(57)【要約】  ここに提供されるのは、ＰＤ−Ｌ１阻害剤と組み合わせて、メソテリンに特異的なキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現する細胞を投与することを含む、メソテリンの発現と関連する疾患の処置のための組成物および方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メソテリン発現と関連する疾患を有する対象の処置方法であって、該対象に
ｉ)キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を含む、例えば、発現する、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団であって、ＣＡＲがメソテリン結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むもの；および
ii)ＰＤ−Ｌ１阻害剤
を投与することを含み、ここで、ＰＤ−Ｌ１阻害剤がＣＡＲを含む細胞の投与前に投与される、方法。
【請求項２】
ＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤が処置インターバルで投与され、ここで、処置インターバルは、ＰＤ−Ｌ１阻害剤１回投与およびＣＡＲ発現細胞１回投与を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
処置インターバルがＰＤ−Ｌ１阻害剤投与により開始され、ＣＡＲ発現細胞投与により完了する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
処置インターバルが、さらに、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の１以上、例えば、１、２、３、４または５またはそれ以上の続く投与を含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
ＣＡＲ発現細胞がＰＤ−Ｌ１阻害剤投与の少なくとも２日、３日、４日、５日、６日、７日または２週後に投与される、請求項２〜４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
ＣＡＲ発現細胞がＰＤ−Ｌ１阻害剤投与の２日後に投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤が処置インターバルで投与され、ここで、処置インターバルは、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の第一および第二の投与およびＣＡＲ発現細胞１回投与を含み、ここで、ＣＡＲ発現細胞を、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の第一の投与後であって、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の第二の投与前に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
処置インターバルが、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の第一の投与により開始され、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の第二の投与により完了する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＰＤ−Ｌ１阻害剤の第二の投与を、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の最初の投与の少なくとも５日、７日、１週、２週または３週後に行う、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＡＲ発現細胞が、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の第一の投与の少なくとも２日、３日、４日、５日、６日、７日または２週間後に投与される、請求項７〜９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
ＰＤ−Ｌ１阻害剤の第二の投与を、ＣＡＲ発現細胞の最初の投与の少なくとも２日、３日、４日、５日、６日、７日または２週後に行う、請求項７〜１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
処置インターバルが、例えば、１回以上、例えば、１回、２回、３回、４回または５回またはそれ以上反復される、請求項２〜１１の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
処置インターバルが、１以上、例えば、１、２、３、４または５のその後の処置インターバルに続く、請求項２〜１１の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
１以上のその後の処置インターバルが、第一のまたは先の処置インターバルと異なる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
１以上のその後の処置インターバルを、第一のまたは先の処置インターバル完了少なくとも１日、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日または２週間後に、適用する、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＰＤ−Ｌ１阻害剤の１以上のその後の投与、例えば、１、２、３、４または５またはそれ以上の投与を、１以上の処置インターバル完了後に行う、請求項２〜１５の何れかに記載の方法。
【請求項１７】
ＰＤ−Ｌ１阻害剤を、１以上の処置インターバル完了の５日、７日、２週、３週または４日後に投与する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
処置インターバルが、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の投与２日後のＣＡＲ発現細胞の投与を含み、ここで、処置インターバルが２回反復され、処置インターバルが先の処置インターバル完了の３日後に開始される、請求項２〜６の何れかに記載の方法。
【請求項１９】
ＰＤ−Ｌ１阻害剤の１以上のその後の投与が、第二処置インターバル後、５日、７日、２週、３週または４週毎に行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
対象がＣＡＲ発現細胞の１回用量およびＰＤ−Ｌ１阻害剤の１回用量が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ＣＡＲ発現細胞１回投与が、ＰＤ−Ｌ１阻害剤１回投与の少なくとも２日、例えば、２日、３日、４日、５日、６日、７日または２週間後に、行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＡＲ発現細胞の１以上、例えば、１、２、３、４または５のその後の投与が、ＣＡＲ発現細胞の最初の投与後に対象に行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＣＡＲ発現細胞の１以上のその後の投与が、ＣＡＲ発現細胞の先の投与の少なくとも２日、例えば、２日、３日、４日、５日、６日、７日または２週間後に行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＣＡＲ発現細胞の１以上のその後の投与が、ＣＡＲ発現細胞の先の投与の少なくとも５日後に行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＰＤ−Ｌ１阻害剤の１以上、例えば、１、２、３、４または５のその後の投与が、ＰＤ−Ｌ１阻害剤１回投与後に行われる、請求項２１〜２４の何れかに記載の方法。
【請求項２６】
ＰＤ−Ｌ１阻害剤の１以上のその後の投与が、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の先の投与の少なくとも５日、７日、２週、３週または４週間後に行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＰＤ−Ｌ１阻害剤の１以上のその後の投与が、ＣＡＲ発現細胞の投与、例えば、ＣＡＲ発現細胞の最初の投与少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日後に、行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ＰＤ−Ｌ１阻害剤の１以上、例えば、１、２、３、４または５の投与が、ＣＡＲ発現細胞の最初の投与前に行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
ＡＲ発現細胞の１回以上の投与およびＰＤ−Ｌ１阻害剤の１回以上の投与が反復される、請求項２０〜２８の何れかに記載の方法。
【請求項３０】
ＣＡＲ発現細胞の用量が、少なくとも約１〜３×１０７〜１〜３×１０８を含む、請求項１〜２９の何れかに記載の方法。
【請求項３１】
ＣＡＲ発現細胞の用量が約１〜３×１０８細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＣＡＲ発現細胞の用量が約１〜３×１０８細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ＰＤ−Ｌ１阻害剤の用量が１〜３０mg／kg、例えば、約５〜２５mg／kg、約１０〜２０mg／kgまたは約１〜５mg／kgである、請求項１〜３２の何れかに記載の方法。
【請求項３４】
ＰＤ−Ｌ１阻害剤の用量が約１０〜２０mg／kgである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＰＤ−Ｌ１阻害剤が抗体分子、小分子、ポリペプチド、例えば、融合タンパク質または阻害性核酸、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む、請求項１〜３４の何れかに記載の方法。
【請求項３６】
ＰＤ−Ｌ１阻害剤が、
ｉ)ＰＤ−Ｌ１発現、例えば、ＰＤ−Ｌ１の転写または翻訳阻害または低減；
ii)ＰＤ−Ｌ１活性の阻害または低減、例えば、ＰＤ−Ｌ１のその同族受容体、例えば、ＰＤ−１への結合の阻害または低減；または
iii)ＰＤ−Ｌ１またはその受容体、例えば、ＰＤ−１への結合
の１以上により特徴付けられる、請求項１〜３５の何れかに記載の方法。
【請求項３７】
ＰＤ−Ｌ１阻害剤は抗体分子である、請求項１〜３６の何れかに記載の方法。
【請求項３８】
ＰＤ−Ｌ１阻害剤がＹＷ２４３.５５.Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ(アテゾリズマブ)、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＳＢ−００１０７１８Ｃ(アベルマブ)、ＭＤＸ−１１０５および表６に提供される何れかの抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子からなる群から選択される、請求項１〜３７の何れかに記載の方法。
【請求項３９】
ＰＤ−Ｌ１阻害剤が、
ｉ)表６に挙げる何れかのＰＤ−Ｌ１抗体分子アミノ酸配列の重鎖相補性決定領域１(ＨＣ  ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ  ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ  ＣＤＲ３)；および
ii)表６に挙げる何れかのＰＤ−Ｌ１抗体分子アミノ酸配列の軽鎖相補性決定領域１(ＬＣ  ＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣ  ＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣ  ＣＤＲ３)
を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子である、請求項１〜３８の何れかに記載の方法。
【請求項４０】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子が、
ｉ)ａ)配列番号２８７、２９０または１９５から選択されるＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２８８のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列および配列番号２８９のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；および
ｂ)配列番号２９５のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２９６のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列および配列番号２９７のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；または
ii)ａ)配列番号２８７、２９０または１９５から選択されるＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２９１のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列および配列番号２９２のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；および
ｂ)配列番号２９８のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２９９のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列および配列番号３００のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子が、
ｉ)表６に挙げる何れかの重鎖可変領域のアミノ酸配列、例えば、配列番号３０４、３１６、３２４、３３２、３３６、３４０、３４８、３５６または３６４；
ii)表６に挙げる何れかの重鎖可変領域のアミノ酸配列、例えば、配列番号３０４、３１６、３２４、３３２、３３６、３４０、３４８、３５６または３６４に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または
iii)表６に挙げる何れかの重鎖可変領域のアミノ酸配列、例えば、配列番号３０４、３１６、３２４、３３２、３３６、３４０、３４８、３５６または３６４と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子が、
ｉ)表６に挙げる何れかの重鎖のアミノ酸配列、例えば、配列番号３０６、３１８、３２６、３３４、３３８、３４２、３５０、３５８、３６６、３９３、３７７または３８２；
ii)表６に挙げる何れかの重鎖、例えば、配列番号３０６、３１８、３２６、３３４、３３８、３４２、３５０、３５８、３６６、３９３、３７７または３８２に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または
iii)表６に挙げる何れかの重鎖のアミノ酸配列、例えば、配列番号３０６、３１８、３２６、３３４、３３８、３４２、３５０、３５８、３６６、３９３、３７７または３８２と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
を含む重鎖を含む、請求項３９〜４１の何れかに記載の方法。
【請求項４３】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子が
ｉ)表６に挙げる何れかの軽鎖可変領域のアミノ酸配列、例えば、配列番号３０８、３１２、３２０、３２８、３４４、３５２、３６０、３６８または３７２；
ii)表６に挙げる何れかの軽鎖可変領域のアミノ酸配列、例えば、配列番号３０８、３１２、３２０、３２８、３４４、３５２、３６０、３６８または３７２に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または
iii)表６に挙げる何れかの軽鎖可変領域のアミノ酸配列、例えば、配列番号３０８、３１２、３２０、３２８、３４４、３５２、３６０、３６８または３７２と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、請求項３９〜４２の何れかに記載の方法。
【請求項４４】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子が
ｉ)表６に挙げる何れかの軽鎖のアミノ酸配列、例えば、配列番号３１０、３１４、３２２、３３０、３４６、３５４、３６２、３７０または３７４；
ii)表６に挙げる何れかの軽鎖、例えば、配列番号３１０、３１４、３２２、３３０、３４６、３５４、３６２、３７０または３７４に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または
iii)表６に挙げる何れかの軽鎖のアミノ酸配列、例えば、配列番号３１０、３１４、３２２、３３０、３４６、３５４、３６２、３７０または３７４と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖を含む、請求項３９〜４３の何れかに記載の方法。
【請求項４５】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子が
ｉ)配列番号３０４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３０８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
ii)配列番号３０４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
iii)配列番号３０４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３７２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
iv)配列番号３１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
ｖ)配列番号３１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
vi)配列番号３２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
vii)配列番号３２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３６０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
viii)配列番号３３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
ix)配列番号３３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
ｘ)配列番号３３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３０８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
xi)配列番号３３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３７２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
xii)配列番号３４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
xiii)配列番号３４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３７２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
xiv)配列番号３４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
xv)配列番号３４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
xvi)配列番号３５６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；または
xvii)配列番号７８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３６８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、請求項３９〜４４の何れかに記載の方法。
【請求項４６】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子が
