(57)【要約】  本開示により、プログラム細胞死１受容体（ＰＤ−１）のアンタゴニストと、ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドであるＴｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）アゴニストとを含む併用療法、およびがんの処置のための該併用療法の使用を説明する。【選択図】図１６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体にＰＤ−１アンタゴニストとＴＬＲ９アゴニストを含む併用療法を投与することを含む、個体のがんを処置するための方法であって、前記ＴＬＲ９アゴニストがＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドである方法。
【請求項２】
前記ＰＤ−１アンタゴニストがモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記個体がヒトであり、前記ＰＤ−１アンタゴニストが、ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合してヒトＰＤ−Ｌ１がヒトＰＤ−１に結合するのをブロックするモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記個体がヒトであり、前記ＰＤ−１アンタゴニストが、ヒトＰＤ−１に特異的に結合してヒトＰＤ−Ｌ１がヒトＰＤ−１に結合するのをブロックするモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＤ−１アンタゴニストがまた、ヒトＰＤ−Ｌ２がヒトＰＤ−１に結合するのもブロックする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＤ−１アンタゴニストが：（ａ）配列番号：１、２および３の軽鎖ＣＤＲと配列番号：４、５および６の重鎖ＣＤＲ；または（ｂ）配列番号：７、８および９の軽鎖ＣＤＲと配列番号：１０、１１および１２の重鎖ＣＤＲ；を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＤ−１アンタゴニストが、配列番号：７、８および９の軽鎖ＣＤＲと配列番号：１０、１１および１２の重鎖ＣＤＲを含むモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＤ−１アンタゴニストが、重鎖と軽鎖を含む抗ＰＤ−１モノクローナル抗体であり、そしてここで、前記重鎖が配列番号：２１を含み、前記軽鎖が配列番号：２２を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＤ−１アンタゴニストが、重鎖と軽鎖を含む抗ＰＤ−１モノクローナル抗体であり、そしてここで、前記重鎖が配列番号：２３を含み、前記軽鎖が配列番号：２４を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＤ−１アンタゴニストが、ペンブロリズマブ、ペンブロリズマブバリアントまたはニボルマブである、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドが：
（ａ）５’−Ｎｘ（ＴＣＧ（Ｎｑ））ｙＮｗ（Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ２’Ｘ１’（ＣＧ）ｐ）ｚ，Ｎｖ（配列番号：３８）であって、ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０、１、２または３、ｙ＝１、２、３または４、ｗ＝０、１または２、ｐ＝０または１、ｑ＝０、１または２、ｖ＝０〜８９およびｚ＝１〜２０であり、Ｘ１とＸ１’は自己相補型ヌクレオシドであり、そして、Ｘ２とＸ２’も自己相補型ヌクレオシドである；および
（ｂ）少なくとも８塩基長のパリンドローム配列であって、ここで、前記パリンドローム配列は（Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ２’Ｘ１’（ＣＧ）ｐ）ｚ配列の最初の（Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ２’Ｘ１’）を含む、
からなるものであり、前記オリゴヌクレオチドが１２〜１００塩基長である、
請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ｘ＝０、ｙ＝１、ｗ＝０、ｐ＝０または１、ｑ＝０、１または２、ｖ＝０〜２０およびｚ＝１、２、３または４である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドがＴＣＧＮｑ（Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ２’Ｘ１’ＣＧ）ｚＮｖ（配列番号：３９）からなり、ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｑ＝０、１、２、３、４または５、ｖ＝０〜２０、ｚ＝１〜４であり、Ｘ１とＸ１’は自己相補型ヌクレオシドであり、そして、Ｘ２とＸ２’も自己相補型ヌクレオシドであり、そしてここで、前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１２塩基長である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドが５’−ＴＣＧＮｑＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＮｓ−３’（配列番号：４０）からなり、ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｑ＝０、１、２、３または４、ｓ＝０〜２０であり、そしてここで、前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１２塩基長である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドが、５’−ＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＴ−３’（配列番号：４５）からなる配列を有する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴデオキシヌクレオチドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
さらに、前記個体に抗ＩＬ−１０抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗ＩＬ−１０抗体またはその抗原結合断片が：（ａ）配列番号：２６、２７および２８の軽鎖ＣＤＲと配列番号：２９、３０および３１の重鎖ＣＤＲを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗ＩＬ−１０抗体またはその抗原結合断片が、配列番号：３２および配列番号：３３の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗ＩＬ−１０抗体が、重鎖と軽鎖を含む抗ＩＬ−１０モノクローナル抗体であり、そしてここで、前記重鎖が配列番号：３４を含み、前記軽鎖が配列番号：３５を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗ＩＬ−１０抗体が、抗ＩＬ−１０  ｈｕｍ  １２Ｇ８であるかまたは抗ＩＬ−１０  ｈｕｍ  １２Ｇ８バリアントである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
がんと診断されたヒト個体の処置方法であって、前記個体にまずペンブロリズマブを投与した後、３週間後に、配列番号：４５からなるオリゴヌクレオチドを腫瘍内投与することを含む方法。
【請求項２３】
前記個体に、２００ｍｇのペンブロリズマブをＱ３Ｗで、１日目から開始して投与し、そして配列番号：４５のオリゴヌクレオチドを、２．０、４．０または８．０ｍｇの用量で、２２日目から開始して週に１回を４週間にわたって、続いて２．０、４．０または８．０ｍｇの用量で３週に１回、腫瘍内投与することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記個体が、抗ＰＤ−１療法もしくは抗ＰＤ−Ｌ１療法で以前に処置されたことがないかまたは抗ＰＤ−１の前治療を受けている間に進行が確認されている、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドが、５’−ＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＴ−３’（配列番号：４５）からなる配列とのナトリウム塩であり、そして、前記オリゴヌクレオチドがホスホロチオエート骨格を有するオリゴデオキシヌクレオチドである、請求項２２および２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドが、５’−ＴＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡ−３’（配列番号：４２）からなる配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記がんが、進行型もしくは転移性の黒色腫、腎細胞癌、非小細胞肺がん、膀胱がんまたは結腸直腸がんである、請求項１および２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＰＤ−１アンタゴニストがペンブロリズマブであり、そして、前記ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドが、５’−ＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＴ−３’（配列番号：４５）からなる配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＰＤ−１アンタゴニストがペンブロリズマブであり、前記ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドが、５’−ＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＴ−３’（配列番号：４５）からなる配列を有し、前記オリゴヌクレオチドがホスホロチオエート骨格を有するオリゴデオキシヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記がんが、進行型または転移性の黒色腫、腎癌、ＮＳＣＬＣ、膀胱がんおよび結腸直腸がんからなる群より選択される、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＰＤ−１アンタゴニストがペンブロリズマブであり、前記ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドが、５’−ＴＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡ−３’（配列番号：４２）からなる配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＰＤ−１アンタゴニストが、配列番号：７、８および９の軽鎖ＣＤＲと配列番号：１０、１１および１２の重鎖ＣＤＲを含むモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であり、前記ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドが：
（ａ）５’−Ｎｘ（ＴＣＧ（Ｎｑ））ｙＮｗ（Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ２’Ｘ１’（ＣＧ）ｐ）ｚ，Ｎｖ（配列番号：３８）であって、ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０、１、２または３、ｙ＝１、２、３または４、ｗ＝０、１または２、ｐ＝０または１、ｑ＝０、１または２、ｖ＝０〜８９およびｚ＝１〜２０であり、Ｘ１とＸ１’は自己相補型ヌクレオシドであり、そして、Ｘ２とＸ２’も自己相補型ヌクレオシドである；および
（ｂ）少なくとも８塩基長のパリンドローム配列であって、ここで、前記パリンドローム配列は（Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ２’Ｘ１’（ＣＧ）ｐ）ｚ配列の最初の（Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ２’Ｘ１’）を含む、
からなるものであり、前記オリゴヌクレオチドが１２〜１００塩基長である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの処置に有用な併用療法に関する。特に、本発明は、プログラム細胞死１タンパク質（ＰＤ−１）のアンタゴニストとＴｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）アゴニストであるＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドを含む併用療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＤ−１は、免疫調節および末梢性免疫寛容の維持における重要な分子であることが認知されている。ＰＤ−１はナイーブＴ、ＢおよびＮＫＴ細胞において中程度に発現され、リンパ球、単球および骨髄系細胞においてＴ／Ｂ細胞受容体シグナル伝達によって上方調節される（１）。
【０００３】
ＰＤ−１の２つの既知のリガンドであるＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）とＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ）は、種々の組織に発生するヒトのがんにおいて発現される。例えば、卵巣がん、腎がん、結腸直腸がん、膵臓がん、肝臓がんおよび黒色腫の大型の試料セットでは、ＰＤ−Ｌ１発現は予後不良と相関しており、その後の処置に関係なく全生存率が低下することが示された（２〜１３）。同様に、腫瘍浸潤リンパ球におけるＰＤ−１発現は、乳がんおよび黒色腫ではＴ細胞の機能不全の印であること（１４〜１５）、ならびに腎がんでは予後不良と相関していること（１６）がわかった。したがって、ＰＤ−Ｌ１発現腫瘍細胞は、ＰＤ−１発現Ｔ細胞と相互作用してＴ細胞の活性化を減弱させ、免疫監視機構を回避し、それにより、腫瘍に対する免疫応答の障害に寄与するということが提案されている。
【０００４】
ＰＤ−１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の一方または両方との相互作用を阻害するいくつかのモノクローナル抗体ががんの処置のために臨床開発されている。かかる抗体の有効性は、他の承認された、または実験的がん治療法、例えば、放射線、手術、化学療法剤、標的療法、腫瘍において調節不全状態の他のシグナル伝達経路を阻害する薬剤、および他の免疫増強剤と併用して投与した場合、増強されるかもしれないということが提案されている。
【０００５】
免疫賦活性配列として一般的に知られている特定のＤＮＡ配列の投与により、Ｔｈ１型偏向を伴う免疫応答が誘導され、これはＴｈ１関連サイトカインの分泌によって示される。免疫賦活性ポリヌクレオチドを抗原とともに投与すると、投与された抗原に対するＴｈ１型免疫応答がもたらされる。Ｒｏｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．３：８４９−８５４．例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ））のβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）（生理食塩水中またはアジュバントのミョウバン中）を皮内注射したマウスは、特異的ＩｇＧ１およびＩｇＥ抗体、ならびにＩＬ−４およびＩＬ−５を分泌するがＩＦＮ−γは分泌しないＣＤ４＋細胞が生成することによる応答を示し、Ｔ細胞が主にＴｈ２サブセットのものであることが示された。しかしながら、β−Ｇａｌをコードしており、免疫賦活性配列を含めたプラスミドＤＮＡ（生理食塩水中）を皮内注射した（または櫛型アプリケータで皮膚に傷をつけた）マウスは、ＩｇＧ２ａ抗体およびＩＦＮ−γを分泌するがＩＬ−４およびＩＬ−５は分泌しないＣＤ４＋細胞が生成することによる応答を示し、Ｔ細胞が主にＴｈ１サブセットのものであることが示された。さらに、プラスミドＤＮＡを注射したマウスによる特異的ＩｇＥの産生は６６〜７５％低かった。Ｒａｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：５１４１−５１４５。一般に、裸のＤＮＡでの免疫処置に対する応答は、Ｔｈ１型の応答を示す抗原刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２、ＴＮＦαおよびＩＦＮ−γの産生を特徴とする。これは、低いＩｇＥ産生によって示されるように、アレルギーおよび喘息の処置において特に重要である。免疫賦活性ポリヌクレオチドがＴｈ１型免疫応答を刺激できる能力は、細菌抗原、ウイルス抗原およびアレルゲンで実証されている（例えば、国際公開第９８／５５４９５号参照）。
【０００６】
当該技術分野において、がんの免疫療法の有効性を改善するための必要性が存在している。したがって、ＰＤ−１アンタゴニストと免疫賦活性オリゴヌクレオチド配列の併用療法を探求することが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第９８／５５４９５号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｒｏｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．３：８４９−８５４
【非特許文献２】Ｒａｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：５１４１−５１４５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一実施形態では、本発明により、個体にＰＤ−１アンタゴニストとＴＬＲ９アゴニストを含む併用療法を投与することを含む、個体のがんを処置するための方法であって、該ＴＬＲ９アゴニストがＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドである方法を提供する。
【００１０】
別の実施形態では、本発明により、ＴＬＲ９アゴニストとの併用における使用のためのＰＤ−１アンタゴニストを含む、がんを処置するための医薬であって、該ＴＬＲ９アゴニストがＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドである医薬を提供する。また別の実施形態では、本発明により、ＰＤ−１アンタゴニストとの併用における使用のためのＴＬＲ９アゴニストを含む、がんを処置するための医薬であって、該ＴＬＲ９アゴニストがＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドである医薬を提供する。
【００１１】
他の実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストと併用して投与する場合の個体のがんを処置するための医薬の製造におけるＰＤ−１アンタゴニストの使用、および、ＰＤ−１アンタゴニストと併用して投与する場合の個体のがんを処置するための医薬の製造におけるＴＬＲ９アゴニストの使用を提供する。かかる実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストはＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドである。
【００１２】
なおさらなる一実施形態で、本発明により、個体のがんを処置するための医薬の製造におけるＰＤ−１アンタゴニストとＴＬＲ９アゴニストの使用であって、該ＴＬＲ９アゴニストがＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドである使用を提供する。いくつかの実施形態では、該医薬はキットを含み、また、キットは、個体のがんを処置するためにＴＬＲ９アゴニストと併用してＰＤ−１アンタゴニストを使用するための使用説明を含む添付文書を備えている。
【００１３】
さらなる一実施形態では、上記で論考した併用療法の方法、医薬またはキットはさらに抗ＩＬ−１０抗体を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明において有用な例示的な抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖のＣＤＲのアミノ酸配列を示す（配列番号：１〜６）。
【図２】図２は、本発明において有用な別の例示的な抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖のＣＤＲのアミノ酸配列を示す（配列番号：７〜１２）。
【図３】図３は、本発明において有用な例示的な抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の重鎖可変領域および完全長の重鎖のアミノ酸配列を示す（配列番号：１３および配列番号：１４）。
【図４】図４は、本発明において有用な例示的な抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の別の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す（配列番号：１５〜１７）。
【図５】図５は、本発明において有用な例示的な抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の別の軽鎖のアミノ酸配列を示し、図５Ａは、Ｋ０９Ａ−Ｌ−１１軽鎖およびＫ０９Ａ−Ｌ−１６軽鎖のアミノ酸配列を示し（それぞれ、配列番号：１８および１９）、図５Ｂは、Ｋ０９Ａ−Ｌ−１７軽鎖のアミノ酸配列を示す（配列番号：２０）。
【図６】図６は、ペンブロリズマブの重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を示す（それぞれ、配列番号２１および２２）。
【図７】図７は、ニボルマブの重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を示す（それぞれ、配列番号２３および２４）。
【図８】図８は、抗ＩＬ−１０  ｈｕｍ１２Ｇ８のアミノ酸配列を示し、軽鎖配列は配列番号：３５であり、重鎖配列は配列番号：３４である。
【図９】図９は、抗ＩＬ−１０  ＴＣ４０．１１Ｄ８のアミノ酸配列を示し、軽鎖配列は配列番号：３７であり、重鎖配列は配列番号：３６である。
【図１０】図１０は、マウスＴＣ−１両側性腫瘍モデルにおける注入腫瘍の腫瘍成長を示す。パネルＡは、個々の動物の注入腫瘍の体積および一群あたりの完全退縮（ＣＲ）の数を示す。パネルＢは注入腫瘍の体積の中央値を示し、エラーバーは６８％信頼区間を示す。パネルＣは、日毎の処置群間の注入腫瘍の体積の比較を示す。パネルＤは、処置間の注入腫瘍の体積の比較の未調整および多重性調整したＰ値を示す。未調整ｐ値は、右側打ち切りデータのゲーハン−ブレスローノンパラメトリック統計検定のピトー／ピトーバージョンに基づいた両側ｐ値をいう。Ｐ値は、比較対象の２つの処置間に無作為に再割り付けした２０，０００匹の動物から推定した。多重性調整ｐ値は、所与の処置ペアについてすべての時間点におけるファミリーワイズエラー率を制御するために調整したｐ値をいう。調整は、ウェストフォールとヤングのｍａｘＴ手順を並べ替え分布に適用することにより行った。
【図１１】図１１は、マウスＴＣ−１両側性腫瘍モデルにおける非注入腫瘍の腫瘍成長を示す。パネルＡは、個々の動物の非注入腫瘍の体積および一群あたりの完全退縮（ＣＲ）の数を示す。パネルＢは非注入腫瘍の体積の中央値を示し、エラーバーは６８％信頼区間を示す。パネルＣは、日毎の処置群間の非注入腫瘍の体積の比較を示す。パネルＤは、処置間の非注入腫瘍の体積の比較の未調整および多重性調整したＰ値を示す。未調整ｐ値は、右側打ち切りデータのゲーハン−ブレスローノンパラメトリック統計検定のピトー／ピトーバージョンに基づいた両側ｐ値をいう。Ｐ値は、比較対象の２つの処置間に無作為に再割り付けした２０，０００匹の動物から推定した。多重性調整ｐ値は、所与の処置ペアについてすべての時間点におけるファミリーワイズエラー率を制御するために調整したｐ値をいう。調整は、ウェストフォールとヤングのｍａｘＴ手順を並べ替え分布に適用することにより行った。
【図１２】図１２は、Ｃ５９−０８での２４時間の処置によるヒトＰＢＭＣ（２例のドナー）におけるＩＦＮα２ａおよびＩＬ−１０の誘導を示す。
【図１３】図１３は、Ｃ５９−０８で２４時間の処置後のヒト腎細胞癌組織塊培養物におけるＩＦＮα誘導性遺伝子（パネルＡ）、サイトカイン（パネルＢ）および免疫活性化マーカー（パネルＣ）のｍＲＮＡ発現の誘導を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ＣＴ−２６結腸癌細胞を注射したマウスにおける腫瘍結節サイズの分布を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、腫瘍組織１グラムあたりの腫瘍浸潤白血球（ＴＩＬ）数を示す。有意性は、Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用して対応のない検定を用いて計算した。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、腫瘍サイズに対するＴ細胞の浸潤および活性化の種々のマーカーの遺伝子発現レベルを示す。
【図１４Ｄ】一方、図１４Ｄは、腫瘍組織内の種々のＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答性マーカーの遺伝子発現レベルを示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは平均腫瘍サイズを示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは生存率を示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、ＣＴ−２６結腸癌細胞を移植した種々の処置マウス群および非処置マウス群の生存率を示す。
【図１６】図１６は、ＣＤ４もしくはＣＤ８細胞の存在下もしくは非存在下で抗ＰＤ−１  Ａｂを全身投与してＣ５９−０８を腫瘍内投与したか、または非処置のままにしたかのいずれかのＣＴ−２６結腸癌細胞移植マウスの生存率を示す。
【図１７】図１７は、抗ＰＤ−１  Ａｂを全身投与してＣ５９−０８を腫瘍内投与したか、または非処置のままにしたかのいずれかの、ＣＴ−２６結腸癌細胞を両側移植したマウスの生存率を示す。
【図１８Ａ】図１８Ａは、種々の処置を施したＣＴ−２６結腸癌細胞移植マウスの腫瘍体積を対照オリゴヌクレオチド処置マウスの平均腫瘍体積と比較して示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ＣＤ４５＋腫瘍浸潤白血球のうちのＣＤ８＋  Ｔ細胞の割合、および腫瘍組織１グラムあたりのＣＤ８＋  Ｔ細胞の総数を示す。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、ＢＦＡの存在下でＰＭＡとイオノマイシン（粗い斜線のバー）またはＢＦＡ単独（密な斜線のバー）で３時間刺激した後の、細胞内染色およびＣＤ８＋Ｔ細胞にゲーティングしたフローサイトメトリーによって測定したときの、１５０，０００個の腫瘍浸潤白血球によるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの産生レベルを示す。図１８Ｃについて、Ｙ軸に表示した数値は、それぞれ下から上に−１０３、０、１０３、１０４、１０５であり、Ｘ軸に表示した数値は、それぞれ左から右に−１０３、０、１０３、１０４、１０５である。
【図１８Ｄ】図１８Ｄは、ＢＦＡの存在下でＰＭＡとイオノマイシン（粗い斜線のバー）またはＢＦＡ単独（密な斜線のバー）で３時間刺激した後の、細胞内染色およびＣＤ８＋Ｔ細胞にゲーティングしたフローサイトメトリーによって測定したときの、１５０，０００個の腫瘍浸潤白血球によるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの産生レベルを示す。
【図１９Ａ】図１９Ａは、Ｃ５９−０８を腫瘍内投与したか、または対照オリゴヌクレオチドを腫瘍内投与したかのいずれかのＣＴ−２６結腸癌細胞移植マウスの腫瘍成長曲線を示す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、Ｃ５９−０８または対照オリゴヌクレオチドのいずれかで処置したマウスの腫瘍浸潤白血球による種々のＩ型インターフェロン応答性遺伝子の発現レベルを示す。データを、ハウスキーピング遺伝子ユビキチンに対する目的遺伝子の相対サイクル閾値（ＣＴ）として示した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細説明
略号。本発明の詳細説明および実施例全体を通して、以下の略号を使用する：
ＢＯＲ    最良総合効果
ＢＩＤ    １回用量を１日２回
ＣＢＲ    臨床的有用率
ＣＤＲ    相補性決定領域
ＣＨＯ    チャイニーズハムスターの卵巣
ＣＲ    完全奏効
ＤＣＲ    病勢コントロール率
ＤＦＳ    無病生存期間
ＤＬＴ    用量制限毒性
ＤＯＲ    奏功期間
ＤＳＤＲ    長期病勢安定率
ＦＦＰＥ    ホルマリン固定パラフィン包埋
