(57)【要約】  嗅神経鞘細胞の調製方法が提供される。本発明の方法は、細胞培地を調合する工程、組織の採取および前処理を行う工程、酵素消化を行う工程、細胞培養を行う工程、凍結保存を行う工程、ならびに分化培養を行う工程を含む。調製された嗅神経鞘細胞は増殖能を長期間にわたって維持することができ、かつ、嗅神経鞘細胞の活性を１１回目の継代の後において依然として有することができる。
2018526025.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程：
（１）上鼻甲介および中鼻甲介の嗅粘膜に由来する単一の嗅神経鞘細胞を３７℃および５％ＣＯ2の条件のもとで嗅神経鞘細胞用の培養培地において培養し、前記細胞を接着させて成長させる工程；
（２）工程（１）で得られる培養上清をろ過することによって得られる前記細胞を再び嗅神経鞘細胞用の培養培地と混合し、３７℃および５％ＣＯ2の条件のもとで培養し、前記細胞を接着させて成長させる工程
を含む、嗅神経鞘細胞の調製方法。
【請求項２】
前記嗅神経鞘細胞が、ヒト嗅粘膜に由来する嗅神経鞘細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
嗅神経鞘細胞用の前記培養培地が、２０ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ〜８０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ、１ｍｌ〜２ｍｌのＮ２（１００×）、２ｍｌ〜３ｍｌのＢ２７（５０×）および０．１μｇ／ｍｌのＴ３（Ｓｉｇｍａ）を最終濃度で含む神経栄養因子が補充される、基礎培養培地としてのＤＭＥＭ／ＤＦ１２（Ｇｉｂｃｏ）であり、
好ましくは、ヒト嗅粘膜に由来する嗅神経鞘細胞用の前記培養培地が、ＤＭＥＭ／ＤＦ１２（Ｇｉｂｃｏ）と、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ）、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ）、１％のＮ２（Ｇｉｂｃｏ）、２％のＢ２７（Ｇｉｂｃｏ）およびＴ３（Ｓｉｇｍａ）の神経栄養因子とからなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、
単一の嗅神経鞘細胞のための前記調製方法が、上鼻甲介および中鼻甲介の嗅粘膜の組織ブロックを酵素により消化して、単一の細胞を得る工程を含み；
好ましくは、単一の嗅神経鞘細胞のための前記調製方法が、上鼻甲介および中鼻甲介の嗅粘膜の組織ブロックをコラゲナーゼＩおよび中性プロテアーゼにより消化して、単一の細胞を得る工程を含み、
好ましくは、前記中性プロテアーゼが組織用のディスパーゼＩＩであり；
より好ましくは、単一の嗅神経鞘細胞のための前記調製方法が、上鼻甲介および中鼻甲介の嗅粘膜の組織ブロックを１ｍｍ3の大きさで、振動下、３７℃での水浴においてコラゲナーゼＩおよび中性プロテアーゼにより消化して、単一の細胞を得る工程（ただし、コラゲナーゼＩおよび中性プロテアーゼの、上鼻甲介および中鼻甲介の嗅粘膜の前記組織ブロックに対する体積比率が２：１である）を含み；
好ましくは、前記コラゲナーゼＩが０．１％の濃度で使用され、かつ、前記中性プロテアーゼが０．２％の濃度で使用される、
方法。
【請求項５】
前記上鼻甲介および中鼻甲介の嗅粘膜の組織ブロックが、その表面の残留血液を除くために前記消化の前に洗浄され；好ましくは、前記表面の前記残留血液が、ペニシリンおよび生理食塩水の１：１の比率での溶液によって除かれ、より好ましくは、清浄化された嗅粘膜が、培養皿において、滅菌ハサミにより、大きさが１ｍｍ3の組織ブロックに切断される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（１）の培養の接種密度が１×１０4細胞／ｍｌであり；好ましくは、前記細胞が９０％にまで接着して成長し；
