットの全体にわたって主要位置における特定のアミノ酸置換を有し得る、Ｃ１Ｖ１キメラ光応答性タンパク質が含まれる。一部の場合において、好適なＣ１Ｖ１キメラ光応答性タンパク質は、図７Ｈ（配列番号３６）に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２５】
他の実施形態において、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉからのＣｈＲ１及びＣｈＲ２タンパク質に由来するＣ１Ｃ２キメラタンパク質であり、このとき当該タンパク質は、光に応答性であり、細胞が光で照射されたときに、細胞内の脱分極性電流を媒介することができる。光応答性カチオンチャネルタンパク質は、さらに、ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含んで、光に対する感受性を増加もしくは減少、特定の波長の光に対する感受性を増加もしくは減少、及び／または光応答性カチオンチャネルタンパク質における、細胞の形質膜の分極状態を調節する能力を増加もしくは減少させることができる。加えて、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含む。ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含有する光応答性プロトンポンプタンパク質は、細胞膜を横断してカチオンを輸送する能力を好適に保持する。一部の場合において、好適なＣ１Ｃ２キメラ光応答性タンパク質は、図７Ｉ（配列番号３７）に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２６】
一部の態様において、脱分極性光応答性ポリペプチドは、Ｓｃｈｅｒｆｆｅｌｉａ  ｄｕｂｉａ由来のＳｄＣｈＲポリペプチド（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＮｏ．：ＡＨＨ０２１３８）であり、このときＳｄＣｈＲポリペプチドは、細胞が光で照射されたときに、細胞膜を横断してカチオンを輸送することができる。ＳｄＣｈＲポリペプチドの活性化に使用する光は、約４４０から約４９０ｎｍの間の波長を有することができ、または約４６０ｎｍの波長を有することができる。ＳｄＣｈＲタンパク質は、さらに、ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含んで、光に対する感受性を増加もしくは減少、特定の波長の光に対する感受性を増加もしくは減少、及び／またはＳｄＣｈＲタンパク質における、細胞の形質膜の分極状態を調節する能力を増加もしくは減少させることができる。一部の場合において、ＳｄＣｈＲタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含む。ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含有するＳｄＣｈＲタンパク質は、細胞膜を横断してカチオンを輸送する能力を好適に保持する。一部の場合において、好適なＳｄＣｈＲタンパク質は、図７Ｊ（配列番号３８）に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２７】
一部の態様において、脱分極性光応答性ポリペプチドは、例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｎｏｃｔｉｇａｍａ由来のＣｎＣｈＲ２（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＮｏ．：ＡＨＨ０２１３９）であり、このときＣｎＣｈＲ２ポリペプチドは、細胞が光で照射されたときに、細胞膜を横断してカチオンを輸送することができる。ＣｎＣｈＲ２ポリペプチドの活性化に使用する光は、約５６０から約６３０ｎｍの間の波長を有することができ、または約６００ｎｍの波長を有することができる。ＣｎＣｈＲ２タンパク質は、さらに、ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含んで、光に対する感受性を増加もしくは減少、特定の波長の光に対する感受性を増加もしくは減少、及び／またはＣｎＣｈＲ２タンパク質における、細胞の形質膜の分極状態を調節する能力を増加もしくは減少させることができる。一部の場合において、ＣｎＣｈＲ２タンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含む。ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含有するＣｎＣｈＲ２タンパク質は、細胞膜を横断してカチオンを輸送する能力を好適に保持する。一部の場合において、好適なＣｎＣｈＲ２タンパク質は、図７Ｋ（配列番号３９）に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２８】
他の実施形態において、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、Ｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ  ｓｕｂｄｉｖｉｓａのＣｓＣｈＲ（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＮｏ．：ＡＨＨ０２１４４）タンパク質及びＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｎｏｃｔｉｇａｍａからのＣｎＣｈＲ１タンパク質に由来するＣｓＣｈｒｉｍｓｏｎキメラタンパク質であり、このとき当該タンパク質のＮ末端は、ＣｓＣｈＲのアミノ酸配列の残基１〜７３と、その後に続くＣｎＣｈＲ１のアミノ酸配列の残基７９〜３５０とを含み、光に応答性であり、細胞が光で照射されたときに、細胞内の脱分極性電流を媒介することができる。ＣｓＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質は、さらに、ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含んで、光に対する感受性を増加もしくは減少、特定の波長の光に対する感受性を増加もしくは減少、及び／またはＣｓＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質における、細胞の形質膜の分極状態を調節する能力を増加もしくは減少させることができる。加えて、ＣｓＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含むことができる。ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含有するＣｓＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質は、細胞膜を横断してカチオンを輸送する能力を好適に保持する。一部の場合において、好適なＣｓＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質は、図７Ｌ（配列番号４０）に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２９】
一部の態様において、脱分極性光応答性ポリペプチドは、例えば、Ｓｔｉｇｅｏｃｌｏｎｉｕｍ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｍ由来のＳｈＣｈＲ１（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＮｏ．：ＡＨＨ０２１０６）であり、このときＳｈＣｈＲ１ポリペプチドは、細胞が光で照射されたときに、細胞膜を横断してカチオンを輸送することができる。Ｓｔｉｇｅｏｃｌｏｎｉｕｍ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｍ由来のＳｈＣｈＲ１タンパク質の活性化に使用する光は、約４８０から約５１０ｎｍの間の波長を有することができ、または約５００ｎｍの波長を有することができる。ＳｈＣｈＲ１タンパク質は、さらに、ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含んで、光に対する感受性を増加もしくは減少、特定の波長の光に対する感受性を増加もしくは減少、及び／またはＳｈＣｈＲ１タンパク質における、細胞の形質膜の分極状態を調節する能力を増加もしくは減少させることができる。加えて、ＳｈＣｈＲ１タンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含むことができる。ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含有するＳｈＣｈＲ１タンパク質は、細胞膜を横断してカチオンを輸送する能力を好適に保持する。一部の場合において、好適なＳｈＣｈＲ１タンパク質は、図７Ｍ（配列番号４１）に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１３０】
一部の実施形態において、好適な過分極性光応答性ポリペプチドは、細胞が光で照射されたときに、細胞膜を横断して１つ以上のプロトンを輸送することができる、アーキロドプシン（Ａｒｃｈ−ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＮｏ．：ＡＤＢ０３１１１）プロトンポンプ（例えば、Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ  ｓｏｄｏｍｅｎｓｅ由来のプロトンポンプ）である。Ａｒｃｈタンパク質は、さらに、ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を有して、光に対する感受性を増加もしくは減少、特定の波長の光に対する感受性を増加もしくは減少、及び／またはＡｒｃｈタンパク質における、細胞の形質膜を横断してイオンを輸送する能力を増加もしくは減少させることができる。加えて、Ａｒｃｈタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含むことができる。ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含有するＡｒｃｈタンパク質は、光に応答してターゲット細胞の細胞膜を横断してイオンを輸送する能力を好適に保持する。一部の場合において、好適なＡｒｃｈタンパク質は、図７Ｎ（配列番号４２）に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１３１】
一部の実施形態において、好適な光活性化タンパク質は、細胞が光で照射されたときに、細胞膜を横断して１つ以上のプロトンを輸送することができる、アーキロドプシン（ＡｒｃｈＴ−ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＮｏ．：ＡＢＴ１７４１７）プロトンポンプ（例えば、Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ  ｓｐ．ＴＰ００９由来のプロトンポンプ）である。光は、約５３０から約５９５ｎｍの間の波長を有することができ、または約５６０ｎｍの波長を有することができる。ＡｒｃｈＴタンパク質は、さらに、ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含んで、光に対する感受性を増加もしくは減少、特定の波長の光に対する感受性を増加もしくは減少、及び／またはＡｒｃｈＴタンパク質における、ターゲット細胞の形質膜を横断してイオンを輸送する能力を増加もしくは減少させることができる。加えて、ＡｒｃｈＴタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含むことができる。ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含有するＡｒｃｈＴタンパク質は、光に応答してターゲット細胞の細胞膜を横断してイオンを輸送する能力を好適に保持する。一部の場合において、好適なＡｒｃｈＴタンパク質は、図７Ｏ（配列番号４３）に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１３２】
一部の実施形態において、光応答性ポリペプチドは、青色光に応答性であり、かつＧｕｉｌｌａｒｄｉａ  ｔｈｅｔａ由来のプロトンポンプタンパク質であり、このとき当該プロトンポンプタンパク質は、細胞が青色光で照射されたときに、細胞内の過分極性電流を媒介することができる（このようなタンパク質を、本明細書では「ＧｔＲ３タンパク質」または「ＧｔＲ３ポリペプチド」と称する）。ＧｔＲ３（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１７３０１４９８）タンパク質は、さらに、ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含んで、光に対する感受性を増加もしくは減少、特定の波長の光に対する感受性を増加もしくは減少、及び／またはＧｔＲ３タンパク質における、細胞の形質膜の分極状態を調節する能力を増加もしくは減少させることができる。加えて、ＧｔＲ３タンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含むことができる。ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含有するＧｔＲ３タンパク質は、光に応答して興奮性細胞（例えば、ニューロン）の形質膜を過分極する能力を好適に保持する。一部の場合において、好適なＧｔＲ３タンパク質は、図７Ｐ（配列番号４４）に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１３３】
一部の実施形態において、光活性化タンパク質は、細胞が光で照射されたときに、細胞膜を横断して１つ以上のプロトンを輸送することができる、Ｏｘｙｒｒｈｉｓ  ｍａｒｉｎａ（Ｏｘｙ−ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＮｏ．：ＡＤＹ１７８０６）プロトンポンプである。光は、約５００から約５６０ｎｍの間の波長を有することができ、または約５３０ｎｍの波長を有することができる。Ｏｘｙタンパク質は、さらに、ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含んで、光に対する感受性を増加もしくは減少、特定の波長の光に対する感受性を増加もしくは減少、及び／またはＯｘｙタンパク質における、ターゲット細胞の形質膜を横断してイオンを輸送する能力を増加もしくは減少させることができる。加えて、Ｏｘｙタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含むことができる。ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含有するＯｘｙタンパク質は、光に応答してターゲット細胞の細胞膜を横断してイオンを輸送する能力を好適に保持する。一部の場合において、好適なＯｘｙタンパク質は、図７Ｑ（配列番号４５）に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１３４】
一部の実施形態において、光応答性プロトンポンプタンパク質（本明細書では「Ｍａｃタンパク質」（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１３２８７９０５）と称する）は、光に応答性であり、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍａｃｕｌａｎｓに由来し、ここでＭａｃプロトンポンプタンパク質は、細胞が５２０ｎｍ〜５６０ｎｍの光で照射されたときに、細胞の膜を横断してプロトンを送り出すことができる。Ｍａｃタンパク質は、さらに、ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含んで、光に対する感受性を増加もしくは減少、特定の波長の光に対する感受性を増加もしくは減少、及び／またはＭａｃタンパク質における、細胞の形質膜の分極状態を調節する能力を増加もしくは減少させることができる。加えて、Ｍａｃタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含むことができる。ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含有するＭａｃタンパク質は、光に応答して興奮性細胞（例えば、ニューロン）の形質膜を横断してプロトンを送り出す能力を好適に保持する。一部の場合において、好適なＭａｃタンパク質は、図７Ｒ（配列番号４６）に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１３５】
一部の場合において、好適な光応答性クロライドポンプタンパク質は、Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓ  ｐｈａｒａｏｎｉｓに由来し、このようなタンパク質を本明細書では「ＮｐＨＲタンパク質」または「ＮｐＨＲポリペプチド」と称する。一部の実施形態において、ＮｐＨＲ（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：３７０２８２８）タンパク質は、琥珀色光及び赤色光に反応性であってもよく、ＮｐＨＲタンパク質が琥珀色光または赤色光で照射されたときに、興奮性細胞（例えば、ニューロン）内の過分極性電流を媒介することができる。ＮｐＨＲタンパク質を活性化し得る光の波長は、約５８０から６３０ｎｍの間であり得る。一部の実施形態において、光は約５８９ｎｍの波長であってもよく、または光は約６３０ｎｍ超（例えば、約７４０ｎｍ未満）の波長を有することができる。別の実施形態において、光は６３０ｎｍ前後の波長を有する。一部の実施形態において、ＮｐＨＲタンパク質は、光の連続パルスに曝露されたときに、神経膜を少なくとも約９０分間過分極することができる。加えて、ＮｐＨＲタンパク質は、ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含んで、光に対する感受性を増加もしくは減少、特定の波長の光に対する感受性を増加もしくは減少、かつ／またはＮｐＨＲタンパク質における、細胞の形質膜の分極状態を調節する能力を増加もしくは減少させることができる。一部の実施形態において、ＮｐＨＲタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、ＮｐＨＲタンパク質は、１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含む。ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含有するＮｐＨＲタンパク質は、光に応答して興奮性細胞の形質膜を過分極する能力を好適に保持する。一部の場合において、好適なＮｐＨＲタンパク質は、図７Ｓ（配列番号４７）に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１３６】
光応答性クロライドポンプタンパク質に関するさらなる開示は、米国特許出願公開第２００９／００９３４０３号及び第２０１０／０１４５４１８号、ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２８８９３号で見いだされ得る。これらのそれぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３７】
一部の実施形態において、好適な光応答性イオンチャネルタンパク質は、例えば、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ由来のＤｓＣｈＲタンパク質（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＮｏ．：ＡＥＹ６８８３３）であり、当該イオンチャネルタンパク質は、細胞が光で照射されたときに、細胞内の過分極性電流を媒介することができる。光は、約４７０ｎｍから約５１０ｎｍの間の波長を有することができ、または約４９０ｎｍの波長を有することができる。ＤｓＣｈＲタンパク質は、さらに、ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含んで、光に対する感受性を増加または減少、特定の波長の光に対する感受性を増加または減少、及び／またはＤｓＣｈＲタンパク質における、細胞の形質膜の分極状態を調節する能力を増加または減少させることができる。加えて、ＤｓＣｈＲタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含むことができる。ネイティブアミノ酸配列内に導入される置換、欠失、及び／または挿入を含有するＤｓＣｈＲタンパク質は、光に応答して興奮性細胞（例えば、ニューロン）の形質膜を横断してイオンを輸送する能力を好適に保持する。一部の場合において、好適なＤｓＣｈＲタンパク質は、図７Ｔ（配列番号４８）に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１３８】
一部の実施形態において、光応答性タンパク質は、Ａｒｃｈ−ＴＳ−ｐ２Ａ−ＡＳＩＣ  ２ａ−ＴＳ−ＥＹＦＰ−ＥＲ−２（Ｃｈａｍｐ）を含むキメラタンパク質である。本開示のＣｈａｍｐタンパク質は、Ａｒｃｈドメイン及び酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）−２ａドメインを含む。Ｃｈａｍｐの光活性化により、ＡＳＩＣ−２ａプロトン活性化カチオンチャネル（ＡＳＩＣ−２ａドメイン）を活性化するプロトンポンプ（Ａｒｃｈドメイン）が活性化される。一部の場合において、好適なＣｈａｍｐタンパク質は、図７Ｕ（配列番号４９）に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１３９】
一部の実施形態において、過分極性光応答性イオンチャネルは、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／２３０８７号に記載されているように、脱分極性光応答性イオンチャネルに基づいている。一部の実施形態において、光応答性アニオンチャネルポリペプチドは、Ｃ１Ｃ２タンパク質（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＮｏ．：ＡＨＡ４９６４６）に基づいている。一部の実施形態において、好適な過分極性光応答性ポリペプチドは、ＣｈＲ２タンパク質（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＮｏ．：ＡＥＲ２９８３５）のアミノ酸配列に基づいている。一部の実施形態において、好適な過分極性光応答性ポリペプチドは、Ｃ１Ｖ１タンパク質（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＮｏ．：ＡＥＬ２８９２４）のアミノ酸配列に基づいている。
【０１４０】
指示色素の使用
一部の場合において、ターゲット細胞は、自らの細胞膜内に本開示の変異型光応答性ポリペプチドを発現するように修飾され、このとき当該修飾ターゲット細胞は、指示色素を含む。指示色素は、細胞内カルシウムイオン濃度の変化、細胞内ナトリウムイオン濃度の変化などの検出を提供することができる。
【０１４１】
一部の場合において、指示色素は、蛍光色素である。このような場合において、対象となる蛍光色素としては、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テトラメチレンローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、スルホローダミン１０１酸クロリド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標））、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン、フィコエリトリン−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）（ＰＥＴＲ）、４−メチルウンベリフェロンなどが挙げられる。
【０１４２】
一部の場合において、指示色素は、カルシウム指示色素である。好適なカルシウム指示色素としては、例えば、Ｉｎｄｏ−１、Ｆｕｒａ−２、及びＦｌｕｏ−３、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ｆｌｕｏ−４などが挙げられる。
【０１４３】