ＦＲ    フレームワーク領域
ＩｇＧ    免疫グロブリンＧ
ＩＨＣ    免疫組織化学または免疫組織化学的
ｉｒＲＣ    免疫関連効果判定基準
ＩＶ    静脈内
ＭＴＤ    最大耐用量
ＮＣＢＩ    米国立生物工学情報センター
ＮＣＩ    米国立がん研究所
ＯＲＲ    客観的奏効率
ＯＳ    全生存期間
ＰＤ    進行性疾患
ＰＤ−１    プログラム細胞死１
ＰＤ−Ｌ１    プログラム細胞死１リガンド１
ＰＤ−Ｌ２    プログラム細胞死１リガンド２
ＰＦＳ    無増悪生存期間
ＰＲ    部分奏功
Ｑ２Ｗ    １回用量を２週間毎
Ｑ３Ｗ    １回用量を３週間毎
ＱＤ    １回用量を１日１回
ＲＥＣＩＳＴ  固形癌効果判定基準
ＳＤ    病勢安定
ＶＨ    免疫グロブリン重鎖可変領域
ＶＫ    免疫グロブリンκ軽鎖可変領域。
【００１６】
Ｉ．定義
本発明がより容易に理解され得るように、一部の特定の科学技術用語を以下に具体的に定義する。本文書中の別の箇所に具体的に定義していない限り、本明細書で用いる他のすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
【００１７】
本明細書（添付の特許請求の範囲を含む）で用いる場合、単数形の語、例えば、“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”は、本文中にそうでないことを明記していない限り、その対応する複数の指示対象物を包含している。
【００１８】
「投与」は、動物、ヒト、実験被験体、細胞、組織、器官または体液に適用される場合、外来性の医薬用、治療用、診断用の薬剤または組成物と、動物、ヒト、被験体、細胞、組織、器官または体液との接触をいう。細胞の処理は、試薬と該細胞との接触ならびに該細胞と接触している体液と試薬との接触を包含している。用語「被験体」は、任意の生物体、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ）、最も好ましくはヒトを包含している。
【００１９】
本明細書で用いる場合、用語「抗体」は、所望の生物学的活性または結合活性を示す任意の形態の抗体をいう。したがって、これは、最も広い意味で用いており、具体的には、限定されないが、モノクローナル抗体（例えば、完全長モノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト化され、完全ヒト抗体、キメラ抗体およびラクダ化シングルドメイン抗体を包含している。「親抗体」は、意図された使用、例えば、ヒト用治療薬としての使用のための抗体のヒト化のために抗体修飾する前の、免疫系を抗原に曝露することによって得られる抗体である。
【００２０】
一般に、抗体の基本的な構造単位は四量体で構成されている。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖ペアを含むものであり、各ペアは、１つの“軽”鎖（約２５ｋＤａ）と１つの“重”鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有している。各鎖のアミノ末端部分には、主に抗原認識を担う約１００〜１１０個以上のアミノ酸の可変領域が含まれている。重鎖のカルボキシ末端部分には、主にエフェクター機能を担う定常領域が画定され得る。典型的には、ヒト軽鎖はκ軽鎖とλ軽鎖に分類される。さらに、ヒト重鎖は、典型的にはμ、δ、γ、αまたはεに分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥと抗体のアイソタイプを規定する。軽鎖および重鎖では、可変領域と定常領域が約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連接されており、また、重鎖には、約１０個多いアミノ酸の「Ｄ」領域も含まれている。一般的に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照のこと。
【００２１】
各軽鎖／重鎖ペアの可変領域は、抗体結合部位を形成している。したがって、一般に、インタクトな抗体は２つの結合部位を有している。二元機能性または二重特異性の抗体の場合を除き、この２つの結合部位は一般に同じである。
【００２２】
典型的には、重鎖の可変ドメインおよび軽鎖の可変ドメインにはどちらも相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される３つの超可変領域が含まれており、これらは、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）内に存在している。ＣＤＲは通常、フレームワーク領域と一直線上であり、特異的エピトープとの結合が可能になっている。一般に、Ｎ末からＣ末端に向かって、軽鎖の可変ドメインおよび重鎖の可変ドメインはともに、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインに対するアミノ酸の指定は、一般的に、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；５ｔｈ  ｅｄ．；ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）；Ｋａｂａｔ（１９７８）Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．３２：１−７５；Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９−６６１６；Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７またはＣｈｏｔｈｉａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３の規定に従う。
【００２３】
本明細書で用いる場合、特に記載のない限り、「抗体断片」または「抗原結合断片」は、抗体の抗原結合断片、すなわち、完全長抗体が結合する抗原に対する特異的結合能を保持している抗体断片、例えば、１つ以上のＣＤＲ領域を保持している断片をいう。抗体結合断片の例としては、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子、例えばｓｃ−Ｆｖ；抗体断片で形成されたナノボディならびに多重特異性抗体が挙げられる。
【００２４】
指定の標的タンパク質「に特異的に結合する」抗体は、他のタンパク質と比べて該標的に対して優先的結合性を示す抗体であるが、この特異性は絶対的な結合特異性を要するものではない。抗体は、その結合によって試料中の標的タンパク質の存在が確定的である場合、例えば、偽陽性などの望まない結果をもたらさない場合、その目的の標的に対して「特異的」とみなす。本発明において有用な抗体またはその結合断片は、標的タンパク質に、非標的タンパク質との親和性よりも少なくとも２倍大きい、好ましくは少なくとも１０倍大きい、より好ましくは少なくとも２０倍大きい、最も好ましくは少なくとも１００倍大きい親和性で結合するものである。本明細書で用いる場合、抗体が所与のアミノ酸配列、例えば、成熟ヒトＰＤ−１またはヒトＰＤ−Ｌ１分子のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合すると言えるのは、これが、該配列を含むポリペプチドに結合するが該配列がないタンパク質には結合しない場合である。
【００２５】
「キメラ抗体」は、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の種（例えば、ヒト）に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるが、該鎖（１つまたは複数）の残部が別の種（例えば、マウス）に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である抗体、ならびにかかる抗体の断片（所望の生物学的活性を示す場合に限る）をいう。
【００２６】
「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンタンパク質の配列のみを含む抗体をいう。ヒト抗体は、マウス、マウス細胞またはマウス細胞由来のハイブリドーマで産生させた場合、マウス糖鎖を含有している場合があり得る。同様に、「マウス抗体」または「ラット抗体」は、それぞれ、マウス免疫グロブリン配列のみ、またはラット免疫グロブリン配列のみを含む抗体をいう。
【００２７】
「ヒト化抗体」は、非ヒト（例えば、マウス）抗体由来の配列ならびにヒト抗体由来の配列が含まれた形態の抗体をいう。かかる抗体に含まれている非ヒト免疫グロブリン由来の配列は最小限である。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含むものであり、超可変ループの全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのものに対応しており、ＦＲ領域の全部または実質的に全部がヒト免疫グロブリン配列のものである。また、ヒト化抗体は、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部分を含むものであってもよい。ヒト化抗体を齧歯類の親抗体と区別する必要がある場合、抗体クローンの表記に接頭辞“ｈｕｍ”、“ｈｕ”または“ｈ”を付けている。齧歯類抗体のヒト化形態は、一般的には齧歯類の親抗体と同じＣＤＲ配列を含むものであるが、親和性を高めるため、ヒト化抗体の安定性を高めるため、または他の理由で特定のアミノ酸置換を含めてもよい。
【００２８】
「抗腫瘍応答」は、治療レジメン、例えば本明細書に記載の併用療法で処置したがん患者に言及している場合、少なくとも１つのプラスの治療効果、例えば、がん細胞の数の低減、腫瘍サイズの低減、末梢器官内へのがん細胞浸潤の速度の低下、腫瘍転移もしくは腫瘍成長の速度の低下、または無増悪生存率などを意味する。がんにおけるプラスの治療効果は、いくつかの様式で測定することができる（Ｗ．Ａ．Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ｎｕｌｌ．Ｍｅｄ．５０：１Ｓ−１０Ｓ（２００９）；Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）参照）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の併用療法に対する抗腫瘍応答は、ＲＥＣＩＳＴ  １．１基準、２次元（ｂｉｄｉｍｅｎｔｉｏｎａｌ）ｉｒＲＣまたは１次元ｉｒＲＣを用いて評価される。いくつかの実施形態では、抗腫瘍応答はＳＤ、ＰＲ、ＣＲ、ＰＦＳまたはＤＦＳのいずれかである。
【００２９】
「２次元ｉｒＲＣ」は、固形腫瘍における免疫療法活性の評価のためのＷｏｌｃｈｏｋ  ＪＤ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓに記載の一組の基準：免疫関連効果判定基準をいう。Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００９；１５（２３）：７４１２−７４２０。この基準は、各病変部の最大直径とこれに垂直な最大直径を掛け算することにより得られる標的病変部の２次元腫瘍測定値（ｃｍ２）を利用するものである。
【００３０】
「生物療法剤」は、腫瘍の維持および／または成長をサポートするか、あるいは抗腫瘍免疫応答を抑制する任意の生物学的経路におけるリガンド／受容体シグナル伝達をブロックする生物学的分子、例えば、抗体または融合タンパク質を意味する。生物療法剤の類型としては、限定されないが、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、他の増殖因子受容体、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＣＤ−４０Ｌ、ＣＴＬＡ−４、ＯＸ−４０、４−１ＢＢおよびＩＣＯＳに対する抗体が挙げられる。
【００３１】
用語「がん」、「がん性」または「悪性」は、典型的には無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態をいう、または示す。がんの例としては、限定されないが：心臓：肉腫（血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫および奇形腫；肺：気管支原性癌（扁平上皮細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞（細気管支）癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫；胃腸：食道（扁平上皮細胞癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（癌、リンパ腫、平滑筋肉腫）、膵臓（腺管癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）、小腸（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）結腸直腸；尿生殖路：腎臓（腺癌、ウィルムス腫瘍［腎芽腫］、リンパ腫、白血病）、膀胱および尿道（扁平上皮細胞癌、移行上皮癌、腺癌）、前立腺（腺癌、肉腫）、精巣（セミノーマ、奇形腫、胎児性癌、奇形癌、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、線維腫、線維腺腫、類腺腫瘍、脂肪腫）；肝臓：ヘパトーマ（肝細胞癌）、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫；骨：骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫  脊索腫、骨軟骨腫（ｏｓｔｅｏｃｈｒｏｎｆｒｏｍａ）（骨軟骨性外骨症）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液性線維腫、類骨骨腫および巨細胞腫；神経系：頭蓋（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、グリオマトーシス）、脳（星状細胞腫、髄芽細胞腫、神経膠腫、上衣細胞腫、胚細胞腫［松果体腫］、多形性膠芽腫、乏突起膠腫、シュワン細胞腫、網膜芽腫、先天性腫瘍）、脊髄神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫）；婦人科系：子宮（子宮内膜癌）、子宮頸部（子宮頸癌、前腫瘍性子宮頸部形成異常）、卵巣（卵巣癌［漿液性嚢胞腺癌、ムチン性嚢胞腺癌、分類不能型の癌］、顆粒膜細胞腫、セルトリ−ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰（扁平上皮細胞癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫）、膣（明細胞癌、扁平上皮細胞癌、ブドウ状肉腫（胎児性横紋筋肉腫）、卵管（癌）、乳房；血液系：血液（骨髄性白血病［急性および慢性］、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫［悪性リンパ腫］；皮膚：悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、カポジ肉腫、異形成母斑（ｍｏｌｅｓ  ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｎｅｖｉ）、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬；ならびに副腎：神経芽細胞腫が挙げられる。別の実施形態では、がんは、癌腫、リンパ腫、白血病、芽細胞腫および肉腫である。かかるがんのより特別な例としては、扁平上皮細胞癌、骨髄腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫、胃腸（管）のがん、腎がん、卵巣がん、肝臓がん、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、結腸直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、前立腺がん、甲状腺がん、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓がん、多形性膠芽腫、子宮頚部がん、脳のがん、胃がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん、結腸癌および頭頸部がんが挙げられる。がんの別の特別な例としては腎細胞癌が挙げられる。がんのまた別の特別な例は、非ホジキンリンパ腫または皮膚Ｔ細胞リンパ腫である。がんのまた別の特別な例は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または骨髄異形成症候群である。本発明に従って処置され得るがんとしては、試験対象組織試料中においてＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２の一方または両方の高値発現を特徴とするものが挙げられる。
【００３２】
「ＣｐＧ−Ｃ  ＯＮ」または「ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチド」は、１２〜１００塩基長のオリゴヌクレオチドであって、１つ以上の５’−ＴＣＧトリヌクレオチド（ここで、５’−Ｔは、該オリゴヌクレオチドの５’末端から０、１、２または３塩基側に位置している）と、１つ以上の非メチル化ＣＧジヌクレオチドを含む少なくとも８塩基長の少なくとも１つのパリンドローム配列とを有する。１つ以上の５’−ＴＣＧトリヌクレオチド配列は、該パリンドローム配列の５’末端から０、１または２塩基、離れていてもよく、又は、該パリンドローム配列は、１つ以上の５’−ＴＣＧトリヌクレオチド配列の全部または一部を含んでいてもよい。一実施形態では、該オリゴヌクレオチドは、オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。一実施形態では、該オリゴヌクレオチドは、２’−オリゴデオキシヌクレオチドである。ＣｐＧ−Ｃ  ＯＤＮは、Ｂ細胞を刺激し、形質細胞様樹状細胞（ＰＤＣ）の成熟を誘導し、高レベルのＩ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γなど）の分泌を引き起こす能力を有する。いくつかの実施形態では、ＣｐＧ−Ｃ  ＯＤＮは、１２〜１００塩基長、好ましくは１２〜５０塩基長、好ましくは１２〜４０塩基長または好ましくは１２〜３０塩基長である。いくつかの実施形態では、ＯＤＮは、少なくとも（下限が）１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３４、３６、３８、４０、５０、６０、７０、８０または９０塩基長である。いくつかの実施形態では、ＯＤＮは、最長（上限が）１００、９０、８０、７０、６０、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１または３０塩基長である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのパリンドローム配列は、８〜９７塩基長、好ましくは８〜５０塩基長または好ましくは８〜３２塩基長である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのパリンドローム配列は、少なくとも（下限が）８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８または３０塩基長である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのパリンドローム配列は、最長（上限が）５０、４８、４６、４４、４２、４０、３８、３６、３４、３２、３０、２８、２６、２４、２２、２０、１８、１６、１４、１２または１０塩基長である。一実施形態では、該オリゴヌクレオチドはオリゴデオキシヌクレオチドである。一実施形態では、ＣｐＧ−Ｃ  ＯＤＮのヌクレオチド間結合の１つ以上は、修飾された結合である。一実施形態では、ＣｐＧ−Ｃ  ＯＤＮのヌクレオチド間結合の１つ以上がホスホロチオエート（ＰＳ）結合である。一実施形態では、ＣｐＧ−Ｃ  ＯＤＮのヌクレオチド間結合のすべてがホスホロチオエート（ＰＳ）結合である。ホスホロチオエート骨格は、ＣｐＧ−Ｃ  ＯＤＮのヌクレオチド間結合のすべてがホスホロチオエート（ＰＳ）結合であるものをいう。
【００３３】
本明細書において論考しているＣｐＧ−Ｃ型ＯＤＮおよび配列番号：３８〜５１は、特に記載のない限り、その薬学的に許容され得る塩の形態である。例示的な塩基性の塩としては、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えば、ナトリウム、リチウムおよびカリウムの塩、アルカリ土類金属塩、例えば、カルシウムおよびマグネシウムの塩、亜鉛塩、有機塩基（例えば、有機アミン）、例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｄ−グルカミン、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、コリン、トロメタミン、ジシクロヘキシルアミン、ｔ−ブチルアミンとの塩、ならびにアミノ酸、例えば、アルギニン、リジンとの塩などが挙げられる。一実施形態では、ＣｐＧ−Ｃ型ＯＤＮは、アンモニウム、ナトリウム、リチウムまたはカリウムの塩の形態である。好ましい一実施形態では、ＣｐＧ−Ｃ型ＯＤＮはナトリウム塩の形態である。ＣｐＧ−Ｃ  ＯＤＮを、薬学的に許容され得る賦形剤を含む液状医薬で提供してもよい。あるいはまた、ＣｐＧ−Ｃ  ＯＤＮを凍結乾燥固形物として提供してもよく、これは、後で投与前に、滅菌水、生理食塩水または薬学的に許容され得るバッファーで再構成される。
【００３４】
本開示の薬学的に許容され得る賦形剤としては、例えば、溶媒、増量剤、緩衝剤、張度調整剤および保存料が挙げられる（例えば、Ｐｒａｍａｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａ  Ｔｉｍｅｓ，４５：６５−７７，２０１３参照）。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、溶媒、増量剤、緩衝剤および張度調整剤のうちの１種類以上としての機能を果たす賦形剤を含むものであり得る（例えば、生理食塩水中の塩化ナトリウムは水性ビヒクルと張度調整剤の両方の機能を果たし得る）。本開示の医薬組成物は非経口投与に適している。
【００３５】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は溶媒として水性ビヒクルを含む。好適なビヒクルとしては、例えば、滅菌水、生理食塩水液、リン酸緩衝生理食塩水およびリンゲル液が挙げられる。いくつかの実施形態では、該組成物は等張性である。
【００３６】
医薬組成物に増量剤を含めてもよい。増量剤は、医薬組成物が投与前に凍結乾燥させる場合に特に有用である。いくつかの実施形態では、増量剤は、凍結乾燥もしくは噴霧乾燥中および／または保存中の活性薬剤の安定化およびその分解の抑制を補助する保護剤である。好適な増量剤は、糖類（単糖類、二糖類および多糖類）、例えば、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビタール（ｓｏｒｂｉｔａｌ）、グルコースおよびラフィノースである。
【００３７】
医薬組成物に緩衝剤を含めてもよい。緩衝剤は、加工処理中、保存中および場合によっては再構成中における活性薬剤の分解を抑止するためにｐＨを制御する。好適なバッファーとしては、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩または硫酸塩を含む塩が挙げられる。他の好適なバッファーとしては、例えばアミノ酸、例えば、アルギニン、グリシン、ヒスチジンおよびリジンが挙げられる。緩衝剤はさらに、塩酸または水酸化ナトリウムを含むものであってもよい。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、組成物のｐＨを４〜９の範囲内に維持するものである。いくつかの実施形態では、ｐＨは、（下限が）４、５、６、７または８より大きい。いくつかの実施形態では、ｐＨは、（上限が）９、８、７、６または５未満である。すなわち、ｐＨは、下限が上限より小さい約４〜９の範囲である。
【００３８】
医薬組成物に張度調整剤を含めてもよい。好適な張度調整剤としては、例えば、デキストロース、グリセロール、塩化ナトリウム、グリセリンおよびマンニトールが挙げられる。
【００３９】
医薬組成物に保存料を含めてもよい。好適な保存料としては、例えば、酸化防止剤および抗菌剤が挙げられる。しかしながら、好ましい実施形態では、医薬組成物は滅菌条件下で調製されて単回使用の容器に入れられ、したがって保存料を含める必要はない。
【００４０】
用語「パリンドローム配列」または「パリンドローム」は、逆向きの反復配列、例えばＡＢＣＤＤ’Ｃ’Ｂ’Ａ’である核酸配列をいい、このとき、塩基、例えば、ＡとＡ’、ＢとＢ’、ＣとＣ’、ＤとＤ’は、ワトソン−クリック型塩基対を形成し得る。かかる配列は一本鎖であってもよく、二本鎖構造を形成するものであってもよく、又は、なんらかの条件下でヘアピン型ループ構造を形成するものであってもよい。例えば、本明細書で用いる場合、「８塩基型パリンドローム」は、パリンドローム配列が８塩基長である核酸配列、例えば、ＡＢＣＤＤ’Ｃ’Ｂ’Ａ’をいう。パリンドローム配列は、非パリンドローム配列も含んでいるオリゴヌクレオチドの一部であってもよい。オリゴヌクレオチドは、１つ以上のパリンドローム配列部分と１つ以上の非パリンドローム配列部分を含むものであってもよい。あるいはまた、オリゴヌクレオチド配列は、完全にパリンドロームであってもよい。１つより多くのパリンドローム配列部分を有するオリゴヌクレオチドでは、パリンドローム配列部分が互いにオーバーラップしていてもそうでなくてもよい。
【００４１】
一実施形態では、本開示のＣｐＧ−Ｃ  ＯＤＮは：
（ａ）５’−Ｎｘ（ＴＣＧ（Ｎｑ））ｙＮｗ（Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ２’Ｘ１’（ＣＧ）ｐ）ｚ，Ｎｖ（配列番号：３８）であって、ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０、１、２または３、ｙ＝１、２、３または４、ｗ＝０、１または２、ｐ＝０または１、ｑ＝０、１または２、ｖ＝０〜８９およびｚ＝１〜２０であり、Ｘ１とＸ１’は自己相補型ヌクレオシドであり、Ｘ２とＸ２’は自己相補型ヌクレオシドであり、（ＴＣＧ（Ｎｑ））ｙ配列の５’−Ｔは該オリゴヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基側である；および
（ｂ）少なくとも８塩基長のパリンドローム配列であって、ここで、該パリンドローム配列は（Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ２’Ｘ１’（ＣＧ）ｐ）ｚ（配列番号：５６）配列の最初の（Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ２’Ｘ１’）（配列番号：５５）を含む、
を含み、該ＯＤＮは１２〜１００塩基長である。いくつかの実施形態では、ｘ＝０、ｙ＝１、ｗ＝０、ｐ＝０または１、ｑ＝０、１または２、ｖ＝０〜２０およびｚ＝１、２、３または４である。いくつかの実施形態では、Ｘ１とＸ２が各々ＡまたはＴのいずれかである。いくつかの実施形態では、該パリンドローム配列は、３分の１より多くがＡとＴの塩基組成を有する。いくつかの実施形態では、ＣｐＧ−Ｃ  ＯＤＮは、配列番号：３８〜５１からなる群より選択される配列を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、本開示のＣｐＧ−Ｃ  ＯＤＮは、ＴＣＧＮｑ（Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ２’Ｘ１’ＣＧ）ｚＮｖ（配列番号：３９）からなり、ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｑ＝０、１、２、３、４または５、ｖ＝０〜２０、ｚ＝１〜４であり、Ｘ１とＸ１’は自己相補型ヌクレオシドであり、Ｘ２とＸ２’は自己相補型ヌクレオシドであり、該ＯＤＮは、少なくとも１２塩基長である。いくつかの実施形態では、ＣｐＧ−Ｃ  ＯＤＮは、配列番号：３８〜５１からなる群より選択される配列からなる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本開示のＣｐＧ−Ｃ  ＯＤＮは、５’−ＴＣＧＮｑＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＮｓ−３’（配列番号：４０）からなり、ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｑ＝０、１、２、３、４または５、ｓ＝０〜２０であり、該ＯＤＮは、少なくとも１２塩基長である。一実施形態では、ｓ＝０、１、２、３、４または５である。いくつかの実施形態では、ＣｐＧ−Ｃ  ＯＤＮは、
５’−ＴＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡ−３’（配列番号：４２）ｑ＝０およびｓ＝４、
５’−ＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴ−３’（配列番号：４３）ｑ＝４およびｓ＝０、
５’−ＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＴ−３’（配列番号：４５）ｑ＝４およびｓ＝５、
５’−ＴＣＧＴＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＡ−３’（配列番号：４６）ｑ＝５およびｓ＝１、ならびに