好ましくは、前記工程（２）の培養の接種密度が１×１０4細胞／ｍｌであり；より好ましくは、前記細胞が９０％にまで接着して成長する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法であって、前記調製方法がさらに、前記嗅神経鞘細胞の継代培養または凍結保存を行う工程を含み；
好ましくは、前記継代培養の期間中に、継代される前記細胞の培養上清が集められ、ろ過され、嗅粘膜由来の嗅神経鞘細胞用の培養培地と１：３の比率で混合されて、継代のための培養培地を調合し；
好ましくは、前記調製方法がさらに、前記嗅神経鞘細胞の凍結保存を行う工程を含み；好ましくは、前記凍結保存が超低温での凍結保存であり；好ましくは、超低温での前記嗅神経鞘細胞の前記凍結保存が、工程（２）における前記細胞が９０％にまで接着して成長したときの前記培養上清をろ過して、嗅神経鞘細胞の前記凍結保存のための凍結保存培地を調製する工程を含み；より好ましくは、嗅神経鞘細胞用の前記凍結保存培地が、自己血清、前記培養上清、ＤＭＥＭ／Ｆ１２およびＤＭＳＯからなり；さらに好ましくは、嗅神経鞘細胞用の前記凍結保存培地が、５：２：２：１の体積比での自己血清、前記培養上清、ＤＭＥＭ／Ｆ１２およびＤＭＳＯからなる、
方法。
【請求項８】
前記嗅神経鞘細胞の分化培養を行う工程をさらに含み、好ましくは、前記嗅神経鞘細胞の分化培養を行う前記工程が、グリア細胞を分化させるための培養培地を前記嗅神経鞘細胞に加え、分化のために培養することを含み、より好ましくは、グリア細胞を分化させるための前記培養培地が、８７：１３の体積比での嗅神経鞘細胞用の培養培地および自己血清からなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
下記の工程：
工程１．神経栄養因子を用いて、嗅神経鞘細胞用の培養培地を調合する工程；
工程２．組織の採取：上鼻甲介および中鼻甲介の嗅粘膜組織の適量を局所麻酔下で集める工程；
工程３．組織ブロックの前処理：得られた組織ブロックの表面の残留血液を洗い流し、前記組織ブロックを１ｍｍ3の大きさでのブロックに加工する工程；
工程４．２つの酵素の組合せによる消化：はさみで切り刻んだ前記組織ブロックを集め、２体積のコラゲナーゼＩおよび中性プロテアーゼを加え、振動下、３７℃での水浴において消化する工程；
工程５．初代培養：前記消化によって得られる単一の細胞を集め、前記単一の細胞を遠心分離チューブに入れ、嗅神経鞘細胞用の培養培地と十分に混合し、その後、細胞培養フラスコに接種し、３７℃および５％ＣＯ2でインキュベーターにおいて培養する工程；
工程６．継代培養：前記細胞がおよそ９０％にまで接着して成長したとき、継代される前記細胞の培養上清を集め、ろ過し、前記上清を嗅神経鞘細胞用の培養培地と１：３の比率で混合して、前記継代のための培養培地を調合する工程；
工程７．超低温での凍結保存：前記細胞がおよそ９０％にまで接着して成長したとき、凍結保存される細胞の上清を集め、ろ過して、（自己血清、前記細胞培養上清、ＤＭＥＭ／Ｆ１２およびＤＭＳＯからなる）嗅神経鞘細胞に特有の凍結保存培地を調合し、凍結保存を常法手順に従って行う工程；
工程８．分化培養：グリア細胞を分化させるための調合された培養培地（嗅神経鞘細胞用の培養培地：前記自己血清＝８７：１３）を加え、分化のための培養を常法手順に従って行う工程
を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞培養技術の分野に属しており、嗅神経鞘細胞の単離、継代、凍結保存および分化、ならびに要求される試薬の調合を含む嗅神経鞘細胞の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
