(57)【要約】  外科用留め具および該留め具に固定化された複数のフィブリノーゲン結合ペプチドを含む止血装置。外科用留め具は縫合糸であってよい。装置は、外科手術中の、縫合孔の出血などの出血を防ぐまたは減らし得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
外科用留め具および前記留め具に固定化された複数のフィブリノーゲン結合ペプチドを含む止血装置。
【請求項２】
前記複数のフィブリノーゲン結合ペプチドが、前記留め具に非共有結合で固定化される、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
複数の担体が前記留め具に固定化され、複数のフィブリノーゲン結合ペプチドがそれぞれの担体に固定化される、請求項１または請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記複数のフィブリノーゲン結合ペプチドが、それぞれの担体に共有結合で固定化される、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
それぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドが、非ペプチドスペーサーにより前記担体に共有結合で固定化される、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記非ペプチドスペーサーが、親水性ポリマーを含む、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記親水性ポリマーが、ポリエチレングリコールを含む、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記担体が、可溶性担体である、請求項３〜７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項９】
前記留め具が、吸収性材料から製造される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１０】
前記留め具が、ポリグラクチン、ポリグレカプロン、ポリジオキサノン、動物の腸または酸化セルロースを含む、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記留め具が、非吸収性材料から製造される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１２】
前記留め具がポリプロピレン、ポリエステル、ナイロン、絹または鋼を含み、好ましくは前記留め具がポリプロピレンを含む、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記複数のフィブリノーゲン結合ペプチドが、前記留め具に共有結合で固定化される、請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
前記留め具が、酸化セルロースを含む、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
それぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドが、配列Ｇｌｙ−（Ｐｒｏ、Ｈｉｓ）−Ａｒｇ−Ｘａａ（配列番号１）を含み、Ｘａａは任意のアミノ酸であり、Ｐｒｏ／Ｈｉｓはプロリンまたはヒスチジンがその位置に存在することを意味する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１６】
それぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドが、そのアミノ末端に配列ＮＨ２−Ｇｌｙ−（Ｐｒｏ、Ｈｉｓ）−Ａｒｇ−Ｘａａ（配列番号１）を含み、Ｘａａは任意のアミノ酸であり、Ｐｒｏ／Ｈｉｓはプロリンまたはヒスチジンがその位置に存在することを意味する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１７】
前記フィブリノーゲン結合ペプチドが、それぞれ４〜６０個のアミノ酸残基の長さである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１８】
前記留め具が、縫合糸である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１９】
外科用留め具および、前記留め具に固定化するための複数のフィブリノーゲン結合ペプチドを別々に含む、止血装置を形成するためのキット。
【請求項２０】
前記装置を前記患者に適用する前に、前記フィブリノーゲン結合ペプチドを前記留め具に適用して前記装置を形成するための説明書をさらに含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
止血装置を患者に適用することを含む組織を接合する方法であって、前記装置が請求項１〜１８のいずれか１項で定義される通りである方法。
【請求項２２】
複数のフィブリノーゲン結合ペプチドを外科用留め具に固定化することを含む、止血装置を製造する方法。
【請求項２３】
前記複数のフィブリノーゲン結合ペプチドが、止血剤を前記留め具に非共有結合で固定化することにより前記留め具に固定化され、前記止血剤が複数の担体を含み、それぞれの担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合ペプチドが存在する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記止血剤の溶液を前記留め具に接触させること、および乾燥することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
熱グラフト化により、前記止血剤を前記留め具に固定化することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
フィブリノーゲン結合ペプチドを前記留め具に共有結合で固定化することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記添付図面に基づいて、実質的に上記で記載されている通りの止血装置。
【請求項２８】
前記添付図面に基づいて、実質的に上記で記載されている通りの止血装置の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、止血縫合糸などの止血装置、キットおよび該装置を製造する方法、ならびに手術中の出血を防止するまたは減らすための該装置の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
縫合糸は通常、細い繊維または糸から形成され、外科手術で創傷を閉じて、組織を接合するために使用される、それらはまた、創傷包帯材または貼付剤などの材料を患者に取り付けるためにも使用し得る。縫合糸を使って組織を一緒に接合し、外科的縫合を形成するプロセスは、多くの場合、スティッチングと呼ばれる。スティッチングは通常、縫合糸を取り付けた針を患者の組織に押し込み、その後、創傷の端部間で糸を引っ張ることを含む。後続の糸は、縛って結び目を作り、糸を所定位置で固定することができる。
【０００３】
縫合孔の出血は、血管手術でよく発生する合併症であり、縫合糸より大きな針により形成された孔から生じ得る。これは、縫合糸が貼付剤または包帯材と共に使用され、その材料が縫合糸のまわりの孔を充分に閉塞することができない場合に起こり得る。
【０００４】
縫合孔の出血は、縫合糸の代わりに、または縫合糸と組み合わせて組織接着剤を使用することにより減らし得る。しかし、縫合糸の代わりとしての組織接着剤の使用は、必ずしも可能とは限らない。理由は、例えば、それらが組織を一緒に接合するのに十分強力な接着力を与えない場合があるためである。さらに、手術中に縫合糸と組織接着剤の両方を適用することは、不便で、やっかいな場合がある。さらに、組織接着剤は、特定の種類の創傷には適さないことがある。縫合孔の出血は、止血剤または密封材で処置できるが、このためには追加の時間とコストを要し、また、多くのこのような製品は、血液由来の材料から製造されるので、患者を汚染にさらす可能性がある。縫合孔の出血を防ぐまたは減らすためのより効果的な解決策が望まれている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明では、外科用留め具およびその留め具に固定化された複数のフィブリノーゲン結合ペプチドを含む止血装置が提供される。
【０００６】
本明細書で使用される場合、「外科用留め具」という用語は、組織を穿孔または穿刺することにより適用される、機械的に組織を連結するための手段または媒介物を意味する。外科用留め具の例には、縫合糸、ステープルおよびピンが含まれる。
【０００７】
好ましい実施形態では、止血装置は縫合糸を含み、フィブリノーゲン結合ペプチドがその縫合糸に固定化されている。
【０００８】
したがって、装置は縫合孔などの装置の適用中に生成した孔中で凝固を促進し得る。それにより、縫合孔の出血を減らすか、または防止し得る。
【０００９】
本発明の止血装置は、外来性トロンビンの作用に依存しない。フィブリノーゲン結合ペプチドは合成的に作製でき、したがって、抗原性は最小限であり、ウイルス伝染のリスクを伴わず、哺乳動物細胞株で発現される組換えタンパク質より安価に作製でき、また、室温で長期間貯蔵し得る。
【００１０】
好都合にも、本発明の止血装置は、別途の組織密封材を必要とすることなく出血を防ぐまたは減らし得る。これは、本発明の止血装置が、患者への適用の前に、固定化されたフィブリノーゲン結合ペプチドを含んでいるためである。したがって、止血装置は、予め形成されていると称しても良い。これは、外科用留め具が組織を接合するために患者に適用された後に、接合組織上に組織密封材が適用されるのと対照的である。したがって、本発明は、患者への適用に好適であるが、まだ適用されていない止血装置を包含する。止血装置は、患者に適用する前に、組織密封材を留め具に適用する初期ステップが必要ないので、止血装置はすぐに使える。
【００１１】
好ましくは、止血装置は無菌である。止血装置は、熱、蒸気、エチレンオキシドの適用により、または照射により、好ましくはγ線への暴露により、無菌化され得る。装置は、好ましくは無菌梱包材料で、包装し得る。
【００１２】
留め具は、吸収性材料を含んでもよい。吸収性材料の例には、ポリグラクチン、ポリグレカプロン、ポリジオキサノン、動物の腸および酸化セルロースが挙げられる。あるいは、留め具は、非吸収性材料を含んでもよい。非吸収性材料の例には、ポリプロピレン、ポリエステル、ナイロン、絹または鋼が挙げられる。特定の好ましい実施形態では、留め具はポリプロピレンを含む。
【００１３】
留め具が縫合糸である場合には、縫合糸は０．０１ｍｍ〜１ｍｍの直径を有してよい。縫合糸は、編物であっても、またはモノフィラメントであってもよい。
【００１４】
止血装置は、フィブリノーゲン結合ペプチドのフィルムまたはコーティングを含んでもよい。好ましくは、留め具は、その長さの大部分に沿って、固定化されたフィブリノーゲン結合ペプチドでコートされる。最も好ましくは、留め具は、実質的にその全体長さに沿って、固定化されたフィブリノーゲン結合ペプチドでコートされる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、複数のフィブリノーゲン結合ペプチドは留め具に非共有結合で固定化される。例えば、フィブリノーゲン結合ペプチドは、留め具に接着または吸着されてもよい。これは、留め具に止血剤を固定化することにより達成され得る。
【００１６】
止血剤は、複数の担体およびそれぞれの担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合ペプチドを含んでよい。
【００１７】
