(57)【要約】本開示主題は、神経変性疾患の処置に使用するためのシタロプラム、エスシタロプラム又は薬学的に許容されるそれらの塩又は誘導体に関し、さらに、タンパク質のミスフォールディングの減少及び／又は凝集の減少によって積極的に影響を受ける神経変性疾患の処置における、シタロプラム又はエスシタロプラム、薬学的に許容されるそれらの塩又は誘導体の使用に関し、特に経口投与による使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マチャド・ジョセフ病、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、脊髄小脳失調症１型、脊髄小脳失調症２型、脊髄小脳変性症６型、脊髄小脳失調症７型、脊髄小脳失調症１７型の処置に使用するためのシタロプラム又はエスシタロプラム、又は薬学的に許容される塩。
【請求項２】
ポリグルタミン病がタンパク質のミスフォールディング及び／又は凝集の制御によって積極的に影響を受ける、ポリグルタミン病の処置に使用するための請求項１に記載のシタロプラム又はエスシタロプラム。
【請求項３】
前記タンパク質のミスフォールディング及び／又は凝集の制御は、影響を受けたタンパク質のポリグルタミンセグメントにおける膨張によって引き起こされるタンパク質凝集の制御である、請求項２に記載のシタロプラム又はエスシタロプラム。
【請求項４】
マチャド・ジョセフ病、又は脊髄小脳失調症３型の処置に使用するための請求項１〜３のいずれか一項に記載のシタロプラム又はエスシタロプラム。
【請求項５】
前記処置は、運動症状、すなわち、平衡性、運動協調性、及び／又は運動能力の欠如を改善するためのものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のシタロプラム又はエスシタロプラム。
【請求項６】
請求項１〜５に記載の神経変性疾患の処置に使用するための処置上有効な量のシタロプラム、エスシタロプラム又はそれらの塩及び薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤又はそれらの混合物を含む医薬組成物。
【請求項７】
経口投与によって請求項１〜５に記載の神経変性疾患の処置に使用するための請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
タンパク質のミスフォールディングの減少及び／又は凝集の減少によって積極的に影響を与えられる神経変性疾患を有する人への連日投与量であって、当該投与量が４０ｍｇ未満／日である用量を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
投与量は２０ｍｇ〜４０ｍｇ／日である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
投与量は３０ｍｇ〜３８ｍｇ／日である、請求項８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はシタロプラム又はエスシタロプラムを有効成分として使用し、神経変性疾患、特にポリグルタミン病、特にマチャド・ジョセフ病（ＭＪＤ）又は脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリグルタミン病は、効果的な処置方法の存在しない優性遺伝性神経変性疾患のクラスである。トリヌクレオチドＣＡＧリピートの拡張は、ハンチントン病（ＨＤ）、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症及び脊髄小脳失調症の６つの型等の遺伝性の成人発症型神経変性疾患を引き起こす。世界的に最も一般的な優性遺伝性ＳＣＡであるＭＪＤ／ＳＣＡ３は、認知機能低下が無い、ジストニア、痙攣、末梢神経障害及び筋萎縮に関連する運動失調、眼筋麻痺及び錐体路兆候を特徴とする。病理学的には、小脳核、橋核及び視床下核、黒質及び脊髄小脳核の変性がある。ＭＪＤの遺伝的基盤は、タンパク質ａｔａｘｉｎ―３（ＡＴＸＮ３）内のポリグルタミン（ｐｏｌｙＱ）トラクトの拡張である。ｐｏｌｙＱトラクトが６０個の連続したグルタミンを超えると、ＡＴＸＮ３は高凝集傾向になり、凝集関連タンパク質毒性がフォールディング及びクリアランスを支配するので、細胞プロテオスタシスに失調をもたらす。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｄ’Ａｂｒｅｕ，Ａ．，Ｆｒａｎｃａ，ＭＣ，Ｊｒ．、Ｐａｕｌｓｏｎ，ＨＬ＆Ｌｏｐｅｓ―Ｃｅｎｄｅｓ、Ｉ．Ｃａｒｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｍａｃｈａｄｏ―Ｊｏｓｅｐｈ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｏｗ  ｔｏ  ｈｅｌｐ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ  Ｒｅｌａｔ  Ｄｉｓｏｒｄ  １６、２〜７（２０１０）
【非特許文献２】Ｃｏｓｔａ  Ｍ．  ｄｏ，Ｃ．＆Ｐａｕｌｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．Ｔｏｗａｒｄ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  Ｍａｃｈａｄｏ―Ｊｏｓｅｐｈ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｒｏｇ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ９７、２３９〜２５７  （２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在、疾患の進行を効果的に遅らせるＭＪＤの処置方法はない。患者の生活の質を改善し、自立を維持する取り組みが、下肢静止不能症候群及び錐体外路症候群、痙攣及び疲労の影響の処置に対し行われている（非特許文献１）。薬理学的シャペロン及びキネティック安定剤アプローチ、ならびにＡＴＸＮ３の濃度、構造、及び／又は位置を操作するための小分子又は遺伝子ターゲティングの使用を含む処置戦略は、未だ臨床診療へと転換されていない（非特許文献２）。提案された多くの処置方法においては、臨床診療へのトランスレーションは慢性処置に際してのヒトの安全性及び毒性の欠如によってさらに制限されるだろう。新たな分子標的の新規の同定及び検証を含む従来の新薬発見のアプローチは、コスト及び時間がかかるため、臨床に導入される新薬の数は制限される。さらに、薬物開発に要する平均時間が増加し続けているため、薬物を別の目的で再利用化する戦略に新たな関心が向けられてきている。一方、過去数年にわたって、新薬候補物の失敗の主な原因は、臨床試験における処置効果が低いことであった。この欠点の最も頻繁に提唱される理由として、インビトロにおける組み換え型の薬物活性から、全生物系におけるインビボでの処置効果への転換の欠如があげられる。
【０００５】
これらの事実は、本発明によって対処される技術的課題を説明するために開示される。
【０００６】
