(57)【要約】  本発明は前立腺癌に関連する孤児G蛋白質共役型受容体GPR160遺伝子のdsRNA構築物および使用を提供し、前記GPR160遺伝子のdsRNA構築物およびその組成物は前立腺癌を予防または治療することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖で、かつそのフォワード鎖またはリバース鎖に式Iで表される構造が含まれることを特徴とするdsRNA構築物。
【化１】
2018529362.tif 000011
（式中において、
SeqフォワードはGPR160遺伝子またはGPR160遺伝子断片である。
Seqリバースは、Seqフォワードに基本的に相補的なヌクレオチド配列である。
Xは、SeqフォワードとSeqリバースの間にあるスペーサー配列で、かつ前記スペーサー配列はSeqフォワードおよびSeqリバースに相補的なものではない。）
【請求項２】
前記GPR160遺伝子配列は配列番号1で示され、かつ/あるいは、ことを特徴とする請求項1に記載の構築物。
前記GPR160遺伝子断片の配列は配列番号6、または7で示される
【請求項３】
前記Seqフォワードの配列は配列番号6、または配列番号7で示されることを特徴とする請求項1に記載の構築物。
【請求項４】
式IIで表される構造を有することを特徴とするdsRNA。
【化２】
2018529362.tif 000012
（式中において、
Seq’フォワードはGPR160遺伝子またはGPR160遺伝子断片のヌクレオチド配列に相応するRNA配列または配列断片である。
Seq’リバースはSeq’フォワードに基本的に相補的な配列である。
X’はないか、あるいはSeq’フォワードとSeq’リバースの間にあるスペーサー配列で、かつ前記スペーサー配列はSeq’フォワードおよびSeq’リバースに相補的なものではない。
【化３】
2018529362.tif 000013
は、Seq’フォワードとSeq’リバースの間に形成された水素結合を表す。
好ましくは、前記GPR160遺伝子の配列は配列番号1で示される。
より好ましくは、前記GPR160遺伝子断片の配列は配列番号6、または配列番号7で示される。）
【請求項５】
請求項1に記載のdsRNA構築物を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項６】
請求項5に記載の発現ベクターを含むか、あるいは染色体に請求項1に記載のdsRNA構築物に相応するDNA配列が組み込まれていることを特徴とする宿主細胞。
【請求項７】
GPR160遺伝子の発現を抑制するか、GPR160受容体の活性を拮抗する阻害剤または拮抗剤を含み、好ましくは、前記阻害剤は、特異的にGPR160遺伝子の発現を干渉する低分子干渉分子またはアンチセンスヌクレオチド、あるいは
GPR160遺伝子がコードするタンパク質と特異的に結合する生物または化学配位子を含む、
ことを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項1に記載のdsRNA構築物および/または請求項4に記載のdsRNAと、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする請求項7に記載の組成物。
【請求項９】
前記の組成物は動物内在性GPR160遺伝子の発現を抑制するための組成物であることを特徴とする請求項7に記載の組成物。
【請求項１０】
前記のdsRNAは配列番号6、または配列番号7で示される配列を有することを特徴とする請求項8に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項1に記載のdsRNA構築物、または請求項2に記載のdsRNA、または請求項3に記載の発現ベクター、または請求項5に記載の組成物の使用であって、GPR160遺伝子の発現を抑制する阻害剤の製造における使用。
好ましくは、前記使用は、さらに、癌を予防または治療する薬物の製造における使用を含む。
より好ましくは、前記癌は、前立腺癌、鼻咽頭癌、乳癌、肺癌、胃癌、肝臓癌、膵臓腺癌、結直腸癌のような固形腫瘍、白血病、リンパ腫のような血液腫瘍、メラノーマのような皮膚腫瘍などを含むが、これらに限定されない。
【請求項１２】
dsRNAを製造する方法であって、
（i） dsRNAを発現する構築物であって、二本鎖で、かつそのセンス鎖またはアンチセンス鎖に式Iで表される構造が含まれる構築物を製造する工程、
【化４】
2018529362.tif 000014
（式中において、
SeqフォワードはGPR160遺伝子またはGPR160遺伝子断片である。
Seqリバースは、Seqフォワードに基本的に相補的なヌクレオチド配列である。
Xは、SeqフォワードとSeqリバースの間にあるスペーサー配列で、かつ前記ペーサー配列はSeqフォワードおよびSeqリバースに相補的なものではない。）
（ii） 工程（i）に記載の構築物を宿主細胞に導入することによって、宿主細胞において式IIで表されるdsRNAを発現させる工程、
【化５】
2018529362.tif 000015
（式中において、
Seq’フォワードはSeqフォワード配列に相応するRNA配列または配列断片である。
Seq’リバースはSeq’フォワードに基本的に相補的な配列である。
X’はないか、あるいはSeq’フォワードとSeq’リバースの間にあるスペーサー配列で、かつ前記スペーサー配列はSeq’フォワードおよびSeq’リバースに相補的なものではない。
【化６】
2018529362.tif 000016
は、Seq’フォワードとSeq’リバースの間に形成された水素結合を表す。
好ましくは、前記GPR160遺伝子の配列は配列番号1で示される。
より好ましくは、前記GPR160遺伝子断片の配列は配列番号6、または配列番号7で示される。）
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
前記スペーサー配列Xの長さは1〜100 bp、好ましくは4〜10 bpであることを特徴とする請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記GPR160遺伝子またはGPR160遺伝子断片は哺乳動物、好ましくはヒト由来のものであることを特徴とする請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
配列番号6、または7で示される核酸配列の使用であって、GPR160遺伝子発現阻害剤、好ましくは低分子干渉RNAである発現阻害剤の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物技術の分野に属する。具体的に、本発明は、前立腺癌（Prostate cancer、PCa）に関連するGPR160遺伝子の機能およびその使用に関し、GPR160遺伝子発現阻害剤またはそのタンパク質産物拮抗剤を含む。また、本発明はPCaを診断、予防および治療する方法に関する。本発明は、GPR160遺伝子およびそのタンパク質産物に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は重篤な男性老年疾患で、欧米で男性癌死亡の主な原因の一つである。その発症率は年齢とともに増加し、80歳以上の老年男性の前立腺検査で半数は癌病巣が発見される。我が国のPCaの発症率は欧米国家よりも低いが、近年顕著に増加する態勢を示し、かつ患者の年齢が低齢化する傾向が現れた。前立腺増殖およびPCa病因学に関する研究および臨床治療はすでに世界中で医学界から幅広く注目されている。
【０００３】