好ましい実施形態では、担体は可溶性担体である。例えば、担体は血漿中に可溶性であってよい。担体は出血創傷部位への投与に好適する必要がある。担体は、ポリマー、例えば、タンパク質、ポリサッカライド、もしくはポリエチレングリコールなどの合成生体適合性ポリマー、またはこれらの内のいずれかの組み合わせを含んでよい。アルブミンは好ましいタンパク質担体である。可溶性担体または止血剤は、少なくとも１ｍｌの溶媒あたり１０ｍｇの溶解度、例えば、１０〜１０００ｍｇ／ｍｌ、３３〜１０００ｍｇ／ｍｌ、または３３〜１００ｍｇ／ｍｌの溶解度を有し得る。
【００１８】
好ましい実施形態では、フィブリノーゲン結合ペプチドは共有結合で担体に固定化される。
【００１９】
担体は、フィブリノーゲン結合ペプチドの結合を可能とする反応性基を含んでよい。例えば、担体は、その表面にチオール部分またはアミン部分を含んでよい。担体がタンパク質性である場合は、チオールまたはアミン部分はアミノ酸、例えば、システインまたはリシンの側鎖により提供され得る。あるいは、反応性基を担体に付加してもよい。担体がアルブミンなどのタンパク質から形成される場合は、これは特に有利である。例えば、担体は、担体上の一級アミン基と反応できる２−イミノチオラン（２−ＩＴ）などの試薬を用いてチオール化され得る。あるいは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の存在下でシスタミンを担体上のカルボキシル基に結合させ、その後、導入されたジスルフィド結合の還元開裂を行ってもよい。
【００２０】
好ましい実施形態では、フィブリノーゲン結合ペプチドはスペーサーを介して担体に共有結合で固定化される。好ましいスペーサーは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性ポリマーを含む非ペプチドスペーサーである。好ましい実施形態では、ＰＥＧスペーサーによってチオール反応性基（例えば、マレイミド基）に結合したフィブリノーゲン結合ペプチドをそれぞれ含む複数のペプチド複合体が、チオール化担体（例えば、２−ＩＴまたはシスタミンを使って上述のように調製された）と反応する。好適な非ペプチドスペーサーは、国際公開第２０１３／１１４１３２号に記載されている。
【００２１】
止血剤はペプチド複合体を含んでよい。したがって、好適な担体は、１個または複数のアミノ酸残基、例えば、リシンアミノ酸残基などの単一アミノ酸残基を含み得る。１個または複数のアミノ酸残基を含む担体を含む複合体の利点は、それらが固相ペプチド合成法を使って容易に作成できることである。さらに、免疫原性薬剤を使用せずにそれらは容易に作製し得、また、滅菌放射線に対し耐え得る。
【００２２】
ペプチド複合体のそれぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドは、独立に、カルボキシ末端で（必要に応じてリンカーを介して）、またはアミノ末端で（必要に応じてリンカーを介して）担体に結合し得る。
【００２３】
一例では、ペプチド複合体は下記の一般式を有し得る：
ＦＢＰ−（リンカー）−Ｘ−（リンカー）−ＦＢＰ
式中、
ＦＢＰは、フィブリノーゲン結合ペプチドであり；
−（リンカー）−は、任意のリンカー、好ましくは非ペプチドリンカーであり；
Ｘは、アミノ酸、好ましくは多官能性アミノ酸、最も好ましくは三官能性アミノ酸残基、例えば、リシン、オルニチン、またはアルギニンである。
【００２４】
ペプチド複合体はデンドリマーであってよい。デンドリマーは分岐コアおよび分岐コアに別々に共有結合した複数のフィブリノーゲン結合ペプチドを含み得る。分岐コアは、１個または複数の多官能性アミノ酸を含み得る。それぞれの多官能性アミノ酸、または複数の多官能性アミノ酸は、それに共有結合した１個または複数のフィブリノーゲン結合ペプチドを有し得る。
【００２５】
分岐コアは、ｉ）２〜１０個の多官能性アミノ酸残基であって、それぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドが別々に分岐コアの多官能性アミノ酸残基に共有結合している多官能性アミノ酸残基；ｉｉ）複数の多官能性アミノ酸残基であって、１個または複数のフィブリノーゲン結合ペプチドがそれぞれ別々に分岐コアの少なくとも２個の隣接する多官能性アミノ酸残基に共有結合する多官能性アミノ酸残基；ｉｉｉ）複数の多官能性アミノ酸残基であって、２個以上のフィブリノーゲン結合ペプチドが別々に分岐コアの少なくとも１個の多官能性アミノ酸残基に共有結合する多官能性アミノ酸残基；ｉｖ）複数の多官能性アミノ酸残基であって、２個以上の多官能性アミノ酸残基が隣接する多官能性アミノ酸残基の側鎖を介して共有結合で連結する多官能性アミノ酸残基；またはｖ）単一の多官能性アミノ酸残基であって、フィブリノーゲン結合ペプチドが別々に多官能性アミノ酸残基のそれぞれの官能基に共有結合する多官能性アミノ酸残基、を含み得る。
【００２６】
多官能性アミノ酸残基は、三もしくは四官能性アミノ酸残基、または三および四官能性アミノ酸残基であってよく、あるいは単一の多官能性アミノ酸残基は、三もしくは四官能性アミノ酸残基である。
【００２７】
それぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドは、異なる分岐コアとの結合点を有してよく、したがって、フィブリノーゲン結合ペプチドは、本明細書では分岐コアに「別々に共有結合される」と呼ばれる。
【００２８】
分岐コアは任意の好適なアミノ酸配列を含む。分岐コアは、１０個までの多官能性アミノ酸残基、例えば、２〜１０個、または２〜６個の多官能性アミノ酸残基を含み得る。
【００２９】
分岐コアは、複数の連続した多官能性アミノ酸残基を含み得る。分岐コアは、１０個までの連続した多官能性アミノ酸残基を含み得る。
【００３０】
本明細書で使われる場合、用語の「三官能性アミノ酸」は、アミン（−ＮＨ２）である第１の官能基、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）である第２の官能基、および第３の官能基を有する任意の有機化合物を意味する。本明細書で使われる場合、用語の「四官能性アミノ酸」は、アミン（−ＮＨ２）である第１の官能基、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）である第２の官能基、第３の官能基、および第４の官能基を有する任意の有機化合物を意味する。第３および第４の官能基は、フィブリノーゲン結合ペプチドのカルボキシ末端と反応できる任意の官能基、またはフィブリノーゲン結合ペプチドのカルボキシ末端に結合したリンカーの官能基と反応できる任意の官能基であってよい。
【００３１】
多官能性アミノ酸は、アミノ基、カルボキシル基、およびさらなる官能基（それにより、三官能性アミノ酸を提供する）、またはさらなる２個の官能基（それにより、四官能アミノ酸を提供する）を有する側鎖を有する中心炭素原子（α−または２−）を含み得る。
【００３２】
その、またはそれぞれの多官能性アミノ酸残基は、タンパク質を構成するまたは非蛋白質構成多官能性アミノ酸の残基、または天然のまたは非天然の多官能性アミノ酸の残基であってよい。
【００３３】
タンパク質を構成する三官能性アミノ酸は、アミノ基、カルボキシル基、側鎖およびα−水素左旋性配座を有する中心炭素原子（α−または２−）を有する。好適な三官能性タンパク質を構成するアミノ酸の例には、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、およびＬ−システインが挙げられる。
【００３４】
好適な三官能性の非蛋白質構成アミノ酸残基の例には、Ｄ−リシン、ベータリシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−オルニチン、およびＤ−アルギニン残基が挙げられる。
【００３５】
したがって、本発明のペプチドデンドリマーのための使用に好適な三官能性アミノ酸残基の例には、リシン、オルニチン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、およびシステイン残基、例えば、Ｌ−リシン、Ｄ−リシン、ベータリシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｄ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｄ−グルタミン、Ｌ−システイン、およびＤ−システイン残基が挙げられる。
【００３６】
本発明のペプチドデンドリマーに使用するために好適な多官能性非天然アミノ酸の例には、シトルリン、２，４−ジアミノイソ酪酸、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、およびシス−４−アミノ−Ｌ−プロリンが挙げられる。多官能性非天然アミノ酸は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手できる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、分岐コアは、２〜１０個、または２〜６個の、連続したリシン、アルギニン、またはオルニチン残基を含む分岐コアなどの、ホモポリマー多官能性アミノ酸配列、例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、またはポリオルニチン配列を含んでよい。他の実施形態では、分岐コアは、異なる多官能性アミノ酸残基、例えば、１個または複数のリジン残基、１個または複数のアルギニン残基、および／または１個または複数のオルニチン残基を含んでよい。
【００３８】
他の実施形態では、分岐コアは、複数の多官能性アミノ酸残基、および１個または複数のその他のアミノ酸残基を含んでよい。
【００３９】
分岐コアが複数の多官能性アミノ酸残基を含む場合は、隣接する多官能性アミノ酸残基はアミノ酸側鎖連結により、ペプチド結合により一緒に連結され得、またはいくつかの隣接する多官能性アミノ酸残基は側鎖連結によりおよびその他の残基はペプチド結合により一緒に連結され得る。
【００４０】
さらなる実施形態では、分岐コアは２個以上の多官能性アミノ酸残基を含んでよく、少なくとも１個のフィブリノーゲン結合ペプチドは、２個以上の多官能性アミノ酸残基のそれぞれに別々に結合し、また、２個以上のフィブリノーゲン結合ペプチドは、分岐コアの少なくとも１個の多官能性アミノ酸残基に別々に結合する。
【００４１】
その他の実施形態では、２個のフィブリノーゲン結合ペプチドは、分岐コアの末端多官能性アミノ酸残基に別々に結合する。
ペプチドデンドリマーの構造の例には、下記のペプチドデンドリマーが含まれる：
・分岐コアは、２個のフィブリノーゲン結合ペプチドが結合している第１の三官能性アミノ酸残基、および１個のフィブリノーゲン結合ペプチドが結合している第２の三官能性アミノ酸残基を含む；
・分岐コアは、２個のフィブリノーゲン結合ペプチドが結合している第１の三官能性アミノ酸残基、および２個のフィブリノーゲン結合ペプチドが結合している第２の三官能性アミノ酸残基を含む；
・分岐コアは、２個のフィブリノーゲン結合ペプチドが結合している第１の三官能性アミノ酸残基、１個のフィブリノーゲン結合ペプチドが結合している第２の三官能性アミノ酸残基、および１個のフィブリノーゲン結合ペプチドが結合している第３の三官能性アミノ酸残基を含む；または
・分岐コアは、２個のフィブリノーゲン結合ペプチドが結合している第１の三官能性アミノ酸残基、１個のフィブリノーゲン結合ペプチドが結合している第２の三官能性アミノ酸残基、１個のフィブリノーゲン結合ペプチドが結合している第３の三官能性アミノ酸残基、および１個のフィブリノーゲン結合ペプチドが結合している第４の三官能性アミノ酸残基を含む。
【００４２】
ペプチドデンドリマーは、下記の一般式（Ｉ）を含み得る：
【化１】
2018516648.tif 000002
式中、
ＦＢＰは、フィブリノーゲン結合ペプチドであり；
−（リンカー）−は、任意のリンカー、好ましくは非ペプチドリンカーであり；
Ｘは、三官能性アミノ酸残基、好ましくは、リシン、オルニチン、またはアルギニンであり；
Ｙは、−ＦＢＰ、または−ＮＨ２であり；
Ｚは、Ｙが−ＦＢＰの場合、−（リンカー）−ＦＢＰであり、またはＹが−ＮＨ２の場合、−［−Ｘｎ−（リンカー）−ＦＢＰ］ａ−（リンカー）−ＦＢＰであり；
式中、
Ｘｎは、三官能性アミノ酸残基、好ましくは、リシン、Ｌ−オルニチン、またはアルギニンであり；および
ａは１〜１０、好ましくは１〜３である。
【００４３】