５’−ＴＣＧＴＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴ−３’（配列番号：４７）ｑ＝５およびｓ＝０
からなる群より選択される配列からなる。
【００４４】
一実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストは、配列５’−ＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＴ−３’（配列番号：４５）からなるＣｐＧ−Ｃ  ＯＤＮである。別の実施形態では、ＣｐＧ−Ｃ  ＯＤＮは、５’−ＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＴ−３’（配列番号：４５）のナトリウム塩である。さらなる一実施形態では、ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドは、５’−ＴＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡ−３’（配列番号：４２）からなる配列を有する。さらなる一実施形態では、ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドは、５’−ＴＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡ−３’（配列番号：４２）のナトリウム塩である。
【００４５】
別の実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストのＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドは：
５’−ＴＣＧＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡＴ−３’（配列番号：４１）；
５’−ＴＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡ−３’（配列番号：４２）；
５’−ＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴ−３’（配列番号：４３）；
５’−ＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＴＴＴＴ−３’（配列番号：４４）；
５’−ＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＴ−３’（配列番号：４５）；
５’−ＴＣＧＴＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＡ−３’（配列番号：４６）；
５’−ＴＣＧＴＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴ−３’（配列番号：４７）；
５’−ＴＣＧＴＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴ−３’（配列番号：４８）；
５’−ＴＣＧＴＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧ−３’（配列番号：４９）；
５’−ＴＣＧＴＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣ−３’（配列番号：５０）；および
５’−ＴＣＧＴＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡ−３’（配列番号：５１）
からなる群より選択される。
【００４６】
表１  ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドのモチーフおよび配列
【表１】
2018516911.tif 000003
【００４７】
本明細書に記載の式または配列モチーフに関して、あらゆるすべてのパラメータは独立して選択されることは理解されよう。例えば、ｘ＝０〜２である場合、ｙは、該オリゴヌクレオチドの全長の制限が満たされている限り、ｘ（または式中の任意の他の選択可能なパラメータ）の値に関係なく独立して選択され得る。
【００４８】
本開示のモチーフに包含される配列を有するさらなるＣｐＧ−Ｃオリゴヌクレオチドも、本明細書に開示した方法および医薬における使用に適している。本開示のモチーフに包含される配列を有する複数のさらなるＣｐＧ−Ｃオリゴヌクレオチドが、米国特許第７，７４５，６０６号、同第８，１５８，７６８号および同第８，８７１，７３２（Ｄｙｎａｖａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのもの）に記載されている。これらの配列は引用により本明細書に組み込まれる。
【００４９】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは当該技術分野において報告されており、その活性は、免疫応答の種々の側面（例えば、サイトカイン分泌、抗体産生、ＮＫ細胞活性化、Ｂ細胞増殖、Ｔ細胞増殖など）を測定する標準的なアッセイを用いて容易に測定され得る。例示的な方法は、国際公開第９７／２８２５９号；国際公開第９８／１６２４７号；国際公開第９９／１１２７５号、国際公開第９８／５５４９５号および国際公開第００／６１１５１号、ならびに米国特許第７，７４５，６０６号、同第８，１５８，７６８号および同第８，８７１，７３２号（Ｄｙｎａｖａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのもの）に記載されている。したがって、これらおよび他の方法が、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの免疫調節活性を検出および定量するために使用され得る。
【００５０】
ＣｐＧ−Ｃオリゴヌクレオチドは修飾を含むものであってもよい。好適な修飾としては、限定されないが、３’ＯＨまたは５’ＯＨ基の修飾、ヌクレオチドの塩基の修飾、糖成分の修飾およびリン酸基の修飾が挙げられる。修飾塩基は、修飾塩基（１個または複数）がワトソン−クリック型塩基対合するその天然の相補鎖に対して同じ特異性を保持している（例えば、ＣｐＧ−Ｃオリゴヌクレオチドのパリンドローム部分が自己相補型のままである）限り、パリンドローム配列内に含めてもよい。
【００５１】
ＣｐＧ−Ｃオリゴヌクレオチドは線形であってもよく、環状であってもよく、環状部分および／またはヘアピン型ループを含むものであってもよい。ＣｐＧ−Ｃオリゴヌクレオチドは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。ＣｐＧ−ＣオリゴヌクレオチドはＤＮＡであってもＲＮＡであってもＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであってもよい。
【００５２】
ＣｐＧ−Ｃオリゴヌクレオチドは、天然に存在する塩基を含むものであっても、天然に存在しない修飾塩基を含むものであってもよく、修飾された糖、リン酸基および／または末端を含むものであってもよい。例えば、ホスホジエステル結合に加えて、リン酸基の修飾としては、限定されないが、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート（橋状または非橋状）、ホスホトリエステルおよびホスホロジチオエートが挙げられ、任意の組み合わせで使用され得る。いくつかの実施形態では、ＣｐＧ−Ｃオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合のみ、ホスホジエステル結合のみ、またはホスホジエステル結合とホスホロチオエート結合の組み合わせを有する。
【００５３】
また、当分野で知られた糖修飾体、例えば、２’−アルコキシ−ＲＮＡアナログ、２’−アミノ−ＲＮＡアナログ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、および２’−アルコキシ−またはアミノ−ＲＮＡ／ＤＮＡキメラならびに本明細書に記載の他のものを作製してもよく、任意のリン酸基修飾と組み合わされ得る。塩基修飾の例としては、限定されないが、ＣｐＧ−ＣオリゴヌクレオチドのシトシンのＣ−５および／またはＣ−６への電子求引性部分の付加（例えば、５−ブロモシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ヨードシトシン）ならびにＣｐＧ−ＣオリゴヌクレオチドのウラシルのＣ−５および／またはＣ−６への電子求引性部分の付加（例えば、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ヨードウラシル）が挙げられる。上記のように、ＣｐＧ−Ｃオリゴヌクレオチドのパリンドローム配列内における塩基修飾の使用は、ワトソン−クリック型塩基対合に関与する塩基の自己相補性に支障はないはずである。しかしながら、パリンドローム配列以外では、修飾塩基は、このような制限なく使用され得る。例えば、２’−Ｏ−メチル−ウリジンおよび２’−Ｏ−メチル−シチジンはパリンドローム配列以外で使用するのがよいが、５−ブロモ−２’−デオキシシチジンは、パリンドローム配列の内外のどちらにも使用され得る。パリンドローム配列の内外のどちらにも使用され得る他の修飾ヌクレオチドとしては、７−デアザ−８−アザ−ｄＧ、２−アミノ−ｄＡおよび２−チオ−ｄＴが挙げられる。
【００５４】
ほとんどのオリゴヌクレオチドの二重鎖（すなわち、二本鎖）形態とヘアピン型形態は動的平衡であり、低オリゴヌクレオチド濃度および高温では、ヘアピン型形態の方が一般的に有利である。共有結合性の鎖間架橋または鎖内架橋は、それぞれ、二重鎖またはヘアピン型の安定性を、熱−、イオン−、ｐＨ−および濃度−誘導的に立体構造変化する方向に増大させる。化学的架橋は、物理化学的および生物学的特性評価のためにポリヌクレオチドを二重鎖またはヘアピン型形態のいずれかにロックするために使用され得る。立体構造的に均一であり、その最も活性な形態（二重鎖またはヘアピン型形態のいずれか）に「ロックされた」架橋オリゴヌクレオチドは、潜在的にその非架橋対応物よりも活性となり得る。したがって、本開示の一部のＣｐＧ−Ｃオリゴヌクレオチドは、共有結合性の鎖間架橋および／または鎖内架橋を含む。
【００５５】
二重鎖ＤＮＡを化学的架橋させるためのさまざまな様式が、当該技術分野において知られている。架橋されたポリヌクレオチド産物が所望の免疫調節活性を有している限り、任意の架橋方法が使用され得る。例えば、一例の方法では、二重鎖またはヘアピン型の末端の２個の対向するチミジン間にジスルフィド結合をもたらす。この架橋方法では、目的のオリゴヌクレオチド（１つまたは複数）は、５’−ＤＭＴ−Ｎ３−（ｔＢｕ−ＳＳ−エチル）チミジン−３’−ホスホルアミダイト（“Ｔ＊”）を用いて合成される。ジスルフィド結合を形成するため、混合型ジスルフィド結合を還元し、オリゴヌクレオチドを精製し、鎖をハイブリダイズさせ、化合物を空気酸化させると、ヘアピン型形態の場合は鎖内架橋が、または二重鎖形態の場合は鎖間架橋が形成される。あるいはまた、オリゴヌクレオチドをまずハイブリダイズさせ、次いで還元し、精製し、空気酸化させてもよい。かかる方法および他のものは当該技術分野において報告されている（例えば、Ｇｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ，５６：６７４６−６７４７，１９９１，Ｇｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，１１４：５４４７−５４４８，１９９２，Ｇｏｏｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３５：１６４７−１６５０，１９９４，Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，１１７：２９８１−２９９１，１９９５，Ｏｓｂｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，６：２３３９−２３４２，１９９６およびＯｓｂｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，１１８：１１９９３−１２００３，１９９６参照）。
【００５６】
別の架橋方法では、二重鎖またはヘアピン型構造内のオフセット残基間にジスルフィド結合を形成する。この架橋方法では、目的のオリゴヌクレオチド（１つまたは複数）は、コンバーチブル（ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅ）ヌクレオシド（例えば、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから市販されている）を用いて合成される。この方法では、例えば、Ａ−Ａジスルフィド結合またはＣ−Ａジスルフィド結合を使用し、また、他の塩基による結合も可能である。ジスルフィド修飾ポリヌクレオチドを形成するため、コンバーチブルヌクレオシドを含むポリヌクレオチドをシスタミン（または他のジスルフィド含有アミン）と反応させる。ジスルフィド結合を形成するため、混合型ジスルフィド結合を還元し、オリゴヌクレオチドを精製し、鎖をハイブリダイズさせ、化合物を空気酸化させると、ヘアピン型形態の場合は鎖内架橋が、または二重鎖形態の場合は鎖間架橋が形成される。あるいはまた、オリゴヌクレオチドをまずハイブリダイズさせ、次いで還元し、精製し、空気酸化させてもよい。かかる方法は当該技術分野において報告されている（例えば、Ｆｅｒｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，１１３：４０００−４００２，１９９１およびＦｅｒｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，１１５：９００６−９０１４，１９９３参照）。
【００５７】
ポリヌクレオチドおよび修飾ポリヌクレオチドを作製するための手法は、当該技術分野において知られている。ホスホジエステル結合を含む天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡは、一般的に３’末端を固相支持体に結合させた伸長中のオリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシ基に適切なヌクレオシドホスホルアミダイトを逐次カップリングさせた後、中間体の亜リン酸トリエステルをリン酸トリエステルに酸化させることにより合成される。所望のポリヌクレオチド配列が合成されたら、ポリヌクレオチドを支持体から離し、リン酸トリエステル基を脱保護してリン酸ジエステルにし、ヌクレオシド塩基を、アンモニア水または他の塩基を用いて脱保護する（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ“Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ａｇｒａｗａｌ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９３；Ｗａｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  ３：４０１，１９８４および米国特許第４，４５８，０６６号参照）。
【００５８】
ＣｐＧ−Ｃオリゴヌクレオチドはリン酸基修飾オリゴヌクレオチドを含むものであってもよく、その一部のものはオリゴヌクレオチドを安定化させることが知られている。したがって、いくつかの実施形態は、安定化されたＣｐＧ−Ｃオリゴヌクレオチドを含む。修飾リン酸結合または非リン酸結合を含むオリゴヌクレオチドの合成も当該技術分野において知られている（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ：ａｎ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ”，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ，（Ｄ．Ｊ．Ｃｈａｄｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｇ．Ｃａｒｄｅｗ，ｅｄ．）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９７参照）。オリゴヌクレオチドの糖または糖アナログ部分に結合させ得るリン誘導体（または修飾リン酸基）は、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデートなどであり得る。上記のリン酸基アナログの調製、ならびに、そのヌクレオチド、修飾ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド内への組み込み自体は既に充分に報告されている（例えば、Ｐｅｙｒｏｔｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２４：１８４１−１８４８，１９９６；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２４：２３１８−２３２３，１９９６；およびＳｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２４：２９６６−２９７３，１９９６参照）。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成は、酸化工程を硫化工程に置き換えること以外は天然に存在するオリゴヌクレオチドについて上記のものと同様である（Ｚｏｎ  “Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ”，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ａｇｒａｗａｌ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１６５−１９０，１９９３）。
【００５９】
ＣｐＧ−Ｃオリゴヌクレオチドは、１個以上のリボヌクレオチド（唯一または主な糖成分としてリボースを含むもの）、デオキシリボヌクレオチド（主な糖成分としてデオキシリボースを含むもの）、修飾された糖または糖アナログを含むものであり得る。したがって、リボースおよびデオキシリボースに加えて、糖部分は、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソース、および糖アナログのシクロペンチル基であり得る。糖はピラノシルまたはフラノシルの形態であってもよい。ＣｐＧ−Ｃオリゴヌクレオチドにおいて、糖部分は好ましくは、リボース、デオキシリボース、アラビノースまたは２’−０−アルキルリボースのフラノシドであり、糖は、それぞれの複素環式塩基に、いずれかのアノマー立体配置で結合され得る。糖修飾体としては、限定されないが、２’−アルコキシ−ＲＮＡアナログ、２’−アミノ−ＲＮＡアナログ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、および２’−アルコキシ−またはアミノ−ＲＮＡ／ＤＮＡキメラが挙げられる。例えば、ＣｐＧ−Ｃオリゴヌクレオチドの糖修飾体としては、限定されないが、２’−Ｏ−メチル−ウリジンおよび２’−Ｏ−メチル−シチジンが挙げられる。このような糖または糖アナログおよびかかる糖またはアナログが複素環式塩基（核酸塩基）に結合しているそれぞれのヌクレオシドの調製それ自体は既知であり、したがって、ここで説明する必要はない。また、糖修飾体を、ＣｐＧ−Ｃオリゴヌクレオチドの調製において作製し、任意のリン酸基修飾と組み合わせてもよい。
【００６０】
ＣｐＧ−Ｃオリゴヌクレオチド内に組み込まれる複素環式塩基または核酸塩基は、天然に存在する主要なプリンおよびピリミジン塩基（すなわち、上記のようなウラシル、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニン）、ならびに前記主要塩基の天然に存在する修飾体および合成修飾体であり得る。したがって、ＣｐＧ−Ｃオリゴヌクレオチドは、イノシン、２’−デオキシウリジンおよび２−アミノ−２’−デオキシアデノシンのうちの１個以上を含むものであってもよい。
【００６１】
「ＣＢＲ」または「臨床的有用率」は、ＣＲ＋ＰＲ＋長期ＳＤを意味する。
【００６２】
「ＣＤＲ」または「ＣＤＲｓ」は、本明細書で用いる場合、特に記載のない限りカバットの番号付け方式を用いて規定される、免疫グロブリンの可変領域内の相補性決定領域（１つまたは複数）を意味する。
【００６３】
「化学療法剤」は、がんの処置に有用な化学的化合物である。化学療法剤の類型としては、限定されないが：アルキル化剤、代謝拮抗薬、キナーゼ阻害薬、紡錘毒（ｓｐｉｎｄｌｅ  ｐｏｉｓｏｎ）植物アルカロイド、細胞毒性（ｃｙｔｏｘｉｃ）／抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害薬、光感作性薬剤、抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）、抗プロゲステロン、エストロゲン受容体下方調節薬（ＥＲＤ）、エストロゲン受容体アンタゴニスト、黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト、抗アンドロゲン、アロマターゼ阻害薬、ＥＧＦＲ阻害薬、ＶＥＧＦ阻害薬、ならびに異常な細胞増殖または腫瘍成長に関与している遺伝子の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。本発明の処置方法に有用な化学療法剤としては、細胞増殖抑制性および／または細胞毒性の薬剤が挙げられる。
【００６４】
「コチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）」は、本明細書で用いる場合、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ  ２７３：９２７−９４８（１９９７）に記載の抗体の番号付け方式を意味する。
【００６５】
“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（〜を含む）”、または、語尾変化形、例えば、“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”、“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”または“ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ”は、本明細書および特許請求の範囲全体を通して、文言の明示または必然性の暗示のため文脈からそうでないことが必要とされていない限り、包含的意味で用いており、すなわち、記載の特色の存在を明示しているが、本発明の任意の実施形態の機能発揮または有用性を実質的に向上させ得るさらなる特色の存在または付加を排除しないために用いている。
【００６６】
「保存的修飾バリアント」または「保存的置換」は、タンパク質のアミノ酸の、同様の特徴（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、骨格の立体構造および剛直性など）を有する他のアミノ酸での置換であって、該タンパク質の生物学的活性または他の所望の特性、例えば抗原親和性および／または特異性が改変されることなく変化が頻繁に起こり得るような置換をいう。当業者には、一般に、ポリペプチドの非必須領域内での単一アミノ酸置換は生物学的活性を実質的に改変しないことは認識されよう（例えば、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４（４ｔｈ  Ｅｄ．）参照）。また、構造的または機能的に同様のアミノ酸の置換によって生物学的活性が崩壊することは起こりにくい。例示的な保存的置換を以下の表２に示す。
【００６７】
表２．例示的な保存的アミノ酸置換
【表２】
2018516911.tif 000004
【００６８】
“ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（本質的に〜からなる）”、および、語尾変化形、例えば、“ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ”または“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ”は、本明細書および特許請求の範囲で用いている場合、全体を通して、記載の要素または要素の群の任意のものが含まれ、明記されている投薬レジメン、方法または組成物の基本的または新規な特性を実質的に変化させない、記載の要素と同様または異なる性質の他の要素を含んでいてもよいことを示す。非限定的な一例として、本質的に記載のアミノ酸配列からなるＰＤ−１アンタゴニストにはまた、この結合性化合物の特性に実質的に影響を及ぼさない１個以上のアミノ酸（１個以上のアミノ酸残基の置換を含む）が含まれていてもよい。
【００６９】
「ＤＣＲ」または「病勢コントロール率」は、ＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤを意味する。
【００７０】
「診断用抗ＰＤ−Ｌモノクローナル抗体」は、特定の哺乳動物細胞の表面上に発現している成熟形態の指定のＰＤ−Ｌ（ＰＤ−Ｌ１またはＰＤＬ２）に特異的に結合するｍＡｂを意味する。成熟ＰＤ−Ｌには前分泌リーダー配列（リーダーペプチドとも称される）がない。用語「ＰＤ−Ｌ」および「成熟ＰＤ−Ｌ」は、本明細書において互換的に用いており、特に記載のない限り、または文脈からすぐにわかることでない限り、同じ分子を意味していると理解されたい。
【００７１】
本明細書で用いる場合、診断用抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂまたは抗ｈＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂは、成熟ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するモノクローナル抗体をいう。成熟ヒトＰＤ−Ｌ１分子は、以下の配列：
ＭＲＩＦＡＶＦＩＦＭＴＹＷＨＬＬＮＡＦＴＶＴＶＰＫＤＬＹＶＶＥＹＧＳＮＭＴＩＥＣＫＦＰＶＥＫＱＬＤＬＡＡＬＩＶＹＷＥＭＥＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨＳＳＹＲＱＲＡＲＬＬＫＤＱＬＳＬＧＮＡＡＬＱＩＴＤＶＫＬＱＤＡＧＶＹＲＣＭＩＳＹＧＧＡＤＹＫＲＩＴＶＫＶＮＡＰＹＮＫＩＮＱＲＩＬＶＶＤＰＶＴＳＥＨＥＬＴＣＱＡＥＧＹＰＫＡＥＶＩＷＴＳＳＤＨＱＶＬＳＧＫＴＴＴＴＮＳＫＲＥＥＫＬＦＮＶＴＳＴＬＲＩＮＴＴＴＮＥＩＦＹＣＴＦＲＲＬＤＰＥＥＮＨＴＡＥＬＶＩＰＥＬＰＬＡＨＰＰＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤＶＫＫＣＧＩＱＤＴＮＳＫＫＱＳＤＴＨＬＥＥＴ（配列番号：２５）、のアミノ酸１９〜２９０からなる。
【００７２】
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織切片におけるＰＤ−Ｌ１発現の免疫組織化学（ＩＨＣ）検出のための診断用ｍＡｂとして有用な診断用抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂの具体例は、抗体２０Ｃ３および抗体２２Ｃ３であり、これらは、同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１３／０７５９３２（２０１３年１２月１８日に出願、２０１４年６月２６日にＷＯ２０１４／１０００７９として公開）に記載されている。ＦＦＰＥ組織切片におけるＰＤ−Ｌ１発現のＩＨＣ検出に有用であると報告されている別の抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ（Ｃｈｅｎ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９：３４６２−３４７３（２０１３））は、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ；カタログ番号１００８４−Ｒ０１５）から公然と入手可能なウサギ抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂである。
【００７３】
「抗ＩＬ−１０抗体」は、ＩＬ−１０に結合してＩＬ−１０の活性を阻害するアンタゴニスト抗体を意味する。ＩＬ−１０の別名または同義語としては：インターロイキン−１０、サイトカイン合成阻害薬またはＣＳＩＦが挙げられる。ヒトＩＬ−１０のアミノ酸配列は米国特許６２１７８５７において知得され得る。成熟ヒトＩＬ−１０タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＰＧＱＧＴＱＳＥＮＳＣＴＨＦＰＧＮＬＰＮＭＬＲＤＬＲＤＡＦＳＲＶＫＴＦＦＱＭＫＤＱＬＤＮＬＬＬＫＥＳＬＬＥＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬＥＥＶＭＰＱＡＥＮＱＤＰＤＩＫＡＨＶＮＳＬＧＥＮＬＫＴＬＲＬＲＬＲＲＣＨＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡＶＥＱＶＫＮＡＦＮＫＬＱＥＫＧＩＹＫＡＭＳＥＦＤＩＦＩＮＹＩＥＡＹＭＴＭＫＩＲＮ（配列番号：５２）である。
【００７４】
本発明の任意の処置方法、医薬および使用に有用な抗ＩＬ−１０抗体としては、ＩＬ−１０に特異的に結合する、好ましくはヒトＩＬ−１０に特異的に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはその抗原結合断片が挙げられる。該ｍＡｂはヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得、ヒト定常領域を含むものであり得る。いくつかの実施形態では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の定常領域からなる群より選択され、好ましい実施形態では、ヒト定常領域はＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常領域である。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖおよびＦｖ断片からなる群より選択される。
