(57)【要約】  粘膜付着型薬物送達に使用するための生体適合性ブロックコポリマーミセルを提供する。本発明のミセルは、分解性の疎水性ポリマー、分解性の合成親水性ポリマーおよび粘膜付着性ポリマーを含む。本発明のミセルは、特に眼科用途において有用である。
2018526438.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分解性の疎水性ポリマー、分解性の合成親水性ポリマーおよび粘膜付着性成分を含む、生体適合性の粘膜付着性ブロックコポリマーミセル。
【請求項２】
前記疎水性ポリマーが、ポリエステル、ポリウレタン、ポリウレア、ポリカーボネート、ポリエーテル、ポリスルフィド、ポリスルホネート、ポリイミド、ポリベンズイミダゾール、リポグリカン、プロテオグリカンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載のミセル。
【請求項３】
前記疎水性ポリマーが、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ−３−ヒドロキシブチレート、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）、ポリ（３−ヒドロキシバレレート）、ポリ（バレロラクトン）、ポリ（タルトロン酸）、ポリ（マロン酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、ポリホスファゼンおよびアクリロイルオキシ−ジメチル−γ−ブチロラクトン（ＤＢＡ）またはこれらの組み合わせである、請求項２に記載のミセル。
【請求項４】
前記合成親水性ポリマーが、メタクリル酸、アクリル酸、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリレート、ポリ（エチレングリコール）メタクリレート、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（２−オキサゾリン）、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドンおよびこれらのコポリマーからなる群より選択される、請求項１に記載のミセル。
【請求項５】
前記粘膜付着性成分が、ボロン酸またはその誘導体、チオール含有化合物、アクリレート、キトサン、セルロース、チオール化キトサン、チオール化ヒアルロン酸、チオール化ポリ（アクリル酸）およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項４に記載のミセル。
【請求項６】
前記粘膜付着性成分が、ボロン酸またはボロン酸エステルである、請求項５に記載のミセル。
【請求項７】
前記ボロン酸またはその誘導体が、フェニルボロン酸、２−チエニルボロン酸、メチルボロン酸、シス−プロペニルボロン酸、トランス−プロペニルボロン酸、（４−アリルアミノカルボニル）ベンゼンボロン酸、（４−アミノスルホニルフェニル）ボロン酸、（４−ベンジルオキシ−２−ホルミル）フェニルボロン酸、（４−ヒドロキシ−２−メチル）フェニルボロン酸、（４−ヒドロキシ−２−メチル）フェニルボロン酸、（４−メタンスルホニルアミノメチルフェニル）ボロン酸、（４−メタンスルホニルアミノメチルフェニル）ボロン酸、（４−メチルアミノスルホニル−フェニル）ボロン酸、（４−メチルアミノスルホニルフェニル）ボロン酸、（４−フェニルアミノ−カルボニルフェニル）ボロン酸、（４−フェニルアミノカルボニルフェニル）ボロン酸、（４−ｓｅｃ−ブチル）ベンゼンボロン酸、（２，６−ジメトキシ−４−メチルフェニル）ボロン酸、（２，６−ジメトキシ−４−メチルフェニル）ボロン酸、（２−メチルプロピル）ボロン酸、（２−メチルプロピル）ボロン酸、（３−アセトアミド−５−カルボキシ）フェニルボロン酸、（３−アセトアミド−５−カルボキシ）フェニルボロン酸、（３−アセトアミドメチルフェニル）ボロン酸、（３−アセトアミドメチルフェニル）ボロン酸、（３−アリルアミノカルボニル）ベンゼンボロン酸、（３−シアノメチルフェニル）ボロン酸、アリルボロン酸ピナコールエステル、フェニルボロン酸トリメチレングリコールエステル、ジイソプロポキシメチルボラン、ビス（ヘキシレングリコラト）ジボロン、ｔ−ブチル−Ｎ−［４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル］カルバメート、２，６−ジメチル−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベンゾエート、４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）アニリン、４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）安息香酸、４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェノールおよび２−メトキシ−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェノールからなる群より選択される、請求項６に記載のミセル。
【請求項８】
前記疎水性ポリマーと前記親水性ポリマーと前記粘膜付着性成分との比率が、約０．５：９４．５：５〜約５：６５：３０の範囲である、請求項１に記載のミセル。
【請求項９】
サイズが約２００ｎｍ未満である、請求項１に記載のミセル。
【請求項１０】
カーゴが封入されている、請求項１に記載のミセル。
【請求項１１】
前記カーゴが、前記ミセルの約５〜５０重量％を占める、請求項１０に記載のミセル。
【請求項１２】
前記カーゴが、治療剤および診断剤から選択される、請求項１０に記載のミセル。
【請求項１３】
前記カーゴが、鎮痛剤、抗炎症剤、抗菌剤、抗ウイルス剤および抗真菌剤を含む抗病原体剤、消化管剤、抗ヒスタミン剤、抗アレルギー剤、抗がん剤、制嘔吐剤、抗喘息剤、鬱血除去剤、緑内障治療剤、眼圧降下剤（ＩＯＰ降下剤）、滑沢剤、粘滑剤、反対刺激剤（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｉｒｒｉｔａｎｔｓ）、高張性涙液、抗聴器毒性剤（ａｎｔｉ−ｏｔｏｔｏｘｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）、タンパク質、核酸ならびに糖からなる群より選択される、請求項１０に記載のミセル。
【請求項１４】
前記カーゴが点眼薬である、請求項１０に記載のミセル。
【請求項１５】
前記点眼薬が、シクロスポリンＡ、アシクロビル、アトロピン、アセタゾラミド、アルファガン、アジスロマイシン、バシトラシン、ベタジン、ベタキソロール、ベトプチック、ブリンゾラミド、カルバコール、セファゾリン、セルビスク、クロラムフェニコール、シロクサン、シプロフロキサシン、セファロスポリン、デメカリウム（ｅｍｅｃａｒｉｕｍ）、デキサメタゾン、ジピベフリン、ドルゾラミド、エピネフリン、エリスロマイシン、フルオレセイン、フルルビプロフェン、フルオロキノロンなどのキノロン、ゲンタマイシン、ゴニソール（ｇｏｎｉｏｓｏｌ）、グラミシジン、ガンシクロビル、ガチフロキサシン（ｇａｔａｆｌｏｘａｃｉｎ）、フモルソール、ヒラルチン（ｈｙｌａｒｔｉｎ）、イトラコナゾール、ケトチフェン、ラタノプロスト、レボフロキサシン、ビマトプロスト、トラボプロスト、ピロカルピン、ポリミキシンＢ、プレドニゾロン、プロパラカイン、プロピン、ピュラルーブ、マンニトール、メタゾラミド、ミコナゾール、ミオスタット、モキシフロキサシン、ナタマイシン、ネオマイシン、ネプタザン、オキュフロックス、オフロキサシン、オキシテトラサイクリン、オロパタジン、フェニレフリン、プロスタグランジン、ヒアルロン酸ナトリウム、スプロフェン、テラマイシン、チモロール、トブラマイシン、トリアムシノロン、トリフルリジン（ｔｒｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、トロピカミド、ビダラビン、バラシクロビル（ｖａｌｃｙｃｌｏｖｉｒ）、バンコマイシン、キサラタン、フェニレフリン、プロスタグランジンおよび抗ＶＥＧＦ薬からなる群より選択される、請求項１４に記載のミセル。
【請求項１６】
請求項１に記載のミセルと共に、薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項１７】
経口、鼻腔内、経腸、局所、舌下、動脈内、髄内、子宮内、髄腔内、吸入、眼内、経皮、膣内、直腸内、皮下、腹腔内、筋肉内または静脈内の投与用に製剤化される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
