(57)【要約】  本発明は、金属および／または半導体を含むコア、および当該コアと共有結合された複数のリガンドを含むナノ粒子を提供し、ここで当該リガンドは少なくとも１種類の肝臓標的化リガンド、生物活性剤を含む少なくとも１種類のペイロードリガンド、および炭水化物を含む少なくとも１種類の希釈リガンドを含む。また、当該ナノ粒子を含む医薬組成物、肝臓癌の治療および撮像を含むこの医学的利用、ならびに当該ナノ粒子の製造方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属および／または半導体を含むコア、および前記コアと共有結合された複数のリガンドを含むナノ粒子であって、前記リガンドが
（ｉ）少なくとも１種類の肝臓標的化リガンド、
（ｉｉ）生物活性剤を含む少なくとも１種類のペイロードリガンド、および
（ｉｉｉ）炭水化物を含む少なくとも１種類の希釈リガンド、
を含む、ナノ粒子。
【請求項２】
前記肝臓標的化リガンドが、
ラクトース、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、または他のアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）結合剤、
グリピカン−３結合剤、
α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）受容体結合剤、
ＦＧＦ−４（線維芽細胞増殖因子４）、
ｃ−Ｍｅｔ（肝細胞増殖因子受容体）、および
グリピカン−３、ＡＳＧＰＲ、ＦＧＦ−４、ｃ−Ｍｅｔ、またはＡＦＰと特異的に結合する抗体またはこの結合フラグメント、
から選択される、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記肝臓標的化リガンドがグリピカン−３結合ペプチドまたはラクトースを含む、請求項１または２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記グリピカン−３結合ペプチドが、アミノ酸配列ＲＬＮＶＧＧＴＹＦＬＴＴＲＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）もしくはＹＦＬＴＴＲＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）のペプチドを含む、もしくはこれからなる、または３個を超えないアミノ酸の欠失、付加、修飾、もしくは置換によって前記アミノ酸配列が異なるこの変異体であり、ここで前記変異体がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のペプチドのヒトグリピカン−３への結合アフィニティーの少なくとも５０％を保持する、請求項３に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記グリピカン−３ペプチドがＮ末端アセチル化および／またはＣ末端アミド化を有する、請求項４に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記肝臓標的化リガンドが、第一リンカーを介して前記コアと共有結合され、前記第一リンカーが２〜５０原子の鎖長を有する、先行請求項のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記第一リンカーが、基−（ＣＨ２）ｎ−および／または−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−を含み、ここでｎおよびｍが独立して≧１である、請求項６に記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記第一リンカーが、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−を含み、ここでｍは１〜１０であり、任意にｍは８である、請求項７に記載のナノ粒子。
【請求項９】
前記少なくとも１種類の肝臓標的化リガンドおよび前記第一リンカーが、
ＨＳ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）８−ＣＯＮＨ−ＲＬＮＶＧＧＴＹＦＬＴＴＲＱ、
ＨＳ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）８−ＣＯＮＨ−ＲＬＮＶＧＧＴＹＦＬＴＴＲＱ−ＮＨ２、
ＨＳ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）８−ＣＯＮＨ−ＹＦＬＴＴＲＱ、
ＨＳ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）８−ＣＯＮＨ−ＹＦＬＴＴＲＱ−ＮＨ２、
ＨＳ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６−ＮＨ（Ａｃ）−ＲＬＮＶＧＧＴＹＦＬＴＴＲＱ、および
ＨＳ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６−ＮＨ（Ａｃ）−ＹＦＬＴＴＲＱ、
からなる群から選択される、請求項８に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
前記第一リンカーが−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−を含み、ここでｍ＝１〜１０およびｎ＝１〜１５である、請求項７に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
ｍ＝３〜７およびｎ＝５〜１２である、請求項１０に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
前記第一リンカーが末端イオウ原子を介して前記コアと結合される、先行請求項のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
前記第一リンカーを介して前記コアと共有結合される前記肝臓標的化リガンドが式（Ｉ）の構造を有し、
【化１】
2018526432.tif 000033
ここで前記第一リンカーが末端チオール基を介して前記コアと結合される、請求項７に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
前記少なくとも１種類のペイロードリガンドが治療剤を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
前記治療剤が化学療法用または細胞毒性化合物である、請求項１４に記載のナノ粒子。
【請求項１６】
前記ペイロードリガンドが、メイタンシノイドＤＭ４、ドキソルビシン、イリノテカン、プラチナ（ＩＩ）、プラチナ（ＩＶ）、テモゾロミド、カルムスチン、カンプトテシン、ドセタキセル、ソラフェニブ、メイタンシン、メイタンシノイドＤＭ１、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、およびパノビノスタットからなる群から選択される化合物を含む、請求項１５に記載のナノ粒子。
【請求項１７】
前記ペイロードリガンドがメイタンシノイドＤＭ４、ＭＭＡＥ、またはドキソルビシンを含む、請求項１６に記載のナノ粒子。
【請求項１８】
前記ペイロードリガンドが、
【化２】
2018526432.tif 000034
【化３】
2018526432.tif 000035
【化４】
2018526432.tif 000036
【化５】
2018526432.tif 000037
および
【化６】
2018526432.tif 000038
から選択される、請求項１５に記載のナノ粒子。
【請求項１９】
前記ナノ粒子が、検出可能な標識を含む少なくとも１種類のさらなるペイロードリガンドをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２０】
前記検出可能な標識が蛍光標識または光音響色素を含む、請求項１９に記載のナノ粒子。
【請求項２１】
前記少なくとも１種類の希釈リガンドがモノサッカライドを含む、先行請求項のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２２】
前記モノサッカライドがグルコースまたはガラクトースである、請求項２１に記載のナノ粒子。
【請求項２３】
前記少なくとも１種類の希釈リガンドが、第三リンカーを介して前記コアと共有結合される、先行請求項のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２４】
前記第三リンカーが２〜１０原子の鎖長を有する、請求項２３に記載のナノ粒子。
【請求項２５】
前記第三リンカーが−（ＣＨ２）ｎ−を含み、ここでｎ＝２〜３である、請求項２４に記載のナノ粒子。
【請求項２６】
前記第三リンカーが末端イオウ原子を介して前記コアと結合される、請求項２５に記載のナノ粒子。
【請求項２７】
前記第三リンカーを介して前記コアと共有結合される前記少なくとも１種類の希釈リガンドが式１、２、３、４、または５の構造を有し、
【化７】
2018526432.tif 000039
ここで、前記第三リンカーが末端チオール基を介して前記コアと結合される、先行請求項のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２８】
前記複数のリガンドが、
ラクトース含有リガンドまたはグリピカン−３結合ペプチド、
ドキソルビシン含有リガンドまたはメイタンシノイドＤＭ４リガンド、および
ガラクトースまたはグルコースを含むモノサッカライドリガンド、
を含む、請求項１に記載にナノ粒子。
【請求項２９】
前記リガンドが数による比において、
（ｉ）前記肝臓標的化リガンドが１〜３０％
（ｉｉ）前記ペイロードリガンドが１０〜７０％、
（ｉｉｉ）前記希釈リガンドが１０〜７０％、
（ｉｖ）前記第一リンンカーが０〜１０％、および
（ｖ）前記第二リンカーが０〜７０％、
で存在し、ここでパーセントは前記ナノ粒子の前記リガンドの全数の数に対するものであり、ここで前記パーセントの合計は１００である、先行請求項のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項３０】
前記コアが、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｇｄ、Ｚｎ、またはこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される金属を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項３１】
前記コアが金を含む、請求項３０に記載のナノ粒子。
【請求項３２】
前記コアの直径が１〜５ｎｍの範囲である、先行請求項のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項３３】
前記ナノ粒子のそのリガンドを含む直径が３〜５０ｎｍの範囲である、先行請求項のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項３４】
先行請求項のいずれか一項の複数のナノ粒子および少なくとも１種類の医薬品として許容可能な担体または希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項３５】
前記医薬組成物が持続放出製剤であり、前記複数のナノ粒子の少なくとも一部が生体適合性ポリマーにカプセル化されている、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記持続放出製剤がマイクロ粒子、マイクロスフェア、ビーズ、またはフィルムの剤形である、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記組成物が注入可能な剤形である、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
医薬品における使用のための、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のナノ粒子、または請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
哺乳動物対象における肝臓障害の治療における使用のための、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のナノ粒子、または請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記肝臓障害が肝臓の原発性または二次性癌を含む、請求項３９に記載の使用のためのナノ粒子または組成物。
【請求項４１】
前記癌が肝細胞癌（ＨＣＣ）である、請求項４０に記載の使用のためのナノ粒子または組成物。
【請求項４２】
前記癌が、肝芽腫、胆管癌、胆管細胞嚢胞腺癌、血管肉腫、血管内皮腫、胎児性肉腫、線維肉腫、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫から選択される、請求項４０に記載の使用のためのナノ粒子または組成物。
【請求項４３】
哺乳動物対象における肝臓障害を治療する方法であって、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のナノ粒子または請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の医薬組成物を、治療を必要とする前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項４４】
