(57)【要約】本発明は、血管新生阻害ペプチドに関する。本発明は、血管新生を阻害する方法、および本発明のペプチドを使用してＶＥＧＦ誘発血管透過性に関連する障害を治療する方法にも関する。本発明は、例えば、ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）、またはこれらの断片のアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチドを必要性のある患者に投与することを含んでなる血管新生の阻害方法を提供する。一態様において、前記患者は、ＶＥＧＦ誘発透過性に関連する障害または癌に罹患している。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）、またはこれらの断片のアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチドを必要性のある患者に投与することを含んでなる血管新生の阻害方法。
【請求項２】
前記患者がＶＥＧＦ誘発透過性に関連する障害または癌に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）、またはこれらの断片のアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチドを必要性のある患者に投与することを含んでなる、ＶＥＧＦ誘発血管透過性に関連する障害を治療する方法。
【請求項４】
前記ＶＥＧＦ誘発血管透過性に関連する障害が、機能障害、視力喪失（失明）、黄斑変性、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞増殖性糖尿病性網膜症、血管新生加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、および糖尿病性増殖性網膜症、虹彩ルベオーシス、血管新生緑内障、網膜芽腫、ブドウ膜炎、ならびに角膜移植血管新生である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドがキャリアペプチドと結合している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記キャリアペプチドが、アンテナペディアペプチド（ＡＰ）、アンテナペディアペプチド、ペネトラチンペプチド、ＴＡＴ、ｔｒａｎｐｏｒｔａｎ、またはポリアルギニンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドが脂肪酸と結合している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチドがミリストイル化されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記単離ペプチドまたはその断片を、１つ以上のＶＥＧＦ阻害剤との併用で投与する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記単離ペプチドまたはその断片を、眼病のレーザー治療との併用で投与する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記単離ペプチドまたはその断片を、ステロイドとの併用で投与する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記単離ペプチド、ＶＥＧＦ阻害剤、またはステロイドを、硝子体内注射により、または局所的に送達する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
必要性のある患者における血管新生の阻害のための薬剤の製造での単離ペプチドの使用であって、前記ペプチドが、ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）、またはこれらの断片のアミノ酸配列を含んでなる、前記使用。
【請求項１４】
前記患者がＶＥＧＦ誘発透過性に関連する障害または癌に罹患している、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
ＶＥＧＦ誘発透過性に関連する障害の治療用の薬剤の製造での単離ペプチドの使用であって、前記単離ペプチドが、ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）、またはこれらの断片のアミノ酸配列を含んでなる、前記使用。
【請求項１６】
前記ＶＥＧＦ関連欠陥障害が、視力障害または視力喪失（失明）、黄斑変性、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞増殖性糖尿病性網膜症、血管新生加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、および糖尿病性増殖性網膜症、虹彩ルベオーシス、血管新生緑内障、網膜芽腫、ブドウ膜炎、ならびに角膜移植血管新生である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記ペプチドがキャリアペプチドと結合している、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
前記キャリアペプチドが、アンテナペディアペプチド（ＡＰ）、アンテナペディアペプチド、ペネトラチンペプチド、ＴＡＴ、ｔｒａｎｐｏｒｔａｎ、またはポリアルギニンである、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記ペプチドが脂肪酸と結合している、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
前記ペプチドがミリストイル化されている、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記単離ペプチドまたはその断片を、１つ以上のＶＥＧＦ阻害剤との併用で投与する、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
前記単離ペプチドまたはその断片を、眼病のレーザー治療との併用で投与する、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
前記単離ペプチドまたはその断片を、ステロイドとの併用で投与する、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
前記単離ペプチド、ＶＥＧＦ阻害剤、またはステロイドを、硝子体内注射により、または局所的に送達する、請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
血管新生の阻害のための単離ペプチドあって、前記ペプチドが、ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）、またはこれらの断片のアミノ酸配列を含んでなる、前記単離ペプチド。
【請求項２６】
ＶＥＧＦ誘発血管透過性に関連する障害に罹患している患者における血管新生の阻害に使用するための請求項２５に記載のペプチド。
【請求項２７】
ＶＥＧＦ誘発血管透過性に関連する障害の治療のための単離ペプチド。
【請求項２８】
前記ＶＥＧＦ誘発血管透過性に関連する障害が、視力障害または視力喪失（失明）、黄斑変性、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞増殖性糖尿病性網膜症、血管新生加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、および糖尿病性増殖性網膜症、虹彩ルベオーシス、血管新生緑内障、網膜芽腫、ブドウ膜炎、ならびに角膜移植血管新生である、請求項２６または２７に記載のペプチド。
【請求項２９】
前記ペプチドがキャリアペプチドと結合している、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項３０】
前記キャリアペプチドが、アンテナペディアペプチド（ＡＰ）、ペネトラチンペプチド、ＴＡＴ、ｔｒａｎｐｏｒｔａｎ、またはポリアルギニンである、請求項２９に記載のペプチド。
【請求項３１】
前記ペプチドが脂肪酸と結合している、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項３２】
前記ペプチドがミリストイル化されている、請求項３１に記載のペプチド。
【請求項３３】
前記単離ペプチドまたはその断片を、１つ以上のＶＥＧＦ阻害剤との併用で投与する、請求項２５〜３２のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項３４】
前記単離ペプチドまたはその断片を、眼病のレーザー治療との併用で投与する、請求項２５〜３３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項３５】
前記単離ペプチドまたはその断片を、ステロイドとの併用で投与する、請求項２５〜３３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項３６】
前記単離ペプチド、ＶＥＧＦ阻害剤、またはステロイドを、硝子体内注射により、または局所的に投与する、請求項２５〜３５のいずれか一項に記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年３月２日に出願された米国仮特許出願第６２／１２６，９６８号の優先権を主張し、その全体を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
本発明は、血管新生阻害ペプチドに関する。本発明は、血管新生を阻害する方法、および本発明のペプチドを使用してＶＥＧＦ誘発血管透過性に関連する障害を治療する方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
微小管（ＭＴ）細胞骨格は、内皮バリアー制御の重要な制御点を与えるが、この重要な細胞骨格要素の役割は、よく研究されていなかった。ＭＴ安定化薬剤タキソールは、肺炎症のマウスモデルにおける内皮血管漏出を減じることが示されており、これは、ＭＴが、肺血管透過性の上昇の媒介において重要であり得ることを示唆する。しかしながら、タキソールは、一般毒性を示し、そのため、医師およびその患者にとって不都合な薬剤となっている。
【０００４】
微小管末端結合タンパク質は、高度に保存された、伸長している微小管（ＭＴ）に結合する微小管プラス端追跡補助要素であり、ＭＴの破局的イベントを抑制する。２つのこのような末端結合タンパク質、ＥＢ１およびＥＢ３は、内皮細胞骨格の動態および細胞形態の変化の制御において役割を果たし、内皮バリアーの透過性の一次決定因子である。
【０００５】
Ｃａ２＋は、内皮透過性および血管のホメオスタシスを制御する非常に万能なセカンドメッセンジャーである。炎症促進性メディエータの下流でのホスホリパーゼＣβ（ＰＬＣβ）の活性化は、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）のイノシトール１，４，５−トリスリン酸（ＩＰ３）およびジアシルグリセロール（ＤＡＧ）への加水分解を促進する。ＩＰ３は、ＩＰ３感受性細胞内ストア、すなわち小胞体（ＥＲ）からのＣａ２＋の放出を刺激する。ＥＲストアからのＣａ２＋の枯渇は、ＥＲ膜上のＩＰ３Ｒの活性化により媒介され、細胞内Ｃａ２＋の一過性の増加をもたらす。Ｃａ２＋の流入または「流れ込み」は、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含む様々な陽イオンを透過させる一過性受容体電位標準的（canonical）（ＴＲＰＣ）チャネルにより媒介される。ＴＲＰＣ１および４は、ＥＲの枯渇によって活性化される内皮肺微小血管細胞内のストア感受性Ｃａ２＋チャネル（ＳＯＣ）である。
【０００６】