ｉ)配列番号３０６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３１０のアミノ酸配列を含む軽鎖；
ii)配列番号３０６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号２１４のアミノ酸配列を含む軽鎖；
iii)配列番号３０６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３７４のアミノ酸配列を含む軽鎖；
iv)配列番号３１８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３２２のアミノ酸配列を含む軽鎖；
ｖ)配列番号３１８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３５４のアミノ酸配列を含む軽鎖；
vi)配列番号３２６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３３０のアミノ酸配列を含む軽鎖；
vii)配列番号３２６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３６２のアミノ酸配列を含む軽鎖；
viii)配列番号３３４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３３０のアミノ酸配列を含む軽鎖；
ix)配列番号３３８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３３０のアミノ酸配列を含む軽鎖；
ｘ)配列番号３３８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３１０のアミノ酸配列を含む軽鎖；
xi)配列番号３３８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３７４のアミノ酸配列を含む軽鎖；
xii)配列番号３４２のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３４６のアミノ酸配列を含む軽鎖；
xiii)配列番号３４２のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３７４のアミノ酸配列を含む軽鎖；
xiv)配列番号３５０のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３５４のアミノ酸配列を含む軽鎖；
xv)配列番号３５０のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３７４のアミノ酸配列を含む軽鎖；
xvi)配列番号３５８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３５４のアミノ酸配列を含む軽鎖；
xvii)配列番号３６６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３７０のアミノ酸配列を含む軽鎖；
xviii)配列番号３９３のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３２２のアミノ酸配列を含む軽鎖；
xix)配列番号９１のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３３０のアミノ酸配列を含む軽鎖；または
xx)配列番号３８２のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３５４のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項３９〜４５の何れかに記載の方法。
【請求項４７】
メソテリン結合ドメインが、表２に挙げる何れかのメソテリン重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖相補性決定領域１(ＨＣ  ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ  ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ  ＣＤＲ３)；および表２に挙げる何れかのメソテリン軽鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖相補性決定領域１(ＬＣ  ＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣ  ＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣ  ＣＤＲ３)を含む、請求項１〜４６の何れかに記載の方法。
【請求項４８】
メソテリン結合ドメインが表４におけるＨＣ  ＣＤＲアミノ酸配列に従うＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３および表５におけるＬＣ  ＣＤＲアミノ酸配列に従うＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
メソテリン結合ドメインが
ｉ)表２に挙げるメソテリン結合ドメインの何れかの重鎖可変領域のアミノ酸配列；
ii)表２に挙げるメソテリン結合ドメインの何れかの重鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または
iii)表２に挙げるメソテリン結合ドメインの何れかの重鎖可変領域のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項１〜４８の何れかに記載の方法。
【請求項５０】
メソテリン結合ドメインが
ｉ)表２に挙げるメソテリン結合ドメインの何れかの重鎖のアミノ酸配列；
ii)表２に挙げるメソテリン結合ドメインの何れかの重鎖のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または
iii)表２に挙げるメソテリン結合ドメインの何れかの重鎖のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項１〜４９の何れかに記載の方法。
【請求項５１】
メソテリン結合ドメインが
ｉ)表２に挙げるメソテリン結合ドメインの何れかの軽鎖可変領域のアミノ酸配列；
ii)表２に挙げるメソテリン結合ドメインの何れかの軽鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または
iii)表２に挙げるメソテリン結合ドメインの何れかの軽鎖可変領域のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項１〜５０の何れかに記載の方法。
【請求項５２】
メソテリン結合ドメインが
ｉ)表２に挙げるメソテリン結合ドメインの何れかの軽鎖のアミノ酸配列；
ii)表２に挙げるメソテリン結合ドメインの何れかの軽鎖のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または
iii)表２に挙げるメソテリン結合ドメインの何れかの軽鎖のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項１〜５１の何れかに記載の方法。
【請求項５３】
メソテリン結合ドメインが表２に挙げる何れかの重鎖可変領域のアミノ酸配列および表２に挙げる何れかの軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む、請求項１〜５２の何れかに記載の方法。
【請求項５４】
メソテリン結合ドメインが
ｉ)配列番号４３、配列番号４９、配列番号２７５、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１または配列番号６２からなる群から選択されるアミノ酸配列；
ii)配列番号４３、配列番号４９、配列番号２７５、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１または配列番号６２の何れかに少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または
iii)配列番号４３、配列番号４９、配列番号２７５、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１または配列番号６２の何れかのアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項１〜５３の何れかに記載の方法。
【請求項５５】
膜貫通ドメインがタンパク質Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択される膜貫通ドメインを含む、請求項１〜５４の何れかに記載の方法。
【請求項５６】
膜貫通ドメインが
(ｉ)配列番号６のアミノ酸配列、
(ii)配列番号６のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を含むが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または
(iii)配列番号６のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性の配列のアミノ酸配列
を含む、請求項１〜の５５何れかに記載の方法。
【請求項５７】
メソテリン結合ドメインがヒンジ領域により膜貫通ドメインに結合される、請求項１〜５６の何れかに記載の方法。
【請求項５８】
ヒンジ領域が配列番号２またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項１〜５７の何れかに記載の方法。
【請求項５９】
細胞内シグナル伝達ドメインが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群から選択されるタンパク質から得た機能的シグナル伝達ドメインを含む共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜５８の何れかに記載の方法。
【請求項６０】
共刺激ドメインが配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
細胞内シグナル伝達ドメインが４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜６０の何れかに記載の方法。
【請求項６２】
細胞内シグナル伝達ドメインが配列番号７のアミノ酸配列および／または配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列；または配列番号７および／または配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列；または配列番号７のアミノ酸配列および／または配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜６１の何れかに記載の方法。
【請求項６３】
細胞内シグナル伝達ドメインが配列番号７のアミノ酸配列および配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列が同じフレームにかつ単一ポリペプチド鎖として発現される、請求項１〜６２の何れかに記載の方法。
【請求項６４】
ＣＡＲが、さらに、配列番号１のアミノ酸配列を含むリーダー配列を含む、請求項１〜６３の何れかに記載の方法。
【請求項６５】
ＣＡＲが
(ｉ)配列番号６７；配列番号７３、配列番号２７８、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の何れかのアミノ酸配列；
(ii)配列番号６７、配列番号７３、配列番号２７８、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の何れかに少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または
(iii)配列番号６７；配列番号７３、配列番号２７８、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の何れかと９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項１〜６４の何れかに記載の方法。
【請求項６６】
ＣＡＲを含む細胞がＣＡＲをコードする核酸を含む、請求項１〜６５の何れかに記載の方法。
【請求項６７】
ＣＡＲをコードする核酸がレンチウイルスベクターである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
ＣＡＲをコードする核酸が細胞にレンチウイルス形質導入により導入される、請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項６９】
ＣＡＲをコードする核酸がＲＮＡ、例えば、インビトロ転写ＲＮＡである、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
ＣＡＲをコードする核酸が細胞にエレクトロポレーションにより導入される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
細胞がＴ細胞またはＮＫ細胞である、請求項１〜７０の何れかに記載の方法。
【請求項７２】
Ｔ細胞が自己または同種Ｔ細胞である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
さらにメソテリン発現と関連する疾患を処置する付加的治療剤、例えば、抗癌剤を投与する、請求項１〜７２の何れかに記載の方法。
【請求項７４】
メソテリン発現と関連する疾患が癌である、請求項１〜７３の何れかに記載の方法。
【請求項７５】
癌が中皮腫、悪性胸膜中皮腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、扁平上皮細胞肺癌または大細胞肺癌、膵臓癌、膵管腺癌、膵臓転移、卵巣癌または結腸直腸癌および膀胱癌またはその転移癌の１以上から選択される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
対象が哺乳動物、例えば、ヒトである、請求項１〜７５の何れかに記載の方法。
【請求項７７】
対象がＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２を発現する、請求項１〜７６の何れかに記載の方法。
【請求項７８】
対象における癌細胞または癌細胞に近接する細胞がＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２を発現する、請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
ＣＡＲ発現細胞がＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１を発現する、請求項１〜７８の何れかに記載の方法。
【請求項８０】
ＣＡＲを含む細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団であって、ここで、ＣＡＲがメソテリン結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むもの；および
表６から選択されるＰＤ−Ｌ１阻害剤；
を含む、対象におけるメソテリン発現と関連する疾患、例えば、癌を処置するための組み合わせ。
【請求項８１】
ＣＡＲを含む細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団であって、ここで、ＣＡＲがメソテリン結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインであるもの、および
表６から選択されるＰＤ−Ｌ１阻害剤
を含む、組成物(例えば、１以上の組成物または投与形態)。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年１２月２２日に出願の米国仮出願６２／２７０７８０に基づく優先権を主張し、その内容は、全体として引用により本明細書に包含させる。
【０００２】
配列表
本出願はASCII形式で電子的に提供しており、引用によりその全体を本明細書に包含させる配列表を含む。該ASCIIコピーは、２０１６年１２月２０日に作成し、N2067-7099WO_SL.txtなる名称であり、５２０,０２８バイトサイズである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、一般に疾患処置のために、ＰＤ−Ｌ１阻害剤と組み合わせた、メソテリンを標的とするキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように改変した細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
メソテリンは、元々Pastanおよび同僚により、正常組織による発現が限定的であり、腫瘍で過発現されるため、腫瘍関連抗原として同定された。Chang K, et al., Cancer Res. 1992;52(1):181-186およびChang K, et al. ProcNatlAcadSciUSA. 1996;93(1):136-140。メソテリン遺伝子は前駆体７１kDaタンパク質をコードし、これは処理されて４０kDaタンパク質、メソテリンを産生し、グリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)結合および巨核球増強因子(ＭＰＦ)と称されるアミノ末端３１kDa脱落フラグメントにより、細胞膜に固定される。両フラグメントはＮ−グリコシル化部位を含む。“可溶性メソテリン／ＭＰＦ関連”と称される４０kDaカルボキシル末端フラグメントの可溶性スプライスバリアントが、膵管腺癌(ＰＤＡ)を有する患者の血清で見つかっている。Johnston, F, et al. Clinical Cancer Research. 2009;15(21):6511。メソテリンは、現在治療標的ならびに疾患活性および治療応答のバイオマーカーの両方として探索されている。Argani P, et al. Clin Cancer Res. 2001;7(12):3862-3868。
【０００５】
メソテリンは、正常組織にも存在する分化抗原である。Pastanグループにより開発されたマウス抗ヒトメソテリン抗体Ｋ１を使用して、強いＫ１反応性が腹膜、胸膜および心膜腔を裏打ちする中皮細胞内で示されているが、悪性組織で通常見られるより低いレベルである。Chang K, et al., Cancer Res. 1992;52(1):181-186。弱いＫ１反応性が卵管上皮、気管基底上皮および扁桃上皮内で検出されている。メソテリンはまた角膜の全層で見られている。Jirsova K, et al. Experimental eye research. 2010;91(5):623-629。しかしながら、Ｋ１反応性は、肝臓、腎臓、脾臓、骨髄、リンパ節、胸腺、心筋、舌、骨格筋、皮膚、脳皮質、小脳、脊髄、末梢神経、下垂体、副腎、唾液腺、乳腺、甲状腺、副甲状腺、精巣、前立腺、精巣上体、子宮頸上皮、肺実質、食道、小腸上皮、結腸上皮、膀胱上皮、胆嚢上皮を含む正常組織の大部分で検出されていない。Chang K, et al., Cancer Res. 1992;52(1):181-186。
【０００６】
メソテリンは原発膵臓腺癌の大部分で過発現されており、良性膵臓組織での発現は稀であり、弱い。Argani P, et al. Clin Cancer Res. 2001;7(12):3862-3868。上皮性悪性胸膜中皮腫(ＭＰＭ)は普遍的にメソテリンを発現し、一方肉腫様ＭＰＭはメソテリンを発現しない。大部分の漿液性上皮性卵巣癌および関連原発腹膜癌はメソテリンを発現する。
【０００７】
メソテリンは、卵巣癌における天然免疫応答の標的であり、癌免疫療法の標的となることが提案されている。Bracci L, et al. Clin Cancer Res. 2007;13(2 Pt 1):644-653; Moschella F, et al. Cancer Res. 2011;71(10):3528-3539; Gross G, et al. FASEB J. 1992;6(15):3370-3378; Sadelain M, et al. NatRevCancer. 2003;3(1):35-45; Muul LM, et al. Blood. 2003;101(7):2563-2569; Yee C, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(25):16168-16173。膵臓癌を有する患者におけるメソテリン特異的ＣＴＬの存在は、全生存と相関する。Thomas AM, et al. J Exp Med. 2004;200:297-306。さらに、Pastanおよび同僚は、メソテリン陽性腫瘍を有する癌患者の処置に、免疫毒素とコンジュゲートした抗メソテリン抗体の可溶性抗体フラグメントを使用している。この試みは、膵臓癌において妥当な安全性およびいくぶんかの臨床活性を示している。Hassan R, et al. Cancer Immun. 2007;7:20およびHassan R, et al. Clin Cancer Res. 2007;13(17):5144-5149。卵巣癌において、この治療戦略は、一名でＲＥＣＩＳＴ基準による軽微な応答および第二の患者で疾患安定を生じ、後者は腹水も完全に解消している。
