(57)【要約】  本発明は、免疫学、バイオテクノロジー及び医薬に、特に、モノクローナル抗体に基づく抗腫瘍薬剤の分野に関し、腫瘍学的疾患の処置のための医薬で用いられ得る。本発明の目的は、有効かつ安全な汎用的な抗腫瘍剤であってその生成が、有効、迅速かつ容易である抗腫瘍剤を作製することであった。この問題は、ＩｇＧ４アイソタイプの、または抗体半減期を延長するためのＩｇＧフラグメント及びアミノ酸置換を有する、著者らのアミノ酸及びヌクレオチド配列によって算出及び作成される規定の組み合わせによって特徴付けられ、腫瘍疾患の治療のための自己作用性物質として用いられる、シンデカン−１に特異的な提唱されたヒト化モノクローナル抗体によって解決される。ヌクレオチド配列はさらに、Ｎ末端でシグナル分泌配列をコードするフラグメントを含み、哺乳動物細胞中の抗体産生を増大するようにコドン最適化されている。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
シンデカン−１に特異的なモノクローナル抗体であって、重鎖が配列番号１もしくは配列番号９のアミノ酸配列によって特徴付けられ、軽鎖がアミノ酸配列の列番号７によって特徴付けられるか、または重鎖が、配列番号５もしくは配列番号１１のアミノ酸配列によって特徴付けられ、軽鎖は、配列番号３もしくは配列番号７のアミノ酸配列によって特徴付けられ、抗体は、自己作用物質として使用される、モノクローナル抗体。
【請求項２】
シンデカン−１に特異的なモノクローナル抗体のアミノ酸配列の配列番号５、または配列番号７、または配列番号９、または配列番号１１の鎖によって特徴付けられるコードするポリヌクレオチドであって、プロデューサー細胞における発現のためにコドン最適化されているという点で特徴付けられる、ポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドであって、前記プロデューサー細胞からの分泌の際に作製されるＮ末端で分泌性シグナル配列をコードするフラグメントをさらに含み、配列番号６または配列番号８または配列番号１０または配列番号１２によって提示される、哺乳動物細胞中の発現についてコドン最適化されているという点で特徴付けられる、ポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明のある実施形態は、免疫学、バイオテクノロジー及び医薬に、特にモノクローナル抗体に基づく抗腫瘍薬の分野に関するものであり、腫瘍学的疾患の処置のための医薬に使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍学的疾患は、心臓血管疾患後の死因の第２位である［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｈｅａｌｔｈｉｎｆｏ／ＥＮ＿ＷＨＳ２０１２＿Ｆｕｌｌ．ｐｄｆＪ］。さまざまな情報源によれば、過去１０年間に、がんと診断された人の数は１５％増大した。ロシア連邦では、毎年４９万人を超える新規患者が登録され、２５０万人の癌キャリアが、医師の診療を受けており、２９万人を超えるがん罹患者が毎年異なる癌の形で死んでいる。このため、安全で有効かつ手頃な抗腫瘍薬の開発及び創出が必須である。
【０００３】
抗腫瘍薬の１つのタイプとしては、バイオテクノロジーの合成生成物であるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を指す。いくつかの医薬品が現在使用されており、とりわけ、腫瘍細胞の活性に影響を及ぼし、異なる組織の正常細胞の機能に不十分な影響を及ぼすことが立証されている、血管内皮増殖因子に対する上皮成長因子受容体に対するＭＡｂが存在する［非特許文献１］。
【０００４】
世界では、モノクローナル抗体に基づく約１０種の抗腫瘍薬、とりわけ、リツキシマブ（ＣＤ２０受容体に対するＭＡｂ）、トラスツズマブ（ＨＥＲ２ｎｅｕ受容体が標的）、ベバシズマブ（ＶＥＧＦ）、セツキシマブ及びパニツムマブ（ＥＧＦＲ）が現在登録されており、生産されている。現在、表面抗原シンデカン−１（ＣＤ１３８）を標的とする登録医薬品は存在しない。
【０００５】
シンデカン−１タンパク質（ＣＤ１３８）［非特許文献２］は、モノクローナル抗体による抗腫瘍治療の有望な標的であり：この分子が腫瘍細胞の活性に重要な役割を果たしていることが証明されており、様々な組織の正常細胞の機能に不十分な影響であることが明らかである［非特許文献３］。
【０００６】
この分子は、細胞−細胞相互作用、及び細胞−マトリックス相互作用、接着及び移動を提供する。ＣＤ  １３８の過剰発現は、乳癌、結腸癌、胃癌、前立腺癌及び他の上皮悪性腫瘍を含む様々な腫瘍型の細胞の大部分（約９０％）で明らかにされた［非特許文献４］。骨髄性細胞の細胞表面からのシンデカン−１の喪失及び原則として線維性領域における間質でのその蓄積などの現象も記載されている［非特許文献５］。シンデカン−１の欠損の下で骨髄性細胞がＴＲＡＩＬ誘発アポトーシスを受けることが明らかになった［非特許文献６］。シンデカン−１は、機能的に、腫瘍細胞の侵襲的増殖及び転移性傾向と関連している。悪性腫瘍治療に関して、ＣＤ１３８の活性は、既存の療法にほとんど応答しない腫瘍細胞のそのような特性と関連している。
【０００７】
抗体によって認識され得る形態の腫瘍細胞の表面上のＣＤ１３８の局在が明らかにされている［非特許文献７］。さらに、ＣＤ  １３８を抗原として用いたワクチン接種の有効性を明らかにするデータが存在する［非特許文献８］。
【０００８】
シンデカン−１に対するマウス抗体は、現在、Ｂ−Ｂ４（ＩｇＧ１）［非特許文献９］、Ｂ−Ｂ２（ＩｇＧ２ｂ）、ならびにキメラ抗体［非特許文献１０］−ＭＩ１５（ＩｇＧ１κ）−及びそれらのタグとのコンジュゲート［非特許文献１１］において使用される。このような化合物は、研究または診断の目的に用いられ、この抗体は、標的化機能のみを行う［非特許文献１２］。細胞毒性機能は、抗体に殆どコンジュゲートしているエフェクター分子によって行われる［特許文献１、特許文献２、特許文献３］。マウス及びウサギのＭＡｂは、抗体（ＣＨ、ＣＬ）の定常ドメインの違いのために、ヒト免疫系によって外来として認識され、それらに対する免疫応答が誘発される。ヒトにおける使用の目的のために、キメラ抗体が開発されており、これはヒト定常ドメイン（ＣＨ、ＣＬ）及びマウス可変ドメイン（ＶＨ、ＶＬ）を含む。この改変により、ＭＡｂをより安全にすることが可能である。サブクラスＩｇＧ４のＣＤ１３８に対するキメラモノクローナル抗体が知られており［特許文献４］、これは、本発明の著者らのプロトタイプと考えられている。しかしながら、このＭＡｂは、それとコンジュゲートした細胞傷害剤（ＤＭ４）の標的化のみを提供する。
【０００９】
多数の発明が公知であり、ＣＤ１３８に対する抗体が挙げられるが、これらの抗体の構造は示されていない。ヒトＣＤ１３８に対する抗体は、（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ  ＩＩＩ）をコードする少なくとも１つの核酸を発現する細胞、及びヒト抗ＣＤ１３８抗体をコードする少なくとも１つのトランスフェクトされた核酸の使用により得られた、グリコシル化修飾を有することが知られており、そのような抗体のアミノ酸及び／またはヌクレオチド配列は示されていないが、そのような抗体の構造は特徴付けられていない［特許文献５］。抗ＣＤ１３８抗体が、抗Ｔｒｏｐ−２抗体と化学療法剤のコンジュゲート、またはムチンに対する抗体もしくはその抗原結合フラグメントのコンジュゲート及び膵臓がんの処置のための放射性核種と同時投与される［特許文献６］。抗体二重特異性構造の一部として、ＣＤ１３８に結合する抗体、及び抗ＣＤ７４抗体［特許文献７］及びＳＮ３８分子［特許文献８］の抗体（そのフラグメントを含む）のコンジュゲートが公知である［特許文献９］。血漿細胞に結合することができるアンカー領域、及びアンカー領域に結合した特異的血漿細胞抗体に結合する部位を含む組成物も知られており、シンデカン−１に結合することができる抗体は、設計の一部であり得る［特許文献１０］。
【００１０】
ヒト黒色腫細胞上のヒト抗体のインビトロファージディスプレイライブラリー選択（ＥＴＨ−２−Ｇｏｌｄ）及び哺乳動物細胞において得られた遺伝子のその後の発現の結果として産生されたシンデカン−１に対する組換え抗体が現在使用されている（ＯＣ−４６Ｆ２）［非特許文献１３］。この抗体は、実験的ヒト黒色腫モデル（マウス上）において血管成熟及び腫瘍増殖を阻害することが明らかにされている。ヒト卵巣癌モデルにおいて治療的に有効であることも証明されている。
