(57)【要約】  本開示は、細胞分裂遺伝子座（ＣＤＬ）を用いて動物細胞における細胞増殖を制御するための分子ツール、方法及びキットを提供する。本明細書において提供されるＣＤＬは、遺伝子座であって、その転写産物が細胞分裂中に発現される遺伝子座である。ＣＤＬは、本明細書に記載される通り、陰性選択マーカ及び／又は誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を含むように遺伝子修飾され得、これにより、ユーザは、適切な誘導物質を添加又は除去することにより、遺伝子修飾細胞の増殖を可能にし、アブレートし、及び／又は阻害することができる。【選択図】図２
2018507701.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物細胞の増殖を制御する方法であって、
−  動物細胞を用意するステップ；
−  前記動物細胞において、細胞分裂遺伝子座（ＣＤＬ）を遺伝子修飾するステップであって、前記ＣＤＬは、１つ又は複数の遺伝子座であって、その転写産物が分裂細胞によって発現される１つ又は複数の遺伝子座であり、前記ＣＤＬの前記遺伝子修飾は、
ａ）アブレーションリンク（ＡＬＩＮＫ）系であって、前記ＣＤＬをコードするＤＮＡ配列に転写によって連結される陰性選択マーカをコードするＤＮＡ配列を含む、アブレーションリンク（ＡＬＩＮＫ）系と；
ｂ）ＣＤＬの調節の誘導性外性活性化因子（ＥＡＲＣ）系であって、前記ＣＤＬに作動可能に連結される誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を含む、ＣＤＬの調節の誘導性外性活性化因子（ＥＡＲＣ）系と
の１つ又は複数を含む、ステップ；
−  前記陰性選択マーカの誘導物質を用いて、前記ＡＬＩＮＫ系を含む前記遺伝子修飾動物細胞の増殖を制御するステップ；及び／又は
−  前記誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質を用いて、前記ＥＡＲＣ系を含む前記遺伝子修飾動物細胞の増殖を制御するステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記ＡＬＩＮＫ修飾動物細胞の前記制御は、
−  前記陰性選択マーカの誘導物質の非存在下で、前記ＡＬＩＮＫ系を含む前記遺伝子修飾動物細胞を維持することにより、前記ＡＬＩＮＫ系を含む前記遺伝子修飾動物細胞の増殖を可能にするステップ；及び
−  前記ＡＬＩＮＫ系を含む前記動物細胞を前記陰性選択マーカの前記誘導物質に曝露することにより、前記ＡＬＩＮＫ系を含む前記遺伝子修飾動物細胞の増殖をアブレート又は阻害するステップ
の１つ又は複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＥＡＲＣ修飾動物細胞の前記制御は、
−  前記ＥＡＲＣ系を含む前記遺伝子修飾動物細胞を前記誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質に曝露することにより、前記ＥＡＲＣ系を含む前記遺伝子修飾動物細胞の増殖を可能にするステップ；及び
−  前記誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の前記誘導物質の非存在下で、前記ＥＡＲＣ系を含む前記動物細胞を維持することにより、前記ＥＡＲＣ系を含む前記遺伝子修飾動物細胞の増殖を阻止又は阻害するステップ
の１つ又は複数を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＤＬの前記遺伝子修飾は、
ａ）前記ＡＬＩＮＫ系を含むＤＮＡベクター；
ｂ）前記ＥＡＲＣ系を含むＤＮＡベクター；及び
ｃ）前記ＡＬＩＮＫ系及び前記ＥＡＲＣ系を含むＤＮＡベクター
の１つ又は複数による前記ＣＤＬの標的置換を実施するステップを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＤＬの前記ＡＬＩＮＫ遺伝子修飾は、同型接合性、異型接合性、半接合性若しくは化合物異型接合性であり、及び／又は前記ＥＡＲＣ遺伝子修飾は、機能性ＣＤＬ修飾がＥＡＲＣ修飾対立遺伝子を通してのみ生成され得ることを確実にする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＤＬは、表２に列挙される１つ又は複数の遺伝子座である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＤＬは、遺伝子産物であって、その機能が細胞周期、ＤＮＡ複製、ＲＮＡ転写、タンパク質翻訳、及び代謝の１つ又は複数に関与している遺伝子産物をコードする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＤＬは、Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１、Ｔｏｐ２Ａ／ＴＯＰ２Ａ、Ｃｅｎｐａ／ＣＥＮＰＡ、Ｂｉｒｃ５／ＢＩＲＣ５、及びＥｅｆ２／ＥＥＦ２の１つ又は複数であり、好ましくは、前記ＣＤＬはＣｄｋ１又はＣＤＫ１である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＡＬＩＮＫ系は、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系、シトシンデアミナーゼ／５−フルオロシトシン系、カルボキシルエステラーゼ／イリノテカン系、又はｉＣａｓｐ９／ＡＰ１９０３系を含み、好ましくは、前記ＡＬＩＮＫ系は単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＥＡＲＣ系は、ｄｏｘ−架橋系、クメートスイッチ誘導系、エクジソン誘導系、電波誘導系、又はリガンド−可逆的二量体化系であり、好ましくは、前記ＥＡＲＣ系はｄｏｘ−架橋系である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記動物細胞は、哺乳動物細胞又は鳥類細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物細胞は、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、シカ、エルク、スイギュウ、雄牛、ラクダ、ラマ、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、又は非ヒト霊長類細胞であり、好ましくは、前記哺乳動物細胞はヒト細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記動物細胞は、多能性幹細胞、複能性細胞、単能性前駆細胞、又は最終分化細胞である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記動物細胞は、多能性幹細胞、複能性細胞、単能性前駆細胞、又は最終分化細胞に由来する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法に従って動物細胞集団の増殖を制御する方法。
【請求項１６】
細胞増殖を制御するための少なくとも１つの機構を含むように遺伝子修飾された動物細胞であって、
−  １つ又は複数の細胞分裂遺伝子座（ＣＤＬ）の遺伝子修飾
を含み、前記ＣＤＬは、１つ又は複数の遺伝子座であって、その転写産物が分裂細胞によって発現される１つ又は複数の遺伝子座であり、前記遺伝子修飾は、
ａ）アブレーションリンク（ＡＬＩＮＫ）系であって、前記ＣＤＬをコードするＤＮＡ配列に転写によって連結される陰性選択マーカをコードするＤＮＡ配列を含む、アブレーションリンク（ＡＬＩＮＫ）系と；
ｂ）ＣＥＤＬの調節の外性活性化因子（ＥＡＲＣ）系であって、前記ＣＤＬに作動可能に連結される誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を含む、ＣＥＤＬの調節の外性活性化因子（ＥＡＲＣ）系と
の１つ又は複数である、動物細胞。
【請求項１７】
前記ＣＤＬの前記遺伝子修飾は、
ａ）前記ＡＬＩＮＫ系を含むＤＮＡベクター；
ｂ）前記ＥＡＲＣ系を含むＤＮＡベクター；
ｃ）前記ＡＬＩＮＫ系及び前記ＥＡＲＣ系を含むＤＮＡベクター
の１つ又は複数による前記ＣＤＬの標的置換を実施するステップを含む、請求項１６に記載の遺伝子修飾動物細胞。
【請求項１８】
前記ＣＤＬの前記ＡＬＩＮＫ遺伝子修飾は、同型接合性、異型接合性、半接合性若しくは化合物異型接合性であり、及び／又は前記ＥＡＲＣ遺伝子修飾は、機能性ＣＤＬ修飾がＥＡＲＣ修飾対立遺伝子を通してのみ生成され得ることを確実にする、請求項１６又は１７に記載の遺伝子修飾動物細胞。
【請求項１９】
前記ＣＤＬは、表２に列挙される遺伝子座の１つ又は複数である、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の遺伝子修飾動物細胞。
【請求項２０】
前記ＣＤＬは、遺伝子産物であって、その機能が細胞周期、ＤＮＡ複製、ＲＮＡ転写、タンパク質翻訳、及び代謝の１つ又は複数に関与している遺伝子産物をコードする、請求項１９に記載の遺伝子修飾動物細胞。
【請求項２１】
前記ＣＤＬは、Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１、Ｔｏｐ２Ａ／ＴＯＰ２Ａ、Ｃｅｎｐａ／ＣＥＮＰＡ、Ｂｉｒｃ５／ＢＩＲＣ５、及びＥｅｆ２／ＥＥＦ２の１つ又は複数であり、好ましくは、前記ＣＤＬはＣｄｋ１又はＣＤＫ１である、請求項２０に記載の遺伝子修飾動物細胞。
【請求項２２】
前記ＡＬＩＮＫ系は、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系、シトシンデアミナーゼ／５−フルオロシトシン系、カルボキシルエステラーゼ／イリノテカン系、又はｉＣａｓｐ９／ＡＰ１９０３系を含み、好ましくは、前記ＡＬＩＮＫ系は単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系である、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の遺伝子修飾動物細胞。
【請求項２３】
前記ＥＡＲＣ系は、ｄｏｘ−架橋系、クメートスイッチ誘導系、エクジソン誘導系、電波誘導系、又はリガンド−可逆的二量体化系であり、好ましくは、前記ＥＡＲＣ系はｄｏｘ−架橋系である、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の遺伝子修飾動物細胞。
【請求項２４】
前記動物細胞は、哺乳動物細胞又は鳥類細胞である、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の遺伝子修飾動物細胞。
【請求項２５】
前記哺乳動物細胞は、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、シカ、エルク、スイギュウ、雄牛、ラクダ、ラマ、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、又は非ヒト霊長類細胞であり、好ましくは、前記哺乳動物細胞はヒト細胞である、請求項２４に記載の遺伝子修飾動物細胞。
【請求項２６】
前記動物細胞は、多能性幹細胞、複能性細胞、単能性前駆細胞、又は最終分化細胞である、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載の遺伝子修飾動物細胞。
【請求項２７】
前記動物細胞は、多能性幹細胞、複能性細胞、単能性前駆細胞、又は最終分化細胞に由来する、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載の遺伝子修飾動物細胞。
【請求項２８】
請求項１６〜２７のいずれか一項に記載の細胞による遺伝子修飾動物細胞の集団。
【請求項２９】
細胞分裂遺伝子座（ＣＤＬ）の発現を修飾するためのＤＮＡベクターであって、前記ＣＤＬは、１つ又は複数の遺伝子座であって、その転写産物が分裂細胞によって発現される１つ又は複数の遺伝子座であり、前記ＤＮＡベクターは、
−  アブレーションリンク（ＡＬＩＮＫ）系
を含み、前記ＡＬＩＮＫ系は、前記ＣＤＬに転写によって連結される陰性選択マーカをコードするＤＮＡ配列を含み、
前記ＤＮＡベクターが１つ又は複数の宿主細胞に挿入される場合、前記ＤＮＡベクターを含む増殖宿主細胞は、前記ＤＮＡベクターを含む前記増殖宿主細胞が前記陰性選択マーカの誘導物質に曝露されると殺傷されることになる、ＤＮＡベクター。
【請求項３０】
細胞分裂必須遺伝子座（ＣＤＬ）の発現を修飾するためのＤＮＡベクターであって、前記ＣＤＬは、１つ又は複数の遺伝子座であって、その転写産物が分裂細胞によって発現される１つ又は複数の遺伝子座であり、前記ＤＮＡベクターは、
−  ＣＤＬの調節の外性活性化因子（ＥＡＲＣ）系
を含み、前記ＥＡＲＣ系は、前記ＣＤＬに作動可能に連結される誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を含み、
前記ＤＮＡベクターが１つ又は複数の宿主細胞に挿入される場合、前記ＤＮＡベクターを含む増殖宿主細胞は、前記ＤＮＡベクターを含む前記増殖宿主細胞が前記誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質に曝露されなければ殺傷されることになる、ＤＮＡベクター。
【請求項３１】
細胞分裂必須遺伝子座（ＣＤＬ）の発現を修飾するためのＤＮＡベクターであって、前記ＣＤＬは、１つ又は複数の遺伝子座であって、その転写産物が分裂細胞によって発現される１つ又は複数の遺伝子座であり、前記ＤＮＡベクターは、
−  アブレーションリンク（ＡＬＩＮＫ）系であって、前記ＣＤＬに転写によって連結される陰性選択マーカをコードするＤＮＡ配列である、アブレーションリンク（ＡＬＩＮＫ）系と；
−  ＣＤＬの調節の外性活性化因子（ＥＡＲＣ）系であって、前記ＣＤＬに作動可能に連結される誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を含む、ＣＤＬの調節の外性活性化因子（ＥＡＲＣ）系と
を含み、
前記ＤＮＡベクターが１つ又は複数の宿主細胞に挿入される場合、前記ＤＮＡベクターを含む増殖宿主細胞は、前記ＤＮＡベクターを含む前記増殖宿主細胞が前記陰性選択マーカの誘導物質に曝露され、且つ前記ＤＮＡベクターを含む前記増殖宿主細胞が前記誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質に曝露されなければ殺傷されることになる、ＤＮＡベクター。
【請求項３２】
前記ＣＤＬは、表２に列挙される遺伝子座の１つ又は複数である、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
【請求項３３】
前記ＣＤＬは、遺伝子産物であって、その機能が細胞周期、ＤＮＡ複製、ＲＮＡ転写、タンパク質翻訳、及び代謝の１つ又は複数に関与している遺伝子産物をコードする、請求項３２に記載のＤＮＡベクター。
【請求項３４】
前記ＣＤＬは、Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１、Ｔｏｐ２Ａ／ＴＯＰ２Ａ、Ｃｅｎｐａ／ＣＥＮＰＡ、Ｂｉｒｃ５／ＢＩＲＣ５、及びＥｅｆ２／ＥＥＦ２の１つ又は複数であり、好ましくは、前記ＣＤＬはＣｄｋ１又はＣＤＫ１である、請求項３３に記載のＤＮＡベクター。
【請求項３５】
前記ＡＬＩＮＫ系は、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系、シトシンデアミナーゼ／５−フルオロシトシン系、カルボキシルエステラーゼ／イリノテカン系、又はｉＣａｓｐ９／ＡＰ１９０３系を含み、好ましくは、前記ＡＬＩＮＫ系は単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系である、請求項２９又は３１に記載のＤＮＡベクター。
【請求項３６】
前記ＥＡＲＣ系は、ｄｏｘ−架橋系、クメートスイッチ誘導系、エクジソン誘導系、電波誘導系、又はリガンド−可逆的二量体化系であり、好ましくは、前記ＥＡＲＣ系はｄｏｘ−架橋系である、請求項３０又は３１に記載のＤＮＡベクター。
【請求項３７】
１つ又は複数の細胞分裂必須遺伝子座（ＣＤＬ）を遺伝子修飾することにより、動物細胞の増殖を制御するためのキットであって、前記ＣＤＬは、１つ又は複数の遺伝子座であって、その転写産物が分裂細胞によって発現される１つ又は複数の遺伝子座であり、前記キットは、
−  アブレーションリンク（ＡＬＩＮＫ）系であって、前記ＣＤＬをコードするＤＮＡ配列に転写によって連結される陰性選択マーカをコードするＤＮＡ配列を含む、アブレーションリンク（ＡＬＩＮＫ）系を含むＤＮＡベクター；及び／又は
−  ＣＤＬの調節の外性活性化因子（ＥＡＲＣ）系であって、前記ＣＤＬに作動可能に連結される誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を含む、ＣＤＬの調節の外性活性化因子（ＥＡＲＣ）系を含むＤＮＡベクター；及び／又は
−  ＡＬＩＮＫ系とＥＡＲＣ系とを含むＤＮＡベクターであって、前記ＡＬＩＮＫ系及び前記ＥＡＲＣ系は、それぞれ前記ＣＤＬに作動可能に連結されている、ＤＮＡベクター；並びに
−  前記ＤＮＡベクターの１つ又は複数を用いた動物細胞における前記ＣＤＬの標的置換の指示
を含むキット。
【請求項３８】
前記ＣＤＬは、表２に列挙される１つ又は複数の遺伝子座である、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記ＣＤＬは、遺伝子産物であって、その機能が細胞周期、ＤＮＡ複製、ＲＮＡ転写、タンパク質翻訳、及び代謝の１つ又は複数に関与している遺伝子産物をコードする、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
前記ＣＤＬは、Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１、Ｔｏｐ２Ａ／ＴＯＰ２Ａ、Ｃｅｎｐａ／ＣＥＮＰＡ、Ｂｉｒｃ５／ＢＩＲＣ５、及びＥｅｆ２／ＥＥＦ２の１つ又は複数であり、好ましくは、前記ＣＤＬはＣｄｋ１又はＣＤＫ１である、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
前記ＡＬＩＮＫ系は、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系、シトシンデアミナーゼ／５−フルオロシトシン系、カルボキシルエステラーゼ／イリノテカン系、又はｉＣａｓｐ９／ＡＰ１９０３系を含み、好ましくは、前記ＡＬＩＮＫ系は単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系である、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４２】
前記ＥＡＲＣ系は、ｄｏｘ−架橋系、クメートスイッチ誘導系、エクジソン誘導系、電波誘導系、又はリガンド−可逆的二量体化系であり、好ましくは、前記ＥＡＲＣ系はｄｏｘ−架橋系である、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
先行出願の相互参照
本願は、パリ条約に基づき、２０１５年３月９日に出願された米国仮特許出願第６２／１３０，２５８号明細書、及び２０１５年３月９日に出願された米国仮特許出願第６２／１３０，２７０号明細書に対する優先権を主張するものであり、これら文献の各々は、記載されているのと同様にその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０００２】
本記載は、概して、細胞及び分子生物学の分野に関する。より具体的には、本記載は、動物細胞及びそれに関連する遺伝子修飾細胞の分裂を制御するための分子ツール、方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞は、正常な細胞発生、疾患発生を理解するためのツール、並びに例えば遺伝性疾患、変性疾患及び／又は様々な傷害などの現在治療不能の障害を治療するための細胞療法に用いるためのツールとして使用することができる。これらの細胞の多能性により、細胞は、幹細胞状態の自己再生の期間後にあらゆる細胞型に分裂することができる（Ｒｏｓｓａｎｔ  ａｎｄ  Ｎａｇｙ，１９９９）。ｈＰＳ細胞の至適基準は、１９９８年に報告されたヒト胚幹細胞（ｈＥＳ）である（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。２００６年及び２００７年に、皮膚線維芽細胞などの分裂した体細胞をＥＳ細胞様「人工多能性幹」（ｉＰＳ）細胞にリプログラミングする方法が報告され、多能性細胞のタイプを拡大した（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，２００６；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。それ以来、ｉＰＳ細胞の作製方法並びに疾患及び異常な生理学的状態を治療するための細胞療法をはじめとする多方面でのその適用がさらに開発されている。
【０００４】
多能性細胞療法に関する１つの懸念は安全性である。例えば、細胞移植片を起源とする悪性腫瘍が懸念される。リプログラミング法は、ゲノム損傷及び異常な後成的変化を引き起こし得ることが報告されており（Ｈｕｓｓｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｌａｕｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｌｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、ｉＰＳ細胞由来の細胞の悪性形質転換の危険性をもたらし得ることから、分化した細胞をｉＰＳ細胞にリプログラミングする方法も安全性に関連する。
【０００５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させた多能性細胞を伴う細胞療法に関する１つの課題は、細胞自体の多能性である。例えば、多能性細胞が分化した治療細胞中に残っていると、多能性細胞が奇形腫になる場合がある（Ｙｏｓｈｉｄａ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，２０１０）。多能性細胞由来の製剤及び療法の安全性を高める試みとして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化後に細胞培養物から多能性細胞を排除する取り組みがある。例えば、多能性特異的抗原を有する細胞を排除するために細胞傷害性抗体が使用され（Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）；多能性細胞表面マーカに基づいて細胞が選別され（Ｂｅｎ−Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３ａ；Ｆｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）；腫瘍進行遺伝子が細胞内で遺伝子改変され（Ｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｍｅｎｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）；分化細胞の分離を補助するためのトランスジーンが細胞に導入され（Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｅｉｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；  Ｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）；自殺遺伝子が細胞に導入されて、分化後の残留多能性幹細胞を排除するために使用され（Ｒｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）；並びに化学薬品を用いて不要な多能性細胞がアブレートされている（Ｂｅｎ−Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３ｂ；Ｄａｂｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｔｏｈｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。残留する多能性細胞を分化した培養物から排除しても、多能性細胞の分化誘導体は発癌性を有する可能性がある（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。関連する発癌性事象は、ｉ）細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ調製中に、又はｉｉ）宿主に細胞を移植した後に治療用細胞内で起こり得る。