【発明の概要】
【０００８】
発明の要約
本発明は、少なくとも一部、メソテリンに特異的に結合するキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現する細胞、例えば、免疫エフェクター細胞(ここでは“メソテリンＣＡＲ発現細胞”とも称する)およびプログラム死リガンド１阻害剤(ここでは“ＰＤ−Ｌ１阻害剤”とも称する)を含む、組み合わせ治療の使用により、対象におけるメソテリンの発現と関連する疾患、例えば、癌を処置するための方法および組成物に関する。ある実施態様において、メソテリンに特異的に結合するＣＡＲは、例えば、ここに記載する、抗原結合ドメイン、例えば、メソテリン結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、抗体分子、ポリペプチド、小分子またはポリヌクレオチド、例えば、阻害性核酸である。ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、抗体分子、例えば、ここに記載する抗体分子である。理論に拘束されることを意図しないが、メソテリン発現と関連する疾患、例えば、ここに記載する癌を有する対象のメソテリンＣＡＲ発現細胞とＰＤ−Ｌ１阻害剤を含む組み合わせ治療での処置は、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞またはＰＤ−Ｌ１阻害剤単独での該疾患を有する対象の処置と比較して、腫瘍進行の阻害または低減を改善すると考えられる。
【０００９】
従って、ある態様において、本発明は、メソテリン発現と関連する疾患、例えば、ここに記載する癌を有する対象を処置する方法に関する。方法は、対象にメソテリンに特異的に結合するＣＡＲおよびＰＤ−Ｌ１阻害剤を含む、例えば、発現する、細胞、例えば、細胞の集団を投与することを含む。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤は、逐次的に投与される。ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、メソテリンＣＡＲ発現細胞投与前に投与される。ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、メソテリンＣＡＲ発現細胞投与後に投与される。ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤およびメソテリンＣＡＲ発現細胞は、同時にまたは一緒に投与される。
【００１０】
ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞例えば、ここに記載するメソテリンＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤は、処置インターバルで投与する。ある実施態様において、処置インターバルは、ＰＤ−Ｌ１阻害剤１回投与およびＣＡＲ発現細胞１回投与を含む。他の実施態様において、処置インターバルは、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の第一および第二の投与およびＣＡＲ発現細胞１回投与を含む。
【００１１】
処置インターバルがＰＤ−Ｌ１阻害剤１回投与およびＣＡＲ発現細胞１回投与を含む実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤をＣＡＲ発現細胞投与前に投与し、処置インターバルはＰＤ−Ｌ１阻害剤投与により開始され、ＣＡＲ発現細胞投与により完了する。ある実施態様において、処置インターバルは、さらに、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の１以上、例えば、１、２、３、４または５またはそれ以上の続く投与を含む。このような実施態様において、処置インターバルは、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の２、３、４、５、６またはそれ以上の投与およびＣＡＲ発現細胞の１回投与を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞を、ＰＤ−Ｌ１阻害剤投与後少なくとも２日、３日、４日、５日、６日、７日または２週間後に投与する。１を超えるＰＤ−Ｌ１阻害剤が投与される実施態様において、ＣＡＲ発現細胞をＰＤ−Ｌ１阻害剤の最初の投与または処置インターバル開始少なくとも２日、３日、４日、５、日、６日、７日または２週間後に投与する。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ＰＤ−Ｌ１阻害剤投与約２日後に投与される。
【００１２】
処置インターバルがＰＤ−Ｌ１阻害剤の第一および第二の投与およびＣＡＲ発現細胞の１回投与を含む実施態様において、ＣＡＲ発現細胞を、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の第一の投与後、しかし、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の第二の投与前に投与する。このような実施態様において、処置インターバルは、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の第一の投与により開始され、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の第二の投与により完了する。ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の第二の投与は、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の第一の投与少なくとも５日、７日、１週、２週、３週または４週間後に投与される。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の第一の投少なくとも２日、３日、４日、５日、６日、７日または２週間後に投与される。ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の第二の投与は、ＣＡＲ発現細胞投与少なくとも２日、３日、４日、５日、６日、７日、２週間または３週間後に投与される。
【００１３】
ある実施態様において、ここに記載する処置インターバルの何れも、１回以上、例えば、１回、２回、３回、４回または５回またはそれ以上繰り返してよい。ある実施態様において、処置インターバルを、２処置インターバルを含む処置レジメンをもたらすように、１回繰り返す。ある実施態様において、反復処置インターバルを、第一のまたは先の処置インターバル完了少なくとも１日、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日または２週間後、適用する。ある実施態様において、反復処置インターバルは、第一のまたは先の処置インターバル終了少なくとも３日後、適用される。
【００１４】
ある実施態様において、ここに記載する処置インターバルの何れも、１以上、例えば、１、２、３、４または５のその後の処置インターバルが続き得る。１以上のその後の処置インターバルは、第一のまたは先の処置インターバルと異なる。例として、ＰＤ−Ｌ１阻害剤１回投与およびＣＡＲ発現細胞１回投与からなる第一処置インターバルに、ＰＤ−Ｌ１阻害剤２回投与およびＣＡＲ発現細胞１回投与からなる第二処置インターバルが続く。ある実施態様において、１以上のその後の処置インターバルを、第一のまたは先の処置インターバル完了少なくとも１日、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日または２週間後、適用する。
【００１５】
ここに記載する方法の何れかにおいて、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の１以上のその後の投与、例えば、１、２、３、４または５またはそれ以上の投与を、１以上の処置インターバル完了後に適用する。処置インターバルを繰り返すまたは２以上の処置インターバルが適用される実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の１以上のその後の投与、例えば、１、２、３、４または５またはそれ以上の投与を、ある処置インターバルの完了後かつ次の処置インターバルの開始前に適用する。ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤を、１以上のまたは各処置インターバル完了後５日、７日、２週、３週または４日毎に投与する。
【００１６】
ここに記載する方法の何れかにおいて、１以上、例えば、１、２、３、４または５またはそれ以上のＣＡＲ発現細胞のその後の投与は、１以上の処置インターバル完了後に適用される。処置インターバルを繰り返すまたは２以上の処置インターバルが適用される実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の１以上のその後の投与、例えば、１、２、３、４または５またはそれ以上の投与は、ある処置インターバルの完了後かつ次の処置インターバル開始前に適用される。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞を、１以上のまたは各処置インターバル完了後２日、３日、４日、５日、７日、２週、３週または４週毎に投与する。
【００１７】
ある実施態様において、処置インターバルは、ＣＡＲ発現細胞１回投与前に投与されるＰＤ−Ｌ１阻害剤１回投与を含む。この実施態様において、ＣＡＲ発現細胞を、ＰＤ−Ｌ１阻害剤投与２日後に投与する。処置インターバルは１回繰り返され、第二処置インターバルは、第一処置インターバル完了、例えば、ＣＡＲ発現細胞１回投与３日後に開始される。ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、第二処置インターバル完了後５日毎に投与され、例えば、ＰＤ−Ｌ１阻害剤が１回以上、第二処置インターバル後５日、７日、２週、３週または４週毎に投与される。
【００１８】
ここに記載する方法の何れかにおいて、対象は、ＣＡＲ発現細胞１回投与およびＰＤ−Ｌ１阻害剤１回投与が適用される。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞１回投与が、ＰＤ−Ｌ１阻害剤１回投与少なくとも２日、例えば、２日、３日、４日、５日、６日、７日または２週間後、適用される。
【００１９】
ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の１以上、例えば、１、２、３、４または５のその後の投与が、ＣＡＲ発現細胞の最初の投与後対象に適用される。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の１以上のその後の投与が、ＣＡＲ発現細胞の先の投与少なくとも２日、例えば、２日、３日、４日、５日、６日、７日または２週間後に適用される。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の１以上のその後の投与が、ＣＡＲ発現細胞の先の投与少なくとも５日後に適用される。ある実施態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞を週３回または２日毎に１回投与される。
【００２０】
ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の１以上、例えば、１、２、３、４または５のその後の投与が、ＰＤ−Ｌ１阻害剤１回投与後に適用される。ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の１以上のその後の投与が、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の先の投与少なくとも５日、７日、２週、３週または４週間後に適用される。
【００２１】
ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の１以上のその後の投与は、ＣＡＲ発現細胞の投与、例えば、ＣＡＲ発現細胞の最初の投与少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日後、適用される。
【００２２】
ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の１以上、例えば、１、２、３、４または５の投与を、ＣＡＲ発現細胞を最初の投与の前に適用する。
【００２３】
ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の１回以上の投与およびＰＤ−Ｌ１阻害剤の１回以上の投与は、例えば、１回、２回、３回、４回または５回またはそれ以上反復される。
【００２４】
ここに記載する投与レジメンまたは処置インターバルの何れにおいても、メソテリンＣＡＲ発現細胞の用量は、少なくとも約１×１０７、１.５×１０７、２×１０７、２.５×１０７、３×１０７、３.５×１０７、４×１０７、５×１０７、１×１０８、１.５×１０８、２×１０８、２.５×１０８、３×１０８、３.５×１０８、４×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９または５×１０９細胞含む。ある実施態様において、メソテリンＣＡＲ発現細胞の用量は、少なくとも約１〜３×１０７〜１〜３×１０８含む。ある実施態様において、対象に約１〜３×１０７メソテリンＣＡＲ発現細胞投与する。他の実施態様において、対象に約１〜３×１０８メソテリンＣＡＲ発現細胞投与する。
【００２５】
ここに記載する投与レジメンの何れにおいても、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、例えば、ここに記載する抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子の用量は、約１〜３０mg／kg、例えば、約５〜２５mg／kg、約１０〜２０mg／kg、約１〜５mg／kgまたは約３mg／kgを含む。ある実施態様において、用量は約１０〜２０mg／kgである。ある実施態様において、用量は約１〜５mg／kgである。ある実施態様において、用量は５mg／kg未満、４mg／kg未満、３mg／kg未満、２mg／kg未満または１mg／kg未満である。
【００２６】
他の態様において、本発明は、ここに記載するメソテリンＣＡＲを発現する細胞およびここに記載するＰＤ−Ｌ１阻害剤を含む組成物(例えば、１以上の投与量製剤、組み合わせまたは１以上の医薬組成物)に関する。ある実施態様において、メソテリンＣＡＲは、ここに記載する、メソテリン抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、メソテリンＣＡＲは、表２に挙げるメソテリン抗原結合ドメインを含む。ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、抗体分子、小分子、ポリペプチド、例えば、融合タンパク質または阻害性核酸、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む。ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、抗体分子、例えば、表６に挙げる抗体分子を含む。ＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤は同一または異なる製剤または医薬組成物に存在し得る。
【００２７】
他の態様において、本発明は、メソテリンの発現と関連する疾患、例えば、ここに記載する癌の処置方法において使用するための、ここに記載するメソテリンＣＡＲを発現する細胞およびここに記載するＰＤ−Ｌ１阻害剤を含む組成物(例えば、１以上の投与量製剤、組み合わせまたは１以上の医薬組成物)に関する。ある実施態様において、メソテリンＣＡＲは、ここに記載する、メソテリン抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、メソテリンＣＡＲは、表２に挙げるメソテリン抗原結合ドメインを含む。ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、抗体分子、小分子、ポリペプチド、例えば、融合タンパク質または阻害性核酸、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む。ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、抗体分子、例えば、表６に挙げる抗体分子を含む。ＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤は同一または異なる製剤または医薬組成物に存在し得る。
【００２８】
ＰＤ−Ｌ１阻害剤
ここに提供されるのは、ここに記載する方法または組成物の何れかに使用するためのＰＤ−Ｌ１阻害剤である。ここに記載する方法または組成物の何れにおいても、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、抗体分子、小分子、ポリペプチド、例えば、融合タンパク質または阻害性核酸、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む。
【００２９】
ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、次の１以上により特徴付けられる。
ＰＤ−Ｌ１発現、例えば、ＰＤ−Ｌ１の転写または翻訳の阻害または低減；ＰＤ−Ｌ１活性の阻害または低減、例えば、ＰＤ−Ｌ１のその受容体、例えば、ＰＤ−１またはＣＤ８０(Ｂ７−１)または両方への結合の阻害または低減；またはＰＤ−Ｌ１またはその受容体、例えば、ＰＤ−１への結合。
【００３０】
ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は抗体分子である。ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、ＹＷ２４３.５５.Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ(アテゾリズマブ)、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＳＢ−００１０７１８Ｃ(アベルマブ)、ＭＤＸ−１１０５および表６に挙げる何れかの抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子からなる群から選択される。
【００３１】
ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、表６に挙げる何れかのＰＤ−Ｌ１抗体分子アミノ酸配列の重鎖相補性決定領域１(ＨＣ  ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ  ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ  ＣＤＲ３)；および表６に挙げる何れかのＰＤ−Ｌ１抗体分子アミノ酸配列の軽鎖相補性決定領域１(ＬＣ  ＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣ  ＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣ  ＣＤＲ３)を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子を含む。
【００３２】
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、配列番号２８７、２９０または１９５から選択されるＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２８８のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列および配列番号２８９のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；および配列番号２９５のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２９６のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列および配列番号２９７のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号２８７、２９０または１９５から選択されるＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２９１のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列および配列番号２９２のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；および配列番号２９８のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２９９のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列および配列番号３００のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【００３３】