眼または耳への局所投与用に製剤化される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１０に記載のミセルを哺乳動物に投与することを特徴とする、哺乳動物の粘膜表面にカーゴを送達する方法。
【請求項２０】
眼、鼻、口腔、耳、咽頭、食道、胃、腸管、子宮内膜、陰茎、膣または肛門の病態の治療または診断を目的とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記病態が、感染症、炎症、がん、変性疾患、アレルギー反応または機械的損傷である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記カーゴが、鎮痛剤、抗炎症剤、抗菌剤、抗ウイルス剤および抗真菌剤を含む抗病原体剤、消化管剤、抗ヒスタミン剤、抗アレルギー剤、抗がん剤、制嘔吐剤、抗喘息剤、鬱血除去剤、緑内障治療剤、眼圧降下剤（ＩＯＰ降下剤）、滑沢剤、粘滑剤、反対刺激剤（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｉｒｒｉｔａｎｔｓ）、高張性涙液、抗聴器毒性剤（ａｎｔｉ−ｏｔｏｔｏｘｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）、タンパク質、核酸ならびに糖からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記カーゴが点眼薬である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
ポリ（Ｌ−ラクチド）−ｂ−ポリ（メタクリル酸−ｃｏ−フェニルボロン酸）コポリマーミセルを含む、粘膜付着性を利用した点眼薬送達システム。
【請求項２５】
点眼薬をさらに含む、請求項２４に記載の薬物送達システム。
【請求項２６】
シクロスポリンＡ、アシクロビル、アトロピン、アセタゾラミド、アルファガン、アジスロマイシン、バシトラシン、ベタジン、ベタキソロール、ベトプチック、ブリンゾラミド、カルバコール、セファゾリン、セルビスク、クロラムフェニコール、シロクサン、シプロフロキサシン、セファロスポリン、デメカリウム（ｅｍｅｃａｒｉｕｍ）、デキサメタゾン、ジピベフリン、ドルゾラミド、エピネフリン、エリスロマイシン、フルオレセイン、フルルビプロフェン、フルオロキノロンなどのキノロン、ゲンタマイシン、ゴニソール（ｇｏｎｉｏｓｏｌ）、グラミシジン、ガンシクロビル、ガチフロキサシン（ｇａｔａｆｌｏｘａｃｉｎ）、フモルソール、ヒラルチン（ｈｙｌａｒｔｉｎ）、イトラコナゾール、ケトチフェン、ラタノプロスト、レボフロキサシン、ビマトプロスト、トラボプロスト、ピロカルピン、ポリミキシンＢ、プレドニゾロン、プロパラカイン、プロピン、ピュラルーブ、マンニトール、メタゾラミド、ミコナゾール、ミオスタット、モキシフロキサシン、ナタマイシン、ネオマイシン、ネプタザン、オキュフロックス、オフロキサシン、オキシテトラサイクリン、オロパタジン、フェニレフリン、プロスタグランジン、ヒアルロン酸ナトリウム、スプロフェン、テラマイシン、チモロール、トブラマイシン、トリアムシノロン、トリフルリジン（ｔｒｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、トロピカミド、ビダラビン、バラシクロビル（ｖａｌｃｙｃｌｏｖｉｒ）、バンコマイシン、キサラタン、フェニレフリン、プロスタグランジンおよび抗ＶＥＧＦ薬からなる群より選択される、請求項２５に記載の薬物送達システム。
【請求項２７】
前記点眼薬がシクロスポリンＡである、請求項２５に記載の薬物送達システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体として、薬物送達のための材料に関し、特に、粘膜付着型薬物送達のためのミセルに関する。
【背景技術】
【０００２】
前眼部疾患の治療では、低コストで、使い易く、非侵襲性であるという理由から、局所点眼薬の投与がよく行われている。しかし、数多くのバリア機構によって前眼部への治療薬の効率的な送達が妨げられるため、通常、前眼部組織に到達するのは投薬量の５％未満に過ぎない。静的なバリア機構としては、結膜のタイトジャンクション、疎水性の角膜上皮および親水性の角膜実質が挙げられ、動的なバリア機構としては、急速な涙液ターンオーバーおよび結膜の血管やリンパ管が挙げられ、このようなバリア機構により、前眼部表面からの浸透性は極めて低くなっている。また、瞬き、急速な涙液ターンオーバーや涙液の排泄などの角膜の手前で機能する浄化機構も、前眼部組織への到達前に乗り越えなければならないバリア機構である。点眼薬を滴下した場合、結膜嚢に最大３０μＬまで液を保持することができるが、２〜３分以内にもとの涙量である７μＬに戻るため、投与薬物の８０％以上が鼻涙管から急速に排出されて全身吸収され、場合によっては副作用が現れることもある。
【０００３】
涙膜自体は、外側の油層と、分泌型ムチンを含む中間の水層と、角膜上皮および結膜上皮を覆う糖衣上に固定された内側のムチン層とで構成されている。固定されている内側のムチン層は親水性であるため、このムチン層も、高分子、微生物や疎水性分子の拡散を防止するバリアとして機能すると考えられている。アニオン性色素であるローズベンガルは、ムチン量の少ない角膜上皮ほど染めやすいことが確認されており、このことから、ムチンは薬物送達に影響を及ぼす物質であることが分かっている。
【０００４】
眼組織への薬物輸送を向上させるための方法として、固定されたムチン層における薬物の生物学的利用率を向上させる粘膜付着性ポリマーを用いる方法が研究されている。天然の粘膜付着性ポリマーとして、キトサン、セルロース誘導体、チオマー（チオール化ポリマー）など数多くの物質が知られているが、これらの物質は、概して、ナノ粒子の設計において所望の放出特性を達成できるような汎用性を欠いている。フェニルボロン酸（ＰＢＡ）は、１，２−シスジオールと高親和性複合体を形成するという性質から、グルコース応答性インシュリン送達システムで広く利用されている合成分子である。このボロン酸とジオールとの親和性は、インターフェロンの膣内送達、インスリンの鼻腔内送達およびシクロスポリンＡ（ＣｙｃＡ）の眼内送達などの粘膜付着型薬物送達システムにおいても利用されている。
【０００５】
眼粘膜などの粘膜表面に、治療剤などのカーゴを送達するための新規の方法を開発することができれば望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明により、粘膜付着性成分、分解性成分およびミセル形成成分を含む、新規の粘膜付着性ブロックポリマーミセルが提供される。本発明のミセルは、粘膜表面へのカーゴの送達に有用である。
【０００７】
したがって、本発明の一態様において、分解性の疎水性ポリマー、分解性の合成親水性ポリマーおよび粘膜付着性成分を含む、生体適合性の粘膜付着性ブロックコポリマーミセルが提供される。
【０００８】
別の一態様において、分解性の疎水性ポリマー、分解性の合成親水性ポリマーおよび粘膜付着性成分を含むミセルを哺乳動物に投与することを特徴とする、哺乳動物の粘膜表面にカーゴを送達する方法が提供される。
【０００９】
別の一態様において、ポリ（Ｌ−ラクチド）−ｂ−ポリ（メタクリル酸−ｃｏ−フェニルボロン酸）コポリマーミセルを含む、粘膜付着性を利用した点眼薬送達システムが提供される。
【００１０】
本発明におけるこれらの態様およびその他の態様は、下記の詳細な説明の項目において、以下の図面を参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＬＭＰ−１０コポリマー合成における、ＭＡＡとＰＢＡとの重合反応の速度論的プロットを示した図である。
【００１２】
【図２】ＬＭＰコポリマーミセルにおいて推定される構造変化を示した図である。
【００１３】
【図３】ｐＨ７．４における各ＬＭＰミセルのゼータ電位を示した図である。それぞれ１重量％のミセルに対して測定を行った。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１。その他の群間比較では、いずれも有意差は認められなかった（ｐ≧０．０５）。
【００１４】
【図４】ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の各ＬＭＰコポリマーの臨界ミセル濃度を示した図である。臨界ミセル濃度は、３４０ｎｍで励起した後の３８３ｎｍの蛍光強度に対する３７３ｎｍの蛍光強度の比率から求めた。
【００１５】
【図５】各ＬＭＰコポリマーおよびコントロールであるＣｙｃＡのエントラップメント効率を示した図である。＊＊＊すべてのＬＭＰコポリマーに対して、ｐ＜０．００１。その他の群間比較では、いずれも有意差は認められなかった（ｐ＞０．０５）。
【００１６】