ここで、セロトニン作動性シグナル伝達の活性化がＭＪＤの動物モデルにおいて有益であるという事実の証拠を提供する。選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）であるシタロプラムは、有益な効果を有すると同定され、これまでに記述された、変異アタキシン―３誘発神経毒性のカエノルハブディティスエレガンス（Ｃ．エレガンス）モデルにおける神経機能障害及びタンパク質凝集を減少させる（Ｔｅｉｘｅｉｒａ―Ｃａｓｔｒｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ―ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔ  ａｔａｘｉｎ−３  ｉｎ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ：ｒｅｓｃｕｅ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＤＡＦ―１６  ａｎｄ  ＨＳＦ―１  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ２０、２９９６〜３００９（２０１１））。セロトニントランスポーターのＣ．エレガンスオルソログでありシタロプラムの細胞標的であるＭＯＤ−５、ならびにセロトニン受容体のＳＥＲ―１とＳＥＲ―４は、ＭＪＤの強力な遺伝的修飾因子であり、処置効果に必要であることが示された。さらに、ＣＭＶＭＪＤ１３５マウス（Ｓｉｌｖａ―Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，Ａ. ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  １７−ＤＭＡＧ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｂａｌａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａ  Ｎｅｗ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｍａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ  Ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  （２０１４））のシタロプラム用いた慢性処置は、ＡＴＸＮ３神経封入体及びアストログリオーシスを減少させ、著しく運動症状を改善し、減少した体重を回復した。これらの結果は、セロトニン作動性シグナル伝達の小分子調節がＭＪＤの処置標的を表すこと明らかにした。さらに、セロトニン再捕獲阻害剤がタンパク質毒性を調節するという発見は、他のタンパク質構造障害に関連し得る。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示主題は、タンパク質のミスフォールディング及び／又は凝集の減少によって積極的に影響を受ける神経変性疾患の処置における、シタロプラム又はエスシタロプラム、薬学的に許容される塩又は誘導体の使用に関し、すなわち、患者の運動症状、すなわち、平衡性の欠如、運動協調性の欠如、及び／又は運動能力の欠如を改善を目的とする。
【０００８】
一実施形態では、シタロプラム又はエスシタロプラムの使用は、神経変性疾患の予防及び遅延に使用するものである。
【０００９】
一実施形態では、シタロプラム又はエスシタロプラムは、神経変性疾患の処置に使用するものであり、前記疾患は、タンパク質のミスフォールディング及び／又は凝集の制御によって積極的に影響される。
【００１０】
一実施形態では、シタロプラム又はエスシタロプラムは、神経変性疾患の処置に使用するためのものであり、前記疾患はタンパク質のミスフォールディング及び／又は凝集の制御によって積極的に影響され、前記制御は影響を受けたタンパク質のポリグルタミンセグメントにおける拡張によって引き起こされるタンパク質凝集の制御である。
【００１１】
一実施形態では、シタロプラム又はエスシタロプラムは、マチャド・ジョセフ病としても知られる脊髄小脳失調症３型の処置に使用するものである。
【００１２】
一実施形態では、シタロプラム又はエスシタロプラムは、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、マチャド・ジョセフ病、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症及び脊髄小脳失調症１型、脊髄小脳失調症２型、脊髄小脳失調症６型、脊髄小脳失調症７型ならびに脊髄小脳失調症１７型の処置に使用するものである。すなわち、運動症状、つまり患者の平衡性の欠如、運動協調性の欠如、及び／又は運動能力の欠如の改善のためのものである。
【００１３】
開示した主題の目的はまた、神経変性疾患の処置に使用するための、処置上有効な量のシタロプラム、エスシタロプラム又はその塩及び薬学的に許容できる担体、アジュバント、賦形剤又はそれらの混合物を含む医薬組成物に関する。
【００１４】
一実施形態では、当該組成物は、タンパク質のミスフォールディング及び／又は凝集の減少によって積極的に影響される神経変性疾患を有する人への１日投与量であって、当該投与量が、特に経口投与により、４０ｍｇ未満／日、好ましくは２０〜４０ｍｇ／日、より好ましくは３０〜３８ｍｇ／日である用量を含む。
【００１５】
一実施形態では、日用の薬剤の形態は、特定量のシタロプラム又はエスシタロプラムを含み、その全体で単一用量として投与されることが意図される、錠剤、坐剤、アンプル又はその他の装置からなる。
【００１６】
明細書及び特許請求の範囲を通して、「含む」という語及びその語の変形は、他の技術的特徴、添加物、構成要素又はステップを排除することを意図したものではない。本発明の追加の目的、利点及び特徴は、説明を検討することにより当業者にとって明らかになるであろうし、又は、本発明の実施によって知られ得る。以下の実施例及び図面は例示として提供されるもので、本発明を限定するものではない。さらに、本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態及び好ましい実施形態のすべての可能な組み合わせを包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、シタロプラム及び他のＳＳＲＩは、ＭＪＤのＣ．エレガンスモデルにおいて運動能力を回復させることを示す図である。ａは、シタロプラムによる処置時のＡＴ３ｑ１３０動物の移動障害を示す図である。ｂは、シタロプラム処置時のＡＴ３ｑ１３０動物の移動障害の用量―応答プロフィールを示す図である。ｃは、Ｓ―シタロプラム（エスシタロプラム）、フルオキセチン及びジメリジンによる処置時のＡＴ３ｑ１３０動物の移動障害を示す図である。ｄは、シタロプラム、Ｓ―シタロプラム（エスシタロプラム）及びフルオキセチン処置時のＡＴ３ＷＴの運動性能を示す図である。（ｎ＝３±ｓ．ｄ．）、Ｐ＞０．０５（スチューデントｔ検定）である。ＡＴ３ｑ１３０は変異ＡＴＸＮ３動物を示す。ＡＴ３ＷＴは野生型ＡＴＸＮ３動物を示す。ｃｉｔはシタロプラムを示す。Ｓ―ｃｉｔはＳ―シタロプラムを示す。ｆｌｕｏｘはフルオキセチンを示す。ｚｉｍｅｌはジメリジンを示す。