前記肝臓障害が肝臓の原発性または二次性癌を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記癌が肝細胞癌（ＨＣＣ）である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記癌が、肝芽腫、胆管癌、胆管細胞嚢胞腺癌、血管肉腫、血管内皮腫、胎児性肉腫、線維肉腫、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の方法で使用するための医薬品の調製における、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のナノ粒子、または請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４８】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載のナノ粒子、または請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の医薬組成物、
前記ナノ粒子または医薬組成物を収納するための容器、および
インサートまたはラベル
を含む、製造品。
【請求項４９】
前記インサートおよび／またはラベルが、哺乳動物対象の肝臓障害の治療におけるナノ粒子または医薬組成物の使用に関連する指示、用量、および／または投与情報を提供する、請求項４８に記載の製造品。
【請求項５０】
請求項１〜３３のいずれか一項で定められるナノ粒子を産生するための工程であって、前記工程が、
イオウ含有肝臓標的化リガンドおよび／または第一リンカーを含む溶液、
イオウ含有第二リンカーを含む溶液、
炭水化物−リンカー−チオールまたは炭水化物−リンカー−Ｓ−Ｓ−リンカー−炭水化物を含む溶液、
コア形成金属塩を含む溶液、および
還元剤を混合し、
これによって前記ナノ粒子に自己集合を生じさせ、
少なくとも１種類のペイロード化合物を前記第二リンカーと反応させ、これによって前記第二リンカーを介して前記少なくとも１種類のペイロード化合物を前記ナノ粒子と共有結合させ、
任意に少なくとも１種類の標的化化合物を前記第一リンカーと反応させて、前記第一リンカーを介して前記少なくとも１種類の肝臓標的化化合物を前記ナノ粒子と共有結合させることを含む、工程。
【請求項５１】
（ｉ）前記ペイロードがドキソルビシン、メイタンシノイドＤＭ４、またはＭＭＡＥを含み、
（ｉｉ）前記炭水化物がグルコースまたはガラクトースを含み、
（ｉｉｉ）前記コア形成金属塩が金塩を含み、および／または
（ｉｖ）前記還元剤が水素化ホウ素ナトリウムを含む、
請求項５０に記載の工程。
【請求項５２】
肝臓腫瘍を撮像する方法における使用のための、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のナノ粒子または請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、前記少なくとも１種類のペイロードが検出可能な薬剤を含む、ナノ粒子または医薬組成物。
【請求項５３】
前記検出可能な薬剤が蛍光剤または光音響色素である、請求項５２に記載の使用ためのナノ粒子または組成物。
【請求項５４】
前記撮像方法が外科切除の際に腫瘍境界を輪郭化する方法である、請求項５２または５３に記載の使用ためのナノ粒子または組成物。
【請求項５５】
肝臓腫瘍を撮像する方法であって、請求項１〜３３に記載のいずれか一項に記載のナノ粒子、または請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の医薬組成物を、肝臓腫瘍を有する、または有することが疑われる対象に投与することであって、ここで前記少なくとも１種類のペイロードは検出可能な薬剤を含むこと、および
前記検出可能な薬剤を検出することを含み、
これによって前記肝臓腫瘍のすべてまたは一部の画像を形成する、方法。
【請求項５６】
前記検出可能な薬剤が蛍光剤である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記方法が外科切除の際に腫瘍境界を輪郭化するためのものである、請求項５５または５６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤の特定組織型または部位への標的化送達、特に医薬品における使用のための媒体としてのナノ粒子に関するものであり、肝臓癌のような肝臓障害の治療のための方法を含む。医薬組成物、ナノ粒子の調製方法、およびこれらの使用方法も開示される。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、哺乳動物および特にヒトの治療用を含む、組成物および製品、ならびにこのような組成物および製品を調製および投与する方法に関する。
【０００３】
薬剤送達はいくつかの重要な課題を、特に作用部位に関して引き起こしている。特定の腫瘍の治療の場合、例えば、腫瘍部位を抗癌剤が標的にすることでき、標的外への影響を最小限にする送達システムが依然として必要とされている。
【０００４】
原発性肝臓癌は世界で６番目に頻度が高い癌であり、癌死亡の２番目の主たる原因である。最も頻度が高い肝臓癌は、全原発性肝臓癌の約７５％を占める肝細胞癌（ＨＣＣ）である。ＨＣＣは悪性になる肝細胞によって形成される。Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、アフラトキシンＢ１、およびアルコール乱用がヒトＨＣＣの約８０％に関与する４種の作用原因である。従って、脂肪性肝炎、線維症、および肝硬変のような潜在的な疾患が従来のＨＣＣ療法をしばしば複雑にする。現在、腫瘍が切除可能な場合、外科切除がＨＣＣにおける主な治療選択肢である。しかし、ＨＣＣの１０〜２０％のみが手術によって完全に除去することができる。そのため標的化薬剤療法は、承認された化学療法剤の効能の改善およびこれらの副作用の低下の両方にとって重大な関心事である（Ｓｈｉ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，２０１３，Ｖｏｌ．６１，ｐｐ．９０１−９０９）。
【０００５】
ＷＯ０２３２４０４は炭水化物結合（ラクトース結合を含む）金ナノ粒子を説明している。ＷＯ２０１４／１２５２５６は、例えばＣＮＳ障害を治療するために、生物学的に活性な薬剤が中枢神経系（ＣＮＳ）を標的として使用するナノ粒子送達システムを説明している
【０００６】
Ｇａｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＡＰＳ  ＰｈａｒｍＳｃｉＴｅｃｈ，２０１３，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．３，ｐｐ．１２１９−１２２６は、蛍光クマリン誘導体の肝細胞への細胞内送達に関するラクトース表面修飾金ナノベヒクルを報告している。
【０００７】
Ｐｅｎａｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，Ｖｏｌ．９，ｐｐ．１９０９−１９２１は、蛍光グリコナノ粒子の合成を報告している。
【０００８】
Ｐｅｎａｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．  ３４４，ｐｐ．１４７４−１４７８は、ラクトース官能化金粒子を用いたリガンド密度の影響およびタンパク質受容体の認識における提示を評価する研究を報告している。
【０００９】
Ｐｅｎａｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５，ｐｐ．２９１−２９７は、実験的転移の進行を低下するラクトース提示グリコナノ粒子の利用を検討する研究を報告している。
【００１０】
さらなるナノ粒子送達システムおよび対象における特定の組織または部位に生物学的活性および／または検出可能な薬剤を送達する方法が、原発性肝臓癌の標的化治療を含め、必要性が満たされないままである。本発明はこれらおよび他の必要性を検討する。
【発明の概要】
【００１１】
全般的には、本発明は肝臓標的化部分およびペイロードを備えたナノ粒子に関するものであり、ナノ粒子は肝臓の疾患細胞を含む肝臓にペイロードを送達するための媒体として有用である。ペイロードは治療用途および／または撮像用途のために、それぞれ１種類以上の生物活性剤および／または検出可能な薬剤を含み得る。本発明者らは、ラクトースリガンドがラクトース−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ型の比較的長いリンカーを介して金コアと共有結合されているナノ粒子は、インビボおよびインビトロで肝臓の肝細胞に標的化を示すことを、驚くべきことに発見している。本明細書において例で示される証拠は、ラクトース長鎖リンカー金ナノ粒子（ＧＮＰ）が肝細胞で発現されるアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）と相互作用することを示唆する。いかなる特定の理論によって拘束されることも望まないが、本発明者らはコアに近い比較的リジッドな（アルキル）リンカー部分およびラクトース基に近い比較的フレキシブルな（エチレングリコール）リンカー部分の組み合わせが、ＡＳＧＰＲとの相互作用、そして最終的には肝臓への薬物ペイロードの送達にとって効果的なリガンド配置をもたらすと考えている。さらに本発明者らは、特定のグリピカン−３結合ペプチドが、ナノ粒子コアと共有結合されるとき、ナノ粒子が肝細胞の癌細胞を標的とするように作用し、例えばベースナノ粒子に比べて７倍標的化し、メイタンシノイドＤＭ４化学療法剤ペイロードなどを有するナノ粒子に肝臓標的化機能を付与することができることを発見している。
【００１２】
従って第一態様では、本発明は、金属および／または半導体を含むコア、およびコアと共有結合された複数のリガンドを含むナノ粒子に関するものであり、ここで当該リガンドは（ｉ）少なくとも１種類の肝臓標的化リガンド、（ｉｉ）生物活性剤および／または検出可能な薬剤を含む少なくとも１種類のペイロードリガンド、および（ｉｉｉ）炭水化物を含む少なくとも１種類の希釈リガンドを含む。
【００１３】
従って関連する第一態様では、本発明は、金属および／または半導体を含むコア、およびコアと共有結合された複数のリガンドを含むナノ粒子を提供し得、ここで当該リガンドは（ｉｖ）少なくとも１種類の肝臓標的化リガンド、（ｖ）生物活性剤を含む少なくとも１種類のペイロードリガンド、および（ｉｖ）炭水化物を含む少なくとも１種類の希釈リガンドを含む。
【００１４】
いくつかの例では、肝臓標的化リガンドは、ラクトース、ＦＧＦ−４（線維芽細胞増殖因子４）、ｃ−Ｍｅｔ（肝細胞増殖因子受容体）、グリピカン−３結合物質（例えば、ＵＳ８３８８９３７で開示されるグリピカン−３結合ペプチド、特にそこで開示されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または１０、あるいは抗グリピカン−３抗体）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）受容体結合剤（例えば、ＵＳ２０１２／０２７０２３８で開示されているＡＦＰ受容体結合ペプチド、または抗ＡＦＰ受容体抗体）、およびＡＳＧＰＲ結合物質（例えば、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ラクトース、グルコース、マンノース、またはＭａｍｉｄｙａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１２，Ｖｏｌ．１３３４，Ｎｏ．４，ｐｐ．１９７８−１９８１で公表されるような糖疑似リガンド）から選択され得る。肝臓標的化リガンドはまた、グリピカン−３、ＡＳＧＦＲ、ＦＧＦ−４、ｃ−Ｍｅｔ、ＡＦＰ、あるいは他の肝臓発現性タンパク質または肝臓発現性受容体のような肝臓または肝細胞標的に対する抗体、またはこの結合フラグメント、例えばＦａｂフラグメント（抗原結合フラグメント）、単一ドメイン抗体／ナノ抗体であり得る。
【００１５】
いくつかの例では、肝臓標的化リガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または２に示されるアミノ酸配列のペプチドを含む、またはこれからなるグリピカン−３結合ペプチド、あるいは３個を超えないアミノ酸の欠失、付加、修飾、または置換によって当該アミノ酸配列と異なるこの変異体を含み得、ここで当該変異体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または２のペプチドのヒトグリピカン−３に対する結合アフィニティーの少なくとも５０％を保持する。結合アフィニティーは、例えば、変異ペプチドがヒトグリピカン−３ペプチドとの結合をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または２のペプチドと競合する、競合結合アッセイで測定し得る。
【００１６】
特定の例では、グリピカン−３ペプチドはＮ末端アセチル化および／またはＣ末端アミド化を有する
【００１７】
いくつかの例では、肝臓標的化リガンド（例えば、ラクトースまたはグリピカン−３結合ペプチド）は、リンカーを介してナノ粒子コア（例えば、金コア）と共有結合され得る。
【００１８】
いくつかの例では、肝臓標的化リガンドは第一リンカーを介してコアと共有結合され得、当該第一リンカーは２〜５０原子の鎖長を有する。特に、第一リンカーは基−（ＣＨ２）ｎ−および／または−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−を含み得、ここでｎおよびｍは独立して≧１である。特定の例では、第一リンカーは−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−を含み、ここでｍは１〜１０であり、例えばｍは５〜９であり、例えばｍは８である。特定の例では、第一リンカーは−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−を含み、ここでｍ＝１〜１０、ｎ＝１〜１５である。特に、ｍは３〜７の範囲であり得、ｎは５〜１２の範囲であり得る。