嗅神経鞘細胞（ＯＥＣ）は、嗅上皮に由来するものであり、嗅球および嗅粘膜に分散している。原始嗅覚ニューロンが多数のプラコード細胞と一緒に、嗅粘膜上の遠心性軸索から終脳小胞に向かって遊走し、嗅神経鞘細胞が、嗅覚ニューロン軸索を終脳小胞に到達させるように誘導する。これらの細胞は、形成後に裏返る早期嗅球を形成し、一方、遊走した細胞はその表面を覆って、薄い層を形成し、その後、グリア境界を突き抜け、その結果として、嗅覚神経層および糸球体層の形成がもたらされ、これらが、嗅球の表面を覆う新しいグリア境界となる。成体における嗅神経鞘細胞は依然として、末梢神経と中枢神経との間のグリア境界バリアを突き抜けて遊走することができる。嗅球において、嗅神経鞘細胞は、嗅覚ニューロン軸索と接触し、これを取り囲む唯一のグリア細胞である。中枢神経系経路全体にわたって、嗅神経鞘細胞が、他の中枢神経系の細胞とのその接触を防ぐために嗅覚ニューロン軸索を取り囲んでいる。ＯＥＣは、軸索成長を刺激するための様々な神経栄養因子および物質を分泌することができ、これらにより、軸索再生の増進およびミエリン形成の促進をもたらすことができる。シュワン細胞および乏突起膠細胞とともに同様の機能を有する特別なグリア細胞の一種として、ＯＥＣは、神経に栄養を与える作用、神経を保護する作用、神経を調節する作用または刺激する作用、ミエリン形成および軸索再生を増進させる作用、グリア過形成および瘢痕形成を抑制する作用、ならびに、神経系に対する他の修復作用を有する。嗅神経鞘細胞のこれらの性質により、損傷神経または変性神経の機能的および構造的な回復および再構築のための良好な内部環境がもたらされる。嗅神経鞘細胞のこれらの性質により、嗅神経鞘細胞が神経回復のための最適な選択肢となっている。嗅神経鞘細胞の移植に関する発表された論文もまた、嗅神経鞘細胞が神経回復のための最良の細胞であることを大いに実証している。しかしながら、嗅神経鞘細胞の既存の調製方法は、脳内の嗅球組織を、中絶した３ヶ月〜５ヶ月の胎児から採取すること、この組織をそのまま、一定量の動物血清とともに用いて培養すること、その後、嗅神経鞘細胞を精製するという目的を達成するために、線維芽細胞を阻害するための、または減少させるための一定量のシタラビン、物理的方法または化学薬剤を使用することを含む。高濃度での動物血清をＤＭＳＯと混合することによって作製される嗅神経鞘細胞用の凍結保存溶液の使用は多くの欠点をもたらしている。
１．倫理的要因：中絶胎児に由来する嗅球組織の使用は倫理によって制約される場合がある；
２．細胞の純度がより低いこと：（１）広域スペクトルの細胞増殖抑制剤であるシタラビンおよび化学試薬は、線維芽細胞の成長を阻害するのと同時に嗅神経鞘細胞を阻害し、そのため、その量を決定することが困難である；（２）物理的方法は、線維芽細胞を除くときに、多数の嗅神経鞘細胞を失うことをもたらす；（３）血清含有培養培地が使用されるときには、線維芽細胞の方が、速く、かつ容易に成長する；
３．連続した継代培養ができないこと：（１）広域スペクトルの細胞増殖抑制剤としてのシタラビンおよび化学試薬は嗅神経鞘細胞の継代数に影響を及ぼす；（２）血清が基本培地として使用されるときには、嗅神経鞘細胞は無指向的に分化しやすく、また、線維芽細胞が急速に成長し、そのため、生物学的特徴を多数回の継代の後において維持することが困難である；
４．潜在的危険性の存在：同種の血清および組織試料はウイルス感染および細菌感染を受けやすく、また、拒絶反応、アレルギーまたはその他の未知の危険をもたらす傾向がある。
【発明の概要】
【０００３】
先行技術において存在する上述の問題点を解決するために、本発明の目的は、非常に多数の活性な嗅神経鞘細胞を迅速かつ都合よく得ることができ、それにより、臨床での神経回復処置のための嗅神経鞘細胞の十分な供給源を提供する調製方法を提供することである。
【０００４】
上記目的を実現するために使用される技術的解決法が以下の通りである：
下記の工程を含む、嗅神経鞘細胞の調製方法：
（１）上鼻甲介および中鼻甲介の嗅粘膜に由来する単一の嗅神経鞘細胞を３７℃および５％ＣＯ2の条件のもとで嗅神経鞘細胞用の培養培地において培養し、前記細胞を接着させて成長させる工程；
（２）工程（１）で得られる培養上清をろ過することによって得られる前記細胞を再び嗅神経鞘細胞用の培養培地と混合し、前記細胞を３７℃および５％ＣＯ2の条件のもとで培養し、前記細胞を接着させて成長させる工程。
【０００５】