従来のPCa治療方法は、アンドロゲン除去、前立腺摘出、ホルモン補充および放射線/化学治療を含む。早期のPCaは通常アンドロゲン除去治療が使用される。ホルモン補充療法は比較的に簡単で、苦痛も少ないが、薬物耐性になりやすい。局所性PCaは通常手術摘出と放射線/化学治療を併用するが、患者はよく副作用、たとえば脱毛または免疫機能異常などに苦しまされる。腫瘍自身は異質性があり、かつ大半のPCaはホルモン依存性のものからホルモン非依存性のものに発展するため、治療に大きな障害をもたらす。そのため、新たな治療標的の発見および真新しい作用機序を有する抗PCa薬物の開発は幅広い市場需要がある。
【０００４】
癌組織で発現が上方制御された遺伝子産物は潜在の抗癌薬の作用標的として有用である。現在、ある種類の癌において異常発現され、癌細胞の増殖と拡散につながる分子標的に基づいて開発に成功した新薬、たとえば慢性骨髄性白血病を治療するグリベック（Glivec）や乳癌を治療するハーセプチン（Herceptin）などはすでにある。PCaにも数種類の過剰発現される分子が発見され、かつPCaマーカーまたは治療標的とされ、このような探索はまだまだつづく。
【０００５】
このように、本分野では、PCaの発生と発展と密接に関連し、PCa組織だけにおいて特異的に発現される遺伝子またはその産物を見つけて関与標的とすることによって、PCaの診断、予防および治療に新たなアプローチを提供することが切望されている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的は、GPR160遺伝子の発現を有効に抑制する阻害剤を提供することにある。
本発明の第一の側面では、二本鎖で、かつそのフォワード鎖またはリバース鎖に式Iで表される構造が含まれるdsRNA構築物を提供する。
【０００７】
【化１】
2018529362.tif 000002
（式中において、
SeqフォワードはGPR160遺伝子またはGPR160遺伝子断片である。
【０００８】
Seqリバースは、Seqフォワードに基本的に相補的なヌクレオチド配列である。
Xは、SeqフォワードとSeqリバースの間にあるスペーサー配列で、かつ前記スペーサー配列はSeqフォワードおよびSeqリバースに相補的なものではない。）
もう一つの好適な例において、前記GPR160遺伝子の配列は配列番号1で示される。
【０００９】
もう一つの好適な例において、前記GPR160遺伝子断片の配列は配列番号6、または7のいずれかで示される。
もう一つの好適な例において、前記Seqフォワードの配列は配列番号6、または配列番号7で示される。
【００１０】
もう一つの好適な例において、前記スペーサー配列Xの長さは1〜100 bp、好ましくは4〜10 bpである。
もう一つの好適な例において、前記GPR160遺伝子またはGPR160遺伝子断片は哺乳動物、好ましくはヒト由来のものである。
【００１１】
もう一つの好適な例において、前記dsRNA構築物は宿主細胞において式IIで表されるdsRNAになる。
【００１２】
【化２】
2018529362.tif 000003
（式中において、
Seq’フォワードはSeqフォワード配列に相応するRNA配列または配列断片である。
【００１３】
Seq’リバースはSeq’フォワードに基本的に相補的な配列である。
X’はないか、あるいはSeq’フォワードとSeq’リバースの間にあるスペーサー配列で、かつ前記スペーサー配列はSeq’フォワードおよびSeq’リバースに相補的なものではない。
【００１４】
【化３】
2018529362.tif 000004
は、Seq’フォワードとSeq’リバースの間に形成された水素結合を表す。）
本発明の第二の側面では、式IIで表される構造を有するdsRNAを提供する。
【００１５】
【化４】
2018529362.tif 000005
（式中において、
Seq’フォワードはGPR160遺伝子またはGPR160遺伝子断片のヌクレオチド配列に相応するRNA配列または配列断片である。
【００１６】
Seq’リバースはSeq’フォワードに基本的に相補的な配列である。
X’はないか、あるいはSeq’フォワードとSeq’リバースの間にあるスペーサー配列で、かつ前記スペーサー配列はSeq’フォワードおよびSeq’リバースに相補的なものではない。
【００１７】
【化５】
2018529362.tif 000006
は、Seq’フォワードとSeq’リバースの間に形成された水素結合を表す。）
もう一つの好適な例において、前記GPR160遺伝子の配列は配列番号1で示される。
【００１８】
もう一つの好適な例において、前記GPR160遺伝子断片の配列は配列番号6、または配列番号7で示される。
もう一つの好適な例において、前記スペーサー配列Xの長さは1〜100 bp、好ましくは4〜10 bpである。
【００１９】
もう一つの好適な例において、前記GPR160遺伝子またはGPR160遺伝子断片は哺乳動物、好ましくはヒト由来のものである。
本発明の第三の側面では、本発明の第一の側面に記載のdsRNA構築物を含有する発現ベクターを提供する。
【００２０】
もう一つの好適な例において、前記の発現ベクターはウイルスベクターまたはプラスミドベクターである。
もう一つの好適な例において、前記のウイルスベクターはレンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである。
【００２１】
本発明の第四の側面では、本発明の第三の側面に記載の発現ベクターを含むか、あるいは染色体に本発明の第一の側面に記載のdsRNA構築物のDNA配列が組み込まれた宿主細胞を提供する。
【００２２】
もう一つの好適な例において、前記宿主細胞に本発明の第一の側面に記載のdsRNA構築物のDNA配列が組み込まれた。
本発明の第五の側面では、GPR160遺伝子の発現を抑制するか、GPR160受容体の活性を拮抗する阻害剤または拮抗剤を含む組成物を提供する。好ましくは、前記阻害剤は、特異的にGPR160遺伝子の発現を干渉する低分子干渉分子またはアンチセンスヌクレオチド、あるいは
GPR160遺伝子がコードするタンパク質と特異的に結合する生物または化学配位子を含む。
【００２３】
もう一つの好適な例において、前記組成物は、本発明の第一の側面に記載のdsRNA構築物およびまたは本発明の第二の側面に記載のdsRNAと、薬学的に許容される担体とを含む。
【００２４】
もう一つの好適な例において、前記の組成物は、動物内在性GPR160遺伝子の発現を抑制するための組成物である。
もう一つの好適な例において、前記dsRNAは、配列番号6、または配列番号7で示される配列を有する。
【００２５】
もう一つの好適な例において、前記組成物は試薬または薬物組成物である。
本発明の第六の側面では、本発明の第一の側面に記載のdsRNA構築物、または本発明の第二の側面に記載のdsRNA、または本発明の第三の側面に記載の発現ベクター、または本発明の第五の側面に記載の組成物の使用であって、GPR160遺伝子の発現を抑制する阻害剤の製造における使用を提供する。
【００２６】
もう一つの好適な例において、前記GPR160遺伝子はヒトGPR160遺伝子である。
もう一つの好適な例において、前記使用は、さらに、癌を予防または治療する薬物の製造における使用を含む。
【００２７】
もう一つの好適な例において、前記癌は、前立腺癌、鼻咽頭癌、乳癌、肺癌、胃癌、肝臓癌、膵臓腺癌、結直腸癌のような固形腫瘍、白血病、リンパ腫のような血液腫瘍、メラノーマのような皮膚腫瘍などを含むが、これらに限定されない。
【００２８】
本発明の第七の側面では、dsRNAを製造する方法であって、
（i） dsRNAを発現する構築物であって、二本鎖で、かつそのセンス鎖またはアンチセンス鎖に式Iで表される構造が含まれる構築物を製造する工程、