【００１９】
いくつかの例では、少なくとも１種類の肝臓標的化リガンドおよび第一リンカーは、
ＨＳ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）８−ＣＯＮＨ−ＲＬＮＶＧＧＴＹＦＬＴＴＲＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、
ＨＳ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）８−ＣＯＮＨ−ＲＬＮＶＧＧＴＹＦＬＴＴＲＱ−ＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、
ＨＳ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）８−ＣＯＮＨ−ＹＦＬＴＴＲＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、
ＨＳ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）８−ＣＯＮＨ−ＹＦＬＴＴＲＱ−ＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、
ＨＳ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６−ＮＨ（Ａｃ）−ＲＬＮＶＧＧＴＹＦＬＴＴＲＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、および
ＨＳ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）６−ＮＨ（Ａｃ）−ＹＦＬＴＴＲＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
からなる群から選択され得る。
【００２０】
いくつかの例では、第一リンカーは末端イオウ原子（例えば、金イオウまたは金−チオール結合）を介してコアと結合され得る。
【００２１】
特定の例では、第一リンカーを介してコアと共有結合される肝臓標的化リガンドは、式（Ｉ）の構造を有し、
【化１】
2018526432.tif 000002
ここで、第一リンカーは末端チオール基を介してコアと結合される。
【００２２】
いくつかの例では、ペイロードリガンドは化学療法用または細胞毒性化合物のような治療剤を含む。特定の例では、ペイロードリガンドは、メイタンシノイドＤＭ４、ドキソルビシン、イリノテカン、プラチナ（ＩＩ）、プラチナ（ＩＶ）、テモゾロミド、カルムスチン、カンプトテシン、ドキソルビシン、ドセタキセル、ソラフェニブ、メイタンシン、メイタンシノイドＤＭ１、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、およびパノビノスタットからなる群から選択される化合物を含み得る。ペイロードリガンドは、いくつかの例では、第一リンカーと同一または異なり得る第二リンカーを介してナノ粒子のコアと共有結合され得る。いくつかの例では、例えばペイロードリガンドがチオール基を含むとき、ペイロードリガンドは、例えば結合部位としてペイロードリガンドのチオール基を用いた金−チオール結合を介して、ナノ粒子と直接的に結合され得る。
【００２３】
いくつかの実施形態では、第二リンカーは２〜５０原子の鎖長を有する。特に、−（ＣＨ２）ｎ−および／または−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−を含み得、ここでｎおよびｍは独立して≧１である。特定の例では、第二リンカーは−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−を含み、ここでｍ＝１〜１０、任意にここで、ｍ＝１、２、３、４、５、または６である。いくつかの例では、短いリンカーが好ましく、ｍは１である。いくつかの例では、長いリンカーが好ましく、ｍは５である。
【００２４】
いくつかの例では、第二リンカーは末端イオウ原子（例えば、金イオウまたは金−チオール結合）を介してコアと結合され得る。従って、いくつかの例では、第二リンカーは−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍＳＨを含む（ここで本リンカーは末端チオール基を介してコアと結合される）。いくつかの例では、第二リンカーは、例えば結合リンカーを介して、ペイロードの結合を促進するω−アミノ酸を含む。
【００２５】
従って、いくつかの例では、第二リンカーは・・ＮＨＣＨ２ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍＳＨを含む（ここでリンカーは末端チオール基を介してコアと結合され、・・（すなわち、下記構造での破線）は生物活性剤または中間リンカーとの結合点を示す）。特に好ましい第二リンカーは、
【化２】
2018526432.tif 000003
である。
【００２６】
生物活性分子または検出可能な標識は第二リンカーに直接的、または中間リンカーを介して結合され得る。適切な中間リンカーはジカルボン酸由来であり得る。例えば、適切な中間リンカーにはコハク酸およびマロン酸が含まれる。例えば、ペイロードリガンドは次の式のリガンドであり得る。
【化３】
2018526432.tif 000004
【００２７】
例えば、いくつかの実施形態では、ナノ粒子は次の式のペイロードリガンドを含む。
【化４】
2018526432.tif 000005
【００２８】
いくつかの治療剤は、例えば金属中心に、錯体形成によって結合され得る。末端酸素単位を有するコハク酸中間リンカーが使用され得る。
【００２９】
例えば、いくつかの実施形態では、ナノ粒子は次の式のペイロードリガンドを含む。
【化５】
2018526432.tif 000006
【００３０】
配位は二座であり得る。例えば、Ｐｔ（ＩＩ）中心はジカルボン酸部分を有する中間リンカーに配位され得る。例えば、中間リンカーは２−マロン酸部分を含み得る。
【００３１】
例えば、いくつかの実施形態では、ナノ粒子は次の式のペイロードリガンドを含む。
【化６】
2018526432.tif 000007
【００３２】
これはマロン酸含有リンカーを用いたナノ粒子集合、続いてＰｔ（ＩＩ）種の錯体形成によって合成され得る。
【００３３】
特定の場合では、ペイロードリガンドは次の式からなる群から選択され得る。
【化７】
2018526432.tif 000008
【化８】
2018526432.tif 000009
【化９】
2018526432.tif 000010
【化１０】
2018526432.tif 000011
および
【化１１】
2018526432.tif 000012
【００３４】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は次の式のペイロードリガンドを含む。
【化１２】
2018526432.tif 000013
【００３５】
これはω−プロ−２−エニアミド基を有するリンカーを含むナノ粒子を集合化することによって合成され得、ついで末端アジド部分を有する生物活性誘導体によって１，３−双極性環化付加をもたらす。一般的な「クリックケミストリー」反応機構の例を説明する概要を次に示す。
【化１３】
2018526432.tif 000014
【化１４】
2018526432.tif 000015
【００３６】
いくつかの例では、ナノ粒子は検出可能な薬剤または検出可能な標識をさらに含む。ナノ粒子はさらにペイロードリガンドを含み得、さらなるペイロードリガンドは検出可能な薬剤または検出可能な標識を含む。特に、検出可能な標識は蛍光標識または光音響色素であり得る。
【００３７】
例えば、検出可能な薬剤は色素、例えばローダミン色素（例、ローダミンＢ、スルホローダミンＢ）またはＣｙ５．５のような近赤外色素であり得る。例えば、色素はＣｙ７、Ｃｙ７．５、Ｃｙ８、またはＬｉ−ｃｏｒ（登録商標）ＩＲＤｙｅ８００（登録商標）のような光音響色素であり得る。
【００３８】
さらなるペイロードリガンドは、前述のリンカー（第一および第二リンカー）を含み得る。例えば、さらなるペイロードリガンドは式−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−（ＣＨ２）ｎのリンカーを含み得、ここでｍ＝１〜１０であり、ｎ＝１〜１５である。特に、ｍは３〜７の範囲であり得、および／またはｎは５〜１２の範囲であり得る。
【００３９】
いくつかの例では、ナノ粒子は次の式の検出可能な薬剤を含むペイロードリガンドを含む。
【化１５】
2018526432.tif 000016
【００４０】
いくつかの例では、少なくとも１種類の希釈リガンドはモノサッカライドを含む。いくつかの例では、希釈リガンドは少なくとも１つの６員環を有する炭水化物を含む。特に、モノサッカライドはグルコースまたはガラクトースであり得る。
【００４１】
特定の例では、少なくとも１つの希釈リガンドは第三リンカーを介してコアと共有結合され得る。例えば、第三リンカーは２〜１０原子の鎖長を含み得る。第三リンカーは第一または第二リンカーと同一または異なり得る。いくつかの例では、第三リンカーは−（ＣＨ２）ｎ−を含み、ここでｎは１〜１０の範囲、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。
【００４２】
いくつかの例では、第三リンカーは末端イオウ原子を介してコアと結合される。
【００４３】
いくつかの例では、第三リンカーを介してコアと共有結合される少なくとも１つの希釈リガンドは、式１、２、３、４、または５の構造を有し、ここで第三リンカーは末端チオール基を介してコアと結合される。
【化１６】
2018526432.tif 000017
【００４４】
本発明のこの態様または他の態様によるいくつかの例では、複数のリガンドは、
（ｉ）ラクトース含有リガンドまたはグリピカン−３結合ペプチド、
（ｉｉ）ドキソルビシン含有リガンドまたはメイタンシノイドＤＭ４リガンド、および
（ｉｉｉ）ガラクトースまたはグルコースを含むモノサッカライドリガンド、
を含む。
【００４５】
本発明のこの態様または他の態様によるいくつかの例では、リガンドはナノ粒子に、数による比率として下記で存在している。
（ｉ）肝臓標的化リガンド：１〜９９％
（ｉｉ）ペイロードリガンド：１〜９９％
（ｉｉｉ）希釈リガンド：１〜９９％
（ｉｖ）第一リンカー：０〜９９％
（ｖ）第二リンカー：０〜９９％
【００４６】
いくつかの例では、第一リンカー（肝臓標的化リガンドの結合用）は肝臓標的化部分を有さずに存在し得る。
【００４７】
例えば、肝臓標的化部分がナノ粒子に存在する第一リンカーと反応することによって結合される状況では（例えば、肝臓標的化部分が抗体フラグメントを含む場合に好ましいものであり得る）、反応は利用可能な第一リンカーを完全には飽和せずに、第一リンカーの一部がナノ粒子に「未反応」のまま残り得る。
【００４８】
追加または代替として、第二リンカー（例えば、ペイロード結合用）は、存在する場合、結合したペイロードを有さずに存在し得る。例えば、ペイロード化合物がナノ粒子に存在する第二リンカーとの反応によって結合される状況では（例えば、後述のドキソルビシンを参照する）、反応は利用可能な第二リンカーを完全には飽和せず、第二リンカーの一部がナノ粒子に「未反応」のまま残り得る。特定の例では、ペイロードはすべての利用可能な第二リンカー結合部位を飽和しないという利点であり得る。例えば、本発明者は高添加量のドキソルビシン（例えば、ナノ粒子コアあたりのドキソルビシン分子が２０個超、１５個超、または９個超）では、水溶解度が低下することを発見している。さらに、未反応第二リンカー（例えば、本明細書でさらに説明されるアミンリンカー）はそれ自体がナノ粒子に、改善された水溶解度のような効果的な特性を付与し得る。
【００４９】
特定の適用では、多い数および／または高い比率の肝臓標的化リガンドを有することが望ましいものであり得、比率をナノ粒子におけるすべてのリガンドの数に対する割合の範囲で示す場合、例えば４０〜９０％、または５０〜８０％、または６０〜７０％である。いくつかの例では、少ない数および／または低い比率の肝臓標的化リガンドを有することが望ましいものであり得、比率をナノ粒子におけるすべてのリガンドの数に対する割合の範囲で示す場合、例えば１〜４０％、または５〜３０％、または１０〜２０％である。いくつかの例では、ナノ粒子あたりの肝臓標的化リガンド（例えば、本明細書でさらに定められるグリピカン−３結合ペプチド）の数は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個であり得る。特定の例では、肝臓標的化リガンド（例えば、本明細書でさらに定められるグリピカン−３結合ペプチド）の数が大きい、例えばナノ粒子あたり３個以上、４個以上、または５個以上の場合、本発明のナノ粒子の肝臓標的化度を高め得る。特定の例では、肝臓標的化リガンド（例えば、本明細書でさらに定められるグリピカン−３結合ペプチド）の数が小さい、例えばナノ粒子あたり１または２個の場合、それでも本発明のナノ粒子に十分な肝臓標的化を付与し得る。
【００５０】
特定の適用では、多い数および／または高い比率のペイロードリガンドを有することが望ましいものであり得、比率をナノ粒子におけるすべてのリガンドの数に対する割合の範囲で示す場合、例えば４０〜９０％、または５０〜８０％、または６０〜７０％である。ここで、例えば溶解性が許せば、多い数および／または高い比率のペイロードを有することは、送達されるペイロードを高濃度にすることができる。いくつかの例では、少ない数および／または低い比率のペイロードリガンドを有することが望ましいものであり得、比率をナノ粒子におけるすべてのリガンドの数に対する割合の範囲で示す場合、例えば１〜４０％、または５〜３０％、または１０〜２０％である。低い割合は、例えば、溶解度または溶解限度がわからない場合、またはペイロードの効能は低い濃度で安全かつ有効であるような場合、効果的であり得る。