好ましくは、前記嗅神経鞘細胞が、ヒトの嗅粘膜に由来する嗅神経鞘細胞である。好ましくは、嗅神経鞘細胞用の前記培養培地が、２０ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ〜８０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ、１ｍｌ〜２ｍｌのＮ２（１００×）、２ｍｌ〜３ｍｌのＢ２７（５０×）および０．１μｇ／ｍｌのＴ３（Ｓｉｇｍａ）を最終濃度で含む神経栄養因子が補充される、基礎培地としてのＤＭＥＭ／ＤＦ１２（Ｇｉｂｃｏ）である。
【０００６】
好ましくは、ヒト嗅粘膜に由来する嗅神経鞘細胞用の前記培養培地は、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ）、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ）、１％のＮ２（Ｇｉｂｃｏ）、２％のＢ２７（Ｇｉｂｃｏ）およびＴ３（Ｓｉｇｍａ）を含む神経栄養因子が補充されるＤＭＥＭ／ＤＦ１２（Ｇｉｂｃｏ）である。
【０００７】
好ましくは、単一の嗅神経鞘細胞のための前記調製方法が、下記の工程：
上鼻甲介および中鼻甲介の嗅粘膜の組織ブロックを酵素により消化して、単一の細胞を得る工程
を含む。
【０００８】
より好ましくは、単一の嗅神経鞘細胞のための前記調製方法が、上鼻甲介および中鼻甲介の嗅粘膜の組織ブロックをコラゲナーゼＩおよび中性プロテアーゼにより消化して、単一の細胞を得る工程を含む。
【０００９】
好ましくは、前記中性プロテアーゼが組織用のディスパーゼＩＩである。
【００１０】
より好ましくは、単一の嗅神経鞘細胞のための前記調製方法が、上鼻甲介および中鼻甲介の嗅粘膜の組織ブロックを１ｍｍ3の大きさで、振動下、３７℃での水浴においてコラゲナーゼＩおよび中性プロテアーゼにより消化して、単一の細胞を得る工程（ただし、コラゲナーゼおよび中性プロテアーゼの、上鼻甲介および中鼻甲介の嗅粘膜の前記組織ブロックに対する体積比が２：１である）を含む。
【００１１】
好ましくは、前記コラゲナーゼＩが０．１％の濃度で使用され、前記中性プロテアーゼが０．２％の濃度で使用される。
【００１２】
さらに好ましくは、上鼻甲介および中鼻甲介の嗅粘膜の前記組織ブロックが、その表面の残留血液を除くために前記消化の前に洗浄される。一層さらに好ましくは、表面の前記残留血液が、ペニシリンおよび生理食塩水の１：１の比率での溶液によって除かれる。なおさらに好ましくは、清浄化された嗅粘膜が、培養皿において、滅菌ハサミにより、１ｍｍ3の大きさでの組織ブロックに切断される。
【００１３】
好ましくは、前記工程（１）の培養の接種密度が１×１０4細胞／ｍｌである。好ましくは、前記細胞は９０％にまで接着して成長する。
【００１４】
好ましくは、前記工程（２）の培養の接種密度が１×１０4細胞／ｍｌである。好ましくは、前記細胞は９０％にまで接着して成長する。
【００１５】
好ましくは、前記調製方法がさらに、前記嗅神経鞘細胞の継代培養または凍結保存を行う工程を含む。
【００１６】
より好ましくは、前記継代培養の期間中に、継代培養される前記細胞の培養上清が集められ、ろ過され、嗅粘膜由来の嗅神経鞘細胞用の培養培地と１：３の比率で混合されて、継代のための培養培地を調合する。
【００１７】
好ましくは、前記調製方法がさらに、嗅神経鞘細胞の凍結保存を行う工程を含む。好ましくは、前記凍結保存が超低温での前記凍結保存である。好ましくは、超低温での嗅神経鞘細胞の前記凍結保存が、工程（２）における前記細胞が９０％にまで接着して成長したときの培養上清をろ過して、嗅神経鞘細胞のための凍結保存培地を凍結保存のための前記培養上清から調製する工程を含む。より好ましくは、嗅神経鞘細胞用の前記凍結保存培地が、自己血清、前記培養上清、ＤＭＥＭ／Ｆ１２およびＤＭＳＯからなる。さらに好ましくは、嗅神経鞘細胞用の前記凍結保存培地は、５：２：２：１の体積比での自己血清、前記培養上清、ＤＭＥＭ／Ｆ１２およびＤＭＳＯからなる。
【００１８】
好ましくは、前記調製方法はさらに、嗅神経鞘細胞を分化培養する工程を含む。好ましくは、嗅神経鞘細胞の分化培養を行う前記工程が、グリア細胞を分化させるための培養培地を分化培養のための前記嗅神経鞘細胞に加えることを含む。より好ましくは、グリア細胞を分化させるための前記培養培地が、８７：１３の体積比での嗅神経鞘細胞用の培養培地および前記自己血清からなる。