【００７５】
本発明の処置方法、医薬および使用の好ましいいくつかの実施形態では、抗ＩＬ−１０抗体は：（ａ）抗ＩＬ−１０  ｈｕｍ１２Ｇ８の配列番号：２６、２７および２８の軽鎖ＣＤＲと配列番号：２９、３０および３１の重鎖ＣＤＲを含むモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。
【００７６】
本発明の処置方法、医薬および使用の他の好ましい実施形態では、抗ＩＬ−１０抗体は、ヒトＩＬ−１０に特異的に結合し、（ａ）配列番号：３２またはそのバリアントを含む重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号：３３またはそのバリアントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。重鎖可変領域の配列のバリアントは、フレームワーク領域内（すなわち、ＣＤＲ外）に１７個までの保存的アミノ酸置換を有すること以外は参照配列と同一のものであり、好ましくは、フレームワーク領域内に１０個未満、９、８、７、６または５個の保存的アミノ酸置換を有する。軽鎖可変領域の配列のバリアントは、フレームワーク領域内（すなわち、ＣＤＲ外）に５個までの保存的アミノ酸置換を有すること以外は参照配列と同一のものであり、好ましくは、フレームワーク領域内に４個未満、３個または２個の保存的アミノ酸置換を有する。
【００７７】
以下の表３に、本発明の処置方法、医薬および使用における使用のための例示的な抗ＩＬ−１０  ｍＡｂのアミノ酸配列の一覧を示し、配列を図８〜９に示す。
【表３】
2018516911.tif 000005
【００７８】
本明細書で用いる場合、「抗ＩＬ−１０  ｈｕｍ  １２Ｇ８バリアント」は、軽鎖ＣＤＲの外側に存在する位置に３個、２個または１個の保存的アミノ酸置換および重鎖ＣＤＲの外側に存在する６、５、４、３、２または１個の保存的アミノ酸置換を有すること以外は抗ＩＬ−１０  ｈｕｍ  １２Ｇ８のものと同一である重鎖配列と軽鎖配列を含むモノクローナル抗体を意味し、例えば、バリアント位置はＦＲ領域または定常領域に存在する。換言すると、抗ＩＬ−１０  ｈｕｍ  １２Ｇ８と抗ＩＬ−１０  ｈｕｍ  １２Ｇ８バリアントは同一のＣＤＲ配列を含んでいるが、その完全長の軽鎖配列および重鎖配列内のそれぞれ３つ以下または６つ以下の他の位置に保存的アミノ酸置換を有するために互いに異なる。抗ＩＬ−１０  ｈｕｍ  １２Ｇ８バリアントは、以下の特性：ＩＬ−１０に対する結合親和性およびインビボ中和効果に関して抗ＩＬ−１０  ｈｕｍ  １２Ｇ８と実質的に同じである。
【００７９】
「ＤＳＤＲ」または「長期病勢安定率」は、２３週間以上のＳＤを意味する。
【００８０】
「フレームワーク領域」または「ＦＲ」は、本明細書で用いる場合、ＣＤＲ領域を除いた免疫グロブリンの可変領域を意味する。
【００８１】
「カバット」は、本明細書で用いる場合、Ｅｌｖｉｎ  Ａ．Ｋａｂａｔによって先駆的に作られた（（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）免疫グロブリンのアラインメントおよび番号付け方式を意味する。
【００８２】
「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」または「Ｍａｂ」は、本明細書で用いる場合、実質的に均一な抗体集団をいい、すなわち、該集団で構成された抗体分子は、微量に存在し得る天然に存在する変異が存在しているかもしれないこと以外はアミノ酸配列が同一である。対照的に、通常の（ポリクローナル）抗体調製物は、典型的には、可変ドメイン、特にＣＤＲ（これらは、多くの場合、異なるエピトープに特異的である）において異なるアミノ酸配列を有する数多くの異なる抗体を含む。修飾語句「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られたものであるという抗体の性質を示しており、なんら特定の方法による抗体の作製を必要としていると解釈されるべきでない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５によって報告されたハイブリドーマ法によって作製してもよく、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作製してもよい。また、「モノクローナル抗体」は、ファージ抗体ライブラリーから、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７に記載された手法を用いて単離したものであってもよい。また、Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１も参照のこと。
【００８３】
「治療無反応群患者」は、本明細書に記載の併用療法での処置に対する特異的抗腫瘍応答に言及している場合、患者が抗腫瘍応答を示さなかったことを意味する。
【００８４】
「ＯＲＲ」または「客観的奏効率」は、いくつかの実施形態においてＣＲ＋ＰＲをいい、ＯＲＲ（２４週目）は、ペンブロリズマブと併用したＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドでの２４週間の処置後のコホート内の各患者においてｉｒＲＥＣＩＳＴを用いて測定されるＣＲとＰＲをいう。
【００８５】
「患者」または「被験体」は、治療が所望されているか、または臨床試験、疫学的研究に参加しているか、もしくは対照として使用される、任意の単独の被験体、例えば、ヒトならびに哺乳動物の獣医学的患者、例えば、ウシ、ウマ、イヌおよびネコをいう。
【００８６】
「ＰＤ−１アンタゴニスト」は、がん細胞上に発現しているＰＤ−Ｌ１が免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞またはＮＫＴ細胞）上に発現しているＰＤ−１に結合するのをブロックし、好ましくは、がん細胞上に発現しているＰＤ−Ｌ２が免疫細胞上の発現ＰＤ−１に結合するのもブロックする任意の化学的化合物または生物学的分子を意味する。ＰＤ−１およびそのリガンドの別名または同義語としては：ＰＤ−１についてはＰＤＣＤ１、ＰＤ１、ＣＤ２７９およびＳＬＥＢ２；ＰＤ−Ｌ１についてはＰＤＣＤ１Ｌ１、ＰＤＬ１、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７−４、ＣＤ２７４およびＢ７−Ｈ；ならびにＰＤ−Ｌ２についてはＰＤＣＤ１Ｌ２、ＰＤＬ２、Ｂ７−ＤＣ、ＢｔｄｃおよびＣＤ２７３が挙げられる。ヒト個体が処置対象である本発明の任意の処置方法、医薬および使用では、ＰＤ−１アンタゴニストは、ヒトＰＤ−Ｌ１がヒトＰＤ−１に結合するのをブロックし、好ましくは、ヒトＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２のどちらもヒトＰＤ−１に結合するのをブロックする。ヒトＰＤ−１のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ  Ｌｏｃｕｓ  Ｎｏ．：ＮＰ＿００５００９において知得され得る。ヒトＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のアミノ酸配列は、それぞれＮＣＢＩ  Ｌｏｃｕｓ  Ｎｏ．：ＮＰ＿０５４８６２およびＮＰ＿０７９５１５において知得され得る。
【００８７】
本発明の任意の処置方法、医薬および使用に有用なＰＤ−１アンタゴニストとしては、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、好ましくはヒトＰＤ−１またはヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはその抗原結合断片が挙げられる。ｍＡｂはヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得、ヒト定常領域を含むものであり得る。いくつかの実施形態では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の定常領域からなる群より選択され、好ましい実施形態では、ヒト定常領域はＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常領域である。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖおよびＦｖ断片からなる群より選択される。
【００８８】
ヒトＰＤ−１に結合し、本発明の処置方法、医薬および使用に有用なｍＡｂの例は、米国特許第７４８８８０２号、米国特許第７５２１０５１号、米国特許第８００８４４９号、米国特許第８３５４５０９号、米国特許第８１６８７５７号、国際公開第２００４／００４７７１号、国際公開第２００４／０７２２８６号、国際公開第２００４／０５６８７５号および米国特許出願公開第２０１１／０２７１３５８号に記載されている。本発明の処置方法、医薬および使用におけるＰＤ−１アンタゴニストとして有用な具体的な抗ヒトＰＤ−１  ｍＡｂとしては：ペンブロリズマブ（ＭＫ−３４７５としても知られている）（ＷＨＯ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．２，ｐａｇｅｓ  １６１−１６２（２０１３）に記載の構造を有し、図６に示す重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を含むヒト化ＩｇＧ４  ｍＡｂ）；ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８）（ＷＨＯ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．１，ｐａｇｅｓ  ６８−６９（２０１３）に記載の構造を有し、図７に示す重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ４  ｍＡｂ）；ヒト化抗体ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６およびｈ４０９Ａ１７（これらは国際公開第２００８／１５６７１２号に記載されている）ならびにＡＭＰ−５１４（これはＭｅｄＩｍｍｕｎｅによって開発中である）が挙げられる。
【００８９】
ヒトＰＤ−Ｌ１に結合し、本発明の処置方法、医薬および使用に有用なｍＡｂの例は、国際公開第２０１３／０１９９０６号、国際公開第２０１０／０７７６３４Ａ１号および米国特許第８３８３７９６号に記載されている。本発明の処置方法、医薬および使用におけるＰＤ−１アンタゴニストとして有用な具体的な抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂとしては、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＭＳ−９３６５５９、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、および、それぞれ配列番号：２４および配列番号：２１の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む国際公開第２０１３／０１９９０６号の抗体が挙げられる。
【００９０】
本発明の処置方法、医薬および使用に有用な他のＰＤ−１アンタゴニストとしては、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、好ましくはヒトＰＤ−１またはヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するイムノアドヘシン、例えば、免疫グロブリン分子の定常領域、例えばＦｃ領域と融合させたＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２の細胞外またはＰＤ−１結合部分を含む融合タンパク質が挙げられる。ＰＤ−１に特異的に結合する免疫接着分子の例は、国際公開第２０１０／０２７８２７号および国際公開第２０１１／０６６３４２号に記載されている。本発明の処置方法、医薬および使用におけるＰＤ−１アンタゴニストとして有用な具体的な融合タンパク質としては、ＰＤ−Ｌ２−ＦＣ融合タンパク質であり、ヒトＰＤ−１に結合するＡＭＰ−２２４（Ｂ７−ＤＣＩｇとしても知られている）が挙げられる。
【００９１】
本発明の処置方法、医薬および使用の好ましいいくつかの実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストが：（ａ）軽鎖ＣＤＲの配列番号：１、２および３と重鎖ＣＤＲの配列番号：４、５および６；または（ｂ）軽鎖ＣＤＲの配列番号：７、８および９と重鎖ＣＤＲの配列番号：１０、１１および１２；を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。
【００９２】
本発明の処置方法、医薬および使用の他の好ましい実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストが、ヒトＰＤ−１に特異的に結合し、（ａ）配列番号：１３またはそのバリアントを含む重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号：１５またはそのバリアント；配列番号：１６またはそのバリアント；および配列番号：１７またはそのバリアントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。重鎖可変領域の配列のバリアントは、フレームワーク領域内（すなわち、ＣＤＲ外）に１７個までの保存的アミノ酸置換を有すること以外は参照配列と同一のものであり、好ましくは、フレームワーク領域内に１０個未満、９、８、７、６または５個の保存的アミノ酸置換を有する。軽鎖可変領域の配列のバリアントは、フレームワーク領域内（すなわち、ＣＤＲ外）に５個までの保存的アミノ酸置換を有すること以外は参照配列と同一のものであり、好ましくは、フレームワーク領域内に４個未満、３個または２個の保存的アミノ酸置換を有する。
【００９３】
本発明の処置方法、医薬および使用の別の好ましい実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストが、ヒトＰＤ−１に特異的に結合し、（ａ）配列番号：１４を含む重鎖と（ｂ）配列番号：１８、配列番号：１９または配列番号：２０を含む軽鎖、を含むモノクローナル抗体である。
【００９４】
本発明の処置方法、医薬および使用のまた別の好ましい実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストが、ヒトＰＤ−１に特異的に結合し、（ａ）配列番号：１４を含む重鎖と（ｂ）配列番号：１８を含む軽鎖を含む、モノクローナル抗体である。
【００９５】
上記の処置方法、医薬および使用のすべてにおいて、ＰＤ−１アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１に結合するのを阻害し、好ましくはＰＤ−Ｌ２がＰＤ−１に結合するのもまた阻害する。上記の処置方法、医薬および使用のいくつかの実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストが、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に特異的に結合してＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１に結合するのをブロックするモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。一実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストが、重鎖と軽鎖を含む抗ＰＤ−１抗体であり、そしてここで、該重鎖と該軽鎖は図６に示すアミノ酸配列（配列番号：２１および配列番号：２２）を含む。
【００９６】
以下の表４は、本発明の処置方法、医薬および使用における使用のための例示的な抗ＰＤ−１  ｍＡｂのアミノ酸配列の一覧を示し、配列を図１〜５に示す。
【表４】
2018516911.tif 000006
【００９７】
表５は、配列表のＰＤ−１アンタゴニストの配列の簡単な説明を示す。
【表５】
2018516911.tif 000007
【表６】
2018516911.tif 000008
【００９８】
「ＰＤ−Ｌ１」または「ＰＤ−Ｌ２」の発現は、本明細書で用いる場合、細胞表面上の表示されたＰＤ−Ｌタンパク質または細胞もしくは組織内の表示されたＰＤ−Ｌ  ｍＲＮＡの任意の検出可能なレベルの発現を意味する。ＰＤ−Ｌタンパク質の発現は、診断用ＰＤ−Ｌ抗体を用いて、腫瘍組織切片のＩＨＣアッセイにおいて、またはフローサイトメトリーによって検出され得る。あるいはまた、腫瘍細胞によるＰＤ−Ｌタンパク質の発現をＰＥＴイメージングにより、所望のＰＤ−Ｌ標的、例えばＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２に特異的に結合する結合剤（例えば、抗体断片、アフィボディなど）を用いて検出してもよい。ＰＤ−Ｌ  ｍＲＮＡ発現を検出および測定するための手法としてはＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲが挙げられる。
【００９９】
ＩＨＣアッセイにおいて腫瘍組織切片のＰＤ−Ｌ１タンパク質の発現を定量するためのいくつかのアプローチが報告されている。例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０１（４９）；１７１７４−１７１７９（２００４）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：３３８１−３３８５（２００６）；Ｇａｄｉｏｔ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  １１７：２１９２−２２０１（２０１１）；Ｔａｕｂｅ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ４，１２７ｒａ３７（２０１２）；およびＴｏｐｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ  Ｍｅｄ．３６６（２６）：２４４３−２４５４（２０１２）を参照のこと。
【０１００】
アプローチの一例では、ＰＤ−Ｌ１発現について陽性または陰性の単純なバイナリーエンドポイントを使用し、陽性結果は、細胞表面膜染色の組織学的証拠を示す腫瘍細胞のパーセンテージによって規定される。腫瘍組織切片が全腫瘍細胞の少なくとも１％、好ましくは５％である場合、ＰＤ−Ｌ１発現について陽性とカウントする。
【０１０１】
別のアプローチでは、腫瘍組織切片におけるＰＤ−Ｌ１発現を腫瘍細胞ならびに浸潤免疫細胞（これは主にリンパ球を含む）において定量する。膜染色を示す腫瘍細胞および浸潤免疫細胞のパーセンテージを、＜５％、５〜９％、それ以降は１０％きざみで１００％までとして別々に定量する。腫瘍細胞では、ＰＤ−Ｌ１発現を、スコアが＜５％のスコアである場合は陰性、スコアが≧５％である場合は陽性とカウントする。浸潤免疫細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現は、調整炎症スコア（ａｄｊｕｓｔｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ）（ＡＩＳ）と称される半定量的測定値として報告され、これは、膜染色細胞の割合に浸潤細胞の呈色強度（ｉｎｔｅｓｉｔｙ）を掛け算することにより求められ、なし（０）、軽度（スコア１、リンパ球に稀にみられる）、中等度（スコア２、リンパ組織凝集塊による腫瘍の巣状浸潤）または重度（スコア３、広汎性浸潤）として評点付けされる。腫瘍組織切片は、ＡＩＳが≧５である場合、浸潤免疫細胞によるＰＤ−Ｌ１発現について陽性とカウントする。
【０１０２】
ＰＤ−Ｌ  ｍＲＮＡの発現レベルは、定量ＲＴ−ＰＣＲにおいて高頻度に使用される１つ以上の参照遺伝子、例えばユビキチンＣのｍＲＮＡ発現レベルと比較され得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、悪性細胞および／または腫瘍内の浸潤免疫細胞によるＰＤ−Ｌ１発現（タンパク質および／またはｍＲＮＡ）レベルは、適切な対照によるＰＤ−Ｌ１発現（タンパク質および／またはｍＲＮＡ）レベルとの比較に基づいて「過剰発現されている」または「高値である」と判定される。例えば、対照ＰＤ−Ｌ１タンパク質またはｍＲＮＡの発現レベルは、同じ型の非悪性細胞またはマッチしている正常組織の切片において定量されたレベルであり得る。好ましいいくつかの実施形態では、腫瘍試料におけるＰＤ−Ｌ１発現は、試料中のＰＤ−Ｌ１タンパク質（および／またはＰＤ−Ｌ１  ｍＲＮＡ）が対照よりも少なくとも１０％、２０％または３０％多い場合、高値であると判定される。
【０１０４】
本明細書で用いる場合、「ペンブロリズマブバリアント」は、軽鎖ＣＤＲの外側に存在する位置に３個、２個または１個の保存的アミノ酸置換および重鎖ＣＤＲの外側に存在する６、５、４、３、２または１個の保存的アミノ酸置換を有すること以外はペンブロリズマブのものと同一である重鎖配列と軽鎖配列を含むモノクローナル抗体を意味し、例えば、バリアント位置はＦＲ領域または定常領域に存在する。換言すると、ペンブロリズマブとペンブロリズマブバリアントは同一のＣＤＲ配列を含んでいるが、その完全長の軽鎖配列および重鎖配列内のそれぞれ３つ以下または６つ以下の他の位置に保存的アミノ酸置換を有するために互いに異なるものである。ペンブロリズマブバリアントは、以下の特性：ＰＤ−１に対する結合親和性ならびにＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の各々がＰＤ−１に結合するのをブロックする能力に関してペンブロリズマブと実質的に同じである。
【０１０５】
「ＲＥＣＩＳＴ  １．１効果判定基準」は、本明細書で用いる場合、Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４５：２２８−２４７（２００９）に示された、標的病変部または非標的病変部での、適宜、応答を測定している状況に基づいた規定を意味する。
【０１０６】
「治療反応群患者」は、本明細書に記載の併用療法での処置に対する特異的抗腫瘍応答に言及している場合、抗腫瘍応答を示した患者を意味する。
【０１０７】
「持続性応答」は、治療用薬剤または本明細書に記載の併用療法での処置を停止した後の持続性の治療効果を意味する。いくつかの実施形態では、持続性応答は、少なくとも処置期間と同じ期間、または処置期間より少なくとも１．５、２．０、２．５もしくは３倍長い期間を有する。
【０１０８】
「組織切片」は、組織試料の単一の一部分または一片、例えば、正常組織または腫瘍の試料から切り取られた組織の薄片をいう。
【０１０９】
がんを「処置する（“ｔｒｅａｔ”または“ｔｒｅａｔｉｎｇ”）」とは、本明細書で用いる場合、ＰＤ−１アンタゴニストおよびＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドの併用療法の投与を、がんを有する被験体またはがんと診断された被験体に対して行ない、少なくとも１つのプラスの治療効果、例えば、がん細胞の数の低減、腫瘍サイズの低減、末梢器官内へのがん細胞浸潤の速度の低下または腫瘍転移もしくは腫瘍成長の速度の低下などを得ることを意味する。がんにおけるプラスの治療効果は、いくつかの様式で測定することができる（Ｗ．Ａ．Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．５０：１Ｓ−１０Ｓ（２００９）参照）。例えば、腫瘍成長阻害に関して、ＮＣＩの基準によれば、Ｔ／Ｃ≦４２％が最低限の抗腫瘍活性レベルである。Ｔ／Ｃ＜１０％を高い抗腫瘍活性レベルとみなし、Ｔ／Ｃ（％）＝処置対象の腫瘍体積の中央値／対照の腫瘍体積の中央値×１００である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の併用療法に対する奏功はＲＥＣＩＳＴ  １．１基準またはｉｒＲＣ（２次元もしくは１次元）を用いて評価され、本発明の併用療法によって得られる処置は、ＰＲ、ＣＲ、ＯＲ、ＰＦＳ、ＤＦＳおよびＯＳのいずれかである。ＰＦＳは、“Ｔｉｍｅ  ｔｏ  Ｔｕｍｏｒ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ（腫瘍増殖抑制時間）”とも称され、処置中および処置後にがんが成長しない時間の長さを示し、患者にＣＲまたはＰＲがみとめられた時間量ならびに患者にＳＤがみとめられた時間量を包含している。ＤＦＳは、処置中および処置後に患者が無疾患のままである時間の長さをいう。ＯＳは、治療未経験または非処置の個体または患者と比べて平均余命の延長をいう。いくつかの実施形態では、本発明の併用療法に対する奏功は、ＲＥＣＩＳＴ  １．１効果判定基準を用いて評価されるＰＲ、ＣＲ、ＰＦＳ、ＤＦＳ、ＯＲおよびＯＳのいずれかである。がん患者を処置するために有効である本発明の併用療法のための処置レジメンは、患者の疾患状態、年齢および体重ならびに被験体において抗がん応答を誘起する治療能力などの要素に応じてさまざまであり得る。本発明の諸態様のいずれかの一実施形態が、どの被験体においてもプラスの治療効果を得ることに有効でない場合もあり得るが、当該技術分野において知られた任意の統計学的検定、例えば、スチューデントのｔ検定、カイ二乗検定、マン・ホイットニーによるＵ検定、クラスカル・ウォリス（Ｈ検定）、ヨンクヒール・タプストラ検定およびウイルコクソン検定によって調べたとき、統計学的に有意な数の被験体においてそのように実施される必要があるものとする。
【０１１０】
用語「処置レジメン」、「投薬プロトコル」および「投与レジメン」は、本発明の併用療法の各治療用薬剤の投与の用量とタイミングをいうために互換的に用いている。
【０１１１】
「腫瘍」は、がんと診断された被験体またはがんを有することが疑われる被験体に適用される場合、任意のサイズの悪性または潜在的に悪性の新生物または組織塊をいい、原発性腫瘍および続発性新生物を包含している。固形腫瘍は、通常、嚢胞または液性領域を含有していない異常な増殖組織または組織塊である。さまざまな型の固形腫瘍が、これを形成している細胞型にちなんで命名されている。固形腫瘍の例は肉腫、癌およびリンパ腫である。白血病（血液のがん）は一般的に、固形腫瘍を構成しない（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｅｒｍｓ）。
【０１１２】
「腫瘍量（“ｔｕｍｏｒ  ｂｕｒｄｅｎ”）」は、腫瘍細胞量（“ｔｕｍｏｒ  ｌｏａｄ”）とも称され、全身に分布している腫瘍物の総量をいう。腫瘍量は、全身（リンパ節および骨髄を含む）のがん細胞の総数または腫瘍（１つまたは複数）のトータルサイズをいう。腫瘍量は、当該技術分野において知られたさまざまな方法、例えば、腫瘍（１つまたは複数）を被験体から切除して寸法を例えばカリパスを用いて測定すること、または体内に存在するままでイメージング手法、例えば、超音波、骨のスキャン、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）もしくは磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャンを用いることなどによって測定され得る。
【０１１３】
用語「腫瘍サイズ」は、腫瘍の長さおよび幅として測定され得る腫瘍のトータルサイズをいう。腫瘍サイズは、当該技術分野において知られたさまざまな方法、例えば、腫瘍（１つまたは複数）を被験体から切除して寸法を例えばカリパスを用いて測定すること、または体内に存在するままでイメージング手法、例えば、骨のスキャン、超音波、ＣＴもしくはＭＲＩスキャンを用いることなどによって測定され得る。
【０１１４】
「１次元ｉｒＲＣは、Ｎｉｓｈｉｎｏ  Ｍ，Ｇｉｏｂｂｉｅ−Ｈｕｒｄｅｒ  Ａ，Ｇａｒｇａｎｏ  Ｍ，Ｓｕｄａ  Ｍ，Ｒａｍａｉｙａ  ＮＨ，Ｈｏｄｉ  ＦＳ．Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ａ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｌａｎｇｕａｇｅ  ｆｏｒ  Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｉｍｍｕｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｕｓｉｎｇ  Ｕｎｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１３；１９（１４）：３９３６−３９４３）に記載の一組の基準をいう。この基準では、各病変部の最大直径（ｃｍ）を利用する。
【０１１５】
「可変領域」または「Ｖ領域」は、本明細書で用いる場合、異なる抗体間で配列が変わりやすいＩｇＧ鎖セグメントを意味する。軽鎖のカバット残基１０９まで、および重鎖のカバット残基１１３までに及ぶ。
【０１１６】
本発明の上記の処置方法、医薬および使用のいくつかの実施形態では、個体はヒトであり、がんは固形腫瘍であり、いくつかの実施形態では、固形腫瘍は、膀胱がん、乳がん、腎明細胞がん、頭頸部の扁平上皮細胞癌、肺扁平上皮細胞癌、悪性黒色腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎細胞がん（ＲＣＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）またはトリプルネガティブ乳がんである。いくつかの実施形態では、がんは、ＮＳＣＬＣ、子宮内膜がん、尿路上皮がん、頭頸部の扁平上皮細胞癌または黒色腫である。