【００５１】
特定の用途では、多い数および／または高い比率の希釈リガンドを有することが望ましいものであり得、比率をナノ粒子におけるすべてのリガンドの数に対する割合の範囲で示す場合、例えば４０〜９０％、または５０〜８０％、または６０〜７０％である。いくつかの例では、少ない数および／または低い比率の希釈リガンドを有することが望ましいものであり得、比率をナノ粒子におけるすべてのリガンドの数に対する割合の範囲で示す場合、例えば１〜４０％、または５〜３０％、または１０〜２０％である。
【００５２】
第二態様では、本発明は、金属および／または半導体を含むコア、およびコアと共有結合された複数のリガンドを含むナノ粒子を提供し、ここで当該リガンドは（ｉ）末端チオールのイオウ原子がコアと結合された式（Ｉ）の少なくとも１つのリガンド、
【化１７】
2018526432.tif 000018
（ｉｉ）生物活性剤を含む少なくとも１つのペイロードのリガンド、および（ｉｉｉ）任意に少なくとも１つの希釈リガンドを含む。
【００５３】
本発明の第二態様により、ペイロードリガンドは本発明の第一態様と関連して定められるものであり得る。
【００５４】
少なくとも１つの希釈リガンドが存在する本発明の第二態様による例では、希釈リガンドは本発明の第一態様と関連して定められるものであり得る。
【００５５】
本発明の第一、第二、および他の態様により、コアはいくつかの例では、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｇｄ、およびＺｎからなる群から選択される金属、またはこれらのいずれかの組み合わせを含み得る。特に、コアは金を含み得る。
【００５６】
いくつかの例では、コアの直径は１〜５ｎｍの範囲であり得る。
【００５７】
いくつかの例では、ナノ粒子のそのリガンドを含む直径は３〜５０ｎｍの範囲である。
【００５８】
いくつかの例では、ナノ粒子は、ナノ粒子のコアあたり少なくとも５、１０、２０、または少なくとも５０個のリガンドを含み得る。
【００５９】
第三の態様では、本発明は、本発明の第一または第二態様による複数のナノ粒子および少なくとも１種類の医薬品として許容可能な担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【００６０】
いくつかの例では、医薬組成物は複数のナノ粒子の少なくとも一部が生体適合性ポリマーにカプセル化されている持続放出製剤であり得る。特に、生体適合性ポリマーは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）および／またはポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）を含み得る。
【００６１】
いくつかの例では、医薬組成物はマイクロ粒子、マイクロスフェア、ビーズ、またはフィルムの剤形であり得る。
【００６２】
いくつかの例では、医薬組成物は注入可能な剤形、例えば蓄積注射であり得る。
【００６３】
いくつかの例では、医薬組成物は濃縮剤形であり得、組成物は対象への投与前（例えば、直前）に、希釈または再構成され得る。
【００６４】
第四態様では、本発明は医薬品に使用するために、本発明の第一または第二態様によるナノ粒子、あるいは本発明の第三態様による医薬組成物を提供する。
【００６５】
第五態様では、本発明は哺乳動物対象における肝臓障害の治療に使用するために、本発明の第一または第二態様によるナノ粒子、あるいは本発明の第三態様による医薬組成物を提供する。
【００６６】
本発明により、対象はヒト、愛玩用動物（例えば、イヌまたはネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、または非ヒト霊長類）、飼育動物または家畜（例えば、ブタ、ウシ、ウマ、またはヒツジ）であり得る。好ましくは、対象はヒトである。
【００６７】
いくつかの例では、肝臓障害は、肝臓の原発性癌または肝臓の二次性癌（すなわち、肝臓に侵入していない非肝臓起源の転移性癌）を含む。
【００６８】
いくつかの例では、肝臓障害は肝細胞癌（ＨＣＣ）である。
【００６９】
いくつかの例では、肝臓障害は、肝芽腫、胆管癌、胆管細胞嚢胞腺癌、血管肉腫、血管内皮腫、胎児性肉腫、線維肉腫、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫から選択される癌である。
【００７０】
第六態様では、本発明は哺乳動物対象における肝臓障害を治療する方法を提供し、本発明の第一または第二態様によるナノ粒子、あるいは本発明の第三態様による医薬組成物を、治療を必要とする対象に投与することを含む。肝臓障害は本発明の第五態様と関連して定められるものであり得る。
【００７１】
第七態様では、本発明は、本発明の第六態様による方法での使用のための医薬品の調製における、本発明の第一または第二態様によるナノ粒子、あるいは本発明の第三態様による医薬組成物の使用を提供する。
【００７２】
第八態様では、本発明は、本発明の第一または第二態様によるナノ粒子、あるいは本発明の第三態様による医薬組成物、ナノ粒子または医薬組成物を収納するための容器、およびインサートまたはラベルを含む製造品を提供する。
【００７３】
いくつかの例では、インサートおよび／またはラベルは、哺乳動物対象の肝臓障害の治療におけるナノ粒子または医薬組成物の使用に関連する指示、用量、および／または投与情報を提供する。肝臓障害は本発明の第五態様により定められるものであり得る。
【００７４】
第九態様では、本発明は、本発明の第一態様によるナノ粒子を産生するための工程を提供し、工程は、イオウ含有肝臓標的化リガンドおよび／または第一リンカーを含む溶液、イオウ含有第二リンカーを含む溶液、炭水化物−リンカー−チオールまたは炭水化物−リンカー−Ｓ−Ｓ−リンカー−炭水化物を含む溶液、コア形成金属塩を含む溶液、および還元剤を混合し、これによってナノ粒子に自己集合を生じさせ、少なくとも１種類のペイロード化合物を第二リンカーと反応させ、これによって第二リンカーを介して少なくとも１種類のペイロード化合物をナノ粒子と共有結合させ、任意に少なくとも１種類の標的化化合物を第一リンカーと反応させて、第一リンカーを介して少なくとも１種類の肝臓標的化化合物をナノ粒子と共有結合させることを含む。
【００７５】
好ましくは、溶液はイオウ含有肝臓標的化リガンドを含み、例えば溶液は次の式（Ｉ）のリガンドを含み得る。
【化１８】
2018526432.tif 000019
【００７６】
いくつかの例では、ペイロードはドキソルビシンまたはメイタンシノイドＤＭ４を含む。
【００７７】
いくつかの例では、炭水化物はグルコースまたはガラクトースを含む。
【００７８】
いくつかの例では、コア形成金属塩は金塩を含む。
【００７９】
いくつかの例では、還元剤は水素化ホウ素ナトリウムを含む。
【００８０】
第一および／または第二リンカーは、ペイロードの結合を促進するために官能化され得る。例えば、末端ω−アミノ官能性は、ＥＤＣのような既知のペプチド結合剤を用いてアミド結合形成のためにプライミングされ得る。ペイロードは中間リンカーを介して第二リンカーと結合され得る。中間リンカーは最初に生物活性／検出可能物質と結合され、ついで第二リンカーと結合され得、あるいは第二リンカーが生物活性または検出可能物質と結合される中間リンカーによって官能化され得る。例えば、プラチナ中心化生物活性部分はコハク酸部分と最初に結合されて、ついでアミド結合技術を用いて第二リンカーと結合され得る。例えば、ドキソルビシンがコハク酸−第二リンカー部分と結合され得る。
【００８１】
いくつかの例では、当該方法は少なくとも１種類の検出可能化合物を第一リンカーまたは第二リンカーと反応させる段階を含み、第一または第二リンカーを介して少なくとも１種類の肝臓標的化化合物をナノ粒子に共有結合させる。
【００８２】
第十態様では、本発明は肝臓腫瘍を撮像する方法に使用するために、本発明の第一または第二態様によるナノ粒子、あるいは本発明の第三態様による医薬組成物を提供し、ここで少なくとも１種類のペイロードは検出可能な薬剤を含む。特に、検出可能な薬剤は蛍光剤である。いくつかの例では、撮像方法は外科切除の際に腫瘍境界の輪郭を描く方法である。
【００８３】
第十一態様では、本発明は肝臓腫瘍を撮像する方法を提供し、当該方法は、本発明の第一または第二態様によるナノ粒子、あるいは本発明の第三態様による医薬組成物を、肝臓腫瘍を有する、または有することが疑われる対象に投与することであって、ここで少なくとも１種類のペイロードは検出可能な薬剤を含むこと、およびこの検出可能な薬剤を検出し、これによって当該肝臓腫瘍のすべてまたは一部の境界を定める、または画像を形成することを含む。いくつかの例では、検出可能な薬剤は蛍光剤であり得る。いくつかの例では、本方法は外科切除の際に腫瘍境界の輪郭を描くためのものである。
【００８４】
本発明は、説明された態様および好ましい特性の組み合わせを含むが、このような組み合わせが明らかに容認できない、または明らかに無効とされることが明記されている組み合わせは除かれる。これらならびに本発明のさらなる態様および実施形態が、後述および付随する例および図を参考にしてさらに詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】従来の化学療法剤および肝臓標的化ナノ粒子における生体分布の図式的な単純化した描写を示す図である。
【図２】炭水化物（希釈）リガンド、標的化剤（Ｒ１）を含むリガンド、および化学療法剤（Ｒ２）を含むリガンドを有する官能化金ナノ粒子の図式的な描写を示す図である。反復するエチレングリコールおよびアルキル基をそれぞれ下付き文字ｘおよびｙで示す。
【図３】ペイロードを有さないＬａｃＬＬ−ＮＰ（ａ）およびＰｔコハク酸ペイロードを有する相当するＰｔ−ＬａｃＬＬ−ＮＰ（ｂ）の図式的な描写を示す図である。
【図４】図３のナノ粒子のＫＣＮエッチング後における１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。（ａ）ＫＣＮエッチング後のＬａｃＬＬ−ＮＰ１のスペクトルを示す。レポートシグナル：ＬａｃＬＬ＝４．０９ｐｐｍ、ＡＬ＝２．８１ｐｐｍ、ＧｌｃＣ２＝３．２７ｐｐｍ、（ｂ）ＫＣＮエッチング後のＰｔ−ＬａｃＬＬ−ＮＰ３のスペクトルを示す。レポートシグナル：Ｐｔ（ＩＶ）−ｓｕｃ＝２．４７ｐｐｍ、ＬａｃＬＬ＝４．０８ｐｐｍ、ＡＬ＝２．７９ｐｐｍ、ＧｌｃＣ２＝３．２６ｐｐｍ。
【図５】ＬａｃＬＬ−ＮＰ１に関するＴＥＭ画像およびデータを示す図である。
【図６】体内の様々な器官におけるローダミン共役体化ＧＮＰの蓄積に関するＩＣＰ−ＭＳ結果を示す図である。ｘ軸は左から右に、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、脾臓、腫瘍、膀胱、および腸を示す。ＭＢＬＢ−０１２６−０１２はコントロール、ＮＢＬＢ−１２６−０７８はＬａｃＬＬ−ＮＰ２、ＭＢＬＢ−１３５−０４２はＬａｃＬＬ−ＮＰ１、ＮＢＬＢ−１２６−０８２はＬａｃＳＬ−ＮＰ１、およびＭＢＬＢ−１２６−０８４はＬａｃＳＬ−ＮＰ２である。
【図７】（ａ）Ｐｔ−ＬａｃＬＬ−ＮＰ、（ｂ）遊離Ｐｔ、（ｃ）Ｄｏｘｏ−ＬａｃＬＬ−ＮＰ、および（ｄ）遊離ドキソルビシンの処置後７２時間におけるＭＴＴ細胞生存測定の結果を示す図である。
【図８】×２０拡大倍率で視野あたりのカウント数として測定されたＨＣＣ細胞に対するＧＮＰのインビトロ標的化を示す図である。左の図は、陰性コントロールによって示されたカウント数の欠如を示す。中央の図およびバーは、ガラクトース−Ｃ２リガンドおよびＨＳＰＥＧ８ＣＯＯＨリガンドのコロナを有するＧＮＰにおけるカウント数を示す。右の図およびバーは、ガラクトース−Ｃ２リガンドおよびＨＳＰＥＧ８ＣＯＯＨリガンドのコロナを有するＧＮＰにおけるカウント数を示し、ＨＳＰＥＧ８ＣＯＯＨリガンドの一部は、グリピカン−３結合ペプチドであるＲＬＮＶＧＧＴＹＦＬＴＴＲＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と、そのＮ末端を介して共役体化されている（ナノ粒子あたり約４個のペプチド分子）。グリピカン−３結合ペプチドを有するＧＮＰが、グリピカン−３結合ペプチドを欠如するＧＮＰと比べてＨＣＣ細胞への有意に増加した標的化を示すことは極めて明白である（約７倍増加した標的化）。
【図９】示した濃度による処理後７２時間におけるＨｅｐＧ２細胞の細胞生存に対する、様々なＧＮＰ構築体、および遊離メイタンシノイドＤＭ４の効果を示す図である。ＭＴＴアッセイにおけるコントロールに対する割合として測定した細胞生存を、μｇ／ｍＬの濃度（ＤＭ４が存在する場合）に対して示す（ｘ軸は対数スケールであることに注意する）。ガラクトース−Ｃ２およびＨＳＰＥＧ８ＣＯＯＨリガンド（４０：６０比）のコロナを有するＧＮＰを正方形で示す。このＧＮＰはＤＭ４を欠如し、試験した条件下で基本的に毒性を示さない。ガラクトース−Ｃ２、ＨＳＰＥＧ８ＣＯＯＨ、およびＤＭ４リガンドのコロナを有するＧＮＰを丸形で示す。用量毒性曲線は、菱形で示す遊離ＤＭ４と極めて類似する。ガラクトース−Ｃ２、ＨＳＰＥＧ８ＣＯＯＨ、およびＤＭ４リガンドのコロナを有するＧＮＰで、ＨＳＰＥＧ８ＣＯＯＨリガンドの一部がグリピカン−３結合ペプチドＲＬＮＶＧＧＴＹＦＬＴＴＲＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のＮ末端と、ナノ粒子あたり約１個未満のペプチドで共役体化されたものを、三角形で示す。これらのＤＭ４およびグリピカン−３結合ペプチド保持ＧＮＰの用量毒性曲線は、菱形で示す遊離ＤＭ４と極めて類似する。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
本発明の説明において、次の用語が使用され、下記に示すように定義されることが意図されている。
【００８７】
肝臓標的化リガンド