一部の場合において、指示色素は、ナトリウム指示色素である。好適なナトリウム指示色素としては、例えば、ナトリウム結合ベンゾフランイソフタレート（ＳＢＦＩ）、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ（商標）、ＣｏｒｏＮａ（商標）Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｒｏＮａ（商標）Ｒｅｄなど、及びプロトン指示色素（２’，７’−ビス−（カルボキシエチル）−５−（及び−６−）−カルボキシフルオセイン（ＢＣＥＣＦ）など）が挙げられる。
【０１４４】
記憶想起を誘発する方法
本開示は、哺乳類対象における文脈記憶想起を誘発する方法であって、６００ｎｍ〜７００ｎｍの波長を有する光を、哺乳類対象におけるニューロンの単シナプス性前頭前野−海馬間突起に送達することを含み、当該突起が本開示の変異型光応答性ポリペプチドを含み、当該突起に光を送達することが当該突起を脱分極し文脈記憶想起を誘発する、方法を提供する。一部の場合において、当該前頭前野−海馬間突起は、前頭前野−海馬間突起である。一部の場合において、当該前頭前野−海馬間突起は、前帯状回−海馬間突起である。一部の場合において、当該突起は、海馬の錐体ＣＡ３／ＣＡ１細胞に対するものである。一部の場合において、前帯状回のニューロンは変異型光応答性ポリペプチドを含む。
【０１４５】
デバイス
本開示は、主題の方法（ターゲット細胞の活性を調整する方法、処置方法）の態様の実行に使用され得るシステム及びデバイスを提供する。一部の場合において、本開示のシステムは、上記の本開示の変異型光活性化ポリペプチドと、活性化波長の光をターゲット組織または細胞に送達するための１つ以上のデバイスとを含む。本開示の方法を実行する上で使用するデバイスとしては、本開示の変異型光活性化ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（または組換え発現ベクター）をターゲット細胞及び組織に送達するために使用され得るデバイス、本開示の変異型光活性化ポリペプチドをターゲット細胞及び組織に送達するために使用され得るデバイス、本開示の変異型光活性化ポリペプチドを発現するターゲット細胞を照射するために使用され得る光生成デバイス、ならびに特定のターゲット細胞または組織の送達を制御するために使用され得る制御デバイスが挙げられる。これらの構成要素のそれぞれが、以下でさらに説明される。
【０１４６】
送達デバイス
本開示の態様には、本開示の変異型光活性化ポリペプチド、または本開示の変異型光活性化ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（もしくは組換え発現ベクター）を、ターゲット細胞に送達するために使用され得る送達デバイスが含まれる。本開示の送達デバイスは、規則的な、不規則的な、プログラム化された、または医師もしくは患者により活性化される用量の本開示の変異型光活性化ポリペプチド、または本開示の変異型光活性化ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（もしくは組換え発現ベクター）を１つ以上のターゲット細胞に提供して、ターゲット細胞が変異型光活性化ポリペプチドを所望の期間発現し続けるように保証することができる。
【０１４７】
主題の送達デバイスは、概して、様々な構成要素を含むことができ、例えば、リザーバー、ポンプ、アクチュエーター、チューブ構成要素、針、カテーテル、及び主題の医薬組成物を患者のターゲット細胞または組織に送達するための任意の他の好適な構成要素を含むことができる。送達デバイスは、コンピューター化された操作を容易にする構成要素を含むこともでき、例えば、電源、メモリーを備えるプロセッサー、ユーザー入力デバイス、及び／またはグラフィカルユーザーインターフェースを含むことができる。一部の実施形態において、送達デバイスは、患者の体内に完全または部分的に移植可能であり得る。一部の実施形態において、送達デバイスは、介護者により操作される場合があり、このとき当該デバイスは、患者の身体の一部に、例えば患者の脳内に導入され、主題の医薬組成物は、ターゲット組織に、例えば患者の脳の一部に送達される。一部の実施形態において、医薬組成物の送達後、当該デバイスは除去されてもよい。他の実施形態において、当該デバイスは、後で追加の医薬組成物を送達するために所定の位置に保たれ得る。
【０１４８】
光生成デバイス
本開示の態様には、本開示の変異型光活性化ポリペプチドを発現するターゲット細胞に光を送達するために使用され得る光生成デバイスが含まれる。「光生成デバイス」、「光学アプリケーター」、及び「光アプリケーター」は、本明細書では互換的に使用される。本開示の実施形態による光生成デバイスは、概して、当該デバイスの１つ以上の光源から様々な異なる波長の光を産生することができる。一部の実施形態において、光生成デバイスは、本開示の変異型光活性化ポリペプチドを発現するターゲット細胞の周囲または近くに配置され得る、光カフまたはスリーブを含むことができる。一部の場合において、光源の一部または光源全体は、移植可能である。主題の光生成デバイスは、本明細書で開示される光活性化タンパク質を刺激するための任意の有用な構成をとることができる。例えば、一部の実施形態において、光生成デバイス（すなわち、光学アプリケーター）は、ターゲット細胞または組織の排他的な照射を容易にする構成要素を含むことができる。例えば、一部の実施形態において、光生成デバイスは、ターゲット細胞、ターゲット細胞の一部（例えば、神経細胞の特定の軸索）、または特定の解剖学的構造（例えば、神経線維の束、ターゲット組織、もしくは脊髄の一部）に対し、排他的に光を向けることができる。「排他的に光を向ける」とは、光生成デバイスが特定のターゲット構造にのみ光を送達し、他の構造を照射しないことを意味する。例えば、一部の実施形態において、光生成デバイスは、神経細胞の軸索を照射し、神経細胞のいかなる他の部分も照射しないように構成することができる。このようにして、光生成デバイスからの光は、照射された特定のターゲット構造における光活性化タンパク質のみに影響を及ぼす。
【０１４９】
本開示の態様には、光を１つ以上の２次元及び／または３次元のパターンで１つ以上のターゲット位置に送達するように構成された１つ以上の光源を含む光送達デバイス（すなわち、光学アプリケーター）が含まれる。ターゲット位置には、ターゲット組織及び／または解剖学的構造のうちの１つ以上の部分（例えば、複数の層）が含まれるが、これらに限定されない。あるいくつかの実施形態において、光送達デバイスは、複数の光源（例えば、複数のレーザー光源、発光ダイオード（ＬＥＤ）など）に加えて、光を所望の様式で曲げまたは形づくるように構成された任意の数の好適な光ガイドを含むことができる。光送達デバイスの例は、米国特許第８，５４５，５４３号に示されており、この開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５０】
一部の実施形態において、光生成デバイス（すなわち、光学アプリケーター）は、光活性化タンパク質を発現するターゲット細胞を含有する領域を完全に包囲せずに、Ｕ字形を有する場合がある。一部の場合において、光生成デバイスは、光生成デバイスを特定の領域またはターゲット構造（例えば、特定のニューロン領域）にガイドするために使用され得るアタッチメントアームを有することができる。アタッチメントアームは、光生成デバイスの移植後に除去してもよく、または光生成デバイスの位置を対象となるターゲット細胞の近くに固定するために所定の位置に残してもよい。
【０１５１】
一部の場合において、主題の光生成デバイスは、電源に接続した光を生成するための少なくとも１つの手段を有する内部ボディを備えることができる。一部の実施形態において、電源は、光生成デバイスに電力を供給するための内部バッテリーであり得る。一部の実施形態において、移植可能な光生成デバイスは、当該デバイスに電源を供給するために外部ソースからワイヤレス送信される電磁エネルギーを受信するための、外部アンテナを備えることができる。ワイヤレス送信される電磁エネルギーは、光生成デバイスに電源を供給するために外部ソースから送信され得る電波、マイクロ波、または任意の他の電磁エネルギーであり得る。一部の実施形態において、光生成デバイスは、例えば、半導体を用いて生産された集積回路または当技術分野で知られる他のプロセスにより制御される。
【０１５２】
一部の場合において、光生成デバイスは、発光ダイオード（ＬＥＤ）を備える。一部の実施形態において、ＬＥＤは、青色光及び／または緑色光を生成する。他の実施形態において、ＬＥＤは、琥珀色光及び／または黄色光を生成する。一部の場合において、いくつかのマイクロＬＥＤは、光生成デバイスの内部ボディに埋め込まれる。他の場合において、光生成デバイスは、固体レーザーダイオードまたは光を生成することができる任意の他の手段である。光生成デバイスは、本開示の変異型光活性化ポリペプチドの活性化に十分な波長と強度を有する光を生成することができる。一部の場合において、光生成デバイスは、約０．０５ｍＷ／ｍｍ２、０．１ｍＷ／ｍｍ２、０．２ｍＷ／ｍｍ２、０．３ｍＷ／ｍｍ２、０．４ｍＷ／ｍｍ２、０．５ｍＷ／ｍｍ２、約０．６ｍＷ／ｍｍ２、約０．７ｍＷ／ｍｍ２、約０．８ｍＷ／ｍｍ２、約０．９ｍＷ／ｍｍ２、約１．０ｍＷ／ｍｍ２、約１．１ｍＷ／ｍｍ２、約１．２ｍＷ／ｍｍ２、約１．３ｍＷ／ｍｍ２、約１．４ｍＷ／ｍｍ２、約１．５ｍＷ／ｍｍ２、約１．６ｍＷ／ｍｍ２、約１．７ｍＷ／ｍｍ２、約１．８ｍＷ／ｍｍ２、約１．９ｍＷ／ｍｍ２、約２．０ｍＷ／ｍｍ２、約２．１ｍＷ／ｍｍ２、約２．２ｍＷ／ｍｍ２、約２．３ｍＷ／ｍｍ２、約２．４ｍＷ／ｍｍ２、約２．５ｍＷ／ｍｍ２、約３ｍＷ／ｍｍ２、約３．５ｍＷ／ｍｍ２、約４ｍＷ／ｍｍ２、約４．５ｍＷ／ｍｍ２、約５ｍＷ／ｍｍ２、約５．５ｍＷ／ｍｍ２、約６ｍＷ／ｍｍ２、約７ｍＷ／ｍｍ２、約８ｍＷ／ｍｍ２、約９ｍＷ／ｍｍ２、または約１０ｍＷ／ｍｍ２（これらの数値における両端の値、中間の値を含む）のいずれかの強度を有する光を生成する。一部の実施形態において、光生成デバイスは、少なくとも約５Ｈｚ（例えば約２０Ｈｚまで）、少なくとも約１０Ｈｚ（例えば約２５Ｈｚまで、例えば約５０Ｈｚまで、例えば約７５Ｈｚまで、例えば約１００Ｈｚまで）の周波数で光を生成する。
【０１５３】
主題の光生成デバイスは、概して、約３５０ｎｍから約３６０ｎｍまで、約３７０ｎｍまで、約３８０ｎｍまで、約３９０ｎｍまで、約４００ｎｍまで、約４１０ｎｍまで、約４２０ｎｍまで、約４３０ｎｍまで、約４４０ｎｍまで、約４５０ｎｍまで、約４６０ｎｍまで、約４７０ｎｍまで、約４７５ｎｍまで、約４８０ｎｍまで、約４９０ｎｍまで、約５００ｎｍまで、約５１０ｎｍまで、約５２０ｎｍまで、約５３０ｎｍまで、約５４０ｎｍまで、約５５０ｎｍまで、約５６０ｎｍまで、約５７０ｎｍまで、約５８０ｎｍまで、約５９０ｎｍまで、約６００ｎｍまで、約６１０ｎｍまで、約６２０ｎｍまで、約６３０ｎｍまで、約６３５ｎｍまで、約６４０ｎｍまで、約６５０ｎｍまで、約６６０ｎｍまで、約６７０ｎｍまで、約６８０ｎｍまで、約６９０ｎｍまで、約７００ｎｍまで、約７１０ｎｍまで、約７２０ｎｍまで、約７３０ｎｍまで、約７４０ｎｍまで、及び／または約７５０ｎｍまでの範囲の波長を有する光を生成することができる。本開示の主題の光生成デバイスは、主題の光活性化タンパク質の活性化に十分な波長を有する光を生成することができる。このような光生成デバイスは、約５５０ｎｍ〜約６５０ｎｍ、約６００ｎｍ〜約７００ｎｍ、約６５０ｎｍ〜約７５０ｎｍの範囲の波長を有する光を生成することができる。
【０１５４】
一部の実施形態において、光生成デバイスは、約６００ｎｍ〜約７７５ｎｍの範囲の波長を有する赤色光を生成することができる。例えば、光生成デバイスは、約６００ｎｍ〜約６５０ｎｍ、約６２５ｎｍ〜約６７５ｎｍ、約６５０ｎｍ〜約７００ｎｍ、約６７５ｎｍ〜約７２５ｎｍ、約７００ｎｍ〜約７５０ｎｍ、約７２５ｎｍ〜約７７５ｎｍ、約６００ｎｍ〜約７００ｎｍの範囲の波長を有する赤色光を生成することができる。
【０１５５】
一部の実施形態において、好適な光生成デバイスは、光源からの光を送信しターゲット構造にその光を送達することができる１種以上の光ファイバーを備えることができる。光ファイバーは、プラスチック材料またはガラス材料を含むことができ、一部の実施形態では、光生成デバイスを堅い構造では収容されないであろう位置に容易に配置できるように好適に柔軟であってもよい。例えば、一部の実施形態において、光生成デバイスは、光を生成する光源に加えて、患者の体表面または体内の様々な位置に配置することができる１つ以上の光ファイバーを備えてもよい。光源からの光は、光ファイバーを通り、光ファイバー内のコーナー及び屈曲部を迂回し、光ファイバーの末端に現れてターゲット構造に光を送達する。
【０１５６】
一部の実施形態において、主題の光生成デバイスは、ターゲット組織を異なる波長の光で照射するために使用され得る複数の光源を備えてもよい。例えば、一部の実施形態において、光生成デバイスは、第１の波長の光（例えば、赤色光）を生成する第１の光源と、第２の波長の光（例えば、青色光）を生成する第２の光源と、を備えてもよい。このような光生成デバイスは、同じターゲット組織を両方の波長の光で同時に照射するために使用してもよく、またはターゲット組織を第１の波長の光及び第２の波長の光で交互に照射してもよい。一部の実施形態において、このような光生成デバイスは、同じ光源からの光を異なるターゲット組織に送達するために使用してもよい。例えば、一部の実施形態において、光生成デバイスは、第１の波長の光を第１のターゲット組織に送達し、第２の波長の光を異なるターゲット組織に送達してもよい。
【０１５７】
好適な光生成デバイスは、ターゲットエリアに光を送達するように構成され、あるいくつかの強度及び波長の光を生成するように構成された光源に作動可能に連結した、移植可能な光学アプリケーターを備えることができる。
【０１５８】
制御デバイス
本開示の態様には、主題のシステムの１つ以上の構成要素を制御または操作するように構成または適合された、コントローラー、プロセッサー（例えば、コンピューター）、及びコンピューター可読媒体を含む。一部の実施形態において、システムは、本明細書に記載のように、システムの１つ以上の構成要素と通信状態にあるコントローラーを含み、そして、システムの態様を制御するように、かつ／または主題のシステムの１つ以上の操作または機能を実行するように構成される。一部の実施形態において、システムは、プロセッサー及びコンピューター可読媒体（メモリー媒体及び／またはストレージ媒体が含まれ得る）を含む。コンピューター可読命令として具体化されるアプリケーション及び／またはオペレーティングシステムは、プロセッサーにより実行されて、本明細書に記載の一部または全ての機能を提供することができる。
【０１５９】
一部の実施形態において、システムは、ユーザーからの入力を受け取り、かつ本明細書に記載の方法の１つ以上を実行するように適合または構成されたユーザーインターフェース、例えば、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）を含む。一部の実施形態において、ＧＵＩは、データまたは情報をユーザーに表示するように構成される。
【０１６０】
本開示の態様には、主題の光生成デバイスから放出される光の量を制御または調整することができる、制御デバイスが含まれる。一部の実施形態において、制御デバイスは、光生成デバイスからターゲット組織に送達される光の波長及び／または強度を調整するように構成され得る。一部の実施形態において、制御デバイスは、光生成デバイスからターゲット組織に送達される光の周波数及び／または持続時間を調整するように構成され得る。例えば、一部の実施形態において、制御デバイスは、光生成デバイスからの光のパルスをターゲット組織に送達するように構成され得る。制御デバイスは、ターゲット組織が、例えば、規則的または不規則的な割合、ユーザー入力などにより、光生成デバイスからの光で照射されるように、光パルスの周波数及び／または持続時間を調整することができる。一部の実施形態において、制御デバイスは、約１ミリ秒以下から約１秒まで、約１０秒まで、約２０秒まで、約３０秒まで、約４０秒まで、約５０秒まで、約６０秒まで、またはそれ以上までの範囲の持続時間を有する光生成デバイスからの光のパルスを産生することができる。一部の実施形態において、制御デバイスは、１ミリ秒当たり１パルスから１秒当たり約１パルスまで、１分当たり約１パルスまで、１０分当たり約１パルスまで、２０分当たり約１パルスまで、３０分当たり約１パルスまでの周波数を有する光生成デバイスからの光のパルスを産生することができる。
【０１６１】
一部の実施形態において、主題の制御デバイスは、送信コイルにマウントされ得る電源を備えることができる。一部の実施形態において、バッテリーを電源に接続してバッテリーに電力を供給してもよい。スイッチを電源に接続して、操作者（例えば、患者または介護者）が手動で電源を起動または停止できるようにしてもよい。一部の実施形態において、スイッチを起動すると、電源は、制御デバイス上の送信コイルと移植可能な光生成デバイス（例えば、光カフまたはスリーブ）の外部アンテナとの間の電磁結合により、光生成デバイスに電源を供給することができる。送信コイルは、移植可能な光生成デバイスの近くにあると移植可能な光生成デバイス外部アンテナとの電磁結合を確立して、光生成デバイスに電力を補給し、光生成デバイスに１つ以上の制御シグナルを送信することができる。一部の実施形態において、制御デバイスの送信コイルと移植可能な光生成デバイスの外部アンテナとの電磁結合は、高周波磁気誘導結合であり得る。高周波磁気誘導結合を使用する場合、電波の操作周波数は、約１から２０ＭＨｚの間とすることができ、両端値を含み、これらの数字の間にある任意の値が含まれる（例えば、約１ＭＨｚ、約２ＭＨｚ、約３ＭＨｚ、約４ＭＨｚ、約５ＭＨｚ、約６ＭＨｚ、約７ＭＨｚ、約８ＭＨｚ、約９ＭＨｚ、約１０ＭＨｚ、約１１ＭＨｚ、約１２ＭＨｚ、約１３ＭＨｚ、約１４ＭＨｚ、約１５ＭＨｚ、約１６ＭＨｚ、約１７ＭＨｚ、約１８ＭＨｚ、約１９ＭＨｚ、または約２０ＭＨｚ）。ただし、受光器、赤外線、または生物医学的遠隔測定システムのような、他の結合手法を使用してもよい（例えば、Ｋｉｏｕｒｔｉ，“Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｌｅｍｅｔｒｙ：Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｉｍｐｌａｎｔｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｅｘｔｅｒｎａｌ  Ｗｏｒｌｄ”，Ｏｐｔｉｃｏｎ１８２６，（８）：Ｓｐｒｉｎｇ，２０１０を参照）。
【０１６２】
システム
本開示のシステムは、送達デバイス、光生成デバイス、制御デバイスを備える光刺激システムである。一部の場合において、主題のシステムは、本開示の核酸または組換え発現ベクターを含む容器（核酸または組換え発現ベクターは、本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む）、移植可能な光学アプリケーター、移植可能な光学アプリケーターに作動可能に結合した光源、コントローラー（すなわち、制御デバイス）、電源、及び移植可能な照度センサーを備える。一部の場合において、主題のシステムは、本開示の変異型光応答性ポリペプチドを含む容器、移植可能な光学アプリケーター、移植可能な光学アプリケーターに作動可能に結合した光源、コントローラー（すなわち、制御デバイス）、電源、任意の移植可能な照度センサーを備える。一部の場合において、移植可能な光学アプリケーターは、ターゲットとする組織構造に対し、移植後、ターゲットとする組織構造に隣接する位置において光を送達するように構成される。主題のシステムのコントローラーは、電源が光源に電流を流すようにさせて、移植可能な照度センサーからの出力シグナルに少なくとも部分的に基づいて、移植可能な光アクチュエーターに光子放出をもたらす。
【０１６３】
一部の実施形態において、本開示のシステムは、移植可能な光アプリケーターによりターゲットとする組織構造に向けられた光子の少なくとも一部をキャプチャーするように位置付けられた、移植可能な照度センサーを備える。当該システムは、さらに、移植可能な光学アプリケーターの照度に関連付けられた出力シグナルを、ターゲット組織構造と交差する前の光子放出位置で産生するように構成された、移植可能な入力センサーを備えてもよい。コントローラー（すなわち、制御デバイス）は、移植可能な出力センサーに作動可能に結合していてもよく、それにより、出力信号を移植可能な入力センサー及び移植可能な照度センサーの両方と比較して、予期しない損失が経験されているかどうかを判定することができる。コントラーは、所定の閾値損失レベルを超えた損失レベルに反応するように構成されてもよい。コントローラーは、コントローラーが維持するソフトウェアログファイルにおいて所定のレベルを超えている損失レベルのイベントをフラグ付けすることにより、反応するように構成されてもよい。コントローラーは、電源が光源に電流を流すのを停止するように構成されてもよい。
【０１６４】
本開示の移植可能な照度センサー及び入力センサーは、光起電力セル、フォトダイオード、焦電センサー、フォトレジスター、光導電体、フォトトランジスター、または光ガルバニセンサーであり得る。
【０１６５】
当該システムは、さらに、ターゲット組織構造への光の入力に応答して少なくとも部分的に変動すると考えられる生理学的パラメーターに関連付けられた出力シグナルを産生するように構成された生理学的センサーを備えてもよい。生理学的センサーは、例えば、筋電センサー、神経電気センサー、脳波センサー、心電センサー、圧力センサー、温度センサー、計量化学センサー、動作センサー、加速度計、ジャイロスコープ、ひずみセンサー、インピーダンスセンサー、または静電容量センサーであり得る。
【０１６６】
本開示のシステムにおけるコントローラーは、ある所定の閾値を超えている生理学的センサーの出力に反応するように構成されてもよい。コントローラーは、コントローラーが維持するソフトウェアログファイルにおいて所定のレベルを超えている損失レベルのイベントをフラグ付けすることにより反応するように構成されてもよい。コントローラーは、電源が光源に電流を流すのを停止するように構成されてもよい。
【０１６７】
これより図８を参照すると、第１の例である光刺激システム１００が示されている。光刺激システム１００は、本開示の変異型光応答性ポリペプチド、または本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸もしくは組換え発現ベクターを、ターゲット組織（例えば、患者の脳組織１０７）に送達するための、送達デバイス１０１を備える。また、光生成デバイス１０２、制御デバイス１０３、及び光生成デバイス１０２により生成された光を光カフ１０６上に位置付けられた光アレイ１０５に伝達するための、光ファイバー１０４も提供される。
【０１６８】
次に図９を参照すると、第２の例である光システム１１０が示されている。光刺激システム１１０は、本開示の変異型光応答性ポリペプチド、または本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸もしくは組換え発現ベクターを、ターゲット組織（例えば、患者の脳組織１０７）に送達するための、カテーテル１１２を備える。また、光生成デバイス１０２、制御デバイス１０３、及び光生成デバイス１０２により生成された光を光ファイバー１０４の末端に伝達するための、光ファイバー１０４も提供される。
【０１６９】
次に図１０を参照すると、第３の例である光システム１２０が示されている。光刺激システム１２０は、光生成デバイス１０２、制御デバイス１０３、及び光生成デバイス１０２により生成された光を患者の脊髄１２１に沿って様々な位置に伝達するための、光ファイバー１０４を備える。
【０１７０】
効用
本開示のターゲット細胞の活性を調整する方法は、様々な研究、診断、イメージング、及び処置用途に有用である。主題の方法は、概して、本開示の変異型光活性化ポリペプチド、または本開示の変異型光活性化ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（もしくは組換え発現ベクター）をターゲット細胞内に導入して、それにより、ターゲット細胞が光活性化カチオンチャネルタンパク質を発現しそれを膜内に挿入するようにすることと、ターゲット細胞を活性化波長の光で照射することと、を含む。ターゲット細胞を活性化波長の光で照射することにより、光活性化カチオンチャネルタンパク質は、１種以上のカチオンによるターゲット細胞の形質膜が通過できるようにする。カチオンがターゲット細胞の形質膜を通過することで、例えば、形質膜の膜電位調整のような所望の効果がもたらされる。一部の実施形態において、カチオン種の形質膜通過は、患者における１つ以上の神経学的応答またはプロセスの調整に使用することができ、そのため患者における疾患または状態の処置に使用することができる。そのため、一部の実施形態において、主題の方法は、患者のある状態、例えば神経学的状態を処置することを含む。一部の実施形態において、主題の方法は、患者のある状態、例えば神経学的状態を、本明細書で提供されるシステム及びデバイスを用いて処置することを含む。
