(57)【要約】Ｍｓｉ２タンパク質における未成熟な終止コドンの導入をもたらすヌクレオチド多型により、機能性Ｍｓｉ２タンパク質を喪失した植物が、機能性Ｍｓｉ２タンパク質を含む野生型植物への又はそれとの交配後に、半数体子孫を誘導できることがわかった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能喪失型変異を含む、植物起源のＭｓｉ２タンパク質。
【請求項２】
前記変異が、ＷＤ４０リピート及び／又はＣＡＦ１Ｃドメイン中に存在する、請求項１に記載のＭｓｉ２タンパク質。
【請求項３】
機能喪失型変異を有する、植物Ｍｓｉ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドによりコードされ、前記タンパク質は、その内在性Ｍｓｉ２タンパク質の非存在下で植物中に存在する場合、前記植物が野生型植物と交配されるときに、いくつかの半数体後代又は異常な倍数性を有する後代の生成を可能とする、請求項１又は２に記載のＭｓｉ２タンパク質。
【請求項４】
配列番号１若しくは１０のアミノ酸配列、又は配列番号１若しくは１０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、なおさらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を有するその変異体を含むポリペプチドに由来し、前記タンパク質は、機能喪失型変異を有する、植物Ｍｓｉ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドによりコードされ、前記タンパク質は、その内在性Ｍｓｉ２タンパク質の非存在下で植物中に存在する場合、前記植物が野生型植物と交配されるときに、いくつかの半数体後代又は異常な倍数性を有する後代の生成を可能とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＭｓｉ２タンパク質。
【請求項５】
配列番号２若しくは３のアミノ酸配列、又は配列番号２若しくは３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、なおさらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を有するその変異体を含むポリペプチドに由来し、前記タンパク質は、機能喪失型変異を有する、植物Ｍｓｉ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドによりコードされ、前記タンパク質は、その内在性Ｍｓｉ２タンパク質の非存在下で植物中に存在する場合、前記植物が野生型植物と交配されるときに、いくつかの半数体後代又は異常な倍数性を有する後代の生成を可能とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＭｓｉ２タンパク質。
【請求項６】
産生された後代の０．１、０．５、１又は５％が、半数体であるか、又は異常な倍数性を有するか、又は倍加半数体である、請求項４又は５に記載のＭｓｉ２タンパク質。
【請求項７】
前記機能喪失型変異が、タンパク質の切断を引き起こす未成熟な終止コドンを導入する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＭｓｉ２タンパク質。
【請求項８】
配列番号２、３若しくは１０の１２５位のアミノ酸残基の後で、又は配列番号１の１２３位のアミノ酸残基の後で、タンパク質が切断されている、請求項７に記載のＭｓｉ２タンパク質。
【請求項９】
配列番号６のアミノ酸配列からなる、Ｍｓｉ２タンパク質。
【請求項１０】
配列番号４又は９の核酸配列を含む核酸分子によりコードされている、請求項８又は９に記載のＭｓｉ２タンパク質。
【請求項１１】
標的ヌクレオチド交換を使用して又はエンドヌクレアーゼを適用することにより、内在性Ｍｓｉ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドから得られた、機能喪失型変異を含むポリヌクレオチドによりコードされている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＭｓｉ２タンパク質。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＭｓｉ２タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１３】
配列番号５、７若しくは８の核酸配列、又は配列番号５、７若しくは８の核酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、なおさらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を有するその変異体を含む核酸分子であって、配列番号５、７又は８の核酸配列のうちの１つ又は複数のヌクレオチドが、前記核酸分子が機能喪失型変異を含むＭｓｉ２タンパク質をコードするように修飾されている、核酸分子。
【請求項１４】
配列番号５、７若しくは８の核酸配列、又は配列番号５、７若しくは８の核酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、なおさらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を有するその変異体を含む核酸分子であって、１つ又は複数のヌクレオチドが、未成熟の終止コドンが導入され、前記核酸分子が切断型Ｍｓｉ２タンパク質をコードするように修飾されている、核酸分子。
【請求項１５】
配列番号５若しくは７の核酸配列の３７６、３７７及び／若しくは３７８位における１つ又は複数のヌクレオチド、又は配列番号８の核酸配列の６８５、６８６及び／若しくは６８７位における１つ又は複数のヌクレオチドが、終止コドンが導入され、前記核酸分子が、配列番号２又は３の１２５位に対応するアミノ酸残基の後で切断されているアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするように修飾されている、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１６】
配列番号４又は９の核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項１７】
単離された核酸、ゲノム核酸又はｃＤＮＡである、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１８】
請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、キメラ遺伝子。
【請求項１９】
請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子又は請求項１８に記載のキメラ遺伝子を含む、ベクター。
【請求項２０】
請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１８に記載のキメラ遺伝子又は請求項１９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２１】
植物細胞、好ましくはトマト植物細胞である、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１８に記載のキメラ遺伝子又は請求項１９に記載のベクターを含む、植物、種子又は植物細胞。
【請求項２３】
内在性Ｍｓｉ２タンパク質が発現されていない、請求項２２に記載の植物、種子又は植物細胞。
【請求項２４】
内在性Ｍｓｉ２タンパク質が発現されておらず、前記植物がシロイヌナズナ植物、種子又は植物細胞でない、植物、種子又は植物細胞。
【請求項２５】
内在性Ｍｓｉ２遺伝子がノックアウトされている、請求項２４に記載の植物、種子又は植物細胞。
【請求項２６】
ナス属植物、種子又は植物細胞、好ましくはトマト植物細胞、種子又は植物細胞である、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の植物、種子又は植物細胞。
【請求項２７】
請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の植物、種子又は植物細胞を作製するための方法であって、
ａ）植物内の内在性Ｍｓｉ２遺伝子を改変して、変異した、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＭｓｉ２タンパク質をコードするＭｓｉ２遺伝子を得るか、又は植物細胞内の内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現をノックアウトするために、植物細胞内の内在性Ｍｓｉ２遺伝子を改変するステップと；
ｂ）変異したＭｓｉ２遺伝子を含む植物細胞、又は前記内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現がノックアウトされている植物細胞を選択するステップと；
ｃ）任意選択で、前記植物細胞から植物を再生するステップと
を含む、方法。
【請求項２８】
請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の植物、種子又は植物細胞を作製するための方法であって、
ａ）請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１８に記載のキメラ遺伝子、又は請求項１９に記載のベクターを使用して植物細胞を形質転換するか、又は内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現をノックアウトするために、核酸分子を使用して植物細胞を形質転換するステップと；
ｂ）任意選択で、前記植物細胞内の内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現をノックアウトするために、追加的に植物細胞内の内在性Ｍｓｉ２遺伝子を改変するステップと；
ｃ）請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１８に記載のキメラ遺伝子、若しくは請求項１９に記載のベクターを含む植物細胞、及び／又は内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現がノックアウトされている植物細胞を選択するステップと；
ｄ）任意選択で、前記植物細胞から植物を再生するステップと
を含む、方法。
【請求項２９】
半数体植物、異常な倍数性を有する植物、又は倍加半数体植物を生成する方法であって、
ａ）内在性Ｍｓｉ２タンパク質を発現する植物を請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の植物に交配するステップであって、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の植物は、少なくともその生殖部分において及び／又は胚発生の間は内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を欠く、ステップと；
ｂ）種子を収集するステップと；
ｃ）前記種子から、少なくとも１つの実生、小植物又は植物を生育させるステップと；
ｄ）半数体実生、小植物若しくは植物、異常な倍数性を有する実生、小植物若しくは植物、又は倍加半数体実生、小植物若しくは植物を選択するステップと
を含む、方法。
【請求項３０】
倍加半数体植物を生成する方法であって、
ａ）内在性Ｍｓｉ２タンパク質を発現する植物を請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の植物に交配するステップであって、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の植物は、少なくともその生殖部分において及び／又は胚発生の間は内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を欠く、ステップと；
ｂ）半数体植物を選択するステップと；
ｃ）前記半数体植物を倍加半数体植物に転換するステップと
を含む、方法。
【請求項３１】
ステップｃ）における前記転換が、コルヒチンによる処理によって実施される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記内在性Ｍｓｉ２タンパク質を発現する植物がＦ１植物である、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記内在性Ｍｓｉ２タンパク質を発現する植物が、交配の花粉親である、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記内在性Ｍｓｉ２タンパク質を発現する植物が、交配の胚珠親である、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