例えば、ＹがＮＨ２、Ｚが−［−Ｘｎ−（リンカー）−ＦＢＰ］ａ−（リンカー）−ＦＢＰである場合、デンドリマーの構造は以下の通りである：
ａが１の場合：
【化２】
2018516648.tif 000003
または、ａが２の場合：
【化３】
2018516648.tif 000004
または、ａが３の場合：
【化４】
2018516648.tif 000005
【００４４】
あるいは、Ｙが−ＦＢＰの場合、Ｚは、−［−Ｘｎ−（リンカー）−ＦＢＰ］ａ−（リンカー）−ＦＢＰであり；
式中、
Ｘｎは、三官能性アミノ酸残基、好ましくは、リシン、Ｌ−オルニチン、またはアルギニンであり；および
ａは１〜１０、好ましくは１〜３である。
【００４５】
例えば、Ｙが−ＦＢＰ、Ｚが−［−Ｘｎ−（リンカー）−ＦＢＰ］ａ−（リンカー）−ＦＢＰで、ａが１である場合、デンドリマーの構造は以下の通りである：
【化５】
2018516648.tif 000006
【００４６】
ペプチドデンドリマーは、下記の一般式（ＩＩ）を含み得る：
【化６】
2018516648.tif 000007
式中、
ＦＢＰは、フィブリノーゲン結合ペプチドであり；
−（リンカー）−は、任意のリンカー、好ましくは−ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ−を含み；
Ｙは、−ＦＢＰ、または−ＮＨ２であり；
Ｚは：
Ｙが−ＦＢＰの場合、
−Ｒ−（リンカー）−ＦＢＰ
であり、または
Ｙが−ＮＨ２の場合、
【化７】
2018516648.tif 000008
であり；または
Ｙが−ＮＨ２の場合、
【化８】
2018516648.tif 000009
であり；または
Ｙが−ＮＨ２の場合、
【化９】
2018516648.tif 000010
であり；
式中、Ｒは、−（ＣＨ２）４ＮＨ−、−（ＣＨ２）３ＮＨ−、または−（ＣＨ２）３ＮＨＣＮＨＮＨ−である。
【００４７】
したがって、一実施形態では、Ｚは：
Ｙが−ＮＨ２の場合、
【化１０】
2018516648.tif 000011
であってよく；
式中、Ｒは、−（ＣＨ２）４ＮＨ−、−（ＣＨ２）３ＮＨ−、または−（ＣＨ２）３ＮＨＣＮＨＮＨ−であり；
ａは１〜３である。
あるいは、ａは４〜１０であってよく、または１〜１０であってよい。
【００４８】
別の実施形態では、Ｚは：
Ｙが−ＦＢＰの場合、
【化１１】
2018516648.tif 000012
であり、
式中、Ｒは、−（ＣＨ２）４ＮＨ−、−（ＣＨ２）３ＮＨ−、または−（ＣＨ２）３ＮＨＣＮＨＮＨ−であり；
式中、ａは１〜１０、好ましくは１〜３である。
【００４９】
例えば、Ｚは：
Ｙが−ＦＢＰで、ａが１の場合、
【化１２】
2018516648.tif 000013
である。
【００５０】
ペプチドデンドリマーは、下記の一般式（ＩＩＩ）を含み得る：
【化１３】
2018516648.tif 000014
式中、
ＦＢＰは、フィブリノーゲン結合ペプチドであり；
−（リンカー）−は、任意のリンカー、好ましくは−ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ−を含み；
Ｙは、−ＦＢＰ、または−ＮＨ２であり；
Ｚは：
Ｙが−ＦＢＰの場合、
−（ＣＨ２）４ＮＨ−（リンカー）−ＦＢＰ
であり；または
Ｙが−ＮＨ２の場合、
【化１４】
2018516648.tif 000015
であり；または
Ｙが−ＮＨ２の場合、
【化１５】
2018516648.tif 000016
であり；または
Ｙが−ＮＨ２の場合、
【化１６】
2018516648.tif 000017
2018516648.tif 000018
である。
【００５１】
したがって、一実施形態では、Ｚは：
Ｙが−ＮＨ２の場合、
【化１７】
2018516648.tif 000019
であってよく；
ａは１〜３である。
あるいは、ａは４〜１０であり、または１〜１０であってよい。
【００５２】
別の実施形態では、Ｚは：
Ｙが−ＦＢＰの場合、
【化１８】
2018516648.tif 000020
であり；
式中、ａは１〜１０、好ましくは１〜３である。
【００５３】
例えば、Ｚは：
Ｙが−ＦＢＰで、ａが１の場合、
【化１９】
2018516648.tif 000021
である。
【００５４】
１個または複数の、またはそれぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドは非ペプチドリンカーにより共有結合され得る。リンカーは、フィブリノーゲンのフィブリノーゲン結合ペプチドへの結合と干渉しない任意の好適なリンカーであってよい。リンカーは可撓性の直鎖リンカー、適宜に直鎖アルキル基を含んでよい。したがって、このようなリンカーは、ペプチドデンドリマーのフィブリノーゲン結合ペプチドが相互に離れて伸長するのを可能にする。例えば、リンカーは、−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ−基を含んでもよく、式中、ｎは任意の数値、適宜に１〜１０、例えば、５である。−ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ−基を含むリンカーは、ε−アミノ酸  ６−アミノヘキサン酸（εＡｈｘ）の使用により形成し得る。
【００５５】
ペプチドデンドリマーなどの特定のペプチド複合体の利点は、例えば、照射、適切にガンマ線照射に暴露することにより、ペプチドデンドリマー、または組成物のフィブリノーゲンと重合する能力を大きく失うことなく、容易に無菌化できることである。
【００５６】
本発明では、止血装置を無菌化する方法が提供され、該方法は、装置を、好ましくは３０ｋＧｙまでのガンマ線照射に暴露することを含み、止血装置は外科用留め具および留め具に固定化された複数のフィブリノーゲン結合ペプチドを含む。好ましくはフィブリノーゲン結合ペプチドは、ペプチドデンドリマーなどのペプチド複合体により提供される。
【００５７】
理論上は、担体当たりのフィブリノーゲン結合ペプチドの数に制限はない。しかし、実際には、任意の特定の構造に対し、フィブリノーゲン結合ペプチドの数を変え、所望のフィブリノーゲン重合特性、例えば、フィブリノーゲン重合速度のための、またはフィブリノーゲンとの重合により作製されたヒドロゲルの密度のための、最適数を決定するために試験することができる。最適数は、多くの因子、例えば、担体の性質、およびそれぞれの担体上のフィブリノーゲン結合ペプチドに結合するための反応性基の数に依存し得る。しかし、平均で担体分子当たり１００個までのフィブリノーゲン結合ペプチドが存在することが好ましい。平均で担体分子当たり少なくとも３個の、好ましくは少なくとも５個のフィブリノーゲン結合ペプチドが存在することが好ましい。好ましい範囲は、担体分子当たり、１０〜２０個のフィブリノーゲン結合ペプチドである。ペプチドデンドリマーなどのペプチド複合体は、デンドリマー当たり、合計で２０個までのフィブリノーゲン結合ペプチド、例えば、デンドリマー当たり１０個までのフィブリノーゲン結合ペプチド、またはデンドリマー当たり５個までのフィブリノーゲン結合ペプチドを含んでよい。
【００５８】
止血剤は、留め具を止血剤の溶液または懸濁液と接触させ、乾燥させることにより留め具に固定化され得る。このようなプロセスの例は、実施例１および２に例示されている。
【００５９】
あるいは、止血剤は、熱固定化または熱グラフト化により留め具に固定化され得る。このようなプロセスの例は、実施例３に記載されている。
【００６０】
Ｔｓｅｎｇ  Ｙ．，Ｍｕｌｌｉｎｓ  Ｗ．ａｎｄ  Ｐａｒｋ  Ｋ．；Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ；１９９３；１４；ｐ３９２−４００には、血栓形成タンパク質の表面への吸着を抑制する目的ならびに血小板粘着および活性化を減らす目的で、アルブミンをポリプロピレンに熱グラフト化するためのプロセスが記載されている。アルブミンは、４−アジド−２−ニトロフェニルアルブミン（ＡＮＰ−アルブミン）のアジド基の熱分解により、ポリプロピレン（ＰＰ）フィルム上にグラフト化された。ＰＰフィルムに、５ｍｇ／ｍｌ以上の濃度でＡＮＰ−アルブミンを吸着させて、１００℃で５時間より長時間インキュベートした。アルブミンはこのプロセスにより変性されたが、血小板粘着および活性化は減少した。
【００６１】
意外にも、出願者は、縫合糸と接触させている間に止血剤の溶液を加熱することにより、止血縫合糸がフィブリノーゲンに接触する際に凝血塊を形成することができる止血縫合糸が得られることを見出した。
【００６２】
したがって、本発明は、フィブリノーゲン結合ペプチドを基材に固定化する方法を提供し得、該方法は、基材をフィブリノーゲン結合ペプチドを含む溶液または懸濁液と接触させること；および４０℃以上、５０℃以上、６０℃以上、７０℃以上、８０℃以上、９０℃以上の温度に加熱すること、を含む。好ましくは温度は、１００℃以下である。あるいは、好ましくは温度は、１２０℃以下である。加熱は、最大２４時間まで行われてもよい。フィブリノーゲン結合ペプチドは、上記種々の形態で記載の止血剤により提供し得る。基材は外科用留め具であるのが好ましい。好ましい実施形態では、基材はポリプロピレンから製造される、またはポリプロピレンを含む。
【００６３】
好ましい実施形態では、複数のフィブリノーゲン結合ペプチドが留め具に共有結合で固定化される。フィブリノーゲン結合ペプチドは、ペーサーを介して留め具に共有結合で固定化され得る。スペーサーは、１個または複数のアミノ酸残基を含むペプチドスペーサーを含んでよい。例えば、スペーサーは、１個または複数のグリシン残基を含んでよい。あるいは、スペーサーは、６−アミノヘキサン酸またはβ−アラニンを含んでよい。
【００６４】
担体材料は、フィブリノーゲン結合ペプチドの共有結合を可能とする反応性基を含んでよい。例えば、材料は、その表面にチオール部分またはアミン部分を含んでよい。材料がタンパク質性である場合は、チオールまたはアミン部分はアミノ酸、例えば、システインまたはリシンの側鎖により提供され得る。あるいは、反応性基を留め具材料に付加してもよい。
【００６５】
フィブリノーゲン結合ペプチドが留め具に共有結合で固定化される場合、好ましい材料は、酸化再生セルロースなどの酸化セルロースである。フィブリノーゲン結合ペプチドを酸化セルロースに共有結合させる方法の例は、下記実施例４に記載されている。このような方法は、表面上に遊離カルボキシル基を有する全ての留め具材料に対し使用できるであろう。
【００６６】
あるいは、本明細書で記載の止血剤は、外科用留め具に共有結合で固定化され得る。いくつかの実施形態では、止血剤の担体は、その担体に共有結合で固定化され得る。例えば、留め具に共有結合で固定化されたペプチド複合体またはペプチドデンドリマーを有する外科用留め具を含む止血装置を提供し得る。
【００６７】
本明細書で使用される場合、用語の「ペプチド」は、ペプチド類似体も包含する。いくつかのペプチド類似体は当業者に既知である。フィブリノーゲンがフィブリノーゲン結合ペプチドに結合できる限りにおいて、任意の好適な類似体を使ってよい。
【００６８】
好適なフィブリノーゲン結合ペプチドの例およびそれらを特定し得る方法は、国際公開第２００５／０３５００２号、同第２００７／０１５１０７号、および同第２００８／０６５３８８号で提供されている。
【００６９】
好ましくは、フィブリノーゲン結合ペプチドは、それぞれ４〜６０個、好ましくは４〜３０個、より好ましくは４〜１０個のアミノ酸残基の長さである。他の実施形態では、それぞれのペプチドは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸残基の長さであってよい。それぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドが６０個のアミノ酸残基の長さ以下、より好ましくは３０個のアミノ酸残基の長さ以下であるのが好ましい。
【００７０】
それぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドが合成ペプチドであるのが好ましい。
【００７１】