【０１１７】
本発明の上記の処置方法、医薬および使用の他の実施形態では、個体はヒトであり、がんは、造血器（ｈｅｍｅ）悪性腫瘍であり、いくつかの実施形態では、造血器悪性腫瘍は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ＥＢＶ陽性ＤＬＢＣＬ、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ−細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄性細胞白血病−１タンパク質（Ｍｃｌ−１）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）または小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）である。
【０１１８】
また、上記の任意の処置方法、医薬および使用のいくつかの実施形態において、がんは、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の一方または両方の発現に関する試験で陽性である。さらに他の実施形態では、がんは高値のＰＤ−Ｌ１発現を有する。
【０１１９】
上記の処置方法、医薬および使用の一実施形態では、個体はヒトであり、がんは、ヒトＰＤ−Ｌ１に関する試験で陽性のものであり、ＮＳＣＬＣ、子宮内膜がん、尿路上皮がん、頭頸部の扁平上皮細胞癌または黒色腫からなる群より選択される。上記の処置方法、医薬および使用の一実施形態では、個体はヒトであり、がんは、ヒトＰＤ−Ｌ１に関する試験で陽性のものであり、進行型または転移性の黒色腫である。
【０１２０】
ＩＩ．方法、使用および医薬
本発明の一態様では、本発明により、個体にＰＤ−１アンタゴニストとＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドを含む併用療法を投与することを含む、個体のがんを処置するための方法を提供する。
【０１２１】
また、併用療法に１種類以上のさらなる治療用薬剤を含めてもよい。さらなる治療用薬剤は、例えば、ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチド以外の化学療法薬、生物療法剤、免疫原性因子（例えば、弱めたがん性細胞、腫瘍抗原、抗原提示細胞、例えば、腫瘍由来の抗原または核酸、免疫刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮα２、ＧＭ−ＣＳＦ）でパルス処理した樹状細胞、および免疫刺激サイトカイン、例えば限定されないがＧＭ−ＣＳＦをコードしている遺伝子でトランスフェクトした細胞）であり得る。さらなる治療用薬剤の具体的な投薬量および投薬スケジュールはさらにさまざまであり得、至適用量、投与スケジュールおよび投与経路は、使用される具体的な治療用薬剤に基づいて決定される。一実施形態では、生物療法剤は、抗ＩＬ−１０抗体またはその抗原結合断片である。
【０１２２】
化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）；アルキルスルフェート、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；エチレンイミンおよびメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）、例えば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ））；カンプトセシン（例えば、合成アナログのトポテカン）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（例えば、そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成アナログ）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（例えば、合成アナログのＫＷ−２１８９およびＣＢＩ−ＴＭＩ）；エレウテロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン；サルコジクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンジスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えば、エンジイン型抗生物質（例えば、カリケアミシン、特に、カリケアミシンγ１ＩおよびカリケアミシンφＩ１、例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）参照；ジネマイシン、例えば、ジネマイシンＡ；ビスホスホネート、例えば、クロドロネート；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連色素タンパク質エンジイン型抗生物質発色団（ｃｈｒｏｍｏｍｏｐｈｏｒｅ））、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルチノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（例えば、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルチェロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、��ベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；副腎皮質抑制薬（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌｓ）、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充薬、例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジクオン；エルホルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；メイタンシノイド、例えば、メイタンシンおよびアンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトザントロン；モピダモール；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｃｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（“Ａｒａ−Ｃ”）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドキセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトザントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸；カペシタビン；ならびに上記のもののいずれかの薬学的に許容され得る塩、酸または誘導体が挙げられる。また、腫瘍に対するホルモンの作用を調節または阻害する作用をする抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェ���、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストンおよびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）など；副腎でのエストロゲン生成を調節する、酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害薬、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール、エキセメスタン、ホルスタン、ファドロゾール、ボロゾール、レトロゾールおよびアナストロゾールなど；ならびに抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリン；ならびに上記のもののいずれかの薬学的に許容され得る塩、酸または誘導体も挙げられる。
【０１２３】
本発明の併用療法の各治療用薬剤は、単独で、または治療用薬剤と１種類以上の薬学的に許容され得る担体、賦形剤および希釈剤とを含む医薬（本明細書では医薬組成物とも称する）でのいずれかで、標準的な薬学的実務に従って投与され得る。
【０１２４】
本発明の併用療法の各治療用薬剤は、同時（すなわち、同じ医薬で）、並存的（すなわち、別々の医薬で次々に任意の順序で投与）または任意の順序で逐次に投与され得る。逐次投与は、併用療法の治療用薬剤が異なる投薬形態である（ある薬剤は錠剤またはカプセル剤であり、別の薬剤は滅菌液状剤である）場合および／または異なる投与スケジュールで投与される場合（例えば、少なくとも毎日投与される化学療法薬と、それより低頻度で、例えば、週１回、２週に１回もしくは３週に１回投与される生物療法薬）、特に有用である。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドはＰＤ−１アンタゴニストの投与の前に投与されるが、他の実施形態では、ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドはＰＤ−１アンタゴニストの投与の後に投与される。別の実施形態では、ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドはＰＤ−１アンタゴニストと並存的に投与される。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、併用療法の治療用薬剤の少なくとも１種類は、該薬剤が同じがんを処置するために単独療法薬として使用される場合に典型的に使用されるものと同じ投薬レジメン（用量、頻度および処置期間）を用いて投与される。他の実施形態では、患者に投与される併用療法の治療用薬剤の少なくとも１種類の総量は、該薬剤が単独療法薬として使用される場合より少なく、例えば、用量が少ない、投与頻度が少ない、および／または処置期間が短い。
【０１２７】
本発明の併用療法の各小分子治療用薬剤は、経口または非経口で、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経直腸、経表面および経皮投与経路で投与され得る。
【０１２８】
本発明の併用療法は、腫瘍を除去するために手術前または手術後に使用され得、放射線療法の前、該療法中または該療法後に使用され得る。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本発明の併用療法は、生物療法剤または化学療法剤で以前に処置されたことがない、すなわち、処置未経験の患者に投与される。他の実施形態では、該併用療法は、生物療法剤または化学療法剤での以前の治療後に持続性応答が得られなかった、すなわち、処置経験済の患者に投与される。
【０１３０】
本発明の併用療法は、典型的には触診または当該技術分野においてよく知られたイメージング手法、例えば、ＭＲＩ、超音波もしくはＣＡＴスキャンでわかるのに充分に大きい腫瘍を処置するために使用される。
【０１３１】
本発明の併用療法は、好ましくは、ＰＤ−Ｌ１発現に関する試験で陽性であるがんを有するヒト患者に投与される。好ましいいくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１発現は、診断用抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片を用いてＩＨＣアッセイにおいて、患者から切除した腫瘍試料のＦＦＰＥまたは凍結組織切片において検出される。典型的には、患者の担当医は、ＰＤ−１アンタゴニストとＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドでの処置の開始前に、患者から切除された腫瘍組織試料におけるＰＤ−Ｌ１発現を調べるための診断試験を指示するであろうが、担当医が、処置開始後の任意の時点で、例えば、処置サイクルの終了後などに最初または後続の診断試験を指示する場合があり得ることも想定される。
【０１３２】
本発明の併用療法の投薬レジメン（本明細書では投与レジメンとも称する）の選択は、いくつかの要素、例えば、実際の物質の血清または組織中の代謝回転率、症状のレベル、実際の物質の免疫原性、および処置対象の個体における標的細胞、組織または器官への到達可能性に依存する。好ましくは、投薬レジメンは、患者に送達される各治療用薬剤の量を最大限にし、許容範囲のレベルの副作用と調和するものである。したがって、該併用療法の生物療法剤と化学療法剤の各々の用量および投与頻度は、一部において、具体的な治療用薬剤、処置対象のがんの重症度および患者の特徴に依存する。抗体、サイトカインおよび小分子の適切な用量の選択における手引きが入手可能である。例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ（１９９６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂ．Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ；Ｋｒｅｓｉｎａ（ｅｄ．）（１９９１）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｃｈ（ｅｄ．）（１９９３）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１−６０８；Ｍｉｌｇｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６−１９７３；Ｓｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３−７９２；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３−６１９；Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４−３２；Ｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４−１６０２；Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ２００３（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５７ｔｈ  Ｅｄ）；Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ；ＩＳＢＮ：１５６３６３４４５７；５７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００２）を参照のこと。適切な投薬レジメンの決定は、医師により、例えば、処置に影響することが当該技術分野において既知であるか、もしくは疑われているか、または処置に影響すると予測されるパラメータまたは要素を用いて行なわれ得、例えば、患者の臨床歴（例えば、以前の治療）、処置対象のがんの型およびステージならびに併用療法の治療用薬剤の１種類以上に対するバイオマーカーの応答に依存する。
【０１３３】
本発明の併用療法の生物療法剤は、連続輸注によって、または例えば、毎日、隔日、週３回もしくは週１回、２週間に１回、３週間に１回、毎月、２ヶ月に１回などの間隔での投与によって投与され得る。１週間の総用量は、一般的に少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ、０．２μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ体重またはそれ以上である。例えば、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：４２７−４３４；Ｈｅｒｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６９２−１６９８；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．６７：４５１−４５６；Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：１３３−１４４を参照のこと。
【０１３４】
抗ヒトＰＤ−１  ｍＡｂが併用療法のＰＤ−１アンタゴニストとして使用されるいくつかの実施形態では、投与レジメンは、抗ヒトＰＤ−１  ｍＡｂを１、２、３、５または１０ｍｇ／ｋｇの用量で約１４日（±２日）または約２１日（±２日）または約３０日（±２日）の間隔で処置過程全体を通して投与することを含む。
【０１３５】
抗ヒトＰＤ−１  ｍＡｂが併用療法のＰＤ−１アンタゴニストとして使用される他の実施形態では、投与レジメンは、抗ヒトＰＤ−１  ｍＡｂを約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で、患者内用量漸増を伴って投与することを含む。他の用量漸増実施形態では、投与間の間隔はだんだん短くする、例えば、１回目と２回目の投薬の間は約３０日（±２日）、２回目と３回目の投薬の間は約１４日（±２日）にする。一部の特定の実施形態では、投与間隔は２回目の投与以降の投与を約１４日（±２日）にする。
【０１３６】
一部の特定の実施形態では、被験体には、本明細書に記載の任意のＰＤ−１アンタゴニストを含む医薬の静脈内（ＩＶ）輸注が投与される。
【０１３７】
本発明の好ましい一実施形態では、併用療法のＰＤ−１アンタゴニストがニボルマブであり、これは：１ｍｇ／ｋｇ  Ｑ２Ｗ、２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ２Ｗ、３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ２Ｗ、５ｍｇ／ｋｇ  Ｑ２Ｗ、１０ｍｇ  Ｑ２Ｗ、１ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、５ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗおよび１０ｍｇ  Ｑ３Ｗからなる群より選択される用量で静脈内投与される。
【０１３８】
本発明の別の好ましい実施形態では、併用療法のＰＤ−１アンタゴニストがペンブロリズマブまたはペンブロリズマブバリアントであり、これは液状医薬にて、１ｍｇ／ｋｇ  Ｑ２Ｗ、２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ２Ｗ、３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ２Ｗ、５ｍｇ／ｋｇ  Ｑ２Ｗ、１０ｍｇ  Ｑ２Ｗ、１ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、５ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、１０ｍｇ  Ｑ３Ｗおよびこれらの用量のいずれかの等価な一定用量（ｆｌａｔ−ｄｏｓｅ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）、すなわち、例えば２００ｍｇ  Ｑ３Ｗからなる群より選択される用量で投与される。いくつかの実施形態では、ペンブロリズマブは、２５ｍｇ／ｍｌのペンブロリズマブ、７％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を１０ｍＭのヒスチジンバッファー（ｐＨ５．５）中に含む液状医薬として提供される。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、選択された用量のペンブロリズマブはＩＶ輸注によって投与される。一実施形態では、選択された用量のペンブロリズマブは、ＩＶ輸注によって２５〜４０分または約３０分の時間にわたって投与される。
【０１４０】
本発明の一実施形態では、併用療法のＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドは配列番号：４５の配列を有する。しかしながら、本明細書に記載のモチーフおよび配列を有する他のＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドもまた、本発明の併用療法における使用に適している。したがって、配列番号：４５のＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドを含む方法または医薬に関する任意の説明は、他のＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチド、特にＣ５９−０１〜Ｃ５９−１４（配列番号：３８〜５１）にもまた適用可能であると理解されたい。簡潔にするため、この理解は、全体を通して繰り返さない。本発明の一実施形態では、併用療法のＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドは、配列番号：４５の配列を有し、０．１〜１６．０ｍｇを週に１回、好ましくは０．１、０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０または８．０ｍｇを週に１回の用量で腫瘍内投与される。本発明の別の実施形態では、配列番号：４５のオリゴヌクレオチドは、０．１〜１６．０ｍｇを週に１回を４週間にわたって、好ましくは０．１、０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、６．０、７．０または８．０ｍｇを週に１回を４週間にわたる用量で腫瘍内投与される。本発明のさらなる一実施形態では、配列番号：４５のオリゴヌクレオチドは、０．１〜１６．０ｍｇを３週に１回、好ましくは０．１、０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、６．０、７．０または８．０ｍｇを３週に１回の用量で腫瘍内投与される。本発明の別の実施形態では、配列番号：４５のオリゴヌクレオチドは、２．０、４．０または８．０ｍｇを週に１回を４週間にわたる用量で腫瘍内投与される。本発明のまた別の実施形態では、配列番号：４５のオリゴヌクレオチドは、２．０、４．０または８．０ｍｇを週に１回を４週間にわたり、続いて３週に１回の用量で腫瘍内投与される。一実施形態では、配列番号：４５のオリゴヌクレオチドは、進行がみられるまで、または最初の投与後１２〜２４週間まで投与される。別の実施形態では、配列番号：４５のオリゴヌクレオチドは、合計４、５、６、７または８回の用量で投与される。いくつかの実施形態では、配列番号：４５のＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドは、週２回、週１回、隔週、３週に１回、１ヶ月に１回または隔月で投与される。
【０１４１】
ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドとの併用でのペンブロリズマブの至適用量は、これらの薬剤の一方または両方の用量漸増または用量漸減によって特定され得る。一実施形態では、ペンブロリズマブは２００ｍｇ  Ｑ３Ｗで投与され、配列番号：４５のオリゴヌクレオチドは、１〜１６ｍｇを週に１回、好ましくは、１．０、２．０、４．０、８．０または１６．０ｍｇを週に１回の用量で腫瘍内投与される。一実施形態では、患者は、２００ｍｇのペンブロリズマブをＱ３Ｗで１日目に処置され、配列番号：４５のオリゴヌクレオチドを、１〜１６ｍｇを１日目に、好ましくは、１．０、２．０、４．０、８．０または１６．０ｍｇを１日目、週に１回を４週間の用量で、続いて１〜１６ｍｇ、好ましくは、１．０、２．０、４．０、８．０または１６．０ｍｇを３週に１回の用量で腫瘍内投与される。一実施形態では、配列番号：４５のオリゴヌクレオチドは、進行がみられるまで、または最初の投与後２４週間まで投与される。さらなる一実施形態では、配列番号：４５のオリゴヌクレオチドは、１〜１６ｍｇ、好ましくは、１．０、２．０、４．０、８．０または１６．０ｍｇを１日目、週に１回を４週間にわたる用量で、続いて１〜１６ｍｇ、好ましくは、１．０、２．０、４．０、８．０または１６．０ｍｇを３週に１回９週間の用量で腫瘍内投与される。別の実施形態では、配列番号：４５のオリゴヌクレオチドは、進行がみられるまで、または最初の投与後２４週間まで投与される。一実施形態では、患者が、抗ＰＤ−１の前治療を受けている間に進行性疾患を有していると確認される。別の実施形態では、ペンブロリズマブは静脈内投与され、進行がみられるまで、または４５週間まで投与される。
【０１４２】
別の実施形態では、患者が２００ｍｇのペンブロリズマブをＱ３Ｗで１日目に処置され、配列番号：４５のオリゴヌクレオチドを、１〜１６ｍｇ、好ましくは、１．０、２．０、４．０、８．０または１６．０ｍｇを２２日目に、週に１回を４週間にわたる用量で、続いて１〜１６ｍｇ、好ましくは、１．０、２．０、４．０、８．０または１６．０ｍｇを３週に１回の用量で腫瘍内により処置される。さらなる一実施形態では、配列番号：４５のオリゴヌクレオチドは、１〜１６ｍｇ、好ましくは、１．０、２．０、４．０、８．０または１６．０ｍｇを１日目に、週に１回を４週間にわたる用量で、続いて１〜１６ｍｇ、好ましくは、１．０、２．０、４．０、８．０または１６．０ｍｇを３週に１回を９週間にわたる用量で腫瘍内投与される。一実施形態では、患者が抗ＰＤ−１／Ｌ１処置について治療未経験である。別の実施形態では、ペンブロリズマブは静脈内投与される。別の実施形態では、ペンブロリズマブは静脈内投与され、進行がみられるまで、または４５週間まで投与される。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、患者は併用療法で少なくとも２４週間、例えば８回の３週間サイクルで処置される。いくつかの実施形態では、併用療法での処置を、患者がＰＤまたはＣＲの徴候を示すまで継続する。
【０１４４】
本発明のさらなる一態様では、ＰＤ−１アンタゴニストとＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドを含む併用療法に、さらに抗ＩＬ−１０抗体を含める。本発明の一実施形態では、併用療法の抗ＩＬ−１０抗体は抗ＩＬ  １０  ｈｕｍ  １２Ｇ８であり、これは：１ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、４ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、５ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、６ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、７ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、８ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、９ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、１０ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、１１ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、１２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、１３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、１４ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗおよび１５ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗからなる群より選択される用量で静脈内投与される。本発明の別の実施形態では、併用療法中の抗ＩＬ−１０抗体は抗ＩＬ−１０  ｈｕｍ  １２Ｇ８であり、これは、１ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗの用量で静脈内投与される。本発明のさらなる一実施形態では、併用療法の抗ＩＬ−１０抗体は抗ＩＬ  １０  ｈｕｍ  １２Ｇ８であり、これは、３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗの用量で静脈内投与される。本発明のまた別の実施形態では、併用療法の抗ＩＬ−１０抗体は抗ＩＬ  １０  ｈｕｍ  １２Ｇ８であり、これは１０ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗの用量で静脈内投与される。
【０１４５】
本発明の好ましい一実施形態では、併用療法の抗ＩＬ−１０抗体は抗ＩＬ−１０  ｈｕｍ  １２Ｇ８または抗ＩＬ−１０  ｈｕｍ  １２Ｇ８バリアントであり、これは、液状医薬にて、１ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、４ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、５ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、６ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、７ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、８ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、９ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、１０ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、１１ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、１２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、１３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、１４ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗおよび１５ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗからなる群より選択される用量で投与される。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、患者は、ＮＳＣＬＣ、ＲＣＣ、子宮内膜がん、尿路上皮がん、頭頸部の扁平上皮細胞癌または黒色腫と診断されている場合、本発明の併用療法での処置に選択される。
