(57)【要約】  細胞型特異的ゲノムＤＮＡサンプルの潜在的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９オフターゲット切断部位のゲノムワイドな検出のための高感度で偏りのない方法。
2018530536.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共有結合閉鎖ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する方法であって、
ＤＮＡ、好ましくは、対象の細胞型または生物に由来するゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を提供することと、
任意選択的に、前記ＤＮＡを規定の平均長さ、好ましくは約２００〜１０００塩基対（ｂｐ）の平均長さにランダムに剪断してＤＮＡ断片の集団を提供することと、
好ましくは、前記剪断ＤＮＡの末端修復、次いで、Ａテール付加により、末端ライゲーション用の断片を調製することと、
少なくとも１個のデオキシウリジンと第１のプライマー部位とを含む第１のヘアピンアダプターを前記断片の末端にライゲートしてライゲート断片の集団を調製することと、
前記ライゲート断片と二本鎖切断を誘発するヌクレアーゼとを接触させることと、
エキソヌクレアーゼを用いて前記ライゲート断片を精製することにより共有結合閉鎖ＤＮＡ断片のライブラリーを作製することと、
を含む方法。
【請求項２】
前記第１のプライマー部位が、ＰＣＲプライミングおよび／またはシーケンシング、好ましくは次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に使用するのに適合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
共有結合閉鎖ＤＮＡ断片の前記ライブラリーとヌクレアーゼとを接触させて、好ましくは部位特異的切断を含む、二本鎖切断を誘発すること、
少なくとも１個のデオキシウリジンと、ＰＣＲプライミングおよび／またはシーケンシングで前記第１のプライマー部位と共に使用するのに適合した第２のプライマー部位と、を含む第２のヘアピンアダプターをライゲートすることと、
前記ライブラリーと酵素とを接触させて前記デオキシウリジンにおいて前記ＤＮＡにニックを入れることと、
第１および第２のヘアピンアダプターを有する断片をシーケンスすることと、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記デオキシウリジンにおいて前記ＤＮＡにニックを入れる酵素がウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）またはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＤＮＡ中にヌクレアーゼ誘発二本鎖切断を含む断片のライブラリーを作製する方法であって、
ＤＮＡを提供することと、
前記ＤＮＡを規定の平均長さ、好ましくは約２００〜１０００塩基対（ｂｐ）の平均長さにランダムに剪断することと、
任意選択的に、前記剪断ＤＮＡの末端修復、次いでＡテール付加を行うことと、
好ましくは、約１０〜２０ヌクレオチドの第１の領域と、１つ以上のヘアピンループを形成する、かつＰＣＲプライミングおよび／またはシーケンシングに使用するのに適合した第１のプライマー部位を含む、約４５〜６５ヌクレオチドの第２の領域と、前記第１の領域に相補的である約１０〜２０ヌクレオチドの第３の領域と、を前記第１および第２の領域間の１個のデオキシウリジンヌクレオチドと共に含む第１のヘアピンアダプターを前記ＤＮＡにライゲートすることと、
前記サンプルと１種以上のエキソヌクレアーゼとを十分に接触させて、両末端にライゲートされた前記第１のヘアピンアダプターが欠如したいずれのＤＮＡ分子も分解することと、
前記サンプルをヌクレアーゼで処理して部位特異的切断を誘発することと、
任意選択的に、得られた末端の末端修復、次いでＡテール付加を行うことと、
約１０〜２０ヌクレオチドの第１の領域と、１つ以上のヘアピンループを形成する、かつＰＣＲプライミングおよび／またはシーケンシングで前記第１のプライマー部位と共にに使用するのに適合した第２のプライマーを含む、約４０〜６０ヌクレオチドの第２の領域と、前記第１の領域に相補である、かつ前記第２および第３の領域間に１個のデオキシウリジンヌクレオチドをさらに含有する、約１０〜２０ヌクレオチドの第３の領域と、を含む第２のヘアピンアダプターをライゲートして、前記ヌクレアーゼにより切断された前記ＤＮＡ断片が、そのそれぞれの末端にライゲートされた第１および第２のヘアピンアダプターを有する、集団を生成することにより、一方の末端が前記ＤＮＡのヌクレアーゼ誘発二本鎖切断により生成された、断片のライブラリーを作製することと、
を含む方法。
【請求項６】
前記ライブラリーとウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）および／またはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩとを接触させて前記デオキシウリジンにおいて前記ＤＮＡにニックを入れることと、
第１および第２のヘアピンアダプターを有する断片をシーケンスすることと、
をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡ中のヌクレアーゼ誘発二本鎖切断（ＤＳＢ）を検出する方法であって、
ＤＮＡを提供することと、
前記ＤＮＡを規定の平均長さにランダムに剪断することと、
任意選択的に、前記剪断ＤＮＡの末端修復、次いでＡテール付加を行うことと、
好ましくは、約１０〜２０ヌクレオチドの第１の領域と、１つ以上のヘアピンループを形成する、かつＰＣＲプライミングおよび／またはシーケンシングに使用するのに適合した第１のプライマー部位を含む、約４５〜６５ヌクレオチドの第２の領域と、前記第１の領域に相補である約１０〜２０ヌクレオチドの第３の領域と、を前記第１および第２の領域間の１個のデオキシウリジンヌクレオチドと共に含む第１のヘアピンアダプターをライゲートすることと、
前記サンプルと１種以上のエキソヌクレアーゼとを十分に接触させて、両末端にライゲートされた前記第１のヘアピンアダプターが欠如したいずれのＤＮＡ分子も分解することと、
前記サンプルをヌクレアーゼで処理して、好ましくは部位特異的切断を含む、前記ＤＮＡの二本鎖切断を誘発することと、
任意選択的に、得られた切断末端の末端修復、次いでＡテール付加を行うことと、
約１０〜２０ヌクレオチドの第１の領域と、１つ以上のヘアピンループを形成する、かつＰＣＲプライミングおよび／またはシーケンシングで前記第１のプライマー部位と共に使用するのに適合した第２のプライマーを含む、約４０〜６０ヌクレオチドの第２の領域と、前記第１の領域に相補である、かつ前記第２および第３の領域間に１個のデオキシウリジンヌクレオチドをさらに含有する、約１０〜２０ヌクレオチドの第３の領域と、を含む第２のヘアピンアダプターをライゲートして、前記ヌクレアーゼにより切断された前記ＤＮＡ断片が、そのそれぞれの末端にライゲートされた前記第１および第２のヘアピンアダプターを有する、集団を生成することにより、一方の末端が前記ＤＮＡのヌクレアーゼ誘発二本鎖切断により生成された、前記ＤＮＡのヌクレアーゼ誘発二本鎖切断を含む断片のライブラリーを作製することと、
前記ライブラリーと、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）および／またはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼと、を接触させて前記デオキシウリジンにおいて前記ＤＮＡにニックを入れることと、
第１および第２のヘアピンアダプターを有する断片をシーケンスすることにより、
前記ヌクレアーゼにより誘発されたＤＳＢを検出することと、
を含む方法。
【請求項８】
複数のガイドＲＮＡのどれが最も特異的であるかを決定する方法であって、
前記複数のガイドＲＮＡのそれぞれに対して、
ＤＮＡを提供することと、
前記ＤＮＡを規定の平均長さにランダムに剪断することと、
前記剪断ＤＮＡの末端修復、次いでＡテール付加を行うことと、
好ましくは、約１０〜２０ヌクレオチドの第１の領域と、１つ以上のヘアピンループを形成する、かつＰＣＲプライミングおよび／またはシーケンシングに使用するのに適合した第１のプライマー部位を含む、約４５〜６５ヌクレオチドの第２の領域と、前記第１の領域に相補的である約１０〜２０ヌクレオチドの第３の領域と、を前記第１および第２の領域間の１個のデオキシウリジンヌクレオチドと共に含む第１のヘアピンアダプターをライゲートすることと、
前記サンプルと１種以上のエキソヌクレアーゼとを十分に接触させて、両末端にライゲートされた前記第１のアダプターが欠如したいずれのＤＮＡ分子も分解することと、
前記サンプルを前記ガイドＲＮＡに適合したＣａｓ９ヌクレアーゼで処理して、好ましくは部位特異的二本鎖切断を含む、前記ＤＮＡの二本鎖切断を誘発することと、
任意選択的に、得られた切断末端の末端修復、次いでＡテール付加を行うことと、
約１０〜２０ヌクレオチドの第１の領域と、１つ以上のヘアピンループを形成する、かつＰＣＲプライミングおよび／またはシーケンシングで前記第１のプライマー部位と共にに使用するのに適合した第２のプライマーを含む、約４０〜６０ヌクレオチドの第２の領域と、前記第１の領域に相補である、かつ前記第２および第３の領域間に１個のデオキシウリジンヌクレオチドをさらに含有する、約１０〜２０ヌクレオチドの第３の領域と、を含む第２のヘアピンアダプターをライゲートして、末端にライゲートされた第１および第２のヘアピンアダプターを有するＤＮＡ断片が、ヌクレアーゼにより切断されたものである、集団を生成することにより、一方の末端が前記ＤＮＡのヌクレアーゼ誘発二本鎖切断により生成された、ＤＮＡのヌクレアーゼ誘発二本鎖切断を含む断片のライブラリーを作製することと、
前記ライブラリーとウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）および／またはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩとを接触させて前記デオキシウリジンにおいて前記ＤＮＡにニックを入れることと、
第１および第２のヘアピンアダプターを有する断片をシーケンスすることにより、各サンプルでヌクレアーゼにより誘発されたＤＳＢを検出することと、
任意選択的に、各ＤＳＢがオンターゲットであるかまたはオフターゲットであるとかを同定することと、
各サンプルでヌクレアーゼにより誘発されたＤＳＢを比較することと、
複数のガイドＲＮＡのどれが最も少ないオフターゲットＤＳＢを誘発したかを決定することと、
を含む方法。
【請求項９】
前記サンプルをヌクレアーゼで処理して部位特異的切断を誘発することが、前記サンプルと、特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体化されたＣａｓ９ヌクレアーゼと、を接触させることを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡが、哺乳動物、植物、細菌性、または菌類の細胞から単離されたゲノムＤＮＡである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡが合成品である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