Ｃａ２＋の細胞内濃度の増加は、タンパク質キナーゼＣα（ＰＫＣα）の活性をアップレギュレートする。ＰＫＣαは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む複数のメディエータに対する内皮透過性応答の主要制御因子である。ＰＫＣαは、ｐ１２０−カテニンをリン酸化し、ＶＥ−カドヘリンからのその解離を媒介し、それにより、ＶＥカドヘリンの内在化をもたらし、ＰＫＣαは、ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦおよびＧＤＩ−１をリン酸化することにより、ＲｈｏＡの活性化の上流でも作用する。次に、ＲｈｏＡは、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）を活性化することにより、ミオシン軽鎖ホスファターゼ（ＭＬＣＰ）のリン酸化によって誘起される阻害を促進する。ＭＬＣＰの阻害は、ＭＬＣのリン酸化を引き起こし、トロンビンおよびヒスタミンなどの炎症促進性メディエータならびに増殖因子に応答してアクトミオシン収縮を引き起こすＭＬＣＫのＣａ２＋／カルモジュリン依存性活性化に付随して起こる。
【０００７】
ＭＴ細胞骨格の完全性は、ＥＲストアからのＩＰ３誘発性のＣａ２＋放出に必要である。ＭＴ不安定化剤またはＭＴ安定化剤のノコダゾール、コルヒチン、およびタキソールによるＭＴ動態の変化は、Ｃａ２＋のＩＰ３ゲート放出を阻害し、ＭＴ動態が、ＩＰ３Ｒの完全な活性化に必要であることを示唆する。ＭＴ細胞骨格は、ＥＲの再構成に関与し、それにより、外部刺激に対する応答においてＣａ２＋波の構築および伝播を確保する。ＥＲは、ＥＢ１およびＥＢ３の間質相互作用分子１（ＳＴＩＭ１）との直接相互作用により、ＭＴ伸長端と結合し共に伸長する。ＨｅＬａ（ＨｅＬａ細胞はＥＢ３を発現していない）におけるＥＢ１の枯渇は、ＥＲの突出イベントを減ずるが、タプシガルジンによるＳＯＣの活性化を阻害せず、いくつかの他の機構が、ＳＯＣの活性化および上皮細胞におけるカルシウムシグナリングの伝播に関与することを示唆する。内皮細胞において、小胞におけるＩＰ３Ｒの局在化は、ＥＲ  Ｃａ２＋ストア枯渇およびＳＯＣ活性化の両方に重要である。このことは、ＩＰ３Ｒの活性化および／またはＩＰ３へのその応答性が、カルシウムシグナリングの重要な要素であることを示す。これまでの発見と一致して、我々は、ＭＴ細胞骨格が、ＩＰ３に応答してＩＰ３Ｒの活性化を正に調節し、それにより、細胞全体に細胞外シグナルを伝え、生理応答を誘発するということを発見した。ＥＢ１ではなくＥＢ３は、ＩＰ３Ｒと直接相互作用し、この相互作用は、内皮細胞におけるカルシウムシグナルの構築のための重要な制御点を与える。
【０００８】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、直接的および非直接的方法により血管新生に寄与することが分かっている。ＶＥＧＦは、微小血管内皮細胞を超透過性にし、それにより血漿タンパク質を血管外スペースに流出させ、フィブリンゲルの堆積と共に溢出したｆｉｂｒｏｇｅｎの凝固を引き起こすことが分かって売る。血管外フィブリンは、新しい血管、および成熟し血管化した間質を生む他の間葉細胞の内方成長を支持するマトリックスとしての役割を果たす。したがって、ＶＥＧＦ誘発血管透過性の阻害は、血管新生の阻害をもたらすことになる。ＶＥＧＦ誘発血管透過性を予防し、血管新生を阻害するために、新規の治療法が必要である。
【０００９】
血管の腫瘍のネットワークの形成、すなわち血管新生は、腫瘍が成長し転移するよう促すことにより、腫瘍成長全体に亘って重要な役割を果たす。    腫瘍病巣の直径が数ミリメートルを超えると、低酸素および栄養枯渇が、「血管新生スイッチ」を始動する。腫瘍細胞は、内皮細胞の発芽および増殖を刺激する、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を放出する。いくつかの増殖受容体を標的とする、ＶＥＧＦ−Ａに対するヒト化機能性遮断抗体断片であるAvastin（ベバシズマブ）、およびチロシンキナーゼ阻害剤であるソラフェニブおよびスニチニブを含む、いくつかの抗血管新生療法が、癌についてＦＤＡにより現在認可されている。したがって、腫瘍関連血管新生を制御する治療法は、癌の進行および転移を制限する有望な方法である。
【００１０】
内側内皮血液網膜関門の損失ならびに結果として起きる黄斑浮腫および損傷は、高齢世代における眼障害および失明の主な原因である。現在、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）としても知られるこれらの状態は、不治である。また、ＡＭＤの血管新生の形態は、ブルック膜を貫通して網膜下領域に達する、脈絡膜からの血管の成長により特徴づけられる。血管新生ＡＭＤの共通の根底にある原因を抑えるいくつかの有効な治療法は、脈絡膜に生じる新しい血管を破壊することによって、視力喪失を阻止する目的で制限されている。コルチコステロイドおよび抗ＶＥＧＦ剤の硝子体内注射での現在の治療は眼疾患の進行を遅らせるのに有効であるが、これらは、失明のリスクを完全には取り除かない。したがって、眼障害を治療し視力喪失を予防するための新規のより強力な治療法または併用療法のアプローチが必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
単離ペプチドが本明細書で与えられる。ペプチドは、ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）、これらの断片、またはこれらの変異体を含んでなり得る。ペプチドは、ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）、これらの断片、またはこれらの変異体からなり得ることもあり得る。変異体は、保存的置換を含んでなり得る。変異体は、最小ＥＢ結合コンセンサスモチーフ配列であるＳｅｒ／Ｔｈｒ−ｘ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ配列（配列番号５）を含む、任意のペプチド配列を含んでなり得る。ペプチドは、脂肪酸と結合している、すなわちミリストイル化されている、またはキャリアペプチドと結合していることがあり得る。キャリアペプチドは、アンテナペディアペプチド（ＡＰ）、アンテナペディアペプチド、ペネトラチンペプチド、ＴＡＴ、ｔｒａｎｐｏｒｔａｎ、またはポリアルギニンであり得る。ペプチドは、薬剤的に許容できる賦形剤を含んでなり得る医薬製剤の一部であり得る。
【００１２】
本発明は、ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）、またはこれらの断片のアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチドを必要性のある患者に投与することを含んでなる血管新生の阻害方法を与える。方法は、血管新生を阻害するのに有効な量などの治療有効量の本発明のペプチドを投与することを含む。また、方法は、治療有効量の本発明のペプチドを含んでなる医薬組成物を投与することを含む。本発明は、癌、または視力障害もしくは視力喪失（失明）、黄斑変性、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞増殖性糖尿病性網膜症、血管新生加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、および糖尿病性増殖性網膜症、虹彩ルベオーシス、血管新生緑内障、網膜芽腫、ブドウ膜炎、ならびに角膜移植血管新生などのＶＥＧＦ誘発透過性に関連する障害に罹患している必要性のある患者における治療方法を与える。
【００１３】
本発明は、ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）、またはこれらの断片のアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチドを必要性のある患者に投与することを含んでなる、ＶＥＧＦ誘発血管透過性に関連する障害を治療する方法も与える。方法は、ＶＥＧＦ誘発血管透過性を阻害するのに有効な量などの治療有効量の本発明のペプチドを投与することを含む。また、方法は、治療有効量の本発明のペプチドを含んでなる医薬組成物を投与することを含む。本発明は、癌、または視力障害もしくは視力喪失（失明）、黄斑変性、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞増殖性糖尿病性網膜症、血管新生加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、および糖尿病性増殖性網膜症、虹彩ルベオーシス、血管新生緑内障、網膜芽腫、ブドウ膜炎、ならびに角膜移植血管新生などのＶＥＧＦ誘発透過性に関連する障害に罹患している必要性のある患者における治療方法を与える。
【００１４】
上記の方法のいずれかにおいて、投与するペプチドは、アンテナペディアペプチド（ＡＰ）、アンテナペディアペプチド、ペネトラチンペプチド、ＴＡＴ、ｔｒａｎｐｏｒｔａｎ、またはポリアルギニンなどのキャリアペプチドと結合していることがあり得る。また、上記の方法のいずれかにおいて、投与するペプチドは、脂肪酸と結合している、例えばミリストイル化されていることがあり得る。
【００１５】
上記の方法のいずれかにおいて、ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）、またはこれらの断片のアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチドを、１つ以上のＶＥＧＦ阻害剤との併用で投与し、ここで、「ＶＥＧＦ阻害剤」は、抗ＶＥＧＦ抗体およびそれらの断片、抗ＶＥＧＦ受容体（抗ＶＥＧＦＲ）抗体およびそれらの断片、アンタゴニストペプチド、ならびにＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲの活性またはシグナル経路を阻害する小分子を表す。ＶＥＧＦ阻害剤の例として、ベバシズマブ（Avastin）、ラニビズマブ（Lucentis）、ペガプタニブ（Macugen）、アフリベルセプト（Eylea）、ソラフェニブ（Nexvar）、スニチニブ（Sutent）、パゾパニブ（Votrient）、アキシチニブ（Inlyta）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、ＺＤ−６４７４、ＳＵ６６６８、ＰＤ−５４７，６３２、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、ＣＥＰ−７０５５、ＮＭ−３、またはＳＵ１１２４８が挙げられる。
【００１６】
本発明の上記の方法のいずれかにおいて、ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）、またはこれらの断片のアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチドを、癌疾患に対するレーザー治療との併用で投与し得、ここで、「眼疾患」は、視力障害または視力喪失（失明）、黄斑変性、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞増殖性糖尿病性網膜症、血管新生加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、および糖尿病性増殖性網膜症、虹彩ルベオーシス、血管新生緑内障、網膜芽腫、ブドウ膜炎、ならびに角膜移植血管新生を表す。
【００１７】
本発明の上記の方法のいずれかにおいて、ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）、またはこれらの断片のアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチドを、ステロイドまたは癌疾患に対する任意の現在の治療法との併用で投与し得る。
【００１８】
また、本発明の方法のいずれかにおいて、本発明の単離ペプチド、ＶＥＧＦ阻害剤、ステロイド、または任意の他の治療薬を、硝子体内注射により、または点眼薬の形態などで局所的に、投与し得る。
【００１９】
本発明は、必要性のある患者における血管新生の阻害のための薬剤の製造での単離ペプチドの使用であって、前記ペプチドが、ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）、またはこれらの断片のアミノ酸配列を含んでなる、前記使用も与える。  本発明の使用には、血管新生を阻害するのに有効な量などの治療有効量の本発明のペプチドを含んでなる薬剤の製造に本発明の単離ペプチドを使用することが含まれる。また、本発明は、治療有効量の本発明のペプチドを含んでなる組成物を含んでなる薬剤の製造のための本発明の単離ペプチドの使用を与える。本発明は、癌、または視力障害もしくは視力喪失（失明）、黄斑変性、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞増殖性糖尿病性網膜症、血管新生加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、および糖尿病性増殖性網膜症、虹彩ルベオーシス、血管新生緑内障、網膜芽腫、ブドウ膜炎、ならびに角膜移植血管新生などのＶＥＧＦ誘発透過性に関連する障害の罹患者に投与する薬剤の製造のための本発明の単離ペプチドの使用を与える。