好ましくは、それぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドは、１０−９〜１０−６Ｍ、例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、またはそれを超えるｎＭの解離定数（ＫＤ）でフィブリノーゲンに結合する。約１００ｎＭのＫＤが好ましい。解離定数は平衡時に測定できる。例えば、既知の濃度の放射標識フィブリノーゲンをフィブリノーゲン結合部分が架橋結合しているマイクロスフェアとインキュベートできる。通常、５μＭのペプチドが１ｇｍのマイクロスフェアに架橋結合する、または１５〜４０μモルのペプチドが１ｇｍのマイクロスフェアに架橋結合する。ペプチド結合マイクロスフェアは、０．５ｍｇ／ｍｌに希釈され、ｐＨ７．４の等張性緩衝液（例えば、０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍヘペス緩衝液）中で、０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌの濃度の放射標識フィブリノーゲンと共に２０℃で１時間までインキュベートされる。マイクロスフェア上のフィブリノーゲン結合部分に結合したフィブリノーゲンは、遠心分離により遊離フィブリノーゲンから分離でき、遊離および結合フィブリノーゲンの量が測定される。次に、結合：遊離フィブリノーゲンの濃度の比率に対し、結合フィブリノーゲンの濃度をプロットすることにより、スキャチャード解析で解離定数が計算でき、曲線の傾斜がＫＤを表す。
【００７２】
フィブリノーゲンの分子は、ジスルフィド結合で一緒に連結された非同一ポリペプチド鎖、Ａα、Ｂβおよびγの３種の対から構成される。フィブリノーゲン鎖は、３つの別々の構造領域、１つの中央Ｅ領域に結合した２つの遠位のＤ領域に折り畳まれる。それぞれのＤ領域は、γおよびＢβ鎖のＣ末端中に位置する重合「ａ」および「ｂ」ホールをそれぞれ含む。トロンビンは、それぞれ、２つの重合部位：アミノ末端配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−を有する「ノブＡ」；およびアミノ末端配列Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−を有する「ノブＢ」を露出している、中心Ｅ領域中のフィブリノーゲンのＡαおよびＢβ鎖のアミノ末端からの、短ペプチド、フィブリノペプチドＡ（ＦｐＡ）およびＢ（ＦｐＢ）の除去を触媒する。新しく露出された１個のフィブリンモノマーの重合ノブは、「Ａ−ａ」および「Ｂ−ｂ」ノブ−ホール相互作用を介して別のフィブリンモノマーの対応するホールと相互作用し、フィブリンモノマーが、半分ずらして交互に配置された、二本鎖プロトフィブリルへと組み合わされる。
【００７３】
本発明の好ましい実施形態では、それぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドは、配列Ｇｌｙ−（Ｐｒｏ、Ｈｉｓ）−Ａｒｇ−Ｘａａ（配列番号１）を含み、Ｘａａは任意のアミノ酸であり、Ｐｒｏ／Ｈｉｓはプロリンまたはヒスチジンがその位置に存在することを意味する。この配列がペプチドのアミノ末端にあるのが好ましい。例えば、ペプチドは、配列ＮＨ２−Ｇｌｙ−（Ｐｒｏ、Ｈｉｓ）−Ａｒｇ−Ｘａａ（配列番号１）を含んでよい。ペプチドは、そのカルボキシ末端を介して担体または留め具に結合し得る。
【００７４】
しかし、いくつかの実施形態では、このアミノ酸配列がペプチドのカルボキシ末端にあってよく、また、このペプチドがそのアミノ末端を介して担体または留め具に結合してもよい。例えば、フィブリノーゲンのホール「ｂ」よりホール「ａ」に選択的に結合する少なくとも１個のフィブリノーゲン結合ペプチド、例えば、配列ＡＰＦＰＲＰＧ（配列番号２）を含むペプチドは、そのアミノ末端を介して、担体または留め具に結合し得る。フィブリノーゲン結合ペプチドがそのアミノ末端を介して結合する場合は、ペプチドのカルボキシ末端は、アミド基を含み得る。露出したペプチドのカルボキシ末端での、カルボキシル基（または負電荷カルボキシレートイオン）ではなくアミド基の存在は、フィブリノーゲン結合ペプチドのフィブリノーゲンへの結合を最適化するのを支援し得る。
【００７５】
本発明のいくつかの実施形態では、少なくとも一部のフィブリノーゲン結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｘａａ（配列番号３）を含み、ここでＸａａは任意のアミノ酸である。好ましくは、Ｘａａは、Ｖａｌ以外の任意のアミノ酸であり、好ましくは、Ｐｒｏ、Ｓａｒ、またはＬｅｕである。
【００７６】
いくつかの実施形態では、少なくとも一部のフィブリノーゲン結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｘａａ（配列番号４）を含み、ここでＸａａは、Ｐｒｏ以外の任意のアミノ酸である。
【００７７】
本発明のいくつかの実施形態では、フィブリノーゲン結合ペプチドは、フィブリノーゲンのホール「ｂ」より、フィブリノーゲンのホール「ａ」に選択的に結合する。フィブリノーゲンのホール「ｂ」より、ホール「ａ」に選択的に結合する好適なフィブリノーゲン結合ペプチドの配列例には下記が含まれる：ＧＰＲ−；ＧＰＲＰ−（配列番号５）；ＧＰＲＶ−（配列番号６）；ＧＰＲＰＦＰＡ−（配列番号７）；ＧＰＲＶＶＡＡ−（配列番号８）；ＧＰＲＰＶＶＥＲ−（配列番号９）；ＧＰＲＰＡＡ−（配列番号１０）；ＧＰＲＰＰＥＣ−（配列番号１１）；ＧＰＲＰＰＥＲ−（配列番号１２）；ＧＰＳＰＡＡ−（配列番号１３）。
【００７８】
いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン結合ペプチドは、フィブリノーゲンのホール「ａ」より、フィブリノーゲンのホール「ｂ」に選択的に結合する。フィブリノーゲンのホール「ａ」より、ホール「ｂ」に選択的に結合するフィブリノーゲン結合ペプチドの配列例には下記が含まれる：ＧＨＲ−、ＧＨＲＰ−（配列番号１４）、ＧＨＲＰＹ−（配列番号１５）、ＧＨＲＰＬ−（配列番号１６）、ＧＨＲＰＹアミド−（配列番号１７）。
【００７９】
留め具または担体は、異なる配列のフィブリノーゲン結合ペプチドを含んでよい。例えば、いくつかの実施形態では、留め具または担体は、フィブリノーゲンのホール「ｂ」と比較してホール「ａ」に対する異なる結合選択性を有するフィブリノーゲン結合ペプチドを含んでよい。
【００８０】
止血剤が留め具に固定化された複数の担体を含む場合は、複数の担体は、第１の複数の担体、および第２の複数の担体を含んでよく、第１の複数の担体に結合したフィブリノーゲン結合ペプチドは、第２の複数の担体に結合したフィブリノーゲン結合ペプチドとは異なる配列である。
【００８１】
留め具への固定化に好適する止血剤は、２個以上のフィブリノーゲン結合ペプチドを含むペプチドデンドリマー、およびペプチド複合体を含んでよい。ペプチド複合体は、同じ配列のまたは異なる配列のフィブリノーゲン結合ペプチドを含んでよい。例えば、ペプチド複合体は、フィブリノーゲンのホール「ｂ」よりもホール「ａ」に選択的に結合するフィブリノーゲン結合ペプチドのみを含んでもよく、またはフィブリノーゲンのホール「ａ」よりもホール「ｂ」に選択的に結合するフィブリノーゲン結合ペプチドのみを含んでもよく、またはフィブリノーゲンのホール「ｂ」よりもホール「ａ」に選択的に結合する１個または複数のフィブリノーゲン結合ペプチドおよびフィブリノーゲンのホール「ａ」よりもホール「ｂ」に選択的に結合する１個または複数のフィブリノーゲン結合ペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ペプチド複合体はペプチドデンドリマーであってよい。ペプチドデンドリマーのフィブリノーゲン結合ペプチドは、フィブリノーゲンのホール「ｂ」よりもフィブリノーゲンのホール「ａ」に選択的に結合し得、およびペプチド複合体のフィブリノーゲン結合ペプチドは、フィブリノーゲンのホール「ａ」よりもフィブリノーゲンのホール「ｂ」に選択的に結合し得る。このような組成物は、それらがペプチドデンドリマーまたはペプチド複合体単独よりもより急速にフィブリノーゲンを重合できるという点で相乗的効果を有することが見出された。この相乗的作用の機構は完全には理解されていない。しかし、理論に束縛されるものではないが、それは、組成物がより多くの「Ａ」および「Ｂ」フィブリノーゲン重合部位を提供するという理由で起こると考えられている。
【００８２】
あるいは、ペプチドデンドリマーのフィブリノーゲン結合ペプチドが、フィブリノーゲンのホール「ａ」よりもフィブリノーゲンのホール「ｂ」に選択的に結合し得、およびペプチド複合体のフィブリノーゲン結合ペプチドが、フィブリノーゲンのホール「ｂ」よりもフィブリノーゲンのホール「ａ」に選択的に結合し得る。
【００８３】
好ましくは、フィブリノーゲン結合ペプチドはフィブリノーゲンではなく、またはフィブリノーゲンを含まない。例えば、止血装置は固定化されたフィブリノーゲンを含まなくてもよい。装置は、好ましくは、フィブリノーゲンを（共有結合でまたは非共有結合で）留め具に固定化することによっては、またはフィブリノーゲンを含む止血剤を留め具に固定化することによっては形成されない。
【００８４】
好ましい構成では、フィブリノーゲン分子は少なくとも２個のフィブリノーゲン結合ペプチドに結合できる。したがって、止血装置が複数の固定化された担体を含み、複数のフィブリノーゲン結合ペプチドがそれぞれの担体に固定化されている場合には、フィブリノーゲン分子は、非共有結合で担体を介して架橋結合して、担体およびフィブリンを含み、フィブリン塊の特性を有するコポリマーを形成してもよい。したがって、フィブリノーゲン結合ペプチドは、フィブリノーゲンの２つの異なる領域に同時に結合できる１個または複数の配列を含んでよい。例えば、フィブリノーゲンは２つの末端ドメイン（Ｄ−ドメイン）を含み、それぞれのドメインは、フィブリノーゲン結合ペプチドに結合し得る。
【００８５】
本発明は、外科用留め具および、複数のフィブリノーゲン結合ペプチドを別々に含む、止血装置を形成するためのキットを提供し得る。
【００８６】
特定の好ましい実施形態では、キットのフィブリノーゲン結合ペプチドは、本明細書中、種々の形態で記載の止血剤により提供される。
【００８７】
キットは、装置を患者に適用する前に、フィブリノーゲン結合ペプチドを留め具に適用して止血装置を形成するための説明書をさらに含んでよい。
【００８８】
本発明は、本発明による止血装置を患者に適用することを含む方法を提供し得る。したがって、止血装置は、創傷を縫合もしくは密封して、組織を接合する、または創傷包帯材を患者に取り付けるのに使用され得る。止血装置は血管手術中に適用可能であるのが好ましい。
【００８９】
本発明は、止血装置を止血縫合糸の形で患者に適用することにより、縫合孔の出血を減らすまたは防止する方法を提供し得る。
【００９０】
本発明は、複数のフィブリノーゲン結合ペプチドを外科用留め具に固定化することを含む、止血装置を製造する方法を提供し得る。
【００９１】
方法は、非共有結合でフィブリノーゲン結合ペプチドを留め具に固定化することを含み得る。例えば、方法は、止血剤を留め具に固定化することを含み得、止血剤は複数の担体を含み、それぞれの担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合ペプチドが存在する。
【００９２】
フィブリノーゲン結合ペプチドは、フィブリノーゲン結合ペプチドを含む溶液または懸濁液を留め具に接触させ、乾燥させることにより、非共有結合で留め具に固定化されてもよい。あるいは、方法は、共有結合でフィブリノーゲン結合ペプチドを留め具に固定化してもよい。
【００９３】
本発明は、本発明の方法により得ることができる止血装置を提供し得る。
【００９４】
本発明の実施形態が、添付の図面を参照しながら、例示の目的のみで以降で記載される。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】ヒトフィブリノーゲン中で止血縫合糸が凝血塊を形成する能力を示す図である。
【図２ａ】ポリプロピレンチューブ中に配置された止血縫合糸および対照縫合糸を示す図である。
【図２ｂ】フィブリノーゲンの止血縫合糸との重合を示す図である。
【図２ｃ】止血縫合糸のフィブリノーゲンを凝血させる能力、およびポリプロピレンチューブを閉塞させる能力を示す図である。