【図６】ＰＢＡの量が異なるＬＭＰコポリマーに封入されたＣｙｃＡの推定分布を示した図である。
【００１７】
【図７】ＬＭＰミセルからのＣｙｃＡ累積放出量を示した図である。
【００１８】
【図８】各ＬＭＰミセルのＳＰＲセンサーグラムを示した図である。ＳＴＦは、模擬涙液のフローを示し、ＬＭＰは、ＬＭＰミセルのフローを示す。
【００１９】
【図９】Ａ）ＭＴＴアッセイ、Ｂ）ＣａｌＡＭおよびＣ）ＥｔｈＤ−１によるＨＣＥＣ生存率を示した図である。
【００２０】
【図１０】ＤＥＤラットモデルを用いてｉｎ  ｖｉｖｏで検証した、涙量に対するミセルの効果を示したグラフである。
【００２１】
【図１１】ｉｎ  ｖｉｖｏにおける涙膜浸透圧モル濃度に対するミセルの効果を示したグラフである。
【００２２】
【図１２】改変ドレイズ試験およびフルオレセイン評価法により、ミセルが副作用を有さないことを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明により、疎水性成分、親水性成分および粘膜付着性成分を含む、新規の生体適合性の粘膜付着性ミセルが提供される。本発明のミセルは、治療剤などのカーゴの粘膜表面への送達に有用である。
【００２４】
本発明の粘膜付着性ミセルは、ミセルのコア部を形成する疎水性成分を含む。前記疎水性成分は、一般に約０．１〜２０００ｋＤａ、好ましくは１〜２００ｋＤａの分子量を有する分解性ポリマーである。前記疎水性成分は、合成疎水性ポリマーを含んでいてもよく、該合成疎水性ポリマーとしては、以下に限定されないが、ポリエステル、ポリウレタン、ポリウレア、ポリカーボネート、ポリエーテル、ポリスルフィド、ポリスルホネート、ポリイミド、ポリベンズイミダゾールおよびこれらの組み合わせが挙げられる。前記疎水性ポリマーは、リポグリカン、プロテオグリカンなどの天然の疎水性ポリマー、もしくはその修飾体、またはこれらの組み合わせであってもよい。したがって、本発明のミセルに配合される疎水性ポリマーとしては、以下に限定されないが、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ−３−ヒドロキシブチレート、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）、ポリ（３−ヒドロキシバレレート）、ポリ（バレロラクトン）、ポリ（タルトロン酸）、ポリ（マロン酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、ポリホスファゼン、アクリロイルオキシ−ジメチル−γ−ブチロラクトン（ＤＢＡ）およびその他のラクトン含有ポリマーならびにこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２５】
前記親水性成分は、本発明のミセルの外側のシェル部を形成する。前記親水性成分は、反応基を有し、約０．１〜１０００ｋＤａ、好ましくは１〜１００ｋＤａの分子量を有する分解性の合成親水性ポリマーを含んでいてもよい。本明細書において「合成」という用語は、天然に存在するものに対して化学的に合成されたポリマーを意味するために用いられる。本発明のミセルに配合される好適な合成親水性ポリマーとしては、ポリアクリル酸、ポリアルコール、ポリアクリレート、ポリウレタン、ポリアクリルアミン、ポリアクリルアミド、ポリエーテルおよびポリピロリドンが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、好適な親水性ポリマーには、アクリレート、アクリル酸、メタクリレート、メタクリル酸、メチルアクリレート、エチルアクリレート、メチルメタクリレート、アクリロニトリル、２−クロロエチルビニルエーテル、２−エチルヘキシルアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリレート、ポリ（エチレングリコール）メタクリレート、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（２−オキサゾリン）、ポリエチレングリコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドンポリマーおよびこれらのコポリマーから選択される１以上のモノマーを含む親水性ポリマーが含まれる。
【００２６】
前記親水性成分は、標的の粘膜表面にミセルを吸着させる作用を有する粘膜付着性成分に結合している。前記粘膜付着性成分は、前記親水性成分の反応基を介して前記親水性成分に結合している。本明細書において「結合している」という用語は、共有結合、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス力などにより結合しているという意味で用いられる。前記反応基は、前記親水性成分にもともと存在している、すなわち前記親水性成分が本来有しているものであってもよく、前記親水性成分に導入されたものであってもよい。このような反応基としては、例えば、ヒドロキシル基、アミン基、チオール基、ケトン基およびカルボン酸基が挙げられる。
【００２７】
本発明のミセルを標的の粘膜部位に保持するために、前記粘膜付着性成分としては、粘膜表面に接着または結合することができる成分が選択される。したがって、前記粘膜付着性成分は、一般に、標的の粘膜表面の構成成分を認識して結合する成分であり、該構成成分には、ムチンなどの糖タンパク質、受容体、多糖などが含まれる。
【００２８】
一実施形態において、前記粘膜付着性成分はムチンに結合する成分である。この実施形態においては、前記粘膜付着性成分として、ムチンの糖鎖のシスジオール基、例えば、シアル酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースおよびフコースのシスジオール基に結合する成分が選択される。この目的に適した粘膜付着性成分としては、フェニルボロン酸、２−チエニルボロン酸、メチルボロン酸、シス−プロペニルボロン酸、トランス−プロペニルボロン酸、（４−アリルアミノカルボニル）ベンゼンボロン酸、（４−アミノスルホニルフェニル）ボロン酸、（４−ベンジルオキシ−２−ホルミル）フェニルボロン酸、（４−ヒドロキシ−２−メチル）フェニルボロン酸、（４−ヒドロキシ−２−メチル）フェニルボロン酸、（４−メタンスルホニルアミノメチルフェニル）ボロン酸、（４−メタンスルホニルアミノメチルフェニル）ボロン酸、（４−メチルアミノスルホニル−フェニル）ボロン酸、（４−メチルアミノスルホニルフェニル）ボロン酸、（４−フェニルアミノ−カルボニルフェニル）ボロン酸、（４−フェニルアミノカルボニルフェニル）ボロン酸、（４−ｓｅｃ−ブチル）ベンゼンボロン酸、（２，６−ジメトキシ−４−メチルフェニル）ボロン酸、（２，６−ジメトキシ−４−メチルフェニル）ボロン酸、（２−メチルプロピル）ボロン酸、（２−メチルプロピル）ボロン酸、（３−アセトアミド−５−カルボキシ）フェニルボロン酸、（３−アセトアミド−５−カルボキシ）フェニルボロン酸、（３−アセトアミドメチルフェニル）ボロン酸、（３−アセトアミドメチルフェニル）ボロン酸、（３−アリルアミノカルボニル）ベンゼンボロン酸、（３−シアノメチルフェニル）ボロン酸などのボロン酸、およびこれらのボロン酸の誘導体、例えば、ボロン酸とアルコールとの反応により生成されるボロン酸エステルなどが挙げられるが、これらに限定されない。ボロン酸エステルとしては、アリルボロン酸ピナコールエステル、フェニルボロン酸トリメチレングリコールエステル、ジイソプロポキシメチルボラン、ビス（ヘキシレングリコラト）ジボロン、ｔ−ブチル−Ｎ−［４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル］カルバメート、２，６−ジメチル−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベンゾエート、４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）アニリン、４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）安息香酸、４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェノール、２−メトキシ−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェノールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