【０１４７】
また、本発明により、上記のＰＤ−１アンタゴニストおよび薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬を提供する。ＰＤ−１アンタゴニストが生物療法剤、例えばｍＡｂである場合、該アンタゴニストは、ＣＨＯ細胞において、慣用的な細胞培養および回収／精製技術を用いて作製され得る。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体をＰＤ−１アンタゴニストとして含む医薬は、液状製剤として提供され得るか、または使用前に凍結乾燥粉末剤を注射用滅菌水で再構成することにより調製され得る。国際公開第２０１２／１３５４０８号に、本発明における使用に適したペンブロリズマブを含む液状および凍結乾燥型の医薬の調製が記載されている。いくつかの実施形態では、ペンブロリズマブを含む医薬がガラスバイアル内に提供され、これには約１００ｍｇのペンブロリズマブが４ｍｌの液剤で収容される。液剤１ｍＬ毎に２５ｍｇのペンブロリズマブが含有されており：Ｌ−ヒスチジン（１．５５ｍｇ）、ポリソルベート８０（０．２ｍｇ）、スクロース（７０ｍｇ）および注射用水ＵＳＰで製剤化される。この液剤は、ＩＶ輸注のために希釈が必要とされる。
【０１４９】
また、本発明により、ＴＬＲ９アゴニストおよび薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬であって、該ＴＬＲ９アゴニストがＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドである医薬を提供する。ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドは、腫瘍内注射のために生理学的バッファー中で再構成させるものであってもよい。
【０１５０】
本明細書に記載の医薬を、第１の容器と第２の容器と添付文書を備えたキットとして提供してもよい。第１の容器には、ＰＤ−１アンタゴニストを含む少なくとも１回の用量の医薬が収容され、第２の容器には、ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１回の用量の医薬が収容され、添付文書またはラベルは該医薬を用いて患者のがんを処置するための使用説明書を含む。第１および第２の容器は同じまたは異なる形状（例えば、バイアル、シリンジおよびボトル）および／または材質（例えば、プラスチックもしくはガラス）で構成されたものであり得る。キットはさらに、該医薬の投与に有用であり得る他の材料、例えば、希釈剤、フィルター、ＩＶバッグとライン、針とシリンジを備えていてもよい。キットの好ましいいくつかの実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストは抗ＰＤ−１抗体であり、使用説明書には、医薬がＩＨＣアッセイによるＰＤ−Ｌ１発現に関する試験で陽性であるがんを有する患者の処置における使用が意図されたものであることが記載されている。
【０１５１】
本発明のこれらおよび他の態様、例えば、以下に示す例示的な特異的実施形態は、本明細書に示した教示から自明であろう。
【０１５２】
本発明の例示的な具体的な実施形態
１．個体にＰＤ−１アンタゴニストとＴＬＲ９アゴニストを含む併用療法を投与することを含む、個体のがんを処置するための方法であって、該ＴＬＲ９アゴニストがＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドである方法。
【０１５３】
２．個体にＰＤ−１アンタゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体またはその抗原結合断片およびＴＬＲ９アゴニストを含む併用療法を投与することを含む、個体のがんを処置するための方法であって、該ＴＬＲ９アゴニストがＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドである方法。
【０１５４】
３．ＰＤ−１アンタゴニストがモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である実施形態１または２の方法。
【０１５５】
４．ＴＬＲ９アゴニストとの併用における使用のためのＰＤ−１アンタゴニストを含む、個体のがんを処置するための医薬であって、該ＰＤ−１アンタゴニストがモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であり、該ＴＬＲ９アゴニストがＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドであり、好ましくは、該ＰＤ−１アンタゴニストが該ＴＬＲ９アゴニストの前に投与される医薬。
【０１５６】
５．ＴＬＲ９アゴニストおよび抗ＩＬ−１０抗体またはその抗原結合断片との併用における使用のための、個体のがんを処置するための、ＰＤ−１アンタゴニストを含む医薬であって、該ＰＤ−１アンタゴニストがモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であり、該ＴＬＲ９アゴニストがＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドである医薬。
【０１５７】
６．ＰＤ−１アンタゴニストとの併用における使用のための、個体のがんを処置するための、ＴＬＲ９アゴニストを含む医薬であって、該ＴＬＲ９アゴニストがＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドである医薬。
【０１５８】
７．ＴＬＲ９アゴニストと併用して投与する場合の個体のがんを処置するための医薬の製造におけるＰＤ−１アンタゴニストの使用であって、該ＴＬＲ９アゴニストがＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドである使用。
【０１５９】
８．ＴＬＲ９アゴニストおよび抗ＩＬ−１０抗体またはその抗原結合断片と併用して投与する場合の個体のがんを処置するための医薬の製造におけるＰＤ−１アンタゴニストの使用であって、該ＴＬＲ９アゴニストがＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドである使用。
【０１６０】
９．ＰＤ−１アンタゴニストと併用して投与する場合の個体のがんを処置するための医薬の製造におけるＴＬＲ９アゴニストの使用であって、該ＴＬＲ９アゴニストがＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドである使用。
【０１６１】
１０．個体のがんを処置するための医薬の製造におけるＰＤ−１アンタゴニストおよびＴＬＲ９アゴニストの使用であって、該ＴＬＲ９アゴニストがＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドである使用。
【０１６２】
１１．第１の容器、第２の容器および添付文書を備えたキットであって、第１の容器には、抗ＰＤ−１アンタゴニストを含む少なくとも１回の用量の医薬が含まれており、第２の容器には、ＴＬＲ９アゴニストを含む少なくとも１回の用量の医薬が含まれており、該添付文書は、該医薬を用いて個体のがんを処置するための使用説明書を含み、該ＴＬＲ９アゴニストがＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドであるキット。
【０１６３】
１２．使用説明書に、医薬が、免疫組織化学的（ＩＨＣ）アッセイによるＰＤ−Ｌ１発現に関する試験で陽性であるがんを有する個体の処置における使用が意図されたものであることが記載されている、実施形態１１のキット。
【０１６４】
１３．個体がヒトであり、ＰＤ−１アンタゴニストが、ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合してヒトＰＤ−Ｌ１がヒトＰＤ−１に結合するのをブロックするモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、実施形態１〜１２のいずれかの方法、医薬、使用またはキット。
【０１６５】
１４．ＰＤ−１アンタゴニストが、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＭＳ−９３６５５９、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃであるか、または、それぞれ配列番号：２４および配列番号：２１の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む国際公開第２０１３／０１９９０６号のモノクローナル抗体である、実施形態１〜１２のいずれか１つの方法、医薬、使用またはキット。
【０１６６】
１５．個体がヒトであり、ＰＤ−１アンタゴニストが、ヒトＰＤ−１に特異的に結合してヒトＰＤ−Ｌ１がヒトＰＤ−１に結合するのをブロックするモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、実施形態１〜１２のいずれかの方法、医薬、使用またはキット。
【０１６７】
１６．ＰＤ−１アンタゴニストがまた、ヒトＰＤ−Ｌ２がヒトＰＤ−１に結合するのもブロックする、実施形態１５の方法、医薬、使用またはキット。
【０１６８】
１７．モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が：（ａ）配列番号：１、２および３の軽鎖ＣＤＲと配列番号：４、５および６の重鎖ＣＤＲ；または（ｂ）配列番号：７、８および９の軽鎖ＣＤＲと配列番号：１０、１１および１２の重鎖ＣＤＲ；を含む実施形態１５の方法、医薬、使用またはキット。
【０１６９】
１８．モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が配列番号：７、８および９の軽鎖ＣＤＲと配列番号：１０、１１および１２の重鎖ＣＤＲを含む、実施形態１５の方法、医薬、使用またはキット。
【０１７０】
１９．ＰＤ−１アンタゴニストが、重鎖と軽鎖を含む抗ＰＤ−１モノクローナル抗体であり、そしてここで、該重鎖が配列番号：２１を含み、該軽鎖が配列番号：２２を含む、実施形態１５の方法、医薬、使用またはキット。
【０１７１】
２０．ＰＤ−１アンタゴニストが、重鎖と軽鎖を含む抗ＰＤ−１モノクローナル抗体であり、そしてここで、該重鎖が配列番号：２３を含み、該軽鎖が配列番号：２４を含む、実施形態１５の方法、医薬、使用またはキット。
【０１７２】
２１．抗ＩＬ−１０抗体またはその抗原結合断片が、配列番号：３２および配列番号：３３の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、実施形態１〜２０のいずれか１つの方法、医薬、使用またはキット。
【０１７３】
２２．抗ＩＬ−１０抗体またはその抗原結合断片が：（ａ）配列番号：２６、２７および２８の軽鎖ＣＤＲと配列番号：２９、３０および３１の重鎖ＣＤＲを含む、実施形態１〜２０のいずれか１つの方法、医薬、使用またはキット。
【０１７４】
２３．抗ＩＬ−１０抗体が、重鎖と軽鎖を含む抗ＩＬ−１０モノクローナル抗体であり、そしてここで、該重鎖が配列番号：３４を含み、該軽鎖が配列番号：３５を含む、実施形態１〜２０のいずれか１つの方法、医薬、使用またはキット。
【０１７５】
２４．抗ＩＬ−１０抗体が抗ＩＬ−１０  ｈｕｍ  １２Ｇ８または抗ＩＬ−１０  ｈｕｍ  １２Ｇ８バリアントである実施形態１〜２０のいずれか１つの方法、医薬、使用またはキット。
【０１７６】
２５．ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドが：
（ａ）５’−Ｎｘ（ＴＣＧ（Ｎｑ））ｙＮｗ（Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ２’Ｘ１’（ＣＧ）ｐ）ｚ，Ｎｖ（配列番号：３８）であって、ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０、１、２または３、ｙ＝１、２、３または４、ｗ＝０、１または２、ｐ＝０または１、ｑ＝０、１または２、ｖ＝０〜８９およびｚ＝１〜２０であり、Ｘ１とＸ１’は自己相補型ヌクレオシドであり、Ｘ２とＸ２’も自己相補型ヌクレオシドである；および
（ｂ）少なくとも８塩基長のパリンドローム配列であって、ここで、該パリンドローム配列は（Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ２’Ｘ１’（ＣＧ）ｐ）ｚ配列の最初の（Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ２’Ｘ１’）を含む、
からなり、該オリゴヌクレオチドが１２〜１００塩基長である、実施形態１〜２４のいずれか１つの方法、医薬、使用またはキット。
【０１７７】
２６．ｘ＝０、ｙ＝１、ｗ＝０、ｐ＝０または１、ｑ＝０、１または２、ｖ＝０〜２０およびｚ＝１、２、３または４である、実施形態２５の方法、医薬、使用またはキット。
【０１７８】
２７．ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドがＴＣＧＮｑ（Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ２’Ｘ１’ＣＧ）ｚＮｖ（配列番号：３９）からなり、ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｑ＝０、１、２、３、４または５、ｖ＝０〜２０、ｚ＝１〜４であり、Ｘ１とＸ１’は自己相補型ヌクレオシドであり、Ｘ２とＸ２’も自己相補型ヌクレオシドであり、該オリゴヌクレオチドが少なくとも１２塩基長である、請求項１〜２４のいずれか１つの方法、医薬、使用またはキット。
【０１７９】
２８．ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドが５’−ＴＣＧＮｑＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＮｓ−３’（配列番号：４０）からなり、ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｑ＝０、１、２、３、４または５、ｓ＝０〜２０であり、該オリゴヌクレオチドが少なくとも１２塩基長である、実施形態１〜２４のいずれか１つの方法、医薬、使用またはキット。
【０１８０】
２９．ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドが：
５’−ＴＣＧＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡＴ−３’（配列番号：４１）；
５’−ＴＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡ−３’（配列番号：４２）；
５’−ＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴ−３’（配列番号：４３）；
５’−ＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＴＴＴＴ−３’（配列番号：４４）；
５’−ＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＴ−３’（配列番号：４５）；
５’−ＴＣＧＴＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＡ−３’（配列番号：４６）；
５’−ＴＣＧＴＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴ−３’（配列番号：４７）；
５’−ＴＣＧＴＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴ−３’（配列番号：４８）；
５’−ＴＣＧＴＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧ−３’（配列番号：４９）；
５’−ＴＣＧＴＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣ−３’（配列番号：５０）；および
５’−ＴＣＧＴＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡ−３’（配列番号：５１）
からなる群より選択される、実施形態１〜２４のいずれか１つの方法、医薬、使用またはキット。
【０１８１】
３０．ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドが、５’−ＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＴ−３’（配列番号：４５）からなる配列を有する、実施形態１〜２４のいずれか１つの方法、医薬、使用またはキット。
【０１８２】
３１．がんが固形腫瘍である、実施形態１〜３０のいずれか１つの方法、医薬、使用またはキット。
【０１８３】
３２．がんが、膀胱がん、乳がん、腎明細胞がん、頭／頸部扁平上皮細胞癌、肺扁平上皮細胞癌、悪性黒色腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎細胞がん、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）またはトリプルネガティブ乳がんである、実施形態１〜３０のいずれか１つの方法、医薬、使用またはキット。
【０１８４】
３３．がんが、ＮＳＣＬＣ、ＲＣＣ、子宮内膜がん、尿路上皮がん、頭頸部の扁平上皮細胞癌または黒色腫である、実施形態１〜３０のいずれか１つの方法、医薬、使用またはキット。
【０１８５】
３４．個体が、ＮＳＣＬＣ、ＲＣＣ、子宮内膜がん、尿路上皮がん、頭頸部の扁平上皮細胞癌または黒色腫について以前に処置されたことがない個体である、実施形態１〜３０のいずれか１つの方法、医薬、使用またはキット。
【０１８６】
３５．がんが、進行型または転移性の黒色腫である、実施形態１〜３０のいずれか１つの方法、医薬、使用またはキット。
【０１８７】
３６．がんが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄性細胞白血病−１タンパク質（Ｍｃｌ−１）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫または小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）である、実施形態１〜３０のいずれか１つの方法、医薬、使用またはキット。
【０１８８】
３７．がんが、腎細胞癌、非小細胞肺がん、膀胱がんおよび結腸直腸がんからなる群より選択される、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法または医薬。
【０１８９】
３８．がんが、ヒトＰＤ−Ｌ１に関する試験で陽性である、実施形態１〜３７のいずれか１つの方法、医薬、使用またはキット。
【０１９０】
３９．ヒトＰＤ−Ｌ１発現が高値である、実施形態３８の方法、医薬、使用またはキット。
【０１９１】
４０．ＰＤ−１アンタゴニストが、ペンブロリズマブ、ペンブロリズマブバリアントまたはニボルマブである、実施形態３８の方法、医薬、使用またはキット。
【０１９２】
４１．ペンブロリズマブが、２５ｍｇ／ｍｌのペンブロリズマブ、７％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を１０ｍＭのヒスチジンバッファー（ｐＨ５．５）中に含む液状医薬として製剤化される、実施形態４０の方法、医薬、使用またはキット。
【０１９３】
４２．配列番号：４５のＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドとの併用における使用のためのペンブロリズマブを含む医薬であって、個体にまずペンブロリズマブ投与した後、１〜４週間後、好ましくは１、２または３週間後に配列番号：４５のオリゴヌクレオチドを腫瘍内投与することを含む方法によりヒト個体のがんを処置するための医薬。
【０１９４】
４３．個体にペンブロリズマブと配列番号：４５のＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドを含む併用療法を投与することを含む、がんと診断されたヒト個体を処置するための方法であって、ペンブロリズマブが２００ｍｇ  Ｑ３Ｗで投与され、配列番号：４５のオリゴヌクレオチドが１〜１６ｍｇの用量で週に１回、好ましくは１．０、２．０、４．０、８．０または１６．０ｍｇの用量で週に１回腫瘍内投与される方法。
【０１９５】
４４．配列番号：４５のＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドとの併用における使用のためのペンブロリズマブを含む医薬であって、個体に、２００ｍｇのペンブロリズマブをＱ３Ｗで、１日目から開始して投与し、そして配列番号：４５のオリゴヌクレオチドを１〜１６ｍｇの用量で２２日目から開始し、その後週に１回を４週間にわたって、続いて１〜１６ｍｇの用量で３週に１回、腫瘍内投与することを、好ましくは、配列番号：４５のオリゴヌクレオチドが、１．０、２．０、４．０、８．０または１６．０ｍｇの用量で腫瘍内投与される、ことを含む方法によりヒト個体のがんを処置するための医薬。
【０１９６】
４５．配列番号：４５のＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドとの併用における使用のためのペンブロリズマブを含む医薬であって、個体に、２００ｍｇのペンブロリズマブをＱ３Ｗで、１日目から開始して投与し、そして配列番号：４５のオリゴヌクレオチドを１〜１６ｍｇの用量で１日目から開始して週に１回を４週間にわたって、続いて１〜１６ｍｇの用量で３週に１回、腫瘍内投与することを、好ましくは、配列番号：４５のオリゴヌクレオチドは１．０、２．０、４．０、８．０または１６．０ｍｇの用量で腫瘍内投与される、ことを含む方法によりヒト個体のがんを処置するための医薬。
【０１９７】
４６．配列番号：４５のＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドとの併用における使用のためのペンブロリズマブを含む医薬であって、個体に、２００ｍｇのペンブロリズマブをＱ３Ｗで、１日目から開始して投与し、そして配列番号：４５のオリゴヌクレオチドを１〜１６ｍｇの用量で２２日目から開始して週に１回を４週間にわたって、続いて１〜１６ｍｇの用量で３週に１回、腫瘍内投与することを、好ましくは、配列番号：４５のオリゴヌクレオチドは１．０、２．０、４．０、８．０または１６．０ｍｇの用量で腫瘍内投与される、ことを含む方法によりヒト個体のがんを処置するための医薬。
【０１９８】
４７．個体が、抗ＰＤ−１療法または抗ＰＤ−Ｌ１療法で以前に処置されたことがない個体である、実施形態４２〜４４または４６の方法または医薬。
【０１９９】
４８．個体が、抗ＰＤ−１の前治療を受けている間に進行が確認されている個体である、実施形態４３または４５の方法または医薬。
【０２００】
４９．ペンブロリズマブが、２５〜４０分間または約３０分間のＩＶ輸注によって投与される、実施形態４２〜４８のいずれかの方法または医薬。
【０２０１】
５０．がんの組織切片が、併用療法の投与の実施前に個体から切除されたものであり、ＰＤ−Ｌ１発現に関する試験で陽性である、実施形態４２〜４９のいずれかの方法または医薬。
【０２０２】
５１．組織切片中の腫瘍細胞の少なくとも５０％が、免疫組織化学的（ＩＨＣ）アッセイによるＰＤ−Ｌ１発現に関する試験で陽性である、実施形態５０の方法または医薬。
【０２０３】
５２．ＩＨＣアッセイでＰＤ−Ｌ１発現を検出するために抗体２２Ｃ３を使用した、実施形態５１の方法または医薬。
【０２０４】
５３．ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドが、５’−ＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＴ−３’（配列番号：４５）の配列とのナトリウム塩であり、該オリゴヌクレオチドがホスホロチオエート骨格を有するオリゴデオキシヌクレオチドである、実施形態１〜５２のいずれか１つの方法または医薬。
【０２０５】
５４  ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドが、５’−ＴＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡ−３’（配列番号：４２）からなる配列を有する、実施形態１〜５３のいずれか１つの方法、医薬、使用またはキット。
【０２０６】
５５．ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドが、５’−ＴＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡ−３’（配列番号：４２）のナトリウム塩である、実施形態１〜５３のいずれか１つの方法、医薬、使用またはキット。
【０２０７】
５６．がんが進行型または転移性の黒色腫である、実施形態４２〜５５のいずれかの方法、医薬、使用またはキット。
【０２０８】
５７．ＰＤ−１アンタゴニストがペンブロリズマブであり、ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドが、５’−ＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＴ−３’（配列番号：４５）からなる配列を有する、実施形態１の方法。
【０２０９】
５８．ＰＤ−１アンタゴニストがペンブロリズマブであり、ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドが、５’−ＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＴ−３’（配列番号：４５）からなる配列を有するものであり、該オリゴヌクレオチドがホスホロチオエート骨格を有するオリゴデオキシヌクレオチドである、実施形態１の方法。
【０２１０】
５９．がんが進行型または転移性の黒色腫である、実施形態５７または５８の方法。
【０２１１】
６０．ＰＤ−１アンタゴニストがペンブロリズマブであり、ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドが、５’−ＴＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡ−３’（配列番号：４２）からなる配列を有する、実施形態１の方法。
【０２１２】
６１．ＰＤ−１アンタゴニストが、配列番号：７、８および９の軽鎖ＣＤＲと配列番号：１０、１１および１２の重鎖ＣＤＲを含むモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であり、ＣｐＧ−Ｃ型オリゴヌクレオチドが：
（ａ）５’−Ｎｘ（ＴＣＧ（Ｎｑ））ｙＮｗ（Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ２’Ｘ１’（ＣＧ）ｐ）ｚ，Ｎｖ（配列番号：３８）であって、ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０、１、２または３、ｙ＝１、２、３または４、ｗ＝０、１または２、ｐ＝０または１、ｑ＝０、１または２、ｖ＝０〜８９およびｚ＝１〜２０であり、Ｘ１とＸ１’は自己相補型ヌクレオシドであり、Ｘ２とＸ２’も自己相補型ヌクレオシドである；および
（ｂ）少なくとも８塩基長のパリンドローム配列であって、ここで、該パリンドローム配列は（Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ２’Ｘ１’（ＣＧ）ｐ）ｚ（配列番号：５６）配列の最初の（Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ２’Ｘ１’）（配列番号：５５）を含む、
からなるものであり、該オリゴヌクレオチドが１２〜１００塩基長である、実施形態１の方法。
【０２１３】
一般法
分子生物学の標準的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８２  ＆  １９８９  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｗｕ（１９９３）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｖｏｌ．２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に記載されている。また、標準的な方法は、Ａｕｓｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹにも示されており、これには、細菌細胞でのクローニングおよびＤＮＡ変異誘発（第１巻）、哺乳動物細胞および酵母でのクローニング（第２巻）、複合糖質およびタンパク質の発現（第３巻）ならびにバイオインフォマティクス（第４巻）が記載されている。
