(57)【要約】非天然ベイト領域を含有するＡ２Ｍポリペプチド組成物が開示される。また、野生型Ａ２Ｍポリペプチドおよび変異体Ａ２Ｍポリペプチド、ならびに非天然ベイト領域を含有するポリヌクレオチドを作製する方法も開示される。変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、野生型Ａ２Ｍと比較して、プロテアーゼ阻害性特徴の増強を裏付ける。生物に投与すると、野生型Ａ２Ｍと比較して長い半減期を裏付ける、変異体Ａ２Ｍポリペプチドが開示される。Ａ２Ｍ組成物は、炎症、慢性創傷、およびプロテアーゼと関連する病態を有する疾患を含む、いくつかの疾患および状態の処置において有用である。
2018501207.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のプロテアーゼ認識配列を含む非天然ベイト領域を含む変異体Ａ２Ｍポリペプチドを含む組成物であって、前記非天然ベイト領域が、配列番号６〜３０からなる群から選択される配列に対して少なくとも６０％の同一性を有する配列を含む組成物。
【請求項２】
前記非天然ベイト領域が、配列番号８４〜１４３からなる群から選択される配列を含まない配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記非天然ベイト領域が、配列番号６〜３０からなる群から選択される配列に対して少なくとも６５％の同一性を有する配列を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記非天然ベイト領域が、配列番号６〜３０からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記非天然ベイト領域が、配列番号６〜３０からなる群から選択される配列に対して少なくとも７５％の同一性を有する配列を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記非天然ベイト領域が、配列番号６〜３０からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記非天然ベイト領域が、配列番号６〜３０からなる群から選択される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記非天然ベイト領域が、配列番号６〜３０からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記非天然ベイト領域が、配列番号６〜３０からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記非天然ベイト領域が、配列番号６〜３０からなる群から選択される配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記非天然ベイト領域が、配列番号３１〜８１からなる群から選択されるプロテアーゼ認識配列を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記非天然ベイト領域が、配列番号８２および８３からなる群から選択されるプロテアーゼ認識配列を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記変異体Ａ２Ｍポリペプチドが、組換えである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記変異体Ａ２Ｍポリペプチドが、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、もしくは哺乳動物細胞、または無細胞系からなる群から選択される宿主内で産生される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記変異体Ａ２Ｍポリペプチドが、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、およびこれらの組合せからなる群から選択されるプロテアーゼの、野生型Ａ２Ｍタンパク質による前記プロテアーゼの阻害と比較して増強された阻害を特徴とする、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記阻害の増強が、前記プロテアーゼに対して非特異的である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１７】
前記阻害の増強が、前記プロテアーゼに対して特異的である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記変異体Ａ２Ｍポリペプチドが、非正常グリコシル化部位をさらに含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記変異体Ａ２Ｍポリペプチドが、ＰＥＧを含む非正常グリコシル化部位をさらに含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記変異体Ａ２Ｍポリペプチドが、対象内に位置すると、野生型Ａ２Ｍタンパク質の半減期より長い半減期を有する、請求項１から１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記変異体Ａ２Ｍポリペプチドが、対象内に位置すると、野生型Ａ２Ｍポリペプチドの半減期より、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１０９０％、１２０％、１４０％、１５０％、１６０％、１８０％、２００％、２２０％、２４０％、２６０％、２８０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、または５００％長い半減期を有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記変異体Ａ２Ｍポリペプチドが、野生型Ａ２Ｍタンパク質のプロテアーゼ阻害有効性と比較して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１０９０％、１２０％、１４０％、１５０％、１６０％、１８０％、２００％、２２０％、２４０％、２６０％、２８０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、または５００％増大したプロテアーゼ阻害有効性を特徴とする、請求項１から２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記変異体Ａ２Ｍポリペプチドが、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、およびこれらの組合せからなる群から選択されるプロテアーゼについてのコンセンサス配列を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記変異体Ａ２Ｍポリペプチドが、ＭＭＰ１（間質コラゲナーゼ）、ＭＭＰ２（ゼラチナーゼＡ）、ＭＭＰ３（ストロメリシン１）、ＭＭＰ７（マトリリシン、ＰＵＭＰ１）、ＭＭＰ８（好中球コラゲナーゼ）、ＭＭＰ９（ゼラチナーゼＢ）、ＭＭＰ１０（ストロメリシン２）、ＭＭＰ１１（ストロメリシン３）、ＭＭＰ１２（マクロファージメタロエラスターゼ）、ＭＭＰ１３（コラゲナーゼ３）、ＭＭＰ１４（ＭＴ１−ＭＭＰ）、ＭＭＰ１５（ＭＴ２−ＭＭＰ）、ＭＭＰ１６（ＭＴ３−ＭＭＰ）、ＭＭＰ１７（ＭＴ４−ＭＭＰ）、ＭＭＰ１８（コラゲナーゼ４、ｘｃｏｌ４、Ｘｅｎｏｐｕｓ属コラゲナーゼ）、ＭＭＰ１９（ＲＡＳＩ−１、ストロメリシン４）、ＭＭＰ２０（エナメリシン）、ＭＭＰ２１（Ｘ−ＭＭＰ）、ＭＭＰ２３Ａ（ＣＡ−ＭＭＰ）、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ２４（ＭＴ５−ＭＭＰ）、ＭＭＰ２５（ＭＴ６−ＭＭＰ）、ＭＭＰ２６（マトリリシン２、エンドメターゼ）、ＭＭＰ２７（ＭＭＰ−２２、Ｃ−ＭＭＰ）、ＭＭＰ２８（エピリシン）；ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＤＡＭＴＳ３、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５（ＡＤＡＭＴＳ１１）、ＡＤＡＭＴＳ６、ＡＤＡＭＴＳ７、ＡＤＡＭＴＳ８（ＭＥＴＨ−２）、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＤＡＭＴＳ１０、ＡＤＡＭＴＳ１２、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＡＤＡＭＴＳ１４、ＡＤＡＭＴＳ１５、ＡＤＡＭＴＳ１６、ＡＤＡＭＴＳ１７、ＡＤＡＭＴＳ１８、ＡＤＡＭＴＳ１９、ＡＤＡＭＴＳ２０などのＡＤＡＭＴＳ（Ａ  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  Ｍｏｔｉｆｓ）プロテアーゼ；キモトリプシン；トリプシン；エラスターゼ；補体因子；凝固因子；トロンビン；プラスミン；スブチリシン；ネプリリシン；プロコラーゲンペプチダーゼ；テルモリシン；妊娠関連血漿タンパク質Ａ；骨形成タンパク質１；リソスタフィン；インスリン分解酵素；ＺＭＰＳＴＥ２；ＺＭＰＳＴＥ４；ＺＭＰＳＴＥ２４；アセチルコリンエステラーゼ；およびこれらの組合せからなる群から選択されるプロテアーゼについてのコンセンサス配列を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記変異体Ａ２Ｍポリペプチドが、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＭＭＰ１３、およびこれらの組合せからなる群から選択されるプロテアーゼについてのコンセンサス配列を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記変異体Ａ２Ｍポリペプチドが、１または複数の生物に由来するプロテアーゼ認識コンセンサス配列を含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記１または複数の生物が、哺乳動物、動物、植物、細菌、酵母、魚類、爬虫類、両生類、ウイルス、または真菌からなる群から選択される、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記変異体Ａ２Ｍポリペプチドが、Ａ２Ｍ以外のタンパク質に由来するプロテアーゼ認識配列を含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
Ａ２Ｍ以外のタンパク質に由来する前記プロテアーゼ認識配列のうちの２つまたはそれ超が、同じである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
Ａ２Ｍ以外のタンパク質に由来する前記プロテアーゼ認識配列のうちの２つまたはそれ超が、異なる種に由来する、請求項２８または２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記変異体Ａ２Ｍポリペプチドが、野生型Ａ２Ｍに由来するプロテアーゼ認識配列を含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
野生型Ａ２Ｍに由来する前記プロテアーゼ認識配列のうちの２つまたはそれ超が、同じである、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記変異体Ａ２Ｍポリペプチドが、非天然プロテアーゼ認識配列を含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記非天然プロテアーゼ認識配列のうちの２つまたはそれ超が、同じである、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記変異体Ａ２Ｍポリペプチドが、自殺型阻害因子を含むプロテアーゼ認識配列を含み、前記自殺型阻害因子が、プロテアーゼを、前記変異体Ａ２Ｍポリペプチドに共有結合によって接合させるように作動可能である、請求項１から３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記変異体Ａ２Ｍポリペプチドが、単離されている、請求項１から３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記変異体Ａ２Ｍポリペプチドが、精製されている、請求項１から３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記変異体Ａ２Ｍポリペプチドが、野生型Ａ２ＭによるＦＡＣの形成の阻害と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１４０％、１５０％、１６０％、１８０％、２００％、２２０％、２４０％、２６０％、２８０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、または５００％増強されたＦＡＣの形成の阻害を特徴とする、請求項１から３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記変異体Ａ２Ｍポリペプチドが、配列番号４に対して少なくとも８０％、９０％、または１００％の同一性を有する配列を含む、請求項１から３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記野生型Ａ２Ｍポリペプチドが、配列番号３に対して少なくとも８０％、９０％、または１００％の同一性を有する配列を含む、請求項１から３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記変異体Ａ２Ｍポリペプチドが、野生型Ａ２Ｍのベイト領域以外の配列を含む、請求項１から４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
１または複数の状態を有する対象を処置する方法であって、前記対象に、有効量の、請求項１から４１のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項４３】
前記対象における１または複数のプロテアーゼの非特異的阻害を増大させる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記対象におけるアグリカンＧ３断片の形成の阻害を増大させる、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記対象におけるＦＡＣの形成の阻害を増大させる、請求項４２から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記対象における、組織、軟骨、および椎間板の変性、滑膜炎症、またはこれらの組合せの速度を減少させる、請求項４２から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記１または複数の状態の重症度、発生、進行速度、またはこれらの組合せを低減する、請求項４２から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
１または複数のさらなる担体または薬物を投与するステップをさらに含む、請求項４２から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記１または複数のさらなる担体または薬物が、ハイドロゲル、ヒアルロン酸調製物、ポリマーマイクロスフェア、コルチコステロイド、マイクロ粒子、キトサン、局所麻酔剤、増殖因子、サイトカイン、プロテアーゼ阻害剤、ステロイド、ヒアルロン酸（ＨＡ）、または他の生物学的に活性な自原性もしくは内因性のメディエーターを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記１または複数の状態が、その発症機序がプロテアーゼの活性を含む、変性疾患、慢性創傷、創傷、外傷性疾患、炎症性疾患、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項４２から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記１または複数の状態が、骨関節炎、炎症性関節炎、軟骨形成、軟骨傷害、筋腱付着部症、腱障害、靭帯傷害、骨の変性疾患、軟骨の変性疾患、腱の変性疾患、靭帯の変性疾患、術後状態、創傷の治癒、筋骨格疾患、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項４２から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記１または複数の状態が、関節炎、炎症、靭帯傷害、腱傷害、骨傷害、軟骨変性、軟骨傷害、自己免疫疾患、背部痛、関節痛、関節変性、椎間板変性、脊椎変性、骨変性、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項４２から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記１または複数の状態が、手術により引き起こされる関節炎症、手術により引き起こされる椎間板炎症、関節置換術により引き起こされる関節炎症、椎間板置換術により引き起こされる椎間板炎症、またはこれらの組合せからなる群から選択される、請求項４２から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記１または複数の状態が、がんである、請求項４２から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記対象が、ヒトである、請求項４２から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記対象が、哺乳動物である、請求項４２から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記対象が、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、カエル、ウマまたはヤギである、請求項４２から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記対象が、前記１または複数の状態を有すると既に診断されている、請求項４２から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記組成物を、前記１または複数の状態の病態に関係する解剖学的部位に投与する、請求項４２から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記投与が、中空管デバイスまたは可撓性カテーテルによる注射を含む、請求項４２から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記中空管デバイスが、注射針、シリンジ、またはこれらの組合せを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記投与を、手術手順中に行う、請求項４２から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
単離変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドが、複数のプロテアーゼ認識配列を含む非天然ベイト領域をコードし、前記非天然ベイト領域が、配列番号６〜３０からなる群から選択される配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする配列を有する組成物。
【請求項６４】
前記非天然ベイト領域が、アミノ酸配列番号６〜３０のうちのいずれか１つからなる群から選択される配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９８％、９９．９９％、または１００％の同一性を有する配列をコードする配列を有する、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
前記非天然ベイト領域が、配列番号３１〜８３からなる群から選択されるプロテアーゼ認識アミノ酸配列をコードする、請求項６３または６４に記載の組成物。
【請求項６６】
前記非天然ベイト領域が、野生型Ａ２Ｍ内に存在しないプロテアーゼ認識アミノ酸配列をコードする、請求項６３から６５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６７】
前記変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドが、配列番号２に対して少なくとも９０％、９５％、または１００％の同一性を含む、請求項６３から６６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６８】
野生型Ａ２Ｍポリヌクレオチドが、配列番号１に対して少なくとも９０％、９５％、または１００％の同一性を含む、請求項６３から６７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６９】
前記変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドが、発現ベクター内にある、請求項６３から６８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７０】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドによるプロテアーゼの阻害の増強を決定する方法であって、
（ａ）配列番号６〜３０からなる群から選択される配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９８％、９９．９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む変異体Ａ２Ｍポリペプチドを用意するステップと；
（ｂ）前記変異体Ａ２Ｍポリペプチドを、前記プロテアーゼおよび前記プロテアーゼにより切断される基質と接触させるステップと；
（ｃ）野生型Ａ２Ｍポリペプチドを、前記プロテアーゼおよび前記プロテアーゼにより切断される前記基質と接触させるステップと；
（ｄ）（ｂ）による前記基質の切断量を、（ｃ）による前記基質の切断量と比較し、これにより、前記変異体Ａ２Ｍポリペプチドによる前記プロテアーゼの阻害の前記増強を決定するステップと
を含む方法。
【請求項７１】
変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを製作する方法であって、
（ａ）配列番号２に対して少なくとも９０％、９５％、または１００％の同一性を有する配列を含む変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを含有するベクターを用意するステップと；
（ｂ）前記ベクターを制限酵素で消化して、直鎖状ベクターを形成するステップと；
（ｃ）配列番号６〜３０からなる群から選択される配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９８％、９９．９９％、または１００％の同一性を有する非天然ベイト配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドの一方の端部を前記直鎖状ベクターの一方の端部にライゲーションするステップと；
（ｄ）配列番号６〜３０からなる群から選択される配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９８％、９９．９９％、または１００％の同一性を有する非天然ベイト配列をコードする配列を含む前記ポリヌクレオチドの他方の端部を前記直鎖状ベクターの他方の端部にライゲーションし、これにより、前記変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを形成するステップと
を含む方法。
【請求項７２】
治療における使用のための、請求項１から４１または６３から６９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７３】
非自家療法における使用のための、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
慢性創傷、がん、関節炎、炎症、靭帯傷害、腱傷害、骨傷害、軟骨変性、軟骨傷害、自己免疫疾患、背部痛、関節痛、関節変性、椎間板変性、脊椎変性、骨変性、またはこれらの任意の組合せの処置における使用のための組成物であり、炎症が、手術により引き起こされる関節炎症もしくは椎間板炎症、関節置換術もしくは椎間板置換術により引き起こされる関節炎症もしくは椎間板炎症、またはこれらの組合せを含む、請求項７２または７３に記載の組成物。
【請求項７５】
治療における使用のための医薬を製造するための、請求項１から４１または６３から６９に記載の組成物の使用。
【請求項７６】
前記医薬が、非自家療法における使用のための医薬である、請求項７５に記載の使用。
【請求項７７】
前記医薬が、慢性創傷、がん、関節炎、炎症、靭帯傷害、腱傷害、骨傷害、軟骨変性、軟骨傷害、自己免疫疾患、背部痛、関節痛、関節変性、椎間板変性、脊椎変性、骨変性、手術により引き起こされる関節炎症もしくは椎間板炎症、関節置換術もしくは椎間板置換術により引き起こされる関節炎症もしくは椎間板炎症、またはこれらの任意の組合せの処置における使用のための医薬である、請求項７５または７６に記載の使用。
【請求項７８】
医薬を製造する方法であって、創傷の治癒を促進するのに有効な量の、請求項１から４１または６３から６９に記載の変異体Ａ２Ｍポリペプチド組成物と、薬学的に許容される担体とを一体にするステップを含む方法。
【請求項７９】
治療有効量の、請求項１から４１または６３から６９に記載の変異体Ａ２Ｍポリペプチド組成物と、対象の創傷の処置における使用のための指示書とを含むパッケージ材料を含む製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１４年１１月２０日に出願された米国仮出願第６２／０８２，３０４号の優先権を主張し、当該出願はその全体が参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
脊椎痛および関節痛を引き起こす炎症は、処置が困難でありうる。炎症の程度および関節にかかる力の増大は、関節傷害を結果としてもたらす。関節解剖学的特徴の異常は、老化の顕徴でありうるが、関節傷害はまた、スポーツ選手において見られることが多い軟骨病変など、外傷の結果でもありうる。外傷から生じる関節傷害は、急性炎症と関連することが典型的でありうるが、老化から生じる、関節解剖学的特徴の異常（例えば、骨関節炎）は、慢性状態でありうる。医師は現在のところ、外傷に起因する急性傷害と、加齢関連の関節の劣化とを鑑別するのに利用可能なシステムまたは方法を有さない。
【０００３】
現在、患者が患う特定の状態が、急性であるのか、慢性であるのか、または関節内の病態が、疼痛の原因であるのかどうかは、しばしば不明確であるので、所与の患者に適切な処置コースを決定することは、困難でありうる。
【０００４】
脊椎関連疼痛は、椎間板性疼痛、椎間関節性疼痛、または神経根障害性疼痛として分類されることが典型的でありうる。神経根障害性疼痛の症状は従来、椎間板ヘルニア、狭窄、脊椎すべり症、坐骨神経痛、梨状筋症候群、閉鎖筋症候群、嚢胞性病変（例えば、神経節および滑膜）、腫瘍、および化学的に媒介される原因などの他の病態などの状態と関連する、神経根の圧迫または機械的刺激など、多様な物理的異常および／または機械的異常に帰せられてきた。
【０００５】
脊椎関連疼痛の病態生理を解明するように、多数の研究が試みられており、いくつかの分子経路が、暫定的に示唆されている。しかし、傷害または変性から、有痛状態に至る、明確な因果的経路は、確認されていない。分子マーカーは、臨床症候と連関している可能性があり、診断法および治療用ツールを開発するための、潜在的な標的として用いられうる。一部の研究は、硬膜外腔が、椎間板ヘルニアの影響を受けている可能性があるという証拠をもたらしているが、罹患した人と罹患していない人との差違を検出しようとする試みでは、硬膜外腔内の生体分子の濃度が測定されていない。
【０００６】
筋肉を骨に接続する腱、および骨を他の骨に接続する靭帯はいずれも、線維性結合組織の帯からなる。線維性結合組織の細胞は大部分が、強力な線維性タンパク質（コラーゲン、網膜線維および弾性線維、ならびに糖タンパク質など）を、細胞外マトリックスとして分泌する、不規則で、分枝状の細胞である、線維芽細胞から構成されている。細胞外マトリックスは部分的に、組織のうちの、任意の素材部分であって、任意の細胞の部分ではない素材部分として規定することができる。このように規定される細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、線維性結合組織の著明な特色でありうる。
【０００７】
ＥＣＭの主要な成分は、多様な糖タンパク質でありうる。大半の動物では、ＥＣＭ中で最も夥多な糖タンパク質は、コラーゲンでありうる。コラーゲンは、頑健かつ可撓性であることが可能であり、結合組織に強度を与える。実際、線維性結合組織の主要な要素は、コラーゲン（またはコラーゲン性）線維である。ＥＣＭはまた、他の多くの成分：フィブリンおよびエラスチンなどのタンパク質、ヒドロキシアパタイトなどのミネラル、または分泌された遊離流動抗原を伴う、血漿もしくは血清などの流体も含有する。この多様性を踏まえると、ＥＣＭは、細胞のための支持およびアンカレッジをもたらす機能（接着斑を介して接合させる機能）、組織を分離する方途をもたらす機能、および細胞間コミュニケーションを調節する機能など、任意の数の機能を果たしうる。したがって、ＥＣＭは、細胞の力動的挙動において機能しうる。
【０００８】
腱および靭帯への傷害は、結合組織への損傷のみでなく、細胞外マトリックスへの損傷もまた引き起こす。ＥＣＭへの損傷は、結合組織内の細胞挙動を妨げる可能性があり、治癒を減殺および／または制限しうる。傷害の後も、身体によるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の産生により、持続的損傷が引き起こされうる。ＭＭＰとは、ＥＣＭの全ての成分を分解する酵素である。身体が、自身を治癒させようと試みても、この酵素は、ＥＣＭをリモデリングするので、ＭＭＰは、ＥＣＭの合成と分解との間の不均衡をもたらしうる。ＭＭＰによるリモデリングの過夥多は、既に結合した組織への損傷を引き起こし、これは、結果として、瘢痕組織の形成をもたらす。加えて、瘢痕組織の、周囲の組織への接着は、腱または靭帯の、さらなる引っ張りおよび／または引き伸ばし、ならびに結果として生じる疼痛を引き起こしうる。
【０００９】
今日、腱および靭帯への傷害の処置は、問題を悪化させる活動の回避；傷害領域の休息；傷害日における領域のアイシング；および市販の抗炎症薬の服用など、いくつかの簡単な手段を含む。しかし、これらの簡単な加療で、損傷が常に治るわけではなく、より進んだ処置が必要とされることが多い。これらの処置は、コルチコステロイド注射、血小板リッチ血漿（ＰＲＰ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）注射、理学療法、なおかつ手術も含む。コルチコステロイドは、炎症および疼痛を減殺するのに迅速に作用しうるため、使用されることが多い。理学療法は、ある範囲の運動訓練および副木固定（手指、手掌、および前腕など）を含みうる。手術は、他の処置に応答しない重度の問題に、まれに必要とされるに過ぎない。腱および靭帯の、より迅速で改善された治癒のために、細胞外マトリックスの分解を処置および防止するのに、さらなる処置手段が必要とされていることが察知されうる。
アルファ２−マクログロブリン（Ａ２Ｍ）とは、血漿中に比較的高濃度（０．１〜６ｍｇ／ｍｌ）で存在する、高度に保存的なプロテアーゼ阻害剤である。Ａ２Ｍは、全ての主要なクラスのプロテアーゼを阻害するその能力において固有である（Bhattacharjeeら（２０００年）、J.  Biol.  Chem.、２７５巻、２６８０６〜２６８１１頁）。Ａ２Ｍは、肝細胞、肺線維芽細胞、マクロファージ、星状細胞、および腫瘍細胞など、いくつかの細胞型により産生されうる（Borth  W、「Alpha  2-macroglobulin,  A  multifunctional  binding  and  targeting  protein  with  possible  roles  in  immunity  and  autoimmunity」、Ann.  N.Y.  Acad.  Sci.、７３７巻：２６７〜２７２頁（１９９４年））。Ａ２Ｍは、中空円筒様構造を形成する、１８０ｋＤａの、４つの同一なサブユニットによる四量体として存在することが多い。Ａ２Ｍは、その中央の「ベイト」ドメイン内に、攻撃するプロテアーゼに対する、複数の標的ペプチド結合を提示しうる。Ａ２Ｍは、ヘビ毒など、外来のプロテアーゼに作用する、主要なプロテアーゼ阻害剤でありうる。しかし、循環中には、他の多くのプロテアーゼ阻害剤が存在し、Ａ２Ｍは、サイトカインおよび増殖因子への結合ならびにこれらの活性の調節、マクロファージの殺腫瘍能の促進、および抗原提示の増強を含む、他の機能を有しうることも提起されている。Ａ２Ｍはまた、サイトカインまたは増殖因子に対するターゲティング担体でもありうる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Bhattacharjeeら（２０００年）、J.  Biol.  Chem.、２７５巻、２６８０６〜２６８１１頁
【非特許文献２】Borth  W、「Alpha  2-macroglobulin,  A  multifunctional  binding  and  targeting  protein  with  possible  roles  in  immunity  and  autoimmunity」、Ann.  N.Y.  Acad.  Sci.、７３７巻：２６７〜２７２頁（１９９４年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、本発明の目的は、脊椎内または関節内の炎症、疼痛、細胞外マトリックスの分解の、検出、診断、および処置、ならびにフィブロネクチン−アグリカン複合体（ＦＡＣ）（図１）の阻害のための、組成物、システム、方法、およびキットを提供することである。本発明の別の目的は、疼痛を処置するために、脊椎内または関節内の部位を同定するための、バイオマーカーおよび方法を提供することである。本発明の別の目的は、脊椎関連疼痛または関節関連疼痛の原因となる病態の存在を診断するか、またはこれについての診断の一助とするのに使用しうるバイオマーカーを提供することである。本発明の別の目的は、脊椎関連疼痛または関節関連疼痛の原因となる病態の存在を診断するか、またはこれについての診断の一助とするための方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、脊椎関連疼痛または関節関連疼痛を受ける対象に適切な治療を決定する、バイオマーカーおよび方法を提供することである。本発明の別の目的は、脊椎関連疼痛または関節関連疼痛のための処置の有効性をモニタリングし、評価する、バイオマーカーおよび方法を提供することである。本発明の別の目的は、脊椎痛または関節痛を処置し、疼痛を阻害または低減する処置のための、脊椎内または関節内の処置部位を選択するための組成物および方法を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、検出、診断、および炎症の処置、細胞外マトリックスの分解、および創傷のための、組成物、システム、方法、およびキットを提供することである。本発明の別の目的は、炎症、細胞外マトリックスの分解、および慢性創傷の処置のための組成物を作製するシステムおよび方法を提供することである。本発明の別の目的は、慢性創傷の部位を同定するためのバイオマーカーおよび方法を提供することである。本発明の別の目的は、慢性創傷の原因となる病態の存在を診断するか、またはこれについての診断の一助とするための方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、慢性創傷を受ける対象に適切な治療を決定する、バイオマーカーおよび方法を提供することである。本発明の別の目的は、慢性創傷のための処置の有効性をモニタリングし、評価する、バイオマーカーおよび方法を提供することである。本発明の別の目的は、慢性創傷を処置し、慢性創傷の処置のための処置部位および方法を選択するための組成物および方法を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、慢性創傷を処置するための変異体ポリペプチドを提供することである。本発明の別の目的は、野生型Ａ２Ｍポリペプチドよりプロテアーゼ阻害活性が大きな、変異体Ａ２Ｍポリペプチドを提供することである。本発明の別の目的は、慢性創傷の処置のための変異体ポリペプチドを製作する方法を提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、炎症および疼痛を処置するための変異体ポリペプチドを提供することである。本発明の別の目的は、フィブロネクチン−アグリカン複合体（ＦＡＣ）の形成を阻害する変異体Ａ２Ｍポリペプチドを提供することである。本発明の別の目的は、野生型Ａ２Ｍポリペプチドよりプロテアーゼ阻害活性が大きな、変異体Ａ２Ｍポリペプチドを提供することである。本発明の別の目的は、炎症および疼痛の処置のための変異体ポリペプチドを製作する方法を提供することである。