【０１７１】
主題の方法を用いて、当業者であれば、興奮性細胞（例えば、ニューロン）の活性のｉｎ  ｖｉｖｏ記録及びイメージングを実施することができる。一部の実施形態において、ｉｎ  ｖｉｖｏカルシウムのイメージングは、各ニューロンに対し３０Ｈｚ以上で、１００以上のニューロンに実質的に同時に実施することができる。
【０１７２】
主題の方法は、ターゲット組織（例えば、脳）のニューロンの結合性の解析またはマッピングに使用することもできる。例えば、主題の方法は、解析対象ターゲット組織の局所的エリアにおける１つ以上のニューロンに対する刺激、または測定部位から離れた部位に対する刺激のいずれかに応答したターゲット組織ボリュームにおける複数のニューロンの個々の活性を測定するために使用することができる。当該刺激は、感覚的刺激、電極による電気的刺激、または光刺激であり得る。測定対象ニューロンの様々な刺激及び他の操作に応答した活性のパターンを観察することにより、ターゲット組織の観察エリアにおけるニューロンの結合性を推定することができる。
【０１７３】
一部の実施形態において、主題の方法による測定または刺激のターゲットとされるニューロン領域には、任意の新皮質領域が含まれる。適切な組織曝露を伴う好適なターゲット神経領域としては、視床下部、嗅内皮質及び海馬体皮質、乳頭体、隔壁、分界条床核、背側及び腹側線条体、視床、扁桃体、側坐核、脳幹、及び皮質下構造全般が挙げられる。ターゲット位置としては、細胞、細胞の一部、複数の細胞、神経線維の束、神経筋接合部、中枢神経系（ＣＮＳ）組織、末梢神経系（ＰＮＳ）組織、筋組織もしくは心臓組織、または解剖学的領域が挙げられ得る。
【０１７４】
活動電位が関係する疾患または状態のモデリング
一部の実施形態において、主題の方法は、対象におけるあるいくつかの疾患または状態、例えば、細胞内の活動電位の形成増加及び／または活動電位の不適切な形成促進が関与するまたはそれに起因する状態、の研究及び／またはモデリングに使用することができる。例えば、主題の方法は、ターゲット細胞（例えば、特定のターゲット神経細胞）内の活動電位形成を特異的に増加させて、当該細胞内の活動電位形成を促進することの効果を研究するために使用することができる。一部の実施形態において、主題の方法は、ターゲット細胞のあるいくつかの部分（例えば、ターゲット神経細胞の軸索）内の活動電位形成を選択的に増加させて、ターゲット細胞の選択部分内の活動電位形成を促進することの効果を研究するために使用することができる。このような方法は、ターゲット細胞もしくはその一部で活動電位が異常に高い割合で発火する疾患もしくは状態のモデルとして、またはターゲット細胞もしくはその一部で活動電位が誤形成される疾患もしくは状態のモデルとして使用することができる。
【０１７５】
一部の実施形態において、主題の方法は、ターゲット細胞もしくはその一部の内部での活動電位の異常形成に関連する疾患もしくは状態、またはターゲット細胞もしくはその一部の内部での活動電位形成の増加に関連する疾患もしくは状態における動物モデル（トランスジェニック動物モデルが含まれるが、これに限定されない）で使用することができる。例えば、一部の実施形態において、動物のターゲット細胞（例えば神経細胞、例えばげっ歯類の脳細胞）を主題の遺伝子操作された光活性化カチオンチャネルタンパク質と接触させて、ターゲット細胞がカチオンチャネルタンパク質を発現するようにしてもよい。次に、ターゲット細胞を活性化波長の光で照射して、ターゲット細胞内の活動電位形成を促進する。次に、当該動物におけるターゲット細胞またはその一部の内部での活動電位形成を促進することの効果を検討する。１種以上の遺伝子産物を過剰発現するトランスジェニック動物の使用、または１種以上の遺伝子産物を発現することができない「ノックアウト」トランスジェニック動物の使用は、ターゲット細胞内の活動電位形成における特定の遺伝子産物の役割を調べるために用いられ得る。
【０１７６】
スクリーニングの方法
一部の実施形態において、主題の方法は、例えば、ターゲット細胞内の活動電位形成またはターゲット細胞内の活動電位形成増加が関与する、疾患もしくは状態の処置に有効であり得る、化合物のスクリーニングに使用することができる。一部の実施形態において、スクリーニングの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで本開示の変異型光活性化ポリペプチドを含む細胞を培養することを含む。本開示の変異型光活性化ポリペプチドを発現する培養細胞を試験化合物と接触させ、次に細胞を活性化波長の光に曝露して、細胞またはその一部の内部での活動電位形成を促進する。細胞からの所望の効果または応答を誘発すると同時に活動電位形成を促進する試験化合物の能力は、特定の疾患または状態の処置に有用であり得る。
【０１７７】
一部の実施形態において、主題の方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏの非ヒト動物モデルにおける精神神経性疾患の診断指標または原因となる神経回路要素のスクリーニングに使用される。例えば、非ヒト動物は、本開示の変異型光応答性ポリペプチドを１つ以上のニューロン細胞、特にニューロン組織などで発現するように修飾され得る。対象となる精神神経性疾患としては、気分・情動障害、不安障害、精神障害、人格障害などが挙げられ得る。動物モデルは任意の好適なモデルであり得、げっ歯類、ネコ、イヌ、サル、及び非ヒト霊長類が含まれるが、これらに限定されない。精神神経性疾患のモデル化に使用する撹乱には、神経疾患または精神疾患の遺伝子モデルが含まれ、例えば、自閉症；カイニン酸もしくはピロカルピン誘発性てんかんまたは慢性ストレス誘発性うつ病のような慢性誘発モデル；及びケタミンまたはフェンシクリジン（ＰＣＰ）などの幻覚剤または精神障害誘発剤のような急性誘発モデルが含まれる。正常なターゲット組織のニューロンと異常なターゲット組織のニューロンとの間の活性パターンにおける相違を比較することにより、精神神経性障害の神経的関連性を識別することができる。そして、ターゲット組織のニューロンを光学的に制御することで、特定の精神神経性障害の原因となるニューロン活性パターンを識別することができる。このような操作から、可能性として新たな処置ターゲットがもたらされ得る。
【０１７８】
一部の実施形態において、主題の方法は、ニューロンの集団における所望の活性を伴う処置、例えば治療的処置を識別する方法で使用される。所望の結果が既知である場合、本発明のシステム及び方法は、所望の神経活性パターンをもたらす処置（薬理学的作用物質、非化学物質系治療的処置、行動処置、電気系、磁気系、または光学系の神経調整処置などを含むが、これらに限定されない）のスクリーニングに使用することができる。スクリーニングは、正常なモデルであっても、神経性障害のモデル（例えば、アルツハイマー病及びパーキンソン病、軽度認知障害、その他の認知症、ならびにダウン症候群、さらに統合失調症、自閉症、気分障害、感情障害、不安障害、及び人格／発達障害）であっても、任意の好適な動物モデルで実施することができる。
【０１７９】
処置方法
一部の場合において、主題の方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏのターゲット細胞の活性を調整することを含む。一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（または組換え発現ベクター）は、ターゲット細胞内に導入され、このときコードされた変異型光応答性ポリペプチドは、ターゲット細胞内で産生され、変異型光応答性ポリペプチドは、活性化波長の光に曝露することにより活性化される。一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（または組換え発現ベクター）は、変異型光応答性ポリペプチドがターゲット細胞内で産生されるように（例えば、変異型光応答性ポリペプチドがターゲット細胞の形質膜上に存在するように）必要とする個体に投与され、それにより、ターゲット細胞の活性が活性化波長の光により調整されるようになる。一部の場合において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドは、変異型光応答性ポリペプチドがターゲット細胞内に導入されるように（例えば、変異型光応答性ポリペプチドがターゲット細胞の形質膜上に存在するように）必要とする個体に投与され、それにより、ターゲット細胞の活性が活性化波長の光により調整されるようになる。本開示の変異型光応答性ポリペプチドが、ひとたび個体におけるターゲット細胞（複数可）の形質膜内に存在すると、ターゲット細胞（複数可）は、活性化波長の光に曝露され、それによりターゲット細胞（複数可）が脱分極される。
【０１８０】
一部の実施形態において、主題の方法は、患者の体内のターゲット細胞の活性電位をオプトジェネティクス的に調整することにより、患者のある状態または障害、例えば神経性状態または障害を処置するために使用される。一部の実施形態において、主題の方法は、本開示の変異型光応答性ポリペプチドを、患者の体内のターゲット組織内に導入することを含む。一部の実施形態において、本開示の変異型光応答性ポリペプチドのターゲット組織内導入は、主題の送達デバイスを用いて達成される。本開示の変異型光応答性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、組換え発現ベクター）をターゲット組織内に導入すると、ターゲット組織内のターゲット細胞（例えば、神経細胞）により変異型光応答性ポリペプチドが発現し、ターゲット細胞の形質膜内に挿入される。
【０１８１】
次に、光生成デバイスは、光生成デバイスを起動したときに、活性化波長の光でターゲット組織を照射するように位置付けられる。光生成デバイスは、（患者または介護者（例えば、医療機関職員）により）起動されてターゲット組織に光を送達し、本開示の変異型光応答性ポリペプチドにより、カチオン（例えば、ナトリウムカチオン）が形質膜を通過し、形質膜を脱分極し、それによりターゲット組織の細胞（複数可）内の活動電位形成を促進するようにする。
【０１８２】
そのため、細胞内の活動電位形成は、光パルスの効果及び結果として生じる形質膜の脱分極の持続期間の間増加する。したがって、主題の方法は、本開示の変異型光応答性ポリペプチドを神経細胞内に導入し神経細胞を光生成デバイスからの活性化波長の光で照射することによる、神経細胞内の活動電位形成の促進に使用することができる。活動電位増加の持続期間は、光パルスの持続期間より長く続くように調整することができるため、活動電位形成の増加は、連続的な光送達ではなく、パルス光の送達を用いて達成することができる。
【０１８３】
一部の場合において、本開示の方法は、ターゲット組織内の活動電位形成を促進することにより、対象の障害を処置することを含む。したがって、一部の場合において、主題の方法は、ターゲット細胞内に本開示の変異型光応答性ポリペプチドを導入することにより、対象を処置することを含む。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドをターゲット細胞内に導入すると、ターゲット細胞によりタンパク質が発現し、ターゲット細胞の形質膜内に挿入される。次に、ターゲット細胞を光生成デバイスからの活性化波長の光で照射すると、光活性化カチオンチャネルタンパク質により、カチオン（例えば、ナトリウムカチオン）が細胞の外側から細胞の内側に形質膜を通ることができるようになる。
【０１８４】
ひとたび細胞内に入ると、カチオンは膜を脱分極して活動電位形成を促進する。膜の脱分極により活動電位形成が促進され、そのため細胞は、膜の脱分極の効果が消失するまで、例えば、周囲の細胞（例えば、隣接する神経細胞）における活動電位の生成、神経伝達物質、修飾物質、またはホルモンの放出の媒介、筋収縮の媒介などを行うことができる。したがって、主題の方法は、ターゲット細胞内の活動電位形成を促進することにより、対象の障害を処置するために使用することができる。膜の脱分極の持続期間は、光パルスの持続期間より長く続くように調整することができるため、活動電位形成の促進は、連続的な光送達ではなく、パルス光の送達を用いて達成することができる。
【０１８５】
本開示の処置方法は、ターゲット細胞内、またはターゲット細胞の特定の部分に沿った活動電位形成の促進または増加が患者に治療効果をもたらすと考えられる、任意の疾患または状態の処置に使用することができる。主題の方法の治療応用の例としては、神経性障害、例えば、アルツハイマー病及びパーキンソン病、軽度認知障害、その他の認知症、ならびにダウン症候群、さらに統合失調症、自閉症、気分障害、感情障害、不安障害、及び人格／発達障害などが挙げられるが、これらに限定されない。特異性は、上述のように、軸索分岐または細胞の特定のサブドメインまたは部分における活動電位形成を促進することにより、達成することができる。
【０１８６】
一部の実施形態において、主題の方法は、オプトジェネティクス的制御（閉ループ制御）を用いて神経性状態または精神医学的状態のような状態または障害の処置で使用される。主題の方法を用いてニューロンのリアルタイム活性がモニターされることから、コントローラーは、イメージ化された活性シグナルに応答して、例えば、状態または障害の症状を処置または低減するようなやり方で、行動学的及び／または生理学的レベルでニューロンの活性を調整するように、構成してもよい。
【実施例】
【０１８７】
以下の実施例は、本発明の作製及び使用方法についての完全な開示及び説明を当業者に提供するために示されるものであり、発明者らが発明とみなすものの範囲を限定するようには意図されておらず、また以下の実験が実施された全ての実験である、すなわち以下の実験のみが実施された実験であることを表すようにも意図されていない。使用する数字（例えば、量、温度など）に関しては正確さを保証するよう努めたが、ある程度の実験的誤差及び偏差は考慮されるべきである。別段の指示がない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧前後である。標準的な省略形が使用され得る。例えば、ｂｐは塩基対（複数可）、ｋｂはキロベース（複数可）、ｐｌはピコリットル（複数可）、ｓまたはｓｅｃは秒（複数可）、ｍｉｎは分（複数可）、ｈまたはｈｒは時間（複数可）、ａａはアミノ酸（複数可）、ｋｂはキロベース（複数可）、ｂｐは塩基対（複数可）、ｎｔはヌクレオチド（複数可）、ｉ．ｍ．は筋肉内（に）、ｉ．ｐ．は腹腔内（に）、ｓ．ｃ．は皮下（に）などである。
【０１８８】
実施例１：ｂＲｅａｃｈ−ＥＳの特徴づけ
図１Ａ−１Ｋは、ＲｅａＣｈＲ及びｂＲｅａｃｈ−ＥＳの特性を示す。図１Ａは、ＲｅａＣｈＲ及びｂＲｅａｃｈ−ＥＳの図式的設計を示す。いずれのコンストラクトも、チャネルロドプシン１（ＣｈＲ１）とボルボックスチャネルロドプシン１及び２（ＶＣｈＲ１、ＶＣｈＲ２）とのハイブリッドである。矢印は、各セグメントにおける基礎的チャネルロドプシンにそれぞれ最後のアミノ酸（ａａ）のナンバリングを付したものを示す。ＲｅａＣｈＲは、追加的突然変異Ｌｅｕ１７１Ｉｌｅを含有する。ｂＲｅａｃｈ−ＥＳにおいて、ＲｅａｃｈＲの最初の５１ｎ末端残基を、チャネルロドプシン−２（ＣｈＲ２）からの最初の１１ｎ末端残基で置き換え、最後の５ｃ末端残基は完全に切断した。加えて、ｂＲｅａｃｈ−ＥＳは、突然変異Ｇｌｕ１２３Ｓｅｒ及びＬｅｕ１７１Ｉｌｅを含有する。図１Ｂは、ラット海馬由来の培養ニューロンにおいて０．６５ｍＷ／ｍｍ２で４００から６５０ｎｍの間の波長で測定したＣ１Ｖ１−ＴＴ、ｂＲｅａｃｈ−ＥＳ及びＣｈＲ２のスペクトル（それぞれｎ＝６）を示している。図１Ｃは、５７５ｎｍにおける定常光電流（左：Ｃ１Ｖ１−ＴＴ＝６３０ｐＡ、ｓ．ｅ．ｍ．＝１０９、ＲｅａＣｈＲ＝９６３ｐＡ、ｓ．ｅ．ｍ．＝１１３、ｂＲｅａＣｈＲ＝１３６５ｐＡ、ｓ．ｅ．ｍ．＝１２８）及び６３２ｎｍにおける定常光電流（右：Ｃ１Ｖ１−ＴＴ＝３１５ｐＡ、ｓ．ｅ．ｍ．＝１１１、ＲｅａＣｈＲ＝１００３ｐＡ、ｓ．ｅ．ｍ．＝９５、ｂＲｅａＣｈＲ＝８４１ｐＡ、ｓ．ｅ．ｍ．＝１０２）を示す。ラット海馬由来の培養ニューロンの電流増幅を、−８０ｍＶ及び５ｍＷ／ｍｍ２の光強度でそれぞれ測定した。図１Ｄは、単一指数関数的オフ反応速度（ｏｆｆ−ｋｉｎｅｔｉｃｓ）のタウ値として表現されたチャネル閉鎖の速度を示す（Ｃ１Ｖ１−ＴＴ＝７９ｍｓ、ｓ．ｅ．ｍ．＝３．７、ＲｅａＣｈＲ＝６８２ｍｓ、ｓ．ｅ．ｍ．＝８６、ｂＲｅａＣｈＲ＝４９ｍｓ、ｓ．ｅ．ｍ．＝４．４）。ｐ＜０．０００５。エラーバーは、平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）を表す。Ｃ１Ｖ１−ＴＴ：ｎ＝２６、ＲｅａＣｈＲ：ｎ＝６、ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ：ｎ＝２５。図１Ｅは、６３３ｎｍの光パルス（５ｍｓ、５ｍＷ／ｍｍ２）で興奮する培養ニューロンを発現するＲｅａＣｈＲ及びｂＲｅａＣｈ−Ｅｓの代表的な電圧トレースを示す。ＲｅａＣｈＲは反応速度が非常に遅いため、信頼性の高い活動電位は低周波でしか生成できなかった。ｂＲｅａＣｈＲ−ＥＳは加速的なチャネル閉鎖により、２０Ｈｚまで信頼性の高いスパイクを生成することができた。
【０１８９】
実施例２：
図２Ａは、内側前頭前皮質の注入部位付近の細胞体におけるオプシン発現及び扁桃体の下流の軸索線維におけるオプシン発現の共焦点画像を示す。スケールバー：１００μｍ。図２Ｂは、Ｃ１Ｖ１−ＴＴを発現するシナプス前終末の光パルス刺激（バー）に応答したシナプス後細胞の代表的な電圧及び電流クランプのトレースを示す。パルス長は５ｍｓであった。光波長は５７５／２５ｎｍに設定し、光パワー密度は５ｍＷ／ｍｍ２であった。
【０１９０】
実施例３：
図３Ａは、ホールセル記録パラダイムの概略図を示す。図３Ｂは、ｂＲｅａＣｈ−ＥＳを発現するシナプス前終末の光パルス刺激（バー）に応答したシナプス後細胞の代表的な電圧固定及び電流固定のトレースを示している。パルス長は５ｍｓであった。図３Ｃは、オプシンを発現するｍＰＦＣ細胞における定常光電流についての概括的な棒グラフを示す（Ｃ１Ｖ１−ＴＴ：ｎ＝１１、ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ：ｎ＝１０）。図３Ｄは、オプシンを発現するｍＰＦＣ細胞における光誘起されたスパイクの確率についての概括的な棒グラフを示す（Ｃ１Ｖ１−ＴＴ：ｎ＝１１、ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ：ｎ＝１０）。図３Ｅは、光誘起されたＥＰＳＣ増幅についての概括的な棒グラフを示す（Ｃ１Ｖ１−ＴＴ：ｎ＝１０、ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ：ｎ＝１８）。図３Ｆは、シナプス後細胞における光誘起されたスパイクの確率についての概括的な棒グラフを示す（Ｃ１Ｖ１−ＴＴ：ｎ＝１０、ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ：ｎ＝１７）。光波長は５７５／２５ｎｍに設定し、光パワー密度は５ｍＷ／ｍｍ２であった。データを平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｐ＜０．０５として提示する。
【０１９１】
実施例４：新皮質からの突起が記憶想起のトップダウン制御を媒介
以下に提示するデータは、単シナプス性前頭前野（主に前帯状回）から海馬（ＣＡ３／ＣＡ１）にかけての突起がマウスに存在し、この突起（ここではＡＣ−ＣＡと称する）にオプトジェネティクス的操作を行うことにより、文脈記憶想起を誘発できることを示すものである。
【０１９２】
材料及び方法
動物
野生型Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊの雄マウスを３〜５匹の集団でケージに収容し、逆転した１２時間の明／暗周期で飼育し、食物及び水は自由に与えた（例外として、バーチャルリアリティ行動実験では水を制限した。詳細は下記）。実験プロトコルは、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＩＡＣＵＣの承認を受けており、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにおける実験動物の管理と使用に関する指針のガイドラインを満たしている。各実験に使用する対象のターゲット数は、公表された研究で報告された数に基づいて決定した。サンプルサイズの予備決定には、統計的方法を使用しなかった。
【０１９３】
解剖学的追跡及び組織学
ウイルス注入は、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＩＡＣＵＣの承認を受けたプロトコル下で行い、定位固定装置（Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で１〜２％イソフルランで麻酔をかけたマウスに実施した。逆方向追跡のため、４〜５週齢の野生型雄マウスに対し、ｔｄＴｏｍａｔｏ（ＲＶ−ｔｄＴｏｍａｔｏ）２２でタグ付けした少量（２００ｎｌ）の高濃縮糖タンパク質除去狂犬病ウイルス（ＲＶ）を、１ｕｌハミルトンシリンジ及び３５ゲージ斜めカット針（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、ＵＭＰ３シリンジポンプ（ＷＰＩ）の制御下で、ゆっくりと（５０ｎｌ／分）背側海馬（Ａ／Ｐ：−１．５ｍｍ；Ｍ／Ｌ：＋１．７５ｍｍ；Ｄ／Ｖ：−１．８ｍｍ）に注入した。注入後、Ｖｅｔｂｏｎｄ組織接着剤（Ｆｉｓｃｈｅｒ）を用いて切開を閉じ、マウスを回復させ、５日間収容して発現させてから組織学的解析用にマウスの脳を採取した。順方向追跡の場合は、４〜５週齢の野生型雄マウスに対し、５００ｎｌのＡＡＶ５−ＣａＭＫＩＩα：：ＥＹＦＰ（力価：２ｘ１０１２ｖｇ／ｍｌ）を背側前帯状回（Ａ／Ｐ：＋１；Ｍ／Ｌ：−０．３５；Ｄ／Ｖ：＋１．２）に注入し（１５０ｎｌ／分）、３０日間収容して末端に発現させてから組織学的解析用に脳を採取した。
【０１９４】
組織学的解析のため、注入を行ったマウスに氷冷１ｘＰＢＳを経心的に灌流し、その直後に４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を灌流した。脳をＰＦＡ中で終夜固定し、次に３０％スクロース／リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）溶液に移した。冠状切片は、（ＲＶによる逆方向追跡用に）凍結ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ）で用意する４０μｍ、または（ＡＡＶ５による順方向追跡用に）ビブラトーム（Ｌｅｉｃａ）で用意する３００μｍのいずれかを採取し、さらなる処理を行うまで、凍結保護物質溶液（ＰＢＳ中２５％グリコール、３０％エチレングリコール）中で保管した。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色のため、スライスをＰＢＳ中で洗浄し、１：５０，０００のＤＡＰＩで２０分間インキューベートし、再びＰＢＳ中で洗浄し、次にＰＶＡ−ＤＡＢＣＯ（Ｓｉｇｍａ）でマウントした。走査型共焦点顕微鏡（ＴＣＳ  ＳＰ５、Ｌｅｉｃａ）及びＬＡＳ  ＡＦソフトウェア（Ｌｅｉｃａ）を使用して画像を取得し解析した。
ＰＦＣ−海馬シナプス特徴づけのための急性スライスによる電気生理学
【０１９５】
６〜８週齢のマウスからの急性脳スライスを、ＡＡＶ５−ＣａＭＫＩＩα：：ＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ＥＹＦＰをウイルス注入し、チャネルロドプシンが軸索末端で発現するのに十分な時間をかけた後に用意した。致死性麻酔をかけた後、マウスに冷たいスクローススライス溶液（下記参照）を経心的に灌流してから断頭し、その後速やかに脳を抽出し、氷冷スクロースベーススライス溶液（２３４ｍＭスクロース、２６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１１ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、２．５ＫＣｌ、１．２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ）に浸した。スクロース溶液中で冠状海馬スライス（厚さ３００μｍ）をＬｅｉｃａビブラトーム（Ｌｅｉｃａ  ＶＴ１０００Ｓ）で切断し、次に高張性回復溶液（オスモル濃度を８％増加させた人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ））中に３３℃で１５分間浸してから、標準的なＡＣＳＦ（１２３ｍＭ  ＮａＣｌ、２６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１１ｍＭグルコース、３ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、１．２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）に移してさらに３３℃で４５分間置いた。この時点でスライスは室温に移行された。