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、表６に挙げる何れかの重鎖可変領域のアミノ酸配列、例えば、配列番号３０４、３１６、３２４、３３２、３３６、３４０、３４８、３５６または３６４を含む重鎖可変領域を含む。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、表６に挙げる何れかの重鎖可変領域のアミノ酸配列、例えば、配列番号３０４、３１６、３２４、３３２、３３６、３４０、３４８、３５６または３６４に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、表６に挙げる何れかの重鎖可変領域のアミノ酸配列、例えば、配列番号３０４、３１６、３２４、３３２、３３６、３４０、３４８、３５６または３６４と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００３４】
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、表６に挙げる何れかの重鎖のアミノ酸配列、例えば、配列番号３０６、３１８、３２６、３３４、３３８、３４２、３５０、３５８、３６６、３９３、３７７または３８２を含む重鎖を含む。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、表６に挙げる何れかの重鎖、例えば、配列番号３０６、３１８、３２６、３３４、３３８、３４２、３５０、３５８、３６６、３９３、３７７または３８２に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列を含む重鎖を含む。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、表６に挙げる何れかの重鎖のアミノ酸配列、例えば、配列番号３０６、３１８、３２６、３３４、３３８、３４２、３５０、３５８、３６６、３９３、３７７または３８２と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【００３５】
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、表６に挙げる何れかの軽鎖可変領域のアミノ酸配列、例えば、配列番号３０８、３１２、３２０、３２８、３４４、３５２、３６０、３６８または３７２を含む軽鎖可変領域を含む。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、表６に挙げる何れかの軽鎖可変領域のアミノ酸配列、例えば、配列番号３０８、３１２、３２０、３２８、３４４、３５２、３６０、３６８または３７２に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、表６に挙げる何れかの軽鎖可変領域のアミノ酸配列、例えば、配列番号３０８、３１２、３２０、３２８、３４４、３５２、３６０、３６８または３７２と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３６】
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、表６に挙げる何れかの軽鎖のアミノ酸配列、例えば、配列番号３１０、３１４、３２２、３３０、３４６、３５４、３６２、３７０または３７４を含む軽鎖を含む。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、表６に挙げる何れかの軽鎖、例えば、配列番号３１０、３１４、３２２、３３０、３４６、３５４、３６２、３７０または３７４に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、表６に挙げる何れかの軽鎖のアミノ酸配列、例えば、配列番号３１０、３１４、３２２、３３０、３４６、３５４、３６２、３７０または３７４と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００３７】
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、
ｉ)配列番号３０４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３０８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
ii)配列番号３０４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
iii)配列番号３０４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３７２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
iv)配列番号３１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
ｖ)配列番号３１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
vi)配列番号３２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
vii)配列番号３２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３６０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
viii)配列番号３３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
ix)配列番号３３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
ｘ)配列番号３３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３０８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
xi)配列番号３３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３７２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
xii)配列番号３４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
xiii)配列番号３４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３７２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
xiv)配列番号３４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
xv)配列番号３４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
xvi)配列番号３５６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；または
xvii)配列番号７８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３６８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む。
【００３８】
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、
ｉ)配列番号３０６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３１０のアミノ酸配列を含む軽鎖；
ii)配列番号３０６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号２１４のアミノ酸配列を含む軽鎖；
iii)配列番号３０６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３７４のアミノ酸配列を含む軽鎖；
iv)配列番号３１８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３２２のアミノ酸配列を含む軽鎖；
ｖ)配列番号３１８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３５４のアミノ酸配列を含む軽鎖；
vi)配列番号３２６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３３０のアミノ酸配列を含む軽鎖；
vii)配列番号３２６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３６２のアミノ酸配列を含む軽鎖；
viii)配列番号３３４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３３０のアミノ酸配列を含む軽鎖；
ix)配列番号３３８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３３０のアミノ酸配列を含む軽鎖；
ｘ)配列番号３３８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３１０のアミノ酸配列を含む軽鎖；
xi)配列番号３３８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３７４のアミノ酸配列を含む軽鎖；
xii)配列番号３４２のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３４６のアミノ酸配列を含む軽鎖；
xiii)配列番号３４２のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３７４のアミノ酸配列を含む軽鎖；
xiv)配列番号３５０のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３５４のアミノ酸配列を含む軽鎖；
xv)配列番号３５０のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３７４のアミノ酸配列を含む軽鎖；
xvi)配列番号３５８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３５４のアミノ酸配列を含む軽鎖；
xvii)配列番号３６６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３７０のアミノ酸配列を含む軽鎖；
xviii)配列番号３９３のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３２２のアミノ酸配列を含む軽鎖；
xix)配列番号９１のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３３０のアミノ酸配列を含む軽鎖；または
xx)配列番号３８２のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３５４のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む。
【００３９】
メソテリンＣＡＲ発現細胞
ここに提供されるのは、ここに記載する方法または組成物の何れかにおいて使用するための、メソテリンを標的とする、例えば、特異的に結合する、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現する細胞、例えば、免疫エフェクター細胞である。メソテリンに特異的に結合するＣＡＲはここでは“メソテリンＣＡＲ”または“ｍｅｓｏＣＡＲ”とも称する。ここに記載するメソテリンＣＡＲ発現細胞により発現されるメソテリンＣＡＲは、メソテリン結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む。
【００４０】
ある実施態様において、メソテリン結合ドメインは、表２に挙げる何れかのメソテリン重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖相補性決定領域１(ＨＣ  ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ  ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ  ＣＤＲ３)；および表２に挙げる何れかのメソテリン軽鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖相補性決定領域１(ＬＣ  ＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣ  ＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣ  ＣＤＲ３)を含む。ある実施態様において、メソテリン結合ドメインは、表４におけるＨＣ  ＣＤＲアミノ酸配列に従うＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３および表５におけるＬＣ  ＣＤＲアミノ酸配列に従うＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３を含む。
【００４１】
ある実施態様において、メソテリン結合ドメインは、配列番号４３、配列番号４９、配列番号２７５、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１または配列番号６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む(例えば、それからなる)。ある実施態様において、メソテリン結合ドメインは、配列番号４３、配列番号４９、配列番号２７５、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１または配列番号６２の何れかに少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列を含む(例えば、それからなる)。ある実施態様において、メソテリン結合ドメインは、配列番号４３、配列番号４９、配列番号２７５、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１または配列番号６２の何れかのアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む(例えば、それからなる)。
【００４２】
ある実施態様において、メソテリンＣＡＲは、タンパク質、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択される、例えば、ここに記載するタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインである。ある実施態様において、膜貫通ドメインは、配列番号６の配列を含む。ある実施態様において、膜貫通ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号６のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性の配列または配列番号６のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性の配列を含む。ある実施態様において、膜貫通ドメインの核酸配列は、配列番号１７のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００４３】
ある実施態様において、メソテリン結合ドメインは、ヒンジ領域、例えば、ここに記載するヒンジ領域により膜貫通ドメインに結合される。ある実施態様において、コードヒンジ領域は、配列番号２またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある実施態様において、ヒンジ領域をコードする核酸配列は、配列番号１３のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００４４】
ある実施態様において、単離核酸分子は、さらに共刺激ドメイン、例えば、ここに記載する共刺激ドメインをコードする配列を含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む。
【００４５】
ある実施態様において、共刺激ドメインは、例えば、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群から選択される、例えば、ここに記載する、タンパク質からの機能的シグナル伝達ドメインである。
【００４６】
ある実施態様において、４−１ＢＢの共刺激ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、コードされる共刺激ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある実施態様において、該共刺激ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１８のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。他の実施態様において、ＣＤ２８の共刺激ドメインは、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、共刺激ドメインは、配列番号４３のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号４３のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある実施態様において、ＣＤ２８の共刺激ドメインをコードする核酸配列は、配列番号４４のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。他の実施態様において、ＣＤ２７の共刺激ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、共刺激ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号８のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある実施態様において、ＣＤ２７の共刺激ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１９のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。他の実施態様において、ＩＣＯＳの共刺激ドメインは、配列番号４５のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＩＣＯＳの共刺激ドメインは、配列番号４５のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号４５のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある実施態様において、ＩＣＯＳの共刺激ドメインをコードする核酸配列は、配列番号４６のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００４７】
ある実施態様において、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインは、配列番号９(変異体ＣＤ３ゼータ)または配列番号１０(野生型ヒトＣＤ３ゼータ)のアミノ酸配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００４８】
ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７の配列および／または配列番号９または配列番号１０のＣＤ３ゼータアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列および／または配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列および／または配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは配列番号７の配列および配列番号９または配列番号１０の配列を含み、ここで、これら細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は同じフレームにかつ単一ポリペプチド鎖として発現される。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１８のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列および／または配列番号２０または配列番号２１のＣＤ３ゼータヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００４９】
ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７の機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、コードされるＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列および／または配列番号９または配列番号１０のＣＤ３ゼータアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列および／または配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号８のアミノ酸配列および／または配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８の配列および配列番号９または配列番号１０の配列を含み、ここで、これら細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は同じフレームにかつ単一ポリペプチド鎖として発現される。ある実施態様において、ＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１９のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列および／または配列番号２０または配列番号２１のＣＤ３ゼータヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００５０】
ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８の機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４３のアミノ酸配列および／または配列番号９または配列番号１０のＣＤ３ゼータアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４３のアミノ酸配列および／または配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号４３のアミノ酸配列および／または配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４３の配列および配列番号９または配列番号１０の配列を含み、ここで、これら細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は同じフレームにかつ単一ポリペプチド鎖として発現される。ある実施態様において、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号４４のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列および／または配列番号２０または配列番号２１のＣＤ３ゼータヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００５１】
ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＣＯＳの機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、ＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４５のアミノ酸配列および／または配列番号９または配列番号１０のＣＤ３ゼータアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４５のアミノ酸配列および／または配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号４５のアミノ酸配列および／または配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４５の配列および配列番号９または配列番号１０の配列を含み、ここで、これら細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は同じフレームにかつ単一ポリペプチド鎖として発現される。ある実施態様において、ＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号４６のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列および／または配列番号２０または配列番号２１のＣＤ３ゼータヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００５２】
ある実施態様において、メソテリンＣＡＲは、さらに、配列番号１のアミノ酸配列を含むリーダー配列を含む。
【００５３】
ある実施態様において、メソテリンＣＡＲは、配列番号６７；配列番号７３、配列番号２７８、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の何れかのアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、メソテリンＣＡＲは、配列番号６７、配列番号７３、配列番号２７８、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の何れかに少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、メソテリンＣＡＲは、配列番号６７；配列番号７３、配列番号２７８、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の何れかと９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００５４】
ここに記載する方法および組成物の何れかの実施態様において、ＣＡＲを含む細胞は、ＣＡＲをコードする核酸を含む。
【００５５】
ある実施態様において、ＣＡＲをコードする核酸は、レンチウイルスベクターである。ある実施態様において、ＣＡＲをコードする核酸は、細胞にレンチウイルス形質導入により導入される。ある実施態様において、ＣＡＲをコードする核酸は、ＲＮＡ、例えば、インビトロ転写ＲＮＡである。ある実施態様において、ＣＡＲをコードする核酸は、細胞にエレクトロポレーションにより導入される。
【００５６】
ここに記載する方法および組成物の何れかの実施態様において、細胞はＴ細胞またはＮＫ細胞である。ある実施態様において、Ｔ細胞は、自己または同種Ｔ細胞である。
【００５７】
ある実施態様において、方法は、ここに記載する疾患を処置するための付加的治療剤、例えば、抗癌治療剤をさらに投与することを含む。
【００５８】
ここに記載する方法および組成物の何れかの実施態様において、メソテリン発現と関連する疾患は癌である。ある実施態様において、癌は、中皮腫、悪性胸膜中皮腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、扁平上皮細胞肺癌または大細胞肺癌、膵臓癌、膵管腺癌、膵臓転移、卵巣癌または結腸直腸癌および膀胱癌またはその転移の１以上から選択される。
【００５９】
ここに記載する方法および組成物の何れかの実施態様において、対象は、哺乳動物、例えば、ヒトである。ある実施態様において、対象は、ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２を発現する。ある実施態様において、対象における癌細胞または癌細胞に近接する細胞、例えば、癌関連細胞は、ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２を発現する。ある実施態様において、癌関連細胞は、抗腫瘍免疫細胞、例えば、腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ)である。
【００６０】
ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ここに記載するメソテリンＣＡＲ発現細胞は、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１を発現する。
【００６１】
特に断らない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野における当業者により共通して理解されるのと同じ意味を有する。ここに記載するものに類似するまたは均等な方法および材料が本発明の実施または試験に際して使用され得るが、適当な方法および材料は下に記載する。ここに記載する全ての刊行物、特許出願、特許およびその他の文献は、引用によりその全体を本明細書に包含させる。さらに、材料、方法および例は説明のためのみであり、限定を意図するものではない。表題、副題または番号もしくは文字を付した要素、例えば、(ａ)、(ｂ)、(ｉ)等は、読みやすくするためだけに付される。本明細書における表題または番号もしくは文字を付した要素は、該工程もしくは要素がアルファベット順に行われなければならないことまたは工程もしくは要素が必ず互いに分かれていることを必要とするものではない。本発明の他の特性、目的および利点は、明細書および図面ならびに特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１Ａ】図１Ａは、ＣＡＲ  Ｔ細胞上のＰＤ−１の発現のフローサイトメトリー解析を示す。ＰＤ−１を発現するＣＤ８＋  ＣＡＲ＋細胞のパーセンテージを示す。骨髄、脾臓および腫瘍を、Ｐａｎｃ０２.０３腫瘍担持ＮＳＧマウスに養子移入３０日後に解析した。ＣＡＲ  Ｔ細胞他の臓器ではなく、腫瘍から採取したＣＡＲ  Ｔ細胞は、大部分ＰＤ−１発現に陽性であった(６０％を超える)。ＣＡＲＴを、抗ＣＤ８ａ(BioLegend、ＲＰＡＴ８)、抗ＰＤ−１(BD Bioscience、ＥＨ１２.１)、抗ＰＤ−Ｌ１(BD Bioscience、Ｍ１Ｈ１)、タンパク質Ｌ−ビオチンおよびストレプトアビジン−ＰＥで染色した。
【００６３】
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｐａｎｃ０２.０３癌細胞上のＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の発現のフローサイトメトリー解析を示す。図１Ａで解析したのと同じ腫瘍から、インビトロおよびエクスビボの両方で解析したときの、Ｐａｎｃ０２.０３癌細胞によるＰＤＬ１およびＰＤ−Ｌ２両方の発現を示す。癌細胞を抗ＰＤ−Ｌ１(BioLegend、２９Ｅ.２Ａ３)および抗ＰＤＬ２(BioLegend、２４Ｆ.１０Ｃ１２)で染色した。
【００６４】
【図２】図２は、メソテリンＣＡＲＴおよびＰＤ−Ｌ１阻害剤での種々の組み合わせ処置後の腫瘍進行を示すグラフであり、ここで、ＰＤ−Ｌ１阻害剤はＣＡＲ投与前に投与された。ＰＤ−Ｌ１抗体を＃で示す時点で投与した。記載したＣＡＲ発現細胞を、＊で示す時点で投与した。組織を採取した時点は、Ｘ軸上の星印で示す。
【００６５】
【図３】図３は、メソテリンＣＡＲＴおよびＰＤ−Ｌ１阻害剤での種々の組み合わせ処置後の腫瘍進行のグラフであり、ここで、ＰＤ−Ｌ１阻害剤をＣＡＲ投与後に投与した。ＰＤ−Ｌ１抗体を＃で示す時点で投与した。記載したＣＡＲ発現細胞を、＊で示す時点で投与した。
【００６６】
【図４】図４は、Ｍ５メソテリンＣＡＲＴ処置後のＰａｎｃ異種移植組織の免疫組織化学的解析からの一連の画像である。
【００６７】
【図５】図５は、Ｍ５メソテリンＣＡＲＴ処置後のＰａｎｃ異種移植組織の免疫組織化学的解析からの一連の画像である。
【００６８】
【図６】図６は、ＣＡＲ発現、形質導入Ｔ細胞の増殖が、細胞培養系における低用量のＲＡＤ００１により増強されることを示す。ＣＡＲＴを、種々の濃度のＲＡＤ００１の存在下、Ｎａｌｍ−６細胞と共培養した。ＣＡＲ陽性ＣＤ３陽性Ｔ細胞(黒色)および総Ｔ細胞(灰色)の数を,共培養４日後に評価した。
【００６９】
【図７】図７は、ＲＡＤ００１連日０.３mg／kg、１mg／kg、３mg／kgおよび１０mg／kg(ｍｐｋ)投与または媒体投与でのＮＡＬＭ６−ｌｕｃ細胞の腫瘍増殖測定を記載する。丸は媒体を示し、四角は１０mg／kg用量のＲＡＤ００１を示し、三角は３mg／kg用量のＲＡＤ００１を示し、逆三角は１mg／kg用量のＲＡＤ００１を示し、菱形は０.３mg／kg用量のＲＡＤ００１を示す。
【００７０】
【図８】図８Ａおよび８Ｂを含む図８は、ＮＡＬＭ６腫瘍を有するＮＳＧマウスの血液におけるＲＡＤ００１の量を示す薬物動態曲線を示す。図８Ａは、ＲＡＤ００１の最初の投与後０日目のＰＫを示す。図８Ｂは、ＲＡＤ００１の最後の投与後１４日目のＰＫを示す。菱形は１０mg／kg用量のＲＡＤ００１を示し、四角は１mg／kg用量のＲＡＤ００１を示し、三角は３mg／kg用量のＲＡＤ００１を示し、ｘは１０mg／kg用量のＲＡＤ００１を示す。
【００７１】
【図９】図９Ａおよび９Ｂを含む図９は、ＲＡＤ００１投与を併用するおよび併用しないヒト化ＣＤ１９  ＣＡＲＴ細胞のインビボ増殖を示す。低用量のＲＡＤ００１(０.００３mg／kg)連日は、ｈｕＣＡＲ１９増殖の正常レベルを超えるＣＡＲ  Ｔ細胞増殖の増強に至った。図９Ａは、ＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞を示し、図９ＢはＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞を示す。白丸はＰＢＳを示し、四角はｈｕＣＴＬ０１９を示し、三角はｈｕＣＴＬ０１９と３mg／kg  ＲＡＤ００１を示し、逆三角はｈｕＣＴＬ０１９と０.３mg／kg  ＲＡＤ００１を示し、菱形はｈｕＣＴＬ０１９と０.０３mg／kg  ＲＡＤ００１を示し、黒丸はｈｕＣＴＬ０１９と０.００３mg／kg  ＲＡＤ００１を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
詳細な記載
定義
特に断らない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野における当業者により共通して理解されるのと同じ意味を有する。
【００７３】
単数表現は、文法的対象の１または１を超える(すなわち、少なくとも１)を意味する。例として、“要素”は、１要素または１を超える要素を意味する。
【００７４】
用語“約”は、量、期間などの測定可能な値をいうとき、±２０％またはある場合±１０％の逸脱またはある場合±５％またはある場合±１％またはある場合±０.１％の逸脱を、このような逸脱が開示の方法の実施に適する限り、包含することを意味する。
【００７５】
ここで使用する“組み合わせた”投与は、２(またはそれ以上)の異なる処置が、対象の障害罹患経過中に対象に送達されることを意味し、例えば、２以上の処置が、対象が障害を有すると診断された後かつ障害が治癒もしくは解消されるかまたは処置が他の理由で中止される前に送達される。ある実施態様において、一方の処置の送達は、投与の重複期間があるように、第二剤の送達時にまだ行われていてよい。これは、ここでは、“同時”または“一括送達”と称することがある。他の実施態様において、一方の処置の送達は、他方の処置の開始前に終了する。何れかの場合のある実施態様において、処置は、組み合わせ投与のためにより効果的である。例えば、第二処置は、第二処置が第一処置非存在下に投与されたときに見られるよりも効果的である、例えば、少ない第二処置で同等な効果画見られるかまたは第二処置が症状をより大きな程度軽減し、または同様の状況が第一処置で見られる。ある実施態様において、送達は、症状または障害と関連する他のパラメータの軽減が、一方の処置を他方の非存在下に送達したときに見られるように大きな程度であるようなものである。２処置の効果は、部分的相加、完全相加または相加より大きくてよい。送達は、送達した第一処置の効果が、第二処置送達時になお検出可能であるようなものであり得る。
【００７６】
用語“キメラ抗原受容体”あるいは“ＣＡＲ”は、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび下に定義する刺激分子由来の細胞質シグナル伝達ドメイン(ここでは“細胞内シグナル伝達ドメイン”とも称する)を含む、組み換えポリペプチド構築物をいう。ある実施態様において、ＣＡＲポリペプチド構築物におけるこれらドメインは同じポリペプチド鎖にある、例えば、キメラ融合タンパク質を含む。ある実施態様において、ＣＡＲポリペプチド構築物におけるこれらドメインは、互いに連続しておらず、例えば、ここに記載するＲＣＡＲに提供されるように、例えば、異なるポリペプチド鎖にある。
【００７７】
ある態様において、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体と関連するゼータ鎖である。ある態様において、細胞質シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメイン)を含む。ある態様において、細胞質シグナル伝達ドメインは、さらに、下に定義する少なくとも１共刺激分子に由来する１以上の機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、共刺激分子は、４−１ＢＢ(すなわち、ＣＤ１３７)、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよび／またはＣＤ２８から選択される。ある態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび１以上の共刺激分子由来の２個の機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび少なくとも１以上の共刺激分子由来の２個の機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある態様において、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端(Ｎ−ｔｅｒ)に任意的リーダー配列を含む。ある態様において、ＣＡＲはさらに細胞外抗原結合ドメインのＮ末端にリーダー配列を含み、ここで、リーダー配列は、細胞プロセシングおよびＣＡＲの細胞膜への局在化の間に抗原認識ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)から所望により開裂される。
【００７８】
用語“シグナル伝達ドメイン”は、第二メッセンジャーの産生によりまたはこのようなメッセンジャーに応答することによりエフェクターとして機能することにより、規定シグナル伝達経路を経て細胞活性を制御するために細胞内の情報を伝達することにより作用する、タンパク質の機能的部分をいう。ある態様において、ここに記載するＣＡＲのシグナル伝達ドメインはここに記載する刺激分子または共刺激分子に由来するまたは合成もしくは改変シグナル伝達ドメインである。
【００７９】
ここで使用する用語“メソテリン”は、グリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)結合および巨核球増強因子(ＭＰＦ)と称されるアミノ末端３１kDa脱落フラグメントにより、細胞膜に固定される、４０kDaタンパク質、メソテリンをいう。両フラグメントはＮ−グリコシル化部位を含む。本用語はまた“可溶性メソテリン／ＭＰＦ関連”とも称される、４０kDaカルボキシル末端フラグメントの可溶性スプライスバリアントをいう。好ましくは、本用語は、例えば、細胞膜、例えば、癌細胞膜に発現される、GenBank accession number AAH03512.1のヒトメソテリンおよびその自然に開裂される部分をいう。
【００８０】
ここで使用する用語“抗体”または“抗体分子”は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子由来のタンパク質またはポリペプチド配列をいう。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル、複数または一本鎖またはインタクト免疫グロブリンであってよく、天然供給源または組み換え供給源由来であり得る。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であり得る。ある実施態様において、抗体または抗体分子は、抗体フラグメントを含む、例えば、それからなる。
【００８１】