【００１５】
一部の態様では、ベイト領域を含む変異体Ａ２Ｍポリペプチドを含む組成物であって、変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域が、一連に配置された、複数のプロテアーゼ認識部位を含む組成物が提供される。一部の実施形態では、変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、組換えタンパク質である。一部の実施形態では、変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、もしくは哺乳動物細胞、または無細胞系を含む宿主内で産生される。一部の実施形態では、変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、またはこれらの任意の組合せの、非特異的阻害の増強を特徴とする。一部の実施形態では、変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、ＰＥＧを伴う非正常グリコシル化部位をさらに含む。一部の実施形態では、変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、対象の関節または脊椎椎間板内に位置すると、野生型Ａ２Ｍタンパク質の半減期より長い半減期を有する。一部の実施形態では、複数のプロテアーゼ認識部位は、Ａ２Ｍ以外の、１もしくは複数のタンパク質に由来する、１もしくは複数のプロテアーゼ基質ベイト領域、Ａ２Ｍに由来する、１もしくは複数のさらなるプロテアーゼベイト領域、１もしくは複数の非天然タンパク質配列、またはこれらの任意の組合せを含み、修飾Ａ２Ｍタンパク質は、野生型Ａ２Ｍタンパク質のプロテアーゼ阻害有効性と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または３０％増大したプロテアーゼ阻害有効性を特徴とする。一部の実施形態では、非天然タンパク質配列は、プロテアーゼに対するベイトとして機能しうる、１または複数のプロテアーゼ認識部位を含む。一部の実施形態では、１または複数のプロテアーゼ基質ベイト領域は、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテイナーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、またはこれらの任意の組合せについてのコンセンサス配列を含む。一部の実施形態では、プロテアーゼ基質ベイト領域は、１または複数の生物に由来する１または複数のプロテアーゼについての１または複数のコンセンサス配列を含む。一部の実施形態では、１または複数の生物は、動物、植物、細菌、酵母、魚類、爬虫類、両生類、または真菌を含む。一部の実施形態では、Ａ２Ｍ以外の、１または複数のタンパク質に由来する１または複数のプロテアーゼ基質ベイト領域のうちの１または複数は、同じである。一部の実施形態では、Ａ２Ｍに由来する１または複数のプロテアーゼ基質ベイト領域のうちの１または複数は、同じである。一部の実施形態では、１または複数の非天然タンパク質配列に由来する１または複数のプロテアーゼ基質ベイト領域のうちの１または複数は、同じである。一部の実施形態では、Ａ２Ｍ以外の、１もしくは複数のタンパク質、または１もしくは複数の非天然タンパク質配列に由来する１または複数のプロテアーゼ基質ベイト領域のうちの１または複数は、自殺型阻害因子を含み、自殺型阻害因子は、プロテアーゼを、Ａ２Ｍに共有結合によって接合させるように作動可能である。一部の実施形態では、１または複数のプロテアーゼ基質ベイト領域のうちの１または複数は、異なる種に由来する。
【００１６】
一部の態様では、本明細書では、単離変異体Ａ２Ｍポリペプチドを含む組成物であって、変異体Ａ２Ｍポリペプチドが、１または複数の非天然ベイト領域を含み、１または複数の非天然ベイト領域が、野生型Ａ２Ｍポリペプチド内に存在しない、１または複数のプロテアーゼ認識部位を含む組成物が提供される。一部の実施形態では、修飾Ａ２Ｍポリペプチドは、野生型Ａ２Ｍによる１または複数のプロテアーゼの阻害と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または３０％増強された１または複数のプロテアーゼの阻害を特徴とする。一部の実施形態では、阻害の増強は、非特異的阻害の増強を含む。一部の実施形態では、阻害の増強は、特異的阻害の増強を含む。一部の実施形態では、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、プロテアーゼは、ＭＭＰ１（間質コラゲナーゼ）、ＭＭＰ２（ゼラチナーゼＡ）、ＭＭＰ３（ストロメリシン１）、ＭＭＰ７（マトリリシン、ＰＵＭＰ１）、ＭＭＰ８（好中球コラゲナーゼ）、ＭＭＰ９（ゼラチナーゼＢ）、ＭＭＰ１０（ストロメリシン２）、ＭＭＰ１１（ストロメリシン３）、ＭＭＰ１２（マクロファージメタロエラスターゼ）、ＭＭＰ１３（コラゲナーゼ３）、ＭＭＰ１４（ＭＴ１−ＭＭＰ）、ＭＭＰ１５（ＭＴ２−ＭＭＰ）、ＭＭＰ１６（ＭＴ３−ＭＭＰ）、ＭＭＰ１７（ＭＴ４−ＭＭＰ）、ＭＭＰ１８（コラゲナーゼ４、ｘｃｏｌ４、Ｘｅｎｏｐｕｓ属コラゲナーゼ）、ＭＭＰ１９（ＲＡＳＩ−１、ストロメリシン４）、ＭＭＰ２０（エナメリシン）、ＭＭＰ２１（Ｘ−ＭＭＰ）、ＭＭＰ２３Ａ（ＣＡ−ＭＭＰ）、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ２４（ＭＴ５−ＭＭＰ）、ＭＭＰ２５（ＭＴ６−ＭＭＰ）、ＭＭＰ２６（マトリリシン２、エンドメターゼ）、ＭＭＰ２７（ＭＭＰ−２２、Ｃ−ＭＭＰ）、ＭＭＰ２８（エピリシン）；ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＤＡＭＴＳ３、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５（ＡＤＡＭＴＳ１１）、ＡＤＡＭＴＳ６、ＡＤＡＭＴＳ７、ＡＤＡＭＴＳ８（ＭＥＴＨ−２）、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＤＡＭＴＳ１０、ＡＤＡＭＴＳ１２、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＡＤＡＭＴＳ１４、ＡＤＡＭＴＳ１５、ＡＤＡＭＴＳ１６、ＡＤＡＭＴＳ１７、ＡＤＡＭＴＳ１８、ＡＤＡＭＴＳ１９、ＡＤＡＭＴＳ２０などのＡＤＡＭＴＳ（Ａ  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  Ｍｏｔｉｆｓ）プロテアーゼ；キモトリプシン；トリプシン；エラスターゼ；補体因子；凝固因子；トロンビン；プラスミン；スブチリシン；ネプリリシン；プロコラーゲンペプチダーゼ；テルモリシン；妊娠関連血漿タンパク質Ａ；骨形成タンパク質１；リソスタフィン；インスリン分解酵素；ＺＭＰＳＴＥ２；ＺＭＰＳＴＥ４；ＺＭＰＳＴＥ２４；アセチルコリンエステラーゼ；またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、プロテアーゼは、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＭＭＰ１３、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、修飾Ａ２Ｍポリペプチドは、野生型Ａ２ＭによるＦＡＣの形成の阻害と比較して、少なくとも１０％の増強されたＦＡＣの形成の阻害を特徴とする。一部の実施形態では、１または複数の非天然ベイト領域は、Ａ２Ｍ以外の、１または複数のタンパク質に由来する。一部の実施形態では、Ａ２Ｍ以外の、１または複数のタンパク質は、非ヒト生物に由来する。一部の実施形態では、非ヒト生物は、動物、植物、細菌、酵母、魚類、爬虫類、両生類、または真菌を含む。一部の実施形態では、１または複数の非天然ベイト領域は、配列番号６〜８３またはこれらの断片のうちの、１または複数の配列を含む。一部の実施形態では、変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、配列番号４またはその断片を含む。一部の実施形態では、１または複数の非天然ベイト領域は、配列番号６〜３０を含む。一部の実施形態では、１または複数のプロテアーゼ認識配列は、配列番号３１〜８３またはこれらの断片を含む。一部の実施形態では、野生型Ａ２Ｍポリペプチドは、配列番号３またはその断片を含む。野生型Ａ２Ｍベイト領域は、配列番号５からなる。一部の実施形態では、１または複数の非天然ベイト領域のうちの１または複数は、自殺型阻害因子を含み、自殺型阻害因子は、プロテアーゼを、変異体Ａ２Ｍポリペプチドに共有結合によって接合させるように作動可能である。一部の実施形態では、１または複数のプロテアーゼ認識部位は、１または複数のプロテアーゼ認識配列の２つまたはそれ超のコピーを含む。一部の実施形態では、１または複数の非天然ベイト領域は、１または複数の非天然ベイト領域の２つまたはそれ超のコピーを含む。一部の実施形態では、変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、野生型Ａ２Ｍベイト領域の配列を含む。一部の実施形態では、変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、組換えポリペプチドである。一部の実施形態では、１または複数のプロテアーゼ認識部位は、プロテアーゼについてのコンセンサス配列を含む。一部の実施形態では、変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、１または複数の修飾グリコシル化部位を含む。一部の実施形態では、１または複数の修飾グリコシル化部位を、ＰＥＧで機能化する。一部の実施形態では、変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、対象内に位置すると、野生型Ａ２Ｍポリペプチドの半減期より、少なくとも１０％長い半減期を有する。
【００１７】
一部の態様では、本明細書では、１または複数の状態を有する対象を処置する方法であって、対象に、有効量の、本明細書で提供される任意の組成物であり、Ａ２Ｍ変異体を含む組成物を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、対象における、１または複数のプロテアーゼの非特異的阻害、アグリカンＧ３断片の形成の阻害、ＦＡＣの形成の阻害、またはこれらの組合せを増大させる。一部の実施形態では、対象における、組織、軟骨、および椎間板の変性、滑膜炎症、またはこれらの組合せの速度を減少させる。一部の実施形態では、処置は、１または複数の状態の重症度、発生、進行速度、またはこれらの組合せの低減を結果としてもたらす。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法のうちのいずれかは、１または複数のさらなる担体または薬物を投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、１または複数のさらなる担体または薬物は、ハイドロゲル、ヒアルロン酸調製物、ポリマーマイクロスフェア、コルチコステロイド、マイクロ粒子、キトサン、局所麻酔剤、増殖因子、サイトカイン、プロテアーゼ阻害剤、ステロイド、ヒアルロン酸（ＨＡ）、または他の生物学的に活性な自原性もしくは内因性のメディエーターを含む。一部の実施形態では、１または複数の状態は、本明細書で提供される任意の組成物で処置可能である。一部の実施形態では、１または複数の状態は、その発症機序がプロテアーゼの活性を含む、がん、変性疾患、外傷性疾患、および／または炎症性疾患を含む。一部の実施形態では、その発症機序がプロテアーゼの活性を含む、がん、変性疾患、外傷性疾患、および／または炎症性疾患は、骨関節炎、炎症性関節炎、軟骨形成、軟骨傷害、筋腱付着部症、腱障害、靭帯傷害、骨の変性疾患、軟骨の変性疾患、腱の変性疾患、および靭帯の変性疾患、術後状態および創傷の治癒、ならびに他の筋骨格疾患を含む。一部の実施形態では、１または複数の状態は、がん、関節炎、炎症、靭帯傷害、腱傷害、骨傷害、軟骨変性、軟骨傷害、自己免疫疾患、背部痛、関節痛、関節変性、椎間板変性、脊椎変性、骨変性、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、炎症は、手術により引き起こされる関節炎症もしくは椎間板炎症、関節置換術もしくは椎間板置換術により引き起こされる関節炎症もしくは椎間板炎症、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、対象は、ヒト、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、カエル、ウマまたはヤギである。一部の実施形態では、対象は、１または複数の状態を有すると既に診断されている。一部の実施形態では、組成物を、宿主病態に関係する解剖学的部位に投与する。一部の実施形態では、投与は、中空管デバイスまたは可撓性カテーテルの組合せによる注射を含む。一部の実施形態では、中空管デバイスは、注射針、シリンジ、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、投与を、手術手順中に行う。
【００１８】
一部の態様では、本明細書では、単離変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを含む組成物であって、変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドが、１または複数の非天然ベイト領域をコードし、１または複数の非天然ベイト領域が、野生型Ａ２Ｍポリペプチド内に存在しない、１または複数のプロテアーゼ認識部位を含む組成物が提供される。一部の実施形態では、非天然ベイト領域は、配列番号６〜８３またはこれらの断片のうちのいずれか１つに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、非天然ベイト領域は、配列番号３１〜８３のうちのいずれか１つに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の同一性を有する１または複数のプロテアーゼ認識配列を含む。一部の実施形態では、変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドは、配列番号２またはその断片に対して少なくとも９０％の同一性を含む。一部の実施形態では、野生型Ａ２Ｍポリヌクレオチドは、配列番号１またはその断片を含む。一部の実施形態では、変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドは、発現ベクター内にある。
【００１９】
一態様では、本明細書では、変異体Ａ２Ｍポリペプチドによるプロテアーゼの阻害の増強を決定するための方法であって、（ａ）配列番号６〜８３のうちの、１または複数の配列を含む変異体Ａ２Ｍポリペプチドを用意するステップと；（ｂ）変異体Ａ２Ｍポリペプチドを、プロテアーゼおよびプロテアーゼにより切断される基質と接触させるステップと；（ｃ）野生型Ａ２Ｍポリペプチドを、プロテアーゼおよびプロテアーゼにより切断される基質と接触させるステップと；（ｄ）ステップ（ｂ）による基質の切断量を、ステップ（ｃ）による基質の切断量と比較し、これにより、変異体Ａ２Ｍポリペプチドによるプロテアーゼの阻害の増強を決定するステップとを含む方法が提供される。
【００２０】
一部の態様では、本明細書では、変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを製作するための方法であって、（ａ）配列番号２の配列を含む変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを含有するベクターを用意するステップと；（ｂ）変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを含有するベクターを制限エンドヌクレアーゼで消化して、直鎖状ベクターを形成するステップと；（ｃ）配列番号６〜８３の非天然ベイト領域のうちの１または複数をコードする１または複数のポリヌクレオチドの一方の端部を、直鎖状ベクターの一方の端部にライゲーションするステップと；（ｄ）配列番号６〜８３の非天然ベイト領域のうちの１または複数をコードする１または複数のポリヌクレオチドの他方の端部を、直鎖状ベクターの他方の端部にライゲーションし、これにより、配列番号６〜８３の非天然ベイト領域を含む、変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを含有するベクターを形成するステップとを含む方法が提供される。
【００２１】
一部の態様では、本明細書では、変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを製作するための方法であって、（ａ）配列番号２の配列を含む、変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを含有するベクターを用意するステップと；（ｂ）変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを含有するベクターを制限エンドヌクレアーゼで消化して、直鎖状ベクターを形成するステップと；（ｃ）配列番号６〜３０の非天然ベイト領域のうちの１もしくは複数、または配列番号３１〜８３の１もしくは複数のプロテアーゼ認識部位をコードする１または複数のポリヌクレオチドの一方の端部を直鎖状ベクターの一方の端部にライゲーションするステップと；（ｄ）配列番号６〜３０の非天然ベイト領域のうちの１もしくは複数、または配列番号３１〜８３の１もしくは複数のプロテアーゼ認識部位をコードする、１または複数のポリヌクレオチドの他方の端部を、直鎖状ベクターの他方の端部にライゲーションし、これにより、配列番号６〜３０の非天然ベイト領域、または配列番号３１〜８３の、１もしくは複数のプロテアーゼ認識部位を含む、変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを含有するベクターを形成するステップとを含む方法が提供される。
【００２２】
一部の態様では、変異体Ａ２Ｍポリペプチドまたは変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを含む組成物であって、本明細書で提供される任意の方法により得られる組成物が提供される。
【００２３】
一態様では、本明細書では、治療における使用のための、Ａ２Ｍを含む組成物であって、本明細書で提供される任意の方法により得られる組成物、または本明細書で提供される、任意の変異体Ａ２Ｍ組成物である組成物が提供される。一部の実施形態では、組成物は、がん、関節炎、炎症、靭帯傷害、腱傷害、骨傷害、軟骨変性、軟骨傷害、自己免疫疾患、背部痛、関節痛、関節変性、椎間板変性、脊椎変性、骨変性、またはこれらの任意の組合せの処置における使用のための組成物であり、炎症は、手術により引き起こされる関節炎症もしくは椎間板炎症、関節置換術もしくは椎間板置換術により引き起こされる関節炎症もしくは椎間板炎症、またはこれらの組合せを含む。
【００２４】
一態様では、本明細書では、治療における使用のための医薬を製造するための、本明細書で提供される任意の方法により得られる組成物、または本明細書で提供される、任意の変異体Ａ２Ｍ組成物の使用が提供される。一部の実施形態では、医薬は、がん、関節炎、炎症、靭帯傷害、腱傷害、骨傷害、軟骨変性、軟骨傷害、自己免疫疾患、背部痛、関節痛、関節変性、椎間板変性、脊椎変性、骨変性、またはこれらの任意の組合せの処置における使用のための医薬であり、炎症は、手術により引き起こされる関節炎症もしくは椎間板炎症、関節置換術もしくは椎間板置換術により引き起こされる関節炎症もしくは椎間板炎症、またはこれらの組合せを含む。
【００２５】
参照による組込み
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれることが、具体的かつ個別に指し示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。万一、本明細書の用語と、参照により組み込まれる用語との間の利益相反の場合は、本明細書の用語が優先される。
【００２６】
特定された新規の特色は、付属の特許請求の範囲に明示される。特色および利点についてのよりよい理解は、デバイス、方法、および組成物についての原理が活用される、例証的な実施形態を明示する、以下の詳細な記載、ならびに付属の図面を参照することにより得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、フィブロネクチン−アグリカン複合体（ＦＡＣ）の形成、および細胞内の、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）受容体シグナル伝達の、ＦＡＣにより誘導される活性化と関連する、ステップおよびシグナル伝達経路についての概略を描示する図である。２つの過程の組合せは、軟骨を持続的に分解する、周期的過程を創出する。
【００２８】
【図２】図２は、フィブロネクチンを使用して、精製全長アグリカンまたは組換えＧ３アグリカンとの複合体を形成する、ＦＡＣの形成を描示する図である。アグリカンおよびＧ３ドメインのいずれも、フィブロネクチンに結合して、ＦＡＣを形成する。
【００２９】
【図３】図３は、構築物またはタンパク質を発現させるためのステップについてのフローチャートを描示する図である。
【００３０】
【図４】図４は、Ａ２Ｍの構造およびＡ２Ｍの多様なドメインを描示する図である。
【００３１】
【図５】図５Ａは、ウシ軟骨外植片（ＢＣＥ）の、白血球リッチ血小板リッチ血漿（ＬＲ−ＰＲＰ）による処理が、軟骨の異化を誘導し、精製Ａ２Ｍによる処置は、軟骨の分解を阻害することを裏付けるグラフを描示する図である。
【００３２】
図５Ｂは、ウシ軟骨外植片（ＢＣＥ）の、同じ患者に由来する、ＡＰＩＣ−ＰＲＰ、血液、または白血球リッチ血小板リッチ血漿（ＬＲ−ＰＲＰ）による処置を裏付けるグラフを描示する図である。ＬＲ−ＰＲＰは、軟骨の異化を誘導するが、血液は、これを誘導しない。ＢＣＥの、ＡＰＩＣ−ＰＲＰによる処置は、軟骨の分解を、内因性レベルを下回るように阻害する。
【００３３】
図５Ｃは、白血球リッチ血小板リッチ血漿（ＬＲ−ＰＲＰ）が、ウシ軟骨外植片（ＢＣＥ）モデルにおける、軟骨の異化を誘導することを裏付けるグラフを描示する図である。ＡＰＩＣ−ＰＲＰによる処置は、ＬＲ−ＰＲＰによる処理が誘導した軟骨の分解を阻害する。
【００３４】
【図６】図６Ａは、炎症促進性サイトカインである、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βで処理された、ウシ軟骨外植片（ＢＣＥ）が、軟骨の異化を誘導することを示すグラフを描示する図である。各サイトカインによる軟骨の異化は、硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）の、培養培地への放出により、個別に裏付けられる。ＡＰＩＣ−ＰＲＰによる処置は、各炎症促進性サイトカインによる軟骨の異化を、個別に、効果的に阻害する。
【００３５】
図６Ｂは、炎症促進性サイトカインである、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの組合せで処理された、ウシ軟骨外植片（ＢＣＥ）が、軟骨の異化を誘導することを示すグラフを描示する図である。ＡＰＩＣ−ＰＲＰによる処置は、炎症促進性サイトカインの組合せによる軟骨の異化を、用量依存的に、効果的に阻害した。
【００３６】
【図７】図７Ａは、ＡＤＡＭＴＳ−５による処理であり、精製Ａ２Ｍの系列希釈液を伴うかまたは伴わない処理を伴うＢＣＥモデル、およびこれを伴わないＢＣＥモデルにおいて、軟骨の異化時に放出される硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）（上）を描示する図である。試料についてのウェスタンブロット（下）は、ＡＤＡＭＴＳ−５による軟骨の分解が、アグリカンＧ３断片および高分子量のアグリカン断片をもたらしたが、Ａ２Ｍによる処置が、これを用量依存的に阻害したことを裏付ける。柱状グラフの上方の値は、ＡＤＡＴＭＳ−５を阻害するのに必要とされる、Ａ２Ｍの濃度（μｇ／ｍｌ）を指し示す。８５ｋＤａの非特異的バンドもまた、目視可能であるが、これは、培地のみの対照におけるバンドであることが明らかであった（データは示さない）。
【００３７】
図７Ｂは、ＡＤＡＭＴＳ−４による処理であり、精製Ａ２Ｍの系列希釈液を伴うかまたは伴わない処理を伴うＢＣＥモデル、およびこれを伴わないＢＣＥモデルにおいて、軟骨の異化時に放出される硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）（上）を描示する図である。試料についての、α−アグリカンＧ３抗体によるウェスタンブロット解析（下）は、ＡＤＡＭＴＳ−４による軟骨の分解が、Ｇ３ドメインを含有する、高分子量のアグリカンＣ末端断片をもたらしたことを裏付ける。Ａ２Ｍは、軟骨の異化を、用量依存的に阻害し、軟骨アグリカン断片の放出を低減する。８５ｋＤａの非特異的バンドもまた、目視可能であるが、これは、培地のみの対照におけるバンドであることが明らかであった（データは示さない）。
【００３８】
【図８】図８Ａは、ＭＭＰ−７およびＭＭＰ−１２による処理を伴うＢＣＥモデル、およびこれを伴わないＢＣＥモデルにおいて、軟骨の異化時に放出される硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）を裏付けるグラフを描示する図である。精製Ａ２Ｍによる処置は、ＭＭＰにより誘導される軟骨の異化を阻害した。
【００３９】
図８Ｂは、図９Ａにおいて作製される試料についての、染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを描示する図である。ＭＭＰ−７またはＭＭＰ−１２により誘導される軟骨の分解、およびゲル内で目視可能な、軟骨タンパク質断片の産生は、精製Ａ２Ｍの添加により阻害された。
【００４０】
図８Ｃは、図８Ｂによるゲル、および図８Ａによる試料を使用する、α−アグリカンＧ３抗体によるウェスタンブロットを描示する図である。ＭＭＰ−７またはＭＭＰ−１２による軟骨の分解は、約３０ｋＤａにおいて、アグリカンＧ３断片をもたらすが、これは、精製Ａ２Ｍの添加により阻害することができる。
【００４１】
【図９】図９は、フィブロネクチンと、アグリカンＧ３との複合体を認識するＥＬＩＳＡ試験の結果（ＦＡＣＴ：フィブロネクチン−アグリカン複合体試験）を描示する図である。列挙されたプロテアーゼを伴うかまたは伴わずに、Ａ２Ｍの存在下または非存在下で処置されたＢＣＥに由来する培養培地を、遊離フィブロネクチンでスパイクされた滑液（ＳＦ）と共にインキュベートし、ＦＡＣＴアッセイで調べた。軟骨の分解が、アグリカン断片をもたらした各場合において、結果は、ＳＦバックグラウンド対照を上回る、さらなるフィブロネクチン−アグリカン複合体の形成であった。Ａ２Ｍによる処置は、軟骨の異化を防止したが、その後、ＦＡＣの形成も防止した。
【００４２】
【図１０】図１０は、ＡＰＩＣ（５００ｋＤａのフィルターに由来する保持液）および濾液が、軟骨の分解を防止する能力を裏付ける、２つの棒グラフを描示する図である。軟骨の異化は、ＢＣＥモデルにおいて、ＡＤＡＭＴＳ−５により誘導され、ＡＰＩＣの系列希釈液は、これを阻害しえた（左、保持液）が、Ａ２Ｍを欠く濾液は、これを阻害しえなかった（右、濾液）。柱状グラフの上方の数は、培養培地中の、ＡＰＩＣ（ｖ／ｖ）または濾液の百分率を表す。濾液のうちの５％中の阻害潜在力は、ＡＰＩＣのうちの０．０１％中の阻害潜在力と同等であるので、ＡＰＩＣの作製工程は、血液の軟骨保護効果のうちの＞９９％を濃縮する。
【００４３】
【図１１】図１１は、培養物中で２日間にわたる、変異体Ａ２Ｍによる、ＴＨＰ−１単球の処置の効果を描示する棒グラフである。サイトカイン、ケモカイン、および増殖因子のパネル（左から右へ：ＩＬ−１β、ＩＬ−１受容体アゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１０、ＭＩＰ−１β、ＰＤＧＦ−ββ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−α、およびＶＥＧＦ）によるモニタリングを介して、単球の活性化は観察されなかった。
【００４４】
【図１２】図１２は、ＡＣＬ−Ｔ術および生理食塩液またはＡＰＩＣ  ｃｅｌｌ  ｆｒｅｅによる処置の６週間の後における、ウサギ膝の顕微鏡画像を描示する図である。ＡＣＬ−Ｔを伴わない偽手術を、対照として実施した。
【００４５】
【図１３】図１３Ａは、図１２で示した実験のための、巨視的査定についてのグラフを描示する図である。示される値は、６匹のウサギについての巨視的査定の平均である。
【００４６】
図１３Ｂは、図１２で示した実験について、ＡＰＩＣ  ｃｅｌｌ  ｆｒｅｅ処置におけるＡ２Ｍと、軟骨の分解との逆相関を示す、巨視的査定についてのグラフを描示する図である。
【００４７】
【図１４】図１４は、図１２および１３で描示される実験による、ウサギ膝についての組織病理学査定であって、構造、軟骨細胞密度、Ｓａｆａｒｉｎ−Ｏ染色、およびクラスター形成の査定を含む査定についてのグラフを描示する図であり、各ウサギのＡＰＩＣ中のＡ２Ｍ濃度と、評定基準との間の逆相関を示す。異常値を示す１匹のウサギ直線上の計算からは除外するが、図に含まれる。
【００４８】
【図１５】図１５は、タグ付けされた、野生型Ａ２Ｍタンパク質と、４つの選択された可変ベイト領域Ａ２Ｍタンパク質との代表的精製についての、擬似カラーによる、色素非含有ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの描示である。野生型Ａ２Ｍの単量体の理論的分子量は、１６３ＫＤａであり、グリコシル化を含まない。２５０ＫＤａを上回る、不明瞭なバンドは、試料調製時に完全に還元されていないか、またはアミノ酸修飾機構を介して、共有結合によって結合した二量体である、二量体のＡ２Ｍから構成される。
【００４９】
【図１６】図１６は、ＡＤＡＭＴＳ−５による、アグリカンＩＧＤドメイン（ＩＧＤ断片）の切断の、野生型（ＷＴ）Ａ２Ｍおよびベイト領域を置換したＡ２Ｍによる阻害についての、代表的スクリーニングアッセイの、擬似カラーによる、色素非含有ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（上）およびウェスタンブロット（下）の描示である。陰性対照は、ＩＧＤ断片タンパク質単独であり、陽性対照は、ＩＧＤ断片に加えたＡＤＡＭＴＳ−５である。ＡＤＡＭＴＳ−５、野生型Ａ２Ｍ、および変異体Ａ２Ｍは各々、５０ｎＭで保ち、Ａ２ＭとＡＤＡＭＴＳ−５とは、ＩＧＤ断片を添加する前に、１０分間にわたり、あらかじめ混合した。ウェスタンブロットのための一次抗体は、抗アグリカンＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ）であった。
【００５０】
【図１７】図１７は、２つのＩＧＤスクリーニング実験により決定される、多様なＭＭＰならびにＡＤＡＭＴＳ−４およびＡＤＡＭＴＳ−５に対する、４つの選び出された変異体の相対的な阻害特徴についての比較を描示するグラフである。各場合に、ｙ軸の単位は、野生型による、各プロテアーゼの阻害の倍数である。
【００５１】
【図１８】図１８Ａは、タグ付けされた、野生型Ａ２Ｍ（ＷＴ）、または４つの選び出されたＡ２Ｍ変異体の存在下における、ウシトリプシンによる、ＦＴＣ−カゼインの消化についての、生データ（左）および計算された傾き（右）を描示する図である。「−Ｄ」を伴わない試料は、Ａ２Ｍ：プロテアーゼのモル比を１：１として調製されている。「−Ｄ」を伴う試料は、Ａ２Ｍ：プロテアーゼの比を０．５：１として調製されている。
【００５２】
図１８Ｂは、タグ付けされた、野生型Ａ２Ｍ（ＷＴ）、または４つの選び出されたＡ２Ｍ変異体の存在下における、キモトリプシンによる、ＦＴＣ−カゼインの消化についての、生データ（左）および計算された傾き（右）を描示する図である。「−Ｄ」を伴わない試料は、Ａ２Ｍ：プロテアーゼのモル比を１：１として調製されている。「−Ｄ」を伴う試料は、Ａ２Ｍ：プロテアーゼの比を０．５：１として調製されている。
【００５３】
【図１９】図１９は、ＭＭＰ３の存在下で、ＩＧＤ断片を、基質として使用する切断アッセイについてのウェスタンブロット解析を描示する図である。
【００５４】
【図２０】図２０は、表示の変異体による、ＩＧＤ断片のタンパク質分解の阻害であって、野生型Ａ２Ｍに対する百分率としての阻害についての図表（上）と、表示のＡ２Ｍ変異体に対応するベイト配列の配列（下）とを描示する図である。
【００５５】
【図２１】図２１は、表示のタンパク質の既知量の関数としての、Ａ２Ｍの分解形態および非分解形態（上）と、プロテアーゼの存在下で、ある時間経過にわたる、多様なＡ２Ｍポリペプチドの切断（下）とについての対照ブロットを示す、ウェスタンブロットを描示する図である。対照ブロットを使用して、切断されたＡ２Ｍの量であって、プロテアーゼ阻害の速度と正比例する量を定量することができる。
【００５６】
【図２２】図２２は、プロテアーゼの混合物による、ＩＧＤドメインの消化に対する、Ａ２Ｍ野生型の、変異体の一部と対比した保護効果を描示する図である。各々１０ｎＭの、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ１３、ＡＤＡＭＴＳ４、およびＡＤＡＭＴＳ５を、混合し、野生型Ａ２ＭおよびＡ２Ｍ変異体の存在下または非存在下で、ＩＧＤを消化するのに使用した。
【００５７】
【図２３】図２３は、哺乳動物発現ベクターである、ｐＪ６０８についてのベクターマップを描示する図である。野生型Ａ２Ｍおよび変異体Ａ２ＭをコードするＯＲＦ配列は、Ｋｐｎ１制限部位と、ＢａｍＨ１制限部位との間にクローニングされる。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本明細書では、脊椎内または関節内の炎症、疼痛、および細胞外マトリックスの分解の、検出、診断、および処置のための、組成物、方法、キット、およびシステムが提供される。
【００５９】