【０００６】
不要な細胞増殖及び／若しくは分化を排除又は予防する最新の戦略は、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）／ガンシクロビル（ＧＣＶ）陰性選択可能系に基づくものであり、これは、悪性腫瘍が発生した場合に移植片を完全に排除する（Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）か、又は意図する分化誘導体に「混入した」多能性細胞のみを排除する（Ｂｅｎ−Ｄａｖｉｄ  ａｎｄ  Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ，２０１４；Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）ために用いることができる。ＧＣＶ誘導細胞殺傷及びアポトーシスの機構は十分に理解されている。これは、ＤＮＡ二本鎖切断の複製依存的形成を生じ（Ｈａｌｌｏｒａｎ  ａｎｄ  Ｆｅｎｔｏｎ，１９９８）、これによってアポトーシスを招く（Ｔｏｍｉｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。しかしながら、多くのＨＳＶ−ＴＫ／ＧＣＶ系は、少なくともＨＳＶ−ＴＫのランダム組込み又は一過性発現に依存するため、これらの発現は確実ではない。例えば、カスパーゼ（Ｃａｓｐａｓｅ）９（Ｄｉ  Ｓｔａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）などの様々な殺傷機構と共に陰性選択マーカを含む戦略が試験されてきたが、陰性選択マーカの確実な発現は証明されていない。細胞療法は、数百万又は数十億の細胞を必要とし、これは、不要な細胞増殖及び／又は分化によって生じるあらゆる問題を増大し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本開示の目的は、前述の欠陥の１つ又は複数を軽減し、及び／又は取り除くことである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様では、動物細胞の増殖を制御する方法が提供される。この方法は、動物細胞を用意するステップ；動物細胞において、細胞分裂遺伝子座（ＣＤＬ）を遺伝子修飾するステップであって、ＣＤＬは、１つ又は複数の遺伝子座であって、その転写産物が分裂細胞によって発現される１つ又は複数の遺伝子座であり、ＣＤＬの遺伝子修飾は、ａ）アブレーションリンク（ＡＬＩＮＫ）系であって、ＣＤＬをコードするＤＮＡ配列に転写によって連結される陰性選択マーカをコードするＤＮＡ配列を含む、アブレーションリンク（ＡＬＩＮＫ）系と；ｂ）ＣＤＬの調節の誘導性外性活性化因子（ＥＡＲＣ）系であって、ＣＤＬに作動可能に連結される誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を含む、ＣＤＬの調節の誘導性外性活性化因子（ＥＡＲＣ）系との１つ又は複数を含む、ステップ；陰性選択マーカの誘導物質を用いて、ＡＬＩＮＫ系を含む遺伝子修飾動物細胞の増殖を制御するステップ；及び／又は誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質を用いて、ＥＡＲＣ系を含む遺伝子修飾動物細胞の増殖を制御するステップを含む。
【０００９】
本明細書に記載する動物細胞の増殖を制御する方法の一実施形態では、ＡＬＩＮＫ修飾動物細胞の制御は、陰性選択マーカの誘導物質の非存在下で、ＡＬＩＮＫ系を含む遺伝子修飾動物細胞を維持することにより、ＡＬＩＮＫ系を含む遺伝子修飾動物細胞の増殖を可能にするステップ；及びＡＬＩＮＫ系を含む動物細胞を陰性選択マーカの誘導物質に曝露することにより、ＡＬＩＮＫ系を含む遺伝子修飾動物細胞の増殖をアブレート又は阻害するステップの１つ又は複数を含む。
【００１０】
本明細書に記載する動物細胞の増殖を制御する方法の一実施形態では、ＥＡＲＣ修飾動物細胞の制御は、ＥＡＲＣ系を含む遺伝子修飾動物細胞を誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質に曝露することにより、ＥＡＲＣ系を含む遺伝子修飾動物細胞の増殖を可能にするステップ；及び誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質の非存在下で、ＥＡＲＣ系を含む動物細胞を維持することにより、ＥＡＲＣ系を含む遺伝子修飾動物細胞の増殖を阻止又は阻害するステップの１つ又は複数を含む。
【００１１】
本明細書に記載する動物細胞の増殖を制御する方法の様々な実施形態では、ＣＤＬの遺伝子修飾は、ａ）ＡＬＩＮＫ系を含むＤＮＡベクター；ｂ）ＥＡＲＣ系を含むＤＮＡベクター；及びｃ）ＡＬＩＮＫ系及びＥＡＲＣ系を含むＤＮＡベクターの１つ又は複数によるＣＤＬの標的置換を実施するステップを含む。
【００１２】
本明細書に記載する動物細胞の増殖を制御する方法の様々な実施形態では、ＣＤＬのＡＬＩＮＫ遺伝子修飾は、同型接合性、異型接合性、半接合性若しくは化合物異型接合性であり、及び／又はＥＡＲＣ遺伝子修飾は、機能性ＣＤＬ修飾がＥＡＲＣ修飾対立遺伝子を通してのみ生成され得ることを確実にする。
【００１３】
本明細書に記載する動物細胞の増殖を制御する方法の様々な実施形態では、ＣＤＬは、表２に列挙される１つ又は複数の遺伝子座である。様々な実施形態では、ＣＤＬは、遺伝子産物であって、その機能が細胞周期、ＤＮＡ複製、ＲＮＡ転写、タンパク質翻訳、及び代謝の１つ又は複数に関与している遺伝子産物をコードする。様々な実施形態では、ＣＤＬは、Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１、Ｔｏｐ２Ａ／ＴＯＰ２Ａ、Ｃｅｎｐａ／ＣＥＮＰＡ、Ｂｉｒｃ５／ＢＩＲＣ５、及びＥｅｆ２／ＥＥＦ２の１つ又は複数であり、好ましくは、ＣＤＬはＣｄｋ１又はＣＤＫ１である。
【００１４】
本明細書に記載する動物細胞の増殖を制御する方法の様々な実施形態では、ＡＬＩＮＫ系は、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系、シトシンデアミナーゼ／５−フルオロシトシン系、カルボキシルエステラーゼ／イリノテカン系、又はｉＣａｓｐ９／ＡＰ１９０３系を含み、好ましくは、ＡＬＩＮＫ系は単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系である。
【００１５】
本明細書に記載する動物細胞の増殖を制御する方法の様々な実施形態では、ＥＡＲＣ系は、ｄｏｘ−架橋（ｄｏｘ−ｂｒｉｄｇｅ）系、クメート（ｃｕｍａｔｅ）スイッチ誘導系、エクジソン誘導系、電波誘導系、又はリガンド−可逆的二量体化系であり、好ましくは、ＥＡＲＣ系はｄｏｘ−架橋系である。
【００１６】
本明細書に記載する動物細胞の増殖を制御する方法の様々な実施形態では、動物細胞は、哺乳動物細胞又は鳥類細胞である。様々な実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、シカ、エルク、スイギュウ、雄牛、ラクダ、ラマ、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、又は非ヒト霊長類細胞であり、好ましくは、哺乳動物細胞はヒト細胞である。
【００１７】
本明細書に記載する動物細胞の増殖を制御する方法の様々な実施形態では、動物細胞は、多能性幹細胞、複能性細胞、単能性前駆細胞、又は最終分化細胞である。
【００１８】
本明細書に記載する動物細胞の増殖を制御する方法の様々な実施形態では、動物細胞は、多能性幹細胞、複能性細胞、単能性前駆細胞、又は最終分化細胞に由来する。
【００１９】
一態様では、細胞増殖を制御するための少なくとも１つの機構を含むように遺伝子修飾された動物細胞が提供される。遺伝子修飾された動物細胞は、１つ又は複数の細胞分裂遺伝子座（ＣＤＬ）の遺伝子修飾を含み、ＣＤＬは、１つ又は複数の遺伝子座であって、その転写産物が分裂細胞によって発現される１つ又は複数の遺伝子座である。遺伝子修飾は、ａ）アブレーションリンク（ＡＬＩＮＫ）系であって、ＣＤＬをコードするＤＮＡ配列に転写によって連結される陰性選択マーカをコードするＤＮＡ配列を含む、アブレーションリンク（ＡＬＩＮＫ）系と；ｂ）ＣＥＤＬの調節の外性活性化因子（ＥＡＲＣ）系であって、ＣＤＬに作動可能に連結される誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を含む、ＣＥＤＬの調節の外性活性化因子（ＥＡＲＣ）系との１つ又は複数である。
【００２０】
本明細書に記載する、細胞増殖を制御するための少なくとも１つの機構を含むように遺伝子修飾された動物細胞の一実施形態では、ＣＤＬの遺伝子修飾は、ａ）ＡＬＩＮＫ系を含むＤＮＡベクター；ｂ）ＥＡＲＣ系を含むＤＮＡベクター；及びｃ）ＡＬＩＮＫ系及びＥＡＲＣ系を含むＤＮＡベクターの１つ又は複数によるＣＤＬの標的置換を実施するステップを含む。
【００２１】
本明細書に記載する、細胞増殖を制御するための少なくとも１つの機構を含むように遺伝子修飾された動物細胞の様々な実施形態では、ＣＤＬのＡＬＩＮＫ遺伝子修飾は、同型接合性、異型接合性、半接合性若しくは化合物異型接合性であり、及び／又はＥＡＲＣ遺伝子修飾は、機能性ＣＤＬ修飾がＥＡＲＣ修飾対立遺伝子を通してのみ生成され得ることを確実にする。
【００２２】
本明細書に記載する、細胞増殖を制御するための少なくとも１つの機構を含むように遺伝子修飾された動物細胞の様々な実施形態では、ＣＤＬは、表２に列挙される１つ又は複数の遺伝子座である。様々な実施形態では、ＣＤＬは、遺伝子産物であって、その機能が細胞周期、ＤＮＡ複製、ＲＮＡ転写、タンパク質翻訳、及び代謝の１つ又は複数に関与している遺伝子産物をコードする。様々な実施形態では、ＣＤＬは、Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１、Ｔｏｐ２Ａ／ＴＯＰ２Ａ、Ｃｅｎｐａ／ＣＥＮＰＡ、Ｂｉｒｃ５／ＢＩＲＣ５、及びＥｅｆ２／ＥＥＦ２の１つ又は複数であり、好ましくは、ＣＤＬはＣｄｋ１又はＣＤＫ１である。
【００２３】
本明細書に記載する、細胞増殖を制御するための少なくとも１つの機構を含むように遺伝子修飾された動物細胞の様々な実施形態では、ＡＬＩＮＫ系は、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系、シトシンデアミナーゼ／５−フルオロシトシン系、カルボキシルエステラーゼ／イリノテカン系、又はｉＣａｓｐ９／ＡＰ１９０３系を含み、好ましくは、ＡＬＩＮＫ系は単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系である。
【００２４】
本明細書に記載する、細胞増殖を制御するための少なくとも１つの機構を含むように遺伝子修飾された動物細胞の様々な実施形態では、ＥＡＲＣ系は、ｄｏｘ−架橋系、クメートスイッチ誘導系、エクジソン誘導系、電波誘導系、又はリガンド−可逆的二量体化系であり、好ましくは、ＥＡＲＣ系はｄｏｘ−架橋系である。
【００２５】
本明細書に記載する、細胞増殖を制御するための少なくとも１つの機構を含むように遺伝子修飾された動物細胞の様々な実施形態では、動物細胞は、哺乳動物細胞又は鳥類細胞である。様々な実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、シカ、エルク、スイギュウ、雄牛、ラクダ、ラマ、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、又は非ヒト霊長類細胞であり、好ましくは、哺乳動物細胞はヒト細胞である。
【００２６】
本明細書に記載する、細胞増殖を制御するための少なくとも１つの機構を含むように遺伝子修飾された動物細胞の様々な実施形態では、動物細胞は、多能性幹細胞、複能性細胞、単能性前駆細胞、又は最終分化細胞である。
【００２７】
本明細書に記載する、細胞増殖を制御するための少なくとも１つの機構を含むように遺伝子修飾された動物細胞の様々な実施形態では、動物細胞は、多能性幹細胞、複能性細胞、単能性前駆細胞、又は最終分化細胞に由来する。
【００２８】
一態様では、細胞分裂遺伝子座（ＣＤＬ）の発現を修飾するためのＤＮＡベクターが提供され、ＣＤＬは、１つ又は複数の遺伝子座であって、その転写産物が分裂細胞によって発現される１つ又は複数の遺伝子座である。ＤＮＡベクターは、アブレーションリンク（ＡＬＩＮＫ）系を含み、ＡＬＩＮＫ系は、ＣＤＬに転写によって連結される陰性選択マーカをコードするＤＮＡ配列を含み、このＤＮＡベクターが１つ又は複数の宿主細胞に挿入される場合、ＤＮＡベクターを含む増殖宿主細胞は、ＤＮＡベクターを含む増殖宿主細胞が陰性選択マーカの誘導物質に曝露されると殺傷されることになる。
【００２９】
一態様では、細胞分裂必須遺伝子座（ＣＤＬ）の発現を修飾するためのＤＮＡベクターが提供され、ＣＤＬは、１つ又は複数の遺伝子座であって、その転写産物が分裂細胞によって発現される１つ又は複数の遺伝子座である。ＤＮＡベクターは、ＣＤＬの調節の外性活性化因子（ＥＡＲＣ）系を含み、ＥＡＲＣ系は、ＣＤＬに作動可能に連結される誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を含み、このＤＮＡベクターが１つ又は複数の宿主細胞に挿入される場合、ＤＮＡベクターを含む増殖宿主細胞は、ＤＮＡベクターを含む増殖宿主細胞が誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質に曝露されなければ殺傷されることになる。
【００３０】
一態様では、細胞分裂必須遺伝子座（ＣＤＬ）の発現を修飾するためのＤＮＡベクターが提供され、ＣＤＬは、１つ又は複数の遺伝子座であって、その転写産物が分裂細胞によって発現される１つ又は複数の遺伝子座である。ＤＮＡベクターは、アブレーションリンク（ＡＬＩＮＫ）系であって、ＣＤＬに転写によって連結される陰性選択マーカをコードするＤＮＡ配列である、アブレーションリンク（ＡＬＩＮＫ）系と；ＣＤＬの調節の外性活性化因子（ＥＡＲＣ）系であって、ＣＤＬに作動可能に連結される誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を含む、ＣＤＬの調節の外性活性化因子（ＥＡＲＣ）系とを含み、このＤＮＡベクターが１つ又は複数の宿主細胞に挿入される場合、ＤＮＡベクターを含む増殖宿主細胞は、ＤＮＡベクターを含む増殖宿主細胞が陰性選択マーカの誘導物質に曝露され、且つＤＮＡベクターを含む増殖宿主細胞が誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質に曝露されなければ殺傷されることになる。
【００３１】
本明細書に記載するＤＮＡベクターの様々な実施形態では、ＣＤＬは、表２に列挙される１つ又は複数の遺伝子座である。様々な実施形態では、ＣＤＬは、遺伝子産物であって、その機能が細胞周期、ＤＮＡ複製、ＲＮＡ転写、タンパク質翻訳、及び代謝の１つ又は複数に関与している遺伝子産物をコードする。様々な実施形態では、ＣＤＬは、Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１、Ｔｏｐ２Ａ／ＴＯＰ２Ａ、Ｃｅｎｐａ／ＣＥＮＰＡ、Ｂｉｒｃ５／ＢＩＲＣ５、及びＥｅｆ２／ＥＥＦ２の１つ又は複数であり、好ましくは、ＣＤＬはＣｄｋ１又はＣＤＫ１である。
【００３２】
本明細書に記載するＤＮＡベクターの様々な実施形態では、ＡＬＩＮＫ系は、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系、シトシンデアミナーゼ／５−フルオロシトシン系、カルボキシルエステラーゼ／イリノテカン系、又はｉＣａｓｐ９／ＡＰ１９０３系を含み、好ましくは、ＡＬＩＮＫ系は単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系である。
【００３３】
本明細書に記載するＤＮＡベクターの様々な実施形態では、ＥＡＲＣ系は、ｄｏｘ−架橋系、クメートスイッチ誘導系、エクジソン誘導系、電波誘導系、又はリガンド−可逆的二量体化系であり、好ましくは、ＥＡＲＣ系はｄｏｘ−架橋系である。
【００３４】
一態様では、１つ又は複数の細胞分裂必須遺伝子座（ＣＤＬ）を遺伝子修飾することにより、動物細胞の増殖を制御するためのキットが提供され、ＣＤＬは、１つ又は複数の遺伝子座であって、その転写産物が分裂細胞によって発現される１つ又は複数の遺伝子座である。キットは、アブレーションリンク（ＡＬＩＮＫ）系であって、ＣＤＬをコードするＤＮＡ配列に転写によって連結される陰性選択マーカをコードするＤＮＡ配列を含む、アブレーションリンク（ＡＬＩＮＫ）系を含むＤＮＡベクター；及び／又はＣＤＬの調節の外性活性化因子（ＥＡＲＣ）系であって、ＣＤＬに作動可能に連結される誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を含む、ＣＤＬの調節の外性活性化因子（ＥＡＲＣ）系を含むＤＮＡベクター；及び／又はＡＬＩＮＫ系とＥＡＲＣ系とを含むＤＮＡベクターであって、ＡＬＩＮＫ系及びＥＡＲＣ系は、それぞれＣＤＬに作動可能に連結されている、ＤＮＡベクター；並びにこれらのＤＮＡベクターの１つ又は複数を用いた動物細胞におけるＣＤＬの標的置換の指示を含む。
【００３５】
本明細書に記載するキットの一実施形態では、ＣＤＬは、表２に列挙される１つ又は複数の遺伝子座である。様々な実施形態では、ＣＤＬは、遺伝子産物であって、その機能が細胞周期、ＤＮＡ複製、ＲＮＡ転写、タンパク質翻訳、及び代謝の１つ又は複数に関与している遺伝子産物をコードする。様々な実施形態では、ＣＤＬは、Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１、Ｔｏｐ２Ａ／ＴＯＰ２Ａ、Ｃｅｎｐａ／ＣＥＮＰＡ、Ｂｉｒｃ５／ＢＩＲＣ５、及びＥｅｆ２／ＥＥＦ２の１つ又は複数であり、好ましくは、ＣＤＬはＣｄｋ１又はＣＤＫ１である。
【００３６】
本明細書に記載するキットの様々な実施形態では、ＡＬＩＮＫ系は、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系、シトシンデアミナーゼ／５−フルオロシトシン系、カルボキシルエステラーゼ／イリノテカン系、又はｉＣａｓｐ９／ＡＰ１９０３系を含み、好ましくは、ＡＬＩＮＫ系は単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系である。
【００３７】
本明細書に記載するキットの様々な実施形態では、ＥＡＲＣ系は、ｄｏｘ−架橋系、クメートスイッチ誘導系、エクジソン誘導系、電波誘導系、又はリガンド−可逆的二量体化系であり、好ましくは、ＥＡＲＣ系はｄｏｘ−架橋系である。
【００３８】
本特許又は出願ファイルは、少なくとも１枚のカラー図面を含む。カラー図面を含む本特許又は特許出願公開のコピーは、要請に応じて且つ必要費用の支払い時に特許庁により提供される。
【００３９】
本開示の上記及びその他の特徴は、添付の図面を参照する以下の詳細な説明においてさらに明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１−１】本明細書において提供する方法及びツールで使用するために考慮される、誘導された陰性増殖エフェクター（ｉＮＥＰ）の概念及びｉＮＥＰ系の例を説明する概略図を示す。図１Ａは、様々なｉＮＥＰ修飾ＣＤＬの例を表す概略図を示し、ＣＤＬ１での同型接合性修飾、ＣＤＬ１及びＣＤＬ２への同型接合性挿入、共に細胞分裂に不可欠な２つの個別の遺伝子座を含むＣＤＬ（ＣＤＬ３）が含まれる。
【図１−２】図１Ｂは、アベレーションリンク（ＡＬＩＮＫ）とＣＤＬの調節の外性活性化因子（ＥＡＲＣ）とを様々な立体配置で含むｉＮＥＰの例を表す概略図を示す。
【図１−３】図１Ｃは、二量体化物質調節発現誘導と組み合わせた転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）技術を示す。図１Ｄは、逆クメートトランス活性化因子（ｒｃＴＡ）系を例示する概略図を示す。
【図１−４】図１Ｅは、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）と、Ｖｐ１６の活性化ドメインに融合したエクジソン受容体（ＥｃＲ）（ＶｐＥｃＲ）のＮ−末端切断とを例示する概略図を示す。
【図１−５】図１Ｆは、フェリチンと一緒に、本明細書に記載するｉＮＥＰ系の一例である一過性受容体ポテンシャルバニロイド１（ＴＲＰＶ１）を例示する概略図を示す。
【図１−６】図１Ｇは、ＩＲＥＳ及び二量体化剤をｉＮＥＰとしてどのように用いることができるかを説明する概略図を示す。
【図２】分裂修飾ＣＤＫ１発現細胞の排除を可能にする、ＡＬＩＮＫを生成するためのＣｄｋ１遺伝子座の３’ＵＴＲへのＨＳＶ−ＴＫのターゲティングを説明する概略図を示す。図２Ａは、マウスＣｄｋ１遺伝子座の概略図を示す。図２Ｂは、マウス標的ベクターＩの概略図を示す。図２Ｃは、Ｃｄｋ１ＴＣ対立遺伝子の概略図を示す。図２Ｄは、マウス標的ベクターＩＩの概略図を示す。図２Ｅは、Ｃｄｋ１ＴＣｌｏｘ対立遺伝子の概略図を示す。図２Ｆは、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡの位置を示し；黄色のボックス内の配列は、Ｃｄｋ１の第８エキソンである。
【図３−１】ＡＬＩＮＫ例の生成、すなわちマウスＥＳ細胞株にＡＬＩＮＫを生成するためのＣＤＫ１遺伝子座の３’ＵＴＲへのＨＳＶ−ＴＫ−ｍＣｈｅｒｒｙを示す。図３Ａは、マウスＣ２  ＥＳ細胞にＡＬＩＮＫを生成するステップ全体を示す。図３Ｂは、Ｃｄｋ１（ＴＫ／＋）、Ｃｄｋ１（ＴＫ、ｌｏｘＰ−ＴＫ）、及びＣｄｋ１（ＴＫ／ＴＫ）の正しい遺伝子型決定のサザンブロッティング結果を示す。図３Ｃは、マウス細胞でのＡＬＩＮＫ遺伝子型決定に用いられるプライマーの位置を示す。
【図３−２】図３Ｄは、ＣＤＫ１遺伝子座の３’ＵＴＲへのターゲティングベクターＩのターゲティングを説明するＰＣＲ結果を含む。図３Ｅは、ＨＳＶ−ＴＫ−ｍＣｈｅｒｒｙの発現を活性化するための、ターゲティングベクターＩで既に正しくターゲティングされたマウスＥＳ細胞での選択マーカの切り出しイベントを説明するＰＣＲ結果を示す。図３Ｆは、Ｃｄｋ１（ＴＫ／＋）細胞へのターゲティングベクターＩＩのターゲティングを説明するＰＣＲ結果を示す。図３Ｇは、ＨＳＶ−ＴＫ−ｍＣｈｅｒｒｙの第２対立遺伝子発現を活性化し、これによりＣｄｋ１（ＴＫ／ＴＫ）を生成するための、Ｃｄｋ１（ＴＫ、ｌｏｘＰ−ＴＫ）での選択マーカの切り出しイベントを説明するＰＣＲ結果を示す。
【図４−１】ヒトＥＳ細胞株におけるＡＬＩＮＫ修飾の生成、すなわちＣＤＫ１遺伝子座の３’ＵＴＲへのＨＳＶ−ＴＫ−ｍＣｈｅｒｒｙを示す。図４Ａは、ヒトＣＡ１  ＥＳ細胞にＡＬＩＮＫを生成するステップ全体を示す。図４Ｂは、ヒトＣＡ１細胞でのＡＬＩＮＫ遺伝子型決定に用いられるプライマーの位置を示す。図４Ｃは、ＣＤＫ１遺伝子座の３’ＵＴＲへのターゲティングベクターＩのターゲティングを説明するＰＣＲ結果を示す。