【００１１】
ＯＣ−４６Ｆ２は、短いリンカーペプチドを介して結合した重（ＶＨ）及び軽（ＶＬ−λ）免疫グロブリン鎖の可変断片からなる融合タンパク質である一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を表す。
【００１２】
この化合物は、抗体形成の使用に関連する適切な免疫応答を複雑にする定常抗体フラグメントを含まない。分子の可変断片は、抗原との接合部のみを提供し、これが著者らによって明らかにされた抑制効果を決定する。しかし、この場合には、腫瘍の除去のために、追加の活性化合物及びおそらくコンジュゲートの生成が必要である。
【００１３】
このようにして、ＣＤ  １３８に対する現在記載されているマウス抗体は、その高い免疫原性のためにヒトでの使用に適していない。これらは実験室目的でのみ使用される。キメラＭＡｂは、なんら独立した治療効果を保有せず（標的化剤としてのみ適用され）、また免疫原性であってもよい。特定のＭＡｂに対する患者の個々の反応は、除外すべきではない。さらに、抗体を介して標的化された活性剤またはその分解生成物は、それらの構造、分解能、崩壊期間、及び分解する化合物の特性に起因して、ヒト生物のストレス因子になり得る。シンデカン−１に対する天然のヒトモノクローナル抗体の正確な構造は確立されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２００９０８０８３２号
【特許文献２】国際公開第２００９０８０８３０号
【特許文献３】国際公開第２０１０１２８０８７号
【特許文献４】国際公開第２００９０８０８２９号
【特許文献５】露国特許第２３２１６３０号
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１４／０４４６４０号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２０１４／０５６９１７号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２０１４／０５８０６７号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２０１４／０８６８３２号明細書
【特許文献１０】国際公開第２０１４０３７５１９号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】ジューコフ・エヌ・ヴィ（Ｚｈｕｋｏｖ  Ｎ．Ｖ．）、ツランジン・エス・エー（Ｔｊｕｌａｎｄｉｎ  Ｓ．Ａ．）ターゲティッド・テラピー・イン・ザ・トリートメント・オブ・ソリッド・チューモアズ：プラクティス・コントラディクツ・セオリー／バイオケミストリー（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ：ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｃｏｎｔｒａｄｉｃｔｓ  ｔｈｅｏｒｙ／Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（モスクワ（（Ｍｏｓｃ））．２００８年５月；７３巻（５号）：６０５〜１８頁
【非特許文献２】ウィジデネス・ジェイ（Ｗｉｊｄｅｎｅｓ  Ｊ．）、ドーア・ジェイ・エム（Ｄｏｒｅ  Ｊ．Ｍ．）、クレメント・シー（Ｃｌｅｍｅｎｔ  Ｃ）、バーモット・デスロッチ・シー（Ｖｅｒｍｏｔ−Ｄｅｓｒｏｃｈｅｓ  Ｃ．）（２００３年）。「ＣＤ１３８」。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・レギュレーターズ・アンド・ホメオティクス・エージェント（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｇｕｌｔｏｒｓ  ＆  Ｈｏｍｅｏｓｔｉｃｓ  Ａｇｅｎｔｓ）１６巻（２号）：１５２〜５頁
【非特許文献３】グオ・ピー（Ｇｕｏ  Ｐ．）ら、エクスプレッション・オブ・レグマイン・コリレーツ・ウイズ・プログノーシス・アンド・メタスタシス・イン・ガストリック・カルシノーマ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｅｇｕｍａｉｎ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈａｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）／／ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３年．第８巻第９号．Ｐ．ｅ７３０９０。
【非特許文献４】ルソー（Ｒｏｕｓｓｅａｕ）ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ヌクレアー・メディシン。アンド・モレキュラー・イメージング・リサーチ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１１年、バイエル・ガーナー・アイ・ビー（Ｂａｙｅｒ−Ｇａｒｎｅｒ  Ｉ．Ｂ．）、サンダーソン・アール・ディー（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｒ．Ｄ．）、ドダプカル・エム・ヴィ（Ｄｈｏｄａｐｋａｒ  Ｍ．Ｖ．）ら、シンデカン−１（ＣＤ１３）イムノリアクティビティ・イン・ボーン・マロウ・バイオプシーズ・オブ・マルチプル・ミエローマ（Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１（ＣＤ１３８）ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｂｉｏｐｓｉｅｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ）（シェッド・シンデカン−１・アキュムレーツ・イン・フィブロティック・リージョンズ（ｓｈｅｄ  ｓｙｎｄｅｃａｎ−１  ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｓ  ｉｎ  ｆｉｂｒｏｔｉｃ  ｒｅｇｉｏｎｓ））．モダン・パソロジー（Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）２００１年；１４巻：１０５２〜８頁
【非特許文献５】バイコフ・ヴイ・ヴイ（Ｂａｉｋｏｖ  Ｖ．Ｖ．）ディフィカルティーズ・イン・モルフォロジカル・ダイアグノスティック・オブ・マルチプル・ミエローマ（Ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｉｅｓ  ｉｎ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ）．モスクワ・オンコヘマトロジー（Ｍｏｓｃｏｗ、Ｏｎｃｏｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ）２  ２００７年、１０〜１５頁
【非特許文献６】ウー・ワイ・エイチ（Ｗｕ  Ｙ．Ｈ．）、ヤン・シー・ワイ（Ｙａｎｇ  Ｃ．Ｙ．）、チェン・ダブリュ・エル（Ｃｈｉｅｎ  Ｗ．Ｌ．）、リン・ケー・アイ（Ｌｉｎ  Ｋ．Ｉ．）、レイ・エム・ゼット（Ｌａｉ  Ｍ．Ｚ．）リムーバル・オブ・シンデカン−１・プロモーツ・ＴＲＡＩＬ・インデュースド・アポトーシス・イン・ミエローマ・セルズ（Ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  ｓｙｎｄｅｃａｎ−１  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ＴＲＡＩＬ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）．ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）．２０１２年３月１５日１８８巻（６号）：２９１４〜２１頁．Ｅｐｕｂ  ２０１２年２月３日