本発明の１または複数の実施形態の詳細を、付属の図面、特許請求の範囲、および本明細書における記載に明示する。本明細書で開示および企図される、本発明の実施形態の、他の特色、目的、および利点は、記載および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。そうでないことが指し示されない限りにおいて、本明細書で使用される冠詞である「ａ（ある）」とは、そうでないことが明示的に仮定されない限りにおいて、「１または複数」を意味する。そうでないことが指し示されない限りにおいて、本明細書で使用される、「〜を含有する」、「〜を含有すること」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「〜を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの用語は、「〜を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味する。そうでないことが指し示されない限りにおいて、本明細書で使用される「または」という用語は、統合的な場合もあり、選言的な場合もある。そうでないことが指し示されない限りにおいて、本明細書で使用される、任意の実施形態は、他の任意の実施形態と組み合わせることができる。そうでないことが指し示されない限りにおいて、本明細書で使用される、本明細書における、本発明の一部の実施形態は、数値範囲を企図する。範囲が存在する場合、範囲は、範囲の端点を含む。加えて、範囲内のあらゆる部分範囲および値も、明記された場合と同様に存在する。
【００６０】
定義
「非免疫原性」または「非抗原性」という用語は、対象に投与される組成物が、免疫応答を誘発しないことを意味する。
【００６１】
「対象」とは、本発明の組成物の、ドナー、レシピエント、または宿主を指す。一部の実施形態では、ドナーとレシピエントとは、同じである。一部の実施形態では、対象は、ヒト対象である。
【００６２】
「プロテオグリカン」とは、タンパク質の特殊なクラスであって、グリコシル化の度合いが大きいクラスを指す。プロテオグリカンは、多数の高硫酸化グリコサミノグリカン鎖を、共有結合によって接合させたコアタンパク質から構成されている。細胞外マトリックスプロテオグリカンの非限定的な例は、アグリカンと、コラーゲンＩＸなど、ある特定のコラーゲンとを含む。
【００６３】
本明細書で使用される「グリコサミノグリカン」または「ＧＡＧ」とは、細胞表面上または細胞外マトリックス内に見出される、長鎖の非分枝状多糖分子を指す。グリコサミノグリカンの非限定的な例は、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、ケラチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘキスロニルヘキソサミノグリカン硫酸、およびイノシトールヘキサ硫酸を含む。
【００６４】
「非自家」という用語は、レシピエント以外のドナーに由来する、組織または細胞を指す。非自家とは、例えば、同種を指す場合もあり、異種を指す場合もある。自家組成物中などの場合における「自家」という用語は、ドナーとレシピエントとが、同じ個体である組成物を指す。同様に、「同種」とは、同じ種のドナーおよびレシピエントを指し；「同系」とは、遺伝子構成が同一なドナーおよびレシピエント（例えば、一卵性双生児のドナーおよびレシピエントまたは遺伝子型が同一なドナーおよびレシピエント）を指し、「異種」とは、異なる種のドナーおよびレシピエントを指す。
【００６５】
「変異体」（または「類似体」）とは、野生型分子と異なる分子を指す。
【００６６】
「変異体ポリヌクレオチド」（または「類似体」）という用語は、自然発生のポリヌクレオチドと異なる、任意のポリヌクレオチドを指す。例えば、「変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチド」とは、自然発生のＡ２Ｍポリヌクレオチドと異なる、任意のＡ２Ｍポリヌクレオチドを指す。変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドは、野生型Ａ２Ｍポリヌクレオチド配列（配列番号１）と異なるポリヌクレオチド配列を含む。変異体ポリヌクレオチドは、例えば、組換えＤＮＡ法を使用して創出される、核酸の挿入、欠失、および置換を特徴としうる。変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドは、野生型Ａ２Ｍポリヌクレオチド配列のベイト領域内に、突然変異、挿入、欠失、またはこれらの組合せを含むことが好ましい。ポリペプチドに言及する場合に、本明細書で使用される「ベイト領域」は、Ａ２Ｍポリペプチドの領域であって、プロテアーゼに結合する領域、例えば、プロテアーゼ認識部位を含有する領域をコードする、Ａ２Ｍポリヌクレオチドの領域を含む。変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドは、組換えＤＮＡ法により、例えば、変異体ベイト領域をコードする、多様なポリヌクレオチド配列を挿入する一助となるように、制限酵素クローニング部位を創出することにより、変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを創出する一助となりうる点突然変異を伴う、Ａ２Ｍのポリヌクレオチド配列を含む、「Ａ２Ｍアクセプター配列」（配列番号２）を含む。変異体ベイト領域は、配列番号６〜８３のうちの、１または複数の配列、および配列番号６〜８３と実質的に類似する配列を含みうる。例えば、変異体ベイト領域は、配列番号６〜３０の、１または複数の非天然ベイト領域、配列番号３１〜８３の、１または複数のプロテアーゼ認識部位、またはこれらの任意の組合せを含みうる。
【００６７】
「変異体ポリペプチド」という用語は、自然発生のポリペプチドと異なる、任意のポリペプチドを指す。例えば、「変異体Ａ２Ｍポリペプチド」とは、自然発生のＡ２Ｍポリペプチドと異なる、任意のＡ２Ｍポリペプチドを指す。変異体ポリペプチドは、例えば、組換えＤＮＡ法を使用して創出される、アミノ酸の、挿入、欠失、および置換を特徴としうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、野生型Ａ２Ｍポリペプチド配列と異なるポリペプチド配列を含む。変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、野生型Ａ２Ｍタンパク質のベイト領域内に、突然変異、挿入、欠失、またはこれらの組合せを含むことが好ましい。ポリペプチドに言及する場合の「ベイト領域」は、プロテアーゼに結合する、Ａ２Ｍポリペプチドの領域、例えば、１または複数のプロテアーゼ認識部位を含有する、アミノ酸の連なりを含む。変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、Ａ２Ｍアクセプター配列（配列番号２）によりコードされるポリペプチド（配列番号３）を含む。「変異体Ａ２Ｍポリペプチド」は、ベイト領域内の、対応する野生型ポリペプチドのアミノ酸配列と比較した、少なくとも１つのアミノ酸配列変更を有しうる。アミノ酸配列の変更は、１または複数のアミノ酸の置換、欠失、または挿入でありうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、または挿入の、任意の組合せを有しうる。
【００６８】
目的の活性を失効化させずに、どのアミノ酸残基を、置きかえるか、付加するか、または欠失させうるのかの決定における指針は、特定のポリペプチドの配列を、相同なペプチドの配列と比較し、相同性の大きな領域（保存的領域）内で施されるアミノ酸配列の変化の数を最小化することにより見出すこともでき、アミノ酸を、コンセンサス配列で置きかえることによりにより見出すこともできる。代替的に、これらの同じポリペプチドまたは類似するポリペプチドをコードする組換え変異体は、遺伝子コード内の「冗長性」を使用することにより、合成または選択することができる。多様な制限部位をもたらすサイレント変化など、多様なコドン置換を導入して、プラスミドベクターもしくはウイルスベクターへのクローニング、または特定の原核系もしくは真核系における発現を最適化することができる。ポリヌクレオチド配列内の突然変異は、ポリペプチド内、またはポリペプチドの任意の部分の特性を修飾し、プロテアーゼの阻害、リガンドへの結合アフィニティー、鎖間のアフィニティー、または分解／代謝回転速度などの特徴を変化させるように、ポリペプチドに付加される、他のペプチドのドメイン内に反映されうる。変異体ヌクレオチドはまた、発現のために選び出される宿主細胞内の発現、スケールアップなどにより良好に適するポリペプチドを作出するのにも使用することができる。例えば、ジスルフィド架橋を消失させるために、システイン残基を、欠失させるか、または別のアミノ酸残基で置換することができる。
【００６９】
アミノ酸「置換」は、１つのアミノ酸を、類似する構造的特性および／または化学的特性を有する、別のアミノ酸で置きかえること、例えば、保存的アミノ酸による置きかえを含む。「保存的」アミノ酸置換は、関与する残基の、極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、両親媒性、またはこれらの組合せの類似性に基づき施すことができる。非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含む。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む。正に帯電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リシン、およびヒスチジンを含む。負に帯電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。「挿入」または「欠失」は、好ましくは、約１〜５０アミノ酸の範囲であり、より好ましくは、１〜３０アミノ酸の範囲である。許容される変異は、実験において、組換えＤＮＡ法を使用して、アミノ酸を、ポリペプチド内に挿入するか、ポリペプチド内で欠失させるか、または置換し、結果として得られる組換え変異体を、活性、例えば、プロテアーゼ阻害活性についてアッセイすることにより決定することができる。
【００７０】
本明細書で使用される「精製された」または「実質的に精製された」という用語は、指し示された核酸またはポリペプチドが、他の生体高分子、例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質などの実質的な非存在下で存在することを表す。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、存在する、指し示された生体高分子のうちの、重量で少なくとも９５％、例えば、重量で少なくとも９９％を構成するように、精製することができる。水、緩衝液、および分子量が１０００ドルトン未満である、他の低分子は、任意の量で存在しうる。本明細書で使用される「単離された」という用語は、その天然の供給源中のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと共に存在する、少なくとも１つの他の成分から分離された、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの溶液中に通常存在する、溶媒、緩衝液、イオン、または他の成分のみの存在下で見出すことができる。「単離された」および「精製された」という用語は、それらの天然の供給源中に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを包摂しない。
【００７１】
本明細書で使用される、「組換えポリペプチド」は、組換え発現系、例えば、微生物発現系、昆虫発現系、または哺乳動物発現系に由来する、ポリペプチドまたはタンパク質を含む。大半の細菌培養物中で発現させたポリペプチドまたはタンパク質は、グリコシル化修飾を含まず、酵母内で発現させたポリペプチドまたはタンパク質は、哺乳動物細胞内で発現させたポリペプチドまたはタンパク質とは一般に異なるグリコシル化パターンを有しうる。
【００７２】
「発現ベクター」という用語は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列からポリペプチドを発現させるための、プラスミドまたはファージまたはウイルスまたはベクターを指す。発現ベクターは、遺伝子発現において調節的役割を有する、１または複数の遺伝子エレメント、例えば、プロモーターまたはエンハンサー、ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される、構造配列またはコード配列、ならびに適切な転写開始配列および転写終結配列のアセンブリーを含む転写単位を含みうる。酵母発現系または真核発現系における使用が意図される構造単位は、宿主細胞により翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能とするリーダー配列を含みうる。代替的に、組換えタンパク質を、リーダー配列または輸送配列を伴わずに発現させる場合、組換えタンパク質は、アミノ末端のメチオニン残基を含みうる。この残基は、発現した組換えタンパク質からその後切断されて、最終産物をもたらしうる。
【００７３】
「組換え発現系」という用語は、組換え転写単位を、染色体ＤＮＡに安定的に組み入れているか、または組換え転写単位を染色体外に保有する宿主細胞を意味する。組換え発現系を使用して、発現させるＤＮＡセグメントまたは合成遺伝子に連結された調節エレメントが誘導されると、異種ポリペプチドまたは異種タンパク質を発現させることができる。この用語は、遺伝子発現において調節的役割を有する、１または複数の組換え遺伝子エレメント、例えば、プロモーターまたはエンハンサーを安定的に組み入れた宿主細胞を含む。組換え発現系を使用して、発現させる内因性ＤＮＡセグメントまたは遺伝子に連結された調節エレメントが誘導されると、細胞に対して内因性であるポリペプチドまたはタンパク質を発現させることができる。細胞は、原核細胞の場合もあり、真核細胞の場合もある。
【００７４】
「分泌された」という用語は、膜を隔てて、または膜を介して輸送されるタンパク質であって、適切な宿主細胞内で発現すると、そのアミノ酸配列内のシグナル配列の結果として生じる輸送を含むタンパク質を含む。「分泌」タンパク質は、限定なしに述べると、それらが発現する細胞から完全に分泌されたタンパク質、例えば、可溶性タンパク質、または部分的に分泌されたタンパク質、例えば、受容体を含む。「分泌」タンパク質はまた、小胞体の膜を隔てて輸送されるタンパク質も含む。「分泌」タンパク質はまた、非典型的シグナル配列も含む。
【００７５】
所望の場合、発現ベクターは、細胞膜を介してポリペプチドを方向付ける「シグナル配列」を含有するように設計することができる。シグナル配列は、ポリペプチド上に天然で存在する場合もあり、異種タンパク質供給源から施される場合もある。
【００７６】
本明細書で使用される「実質的に同等」および「実質的に同様」はいずれも、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列、例えば、その正味の効果が、基準配列と対象配列との間の、有害な、機能的相違を結果としてもたらさない、１または複数の、置換、欠失、または付加により、基準配列から変動する変異体配列を指す場合がある。このような実質的に同等な配列は、本明細書で列挙される配列のうちの１つから、約３５％を超えて変動しないことが典型的である。例えば、実質的に同等な配列内の個別の残基の、対応する基準配列と比較した、置換、付加、および／または欠失の数を、実質的に同等な配列内の残基の総数で除した商は、約０．３５またはそれ未満である。実質的に同等な配列は、基準配列に対して６５％の配列同一性を有する配列を含む。本発明の、実質的に同等な配列は、基準配列から、３０％を超えて変動しない（７０％の配列同一性）、２５％を超えて変動しない（７５％の配列同一性）、２０％を超えて変動しない（８０％の配列同一性）、１０％を超えて変動しない（９０％の配列同一性）、または５％を超えて変動しない（９５％の配列同一性）。本発明に従う、実質的に同等なアミノ酸配列は、基準アミノ酸配列との、少なくとも８０％の配列同一性を有することが好ましく、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有することが好ましい。本発明の、実質的に同等なポリヌクレオチド配列は、例えば、遺伝子コードの冗長性または縮重を考慮に入れると、配列同一性パーセントが小さい。ポリヌクレオチド配列は、少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有することが好ましい。実質的に同等な生物活性および実質的に同等な発現特徴を有する配列は、実質的に同等であると考えられる。配列間の同一性は、配列のアライメントまたはハイブリダイゼーション条件を変動させることなど、当技術分野で公知の方法により決定することができる。
【００７７】
本明細書で使用される「有効量」または「治療有効量」という用語は、それを必要とする対象における脊椎痛を処置、阻害、または緩和するのに十分な投与量を意味する。
【００７８】
「縮重変異体」とは、本発明の核酸断片（例えば、ＯＲＦ）と、ヌクレオチド配列が異なるが、遺伝子コードの縮重に起因して、同一なポリペプチド配列をコードする、ヌクレオチド断片を意図しうる。
【００７９】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、互換的に使用することができ、アミノ酸残基またはその変異体のポリマーを指す場合がある。アミノ酸ポリマーは、１または複数のアミノ酸残基を有することが可能であり、対応する自然発生のアミノ酸の、人工的な化学的模倣体のほか、修飾残基を含有する自然発生のアミノ酸ポリマーである、自然発生のアミノ酸ポリマー、および非自然発生のアミノ酸ポリマーでもありうる。変異体ポリペプチドは、対応する野生型ポリペプチドのアミノ酸配列と比較した、少なくとも１つのアミノ酸配列変更を有しうる。アミノ酸配列の変更は、例えば、１または複数のアミノ酸の置換、欠失、または挿入でありうる。変異体ポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、または挿入の、任意の組合せを有しうる。突然変異、例えば、フレームシフト突然変異、ナンセンス  突然変異、ミスセンス突然変異、中性突然変異、またはサイレント突然変異など、アミノ酸配列の変更は、それが由来するヌクレオチド配列を変更することにより形成することができる。例えば、野生型ヌクレオチド配列と比較した場合の配列の差違は、フレームシフトを結果としてもたらす、単一のヌクレオチドまたは１つを超えるヌクレオチドの挿入または欠失；コードされるアミノ酸の変化を結果としてもたらす、少なくとも１つのヌクレオチドの変化；未成熟終止コドンの発生を結果としてもたらす、少なくとも１つのヌクレオチドの変化；ヌクレオチドによりコードされる、１または複数のアミノ酸の欠失を結果としてもたらす、いくつかのヌクレオチドの欠失；不等組換えもしくは遺伝子転換などによる、１つまたはいくつかのヌクレオチドの挿入であって、リーディングフレームのコード配列の中断を結果としてもたらす挿入；配列の全部または一部の複製；転座；またはヌクレオチド配列の再配列を含みうる。このような配列変化は、核酸によりコードされるポリペプチドを変更することが可能であり、例えば、核酸配列の変化が、フレームシフトを引き起こす場合、フレームシフトは、コードされるアミノ酸の変化を結果としてもたらすことが可能であり、かつ／または切断型ポリペプチドの発生を引き起こす、未成熟終止コドンの発生を結果としてもたらしうる。
【００８０】
「断片」という用語は、全長タンパク質のうちの短いポリペプチドでありうる、ポリペプチドの任意のサブセットを指す場合がある。Ａ２Ｍの断片は、Ａ２Ｍに由来する、２０、３０、４０、５０またはそれ超のアミノ酸であって、抗Ａ２Ｍ抗体により検出されうるアミノ酸を含みうる。他のＡ２Ｍの断片は、Ａ２Ｍの多様なドメインおよびこれらの組合せを含む。
【００８１】
「血小板リッチ血漿」（「ＰＲＰ」）とは、血小板について濃縮された血漿を指す。
【００８２】
治療のための変異体Ａ２Ｍポリペプチド組成物
Ａ２Ｍとは、ＡＤＡＭＴＳ  ４およびＡＤＡＭＴＳ５など、メタロプロテアーゼおよび他のプロテアーゼの一般的な阻害剤である。変性および炎症の結果として、またはこれらに先行して産生される、これらのプロテアーゼおよび他のプロテアーゼは、軟骨および椎間板変性、ならびに滑膜関節、脊椎、腱および靭帯、ならびに他の関節、筋腱付着部、および一般的組織における疼痛の一因でありうる。本明細書で記載される組換え組成物のうちのいずれかを、本明細書で記載される方法のうちのいずれかに従い、状態、疾患、疼痛、または炎症を有する対象の処置のために使用することができる。
【００８３】
Ａ２Ｍは、多種多様なプロテアーゼ（セリンメタロプロテアーゼ、システインメタロプロテアーゼ、およびアスパラギン酸メタロプロテアーゼを含む）を不活化させることが可能である。Ａ２Ｍは、プラスミンおよびカリクレインを阻害することにより、線維素溶解阻害剤として機能しうる。Ａ２Ｍは、トロンビンを阻害することにより、凝固の阻害剤として機能しうる。ヒトＡ２Ｍは、その構造内に、３８アミノ酸の「ベイト」領域を有する。ベイト領域は、動物種間で、アミノ酸数（２７〜５２アミノ酸）および配列が広範に変動する。ベイト領域に結合し、これを切断するプロテアーゼは、Ａ２Ｍに結合しうる。プロテアーゼ−Ａ２Ｍ複合体は、マクロファージ受容体により認識され、生物の系から取り除かれうる。Ａ２Ｍは、固有の「トラッピング」機構により、プロテアーゼの４つクラス全てを阻害することが可能である。プロテアーゼが、ベイト領域を切断すると、タンパク質内のコンフォメーション変化の誘導が可能となり、これにより、プロテアーゼが捕獲されうる。捕捉された酵素は、低分子量の基質に対しては、依然として活性でありうる（高分子量の基質に対する活性は、大幅に低減されうる）。ベイト領域内の切断に続き、チオエステル結合の加水分解が可能となり、これに媒介されて、タンパク質は、プロテアーゼに共有結合する。
【００８４】
一態様では、本明細書では、変異体Ａ２Ｍポリペプチドでありうる組成物が提供される。変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、組換えタンパク質またはその断片であることが可能であり、宿主細胞内で産生させることができ、疼痛および炎症状態および疾患の処置における使用のために精製することができる。変異体Ａ２Ｍ組成物は、野生型Ａ２Ｍと比較して、プロテアーゼの阻害においてより効果的であるか、半減期が長いか、緩徐なクリアランス係数を有するか、またはこれらの任意の組合せを示しうる。変異体Ａ２Ｍは、組換えタンパク質またはその断片であることが可能であり、宿主細胞内で産生させることができ、精製することができる。例えば、変異体Ａ２Ｍ組換えタンパク質は、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、もしくは哺乳動物細胞、または無細胞系を含む宿主内で産生させることができる。
【００８５】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドまたはこれらの断片はまた、Ａ２Ｍの変異体の場合もあり、Ａ２Ｍの、翻訳後修飾された変異体の場合もある。Ａ２Ｍ変異体ポリペプチドは、それらのアミノ酸配列が、野生型Ａ２Ｍポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を共有するように、整数カ所のアミノ酸変更を有しうる。一部の実施形態では、Ａ２Ｍ変異体ポリペプチドは、野生型Ａ２Ｍポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を共有するアミノ酸配列を有しうる。
【００８６】
配列同一性パーセントは、コンピュータプログラムまたは直接的な配列比較を使用して計算することができる。２つの配列の間の同一性を決定する、好ましいコンピュータプログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージである、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＰ、およびＴＢＬＡＳＴＮ（例えば、D.  W.  Mount、２００１年、「Bioinformatics:  Sequence  and  Genome  Analysis」、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、N.Y.を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。ＢＬＡＳＴＰプログラムおよびＴＢＬＡＳＴＮプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の情報源から公開されている。また、スミス−ウォーターマンアルゴリズムも、同一性パーセントを決定するのに使用することができる。アミノ酸配列比較のための例示的なパラメータは、以下：１）NeedlemanおよびWunsch（J.  Mol.  Biol.、４８巻：４４３〜４５３頁（１９７０年））によるアルゴリズム；２）HentikoffおよびHentikoff（Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  USA.、８９巻：１０９１５〜１０９１９頁（１９９２年））によるＢＬＯＳＳＵＭ６２比較行列；３）ギャップペナルティー＝１２；ならびに４）ギャップ長ペナルティー＝４を含む。これらのパラメータと共に有用なプログラムは、「ギャップ」プログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）として公開されているものを利用することができる。前述のパラメータは、ポリペプチド比較のためのデフォルトのパラメータ（末端ギャップについてのペナルティーを伴わない）である。代替的に、ポリペプチド配列の同一性は、以下の式：同一性％−（同一な残基の数）／（アミノ酸残基内のアライメント長）×１００を使用して計算することができる。この計算では、アライメント長は、内部のギャップは含むが、末端のギャップは含まない。
【００８７】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドまたはこれらの断片は、一次アミノ酸配列として、配列番号６〜８３によりコードされるアミノ酸配列のうちの１または複数の全部または一部、およびこれらのタンパク質の断片であって、機能的に同等なアミノ酸残基で、配列内の残基を置換する結果として、サイレント変化をもたらす、配列の変更を含む断片を含有する、変異体Ａ２Ｍポリペプチドまたはこれらの断片を含むがこれらに限定されない。変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、配列番号３によりコードされるアミノ酸配列の全部または一部を含みうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、例えば、配列番号６〜８３の１または複数のアミノ酸配列を含有する、４〜２０、２０〜５０、５０〜１００、１００〜３００、３００〜６００、６００〜１０００、１０００〜１４５０の間の任意の数の連続アミノ酸でありうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、および１４５０アミノ酸未満であるか、またはこれと等しい長さであることが可能であり、配列の一部として、配列番号６〜８３のうちの、１または複数の配列を含有しうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、配列番号６〜８３のうちの、１または複数の配列を含有する、任意の変異体Ａ２Ｍポリペプチドに対して少なくとも９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、または６０％の配列同一性または配列類似性を有するポリペプチド配列を含む。
【００８８】
本明細書で提供される変異体Ａ２Ｍポリペプチドはまた、精製タンパク質のアミノ酸配列と同様であるが、修飾が天然でもたらされているか、意図的に操作されているアミノ酸配列を特徴とするタンパク質も含む。例えば、当業者は、公知の技法を使用して、変異体Ａ２Ｍペプチド内または変異体Ａ２Ｍ  ＤＮＡ配列内の修飾を施すことができる。タンパク質配列内の目的の修飾は、コード配列内の、選択されたアミノ酸残基の、変更、置換、置きかえ、挿入、または欠失を含みうる。例えば、システイン残基のうちの１または複数を欠失させるか、または別のアミノ酸で置きかえて、分子のコンフォメーションを変更することができる。当業者には、このような変更、置換、置きかえ、挿入、または欠失のための技法が周知である（例えば、米国特許第４，５１８，５８４号を参照されたい）。このような変更、置換、置きかえ、挿入、または欠失は、タンパク質の所望の活性を保持することが好ましい。タンパク質の機能に重要な、タンパク質の領域は、当技術分野で公知の多様な方法であって、単一または複数のアミノ酸の、アラニンによる系統的な置換に続き、結果として得られるアラニン含有変異体を、生物活性について調べるステップを伴うアラニン走査法を含む方法により決定することができる。この種の解析を使用して、置換されたアミノ酸の、生物活性における重要性を決定することができる。
【００８９】
Ａ２Ｍのベイト領域とは、タンパク質分解性切断を受けやすく、切断されると、プロテアーゼ近傍の構造の崩壊を結果としてもたらす、Ａ２Ｍ分子内のコンフォメーション変化を誘発するセグメントである。配列番号３で明示された、例示的なＡ２Ｍ配列では、ベイト領域は、アミノ酸６９０〜７２８に対応する。配列番号１および２で明示された、例示的なＡ２Ｍ配列では、ベイト領域は、アミノ酸６９０〜７２８（配列番号５）をコードするヌクレオチドに対応する。
【００９０】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、野生型Ａ２Ｍのベイト領域の変異体である、ベイト領域を含みうる。例えば、変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、突然変異体ベイト領域、ベイト領域の断片、別の種に由来するベイト領域、ベイト領域のアイソフォーム、または本明細書で記載される、１または複数のプロテアーゼ認識部位および／もしくはベイト領域、またはこれらの任意の組合せの、複数のコピーを含有するベイト領域でありうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、一連に配置された、複数のプロテアーゼ認識部位を含むことが可能であり、任意の順序で配置することができる。
【００９１】
場合によって、変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、ベイト領域以外の領域に関して、野生型Ａ２Ｍと実質的に同じ配列を含みうる。例えば、変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、ベイト領域以外の配列であって、野生型Ａ２Ｍの、対応するベイト領域以外の配列に対して少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、または１００％の同一性を有する配列を含みうる。
【００９２】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、配列番号６〜３０のうちのいずれか１つに対して少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、または１００％の同一性を有する配列を含む、１または複数の変異体ベイト領域を有しうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、１または複数のコンセンサスプロテアーゼ認識部位を有しうる。例えば、変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、２つまたはそれ超の、あるいは３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはそれ超のプロテアーゼ認識部位を有しうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、１または複数のプロテアーゼ認識部位を有しうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、配列番号３１〜８１のうちのいずれか１つに対して少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、または１００％の同一性を有する配列を含む、１または複数のプロテアーゼ認識部位を有しうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、配列番号８２または配列番号８３の配列を含む、１または複数のプロテアーゼ認識部位を有しうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、１または複数のコンセンサスプロテアーゼ認識部位を有しうる。例えば、変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、２つまたはそれ超の、あるいは３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはそれ超のプロテアーゼ認識部位を有しうる。例示的なプロテアーゼ認識部位を、表２に明示する。
【００９３】
プロテアーゼ認識部位またはプロテアーゼ基質ベイト領域は、野生型Ａ２Ｍタンパク質と比較した、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、またはこれらの任意の組合せについてのコンセンサス配列でありうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、１または複数のプロテアーゼ（例えば、複数種のプロテアーゼ）の阻害の、少なくとも１０％の増大を特徴としうる。例えば、変異体Ａ２Ｍは、１または複数のセリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、またはこれらの任意の組合せの阻害の、野生型Ａ２Ｍタンパク質と比較した、少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１０９０％、１２０％、１４０％、１５０％、１６０％、１８０％、２００％、２２０％、２４０％、２６０％、２８０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、または５００％、またはそれ超の増強を特徴としうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、またはこれらの任意の組合せの、特異的阻害の増強を特徴としうる。例えば、変異体Ａ２Ｍは、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、またはこれらの任意の組合せの特異的阻害の、野生型Ａ２Ｍタンパク質と比較した、少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１０９０％、１２０％、１４０％、１５０％、１６０％、１８０％、２００％、２２０％、２４０％、２６０％、２８０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、または５００％、またはそれ超の増強を特徴としうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、またはこれらの任意の組合せの非特異的阻害の、野生型Ａ２Ｍタンパク質と比較した増強を特徴としうる。例えば、変異体Ａ２Ｍは、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、またはこれらの任意の組合せの非特異的阻害の、野生型Ａ２Ｍタンパク質と比較した、少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１０９０％、１２０％、１４０％、１５０％、１６０％、１８０％、２００％、２２０％、２４０％、２６０％、２８０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、または５００％、またはそれ超の増強を特徴としうる。例示的な変異体Ａ２Ｍポリペプチドによる、プロテアーゼ活性の阻害は、表３で見ることができる。他の例示的な変異体Ａ２Ｍポリペプチドによる、プロテアーゼ活性の阻害は、表４ａおよび４ｂで見ることができる。
