(57)【要約】  第XII因子の遺伝子発現を阻害するための組成物と方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第XII因子（Ｆ１２）遺伝子の発現を阻害することができるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）トリガーであって、該ＲＮＡｉトリガーがセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、該アンチセンス鎖が表１及び表２のアンチセンス配列のいずれかを含む、上記トリガー。
【請求項２】
前記ＲＮＡｉトリガーが少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のＲＮＡｉトリガー。
【請求項３】
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、２’，３’−セコヌクレオチド模倣物、ロックされたヌクレオチド、２’−Ｆ−アラビノヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、脱塩基リボース、リビトール、反転ヌクレオチド、反転脱塩基ヌクレオチド、反転２’−ＯＭｅヌクレオチド、反転２’−デオキシヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオシド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ビニルホスホネートデオキシリボヌクレオチド、及び３’−ＯＭｅヌクレオチドからなる群より選択される、請求項２に記載のＲＮＡｉトリガー。
【請求項４】
前記センス鎖が、３’末端から１１、１２、及び／又は１３位に１、２、又は３個の２’−Ｆヌクレオチドを含む、請求項１に記載のＲＮＡｉトリガー。
【請求項５】
前記アンチセンス鎖が、５’末端から２位に２’−Ｆヌクレオチドを含む、請求項１に記載のＲＮＡｉトリガー。
【請求項６】
前記アンチセンス鎖が、５’末端から１４位に２’−Ｆヌクレオチドを含む、請求項１に記載のＲＮＡｉトリガー。
【請求項７】
前記アンチセンス鎖が、５’末端から４、６、８、１０、及び１２位に１、２、３、又は４個の２’−Ｆヌクレオチドを含む、請求項１に記載のＲＮＡｉトリガー。
【請求項８】
前記ＲＮＡｉトリガーが１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉトリガー。
【請求項９】
前記センス鎖が、１つ又は２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉトリガー。
【請求項１０】
前記アンチセンス鎖が、１、２、３、又は４個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉトリガー。
【請求項１１】
前記センス鎖に結合した標的化基をさらに含む、請求項１に記載のＲＮＡｉトリガー。
【請求項１２】
前記標的化基が、コレステロール又はコレステリル誘導体を含む、請求項１１に記載のＲＮＡｉトリガー分子。
【請求項１３】
標的化基がアシアロ糖タンパク質受容体リガンドを含む、請求項１１に記載のＲＮＡｉトリガー。
【請求項１４】
前記アシアロ糖タンパク質受容体リガンドがガラクトースクラスターを含む、請求項１３に記載のＲＮＡｉトリガー。
【請求項１５】
前記ガラクトースクラスターがＮ−アセチル−ガラクトサミン三量体を含む、請求項１４に記載のＲＮＡｉトリガー。
【請求項１６】
前記Ｎ−アセチル−ガラクトサミン三量体が、ＮＡＧ３、ＮＡＧ１３、ＮＡＧ１４、ＮＡＧ１５、ＮＡＧ１６、ＮＡＧ１７、ＮＡＧ１８、ＮＡＧ１９、ＮＡＧ２０、ＮＡＧ２１、ＮＡＧ２３、及びＮＡＧ４からなる群より選択される構造を有する、請求項１５に記載のＲＮＡｉトリガー。ＮＡＧ４。
【請求項１７】
前記ＲＮＡｉトリガーが、ＡＤ０１５２０、ＡＤ０２０２３、ＡＤ００９００、ＡＤ０１００１、ＡＤ０２６３９、ＡＤ０２６４０、ＡＤ０２６４２、ＡＤ０２７０８、ＡＤ０２８０７、ＡＤ０２８２２、ＡＤ０２８６７、又はＡＤ０２８６８を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉトリガー。
【請求項１８】
前記アンチセンス鎖が、配列番号１７７、配列番号１５０、又は配列番号１１のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉトリガー。
【請求項１９】
前記センス鎖が、配列番号３７４又は配列番号３７９のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉトリガー。
【請求項２０】
第XI因子遺伝子の発現を阻害することができるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）トリガー分子［該ＲＮＡｉトリガー分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は表１及び表２のアンチセンス配列のいずれかを含む］と、少なくとも１つの医薬的に許容し得る賦形剤と、を含む組成物。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの医薬的に許容し得る賦形剤が送達ポリマーを含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記送達ポリマーがメリチン様ペプチドを含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
第２の治療又は処置をさらに含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
前記組成物が、キット、容器、パック、ディスペンサー、予め充填されたシリンジ、又はバイアルにパッケージされている、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物が非経口的に投与される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２６】
Ｆ１２遺伝子の発現を阻害することができるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）トリガーの治療有効量を被験体に投与することを含む、該被験体における第XII因子の発現を阻害する方法であって、該ＲＮＡｉトリガーがセンス鎖及びアンチセンスを含み、該アンチセンス鎖が表１及び表２のアンチセンス配列のいずれかを含む、上記方法。
【請求項２７】
遺伝性血管浮腫及び静脈血栓塞栓症を含む血管浮腫の治療方法であって、そのような治療を必要とする患者に請求項１又は１７に記載の組成物を投与することを含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
第XII因子は、主に肝臓で発現され、血液中に見出されるセリンプロテアーゼであり、内因性凝固経路とキニン−カリクレイン系の両方における２重の機能を有する。キニン−カリクレイン系は、炎症、血圧調節、凝固、及び疼痛において役割を果たす。第XII因子（ＦXII、Ｆ１２、又はヘゲマン因子とも呼ばれる）の活性型は、凝固カスケードの第XI因子とキニン−キニノゲン系のプレカリクレインとの両方に結合して切断し、それぞれ活性型ＦXI及びカリクレインを生じる。
【０００２】
Ｆ１２を完全に喪失した患者は出血性障害を示さない。さらに、遺伝子ノックアウトによりＦ１２を欠くマウスは、血栓症から防御される（Renne et al., JEM 2005, 202:271-281）。Ｆ１２枯渇の血栓防御効果は、Ｆ１２阻害抗体で処置されたマウス、ウサギ、及び霊長類においても観察された（Larsson et al., ScienceTransMed, 2014 6:22ra17）。血栓塞栓事象の現在の治療法は、フィブリン形成による傷害関連失血を抑制するのに重要な、凝固経路の下流の酵素を標的とするため、これらの薬剤を用いる治療は生命を脅かす可能性のある出血という欠点を有する。
【０００３】
遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）は、重度の腫脹の再発性エピソードを特徴とする稀な疾患である。腫脹を発症する身体の最も一般的な領域は、四肢、顔、腸管、及び気道である。エピソードは、自発的な場合、又は物理的な外傷又はストレスにより誘発される場合がある。喉頭（気道）浮腫は、窒息により死につながる可能性があるため、生命を脅かす可能性がある。
【０００４】
ＨＡＥ治療選択肢の大半は、Ｃ１ＩＮＨの置換、カリクレインの阻害、又はブラジキニン２受容体によるシグナル伝達のいずれかに注目する、発作時の投与である。現在、唯一の長期的な予防的処置は、Ｃ１ＩＮＨ補充療法である。血栓症（静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）を含む）及び血管浮腫は、それらのそれぞれの経路の過剰なシグナル伝達により生じると考えられるため、Ｆ１２遺伝子発現の阻害は両方のタイプの障害の予防に有用であろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Ｆ１２遺伝子の発現をインビボで阻害するためのＦ１２ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）トリガー及びその組成物が本明細書に記載される。本明細書に記載のＦ１２ＲＮＡｉトリガーは、キニン−カリクレイン及び内因性凝固経路の過剰活性化により引き起こされる疾患（例えば、ＨＡＥ及び血栓症）を治療するために使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書には、第XI１因子（第１２因子又はハーゲマン（Hageman）因子とも呼ばれる）の発現を選択的かつ効率的に低下させることができるＦ１２遺伝子特異的ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）トリガー分子（ＲＮＡｉ因子、ＲＮＡｉトリガー又はトリガーとも呼ばれる）が記載される。記載されたＦ１２ＲＮＡｉトリガーは、特に限定されないが、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、後天性血管浮腫（ＡＡＥ）、ＡＣＥ阻害剤関連血管浮腫、アレルギー性血管浮腫、非ヒスタミン作動性血管浮腫（ＩＮＡＥ）、特発性血管浮腫を含む血管浮腫に関連する疾患の治療的処置、血栓症、静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）、血栓性閉塞性疾患、術中静脈閉塞性疾患予防のための方法で使用することができる。記載されたＦ１２ＲＮＡｉトリガーの使用は、深部静脈血栓症又は肺塞栓症などの静脈閉塞性疾患の治療と予防、及び動脈血栓塞栓症の治療又は予防のための方法をさらに提供する。このような方法は、ヒト又は動物被験体を含む被験体への、本明細書に記載のＦ１２ＲＮＡｉトリガーの投与を含む。
【０００７】
ヒトＦ１２遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉトリガー（Ｆ１２ＲＮＡｉトリガー）が本明細書に記載される。各ＲＮＡｉトリガーは、少なくともセンス鎖とアンチセンス鎖とを含む。センス鎖及びアンチセンス鎖は互いに、部分的に、実質的に、又は完全に相補的であり得る。本明細書に記載のＲＮＡｉトリガーセンス鎖及びアンチセンス鎖の長さは、それぞれ１６〜３０ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施態様において、センス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれは、１７〜２６ヌクレオチドの長さであり得る。センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さでも又は異なる長さでもよい。いくつかの実施態様において、センス鎖及びアンチセンス鎖はいずれも、それぞれ２６ヌクレオチドの長さであり得る。他の実施態様において、センス鎖は長さが約２３ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖は長さが約２１ヌクレオチドである。いくつかの実施態様において、センス鎖及びアンチセンス鎖は１７ヌクレオチドの長さである。本明細書に記載のＲＮＡｉトリガーは、Ｆ１２遺伝子を発現する細胞に送達されると、インビトロ又はインビボでＦ１２遺伝子の発現を阻害する。
【０００８】
本明細書に記載のＦ１２ＲＮＡｉトリガーのセンス鎖は、Ｆ１２ｍＲＮＡ中の配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ｍＲＮＡ中の配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６ヌクレオチドの長さである。本明細書に記載のＦ１２ＲＮＡｉトリガーのアンチセンス鎖は、Ｆ１２ｍＲＮＡ中の配列と少なくとも９０％の相補性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ｍＲＮＡ中の配列と少なくとも９０％の相補性を有するヌクレオチド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２４、２５、又は２６ヌクレオチドの長さである。Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーに使用することができるＦ１２ＲＮＡｉトリガーセンス鎖及びアンチセンス鎖の例を表１〜３に示す。
【０００９】
いくつかの実施態様において、１つ以上のＦ１２ＲＮＡｉトリガーは、当該分野で公知の任意のオリゴヌクレオチド送達技術を用いて標的細胞又は組織に送達される。核酸送達方法には、特に限定されないが、リポソームへの封入、イオントフォレシス、又はヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性微小球、タンパク質性ベクター、又はＤＰＣなどの他のビヒクルへの組み込みが含まれる（例えば、国際公開第２０００／０５３７２２号パンフレット、国際公開第２００８／００２２３０９号パンフレット、国際公開第２０１１／１０４１６９号パンフレット、及び国際公開第２０１２／０８３１８５号パンフレットを参照、これらの各々は参照のため本明細書に組み込まれる）に記載されている。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーは、標的化基に共有結合される。標的化基は、細胞受容体リガンド、例えばガラクトースクラスター（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン三量体からなるガラクトースクラスター、又はコレステロールなどの疎水性基を含む）を含むことができる。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーは、インビボ送達化合物又はビヒクルを備える。送達化合物又はビヒクルは、メリチン様ペプチド（ＭＬＰ）送達ポリマー又はコポリマーのようなポリマーを含むことができる。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーは、送達化合物又はビヒクルに共有結合させることができる。
【００１０】
Ｆ１２ＲＮＡｉトリガー又は１つ以上のＦ１２ＲＮＡｉトリガーを含む医薬組成物は、局所的又は全身的治療が所望されるかどうか、及び治療される領域に応じて、多くの方法で投与することができる。いくつかの実施態様において、投与は、局所的（例えば、経皮パッチによる）、肺投与、例えば粉末又はエアロゾルの吸入又は吹送（ネブライザー、気管内、鼻腔内、表皮及び経皮、経口又は非経口を含む）による。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、又は筋肉内の注射若しくは注入；例えば移植されたデバイスを介して真皮下；又は頭蓋内、例えば、実質内、くも膜下腔内、又は脳室内投与を含む。
【００１１】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と類似又は同等の方法及び材料を、本発明の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料が以下に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照のためその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法、及び実施例は、例示的なものにすぎず、本発明を限定することを意図するものではない。
【００１２】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ａ．２ｍｇ／ｋｇのＲＮＡｉトリガーを２ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーとともに投与後の野生型マウスにおける血清Ｆ１２タンパク質レベル、及びＢ．４ｍｇ／ｋｇのＲＮＡｉトリガーを４ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーとともに投与後の野生型マウスにおける血清Ｆ１２タンパク質レベル、を示すグラフ。ｍＦ１２レベルは１日目及び食塩水対照に対して標準化された。
【図２】１、２、又は４ｍｇ／ｋｇのＦ１２ＲＮＡｉトリガーをＭＬＰ送達ポリマーと１：１ｗｔ／ｗｔで混合して投与後の野生型マウスにおける血清Ｆ１２タンパク質レベルを示すグラフ。ｍＦ１２レベルは１日目及び食塩水対照に対して標準化された。