【００２９】
【化６】
2018529362.tif 000007
（式中において、
SeqフォワードはGPR160遺伝子またはGPR160遺伝子断片である。
【００３０】
Seqリバースは、Seqフォワードに基本的に相補的なヌクレオチド配列である。
Xは、SeqフォワードとSeqリバースの間にあるスペーサー配列で、かつ前記ペーサー配列はSeqフォワードおよびSeqリバースに相補的なものではない。）
（ii） 工程（i）に記載の構築物を宿主細胞に導入することによって、宿主細胞において式IIで表されるdsRNAを発現させる工程、
【００３１】
【化７】
2018529362.tif 000008
（式中において、
Seq’フォワードはSeqフォワード配列に相応するRNA配列または配列断片である。
【００３２】
Seq’リバースはSeq’フォワードに基本的に相補的な配列である。
X’はないか、あるいはSeq’フォワードとSeq’リバースの間にあるスペーサー配列で、かつ前記スペーサー配列はSeq’フォワードおよびSeq’リバースに相補的なものではない。
【００３３】
【化８】
2018529362.tif 000009
は、Seq’フォワードとSeq’リバースの間に形成された水素結合を表す。）
を含む方法を提供する。
【００３４】
もう一つの好適な例において、前記GPR160遺伝子の配列は配列番号1で示される。
もう一つの好適な例において、前記GPR160遺伝子断片の配列は配列番号6、または配列番号7で示される。
【００３５】
もう一つの好適な例において、前記スペーサー配列Xの長さは1〜100 bp、好ましくは4〜10 bpである。
もう一つの好適な例において、前記GPR160遺伝子またはGPR160遺伝子断片は哺乳動物、好ましくはヒト由来のものである。
【００３６】
本発明の第八の側面では、配列番号6、または7で示される核酸配列の使用であって、GPR160遺伝子発現阻害剤の製造における使用を提供する。
もう一つの好適な例において、前記発現阻害剤は低分子干渉RNAである。
【００３７】
本発明の他の主旨は、本文の公開される内容によって、この分野の技術者にとっては明らかになっている。
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図1は、GPR160のヒト前立腺癌組織および前立腺癌細胞株における発現情況を示す。Aは正常前立腺および前立腺癌の組織におけるGPR160の発現情況で、Bは正常前立腺の上皮細胞RWPE-1および4種類の前立腺癌細胞株（PC-3、DU145、LNCaPおよび22RV1）におけるGPR160の発現情況である。
【図２】図2は、GPR160低分子干渉RNAの前立腺癌細胞に対する抑制作用を示す。AおよびBは定量RT-PCRの検出結果を示すが、特異性低分子干渉RNAは顕著にPC-3細胞（A）およびLNCaP細胞（B）におけるGPR160遺伝子の発現を低下させた。CおよびD：特異性低分子干渉RNAはPC-3細胞（C）およびLNCaP細胞（D）の増殖を抑制した。EおよびF：特異性低分子干渉RNAはPC-3細胞（E）およびLNCaP細胞（F）のクローン形成を抑制した。
【図３】図3は、GPR160特異性低分子干渉RNAで作用した後、顕著にPC-3細胞（A）およびLNCaP細胞（B）におけるDNA低二倍体ピークの比率を増加させたことを示す。
【図４】図4は、GPR160特異性低分子干渉RNAが前立腺癌細胞のアポトーシスを誘導したことを示す。PC-3細胞（A）およびLNCaP細胞（B）がGPR160低分子干渉RNAをコードするレンチウイルスで感染された後、アネキシンVおよびPIの二重染色を行い、図面はアネキシンV単独染色が陽性の細胞の比率を示すが、当該比率はGPR160低分子干渉RNAで処理された細胞では顕著に対照低分子干渉RNAで処理された細胞よりも高かった。
【図５】図5は、安定してGPR160およびGα16が形質移入されたCHO細胞株でGPR160の低分子作動剤を選別したことを示す。ここで、緑色の曲線はDMSO溶媒対照で、赤色曲線は8 μMのイオノマイシン（Ionomycin）刺激によるシグナル反応を示し、黄色曲線は2 μMのイオノマイシンで、灰色曲線は5 μg/mlの化合物H5によるシグナル反応である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
具体的な実施形態
本発明者は幅広く深く研究したところ、GPR160遺伝子を有効に抑制する低分子干渉RNAを獲得し、実験結果から、前記低分子干渉RNAへ顕著に腫瘍の生長を抑制することが示されたが、これに基づいて本発明を完成させた。
【００４０】
本発明を説明する前、方法および条件は変更することができるため、本発明は記載される具体的な方法および実験条件に限定されないと理解される。また、本明細書で用いられる用語は具体的な実施形態の説明だけを目的とし、かつその意図は限定性のものではなく、本発明の範囲は添付の請求の範囲だけに限定されると理解される。
【００４１】
別途に定義しない限り、本明細書で用いられるすべての技術と科学の用語はいずれも本発明が属する分野の当業者が通常理解する意味と同様である。本明細書で用いられるように、具体的に例示される数値で使用される場合、用語「約」とは当該値が例示される数値から1％以内で変わってもよい。たとえば、本明細書で用いられるように、「約100」という記述は99と101およびその間の全部の値（たとえば、99.1、99.2、99.3、99.4など）を含む。°
本発明の実施またはテストにおいて本発明における記載と類似または等価の任意の方法と材料を使用することができるが、本明細書で好適な方法と材料が挙げられた。
【００４２】
本発明は、GPR160遺伝子はPCaの組織および細胞のいずれにおいても高発現され、かつPCaの発生および発展と密接に関連することを開示する。GPR160の過剰発現に対する抑制は腫瘍細胞の生長を抑制し、そのアポトーシスを誘導することができ、GPR160がPCaに関与する標的として有用であることが示唆された。
【００４３】
本発明の一つの目的は、PCaに関連するG蛋白質共役型受容体GPR160遺伝子およびその使用を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、PCaの臨床診断、治療効果評価および予後推測における前記GPR160の使用を提供することにある。
【００４４】
本発明のもう一つの目的は、前記GPR160遺伝子発現阻害剤または受容体拮抗剤およびPCaを予防または治療する薬物におけるその使用を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記GPR160遺伝子発現阻害剤または受容体拮抗剤でPCaを予防または治療する方法を提供することにある。
【００４５】
本発明のもう一つの目的は、前記GPR160を薬物作用標的とすることに基づき、PCaを予防または治療する活性物質を選別する方法を提供することにある。
本発明の一つの好適な実施形態において、本発明はGPR160遺伝子またはタンパク質産物、GPR160受容体に基づいてPCaに対して診断、治療効果評価および予後推測を行う方法を提供する。
【００４６】
一つの好適な例において、前記方法は特的にGPR160遺伝子またはそれがコードするタンパク質を認識する物質（特異的にGPR160遺伝子を増幅させるプライマー、または特異的にGPR160タンパク質と結合する配位子を含む）でGPR160遺伝子の発現レベルを検出することを含む。
【００４７】
一つの好適な例において、前記の方法はPCR、NGS、ELISA、Western Blot、同位体標識、フローサイトメトリーなどを含むが、これらに限定されない。