【００９４】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、１または複数の突然変異体ベースの領域を有しうる。例えば、変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、２つまたはそれ超の、あるいは３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはそれ超の突然変異体ベースの領域を有しうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、１または複数のベイト領域断片を有しうる。例えば、変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、２つまたはそれ超の、あるいは３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはそれ超のベイト領域断片を有しうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域の断片は、配列番号６〜８３のうちの、１または複数の配列の断片でありうる。
【００９５】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、野生型Ａ２Ｍポリペプチド内のアミノ酸と異なる、１または複数の突然変異体アミノ酸を有しうる。例えば、変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、野生型Ａ２Ｍポリペプチド内のアミノ酸と異なる、２つまたはそれ超の、あるいは３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはそれ超の突然変異体アミノ酸を有しうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、野生型Ａ２Ｍポリペプチド内の領域と異なる、１または複数の突然変異体アミノ酸領域を有しうる。例えば、変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、野生型Ａ２Ｍポリペプチド内の領域と異なる、２つまたはそれ超の、あるいは３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはそれ超の突然変異体アミノ酸領域を有しうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドの突然変異体ベイト領域で、野生型Ａ２Ｍポリペプチド内のベイト領域を置きかえるか、または置換することができる。突然変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、配列番号６〜８３のいずれかのうちの、１または複数の配列を含みうる。
【００９６】
本明細書で提供される、Ａ２Ｍ変異体ポリペプチドはまた、保存的アミノ酸配列を特徴とするＡ２Ｍ変異体タンパク質も含む。単離変異体Ａ２Ｍポリペプチドまたは精製変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、機能的同等物として作用することによりサイレント変更をもたらす、極性が同様である別のアミノ酸により置換された、ポリペプチド内の１または複数のアミノ酸残基を有しうる。配列内のアミノ酸に対する置換基は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含む。極性の中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む。正に帯電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リシン、およびヒスチジンを含む。負に帯電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸、およびグルタミン酸を含む。芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンを含む。
【００９７】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、１または複数のベイト領域のアイソフォームを有しうる。例えば、変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、２つまたはそれ超の、あるいは３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはそれ超のベイト領域のアイソフォームを有しうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、１または複数の突然変異体ベイト領域または操作ベイト領域を有しうる。例えば、変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、２つまたはそれ超の、あるいは３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはそれ超の突然変異体ベイト領域または操作ベイト領域を有しうる。
【００９８】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、１または複数のベイト領域の、１または複数のコピーを有しうる。１または複数のベイト領域は、同じベイト領域（リピート）の場合もあり、異なるベイト領域の場合もあり、これらの任意の組合せの場合もある。例えば、変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、１または複数のベイト領域の、２つまたはそれ超の、あるいは３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはそれ超のコピーを有することが可能であり、１または複数のベイト領域は、同じベイト領域（リピート）の場合もあり、異なるベイト領域の場合もあり、これらの任意の組合せの場合もある。
【００９９】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、異なる生物、生物の異なる種、またはこれらの組合せに由来する、１または複数のベイト領域を含みうる。例えば、変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、異なる生物、生物の異なる種、またはこれらの組合せに由来する、２つまたはそれ超の、あるいは３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはそれ超のベイト領域を有しうる。異なる生物に由来する、１または複数のベイト領域は、１または複数の異なる生物に由来しうるが、生物の異なる種には由来しえない。例えば、１または複数の修飾ベイト領域は、２つまたはそれ超の、あるいは３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはそれ超の異なる生物に由来しうるが、生物の異なる種に由来する２つまたはそれ超のベイト領域は含有しえない。生物の異なる種に由来する、１または複数のベイト領域は、１または複数の生物の異なる種に由来しうるが、異なる生物には由来しえない。例えば、１または複数の修飾ベイト領域は、２つまたはそれ超の、あるいは３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはそれ超の生物の異なる種に由来しうるが、異なる生物に由来する２つまたはそれ超のベイト領域は含有しえない。修飾ベイト領域は、任意の動物、昆虫、植物、細菌、ウイルス、酵母、魚類、爬虫類、両生類、または真菌に由来しうる。修飾ベイト領域は、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、カエル、サル、ウマまたはヤギなど、Ａ２Ｍまたは相同なタンパク質を伴う任意の動物に由来しうる。
【０１００】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、変異体Ａ２Ｍポリペプチドの、１または複数のベイト領域を含みうる。例えば、変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、変異体Ａ２Ｍポリペプチドの２つまたはそれ超の、あるいは３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはそれ超のベイト領域を有しうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドの、１または複数のベイト領域は、１または複数の異なる種に由来しうる。例えば、変異体Ａ２Ｍポリペプチドの、１または複数のベイト領域は、２つまたはそれ超の、あるいは３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはそれ超の異なる種に由来しうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドのベイト領域は、任意の動物種、昆虫種、植物種、細菌種、ウイルス種、酵母種、魚類種、爬虫類種、両生類種、または真菌種に由来しうる。
【０１０１】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、Ａ２Ｍ以外の、１または複数のタンパク質に由来する、１または複数のプロテアーゼ基質ベイト領域でありうる、複数のプロテアーゼ認識部位を有しうる。
【０１０２】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、Ａ２Ｍに由来する、１または複数のプロテアーゼ基質ベイト領域でありうる、複数のプロテアーゼ認識部位を有しうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、１または複数の非天然タンパク質配列に由来する、１または複数のプロテアーゼ基質ベイト領域でありうる、複数のプロテアーゼ認識部位を有しうる。非天然タンパク質配列は、１または複数のプロテアーゼ認識部位を、一連に含むことが可能であり、プロテアーゼに対するベイトとして機能しうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、本明細書で記載されるベイト領域の組合せに由来する、１または複数のプロテアーゼ基質ベイト領域の場合もあり、本明細書で記載されるベイト領域の組合せのうちのいずれかの場合もある、複数のプロテアーゼ認識部位を有しうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、一連に配置された、任意の数のプロテアーゼベイト領域を有しうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、任意の種に由来する任意の数のプロテアーゼベイト領域を有することが可能であり、一連に配置することができる。Ａ２Ｍ以外の、１もしくは複数のタンパク質、または１もしくは複数の非天然タンパク質配列に由来する、１または複数のプロテアーゼ基質ベイト領域は、自殺型阻害因子でありうる。例えば、変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ超の自殺型阻害因子のベイト領域を有しうる。自殺型阻害因子は、プロテアーゼを、Ａ２Ｍに共有結合によって接合させるように作動可能でありうる。ヒトアグリカン内の、例示的なＡＤＡＭＴＳおよびＭＭＰについて公知の認識配列の例を、表１に指し示す。破線は、タンパク質分解の場所を示す。
【表１】
2018501207.tif 000003
【０１０３】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、プロテアーゼ阻害有効性の、野生型Ａ２Ｍタンパク質のプロテアーゼ阻害有効性と比較した、少なくとも約１０％の増大を特徴としうる。例えば、変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、野生型Ａ２Ｍタンパク質のプロテアーゼ阻害有効性と比較した場合、プロテアーゼ阻害有効性の、少なくとも約２０、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の増大を特徴としうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、プロテアーゼ阻害有効性の、野生型Ａ２Ｍタンパク質のプロテアーゼ阻害有効性と比較した増大を特徴としうる。例えば、変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、プロテアーゼ阻害有効性の、野生型Ａ２Ｍタンパク質のプロテアーゼ阻害有効性と比較した、１．２、１．２、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００倍の増大を特徴としうる。
【０１０４】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、１または複数のプロテアーゼを阻害する能力を、野生型Ａ２Ｍポリペプチドと比較して増大させていることとして特徴付けることができる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、１または複数のプロテアーゼを阻害する能力であって、１または複数のプロテアーゼを阻害する、野生型Ａ２Ｍポリペプチドの能力の、少なくとも１．５倍である能力を有しうる。例えば、変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、１または複数のプロテアーゼを阻害する能力であって、１または複数のプロテアーゼを阻害する、野生型Ａ２Ｍポリペプチドの能力の、少なくとも１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍である能力を有しうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、１または複数のプロテアーゼを阻害する能力であって、１または複数のプロテアーゼを阻害する、野生型Ａ２Ｍポリペプチドの能力の、１．５〜１００倍である能力を有しうる。例えば、変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、１または複数のプロテアーゼを阻害する能力であって、１または複数のプロテアーゼを阻害する、野生型Ａ２Ｍポリペプチドの能力の、１．６〜１００、１．７〜１００、１．８〜１００、１．９〜１００、２〜１００、２．１〜１００、２．２〜１００、２．３〜１００、２．４〜１００、２．５〜１００、２．６〜１００、２．７〜１００、２．８〜１００、２．９〜１００、３．０〜１００、３．１〜１００、３．２〜１００、３．３〜１００、３．４〜１００、３．５〜１００、３．６〜１００、３．７〜１００、３．８〜１００、３．９〜１００、４〜１００、５〜１００、６〜１００、７〜１００、８〜１００、９〜１００、１０〜１００、１１〜１００、１２〜１００、１３〜１００、１４〜１００、１５〜１００、１６〜１００、１７〜１００、１８〜１００、１９〜１００、２０〜１００、２５〜１００、３０〜１００、３５〜１００、４０〜１００、４５〜１００、５０〜１００、６０〜１００、７０〜１００、８０〜１００、９０〜１００、１．５〜９０、１．６〜９０、１．７〜９０、１．８〜９０、１．９〜９０、２〜９０、２．１〜９０、２．２〜９０、２．３〜９０、２．４〜９０、２．５〜９０、２．６〜９０、２．７〜９０、２．８〜９０、２．９〜９０、３．０〜９０、３．１〜９０、３．２〜９０、３．３〜９０、３．４〜９０、３．５〜９０、３．６〜９０、３．７〜９０、３．８〜９０、３．９〜９０、４〜９０、５〜９０、６〜９０、７〜９０、８〜９０、９〜９０、１０〜９０、１１〜９０、１２〜９０、１３〜９０、１４〜９０、１５〜９０、１６〜９０、１７〜９０、１８〜９０、１９〜９０、２０〜９０、２５〜９０、３０〜９０、３５〜９０、４０〜９０、４５〜９０、５０〜９０、６０〜９０、７０〜９０、８０〜９０、１．５〜８０、１．６〜８０、１．７〜８０、１．８〜８０、１．９〜８０、２〜８０、２．１〜８０、２．２〜８０、２．３〜８０、２．４〜８０、２．５〜８０、２．６〜８０、２．７〜８０、２．８〜８０、２．９〜８０、３．０〜８０、３．１〜８０、３．２〜８０、３．３〜８０、３．４〜８０、３．５〜８０、３．６〜８０、３．７〜８０、３．８〜８０、３．９〜８０、４〜８０、５〜８０、６〜８０、７〜８０、８〜８０、９〜８０、１０〜８０、１１〜８０、１２〜８０、１３〜８０、１４〜８０、１５〜８０、１６〜８０、１７〜８０、１８〜８０、１９〜８０、２０〜８０、２５〜８０、３０〜８０、３５〜８０、４０〜８０、４５〜８０、５０〜８０、６０〜８０、７０〜８０、１．５〜７０、１．６〜７０、１．７〜７０、１．８〜７０、１．９〜７０、２〜７０、２．１〜７０、２．２〜７０、２．３〜７０、２．４〜７０、２．５〜７０、２．６〜７０、２．７〜７０、２．８〜７０、２．９〜７０、３．０〜７０、３．１〜７０、３．２〜７０、３．３〜７０、３．４〜７０、３．５〜７０、３．６〜７０、３．７〜７０、３．８〜７０、３．９〜７０、４〜７０、５〜７０、６〜７０、７〜７０、８〜７０、９〜７０、１０〜７０、１１〜７０、１２〜７０、１３〜７０、１４〜７０、１５〜７０、１６〜７０、１７〜７０、１８〜７０、１９〜７０、２０〜７０、２５〜７０、３０〜７０、３５〜７０、４０〜７０、４５〜７０、５０〜７０、６０〜７０、１．５〜６０、１．６〜６０、１．７〜６０、１．８〜６０、１．９〜６０、２〜６０、２．１〜６０、２．２〜６０、２．３〜６０、２．４〜６０、２．５〜６０、２．６〜６０、２．７〜６０、２．８〜６０、２．９〜６０、３．０〜６０、３．１〜６０、３．２〜６０、３．３〜６０、３．４〜６０、３．５〜６０、３．６〜６０、３．７〜６０、３．８〜６０、３．９〜６０、４〜６０、５〜６０、６〜６０、７〜６０、８〜６０、９〜６０、１０〜６０、１１〜６０、１２〜６０、１３〜６０、１４〜６０、１５〜６０、１６〜６０、１７〜６０、１８〜６０、１９〜６０、２０〜６０、２５〜６０、３０〜６０、３５〜６０、４０〜６０、４５〜６０、５０〜６０、１．５〜５０、１．６〜５０、１．７〜５０、１．８〜５０、１．９〜５０、２〜５０、２．１〜５０、２．２〜５０、２．３〜５０、２．４〜５０、２．５〜５０、２．６〜５０、２．７〜５０、２．８〜５０、２．９〜５０、３．０〜５０、３．１〜５０、３．２〜５０、３．３〜５０、３．４〜５０、３．５〜５０、３．６〜５０、３．７〜５０、３．８〜５０、３．９〜５０、４〜５０、５〜５０、６〜５０、７〜５０、８〜５０、９〜５０、１０〜５０、１１〜５０、１２〜５０、１３〜５０、１４〜５０、１５〜５０、１６〜５０、１７〜５０、１８〜５０、１９〜５０、２０〜５０、２５〜５０、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、１．５〜４０、１．６〜４０、１．７〜４０、１．８〜４０、１．９〜４０、２〜４０、２．１〜４０、２．２〜４０、２．３〜４０、２．４〜４０、２．５〜４０、２．６〜４０、２．７〜４０、２．８〜４０、２．９〜４０、３．０〜４０、３．１〜４０、３．２〜４０、３．３〜４０、３．４〜４０、３．５〜４０、３．６〜４０、３．７〜４０、３．８〜４０、３．９〜４０、４〜４０、５〜４０、６〜４０、７〜４０、８〜４０、９〜４０、１０〜４０、１１〜４０、１２〜４０、１３〜４０、１４〜４０、１５〜４０、１６〜４０、１７〜４０、１８〜４０、１９〜４０、２０〜４０、２５〜４０、３０〜４０、１．５〜３０、１．６〜３０、１．７〜３０、１．８〜３０、１．９〜３０、２〜３０、２．１〜３０、２．２〜３０、２．３〜３０、２．４〜３０、２．５〜３０、２．６〜３０、２．７〜３０、２．８〜３０、２．９〜３０、３．０〜３０、３．１〜３０、３．２〜３０、３．３〜３０、３．４〜３０、３．５〜３０、３．６〜３０、３．７〜３０、３．８〜３０、３．９〜３０、４〜３０、５〜３０、６〜３０、７〜３０、８〜３０、９〜３０、１０〜３０、１１〜３０、１２〜３０、１３〜３０、１４〜３０、１５〜３０、１６〜３０、１７〜３０、１８〜３０、１９〜３０、２０〜３０、１．５〜２０、１．６〜２０、１．７〜２０、１．８〜２０、１．９〜２０、２〜２０、２．１〜２０、２．２〜２０、２．３〜２０、２．４〜２０、２．５〜２０、２．６〜２０、２．７〜２０、２．８〜２０、２．９〜２０、３．０〜２０、３．１〜２０、３．２〜２０、３．３〜２０、３．４〜２０、３．５〜２０、３．６〜２０、３．７〜２０、３．８〜２０、３．９〜２０、４〜２０、５〜２０、６〜２０、７〜２０、８〜２０、９〜２０、１０〜２０、１１〜２０、１２〜２０、１３〜２０、１４〜２０、１５〜２０、１．５〜１５、１．６〜１５、１．７〜１５、１．８〜１５、１．９〜１５、２〜１５、２．１〜１５、２．２〜１５、２．３〜１５、２．４〜１５、２．５〜１５、２．６〜１５、２．７〜１５、２．８〜１５、２．９〜１５、３．０〜１５、３．１〜１５、３．２〜１５、３．３〜１５、３．４〜１５、３．５〜１５、３．６〜１５、３．７〜１５、３．８〜１５、３．９〜１５、４〜１５、５〜１５、６〜１５、７〜１５、８〜１５、９〜１５、１０〜１５、１１〜１５、１２〜１５、１３〜１５、１４〜１５、１．５〜１０、１．６〜１０、１．７〜１０、１．８〜１０、１．９〜１０、２〜１０、２．１〜１０、２．２〜１０、２．３〜１０、２．４〜１０、２．５〜１０、２．６〜１０、２．７〜１０、２．８〜１０、２．９〜１０、３．０〜１０、３．１〜１０、３．２〜１０、３．３〜１０、３．４〜１０、３．５〜１０、３．６〜１０、３．７〜１０、３．８〜１０、３．９〜１０、４〜１０、５〜１０、６〜１０、７〜１０、８〜１０、９〜１０、１．５〜９、１．６〜９、１．７〜９、１．８〜９、１．９〜９、２〜９、２．１〜９、２．２〜９、２．３〜９、２．４〜９、２．５〜９、２．６〜９、２．７〜９、２．８〜９、２．９〜９、３．０〜９、３．１〜９、３．２〜９、３．３〜９、３．４〜９、３．５〜９、３．６〜９、３．７〜９、３．８〜９、３．９〜９、４〜９、５〜９、６〜９、７〜９、８〜９、１．５〜８、１．６〜８、１．７〜８、１．８〜８、１．９〜８、２〜８、２．１〜８、２．２〜８、２．３〜８、２．４〜８、２．５〜８、２．６〜８、２．７〜８、２．８〜８、２．９〜８、３．０〜８、３．１〜８、３．２〜８、３．３〜８、３．４〜８、３．５〜８、３．６〜８、３．７〜８、３．８〜８、３．９〜８、４〜８、５〜８、６〜８、７〜８、１．５〜７、１．６〜７、１．７〜７、１．８〜７、１．９〜７、２〜７、２．１〜７、２．２〜７、２．３〜７、２．４〜７、２．５〜７、２．６〜７、２．７〜７、２．８〜７、２．９〜７、３．０〜７、３．１〜７、３．２〜７、３．３〜７、３．４〜７、３．５〜７、３．６〜７、３．７〜７、３．８〜７、３．９〜７、４〜７、５〜７、６〜７、１．５〜６、１．６〜６、１．７〜６、１．８〜６、１．９〜６、２〜６、２．１〜６、２．２〜６、２．３〜６、２．４〜６、２．５〜６、２．６〜６、２．７〜６、２．８〜６、２．９〜６、３．０〜６、３．１〜６、３．２〜６、３．３〜６、３．４〜６、３．５〜６、３．６〜６、３．７〜６、３．８〜６、３．９〜６、４〜６、５〜６、１．５〜５、１．６〜５、１．７〜５、１．８〜５、１．９〜５、２〜５、２．１〜５、２．２〜５、２．３〜５、２．４〜５、２．５〜５、２．６〜５、２．７〜５、２．８〜５、２．９〜５、３．０〜５、３．１〜５、３．２〜５、３．３〜５、３．４〜５、３．５〜５、３．６〜５、３．７〜５、３．８〜５、３．９〜５、４〜５、１．５〜４、１．６〜４、１．７〜４、１．８〜４、１．９〜４、２〜４、２．１〜４、２．２〜４、２．３〜４、２．４〜４、２．５〜４、２．６〜４、２．７〜４、２．８〜４、２．９〜４、３．０〜４、３．１〜４、３．２〜４、３．３〜４、３．４〜４、３．５〜４、３．６〜４、３．７〜４、３．８〜４、３．９〜４、１．５〜３、１．６〜３、１．７〜３、１．８〜３、１．９〜３、２〜３、２．１〜３、２．２〜３、２．３〜３、２．４〜３、２．５〜３、２．６〜３、２．７〜３、２．８〜３、２．９〜３、１．５〜２、１．６〜２、１．７〜２、１．８〜２、または１．９〜２倍である能力を有しうる。
【０１０５】
１または複数のプロテアーゼは、ＭＭＰ１（間質コラゲナーゼ）、ＭＭＰ２（ゼラチナーゼＡ）、ＭＭＰ３（ストロメリシン１）、ＭＭＰ７（マトリリシン、ＰＵＭＰ１）、ＭＭＰ８（好中球コラゲナーゼ）、ＭＭＰ９（ゼラチナーゼＢ）、ＭＭＰ１０（ストロメリシン２）、ＭＭＰ１１（ストロメリシン３）、ＭＭＰ１２（マクロファージメタロエラスターゼ）、ＭＭＰ１３（コラゲナーゼ３）、ＭＭＰ１４（ＭＴ１−ＭＭＰ）、ＭＭＰ１５（ＭＴ２−ＭＭＰ）、ＭＭＰ１６（ＭＴ３−ＭＭＰ）、ＭＭＰ１７（ＭＴ４−ＭＭＰ）、ＭＭＰ１８（コラゲナーゼ４、ｘｃｏｌ４、Ｘｅｎｏｐｕｓ属コラゲナーゼ）、ＭＭＰ１９（ＲＡＳＩ−１、ストロメリシン４）、ＭＭＰ２０（エナメリシン）、ＭＭＰ２１（Ｘ−ＭＭＰ）、ＭＭＰ２３Ａ（ＣＡ−ＭＭＰ）、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ２４（ＭＴ５−ＭＭＰ）、ＭＭＰ２５（ＭＴ６−ＭＭＰ）、ＭＭＰ２６（マトリリシン２、エンドメターゼ）、ＭＭＰ２７（ＭＭＰ−２２、Ｃ−ＭＭＰ）、ＭＭＰ２８（エピリシン）などのマトリックスメタロプロテアーゼ；ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＤＡＭＴＳ３、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５（ＡＤＡＭＴＳ１１）、ＡＤＡＭＴＳ６、ＡＤＡＭＴＳ７、ＡＤＡＭＴＳ８（ＭＥＴＨ−２）、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＤＡＭＴＳ１０、ＡＤＡＭＴＳ１２、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＡＤＡＭＴＳ１４、ＡＤＡＭＴＳ１５、ＡＤＡＭＴＳ１６、ＡＤＡＭＴＳ１７、ＡＤＡＭＴＳ１８、ＡＤＡＭＴＳ１９、ＡＤＡＭＴＳ２０などのＡＤＡＭＴＳ（Ａ  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  Ｍｏｔｉｆｓ）プロテアーゼ；キモトリプシン；トリプシン；エラスターゼ；補体因子；凝固因子；トロンビン；プラスミン；スブチリシン；ネプリリシン；プロコラーゲンペプチダーゼ；テルモリシン；妊娠関連血漿タンパク質Ａ；骨形成タンパク質１；リソスタフィン；インスリン分解酵素；ＺＭＰＳＴＥ２；ＺＭＰＳＴＥ４；ＺＭＰＳＴＥ２４；；およびアセチルコリンエステラーゼを含みうる。
【０１０６】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、ＦＡＣの形成を防止する能力を、野生型Ａ２Ｍポリペプチドと比較して増大させていることとして特徴付けることができる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、ＦＡＣの形成を防止する能力であって、ＦＡＣの形成を防止する、野生型Ａ２Ｍポリペプチドの能力の、少なくとも１．５倍である能力を有しうる。例えば、変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、ＦＡＣの形成を防止する能力であって、ＦＡＣの形成を防止する、野生型Ａ２Ｍポリペプチドの能力の、少なくとも１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍である能力を有しうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、ＦＡＣの形成を防止する能力であって、ＦＡＣの形成を防止する、野生型Ａ２Ｍポリペプチドの能力の、１．５〜１００倍である能力を有しうる。例えば、変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、ＦＡＣの形成を防止する能力であって、ＦＡＣの形成を防止する、野生型Ａ２Ｍポリペプチドの能力の、１．６〜１００、１．７〜１００、１．８〜１００、１．９〜１００、２〜１００、２．１〜１００、２．２〜１００、２．３〜１００、２．４〜１００、２．５〜１００、２．６〜１００、２．７〜１００、２．８〜１００、２．９〜１００、３．０〜１００、３．１〜１００、３．２〜１００、３．３〜１００、３．４〜１００、３．５〜１００、３．６〜１００、３．７〜１００、３．８〜１００、３．９〜１００、４〜１００、５〜１００、６〜１００、７〜１００、８〜１００、９〜１００、１０〜１００、１１〜１００、１２〜１００、１３〜１００、１４〜１００、１５〜１００、１６〜１００、１７〜１００、１８〜１００、１９〜１００、２０〜１００、２５〜１００、３０〜１００、３５〜１００、４０〜１００、４５〜１００、５０〜１００、６０〜１００、７０〜１００、８０〜１００、９０〜１００、１．５〜９０、１．６〜９０、１．７〜９０、１．８〜９０、１．９〜９０、２〜９０、２．１〜９０、２．２〜９０、２．３〜９０、２．４〜９０、２．５〜９０、２．６〜９０、２．７〜９０、２．８〜９０、２．９〜９０、３．０〜９０、３．１〜９０、３．２〜９０、３．３〜９０、３．４〜９０、３．５〜９０、３．６〜９０、３．７〜９０、３．８〜９０、３．９〜９０、４〜９０、５〜９０、６〜９０、７〜９０、８〜９０、９〜９０、１０〜９０、１１〜９０、１２〜９０、１３〜９０、１４〜９０、１５〜９０、１６〜９０、１７〜９０、１８〜９０、１９〜９０、２０〜９０、２５〜９０、３０〜９０、３５〜９０、４０〜９０、４５〜９０、５０〜９０、６０〜９０、７０〜９０、８０〜９０、１．５〜８０、１．６〜８０、１．７〜８０、１．８〜８０、１．９〜８０、２〜８０、２．１〜８０、２．２〜８０、２．３〜８０、２．４〜８０、２．５〜８０、２．６〜８０、２．７〜８０、２．８〜８０、２．９〜８０、３．０〜８０、３．１〜８０、３．２〜８０、３．３〜８０、３．４〜８０、３．５〜８０、３．６〜８０、３．７〜８０、３．８〜８０、３．９〜８０、４〜８０、５〜８０、６〜８０、７〜８０、８〜８０、９〜８０、１０〜８０、１１〜８０、１２〜８０、１３〜８０、１４〜８０、１５〜８０、１６〜８０、１７〜８０、１８〜８０、１９〜８０、２０〜８０、２５〜８０、３０〜８０、３５〜８０、４０〜８０、４５〜８０、５０〜８０、６０〜８０、７０〜８０、１．５〜７０、１．６〜７０、１．７〜７０、１．８〜７０、１．９〜７０、２〜７０、２．１〜７０、２．２〜７０、２．３〜７０、２．４〜７０、２．５〜７０、２．６〜７０、２．７〜７０、２．８〜７０、２．９〜７０、３．０〜７０、３．１〜７０、３．２〜７０、３．３〜７０、３．４〜７０、３．５〜７０、３．６〜７０、３．７〜７０、３．８〜７０、３．９〜７０、４〜７０、５〜７０、６〜７０、７〜７０、８〜７０、９〜７０、１０〜７０、１１〜７０、１２〜７０、１３〜７０、１４〜７０、１５〜７０、１６〜７０、１７〜７０、１８〜７０、１９〜７０、２０〜７０、２５〜７０、３０〜７０、３５〜７０、４０〜７０、４５〜７０、５０〜７０、６０〜７０、１．５〜６０、１．６〜６０、１．７〜６０、１．８〜６０、１．９〜６０、２〜６０、２．１〜６０、２．２〜６０、２．３〜６０、２．４〜６０、２．５〜６０、２．６〜６０、２．７〜６０、２．８〜６０、２．９〜６０、３．０〜６０、３．１〜６０、３．２〜６０、３．３〜６０、３．４〜６０、３．５〜６０、３．６〜６０、３．７〜６０、３．８〜６０、３．９〜６０、４〜６０、５〜６０、６〜６０、７〜６０、８〜６０、９〜６０、１０〜６０、１１〜６０、１２〜６０、１３〜６０、１４〜６０、１５〜６０、１６〜６０、１７〜６０、１８〜６０、１９〜６０、２０〜６０、２５〜６０、３０〜６０、３５〜６０、４０〜６０、４５〜６０、５０〜６０、１．５〜５０、１．６〜５０、１．７〜５０、１．８〜５０、１．９〜５０、２〜５０、２．１〜５０、２．２〜５０、２．３〜５０、２．４〜５０、２．５〜５０、２．６〜５０、２．７〜５０、２．８〜５０、２．９〜５０、３．０〜５０、３．１〜５０、３．２〜５０、３．３〜５０、３．４〜５０、３．５〜５０、３．６〜５０、３．７〜５０、３．８〜５０、３．９〜５０、４〜５０、５〜５０、６〜５０、７〜５０、８〜５０、９〜５０、１０〜５０、１１〜５０、１２〜５０、１３〜５０、１４〜５０、１５〜５０、１６〜５０、１７〜５０、１８〜５０、１９〜５０、２０〜５０、２５〜５０、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、１．５〜４０、１．６〜４０、１．７〜４０、１．８〜４０、１．９〜４０、２〜４０、２．１〜４０、２．２〜４０、２．３〜４０、２．４〜４０、２．５〜４０、２．６〜４０、２．７〜４０、２．８〜４０、２．９〜４０、３．０〜４０、３．１〜４０、３．２〜４０、３．３〜４０、３．４〜４０、３．５〜４０、３．６〜４０、３．７〜４０、３．８〜４０、３．９〜４０、４〜４０、５〜４０、６〜４０、７〜４０、８〜４０、９〜４０、１０〜４０、１１〜４０、１２〜４０、１３〜４０、１４〜４０、１５〜４０、１６〜４０、１７〜４０、１８〜４０、１９〜４０、２０〜４０、２５〜４０、３０〜４０、１．５〜３０、１．６〜３０、１．７〜３０、１．８〜３０、１．９〜３０、２〜３０、２．１〜３０、２．２〜３０、２．３〜３０、２．４〜３０、２．５〜３０、２．６〜３０、２．７〜３０、２．８〜３０、２．９〜３０、３．０〜３０、３．１〜３０、３．２〜３０、３．３〜３０、３．４〜３０、３．５〜３０、３．６〜３０、３．７〜３０、３．８〜３０、３．９〜３０、４〜３０、５〜３０、６〜３０、７〜３０、８〜３０、９〜３０、１０〜３０、１１〜３０、１２〜３０、１３〜３０、１４〜３０、１５〜３０、１６〜３０、１７〜３０、１８〜３０、１９〜３０、２０〜３０、１．５〜２０、１．６〜２０、１．７〜２０、１．８〜２０、１．９〜２０、２〜２０、２．１〜２０、２．２〜２０、２．３〜２０、２．４〜２０、２．５〜２０、２．６〜２０、２．７〜２０、２．８〜２０、２．９〜２０、３．０〜２０、３．１〜２０、３．２〜２０、３．３〜２０、３．４〜２０、３．５〜２０、３．６〜２０、３．７〜２０、３．８〜２０、３．９〜２０、４〜２０、５〜２０、６〜２０、７〜２０、８〜２０、９〜２０、１０〜２０、１１〜２０、１２〜２０、１３〜２０、１４〜２０、１５〜２０、１．５〜１５、１．６〜１５、１．７〜１５、１．８〜１５、１．９〜１５、２〜１５、２．１〜１５、２．２〜１５、２．３〜１５、２．４〜１５、２．５〜１５、２．６〜１５、２．７〜１５、２．８〜１５、２．９〜１５、３．０〜１５、３．１〜１５、３．２〜１５、３．３〜１５、３．４〜１５、３．５〜１５、３．６〜１５、３．７〜１５、３．８〜１５、３．９〜１５、４〜１５、５〜１５、６〜１５、７〜１５、８〜１５、９〜１５、１０〜１５、１１〜１５、１２〜１５、１３〜１５、１４〜１５、１．５〜１０、１．６〜１０、１．７〜１０、１．８〜１０、１．９〜１０、２〜１０、２．１〜１０、２．２〜１０、２．３〜１０、２．４〜１０、２．５〜１０、２．６〜１０、２．７〜１０、２．８〜１０、２．９〜１０、３．０〜１０、３．１〜１０、３．２〜１０、３．３〜１０、３．４〜１０、３．５〜１０、３．６〜１０、３．７〜１０、３．８〜１０、３．９〜１０、４〜１０、５〜１０、６〜１０、７〜１０、８〜１０、９〜１０、１．５〜９、１．６〜９、１．７〜９、１．８〜９、１．９〜９、２〜９、２．１〜９、２．２〜９、２．３〜９、２．４〜９、２．５〜９、２．６〜９、２．７〜９、２．８〜９、２．９〜９、３．０〜９、３．１〜９、３．２〜９、３．３〜９、３．４〜９、３．５〜９、３．６〜９、３．７〜９、３．８〜９、３．９〜９、４〜９、５〜９、６〜９、７〜９、８〜９、１．５〜８、１．６〜８、１．７〜８、１．８〜８、１．９〜８、２〜８、２．１〜８、２．２〜８、２．３〜８、２．４〜８、２．５〜８、２．６〜８、２．７〜８、２．８〜８、２．９〜８、３．０〜８、３．１〜８、３．２〜８、３．３〜８、３．４〜８、３．５〜８、３．６〜８、３．７〜８、３．８〜８、３．９〜８、４〜８、５〜８、６〜８、７〜８、１．５〜７、１．６〜７、１．７〜７、１．８〜７、１．９〜７、２〜７、２．１〜７、２．２〜７、２．３〜７、２．４〜７、２．５〜７、２．６〜７、２．７〜７、２．８〜７、２．９〜７、３．０〜７、３．１〜７、３．２〜７、３．３〜７、３．４〜７、３．５〜７、３．６〜７、３．７〜７、３．８〜７、３．９〜７、４〜７、５〜７、６〜７、１．５〜６、１．６〜６、１．７〜６、１．８〜６、１．９〜６、２〜６、２．１〜６、２．２〜６、２．３〜６、２．４〜６、２．５〜６、２．６〜６、２．７〜６、２．８〜６、２．９〜６、３．０〜６、３．１〜６、３．２〜６、３．３〜６、３．４〜６、３．５〜６、３．６〜６、３．７〜６、３．８〜６、３．９〜６、４〜６、５〜６、１．５〜５、１．６〜５、１．７〜５、１．８〜５、１．９〜５、２〜５、２．１〜５、２．２〜５、２．３〜５、２．４〜５、２．５〜５、２．６〜５、２．７〜５、２．８〜５、２．９〜５、３．０〜５、３．１〜５、３．２〜５、３．３〜５、３．４〜５、３．５〜５、３．６〜５、３．７〜５、３．８〜５、３．９〜５、４〜５、１．５〜４、１．６〜４、１．７〜４、１．８〜４、１．９〜４、２〜４、２．１〜４、２．２〜４、２．３〜４、２．４〜４、２．５〜４、２．６〜４、２．７〜４、２．８〜４、２．９〜４、３．０〜４、３．１〜４、３．２〜４、３．３〜４、３．４〜４、３．５〜４、３．６〜４、３．７〜４、３．８〜４、３．９〜４、１．５〜３、１．６〜３、１．７〜３、１．８〜３、１．９〜３、２〜３、２．１〜３、２．２〜３、２．３〜３、２．４〜３、２．５〜３、２．６〜３、２．７〜３、２．８〜３、２．９〜３、１．５〜２、１．６〜２、１．７〜２、１．８〜２、または１．９〜２倍である能力を有しうる。