【００２０】
本発明は、ＶＥＧＦ誘発血管障害の治療用の薬剤の製造のための単離ペプチドの使用であって、前記ペプチドが、ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）、またはこれらの断片のアミノ酸配列を含んでなる、前記使用も与える。本発明の使用には、ＶＥＧＦ誘発血管透過性を阻害するのに有効な量などの治療有効量の本発明のペプチドを含んでなる薬剤の製造に本発明の単離ペプチドを使用することが含まれる。また、本発明は、治療有効量の本発明のペプチドを含んでなる組成物を含んでなる薬剤の製造のための本発明の単離ペプチドの使用を与える。本発明は、癌、または視力障害もしくは視力喪失（失明）、黄斑変性、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞増殖性糖尿病性網膜症、血管新生加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、および糖尿病性増殖性網膜症、虹彩ルベオーシス、血管新生緑内障、網膜芽腫、ブドウ膜炎、ならびに角膜移植血管新生などのＶＥＧＦ誘発透過性に関連する障害に罹患している対象に投与する薬剤の製造のための本発明のペプチドの使用を与える。
【００２１】
本発明の上記の使用のいずれかにおいて、投与する単離ペプチドは、アンテナペディアペプチド（ＡＰ）、アンテナペディアペプチド、ペネトラチンペプチド、ＴＡＴ、ｔｒａｎｐｏｒｔａｎ、またはポリアルギニンなどのキャリアペプチドと結合していることがあり得る。また、上記の方法のいずれかにおいて、投与する単離ペプチドは、脂肪酸と結合している、例えばミリストイル化されていることがあり得る。
【００２２】
上記の使用のいずれかにおいて、ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）、またはこれらの断片のアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチドを、１つ以上のＶＥＧＦ阻害剤との併用で投与し、ここで、「ＶＥＧＦ阻害剤」は、抗ＶＥＧＦ抗体およびそれらの断片、抗ＶＥＧＦＲ抗体およびそれらの断片、アンタゴニストペプチド、ならびにＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲの活性またはシグナル経路を阻害する小分子を表す。ＶＥＧＦ阻害剤の例として、ベバシズマブ（Avastin）、ラニビズマブ（Lucentis）、ペガプタニブ（Macugen）、アフリベルセプト（Eylea）、ソラフェニブ（Nexvar）、スニチニブ（Sutent）、パゾパニブ（Votrient）、アキシチニブ（Inlyta）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、ＺＤ−６４７４、ＳＵ６６６８、ＰＤ−５４７，６３２、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、ＣＥＰ−７０５５、ＮＭ−３、またはＳＵ１１２４８が挙げられる。
【００２３】
本発明の上記の使用のいずれかにおいて、ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）、またはこれらの断片のアミノ酸配列を含んでなる薬剤を、癌疾患に対するレーザー治療との併用で投与し得、ここで、「眼疾患」は、視力障害または視力喪失（失明）、黄斑変性、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞増殖性糖尿病性網膜症、血管新生加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、および糖尿病性増殖性網膜症、虹彩ルベオーシス、血管新生緑内障、網膜芽腫、ブドウ膜炎、ならびに角膜移植血管新生を表す。
【００２４】
本発明の上記の使用のいずれかにおいて、ステロイドまたは癌疾患に対する任意の現在の治療法との併用で薬剤を投与し得る。
【００２５】
また、本発明の使用のいずれかにおいて、薬剤を、硝子体内注射により、または点眼薬の形態などで局所的に、投与し得る。
【００２６】
本発明は、血管新生の阻害のための単離ペプチドあって、ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）、またはこれらの断片のアミノ酸配列を含んでなる、前記単離ペプチドを与える。
【００２７】
本発明は、血管新生の阻害のための治療有効量の本発明のペプチドを含んでなる組成物も与える。本発明は、癌、または視力障害もしくは視力喪失（失明）、黄斑変性、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞増殖性糖尿病性網膜症、血管新生加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、および糖尿病性増殖性網膜症、虹彩ルベオーシス、血管新生緑内障、網膜芽腫、ブドウ膜炎、ならびに角膜移植血管新生などのＶＥＧＦ誘発透過性に関連する障害に罹患している対象における血管新生の阻害のための単離ペプチド、または治療有効量の前記ペプチドを含んでなる組成物を与える。
【００２８】
本発明は、ＶＥＧＦ誘発血管透過性に関連する障害に罹患している患者における血管新生の阻害に使用するための単離ペプチドであって、ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）、またはこれらの断片のアミノ酸配列を含んでなる、前記単離ペプチドも与える。
【００２９】
本発明は、ＶＥＧＦ誘発血管透過性の阻害のための治療有効量の本発明の単離ペプチドを含んでなる組成物も与える。本発明は、癌、または視力障害もしくは視力喪失（失明）、黄斑変性、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞増殖性糖尿病性網膜症、血管新生加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、および糖尿病性増殖性網膜症、虹彩ルベオーシス、血管新生緑内障、網膜芽腫、ブドウ膜炎、ならびに角膜移植血管新生などのＶＥＧＦ誘発透過性に関連する障害に罹患している対象におけるＶＥＧＦ誘発透過性の阻害のための単離ペプチド、または治療有効量の前記ペプチドを含んでなる組成物を与える。
【００３０】
本発明は、ＶＥＧＦ誘発血管透過性に関連する障害の治療のための単離ペプチドも与える。例えば、ＶＥＧＦ関連血管障害は、視力障害または視力喪失（失明）、黄斑変性、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞増殖性糖尿病性網膜症、血管新生加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、および糖尿病性増殖性網膜症、虹彩ルベオーシス、血管新生緑内障、網膜芽腫、ブドウ膜炎、ならびに角膜移植血管新生である。
【００３１】
血管新生を阻害するため、またはＶＥＧＦ誘発血管透過性に関連する障害を治療するために使用する本発明のペプチドのいずれかは、アンテナペディアペプチド（ＡＰ）、アンテナペディアペプチド、ペネトラチンペプチド、ＴＡＴ、ｔｒａｎｐｏｒｔａｎ、またはポリアルギニンなどのキャリアペプチドと結合していることがあり得る。また、血管新生を阻害するため、またはＶＥＧＦ誘発血管透過性に関連する障害を治療するために使用する本発明の単離ペプチドのいずれかは、脂肪酸と結合している、例えばミリストイル化されていることがあり得る。
【００３２】
本発明の単離ペプチドまたは組成物のいずれかを、１種以上のＶＥＧＦ阻害剤との併用で投与し得、ここで、「ＶＥＧＦ阻害剤」は、抗ＶＥＧＦ抗体およびそれらの断片、抗ＶＥＧＦＲ抗体およびそれらの断片、アンタゴニストペプチド、ならびにＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲの活性またはシグナル経路を阻害する小分子を表す。ＶＥＧＦ阻害剤の例として、ベバシズマブ（Avastin）、ラニビズマブ（Lucentis）、ペガプタニブ（Macugen）、アフリベルセプト（Eylea）、ソラフェニブ（Nexvar）、スニチニブ（Sutent）、パゾパニブ（Votrient）、アキシチニブ（Inlyta）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、ＺＤ−６４７４、ＳＵ６６６８、ＰＤ−５４７，６３２、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、ＣＥＰ−７０５５、ＮＭ−３、またはＳＵ１１２４８が挙げられる。また、ペプチドまたはＶＥＧＦＲを、硝子体内注射により、または点眼薬の形態などで局所的に、投与する。
【００３３】
本発明の単離ペプチドまたは組成物のいずれかを、癌疾患に対するレーザー治療との併用で投与し得、ここで、「眼疾患」は、視力障害または視力喪失（失明）、黄斑変性、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞増殖性糖尿病性網膜症、血管新生加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、および糖尿病性増殖性網膜症、虹彩ルベオーシス、血管新生緑内障、網膜芽腫、ブドウ膜炎、ならびに角膜移植血管新生を表す。
【００３４】
本発明の単離ペプチドまたは組成物を、ステロイドまたは癌疾患に対する任意の現在の治療法との併用で投与し得る。
【００３５】
また、本発明の単離ペプチドまたは組成物を、硝子体内注射により、または点眼薬の形態などで局所的に、投与し得る。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】内皮バリアーの炎症誘発性超透過性におけるＥＢ３の役割を示す。ＥＢ３は、炎症の間、伸長しているＭＴ末端とＩＰ３Ｒ３との一過性相互作用を確立し、ＩＰ３Ｒ３の感受性を高め、ストアからのＣａ２＋の放出とＳＯＣ依存性Ｃａ２＋の流入の両方を正に調節する。このことは、Ｃａ２＋のシグナリングの増幅、ならびにｐ１２０−カテニンのＰＫＣα媒介リン酸化およびアクトミオシン収縮性による透過性の上昇をもたらす。
【図２】ヒトＩＰ３受容体（ＩＰ３Ｒ３タイプ３の７９４〜８１４ａａ）の（強調表示された）ＥＢ結合モチーフでの配列比較を示す。ＩＰ３Ｒ３ペプチド（配列番号１）は、配列比較の下に示されている。
【図３】ＥＢ３構造（マゼンタ）およびＥＢ３のＥＢ３疎水性結合溝にドッキングされたＩＰ３Ｒ３由来ペプチド（配列番号１）のリボン表示を示し、１８０℃回転したものが示されている。ＩＰ３Ｒ３由来ペプチドを、Discovery  Studio  3.0ソフトウェアと共にZ-Dockプログラムを使用して、ドッキングした。ペプチドとＥＢ３との結合エネルギーは、−６８．８８２ｋｃａｌ／ｍｏｌと計算された。
【図４】ＩＰ３Ｒ３ペプチド（配列番号１）が、ＰＡＲ−１活性化に応答したＥＲからのＣａ２＋放出を阻害することを示す。Ａ．ＡＰが結合したＩＰ３Ｒ３ペプチドまたはコントロール（ＡＰ）ペプチドで予め治療したＨＭＶＥＣに、Ｆｕｒａ  ２−ＡＭを添加し、細胞外Ｃａ２＋の非存在下および存在下でトロンビン（５０ｎＭ）で細胞を刺激した後、３４０／３８０比を計算した。矢印はトロンビンの添加時を示す。Ｂ．プロットは、基底値を超える最大増加として計算されたトロンビン誘発性Ｃａ２＋放出および流入についての平均±ＳＤを示す。増加は、同じ実験（ｎ＝４）からのコントロール未治療細胞に標準化した。
【図５】ＥＢＩＮ（配列番号３）およびＩＰ３Ｒ３ペプチド（配列番号１）との複合体におけるＥＢ３のリボン表示を示す。計算された結合エネルギーは、ＩＰＲとＥＢＩＮについて、それぞれ、−６８．８８２と−６０．２５１である。
【図６】パネルＡは、ＶＥＧＦの皮内注射により誘発された、アルブミン結合Evans  Blue  Dyeの皮下血管漏出を示し、パネルＢは、６２０ｎｍで分光測定された血管漏出を数値で表す。