もう一つの好適な例において、前記方法の検出対象はヒト試料で、血液、細胞、組織や体液などを含むが、これらに限定されない。
【００４８】
もう一つの好適な例において、前記のPCR検出方法で使用されるプライマーは、
配列番号2で示されるヌクレオチド配列、および/または
配列番号3で示されるヌクレオチド配列、
に相応する配列を含む。
【００４９】
本発明のもう一つの好適な実施形態において、本発明はGPR160遺伝子の発現を抑制するか、またはGPR160受容体の活性を拮抗する阻害剤の使用であって、前立腺癌（PCa）を予防または治療する組成物の製造における使用を提供する。
【００５０】
もう一つの好適な例において、前記のPCaの組織または細胞はGPR160を発現する。
もう一つの好適な例において、前記の阻害剤は、
特異的にGPR160遺伝子の発現を干渉する低分子干渉分子またははアンチセンスヌクレオチド、あるいは
GPR160遺伝子がコードするタンパク質と特異的に結合する生物または化学配位子、
から選ばれるが、これらに限定されない。
【００５１】
もう一つの好適な例において、前記低分子干渉分子は低分子干渉RNA分子（Small interfering RNA、siRNA）である。
もう一つの好適な例において、前記siRNAはGPR160遺伝子のセンスヌクレオチドおよびアンチセンスヌクレオチドを含む。
【００５２】
もう一つの好適な例において、前記の低分子干渉RNA分子は相応する配列の配列番号1で示されるヌクレオチド配列を標的配列とする。
もう一つの好適な例において、前記の低分子干渉RNA分子は、
配列番号6で示されるヌクレオチド配列、および/または
配列番号7で示されるヌクレオチド配列、
に相応する配列を含む。
【００５３】
もう一つの好適な例において、前記のGPR160遺伝子は哺乳動物、好ましくはヒト由来のものである。
本発明の一つの好適な実施形態において、本発明はPCaを予防または治療する方法であって、必要な対象にGPR160遺伝子の発現を低下させるヌクレオチド配列を含むsiRNA組成物を施用することを含む方法を提供する。
【００５４】
もう一つの好適な例において、前記方法は、患者にGPR160コード配列に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス組成物を投与することを含む。
もう一つの好適な例において、前記方法は、有効量で患者にGPR160遺伝子がコードする受容体と結合する拮抗剤を投与することを含む。
【００５５】
本発明のもう一つの好適な実施形態において、本発明はPCaを予防または治療するための低分子干渉RNA分子であって、二本鎖分子で、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、
配列番号6で示されるヌクレオチド配列、および/または
配列番号7で示されるヌクレオチド配列、
に相応する配列を含む。
【００５６】
アンチセンス鎖は前記センス鎖に相補的なリボヌクレオチド配列を含み、ここで、前記センス鎖とアンチセンス鎖は相互に交雑して前記二本鎖分子になる。
好ましくは、前記二本鎖分子はGPR160遺伝子を発現させる細胞に導入されると前記遺伝子の発現を抑制する。
【００５７】
もう一つの好適な例において、前記二本鎖分子の標的配列は、配列番号1からなるヌクレオチド由来の少なくとも約10個の連続のヌクレオチドを含む。
好ましくは、前記二本鎖分子の標的配列は、配列番号1からなるヌクレオチド由来の少なくとも約19〜約25個の連続のヌクレオチドを含む。
【００５８】
好ましくは、前記二本鎖分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる単一のリボヌクレオチドの転写物である。
本発明のもう一つの実施形態において、本発明はPCaを予防または治療する組成物であって、
1．有効量のGPR160遺伝子発現阻害剤または受容体拮抗剤と、
2．薬学的に許容される担体と、
を含有する組成物を提供する。
【００５９】
好ましくは、前記組成物はGPR160遺伝子の低分子干渉RNA分子を含む。
好ましくは、前記の低分子干渉RNA分子は二本鎖分子で、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、
配列番号6で示されるヌクレオチド配列、および/または
配列番号7で示されるヌクレオチド配列、
に相応する配列を含む。
【００６０】
アンチセンス鎖は前記センス鎖に相補的なリボヌクレオチド配列を含み、ここで、前記センス鎖とアンチセンス鎖は相互に交雑して前記二本鎖分子になる。
好ましくは、前記二本鎖分子はGPR160遺伝子を発現させる細胞に導入されると前記遺伝子の発現を抑制する。
【００６１】
本発明のもう一つの好適な実施形態において、本発明はPCaを予防または治療する潜在的な活性物質を選別する方法であって、
1．被験物質でGPR160を発現する系を処理する工程と、
2．前記系におけるGPR160遺伝子の発現および活性を検出する工程と、
3．GPR160遺伝子の発現を抑制するか、またはその受容体の活性を低下させることができる被験物質を選択する工程と、
を含む方法を提供する。
【００６２】
もう一つの好適な例において、前記方法の工程（1）は、試験群で、被験物質をGPR160を発現する系に入れることを含み、かつ/あるいは
前記方法の工程（2）は、被験物質の系におけるGPR160遺伝子の発現または活性に対する影響を検出し、そして対照と比較することを含み、ここで、前記の対照は前記被験物質が添加されていないGPR160発現系である。
【００６３】
被験物質を含む系においてGPR160遺伝子の発現または受容体の活性は統計学的に対照よりも低い（好適に顕著に、たとえば20％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは80％以上低い）場合、当該被験物質がPCaを予防または治療する潜在力を有することを示す。
【００６４】
もう一つの好適な例において、前記の系は細胞である。
もう一つの好適な例において、前記の方法は、さらに、得られる活性物質に対して細胞機能および/または動物の実験を行うことによって、さらにPCaの予防または治療に有益かどうか選択および確認する。
【００６５】
本発明のもう一つの好適な実施形態において、本発明はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子を提供し、ここで、センス鎖は配列番号6および/または配列番号7からなる標的配列に相応するリボヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖は前記センス鎖に相補的なリボヌクレオチド配列を含み、ここで、前記センス鎖とアンチセンス鎖は相互に交雑して前記二本鎖分子になり、かつここで、前記二本鎖分子はGPR160遺伝子を発現させる細胞に導入されると前記遺伝子の発現を抑制する。
【００６６】
もう一つの好適な例において、前記標的配列は、配列番号1からなるヌクレオチド由来の少なくとも約10個の連続のヌクレオチドを含む。
もう一つの好適な例において、前記標的配列は、配列番号1からなるヌクレオチド由来の少なくとも約19〜約25個の連続のヌクレオチドを含む。
【００６７】
もう一つの好適な例において、前記二本鎖分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる単一のリボヌクレオチドの転写物である。
限定されずに発明の内容を説明するために、発明を以下のいくつかの章節に分けて詳しく説明する。
【００６８】
A．定義