【図２】図２は、早期慢性シタロプラム処置は、Ｃ．エレガンスにおける変異ＡＴＸＮ３凝集及び神経機能障害を抑制したことを示す図である。ａは、シタロプラム処置時のＡＴ３ｑ１３０動物における凝集の定量化を示す図である。ｂは、ＡＴ３ｑ１３０のタンパク質抽出物の生化学的分画に際してのＡＴＸＮ３タンパク質の代表的なウェスタンブロット分析を示す図である。（ｎ＝３以外）である。ｃは、ＡＴ３ｑ１３０シタロプラム動物におけるヒトＡＴＸＮ３タンパク質レベルを示す図である。ｄは、シタロプラム処置時のＡＴ３ｑ１３０動物の生存率を示す図であり、図２ｅは統計を示す図である。ｆは、シタロプラム処置したＷＴ及びＡＴ３ｑ１３０動物の運動性及び疾患が進行するにつれての薬物外効果を示す図である。ｇは、示された日に処置を開始し、４日間処置を施したＡＴ３ｑ１３０シタロプラム動物の運動行動を示す図であり、ｈは、示された日数の処置期間を示す図である。ｉは、ｍｏｄ―５バックグラウンドにおける、シタロプラム、Ｓ―シタロプラム及びフルオキセチンによる処置時のＡＴ３ｑ１３０動物の移動障害及び凝集量を示す図である。運動行動アッセイについては：（ｎ＝３〜４、±ｓ．ｄ．）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントｔ検定）である。凝集定量化については：（ｎ≧８、±ｓ．ｄ．）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（ＡＮＯＶＡ、ボンフェローニ検定）である。ウェスタンブロットについては：（ｎ＝４、±ｓ．ｄ．）、Ｐ＞０．０５（スチューデントｔ検定）である。ＴＸ１００はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ―１００を示す。ＦＡはギ酸を示す。ｃｉｔはシタロプラムを示す。Ｓ―ｃｉｔはＳ―シタロプラム（エスシタロプラム）を示す。ｆｌｕｏｘはフルオキセチンを示す。ＷＴは野生型を示す。
【図３】図３は、セロトニン作動性シグナル伝達は、Ｇタンパク質共役型受容体依存的にＡＴＸＮ３病因を改善することを示す図である。ａは、５−ＨＴが合成され、シナプス間隙に放出され、シナプス間隙において５−ＨＴがシナプス後５−ＨＴ受容体を活性化することを示すセロトニン作動性シナプスを示す概略図である。バビカセリンは、ＳＥＲ―１と結合した制御シグナル伝達を活性化し得る。ピンドロール、リゼルゴール及びＤＨＥはおそらく５−ＨＴ自己受容体ＳＥＲ―４と拮抗し、一方、５―ＨＴ１ＡＲアゴニストであるブスピロンは、シナプス前ニューロンにおける５−ＨＴ自己受容体によって媒介されるストッププロダクションシグナルを遮断し、受容体を脱感作できる。ｂは、バビカセリン、ブスピロン、ＤＨＥ、ピンドロール及びリゼルゴール処置したＡＴ３ｑ１３０動物の運動行動を示す図である。ｃは、シタロプラム、Ｓ―シタロプラム及びエストロン処置した又は処置しなかった、ｓｅｒ―１遺伝的背景を有するＡＴ３ｑ１３０動物の運動性欠陥及び凝集量を示す図である。ｄは、ＳＥＲ―４の非存在下におけるＡＴ３ｑ１３０動物の運動能力と変異ＡＴＸＮ３凝集表現型を示す図である。運動行動アッセイについては：（ｎ＝３〜４、±ｓ．ｄ．）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントｔ検定）である。凝集定量化については：（ｎ≧１２、±ｓ．ｄ．）＊Ｐ＜０.０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（ＡＮＯＶＡ、及びボンフェローニ検定）である。ＤＨＥはジヒドロエルゴタミンを示す。ｃｉｔはシタロプラムを示す。Ｓ―ｃｉｔはＳ―シタロプラム（エスシタロプラム）を示す。
【図４】図４は、ＣＭＶＭＪＤ１３５マウスは、疾患の完全な発症段階において正常レベルの５―ＨＴ及び５−ＨＴの代謝回転を示すことを示す図である。５−ＨＴ、５―ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）及び５−ＨＴターンオーバー（５−ＨＩＡＡ／５―ＨＴ比によって評価）は、２４週齢時に、（ａに示す）小脳（ｎ＝５  ＷＴ；ｎ＝７  ＣＭＶＭＪＤ１３５）内のＨＰＬＣ、（ｂに示す）延髄（ｎ＝６  ＷＴ；ｎ＝８  ＣＭＶＭＪＤ１３５）内のＨＰＬＣ、及び（ｃに示す）黒質（ｎ＝５  ＷＴ；ｎ＝５  ＣＭＶＭＪＤ１３５）内のＨＰＬＣによって測定した。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示す。Ｐ＞０．０５（スチューデントｔ検定）である。ＴＯはターンオーバーを示す。ＷＴは野生型を示す。
【図５】図５は、ＣＭＶＭＪＤ１３５マウスの神経障害に対する８ｍｇ／ｋｇでのシタロプラム処置の影響を示す図である。ａは、前臨床治験の概略図である。ｂは、ビヒクル処置したＣＭＶＭＪＤ１３５マウス（ｎ＝１３）及びシタロプラム処置したＣＭＶＭＪＤ１３５マウス（ｎ＝１６）の体重に有意な差異が観察されたことを示す図である（Ｐ＝０．００１、２０週齢―３４週齢）。ｃは、１４週齢時の脚の引きずりの軽度の改善を示す図である。ｄは、探索活動に改善の無いことを示す図である。ｅは、筋力試験：ハンギングワイヤー及び前肢強度に影響の無いことを示す図である。ｆは、後肢筋緊張に影響の無いことを示す図である。 ｇは、ビヒクル処置したマウス（ｎ＝１３）及びシタロプラム処置したＣＭＶＭＪＤマウス（ｎ＝１６）の歩長に有意な差異が観察されたことを示す図である（Ｐ＝０．０１５、３０週齢）。振戦（ｈに示す）、肢のクラスピング（ｉに示す）及び歩調（ｊに示す）について１８週齢から３４週齢の後期表現型改善によって判定した。（ｎ＝１３〜１６、±ｓ．ｄ．）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１（ノンパラメトリック変数及びＡＮＯＶＡに対してマン―ホイットニーＵ検定、連続的変数に対してテューキー補正を用いた。ハンギングワイヤー試験は：ＣＭＶＭＪＤ１３５群について対数関数モデルのアールスクエア比較を用いた。）。ｃｉｔはシタロプラムを示す。
【図６】図６は、シタロプラム処置は、平衡性及び協応性における障害、ならびにＭＪＤマウスの変異ＡＴＸＮ３凝集を低減させることを示す図である。平均台歩行試験（Ｐ＜０．００１、２０週齢〜３４週齢）（ａに示す）、及び、水泳試験（Ｐ＜０．００１、１４週齢〜３４週齢）（ｂに示す）において、ビヒクル処置したＣＭＶＭＪＤ１３５マウス（ｎ＝１３）及びシタロプラム処置したＣＭＶＭＪＤ１３５マウス（ｎ＝１６）間に有意な差異が観察された。ｃは、ＷＴ、ビヒクル処置したＣＭＶＭＪＤ１３５マウス及びシタロプラム処置したＣＭＶＭＪＤ１３５マウスからのＳＮにおける面積当たりのＧＦＡＰ陽性細胞の免疫組織化学及び定量化を示す図である（１グループにつきｎ＝５）。ｄは、ビヒクル処置したＣＭＶＭＪＤ１３５マウス及びシタロプラム処置したＣＭＶＭＪＤ１３５マウスのＰＮ、ＲｔＴｇ、７Ｎ及びＬＲｔにおける神経封入体を示す図である（ｎ＝４、３４週齢）。ｅは、ビヒクル処置したＣＭＶＭＪＤ１３５マウス及びシタロプラム処置したＣＭＶＭＪＤ１３５マウスからの総ヒトＡＴＸＮ３タンパク質の脳幹免疫ブロット及び定量化を示す図である（ｎ＝５、３４週齢）。データは平均±ｓ.ｅ.ｍ.として示す。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１（ＡＮＯＶＡ、テューキー補正（ａ、ｂ）及び一方向ＡＮＯＶＡ（ｃ〜ｅ））。スケールバーは２０μｍである。ｃｉｔはシタロプラムを示す。ＷＴは野生型を示す。ＳＮは黒質を示す。ＰＮは橋核を示す。ＲｔＴｇは橋被蓋網様核を示す。７Ｎは顔面運動核を示す。ＬＲｔは側索核を示す。