【図７】パネルＡは、ＥＢＩＮがマトリゲル被覆壁における管形成を阻害したことを示す（スケールバーは２００μｍ）。パネルＢは、面積当りの分枝の数を示し、ＵＴ＝未治療、Ｃｏｎｔｒ＝コントロールペプチド、＊＊はｐ＜０．００１である（群当りｎ＝３壁）。パネルＣは、インビボマトリゲルプラグのヘマトキシリン（hemematoxylin）およびエオシン（ＨＥ）染色を示す。群１は、コントロールペプチドで治療され、群３は、Ｍｙｒ−ＥＢＩＮで０、３６、および６０時間で治療され、群２は、３６および６０時間の治療のみを受けた。パネルＤは、１ｍｍ２当りの血管数を示し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１である（群当りｎ＝１５）。スケールバーは２００μｍである。
【図８】腫瘍増殖曲線および血管新生でのＥＢＩＮ治療の効果を示す。パネルＡは、異種移植モデルにおける腫瘍増殖曲線をプロットしており、平均が示されており、群当りｎ＝８マウスである。プロットＢは、腫瘍の外側で数えられた面積当りの血管数をプロットしており、ｎ＝２５視野／マウスであり、Ｎ＝５マウスであり、＊はｐ＜０．０５であり、＊＊はｐ＜０．０１である。
【図９】脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）誘発に関する動物モデルの概要を示す。（ａ）レーザービームの焦点を網膜色素上皮に合わせてブルック膜のレーザー熱傷および破裂を引き起こすことを示す眼の断面図、（ｂ）ブルック膜の破裂が、脈絡膜で血管の増殖を引き起こし、網膜へとＣＮＶ病変を引き起こす。
【図１０】（表４に提示された）群１〜３に関するレーザー誘発性ＣＮＶ、眼干渉断層撮影（ＯＣＴ）、眼底蛍光血管造影、治療、および組織収集についてのスケジュールの概要を示す。
【図１１】ＣＮＶへのＥＢＩＮ治療の効果を示す。コントロールペプチド（Ｍｙｒ−ＦＡＥＩＰＴＩ）、ＥＢＩＮ（Ｍｙｒ−ＦＴＥＩＰＴＩ）、およびマウス抗ＶＥＧＦ抗体（LEAFＴＭ）の硝子体内注射により治療したマウスにおける血管漏出（ａ）および病変（ｂ〜ｃ）の相関分析。レーザー光凝固術後１５日目での眼底蛍光血管造影（ａ）および対応する光干渉断層撮影（ｂ）の代表画像であり、黄色の数は、対応するＣＮＶ病変を示す。漏出面積は、病変サイズと相関する。（ｃ）ＣＮＶ病変を、網膜色素上皮／脈絡膜／強膜のフラットマウントを使用してイソレクチンＢ４で染色することにより、検出する。（ａ）および（ｃ）で示されている画像を使用したフルオレセイン漏出（ｄ）および病変（ｅ）の面積の数値化、群当りｎ＝６〜９マウスであり、＊＊はｐ＜０．０１である。（ａ）および（ｃ）において、それぞれ、スケールバーは２００μｍおよび１００μｍを示す。群間の比較をＡＮＯＶＡを使用して実施した。抗ＶＥＧＦ治療は、損傷した領域の創傷治癒／瘢痕化を有意に変えたが、ＥＢＩＮでの治療は、治癒過程に影響を与えなかった。
【図１２】ＥＢＩＮに関する７日間の急性毒性研究の効果を示す。ＥＢＩＮ（１μｇ／眼）の硝子体内治療の８日目での眼底蛍光血管造影（ａ）および対応する光干渉断層撮影（ｂ）の代表画像。注、ＥＢＩＮは様々な体液内に小さい結晶／沈殿物を形成し、網膜血管系および網膜色素上皮、脈絡膜、強膜で目に見える変化は検出されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
詳細な説明
本発明者は、イノシトール１，４，５−トリスリン酸（ＩＰ３）３型受容体（ＩＰ３Ｒ３）のＥＢ３相互作用ドメイン由来のペプチドが、末端結合タンパク質３（ＥＢ３）とＩＰ３Ｒ３との間の相互作用を低減し、ＶＥＧＦ誘発血管透過性またはＶＥＧＦ誘発微小血管漏出を阻害するという驚くべき発見をした。本発明のペプチドは、様々な炎症性疾患においてバリアー保護特性を呈し、インビトロおよびインビボで抗血管新生特性を呈す。
【００３８】
先行研究は、ＥＲストアからのＣａ２＋のＩＰ３ゲート放出の制御におけるＭＴ細胞骨格の役割およびＥＢ３が、ＥＲ  Ｃａ２＋枯渇に必要であることを示唆した。ＩＰ３Ｒ３は、ＥＢ結合コンセンサスモチーフであるＳｅｒ／Ｔｈｒ−ｘ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（ＳｘＩＰ）（配列番号５）を含む。ＩＰ３Ｒ３配列（ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ−−配列番号１）をベースとする短ペプチドは、ＥＢ３に対して高い結合活性を示す（実施例１を参照）。これらの研究は、ＩＰ３Ｒ３とＥＢ３との間の相互作用がＩＰ３Ｒ３活性化の機構において重大な意味を持つことを示す。
【００３９】
内皮バリアーの炎症誘発性超透過性におけるＥＢ３の役割は、伸長しているＭＴ末端のＩＰ３Ｒ３との一過性相互作用を確立するＥＢ３の能力を中心とする。結果として、ＥＢ３は、ＩＰ３Ｒ３のＩＰ３に対する感受性を高め、小胞体（ＥＲ）からのＣａ２＋の放出を正に調節する。このことは、ＳＯＣ依存性のＣａ２＋の流入およびＣａ２＋シグナリングの増幅をもたらす。細胞質Ｃａ２＋の濃度の上昇は、ＶＥ−カドヘリン接着分子の分解をもたらすｐ１２０−カテニンのＰＫＣα媒介リン酸化を誘発する。細胞質Ｃａ２＋の濃度の上昇は、細胞形状の変化をもたらすＲｈｏＡ依存性のアクトミオシン収縮性も促進する。図１を参照されたい。この研究は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４２１１８号および米国特許第８，９１２，１３９号に詳細に記載されており、これらの全体を参照により本明細書に援用する。
【００４０】
以下に記載の方法および材料は、ＶＥＧＦ誘発微小血管透過性を予防または阻害し、そのため、血管新生の阻害、ならびに障害、数例を挙げると、黄斑変性、糖尿病性網膜症、癌、網膜中心静脈閉塞症、および網膜静脈分枝閉塞の治療に有用である。
定義
【００４１】
本明細書で使用される専門用語は、ただ特定の実施形態を記載するためのものであり、限定的なものではない。明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別段の規定をしていない限り、複数の言及を含む。
【００４２】
本明細書における数の範囲の記載では、同じ精度を有する数の範囲の間にある各々の間の数が、明確に考慮される。例えば、６〜９の範囲では、数７および８が、６および９に加えて考慮され、６．０〜７．０の範囲では、数６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６，９、および７．０が明確に考慮される。
【００４３】
「血管新生」は、本明細書で使用される場合、新しい血管が既存の血管から形成されるプロセスを表す。例えば、サイトカインおよび細胞外マトリックスプロテアーゼは、既存の血管から内皮細胞が移動して新しい血管を形成するための準備において、組織再構築を誘発する。
【００４４】
「断片」は、本明細書で使用される場合、言及されているペプチドまたはポリペプチドまたは塩基配列の部分を意味し得る。
【００４５】
「同一」または「同一性」は、２つ以上のポリペプチドまたは塩基配列との関連で本明細書で使用される場合、配列が、特定領域に亘って同一である特定のパーセンテージの残基またはヌクレオチドを有することを意味し得る。パーセンテージは、２つの配列を最適にアライメントし、特定領域に亘って２つの配列を比較し、両方の配列で同一の残基が生じている位置の数を求めて、一致位置の数を得、一致位置の数を特定領域中の位置の総数で割り、結果に１００をかけて配列同一性のパーセンテージを得ることによって、計算され得る。２つの配列が異なる長さであり、またはアラインメントが１つ以上のずれた末端を生み、比較の特定領域が単一の配列しか含まない場合、単一配列の残基は、計算の分母に含まれるが、分子には含まれない。
【００４６】
「ペプチド」または「ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、アミノ酸の結合配列を表し得、天然型、合成型、もしくは修飾型、または天然型および合成型の組み合わせであり得る。
【００４７】
「実質的に同一」は、本明細書で使用される場合、第１および第２のタンパク質または塩基配列が、６〜１００以上のアミノ酸ヌクレオチドの領域に亘って少なくとも５０％〜９９％同一であることを意味し得る。
【００４８】
「治療（Treating）」、「治療（treatment）」、または「治療（to  treat）」は、それぞれ、状態または障害の症候、臨床徴候、または基礎病理の出現を、一時的または持続的に、軽減する、抑止する、抑圧する、除去する、予防する、または遅くすることを意味し得る。状態または障害の予防は、疾患の発症の前に対象に本発明の薬剤を投与することを含む。状態または障害の抑止は、状態または障害の誘発後であるが臨床的出現の前に、対象に本発明の薬剤を投与することを含む。状態または障害の抑圧は、疾患の臨床的出現の後に対象に本発明の薬剤を投与することを含む。
【００４９】
用語「治療有効」は、対象の状態および投与する特定の化合物に依存する。用語は、所望の臨床効果を達成するのに有効な量を表す。治療有効量は、治療される状態の性質、活性が望まれる時間の長さ、ならびに対象の年齢および状態で変わり、最終的に、医療提供者により決められる。一態様において、ペプチドまたは組成物の治療有効量は、ＶＥＧＦ誘発血管透過性および／または血管新生を阻害、軽減、または予防するのに有効な量である。
【００５０】
「変異体」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によりアミノ酸配列が異なっているが、１つ以上の生物活性を保持するペプチドまたはポリペプチドを意味する。「生物活性」の代表例には、末端結合タンパク質であるトール様受容体（ＴＬＲ）に結合し、特異抗体に結合される能力が含まれる。変異体は、１つ以上の生物活性を保持するアミノ酸配列を有する被参照タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）が類似している異なるアミノ酸でアミノ酸を置換することは、当業において、通常マイナーチェンジを伴うものとして認識されている。これらのマイナーチェンジは、当業で分かっているように、アミノ酸の疎水性親水性指標を考察することによって、ある程度、特定され得る。Kyte  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  157:105-132  (1982).アミノ酸の疎水性親水性指標は、疎水性および電荷の考察をベースとする。疎水性親水性指標が類似したアミノ酸は置換され、タンパク質の機能を保持できることが、当業で知られている。一態様において、±２の疎水性親水性指標を有するアミノ酸を置換する。生物学的機能を保持するタンパク質をもたらし得る置換を明らかにするために、アミノ酸の親水性を使用することもできる。ペプチドとの関連でアミノ酸の親水性を考察することにより、抗原性および免疫原性とよく相関することが報告されている有用な尺度である、ペプチドの最大の局所平均親水性の計算が可能になる。米国特許第４，５５４，１０１号は、参照により本明細書に完全に援用される。類似した親水性値を有するアミノ酸の置換は、当業で分かっているように、生物活性、例えば免疫原性を保持するペプチドをもたらすことができる。置換を、互いの±２以内の親水性値を有するアミノ酸で実施し得る。アミノ酸の疎水性指標および親水性値の両方とも、アミノ酸の特定の側鎖により影響を受ける。この観察と一致して、生物学的機能に互換性があるアミノ酸の置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、およびその他の特性によって明らかになる、アミノ酸、特にアミノ酸の側鎖の相対的な類似性に依存することが分かっている。
【００５１】