別途に定義しない限り、本発明で使用される技術および科学における用語は、本発明が属する分野の汎用技術の一般的な理解と同様の意味を持つ。本明細書に記載の遺伝子ライブラリーおよびほかのデータベースからのすべての特許出願、特許授権およびほかの出版物と配列は全面的に参照として引用される。本章節で説明された定義は本特許で参照される遺伝子ライブラリーおよびほかのデータベースからのすべての特許出願、特許授権およびほかの出版物と配列で取り込まれて引用される定義の記述と相違するか、または一致しない場合、本章節で説明された定義に準ずる。
【００６９】
別途に特別に説明しない限り、本明細書において用語「1種」、「当該」および「前記」とは「少なくとも1種」あるいは「一つまたは複数」をいう。
本明細書で用いられるように、「前立腺癌」とは男性生殖系のよく見られる悪性腫瘍で、腺癌を主とする。
【００７０】
本明細書で用いられる、ある特定の疾患を治療するための化合物の「有効量」とは当該疾患に主なう症状を改善するか、あるいはある程度軽減するには十分な投与量をいう。本発明において、主に病理的に上方制御した遺伝子の発現に対する治療で、「有効量」は個体における病巣の大きさ、数や転移の可能性にもよる。当該投与量は単一の製剤で投与してもよく、治療プランに従って投与してもよい。当該投与量は疾患を治癒するものでもよいが、典型的には症状を緩和するために投与する。治療が予防のための場合、「有効」とはPCaの形成を遅延または阻止するか、あるいは臨床症状を予防、遅延または軽減することをいう。前立腺腫瘍の評価は標準臨床プロトコールに従って行ってもよい。また、有効性はPCaを診断および治療する任意の既知方法によって関連して測定することができるが、たとえばPCaの診断は、現れた症状の異常情況、たとえば体重減少、腹痛、背痛、拒食、吐き気、嘔吐、体調不良、虚弱や黄疸を同定することによって行うことができる。症状を改善するために繰り返して投与することが必要な可能性がある。
【００７１】
本明細書で用いられるように、「治療」とは疾患および症状を何らかの手段によって改善するか、あるいはほかの有益な変化をさせることをいう。治療は薬物における本発明の使用も含む。
【００７２】
本明細書で用いられるように、ある特定の薬物組成物を投与してある特定の疾患の症状を「改善」するとは、すべての軽減の原因が、永久的でも、一時的でも、長時間でも、短時間でも、当該薬物組成物の施用に帰するか、関連する。
【００７３】
本明細書で用いられる「組成物」とは任意の混合物をいう。溶液、懸濁液、液体、粉末、軟膏、水性のもの、非水性のものまたはこれらの任意の組み合わせでもよい。
本明細書で用いられる「組み合わせ」とは2種または複数種の間の任意の併用をいう。
【００７４】
本明細書で用いられる用語「対象」はヒトおよび動物、たとえばイヌ、ネコ、ウシ、ブタ、齧歯動物などを含む。経験のある実施者にとって、対象が予防および治療に適し、かつ受ける意向がある個体であることは理解することができる。
【００７５】
B．GPR160遺伝子
GPR160は孤児G蛋白質共役型受容体に属する。ヒトGPR160遺伝子は第3染色体のq26.2-q27の位置にあり、それがコードするタンパク質はクラスAの蛋白質共役型受容体に属し、338個のアミノ酸を含む。現在、GPR160の生理機能はまだ知られず、癌の発生および発展との関係も明らかではない。本発明は正常前立腺および前立腺癌の組織のcDNAチップに対してqRT-PCR検出を行ったところ、GPR160の転写レベルが前立腺癌の組織において顕著に正常前立腺の組織よりも高いことが見出された。本発明は同時にGPR160の4種類のPCa細胞（PC-3、DU145、LNCaPおよび22RV1）と1種類の正常前立腺の上皮細胞（RWPE-1）における発現を分析したところ、PCa細胞株におけるGPR160発現レベルがその正常前立腺の上皮における発現よりも顕著に高いことが見出された。上記結果から、GPR160の発現がPCaの発生・発展とある程度関連することが示された。
【００７６】
GPR160の発現に対する関与がPCa細胞の生長を抑制することができるか研究するため、本発明は内在性GPR106発現レベルを顕著に低下させる低分子干渉RNA分子を含み、かつ効率的にPCa細胞株を感染するレンチウイルスを製造した。実験において、対照低分子干渉RNA分子による処理と比較すると、GPR160低分子RNA分子で作用させたPCa細胞における大半の内在性GPR160の発現量が低下し、細胞の生長が抑制され、クローン形成数が顕著に減少したことがわかり、GPR160の発現を低下させるとPCa細胞の生長を抑制することができることが示された。
【００７７】
好ましくは、前記GPR160遺伝子はヒトGPR160遺伝子で、そのポリヌクレオチド配列は以下の通りである。
配列番号1、ヒト由来GPR160遺伝子（NM_014373.2）
【００７８】
【表１】
2018529362.tif 000010
C．GPR160遺伝子またはタンパク質産物に基づいた診断方法
上記発見に基づき、GPR160をPCaを診断するマーカーとして、以下のように使用することができる。
【００７９】
1、  PCaの分類、鑑別診断および/または感受性分析、
2、  関連者のPCa治療に対する反応、薬物の治療効果および予後の評価ならびに適切な治療方案の選択、
3、  関連者のPCa罹患リスクの早期評価、早期モニタリング、早期予防・治療、たとえば、GPR160の発現異常がある人を選別して特異的関与を行う。
【００８０】
そのため、本発明はGPR160遺伝子またはタンパク質の使用であって、PCaを診断（および/または検出）する試薬および/またはキットの製造に使用され、PCaに対して診断、治療効果価および予後推測を行う使用を提供する。
【００８１】
本分野で既知の様々な技術によってGPR160遺伝子の発現情況を検出することができるが、このような方法はいずれも本発明に含まれ、PCR、NGS、ELISA、Western Blot、同位体標識、フローサイトメトリーなどを含むが、これらに限定されない。
【００８２】
D．GPR160遺伝子発現阻害剤または受容体拮抗剤
上記発見に基づき、本発明はGPR160遺伝子発現阻害剤または受容体拮抗剤の使用であって、PCaを予防または治療する組成物の製造における使用を提供する。
【００８３】
本明細書で用いられるように、前記のGPR160遺伝子発現阻害剤または受容体拮抗剤は阻害剤、上方制御剤、ブロッカー、遮断剤や拮抗剤などを含む。
前記のGPR160遺伝子発現阻害剤または受容体拮抗剤とはGPR160遺伝子の発現を下方制御するか、受容体の活性を低下させるか、GPR160遺伝子または受容体の安定性を減少させるか、そして受容体の作用時間を短縮させるか、あるいは遺伝子の転写と翻訳を抑制する任意の物質をいう。これらの物質はいずれも本発明に使用し、GPR160遺伝子発現阻害剤または受容体拮抗剤としてPCaの予防または治療に使用することができる。たとえば、前記の阻害剤は、特異的にGPR160遺伝子の発現を干渉するsiRNA分子またははアンチセンスヌクレオチドで、前記の拮抗剤は、特異的にGPR160受容体と結合する生物または化学配位子である。
【００８４】
本発明の一つの好適な形態として、前記の阻害剤はGPR160遺伝子特異性の低分子干渉RNA分子である。本明細書で用いられるように、前記の「低分子干渉RNA（siRNA）」とは短鎖断片の二本鎖RNA分子で、相同相補配列のmRNAを標的として特定のmRNAを分解させることができるが、この過程はRNA干渉（RNA interference）である。
【００８５】