【図３】１日目に１、３、又は１０ｍｇ／ｋｇのＲＮＡｉトリガーを単回皮下（ＳＱ）投与後の野生型マウスにおける血清Ｆ１２タンパク質レベルを示すグラフ。ｍＦ１２レベルは１日目及び食塩水対照に対して標準化された。
【図４】１日目、８日目、及び１５日目に１又は２ｍｇ／ｋｇのＲＮＡｉトリガーをＳＱ投与後の野生型マウスにおける血清Ｆ１２タンパク質レベルを示すグラフ。ｍＦ１２レベルは１日目及び食塩水対照に対して標準化された。
【図５】１日目に、単一の２ｍｇ／ｋｇのＲＮＡｉトリガーをＭＬＰ送達ポリマーと１：１ｗｔ／ｗｔで混合して投与後のカニクイザル（cynomologus monkey）における血清Ｆ１２タンパク質レベルを示すグラフ。ｃＦ１２レベルは１日目に対して標準化された．Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーＡＤ０１００１を黒丸で示し、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーＡＤ０１５２０を灰色四角で示す。標準偏差は、平均の上にグラフ化されたエラーバーとして表示される。
【図６】１日目、２９日目、５７日目、及び８５日目に、２ｍｇ／ｋｇのＲＮＡｉトリガーをＭＬＰ送達ポリマーと１：１で混合して投与後の、カニクイザルにおける血清Ｆ１２タンパク質レベルを示すグラフ．ｃＦ１２レベルは１日目に対して標準化された。Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーＡＤ０１００１は黒丸で示し、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーＡＤ０１５２０は灰色四角で示す。標準偏差は、平均の上にグラフ化されたエラーバーとして表示される。
【図７】１日目、２９日目、５７日目、８５日目、及び１２１日目に、４ｍｇ／ｋｇのＦ１２ＲＮＡｉトリガーＡＤ０１５２０をＭＬＰ送達ポリマーと１：１で混合して投与後の、カニクイザルにおける血清Ｆ１２タンパク質レベルを示すグラフ．ｃＦ１２レベルは１日目に対して標準化された。ｃＦ１２レベルは灰色四角で、ａＰＴＴは黒丸で示す。標準偏差は、平均の上にグラフ化されたエラーバーとして表示される。
【図８】１日目に３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｐｇのＦ１２ＲＮＡｉトリガーＡＤ０２５６２を単回皮下投与後の、カニクイザルにおける血清Ｆ１２タンパク質レベルを示すグラフ。ｃＦ１２レベルは１日目に対して標準化された．３ｍｇ／ｋｇ用量は灰色四角で、１０ｍｇ／ｋｇ用量は黒丸で示す。標準偏差は、平均の上にグラフ化されたエラーバーとして表示される。
【図９】カラゲニン注射の７日前に、食塩水を用いて、又は８ｍｇ／ｋｇのＦ１２ＲＮＡｉトリガーＡＤ０１５２０を８ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーとともに用いて処置したラットにおける、カラゲニン注射後のラット足容積の変化を示すグラフ。Ａ．処置動物対食塩水動物の足容積の変化を示す。Ｂ．処置動物対食塩水動物のノックダウンのレベルを示す。
【図１０】Ａ．塩化第二鉄チャレンジの７日前に、食塩水を用いて、又は８ｍｇ／ｋｇのＦ１２ＲＮＡｉトリガーＡＤ０１５２０を８ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーとともに用いて処置したマウスにおける、塩化第二鉄チャレンジ後の閉塞までの時間。ＲＮＡｉトリガー処置群の全ての動物は、実験期間中に閉塞しなかった（３０分、破線で示す）、Ｂ．食塩水で処置した動物と比較した、ＭＬＰ送達ポリマーとともにＦ１２ＲＮＡｉトリガーＡＤ０１５２０を用いて処置した動物におけるノックダウン、を示すグラフ。
【図１１】Ａ．食塩水を用いて、８ｍｇ／ｋｇのＦ７標的化ＲＮＡｉトリガーを８ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーとともに用いて、又は８ｍｇ／ｋｇのＦ１２ＲＮＡｉトリガーＡＤ０１５２０を８ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーとともに用いて、処置したマウスの出血時間、Ｂ．Ｆ１２タンパク質レベル、Ｃ．Ｆ７タンパク質レベル、を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
本明細書に、第XII因子遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉトリガー（本明細書ではＦ１２ＲＮＡｉトリガーと呼ばれる）が記載される。Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーはそれぞれ、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む。センス鎖及びアンチセンス鎖は互いに、部分的に、実質的に、又は完全に相補的である。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のＲＮＡｉトリガーセンス鎖及びアンチセンス鎖は、独立して１６〜３０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のＲＮＡｉトリガーセンス鎖及びアンチセンス鎖の長さは、独立して１７〜２６ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のＲＮＡｉトリガーセンス鎖及びアンチセンス鎖は、独立して１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６ヌクレオチドの長さである。センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さであっても、異なる長さであってもよい。いくつかの実施態様において、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方ともそれぞれ２６ヌクレオチドの長さである。他の実施態様において、センス鎖は約２３ヌクレオチド長さであり、アンチセンス鎖は約２１ヌクレオチドの長さである。他の実施態様において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、独立して１７〜２１ヌクレオチドの長さである。Ｆ１２ＲＮＡｉトリガー分子を形成するのに使用されるヌクレオチド配列の例を表１〜３に示す。
【００１５】
ＲＮＡｉトリガーには、特に限定されないが、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びダイサー基質（米国特許第８，０８４，５９９号、第８，３４９，８０９号、及び第８，５１３，２０７号）が含まれる。本明細書に記載のＲＮＡｉトリガーは、Ｆ１２遺伝子を発現する細胞に送達されると、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の生物学的過程を介して、Ｆ１２遺伝子の発現をインビトロ又はインビボで阻害又はノックダウンする。
【００１６】
Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーは、長さが１６〜２３ヌクレオ塩基のコア配列をそれぞれ含むセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。アンチセンス鎖コア配列は、Ｆ１２ｍＲＮＡ中に存在するヌクレオチド配列（時に、例えば標的配列と呼ばれる）と１００％（完全に）相補的であるか、又は少なくとも９０％（実質的に）相補的である。センス鎖コア配列は、アンチセンス鎖の配列に対して１００％（完全に）相補的であるか又は少なくとも９０％（実質的に）相補的であり、従って、センス鎖コア配列は、Ｆ１２ｍＲＮＡ中に存在するヌクレオチド配列（標的配列）と完全に同一であるか又は少なくとも９０％同一である。センス鎖コア配列は、対応するアンチセンスコア配列と同じ長さであっても又は異なる長さであってもよい。いくつかの実施態様において、アンチセンス鎖コア配列は、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施態様において、センス鎖コア配列は、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３ヌクレオチドの長さである。
【００１７】
Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーセンス鎖及びアンチセンス鎖は、典型的にはアニールして２本鎖を形成する。相補的２本鎖領域内では、センス鎖コア配列は、アンチセンスコア配列に対して少なくとも９０％相補的であるか又は１００％相補的である。いくつかの実施態様において、センス鎖コア配列は、アンチセンス鎖コア配列の対応する１６、１７、１８、１９、２０、又は２１ヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％又は１００％相補的である少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、又は少なくとも２１ヌクレオチド配列を含む（すなわち、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーのセンス鎖コア配列及びアンチセンスコア配列は、少なくとも９０％の塩基対合又は１００％の塩基対合している少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、又は少なくとも２１ヌクレオチドの領域を有する）。
【００１８】
センス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、場合により及び独立して、コア配列の３’末端、５’末端、又は３’末端と５’末端の両方に、追加の１、２、３、４、５、又は６ヌクレオチド（伸長部）を含み得る。アンチセンス鎖のさらなるヌクレオチドは、存在する場合、Ｆ１２ｍＲＮＡ中の対応する配列に相補的であっても相補的でなくてもよい。センス鎖のさらなるヌクレオチドは、存在する場合、Ｆ１２ｍＲＮＡ中の対応する配列と同一であっても同一でなくてもよい。アンチセンス鎖のさらなるヌクレオチドは、存在する場合、対応するセンス鎖のさらなるヌクレオチ（存在する場合）ドに相補的であっても相補的でなくてもよい。
【００１９】
本明細書で使用される伸長部は、センス鎖コア配列及び／又はアンチセンス鎖コア配列の５’末端及び／又は３’末端に１、２、３、４、５、又は６個のヌクレオチドを含む。センス鎖上の伸長ヌクレオチドは、対応するアンチセンス鎖中のコア配列ヌクレオチド又は伸長ヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドに相補的であっても相補的でなくてもよい。逆に、アンチセンス鎖上の伸長ヌクレオチドは、対応するセンス鎖中のコア配列ヌクレオチド又は伸長ヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドに相補的であっても相補的でなくてもよい。いくつかの実施態様において、ＲＮＡｉトリガーのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、３’伸長部及び５’伸長部を含む。いくつかの実施態様において、一方の鎖の３’伸長ヌクレオチドの１つ以上は、他方の鎖の１つ以上の５’伸長ヌクレオチドと塩基対合する。他の実施態様において、一方の鎖の３’伸長ヌクレオチドの１つ以上は、他方の鎖の１つ以上の５’伸長ヌクレオチドと塩基対合しない。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーは、３’伸長部を有するアンチセンス鎖と５’伸長部を有するセンス鎖とを有する。
【００２０】
いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガー分子は、長さが１、２、３、４、５、又は６ヌクレオチドの３’伸長部を有するアンチセンス鎖を含む。他の実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガー分子は、長さが１、２、又は３ヌクレオチドの３’伸長部を有するアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施態様において、アンチセンス鎖伸長ヌクレオチドの１つ以上は、ウラシル又はチミジンヌクレオチド、又は対応するＦ１２ｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、アンチセンス鎖伸長部は、特に限定されないが、ｕＡｕ、ｕＧｕ、ｕｄＴｓｄＴ、ｕｓｄＴｓｄＴ、ＵｆＡｕ、Ａｕａ、Ａｆｓｕｓａ、ＵＡＵ、ｕＡｆｕ、ｕａｕ、ｕｄＡｕ、ｕｓｃｕ、ｕｓｇｕ、ｕｓｃｓｕ、ｃＡｕ、ａＵａ、ａｕａ、ｕ（ｉｎｖｄＡ）ｕ、ｃａｇ、ａｇｕ、ｇｃｇ、ｃａａ、ｕｓａｓｕ、ｕＡＭＴＭ、ｕｓＴＭｓＡＭでもよい（それぞれ５’から３’に記載されており、表記は表２及び表３と同じである）。
【００２１】
いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガー分子は、長さが１、２、３、４、又は５ヌクレオチドの５’伸長部を有するアンチセンス鎖を含む。他の実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガー分子は、長さが１又は２ヌクレオチドの５’伸長部を有するアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施態様において、アンチセンス鎖伸長ヌクレオチドの１つ以上は、ウラシル又はチミジンヌクレオチド、又は対応するＦ１２ｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチドを含む。他の実施態様において、アンチセンス鎖伸長部は、ｄＡ、ｄＴ、ｐｄＴ、ｖｐｄＴ、又はｕを含むか又はこれからなり、ここで、ｄＡ及びｄＴはそれぞれデオキシアデノシン及びデオキシチミジンヌクレオチドを表し、ｐｄＴは５’ホスホネートを有するデオキシチミジンヌクレオチドを表し、ｖｐｄＴはビニルホスホネートデオキシチミジンヌクレオチドを表し、ｕは２’−ＯＭｅ修飾ウラシルヌクレオチドを表す。アンチセンス鎖は、存在する場合、記載された５’アンチセンス鎖伸長部のいずれかと組み合わせて、上記の３’伸長部のいずれかを有することができる。
【００２２】
いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガー分子は、長さが１、２、３、４、又は５ヌクレオチドの３’伸長部を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施態様において、センス鎖伸長ヌクレオチドの１つ以上は、アデノシン、ウラシル、又はチミジンヌクレオチド、ＡＴジヌクレオチド、又はＦ１２ｍＲＮＡ配列中のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。他の実施態様において、３’センス鎖伸長部は、Ａｆ、ｉｎｖｄＡ、ｉｎｖｄＴ、Ａ（ｉｎｖｄＴ）、Ａｆ（ｉｎｖｄＴ）、Ｕ（ｉｎｖｄＴ）、Ｕｆ（ｉｎｖｄＴ）、ＡｆＡｂｕＡｕ、ｄＴｄＴ、又はｄＴｓｄＴからなり、ここで、Ａｆ及びＵｆはそれぞれ２’−フルオロアデノシン及びウラシルヌクレオチドを表し、ｉｎｖｄＡ及びｉｎｖｄＴはそれぞれ３’−３’結合（反転）デオキシアデノシン及びデオキシチミジンヌクレオチドを表し、Ａｂは脱塩基リボースを表し、ｕは２’−ＯＭｅ修飾ウラシルヌクレオチドを表し、ｄＴはデオキシチミジンヌクレオチドを表し、ｓｄＴは５’ホスホロチオエートを有するデオキシチミジンヌクレオチドを表し、Ｕ及びＡはウラシル及びアデノシンリボヌクレオチドを表す。
【００２３】
いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガー分子は、長さが１、２、３、４、５、又は６個のヌクレオチドの５’伸長部を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施態様において、センス鎖伸長ヌクレオチドの１つ以上は、ウラシル又はアデノシンヌクレオチド、又はＦ１２ｍＲＮＡ配列中のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、センス鎖５’伸長部は、特に限定されないが、ｕＡｕＡｕｓ、ｕＡｕＡｕ、ＵＡＵＵＡＧｆｓ、ＵｆａＵｆａＡ、ｕａｕａＡ、ＡＵＡＵＵ、ＡｆｕＡｆｕＵ、ａｕａｕＵ、ｕａＵｆａｕ、ｕＡＵＡ（ＵUNA）、ｕａｕａｕ、ｕｄＡｕｄＡｕ、ｕｕＡｇａ、ｕｕＡｕｕ、ｕｕＧＡｕ、ｕｕａｇａ、ｕＡｕｇａ、ａＵａＧａｓ、ｕａｕａｕｓ、ｕＡｕａａｓ、ｕｄＡｕａｕ、ａｄＴａｇａ、ａｕａｇａ、ｕ（ｉｎｖｄＡ）ｕａｕ、ｇａｃａｕ、ｕｇａａｕ、ｇｃｇａｕ、ｕａｕｇａ、ｕｕｇｇａ、ａｕａｇａ（それぞれ５’から３’に記載されており、表記は表２及び表３と同じである）。センス鎖は、３’伸長部及び／又は５’伸長部を有し得る。
【００２４】
非修飾Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーセンス鎖及びアンチセンス鎖配列を表１に示す。各行において、アンチセンス鎖は必ずしも対応する（相補的な）センス鎖と共に示されていないことに留意されたい。Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーを形成する際に、表１に列記した配列のそれぞれの各ヌクレオチドは修飾ヌクレオチドであってもよい。