【０１９６】
ＣＡ３／ＣＡ１海馬ニューロンからのホールセルのパッチクランプ記録を、直立型Ｌｅｉｃａ  ＤＭ−ＬＦＳＡ顕微鏡で実施した。ホウケイ酸ガラス（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）ピペットの抵抗を３〜６ＭΩに引き寄せ、グルコン酸カリウム細胞内溶液（１３０ｍＭグルコン酸Ｋ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨをＫＯＨで７．３に調整）で満たした。電圧及び電流クランプの記録を、ｐＣｌａｍｐ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて実施した。リーク電流が−２００ｐＡ超または直列抵抗が３５ＭΩ超の細胞は除外した。光刺激は、３００Ｗ  ＤＧ−４ランプ（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を青色光用外部フィルター（波長（ｎｍ）／帯域幅（ｎｍ）：４７０／２０）と共に用いて実施した。光パルス（２〜５ｍｓパルス幅）を、４０ｘ、０．８ＮＡの水浸対物レンズを通じて４〜１０ｍＷ／ｍｍ２の光パワー密度で送達した。潜時は、光パルス開始からＥＰＳＣ開始までとして測定した。
【０１９７】
オプトジェネティクス及び行動
指示ウイルス（例えば、ＣｈＲ２、ｅＮｐＨＲ３．０、またはＥＹＦＰを発現するＣＡＶまたはＲＶ）を妥当な位置（例えば、帯状回、海馬、または内側中隔）に注入した後、図１４及び図１３に記載のように、４〜５週齢の野生型雄マウスに、直径２．５ｍｍ、０．２２ＮＡの金属フェルール及び厚さ２００μｍの、突出部分が切断され所望の長さにカットされたむき出しの光ファイバー（Ｔｈｏｒｌａｂｓ）からなるＩＦＬ（移植可能な光ファイバーライトガイド）を、先述のように３６、指示される刺激実験のために注入部位（典型的には注入部位から約０．２ｍｍ背面に）または末端に移植した。抑制実験用に、厚さ２００μｍ、０．２２ＮＡで０．７ｍｍ離間したデュアル光ファイバーカニューレを使用して前帯状回を双方向的にターゲットにし、３ｍｍ離間した２つのフェルールカニューレを使用して海馬を双方向的にターゲットにした。典型的には、マウスを回復させ、１ヵ月間収容して十分に発現させてから行動試験を行った。行動実験を受ける全ての動物は、逆転した１２時間の明／暗周期に順化させ、これを数日間運用し、行動試験の前には、実験を行うことになる部屋に少なくとも３０分間順化させた。
【０１９８】
恐怖条件付け装置は、格子状の床がショックジェネレーター及びスクランブラーに配線され、音響チャンバーに囲まれた、正方形の条件付けケージ（１８ｘ１８ｘ３０ｃｍ）からなるものであった（Ｃｏｕｌｂｕｒｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＰＡ，ＵＳＡ）。装置を改変して、想起試験中に光を送達できるようにした。文脈的恐怖条件付けは、マウスを条件付けケージ（視覚的手がかり：むき出しの壁、触覚的手がかり：格子状の床、嗅覚的手がかり：７０％エタノール）に６分間入れることにより実施し、条件付け文脈にマウスを入れてから２分後に第１のショックを提示し、それから各１分間隔で７ｍＡの２秒ショックパルスを４回受けさせた。同じコホートの動物の一部には、恐怖条件付けを行わずに対照群としての役目を果たさせ、単に同じ量の時間（６分間）条件付け文脈に曝露しただけでいかなる関連ショックも受けさせなかった。次の日、全てのマウスに対し、別の「ニュートラルな」ケージ（視覚的手がかり：有色の形状、触覚的手がかり：滑らかなペーパータオルで覆われたプレキシグラスの床、嗅覚的手がかり：１％酢酸）で光媒介による恐怖想起の試験を行った。
【０１９９】
刺激実験については、光ファイバーコネクターを通じての光刺激を、４７３ｎｍレーザーに接続したパッチコードを通じて、３０秒光オン／１分光オフのセッションで光を送達することにより管理した。光オンセッション中の刺激は、２０Ｈｚ、１５ｍｓパルス、ファイバー先端出力８〜１０ｍＷで送達した。次に３日目に、全てのマウスを元の条件付け文脈に２．５分間戻して、インタクトな自然の恐怖記憶想起を評価した。一部の場合において、後続的な恐怖記憶消去を実施した。これは、マウスを元の条件付けチャンバーに３日続けて各５分間、ショックを与えずに入れることにより行った。次に、光誘発性恐怖想起の試験を、最後の消去訓練セッションの２４時間後、ニュートラル文脈で行った。動物を、再び条件付け文脈に６分間の１間隔分配置し、７ｍＡの２秒ショックパルスをそれぞれ１分間隔で４回与えることにより、後続的な復元を実施した。最後の光誘発性恐怖想起試験を、上述のように２４時間後に実施した。
【０２００】
機能喪失実験については、光ファイバーコネクターを通じての光抑制を、５８９ｎｍレーザーに接続したデュアルパッチコードを通じて光を送達することにより管理した。８〜１０ｍＷの一定の光をファイバー先端で使用して細胞体または末端における抑制を送達した。１日目に、ｅＮｐＨＲ３．０及びｅＹＦＰ対照群の両方に対し、上述のように文脈的恐怖条件付けを行い、２日目に、マウスに通常通り、最初の２分間の光オフの間に想起を実施して、各動物におけるベースラインすくみ反応を評価した。そして、次の３０秒間光をオンにした（消去に関する非すくみ潜時は、典型的な２〜３分想起プロトコルの次の時点の光に関する非すくみ潜時と混同する恐れがあるため、これより長くしなかった）。３０秒の光セッションの間のすくみ反応スコアを、光オフセッション直前３０秒間のすくみ反応パーセントと比較した。３日目に、全てのマウスに、２分間光オフを伴った条件付け文脈における想起を受けさせ、光誘発性行動の逆転を試験した。文脈条件付け及び想起の後、次は全てのマウスに聴覚的手がかりによる条件付けを受けさせた（文脈及び手がかりの両方に対するロバストな条件付けを確保するため、手がかりによる条件付けは、文脈条件付けとは別個に行った。というのも、これらを一緒に実施すると、マウスは音（より顕著な手がかり）に対するロバストな条件付けを発達させ、文脈に対しては弱い条件付けしか発達させないことが多いためである）。聴覚的手がかりによるＦＣを実施するため、マウスを別の文脈（視覚手がかりとしての有色の形状、滑らかな床）に６分間配置し、最初の２分経過後、２．９ｋＨｚの音からなる２０秒の聴覚的手がかりを４回、１分間隔で、それぞれ２秒の７ｍＡショックの後に再生した。次の日の想起は、音を１分間隔で４回提示し（２回は光オフ中、２回は光オン中に）、すくみ反応のパーセントの評価を、音提示後２０秒と音提示の直前２０秒について、光オフ及び光オンの両条件で比較して行った。潜時測定を、同じコホートを用いて別個の実験として実施した。文脈的条件付け及び手がかりによる条件付けの終了後、マウスを最初の条件付け文脈に再び訓練した（文脈的恐怖条件付けを行った）。次の日、２分の想起を、条件付け文脈において終始光オンの状態で実施して、すくみ反応の潜時を試験した。ここで潜時は、動物が連続５秒間動かない最初の時間として定義した。処置群を知らされていない実験者が、全実験におけるすくみ反応をスコア化した。実験群及び対照群に対する動物の無作為化を、実験者が明示的な無作為化アルゴリズムを使用することなく実施した。全ての結果をスチューデントｔ検定または２方向ＡＮＯＶＡにより解析し、その後、適用可能な場合は事後検定を行った。
【０２０１】
海馬頭蓋窓（Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  Ｃｒａｎｉａｌ  Ｗｉｎｄｏｗ）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスに対し、５００ｎＬのＡＡＶｄｊ−ＣａＭＫＩＩα：：ＧＣａＭＰ６ｍをＣＡ３（Ａ／Ｐ：−１．７、Ｍ／Ｌ：＋１．９、Ｄ／Ｖ：−１．９）に注入し、少なくとも１週間回復させてから、過去に記載のある海馬調製物（ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｐｒｅｐｓ）２４に類似する、光アクセス用の頭蓋窓の外科的移植をＣＡ３上方で行った。簡潔に述べると、マウスに対し８０ｍｇ／６ｍｇ／ｋｇのケタミン／キシラジンを腹腔内注入し、終始１．０〜２．０％イソフルラン下で維持した。ＣＡ３へのアクセスに最適な窓配置にするため、手術中ＣＡ３注入部位における頭蓋骨の位置が水平でありかつ頭部の背側から見て正確に垂直になるようにマウスの頭部を傾けた。円形のチタンヘッドプレート（直径７ｍｍ）をＣＡ３上方の中央に置き、接着セメント（Ｍｅｔａｂｏｎｄ；Ｐａｒｋｅｌｌ）で頭蓋骨に接着し、トレフィン（Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて中央部に約３ｍｍの開頭術を行った。皮質領域Ｓ１及び頭頂連合皮質の一部を、脳室を回避するよう注意しながら真空吸引し、海馬の上方に白質が見えるようになるまで行った。真空吸引は、２７ゲージのブラントニードルを用いて、冷却した１ｘＰＢＳで灌注しながら行った。海馬の上方にある白質の最上層を、３１ゲージのブラントニードルを用いた真空吸引によりさらに除去したが、外包の深層及び白板を保存するよう注意した（海馬の求心性及び遠心性を保存するため）。鉗子を使用して円柱状のホウケイ酸ガラスインプラントを手動で挿入し、インプラントの底が海馬に対し静止するまで挿入した。インプラントは、直径３．０ｍｍのガラスキャピラリー管（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ  ＆  Ｄｉｍｍｏｃｋ）を長さ１．５ｍｍにカスタムカットしたものの一端を、ＵＶ硬化光接着剤（Ｎｏｒｌａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いて直径３．０ｍｍの厚さ＃０カバーガラス（Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に接着して構築した。次に、開頭部から突出しているインプラントの上面を、Ｍｅｔａｂｏｎｄ接着セメントを用いて頭蓋骨に固定した。手術後、マウスに５ｍｇ／ｋｇのカルプロフェンを皮下投与し、少なくとも１週間回復させてから行動訓練を行った。
【０２０２】
上記操作（ＣＡ３へのＧＣａＭＰ６ｍウイルス注入、ＧＣａＭＰ６ｍ発現、及び皮質のいくつかの領域に対する外科的掘削）が海馬の正常な生理学的特性に影響を及ぼさないことを保証するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの弱発現ｖｓ．強発現ＣＡ３ニューロンにおけるＣａ２＋依存的生理学、ｉｎ  ｖｉｖｏでの弱発現ｖｓ．強発現ＣＡ３ニューロンにおける自発的活動、及びカニューレ設置前後の行動測定値を評価するための対照実験を実施した（図１６）。
【０２０３】
バーチャルリアリティ行動
過去に報告されたバージョン２４，５１を改変してカスタム構築したバーチャルリアリティ環境を使用した。直径２００ｍｍの発泡スチレンボール（Ｇｒａｈａｍ  Ｓｗｅｅｔ  Ｓｔｕｄｉｏｓ）を直径６ｍｍのアセンブリーロッド（Ｔｈｏｒｌａｂｓ）で軸固定し、ボールの中央に通して、各端部を９０°ポストホルダー（Ｔｈｏｒｌａｂｓ）に載せ、ボールが前後に回転できるようにした。マウスの頭を、ヘッドプレートマウントを用いて、ボールの中心の上方の所定の位置に固定した。バーチャル環境をゲーム開発ソフトウェアＵｎｉｔｙ３ｄ（ｕｎｉｔｙ３ｄ．ｃｏｍ）で設計した。バーチャル環境は、マウスの中央の約２０ｃｍ前に配置した直径１４インチの透明アクリル半球にプロジェクタースクリーンファブリックを広げたものに対し、逆投影で表示した。スクリーンは、マウスの視野の約２２０°を包囲する。バーチャル環境は、２つのレーザー走査型プロジェクター（Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ）（各プロジェクターがスクリーンの半分をカバーした）を用いて、このスクリーンに対し逆投影した。３ｄスクリーン上に平坦なイメージを作成するため、バーチャル環境の２ｄイメージを、ビデオ操作ソフトウェア（Ｍａｄｍａｐｐｅｒ）を用いて変形した。当該ゲームエンジンにより、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔまたはＣ＃で書いたスクリプトは、ＴＣＰソケットを介してカスタムＰｙｔｈｏｎ制御ソフトウェアと通信することにより、マウスのバーチャル環境との相互作用に基づいて外部事象を引き起こすことができた。ＬａｂＪａｃｋＵ６（ｈｔｔｐ：／／ｌａｂｊａｃｋ．ｃｏｍ）を使用して、バーチャル環境事象及びイメージングフレーム時間のタイムロック、リッコメーター（Ｉｓｌａｎｄ  Ｍｏｔｉｏｎ）からの受信ＴＴＬパルスに伴うマウスのリッキング行動の記録、ならびにソレノイド開口型水報酬（リッコメーターに接続した管に取り付けた重力援用シリンジから送達）及び嫌悪エアパフ（圧縮空気タンクから管に至り、末端のピペット先端がマウスの鼻先に面している）を送達するためのＴＴＬパルス送信を行った。触覚的手がかり及び嗅覚的手がかりを、２つの別々の文脈に相当する２つの発泡スチレンボールのそれぞれに、直接固定した。聴覚的刺激は、動物の後方に位置するスピーカーを通じて提示した。ボール上のマウスの動きを、バーチャル環境ソフトウェアとインターフェイス接続する光学コンピューターマウス（Ｌｏｇｉｔｅｃｈ）を用いて記録した。
【０２０４】
バーチャル環境における恐怖条件付けのため、マウスに水制限を行い（＞８０％欠乏前体重）、ハンドリング、頭部固定、及びバーチャル環境に少なくとも２週間慣れさせ、ボール上にいる間、少量の水報酬（約０．５μｌ／１０リック）を自由に使えるようにさせた。２週間（１回の５分セッション／日）の終わりまでに、マウスは、ボール上で安楽かつ注意深い様子になっていた。慣らしの後、マウスは４日間の恐怖条件付け訓練及び試験プロトコルを受けた。１日目に、マウスを、視覚（青色の三角形ｖｓピンク色の縦縞）、触覚（ランニングボールに固定されたベルクロの滑らかな面ｖｓベルクロの鋭い面）、臭気物質（酢酸ｖｓエタノール）、及び聴覚的手がかり（８ｋＨｚの位相音（ｐｈａｓｉｃ  ｔｏｎｅ）ｖｓ  ３ｋＨｚの純音）において異なる２つの文脈に、５分ずつ曝露した。２日目に、恐怖文脈の間の５分間にわたり、ランダムな時間間隔でマウスの鼻先に８回の嫌悪エアパフを与え（５００ｍｓ、１０ｐｓｉ）、ニュートラル文脈の間の５分間にはこれを行わなかった。３日目及び３０日目に、想起のため、再びマウスを２つの文脈のそれぞれに５分間配置した。
イメージング
【０２０５】
５匹のマウスに対するイメージングを、全日程にわたり、５分セッション、曝露、訓練、想起の間行った。共振型ガルバノメーター２光子顕微鏡（Ｐｒａｉｒｉｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。遺伝子コード型カルシウム指示物質のＧＣａＭＰ６ｍを全ての実験で使用した（ＧＣａＭＰ６ｍは、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃４０７５４からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、ＣａＭＫＩＩａプロモーターの制御下でＡＡＶバックボーンにサブクローニングした）。全ての実験は、ＧＣａＭＰ６ｍを励起するのにＣｏｈｅｒｅｎｔ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩチタンサファイアパルスレーザーを９２０ｎｍにして使用し、数滴の滅菌水を介し移植カニューレと界面接続する２０ｘ０．５  ＬＵＭＰｌａｎＦＬ／Ｎ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）水浸対物レンズを通じて実施した。蛍光は、ガリウムヒ素リン（ＧａＡｓＰ）光電子増倍管（ＰＭＴ）を介し、ＰｒａｉｒｉｅＶｉｅｗ取得ソフトウェアを用いて検出した。高速ｚスタックを、緑色チャネルにおいて（５２０／４４バンドパスフィルター、Ｓｅｍｒｏｃｋを使用）、５１２ｘ５１２ピクセル（約１００μｍの深度にわたり（約１０〜２０μｍ離して３〜７のｚスライス）５００μｍｘ５００μｍの各ｘ−ｙ平面をカバー）にて、３０Ｈｚ高速共振走査（ｘ−ｙ）をＺピエゾにカップリングすることにより収集し、ボリューム当たり約６Ｈｚを達成した。
データ解析
【０２０６】
以下に、細胞の抽出（前処理）、細胞レベルの活性（ｄＦ／Ｆ）測定値の取得（処理）、及び集団レベルの活性測定値（後処理）の評価の方法を示す。後処理されたデータの統計処理では、パラメトリック検定及びノンパラメトリック検定の両方を適宜用いた。正規性を評価することができない（サンプルサイズが小さい）場合、顕著な外れ値が存在しないこと（グラブス検定により）及び群間の分散が有意に異ならないこと（ルビーン検定により）を確実にした。
【０２０７】
１．前処理（細胞抽出）
時系列のデータセットを、ＩｍａｇｅＪのプラグインＳｔａｃｋ  Ｒｅｇにより、剛体変換を用いてｘ−ｙ運動補正した。次に、細胞抽出を、最初に細胞セグメントを自動で計算し、次に見落とされた細胞、非細胞、または結合細胞について手動で品質制御することにより、順次実施した。最初の自動抽出については、画像の閾値輝度、分散、及び歪度に基づいた基準を使用した。最大輝度における明確な閾値が細胞及びバックグラウンドを分ける高コントラスト−ノイズ比の画像は、完全に前者でセグメント化した。残りの場合においては、時間の標準偏差（活性細胞は高い）、または時間にわたる輝度の歪度（非対称性）に基づいて、細胞をバックグラウンドから区別した。この結果、各ボクセル位置（ｉ、ｊ、ｋ）における細胞マスクを定義するための一般的な数学的基準が得られた。
【０２０８】
2018529335.tif 000003
【０２０９】
2018529335.tif 000004
【０２１０】
式中、Ｉは、指示関数（条件が満たされる場合１）であり、
2018529335.tif 000005
は、次式のように定義される経時的な輝度の標準偏差であり、
【０２１１】
2018529335.tif 000006
；
【０２１２】
歪度は、次式のように定義される。
【０２１３】
2018529335.tif 000007
【０２１４】
Ｅは、期待値演算子であり、Ｆｃ、σｃ、及びｓｃは、それぞれ画像輝度のカットオフ、標準偏差、及び歪度を表す。係数α、β、及びγは、画像に固有に基づいて選択され、閾値処理が十分である場合はβ及びγはゼロに選択され、それ以外の場合、係数は、活性細胞の最大集団を含む細胞マスクを取得するように反復される（点検により評価）。
【０２１５】
自動細胞抽出の次に、手動による細胞ごとのキュレーションを行い、自動化アルゴリズムを用いて抽出されなかった細胞を特定した。これは、元のイメージングにおける非並進運動アーチファクト、及び／または細胞とバックグラウンドとを区別する明確なカットオフＦｃ、σｃ、及びｓｃの欠如が原因で、細胞の境界がキャプチャーされない場合に生じ得る。これらの場合に関しては、細胞検出は、自動化細胞マスクの生画像データとの比較を含む手動編集ステップにより実施し、ガウスフィルターを使用することにより編集画像に適用してエッジを軽減し、エッジ検出を使用して細胞の境界を画定した。得られた細胞の内部を埋め、最終的な細胞マスクを削ってニューロピルシグナルの混入を最小化した。各細胞を、次の段階用に一意の識別子で標識した。カスタム記述したＭＡＴＬＡＢスクリプトを全ステップで使用した。
【０２１６】
２．処理
ｄＦ／Ｆの算出：
【０２１７】
ステップ１で識別された各細胞について、ＲＯＩ内の全ピクセルにわたり平均化して、各フレーム（単一の時点に対応）について空間平均値
2018529335.tif 000008
を算出することにより、輝度値Ｆを取得した。これらを、各細胞におけるｄＦ／Ｆを定義するために使用した。すなわち
【０２１８】
2018529335.tif 000009
【０２１９】
式中、
2018529335.tif 000010
は、所与の細胞の蛍光値の平均値として計算され、蛍光におけるゆっくりしたタイムスケール変化を説明するために２０秒の動作時間ウインドウにわたり連続的に獲得される、ベースライン蛍光である。データセットにおけるニューロンの希薄な発火を考慮すると、この平均値は、ベースライン活性（蛍光）の的確な推定値としての役割を果たすものであった。さらに、本研究の主な結果は、ベースラインとして中央値または８パーセンタイルを使用することによる影響を受けなかった（そして、相関はベースラインの定義とは無関係であった）。
ニューロン応答の統計的解析：
【０２２０】
Ｄｏｍｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）２４で概説されているものと同様のアプローチを使用して、各ニューロンにおける顕著な過渡応答を特定し、さらに運動アーチファクトに関連し得る影響を推定し除去した。簡潔に述べると、シグナルにおいて、運動に関連する可能性がある蛍光変化の発生率を推定するため、ｄＦ／Ｆトレースにおける全ての負の偏りを運動によるものとみなした。運動に関連する蛍光変化は、同様の可能性で正方向の変化も負方向の変化ももたらすはずであるため、運動に起因し得る、ｄＦ／Ｆ曲線における正及び負の偏りは、同じ頻度で発生するはずであり、これらは、負方向の過渡応答の発生率を運動に関連する正方向の過渡応答の推定率として使用することにより、シグナルから差し引くことができる。
【０２２１】
統計的に有意な過渡応答を決定するため、最初に、反復アプローチを用いた各細胞についてのノイズ推定値を以下のように算出した：（ｉ）シグナル及びノイズを分けるカットオフ値を初期化する、（ｉｉ）カットオフを下回る全てのｄＦ／Ｆ値の標準偏差（σ）を算出する、（ｉｉｉ）３σをカットオフと比較する。この解析における目標は、神経的事象を含む可能性の低い期間に対し定義されるノイズの標準偏差（σ）の推定値を見いだすことであった（すなわち、ノイズのσを推定するには、実際の事象を含むと考えられる全体の時間に対する標準偏差を算出するのではなく、反復アプローチを使用した）。解析の各反復について、｜カットオフ−３σ｜＜許容値（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）の場合、プログラムを終了した（許容値＝０．０２）。カットオフ＞３σの場合、プログラムはカットオフを１０％増加させ、ステップ１に戻る。カットオフ＜３σの場合、プログラムはカットオフを１０％減少させ、ステップ１に戻る。このアプローチは、ｄＦ／Ｆにおいて神経活性がもたらす事象がノイズの推定に含まれないことを補償する助けとなり、またノイズを推定するために、細胞ごとに事象を含まない時間間隔を手動で選択する必要性を回避するものであった。
【０２２２】
続いて、偽陽性率をさらに確定するために、正方向及び負方向の過渡応答を解析した。過渡応答オンセットは、ｄＦ／Ｆが２σを超える時間として定義され、オフセットは、所与の過渡応答が０．５σ３を下回る時間として定義される。種々の持続時間について、各σ閾値（すなわち、＞２σ、＞３σ、＞４σ）に存在する過渡応答の数のヒストグラムを抽出した。負方向の過渡応答は座標の左側にあり、赤色でプロットされている（図１８Ｃ〜図１８Ｆ）。負方向対正方向の過渡応答数の比率は、３つの振幅レベル（２σ、３σ、４σ）にわたり、種々の過渡応答持続期間について算出され、偽陽性率の推定値としての役割を果たす。上述の推論に従えば、運動に基づいたノイズが顕著にシグナルを上回る場合、この比率は５０％となる。上記の異なるシナリオについての偽陽性の比率をプロットし、（σにおける）振幅及び持続時間カットオフ（図１８Ｃ〜図１８Ｆ）において、偽陽性率を５％未満に減少させる必要のあるものを選択した。Ｄｏｍｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７で言及されているように、重要なことは、このノイズ推定値は上限に相当するものであり、運動以外の他のノイズ源（すなわち、光子ショットノイズ）による影響を受ける可能性も考えられることに留意することである。
【０２２３】
ニューロンペア間の相関係数の算出：
【０２２４】
細胞の各ペア（ａ及びｂ）間のピアソン相関係数を、以下のように算出した。
【０２２５】
2018529335.tif 000011
【０２２６】