肝臓標的化リガンドは、肝細胞、その中、またはその表面上に存在する（いくつかの例では、健康な肝細胞、他の例では肝臓腫瘍（例えば、肝細胞癌）の癌細胞のみまたは主に癌細胞、また別の例では、例えば、健康な肝細胞と肝臓腫瘍の癌細胞の両方、その中、その表面上に存在する）受容体、マーカー、タンパク質、または抗原と結合、連結、または相互作用する。肝臓（またはこの腫瘍）への結合、さもなければ誘引において、肝臓標的化リガンドは本発明のナノ粒子を意図した作用の部位に標的化するのに役立つ。肝臓標的化リガンドはナノ粒子コアと共有結合され（直接的またはより一般的にはリンカーを介して）、従ってそのペイロードを含むナノ粒子を、肝臓標的化リガンドが存在しないナノ粒子の場合よりも、高い頻度、長い期間、および／または高い濃度で肝臓（またはその腫瘍）と結合、さもなければ接触させる。
【００８８】
肝臓標的化リガンドの例には、ラクトース、ＦＧＦ−４（線維芽細胞増殖因子４）、ｃ−Ｍｅｔ（肝細胞増殖因子受容体）、グリピカン−３結合剤（例えば、ＵＳ８３８８９３７で開示されるグリピカン−３結合ペプチド（具体的には、本明細書に参考によって明確に組み込まれているいＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、４、５、６、７、および１０のペプチドを含む）または抗グリピカン−３抗体）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）受容体結合剤（例えば、ＵＳ２０１２／０２７０２３８で開示されるＡＦＰ受容体結合ペプチド、または抗ＡＦＰ受容体抗体）、およびＡＳＧＰＲ結合剤（例えば、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ラクトース、グルコース、マンノース、またはＭａｍｉｄｙａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１２，Ｖｏｌ．１３３４，Ｎｏ．４，ｐｐ．１９７８−１９８１で開示されるような糖模倣リガンド）が含まれる。肝臓標的化リガンドはまた、グリピカン−３、ＡＳＧＰＲ、ＦＧＦ−４、ｃ−Ｍｅｔ、ＡＦＰ、あるいは他の肝臓発現タンパク質または肝臓発現受容体のような肝臓または肝細胞標的に対する抗体またはこの結合フラグメント、例えば、Ｆａｂフラグメント（フラグメント抗原−結合）、単一ドメイン抗体／ナノ抗体であり得る。
【００８９】
アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）はペイロード含有ナノ粒子を肝臓に対して標的化するのに適した標的であると考えられる。ＡＳＧＰＲはガラクトース残基を認識し、肝臓で発現されるが、他のヒト組織では発現されない。極小の糖コーティング金ナノ粒子（１．６〜１．８ｍｍ）への標的化剤（ラクトースなど）および化学療法剤の組み合わせ結合は、ＨＣＣの治療に独自の特性をもたらす。投与および体内循環後、標的化Ａｕ−ＮＰは肝臓およびＡＳＧＰＲ過剰発現ＨＣＣに蓄積し（図１、「標的化」）、一方、従来の化学療法剤は広く分布される（図１、「非標的化」）。さらに、小さいＡｕ−ＮＰ（＜２ｎｍ）は大きいＮＰ（約１５ｎｍ）と比べて増加した腫瘍浸透能を示し、効果的な表面被覆をもたらす（Ｈｕａｎｇ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，２０１２，Ｖｏｌ．６，ｐｐ．４４８３−４４９３、Ｋｕｍａｒａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，２０１４，Ｖｏｌ．８，ｐｐ．６４３１−６４３９）。このような官能化金ナノ粒子の図式を図２に示す。
【００９０】
リガンドコロナはＡｕ−イオウ結合によって生理学的な条件下で準安定性を示し、血漿中で安定であり、サイトゾルで放出される。ここで本発明者らは、効率的な肝臓標的化に対してインビトロ、体外、および体内モデルを利用する標的化ＧＮＰ化学療法スクリーニング試験の有望な結果を示す。
【００９１】
グリピカン−３結合ペプチドはＲＬＮＶＧＧＴＹＦＬＴＴＲＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ＹＦＬＴＴＲＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、およびこの配列とは３個以下、２個以下、または１個のアミノ酸の付加、欠失、置換、または化学的修飾（例えば、非天然または修飾アミノ酸）によって異なる変異体を含む。当該変異体は、例えば、１、２、または３個の非天然または修飾されたアミノ酸を含み得る。適切な非天然アミノ酸には、例えば、Ｄ−アミノ酸、オルニチン、ジアミノ酪酸オルニチン、ノルロイシンオルニチン、ピリイルアラニン（ｐｙｒｉｙｌａｌａｎｉｎｅ）、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、フェニルグリシン、αおよびα二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、天然アミノ酸のハロゲン化物誘導体としてトリフルオロチロシン、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン、ｐ−Ｉ−フェニルアラニンなど、Ｌ−アリル−グリシン、β−アラニン、Ｌ−α−アミノ酪酸、Ｌ−γ−アミノ酪酸、Ｌ−α−アミノイソ酪酸、Ｌ−ε−アミノカプロン酸、７−アミノヘプタン酸、Ｌ−メチオニンスルホン、Ｌ−ノルロイシン、Ｌ−ノルバリン、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−チオプロリン、フェニルアラニンのメチル誘導体として１−メチル−Ｐｈｅ、ペンタメチル−Ｐｈｅなど、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸）、Ｌ−ジアミノプロピオン酸、およびＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）が含まれる。ペプチドはさらに修飾され得る。例えば、１つ以上のアミド結合がエステルまたはアルキルバックボーン結合によって置換され得る。ＮまたはＣアルキル置換基、側鎖修飾、あるいはジスリフィド架橋、側鎖アミド、またはエステル結合のような拘束が存在し得る。変異ペプチドは修飾されたペプチドおよび合成ペプチドアナログの両方を含み得る。ペプチドは例えば、溶解性、製剤、および保存特性を改善、または非ペプチド構造を組み込むことによって不安定なペプチドを保護するために修飾され得る。
【００９２】
グリピカン−３結合ペプチドのようなペプチドのＮ末端および／またはＣ末端が、Ｎ末端アセチル化および／またはＣ末端アミド化によって修飾され得ることが、本明細書で特に考えられている。特に、このような末端修飾は、肝臓標的化ペプチドのナノ粒子への共有結合に役立ち得る（例えば、リンカーを介して）。
【００９３】
ナノ粒子
本明細書で使用されるとき、「ナノ粒子」はナノスケールを有する粒子を意味し、いずれかの特定な形状に限定することは意図されていない。特に、「ナノ粒子」はナノスフェア、ナノチューブ、ナノボックス、ナノクラスター、ナノロッドなどを包含する。特定の実施形態では、本明細書で検討されるナノ粒子および／またはナノ粒子コアは、一般的な多面体または球体形状を有する。ナノ粒子またはナノ粒子コアの「直径」と言った場合、それぞれナノ粒子またはナノ粒子コアの最も長い寸法を意味するように一般的に考えられる。ほぼ多面系または球体形状を有するナノ粒子では、粒子を横切る最短の寸法は、粒子を横切る最も長い寸法の一般的には５０％以内であり、例えば２５％または１０％以内であり得る。
【００９４】
複数の炭水化物含有リガンドを含むナノ粒子は、例えばＷＯ２００２／０３２４０４、ＷＯ２００４／１０８１６５、ＷＯ２００５／１１６２２６、ＷＯ２００６／０３７９７９、ＷＯ２００７／０１５１０５、ＷＯ２００７／１２２３８８、ＷＯ２００５／０９１７０４に記載されており（それぞれの全内容が本明細書に参考によって明確に組み込まれている）、このようなナノ粒子は本発明による使用を認め得る。
【００９５】
本明細書で使用されるとき、「コロナ」は層またはコーティングを意味し、ナノ粒子コアの暴露された表面を部分的または完全に覆い得る。コロナはナノ粒子コアと共有結合された複数のリガンドを含む。このため、コロナは金属コアを囲むまたは部分的に囲む有機層であると考えられ得る。特定の実施形態では、コロナはナノ粒子コアの不動態化をもたらす、および／またはそれに関与する。このため、特定の例では、コロナは十分完全なコーティング層を含み、コアをかなり安定化させる。特定の例では、コロナは本発明のナノ粒子の水溶性のような溶解性を促進する。
【００９６】
ナノ粒子は金属または半導体原子のクラスターなどの小さい粒子であり、リガンドを固定化するための基材として使用することができる。
【００９７】
好ましくは、ナノ粒子は０．５〜５０ｎｍ、より好ましくは０．５〜１０ｎｍ、より好ましくは０．５〜５ｎｍ、より好ましくは０．５〜３ｎｍ、さらにより好ましくは５〜２．５ｎｍの平均直径を有するコアを有する。コアとともにリガンドを考慮すると、好ましくは粒子の全体の平均直径は、２．０〜５０ｎｍ、より好ましくは３〜１０ｎｍ、最も好ましくは４〜５ｎｍである。平均直径は透過型電子顕微鏡のような従来技術で良く知られた技術を用いて測定することができる
【００９８】
コア材は金属または半導体であることができ、原子の一つの型を超えて形成され得る。好ましくは、コア材はＡｕ、Ｆｅ、またはＣｕから選択される金属である。ナノ粒子コアもまた、Ａｕ／Ｆｅ、Ａｕ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｇｄ、Ａｕ／Ｆｅ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｆｅ／Ｇｄ、およびＡｕ／Ｆｅ／Ｃｕ／Ｇｄを含む合金から形成され得、本発明で使用され得る。好ましいコア金属はＡｕおよびＦｅであり、最も好ましい材料はＡｕである。ナノ粒子のコアは好ましくは約１００〜５００原子（例えば、金原子）を含み、コア直径をナノメーター範囲にする。他の特に有用なコア材は、ＮＭＲ活性である１種類以上の原子でドープされ、インビトロおよびインビボの両方でＮＭＲを用いてナノ粒子を検出することができる。ＮＭＲ活性原子の例には、Ｍｎ＋２、Ｇｄ＋３、Ｅｕ＋２、Ｃｕ＋２、Ｖ＋２、Ｃｏ＋２、Ｎｉ＋２、Ｆｅ＋２、Ｆｅ＋３、およびランタノイド＋３、あるいは量子ドットが含まれる。
【００９９】
半導体化合物を含むナノ粒子コアは、ナノスケール半導体結晶が量子ドットとして作用できるときに検出することが可能であり、すなわち、これらは光を吸収でき、これによって材料における電子を高いエネルギーレベルに励起し、続いて材料に特徴的な周波数で光の光子を放出する。半導体コア材の例は、セレン化カドミウム、硫化カドミウム、テルル化カドミウムである。また、硫化亜鉛のような亜鉛化合物も含まれる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子またはそのリガンドは、検出可能な標識を含む。標識は、ナノ粒子のコアまたはリガンドの構成要素であり得る。標識は、ナノ粒子のその構成要素の固有な性質によって、または検出可能なさらなる部分に結合、共役体化、または連結することによって検出可能であり得る。標識の好ましい例には、蛍光基である標識、放射性核種、磁気標識、または色素が含まれる。蛍光基にはフルオレセイン、ローダミンまたはテトラメチルローダミン、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５などが含まれ、ラマン散乱分光法を用いて蛍光標識の励起および放出光の検出によって検出し得る（Ｙ．Ｃ．Ｃａｏ、Ｒ．Ｊｉｎ、Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２，２９７：１５３６−１５３９）。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、放射性核種によって放出される放射能を用いた（例えば、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴを用いた）ナノ粒子の検出に使用するための、または療法のため、すなわち標的細胞を殺すための放射性核種を含み得る。従来技術で一般的に使用されている放射性核種の例は、本発明における使用に容易に適応することができ、様々な酸化状態で存在するが最も安定なものはＴｃＯ４−である９９ｍＴｃ、３２Ｐまたは３３Ｐ、５７Ｃｏ、５９Ｆｅ、しばしばＣｕ２＋塩として使用される６７Ｃｕ、一般的にＧａ３＋塩、例えばクエン酸ガドリニウムとして使用される６７Ｇａ、６８Ｇｅ、８２Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０３Ｐｄ、一般的にＩｎ３＋塩として使用される１１１Ｉｎ、一般的にヨウ化ナトリウムとして使用される１２５Ｉまたは１３１Ｉ、１３７Ｃｓ、１５３Ｇｄ、１５３Ｓｍ、１５８Ａｕ、１８６Ｒｅ、一般的に塩化タリウムのようなＴｌ＋塩として使用される２０１Ｔｌ、３９Ｙ３＋、７１Ｌｕ３＋、および２４Ｃｒ２＋が含まれる。放射性核種の標識およびトレーサーとしての一般的な使用は従来技術で良く知られており、本発明の態様で使用するために従来技術の当業者によって容易に適応され得る。放射性核種はナノ粒子のコアにドープすることによって、またはナノ粒子に固定化されたリガンドの一部として存在する標識としてこれらを含むことによって最も簡単に使用され得る。
【０１０２】
活性剤