二本鎖切断を誘発するヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ＭｅｇａＴＡＬ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写アクチベーターエフェクター様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ  ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＧＮ）からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼであり、かつ前記方法が、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼを前記ゲノムの標的配列に案内するガイドＲＮＡを前記細胞内で発現することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１または第２のヘアピンアダプターのプライマー部位が、次世代シーケンシングプライマー部位、ランダム化ＤＮＡバーコード、またはユニーク分子識別子（ＵＭＩ）を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、米国法典第３５編第１１９条（ｅ）の規定により２０１５年９月１１日出願の米国特許出願第６２／２１７，６９０号に基づく優先権を主張する。上記の内容はすべて、本出願をもって参照により組み込まれる。
【０００２】
連邦政府委託の研究または開発
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により授与された助成金番号ＤＰ１ＧＭ１０５３７８に基づいて政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に関する一定の権利を有する。
【０００３】
本明細書には、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどの工学操作ヌクレアーゼのゲノムワイドな切断特異性を規定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法が記載されている。
【背景技術】
【０００４】
ジンクフィンガー、ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼをはじめとする工学操作ヌクレアーゼ技術は、バイオメディカル研究に革命をもたらしつつあるとともに、遺伝子ベースの疾患の重要な新しい治療方法を提供しつつある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
少なくとも部分的には、本発明は、細胞型特異的ゲノムＤＮＡサンプルから工学操作ヌクレアーゼ（たとえばＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）の潜在的オフターゲット切断部位をゲノムワイドに検出するための高感度で偏りのない方法の開発に基づく。本方法では、共有結合閉鎖ＤＮＡ分子のエキソヌクレアーゼ選択を用いて切断特異的富化およびシーケンシングのための出発集団として遊離ＤＮＡ末端がほとんどないゲノムＤＮＡ分子の集団を生成する。こうした切断断片の富化は、ヒトゲノムＤＮＡでは＞２０，０００倍と推定されるので、全ゲノムシーケンシングに基づくＤｉｇｅｎｏｍｅ−Ｓｅｑ（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１５  Ｍａｒ；１２（３）：２３７−４３）などの方法とは対照的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断ＤＮＡ断片を非常にシーケンシング効率良く発見することが可能になる。最適化後、本ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは、テストケースとして使用したＴｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５  Ｆｅｂ；３３（２）：１８７−９７に記載の細胞内ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑアッセイによりＶＥＧＦＡ部位標的部位で検出されたオフターゲット切断部位の１００％が検出された（言い換えると、本ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイではＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ検出切断部位のスーパーセットが検出される）。
【０００６】
本明細書には、ステムループアダプターまたはヘアピンアダプターのライゲーションおよびそれに続くにエキソヌクレアーゼ選択によりＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）（「切断（ｂｒｅａｋｓ）」および「切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）」という用語は本明細書では同義的に用いられる）のないＤＮＡ断片のライブラリーを酵素的に調製する方法と、共有結合閉鎖ＤＮＡ断片のこうした酵素的精製ライブラリーのヌクレアーゼ誘発切断をシーケンシングにより検出する方法と、が記載されている。全体として、これらの２つ方法は、ＤＮＡの複合混合物においてヌクレアーゼ誘発切断部位を効率的に破壊する戦略を含む。したがって、本方法は、末端のない分子の集団を生成することと、その集団をヌクレアーゼで処理することと、ヌクレアーゼ誘発切断の結果として新たに生成した末端を有する分子をこの集団の中に見いだすことと、を含みうる。
【０００７】
第１の態様では、本発明は、共有結合閉鎖ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する方法を提供する。本方法は、ＤＮＡ、たとえば、対象の細胞型または生物のｇＤＮＡを提供することと、任意選択的に、ＤＮＡを規定の平均長さ、たとえば約２００〜１０００ｂｐ、たとえば約５００ｂｐの平均長さにランダムに剪断してＤＮＡ断片の集団を提供することと、たとえば、剪断ＤＮＡの末端修復、次いでＡテール付加により末端ライゲーション用の断片を調製することと、少なくとも１個のデオキシウリジン（ウラシル）と、ＰＣＲプライミングおよび／またはシーケンシングたとえば次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に使用するのに適合した第１のプライマー部位と、を含む第１のヘアピンアダプターを断片の末端にライゲートしてライゲート断片の集団を調製することと、ライゲート断片と二本鎖切断を誘発するヌクレアーゼとを接触させることと、エキソヌクレアーゼを用いてライゲート断片を精製することにより共有結合閉鎖ＤＮＡ断片のライブラリーを作製することと、を含む。
【０００８】
本方法はまた、共有結合閉鎖ＤＮＡ断片のライブラリーと部位特異的切断を誘発するヌクレアーゼとを接触させることと、少なくとも１個のデオキシウリジンと、ＰＣＲプライミングおよび／またはシーケンシングで第１のプライマー部位と共に使用するのに適合した第２のプライマー部位と、を含む第２のヘアピンアダプターをライゲートすることと、ライブラリーと、酵素、たとえば、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）および／またはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼと、を接触させてデオキシウリジンにおいてＤＮＡにニックを入れることと、第１および第２のヘアピンアダプターを有する断片をシーケンスすることと、を含みうる。
【０００９】
また、本明細書には、ＤＮＡたとえばゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）中にヌクレアーゼ誘発二本鎖切断を含む断片のライブラリーを作製する方法も提供される。本方法は、ＤＮＡ、たとえば、対象の細胞型または生物のｇＤＮＡを提供することと、ＤＮＡを規定の平均長さ、たとえば約２００〜１０００ｂｐ、たとえば約１００〜５００ｂｐの平均長さにランダムに剪断することと、任意選択的に、剪断ＤＮＡの末端修復、次いでＡテール付加を行うことと、好ましくは、たとえば約１０〜２０たとえば１２ヌクレオチドの第１の領域と、１つ以上のヘアピンループを形成する、かつＰＣＲプライミングおよび／またはシーケンシングたとえば次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に使用するのに適合した第１のプライマー部位を含む、たとえば約４５〜６５たとえば５８ヌクレオチドの第２の領域と、第１の領域に相補的である、たとえば約１０〜２０たとえば１３ヌクレオチドの第３の領域（たとえば第１の領域よりも長い領域）と、を第１および第２の領域間の１個のデオキシウリジンヌクレオチドと共に含む第１のシングルテールヘアピンアダプターをライゲートすることと、サンプルと１種以上のエキソヌクレアーゼ（たとえば、バクテリオファージｌａｍｂｄａエキソヌクレアーゼ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥｘｏＩ、ＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅ（商標）ＡＴＰ依存エキソヌクレアーゼ）を十分に接触させて、その両末端にライゲートされた第１の（たとえば５’）シングルテールヘアピンアダプターが欠如したいずれのＤＮＡ分子も分解することと、サンプルをヌクレアーゼで処理して部位特異的切断を誘発し（たとえば、オンターゲット部位および／またはオフターゲット部位で誘発して、たとえば、平滑末端または付着／オーバーハング末端を誘導し）、得られた末端の末端修復、次いでＡテール付加を任意選択的に行うことと、約１０〜２０たとえば１５ヌクレオチドの第１の領域と、１つ以上のヘアピンループを形成する、かつＰＣＲプライミングおよび／またはシーケンシングたとえば次世代シーケンシング（ＮＧＳ）で第１のプライマー部位と共に使用するのに適合した第２のプライマーを含む、約４０〜６０たとえば４８ヌクレオチドの第２の領域と、第１の領域に相補的である、かつさらに第２および第３の領域間に１個のデオキシウリジンヌクレオチドを含有する、約１０〜２０たとえば１６ヌクレオチドの第３の領域（たとえば第１の領域よりも長い領域）と、を含む第２の（たとえば３’）シングルテールヘアピンアダプターをライゲートして、ヌクレアーゼにより切断されたＤＮＡ断片が、そのそれぞれの末端にライゲートされた第１および第２のシングルテールヘアピンアダプターを有する、集団を生成することにより、たとえば、一方の末端がＤＮＡのヌクレアーゼ誘発二本鎖切断により生成された、断片のライブラリーを作製することと、を含みうる。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本方法は、ライブラリーと、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）および／またはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼと、を接触させてデオキシウリジンにおいてＤＮＡにニックを入れることと、第１および第２のヘアピンアダプターを有する断片をシーケンスすることと、を含む。
【００１１】