この基準は、２つの細胞におけるシグナル間の一次従属性を測定し、細胞シグナルのスケーリングまたは振幅変換に対しては不変である。サイズＮ細胞ｘＮ細胞の相関係数のマトリックス（式中、各エントリーは対応する行及び列により識別される細胞間の相関に対応する）を定義した。遅いドリフト（例えば、ＧＣａＭＰ６ｍの長い減衰曲線）に起因する関連シグナルの蓄積を避けるため、顕著な過渡応答（上記で定義）のウインドウ外にある全てのｄＦ／Ｆ値を０に設定した。
【０２２７】
３．後処理
細胞活性相関のヒストグラム：
【０２２８】
各ニューロンにおける高相関（ＨＣ）の特性を、ピアソン相関係数が０．３超である相関ニューロンの数を見いだすことにより、試験した（２光子カルシウムイメージングを使用し、次にペアになったホールセルの記録を行った過去の研究で、Ｃａ２＋シグナルの相関がｉｎ  ｖｉｖｏで０．３を超える場合に接続性の確率が５０％超と報告されているため、ピアソン相関の０．３カットオフを接続性の保存的推定値として使用した）。ヒストグラムは、５つのステップにおいてニューロンに対しこの数字をビニングし、各ビンに該当するニューロンの数を算出することにより取得した。得られたヒストグラムは、ネットワーク内の全てのニューロンの度数分布を表す。ＨＣニューロンを、＞１の標準偏差で同じ体積の平均的ニューロンよりも相関の高いパートナーを有するニューロンとして定義した。
【０２２９】
超平面の最適分離：
【０２３０】
恐怖文脈及びニュートラル文脈を最も良好に区別するネットワーク集団活性測定値を特定するため、グラフ理論パラメーターの空間（後述）を使用した。これは同時に、２つの文脈間にある最適分離超平面の定義に使用することができる。数学的には、これは制約付き最適化問題として提起するものであり、目的関数は、各文脈における最も近いデータポイントに対する超平面の距離の和を最大化するよう探索し、制約は、超平面が２つの文脈を分離することであった。この制約付き最適化問題をラグランジュ乗数を用いて解決した。
【０２３１】
同期及び先行／遅れ（ｌｅａｄ−ｌａｇ）の定量化：
【０２３２】
ネットワーク全体の自発的活性を解析するため、各活性の過渡応答のオンセット及び持続時間（事象オンセット及びオフセットは、上述のように算出される）をニューロンごとに計算し、次に全ての細胞からの過渡応答を合わせてラスタープロットにし、このラスタープロットを、活性細胞のパーセンテージを時間の関数として示す活性ヒストグラムにたたみ込んだ。
【０２３３】
各フレームで偶然予測されたものより活性の高い細胞を含む同期的活性の時間を特定するため、間隔の再編成（各細胞における事象間の間隔をランダムに並べ替える）を行った。各文脈における各マウスに対し１，０００回実施して、再編成ごとに代替ヒストグラムが構築されるようにした。有意レベルのＰ＜０．０５に対応する活性ニューロンの閾値パーセンテージ（ヒストグラムの５％にのみ出現）を、単一フレームにおいて同期的事象とみなす必要のある同時活性細胞のパーセントとみなし、この閾値は、全てのマウス及び視野にわたるフレーム当たりの活性ニューロンの２．５％から５％の間を範囲とした。有意閾値を上回る活性を伴う少なくとも３つ連続するフレームは、同期的事象とみなす必要があり、この閾値を上回る全ての後続の近接フレームを共にグループ化して同じ同期的事象とした。同期事象中のＨＣ及び非ＨＣニューロンについての事象オンセットの累積分布関数をプロットするため、全てのマウスにわたる全ての同期的事象を特定し、ＨＣｖｓ非ＨＣニューロンのオンセットタイムをフレームごとにビニングし、同期ウインドウ中の経過時間のパーセンテージの関数として累積的にプロットした。
【０２３４】
ＨＣニューロンの活性が、相関ペアに先行しているか遅れているかを定量化するため、ＨＣニューロンの事象オンセット（シグナルが２つの連続フレームに対し３σを超えた最初の場合として定義される）を、まずｔ＝０に固定した。次に、全ての相関ペアの事象オンセットを、ｔ＝０におけるハブニューロンのオンセットの直前または直後の０．１６７秒の時間ウインドウにビニングした。
【０２３５】
主成分分析（ＰＣＡ）：
【０２３６】
各文脈における全てのニューロンの経時的な集団活性を説明及び可視化するために、ＰＣＡを使用した。これは、各細胞の
2018529335.tif 000012
（典型的には、文脈ごとのマウス当たり約５００細胞）を、所与の文脈における全ての時点にわたり（典型的には１８００フレーム）、一次独立の固有ベクトル（各固有ベクトルは、異なる細胞の重み付き組合せを表す）により特徴づけられる異なる座標系に変換することにより行った。固有値を降順に並べ替えて、最もエネルギーの高い（寄与の大きい）固有ベクトル及びその全体的寄与の大きさを明らかにした。ＰＣＡは、相関行列の固有値分解を用いて実施した。対応する固有値及び固有ベクトルは、カスタムＭＡＴＬＡＢスクリプトを用いて算出した。
【０２３７】
グラフ理論パラメーターの推定：
【０２３８】
無向グラフは、集団における細胞の相関に基づいて定義される。エッジＥは、上述の閾値を上回って相関のあるニューロン間に定義される。無向ニューロングラフＧ（Ｖ、Ｅ）は、Ｖ（頂点）及びＥ（エッジ）によって示される全ての細胞を用いて定義される。平均及び最大細胞相関は、全ての測定された相関における総平均及び最大値を用いて算出される。指数分布を相関の数字（ｎ相関）及びｎ頻度（上述の度数分布）の間で適合させて、グラフが、どの程度密接にべき乗則次数分布により特徴づけられるスモールワールドネットワークを模倣するか、定量化した。
【０２３９】
2018529335.tif 000013
【０２４０】
べき乗則パラメーターのａ及びｂは、上記の式を対数スケールに変換し、極小の最小２乗適合を実施することにより算出される。
【０２４１】
近傍（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ）は、各細胞に対し、半径３０ミクロンの球体として定義される。頂点のクラスター係数は、最大可能接続数の近傍内におけるエッジの数の比率として定義される。近傍にｋノードが存在する場合、ｋ（ｋ−１）／２が最大可能接続数である９。ネットワーク全体のクラスター係数は、全頂点における平均クラスター係数として定義される。平均パス長は、グラフにおけるランダム選択された任意の２つの頂点の平均パスとして定義される。平均パス長は、まず、ｎ細胞ｘｎ細胞行列であるところの隣接行列を構築することにより算出され、全ての相関する頂点ペアに、対応する行及び列のうちの１つの値、そうでなければゼロを与える。ｉからｊへの最小パスは、次式を用いて帰納的に計算することができる。
【０２４２】
2018529335.tif 000014
【０２４３】
スモールワールドネットワークは、高いクラスター係数及び低い平均パス長により特徴づけられ、クラスター係数対平均パス長の比率を用いて定量化された（各項は、同じ数の頂点を有する純ランダムなグラフに正規化される）。媒介中心性（ｂｅｔｗｅｅｎｎｅｓｓ  ｃｅｎｔｒａｌｉｔｙ）は、ネットワークにおけるノードの中心性の基準であり、ノードが全てのノードペア間でコミュニケーションする上でどの程度中心にあるかを示す。２つのノード間にあり得る全てのパスを算出し、所与のノードを通過するパスの数を算出することにより、媒介中心性を計算した。グラフの強度は、グラフにおける種々のサブ構成要素がどの程度強く接続しているかを定量化するものであり、エッジへの攻撃に対するグラフの抵抗性の基準である。
2018529335.tif 000015
は、グラフＧにおける全てのあり得る区画（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）が、全ての頂点の集合がＶになるような、相互排他的な頂点のセット
2018529335.tif 000016
になることを意味する。Ｅｒは、区画Ｐを作成するためにＧから除去される必要のあるエッジの数を示す。このとき、強度は、次式のように定義される。
【０２４４】
2018529335.tif 000017
（最小値ｍｉｎは、全てのあり得る区画Ｐに対して算出される）。言い換えると、強度は、どのように最小数のエッジを除去してグラフの頂点間に最大の分離を作成するかを定量化するものである。過去に記載されたアルゴリズム（Ｔａｒｊａｎ，Ｒ．Ｅ．Ｄｅｐｔｈ  ｆｉｒｓｔ  ｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｐｈ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ．ＳＩＡＭ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  １９７２，２：１４６−１６０；Ｓｅｄｇｅｗｉｃｋ，Ｒ．Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｉｎ  Ｃ＋＋，Ｐａｒｔ  ５  Ｇｒａｐｈ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ（Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ）．２００２）に基づいたＭＡＴＬＡＢコードを用いて強度を算出した。
【０２４５】
高速非負デコンボリューションアルゴリズムの実装
【０２４６】
デコンボリューションアルゴリズムは、蛍光データからスパイク率列の推定を可能にする。本明細書では、デコンボリューションは活性事象オンセットの推定に使用し、単一スパイクの検出には使用しなかった。というのは、ＧＣａＭＰ６ｍは、海馬内のバーストニューロンから単一スパイクを検出するために必要とされる、線形応答反応速度も感受性も有しないと想定されているからである。この解析は、同期的事象及び高相関ニューロンのタイミングに関する発明者らの主な結果を裏付ける助けに使用した。というのは、これらの解析は、事象オンセットを特定するための代替方法を提供すると同時に、解析からのノイズ（例えば、長時間のＣａ２＋シグナル減衰）を除去する助けとなるからである。
【０２４７】
多くのデコンボリューションアルゴリズムが存在する。初期の蛍光データデコンボリューション方法は、事象オンセットを推測するための閾値処理か、または選択したスパイクプロファイルに一致させる最適化を使用した。ウィーナー線形フィルターのような、よりロバストなアルゴリズムは有望である（Ｈｏｌｅｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ，２００８，５７：６６１−６７２）が、負方向のスパイクが許容されるため、実際的な値が減弱される。２０１０年に、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎらが、高速非負デコンボリューション法をもたらした。これは、スパイクの列に非負制約を課すことに加えて、大きな集団のニューロンに対してもスケーラブルである３２。イメージングは、複数の文脈及び日にわたり１００単位のニューロンに関与するため、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎらのアルゴリズムを蛍光シグナルのデコンボリューションに使用した。
【０２４８】
３つのクラスのパラメーターを本アルゴリズムで最適化してデータに適合させた：（ａ）ＧＣａＭＰ関連パラメーター、すなわち、細胞内Ｃａ２＋濃度（アルファ）及びベースライン濃度（ベータ）の上昇に対する蛍光の感受性；（ｂ）取得パラメーター、すなわち、ｄＦ／Ｆシグナルにおける時間ビン（デルタ）及びノイズ（シグマ）のサイズ；ならびに（ｃ）システム（海馬／ＣＡ３）関連パラメーター、すなわち、秒当たりの予想スパイク率（ファイ）及び時定数（タウ）、またはＣａ２＋濃度が減衰するのにかかる長さ。ＧＣａＭＰ関連パラメーターについては、上述のようにベータをｄＦ／Ｆトレースのベースラインに設定し、アルファをデフォルト値としての１に設定した（アルファをこの値の前後で大きく変動させてもデコンボリューション結果に影響を及ぼさなかったため）。イメージ取得は、光スライス当たり少なくとも３Ｈｚであることから、デルタを１／３秒に設定し、シグマは先に説明したように０．１６と推定した。ファイ及びタウのパラメーター選択には大きな課題が存在した。というのは、１）予想スパイク率（平均は０．１Ｈｚに近いが、バースト時は＞１０Ｈｚ）が二峰性であり、このモデルが想定するスパイクのポワソン分布では十分にキャプチャーされないこと、そして２）海馬内のＣａ２＋シグナルに予想される時定数が十分に理解されていないことのためである。そのため、これらの２つのパラメーターは、複数の時定数の組合せに対し反復することにより最適化し、データへの良好な適合に調和するスパイク事象をもたらすスパイク率を予想した（図２２）。選択した最終的なパラメーターは、アルファ＝１、ベータ＝ベースライン、デルタ＝０．３３秒、シグマ＝０．１６、ファイ＝５Ｈｚ、タウ＝２秒であった。これらの値は、他方面から報告された皮質領域の値と全く同じではなかったが、適合性のあるものであった。重要なことには、かなり広範囲でファイ及びタウを変動させても（ファイ：５〜１０、タウ：０．６７〜２）、後続の解析における主な結果を顕著に変化させることはなかった。全てのマウス、文脈、日に対するｄＦ／Ｆシグナルをデコンボリューションした。デコンボリューションされたシグナルにおける相関係数を算出し、事象オンセットの的確な推定に依存する基準（例えば、同期、先行／遅れ、及びＨＣニューロンの識別）を再計算した。先に記載の方法との唯一の相違は、最適なスパイク率（ここでは、事象率）を見いだすプロセスでノイズがフィルタリングされるため、追加的なノイズフィルターが存在しなかったことであり、オンセット時間は、シグナルが最初にゼロ以外になった場合によって特徴づけられた。様々な特定のデコンボリューションパラメーターのさらなる解析が重要になってくると考えられるが、おそらくｉｎ  ｖｉｖｏのイメージング及び単一細胞のパッチング実験を組み合わせたものが必要となり、これは本研究の範囲を超えるものである。また、広い範囲のパラメーターに対する結果のロバストネスから考えて、本研究で適用された特定の解析に顕著に影響を及ぼす可能性は低いと思われる。さらに、上記の解析は、単に、正確なタイミングに依存する測定値（相関、先行ｖｓ遅れ、及び同期）について生ｄＦ／Ｆを用い���得られた結果におけるロバストネスを保証する助けにするために実施したものである。
【０２４９】
バーチャルリアリティ行動の解析
ボール上でのリッキング率及び動作を、行動データのタイムスタンプを格納するＸＭＬログファイルにキャプチャーした。次にこれらのファイルをカスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトで構文解析し、顕微鏡のイメージングフレームとｋＨｚ精度で同期させるために、そして次の解析に用いるために、ＭＡＴＬＡＢにインポートした。想起中における恐怖文脈とニュートラル文脈との間のリッキングの差を定量化するため、秒当たりのリッキング回数（リッキングのたびにビームブレークが生じ、その結果少なくとも１ＶのＴＴＬパルス出力がもたらされる）を、文脈における最初の２分間にわたってまとめた。総リッキング量は、任意の文脈における任意のマウスから観察された最も高いリッキング率を基準に正規化し、各マウス及び各文脈に対するこの値の一部として提示した。リッキング抑制データを、各実験群の全てのマウスにおける平均値として提示し、文脈間の差が顕著な値をスチューデントｔ検定により評価した。オプトジェネティクス刺激実験中のリッキング率を、１５秒の光送達中の定量化によりスコア化し、次にこれを光送達の直前の１５秒から得られた対応値を基準に正規化した。恐怖文脈ｖｓニュートラル文脈及びニュートラル／刺激文脈ｖｓニュートラル文脈のみにおけるリッキングの顕著な差を、スチューデントｔ検定を用いて評価した。同期的集団活性事象中のボール上でのリッキング率及び速度は、同期的事象開始時から始まる５秒ウインドウにおけるリッキング量及び移動距離を比較し、次に同期的事象の前の５秒ウインドウにおけるリッキング量及び移動距離を基準に正規化することにより、算出した。この時間ウインドウを同期後の１〜１０秒に設定して同様の定量的結果を観察し、同期の前と比較したが、同期の最中ｖｓ前でリック率及び速度における有意差はなかった。
【０２５０】
ｉｎ  ｖｉｖｏの１Ｐ刺激及びｉｎ  ｖｉｖｏの２Ｐイメージングの同時実施
帯状回におけるＡＡＶ８及びＣＡ３におけるＡＡＶｄｊを介したＧＣＡＭＰ６ｍを経由して、トラフィッキング及び反応速度が向上した新たな赤色シフトのオプシン（ｂＲｅａＣｈＥＳ）を注入し、光アクセス用にＣＡ２／ＣＡ３の上方に頭蓋窓を位置付けることにより、１光子（１Ｐ）刺激（５９４ｎｍ）及び２光子（２Ｐ）イメージング（９２０ｎｍ）を同時に実施した。２光子（２Ｐ）イメージング及び全野オプトジェネティクス刺激のセットアップが図１７Ｂに示されている：緑色（ＧＣａＭＰ６ｍシグナル）；赤色（刺激アーチファクト）；マルチモードファイバー（ＭＭＦ）、ファイバー結合（ＦＣ）、２５ｍｍ平凹レンズ（Ｌ）、６８０ｎｍショートパスダイクロイック（Ｄ１）、チューブレンズ（ＴＬ）、５９４バンド／ＮＩＲロングパスダイクロイック（Ｄ２）、対物レンズ（Ｏｂｊ）、ＮＩＲブロッキングフィルター（ＢＦ）、５５５ｎｍロングパスダイクロイック（Ｄ３）、５２０±２２ｎｍフィルター（Ｆ１）、６２４±２０ｎｍフィルター（Ｆ２）、及びＧａＡｓＰ  ＰＭＴ（ＰＭＴ１及びＰＭＴ２）。簡潔に述べると、９２０ｎｍに設定したＮＩＲパルスレーザーを用いた共振型ガルバノメーター２Ｐ顕微鏡を、光ファイバー、レンズ、及びダイクロイックビームスプリッターを有するシステムに結合した５９４ｎｍ連続波レーザーを用いた同時的な全野刺激と組み合わせる。追加的な５９４ｎｍバンドパスフィルターと共に設計された２Ｐ適合性ＮＩＲ反射ダイクロイックを、２Ｐイメージング中、１Ｐ黄色光刺激に使用した。ＧＣａＭＰ６ｍシグナル（緑色チャネル）及び刺激アーチファクト（赤色チャネル、刺激時点を正確に消去するのに使用）を、標準的な２Ｐ共振走査イメージングを用いて記録する。サブミリ秒ＰＭＴシャッターを、イメージング中の刺激アーチファクト収集を防止するために使用した。ＰＭＴシャッターが適用されない場合、１Ｐ刺激アーチファクトを２Ｐイメージからオフライン除去した。刺激パラメーター：５９１ｎｍ光、２０Ｈｚ、１５ｍｓパルス、１５秒、８〜１０Ｗ／ｍｍ２レーザーパワー（対物レンズの後のサンプルにおいて）。合計で４匹のマウス（イメージングのみの実験で使用したマウスとは別個のコホート）を刺激＆イメージング併用試験で使用した。訓練前刺激実験及び訓練後刺激実験（５〜７日後に実施）で、同じ細胞及び同じＦＯＶをキャプチャーする。刺激に対し応答性（刺激により動員される）と考えられるニューロンについては、上記で定義した少なくとも１つの顕著な過渡応答が刺激ウインドウ中に発生する必要があった。図１７に示される遅延測定については、事象オンセットは、応答がノイズを上回って３標準偏差超え、少なくとも２つの連続フレームで増加する最初のタイムフレームとして定義された。最初のフレーム内で発生した場合、その前のフレームから応答が増加したニューロンのみが考慮され、刺激ウインドウ内で減衰する応答を除外する。応答ニューロンは、３３３ｍｓの遅延ビンに割り当てられた。
【０２５１】
ＤＳＩ電気生理学
ＤＳＩは、シナプス後細胞内Ｃａ２＋の増加に応じて、カンナビノイド受容体を発現するシナプス前抑制性ニューロンからのＧＡＢＡ放出を抑制する。ＧＣａＭＰ６ｍを発現するＣＡ３ニューロンからのパッチクランプ記録を実施し、Ｃａ２＋流入を誘発する脱分極性パルス前後の自発性抑制性シナプス後電流（ｓＩＰＳＣ）を調べた。（４〜５週齢のマウスにおける）ＣＡ３へのＡＡＶｄｊ−ＣａＭＫＩＩα：：ＧＣａＭＰ６ｍ注入から４〜６週間後に、電気生理学的記録を実施した。注入マウスからの冠状スライス（３００μｍ）は、氷冷スクロース含有人工脳脊髄液溶液（ＡＣＳＦ、ｍＭで）：８５ＮａＣｌ、７５スクロース、２．５ＫＣｌ、２５グルコース、１．２５ＮａＨ２ＰＯ４、４ＭｇＣｌ２、０．５ＣａＣｌ２、及び２４ＮａＨＣＯ３を心臓内灌流させた後に用意した。スライスを３２〜３４℃で１時間回復させ、次に酸素化した記録ＡＣＳＦ溶液（ｍＭで）：１２３ＮａＣｌ、３ＫＣｌ、２６ＮａＨＣＯ３、２ＣａＣｌ２、１ＭｇＣｌ２、１．２５ＮａＨ２ＰＯ４及び１１グルコースに室温で移した。興奮性シナプス伝達ブロッカー（Ｄ−２−アミノ−５−ホスホノ吉草酸（ＡＰＶ；２５μＭ）及び２，３−ジヒドロキシ−６−ニトロ−７−スルファモイル−ベンゾ［ｆ］キノキサリン−２，３−ジオン（ＮＢＱＸ；１０μＭ））を添加して、ＧＡＢＡ作動性シナプス後電流を単離し、５μＭのカルバコールを、ｓＩＰＳＣ周波数を強化してＤＳＩの検出を容易にするために使用した。記録は、酸素化記録ＡＣＳＦ溶液の一定の灌流下、３２〜３４℃で実施した。スライスを、赤外線微分干渉（ＩＲ−ＤＩＣ）光学素子下の直立型顕微鏡（ＢＸ６１ＷＩ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）で可視化し、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｘ  Ｌｉｇｈｔエンジン（Ｌｕｍｅｎｃｏｒ）を使用してＧＣａＭＰ６ｍ発現を観察した。ＣＡ３ニューロンの記録は、ＧＣａＭＰ６ｍ発現を特定した後に行い、機能的ＧＣａＭＰ６ｍ活性は、ＤＳＩの誘発に使用される脱分極性パルスの間にＧＣａＭＰ６ｍ蛍光の増加を観察することにより、（ＢＡＰＴＡなしの細胞内で）検証可能であった。以下の細胞内溶液をパッチクランプ電極に使用した（以下、ｍＭで）：４０ＣｓＣｌ、９０Ｋ−グルコネート、１．８ＮａＣｌ、１．７ＭｇＣｌ２、３．５ＫＣｌ、１０ＨＥＰＥＳ、２ＭｇＡＴＰ、０．４Ｎａ２ＧＴＰ、１０ホスホクレアチン（ｐＨ７．２、２７０〜２９０ｍＯｓｍ）。ＢＡＰＴＡ実験用に、細胞内溶液に４０ｍＭのＢＡＰＴＡを添加した。直列抵抗の安定性をモニターし、直列抵抗が顕著に（＞２０％）変化した場合や２０ＭΩに達した場合は、記録を破棄した。静止膜電位を静止時に測定した。報告値は、＋１１．２ｍＶの液間電位を含む。入力抵抗を１００ｐＡパルスから算出した。ＭｉｎｉＡｎａｌｙｓｉｓ（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｆｔ）及びｐＣｌａｍｐ１０．３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、電荷移動（ｓＩＰＳＣ下のエリア）を算出しデータを解析した。ベースライン電荷移動を４秒のプレパルス期間中に測定し、ＤＳＩを脱分極性パルスの後の４秒期間中に調べ、ＤＳＩから回復した後の電荷移動を４秒のウインドウ中に測定した。ＤＳＩ誘起に使用したパルスは、−６５ｍＶの保持電位から０ｍＶへの５００ｍｓステップであった。
ｂＲｅａＣｈＥＳ計画及び試験
【０２５２】
ＲｅａＣｈＲ及びｂＲｅａＣｈＥＳのクローニング及び単一突然変異誘発
ＲｅａｃｈＲ及びｂＲｅａＣｈのＤＮＡ配列を合成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、ニューロンでの発現のためにＣａｍＫＩＩプロモーターを含有するＡＡＶベクターにクローニングした。全てのコンストラクトをＹＦＰ  ＤＮＡ（強化型黄色蛍光タンパク質）に融合して、蛍光顕微鏡法によりニューロンでのタンパク質発現を検出した。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、Ｇｌｕ１２３Ｓｅｒ突然変異を導入した。Ｅ．Ｃｏｌｉにおける形質転換及び増幅の後、プラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ（商標）Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
【０２５３】
培養海馬ニューロンにおける電気生理学的記録