本発明の特に好適な形態として、効果が良好な低分子干渉RNA分子を提供し、前記の低分子干渉RNA分子は特異的にヒトGPR160遺伝子の発現を干渉し、ほかのヒト核酸配列と顕著な相同性を有さず、かつ実験でGPR160の発現を干渉する良好な効果を有することが検証された。前記の低分子干渉RNA分子は、配列番号6および配列番号7の配列の1種または複数種を含む。より好ましくは、前記の低分子干渉RNAは、配列番号6および配列番号7の配列を含む低分子干渉RNA分子の組み合わせ分子である。
【００８６】
本発明は、低分子干渉RNAの製造方法に対して特に限定せず、化学合成法、体外転写法や特定のベクターによる体内発現などを含むが、これらに限定されない。当業者は本発明によって提供される低分子干渉RNAの配列を知ると、様々な手段によって便利に前記の低分子干渉RNAを製造または発現することができる。たとえば、本発明の一つの好適な例において、前記の低分子干渉RNAは化学合成のもので、もう一つの好適な例において、レンチウイルス発現ベクターによって発現されるものである。
【００８７】
低分子干渉RNAは、一つのセンス鎖と一つのアンチセンス鎖を含み、この二本の鎖が交雑条件だけで二本鎖になる、二本鎖核酸の形態として製造してもよい。一つの二本鎖RNA複合体は互いに分離しているセンス鎖とアンチセンス鎖で製造することができる。たとえば、化学合成法において、相補的なセンス鎖とアンチセンス鎖がそれぞれ合成された後、アニーリング、交雑によって、合成した二本鎖RNA複合体になる。また、低分子干渉RNAに含まれるセンス鎖とアンチセンス鎖は一つまたは複数のセンス鎖とアンチセンス鎖をコードする発現カセットによって製造してもよい。センス鎖とアンチセンス鎖が一つの単独の発現カセットによってコードされる場合、生成した転写物から断裂して分離したセンス鎖とアンチセンス鎖になった後、交雑して二本鎖の低分子干渉RNAが生成してもよい。たとえば、レンチウイルス発現系によって製造する場合、センス鎖とアンチセンス鎖は連結配列によってshRNAを構成し、公知のレンチウイルス発現ベクターに導入し、体内発現後酵素切断で加工されて低分子干渉RNA分子になり、そして特異的にPCaにおける内在性GPR160遺伝子の発現を沈黙させる作用を発揮する。
【００８８】
本発明の一つの好適な実施形態において、センスとアンチセンス鎖が連結配列によって構成する、本発明のshRNAの構築物に相応する配列は、配列番号6で示されるセンス鎖の配列と配列番号11で示されるアンチセンス鎖の配列を含む。
【００８９】
5’-TTGGTACAGGCTATCAGGATAACTTCCTA-3’ (配列番号6)
5’-TAGGAAGTTATCCTGATAGCCTGTACCAA-3’ (配列番号11)
本発明の一つの好適な実施形態において、センスとアンチセンス鎖が連結配列によって構成する、本発明のshRNAの構築物に相応する配列は、配列番号7で示されるセンス鎖の配列と配列番号12で示されるアンチセンス鎖の配列を含む。
【００９０】
5’-TTCTATGTCAGCATTCAGAGTTACTGGCT-3’ (配列番号7)
5’-AGCCAGTAACTCTGAATGCTGACATAGAA-3’ (配列番号12)
前記の低分子干渉RNA分子は本分野で既知の様々な技術によって細胞内に導入することができる。
【００９１】
E．GPR160を標的とする薬物選別技術
GPR160のPCa細胞における過剰発現およびその発現に対する干渉が腫瘍細胞の生長を抑制するができるという特性に基づき、それを標的としてGPR160遺伝子の発現を抑制するか、または受容体の活性を拮抗する物質を選別することができるため、PCaを予防および治療する新薬を提供することが期待されている。そのため、本発明はGPR160遺伝子の発現を抑制するか、または受容体の活性を拮抗する物質を選別する方法であって、
1．被験物質でGPR160を発現する系を処理する工程と、
2．前記系におけるGPR160遺伝子の発現および活性に対する被験物質の影響を検出する工程と、
3．GPR160遺伝子の発現を抑制するか、または受容体の活性を拮抗することができる被験物質を選択する工程と、
を含む方法を提供する。
【００９２】
前記の系は細胞（または細胞培養物）が好ましく、前記の細胞は内在的にGPR160を発現する細胞または組換えでGPR160を発現する細胞でもよい。たとえば、前記の細胞はPC-3、LNCaPまたは遺伝子の形質移入によってGPR160を発現するエンジニアリング細胞株、たとえばCHO、HEK293などから選ばれる。
【００９３】
本発明の好適な形態において、選別する時、GPR160の発現または受容体の活性の変化が観察しやすくなるように、対照を設けてもよいが、前記の対照は前記被験物質を添加していないGPR160発現系でもよい。
【００９４】
本発明の好適な形態において、前記方法は、さらに、得られる活性物質に対して細胞機能および/または動物の実験を行うことによって、さらにPCaの予防または治療に有益かどうか選択および確認する。
【００９５】
F．GPR160遺伝子発現阻害剤または受容体拮抗剤組成物
また、本発明はPCaを予防または治療する組成物であって、有効量のGPR160遺伝子発現阻害剤または受容体拮抗剤と薬学的に許容される担体とを含有する組成物を提供する。前記のGPR160遺伝子発現阻害剤または受容体拮抗剤のいずれも組成物の製造に使用することができる。
【００９６】
本発明の一つの好適な形態として、PCaを予防または治療する組成物であって、有効量の本発明に係るGPR160を標的とする低分子干渉RNA分子、特異的に受容体と結合する抗体または化学拮抗剤と、薬学的に許容される担体とを含有する組成物を提供する。
【００９７】
本明細書で用いられるように、「治療有効量」とは、ヒトおよび/または動物に機能や活性があり、かつヒトおよび/または動物にとって受けられる治療量である。前記「薬学的に許容される担体」とは、治療量で投与する担体で、様々な賦形剤と希釈剤を含む。この用語が指す薬剤担体は、自身が必要な活性成分ではなく、かつ使用後過度の毒性がない。適切な担体は当業者に熟知のもので、液体、たとえば水、塩水、緩衝液を含有してもよく、さらに、補助性の物質、たとえば充填剤、潤滑剤、流動補助液、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質などが存在してもよい。また、前記担体は、細胞形質移入試薬を含有してもよい。
【００９８】
G．治療と予防の方法
本発明はGPR160高発現のPCaおよびその症状を予防または治療する方法に関する。当該方法は、予防または治療が必要な対象あるいは受ける意向がある対象に対し、有効量で選択的にGPR160遺伝子の発現を干渉する阻害剤またはGPR160受容体の活性を低下させる拮抗剤およびその組成物を投与することによって、上記疾患または症状を予防または治療することを含む。
【００９９】
好ましくは、上記前立腺癌は有効量の本発明に係るGPR160を標的とする特異性低分子干渉RNA分子、GPR160受容体特異的生物または化学拮抗剤と、薬学的に許容される担体とを投与することによって予防または治療する。
【０１００】
本方法によって任意の対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを治療することができる。
上記疾患と症状を予防または治療する場合、本発明のGPR160阻害剤または拮抗剤を単独に使用するか、あるいはほかの既に市販または市販の予定の抗腫瘍薬と併用することができる。
【０１０１】
前記GPR160遺伝子阻害剤または受容体拮抗剤あるいはその薬物組成物に対し、任意の適切な方法で本発明の組成物を単独でするか、あるいはほかの適切な抗腫瘍薬と併用することができる。使用できる投与形態は、腔内注射、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、真皮内注射、局部、インプラントおよび徐放投与などを含むが、これらに限定されない。