【０１０７】
本発明の一態様は、変異体Ａ２Ｍポリペプチドによるプロテアーゼの阻害の増強を決定するための方法であって、ａ）配列番号６〜８３のうちの、１または複数の配列を含む、変異体Ａ２Ｍポリペプチドを用意するステップと；ｂ）変異体Ａ２Ｍポリペプチドを、プロテアーゼおよびプロテアーゼにより切断される基質と接触させるステップと；ｃ）野生型Ａ２Ｍポリペプチドを、プロテアーゼおよびプロテアーゼにより切断される基質と接触させるステップと；ｄ）ステップｂ）による基質の切断量を、ステップｃ）による基質の切断量と比較し、これにより、変異体Ａ２Ｍポリペプチドによるプロテアーゼの阻害の増強を決定するステップとを含む方法である。
【０１０８】
酵素による糖コンジュゲーション反応を、グリコシル化部位およびグリコシル化部位に接合させる残基にターゲティングすることができる。標的グリコシル化部位は、野生型Ａ２Ｍタンパク質に対して天然の部位の場合もあり、変異体Ａ２Ｍポリペプチドに対して天然の部位の場合もあり、代替的に、突然変異により、野生型Ａ２Ｍまたは変異体Ａ２Ｍポリペプチドに導入することもできる。こうして、本発明の方法により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、変異体Ａ２Ｍポリペプチドの半減期を増大するための方法が提供される。
【０１０９】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、タンパク質内の、１または複数のグリコシル化部位を挿入するか、除去するか、または再配置するように突然変異させたアミノ酸配列を含みうる。部位を、付加または再配置する場合、部位は、野生型Ａ２Ｍペプチド内に存在しないか、または野生型Ａ２Ｍペプチド内の、選択された場所に存在しない。突然変異体グリコシル化部位は、グリコシル化部位に酵素的にコンジュゲートさせうる、修飾グリコシル残基のための接合点でありうる。本発明の方法を使用して、グリコシル化部位を、ペプチド上の、任意の効果的な位置にシフトさせることができる。例えば、コンジュゲーションが、プロテアーゼに結合する能力、プロテアーゼを阻害する能力、またはこれらの組合せに干渉する程度に十分に、天然グリコシル化部位が、変異体Ａ２Ｍポリペプチドペプチドのベイト領域と近位であるか、またはこのベイト領域内にある場合、生物学的に活性な変異体Ａ２Ｍポリペプチドをもたらす必要に応じて、修飾グリコシル化部位、またはベイトから除去されたグリコシル化部位を含む、変異体Ａ２Ｍポリペプチドを操作することは、本発明の範囲内にある。
【０１１０】
任意のグリコシルトランスフェラーゼ、または当技術分野で公知のそれらの使用法を、カスタムで設計されたグリコシル化パターン、多様なグリコシル構造、またはこれらの可能な組合せを伴う、変異体Ａ２Ｍポリペプチドの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、酵素による合成のために使用することができる。例えば、米国特許第５，８７６，９８０号；同第６，０３０，８１５号；同第５，７２８，５５４号；同第５，９２２，５７７号；ならびにＷＯ／９８３１８２６；ＵＳ２００３１８０８３５；およびＷＯ０３／０３１４６４を参照されたい。
【０１１１】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、１または複数のプロテアーゼについてのコンセンサス配列を含みうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、表２における、１または複数のプロテアーゼ認識部位／プロテアーゼ認識配列を含みうる。
【表２−１】
2018501207.tif 000004
【表２−２】
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【表３】
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【表４Ａ−１】
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【表４Ａ−２】
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【表４Ｂ−１】
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【表４Ｂ−２】
2018501207.tif 000010
【０１１２】
本発明は、完全なグリコシル連結基を介して、水溶性のポリマーを、変異体Ａ２Ｍポリペプチドにコンジュゲートさせることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける変異体Ａ２Ｍポリペプチドの半減期を改善または延長する方法を提供する。例示的な実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマーの、このような変異体Ａ２Ｍポリペプチドへの共有結合的接合は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける滞留時間、ならびに薬物動態特性および薬力学特性が、コンジュゲートさせていない変異体Ａ２Ｍポリペプチドと比べて増強された、変異体Ａ２Ｍポリペプチドをもたらす。
【０１１３】
水溶性ポリマーのポリマー主鎖は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）でありうる。しかし、他の類縁のポリマーもまた、本発明の実施における使用に適し、ＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）という用語の使用は、この点で、包含的であることを意図するものであり、除外的であることを意図するものではないことを理解されたい。ＰＥＧという用語は、その形態のうちのいずれかの中のポリ（エチレングリコール）であって、アルコキシＰＥＧ、二官能性ＰＥＧ、マルチアーム型ＰＥＧ、フォーク型ＰＥＧ、分枝状ＰＥＧ、ペンダント型ＰＥＧ（すなわち、ポリマー主鎖に懸垂する１または複数の官能基を有する、ＰＥＧまたは類縁のポリマー）、またはその中に分解性連結を伴うＰＥＧを含むポリ（エチレングリコール）を含む。ポリマー主鎖は、直鎖状の場合もあり、分枝状の場合もある。当技術分野では一般に、分枝状ポリマー主鎖が公知である。分枝状ポリマーは、中央の分枝コア部分と、中央の分枝コアに連結された、複数の直鎖状ポリマー鎖とを有することが典型的である。ＰＥＧは一般に、エチレンオキシドの、グリセロール、ペンタエリトリトール、およびソルビトールなどの多様なポリオールへの付加により調製されうる分枝状形態で使用する。中央の分枝部分はまた、リシンなど、いくつかのアミノ酸にも由来しうる。分枝状ポリ（エチレングリコール）は、一般的形態では、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｎ［式中、Ｒは、グリセロールまたはペンタエリトリトールなどのコア部分を表し、ｎは、アームの数を表す］として表すことができる。他の多くのポリマーもまた、本発明に適する。適するポリマーの例は、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）など、他のポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）など、エチレングリコールと、プロピレングリコールとのコポリマー、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ならびにこれらのコポリマー、テルポリマー、および混合物を含むがこれらに限定されない。ポリマー主鎖の各鎖の分子量は、変動しうるが、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの範囲であることが典型的であり、約６，０００Ｄａ〜約８０，０００Ｄａであることが多い。
【０１１４】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、ＰＥＧをさらに含みうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、１または複数の突然変異体グリコシル化部位または修飾グリコシル化部位を有しうる。修飾グリコシル化部位は、ＰＥＧを含みうる。例えば、変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ超の突然変異体グリコシル化部位または修飾グリコシル化部位を有しうる。ＰＥＧの、１または複数の修飾グリコシル化部位または非正常グリコシル化部位を伴う、変異体Ａ２Ｍポリペプチドへの、コンジュゲーションまたは付加は、対象の関節または脊椎椎間板など、対象内に位置すると、ＰＥＧを伴わない、野生型Ａ２Ｍタンパク質の半減期より半減期が長い、変異体Ａ２Ｍポリペプチドを結果としてもたらしうる。ＰＥＧの、１または複数の修飾グリコシル化部位または非正常グリコシル化部位を伴う、変異体Ａ２Ｍポリペプチドへの、コンジュゲーションまたは付加は、対象の関節または脊椎椎間板など、対象内に位置すると、１または複数の修飾グリコシル化部位を伴わず、ＰＥＧを伴わない、変異体Ａ２Ｍポリペプチドの半減期より半減期が長い、変異体Ａ２Ｍポリペプチドを結果としてもたらしうる。ＰＥＧの、１または複数の修飾グリコシル化部位または非正常グリコシル化部位を伴う、変異体Ａ２Ｍポリペプチドへの、コンジュゲーションまたは付加は、対象の関節または脊椎椎間板など、対象内に位置すると、１または複数の修飾グリコシル化部位を伴うが、ＰＥＧを伴わない、変異体Ａ２Ｍポリペプチドの半減期より半減期が長い、変異体Ａ２Ｍポリペプチドを結果としてもたらしうる。例えば、ＰＥＧを伴う、１または複数の修飾グリコシル化部位または非正常グリコシル化部位を伴う変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、ＰＥＧを伴わない野生型Ａ２Ｍタンパク質、１もしくは複数の修飾グリコシル化部位を伴うが、ＰＥＧを伴わない、変異体Ａ２Ｍポリペプチド、または１もしくは複数の修飾グリコシル化部位を伴わず、ＰＥＧを伴わない、変異体Ａ２Ｍポリペプチドの半減期の、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００倍である半減期を有しうる。例えば、ＰＥＧを伴う、１または複数の修飾グリコシル化部位または非正常グリコシル化部位を伴う変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、対象の関節または脊椎椎間板内に位置すると、１または複数の修飾グリコシル化部位または非正常グリコシル化部位を伴わず、ＰＥＧを伴わない、野生型Ａ２Ｍタンパク質組成物の半減期の２倍である半減期を有しうる。
【０１１５】
本発明はさらに、本発明の核酸断片または本発明の核酸断片の縮重変異体によりコードされる単離ポリペプチドも提供する。「縮重変異体」とは、本発明の核酸断片（例えば、ＯＲＦ）と、ヌクレオチド配列が異なるが、遺伝子コードの縮重に起因して、同一なポリペプチド配列をコードするヌクレオチド断片を意図しうる。本発明の好ましい核酸断片は、タンパク質をコードするＯＲＦである。
【０１１６】
本発明はまた、生物活性を呈示することが可能な、本発明のＡ２Ｍ変異体の断片も包摂する。Ａ２Ｍ変異体の断片は、例えば、それらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、H.  U.  Saragoviら、Bio/Technology、１０巻、７７３〜７７８頁（１９９２年）；およびR.  S.  McDowellら、J.  Amer.  Chem.  Soc.、１１４巻、９２４５〜９２５３頁（１９９２年）において記載されている、公知の方法を使用して、直鎖状形態の場合もあり、環状形態の場合もある。このような断片は、タンパク質結合性部位の価数を増大させることを含む、多くの目的で、免疫グロブリンなどの担体分子に融合させることができる。本発明はまた、開示されるＡ２Ｍ変異体の、全長形態および成熟形態（例えば、シグナル配列または前駆体配列を伴わない）のいずれも提供する。タンパク質コード配列は、開示されるヌクレオチド配列の翻訳により、配列表内で同定することができる。このようなＡ２Ｍ変異体の成熟形態は、適切な哺乳動物細胞または他の宿主細胞内の全長ポリヌクレオチドの発現により得ることができる。Ａ２Ｍ変異体の成熟形態の配列はまた、全長形態のアミノ酸配列からも決定可能である。本発明のＡ２Ｍ変異体は、膜結合型であるが、Ａ２Ｍ変異体の可溶性形態もまた提供される。このような形態では、Ａ２Ｍ変異体が、それを発現させる細胞から、完全に分泌されるように、Ａ２Ｍ変異体を膜結合させる領域の一部または全部を欠失させている。本発明のＡ２Ｍ変異体組成物は、親水性の担体、例えば、薬学的に許容される担体など、許容可能な担体をさらに含みうる。
【０１１７】
変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチド組成物
配列番号１または２に言及して、本明細書で使用される場合の「Ａ２Ｍポリヌクレオチド」とは、配列番号１もしくは２のポリヌクレオチド配列、またはこれらの断片のほか、１もしくは複数の挿入、欠失、突然変異、またはこれらの組合せを含む、任意の核酸変異体を意味する。挿入、欠失、および突然変異は、Ａ２Ｍタンパク質のベイト領域をコードするポリヌクレオチド配列内にあることが好ましい。同様に、配列番号１または２に言及して使用される場合の「Ａ２Ｍ  ｃＤＮＡ」、「Ａ２Ｍコード配列」、または「Ａ２Ｍコード核酸」も、配列番号１もしくは２の核酸配列、またはこれらの断片のほか、１もしくは複数の挿入、欠失、突然変異、またはこれらの組合せを含む核酸変異体を意味する。Ａ２Ｍポリヌクレオチドまたはこれらの断片は、変異体Ａ２Ｍポリペプチドをコードする、変異体Ａ２Ｍ組換えポリヌクレオチド構築物であって、変異体Ａ２Ｍポリペプチドを発現させる変異体Ａ２Ｍ組換えポリヌクレオチド構築物を創出するように、分子生物学における従来の技法を使用して操作することができる。変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドは、配列番号１および２に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。Ａ２Ｍコード配列は、配列番号１および２のうちのいずれか１つに対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１１８】
一態様では、本明細書では、変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチド組成物が提供される。多様な生物に由来する野生型Ａ２Ｍタンパク質をコードする、多数のポリヌクレオチド配列が決定されている。同定された、任意のＡ２Ｍ  ＤＮＡ配列はその後、化学合成および／またはオーバーラップエクステンション法などのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により得ることができる。短い配列には、完全にデノボの合成が十分でありうるが、大型の遺伝子を得るには、合成プローブを使用する、ヒトｃＤＮＡライブラリーまたはヒトゲノムＤＮＡライブラリーからの全長コード配列のさらなる単離が必要でありうる。代替的に、Ａ２Ｍポリペプチドをコードする核酸配列は、相同性ベースのプライマーが、公知のＡ２Ｍポリペプチドをコードする核酸配列に由来しうることが多い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）など、標準的なクローニング法を使用して、ヒトｃＤＮＡライブラリーまたはヒトゲノムＤＮＡライブラリーから単離することもできる。
【０１１９】
野生型Ａ２Ｍポリペプチドのコード配列を得るのに適するｃＤＮＡライブラリーは、市販品を得ることもでき、構築することもできる。ｍＲＮＡを単離し、逆転写によりｃＤＮＡを製作し、ｃＤＮＡを、組換えベクターにライゲーションし、増殖、スクリーニング、およびクローニングのために、組換え宿主にトランスフェクトする一般的方法は、周知である。ＰＣＲにより、ヌクレオチド配列の増幅セグメントを得たら、野生型Ａ２Ｍタンパク質をコードする全長ポリヌクレオチド配列を、ｃＤＮＡライブラリーから単離するように、セグメントを、プローブとしてさらに使用することができる。同様の手順に従って、野生型Ａ２Ｍタンパク質をコードする全長配列を、ヒトゲノムライブラリーから得ることができる。ヒトゲノムライブラリーは、市販されているか、または当技術分野で認識されている多様な方法に従い構築することができる。一般に、ゲノムライブラリーを構築するには、まず、ＤＮＡを、ペプチドが見出される可能性が高い組織から抽出する。次いで、ＤＮＡを、機械的にせん断処理するか、または酵素的に消化して、約１２〜２０ｋｂの長さの断片をもたらす。その後、断片を、勾配遠心分離により、所望されないサイズのポリヌクレオチド断片から分離し、バクテリオファージλベクター内に挿入する。これらのベクターおよびファージを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてパッケージングする。組換えファージを、プラークハイブリダイゼーションにより解析する。
【０１２０】
配列相同性に基づき、縮重オリゴヌクレオチドを、プライマーセットとして設計することができ、ＰＣＲを、ヌクレオチド配列のセグメントを、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーから増幅するのに適する状態下で実施することができる。増幅されたセグメントを、プローブとして使用して、野生型Ａ２Ｍタンパク質をコードする全長核酸を得ることができる。
【０１２１】
野生型Ａ２Ｍタンパク質をコードする核酸配列を得たら、組換え野生型Ａ２Ｍタンパク質を、結果として得られる構築物から産生される、本発明の変異体Ａ２Ｍポリペプチドに、突然変異させて発現させうるように、コード配列を、ベクター、例えば、発現ベクターにサブクローニングすることができる。その後、野生型Ａ２Ｍタンパク質コード配列へのさらなる修飾、例えば、ヌクレオチド置換を施して、Ａ２Ｍタンパク質のベイト領域を変更することができる。
【０１２２】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはこれらの断片、または本発明のポリヌクレオチドもしくはこれらの断片の縮重変異体によりコードされる、単離ポリペプチドも提供する。本発明の、好ましいポリヌクレオチドまたはこれらの断片は、Ａ２Ｍ変異体をコードするＯＲＦである。
【０１２３】
変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドは、野生型Ａ２Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を突然変異させることにより製作することができる。これは、任意の公知の突然変異誘発法を使用することにより達成することができる。本明細書で記載される変異体ベイト領域を受容するための、野生型Ａ２Ｍポリヌクレオチドに対する例示的な修飾は、配列番号２における修飾を含む。Ａ２Ｍヌクレオチドに対する例示的な修飾は、配列番号６〜３０の変異体ベイト領域、または配列番号３１〜８３の１もしくは複数のプロテアーゼ認識配列を含む変異体ベイト領域をコードするヌクレオチド配列を、配列番号１の野生型Ａ２Ｍポリヌクレオチド配列、および配列番号２の変異体Ａ２Ｍアクセプターポリヌクレオチド配列に挿入するか、または前者のヌクレオチド配列で後者のポリヌクレオチド配列を置換することを含む。突然変異誘発手順を、個別に、または組み合わせて使用して、核酸のセットの変異体を作製することができ、よって、コードされるポリペプチドの変異体を作製することができる。突然変異誘発のためのキットは、市販されている。
【０１２４】
一態様では、本明細書では、変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドのうちのいずれかを製作する方法が提供される。変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを製作する方法は、変異体ベイト領域を、野生型Ａ２Ｍポリヌクレオチド配列または実質的に類似する配列に挿入するか、または前者で後者を置換するステップを含みうる。実質的に類似する配列は、配列番号２でありうる。本発明の一態様は、変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを製作するための方法であって、ａ）配列番号２の配列を含む、変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを含有するベクターを用意するステップと；ｂ）変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを含有するベクターを、制限エンドヌクレアーゼで消化して、直鎖状ベクターを形成するステップと；ｃ）配列番号６〜３０の変異体ベイト領域、または配列番号３１〜８３の１もしくは複数のプロテアーゼ認識配列を含む変異体ベイト領域のうちの１または複数をコードする１または複数のポリヌクレオチドの一方の端部を直鎖状ベクターの一方の端部にライゲーションするステップと；およびｄ）配列番号６〜３０の変異体ベイト領域、または配列番号３１〜８３の１もしくは複数のプロテアーゼ認識配列を含む変異体ベイト領域のうちの１または複数をコードする１または複数のポリヌクレオチドの他方の端部を、直鎖状ベクターの他方の端部にライゲーションし、これにより、配列番号６〜３０の変異体ベイト領域、または配列番号３１〜８３の１もしくは複数のプロテアーゼ認識配列を含む変異体ベイト領域を含む変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを含有するベクターを形成するステップとを含む方法である。
【０１２５】
タンパク質の産生
当技術分野で公知の様々な方法を活用して、本発明の単離Ａ２Ｍ変異体タンパク質のうちのいずれか１つを得ることができる。最も簡素なレベルでは、アミノ酸配列は、市販のペプチド合成装置を使用して、合成することができる。このようなポリペプチドは、アミノ末端上にメチオニンを伴って合成することもでき、メチオニンを伴わずに合成することもできる。化学合成されたポリペプチドは、これらの参考文献において明示されている方法を使用して、ジスルフィド架橋を形成するように、酸化することができる。合成により構築されたＡ２Ｍ変異体配列は、一次構造特徴、二次構造特徴、もしくは三次構造特徴、および／またはコンフォメーション特徴を、Ａ２Ｍ変異体と共有しているために、Ａ２Ｍ変異体と共通の生物学的特性であって、プロテアーゼ阻害活性を含む生物学的特性を有しうる。この技法は、小型のペプチドおよび大型のポリペプチドの断片の作製において、特に有用である。断片は、例えば、Ａ２Ｍ変異体に対する抗体を作出するのに有用である。こうして、断片を、治療用化合物のスクリーニング、および抗体を開発するための免疫学的工程において、天然の精製Ａ２Ｍ変異体の、生物学的に活性の代替物、または免疫学的代替物として援用することができる。
【０１２６】
本発明のＡ２Ｍ変異体ポリペプチドは代替的に、所望のＡ２Ｍ変異体を発現させるように変更された細胞から精製することもできる。本明細書で使用される、細胞が、遺伝子操作を介して、それが通常産生しないか、または通常低レベルで産生する、Ａ２Ｍ変異体ポリペプチドを産生するように製作されている場合、細胞は、所望のＡ２Ｍ変異体ポリペプチドまたはＡ２Ｍ変異体タンパク質を発現させるように変更されているという。当業者は、本発明のＡ２Ｍ変異体ポリペプチドのうちの１つを産生する細胞を作出するために、組換え配列または合成配列を、真核細胞または原核細胞に導入し、発現させるための手順を、たやすく適応させることができる。
【０１２７】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、組換えタンパク質またはその断片であることが可能であり、宿主細胞内で産生させることもでき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系により作製することもできる。組換えポリペプチドおよびタンパク質プロモーターは、宿主細胞、例えば、細菌培養物、または酵母細胞もしくは昆虫細胞などの下等真核細胞、または原核細胞、あるいは当技術分野で公知の任意の宿主内で、作動的に産生されうるように、挿入することができる。変異体Ａ２Ｍ組換えタンパク質は、細菌細胞内、酵母細胞内、真菌細胞内、昆虫細胞内、もしくは哺乳動物細胞内、または無細胞系内で産生させることができる。例えば、変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｒａｉｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、バキュロウイルス感染性昆虫細胞、またはＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞、ＮＳ０ハイブリドーマ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）ヒト細胞、ＨＥＫ２９３細胞、もしくはＣｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞内で産生させることができる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、一過性発現、安定的細胞系、ＢａｃＭａｍ媒介型一過性形質導入、または無細胞タンパク質産生により作製することができる。
【０１２８】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドはまた、単離変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを、１または複数の昆虫発現ベクター内の適切な制御配列に、作動可能に連結し、昆虫発現系を援用することによって作製することもできる。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための、材料および方法は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．（ＭａｘＢａｔ（商標）キット）から、キット形態で市販されており、このような方法は、参照により本明細書に組み込まれる、SummersおよびSmith、Texas  Agricultural  Experiment  Station  Bulletin、１５５５号（１９８７年）において記載されている通り、当技術分野で周知である。
【０１２９】
哺乳動物宿主細胞内では、いくつかのウイルスベースの発現系を活用することができる。アデノウイルスを、発現ベクターとして使用する場合、目的の変異体Ａ２Ｍヌクレオチド配列を、アデノウイルス転写／翻訳転写複合体、例えば、後期プロモーター配列および三部分リーダー配列にライゲーションすることができる。次いで、このキメラ遺伝子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける組換えにより、アデノウイルスゲノム内に挿入することができる。ウイルスゲノムの、非必須領域内の挿入は、生存可能であり、感染性宿主内で変異体Ａ２Ｍ遺伝子産物を発現させることが可能な、組換えウイルスを結果としてもたらしうる。挿入されたヌクレオチド配列の効果的な翻訳のためにはまた、特異的な開始シグナルも要請されうる。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を含む。それ自体の開始コドンおよび隣接する配列を含む、変異体Ａ２Ｍ遺伝子またはｃＤＮＡの全体を、適切な発現ベクター、例えば、ｐＪ６０８哺乳動物発現ベクター（図２３）内に挿入する場合、さらなる翻訳制御シグナルは必要とされない。ＡＴＧ開始コドンなどの、外因性翻訳制御シグナルを用意することができる。
【０１３０】
宿主細胞は、本発明の変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを含有するように、遺伝子操作することができる。例えば、このような宿主細胞は、公知の形質転換法、トランスフェクション法、または感染法を使用して、宿主細胞に導入される、変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを含有しうる。本明細書で使用される、変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを発現させることが可能な細胞は、「形質転換」することができる。本発明の変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、形質転換された宿主細胞を、組換えタンパク質を発現させるのに適する培養条件下で培養することにより調製することができる。外来ヌクレオチド配列を、宿主細胞に導入するための、任意の手順を使用することができる。非限定的な例は、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、トランスフェクション、ＤＥＡＥ、デキストラン媒介型トランスフェクション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、電気穿孔（Davis,  L.ら、「Basic  Methods  in  Molecular  Biology」（１９８６年））、リポソーム、マイクロインジェクション、プラスミドベクター、ウイルスベクター、およびクローニングされた、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、または他の外来遺伝子材料を、宿主細胞に導入するための、他の任意の周知の方法の使用を含む。少なくとも１つの遺伝子を、変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを発現させることが可能な、宿主細胞への導入に成功することが可能な遺伝子操作手順を使用することができる。
【０１３１】
本発明はなおさらに、本発明の変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを発現させるように操作された宿主細胞であって、変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドが、細胞内の変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドの発現を駆動する宿主細胞と異種の調節配列により作動性である宿主細胞を提供する。Ａ２Ｍ様ＤＮＡについての知見は、Ａ２Ｍ様ポリペプチドの発現を許容するか、または増大させる細胞の改変を可能とする。細胞は、例えば、ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来する、自然発生のＡ２Ｍを、全部または一部において置きかえること、例えば、細胞の変異体Ａ２Ｍ部位を、要請される非転写ポリペプチドをもたらすのに使用し、高レベルで発現させうるよう、ＳＶ４０マクログロブリン様プロモーターを、異種プロモーターの全部または一部で置きかえることにより、相同組換えを介して、変異体Ａ２Ｍポリペプチド発現の増大をもたらすように改変することができる。
【０１３２】
組換え変異体Ａ２Ｍポリペプチドの、長期にわたる高収率の産生のためには、安定的な発現が好ましい。例えば、本明細書で記載される変異体Ａ２Ｍ配列を安定的に発現させる細胞系を操作することができる。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）、および選択マーカーにより制御されるＤＮＡで形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入に続き、操作された細胞を、濃縮された培地中で、１〜２日間にわたり増殖させ、次いで、選択培地に切り替える。組換えプラスミド内の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞が、プラスミドを、それらの染色体に安定的に組み入れ、増殖して、増殖巣を形成することを可能とするが、これを、細胞系に、クローニングおよび拡大する。この方法は、変異体Ａ２Ｍ遺伝子産物を発現させる細胞系を操作するのに使用すると有利である。このような操作された細胞系は、変異体Ａ２Ｍ遺伝子産物の内因性活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニングおよび査定において、特に有用である。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むがこれらに限定されないいくつかの選択系をそれぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、ａｐｒｔ−細胞において使用することもできる。また、代謝拮抗剤耐性も、以下の遺伝子：メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ；アミノ糖側鎖であるＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ；およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏについての選択のベースとして使用することができる。
【０１３３】
変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチド配列は、タンパク質のプロセシングまたは発現を修飾するように、操作することができる。限定を目的とするものではないが、例えば、変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを、プロモーター配列および／またはリボソーム結合性部位と組み合わせることもでき、シグナル配列を、変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチド配列の上流に挿入して、変異体Ａ２Ｍポリペプチドの分泌を可能とし、これにより、採取を容易とするか、またはバイオアベイラビリティーを促進することもできる。加えて、変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて突然変異させて、翻訳配列、開始配列、および／または終結配列を、創出および／または破壊するか、あるいはコード領域内の変異を創出し、かつ／または新たな制限部位を形成するか、もしくは既存の部位を破壊するか、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるさらなる修飾を容易とすることもできる。突然変異誘発のための、当技術分野で公知の任意の技法であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける部位指向突然変異誘発を含むがこれらに限定されない、任意の技法を使用することができる。
【０１３４】