【図７】図７は、ＷＴマウスの体重及び運動行動に対する８ｍｇ／ｋｇでのシタロプラム処置の影響を示す図である。ビヒクル処置したＷＴマウス及びシタロプラム処置したＷＴマウスの、体重（ａに示す）、平均台歩行試験（ｂに示す）、及び運動水泳試験（ｃに示す）を示す図である。シタロプラム処置は体重の大きな増加をもたらした（処置：Ｆ１，１８＝５．３３７、Ｐ＝０．０３３）。ＷＴと、シタロプラム処置したＷＴマウスとの間には平均台歩行試験（処置：Ｆ１，１６＝０．７４８、Ｐ＝０．４０）、及び運動水泳試験（処置：Ｆ１、１４＝０．０４３、Ｐ ＝０．８３９）において差異は観察されなかった。（ｎ＝１０±ｓ．ｅ．ｍ．）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１（反復測定ＡＮＯＶＡ）。ｃｉｔはシタロプラムを示す。ＷＴは野生型を示す。
【図８】図８は、高用量のシタロプラム（１３ｍｇ／ｋｇ）による処置は、ＣＭＶＭＪＤ１３５マウスの神経症状の限定的改善をもたらしたことを示す図である。ビヒクル処置（ｎ＝１４）したＷＴマウス及びシタロプラム処置（１３ｍｇ／ｋｇ）したＷＴ（ＷＴ  ｃｉｔ１３）マウス（ｎ＝１７）、及び、ビヒクル処置（ｎ＝１６）したＣＭＶＭＪＤ１３５マウス及びシタロプラム処置（１３ｍｇ／ｋｇ）したＣＭＶＭＪＤ１３５マウス（ＣＭＶＭＪＤ１３５  ｃｉｔ１３）（ｎ＝１３）の、体重（ａに示す）、歩幅（ｂに示す）、平均台歩行試験（ｃに示す）及び運動水泳試験（ｄに示す）を示す図である。ＣＭＶＭＪＤ１３５マウスとＣＭＶＭＪＤ１３５  ｃｉｔ１３マウスとの間には体重において差異は観察されなかった（遺伝子型：Ｆ１，６７＝３１.３３５、Ｐ＜０．００１；処置：Ｆ２，６７＝１４．１８１、Ｐ＝０．０００００７；遺伝子型＊処置Ｆ１，６７＝１.４２５、Ｐ＝０．２３７；ポストホックテューキーテスト（ビヒクル処置したＣＭＶＭＪＤ１３５マウス対シタロプラム処置したＣＭＶＭＪＤ１３５マウス、Ｐ＝０．４３１）。シタロプラム処置したＷＴマウスには体重の有意な増加が見られた（テューキーテスト、Ｐ＝０．００７）。処置時に歩幅において差異は観察されなかった。平均台歩行試験については、２０週齢時及び２４週齢時にわずかな改善が発見された（一方向ＡＮＯＶＡ、テューキーテスト、各々Ｐ＝０．０３とＰ＝０．０３１；遺伝子型：Ｆ１，４９＝１２４．１８１、Ｐ＜０，００１；処置： Ｆ１，４９ ＝２．４７８、遺伝子型＊処置：Ｆ１，４９ ＝２．４７８、Ｐ＝０．１２２）。運動水泳試験においては、２２週齢時及び３４週齢時においてのみ処置時の有意な差異が観察された（一方向ＡＮＯＶＡ、テューキーテスト、各々Ｐ＝０．０１６とＰ＝０．０４１、遺伝子型：Ｆ１，６４＝１１８．１５７、Ｐ＜０，００１、処置：Ｆ２，６４＝１９．９５９、Ｐ＜０，００１；遺伝子型＊処置：Ｆ１，６４＝６．３、Ｐ＝０．０１５）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊Ｐ＜０．００１（反復測定ＡＮＯＶＡ、テューキー補正）。ｃｉｔ１３は１３ｍｇ／ｋｇのシタロプラムを示す。ＷＴは野生型を示す。
【００１８】
本発明はシタロプラム又はエスシタロプラムを有効成分として使用し、神経変性疾患、特にポリグルタミン病、特にマチャド・ジョセフ病（ＭＪＤ）又は脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）の処置に関する。
【００１９】
＜Ｃ.エレガンスＳＥＲＴの薬理学的及び遺伝的阻害による、ＡＴＸＮ３病因の抑制＞
シタロプラムは、うつ病の処置に広く使用されている証明された安全記録を有するＳＳＲＩである（Ｍａｎｄｒｉｏｌｉ，Ｒ．、Ｍｅｒｃｏｌｉｎｉ，Ｌ．，Ｓａｒａｃｉｎｏ，ＭＡ＆Ｒａｇｇｉ，ＭＡ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｒｅｕｐｔａｋｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（ＳＳＲＩｓ）：ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｒｕｇ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １９，１８４６〜６３  （２０１２））。シタロプラムの主要な分子標的は、セロトニン作動性ニューロンによる５−ＨＴ再取り込みの原因となる５−ＨＴトランスポーター（ＳＥＲＴ）である。この標的特異性と保存性は、モデルの無脊椎動物モデルにおけるＭＪＤ病因へのシタロプラムの効果を調べることを我々に促した。シタロプラムによる処置は、用量―応答プロフィール及び４５μΜ（図１ｂ）の得られた半数効果濃度（ＥＣ５０）値を用いて、変異ＡＴＸＮ３媒介性の神経機能障害（図１ａ）の完全な救済をもたらした。シタロプラムはラセミ混合物として存在するが、その効果は主にＳ―エナンチオマー、エスシタロプラムに起因する。このＳＳＲＩ及び他のＳＳＲＩは、ＡＴ３ｑ１３０動物に対しても有益な効果があった（図１ｃ）。ＷＴ動物における正常な行動及び運動性、発達及び生殖能力は、ＳＳＲＩ処置によって影響を受けなかった（図１ｄ）。重要なことに、生化学的分画によって評価すると、タンパク質の全体的なレベル（図２ｃ）に影響を与えることなく、シタロプラム処置はＣ．エレガンスの神経における変異ＡＴＸＮ３凝集を大きく低減させ（図２ａ）、そしてＡＴＸＮ３溶解度を増加させた（図２ｂ）。
【００２０】
シタロプラムに連続曝露すると、ＡＴ３ｑ１３０動物の生存率が救済され（図２ｄ、ｅ）、１４日齢を通じてＡＴＸＮ３動物において神経機能障害が回復した（図２ｆ）。この有益な効果は、シタロプラムを引き抜いたときに減少し、３日から４日の処置中止後に神経毒性が戻った（図２ｆ）。最大保護は早期処置（卵期から成人期の４日を通じて）を必要とした（図２ｇ）。さらに、２日間の処置では有益な効果を発揮するには不十分であったため、薬物暴露期間の範囲は重要であった（図２ｈ）。
【００２１】
Ｃ．エレガンスでは、脊椎動物ＳＥＲＴの１つの５−ＨＴトランスポーターオーソログである、ＭＯＤ−５が存在する。セロトニン再取り込みの薬理学的阻害の有益な効果を確認するため、ＭＯＤ−５の遺伝的除去がＣ．エレガンスにおける変異ＡＴＸＮ３媒介運動機能障害及び凝集を救済したことを示した（図２ｉ）。薬理遺伝学的分析はまた、この薬剤での処置がＭＯＤ−５の非存在下で変異ＡＴＸＮ３媒介病因をさらに改善しなかったので、ＭＯＤ−５を線虫におけるシタロプラムの細胞標的として支持した。対照的に、エストロン（ステロイドホルモン）はｍｏｄ−５；ＡＴ３ｑ１３０動物の運動性障害をさらに減少させることができた（図２ｉ）が、これはこれら２つの化合物の独立した作用様式と一致する。
【００２２】
５−ＨＴ受容体（５‐ＨＴＲ）の役割を、薬理学的アプローチ及び薬理遺伝学的アプローチを用いて調べた（図３ａ）。５―ＨＴ２ＣＲアゴニストであるバビカセリンによるシナプス後５ＨＴＲの活性化、及び、ブスピロン、ジヒドロエルゴタミン、リゼルゴール又はピンドロールによるシナプス前５―ＨＴ自己受容体の刺激（図３ｂ）は、変異ＡＴＸＮ３媒介運動機能障害を改善した。これと一致して、５―ＨＴシナプス後Ｇタンパク質共役受容体ＳＥＲ―１の遺伝子除去は、ＡＴ３ｒ１０凝集及び移動不全を増強した（図３ｃ）。同様に、シタロプラムの効果もまた、これらの受容体に依存した。さらに、ネガティブフィードバックを排除することにより５―ＨＴの有用性を高める可能性があるＳＥＲ―４自己受容体の除去は、移動力を回復させ、生体内でＡＴＸＮ３凝集を減少させた（図３ｄ）。まとめると、これらの結果は、ＭＯＤ―５の薬理学的阻害及び遺伝的阻害が運動性を回復し、５ＨＴＲ活性の調節を介してＡＴ３ｒ１０の凝集を抑制するという考えを裏付けている。