交配が、約２４〜約３０℃の範囲、好ましくは約２６〜約２８℃の範囲の温度において実施される、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
半数体インデューサー系統を産生するための、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子の使用。
【請求項３７】
請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１８に記載のキメラ遺伝子、又は請求項１９に記載のベクターを含む、トマト植物、種子又は植物細胞。
【請求項３８】
配列番号６のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるポリペプチドをコードする核酸分子を含む、トマト植物、種子又は植物細胞。
【請求項３９】
配列番号４又は９の核酸分子を含む、トマト植物、種子又は植物細胞。
【請求項４０】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＭｓｉ２タンパク質をコードする核酸分子を含む、トマト植物、種子又は植物細胞。
【請求項４１】
機能性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を欠き、任意選択で、機能喪失型変異を含むＭｓｉ２タンパク質が発現されている、トマト植物、種子又は植物細胞。
【請求項４２】
Ｍｓｉ２タンパク質が切断されているか又は非存在である、請求項４１に記載のトマト植物、種子又は植物細胞。
【請求項４３】
半数体トマト植物、種子又は植物細胞を産生するための、請求項３７〜４２のいずれか一項に記載のトマト植物、種子又は植物細胞の使用。
【請求項４４】
倍加半数体トマト植物、種子又は植物細胞を産生するための、請求項３７〜４２のいずれか一項に記載のトマト植物、種子又は植物細胞の使用。
【請求項４５】
前記トマト植物が、少なくともその生殖部分において及び／又は胚発生の間は内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を欠く、請求項４３又は４４に記載の方法。
【請求項４６】
半数体又は倍加半数体植物を生成する方法であって、内在性Ｍｓｉ２タンパク質を発現する植物及び請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の植物を同定するステップであって、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の前記植物が、少なくともその生殖部分において及び／又は胚発生の間は内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を欠く、ステップを含む、方法。
【請求項４７】
前記植物の全ゲノムを有性交配するステップを含まない、請求項２９〜３５又は４６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、農業分野に関する。特に、本開示は、半数体及びそれに続く倍加半数体植物の産生に関する。
【背景技術】
【０００２】
育種材料の高度なヘテロ接合性は、植物育種及び有益な形質の選択を非常に時間のかかるプロセスにする可能性がある。広範な集団のスクリーニングは、最新の分子育種ツールを用いたとしても、労力と費用の両方を要する。
【０００３】
半数体植物の創出とそれに続く化学的又は自発的ゲノム倍加は、高いヘテロ接合性の問題を解決するための効率的な方法である。そのような倍加半数体は、そうでなければ許容できるレベルまでヘテロ接合性を低減させるために必要とされる、少なくとも７世代の自殖を回避する。半数体植物は、小胞子培養によって一部の作物において産生されうる。しかしながら、これは、費用と時間がかかる。多くの作物において小胞子培養法が機能しないことは、より重要である。一部の作物種において、（倍加）半数体植物は、卵細胞の単為生殖又は親ゲノムのうちの一方の排除により得られうる。しかしながら、これらの方法も選ばれたわずかな作物に限定され、倍加半数体植物の産生率は低い。
【０００４】
国際公開第ＷＯ２０１１／０４４１３２号は、半数体植物を産生する方法を開示する。採用された方法のうちの１つは、ＣｅｎＨ３タンパク質を不活性化又はノックアウトすることである。これは、Ｎ末端ＧＦＰをＣｅｎＨ３タンパク質に付加し、それによってＧＦＰ−ＣｅｎＨ３を創出することによって行われた。これは、「テールスワップ（ｔａｉｌｓｗａｐ）」とも呼ばれる。テールスワップは、ＣｅｎＨ３タンパク質のそのような修飾Ｎ末端部分を含まない植物への交配に際して、片親ゲノムの排除を誘導するのに十分であった。片親ゲノムの排除は、半数体植物の産生をもたらした。これまで、このプロセスは、モデル植物であるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）においてのみ実証され、作物植物においては実証されていない。加えて、異なる遺伝子導入により修飾されたＣｅｎＨ３タンパク質のＮ末端部分からなる別の人工構築物が、内在性ＣｅｎＨ３を欠く遺伝的背景を有する植物に導入された場合、これは、片親ゲノムの排除及びそれに続く半数体植物の産生をもたらさないようであった（国際公開第ＷＯ２０１４／１１０２７４号）。したがって、ＣｅｎＨ３タンパク質のどの修飾が片親ゲノムの排除に十分であるかは不明確なままである。
【０００５】
よって、本分野においては、後に倍加されて、倍加半数体植物を産生することのできる半数体植物の効率的な生成を可能とする方法に対する必要が残っている。倍加半数体産生系により、ホモ接合性が一世代で達成される。
【発明の概要】
【０００６】
ここに、本発明者らは、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）Ｍｓｉ２タンパク質の１２６位におけるＫから終止コドンへのアミノ酸修飾をもたらす独特の一塩基多型によって、機能性Ｍｓｉ２タンパク質を喪失したトマト植物が、機能性Ｍｓｉ２タンパク質を含む野生型植物への又はそれとの交配後に半数体子孫を誘導することができることを見出した。Ｍｓｉ２タンパク質においてＫからＭへのアミノ酸修飾をもたらす一塩基多型は、コンピュータを用いた方法によって非破壊的であることがわかった（ＳＩＦＴ、Ｋｕｍａｒ  Ｐ、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  Ｓ、Ｎｇ  ＰＣ．（２００９年）Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｏｄｉｎｇ  ｎｏｎ−ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＳＩＦＴ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ．、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ；４巻（７号）：１０７３〜８１ページ）。これらのモデルと一致して、後者のアミノ酸修飾は、Ｍｓｉ２タンパク質における上記ＫからＭへの特定の酸修飾を欠く野生型植物への又はそれとの交配後に、半数体子孫を誘導しなかった。アミノ酸配列（Ｍｓｉ２Ｄ３３７Ｄ）を変更しない同義一塩基多型との正逆コントロール交配（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｃｒｏｓｓ）は、いかなる半数体子孫も生じさせなかった。
【０００７】
第１の態様において、本発明は、機能喪失型変異を含む、植物起源のＭｓｉ２タンパク質に関する。
【０００８】
上記変異は、ＷＤ４０リピート及び／又はＣＡＦ１Ｃドメイン中に存在しうる。
【０００９】
上記Ｍｓｉ２タンパク質は、機能喪失型変異を有する、植物Ｍｓｉ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドによりコードされてもよく、このタンパク質は、その内在性Ｍｓｉ２タンパク質の非存在下で植物中に存在する場合、上記植物が野生型植物と交配されるときに、いくつかの半数体後代又は異常な倍数性を有する後代の生成を可能とする。
【００１０】
上記Ｍｓｉ２タンパク質は、配列番号１若しくは１０のアミノ酸配列、又は配列番号１若しくは１０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、なおさらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を有するその変異体を含むポリペプチドに由来してもよく、上記タンパク質は、機能喪失型変異を有する、植物Ｍｓｉ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドによりコードされ、このタンパク質は、その内在性Ｍｓｉ２タンパク質の非存在下で植物中に存在する場合、上記植物が野生型植物と交配されるときに、いくつかの半数体後代又は異常な倍数性を有する後代の生成を可能とする。
【００１１】
上記Ｍｓｉ２タンパク質は、配列番号２若しくは３のアミノ酸配列、又は配列番号２若しくは３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、なおさらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を有するその変異体を含むポリペプチドに由来してもよく、上記タンパク質は、機能喪失型変異を有する、植物Ｍｓｉ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドによりコードされ、このタンパク質は、その内在性Ｍｓｉ２タンパク質の非存在下で植物中に存在する場合、上記植物が野生型植物と交配されるときに、いくつかの半数体後代又は異常な倍数性を有する後代の生成を可能とする。例えば、産生された後代の０．１、０．５、１又は５％は、半数体であるか、又は異常な倍数性を有するか、又は倍加半数体である。
【００１２】
機能喪失型変異は、タンパク質の切断を引き起こす未成熟な終止コドンを導入しうる。例えば、上記タンパク質は、配列番号２、３若しくは１０の１２５位のアミノ酸残基の後で、又は配列番号１の１２３位のアミノ酸残基の後で切断されうる。
【００１３】
ある実施形態において、Ｍｓｉ２タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列を含むか又は配列番号６のアミノ酸配列からなる。
【００１４】
ある実施形態において、Ｍｓｉ２タンパク質は、配列番号４又は９の核酸配列を含む核酸分子によりコードされていてもよい。
【００１５】
Ｍｓｉ２タンパク質は、標的ヌクレオチド交換を使用して又はエンドヌクレアーゼを適用することにより、内在性Ｍｓｉ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドから得られた、機能喪失型変異を含むポリヌクレオチドによりコードされていてもよい。
【００１６】
別の態様において、本発明は、本明細書に教示されるＭｓｉ２タンパク質をコードする核酸分子を提供する。
【００１７】
また、本発明は、配列番号５、７若しくは８の核酸配列、又は配列番号５、７若しくは８の核酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、なおさらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を有するその変異体を含む核酸分子であって、配列番号５、７又は８の核酸配列のうちの１つ又は複数のヌクレオチドが、上記核酸分子が機能喪失型変異を含むＭｓｉ２タンパク質をコードするように修飾されている、核酸分子を提供する。
【００１８】
本発明は、配列番号５、７若しくは８の核酸配列、又は配列番号５、７若しくは８の核酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、なおさらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を有するその変異体を含む核酸分子であって、１つ又は複数のヌクレオチドが、未成熟の終止コドンが導入され、上記核酸分子が切断型Ｍｓｉ２タンパク質をコードするように修飾されている、核酸分子も提供する。
【００１９】
ある実施形態において、配列番号５若しくは７の核酸配列の３７６、３７７及び／若しくは３７８位における１つ又は複数のヌクレオチド、又は配列番号８の核酸配列の６８５、６８６及び／若しくは６８７位における１つ又は複数のヌクレオチドが、終止コドンが導入され、上記核酸分子が、配列番号２又は３の１２５位に対応するアミノ酸残基の後で切断されているアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするように、修飾されている。
【００２０】
配列番号４又は９の核酸配列を含む核酸分子も教示される。
【００２１】
本明細書に教示される核酸分子は、単離された核酸、ゲノム核酸又はｃＤＮＡであってもよい。
【００２２】
本発明は、さらに、本明細書に教示される核酸分子を含むキメラ遺伝子、及び本明細書に教示される核酸分子又は本明細書に教示されるキメラ遺伝子を含むベクターを提供する。
【００２３】