さらに、融合タンパク質を創出するように、他のタンパク質または他のタンパク質のドメインをコードする核酸を、変異体Ａ２Ｍポリペプチドまたはその断片をコードする核酸に接続することもできる。融合タンパク質をコードするヌクレオチドは、全長変異体Ａ２Ｍタンパク質もしくは全長野生型Ａ２Ｍタンパク質、切断型変異体Ａ２Ｍタンパク質もしくは切断型野生型Ａ２Ｍタンパク質、または例えば、Ａ２Ｍペプチド断片を、細胞膜にアンカリングする膜貫通配列；結果として得られる融合タンパク質の安定性および半減期を増大させ、Ｉｇ  Ｆｃドメイン；マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはチオレドキシン（ＴＲＸ）、Ｈｉｓタグ、酵素、マーカーとして使用しうる、蛍光タンパク質、発光タンパク質、例えば、Ａ２Ｍ−緑色蛍光タンパク質融合タンパク質などの非類縁タンパク質もしくは非類縁ペプチドに融合させた、変異体Ａ２Ｍタンパク質もしくは野生型Ａ２Ｍタンパク質のペプチド断片を含みうるがこれらに限定されない。融合タンパク質は、アフィニティー精製に使用することができる。
【０１３５】
変異体Ａ２Ｍ核酸および変異体Ａ２Ｍポリペプチドはまた、トランスジェニック生物を創出するように、生物内で発現させることもできる。これらの配列のうちの１または複数を有する、所望のトランスジェニック植物系は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属、トウモロコシ、およびＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ属を含む。変異体Ａ２Ｍポリヌクレオチドおよび／または変異体Ａ２Ｍポリペプチドのうちの１または複数を有する、所望の昆虫系は、例えば、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓを含む。両生類、爬虫類、鳥類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、マイクロブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、および非ヒト霊長動物、例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジーを含むがこれらに限定されない、任意の種の動物を使用して、変異体Ａ２Ｍを含有するトランスジェニック動物を作出することができる。トランスジェニック生物は、本明細書で記載される、変異体Ａ２Ｍ核酸および変異体Ａ２Ｍポリペプチドの、生殖細胞系列への導入を呈示することが所望される。
【０１３６】
当技術分野で公知の様々な方法を活用して、本発明の単離ポリペプチドまたは単離タンパク質のうちのいずれか１つを得ることができる。最も簡素なレベルでは、アミノ酸配列は、市販のペプチド合成器を使用して、合成することができる。合成により構築されたタンパク質配列は、一次構造特徴、二次構造特徴、もしくは三次構造特徴、および／またはコンフォメーション特徴を、タンパク質と共有しているために、タンパク質と共通の生物学的特性であって、タンパク質活性を含む生物学的特性を有しうる。この技法は、小型のペプチドおよび大型のポリペプチドの断片の作製において、特に有用である。断片は、例えば、天然ポリペプチドに対する抗体を作出するのに有用である。こうして、断片を、治療用化合物のスクリーニング、および抗体を開発するための免疫学的工程において、天然の精製タンパク質の、生物学的に活性の代替物、または免疫学的代替物として援用することができる。本発明のポリペプチドおよびタンパク質は代替的に、所望のポリペプチドまたはタンパク質を発現させるように変更された細胞から精製することもできる。本明細書で使用される、細胞が、遺伝子操作を介して、それが通常産生しないか、または通常低レベルで産生する、ポリペプチドまたはタンパク質を産生するように製作されうる場合、細胞は、所望のポリペプチドまたはタンパク質を発現させるように変更されているということができる。当業者は、本発明のポリペプチドまたはタンパク質のうちの１つを産生する細胞を作出するために、組換え配列または合成配列を、真核細胞または原核細胞に導入し、発現させるための手順を、たやすく適応させることができる。
【０１３７】
本発明はまた、ポリペプチドを作製するための方法であって、適切な培養培地中の、宿主細胞の培養物を増殖させるステップと、タンパク質を、細胞または細胞を増殖させる培養物から精製するステップとを含む方法にも関する。例えば、方法は、ポリペプチドを作製するための工程であって、本発明のポリヌクレオチドを含む、適切な発現ベクターを含有する宿主細胞を、コードされるポリペプチドの発現を可能とする条件下で培養しうる工程を含みうる。ポリペプチドは、培養物から、好都合には、培養培地から回収することもでき、宿主細胞から調製された溶解物から回収し、さらに精製することもできる。好ましい実施形態は、このような工程により作製されるタンパク質が、Ａ２Ｍなど、タンパク質の全長形態の場合もあり、成熟形態の場合もある実施形態を含む。代替的な方法では、ポリペプチドまたはタンパク質を、ポリペプチドまたはタンパク質を天然で産生する、細菌細胞から精製することもできる。当業者は、本発明の単離ポリペプチドまたは単離タンパク質のうちの１つを得るために、ポリペプチドおよびタンパク質を単離するための公知の方法にたやすく従うことができる。これらは、免疫組織化学、ＨＰＬＣ、サイズ除外クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および免疫アフィニティークロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない。例えば、Scopes、「Protein  Purification:  Principles  and  Practice」、Springer-Verlag（１９９４年）；Sambrookら、「Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual」；Ausubelら、「Current  Protocols  in  Molecular  Biology」を参照されたい。生物学的活性または免疫学的活性を保持するポリペプチド断片は、約１００を超えるアミノ酸を含む断片、または約２００を超えるアミノ酸を含む断片、および特異的タンパク質ドメインをコードする断片を含む。精製ポリペプチドを、当技術分野で周知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて使用して、ポリペプチドに結合する分子を同定することができる。これらの分子は、低分子、コンビナトリアルライブラリーに由来する分子、抗体、または他のタンパク質を含むがこれらに限定されない。次いで、結合アッセイにおいて同定された分子を、アンタゴニスト活性またはアゴニスト活性について、当技術分野で周知の、ｅｘ  ｖｉｖｏ組織培養物モデルまたはｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルにおいて調べることができる。略述すると、分子を、複数の細胞培養物中または動物内で滴定し、次いで、細胞もしくは動物の死、または動物もしくは細胞の生存の延長について調べる。
【０１３８】
次いで、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過、およびイオン交換クロマトグラフィーなど、公知の精製過程を使用して、結果として得られる、発現させた変異体Ａ２Ｍポリペプチドを、培養物、例えば、培養培地、または細胞抽出物から精製することができる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドの精製はまた、タンパク質に結合する薬剤を含有するアフィニティーカラム；コンカナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）、もしくはＣｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ  ３ＧＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）などのアフィニティー樹脂上の、１または複数のカラムステップ；フェニルエーテル、ブチルエーテル、もしくはプロピルエーテルなどの樹脂を使用する、疎水性相互作用クロマトグラフィーを伴う、１または複数のステップ；またはイムノアフィニティークロマトグラフィーも含みうる。代替的に、本発明のタンパク質はまた、精製を容易とする形態でも、発現させることができる。例えば、タンパク質は、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはチオレドキシン（ＴＲＸ）の融合タンパク質などの融合タンパク質として発現させることもでき、Ｈｉｓタグとの融合タンパク質として発現させることもできる。このような融合タンパク質の発現および精製のためのキットは、それぞれ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている。タンパク質はまた、エピトープでタグ付けし、その後、このようなエピトープを指向する特異的抗体を使用することにより精製することもできる。このような１つのエピトープ（「ＦＬＡＧ（登録商標）」）は、Ｋｏｄａｋ（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、Ｃｏｎｎ．）から市販されている。最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒質、例えば、ペンダントメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルを援用する、１または複数の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）ステップを援用して、タンパク質をさらに精製することができる。前出の精製手順の任意の組合せはまた、実質的に同種の、単離または精製組換え変異体Ａ２Ｍポリペプチドをもたらすのにも援用することができる。精製された変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、他の哺乳動物タンパク質を実質的に含まないことが可能であり、本発明に従い、「単離タンパク質」として規定することができる。
【０１３９】
治療法
当技術分野で公知の任意の方法を使用して、慢性創傷を処置することもでき、慢性創傷を引き起こしうる病態を処置することもできる。方法は、神経障害性潰瘍、褥瘡性潰瘍、静脈性潰瘍、もしくは糖尿病性潰瘍、または感染性創傷など、哺乳動物における慢性創傷の処置を含みうる。方法は、Ａ２Ｍ組成物の、創傷への適用を含みうる。Ａ２Ｍ組成物およびＡ２Ｍ製剤を、プロテアーゼを阻害するために使用することができる。Ａ２Ｍ組成物を使用して、ＦＡＣの形成を防止するか、遅延させるか、または変更することができる。変異体Ａ２Ｍは、プロテアーゼの阻害において、野生型Ａ２Ｍポリペプチドより効果的であることが可能であり、半減期が長いか、クリアランス係数が緩徐であるか、またはこれらの任意の組合せを示す。
【０１４０】
一部の実施形態では、創傷は、褥瘡性潰瘍、床ずれ、下肢潰瘍、深部胸骨創傷、術後創傷、体幹領域の不応性術後創傷、大伏在静脈採取後における、大伏在静脈への創傷、静脈性潰瘍、または裂肛である。下肢潰瘍を伴う実施形態では、潰瘍は、糖尿病性患者において存在しうる。他の実施形態では、創傷は、静脈性潰瘍、床ずれ、または術後潰瘍である。
【０１４１】
Ａ２Ｍ組成物は、創傷包帯上に含むことができる。乾性創傷包帯および含水創傷包帯、すなわち、湿性創傷包帯、ならびにこれらの送達系を使用することができるが、また、有効成分、創傷および皮膚疾患、好ましくは、慢性創傷の処置のためのそれらの使用にも適しうる。創傷包帯は、慢性創傷に、少なくとも１時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間にわたり適用することができる。処置は、数日間、数週間、または数カ月間にわたり延長することができ、慢性創傷に必要な場合、適切であれば、包帯を交換することができる。
【０１４２】
本発明の別の態様は、本発明の組成物および包帯を含む製品に関する。一部の実施形態では、包帯は、乾性包帯、保湿バリア包帯、または生物活性包帯である。乾性包帯を伴う実施形態では、包帯は、ガーゼ、絆創膏、非接着性メッシュ、膜、フォイル、フォーム、または組織接着性でありうる。保湿バリア包帯を伴う実施形態では、包帯は、ペースト、クリーム、軟膏、不透膜もしくは半透膜もしくはフォイル、ハイドロコロイド、ハイドロゲル、またはこれらの組合せでありうる。生物活性包帯を伴う実施形態では、包帯は、抗微生物性包帯でありうる。例えば、創傷包帯は、その上にＡ２Ｍ組成物をコーティングした、織布、不織布、または編布の場合もあり、潰瘍部位における持続放出のために、Ａ２Ｍ組成物を分散させた、生体吸収性ポリマーフィルムまたはスポンジの場合もある。
【０１４３】
疼痛が由来しうる部位を、Ａ２Ｍの存在により同定できたら、当技術分野で公知の、任意の方法を、疼痛を処置するか、または疼痛を引き起こしうる病態を処置するのに使用することができる。例えば、神経根障害または椎間板原性疼痛または椎間関節痛を診断した場合は、脊椎痛を処置するための、任意の数の、当技術分野で公知の方法を適用して、患者を処置することができる。適切な方法は、椎弓切開術、椎弓切除術、椎間板切除術、顕微鏡下椎間板切除術、経皮椎間板切除術、内視鏡下椎間板切除術、レーザー椎間板切除術、椎間孔拡大術（foramenotomy）、固定、増殖療法、他の減圧術、装具を伴うかまたは伴わない、固定を伴う減圧を含むがこれらに限定されない。
【０１４４】
脊椎内の疼痛はまた、手術以外の標準的な方法であって、ステロイド性抗炎症薬または非ステロイド性抗炎症薬の投与を含む方法により処置することもできる。当技術分野では、非ステロイド性抗炎症（ＮＳＡＩＤ）薬が周知である。イブプロフェン、アスピリン、またはパラセタモールなどのＮＳＡＩＤを含む、非ステロイド性薬剤を使用することができる。コルチゾール受容体に結合することにより炎症を低減する、グルココルチコイドなどのステロイドもまた、処置のために使用することができる。
【０１４５】
関節関連疼痛を処置するための、任意の数の、当技術分野で公知の方法を適用して、患者を処置することができる。適切な方法は、手術法を含み、手術以外の方法は、関節鏡下デブリドマン、またはステロイド性抗炎症薬もしくは非ステロイド性抗炎症薬の投与を含むがこれらに限定されない。
【０１４６】
本明細書で記載される組成物のうちのいずれかを、関節炎、炎症、靭帯傷害、腱傷害、骨傷害、軟骨変性、軟骨傷害、自己免疫疾患、背部痛、関節痛、関節変性、椎間板変性、脊椎変性、骨変性、またはこれらの任意の組合せの群から選択される、１または複数の状態を受けつつあるか、またはこれらの影響を受けやすい、ヒトまたは非ヒト動物における、１または複数のプロテアーゼの非特異的阻害を増強するために使用することができる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドを、動物に投与して、動物における、１または複数のプロテアーゼ活性を低減することができる。
【０１４７】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドを、プロテアーゼを阻害するために使用することができる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドを、疼痛および炎症状態および疾患の処置のために使用することができる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドを使用して、ＦＡＣの形成を防止するか、遅延させるか、または変更することができる。変異体Ａ２Ｍは、プロテアーゼの阻害において、野生型Ａ２Ｍポリペプチドより効果的であることが可能であり、半減期が長いか、クリアランス係数が緩徐であるか、またはこれらの任意の組合せを示す。
【０１４８】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、非経口（筋内注射、腹腔内注射、静脈内（ＩＶ）注射、または皮下注射）、経皮（受動、またはイオントフォレーシスもしくは電気穿孔を使用する）、または経粘膜（経鼻、膣内、直腸内、または舌下）、経口、関節内、または吸入の投与経路による投与のための変異体Ａ２Ｍポリペプチドでありうる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドはまた、生体内分解性インサート、従来型ステント（ＢＭＳ）、または薬物溶出型ステント（ＤＥＳもしくはコーティング型ステント、または薬物含有ステント）を使用して投与することもでき、椎間板、硬膜外腔、および椎間関節など、脊椎の構造に直接送達することもでき、可動（diarthroidal）関節に直接送達することもできる。変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、各投与経路に適切な剤形で製剤化することができる。加えて、変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、腸内投与のために製剤化することもできる。
【０１４９】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、対象に、治療有効量で投与することができる。精密な投与量は、年齢、処置される傷害または病態、および実施されている処置などの対象依存的変数など、様々な因子に従い変動するであろう。個別の医師は、処置される患者を念頭に置いて、正確な投与量を選び出すことができる。投与量および投与は、十分なレベルの活性部分をもたらすか、または所望の効果を維持するように調整する。考慮に入れうる、さらなる因子は、疾患の重症度、生体の年齢、および生体の体重またはサイズ；食餌、投与時間および投与頻度、薬物の組合せ、反応感受性、および治療に対する忍容性／応答を含む。短期作用型医薬組成物が、毎日投与されるのに対し、長期作用型医薬組成物は、２、３〜４日ごと、隔週、または２週間に１回投与される。特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、本発明の医薬組成物は、毎日１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれ超の回数投与される。
【０１５０】
本明細書で開示される変異体Ａ２Ｍポリペプチドなど、一部の組成物については、さらなる研究が行われるにつれて、多様な対象における多様な状態の処置に適切な投与量レベルに関する情報が現れ、当業者は、レシピエントの治療的コンテキスト、年齢、および全般的健康を考慮して、適正な用量を確認することが可能となろう。選択される投与量は、所望される処置の投与経路および持続期間に依存する。一般に、投与量レベルは、毎日体重１ｋｇ当たり０．１〜４０ｍｇを含みうる。一般に、局所注射または局所注入では、用量は、組成物および投与部位に応じて、低量であることが可能である。投与量レベルは、約０．１〜１０ｍＬの間の容量中、約１〜５００，０００ｍｇの間でありうる。例えば、投与量レベルは、約０．１〜９ｍＬ、０．１〜８ｍＬ、０．１〜７ｍＬ、０．１〜６ｍＬ、０．１〜５ｍＬ、０．１〜４ｍＬ、０．１〜３ｍＬ、０．１〜２ｍＬ、０．１〜１ｍＬ、０．１〜０．９ｍＬ、０．１〜０．７ｍＬ、０．１〜０．６ｍＬ、０．１〜０．５ｍＬ、０．１〜０．４ｍＬ、０．１〜０．３ｍＬ、０．１〜０．２ｍＬ、１〜９ｍＬ、１〜８ｍＬ、１〜７ｍＬ、１〜６ｍＬ、１〜５ｍＬ、１〜４ｍＬ、１〜３ｍＬ、または１〜２ｍＬの間の容量中、約５〜４５０ｍｇ、５〜４００ｍｇ、５〜３５０ｍｇ、５〜３００ｍｇ、５〜２５０ｍｇ、５〜２００ｍｇ、５〜１５０ｍｇ、５〜１００ｍｇ、５〜５００ｍｇ、５〜２５ｍｇ、１００〜１５０ｍｇ、１００〜２００ｍｇ、１００〜２５０ｍｇ、１００〜３００ｍｇ、１００〜３５０ｍｇ、１００〜４００ｍｇ、１００〜４５０ｍｇ、または１００〜５００ｍｇの間でありうる。多様な変異体Ａ２Ｍポリペプチドもしくは変異体Ａ２Ｍ核酸またはこれらの断片の通常の投与量は、投与経路に応じて、約１〜５００，０００マイクログラムの間の任意の数から、約５０グラムの総用量まで変動させることができる。所望の用量は、例えば、２５０μｇ、５００μｇ、１ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇ、８００ｍｇ、８５０ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、１．１ｇ、１．２ｇ、１．３ｇ、１．４ｇ、１．５ｇ、１．６ｇ、１．７ｇ、１．８ｇ、１．９ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、５、６ｇ、７ｇ、８ｇ、９ｇ、１０ｇ、２０ｇ、３０ｇ、４０ｇ、および５０ｇを含む。
【０１５１】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドまたはその断片の用量を投与して、０．１μＭ〜５００ｍＭの間の任意の数である、組織濃度もしくは血中濃度またはこれらの両方をもたらすことができる。所望の用量は、１〜８００μＭの間の任意の数である、組織濃度もしくは血中濃度またはこれらの両方をもたらす。好ましい用量は、１０μＭ〜約５００μＭの間の任意の数を超える、組織濃度または血中濃度をもたらす。好ましい用量は、例えば、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭ、５５μＭ、６０μＭ、６５μＭ、７０μＭ、７５μＭ、８０μＭ、８５μＭ、９０μＭ、９５μＭ、１００μＭ、１１０μＭ、１２０μＭ、１３０μＭ、１４０μＭ、１４５μＭ、１５０μＭ、１６０μＭ、１７０μＭ、１８０μＭ、１９０μＭ、２００μＭ、２２０μＭ、２４０μＭ、２５０μＭ、２６０μＭ、２８０μＭ、３００μＭ、３２０μＭ、３４０μＭ、３６０μＭ、３８０μＭ、４００μＭ、４２０μＭ、４４０μＭ、４６０μＭ、４８０μＭ、および５００μＭである、組織濃度もしくは血中濃度またはこれらの両方を達成するのに要請される有効成分の量である。８００μＭを超える組織濃度をもたらす用量は、好ましくないが、本発明の一部の実施形態と共に使用することができる。血中レベルにより測定される、組織内の安定濃度を維持するように、変異体Ａ２Ｍポリペプチドまたはその断片の持続注入もまた、提供することができる。
【０１５２】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、水溶液中の、非経口注射、椎間板内注射、椎間関節内注射、髄腔内注射、硬膜外注射、または関節注射により投与することができる。本明細書の変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、対象における疼痛源でありうる、脊椎領域または関節領域に、直接投与することができる。例えば、フィブロネクチン−アグリカン複合体が、硬膜外腔内で検出される場合、プロテアーゼを阻害するか、またはＦＡＣの形成を防止する、変異体Ａ２Ｍポリペプチドを、直接的な注射により、硬膜外腔に投与することができる。代替的に、プロテアーゼを阻害するか、またはＦＡＣの形成を防止する、変異体Ａ２Ｍポリペプチドを、フィブロネクチン−アグリカン複合体が、これらの腔内で検出される場合も、直接的な注射により、椎間板腔、椎間関節、または可動（diarthroidial）関節に投与することができる。一部の実施形態では、アグリカンは、アグリカン、バーシカン、ブレビカン、およびニューロカンの、任意の自然発生の変異体およびスプライス変異体、ならびに異なる細胞型によるスプライシングに起因する、アグリカン、バーシカン、ブレビカン、およびニューロカンの、任意の変異体を含みうる。一部の実施形態では、フィブロネクチンは、疾患または障害と関連する、約２０の公知のスプライス変異体を含む、任意の自然発生のフィブロネクチン変異体、および異なる細胞型による異なるスプライシングに起因する、フィブロネクチン変異体を含みうる。
【０１５３】
組成物または製剤または薬剤はまた、懸濁液またはエマルジョンの形態でもありうる。一般に、有効量のペプチドまたはポリペプチドを含む医薬組成物が提供されるが、医薬組成物は任意選択で、薬学的に許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｒ）、乳化剤、アジュバント、および／または担体を含む。このような組成物は、希釈剤である滅菌水、多様な緩衝液内容物（例えば、トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ、およびイオン強度の、緩衝生理食塩液を含み、任意選択で、洗浄剤および可溶化剤（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、ピロ亜硫酸ナトリウム）、および保存剤（例えば、チメロサール（Thimersol）、ベンジルアルコール）、およびバルキング物質（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤を含む。非水性溶媒または非水性媒体の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油およびトウモロコシ油などの植物油、ゼラチン、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。製剤は、凍結乾燥させ、使用直前に、再溶存または再懸濁させることができる。製剤は、例えば、細菌保持フィルターを介する濾過により滅菌処理することもでき、滅菌剤を、組成物に組み込むことにより滅菌処理することもでき、組成物を照射することにより滅菌処理することもでき、組成物を加熱することにより滅菌処理することもできる。
【０１５４】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドはまた、制御放出製剤によっても投与することができる。制御放出型ポリマー性デバイスは、ポリマー性デバイス（ロッド、シリンダー、フィルム、またはディスク）または注射（マイクロ粒子）の植込みに続く、長期全身放出のために施すことができる。マトリックスは、ペプチドを、固体ポリマーマトリックス内に分散させた、マイクロスフェア、またはコアが、ポリマーシェルとは異なる材料であることが可能であり、ペプチドを、液体の性質の場合もあり、固体の性質の場合もあるコア内に分散または懸濁させうる、マイクロカプセルなど、マイクロ粒子の形態でありうる。本明細書で具体的に規定されない限りにおいて、マイクロ粒子、マイクロスフェア、およびマイクロカプセルは、互換的に使用される。代替的に、ポリマーは、ナノメートル〜４センチメートルの範囲の、薄層スラブまたは薄膜として成形される場合もあり、粉砕または他の標準的な技法により作製される粉末の場合もあり、なおまたはハイドロゲルなどのゲルの場合もある。
【０１５５】
本明細書で記載される任意の組成物の送達には、非生体分解性マトリックスを、使用することもでき、生体分解性マトリックスを、使用することもできるが、生体分解性マトリックスが好ましい。これらは、天然ポリマーの場合もあり、合成ポリマーの場合もあるが、分解プロファイルおよび放出プロファイルの良好な特徴付けのために、合成ポリマーが好ましい。ポリマーは、放出が所望されうる期間に基づき選択することができる。ある場合には、直線的放出が最も有用でありうるが、他の場合には、パルス放出または「バルク放出」が、より有効な結果をもたらしうる。ポリマーは、ハイドロゲル（重量で、水の、最大で約９０％を吸収することが典型的である）の形態であることが可能であり、任意選択で、多価イオンまたはポリマーにより架橋することができる。
【０１５６】
マトリックスは、溶媒の蒸発、スプレー乾燥、溶媒による抽出、および当業者に公知の他の方法を介して形成することができる。生体分解性マイクロスフェアは、例えば、MathiowitzおよびLanger,  J.、Controlled  Release、５巻：１３〜２２頁（１９８７年）；Mathiowitzら、Reactive  Polymers、６巻：２７５〜２８３頁（１９８７年）；ならびにMathiowitzら、J.  Appl.  Polymer  Sci.、３５巻：７５５〜７７４頁（１９８８年）により記載されている通り、薬物送達のためのマイクロスフェアを製作するために開発された方法のうちのいずれかを使用して調製することができる。
【０１５７】
デバイスを、植込み領域または注射領域を処置する局所放出であって、全身の処置または全身送達のための投与量よりはるかに少量でありうる投与量を送達することが典型的である局所放出のために製剤化することができる。これらは、皮下、筋肉、脂肪に植え込むか、または注射することもでき、嚥下することもできる。
【０１５８】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、慢性創傷などの状態または疾患の処置において使用することができる。例えば、状態または疾患は、腱状態、靭帯状態、関節傷害、脊椎傷害、または炎症、アルツハイマー病、脳アミロイド血管症、多発性硬化症、先天性アンチトロンビン欠損症、関節リウマチ、多様な腫瘍の増殖、冠動脈虚血症または虚血肢、網膜症、ならびに腫瘍およびウイルス感染に対する免疫応答の調節でありうる。他の状態または疾患は、尋常性座瘡、アルツハイマー病、関節炎、喘息、座瘡、アレルギーおよび過敏症（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）、自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化、気管支炎、がん、心臓炎、クローン病、大腸炎、慢性疼痛、肝硬変、セリアック病、慢性前立腺炎、皮膚炎、憩室炎、認知症、皮膚炎、糖尿病、ドライアイ、浮腫、気腫、湿疹、線維筋痛症、胃腸炎、歯肉炎、糸球体腎炎、過敏症（ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）、肝炎、全身性エリテマトーデス、胃酸の逆流／胸やけ、心疾患、肝炎、高血圧、インスリン抵抗性、間質性膀胱炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、関節痛／関節炎／関節リウマチ、メタボリック症候群（症候群Ｘ）、筋炎、腎炎、肥満、骨減少症、骨粗鬆症、骨盤炎症性疾患、パーキンソン病、歯周病、多発動脈炎、多発性軟骨炎、乾癬、再灌流傷害、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、副鼻腔炎、シェーグレン症候群、痙攣性結腸、全身性カンジダ症、腱炎、移植片拒絶、潰瘍性結腸炎（ulcerative  colitcis）、尿路感染症、血管炎、および膣炎を含む。
【０１５９】
一部の実施形態では、変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、がんの処置において使用することができる。例えば、変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、注射または別の適切な手段により、固形腫瘍など、腫瘍に、直接投与することができる。
【０１６０】
自己免疫疾患は、個体自身の組織もしくは臓器から生じ、これらを指向する疾患もしくは障害、またはこれらの共分離もしくは症状、またはこれらから結果として生じる状態でありうる。これらの自己免疫障害および炎症性障害の多くでは、高ガンマグロブリン血症、自己抗体レベルの上昇、組織内の抗原−抗体複合体の沈着、コルチコステロイド処置または免疫抑制処置による利益、および罹患組織内のリンパ球凝集物を含むがこれらに限定されない、いくつかの臨床マーカーおよび検査室マーカーが存在しうる。Ｂ細胞介在型自己免疫疾患に関する、いかなる１つの理論にも限定されずに述べると、Ｂ細胞は、自己抗体の産生、免疫複合体の形成、樹状細胞およびＴ細胞の活性化、サイトカインの合成、直接的なケモカインの放出、および異所性リンパ新生の病巣の供給を含む、膨大な機構経路を介して、ヒト自己免疫疾患における病理作用を裏付けると考えられている。
【０１６１】
これらの経路の各々は、異なる程度で、自己免疫疾患の病態に参与しうる。「自己免疫疾患」は、臓器特異的疾患（すなわち、免疫応答は、内分泌系、造血系、皮膚、心肺系、消化器および肝臓系、腎臓系、甲状腺、耳、神経筋系、中枢神経系などの臓器系を特異的に指向しうる）の場合もあり、複数の臓器系に影響を及ぼしうる、全身疾患（例えば、ＳＬＥ、ＲＡ、多発筋炎など）の場合もある。好ましいこのような疾患は、自己免疫性リウマチ性障害（例えば、ＲＡ、シェーグレン症候群、強皮症、ＳＬＥおよびループス腎炎などのループス、多発筋炎、皮膚筋炎、寒冷グロブリン血症、抗リン脂質抗体症候群、および乾癬性関節炎など）、自己免疫性消化器／肝臓障害（例えば、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎およびクローン病）、自己免疫性胃炎および悪性貧血、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、およびセリアック病など）、血管炎（例えば、ＡＮＣＡ陰性血管炎、ならびにチャーグ−シュトラウス血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、および顕微鏡的多発血管炎を含む、ＡＮＣＡ関連血管炎など）、自己免疫性神経障害（例えば、ＭＳ、眼球クローヌスミオクローヌス症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、パーキンソン病、アルツハイマー病、および自己免疫性多発ニューロパチーなど）、腎臓障害（例えば、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、およびバージャー病など）、自己免疫性皮膚障害（例えば、乾癬、蕁麻疹、蕁麻疹、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、および皮膚性エリテマトーデスなど）、血液障害（例えば、血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、輸血後紫斑病、および自己免疫性溶血性貧血など）、アテローム性動脈硬化、ブドウ膜炎、自己免疫性難聴（例えば、内耳疾患および聴覚喪失など）、ベーチェット病、レイノー症候群、臓器移植、および自己免疫性内分泌障害（例えば、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）などの糖尿病性関連自己免疫疾患、アジソン病、および自己免疫性甲状腺疾患（例えば、グレーブス病および甲状腺炎）など）を含む。より好ましくは、このような疾患は、例えば、ＲＡ、潰瘍性大腸炎、ＡＮＣＡ関連血管炎、ループス、ＭＳ、シェーグレン症候群、グレーブス病患、ＩＤＤＭ、悪性貧血、甲状腺炎、および糸球体腎炎を含む。
【０１６２】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、１もしくは複数の関節または脊椎への送達に適しうる。１または複数の関節は、１または複数の滑膜関節、可動関節、半関節、不動関節、恥骨結合関節、または軟骨関節でありうる。関節は、手首関節、脊椎関節、脊柱関節、頸部関節、肩関節、肘関節、手根骨関節、中手骨関節、指関節、肩鎖関節、胸鎖関節、肩甲骨関節、肋骨関節、仙腸関節、股関節、膝関節、足関節／足根骨関節、手足の関節、腋窩関節、または中足骨関節でありうる。
【０１６３】
関節とは、任意の可動関節（また滑膜関節とも呼ばれる）を指す場合がある。関節は、骨、関節軟骨、関節包、滑膜組織表層、または関節包内の潤滑性滑液を含有する任意の関節でありうる。関節の軟骨成分（ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）は、軟骨成分（ｃｈｏｎｄｒａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）でありうる。膝の成分は、半月板成分でありうる。一部の実施形態では、滑膜関節は、肩関節もしくは手首関節もしくは足首関節もしくは股関節もしくは肘関節、または手指もしくは足指の小型の関節でありうる。関節は、正常関節または対照関節でありうる。正常関節または対照関節は、対象に対する疼痛の供給源として重要でない関節でありうる。正常関節内に存在しうる、疼痛のレベルは、患者が医療ケアを求める程度には、機能または患者の生活の質に影響を及ぼしえないことが典型的である。関節試料または関節に由来する試料は、関節に由来する組織試料または流体試料であって、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける滑液試料ならびに関節洗浄液または組織洗浄液を含むがこれらに限定されない試料でありうる。関節試料または関節に由来する試料は、生物学的試料でありうる。