【図４−２】図４Ｄは、ＨＳＶ−ＴＫ−ｍＣｈｅｒｒｙの発現を活性化するために、ヒトＣｄｋ１（ＰＢ−ＴＫ／＋）ＥＳ細胞株での選択マーカの切り出しイベントを示すフローサイトメトリーを示し；Ｙ軸は、ｍＣｈｅｒｒｙ発現レベルを示し、Ｘ軸は、自家蛍光チャネルである。図４Ｅは、Ｃｄｋ１（ＴＫ／＋）細胞へのターゲティングベクターＩＩ（ｐｕｒｏバージョン）のターゲティングを説明するＰＣＲ結果を示し；上のパネルは、５’相同性アームにフランキングするプライマーを使用するＰＣＲであり；下のパネルは、５’及び３’相同性アーム内のプライマーを用いるＰＣＲであり、従って、０．７ｋｂバンドの非存在及び２．８ｋｂバンドの存在は、クローンがＡＬＩＮＫにおいて同型接合性であることを意味し、０．７ｋｂバンドの存在は、クローンがＡＬＩＮＫにおいて異型接合性であるか、又は集団がクローンではないことを意味する。図４Ｆは、ＨＳＶ−ＴＫ−ｍＣｈｅｒｒｙの第２対立遺伝子発現を活性化するための、Ｃｄｋ１（ＴＫ、ｌｏｘＰ−ＴＫ）での選択マーカの切り出しイベントを説明するフローサイトメトリー分析を示し；Ｙ軸は、ｍＣｈｅｒｒｙ発現レベルを示し、Ｘ軸は、自家蛍光チャネルである。
【図４−３】図４Ｇは、ヒトＨ１  ＥＳ細胞にＡＬＩＮＫを生成するステップ全体を示す。図４Ｈは、ヒトＨ１細胞でのＡＬＩＮＫ遺伝子型決定に用いられるプライマーの位置を示す。図４Ｉは、ＣＤＫ１遺伝子座の３’ＵＴＲへのターゲティングベクターＩＩのターゲティングを説明するＰＣＲ結果を示す。
【図４−４】図４Ｊは、ＨＳＶ−ＴＫ−ｍＣｈｅｒｒｙの発現を活性化するための、ヒトＨ１  Ｃｄｋ１（ｌｏｘＰ−ＴＫ／＋）での選択マーカの切り出しイベントを説明するＰＣＲ結果を示し；Ｙ軸は、ｍＣｈｅｒｒｙ発現レベルを示し、Ｘ軸は、自家蛍光チャネルである。図４Ｋは、Ｃｄｋ１（ＴＫ／＋）細胞へのターゲティングベクターＩＩＩ（ＧＦＰバージョン）のターゲティングの蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を示す。ＦＡＣＳ選別後、希薄な平板培養から採取したクローンをｍＣｈｅｒｒｙ対立遺伝子特異的プライマー、ｅＧＦＰ対立遺伝子特異的プライマー並びに５’及び３’相同性アーム中のプライマーで遺伝子型決定し；オレンジ色の星印で示すクローンは、ｍＣｈｅｒｒｙの１対立遺伝子及びｅＧＦＰの１対立遺伝子を有する同型接合性ＡＬＩＮＫであり；緑色の星印で示す１つのクローンは、ｅＧＦＰの２つの対立遺伝子を有する同型接合性ＡＬＩＮＫである。
【図５】奇形腫組織学（奇形腫の内胚葉、中胚葉及び外胚葉部分をそれぞれ左から右に示す）を示す。図５Ａは、マウスＥＳ  Ｃｄｋ１＋／＋，ａｌｉｎｋ／ａｌｉｎｋ細胞由来の奇形腫の顕微鏡写真を示す。図５Ｂは、マウスＥＳ  Ｃｄｋ１ｅａｒｃ／ｅａｒｃ，ａｌｉｎｋ／ａｌｉｎｋ細胞由来の奇形腫の顕微鏡写真を示す。図５Ｃは、ヒトＥＳ  Ｃｄｋ１＋／＋，ａｌｉｎｋ／ａｌｉｎｋ細胞由来の奇形腫の顕微鏡写真を示す。
【図６】ＣＤＫ１遺伝子座の３’ＵＴＲへのＨＳＶ−ＴＫ−ｍＣｈｅｒｒｙノックインを含むマウスＥＳ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能性分析を示す。図６Ａは、細胞を様々な濃度のＧＣＶに３日間曝露した後のＴＫ．００７により達成される傷害効率を示す。コロニーサイズ及び数は、ＧＣＶ濃度に直接比例する。２番目に低い濃度の０．０１μＭは、コロニー数に影響しなかったが、コロニーのサイズ縮小により証明されるように、細胞増殖を減速した（ｎ＝５）。図６Ｂは、ＰＢ媒介によるｎｅｏ−カセットの除去前（Ｃｄｋ１・ＨＳＶ−ＴＫ・ＮｅｏＩＮ）及び除去後（Ｃｄｋ１・ＨＳＶ−ＴＫ）のｍＣｈｅｒｒｙの発現を示す。
【図７−１】ＡＬＩＮＫ修飾細胞を用いた細胞実験の結果を示す。図７Ａは、ＡＬＩＮＫ修飾マウスＣ２細胞を含む皮下奇形腫のＧＣＶ処理の結果をグラフで示す。図７Ｂは、ＡＬＩＮＫ修飾Ｈ１  ＥＳ細胞を含む皮下奇形腫のＧＣＶ処理の結果をグラフで示す。図７Ｃは、ＡＬＩＮＫ修飾細胞を含む乳腺腫瘍のＧＣＶ処理の結果をグラフで示す。
【図７−２】図７Ｄは、神経アッセイの実験設計を概略的に示す。図７Ｅは、Ｃｄｋ１＋／＋，＋／ａｌｉｎｋヒトＣＡ１  ＥＳ細胞由来の神経上皮前駆（ＮＥＰ）細胞の顕微鏡画像である。図７Ｆは、分裂ＡＬＩＮＫ修飾ＮＥＰのＧＣＶ誘導による傷害と、非分裂ニューロンの非傷害とを示す顕微鏡画像を示す。
【図８】異型接合性（青色の線）及び同型接合性（赤色の線）ＡＬＩＮＫ細胞から集団を拡大する場合に、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子に自発的突然変異を含む細胞の予想数を示すグラフを示す。
【図９Ａ−９Ｂ】ＥＡＲＣを生成するための、マウスＣｄｋ１遺伝子座の５’ＵＴＲへのｄｏｘ−架橋のターゲティング、及びＣｄｋ１への挿入後の架橋の挙動を示す。図９Ａは、マウスＣｄｋ１遺伝子座の構造、標的ベクター、及び相同組換えイベントの遺伝子型決定に使用するプライマーの位置を示す概略図である。図９Ｂは、Ｃｄｋ１  ５’ＵＴＲにｄｏｘ−架橋を組み込んだものを同定するためのプロマイシン耐性コロニーの遺伝子型決定を示すＰＣＲ結果を示す。
【図１０】同型接合性ｄｏｘ−架橋ノックインを有するＥＳ細胞がドキシサイクリン（又はドキシサイクリンオーバーラップ機能を有する薬剤）の存在下でのみ生存及び分裂することを説明するフローチャートを示す。
【図１１】同型接合性ｄｏｘ−架橋ノックインＥＳ細胞がドキシサイクリン濃度依存性生存及び増殖を示すことを説明する典型的顕微鏡写真を示す。
【図１２】Ｃｒｅレコンビナーゼ媒介の切り出しによるｄｏｘ−架橋除去を示し、これは、ＥＳ細胞のドキシサイクリン依存性生存をレスキューする。
【図１３】ｄｏｘ−架橋ＥＳ細胞の増殖に対するドキシサイクリンの使用中止の作用を示す。図１３Ａは、ドキシサイクリンの存在下で、細胞が指数関数的に増殖する（丸の付いた赤色の線）ことを示すグラフであり、これはその正常な増殖を示している。第１日にドキシサイクリンの使用を中止すると、細胞は２日間にわたってのみ増殖し、その後、プレートから消失し始め、第９日には細胞は全く残らなかった（四角の付いた濃い青色の線）。最初の３日間の増殖後の２０倍低いドキシサイクリン濃度（５０ｎｇ／ｍｌ）では、少なくとも５日間プレート上に一定の細胞数を維持した（図１３、三角を有する水色の線）。第１０日にドキシサイクリンの正常濃度をプレートに再度添加したところ、細胞は、再び正常ＥＳ細胞と同様に増殖を開始した。図１３Ｂは、Ｄｏｘ除去から０、１及び２日後のＣｄｋ１  ｍＲＮＡのレベル（定量ＰＣＲにより測定）を示す棒グラフを示す。発現レベルをβアクチンに正規化する。
【図１４】ｄｏｘ−架橋ＥＳ細胞を増殖するプロセスを示し、培地でのドキシサイクリンを使用中止したとき、１００，０００，０００個のｄｏｘ−架橋ＥＳ細胞中に逃避（ｅｓｃａｐｅｒ）細胞は見出されなかったが、センチネル（野生型、ＧＦＰ陽性）細胞は高い効率で生存したことを示す。
【図１５】ｄｏｘ−架橋ＥＳ細胞に対する高ドキシサイクリン濃度（１０μｇ／ｍｌ）の作用を示すグラフを示し：高いドキシサイクリンの存在下で、細胞は、低ドキシサイクリンの場合と同様にその増殖速度が低下した（高ｄｏｘは１０μｇ／ｍｌ、正常ｄｏｘは１μｇ／ｍｌ、低ｄｏｘは０．０５μｇ／ｍｌ）が、これは、細胞増殖のためのＣＤＫ１発現の最適レベルを定めるＤｏｘ濃度のウィンドウがあることを示している。
【図１６】ＡＬＩＮＫ修飾（すなわち、Ｃｄｋ１（ＴＫ／ＴＫ）細胞；細胞産物は図３Ａ〜３Ｇに記載される）を含むマウス細胞のＣｄｋ１遺伝子座の５’ＵＴＲへのｄｏｘ−架橋のターゲティングを示す。図１６Ａは、Ｃｄｋ１（ＴＫ／ＴＫ）細胞におけるＣｄｋ１遺伝子座の構造、架橋標的ベクター、及び遺伝子型決定プライマーの位置を示す概略図である。図１６Ｂは、マウスＣｄｋ１（ＴＫ／ＴＫ）細胞のＣｄｋ１  ５’ＵＴＲにｄｏｘ−架橋を組み込み、これによりマウス細胞産物Ｃｄｋ１ｅａｒｃ／ｅａｒｃ，ａｌｉｎｋ／ａｌｉｎｋを産生するものを同定するための、プロマイシン耐性コロニーの遺伝子型決定を示すＰＣＲ結果を示す。
【図１７】ＡＬＩＮＫ修飾（すなわち、Ｃｄｋ１（ＴＫ／ＴＫ）細胞；細胞産物は図４Ａ〜４Ｆに記載される）を含むヒト細胞のＣｄｋ１遺伝子座の５’ＵＴＲへのｄｏｘ−架橋のターゲティングを示す。図１７Ａは、Ｃｄｋ１（ＴＫ／ＴＫ）細胞におけるＣｄｋ１遺伝子座の構造、架橋標的ベクター、及び遺伝子型決定プライマーの位置を示す概略図である。図１７Ｂは、ヒトＣｄｋ１（ＴＫ／ＴＫ）細胞のＣｄｋ１  ５’ＵＴＲにｄｏｘ−架橋を組み込み、従って、ヒト細胞産物Ｃｄｋ１ｅａｒｃ／ｅａｒｃ，ａｌｉｎｋ／ａｌｉｎｋを産生するものを同定するための、プロマイシン耐性コロニーの遺伝子型決定を示すＰＣＲ結果を示す。
【図１８】Ｔｏｐ２ａへのＥＡＲＣ挿入を生成するためのＴｏｐ２遺伝子座の５’ＵＴＲへのｄｏｘ−架橋のターゲティングを示す。図１８Ａは、Ｔｏｐ２ａ遺伝子座の構造及び標的ベクターを示す概略図である。ＴＯＰ２ａ＿５ｓｃｒＦ、ｒｔｔａＲｅｖ、ＣＭＶｆｏｒｗ及びＴＯＰ２ａ＿３ｓｃｒＲは、相同組換えイベントの遺伝子型決定に用いられるプライマーの位置を示す。図１８Ｂは、Ｔｏｐ２ａ  ５’ＵＴＲにｄｏｘ−架橋を組み込んだものを同定するためのｐｕｒｏ耐性コロニーの遺伝子型決定を示すＰＣＲ結果を示す。これらの細胞株のうちの９つが同型接合性ターゲティングされ、Ｔｏｐ２ａの両対立遺伝子の５’ＵＴＲへの相同組換えにより挿入されたｄｏｘ−架橋を含むことが判明した。
【図１９】Ｔｏｐ２ａ−ＥＡＲＣ  ＥＳ細胞の増殖に対するドキシサイクリンの使用中止の作用を示す。図１９Ａは、ドキシサイクリンの使用中止により、４日以内に有糸分裂活性ＥＳ細胞の完全な排除が起こることを示している。図１９Ｂは、細胞増殖を４日間測定することにより、様々な濃度のドキシサイクリンがｄｏｘ−架橋ＥＳ細胞の増殖にどの程度影響したかを示す。ドキシサイクリンの存在下で、ＥＳ細胞は指数関数的に増殖したが、これはその正常な増殖を示している。対照的に、ドキシサイクリンの除去から２日後、細胞増殖は完全に停止した。
【図２０】ＣｅｎｐａへのＥＡＲＣ挿入を生成するためのＣｅｎｐａ遺伝子座の５’ＵＴＲへのｄｏｘ−架橋のターゲティングを示す。図２０Ａは、Ｃｅｎｐａ遺伝子座の構造及び標的ベクターを示す概略図である。Ｃｅｎｐａ＿５ｓｃｒＦ、ｒｔｔａＲｅｖ、ＣＭＶｆｏｒｗ及びＣｅｎｐａ＿３ｓｃｒＲは、相同組換えイベントの遺伝子型決定に用いられるプライマーの位置を示す。図２０Ｂは、Ｃｅｎｐａ  ５’ＵＴＲにｄｏｘ−架橋を組み込んだものを同定するためのｐｕｒｏ耐性コロニーの遺伝子型決定を示すＰＣＲ結果を示す。これらの細胞株のうちの６つが５’及び３’に正しい挿入を有することが判明し、少なくとも１つのクローン（Ｃｅｎｐａ＃４）が同型接合性ターゲティングを有し、Ｃｅｎｐａの両対立遺伝子の５’ＵＴＲへの相同組換えにより挿入されたｄｏｘ−架橋を含むことが判明した。
【図２１】Ｃｅｎｐａ−ＥＡＲＣ  ＥＳ細胞の増殖に対するドキシサイクリンの使用中止の作用を示す。図２１Ａは、ドキシサイクリンの使用中止により、４日以内に有糸分裂活性ＥＳ細胞の完全な排除が起こることを示している。図２１Ｂは、Ｄｏｘを用いた場合及びＤｏｘ除去から２日後のＣｅｎｐａ−ＥＡＲＣ細胞におけるＣｅｎｐａ遺伝子発現レベル（ｑ−ＰＣＲにより決定）であり、これを野生型マウスＥＳ細胞（Ｃ２）での発現レベルと比較した。予想通り、Ｃｅｎｐａ発現レベルは、２日間ＤｏｘなしのＣｅｎｐａ−ＥＡＲＣ細胞において大幅に低下した。
【図２２】細胞増殖を４日間測定することにより、様々な濃度のドキシサイクリンがＣｅｎｐａ−ＥＡＲＣ  ＥＳ細胞の増殖にどの程度影響したかを示す。ドキシサイクリンの存在下で、ＥＳ細胞は指数関数的に増殖したが、これはその正常な増殖を示している。対照的に、ドキシサイクリンの除去から８０時間後、細胞増殖は完全に停止した。
【図２３】Ｂｉｒｃ５遺伝子座へのＥＡＲＣ挿入を生成するためのＢｉｒｃ５遺伝子座の５’ＵＴＲへのｄｏｘ−架橋のターゲティングを示す。図２３Ａは、Ｂｉｒｃ５遺伝子座の構造及び標的ベクターを示す概略図である。Ｂｉｒｃ５＿５ｓｃｒＦ及びｒｔｔａＲｅｖは、相同組換えイベントの遺伝子型決定に用いられるプライマーの位置を示す。図２３Ｂは、Ｂｉｒｃ５  ５’ＵＴＲにｄｏｘ−架橋を組み込んだものを同定するためのｐｕｒｏ耐性コロニーの遺伝子型決定を示すＰＣＲ結果を示す。５つのクローンが正しくターゲティングされ、Ｂｉｒｃ５の両対立遺伝子の５’ＵＴＲへの相同組換えにより挿入されたｄｏｘ−架橋を含むことが判明した。これらのクローンの１つはＢｉｒｃ＃３であり、Ｄｏｘの非存在下で増殖を停止するか、又は死滅することが判明した。
【図２４】Ｂｉｒｃ５−ＥＡＲＣ  ＥＳ細胞の増殖に対するドキシサイクリンの使用中止の作用を示す。図２４Ａは、ドキシサイクリンの使用中止により、４日以内に有糸分裂活性ＥＳ細胞の完全な排除が起こることを示している。図２４Ｂは、Ｄｏｘを用いた場合及びＤｏｘ除去から２日後のＢｉｒｃ５−ＥＡＲＣ細胞におけるＢｉｒｃ５遺伝子発現レベル（ｑ−ＰＣＲにより決定）であり、これを野生型マウスＥＳ細胞（Ｃ２）での発現レベルと比較した。予想通り、Ｂｉｒｃ５発現レベルは、２日間ＤｏｘなしのＢｉｒｃ５−ＥＡＲＣ細胞において大幅に低下した。
【図２５】細胞増殖を４日間測定することにより、様々な濃度のドキシサイクリンがＢｉｒｃ５−ＥＡＲＣ  ＥＳ細胞の増殖にどの程度影響したかを示す。ドキシサイクリンの存在下で、ＥＳ細胞は指数関数的に増殖したが、これはその正常な増殖を示している。対照的に、ドキシサイクリンの除去から５０時間後、細胞増殖は完全に停止した。興味深いことに、低Ｄｏｘ濃度（０．５及び０．０５μｇ／ｍｌ）の方が高濃度（１μｇ／ｍｌ）より良好に細胞増殖を促進した。
【図２６】Ｅｅｆ２へのＥＡＲＣ挿入を生成するためのＥｅｆ２遺伝子座の５’ＵＴＲへのｄｏｘ−架橋のターゲティングを示す。図２６Ａは、Ｅｅｆ２遺伝子座の構造及び標的ベクターを示す概略図である。Ｅｅｆ２＿５ｓｃｒＦ及びｒｔｔａＲｅｖは、相同組換えイベントの遺伝子型決定に用いられるプライマーの位置を示す。図２６Ｂは、Ｅｅｆ２  ５’ＵＴＲにｄｏｘ−架橋を組み込んだものを同定するためのｐｕｒｏ耐性コロニーの遺伝子型決定を示すＰＣＲを示す。これらの細胞株のうちの９つが、Ｄｏｘ培地中でのみ増殖する少なくとも１つのクローンで正しくターゲティングされていることが判明した。
【図２７】Ｅｅｆ２−ＥＡＲＣ  ＥＳ細胞の増殖に対するドキシサイクリンの使用中止の作用を示す。ドキシサイクリンの使用中止により、４日以内に有糸分裂活性ＥＳ細胞の完全な排除が起こる。
【図２８】細胞増殖を４日間測定することにより、様々な濃度のドキシサイクリンがＥｅｆ２−ＥＡＲＣ  ＥＳ細胞の増殖にどの程度影響したかを示す。ドキシサイクリンの存在下で、ＥＳ細胞は指数関数的に増殖したが、これはその正常な増殖を示している。対照的に、ドキシサイクリンがなければ、細胞は全く増殖することができない。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
別に定義しない限り、本明細書で使用する技術及び科学用語は全て、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００４２】
定義
本明細書で使用する用語「１つの細胞分裂遺伝子座」、「複数の細胞分裂遺伝子座」及び「ＣＤＬ」は、ゲノム遺伝子座であって、その転写産物が分裂細胞によって発現されるゲノム遺伝子座を指す。ＣＤＬが単一遺伝子座を含むとき、細胞（又はその誘導体）におけるＣＤＬ発現の非存在は、細胞がＣＤＬ発現の非存在下でアブレートされるか、又は細胞の増殖がＣＤＬ発現の非存在下で阻止若しくは障害されるかのいずれかであるため、腫瘍開始及び／又は形成が妨げられることを意味する。ＣＤＬが複数の遺伝子座を含む場合、細胞（又はその誘導体）における遺伝子座の全部又はサブセットによる発現の非存在は、細胞がＣＤＬ発現の非存在下でアブレートされるか、又は細胞の増殖がＣＤＬ発現の非存在下で阻止若しくは障害されるかのいずれかであるため、腫瘍開始及び／又は形成が妨げられることを意味する。ＣＤＬは、非分裂及び／又は非増殖細胞において発現されても、発現されなくてもよい。ＣＤＬは、宿主細胞に対して内在性であってもよく、又はトランスジーンであってもよい。ＣＤＬがトランスジーンである場合、これは、宿主細胞と同じ若しくは異なる種に由来するものでもよく、又は合成起源のものでもよい。一実施形態では、ＣＤＬは、細胞分裂中に転写される単一遺伝子座である。例えば、一実施形態では、単一遺伝子座ＣＤＬは、ＣＤＫ１である。一実施形態では、ＣＤＬは、細胞分裂中に転写される２つ以上の遺伝子座を含む。例えば、一実施形態では、多遺伝子座ＣＤＬは、２つのＭＹＣ遺伝子（ｃ−Ｍｙｃ及びＮ−ｍｙｃ）を含む（Ｓｃｏｇｎａｍｉｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。一実施形態では、多遺伝子座ＣＤＬは、ＡＵＲＯＲＡ  Ｂ及びＣキナーゼを含み、これらは重複する機能を有し得る（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｉｒａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。細胞分裂及び細胞増殖は、本明細書では置き換え可能に使用され得る用語である。
【００４３】
本明細書で使用する用語「細胞分裂の正常速度」、「正常な細胞分裂速度」、「細胞増殖の正常速度」、及び「正常な細胞増殖速度」は、非癌性の健全な細胞に典型的な細胞分裂及び／又は増殖の速度を指す。細胞分裂及び／又は増殖の正常速度は、細胞型に特有であり得る。例えば、表皮、腸、肺、血液、骨髄、胸腺、精巣、子宮及び乳腺の細胞数は、高速度の細胞分裂及び高速度の細胞死によって維持されることが広く認められている。対照的に、膵臓、腎臓、角膜、前立腺、骨、心臓及び脳の細胞数は、低速度の細胞分裂及び低速度の細胞死によって維持される（Ｐｅｌｌｅｔｔｉｅｒｉ  ａｎｄ  Ｓａｎｃｈｅｚ  Ａｌｖａｒａｄｏ，２００７）。
【００４４】
本明細書で使用する用語「誘導性陰性増殖エフェクター」及び「ｉＮＥＰ」は、ｉ）ＣＤＬ発現を誘導により停止又は阻止し、これによって細胞分裂及び増殖を妨げ；ｉｉ）ＣＤＬ発現細胞を誘導によりアブレートする（すなわち、増殖細胞の少なくとも一部を殺傷する）；又はｉｉｉ）細胞分裂の速度が腫瘍形成に寄与する上で十分速くならないように、細胞の正常細胞分裂速度に対して細胞分裂の速度を遅くすることにより、細胞分裂及び／又は増殖を制御する目的で、ＣＤＬ発現の使用を促進する遺伝子修飾を指す。
【００４５】
本明細書で使用する用語「アブレーションリンク」及び「ＡＬＩＮＫ」は、ＣＤＬと、陰性選択マーカをコードする配列との間に転写リンクを含む、ｉＮＥＰの一例を指す。ＡＬＩＮＫ修飾により、ユーザは、ＡＬＩＮＫ修飾細胞を陰性選択マーカの誘導物質に曝露することにより、ＡＬＩＮＫを含む増殖宿主細胞を誘導的に殺傷するか、又は増殖細胞の少なくとも一部を殺傷することにより、宿主細胞の増殖を阻害することが可能になる。例えば、増殖細胞の少なくとも一部を殺傷することによって増殖細胞をアブレートするか又は細胞増殖を阻害するために、ＣＤＬにＡＬＩＮＫを含むように修飾された細胞を陰性選択マーカの誘導物質（例えば、プロドラッグ）で処理してもよい（図１Ｂ）。
【００４６】
本明細書で使用する用語「ＣＤＬの調節の外性活性化因子」及び「ＥＡＲＣ」は、活性化因子を介した非コード若しくはコードＤＮＡ転写又は対応する翻訳の外因性改変を促進する機構又は体系を含む、ｉＮＥＰの一例を指す。ＥＡＲＣ修飾により、ユーザは、ＥＡＲＣ修飾細胞から、ＥＡＲＣ修飾ＣＤＬの転写及び／又は翻訳を可能にする誘導物質を除去することにより、ＥＡＲＣを含む細胞の分裂を停止又は阻害することが可能になる。例えば、誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系をＣＤＬに作動可能に連結させて、ＣＤＬの発現又はＣＤＬ翻訳を外因的に制御するために使用することができ、これにより、ＣＤＬ転写及び／又は翻訳に薬物誘導性活性化因子及び対応する誘導薬の存在が必要となる。誘導薬の非存在下では、細胞分裂及び／又は増殖は停止又は阻害される（例えば、正常細胞分裂速度まで減速される）であろう。例えば、ＣＤＬ  Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１の発現並びに細胞分裂及び増殖が誘導物質（例えば、ドキシサイクリン）の存在下でのみ可能となるように、ＣＤＬ  Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１を修飾してｄｏｘ−架橋を含有させもよい（図１Ｂ）。
【００４７】
本明細書で使用する用語「増殖アンタゴニスト系」は、その存在が細胞の増殖を（完全若しくは部分的に）阻害する天然又は操作された化合物を指す。
【００４８】
ツール及び方法の概要
本明細書に記載するように、本発明者らは、動物細胞における１つ又は複数の細胞分裂遺伝子座（ＣＤＬ）を用いて遺伝子修飾細胞を作製するための分子ツール、方法及びキットを提供しており、こうした細胞において、細胞分裂及び／又は増殖は、ユーザにより１つ又は複数のｉＮＥＰを介して制御することができる（図１Ａ）。例えば、本明細書に記載する１つ又は複数のツール及び／又は方法を用いて作製された細胞の分裂は、細胞の分裂速度が腫瘍形成に寄与するほど十分早くならないように、ユーザによって停止、阻止若しくは阻害することができる。例えば、本明細書に記載する１つ又は複数のツール及び／若しくは方法を用いて作製された細胞の増殖は、増殖細胞の少なくとも一部を殺傷又は停止することにより、ユーザによって停止、阻止若しくは阻害することができ、これにより、細胞増殖速度又は量は、それぞれユーザが所望する速度又はサイズで維持され得る。
【００４９】
例えば、より高速の細胞分裂速度（正常細胞分裂速度に対して）が望ましくない場合、細胞分裂及び／又は増殖を制御するツール及び／又は方法が望ましい。例えば、正常速度より速く分裂する細胞は、ｉｎ  ｓｉｔｕで腫瘍を形成する可能性があり、これは、宿主にとって有害となり得る。一実施形態では、本明細書に記載する遺伝子修飾動物細胞は、望ましくない細胞分裂及び／又は増殖がユーザにより制御され得るように、正常な細胞分裂及び／又は増殖を可能すると共に、細胞分裂及び／又は増殖を停止し、アブレートし、阻止し、及び／又は遅らせるための１つ又は複数の機構を含む（図１Ｂ）。図１Ｂを参照すると、例（Ｉ）では、ＥＡＲＣがＣＤＬの５’ＵＴＲに挿入され、またＡＬＩＮＫが３’ＵＴＲに挿入され、転写の産物は、２つのタンパク質でプロセシングされる２シストロン性ｍＲＮＡである。例（ＩＩ）では、ＥＡＲＣ及びＡＬＩＮＫの両方がＣＤＬの５’ＵＴＲに挿入され、転写の産物は、２つのタンパク質でプロセシングされる２シストロン性ｍＲＮＡである。例（ＩＩＩ）では、ＥＡＲＣがＣＤＬの５’ＵＴＲに挿入され、またＡＬＩＮＫがＣＤＬコード配列内に挿入され、転写の産物は、前駆タンパク質でプロセシングされて、特殊設計された切断配列の切断時に２つの個別のタンパク質を産生するｍＲＮＡである。例（ＩＶ）では、ＥＡＲＣ及びＡＬＩＮＫの両方がＣＤＬの５’ＵＴＲに挿入され、転写の産物は、ＣＤＬ及びＡＬＩＮＫ機能の両方を維持する融合タンパク質にプロセシングされるｍＲＮＡである。例（Ｖ）では、ＥＡＲＣがＣＤＬの５’ＵＴＲに挿入され、ＡＬＩＮＫが３’ＵＴＲに挿入され、転写の産物は、ＣＤＬ及びＡＬＩＮＫ機能の両方を維持する融合タンパク質にプロセシングされるｍＲＮＡである。
【００５０】
例えば、本明細書に記載する遺伝子修飾動物細胞は、対象に適用される細胞療法処置に使用され得る。対象に提供された遺伝子修飾動物細胞の１つ又は複数が望ましくない速度で（例えば、正常より早く）分裂を開始することになる場合、ユーザは、ｉ）望ましくない速度で分裂する細胞に、細胞中の遺伝子修飾に対応する誘導物質を適用するか；又はｉｉ）細胞中の遺伝子修飾に対応する誘導物質に対する、望ましくない速度で分裂する細胞のアクセスを制限することにより、望ましくない速度で分裂する細胞の分裂を停止するか若しくは遅らせ、望ましくない速度で増殖する細胞を遅らせるか若しくは停止することができ、ｉ）又はｉｉ）は、遺伝子修飾動物細胞に提供されたｉＮＥＰのタイプに基づいて決定される。
【００５１】
一実施形態では、本明細書に記載する遺伝子修飾動物細胞は、「フェイルセーフ細胞」と呼ばれることもある。フェイルセーフ細胞は、１つ又は複数のＣＤＬに１つ又は複数の同型接合性、異型接合性、半接合性又は化合物異型接合性ＡＬＩＮＫを含む。一実施形態では、フェイルセーフ細胞は、１つ又は複数のＣＤＬに１つ又は複数のＥＡＲＣをさらに含む。一実施形態では、フェイルセーフ細胞は、ＡＬＩＮＫ及びＥＡＲＣ修飾の両方を含むＣＤＬを含む。