また、本明細書には、ＤＮＡたとえば細胞のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）のヌクレアーゼ誘発二本鎖切断（ＤＳＢ）を検出する方法も提供される。本方法は、ＤＮＡ、たとえば、対象の細胞型または生物のｇＤＮＡを提供することと、ＤＮＡを規定の平均長さ、たとえば約２００〜１０００ｂｐ、たとえば約５００ｂｐの平均長さにランダムに剪断することと、任意選択的に、剪断ＤＮＡの末端修復、次いでＡテール付加を行うことと、好ましくは、たとえば約１０〜２０たとえば１２ヌクレオチドの第１の領域と、１つ以上のヘアピンループを形成する、かつＰＣＲプライミングおよび／またはシーケンシングたとえば次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に使用するのに適合した第１のプライマー部位を含む、たとえば約４５〜６５たとえば５８ヌクレオチドの第２の領域と、第１の領域に相補的である、たとえば約１０〜２０たとえば１３ヌクレオチドの第３の領域（たとえば第１の領域よりも長い領域）と、を第１および第２の領域間の１個のデオキシウリジンヌクレオチドと共に含む第１のシングルテールヘアピンアダプターをライゲートすることと、サンプルと１種以上のエキソヌクレアーゼ（たとえば、バクテリオファージｌａｍｂｄａエキソヌクレアーゼ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥｘｏＩ、ＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅ（商標）ＡＴＰ依存エキソヌクレアーゼ）を十分に接触させて、その両末端にライゲートされた第１のシングルテールヘアピンアダプターが欠如したいずれのＤＮＡ分子も分解することと、サンプルをヌクレアーゼで処理してＤＮＡの部位特異的切断を誘発することにより、たとえば、オンターゲット切断部位および／またはオフターゲット切断部位を生成することと、任意選択的に、得られた切断末端の末端修復、次いでＡテール付加を行うことと、約１０〜２０たとえば１５ヌクレオチドの第１の領域と、１つ以上のヘアピンループを形成する、かつＰＣＲプライミングおよび／またはシーケンシングたとえば次世代シーケンシング（ＮＧＳ）で第１のプライマー部位と共に使用するのに適合した第２のプライマーを含む、約４０〜６０たとえば４８ヌクレオチドの第２の領域と、第１の領域に相補的である、かつさらに第２および第３の領域間に１個のデオキシウリジンヌクレオチドを含有する、約１０〜２０たとえば１６ヌクレオチドの第３の領域（たとえば第１の領域よりも長い領域）と、を含む第２の（たとえば３’）シングルテールヘアピンアダプターをライゲートして、ヌクレアーゼにより切断されたＤＮＡ断片が、そのそれぞれの末端にライゲートされた第１および第２のヘアピンアダプターを有する、集団を生成することにより、たとえば、一方の末端がＤＮＡのヌクレアーゼ誘発二本鎖切断により生成された、ＤＮＡのヌクレアーゼ誘発二本鎖切断を含む断片のライブラリーを作製することと、ライブラリーと、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）および／またはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼと、を接触させてデオキシウリジンにおいてＤＮＡにニックを入れることと、第１および第２のヘアピンアダプターを有する断片をシーケンスすることにより、ヌクレアーゼにより誘発されたＤＳＢを検出することと、を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、工学操作ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ＭｅｇａＴＡＬ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写アクチベーターエフェクター様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ  ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＧＮ）からなる群から選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、たとえば、オンターゲット部位およびオフターゲット部位で、サンプルをヌクレアーゼで処理して、部位特異的切断を誘発することは、サンプルと、特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体化されたＣａｓ９ヌクレアーゼと、を接触させることを含む。
【００１４】
さらに、本明細書には、複数のガイドＲＮＡのどれが最も特異的であるか、すなわち、最も少ないオフターゲットＤＳＢを誘発するか、を決定する方法が提供される。本方法は、複数のガイドＲＮＡのそれぞれに対して、対象の細胞型または生物のｇＤＮＡを提供することと、ｇＤＮＡを規定の平均長さ、たとえば約２００〜１０００ｂｐ、たとえば約５００ｂｐの平均長さにランダムに剪断することと、任意選択的に、剪断ｇＤＮＡの末端修復、次いでＡテール付加を行うことと、好ましくは、たとえば約１０〜２０たとえば１２ヌクレオチドの第１の領域と、１つ以上のヘアピンループを形成する、かつＰＣＲプライミングおよび／またはシーケンシングたとえば次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に使用するのに適合した第１のプライマー部位を含む、たとえば約４５〜６５たとえば５８ヌクレオチドの第２の領域と、第１の領域に相補的である、たとえば約１０〜２０たとえば１３ヌクレオチドの第３の領域（たとえば第１の領域よりも長い領域）と、を第１および第２の領域間の１個のデオキシウリジンヌクレオチドと共に含む第１のシングルテールヘアピンアダプターをライゲートすることと、サンプルと１種以上のエキソヌクレアーゼ（たとえば、バクテリオファージｌａｍｂｄａエキソヌクレアーゼ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥｘｏＩ、ＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅ（商標）ＡＴＰ依存エキソヌクレアーゼ）を十分に接触させて、その両末端にライゲートされた第１のヘアピンアダプターが欠如したいずれのＤＮＡ分子も分解することと、サンプルをガイドＲＮＡに適合したＣａｓ９ヌクレアーゼで処理して部位特異的切断を誘発することと（たとえば、オンターゲット部位および／またはオフターゲット部位で誘発して、たとえば、平滑末端または付着／オーバーハング末端を誘導することと）、任意選択的に、得られた切断末端の末端修復、次いでＡテール付加を行うことと、約１０〜２０たとえば１５ヌクレオチドの第１の領域と、１つ以上のヘアピンループを形成する、かつＰＣＲプライミングおよび／またはシーケンシングたとえば次世代シーケンシング（ＮＧＳ）で第１のプライマー部位と共に使用するのに適合した第２のプライマーを含む、約４０〜６０たとえば４８ヌクレオチドの第２の領域と、第１の領域に相補的である、かつさらに第２および第３の領域間に１個のデオキシウリジンヌクレオチドを含有する、約１０〜２０たとえば１６ヌクレオチドの第３の領域（たとえば第１の領域よりも長い領域）と、を含む第２の（たとえば３’）シングルテールヘアピンアダプターをライゲートして、末端にライゲートされた第１および第２のヘアピンアダプターを有するＤＮＡ断片が、ヌクレアーゼにより切断されたものである、集団を生成することにより、たとえば、一方の末端がＤＮＡのヌクレアーゼ誘発二本鎖切断により生成された、ＤＮＡのヌクレアーゼ誘発二本鎖切断を含む断片のライブラリーを作製することと、ライブラリーと、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）および／またはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼと、を接触させてデオキシウリジンにおいてＤＮＡにニックを入れることと、第１および第２のヘアピンアダプターを有する断片をシーケンスすることにより、各サンプルでヌクレアーゼにより誘発されたＤＳＢを検出することと、任意選択的に、各ＤＳＢがオンターゲットであるかまたはオフターゲットであるとかを同定することと、各サンプルでヌクレアーゼにより誘発されたＤＳＢを比較することと、複数のガイドＲＮＡのどれが最も少ないオフターゲットＤＳＢを誘発したかを決定することと、を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、哺乳動物細胞、植物細胞、細菌細胞、または菌類細胞から単離される（たとえばｇＤＮＡ）。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡは合成品である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、工学操作ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガー、メガヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、またはＣａｓ９ヌクレアーゼである。
【００１８】
いくつかの実施形態では、工学操作ヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼであり、かつ本方法はまた、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをゲノムの標的配列に案内するガイドＲＮＡを細胞内で発現することを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、第１または第２のヘアピンアダプターのプライマー部位は、次世代シーケンシングプライマー部位、ランダム化ＤＮＡバーコード、またはユニーク分子識別子（ＵＭＩ）を含む。
【００２０】
本方法はいくつかの利点を有する。たとえば、本方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われるのに対して、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑは細胞ベースであり、細胞内への二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）の導入さらにはヌクレアーゼまたはヌクレアーゼコード成分の発現または導入を必要とする。すべての細胞でｄｓＯＤＮおよび／またはヌクレアーゼまたはヌクレアーゼコード成分の導入が可能であるとは限らないであろうし、いくつかの場合には、これらの試薬が毒性であることもありうる。とくに興味深い細胞型がｄｓＯＤＮ、ヌクレアーゼ、またはヌクレアーゼコード成分の導入に適合しない場合、サロゲート細胞型を使用しうるが、細胞特異的効果が検出されない可能性がある。本方法は、細胞内へのｄｓＯＤＮ、ヌクレアーゼ、またはヌクレアーゼコード成分の送達を必要としせず、クロマチン状態による影響を受けず、毒性問題を引き起こすことがなく、しかも対象の細胞型から得られるゲノムＤＮＡの切断による特異的細胞ゲノムの照合を可能にする。
【００２１】
とくに定義がない限り、本明細書で用いられる科学技術用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されているものと同一の意味を有する。方法および材料は、本発明に使用するために本明細書に記載されているが、当技術分野で公知の他の好適な方法および材料を使用することも可能である。材料、方法、および実施例は、例示的なものにすぎず、限定しようとするものではない。本明細書に挙げられる出版物、特許出願、特許、シーケンス、データベース項目、および他の参照文献はすべて、その全体が参照により組み込まれる。矛盾を生じた場合、定義を含む本明細書が優先するものとする。
【００２２】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面からならびに特許請求の範囲から明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】ＦＩＮＤ−ｓｅｑ（ヌクレアーゼＤＳＢの完全照合）と呼ばれるＤＮＡの複合混合物からＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断部位のゲノムワイドな同定を行うための例示的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの概要。ゲノムＤＮＡをヒト細胞から単離し、Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｓ２２０  ＡＦＡ装置を用いて平均約５００ｂｐに剪断する。剪断ＤＮＡに対して末端修復、Ａテール付加、および１個のデオキシウリジンを含有する５’シングルテールヘアピンアダプターのライゲーションを行う。ＤＮＡ断片の両末端へのヘアピンアダプターのライゲーションが成功すると、遊離末端のない共有結合閉鎖ＤＮＡが得られるであろう。次いで、ｌａｍｂｄａエキソヌクレアーゼおよびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥｘｏＩまたはＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅ  ＡＴＰ依存エキソヌクレアーゼを用いて遊離末端を有するＤＮＡのバックグラウンドを劇的に低減させることにより、主に共有結合閉鎖ＤＮＡ分子の均一な集団を残すことが可能である。アダプターライゲートｇＤＮＡをＣａｓ９切断すると、同様に１個のウラシル塩基を含有する第２の３’シングルテールヘアピンアダプターのライゲーション用の遊離５’リン酸を有する末端を生じるであろう。ＵＳＥＲ酵素混合物で処理してＰＣＲを行うことにより、５’および３’シングルテールアダプターの両方がライゲートされたＤＮＡ分子を富化する。シングルテールアダプターを使用すると、５’および３’アダプターの両方を含有する分子のみを増幅およびシーケンスすることが可能であるので、バックグラウンドが低減される。