【図２ｄ】止血縫合糸のフィブリノーゲンを凝血させる能力、およびポリプロピレンチューブを閉塞させる能力を示す図である。
【図２ｅ】止血縫合糸のフィブリノーゲンを凝血させる能力、およびポリプロピレンチューブを閉塞させる能力を示す図である。
【図３ａ】ポリプロピレンチューブ中に配置された止血縫合糸および対照縫合糸を示す図である。
【図３ｂ】止血縫合糸による血漿の重合を示す図である。
【図４】フィブリノーゲンと接触時に、凝血塊を形成する止血縫合糸を示す図である。
【図５ａ】外科用留め具を修飾するための反応スキームを示す図である。
【図５ｂ】フィブリノーゲン結合ペプチドを修飾外科用留め具に共有結合で固定化するための反応スキームを示す図である。
【図５ｃ】共有結合で固定化されたフィブリノーゲン結合ペプチドを有する縫合糸に対し行った陽性カイザー試験を示す図である。
【図６ａ】ポリプロピレンチューブ中に配置された止血縫合糸および対照縫合糸を示す図である。
【図６ｂ】止血縫合糸によるヒト血漿中のフィブリノーゲンの重合を示す図である。
【図６ｃ】止血縫合糸上のフィブリノーゲン凝血塊を示す図である。
【図７】フィブリノーゲン結合ペプチドを外科用留め具に共有結合で固定化するための反応スキームを示す図である。
【図８ａ】外科用留め具を修飾するための反応スキームを示す図である。
【図８ｂ】フィブリノーゲン結合ペプチドを修飾外科用留め具に共有結合で固定化するための反応スキームを示す図である。
【図９ａ】外科用留め具を修飾するための反応スキームを示す図である。
【図９ｂ】フィブリノーゲン結合ペプチドを修飾外科用留め具に共有結合で固定化するための反応スキームを示す図である。
【図１０】種々の濃度で、ペプチドデンドリマーのフィブリノーゲンを重合する能力を示す図である。
【図１１】種々の濃度で、いくつかの異なるペプチドデンドリマーのフィブリノーゲンを重合する能力を示す図である。番号は、ペプチドデンドリマーの識別情報を意味する。
【図１２】種々の濃度で、いくつかの異なるペプチドデンドリマーのフィブリノーゲンを重合する能力を示す図である。番号は、ペプチドデンドリマーの識別情報を意味する。
【図１３】種々の濃度で、いくつかの異なるペプチドデンドリマーのフィブリノーゲンを重合する能力を示す図である。番号は、ペプチドデンドリマーの識別情報を意味する。
【図１４】異なるペプチドデンドリマーを使って、フィブリノーゲンの重合により形成されたヒドロゲルの写真を示す。
【図１５】種々の濃度で、ペプチド複合体との異なる組み合わせのペプチドデンドリマーのフィブリノーゲンを重合する能力を示す図である。
【図１６】ヒト血漿中で、いくつかの異なるペプチドデンドリマーのフィブリノーゲンを重合する能力を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００９６】
実施例１：止血剤でコートした絹繊維（ＰｅｐｒｏＳｔａｔ）
ＰｅｐｒｏＳｔａｔは、アルブミン担体に固定化されたフィブリノーゲン結合ペプチド（それぞれ配列ＧＰＲＰＧを有する）を含む止血剤である。
【００９７】
絹繊維（６０ｍｇ）をＰｅｐｒｏＳｔａｔの溶液（６０μｌ、１８．６ｍｇ／ｍｌ、バッチＮｏ．ＲＸ５００５５２．００２、２０ｍＭトリス緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．２中で配合）に浸漬した。対照として、絹繊維（６０ｍｇ）をトリス緩衝液（６０μｌ、２０ｍＭトリス緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．２）中に投入した。
【００９８】
処理絹繊維を３３℃で一晩乾燥した後、別のポリプロピレンチューブ中に投入した。
【００９９】
フィブリノーゲン溶液（生理的濃度３ｍｇ／ｍｌの１５０μｌ、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手、バッチＮｏ．Ｆ１Ｂ１４２３０Ｌ、２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ＝７．２中で配合）をそれぞれの試料に加え、チューブを３３℃で３分間インキュベートした。
【０１００】
結果を図１に示す。チューブＰはＰｅｐｒｏＳｔａｔ含有試料、チューブＣは対照である。図１は、ＰｅｐｒｏＳｔａｔ絹繊維のフィブリノーゲンと共重合する能力を示す。結果は、絹繊維が対照試料中のフィブリノーゲンと凝血塊を形成できなかったことを示している。
【０１０１】
実施例２：止血剤（デンドリマーＰ１２）でコートした綿（ガーゼ）繊維
ペプチドデンドリマー１２（Ｐ１２）の構造は、実施例５で下記に示されている。
セルロース（綿）繊維をデンドリマーＰ１２の溶液（６０μｌ、５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ＝７．２）またはリン酸緩衝液（６０μｌ、２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ＝７．２）中に投入した。処理繊維を３３℃で２時間乾燥した後、別のポリプロピレンチューブ中に投入した。図２ａは、ポリプロピレンチューブ中に投入した繊維を示す（上側：チューブＰ−１２、下側：チューブＣ）。
【０１０２】
フィブリノーゲン溶液（生理的濃度３ｍｇ／ｍｌの１５０μｌ、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手、バッチＮｏ．Ｆ１Ｂ１４２３０Ｌ、２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ＝７．２中で配合）をそれぞれの試料に加え、チューブを３３℃で３分間インキュベートした。図２ｂは、フィブリノーゲンのＰ１２（チューブＰ１２（上側））および対照試料（チューブＣ（下側））による重合（ミルク状ゲル）を示す。図２ｃ〜２ｅは、左から右へ進行した時点での、垂直に保持されているチューブを示す。チューブＰ−１２（左）の凝血塊はチューブを閉塞し、滴下させないようにした。チューブＣ（右）では、チューブを閉塞する凝血塊が存在しなかったので、滴下は阻止されなかった。
【０１０３】
ヒト血漿中の綿Ｐ１２に対して、同じ調製手順を用いた。それぞれの繊維を１５０μｌのヒト血漿と共に３３℃で３分間インキュベートした。図３ａは、ポリプロピレンチューブ中に投入した綿繊維を示す（チューブＣ（上側）およびチューブＰ−１２（下側））。図３ｂは、ヒト血漿中のフィブリノーゲンの重合（ミルク状ゲル）がチューブＰ−１２（上側）中で起こり、対照試料（下側）では起こらなかったことを示す。
【０１０４】
実施例３：止血剤（ＰｅｐｒｏＳｔａｔ）の熱固定化
１０ｍｍ長の縫合糸−（ＬＯＴ  ＣＫＥ６２７−Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｐｒｏｌｅｎｅ）をＰｅｐｒｏＳｔａｔ（１００μｌ、１８．６ｍｇ／ｍｌ、バッチＮｏ．ＲＸ５００５５２．００２、２０ｍＭトリス緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．２中で配合）を含む別々のガラスバイアル中に投入した。試料を密封し、９２℃の水浴中に投入した。これを一晩（１６時間）かけて室温まで冷却させた。
【０１０５】
縫合糸をガラスバイアルから取り出し、別々のポリプロピレンチューブに移した。フィブリノーゲン溶液（生理的濃度３ｍｇ／ｍｌの１５０μｌ、バッチＮｏ．Ｆ１Ｂ１４２３０Ｌ、２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ＝７．２中で配合）をそれぞれの試料に加えた。図４は、熱グラフト化ＰｅｐｒｏＳｔａｔ縫合糸（チューブＰ（下側））のヒトフィブリノーゲンと凝血塊を形成する能力および脱イオン化水試料（チューブＣ（上側））での凝血塊の欠如を示す。
【０１０６】
実施例４：フィブリノーゲン結合ペプチドの縫合糸への共有結合による固定化
酸化再生セルロース繊維に共有結合で連結されたフィブリノーゲン結合ペプチドのフィブリノーゲン結合特性を試験した。
【０１０７】
２８５ｍｇの市販の酸化再生セルロース繊維（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．により製造されたＳｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）Ｏｒｉｇｉｎａｌ）を合成に使用した。酸化セルロース繊維中のカルボン酸含量は、欧州特許第ＥＰ０６５９４４０号から採用した。例えば、５０ｇのＳｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）Ｎｕ−Ｋｎｉｔ（登録商標）クロスは２０％のカルボン酸含量（０．２２モルのカルボン酸）を有する。
【０１０８】
Ｇｌｙ−Ｇｌｙスペーサーによる表面修飾酸化セルロース繊維の調製
塩基触媒ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴアミド結合形成により、Ｇｌｙ−Ｇｌｙスペーサーの酸化再生セルロース（ＯＲＣ）繊維への導入を行った。合成に使用した繊維を、２ｘ５ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）（１分）で予備洗浄し、３３℃で乾燥した。乾燥後、２８５ｍｇの繊維（１．２５ｍｍｏｌのＣＯＯＨ濃度）を、５ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中に浸漬し、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ；５９７ｍｇ、１．５６ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ；２１７ｍｇ、１．５６ｍｍｏｌ）を混合した後、繊維を室温で１５分間活性化した。次に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチレンジアミン（３．１４ｍｍｏｌ、０．５０５ｍｌ、ｄ＝０．７９８）（またはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン  ＤＩＰＥＡ）を加え、得られた溶液をさらに１５分間反応させた。この後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解した２４ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌのＧｌｙ−ＯＨを反応混合物に加えた。カップリング反応を室温で２時間３０分実施した。
【０１０９】
ＯＲＣ繊維をＤＭＦ（３ｘ５ｍｌ）、メタノール（ＭｅＯＨ）（３ｘ５ｍｌ）およびＤＭＦ（３ｘ５ｍｌ）で洗浄した。Ｇｌｙ−ＯＨのカップリングステップを反復し、室温で３０分間インキュベートした後、ＤＭＦ（２ｘ５ｍｌ）、ＭｅＯＨ（１ｘ５ｍｌ）およびＤＭＦ（２ｘ５ｍｌ）で洗浄した。
【０１１０】
図５ａに酸化セルロースのＧｌｙ−Ｇｌｙスペーサーを使った修飾中の、反応スキームおよび構造をまとめている。
【０１１１】
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ官能化ＯＲＣ繊維を使って、Ｂｏｃ−ＧＰＲ（Ｐｂｆ）ＰＧ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２とのカップリングを行った。Ｆｍｏｃ反応のみで、Ｂｏｃ−ＧＰＲ（Ｐｂｆ）ＰＧ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２（Ｂｏｃ−ＦＢＰ）ペプチドをＣからＮ末端へ構築した。合成の最終合成段階で、Ｃ末端に対する遊離アミン基、およびＡｒｇに対するＰｂｆ保護基を使って、ペプチド鎖を完全に保護した。完全に保護されたペプチドは、Ａｌｍａｃ  Ｌｔｄ．から購入した。
【０１１２】
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ官能化繊維上のＢｏｃ−ＦＢＰの合成