【００５２】
本明細書で使用する場合、用語「フェイルセーフ」は、細胞数を定める確率（ｐＦＳと呼ばれる）を指す。例えば、単一のフェイルセーフ細胞から増殖させることができる細胞の数（クローン量）であり、ここで、全てのＡＬＩＮＫを喪失した細胞を含むクローンを取得する確率は、任意の値（ｐＦＳ）より低い。例えば、ｐＦＳ＝０．０１は、クローンが、ＡＬＩＮＫ修飾ＣＤＬを含む単一細胞から１００倍増殖された場合、１つのみのクローンがＡＬＩＮＫ機能（陰性選択マーカの発現）を喪失しているものの、細胞分裂が依然として可能な細胞を有すると予想される、シナリオを指す。フェイルセーフ量は、ＡＬＩＮＫの数及びＡＬＩＮＫ標的ＣＤＬの数に左右される。フェイルセーフ特性は、表１にさらに詳しく記載する。
【００５３】
表１．フェイルセーフ細胞量、並びにヒト身体とのそれらの関係を、数学的モデル化を用いて計算した。このモデルは、ＣＤＬ発現が陰性選択マーカ活性の消失と一緒に同時消失し、細胞増殖を障害した際のイベントは計算に入れなかった。従って、これらの値は過小評価値であり、陰性選択マーカについて１０〜６前進突然変異速度を想定して算出した。ヒト身体の推定細胞数：３．７２×１０１３を（Ｂｉａｎｃｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）から採用した。
【００５４】
【表１】
2018507701.tif 000003
【００５５】
本明細書では、フェイルセーフ細胞は、こうした細胞が宿主への細胞の移植前又は移植後に産生されたか否かとは関係なく、望ましくない増殖速度を呈示する細胞を排除することが要望され得る細胞療法で有用となると考えられる。
【００５６】
細胞分裂遺伝子座（ＣＤＬ）
本明細書に記載するシステム、方法及び組成物は、例えば、表２に示すＣＤＬなどの１つ又は複数のＣＤＬの同定に基づく。本明細書では、本明細書に記載する方法を用いて様々なＣＤＬをターゲティングすることができると考えられる。
【００５７】
様々な実施形態では、ＣＤＬは、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５（明示されているのと同様に、参照によりその全体を本明細書に組み込む）に記載されている「必須遺伝子」として同定される遺伝子座である。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５に記載の必須遺伝子は、各々の遺伝子についてスコア（すなわち、ＣＲＩＳＰＲスコア）を計算することによって同定され、このスコアは、遺伝子の不活性化により課される適応コストを表す。一実施形態では、ＣＤＬは、約−１．０未満のＣＲＩＳＰＲスコアを有する（表２、第５列）。
【００５８】
様々な実施形態では、ＣＤＬは、細胞分裂及び／又は複製に関連する遺伝子産物をコードする１つ又は複数の遺伝子座である（表２、第６列）。例えば、様々な実施形態では、ＣＤＬは、ｉ）細胞周期；ｉｉ）ＤＮＡ複製；ｉｉｉ）ＲＮＡ転写及び／又はタンパク質翻訳；並びにｉｖ）代謝の１つ又は複数に関連する遺伝子産物をコードする遺伝子座である（表２、第７列）。
【００５９】
一実施形態では、ＣＤＬは、細胞周期の進行の調節（例えば、Ｇ１／Ｓ  Ｇ２／Ｍ及び中期から後期への移行の制御）に関与する１つ又は複数のサイクリン依存性キナーゼ、例えば、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７、ＣＤＫ８、ＣＤＫ９及び／又はＣＤＫ１１などである（Ｍｏｒｇａｎ，２００７）。一実施形態では、ＣＤＬは、１つ又は複数のＣＤＫを活性化することによって細胞周期の進行の制御に関与する１つ又は複数のサイクリン、例えば、サイクリンＢ、サイクリンＥ、サイクリンＡ、サイクリンＣ、サイクリンＤ、サイクリンＨ、サイクリンＣ、サイクリンＴ、サイクリンＬ及び／又はサイクリンＦなどである（ＦＵＮＧ  ａｎｄ  ＰＯＯＮ，２００５）。一実施形態では、ＣＤＬは、細胞周期のＭ期における中期から後期への移行の進行を制御する後期促進複合体に関与する１つ又は複数の遺伝子座である（Ｐｅｔｅｒｓ，２００２）。一実施形態では、ＣＤＬは、細胞周期のＭ期における中期から後期への移行の進行を制御する動原体成分に関与する１つ又は複数の遺伝子座である。一実施形態では、ＣＤＬは、細胞周期に必要な微小管運動を制御する微小管成分に関与する１つ又は複数の遺伝子座である（Ｃａｓｓｉｍｅｒｉｓ，１９９９）。
【００６０】
様々な実施形態では、ＣＤＬは、ハウスキーピングに関与する１つ又は複数の遺伝子座である。本明細書で使用する場合、用語「ハウスキーピング遺伝子」又は「ハウスキーピング遺伝子座」は、基本的な細胞機能の維持に必要な１つ又は複数の遺伝子を指す。ハウスキーピング遺伝子は、正常な状態及び病態生理学的状態にある生物の全ての細胞で発現される。
【００６１】
様々な実施形態では、ＣＤＬは、細胞分裂及び／又は増殖に関連する遺伝子産物をコードする１つ又は複数の遺伝子座であり、約−１．０未満のＣＲＩＳＰＲスコアを有する。例えば、一実施形態では、ＣＤＬは、ｉ）細胞周期；ｉｉ）ＤＮＡ複製；ｉｉｉ）ＲＮＡ転写及び／又はタンパク質翻訳；並びにｉｖ）代謝の１つ又は複数に関連する遺伝子産物をコードする１つ又は複数の遺伝子座であり、約−１．０未満のＣＲＩＳＰＲスコアを有する。一実施形態では、ＣＤＬは、ハウスキーピング遺伝子でもある。
【００６２】
一実施形態では、潜在的なＣＤＬを同定するために、本発明者らは、遺伝子ノックアウトの早期マウス胚性致死表現型を調べた（ＫＯｓ；表２、第８列）。例えば、本発明者らは、Ｃｄｋ１（サイクリン依存性キナーゼ１、細胞分裂周期タンパク質２相同体（ＣＤＣ２）とも呼ばれる）ヌル突然変異について同型接合性ヌルのマウス胚が２細胞期で死滅することを見出した（Ｅ１．５）（Ｓａｎｔａｍａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。Ｃｄｋ１（ヒトではＣＤＫ１と呼ばれる）は、その機能が細胞周期の調節に極めて重要である高度に保存されたセリン／トレオニンキナーゼである。Ｃｄｋ１のタンパク質複合体は、多数の標的基質をリン酸化することによって細胞周期進行をもたらす。Ｃｄｋ１発現が存在しなければ、細胞は、細胞周期のＧ２からＭ期に移行することができない。
【００６３】
Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１は、単一遺伝子座ＣＤＬの一例である。遺伝子座の転写がＡＬＩＮＫ修飾の挿入によりアブレートされるか、及び／又はＥＡＲＣ修飾の挿入により外因的に制御されるＣｄｋ１／ＣＤＫ１の遺伝子修飾を本明細書において実施例１、２及び３に記載するように調べた。Ｔｏｐ２Ａ／ＴＯＰ２Ａは、ＣＤＬの一例である。Ｃｅｎｐａ／ＣＥＮＰＡは、ＣＤＬの一例である。Ｂｉｒｃ５／ＢＩＲＣ５は、ＣＤＬの一例である。Ｅｅｆ２／ＥＥＦ２は、ＣＤＬの一例である。遺伝子座の転写をＥＡＲＣ修飾の挿入により外因的に制御することができる、Ｔｏｐ２ａ、Ｃｅｎｐａ、Ｂｉｒｃ５、及びＥｅｆ２の遺伝子修飾を本明細書で実施例４〜７にそれぞれ記載するように調べた。
【００６４】
一実施形態では、本明細書において、代替及び／又は追加の遺伝子座は、本明細書に記載する方法を用いてターゲティングすることができるＣＤＬであることが考えられる。
【００６５】
例えば、ヒト細胞株のＲＮＡｉスクリーニングにより、細胞増殖に不可欠な複数の遺伝子が同定された（Ｈａｒｂｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｋｉｔｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。本発明者らは、オーソログが欠損するマウスの遺伝子座の早期胚性致死表現型を確認し、及び／又は遺伝子座のＧＯターム（ｔｅｒｍ）及び／又はジーンカード（ｇｅｎｅｃａｒｄ）を分析した後、これらの遺伝子座のサブセットがＣＤＬであると予測した（表２、第８列）。
【００６６】
アブレーションリンク（ＡＬＩＮＫ）遺伝子修飾を有するＣＤＬのターゲティング
一態様では、本開示は、ＣＤＬの発現を、陰性選択マーカをコードするＤＮＡ配列の発現と連結することにより、結果的にＣＤＬと陰性選択マーカを発現する有糸分裂活性細胞の薬物誘導性アブレーションを可能にするための分子ツール、方法及びキットを提供する。増殖細胞のアブレーションは、例えば、細胞増殖が制御不良であり、及び／又は細胞の正常分裂速度に対して加速している（例えば、癌細胞により呈示される制御不良の細胞分裂）場合に望ましいであろう。増幅細胞のアブレーションは、陰性選択マーカをコードするＤＮＡ配列の発現をＣＤＬの発現と連結することにより、結果としてＣＤＬ遺伝子座を発現するＡＬＩＮＫ修飾増幅細胞の排除又は十分な阻害（腫瘍形成に寄与するには低すぎる速度までの細胞増殖速度の阻害である十分な阻害）を可能にする、本明細書で「アブレーションリンク」（ＡＬＩＮＫ）と呼ばれる細胞に対する遺伝子修飾により達成することができる。陰性選択系のプロドラッグ又は他の誘導物質の存在下で陰性選択マーカを発現する細胞は、選択マーカの作用機構に応じて増殖を停止するか、又は死滅するであろう。細胞は、同型接合性、異型接合性、半接合性又は化合物異型接合性ＡＬＩＮＫを含むように修飾してよい。一実施形態では、アブレーションの忠実性を向上させるために、ＣＤＬの全ての機能性対立遺伝子に陰性選択マーカを導入してもよい。１つの好ましい実施形態では、ＣＤＬの全ての機能性対立遺伝子に陰性選択マーカを導入してもよい。
【００６７】
ＡＬＩＮＫは、ＣＤＬの任意の位置に導入してよく、これにより、ＣＤＬ及び陰性選択マーカの同時発現が可能になる。
【００６８】
以下の実施例１にさらに論じるように、陰性選択マーカの発現により、陰性選択マーカ並びに必然的にＣＤＬを発現する宿主細胞が陰性選択マーカの誘導物質（例えば、プロドラッグ）（例えば、ガンシクロビル（ＧＣＶ））の存在下で死滅するように、陰性選択マーカ（例えば、ＨＳＶ−ＴＫ）をコードするＤＮＡを宿主細胞のＣＤＬ（例えば、ＣＤＫ１）に挿入することができる。この例では、ＡＬＩＮＫで修飾された宿主細胞は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）を産生し、及びＴＫタンパク質は、ＧＣＶをＧＣＶ一リン酸に変換し、次にこれが細胞キナーゼによりＧＣＶ三リン酸に変換される。ＧＣＶ三リン酸はＳ期中に複製ＤＮＡに組み込まれ、これは、ＤＮＡ伸長及び細胞アポトーシスの終結を招く（Ｈａｌｌｏｒａｎ  ａｎｄ  Ｆｅｎｔｏｎ、１９９８）。
【００６９】
修飾ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子（Ｐｒｅｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）は、本明細書において、望ましくない細胞分裂速度を含む細胞を選択的にアブレートするためのＡＬＩＮＫ遺伝子修飾に使用され得る陰性選択マーカをコードするＤＮＡの一例として開示される。
【００７０】
本明細書では、代替及び／又は追加の陰性選択系を本明細書に記載するツール及び／又は方法で使用することができると考えられる。様々な陰性選択マーカ系が当技術分野で知られている（例えば、ｄＣＫ．ＤＭ（Ｎｅｓｃｈａｄｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２））。
【００７１】
例えば、臨床との関連を有する様々な陰性選択系は、副作用が全くないか、又は最小限の副作用で従来の癌療法の治療効果を改善することを目標とする「遺伝子指向性酵素／プロドラッグ療法」（ＧＥＰＴ）の分野で開発進行中である（Ｈｅｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｎａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。多くの場合、ＧＥＰＴは、ウイルスベクターを使用して、癌細胞又は癌細胞の領域内で癌細胞の近傍に、哺乳動物細胞には存在せず、酵素を産生する遺伝子を送達することを含み、この酵素は、比較的非毒性のプロドラッグを毒性物質に変換することができる。
【００７２】
ＨＳＶ−ＴＫ／ＧＣＶ、シトシンデアミナーゼ／５−フルオロシトシン（ＣＤ／５−ＦＣ）、及びカルボキシルエステラーゼ／イリノテカン（ＣＥ／ＣＰＴ−１１）は、ＧＥＰＴ前臨床試験及び臨床試験で評価されている陰性選択マーカ系の例である（Ｄａｎｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｓｈａｈ，２０１２）。
【００７３】
１型単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ／ガンシクロビル（ＴＫ／ＧＣＶ）系の潜在的な免疫原性の問題を解決するために、ヒトデオキシシチジンキナーゼ酵素がチミジン活性となり、非毒性プロドラッグ：ブロモビニル−デオキシウリジン（ＢＶｄＵ）、Ｌ−デオキシチミジン（ＬｄＴ）又はＬ−デオキシウリジン（ＬｄＵ）と共に陰性選択（自殺）系として作用するように、この酵素を操作することによって「ヒト化」自殺系が開発されている（Ｎｅｓｃｈａｄｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【００７４】
ＣＤ／５−ＦＣ陰性選択マーカ系は、広く使用されている「自殺遺伝子」系である。シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）は、細菌又は酵母（例えば、それぞれ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）又はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来）から得ることができる非哺乳動物酵素である（Ｒａｍｎａｒａｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＣＤは、シトシンのウラシルへの変換を触媒し、原生動物及び真菌におけるピリミジンサルベージ経路の重要なメンバーであるが、哺乳動物細胞には存在しない。５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）は、ヒトにおける低レベルの細胞傷害性を引き起こす抗真菌プロドラッグである（Ｄｅｎｎｙ，２００３）。ＣＤは、５−ＦＣの遺伝毒性物質５−ＦＵへの変換を触媒し、ヒトにおいて高レベルの毒性を有する（Ｉｒｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【００７５】
ＣＥ／ＣＰＴ−１１系は、哺乳動物種の様々な組織に見出されるセリンエステラーゼであるカルボキシルエステラーゼ酵素を基材とする（Ｈｕｍｅｒｉｃｋｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。抗がん剤ＣＰＴ−１１は、ＣＥにより活性化されて、強力な哺乳動物トポイソメラーゼＩ阻害物質である、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ−３８）と呼ばれる活性を産生する（Ｗｉｅｒｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ＳＮ−３８は、分裂細胞に二本鎖ＤＮＡ切断の蓄積を誘導する（Ｋｏｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【００７６】
陰性選択マーカ系の別の例は、ｉＣａｓｐ９／ＡＰ１９０３自殺系であり、これは、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）に融合した修飾ヒトカスパーゼ９を基材とし、小分子ＡＰ１９０３を用いて化学的二量体化を可能にするものであり、これはヒトで安全に試験されている。二量体化薬を投与すると、操作カスパーゼ９成分を発現する細胞のアポトーシスが誘導される。この系は、例えば、低い潜在的免疫原性をはじめとするいくつかの利点を有し、これはヒト遺伝子産物から構成されるため、二量体化薬は、操作カスパーゼ９成分を発現する細胞のみに作用する（Ｓｔｒａａｔｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ｉＣａｓｐ／ＡＰ１９０３自殺系は、臨床現場で試験中である（Ｄｉ  Ｓｔａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【００７７】
本明細書において、ＡＬＩＮＫ系の陰性選択マーカ系は、増殖アンタゴニスト系で置換することができると考えられる。本明細書で使用する用語「増殖アンタゴニスト」は、その存在が細胞の分裂を（完全若しくは部分的に）阻害する天然又は操作化合物を指す。例えば、ＯｍｏｍｙｃＥＲは、突然変異マウスエストロゲン受容体（ＥＲ）ドメインとＭＹＣドミネントネガティブＯｍｏｍｙｃとの融合タンパク質である。タモキシフェン（ＴＡＭ）で誘導されると、融合タンパク質ＯｍｏｍｙｃＥＲは核に局在化し、ここで、ドミネントネガティブＯｍｏｍｙｃは、Ｃ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ及びＮ−Ｍｙｃと二量体化して、これらを、Ｍｙｃ  ＤＮＡ結合共通配列と結合することができない複合体中に隔離する（Ｓｏｕｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。Ｍｙｃ活性が欠失しているために細胞は分裂することができない（Ｏｒｉｃｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。増殖アンタゴニストの別の例は、Ａ−Ｆｏｓ、すなわち、等モル競合でのＤＮＡ結合を阻害する、活性化タンパク質１（ＡＰ１）に対するドミネントネガティブ（癌遺伝子Ｆｏｓ及びＪｕｎのヘテロ二量体）である（Ｏｌｉｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。Ａ−Ｆｏｓはまた、ＥＲドメインと融合して、ＴＡＭにより誘導されるその核局在化をもたらす。ＯｍｏｍｙｃＥＲ／タモキシフェン又はＡ−ＦｏｓＥＲ／タモキシフェンは、ＴＫ／ＧＣＶの代わりに用いてＡＬＩＮＫにすることができる。
【００７８】
ＥＡＲＣ遺伝子修飾を有するＣＤＬのターゲティング
一態様では、本開示は、誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系などのＥＡＲＣとＣＤＬとを作動可能に連結することにより、ＣＤＬを外因的に制御するための分子ツール、方法及びキットを提供する。これらの条件下では、ＣＤＬは、誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質の存在下でのみ発現され、その存在下でのみ細胞は分裂することができる。これらの条件下で、ＥＡＲＣ修飾細胞は、誘導物質が存在しなければ、誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の作用機構及びＣＤＬ機能に応じて分裂を停止するか、大幅に減速するか、又は死滅する。細胞は、同型接合性若しくは化合物異型接合性ＥＡＲＣを含むように修飾してもよく、又はＥＡＲＣ修飾対立遺伝子のみが機能性ＣＤＬを産生することができるように改変してもよい。一実施形態では、例えば、細胞分裂制御のための機構を提供するために、ＥＡＲＣ修飾をＣＤＬの全ての対立遺伝子に導入してもよい。
【００７９】
ＥＡＲＣは、誘導物質の存在下で、ＣＤＬ及び誘導系の活性化因子成分の同時発現を可能にするＣＤＬの任意の位置に挿入してよい。
【００８０】
一実施形態では、「活性化因子」に基づく遺伝子発現系は、「抑制因子」に基づく遺伝子発現系より好ましい。例えば、抑制因子を用いてＣＤＬを抑制する場合、抑制因子の機能突然変異の喪失によってＣＤＬ発現が解除され、これにより細胞増殖が可能になる。細胞分裂の活性化に基づく抑制の場合、活性化因子機能の喪失（突然変異）によってＣＤＬ発現が停止され、これにより細胞増殖が不可能となる。
【００８１】
以下の実施例２〜６にさらに論じるように、誘導物質（例えば、ドキシサイクリン又は「ＤＯＸ」）の存在下で、ｄｏｘ−架橋がＣＤＬ発現を可能にし、これにより細胞分裂及び増殖が可能になるように、ｄｏｘ−架橋を宿主細胞のＣＤＬ（例えば、ＣＤＫ１）に挿入してもよい。ｄｏｘ−架橋ＥＡＲＣで修飾された宿主細胞は、分裂細胞中（例えば、ＣＤＬ中）で活性のプロモータの転写制御下において逆テトラサイクリントランス−アクチベータ（ｒｔＴＡ）遺伝子を含み得る（Ｕｒｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。この標的挿入により、ＣＤＬプロモータは、ＣＤＬ転写のためにもはや利用可能ではなくなる。ＣＤＬ転写を回復するために、テトラサイクリン応答エレメント促進剤（例えば、ＴＲＥ（Ａｇｈａ−Ｍｏｈａｍｍａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４））をＣＤＬ転写物の前に挿入すれば、これは、ｒｔＴＡが発現され、ドキシサイクリンが存在する状況でのみＣＤＬ遺伝子を発現するであろう。ＣＤＬ発現の唯一の供給源がｄｏｘ−架橋対立遺伝子であるとき、ドキシサイクリンの非存在下でＣＤＬ遺伝子発現は起こらない。ＣＤＬ発現がなければ、ＥＡＲＣ修飾細胞は、細胞死、細胞分裂の停止によるか、又はＥＡＲＣ修飾細胞が腫瘍形成に寄与できないほど細胞有糸分裂速度を遅くすることによるかのいずれかでその増幅が障害される。
【００８２】
本明細書で使用する用語「ｄｏｘ−架橋」は、内在性若しくは外性プロモータによりｒｔＴＡを発現させ（Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、標的領域の転写をＴＲＥの制御下に置くことにより、標的転写領域からプロモータの活性を分離する機構を指す。本明細書で使用する場合、「ｒｔＴＡ」は、テトラサイクリン誘導系の逆テトラサイクリントランスアクチベータエレメントを指し（Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、「ＴＲＥ」は、最小プロモータ上流のＴｅｔＯオペレータ配列から構成されるプロモータを指す。ドキシサイクリンの存在下でＴＲＥプロモータにｒｔＴＡを結合した後、ＴＲＥプロモータ下流の遺伝子座の転写が増大する。標的領域の転写発現の許可又は不許可ステータスがドキシサイクリンにより制御される限り、ｒｔＴＡ配列は、ＣＤＬと同じ転写ユニット又はゲノムの異なる位置に挿入してよい。ｄｏｘ−架橋は、ＥＡＲＣの一例である。
【００８３】
本明細書では、ＣＤＬの５’調節領域へのＥＡＲＣ系の導入も考慮される。
【００８４】
本明細書では、ＥＡＲＣ修飾を生成するために、本明細書に記載するツール又は方法に、別の及び／又は追加の誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を使用できることが考慮される。
【００８５】
例えば、細胞分裂及び／又は増殖が望ましいとき、コードＣＤＬの作用タンパク質産物と融合した不安定化タンパク質ドメイン（Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）を小分子合成リガンドと一緒に使用して、ＣＤＬ融合タンパク質を安定化することができる。安定化物質が存在しない場合、不安定化ＣＤＬタンパク質は、細胞により分解され、次に、この細胞が増殖を停止することになる。安定化化合物が添加されると、これは、不安定化ＣＤＬタンパク質と結合し、不安定化ＣＤＬタンパク質は分解されないため、細胞は増殖することが可能になる。
【００８６】
例えば、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）技術（Ｍａｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を二量体化物質調節発現誘導（Ｐｏｌｌｏｃｋ  ａｎｄ  Ｃｌａｃｋｓｏｎ，２００２）と組み合わせることができる。ＴＡＬＥ技術を用いて、ＣＤＬのプロモータに代わる最小プロモータと一緒に配置される配列に特異的であるように設計されたＤＮＡ結合ドメインを作製することができる。ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインも薬剤二量体化ドメインによって伸長した。後者は、対応する二量体化ドメイン及び転写活性化ドメインを有する別の操作タンパク質に結合することができる（図１Ｃ）。