【非特許文献７】ウー・ビー（Ｗｕ  Ｂ．）ら、ブラストシスティス・レグマイン・イズ・ローカライズド・オン・ザ・セル・サーフェイス、アンド・スペシフィック・インヒビション・オブ・イッツ・アクティビティ・インプリケーツ・ア・プロサバイバル・ロール・フォー・ザ・エンザイム（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ  ｌｅｇｕｍａｉｎ  ｉｓ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ，ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｍｐｌｉｃａｔｅｓ  ａ  ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍｅ）／／ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．）２０１０年．第２８５巻、第３号．１７９０〜１７９８頁
【非特許文献８】ベー・ジェイ（Ｂａｅ  Ｊ．）、タイ・ワイ・ティ（Ｔａｉ  Ｙ．Ｔ．）、アンダーソン・ケー・シー（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｋ．Ｃ．）、ムンシ・エヌ・シー（Ｍｕｎｓｈｉ  Ｎ．Ｃ．）２０１１年
【非特許文献９】ウィジデネス・ジェイ（Ｗｉｊｄｅｎｅｓ  Ｊ．）、ヴォイジス・ダブリュ・シー（Ｖｏｏｉｊｓ  Ｗ．Ｃ．）、クレメント・シー（Ｃｌｅｍｅｎｔ  Ｃ．）ら、ア・プラズマサイト・セレクティブ・モノクローナル・アンチボディ（Ｂ−Ｂ４）レコグナイゼス・シンデカン−１（Ａ  ｐｌａｓｍａｃｙｔｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂ−Ｂ４）ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ  ｓｙｎｄｅｃａｎ−１）．ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ）１９９６年；９４巻：３１８〜２３頁
【非特許文献１０】バイコフ・ヴィ・ヴィ（Ｂａｉｋｏｖ  Ｖ．Ｖ．）２００７年、コブリギナ・エー・エム（Ｋｏｖｒｉｇｉｎａ  Ａ．Ｍ．）、プロバトヴァ・エヌ・エー（Ｐｒｏｂａｔｏｖａ  Ｎ．Ａ）．ディフェレンシァル・ダイアグノスティックス・オブ・ノン・ホジキンズ・ビー・セルズ・リンフォーマ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｂ−ｃｅｌｌ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）オンコマトロジー（Ｏｎｃｏｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ）．２’２００７年、６頁
【非特許文献１１】クリニカル・トライアルズ・ゴヴ・アイデンティファイアー（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）：ＮＣＴ０１２９６２０４、ガッティ・ヴィ（Ｇａｔｔｅｉ  Ｖ．）、ゴデアス・シー（Ｇｏｄｅａｓ  Ｃ）、デガン・エム（Ｄｅｇａｎ  Ｍ．）、ロッシ・エフ・エム（Ｒｏｓｓｉ  Ｆ．Ｍ．）、アルディヌッシ・ディ（Ａｌｄｉｎｕｃｃｉ  Ｄ．）、ピント・エー（Ｐｉｎｔｏ  Ａ．）キャラクタリゼーション・オブ・アンチ−ＣＤ１８・モノクローナル・アンチボディズ・アズ・ツールズ・フォー・インベスティゲーティング・ザ・モレキュラー・ポリモルフィズム・オブ・シンデカン−１・イン・ヒューマン・リンホーマ・セルズ（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ１３８  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｓ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｓｙｎｄｅｃａｎ−１  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ）．１９９９年１月；１０４巻（１号）：１５２〜６２頁
【非特許文献１２】バイコフ・ヴィ・ヴィ（Ｂａｉｋｏｖ  Ｖ．Ｖ）．２００７年、コブリギナ・エー・エム（Ｋｏｖｒｉｇｉｎａ  Ａ．Ｍ．）、プロバトヴァ・エヌ・エー（Ｐｒｏｂａｔｏｖａ  Ｎ．Ａ．）、２００７年
【非特許文献１３】オレッチア・ピー（Ｏｒｅｃｃｈｉａ  Ｐ）、コンテ・アール（Ｃｏｎｔｅ  Ｒ）、バルザ・イー（Ｂａｌｚａ  Ｅ）、ペトレット・エー（Ｐｅｔｒｅｔｔｏ  Ａ）、マウリ・ピー（Ｍａｕｒｉ  Ｐ）、ミンガリ・エムシー（Ｍｉｎｇａｒｉ  ＭＣ）、カルネモラ・ビー（Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ  Ｂ）．ア・ノベル・ヒューマン・アンチ−シンデカン−１・アンチボディ・インヒビッツ・バスキュラー・マチュレーション・アンド・チューモア・グロウス・イン・メラノーマ（Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ｓｙｎｄｅｃａｎ−１  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ）．２０１３年５月；４９巻（８号）：２０２２−３３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｊｃａ．２０１２．１２．０１９．Ｅｐｕｂ  ２０１３年１月２４日
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
腫瘍の侵襲的増殖及び転移性の特性におけるシンデカン−１の機能的役割を考慮して、シンデカン−１に対するより効率的かつ安全な抗体の生成は、現在重要な課題である。
【００１７】
この課題は、アナログの欠点を持たない本発明によって解決される。
【００１８】
ＣＤ  １３８に特異的な本発明の抗体の適用の技術的結果は少なくとも、ＭＡｂｓのスペクトル拡散にあり、また腫瘍治療において使用されるＣＤ  １３８に対してもあり、これによって類似体に対するイディオクラシー（ｉｄｉｏｃｒａｓｙ）下での処置または弱い耐性が可能になる。
【００１９】
技術的結果は、ＣＤ１３８に対する抗体の有効性の増大である。明らかにされた技術的結果は、著者の提案したＩｇＧ４アイソタイプの抗体によって算出及び作製された使用に起因して独立した抗腫瘍活性を得ることによって達成され、本発明者らによって得られる抗体鎖の記載の配列の特定の組み合わせによって与えられ、同様に抗原に対する親和性増大によって、また本発明の抗体の使用に起因して、また抗体のヒト化に起因して：ヒト抗体フレームワークの使用に起因して与えられ、これによってエピトープ及びパラトープの一致、従って親和性を増大する超可変領域がさらに正確に指摘され得る。
【００２０】
独立した抗腫瘍活性は、高い抗体依存性及び補体依存性の細胞傷害性を媒介するＩｇＧ３鎖のフラグメントがＩｇＧ４抗体の重鎖の定常フラグメントに挿入された結果、本発明の実施形態の１つにおいて達成され、結果として、このような抗体は、ＣＤ１３８への結合時に細胞傷害性効果が増大する。本発明のこの実施形態を使用する場合の上記技術的結果は、また、抗体半減期の増大によっても達成され、この半減期増大は、重鎖の定常部分のＣ末端でアミノ酸置換を導入することによって達成される。これは、より長い効果を達成すること、より低い用量を使用すること、抗体の投与をより少なくすることを可能にし、これはまた、治療コストを低減することを可能にし得る。
【００２１】
本抗体をＣＤ１３８に適用する技術的な結果はまた、抗癌剤の安全性の向上にもつながる。示された技術的結果は、抗体のヒト化に起因する免疫原性を低下させることによって、また活性因子がモノクローナル抗体分子（タンパク質、これは、その後にアミノ酸に分解する）であり、適用される場合、活性因子（非タンパク質化合物）またはその分解生成物の特定の時間内の不明瞭さの結果がなくなり、その結果、ヒト生物に対する抗腫瘍薬のストレス効果の減少が観察されるという事実に起因しても達成される。
【００２２】