ニューロン培養物における電気生理学的記録を記載６４の通り用意した。電圧及び電流クランプのホールセル記録のため、水平プラー（Ｐ−２０００、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてガラスキャピラリー（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）からパッチピペット（４〜６ＭΩ）を引き出した。記録は、ＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ７００Ｂ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて行った。外部記録溶液は、以下のものを含有した（以下、ｍＭで）：１２７ＮａＣｌ、１０ＫＣｌ、１０ＨＥＰＥＳ、２ＣａＣｌ２、２ＭｇＣｌ２、３０Ｄ−グルコース、ｐＨ７．３、シナプスブロッカーを含む（２５μＭ  Ｄ−ＡＰＶ、１０μＭ  ＮＢＱＸ）。パッチピペット溶液は、以下のものを含有した（以下、ｍＭで）：１４０Ｋ−グルコネート、１０ＨＥＰＥＳ、１０ＥＧＴＡ、２ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．３。全ての測定値は、＋１５ｍＶの液間電位に対して補正された。記録全体にわたり、直列抵抗の安定性をモニターした。Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｘ  Ｌｉｇｈｔエンジン（Ｌｕｍｅｎｃｏｒ）を、ＹＦＰの励起やオプシン活性化のための光適用に使用した。黄色及び赤色の刺激光を、５７５／２５または６３２／２２バンドパスフィルター（Ｃｈｒｏｍａ）によりフィルタリングし、４０Ｘ対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を介して５ｍＷ／ｍｍ２の光強度で適用した。光パワー密度をパワーメーター（ＴｈｏｒＬａｂｓ）で測定した。全てのコンストラクトの機能性を、−８０ｍＶの定常光電流を１秒連続的光パルスと比較することにより決定した。光パルス（５ｍｓ）を６３３ｎｍ、５ｍＷ／ｍｍ２、及び１〜２０Ｈｚで送達する電流クランプモードで、スパイクを光学的に誘起した。Ｃ１Ｖ１、ｂＲｅａＣｈ−ＥＳ、及びＣｈＲ２の活性化スペクトルを、各波長で−８０ｍＶの電圧クランプモード及び０．６５ｍＷ／ｍｍ２の光強度における定常光電流を記録することにより、測定した。光を、２０ｎｍバンドパスフィルター（Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を介して、４００、４２０、４４０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５２０、５４０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６２０、６３０、６５０（ｎｍ）で送達した。それぞれ以下の最大値を基準に、光電流を正規化した：ＣｈＲ２は４８０ｎｍ、Ｃ１Ｖ１は５６０ｎｍ、ｂＲｅａＣｈ−ＥＳは５７０ｎｍ。光オフ後の光電流の減衰を単一指数関数に適合させることにより、チャネル閉鎖の反応速度を決定した。タウｏｆｆ値をそれぞれ対応させることにより、チャネル反応速度を定量化した。ｐＣｌａｍｐ１０．３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）及びＯｒｉｇｉｎＬａｂ８（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ）ソフトウェアを使用して、データの記録及び解析を行った。
ｂＲｅａＣｈ−ＥＳの定位的ウイルス注入
【０２５４】
下記の血清型ＤＪを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｇｅｎｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｃｏｒｅで産生した。
【０２５５】
ＡＡＶＤＪ−ＣａＭＫＩＩ：：ｂＲｅａｃｈ−Ｅ１６２Ｓ−ＴＳ−ｅＹＦＰ
【０２５６】
ＡＡＶＤＪ−  ＣａＭＫＩＩ：：Ｃ１Ｖ１（Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔ）−ＴＳ−ｅＹＦＰ
【０２５７】
４〜６週齢のマウスに１μｌのいずれかのウイルスを、以下の座標（ブレグマから）にて両側注入した：Ａ／Ｐ：＋１．７ｍｍ；Ｍ／Ｌ：＋０．３ｍｍ；Ｄ／Ｖ：−２．５ｍｍ。両方のウイルスについて、力価を１．５ｘ１０１２ｖｇ／ｍｌで一致させた。
【０２５８】
ｍＰＦＣ及びＢＬＡにおけるｂＲｅａＣｈ−ＥＳ特徴づけのためのスライス電気生理学
電気生理学的記録を、ｍＰＦＣ末端におけるオプシン発現のための注入から１２〜１４週間後に実施した。注入マウスからの冠状スライス（３００μｍ）は、氷冷スクロース含有人工脳脊髄液溶液（ＡＣＳＦ、ｍＭで）：８５ＮａＣｌ、７５スクロース、２．５ＫＣｌ、２５グルコース、１．２５ＮａＨ２ＰＯ４、４ＭｇＣｌ２、０．５ＣａＣｌ２、及び２４ＮａＨＣＯ３を心臓内灌流させた後に用意した。スライスを３２〜３４℃で１時間回復させ、次に酸素化した記録ＡＣＳＦ溶液（ｍＭで）：１２３ＮａＣｌ、３ＫＣｌ、２６ＮａＨＣＯ３、２ＣａＣｌ２、１ＭｇＣｌ２、１．２５ＮａＨ２ＰＯ４及び１１グルコースに室温で移した。電気生理学的記録は、酸素化記録ＡＣＳＦ溶液の一定の灌流下、３２〜３４℃で実施した。ｍＰＦＣ記録のため、シナプス伝達ブロッカー（Ｄ−２−アミノ−５−ホスホノ吉草酸（ＡＰＶ；２５μＭ）及び２，３−ジヒドロキシ−６−ニトロ−７−スルファモイル−ベンゾ［ｆ］キノキサリン−２，３−ジオン（ＮＢＱＸ；１０μＭ）及びガバジン（１０μＭ））を記録ＡＣＳＦ溶液に添加した。スライスを、赤外線微分干渉（ＩＲ−ＤＩＣ）光学素子下の直立型顕微鏡（ＢＸ６１ＷＩ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）で可視化した。Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｘ  Ｌｉｇｈｔエンジン（Ｌｕｍｅｎｃｏｒ）を、蛍光タンパク質発現の観察及びオプシン活性化のための光パルス送達の両方に使用した。光パワー密度をパワーメーター（Ｔｈｏｒｌａｂｓ）で取得した。ｍＰＦＣニューロンの記録を、ｅＹＦＰ＋発現領域を最初に特定後に行い、シナプス後扁桃体基底外側部（ＢＬＡ）ニューロンの記録を、ｍＰＦＣ及びＢＬＡにおけるｍＰＦＣ軸索線維でのｅＹＦＰ＋発現を確認した後に取得した。ホールセル電圧クランプ記録を−６５ｍＶで実施し、電流クランプ記録を静止時に実施した。パッチクランプピペットは、以下の内部溶液を含有した（以下、ｍＭで）：１２５Ｋ−グルコネート、１０ＫＣｌ、１０ＨＥＰＥＳ、４Ｍｇ３−ＡＴＰ、０．３  Ｎａ−ＧＴＰ、１０ホスホクレアチン、１ＥＧＴＡ。ＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ７００Ｂ増幅器及びｐＣｌａｍｐ１０．３ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて記録を行った。ｐＣｌａｍｐ１０．３、ＯｒｉｇｉｎＬａｂ８（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ）、及びＳｉｇｍａＰｌｏｔ（ＳＰＳＳ）をデータ解析に使用した。オプシンの定常光電流を、電圧クランプモードにおける１秒光パルスの終わりに測定した。ｍＰＦＣニューロン及びシナプス後ＢＬＡニューロンにおける光誘起スパイクの確率を、記録したニューロンにおいて様々な光刺激周波数で誘起された正常な活動電位の一部として算出した。シナプス後ＢＬＡニューロンにおける光誘起ＥＰＳＣ振幅を、オプシン発現ｍＰＦＣ線維の光刺激に対する誘起応答のピークで測定した。直列抵抗安定性をモニターし、直列抵抗が顕著に（＞２０％）変化した場合や２０ＭΩに達した場合は、記録を破棄した。両側ｔ検定（有意性をｐ＜０．０５（＊で示される）に設定）により、統計的解析を実施した。
【０２５９】
結果
ＡＣ−ＣＡ：直接的なトップダウン突起
海馬への直接的なトップダウン入力を識別するため、求心性ニューロンをｔｄＴｏｍａｔｏ（ＲＶ−ｔｄＴ２２）で標識することができる逆方向トレーサーを海馬に注入した。海馬に既知の入力を有する脳領域（内側中隔、対側ＣＡ３、及び嗅内皮質を含む）において、ロバストなｔｄＴ標識が観察された（図１１Ａ、図１２Ａ）。加えて、過去に特徴づけられていなかった入力が識別された。この入力は、背側前帯状回皮質（ＡＣ）及び隣接する前頭皮質性連合皮質（ＦｒＣ）から生じており、これらはいずれも、げっ歯類における前頭皮質（ＰＦＣ）の定義的特徴である視床背内側核に接続している（図１１Ａ；これは、別の逆方向トレーサーであるイヌアデノウイルス、すなわちＣＡＶ２３でも確認された（図１２Ｂ））。ＡＣへのＲＶ−ｔｄＴの注入により、両側的に背側海馬内のニューロンもまばらに標識されたが、これはＡＣと海馬との間の可能性として考えられる双方向通信に一致するものである（図１２Ｃ）。この新規の前頭前野−海馬突起の存在を検証するため、順方向標識（ＡＡＶ５−ＥＹＦＰ）を背側前帯状回に注入し（図１２Ｂ）、線条体に両側的に、内側背側視床核に同側的に（両方の領域は、ＰＦＣからの突起を受け取ることが知られている）、ただし海馬にも両側的に、蛍光で満たされた突起末端が検出された。
【０２６０】
これらの前頭前野の突起が海馬ニューロンの直接的な単シナプス性駆動をもたらすかを判定するため、前帯状回にチャネルロドプシンをコードするＡＡＶを形質導入し、ＣＡ１／ＣＡ３細胞体（図１１Ｃ）における光駆動の興奮性シナプス後電流（ＥＰＳＣ）のパッチクランプ記録を実施した。ＣＡ１（図１１Ｄ）及びＣＡ３（図１１Ｆ）の両方における細胞は、光パルスの列に確実に応答し、活性電位を駆動するのに十分な誘起ＥＰＳＣ振幅を生成した（図１１Ｈ及び図１１Ｉ）。応答は、存在する場合速く、平均潜時はＣＡ１で３．２ｍｓ（ｎ＝２６、図１１Ｅ）、ＣＡ３で２．７ｍｓ（ｎ＝１３、図１１Ｇ）であった。１０Ｈｚ刺激の後に誘起スパイクが保持された（図１１Ｈ及び図１１Ｉ）ことの観察から、この発見は、直接かつ効果的な前帯状回から海馬の錐体細胞ＣＡ３／ＣＡ１への単シナプス性接続の存在に一致するものであり、したがってＡＣ−ＣＡ突起と称する。歯状回ニューロンでは何ら応答が観察されなかった（図１１Ｊ）。
【０２６１】
図１１Ａ〜図１１Ｊ。ＡＣ−ＣＡ単シナプス性突起の特徴づけ。ａ、海馬へのＲＶ−ｔｄＴ注入（座標明記）から５日後、逆方向標識されたニューロンがＡＣ（矢印）内で検出された。注入により、海馬下の既知のＰＦＣの突起ターゲットである内側背側視床（アスタリスク）への漏出はなかった。スケール：５ｘ：３００μｍ；１０ｘ：１００μｍ（共焦点）。ｂ、ＡＣへのＡＡＶ５−ＣａＭＫＩＩα：：ＥＹＦＰ注入（座標明記）から５週間後、突起線維が両側線条体（矢印）、両側海馬の多形細胞層、ならびにＣＡ１（１アスタリスク）及びＣＡ３（２アスタリスク）の放線層、同側内側背側視床（矢印）で可視化され、一方ＣＡ２及び歯状回ではまばらであった（角括弧）。注入により、既知の海馬への入力である内側中隔への漏出はなかった（カレット）。スケール：５ｘ：３００μｍ；２０ｘ：６０μｍ（最大突起１００μｍ）。ｃ、ＡＡＶｄｊ−ＣａＭＫＩＩα：：ＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ＥＹＦＰを背側ＡＣに注入した；急性スライスのＣＡ１錐体から記録されたシナプス後応答。ｄ、ＣＡ１応答振幅（ｎ＝２６ニューロン、ｎ＝６マウス）；挿入物：生トレース。ｅ、ＣＡ１応答潜時（平均３．２ｍｓ）。ｆ、ＣＡ３応答振幅（ｎ＝１３ニューロン、ｎ＝２マウス）；挿入物：生トレース。ｇ、ＣＡ３応答潜時（平均２．７ｍｓ）。ｈ、ＣＡ１及びＣＡ３（ｉ）１０Ｈｚにおけるスパイクフォロー（ｓｐｉｋｉｎｇ−ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ）信頼性を例示する電流クランプトレース。スケール：１０ｍＶ、２５０／５００ｍｓ。ｊ、歯状回ニューロンで応答検出されず（ｎ＝５）。
【０２６２】
図１２Ａ〜図１２Ｃ。ＡＣ−ＣＡ突起の解剖学的特徴づけ。ａ、海馬へのＲＶ−ｔｄＴ注入（座標明記）から５日後、逆方向標識ニューロンが対側海馬（矢印）、内側中隔（角括弧）、及びＡＣで検出された（図１１Ａ）。スケールバー：５ｘ：３００μｍ；１０ｘ：１００μｍ（共焦点）。ｂ、海馬へのＣＡＶ−Ｃｒｅ注入及び前帯状回へのＤＩＯ−ＥＹＦＰの注入（座標明記）から８週間後、前帯状回で求心性の細胞体が検出された（矢印）。共焦点画像；１０ｘ倍率；スケール：１００μｍ。ｃ、ＲＶ−ｔｄＴｏｍａｔｏによる前帯状回からの逆方向トレーシングをして海馬からの相互接続をマッピング。注入部位は角括弧で示される。求心性細胞体の希薄な標識が海馬の左右、主に海馬台に見られ（矢印）、予想されるように内側背側視床核にも見られた（アスタリスク）。共焦点５ｘ、スケール：２００μｍ；１０ｘ画像、スケール：１００μｍ。
文脈記憶におけるＡＣ−ＣＡの因果的役割
【０２６３】
この突起の機能的重要性を探るため、一連のオプトジェネティクス実験を行い、この経路を、文脈的恐怖条件付けの前後で、そして記憶消去及び復元の設定においても、操作した。ＲＶ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ（またはＲＶ−ＥＹＦＰ）を背側海馬に注入し、光送達のターゲットをＡＣにおける逆方向標識された細胞体に定めた（図１３Ａ）。１日目に、ＣｈＲ２及びＥＹＦＰマウスは、文脈的恐怖条件付けを１つの文脈において受け、ＣｈＲ２発現対照群は、ショックを与えることなく文脈に曝露した。２日目に、全てのマウスを異なる文脈に配置し、このときＣｈＲ２発現かつ恐怖条件付けされた群（ｎ＝８）は、条件付けされていないＣｈＲ２（ショックなし、ｎ＝６）またはショック対照群との比較で、有意な恐怖行動（すくみ反応）を光刺激の間のみ示した（ＥＹＦＰ、ｎ＝６、ｐ＜０．００１、２方向反復測定ＡＮＯＶＡ、図１３Ｂ）。光オン／オフ切り替えに伴うすくみ反応までの時間及びすくみ解除までの時間は、動物全体においてほとんど一致していた。３日目に、マウスを再び当初の文脈に配置し、ＣｈＲ２及びＥＹＦＰ両方の恐怖条件付けされたコホートにおいて強力な記憶コード化及び想起について検証し、ショックなし対照との比較で有意に高いレベルのすくみ反応が見られた（図１３Ｃ、Ｐ＜０．００１、対応のないｔ検定）。
【０２６４】
この、ＡＣ−ＣＡ突起に寄与する細胞が文脈的に条件付けられた恐怖行動を起動し得るという観察を、補完的な順方向突起ターゲット化方策を用いて、繰り返しかつ拡張した。ＡＡＶｄｊ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ（または対応コホートにおけるＡＡＶｄｊ−ＥＹＦＰ）を前帯状回に注入し、光刺激のターゲットを海馬の末端に定めた（図１４Ａ）。ショックなし対照及びＥＹＦＰ対照との比較で、ニュートラル文脈における光刺激に対する有意なすくみ反応がＣｈＲ２群のみで観察された（図１４Ｂ、全ての群についてｎ＝８；ｐ＜０．００１、２方向反復測定ＡＮＯＶＡ）。これらの動物は、以前の実験におけるような光の間のすくみ反応と同じ特有の潜時を示した。この一貫した行動応答が、不特定の直接的な恐怖行動の駆動要因によるものではなく、本当に恐怖記憶の再活性化によるものなのかについて、試験を行った。図１４Ａ及び図１４Ｂに対応する同じマウスを、ショックなしの文脈Ａに曝露することによる偶発的退行に数日の間供した（Ｍｅｔｈｏｄｓ）ところ、この後光は、ショックなし対照及びＥＹＦＰ対照の場合のように、ＣｈＲ２動物に有意なすくみ反応をもたらすことができなかった（図１４Ｃ）。次に、恐怖条件付けを新たな文脈でこれらのマウスに復元したところ、この後は、光刺激は、ショックなし対照及びＥＹＦＰ対照との比較で、再び確実にＣｈＲ２マウスにおけるすくみ反応をもたらした（図１４Ｄ、全ての群についてｎ＝８；ｐ＜０．００１、２方向反復測定ＡＮＯＶＡ）。３日目における文脈的恐怖記憶の保存及び１４日目における正常な恐怖記憶の消去も確認した（図１４Ｅ）。これらのデータは、ＡＣ−ＣＡ突起に寄与する細胞が恐怖記憶の想起を駆動し得ることを実証するものであったが、海馬の任意の駆動要因が、海馬において最近強く表された記憶の想起を誘発し得る可能性も残った。しかし、この可能性の証拠は、２つの追加的な対照実験、すなわち異なる（中隔海馬の）突起を直接駆動する実験（図１４Ｆ及び図１４Ｇ）または海馬そのものを直接駆動する実験（図１４Ｈ及び図１４Ｉ）では見いだされなかった。これらのマウスにおける正常な文脈的恐怖記憶の保存は、以前のように確認された（図１３Ｄ及び図１３Ｅ、ｎ＝８、Ｐ＜０．００１、対応のあるｔ検定）。
【０２６５】
ＡＣ−ＣＡ突起をもたらす細胞により媒介される海馬依存記憶形成をターゲットとする、有効な機能喪失実験からの発見の拡張（図１４Ａ〜図１４Ｌ）：記憶発現のオンセット速度に有意な効果。実験計画：ＣＡＶ−Ｃｒｅを背側海馬に注入し、ＤＩＯ−ｅＮｐＨＲ３．０（またはＤＩＯ−ｅＹＦＰ）をＡＣに注入し、ＡＣにおける細胞体の上方に光を送達。全てのマウスを文脈Ａで恐怖条件付けを行い（１日目）、光オンのみで文脈想起への潜時を試験し（２日目）、次に光オフのみで文脈想起への潜時を試験した（３日目）。２日目：光オンの間、ｅＮｐＨＲ３．０（ｎ＝１２）について６６．１±１８．１秒ｖｓＥＹＦＰ（ｎ＝８）について４３．８±１１．１秒；３日目：光オフの間、ｅＮｐＨＲ３．０について５３．８±１３．７秒ｖｓＥＹＦＰについて４８．８±７．７秒；Ｐ＜０．０５、２方向反復測定ＡＮＯＶＡ。
【０２６６】
図１３Ａ〜図１３Ｇ。ＡＣ−ＣＡ突起のオプトジェネティクス操作。ａ、実験計画：ＲＶ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ（またはＥＹＦＰのみ）を背側海馬に注入し、前帯状回の細胞体の上方に光を送達し、ＣｈＲ２及びＥＹＦＰマウスは文脈Ａにおいて恐怖条件付けを行い、ショックなし対照群は単に文脈Ａに曝露した（１日目）。全てのマウスに対し、文脈Ｂにおいて光オン・オフセッションの試験を行い（２日目）、次に文脈Ａにおいて文脈的記憶想起の試験を行った（３日目）。オプトジェネティクス刺激は、２０−Ｈｚ、１５ｍｓのパルス、３０秒の持続時間、ファイバー先端における８〜１０ｍＷのレーザー電力において、４７３ｎｍの光を用いた。ｂ、２日目の文脈Ｂにおけるすくみ反応（頭部運動は観察されず）を、１５０秒にわたり５秒の時間ビンでプロットしたものである（左）。ＣｈＲ２／ショック（ＦＣ）：黒色；ＣｈＲ２／ショックなし（ＮＳ）：赤色；ＥＹＦＰ／ショック（ＥＹＦＰ）：青色。ＦＣ群における個体（動物ごとに色が異なる）を示す（中央）。概要（右）：％すくみ反応時間（平均±ｓ．ｄ．）。光オンの２０秒前（濃い色）ｖｓ光オンの２０秒後（薄い色）；ＦＣ：６０．９±７．４％光オンｖｓ６．５±４．４％光オフ、ｎ＝８；ＮＳ：２．７±０．６５％光オンｖｓ３．４±０．９５％光オフ、ｎ＝６；ＥＹＦＰ：２．９±０．７５％光オンｖｓ３．６±１％光オフ、ｎ＝６；Ｐ＜０．００１、２方向反復測定ＡＮＯＶＡ）。ｃ、３日目における当初の文脈での文脈的恐怖記憶（％すくみ反応時間）の保存（平均±ｓ．ｄ．、Ｐ＜０．００１、対応のないｔ検定）。ｄ、内側中隔注入マウスにおける文脈記憶の保存（図１１Ｆ）；３日目における当初の文脈での％すくみ反応時間（平均±ｓ．ｄ．、Ｐ＜０．００１、比較表示、対応のないｔ検定）。ｅ、海馬注入マウスにおける文脈記憶の保存（図ｈ）；３日目における当初の文脈での％すくみ反応時間（平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝８マウス、Ｐ＜０．００１、対応のあるｔ検定）。ｆ、ＡＣ−ＣＡ突起を生じさせる細胞により媒介される海馬依存記憶形成（図１４Ａ〜図１４Ｌで報告）をターゲットとする正常な機能喪失実験を計画し、この回路エレメントを最もロバストに抑制できるようにした。本明細書に示すように代替的な計画（海馬体における広範かつ長い中隔側頭の広がりにもかかわらず、突起領域をターゲットにしようとした）も探索したが、予想されるように有効ではなかった；ＡＡＶ５−ｅＮｐＨＲ３．０−ＥＹＦＰ（または対応コホートにおけるＡＡＶ５−ＥＹＦＰ）を両側的に前帯状回に注入し、海馬内の軸索末端を光刺激の両側的ターゲットにした。注入から８週間後、全てのマウスに文脈に対する恐怖条件付けを行い（１日目）、光オン／オフセッション中の文脈想起を試験し（２日目）、光オフのみにおいて再び文脈想起を試験した（３日目）。オプトジェネティクス抑制は、５８９ｎｍの光、３０秒の持続時間、ファイバー先端における８〜１０ｍＷのレーザー電力において、一定の照射で行った。ｇ、記憶想起中におけるＡＣ−ＣＡ突起の光抑制に起因するすくみ反応の減少傾向が観察された。２日目の文脈Ａにおける、光の前（左側の濃い色の棒）ｖｓ光の後（右側の薄い色の棒）％すくみ反応時間。ｅＮｐＨＲ���．０：  ７３．５±８．５％光オフｖｓ．５５．５±１１．４％光オン、ｎ＝１０；ＥＹＦＰ：７４±７．４％光オフｖｓ．７４±１１．３％光オン、ｎ＝１０；３日目の文脈Ａで光オフにおける％すくみ反応時間（濃い色の棒）は、点線の後に示されている。ｅＮｐＨＲ３．０：６７．５±７．２％、ｎ＝１０；ＥＹＦＰ：６６．５±９．１％、ｎ＝１０（Ｐ＝０．０６７、２方向ＡＮＯＶＡ）。予想されるように、点照射は、広範な軸索末端領域体積の抑制には有効性が低い可能性がある。
【０２６７】
図１４Ａ〜図１４Ｌ。ＡＣ−ＣＡ突起は、トップダウン記憶想起を制御する。ａ、ＡＡＶｄｊ−ＣａＭＫＩＩα：：ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ（またはＥＹＦＰのみ）をＡＣに注入し、注入から５週間後に光のターゲットを背側海馬に定めた。タイムラインが示されている。ｂ〜ｄ、％すくみ反応時間、２日目、１５日目、１７日目：５秒時間ビン（ｎ＝８；Ｐ＜０．００１、２方向反復測定ＡＮＯＶＡ）；下の概要的棒グラフは、平均±ｓ．ｄ．、光の２０秒前（濃い色の棒）ｖｓ．光の２０秒後（薄い色の棒）である。ｅ、文脈記憶の保存（３日目）及び文脈消去（１４日目）、当初の文脈Ａ（平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝８、Ｐ＜０．００１、対応のあるｔ検定）。ｆ．ＡＡＶｄｊ−ＣａＭＫＩＩα：：ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ（またはＥＹＦＰのみ）を内側中隔に注入；光刺激は注入から５週間後、背側海馬をターゲットにした。ｇ、２日目における％すくみ反応時間：１０秒時間ビン、右側に概要的棒グラフ（ｎ．ｓ．対応のないｔ検定）。ｈ、背側海馬にＡＡＶｄｊ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ（またはＥＹＦＰのみ）注入し、注入から５週間後に光のターゲットにした。ｉ、２日目における％すくみ反応時間、５秒時間ビン、右側に概要的棒グラフ（ｎ＝８、ｎ．ｓ．、対応のあるｔ検定）。ｊ、ＣＡＶ−Ｃｒｅを背側海馬に、ＤＩＯ−ｅＮｐＨＲ３．０（またはＤＩＯ−ｅＹＦＰ）をＡＣに注入し、注入から８週間後に上記ＡＣの細胞体に光を送達。ｋ、２日目の文脈Ａにおける％すくみ反応時間、光の前（濃い色の棒）ｖｓ光の後（薄い色の棒）。この効果は、３日目において可逆的である（点線の後）。（ｅＮｐＨＲ３．０：ｎ＝１２；ＥＹＦＰ：ｎ＝８；Ｐ＜０．００１、２方向反復測定ＡＮＯＶＡ）。ｌ、１日目に手がかり条件付け、２日目に光オン／オフセッション中の音に対する想起。
【０２６８】
上記の実験は、ＡＣ−ＣＡ突起細胞の活性化は文脈記憶を十分に誘発することを実証するものであった；次に、抑制性オプシンｅＮｐＨＲ３．０のターゲットを突起をもたらす細胞にすることにより、必要性を試験（図１３Ｆ及び図１３Ｇ）し、光の限局的かつ両側的なターゲットをＡＣ−ＣＡ細胞体に定めた（図１４Ｊ）。ｅＮｐＨＲ３．０群の恐怖応答について、ＥＹＦＰ対照と比べて潜時及び強度の著しい欠落（図１４Ｋ、ｅＮｐＨＲ３．０群はｎ＝１２、ｅＹＦＰ群はｎ＝８、ｐ＜０．００１、２方向反復測定ＡＮＯＶＡ）が観察された。この効果は、十分に可逆的であった（図１４Ｋ）。ｅＮｐＨＲ３．０マウスは、インタクトな聴覚的手がかりによる記憶想起を実証することが見いだされた（図１４Ｌ、全群についてｎ＝８、対応のあるｔ検定でｎ．ｓ．）。これは、上述の機能喪失実験がＡＣ−ＣＡ突起細胞の海馬特異的効果を提示したことを裏付けている。
【０２６９】
総合すると、これらの解剖学的、電気生理学的、及び行動的データは、過去に特徴づけられていなかった単シナプス性の前頭前野−海馬突起の存在を明らかにするものである。この回路を抑制すると、恐怖条件付けされたマウスは、対照の対応マウスと同じ強度または速度で恐怖記憶を想起することができず、このことは記憶想起についての内在的重要性を示している。対照的に、この回路の活性化は、近い時期に条件付けされたマウスにロバストな恐怖記憶想起をもたらすのに十分であるが、ナイーブな条件付けされていないマウス、記憶が消去されたマウス、オプシンを発現しないマウス、または海馬を直接的もしくは間接的に駆動する他のタイプのものを受信しているマウスには十分ではない。
【０２７０】
高相関ニューロンは学習中に出現する
ＡＣ−ＣＡ突起が海馬のネットワーク活性に及ぼすリアルタイムの影響を観察するため、２光子顕微鏡下で、バーチャル環境（ＶＥ）において頭部を固定され、軸固定されたトラックボール上で移動するマウスに対し、恐怖条件付けパラダイム２４を適合させた。非移動性ではなく、リッキング抑制を恐怖行動の基準として使用した２５〜２７（図１５Ａ；方法）。マウスはこの課題を学習し、恐怖文脈において有意なリッキング抑制を示した。これは、正常な記憶想起を示す（図１５Ｂ、ｎ＝１２、Ｐ＜０．０１、対応のあるｔ検定）。行動中のイメージングのため、マウスに遺伝子コード型Ｃａ２＋指示物質ＧＣａＭＰ６ｍ２８を注入し、ＣＡ３の上方に頭蓋窓を移植し（図１５Ｃ、正常な海馬生理学の確認、そして図１６Ａ〜図１６Ｆにこれらのマウスの行動が示されている）、毎日、訓練及び想起の間、両方の文脈においてイメージングした（図１８Ａ）。全ての場合において、高速体積測定（５００ｘ５００μｍ  ｘ／ｙ、１００μｍ  ｚ）２光子イメージングを、＞４００ニューロンにアクセスしながら実施した（図１８Ｂ）。
【０２７１】