アミノ酸配列ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＫＦＡＲＬＷＡＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号２）（本明細書でＩＰ３Ｒ３ペプチドとも呼ばれる）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）（本明細書で末端結合阻害ペプチドもしくは「ＥＢＩＮ」とも呼ばれる）、本明細書の表１に開示されているペプチド、それらの断片、またはそれらの変異体を含んでなり得るペプチドが、本明細書で与えられる。変異体は、保存的置換を含んでなり得る。ペプチドは、ＩＰ３Ｒ３のＥＢ結合コンセンサス配列などのＥＢ結合コンセンサスモチーフ配列、またはその断片を含み得る。ＩＰ３Ｒ３のＥＢ結合コンセンサス配列は、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−ｘ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（配列番号５）であり得る。ペプチドは、ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＫＦＡＲＬＷＡＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号２）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−ｘ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（配列番号５）を含んでなるコンセンサス配列、本明細書の表１に開示されているペプチド、前述の断片、または前述の保存的変異体からなり得る。変異体は、最小ＥＢ結合コンセンサスモチーフ配列であるＳｅｒ／Ｔｈｒ−ｘ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ配列（配列番号５）を含む、任意のペプチド配列を含んでなり得る。
【００５２】
ペプチドは、ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＫＦＡＲＬＷＡＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号２）（本明細書でＩＰ３Ｒ３ペプチドとも呼ばれる）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）（本明細書で末端結合阻害ペプチドもしくは「ＥＢＩＮ」とも呼ばれる）、本明細書の表１に開示されているペプチド、それらの断片、またはそれらの変異体のアミノ酸配列を含んでなり得、前記ペプチドまたは前記ペプチドを含んでなるポリペプチドは、７アミノ酸残基、８アミノ酸残基、９、アミノ酸残基、１０、アミノ酸残基、１１、アミノ酸残基、１２アミノ酸残基、１３アミノ酸残基、１４アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、１６アミノ酸残基、１７アミノ酸残基、１８アミノ酸残基、１９、アミノ酸残基、２０アミノ酸残基、２１アミノ酸残基、２２アミノ酸残基、２３アミノ酸残基、２４アミノ酸残基、２５アミノ酸残基、２６アミノ酸残基、２７アミノ酸残基、２８アミノ酸残基、２９アミノ酸残基、３０アミノ酸残基、３５アミノ酸残基、４０アミノ酸残基、４５アミノ酸残基、５０アミノ酸残基、５５アミノ酸残基、６０アミノ酸残基、６５アミノ酸残基、７０アミノ酸残基、７５アミノ酸残基、８０アミノ酸残基、８５アミノ酸残基、９０アミノ酸残基、９５アミノ酸残基、または１００アミノ酸残基である。
【００５３】
ペプチドは、アミノ酸配列が１つ以上のアミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、カルボキシ末端切断、またはアミノ末端切断を有するという修飾がなされていることがあり得る。
【００５４】
ペプチドは、グリコシル化、リン酸化、硫酸化、グリコシル化、アニメ化、カルボキシル化、アセチル化されていることもあり得る。例えば、Ｃ末端は、アミド化、ペプチドアルコールおよびアルデヒドの付加、エステルの付加、ｐ−ニトロアニリンおよびチオエステルの付加、ならびに多抗原ペプチドで修飾されていることがあり得る。Ｎ末端および側鎖は、ペグ化、アセチル化、ホルミル化、脂肪酸の付加、ベンゾイルの付加、ブロモアセチルの付加、ピログルタミルの付加、スクシニル化、テトラブトキシカルボニルの付加および３−メルカプトプロピルの付加、アシル化（例えば、リポペプチド）、ビオチン化、リン酸化、硫酸化、グリコシル化、マレイミド基、キレート化部分、発色団、および発蛍光団の導入により修飾されていることがあり得る。
【００５５】
ペプチドは、脂肪酸と結合していることがあり得、例えばペプチドはミリストイル化されている。例えば、脂肪酸がペプチドのＮ末端に結合していることがあり得、このような脂肪酸には、カプリル酸（Ｃ８）、カプリン酸（Ｃ１０）、ラウリン酸（Ｃ１２）、ミリスチン酸（Ｃ１４）、パルミチン酸（Ｃ１６）、またはステアリン酸（Ｃ１８）などが含まれる。さらにペプチド中のシステインは、パルミトイル化されていることができる。
【００５６】
ペプチドは、キャリアペプチドなどの別のペプチドと結合または連結していることがあり得る。アンテナペディアペプチド、ペネトラチンペプチド、ＴＡＴ、ｔｒａｎｐｏｒｔａｎ、またはポリアルギニンなどのキャリアペプチドは、細胞透過を促進し得る。
【００５７】
ペプチドは、環状であり得る。本明細書で開示されるペプチドは、１つまたは複数のジスルフィド架橋を付加すること、Ｎ末端とＣ末端との間に１つまたは複数のアミド結合を付加すること、加熱して末端を環化すること、側鎖環化（例えば、ラクタム架橋、チオエステル）、炭化水素安定化ペプチドにより環化されていることがあり得る。
【００５８】
ペプチドは、重同位体標識、例えば、１５Ｎ、１３Ｃ、ＦＩＴＣ、キャリアタンパク質へのコンジュゲーション、造影剤へのコンジュゲーション、発蛍光団／クエンチャーペアを有するＦＲＥＴ基質、ペプチド−ＤＮＡコンジュゲーション、ペプチド−ＲＮＡコンジュゲーション、およびペプチド−酵素標識で標識されていることがあり得る。
【００５９】
ペプチドは、オリゴマー形成を促進するポリペプチドまたはペプチドと融合した融合タンパク質内、例えばロイシンジッパー領域内、安定性を高める、または半減期を延ばすポリペプチドまたはペプチド内、例えば免疫グロブリン定常領域内、およびペプチドまたは本発明、化学療法剤、組織特異的標的化のための抗体またはタンパク質とは異なる治療活性を有するポリペプチド内にあり得る。
【００６０】
融合は、ポリペプチドのアミノ末端、またはカルボキシ末端のいずれかでなされていることができる。融合タンパク質は、リンカーまたはアダプター分子なく直接的であるか、またはリンカーまたはアダプター分子を用いて非直接的であり得る。リンカーまたはアダプター分子は、１つ以上のアミノ酸残基、通常最大約２０〜約５０のアミノ酸残基であり得る。リンカーまたはアダプター分子は、融合部分の分離を可能とするように、プロテアーゼの切断部位を有するように設計されていることもあり得る。例えば、ペプチドは、ペプチドの半減期を延ばすように、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の１つ以上のドメインに融合されていること、またはペプチドの半減期を短くするようにＦａｂ可変ドメインが付加されていることがあり得る。
治療方法
【００６１】
血管新生を阻害、予防、または低減する方法が、本明細書に与えられる。血管新生は、数例を挙げると、腫瘍の増殖、癌の進行および転移、失明および黄斑変性、糖尿病性網膜症と関係がある。
【００６２】
本発明は、腫瘍の増殖、癌の進行および転移に関係する血管新生を阻害する方法を与える。本発明は、腫瘍増殖および癌、例えば、脳腫瘍（髄膜腫、多形性グリア芽細胞腫、退形成星状細胞腫、小脳星状細胞腫、他の高悪性度もしくは低悪性度の星状細胞腫、脳幹神経膠腫、乏突起膠細胞系神経膠腫、混合性神経膠腫、他の神経膠腫、大脳神経芽腫、頭蓋咽頭腫、間脳神経膠腫、胚細胞腫、髄芽腫、上衣腫、脈絡叢腫瘍、松果体実質腫瘍、神経節膠腫、神経上皮腫瘍、ニューロンもしくは混合ニューロン神経膠腫を含む）、肺腫瘍（小細胞癌、類表皮癌、腺癌、大細胞癌、カルチノイド腫瘍、気管支腺腫瘍、中皮腫、肉腫、もしくは混合腫瘍を含む）、前立腺癌（腺癌、扁平上皮細胞癌、移行上皮癌、前立腺小室癌、もしくは癌肉腫を含む）、乳癌（腺癌もしくはカルチノイド腫瘍を含む）、または胃、腸、もしくは結腸の癌（腺癌、侵襲性腺管癌、浸潤性もしくは侵襲性の小葉癌、髄様癌、非浸潤性腺管癌、非浸潤性小葉癌、膠様癌、もしくは乳頭のパジェット病を含む）、皮膚癌（メラノーマ、扁平上皮細胞癌、ヒト皮膚ケラチノサイトの腫瘍進行、基底細胞癌、血管周囲細胞腫、およびカポジ肉腫を含む）、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキンリンパ腫を含む）、肉腫（骨肉腫、軟骨肉腫、および線維肉腫を含む）などを治療、阻害、および予防する方法、ならびに神経系障害の治療も与える。
【００６３】
本発明のペプチドの投与は、他の癌療法、抗腫瘍剤、および化学療法剤、例えば、アロマターゼ阻害剤、抗エストロゲン、抗アンドロゲン、ゴナドレリンアゴニスト、トポイソメラーゼI阻害剤、トポイソメラーゼII阻害剤、微小管活性剤、アルキル化剤、レチノイド、カロテノイド、トコフェロール、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、ＭＭＰ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、代謝拮抗剤、白金化合物、メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤、ビスホスホネート、抗増殖性抗体、ヘパラナーゼ阻害剤、Ｒａｓ発癌性アイソフォームの阻害剤、テロメラーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、血液悪性腫瘍の治療に用いられる化合物、Ｆｌｔ−３阻害剤、Ｈｓｐ９０阻害剤、キネシン紡錘形タンパク質阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、抗腫瘍抗生物質、ニトロソ尿素、タンパク質または脂質キナーゼ活性を標的とする／低下させる化合物、タンパク質または脂質ホスファターゼ活性を標的とする／低下させる化合物、あらゆるその他の抗血管新生化合物、およびこれらの組み合わせと併用され得る。抗腫瘍剤の具体例として、限定はされないが、アザシチジン、アザチオプリン、ベバシズマブ、ブレオマイシン、カペシタビン、カルボプラチン、クロラブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ハーセプチン、イダルビシン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、タフルポシド、テニポシド、チオグアニン、レチノイン酸、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、およびこれらの組み合わせが挙げられる。抗腫瘍剤または化学療法剤の他の例が、当業で知られている。
【００６４】
本発明は、本発明のペプチドの投与を含んでなる、湿性および乾性黄斑変性を含む黄斑変性の治療方法を与える。湿性黄斑変性は、異常な血管が黄斑の裏で成長するときに起こる。これらの血管は、もろく、体液および血液を漏出でき、黄斑の瘢痕化をもたらし、急速で深刻な損傷の可能性を高める。ブルック膜が壊れ、通常ドルーゼンの近くに堆積する。これは、新しい血管が成長する、または血管新生が起こる場所である。中心視は、短期間、時には数日内に、歪むようになり得る、または完全に失われ得る。
【００６５】
黄斑変性の治療方法では、本発明のペプチドの眼内投与が考慮される。また、ペプチドの投与は、他の抗血管新生薬などの他の治療薬、例えば、ベバシズマブ（Avastin）、ラニビズマブ（Lucentis）、ペガプタニブ（Macugen）、アフリベルセプト（Eylea）、ロダミン（ＴＮＰ−４７０のポリマー製剤）、ベルテポルフィン（Visudyne）（光力学療法もしくはＰＤＴ）、オリゴヌクレオチド療法、Ｄｒ５に対する抗体、ｃ−Ｍｅｔを標的とする小分子キナーゼモジュレーター、キノロン誘導体、縮合二環式ピリジンおよびピラジン誘導体、またはＣＤＫ４／６の阻害剤としてのピロロピリミジン化合物と併用され得る。他の治療薬が、当業で知られている。また、黄斑変性を治療するための本発明のペプチドの投与は、埋め込み型テレスコープ、レーザー光凝固、および黄斑移動手術などの他の処置と併用され得る。
【００６６】
ＶＥＧＦ誘発血管透過性に関連する障害を治療する方法が本明細書で与えられる。例えば、本発明は、視力障害または視力喪失（失明）、黄斑変性、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞増殖性糖尿病性網膜症、血管新生加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、および糖尿病性増殖性網膜症、虹彩ルベオーシス、血管新生緑内障、網膜芽腫、ブドウ膜炎、ならびに角膜移植血管新生を治療する方法を与える。
対象
【００６７】