【図１Ｂ】ＦＩＮＤ−ｓｅｑ（ヌクレアーゼＤＳＢの完全照合）と呼ばれるＤＮＡの複合混合物からＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断部位のゲノムワイドな同定を行うための例示的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの概要。ヘアピンアダプターの配列および予測ＤＮＡ二次構造を含むアダプターライゲーション工程の詳細模式図。両末端でヘアピンアダプターのライゲーションを行うことにより、ウラシル含有部位で後続的に再開放可能な共有結合閉鎖ＤＮＡ分子を生成する。
【図２Ａ】オンターゲットおよびオフターゲットの切断部位にマッピングされたリード。Ｃａｓ９切断のユニフォーム末端リードシグネチャーの二方向マッピングを同定可能な「オンターゲット」ゲノム領域の可視化。リードは矩形により表され、カバレッジは上に表示される。矢印は予測カット部位を表す。また、データはＶＥＧＦＡ位置の３つの標的部位に対して示される。ＥＭＸ１  ｇＲＮＡと複合体化されたストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９で処理したサンプルも、陰性対照として示される。
【図２Ｂ】オンターゲットおよびオフターゲットの切断部位にマッピングされたリード。ＶＥＧＦＡ部位１での「オフターゲット」ゲノム領域例２０：５６１７５３４９−５６１７５３７２の可視化。「ユニフォーム」末端を有するリードの二方向マッピングをこの領域内に観察可能であり、これは本ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより検出される部位に特有である。リードは、一般的には、予測カット部位から１ｂｐ以内で開始され、この位置から両方向に外向きに広がる。
【図３Ａ】さまざまなエキソヌクレアーゼ処理条件を用いたＦＩＮＤ−ｓｅｑ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断選択アッセイの結果分析。さまざまなエキソヌクレアーゼ処理下でゲノムワイドなｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断アッセイにより検出された部位にマッピングされたリード数。
【図３Ｂ】さまざまなエキソヌクレアーゼ処理条件を用いたＦＩＮＤ−ｓｅｑ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断選択アッセイの結果分析。さまざまなエキソヌクレアーゼ処理を用いたゲノムワイドなｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断アッセイにより検出された部位の数。
【図３Ｃ】さまざまなエキソヌクレアーゼ処理条件を用いたＦＩＮＤ−ｓｅｑ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断選択アッセイの結果分析。さまざまなエキソヌクレアーゼ処理下でゲノムワイドなｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断アッセイにより検出された部位の平均リード数。
【図３Ｄ】さまざまなエキソヌクレアーゼ処理条件を用いたＦＩＮＤ−ｓｅｑ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断選択アッセイの結果分析。ゲノムワイドなｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断アッセイにより検出されたＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ検出部位のパーセント。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ部位の１００％が単純なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いて検出される３つの条件が存在することに留意されたい。
【図４】ＶＥＧＦＡ標的部位１におけるＧＵＩＤＥ−ｓｅｑアッセイと１時間のｌａｍｂｄａエキソヌクレアーゼ処理およびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩ処理ならびに１時間のＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅエキソヌクレアーゼ処理を用いたＦＩＮＤ−ｓｅｑゲノムｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断アッセイとの間のオーバーラップのベン図。この条件では、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ部位の１００％がｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでも検出される。
【図５Ａ】さまざまなエキソヌクレアーゼ処理条件を用いてアダプターライゲーション順序を試験するＦＩＮＤ−ｓｅｑゲノムｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断アッセイの分析。最も多くの部位を検出した条件は、３’アダプターを最初に添加した１時間のＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅ、１時間のエキソヌクレアーゼ／Ｅ．コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩの処理であった。さまざまなエキソヌクレアーゼ処理およびアダプターライゲーション順序を用いたＦＩＮＤ−ｓｅｑのゲノムワイドなｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断アッセイによる部位の数。
【図５Ｂ】さまざまなエキソヌクレアーゼ処理条件を用いてアダプターライゲーション順序を試験するＦＩＮＤ−ｓｅｑゲノムｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断アッセイの分析。最も多くの部位を検出した条件は、３’アダプターを最初に添加した１時間のＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅ、１時間のエキソヌクレアーゼ／Ｅ．コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩの処理であった。さまざまなエキソヌクレアーゼ処理およびアダプターライゲーション順序を用いてＦＩＮＤ−ｓｅｑにより検出されたオフターゲット部位のリード数。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼを治療に利用するうえで重要な要件は、そのオフターゲット効果を規定するロバストで包括的で偏りのない高感度の方法を有することである。最近、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９および他のカスタマイズ可能なヌクレアーゼのゲノムワイドなオフターゲット効果を規定するいくつかの方法が記載された。たとえば、生細胞におけるヌクレアーゼ誘発ＤＳＢへの短い二本鎖オリゴヌクレオチド「タグ」の取込みに基づくＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ法は、ゲノムワイドなスケールでオフターゲット部位を規定して細胞集団において０．１％程度の低い頻度で突然変異した部位を同定することが示されている（Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５）。ヌクレアーゼ誘発オフターゲット切断を規定する他の細胞ベースの方法は、オンターゲット部位に転座融合をマッピングする方法およびＤＳＢ部位への組込み欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）ゲノムの取込みに基づく他の方法を含む。
【００２５】
こうした最近の進歩にもかかわらず、オフターゲット決定の細胞ベースの方法は、（１）ヌクレアーゼ成分とｄｓＯＤＮやＩＤＬＶゲノムなどのタグとの両方を細胞内に導入可能にする必要性、（２）ある特定のタイプのオフターゲット突然変異を有する細胞の成長に有利または不利でありうる生物学的選択圧、および／または（３）ヌクレアーゼオフターゲット活性／作用に及ぼすクロマチン、ＤＮＡメチル化、遺伝子発現、核構造などの細胞型特異的パラメーターの潜在的交絡効果を含めて、いくつかの制約を有する。
【００２６】
精製ゲノムＤＮＡを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ法は、細胞ベースの方法のこうした種々の制約を回避しうるので、魅力的な選択肢を提供する。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法は、単離されたゲノムＤＮＡを実験的必要性からより小さい部分にランダムに剪断（または切断）するという難題に直面する。剪断により誘発されるＤＳＢとヌクレアーゼによりｉｎ  ｖｉｔｒｏでゲノムＤＮＡを処理することにより誘発されるＤＳＢとを示差的に同定することは容易でないので、このことから難題が課される。最近記載されたＤｉｇｅｎｏｍｅでは、ゲノム配列中にヌクレアーゼにより誘導される共通末端のアライメントを使用することを試みたが、このタイプのイベントのシグナルは、ゲノムＤＮＡの単離時に誘発されるゲノムＤＮＡの剪断に基づくおよびＤＮＡシーケンシング法に必要とされるより小さいサイズの部分にＤＮＡを意図的に剪断することによるランダムＤＳＢのバックグラウンドとの識別が難題となりうる。そのほかに、おそらくより重要なこととして、ヌクレアーゼ誘発ＤＳＢの富化が行われないので、Ｄｉｇｅｎｏｍｅにより生成されたシーケンシングデータのほぼすべてがランダムゲノムＤＮＡの単なる再シーケンシングであり、生成されたごくわずかなリードがヌクレアーゼ誘発ＤＳＢに関する所望の情報に寄与するにすぎないので、この方法の感度をさらに制限する因子となる。実際には、Ｄｉｇｅｎｏｍｅは、特定のｇＲＮＡでＧＵＩＤＥ−ｓｅｑにより見いだされたいくつかのオフターゲット部位の同定に失敗したが、２つの実験は異なる細胞系で行われたということに注意しなければならない。
【００２７】
本明細書には、対象の任意のゲノムＤＮＡ上にヌクレアーゼにより誘発されるＤＳＢの包括的決定を可能にするｉｎ  ｖｉｔｒｏ法が記載されている。本方法は、ゲノムＤＮＡの剪断により誘発されるランダムＤＳＢよりもヌクレアーゼ誘発ＤＳＢを富化することを可能にする。本方法がどのように機能するかの概要は、図１Ａおよび１Ｂに見いだしうる。簡潔に述べると、対象の細胞型または生物からのゲノムＤＮＡは、規定の平均長さにランダムに剪断される。本実験では、５００ｂｐの平均長さで後続の次世代シーケンシングの工程で十分に機能したが、より短いまたはより長い長さも使用可能である。このゲノムＤＮＡのランダム切断末端は、末端修復され（すなわち、ランダムオーバーハング末端は、たとえば、Ｔ４ポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ断片、およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）を用いて充填／平滑化される）、次いでＡテール付加される（すなわち、Ａ（アデノシン）が酵素的に平滑二本鎖ＤＮＡ分子の３’末端に付加される）。次いで、これにより、特定位置に１個のデオキシウリジンヌクレオチド（図１Ｂ）と３’末端に１ヌクレオチド（チミジン）のオーバーハングとをさらに含有する、好ましくは５’末端次世代シーケンシングプライマー部位を有するヘアピンアダプターのライゲーションが可能になる。これ以降では、このアダプターは、「５’シングルテールヘアピンアダプター」または単に「５’ヘアピンアダプター」と呼ばれる。