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ官能化繊維上へのＢｏｃ−ＦＢＰのカップリングをＳＰＯＴ合成法（Ｈｉｌｐｅｒｔ  Ｋ．，Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｄ．，Ｈａｎｃｏｃｋ  Ｒ．；Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；２００７；ｖｏｌ．２，Ｎｏ．６，ｐ  １３３３−１３４９）の新規改造により実施した。
【０１１３】
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ官能化繊維をＤＭＦ（５ｍｌ）中に浸漬し、ＨＢＴＵ（４７５ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（１６９ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）と混合した。室温で２分間撹拌後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチレンジアミン（０．４０６ｍｌ、２．５ｍｍｏｌ）（またはＤＩＰＥＡ）を加え、２分間混合した。２７５ｍｇ（０．３１ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−ＦＢＰペプチドをＤＭＦ（２００μｌ）に溶解し、これを、反応混合物に添加した。カップリング反応を室温で一晩（１７時間）実施した。その後、繊維をＤＭＦ（３ｘ５ｍｌ）およびＤＣＭ（３ｘ５ｍｌ）で洗浄した。カップリング反応後、９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＳ、２．５％水（３ｍｌ）による保護基の除去により、ＧＰＲＰＧ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−Ｇ−Ｇ−繊維（「ＧＰＲＰＧ−Ｇ−Ｇ−ＯＲＣ」）が得られた。
【０１１４】
図５ｂにＢｏｃ−ＦＢＰのＧｌｙ−Ｇｌｙ官能化繊維へのカップリングに関与した反応スキームおよび構造をまとめている。
【０１１５】
カイザー試験（ニンヒドリン試験）を使って、セルロース繊維上に結合して残っている完全に脱保護されたＧＰＲＰＧ−リンカー−ＯＲＣの存在をモニターした（図５ｃ参照−ＯＲＣ（対照）（上側）；ＧＰＲＰＧ−Ｇ−Ｇ−ＯＲＣ（下側））。
【０１１６】
官能性試験
図６ａは、別々のポリプロピレンチューブ中に置かれたＧＰＲＰＧ−Ｇ−Ｇ−ＯＲＣ（チューブ標識ＳＣ＋）およびＯＲＣ（対照）（チューブ標識ＳＣ−）繊維を示す。１５０μｌのヒト血漿（Ａｌｐｈａ  Ｌａｂｓ−Ｐｌａｓｍａ  Ｌｏｔ＃Ａ１１６２  Ｅｘｐ  ２０１６−０３）をそれぞれの試料に加え、繊維を３７℃で１．５分間インキュベートした。図６ｂに示すように、ＳＣ＋（上側）には凝血塊が存在する。
【０１１７】
ポリエチレンチューブから取りだした糸の目視検査も行った。図６ｃは、ＧＰＲＰＧ−Ｇ−Ｇ−ＯＲＣ繊維がヒトフィブリノーゲンと凝血塊を形成したことを示す。容器から取り出したＧＰＲＰＧ−Ｇ−Ｇ−ＯＲＣは対照試料より肉厚であった。
【０１１８】
ＧＰＲＰＧ−Ｇ−Ｇ−ＦＢＰおよびＯＲＣ（対照）の試料を秤取し、１５０μｌのヒト血漿（Ａｌｐｈａ  Ｌａｂｓ−Ｐｌａｓｍａ  Ｌｏｔ＃Ａ１１７４  Ｅｘｐ  ２０１６−０３）で処理し、３３℃で１．５分間インキュベートした。試験した試料および対照を血漿から取り出した後、秤量して、何らかの差異が観察されるかどうかを判定した。この試験を４回繰り返した。表１の結果から、ＧＰＲＰＧ−Ｇ−Ｇ−ＯＲＣ上に残っている量は、対照試料に比べてかなり多く、再生酸化セルロース材料に結合された場合、フィブリノーゲン結合ペプチドの活性が維持されることを示すことがわかる。
【表１】
2018516648.tif 000022
【０１１９】
Ｂｏｃ−ＧＰＲ（Ｐｂｆ）ＰＧ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２（Ｂｏｃ−ＦＢＰ−）の酸化再生セルロース材料上への一段階カップリング
Ｆｍｏｃ反応のみで、Ｂｏｃ−ＧＰＲ（Ｐｂｆ）ＰＧ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２（Ｂｏｃ−ＦＢＰ−）部分をＣからＮ末端へ構築した。合成の最終合成段階で、Ａｒｇに対するＰｂｆ保護基を含めて、Ｃ末端に対し遊離アミン基で、部分を完全に保護した。保護された部分は、Ａｌｍａｃ  Ｌｔｄ．から購入した。
【０１２０】
市販のＪｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＬｉｍｉｔｅｄのＥｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．で製造されたＳｕｒｇｉｃｅｌ＊  Ｏｒｉｇｉｎａｌ  Ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ  Ｈｅｍｏｓｔａｔ（酸化再生セルロース（ＯＲＣ））を基材として使用した。Ｓｕｒｇｉｃｅｌ中のカルボン酸含量は、文献から採用した（欧州特許第ＥＰ０６５９４４０号を参照）。５０ｇのＳｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）Ｎｕ−Ｋｎｉｔ（登録商標）＊クロスは２０％のカルボン酸含量を有する（モルのカルボン酸）。
【０１２１】
合成に使用したＯＲＣ材料を、２ｘ１ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）（１分）で予備洗浄し、３３℃で乾燥した。乾燥後、５０ｍｇのＯＲＣ材料（０．２ｍｍｏｌのカルボン酸ＣＯＯＨ）を、１ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中に浸漬し、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ；９０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ；３０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）と混合した後、包帯材を室温で１５分間活性化した。次に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチレンジアミン（０．４ｍｍｏｌ、０．０７５ｍｌ、ｄ＝０．７９８）（またはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン  ＤＩＰＥＡ）を加え、得られた溶液をさらに１５分間反応させた。この後、ＤＭＦ中に溶解した５０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌのＢｏｃ−ＧＰＲ（Ｐｂｆ）ＰＧ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２を反応混合物に加えた−合計２ｍｌ。カップリング反応を室温で５時間実施した。材料をＤＭＦ（３ｘ１ｍｌ）、メタノール（ＭｅＯＨ）（３ｘ１ｍｌ）およびＤＭＦ（３ｘ１ｍｌ）で洗浄した。Ｂｏｃ−ＧＰＲ（Ｐｂｆ）ＰＧ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２のカップリングステップを反復し、室温で一晩インキュベートした後、ＤＭＦ（２ｘ１ｍｌ）、ＭｅＯＨ（１ｘ１ｍｌ）およびＤＭＦ（２ｘ１ｍｌ）で洗浄した。その後、ＯＲＣ材料をＤＭＦ（３ｘ５ｍｌ）およびＤＣＭ（３ｘ５ｍｌ）で洗浄した。カップリング反応後、９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＳ、２．５％水（３ｍｌ）による保護基の除去により、ＧＰＲＰＧ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＯＲＣ（「ＧＰＲＰＧ−ＯＲＣ」）が得られた。
【０１２２】
図７に反応スキームおよび構造をまとめている。
【０１２３】
官能性試験
ＧＰＲＰＧ−ＦＢＰおよびＯＲＣ（対照）の試料を秤取し、１００μｌのヒト血漿（Ａｌｐｈａ  Ｌａｂｓ−Ｐｌａｓｍａ  Ｌｏｔ＃Ａ１１６２  Ｅｘｐ  ２０１５−０３）で処理し、３３℃で１．５分または３分間インキュベートした。試験した試料および対照を血漿から取り出した後、秤量して、差異を判定した。この試験を３回繰り返した。表２の結果から、ＧＰＲＰＧ−ＯＲＣ上に残っている量は、対照試料に比べてかなり多く、材料に結合された場合、フィブリノーゲン結合ペプチドの活性が維持されることを示すことがわかる。
【表２】
2018516648.tif 000023
【０１２４】
ε−Ａｈｘスペーサーによる表面修飾酸化セルロース材料の調製
塩基触媒ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴアミド結合形成により、６−アミノヘキサン酸（ε−Ａｈｘ）スペーサーの酸化セルロース材料への導入を行った。用いた合成方法は、ＯＲＣ材料のＧｌｙ−Ｇｌｙスペーサーによる修飾のために記載したものと実質的に同じであった。
【０１２５】
予備洗浄と乾燥ステップ後、１１４ｍｇのＯＲＣ材料を、２ｍｌのＤＭＦ溶液中に浸漬し、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ；２３７ｍｇ、０．６２５ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ；８４ｍｇ、０．６２５ｍｍｏｌ）を混合した後、材料を室温で１５分間活性化した。次に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチレンジアミン（１．２５ｍｍｏｌ、０．２００ｍｌ、ｄ＝０．７９８）（またはＤＩＰＥＡ）を加え、得られた溶液をさらに１５分間反応させた。この後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解した１６．４ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌのε−Ａｈｘ−ＯＨを反応混合物に加えた。カップリング反応を室温で一晩実施した。
【０１２６】
材料をＤＭＦ（３ｘ３ｍｌ）、メタノール（ＭｅＯＨ）（３ｘ３ｍｌ）およびＤＭＦ（３ｘ３ｍｌ）で洗浄した。
【０１２７】
図８ａに反応スキームおよび構造をまとめている。
【０１２８】
Ｂｏｃ−ＦＢＰのε−Ａｈｘ官能化包帯材へのカップリング
反応スキームおよび構造の概要を図８に示す。
【０１２９】
最初に、ε−Ａｈｘ官能化包帯材をＤＭＦ（２ｍｌ）中に浸漬し、ＨＢＴＵ（１９０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（６７．４ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）と混合した。室温で２分間撹拌後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチレンジアミン（０．１８０ｍｌ、１．１ｍｍｏｌ）（またはＤＩＰＥＡ）を加え、２分間混合した。１１０ｍｇ（０．１２５ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−ＦＢＰペプチドをＤＭＦ（２００μｌ）に溶解し、これを、反応混合物に添加した。カップリング反応を室温で一晩（１７時間）実施した。その後、包帯材をＤＭＦ（３ｘ３ｍｌ）およびＤＣＭ（３ｘ３ｍｌ）で洗浄した。カップリング反応後、９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＳ、２．５％水（３ｍｌ）による保護基の除去により、ＧＰＲＰＧ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−Ａｈｘ−ＯＲＣ（「ＧＰＲＰＧ−Ａｈｘ−ＯＲＣ」）が得られた。
【０１３０】
カイザー試験（ニンヒドリン試験）を使って、セルロース上に結合して残っている完全に脱保護されたペプチドの存在をモニターした。
【０１３１】
β−Ａｌａスペーサーによる表面修飾酸化セルロース材料の調製
塩基触媒ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴアミド結合形成により、β−アラニン（β−Ａｌａ）スペーサーの酸化セルロース材料への導入を行った。