本明細書で使用されるとき、用語「生物学的に活性な薬剤」または「生物活性剤」は、生物系に効果、好ましくは治療効果を及ぼす薬剤およびプロドラッグを包含することが意図されている。本明細書で考えられる活性剤の種類は、小分子有機化合物、ペプチド、ポリペプチド、および核酸を含む。治療剤の例示的な種類は抗癌剤であり、細胞毒性化合物、抗増殖剤、または抗血管形成剤などである。特定な例には化学療法剤を含み、例えば、ドキソルビシン、テモゾロミド、イリノテカン、カルムスチン、プラチナ（ＩＶ）、プラチナ（ＩＩ）、カンプトテシン、ドセタキセル、ソラフェニブ、メイタンシン、メイタンシノイド（例えば、メイタンシノイドＤＭ１またはメイタンシノイドＤＭ４）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、およびヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤（例えば、パノビノスタット）である。
【０１０３】
特定の例では、少なくとも１種類のペイロードリガンドは下記から選択される。
【化１９】
2018526432.tif 000020
【化２０】
2018526432.tif 000021
【化２１】
2018526432.tif 000022
【化２２】
2018526432.tif 000023
【化２３】
2018526432.tif 000024
および
【化２４】
2018526432.tif 000025
【０１０４】
検出可能な薬剤
検出可能な薬剤は蛍光標識および光音響色素を含む。両方の例は従来技術で知られている。限定されないが、蛍光色素の例にはローダミン色素（ローダミンＢおよびスルホローダミンＢなど）およびＣｙ５．５を含む。限定されないが、光音響色素の例にはＣｙ７、Ｃｙ７．５、Ｃｙ８、またはＬｉ−ｃｏｒ（登録商標）ＩＲＤｙｅ８００（登録商標）を含む。
【０１０５】
投与および治療
本発明のナノ粒子および組成物は、腸内または非経口経路を含むいくつかの異なる経路によって患者に投与され得る。非経口投与は、静脈内、皮膚または皮下、鼻腔、筋肉内、眼内、経上皮、腹腔内、および局所（皮膚、眼、結腸、鼻腔、吸入、およびエアゾールを含む）の経路、ならびに結腸全身経路による投与を含む。
【０１０６】
投与は、蓄積注射を含む注入などによって実施される。
【０１０７】
本発明のナノ粒子は、固体または液体組成物の剤形であり得る医薬組成物として製剤化され得る。このような組成物は一般的にいくつの種類の担体を含み、例えば、固体担体または液体担体を含み、水、石油、動物または植物オイル、ミネラルオイル、あるいは合成オイルが挙げられる。生理食塩水溶液、あるいはエチレングリコール、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールのようなグリコールも含まれ得る。このような組成物および調製物は一般的には本化合物を少なくとも０．１ｗｔ％含む。
【０１０８】
静脈内、皮膚または皮下注入、あるいは患部での注入のため、有効成分はパイロジェンフリーであり、適切なｐＨ、等張性、および安定性を有する非経口として許容可能な水溶液または液体の剤形である。従来技術の当業者は、例えば生理食塩水、グリセロールで調製した分散、液体ポリエチレングリコール、またはオイルに、例えば本化合物またはこの誘導体の溶液を用いて、適切な溶液を調製することが十分可能である。
【０１０９】
１種類以上の本化合物に加え、任意に他の有効成分と組み合わせて、本組成物は１種類以上の医薬品として許容可能な添加剤、担体、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、または抗酸化剤、あるいは従来技術の当業者によって良く知られている他の材料を含むことができる。このような材料は非毒性であるべきであり、有効成分の効能に干渉すべきでない。担体または他の材料のあるべき性質は、静脈内注入などの投与経路に依存し得る。
【０１１０】
好ましくは、医薬組成物は個体に、予防上効果的な量または治療上効果的な量で与えられ（場合によっては、予防が治療と考えられ得る）、これは個体に対して効果を示すのに十分なものである。一般的に、これは治療上有用な活性を生じて個体に効果をもたらす。投与される化合物の実際の量、ならびに投与の割合および時間的推移は、治療される症状の性質および重篤度に依存する。治療の処方、例えば用量の決定などは、一般開業医および他の医師の責任範囲であり、一般的に、治療する障害、個別患者の症状、送達部位、投与方法、および医師が知る他の要因が考慮される。前述の技術およびプロトコルの例は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（ｅｄｓ．Ｍ．Ａｓｈ  ａｎｄ  Ｉ．Ａｓｈ），２００１（Ｓｙｎａｐｓｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｎｄｉｃｏｔｔ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００，ｐｕｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９４で認めることができる。例として、本組成物は好ましくは体重１ｋｇあたり約０．０１〜１００ｍｇの有効成分の投与量で患者に投与され、より好ましくは約０．５〜１０ｍｇ／体重ｋｇである。本発明のナノ粒子における肝臓標的化の一つの利点は、活性「ペイロード」の治療上効果的な用量が、例えば全身投与によって遊離薬剤として投与されるときの効果的な用量と比べて、同一の活性について低いものであり得ることである。
【０１１１】
次に例によって示すが、請求項の範囲の制限として解釈されるべきではない。
【０１１２】
例
例示的なリガンドおよびリンカーの合成
ラクトース長鎖リンカーリガンド
【化２５】
2018526432.tif 000026
Ｌａｃ−Ｏ−ＥＧ６−Ｃ１１−ＳＨおよびＬａｃＬＬとも呼ばれ、このリガンド＋リンカー部分のＩＵＰＡＣ名は（ω−１１−チオウンデシル）−（ヘキサエチレングリセリルβ−Ｄ−ラクトースである。これはＡ．Ｇ．Ｂａｒｒｉｅｎｔｏｓ，Ｊ．Ｍ．ｄｅ  ｌａ  Ｆｕｅｎｔｅ，Ｔ．Ｃ．Ｒｏｊａｓ，Ａ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｓ．Ｐｅｎａｄｅｓ，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２００３，９，１９０９−１９２１に従って合成することができる。
【０１１３】
グルコース短鎖リンカー（希釈リガンド）
【化２６】
2018526432.tif 000027
Ｇｌｃ−Ｃ２−ＳＨ、ＧｌｃＳＬ、ＧｌｃＣ２とも呼ばれ、このリガンドのＩＵＰＡＣ名はチオエチルβ−Ｄ−グルコピラノシドである。これはＭｉｄａｔｅｃｈ特許ＷＯ２００６／０３７９７９Ａ２およびＲ．Ｏｊｅｄａ，Ｊ．Ｌ．ｄｅ  Ｐａｚ，Ａ．Ｇ．Ｂａｒｒｉｅｎｔｏｓ，Ｍ．Ｍａｒｔｉｎ−Ｌｏｍａｓ，Ｓ．Ｐｅｎａｄｅｓ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２００７，３４２，４４８−４５９に従って合成することができる。
【０１１４】
アミノリンカー
【化２７】
2018526432.tif 000028
しばしばアミノリンカーと呼ばれ、このリンカーはまたＡＬおよびＮＨ２−ＥＧ６−ＳＨと略される。このＩＵＰＡＣ名はα−アミノ−ω−チオヘキサエチレングリコールである。これは次のようにヘキサエチレングリコールから相当するジスルフィドとして合成および分離することができる。
【化２８】
2018526432.tif 000029
【０１１５】
代表的な手順を次に説明する。ヘキサエチレングリコール（９０．０ｇ、３１８．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１Ｌ）に溶解し、トリエチルアミン（１７７ｍＬ、１２７５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１．９４ｇ、１５．９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を４℃に冷却し、トシルクロリド（１８１．８ｇ、９５６．３ｍｍｏｌ）を少しずつ３０分かけて加えた。約５℃で１０分後、反応物を室温に加温して３時間撹拌し、ついでエチレンジアミンのジクロロメタン溶液（６３０ｍＬ中に２３．０ｍＬ、３４４．４ｍｍｏｌ）に注いだ。有機層を洗浄し（ＨＣｌ、６３０ｍＬ、５％ＮａＨＣＯ３、５％食塩水、各６３０ｍＬ）、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空で濃縮して２１７．６９ｇを得、さらに精製することなく使用した。
【０１１６】
この生成物をジメチルホルムアミド（１．４Ｌ）に溶解し、アジ化ナトリウム（２４．９ｇ、３８２．５ｍｍｏｌ）を加えた。反応物をアルゴン下の室温で１８時間撹拌し、ついで食塩水（１３００ｍＬ）に注ぎ、酢酸エチル（６３０ｍＬ×２）で抽出した。抽出物を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空で濃縮して精製し（クロマトグラフィー、ＳｉＯ２、１５→４０％アセトン／ヘキサン）、トシルアジドを６２．６７ｇ（４２％）得た。
【０１１７】
このトシルアジドをアセトン（６３０ｍＬ）に溶解し、チオ酢酸カリウム（２０．２ｇ、１７６．５ｇ）を加えた。１９時間後、反応混合物を食塩水（１．２Ｌ）に注ぎ、酢酸エチル（６００ｍＬ×３）で抽出した。抽出物を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮して精製し（クロマトグラフィー、ＳｉＯ２、０→４％メタノール／ジクロロメタン）、チオアセチルアジドを４６．１ｇ（９３％）得た。
【０１１８】
このチオアセチルアジドをメタノール（１．１Ｌ）に溶解し、ナトリウムメトキシド（６８．１ｇ、１２６１．５ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。反応物を５日間撹拌（空気に開放）し、ついで水（７００ｍＬ）で希釈し、ジクロロメタン（７００ｍＬ×２）で抽出した。抽出物を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮して精製し（クロマトグラフィー、ＳｉＯ２、４０％アセトン／ヘキサン）、ジスルフィドを２２．３ｇ（５５％）得た。
【０１１９】
このジスルフィドをテトラヒドロフラン（２２５ｍＬ）に溶解し、水（７０ｍＬ）およびトリフェニルホスフィン（１８．６ｇ、７１．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物をアルゴン下の室温で１６時間撹拌し、ついで水（５０ｍＬ）で希釈して、酢酸エチル（１００ｍＬ×３）で洗浄した。得られる水溶液を真空で濃縮してアミノリンカーを１１．３ｇ得た。
【０１２０】
例１−肝臓標的化ラクトース長鎖リンカー金ナノ粒子の合成
金表面に結合された肝臓標的化分子、結合リンカー、および炭水化物希釈剤を有する金ナノ粒子の調製および特徴付けが下記で説明される。
【０１２１】
リガンドＬａｃＬＬ、ＡＬ、およびＧｌｃＣ２を使用した。ヘキサエチレングリコリルウンデカニルラクトースグリコシドを肝臓標的化部分として選択し、短鎖Ｃ２グルコシドを希釈部分として使用した。化学療法剤ペイロードあるいは薬剤のような他の治療用または予防用分子、蛍光色素、および放射性トレーサーの結合のため、アミノ官能化ヘキサエチレングリコールを使用した。金コアへの結合は金イオウ結合を介して実施した。
【０１２２】
肝臓標的化分子ＬａｃＬＬの異なる比を有する金ナノ粒子を合成し、ＬａｃＬＬ−ＮＰ１（Ｌａｃｃｌｌ：ＡＬ：ＧｌｃＣ２＝９：５０：４１）およびＬａｃＬＬ−ＮＰ２（Ｌａｃｃｌｌ：ＡＬ：ＧｌｃＣ２＝２７：５０：２３）だった。
【０１２３】
ナノ粒子の調製のため、リガンドＬａｃＬＬ、ＡＬ、およびＧｌｃＣ２をメタノールに所望の比率で溶解し、ＨＡｕＣｌ４の水溶液に加えた。金塩をチオール／ジスルフィドの存在下でリガンドコロナを有する金（０）クラスターに還元した。遠心分離ろ過の反復による精製および所望の容量への最終希釈後、ナノ粒子が水溶液として得られた（図３Ａ）。ナノ粒子におけるリガンド比を１Ｈ  ＨＭＲによって確証した。その後、ナノ粒子溶液の小分けを、Ｄ２Ｏに溶媒交換後、重水素水中、０．３ＭのＫＣＮおよび０．１ＭのＫＯＨによって処理した。金コアのエッチング後、遊離リガンドのスペクトルを得、リガンド比をレポートシグナル積分によって判断し、本来の比率が反応後にナノ粒子で誤差範囲内に維持されていることが示された。（図４Ａ）。これらの構築体の平均直径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて測定したとき、ＬａｃＬＬ−ＮＰ１およびＬａｃＬＬ−ＮＰ２で、２．０６ｎｍおよび１．９８ｎｍだった（図５はＬａｃＬＬ−ＮＰ１のＴＥＭを示す）。
【０１２４】
実験セクション
ＬＡｃＬＬ、ＡＬ、およびＧｌｃＣ２を参考に従って合成した。ＨＡｕＣｌ４、ＮａＢＨ４、ＫＣＮ、ＫＯＨ、およびメタノールをシグマアルドリッチから入手した。すべての試薬はさらに精製することなく使用した。ミリＱ水（１８．２ｍΩ）をＳｉｍｐｌｉｃｉｔｙ水精製システム（メルクミリポア）から得た。ナノ粒子をＫＣＮ／ＫＯＨエッチング後の１Ｈ  ＮＭＲ、ＤＬＳ、ＴＥＭ、およびゼータ電位によって特徴付けした。ナノ粒子溶液の金濃度をＩＣＰ−ＭＳまたはＭＰＡＥＳによって測定した。
【０１２５】
ＮＭＲサンプル調製のため、ナノ粒子の１ｍＬ溶液を遠心分離ろ過（アミコン、１０ｋＤａ、４ｍＬ）によって濃縮して洗浄した（２ｍＬのＤ２Ｏ×３）。残存ＮＰ溶液（約２００μＬ）をＤ２Ｏ中の０．３ＭのＫＣＮ／０．１ＭのＫＯＨ溶液（約４００μＬ）とともに５０℃で３０分間インキュベーションした。混合物を簡単に遠心分離して上清をＮＭＲチューブに移した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ  ＩＩＩ  ５００  ＮＭＲスペクトロメーターで記録した。化学シフトを相当する溶媒に校正した（Ｄ２Ｏ＝４．７９ｐｐｍ）。
【０１２６】
ａ）ＬａｃＬＬ−ＮＰ１（ＬａｃＬＬ：ＡＬ：ＧｌｃＣ２＝９：５０：４１）