【００２３】
＜シタロプラム処置による、ＣＭＶＭＪＤ１３５マウスの運動平衡性と運動協応性の向上＞
シタロプラムの処置効果をさらに実証するために、我々は、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＡＴＸＮ３陽性の核内封入体を含む、ＭＪＤのような進行性の運動機能低下及び神経病理を示す、ＭＪＤのトランスジェニックマウスモデルであるＣＭＶＭＪＤ１３５を使用した。ＣＭＶＭＪＤ１３５マウスは、ＨＰＬＣ（図４）で測定した基線５−ＨＴレベルにおいて変化を示さなかったが、これらの動物へのシタロプラム（８ｍｇ／ｋｇ）の経口投与（研究デザイン―図５ａ）は、動物の体重増加の低減を防ぎ（図５ｂ）、運動表現型に非常に有益な効果をもたらした。脚の引きづり（図５ｃ）の限界改善、及び探索活動（図５ｄ）、掴む強さ（図５ｅ）ならびに後肢筋緊張（図５ｆ）への限定的な効果が見られたが、シタロプラム処置は試験の進行段階において歩幅をＷＴレベルまで回復させた（図５ｇ）。さらに、処置した動物は、振戦の減少（図５ｈ）、肢のクラスピングの減少（図５ｉ）、及び歩調の質の改善（図５ｊ）を示した。シタロプラム処置はまた、ビヒクル処置したＣＭＶＭＪＤ１３５マウスと比較して、平衡性及び運動協応性において顕著な改善をもたらした。平均台歩行試験において、我々は２０週齢から３４週齢のマウスにおいて１２ｍｍ四方の平均台を通過するのに要する時間の大幅な改善を観察した（図６ａ）。試験の多くの時点及び非常に遅い時点まで、シタロプラム処置した動物はＷＴと区別がつかなかったので、運動水泳試験では、シタロプラムの最も顕著な利点が観察された（図６ｂ）。全体的に、これらの結果は、シタロプラムがＭＪＤマウスの運動協応性障害を減少させることができ、筋力については利点が少ないことを実証し、脊髄小脳路や筋神経支配よりもむしろ脳幹、中脳又は小脳のレベルにおいて、シタロプラムの効果があることを示唆する。処置はまた、マウスにおける疾患の進行を大きく遅らせた。
【００２４】
一実施形態では、シタロプラム処置したＷＴマウスは、シタロプラム処置していない同腹子と同じように行動し、効果の特異性を確認した（図７）。さらに、１３ｍｇ／ｋｇの用量で処置したＣＭＶＭＪＤ１３５マウスは、上記のすべてのパラダイムにおいてビヒクル処置したコントロールと比較して、より限定された改善を示した（図８）。
【００２５】
一実施形態では、ＣＭＶＭＪＤ１３５マウスからの脳組織の分析は、シタロプラム処置（８ｍｇ／ｋｇ）が、Ｃ．エレガンスにおける神経凝集体の減少に類似して、反応性アストログリオーシスを軽減し（図６ｃ）、脳幹におけるＡＴＸＮ３核内封入物を減少させたことを示した（図６ｄ）。この減少は、処置したＣＭＶＭＪＤ１３５マウスの橋核（ＰＮ）、橋被蓋網様核（ＲｔＴｇ）及び顔面運動核（７Ｎ）において、ビヒクル処置した対応物と比較した場合に、観察された（図６ｄ）。シタロプラムの影響は側索核（ＬＲｔ）においてあまり顕著ではなかった。この減少したＡＴＸＮ３凝集は、脳幹におけるＡＴＸＮ３タンパク質レベルの低レベルには対応せず（図６ｅ）、これはシタロプラムのマウスにおける効果はＣ．エレガンスにおける効果と類似し、タンパク質のクリアランスよりもむしろ、変異ＡＴＸＮ３のフォールディング及び安定に影響することを示唆した。
【００２６】
本主題は、シタロプラム及び他のＳＳＲＩがＣ．エレガンス及びマウスモデルにおいてＭＪＤ病因を抑制することを示し、運動性／協応性、変異ＡＴＸＮ３の凝集、及び疾患の進行に有益な効果を示すことを示す。シタロプラムによるＭＯＤ−５（及びＳＥＲＴ）阻害は、細胞外５−ＨＴレベルの増加及びセロトニン作動性神経伝達の増強をもたらし、ニューロン活動、適応及びリモデリングに対する５−ＨＴ依存性効果を引き出すことができる。
【００２７】
Ｃ．エレガンス及びマウスの両方における変異ＡＴＸＮ３媒介性神経毒性を改善するＳＳＲＩの処置効果は、慢性処置を必要とした。同様に、うつ病では、シタロプラムの長期処置が必要である。そのようなＳＳＲＩ処置法は、５−ＨＴ１Ａ自己受容体の減感をもたらし、この減感がシナプス前ニューロンにおけるネガティブフィードバック機構を不活性化し、よって５−ＨＴ有用性を高めシナプス後受容体を活性化する。５−ＨＴ１Ａ受容体アンタゴニスト特性を有するβ―アドレナリン作動性受容体部分アゴニストであるピンドロールは、ＳＳＲＩと組み合わせた場合、ＳＳＲＩ単独と比較して初回奏功までの時間が大きく減少する。さらに、直接的アゴニスト（例えばブスピロン）による５−ＨＴ１Ａ自己受容体のより速い減感もまたＳＳＲＩの処置効果を促進し得る。一貫して、慢性処置による５−ＨＴ自己受容体のターゲティングは、Ｃ．エレガンスにおける変異ＡＴＸＮ３媒介病因を改善した。
【００２８】
ＭＪＤにおける慢性的かつ初期症候段階でのＭＪＤの処置の必要性は、ＭＪＤマウスにおける５―ＨＴのシグナル伝達カスケード又は失調の調整に対する即時効果ではなく、神経保護機構を示唆する。さらに、シタロプラム及びＭＯＤ―５不活性化の凝集ＡＴＸＮ３に対する効果は、生物のプロテオスタシス状態の再調整にセロトニン作動性神経伝達が及ぼす影響と一致する。実際に、神経からのセロトニンの放出は、タンパク質毒性を防ぐ保護機構の活性化を末梢組織にシグナルを送ることが近年記載された。
【００２９】
シタロプラムで得られた効果と、ＭＪＤモデルにおいて正の効果を有する他の分子についての文献に記載された効果とを比較すると、このＳＳＲＩは、より高い処置効果を有するように見える。私達の研究から、今回の結果とＨｓｐ９０阻害剤１７―ＤＭＡＧについての以前の所見とを比較すると（Ｓｉｌｖａ―Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，Ａ，ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  １７―ＤＭＡＧ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｂａｌａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａ  Ｎｅｗ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｍａｃｈａｄｏ―Ｊｏｓｅｐｈ  Ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  （２０１４））、シタロプラムの処置効果がより顕著に認められた。すなわち、運動泳動障害の兆候は、１７―ＤＭＡＧ処置では８週間遅延させられ、シタロプラム処置では少なくとも２０週間遅延させられ、また、３０週齢において、この試験における１７―ＤＭＡＧの効果の割合は３３％であり、シタロプラムの効果の割合は７９％であった。２つの実験における処置群（それぞれの非処置群に対して標準化）間の効能の差は、この週齢で統計的に有意であった（Ｐ＝０．０１８）。
【００３０】
結論として、２つの疾患モデルにおけるＡＴＸＮ３病因の抑制におけるシタロプラムの効能並びにうつ病患者に広く使用されているシタロプラムの安全記録は、我々にＭＪＤ患者における臨床試験にこの薬剤を提案することを促した。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