対象は、哺乳類であり得、人であり得る。診断に先立ち、対象は、１つ以上のリスク因子に晒されたために、癌のリスクがあり得るか、または癌を発症する遺伝的リスクを有し得る。１つ以上のリスク因子には、例えば、対象が癌の家族歴を有すること、年齢、喫煙、日光暴露、アルコール飲料の摂取、身体活動の欠如、肥満、および／または食事障害が含まれ得る。
【００６８】
診断に先立ち、対象は、１つ以上のリスク因子に晒されたために、黄斑変性を発症するリスクがあり得るか、または黄斑変性を発症する遺伝的リスクを有し得る。１つ以上のリスク因子には、例えば、対象が黄斑変性の家族歴を有すること、年齢、喫煙、長い日光暴露、高脂肪食、食事障害、高血圧、肥満、および／または眼の色が明るいことが含まれ得る。
投与
【００６９】
生理的に許容できる組成物、例えば本明細書に記載の化合物および／またはミセルを含んでなる医薬組成物を投与する好適な方法は、当業でよく知られている。１つ以上の経路を使用してペプチドを投与できるが、特定の経路が、他の経路よりもより即時でより有効な反応を与えることができる。状況に応じて、ペプチドを含んでなる医薬組成物は、体腔に投与もしくは注入される、皮膚もしくは粘膜を通じて吸収される、摂取される、吸入される、および/または循環系へ導入される。例えば、特定の状況においては、医薬組成物を、経口で、静脈内、腫瘍内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、病巣内、髄内、くも膜下腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、尿道、膣、もしくは直腸の手段により注射または注入によって、制御された、遅延された、持続された、もしくは調整された放出システムによって、または埋め込み装置によって、送達することが望ましいであろう。一態様において、薬剤の暴露を、時間が経過しても一定の薬剤の血漿中濃度を維持することによって、最適化することができる。このような定常状態は、一般的に、薬剤クリアランスおよび持続させる血漿中濃度に応じた用量での連続的な薬剤注入による臨床セッティングで達成される。必要に応じて、組成物を、腫瘍内投与、くも膜下腔内投与、大脳内（実質内）投与、脳室内投与、または関心領域を標的とする動脈内もしくは静脈内投与により、局所的に投与する。あるいは、ペプチドを、マトリックス、膜、スポンジ、または所望の化合物が吸収もしくはカプセル化された他の適切な材料の埋め込みにより、局所的に投与する。埋め込み装置を使用する場合、装置を、一態様において、任意の好適な組織または臓器に埋め込み、例えば、拡散、持続放出型ボーラス、または連続投与により、所望の化合物を送達する。
【００７０】
ペプチドの眼内投与を、眼内インプラント、硝子体内注射、全身投与、局所適用、ナノ粒子、微粒子、点眼薬、生体接着性ゲルまたはフィブリンシーラント、上皮細胞バリアー複合体の透過性を調節する多糖類、角膜薬物送達を増強するペプチド、バイオベクターポリマーを使用する投与などの粘膜投与、水性眼科用スプレー、および動電型眼用スプレー治療を使用して、実施し得る。一つの特定の実施形態において、ペプチドを、硝子体内注射により、または点眼薬の形態などで局所的に、投与し得る。
【００７１】
ペプチドを、単独療法として、または手術もしくは腫瘍の除去であり得る他の治療と同時もしくはメトロノミックに、投与し得る。用語「同時（simultaneous）」または「同時（simultaneously）」は、本明細書で使用される場合、ペプチドおよび他の治療を、互いの４８時間以内、好ましくは２４時間以内、より好ましくは１２時間以内、さらにより好ましくは６時間以内、最も好ましくは３時間以内に投与することを、意味する。用語「メトロノミックに」は、本明細書で使用される場合、他の治療と異なる時点で、反復投与に対して特定の頻度でペプチドを投与することを意味する。例えば、本発明のペプチドを、１種以上のＶＥＧＦ阻害剤と共に投与し得る。例えば、本発明のペプチドを、１種以上のＶＥＧＦ阻害剤と共に、または視力喪失に対するレーザー治療との併用で投与し得る。
【００７２】
ペプチドを、約１２０時間、１１８時間、１１６時間、１１４時間、１１２時間、１１０時間、１０８時間、１０６時間、１０４時間、１０２時間、１００時間、９８時間、９６時間、９４時間、９２時間、９０時間、８８時間、８６時間、８４時間、８２時間、８０時間、７８時間、７６時間、７４時間、７２時間、７０時間、６８時間、６６時間、６４時間、６２時間、６０時間、５８時間、５６時間、５４時間、５２時間、５０時間、４８時間、４６時間、４４時間、４２時間、４０時間、３８時間、３６時間、３４時間、３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５５分、５０分、４５分、４０分、３５分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分、および１分を含む他の治療の前の任意の時点で、投与し得る。ペプチドを、約１２０時間、１１８時間、１１６時間、１１４時間、１１２時間、１１０時間、１０８時間、１０６時間、１０４時間、１０２時間、１００時間、９８時間、９６時間、９４時間、９２時間、９０時間、８８時間、８６時間、８４時間、８２時間、８０時間、７８時間、７６時間、７４時間、７２時間、７０時間、６８時間、６６時間、６４時間、６２時間、６０時間、５８時間、５６時間、５４時間、５２時間、５０時間、４８時間、４６時間、４４時間、４２時間、４０時間、３８時間、３６時間、３４時間、３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５５分、５０分、４５分、４０分、３５分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分、および１分を含むペプチドの第２の治療の前の任意の時点で、投与し得る。
【００７３】
ペプチドを、約１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、２６時間、２８時間、３０時間、３２時間、３４時間、３６時間、３８時間、４０時間、４２時間、４４時間、４６時間、４８時間、５０時間、５２時間、５４時間、５６時間、５８時間、６０時間、６２時間、６４時間、６６時間、６８時間、７０時間、７２時間、７４時間、７６時間、７８時間、８０時間、８２時間、８４時間、８６時間、８８時間、９０時間、９２時間、９４時間、９６時間、９８時間、１００時間、１０２時間、１０４時間、１０６時間、１０８時間、１１０時間、１１２時間、１１４時間、１１６時間、１１８時間、および１２０時間を含む他の治療の後の任意の時点で、投与し得る。ペプチドを、約１２０時間、１１８時間、１１６時間、１１４時間、１１２時間、１１０時間、１０８時間、１０６時間、１０４時間、１０２時間、１００時間、９８時間、９６時間、９４時間、９２時間、９０時間、８８時間、８６時間、８４時間、８２時間、８０時間、７８時間、７６時間、７４時間、７２時間、７０時間、６８時間、６６時間、６４時間、６２時間、６０時間、５８時間、５６時間、５４時間、５２時間、５０時間、４８時間、４６時間、４４時間、４２時間、４０時間、３８時間、３６時間、３４時間、３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５５分、５０分、４５分、４０分、３５分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分、および１分を含むペプチドの第２の治療の後の任意の時点で、投与し得る。
製剤
【００７４】
方法は、ペプチドを投与することを含んでなり得る。本明細書に与えられるペプチドは、従来の方法で製剤化された錠剤またはロゼンジの形態であり得る。例えば、経口投与用錠剤およびカプセルは、結合剤、増量剤、潤滑剤、崩壊剤、および湿潤剤であり得る従来の賦形剤を含み得る。結合剤には、限定はされないが、シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガント、デンプンおよびポリビニルピロリドンの漿剤が含まれる。増量剤は、ラクトース、砂糖、微結晶セルロース、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、およびソルビトールであり得る。潤滑剤には、限定はされないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコール、およびシリカが含まれる。崩壊剤は、ジャガイモデンプン、およびデンプングリコール酸ナトリウムであり得る。湿潤剤は、ラウリル硫酸ナトリウムであり得る。錠剤を、当業でよく知られている方法に従ってコーティングし得る。
【００７５】
本明細書に与えられるペプチドは、水性または油性懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ、およびエリキシルなどの液体製剤でもあり得る。ペプチドを、使用前に水または他の好適な賦形剤と構成するための乾燥製品としても製剤化し得る。このような液体製剤は、懸濁剤、乳化剤、非水性賦形剤、および保存剤などの添加剤を含み得る。懸濁剤は、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／シュガーシロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、および水素化食用脂であり得る。乳化剤は、レシチン、モノオレイン酸ソルビタン、およびアラビアゴムであり得る。非水性賦形剤は、食用油、アーモンド油、分留ヤシ油、油性エステル、プロピレングリコール、およびエチルアルコールであり得る。保存剤は、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピル、およびソルビン酸であり得る。特に、本発明のペプチドは、点眼薬の形態など、局所的投与用の水性製剤であり得る。
【００７６】
本明細書に与えられるペプチドは、カカオ脂またはグリセリドなどの坐剤基剤を含み得る坐剤としても製剤化され得る。本明細書に与えられるペプチドは、吸入用にも製剤化され得、乾燥粉末として、またはジクロロジフルオロメタンもしくはトリクロロフルオロメタンなどの噴射剤を使用してエアロゾルの形態で投与し得る液体、懸濁液、またはエマルジョンなどの形態であり得る。本明細書に与えられるペプチドは、クリーム、軟膏、ローション、ペースト、薬用石膏、パッチ、または膜などの水性または非水性賦形剤を含んでなる経皮製剤としても製剤化され得る。本明細書に与えられるペプチドは、注射、腫瘍内注射、または連続注入などの非経口投与用にも製剤化され得る。注射用製剤は、油性または水性賦形剤中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンの形態であり得、製剤化剤を含み得、製剤化剤には、限定はされないが、懸濁剤、安定化剤、および分散剤が含まれる。ペプチドは、好適な賦形剤と再構成するための粉末形態でも与えられ得、好適な賦形剤には、限定はされないが、無菌の発熱物質を含まない水が含まれる。
【００７７】
本明細書に与えられるペプチドは、埋め込みにより、または筋肉内注射により投与され得る、デポー製剤としても製剤化され得る。ペプチドは、好適なポリマー材料もしくは疎水性材料（例えば、許容できる油中のエマルジョンとして）、イオン交換樹脂、またはやや難溶性の誘導体（例えば、やや難溶性の塩として）を用いて製剤化され得る。
用量
【００７８】
方法は、治療有効量のペプチドを必要性のある患者に投与することを含んでなり得る。治療に使用するために必要とされる治療有効量は、治療する状態の性質、ＴＬＲ活性を活性化するために求められる時間の長さ、および患者の年齢／状態で変わる。しかしながら、通常、成人のヒトの治療に適用される用量は、一般的に、一日当たり０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇの範囲内にある。用量は、一日当たり約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｇ／ｋｇであり得る。所望の用量を、単回投与、または適切な間隔で投与される複数回投与として、例えば、１日当たり２、３、４、またはそれ以上の副投与として、都合よく投与し得る。複数回投与が、望ましいか、または必要であり得る。
【００７９】