本発明は、さらに、本明細書に教示される核酸分子、本明細書に教示されるキメラ遺伝子、又は本明細書に教示されるベクターを含む宿主細胞に関する。
【００２４】
上記宿主細胞は、プロトプラストを含む植物細胞、好ましくはトマト植物細胞でありうる。
【００２５】
本明細書に教示される核酸分子、本明細書に教示されるキメラ遺伝子、又は本明細書に教示されるベクターを含む、植物、種子又は植物細胞も開示される。
【００２６】
ある実施形態において、内在性Ｍｓｉ２タンパク質は、上記植物、種子又は植物細胞において発現されない。
【００２７】
本発明は、植物、種子又は植物細胞であって、内在性Ｍｓｉ２タンパク質が発現されていない、例えば、内在性Ｍｓｉ２遺伝子がノックアウトされている、植物、種子又は植物細胞にも関する。ある実施形態において、上記植物、種子又は植物細胞は、シロイヌナズナ植物、種子又は植物細胞ではない。
【００２８】
上記植物、種子又は植物細胞は、ナス属植物、種子又は植物細胞、好ましくはトマト植物、
種子又は植物細胞でありうる。
【００２９】
本発明は、さらに、本明細書に教示される植物、種子又は植物細胞を作製するための方法であって、
ａ）植物細胞内の内在性Ｍｓｉ２遺伝子を改変して、変異した、本明細書に教示されるＭｓｉ２タンパク質をコードするＭｓｉ２遺伝子を得るか、又は植物細胞内の内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現をノックアウトするために、植物細胞内の内在性Ｍｓｉ２遺伝子を改変するステップと；
ｂ）変異したＭｓｉ２遺伝子を含む植物細胞、又は上記内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現がノックアウトされている植物細胞を選択するステップと；
ｃ）任意選択で、上記植物細胞から植物を再生するステップと
を含む、方法に関する。
【００３０】
本発明は、本明細書に教示される植物、種子又は植物細胞を作製するための方法であって、
ａ）本明細書に教示される核酸分子、本明細書に教示されるキメラ遺伝子、又は本明細書に教示されるベクターを使用して植物細胞を形質転換するか、又は内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現をノックアウトするために、核酸分子を使用して植物細胞を形質転換するステップと；
ｂ）任意選択で、植物細胞内の内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現をノックアウトするために、追加的に上記植物細胞内の内在性Ｍｓｉ２遺伝子を改変するステップと；
ｃ）本明細書に教示される核酸分子、本明細書に教示されるキメラ遺伝子、若しくは本明細書に教示されるベクターを含む植物細胞、及び／又は上記内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現がノックアウトされている植物細胞を選択するステップと；
ｄ）任意選択で、上記植物細胞から植物を再生するステップと
を含む、方法も対象とする。
【００３１】
別の態様において、本発明は、半数体植物、異常な倍数性を有する植物、又は倍加半数体植物を生成する方法であって、
ａ）内在性Ｍｓｉ２タンパク質を発現する植物を本明細書に教示される植物に交配するステップであって、本明細書に教示される植物は、少なくともその生殖部分において及び／又は胚発生の間は内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を欠く、ステップと；
ｂ）種子を収集するステップと；
ｃ）上記種子から、少なくとも１つの実生、小植物又は植物を生育させるステップと；
ｄ）半数体実生、小植物若しくは植物、異常な倍数性を有する実生、小植物若しくは植物、又は倍加半数体実生、小植物若しくは植物を選択するステップと
を含む、方法を提供する。
【００３２】
本発明は、倍加半数体植物を生成する方法であって、
ａ）内在性Ｍｓｉ２タンパク質を発現する植物を本明細書に教示される植物に交配するステップであって、本明細書に教示される植物は、少なくともその生殖部分において及び／又は胚発生の間は内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を欠く、ステップと；
ｂ）半数体植物を選択するステップと；
ｃ）上記半数体植物を倍加半数体植物に転換するステップと
を含む、方法にも関する。
【００３３】
ステップｃ）における転換は、コルヒチンによる処理によって実施されてもよい。
【００３４】
内在性Ｍｓｉ２タンパク質を発現する植物は、Ｆ１植物であってもよい。
【００３５】
内在性Ｍｓｉ２タンパク質を発現する植物は、交配の花粉親であってもよく、又は交配の胚珠親であってもよい。
【００３６】
交配は、約２４〜約３０℃の範囲、好ましくは約２６〜約２８℃の範囲の温度において実施されうる。
【００３７】
本発明は、さらに、半数体インデューサー系統を産生するための本明細書に教示される核酸分子の使用に関する。
【００３８】
また、本発明は、本明細書に教示される核酸分子、本明細書に教示されるキメラ遺伝子、又は本明細書に教示されるベクターを含むトマト植物、種子又は植物細胞を対象とする。
【００３９】
さらに、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子を含むトマト植物、種子又は植物細胞が、本明細書に教示される。
【００４０】
また、配列番号４又は９の核酸分子を含むトマト植物、種子又は植物細胞も本明細書に教示される。
【００４１】
なお別の態様において、本明細書に教示されるＭｓｉ２タンパク質をコードする核酸分子を含むトマト植物、種子又は植物細胞が提供される。
【００４２】
また、機能性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を欠き、任意選択で、機能喪失型変異を含むＭｓｉ２タンパク質が発現されているトマト植物、種子又は植物細胞も、本明細書に教示される。
【００４３】
本明細書に教示されるトマト植物は、半数体トマト植物を産生するため、及び／又は倍加半数体トマト植物を産生するために使用されうる。
【００４４】
本明細書に教示されるトマト植物は、少なくともその生殖部分において及び／又は胚発生の間は内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を欠く可能性がある。
【００４５】
最終的な態様において、本発明は、半数体又は倍加半数体植物を生成する方法であって、内在性Ｍｓｉ２タンパク質を発現する植物及び本明細書に教示される植物を同定するステップであって、本明細書に教示される植物が、少なくともその生殖部分において及び／又は胚発生の間は内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を欠く、ステップを含む、方法を対象とする。
【００４６】
本明細書に教示される交配方法は、上記植物の全ゲノムを有性交配するステップを含まない。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】Ｍｓｉ２−Ｋ１２６−ｓｔｏｐ変異体の四分染色体を示す。矢印は、微小核を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
定義
用語「Ｍｓｉ２」は、ＲＮＡ結合タンパク質Ｍｕｓａｓｈｉ２を指す。ＲＮＡ結合タンパク質Ｍｕｓａｓｈｉ２は、ＷＤ−４０リピート含有タンパク質である。（ＷＤ又はベータ−トランスデューシンリピートとしても知られている）ＷＤ−４０リピートは、Ｔｒｐ−Ａｓｐ（Ｗ−Ｄ）ジペプチドで終端することの多い、短い約４０アミノ酸モチーフである。ＷＤ４０リピートは、通常、７〜８枚羽根のβプロペラ折りたたみ構造（ｂｅｔａ−ｐｒｏｐｅｌｌｅｒ  ｆｏｌｄ）と推定されるが、タンパク質は、環化したβプロペラ構造も形成する４〜１６個の反復単位が認められている。ＷＤリピートタンパク質は、すべての真核生物に認められる大きなファミリーであり、シグナル伝達及び転写制御から細胞周期調節及びアポトーシスまでにわたる多様な機能に関係している。反復するＷＤ４０モチーフは、タンパク質−タンパク質相互作用のための部位として作用し、ＷＤ４０リピートを含有するタンパク質は、タンパク質複合体の組み立てのためのプラットフォーム又は他のタンパク質の間の一過性の相互作用のメディエーターとして働くことが知られている。タンパク質の特異性は、リピート自体の外部の配列により決定される。Ｍｓｉ２は、標的ｍＲＮＡの発現を翻訳レベルで調節するＲＮＡ結合タンパク質であると考えられている。アラビドプシス種（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．）において、数種のＷＤ４０含有タンパク質が、植物特異的な発生イベントの主要調節因子として作用する。シロイヌナズナＭｓｉ２（Ａｔ２ｇ１６７８０）のＴ−ＤＮＡ挿入変異体及びＭｓｉ２を過剰発現するトランスジェニック植物は、野生型と同じ表現型を有すると報告された。野生型におけるＭｓｉ２遺伝子の発現は、乾燥、塩、高温、低温、マンニトール、ＡＢＡ、ＧＡ、サリチル酸及びジャスモン酸によって誘発することはできなかった。３５Ｓプロモーターによる制御下で完全長のＭｓｉ２  ｃＤＮＡ及びＧＦＰからなる融合タンパク質を使用する、局在化試験は、細胞質及び核の両方で蛍光が検出されたことを明らかにした。植物におけるＭｓｉ２の正確な役割は、いまだ知られていない。
【００４９】
「変異」は、生物、ウイルスのゲノム又は染色体外ＤＮＡ又は他の遺伝要素のヌクレオチド配列の恒久的変化である。（放射線又は化学的変異原により典型的に引き起こされる）修復されないＤＮＡ、若しくはＲＮＡゲノムに対する損傷、複製の過程におけるエラーにより、又は可動遺伝因子によるＤＮＡのセグメントの挿入若しくは欠失によりもたらされる。変異は、生物の観察可能な特徴（表現型）において認識できる変化を生じても生じなくてもよい。変異は、配列に数種の異なるタイプの変化をもたらすことができる。遺伝子における変異は、影響を及ぼさないか、遺伝子産物を変化させるか、又は遺伝子が適切に若しくは完全に機能することを阻むことのいずれかでありうる。変異は、非遺伝子領域においても起こりうる。
【００５０】
本発明の状況におけるタンパク質の「機能喪失型変異」は、その機能の喪失を引き起こす、タンパク質の変異を指す。ポリヌクレオチドの「機能喪失型変異」は、タンパク質の機能喪失を引き起こす、上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの変異を指す。タンパク質はなお、機能喪失型変異を含むポリヌクレオチドから産生されうるが、上記タンパク質はもはや機能を発揮できないか又はその機能を有効に発揮することができない。
【００５１】
「発現喪失型変異」は、変異した遺伝子又は上記変異した遺伝子によりコードされる産物の発現の喪失をもたらす。
【００５２】
「機能喪失型Ｍｓｉ２タンパク質」は、機能喪失型変異を含むＭｓｉ２タンパク質である。上記機能喪失型Ｍｓｉ２タンパク質は、その内在性Ｍｓｉ２タンパク質の非存在下で植物中に存在する場合、上記植物が野生型植物、好ましくは同じ種の野生型植物と交配されるときに、いくつかの半数体後代又は異常な倍数性を有する後代の生成を可能とする。機能喪失型Ｍｓｉ２タンパク質は、Ｍｓｉ２タンパク質に特異的に結合する抗体、又は他のＭｓｉ２阻害剤、例えば、内在性Ｍｓｉ２タンパク質の活性を遮断し、阻止し若しくは低減させるタンパク質、又はイオン若しくは金属のような化学阻害剤のようなタンパク質の阻害剤を使用することにより、或いはコファクターを除去することにより、非機能性に又はより機能性が低くもなりうる。例えば、Ｍｓｉ２タンパク質に特異的に結合する抗体が、上記Ｍｓｉ２タンパク質と同時に発現され、それによって、上記Ｍｓｉ２タンパク質の比活性を低減しうる。Ｍｓｉ２タンパク質の機能が減損されてもよく、又はＭｓｉ２タンパク質は内在性Ｍｓｉ２タンパク質よりも機能性が低くてもよい。
【００５３】
「機能喪失型Ｍｓｉ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド」は、非内在性の、変異したＭｓｉ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、機能喪失型変異を含むＭｓｉ２タンパク質をコードし、その内在性Ｍｓｉ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドの非存在下で植物中に存在する場合、上記植物が野生型植物、好ましくは同じ種の野生型植物と交配されるときに、いくつかの半数体後代又は異常な倍数性を有する後代の生成を可能とするポリヌクレオチドを指す。機能喪失型変異は、フレームシフト変異を含む。
【００５４】
本発明の状況において、タンパク質、遺伝子又はポリヌクレオチドと組み合わせて使用される用語「内在性」は、上記タンパク質、遺伝子又はポリヌクレオチドが、それがなお含有されている植物に起源を有することを意味する。内在性遺伝子は、植物中で、その正常な遺伝学的状況にあることが多い。
【００５５】