用語“抗体フラグメント”は、インタクト抗体またはその組み換えバリアントの抗体フラグメントの少なくとも一部分をいい、抗原などの標的の認識および特異的結合に貢献するのに十分な、抗原結合ドメイン、例えば、インタクト抗体の抗原決定可変領域をいう。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２およびＦｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、直線状抗体、ｓｄＡｂなどの単一ドメイン抗体(ＶＬまたはＶＨ)、ラクダ類ＶＨＨドメインおよびヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合した２Ｆａｂフラグメントを含む二価フラグメントなどの抗体フラグメントから形成された多特異的抗体および単離ＣＤＲまたは抗体の他のエピトープ結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。抗原結合フラグメントはまた単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、二重特異性抗体、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびビスｓｃＦｖに取り込まれ得る(例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005参照)。抗原結合フラグメントはまたフィブロネクチンIII型(Ｆｎ３)などのポリペプチドに基づくスキャフォールドに移植もされ得る(例えば、フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載する、米国特許６,７０３,１９９号参照)。
【００８２】
用語“ｓｃＦｖ”は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１抗体フラグメントおよび重鎖の可変領域を含む少なくとも１抗体フラグメントを含む融合タンパク質をいい、ここで、軽鎖および重鎖可変領域が短可撓性ポリペプチドリンカーを介して連続的に結合され、一本鎖ポリペプチドとして発現されることができ、ここで、ｓｃＦｖはそれが由来するインタクト抗体の特異性を保持する。断らない限り、ここで使用するｓｃＦｖは、例えば、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に対して、ＶＬおよびＶＨ可変領域を何れの順序で有してもよく、ｓｃＦｖはＶＬ−リンカー−ＶＨを含んでも、ＶＨ−リンカー−ＶＬを含んでもよい。
【００８３】
ここで使用する用語“相補性決定領域”または“ＣＤＲ”は、抗原特異性および結合親和性に貢献する抗体可変領域内のアミノ酸の配列をいう。例えば、一般に、各重鎖可変領域に３ＣＤＲ(例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３)および各軽鎖可変領域に３ＣＤＲ(ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３)ある。あるＣＤＲの厳密なアミノ酸配列境界は、Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(“Ｋａｂａｔ”ナンバリングスキーム)、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948(“Ｃｈｏｔｈｉａ”ナンバリングスキーム)またはこれらの組み合わせに記載のものを含む、何れかの数の周知スキームを使用して、決定できる。Ｋａｂａｔナンバリングスキーム下、ある実施態様において、重鎖可変ドメイン(ＶＨ)は３１〜３５(ＨＣＤＲ１)、５０〜６５(ＨＣＤＲ２)および９５〜１０２(ＨＣＤＲ３)と番号付けられ、軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)におけるＣＤＲアミノ酸残基は２４〜３４(ＬＣＤＲ１)、５０〜５６(ＬＣＤＲ２)および８９〜９７(ＬＣＤＲ３)と番号付けられる。Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム下、ある実施態様において、ＶＨにおけるＣＤＲアミノ酸は２６〜３２(ＨＣＤＲ１)、５２〜５６(ＨＣＤＲ２)および９５〜１０２(ＨＣＤＲ３)と番号付けられ、ＶＬにおけるＣＤＲアミノ酸残基は２６〜３２(ＬＣＤＲ１)、５０〜５２(ＬＣＤＲ２)および９１〜９６(ＬＣＤＲ３)と番号付けられる。組み合わせＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームにおいて、ある実施態様において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲまたは両方の部分であるアミノ酸残基に対応する。例えば、ある実施態様において、ＣＤＲは、ＶＨ、例えば、哺乳動物ＶＨ、例えば、ヒトＶＨにおけるアミノ酸残基２６〜３５(ＨＣＤＲ１)、５０〜６５(ＨＣＤＲ２)および９５〜１０２(ＨＣＤＲ３)およびＶＬ、例えば、哺乳動物ＶＬ、例えば、ヒトＶＬにおけるアミノ酸残基２４〜３４(ＬＣＤＲ１)、５０〜５６(ＬＣＤＲ２)および８９〜９７(ＬＣＤＲ３)に対応する。
【００８４】
本発明のＣＡＲの抗体またはその抗体フラグメントを含む部分は、抗原結合ドメインが、例えば、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、直線状抗体、ｓｄＡｂなどの単一ドメイン抗体(ＶＬまたはＶＨ)、ラクダ類ＶＨＨドメイン、ヒト化抗体、二特異的抗体、抗体コンジュゲートを含む連続ポリペプチド鎖の一部として発現される、多様な形態で存在し得る(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-588)。ある態様において、本発明のＣＡＲの抗原結合ドメインは抗体フラグメントを含む。さらなる態様において、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。
【００８５】
ここで使用する用語“抗体分子”は、少なくとも１免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、タンパク質、例えば、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメントをいう。用語抗体分子は、抗体および抗体フラグメントを包含する。ある実施態様において、抗体分子は、“結合ドメイン”を包含する(ここでは“抗標的(例えば、メソテリン)結合ドメイン”とも称する)。ある実施態様において、抗体分子は多特異的抗体分子であり、例えば、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、ここで、該複数の中の第一免疫グロブリン可変ドメイン配列は第一エピトープに結合特異性を有し、該複数の中の第二免疫グロブリン可変ドメイン配列は第二エピトープに結合特異性を有する。ある実施態様において、多特異的抗体分子は、二特異的抗体分子である。二特異的抗体は、２を超える抗原に特異性を有しない。二特異的抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する第一免疫グロブリン可変ドメイン配列および第二エピトープに結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。
【００８６】
用語“抗体重鎖”は、天然に存在する構造体で抗体分子に存在する２タイプのポリペプチド鎖の大きい方をいい、通常該抗体が属するクラスを決定する。
【００８７】
用語“抗体軽鎖”は、天然に存在する構造体で抗体分子に存在する２タイプのポリペプチド鎖の小さい方をいう。カッパ(κ)およびラムダ(λ)軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプをいう。
【００８８】
用語“組み換え抗体”は、例えば、バクテリオファージまたは酵母発現系により発現された抗体などの、組み換えＤＮＡテクノロジーを使用して産生される抗体をいう。本用語はまた該抗体をコードするＤＮＡ分子の合成により産生されており、該ＤＮＡ分子が抗体タンパク質または該抗体を特徴付けるアミノ酸配列を発現する抗体を意味すると解釈されるべきであり、ここで、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当分野で利用可能であり、周知の組み換えＤＮＡまたはアミノ酸配列テクノロジーを使用して得られたものである。
【００８９】
用語“抗原”または“Ａｇ”は、免疫応答を誘発する分子をいう。この免疫応答は、抗体産生または特異的免疫コンピテント細胞の活性化あるいはそれらの両方を含む。当業者は、事実上全てのタンパク質またはペプチドを含む、あらゆる巨大分子が抗原として作用し得ることを理解する。さらに、抗原は、組み換えまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者は、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含むあらゆるＤＮＡが、それ故に、ここで使用する用語としての“抗原”をコードすることを理解する。さらに、当業者は、抗原が必ずしも遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされることを要しないことを理解する。本発明は、複数の遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含み、かつこれに限定されないことおよびこれらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を誘発するポリペプチドをコードするように種々の組み合わせで配列されていることは容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が全く“遺伝子”によりコードされる必要が全く無いことを理解する。抗原は合成により製造でき、または生物学的サンプルに由来でき、またはポリペプチド以外の巨大分子であり得ることは容易に明らかである。このような生物学的サンプルは、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または他の生物学的成分を含む体液を含み得るが、これらに限定されない。
【００９０】
用語“抗癌効果”は、例えば、腫瘍体積減少、癌細胞数減少、転移数減少、余命延長、癌細胞増殖減少、癌細胞生存短縮または癌性状態と関連する種々の生理学的症状改善を含むが、これらに限定されない種々の手段により顕在化され得る生物学的効果をいう。“抗癌効果”はまた、ペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体が、まず癌を予防する能力によっても顕在化され得る。用語“抗腫瘍効果”は、例えば、腫瘍体積減少、腫瘍細胞数減少、腫瘍細胞増殖減少または腫瘍細胞生存短縮を含むが、これらに限定されない種々の手段により顕在化され得る生物学的効果をいう。
【００９１】
用語“自己”は、後に再導入される個体と同じ個体由来のあらゆる物質をいう。
【００９２】
用語“同種”は、物質が導入される個体と同じ種に属する他の動物由来のあらゆる物質をいう。２以上の個体は、１以上の座位での遺伝子が同一でない場合、互いに同種であると言える。ある態様において、同じ種の個体から得た同種物質は、抗原的に相互作用するので遺伝的に十分非類似である。
【００９３】
用語“異種”は、異なる種の動物由来の移植片をいう。
【００９４】
用語“癌”は、異常細胞の制御されない増殖により特徴付けられる、疾患をいう。癌は、病理組織学的型または侵襲性のステージとは無関係に、すべてのタイプの癌性増殖または発癌過程、転移組織または悪性転換細胞、組織または臓器を含む。癌細胞は局所性にまたは血流およびリンパ系を介して体の他の部分に拡散され得る。種々の癌の例はここに記載されており、中皮腫、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌などを含むが、これらに限定されない。
【００９５】
用語“メソテリンの発現と関連する疾患”は、例えば、癌または悪性腫瘍または中皮過形成などの前癌状態などの増殖性疾患またはメソテリンを発現する細胞と関連する非癌関連兆候を含む、メソテリンの発現と関連する疾患またはメソテリンを発現する細胞と関連する状態を含むが、これらに限定されない。メソテリンを発現する種々の癌の例は、中皮腫、肺癌、卵巣癌、膵臓癌などを含むが、これらに限定されない。
【００９６】
用語“保存的配列修飾”は、アミノ酸配列を含む抗体または抗体フラグメントの結合特性に顕著に影響しないまたは変えないアミノ酸修飾をいう。このような保存的修飾はアミノ酸置換、付加および欠失を含む。修飾は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在変異誘発などの当分野で知られる標準技術により本発明の抗体または抗体フラグメントに導入され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基に置換されるものである。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。それ故に、本発明のＣＡＲ内の１以上アミノ酸残基を同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基で置き換えてよく、改変ＣＡＲを、例えば、ここに記載する機能的アッセイを使用して、メソテリンに結合する能力について、試験し得る。
【００９７】
用語“刺激”は、刺激分子(例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＡＲ)とその同族リガンド(またはＣＡＲの場合腫瘍抗原)の結合により誘発され、それにより、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を経るシグナル伝達またはＣＡＲの適切なＮＫ受容体またはシグナル伝達ドメインを経るシグナル伝達などの、しかし、これらに限定されない、シグナル伝達事象が媒介される、一次応答をいう。刺激は、ＴＧＦ−βの下方制御などのある分子の発現改変および／または細胞骨格構造の認識などに介在し得る。
【００９８】
用語“刺激分子”は、免疫エフェクター細胞シグナル伝達経路、例えば、Ｔ細胞シグナル伝達経路の少なくともある態様について刺激方向で免疫エフェクター細胞の活性化を制御する細胞質シグナル伝達配列を提供する、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞)により発現される分子をいう。ある態様において、シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドと共に導入されたＭＨＣ分子の結合により開始され、増殖、活性化、分化などを含むが、これらに限定されないＴ細胞応答の介在にいたる、一次シグナルである。刺激方向で作用する一次細胞質シグナル伝達配列(“一次シグナル伝達ドメイン”とも称する)は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。本発明に特に有用であるＩＴＡＭ含有一次細胞質シグナル伝達配列の例は、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃガンマＲIIａ、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８(“ＩＣＯＳ”としても知られる)、ＦｃεＲＩ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２およびＣＤ６６ｄ由来のものを含むが、これらに限定されない。本発明の特定のＣＡＲにおいて、本発明の何れかの１以上のＣＡＲにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達配列、例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列を含む。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号１８として提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基である。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号２０として提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基である。
【００９９】
用語“抗原提示細胞”または“ＡＰＣ”は、表面上の主要組織適合複合体(ＭＨＣ)と複合体化した外来抗原を呈するアクセサリー細胞(例えば、Ｂ細胞、樹状細胞など)などの免疫系細胞をいう。Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体(ＴＣＲ)を使用して、これらの複合体を認識し得る。ＡＰＣは抗原を処理し、それらをＴ細胞に提示させる。
【０１００】
ここで使用する用語“細胞内シグナル伝達ドメイン”は、分子の細胞内部分をいう。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを産生する。例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞における免疫エフェクター機能の例は、サイトカイン分泌を含む、細胞溶解活性およびヘルパー活性を含む。細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いてよいが、多くの場合、鎖全体を用いる必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分を使用する限り、このような切断部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクト鎖の代わりに使用され得る。用語細胞内シグナル伝達ドメインは、それ故に、エフェクター機能シグナルの伝達に十分な細胞内シグナル伝達ドメインのあらゆる切断部分を含むことを意味する。
【０１０１】
ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。一次細胞内シグナル伝達ドメインの例は、一次刺激または抗原依存的刺激を担う分子由来のものを含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激細胞内ドメインを含み得る。共刺激細胞内シグナル伝達ドメインの例は、共刺激シグナルまたは抗原非依存的刺激を担う分子由来のものを含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、合成または改変される。例えば、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞の場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインはＴ細胞受容体の細胞質配列を含むことができ、一次細胞内シグナル伝達ドメインはＴ細胞受容体の細胞質配列を含むことができ、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共受容体または共刺激分子からの細胞質配列を含み得る。
【０１０２】
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。ＩＴＡＭ含有一次細胞質シグナル伝達配列の例は、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃガンマＲIIａ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８(“ＩＣＯＳ”)、ＦｃεＲＩ  ＣＤ６６ｄ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２由来のものを含むが、これらに限定されない。
【０１０３】
用語“ゼータ”あるいは“ゼータ鎖”、“ＣＤ３ゼータ”または“ＴＣＲゼータ”は、GenBan Acc. No. BAG36664.1として提供されるタンパク質または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基として定義され、“ゼータ刺激ドメイン”あるいは“ＣＤ３ゼータ刺激ドメイン”または“ＴＣＲゼータ刺激ドメイン”は、Ｔ細胞活性化に必要な初期シグナルの機能的伝達に十分なゼータ鎖の細胞質ドメインからのアミノ酸残基として定義される。ある態様において、ゼータの細胞質ドメインは、Acc. No. BAG36664.1の残基５２〜１６４またはその機能的オルソログである非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基を含む。ある態様において、“ゼータ刺激ドメイン”または“ＣＤ３ゼータ刺激ドメイン”は、配列番号１８として提供される配列である。ある態様において、“ゼータ刺激ドメイン”または“ＣＤ３ゼータ刺激ドメイン”は、配列番号２０として提供される配列である。またここに包含されるのは、ここに記載するアミノ酸配列、例えば、配列番号２０に１以上の変異を含むＣＤ３ゼータドメインである。
【０１０４】
用語“共刺激分子”は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、増殖のような、しかしこれに限定されない、Ｔ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーをいう。共刺激分子は、効率的免疫応答に必要な、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含むが、これらに限定されない。