用量は、約０．０５μｇ／ｋｇ、０．０６μｇ／ｋｇ、０．０７μｇ／ｋｇ、０．０８μｇ／ｋｇ、０．０９μｇ／ｋｇ、０．１μｇ／ｋｇ、０．２μｇ／ｋｇ、０．３μｇ／ｋｇ、０．４μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、０．６μｇ／ｋｇ、０．７μｇ／ｋｇ、０．８μｇ／ｋｇ、０．９μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１．５μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ、４μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１２５μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、１７５μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２２５μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、２７５μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３２５μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、３７５μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４２５μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、４７５μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、５２５μｇ／ｋｇ、５５０μｇ／ｋｇ、５７５μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、６２５μｇ／ｋｇ、６５０μｇ／ｋｇ、６７５μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、７２５μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、７７５μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、８２５μｇ／ｋｇ、８５０μｇ／ｋｇ、８７５μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、９２５μｇ／ｋｇ、９５０μｇ／ｋｇ、９７５μｇ／ｋｇなどの任意の用量であり得る。
【００８０】
用量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１７５ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２２５ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、２７５ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、３２５ｍｇ／ｋｇ、３５０ｍｇ／ｋｇ、３７５ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、４２５ｍｇ／ｋｇ、４５０ｍｇ／ｋｇ、４７５ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、５２５ｍｇ／ｋｇ、５５０ｍｇ／ｋｇ、５７５ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ、６２５ｍｇ／ｋｇ、６５０ｍｇ／ｋｇ、６７５ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ、７２５ｍｇ／ｋｇ、７５０ｍｇ／ｋｇ、７７５ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ、８２５ｍｇ／ｋｇ、８５０ｍｇ／ｋｇ、８７５ｍｇ／ｋｇ、９００ｍｇ／ｋｇ、９２５ｍｇ／ｋｇ、９５０ｍｇ／ｋｇ、９７５ｍｇ／ｋｇ、１ｇ／ｋｇ、２ｇ／ｋｇ、３ｇ／ｋｇ、４ｇ／ｋｇ、５ｇ／ｋｇ、６ｇ／ｋｇ、７ｇ／ｋｇ、８ｇ／ｋｇ、９ｇ／ｋｇ、または１０ｇ／ｋｇなどの任意の用量であり得る。
キット
【００８１】
ＶＥＧＦ誘発血管透過性または血管新生に関連する障害を治療するために使用され得るキットが本明細書で与えられる。キットは、１つ以上のペプチドを含んでなり得る。ペプチドは、医薬組成物の一部であり得る。キットは、キットを使用し、ペプチドまたは製剤の投与を実施するための指示書をさらに含んでなり得る。
【００８２】
キットは、１つ以上の容器、例えば、バイアルまたはボトルも含んでなり得、それぞれの容器は、別の試薬を含む。キットは、本明細書に記載の方法を実施または解釈する方法を記載し得る書面での指示をさらに含んでなり得る。
【実施例】
【００８３】
実施例１
Ｃａ２＋のＩＰ３ゲート放出の機構におけるＥＢ３とＩＰ３Ｒとの相互作用の役割
本発明のペプチド（配列番号１および配列番号３）を用いたＥＢ３機能のアロステリック調節がＶＥＧＦ誘発血管漏出および血管新生を阻害の両方を阻害するかどうかを測定した。マウスで、マトリゲルの皮下注射、腫瘍細胞、またはブルック膜のレーザー熱傷により、ＶＥＧＦまたは血管新生を誘発した。
【００８４】
ＩＰ３Ｒ５は、ＥＢ結合コンセンサスモチーフであるＳｅｒ／Ｔｈｒ−ｘ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（ＳｘＩＰ）（配列番号５）を含む。ＩＰ．ｓｕｂ．３Ｒ．ｓｕｂ．３配列（ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ−−配列番号１）（図２）をベースとする短ペプチドは、自由エネルギー結合が−６８．８８２ｋｃａｌ／ｍｏｌであり、ＥＢ３に対して高い結合活性を示す（図３）。ＥＢ３とＩＰ３Ｒ３との間の相互作用の役割は、Geyer  et  al.,  Cell  Rep  12(1):79-89;  2015により最近記載された。細胞浸透性アンテナペディアペプチド（ＡＰ）のＣ末端に結合されたＩＰ３Ｒ３配列で１０ｎＭで細胞を前治療することは、トロンビンに応答したストアからのＣａ２＋の放出を著しく減少させ（図４Ａ）、このことは、ＩＰ．ｓｕｂ．３Ｒ．ｓｕｂ．３とＥＢ３との間の相互作用が、ＩＰ３Ｒ３の活性化の機構において、重大な意味を持つことを示唆する。ＩＰ３Ｒ３ペプチドおよびタキソールの効果を、Ｃａ２＋の放出の制御において比較した。トロンビンの刺激の前に細胞を５μｇ／ｍｌのタキソールで２０分間前治療することは、  ＩＰ３Ｒ３ペプチドと同程度、ＥＲからのＣａ２＋の放出を阻害する（図４Ｂ）。
実施例２
末端結合阻害ペプチド（ＥＢＩＮ）の構造に基づく設計
【００８５】
末端結合阻害ペプチド、すなわちＥＢＩＮを、シリコアラニンスキャニング（silico  alanine-scanning）およびＩＰＲペプチドのＥＢ結合ポケットへの完全にフレキシブルなドッキングのコンピューター解析に基づいて設計した（表２および３）。結合自由エネルギー（ΔＧ）を使用して、ペプチドとＥＢタンパク質の相互作用の安定化における各残基の寄与を求めた。
【００８６】
以下の基準を使用した。ΔＧ値≧１＝安定化残基  ΔＧ値≧−１＝不安定化残基  ΔＧ値＜−１〜０〜＜１＝中間残基  アラニンスキャニングは、安定化（正の結合エネルギーが０．５０Ｋｊ／モル以上；黒色で示されている）および不安定化（負の結合エネルギーが−１，青色で示されている）残基を明らかにする。
表１：ＩＰ３Ｒ３のＴｈｒ−ｘ−Ｐｒｏモチーフを取り囲むアミノ酸残基の切断後の結合自由エネルギーの計算された変化
【表１】
2018508528.tif 000002
表２：アラニンについてＩＰ３Ｒ３の各アミノ酸残基を変異させた後の結合自由エネルギーの計算された変化：Ｋ１Ｆ２Ａ３Ｒ４Ｌ５Ｗ６Ｔ７Ｅ８Ｉ９Ｐ１０Ｔ１１Ａ１２Ｉ１３Ｔ１４
【表２】
2018508528.tif 000003

表３：アラニンについてＥＢＩＮの各アミノ酸残基を変異させた後の結合自由エネルギーの計算された変化
【表３】
2018508528.tif 000004
【００８７】
結果として、１４アミノ酸ＩＰＲペプチドは、７アミノ酸末端結合阻害ペプチド（ＥＢＩＮ、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３））に減らされた。図５は、ＥＢ３とＥＢＩＮとの間の相互作用を示す。（図５で黄色の棒で示されている）ＩＰ３Ｒ３と同様に、ＥＢＩＮは、ＥＢ酸性末端とコイルドコイルドメインとの間の疎水性の溝に結合する。ＥＢＩＮのＥＢ３との計算されたエネルギー結合は、−６０．２５１ｋｃａｌ／ｍｏｌであり、ＩＰＲとＥＢ３との間のエネルギー結合と類似している。ＥＢＩＮの位置２でのトレオニンは、ＥＢ３境界面との結合において重要な役割を果たし、これは、この残基のアラニンへの変異が、結合を完全に消失させるからである。したがって、単一のアミノ酸変異Ｔ→ＡのペプチドであるＦＡＥＩＰＴＩ（配列番号４）を結合欠損コントロールとして使用した。
実施例６
ＥＢＩＮはＶＥＧＦ誘発微小血管漏出を予防した
【００８８】
ＶＥ−カドヘリンは、内皮細胞を架橋して連続的な単層にして、タンパク質を豊富に含む体液に対する血管壁の制限的バリアーを維持する、内皮内接合部の主要な接着タンパク質である。ＶＥＧＦおよびＡｎｇ２の両方が、ＶＥ−カドヘリンのチロシンリン酸化を誘発し、ＶＥ−カドヘリンを内在化および分解の標的とすることにより直接的に、または細胞内の力への応答によるＶＥ−カドヘリン接着の破壊という方法により非直接的に、ＶＥ−カドヘリン接着を不安定化する。
【００８９】
ＶＥ−カドヘリン接着と微小管細胞骨格との間の重要な相互作用は、最近記載された（Komarova  et  al.  Molecular  Cell  48(6):  914-25;  2012.）。カルシウム依存性ホスファターゼであるカルシニューリンは、ＥＢ３を脱リン酸化し、ＭＴ細胞骨格のＥＢ３依存性の再編成を促進し、それによりＶＥ−カドヘリン接着を破壊するフィードフォワード機構を与えるので、この相互作用において主要なシグナル因子であることが分かった。
【００９０】
ＥＢＩＮの注射が血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）誘発微小管漏出を予防するかどうかを調査する研究を実施した。Ｂａｌｂ／ｃＪマウスを、ＥＢＩＮペプチド（１μＭ／ｋｇ）またはコントロールペプチド（２Ｔ→Ａの変異）で前治療し、次に、ヒトＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｋｇ体重）を皮内に注射して、アルブミン結合エバンスブルーの血管漏出を誘発した（図６Ａ参照）。また、ホルムアミドで抽出したエバンスブルーを、６２０ｎｍの分光測定で定量し、ヘモグロビン（７４０ｎｍ）および皮膚重量に対して補正した（図６Ｂ参照）。図６に与えられているデータは、ＥＢＩＮペプチドでの動物の治療が、ヒトＶＥＧＦの皮内の注射により誘発される皮下の血管漏出を有意に阻害したことを示し、したがって、ＥＢＩＮが、血管新生の阻害のため、およびＶＥＧＦ誘発血管透過性に関連する障害の治療のための新規の強力な療法に相当し得ることを完全に支持する。
実施例７
ＥＢＩＮは、血管新生のモデルにおいて血管増殖を消失させた
【００９１】
インビトロの管形成およびインビボの血管新生に対するＥＢＩＮの効果をマトリゲルモデルを使用して調査した。ヒト臍静脈内皮細胞の単細胞懸濁液を、１μＭのＥＢＩＮまたはコントロールペプチドの存在下でマトリゲルをコーティングしたウェルの上に蒔き、管形成を１６時間後評価した。図７Ａおよび７Ｂに示されているように、ＥＢＩＮは、このインビトロの２Ｄマトリゲルモデルにおいて、管の形成を有意に消失した。
【００９２】
異所性マトリゲル血管新生のインビボモデルにおける血管の内方成長に対するＥＢＩＮの効果も調査した。グロースマトリゲル中の血管をヘパリンおよびＶＥＧＦとプレミックスし、内皮細胞とはプレミックスせず、マウスの下腹部に腹腔内注射した。マウス当り２つの４００μＬのプラグがあった。コントロールペプチドで治療したマウスにおいて（群１）、新しく形成された血管は、マトリゲルへと成長した（図７Ｃ，１）。これらの血管は、機能性であり、血管内の赤血球の存在から明らかであるように、血液がかん流していた。また、マウスを、マトリゲル注射時（図７Ｃ，２；群２）、またはマトリゲルから３６時間後（図７Ｃ，３；群３）に、ＥＢＩＮで治療した。マトリゲルプラグを９６時間で除去し、固定し、ＨＥで染色して、血管形成を評価した。血管の数が顕著に減少し、９９％の信頼区間で血管の内方成長における有意な減少を示した。治療後の処置が治療と同程度に効果があり、抗ＶＥＧＦ療法およびタキソールと同様に、ＥＢＩＮが血管の退縮を引き起こすことができることを示すことに留意されたい。しかしながら、ＥＢＩＮは、内皮細胞死または細胞周期停止を誘発しなかった（データは示さず）。