本明細書中で使用される用語「遺伝子」は、好適な調節領域（例えば、プロモーター）に操作可能に連結されている、細胞中でＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）に転写される領域（転写領域）を含むＤＮＡ配列を指す。この結果、遺伝子は、プロモーター、例えば、翻訳開始に関与する配列などを含む５‘リーダー配列、（タンパク質）コード領域（ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）及び、例えば、転写終結点などを含む３’非翻訳配列のような数種の操作可能に連結された配列を含んでもよい。
【００５６】
本開示の状況において使用される用語「半数体インデューサー系統」は、非インデューサー系統と少なくとも１つの一塩基多型において異なる植物系統を指す。雌株又は花粉ドナーのいずれかとして使用される半数体インデューサー系統が交配される場合、半数体インデューサー系統のゲノムの片親ゲノムの排除をもたらす。
【００５７】
本明細書中で使用される用語「片親ゲノムの排除」は、交配後に、交配の方向に関わりなく一方の親のすべての染色体を意味するすべての遺伝情報を失うという効果を指す。これは、そのような交配の子孫が、排除されない親ゲノムの染色体のみを含有するような方法で起こる。排除されるゲノムは、常に半数体インデューサーである親に起源を有する。
【００５８】
「倍加半数体」は、半数体細胞が染色体倍加を受けるときに形成される遺伝子型である。これは、半数体細胞からの誘導された又は自発的な染色体倍加により産生されうる。二倍体植物にとって、半数体細胞は一倍体であり、用語「倍加一倍体」も、倍加半数体について使用されうる。
【００５９】
（フレーミングエラー（ｆｒａｍｉｎｇ  ｅｒｒｏｒ）又は読み枠シフトとも呼ばれる）「フレームシフト変異」は、ヌクレオチド配列中で均一に３で割り切れないいくつかのヌクレオチドのインデル（挿入又は欠失）に起因する遺伝子変異である。コドンによる遺伝子発現のトリプレットの性質により、挿入又は欠失は、読み枠（コドンのグループ分け）を変化させることができ、テンプレートの完全に異なる翻訳をもたらす。挿入又は欠失が配列中で早く起こるほど、タンパク質産物はより大きく変更される。フレームシフト変異は、一般に、変異後のコドンの読みが、異なるアミノ酸をコードするようにさせるが、遺伝コードの縮重の結果として生じる例外もありうる。さらに、元の配列中の終止コドンは読まれず、代替の終止コドンがより早い又はより遅い終結部位を生じさせうる。タンパク質産物は、異常に短いか又は異常に長い。
【００６０】
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」及び「核酸」は、本明細書において互換的に使用される。
【００６１】
「キメラ遺伝子」（又は組換え遺伝子）は、通常、ある種において自然界で見られない任意の遺伝子、特に、自然界で互いに関連し合わない核酸配列の１つ又は複数の部分がその中に存在する遺伝子を指す。例えば、プロモーターは、自然界で転写領域の一部若しくはすべて、又は別の調節領域とは関連し合わない。用語「キメラ遺伝子」は、その中のプロモーター又は転写調節配列が、１つ若しくは複数のコード配列に又はアンチセンス（センス鎖の逆相補体）若しくは逆位反復配列（それによって、転写に際してＲＮＡトランスクリプトが二本鎖ＲＮＡを形成する、センス及びアンチセンス）に操作可能に連結される、発現構築物を含むと理解される。
【００６２】
「配列同一性」及び「配列類似性」は、グローバル又はローカルアライメントアルゴリズムを使用する２つのペプチド又は２つのヌクレオチド配列のアライメントにより決定されうる。その結果、配列は、それらが（例えばデフォルトパラメータを使用するＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴプログラムにより最適に整列化された場合に）少なくとも（以下に定義される）ある特定の最小限のパーセンテージの配列同一性を共有する場合に、「実質的に同一」又は「本質的に類似する」と呼ばれうる。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズムを使用して、マッチの数を最大にし、ギャップの数を最小としつつ、２つの配列をその長さ全体にわたって整列化する。一般に、ギャップクリエーションペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップエクステンションペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）でＧＡＰデフォルトパラメータが使用される。ヌクレオチドについては、使用されるデフォルトスコアリングマトリックスは、ｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質については、デフォルトスコアリングマトリックスは、Ｂｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２年、ＰＮＡＳ  ８９巻、９１５〜９１９ページ）。配列アライメント及び配列同一性パーセンテージのためのスコアが、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．、９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  ９２１２１−３７５２  ＵＳＡからのＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３又は（「ｎｅｅｄｌｅ」プログラムを使用する）ＥｍｂｏｓｓＷｉｎ  バージョン２．１０．０などのコンピュータプログラムを使用して決定されうる。代替的には、類似性又は同一性パーセントは、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを使用してデータベースを検索することによって決定されうる。
【００６３】
「宿主細胞」又は「組換え宿主細胞」又は「形質転換細胞」は、特に所望のタンパク質をコードするキメラ遺伝子を含む、少なくとも１つの核酸分子の導入の結果として生じる新しい個別の細胞（又は生物）を指す用語である。宿主細胞は、植物細胞又は細菌細胞であることが好ましい。宿主細胞は、染色体外で（エピソームの）複製する分子として核酸分子若しくはキメラ遺伝子を含有してもよく、又はより好ましくは、宿主細胞の核若しくはプラスチドゲノム中に集積された核酸分子若しくはキメラ遺伝子を含む。
【００６４】
本明細書において使用される場合、用語「植物」は、植物細胞、植物組織又は器官、植物プロトプラスト、そこから植物が再生されることのできる植物細胞組織培養、植物カルス、植物細胞凝集塊、及び植物中で無傷である植物細胞、又は胚、花粉、胚珠、果実（例えば、収穫されたトマト）、花、葉、種子、根、毛根などのような植物の部分を含む。
【００６５】
この文書において及びその請求の範囲において、動詞「含む」及びその活用形は、その非限定的な意味で使用されて、この単語に続く項目が含まれるが、具体的に言及されない項目が除外されないことを意味する。これは、動詞「から本質的になる」及び「からなる」を包含する。
【００６６】
加えて、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」による要素への言及は、要素のうちの１つ及び１つのみが存在することを文脈が明らかに要求しない限り、要素のうちの複数が存在する可能性を排除しない。よって、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。さらに、本明細書において「配列」に言及する場合、一般に、サブユニット（例えば、アミノ酸）のある特定の配列を含む実際の物理的な分子が言及される。
【発明の詳細な説明】
【００６７】
本発明の作用機序
機能性Ｍｓｉ２タンパク質の非存在下又は低減された存在下で生じる、機能性Ｍｓｉ２タンパク質の発現が減損され及び／又はＭｓｉ２タンパク質の機能が減損されている植物は、そのような植物に半数体インデューサー表現型を付与すると考えられる。上記植物が性的に適合性の野生型植物、好ましくは同じ種の野生型植物と交配される場合、いくつかの半数体後代又は異常な倍数性を有する後代の生成が、比較的高い頻度で誘発される。そのような植物を使用して生成される半数体後代又は異常な倍数性を有する後代のパーセンテージは、例えば、少なくとも０．１、０．５、１、５、１０、２０％又はそれ超でありうる。
【００６８】
機能性Ｍｓｉ２タンパク質の減損された発現は、Ｍｓｉ２遺伝子の発現が減損され、及び／又はＭｓｉ２遺伝子の発現は正常であるが、転写されたｍＲＮＡの翻訳が（例えば、ＲＮＡ干渉によって）阻害又は阻止されることを意味しうる。
【００６９】
転写レベルでの機能性Ｍｓｉ２タンパク質の減損された発現は、プロモーター、エンハンサー、又は開始、終結若しくはイントロンスプライシング配列を含む転写調節配列における１つ又は複数の変異の導入の結果でありうる。一般に、これらの配列は、Ｍｓｉ２タンパク質をコードする遺伝子（単数又は複数）のコード配列の５’又は３’又はその内部に位置する。代替的に、又は追加的に、機能性Ｍｓｉ２タンパク質の減損された発現は、内在性Ｍｓｉ２遺伝子（単数又は複数）のコード領域におけるヌクレオチドの欠失、置換、再構成又は挿入によっても達成されうる。例えば、コード領域において、ヌクレオチドは、置換され、挿入され又は欠失されて、１つ、２つ又はそれ超の未成熟な終止コドンの導入をもたらす。また、挿入、欠失、再構成又は置換は、コードされるアミノ酸配列における改変をもたらし、それによって機能性Ｍｓｉ２タンパク質の減損された発現をもたらすことができる。Ｍｓｉ２遺伝子（複数可）の大部分、例えば、Ｍｓｉ２遺伝子（複数可）の（コード領域の）少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はさらに１００％が、植物中に存在するＤＮＡから除去され、それによって機能性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を減損しうる。
【００７０】
代替的に、１つ、２つ、３つ又はそれ超のヌクレオチドがＭｓｉ２遺伝子（複数可）に導入され、例えば、フレームシフトをもたらすか又はＭｓｉ２タンパク質への追加のアミノ酸の導入をもたらすか、又はアミノ酸をコードしない核酸配列の導入をもたらすか、又は大きな挿入断片の導入（例えば、Ｔ−ＤＮＡ挿入）をもたらし、それによって、機能性Ｍｓｉ２タンパク質の供給／発現を減損しうる。
【００７１】
翻訳レベルでの減損は、未成熟な終止コドンの導入により、或いは（スプライシングのような）他のＲＮＡからタンパク質へのプロセシングメカニズム又はタンパク質のフォールディング若しくは細胞輸送などに影響を及ぼす翻訳後修飾に影響を及ぼすことによって達成されうる。
【００７２】
タンパク質レベルでの減損又は機能喪失は、活性、基質結合、補助因子結合、フォールディング、タンパク質−タンパク質相互作用などに重要なアミノ酸残基の切断により、又は修飾によってもたらされうる。
【００７３】
機能性Ｍｓｉ２タンパク質の発現の減損は、例えば、ＣＲＩＳＰ、ＲＮＡｉ、ＶＩＧＳなどを使用する、遺伝子サイレンシングによっても達成されうる。
【００７４】
加えて、機能性Ｍｓｉ２タンパク質の発現の減損は、Ｍｓｉ２タンパク質に特異的に結合する抗体のようなＭｓｉ２タンパク質阻害剤、又は他のＭｓｉ２阻害剤、例えば、内在性Ｍｓｉ２タンパク質の活性を遮断し、阻止し若しくは低減するタンパク質又はイオン若しくは金属のような化学阻害剤を使用することにより、或いは補助因子の除去により達成されうる。例えば、Ｍｓｉ２タンパク質に特異的に結合する抗体が、上記Ｍｓｉ２タンパク質と同時に発現され、それによってその比活性を低減することができる。
【００７５】
機能喪失型変異を含むＭｓｉ２タンパク質
本発明は、１つ又は複数の機能喪失型変異を含む、Ｍｓｉ２タンパク質、好ましくは植物起源のＭｓｉ２タンパク質を提供する。１つ又は複数の機能喪失型変異を含むそのようなＭｓｉ２タンパク質を発現し、内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を欠くか若しくはその発現の抑制された植物が、内在性Ｍｓｉ２タンパク質を発現する野生型植物と交配される場合、比較的高頻度で半数体植物が形成される。半数体植物は、少なくとも０．１、０．５、１、５、１０、２０％又はそれ超のような、正常を超える頻度で形成される。１つ又は複数の機能喪失型変異を含むＭｓｉ２タンパク質は、当業者に公知の多様な手段によって創出されうる。これらは、制限なく、ランダム変異誘発、単一又は複数アミノ酸標的変異誘発、完全な又は部分的なタンパク質ドメイン欠失の生成、異種アミノ酸配列との融合などを含む。典型的に、内在性Ｍｓｉ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドがノックアウトされ又は不活性化されて、内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を欠く植物を創出する。
【００７６】