ＬａｃＬＬ（０．０４１０ｍｍｏｌ、３２．５ｍｇ、１．４１ｍＬ）、ＧｌｃＣ２（０．１８５ｍｍｏｌ、４４．５ｍｇ、１．５８ｍＬ）、およびＡＬ（０．２２８ｍｍｏｌ、６７．７ｍｇ、２．４０ｍＬ）のメタノール溶液を１００ｍＬ丸底フラスコに加え、メタノール（３２．４ｍＬ）で希釈して、０．０１２Ｍ濃度のリガンド溶液を得た。ついでＨＡｕＣｌ４（６０．０ｍｇ、０．１５２ｍｍｏｌ、１当量）の水溶液（６．０９ｍＬ）を加えた。反応混合物をＮａＢＨ４（１２６ｍｇ、３．３４ｍｍｏｌ、２２当量）の水溶液（３．３３ｍＬ）によってボルテックス撹拌下で還元した。得られる黒色ナノ粒子溶液を楕円式振とう器によって室温で３５分間振とうさせた。時間が経過とともにナノ粒子が沈殿した。反応終了後、溶液中に残存するナノ粒子を遠心分離（４５００ｒｐｍで１分間）によってスピンダウンさせ、沈殿を４ｍＬのミリＱ水で再溶解した。水性ＮＰ懸濁液を洗浄済みのアミコンフィルター（４ｍＬ、１０ｋＤａ）に移した。濃縮後、ナノ粒子を遠心ろ過によってミリＱ水（３〜４ｍＬ）を用いて４回洗浄した。最後に、ナノ粒子をミリＱ水の最終容量６ｍＬに収集した。ナノ粒子をＫＣＮ／ＫＯＨエッチング後の１Ｈ  ＮＭＲ、ＤＬＳ、ＴＥＭ、およびゼータ電位によって特徴付けした。ナノ粒子溶液の金濃度をＩＣＰ−ＭＳによって測定した。ＴＥＭ：平均直径２．０６ｎｍ。
【０１２７】
ｂ）ＬａｃＬＬ−ＮＰ２（ＬａｃＬＬ：ＡＬ：ＧｌｃＣ２＝２７：５０：２３）
ＬａｃＬＬ（０．０８７０ｍｍｏｌ、６９．８ｍｇ、３．５５ｍＬ）、ＧｌｃＣ２（０．０７１０ｍｍｏｌ、１７．０ｍｇ、１．６７ｍＬ）、およびＡＬ（０．１５９ｍｍｏｌ、４７．２ｍｇ、１．９６ｍＬ）のメタノール溶液を１００ｍＬ丸底フラスコに加え、メタノール（１９．３ｍＬ）で希釈して、０．０１２Ｍ濃度のリガンド溶液を得た。ついでＨＡｕＣｌ４（４０．０ｍｇ、０．１０２ｍｍｏｌ、１当量）の水溶液（４．２４ｍＬ）を加えた。反応混合物をＮａＢＨ４（８４．８ｍｇ、２．２４ｍｍｏｌ、２２当量）水溶液（２．３３ｍＬ）によってボルテックス撹拌下で還元した。得られる黒色ナノ粒子溶液を楕円式振とう器によって室温で３５分間振とうさせた。時間経過でナノ粒子が沈殿した。反応終了後、溶液中に残存するナノ粒子を遠心分離（４５００ｒｐｍで１分間）によってスピンダウンさせ、沈殿を４ｍＬのミリＱ水で再溶解した。水性ＮＰ懸濁液を洗浄済みのアミコンフィルター（４ｍＬ、１０ｋＤａ）に移した。濃縮後、ナノ粒子を遠心ろ過によってミリＱ水（３〜４ｍＬ）を用いて４回洗浄した。最後に、ナノ粒子をミリＱ水の最終容量４ｍＬに収集した。ナノ粒子をＫＣＮ／ＫＯＨエッチング後の１Ｈ  ＮＭＲ、ＤＬＳ、ＴＥＭ、およびゼータ電位によって特徴付けした。ナノ粒子溶液の金濃度をＩＣＰ−ＭＳによって測定した。ＴＥＭ：平均直径１．９８ｎｍ。
【０１２８】
例２−肝臓標的化ラクトース長鎖リンカー金ナノ粒子の異なるペイロードによる官能化
結合リンカーの官能化ならびに化学療法剤および蛍光色素を備えた肝臓標的化金ナノ粒子の特徴付けを下記で説明する。
【０１２９】
肝臓標的化ナノ粒子の官能化では、２種の抗新生物剤であるプラチナ（ＩＶ）−コハク酸（ＰＴ（ＩＶ）−ｓｕｃ）およびドキソルビシンを化学療法剤として選択した。両化学療法剤を、ＥＤＣ・ＨＣｌ／ＮＨＳ促進化アミド結合形成を介して結合リンカーと結合させた。Ｐｔ（ＩＶ）−ｓｕｃの場合では、化合物が水性系に可溶性でなかったため、反応はＤＭＳＯ中で実施した。従って、ナノ粒子溶液を凍結乾燥または遠心分離濃縮およびその後の希釈のいずれかによってＤＭＳＯに交換した。ついで、ＥＤＣ・ＨＣｌ／ＮＨＳ前活性化コハク酸をナノ粒子と一昼夜反応させた。残存する試薬を取り除く最終洗浄によって、プラチナベースの化学療法剤ペイロードを有する肝臓標的化金ナノ粒子の水溶液を得た（図３Ｂ）。Ｐｔ／Ａｕ比はＭＰＡＥＳによって１／１５まで測定した。ナノ粒子への薬剤の共有結合が、エッチング後の最終構成物の１Ｈ  ＮＭＲによって示された（図４Ｂ）。２．８１ｐｐｍの化学シフトを有するアミノメチレン基の本来のシグナルがほとんど消失し、一方、２．４７ｐｐｍでのコハク酸エチレン基の新たな多重項がスペクトルに認められる。レポーターシグナルの積分は変化せず、ナノ粒子操作の際のコロナ安定性を示した。
【０１３０】
ドキソルビシン結合では、逆の結合方法が適用された。最初にアミノ官能基を、ＬａｃＬＬ−ＮＰの無水コハク酸との反応によってカルボキシル部分に転化した。そしてカルボン酸をＤＭＳＯ中でＥＤＣ・ＨＣｌ／ＮＨＳと反応させた。溶媒交換後、前活性化ナノ粒子溶液をＨＥＰＥＳ緩衝液中でドキソルビシン溶液とともにインキュベーションした。遠心分離ろ過による精製およびＭＥＳ緩衝液での最終希釈後、ドキソルビシンペイロード肝臓標的化ナノ粒子を得た。金およびドキソルビシンの濃度を比色アッセイによって測定した。
【０１３１】
蛍光色素スルホローダミンＢ酸クロリドを診断模倣剤として使用した。結合は、スルホローダミンＢ酸クロリドのスルホニルクロリド部分と、肝臓標的化金ナノ粒子上の結合リンカーのアミノ官能基とのスルホンアミド結合によって実現した。反応はｐＨ９．３の炭酸緩衝液中で実施して標識化粒子を得た。
【０１３２】
この３例の実験は、肝臓標的化金ナノ粒子の官能化における化学的な順応性を示した。
【０１３３】
実験セクション
スルホローダミンＢ酸クロリド、ＥＤＣ・ＨＣｌ、ＮＨＳ、およびＤＭＳＯはシグマアルドリッチから入手した。Ｐｔ（ＩＶ）−コハク酸はＣｈａｒｎｗｏｏｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒから入手した。ドキソルビシンはＬＣ  Ｌａｂｓから入手した。すべての試薬はさらに精製することなく使用した。ミリＱ水（１８．２ｍΩ）はＳｉｍｐｌｉｃｉｔｙ水精製システム（メルクミリポア）から得た。ナノ粒子をＫＣＮ／ＫＯＨエッチング後の１Ｈ  ＮＭＲ、ＤＬＳ、ＴＥＭ、およびゼータ電位によって特徴付けした。ナノ粒子溶液の金濃度をＩＣＰ−ＭＳまたはＭＰＡＥＳによって測定した。
【０１３４】
ＮＭＲサンプル調製のため、ナノ粒子の１ｍＬ溶液を遠心分離ろ過（アミコン、１０ｋＤａ、４ｍＬ）によって濃縮して洗浄（２ｍＬのＤ２Ｏ×３）した。残存ＮＰ溶液（約２００μＬ）をＤ２Ｏ中の０．３ＭのＫＣＮ／０．１ＭのＫＯＨ溶液（約４００μＬ）とともに５０℃で３０分間インキュベーションした。混合物を簡単に遠心分離して上清をＮＭＲチューブに移した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ  ＩＩＩ  ５００  ＮＭＲスペクトロメーターで記録した。化学シフトを相当する溶媒に校正した（Ｄ２Ｏ＝４．７９ｐｐｍ）。
【０１３５】
ａ）Ｐｔ−ＬａｃＬＬ−ＮＰ３
５ｍＬのＬａｃＬＬ−ＮＰ１ナノ粒子水溶液（低濃度の標的化リガンド）（２１．４μｍｏｌ反応性ＡＬ）をアミコンフィルター（４ｍＬ、１０ｋＤａ）中で遠心分離（４５００ｒｐｍで１５分×２）によって濃縮し、ＤＭＳＯで２．５ｍＬの容量に希釈した。Ｐｔ（ＩＶ）−コハク酸（２２．９ｍｇ、５２．９μｍｏｌ）のＤＭＳＯ溶液（５２８μＬ、０．１Ｍ）に添加する前に、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１２．２ｍｇ、６３．４μｍｏｌ）のＤＭＳＯ溶液（１２７μＬ、０．５Ｍ）およびＮＨＳ（７．２９ｍｇ、６３．４μｍｏｌ）のＤＭＳＯ溶液（６３．４μＬ、１．０Ｍ）を混合して室温で１５分間インキュベーションした。前活性化の３０分後、反応混合物をナノ粒子溶液に加えて混合物を楕円式振とう器を用いて室温で一昼夜振とうさせた。反応溶液を２５ｍＬのミリＱ水で希釈し、濃縮して繰り返しミリＱ水で洗浄した。黒色残渣を５．００ｍＬのミリＱ水に採取した。ナノ粒子をＫＣＮ／ＫＯＨエッチング後の１Ｈ  ＮＭＲ、ＤＬＳ、ＴＥＭ、およびゼータ電位によって特徴付けした。ナノ粒子溶液の金およびプラチナの濃度をＩＣＰ−ＭＳによって測定した。［Ａｕ］，ＭＰＡＥＳ：２．８４ｍｇ／ｍＬ、［Ｐｔ］，ＭＰＡＥＳ：０．１９ｍｇ／ｍＬ
【０１３６】
ｂ）Ｄｏｘｏ−ＬａｃＬＬ−ＮＰ４
ＬａｃＬＬ−ＮＰにおけるアミノ官能基のコハク酸化：
８．０ｍＬのＬａｃＬＬ−ＮＰ１ナノ粒子水溶液（低濃度の標的化リガンド）（３３．８μｍｏｌ反応性ＡＬ）をアミコンフィルター（１５ｍＬ、１０ｋＤａ）で遠心分離（４５００ｒｐｍで１５分）によって濃縮し、ＤＭＳＯで８．０ｍＬの容量に希釈した。無水コハク酸（１６．９ｍｇ、１６９μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５６４μＬ）で希釈して０．５Ｍ溶液を得、ナノ粒子溶液に加えた。反応混合物を楕円式振とう器を用いて室温で一昼夜振とうさせた。反応溶液を２５ｍＬのミリＱ水で希釈して濃縮し、繰り返しミリＱ水で洗浄した。黒色残渣を５．００ｍＬのミリＱ水に採取した。ナノ粒子をＫＣＮ／ＫＯＨエッチング後の１Ｈ  ＮＭＲ、ＤＬＳ、ＴＥＭ、およびゼータ電位によって特徴付けした。ナノ粒子溶液の金およびプラチナの濃度をＩＣＰ−ＭＳによって測定した。
【０１３７】
ＬａｃＬＬ−ＮＰのコハク酸化結合リンカーへのドキソルビシン結合：
３．０ｍＬのＬａｃＬＬ−ＮＰナノ粒子水溶液（１０．０μｍｏｌ反応性コハク酸化ＡＬ）をアミコンフィルター（４ｍＬ、１０ｋＤａ）中で遠心分離（４５００ｒｐｍで１５分）によって濃縮し、ＤＭＳＯで３．０ｍＬの容量に希釈した。１５分間インキュベーションしたＥＤＣ・ＨＣｌ（４．８２ｍｇ、２５．１μｍｏｌ）およびＮＨＳ（５．７５ｍｇ、５０．０μｍｏｌ）のＤＭＳＯ溶液（４１６μＬ）をナノ粒子溶液に加え、混合物を楕円式振とう器を用いて室温で２時間振とうさせた。水（８０ｍＬ）で希釈したナノ粒子溶液を遠心分離によってろ過し、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．８、２５．０ｍＬ）で希釈し、ドキソルビシンの溶液（２０ｍＭヘペスで２．００ｍｇ／ｍＬ、２．５０ｍＬ）を直ちに加えた。結合反応物を室温で１時間インキュベーションした。ドキソルビシンと結合されたナノ粒子を遠心分離ろ過（アミコン、１５ｍＬ、１０ｋＤａ）によってミリＱ水で精製した。残存溶液をＭＥＳ緩衝液（３．０ｍＬ）で収集した。ナノ粒子をＫＣＮ／ＫＯＨエッチング後の１Ｈ  ＮＭＲ、ＤＬＳ、ＴＥＭ、およびゼータ電位によって特徴付けした。ナノ粒子溶液の金濃度をＩＣＰ−ＭＳによって測定した。［Ａｕ］，比色分析：１．０５ｍｇ／ｍＬ、［Ｄｏｘｏ］，比色分析：０．６６ｍｇ／ｍＬ
【０１３８】
ｃ）ｓＲｈｏＢ−ＬａｃＬＬ−ＮＰ５
３ｍＬのＬａｃＬＬ−ＮＰ１ナノ粒子水溶液（０．６０９μｍｏｌナノ粒子）（低濃度の標的化リガンド）を遠心分離ろ過（アミコン、４ｍＬ、１０ｋＤａ）によって濃縮し、Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．３）で１回洗浄した。残存溶液を１．５ｍＬの緩衝液に溶解した。ＮＰ溶液に、ＤＭＦ中のスルホローダミンＢ酸クロリド溶液（１３３μＬ、９．１４μｍｏｌ、５．２７ｍｇ）を加え、日光を遮断して楕円式振とう器によって室温で一昼夜振とうさせた。反応混合物を事前に洗浄したアミコンフィルター（４ｍＬ、１０ｋＤａ）に移した。ナノ粒子溶液を遠心分離して、Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．３）で３回洗浄を繰り返し、ミリＱ水でろ液が透明になるまで繰り返した。最後に、ナノ粒子を３ｍＬのミリＱ水に収集した。ナノ粒子をＫＣＮ／ＫＯＨエッチング後の１Ｈ  ＮＭＲ、ＤＬＳ、ＴＥＭ、およびゼータ電位によって特徴付けした。ナノ粒子溶液の金濃度をＩＣＰ−ＭＳによって測定した。
【０１３９】
例３−インビボで実証されたナノ粒子の肝臓標的化
ラクトース長鎖リンカー金ナノ粒子の肝臓標的化特性は、インビボ体内分布試験における異なるナノ粒子構築体の比較によって示すことができた。高含量および低含量の肝臓標的化分子を有する２種のラクトース長鎖リンカーナノ粒子（ＬａｃＬＬ−ＮＰ１（低）＋ＬａｃＬＬ−ＮＰ２（高））、２種の同様なラクトース短鎖リンカーナノ粒子（ＬａｃＳＬ−ＮＰ１（低）＋ＬａｃＳＬ−ＮＰ２（高））（ラクトースはＣ２リンカーに結合される）、および非標的化ナノ粒子（Ｇｌｃ−ＮＰ）をそれぞれマウスに静脈内注入した。
【０１４０】
９０分の循環時間後、マウスを屠殺し、主要器官を採取してＩＣＰ−ＭＳによって分析し、器官における金濃度を測定した。これらのデータのグラフ化は種々の構築体について生体分布マップを示した（図６）。予期されたように、肝臓標的化構築体は主に肝臓で認められ、一方、非標的化ナノ粒子は腎臓に蓄積した。肝臓標的化分子のリンカー長は金ナノ粒子の肝臓取り込みに影響することが認められた。短鎖リンカー型では、すべての認められた金量の４２〜４６％が肝臓に存在した。これに対し、長鎖リンカー構築体ではほとんどすべての金が肝臓で検出された（最大９１％）。
【０１４１】
この実験は、適切なペイロードが、肝臓標的化ラクトース長鎖リンカー金ナノ粒子を用いて、高い効率で肝臓に向けられることを実証する。
【０１４２】
実験セクション
細胞株およびトランスフェクション
肝癌細胞株であるＨｅｐＧ２細胞を、１０％ＦＣＳ（ギブコ）を添加したＤＭＥＭ（シグマアルドリッチ）で、１０ｃｍペトリ皿（ＢＤ）において３７℃、９５％空気および５％ＣＯ２で増殖させ、ＰＢＳ  １×（シグマアルドリッチ）で洗浄し、０．０５％トリプシン・ＥＤＴＡ（ギブコ）による処理で継代した。生きた細胞をトリパンブルー排除アッセイにおいて血球計数器で計数した。ＨｅｐＧ２細胞は、マイコプラズマ属のすべてのメンバーに共通であるプライマーセットを用いてマイコプラズマについて定期的に試験した（Ｃｈｏｐｐａら，１９９８）。細胞を６ウェルプレートに２〜３×１０４個／ｃｍ２の密度で接種し、続いてｐＥＧＦＰ−Ｌｕｃベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とＰＥＩ２５（シグマアルドリッチ）の１：３および１：５のモル比でトランスフェクションした。トランスフェクションでは、８００μｇ／μｇのＧ４１８を培養培地に加えることによって細胞を４８時間で選択した。続いて、細胞を新鮮な培地に維持してコンフルエントまで増殖させた。インビトロ生物発光シグナルを評価するため、Ｍｉｔｈｒａｓマルチモードプレートリーダーを補助として用いたシンプルルシフェラーゼアッセイを、ＣＣＬＲ緩衝液中で細胞溶解物にＤ−ルシフェラーゼを加えることによって実施した（２５ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．８、２ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのＥＧＴＡ、１０％グリセロール、１％トライトンＸ−１００）。