【００８７】
例えば、図１Ｄを参照すると、逆クメートトランス活性化因子（ｒｃＴＡ）をＣＤＬの５’非翻訳領域に挿入し、これが内在性ＣＤＬプロモータにより発現されるようにしてもよい。クメートオペレータ（Ｃｕｍａｔｅ  Ｏｐｅｒａｔｏｒ）の６回反復（６×ＣｕＯ）をＣＤＬの転写開始（ＡＴＧ）の直前に挿入してもよい。その系にクメートがない場合、ｒｃＴＡは、６×ＣｕＯに結合することができず、６×ＣｕＯが活性でないため、ＣＤＬは転写されない。クメートが添加されると、これはｒｃＴＡと複合体を形成し、６×ＣｕＯとの結合が可能になるため、ＣＤＬの転写が可能になる（Ｍｕｌｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【００８８】
例えば、図１Ｅを参照すると、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）と、Ｖｐ１６の活性化ドメインに融合したエクジソン受容体（ＥｃＲ）（ＶｐＥｃＲ）のＮ−末端切断型とをＣＤＬの５’非翻訳領域に挿入して、これらが内在性ＣＤＬプロモータにより同時発現されるようにしてもよい。エクジソン応答性エレメント（ＥｃＲＥ）は、下流の最小プロモータと一緒に、出発コドンの直接上流でＣＤＬに挿入してもよい。同時発現されたＲＸＲとＶｐＥｃＲとは、互いにヘテロ二量体化することができる。エクジソン又は合成薬類似体ムリステロンＡがない場合、二量体化ＲＸＲ／ＶｐＥｃＲはＥｃＲＥと結合することができないため、ＣＤＬは転写されない。エクジソン又はムリステロンＡの存在下では、二量体化ＲＸＲ／ＶｐＥｃＲはＥｃＲＥと結合し、これによりＣＤＬは転写される（Ｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【００８９】
例えば、図１Ｆを参照すると、一過性受容体ポテンシャルバニロイド１（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｖａｎｉｌｌｏｉｄ−１）（ＴＲＰＶ１）をフェリチンと一緒に、ＣＤＬの５’非翻訳領域に挿入して、内在性ＣＤＬプロモータにより同時発現させてもよい。また、ＮＦＡＴ（ＮＦＡＴｒｅ）により誘導可能なプロモータを出発コドンの直接上流でＣＤＬに挿入してもよい。通常の環境では、ＮＦＡＴプロモータは活性ではない。しかし、低周波電波に曝露すると、ＴＲＰＶ１及びフェリチンは、細胞に進入するＣａ＋＋の波を形成し、次に、これが細胞質−ＮＦＡＴ（ＮＦＡＴｃ）を核−ＮＦＡＴ（ＮＦＡＴｎ）に変換し、これは、最終的にＮＦＡＴｒｅを活性化してＣＤＬを転写することになる（Ｓｔａｎｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【００９０】
例えば、図１Ｇを参照すると、ＣＤＬは、部分／ドメイン：５’−ＣＤＬ及び３’ＣＤＬに機能的に区分してＦＫＢＰペプチド配列を各ドメインに挿入することができる。ＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）配列は、２つのドメイン間に配置してよく、これらはＣＤＬプロモータによって同時に転写されるが、２つの個別のタンパク質を産生する。誘導物質がなければ、２つの個別のＣＤＬドメインは機能的に不活性となる。ラパマイシン又はＡＰ２０１８７などの二量体化物質を導入すると、ＦＫＢＰペプチドは二量体化し、５’及び３’ＣＤＬ部分をもたらし、活性タンパク質を再構成する（Ｒｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【００９１】
動物細胞の分裂を制御する方法
一態様では、動物細胞の分裂を制御する方法が本明細書において提供される。
【００９２】
本方法は、動物細胞を用意するステップを含む。例えば、動物細胞は、鳥類又は哺乳動物細胞であってよい。例えば、哺乳動物細胞は、多能性（例えば、胚性幹細胞若しくはｉＰＳ細胞）、複能性、単能性前駆、又は最終分化細胞である、単離されたヒト又は非ヒト細胞であってもよい。哺乳動物細胞は、多能性、複能性、単能性前駆、又は最終分化細胞に由来するものであってもよい。哺乳動物細胞は、体幹細胞、複能性、単能性前駆細胞、複能性体細胞、又は体幹細胞、複能性前駆細胞若しくは体細胞に由来する細胞であってもよい。好ましくは、動物細胞は、遺伝子修飾を受けやすい。好ましくは、動物細胞は、治療価値を有するとユーザによりみなされ、これは、細胞を用いて、治療を必要とする対象の疾患、障害、欠損又は傷害を治療し得ることを意味する。様々な実施形態では、非ヒト哺乳動物細胞は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、シカ、エルク、スイギュウ、雄牛、ラクダ、ラマ、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、又は非ヒト霊長類細胞である。好ましい実施形態では、動物細胞はヒト細胞である。
【００９３】
本方法は、動物細胞において、ＣＤＬを遺伝子修飾するステップをさらに含む。ＣＤＬを遺伝子修飾するステップは、１つ又は複数のＡＬＩＮＫ系又は１つ又は複数のＡＬＩＮＫ系及びＥＡＲＣ系などのｉＮＥＰを宿主動物細胞に導入するステップを含む。陰性選択マーカ系及び誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系などの様々な遺伝子修飾を動物細胞に導入する技術は、当技術分野で公知であり、その修飾の標的（すなわち、非ランダム）化合物異型接合性及び同型接合性導入の技術などがある。ＥＡＲＣ修飾の使用を含む場合、修飾により、機能性ＣＤＬ発現がＥＡＲＣ修飾対立遺伝子を通してのみ生成され得ることを確実にすべきである。例えば、１つ又は複数のＡＬＩＮＫのみを含むか、これらを若しくは１つ又は複数のＥＡＲＣ系と一緒に含むＤＮＡベクターによるＣＤＬ又はＣＤＬの標的置換を実施して、宿主動物細胞を遺伝子修飾してもよい。
【００９４】
本方法は、ｉＮＥＰ系を含む遺伝子修飾動物細胞の分裂を可能にするステップもさらに含む。
【００９５】
例えば、ＡＬＩＮＫ系を含む遺伝子修飾動物細胞を、対応するＡＬＩＮＫ陰性選択マーカの誘導物質の非存在下で維持することにより、ＡＬＩＮＫ修飾細胞の分裂を可能にすることである。細胞分裂及び増殖は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。例えば、遺伝子修飾細胞は、治療用途のために十分大きい細胞集団が形成されるまでｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖及び拡大させることができる。例えば、増殖及び拡大させた遺伝子修飾動物細胞の１つ又は複数を宿主に導入し（例えば、移植により）、ｉｎ  ｖｉｖｏでさらに増殖させることもできる。様々な実施形態では、ＡＬＩＮＫ系を含む遺伝子修飾動物細胞のアブレート及び／又は阻害は、ＡＬＩＮＫ系を含む遺伝子修飾動物細胞を、対応する陰性選択マーカの誘導物質に曝露することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。このような曝露は、増殖細胞の少なくとも一部を殺傷することにより、増殖細胞をアブレートし、及び／又は遺伝子修飾動物細胞の増殖速度を阻害することになる。遺伝子修飾細胞のアブレーション及び／又は遺伝子修飾動物細胞の細胞増殖の阻害は、例えば、細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで正常より速い速度で分裂を開始し、それが腫瘍形成及び／又は不要な細胞増殖を招き得る場合に望ましいであろう。
【００９６】
例えば、ＥＡＲＣ系を含む遺伝子修飾動物細胞を、誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質の存在下で維持することにより、ＥＡＲＣ修飾細胞の分裂を可能にすることである。細胞分裂及び増殖は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。例えば、遺伝子修飾細胞は、治療用途のために十分大きい細胞集団が形成されるまでｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖及び拡大させることができる。例えば、増殖及び拡大させた遺伝子修飾動物細胞の１つ又は複数を宿主に導入し（例えば、移植により）、ｉｎ  ｖｉｖｏでさらに増殖させることもできる。様々な実施形態では、ＥＡＲＣ系を含む遺伝子修飾動物細胞のアブレート及び／又は阻害は、ＥＡＲＣ系を含む遺伝子修飾動物細胞を、誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質への曝露を阻止若しくは阻害することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。誘導物質が存在しなければ、腫瘍形成に寄与するには速度が遅すぎる増殖により、増殖細胞をアブレートし、及び／又は遺伝子修飾動物細胞の拡大を阻害し得る。遺伝子修飾動物細胞のアブレーション及び／又は細胞増殖の阻害は、例えば、細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで正常より速い速度で分裂を開始し、それが腫瘍形成及び／又は不要な細胞増殖を招き得る場合に望ましいであろう。
【００９７】
例えば、以下の様々な実施例に記載する、本明細書で提供する方法の様々な実施形態では、誘導物質はドキシサイクリン及びガンシクロビルである。
【００９８】
一実施形態では、ドキシサイクリンは、例えば、増殖培地中約１μｇ／ｍｌの最終濃度まで、Ｈ２Ｏに溶解させた約１ｍｇ／ｍｌのＤｏｘなどの誘導物質の濃縮溶液を細胞増殖培地に添加することにより、細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで送達することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでドキシサイクリンを対象に経口投与してもよく、例えば、飲料水（例えば、約５〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で）若しくは食品（例えば、約１００ｍｇ／ｋｇの用量で）、注射（例えば、約５０ｍｇ／ｋｇの用量でのＩ．Ｖ．若しくはＩ．Ｐ．）により、又は錠剤（例えば、約１〜４ｍｇ／ｋｇの用量で）により投与することができる。
【００９９】
一実施形態では、ガンシクロビルは、例えば、増殖培地中約０．２５〜２５μｇ／ｍｌの最終濃度まで、Ｈ２Ｏに溶解させた約１０ｍｇ／ｍｌのＧＣＶなどの誘導物質の濃縮溶液を細胞増殖培地に添加することにより、細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで送達することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでＧＣＶを対象に経口投与してもよく、例えば、飲料水（例えば、約４〜２０ｍｇ／ｋｇの用量で）若しくは食品（例えば、約４〜２０ｍｇ／ｋｇの用量で）、注射（例えば、約Ｉ．Ｖ．若しくはＩ．Ｐ．５０ｍｇ／ｋｇの用量で）により、又は錠剤（例えば、約４〜２０ｍｇ／ｋｇの用量で）により投与することができる。
【０１００】
一実施形態では、誘導物質がｉｎ  ｖｉｔｒｏで作用しているかどうかを評価するために、例えば、治療開始後２４時間毎に細胞増殖及び細胞死を測定してもよい（例えば、細胞計数及び生存能アッセイにより）。誘導物質がｉｎ  ｖｉｖｏで作用しているかどうかを評価するために、遺伝子修飾多能性細胞から産生された奇形腫のサイズを例えば治療開始後１〜２日毎に測定することができる。
【０１０１】
本明細書において提供される方法の特に好ましい実施形態では、動物細胞は、ＡＬＩＮＫ及びＥＡＲＣ系の両方を含むように遺伝子修飾してもよい。ＡＬＩＮＫ及びＥＡＲＣ系は、同じ又は異なるＣＤＬをターゲティングし得る。こうした細胞は、例えば、増殖細胞の少なくとも一部を殺傷することにより、細胞分裂をアブレート及び／若しくは阻害し、且つ／又は増殖をアブレート及び／若しくは阻害する少なくとも２つの機構をユーザに提供することから、特定の用途について望ましいであろう。
【０１０２】
本明細書では、本明細書において提供される方法を用いて、鳥類細胞、例えば、ニワトリ細胞の分裂及び／又は増殖を制御し得ることが考慮される。
【０１０３】
細胞分裂を制御するための少なくとも１つの機構を含むように操作された細胞
一態様では、細胞分裂及び／又は増殖並びにその集団を制御するための少なくとも１つの機構を含むように遺伝子修飾された動物細胞が本明細書において提供される。例えば、哺乳動物細胞は、多能性（例えば、胚性肝細胞若しくはｉＰＳ細胞）、複能性、単能性前駆、又は最終分化細胞である、単離されたヒト又は非ヒト細胞であってもよい。哺乳動物細胞は、多能性、複能性、単能性前駆、又は最終分化細胞に由来するものであってもよい。哺乳動物細胞は、体幹細胞、複能性、単能性前駆、前駆細胞若しくは体細胞、又は体幹細胞、複能性若しくは単能性前駆細胞又は体細胞に由来する細胞であってもよい。好ましくは、動物細胞は、遺伝子修飾を受けやすい。好ましくは、動物細胞は、治療価値を有するとユーザによりみなされ、これは、細胞を用いて、治療を必要とする対象の疾患、障害、欠損又は傷害を治療し得ることを意味する。一部の実施形態では、非ヒト哺乳動物細胞は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、シカ、エルク、スイギュウ、雄牛、ラクダ、ラマ、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、又は非ヒト霊長類細胞である。
【０１０４】
本明細書において提供される遺伝子修飾細胞は、１つ又は複数のＣＤＬの１つ又は複数の遺伝子修飾を含む。ＣＤＬの遺伝子修飾はＡＬＩＮＫ系であり、複数のＣＤＬの場合、ＡＬＩＮＫ系及びＥＡＲＣ系の１つ又は複数、例えば、本明細書に記載のＡＬＩＮＫ系及び／又はＥＡＲＣ系の１つ又は複数である。例えば、本明細書において提供される遺伝子修飾動物細胞は、１つ又は複数のＣＤＬに１つのＡＬＩＮＫ系；１つ又は複数のＣＤＬに１つのＥＡＲＣ系；又は１つ又は複数のＣＤＬにＡＬＩＮＫ及びＥＡＲＣ系を含んでよく、ここで、ＡＬＩＮＫ及びＥＡＲＣ系は、同じ若しくは異なるＣＤＬに対応する。遺伝子修飾細胞は、同型接合性、異型接合性、半接合性又は化合物異型接合性ＡＬＩＮＫ遺伝子修飾を含み得る。ＥＡＲＣ修飾の場合、修飾により、機能性ＣＤＬ発現がＥＡＲＣ修飾対立遺伝子を通してのみ生成され得ることを確実にすべきである。
【０１０５】
本明細書で提供される遺伝子修飾細胞は、疾患、障害若しくは傷害の治療を目的とする細胞療法並びに／又は化合物及び／若しくは組成物（例えば、天然若しくは設計生物製剤）の制御細胞送達を含む細胞療法に有用となり得る。前述したように、患者の安全は、特に、治療細胞移植片から生じる悪性増殖の可能性に関して、細胞療法における懸念事項である。治療細胞移植片の強度の増殖を必要としない細胞療法の場合、本明細書に記載するように、１つ又は複数のｉＮＥＰ修飾を含む遺伝子修飾細胞が治療及び安全ニーズに取り組む上で好適であると考えられる。治療細胞移植片の強度の増殖を必要とする細胞療法の場合、本明細書に記載するように、２つ以上のｉＮＥＰ修飾を含む遺伝子修飾細胞が治療及び安全ニーズに取り組む上で好適であると考えられる。
【０１０６】
本明細書では、ニワトリ細胞などの鳥類細胞を用意してもよく、ここで、鳥類細胞は前述の遺伝子修飾を含むことが考えられる。
【０１０７】
ＣＤＬをターゲティングする分子ツール
一態様では、ＣＤＬの発現を修飾するための様々なＤＮＡベクターが本明細書において提供される。
【０１０８】
一実施形態では、ＤＮＡベクターはＡＬＩＮＫ系を含み、このＡＬＩＮＫ系は、陰性選択マーカをコードするＤＮＡ配列を含む。陰性選択マーカの発現はＣＤＬの発現と関連している。
【０１０９】
一実施形態では、ＤＮＡベクターはＥＡＲＣ系を含み、ＥＡＲＣ系は、ＣＤＬに作動可能に連結した誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を含み、ここで、ＣＤＬの発現は、誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系によって誘導可能である。
【０１１０】
一実施形態では、ＤＮＡベクターは、本明細書に記載する通りのＡＬＩＮＫ系と、本明細書に記載する通りのＥＡＲＣ系とを含む。このようなカセットを宿主細胞に挿入すると、ＣＤＬ転写産物の発現がＡＬＩＮＫ系の陰性選択マーカの誘導物質により阻止及び／又は阻害され、また、ＣＤＬの発現は、ＥＡＲＣ系の誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系により誘導可能である。
【０１１１】
様々な実施形態では、ＤＮＡベクター中のＣＤＬは、表２に列挙されるＣＤＬである。
【０１１２】
様々な実施形態では、ＤＮＡベクター中のＡＬＩＮＫ系は、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系、シトシンデアミナーゼ／５−フルオロシトシン系、カルボキシルエステラーゼ／イリノテカン系又はｉＣａｓｐ９／ＡＰ１９０３系である。
【０１１３】
様々な実施形態では、ＤＮＡベクター中のＥＡＲＣ系は、ｄｏｘ−架橋系、クメートスイッチ誘導系、エクジソン誘導系、電波誘導系、又はリガンド−可逆的二量体化系である。
【０１１４】
キット
本開示は、本明細書に開示する方法を実施するためのキットを考慮する。このようなキットは、典型的に、ＣＤＬ及び／又はＣＤＬを用いて、細胞増殖を制御するのに必要な２つ以上の構成要素を含む。キットの構成要素は、限定はしないが、１つ又は複数の化合物、試薬、容器、装置、並びにキットの使用指示書を含む。従って、本明細書に記載する方法は、本明細書において提供されるプレパッケージキットを使用することにより実施することができる。一実施形態では、キットは、１つ又は複数のＤＮＡベクター及び指示書を含む。一部の実施形態では、指示書は、１つ又は複数のＤＮＡベクターを宿主細胞に導入するための１つ又は複数のプロトコルを含む。一部の実施形態では、キットは、１つ又は複数の対照を含む。
【０１１５】
一実施形態では、キットは、本明細書に記載するように、ＣＤＬの発現を修飾する１つ又は複数のＤＮＡベクターを含む。例として、キットは、ＡＬＩＮＫ系を含むＤＮＡベクター；ＥＡＲＣ系を含むＤＮＡベクター；及び／又はＡＬＩＮＫ系及びＥＡＲＣ系を含むＤＮＡベクター；並びに１つ又は複数のＤＮＡベクターを用いた動物細胞中のＣＤＬ及び／又はＣＤＬの標的置換のための指示書を含み得る。好ましい実施形態では、キットは、キットのＤＮＡベクターに提供されるＡＬＩＮＫ及び／又はＥＡＲＣ系に対応する１つ又は複数の誘導物質（例えば、誘導薬）をさらに含んでもよい。
【実施例】
【０１１６】
本開示を例証する非限定的実施例を以下に記載する。
【０１１７】
実施例１：ＡＬＩＮＫ修飾細胞（マウス及びヒト）の作製
実施例１では、Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１をターゲティングするＡＬＩＮＫ（ＨＳＶ−ＴＫ）ベクターの構築、並びに増殖細胞の少なくとも一部を殺傷することにより、マウス及びヒトＥＳ細胞における細胞増殖を制御するためのそのベクターの使用を記載する。この実施例では、Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１はＣＤＬであり、ＨＳＶ−ＴＫは陰性選択マーカである。
【０１１８】
Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１は、全ての有糸分裂活性（すなわち、分裂細胞）に発現させる。ＣＤＫ１遺伝子座とＨＳＶ−ＴＫとの間に同型接合性ＡＬＩＮＫを含むように修飾された細胞では、全ての有糸分裂活性細胞がＣＤＫ１及びＨＳＶ−ＴＫを発現する。従って、ＡＬＩＮＫ修飾された有糸分裂活性細胞は、ＧＣＶ（ＨＳＶ−ＴＫのプロドラッグ）での処置により排除することができる。対立遺伝子を発現する全ての機能性ＣＤＫ１がＡＬＩＮＫ修飾されて、細胞がＨＳＶ−ＴＫ発現をサイレンシングする場合、同様に、ＣＤＫ１発現もサイレンシングされて、細胞はもはや分裂することはできなくなるであろう。静止（すなわち、非分裂）細胞は、Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１を発現しない。従って、ＡＬＩＮＫ修飾された静止細胞は、Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１−ＨＳＶ−ＴＫリンクを発現しないであろう。
【０１１９】
実施例１では、相同組換えに基づくノックインによってＣｄｋ１／ＣＤＫ１及びＨＳＶ−ＴＫ間の転写リンクを達成した。
【０１２０】
方法
標的ベクターの作製
マウス標的ベクター１：
マウスＣｄｋ１ゲノム遺伝子座を図２Ａに示す。図２Ｂを参照すると、ｐＵＣ５７ベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）での遺伝子合成により、２つのＤＮＡ断片：５ＴＫ（配列番号１）及び３ＴＫ（配列番号２）（ＳａｌＩ−Ｆ２Ａ−５’ＴＫ．００７−ＰＢ  ５’ＬＴＲ−ＮｏｔＩ−ＳａｃＩＩ及びＳａｌＩ−ＳａｃＩＩ−３’ＴＫ．００７−ＰＢ  ３’ＬＴＲ−３’ＴＫ．００７−Ｔ２Ａ−ＸｈｏＩ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＮｈｅＩ）を取得した。断片５ＴＫをＳａＩＩ＋ＳａｃＩＩで消化し、同じ消化で３ＴＫにクローニングしてｐＵＣ５７−５ＴＫ−３ＴＫを作製した。プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−Ｍ２１４（配列番号３）をＮｏｔＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩで切断することにより、ＰＧＫ−ネオマイシンカセットを取得し、これをｐＵＣ５７−５ＴＫ−３ＴＫのＮｏｔＩ＋ＳａｃＩＩ部位に連結して、Ｃｄｋ１（すなわち、ＣＤＬ）の３’末端に挿入するためのＡＬＩＮＫカセットを作製した。
【０１２１】
ＣＤＬの３’への挿入ＡＬＩＮＫに対する相同性アーム：
Ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＴＣＡＧ）から購入したＣｄｋ１のゲノム配列（配列番号４）で、細菌人工染色体（ＢＡＣ）を含有するＤＨ１０Ｂ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞株を組み換えることにより、Ｃｄｋ１ＤＮＡコード配列をクローニングした。組換えプロセスは、プラスミドｐＳＣ１０１−ＢＡＤ−γβα  Ｒｅｄ／ＥＴ（ｐＲＥＴ）（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｇｅｒｍａｎｙ）により媒介した。初めに、ｐＲＥＴをＢＡＣ含有ＤＨ１０Ｂ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に１．８ｋＶ、２５μＦ、４００オームでエレクトロポレーションした（ＢｉｏＲａｄ  ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩ／ＩＩ  ｓｙｓｔｅｍ，ＢｉｏＲａｄ，ＯＮ，ＣＡ）後、クロラムフェニコール及びテトラサイクリン耐性について選択した。ＡＬＩＮＫ挿入点（Ｃｄｋ１終止コドンの５’及び３’）にわたる短い相同性アーム（５０ｂｐ）（それぞれ配列番号５及び６）をＰＣＲにより、カセット、Ｆ２Ａ−５’ＴＫ−ＰＢ−ＰＧＫｎｅｏ−ＰＢ−３’ＴＫ−Ｔ２Ａ−ｃｈｅｒｒｙに付加した。このＰＣＲ産物を前述の条件下でＢａｃ＋ｐＲＥＴＤＨ１０Ｂ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にエレクトロポレーションした後、カナマイシン耐性について選択した。７５５ｂｐ及び８４２塩基対（ｂｐ）相同性アーム（それぞれ配列番号７及び８）から構成される最終ターゲティングカセットを、プライマー（それぞれ配列番号９及び１０）を含むＰＣＲにより回収してｐＧｅｍＴ−Ｅａｓｙベクターにクローニングすることにより、マウス標的ベクターＩを作製した。ベクターの重要な結合領域をＴＣＡＧで配列決定し、確認した。