図１５Ａ〜図１５Ｌ。記憶形成は、文脈に相当する高相関のＨＣニューロンを生成する。ａ、頭部固定バーチャルリアリティのセットアップ。リッキング抑制により定量化される恐怖（方法）。ｂ、恐怖（黒色）ｖｓニュートラル（灰色）文脈におけるリッキング率（平均±ｓｄ、ｎ＝１２、Ｐ＜０．００１、対応のあるｔ検定）。恐怖（上）ｖｓニュートラル（下）文脈における、３日目のサンプル生リッキングプロファイル（スケール：１Ｖ、２０秒）。ｃ、注入／外科的移植から４週間後に実施した組織像。ＧＣａＭＰ６ｍ発現ニューロンの上方にインプラントが示されている。左：１０ｘ；スケール：２００μｍ。右：２０ｘ；スケール：５０μｍ。ｄ、代表的なマウスの恐怖文脈ｖｓニュートラル文脈における各ニューロンの相関パートナーの数を示すヒストグラム（図１９参照）。ｅ、恐怖文脈におけるＨＣニューロン（赤色）は、ニュートラル文脈では相関パートナーが少数である。（ｆ）、ｎ＝４マウス（恐怖文脈の６０±１８．２（ｓ．ｄ．）ｖｓニュートラル文脈の１８±１５．８；Ｐ＜０．０１、対応のあるｔ検定；図２０参照）。ｇ、１匹のマウスにおける記憶想起中のラスタープロット（上）及びたたみ込まれた活性ヒストグラム（下）；代表的なＨＣニューロン時系列を被せている（赤色）。ｈ、ＨＣニューロン活性オンセット（時間０）を相関ペアのオンセット活性と比較（ｎ＝６７ＨＣニューロン、６０．３±６％先行ｖｓ２３．２±１０％遅れ；Ｐ＜０．０１、対応のないｔ検定）。ｉ、同期的活性（Ｍｅｔｈｏｄｓ）の定量化（ｎ＝５、恐怖文脈で８．１±４事象ｖｓニュートラル文脈で４．２±１．６事象；Ｐ＜０．０１、対応のあるｔ検定）、速度（ｊ）やリッキング率（ｋ）では有意な変化を伴わなかった（ｎ＝５マウス；ｎ．ｓ．、対応のあるｔ検定）。ｌ、代表的なマウスからの主成分分析（図２３にさらなるデータセットあり）。恐怖文脈（赤色）ｖｓニュートラル文脈（青色）における集団軌跡、それぞれの最初の３つの主成分に対し投影。右：ＨＣニューロン及び各偏りに関与する相関ニューロンのｄＦ／Ｆトレース。スケール：４００％ｄＦ／Ｆ、２０秒。
【０２７２】
図１６Ａ〜図１６Ｆ。ＧＣａＭＰ６ｍ発現ＣＡ３ニューロンの生理学的特性。ａ、ＧＣａＭＰ６ｍの発現がＣａ２＋関連の生理学的プロセスを変化させないことを保証するため、ＤＳＩ（脱分極誘導性脱抑制：Ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）として知られる、エンドカンナビノイド介在の短期的可塑性の一形態をトラッキングした。ＤＳＩの概略図が示されている。ＤＳＩはシナプス後細胞内Ｃａ２＋の増加に応じて、エンドカンナビノイドの合成及び放出をもたらし、次に逆方向的方式で、カンナビノイド受容体を発現するシナプス前抑制性ニューロンからのＧＡＢＡ放出を抑制するシグナルをもたらす（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３１：１０９９３−１００２から改変）。ＧＣａＭＰ６ｍ発現ＣＡ３細胞の内在的膜特性は、過去に報告されたＣＡ３の値に類似していた（Ｋｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１４  １７：２６９−７９）；平均静止電位：−７２．１±１．６ｍＶ、平均入力抵抗：１６１．８±２６．４ＭΩ、ｎ＝７。ｂ、脱分極性電流ステップの適用後のＧＣａＭＰ６ｍ発現ＣＡ３細胞におけるｓＩＰＳＣのＤＳＩを例示するサンプルトレース（−６５ｍＶ〜０ｍＶ、５００ｍｓ）。ｃ、パッチピペット中に細胞内ＢＡＰＴＡを含むｓＩＰＳＣにＤＳＩが欠如したことを例示するサンプルトレース。ｄ、標準的な細胞内溶液を含むＧＣａＭＰ６ｍ発現細胞における正規化された電荷移動の概要的グラフ（左、ＤＳＩの後の正規化されたｓＩＰＳＣの電荷移動、同じ固定間隔にわたりプレパルスベースラインと比較：ベースライン電荷の４６．９±６．７％に電荷が減少；ｎ＝７；非ＧＣａＭＰ発現細胞で報告された電荷移動（Ｖａｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１０，１３：８２２−２４）に対する適合性あり）、そして細胞内ＢＡＰＴＡの添加（右、ｎ＝６；エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表す；ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定）。ｅ、各細胞（全てのマウスから、全てのＦＯＶにわたり、＞＝１の顕著な過渡応答を有する全てのニューロンをプール）における、ベースラインＧＣａＭＰ６ｍ蛍光強度（任意の単位は事象率集団データが確実に定量化され得る範囲に及ぶ）の関数としてのＧＣａＭＰ６ｍ発現ニューロンの自発的事象率（検出はＯｎｌｉｎｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓに記載）。事象率がＧＣａＭＰ６ｍ発現レベルの関数として有意に変化するようには観察されなかった（スピアマンの順位相関係数：０．４８，Ｐ＝０．３）。ｆ、ＧＣａＭＰ６ｍウイルス注入及び海馬上方のカニューレ移植を行う前のマウスからの行動スコア；恐怖文脈（黒色）ｖｓニュートラル文脈（灰色）における最初の２分のリッキング率が示されている。３日目の想起におけるリッキング抑制により評価される学習のレベル（３日目の恐怖文脈で平均０．５±０．３ｖｓ３日目のニュートラル文脈で２．７±０．３；ｎ＝１０、Ｐ＜０．００１、対応のあるｔ検定）。注入／移植前は、注入／移植後に対応するレベルに匹敵するものであった（図１５Ｂと比較）。
【０２７３】
図１７Ａ〜図１７Ｆ。ＡＣ−ＣＡ突起は、記憶想起中にＨＣニューロンを優先的に動員する。ａ、左：ＡＣに注入したＡＡＶ８−ＣａＭＫＩＩ：：ｂＲｅａＣｈＥＳ−ＥＹＦＰまたはＡＡＶ８−ＣａＭＫＩＩ：：Ｃ１Ｖ１−ＥＹＦＰ；ＣＡ２／ＣＡ３における可視化された線維末端（赤色）。（２０ｘ）；スケール：６０μｍ。右：ＡＣにおけるＡＡＶ８−ＣａＭＫＩＩ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ及びＣＡ３におけるＡＡＶｄｊ−ＣａＭＫＩＩ：：ＧＣＡＭＰ６ｍ。カニューレ移植から８週間後、ＧＣａＭＰ６ｍ発現ニューロン（緑色）の付近にあるＡＣ−ＣＡ突起（赤色）の保存を示す組織像。２０ｘ。スケール：５０μｍ。ｂ、２Ｐイメージング及び全野にわたるオプトジェネティクス的刺激のセットアップ（方法）。ｃ、訓練前及び訓練後の代表的なマウスから得られた２つの深度（４０μｍ離れた）におけるＺ−投影画像（経時的平均）。スケール：６０μｍ。ｄ、潜時の関数としてのＡＣ−ＣＡ刺激に対するＣＤＦ（応答細胞の割合）（ｎ＝４マウス；試験回数１２回、ｐ＝０．００２、コルモゴロフ−スミルノフ両側検定、κ＝０．２６７３）。挿入図におけるサンプルトレース（赤い枠：刺激持続時間）。連続試験は上塗りされている。ｅ、ニュートラル文脈における光刺激が、訓練後の有意なリッキング抑制を誘発している（ｎ＝４マウス、総試験回数１２回、平均±ｓｄ、Ｐ＜０．０１、対応のあるｔ検定）。訓練前にはリッキング抑制なし（対応のあるｔ検定で有意性なし）。ｆ、恐怖及びニュートラル文脈における、動員されたＨＣ及び非ＨＣニューロンの一部：光刺激訓練の前（ｎ＝３マウス、総試験回数１０回）及び後（ｎ＝４マウス、総試験回数１２回、Ｐ＜０．００１、一方向ＡＮＯＶＡ）。平均値、四分位値、最小値、及び最大値が示されている。
【０２７４】
日または文脈にわたり一貫して異なる機能ネットワークの特徴の識別を最初に探索した。活性ニューロンの平均応答マグニチュード、平均活性事象率、平均活性事象持続時間、及び活性ニューロンの空間分布を含めた、多くの特徴が区別不可能であった（図１８Ｃ〜図１８Ｆ、図１９Ａ〜図１９Ｊ）。しかし、恐怖文脈における記憶想起中に活性のニューロンの数の顕著な増加（図１９Ｂ、ｎ＝５マウス）が注目される。興味深いことには、これは平均相関活性の顕著な減少を伴った。先行研究は、学習後の相関活性増加を報告している２９〜３１が、簡素にまとめて説明すれば、平均相関が減少したネットワーク活性は、少数のニューロンが顕著に高い相関活性に関わる一方で大部分のニューロンが相関から脱している、学習後のより希薄な状態を反映しているという可能性が考えられる。実際に、各ニューロンの相関パートナーの数をビニングし、ヒストグラムに分布ａｅ−ｂｘを適合させると、学習前のランダム編成されたポワソンのような相関分布から、学習後のより規則正しい、べき乗則のような分布への顕著な分布シフトが明らかになり（図１５Ｄ、図１９Ｄ）、ニューロンの小集団の出現はネットワークにおける高相関活性を示した（ＨＣニューロン）。実際に、単一ニューロンレベルでは、最も高いレベルの細胞ごとの相関が、恐怖文脈で見られた（図１５Ｄ、図１９Ｄ；ｎ＝５；Ｐ＜０．０１、対応のあるｔ検定）。恐怖及びニュートラル文脈の区別的な表現について、さらなる定量的特性を評価した（図１９Ｄ〜図１９Ｉ）ところ、べき乗則の指数ｂが、この文脈分離に最も大きく寄与することが明らかになり（図１９Ｃ、ｎ＝５、Ｐ＜０．０１）、これは恐怖記憶想起の側面を表すＨＣニューロンの出現に整合する。興味深いことには、恐怖文脈におけるＨＣニューロン（図１５Ｅ；濃い色のドットで示される）は、ニュートラル文脈（図１５Ｆ；図２０）では低い程度の相関パートナーを有するニューロンである傾向がみられたことであり、このことは、学習後のＨＣニューロンの出現が、単に先在する相関細胞アンサンブルの強化に由来するわけではないことを示唆している。
【０２７５】
図１８Ａ〜図１８Ｆ。３Ｄ海馬ボリュームにおける神経アンサンブルのリアルタイムイメージング：神経源の抽出及び重要な過渡応答の識別。ａ、ヘッド固定バーチャルリアリティのセットアップ。マウスが軸方向に固定したトラックボール３１．上で走る間、動作及びリッキング行動を、いずれもバーチャルリアリティゲームソフトウェアに接続した状態で、それぞれ光マウス及びリッコメーター（ｌｉｃｋｏｍｅｔｅｒ）により測定した。文脈的恐怖条件付けのため、水制限したマウスを別々の視覚的、嗅覚的、触覚的、及び聴覚的手がかりを有する２つの文脈に曝露した（１日目）。一方の文脈（恐怖文脈）では嫌悪エアパフを与え、もう一方（ニュートラル文脈）では与えなかった（２日目）。２つの文脈における恐怖記憶想起をリッキング抑制により定量化した（３日目、３０日目）。ｂ、光セクションのそれぞれについてＣＡ２／ＣＡ３から抽出した神経ソース（セグメント化細胞）を用いた、生動画からのサンプル平均輝度ｚ投影（スケール：５０μｍ）、及び最初の５０の時系列トレース。スケール：３００％  ｄＦ／Ｆ、３０秒。ｃ、ｄＦ／Ｆトレースにおける顕著な過渡応答の特定。振幅２σ以上のノイズ（ノイズは細胞ごとに算出）で生じた事象の分布を、秒単位の事象持続時間の範囲にわたって示すヒストグラム。各振幅及び持続時間における負方向の過渡応答の数を赤色で座標の左側にプロットし、各振幅及び持続時間における正方向の過渡応答を青色で右側にプロットした。ｄ、３σ、そしてｅ、４σの振幅で発生する事象について上記解析を反復した。ｆ、２σ、３σ、及び４σ事象についての偽陽性率（全てのＦＯＶにわたる全てのマウスの全てのニューロンをプールした）。偽陽性率曲線を、各σレベルについて、そのレベルにおける負の事象の数をそのレベルにおける正の事象の数で割ることにより、算出した（Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）。事象オンセットは、２σを超えるｄＦ／Ｆに対応する時間として定義され、オフセットは、０．５σを下回るｄＦ／Ｆに対応する時間として定義された。減衰指数関数は、最小２乗により、偽陽性率値に対し適合させた。これにより、各σレベルにおいて種々の信頼レベルで最小過渡応答持続期間の決定が可能になった。
【０２７６】
図１９Ａ〜図１９Ｊ。想起中の海馬における不安及びニュートラルネットワークの細胞集団及びグラフ特性。ａ、全事象振幅または全事象率における非文脈依存変化が検出された。上のパネル：ＧＣａＭＰ６ｍが検出された平均事象振幅（全ての有意な事象の平均ｄＦ／Ｆ；各ニューロンについての有意な事象の定義は、方法に記載の通り）を、恐怖及びニュートラル文脈におけるマウスに対し何日かにわたりプロットした（ｎ＝５マウス、ｎ．ｓ．対応のあるｔ検定）。下のパネル：ＧＣａＭＰ６ｍが検出された平均事象率を、恐怖及びニュートラル文脈におけるマウスに対し何日かにわたりプロットした（ｎ＝５マウス、ｎ．ｓ．対応のあるｔ検定）。ｂ、個々のニューロンにおける文脈依存変化及び相関行動が観察された。上のパネル：活性ニューロンの数（文脈の最初の２分以内で少なくとも１つの有意なＧＣａＭＰ６ｍ過渡応答が検出される）を恐怖及びニュートラル文脈についてプロットした（ｎ＝５マウス、３日目の恐怖文脈で３７８±６４ｖｓ３日目のニュートラル文脈で２５７±３９；Ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定、平均±ｓ．ｄ．）。下のパネル：ニューロンごとの相関ペアの平均数（ペアワイズピアソン相関係数＞０．３）を恐怖及びニュートラル文脈についてプロットした（ｎ＝５マウス、２日目の恐怖文脈で１８．５±１．８ｖｓ２日目のニュートラル文脈で１３．４±１．４；３日目の恐怖文脈で１１．３±０．８ｖｓ３日目のニュートラル文脈で１３．６±０．５；Ｐ＜０．０５，対応のあるｔ検定）。ｃ、図１５Ｄのヒストグラムをａｅ−ｂｘの形式の指数分布に適合させることで、３日目の恐怖文脈（各赤色のドットは１匹のマウスを表す）におけるべき乗則分布（ｂ＞１）が、３日目のニュートラル文脈（ｂ＜１；緑色のドット）との比較で実証される。これは、全てのマウスにわたり一貫していた（ｎ＝５マウス；Ｐ＜０．０１、対応のあるｔ検定）。多くのグラフ特性が恐怖ｖｓ．ニュートラル文脈について算出されたが、度数分布のべき乗則指数が最も強力にニュートラル（緑色）から恐怖（赤色）を区別した（判別を示す：べき乗則指数の係数＝０．７８、クラスター係数の係数＝０．６１、平均パス長の係数＝０．１１、９０％信頼区間はそれぞれ［０．７４，１．０］、［０．１，０．６５］、及び［０．０１，０．２３］である）。これらの信頼区間は、１０００のブートストラップサンプルを用いて得られた；線形サポートベクターマシン分類を用いた最も良好な３Ｄ超空間分離が示されている。ｄ、３日目（想起試験）の恐怖ｖｓニュートラル文脈においてマウス全体にわたり各ニューロンに存在する相関パートナーニューロンの数のヒストグラム。赤色の点線は、相関閾値を示す（ネットワーク中の相関ペアの数において自動で平均＋１標準偏差として設定）、右側には（定義により）高相関すなわちＨＣニューロンがある。マウス全体にわたり、恐怖ｖｓ．ニュートラル文脈において対象となる同様の測定値を算出し、本明細書で他のグラフ不変量特性として示す；ｅ、媒介中心性；ｆ、ｇ、クリーク特性；ｈ、強度；ｉ、クラスター係数；及びｊ、平均パス長（全てＯｎｌｉｎｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓで定義されている）。上記の計算について、２つのニューロン間の相関��、ペアワイズピアソン相関係数が０．３を超える場合に存在するものとして定義された（Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）。データは、各マウスに対応する個々のデータポイントとして、平均±Ｓ．Ｄ．と共に提示される。（＊）＝ｐ＜０．０５；（＊＊）＝ｐ＜０．０１；（＊＊＊）＝ｐ＜０．００１、対応のあるｔ検定を使用。
【０２７７】
図２０。恐怖ｖｓ．ニュートラル文脈で出現し、恐怖文脈により定義されるＨＣニューロンの機能的関係。ａ〜ｃ、全ての追加的マウス（図１５Ｅ、図１５Ｆの代表例以外）からのデータ。ＨＣニューロン（赤色の丸）が、恐怖文脈においては相関パートナー（灰色のエッジ）の程度が高く、ニュートラル文脈に置かれると相関パートナーの程度がはるかに低くなることを実証している（ｎ＝４マウス、図１５Ｅ、図１５Ｆの例を含む）；恐怖文脈で平均＝６０相関ペア（標準偏差１９．４）ｖｓニュートラル文脈で平均＝１８相関ペア（標準偏差１４．２）；対応のあるｔ検定によりＰ＜０．０１）。全く同じＦＯＶ（細胞同一性を伴う）は、１匹のマウスについて恐怖ｖｓ．ニュートラル文脈でキャプチャーしなかったため、ここでは４匹のマウスのみを解析する。
【０２７８】
これらのＨＣニューロンの重要性を良好に理解するため、解析はＨＣニューロンが活性である時点におけるネットワーク全体の活性に焦点を絞った。ＨＣニューロンは、自らの相関ペアに遅れるのではなく先行する傾向があり（図１５Ｈ）、ボリューム全体に空間分布していた（図２１Ａ及び図２１Ｂ）。さらに、全体の細胞ごとの相関活性は、恐怖想起試験中には減少したが、運動に関連しないことが確認され（図１５Ｊ及び図１５Ｋ）、本質的に直交するニューロンの群からなる（図１５Ｌ、図２３Ａ〜図２３Ｅ）、顕著により多い集団規模の同期的事象（図１５Ｇ及び図１５Ｉ）は、恐怖文脈において発生した；ＨＣニューロンはこれらの広範な同期的事象を先導することが見いだされ（図２１Ｃ、ｐ＜０．００１、コルモゴロフ−スミルノフ両側検定）、ＨＣニューロンの７８％が同期的事象の最初の２０％以内で活性だった。この事象を先導する性質は、ＨＣニューロンのネットワーク活性を動員する役割に整合すると考えられる。
【０２７９】
重要なことには、上記の解析は、シグナルにおける遅い変動であるところの潜在的な混乱要因（例えば、ＧＣａＭＰ６ｍ及びＣａ２＋反応速度）がニューロン間の相関に及ぼす影響を制限するために設計されたことである。加えて、遅い減衰反応速度を除去しながら活性のオンセットを検出する高速非負デコンボリューション解析３２は、上記のように、恐怖ｖｓ．ニュートラル文脈におけるペアワイズ相関の増加、ＨＣニューロンが相関ペアと比較して事象を先導する性質、及び恐怖ｖｓ．ニュートラル文脈における同期的事象の増加について、一貫性のある結果をもたらした（図２２Ａ〜図２２Ｄ）。
【０２８０】
図２１Ａ〜図２１Ｃ。ＨＣニューロンによる空間及び時間の編成。ａ、平均ペアワイズ相関に対する、５匹の全てのマウスからの全てのＦＯＶ（全ての日及び全ての文脈）について平均化した平均ペアワイズ距離のプロット。有意ではあるが弱い関係を平均相関と距離との間で検出することは可能であった（スピアマンの相関＝−０．６６、Ｐ＝０．０１）。これは、ＣＡ２／ＣＡ３の反復的回路から予想され得るような微細なスケールでの空間クラスタリングの反映であると考えられるが、脳の運動及び一般的なニューロピルシグナルに起因するＲＯＩ間の残余のクロストークを含む可能性も考えられる。これは予想されることであり、海馬において過去に観察されたこと３と顕著に異なるわけではない。ｂ、相関ペアの数に対する、全てのニューロンのペアワイズ距離（黒色の線）、及びＨＣニューロンのみのペアワイズ距離（灰色の線）のプロット。ＨＣニューロンについては、より遠くの距離に相関のより高いペアが見いだされた（ＨＣニューロンはスピアマン＝０．８４、Ｐ＝０．００２；全てのニューロンはスピアマンの相関＝０．２３、Ｐ＝０．４３）。ｃ、経時的な同期的事象（ｘ軸）にわたり、様々な潜時におけるオンセット時間を有するＨＣニューロン（ｙ軸）のフラクションを示す累積分布。全てのマウスに対し平均し、非ＨＣニューロンの応答潜時と比較。ＨＣニューロン活性は、同期的事象中、非ＨＣニューロンよりも有意に早く出現した（ｐ＜０．００１、コルモゴロフ−スミルノフ両側検定、κ＝０．６６４；プロットの水平解像度は、同期ウインドウの長さに反比例し、フレーム持続時間に依存していることに留意されたい；例えば、３３３ｍｓのフレーム持続時間を伴う長さ１０秒の同期ウインドウは、フレーム当たり３．３３％の解像度に相当する）。
【０２８１】
図２２Ａ〜図２２Ｅ。追加的解析：高速非負デコンボリューション解析及び相関ペア解析を用いた事象オンセットの推定。ａ、当初のＧＣａＭＰ６ｍトレース（上のトレース）とデコンボリューションされたトレース（下のトレース）のペアリング例。これは、デコンボリューションされたデータから信頼性の高い事象オンセットの推定がなされることを示す（デコンボリューションのアルゴリズム及びパラメーターはＯｎｌｉｎｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓにさらに詳述されている）。スケールバー：１５０％ｄＦ／Ｆ、１０秒。ｂ、一匹の動物における代表的な同期的事象からの当初のＧＣａＭＰ６ｍトレース（左）を、同じ同期的事象についてデコンボリューションされたトレース（右）とペアリングする。スケールバー：３００％ｄＦ／Ｆ、１０秒。ｃ、３日目の恐怖文脈における最高度（ｈｉｇｈｅｓｔ−ｄｅｇｒｅｅ）ノード（最大数の相関ペアを有するニューロン）は、３日目のニュートラル文脈における最高度ノードよりも有意に多くの相関ペアーを有し、ｎ＝５マウスにわたり有意であった（５８．８ｖｓ３３．２ペア、Ｐ＜０．０１、対応のあるｔ検定）。ｄ、ＨＣニューロン活性オンセットの経時的関係（時間０に設定）を相関ペアのオンセット活性と比較（ＨＣ活性の前または後の３３３ｍｓにビニング）；ｎ＝４８  ＨＣニューロン。ＨＣニューロンは、自らの相関ペアに遅れる可能性よりも先行する可能性の方が高かった（先行５８．５±２０％ｖｓ遅れ２４．４±１０％；Ｐ＜０．０１、対応のないｔ検定）。ｅ、５匹のマウスにわたり定量化した有意な同期的活性：恐怖文脈における同期的事象の数は、ニュートラル文脈におけるよりも有意に多かった（恐怖文脈で５．８±２．９事象ｖｓニュートラル文脈で１．２±１．１；Ｐ＜０．０１、対応のあるｔ検定）。
ＡＣ−ＣＡ突起は想起中にＨＣニューロンをターゲットにする
【０２８２】
記憶想起中におけるこれらの体積イメージング研究は、高相関及び局所的な同期的事象の先導によって特徴づけられる、ＨＣニューロンの希薄なセットの出現を実証するものである。このようなニューロンは、記憶想起中にトップダウン突起によって優先的に動員された場合に、効率的なアクセスポイントとしての役割を果たし得る。この考えを試験するため、ＡＣ−ＣＡ突起を刺激すると同時にシナプス後海馬ネットワークをイメージングして局所的な動態を直接観察することが求められた。ＣｈＥＴＡ３５ベース及び他の突然変異を含めるようにＲｅａＣｈＲを広範囲に修飾することにより、強力な光電流、高いスパイク忠実度（図２４Ａ〜図２４Ｋ）、及び長距離の突起におけるロバストなトラフィッキング配列を有する、赤色シフトしたオプシン（ｂＲｅａＣｈＥＳと称される）が生成された（図１７Ａ）。
【０２８３】
マウスに対し、ＣＡ３にＧＣａＭＰ６ｍを、前帯状回にｂＲｅａＣｈＥＳを注入し、ＣＡ３の上方にカニューレを移植して（図１７Ａ）、同じ窓を介して突起末端の１Ｐ刺激及びＣＡ３錐体ニューロンの２Ｐイメージングを行った（図１７Ｂ）。突起の因果的効果を試験するため、複数の光刺激試験を条件付けの前と後の両方で実施し、同時に複数の文脈と日にまたがって同じニューロンのトラッキングを実施した（図１７Ｃ）。試験対試験の変動性が活性化されたニューロンの数及び同一性において存在したが、恐怖条件付けにより、トップダウン突起のオプトジェネティクス刺激のオンセットがタイムロックされた細胞のフラクションが一貫して増加することが見いだされた（図１７Ｄ、Ｐ＝０．００２、コルモゴロフ−スミルノフ両側検定）。最後に、この突起による記憶関連のＨＣニューロンの動員を直接的に試験した。これを行うため、まず、先の結果に一致して、頭部を固定されたマウスが文脈的恐怖条件付け課題を学習することと、ＡＣ−ＣＡ突起の刺激が訓練の後にのみ記憶想起を誘発し、訓練前には誘発しないこととを確証した（図１７Ｅ）。多くの試験にわたる定量化により示されたことは、ＡＣ−ＣＡ突起の刺激は、訓練前には恐怖文脈またはニュートラル文脈のいずれにおいても比較的少ない（約５％）ＨＣニューロンを動員し、一方訓練後には、動員されるＨＣニューロンのフラクションに著明な増加（約２０％）があり、恐怖文脈における非ＨＣニューロンの動員、及びニュートラル文脈における任意のニューロンの動員は、変化しないか低いままであった（図１７Ｆ）。これらの結果はさらに、ＡＣ−ＣＡ突起の機能的影響が迅速に再編成され、最近形成された文脈的恐怖記憶に関連したＨＣニューロンの優先的動員がもたらされることが実証された。これらの発見は共に、トップダウン突起回路が影響を及ぼす手段が、著しい記憶提示を編成及び係合して効率的な想起を可能にし得ることを明らかにするものである。
【０２８４】
図２３Ａ〜図２３Ｅ。恐怖ｖｓ．ニュートラル文脈における集団軌跡のＰＣＡ。ａ、マウス２における全ての活性細胞のｄＦ／ＦトレースのＰＣＡを、恐怖及びニュートラル文脈について別々に実施。恐怖文脈における集団軌跡は大きく、直角に近く、中心から外れていた；一方ニュートラル文脈の軌跡は、元の場所に近いところでとどまった。ｂ、ニューロン集団の３Ｄ再構築。各同期的事象｛赤色の丸（ｔ＝３９）、緑色の丸（ｔ＝９２）、青色の丸（ｔ＝２００）｝に関与するニューロンが、大体においてオーバーラップせず、ボリューム全体にわたって解剖学的に均質に分布していることを示す。３つの全ての事象に関与するニューロンの小さなフラクションが存在する（黒色の丸）。ｃ、ｄ、別の代表的なマウスについてデータが示されている。全ての他のマウスに同様の結果が見られた。ｅ、３つのイベントのそれぞれに関与するランダム選択された３０ニューロンのセットのｄＦ／Ｆトレースが示され、最大量のオーバーラップはｔ＝６５からｔ＝２１０の間で見られる。スケールバー：４００％ｄＦ／Ｆ、２０秒。