【０１４３】
動物飼育
７０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（６週齢）を認定供給業者（Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓ）から入手した。すべてのマウスは特定病原体フリー条件下の層流キャビネットにおいて室温、１２時間明／暗サイクルで飼育し、食餌はペレットおよび水が自由に与えられた。ＵＳＣの実験動物委員会が動物試験を承認し、結果として、すべての動物実験が動物愛護ガイドラインに適合した。
【０１４４】
異種移植およびインビボ近赤外蛍光撮像
対数増殖期のＨｅｐＧ２細胞（０．１ｍＬのＰＢＳに細胞１０５個）を無胸腺ヌードマウス（各実験群ｎ＝６）の左脇腹に皮下注射して腫瘍保持マウスモデルを確立した。腫瘍移植を目視検査で定期的に確認し、最後にＩＶＩＳスペクトル（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）における生物発光シグナルの表示によって確証した。Ｄ−ルシフェリンを投与（１５０ｍｇ／ｋｇ）して、生物発光を腫瘍細胞に蛍光ＮＰとともに共局在化させた。腫瘍保持マウスをそれぞれ６匹の５群（コントロール群を含む）に分けた。腫瘍容積を［（長さ２×幅）／２］の式によって計算した（Ｓｏｅｎｇａｓら，１９９９）。腫瘍が４００ｍｍ３の容積に達したとき、ナノ粒子を静脈内に投与した。
【０１４５】
ローダミン共役体化ＧＮＰの検出のためにＩＶＩＳスペクトル（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、インビボ蛍光画像を注射後０分、４５分、および９０分に取得した。マウスは画像を取得している間、イソフルランを用いて麻酔をかけ、蛍光／生物発光画像の取得では安楽死させ（注射後９０分）、これらの器官（脳、肺、心臓、肝臓、脾臓、膵臓、腸、膀胱、および腎臓）および腫瘍をその後のＩＣＰ−ＭＳ分析のために採取した。
【表１】
2018526432.tif 000030
【０１４６】
例４−化学療法剤ペイロードを含有する肝臓標的化ラクトース長鎖リンカー金ナノ粒子によるインビトロ細胞毒性
化学療法剤Ｐｔ（ＩＶ）−コハク酸でペイロードされた肝臓標的化ラクトース長鎖リンカー金ナノ粒子（Ｐｔ−ＬａｃＬＬ−ＮＰ＋プラチナ）およびドキソルビシンでペイロードされた肝臓標的化ラクトース長鎖リンカー金ナノ粒子（Ｄｏｘｏ−ＬａｃＬＬ−ＮＰ＋ドキソルビシン）の細胞毒性を、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）細胞生存アッセイにおいて遊離薬剤と比較して試験した（図７）。ヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２をアッセイに使用した。
【０１４７】
プラチナをベースとした抗新生物剤Ｐｔ（ＩＶ）−コハク酸の場合、Ｐｔ−ＬａｃＬＬ−ＮＰは遊離薬剤よりも能力が高いことが実証された。ナノ粒子では、１２．８μＭのＩＣ５０値が認められ、一方、遊離薬剤では３８．６μＭの値が認められた。ドキソルビシンでは、遊離化合物はペイロードナノ粒子と比べてわずかに高い細胞毒性を示した。ナノ粒子への薬剤の結合は化学療法剤活性を維持し、肝臓標的化ラクトース長鎖リンカー金ナノ粒子の薬剤送達システムとしての使用を可能にする。
【表２】
2018526432.tif 000031
【０１４８】
実験セクション
９６ウェルマイクロタイタープレートにおける細胞接種
ＨｅｐＧ２細胞をＴ−７５フラスコ中で増殖させた。細胞を移動のため、培地をフラスコから取り出して、細胞を５分間トリプシン処理した。細胞をファルコンチューブに収集して完全細胞培地で希釈した。細胞計数をノイバウエルチャンバーで実施した。細胞溶液を調製してウェルあたり４０００個（２００μＬ／ウェル）を接種した。マイクロタイタープレートを３７℃で２４時間インキュベーションした。
【０１４９】
接種したＨｅｐＧ２細胞の処理
各ＮＰおよび薬剤について、細胞培地における組成物を調製した。化合物を異なる濃度で試験した（薬剤量に基づいて０．０１、０．０５、０．２、１、５、２５、および１２５μＭ）。処理のため、細胞培地をすべてのウェルから取り除き、薬剤組成物用に交換した。２００μＬ処理液を三つ組で各ウェルに加えた。マイクロタイタープレートを３７℃で２４、４８、および７２時間インキュベーションした。
【０１５０】
処理後２４時間、４８時間、および７２時間でのＭＴＴ測定
１．５ｍＬのＭＴＴ溶液（１．６ｍＬのＤＭＳＯ中に８．０ｍｇ）を完全細胞培地（フェノールレッド無含有）で希釈した。処理細胞培地をマイクロタイタープレートから除いて、ウェルを１００μＬのＰＢＳで洗浄し、１００μＬのＭＴＴ反応性溶液を各ウェル加えた。３７℃、１時間のインキュベーション後、ＭＴＴ溶液を取り除いて、１００μＬのＤＭＳＯを加えてホルマザン色素を溶解した。吸光度を５７０ｎｍで測定した。
【０１５１】
統計的分析およびＩＣ５０計算
データをＯｒｉｇｉｎＰｒｏ８を用いて分析した。基準化したデータをプロットして、曲線を非直線回帰曲線フィット（可変傾きを有するシグモイド用量−反応曲線）を用いてフィッティングさせた。ＩＣ５０絶対値を補間によって得た。
【０１５２】
例５−標的化ＧＮＰの選択およびＨＣＣインビトロ標的化
いくつかのベース／ペプチド標的化ＧＮＰをインビトロでスクリーニングした。ガラクトース−Ｃ２−ＳＨ（Ｇａｌ−Ｃ２）リガンドおよびＨＳＰＥＧ８ＣＯＯＨを含む混合コロナを有するＧＮＰを、例１および２における前述と類似した方法論によって合成したが、グルコース−Ｃ２−ＳＨをガラクトース−Ｃ２−ＳＨで置き換え、アミノリンカーＮＨ−２−ＥＧ６−ＳＨをＨＳＰＥＧ８ＣＯＯＨ（ＳＨ−ＥＧ８−ＣＯＯＨまたはＳＨ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）８−ＣＯＯＨとも略す）で置き換えた。
【０１５３】
Ａｕ＠Ｇａｌ−Ｃ２：ＨＳＰＥＧ８ＣＯＯＨ  ＧＮＰは、低い非特異的結合（正常：腫瘍細胞）およびインビボでの優れた血漿循環を示すことが認められた。従って、Ｇａｌ−Ｃ２およびＨＳＰＥＧ８ＣＯＯＨのコロナを、グリピカン−３結合ペプチドを用いたＨＣＣ標的化試験のために選択した。
【０１５４】
ＵＳ８，３８８，９３７Ｂ２（その内容が本明細書に参考によって明確に組み込まれている）に記載され、そのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で認められるアミノ酸配列：ＲＬＮＶＧＧＴＹＦＬＴＴＲＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を有するグリピカン−３ペプチドを、このペプチドのＮ末端を介してＨＳＰＥＧ８ＣＯＯＨリガンドの一部の末端ＣＯＯＨ基と結合させた。「高保持」ＧＮＰ構築体（下表の１行目を参照）では、約４個のペプチドがナノ粒子コアあたり結合された。「高保持」Ａｕ＠Ｇａｌ−Ｃ２：ＨＳＰＥＧ８ＣＯＯＨ：ＨＳＰＥＧ８ＣＯＮＨＲＬＮＶＧＧＴＹＦＬＴＴＲＱ  ＧＮＰは、ＲＬＮＶＧＧＴＹＦＬＴＴＲＱペプチドを欠如するベースＧＮＰと比べて約７倍の標的化を示すことが認められた（図８および下表の最初の行を参照）。「低保持」Ａｕ＠Ｇａｌ−Ｃ２：ＨＳＰＥＧ８ＣＯＯＨ：ＨＳＰＥＧ８ＣＯＮＨＲＬＮＶＧＧＴＹＦＬＴＴＲＱ  ＧＮＰ（下表の３行目を参照）は、ＲＬＮＶＧＧＴＹＦＬＴＴＲＱペプチドを欠如するベースＧＮＰと比べて約４．６倍の標的化を示した。
【表３】
2018526432.tif 000032
【０１５５】
さらに検討を実施し、結合したＲＬＮＶＧＧＴＹＦＬＴＴＲＱペプチドの配向および／または末端キャッピングを評価した。特に、ＲＬＮＶＧＧＴＹＦＬＴＴＲＱ（前述されたＮ末端を介してＰＥＧ８ＣＯＯＨと結合したもの、遊離ＣＯＯＨ端）およびＲＬＮＶＧＧＴＹＦＬＴＴＲＱ−ＮＨ２（Ｎ末端を介してＰＥＧ８ＣＯＯＨと結合したもの、標準的なＣ末端を置換する第一級アミド末端）である。
【０１５６】
検討されているさらなる構築体は、ガラクトース−Ｃ２−ＳＨおよびアミノリンカー（「ＡＬ」またはＮＨ２−ＥＧ６−ＳＨとしても知られる）が約５０：５０比の混合コロナを含む。ＲＬＮＶＧＧＴＹＦＬＴＴＲＱペプチドはアミノリンカーに、ペプチドのＣ末端を介して、またはペプチドのアシル−Ｎ末端型を用いてアミノリンカーにペプチドのアシル−Ｎ末端を結合することによって結合された。以下の二法を使用して、（１）ペプチドを、Ｃ末端を介してＧＮＰ−ＡＬと結合した（陽性粒子を得る）、または（２）ペプチドを第一段階でＡＬ−ＳＨと、そして陰性粒子を得るナノ粒子合成におけるリガンドとして使用されるＳＨ−ＥＧ６−ＮＨＣＯ−ＲＬＮＶＧＧＴＹＦＬＴＴＲＱと結合した。得られる粒子はＡｕ＠ＧａｌＣ２：ＡＬ：ＡＬ−（Ａｃ）−ＲＬＮＶＧＧＴＹＦＬＴＴＲＱとして表され得る。
【０１５７】
ＵＳ８，３８８，９３７Ｂ２（その内容が本明細書に参考によって明確に組み込まれている）に記載され、そのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で認められるアミノ酸配列：ＹＦＬＴＴＲＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を有するさらなるグリピカン−３ペプチドを、次のようにＧＮＰリガンドと結合させた。ガラクトース−Ｃ２−ＳＨおよびアミノリンカー（ＮＨ２−ＥＧ６−ＳＨ）が約５０：５０の混合コロナを有するＧＮＰはＹＦＬＴＴＲＱペプチドのアシルＮ末端を介してアミノリンカーと結合されたＹＦＬＴＴＲＱを有し、式Ａｕ＠ＧａｌＣ２：ＡＬ：ＡＬ−（Ａｃ）−ＹＦＬＴＴＲＱによって表され得るＧＮＰを生じた。さらに、産生された、または本明細書で考えられるＧＮＰは、Ａｕ＠ＧａｌＣ２：ＨＳＰＥＧ８ＣＯＮＨ−ＹＦＬＴＴＲＱ（Ｎ末端を介してＰＥＧ８ＣＯＯＨと結合、遊離ＣＯＯＨ端）およびＡｕ＠ＧａｌＣ２：ＨＳＰＥＧ８ＣＯＮＨ−ＹＦＬＴＴＲＱ−ＮＨ２（Ｎ末端を介してＰＥＧ８ＣＯＯＨと結合、第一級アミド端）を含む。上記表の２行目で示されるように、ＧＮＰ  Ａｕ＠ＧａｌＣ２：ＡＬ：ＡＬ−（Ａｃ）−ＹＦＬＴＴＲＱは、ＹＦＬＴＴＲＱペプチドを欠如するベースナノ粒子と比べて、ＨＣＣ細胞に対して約５倍の標的化を示した。従って、これらの結果は、グリピカン−３結合ペプチドがＨＣＣ標的化に寄与し、高いペプチド保持（すなわち、ナノ粒子あたりのグリピカン−３結合ペプチドが多い）はＨＣＣ標的化をさらに増加することを示す。
【０１５８】
例６−ＤＭ４ペイロードによるＨｅｐＧ２細胞毒性を示すＧｌｙ−３標的化ＧａｌＣ２  ＧＮＰ
次のＧＮＰ構築体を合成して、ＨｅｐＧ２（肝臓肝細胞癌）細胞に対するこれらの腫瘍細胞致死能力を評価した。
【０１５９】
ガラクトース−Ｃ２およびＨＳＰＥＧ８ＣＯＯＨリガンド（４０：６０比）のコロナを有するＧＮＰであり、Ａｕ＠ＧａｌＣ２：ＨＳＰＥＧ８ＣＯＯＨによって表すことができる。
【０１６０】
ガラクトース−Ｃ２、ＨＳＰＥＧ８ＣＯＯＨ、およびメイタンシノイドＤＭ４リガンドのコロナを有するＧＮＰであり、Ａｕ＠ＧａｌＣ２：ＨＳＰＥＧ８ＣＯＯＨ：ＤＭ４によって表すことができる。
【０１６１】
ガラクトース−Ｃ２、ＨＳＰＥＧ８ＣＯＯＨ、およびメイタンシノイドＤＭ４リガンドのコロナを有するＧＮＰであり、ここでＨＳＰＥＧ８ＣＯＯＨリガンドの一部はグリピカン−３結合ペプチドＲＬＮＶＧＧＴＹＦＬＴＴＲＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のＮ末端と共役体化されており、ナノ粒子あたりのペプチドは１個未満である。このＧＮＰはＡｕ＠ＧａｌＣ２：ＤＭ４：ＨＳＰＥＧ８ＣＯＯＨ：ＨＳＰＥＧ８ＣＯＮＨＲＬＮＶＧＧＴＹＦＬＴＴＲＱによって表すことができる。
【０１６２】
遊離メイタンシノイドＤＭ４もＨｅｐＧ２細胞毒性実験において陽性コントロールとして使用した。
【０１６３】
様々なＧＮＰ構築体および遊離メイタンシノイドＤＭ４による、ＨｅｐＧ２細胞の７２時間処理後における細胞生存に対する効果を図９に示す。ＭＴＴアッセイでコントロールの割合として測定された細胞生存を濃度に対してプロットする。ＧＮＰを欠如するＤＭ４は試験した条件下で基本的に毒性を示さなかった。ＤＭ４を有する両ＧＮＰは、遊離ＤＭ４と極めて類似した用量−毒性曲線を示した。肝臓標的化剤としてグリピカン−３結合ペプチドを有するＧＮＰによって実証されたＨＣＣ標的化を考え合わせ（例５）、これらの結果は希釈リガンド、グリピカン−３結合ペプチド、およびメイタンシノイドＤＭ４のような化学療法剤の混合コロナを有するＧＮＰが、標的外の影響を最少にしながら（すなわち、正常な細胞に対する細胞毒性を最少にしながら）、選択された肝細胞を死滅させることを実証することが予測されることを示す。
【０１６４】
本明細書で引用されたすべての参考は、そのすべて、およびそれぞれの個別公開または特許または特許出願がその全体として参考によって援用されることが具体的そして個別的に指示されている場合と同様な範囲までについて、本明細書に援用される。
【０１６５】
本明細書で説明される具体的な実施形態は、例として示され、限定するものではない。本明細書におけるいずれのサブタイトルも、便宜上のためのみ含まれており、本開示を制限するものと決して解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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