非修飾Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーのアンチセンス鎖とセンス鎖配列。
【表１−１】
2018509913.tif 000002
【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
2018509913.tif 000013
【００２５】
本明細書に記載のＦ１２ＲＮＡｉトリガーは、アンチセンス鎖をセンス鎖でアニールすることにより形成される。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、表１及び２の配列のいずれかのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、表１及び２の配列のいずれかの、ヌクレオチド１〜１７、２〜１７、１〜１８、２〜１８、１〜１９、２〜１９、１〜２０、２〜２０、１〜２１、２〜２１、１〜２２、２〜２２、１〜２３、２〜２３、１〜２４、２〜２４、１〜２５、２〜２５、１〜２６、又は２〜２６の配列を含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーセンス鎖は、表１及び３の配列のいずれかのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーセンス鎖は、表１及び３の配列のいずれかの、ヌクレオチド１〜１７、２〜１７、１〜１８、２〜１８、１〜１９、２〜１９、１〜２０、２〜２０、１〜２１、２〜２１、１〜２２、２〜２２、１〜２３、２〜２３、１〜２４、２〜２４、１〜２５、２〜２５、１〜２６、又は２〜２６の配列を含む。
【００２６】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載のＲＮＡｉトリガーのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ数のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のＲＮＡｉトリガーのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、異なる数のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のＲＮＡｉトリガーのセンス鎖５’末端とアンチセンス鎖３’末端は、平滑末端を形成する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のＲＮＡｉトリガーのセンス鎖３’末端とアンチセンス鎖５’末端は、平滑末端を形成する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のＲＮＡｉトリガーの両端は平滑末端を形成する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のＲＮＡｉトリガーのいずれの末端も平滑末端ではない。本明細書において平滑末端とは、２本のアニールされた鎖の末端ヌクレオチドが相補的である（相補的な塩基対を形成する）２本鎖トリガー分子の末端を指す。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のＲＮＡｉトリガーのセンス鎖５’末端とアンチセンス鎖３’末端は、擦り切れ末端（frayed end）を形成する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のＲＮＡｉトリガーのセンス鎖３’末端とアンチセンス鎖５’末端は、擦り切れ末端を形成する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のＲＮＡｉトリガーの両端は擦り切れ末端を形成する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のＲＮＡｉトリガーのいずれの末端も擦り切れ末端ではない。本明細書中で使用される擦り切れ末端とは、１つの対からの２本のアニールされた鎖の末端ヌクレオチド（すなわち、オーバーハングを形成しない）は相補的ではない（すなわち、非相補対を形成する）２本鎖トリガー分子の末端を指す。本明細書中で使用されるオーバーハングは、２本鎖ＲＮＡｉトリガー分子の１つの鎖の末端における１つ以上の不対ヌクレオチドのストレッチである。不対ヌクレオチドは、センス鎖又はアンチセンス鎖上に存在することができ、３’オーバーハング又は５’オーバーハングのいずれかを形成する。いくつかの実施態様においてＲＮＡｉトリガー分子は、平滑末端と擦り切れ末端、平滑末端と５’オーバーハング末端、平滑末端と３’オーバーハング末端、擦り切れ末端と５’オーバーハング末端、擦り切れ末端と３’オーバーハング末端、２つの５’オーバーハング末端、２つの３’オーバーハング末端、５’オーバーハング末端と３’オーバーハンド末端、２つの擦り切れ末端、又は２つの平滑末端を含む。
【００２７】
いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。ヌクレオシド塩基（又はヌクレオ塩基）は、すべての核酸の構成成分である複素環式ピリミジン化合物又はプリン化合物であり、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）を含む。本明細書で使用される「Ｇ」、「ｇ」、「Ｃ」、「ｃ」、「Ａ」、「ａ」、「Ｕ」、「ｕ」、及び「Ｔ」は、それぞれ一般的に、グアニン、シトシン、アデニン、ウラシル、及びチミジンを塩基として含有するヌクレオ塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、又はヌクレオチド模倣物を意味する。また本明細書で使用される用語「ヌクレオチド」は、修飾ヌクレオチド又はヌクレオチド模倣物、脱塩基部位、又は代用置換部分を含み得る。本明細書で使用される「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ヌクレオチド模倣物、脱塩基部位、又はリボヌクレオチド（２’−ヒドロキシルヌクレオチド）以外の代用置換部分である。いくつかの実施態様において、修飾ヌクレオチドは、２’−修飾ヌクレオチド（すなわち、５員糖環の２’位にヒドロキシル基以外の基を有するヌクレオチド）を含む。修飾ヌクレオチドには、特に限定されないが、２’−修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（本明細書では、ヌクレオチド配列中の小文字「ｎ」として表される）、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド（本明細書ではＮｆとして表され、２’−フルオロヌクレオチドとしても表される）、２’−デオキシヌクレオチド（本明細書ではｄＮとして表される）、２’−メトキシエチル（２’−Ｏ−２−メトキシエチル）ヌクレオチド（本明細書ではＮＭ又は２’−ＭＯＥとして表される）、２’−アミノヌクレオチド。２’−アルキルヌクレオチド、３’−３’結合（反転）ヌクレオチド（ｉｎｖｄＮ、ｉｎｖＮ、ｉｎｖｎ、ｉｎｖＸとして表される）、非天然塩基含有ヌクレオチド、架橋ヌクレオチド、ペプチド核酸、２’，３’−セコヌクレオチド模倣物（ロックされていないヌクレオ塩基類似体、本明細書においてＮUNA又はＮＵＮＡとして表される）、ロックされたヌクレオチド（本明細書においてＮLNA又はＮＬＮＡとして表される）、３’−Ｏ−メトキシ（２’ヌクレオチド結合）ヌクレオチド（本明細書において３’−ＯＭｅｎとして表される）、２’−Ｆ−アラビノヌクレオチド（本明細書においてＮｆＡＮＡ又はＮｆANAとして表される）、モルホリノヌクレオチド、ビニルホスホネートデオキシリボヌクレオチド（本明細書においてｖｐｄＮとして表される）、ビニルホスホネートヌクレオチド、及び脱塩基ヌクレオチド（本明細書においてＸ又はＡｂとして表される）を含む。ある化合物中の全ての位置が一様に修飾される必要はない。逆に、単一のＦ１２ＲＮＡｉトリガー又はその単一ヌクレオチドに２つ以上の修飾を組み込むこともできる。Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーセンス鎖及びアンチセンス鎖は、当技術分野で公知の方法により合成及び／又は修飾することができる。あるヌクレオチドにおける修飾は、別のヌクレオチドの修飾とは無関係である。
【００２８】
修飾されたヌクレオ塩基には、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、並びにＮ−２、Ｎ−６、及び０−６置換プリンなどの合成及び天然ヌクレオ塩基が含み、例えば２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、及び５−プロピニルシトシン、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）  ５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、及びアデニンやグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニンやグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、及び３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンを含む。いくつかの実施態様において、修飾ヌクレオチドの２０％以下は２’−フルオロ修飾ヌクレオチドである。
【００２９】
いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーセンス鎖は、３’末端から１１位に２’−Ｆヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーセンス鎖は、３’末端から１２位に２’−Ｆヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーセンス鎖は、３’末端から１３位に２’−Ｆヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーセンス鎖は、３’末端から１１、１２、及び１３位に少なくとも２つの２’−Ｆヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーセンス鎖は、３’末端から１１位と１２位、１１位と１３位、又は１２位と１３位に２’−Ｆヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーセンス鎖は、３’末端から１１位、１２位、及び１３位に２’−Ｆヌクレオチドを含む。
【００３０】
いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から２位に２’−Ｆヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から１４位に２’−Ｆヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から２位と１４位に２’−Ｆヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーは、センス鎖の３’末端からの１１位、１２位、及び１３位、ならびにアンチセンス鎖の５’末端から２位と１４位に、少なくとも２つの２’−Ｆヌクレオチドを含む。
【００３１】
いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から４位に２’−Ｆヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から６位に２’−Ｆヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から８位に２’−Ｆヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から１０位に２’−Ｆヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から１２位に２’−Ｆヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から４、６、８、１０、及び１２位に少なくとも２つの２’−Ｆヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から４位と６位、４位と８位、４位と１０位、４位と１２位、６位と８位、６位と１０位、６位と１２位、８位と１０位、８位と１２位、又は１０位と１２位に、２’−Ｆヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から４、６、８、１０、及び１２位に３つの２’−Ｆヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から４、６、８、１０、及び１２位に少なくとも４つの２’−Ｆヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から４、６、８、及び１０位、４、６、８、及び１２位、４、６、１０、及び１２位、４、８、１０、及び１２位、又は６、８、１０、及び１２位に、２’−Ｆヌクレオチドを含む。
【００３２】
いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から２位及び／又は１４位に２’−Ｆヌクレオチドを、又は１１、１２、及び１３位に１、２、又は３つの２’−Ｆヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーは、アンチセンス鎖の５’末端から２位及び／又は１４位に２’−Ｆヌクレオチドを、又は１１、１２、及び１３位に１、２、又は３つの２’−Ｆヌクレオチドを、及びセンス鎖の３’末端から１１、１２、及び１３位に少なくとも２つの２’−Ｆヌクレオチドを含む。
【００３３】
いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーの１つ以上のヌクレオチドは、非リン酸含有共有ヌクレオシド間結合により結合される。修飾されたヌクレオシド間結合又は主鎖は、例えばホスホロチオエート、５’−ホスホロチオエート基（本明細書において、ｓＮ、ｓｎ、ｓＮｆ、又はｓｄＮのように、ヌクレオチドの前に小文字「ｓ」で表される）、キラルホスホロチオエート、チオホスフェート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート（３’ーアルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホラミデート（３’−アミノホスホラミデート及びアミノアルキルホスホラミデートを含む）、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、及びヌクレオシド単位の隣接する対が３’−５’から５’−３’又は２’−５’から５’−２’に結合された逆極性を有するものが含まれる。種々の塩、混合塩、及び遊離酸形態も含まれる。いくつかの実施態様において、２’修飾は、修飾されたヌクレオシド間結合と組み合わせることができる。
【００３４】
修飾されたヌクレオシド間結合又は主鎖は、その中（例えば、オリゴヌクレオシド）にリン原子が欠如していてもよく、これは、短鎖アルキル又はシクロアルキル糖間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル又はシクロアルキル糖間結合、又は１つ以上の短鎖ヘテロ原子結合、又は複素環式糖間結合により形成され得る。そのような修飾された結合又は主鎖には、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）を有するもの；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシド、及びスルホン主鎖；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネート及びスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；及びＮ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ2成分が混合された他のものなどがある。
【００３５】
いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーは修飾主鎖を含むことができ、すなわちＦ１２ＲＮＡｉトリガーは２つのヌクレオチド間に非標準的結合を含む。いくつかの実施態様において、修飾された主鎖は、１つ以上のホスホロチオエート結合を含む●。例えば、いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーのセンス鎖は、１、２、３、又は４個のホスホロチオエート結合を含むことができ、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーのアンチセンス鎖は、１、２、３、又は４個のホスホロチオエート結合を含むことができ、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、独立して、１、２、３、又は４個のホスホロチオエート結合を含むことができる。
【００３６】
いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーセンス鎖は、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施態様において、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、センス鎖の３’末端から１〜３位のヌクレオチド間にある。いくつかの実施態様において、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、センス鎖の５’末端から１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、４〜５、又は６〜８位のヌクレオチドの間にある。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、４個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施態様において、４個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、センス鎖の５’末端から１〜３位のヌクレオチド間にあり、及び５’末端から１９〜２１、２０〜２２、２１〜２３、２２〜２４、２３〜２５、又は２４〜２６位のヌクレオチド間にある。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーは、センス鎖に２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を、アンチセンス鎖に４個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
【００３７】
修飾ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖の例を表２に示す。修飾ヌクレオチドを含むセンス鎖の例を表３に示す。表２及び３において、以下の表記は、修飾ヌクレオチド、標的化基、及び結合基を示すために使用される。
Ｎ  ＝  ２’−ＯＨ（非修飾）リボヌクレオチド（ｆ又はｄ指示のない大文字）
ｎ  ＝  ２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド
Ｎｆ  ＝  ２’−フルオロ修飾ヌクレオチド
ｄＮ  ＝  ２’−デオキシヌクレオチド
ＮUNA  ＝  ２’、３’−セコヌクレオチド模倣物（ロックされていないヌクレオ塩基類似体）
ＮLNA  ＝ロックされたヌクレオチド
ＮｆANA  ＝  ２’−Ｆ−アラビノヌクレオチド
ＮＭ  ＝  ２’−メトキシエチルヌクレオチド
Ｘ  ＝  脱塩基リボース
Ｒ  ＝  リビトール
（ｉｎｖｄＮ）＝  反転デオキシリボヌクレオチド（３’−３’結合ヌクレオチド）
（ｉｎｖＸ）＝  反転脱基ヌクレオチド
（ｉｎｖｎ）＝  反転２’−ＯＭｅヌクレオチド
ｓ  ＝  ホスホロチオエート結合ヌクレオチド
ｐ  ＝  リン酸塩
ｖｐｄＮ  ＝  ビニルホスホネートデオキシリボヌクレオチド
（３’ＯＭｅｎ）＝  ３’−ＯＭｅヌクレオチド
【００３８】
以下の標的化基及び結合基は表２と３に列記され、これらの化学構造は更に表４に与えられる：（ＮＡＧ３）、（Ｃ６−ＮＡＧ３）、（Ｃ６−ＰＥＧ４−ＮＡＧ３）、（Ｃ６−Ｃ６−ＮＡＧ３）、（Ｃ６−Ｃ１２−ＮＡＧ３）、（Ｃ１１−ＮＡＧ３）、（Ｃ１１−ｐａｌｍ−ＮＡＧ３）、（Ｃ１１−ＰＥＧ３−ＮＡＧ３）、（ＮＡＧ４）、（ＮＡＧ１３）、（ＮＡＧ１４）、（ＮＡＧ１５）、（ＮＡＧ１６）、（ＮＡＧ１７）、（ＮＡＧ１８）、（ＮＡＧ１９）、（ＮＡＧ２０）、（ＮＡＧ２１）、（ＮＡＧ２３）、（Ｃｈｏｌ−ＴＥＧ）、（ＴＥＧ−Ｃｈｏｌ）、（Ａｌｋ−Ｃ６）、（Ａｌｋ−ＢＣ９−Ｃ６）、（Ａｌｋ−Ｃ６−Ｃ６）、（Ｃ６−Ｃ６−Ａｌｋ）、（Ａｌｋ−Ｃ６−Ｓｅｒ）、（Ｃｅｒ−Ｃ６−Ａｌｋ）、（Ａｌｋ−ＮＨＣＯ−Ｃ６）、（Ａｌｋ−ＮＨＣＯ−ＳＳ−Ｃ６）、（Ａｌｋ−ＰＥＧ４−Ｃ６）、（Ａｌｋ−ＰＥＧ５−Ｃ６）、（Ｃ６−ＰＥＧ５−Ａｌｋ）、（Ａｌｋ−ＰＥＧ１３−Ｃ６）、（Ａｌｋ−ＰＥＧ５−Ｓｅｒ）、（Ａｌｋ−ＰＥＧ１３−Ｓｅｒ）、（Ａｌｋ−ＳＳ−Ｃ６）、（Ｃ６−ＳＳ−Ａｌｋ−Ｍｅ）、（Ｍｅ−Ａｌｋ−ＳＳ−Ｃ６）、（Ｃ６−ＳＭＰＴ−Ａｌｋ）、（ＢＣＮ）、（ＤＢＣＯ−ＴＥＧ）、（Ｃ６−ＮＨ２）、（ＮＨ２−Ｃ６）、（ＮＨ２−Ｃ７）、（ＮＨ２−Ｓｅｒ）、（Ｃ３）、（Ｃ１２）、（Ｃ６−ＳＳ−Ｃ６）、（Ｃｙ５−Ｃ６）、（ノルボルネン−Ｃ６）、（ノルボルネン−Ｓｅｒ）、（ＰＡＺ）、（Ｓｅｒ−ＮＨ２）、（Ｓｐ９）、（Ｓｐｌ８）、（スペルミン）、（ステアリル）、（ＴｅｔＺ−Ｃ６）（ＮＡＧ＝Ｎ−アセチルガラクトサミン）。
修飾されたＦ１２ＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖配列
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
2018509913.tif 000021
【表２−９】
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【表２−１０】
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【表２−１１】
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【表２−１２】
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【表２−１３】
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修飾されたＦ１２ＲＮＡｉトリガーセンス鎖配列
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
2018509913.tif 000030
【表３−５】
2018509913.tif 000031
【表３−６】
2018509913.tif 000032
【表３−７】
2018509913.tif 000033
【表３−８】
2018509913.tif 000034
【表３−９】
2018509913.tif 000035
【表３−１０】
2018509913.tif 000036
【表３−１１】
2018509913.tif 000037
【表３−１２】
2018509913.tif 000038
【表３−１３】
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【表３−１４】
2018509913.tif 000040
【表３−１５】
2018509913.tif 000041
【表３−１６】
2018509913.tif 000042
【００３９】
表１又は３に列記された配列を含むセンス鎖は、表Ｉ又は２に列記された配列を含むいずれかのアンチセンス鎖にハイブリダイズすることができるが、但し、これらの２つの配列は、連続した１６、１７、１８、１９、２０、又は２１のヌクレオチド配列にわたって少なくとも９０％の相補性の領域を有する；代表的な配列は、表２４の２本鎖ＩＤ番号で例示される。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーは、本明細書中に提示される２本鎖ＩＤ番号のいずれかからなる。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーは、本明細書中に提示される２本鎖ＩＤ番号のいずれかを含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーは、本明細書中に提示される２本鎖ＩＤ番号のいずれかのセンス鎖及びアンチセンス鎖ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーは、本明細書中に提示される２本鎖ＩＤ番号のいずれかのセンス鎖及びアンチセンス鎖ヌクレオチド配列、ならびに標的化基及び／又は結合基を含み、ここで標的化基及び／又は結合基はセンス鎖又はアンチセンス鎖に共有結合されている。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーは、本明細書中に提示される２本鎖ＩＤ番号のいずれかのセンス鎖及びアンチセンス鎖修飾ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーは、本明細書中に提示された２本鎖ＩＤ番号のいずれかのセンス鎖及びアンチセンス鎖修飾ヌクレオチド配列、標的化基及び／又は結合基を含み、ここで標的化基及び／又は結合基はセンス鎖又はアンチセンス鎖に共有結合されている。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーは、２本鎖ＩＤ番号ＡＤ００９００、ＡＤ０１００１、ＡＤ０１５２０、ＡＤ０２６３９、ＡＤ０２６４０、ＡＤ０２０２３、ＡＤ０２６４２、ＡＤ０２７０８、ＡＤ０２８０７、ＡＤ０２８２２、ＡＤ０２８６７、又はＡＤ０２８６８を含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーは、配列番号１１、配列番号１５０、又は配列番号１７７を含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーは、配列番号３７４又は配列番号３７９を含む。
【００４０】
いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーは、標的化基、結合基、送達ポリマー、及び／又はセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端及び／又は５’末端に共有結合した他の非ヌクレオチド基をさらに含む。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーは、標的化基、結合基、送達ポリマー、又はセンス鎖の３’末端及び／又は５’末端に共有結合した他の非ヌクレオチド基を含むことができる。いくつかの実施態様において、標的化基、結合基、送達ポリマー、又は他の非ヌクレオチド基は、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーセンス鎖の５’末端に結合される。いくつかの実施態様において、標的化基、結合基、及び／又は送達ビヒクルは、リンカー／結合基を介して、直接又は間接にトリガーに結合される。いくつかの実施態様において、標的化基又は送達ビヒクルは、不安定な、切断可能な、又は可逆的な結合若しくはリンカーを介して、トリガーに結合される。標的化基及び結合基の例を表４に示す。表４は、５’末端又は３’末端に結合された標的化基又は結合基を有するＦ１２ＲＮＡｉトリガーセンス鎖のいくつかの実施態様を提供する。
【００４１】
標的化基は、ＲＮＡｉトリガー又はこれが結合した結合体の薬物動態又は生体内分布特性を高めて、結合体の細胞特異的又は組織特異的取り込みを改善することができる。いくつかの例において、細胞又は細胞受容体への標的化基の結合が、エンドサイトーシスを開始し得る。標的化基は１価、２価、３価、４価。又はより高い結合価を有することができる。代表的な標的化基には、特に限定されないが、細胞表面分子に対する親和性を有する化合物、細胞受容体リガンド、ハプテン、抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、及び細胞表面分子に対する親和性を有する抗体模倣物が含まれる。例えば、薬物及び遺伝子を細胞及び特定の細胞受容体に標的化するために種々のリガンドを使用することができ、これらには、特に限定されないが、炭水化物、グリカン、糖［特に限定されないが、ガラクトース、ガラクトース誘導体（例えば、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン）、マンノース及びマンノース誘導体、ビタミン、葉酸、ビオチン、アプタマー、及びペプチド（特に限定されないが、ＲＧＤ含有ペプチド、インスリン、ＥＧＦ、及びトランスフェリンを含む）を含む。いくつかの実施態様において、標的化基は、ＰＥＧリンカー又は１つ、２つ、又は３つの脱塩基基及び／又はリビトール基などのリンカーを使用して、ＲＮＡｉトリガーに結合され得る。
【００４２】
いくつかの実施態様において、３’又は５’標的化基又は結合基を含む表３に列記されたＦ１２ＲＮＡｉトリガーのいずれかは、代替的に３’又は５’標的化基又は結合基を含まなくてもよく、又は異なる３’又は５’標的化基又は結合基（特に限定されないが、表４に記載されるもの）を含んでもよい。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーは、コレステロールなどの疎水性基又は標的化基（例えば、ガラクトースクラスター）を含むことができる。
【００４３】
いくつかの実施態様において、標的化基は、疎水性基を含むか又はこれからなることができる。いくつかの実施態様において、疎水性基は、少なくとも２０個の炭素原子を含む。疎水性基は、炭化水素（例えば、炭素原子及び水素原子のみを含む）であり得る。しかし、疎水性を維持する置換又はヘテロ原子、例えばフッ素が許容される。標的化基として有用な疎水性基には、特に限定されないが、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、アラルキニル基、が挙げられ、その各々は、直鎖状、分枝鎖状、又は環状、コレステロール、コレステリル誘導体、ステロール、及びステロイド誘導体でもよい。適切な疎水性基の例には、特に限定されないが、コレステロール、コレステリル誘導体、ジコレステロール、トコフェロール、ジトコフェロール、ジデシル、ジドデシル、ジオクタデシル、ジドデシル、ジオクタデシル、イソプレノイド、及びコレラミドが挙げられる。
【００４４】
いくつかの実施態様において、標的化基は、１つ以上のガラクトース誘導体又はガラクトースクラスターを含むか、又はそれらからなることができる。本明細書本明細書で使用される用語ガラクトース誘導体は、ガラクトースと、アシアロ糖タンパク質受容体に対するガラクトース以上の親和性を有するガラクトース誘導体との両方を含む。ガラクトース誘導体には、特に限定されないが、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−ホルミルガラクトサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−プロピオニル−ガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブタノイル−ガラクトサミン、及びＮ−イソ−ブタノイルガラクトサミンが含まれる（例えば、Iobst, S.T. and Drickamer, K. J.B.C. 1996, 271, 6668）。オリゴヌクレオチド及び他の分子の肝臓へのインビボ標的化に有用なガラクトース誘導体及びガラクトースクラスター又は、当技術分野において周知である（例えば、Baenziger and Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620; Connolly et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 939-945を参照）。
【００４５】
本明細書で使用される場合ガラクトースクラスターは、２〜４個の末端ガラクトース誘導体を有する分子を含む。末端ガラクトース誘導体は、そのＣ−１炭素を介して分子に結合している。いくつかの実施態様においてガラクトースクラスターは、ガラクトース誘導体三量体、３分岐ガラクトース誘導体、３価ガラクトース誘導体である。いくつかの実施態様において、ガラクトースクラスターは、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む。いくつかの実施態様において、ガラクトースクラスターは、３価のＮ−アセチル−ガラクトサミンを含む。
【００４６】
本明細書中で使用されるガラクトース誘導体三量体は、それぞれが中心分岐点に結合された３つのガラクトース誘導体を含む。ガラクトース誘導体は、糖のＣ−１炭素を介して中心分岐点に結合することができる。いくつかの実施態様において、ガラクトース誘導体は、リンカー又はスペーサーを介して分岐点に結合される。いくつかの実施態様において、リンカー又はスペーサーは、ＰＥＧ基などの可撓性親水性スペーサーである（例えば、米国特許第５８８５９６８号；Biessen et al., J. Med. Chem. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546参照）。分岐点は、３つのガラクトース誘導体の結合を可能にし、さらにＲＮＡｉトリガーへの分岐点の付加を可能にする任意の小分子であり得る。分岐点群の例は、ジリジン又はジグルタメートである。ＲＮＡｉトリガーへの分岐点の結合は、リンカー又はスペーサーを介して起こり得る。
【００４７】
いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーをインビボで肝細胞に送達するための医薬組成物が記載される。そのような医薬組成物は、例えばガラクトースクラスターに結合したＦ１２ＲＮＡｉトリガーを含むことができる。いくつかの実施態様において、ガラクトースクラスターはガラクトース誘導体三量体を含み、これは例えばＮ−アセチル−ガラクトサミン三量体でもよい。
【００４８】
いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーは、トリガーに結合した結合基を含む。結合基は、標的化基又は送達ポリマーへのトリガーの共有結合を促進する。結合基は、ＲＮＡｉトリガーセンス鎖又はアンチセンス鎖の３’末端又は５’末端に結合することができる。いくつかの実施態様において、結合基はＲＮＡｉトリガーセンス鎖に結合される。いくつかの実施態様において、結合基はＲＮＡｉトリガーセンス鎖の５’末端又は３’末端に結合される。いくつかの実施態様において、結合基はＲＮＡｉトリガーセンス鎖の５’末端に結合される。結合基の例は、特に限定されないが、Ａｌｋ−ＳＭＰＴ−Ｃ６、Ａｌｋ−ＳＳ−Ｃ６、ＤＢＣＯ−ＴＥＧ、Ｍｅ−Ａｌｋ−ＳＳ−Ｃ６、及びＣ６−ＳＳ−Ａｌｋ−Ｍｅ、反応性基（例えば、１級アミン及びアルキン）、アルキル基、脱塩基リボース、リビトール、及び／又はＰＥＧ基を含むか又はこれらからなる。
【００４９】
リンカー又は結合基は、１つの化学基（例えばＲＮＡｉ剤）又は目的のセグメントを別の化学基（例えば標的化基又は送達ポリマー）又は目的のセグメントに、１つ以上の共有結合を介して結合させる２つの原子間の結合である。不安定な結合は不安定な結合を含む。結合は場合により、２つの結合された原子間の距離を増加させるスペーサーを含み得る。スペーサーは、結合に柔軟性及び／又は長さをさらに加えることができる。スペーサーとしては、特に限定されないが、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、及びアラルキニル基が挙げられ、その各々はは、１つ以上のヘテロ原子、複素環、アミノ酸、ヌクレオチド、及び糖類を含むことができる。スペーサー基は当該技術分野において周知であり、前述のリストは本説明の範囲を限定するものではない。
【００５０】
標的化基及び結合基は、特に限定されないが、表４に示される構造により表される化合物を含むか又はそれらからなる。示された標的化基及び結合基構造のいくつかでは、ＲＮＡｉトリガーが示され、トリガー、ＲＮＡ、Ｒ、又はＲ１若しくはＲ２（すなわち、トリガー、ＲＮＡ、又はＲ１若しくはＲ２は、それぞれＲＮＡｉトリガーを含む）により記載される。いくつかの実施態様においてＲＮＡｉトリガーは、標的化基又は結合基に直接結合される。他の実施態様においてＲＮＡｉトリガーは、リンカーを介して標的化基又は結合基に結合される。例えば、（Ａｌｋ−Ｃ６−Ｓｅｒ）、（Ａｌｋ−ＰＥＧ５−Ｓｅｒ）、及び（Ａｌｋ−ＰＥＧ１３−Ｓｅｒ）に関して、Ｒ１及びＲ２の一方はＲＮＡｉトリガーを含み、他方は水素であり得る。リンカー（Ｃ３）、（Ｃ１２）、（Ｓｐ９）、（Ｓｐ１８）、（スペルミン）、（Ｃ６−ＳＳ−Ｃ６）に関して、Ｒ１又はＲ２の一方はＲＮＡｉトリガーを含み、他方は水素、反応性基、標的化基、結合基、アルキル基、又は置換アルキル基であり得る。
ｖｐｄＴ、標的化基、及び結合基を表す構造。
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
2018509913.tif 000048
【表４−７】
2018509913.tif 000049
【表４−８】
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【表４−９】
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【表４−１０】
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【表４−１１】
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【表４−１２】
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【表４−１３】
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【表４−１４】
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【表４−１５】
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【表４−１６】
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【表４−１７】
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【表４−１８】
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【表４−１９】
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【表４−２０】
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【００５１】
いくつかの実施態様において、送達ビヒクルを使用して、ＲＮＡｉトリガーを細胞又は組織に送達することができる。送達ビヒクルは、細胞又は組織へのＲＮＡｉトリガーの送達を改善する化合物である。送達ビヒクルは、特に限定されないが、ポリマー、例えば両親媒性ポリマー、膜活性ポリマー、ペプチド、メリチンペプチド、メリチン様ペプチド、脂質、又は可逆的に修飾されたポリマー又はペプチドを含むか又はこれらからなることができる。
【００５２】
本明細書中で使用される用語「配列」又は「ヌクレオチド配列」は、ヌクレオ塩基又はヌクレオチドの連続又は順序を指し、標準ヌクレオチド命名法及び本明細書に記載の修飾ヌクレオチドのキーを使用する一連の文字で記載される。
【００５３】
別段の指示がない限り、本明細書中で使用される用語「相補的」は、第２のヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖）に関して第１のヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡｉトリガーセンス鎖又はＦ１２ｍＲＮＡ）を記載するために使用される時、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとハイブリダイズし（塩基対水素結合を形成する）、特定の条件下で２本鎖又は２重らせん構造を形成する能力を指す。相補的配列は、ワトソン−クリック塩基対又は非ワトソン−クリック塩基対を含み、それらのハイブリッド形成能力に関する上記要件が満たされる限り、天然又は修飾ヌクレオチド又はヌクレオチド模倣物を含む。「完全に（perfectly）」又は「完全に（fully）相補的」とは、第１のポリヌクレオチドの連続配列中の全て（１００％）の塩基が、第２のポリヌクレオチドの連続配列中の同数の塩基とハイブリッド形成することを意味する。連続配列は、第１又は第２のヌクレオチド配列の全て又は一部を含むことができる。本明細書中で使用される「部分的に相補的」とは、ヌクレオ塩基配列のハイブリダイズした対において、第１のポリヌクレオチドの連続配列中の少なくとも７０％の塩基が、第２のポリヌクレオチドの連続配列中の同じ数の塩基とハイブリダイズすることを意味する。本明細書において使用される「実質的に相補的」とは、ヌクレオ塩基配列のハイブリダイズした対において、第１のポリヌクレオチドの連続配列中の少なくとも８５％の塩基が、第２のポリヌクレオチドの連続配列中の同じ数の塩基とハイブリダイズすることを意味する。本明細書で使用される「相補的」、「完全に相補的」、及び「実質的に相補的」という用語は、ＲＮＡｉトリガーのセンス鎖とアンチセンス鎖との間、又はＲＮＡｉトリガーのアンチセンス鎖とＦ１２ｍＲＮＡの配列との間で一致する塩基について使用し得る。
【００５４】
配列同一性又は相補性は、修飾とは無関係である。例えば、同一性又は相補性を決定する目的のために、ａ及びＡｆはＵ（又はＴ）に相補的であり、Ａと同一である。
【００５５】
いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーを使用して、Ｆ１２の発現を低減又は阻害することにより恩恵を受けるであろう疾患又は障害を有する被験体を治療することができる。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーを使用して、Ｆ１２の発現を低減又は阻害することにより恩恵を受けるであろう被験体の疾患又は障害を治療するための組成物を調製することができる。例えば被験体は、本明細書に記載のＦ１２ＲＮＡｉトリガー又は組成物の任意の１つ以上の治療有効量を投与されることができる。被験体は患者とも呼ばれ、ヒト患者又は動物患者でもよい。記載されたＦ１２ＲＮＡｉトリガーは、疾患の治療的処置のための方法を提供するために使用され得る。そのような方法は、典型的には、被験体への本明細書に記載のＦ１２ＲＮＡｉトリガーの投与を含む。
【００５６】
いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーを使用して、例えば被験体の細胞、細胞群、又は組織におけるＦ１２の発現を阻害することができる。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーを使用して、例えば被験体の細胞、細胞群、又は組織におけるＦ１２の発現を阻害するための組成物を調製することができる。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の１つのタイプの（又は複数の異なるタイプの）Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーの治療有効量（例えば、被験体におけるＦ１２の発現を阻害するのに有効な量）が被験体に投与され、こうして被験体におけるＦ１２の発現が阻害される。
【００５７】
Ｆ１２遺伝子に言及する場合、本明細書中で使用される用語「サイレンス化する」、「低減する」、「阻害する」、「ダウンレギュレートする」、又は「遺伝子発現をノックダウンする」とは、Ｆ１２遺伝子が転写される細胞、細胞群、又は組織中の、遺伝子から転写されるＲＮＡのレベル、又はｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチド、タンパク質、又はタンパク質サブユニットのレベルにより測定される遺伝子の発現が、その細胞、細胞群又は組織群が、記載されたＦ１２ＲＮＡｉトリガーで処理される場合、このように処理されていない第２の細胞、細胞群、又は組織と比較して、又はＦ１２ＲＮＡｉトリガーの投与前の同じ細胞、細胞群、又は組織と比較して、低下していることを意味する。
【００５８】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載のＦ１２ＲＮＡｉトリガーは、Ｆ１２発現の低下又は阻害の恩恵を受けるであろう疾患又は障害を有する被験体を治療するために使用される。Ｆ１２遺伝子発現の低下及び／又は阻害の恩恵を受けるであろう被験体の治療には、治療的及び／又は予防的処置が含まれる。代表的疾患は、血管浮腫に関するものであり、特に限定されないが、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、後天性血管浮腫（ＡＡＥ）、特に限定されないが、ＡＣＥ阻害剤関連血管浮腫、アレルギー性血管浮腫、非ヒスタミン性血管浮腫（ＩＮＡＥ）、特発性血管浮腫、血栓症、静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）、血栓性閉塞性疾患、特に限定されないが深部静脈血栓症又は肺塞栓症などの静脈閉塞性疾患の術中静脈閉塞性疾患予防、治療、及び予防、及び動脈血栓塞栓性疾患の治療又は予防を含む。
【００５９】
いくつかの実施態様において、記載されるＦ１２ＲＮＡｉトリガーの少なくとも１つを含む医薬組成物が企図される。これらの医薬組成物は、細胞、組織、又は生物におけるＦ１２遺伝子の発現の阻害に有用である。いくつかの実施態様において、記載の医薬組成物は、Ｆ１２発現の低下又は阻害の恩恵を受けるであろう疾患又は障害を有する被験体を治療するために使用される。いくつかの実施態様において、記載の医薬組成物は、Ｆ１２発現の低下又は阻害の恩恵を受けるであろう疾患又は障害を発症するリスクのある被験体を治療するために使用される。Ｆ１２発現の低下又は阻害から恩恵を受けるであろう疾患及び／又は障害は、血管浮腫、ＨＡＥ、ＡＡＥ、アレルギー性血管浮腫、ＩＮＡＥ、特発性血管浮腫、血栓症、ＶＴＥ、血栓性閉塞性疾患、静脈閉塞性疾患及び動脈性血栓塞栓性疾患を含むリストから選択することができる。いくつかの実施態様において、被験体は哺乳動物であり、特に限定されないがヒト患者を含む。いくつかの実施態様において、本方法は、本明細書に記載のＦ１２ＲＮＡｉトリガー分子を含む組成物を、治療される哺乳動物に投与することを含む。上記の医薬組成物はまた、１つ以上の医薬的に許容し得る賦形剤（ビヒクル、担体、希釈剤、及び／又は送達ポリマーを含む）を含み得る。
【００６０】
本明細書で使用される「医薬組成物」は、医薬的に有効な量の少なくとも１つのＲＮＡｉトリガー及び１つ以上の医薬的に許容し得る賦形剤を含む。医薬的に許容し得る賦形剤（賦形剤）は、安全性について適切に評価されている活性医薬成分（ＡＰＩ、治療製品、例えばＲＮＡｉトリガー）以外の物質であり、薬物送達システムに意図的に含まれる。賦形剤は、意図する投与量で治療効果を発揮しないか、又は発揮することは意図されていない。賦形剤は、ａ）製造中の薬剤送達システムの加工を支援し、ｂ）ＡＰＩの安定性、バイオアベイラビリティ、又は患者受容性を保護、支持、又は増強し、ｃ）製品識別を補助し、及び／又はｄ）保存又は使用中のＡＰＩの全体的な安全性、有効性、又は送達を増強するように作用する。医薬的に許容し得る賦形剤は、不活性物質であってもなくてもよい。
【００６１】
賦形剤には、特に限定されないが、吸収増強剤、抗付着剤、消泡剤、抗酸化剤、結合剤、緩衝剤、担体、被覆剤、着色剤、色素、送達増強剤、デキストラン、デキストロース、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、増量剤、充填剤、風味剤、流動促進剤、保湿剤、滑沢剤、油、ポリマー、防腐剤、食塩水、塩、溶剤、糖、懸濁剤、徐放性マトリックス、甘味料、増粘剤、等張化剤、ビヒクル、撥水剤、及び湿潤剤が挙げられる。
【００６２】
医薬組成物は、医薬組成物中に通常見出される他の追加の成分を含有することができる。そのような追加の成分には、特に限定されないが、抗掻痒薬、収斂剤、局所麻酔薬、又は抗炎症剤（例えば、抗ヒスタミン薬、ジフェンヒドラミンなど）を含むことができる。本明細書で定義されるＲＮＡｉトリガーを発現するか又は含む細胞、組織、又は単離された器官は、「医薬組成物」として使用され得ることも企図される。本明細書中で使用される「医薬有効量」、「治療有効量」、又は単に「有効量」は、意図される薬理学的、治療的、又は予防的結果を生じるＲＮＡｉトリガーの量を指す。
【００６３】
他の態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーは、血管浮腫、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、後天性血管浮腫（ＡＡＥ）、アレルギー性血管浮腫、非ヒスタミン性血管浮腫（ＩＮＡＥ）、特発性血管浮腫、血栓症、静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）、血栓性閉塞性疾患、静脈閉塞性疾患、及び動脈性血栓塞栓性疾患に関連する臨床的症状を治療、予防、又は管理するのに有用である。上記方法は、そのような治療、予防、又は管理を必要とする被験体に、本明細書に記載の１つ以上のＦ１２ＲＮＡｉトリガーの治療的又は予防的有効量を投与することを含む。いくつかの実施態様において、被験体は、哺乳動物、特に限定されないが、ヒト患者を含む。いくつかの実施態様において本方法は、本明細書に記載のＦ１２ＲＮＡｉトリガー分子を含む組成物を、治療される哺乳動物に投与することを含む。
【００６４】
いくつかの実施態様において、記載されたＦ１２ＲＮＡｉトリガー及びそのようなＦ１２ＲＮＡｉトリガーを使用する方法は、Ｆ１２発現の低下又は阻害の恩恵を受ける疾患又は障害を有する被験体における少なくとも１つの症状を治療又は予防するために使用される。被験体は、記載されたＲＮＡｉトリガーのいずれか１つ以上の治療有効量が投与され、こうして症状が治療される。被験体は、記載されたＲＮＡｉトリガーのいずれか１つ以上の予防有効量を投与され、こうして少なくとも１つの症状が予防される。
【００６５】
いくつかの実施態様において、記載されたＦ１２ＲＮＡｉトリガーが投与される被験体におけるＦ１２の遺伝子発現レベル及び／又はｍＲＮＡレベルは、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーを投与される前の被験体に対して、又はＦ１２ＲＮＡｉトリガーを投与されていない被験体に対して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％低下している。被験体における遺伝子発現レベル及び／又はｍＲＮＡレベルは、被験体の細胞、細胞群、及び／又は組織において低下され得る。いくつかの実施態様において、記載されたＦ１２ＲＮＡｉトリガーが投与された被験体におけるＦ１２のタンパク質レベルは、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーを投与される前の被験体に対して、又はＦ１２ＲＮＡｉトリガーを投与されていない被験体に対して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％低下している。被験体のタンパク質レベルは、被験体の細胞、細胞群、組織、血液、及び／又は他の流体において低下され得る。遺伝子発現、ｍＲＮＡ、又はタンパク質レベルの低下は、当技術分野で公知の任意の方法により評価することができる。Ｆ１２ｍＲＮＡレベル及び／又はタンパク質レベルの低下又は減少は、本明細書では、Ｆ１２の低下若しくは減少、又はＦ１２の発現の阻害又は低下と総称される。