【０２８５】
図２４Ａ〜図２４Ｋ。ｂＲｅａＣｈＥＳ：ロバストな突起ターゲット化のための赤色シフトしたオプシンの操作。ａ、ＲｅａＣｈＲ３１及びｂＲｅａＣｈＥＳの概略図。ＲｅａＣｈＲは、チャネルロドプシン−１（青色、アミノ酸（ａａ）：１〜９５）、ボルボックス−チャネルロドプシン−１（赤色、ａａ：９６〜２４６、２７９〜３５０）、及びボルボックス−チャネルロドプシン−２（緑色、ａａ：２４７〜２７８）からのセグメントのハイブリッドである。ＶＣｈＲ１セグメントは、Ｌｅｕ１７１Ｉｌｅの点突然変異を含有する。ＲｅａＣｈＲは、本明細書において、発現及びメンブレントラフィッキングの強化ならびにチャネル反応速度の高速化のために修飾し、以下のようにｂＲｅａＣｈＥＳが得られた：最初の５１のＮ末端残基は、チャネルロドプシン−２（黄色、ａａ：１〜１１）からの最初の１１のＮ末端残基で置き換え、最後の５のＣ末端残基を除去した。グルタメート−１２３からセリンへの突然変異はチャネル閉鎖の速度を向上させる。ｂ、ラット海馬（それぞれｎ＝６）からの培養ニューロン中、４００から６５０ｎｍの間で０．６５ｍＷ／ｍｍ２にて測定した、Ｃ１Ｖ１ＴＴ、ｂＲｅａＣｈＥＳ、及びＣｈＲ２のスペクトル。ｃ、５７５ｎｍにおける定常光電流（Ｃ１Ｖ１ＴＴ  ６３０±１０９ｐＡ（ｓ．ｅ．ｍ．、図面全体で）、ＲｅａＣｈＲ  ９６３±１１３ｐＡ、ｂＲｅａＣｈＥＳ  １３６５±１２８ｐＡ）及び６３２ｎｍにおける定常光電流（Ｃ１Ｖ１ＴＴ  ３１５±１１１ｐＡ、ＲｅａＣｈＲ  １００３±９５ｐＡ、ｂＲｅａＣｈＥＳ  ８４１±１０２ｐＡ）。電流振幅は−８０ｍＶ及び５ｍＷ／ｍｍ２の光強度でそれぞれ測定された。ｄ、チャネル閉鎖の速度：単一指数のオフ反応速度のτ値（Ｃ１Ｖ１ＴＴ  ７９±３．７ｍｓ、ｎ＝２６；ＲｅａＣｈＲ  ６８２±８６ｍｓ、ｎ＝６；ｂＲｅａＣｈＥＳ  ４９±４．４ｍｓ、ｎ＝２５；Ｐ＜０．０００５）。ｅ、ｆ、６３３ｎｍの光で励起したＲｅａＣｈＲまたはｂＲｅａＣｈＥＳ発現培養ニューロンの代表的な電流クランプトレース（５ｍｓ、５ｍＷ／ｍｍ２）。ＲｅａＣｈＲ反応速度は非常に遅く、信頼できる活動電位は非常に低い周波数でしか生成することができなかった（ｅ）が、一方ｂＲｅａＣｈＥＳは、高速なチャネル閉鎖により、２０Ｈｚまでの信頼できるスパイクを生成することができた（ｆ）。ｇ、代表的な電圧クランプ及びｈ、電流クランプにおける、ｂＲｅａＣｈＥＳ発現シナプス前末端の光刺激（オレンジ色）に応答したシナプス後細胞のトレース。パルス長：５ｍｓ。ｉ、定常光電流、及びｊ、急性スライスのオプシン発現ｍＰＦＣ細胞における光誘起スパイクの確率（Ｃ１Ｖ１ＴＴ：ｎ＝１１、ｂＲｅａＣｈＥＳ：ｎ＝１０）。ｋ、光誘起ＥＰＳＣ振幅、及びｌ、シナプス後細胞におけるスパイク確率（Ｃ１Ｖ１ＴＴ：  ｎ＝１０、ｂＲｅａＣｈＥＳ：ｎ＝１８）。光波長５７５ｎｍ（２５ｎｍ帯域幅）及び電力密度５ｍＷ／ｍｍ２。
【０２８６】
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２７．Ｌｏｖｅｔｔ−Ｂａｒｒｏｎ  Ｍ，Ｋａｉｆｏｓｈ  Ｐ，Ｋｈｅｉｒｂｅｋ  ＭＡ，Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ  Ｎ，Ｚａｒｅｍｂａ  ＪＤ，Ｒｅａｒｄｏｎ  ＴＲ，Ｔｕｒｉ  ＧＦ，Ｈｅｎ  Ｒ，Ｚｅｍｅｌｍａｎ  ＢＶ，Ｌｏｓｏｎｃｚｙ  Ａ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｆｅａｒ  ｌｅａｒｎｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３，８５７−６３（２０１４）．
【０３１３】
２８．Ｃｈｅｎ  ＴＷ，Ｗａｒｄｉｌｌ  ＴＪ，Ｓｕｎ  Ｙ，Ｐｕｌｖｅｒ  ＳＲ，Ｒｅｎｎｉｎｇｅｒ  ＳＬ，Ｂａｏｈａｎ  Ａ，Ｓｃｈｒｅｉｔｅｒ  ＥＲ，Ｋｅｒｒ  ＲＡ，Ｏｒｇｅｒ  ＭＢ，Ｊａｙａｒａｍａｎ  Ｖ，Ｌｏｏｇｅｒ  ＬＬ，Ｓｖｏｂｏｄａ  Ｋ，Ｋｉｍ  ＤＳ．Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ４９９，２９５−３００（２０１３）．
【０３１４】
２９．Ｃｈｅｎｇ  Ｓ，Ｆｒａｎｋ  ＬＭ．Ｎｅｗ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  ｎｅｕｒａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．Ｎｅｕｒｏｎ．２００８  Ｊａｎ  ２４；５７（２）：３０３−１３．
【０３１５】
３０．Ｋｏｍｉｙａｍａ  Ｔ，Ｓａｔｏ  ＴＲ，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ＤＨ，Ｚｈａｎｇ  ＹＸ，Ｈｕｂｅｒ  Ｄ，Ｈｏｏｋｓ  ＢＭ，Ｇａｂｉｔｔｏ  Ｍ，Ｓｖｏｂｏｄａ  Ｋ．Ｌｅａｒｎｉｎｇ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｆｉｎｅ−ｓｃａｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｉｍａｇｅｄ  ｉｎ  ｍｏｔｏｒ  ｃｏｒｔｅｘ  ｃｉｒｃｕｉｔｓ  ｏｆ  ｂｅｈａｖｉｎｇ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４６４，１１８２−６（２０１０）．
【０３１６】
３１．Ｍｏｄｉ  ＭＮ，Ｄｈａｗａｌｅ  ＡＫ，Ｂｈａｌｌａ  ＵＳ．ＣＡ１  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｅｍｅｒｇｅ  ａｆｔｅｒ  ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｖｅ  ｌｅａｒｎｉｎｇ．Ｅｌｉｆｅ．２０１４，３：ｅ０１９８２．
【０３１７】
３２．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｔ．，Ｐａｃｋｅｒ，Ａ．Ｍ．，Ｍａｃｈａｄｏ，Ｔ．Ａ．，Ｓｉｐｐｙ，Ｔ．，Ｂａｂａｄｉ，Ｂ．，Ｙｕｓｔｅ，Ｒ．，＆  Ｐａｎｉｎｓｋｉ，Ｌ．Ｆａｓｔ  ｎｏｎｎｅｇａｔｉｖｅ  ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｓｐｉｋｅ  ｔｒａｉｎ  ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｍａｇｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１０，１０４：３６９１−３７０４．
【０３１８】
３３．Ｙｉｚｈａｒ  Ｏ，Ｆｅｎｎｏ  ＬＥ，Ｐｒｉｇｇｅ  Ｍ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｆ，Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ＴＪ，Ｏ’Ｓｈｅａ  ＤＪ，Ｓｏｈａｌ  ＶＳ，Ｇｏｓｈｅｎ  Ｉ，Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ  Ｊ，Ｐａｚ  ＪＴ，Ｓｔｅｈｆｅｓｔ  Ｋ，Ｆｕｄｉｍ  Ｒ，Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ  Ｃ，Ｈｕｇｕｅｎａｒｄ  ＪＲ，Ｈｅｇｅｍａｎｎ  Ｐ，Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ  Ｋ．Ｎｅｏｃｏｒｔｉｃａｌ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂａｌａｎｃｅ  ｉｎ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｏｃｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７７，１７１−８（２０１１）．
【０３１９】
３４．Ｌｉｎ  ＪＹ，Ｋｎｕｔｓｅｎ  ＰＭ，Ｍｕｌｌｅｒ  Ａ，Ｋｌｅｉｎｆｅｌｄ  Ｄ，Ｔｓｉｅｎ  ＲＹ．ＲｅａＣｈＲ：  ａ  ｒｅｄ−ｓｈｉｆｔｅｄ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｄｅｅｐ  ｔｒａｎｓｃｒａｎｉａｌ  ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６，１４９９−５０８（２０１３）．
【０３２０】
３５．Ｇｕｎａｙｄｉｎ  ＬＡ，Ｙｉｚｈａｒ  Ｏ，Ｂｅｒｎｄｔ  Ａ，Ｓｏｈａｌ  ＶＳ，Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ  Ｋ，Ｈｅｇｅｍａｎｎ  Ｐ．Ｕｌｔｒａｆａｓｔ  ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３，３８７−９２（２０１０）．
【０３２１】
３６．Ｇｏｓｈｅｎ  Ｉ，Ｂｒｏｄｓｋｙ  Ｍ，Ｐｒａｋａｓｈ  Ｒ，Ｗａｌｌａｃｅ  Ｊ，Ｇｒａｄｉｎａｒｕ  Ｖ，Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ  Ｃ，Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ  Ｋ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｒｅｍｏｔｅ  ｍｅｍｏｒｉｅｓ．Ｃｅｌｌ．２０１１，１４７：６７８−８９．
【０３２２】
３７．Ｖｉｎｊｅ  ＷＥ，Ｇａｌｌａｎｔ  ＪＬ．Ｓｐａｒｓｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｖｉｓｕａｌ  ｃｏｒｔｅｘ  ｄｕｒｉｎｇ  ｎａｔｕｒａｌ  ｖｉｓｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７，１２７３−１２７６（２０００）．
【０３２３】
３８．Ｏｌｓｈａｕｓｅｎ  ＢＡ，Ｆｉｅｌｄ  ＤＪ．Ｓｐａｒｓｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｏｆ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｉｎｐｕｔｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１４，４８１−４８７（２００４）．
【０３２４】
３９．Ｌ．Ｙａｓｓｉｎ，Ｂ．Ｌ．Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉ，Ｊ．Ｓ．Ｊｏｕｈａｎｎｅａｕ，Ｊ．Ａ．Ｗｅｎ，Ｊ．Ｆ．Ｐｏｕｌｅｔ，Ａ．Ｌ．Ｂａｒｔｈ．Ａｎ  ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｓｕｂｎｅｔｗｏｒｋ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｅｏｃｏｒｔｅｘ．Ｎｅｕｒｏｎ  ６８，１０４３−１０５０（２０１０）．
【０３２５】
４０．Ｇｄａｌｙａｈｕ  Ａ，Ｔｒｉｎｇ  Ｅ，Ｐｏｌａｃｋ  Ｐ，Ｇｒｕｖｅｒ  Ｒ，Ｇｏｌｓｈａｎｉ  Ｐ，Ｆａｎｓｅｌｏｗ  ＭＳ，Ｓｉｌｖａ  ＡＪ，Ｔｒａｃｈｔｅｎｂｅｒｇ  ＪＴ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｖｅ  Ｆｅａｒ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｓｐａｒｓｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｃｏｄｉｎｇ  ｉｎ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ｃｏｒｔｅｘ．Ｎｅｕｒｏｎ  ７５，１２１−１３２（２０１２）．
【０３２６】
４１．Ｂｕｚｓａｋｉ  Ｇ，Ｇｅｉｓｌｅｒ  Ｃ，Ｈｅｎｚｅ  ＤＡ，Ｗａｎｇ  Ｘ−Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｓｅｒｉｅｓ：  Ｃｉｒｃｕｉｔ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ａｎｄ  ａｘｏｎ  ｗｉｒｉｎｇ  ｅｃｏｎｏｍｙ  ｏｆ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２７，１８６−１９３（２００４）．
【０３２７】
４２．Ｐｅｒｉｎ  Ｒ，Ｂｅｒｇｅｒ  ＴＫ，Ｍａｒｋｒａｍ  Ｈ．Ａ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｆｏｒ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐｓ．ＰＮＡＳ  １０８，５４１９−５４２４（２０１１）．
【０３２８】
４３．Ｂｏｎｉｆａｚｉ  Ｐ，Ｇｏｌｄｉｎ  Ｍ，Ｐｉｃａｒｄｏ  ＭＡ，Ｊｏｒｑｕｅｒａ  Ｉ，Ｃａｔｔａｎｉ  Ａ，Ｂｉａｎｃｏｎｉ  Ｇ，Ｒｅｐｒｅｓａ  Ａ，Ｂｅｎ−Ａｒｉ  Ｙ，Ｃｏｓｓａｒｔ  Ｒ．ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ  ｈｕｂ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｅ  ｓｙｎｃｈｒｏｎｙ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００９，３２６：１４１９−２４．
【０３２９】
４４．Ｂｒｅｃｈｔ  Ｍ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｍ，Ｓａｋｍａｎｎ  Ｂ，Ｍａｒｇｒｉｅ  ＴＷ．Ｗｈｉｓｋｅｒ  ｍｏｖｅｍｅｎｔｓ  ｅｖｏｋｅｄ  ｂｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｙｒａｍｉｄａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｍｏｔｏｒ  ｃｏｒｔｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ  ４２７，７０４−７１０（２００４）．
【０３３０】
４５．Ｈｏｕｗｅｌｉｎｇ  ＡＲ，Ｂｒｅｃｈｔ  Ｍ．Ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｅｕｒｏｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｏｍａｔｏｓｅｎｓｏｒｙ  ｃｏｒｔｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ  ４５１，６５−６８（２００８）．
【０３３１】
４６．Ｌｉ  ＣＹ，Ｐｏｏ  Ｍ−Ｍ，Ｄａｎ  Ｙ．Ｂｕｒｓｔ  ｓｐｉｋｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｎｅｕｒｏｎ  ｍｏｄｉｆｉｅｓ  ｇｌｏｂａｌ  ｂｒａｉｎ  ｓｔａｔｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４：６４３−６４６（２００９）．
【０３３２】
４７．Ｐｒａｋａｓｈ  Ｒ，Ｙｉｚｈａｒ  Ｏ，Ｇｒｅｗｅ  Ｂ，Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ  Ｃ，Ｗａｎｇ  Ｎ，Ｇｏｓｈｅｎ  Ｉ，Ｐａｃｋｅｒ  ＡＭ，Ｐｅｔｅｒｋａ  ＤＳ，Ｙｕｓｔｅ  Ｒ，Ｓｃｈｎｉｔｚｅｒ  ＭＪ，Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ  Ｋ．Ｔｗｏ−ｐｈｏｔｏｎ  ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｏｏｌｂｏｘ  ｆｏｒ  ｆａｓｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｓｔａｂｌｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．９，１１７１−９（２０１２）．
【０３３３】
４８．Ｒｉｃｋｇａｕｅｒ  ＪＰ，Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ  Ｋ，Ｔａｎｋ  ＤＷ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｃｅｌｌｕｌａｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｐｌａｃｅ  ｃｅｌｌ  ｆｉｒｉｎｇ  ｆｉｅｌｄｓ．Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１４，１７：１８１６−２４．
【０３３４】
４９．Ｐａｃｋｅｒ  ＡＭ，Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＬＥ，Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ  ＨＷ，Ｈａｕｓｓｅｒ  Ｍ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ａｌｌ−ｏｐｔｉｃａｌ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｉｒｃｕｉｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１５，１２：１４０−６．
【０３３５】
５０．Ｃｈｕｎｇ  Ｋ，Ｗａｌｌａｃｅ  Ｊ，Ｋｉｍ  ＳＹ，Ｋａｌｙａｎａｓｕｎｄａｒａｍ  Ｓ，Ａｎｄａｌｍａｎ  ＡＳ，Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ＴＪ，Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ  ＪＪ，Ｚａｌｏｃｕｓｋｙ  ＫＡ，Ｍａｔｔｉｓ  Ｊ，Ｄｅｎｉｓｉｎ  ＡＫ，Ｐａｋ  Ｓ，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  Ｈ，Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ  Ｃ，Ｇｒｏｓｅｎｉｃｋ  Ｌ，Ｇｒａｄｉｎａｒｕ  Ｖ，Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ  Ｋ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔａｃｔ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４９７，３３２−７（２０１３）．
【０３３６】
本発明について、その具体的な実施形態を参照しながら記載してきたが、当業者は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、種々の変更がなされてもよく、かつ等価物が代用されてもよいことを理解するはずである。加えて、特定の状況、材料、物質の組成物、プロセス、プロセスステップ（単数または複数）は、本発明の目的、趣旨、及び範囲に適合するように多くの修正が施されてもよい。このような修正は全て、付属の請求項の範囲内であるように意図されている。
【図１−１】
2018529335.tif 000018
【図１−２】
2018529335.tif 000019
【図２】
2018529335.tif 000020
【図３−１】
2018529335.tif 000021
【図３−２】
2018529335.tif 000022
【図４−１】
2018529335.tif 000023
【図４−２】
2018529335.tif 000024
【図５−１】
2018529335.tif 000025
【図５−２】
2018529335.tif 000026
【図５−３】
2018529335.tif 000027
【図５−４】
2018529335.tif 000028
【図５−５】
2018529335.tif 000029
【図５−６】
2018529335.tif 000030
【図５−７】
2018529335.tif 000031
【図５−８】
2018529335.tif 000032
【図５−９】
2018529335.tif 000033
【図６−１】
2018529335.tif 000034
【図６−２】
2018529335.tif 000035
【図７−１】
2018529335.tif 000036
【図７−２】
2018529335.tif 000037
【図７−３】
2018529335.tif 000038
【図７−４】
2018529335.tif 000039
【図７−５】
2018529335.tif 000040
【図７−６】
2018529335.tif 000041
【図７−７】
2018529335.tif 000042
【図８】
2018529335.tif 000043
【図９】
2018529335.tif 000044
【図１０】
2018529335.tif 000045
【図１１−１】
2018529335.tif 000046
【図１１−２】
2018529335.tif 000047
【図１２】
2018529335.tif 000048
【図１３−１】
2018529335.tif 000049
【図１３−２】
2018529335.tif 000050
【図１３−３】
2018529335.tif 000051
【図１３−４】
2018529335.tif 000052
【図１３−５】
2018529335.tif 000053
【図１４−１】
2018529335.tif 000054
【図１４−２】
2018529335.tif 000055
【図１４−３】
2018529335.tif 000056
【図１４−４】
2018529335.tif 000057
【図１４−５】
2018529335.tif 000058
【図１４−６】
2018529335.tif 000059
【図１４−７】
2018529335.tif 000060
【図１４−８】
2018529335.tif 000061
【図１４−９】
2018529335.tif 000062
【図１５−１】
2018529335.tif 000063
【図１５−２】
2018529335.tif 000064
【図１５−３】
2018529335.tif 000065
【図１５−４】
2018529335.tif 000066
【図１６−１】
2018529335.tif 000067
【図１６−２】
2018529335.tif 000068
【図１７−１】
2018529335.tif 000069
【図１７−２】
2018529335.tif 000070
【図１７−３】
2018529335.tif 000071
【図１７−４】
2018529335.tif 000072
【図１８−１】
2018529335.tif 000073
【図１８−２】
2018529335.tif 000074
【図１８−３】
2018529335.tif 000075
【図１９−１】
2018529335.tif 000076
【図１９−２】
2018529335.tif 000077
【図１９−３】
2018529335.tif 000078
【図２０Ａ】
2018529335.tif 000079
【図２０Ｂ】
2018529335.tif 000080
【図２０Ｃ】
2018529335.tif 000081
【図２１】
2018529335.tif 000082
【図２２】
2018529335.tif 000083
【図２３−１】
2018529335.tif 000084
【図２３−２】
2018529335.tif 000085
【図２４−１】
2018529335.tif 000086
【図２４−２】
2018529335.tif 000087
【図２４−３】
2018529335.tif 000088
【図２４−４】
2018529335.tif 000089
【配列表】
2018529335000001.app
【国際調査報告】
2018529335.tif 000090
2018529335.tif 000091
2018529335.tif 000092
2018529335.tif 000093
2018529335.tif 000094
2018529335.tif 000095
2018529335.tif 000096