１つ又は複数の機能喪失型変異を含むＭｓｉ２タンパク質は、例えば、内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を欠く植物における、１つ又は複数の機能喪失型変異を含むＭｓｉ２タンパク質の組換え発現、上記トランスジェニック植物を内在性Ｍｓｉ２タンパク質を発現する植物に交配させること、次いで半数体後代の産生についてスクリーニングすることによって試験されうる。
【００７７】
任意の数の変異が、内在性Ｍｓｉ２タンパク質に導入されて、１つ又は複数の機能喪失型変異を含むＭｓｉ２タンパク質を生成することができる。例えば、１つ又は複数の機能喪失型変異を含むＭｓｉ２タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８個又はそれ超のアミノ酸以外は内在性Ｍｓｉ２タンパク質と同一であってもよい。
【００７８】
Ｍｓｉ２タンパク質は、植物Ｍｓｉ２タンパク質であることが好ましい。植物は任意の植物であってもよいが、ナス科に、より好ましくはナス属に、さらにより好ましくはトマト種に属することが好ましい。
【００７９】
ある実施形態において、１つ又は複数の機能喪失型変異は、配列番号１、１０、２又は３のいずれかに示されるアミノ酸配列によって表される内在性Ｍｓｉ２タンパク質において引き起こされる。代替的に又は追加的に、１つ又は複数の機能喪失型変異は、配列番号１、１０、２若しくは３のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は配列番号１、１０、２若しくは３のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％若しくはそれ超、例えば、１００％のアミノ酸配列同一性を、好ましくは長さ全体にわたって有するその変異体により表される内在性Ｍｓｉ２タンパク質において引き起こされてもよい。アミノ酸配列同一性は、上で定義されたＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム並びにＧＡＰデフォルトパラメータを使用するペアワイズアライメントにより決定される。
【００８０】
１つ又は複数の機能喪失型変異を含むＭｓｉ２タンパク質内の１つ又は複数の機能喪失型変異は、タンパク質内のあらゆる場所に位置する可能性がある。ある実施形態において、機能喪失型変異は、配列番号１、１０、２若しくは３のいずれかに示されるアミノ酸配列により表される内在性Ｍｓｉ２タンパク質又は本明細書に教示されるその変異体のＷＤ４０リピート中に又はＣＡＦ１Ｃドメイン中に位置する。
【００８１】
本明細書に教示されるＭｓｉ２タンパク質は、機能喪失型変異を有する、植物Ｍｓｉ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドによりコードされてもよい。このタンパク質は、その内在性Ｍｓｉ２タンパク質の非存在下で植物中に存在する場合、上記植物が野生型植物と交配されるときに、上記植物の生存可能性に影響を及ぼすことなく、いくつかの半数体後代又は異常な倍数性を有する後代の生成を可能とする。
【００８２】
本明細書に教示されるＭｓｉ２タンパク質は、配列番号１若しくは１０のアミノ酸配列、又は配列番号１若しくは１０のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、なおさらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を有するその変異体を含むポリペプチドに由来してもよく、前記タンパク質は、機能喪失型変異を有する、植物Ｍｓｉ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドによりコードされており、このタンパク質は、その内在性Ｍｓｉ２タンパク質の非存在下で植物中に存在する場合、上記植物が野生型植物と交配されるときに、いくつかの半数体後代又は異常な倍数性を有する後代の生成を可能とする。
【００８３】
本明細書に教示されるＭｓｉ２タンパク質は、配列番号２若しくは３のアミノ酸配列、又は配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、なおさらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を有するその変異体を含むポリペプチドに由来してもよく、前記ポリペプチドは、機能喪失型変異を有する、植物Ｍｓｉ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドによりコードされており、このポリペプチドは、その内在性Ｍｓｉ２タンパク質の非存在下で植物中に存在する場合、上記植物が野生型植物と交配されるときに、いくつかの半数体後代又は異常な倍数性を有する後代の生成を可能とする。
【００８４】
本明細書に教示されるＭｓｉ２タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列、又は配列番号３のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、なおさらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を有するその変異体を含むポリペプチドに由来してもよく、上記ポリペプチドは、機能喪失型変異を有する、植物Ｍｓｉ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドによりコードされており、これは、その内在性Ｍｓｉ２タンパク質の非存在下で植物中に存在する場合、上記植物が野生型植物と交配されるときに、いくつかの半数体後代又は異常な倍数性を有する後代の生成を可能とする。
【００８５】
本明細書に教示される植物が野生型植物と交配される場合、産生される後代の少なくとも０．１、０．５、１又は５％が半数体であるか、又は異常な倍数性を有するか、又は倍加半数体であることが好適である。
【００８６】
ある実施形態において、１つ又は複数の機能喪失型変異は、タンパク質の切断を引き起こす未成熟な終止コドンを導入する。
【００８７】
一実施形態において、タンパク質は、配列番号２又は３の１２５位のアミノ酸残基の後で切断されている。
【００８８】
ある実施形態において、本明細書に教示されるＭｓｉ２タンパク質は、配列番号４又は９の核酸配列を含む核酸分子によりコードされている。
【００８９】
１つ又は複数の機能喪失型変異を含むＭｓｉ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド、キメラ遺伝子、ベクター、宿主細胞
ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びＲＮＡ分子のような、上記タンパク質のいずれかをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドも提供される。遺伝コードの縮重により、様々な核酸配列が同じアミノ酸配列をコードしうる。Ｍｓｉ２タンパク質又はその変異体をコードする任意のポリヌクレオチドは、本明細書において「Ｍｓｉ２をコードするポリヌクレオチド」と呼ばれる。提供されるポリヌクレオチドは、自然起源の、人工の又は合成の核酸配列を含む。配列がＤＮＡ配列として示されるが、ＲＮＡが言及される場合、ＲＮＡ分子の実際の塩基配列は、チミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）に置換されているという相違以外は同一であると理解される。
【００９０】
本発明は、さらに、本明細書に教示される１つ又は複数の機能喪失型変異を含むＭｓｉ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。上記ポリヌクレオチドは、合成、組換え及び／又は単離されたポリヌクレオチドであってもよい。ある実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、配列番号５、７若しくは８の核酸配列、又は配列番号５、７若しくは８の核酸配列に対して、好ましくは全長にわたって、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％、９５％のような少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するその変異体を含む、内在性Ｍｓｉ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド、例えば、Ｍｓｉ２遺伝子に由来し、これは、配列番号５、７又は８のアミノ酸配列を含むポリペプチドの内在性Ｍｓｉ２活性を共有する。対照的に、本明細書に教示される１つ又は複数の機能喪失型変異を含む、Ｍｓｉ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、内在性Ｍｓｉ２タンパク質のＭｓｉ２活性の９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０％未満まで、内在性Ｍｓｉ２活性を低減又は除去する、１つ又は複数の変異を含む。本明細書に教示されるＭｓｉ２タンパク質は、内在性Ｍｓｉ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドの非存在下で植物中に存在する場合、上記植物が野生型植物と交配されるときに、いくつかの半数体後代又は異常な倍数性を有する後代の生成を可能とすることが好ましい。
【００９１】
本明細書に教示される核酸分子は、半数体インデューサー系統を産生するために使用されうる。
【００９２】
本発明の一実施形態において、上述の（１つ又は複数の機能喪失型変異を含むＭｓｉ２タンパク質、又はその変異体若しくは断片を含む）Ｍｓｉ２タンパク質をコードする核酸配列は、宿主細胞中へのＭｓｉ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドの導入及び形質転換された細胞（複数可）に由来する細胞、組織、器官又は生物のような、宿主細胞におけるＭｓｉ２タンパク質（複数可）の産生のためのキメラ遺伝子、及び／又はベクターを作製するために使用される。植物細胞における本明細書に教示されるＭｓｉ２タンパク質（又はそのタンパク質断片若しくは変異体）の産生のためのベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
【００９３】
Ｍｓｉ２タンパク質の発現のための好適な宿主細胞としては、原核生物、酵母又は高等真核細胞が挙げられる。細菌、真菌、酵母及び哺乳動物細胞宿主とともに使用するのに適したクローニング及び発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８５年）に記載されている。本明細書に記載の核酸配列由来のＲＮＡを使用して本発明のタンパク質を産生するために、無細胞翻訳システムも採用されうる。
【００９４】
好適な原核生物宿主細胞としては、グラム陰性及びグラム陽性生物、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）又は桿菌が挙げられる。別の好適な原核生物宿主細胞は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、特にアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）が挙げられる。
【００９５】
本明細書に教示されるＭｓｉ２タンパク質は、例えば、サッカロミセス属（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））由来の酵母宿主細胞においても発現されうる。ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）又はクリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）のような他の酵母属も採用されうる。
【００９６】
代替的には、本明細書に教示されるＭｓｉ２タンパク質は、植物細胞、真菌細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞、任意選択で非ヒト細胞を含む、高等真核生物宿主細胞において発現されてもよい。
【００９７】
本発明の一実施形態は、本明細書に教示されるポリヌクレオチドを含むように改変された非ヒト生物である。非ヒト生物及び／又は宿主細胞は、例えば、脂質及びウイルスベクターのような送達デバイスの使用、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、化学的方法及び粒子媒介性遺伝子導入を含む、遺伝子導入のための本分野で公知の任意の方法により改変されてもよい。有利な実施形態において、非ヒト生物は植物である。
【００９８】