＜線虫株及び一般的方法＞
この試験で使用した株のリスト及び略称については、表１を参照されたい。すべての株をブリストル株Ｎ２に５〜８回戻し交配した。Ｃ．エレガンスの培養及び観察には、他に記載がない限り、標準的な方法を用いた。線虫は、２０℃で大腸菌ＯＰ５０株を播種した線虫飼育培地（ＮＧＭ）プレート上で成長させた。
【００３２】
【表１】
2018508558.tif 000002
【００３３】
＜化合物＞
すべての化合物は、以下に示す商業的供給業者から入手し、さらに精製することなく使用した。：エストロンＣＡＳ  ５３―１６―７（Ｓｉｇｍａ、米国）、フルオキセチンＣＡＳ  ５６２９６―７８―７（Ｋｅｍｐｒｏｔｅｃ  Ｌｄｔ、英国）、ジメリジンＣＡＳ  ６１１２９―３０―４（シグマ、米国）、リゼルゴールＣＡＳ  ６０２−８５―７（Ｓｉｇｍａ、米国）、ピンドロールＣＡＳ  １３５２３―８６―９（Ｓｉｇｍａ、米国）、トラゾドン塩酸塩ＣＡＳ  ２５３３２―３９―２（Ｓｉｇｍａ、米国）、シタロプラム臭化水素酸塩ＣＡＳ  ５９７２９―３２―７（Ｋｅｍｐｒｏｔｅｃ  Ｌｄｔ、英国）、エスシタロプラム（Ｓ―シタロプラム）臭化水素酸塩ＣＡＳ  ２１９８６１―０８―２（Ｋｅｍｐｒｏｔｅｃ  Ｌｄｔ、英国）。マウスの研究に使用されたシタロプラム及びバビカセリンは、Ｌｕｎｄｂｅｃｋ（デンマーク）により親切に提供された。
【００３４】
＜薬物毒性アッセイ＞
ブリストル株Ｎ２を用いて、化合物の毒性を分析し、使用に安全な濃度を測定した。アッセイは、液体培養液で９６ウェルプレート形式で行った。各ウェルは、６０μＬの最終容量を含み、卵の段階の２０匹〜２５匹の動物、適切な濃度の薬剤、及びマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ  ６８０）で測定した０．６〜０．８の最終ＯＤ５９５ｎｍのＯＰ５０細菌を含有していた。卵の年齢を同調させた集団を得るため、産卵期の成体をアルカリ性次亜塩素酸塩溶液（０．５Ｍ ＮａＯＨ、〜２．６％ＮａＣｌＯ）で７分間処理した。
次いで、動物をＭ９緩衝液中で洗浄し、Ｓ培地で適切な卵数に再懸濁し、９６ウェルプレートに移した。ＯＰ５０細菌を、ルリアブロス（ＬＢ）培地中、３７℃及び１５０ｒｐｍで一晩増殖させ、遠心分離によってペレット化し、４〜６サイクルの凍結／融解で不活性化し、−８０℃で凍結し、次いでコレステロール、ストレプトマイシン、ペニシリン及びナイスタチン（Ｓｉｇｍａ、米国）を補充したＳ培地で再懸濁した。虫は、７日間２０℃（Ｓｈｅｌ  Ｌａｂ）で１８０ｒｐｍにて連続振盪しながら成長させた。化合物を１００％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ、米国）中で調製し、溶媒特異的発生欠損及び毒性を避けるために、１％ＤＭＳＯの最大濃度に対応する希釈率で試験した。各化合物について、２つの最終濃度（５０μΜ及び２５μΜ）を試験した。Ｃ．エレガンスの生理学に対する化合物の作用を、Ｃ．エレガンスの増殖、生存又は産卵についての読出しとして、大腸菌食物懸濁液が消費された速度によって監視した。吸光度（ＯＤ５９５ｎｍ）を毎日測定した。ＯＰ５０のみ（Ｓ培地、ビヒクルなし）、及び、ＤＭＳＯ１％（ビヒクル）の対照を用いた。
【００３５】
＜運動性欠陥及び凝集についてのＣ．エレガンスのアッセイ＞
動物（Ｎ２、ＡＴ３ＷＴ又はＡＴ３ｑ１３０）を、上記のように化学化合物を含む９６ウェルプレート形式の液体培養液中で成長させた。４日齢の動物を９６ウェルプレートから播種していないＮＧＭプレート（２０℃で平衡化）に移した。アッセイを開始する前に、プレートを１時間乾燥させた。運動性についてのアッセイは、前述のように２０℃で行った。運動行動についてのアッセイは、遺伝子型及び／又は化合物ごとに試験した合計で少なくとも１５０匹の動物を用いて、３重又は４重（ｎ＝３又は４）に行った。ＡＴＸＮ３凝集の共焦点動的イメージング及び定量化のために、生きた動物を３ｍＭレバミゾール（Ｓｉｇｍａ、米国）で固定し、３％アガロースパッド上に載せた。全ての画像は、６０倍の油浸（ＮＡ＝１．３５）対物レンズ又は６３倍の水浸（ＮＡ＝１．０）対物レンズを用いてＯｌｙｍｐｕｓＦＶ１０００（日本）又はＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０（ドイツ）の共焦点顕微鏡上で取り込まれた。Ｚシリーズのイメージングは、ＹＦＰ融合タンパク質に５１５ｎｍ又は５１４ｎｍのレーザー励起線をかけ、全てのビヒクル処置した動物及び化合物の処置をした動物について取得した。ピンホールは、光学スライスの１．０エアリーユニットに調整し、スキャンはＺ軸に沿って〜０．５μｍ毎に取得した。凝集の定量化のために３つのパラメータを測定した。それは、凝集面積／総面積と、凝集数／総面積と、凝集数である。特に断りのない限り、示した値は、群あたり８匹以上の動物の（ビヒクル処置した対照に対して正規化した）平均値である。
【００３６】
＜Ｃ．エレガンスシタロプラム時間経過アッセイ＞
時間経過実験のために、動物は、シタロプラムを補充したＯＰ５０でのＮＧＭプレート上で成長させた。ＯＰ５０培養物を上記のように調製し、またストレプトマイシン、ペニシリン及びナイスタチン（Ｓｉｇｍａ）を補充したＳ培地で１０倍に濃縮した。シタロプラムのストック溶液（２．５ｍＭ及び０．５ｍＭ）（Ｋｅｍｐｒｏｔｅｃ、英国）又はビヒクル（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ、米国）を調製し、２５μＭ又は５μＭの最終濃度までＯＰ５０培養物に加えた。プレートに２００μＬのＯＰ５０―シタロプラム又はビヒクルを播種し、室温（ＲＴ）に少なくとも３日間放置し乾燥させた。新鮮なプレートを、薬物の劣化を防止するために、週２〜３回用意した。４日間の動物の処置により投薬停止効果を判定し、その後動物をＤＭＳＯプレート（ビヒクル）に移した。生殖期間中、動物は毎日新たな新鮮なプレートに移した。
【００３７】
＜イムノブロッティング分析＞
ＡＴＸＮ３の定常状態タンパク質レベルの決定のため、動物を、上記のように、９６ウェルプレートフォーマットにおけるシタロプラム液体培養液中でインキュベートした。４日齢の動物は、播種していないＮＧＭプレート（２０℃で平衡化した）上に液体培養液から移した。前述のように、１時間の順応後に２５匹の青年期の動物個体を選び、ＳＤＳサンプル緩衝液中で１５分間煮沸し（すべての凝集を破壊するために）、得られた抽出液を１０％ＳＤＳゲル上で分離した。イムノブロットを、抗ＡＴＸＮ３マウス抗体（１Ｈ９、ＭＡＢ５３６０、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、米国；１：１０００又は１：１５０）及び抗チューブリンマウス抗体（Ｔ５１６８、Ｓｉｇｍａ、米国； １：５０００）でプローブし、そして；ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼに結合した二次抗体（Ｂｉｏｒａｄ、米国）及び化学発光（ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ―ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、英国）で検出した。