【００２８】
このアダプターのライゲーションの後、次いで、両末端に５’シングルテールヘアピンアダプターがライゲートされていないいずれのＤＮＡ分子も分解する１種以上のエキソヌクレアーゼ（たとえば、バクテリオファージｌａｍｂｄａエキソヌクレアーゼ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥｘｏＩ、ＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅ（商標）ＡＴＰ依存エキソヌクレアーゼ）でサンプルを処理する。次いで、たとえば、特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体化されたＣａｓ９ヌクレアーゼを用いて、平滑末端カットを誘発するように一群の分子を処理する。得られたヌクレアーゼ誘発平滑末端にＡテールを付加し、次いで、３’末端次世代シーケンシングプライマー部位を有するかつ特定位置に１個のデオキシウリジンヌクレオチドをさらに含有する第２のヘアピンアダプターをこの末端にライゲートする。このアダプターもまた、本明細書では「３’シングルテールヘアピンアダプター」または単に「３’ヘアピンアダプター」と呼ばれる。
【００２９】
これらの処理の結果として、末端に５’および３’シングルテールヘアピンアダプターがライゲートされたＤＮＡ断片のみが、ヌクレアーゼにより切断されたものとなる。デオキシウリジンが存在するすべての箇所でＤＮＡにニックを入れる処理を行った後（たとえば、ＵＳＥＲ酵素混合物により）、２つのタイプのアダプターを有する断片のみがシーケンス可能となる。
【００３０】
本方法は、次世代シーケンシング用の断片のライブラリーを作製するために、たとえば、最も特異的なＤＳＢを誘発する（たとえば、最も少ないオフターゲット効果を有する）ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９の組合せを同定するために、たとえば、治療または研究の目的で、使用可能である。
【００３１】
シングルテールヘアピンアダプター
本方法は、天然に存在しない３’および５’シングルテールヘアピンアダプターの使用を含む。ヘアピンアダプターは、たとえば約１０〜２０たとえば１２または１５ヌクレオチドの第１の領域と、１つ以上のヘアピンループを形成する、かつＰＣＲプライミングおよび／またはシーケンシングたとえば次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に使用するのに適合した配列を含む、たとえば約４５〜６５たとえば５８または４８ヌクレオチドの第２の領域と、第１の領域に相補的である、たとえば約１０〜２０たとえば１３または１６ヌクレオチドの第３の領域と、を（５’→３’方向に）含む。第１の領域、第２の領域、および第３の領域の長さは、選択されるＮＧＳプラットフォームに使用されるプライミングに必要な配列に依存して選択されるので、ＮＧＳ法に依存して異なりうる。
【００３２】
ヘアピンアダプターは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）およびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼ、たとえば、ＵＳＥＲ（ウラシル特異的除去試薬）酵素混合物（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）によりアダプターを開放可能である、少なくとも１つ、好ましくはただ１つのウラシルを含む。ＵＤＧは、ウラシル塩基の除去による脱塩基部位の形成を触媒するが、ホスホジエステル骨格をインタクトな状態に残す（たとえば、Ｌｉｎｄｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．．２５２：３２８６−３２９４（１９７７）、Ｌｉｎｄｈａｌ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５１：６１−６４（１９８２）を参照されたい）。エンドヌクレアーゼＶＩＩＩは、脱塩基部位の３’および５’側でホスホジエステル骨格を切断する（たとえば、Ｍｅｌａｍｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１２５５−１２６４（１９９４）、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３２２３０−３２２３９（１９９７）を参照されたい）。この組合せは、ウラシルの位置に単一のヌクレオチドギャップを生成する。いくつかの実施形態では、５’シングルテールヘアピンアダプター中で、ウラシルは、第１の領域の末端および第２の領域の始端から１、２、３、または４ヌクレオチドの位置またはその範囲内に配置され、３’シングルテールヘアピンアダプター中で、ウラシルは、第１の領域の末端および第２の領域の始端から１、２、３、または４ヌクレオチドの位置またはその範囲内に配置される。
【００３３】
本方法では、ヘアピンアダプターの部分はすべて、好ましくは細胞のゲノムに対してオルソロガスである（すなわち、細胞のゲノムに存在しないか、または存在する配列に相補的でない。すなわち、存在する配列に対して１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以下の同一性を有する）。ヘアピンアダプターは、好ましくは６５〜９５ｎｔの長さ、たとえば７０〜９０ｎｔまたは７５〜８５ｎｔの長さでありうる。
【００３４】
５’および３’シングルテールヘアピンアダプターのそれぞれは、ランダム化ＤＮＡバーコード（たとえば、ＳＨＡＰＥ−ＳＥＱ，Ｌｕｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８：１１０６３−１１０６８）、ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）（たとえば、Ｋｉｖｉｏｊａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，７２−７４（２０１２）、Ｉｓｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１，１６３−１６６（２０１４）、Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１５  Ｍａｒ；１０５（３）：１５０−８を参照されたい）、またはシーケンシング（たとえばＮＧＳ）に使用するのに適合したユニークＰＣＲプライミング配列および／またはユニーク配列であるプライマー部位を含むべきである。シーケンシングに使用するのに適合した配列は、所望のシーケンシング法、たとえば、次世代シーケンシング法、たとえば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、またはライブラリー作製法、たとえば、Ｒｏｃｈｅ／４５４、ｌｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｏｌｅｘａゲノムアナライザー、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳＯＬｉＤ（商標）システム、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）半導体シーケンスアナライザー、ＰａｃＢｉｏ（登録商標）リアルタイムシーケンシング、およびＨｅｌｉｃｏｓ（商標）単分子シーケンシング（ＳＭＳ）と併用するように選択可能である。たとえば、国際公開第２０１４０２０１３７号パンフレット、Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５５：４  ６４１−６５８（２００９）、およびＭｅｔｚｋｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１：３１−４６（２０１０）を参照されたい。いくつかのキットは、ＴｈｒｕＰＬＥＸ  ＤＮＡ−ｓｅｑキット（Ｒｕｂｉｃｏｎ、米国特許第７，８０３，５５０号明細書、同第８，０７１，３１２号明細書、同第８，３９９，１９９号明細書、同第８，７２８，７３７号明細書を参照されたい）およびＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、たとえば、米国特許第８，４２０，３１９号明細書を参照されたい）を含めて、ＮＧＳ用ＤＮＡの調製用として市販されている。例示的な配列は、以下の表Ａに示される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは、制限酵素認識部位、好ましくは、細胞のゲノムで比較的稀な部位を含む。
【００３６】
ヘアピンアダプターは好ましくは修飾され、いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターの５’末端はリン酸化される。いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは平滑末端である。いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは、５’または３’末端にランダムなさまざまな１、２、３、４ヌクレオチド以上のオーバーハングを含むか、または５’または３’末端に１個のＴを含む。
【００３７】
ヘアピンアダプターはまた、たとえば、当技術分野で公知のようにまたは国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６０４９３号パンフレットに記載のように、１つ以上の追加の修飾を含みうる。いくつかの実施形態では、たとえば、ヘアピンアダプターはビオチン化される。ビオチンは、５’末端や３’末端ではなくヘアピンアダプター内の任意の位置に存在しうる（たとえば、修飾チミジン残基（ビオチン−ｄＴ）またはビオチンアジドの使用）。これは、ＦＩＮＤ−ｓｅｑヘアピンアダプターを含有する断片を回収する代替法を提供する。いくつかの実施形態では、これらの配列はＰＣＲにより回収および同定されるが、この手法では、たとえば、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズに結合させることにより、または溶液ハイブリッドキャプチャーを用いて、物理的に牽引したりビオチンを用いて富化したりする。たとえば、Ｇｎｉｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７，１８２−１８９（２００９）を参照されたい。
【００３８】
本試行例は、５’アダプターの次に３’アダプターをライゲートすることを含むが、アダプターは、いずれかの順序で、すなわち、５’アダプターの次に３’アダプターまたは３’アダプターの次に５’アダプターを添加しうる。順序は、使用するエキソヌクレアーゼ処理に依存して最適化しうる。たとえば、５’→３’処理性の高いエキソヌクレアーゼであるｌａｍｂｄａエキソヌクレアーゼの場合、５’アダプターを２番目に添加することが有利でありうる。
【００３９】
工学操作ヌクレアーゼ