この技術的結果はまた、コード配列のコドン最適化に起因する、ならびに軽鎖及び重鎖のＮ末端におけるシグナル分泌配列の挿入に起因する、短時間で哺乳動物細胞における抗体のより高い発現率を得ることによって達成される、価格の低下を可能にする、産物の単純化及び固定における有効性の増大でもある。
【００２３】
本発明の目的は、製造が効率的かつ短時間かつ簡単である、効率的でかつ安全な普遍的な抗癌剤の作製であった。この課題は、腫瘍治療に適切であり、抗原（ＣＤ１３８）に高い親和性を保有し、個々の抗癌活性及び低い免疫原性を有する、ＣＤ１３８に特異的な所与のモノクローナル抗体を用いて解決され、この有効成分はモノクローナル抗体のまさに分子であり、もとはタンパク質であり、これは、哺乳動物細胞において短時間で大量に産生され得る。一実施形態では、この問題は、シンデカン−１に特異的な提案されたモノクローナル抗体が、より高い細胞傷害性及び長い半減期を有するという点で解決される。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
得られた抗体のこれらの特性は、実施例に示された研究結果によって確認され、本発明者らの抗体鎖によって計算され作成された使用によって発現されるその構造、それらの特定の組み合わせ及びコード配列の構造に起因する。
【００２５】
シンデカン−１に特異的な、ＩｇＧ４アイソタイプのモノクローナル抗体が提案され、その重鎖は配列番号１のアミノ酸配列によって特徴付けられ、軽鎖は配列番号７のアミノ酸配列によって特徴付けられるか、または重鎖は、配列番号５のアミノ酸配列によって特徴付けられ、軽鎖は、配列番号３または配列番号７のアミノ酸配列によって特徴付けられ、抗体は、腫瘍疾患の治療のための自己作用性物質として用いられる。また、ＩｇＧ４アイソタイプのシンデカン−１に特異的なモノクローナル抗体が、ＩｇＧ３領域が含まれる重鎖の定常フラグメントならびにＣ末端でのアミノ酸置換において、半減期を増加させることが提唱され、重鎖は配列番号９のアミノ酸配列によって特徴付けられ、軽鎖−カッパ及びアミノ酸配列配列番号７によって特徴付けられるか、または重鎖は配列番号１１のアミノ酸配列によって特徴付けられ、軽鎖（配列番号３または配列番号７）抗体は、腫瘍疾患の治療のための自己作用性物質として使用される。また、配列番号５もしくは配列番号７、または配列番号９もしくは配列番号１１のアミノ酸配列、プロデューサー細胞中の発現のために最適化合物されたコドンによって表されるシンデカン−１モノクローナル抗体に特異的な鎖をコードするポリヌクレオチドも提供される。哺乳動物細胞における発現のために、各ポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化された、プロデューサー細胞からの分泌の際に切断されるＮ末端にシグナル分泌配列をコードするフラグメントをさらに含み、配列番号６または配列番号８または配列番号８または配列番号１０または配列番号１２によって特徴付けられる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１では、カプラン・マイヤー生存曲線が示されている。全ての図で：１−対照、４−パクリタキセル。図１では、Ａ５４９について：２−Ｍａｂ４、３−Ｍａｂ６。
【図２】図２において、群による平均腫瘍増殖、最初の日からの±ＳＥＭを示す。全ての図で：１−対照、４−パクリタキセル。図２では、Ａ５４９について：２−Ｍａｂ４、３−Ｍａｂ６。
【図３】図３では、群平均体重ＢＷ変化を、最初の日からのパーセント±ＳＥＭとして示す。全ての図で：１−対照、４−パクリタキセル。図３では、Ａ５４９について：２−Ｍａｂ４、３−Ｍａｂ６。
【図４】図４では、カプラン・マイヤー生存曲線が示されている。全ての図で：１−対照、４−パクリタキセル。図４では、Ｃｏｌｏ  ２０５について：２−Ｍａｂ２、３−Ｍａｂ３。
【図５】図５において、群による平均腫瘍増殖、最初の日からの±ＳＥＭを示す。全ての図で：１−対照、４−パクリタキセル。図５では、Ｃｏｌｏ  ２０５について：２−Ｍａｂ２、３−Ｍａｂ３。
【図６】図６では、群平均体重ＢＷ変化を、最初の日からのパーセント±ＳＥＭとして示す。全ての図で：１−対照、４−パクリタキセル。図６では、Ｃｏｌｏ  ２０５について：２−Ｍａｂ２、３−Ｍａｂ３。
【図７】図７では、カプラン・マイヤー生存曲線が示されている。全ての図で：１−対照、４−パクリタキセル。図７では、ＰＣ３について、２−Ｍａｂ１、３−Ｍａｂ５。
【図８】図８において、群による平均腫瘍増殖、最初の日からの±ＳＥＭを示す。全ての図で：１−対照、４−パクリタキセル。図８では、ＰＣ３について、２−Ｍａｂ１、３−Ｍａｂ５。
【図９】図９では、群平均体重ＢＷ変化を、最初の日からのパーセント±ＳＥＭとして示す。全ての図で：１−対照、４−パクリタキセル。図９では、ＰＣ３について、２−Ｍａｂ１、３−Ｍａｂ５。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００２７】
シンデカン−１に対するＭａｂの産生。
１．１シンデカン１の製造
シンデカン−１をコードする遺伝子は、化学発酵合成［Ｙｏｕｎｇ  Ｌ、Ｄｏｎｇ  Ｑ．、Ｔｗｏ  ｓｔｅｐ  ｔｏｔａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄ（２ステップ総遺伝子合成法）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ：３２、ｅ５９、２００４］によって２ステップで合成した。得られた遺伝子をベクターｐＥＴ１５１／Ｄ−ＴＯＰＯにクローニングし、次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｓｔａｒ株の細胞を、それを用いて形質転換した。
【００２８】
プロデューサー株の発酵及び組換えタンパク質抽出を行った。シンデカン−１は金属キレートクロマトグラフィーにより精製した。
【００２９】
組換えタンパク質は９８％の純度を有し、これを用いてシンデカン−１に対するマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得て、得られたモノクローナル抗体を試験した。
【００３０】
１．２．シンデカン−１によるＢａｌｂ／Ｃマウスの免疫化。
Ｂａｌｂ／Ｃマウスの免疫化を行った。精製組換えシンデカン−１タンパク質を抗原として用いた。一次免疫中に、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）を含む５０μｇの抗原をマウスに皮下注射した。接種の２８日後、注射された抗原に対する免疫応答のレベルを分析し、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を介して血清中の特異的抗体の力価を評価した。最高レベルの免疫応答を有する動物に、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を含む抗原３０μｇを皮下に再度投与し、注射の２１日後に二次免疫応答のレベルを推定した。その後、体細胞ハイブリダイゼーションの４〜５日前に、生理食塩水（ＮＳＳ）中の抗原３０μｇを腹腔内注射した。
【００３１】
１．３．シンデカン−１に特異的なモノクローナル抗体を合成するハイブリドーマの作製。
融合パートナーとして、約１：３００００のシンデカン−１タンパク質に対する血清抗体力価を有する免疫化マウスの脾細胞、及びマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５８１）を２：１の比で使用した。ハイブリダイゼーションは、標準的な方法に従ってポリエチレングリコール溶液（Ｓｉｇｍａ）の補助で行った。安定なハイブリッド細胞の選択は、１０％ＦＣＩ血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）及びＮＡＴ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｓｉｇｍａ）で培養することによって行った。所望の抗原に特異的な抗体を分泌するハイブリッド細胞クローンの選択は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって行った。一次スクリーニングの結果、シンデカン−１に対するモノクローナル抗体を産生する１０個のハイブリッド細胞クローンを選択した。５クローニングのセットの後、４つの安定したプロデューサークローンを得た。シンデカン−１に対する抗体の重鎖及び軽鎖をコードするｍＲＮＡを各細胞株から単離した。