【０１６４】
変異体Ａ２Ｍポリペプチドは、本開示の状態または疾患と関連する疼痛などの疼痛の処置において使用することができる。
【０１６５】
疼痛は、神経根痛、神経根障害、神経根障害性疼痛、および坐骨神経痛であることが可能であり、１または複数の刺激された腰椎神経根の経路に沿った、脊椎神経根レベルまたは「ラディック」から発する、四肢の放散痛でありうる。坐骨神経痛の場合、疼痛は、Ｌ４、Ｌ５、および／またはＬ６に由来する場合もあり、存在する場合、移行椎に由来する場合もあり、かつ／または坐骨神経を構成する、仙腸部の脊椎神経根に由来する場合もある。放散痛はまた、ｌ３領域内、ｌ２領域内、またはｌ１領域内の、上部腰椎椎間板ヘルニアに由来する可能性もあり、頸部椎間板ヘルニア、頸部神経根刺激、または頸部椎間板変性の場合、任意の頸部神経根に由来する可能性もある。放散痛は、椎間関節または他の脊椎の構造から生じる疼痛であって、「関連」痛として分類されうる疼痛とは異なりうる。放散痛はまた、Ｌ３領域内、Ｌ２領域内、またはＬ１領域内の、上部腰椎椎間板ヘルニアに由来する可能性もあり、頸椎領域に由来する可能性もある。
【０１６６】
疼痛は、椎間板原性疼痛であることが可能であり、椎間板から発生する脊椎関連疼痛でありうる。椎間板は、髄核からの水分補給の喪失と関連して、機能性の低減を被る。機能性の低減は、線維輪内の損傷と符合する。この脆弱化は、椎間板の膨隆、突出、脱出、遊離などの解剖学的病変をもたらしうる。この脆弱化は、椎間板内容物の漏出から生じる、可能な生化学的病変ももたらす場合があり、これは、背部痛または前述の化学的神経根障害において顕在化しうる。
【０１６７】
疼痛は、椎間関節痛または椎間関節性疼痛であることが可能であり、軟骨、関節包、半月体、および滑膜を伴い、対合した、真性滑膜性関節である、１つの椎間関節（ａ  ｆａｃｅｔ  ｊｏｉｎｔ）、複数の椎間関節（ｆａｃｅｔ  ｊｏｉｎｔｓまたはｚｙｇａｐｏｐｈｙｓｉａｌ  ｊｏｉｎｔｓ）から発生する疼痛でありうる。脊椎痛または脊椎関連疼痛は、椎間板性疼痛、椎間関節性疼痛、および神経根障害性疼痛を含むがこれらに限定されない。
【０１６８】
疼痛は、急性疼痛であることが可能であり、最大で６カ月間、例えば、５カ月間、４カ月間、３カ月間、２カ月間、４週間、３週間、２週間、１週間、６日間、５日間、４日間、３日間、２日間、もしくは１日間、またはそれ未満にわたり持続する疼痛でありうる。慢性疼痛は、持続期間が６カ月間より長い疼痛でありうる。
【０１６９】
本明細書で記載される任意の対象を、本明細書で記載される組成物のうちのいずれかで処置することができる。一部の実施形態では、対象は、状態または疾患を有すると診断される前に、またはこの後で、米国特許第７，７０９，２１５号および米国公開第２０１０／００９８６８４Ａ１号において記載された方法などにより、状態または疾患を有すると診断することができる。一部の実施形態では、対象は、状態または疾患を有すると診断される前に、またはこの後で、任意の本明細書で記載される組成物により、処置することができる。
【０１７０】
対象
対象は、脊椎内または関節内の疼痛を提示する、任意の対象を含みうる。一部の実施形態では、対象を、Ａ２Ｍの検出について選択することができる。好ましくは、対象は、ヒトでありうる。対象は、椎間板性疼痛、椎間関節性疼痛、または神経根障害性疼痛を含むがこれらに限定されない、脊椎と関連する疼痛など、任意の疼痛を受けている可能性がある。
【０１７１】
対象は、骨、関節軟骨、または滑膜組織表層を含むがこれらに限定されない、関節の、任意の解剖学的構造と関連する疼痛を受けていることが疑われる可能性がある。関節は、大型可動（滑膜）関節（例えば、膝、股関節、肩）、小型可動（滑膜）関節（例えば、肘関節、手首関節、足首関節、脊椎の椎間関節（ｚｙｇａｐｏｐｈｙｓｉａｌ  ｊｏｉｎｔｓまたはｆａｃｅｔ  ｊｏｉｎｔｓ））、および半関節（例えば、仙腸関節、胸鎖関節、顎関節（「ＴＭＪ」））を含みうるがこれらに限定されない。対象は、急性関節関連疼痛を受けている場合もあり、慢性関節関連疼痛を患う場合もある。これらは、変性疾患（例えば、骨関節炎）、筋膜性疼痛症候群、炎症性関節炎もしくは結晶性関節炎、または他の筋腱付着部症、腱／靭帯傷害もしくは腱／靭帯変性、または筋骨格系の外部の軟組織病態と関連しうる。
【０１７２】
一部の実施形態では、対象は、３０もしくは２５週間またはそれ未満にわたり、関節関連疼痛または脊椎関連疼痛を受けてきた可能性がある。一部の実施形態では、対象は、２０、１５、１０、８、もしくは６週間、またはそれ未満にわたり、関節関連疼痛または脊椎関連疼痛を受けてきた可能性がある。対象は、いずれの性別の場合もあり、いずれの年齢の場合もある。対象は、急性疼痛を受けている場合もあり、慢性疼痛を受けている場合もある。
【０１７３】
対象は、ヒトの場合もあり、非ヒト動物の場合もある。例えば、動物は、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ウマまたはヤギなどの哺乳動物でありうる。対象は、ウイルス、細菌、マイコプラズマ、寄生虫、真菌、もしくは植物、または哺乳動物、例えば、ヒトなどの動物でありうる。
【０１７４】
一部の実施形態では、対象を、本明細書で記載される組成物のうちのいずれかによる処置を必要とすると診断することができる。例えば、対象を、Ａ２Ｍが濃縮された試料またはＦＡＣの形成を防止しうる薬剤による処置を必要とすると診断することができる。
【０１７５】
試料
本明細書で記載される組成物のうちのいずれかは、生物学的試料に由来しうる。生物学的試料はまた、組織学を目的として採取された生検試料、凍結切片などの組織切片試料、および洗浄液試料も含みうる。生物学的試料は、ウイルス、細菌、マイコプラズマ、寄生虫、真菌、または植物に由来しうる。生物学的試料は、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長動物、齧歯動物、ヤギ科動物、ウシ科動物、ヒツジ科動物、ウマ科動物、イヌ科動物、ネコ科動物、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、またはヤギなどの動物に由来しうる。
【０１７６】
生物学的試料は、組織試料またはヒト体液などの体液でありうる。例えば、体液は、血液、血清、血漿、洗浄液、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液、尿道球腺液、スキーン腺液、汗、涙液、嚢胞液、胸水、腹水、心膜液、リンパ、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、経血、膿、皮脂、膣分泌物、粘膜分泌物、便水分、膵液、副鼻腔洗浄液、気管支肺吸引物、卵割腔液、または臍帯血でありうる。生物学的試料のうちの１または複数は、幹細胞、未分化細胞、分化細胞、または罹患対象もしくは特異的状態を有する対象に由来する細胞などの細胞を含みうる。生物学的試料は、対象の関節に由来する血液、細胞、細胞の集団、多量の組織、流体、または洗浄物でありうる。生物学的試料は、軟骨組織に由来する細胞を含む場合もあり、細胞を含まない場合もある。生物学的試料は、アルブミンまたはＩｇＧなどであるがこれらに限定されない、一般的な血清タンパク質を実質的に枯渇させている可能性がある。枯渇は、濾過、分画、またはアフィニティー精製を含みうる。
【０１７７】
生物学的試料は、例えば、対象から採血することにより、または細針吸引もしくは針生検を使用するなど、任意の非侵襲的手段により収集することができる。代替的に、生物学的試料は、例えば、手術時の生検を含む、侵襲的方法により収集することもできる。
【０１７８】
生物学的試料は、疾患特異的タンパク質または状態特異的タンパク質を含みうる。生物学的試料は、疾患または状態を有する対象に由来する場合もあり、疾患または状態を伴わない対象に由来する場合もある。一部の実施形態では、生物学的試料は、疾患または状態を有すると診断された対象に由来する場合もあり、疾患または状態を有するかまたは伴わないと診断されていない対象に由来する場合もある。診断は、本明細書で記載される方法のうちのいずれかにより下すことができる。生物学的試料は、一時点における対象に由来することが可能であり、別の生物学的試料は、後の時点または先の時点における対象に由来しうるが、この場合、対象は、同じ対象の場合もあり、異なる対象の場合もある。例えば、対象は、疾患または状態を有する場合もあり、疾患または状態を有すると診断されている場合もあり、試料は、疾患または状態が進行するにつれて採取することができる。生物学的試料は、処置前の対象に由来することが可能であり、別の生物学的試料は、処置後の対象に由来しうるが、この場合、対象は、同じ対象の場合もあり、異なる対象の場合もある。生物学的試料は、処置に対して非応答性の対象に由来することが可能であり、別の生物学的試料は、処置に対して応答性の対象に由来しうる。生物学的試料は、同じ種に由来する場合もあり、異なる種に由来する場合もある。１または複数の生物学的試料は、同じ対象に由来する場合もあり、１または複数の他の生物学的試料を得た、異なる対象に由来する場合もある。
【０１７９】
脊椎試料または脊椎に由来する試料は、脊椎に由来する組織もしくは流体、または脊椎に添加された組織もしくは流体（洗浄液）の試料であって、脊椎椎間板試料、硬膜外試料、および椎間関節試料を含むがこれらに限定されない試料でありうる。脊椎試料または脊椎に由来する試料は、生物学的試料でありうる。任意の数の、当技術分野で公知の方法を使用して、炎症バイオマーカーを検出するために、試料を脊椎から取り出すことができる。これらの方法は、硬膜外腔、椎間板腔、および椎間関節腔から試料を得るための方法を含むがこれらに限定されない。任意の数の、当技術分野で公知の方法を使用して、炎症バイオマーカーを検出するために、関節試料を得ることができる。適切な方法は、経皮吸引もしくは切開吸引、生検、または洗浄を含むがこれらに限定されない。
【０１８０】
本発明の方法は、１または複数のバイオマーカーのアッセイを可能とする、任意の種類の生物学的試料についての研究に適用することができる。生物学的試料は、対象から収集された、新鮮な試料または凍結試料の場合もあり、診断、処置、および／または転帰歴が公知のアーカイブ試料の場合もある。
【０１８１】
本発明の方法は、試料の加工を伴わないか、または試料の加工を限定的とする、生物学的試料自体に対して実施することができる。本発明の方法は、単一細胞レベルで（例えば、生物学的試料からの細胞の単離）実施することができる。組織についての代表的サンプリングを得るために、複数の生物学的試料を、同じ組織／身体部分から採取することができる。
【０１８２】
本明細書で記載される方法のうちのいずれかは、生物学的試料から調製されたタンパク質抽出物に対して実施することができる。方法はまた、膜タンパク質、核タンパク質、および細胞質ゾルタンパク質のうちの１または複数を含有する抽出物に対しても実施することができる。当技術分野では、タンパク質抽出法が周知である（例えば、「Protein  Methods」、D.  M.  Bollagら、２版、１９９６年、Wiley-Liss；「Protein  Purification  Methods:  A  Practical  Approach」、E.  L.  HarrisおよびS.  Angal（編）、１９８９年；「Protein  Purification  Techniques:  A  Practical  Approach」、S.  Roe、２版、２００１年、Oxford  University  Press；「Principles  and  Reactions  o/Protein  Extraction,  Purification,  and  Characterization」、H.  Ahmed、２００５年、CRC  Press:  Boca  Raton、Fla.を参照されたい）。多数の異なる多目的のキットを使用して、タンパク質を、体液および組織から抽出することができ、これらは、例えば、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｃａｌｉｆ）、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。タンパク質抽出物を得た後で、タンパク質マーカーのシグナルの定量化を可能とするために、抽出物のタンパク質濃度を、対照試料の値と同じである値に照らして、標準化することができる。このような標準化は、光度法もしくは分光法またはゲル電気泳動を使用して行うことができる。
【０１８３】
本明細書で記載される方法のうちのいずれかは、生物学的試料から抽出された核酸分子に対して実施することができる。例えば、ＲＮＡを、解析の前に試料から抽出することができる。当技術分野では、ＲＮＡ抽出法が周知である（例えば、J.  Sambrookら、「Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual」、１９８９年、２版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press:  Cold  Spring  Harbor、N.Y.を参照されたい）。体液または組織からＲＮＡを単離する大半の方法は、ＲＮＡアーゼを、迅速かつ効果的に不活化させるタンパク質変性剤の存在下における、組織の破壊に基づく。次いで、単離された全ＲＮＡは、タンパク質夾雑物からさらに精製し、選択的エタノール沈殿、フェノール／クロロホルム抽出に続く、イソプロパノール沈殿または塩化セシウム、塩化リチウム、もしくはセシウムトリフルオロ酢酸塩による勾配遠心分離を介して濃縮することができる。キットもまた、ＲＮＡ（すなわち、全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）を、体液または組織から抽出するのに利用可能であり、これらは、例えば、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．）、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）、およびＱｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ）から市販されている。
【０１８４】
抽出の後で、ｍＲＮＡを、増幅し、ｃＤＮＡに転写することができ、次いで、ｃＤＮＡは、適切なＲＮＡポリメラーゼによる、複数ラウンドにわたる転写のための鋳型として用いられうる。当技術分野では、増幅法が周知である（例えば、A.  R.  KimmelおよびS.  L.  Berger、「Methods  Enzymol.」、１９８７年、１５２巻：３０７〜３１６頁；J.  Sambrookら、「Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual」、１９８９年、２版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press:  New  York；「Short  Protocols  in  Molecular  Biology」、F.  M.  Ausubel（編）、２００２年、５版、John  Wiley  &  Sons；米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；および同第４，８００，１５９号を参照されたい）。逆転写反応は、アンカリングされたオリゴ−ｄＴプライマー、またはランダム配列プライマーなどの非特異的プライマーを使用して実行することもでき、モニタリングされる各プローブのＲＮＡと相補的な標的特異的プライマーを使用して実行することもでき、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素またはモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素など）を使用して実行することもできる。
【０１８５】
他の実施形態
上記の明細書で言及された、全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。当業者には、本発明の範囲および精神から逸脱しない限りにおいて、記載された本発明の方法およびシステムの、多様な改変および変形が明らかであろう。具体的実施形態との関係で、本発明について記載してきたが、特許請求される本発明は、このような具体的実施形態に、不当に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、本発明を実行するための、記載された方式の、多様な改変であって、当業者に明らかな改変は、本発明の範囲内にあることを意図する。他の実施形態も、特許請求の範囲内にある。
【０１８６】
そうでないことが説明されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。以下の参考文献：「The  Merck  Manual  of  Diagnosis  and  Therapy」、１８版、Merck  Research  Laboratories刊、２００６年（ＩＳＢＮ０−９１１９１０−１８−２）；Benjamin  Lewin、「Genes  IX」、Jones  &  Bartlett  Publishing刊、２００７年（ＩＳＢＮ−１３：９７８０７６３７４０６３４）；Kendrewら（編）、「Encyclopedia  of  Mol.  Biology」、Blackwell  Science  Ltd.刊、１９９４年（ＩＳＢＮ０−６３２−０２１８２−９）；およびRobert  A.  Meyers（編）、「Mol.  Biology  and  Biotechnology：  A  Comprehensive  Desk  Reference」、VCH  Publishers,  Inc.刊、１９９５年（ＩＳＢＮ１−５６０８１−５６９−８）は、本明細書で使用されうる方法および組成物についての実施形態を含有する。
【０１８７】
本開示の標準的手順は、例えば、それらの全てが、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Maniatisら、「Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual」、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、N.Y.、USA（１９８２年）；Sambrookら、「Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual」（２版）、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、N.Y.、USA（１９８９年）；Davisら、「Basic  Methods  in  Molecular  Biology」、Elsevier  Science  Publishing,  Inc.、New  York、USA（１９８６年）；または「Methods  in  Enzymology:  Guide  to  Molecular  Cloning  Techniques」、１５２巻、S.  L.  BergerおよびA.  R.  Kimmerl（編）、Academic  Press  Inc.、San  Diego、USA（１９８７年））；「Current  Protocols  in  Molecular  Biology」（CPMB）（Fred  M.  Ausubelら編、John  Wiley  and  Sons,  Inc.）、「Current  Protocols  in  Protein  Science」（CPPS）（John  E.  Coliganら編、John  Wiley  and  Sons,  Inc.）、「Current  Protocols  in  Immunology」（CPI）（John  E.  Coliganら編、John  Wiley  and  Sons,  Inc.）、「Current  Protocols  in  Cell  Biology」（CPCB）（Juan  S.  Bonifacinoら編、John  Wiley  and  Sons,  Inc.）、「Culture  of  Animal  Cells:  A  Manual  of  Basic  Technique」、R.  Ian  Freshney、Wiley-Liss刊、５版（２００５年）、ならびに「Animal  Cell  Culture  Methods」（「Methods  in  Cell  Biology」５７巻、Jennie  P.  MatherおよびDavid  Barnes編、Academic  Press、１版、１９９８年）において記載されている。
【０１８８】
以下の例は、本明細書で記載される、特定の方法、プロトコール、および組成物などに限定的であるものとみなされるべきではなく、それ自体、変動しうることを理解されたい。本明細書で使用される以下の用語は、特定の実施形態について記載することのみを目的とするものであり、本明細書で開示される実施形態の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１８９】
本明細書では、本明細書で開示される方法および組成物のために使用しうるか、これらと共に使用しうるか、これらを調製するために使用しうるか、またはこれらの生成物である、分子、材料、組成物、および成分が開示される。これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群などを開示する一方で、これらの分子および化合物の、各多様な個別で総体的な組合せおよび順列についての具体的基準を、明示的に開示しえない場合、本明細書では、各組合せおよび各順列を具体的に企図し、これについて記載することが理解される。例えば、ヌクレオチドまたは核酸について開示し、論じ、ヌクレオチドまたは核酸を含むいくつかの分子に施しうる、いくつかの修飾について論じる場合、逆のことが具体的に指し示されない限りにおいて、ヌクレオチドまたは核酸および可能な修飾の、各組合せおよび各順列ならびにあらゆる組合せおよびあらゆる順列が、具体的に企図される。この概念は、開示される分子および組成物を製作し、使用する方法におけるステップを含むがこれらに限定されない、本出願の全ての態様に当てはまる。こうして、様々なさらなるステップを実施しうる場合、これらのさらなるステップの各々を、開示される方法の、任意の具体的実施形態または実施形態の組合せと共に実施することができ、このような組合せの各々が、具体的に企図され、開示されると考えるべきであることが理解される。
【０１９０】
当業者は、本明細書で記載される方法および組成物の具体的実施形態の多くの同等物を認識することもでき、ルーチンの実験のみを使用して、これらを確認することも可能である。このような同等物は、以下の特許請求の範囲により包摂されることを意図する。
【０１９１】
開示される方法および組成物は、変動しうるので、記載される、特定の方法、プロトコール、および試薬に限定されないことが理解される。また、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態について記載することのみを目的とするものであり、付属の特許請求の範囲のみにより限定されうる、本開示の範囲を限定することを意図するものではないことも理解される。
【０１９２】
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての科学技術用語は、本明細書の文脈において、当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【０１９３】
本明細書および付属の特許請求の範囲で使用される、単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈により、そうでないことが明確に指示されない限りにおいて、複数形を含むことに注目されたい。こうして、例えば、「あるヌクレオチド」に対する言及は、複数のこのようなヌクレオチドを含み、「そのヌクレオチド」に対する言及とは、１または複数のヌクレオチド、および当業者に公知のそれらの同等物に対する言及である、などである。
【０１９４】
本明細書の文脈における「および／または」という用語は、それにより接続される項目の一方または両方が関与することを指し示すように理解されうるものとする。本明細書では、本開示の好ましい実施形態について示し、記載してきたが、当業者には、このような実施形態は、例のみを目的として提供されることが明らかでありうる。本開示から逸脱しない限りにおいて、当業者は今や、多数の変形、変化、および代用に想到しうる。本明細書で記載される、本開示の実施形態に対する、多様な代替物を、本開示の実施において援用しうることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、本開示の範囲を規定するものであり、これらの特許請求の範囲の範囲内にある方法および構造、ならびにそれらの同等物は、その対象となることが意図される。
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【実施例】
【０１９５】
（実施例１）
組換えＡ２Ｍを発現させる、ＨＥＫ２９３クローンの作出および選択
組換えＡ２Ｍ野生型配列を、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞内で発現させた。Ｈｅｋ２９３Ｆ細胞を接着播種し、一晩にわたり付着させた。細胞に、ＸＴｒｅｍｅ  Ｇｅｎｅ  ＨＰ（Ｒｏｃｈｅ）およびＤＮＡを、６ｕＬの試薬：２ｕｇのＤＮＡ比でトランスフェクトする。細胞を、５％のＣＯ２および摂氏３７度で、４８時間にわたり増殖させる。トランスフェクションの４８時間後、Ａ２Ｍタンパク質を定量するＥＬＩＳＡアッセイを介して、トランスフェクションの成功を確認するのに、培地試料を採取する。対数増殖期を経るように、細胞を分配し、選択用抗生剤（ブラストサイジン）を、１０μｇ／ｍＬ（実験により決定された選択濃度）で添加する。全ての陰性対照細胞が死滅する（通常、約４〜５日間）まで、細胞を、抗生剤中で選択する。この時点で、別の培地試料を採取して、この新たに確立されたプールが、やはりタンパク質を産生することを確認する。タンパク質の産生を確認したら、細胞を、７．５μｇ／ｍＬのブラストサイジン（実験により決定された維持濃度）を伴う１０ｃｍのディッシュ１枚当たりの細胞約１００個の密度で播種する。この播種密度は、各細胞が、個別のコロニーに増殖することを可能とするのに十分な間隔をあけて、細胞が配置されるように、十分に疎である。これらのコロニーを、クローニングシリンダー（Ｓｉｇｍａ）を使用して収集し、２４ウェルプレート内に播種して、さらなる細胞増殖を可能とする。細胞が２４ウェルプレート内でコンフルエントになったら、ＥＬＩＳＡを、培地試料上で再度実施して、産生が最高度のクローンについてスクリーニングする。高発現クローンを選択し、Ａ２Ｍの作製のために使用する。選び出されたクローンを拡大し、懸濁液に適応させた（図３）。細胞をシェーカーフラスコ内に置く間に、培地を、無血清培地にゆっくり交換することにより、懸濁液への適応を完了した。培養物を懸濁させたら、細胞を培地から単純にスピンすることにより、タンパク質を収集することができる。Ａ２Ｍを含有する上清を、Ａ２Ｍについての精製にかけた。培地の単位容量当たりの高細胞数は、培地１ミリリットル当たりの高タンパク質濃度を結果としてもたらす。２回にわたるクロマトグラフィー法の後で、高純度試料を得た。約１２ｍｇ／Ｌ（接着性プール）の収量が、典型的であった（図１５）。
【０１９６】
（実施例２）
ＡＤＡＭＴＳ−５およびＡＤＡＭＴＳ−４により誘導される軟骨の損傷の、Ａ２Ｍによる阻害
ウシ軟骨外植片（ＢＣＥ）を、５００ｎｇ／ｍｌのＡＤＡＭＴＳ−５またはＡＤＡＭＴＳ−４で、２日間にわたり、精製Ａ２Ｍの３倍の系列希釈液と共に処理した（図７Ａおよび７Ｂ）。被験Ａ２Ｍの濃度は、１００、３３．３、１１．１、３．７、１．２、０．４μｇ／ｍＬであった。変異体Ａ２Ｍは、軟骨の異化を、濃度依存的に阻害した。５００ｎｇ／ｍｌのＡＤＡＭＴＳ−５の阻害についてのＩＣ５０は、約７μｇ／ｍｌのＡ２Ｍであると計算された（モル比を１：１とする）。最大阻害は、１００μｇ／ｍｌのＡ２Ｍにより、約９０％と観察された（モル比を１４：１とする）。Ａ２Ｍは、アグリカンＧ３断片の形成（図７Ａおよび７Ｂ）およびＦＡＣの形成（図９）を遮断することが示された。
【０１９７】
（実施例３）
ＡＰＩＣの保持液と濾液との比較
新鮮な軟骨を、約７ｍｇ／ｍｌのＡ２Ｍを含有するＡＰＩＣで処置した。軟骨の異化は、ＡＰＩＣ作製工程の１％ｖ／ｖの保持液（＞５００ｋＤａのサイズのタンパク質の濃度）により、効果的に遮断されたが、濾液（＜５００ｋＤａのタンパク質を含有する）では、５％ｖ／ｖであってもなお、遮断されなかった（図１０）。ＡＰＩＣの軟骨保護効果は、用量依存的であった。濾液が、軟骨を、ＡＤＡＭＴＳ−５による異化から保護できなかったことは、ＡＰＩＣが、自家血液の保護因子のうちの＞９９％を濃縮することを裏付ける。
【０１９８】
（実施例４）
骨関節炎モデルにおける、Ａ２Ｍによる、軟骨の異化の阻害
新鮮な軟骨を、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−１βで処理して、骨関節炎の病態と同様に、軟骨細胞が、プロテアーゼを分泌するように誘導した。軟骨の異化は、培養培地中の、硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）の増大として検出する。炎症促進性サイトカインによる処理は、軟骨の異化を誘導するが、変異体Ａ２Ｍポリペプチドによる処置が、これを用量依存的に遮断する。
【０１９９】
（実施例５）
変異体Ａ２Ｍで処置された単球の、サイトカインプロファイル
ＴＨＰ−１単球細胞を、変異体Ａ２Ｍを伴うかまたは伴わずに、２日間にわたり処置し、細胞の活性化を、サイトカインおよび増殖因子の、培地への分泌によりモニタリングした。ＴＨＰ−１は、被験サイトカインプロファイルの変化を示さなかった（図１１）。同様の結果は、Ｅ６−１Ｔ細胞およびＳＷ９８２線維芽細胞においても見られた。
【０２００】
（実施例６）
タグ付けされた野生型Ａ２Ｍ発現構築物の、設計および合成
野生型Ａ２Ｍ前駆体タンパク質をコードするＤＮＡ配列（配列番号１）を、ヒトＡ２Ｍ前駆体タンパク質のＲｅｆＳｅｑアミノ酸配列（ＲｅｆＳｅｑ番号：ＮＰ＿０００００５．２）（配列番号３）に基づき、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより合成した。構築物内で使用されるコドンを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより、哺乳動物のコドン使用のバイアス、ＧＣ含量、ＣｐＧジヌクレオチド含量、ｍＲＮＡの二次構造、クリプティックスプライシング部位、未成熟ポリアデニル化部位、内部のカイ部位およびリボソーム結合性部位、ＣｐＧアイランド陰性、ＲＮＡ不安定性モチーフ、リピート配列、および制限エンドヌクレアーゼ部位について最適化した。融合タグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫＧＡＳＨＨＨＨＨＨ）をコードする配列を、タンパク質配列の天然の末端に付加するのに続き、終止コドンを付加した。発現構築物の５’末端に、Ｋｐｎ１制限部位を施し、３’末端に、ＢａｍＨ１制限部位を施した。この構築物を、ｐＵＣ５７ベクターにクローニングした。発現構築物をコードするインサートを、ｐＵＣ５７ベクターから、Ｋｐｎ１およびＢａｍＨ１による二重消化に続く、アガロースゲル電気泳動、および断片のゲル抽出を介して抽出した。このインサートを、ｐＪ６０８哺乳動物発現ベクター（ＤＮＡ  ２．０）の、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの後にライゲーションし（図２３）、Ｅ．ｃｏｌｉのＧＣ１０株（Ｇｅｎｅｓｓｅｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に形質転換した。このステップを実施して、ベクターを維持し、繁殖させる。発現構築物の配列は、ＤＮＡシークェンシング（Ｇｅｎｅｗｉｚ）により検証した。
【０２０１】
（実施例７）
可変ベイト領域のための、アクセプター構築物の設計
ベイト領域をコードする配列を挟む、Ｘｈｏ１制限部位およびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を、まず導入することにより、ベイト領域の配列のスイッチングを可能とするように、野生型発現構築物を突然変異させた。これは、野生型発現構築物を、鋳型として使用する、２回にわたる、逐次的な部位指向突然変異誘発反応を介して行った。突然変異体「アクセプター」構築物の配列は、ベイト領域の、Ｇｅｎｅｗｉｚによる、ＤＮＡシークェンシングにより検証した（配列番号２）。対応するアミノ酸配列は、配列番号４である。ＤＮＡ配列内の突然変異は必然的に、タンパク質内の３つのアミノ酸置換である、ベイト領域のＮ末端側のＱ６９３Ｅ、ならびにベイト領域のＣ末端のＴ７３０ＫおよびＶ７３１Ｌを結果としてもたらす。天然のＤＮＡ配列は、ベイト配列を取り出すのに使用されうる、制限エンドヌクレアーゼ部位を有さないため、これらの突然変異は、回避できなかった。これらの突然変異は、新たなベイト領域設計に含まれる。アクセプター突然変異体の機能の保存は、トリプシンを阻害するその能力により検証し（下記を参照されたい）、設計されたベイト領域の査定の一部として、他のプロテアーゼと対比して調べた。
【０２０２】
（実施例８）
可変ベイト領域の発現構築物の、設計および創出
新規の変異体ベイト領域の配列（配列番号６〜３０）、および１または複数のプロテアーゼ認識配列（配列番号３１〜８３）を含む変異体ベイト領域を、ＡＤＡＭＴＳ−４、ＡＤＡＭＴＳ−５、多様なＭＭＰ、および他のプロテアーゼによる、ヒトアグリカンの公知の切断部位（Fosangら、Eur.  Cells  and  Mat.、１５巻、２００８年、１１〜２６頁）（表１）に基づき設計した。一部の構築物は、野生型Ａ２Ｍベイト配列の部分または全体を保持したが、非天然アミノ酸配列のインサートは、配列番号６〜３０の変異体ベイト領域と、配列番号３１〜８３の１または複数のプロテアーゼ認識配列を含む変異体ベイト領域とを含んだ。各々が、１つ〜６つの間のベイト領域の配列をコードするＤＮＡインサート配列を含有する、いくつかのｐＵＣ５７プラスミドは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより合成され、凍結乾燥粉末として、本発明者らに送付された。各インサート配列は、アクセプター構築物へのライゲーションのために、５’末端のＸｈｏ１部位および３’末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有する。各インサートプラスミドを、アクセプタープラスミドと共に、水中で再構成し、２０ＵのＸｈｏ１およびＨｉｎｄＩＩＩにより、一晩にわたり二重消化して、インサート配列を放離し、消化されたプラスミドを、１％のアガロースゲル上の電気泳動により分離し、ＵＶ光下で可視化した。インサート長およびアクセプター長に対応するバンドは、キットの指示書の通りに、Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを介して、ゲルから抽出した。各抽出から得られるＤＮＡの濃度は、Ｑｕｂｉｔ  蛍光光度計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して決定した。インサートの、ベイト領域をコードするアクセプターの領域へのライゲーションは、各インサートベクターの消化から抽出されるインサート断片を、５０ｎｇの、消化されたアクセプタープラスミドと、インサート：プラスミドのモル比を３：１として混合することにより、セミランダム方式で行った。ライゲーションは、キットの指示書に従い、Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して達成した。次いで、ライゲーションされたプラスミドの混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉのＧＣ１０株（Ｇｅｎｅｓｓｅｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬｕｒｉａ培養液／寒天プレート上に塗り広げ、形質転換細胞の単一のコロニーを発生させた。各ライゲーション反応物に由来する、個々のコロニーの、５ｍＬずつのＬｕｒｉａ培養液による培養物を増殖させ、各培養物中に含有されたプラスミドＤＮＡを、キットの指示書に従い、Ｑｉａｇｅｎ  ＱｉａＰｒｅｐ  ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを介して抽出した。これらのプラスミドは、ベイト領域のすぐ上流の、Ａ２Ｍ構築物の配列にアニールするプライマーを使用する、配列の確認のために、Ｇｅｎｅｗｉｚに送付した。個々のクロマトグラムトレースを、配列内の異質性の存在について解析し、個々のインサートの配列を確認した。