工学操作ヌクレアーゼには、主に４つのクラス、すなわち、１）メガヌクレアーゼ、２）ジンクフィンガーヌクレアーゼ、３）転写アクチベーターエフェクター様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、および４）クラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）Ｃａｓ  ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ＲＧＮ）が現在存在する。たとえば、Ｇａｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３  Ｊｕｌ；３１（７）：３９７−４０５を参照されたい。これらまたはその変異体はいずれも、本方法に使用可能である。ヌクレアーゼは、当技術分野で公知の方法を用いて一過的または安定的に発現可能であり、典型的には、発現を達成するために、タンパク質をコードする配列を、転写を指令するプロモーターを含有する発現ベクターにサブクローニングする。好適な真核発現系は、当技術分野で周知であり、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ  ｅｄ．２０１３）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００６）、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，２０１０）に記載されている。真核細胞および原核細胞の形質転換は、標準的技術に従って行われる（たとえば、以上の参照文献およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，１９７７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３２：３４９−３５１、Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ  ＆  Ｃｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：３４７−３６２（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，１９８３）を参照されたい）。
【００４０】
ホーミングメガヌクレアーゼ
メガヌクレアーゼは、細菌、酵母、藻類、植物オルガネラなどのさまざまな生物に由来する配列特異的エンドヌクレアーゼである。内因性メガヌクレアーゼは、１２〜３０塩基対の認識部位を有し、１８ｂｐおよび２４ｂｐ長のメガヌクレアーゼ認識部位を有するカスタマイズＤＮＡ結合部位が記載されており、いずれも本方法および構築物に使用可能である。たとえば、Ｓｉｌｖａ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１１：１１−２７，（２０１１）、Ａｒｎｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３５５：４４３−５８（２００６）、Ａｒｎｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２４：２７−３１（２０１１）、およびＳｔｏｄｄａｒｄ，Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８，４９（２００５）、Ｇｒｉｚｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３８：２００６−１８（２０１０）を参照されたい。
【００４１】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼ
クラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系（Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４８２，３３１−３３８（２０１２）、Ｈｏｒｖａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７，１６７−１７０（２０１０）、Ｔｅｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １４，３２１−３２７（２０１１））は、細菌、酵母、およびヒト細胞、さらにはミバエ、ゼブラフィッシュ、マウスなどの生物体においてｉｎ  ｖｉｖｏでゲノム編集を行う単純かつ高効率な方法の基礎として機能しうることが、最近の研究から実証された（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５３，９１０−９１８（２０１３）、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ（２０１３）、Ｄｉｃａｒｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２０１３）、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２３３−２３９（２０１３）、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ  ２，ｅ００４７１（２０１３）、Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２２７−２２９（２０１３）、Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８１９−８２３（２０１３）、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８２３−８２６（２０１３ｃ）、Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２３０−２３２（２０１３）、Ｇｒａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９４（４）：１０２９−３５（２０１３））。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９ヌクレアーゼは、工学操作ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、たとえば、単一ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ対の１７〜２０ヌクレオチドと、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、たとえば、配列ＮＧＧまたはＮＡＧに一致するＰＡＭに隣接して位置する対象の標的ゲノムＤＮＡ配列の相補鎖と、の間の単純塩基対相補性を介してガイド可能である（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ（２０１３）、Ｄｉｃａｒｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２０１３）、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２３３−２３９（２０１３）、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ  ２，ｅ００４７１（２０１３）、Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２２７−２２９（２０１３）、Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８１９−８２３（２０１３）、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８２３−８２６（２０１３ｃ）、Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２３０−２３２（２０１３）、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７，８１６−８２１（２０１２）
。
【００４２】
いくつかの実施形態では、本システムは、細菌にコードされるかまたは哺乳動物細胞で発現するようにコドン最適化されるかのいずれかで、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に由来する野生型または変異型Ｃａｓ９タンパク質を利用する。ガイドＲＮＡは細胞内でＣａｓ９と一緒に発現される。ガイドＲＮＡまたはヌクレアーゼの一方またはその両方を細胞内で一過的または安定的に発現可能である。
【００４３】
ＴＡＬエフェクターリピートアレイ
キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）の植物病原性細菌のＴＡＬエフェクターは、宿主ＤＮＡに結合してエフェクター特異的宿主遺伝子を活性化することにより疾患で重要な役割を果たすかまたは防御をトリガーする。特異性は、不完全な典型的には約３３〜３５アミノ酸リピートのエフェクター可変領域数に依存する。多型は、主にリピート位置１２および１３に存在し、これは本明細書ではリピート可変二塩基（ＲＶＤ）と呼ばれる。ＴＡＬエフェクターのＲＶＤは、いくらかの縮重を有するが明確なコンテキスト依存性を有することなく１ＲＶＤ対１ヌクレオチドで直接線形に標的部位のヌクレオチドに対応する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド特異性を与える多型領域は、三塩基またはトリプレットとして発現されうる。
【００４４】
各ＤＮＡ結合リピートは、標的ＤＮＡ配列中の塩基対の認識を決定するＲＶＤを含みうるとともに、各ＤＮＡ結合リピートは、標的ＤＮＡ配列中の一塩基対を認識する役割を果たす。いくつかの実施形態では、ＲＶＤは、Ｃを認識するＨＡ、Ｃを認識するＮＤ、Ｃを認識するＨＩ、Ｇを認識するＨＮ、Ｇを認識するＮＡ、ＧまたはＡを認識するＳＮ、Ｔを認識するＹＧ、およびＧを認識するＮＫの１つ以上と、Ｃを認識するＨＤ、Ｔを認識するＮＧ、Ａを認識するＮＩ、ＧまたはＡを認識するＮＮ、ＡまたはＣまたはＧまたはＴを認識するＮＳ、ＣまたはＴを認識するＮ*（ここで、*はＲＶＤの第２の位置のギャップを表す）、Ｔを認識するＨＧ、Ｔを認識するＨ*（ここで、*はＲＶＤの第２の位置のギャップを表す）、およびＴを認識するＩＧの１つ以上と、を含みうる
【００４５】
ＴＡＬＥタンパク質は、ゲノム工学で相同組換えを促進可能な標的化キメラヌクレアーゼとして研究およびバイオテクノロジーに有用でありうる（たとえば、植物においてバイオ燃料またはバイオ再生可能物に有用な形質を付与または増強する）。このタンパク質はまた、たとえば転写因子として、とくにたとえば限定されるものではないが病原体（たとえばウイルス）に対する治療剤のように非常に高レベルの特異性を必要とする治療用途に有用でありうる。
【００４６】
工学操作ＴＡＬＥアレイを生成する方法は、当技術分野で公知である。たとえば、米国特許出願第６１／６１０，２１２号明細書およびＲｅｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０，４６０−４６５（２０１２）に記載の高速ライゲーションベースの自動化可能な固相高スループット（ＦＬＡＳＨ）システム、さらには、Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ  ＆  Ｖｏｙｔａｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３，１８４３−１８４６（２０１１）、Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ  １３，３９４−４０１（２０１０）、Ｓｃｈｏｌｚｅ  ＆  Ｂｏｃｈ，Ｊ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２０１１）、Ｂｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，１５０９−１５１２（２００９）、Ｍｏｓｃｏｕ  ＆  