【００３２】
１．４．シンデカン−１に対するヒト化抗体の設計
製造業者のプロトコールに従って、「ＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ」キット（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を用いてシンデカン−１に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリッド細胞の安定なクローンからＲＮＡを単離した。（５−１０）×１０６個の細胞あたり、１ｍｌの溶解溶液「ＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ」を使用した。ｃＤＮＡ合成は、Ｒｅｖｅｒｔ  Ａｉｄ（登録商標）ファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）を用いて行った。
【００３３】
マウス抗体の可変断片をコードする遺伝子の増幅は、未知のＶＨ及びＶＬ領域ならびに合成されたｃＤＮＡをマトリックスとしてアニーリングするための５  ’縮重プライマーを用いたＰＣＲ法によって行った。非常に正確な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼＰｆｘを用いたＰＣＲにより、クローニングされるＤＮＡ断片の増幅を行った。得られたＰＣＲ産物を、Ｆａｓｔ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓを用いてｐＧＭＴ−ｅａｓｙベクターにクローニングし、サンガー法に従って配列決定した。ハイブリドーマ１及びハイブリドーマ２が異なるＭＡｂを合成し、これを用いて本発明のモノクローナル抗体を得ることが判明した。
【００３４】
配列決定の結果を用いてヒト化モノクローナル抗体を得た。
【００３５】
抗体のヒト化は、ヒト可変フラグメント上の、抗原に対する相補性を担うマウス抗体の可変フラグメントの検出された（得られたヌクレオチド配列上のコンピュータアルゴリズムの補助を用いて推定された）超可変領域（ＣＤＲ）の移入によって行った；ＣＤＲは、抗体間の構造的相似のデータバンク分析の結果及びバイオインフォマティクスなモデリングの結果に従って、適切なフレームワーク領域の間に配置された。得られたヒト化抗体は、母体マウス抗体の特異性を有するが、フレームワーク領域に起因して、ＣＤＲのより適切な三次元位置の結果として、より高い親和性も有する。
【００３６】
分子グラフィックスには以下のプログラムを使用した：Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ；Ａｃｃｅｌｒｙｓ、ＣＡ。マウスドナー抗体とヒトアクセプター抗体との間の高次構造の相同性のモデリングは、ＷＡＭ（ｈｔｔｐ：／／ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋ）、ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）、ＩＮＳＩＧＨＴ−ＨＯＭＯＬＯＧＹ  （Ａｃｃｅｌｒｙｓ）、ＣＯＭＰＯＳＥＲ（Ｔｒｉｐｏｓ、ＭＯ）、及びＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅを介して行った。マウス抗体可変フラグメントの配列にアノテーションを付け、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａデータベースを介してインデックスを付けた。
【００３７】
可変フラグメントの構造に関する情報は、Ｃｈｏｔｈｉａ［Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ，  Ｌｅｓｋ  ＡＭ．  Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９８７年８月２０日；１９６（４）：９０１〜１７］が開発したインデックスによって考慮される。しかし、抗体の可変フラグメントのアミノ酸残基は、このインデックスでは考慮されない。上述の可変フラグメントのインデックス及びアノテーションについてのデータ（Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａ修正アルゴリズム）を考慮して−Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ  ＫＲ及びＭａｒｔｉｎ  ＡＣが適用された［Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ  ＫＲ及びＭａｒｔｉｎ  ＡＣ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＶＨ／ＶＬ  Ｐａｃｋｉｎｇ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．２０１０，Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ  ＫＲ，Ｍａｒｔｉｎ  ＡＣ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  Ｋａｂａｔ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  ｃｏｒｒｅｃｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８年８月；４５（１４）：３８３２−９］。インデックスの間、Ｋａｂａｔによる複数の抗体配列アラインメントからの補正されたデータ及びＦＲ構造を考慮したＣｈｏｔｈｉａによる構造的ＣＤＲデータだけでなく、ドナー及びアクセプター抗体におけるＶＨ／ＶＬ角度のフォールディングも考慮に入れた。自動アノテーションでは、インタラクティブなＷｅｂインターフェイスを使用したプログラムを使用した：ＳｅｑＴｅｓｔ（ＡｂＣｈｅｃｋ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ｓｅｑｔｅｓｔ．ｈｔｍｌ、Ａｂｎｕｍ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ａｂｎｕｍ／、手動補正及び検証は、Ｋａｂａｔデータベースｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｂａｔｄａｔａｂａｓｅ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌのローカルバージョン、及びプログラムＫａｂａｔＭａｎ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ｓｉｍｋａｂ．ｈｔｍｌ、ならびにＩＭＧＴ  ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／、ならびにＭＵＳＣＵＬＥ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｕｓｃｌｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ、及びプログラムパッケージＦＡＳＴＡ  ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌ（その構造は２０１２年にＰＤＢで発表された）を介した抗体配列の複数の可変フラグメントフィッティングからの訂正されたデータの助けを借りて、ならびに本発明の著者によって開発された自動データ分析のためのいくつかのＰｅｒｌスクリプトによって行った。ＶＨ／ＶＬ角度は、Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ  ［Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ  Ｋ．Ｒ．、２０１０］によって提供されたアルゴリズムに基づいて計算され、予測された。タンパク質の分子構造モデリングに関連する全ての必要な計算は、Ｍｏｄ��ｌｌｅｒ及びＳｗｉｓｓ−Ｍｏｄｅｌを用いて行った。