【０１３２】
予備洗浄と乾燥ステップ後、２０６ｍｇの材料を、５ｍｌのＤＭＦ溶液中に浸漬し、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ；４４２ｍｇ、１．１６５ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ；１５２ｍｇ、１．１２５ｍｍｏｌ）と混合した後、材料を室温で１５分間活性化した。次に、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチレンジアミン（２．４６８ｍｍｏｌ、０．３１９ｍｌ）（またはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン  ＤＩＰＥＡ）を加え、得られた溶液をさらに１５分間反応させた。この後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解した２０ｍｇ、０．２２６ｍｍｏｌのβ−Ａｌａ−ＯＨを反応混合物に加えた。カップリング反応を室温で一晩実施した。
【０１３３】
材料をＤＭＦ（３ｘ５ｍｌ）、メタノール（ＭｅＯＨ）（３ｘ５ｍｌ）およびＤＭＦ（３ｘ５ｍｌ）で洗浄した。
【０１３４】
図９ａに反応スキームおよび構造をまとめている。
【０１３５】
Ｂｏｃ−ＦＢＰのβ−Ａｌａ官能化包帯材へのカップリング
塩基触媒合成手法により、Ｂｏｃ−ＦＢＰのβ−Ａｌａ官能化材料へのカップリングを行った。
【０１３６】
反応スキームおよび構造の概要を図９ｂに示す。
【０１３７】
最初に、β−Ａｌａ官能化包帯材をＤＭＦ（５ｍｌ）中に浸漬し、ＨＢＴＵ（３５０ｍｇ、０．９２３ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（１２４ｍｇ、０．９１８ｍｍｏｌ）と混合した。室温で２分間撹拌後、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチレンジアミン（０．２４７ｍｌ、１．９１１ｍｍｏｌ）（またはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン  ＤＩＰＥＡ）を加え、２分間混合した。２０２ｍｇ（０．２３１ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−ＦＢＰペプチドをＤＭＦ（４００μｌ）に溶解し、これを、反応混合物に添加した。カップリング反応を室温で一晩（１７時間）実施した。その後、包帯材をＤＭＦ（３ｘ５ｍｌ）およびＤＣＭ（３ｘ５ｍｌ）で洗浄した。カップリング反応後、９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＳ、２．５％水（３ｍｌ）による保護基の除去により、ＧＰＲＰＧ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−β−Ａｌａ−ＯＲＣ（「ＧＰＲＰＧ−β−Ａｌａ−ＯＲＣ」）が得られた。
【０１３８】
カイザー試験（ニンヒドリン試験）を使って、セルロース上に結合して残っている完全に脱保護されたペプチドの存在をモニターした。
【０１３９】
官能性試験
ＧＰＲＰＧ−β−Ａｌａ−ＦＢＰ、ＧＰＲＰＧ−Ａｈｘ−ＯＲＣおよびＯＲＣ（対照）の試料を秤取し、１００μｌのヒト血漿（Ａｌｐｈａ  Ｌａｂｓ−Ｐｌａｓｍａ  Ｌｏｔ＃Ａ１１７４  Ｅｘｐ  ２０１６−０３）で処理し、３３℃で１．５分間インキュベートした。試験した試料および対照を血漿から取り出した後、秤量して、何らかの差異が観察されるかどうかを判定した。この試験を３回繰り返した。表３の結果から、ＧＰＲＰＧ−β−Ａｌａ−ＯＲＣ、ＧＰＲＰＧ−Ａｈｘ−ＯＲＣ上に残っている量は、対照（Ｓｕｒｇｉｃｅｌ）試料に比べてかなり多く、再生酸化セルロース材料に結合された場合、フィブリノーゲン結合ペプチドの活性が維持されることを示唆していることがわかる。
【表３】
2018516648.tif 000024
【０１４０】
実施例５：ペプチドデンドリマーおよびペプチド複合体の合成
Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）を使って、標準的Ｆｍｏｃペプチド合成によりＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ低密度充填型樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、０．３６ｍｍｏｌ／ｇ）上でペプチドを合成した。
【０１４１】
一般に、合成全体を通して、単一カップリングサイクルが使用され、ＨＢＴＵ活性化化学を採用した（カップリング剤としてＨＢＴＵおよびＰｙＢＯＰ（ＡＧＴＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓから入手）を使用した）。しかし、いくつかの位置では、カップリングが予測より効率が低く、２回のカップリングが必要であった。
【０１４２】
分岐点までは、自動化ペプチド合成装置およびＨＢＴＵを使ってペプチドを構築し、ペプチド分岐部に対しては、ＰｙＢＯＰを使って手操作によるペプチド合成により構築した。
【０１４３】
自動化合成では、それぞれのカップリングに対し３倍過剰のアミノ酸およびＨＢＴＵを使用し、９倍過剰のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、Ｓｉｇｍａ）中のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、Ｓｉｇｍａ）を使用した。
【０１４４】
手操作による合成では、それぞれのカップリングに対し３倍過剰のアミノ酸およびＰｙＢＯＰを使用し、９倍過剰のＮ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ、Ｓｉｇｍａ）中のＤＩＰＥＡを使用した。
【０１４５】
ＤＭＦ中の２０％のピペリジン（Ｓｉｇｍａ）を使った、成長しているペプチドの脱保護（Ｆｍｏｃ基の除去）も同様に必ずしも効率的とは限らず、２回の脱保護を要する可能性がある。
【０１４６】
分岐部は、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、またはＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨを使って作製した。
【０１４７】
ペプチドの最終的脱保護および固体支持体からの開裂をトリイソプロピルシラン（ＴＩＳ、Ｓｉｇｍａ）、水およびアニソール（Ｓｉｇｍａ）（１：１：１、５％）を含む９５％のＴＦＡ（Ｓｉｇｍａ）を使った樹脂の２〜３時間の処理により実施した。
【０１４８】
開裂させたペプチドを冷ジエチルエーテル（Ｓｉｇｍａ）中で沈殿させ、遠心分離によりペレット化して、凍結乾燥した。ペレットを水（１０〜１５ｍＬ）中に再溶解し、濾過して、Ｃ−１８（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、流速２０ｍｌ／分）カラムおよび０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル／水グラジエントを使って逆相ＨＰＬＣにより精製した。精製生成物を凍結乾燥し、ＥＳＩ−ＬＣ／ＭＳおよび分析用ＨＰＬＣで分析し、純粋（＞９５％）であることが示された。質量分析結果は全て計算値と合致した。
【０１４９】
ペプチドデンドリマーおよびペプチド複合体
上記の方法を使って合成したペプチドデンドリマーおよびペプチド複合体の構造を以下に示す。
【０１５０】
ペプチド配列の末端の「ＮＨ２−」基は、配列のアミノ末端のアミノ基を意味する。ペプチド配列の末端の「−ａｍ」基は、配列のカルボキシ末端のアミド基を意味する。
ペプチド複合体Ｎｏ．１：
【化２０】
2018516648.tif 000025
ペプチド複合体Ｎｏ．２：
【化２１】
2018516648.tif 000026
ペプチド複合体Ｎｏ．３：
【化２２】
2018516648.tif 000027
ペプチド複合体Ｎｏ．４：
【化２３】
2018516648.tif 000028
ペプチド複合体Ｎｏ．５：
【化２４】
2018516648.tif 000029
ペプチド複合体Ｎｏ．８：
【化２５】
2018516648.tif 000030
ペプチド複合体Ｎｏ．９：
【化２６】
2018516648.tif 000031
ペプチド複合体Ｎｏ．１０：
【化２７】
2018516648.tif 000032
ペプチド複合体Ｎｏ．１１：
【化２８】
2018516648.tif 000033
ペプチド複合体Ｎｏ．１２：
【化２９】
2018516648.tif 000034
ペプチド複合体Ｎｏ．１３：
【化３０】
2018516648.tif 000035
【０１５１】
実施例６：ペプチドデンドリマーとフィブリノーゲンの共重合
デンドリマーＮｏ．１２は、５個の連続したリジン残基を有する分岐コアを含む。リジン残基は、隣接するリジン残基の側鎖を介して共有結合で連結される。
【０１５２】
ペプチドデンドリマーＮｏ．１２のフィブリノーゲンを重合させる能力を評価した。０．００５〜２ｍｇ／ｍｌの濃度のデンドリマー溶液３０μｌを、３ｍｇ／ｍｌ（血液中で認められたフィブリノーゲンのレベル）の精製ヒトフィブリノーゲン１００μｌに加えた。Ｓｉｇｍａ  Ａｍｅｌｕｎｇ  ＫＣ４  Ｄｅｌｔａ凝固分析装置を使ってフィブリノーゲンの重合を分析した。図１０は、重合（凝固）時間（秒）とデンドリマーの濃度増加のプロットを示す。
【０１５３】
結果は、デンドリマーが、極めて低いデンドリマー濃度であっても、フィブリノーゲンとほぼ瞬時に共重合することを示している。０．５ｍｇ／ｍｌを超えるデンドリマー濃度による凝固時間の増加は、フィブリノーゲン中の遊離結合ポケットの数に比べて、過剰なフィブリノーゲン結合ペプチドにより説明されると考えられる。より高い濃度では、デンドリマーのフィブリノーゲン結合ペプチドは、フィブリノーゲン結合ポケットを飽和させて、フィブリノーゲンと共重合できないかなりの数の過剰デンドリマー分子を生じるであろう。
【０１５４】
実施例７：デンドリマー当たりの種々の数のフィブリノーゲン結合ペプチドがフィブリノーゲンとの共重合速度に与える影響
この実施例は、デンドリマー当たりの種々の数のフィブリノーゲン結合ペプチドがフィブリノーゲンとの共重合速度に与える影響を調査する。
【０１５５】
実施例６に記載のものと同じ方法を使って、ペプチドデンドリマーＮｏ．４、５、１０、１１、および１２の、フィブリノーゲンと共重合する能力を評価した。それぞれのデンドリマーの濃度を、０．００５〜０．５ｍｇ／ｍｌで変化させた。図１１は、凝固時間（秒）と異なるデンドリマーの濃度増加のプロットを示す。
【０１５６】
結果は、Ｎｏ．５（２個のみのフィブリノーゲン結合ペプチド／デンドリマーを有する）はフィブリノーゲンと共重合できなかったことを示している。フィブリノーゲン結合ペプチドの数が３から５に増加（デンドリマーの濃度で約０．１２５から約０．２７５ｍｇ／ｍｌに増加）するのに伴い、共重合速度が増加する。約０．１２５ｍｇ／ｍｌデンドリマー未満の濃度では、デンドリマーＮｏ．１０（３個のフィブリノーゲン結合ペプチド／デンドリマーを有する）は、デンドリマーＮｏ．４（４個のフィブリノーゲン結合ペプチド／デンドリマーを有する）より速い凝固時間をもたらした。約０．０２〜０．５ｍｇ／ｍｌの範囲では、デンドリマーＮｏ．１２（５個のフィブリノーゲン結合ペプチド／デンドリマーを有する）がほぼ瞬時の凝固をもたらした。約０．０５〜０．３ｍｇ／ｍｌの範囲では、デンドリマーＮｏ．１１（４個のフィブリノーゲン結合ペプチド／デンドリマーを有する）もほぼ瞬時の凝固をもたらした。
【０１５７】
本発明のデンドリマーによりフィブリノーゲンが重合される速度は、デンドリマー当たりのフィブリノーゲン結合ペプチドの数が増加するに伴い、一般に増加すると結論付けられる。
【０１５８】
実施例８：フィブリノーゲン結合ペプチドの配向、および異なるフィブリノーゲン結合ペプチド配列の、フィブリノーゲンとの共重合速度に与える影響