【００６６】
記載されたＦ１２ＲＮＡｉトリガーは、特に限定されないが、第２のＲＮＡｉトリガー又は他のＲＮＡｉ剤、小分子薬剤、抗体、抗体フラグメント、及び／又はワクチンを含む第２の治療薬又は治療を組み合わせることができる。
【００６７】
記載されたＲＮＡｉトリガー及び本明細書中に開示されるＦ１２ＲＮＡｉトリガーを含む医薬組成物は、キット、容器、パック、又はディスペンサー中にパッケージング又は含めることができる。Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーは、予め充填されたシリンジ又はバイアルにパッケージすることができる。
【００６８】
「細胞に導入する」とは、ＲＮＡｉトリガーについて言及する場合、ＲＮＡｉトリガーを細胞に機能的に送達することを意味する。機能的送達とは、ＲＮＡｉトリガーが細胞に送達され、予想される生物学的活性（例えば、遺伝子発現の配列特異的阻害）を有することを意味する。
【００６９】
投与経路は、ＲＮＡｉトリガーが身体に接触する経路である。一般に、被験体の治療のために薬物及び核酸を投与する方法は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載の組成物の投与に適用することができる。本明細書に記載の化合物は、特定の経路に適切に調整された調製物中で、任意の適切な経路を介して投与することができる。従って、本明細書に記載の化合物は、例えば静脈内、筋肉内、皮内、皮下、又は腹腔内注射により投与することができる。
【００７０】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載のＦ１２ＲＮＡｉトリガー分子又は組成物は、当該分野で公知のオリゴヌクレオチド送達技術を用いて、細胞、細胞群、組織、又は被験体に送達することができる。一般に、核酸分子を送達（インビトロ又はインビボで）するために当技術分野で認識されている任意の適切な方法は、本明細書に記載のＦ１２ＲＮＡｉトリガーを使用するように適合させることができる。例えば送達は、局所投与（例えば、直接注射、移植、又は局所投与）、全身投与、又は皮下、静脈内、経口、腹腔内投与、又は頭蓋内（例えば、脳室内、実質内、及び髄腔内）、筋肉内、経皮、気道（エアロゾル）、鼻内、直腸、又は局所（頬及び舌下を含む）投与を含む非経口投与でもよい。ある実施態様において、組成物は、皮下又は静脈内注入又は注射により投与される。
【００７１】
いくつかの実施態様において、ＲＮＡｉトリガーは、当技術分野で利用可能な脂質、ナノ粒子、ポリマー、リポソーム、ミセル、ＤＰＣ、又は他の送達システムと組み合わせることができる。ＲＮＡｉトリガーはまた、化学的に、標的化基、脂質（特に限定されないが、コレステロール及びコレステリル誘導体を含む）、ナノ粒子、ポリマー、リポソーム、ミセル、ＤＰＣ（例えば、国際公開第２０００／０５３７２２号パンフレット、国際公開第２００８／００２２３０９号パンフレット、国際公開第２０１１／１０４１６９号パンフレット、及び国際公開第２０１２／０８３１８５号パンフレットを参照、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）、又は当技術分野で利用可能な他の送達システムに結合することもできる。
【００７２】
いくつかの実施態様において、ＲＮＡｉトリガーは送達ポリマーに結合させることができる。いくつかの実施態様において、送達ポリマーは、可逆的にマスク／修飾された両親媒性膜活性ポリアミンである。
【００７３】
いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガー標的化基結合体は、メリチン様ペプチド（ＭＬＰ）送達ペプチド（例えば、活性な賦形剤）と同時投与することができる。同時投与するとは、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーと送達ペプチドが、被験体中に同時に存在するように、被験体に投与されることを意味する。Ｆ１２ＲＮＡｉトリガー標的化基結合体及び送達ペプチドは、同時に投与されてもよく、又は逐次的に送達されてもよい。同時投与のために、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガー標的化基結合体及び送達ペプチドを、投与前に混合することができる。逐次投与のために、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガー基部分結合体又は送達ペプチドのいずれかを最初に投与することができる。
【００７４】
いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーをインビボで肝細胞に送達するための医薬組成物が記載される。そのような医薬組成物は、ａ）コレステロールなどの少なくとも２０個の炭素原子を含む疎水性基に結合されたＦ１２ＲＮＡｉトリガー（ＲＮＡｉトリガー結合体）、及びｂ）ＭＬＰ送達ポリマーを含むか、又はそれらからなることができる。ＭＬＰ送達ポリマー及びＲＮＡｉトリガー結合体は、別々に合成することができ、別々の容器又は単一の容器で供給することができる。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーは送達ペプチドに結合していない。
【００７５】
本明細書で使用されるメリチン様ペプチド（ＭＬＰ）は、国際公開第２０１２／０８３１８５号パンフレットに記載されているように、天然のハチ毒ペプチドであるメリチン由来の約２３〜約３２アミノ酸を含む小さな両親媒性膜活性ペプチドである。天然に存在するメリチンは２６個のアミノ酸を含み、アミノ末端で主に疎水性であり、カルボキシ末端で主に親水性（カチオン性）である。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のＭＬＰは、生物起源から単離される。他の実施態様において、ＭＬＰは合成品である。ＭＬＰ合成ポリマーは、化学プロセスにより調製又は製造することができる。本明細書中で使用されるＭＬＰは、例えば種：Apis florea、Apis mellifera、Apis cerana、Apis dorsata、Vespula maculifrons、Vespa magnifica、Vespa velutina、Polistes sp. HQL-2001、及びPolistes hebraeus の毒液中に見出され得るメリチンファミリーの天然に存在するハチ毒ペプチドを包含する。本明細書中で使用されるＭＬＰはまた、天然メリチンペプチドと同一又は類似のアミノ酸配列を有する合成ペプチドを包含する。ＭＬＰアミノ酸配列の例は表５に与えられる。いくつかの実施態様において、ＭＬＰは以下を含む：Leu-Ile-Gly-Ala-Ile-Leu-Lys-Val-Leu-Ale-Thr-Gly-Leu-Pro-Thr- Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Asn-Lys-Arg-Lys-Gln（配列番号２２３４）。
ＭＬＰペプチド配列。
【表５−１】
2018509913.tif 000063
【表５−２】
2018509913.tif 000064
ｄＭｅｌ  ＝  Ｄ体アミノ酸を有するメリチンペプチド
Ｎｌｅ  ＝  ノルロイシン
【００７６】
ＭＬＰの膜活性は、可逆的にマスクしてＭＬＰ送達ポリマーを得ることができる。マスキングは、ＭＬＰの第一級アミンにマスキング剤を可逆的に付着させることにより達成することができる。
【００７７】
ＭＬＰ送達ポリマーは、国際公開第２０１２／０８３１８５号パンフレットに記載されるように、ＭＬＰペプチド上の第一級アミンとアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）リガンド含有マスキング剤との反応により可逆的に修飾されたＭＬＰを含むことができる（可逆的修飾は生理学的に不安定な場合がある）。いくつかの実施態様において、マスキング剤は、中性の親水性二置換アルキル無水マレイン酸：
【化１】
2018509913.tif 000065
（ここで、Ｒ１は、非荷電アシアロ糖タンパク質受容体リガンドである）を含む。いくつかの実施態様において、アルキル基はメチル又はエチル基である。置換アルキル無水マレイン酸の例は、２−プロピオン−３−アルキル無水マレイン酸誘導体である。中性の親水性２−プロピオン−３−アルキル無水マレイン酸誘導体は、中性親水性基を２−プロピオン−３−アルキル無水マレイン酸に、２−プロピオン−３−アルキル無水マレイン酸γ−カルボキシル基
【化２】
2018509913.tif 000066
（ここで、Ｒ１は中性のＡＳＧＰｒリガンドを含み、ｎ＝０又は１である）を介して、結合させて形成することができる。いくつかの実施態様において、ＡＳＧＰｒリガンドは、短いＰＥＧリンカーを介して無水物に結合され得る。
【００７８】
ＡＳＧＰｒリガンドは、ＡＳＧＰｒに対する親和性を介して標的化機能を提供する。ＡＳＧＰｒリガンドは、特に限定されないが、ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、及びガラクトース誘導体を含む、ＡＳＧＰｒに親和性を有する糖類を含む。ＡＳＧＰｒに親和性を有するガラクトース誘導体は当該技術分野において周知である。
【００７９】
いくつかの実施態様において、
Ｎ−Ｔ  及び  ＭＬＰ−（Ｌ−Ｍ）X、
（ここで、ＮはＦ１２ＲＮＡｉトリガーであり、Ｔはコレステロールなどの２０以上の炭素原子を有する疎水性基を含み、ＭＬＰはメリチン様ペプチドであり、Ｍは、生理学的に不安定な可逆的マレイミド結合Ｌを介してＭＬＰに共有結合したＡＳＧＰｒリガンドを含み、ｘは１より大きい整数である）を含む組成物が記載される。より具体的には、ｘの値は、母集団ＭＬＰ上の第１級アミンの数の８０％より大きく、９０％より大きく、又は９５％より大きい。本明細書で使用されるＭＬＰ−（Ｌ−Ｍ）xは、ＭＬＰ送達ポリマー（例えば賦形剤）と呼ぶことができる。いくつかの実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガー−コレステロール結合体及びＭＬＰ送達ポリマーは、同じ容器内で供給することができる。他の実施態様において、Ｆ１２ＲＮＡｉトリガー−コレステロール結合体及びＭＬＰ送達ポリマーは、別々の容器で供給することができる。Ｆ１２ＲＮＡｉトリガー−コレステロール結合体及びＭＬＰ送達ポリマーは、投与前に組み合わせるか、同時投与するか、又は連続して投与することができる。
【００８０】
本明細書に記載のＲＮＡｉトリガーの少なくとも１つを含む細胞、組織、及び非ヒト生物が企図される。細胞、組織、又は非ヒト生物は、当技術分野で利用可能な任意の手段により、ＲＮＡｉトリガーを細胞、組織又は非ヒト生物に送達することにより作製される。いくつかの実施態様において、細胞は、特に限定されないがヒト細胞を含む哺乳動物細胞である。細胞、組織、又は非ヒト生物は、研究に又は研究ツール（例えば、薬物試験又は診断）として有用である。
【００８１】
上記で提供された実施態様及び項目は、以下の非限定的実施例により例示される。
【実施例１】
【００８２】
ＲＮＡｉトリガー合成
Ａ）合成
ＲＮＡｉトリガー分子は、オリゴヌクレオチド合成で使用される固相上のホスホラミダイト技術に従って合成された。スケールに応じて、MerMade96E（Bioautomation）又はMerMadel2（Bioautomation）を使用した。合成は、制御細孔ガラス（CPG、５００Å又は６００Å、Prime Synthesis, Aston, PA, USAから得られる）からなる固体支持体上で行った。すべてのＤＮＡ、２’−修飾ＲＮＡ、及びＵＮＡホスホラミダイトは、Thermo Fisher Scientific (Milwaukee, WI, USA) から購入した。具体的には、以下の２’−Ｏ−メチルホスホラミダイトを使用した：（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ6−（ベジゾイル）−２’−Ｏ−メチル−アデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホラミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシ−トリチル−Ｎ4−（アセチル）−２’−Ｏ−メチル−シチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホラミダイト、（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ2−（イソブチリル）−２’−Ｏ−メチル−グアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホルアミダイト、及び５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホラミダイト。２’−デオキシ−２’−フルオロ−ホスホラミダイトは、２’−Ｏ−メチルＲＮＡアミダイトと同じ保護基を有した。以下のＵＮＡホスホラミダイトを使用した：５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−ベンゾイル−２’，３’−セコ−アデノシン、２’−ベンゾイル−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−アセチル−２’，３’−セコ−シトシン、２’−ベンゾイル−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−イソブチリル−２’，３’−セコ−グアノシン、２’−ベンゾイル−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、及び５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’，３’−セコ−ウリジン、２’−ベンゾイル−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト。全てのアミダイトを無水アセトニトリル（５０ｍＭ）に溶解し、モレキュラーシーブ（３Å）を添加した。オリゴマーの５’末端にＴＥＧ−コレステロールを導入するために、Glen Research  (Sterling, VA, USA) からの１−ジメトキシトリチルオキシ−３−Ｏ−（Ｎ−コレステリル−３−アミノプロピル）−トリエチレングリコール−グリセリル−２−Ｏ−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイトを使用した。５’修飾は、合成サイクルの改変なしに導入された。活性化剤溶液として５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＢＴＴ、アセトニトリル中２５０ｍＭ）を使用した。カップリング時間は１０分（ＲＮＡ）、１８０秒（コレステロール）、９０秒（２’ＯＭｅ及びＵＮＡ）、及び６０秒（２’Ｆ及びＤＮＡ）であった。ホスホロチオエート結合を導入するために、無水アセトニトリル中の３−フェニル１，２，４−ジチアゾリン−５−オ��（ＰＯＳ、Poly Org, Inc., Leominster, MA, USAから入手した）の１００ｍＭ溶液を使用した。具体的な順序については、表１〜３を参照されたい。
【００８３】
Ｂ．支持体に結合したオリゴマーの切断と脱保護
固相合成の終了後、乾燥した固体支持体を、水中の４０ｗｔ％メチルアミンと２８％水酸化アンモニウム溶液（Aldrich）の１：１容量溶液で３０℃で２時間処理した。溶液を蒸発させ、固体残渣を水で復元した（下記参照）。
【００８４】
Ｃ．精製
コレステロール含有粗オリゴマーを、Waters XBridge BEH300 C4 5u Prepカラム及びShimadzu LC-8システムを使用する逆相ＨＰＬＣにより精製した。緩衝液Ａは１００ｍＭ  ＴＥＡＡ、ｐＨ７．５であり、５％アセトニトリルを含み、緩衝液Ｂは１００ｍＭ  ＴＥＡＡであり、９５％アセトニトリルを含有した。２６０ｎｍにおけるＵＶトレースを記録した。次に１００ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ６．７及び２０％アセトニトリルのランニングバッファーを用いて、Sephadex G-25媒体を充填したGE Healthcare XK 16/40カラムを使用して、サイズ排除ＨＰＬＣで適切な画分を流した。他の粗オリゴマーを、TKSgel SuperQ-5PW1 3uカラム及びShimadzu LC-8システムを用いる陰イオン交換ＨＰＬＣにより精製した。緩衝液Ａは２０ｍＭのＴｒｉｓ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ９．０であり、２０％のアセトニトリルを含有し、緩衝液Ｂは緩衝液Ａと同じであるが１．５Ｍの塩化ナトリウムを添加した。２６０ｎｍにおけるＵＶトレースを記録した。適切な画分をプールし、次にコレステロール含有オリゴマーについて記載したように、サイズ排除ＨＰＬＣで流した。
【００８５】
Ｄ．アニーリング。