【００３８】
抗体をヒト化するための次の工程は、移入のためのヒト抗体のアクセプター可変フラグメントの選択であった。ヒトアクセプター抗体の正しい選択は、抗原との高強度結合に十分なＫｄ値を有する抗体のヒト化の成功をほぼ１００％保証する。上記の分子モデリング及びアプローチの方法により、シンデカン−１に対する明らかにしたマウスモノクローナル抗体の可変フラグメントの構造モデルを構築した。得られた３Ｄモデルを用いて、ヒトアクセプター抗原の最も相同性のある配列（特に重要な位置を考慮して）を推定したが、Ｈ＞１の「ヒト」係数を有する抗体のみが適用された（ＨＡＨＡ応答を潜在的に低下させる可能性がある）。得られたモデルに基づいて、抗体の重鎖及び軽（κ）鎖の可変フラグメントのアミノ酸配列を推定した。
【００３９】
１．５．シンデカン−１に対するモノクローナル抗体の産生
重鎖の定常及び計算された可変フラグメントのアミノ酸配列を、１つのアミノ酸配列（配列番号５−それぞれハイブリドーマ１に対する）に連結した。定常及び計算された可変κ軽鎖フラグメントの配列を、単一のアミノ酸配列（配列番号７−それぞれハイブリドーマ２に対する）に連結した。
【００４０】
さらに、得られたハイブリドーマ２のキメラ重鎖及び軽鎖（ハイブリドーマ１について）を構築した。重鎖のマウス可変部及びヒト定常フラグメントのアミノ酸配列を連結した（配列番号１、それぞれハイブリドーマ２に対する）。カッパ軽鎖のマウス可変部及びヒト定常フラグメントのアミノ酸配列もまた連結した（配列番号３、それぞれハイブリドーマ１に対する）。
【００４１】
得られたアミノ酸配列を核酸配列に移入し、さらにプロデューサー細胞から分泌の際に切断されたシグナル分泌配列をコードするＮ末端にフラグメントを付加し、哺乳動物細胞（ＣＨＯ）におけるこれらの抗体の産生を増加させるコドン最適化を、サイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｃｏｒｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／Ｃｏｄｏｎ．ｈｔｍのプログラムを使用して行った。
【００４２】
結果として、シンデカン−１に対するモノクローナル抗体の鎖（配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７）をコードするヌクレオチド配列の最終バージョン（配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８）を得て、次に、これを化学合成を用いて合成した。
【００４３】
また、増加した活性を行うように修飾された抗体も得た。全てのアイソタイプの中で最も高い補体系活性化率を有するこのＩｇＧ３フラグメントについて、並びに食細胞に対する最も高いＦｃ受容体結合親和性を、ＩｇＧ４重鎖定常フラグメントに挿入した。抗体の半減期の増加のために、ＩｇＧ４定常フラグメントのＣ末端領域にもアミノ酸置換を挿入した。
【００４４】
推定重鎖可変及び定常フラグメントの配列を１つの配列に連結した（配列番号９−それぞれハイブリドーマ１に対する）。
【００４５】
このような重鎖の改変体はまた、マウス可変部のアミノ酸配列、及び重鎖の算出されたヒト定常フラグメントの１アミノ酸配列（配列番号１１）への連結の結果として、ハイブリドーマ２から得られたマウスのものに基づいて作製されたキメラ重鎖に基づいて受容された。
【００４６】
タンパク質のアミノ酸配列に基づいてヌクレオチド配列を算出し、さらに、放出された分泌配列をコードするＮ末端のフラグメントを導入し、一方でプロデューサー細胞からの分泌及びコドン最適化はまた、哺乳動物細胞（ＣＨＯ）における本発明の抗体産生の増大の目的で、インターネットサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｃｏｒｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／Ｃｏｄｏｎ．ｈｔｍのプログラムの助けを借りて行った。
【００４７】
結果として、ＩｇＧ４−ＩｇＧ３シフトを有するシンデカン−１に対するモノクローナル抗体の重鎖（配列番号９、配列番号１１）をコードするヌクレオチド配列の最終バージョン（配列番号１０、配列番号１２）を得た。得られたヌクレオチド配列を化学的に合成した。合成されたフラグメントを、増幅のためにプラスミドベクターｐＵＣ５７にクローニングし、次いで哺乳類細胞のトランスフェクションの目的でベクターｐｃＤ  Ａ３．１＋に再クローニングした。
【００４８】
次に、シンデカン−１に対するモノクローナル抗体のプロデューサー細胞を作製した。本発明者らは、ハイブリドーマ１及び２に由来するだけでなく、計算された重鎖及び軽鎖の組み合わせによっても作製される抗体のプロデューサーを作製するために、当初の決定を下した。
【００４９】
コンピテント哺乳動物細胞（ＣＨＯ）のトランスフェクションは、それぞれが分泌配列を有する抗体の重鎖または軽鎖をコードする哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されたポリヌクレオチドをそれぞれ保持する、２つの作製プラスミドＤＮＡによって行われた。
【００５０】
産生されたプラスミドによる哺乳動物細胞のトランスフェクションは、リン酸カルシウム沈殿法によって行った。
【００５１】
哺乳動物細胞（ＣＨＯ）を５×１０４細胞／ｓｍ２の密度で１２ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳＡ）に播種した。翌日、細胞分裂の同期のために培地を交換した。３時間後、リン酸カルシウム沈殿したプラスミドＤＮＡを細胞に添加した。沈殿物を調製するために、２５０ｍＭのＣａＣｌ２中の５０μｇのＤＮＡを含有する２５０μｌの溶液を、２５０μｌの溶液（１．６４％ＮａＣｌ、１．１３％ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．１２及び０．０４％Ｎａ２ＨＰＯ４）とゆっくりと混合した。３７℃、５％ＣＯ２での２４時間のインキュベーションの後、培地を、追加の２つの抗生物質（ゼオシン８０μｇ／ｍｌ及び２μｇ／ｍｌのブラストサイジンＳをクローンの選択のために含む）（両方の形質転換したプラスミドを含み、結果として全長モノクローナル抗体を合成する）を含む類似のものに変更した。選択は、生存細胞を含むウェル中で２０日間行った；培地を交換した（以前の培養培地は廃棄せず、ただしＥＬＩＳＡによる抗体分泌の測定に使用した）。１日後、細胞をウェル底から分離し、形質転換された遺伝子の発現を分析した。トランスフェクション効率の分析は、フローサイトメーターＥＰＩＣＳ  ＸＬ  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＵＳＡ）で行った。
【００５２】
得られたＣＨＯ細胞株の安定なトランスフェクトーマの培養培地中のモノクローナル抗体のレベルを、標準固相ＥＬＩＳＡの助けを借りて分析した。
【００５３】
７回のクローニングの結果、安定なＣＨＯトランスフェクトーマを得て、低温保存及びパイロット規模の抗体産生のために蓄積した。配列番号１及び配列番号７（以下、Ｍａｂ２）及び配列番号５及び配列番号３（以下、Ｍａｂ１）に基づいてシンデカン−１に対する抗体を合成する、得られたＣＨＯトランスフェクトーマの生産性は、約５５０μｇ／１０７細胞／日であった。配列番号１及び配列番号３（以下、Ｍａｂ３）、ならびに配列番号５及び配列番号７（以下、Ｍａｂ４とする）に基づいてシンデカン−１に対する抗体を合成する作成されたＣＨＯトランスフェクトーマの生産性は、配列番号１１及び配列番号３（以下−Ｍａｂ７）に基づいて約６５０μｇ／１０７細胞／日、ならびに配列番号１１及び配列番号７（以降−Ｍａｂ６）に基づいて約６５０μｇ／１０７細胞／日であった。配列番号９及び配列番号７（以下、Ｍａｂ５）に基づいてシンデカン−１に対する抗体を合成する作成されたＣＨＯトランスフェクトーマの生産性は、約７００μｇ／１０７細胞／日であった。
【００５４】
本発明のモノクローナル抗体は、他の哺乳動物細胞、例えばＨＥＫ２９３、ＣＯＳを用いて得てもよい。
【００５５】
１．６．シンデカン−１に対するモノクローナル抗体を産生する細胞の培養