【０１０５】
共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体または天然細胞内シグナル伝達ドメイン全体またはその機能的フラグメントを含み得る。
【０１０６】
用語“４−１ＢＢ”は、GenBank Acc. No. AAA62478.2として提供されるアミノ酸配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーをいい、“４−１ＢＢ共刺激ドメイン”は、GenBank Acc. No. AAA62478.2のアミノ酸残基２１４〜２５５として定義されまたは非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基である。ある態様において、“４−１ＢＢ共刺激ドメイン”は配列番号１４として提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基である。
【０１０７】
ここで使用する用語“免疫エフェクター細胞”は、例えば、免疫エフェクター応答の促進において、免疫応答に関与する細胞をいう。免疫エフェクター細胞の例は、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、ナチュラルキラーＴ(ＮＫＴ)細胞、肥満細胞および骨髄由来貪食細胞を含む。
【０１０８】
ここで使用する用語“免疫エフェクター機能または免疫エフェクター応答”は、標的細胞の免疫攻撃を増強または促進する、例えば、免疫エフェクター細胞の、機能または応答をいう。例えば、免疫エフェクター機能または応答は、標的細胞の細胞死を促進するまたは成長もしくは増殖を阻害する、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の性質をいう。Ｔ細胞の場合、一次刺激および共刺激が免疫エフェクター機能または応答の例である。
【０１０９】
用語“エフェクター機能”は、細胞の特殊化機能をいう。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカイン分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。
【０１１０】
用語“コードする”は、ヌクレオチド(すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ)の規定配列であって、生物学的過程において他のポリマーおよび高分子分子の鋳型として働く、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特定配列またはアミノ酸の特定配列およびそれらに由来する生物学的性質を含む固有の性質をコードするこという。それ故に、遺伝子、ｃＤＮＡまたはＲＮＡは、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が、細胞または他の生物システムにおけるタンパク質を生ずるならば、その遺伝子、ｃＤＮＡまたはＲＮＡはタンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列に一致し、通常配列表に提供されるコード鎖および遺伝子またはｃＤＮＡの転写の鋳型として使用される非コード鎖の両方が、タンパク質またはその遺伝子またはｃＤＮＡの他の遺伝子産物をコードするということができる。
【０１１１】
特に断らない限り、“アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列”は、互いの縮重バージョンであり、同一アミノ酸配列をコードする、全ヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列なる表現は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、あるバージョンでイントロンを含み得る限り、イントロンも含み得る。
【０１１２】
用語“有効量”または“治療有効量”は、ここでは相互交換可能に使用し、特定の生物学的結果を達成するのに効果的な、ここに記載する化合物、製剤、物質または組成物の量をいう。
【０１１３】
用語“内因性”は、生物、細胞、組織または系の内部に由来するまたは産生されたあらゆる物質をいう。
【０１１４】
用語“外因性”は、生物、細胞、組織または系の外部から導入されたまたは産生されたあらゆる物質をいう。
【０１１５】
用語“発現”は、特定のヌクレオチド配列の、そのプロモーターにより駆動される、転写および／または翻訳をいう。
【０１１６】
用語“導入ベクター”は、単離核酸を含み、該単離核酸を細胞内部に送達するのに使用できる、組成物をいう。多数のベクターは当分野で知られ、直線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と関連するポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含むが、これらに限定されない。それ故に、用語“導入ベクター”は、自己複製プラスミドまたはウイルスを含む。本用語はまた、例えば、ポリリシン化合物、リポソームなど、核酸の細胞への伝達を促進する、非プラスミドおよび非ウイルス化合物をさらに含むとも解釈されるべきである。ウイルス導入ベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されない。
【０１１７】
用語“発現ベクター”は、発現されるヌクレオチド配列に操作可能に結合した発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含む、ベクターをいう。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性要素を含み、発現のための他の要素は宿主細胞またはインビトロ発現系で提供され得る。発現ベクターは、組み換えポリヌクレオチドを取り込む、コスミド、プラスミド(例えば、裸のまたはリポソームに含まれた)およびウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)を含む、当分野で知られる全てのものを含む。
【０１１８】
用語“レンチウイルス”は、レトロウイルス科の属である。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染できる点で、レトロウイルスの中で独特であり、相当量の遺伝情報を宿主細胞ＤＮＡに送達でき、従って、それらは遺伝子送達ベクターの最も効率的方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶおよびＦＩＶは、全てレンチウイルスの例である。
【０１１９】
用語“レンチウイルスベクター”は、特にMilone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)により提供される自己不活性化レンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターをいう。臨床において使用され得るレンチウイルスベクターの他の例は、例えば、Oxford BioMedicaからのLENTIVECTOR(登録商標)遺伝子送達テクノロジー、LentigenからのLENTIMAXTMベクターシステムなどを含むが、これらに限定されない。非臨床タイプのレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者に知られる。
【０１２０】
用語“相同”または“同一性”は、２重合分子、例えば、２核酸分子、例えば、２ＤＮＡ分子または２ＲＮＡ分子または２ポリペプチド分子間のサブユニット配列同一性をいう。２分子の両方におけるサブユニット位置が同じ単量体サブユニットにより占拠されているとき、例えば、２ＤＮＡ分子の各々におけるある位置がアデニンにより占拠されているならば、それらはその位置で相同または同一である。２配列間の相同性は適合または相同位置の数の直接的関数であり、例えば、２配列の位置の半分(例えば、１０サブユニット長ポリマーにおける５位置)が相同であるならば、２配列は５０％相同であり、９０％の位置(例えば、１０中９)が適合または相同であるならば、２配列は９０％相同である。
【０１２１】
用語“ヒト化”は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２または抗体の他の抗原結合部分配列)の形態である非ヒト(例えば、マウス)抗体をいう。大部分について、ヒト化抗体および抗体そのフラグメントはヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体または抗体フラグメント)であり、ここで、レシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲからの残基に置き換わる。ある場合、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基に置き換わる。さらに、ヒト化抗体／抗体フラグメントは、レシピエント抗体にも移入ＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体または抗体フラグメント性能をさらに精緻化および最適化し得る。一般に、ヒト化抗体またはその抗体フラグメントは、少なくとも１、一般に２可変ドメインの相当部分を含み、ここで、全てのまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てのまたは実質的に全てのＦＲ領域はヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体または抗体フラグメントはまた、一般にヒト免疫グロブリンのものである、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部も含み得る。さらなる詳細について、Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992参照。
【０１２２】
用語“完全ヒト”は、分子全体がヒト起源であるかまたはヒト形態の抗体または免疫グロブリンと同一のアミノ酸配列からなる、抗体または抗体フラグメントなどの免疫グロブリンをいう。
【０１２３】
用語“単離”は、天然状態からの改変または移動を意味する。例えば、生存動物に天然に存在する核酸またはペプチドは“単離”されていないが、その天然状態での併存物質から一部または完全に離されている同じ核酸またはペプチドは“単離”されている。単離核酸またはタンパク質は、実質的に純粋な形態で存在できまたは、例えば、宿主細胞などの非天然環境で存在できる。
【０１２４】
本明細書の記載において、一般的に存在する核酸塩基について、次の略語を使用する。“Ａ”はアデノシンであり、“Ｃ”はシトシンであり、“Ｇ”はグアノシンであり、“Ｔ”はチミジンであり、“Ｕ”はウリジンである。
【０１２５】
用語“操作可能に結合”または“転写制御”は、制御配列および異種核酸配列の後者の発現をもたらす機能的結合をいう。例えば、第一核酸配列は、第一核酸配列が第二核酸配列と機能的相関にあるとき、第二核酸配列と操作可能に結合される。例えば、プロモーターは、コード配列と、該プロモーターが該コード配列の転写または発現に影響するならば、操作可能に結合される。操作可能に結合されたＤＮＡ配列は、互いに連続していてよく、２タンパク質コード領域を連結する必要があるならば、同じリーディングフレームにある。
【０１２６】
免疫原性組成物の“非経腸”投与なる用語は、例えば、皮下(ｓ.ｃ.)、静脈内(ｉ.ｖ.)、筋肉内(ｉ.ｍ.)または胸骨内、腫瘍内注射または点滴技法を含む。
【０１２７】
用語“核酸”または“ポリヌクレオチド”は、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)またはリボ核酸(ＲＮＡ)およびそのポリマーをいう。特に限定しない限り、本用語は対照核酸と類似の結合性質を有し、天然に存在するヌクレオチドに準じる方法で代謝される、天然ヌクレオチドの既知アナログを含む核酸を包含する。特に断らない限り、特定の核酸配列は、その保存的修飾バリアント(例えば、縮重コドン置換)、アレル、オルソログ、ＳＮＰおよび相補配列ならびに明示された配列も暗に包含する。特に、縮重コドン置換は、１以上の選択(または全)コドンが混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列の産生により達成され得る(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
【０１２８】
用語“ペプチド”、“ポリペプチド”および“タンパク質”は相互交換可能に使用され、ペプチド結合により供給結合されたアミノ酸残基を含む化合物をいう。タンパク質またはペプチドは少なくとも２個のアミノ酸含まなければならず、タンパク質またはペプチド配列を構成し得るアミノ酸の最大数に制限は付されていない。ポリペプチドは、互いにペプチド結合により結合された、２以上のアミノ酸を含むあらゆるペプチドまたはタンパク質を含む。ここで使用する本用語は、例えば、当分野でペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとしても一般に称される短鎖および一般に当分野でタンパク質と称され、多くのタイプが存在する長鎖の両方をいう。“ポリペプチド”は、数ある中で、例えば、生物活性フラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは、天然ペプチド、組み換えペプチドまたはこれらの組み合わせを含む。
【０１２９】
用語“プロモーター”は、ポリヌクレオチド配列の特定の転写の開始に必要な、細胞の合成機構または導入された合成機構により認識されるＤＮＡ配列をいう。
【０１３０】
用語“プロモーター／制御配列”は、プロモーター／制御配列に操作可能に結合した遺伝子産物の発現に必要な核酸配列をいう。ある場合、この配列はコアプロモーター配列であってよく、他の場合、この配列は、遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列および他の制御要素も含み得る。プロモーター／制御配列は、例えば、組織特異的方法で遺伝子産物を発現するものであり得る。
【０１３１】
用語“構成的”プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと操作可能に結合したとき、その細胞の大部分のまたは全ての生理学的条件下、細胞に遺伝子産物を産生させる、ヌクレオチド配列をいう。
【０１３２】
用語“誘導性”プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと操作可能に結合したとき、実質的に該プロモーターに対応するインデューサーが細胞に存在するときのみ、細胞に遺伝子産物を産生させる、ヌクレオチド配列をいう。
【０１３３】
用語“組織特異的”プロモーターは、遺伝子によりコードまたは特定されるポリヌクレオチドと操作可能に結合したとき、実質的に細胞が該プロモーターに対応する組織タイプの細胞であるときのみ、細胞に遺伝子産物を産生させる、ヌクレオチド配列をいう。
【０１３４】
ｓｃＦｖと関連して使用する“可撓性ポリペプチドリンカー”または“リンカー”なる用語は、単独でまたは組み合わせて使用されるグリシンおよび／またはセリン残基などのアミノ酸からなる、可変重鎖および可変軽鎖領域を互いに結合するための、ペプチドリンカーをいう。ある実施態様において、可撓性ポリペプチドリンカーはＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列(Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ)ｎ(ここでｎは１以上の正の整数である)を含む(配列番号６０９)。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５およびｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９およびｎ＝１０(配列番号６０６)。ある実施態様において、可撓性ポリペプチドリンカーは、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)４(配列番号２７)または(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(配列番号２８)を含むが、これらに限定されない。他の実施態様において、リンカーは、(Ｇｌｙ２Ｓｅｒ)、(ＧｌｙＳｅｒ)または(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)の複数反復を含む(配列番号２９)。また本発明の範囲内に含まれるのは、引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１２／１３８４７５号に記載のリンカーである。
【０１３５】
ここで使用する、５’キャップ(ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ  ７−メチルグアノシンキャップまたはＲＮＡ  ｍ７Ｇキャップとも称される)は、転写開始直後、真核生物メッセンジャーＲＮＡの“フロント”または５’末端に添加されている修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、最初に転写されたヌクレオチドに結合する末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識およびＲＮａｓｅからの保護に重要である。キャップ付加は、転写と結びつき、互いが影響を与え合うように、共転写的に生じる。転写開始直後、合成されるｍＲＮＡの５’末端は、ＲＮＡポリメラーゼと結合したキャップ合成複合体により結合される。この酵素複合体は、ｍＲＮＡキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は多段階生化学反応として進む。キャッピング部分は、安定性または翻訳効率などのｍＲＮＡの機能性を調節するために修飾され得る。
【０１３６】
ここで使用する、“インビトロ転写ＲＮＡ”は、インビトロで合成されているＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡをいう。一般に、インビトロ転写ＲＮＡは、インビトロ転写ベクターから産生される。インビトロ転写ベクターは、インビトロ転写ＲＮＡの産生に使用される、鋳型を含む。
【０１３７】
ここで使用する、“ポリ(Ａ)”は、ｍＲＮＡのポリアデニル化により結合された一連のアデノシンである。一過性発現のための構築物の好ましい実施態様において、ポリＡは５０〜５０００(配列番号３０)、好ましくは６４以上、より好ましくは１００以上、最も好ましくは３００または４００以上である。ポリ(Ａ)配列は、局在化、安定性または翻訳効率などのｍＲＮＡ機能性を調節するために、化学的または酵素的に修飾され得る。
【０１３８】
ここで使用する、“ポリアデニル化”は、メッセンジャーＲＮＡ分子へのポリアデニリル部分またはその修飾バリアントの共有結合をいう。真核生物において、大部分のメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)分子は、３’末端でポリアデニル化される。３’ポリ(Ａ)テイルは、酵素、ポリアデニレートポリメラーゼの作用によりプレｍＲＮＡに結合されたアデニンヌクレオチドの長い配列(しばしば数百)である。高級真核生物において、ポリ(Ａ)テイルは特異的配列、ポリアデニル化シグナルを含む転写物に付加される。ポリ(Ａ)テイルおよびそれに結合したタンパク質は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼによる分解から保護することを助ける。ポリアデニル化は転写終了、ｍＲＮＡの核からの搬出および翻訳にも重要である。ポリアデニル化はＤＮＡのＲＮＡへの転写直後核で起こるが、さらに、後に細胞質でも起こり得る。転写が終了した後、ｍＲＮＡ鎖はＲＮＡポリメラーゼと結合したエンドヌクレアーゼ複合体の作用により開裂される。開裂部位は、通常、開裂部位近くの塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在により特徴付けられる。ｍＲＮＡが開裂された後、アデノシン残基は開裂部位で遊離３’末端に付加される。
【０１３９】
ここで使用する、“一過性”は、非統合導入遺伝子の一定の時間、日または週の期間の発現をいい、ここで、発現の期間は、該遺伝子がゲノムに統合されるかまたは宿主細胞における安定なプラスミドレプリコン内に含まれるときより短い。
【０１４０】
ここで使用する、用語“処置”および“処置する”は、１以上の治療剤(例えば、本発明のＣＡＲなどの１以上の治療剤)の投与により生じる、増殖性障害の進行、重症度および／または期間の低減もしくは改善または増殖性障害の１以上の症状(好ましくは、１以上の認識できる症状)の改善をいう。特定の実施態様において、用語“処置”および“処置する”は、必ずしも患者が認識できるものではない、腫瘍増殖などの増殖性障害の少なくとも１つの測定可能なパラメータの改善をいう。他の実施態様において、用語“処置”および“処置する”は、例えば、認識できる症状の安定化により身体的に、例えば、身体パラメータの安定化により生理学的に、または両方により、増殖性障害の進行を阻止することをいう。他の実施態様において、用語“処置”および“処置する”は、腫瘍サイズまたは癌細胞数の減少または安定化をいう。