【００１９】
本発明の具体的な実施形態において、前記調製方法は下記の工程からなる：
工程１．神経栄養因子を用いて、嗅神経鞘細胞用の培養培地を調合する工程。
工程２．組織の採取：上鼻甲介および中鼻甲介の嗅粘膜組織の適量を局所麻酔下で把持する工程。
工程３．組織ブロックの前処理：把持した組織ブロックの表面の残留血液を洗い流し、前記組織ブロックを１ｍｍ3の大きさでのブロックに加工する工程。
工程４．２つの酵素の組合せによる消化：はさみで切り刻んだ前記組織ブロックを集め、２体積のコラゲナーゼＩおよび中性プロテアーゼを加え、振動下、３７℃での水浴において消化する工程。
工程５．初代培養：前記消化によって得られる単一の細胞を集め、前記単一の細胞を遠心分離チューブに入れ、嗅神経鞘細胞用の培養培地と十分に混合し、その後、細胞培養フラスコに接種し、３７℃および５％ＣＯ2でインキュベーターにおいて培養する工程。
工程６．継代培養：前記細胞がおよそ９０％にまで接着して成長したとき、継代培養される前記細胞の培養上清を集め、ろ過し、前記培養上清を嗅神経鞘細胞用の培養培地と１：３の比率で混合して、前記継代のための培養培地を調合する工程。
工程７．超低温での凍結保存：前記細胞がおよそ９０％にまで接着して成長したとき、凍結保存される前記細胞の上清を集め、ろ過して、（自己血清、前記細胞培養上清、ＤＭＥＭ／Ｆ１２およびＤＭＳＯからなる）嗅神経鞘細胞に特有の凍結保存培地を調合し、凍結保存を常法手順に従って行う工程。
工程８．分化培養：グリア細胞を分化させるための調合された培養培地（嗅神経鞘細胞用の培養培地：前記自己血清＝８７：１３）を加え、分化培養を常法手順に従って行う工程。
【００２０】
本発明の調製方法では、組織の採取、２つの酵素の組合せによる消化、継代培養、超低温での凍結保存、分化培養、および要求される試薬の調合が伴う。本発明の利点は、嗅神経鞘細胞を取り出し、培養するための提供された方法により、非常に多量の嗅神経鞘細胞を迅速に得ることができ、かつ、前記嗅神経鞘細胞の増殖能を長期間にわたって維持することができ、また、１１回目の継代の後で得られる細胞が依然として、図に示されるように、嗅神経鞘細胞の活性を有しているということである。図１は、通常の倒立顕微鏡（倍率：１０×／０．２５）で観察される場合、接着性細胞が、双極性の伸長した隆起、三極性の伸長した隆起、または多角形を伴って紡錘形状であることを示す。図２は共焦点顕微鏡下での嗅神経鞘細胞の免疫組織化学染色の結果を示し、（Ａ）は、Ｓ１００についての緑色蛍光の免疫細胞化学染色を示し、（Ｂ）は、ｐ７５（Ｌ−ＮＧＦＲ）についての赤色蛍光の免疫細胞化学染色を示し、（Ｃ）は青色蛍光を示し、核がＨｏｅｃｈｓｔによって標識されており、（Ｄ）は、全範囲の蛍光によるグラフである；倍率：２０×／０．５。培養された細胞はＳ１００およびＰ７５（Ｌ−ＮＧＦＲ）を高レベルで発現する（これらは嗅神経鞘細胞の陽性マーカーである）。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】嗅神経鞘細胞に対する顕微鏡試験の結果を示す（倍率：１０×／０．２５）。
【図２】免疫組織化学染色を使用する嗅神経鞘細胞の共焦点顕微鏡法による同定を示す（倍率：２０×／０．５）。
【発明の詳細な説明】
【００２２】
１．嗅神経鞘細胞用の培養培地の調合
嗅神経鞘細胞用の培養培地を、ＤＭＥＭ／ＤＦ１２（Ｇｉｂｃｏ）を基礎培養培地として用いて調合し、これに、２０ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ〜８０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ、１ｍｌ〜２ｍｌのＮ２（１００×）、２ｍｌ〜３ｍｌのＢ２７（５０×）および０．１μｇ／ｍｌのＴ３（Ｓｉｇｍａ）を最終濃度で含む培養因子を補充し、その後、培地をクリーンベンチにおいてろ過し、滅菌し、その後の使用のために４℃で保存した。
【００２３】
２．組織の採取