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，１５０１（２００９）、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９，１４３−１４８（２０１１）、Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７，２１６１７−２１６２２（２０１０）、Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３９，５７９０−５７９９（２０１１）、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９，１４９−１５３（２０１１）、Ｇｅｉｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６，ｅ１９５０９（２０１１）、Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６，ｅ１９７２２（２０１１）、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８６，７５７−７６１（２０１０）、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３９，３５９−３７２（２０１１）、Ｍａｈｆｏｕｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８，２６２３−２６２８（２０１１）、Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２０１１）、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３９，６３１５−６３２５（２０１１）、Ｃｅｒｍａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３９，ｅ８２（２０１１）、Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３，３０７（２０１１）、Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９，７３１−７３４（２０１１）、Ｔｅｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９，６９５−６９６（２０１１）、Ｓａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９，６９７−６９８（２０１１）、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９，６９９−７００（２０１１）、およびＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９，１４９−１５３（２０１１）に記載の方法を参照されたい（それらはすべてその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００４７】
本方法に使用するのに同様に好適なのは、メガヌクレアーゼとＴＡＬエフェクターとの融合体のＭｅｇａＴＡＬである。たとえば、Ｂｏｉｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４２（４）：２５９１−２６０１（２０１４）、Ｂｏｉｓｓｅｌ  ａｎｄ  Ｓｃｈａｒｅｎｂｅｒｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１５；１２３９：１７１−９６を参照されたい。
【００４８】
ジンクフィンガー
ジンクフィンガータンパク質は、独立してフォールディングされた亜鉛含有ミニドメインである１つ以上のジンクフィンガーを含有するＤＮＡ結合タンパク質であり、その構造は当技術分野で周知であり、たとえば、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：１６０９、Ｂｅｒｇ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：９９、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４５：６３５、およびＫｌｕｇ，１９９３，Ｇｅｎｅ，１３５：８３に定義されている。ジンクフィンガータンパク質Ｚｉｆ２６８およびＤＮＡに結合されたその変異体の結晶構造は、半保存相互作用パターンを示し、典型的には、ジンクフィンガーのαヘリックスの３つのアミノ酸は、ＤＮＡの３つの隣接塩基対または「サブ部位」に接触する（Ｐａｖｌｅｔｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：８０９、Ｅｌｒｏｄ−Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，６：４５１）。したがって、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガーとＤＮＡ配列の３塩基対「サブ部位」との間でモジュール方式で１対１相互作用により機能しうることが、Ｚｉｆ２６８の結晶構造から示唆された。天然に存在するジンクフィンガー転写因子では、複数のジンクフィンガーは、典型的には、隣接ＤＮＡ配列の配列特異的認識を達成するためにタンデムアレイで結合一体化される（Ｋｌｕｇ，１９９３，Ｇｅｎｅ  １３５：８３）。
【００４９】
ＤＮＡ結合に関与するαヘリックス位置のアミノ酸をランダム化することにより、かつ対象のＤＮＡ標的部位に結合可能な所望の変異体を同定するためにファージディスプレイなどの選択方法を使用することにより、個々のジンクフィンガーのＤＮＡ結合特性を人工的に工学操作可能であることが、多くの研究から示されている（Ｒｅｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３：６７１、Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１１１６３、Ｊａｍｉｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：５６８９、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：３４４）。かかる組換えジンクフィンガータンパク質は、遺伝子発現を調節したり、ＤＮＡメチル化を変化させたり、モデルの生物、植物、およびヒト細胞のゲノムに標的変化を導入したりするために、転写アクチベーター、転写リプレッサー、メチル化ドメイン、ヌクレアーゼなどの機能ドメインに融合可能である（Ｃａｒｒｏｌｌ，２００８，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１５：１４６３−６８、Ｃａｔｈｏｍｅｎ，２００８，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１６：１２００−０７、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，６４：２９３３−４４）。
【００５０】
「モジュールアセンブリー」として知られるジンクフィンガーアレイを工学操作する既存の一方法では、所定のジンクフィンガーモジュールをアレイとして単に連結一体化することが提言されている（Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２：２１３７−４８、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：１３５−１４１、Ｍａｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３４：Ｗ５１６−５２３、Ｃａｒｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１：１３２９−４１、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：３８５０−５６、Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１：２７５−２８０、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．，１：１６３７−５２）。いずれの研究者が実施するにも十分な程度に単純明快であるが、とくにジンクフィンガーヌクレアーゼに関して、この方法の失敗率が高いこと（Ｒａｍｉｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５：３７４−３７５、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１９：１２７９−８８）、任意の所与の標的遺伝子に対して非常に多くのジンクフィンガータンパク質の構築および細胞ベースの試験が典型的には必要であるという制約があることが（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１９：１２７９−８８）、最近の報告で実証された。
【００５１】
ランダム化ライブラリーからジンクフィンガーアレイを同定するコンビナトリアル選択ベースの方法は、モジュールアセンブリーよりも成功率が高いことが示されている（Ｍａｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，３１：２９４−３０１、Ｊｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７：９１−９２、Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９：６５６−６６０）。好ましい実施形態では、ジンクフィンガーアレイは、国際公開第２０１１／０１７２９３号パンフレットおよび国際公開第２００４／０９９３６６号パンフレットに記載されているか、またはその記載に従って生成される。追加の好適なジンクフィンガーＤＢＤは、米国特許第６，５１１，８０８号明細書、同第６，０１３，４５３号明細書、同第６，００７，９８８号明細書、および同第６，５０３，７１７号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００２／０１６０９４０号明細書に記載されている。
【００５２】
ＤＮＡ
本明細書に記載の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う場合、任意の二本鎖ＤＮＡ、たとえば、任意の細胞から単離されたゲノムＤＮＡ、ＤＮＡの人工的に生成された集団、または任意の他のＤＮＡプールに適用可能である。
【００５３】
シーケンシング
本明細書で用いられる場合、「シーケンシング」とは、核酸の配列を決定する任意の方法を含むものである。本方法では、チェーンターミネーター（Ｓａｎｇｅｒ）シーケンシングおよび染料ターミネーターシーケンシングを含めて、任意のシーケンシング方法を使用可能である。好ましい実施形態では、何千または何百万ものシーケンシング反応を並列して行う高スループットシーケンシング技術である次世代シーケンシング（ＮＧＳ）が使用される。さまざまなＮＧＳプラットフォームでさまざまなアッセイ化学が使用されるが、それらはすべて、多数の鋳型で同時に行われる多数のシーケンシング反応から配列データを生成する。典型的には、配列データはスキャナーを用いて捕集され、次いでアセンブルされ、そしてバイオインフォマティクスで分析される。したがって、シーケンシング反応が行われ、リードがアセンブルされ、そして並列に分析される。たとえば、米国特許第２０１４０１６２８９７号明細書、さらにはＶｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．，５５：６４１−６５８，２００９、およびＭａｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７：２８７−２９６（２００９）を参照されたい。ＮＧＳ法の中には鋳型増幅を必要とするものもあれば、必要としないものもある。増幅を必要とする方法としては、パイロシーケンシング（たとえば、Ｒｏｃｈｅにより商品化されたもので、米国特許第６，２１０，８９号明細書および同第６，２５８，５６８号明細書を参照されたい）、Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム（たとえば、米国特許第６，８３３，２４６号、同第７，１１５，４００号、および同第６，９６９，４８８号を参照されたい）、および支持オリゴヌクレオチドライゲーションおよび検出（ＳＯＬｉＤ）プラットフォーム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、たとえば、米国特許第５，９１２，１４８号明細書および同第６，１３０，０７３号明細書を参照されたい）が挙げられる。単分子シーケンシング法などの増幅を必要としない方法としては、ナノ細孔シーケンシング、ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（米国特許第７，１６９，５６０号明細書、７，２８２，３３７、同第７，４８２，１２０号明細書、同第７，５０１，２４５号明細書、同第６，８１８，３９５号明細書、同第６，９１１，３４５号明細書、および同第７，５０１，２４５号明細書）、リアルタイム合成シーケンシング（たとえば、米国特許第７，３２９，４９２号明細書を参照されたい）、ゼロモード導波路（ＺＭＷ）を用いた単分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）ＤＮＡシーケンシング法、ならびに米国特許第７，１７０，０５０号明細書、同第７，３０２，１４６号明細書、同第７，３１３，３０８号明細書、および同第７，４７６，５０３号明細書に記載のものを含めて他の方法が挙げられる。たとえば、米国特許第２０，１３０，２７４，１４７号明細書、米国特許第２０１４００３８８３１号明細書、Ｍｅｔｚｋｅｒ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １１（１）：３１−４６（２０１０）を参照されたい。