０．２ｘＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水、１ｘ、Corning, Cellgro）中で等モル溶液（センス及びアンチセンス）を組み合わせることにより相補鎖を混合して、ＲＮＡｉトリガーを形成した。この溶液を７０℃のサーモミキサーに入れ、９５℃に加熱し、９５℃で５分間保持し、ゆっくりと室温まで冷却した。一部のＲＮＡｉトリガーを凍結乾燥し、−１５〜−２５℃で保存した。２本鎖濃度は、０．２×ＰＢＳ中で紫外−可視分光計で溶液の吸光度を測定することにより決定した。次に２６０ｎｍでの溶液の吸光度に変換係数及び希釈率を掛けて、２本鎖濃度を決定した。特に断りのない限り、すべての変換係数は０．０３７ｍｇ／（ｍＬ・ｃｍ）であった。いくつかの実験では、変換係数を、実験的に決定された吸光係数から計算した。
【実施例２】
【００８６】
メリチン様ペプチド（ＭＬＰ）送達ポリマー
Ａ）メリチン様ペプチド（ＭＬＰ）合成
すべてのＭＬＰは、当該分野で標準的なペプチド合成技術を用いて作製された。Ｌ型又はＤ型とは無関係に、ＭＬＰ配列は逆転（逆行）することができる。
Ｂ）ＣＤＭ−ＮＡＧ（Ｎ−アセチルガラクトサミン）合成
５０ｍＬの塩化メチレン中のＣＤＭ（３００ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化オキサリル（２ｇ、１０ｗｔ当量）及びジメチルホルムアミド（５μｌ）を添加した。反応を一晩進行させた後、過剰の塩化オキサリル及び塩化メチレンをロータリーエバポレーターで除去して、ＣＤＭ酸塩化物を得た。酸塩化物を１ｍＬの塩化メチレンに溶解した。この溶液に、１０ｍＬの塩化メチレン中の１．１モル当量の（アミノエトキシ）エトキシ−２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（すなわち、アミノビスエトキシルエチルＮＡＧ）及びピリジン（２００μｌ、１．５当量）を加えた。次に溶液を１．５時間撹拌した。次に溶媒を除去し、得られた固体を５ｍＬの水に溶解し、０．１％ＴＦＡ水／アセトニトリル勾配を用いる逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。
【化３】
2018509913.tif 000067
Ｒ１は、中性のＡＳＧＰｒリガンドを含む。いくつかの実施態様において、マスキング剤は非荷電である。
【化４】
2018509913.tif 000068
【００８７】
ｎは１〜１０の整数である。上記したようにＰＥＧスペーサーは、無水物基とＡＳＧＰｒリガンドとの間に配置され得る。いくつかの実施態様において、ＰＥＧスペーサーは、１〜１０個のエチレン単位を含む。あるいは、無水物とＮ−アセチル−ガラクトサミン（ＮＡＧ）との間にアルキルスペーサーを使用してもよい。
【化５】
2018509913.tif 000069
【００８８】
ｎは０〜６の整数である。
【００８９】
無水物とＮ−アセチル−ガラクトサミンとの間に、他のスペーサー又はリンカーを使用することができる。いくつかの実施態様において、スペーサー又はリンカーは、親水性、中性、又は非荷電である。
【００９０】
Ｃ）ＭＬＰ送達ポリマーの形成（すなわち、マスキング）
ＭＬＰをＣＤＭ−ＮＡＧマスキング剤と反応させてＭＬＰ送達ポリマーを得た。ＭＬＰ成分は、最初に水性ヘペス（ナトリウム塩、ＧＭＰ等級、約４３０ｍｇ／ｍＬ）中で８．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度に溶解された。次にＭＬＰ溶液を４℃に冷却し、外観（目に見える粒状物質を含まない澄んだ黄色〜淡黄色の溶液）及びＵＶ分光光度法により濃度をチェックした。ＣＤＭ−ＮＡＧを４℃の水に約７５ｍｇ／ｍＬの最終濃度で溶解した。この溶液を外観（目に見える粒状物質を含まない澄んだ黄色〜淡黄色の溶液）及びＵＶ分光光度法により濃度をチェックした。ＭＬＰ溶液をＣＤＭ−ＮＡＧ溶液と、５：１（ｗ／ｗ）のＣＤＭ−ＮＡＧ対ＭＬＰ比で混合した。ＣＤＭ−ＮＡＧ溶液の添加速度は、攪拌下で約０．３Ｌ／分であった。すべてのＣＤＭ−ＮＡＧ溶液をＭＬＰ溶液に添加した後、混合物を３０分間撹拌した。ＭＬＰ送達ポリマーを安定化するために、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液の添加によりｐＨを９．０±０．２に上昇させた。二置換無水マレイン酸マスキング剤をペプチドと反応させると、
【化６】
2018509913.tif 000070
（ここで、ＲはＭＬＰであり、Ｒ１はＡＳＧＰｒリガンド（例えばＮＡＧ）を含む）で示される構造を有する化合物が得られた。
【００９１】
残りの遊離アミンの比色トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）アッセイを使用して、ＭＬＰがＣＤＭ−ＮＡＧにより十分にマスキングされたことを確認したが、ＭＬＰアミンの総数の１０％未満は非修飾のままであった。
【００９２】
ＭＬＰ送達ポリマーを、１０ｍＭ、ｐＨ９．２の炭酸塩緩衝液に対してダイアフィルトレーションにより精製して、過剰のＣＤＭ−ＮＡＧを除去した。ダイアフィルトレーションプロセスは、マスクされたＭＬＰ反応溶液の１容量当たり約１０容量の炭酸塩緩衝液を交換し、２〜８℃で保持された。
【表６】
2018509913.tif 000071
ａ  −  １つのＭＬＰあたり５つのＣＤＭ−ＮＡＧ部分を有する
【００９３】
ＭＬＰ送達ポリマーを更にデキストランで１０％ｗ／ｖに調製し、２〜８℃で保存した。２２８ｍｇのＭＬＰ送達ポリマー、５００ｍｇの１ｋＤａデキストラン、１．５９ｍｇのＮａ2ＣＯ3、２．９４ｍｇのＮａＨＣＯ３。いくつかの実験では、この溶液を使用前に凍結乾燥した。
【００９４】
Ｄ）注射溶液
ＲＮＡｉトリガーをＭＬＰ送達ポリマーと混合して、注射溶液を作成した。凍結乾燥したＭＬＰ送達ポリマーを水に溶解し、ＲＮＡｉトリガーと混合した。次にその溶液を通常の食塩水で正しい注射濃度に希釈した。
【実施例３】
【００９５】
Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーのインビトロスクリーニング
Ａ）ヒト細胞のバックグランド。
インシリコ（in silico）（コンピューター）分析によりヒト、非ヒト霊長類、及びマウス交差反応性として同定された候補配列を、化学的に修飾された基準ｓｉＲＮＡとしてインビトロでスクリーニングした。インシリコ同定された３２の潜在的なＦ１２ＲＮＡｉトリガーを、基準ｓｉＲＮＡとして合成し、有効性をインビトロでスクリーニングした。スクリーニング目的に、ヒトＦ１２ｃＤＮＡ配列（受け入れ番号ＮＭ＿０００５０５）を合成し、市販のレポーターベースのスクリーニングプラスミドｐｓｉＣＨＥＣＫ２（Promega, Madison, WI）にクローン化した（DNA 2.0, Menlo Park, CA）（これは、ウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼ／Ｆ１２融合ｍＲＮＡを生成した）。ヒトのバックグランドにおけるｓｉＲＮＡの有効性に関して、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ヒト肝細胞癌系）を９６ウェルフォーマットで約１０，０００細胞／ウェルで播種した。３２のＦ１２ｓｉＲＮＡの各々を、１ウェル当たり２５ｎｇのＦ１２−ｐｓｉＣＨＥＣＫ２プラスミドＤＮＡ及び１ウェル当たり０．２μＬのリポフェクタミン２０００を用いて、１ｎＭ及び０．１ｎＭの２つの濃度で同時トランスフェクトした。２重ルシフェラーゼレポーターアッセイ（Promega, Madison, WI）を用いて、ｐｓｉＣＨＥＣＫ２プラスミド上にも存在する、構成的に発現されたホタルルシフェラーゼのレベルに対して標準化されたウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼレベルを測定することにより、遺伝子ノックダウンを決定した。
２重ルシフェラーゼレポーターアッセイにより測定された、ヒトバックグランドにおけるヒト／非ヒト霊長類／マウス交差反応性ＲＮＡｉトリガーの有効性スクリーニング結果
【表７】
2018509913.tif 000072
【００９６】
Ｂ）マウス初代細胞のバックグラウンド
同じ３２のｓｉＲＮＡを、マウスのバックグラウンドでの有効性についてスクリーニングした。マウス初代肝細胞を、９６ウェルプレート（TRL Research, Research Triangle Park, NC）中で凍結保存又はプレプレーティングして得た。ｓｉＲＮＡを、１ｎＭと０．１ｎＭの２つの濃度で４時間、０．６μＬ／ウェルのリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Life Technologies, Grand Island, NY）でトランスフェクトした後、新鮮な培地を供給した。２４時間後、TaqMan 遺伝子発現細胞対CTキット（Life Technologies）を用いて、遺伝子発現解析のために細胞を溶解した。マウス特異的TaqMan遺伝子発現アッセイ（Life Technologies）を用いて、内因性対照であるβ−アクチンに対するＦ１２発現をｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。
ｑＲＴ−ＰＣＲ及び比較ＣT分析により測定された、マウスバックグラウンドにおけるヒト／非ヒト霊長類／マウス交差反応性ＲＮＡｉトリガーの有効性スクリーニング結果
【表８】
2018509913.tif 000073
【００９７】
Ｃ）ＥＣ50計算。
６つのＲＮＡｉトリガー候補をさらに評価した。上記Ａ）と同じ細胞及びトランスフェクション条件を用いて１５０ｆＭ〜３ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度で、１０点ＥＣ50曲線を作成した。これらの６つのＦ１２ＲＮＡｉトリガーのそれぞれをさらに修飾し、対応するＵＮＡ含有ＲＮＡｉトリガーとして合成した。すべての修飾ＲＮＡｉトリガーを、３濃度分析（０．０２，０．２、及び２ｎＭ）及び１０点ＥＣ50測定の両方によるインビトロノックダウン分析により試験した。
示されたＲＮＡｉトリガーのヒトバックグラウンドにおいて測定されたＥＣ50値（ｎＭ）
【表９】
2018509913.tif 000074
【００９８】
Ｄ）ヒト／非ヒト霊長類特異的ＲＮＡｉトリガー
インシリコ分析によりヒト及びヒト以外の霊長類に交差反応性であるがマウスでは交差反応性でないとして同定された追加の配列を、ヒトバックグランドにおいてさらにスクリーニングした。上位１２個の配列を、上記の手順を用いてスクリーニングし、全１０個の用量反応曲線及びＥＣ50測定を６個の最も活性なＲＮＡｉトリガーについて実施した。
ヒト／非ヒト霊長類特異的ＲＮＡｉトリガーの有効性スクリーニングとＥＣ50値（ｎＭ）
【表１０】
2018509913.tif 000075
【実施例４】
【００９９】
野生型マウス又はラットにおけるＲＮＡｉトリガーの有効性のインビボ分析
Ａ）投与及び試料採取
インビボでのＦ１２ＲＮＡｉトリガーの有効性を評価するために、野生型マウス又はラットを使用した。ＲＮＡｉトリガーは、静脈内（ＩＶ）又は皮下（ＳＱ）注射のいずれかにより投与した。１日目に、コレステロール標的化ＲＮＡｉトリガーをＭＬＰ送達ポリマーとともにマウス又はラットに投与した。各げっ歯動物に、ＲＮＡｉトリガー＋ＭＬＰ送達ポリマー（ほとんどの場合、１：１ｗ／ｗのＲＮＡｉトリガー：ＭＬＰ送達ポリマー）の用量を含有する２００〜２５０μＬ溶液を、尾静脈に静脈内（ＩＶ）注射した。アルキン含有ＲＮＡｉトリガーを標的化ポリマーと結合させた後に、ＩＶ又はＳＱ注射のいずれかによりマウスに投与した。ガラクトースクラスター含有ＲＮＡｉトリガーをしばしばＳＱ投与したが、ＭＬＰ送達ポリマーと組み合わせて投与することもできた。可能であれば、７日目から１日目までの注射前マウスからベースライン（処置前）試料を採取した。４日目、８日目、及び７１日まで毎週、マウスから注射後の血清試料を採取した。数匹のマウスにおいて、示された日にＲＮＡ単離のために肝臓組織を採取した。
【０１００】
Ｂ）第１２因子の血清タンパク質レベル
発現レベルがベースラインに戻るまで、ｍＦ１２のＥＬＩＳＡ（Molecular Innovations）又は内部で開発されたmF12 alphaLISA（登録商標）（Perkin Elmer）を用いてマウスの血清をアッセイすることにより、血清中のＦ１２タンパク質（ｍＦ１２）レベルを追跡した。ベースライン試料を有する動物については、それぞれの時点での各動物のｍＦ１２レベルを、その動物における処置前の発現レベルで割って、「処置前に対して標準化された」発現の比率を決定した。次に個々の動物についての「処置前の日に対して標準化された」比を、食塩水対照群の全てのマウスの「処置前の日に対して標準化された」の平均比で割ることにより、特定の時点での発現を食塩水対照群に対して標準化した。これにより、対照群の発現に対して標準化された各時点の発現が得られた。ベースライン試料のない試料については、特定の出血日での発現を、同じ日の食塩水対照グループの平均値に対して標準化した。すべての試験について、実験誤差は標準偏差として与えられる。
【実施例５】
【０１０１】
Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーのインビボスクリーニング及びＦ１２ノックダウンの経時変化
野生型マウスに、ＩＶ（送達ポリマーとともにコレステロール結合ＲＮＡｉトリガー）又は皮下（ＳＱ）（ガラクトースクラスター結合ＲＮＡｉトリガー）のいずれかを投与し、ｍＦ１２レベルを上記のように追跡した。試験した各ＲＮＡｉトリガーのｍＦ１２の最大ノックダウン（最下点（nadir））を表１０に示す。最下点は４〜２２日目の間にあった。実験時間にわたるＲＮＡｉトリガー投与後の相対的な血清ｍＦ１２レベルを、試験した選択ＲＮＡｉトリガーについて示す（表１１、１２、１３、１４、１５、及び１６、図１参照）。試験した全てのＲＮＡｉトリガーの投与後に、９８％を超えるＦ１２血清タンパク質レベルの低下が得られ、ＡＤ００９００はノックダウンの最大持続時間を示した（３６日目に＞８７％のノックダウン）。これらの実験において、既知のマウス第ＶＩＩ因子（ｍＦ７）ＲＮＡｉトリガー配列であるＲＤ１０６９４を対照ＲＮＡｉトリガーとして用いた（表１０）。
記載のＦ１２ＲＮＡｉトリガーをＭＬＰ（送達ポリマー）とともに静脈内投与後の、又は記載のＦ１２ＲＮＡｉトリガー（送達ポリマー無し）を皮下投与後のマウスにおける相対的血清Ｆ１２タンパク質レベル。ｍＦ１２レベルを処置前及び食塩水対照に対して標準化した（センス鎖及びアンチセンス鎖ＩＤ番号を有するＦ１２ＲＮＡｉトリガー２本鎖ＩＤ番号）
【表１１−１】
2018509913.tif 000076
【表１１−２】
2018509913.tif 000077
【表１１−３】
2018509913.tif 000078
【表１１−４】
2018509913.tif 000079
【表１１−５】
2018509913.tif 000080
【表１１−６】
2018509913.tif 000081
【表１１−７】
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【表１１−８】
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【表１１−９】
2018509913.tif 000084
【表１１−１０】
2018509913.tif 000085
８ｍｇのＲＮＡｉトリガーを８ｍｇ／ｋｇをＭＬＰ送達ポリマーとともに投与後の野生型マウスにおける血清Ｆ１２タンパク質レベル。ｍＦ１２レベルを処置前及び食塩水対照に対して標準化した。
【表１２】
2018509913.tif 000086
２ｍｇ／ｋｇの基準又はＵＮＡ含有ＲＮＡｉトリガーを２ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーとともに投与後のＣ５７／Ｂ６マウスにおける血清Ｆ１２タンパク質レベル。ｍＦ１２レベルを処置前及び食塩水対照に対して標準化した。
【表１３】
2018509913.tif 000087
０．５ｍｇ／ｋｇの修飾Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーを２ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーとともに投与後のＣ５７／Ｂ６マウスにおける相対的血清Ｆ１２タンパク質レベル。ｍＦ１２レベルを処置前及び食塩水対照に対して標準化した。
【表１４】
2018509913.tif 000088
０．５ｍｇ／ｋｇの修飾Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーを２ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーとともに投与後のＣ５７／Ｂ６マウスにおける相対的血清Ｆ１２タンパク質レベル。ｍＦ１２レベルを処置前及び食塩水対照に対して標準化した。
【表１５】
2018509913.tif 000089
０．５ｍｇ／ｋｇの修飾Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーを２ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーとともに投与後のＣ５７／Ｂ６マウスにおける相対的血清Ｆ１２タンパク質レベル。ｍＦ１２レベルを処置前及び食塩水対照に対して標準化した。
【表１６】
2018509913.tif 000090
０．５ｍｇ／ｋｇの修飾Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーを２ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーとともに投与後のＣ５７／Ｂ６マウスにおける相対的血清Ｆ１２タンパク質レベル。ｍＦ１２レベルを処置前及び食塩水対照に対して標準化した。