任意の植物細胞が好適な宿主細胞でありうる。本明細書中で使用される用語「植物細胞」は、プロトプラストを含む。好適な植物細胞としては、単子葉植物又は双子葉植物由来のものが挙げられる。例えば、植物は、（トマトを含む）ナス属、タバコ属、トウガラシ属、ペチュニア属及び他の属に属しうる。以下の宿主種：タバコ（タバコ種、例えば、Ｎ．ベンサミアナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、Ｎ．プルムバギニフォリア（Ｎ．ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）、Ｎ．タバクム（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）など）、例えば、チェリートマト、セラシフォルム（ｃｅｒａｓｉｆｏｒｍｅ）変種又はカラントトマト、ピンピネリフォリウム（ｐｉｍｐｉｎｅｌｉｆｏｌｉｕｍ）変種又はツリートマト（タマリロ（Ｓ．ｂｅｔａｃｅｕｍ）、キフォマンドラ・ベタケア（Ｃｙｐｈｏｍａｎｄｒａ  ｂｅｔａｃｅａｅ）の同義語）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ナス（ソラヌム・メロンゲナ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ））、ペピーノ（ソラヌム・ムリカツム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｕｒｉｃａｔｕｍ））、ココナ（ソラヌム・セシリフロラム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｓｅｓｓｉｌｉｆｌｏｒｕｍ））及びナランジラ（ソラヌム・キトエンセ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｑｕｉｔｏｅｎｓｅ））、ペッパー（トウガラシ、キダチトウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｆｕｔｅｓｃｅｎｓ）、キイロトウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｂａｃｃａｔｕｍ））のようなトマト（Ｌ．エスキュレンツム（Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、トマトの同義語）のような野菜種、観賞用種（例えば、ニチニチアサガオ（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）、ペチュニア・アキシラリス（Ｐｅｔｕｎｉａ  ａｘｉｌｌａｒｉｅｓ）、Ｐ．インテグリフォリア（Ｐ．ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ））、コーヒーノキ（コーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ））が好適に使用されうる。
【００９９】
代替的には、植物は、ウリ科又はイネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）のような任意の他の科に属してもよい。好適な宿主植物としては、例えば、トウモロコシ／コーン（ゼア（Ｚｅａ）種）、コムギ（トリティクム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）種）、オオムギ（例えば、ホルデウム・ウルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ））、エンバク（例えば、アベナ・サティバ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ））、モロコシ（タカキビ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ））、ライムギ（セカレ・ケレアレ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ））、ダイズ（グリキーネ種（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｓｐｐ．）、例えば、Ｇ．マックス（Ｇ．ｍａｘ））、ワタ（ゴシピウム種（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えば、Ｇ．ヒルスツム（Ｇ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、Ｇ．バルバデンセ（Ｇ．ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ））、アブラナ種（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐｐ．）（例えば、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、芽キャベツ（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ）、カブ（Ｂ．ｒａｐａ）など）、ヒマワリ（ヘリアンサス・アヌース（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ））、紅花、ヤム、キャッサバ、アルファルファ（ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ））、コメ（オリザ種（Ｏｒｙｚａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えば、Ｏ．サティバ・インディカ栽培品種群（Ｏ．ｓａｔｉｖａ  ｉｎｄｉｃａ  ｃｕｌｔｉｖａｒ−ｇｒｏｕｐ）、又はジャポニカ栽培品種群（ｊａｐｏｎｉｃａ  ｃｕｌｒｉｖａｒ  ｇｒｏｕｐ））、飼料草、パールミレット（ペニセツム種（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｓｐｐ．）、例えば、トウジンビエ（Ｐ．ｇｌａｕｃｕｍ））、樹木種（松果体、ポプラ、モミ、プラシテンなど）、チャノキ、コーヒーノキ、油やし、ココナッツ、エンドウ、ズッキーニ、マメ（例えば、インゲンマメ種（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  Ｓｐｅｃｉｅｓ））、キュウリ、アーティチョーク、アスパラガス、ブロッコリー、ニンニク、リーク、レタス、タマネギ、ラディッシュ、カブ、芽キャベツ、ニンジン、カリフラワー、チコリ、セロリ、ホウレンソウ、エンダイブ、フェンネル、ビーツ、生果実を含む植物（ブドウ、モモ、プラム、イチゴ、マンゴー、リンゴ、プラム、サクランボ、アプリコット、バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、ミカン、キーウィ、イチジク、レモン、ライム、ネクタリン、ラズベリー、スイカ、オレンジ、グレープフルーツなど）のような野菜種、観賞用種（例えば、バラ、ペチュニア、キク、ユリ、ガーベラ種）、ハーブ（ミント、パセリ、バジル、タイムなど）、木質性樹木（ｗｏｏｄｙ  ｔｒｅｅ）（例えば、ハコヤナギ、シダレヤナギ、コナラ、ユーカリ）、繊維種、例えば、麻（アマ）及び大麻（カンナビス・サティバ（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａ））、又はシロイヌナズナのようなモデル生物が挙げられる。
【０１００】
好ましい宿主細胞は、「作物植物」又は「栽培植物」、すなわち、ヒトにより栽培され、育種される植物種に由来する。作物植物は、食品若しくは飼料目的（例えば、農作物）のため、又は鑑賞目的（例えば、切り花、芝生のための草の生産など）のために栽培されうる。本明細書に定義される作物植物としては、燃料のための油、プラスチックポリマー、医薬品、コルク、（ワタのような）繊維などのような、非食品製品がそこから収穫される植物も挙げられる。
【０１０１】
本明細書に教示されるＭｓｉ２タンパク質をコードする核酸配列の宿主細胞のゲノムへの、好ましくは安定な、導入のためのキメラ遺伝子及びベクターの構築は、当分野で一般に公知である。キメラ遺伝子を生成するために、本明細書に教示されるＭｓｉ２タンパク質をコードする核酸配列が、標準的な分子生物学の技術を使用して、宿主細胞における発現に好適なプロモーター配列に操作可能に連結される。Ｍｓｉ２タンパク質をコードする核酸配列が、プロモーター配列の下流のベクター中に単純に挿入されるように、プロモーター配列はすでにベクター中に存在してもよい。次いで、ベクターは、宿主細胞を形質転換するために使用されることができ、キメラ遺伝子は、核ゲノム又はプラスチド、ミトコンドリア若しくは葉緑体ゲノム中に挿入されて、好適なプロモーターを使用して発現されることができる（例えば、Ｍｃ  Ｂｒｉｄｅら、１９９５年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３巻、３６２ページ；米国特許第５，６９３，５０７号）。ある実施形態において、本明細書に教示されるキメラ遺伝子は、本明細書に教示されるＭｓｉ２タンパク質をコードする核酸配列に操作可能に連結された、植物細胞又は微生物細胞（例えば、細菌）における発現のための好適なプロモーターであって、任意選択で３’非翻訳核酸配列がその後に続く、プロモーターを含む。細菌はその後、植物の形質転換に使用されてもよい（アグロバクテリウム媒介性の植物形質転換）。
【０１０２】
本発明は、１）例えば、Ｍｓｉ２遺伝子をノックアウトすることによるＭｓｉ２遺伝子の発現の阻止若しくは低減；２）Ｍｓｉ２遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳の阻止若しくは低減、或いは３）非機能性Ｍｓｉ２タンパク質の発現のいずれかにより、機能性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を欠く、植物、特に作物植物、より具体的には、ナス科に、より具体的には、ナス属に、なおより具体的には、トマト種に属する植物にも関する。
【０１０３】
１つ又は複数の機能喪失型変異を含むＭｓｉ２ポリペプチドを発現する植物
本発明は、本明細書に教示される１つ又は複数の機能喪失型変異を含むＭｓｉ２ポリペプチドを発現する植物、種子又は植物細胞を提供する。本発明は、本明細書に教示されるポリヌクレオチド、本明細書に教示されるキメラ遺伝子又は本明細書に教示されるベクターを含む植物、種子、又は植物細胞も提供する。植物、種子又は植物細胞は、好ましくはナス科に、より好ましくはナス属に、なおより好ましくはトマト種に属する。
【０１０４】
植物、種子又は植物細胞は、内在性Ｍｓｉ２タンパク質を発現しないか、又は低減されたレベル（例えば、野生型レベルの９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０％未満）で発現することが好ましい。例えば、内在性Ｍｓｉ２タンパク質の活性若しくは発現を低減させるか若しくは除去する変異を内在性Ｍｓｉ２タンパク質に作り出すことができ、又は内在性Ｍｓｉ２タンパク質のノックアウトを作り出すことができる。この場合、遺伝子のノックアウト又は変異についてヘテロ接合性の植物を作り出すことができ、本明細書に教示される１つ又は複数の機能喪失型変異を含むＭｓｉ２タンパク質の植物中での発現のための発現ベクターを導入することができる。次いで、変異又はノックアウトについてホモ接合性であるが、１つ又は複数の機能喪失型変異を含むＭｓｉ２タンパク質を含む、ヘテロ接合体由来の後代が選択されうる。
【０１０５】
したがって、本明細書に教示される植物、種子又は植物細胞において、上記植物又は植物細胞が顕著に又は本質的に完全に、内在性Ｍｓｉ２活性を欠くように、一方又は両方の内在性Ｍｓｉ２アレルがノックアウトされるか又は変異させられる。そのような植物は生存可能であることがわかった。二倍体を超える染色体の組を有する植物において、すべての内在性Ｍｓｉ２アレルは、不活性化され、変異させられ又はノックアウトされてもよい。代替的に、当分野で公知の任意の方法で、例えば、内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を低減させ又は除去するｓｉＲＮＡ又はマイクロＲＮＡを導入することにより、内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現が停止されてもよい。
【０１０６】
ある実施形態において、本発明は、本明細書に教示される核酸分子を含むトマト植物、種子又は植物細胞に関する。
【０１０７】
ある実施形態において、本発明は、本明細書に教示されるＭｓｉ２タンパク質をコードする核酸分子を含むトマト植物、種子又は植物細胞に関する。
【０１０８】
ある実施形態において、上記トマト植物、種子又は植物細胞は、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子を含む。
【０１０９】
ある実施形態において、上記トマト植物、種子又は植物細胞は、配列番号４又は９の核酸分子を含む。
【０１１０】
上記トマト植物、種子又は植物細胞は、半数体トマト植物を産生するため及び／又は倍加半数体トマト植物を産生するために使用されうる。
【０１１１】
ある実施形態において、上記トマト植物、種子又は植物細胞は、少なくとも胚発生の間は内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を欠いている。
【０１１２】
植物の生成のための方法