我々のグループにてマウスの脳幹組織からのタンパク質の分離及びウェスタンブロットを前述のように行った。ブロットを、一次抗体ウサギ抗アタキシン―３血清（Ｈｅｎｒｙ  Ｐａｕｌｓｏｎ博士により親切に提供された）（１：５０００）及びマウス抗ＧＡＰＤＨ（Ｇ８７９５、Ｓｉｇｍａ、米国、１： １０００）でブロックし、また４℃で一晩インキュベートした。ローディングコントロールとして、マウスアタキシン―３及びＧＡＰＤＨを使用した。ウェスタンブロットの定量化は、製造者の指示に従って、ＩｍａｇｅＬａｂ  ＳｏｆｔｗａｒｅとＣｈｅｍｉｄｏｃ  ＸＲＳ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏｒａｄ、米国）、又は、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＮＩＨ、米国）を使用して行った。ＡＴＸＮ３分画アッセイは、以下の変更を加えて、前述のように行った。：ＡＴ３ｑ１３０動物はＮＧＭ―シタロプラム又はビヒクルプレートで４日間成長させた。線虫を回収し、Ｍ９緩衝液中で洗浄し、そして、液体窒素中で衝撃凍結する前に、ＲＩＰＡ緩衝液（完全プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、米国）を補充した、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ―１００、２５ｍＭ ＥＤＴＡ）中で再懸濁した。
３回の凍結―融解サイクル後、虫ペレットを電動乳棒で摩砕し、そして０．０２５  Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼ（Ｓｉｇｍａ、米国）の存在下で、氷上で溶解させた。溶解物を卓上遠心機で１０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、屠体をペレット化した。タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）を用いて決定し、全ての実験条件で３〜４μｇ／μＬの最終濃度に設定し、４℃で３０分間２２０００ｇの遠心分離を行った。ペレット画分を上清（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ―１００可溶性画分）から分離し、２％のＳＤＳを含有する１５０μＬのＲＩＰＡ緩衝液中で均質化し、次いで室温で二度目の遠心分離を行った。上清（ＳＤＳ可溶性画分）を除去し、そして残ったペレットを３７℃で１００％のギ酸（ＦＡ）中で１６時間インキュベートした。３７℃でＦＡが蒸発した後、ペレットを２５μＬのＬａｅｍｍｌｉ緩衝液（ＳＤＳ不溶性画分）中に溶解し、次いで２Ｍ  Ｔｒｉｓ―ｂａｓｅでＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のためにｐＨ調整を行った。ゲルに、５０μｇのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ―１００可溶性画分、４０μＬのＳＤＳ可溶性画分及び完全ＳＤＳ不溶性画分をロードした。上記のようにウェスタンブロット分析を行った。
【００３８】
＜寿命＞
アッセイは、前述のように２０℃で行った。約１００匹の半陰陽体を、各ペトリ皿上で培養し、子孫生成を中止するまでは毎日新鮮なプレートに移し、その後は約１〜３日毎に新鮮なプレートに移した。つついたときに、自発的な動きや反応を示さなかった場合、動物は死亡したと記録した。内部で孵化した子孫、押し出された生殖腺又は乾燥を示す動物の死骸は除外した。
【００３９】
＜トランスジェニックマウスモデル及び薬剤投与＞
前述のようにＣＭＶＭＪＤ１３５マウスを生成した。ＤＮＡの抽出、動物の遺伝子型の決定及びＣＡＧリピートサイズ分析を、前述のように行った。使用される全てのマウスについて平均リピートサイズ（±ｓ．ｄ．）は１３０±２とした。同年齢及び同じ遺伝的背景を有するＷＴ動物を対照として使用した。雄マウスのみをこの研究で使用した。我々は、うつ病のヒト患者に処方される高い用量範囲にほぼ等しい２つの投与量（８ｍｇ／ｋｇ／日及び１３ｍｇ／ｋｇ／日）で、飲料水中にシタロプラム臭化水素酸塩ＣＡＳ  ５９７２９―３２―７（Ｌｕｎｄｂｅｃｋ、デンマーク）を投与した。処置は、予想される最初の神経症状の発症の１週間前である５週齢で開始した。試験は、処置していないＣＭＶＭＪＤ１３５マウスに対し定められた人道的エンドポイントに応じて、３４週齢で終了した。すべての動物の手順はヨーロッパ規則に従って行った（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｕｎｉｏｎ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ８６／６０９／ＥＥＣ）。動物施設と動物実験に直接関わる人々（ＡＴＣ、ＳＥ、ＡＳＦ、ＳＤＳ）は、ポルトガルの監督機関であるＤｉｒｅｃｃａｏ  Ｇｅｒａｌ  ｄｅ  Ａｌｉｍｅｎｔａｃａｏ  ｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａによって認定された。行ったプロトコルのすべては、ミーニョ大学のＡｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって承認された。
【００４０】
＜神経化学的定量化＞
ＣＭＶＭＪＤ１３５及びＷＴの雄同腹子マウス（ｎ＝５〜８）を２４週齢で頭部切除により屠殺し、脳を迅速に取り出し、液体窒素中で急速凍結し、解剖した。前述のように、５―ＨＴ及び５−ヒドロキシインドール酢酸（５―ＨＩＡＡ）のレベルは、黒質、延髄及び小脳において、電気化学検出と組み合わせて高速液体クロマトグラフィーにより測定した（ＨＰＬＣ／ＥＣ）。神経伝達物質の濃度を、標準曲線を用いて計算し、その結果、タンパク質の量当たりの５―ＨＴ及び代謝物含量で表した。
【００４１】
＜行動評価＞
行動分析はＣＭＶＭＪＤ１３５ヘミ接合性トランスジェニックマウス及びシタロプラム又はビヒクル（水）処置をしたＷＴ同腹子（遺伝子型当たりｎ＝１３〜１６）を含むケージあたり５匹の雄のグループで昼間に行った。全ての行動試験を、発症前段階（４週間）に開始し、３０週齢又は３４週齢まで続けた（図５ａ）。神経学的テスト、及び一般的な健康評価はハンギングワイヤー試験で富化したＳＨＩＲＰＡプロトコルを使用して行った。脚の引きづりと歩幅はフットプリント分析で判定した。運動行動は、さらに、平均台歩行試験（１２ｍｍ角の角型ビーム及び直径１７ｍｍの丸型ビーム）及び運動水泳試験を用いて判定した。全ての行動試験は、前述のように行った（Ｓｉｌｖａ―Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，Ａ.  ｅｔ  ａｌ.  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  １７―ＤＭＡＧ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｂａｌａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａ  Ｎｅｗ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｍａｃｈａｄｏ―Ｊｏｓｅｐｈ  Ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（２０１４））。体重もまた、各判定時点で記録した。