【表１７】
2018509913.tif 000091
【実施例６】
【０１０２】
選択されたＦ１２ＲＮＡｉトリガーのインビボ用量応答及びＦ１２ノックダウンの経時変化
選択されたＲＮＡｉトリガーのインビボ活性をさらに性状解析するために、複数の用量レベルの活性を１回の実験で調べた。ＭＬＰ送達ポリマー（ＩＶ）を用いる試験のために、ＲＮＡｉトリガーの投与量及び送達ポリマーの量の両方を調整して、用量比が変化させた。投与及びｍＦ１２レベルを上記のように追跡した。ＲＮＡｉトリガーの投与後の実験の時間にわたる相対的な血清ｍＦ１２レベルが示されている（表１７及び１８、図２及び３参照）。
【実施例７】
【０１０３】
選択されたＦ１２ＲＮＡｉトリガーのインビボ多回投与試験及びＦ１２ノックダウンの経時変化
選択トリガ−を、複数回投与計画を用いて検討するために選択した。最も一般的に使用した投薬計画は、上記のように、週３回の投薬及びｍＦ１２レベルの追跡であった。この複数回投与投与計画は、ＳＱ投与トリガーのために最も頻繁に用いられた。ＲＮＡｉトリガーの投与後の、経時的な相対的血清ｍＦ１２レベルを図４に示す。
０．５、１、又は２ｍｇ／ｋｇのＵＮＡ含有ＲＮＡｉトリガーを２ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーとともに投与後のＣ５７／Ｂ６マウスにおける血清Ｆ１２タンパク質レベル。ｍＦ１２レベルを処置前及び食塩水対照に対して標準化した。
【表１８】
2018509913.tif 000092
２又は４ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ０１００１  ＲＮＡｉトリガーを１、２、４、又は８ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーとともに投与後のマウスにおける相対的血清Ｆ１２タンパク質レベル。Ｆ１２レベルを処置前及び食塩水対照に対して標準化した。
【表１９】
2018509913.tif 000093
【実施例８】
【０１０４】
肝臓Ｆ１２ｍＲＮＡレベル
安楽死の時点で、マウス肝臓の一部又は全部を適量のＴＲＩ試薬ＲＴ（Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH）に移した。全ＲＮＡを、製造業者の推奨プロトコールに従って単離した。簡単に説明すると、ＴＲＩ試薬ＲＴ中の肝臓切片を組織ホモジナイザーで約３０秒間処理した。ホモジネート１ｍＬを４−ブロモアニソール５０μＬに加え、混合し、遠心分離により相を分離した。０．２５〜０．５ｍＬの水相を除去し、イソプロピルアルコールで沈殿させ、遠心分離した。得られたペレットを７５％エタノールで洗浄し、０．３〜０．７ｍＬのヌクレアーゼ不含水に懸濁した。
【０１０５】
高能力ｃＤＮＡ逆転写キット（Life Technologies, Grand Island, NY）を使用して、総ＲＮＡ（約５００ｎｇ）を逆転写した。次にｃＤＮＡを１：５に希釈し、マウス第１２因子についての市販のＦＡＭ標識アッセイ（アッセイＩＤ番号Ｍｍ００４９１３４９＿ｍｌ, Life Technologies）、マウスベータアクチンについてのＶＩＣ標識内因性対照アッセイ（Life Technologies）、及びVeriQuestマスターミックス（Affymetrix, Santa Clara, CA）を用いて、５’エキソヌクレアーゼ化学を使用して、多重ＲＴ−ｑＰＣＲを行った。遺伝子発現データを、相対定量の比較ＣＴ法（Livak and Schmittgen, 2001）を用いて分析した（表１９及び２０）。
基準又はＵＮＡ含有ＲＮＡｉトリガーをＭＬＰ送達ポリマーとともに１：１で投与後のマウスにおける相対的血清Ｆ１２タンパク質レベル。血清Ｆ１２レベルを１日目及び食塩水対照に対して標準化した。
【表２０】
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基準又はＵＮＡ含有ＲＮＡｉトリガーをＭＬＰ送達ポリマーとともに１：１重量／重量で投与後のマウスにおける肝臓ｍＦ１２ｍＲＮＡレベル。Ｆ１２ｍＲＮＡレベルをマウスβ−アクチンｍＲＮＡレベルに対して表す。
【表２１】
2018509913.tif 000095
【実施例９】
【０１０６】
Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーによる処置後のＦ１２低下の薬力学的（ＰＤ）効果の試験  −  ラットにおけるカラゲニン誘発足浮腫（ＣＰＥ）
Ｆ１２レベルの低下がカリクレイン／キニン系に与える影響を試験するために、我々はラットの炎症モデル（ＣＰＥ）に対するＦ１２ＲＮＡｉトリガーによる前処置の作用を試験した。λカラゲニンにより誘導される炎症は、ブラジキニンを含む複数のメディエーターにより誘導される。野生型ラットに、８ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーとともに８ｍｇ／ｋｇのＲＮＡｉトリガー（ＡＤ０１５２０）、又は食塩水のいずれかを単回静脈内投与した。７日後、食塩水又はＲＮＡｉトリガー処置したラットの後肢にカラゲニンを注射し、足容積を６時間にわたって測定した。足の容積の経時変化を図９にプロットする。食塩水処置群とＦ１２ＲＮＡｉトリガー処置群との間の足容積変化の差は統計学的に有意（ｐ＜０．０００１）であり、カリクレイン標的化抗体（Kenniston JA et al., 2014）の処置で見られたものと同様であり、カリクレイン／キニン系を介するシグナル伝達の低下を示した。
【実施例１０】
【０１０７】
Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーよる処置後のＦ１２低下の薬力学的（ＰＤ）効果の試験  −  塩化第二鉄チャレンジ。
Ｆ１２ノックダウンに対する生理学的応答の臨床的に関連する指標は、塩化第二鉄処置により誘発される血栓塞栓症モデルである。塩化第二鉄（ＦｅＣ１３）チャレンジの７日前に上記のように野生型マウスに、コレステロール結合基準ＲＮＡｉトリガーを投与した。ＦｅＣ１３チャレンジの前に、Ｆ１２レベルを測定した。４ｍｇ／ｋｇのＡＤ０１５２０と４ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーとによる処置は、血清中のｍＦ１２タンパク質の９９％超のノックダウンをもたらした。血栓症は、頸動脈（ＣＡ）を塩化第二鉄に曝露することにより誘発され、血流の閉塞までの時間は、フロープローブにより最大３０分まで測定される。ＭＬＰ送達ポリマーとともにＦ１２ＲＮＡｉトリガーで処置した全てのマウスは、実験の期間中に閉塞しなかった（図１０）。
【実施例１１】
【０１０８】
Ｆ１２ＲＮＡｉトリガーによる処置後のＦ１２低下の薬力学的（ＰＤ）効果の検討  −  出血リスク
いくつかの抗凝固療法の潜在的なリスクは、出血事象のリスクの上昇である。第７因子（Ｆ７）は外因性凝固経路の重要な成分として知られているため、第７因子（Ｆ７）標的化ＲＮＡｉトリガーを陽性出血対照として使用した。
【０１０９】
野生型マウスにチャレンジの７日前に、８ｍｇ／ｋｇのＡＤ０１５２０を８ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーとともに、又は８ｍｇ／ｋｇのＦ７トリガーを８ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーとともに、単回ＩＶ投与した。尾静脈の横断切開を行い、凝固までの時間を最大１５分まで追跡した。食塩水とＡＤ０１５２０処置マウスとの間に、出血時間に有意差はなかった（図１１）。
【実施例１２】
【０１１０】
ＭＬＰ送達ポリマーにとともにＦ１２ＲＮＡｉトリガー分子送達後の非ヒト霊長類における第１２因子（Ｆ１２）ノックダウン
ＭＬＰ送達ポリマーとＲＮＡｉトリガーを作製し、上記のように医薬的に許容し得る緩衝液中で混合した。１日目に、２匹のカニクイザル（Macaca fascicularis）霊長類（それぞれ雄で５．０ｋｇ及び８．１５ｋｇ）に、２ｍｇ／ｋｇのＲＮＡｉトリガー（ＡＤ０１００１）及び２ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーを同時注射した。各注射について、ＲＮＡｉトリガー＋ＭＬＰ送達ポリマー（２ｍｇ／ｋｇ）を、２２〜２５ゲージの静脈内カテーテルを用いて伏在静脈に注射した。示された時点（表２１〜２３に示される）で、血液試料を採取し、Ｆ１２レベル、凝固パラメーター、及び毒性マーカーについて分析した。大腿静脈から血液を採取し、霊長類を一晩絶食させた後、全ての血液を採取した。血中尿素窒素（ＢＵＮ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、クレアチニン、及び活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）の血液検査を、自動化学分析装置で行った。Ｆ１２発現レベルがベースラインに戻るまで、ヒトＦ１２についてのＥＬＩＳＡ（Molecular Innovations）を用いてサル由来の血清をアッセイすることにより、血清中のＦ１２タンパク質レベルを追跡した。標準化のために、それぞれの時点での各動物のＦ１２レベルを、その動物（この場合、１日目）における発現の前処理レベルで割って、「１日目に対して標準化された」発現の比を決定した。Ｆ１２ノックダウンの機能的読出しは、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）の延長によりも観察することもできる。処置によるプロトロンビン時間の変化は観察されなかった。
【０１１１】
Ｆ１２の有意なノックダウンが観察され、９２．５％の最大ノックダウンが１５日目に観察された。ａＰＴＴの上昇は両方の動物で観察され、出血前値を超える５０〜５６％の最大の増加が１５日目と２２日目に観察されたが、ａＰＴＴは「正常」値を超えなかった。処置動物で、用量に関連する毒性は観察されなかった。
２ｍｇ／ｋｇのＡＤ０１００１を２ｍｇ／ｋｇをＭＬＰ送達ポリマーとともに投与後のカニクイザル（Macaca fascicularis）霊長類における血清Ｆ１２タンパク質レベル。ｍＦ１２レベルを投与前値に対して標準化した。
【表２２】
2018509913.tif 000096
２ｍｇ／ｋｇのＡＤ０１００１を２ｍｇ／ｋｇをＭＬＰ送達ポリマーとともに投与後のカニクイザル（Macaca fascicularis）霊長類における活性化部分トロンボプラスチン時間（秒）。
【表２３】
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２ｍｇ／ｋｇのＡＤ０１００１を２ｍｇ／ｋｇをＭＬＰ送達ポリマーとともに投与後のカニクイザル（Macaca fascicularis）霊長類における尿素窒素、クレアチニン、アラニントランスアミナーゼ、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのレベル。
【表２４】
2018509913.tif 000098
【実施例１３】
【０１１２】
Ｆ１２ＲＮＡｉトリガー分子送達後の非ヒト霊長類における第１２因子（Ｆ１２）ノックダウン。
ＭＬＰ送達ポリマー及びＲＮＡｉトリガーを作製し、上記したように医薬的に許容し得る緩衝液中で混合した。１日目に、上記のように２匹のカニクイザル（Macaca fascicularis）霊長類に、２ｍｇ／ｋｇのＡＤ０１００１と２ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマー、又は２ｍｇ／ｋｇのＡＤ０１５２０と２ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーを同時注射した。血液試料を採取し、Ｆ１２レベル、凝固パラメーター、及び毒性マーカーについて分析した。大腿静脈から血液を採取し、霊長類を一晩絶食させた後、全ての血液を採取した。血液尿素窒素（ＢＵＮ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、クレアチニン、及び活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）の血液検査を、自動化学分析装置で行った。Ｆ１２発現レベルがベースラインに戻るまで、ヒトＦ１２についてのＥＬＩＳＡ（Molecular Innovations）を用いてサルの血清をアッセイすることにより、血清中のＦ１２タンパク質レベルを追跡した。標準化のために、それぞれの時点での各動物のＦ１２レベルを、その動物における処置前（この場合１日目）の発現レベルで割って、「１日目に対して標準化された」発現の比を決定した。Ｆ１２ノックダウンの機能的読出しは、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）の延長により観察することもできる。処置によるプロトロンビン時間（ＰＴ）の変化は観察されなかった。
【０１１３】
Ｆ１２の有意なノックダウンが観察され、１５日目に平均最大ノックダウンの８９％が観察された（図５）。両方の動物でａＰＴＴの上昇が観察され、１５日目及び２２日目に出血前値を約７０％〜８０％超える最大上昇を示したが、ａＰＴＴは「正常」値を超えなかった。処置された動物において、用量に関連する毒性は観察されなかった。
【実施例１４】
【０１１４】
Ｆ１２ＲＮＡｉトリガー分子送達後の非ヒト霊長類における第１２因子（Ｆ１２）ノックダウン
ＭＬＰ送達ポリマー及びＲＮＡｉトリガーを作製し、上記したように医薬的に許容し得る緩衝液中で混合した。１日目、２９日目、５７日目、８５日目に、２匹のカニクイザル（Macaca fascicularis）霊長類に、２ｍｇ／ｋｇのＡＤ０１００１と２ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマー、又は２ｍｇ／ｋｇのＡＤ０１５２０と２ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーを同時注射した。血液試料を採取し、Ｆ１２レベル、凝固パラメーター、及び毒性マーカーについて分析した。大腿静脈から血液を採取し、霊長類を一晩絶食させた後、全ての血液を採取した。（ＢＵＮ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、クレアチニン、及びプロトロンビン時間（ＰＴ）と活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）の血液検査を自動化学分析装置で行った。Ｆ１２発現レベルがベースラインに戻るまで、ヒトＦ１２についてのＥＬＩＳＡ（Molecular Innovations）を用いてサル由来の血清をアッセイすることにより、血清中のＦ１２タンパク質レベルを追跡した。標準化のために、それぞれの時点での各動物のＦ１２レベルを、その動物における処置前（この場合１日目）の発現レベルで割って、「１日目に対して標準化された」発現の比を決定した。Ｆ１２ノックダウンの機能的読出しは、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）の延長により観察することもできる。処置によるプロトロンビン時間（ＰＴ）の変化は観察されなかった。
【０１１５】
Ｆ１２の有意なノックダウンが観察され、１５日目に平均最大ノックダウンの８５〜９３％が、その後の用量で９５〜９８％の平均最大ノックダウンで観察された（図６）。両方の動物でａＰＴＴの上昇が観察され、Ｆ１２レベルが最下点にある場合に出血前値を超える最大上昇が観察された（図７）。実験の時間にわたって、処置動物において用量に関連する毒性もＰＴの上昇も観察されなかった。
【実施例１５】
【０１１６】
Ｆ１２ＲＮＡｉトリガー分子送達後の非ヒト霊長類における第１２因子（Ｆ１２）ノックダウン
ＲＮＡｉトリガーを作製し、皮下（ＳＱ）注射用に上記したように医薬的に許容し得る緩衝液中で混合した。１日目に、２匹のカニクイザル（Macaca fascicularis）霊長類に３ｍｇ／ｋｇのＡＤ０２５６２又は１０ｍｇ／ｋｇのＡＤ０２５６２を皮下注射した。上記したように、血液試料を採取し、Ｆ１２レベル、凝固パラメーター、及び毒性マーカーについて分析した。
【０１１７】
Ｆ１２のノックダウンが観察され、２２日目〜２９日目、３ｍｇ／ｋｇ用量で６０％、１０ｍｇ／ｋｇ用量で８４％の平均最大ノックダウンが観察された（図８）。実験期間中、処置された動物において、用量に関連する毒性もＰＴの上昇も観察されなかった。
【実施例１６】
【０１１８】
Ｆ１２ＲＮＡｉトリガー２本鎖の例
対応するセンス鎖及びアンチセンス鎖を有する２本鎖ＩＤ番号により同定されたＦ１２ＲＮＡｉトリガー。
【表２５−１】
2018509913.tif 000099
【表２５−２】
2018509913.tif 000100
【表２５−３】
2018509913.tif 000101
【表２５−４】
2018509913.tif 000102
【表２５−５】
2018509913.tif 000103
【０１１９】
他の実施態様：本発明をその詳細な説明と併せて説明したが、前述の説明は例示を意図するものであり、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び変更は、以下の請求項の範囲内である。
【図１】
2018509913.tif 000104
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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