（標的ヌクレオチド交換（ＴＮＥ）又はオリゴ指向変異誘発（ｏｌｉｇｏ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＯＤＭ）とも呼ばれる）標的変異誘発法を使用して、内在性Ｍｓｉ２遺伝子を修飾することは、本発明の一実施形態である。標的変異誘発法としては、制限なく、植物プロトプラストへの、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Ｃａｓ９様、Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ若しくはＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＣＲＩＳＰＲシステムを採用するもの、又はＭｓｉ２遺伝子に相補的な配列により変異誘発を促進するための、化学修飾されたヌクレオチドを含有する可能性のある変異誘発性のオリゴヌクレオチドを採用する標的変異誘発（例えば、ＫｅｙＢａｓｅ（登録商標）又はＴＡＬＥＮ）が挙げられる。
【０１１３】
代替的に、１つ又は複数の機能喪失型変異を含むＭｓｉ２タンパク質をコードするＭｓｉ２遺伝子を含む植物系統を生成するために、ＴＩＬＬＩＮＧ（どちらも参照により本明細書に組み込まれる、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｏｃａｌ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ＩＮ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ；ＭｃＣａｌｌｕｍら、２０００年、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、１８巻：４５５ページ及びＭｃＣａｌｌｕｍら、２０００年、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１２３巻、４３９〜４４２ページ）のような変異誘発システムが使用されてもよい。ＴＩＬＬＩＮＧは、伝統的な化学的変異誘発（例えば、ＥＭＳ変異誘発）、その後に続く変異に関するハイスループットスクリーニングを使用する。よって、所望の変異を有するＭｓｉ２遺伝子を含む植物、種子及び組織が得られうる。
【０１１４】
この方法は、植物種子に変異を起こさせるステップ（例えば、ＥＭＳ変異誘発）、植物個体又はＤＮＡをプールするステップ、目的の領域のＰＣＲ増幅ステップ、ヘテロ二本鎖の形成及びハイスループット検出ステップ、変異体植物の同定ステップ、変異体ＰＣＲ産物のシーケンシングステップを含みうる。そのような改変植物を生成するために、他の変異誘発及び選択方法が同等に使用されうることは理解される。例えば、種子が照射されるか又は化学処理されてもよく、植物が改変表現型に関してスクリーニングされてもよい。
【０１１５】
改変植物は、非改変植物、すなわち、野生型植物から、ＤＮＡ中に存在する変異（複数可）のような分子的方法により及び改変表現型の特徴により識別することができる。改変植物は、変異に関してホモ接合性又はヘテロ接合性でありうる。
【０１１６】
よって、本明細書に教示される植物を作製するための方法であって、
ａ）植物細胞内の内在性Ｍｓｉ２タンパク質をコードする核酸分子を改変して、本明細書に教示される変異した、Ｍｓｉ２タンパク質をコードする核酸分子を得るか、又は植物細胞内の内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を阻止するか、又は発現をノックアウトするために、植物細胞内の上記内在性Ｍｓｉ２タンパク質をコードする核酸分子を改変するステップと；
ｂ）変異した核酸分子を含む植物細胞、又は上記内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現が阻止され若しくはノックアウトされている植物細胞を選択するステップと；
ｃ）任意選択で、上記植物細胞から植物を再生するステップと
を含む、方法が提供される。
【０１１７】
本発明は、本明細書に教示される植物を作製するための方法であって、
ａ）本明細書に教示される核酸分子、本明細書に教示されるキメラ遺伝子又は本明細書に教示されるベクターを使用して植物細胞を形質転換するか、又は内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を阻止し又は発現をノックアウトするために、核酸分子を使用して植物細胞を形質転換するステップと；
ｂ）任意選択で、内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を阻止し又は発現をノックアウトするために、追加的に、上記植物細胞において内在性Ｍｓｉ２タンパク質をコードする核酸分子を改変するステップと；
ｃ）本明細書に教示される核酸分子、本明細書に教示されるキメラ遺伝子若しくは本明細書に教示されるベクターを含む植物細胞、又は上記内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現が阻止されているか又はノックアウトされている植物細胞を選択するステップと；
ｄ）任意選択で、上記植物細胞から植物を再生するステップと
を含む、方法をさらに提供する。
【０１１８】
本発明は、本明細書に教示される植物を作製するための方法であって、ｉ）本明細書に教示されるポリヌクレオチド、本明細書に教示されるキメラ遺伝子、又は本明細書に教示されるベクターを使用して、植物細胞を形質転換するステップと；ｉｉ）上記ポリヌクレオチドを含む植物細胞を選択するステップと；ｉｉｉ）任意選択で、上記植物細胞から植物を再生するステップとを含む、方法も提供する。
【０１１９】
本明細書に教示される植物を作製するための方法は、上記植物細胞内での内在性植物Ｍｓｉ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを修飾して、内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を防止するステップをさらに含んでもよい。
【０１２０】
本明細書に教示されるＭｓｉ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド、好ましくはＭｓｉ２タンパク質をコードするキメラ遺伝子は、従来の方法で単一の植物細胞の核ゲノム中に安定に挿入されることができ、そのようにして形質転換された植物細胞は、従来の方法において使用されて、ある特定の時点におけるある特定の細胞中の本明細書に教示されるＭｓｉ２タンパク質の存在により、変更された表現型を有する形質転換された植物を生成することができる。これに関して、アグロバクテリウム・ツメファシエンス中の本明細書に教示されるＭｓｉ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＴ−ＤＮＡベクターは、植物細胞を形質転換するために使用されることができ、その後、例えば、欧州特許第０１１６７１８号、同第０２７０８２２号、国際公開第８４／０２９１３号及び欧州特許出願公開第０２４２２４６号に、並びにＧｏｕｌｄら、（１９９１年、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、９５巻、４２６〜４３４ページ）に記載の手順を使用して、形質転換された植物が再生されうる。アグロバクテリウム媒介性の植物形質転換のためのＴ−ＤＮＡベクターの構築は、当分野で周知である。Ｔ−ＤＮＡベクターは、欧州特許第０１２０５６１号及び同第０１２０５１５号に記載のバイナリーベクター又は欧州特許第０１１６７１８号に記載の相同組換えによりアグロバクテリウムＴｉプラスミド中に組み入れることのできる共挿入ベクターのいずれかであってもよい。
【０１２１】
同様に、形質転換された植物細胞からの形質転換された植物の選択及び再生は、当分野で周知である。明らかに、異なる種ごとに、さらには単一の種の様々な亜種又は栽培品種ごとにも、高頻度で形質転換体が再生されるように具体的にプロトコールを適合させる。
【０１２２】
結果として生じる形質転換された植物は、その後倍加半数体となりうる半数体植物を産生するために、従来の植物育種スキームにおいて使用されうる。
【０１２３】
半数体植物及び／又は倍加半数体植物の生成のための方法
本発明は、半数体植物、異常な倍数性を有する植物又は倍加半数体植物を生成する方法であって、
ａ）内在性Ｍｓｉ２タンパク質を発現する植物を、本明細書に教示される改変植物に交配するステップであって、本明細書に教示される改変植物は、少なくとも胚発生の間は、内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を欠く、ステップと；
ｂ）種子を収集するステップと；
ｃ）上記種子から、少なくとも１つの実生、小植物又は植物を生育させるステップと；
ｄ）半数体実生、小植物若しくは植物、異常な倍数性を有する実生、小植物若しくは植物；又は倍加半数体実生、小植物若しくは植物を選択するステップと；
を含む、方法にも関する。
【０１２４】
内在性Ｍｓｉ２タンパク質を発現する上記植物は、Ｆ１植物であってもよい。
【０１２５】
内在性Ｍｓｉ２タンパク質を発現する植物は、交配の花粉親であってもよく、又は交配の胚珠親であってもよい。
【０１２６】
内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を欠く、本明細書に教示される改変植物を、野生型植物に交配することは、半数体であって、内在性Ｍｓｉ２タンパク質を発現する植物由来の染色体のみを含む、少なくともいくつかの後代をもたらす。よって、本発明は、目的の植物と機能性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を欠く植物を交配し、生じた半数体種子を採取することによって、そのすべてが目的の植物に由来する染色体を有する半数体植物の生成を可能とする。
【０１２７】
よって、親の遺伝子型に依存しない正確な分子変化により、ゲノム排除が操作されうる。Ｍｓｉ２タンパク質はいかなる植物種にも見出される。これは、半数体細胞の組織培養及び遠縁交雑のような半数体植物産生のための従来の方法が成功しない種において半数体植物を作製することを可能とする。
【０１２８】
本明細書に教示される機能性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を欠く植物は、雄親又は雌親のいずれかとして交配されてもよい。本明細書に教示される方法は、親染色体の母系細胞質への導入を可能にする。よって、単一のステップにおいて、所望の遺伝子型を有する細胞質雄性不稔系統を生成することができる。
【０１２９】
本発明は、倍加半数体植物を生成する方法であって、
ａ）内在性Ｍｓｉ２タンパク質を発現する植物を、本明細書に教示される改変植物に交配するステップであって、本明細書に教示される改変植物は、少なくとも胚発生の間は、内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を欠く、ステップと；
ｂ）半数体植物を選択するステップと；
ｃ）上記半数体植物を倍加半数体植物に転換するステップと
を含む方法に関する。
【０１３０】
よって、半数体植物は、ひとたび生成されると、染色体の正確な二本鎖コピーを含む倍加半数体植物の生成に使用することができる。半数体生物から倍加半数体生物を生成するために多種多様な方法が公知である。半数体植物を倍加半数体植物に転換するために、例えば、コルヒチンのような化学物質が適用されてもよい。代替的には、倍数体は、胚発生の間又は植物の後期発生段階において自発的に倍加しうる。
【０１３１】
Ｆ１、Ｆ２又は所望の形質を有する次世代の植物を生成するために、倍加半数体植物は他の植物にさらに交配されうる。
【０１３２】
トランスジェニック又は変異誘発された遺伝子を保有しない倍加半数体植物が得られうる。加えて、倍加半数体植物は、ハイブリッドＦ１から速やかにホモ接合性のＦ２を創出することができる。
【０１３３】
本発明は、半数体又は倍加半数体植物を生成する方法であって、内在性Ｍｓｉ２タンパク質を発現する植物及び本明細書に教示される植物を同定するステップであって、本明細書に教示される植物は、少なくともその生殖部分において及び／又は胚発生の間は内在性Ｍｓｉ２タンパク質の発現を欠く、ステップを含む、方法にも関する。
【０１３４】
ある実施形態において、交配することは、植物の全ゲノムを有性交配することを含まない。その代わりに、１組の染色体が排除される。
【０１３５】
配列表
配列番号１：植物Ｍｓｉ２コンセンサスタンパク質配列
配列番号２：ナス属コンセンサスＭｓｉ２タンパク質配列
配列番号３：トマトＭｓｉ２タンパク質配列
配列番号４：トマトＭｓｉ２＿Ｋ１２６＊コード配列
配列番号５：トマトＭｓｉ２コード配列
配列番号６：トマトＭｓｉ２＿Ｋ１２６＊切断型タンパク質配列
配列番号７：ナス属コンセンサスＭｓｉ２コード配列
配列番号８：トマトＭｓｉ２ゲノムＤＮＡ配列
配列番号９：トマトＭｓｉ２＿Ｋ１２６＊ゲノムＤＮＡ配列
配列番号１０：ナス科コンセンサスＭｓｉ２タンパク質配列
【実施例】
【０１３６】
実施例１：トマトにおける片親ゲノム排除
材料及び方法