プロデューサー細胞の培養は、バイオリアクターＢＩＯＳＴＡＴ（登録商標）Ｂｐｌｕｓ、ならびに９リットルの培地あたり４５ｇのＤＦＢＳ（０．５％）及び２５．８ｇ（１００ミリモル）の硫酸亜鉛七水和物（ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）を補充したオートクレーブ処理した１ＭＤＭ培地を用いて行った。動作モードは以下に設定した：温度３７℃、ｐＨ６．９〜７．２、空気飽和の５０％の酸素濃度。予め設定されたモードに達した後、バイオリアクターの播種を行い、無菌条件下でシード物を導入した。培養は３日間行った。
【００５６】
培養が完了したら、培養液を、孔径１．２μｍの滅菌カプセル≪Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ≫（≪Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ≫、Ｇｅｒｍａｎｙ）を通して１Ｌ／分の速度で、濾過した。清澄化した液体を、５０ｋＤａフィルターを用いてＶｉｖａ  Ｆｌｏｗ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００（≪Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ≫、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて濃縮した。総量２００ｍＬが得られるまで濃縮した。
【００５７】
１．７．シンデカン−１に対する得られたモノクローナル抗体の精製
クロマトグラフィー精製は、滅菌溶液を用いて２段階で行った。第一段階では、自動画分回収装置ＢｉｏＦｒａｃｔ及び半調製クロマトグラフィーカラムＹＭＣ  ＴｒｉＡｒｔ（２５０×４，６ｍｍ、Ｃ１８吸着剤）を用いて、ＢｉｏＬｏｇｉｃ  ＤｕｏＦｌｏｗ  Ｐａｔｈｆｉｎｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）システムを使用した。作業を開始する前に、カラムを手動モードで２００ｍｌの緩衝液（注射用水１ｋｇ及びトリフルオロ酢酸１ｇ）で、クロマトグラフポンプを通して２ｍｌ／分の速度で平衡化した。
【００５８】
２００ｍｌの容量の調製された材料を、ポンプを通して０．５ｍＬ／分の速度でクロマトグラフにポンピングした。溶出は、緩衝液（２ｋｇのアセトニトリル、２ｇのトリフルオロ酢酸）を用いて、０．５ｍＬ／分の速度で行った。画分を２６０ｎｍの最大吸光度で集めた。画分の容積は約５００ｍＬであった。
【００５９】
画分を２６０ｎｍの最大吸光度で集めた。画分の容積は約５００ｍＬであった。
【００６０】
第２精製工程は、ゲルクロマトグラフィーカラムＢｉｏＳｉｌ  ＳＥＣ  １２５−５，３００×７．８ｍｍを用いて行った。カラムを、０．０２Ｍ  ＰＢＳ緩衝液で予備平衡化した。得られた物質を、クロマトグラフポンプを通して０．５ｍｌ／分の速度でクロマトグラフに導入した。溶出は、０．１〜０．６Ｍの濃度勾配の緩衝液（０．６ＭのＮａＣｌ溶液）を用いて行った。Ａ２８０ｎｍで３．４吸光度単位以上の吸光度を有する画分を集めた。その画分をバイアルに集めた。得られた溶液の容積は、１ｍｌあたり抗体２〜４ｍｇの濃度で約１リットルであった。
【００６１】
得られた抗体のＫｄを、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ式を用いてＥＬＩＳＡにより測定した。
【００６２】
配列番号５及び配列番号３のアミノ酸配列によって特徴付けられる抗体（Ｍａｂ１）については、Ｋｄ＝８．５＊１０−９である。配列番号１及び配列番号７のアミノ酸配列によって特徴付けられる抗体（Ｍａｂ２）については、Ｋｄ＝７．８＊１０−９である。配列番号１及び配列番号３によって特徴付けられる抗体（Ｍａｂ３）については、Ｋｄ＝７，０＊１０−９、配列番号５及び配列番号７のアミノ酸配列によって特徴付けられる抗体（Ｍａｂ４）については−６．７＊１０−９である。配列番号１１及び配列番号３のアミノ酸配列によって特徴付けられる抗体（Ｍａｂ７）については、Ｋｄ＝６，０×１０−９、配列番号１１及び配列番号７のアミノ酸配列によって特徴付けられる抗体（Ｍａｂ６）については、−６．９＊１０−９である。配列番号９及び配列番号７のアミノ酸配列を特徴とする抗体（Ｍａｂ５）については、Ｋｄ＝５．０＊１０−９である。
【００６３】
したがって、作製された抗体は有効な抗原結合に十分な親和性を有する。
【実施例２】
【００６４】
シンデカン−１に対するモノクローナル抗体の抗腫瘍効果の研究。
生成した抗体の抗腫瘍活性の研究は、ＢＡＬＢ／ｃ  ＮＵＤＥマウスにおけるヒト腫瘍の異種移植モデルを用いて行った。各腫瘍モデルにおいて、シンデカン−１に対する２〜３種類のモノクローナル抗体を研究した。
【００６５】
マウス
研究のために、女性無胸腺ＢＡＬＢ／ｃ  ＮＵＤＥマウスを使用した。動物には、ＮＩＨ  ３１改変及び照射Ｌａｂ  Ｄｉｅｔ（登録商標）及び水を自由に摂取させた。マウスを、２０〜２２℃及び４０〜６０％湿度で１２時間の明サイクルで飼育した。
【００６６】
腫瘍容積は、式：ｗ２＊ｌ／２（ここで、ｗ＝幅及びｌ＝腫瘍の長さ、ｍｍ）を使用して計算した。腫瘍重量は、１ｍｇが腫瘍容積の１ｍｍ３に等しいと仮定して推定した。
【００６７】
治療薬及びその投与方法
研究中の抗体は、２．５ｍｇ／ｍＬのストック溶液中に保持され、光から保護して４℃で保存された。投与溶液は、０．２ｍＬ／動物の固定容量で０．５ｍｇ／動物の投与量を送達した。投薬溶液は、光から保護された４℃で保存した。
【００６８】
パクリタキセル（ロットＣＰ２Ｎ１０００７）は、乾燥粉末（Ｆｏｒｔ  Ｗｏｒｔｈ、ＴＸ）として購入した。５０％エタノール：５０％Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ中のパクリタキセルのストック溶液（３０ｍｇ／ｍＬ）を調製し、光から保護して室温で保存した。投与の各日に、パクリタキセルストックのアリコートを、水中の５％デキストロース（Ｄ５Ｗ）で希釈して、５％エタノール：５％Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ：９０％Ｄ５Ｗからなるビヒクル中に３．０ｍｇ／ｍＬのパクリタキセル投与溶液を得た。この投与溶液では、１０ｍＬ／ｋｇの投与量で３０ｍｇ／ｋｇの投与量を送達した。
【００６９】
ビヒクル対照群にはＰＢＳ（「ビヒクル」）を投与した。
【００７０】
ビヒクル及び抗体には、４週間の間、１週間に２回腹腔内投与した。パクリタキセルは１日おきに合計５回静脈内に送達された。第１群はビヒクルを受け、腫瘍生着及び進行のベンチマーク群として、ならびに腫瘍増殖遅延解析（ＴＧＤ）の対照として役立てた。
【００７１】
研究結果の評価
その腫瘍が容積のエンドポイントに達したときに各動物を安楽死させた。各マウスのエンドポイントまでの時間（ＴＴＥ）は、以下の等式を用いて計算した：ｌｏｇ１０（エンドポイント容積）−ｂ）／ｍ、ここでｂは切片であり、ｍは、対数変換した腫瘍増殖データセットの直線回帰によって得られる線の勾配である。データセットは、研究のエンドポイントの容積を超えた最初の観察と、エンドポイントの容積の到達直前の３つの連続した観察とから構成される。エンドポイントに到達しなかった動物は、試験終了時に安楽死させ、試験の最終日に等しいＴＴＥ値を割り当てた。対数変換された計算されたＴＴＥがエンドポイントに達する前の日の前、または腫瘍容積のエンドポイントに到達した日を超えた場合、線形補間を行ってＴＴＥを近似した。処置関連（ＴＲ）の原因で死亡したと判定された動物には、死亡日に等しいＴＴＥ値を割りあてた。非治療関連（ＮＴＲ）の原因で死亡した動物は、分析から除外した。
【００７２】
治療成果は、対照群（ＴＧＤ＝Ｔ−Ｃ）と比較して治療群の中央ＴＴＥの増大として定義された腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）から、日数で表すか、または対照群のＴＴＥ中央値のパーセンテージとして、％ＴＧＤ＝（Ｔ−Ｃ）＊１００／Ｃ（ここでＴは、処置群のＴＴＥの中央値、Ｃは、対照群の中央値ＴＴＥ）で推定した。
【００７３】
毒性