【０１０２】
本発明に係るGPR160遺伝子阻害剤または受容体拮抗剤の有効量は、投与対象、投与形態や治療しようとする疾患の重篤度などにもよる。好適な有効量の選択は、当業者がいろいろな要素によって決めることができる（たとえば臨床試験による）。前記の要素は、前記GPR160遺伝子阻害剤または受容体拮抗剤の薬物動態学のパラメーター、たとえば生物利用能、代謝、半減期など、患者の治療しようとする疾患の重篤度、患者の体重、免疫状況や投与経路などを含むが、これらに限定されない。
【０１０３】
具体的な実施形態において、本方法は、さらに、投与対象の疾患または症状に対して診断、治療効果評価および予後判断を行うことを含む。任意の適切な方法によって関連疾患または症状、治療効果およびその予後を診断および評価することができる。診断および予後は任意またはすべての体内物質、たとえば酵素、抗原、抗体、核酸またはほかの病理的マーカーおよび臨床マーカーなどおよび関連症状に対する検出および/または同定によるものでもよい。
【０１０４】
本発明の主な利点は以下の通りである。
（1）本発明は大量の選別を経てGPR160遺伝子に顕著な抑制作用を有する低分子干渉RNAを得た。
【０１０５】
（2）本発明の低分子干渉RNAはGPR160陽性の腫瘍、特に前立腺癌に顕著な抑制効果を有する。
（3）本発明はGPR160発現阻害剤またはタンパク質拮抗剤を主要成分とする薬物組成物であって、GPR160高発現の腫瘍、特に前立腺癌の治療に使用される組成物を提供する。
【０１０６】
（4）本発明はGPR160を標的とする臨床診断および薬物選別を行う方法を提供する。
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を詳述する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例で詳細な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえば米国のJ.  Sambrookら編著、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（黄培堂ら訳、北京：科学出版社、2002年）に記載の条件、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に断らない限り、％と部は、重量で計算される。以下、実施例で使用された実験材料および試薬は、特に説明しない限り、いずれも市販品として得られる。
【０１０７】
実施例1．細胞培養
ヒトヒト胎児腎上皮細胞293T、前立腺癌細胞株PC-3、LNCaP、DU145、22RV1、正常前立腺上皮細胞RWPE-1およびチャイニーズハムスター卵巣細胞CHO-K1はATCCから購入された。LNCaPおよび22RV1は10％ FBSおよび100 U/mlマイシリンを含有する高グルコースRPMI1640培地において、PC-3およびDU145は10％ FBSおよび100 U/mlマイシリンを含有する普通RPMI1640培地において培養した。RWPE-1に使用された培地は50 μg/mlおよび5 ng/ml 上皮成長因子を含有するK-SF培地である。293Tは10％ FBSおよび100 U/mlマイシリンを含有する高グルコースDMEMで培養した。CHO細胞は10％ FBSおよび100 U/mlマイシリンを含有するF12培地で培養した。すべての細胞はいずれも37℃、5％ CO2を含有するインきゅバーターで培養した。
【０１０８】
実施例2．GPR160の前立腺癌組織および前立腺癌細胞株における発現情況の定量RT-PCR（プローブ法）による検出
前立腺癌組織および正常前立腺組織のcDNAチップはOriGeneから購入された。検出に使用されたTaqmanプローブはInvitrogenから購入され、装置はViiA 7 Real-Time PCR検出システム（Applied Biosystems）を使用した。各培養細胞の全RNAはTrizol試薬（Invitrogen）で抽出し、Oligo-dTをプライマーとし、逆転写酵素で転写してcDNAを生成させた。内部参照遺伝子はTATAボックス結合タンパク質（TATA-box binding protein、TBP）遺伝子である。結果は図1に示すように、前立腺癌組織におけるGPR160の発現レベルは顕著に正常の前立腺組織よりも高かった（図1A）。アンドロゲン依存性（LNCaPおよび22RV1）でもアンドロゲン非依存性（PC-3およびDU145）の前立腺癌細胞でも、その内在性GPR160の発現レベルがいずれも顕著に正常の前立腺上皮細胞RWPE-1よりも高かった（図1B）。
【０１０９】
実施例3．GPR160の前立腺癌細胞における発現の定量RT-PCR（SYBR法）による検出
各培養細胞の全RNAはTrizol試薬（Invitrogen）で抽出し、Oligo-dTをプライマーとし、逆転写酵素で転写してcDNAを生成させた。鋳型、プライマーをSYBR検出試薬（TaKaRa）と混合した後、7300定量PCR装置によって検出した。内部参照遺伝子はβ-アクチンをコードする遺伝子ACTB (NC_000007.14)である。
【０１１０】
増幅配列が標的とする遺伝子は配列番号1で示される。
プライマー配列はそれぞれ以下の通りである。
GPR160遺伝子：
フォワード、配列番号2 
5’-TGCAGTCCGGAGACGAACG-3’
リバース、配列番号3  
5’-GTAAGCTCGGAGACATTTGCG-3’
ACTB 
フォワード、配列番号4 
5’-GAGAAAATCTGGCACCACACC-3’
リバース、配列番号5 
5’-TACCCCTCGTAGATGGGCAC-3’
実施例4. GPR160干渉低分子RNAによる前立腺癌細胞の生長に対する抑制
4.1  GPR160干渉低分子RNAの製造
持続的に細胞におけるGPR160遺伝子の発現を抑制するために、本発明者はレンチウイルス発現系を使用した。レンチウイルスshRNA発現プラスミド(商品コード：TL312662)はOriGeneから購入され、ここで、GPR160低分子干渉RNAが標的とする遺伝子の配列は配列番号1で示され、低分子干渉RNAのセンス鎖の配列はそれぞれ配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9で示される。非特異性対照の低分子干渉RNAのセンス鎖の配列は配列番号10で示される。
【０１１１】
配列番号6 （ShGPR160-S6）
5’-TTGGTACAGGCTATCAGGATAACTTCCTA-3’
配列番号7 （ShGPR160-S7）
5’-TTCTATGTCAGCATTCAGAGTTACTGGCT-3’
配列番号8 （ShGPR160-S8）
5’-CCATCTACCAAAGCCTGAAGGCACAGAAT-3’
配列番号9 （ShGPR160-S9）
5’-CCATTTGTCAACTGGAAGTGCTGCTTCAT-3’
配列番号10 （ShGPR160-S10）
5’-GCACTACCAGAGCTAACTCAGATAGTACT-3’
Qiagene社のプラスミド抽出キットによって低分子干渉RNA発現プラスミドpGFP-C-shGPR160および対照プラスミドpGFP-C-Scrambleを抽出し、パッケージングプラスミドと均一に混合した後、MegaTran（OriGene）によってすでに24時間接種された293T細胞に形質移入させ、72時間後ウイルス上清を収集した。15000 rpmで15分間遠心して細胞破片を除去した後、四分の一の体積のレンチウイルス濃縮液（Biomiga）を入れて濃縮し、小分けした後-80℃にて保存した。配列番号6〜配列番号9の配列を含むpGFP-C-shGPR160プラスミドで形質移入されたウイルスはそれぞれShGPR160-S6 、ShGPR160-S7、ShGPR160-S8およびShGPR160-S9と記し、非特異性対照プラスミドの形質移入によるウイルスShGPR160-S10と記する。