実施例８
ＥＢＩＮは、腫瘍細胞の増殖を阻害した
【００９３】
異種移植モデルを使用するトリプルネガティブ（エストロゲン受容体［ＥＲ］、プロゲステロン受容体［ＰＲ］、およびヒト上皮増殖因子受容体２［ＨＥＲ−２］は、この細胞株では発現されない）ヒト乳癌細胞の増殖速度に対するＥＢＩＮの効果を、調査した。ヌードマウス（群当りｎ＝８マウス）に、３×１０６のＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞を左上乳房脂肪体に注射した。全てのマウスが、１３日目までに腫瘍を発症した。その時点で、マウスをランダム化し、５群に分け、各群は、治療を受けた。腫瘍が２０００ｍｍ３の大きさに達した２４日目に、研究を終了した。コントロールペプチドおよびＥＢＩＮでの治療を、７日間毎日実施した。ＥＢＩＮおよびコントロールペプチドを、尾静脈注射により送達した。コントロールペプチドを５μＭ／ｋｇ体重で注射した。ＥＢＩＮを１μＭ／ｋｇ体重および５μＭ／ｋｇ体重で注射した。
【００９４】
タキソールでの治療を、４日間、１０μＭ／ｋｇ体重での腹腔内注射により実施した。腫瘍サイズを１週間に３回測定した。図８Ａに示されているように、タキソール群において腫瘍増殖に有意な遅延が観察され、ＥＢＩＮ治療群において腫瘍サイズの減少が４回の治療後に観察された。この効果はどちらかといえば一過性であるが、ＥＢＩＮ治療群における腫瘍のサイズは、コントロール未治療群と比較して、有意に小さかった。１μＭ／ｋｇのＥＢＩＮで治療したマウスは、未治療マウスと同じ速度で腫瘍を発症し、低い用量は情動的でないことを示唆した。
【００９５】
ＥＢＩＮ治療の効果と腫瘍血管新生とを相関させるために、腫瘍組織を収集し、固定し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。腫瘍塊の外側の細胞数を記録し、面積当りで標準化した。腫瘍増殖曲線と一致して、腫瘍の外側の血管数は、タキソールおよびＥＢＩＮ（５μＭ／ｋｇ）−治療群でのみ有意に減少した。ＥＢＩＮは、タキソールと比較して優れた効果を示した（図８Ｂ参照）。全ての他の群は、未治療群と比較して差異を示さなかった。これらのデータは、ＥＢＩＮが抗血管新生特性を示し、病的血管新生の治療にＥＢＩＮを使用できることを示唆する。タキソールおよび５μＭ／ｋｇ体重のＥＢＩＮでの治療だけが、腫瘍の外側の血管数を有意に減少させた。
実施例９
レーザー誘発脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）のインビボモデルにおける治療に対するＥＢＩＮの有効性の測定
【００９６】
血管新生ＡＭＤは、ブルック膜を貫通して網膜下領域に達する、脈絡膜からの血管の成長により特徴づけられる。レーザー誘発脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）のマウスモデルは、ＡＭＤの滲出性形態の充分に確立されたモデルである。レーザービームによるブルック膜の破壊は、新しい脈絡膜血管の網膜への成長を促進し、それによりＡＭＤの病的状態と似た状態を引き起こす（図９）。このモデルは、血管新生ＡＭＤに対するＶＥＧＦ療法の臨床的有効性の推定に成功裏に使用されてきた。
【００９７】
ＥＢＩＮのバリアー保護活性および抗血管新生活性を評価するために、ＥＢＩＮをＣＮＶのマウスモデルで試験する。ＥＢＩＮでの治療に加えて、LEAFＴＭ抗体（マウスＶＥＧＦ−Ａに対するモノクローナルラット抗体）およびコントロールペプチド（Ｍｙｒ−ＦＡＥＩＰＴＩ）を、ポジティブおよびネガティブ実験コントロールとして謹んで使用した。
【００９８】
Ｃ５７／ＢＬ６マウス（６〜８週齢）を、Charles  River  Laboratoryから購入し、認可されている手順に従って使用した。マウスをケタミン／キシラジン（１００ｍｇ／５ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ）の混合物で麻酔し、その瞳孔をCyclomydril（テキサス州フォートワースのAlcon  Laboratories）の局所適用で散大させた。眼底を撮像カメラで観察し、レーザー光凝固を画像誘導レーザーシステム（Micron  IV，Phoenix  Research  Laboratories，カリフォルニア州のプレザントン）を使用して誘発した。波長が５３２ｎｍ、一定径が５０μｍ、持続時間が７０ｍｓ、パワーレベルが２１０〜２５０ｍＷの緑色アルゴンレーザーパルスにより、視神経から等しい距離にある４つのレーザー熱傷を右目に１つずつ誘発した。レーザースポットでの気泡の出現または小さい網膜下出血（直径＜１ｍｍ）は、ブルック膜の破裂を示すことに役立ち、レーザー誘発ＣＮＶの確認としての役割を果たす。この手順を、各マウスの右目だけで実施した。レーザー誘発光凝固のスケジュールおよび治療手順は、図１０に示されている。コントロールおよびＥＢＩＮペプチド（１μｇ／眼）、およびマウスＶＥＧＦ−Ａに対する抗体（２μｇ／眼；LEAFＴＭ；低エンドトキシン，アジドフリー）での治療を、レーザー光凝固後に、硝子体内注射（２μｌ）により右目に１回適用した。眼を無菌食塩水で穏やかに洗浄して潤滑点眼薬を除去し、抗生物質軟膏であるエリスロマイシン（ニューヨーク州メルヴィルのFougera）で治療した。次に、マウスを、レーザー治療の後、目覚めるまで、３５℃の予め温めた加温板上に置いた。８および１５日目に、ＥＢＩＮの抗血管新生の有効性を眼干渉断層撮影（ＯＣＴ）により評価し、１５日目にだけ、血管造影を実施した（図１０）。患者に臨床的に日常的に使用される手順と同様に、網膜血管系を撮像するために、蛍光血管造影およびＯＣＴを実施した。これを、マウスの尾静脈を通して、１０μｌの０．２％のフルオレセイン色素の静脈内注射により、実施した。治療群当り１０マウスのサンプルサイズが、Gong  et  al.,  PLoS  One  2015,  10(7):  e  0132643で決められたパラメーターをベースとして、血管漏出（レッスン（lesson）領域）の仮定した１０％の差異を検出するのに充分な検出力を与える。
【００９９】
表４は、１０の治療群（治療群当りｎ＝１０ＣＮＶマウス，合計で３０マウス）、薬剤レジメン、および治療への応答を測定するための予定エンドポイントをリストしている。群１のマウスは、Ｍｙｒ−コントロールペプチドを受け、群２のマウスは、Ｍｙｒ−ＥＢＩＮで治療され、群３のマウスは、ポジティブコントロールとしてのLEAFＴＭで治療された。全ての治療を、図１０に概説しているように、硝子体内経路を介して、ＣＮＶの時点で単回注射として送達した。
【０１００】
表４：治療群、薬剤レジメン、およびマウスにおけるＣＮＶの治療への応答を測定するためのエンドポイントアッセイ
【表４】
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【０１０１】
図１１ａおよび１１ｂは、ＥＢＩＮ、抗ＶＥＧＦ抗体、またはコントロールペプチドで治療したＣＮＶマウスについての、レーザー光凝固術後１５日目での眼底蛍光血管造影（ａ）、および対応する光干渉断層撮影（ｂ）の画像（数は、対応するＣＮＶ病変を示す）を示す。ＥＢＩＮは、抗ＶＥＧＦ治療と同様にＣＮＶ病変を減少させ、それ故、黄斑変性などの眼疾患の現在の治療の有力な代替物を与える。実験を１５日目に終了し、この時点で、動物をケタミン／キシラジン（１００ｍｇ／５ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ）でと殺し、次いで頚椎脱臼をし、眼組織を免疫蛍光染色および病理解析のために収集した。網膜／脈絡膜／強膜のフラットマウント標本を、ＣＮＶ領域の死後分析のためのBandeiraea  simplicifoliaからのAlexa594標識レクチン（Ｂ４）を用いた染色（図１１ｃ）に使用した。
【０１０２】
データ分析を、これまでの研究（Gong  et  al.,  PLoS  One  2015,  10(7):  e  0132643）で確立された除外基準を用いて実施した。激しい出血、例えばブルック膜だけでなく脈絡膜および網膜色素上皮も損傷する過度のレーザー熱傷の場合、同じ実験条件下での病変の平均の５倍よりも大きい病変である融合した病変を除外した。血管漏出およびＣＮＶの面積を、蛍光血管造影画像および、MetaMorphソフトウェアを用いるレクチンＢ４でのＣＮＶ染色の共焦点画像を使用して定量した。データをSigma  Plotソフトウェアを用いてプロットし（図１１ｄおよび１１ｅ）、Prism  6（カリフォルニア州サンディエゴのGraphPad）を用いて、１元配置ＡＮＯＶＡにより分析した。
さらなる研究
【０１０３】
マウスのＥＢＩＮでの治療は、コントロールペプチドで治療したマウスと比べて、血管漏出およびＣＮＶ病変の両方を有意に低減した（図１１）。ＥＢＩＮの効果は、LEAFＴＭ治療と類似しており、ＥＢＩＮが、ベバシズマブおよびアフリベルセプトなどのＡＭＤの現在利用可能な抗ＶＥＧＦ治療のコスト効率のよい有効な代替物を与え得ることを示唆する。
【０１０４】
あるいは、ＥＢＩＮを点眼経路により送達する。この場合、治療は、レーザー光凝固の１日前に開始し、マウスを、レーザー光凝固後１５日目まで、１日に２回治療する。治療および観察の期間は、１５日間である。また、ＥＢＩＮをLEAFＴＭ抗体との併用で、硝子体内注射により、および／または点眼経路により送達する。全ての場合において、LEAFＴＭ抗体を硝子体内注射により投与する。上述したように、ＥＢＩＮの抗血管新生の有効性を、レーザー誘発ＣＮＶ後８および１５日目に、蛍光血管造影および眼干渉断層撮影（ＯＣＴ）により評価する。また、眼組織を１５日目に収集する。
【０１０５】
表５は、１０の治療群（治療群当りｎ＝１０ＣＮＶマウス，合計で１００マウス）、薬剤レジメン、および将来の研究のための治療への応答を測定するための予定エンドポイントアッセイをリストしている。群１のマウスは、ポジティブコントロールとしてのLEAFＴＭ抗体で治療され、群２のマウスは、群１に対するコントロールとしてのκアイソトープコントロールであるLEAFＴＭ精製ラットＩｇＧ２ａを受ける。群３および４は、それぞれ、マウスＶＥＧＦに対するデコイ受容体（ポジティブコントロール２）またはネガティブＭｙｒ−コントロールペプチドで治療される。LEAFＴＭ抗体、デコイ受容体、およびコントロールペプチドは、全て、硝子体内経路を介して、ＣＮＶの時点で単回注射として送達される。群５および６は、硝子体内経路を介して、それぞれ、０．１μｇ／眼または１μｇ／眼のＭｙｒ−ＥＢＩＮを受ける。群７および８は、それぞれ、１日２回、点眼により、０．５μｇ／眼または５μｇ／眼のＭｙｒ−ＥＢＩＮを受ける。群９のマウスは、LEAFＴＭ抗体との併用でＭｙｒ−ＥＢＩＮ（０．１μｇ／眼）で治療され、両方とも硝子体内経路を介して送達される。群１０は、硝子体内経路を介して、LEAFＴＭ抗体との併用でＭｙｒ−ＥＢＩＮ点眼薬（０．５μｇ／眼）で治療される。
【０１０６】
表５：将来の治療群、薬剤レジメン、およびマウスにおけるＣＮＶの治療への応答を測定するためのエンドポイントアッセイ
【表５】
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実施例１０
インビボでのＥＢＩＮの急性毒性試験
【０１０７】
短期間の研究を設計して、インビボでの投与の安全性を評価する。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１０，群当り５マウス／治療経路）をランダム化し、２つの群に分ける。第１の群は、右目に、１日に２回送達される点眼薬により、眼当り５μｇ（１０μｌ）で、ＥＢＩＮで治療され、第２の群は、初日に眼当り１μｇ（２μｌ）の最大用量で、右目に、ＥＢＩＮの硝子体内注射で治療される。硝子体内注射をケタミン／キシラジン（１００ｍｇ／５ｍｇ／ｋｇ）麻酔下で実施する。両方の群を、毎日、体重を含む一般的健康状態、ならびに混濁、眼球突出、眼球陥入、結膜炎、異常分泌または痂皮、および角膜潰瘍を含む何らかの眼の異常について、８日間の期間モニタリングする。動物を、蛍光血管造影およびＯＣＴ撮像に続いて付す。ＥＢＩＮでの治療後、ＣＮＶ誘発がある場合、またはない場合で、毒性は観察されなかった（図１２）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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