別の一実施形態においては、前記粘膜付着性成分として、ムチンのシステイン残基に結合する成分が選択される。このような粘膜付着性成分としては、システアミンなどのチオール含有化合物が挙げられる。別の一実施形態においては、前記粘膜付着性成分として、ムチンのヒドロキシル基含有糖タンパク質に結合する成分が選択される。糖タンパク質に結合する好適な粘膜付着性成分としては、メタクリレート、エチルアクリレート、ジアクリレートなどのアクリレート化合物が挙げられる。その他の粘膜付着性化合物としては、キトサン、セルロース、ヒアルロン酸などの天然ポリマー、およびチオール化キトサン、チオール化ヒアルロン酸、チオール化ポリ（アクリル酸）などのチオマー（チオール化ポリマー）が挙げられる。また、複数の粘膜付着性化合物の混合物を使用してもよい。
【００３０】
当技術分野で確立されている方法により、前記疎水性成分、前記親水性成分および前記粘膜付着性成分を結合させて、本発明のミセルを調製する。まず、高分子化学分野で公知の方法により、上記の成分を重合させる。一実施形態において、ミセルの調製にフリーラジカル重合を用いてもよい。別の一実施形態において、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合などの可逆的不活性化ラジカル重合を用いてもよい。ＲＡＦＴ重合には、ジチオエステル、チオカルバメートおよびキサンテートなどのチオカルボニルチオ化合物が用いられ、これらの化合物は、可逆的な連鎖移動過程によって重合反応を媒介する。一般に、疎水性ポリマー、親水性ポリマーおよび粘膜付着性ポリマーをそれぞれ適量用いて結合させる。本発明のミセルの形成に用いられる各ポリマーの量が、使用するポリマーによって異なることは、当業者であれば十分に理解できるであろう。一実施形態において、前記疎水性ポリマー（例えば、約１〜５モル％、例えば、約２モル％）、前記親水性ポリマー（例えば、約７５〜８５モル％、例えば、約８０モル％）、前記粘膜付着性ポリマー（例えば、約１５〜２５モル％、例えば、約２０モル％）およびフリーラジカル開始剤を、適当な溶媒（使用するポリマーによって異なる）に溶解する。好適な溶媒の例としては、ジオキサン：水、アセトン：水、およびＤＭＳＯ：水などの混合溶媒が挙げられる。使用可能なフリーラジカル開始剤としては、ハロゲン分子、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）などのアゾ化合物、有機過酸化物（例えば、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、ジクミルペルオキシドおよびベンゾイルペルオキシド）ならびに無機過酸化物（例えば、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウムおよび過硫酸アンモニウム）が挙げられる。次いで、準備した溶液を、撹拌しながら適当な時間加熱する。生成した粘膜付着性ブロックコポリマーは、沈殿させて単離することができる。
【００３１】
本発明のミセルの形成に適した粘膜付着性ブロックコポリマーは、前記疎水性ポリマー、前記親水性ポリマーおよび前記粘膜付着性ポリマーを約０．５：９４．５：５〜約５：６５：３０の比率で含む。
【００３２】
単離した粘膜付着性コポリマーから、沈殿法によってミセルを形成する。まず、ポリマーをアセトンなどの適当な溶媒に溶解して、コポリマー溶液を調製する。次いで、調製したコポリマー溶液を撹拌下で水に添加し、撹拌を続けて溶媒を蒸発させる。その結果、ナノサイズのミセル、例えば、５００ｎｍ未満、好ましくは約２００ｎｍ未満、例えば、約１〜１５０ｎｍ、例えば１００ｎｍ、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍまたは２０ｎｍ以下のミセルが形成される。形成されたミセルは、疎水性コアと、粘膜付着性成分が組み込まれた親水性シェルとを有する。
【００３３】
本発明のミセルは、例えば治療剤などのカーゴの粘膜表面への送達に有用であり、該粘膜表面としては、眼粘膜、鼻粘膜、口腔粘膜、嗅粘膜、気管支粘膜、食道粘膜、胃粘膜、腸粘膜、子宮内膜、陰茎粘膜、膣粘膜および肛門粘膜が挙げられるが、これらに限定されない。カーゴを含有するミセルは、カーゴを含む溶媒に粘膜付着性コポリマーを溶解し、上記と同様に、得られた溶液を撹拌下で水に添加してミセルを形成することにより容易に調製される。一般に、本発明のミセルには、該ミセルの５〜５０重量％のカーゴが封入される。
【００３４】
本発明のミセルが、治療剤、診断剤などの様々な種類のカーゴを含有できることは、当業者であれば十分に理解できるであろう。前記カーゴは、低分子であってもよく、タンパク質、核酸、糖などの高分子化合物であってもよい。本発明のミセルに封入することができる治療剤としては、鎮痛剤、抗炎症剤、抗菌剤、抗ウイルス剤および抗真菌剤を含む抗病原体剤、消化管剤、抗ヒスタミン剤、抗アレルギー剤、抗がん剤、制嘔吐剤、抗喘息剤、鬱血除去剤、緑内障治療剤、眼圧降下剤（ＩＯＰ降下剤）、滑沢剤、粘滑剤、反対刺激剤（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｉｒｒｉｔａｎｔｓ）、高張性涙液、ならびに内耳に適用される診断剤、治療剤および抗聴器毒性剤（ａｎｔｉ−ｏｔｏｔｏｘｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）が挙げられる。
【００３５】
好ましい治療剤は、粘膜部位の近傍の病態を治療する治療剤である。このような治療剤としては、シクロスポリンＡ、アシクロビル、アトロピン、アセタゾラミド、アルファガン、アジスロマイシン、バシトラシン、ベタジン、ベタキソロール、ベトプチック、ブリンゾラミド、カルバコール、セファゾリン、セルビスク、クロラムフェニコール、シロクサン、シプロフロキサシン、セファロスポリン、デメカリウム（ｅｍｅｃａｒｉｕｍ）、デキサメタゾン、ジピベフリン、ドルゾラミド、エピネフリン、エリスロマイシン、フルオレセイン、フルルビプロフェン、フルオロキノロンなどのキノロン、ゲンタマイシン、ゴニソール（ｇｏｎｉｏｓｏｌ）、グラミシジン、ガンシクロビル、ガチフロキサシン（ｇａｔａｆｌｏｘａｃｉｎ）、フモルソール、ヒラルチン（ｈｙｌａｒｔｉｎ）、イトラコナゾール、ケトチフェン、ラタノプロスト、レボフロキサシン、ビマトプロスト、トラボプロスト、ピロカルピン、ポリミキシンＢ、プレドニゾロン、プロパラカイン、プロピン、ピュラルーブ、マンニトール、メタゾラミド、ミコナゾール、ミオスタット、モキシフロキサシン、ナタマイシン、ネオマイシン、ネプタザン、オキュフロックス、オフロキサシン、オキシテトラサイクリン、オロパタジン、フェニレフリン、プロスタグランジン、ヒアルロン酸ナトリウム、スプロフェン、テラマイシン、チモロール、トブラマイシン、トリアムシノロン、トリフルリジン（ｔｒｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、トロピカミド、ビダラビン、バラシクロビル（ｖａｌｃｙｃｌｏｖｉｒ）、バンコマイシン、キサラタン、フェニレフリン、プロスタグランジン、ならびにラニビズマブおよびペガプタニブナトリウムなどの抗ＶＥＧＦ薬などの点眼薬が挙げられる。
【００３６】
その他の粘膜部位に送達される治療剤としては、メニエール病を治療するために中耳の乳様突起粘膜を標的として送達されるメチルプレドニゾロン；酵母菌感染症を治療するために膣粘膜に送達されるクロトリマゾール；炎症性腸疾患を治療するために腸粘膜を標的として送達されるバルサラジド；急性喘息の治療で吸入器により肺に送達されるイプラトロピウム；およびアレルギー性刺激を軽減するために鼻腔用スプレーにより送達されるアゼラスチンが挙げられるが、これらに限定されない。機能障害または疾患の対象となりうる組織が粘膜を伴う組織であれば、本発明のミセルを使用して、該組織を標的とする治療剤の送達が可能であることは、当業者であれば十分に理解できるであろう。
【００３７】
本発明のミセル系送達システムを利用して粘膜部位に送達できる診断剤としては、ガドリニウムキレート化合物、鉄、マグネシウム、マンガン、銅、クロムなどの造影剤；ヨウ素剤、蛍光性分子などのイメージング剤；およびガンマ放出体、ポジトロン放出体、Ｘ線放出体などの放射性ヌクレオチドが挙げられる。
【００３８】
本発明のミセルは、経口、鼻腔内、経腸、局所、舌下、動脈内、髄内、子宮内、髄腔内、吸入、眼内、経皮、膣内、直腸内、点滴、または例えば皮下、腹腔内、筋肉内もしくは静脈内への注射などの様々な経路による投与に適した形態に製剤化してもよい。
【００３９】