組織ブロック取得の２日前に、鼻腔を清浄化し、感染がないことを確認した；取得前に、２回の局所麻酔手術を、１．２％〜１．５％のテトラカインを含有する生理食塩水が浸された綿糸シートを、ガン型鉗子を用いて鼻腔内に挿入することによって行った（それぞれを５分間〜１０分間行った）；上鼻甲介および中鼻甲介の上部かつ外側１／３に近い嗅粘膜組織を、篩骨洞用の鉗子を用いて採取し、得られた組織をガラス皿に入れ、その後、ガラス皿を氷箱に入れ、氷箱を直ちに培養室に戻した。
【００２４】
３．組織の前処理
実験室に戻した後、組織ブロックを、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンを含有する生理食塩水により洗浄して、粘膜組織ブロックの表面の残留血液を除き、滅菌された眼科用ハサミにより、ガラス皿において大きさが１ｍｍ3のブロックに切断した。
【００２５】
４．２つの酵素の組合せによる消化
ハサミで切り刻んだ組織ブロックを集め、これに２体積のコラゲナーゼＩおよび中性プロテアーゼを加え、組織ブロックを、振動下、３７℃での水浴において１５分間消化し、その後、肉厚エルボ部を有するピペットを用いて繰り返しピペッッティングし、１分間にわたって自然沈降させた。上清を遠心分離チューブに移し、消化を終了させた。上記操作を３回繰り返し、その結果、組織を単一細胞懸濁物に消化することができた。消化終結後のすべての細胞懸濁物を一緒に集め、１２００ｒ／４分で遠心分離し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２により洗浄し、合計で３分間、１２００ｒ／４分で遠心分離した。
【００２６】
５．初代培養
嗅神経鞘細胞用の培養培地を加えて、単一細胞懸濁物を調製し、これを、ポリ−Ｌ−リシンによって処理された傾斜開口部を有するプラスチック製培養フラスコに１×１０4細胞／ｍｌの密度で接種し、その後、３７℃および５％ＣＯ2で恒温恒湿インキュベーターにおいて培養した。
【００２７】
６．継代培養
培養上清を、細胞がおよそ９０％のコンフルエンスにまで成長したときに集め、０．２２μｍのフィルターによりろ過し、嗅神経鞘細胞用の培養培地と１：３の比率で混合して、この継代のための培養培地を調合した；細胞を集め、これに適量の継代用培地を加えて、細胞懸濁物を調製し、トリパンブルーによる染色の後、生細胞を顕微鏡で計数し、その後、再び継代した（継代細胞の密度が１×１０4細胞／ｃｍ3であった）。
【００２８】
７．超低温での凍結保存
培養上清を、細胞がおよそ９０％のコンフルエンスにまで成長したときに集め、０．２２μｍのフィルターによりろ過して、嗅神経鞘細胞に特有の凍結保存培地を調合した（自己血清：細胞培養上清：ＤＭＥＭ／Ｆ１２：ＤＭＳＯの体積比率＝５：２：２：１）；凍結保存のための細胞を常法により集め、これに凍結保護剤を加え、細胞の最終密度を５×１０6細胞／ｍｌ〜５×１０7細胞／ｍｌに調節した。細胞を４℃で６０分間、そして−２０℃で７０分間貯蔵し、−８０℃の超低温で一晩凍結保存し、その後、液体窒素タンクに入れた。
【００２９】
８．分化培養
グリア細胞のための分化培地（嗅神経鞘細胞用の培養培地：自己血清の体積比率＝８７：１３）を調合し、その後の使用のために４℃で貯蔵した。グリア細胞のための調合された分化培地を加え、分化培養を常法手順に従って行った。
【００３０】
本発明が、実施例を参照することにより前記において具体的に説明されている。しかしながら、本発明は前記実施例に限定されない。当業者の知識の範囲内において、様々な改変が、本発明の精神から逸脱することなく行われる場合があり、あるいは、本発明は、他の関連する技術分野において直接的または間接的に適用することができ、そのすべてが同様に本発明の範囲に含まれる。
【図１】
2018526025.tif 000003
【図２】
2018526025.tif 000004
【国際調査報告】
2018526025.tif 000005
2018526025.tif 000006
2018526025.tif 000007
2018526025.tif 000008
2018526025.tif 000009
2018526025.tif 000010