【０１２２】
マウス標的ベクターＩＩ：
図２Ｄを参照すると、Ｆ２Ａ−ｌｏｘＰ−ＰＧＫ−ｎｅｏ−ｐＡ−ｌｏｘＰ−ＡｓｃＩ（配列番号１１）をｐＬｏｘＰＮｅｏ１ベクターからＰＣＲ増幅した後、ＴＡをｐＤｒｉｖｅベクター（Ｑｉａｇｅｎ）にクローニングした。ＡｓｃＩ−ＴＫ−Ｔ２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＥｃｏＲＩ（配列番号１２）を、切除したＴＣ対立遺伝子ＩからＰＣＲ増幅した後、ＴＡをｐＤｒｉｖｅベクターにクローニングした。次に、後者の断片をＢａｍＨＩ＋ＡｓｃＩ制限部位により前者のベクターにクローニングした。このＦ２Ａ−ｌｏｘＰ−ＰＧＫ−ｎｅｏ−ｐＡ−ｌｏｘＰ−ＴＫ−Ｔ２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙカセットを、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｓｅａｍｌｅｓｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってマウスＣｄｋ１相同性アーム間に挿入した。プルマイシン（ｐｕｒｏ）バージョンベクターを作製するために、ＰＧＫ−ｐｕｒｏ−ｐＡ断片（配列番号１３）をＢａｍＨＩ＋ＮｏｔＩでｐＮｅｗＤｏｃｋＺから切断し、Ｔ４平滑化した。ネオバージョンベクターをＡｓｃＩ＋ＣｌａＩで切断し、Ｔ４平滑化した後、ＰＧＫ−ｐｕｒｏ−ｐＡと連結した。
【０１２３】
ヒト標的ベクターＩ：
マウス標的ベクターＩと同様に、ヒトＣＤＫ１終止コドン（配列番号１４）の上流８４７ｂｐ＋Ｆ２Ａ−５’ＴＫ−ＰＢ−ＰＧＫｎｅｏ−ＰＢ−３’ＴＫ−Ｔ２Ａ−ｃｈｅｒｒｙ（配列番号１５）＋ヒトＣＤＫ１終止コドン（配列番号１６）の下流８３１ｂｐを組換え技術により作製した。選択のためのプロマイシン耐性カセットを含むベクターの別のバージョンを作製して、同型接合性ターゲティングの一度での生成を促進した。ＡｇｅＩ−ＰＧＫ−ｐｕｒｏ−ｐＡ−ＦｓｅＩ（配列番号１７）をｐＮｅｗＤｏｃｋＺベクターから増幅し、消化して、ＡｇｅＩ＋ＦｓｅＩにより切断されたネオバージョンベクターにクローニングした。
【０１２４】
ヒト標的ベクターＩＩ：
ＢａｍＨＩ−Ｆ２Ａ−ｌｏｘＰ−ＰＧＫ−ｎｅｏ−ｐＡ−ｌｏｘＰ−ＴＫ−Ｔ２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号１８）及びＢａｍＨＩ−Ｆ２Ａ−ｌｏｘＰ−ＰＧＫ−ｐｕｒｏ−ｐＡ−ｌｏｘＰ−ＴＫ−Ｔ２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号１９）を対応するマウス標的ベクターＩＩから増幅した後、ＢａｍＨＩ＋ＳｇｒＡＩで消化した。ｍＣｈｅｒｒｙ（３’３０ｂｐ）−ｈＣＤＫ１３’ＨＡ−ｐＧｅｍＥａｓｙ−ｈＣＤＫ１５’ＨＡ−ＢａｍＨＩ（配列番号２０）をＰＣＲ増幅し、これもＢａｍＨＩ＋ＳｇｒＡＩで消化した。ヒト標的ベクターＩＩのネオ及びプロマイシンバージョンを、相同性アームバックボーンとネオ又はプロマイシンバージョンＡＬＩＮＫカセットとの連結によって作製した。
【０１２５】
ヒト標的ベクターＩＩＩ：
ＦＡＣＳにより、また選択カセットの切除ステップは回避して、蛍光マーカ（ｍＣｈｅｒｒｙ又はｅＧＦＰ）でターゲティングするために、選択カセットを含まない標的ベクターを作製した。ＢａｍＨＩ−Ｆ２Ａ−ＴＫ−Ｔ２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＳｇｒＡＩ（配列番号５８）を、切除したＴＣ対立遺伝子ＩからＰＣＲ増幅し、ＢａｍＨＩ＋ＳｇｒＡＩで消化し、消化されたｍＣｈｅｒｒｙ（３’３０ｂｐ）−ｈＣＤＫ１３’ＨＡ−ｐＧｅｍＥａｓｙ−ｈＣＤＫ１５’ＨＡ−ＢａｍＨＩ（配列番号２０）で連結した。部位指定ＰＣＲ突然変異誘発プロトコルを用いて、標的ベクター内のＣＲＩＳＰＲ  ＰＡＭ部位をプライマーＰＡＭ＿ｆｗｄ（配列番号５９）及びＰＡＭ＿ｒｅｖ（配列番号６０）で突然変異させた。ＮＥＢｕｉｌｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）を用いて、ＰＣＲ増幅ＸｈｏＩ−ＧＦＰ（配列番号６１）及びｐＧｅｍＴ−ｈＣｄｋ１−ＴＫ−ＰＡＭｍｕｔ（配列番号６２）の融合により、ＧＦＰバージョンベクターを作製した。
【０１２６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドの作製
高度のターゲティング効率を達成するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援遺伝子ターゲティングを使用した（Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。オンラインＣＲＩＳＰＲ設計ツール（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を用いて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のガイド配列を分析した。
【０１２７】
配列番号２３においてマウスＣｄｋ１をターゲティングするためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドｐＸ３３５−ｍＣｄｋＴＫ−Ａ（配列番号２１）及びｐＸ３３５−ｍＣｄｋＴＫ−Ｂ（配列番号２２）を設計した。
【０１２８】
配列番号２６においてヒトＣｄｋ１をターゲティングするためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドｐＸ３３０−ｈＣｄｋＴＫ−Ａ（配列番号２４）及びｐＸ４５９−ｈＣｄｋＴＫ−Ａ（配列番号２５）を設計した。
【０１２９】
Ａｄｄｇｅｎｅから購入したバックボーンプラスミドを用い、提案されたプロトコルに従ってＣＲＩＳＰＲを作製した（Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０１３０】
ＡＬＩＮＫ修飾マウスＥＳ細胞の作製
マウスＥＳ細胞培養：
１５％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭ  ＧｌｕｒａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ  ２−ｍＥＡＲＣａｐｒｏｅｔａｎｏ−ｌ（Ｓｉｇｍａ）、各々５０Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１０００Ｕ／ｍｌの白血病阻害因子（ＬＩＦ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を添加したダルベッコ改変イーグルス培地（ＤＭＥＭ）（高グロース、４５００ｍｇ／リットル）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でマウスＥＳ細胞を培養する。マウスＥＳ細胞を０．２５％トリプシン及び０．１％ＥＤＴＡで継代させた。
【０１３１】
ターゲティング：
５×１０５個のマウスＣ５７ＢＬ／６  Ｃ２ＥＳ細胞（Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）をＪｅｔＰｒｉｍｅトランスフェクション（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）により、２ｕｇのＤＮＡ（標的ベクター：０．５μｇ、ＣＲＩＳＰＲベクター：１．５μｇ）でトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、細胞をＧ４１８及び／又はプロマイシン耐性について選択した。独立に耐性クローンを採取し、９６ウェルプレートに移した。凍結及び遺伝子型決定（配列番号２７、２８、２９及び３０）のために９６ウェルプレートを複製した。ＰＣＲ陽性クローンを拡大し、複数のバイアルに凍結し、サザンブロッティングにより遺伝子型決定した。
【０１３２】
選択カセットの切除：
正しくターゲティングしたＥＳクローンをＥｐｉｓｏｍａｌ−ｈｙＰＢａｓｅ（標的ベクターＩ用）（配列番号３４）又はｐＣＡＧＧｓ−ＮＬＳ−Ｃｒｅ−Ｉｒｅｓ−Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（標的ベクターＩＩ用）（配列番号３５）でトランスフェクトした。トランスフェクションから２〜３日後、細胞をトリプシン処理した後、クローン性に平板培養した（１０ｃｍプレート当たり１０００〜２０００細胞）。ｍＣｈｅｒｒｙ陽性クローンを採取し、独立して９６ウェルプレートに移した後、ＰＣＲにより遺伝子型決定し（配列番号３１及び３６）、サザンブロットにより切除イベントを確認した。除去領域の結合をＰＣＲ増幅し、配列決定して、インタクトで、しかもフレームシフトのないシームレスであることを確認した。
【０１３３】
同型接合性ターゲティング：
ネオバージョン標的ベクターで既に正しくターゲティングされ、選択カセットから切除されたＥＳクローンを標的ベクターのプロマイシン耐性バージョンで再度トランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、プロマイシンの選択を追加し、次に、前述した通りにコロニーを採取し、分析した（配列番号３１及び３２）。独立のプロ（ｐｕｒｏ）−耐性クローンをゼラチン上に増殖させ、ＰＣＲのためにＤＮＡを抽出して、野生型対立遺伝子バンド（配列番号３１、３３）が存在しないことを確認した。
【０１３４】
ＡＬＩＮＫ修飾ヒトＥＳ細胞の作製
ヒトＥＳ細胞培養：
ヒトＣＡ１又はＨ１（Ａｄｅｗｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）ＥＳ細胞を、Ｇｅｌｔｒｅｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）フィーダフリー条件でペニシリン−ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製Ｇｉｂｃｏ）を含むｍＴｅＳＲ１培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養した。ＴｒｙｐｌＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又は  Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により細胞を継代させ、最初の２４時間にわたり、ＲＯＣＫ阻害物質（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むｍＴｅＳＲ培地上で平板培養した後、ｍＴｅＳＲ培地に変えた。完全に密集状態の６ウェルプレートからの細胞の半分を１ｍｌの９０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）中で凍結させた。
【０１３５】
ターゲティング：
６×１０６個のＣＡ１ｈＥＳ細胞を２４ｕｇのＤＮＡ（標的ベクター：ｐＸ３３０−ｈＣｄｋＴＫ−Ａ＝１８ｕｇ：６ｕｇ）でＮｅｏｎプロトコル１４によりトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を４つの１０ｃｍプレート上で平板培養した。トランスフェクションから４８時間後、Ｇ４１８及び／又はプロマイシン選択を開始し、独立したコロニーを採取して９６ウェルプレートに移した。さらなる増殖及び遺伝子型決定（配列番号３７、３８、３９及び４０）のために各プレートを２つずつ作製した。ＰＣＲ陽性クローンを拡大し、複数のバイアルに凍結してサザンブロッティングにより遺伝子型決定した。
【０１３６】
選択カセットの除去：
ＡＬＩＮＫ標的ＥＳクローンをｈｙＰＢａｓｅ又はｐＣＡＧＧｓ−ＮＬＳ−Ｃｒｅ−ＩＲＥＳ−プロマイシンでトランスフェクトした後、６ウェルプレートで平板培養した。細胞が６ウェルプレート中で密集に達したら、細胞をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋Ｆｒｅｅ）（２５  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０、１％ウシ胎児血清）中に懸濁させ、ＡＳＴＲＩＯＳ  ＥＱセルソータ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞を選別して９６ウェルプレートに移した。
【０１３７】
同型接合性ターゲティング：
同型接合性ターゲティングは、マウス系と同じ方法、又はｍＣｈｅｒｒｙ及びｅＧＦＰヒト標的ベクターＩＩＩ及びｐＸ３３０−ｈＣｄｋＴＫ−Ａ若しくはｐＸ４５９−ｈＣｄｋＴＫ−Ａをトランスフェクトした後、ｍＣｈｅｒｒｙ及びｅＧＦＰ二重陽性細胞のＦＡＣＳソーティングを実施することによって達成することができる。
【０１３８】
奇形腫アッセイ
Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を氷上の低温ＤＭＥＭ培地で１：３希釈した。５〜１０×１０６個の細胞を１００ｕｌの６６％ＤＭＥＭ＋３３％Ｍａｔｒｉｇｅｌ培地に懸濁させた後、Ｂ６Ｎマウス（マウスＣ２ＥＳ細胞の場合）及びＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（ヒトＥＳ細胞の場合）の片方若しくは両方の脇腹に皮下注射した。注射の２〜４週間後、奇形腫が形成した。奇形腫のサイズをカリパスで測定し、奇形腫体積は、式Ｖ＝（Ｌ×Ｗ×Ｈ）π／６を用いて算出した。様々な処置時間で、腹腔内への５０ｍｇ／ｋｇの毎日の注射により、ＧＣＶ／ＰＢＳ処置を実施した。処置の終了時にマウスを犠牲にして、腫瘍を切除し、組織学分析のために４％パラホルムアルデヒド中で固定化した。
【０１３９】
乳腺腫瘍アッセイ
Ｃｄｋ１＋／＋，＋／ｌｏｘｐ−ａｌｉｎｋマウスＣ２  ＥＳ及びＣＤ−１バックグラウンドのキメラを二倍体凝集によって作製した後、Ｂ６Ｎ  ＷＴマウスと交配させ、生殖細胞系伝達によりＣｄｋ１＋／＋，＋／ｌｏｘｐ−ａｌｉｎｋマウスを作製した。Ｃｄｋ１＋／＋，＋／ｌｏｘｐ−ａｌｉｎｋマウスをＥｌｌａ−Ｃｒｅマウスと交配させてＣｄｋ１＋／＋，＋／ａｌｉｎｋマウスを作製した。次に、Ｃｄｋ１＋／＋，＋／ａｌｉｎｋマウスをＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウス（Ｇｕｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）と交配させて、乳腺腫瘍とＡＬＩＮＫ修飾とを有する二重陽性子ネズミを取得した。フェイルセーフ修飾を有する乳腺腫瘍を単離し、１ｍｍ３の切片に切断し、野生型Ｂ６Ｎ雌の第４乳腺に移植した。ＧＣＶ／ＰＢＳ処置剤を腹腔内に１日おきに５０ｍｇ／ｋｇの用量で様々な処置時間を用いて注射した。乳腺腫瘍サイズをカリパスで測定して、式Ｖ＝長さ×幅×高さ×π／６を用いて計算した。
【０１４０】
神経前駆細胞対ニューロン傷害アッセイ
Ｃｄｋ１＋／＋，＋／ａｌｉｎｋヒトＣＡ１  ＥＳ細胞を神経上皮前駆細胞（ＮＥＰ）に分化させた。続いて、ニューロンへの分化のための条件下でＮＥＰを培養することにより、非分化ニューロン及び分化ＮＥＰの混合培養物を作製し、これらをＤＡＰＩ、Ｋｉ６７及びＳｏｘ２の免疫染色により特性決定した。ＧＣＶ（１０ｕＭ）を混合培養物に１日おきに２０日間添加した。次に、培養物からＧＣＶを４日かけて回収した後、４％ＰＦＡにより細胞を固定化した。残る全ての細胞が細胞周期から脱したかどうかを確認するための増殖マーカＫｉ６７、並びに成熟ニューロンマーカβ−ＴｕｂｌｉｎＩＩＩについて固定化細胞を免疫染色した。
【０１４１】
結果
マウスＣｄｋ１ゲノム遺伝子座を図２ａに示す。マウスＣｄｋ１をターゲティングする２つのベクターを作製したが（図２Ｂ及びＤ）、各々は、最後のエキソンの終止コドンをＦ２Ａ（Ｓｚｙｍｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）配列で置換し、次に、ｍＣｈｅｒｒｙリポータに結合した増強ＨＳＶ−ＴＫ（ＴＫ．００７（Ｐｒｅｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０））遺伝子をＴ２Ａ（Ｓｚｙｍｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）配列で置換することにより、Ｃｄｋ１遺伝子（図２Ａ）の３’ＵＴＲを修飾するように立体配置されている。
【０１４２】
図２Ｂ及びマウス標的ベクターＩを参照すると、ＰＧＫ−ｎｅｏ−ｐＡ選択性マーカ（ターゲティングに必要）が、ＴＫ発現を中断するｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンと共にＴＫ．００７オープンリーディングフレームに挿入された。ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン挿入は、トランスポゾン除去によってＴＫ．００７の正常なＯＲＦが回復され、その結果、機能性チミジンキナーゼの発現が起こるように設計された（図２Ｃ）。
【０１４３】
図２Ｄ及びマウス標的ベクターＩＩを参照すると、ｎｅｏカセットがｌｏｘＰとフランキングしてＦ２ＡとＴＫ．００７との間に挿入された。
【０１４４】
標的ベクターＩ及びＩＩは短い（約８００ｂｐ）相同性アームを有し、これらは、ＣＲＩＳＰＲ支援相同組換えターゲティングに十分であり、ターゲティングイベントを同定するためのＰＣＲ遺伝子型決定を容易且つ確実にした。ＣＲＩＳＰＲは、４０％ＰＣＲ陽性の薬物耐性クローンで高いターゲティング頻度を促進した（図３Ｄ）。
【０１４５】
ｐｉｇｇｙＢａｃ挿入及びｌｏｘＰフランキングｎｅｏカセットの両方をｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ及びＣｒｅレコンビナーゼの一過性発現によってそれぞれ除去したところ、図２Ｃ及び２Ｅにそれぞれ示す対立遺伝子を含む細胞株が得られた。図２Ｅを参照すると、残るｌｏｘＰ部位はＴＫとフレーム内にあり、１３アミノ酸がＴＫのＮ末端に付加された。ＴＫ機能性試験（ＧＣＶ傷害）により、このＮ末端挿入はＴＫ機能を妨害しないことが証明された。
【０１４６】
図４を参照すると、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９技術により支援されて、２つの異なるヒトＥＳ細胞株、ＣＡ１及びＨ１に同型接合性ＡＬＩＮＫを効率的に作製することもできる（Ａｄｅｗｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０１４７】
図５Ａ及び５Ｃを参照すると、データは、ｉ）Ｃｄｋ１の３’ＵＴＲへのＴＫ．００７挿入がＣｄｋ１発現を妨害しないこと；ｉｉ）ＡＬＩＮＫ修飾同型接合性マウスＣ２  ＥＳ細胞がＥＳ細胞条件下で適正に自己再生し、ｉｎ  ｖｉｖｏで分化して複雑な奇形腫を形成すること；ｉｉｉ）ＡＬＩＮＫ修飾同型接合性ヒトＣＡ１  ＥＳ細胞がＥＳ細胞条件下で適正に自己再生し、ｉｎ  ｖｉｖｏで分化して複雑な奇形腫を形成することを示す。
【０１４８】
図６を参照すると、データは、ｉ）ＴＫ．００７が適正に発現され；未分化ＥＳ細胞のＧＣＶ処置により、異型接合性及び同型接合性修飾細胞の両方がアブレートされる（図６Ａ）こと；及びｉｉ）Ｔ２Ａ連結ｍＣｈｅｒｒｙがＥＳ細胞において構成的に発現される（図６Ｂ）ことを示す。
【０１４９】
図７Ａを参照すると、データは、ＡＬＩＮＫ修飾細胞移植片を含む宿主において、ＡＬＩＮＫ修飾ＥＳ細胞を含む皮下奇形腫のＧＣＶ処置が、分裂細胞をアブレートすることにより奇形腫増殖を停止することを示す。ＧＣＶ処置は奇形腫の静止細胞に影響しなかった。レシピエントの短い（３週間）ＧＣＶ処置は、奇形腫を休眠状態にするのに十分であった。図７Ｂを参照すると、ＡＬＩＮＫ修飾ヒト細胞移植片を含むＮＯＤｓｃｉｄγマウス宿主では、２ラウンドのＧＣＶ処置（第１ラウンド１５日＋第２ラウンド４０日）により、奇形腫は休眠状態になった。
【０１５０】
図７Ｃを参照すると、ＡＬＩＮＫ修飾ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ形質転換乳房表皮腫瘍形成細胞移植片を含むＢ６Ｎ宿主において、ＧＣＶ処置は乳腺腫瘍を休眠状態にすることができた。
【０１５１】
図７Ｄ〜Ｆを参照すると、非分裂ニューロンと分裂ＮＥＰとの混合培養物（全ての細胞は、Ｃｄｋ１＋／＋，＋／ａｌｉｎｋヒトＣＡ１  ＥＳ細胞から得られた）において、ＧＣＶは分裂ＮＥＰを傷害したが、非分裂ニューロンは傷害しなかった。
【０１５２】
一実施形態では、不活性化突然変異がＣＤＬ−ＨＳＶ−ＴＫ転写リンクのＨＳＶ−ＴＫ成分で起こるはずであった場合、１つ又は複数の分裂細胞は、ＧＣＶ媒介アブレーションから逃避し得ることが考慮される。細胞逃避の可能性に取り組むために、本発明者らは、１細胞分裂当たりの一般的突然変異速度（すなわち、１０−６）を考慮し、１つの突然変異型細胞を作出するのに必要な細胞分裂の予測される回数が異型接合性Ｃｄｋ１−ＨＳＶ−ＴＫ転写リンクを含む細胞では１６であり、同型接合性Ｃｄｋ１−ＨＳＶ−ＴＫ転写リンクを含む細胞では３０回の細胞分裂であると決定した。これは、単一の異型接合性ＡＬＩＮＫ修飾細胞が２１６（すなわち、６５，０００細胞）に拡大され、また単一の同型接合性ＡＬＩＮＫ修飾細胞が２３０（すなわち、１０億細胞）に拡大されると、異型接合性及び同型接合性細胞集団毎に、消失ＨＳＶ−ＴＫ活性を含む平均１突然変異型細胞が生成されることになる（図８）。従って、本発明者らは、同型接合性ＡＬＩＮＫ修飾細胞が細胞療法での使用のために非常に安全であると判定した。細胞療法のレベルを計算する別の方法を上に示した。
【０１５３】
実施例２：Ｃｄｋ１遺伝子座におけるＥＡＲＣ修飾マウスＥＳ細胞の作製
実施例２では、Ｃｄｋ１をターゲティングするＥＡＲＣ（ｄｏｘ−架橋）ベクターの構築及びマウスＥＳ細胞の細胞分裂を制御するためのその使用について記載する。この実施例では、Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１はＣＤＬであり、これは誘導性遺伝子発現系によってターゲティングされ、ここで、ｄｏｘ−架橋が挿入されて、ドキシサイクリンがＣＤＬの発現を誘導する。
【０１５４】
前述したように、Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１は、全て有糸分裂活性（すなわち、分裂）細胞において発現される。Ｃｄｋ１遺伝子座にＥＡＲＣ（ｄｏｘ−架橋）を含むように修飾された細胞では、細胞分裂は、Ｃｄｋ１の発現を可能にする誘導物質（ドキシサイクリン）の存在下でのみ可能である。従って、ＥＡＲＣ修飾された有糸分裂活性細胞の細胞分裂は、ドキシサイクリンの非存在下で排除することができる。
【０１５５】
実施例２では、Ｃｄｋ１遺伝子の５’ＵＴＲへのｄｏｘ−架橋挿入は、相同組換えノックイン技術により達成された。
【０１５６】
方法
ｄｏｘ−架橋を含むＥＡＲＣターゲティングベクターの構築
ｒＴＴＡコード配列（配列番号４１）を含有する断片、それに続く３×ＳＶ４０ｐＡシグナルを、ｒＴＴＡの５’に付加されたｌｏｘ７１部位を含有するプライマー（ｒｔｔａ３ｘｐａＦｒｗ１（配列番号６３）、ｒｔｔａ３ｘｐａＲｅｖ１（配列番号６４））を用いて、ＰＢ−ＣＡＧＧ−ｒｔｔａプラスミドからＰＣＲにより増幅した。この断片をｐＧｅｍＴプラスミドにサブクローニングしてｐＧｅｍ−ｂｒｉｄｇｅ−ｓｔｅｐ１を作製した。続いて、ＴｅｔＯプロモータ（配列番号４２）（ｐＰＢ−ＴｅｔＯ−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ由来）を含有するＳａｃＩＩ断片をｐＧｅｍ−ｂｒｉｄｇｅ−ｓｔｅｐ１のＳａｃＩＩ部位にクローニングしてｐＧｅｍ−ｂｒｉｄｇｅ−ｓｔｅｐ２を作製した。ＢａｍＨＩ  ＩＲＥＳ−プロマイシン断片（配列番号４３）をｐＧｅｍ−ｂｒｉｄｇｅ−ｓｔｅｐ２のＢａｍＨＩ部位に挿入することにより、架橋の最終エレメントをクローニングしてｐＧｅｍ−ｂｒｉｄｇｅ−ｓｔｅｐ３を作製した。Ｃ５７／Ｂ６ゲノムＤＮＡから９００ｂｐ断片（配列番号４４）をＰＣＲ増幅し（プライマーｃｄｋ５ＦｒｗＰｓｔ（配列番号４５）及びｃｄｋ５ＲｅｖＳｐｅ（配列番号４６）、これをｐＧｅｍ−ｂｒｉｄｇｅ−ｓｔｅｐ３のＳｂｆＩ及びＳｐｅＩにクローニングすることにより、５’相同性アームをクローニングした。同様に、プライマーｄｋｅ３＿５’ＦＳｐｅ（配列番号４８）、ｃｄｋｅｘ３＿３ｌｏｘ（配列番号４９）を用いたＰＣＲにより、３’相同性アーム（９００ｂｐ）（配列番号４７）を増幅し、ＳｐｈＩ及びＮｃｏＩにクローニングして最終ターゲティングベクターを作製し、これをｐＢｒｉｄｇｅ（配列番号１４８）と呼ぶ。