したがって、本発明のミセルは、標的とする粘膜部位への該ミセルの送達を促進するための、１以上の薬学的に許容される担体および／または添加剤と組み合わせた組成物として調製することもできる。「薬学的に許容される」という表現は、医薬分野および獣医分野において使用が許容されていること、すなわち、許容できない毒性を示すなどの不適な点が認められないことを意味する。薬学的に許容される補助剤としては、ミセル系薬剤で通常使用される補助剤、例えば、希釈剤、賦形剤などが挙げられる。一般的な医薬製剤の参考書として、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”，第２１版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５を参照してもよい。選択される補助剤は、組成物の所望の投与方法によって異なる。本発明の一実施形態において、前記化合物は、眼もしくは耳への局所投与用のゲル剤、液剤または軟膏剤として製剤化される。このような局所製剤は、脂肪、脂肪油、ワックス、ポリエチレングリコール、シリコーン、ケイ酸、酸化亜鉛、デンプンおよびセルロース誘導体を含んでいてもよい。経皮適用されるクリーム剤、ローション剤および軟膏剤は、トリグリセリド基剤などの適当な基剤、または脂肪、脂肪油、ワックス、ポリエチレングリコール、シリコーン、ケイ酸、酸化亜鉛、デンプンおよびセルロース誘導体のうちの１以上を用いて調製することができる。このようなクリーム剤、ローション剤および軟膏剤は、界面活性剤をさらに含有していてもよい。また、直腸内投与用または膣内投与用の坐剤としてのクリーム剤、ローション剤および軟膏剤を調製することもできる。好適な噴射剤を用いた経鼻投与用エアロゾル製剤を調製することも可能である。
【００４０】
錠剤、カプセル剤または懸濁液剤による経口投与を行う場合は、本発明のミセルと、以下の補助剤とを組み合わせてもよい：ラクトース、グルコース、スクロースなどの糖類；コーンスターチ、バレイショデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、セルロースアセテートなどのセルロースおよびその誘導体；トラガント末；麦芽；ゼラチン；タルク；ステアリン酸；ステアリン酸マグネシウム；硫酸カルシウム；ピーナッツ油、綿実油、ごま油、オリーブ油、トウモロコシ油などの植物油；プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコールなどのポリオール；寒天；アルギン酸；水；ならびに等張生理食塩水およびリン酸緩衝液。さらに、湿潤剤、ラウリル硫酸ナトリウムなどの滑沢剤、安定化剤、打錠補助剤、酸化防止剤、防腐剤、着色料および香料を加えてもよい。また、本発明における組成物には、投与方法に拘わらず、他の補助剤を配合してもよく、例えば、長期保管中の微生物の増殖を防ぐために抗菌剤を配合してもよい。
【００４１】
本発明のミセルを、標的の粘膜表面または粘膜部位における病態の治療または診断に用いる際は、標的表面または標的部位に治療用または診断用のカーゴの有効量が送達されるのに十分な用量で投与する。本明細書に例示したようなカーゴの有効量は当業者に公知であり、別の送達システムによる投与量と同量であってもよい。したがって、例えば、点眼薬を送達する場合、本発明のミセルを用いた場合の用量は、当技術分野で通常使用される用量である。また、本発明のミセルを用いた場合の用量が、別の送達システムで投与される有効量より少なくてもよい。例えば、ＣｙｃＡは通常、０．０５％ＣｙｃＡを含む約５００μＬの１回量を１日２回、眼の表面に滴下するという用法で過剰に投与されている。しかし、本発明のミセル技術は、このパラダイムからの根本的な脱却を示すものである。本発明のミセルの粘膜付着性および制御放出を考慮すると、治療効果を得るために必要なＣｙｃＡの投与回数および総投与量を低減できると考えられる。一実施形態において、５ｍｇ／ｍＬ  ＣｙｃＡの週１回１滴（０．０５ｍＬ）の用法としてもよい。
【００４２】
眼、鼻、口腔、耳、咽頭、食道、胃、腸管、子宮内膜、陰茎、膣または肛門などで発生する病態を含む様々な病態を治療または診断するための方法において、目的に合った治療剤または診断剤を含む本発明のミセルを標的の粘膜表面に投与してもよい。上記の病態としては、感染症、炎症、がん、変性疾患、アレルギー反応、損傷、瘢痕などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
一実施形態において、本発明のミセルは、眼の病態の治療に使用される。眼の病態としては、感染症、緑内障、白内障、糖尿病性網膜症、黄斑ジストロフィー、ドライアイ疾患、円錐角膜、リンパ腫、アレルギー、炎症、閉塞症、高血圧、眼振、黄斑変性、角膜移植、ビタミンＡ欠乏症、樹枝状潰瘍、嚢胞、瘢痕および擦過創が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
本発明のミセルは、治療剤または診断剤などのカーゴを所望の粘膜部位に効果的に標的送達できる標的送達システムを提供できるという利点を有する。本発明のミセルは、合成親水性成分の配合により、安定性に優れており、また、選択したカーゴが標的の粘膜部位へと最適に送達されるよう、オーダーメイドで調製することができる。また、合成親水性成分の使用により、免疫原性を有さないミセルを提供できることも利点である。
【実施例】
【００４５】
以下の具体的な実施例において、本発明の実施形態について説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものと解釈すべきではない。
【００４６】
実施例１
材料−
別段の記載がない限り、材料はすべてシグマアルドリッチ社（オークヴィル、オンタリオ州、カナダ）から購入し、そのまま使用した。３−アクリルアミドフェニルボロン酸は、水溶液から再結晶することにより精製した。アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）は、メタノール溶液から再結晶することにより精製した。１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよびアセトニトリルは、Ｃａｌｅｄｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（カレドン、オンタリオ州）から購入し、そのまま使用した。ＤＭＳＯ−ｄ６は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（アンドーバー、マサチューセッツ州、アメリカ）から購入し、そのまま使用した。比抵抗が１８．２ＭΩ・ｃｍの精製水を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂａｒｎｓｔｅａｄ浄水装置（グラハム、ノースカロライナ州、アメリカ）を使用して調製した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は、ＢｉｏＳｈｏｐ社（バーリントン、オンタリオ州、カナダ）から購入した。分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）値が３．５ｋＤａおよび５０ｋＤａのセルロース透析膜は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（ランチョ・ドミンゲス、カリフォルニア州、アメリカ）から購入した。３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、カルセインＡＭおよび臭化エチジウムは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（カールスバード、カリフォルニア州、アメリカ）から購入し、そのまま使用した。
【００４７】
ｐＬＡ−ｂ−ｐ（ＭＡＡ−ＰＢＡ）コポリマーの合成および性状分析−
ｐＬＡ−ｂ−ｐ（ＭＡＡ−ＰＢＡ）（ＬＭＰ）コポリマーの合成は、ＲＡＦＴ重合により行った。一般的な反応手順は以下の通りである（仕込みモル濃度ＭＡＡ：ＰＢＡ：ｐＬＡ：ＡＩＢＮ＝８０：２０：１．４：０．２）。メタクリル酸（ＭＡＡ；１９２．９ｍｇ、２．２４ｍｍｏｌ）、ＰＢＡ（１０７．１ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）４−シアノ−４−［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタノエート（ｐＬＡ−ＣＤＰ；２００．０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）およびＡＩＢＮ（１．１０ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン：水（９０：１０）の混合溶媒５ｍＬに溶解して、１０％溶液を調製した。この溶液に対して、凍結脱気を３回繰り返して脱気を行った後、乾燥窒素を充填した。脱気した溶液が入っているフラスコを７０℃に加熱し、この温度を維持しながら、２４時間撹拌を続けた。反応により得られたコポリマーＬＭＰ−２０（ポリ（ＭＡＡ−ｃｏ−ＰＢＡ）ブロック中に２０重量％のＰＢＡを含む）を、１０倍量の冷却した無水ジエチルエーテル中で沈殿させて単離した後、テトラヒドロフランに溶解し、ジエチルエーテル中で再度沈殿させてさらに精製した。精製したコポリマーを５０℃に設定した真空乾燥器に移して、重量が一定になるまで２４時間乾燥した。