【０１１２】
製造されたレンチウイルスはそれぞれ感染多重度（Multiplicity of infection、MOI）40および10でPC-3およびLNCaP細胞に感染させ、72時間後感染された細胞における全RNAを抽出し、定量RT-PCRによって細胞内におけるGPR160の発現情況を検出した。結果から、対照ウイルスShGPR160-S10処理群と比べ、ShGPR160-S6はPC-3およびLNCaPにおける抑制効率がそれぞれ87.8％および86.2％で、ShGPR160-S7は二つの細胞における抑制効率がそれぞれ85.0％および91.7％で、ShGPR160-S8はPC-3およびLNCaPにおける抑制効率がそれぞれ41.7％および32.8％で、ShGPR160-S9は二つの細胞における抑制効率がそれぞれ41.8％および56.2％であったことが示された。ShGPR160-S6およびShGPR160-S7の細胞内在性GPR160発現に対する抑制作用明は顕著にShGPR160-S8およびShGPR160-S9よりも優れた（図2Aおよび2B）。
【０１１３】
本発明者は大量のGPR160遺伝子に対する低分子干渉RNA分子に対して選別を行ったところ、配列番号6、または配列番号7で示されるヌクレオチド配列を含む低分子干渉RNA分子は顕著にGPR160遺伝子の発現を抑制することができ、抑制活性がほかの低分子干渉RNA分子よりも遥かに優れたことを見出した。
【０１１４】
4.2  GPR160特異性低分子干渉RNAの前立腺癌細胞の生長に対する影響
GPR160特異性干渉低分子RNAの前立腺癌細胞の増殖に対する影響を検出するため、ウイルス感染から48時間後のPC-3およびLNCaP細胞はそれぞれ5000個/100 μl/ウェルおよび2500個/100 μl/ウェルの密度で96ウェルプレートに接種し、かつそれぞれ1、3、5日培養し、培養終了の4時間前に10 μl/ウェルのCCK-8検出試薬（TaKaRa）を入れ、インキュベート終了後450 nm光吸收を検出した。参照波長は650ｎｍであった。Scramble群の読み取り値を100％とした。結果は図2Cおよび2Dに示すように、ShGPR160-S6およびShGPR160-S7はいずれも顕著にPC-3およびLNCaP細胞の増殖を抑制した。ShGPR160-S8は二つの細胞のいずれにも抑制作用がなかった。ShGPR160-S8の効果はPC-3では顕著であったが、LNCaPの生長に顕著な影響がなかった。
【０１１５】
上記結果に基づき、本発明者はShGPR160-S6、ShGPR160-S7およびShGPR160-S10をPC-3およびLNCaP細胞に感染させてから48時間後、1000個/2 ml/ウェルで96ウェルプレートに接種し、連続して12〜20日培養した後、細胞を0.1％でクリスタルバイオレット溶液で染色し、自然乾燥し、各ウェルのクローン数を計数した。ShGPR160-S10ウイルス感染群を100％の対照とした。結果から、PC-3細胞でもLNCaP細胞でも、ShGPR160-S6およびShGPR160-S7は感染後形成したクローン数がいずれも顕著にShGPR160-S10対照群よりも少なかったことが示された（図2Eおよび2F）。
【０１１６】
このように、内在性GPR160の発現を低下させることによって前立腺細胞の生長およびクローンの形成を抑制することができることがわかる。
4.3  GPR160干渉低分子RNAによる前立腺癌細胞のアポトーシスへの誘導
ウイルス感染から48時間後のPC-3およびLNCaP細胞を改めてトリプシン（Invitrogen）で消化して培養し、継続して48時間培養した後1000 rpm×5分間で細胞を収集したが、培養液における細胞破片を含む。4℃に冷却しておいたPBSで1回洗浄し、改めて遠心し、上清を捨てた後4℃に冷却しておいた70％アルコールで細胞を固定化し、50 μg/mlのPI溶液および100 μg /mlのRNase A(Tiangen)によって37℃で30分間処理し、細胞内におけるDNA含有量をAccuri C6フローサイトメーターによって検出した（BD Biosciences）。GPR160特異性干渉低分子RNAをコードするレンチウイルスの感染は顕著に細胞DNAの低二倍体（sub-G1）ピークを増加させた（図3）が、これはアポトーシスが存在したことを示した。
【０１１７】
さらなるアポトーシスの検出はAPCで標識されたアネキシンVとヨウ化プロピジウム（propidium iodide、PI）および二重染色を使用して行った。細胞感染から48時間後、細胞を収集して改めて6ウェルプレートに接種した。継続して48時間培養した後、細胞を収集し、PBSで1回洗浄し、100 μL 1×アネキシン結合緩衝液（Annexin-binding buffer）で再懸濁させ、1 μlのPI溶液（100 μg/ml）および5 μlのAPCでカップリングされたアネキシンV溶液を入れ、室温で15分間染色し、細胞にさらに400 μL 1×アネキシン結合緩衝液を追加し、フローサイトメーターによってアネキシンV陽性細胞数を検出した。GPR160特異性干渉低分子RNAをコードするレンチウイルスの感染は顕著に細胞のアポトーシスを増加させた（図4）。
【０１１８】
実施例5．GPR160低分子調節剤の選別
GPR160の小分子拮抗剤を選別するため、本発明者は選別モデルを構築してその小分子作動剤を選別した。GPR160およびGα16を発現するプラスミドをCHO細胞に共形質移入し、600 μg/mlのネオマイシンおよび200 μg/mlのハイグロマイシンで安定したクローンを選別し、免疫蛍光によって細胞表面の受容体の発現状況を分析し、かつカルシウムイオノフォアのイオノマイシンで細胞のカルシウム流反応を検出し、選別して持続的にGPR160を高発現して良い細胞内カルシウム流反応を有する細胞株を得てGPR160小分子調節剤の選別に使用した。具体的な選別過程は以下の通りである。
【０１１９】
CHO-Gα16-GPR160細胞を5000個/30 μl/ウェルで384ウェル細胞培養プレートに接種し、一晩培養した後、各ウェルに等体積のCalcium 5検出試薬（Molecular Devices）を入れ、37℃で45分間インキュベートした後、FLIPR蛍光プレートリーダーにセットして検出した。化合物仕込み体積は10 μl/ウェルであった（20 μg/ml、DMSO含有量2％）。励起波長は485 nmで、発光波長は525 nmである。図5に示すように、陰性対照は最終濃度0.5％のDMSOで、陽性対照はそれぞれ8 μM（赤色）および2 μM（黄色）のイオノマイシンで、灰色曲線は代表的な活性化合物H5（最終濃度5 μg/ml）の反応シグナルである。
【０１２０】
上記例は説明のためのものだけで、本発明の範囲はこれによって制限されない。当業者にとって変更は容易に想到できることで、本発明は添付された請求の範囲だけに制限される。
【０１２１】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【配列表】
2018529362000001.app
【国際調査報告】
2018529362.tif 000017
2018529362.tif 000018
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