【０２０３】
（実施例９）
Ａ２Ｍ変異体の発現
Ａ２Ｍ変異体は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｇｉｂｃｏ）内で、懸濁細胞内の、各構築物の一過性トランスフェクションにより発現させた。細胞は、８％のＣＯ２／空気混合物を含有する、３７℃のインキュベーター内の、速度を１２５ｒｐｍとするローテーター上、１×ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ）を含有する、２０ｍＬのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する、Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ製の細胞培養フラスコ内の、１ｍＬ当たりの細胞５５０，０００個の密度まで増殖させた。細胞は、各構築物（野生型または変異体）２０μｇずつのプラスミドＤＮＡを、１０μＬのＴｒａｎｓＩＴ  Ｂｏｏｓｔ（Ｍｉｒｕｓ）を加えたＴｒａｎｓＩＴ  Ｐｒｏと、１：２（ｗ／ｖ）の比で、培地への添加の前に１５分間にわたり混合することによりトランスフェクトした。細胞は、トランスフェクション後３日間にわたり、同じ状態で維持してから、分泌された組換えタンパク質を含有する培地を、タンパク質精製のために取り出した（図３）。
【０２０４】
（実施例１０）
Ａ２Ｍ変異体の精製
Ａ２Ｍ発現構築物は、前駆体Ａ２Ｍタンパク質をコードするので、発現し、プロセシングされた組換えタンパク質は、天然のＡ２Ｍ分泌シグナルを介して、細胞培養培地に分泌される。分泌された、組換え野生型Ａ２ＭおよびＡ２Ｍベイト領域変異体は、各構築物のＣ末端における６×Ｈｉｓタグを使用して、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより、トランスフェクト細胞の培養培地から精製した。トランスフェクト細胞から取り出された培地は、１７，５００Ｇで、１５分間にわたり遠心分離して、全ての細胞を除去した。イミダゾールを、清明化された培地に、１０ｍＭの最終濃度まで添加した。１ｍＬのＨｉｓＰｕｒ  Ｃｏｂａｌｔ樹脂スラリー（Ｐｉｅｒｃｅ）を、試料に添加し、４℃で１時間にわたる、ロッカー上の振とうにより平衡化させた。ビーズを、７００Ｇで２分間にわたる遠心分離により収集し、上清を廃棄した。ビーズを、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４による緩衝液１０ｍＬ中で３回にわたり洗浄し、各回において、ビーズを、７００Ｇの遠心分離により収集し、上清を、除去および廃棄した。タンパク質は、２ｍＬの溶出緩衝液（２００ｍＭのイミダゾールを含有する洗浄緩衝液）を、ビーズと混合し、７００Ｇで２分間にわたり遠心分離することにより溶出させた。上清を収集および保持し、溶出を合計３回にわたり反復した。次いで、試料中に含有された精製タンパク質を、１００ＫＤａのＮＭＣＯを伴う、Ａｍｉｃｏｎスピンフィルターを使用して、１００μＬの容量（典型的には、１００μｇ／ｍＬ〜６００μｇ／ｍＬの間）まで濃縮した。濃縮時において、イミダゾールを含有する緩衝液は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１００μＭのＺｎＣｌ２、０．０５％（ｗ／ｖ）のＢｒｉｊ−３５、ｐＨ７．４（ＨＮＺＣＢ緩衝液）と完全に交換した。タンパク質の濃度は、ＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）アッセイおよび６６０ｎｍ（Ｐｉｅｒｃｅ）アッセイを使用して決定した。１μｇずつの各精製タンパク質を、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液と混合し、９５℃で５分間にわたり加熱し、７．５％のトリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ色素非含有ゲル（Ｂｉｏ−ｒａｄ）にロードした。ＵＶ光に、５分間にわたり露出することにより、ゲルを現像し、全タンパク質バンドの写真を撮影した。組換えＡ２Ｍの純度は、全ての変異体タンパク質および野生型タンパク質にわたり、一貫して９０％を超えると推定された（図１５）。
【０２０５】
（実施例１１）
Ａ２Ｍ変異体によるプロテアーゼ阻害の増大についてのスクリーニング
野生型Ａ２Ｍタンパク質と、配列番号３１〜８３の、１または複数のプロテアーゼ認識部位を含有する、配列番号６〜３０のベイト領域を含有する、Ａ２Ｍ変異体を含む、Ａ２Ｍ変異体ポリペプチドとを、Ｇ１ドメイン、Ｇ２ドメイン、および球間ドメイン（Ｒ＆Ｄ）からなる、ヒトアグリカンの組換えＩＧＤ断片の、ＡＤＡＭＴＳ−４、ＡＤＡＭＴＳ−５、およびＭＭＰ１３によるタンパク質分解を阻害するそれらの能力の比較についてスクリーニングした。これらの酵素の各々の阻害に対する、変異体の有効性についてのスクリーニングは、表３、４ａ、および４ｂのプロテアーゼなどの各プロテアーゼのタンパク質分解活性の速度を考慮に入れて、同じ方式で行った。各試料中のＩＧＤ断片の量を、０．１μｇで一定に保つ一方、プロテアーゼの量は、ＩＧＤ断片に対するプロテアーゼの活性に応じて変動させた。変異体Ａ２Ｍおよび野生型Ａ２Ｍの各々は、各プロテアーゼへの結合の反応速度を大幅に変動させるので、あるものは、Ａ２Ｍの、プロテアーゼとのプレインキュベーションを伴わずに、完全な阻害を示す一方、他のものは、プロテアーゼと１０分間にわたりインキュベートした場合に、ある程度の阻害を示し、他のものは、Ａ２Ｍの、プロテアーゼとのプレインキュベーションの後であってもなお、阻害を示さなかった。各Ａ２Ｍ変異体について、プロテアーゼ、ＩＧＤ断片、およびＡ２Ｍの全てを、同時に添加する１つのアッセイ（プレインキュベーションを伴わない）と、阻害剤の、プロテアーゼへの、緩徐な結合を検出するために、ＩＧＤ断片を添加する前に、室温で１０分間にわたり、プロテアーゼとＡ２Ｍとをプレインキュベートする１つのアッセイとの、２つの独立のアッセイを実施した。プロテアーゼの、Ａ２Ｍとのプレインキュベーションを伴わない実験では、ＨＮＺＣＢ緩衝液中の、１５０ｎＭの、タグ付けされた野生型Ａ２ＭまたはＡ２Ｍ変異体５μＬずつを、マイクロ遠心管に添加した。次いで、４０μｇ／ｍＬのＩＧＤ断片５μＬを、同じ遠心管に添加し、混合した。最後に、１５０ｎＭ（ＡＤＡＭＴＳ−４およびＡＤＡＭＴＳ−５、Ａ２Ｍ：プロテアーゼのモル比を１：１とする）または７５ｎＭ（ＭＭＰ１３−Ａ２Ｍ：プロテアーゼのモル比を２：１とする）のプロテアーゼ５μＬずつを、遠心管に添加した。１０分間にわたるプレインキュベーションを伴う実験では、各Ａ２Ｍの５μＬずつを、５μＬのプロテアーゼと、１０分間にわたり混合してから、５μＬのＩＧＤ断片を添加した。全ての試料を、３７℃で１時間にわたりインキュベートしてから、２×還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を添加し、９５℃で５分間にわたり加熱することにより、停止させた。各試料１５μＬずつを、７．５％のＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｆｒｅｅ  Ｇｅｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にロードし、１５０Ｖで１時間にわたり泳動させた。全タンパク質を、ゲルの指示書の通り、ＵＶ光下で可視化し、イメージングした。次いで、タンパク質を、７分間の転写時間を使用する、ｉＢｌｏｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）乾式ブロッティングシステムを介して、ニトロセルロース膜にブロッティングし、ＴＢＳカゼインブロッキング溶液（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を使用して、１���間にわたりブロッキングし、抗ＩＧＤ断片ヤギポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ型番：ＡＦ１２２０）を、ＴＢＳ−Ｔ中０．１μｇ／ｍＬの濃度で使用して、プロービングした。ブロットを、ＴＢＳ−Ｔで、３回にわたり洗浄し、カゼインブロッキング溶液中０．１μｇ／ｍＬのＨＲＰコンジュゲート抗ヤギＩｇＧポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ型番：Ａ５４２０）で、プロービングした。ブロットは、製造元の指示書に従い、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ化学発光キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して現像した。ウェスタンブロットは、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ｉｍａｇｅｒシステム（Ｂｉｏ−ｒａｄ）によりイメージングした。ウェスタンブロット上の各ＩＧＤ断片バンド（完全ＩＧＤ断片および分解ＩＧＤ断片）は、ＩｍａｇｅＬａｂソフトウェアを使用して定量した。各Ａ２Ｍ変異体の存在下におけるＩＧＤ断片の分解量は、分解ＩＧＤ断片バンドの強度と、完全ＩＧＤ断片バンドの強度と（図１６〜２０）を比較することにより定量し、各変異体の阻害能を、各バッチの変異体と共に調製された、野生型Ａ２Ｍ試料と比較した。スクリーニングの、この初期ラウンドから、８つの変異体を、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１２、およびカテプシンＫ（全ての酵素は、組換えヒト構築物であり、Ｒ＆Ｄから購入した）、ならびに表４ａおよび４ｂの酵素など、他の酵素に対するさらなるスクリーニングのために選択した。各変異体の阻害能の比較は、切断された断片が、ウェスタンブロット上に現れないような形で、ＩＧＤ断片を分解させた、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１３を例外として、分解バンドの強度の、完全バンドの強度に対する比をとることにより行った。ＭＭＰ９およびＭＭＰ１３の場合、比較は、残りの完全ＩＧＤ断片バンドの強度のみに基づいて行った。加えて、ＩＧＤ断片を感知可能に切断するのは、ＡＤＡＭＴＳ−１およびＭＭＰ７のみであったので、精密な阻害の測定を定量することはできなかった。これらの場合、変異体の全ては、これらの２つのプロテアーゼに関して、野生型と本質的に同等であると判定された。全ての阻害データを査定した後で、全ての被験プロテアーゼ（図１７〜２１）または軟骨を分解することが公知であるプロテアーゼの混合物（図２２）に対する、改善された阻害特徴または少なくとも同等な阻害特徴に基づき、４つの変異体を選択した。
【０２０６】
（実施例１２）
プロテアーゼに対する、Ａ２Ｍ変異体についてのスクリーニング
４つの、選択されたＡ２Ｍ変異体が、一般的なプロテアーゼである、トリプシンおよびキモトリプシンを、野生型タンパク質と同様の程度に阻害することがやはり可能であることを検証するため、変異体を、蛍光タンパク質分解アッセイにおいて調べた（Twining,  S.S.、Anal.  Biochem.、１４３巻、１９８４年、３０〜３４頁）。このアッセイでは、蛍光色素のタンパク質分解依存的放出により引き起こされる、ＦＩＴＣ標識タンパク質基質からの蛍光発光の増大をモニタリングする。各変異体について、２つの実験：Ａ２Ｍ：プロテアーゼのモル比を１：１に保つ、１つの実験と、Ａ２Ｍを、０．５：１に低減する別の実験とを行った。ＨＮＺＣＢ緩衝液中の濃度を１００ｎＭ（比を１：１とする場合）または５０ｎＭ（比を０．５：１とする場合）とする、野生型Ａ２Ｍまたは変異体Ａ２Ｍの４０μＬを、４０ｎＭのウシトリプシン（Ｓｉｇｍａ）１００μＬと混合し、室温で５分間にわたりインキュベートする。この混合物に、４０μｇ／ｍＬのＦＴＣ−カゼイン基質（Ｐｉｅｒｃｅ）７０μＬを添加し、混合し、３８４ウェルプレートの３つのウェルに速やかにピペッティングした（ウェル１当たり６５μＬ）。プレートを、Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光光度計に入れ、励起波長を４８５ｎｍとし、発光波長を５１９ｎｍとする反応速度モード（単一の波長）で、１５分間にわたり読み取ったが、この間、プロテアーゼによるカゼインの分解速度は、ほぼ直線状を維持した。発光強度を、３つの試料ウェルについて平均し、時間と対比してプロットし、各試料および対照によるデータへの直線当てはめを行った（図１８、左）。当てはめた直線の傾きを、溶液中に残存するプロテアーゼ活性の尺度とした。４つの選び出されたＡ２Ｍ変異体の、野生型タンパク質との比較は、変異体が全て、トリプシンおよびキモトリプシンを含む多様なプロテアーゼを、野生型Ａ２Ｍとほぼ同等に阻害することが可能であることを示す（図１８、右）。
【０２０７】
（実施例１３）
自家療法のための血液の調製
１２０ｍＬの全ヒト血液を、静脈穿刺により、対象から得た。３８ｍＬずつの血液アリコートを、各収集ボトル内に、適切な容量のクエン酸デキストロース溶液Ａ（「ＡＣＤ−Ａ」）を伴う、２本またはそれ超の血液収集ボトルに収集した。血液／ＡＣＤ−Ａを伴う収集ボトルを、一定の角度のローター遠心分離機に取り付け、周囲温度条件下、所定の速度および時間で遠心分離した。沈殿した細胞を撹乱しないように、バフィーコートの水準の上方の血漿約１ｍＬを残して、約１５ｍＬずつの血漿を、血清用ピペットで、各チューブからアリコート分割した。この過程を、１または複数の遠心分離機スピン周期における収集ボトルについて反復して、１２０ｍＬの総採血量から、４５ｍＬの総血漿容量をもたらした。血漿は、個別の滅菌血液収集バッグにプールした。本明細書で記載される組成物は、対象への投与の前に、骨などの組織の自家移植片または同種移植片と混合することができる。
【０２０８】
（実施例１４）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける軟骨分解アッセイ
炎症促進性サイトカインおよび軟骨分解性メタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）により引き起こされた軟骨の異化を、白血球リッチＰＲＰ（ＬＲ−ＰＲＰ）またはＡＰＩＣ−ＰＲＰ（Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）の調製物により阻害しうるという仮説を検証するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ軟骨分解対照アッセイを実施した。ＢＣＥを、ＬＲ−ＰＲＰまたはＡＰＩＣ−ＰＲＰの存在下または非存在において、ＡＤＡＭＴＳ−５、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−１βで処理した。軟骨の異化は、培養物中、２または３日後において、培地中の硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）の存在を介する、プロテオグリカンの放出により測定した。ウシ関節軟骨外植片（ＢＣＥ、２００ｍｇ）を、１〜１．５歳の未出産の雌牛から単離し、培養物中で３日間にわたり平衡化させた。ＢＣＥ培養物を、３日間にわたり、同じ患者から調製された、３３％（ｖ／ｖ）の白血球リッチ血小板リッチ血漿（ＬＲ−ＰＲＰ）、血液、またはＡＰＩＣ−ＰＲＰを伴うかまたは伴わずに処置した。５００ｎｇ／ｍｌのＡＤＡＭＴＳ−５による、２日間にわたる、軟骨のプロテアーゼ消化を、ＡＰＩＣ−ＰＲＰの２倍の系列希釈液で阻害した［ＥＤ５０＝０．１％ｖ／ｖ］。サイトカインにより誘導される軟骨の異化のために、ＢＣＥを、ＳＦＭ中で、８０ｎｇ／ｍｌのヒトＴＮＦ−αまたは８ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１βを伴うかまたは伴わずに、３日間にわたりインキュベートした。軟骨の分解は、５ｍｇ／ｍｌのＡ２Ｍまたは３０％（ｖ／ｖ）のＡＰＩＣ−ＰＲＰを添加することにより阻害した。ＡＰＩＣ−ＰＲＰについての用量反応曲線を裏付けるため、ＡＰＩＣ−ＰＲＰの３倍の系列希釈液［ＥＤ５０＝３％ｖ／ｖ］を使用して、ＴＮＦ−α／ＩＬ−１βにより誘導される軟骨の分解を阻害した。軟骨の異化は、培養物上清中で、硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）の存在を介する、プロテオグリカンの放出により、コンドロイチン硫酸の検量線を伴うＤＭＭＢアッセイを使用して測定した。２００ｍｇのＢＣＥ中の軟骨の分解が、ＬＲ−ＰＲＰ（３３％ｖ／ｖ）の添加により誘導されたことから、ＬＲ−ＰＲＰは、軟骨の異化の発生源であることが裏付けられる。炎症促進性サイトカイン（８０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αまたは８ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β）、ＡＤＡＭＴＳ−５（５００ｎｇ／ｍｌ）による処理もまた、培地中のｓＧＡＧの増大を結果としてもたらした。ＡＰＩＣ−ＰＲＰの添加は、サイトカイン、メタロプロテイナーゼ、またはＬＲ−ＰＲＰにより誘導される軟骨の異化を、用量依存的に阻害した。ＡＰＩＣ−ＰＲＰ研究において使用された、最高の濃度のＬＲ−ＰＲＰの添加は、サイトカインまたはＭＭＰにより誘導される軟骨の異化であって、培地中のｓＧＡＧの放出により測定される軟骨の異化を低減したが、これを阻害しなかった（データは示さない）。骨関節炎（ＯＡ）は、関節軟骨の進行性変性を特徴とする。ＢＣＥモデルは、ＯＡにおける推定治療剤についての研究を代表する。この研究は、白血球リッチＰＲＰ（ＬＲ−ＰＲＰ）が、軟骨の異化に寄与するのに対し、ＡＰＩＣ−ＰＲＰは、軟骨を、公知のＯＡメディエーターによる分解から保護することを裏付ける。この活性は、ＡＰＩＣ−ＰＲＰ中のＡ２Ｍの濃度の、血中のその濃度に対する５〜１０倍の増大により説明することができる。この結論は、Ａ２Ｍの、軟骨に対する保護効果を裏付ける実験と合致する。軟骨の生物学および代謝についての、この理解の改善は、ヒトにおけるＡＰＩＣ−ＰＲＰについての臨床試験をもたらすはずである。
【０２０９】
（実施例１５）
ウサギモデルにおける軟骨保護効果
骨関節炎の病態は、炎症性メディエーターおよびマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）などのプロテアーゼの上方調節を伴う。Ａ２Ｍとは、強力なプロテアーゼ阻害剤である、自然発生の血漿糖タンパク質である。Ａ２Ｍは、ＭＭＰに結合し、これを捕獲し、取り除くその能力により、軟骨の異化をモジュレートするように挙動する。Ａ２Ｍは、複数の組織および細胞外腔全体で機能するが、通常、関節の関節内腔内で高レベルに達することはない。血液からＡ２Ｍを濃縮するＡＰＩＣ−Ｃｅｌｌ  Ｆｒｅｅ（Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）が、軟骨の異化を阻害し、これにより、ＡＣＬ−Ｔウサギモデルにおける骨関節炎の発生を緩和する能力について調べた。ウサギモデルは、骨関節炎を査定するための、耐荷重についての、機能的な、ｉｎ  ｖｉｖｏ解剖モデルであって、ヒト組織と同様の、機械的特性、形状的構造、および治癒能を呈示する解剖モデルを表す。この研究では、８〜１２カ月齢の雌ニュージーランドホワイトウサギを使用した。このウサギモデルは、骨関節炎を査定するための、耐荷重についての、機能的な、ｉｎ  ｖｉｖｏ解剖モデルであって、ヒト組織と同様の、機械的特性、形状的構造、および治癒能を呈示する解剖モデルを表す。複数回注射コホート（群１）：６匹のウサギの、右膝にＡＣＬ−Ｔ術を施し、左膝に偽手術を施した。０．３ｍＬずつ４回分のＡＰＩＣ−Ｃｅｌｌ  Ｆｒｅｅ（Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）注射液を、ウサギ血液から調製し、ＡＣＬ膝傷害後１、４、１４、および２８日目に投与した。ウサギの対側対照膝には、同等容量の滅菌等張性生理食塩液を施した。ウサギを、６週間にわたりモニタリングし、次いで、軟骨変性評価のために屠殺した。対照群（群２）：６匹のウサギの、右膝に、左膝の偽手術を伴わずに、ＡＣＬ−Ｔ術を施した。これらのウサギは、対照群であり、したがって、いかなる処置も施されなかった。
【０２１０】
変異体Ａ２Ｍの調製
ＡＣＬ傷害の前に、変異体Ａ２Ｍポリペプチドを調製した。全てのウサギに、プロテアーゼ阻害剤濃縮液を施した。ＡＣＬ−Ｔ施術の６週間後、動物を、巨視的なおよび顕微鏡による膝関節の軟骨査定のために屠殺して、ＯＡの進行を決定した。
【０２１１】
巨視的解析および組織学的解析
巨視的査定のために、遠位大腿顆および脛骨プラトー表面を解析し、既に記載されている、バリデーション済みの、０〜８のスケールを使用して、病変を分類した。関節内の病変の場所は、巨視的検査の後で、Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（ＯＡＲＳＩ）による分類であって、Ｌｉｎｄｈｏｒｓｔらが、ウサギ膝に適応させた分類に従い、各関節表面についての、特殊な９領域の格子により記録した。単離された大腿骨および脛骨試料にフィードし、組織学的査定（顕微鏡による査定）のために脱灰させた。大腿骨および脛骨についての巨視的査定は、ＯＡと符合する軟骨（cartage）の異化と符合する特色を裏付けた。ＡＰＩＣ  Ｃｅｌｌ  Ｆｒｅｅによる処置は、軟骨の外見を大幅に改善し、偽手術対照と同様の外見をもたらした（図１２〜１４）。ＡＰＩＣの適用は、軟骨の分解を、非処置対照と比較して、５３±２０％軽減した（平均値±ＳＥＭ；ｐ＝０．００８６）（図１３Ａおよび１３Ｂ）。変異体Ａ２Ｍの濃度を決定した。Ａ２Ｍの高濃度と、巨視的査定時における、ＯＡＲＳＩ総膝スコアの減少との間には、用量依存的相関が見られた（図１３Ａおよび１３Ｂ）。Ｓａｆａｒｉｎ−Ｏ染色（ｒ２＝０．７３）、構造（ｒ２＝０．７６）、軟骨細胞密度（ｒ２＝０．５０）、およびクラスター形成（ｒ２＝０．９７）についてのＯＡＲＳＩ組織病理学査定（図１４）の合計ではまた、処置の用量依存的治療利益も観察された。データは、血中のＡ２Ｍの濃度の９〜１０倍を含有する、ＡＰＩＣ−Ｃｅｌｌ  Ｆｒｅｅ（Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）が、骨関節炎ウサギモデルに対して、軟骨保護効果を及ぼすことを示唆する。
【０２１２】
（実施例１６）
Ａ２Ｍの、ＢＣＥに対する効果
炎症促進性サイトカインまたは軟骨分解性メタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳおよびＭＭＰ）の添加は、軟骨の分解を刺激するが、これは、Ａ２Ｍにより阻害されるという仮説を検証するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ軟骨分解対照アッセイを実施した。ウシ軟骨外植片（ＢＣＥ）を、精製Ａ２Ｍの存在下または非存在下で、炎症促進性サイトカイン（ＴＮＦ−αまたはＩＬ−１β）または軟骨分解性メタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ−５、ＡＤＡＭＴＳ−４、ＭＭＰ−７、またはＭＭＰ−１２）を伴うかまたは伴わずに、処置した。
【０２１３】
ウシ関節軟骨外植片（ＢＣＥ；１００±４ｍｇ）を、１〜１．５歳の未出産の雌牛から単離し、培養物中で、３日間にわたり平衡化させた。プロテアーゼ消化により軟骨を分解するために、ＢＣＥを、無血清培地（ＳＦＭ）中で、５００ｎｇ／ｍＬのＡＤＡＭＴＳ−４またはＡＤＡＭＴＳ−５、および３〜５μｇ／ｍＬのＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−１２、またはＭＭＰ−１３を伴うかまたは伴わずに、２日間にわたりインキュベートした。ＭＭＰ−３は、キモトリプシンで活性化させてから、ＢＣＥに適用した。サイトカインにより誘導される軟骨の異化のために、ＢＣＥ（２００±４ｍｇ）を、ＳＦＭ中で、８０ｎｇ／ｍｌのヒトＴＮＦ−αおよび８ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−１βを伴うかまたは伴わずに、３日間にわたりインキュベートした。軟骨の分解は、プロテアーゼ消化に対する、１００μｇ／ｍＬの精製ヒトＡ２Ｍ、またはサイトカインにより誘導される分解に対する、５ｍｇ／ｍＬのＡ２Ｍを添加することにより阻害した。
【０２１４】
軟骨の異化は、培養物上清中で、１）硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）の存在を介する、プロテオグリカンの放出、ならびに２）Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｓｔａｉｎｌｅｓｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、軟骨プロテオグリカン断片の存在、およびウェスタンブロット法による、アグリカンＧ３断片の存在により測定した。
【０２１５】
フィブロネクチン−アグリカン複合体（ＦＡＣ）は、ＢＣＥ実験による、分解された軟骨マトリックスであるプロテオグリカンを、フィブロネクチンおよび滑液と組み合わせ、４時間にわたりインキュベートすることにより形成した。新たに形成されたＦＡＣは、ウシアグリカンを認識するのに必要とされるα−アグリカンＧ３抗体を使用する変更を伴う、ＦＡＣＴ  ＥＬＩＳＡにより測定した。
【０２１６】
５００ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼによる軟骨の異化を阻害するのに必要とされるＩＣ５０は、ＡＤＡＭＴＳ−５についての、７μｇ／ｍＬのＡ２Ｍ、およびＡＤＡＭＴＳ−４についての、３μｇ／ｍＬであった。５ｍｇ／ｍＬのＡ２Ｍの添加はまた、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−１βにより誘導される軟骨の異化も阻害した。さらに、Ａ２Ｍは、フィブロネクチンとの複合体を形成し、疼痛および関節の分解についてのマーカーである、アグリカンＧ３断片の産生も遮断した（図７〜１０）。
【０２１７】
（実施例１７）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、Ａ２Ｍの、創傷の治癒に対する効果
炎症促進性サイトカインまたは軟骨分解性メタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳおよびＭＭＰ）の添加は、創傷の治癒を遅延させるが、これは、組換えＡ２Ｍにより阻害されるという仮説を検証するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ創傷治癒対照アッセイを実施する。動物の創傷に由来する細胞を、組換えＡ２Ｍ組成物の存在下または非存在下で、炎症促進性サイトカイン（ＴＮＦ−αまたはＩＬ−１β）または軟骨分解性メタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ−５、ＡＤＡＭＴＳ−４、ＭＭＰ−７、またはＭＭＰ−１２）を伴うかまたは伴わずに、処置する。創傷細胞を、無血清培地（ＳＦＭ）中で、５００ｎｇ／ｍＬのＡＤＡＭＴＳ−４またはＡＤＡＭＴＳ−５、および３〜５μｇ／ｍＬのＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−１２、またはＭＭＰ−１３を伴うかまたは伴わずに、２日間にわたりインキュベートする。ＭＭＰ−３は、キモトリプシンで活性化させてから、創傷細胞に適用する。サイトカインにより誘導される創傷の治癒の遅延のために、創傷細胞を、ＳＦＭ中で、８０ｎｇ／ｍｌのヒトＴＮＦ−αおよび８ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−１βを伴うかまたは伴わずに、３日間にわたりインキュベートする。創傷の治癒は、プロテアーゼ消化について、１００μｇ／ｍＬの精製ヒト組換えＡ２Ｍの添加により増強されるか、またはサイトカインにより誘導される分解について、５ｍｇ／ｍＬの組換えＡ２Ｍの添加により増強される。
【０２１８】
（実施例１８）
創傷液の収集法
いくつかの技法が、創傷液を収集するのに活用された。１つの技法は、シリンジを活用して、湿性創傷から、創傷液を吸引するステップを伴った。別の技法は、創傷液を吸収する濾紙の使用に続く、緩衝液で洗浄することなどによる、吸収された創傷液の、濾紙からの抽出を伴う。別の技法は、縁辺が直線状の舌圧子を、創傷にわたり走らせ、流体を収集するステップを伴い、濾紙などにより、直線状の縁辺の前方で流体が集められる。
【０２１９】
例えば、ヒト慢性創傷の創傷液は、単一の包帯を、５ｍｌのリン酸塩緩衝生理食塩液ｐＨ４．０〜６．０、氷冷酢酸緩衝液ｐＨ７．０〜８．０により、該当するｐＨに調整された、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．２Ｍの塩酸を使用して、該当するｐＨを緩衝するように補正された、０．２Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）中に、一晩にわたり浸漬することにより、一次創傷液包帯から抽出する。
【０２２０】
（実施例１９）
糖尿病性ラットにおける、Ａ２Ｍ組成物の、創傷の治癒に対する効果
概要
糖尿病性潰瘍など、慢性創傷の治癒は、重大な臨床問題である。本研究では、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、本発明に従う、治療用組換えＡ２Ｍ組成物に対する応答について検討する。創傷の治癒に障害を来した、糖尿病性ラットモデルについての、予備的動物研究は、本明細書で記載される組換えＡ２Ｍ組成物を、蒸留水と比較して行う。結果として、Ａ２Ｍ処置群では、創傷の完全閉止までの時間が短い。創傷の治癒の差違が、処置の９日目から明らかとなる。Ａ２Ｍ処置動物は、瘢痕組織が小さく、体毛の増殖も完全である。水処置動物では、体毛の増殖に障害を来した瘢痕が明らかである。本研究の結果は、これらのＡ２Ｍ組成物の皮膚への使用が、創傷の治癒をモジュレートし、体毛の増殖を刺激する潜在的可能性を有することを示唆する。
【０２２１】
方法
組換えＡ２Ｍ組成物についてのｉｎ  ｖｉｖｏ試験のための動物モデルは、糖尿病性ラットの背部皮膚における全層創傷である。体重２００〜２５０ｇのＷｉｓｔａｒラットを使用する。動物は、個別のケージ内で飼育する。糖尿病は、ストレプトゾトシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）の投与により誘導する。ストレプトゾトシンは、５５ｍｇ／ｋｇの用量で、腹腔内投与する。ストレプトゾトシンの投与の前に、ラットの、ベースラインにおける血中グルコースを決定する。４８時間後、血中グルコースを再度測定して、ラットが糖尿病性であることを確認する。血中グルコースレベルが倍増していれば、糖尿病の誘導が確認される。グルコースは、Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（Ｉｎｆｏｐｉａ  Ｃｏ．、Ｋｏｒｅａ）により決定する。血中グルコースの決定を、５日ごとに継続して、糖尿病の遷延を確認する。ストレプトゾトシンにより誘導される糖尿病の実体に関して、体重が大幅に減少し、虚弱となる動物、血中グルコースレベルが不安定な動物は、研究から除外する。対照群と被験群とを同数とする、合計１４匹のラットを使用する。被験群には、組換えＡ２Ｍ組成物を含む、ある容量の溶液を適用し、対照群には、蒸留水を施す。０日後の時点で、円形で直径１５ｍｍの全層創傷を創出する（例えば、Wound  Rep.  Reg.、２００２年、１０巻：２８６〜２９４頁に従って）。腹腔内ペントバルビタール（５５ｍｇ／ｋｇ）により、ラットに麻酔をかけ、Ｂｅｔａｄｉｎｅを使用して、背部皮膚を、手術のために調製する。創傷は、手術用鋏を使用して創出する。０日後の時点で、調製された包帯を、創傷に直接貼付する。創傷は、滅菌ガーゼで覆い、注意深く包み込む。手術後２〜３日ごとに、ラットを麻酔下に置いて、創傷の包帯を、未使用の対照包帯または被験包帯に交換する。創傷は、滅菌生理食塩液でフラッシュ洗浄して、膿苔を除去し、創傷領域を清浄化する。ディジタルカメラを使用して、創傷の写真を撮影する。写真を、創傷のサイズおよび新鮮な新生上皮の外見の点から、創傷の治癒について検討する。撮影したら、未使用の包帯を創傷に貼付し、創傷を再度覆う。バイアスのコントロールは、実験群の各々に暗号を割り当てることにより達成する。試験責任医師を、群の各々の識別に対して盲検化し、被験群と対照群とが同様の外見を呈するようにする。最終的な４週間にわたる解析が完了した後で、暗号を解除する。
【０２２２】
治療の１５日目の被験群において、創傷は、完全に閉止され、新たな、短い体毛が、瘢痕領域を覆う。治療の２２日目において、創傷は、完全に治癒し、新たな、長い体毛が、瘢痕領域の全体を覆う。かつての創傷の形跡は、見ることができない。対照群では、治療の１５日目において、創傷は、閉止しない。試験の２２日目において、創傷は、閉止されたが、瘢痕はやはり重度であり、完全に無毛である。
【０２２３】
創傷領域および周囲領域は、被験群と対照群とで同様であるが、被験群では、特に、創傷領域と周囲領域との差違が最も顕著となる１５日目において、より迅速な閉止の傾向が見られる。Ａ２Ｍ処置動物では、創傷の完全な閉止までの時間が短い。対照群および被験群のいずれにおいても、創傷領域は、９日目に小さくなりはじめ、１５日目までに、ほぼ完全な創傷の閉止がまず生じる（７匹中１匹のラット）。２２日目までに、両方の群においても、創傷は、本質的に閉止されるが、Ａ２Ｍ処置群における体毛の増殖は、水処置群と比較して、とりわけ完全である。
【０２２４】
本研究の結果は、本発明に従う組換えＡ２Ｍ組成物を含む皮膚用調製物が、創傷の治癒を増強する潜在的可能性を有することを示唆する。創傷の閉止を加速化することに加えて、本研究におけるＡ２Ｍ処置は、体毛が、対照群におけるより効率的に増殖したので、治癒しつつある創傷における組織の質を改善すると考えられる。慢性創傷は、長期間治癒しないことを特徴とするのみでなく、治癒後において、依然として閉止できないことも特徴とする。こうして、閉止までの時間は、唯一の関係する評価項目でも、処置の有効性についてのただ１つのベースでもない。組換えＡ２Ｍ組成物で処置された被験群動物において、より健全な瘢痕組織を得たことから、再発率の低下を期待することが可能となる。
【０２２５】
（実施例２０）
創傷のデブリドマン
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるデブリドマンの有効性研究のために、組換えＡ２Ｍ組成物を、ブタの壊死組織に適用する。組換えＡ２Ｍ組成物を、デブリドマン装置と併せて、発生させた創傷（直径約２ｃｍ）の各々に使用する。２４時間後、Ａ２Ｍ組成物で処置された創傷において、創傷の著明なデブリドマンが観察される。５日後、組換えＡ２Ｍ組成物を伴う創傷は、壊死組織を伴わない清浄化表面および完全な治癒を示す。デブリドマン装置で処置された創傷もまた、４８時間後に、著明なデブリドマンを示す。しかし、創傷は、組換えＡ２Ｍ組成物で処置されたほど清浄化されず、５日後においても、完全な治癒を示さなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018501207.tif 000052
2018501207.tif 000053
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