【０１５７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドの構築
オフターゲット突然変異の可能性を最小限にするために、二重ニッカーゼ戦略を選択した。ガイドＲＮＡ配列（配列番号５０、５１、５２及び５３）をｐＸ３３５（Ａｄｄｇｅｎｅから取得し、提案されたプロトコルに従う）（Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）にクローニングした。
【０１５８】
ＥＡＲＣ修飾マウスＥＳ細胞の作製
マウスＥＳ細胞培養物：
事前に特性決定したＣ５７ＢＬ／６ＮマウスＥＳ細胞株（Ｃ２）について全ての遺伝子操作を実施した（Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。１５％ＥＳ細胞−グレードＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭ  ２−ｍＥＡＲＣａｐｔｏｐｈｅｎｏｌ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、及び２，０００単位／ｍｌ白血病阻止因子（ＬＩＦ）を補充した、高グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を基材とする培地中でマウスＥＳ細胞を増殖させた。マイトマイシンＣ処理マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上で５％ＣＯ２中３７℃において細胞を維持した。
【０１５９】
ターゲティング：
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分（ｐＸ３３５−ｃｄｋ−ｅｘ３Ａ（配列番号１５１）及びｐＸ３３５−ｃｄｋ−ｅｘ３Ｂ（配列番号１５２））を含有するプラスミドと、ターゲティングプラスミド（ｐＢｒｉｄｇｅ；配列番号１４８）とを、８：２のＦｕＧＥＮＥ：ＤＮＡ比（２μｇの総ＤＮＡ：各ｐＸ３３０については２５０ｎｇ、またｐＢｒｉｄｇｅについては１５００ｎｇ）を使用し、製造者の指示に従い、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてマウスＥＳ細胞に同時トランスフェクトした。典型的トランスフェクションを３×１０５細胞に実施し、３５ｍｍプレート上で平板培養した。トランスフェクション時、ドキシサイクリンを１μｇ／ｍｌの最終濃度まで培地に添加した。トランスフェクションから２日後、細胞を１００ｍｍプレート上に平板培養し、１μｇ／ｍｌのプロマイシンを用いて選択を適用した。選択の開始から８〜１０日後、プロマイシン耐性コロニーを採取し、ＰＣＲスクリーニングまで９６ウェルプレート内で維持した。
【０１６０】
遺伝子型決定：
（Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）に従って９６ウェルプレート内のＥＳ細胞から直接ＤＮＡを抽出した。Ｃｄｋ１遺伝子の５’におけるｐＢｒｉｄｇｅの相同組換えによる正しい挿入について陽性のクローンを、５’及び３’相同性アームにわたるプライマー（５’アームについてはプライマーｒｔｔａＲｅｖ（配列番号５４）、ｅｘ３＿５ｓｃｒ（配列番号５５）、３’アームについてはプライマーＣＭＶｆｏｒｗ（配列番号５６）、ｅｘ３＿３ｓｃｒ（配列番号５７））を用いたＰＣＲによりスクリーニングした。
【０１６１】
標的細胞増殖：
Ｆ３−ブリッジ標的細胞をトリプシン処理した後、１ウェル当たり５×１０４細胞の密度においてゼラチン化２４ウェルプレート上で平板培養した。平板培養後１日目から、それぞれの条件について３ウェルをトリプシン処理した後、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ自動化細胞計数器（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて生存細胞を計数することにより、細胞計数を実施した。平板培養から２日後にドキシサイクリンを除去するか又は０．０５ｎｇ／ｍｌまで低減し、様々な条件で１８日後まで毎日生存細胞を計数した。
【０１６２】
Ｃｒｅ−切り出し：
Ｆ３−ブリッジ細胞（Ｄｏｘ＋培地中で増殖）をトリプシン処理した後、２μｇのプラスミド発現Ｃｒｅ（ｐＣＡＧＧ−ＮＬＳ−Ｃｒｅ）でトランスフェクトした。トランスフェクションは、ＪｅｔＰｒｉｍｅ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）を用いて、製造者のプロトコルに従って実施した。トランスフェクション後、ドキシサイクリンを除去し、コロニーをトリプシン処理した後、プールとして拡大した。
【０１６３】
定量ＰＣＲ：
製造者の指示に従い、ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ全ＲＮＡミニプレップキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて、１μｇ／ｍｌ及び０μｇ／ｍｌのＤｏｘで２日間処理した細胞から全ＲＮＡを抽出した。製造者の指示に従い、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、１μｇのＲＮＡの逆転写によりｃＤＮＡを作製した。ＳｅｎｓｉＦａｓｔ−ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲミックス（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を用いて、ＢｉｏＲａｄＣＦＸサーモサイクラ内でリアルタイムｑＰＣＲを設定した。使用したプライマーは、以下のものであった：ｑｐｃｒｃｄｋ１＿Ｆ（配列番号６５）、ｑｐｃｒｃｄｋ１＿Ｒ（配列番号６６）及びａｃｔＢｆ（配列番号６７）、ａｃｔＢｒ（配列番号６８）。結果はΔΔＣＴ法で分析し、βアクチンについて正規化した。
【０１６４】
結果
図９を参照すると、図９Ａに示すｄｏｘ−架橋標的ベクターを用いて３つの標的Ｃ２ＥＳマウスＥＳ細胞株を作製した（図９Ｂ）。これらの細胞株の１つは、Ｃｄｋ１の両対立遺伝子の５’ＵＴＲへの相同組換えにより挿入されたｄｏｘ−架橋を含む同型接合性標的株（図９Ｂの３Ｆ）であることが判明した。
【０１６５】
予想通り、このＥＳ細胞株は、ドキシサイクリンの存在下でのみ増殖する。ドキシサイクリンの存在下で、Ｃｄｋ１プロモータ活性生成ｒｔＴＡはＴＲＥに結合し、Ｃｄｋ１の転写を開始する。３’修飾と同様に、ＣＤＬ発現がＥＡＲＣによってのみ起こり得ることを確実にするために、Ｃｄｋ１の両対立遺伝子の５’ＵＴＲにｄｏｘ−架橋を挿入してもよい。別の方法は、ＣＤＬの残る非ＥＡＲＣ修飾対立遺伝子の全てにヌル突然変異を生成することである。
【０１６６】
ドキシサイクリンの使用を中止すると、５日以内に有糸分裂活性ＥＳ細胞の完全な排除が起こった（図１０）。ｄｏｃ−架橋（dox-架橋）細胞株の誘導及び維持のために使用した濃度と比較してドキシサイクリン濃度を２０倍低下させる（５０ｎｇ／ｍｌ）と、一部の細胞／コロニーを５日間生存させることができた（図１１）。
【０１６７】
図１２を参照すると、ｄｏｘ−架橋は、対立遺伝子の本来の内在性発現調節を回復し、ドキシサイクリンの欠如から細胞致死性をレスキューする、２つのｌｏｘ７１部位間のセグメントのＣｒｅリコンビナーゼ媒介による切り出しを用いて除去することができた。これらのデータは、予測した通り、ｄｏｘ−架橋が細胞内で機能していたことを示す。
【０１６８】
図１３を参照すると、本発明者らは、ドキシサイクリンの存在及び非存在下で細胞増殖を測定することにより、ドキシサイクリンの使用中止がｄｏｘ−架橋ＥＳ細胞の排除にどの程度影響したかを決定した。ドキシサイクリンの存在下で、ＥＳ細胞は指数関数的に増殖したが、これはその正常な増殖を示している。対照的に、ドキシサイクリンの使用を中止すると（第１日）、細胞は２日間にわたってのみ増殖し、その後、細胞死が始まり、これは第９日に生存細胞が存在しなくなるまで続いた。最初の３日の細胞増殖後に供給された２０倍低いドキシサイクリン濃度（５０ｎｇ／ｍｌ）は、少なくとも５日にわたってプレート上で一定数の細胞を維持するのに十分であった（図１３、水色の線）。通常濃度のドキシサイクリンを第１０日のプレートに再度添加すると、細胞は、正常なＥＳ細胞と同様に再び増殖し始めた。
【０１６９】
ドキシサイクリンが不足する培地中で増殖させた場合、分裂細胞は、Ｃｄｋ１のＥＡＲＣ（ｄｏｘ−架橋）修飾を逃避することができると考えられた。細胞逃避の可能性に対処するために、ＥＡＲＣ（ｄｏｘ−架橋）修飾マウスＥＳ細胞を、ドキシサイクリンを含有する培地中の１０プレート上で１００，０００，０００細胞／プレートまで増殖させた。次に、３００ＧＦＰ陽性野生型ＥＳ細胞（センチネル）を修飾ＥＳ細胞の１０プレートの各々に混合した後、培地でのドキシサイクリンの使用を中止する。ＧＦＰ陽性コロニーのみが回収された（図１４）が、これは、培地中の１００，０００，０００細胞中に逃避したｄｏｘ−架橋ＥＳ細胞がなかったことを示している。従って、本発明者らは、ＥＡＲＣ（ｄｏｘ−架橋）修飾ＥＳ細胞が、特定の細胞療法用途のためにＡＬＩＮＫ修飾にさらなるレベルの安定性を追加すると判定した。なぜなら、ｄｏｘ−架橋の喪失が突然変異によって起こるとは考えにくく、細胞分裂は、ＣＤＬ発現の阻止による誘導物質（ドキシサイクリン）の非存在下では不可能であるからである。
【０１７０】
図１５を参照すると、ｄｏｘ−架橋ＥＳ細胞の増殖に対する高ドキシサイクリン濃度（１０μｇ／ｍｌ）の作用を調べた。高濃度ドキシサイクリンの存在下で、ｄｏｘ−架橋ＥＳ細胞の増殖速度は、低濃度ドキシサイクリンで増殖させた細胞と同様の速度まで低下した。これらのデータは、野生型細胞様増殖のための最適なＣｄｋ１発現を可能にし得るドキシサイクリン濃度の範囲があることを示している。
【０１７１】
実施例３：ＣＤＫ１遺伝子座におけるＥＡＲＣ−ＡＬＩＮＫ修飾細胞（マウス及びヒト）の作製
実施例３では、ＣＤＫ１をターゲティングするＥＡＲＣ（ｄｏｘ−架橋）ベクターの構築、並びにマウス及びヒトＡＬＩＮＫ修飾ＥＳ細胞の両方の細胞分裂を制御するためのそのベクターの使用について説明する。この実施例では、Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１はＣＤＬであり、ｄｏｘ−架橋はＥＡＲＣであり、ＨＳＶ−ＴＫはＡＬＩＮＫである。ＣＤＬ  Ｃｄｋ１は、同型接合形態のＥＡＲＣ及びＡＬＩＮＫ系の両方で修飾されており、ここで、ドキシサイクリンは、ＣＤＬの発現を誘導するために必要であり、ドキシサイクリンとＧＣＶとは一緒に、修飾増幅細胞を傷害する方法を提供する。
【０１７２】
実施例３では、ＣＤＫ１遺伝子の５’ＵＴＲへのｄｏｘ−架橋挿入は、相同組換えノックイン技術により達成された。
【０１７３】
方法
マウスＥＡＲＣターゲティングベクター、マウスターゲティングのためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドの構築は、実施例２と同じである。ターゲティング及び遺伝子型決定方法も、Ｃ２ＷＴ細胞の代わりに、実施例１（図３Ａ〜３Ｇ）で作製したＣｄｋ１（ＴＫ／ＴＫ）細胞をトランスフェクションに使用した以外には実施例２に記載したものと同じである。
【０１７４】
ヒトＣＤＫ１のためのｄｏｘ−架橋を含むＥＡＲＣターゲティングベクターの構築
ＣＡ１ゲノムＤＮＡ（プライマーｈｃｄｋ５’Ｆ（配列番号７０）及びｈｃｄｋ５’Ｒ（配列番号７１）から９８１ｂｐ断片をＰＣＲ増幅した後、これをｐＧｅｍ−ｂｒｉｄｇｅ−ｓｔｅｐ３のＳｂｆＩにクローニングすることにより、５’相同性アーム（配列番号６９）をクローニングした。同様に、プライマーｈｃｄｋ３’Ｆ（配列番号７３）及びｈｃｄｋ３’Ｒ（配列番号７４）を用いたＰＣＲにより３’相同性アーム（９４３ｂｐ；配列番号７２）を増幅し、これをＳｐｈＩ及びＮｃｏＩにクローニングして最終ターゲティングベクターを作製し、これをｐＢｒｉｄｇｅ−ｈＣｄｋ１（配列番号７５）と呼ぶ。
【０１７５】
ヒトターゲティングのためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドの構築
ガイドＲＮＡ（ｈＣｄｋ１Ａ＿ｕｐ（配列番号７６）、ｈＣｄｋ１Ａ＿ｌｏｗ（配列番号７７）、ｈＣｄｋ１Ｂ＿ｕｐ（配列番号７８）、ｈＣｄｋ１Ｂ＿ｌｏｗ（配列番号７９）をｐＸ３３５（配列番号１４９）及びｐＸ３３０（配列番号１５０）にクローニングすることにより、ｐＸ３３５−１Ａ（配列番号８０）、ｐＸ３３５−１Ｂ（配列番号８１）及びｐＸ３３０−１Ｂ（配列番号８２）を作製した。
【０１７６】
ＥＡＲＣ修飾ヒトＥＳ細胞の作製
ターゲティング：
２×１０６ＣＡ１（ＴＫ／ＴＫ）（すなわち、図４Ａ〜４Ｆで説明した細胞生成物）ｈＥＳ細胞を８ｕｇのＤＮＡ（標的ベクター：ｐＸ３３０−ｈＣｄＴＫ−Ａ＝５ｕｇ：２ｕｇ）でＮｅｏｎプロトコル１４によりトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を４つの１０ｃｍプレート上で平板培養した。トランスフェクション後、ドキシサイクリンを最終濃度１μｇ／ｍｌまで培地に添加した。トランスフェクションから２日後、０．７５μｇ／ｍｌのプロマイシンを用いて選択を適用した。プロマイシン耐性コロニーを採取して９６ウェルプレートに移し、さらなる増殖並びにプライマー（ｈＣｄｋ１Ｂｒ−５ＨＡｇｅｎ＿Ｆ１（配列番号８３）、ｒｔＴＡ＿ｒｅｖ＿１（配列番号８４）、ｍＣＭＶ＿Ｆ（配列番号８５）、ｈＣｄｋ１Ｂｒ−３ＨＡｇｅｎ＿Ｒ１（配列番号８６））を用いた遺伝子型決定のためにこれを２回繰り返した。
【０１７７】
結果
図１６Ａを参照すると、マウスｄｏｘ−架橋標的ベクター、ｐＢｒｉｄｇｅを用いて実施例１で作製したマウス細胞産物、マウスＣｄｋ１ｅａｒｃ／ｅａｒｃ，ａｌｉｎｋ／ａｌｉｎｋ細胞を産生するＣｄｋ１（ＴＫ／ＴＫ）をターゲティングした。１回のトランスフェクションにより、９つのＣｄｋ１ｅａｒｃ／ｅａｒｃ，ａｌｉｎｋ／ａｌｉｎｋクローンが産生された（図１６Ｂ）。
【０１７８】
図５Ｂを参照すると、データは、ＥＡＲＣ及びＡＬＩＮＫ修飾同型接合性マウスＣ２  ＥＳ  Ｃｄｋ１ｅａｒｃ／ｅａｒｃ，ａｌｉｎｋ／ａｌｉｎｋ細胞がＥＳ細胞条件下で適正に自己再生し、ｉｎ  ｖｉｖｏで分化して複雑な奇形腫を形成したことを示している。
【０１７９】
図１７Ａを参照すると、ヒトｄｏｘ−架橋標的ベクター、ｐＢｒｉｄｇｅ−ｈＣｄｋ１を用いて実施例１で作製したヒト細胞産物、ヒトＣｄｋ１ｅａｒｃ／ｅａｒｃ，ａｌｉｎｋ／ａｌｉｎｋ細胞を産生するＣｄｋ１（ＴＫ／ＴＫ）をターゲティングした。１回のトランスフェクションにより、少なくともＣｄｋ１ｅａｒｃ／ｅａｒｃ，ａｌｉｎｋ／ａｌｉｎｋＣＡ１クローンが産生された（図１７Ｂ）。
【０１８０】
実施例４：Ｔｏｐ２ａ遺伝子座でのＥＡＲＣ修飾マウスＥＳ細胞の作製
実施例４では、Ｔｏｐ２ａをターゲティングするＥＡＲＣ（ｄｏｘ−架橋）ベクターの構築、並びにマウスＥＳ細胞の細胞分裂を制御するためのそのベクターの使用について説明する。この実施例では、Ｔｏｐ２ａ／Ｔｏｐ２ＡはＣＤＬであり、これは、ｄｏｘ−架橋が挿入されて、ドキシサイクリンがＣＤＬの発現を誘導する誘導性遺伝子発現系によってターゲティングされる。
【０１８１】
前述したように、Ｔｏｐ２ａ／ＴＯＰ２Ａは、全ての有糸分裂活性（すなわち、分裂）細胞で発現される。Ｔｏｐ２ａ遺伝子座にＥＡＲＣ（ｄｏｘ−架橋）挿入を含むように修飾された細胞において、細胞分裂は、Ｔｏｐ２ａの発現を可能にする誘導物質（ドキシサイクリン）の存在下でのみ可能である。従って、ＥＡＲＣ修飾有糸分裂活性細胞の細胞分裂は、ドキシサイクリンの非存在下で排除することができる。
【０１８２】
実施例４において、Ｔｏｐ２ａ遺伝子の５’ＵＴＲへのｄｏｘ−架橋挿入は、相同組換えノックイン技術により達成された。
【０１８３】
方法
Ｔｏｐ２ａのためのｄｏｘ−架橋を含むＥＡＲＣターゲティングベクターの構築
Ｃ５７／Ｂ６ゲノムＤＮＡ（プライマーＴｏｐ５Ｆ（配列番号８８）及びＴｏｐ５Ｒ（配列番号８９）から８７０ｂｐ断片をＰＣＲ増幅した後、これをｐＧｅｍ−ｂｒｉｄｇｅ−ｓｔｅｐ３のＳｂｆＩ及びＳｐｅＩにクローニングすることにより、５’相同性アーム（配列番号８７）をクローニングした。同様に、プライマーＴｏｐ３Ｆ（配列番号９１）、Ｔｏｐ３Ｒ（配列番号９２）を用いたＰＣＲにより３’相同性アーム（８１８ｂｐ；配列番号９０）を増幅し、これをＳｐｈＩ及びＮｃｏＩにクローニングして最終ターゲティングベクターを作製し、これをｐＢｒｉｄｇｅ−Ｔｏｐ２ａ（配列番号９３）と称する。
【０１８４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドの構築
オフターゲット突然変異の可能性を最小限にするために、二重ニッカーゼ戦略を選択した。オリゴ：ＴＯＰ２Ａ１ＢＦ（配列番号９４）、ＴＯＰ２Ａ１ＢＲ（配列番号９５）、ＴＯＰ２Ａ１ＡＦ（配列番号９６）、ＴＯＰ２Ａ１ＡＲ（配列番号９７）を用いて、提案されたプロトコル（Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）に従い、ガイドＲＮＡ配列をｐＸ３３５（Ａｄｄｇｅｎｅ）にクローニングしてＣＲＩＳＰＲベクターｐＸ３３５−Ｔｏｐ２ａＡ（配列番号９８）及びｐｘ３３５−Ｔｏｐ２ａＢ（配列番号９９）を作製した。
【０１８５】
ＥＡＲＣ修飾マウスＥＳ細胞の作製
マウスＥＳ細胞培養物：
事前に特性決定したＣ５７ＢＬ／Ｂ６マウスＥＳ細胞株（Ｃ２）について全ての遺伝子操作を実施した（Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。１５％ＥＳ細胞−グレードＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭ  ２−ｍＥＡＲＣａｐｔｏｐｈｅｎｏｌ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、及び２，０００単位／ｍｌ白血病阻止因子（ＬＩＦ）を補充した、高グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を基材とする培地中でマウスＥＳ細胞を増殖させた。マイトマイシンＣ処理マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上で５％ＣＯ２中３７℃において細胞を維持した。
【０１８６】
ターゲティング：
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分（ｐＸ３３５−Ｔｏｐ２ａＡ（配列番号９８）及びｐＸ３３５−Ｔｏｐ２ａＢ（配列番号９９））を含有するプラスミドと、ターゲティングプラスミド（ｐＢｒｉｄｇｅ−Ｔｏｐ２ａ（配列番号９３））とを、８：２のＦｕＧＥＮＥ：ＤＮＡ比（２μｇの総ＤＮＡ：各ｐＸ３３５については２５０ｎｇ及びｐＢｒｉｄｇｅ−Ｔｏｐ２ａについては１５００ｎｇ）で、製造者の指示に従い、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてマウスＥＳ細胞に同時トランスフェクトした。典型的トランスフェクションを３×１０５細胞で実施し、３５ｍｍプレート上で平板培養した。トランスフェクション時、ドキシサイクリンを１μｇ／ｍｌの最終濃度まで培地に添加した。トランスフェクションから２日後、細胞を１００ｍｍプレート上に平板培養し、１μｇ／ｍｌのプロマイシンを用いて選択を適用した。選択の開始から８〜１０日後、プロマイシン耐性コロニーを採取し、ＰＣＲスクリーニングまで９６ウェルプレート内で維持した。
【０１８７】
遺伝子型決定：
（Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）に従って９６ウェルプレート内のＥＳ細胞から直接ＤＮＡを抽出した。Ｔｏｐ２ａ遺伝子の５’におけるｐＢｒｉｄｇｅ−Ｔｏｐ２ａの相同組換えによる正しい挿入について陽性のクローンを、５’及び３’相同性アームにわたるプライマー（５’アームについてはプライマーｒｔｔａＲｅｖ（配列番号５４）、ｔｏｐ２ａ＿５ｓｃｒ（配列番号５５）、３’アームについてはプライマーＣＭＶｆｏｒｗ（配列番号５６）、ｔｏｐ２ａ＿３ｓｃｒ（配列番号５７））を用いたＰＣＲによりスクリーニングした。
【０１８８】
標的細胞増殖：
Ｔｏｐ２ａ同型接合性標的細胞をトリプシン処理した後、１ウェル当たり５×１０４細胞の密度においてゼラチン化２４ウェルプレート上で平板培養した。平板培養後の１日目から、様々なＤｏｘ濃度（１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ及び０μｇ／ｍｌ）に細胞を曝露し、３〜４日にわたって２時間毎に写真を撮り、密集度を測定することにより、ＩｎｃｕｃｙｔｅＺｏｏｍ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でプレートを分析した。
【０１８９】
結果
図１８を参照すると、図１８Ａに示すｄｏｘ−架橋ベクターを用いていくつかの標的Ｃ２マウスＥＳ細胞株を作製した（図１８Ｂ）。これらの細胞株のうちの９つは、同型接合性ターゲティングされており（図１８Ｂ）、Ｔｏｐ２ａの両対立遺伝子の５’ＵＴＲへの相同組換えによって挿入されたｄｏｘ−架橋を含むことが判明した。
【０１９０】
予想通り、このＥＳ細胞株は、ドキシサイクリンの存在下でのみ増殖する。ドキシサイクリンの存在下で、Ｔｏｐ２ａプロモータにより生成されたｒｔＴＡはＴＲＥに結合し、Ｔｏｐ２ａコード配列の転写を開始する。ＣＤＬ発現がＥＡＲＣによってのみ起こり得ることを確実にするために、Ｔｏｐ２ａの両対立遺伝子の５’ＵＴＲにｄｏｘ−架橋を挿入してもよい。別の方法は、ＣＤＬの残る非ＥＡＲＣ修飾対立遺伝子の全てにヌル突然変異を生成することである。
【０１９１】
ドキシサイクリンの使用を中止すると、４日以内に有糸分裂活性ＥＳ細胞が完全に排除された（図１９Ａ）。
【０１９２】
図１９Ｂを参照すると、本発明者らは、４日にわたって細胞増殖を測定することにより、様々な濃度のドキシサイクリンがｄｏｘ−架橋ＥＳ細胞の増殖にどの程度影響するかを決定した。ドキシサイクリンの存在下で、ＥＳ細胞は指数関数的に増殖し、その正常な増殖を示した。対照的に、ドキシサイクリンの除去から２日後、ＥＡＲＣ修飾細胞の細胞増殖は完全に停止した。
【０１９３】
実施例５：Ｃｅｎｐａ遺伝子座でのＥＡＲＣ修飾マウスＥＳ細胞の作製
実施例５では、ＣｅｎｐａをターゲティングするＥＡＲＣ（ｄｏｘ−架橋）ベクターの構築、並びにマウスＥＳ細胞の細胞分裂を制御するためのそのベクターの使用について説明する。この実施例では、Ｃｅｎｐａ／ＣＥＮＰＡはＣＤＬであり、これは、ｄｏｘ−架橋が挿入されて、ドキシサイクリンがＣＤＬの発現を誘導する誘導性遺伝子発現系によってターゲティングされる。
【０１９４】
前述したように、Ｃｅｎｐａ／ＣＥＮＰＡは、全ての有糸分裂活性（すなわち、分裂）細胞で発現される。Ｃｅｎｐａ遺伝子座にＥＡＲＣ（ｄｏｘ−架橋）挿入を含むように修飾された細胞において、細胞分裂は、Ｃｅｎｐａの発現を可能にする誘導物質（ドキシサイクリン）の存在下でのみ可能である。従って、ＥＡＲＣ修飾有糸分裂活性細胞の細胞分裂は、ドキシサイクリンの非存在下で排除することができる。
【０１９５】
実施例５において、Ｃｅｎｐａ遺伝子の５’ＵＴＲへのｄｏｘ−架橋挿入は、相同組換えノックイン技術により達成された。
【０１９６】
方法
ｄｏｘ−架橋を含むＥＡＲＣターゲティングベクターの構築