【００４２】
＜免疫組織化学及びニューロン封入体の定量化＞
３４週齢のビヒクル処置したＷＴ及びＣＭＶＭＪＤ１３５同腹子マウス及びシタロプラム処置したＷＴ及びＣＭＶＭＪＤ１３５同腹子マウス（各群ｎ＝４）を、ケタミン塩酸塩（１５０ｍｇ／ｋｇ）とメデトミジン（０．３ｍｇ／ｋｇ）の混合物で深く麻酔し、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）で経心的に潅流し、次いで、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（Ｐａｎｒｅａｃ、米国）で経心的に潅流した。脳を切除し、ＰＦＡ内で一晩後固定し、パラフィンに包埋した。４μｍ厚のパラフィン切片に抗原回復を行った後、マウス抗ＡＴＸＮ３（１Ｈ９、ＭＡＢ５３６０、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、米国；１：１００）又はウサギ抗ＧＦＡＰ（ＤＡＫＯ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カーピンテリア；１：１０００）でインキュベートし、ビオチン化抗多価抗体でのインキュベーションにより検出し、次いでホースラディッシュ・ペルオキシダーゼに結合したビオチン―ストレプトアビジン及びＤＡＢ（３、３’―ジアミノベンジジン）基質（ＬＡＢ  Ｖｉｓｉｏｎ（商標）Ｕｌｔｒａ−Ｖｉｓｉｏｎ（商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）での反応を介して検出した。スライドを標準的な手順に従ってヘマトキシリン２５％で対比染色した。ビヒクル処置した動物又はシタロプラム処置した動物の、橋核（ＰＮ）におけるＡＴＸＮ３陽性封入体、橋被蓋網様核（ＲｔＴｇ）におけるＡＴＸＮ３陽性封入体、顔面運動核（７Ｎ）におけるＡＴＸＮ３陽性封入体、及び側索核（ＬＲｔ）におけるＡＴＸＮ３陽性封入体；並びに黒質における染色されたアストロサイト（ＧＦＡＰ陽性）（各条件につきｎ＝４ 、動物１匹につき４スライド）を、総面積について、前述のように、オリンパスＢＸ５１立体顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、日本）及びＶｉｓｉｏｐｈａｒｍａインテグレータシステムソフトウェア（Ｖｉｓｏｐｈａｒｍ、デンマーク）を用いて定量化し、正規化した。
【００４３】
＜統計解析＞
変数が非連続的であった場合、又は連続的変数が正規分布（コルモゴロフ―スミルノフ検定、Ｐ＜０．０５）を提示しなかった場合に、データをノン・パラメトリック・マン・ホイットニーのＵ検定を介して分析した。正規分布及び等分散である連続変数（ルビーン検定）は、事後比較のためにテューキー検定又はボンフェローニ検定を用いて、断続的多重比較のためにＡＮＯＶＡを繰り返し測定し、また、一対比較のために一方向ＡＮＯＶＡの測定又はスチューデントのｔ検定を行って分析した。これら後者の２つの仮定を想定していなかった場合、適切なデータ変換（例えば、対数的変換）を適用し、そしてデータを再分析した（体重、平均台歩行試験及び運動水泳試験）。対数データ変換が分散の不均一性を減少させなかった場合（ハンギングワイヤー試験）、いくつかの数学的モデルを適用した。この試験においては、ベストフィットモデルは、対数的モデルであり、処置の差をＣＭＶＭＪＤ１３５群のアールスクエアに従って、通常の残留分布で分析した。Ｃ．エレガンス生存アッセイの統計的分析は、ログランク（マンテル―コックス）検定を用いて行った。全ての統計分析はＳＰＳＳ２０．０／２２．０（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ、シカゴ、イリノイ州）及びＧ−Ｐｏｗｅｒ  ３．１．９．２（キール大学、ドイツ）を用いて行った。Ｐ＜０．０５の有意性の臨界値は、試験全体を通して使用された。
【００４４】
明らかなことではあるが、本願発明は本願明細書にて説明した実施形態に何ら限定されるものではなく、当業者であれば、添付の特許請求の範囲にて規定される事柄を参考にして各場面毎の要求を考慮して、本願発明についての様々な変更例や等価物を用いた技術的事項の置換を予見することができる。
【００４５】
上述した実施形態は互いに組み合わせることができる。添付の特許請求の範囲は本発明の好適例をさらに規定する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年11月27日(2017.11.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マチャド・ジョセフ病、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、脊髄小脳失調症１型、脊髄小脳失調症２型、脊髄小脳変性症６型、脊髄小脳失調症７型、脊髄小脳失調症１７型、及びパーキンソン病の処置に使用するためのシタロプラム又はエスシタロプラム、又は薬学的に許容される塩。
【請求項２】
ポリグルタミン病がタンパク質のミスフォールディング及び／又は凝集の制御によって積極的に影響を受ける、ポリグルタミン病の処置に使用するための請求項１に記載のシタロプラム又はエスシタロプラム。
【請求項３】
前記タンパク質のミスフォールディング及び／又は凝集の制御は、影響を受けたタンパク質のポリグルタミンセグメントにおける膨張によって引き起こされるタンパク質凝集の制御である、請求項２に記載のシタロプラム又はエスシタロプラム。
【請求項４】
マチャド・ジョセフ病、又は脊髄小脳失調症３型の処置に使用するための請求項１〜３のいずれか一項に記載のシタロプラム又はエスシタロプラム。
【請求項５】
前記処置は、運動症状、すなわち、平衡性、運動協調性、及び／又は運動能力の欠如を改善するためのものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のシタロプラム又はエスシタロプラム。
【請求項６】
請求項１〜５に記載の神経変性疾患の処置に使用するための処置上有効な量のシタロプラム、エスシタロプラム又はそれらの塩及び薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤又はそれらの混合物を含む医薬組成物。
【請求項７】
経口投与によって請求項１〜５に記載の神経変性疾患の処置に使用するための請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
タンパク質のミスフォールディングの減少及び／又は凝集の減少によって積極的に影響を与えられる神経変性疾患を有する人への連日投与量であって、当該投与量が４０ｍｇ未満／日である用量を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
投与量は２０ｍｇ〜４０ｍｇ／日である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
投与量は３０ｍｇ〜３８ｍｇ／日である、請求項８に記載の組成物。
【国際調査報告】
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