【０２１４】
免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離および晶出を含むタンパク質の精製のための方法は報告されている（Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の作製、タンパク質のグリコシル化は報告されている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ，ｐｐ．１６．０．５−１６．２２．１７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．（２００１）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；ｐｐ．４５−８９；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１）ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．３８４−３９１参照）。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の作製、精製および断片化は報告されている（Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（上掲））。リガンド／受容体相互作用を特性評価するための標準的な手法が利用可能である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。
【０２１５】
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体およびヒト化抗体が調製され得る（例えば、Ｓｈｅｐｅｒｄ  ａｎｄ  Ｄｅａｎ（ｅｄｓ．）（２０００）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ（ｅｄｓ．）（２００１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．１３９−２４３；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：６２０５；Ｈｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０２９；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２７３７１−２７３７８；Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３；Ｆｏｏｔｅ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−４９９；米国特許第６，３２９，５１１号参照）。
【０２１６】
ヒト化の代替法は、ファージ上にディスプレイされたヒト抗体ライブラリーまたはトランスジェニックマウスにおけるヒト抗体ライブラリーを使用することである（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０９−３１４；Ｂａｒｂａｓ（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １：８３７−８３９；Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｅｓ（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１−３７７；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；ｄｅ  Ｂｒｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：３９７−３９９）。
【０２１７】
抗原の精製は抗体の生成に必要でない。動物が、目的の抗原を有する細胞で免疫処置され得る。次いで、脾細胞が免疫処置した動物から単離され得、この脾細胞が骨髄腫細胞株と融合され、ハイブリドーマが作製され得る（例えば、Ｍｅｙａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：２８３−２９０；Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：２３３−２４２；Ｐｒｅｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）；Ｋａｉｔｈａｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：５１５７−５１６４参照）。
【０２１８】
抗体は、例えば、薬物小分子、酵素、リポソーム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされ得る。抗体は、治療用、診断用、キットまたは他の目的に有用であり、例えば、色素、放射性同位体、酵素または金属、例えば金コロイドとカップリングさせた抗体を包含している。（例えば、Ｌｅ  Ｄｏｕｓｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１６９−１７５；Ｇｉｂｅｌｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３８９１−３８９８；Ｈｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｉｓｈｏｐ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２８０４−２８１１；Ｅｖｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：８８３−８８９参照）。
【０２１９】
フローサイトメトリー、例えば蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）のための方法が利用可能である（例えば、Ｏｗｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｇｉｖａｎ（２００１）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２ｎｄ  ｅｄ．；Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ参照）。例えば診断用の試薬としての使用のための核酸、例えば、核酸プライマーおよびプローブ、ポリペプチドならびに抗体の修飾に適した蛍光試薬が利用可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓｙ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
【０２２０】
免疫系の組織学検査の標準的な方法は報告されている（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈａｒｍｅｌｉｎｋ（ｅｄ．）（１９８６）Ｈｕｍａｎ  Ｔｈｙｍｕｓ：Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｈｉａｔｔ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｏｌｏｒ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ，ＰＡ；Ｌｏｕｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂａｓｉｃ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：Ｔｅｘｔ  ａｎｄ  Ａｔｌａｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ参照）。
【０２２１】
例えば、抗原断片、リーダー配列、タンパク質のフォールディング、機能性ドメイン、グリコシル化部位および配列アラインメントを調べるためのソフトウェアパッケージおよびデータベースが利用可能である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ，Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）；ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；ＤｅＣｙｐｈｅｒ（登録商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ  Ｃｏｒｐ．，Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｂａｙ，Ｎｅｖａｄａ）；Ｍｅｎｎｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １６：７４１−７４２；Ｍｅｎｎｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｎｏｔｅ  １６：７４１−７４２；Ｗｒｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ  Ｂｉｏｍｅｄ．６８：１７７−１８１；ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１７−２１；ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０参照）。
【０２２２】
［実施例］
［実施例１］
実施例１：Ｃ５９−０８によるヒト細胞の免疫調節
Ｃ５９−０８は、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴデオキシヌクレオチド５’−ＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＴ−３’（配列番号：４５）のナトリウム塩である。
【０２２３】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）  ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を加えた２例のドナーのバフィーコートから、標準的な分離方法を用いて単離した。単離したＰＢＭＣを、２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で２回洗浄した。細胞を再懸濁させ、９６ウェルＵ字底プレート内で１×１０６細胞／ウェルにて、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ  １６４０中で培養した。細胞は、０．０１６μＭ〜５μＭの範囲の用量のＣ５９−０８または７μＭの対照ＯＤＮ  １０４０の存在下、加湿インキュベータ内で３７℃，５％ＣＯ２にて、０．２ｍＬの最終容量で４８時間培養した。上清みを回収し、ＩＦＮα２ａおよびＩＬ−１０についてＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  ＤｉｓｃｏｖｅｒｙヒトＩＦＮα２ａおよびヒトＩＬ−１０組織培養キット（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いてアッセイした。
【０２２４】
結果を図１２に示す。Ｃ５９−０８は、ヒトＰＢＭＣにおいてＩＦＮα２ａおよびＩＬ−１０の両方の産生を誘導し、至適濃度は０．２μＭである。
【０２２５】
［実施例２］
実施例２：Ｃ５９−０８によるヒト腫瘍被検体の免疫調節
ヒト腫瘍組織培養物
患者由来のヒト腫瘍被検体を、市販の供給元（Ｂｉｏ−Ｏｐｔｉｏｎｓ，Ｆｏｌｉｏ，Ｃｏｖｅｒｓａｎｔ  Ｂｉｏ，ａｎｄ  Ｂｏｓｔｏｎ  ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）およびロチェスター大学から入手した。新鮮腫瘍組織は術後１時間以内に収集され、ＡＱＩＸ輸送用培地（ＡＱＩＸ，ＵＫ）に入れられたものであった。組織は、４℃にて一晩でＭｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡに輸送された。
【０２２６】
腫瘍をＵｌｔｒａＰｕｒｅ（商標）低融点アガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内に包埋し、Ｍｃｌｌｗａｉｎ（商標）  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｈｏｐｐｅｒ（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ，ＩＬ）を用いて４００μｍに切断した。腫瘍薄片をまず、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＣＭ細胞培養インサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＣＡ）にセットし、空気と培地（４．５ｇ／Ｌのグルコース、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、１０％のＦＢＳ（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補給した１ｍｌのＤＭＥＭ）の界面で、加湿インキュベータ内で３７℃，５％ＣＯ２にて培養した。
【０２２７】
腫瘍薄片を、０．１、０．５および１μＭのＣ５９−０８または１μＭの対照ＯＤＮ  １０４０の存在下で２４時間培養した。腫瘍試料をドライアイスでスナップ凍結させ、加工処理前に３７℃で保存した。
【０２２８】
ＲＮＡの単離およびリアルタイム定量ＰＣＲ
全ＲＮＡを、ポリトロンホモジナーザーを用いたＲＮＡ  ＳＴＡＴ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）とのホモジネーションによって単離した。全ＲＮＡを製造業者のプロトコルに従って抽出した。イソプロパノールでの沈殿後、全ＲＮＡを、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で、Ｐｈａｓｅ−Ｌｏｃｋ  Ｌｉｇｈｔチューブを用いて再度抽出した。
【０２２９】
ＤＮａｓｅ処理した全ＲＮＡを、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を製造業者のプロトコルに従って用いて逆転写した。プライマーは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から市販品を入手した。各試料からの１０ｎｇのｃＤＮＡに対するリアルタイム定量ＰＣＲを、各々９００ｎＭの非標識プライマーを２５０ｎＭのＦＡＭ標識プローブとともに用いてＴＡＱＭＡＮ（商標）  ＲＴｑＰＣＲ反応液中で、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｂｉｏｍａｒｋ配列検出システム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で行なった。別の反応液でユビキチンレベルを測定し、これを、Δ−ΔＣｔ法によるデータの正規化に使用した。ユビキチンおよび各試料の目的遺伝子の平均サイクル閾値（Ｃｔ）値を使用し、以下の式を用いて、正規化された値：１．８（Ｃｔユビキチン−Ｃｔ目的遺伝子）×１０４を得た。
【０２３０】
処置の結果
Ｃ５９−０８でのヒト腫瘍のエキソビボ処置により、ＩＦＮα誘導性遺伝子（ＩＦＮα２、ＭＣＰ１、ＭＣＰ２、ＯＡＳ２、ＩＰ−１０、ＧＢＰ１、ＩＳＧ−５４、ＭｘＢおよびＴＲＡＩＬ）、サイトカイン（ＩＦＮβ，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２，ＩＬ−６およびＴＮＦα）ならびに免疫活性化マーカー（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ７０およびＯＸ４０Ｌ）が腎細胞癌（ＲＣ）（ｎ＝５）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）（ｎ＝３）ならびに膀胱（ｎ＝１）および結腸直腸（ｎ＝１）がんの組織塊培養物において誘導された。ＲＣＣドナー由来の被検体でのデータを図１３：（Ａ）ＩＦＮα誘導性遺伝子；（Ｂ）サイトカイン；および（Ｃ）免疫活性化マーカーに示す。
【０２３１】
［実施例３］
実施例３：動物モデルにおける抗ＩＬ−１０と腫瘍内Ｃ５９−０８の併用の抗腫瘍活性
ＴＣ４０．１１Ｄ８は、マウスＩＬ−１０に対して標的化されるマウスＩｇＧ１／κモノクローナル抗体である。アデノウイルスヘキソン２５に特異的なマウスモノクローナル抗体をマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照にする。どちらの抗体も内部供給源から凍結（−８０℃）ストックとして入手した。
【０２３２】
抗体の製剤化
製剤バッファーは各抗体に特異的であり、タンパク質を安定化させ、沈殿を抑制するためのものである。ＴＣ４０．１１Ｄ８およびマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照のどちらの製剤も、７５ｍＭ塩化ナトリウム，１０ｍＭリン酸ナトリウム，３％スクロース，ｐＨ７．３であった。
【０２３３】
オリゴデオキシヌクレオチド
シチジンホスホ−グアノシン（ＣｐＧ）ベースホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）ＣｐＧ  １８２６  ５’−ｔｃｃａｔｇａｃｇｔｔｃｃｔｇａｃｇｔｔ−３’（配列番号：５３）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は、マウスＴＬＲ９特異的アゴニストである。ＣｐＧ  １８２６はＣｐＧ−Ｂ型配列を有する。ＣｐＧベースホスホロチオエートＯＤＮ  Ｃ５９−０８（Ｄｙｎａｖａｘ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）は、ヒトＴＬＲ９およびマウスＴＬＲ９のどちらも活性化させるアゴニストである。Ｃ５９−０８はＣｐＧ−Ｃ型配列：５’−ＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＴ−３’（配列番号：４５）を有し、５’および３’はＯＨ基である。
【０２３４】
対照ＯＤＮ（Ｄｙｎａｖａｘ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）は、ホスホロチオエート骨格５’−ＴＧＡ  ＣＴＧ  ＴＧＡ  ＡＣＣ  ＴＴＡ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  Ａ−３’（配列番号：５４）を有する非ＣｐＧ配列を有する。
【０２３５】
オリゴデオキシヌクレオチドの製剤化
ＣｐＧ  １８２６を、０．９％塩化ナトリウム中、２ｍｇ／ｍＬの濃度で再構成し、アリコートに分け、−２０℃で保存した。Ｃ５９−０８を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、４．５３ｍｇ／ｍＬの濃度で再構成し、アリコートに分け、−２０℃で保存した。対照ＯＤＮを、ＰＢＳ中、４．４７ｍｇ／ｍＬの濃度で再構成し、アリコートに分け、−２０℃で保存した。
【０２３６】
動物
およそ７〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）から入手した。慣用的な動物飼料と水を随意に与えた。動物を試験開始前の１週間、収容した。試験開始（すなわち、腫瘍移植）時の動物の平均体重は１９グラムであった。
【０２３７】
試験中の動物の管理と使用に関する手順は、Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって審査され、承認された。試験中、動物の管理と使用は、国際実験動物ケア評価認証協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）（ＡＡＡＬＡＣ）、動物保護法（Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｃｔ）、米国獣医師会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（ＡＶＭＡ）の安楽死に関する安楽死委員会（Ｅｕｔｈａｎａｓｉａ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｅｕｔｈａｎａｓｉａ）および実験動物研究協会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（ＩＬＡＲ）の実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）の指針に概略が示された原則に従って実施した。
【０２３８】
腫瘍細胞株の調製および移植
ＴＣ−１細胞株（ジョンズ・ホプキンズ大学（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）により提供）は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ−１６）Ｅ６およびＥ７とｃ−Ｈａ．ｒａｓ癌遺伝子で同時軽質転換されたマウス原発性肺上皮細胞に由来するものである（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：２１−６，１９９６）。ＴＣ−１細胞はＣ５７ＢＬ６／Ｊマウス系統と同系である。
【０２３９】
ＴＣ−１細胞を、１０％ウシ胎仔血清および０．４ｍｇ／ｍＬのジェネティシンを補給したＤＭＥＭ中で培養した。サブコンフルエントＴＣ−１細胞（０．１ｍＬの無血清ＤＭＥＭ中）を、各動物の両方の背側の下脇腹（右脇腹に１×１０５個および左脇腹に０．５×１０５個）に皮下（ＳＣ）注射した。最初に電気バリカンで動物の移植に使用する領域の毛を剃った。
【０２４０】
腫瘍測定および体重
腫瘍を、最初の投与の前日およびそれ以降は週に２回測定した。腫瘍の長さと幅を電子カリパスを用いて測定し、式：体積（ｍｍ３）＝０．５×長さ×幅２（式中、長さは最長寸法である）を用いて腫瘍体積を求めた。動物の体重を、最初の投与の前日およびそれ以降は週に２回測定した。偏りを防ぐため、重量または腫瘍体積の外れ値（あれば）を除外し、残りのマウスを右脇腹の腫瘍体積（注入腫瘍と称する）に基づいて種々の処置群に群分けした。
【０２４１】
投与する液剤の調製
抗体の凍結ストックを解凍し、濡れた氷に移した。凍結解凍の反復を回避するため、各バイアルのストックの解凍は１回にし、単回使用に充分な容量のアリコートを作製した。ポリプロピレン製の低接着チューブをこの目的に使用した。アリコートを−８０℃で保存した。各投与の前毎に、１つのアリコートを解凍し、適切な希釈剤で調製濃度に希釈した。
【０２４２】
各投与の前毎に、ＯＤＮ（対照ＯＤＮ、ＣｐＧ  １８２６およびＣ５９−０８）のアリコートを解凍し、０．９％塩化ナトリウムで調製濃度に希釈した。
【０２４３】
抗体およびオリゴデオキシヌクレオチドの投与
アイソタイプ対照ｍＩｇＧ１および抗ＩＬ−１０  ｍＩｇＧ１を１０ｍｇ／ｋｇで０、４、８および１２日目に腹腔内（ＩＰ）投与した。対照ＯＤＮ（２．５ｍｇ／ｋｇ）、ＣｐＧ  １８２６（１ｍｇ／ｋｇ）およびＣ５９−０８（２．５ｍｇ／ｋｇ）を右の腫瘍だけに０、４、８および１２日目に腫瘍内（ＩＴ）投与した。
【０２４４】
統計的方法
腫瘍体積を、処置間で各追跡日に比較した。個々の動物の追跡は、過剰な腫瘍量のため、または他の理由で早期に終了する場合があり得る。理由および最終測定時の腫瘍サイズによっては、最後に観測された腫瘍体積を、その動物について、以降のすべての日にちの体積の下限値として処理した（右側打ち切りデータ）。
【０２４５】
所与の日における２つの処置群を比較するため、右側打ち切りデータを可能にするノンパラメトリックマン・ホイットニー（またはウイルコクソン順位和）検定の一般化を使用した：ゲーハン−ブレスロー検定のピトー／ピトーバージョン。両側ｐ値は、比較対象の２つの処置間に無作為に再割り付けした２０，０００匹の動物から推定した。所与の処置ペアについてすべての時間点におけるファミリーワイズエラー率を制御するため、ｐ値を、ウェストフォールとヤングのｍａｘＴ手順を並べ替え分布に適用することにより多重性調整した。０．０５未満のｐ値を用いて統計学的有意性を規定した。
【０２４６】
記述目的のため、各日および処置群の体積を中央値で要約した。打ち切りを許容するため、各日および処置群の分布関数をカプラン・マイヤー法によって推定し、信頼帯にはグリーンウッドの公式を使用した（対数スケール）。中央値は、分布関数の５０パーセンタイルとして推定し、信頼区間は、信頼帯を逆にする（ｉｎｖｅｒｔ）ことによって得た。６８％信頼水準を使用し、データをまとめるのに一般的な“平均±ＳＥ”形式と同等にした。これは、後者では平均がおよそ６８％信頼区間だからである。
【０２４７】
動物の追跡を早期に終了する場合、理由をカテゴリー分けし、動物のデータを以下のとおりに処理した：（１）腫瘍負荷：最後の測定値で右側打ち切り；（２）腫瘍潰瘍形成：最後の測定値で右側打ち切り、ただし、これは閾値（１０００ｍｍ３）を超えているものとする；その他の場合は動物を後の時点で除外する；（３）体重減少／健康障害（病気の徴候を伴って死体で発見の場合を含む）：動物は後の時点で除外する；および（４）処置と無関連（例えば、病気の徴候なく死体で発見された事故、管理上の中止）：最後の測定値で右側打ち切り、ただし、これは閾値（１０００ｍｍ３）を超えているものとする；その他の場合は動物を後の時点で除外する。
【０２４８】
処置の結果
ＴＣ−１腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを最初の投与の前日、右脇腹の平均腫瘍体積がおよそ６０ｍｍ３（３９ｍｍ３〜８７ｍｍ３）に達している場合、５つの処置群：（１）ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照＋対照ＯＤＮ；（２）ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照＋Ｃ５９−０８；（３）抗ＩＬ−１０＋ＣｐＧ  １８２６；（４）抗ＩＬ−１０＋対照ＯＤＮ；および（５）抗ＩＬ−１０＋Ｃ５９−０８に群分けした。左の腫瘍体積の範囲は０ｍｍ３〜１１３ｍｍ３であった。腫瘍の完全退縮（ＣＲ）は、腫瘍は、動物を群分けした日には測定可能であったと考えて、測定を実施した時点で測定可能な腫瘍がないことと規定した。結果を図１０および１１に示す。抗ＩＬ−１０を腫瘍内ＣｐＧ  １８２６（第３群）またはＣ５９−０８（第５群）のいずれかと併用すると、少なくとも３匹の動物で注入腫瘍のＣＲがもたらされた（図１０Ａ）。しかしながら、抗ＩＬ−１０とＣ５９−０８（第５群）との併用でだけ、非注入腫瘍のＣＲがもたらされた（１０匹中３匹の動物）（図１１Ａ）。Ｃ５９−０８単独療法（第２群）を含む他の処置では、注入腫瘍または非注入腫瘍のいずれにおいてもＣＲはもたらされなかった。対照処置、抗ＩＬ−１０単独療法およびＣ５９−０８単独療法と比較すると、抗ＩＬ−１０とＣ５９−０８を併用した投与（ＩＴ）では６、９および１２日目で、注入腫瘍の体積の有意な低減がもたらされた（ｐ＜０．０５，時間点間で多重性調整）（図１０Ｂ〜Ｄ）。対照処置および抗ＩＬ−１０単独療法と比較すると、抗ＩＬ−１０とＣ５９−０８を併用した投与（ＩＴ）では、６、９および１２日目で、非注入腫瘍の体積の有意な低減がもたらされた（ｐ＜０．０５，時間点間で多重性調整）（図１１Ｂ〜Ｄ）。
【０２４９】
［実施例４］
実施例４：全身性抗ＰＤ−１抗体と腫瘍内ＣｐＧ−Ｃオリゴヌクレオチドの併用の抗腫瘍活性
抗体
２種類の抗ＰＤ−１ブロック抗体：最初の試験では２９Ｆ．１Ａ１２および後の試験ではＲＭＰ１−１４を使用した。各用量は２５０μｇの抗体／注射を含むものにした。２９Ｆ．１Ａ１２は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から得られる精製ラット抗マウスＰＤ−１抗体（カタログ番号１３５２０２）である。このＢｉｏＬｅｇｅｎｄの抗ＰＤ−１抗体はラットＩｇＧ２ａ，κモノクローナル抗体である。クローンＲＭＰ１−１４は、ＢｉｏＸＣｅｌｌ  Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ）から得られる精製ラット抗マウスＰＤ−１抗体（カタログ番号ＢＥ０１４６）である。このＢｉｏＸＣｅｌｌの抗ＰＤ−１抗体はラットＩｇＧ２ａモノクローナル抗体である。
【０２５０】
オリゴデオキシヌクレオチド
非ＣｐＧ対照オリゴデオキシヌクレオチド（ＣＴＲＬ−ＯＤＮ）は、ホスホロチオエート骨格を有する配列５’−ＴＧＡ  ＣＴＧ  ＴＧＡ  ＡＣＣ  ＴＴＡ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  Ａ−３’（配列番号：５４）を有する。各用量は５０μｇ  ＯＤＮ／注射を含むものにした。
【０２５１】
動物および細胞
６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスをＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手した。ＣＴ２６は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得られるマウス線維芽細胞株（ＣＴ２６．ＷＴ，カタログ番号ＣＲＬ−２６３８（商標））である。ＣＴ２６は、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレタン誘導型未分化結腸癌細胞株であり、これは、免疫療法レジメンを試験するためのモデルとして高頻度に使用される（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５４：４６８５−４６９２，１９９５）。
【０２５２】
単独療法の投与レジメン