【００４８】
ＬＭＰコポリマーの組成および分子量は、ＤＭＳＯ−ｄ６を溶媒とした１Ｈ  ＮＭＲ測定（Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶ  ６００）により確認した。また、ＭＡＡ−ＰＢＡブロック中のＰＢＡの分布および重合の制御性を確認するために、ＬＭＰの重合反応の速度論的解析を行った。先に記載した方法と同様にして、重合反応を行い、所定の各時点で、窒素パージした気密針を用いてサンプルを５０μＬを抜き取り、ＤＭＳＯ−ｄ６を溶媒としたプロトン核磁気共鳴（１Ｈ  ＮＭＲ；Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶ  ６００）による測定を行った。
【００４９】
ミセルの形成および性状分析−
ミセル形成は沈澱法により行った。２０ｍｇのＬＭＰコポリマーを２ｍＬのアセトンに溶解した。このコポリマー溶液を、撹拌下、６ｍＬの精製水に滴下した。このアセトン／水溶液を、蓋をしない状態で、室温で４８時間撹拌してアセトンを蒸発させた後、性状分析を行った。ミセルのサイズは、シングルナノ粒子解析装置ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＬＭ１０（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて測定した。精製水で調製したミセル液を５×１０−２ｍｇ・ｍＬ−１に希釈して、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で測定した。ミセルの安定性は、１０ｍＭ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のゼータ電位（ゼータ電位分析装置ＺｅｔａＰｌｕｓ、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）によって評価した。ゼータ電位の測定は、１ｍｇ・ｍＬ−１  ＬＭＰに対して行った。
【００５０】
臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は、ピレンを用いた蛍光プローブ法により求めた。所定量のピレンをアセトンに溶解し、２ｍＬバイアルに移して、アセトンを蒸発させた。１０ｍｇ・ｍＬ−１〜１０−５ｍｇ・ｍＬ−１のミセル液を加えて、室温で２４時間インキュベートした。ピレンの最終濃度は６．０×１０−７ｍｏｌ・Ｌ−１であった。ＴＥＣＡＮ  Ｍ１０００  Ｐｒｏプレートリーダー（メンネドルフ、スイス）を使用して、蛍光を測定した。３４０ｎｍの波長で励起した後、励起スペクトルを測定した。濃度の対数に対して、３８３ｎｍのピークに対する３７３ｎｍのピークの強度比をプロットすることにより、ＣＭＣを求めた。すべての測定において、発光帯域幅および励起帯域幅は５ｎｍとした。
【００５１】
表面プラズモン共鳴による粘膜付着性−
粘膜付着性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；ＳＰＲ  ＮａｖｉＴＭ  ２００、ＢｉｏＮａｖｉｓ社）により測定した。以下に方法を簡潔に説明する。金センサーＳＰＲ１０２−ＡＵをｐｉｒａｎｈａ溶液（９４％硫酸：過酸化水素＝３：１）で洗浄した後、精製水で十分にすすぎ、窒素気流下で乾燥させた。次いで、このセンサーを１００μＬの１００μｇ・ｍＬ−１ウシ顎下腺ムチン液中、２０℃で２４時間インキュベートした後、精製水ですすいで未結合のムチンを除去した。模擬涙液（ＳＴＦ；２３．１ｍＭ  ＫＣｌ、２０．０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１１３．５ｍＭ  ＮａＣｌ）を１０分間流して、ＳＰＲ測定を行い、安定したベースラインを得た。次いで、フロー液を１ｍｇ・ｍＬ−１キトサン液または１ｍｇ・ｍＬ−１  ＬＭＰミセル液に変えて、５０分間測定した。その後、フロー液を模擬涙液に戻して、粘膜付着安定性を評価した。測定はすべて、流速５０μＬ・ｍｉｎ−１、温度２２℃および６５．４°の固定角度スキャンモードで行った。
【００５２】
シクロスポリンＡ（ＣｙｃＡ）放出量−
ミセルからのＣｙｃＡ放出量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した。以下に方法を簡潔に説明する。２０ｍｇのＬＭＰコポリマーを、１．５ｍｇ・ｍＬ−１  ＣｙｃＡを含む２ｍＬのアセトンに溶解した。この溶液を６ｍＬの精製水に滴下した。この溶液を撹拌しながら２４時間放置して、アセトンを蒸発させた。反応液から０．５ｍＬを採取して、Ｎａｎｏｓｅｐ  １０Ｋ  Ｏｍｅｇａ遠心デバイス（１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ、Ｐａｌｌ社）でろ過し、未反応のＣｙｃＡとミセルとを分離した。ろ液を回収して、エントラップメント効率（ＥＥ）を求めた。次いで、遠心分離していない反応液から５ｍＬを採取して、５０ｋＤａ  ＭＷＣＯの透析チューブに封入し、１５ｍＬのＳＴＦ中に静置した。所定の各時点で、２．５ｍＬをサンプリングして、予め温めておいた新鮮なＳＴＦと置き換えた。採取したサンプルを、２７０７オートサンプラー、２４８９ＵＶ分光光度計、１５２５バイナリＨＰＬＣポンプおよびＢｒｅｅｚｅ２ソフトウェア（Ｂｕｉｌｄ２１５４）で構成されるＷａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣで分析した。分析は、アセトニトリル：０．１％トリフルオロ酢酸／精製水＝８０：２０で構成される移動相のイソクラチック流速を０．７ｍＬ・ｍｉｎ−１、カラム温度を６０℃、サンプル注入量を２０μＬおよび検出波長を２１０ｎｍとして行った。同じ移動相を用いて作成したＣｙｃＡの検量線に基づいて、サンプル濃度を求めた。
【００５３】
細胞培養−
細胞培養においては、コポリマーがミセルを形成しないよう、３．５ｋＤａ  ＭＷＣＯ透析チューブを用いて、すべてのコポリマーをアセトン：水（２：１）の混合溶媒中で十分に透析した後、精製水に移して、凍結乾燥した。次いで、５０ｍｇのコポリマーを１ｍＬのアセトンに溶解し、この溶液を、撹拌下、２．５ｍＬの滅菌水に滴下した。さらに撹拌を続けてアセトンを４８時間かけて蒸発させ、濃縮ＰＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを、それぞれ最終濃度が０．１Ｍおよび１％（ｖ／ｖ）になるように加えた。
【００５４】
ヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥＣ）を、ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）および上皮増殖因子（ＥＧＦ、０．００５ｍｇ・ｍＬ−１）を添加した角化細胞用無血清培地（ＫＳＦＭ）で培養した。ＨＣＥＣを５，０００個／ｗｅｌｌの密度になるように９６穴プレートに播種して、温度制御されたＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気、１００％湿度）でインキュベートした。２４時間増殖させた後、培地を１５０μＬのＫＳＦＭ＋５０μＬのＰＢＳ、２０ｍｇ・ｍＬ−１  ＬＭＰミセルまたは４ｍｇ・ｍＬ−１ミセルに交換した。ＬＭＰミセルの最終濃度は、それぞれ０ｍｇ・ｍＬ−１、５ｍｇ・ｍＬ−１および１ｍｇ・ｍＬ−１であった。プレートを３７℃でインキュベートしながら、所定の時点で、ＭＴＴアッセイにより細胞生存率の評価を行い、２４時間後および７２時間後に、カルセインＡＭ（ＣａｌＡＭ）／エチジウムホモダイマー１（ＥｔｈＤ−１）アッセイを行い、生細胞と死細胞を計数した。
【００５５】
統計分析−
１因子分散分析（ＡＮＯＶＡ）および事後検定としてＴｕｋｅｙ法を用いて、有意水準α＝０．０５で、ミセルのサイズ、ゼータ電位およびＨＣＥＣ生存率を分析した。統計分析は、統計ソフトウェアＩＢＭ  ＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｖ２２．０（ＩＢＭ社、アーモンク、ニューヨーク州、アメリカ）を使用して行った。各エラーバーは標準偏差を示す。
【００５６】
結果
コポリマーの性状分析−
１Ｈ  ＮＭＲ測定により、各ＬＭＰコポリマーのモル組成および数平均分子量を求めた。表１によれば、最終組成は仕込み比に従うことが確認され、また、分子量は反応生成物の組成比に基づく理論分子量と同等であった。