フィブリノーゲン結合ペプチドの配向がペプチドデンドリマーのフィブリノーゲンと共重合する能力に影響を与えることがあり得るのかどうかを評価するために、単一の三官能性アミノ酸残基（リシン）に結合した３個のフィブリノーゲン結合ペプチドを含むペプチドデンドリマーを合成し（「３分岐」デンドリマーと呼ぶ）、そのフィブリノーゲン結合ペプチドの１個を、分岐コアに結合したアミノ末端に配向させ、そのカルボキシ末端をアミド化した。異なるフィブリノーゲン結合ペプチド配列を含むペプチドデンドリマーの、フィブリノーゲンと共重合する能力も試験した。
【０１５９】
ペプチドデンドリマーＮｏ．３および１０のフィブリノーゲン結合ペプチドは、それぞれの配列ＧＰＲＰＧ（配列番号１８）である。ペプチドデンドリマーＮｏ１０．のそれぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドは、分岐コアに結合したそのカルボキシ末端に配向している。ペプチドデンドリマーＮｏ３．の１個のフィブリノーゲン結合ペプチドは、分岐コアに結合したそのアミノ末端に配向している。そのペプチドのカルボキシ末端はアミド基を含む。
【０１６０】
ペプチドデンドリマーＮｏ８．の２個のフィブリノーゲン結合ペプチドは、配列ＧＰＲＰＧ（配列番号１８）であり、３番目のフィブリノーゲン結合ペプチドは、分岐コアに結合したそのアミノ末端に配向した、配列ＡＰＦＰＲＰＧ（配列番号２）である。そのペプチドのカルボキシ末端はアミド基を含む。
【０１６１】
ペプチドデンドリマーＮｏ９．の２個のフィブリノーゲン結合ペプチドは、配列ＧＰＲＰＦＰＡ（配列番号７）であり、３番目のフィブリノーゲン結合ペプチドは、分岐コアに結合したそのアミノ末端に配向した、配列ＡＰＦＰＲＰＧ（配列番号２）である。そのペプチドのカルボキシ末端はアミド基を含む。
【０１６２】
配列ＧＰＲＰＧ（配列番号１８）は、フィブリノーゲンのホール「ａ」およびホール「ｂ」に結合するが、ホール「ａ」に対する多少の選択性を有する。配列ＧＰＲＰＦＰＡ（配列番号７）は、高い選択的でフィブリノーゲンのホール「ａ」に結合する。配列Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏは、ペプチド鎖の主鎖を安定化し、ノブ−ホール相互作用の親和性を高める（Ｓｔａｂｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＬＯＯＤ，２０１０，１１６：１３５２−１３５９）。
【０１６３】
実施例６と同じ方法を使って、０．００５〜０．５ｍｇ／ｍｌの濃度範囲のそれぞれのデンドリマーに対し、デンドリマーのフィブリノーゲンと共重合する能力を評価した。図１２は、それぞれの異なるデンドリマーの濃度増加に対し得られた凝固時間（秒）のプロットを示す。
【０１６４】
結果は、ペプチドが分岐コアに結合したそのアミノ末端に配向するように、３分岐デンドリマーのフィブリノーゲン結合ペプチドの１個の配向を変えること（すなわち、デンドリマーＮｏ．３）が、デンドリマーのフィブリノーゲンを共重合する能力を低下させた（デンドリマーＮｏ．３の凝固時間をデンドリマーＮｏ．１０の凝固時間と比較して）ことを示している。しかし、より高いフィブリノーゲン濃度では、デンドリマーＮｏ．３は、フィブリノーゲンと共重合可能であった（データは示さず）。
【０１６５】
分岐コアに結合したアミノ末端に配向した異なる配列のフィブリノーゲン結合ペプチドを有する３分岐デンドリマーは、フィブリノーゲンと共重合することが可能であった（デンドリマーＮｏ．８に対する結果を参照）。
【０１６６】
選択的にフィブリノーゲンのホール「ｂ」と結合する配列（配列ＧＰＲＰＦＰＡ（配列番号７））を含み、分岐コアに結合したそれらのカルボキシ末端に配向した２個のフィブリノーゲン結合ペプチド、および分岐コアに結合したそのアミノ末端に配向したリバース配列（すなわち、ＡＰＦＰＲＰＧ（配列番号２））を含む別のペプチドを含む３分岐デンドリマー（デンドリマーＮｏ．９）も同様に、フィブリノーゲンと共重合する大きな活性があった。
【０１６７】
実施例９：異なるフィブリノーゲン結合ペプチド配列を有するペプチドデンドリマーの、フィブリノーゲンと共重合する能力
ＧＰＲＰＧ（配列番号１８）およびＧＰＲＰＦＰＡ（配列番号８）モチーフが主にフィブリノーゲンの「ａ」ホールに結合する。この実施例は、キメラペプチドデンドリマー（すなわち、同じ分岐コアに結合した異なるフィブリノーゲン結合ペプチド配列を有するペプチドデンドリマー）の、フィブリノーゲンと共重合する能力の評価について記載する。
【０１６８】
ペプチドデンドリマーＮｏ．１３は、配列ＧＰＲＰＧ−（配列番号１８）（これは「ａ」ホールに対する結合選択性を有する）を有する２個のフィブリノーゲン結合ペプチド、およびＧＨＲＰＹ−（配列番号１５）（これは「ｂ」ホールに対する結合選択性を有する）を有する２個のフィブリノーゲン結合ペプチドを含むキメラ４分岐ペプチドデンドリマーである。非キメラペプチドデンドリマーＮｏ．１１および１２は、それぞれ、４および５アームペプチドデンドリマーである。これらのデンドリマーのそれぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドは、配列ＧＰＲＰＧ−（配列番号１８）を有する。ペプチドデンドリマーＮｏ．１１、１２、および１３のそれぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドは、分岐コアに対しそのカルボキシ末端で結合している。
【０１６９】
実施例６と同じ方法を使って、０．００５〜０．５ｍｇ／ｍｌの濃度範囲のそれぞれのデンドリマーに対し、デンドリマーのフィブリノーゲンと共重合する能力を評価した。図１３は、それぞれの異なるデンドリマーの濃度増加に対し得られた凝固時間（秒）のプロットを示す。
【０１７０】
結果は、キメラデンドリマーを使った凝固速度は、０．３ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で、非キメラデンドリマーよりも遅かったことを示している。しかし、図１４は、異なるデンドリマーを使って得られたヒドロゲルの写真を示す。ゲルは、使用したペプチドデンドリマーの番号（１１、１２、および１３）で標識され、「Ｐ」は、いくつかのフィブリノーゲン結合ペプチドがヒト血清アルブミンに結合されている生成物を使って形成したヒドロゲルの標識である。キメラデンドリマーにより形成したヒドロゲルは、デンドリマーＮｏ．１１および１２（３ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲン、またはより高濃度のフィブリノーゲン）を使って形成されたヒドロゲルに比べて、より緻密で、より少ない流体を含んでいた。したがって、キメラデンドリマーを使った場合、凝固時間はより遅いが、このデンドリマーを使って形成されたヒドロゲルはより緻密であった。
【０１７１】
実施例１０：ペプチドデンドリマーおよびペプチド複合体の混合物のフィブリノーゲンと共重合する能力
配列ＧＰＲＰ−（配列番号５）のフィブリノーゲン結合ペプチドは、フィブリノーゲンの「ａ」ホールに強力におよび選択的に結合する（Ｌａｕｄａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８  ＰＮＡＳ  ７Ｓ）。ペプチド複合体Ｎｏ．１は、この配列を有する２個の、それぞれリジン残基に結合したフィブリノーゲン結合ペプチドを含む。第１のペプチドは、リジン残基へのリンカーによりそのカルボキシ末端に結合され、第２のペプチドは、リジン残基へのリンカーによりそのアミノ末端に結合される。第２のペプチドのカルボキシ末端はアミド基を含む。
【０１７２】
配列ＧＨＲＰＹ−（配列番号１５）のフィブリノーゲン結合ペプチドは、フィブリノーゲンの「ｂ」ホールに強力におよび選択的に結合する（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ａｎｄ  Ｐａｎｄｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００６，４５，２６５７−２６６７）。ペプチド複合体Ｎｏ．２は、リジン残基へのリンカーによりそのカルボキシ末端に結合した、この配列を有する第１のフィブリノーゲン結合ペプチドを含む。リバース配列（ＹＰＲＨＧ（配列番号１９））を有する第２のフィブリノーゲン結合ペプチドは、リジン残基へのリンカーによりそのアミノ末端に結合される。第２のペプチドのカルボキシ末端はアミド基を含む。
【０１７３】
リンカーは、ペプチドは相互に離れて伸長するのを可能にする。
【０１７４】
ペプチド複合体Ｎｏ．１または２（２ｍｇ／ｍｌ）をペプチドデンドリマーＮｏ．３または４、およびフィブリノーゲンと混合し、実施例６での記載と同じ方法を使って、０．０２５〜０．５ｍｇ／ｍｌの範囲のそれぞれのデンドリマーの濃度に対し、その混合物のフィブリノーゲンと共重合する能力を評価した。図１５は、それぞれの異なるデンドリマーの濃度増加に対し得られた凝固時間（秒）のプロットを示す。
【０１７５】
結果は、ペプチド複合体Ｎｏ．２（すなわち、Ｂ−ノブペプチドを有する）およびデンドリマーペプチドを含む混合物のみが、活性が相乗的で、増加したが、ペプチド複合体Ｎｏ．１（Ａ−ノブペプチド）は、ペプチド複合体Ｎｏ．２またはペプチドデンドリマーに添加した場合、活性ではなかったことを示している。
【０１７６】
実施例１１：ヒト血漿中でペプチドデンドリマーのフィブリノーゲンを重合する能力
ヒト血漿中で、いくつかの異なるペプチドデンドリマー（Ｎｏ．４、５、８、９、１０、１１、１２、１３）のフィブリノーゲンを重合する能力を試験した。
【０１７７】
３０μＬのそれぞれのデンドリマー（０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で）を３７℃で１００μＬのヒト血漿に加え、Ｓｉｇｍａ  Ａｍｅｌｕｎｇ  ＫＣ４  Ｄｅｌｔａ凝固分析装置を使ってフィブリノーゲンの重合を測定した。
【０１７８】
それぞれのデンドリマーに対する凝固時間を図１６に示し、また、ペプチドデンドリマーＮｏ．１０、１１、４、１２および１３がヒト血漿中でフィブリノーゲンを重合でき、デンドリマーＮｏ．１２が特に効果的であった（１秒未満の凝固時間）ことを示す。しかし、ペプチドデンドリマーＮｏ．５、８および９は、ヒト血漿中でフィブリノーゲンを重合できなかった。
【０１７９】
実施例１２：すぐに使えるペプチドデンドリマー配合物に対する殺菌の効果
この実施例は、ガンマ線照射の、水和ゼラチンを含むすぐに使えるペースト剤としてのペプチドデンドリマーの止血活性に与えるガンマ線照射の効果について記載している。
【０１８０】
ペプチドデンドリマーＮｏ．１２または１３の２ｍｌの溶液を、ＳＵＲＧＩＦＬＯ  Ｈａｅｍｏｓｔａｔｉｃ  Ｍａｔｒｉｘ（水和流動性ゼラチンマトリックス）と混合し、それぞれのペプチドのペースト剤を形成した。それぞれのペースト剤に、３０ｋＧｙの線量の６０Ｃｏガンマ線による照射により無菌化し、その後室温で貯蔵した。２および４週間の貯蔵後、無菌化ペースト剤試料を試験に使用した。
【０１８１】
貯蔵後、１０ｍＭのヘペス緩衝液を使って、それぞれのペースト剤からペプチドデンドリマーを抽出した。３０μＬのそれぞれ抽出物（約０．２５ｍｇ／ｍｌのペプチド濃度）を３ｍｇ／ｍｌのヒトフィブリノーゲン１００μＬに加え、Ｓｉｇｍａ  Ａｍｅｌｕｎｇ  ＫＣ４  Ｄｅｌｔａ凝固分析装置を使って、３７℃でそれぞれのデンドリマーのフィブリノーゲンを重合する能力（「凝固」活性）を測定した。非照射対照試料の重合活性も測定した。結果を下表にまとめている。
【表４】
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【０１８２】
結果は、本発明の、すぐに使えるペースト剤として配合された水和ゼラチンを含むペプチドデンドリマーは、照射による滅菌後、フィブリノーゲンを重合する能力を保持していることを示している。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年1月18日(2018.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2018516648.tif 000065
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