約８×１０４個のＣＴ２６細胞をＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５〜６／群）の脇腹に０日目に、既報の方法（Ｂｒａｔｔａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，４０：２１４２−２１４６，１９８０）を用いて皮下（ＳＣ）注射した。抗ＰＤ−１ブロック抗体を５、８、１１、１４および１８日目に腹腔内（ＩＰ）注射した。
【０２５３】
併用療法の投与レジメン
約８×１０４個のＣＴ２６細胞を、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５〜６／群）の脇腹に−７日目に皮下（ＳＣ）注射した（Ｂｒａｔｔａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（上掲），１９８０）。処置レジメンを試験０日目（腫瘍細胞移植の７日後；平均腫瘍長さ５ｍｍ）に開始した。マウスを非処置のままにするか、または２００ｍｃｇのマウス抗ＰＤ−１ブロック抗体を２００μＬの容量で腹腔内（ＩＰ）注射した（製造業者によって提供されたそのまま製剤）。抗ＰＤ−１注射液は０、３、７、１０、１４、１８、２１および２５日目に投与した。数回の抗ＰＤ−１注射後（１２日目）、マウスに５０ｍｃｇのＣ５９−０８またはＣＴＲＬ−ＯＤＮ（１５０μＬ容量のＰＢＳ中）を腫瘍内（ＩＴ）注射した。Ｃ５９−０８およびＣＴＲＬ−ＯＤＮの注射液は１２、１４、１８、２１、２５および２８日目に投与した。どちらの群も、抗ＰＤ−１処置を上記のとおりに継続した。同様のサイズの腫瘍を有する別個のマウス群（腫瘍細胞は試験０日目に注射した）に、抗ＰＤ−１前処置なしでＣ５９−０８単独を１２、１４、１８、２１、２５および２８日目に注射した。
【０２５４】
併用療法の投与およびＴ細胞枯渇レジメン
約８×１０４個のＣＴ−２６腫瘍細胞をマウスの脇腹に０日目にＳＣ注射した（Ｂｒａｔｔａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（上掲），１９８０）。マウスを非処置のままにするか、またはＩＰ注射による抗ＰＤ−１で５、９、１２、１５、１９、２２、２６および２９日目に処置した。数回の抗ＰＤ−１注射後（１５日目）、マウスをＩＴ注射によるＣ５９−０８で１５、１９、２２、２６および２９日目に処置するか、または非処置のままにした。抗ＣＤ８または抗ＣＤ４枯渇抗体をＩＰ注射により１４、１５、１６、１９、２２、２６および２９日目に、抗ＰＤ１／Ｃ５９−０８処置群のマウスに投与した。抗ＰＤ−１処置マウスに２５０μｇ／注射のＢｉｏＸＣｅｌｌ  ＲＭＰ１−１４抗体を投与した。また、マウスには５０μｇ／注射のＣ５９−０８も投与した。枯渇のため、マウスに２５０μｇ／注射の抗ＣＤ８  Ａｂ（ＹＴＳ  １６９．４）または抗ＣＤ４  Ａｂ（ＧＫ１．５）（どちらもＢｉｏＸＣｅｌｌから得られる）のいずれかを投与した。
【０２５５】
対側性腫瘍拒絶レジメンでの投与による併用療法
約８×１０４個のＣＴ−２６細胞を０日目に左脇腹に、２日目に右脇腹にＳＣ注射した。マウスを非処置のままにする（ｎ＝１８）か、または抗ＰＤ−１  Ａｂを５、７、１１、１４、２１、２３および２６日目にＩＰ注射する（ｎ＝１９）かのいずれかにした。数回の抗ＰＤ−１  Ａｂ注射後（１４日目）、抗ＰＤ−１処置マウスに、Ｃ５９−０８を左腫瘍に１４、１９、２１、２３および２６日目に注射した。抗ＰＤ−１  Ａｂ処置マウスには２５０μｇ／注射のＢｉｏＸＣｅｌｌ  ＲＭＰ１−１４抗体および５０μｇ／注射のＣ５９−０８を投与した。
【０２５６】
腫瘍浸潤白血球の抽出のための腫瘍の加工処理
ピンセットを用いて腫瘍をペトリ皿に入れ、５ｍＬの５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地を添加した。ハサミを用いて腫瘍を小片に切断し、腫瘍組織が５０ｍＬ容ピペットでピペッティングできるようになるまで３ｍＬ容シリンジプランジャーの底を用いてすり潰した。この腫瘍組織懸濁液を５０ｍＬ容チューブ内に移し、ペトリ皿を、５ｍＬの５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地を用いて２回すすぎ洗いした。この組織懸濁液を、５０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ４（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃ５１３８−１００ＭＧコラゲナーゼ）と２ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ  Ｉ（ウシ膵臓由来のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＤＮ２５−１００ＭＧデオキシリボヌクレアーゼＩ）を含有する１００×腫瘍消化酵素ミックス中で消化させた。チューブを、３分毎に穏やかに振盪しながら３７℃で２０分間、インキュベートした。試料を７０μｍフィルターに通して濾過し、続いて、フィルターを５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩで洗浄した。試料を１４００ｒｐｍで室温にて７分間遠心分離した。細胞を、腫瘍サイズに応じて１〜５容量の５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ中に再懸濁させた。得られた懸濁液中の細胞を、血球計算盤を用いて計数した。
【０２５７】
遺伝子発現解析のための全腫瘍からのＲＮＡ抽出
全腫瘍を、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖｅｎｌｏ，ＮＬ）から得られるＲＮＡｌａｔｅｒ（カタログ番号７６１０４）中で凍結させた。解凍後、全ＲＮＡを、３０ｍｇの完全にホモジナイズされた全腫瘍から、Ｑｉａｇｅｎ製のＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（カタログ番号７４１０６）を製造業者の使用説明書に従って用いて単離した。簡単には、ＲＮＡｌａｔｅｒ  ＲＮＡ安定化試薬中で保存した全腫瘍を解凍し、重量を計り、５ｍｍのステンレス鋼ビーズとＢＭＥを含むＲＬＴバッファー（７００μＬ／３０ｍｇ組織，チューブ１つあたり１ｍＬまでのＲＬＴ）とを入れた２ｍＬ容ＰＣＲｃｌｅａｎ  Ｓａｆｅ−Ｌｏｃｋエッペンドルフチューブ内に入れた。チューブをＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  Ａｄａｐｔｅｒ  Ｓｅｔ  ２ｘ２４内に入れ、これを２回、２５Ｈｚで２分間、作動させた。ライセートを１３，５００ｒｐｍで３分間、遠心分離した。続いて、上清みを新たな１５ｍＬ容チューブに移した。７００μＬ／３０ｍｇの要件を満たすために、必要に応じてＲＬＴバッファーを添加した。約７００μＬのライセートを使用し、残りを−８０℃で保存した。１容量の７０％エタノールを清澄化ライセートに添加し、７００μＬの試料をＲＮｅａｓｙスピンカラムの２ｍＬ容収集チューブに移し、１３，５００ｒｐｍで１分間、遠心分離した。試料が７００μＬを超えていた場合、逐次アリコートを同じＲＮｅａｓｙスピンカラム内で処理し、フロースルーを廃棄した。３５０μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＲＷ１をＲＮｅａｓｙスピンカラムに添加し、試料を遠心分離した。ＤＮａｓｅ  Ｉインキュベーションミックス（８０μＬ：１０μＬのＤＮａｓｅ  Ｉストック溶液＋７０μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＲＤＤ）を直接、ＲＮｅａｓｙスピンカラムに添加し、室温で１５分間インキュベートした。３５０μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＲＷ１を添加し、チューブを遠心分離し、ＲＮｅａｓｙスピンカラムを新たなチューブに移した。２容量の５００μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＲＰＥをカラムに添加し、１分間、遠心分離してカラムを洗浄した。ＲＮｅａｓｙスピンカラムを新たな２ｍＬ容収集チューブに移し、最高速で１分間、遠心分離した。ＲＮｅａｓｙスピンカラムを新たな１．５ｍＬ容収集チューブ内に移し、４５μＬのＲＮａｓｅフリー水（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をカラムに添加し、１３，５００ｒｐｍで１分間、遠心分離し、ＲＮＡを溶出させた。
【０２５８】
定量リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＴＡＱＭＡＮ）
５μｇの溶出ＲＮＡを、５×第一鎖バッファー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ウシ血清アルブミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、組換えＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼインヒビター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、オリゴ（ｄＴ）１５（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ランダムプライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｄＮＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＤＴＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用することにより、ＭｙｉＱ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｃｈｉｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて逆転写した。データをユビキチン発現に対して正規化し、サイクル条件は、９５℃で１５分間の後、９５℃で１５秒と６０℃で１分間を４０回とした。ｍＲＮＡの定量は、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行なった。定量および解析はすべて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステムを使用し、ＳｔｅｐＯｎｅ  ｖ２．１ソフトウェアを用いて行なった。相対遺伝子発現レベルを、以下の式：１．８（平均Ｃｔユビキチン−Ｃｔ遺伝子）＊１００，０００を用いて計算した。
【０２５９】
Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ（登録商標）−Ｍａｍｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａでの腫瘍細胞の分離
この手順を使用し、腫瘍細胞から腫瘍浸潤白血球（ＴＩＬ）を分離した。腫瘍から得た細胞懸濁液を、必要に応じて５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩを添加することによって７ｍＬにした。７ｍＬのＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ（登録商標）−Ｍａｍｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ，カタログ番号：ＣＬ５１２０）を１５ｍＬ容の遠心分離用コニカルチューブに添加し、次いで、上面に７ｍＬの細胞懸濁液を注意深く重層した。細胞を８００×ｇで室温にて２０分間、ブレーキングなしでスピンダウンした。形成された上層を５０ｍＬ容チューブ内に移し、５０ｍＬの目盛まで５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地で満たした。細胞を１８００ｒｐｍで室温にて７分間、最大加速および最大ブレーキング下でペレット化した。培地を吸引し、ＴＩＬ含有ペレットを１ｍＬ  ５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地中に再懸濁させた。一部の細胞（１５０μＬ）を９６ウェルＵ字底プレートに入れ、２０００ｒｐｍで３分間ペレット化し、次いで、遺伝子発現アッセイのために２５０μＬのＲＬＴバッファーで再懸濁させた。残りの細胞をＦＡＣＳ解析に使用し、各染色パネルには約１００〜１５０μＬのＴＩＬ試料を使用した。
【０２６０】
サイトカイン産生のための腫瘍浸潤白血球のインビトロ刺激
Ｌｙｍｏｐｈｏｌｙｔｅ（登録商標）Ｍａｍｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ，カタログ番号：ＣＬ５１２０）を用いて単離した約１．５×１０５個のＴＩＬを、３７℃で３時間、ホルボールミリスタートアセタート（ＰＭＡ）、イオノマイシンおよびブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）を有するＢＤ  ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（５００×）を含むＬｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カタログ番号５５０５８３）から得られる）またはＢＦＡ単独（３μｇ／ｍＬ終濃度）で、２００μＬの最終容量にて刺激した。試料をサイトカイン産生について細胞内染色およびフローサイトメトリーによって解析した。
【０２６１】
細胞染色および蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）解析
試薬はすべて４℃に維持した。洗浄はすべて、プレーティング細胞懸濁液を上下に３回ピペッティングした後、１８００ｒｐｍで４℃にて３分間、遠心分離し、上清みを廃棄することを伴った。各試料について、細胞を３時間の刺激後にペレット化し、８０μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ，１０％ＦＢＳ，０．１％アジ化ナトリウム）中に再懸濁させ、試料あたり２μＬのＦｃ  Ｂｌｏｃｋｅｒと０．５μｇ／ｍＬの各対象抗体を含むカクテルを作製した。試料を４℃で２０分間インキュベートした後、洗浄し、２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファー中に再懸濁させた。細胞を固定するため、２００μＬの１％パラホルムアルデヒドを各ウェルに添加し、表面染色のためにプレートを暗所で４℃にて２０分間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、ペレット化し、３００μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファー中に再懸濁させ、フローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のＬＳＲＩＩ）を用いて即座にデータを取得した。
【０２６２】
細胞内染色のため、４℃で一晩保存した試料をペレット化し、０．５％サポニンバッファー含有ＰＢＳ中に室温で１０分間、再懸濁させ、細胞に透過させた。さらにスピンした後、細胞を、８０μＬの染色ミックス＋２μＬのＦｃ  Ｂｌｏｃｋｅｒおよび対象抗体（０．５％サポニンバッファー含有ＰＢＳ中）で４℃にて３０分間染色した：２．５μＬの抗マウスＩＦＮ−γ−ＰＥ（Ｔｏｎｂｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ５０−７３１１−Ｕ１００）および２．５μＬの抗マウスＴＮＦ−α−ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，カタログ５０６３０８）。細胞をペレット化し、洗浄した後、３００μＬのＦＡＣＳバッファー中に再懸濁させ、フローサイトメータ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のＬＳＲＩＩ）を用いて即座にデータを取得した。
【０２６３】
ＣＴ−２６腫瘍結節を有するマウスでは全身性ＰＤ−１ブロックに対して不均一な応答が生じる。
【０２６４】
腫瘍結節サイズを、最後の抗ＰＤ−１注射後２日目（２１日目）に測定した。図１４Ａは、４３個中１７個（４０％）の腫瘍が抗ＰＤ−１処置に対して応答を示し、その１７個中８個の腫瘍（１９％）が完全に退縮したことを示す。４３個中残りの２６個の腫瘍は対照（ＣＴＲＬ）非処置マウスのものと同様のサイズ分布を示した。すなわち、腫瘍の６０％がＰＤ−１ブロックに応答した。図１４Ｂに示されるように、抗ＰＤ−１処置に対する応答を有した腫瘍は、非処置（ＣＴＲＬ）腫瘍または抗ＰＤ−１処置に応答しなかった腫瘍と比べて腫瘍浸潤白血球（ＴＩＬ）の数の増加を有する。最後の抗ＰＤ−１注射後２〜４日目に回収した全腫瘍を、ＴＡＱＭＡＮアッセイを用いた遺伝子発現の解析のために加工処理した。抗ＰＤ−１に対する応答は、Ｔ細胞浸潤と活性化のマーカー（図１４Ｃ）およびＩ型インターフェロン応答性マーカー（図１４Ｄ）の発現レベルと相関していた。
【０２６５】
これらのデータは、ＣＴ−２６腫瘍モデルが明白な二峰性応答に従っていることを示す：抗腫瘍応答をもたらすことができるマウスは腫瘍成長に対して有意な制御を示すが、処置に対して応答することができないマウスは非処置腫瘍と同じ増殖速度で進行する。また、これらのデータは、腫瘍体積と、Ｔ細胞浸潤と活性化の遺伝子およびＩ型インターフェロン応答性遺伝子の発現との間の負の相関を示す。
【０２６６】
腫瘍内Ｃ５９−０８は、抗ＰＤ−１療法を逃れた腫瘍を逆転させ、腫瘍成長の長期の免疫媒介性制御をもたらす。
【０２６７】
図１５Ａは経時的な平均腫瘍体積を示し、一方、図１５Ｂ〜Ｃは種々の処置群のマウスの長期生存率を示す。継続的抗ＰＤ−１処置を伴う腫瘍内Ｃ５９−０８により、Ｃ５９−０８または抗ＰＤ−１単独療法と比べて生存率が改善される。この概念実証試験は、Ｃ５９−０８と抗ＰＤ−１抗体の併用は、治療無反応群を、完全な腫瘍拒絶能を有する治療反応群に転換できることを示す。
【０２６８】
ＣＤ８＋  Ｔ細胞は抗ＰＤ−１＋Ｃ５９−０８併用処置の有効性に必要とされるがＣＤ４＋  Ｔ細胞は必要とされない。
【０２６９】
図１６は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の枯渇により、抗ＰＤ−１＋Ｃ５９−０８併用処置の有効性が無効になることを示す。
【０２７０】
抗ＰＤ−１＋Ｃ５９−０８併用療法により対側性腫瘍の拒絶が可能になる。
【０２７１】
図１７は、抗ＰＤ−１＋Ｃ５９−０８処置群において、１９匹中１３匹のマウス（６８％）が生存し、Ｃ５９−０８注射腫瘍結節ならびにＣ５９−０８非注射腫瘍結節の両方を拒絶したことを示す。非処置マウスでは、腫瘍サイズの低減は示されなかったか、またはいずれの腫瘍も拒絶されなかった（生存率０％）。したがって、Ｃ５９−０８＋抗ＰＤ−１併用療法によって生じた抗腫瘍応答により、Ｃ５９−０８注射部から遠位の部位の腫瘍を消失させることができる。
【０２７２】
Ｃ５９−０８とＰＤ−１ブロックとのと併用により多機能性ＣＤ８＋  Ｔ細胞の浸潤と活性化が強く誘導される。
【０２７３】
収集時、抗ＰＤ−１で処置した腫瘍を、応答率に基づいて群分けした。腫瘍体積（ｍｍ３）を、式：（幅）２×長さ／２に従って計算した。抗ＰＤ−１に対して非応答性と分類された腫瘍は、対照オリゴヌクレオチド処置腫瘍と比べて平均約２０％の体積低減を示した。対照的に、抗ＰＤ−１に対して応答性と分類された腫瘍は、対照オリゴヌクレオチド処置腫瘍と比べて平均約８０％の体積低減を示した。
【０２７４】
図１８Ａ〜Ｄに示されるように、Ｃ５９−０８は抗ＰＤ−１と強く相乗作用して、ＣＤ８  Ｔ細胞浸潤およびＩＦＮ−γとＴＮＦ−αを並存的に産生し得る多機能性細胞への分化を誘導することが示された。簡単には、併用療法処置した腫瘍のＣＤ８＋  Ｔ浸潤細胞の数の増加および活性化状態は、Ｃ５９−０８なしの抗ＰＤ−１−応答性腫瘍のものよりさらによい。これは、Ｃ５９−０８が抗ＰＤ−１治療反応群ならびに抗ＰＤ−１治療無反応群の両方において抗腫瘍応答を改善する能力を有することを示す。
【０２７５】
Ｃ５９−０８単独療法は、腫瘍体積の低減およびインターフェロン刺激型炎症遺伝子の発現の誘導に有効である。
【０２７６】
ＣＴ２６結腸癌を有するマウスをＣ５９−０８または対照オリゴデオキシヌクレオチドで腫瘍内（ＩＴ）処置した。２５日目（最後の処置後３日目）、ＣＴＲＬ−ＯＤＮを注射した群は、過度な腫瘍拡大のため安楽死させた。３５日目（最後の処置後１３日目）、Ｃ５９−０８を注射した群を安楽死させた。３５日目、Ｃ５９−０８で処置した６匹のマウスのうち２匹で腫瘍が拒絶され、採取可能な組織は残っていなかった。このような場合、平均腫瘍体積の計算には値ゼロを使用した。６つの腫瘍結節のうち残りの４つをＴＩＬの抽出に使用した。
【０２７７】
図１９Ａ〜Ｂに示されるように、Ｃ５９−０８により腫瘍成長を抑止することができ、処置腫瘍から精製した白血球においてＩＦＮ刺激型（ＩＳＧ１５、ＩＳＧ２０、ＩＲＦ７、ＭＸ１、ＩＰ−１０およびＩＦＩＴ）遺伝子または炎症（ＭＩＧ、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ）遺伝子の発現を誘導することができた。これは、Ｃ５９−０８により、ＴＩＬにおいて好都合な遺伝子発現パターンの長期持続性上方調節を誘導できることを示す。
【０２７８】
まとめ
Ｔ細胞表面ＰＤ−１受容体に対する抗体は、がん細胞によってスイッチオンされる免疫阻害経路をブロックする機能を果たす（Ｗｏｌｃｈｏｋ  ａｎｄ  Ｃｈａｎ，Ｎａｔｕｒｅ，５１５：４９６−４９８，２０１４）。ここで本明細書において記載のように、Ｃ５９−０８と称するＣｐＧ−Ｃ  ＯＤＮは、単独またはＰＤ−１に対する抗体と併用して投与した場合、移植可能な結腸癌のマウスＣＴ２６モデルにおいて確立された腫瘍の増殖の抑止に有効であることが示された。具体的には、Ｃ５９−０８により腫瘍成長を抑止し、ＴＩＬの数を増加させ、望ましい遺伝子発現パターンを誘導することができた。Ｃ５９−０８の単独投与では腫瘍拒絶に影響を及ぼすことができなかったが、Ｃ５９−０８は抗ＰＤ−１処置と相乗作用して、確立された腫瘍の拒絶および無再発生存期間の延長をもたらすことが示された。特筆すべきことには、確立された抗ＰＤ−１療法に腫瘍内Ｃ５９−０８を加えると、腫瘍拒絶と相関している活性化Ｔ細胞の明白な浸潤がもたらされた。したがって、抗ＰＤ１抗体とＣｐＧ−Ｃ  ＯＤＮの併用は、腫瘍拒絶の誘導において、いずれかの単剤単独よりも卓越していることが示された。
【０２７９】
［実施例５］
実施例５  転移性黒色腫を有する患者での腫瘍内Ｃ５９−０８とペンブロリズマブとの併用のフェーズ１ｂ／２治験
パート１（フェーズ１ｂ  用量漸増）では、３つの漸増用量レベルのＣ５９−０８を転移性黒色腫を有する患者において評価し、パート２（フェーズ２  拡大）は、特異的黒色腫集団において有効性と安全性をさらに評価するための拡大コホートからなる。患者集団には：
１）抗プログラム細胞死受容体−１／リガンド−１（抗ＰＤ−１／Ｌ１）療法で治療未経験である転移性黒色腫患者；
２）抗ＰＤ−１療法を受けているが進行性疾患が確認された転移性黒色腫患者
を含める。
【０２８０】
どちらのパートも、患者は３週間毎の２００ｍｇのＩＶペンブロリズマブで進行がみられるまで、または最初の投与後４５週間まで処置する。
【０２８１】
パート１では、１日目から開始し、患者を、２、４または８ｍｇで４回の毎週投与、続いて３週に１回の投与のＣ５９−０８で進行がみられるまで、または最初の投与後２４週間まで処置する。Ｃ５９−０８は治験全体を通して使用する同じ部位の病変部Ａに腫瘍内注射する。処置中の任意の時点で、病変部Ａが完全に退縮した場合、残りのＣ５９−０８注射は、病変部Ａの部位への腫瘍周囲注射によって行なう。
【０２８２】
拡大コホートでのパート２では、各患者を、ペンブロリズマブとＣ５９−０８との併用で、パート１で選択された用量を用いて処置する。
【０２８３】
コホート１（抗ＰＤ−１／Ｌ１未経験）では、２２日目から開始して、患者をＣ５９−０８で、週に１回で４週間、続いて３週に１回で９週間処置する。
【０２８４】
コホート２（抗ＰＤ−１療法で進行性疾患）では、１日目から開始し、患者をＣ５９−０８で、週に１回で４週間、続いて３週に１回で９週間処置する。
【０２８５】
パート２では、Ｃ５９−０８を、４つまでの病変部（病変部Ａ、病変部Ｂ、病変部Ｃ、病変部Ｄ）に腫瘍内注射し、治験全体を通して同じ部位（１つまたは複数）を使用する。処置中の任意の時点で注射した病変部（１つまたは複数）が完全に退縮した場合、Ｃ５９−０８は、注射した該病変部の部位（１つまたは複数）に腫瘍周囲注射によって投与される。
【０２８６】
参考文献
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５．  Ｈａｍａｎｉｓｈｉ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  １  ｌｉｇａｎｄ  １  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｒｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （２００７）：  １０４：  ３３６０−３３６５．
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８．  Ｏｈｉｇａｓｈｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１  ｌｉｇａｎｄ−１  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１  ｌｉｇａｎｄ  ２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （２００５）：  １１：  ２９４７−２９５３．
９．  Ｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＤ−Ｌ１  （Ｂ７−Ｈ１）  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌａｄｄｅｒ  ａｎｄ  ＢＣＧ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔａ：  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｓｔａｇｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  （２００７）：  １０９：  １４９９−１５０５．
１０．  Ｓｈｉｍａｕｃｈｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｕｇｍｅｎｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１  ｉｎ  ｂｏｔｈ  ｎｅｏｐｌａｓｍａｔｉｃ  ａｎｄ  ｎｏｎｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ＣＤ４＋  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ／  Ｌｙｍｐｈｏｍａ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  （２００７）：  １２１：２５８５−２５９０．
１１．  Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＰＤ−Ｌ１  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅｎｅｓｓ  ａｎｄ  ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （２００９）  １５：  ９７１−９７９．
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本明細書において挙げた参考文献はすべて、引用により、あたかも個々の各刊行物、データベース登録（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列もしくはＧｅｎｅＩＤ登録）、特許出願または特許が、引用により具体的に個々に示されて組み込まれているのと同程度に組み込まれる。米国特許仮出願第６２／１６９，３０９号および同第６２／１６８，４４９号は引用により本明細書に組み込まれる。この引用による組込みの記載は、本出願人らが、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（１）により、個々の１つ１つの刊行物、データベース登録（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列もしくはＧｅｎｅＩＤ登録）、特許出願または特許（これらは各々、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（２）に従って明確に特定される）が、かかる引用のすぐ隣に引用による組込みの献辞記載がない場合であっても関連していることを意図するものである。本明細書内に引用による組込みの献辞記載（もし、あれば）が含まれていることは、この引用による組込みの一般記載をなんら弱めるものでない。本明細書における参考文献の引用は、該参考文献が直接関係のある先行技術であることの是認を意図するものでなく、このような刊行物または文献の内容または日付に関するなんらの是認を構成するものでもない。参考文献にクレーム用語の定義が示されており、これが本明細書に示した定義と矛盾する限りでは、本明細書に示した定義がクレーム発明の解釈に用いられるものとする。
【図１】
2018516911.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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