マウスは、健康及びなんらかの有害なＴＲ副作用の顕在的な徴候について頻繁に観察された。個々のＢＷの低下をプロトコールごとにモニターし、許容されるＢＷ損失の限界を超えた体重の動物を安楽死させた。群平均ＢＷが回復した場合、その群では投与が再開されたが、より低い用量またはより少ない頻度の投与スケジュールで再開された。許容される毒性とは、研究中の２０％未満の群平均ＢＷ損失、及び１０匹の処置動物のうち１匹以下のＴＲ死、すなわち１０％と定義した。より大きな毒性をもたらす任意の投薬レジメンを、最大耐量（ＭＴＤ）とみなした。死亡は、臨床的徴候及び／または剖検によって証明されるような治療副作用に起因する場合はＴＲとして分類し、投薬期間中または最後の投与の１４日以内に未知の原因に関してはＴＲとして分類してもよい。死亡が治療関連ではなく腫瘍モデルに関連しているという証拠があれば、死亡はＮＴＲと分類した。
【００７４】
統計及びグラフ分析
Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＰｒｉｓｍ  ６．０５（ＧｒａｐｈＰａｄ）を、統計分析及びグラフ分析に採用した。ＴＴＥ値に基づいて、カプラン・マイヤー法により生存を分析した。ｌｏｇｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）及びＧｅｈａｎ−Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定は、ＴＴＥ値に基づいて２つの群の全生存経験（生存曲線）の間の差の有意性を決定した。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロット及び統計的検定は、同じデータセットを共有し、ＮＴＲ死亡として記録された動物は除外する。両側統計分析は、多重比較のために調整されず、Ｐ＝０．０５で実施された。
【００７５】
統計的検定は有意性の検定であり、群間の差の大きさの推定値を提供しないため、有意水準は全て、有意水準または非有意水準として記載される。
【００７６】
腫瘍成長曲線は、同じ群で２つのＴＲ死亡が生じた後に切断された。研究の経過中の群平均ＢＷ変化を、１日目からの変化率±ＳＥＭとしてグラフ化した。腫瘍成長及びＢＷ変化曲線は、研究を終了したグループの評価可能なマウスの半分以上が切り取られた後に切り捨てられた。
【００７７】
２．１．Ａ５４９細胞株を用いるシンデカン−１に対するヒト化モノクローナル抗体（Ｍａｂ４、Ｍａｂ６）の有効性の研究
マウスは研究の１日目に１１週齢であり、ＢＷ範囲は１８．４〜２５．６ｇであった。
【００７８】
１０％ウシ胎仔血清、１００単位／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、２μＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び２５μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有するＫａｉｇｈｎ改変Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地で培養したＡ５４９ヒト非小細胞肺癌細胞で異種移植片を開始した。細胞を、５％ＣＯ２及び９５％空気の雰囲気中、３７℃の加湿インキュベーター内の組織培養フラスコ中で培養した。
【００７９】
移植に使用したＡ５４９腫瘍細胞を、対数期増殖の間に回収し、５×１０７細胞／ｍＬの濃度でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に含まれる５０％マトリゲルマトリックス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁した。各試験マウスに、１×１０７個のＡ５４９細胞（０．２ｍＬの細胞懸濁液）を右脇腹に皮下注射し、平均サイズが１５０〜２２０ｍｍ３の目標範囲に近づくにつれて腫瘍増殖をモニターした。腫瘍は、キャリパーを用いて二次元で測定し、容積を計算した。
【００８０】
腫瘍細胞移植の２４日後、研究の１日目に、動物を、１２６〜２２１ｍｍ３の個々の腫瘍容積を有する４つの群（ｎ＝１０／群）に分類し、群平均腫瘍容積は、１８５〜１８６ｍｍ３であった。腫瘍は、研究の最初の４５日間、さらに５４日目に、毎週２回、キャリパーで測定した。
【００８１】
研究エンドポイントは、８００ｍｍ３の腫瘍容積または５４日目のいずれか早い時点であった。
【００８２】
研究の結果を図１〜図３に示す。
【００８３】
２．２．Ｃｏｌｏ２０５細胞株を用いたシンデカン−１に対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ２、Ｍａｂ３）の有効性の研究
【００８４】
マウスは研究の第１日に９週齢であり、ＢＷ範囲は１７．８〜２３．８ｇであった。
【００８５】
異種移植片は、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．０７５％重炭酸ナトリウム、１００単位／ｍＬのペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン及び２５μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養したヒト結腸直腸腺癌細胞（Ｃｏｌｏ２０５）で開始した。細胞を、５％ＣＯ２及び９５％空気の雰囲気中、３７℃の加湿インキュベーター内の組織培養フラスコ中で培養した。
【００８６】
移植に使用したＣｏｌｏ２０５腫瘍細胞を、対数期増殖の間に採取し、５×１０６細胞／ｍＬの濃度のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の５０％マトリゲルマトリックス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁した。各試験マウスに、１×１０６個のＣｏｌｏ２０５細胞（０．２ｍＬ細胞懸濁液）を右脇腹に皮下注射し、平均サイズが１００〜１５０ｍｍ３の目標範囲に近づくにつれて腫瘍増殖をモニターした。腫瘍は、キャリパーを用いて二次元で測定し、容積を計算した。
【００８７】
腫瘍細胞移植の１０日後、研究の１日目に、動物を８８〜１６２ｍｍ３の個々の腫瘍容積、及び１２３〜１２７ｍｍ３の群平均腫瘍容積を有する４群（ｎ＝１０）に分類した。腫瘍は、試験の最初の６０日間、さらに６５日目及び７５日目に、毎週２回、キャリパーで測定した。
【００８８】
研究のエンドポイントは、腫瘍容積１５００ｍｍ３または７５日のいずれか早い時点であった。
【００８９】
研究の結果を図４〜図６に示す。
【００９０】
パクリタキセル群では、ＴＲの死亡が研究の１１日目に明らかになった。
【００９１】
２．３．ＰＣ３細胞株を用いるシンデカン−１に対するヒト化モノクローナル抗体（Ｍａｂ１、Ｍａｂ５）の有効性の研究。
【００９２】
マウスは、研究の１日目に１１週齢であり、１９．１〜２６．４ｇのＢＷ範囲を有していた。
【００９３】
異種移植は、骨に転移するヒト前立腺癌に由来するアンドロゲン非依存性ＰＣ３腫瘍細胞を用いて開始し、低分化腺癌の形態を示した。本研究のために利用された腫瘍は、雌性ヌードマウスの連続移植によって維持された。腫瘍増殖を開始させるために、１ｍｍ３の断片を、各試験動物の右側腹部に皮下移植した。腫瘍の平均容積が所望の１００〜１５０ｍｍ３の範囲に近づくにつれて、成長をモニターするために腫瘍を２次元で測定した。
【００９４】
腫瘍断片移植の２６日後、研究の１日目に、マウスを、個々の腫瘍容積が６３〜１９６ｍｍ３の４つの群（ｎ＝１０／群）に分類し、群平均腫瘍容積は１９〜１２０ｍｍ３であった。腫瘍は、研究の最初の４５日間、さらに５３日目に、毎週２回、キャリパーで測定した。
【００９５】
研究エンドポイントは、腫瘍容積１５００ｍｍ３または５３日のいずれか早い時点であった。
【００９６】
研究の結果は図７〜９に示されている。
【００９７】
分析された抗体（Ｍａｂ４及びＭａｂ６、Ｍａｂ２及びＭａｂ３、Ｍａｂ１及びＭａｂ５）は、パクリタキセルのものに匹敵して、全ての調査されたパラメーターにおいて、対照群と比較して、統計学的に有意な効力、及び副作用の欠如を示し、また副作用がないことは、これらの薬剤の安全性も意味する。Ｍａｂ７分析によって、Ｍａｂ６の分析と同様の割合が示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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