【表１】
2018526438.tif 000003
【００５７】
ＬＭＰコポリマーの両親媒性と保護されていないフェニルボロン酸の親和性とにより、ゲル透過クロマトグラフィーでは典型的な結果が得られなかった。そこで、重合過程および親水性ブロックのフェニルボロン酸の分布をより正確に把握するために、図１に示すように、反応速度論的解析を行った。この反応速度論的解析では、十分に制御されたＲＡＦＴ重合において予想されるような転化率と時間との相関関係は示されなかった。したがって、従来のＲＡＦＴ重合よりも多分散性が高いと考えられる。また、この速度論的プロットより、重合の初期段階においては、ＭＡＡの反応速度はＰＢＡを上回っているが、１２時間後の重合速度はＭＡＡとＰＢＡとでほぼ同じであることが分かる。このことが、コポリマーの最終組成におけるＭＡＡ／ＰＢＡ比率が仕込み比より高いという結果と、重合反応の進行の過程でＰＢＡの分布が拡大し、ポリ（ＭＡＡ−ｃｏ−ＰＢＡ）部分内で勾配が生じるという結果につながっている。このＰＢＡの勾配は、ミセルの表面に位置してムチンと相互作用するＰＢＡが増えるという理由により、粘膜付着に有利になる可能性がある。
【００５８】
ミセルの形態−
ＮａｎｏＳｉｇｈｔおよびゼータ電位から、図２に示すような、ミセルのサイズおよび構造に対するＰＢＡの効果が推定された。ＭＡＡのｐＫａが約４．６であり、ＰＢＡのｐＫａが約８．８であることから、ｐＨ７．４のＰＢＳ中において、大多数のＭＡＡ基は負電荷を有し、大部分のＰＢＡ基は電荷を有していないと考えられる［２７］。表２に示すミセルの直径から、２つの傾向が認められる。
【表２】
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【００５９】
第１に、ＰＢＡ含有ＬＭＰミセル中のＰＢＡ／ＭＡＡの比率が高くなるにつれて、ミセルの直径は大きくなる。第２に、ＬＭＰ−０ミセルは、最少量のＰＢＡを含むＬＭＰミセルより大きい。これらの結果は、２つの競合する力の存在により説明することができる。すなわち、負電荷を有するＭＡＡと水との間の分子間相互作用、ならびにＰＢＡにより誘導された分子間疎水性相互作用および分子内疎水性相互作用である。ＬＭＰ−０コポリマーにおいて、負電荷を有するＭＡＡ基は、互いに静電気学的に反発し合い、それぞれ水分子と電気的に相互作用する。このような作用により、水和した大きな外側のシェルが形成されるため、ミセルの直径は大きくなる。さらに少量のＰＢＡが外側のシェルに加わると、水和している水分子の一部が排除されるため、外側のシェルの水和量が減少して、サイズが縮小される。ＰＢＡの比率がさらに高くなると、水が排除されて、ポリマー鎖の間の疎水性相互作用が強くなるため、より密な充填構造が形成される。また、大きく嵩高いフェニル環が、ポリ（ＭＡＡ−ｃｏ−ＰＢＡ）ポリマー鎖の分子内の立体障害となって、曲がったり折りたたまったりできない、より堅いポリマーが形成されるため、嵩高い構造が形成される。堅さが増したことにより、親水性のポリ（ＭＡＡ−ｃｏ−ＰＢＡ）ポリマーがより密な充填構造を形成するため、有効曲率半径が大きくなり、ミセルの直径も大きくなる。
【００６０】
図３に示すゼータ電位においても、ミセルのサイズと同様の傾向が示された。ＰＢＡ含有ＬＭＰミセルは、組成比におけるＰＢＡの比率が高くなると、ミセルの負電荷が増大することが分かった。中性のＰＢＡの比率の上昇によりミセルの負電荷が増すことは、最初は直観に反しているにように思われたが、この変化は、総電荷ではなく電荷密度で考えれば説明することができる。先に説明したように、ＰＢＡ比率が高いＬＭＰポリマーは、疎水性相互作用と立体障害とにより密な充填構造を形成する。充填構造が密になると、ゼータ電位で測定される表面電荷は大きくなる。
【００６１】
ミセルの特性を、ＣＭＣおよびＴＥＭにより確認した。ＴＥＭ観察により、球状ミセルを示す円形の形態が示された。いずれのＬＭＰミセルも、乾燥状態において直径が１００ｎｍ未満の比較的単分散の粒子であることが示された。ＣＭＣを用いて、遊離のブロックコポリマーが溶液中でミセルを形成し始める濃度の特徴付けを行った。図４に示すように、ＬＭＰ−０コポリマー、ＬＭＰ−５コポリマー、ＬＭＰ−１０コポリマー、ＬＭＰ−２０コポリマーおよびＬＭＰ−３０コポリマーのＣＭＣは、それぞれ７３．０ｍｇ・ｍＬ−１、４７．８ｍｇ・ｍＬ−１、４０．６ｍｇ・ｍＬ−１、４１．０ｍｇ・ｍＬ−１および３２．５ｍｇ・ｍＬ−１であることが分かった。ＰＢＡ比率の増加に伴い、ＣＭＣがやや低下傾向を示すことは、ブロックコポリマーの溶解性の差およびミセルの安定性の差によって説明することができる。ＰＢＡ比率が高くなると、ポリ（ＭＡＡ−ｃｏ−ＰＢＡ）ブロックの溶解性が低くなるため、溶液になるための駆動力が低減する。さらに、外側のシェルにおけるＰＢＡの間の疎水性相互作用により、ブロックコポリマーが弱く繋ぎ止められることで液中への遊離が妨げられるため、ミセルの安定性が向上する。
【００６２】
シクロスポリンＡの放出量−
ＣｙｃＡおよびＬＭＰコポリマーを、ＣｙｃＡ３ｍｇに対してコポリマー２０ｍｇの比率でアセトンに溶解し、この溶液を精製水に滴下して、ＬＭＰミセル内にＣｙｃＡを封入した。２４時間撹拌しながらアセトンを蒸発させた後、薬物が封入されたミセルをフィルターで除いて、％エントラップメント効率（ＥＥ）を求めた。図５は、各ＬＭＰコポリマーとコントロールであるＣｙｃＡ製剤のＥＥを示した図である。すべてのＬＭＰミセルで、９９．８％を上回るＥＥが示されたが、ＣｙｃＡ製剤のＥＥはいずれのＬＭＰミセルよりも有意に低く、９８．７％であった。この値はＣｙｃＡの水溶解度の最大値である。この結果は、ＬＭＰミセルによるＣｙｃＡのエントラップメント効率が極めて高いことを示しており、適用後に起こる、望ましくない初期バースト放出が抑制される可能性がある。また、ＣｙｃＡ封入ＬＭＰミセルの透明度は様々であった。ＬＭＰ−０／５／１０ミセルは、ほぼ透明な液であったが、ＣｙｃＡ封入ＬＭＰ−２０ミセルおよびＣｙｃＡ封入ＬＭＰ−３０ミセルは不透明な懸濁液となった。これは、図６に示すような、ミセル内のＣｙｃＡの分布によるものである可能性が高い。ＬＭＰ−２０／３０ミセルは、相当量の疎水性ＰＢＡを外側の親水性シェル内に含むため、ＣｙｃＡがミセルのコアとシェルの全般にわたってより広く分布しており、このことがミセルの屈折率の変化の原因となっている。しかし、ＬＭＰ−０／５／１０ミセルにおいては、大部分のＣｙｃＡが疎水性ポリ（ラクチド）コア内に封入されており、外側の親水性シェル内に存在するＣｙｃＡはごく少量であるため、屈折率の変化は極微である。このようなミセル内の疎水性分布は、ミセルの薬物放出特性に対しても影響を及ぼしている。
【００６３】
興味深いことに、いずれのＬＭＰコポリマーも、図７に示すように、ＳＴＦ中において、ＣｙｃＡより高い放出量を示した。この高い放出量は、遊離のブロックコポリマーが５０ｋＤａ  ＭＷＣＯの透析膜を通過して拡散する際に、疎水性ポリ（ラクチド）ブロック中のＣｙｃＡを伴って拡散したことによるものと考えられる。このような拡散は、個々のブロックコポリマーの拡散を妨げるものが存在しないｉｎ  ｖｉｖｏの状況をよりよく示していると言える。また、いずれのＬＭＰコポリマーも、二相の放出プロファイルを示した。ＬＭＰコポリマーの組成によって数値は異なるが、約２４時間にわたる初期バーストにおいては、３５〜４５％が放出され、続いて非線形の放出挙動により、１４日後までに７４〜８０％が放出された。初期バースト放出においては、ＰＢＡ比率が低いミセルほど放出速度が高かった。このことは、ミセルコア内に封入されているＣｙｃＡが多く、ミセルの直径が小さいことに起因すると考えられる。すなわち、ＰＢＡ比率が低いミセルでは、ＣｙｃＡの濃度勾配が大きくかつ拡散距離が短いため、サイズが大きくかつＣｙｃＡがミセルのコアとシェルの全般にわたって分布しているＰＢＡ比率の高いミセルより放出速度が高くなる。初期バースト放出が起こった後は、濃度勾配が小さくなるため、外側のシェルからのＣｙｃＡ拡散率により、ミセルの放出特性が決定されることになる。ＰＢＡ比率の高いミセルは、外側のシェルの疎水性が高いため、ミセルからのＣｙｃＡの拡散率が高く、そのため、ＰＢＡ比率の低いミセルより放出速度が高くなる。薬物放出前に有機溶媒を除去することにより、より現実的な薬物放出プロファイルが示される。
【００６４】