【００５４】
代替的に、ハイブリダイゼーションベースのシーケンス法または他の高スループット法、たとえば、マイクロアレイ分析、ＮＡＮＯＳＴＲＩＮＧ、ＩＬＬＵＭＩＮＡ、または他のシーケンシングプラットフォームも使用可能である。
【００５５】
キット
本明細書にはまた、本明細書に記載の方法に使用するキットも提供される。キットは、次のもの、すなわち、５’シングルテールヘアピンアダプター、３’シングルテールヘアピンアダプター、末端修復およびＡテール付加のための試薬および／または酵素（たとえば、Ｔ４ポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）、および／またはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）、エキソヌクレアーゼ、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）および／またはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼ、たとえば、ＵＳＥＲ（ウラシル特異的除去試薬）酵素混合物（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、精製ｃａｓ９タンパク質、ガイドＲＮＡ（たとえば、対照ｇＲＮＡ）、ｇＤＮＡ鋳型（たとえば、対照ｇＤＮＡ鋳型）、および本明細書に記載の方法の使用説明書の１つ以上を含みうる。
【実施例】
【００５６】
以下の実施例で本発明をさらに説明するが、それらは特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
【００５７】
材料
以下の材料を実施例１〜２で使用した。
【００５８】
【表１】
2018530536.tif 000003
【００５９】
以下のプライマーを実施例１〜２で使用した。
【００６０】
【表２】
2018530536.tif 000004
【００６１】
大文字の配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔｒｕｓｅｑライブラリー調製システムにおけるデュアルインデックスバーコード（サンプルのデマルチプレックス用）である。*はホスホロチオエート結合を表す。
【００６２】
実施例１．  例示的なＦＩＮＤ−Ｓｅｑ法の最適化
本明細書には、対象の任意のゲノムＤＮＡ上にヌクレアーゼにより誘発されるＤＳＢの包括的決定を可能にするｉｎ  ｖｉｔｒｏ法の開発が記載されている。本方法は、ゲノムＤＮＡの剪断により誘発されるランダムＤＳＢよりもヌクレアーゼ誘発ＤＳＢを富化することを可能にする。本方法がどのように機能するかの概要は、図１Ａおよび１Ｂに見いだしうる。簡潔に述べると、対象の細胞型または生物からのゲノムＤＮＡは、規定の平均長さにランダムに剪断される。本実験では、５００ｂｐの平均長さで後続の次世代シーケンシングの工程で十分に機能する。このゲノムＤＮＡのランダム切断末端の末端修復、次いでＡテール付加を行う。次いで、これにより、特定位置に１個のデオキシウリジンヌクレオチドをさらに含有する５’末端次世代シーケンシングプライマー部位を有するヘアピンアダプターのライゲーションが可能になる（図１Ｂ）。このアダプターはまた、本明細書では「５’シングルテールヘアピンアダプター」と呼ばれる。このアダプターのライゲーションの後、次いで、両末端に５’シングルテールヘアピンアダプターがライゲートされていないいずれのＤＮＡ分子も分解する１種以上のエキソヌクレアーゼ（たとえば、バクテリオファージｌａｍｂｄａエキソヌクレアーゼ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥｘｏＩ、ＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅ（商標）ＡＴＰ依存エキソヌクレアーゼ）でサンプルを処理する。次いで、一群の分子を特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体化されたＣａｓ９ヌクレアーゼで処理する。得られたヌクレアーゼ誘発平滑末端にＡテールを付加し、次いで、３’末端次世代シーケンシングプライマー部位を有するかつ特定位置に１個のデオキシウリジンヌクレオチドをさらに含有する第２のヘアピンアダプターをこの末端にライゲートする。このアダプターはまた、本明細書では「３’シングルテールヘアピンアダプター」と呼ばれる。これらの処理の結果として、末端に５’および３’シングルテールヘアピンアダプターがライゲートされたＤＮＡ断片のみが、ヌクレアーゼにより切断されたものとなる。アダプターは任意の順序で添加可能である。デオキシウリジンが存在するすべての箇所でＵＳＥＲ酵素によりＤＮＡにニックを入れる処理を行った後、２つのタイプのアダプターを有する断片のみがシーケンス可能となる。
【００６３】
ペアエンド次世代シーケンシングの後、得られたリードをゲノムにマッピングすることが可能である。ヌクレアーゼ切断の部位は、典型的にはカット部位のヌクレオチド内にあるヌクレアーゼ誘発ＤＳＢの部位に由来する複数の二方向リードを有するであろう（図２Ａおよび２Ｂ）。ヌクレアーゼ誘発切断は、ＤＮＡの物理的ランダム剪断により生じる付着末端とは対照的に「ユニフォーム」末端を生成するので、これらの部位は、それらのシグネチャーユニフォームリードアライメントにより単純にバイオインフォマティクスで同定可能である。
【００６４】
この方法の初期非最適化バージョンを用いて、４つの異なるｇＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼにより誘発されたオフターゲット部位はうまく同定された。標的部位を表１に列挙する。
【００６５】
【表３】
2018530536.tif 000005
【００６６】
ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ検出部位の大多数が本方法でも検出されたので、表２の結果から本アッセイに期待がもてた。最初の試験で２．５〜３Ｍリードを用いて方法間で部位の５８〜７７％がオーバーラップした。切断部位で約２０，０００倍に富化したと推定された。
【００６７】
【表４】
2018530536.tif 000006
【００６８】
本方法の最適化の臨界パラメーターは、最初の５’シングルテールヘアピンアダプターのライゲーション後の線状ＤＮＡ断片の分解の効率であった。理論により拘束することを望むものではないが、実際には、ゲノム全体を通じてマッピングされた「バックグラウンド」リードのほとんどは、この工程での非ライゲートＤＮＡの不完全消化に起因しうるので、その残った末端に後続の３’シングルテールヘアピンアダプターがライゲートする可能性がある。
【００６９】
したがって、最適な処理方法を見いだすために、さまざまな種類および数のエキソヌクレアーゼならびにさまざまなインキュベーション時間を試験することにより、本方法をさらに最適化した。図３Ａ〜３Ｄに見られるように、３つの処理、すなわち、１時間のＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅ処理、２回の逐次的な１時間のＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅ処理、および１時間のｌａｍｂｄａエキソヌクレアーゼ処理の次に１時間のＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅ処理では、一貫して最大のリード数および部位数が得られ、さらに、同一のｇＲＮＡを用いた対応するＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験により同定されたオフターゲット部位の１００％が見いだされた。
【００７０】
最適化エキソヌクレアーゼ処理を用いて、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびＶＥＧＦＡ部位１を標的とするｇＲＮＡにより、本方法を再度行った。この実験では多くのオフターゲット部位が得られた。ＶＥＧＦＡ部位１  ｇＲＮＡを用いて行った各種実験を組み合わせると、多くのオフターゲット部位が得られる。以前、これと同一のＶＥＧＦＡ部位１  ｇＲＮＡを用いてＧＵＩＤＥ−ｓｅｑを行ったところ、一連のゲノムワイドなオフターゲット部位が同定された。重要なこととして、最適化エキソヌクレアーゼ処理を用いて行った本ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法では、試験したｇＲＮＡに対してＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによりすでに同定されたオフターゲット部位のすべてが見いだされ、これまで知られていなかった非常に多くの追加のオフターゲット部位も見いだされた（図４）。こうした新しい方法は、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑと同じくらい高感度だが、以前の方法では見いだされない部位を同定する能力を示すことが、この結果から実証される。この理由としては、本ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法の感度がより高いこと、細胞内でＧＵＩＤＥ−ｓｅｑを行った場合のある特定のオフターゲット突然変異に対する生物学的選択性が陰性であること、ならびに／または細胞内のヌクレアーゼの活性に及ぼすクロマチン、ＤＮＡメチル化、および遺伝子発現の影響がマイナスであることが挙げられる。
【００７１】
実施例２．  例示的なＦＩＮＤ−Ｓｅｑプロトコル
【００７２】
【表５】
2018530536.tif 000007
【００７３】
【表６】
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【００７４】
【表７】
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【００７５】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と組み合わせて説明してきたが、以上の説明は例示することを意図したものであって、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことを理解すべきである。他の態様、利点、および変更は以下の特許請求の範囲内にある。
【図１Ａ】
2018530536.tif 000010
【図１Ｂ】
2018530536.tif 000011
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2018530536.tif 000015
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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