Ｃ５７／Ｂ６ゲノムＤＮＡ（プライマーＣｅｎｐａ５Ｆ（配列番号１０１）及びＣｅｎｐａ５Ｒ（配列番号１０２）から８７４ｂｐ断片をＰＣＲ増幅した後、これをｐＧｅｍ−ｂｒｉｄｇｅ−ｓｔｅｐ３のＳｂｆＩ及びＳｐｅＩにクローニングすることにより、５’相同性アーム（配列番号１００）をクローニングした。同様に、プライマーＣｅｎｐａ３Ｆ（配列番号１０４）、Ｃｅｎｐａ３Ｒ（配列番号１０５）を用いたＰＣＲにより３’相同性アーム（８２５ｂｐ；配列番号１０３）を増幅し、これをＳｐｈＩ及びＮｃｏＩにクローニングして最終ターゲティングベクターを作製し、これをｐＢｒｉｄｇｅ−Ｃｅｎｐａ（配列番号１０６）と呼んだ。
【０１９７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドの構築
オフターゲット突然変異の可能性を最小限にするために、二重ニッカーゼ戦略を選択した。オリゴＣｅｎｐａＡＦ（配列番号１０７）、ＣｅｎｐａＡＲ（配列番号１０８）、ＣｅｎｐａＢＦ（配列番号１０９）、ＣｅｎｐａＢＲ（配列番号１１０）を用いて、提案されたプロトコル（Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）に従い、ガイドＲＮＡ配列をｐＸ３３５（Ａｄｄｇｅｎｅ）にクローニングしてＣＲＩＳＰＲベクターｐＸ３３５−ＣｅｎｐａＡ（配列番号１１１）及びｐＸ３３５−ＣｅｎｐａＢ（配列番号１１２）を作製した。
【０１９８】
ＥＡＲＣ修飾マウスＥＳ細胞の作製
マウスＥＳ細胞培養物：
実施例４に記載の通り。
ターゲティング：
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分（ｐＸ３３５−ＣｅｎｐａＡ；配列番号１１１、及びｐＸ３３５−ＣｅｎｐａＢ；配列番号１１２）を含有するプラスミドと、ターゲティングプラスミド（ｐＢｒｉｄｇｅ−Ｃｅｎｐａ；配列番号１０６）とを、実施例４に記載のように、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてマウスＥＳ細胞に同時トランスフェクトした。
【０１９９】
遺伝子型決定：
実施例４に記載のようにＤＮＡを抽出した。Ｃｅｎｐａ遺伝子の５’におけるｐＢｒｉｄｇｅ−Ｃｅｎｐａの相同組換えによる正しい挿入について陽性のクローンを、５’及び３’相同性アームにわたるプライマー（５’アームについてはプライマーｒｔｔａＲｅｖ（配列番号５４）、Ｃｅｎｐａ＿５ｓｃｒ（配列番号１１３）、３’アームについてはプライマーＣＭＶｆｏｒｗ（配列番号１１４）、Ｃｅｎｐａ＿３ｓｃｒ（配列番号１１５））を用いたＰＣＲによりスクリーニングした。
【０２００】
標的細胞増殖：
Ｃｅｎｐａ同型接合性標的細胞をトリプシン処理した後、１ウェル当たり５×１０４細胞の密度においてゼラチン化２４ウェルプレート上で平板培養した。平板培養後の１日目から、様々なＤｏｘ濃度（１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ及び０μｇ／ｍｌ）に細胞を曝露し、３〜４日にわたって２時間毎に写真を撮り、密集度を測定することにより、ＩｎｃｕｃｙｔｅＺｏｏｍ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でプレートを分析した。
【０２０１】
定量ＰＣＲ：
製造者のプロトコルに従い、ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ全ＲＮＡミニプレップキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて、１μｇ／ｍｌ及び０μｇ／ｍｌのＤｏｘで２日間処理した細胞から全ＲＮＡを抽出した。製造者のプロトコルに従い、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、１μｇのＲＮＡの逆転写によりｃＤＮＡを作製した。ＳｅｎｓｉＦａｓｔ−ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲミックス（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を用いて、ＢｉｏＲａｄＣＦＸサーモサイクラ内でリアルタイムｑＰＣＲを設定した。使用したプライマーは、以下のものであった：ｑｐｃｒｃｅｎｐａ＿Ｆ（配列番号１１６）、ｑｐｃｒｃｅｎｐａ＿Ｒ（配列番号１１７）及びａｃｔＢｆ（配列番号６７）、ａｃｔＢｒ（配列番号６８）。結果はΔΔＣＴ法で分析し、βアクチンについて正規化した。
【０２０２】
結果
図２０を参照すると、図２０Ａに示すｄｏｘ−架橋標的ベクターを用いていくつかの標的Ｃ２マウスＥＳ細胞株を作製した（図２０Ｂ）。これらの細胞株の６つは、５’及び３’に正しい挿入を有することが判明し、少なくとも１つのクローン（Ｃｅｎｐａ＃４）は、Ｃｅｎｐａの両対立遺伝子の５’ＵＴＲへの相同組換えにより挿入されたｄｏｘ−架橋を含む同型接合標的株（図２０Ｂ）であることが判明した。
【０２０３】
予想通り、このＥＳ細胞株は、ドキシサイクリンの存在下でのみ増殖する。ドキシサイクリンの存在下で、Ｃｅｎｐａプロモータにより生成されたｒｔＴＡはＴＲＥに結合し、Ｃｅｎｐａコード配列の転写を開始する。ＣＤＬ発現がＥＡＲＣによってのみ起こり得ることを確実にするために、Ｃｅｎｐａの両対立遺伝子の５’ＵＴＲにｄｏｘ−架橋を挿入してもよい。別の方法は、ＣＤＬの残る非ＥＡＲＣ修飾対立遺伝子の全てにヌル突然変異を生成することである。
【０２０４】
ドキシサイクリンの使用を中止すると、４日以内に有糸分裂活性ＥＳ細胞が完全に排除された（図２１Ａ）。
【０２０５】
図２１Ｂを参照すると、本発明者らは、Ｄｏｘを用いた場合及びＤｏｘの除去の２日後のＣｅｎｐａ−ＥＡＲＣ細胞中のＣｅｎｐａ遺伝子発現レベルをｑＰＣＲにより決定し、それを野生型マウスＥＳ細胞（Ｃ２）中の発現レベルと比較した。予想した通り、Ｃｅｎｐａ発現レベルは、２日間Ｄｏｘを用いないＣｅｎｐａ−ＥＡＲＣ細胞で大幅に低下した。
【０２０６】
図２２を参照すると、本発明者らは、４日にわたって細胞増殖を測定することにより、様々な濃度のドキシサイクリンがｏｘ−架橋ＥＳ細胞の増殖にどの程度影響するかを決定した。ドキシサイクリンの存在下で、ＥＳ細胞は指数関数的に増殖し、その正常な増殖を示した。対照的に、ドキシサイクリンの除去から８０時間後、細胞増殖は完全に停止した。
【０２０７】
実施例６：Ｂｉｒｃ５遺伝子座でのＥＡＲＣ修飾マウスＥＳ細胞の作製
実施例６では、Ｂｉｒｃ５をターゲティングするＥＡＲＣ（ｄｏｘ−架橋）ベクターの構築、並びにマウスＥＳ細胞の細胞分裂を制御するためのそのベクターの使用について説明する。この実施例では、Ｂｉｒｃ５／ＢＩＲＣ５は、ＣＤＬであり、これは、ｄｏｘ−架橋が挿入されて、ドキシサイクリンがＣＤＬの発現を誘導する誘導性遺伝子発現系によってターゲティングされる。
【０２０８】
前述したように、Ｂｉｒｃ５／ＢＩＲＣ５は、全ての有糸分裂活性（すなわち、分裂）細胞で発現される。Ｂｉｒｃ５遺伝子座にＥＡＲＣ（ｄｏｘ−架橋）挿入を含むように修飾された細胞において、細胞分裂は、Ｂｉｒｃ５の発現を可能にする誘導物質（ドキシサイクリン）の存在下でのみ可能である。従って、ＥＡＲＣ修飾有糸分裂活性細胞の細胞分裂は、ドキシサイクリンの非存在下で排除することができる。
【０２０９】
実施例６において、Ｂｉｒｃ５遺伝子の５’ＵＴＲへのｄｏｘ−架橋挿入は、相同組換えノックイン技術により達成された。
【０２１０】
方法
ｄｏｘ−架橋を含むＥＡＲＣターゲティングベクターの構築
Ｃ５７／Ｂ６ゲノムＤＮＡ（プライマーＢｉｒｃ３Ｆ（配列番号１１９）及びＢｉｒｃ３Ｒ（配列番号１２０）から７７５ｂｐ断片をＰＣＲ増幅した後、これをｐＧｅｍ−ｂｒｉｄｇｅ−ｓｔｅｐ３のＳｂｆＩ及びＮｃｏＩにクローニングすることにより、３’相同性アーム（配列番号１１８）をクローニングした。同様に、プライマーＢｉｒｃ５Ｆ（配列番号１２２）及びＢｉｒｃ５Ｒ  ＰｓｔＩ（配列番号１２３）及びＳｐｅＩを用いたＰＣＲにより５’相同性アーム（６１７ｂｐ；配列番号１２１）を増幅し、これをＳｐｅｌにクローニングして最終ターゲティングベクターを作製し、これをｐＢｒｉｄｇｅ−Ｂｉｒｃ５（配列番号１２４）と称する。
【０２１１】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドの構築
オフターゲット突然変異の可能性を最小限にするために、二重ニッカーゼ戦略を選択した。オリゴＢｉｒｃ５ＡＦ（配列番号１２５）、Ｂｉｒｃ５ＡＲ（配列番号１２６）、Ｂｉｒｃ５ＢＦ（配列番号１２７）、Ｂｉｒｃ５ＢＲ（配列番号１２８）を用いて、提案されたプロトコル（Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）に従い、ガイドＲＮＡ配列をｐＸ３３５（Ａｄｄｇｅｎｅ）にクローニングしてＣＲＩＳＰＲベクターｐＸ３３５−Ｂｉｒｃ５Ａ（配列番号１２９）及びｐＸ３３５−Ｂｉｒｃ５Ｂ（配列番号１３０）を作製した。
【０２１２】
ＥＡＲＣ修飾マウスＥＳ細胞の作製
マウスＥＳ細胞培養物：
実施例４に記載の通り。
ターゲティング：
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分（ｐＸ３３５−Ｂｉｒｃ５Ａ及びｐＸ３３５−Ｂｉｒｃ５Ｂ）を含有するプラスミドと、ターゲティングプラスミド（ｐＢｒｉｄｇｅ−Ｂｉｒｃ５）とを、実施例４に記載のように、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、マウスＥＳ細胞に同時トランスフェクトした。
【０２１３】
遺伝子型決定：
実施例４に記載のように、ＤＮＡを抽出した。Ｂｉｒｃ５遺伝子の５’におけるｐＢｒｉｄｇｅ−Ｂｉｒｃ５の相同組換えによる正しい挿入について陽性のクローンを、５’相同性アームにわたるプライマー（プライマーｒｔｔａＲｅｖ（配列番号５４）、Ｂｉｒｃ＿５ｓｃｒＦ（配列番号１３１））を用いたＰＣＲによりスクリーニングした。
【０２１４】
標的細胞増殖：
Ｂｉｒｃ５同型接合性標的細胞をトリプシン処理した後、１ウェル当たり５×１０４細胞の密度で、ゼラチン化２４ウェルプレート上で平板培養した。平板培養後の１日目から、様々なＤｏｘ濃度（１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ及び０μｇ／ｍｌ）に細胞を曝露し、３〜４日にわたって２時間毎に写真を撮り、密集度を測定することにより、ＩｎｃｕｃｙｔｅＺｏｏｍ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でプレートを分析した。
【０２１５】
定量ＰＣＲ：
製造者のプロトコルに従い、ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ全ＲＮＡミニプレップキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて、１μｇ／ｍｌ及び０μｇ／ｍｌのＤｏｘで２日間処理した細胞から全ＲＮＡを抽出した。製造者のプロトコルに従い、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、１μｇのＲＮＡの逆転写により、ｃＤＮＡを作製した。ＳｅｎｓｉＦａｓｔ−ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲミックス（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を用いて、ＢｉｏＲａｄＣＦＸサーモサイクラ内でリアルタイムｑＰＣＲを設定した。使用したプライマーは、以下のものであった：ｑｐｃｒｂｉｒｃ＿Ｆ（配列番号１３２）、ｑｐｃｒｂｉｒｃ＿Ｒ（配列番号１３３）及びａｃｔＢｆ（配列番号６７）、ａｃｔＢｒ（配列番号６８）。結果は、ΔΔＣＴ法で分析し、βアクチンについて正規化した。
【０２１６】
結果
図２３を参照すると、図２３Ａに示すｄｏｘ−架橋標的ベクターを用いて、標的Ｃ２マウスＥＳ細胞株を作製した（図２３Ｂ）。５つのクローンは、正しくターゲティングされ（図２３Ｂ）、Ｂｉｒｃ５の両対立遺伝子の５’ＵＴＲへの組換えにより挿入されたｄｏｘ−架橋を含むことが判明した。これらのクローンの１つは、Ｂｉｒｃ＃３であり、これは、Ｄｏｘの非存在下で増殖を停止するか、又は死滅することが判明した。
【０２１７】
予想通り、このＥＳ細胞株は、ドキシサイクリンの存在下でのみ増殖する。ドキシサイクリンの存在下で、Ｂｉｒｃ５プロモータにより生成されたｒｔＴＡは、ＴＲＥに結合し、Ｂｉｒｃ５コード配列の転写を開始する。ＣＤＬ発現がＥＡＲＣによってのみ起こり得ることを確実にするために、Ｂｉｒｃ５の両対立遺伝子の５’ＵＴＲにｄｏｘ−架橋を挿入してもよい。別の方法は、ＣＤＬの残る非ＥＡＲＣ修飾対立遺伝子の全てにヌル突然変異を生成することである。
【０２１８】
ドキシサイクリンの使用を中止すると、４日以内に有糸分裂活性ＥＳ細胞が完全に排除された（図２４Ａ）。
【０２１９】
図２４Ｂを参照すると、本発明者らは、Ｄｏｘを用いた場合と、Ｄｏｘの除去の２日後のＢｉｒｃ５−ＥＡＲＣ細胞中のＢｉｒｃ５遺伝子発現レベルをｑＰＣＲにより決定し、それを野生型マウスＥＳ細胞（Ｃ２）中の発現レベルと比較した。予想した通り、Ｂｉｒｃ５発現レベルは、２日間Ｄｏｘを用いないＢｉｒｃ５−ＥＡＲＣ細胞において大幅に低下した。
【０２２０】
図２５を参照すると、本発明者らは、４日にわたって細胞増殖を測定することにより、様々な濃度のドキシサイクリンがｄｏｘ−架橋ＥＳ細胞の増殖にどの程度影響するかを決定した。ドキシサイクリンの存在下で、ＥＳ細胞は指数関数的に増殖し、その正常な増殖を示した。対照的に、ドキシサイクリンの除去から５０時間後、細胞増殖は完全に停止した。興味深いことに、より低いＤｏｘ濃度（０．５及び０．０５μｇ／ｍｌ）は、より高い濃度（１μｇ／ｍｌ）に比べ、細胞増殖を良好に促進しているように見える。
【０２２１】
実施例７：Ｅｅｆ２遺伝子座でのＥＡＲＣ修飾マウスＥＳ細胞の作製
実施例７では、Ｅｅｆ２をターゲティングするＥＡＲＣ（ｄｏｘ−架橋）ベクターの構築、並びにマウスＥＳ細胞の細胞分裂を制御するためのそのベクターの使用について説明する。この実施例では、Ｅｅｆ２／ＥＥＦ２は、ＣＤＬであり、これは、ｄｏｘ−架橋が挿入されて、ドキシサイクリンがＣＤＬの発現を誘導する誘導性遺伝子発現系によってターゲティングされる。
【０２２２】
前述したように、Ｅｅｆ２／ＥＥＦ２は、全ての有糸分裂活性（すなわち、分裂）細胞で発現される。Ｅｅｆ２遺伝子座にＥＡＲＣ（ｄｏｘ−架橋）挿入を含むように修飾された細胞において、細胞分裂は、Ｅｅｆ２の発現を可能にする誘導物質（ドキシサイクリン）の存在下でのみ可能である。従って、ＥＡＲＣ修飾有糸分裂活性細胞の細胞分裂は、ドキシサイクリンの非存在下で排除することができる。
【０２２３】
実施例７において、Ｅｅｆ２遺伝子の５’ＵＴＲへのｄｏｘ−架橋挿入は、相同組換えノックイン技術により達成された。
【０２２４】
方法
ｄｏｘ−架橋を含むＥＡＲＣターゲティングベクターの構築
Ｃ５７／Ｂ６ゲノムＤＮＡ（プライマーＥｅｆ２＿５Ｆ（配列番号１３５）及びＥｅｆ２＿５Ｒ（配列番号１３６）から８１７ｂｐ断片（配列番号１３４）をＰＣＲ増幅した後、これをｐＧｅｍ−ｂｒｉｄｇｅ−ｓｔｅｐ３のＳｂｆＩ及びＳｐｅＩにクローニングすることにより、５’相同性アームをクローニングした。同様に、プライマーＥｅｆ２＿３Ｆ（配列番号１３８）、Ｅｅｆ２＿３Ｒ（配列番号１３９）を用いたＰＣＲにより３’相同性アーム（８２６ｂｐ；配列番号１３７）を増幅し、これをＳｐｈＩにクローニングして、ｐＢｒｉｄｇｅ−Ｅｅｆ２（配列番号１４０）と称する最終ターゲティングベクターを作製した。
【０２２５】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドの構築
オフターゲット突然変異の可能性を最小限にするために、二重ニッカーゼ戦略を選択した。オリゴＥｅｒｆ２ａＦＷＤ（配列番号１４１）、Ｅｅｒｆ２ａＲＥＶ（配列番号１４２）、Ｅｅｒｆ２ｂＦＷＤ（配列番号１４３）、Ｅｅｒｆ２ｂＲＥＶ（配列番号１４４）を用いて、提案されたプロトコル（Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）に従い、ガイドＲＮＡ配列をｐＸ３３５（Ａｄｄｇｅｎｅ）にクローニングしてＣＲＩＳＰＲベクターｐＸ３３５−Ｅｅｆ２Ａ（配列番号１４５）及びｐＸ３３５−Ｅｅｆ２Ｂ（配列番号１４６）を作製した。
【０２２６】
ＥＡＲＣ修飾マウスＥＳ細胞の作製
マウスＥＳ細胞培養物：
実施例４に記載の通り。
ターゲティング：
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分（ｐＸ３３５−Ｅｅｆ２Ａ及びｐＸ３３５−Ｅｅｆ２Ｂ）を含有するプラスミドと、ターゲティングプラスミド（ｐＢｒｉｄｇｅ−Ｅｅｆ２）とを、実施例４に記載のように、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてマウスＥＳ細胞に同時トランスフェクトした。
【０２２７】
遺伝子型決定：
実施例４に記載のようにＤＮＡを抽出した。Ｅｅｆ２遺伝子の５’におけるｐＢｒｉｄｇｅ−Ｅｅｆ２の相同組換えによる正しい挿入について陽性のクローンを、５’相同性アームにわたるプライマー（プライマーｒｔｔａＲｅｖ（配列番号５４）、Ｅｅｆ２＿５ｓｃｒＦ（配列番号１４７））を用いたＰＣＲによりスクリーニングした。
【０２２８】
標的細胞増殖：
Ｅｅｆ２同型接合性標的細胞をトリプシン処理した後、１ウェル当たり５×１０４細胞の密度においてゼラチン化２４ウェルプレート上で平板培養した。平板培養後の１日目から、様々なＤｏｘ濃度（１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ及び０μｇ／ｍｌ）に細胞を曝露し、３〜４日にわたって２時間毎に写真を撮り、密集度を測定することにより、ＩｎｃｕｃｙｔｅＺｏｏｍ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でプレートを分析した。
【０２２９】
結果
図２６を参照すると、図２６Ａに示すｄｏｘ−架橋標的ベクターを用いていくつかの標的Ｃ２マウスＥＳ細胞株を作製した（図２６Ｂ）。これらの細胞株のうちの９つは、正しくターゲティングされ（図２６Ｂ）、少なくとも１つのクローンがＤｏｘ培地中でのみ増殖することが判明した。
【０２３０】
予想通り、このＥＳ細胞株は、ドキシサイクリンの存在下でのみ増殖する。ドキシサイクリンの存在下で、Ｅｅｆ２プロモータにより生成されたｒｔＴＡはＴＲＥに結合し、Ｅｅｆ２コード配列の転写を開始する。ＣＤＬ発現がＥＡＲＣによってのみ起こり得ることを確実にするために、Ｅｅｆ２の両対立遺伝子の５’ＵＴＲにｄｏｘ−架橋を挿入してもよい。別の方法は、ＣＤＬの残る非ＥＡＲＣ修飾対立遺伝子の全てにヌル突然変異を生成することである。
【０２３１】
ドキシサイクリンの使用を中止すると、４日以内に有糸分裂活性ＥＳ細胞が完全に排除された（図２７）。
【０２３２】
図２８を参照すると、本発明者らは、４日にわたって細胞増殖を測定することにより、様々な濃度のドキシサイクリンがｄｏｘ−架橋ＥＳ細胞の増殖にどの程度影響するかを決定した。ドキシサイクリンの存在下で、ＥＳ細胞は指数関数的に増殖し、その正常な増殖を示した。対照的に、ドキシサイクリンがなければ、細胞は全く増殖することができなくなった。
【０２３３】
いくつかの具体的な実施形態を参照して本開示を説明してきたが、その様々な改変形態は当業者に明らかであろう。本明細書において提供するいずれの実施例も、本開示を例示するために含まれているにすぎず、本開示を何ら限定する意図はない。本明細書において提供するいずれの図面も、本開示の様々な態様を例示することを目的とするにすぎず、本開示を一定の比率で描くこと又は限定することを決して意図しない。添付の特許請求の範囲は、上の説明に記載した好ましい実施形態によって限定すべきではなく、全体として本明細書と一致する最も広い解釈が与えられるべきである。本明細書で挙げた全ての従来の技術の開示は、全体として参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０２３４】
表２：
予測ＣＤＬ（ＩＤは、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ識別番号を指す。ＣＳスコアは、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５に記載されているＣＲＩＳＰＲスコア平均を指し；機能は、遺伝子座の既知若しくは予測機能を指し、予測は、Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／に記載の通り、ＧＯ  ｔｅｒｍに基づくものであり；機能カテゴリーは、ＧＯｔｅｒｍ予測機能に基づく細胞機能の４カテゴリーを指し；ＣＤＬ（基本）は、遺伝子がＣＤＬであることを予測するために本発明者らが用いた情報を指し、予測は、ＣＳスコア、入手可能な遺伝子ノックアウト（ＫＯ）データ、遺伝子機能、及び本明細書に記載する実験データに基づく）。
【０２３５】
【表２】
2018507701.tif 000004
【０２３６】
【表３】
2018507701.tif 000005
【０２３７】
【表４】
2018507701.tif 000006
【０２３８】
【表５】
2018507701.tif 000007
【０２３９】
【表６】
2018507701.tif 000008
【０２４０】
【表７】
2018507701.tif 000009
【０２４１】
【表８】
2018507701.tif 000010
【０２４２】
【表９】
2018507701.tif 000011
【０２４３】
【表１０】
2018507701.tif 000012
【０２４４】
【表１１】
2018507701.tif 000013
【０２４５】
【表１２】
2018507701.tif 000014
【０２４６】
【表１３】
2018507701.tif 000015
【０２４７】
【表１４】
2018507701.tif 000016
【０２４８】
【表１５】
2018507701.tif 000017
【０２４９】
【表１６】
2018507701.tif 000018
【０２５０】
【表１７】
2018507701.tif 000019
【０２５１】
【表１８】
2018507701.tif 000020
【０２５２】
【表１９】
2018507701.tif 000021
【０２５３】
【表２０】
2018507701.tif 000022
【０２５４】
【表２１】
2018507701.tif 000023
【０２５５】
【表２２】
2018507701.tif 000024
【０２５６】
【表２３】
2018507701.tif 000025
【０２５７】
【表２４】
2018507701.tif 000026
【０２５８】
【表２５】
2018507701.tif 000027
【０２５９】
【表２６】
2018507701.tif 000028
【０２６０】
【表２７】
2018507701.tif 000029
【０２６１】
【表２８】
2018507701.tif 000030
【０２６２】
【表２９】
2018507701.tif 000031
【０２６３】
【表３０】
2018507701.tif 000032
【０２６４】
【表３１】
2018507701.tif 000033
【０２６５】
【表３２】
2018507701.tif 000034
【０２６６】
【表３３】
2018507701.tif 000035
【０２６７】
【表３４】
2018507701.tif 000036
【０２６８】
【表３５】
2018507701.tif 000037
【０２６９】
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【０２７０】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９Ａ−９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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