各ＬＭＰコポリマーの粘膜付着性をＳＰＲを用いて調べ、ポジティブコントロールとして用いたキトサンの粘膜付着性と比較した。図８は、キトサンおよび各ＬＭＰコポリマーの角度固定ＳＰＲセンサーグラムを示した図である。図８から分かるように、ＬＭＰミセルの粘膜付着性はＰＢＡ含有量の増加と共に高くなるが、やがて、ＰＢＡが増えても粘膜付着性がそれほど上昇しない上限に達するようである。この天井効果は、ムチンの単層の飽和により、それ以上ＬＭＰポリマーが表面に接着できなくなることに起因している可能性が高く、この状態はｉｎ  ｖｉｖｏの状況を反映している。このことから、透明度が低下するような高いＰＢＡ比率は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用において有益でない可能性が示唆される。ＬＭＰ１０／２０／３０ミセルはいずれも、キトサンおよびＬＭＰ−０／５ミセルより相対強度が有意に高く、このことは、粘膜付着性が高いことを示している。ＬＭＰ−０ミセルは、予想された通り、粘膜付着性が最も低かった。また、洗浄工程後の相対強度の低下率も、キトサンと同様、ＰＢＡ含有ミセルより大きかった。相対強度の低下率は、吸着層の安定性の指標となる。この結果は、ＬＭＰ−０ミセルが形成する水素結合より、また、キトサンが形成する静電気的結合および水素結合より、ＰＢＡとシアル酸のジオールとの間の結合が強いことに起因すると考えられる。ＰＢＡ含有ＬＭＰミセルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて高い粘膜付着性を示すことから、局所適用される薬物の生物学的利用率を向上させることが見込まれる。
【００６５】
ＨＣＥＣ生存率−
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞生存率を調べるために、各ＬＭＰミセルを１ｍｇ・ｍＬ−１および５ｍｇ・ｍＬ−１の濃度でＨＣＥＣと共に２４時間および７２時間インキュベートした。各時点で、ＭＴＴアッセイにより細胞代謝活性を求め、ＣａｌＡＭアッセイおよびＥｔｈＤ−１アッセイにより、それぞれ生細胞および死細胞を計数した。ＭＴＴアッセイの結果（図９Ａ）から、コントロールと比べて、ＬＭＰミセル存在下では細胞代謝が低いことが分かる。７２時間後、１ｍｇ・ｍＬ−１ミセルと共にインキュベートしたＨＣＥＣの代謝が、５ｍｇ・ｍＬ−１ミセルと共にインキュベートした場合より有意に高いという傾向も示された。蛍光性のＣａｌＡＭ染色（図９Ｂ）から求めた生存率は、２４時間後のサンプルと比べて、７２時間後のサンプルの方が高かった。この結果から、ミセルには細胞毒性はないが、増殖を抑制する作用があることが示唆される。また、ＣａｌＡＭ蛍光分析から、細胞生存率が、５ｍｇ・ｍＬ−１ミセルと比べて、１ｍｇ・ｍＬ−１ミセルの方が高いことも示された。ＥｔｈＤ−１アッセイ（図９Ｃ）から、いずれのミセルにおいても、死細胞率がコントロールの３倍未満であることが示されており、ＬＭＰミセルには重大な細胞毒性がないことが示唆される。またＥｔｈＤ−１アッセイから、７２時間後の死細胞率（％、対コントロール）が、２４時間後より有意に低い傾向が示されているが、この結果は、コントロール細胞ではコンフルエントに達して細胞死が誘導されているのに対して、ミセルを添加したＨＣＥＣでは増殖が遅く、細胞死が誘導されていないことに起因している可能性がある。興味深いことに、ＰＢＡ含有ミセルと共に培養したＨＣＥＣは、ＰＢＡ非含有ミセル群やコントロール群で観察されるような伸展形態をとるのではなく、むしろ密な細胞凝集体を形成する。ＰＢＡミセルは、細胞表面のムチンと相互作用することにより細胞同士の接着を媒介している可能性があり、そのことが、プレート上での伸展を妨げる要因になっていると考えられる。これらのＬＭＰミセルで観察された細胞の増殖阻害は、以下の２つの理由でｉｎ  ｖｉｖｏにおける角膜細胞への影響はないと考えられる。まず、角膜表面上のＬＭＰミセル濃度は、点眼薬を局所投与した後の急速な涙液ターンオーバーにより、実験時の濃度より低くなる点が挙げられる。次いで、角膜細胞の前部層（最外層）では積極的な細胞分裂が起こっていないため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増殖抑制をｉｎ  ｖｉｖｏの状況にそのまま当てはめることはできないという点が挙げられる。細胞生存率に関する結果から、実験に使用したＰＢＡ含有ミセルは、細胞毒性を示さないが、ＨＣＥＣ増殖を抑制し、プレート上での細胞伸展ではなく、細胞凝集体の形成を誘導することが分かる。
【００６６】
結論
粘膜付着性ミセルは、粘膜表面に局所適用される点眼薬などの薬物の生物学的利用率を向上し得る大きな可能性を提供するものである。そのため、局所点眼薬に関する一般的な投与量、投与回数および非特異的な全身毒性の低減が期待される。そこで、様々な量のフェニルボロン酸を含むポリ（Ｌ−ラクチド）−ｂ−ポリ（メタクリル酸−ｃｏ−フェニルボロン酸）コポリマーミセルを、可逆的付加開裂連鎖移動重合により合成した。これらのミセルは、一般に知られた粘膜付着性物質であるキトサンより粘膜付着性が高く、例えば、シクロスポリンＡなどの薬物の送達を向上させることが確認された。細胞生存率のデータにおいては、細胞増殖および細胞形態に対する変化が認められたが、重大な細胞毒性は示されず、ｉｎ  ｖｉｖｏの状況における安全性が示唆される。粘膜付着性ミセルを合成するためのこの簡便な方法は、疾患を治療するために粘膜表面に局所適用される薬物の生物学的利用率を向上し得る大きな可能性を提供するものである。
【００６７】
実施例２
本実験は、本発明のミセルがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて粘膜付着性を示すことを確認するために行った。
【００６８】
カルボジイミドを用いたカップリング反応により、２０％ＰＢＡを含むミセルに、５−アミノフルオレセイン（ＦＡ）による共有結合修飾を施した。一般的な反応手順は以下の通りである。撹拌子を入れた、アルミホイルで遮光した栓付フラスコに、コポリマーと無水ジメチルスルホキシドとを加え、該コポリマーを溶解した。この溶液に、５−アミノフルオレセイン、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび４−ジメチルアミノピリジンを、ＭＡＡ基：ＦＡ：ＤＣＣ：ＤＭＡＰのモル比が１００：３０：１１０：１０となるように加えた。フラスコをゴム栓で密閉し、撹拌しながら２４時間放置した。２４時間反応させた後、十分な純度が得られるまで溶液を透析した。５ｍｇ／ｍＬミセルを含む液を、健康なラットの眼に１滴５０μＬ滴下した。１滴の点眼後、０％ＰＢＡを含むミセルでは、１時間後にフルオレセインによる染色は認められなかったが、２０％ＰＢＡを含むミセルでは、１時間後に明確に染色が認められたことから、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＰＢＡ含有ミセルの眼表面への結合が確認された。
【００６９】
実施例３
本発明のミセルがｉｎ  ｖｉｖｏにおける使用に適していることを確認するために、苛性の化学物質である塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）を用いて（Ｘｉｏｎｇら，Ｃｏｒｎｅａ，２００８年５月に記載の方法と同様にして）ＤＥＤを誘導した、ＤＥＤの前臨床モデルを使用した。
【００７０】
まず、薬物が封入されていないミセルがこのＤＥＤモデルに対して何らかの作用を示すかどうかを、シルマー試験により確認した。シルマー試験とは、目盛のついた試験紙片に涙膜を浸み込ませ、吸い上げた涙量を測定する試験である。ラットでの実施に合うように改変したシルマー試験（すなわち、ヒト用の試験紙片を、幅が１／３になるように３等分にカットした）を行ったところ、図１０に示すように、５日間ミセルで「処置」したＤＥＤラット（ミセル処置ＤＥＤ）の涙量と、ＤＥＤ誘導直後の未処置ＤＥＤラットの涙量およびＤＥＤ誘導後５日間非処置のラットの涙量との間に有意な差は認められなかった。非ＤＥＤ動物（コントロール）の涙膜量は、いずれの群よりも有意に高かった。
【００７１】
ＤＥＤは、多くの場合、涙膜浸透圧モル濃度の制御ができない状態にある。ＴｅａｒＬａｂ浸透圧計で測定した涙膜浸透圧モル濃度においても、先の実施例と同様に、ミセル処置による差異は認められなかった（図１１）。
【００７２】
眼科医は、眼損傷または眼疾患の重症度を判定するために、様々な半定量的評価法を用いており、例えば、（ａ）ドレイズ試験および（ｂ）蛍光定量的試験などを利用している。蛍光定量的試験は、フルオレセインを用いて損傷を受けた角膜組織を染色し、青色光を当てて可視化するという試験で、数値が高いほど、眼組織の損傷度が高いことを意味する。改変ドレイズ試験およびフルオレセイン評価法においても、上記の結果と同様に、ミセルが副作用を有さないことが示された（図１２）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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