植物材料
３種のトマト栽培品種、すなわち、「ＭｏｎｅｙＢｅｒｇＴＭＶ＋」、「ＭｉｃｒｏＴｏｍ」及び「ＲＺ５２２０１」を使用した。国際公開第ＷＯ２００７／０３７６７８号及び同第ＷＯ２００９／０４１８１０号に記載の方法に従って、トマトＲＺ５２２０１変異体集団から、遺伝子Ｍｓｉ２における２種の体細胞非同義変異体、すなわち、どちらもアミノ酸１２６位において変異しているＭｓｉ２＿Ｋ１２６−ＳＴＯＰ及びＭｓｉ２＿Ｋ１２６Ｍを選択した。選択した変異体植物を自家授粉させ、子孫において、変異遺伝子座についてホモ接合性であった植物を選択した。国際公開第ＷＯ２００７／０３７６７８号及び同第ＷＯ２００９／０４１８１０号に記載の方法に従って、トマトＭｏｎｅｙＢｅｒｇＴＭＶ＋変異体集団から、遺伝子Ｍｓｉ２における体細胞同義変異体、すなわち、アミノ酸３３７位において変異した（ＣからＴ）Ｍｓｉ２＿Ｄ３３７Ｄを選択した。選択した変異体を自家授粉させ、子孫において、変異遺伝子座についてホモ接合性であった植物を選択した。
【０１３７】
方法
片親ゲノムの排除及び結果として生じる半数体植物の産生を、いわゆる半数体インデューサー系統と別の非半数体インデューサー系統、例えば、育種系統の間の交配を行うことによって誘発した。高い温度が、一部の場合のみではあるが、片親ゲノムの排除を起こすのに好ましい効果を及ぼすことがわかっている（Ｓａｎｅｉら、ＰＮＡＳ  １０８．３３（２０１１年）；Ｅ４９８〜Ｅ５０５）ため、片親ゲノムの排除のためのトマト系統の交配を、比較的高温（２６〜２８℃）で実施した。
【０１３８】
結果
Ｍｓｉ２＿Ｋ１２６−ＳＴＯＰ変異体におけるＡからＴへの非同義変異は、未成熟の終止コドンの導入及びそれにより切断型タンパク質（配列番号６）の産生をもたらした。Ｍｓｉ２＿Ｋ１２６Ｍ変異体におけるＡからＴへの非同義変異は、リシンからメチオニンへのアミノ酸修飾をもたらした。さらに、Ｍｓｉ２タンパク質についてＳＩＦＴ解析を実施し、この解析により、１２６位におけるリシンからメチオニンへの変異をニュートラルと等級付けした（Ｋｕｍａｒら、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．、２００９年；４巻（７号）：１０７３〜８１ページ）。Ｍｓｉ２＿Ｄ３３７Ｄ変異体におけるＣからＴへの同義変異は、アミノ酸修飾をもたらさなかった。変異していない野生型ＭｉｃｒｏＴｏｍ植物を雌株又は花粉ドナーとしてそれぞれ使用する、比較的高温（２６〜２８℃）での交配において、Ｍｓｉ２＿Ｋ１２６−ＳＴＯＰ、Ｍｓｉ２＿Ｋ１２６Ｍ又はＭｓｉ２＿Ｄ３３７Ｄについてホモ接合性の３種の変異体植物それぞれを、花粉ドナーとして及び雌株として使用した。表１は、行ったすべての交配及びＭｉｃｒｏＴｏｍ表現型について評価した蒔いた種子の概要を列挙する。
【０１３９】
【表１】
2018530323.tif 000002
【０１４０】
表１に列挙した交配に由来する種子を蒔き、フローサイトメトリーによってそのＤＮＡ含有量に関して植物を評価した。フローサイトメトリー分析は、試験したすべての植物について、ＭｏｎｅｙＢｅｒｇＴＭＶ＋のような野生型トマト栽培品種と同様の正常な二倍体の倍数性レベルのみの決定をもたらした。栽培品種ＭｉｃｒｏＴｏｍは、劣性であることが公知の矮性表現型を有する（Ｍａｒｌｉら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔ、５７巻、９号、２０３７〜２０４７ページ、２００６年）。ＭｉｃｒｏＴｏｍの、例えば、ＭｏｎｅｙＢｅｒｇＴＭＶ＋又はＲＺ５２２０１野生型栽培品種への又はそれとの交配後、それぞれＭｏｎｅｙＢｅｒｇＴＭＶ＋又はＲＺ５２２０１野生型栽培品種の不確定な非矮性表現型を有する子孫のみを認めた。Ｍｓｉ２＿Ｄ３３７Ｄ同義変異体とＭｉｃｒｏＴｏｍの交配について同じことが認められ；ＭｉｃｒｏＴｏｍとＭｓｉ２＿Ｄ３３７Ｄ変異体の交配のすべての子孫は、ＭｏｎｅｙＢｅｒｇＴＭＶ＋親の不確定な非矮性表現型を示した。ＭｉｃｒｏＴｏｍ及びＭｓｉ２＿Ｋ１２６Ｍ変異体の相反交配は、ＭｉｃｒｏＴｏｍ表現型を有する子孫を生じさせなかった。雄親又は雌親としてＭｓｉ２＿Ｋ１２６−ＳＴＯＰを使用して、全部で１０個の植物が、ＭｉｃｒｏＴｏｍ表現型を示したことがわかった。これは、ＲＺ５２２０１親の遺伝物質が、生じた子孫の一部でないことを示しており、これらの１０個の子孫植物が、半数体ＭｉｃｒｏＴｏｍ起源であることを示している。後者の１０個の植物のすべての植物の倍数性は、二倍体であることがわかり、トマトにとっては例外的に高い出現頻度を有すると記載されている現象である自発的な倍加が起こったことを示していた（Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｏｍａｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、６２号−２０１２年１２月）。
【０１４１】
片親ゲノムの排除が起こったか否か、及びどの程度であったかを決定するために、２０１４年の子孫について、１２個のトマト染色体のそれぞれにわたって広がる、全４４の位置について一塩基多型（ＳＮＰ）アッセイを行った（１、２、３、４、５、６、１１及び１２番染色体上の４つのＳＮＰ；８及び１０番染色体上の３つのＳＮＰ；９番染色体上の２つのＳＮＰ）。２０１５年の子孫について同じ分析を、ここでは、２２の位置（１、２、３、４、５、６、７、８、１０及び１２番染色体上の２つのＳＮＰ；９及び１１番染色体上の１つのＳＮＰ）について実施した。５つの選択した一塩基多型は、ＭｉｃｒｏＴｏｍ親に関して一塩基対についてホモ接合性であり、ＲＺ５２２０１親におけるＭｉｃｒｏＴｏｍ塩基対以外はすべてについてホモ接合性であった。野生型ＭｉｃｒｏＴｏｍ栽培品種とＲＺ５２２０１栽培品種の間の通常の交配は、ヘテロ接合性の一塩基多型スコアをもたらした。しかしながら、片親ゲノム排除のプロセスが起こった場合、半数体インデューサー系統ゲノムの損失が予想される。一塩基多型試験は、ＭｉｃｒｏＴｏｍ表現型も示す５個の子孫植物のそれぞれについてＭｉｃｒｏＴｏｍ親由来のホモ接合性塩基対スコアのみのコールをもたらし、ＲＺ５２２０１親のいずれもコールしなかった。一塩基多型スコアに基づいて、Ｍｓｉ２＿Ｋ１２６−ＳＴＯＰ変異体の完全なゲノムはもはや子孫に存在しないと結論付けた。したがって、Ｍｓｉ２＿Ｋ１２６−ＳＴＯＰ変異体は、高効率の半数体インデューサー系統として機能すると結論付けられる。Ｍｓｉ２＿Ｋ１２６−ＳＴＯＰ変異体が雌親として使用される交配においては、ＭｉｃｒｏＴｏｍの自殖は無視できる。ＭｉｃｒｏＴｏｍを雌親として使用する実験においては、ＭｉｃｒｏＴｏｍ表現型を示す子孫の数が非常に少なく（８９のうちわずか２つの種子、３２５のうち１つの種子）、ホモ接合性の塩基対のみが得点したことを考えると、自殖が起こった可能性は極めて低い。
【０１４２】
Ｍｓｉ２−Ｋ１２６−ｓｔｏｐ変異体及びＲＺ５２２０１対照植物の花粉四分染色体を異常の発生についてチェックした。４つの異なる花房から少なくとも２つの花を採取し、花粉四分染色体を検査するために、葯を押しつぶした。Ｍｓｉ２−Ｋ１２６−ｓｔｏｐ変異体については、５個の個別の花からの全部で１０個の観察した葯において、微小核を観察した（図１を参照されたい）。観察した各葯において数例の微小核を認めたが、ある葯中の花粉四分染色体の１％以下は異常性を示した。ＲＺ５２２０１対照については、微小核とともに花粉四分染色体を含有する葯はめったに観察されなかった。２つの葯が、その中に全部でわずか２又は３例の微小核を観察できたことがわかった。第２ラウンドの実験において、微小核を計数した；Ｍｓｉ２−Ｋ１２６−ｓｔｏｐ変異体については、１．９４％（ｎ＝１）の頻度で微小核を観察した。ＲＺ５２２０１対照植物の花については、０．５８±０．３６％（ｎ＝５）の平均頻度で微小核を観察した。Ｍｓｉ２−Ｋ１２６−ｓｔｏｐ変異の結果、対照と比較してかなり高い頻度で減数分裂の間の染色体の分離が妨げられると結論する。異常な有糸分裂、例えば、微小核の所見は、作物における種間交配、種内交配における染色体排除及び半数体産生の直接証拠として使用されることが多い。例えば、異常な有糸分裂並びに異常な減数分裂、例えば、微小核を、トウモロコシＤＨ−インデューサー系統の研究において発見した（Ｑｉｕ、Ｆａｚｈａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻（２０１４年）：８３〜９０ページ）。Ｍｓｉ２＿Ｋ１２６−ｓｔｏｐ変異体における減数分裂時の微小核の所見は、有糸分裂の間に同様のプロセスが起こることを示唆している。野生型とＭｓｉ２＿Ｋ１２６−ｓｔｏｐ接合体の融合後、最初の有糸分裂の間に片親ゲノムの排除のプロセスが起こり、これが観察した半数体の誘導をもたらした可能性がある。
【０１４３】
実施例２：アラビドプシスにおける片親ゲノム排除
材料及び方法
植物材料
以下のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＮＡＳＣ  ｓｔｏｃｋ  ｃｅｎｔｒｅ系統：Ｃｏｌｕｍｂｉａ（バックグラウンド系統、Ｃｏｌ−０、Ｎ１０９２）、Ｃｏｌ−５（Ｎ１６４４）、アラビドプシスＭｓｉ２遺伝子（Ａｔ２ｇ１６７８０）Ｔ−ＤＮＡ挿入系統（Ｎ７２０３４４及びＮ５０１２１４、Ｃｏｌ−０バックグラウンド中）及びＭｓｉ２及びＭｓｉ３遺伝子が機能的に重複した遺伝子であるか否かが不明であるため、アラビドプシスＭｓｉ３遺伝子（Ａｔ４ｇ３５０５０）Ｔ−ＤＮＡ挿入変異体（Ｎ３０９８６０、Ｎ３０９８６３及びＮ５６４０９２、Ｃｏｌ−０バックグラウンド中）を使用した。アラビドプシスＭｓｉ２及びＭｓｉ３遺伝子における正確な挿入を決定するために、ＰＣＲ増幅及びそれに続く推定上のＴ−ＤＮＡ挿入遺伝子座のシーケンシングによって、Ｔ−ＤＮＡ挿入系統を評価した。Ｍｓｉ２又はＭｓｉ３遺伝子のいずれかのエクソンに挿入物が位置したという知見に基づいて、これらのＴ−ＤＮＡ挿入系統が、Ｍｓｉ２又はＭｓｉ３遺伝子のいずれかのための真のノックアウトであると結論付けた。開始コドンから下流側の塩基の数で計数した正確な位置は、Ｎ７２０３４４（４２９位、エクソン２）、Ｎ５０１２１４（１１１位、エクソン１）、Ｎ３０９８６３／Ｎ３０９８６０（どちらも５５９位、エクソン２）及びＮ５６４０９２（１２３７位、エクソン６）であった。２つの挿入系統の間で交配を行い、Ｍｓｉ２及びＭｓｉ３遺伝子の両方におけるホモ接合性のＴ−ＤＮＡ挿入物について選択することによって、２種の新規な二重Ｔ−ＤＮＡ挿入系統：Ｎ７２０３４４＋Ｎ３０９８６０及びＮ３０９８６３＋Ｎ５０１２１４を産生した。
【０１４４】
方法
いわゆる半数体インデューサー系統と別の非半数体インデューサー系統、例えば、Ｃｏｌｕｍｉａバックグラウンド（Ｃｏｌ−０）対照系統との間の交配を行うことによって、片親ゲノム排除及び結果として生じる半数体植物の産生を引き起こす。
【０１４５】
結果
Ｍｓｉ２のための単一Ｔ−ＤＮＡ挿入系統（Ｎ７２０３４４及びＮ５０１２１４）、Ｍｓｉ３  Ｔ−ＤＮＡ挿入系統（Ｎ３０９８６３及びＮ５６４０９２）、２つの新たに生成したＭｓｉ２／Ｍｓｉ３二重Ｔ−ＤＮＡ挿入系統（Ｎ７２０３４４＋Ｎ３０９８６０及びＮ３０９８６３＋Ｎ５０１２１４）のいずれか又はＣｏｌ−０バックグラウンド植物を、それぞれ花粉ドナーとして及び雌株として、Ｃｏｌ−５を雌株又は花粉ドナーとして使用する交配において使用する。表２は、行うことができる典型的な交配の例及びＣｏｌ−５表現型についての子孫の評価の例を列挙する。Ｃｏｌ−５は、Ｔ−ＤＮＡ挿入系統及びＣｏｌ−０、すなわち、毛状突起のない葉に比較して、明確な異なる劣性表現型を有する。
【０１４６】
【表２】
2018530323.tif 000003
【０１４７】
Ｃｏｌ−５系統は、毛状突起のない表現型を与えるｇｌ１−１／ｇｌ１−１遺伝子座を有し、これは劣性であることが公知である（Ｋｕｐｐｕら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ、１１．９、２０１５年、ｅ１００５４９４）。Ｃｏｌ−５の例えばＣｏｌ−０野生型栽培品種への又はこれとの交配後、優性なＣｏｌ−０アレル由来の毛状突起を有する子孫のみを認めた。雄親又は雌親としてのＭｓｉ２単一、Ｍｓｉ３単一又はＭｓｉ２／Ｍｓｉ３二重Ｔ−ＤＮＡ挿入系統を使用して、全部で数種の植物が、毛状突起のない表現型を示すことがわかった。これは、Ｃｏｌ−０親の遺伝物質が、生じた子孫の一部でないことを示しており、これらの子孫植物が、半数体Ｃｏｌ−５起源であることを示している。
【０１４８】
実施した交配の子孫の中でＣｏｌ−５単一の表現型を有する個体に基づいて、Ｃｏｌ−０バックグラウンドにおいて各Ｔ−ＤＮＡ挿入系統の完全なゲノムはもはや子孫に存在しないことが結論付けられる。したがって、Ｔ−ＤＮＡ挿入系統「Ｎ７２０３４４、Ｎ５０１２１４、Ｎ３０９８６３、Ｎ５６４０９２、Ｎ７２０３４４＋Ｎ３０９８６０（二重挿入系統）及びＮ３０９８６３＋Ｎ５０１２４４（二重挿入系統）」は、高効率の（倍加）半数体インデューサー系統として機能することが結論付けられる。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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