【０１４１】
用語“シグナル伝達経路”は、細胞のある部分から細胞の他の部分へのシグナル伝達に役割を有する、多様なシグナル伝達分子間の生化学的相関をいう。用語“細胞表面受容体”は、シグナルを受け、細胞膜を通過してシグナルを伝達できる分子および分子の複合体をいう。
【０１４２】
用語“対象”は、免疫応答が誘発され得る生存生物(例えば、哺乳動物、ヒト)を含むことを意図する。
【０１４３】
用語“実質的に精製された”細胞は、他の細胞型が本質的に共存しない細胞をいう。実質的に精製された細胞は、天然に存在する状態では通常付随する他の細胞型から分離されている細胞もいう。ある場合、実質的に精製された細胞の集団は、同種細胞の集団をいう。他の場合、この用語は、単に天然に存在する状態では通常付随する他の細胞型から分離されている細胞をいう。ある態様において、細胞はインビトロで培養される。他の態様において、細胞はインビトロで培養されない。
【０１４４】
ここで使用する用語“治療”は処置を意味する。治療効果は、疾患状態の軽減、抑制、寛解または根絶により得られる。
【０１４５】
ここで使用する用語“予防”は、疾患または疾患状態の予防または防止的処置を意味する。
【０１４６】
用語“癌関連抗原”または“腫瘍抗原”は、相互交換可能であり、完全にまたはフラグメント(例えば、ＭＨＣ／ペプチド)として癌細胞表面に発現され、癌細胞への薬剤の優先的ターゲティングに有用である、分子(一般にタンパク質、炭水化物または脂質)をいう。ある実施態様において、腫瘍抗原は、正常細胞および癌細胞両方により発現されるマーカー、例えば、系譜マーカー、例えば、Ｂ細胞上のＣＤ１９である。ある実施態様において、腫瘍抗原は、正常細胞と比較して癌細胞で過発現している、例えば、正常細胞と比較して、１倍過発現、２倍過発現、３倍過発現またはそれ以上過発現している、細胞表面分子である。ある実施態様において、腫瘍抗原は、癌細胞で不適切に合成されている細胞表面分子、例えば、正常細胞で発現される分子と比較して、欠失、付加または変異を含む分子である。ある実施態様において、腫瘍抗原は排他的に癌細胞の細胞表面に完全にまたはフラグメント(例えば、ＭＨＣ／ペプチド)として発現され、正常細胞表面で合成または発現されない。ある実施態様において、本発明のＣＡＲは、ＭＨＣ提示ペプチドに結合する抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント)を含むＣＡＲを含む。通常、内因性タンパク質由来ペプチドは主要組織適合複合体(ＭＨＣ)クラスＩ分子のポケットを満たし、ＣＤ８＋Ｔリンパ球のＴ細胞受容体(ＴＣＲ)により認識される。ＭＨＣクラスＩ複合体は、全有核細胞で構成的に発現される。癌において、ウイルス特異的および／または腫瘍特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体は、免疫療法のための特有のクラスの細胞表面標的を表す。ヒト白血球抗原(ＨＬＡ)−Ａ１またはＨＬＡ−Ａ２におけるウイルスまたは腫瘍抗原由来ペプチドをターゲティングするＴＣＲ様抗体は記載されている(例えば、Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21):1601-1608; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33; assev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100参照)。例えば、ＴＣＲ様抗体は、ヒトｃＦｖファージディスプレイライブラリーなどのライブラリーのスクリーニングにより同定され得る。
【０１４７】
用語“トランスフェクト”または“トランスフォーム”または“遺伝子導入”は、外因性核酸を宿主細胞に転移または導入する方法をいう。“トランスフェクト”または“トランスフォーム”または“遺伝子導入”細胞は、外因性核酸がトランスフェクト、トランスフォームまたは形質導入されているものである。細胞は初代対象細胞およびその子孫を含む。
【０１４８】
用語“特異的に結合”は、サンプルに存在する結合パートナー(例えば、腫瘍抗原)タンパク質を認識し、結合する抗体またはリガンドをいうが、該抗体またはリガンドはサンプルに存在する他の分子を実質的に認識または結合しない。
【０１４９】
ここで使用する“制御可能キメラ抗原受容体(ＲＣＡＲ)”は、免疫エフェクター細胞において、細胞に標的細胞、一般に癌細胞に対する特異性および制御可能細胞内シグナル産生を提供する、一組の、一般に最も単純な実施態様で２個のポリペプチドをいう。ある実施態様において、ＲＣＡＲは、ＣＡＲ分子の設定において、ここに定義する少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通および刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激分子を含む細胞質シグナル伝達ドメイン(ここでは“細胞内シグナル伝達ドメイン”とも称する)を含む。ある実施態様において、ＲＣＡＲにおける一組のポリペプチドは互いに連続しておらず、例えば、異なるポリペプチド鎖にある。ある実施態様において、ＲＣＡＲは、二量体化分子存在下、互いのポリペプチドに結合でき、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合できる、二量体化スイッチを含む。ある実施態様において、ＲＣＡＲは、ここに記載する細胞(例えば、免疫エフェクター細胞)、例えば、ＲＣＡＲ発現細胞(ここでは“ＲＣＡＲＸ細胞”とも称する)で発現される。ある実施態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＴ細胞であり、ＲＣＡＲＴ細胞と称する。ある実施態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＮＫ細胞であり、ＲＣＡＲＮ細胞と称する。ＲＣＡＲは、ＲＣＡＲ発現細胞に標的細胞、一般に癌細胞に対する特異性および、ＲＣＡＲ発現細胞の免疫エフェクター性質を最適化できる制御可能細胞内シグナル産生または増殖を提供し得る。ある実施態様において、ＲＣＡＲ細胞は、少なくとも一部、抗原結合ドメインに結合される抗原を含む標的細胞への特異性の提供を、該抗原結合ドメインに依存する。
【０１５０】
ここで使用する“膜固定”または“膜繋留ドメイン”は、細胞外または細胞内ドメインを原形質膜に固定するのに十分なポリペプチドまたは部分、例えば、ミリストイル基をいう。
【０１５１】
ここで使用する“スイッチドメイン”は、例えば、ＲＣＡＲを参照するとき、二量体化分子存在下、他のスイッチドメインと結合する、エンティティ、一般にポリペプチドベースのエンティティをいう。結合は、第一スイッチドメインに結合、例えば、融合した第一エンティティと、第二スイッチドメインに結合、例えば、融合した第二エンティティの機能的カップリングをもたらす。第一および第二スイッチドメインは、纏めて二量体化スイッチと称される。ある実施態様において、第一および第二スイッチドメインは互いに同一であり、例えば、それらは、同じ一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、纏めてホモ二量体化スイッチと称される。ある実施態様において、第一および第二スイッチドメインは互いに異なり、例えば、異なる一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、纏めてヘテロ二量体化スイッチと称される。ある実施態様において、スイッチは細胞内である。ある実施態様において、スイッチは細胞外である。ある実施態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースのエンティティ、例えば、ＦＫＢＰまたはＦＲＢベースであり、二量体化分子は小分子、例えば、ラパログである。ある実施態様において、スイッチドメインは、ポリペプチドベースのエンティティ、例えば、ｍｙｃペプチドに結合するｓｃＦｖであり、二量体化分子はポリペプチド、そのフラグメントまたはポリペプチドの多量体、例えば、１以上のｍｙｃ  ｓｃＦｖに結合するｍｙｃリガンドまたはｍｙｃリガンドの多量体である。ある実施態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースのエンティティ、例えば、ｍｙｃ受容体であり、二量体化分子は抗体またはそのフラグメント、例えば、ｍｙｃ抗体である。
【０１５２】
ここで使用する“二量体化分子”は、例えば、ＲＣＡＲを参照するとき、第一スイッチドメインと第二スイッチドメインの結合を促進する分子をいう。ある実施態様において、二量体化分子は対象で自然に生じないまたは顕著な二量体化をもたらす濃度で生じない。ある実施態様において、二量体化分子は小分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１である。
【０１５３】
用語“生物学的同等性”は、対照用量または対照量の対照化合物(例えば、ＲＡＤ００１)により生じる効果と同等な効果をもたらすのに必要な、対照化合物(例えば、ＲＡＤ００１)以外の薬物の量をいう。ある実施態様において、効果は、例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ阻害により測定して、例えば、インビボまたはインビトロアッセイで評価して、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Ｂｏｕｌａｙアッセイまたはウェスタンブロットによるリン酸化Ｓ６レベルの測定により測定して、ｍＴＯＲ阻害レベルである。ある実施態様において、効果は、細胞選別により測定して、ＰＤ−１陽性／ＰＤ−１陰性Ｔ細胞比の改変である。ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的同等量または用量は、対照用量または対照量の対照化合物と同レベルのＰ７０  Ｓ６キナーゼ阻害を達成する量または用量である。ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的同等量または用量は、対照用量または対照量の対照化合物と同レベルのＰＤ−１陽性／ＰＤ−１陰性Ｔ細胞比の改変を達成する量または用量である。
【０１５４】
ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンまたは触媒ｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて使用するときの用語“低い、免疫増強用量”は、例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性阻害により測定して、ｍＴＯＲ活性を部分的に、しかし、不完全に、阻害する、ｍＴＯＲ阻害剤の用量である。例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ阻害により、ｍＴＯＲ活性を評価する方法は、ここに記載される。この用量は、完全免疫抑制をもたらすには不十分であるが、免疫応答増強に十分である。ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の低い、免疫増強用量は、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞数減少および／またはＰＤ−１陰性Ｔ細胞数増加またはＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞比増加をもたらす。ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の低い、免疫増強用量は、ナイーブＴ細胞数増加をもたらす。ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の低い、免疫増強用量は、次の１以上をもたらす。
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の次のマーカーの１以上の発現増加：ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＫＬＲＧ１発現減少；および
記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、次の特徴の何れかの１または組み合わせを有する細胞の数の増加：ＣＤ６２Ｌ高増加、ＣＤ１２７高増加、ＣＤ２７＋増加、ＫＬＲＧ１減少およびＢＣＬ２増加；
ここで、上記変化の何れも、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に、起こる。
【０１５５】
ここで使用する“難治性”は、処置に応答しない疾患、例えば、癌をいう。ある実施態様において、難治性癌は、処置前または開始時に処置に耐性であり得る。他の実施態様において、難治性癌は、処置の間に耐性となり得る。難治性癌は耐性癌とも称される。
【０１５６】
ここで使用する“再発性”または“再発”は、例えば、治療剤、例えば、癌治療剤の先の処置の後の改善または応答性の期間の後の、疾患(例えば、癌)または癌などの徴候および症状の再起または再出現をいう。応答性の最初の期間は、ある閾値、例えば、２０％、１％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％以下の癌細胞のレベルの減少を含み得る。再出現は、ある閾値、例えば、２０％、１％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％を超える癌細胞のレベル上昇を含み得る。例えば、Ｂ−ＡＬＬにおいて、例えば、再出現は、完全応答後の、例えば、血液、骨髄(＞５％)または骨髄外部位における芽細胞再出現を含み得る。完全応答は、この状況において、＜５％ＢＭ芽細胞を含み得る。より一般に、ある実施態様において、応答(例えば、完全応答または部分応答)は、検出可能ＭＲＤ(最小残存疾患)の非存在を含み得る。ある実施態様において、応答性の初期期間は、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日または６日；少なくとも１週、２週、３週または４週；少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、８ヶ月、１０ヶ月または１２ヶ月；または少なくとも１年、２年、３年、４年または５年続く。
【０１５７】
範囲：本明細書をとおして、本発明の種々の態様は範囲表現で示され得る。範囲表現での記載は単に便利さおよび簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する不動の限定として解釈されるべきではないことは理解される。従って、範囲の記載は、当該範囲内の可能な部分範囲ならびに個々の数値が具体的に記載されていると解釈されるべきである。例えば、例えば、１〜６などの範囲の記載は１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分範囲、ならびに該範囲内の個々の数値、例えば、１、２、２.７、３、４、５、５.３および６が具体的に開示されていると解釈されるべきである。他の例として、９５〜９９％同一性などの範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する何かを含み、かつ９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％および９８〜９９％同一性などの部分範囲を含む。これは、範囲の広さにかかわらず適用される。
【０１５８】
記載
ここに提供されるのは、メソテリンを標的とするキメラ抗原受容体、例えば、メソテリンＣＡＲを含む細胞を、ＰＤ−Ｌ１阻害剤と組み合わせて投与することによる、癌などの疾患を処置するための、組成物および方法である。メソテリンＣＡＲおよびメソテリンＣＡＲ発現細胞を産生するための成分の例は、ここに開示される。ＰＤ−Ｌ１阻害剤の例もここに記載される。
【０１５９】
ある実施態様において、ここに記載するメソテリンＣＡＲ発現細胞およびここに記載するＰＤ−Ｌ１阻害剤の組み合わせ治療は、次の１以上をもたらす。メソテリンＣＡＲ発現細胞の抗腫瘍活性の改善または増強；メソテリンＣＡＲ発現細胞の増殖増加または存続増加；メソテリンＣＡＲ発現細胞浸潤の改善または増加；腫瘍進行阻止改善；腫瘍進行遅延；癌細胞増殖阻害または低減；および／または腫瘍負荷、例えば、腫瘍体積またはサイズ減少。
【０１６０】
ここに提供する実施例において示されるとおり、ある実施態様において、メソテリンＣＡＲ発現細胞投与前のＰＤ−Ｌ１阻害剤投与は、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞投与後のＰＤ−Ｌ１阻害剤投与またはＰＤ−Ｌ１阻害剤またはメソテリンＣＡＲ発現細胞単独投与と比較して、ある癌において、治療有効性増加、例えば、腫瘍進行および／または腫瘍増殖阻害の増加をもたらす。
【０１６１】
ＰＤ−Ｌ１は、免疫応答、例えば、抗腫瘍免疫応答を下方制御することが知られる。ＰＤ−Ｌ１は、癌細胞または癌関連細胞、例えば、腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ)によっても発現され得る。理論に拘束されることを意図しないが、ある実施態様において、ここに記載する組み合わせ治療、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤を投与される対象は、対象が次のＰＤ−Ｌ１を発現、例えば、高度に発現する癌；抗腫瘍免疫細胞、例えば、腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ)により浸潤されている癌；および／またはＰＤ−Ｌ１を発現、例えば、高度に発現する癌関連細胞の１以上を有するならば、組み合わせ治療を投与されないかまたはメソテリンＣＡＲ発現細胞またはＰＤ−Ｌ１阻害剤単独を投与される対象と比較して、抗腫瘍活性が増加する可能性が高い。例えば、理論に拘束されることを意図しないが、ＰＤ−Ｌ１阻害剤での処置は、抗腫瘍免疫応答下方制御、例えば、抗腫瘍免疫細胞、例えば、ＴＩＬまたはメソテリンＣＡＲ発現免疫細胞の消耗の予防または軽減をし、それにより、抗腫瘍有効性を増加する。
【０１６２】
メソテリンキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)
本発明は、メソテリンを標的とし、例えば、特異的に結合する、ＣＡＲ分子(メソテリンＣＡＲ)を含む免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を包含する。ある実施態様において、免疫エフェクター細胞は、メソテリンＣＡＲを発現するように改変される。ある実施態様において、免疫エフェクター細胞は、メソテリンＣＡＲをコードする核酸配列を含む組み換え核酸構築物を含む。
【０１６３】
ある実施態様において、メソテリンＣＡＲは、メソテリンに特異的に結合する抗原結合ドメイン、例えば、メソテリン結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、抗原結合ドメインの配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と連続し、同じリーディングフレームにある。細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ゼータ鎖を含み得る。共刺激シグナル伝達ドメインは、少なくとも共刺激分子の細胞内ドメインの一部を含む、ＣＡＲの部分をいう。
【０１６４】
ここに記載するメソテリンＣＡＲ分子の種々の成分の配列の非限定的例を表１に挙げ、ここで、“ａａ”はアミノ酸を意味し、“ｎａ”は対応するペプチドをコードする核酸を意味する。
【０１６５】
【表１】
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【表２】
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【０１６６】
【表３】
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【表４】
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【０１６７】
【表５】
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【０１６８】
ある態様において、ＣＡＲ構築物の例は、選択されるリーダー配列(例えば、ここに記載するリーダー配列)、細胞外抗原結合ドメイン(例えば、ここに記載する抗原結合ドメイン)、ヒンジ(例えば、ここに記載するヒンジ領域)、膜貫通ドメイン(例えば、ここに記載する膜貫通ドメイン)および細胞内刺激ドメイン(例えば、ここに記載する細胞内刺激ドメイン)を含む。ある態様において、ＣＡＲ構築物の例は、選択されるリーダー配列(例えば、ここに記載するリーダー配列)、細胞外抗原結合ドメイン(例えば、ここに記載する抗原結合ドメイン)、ヒンジ(例えば、ここに記載するヒンジ領域)、膜貫通ドメイン(例えば、ここに記載する膜貫通ドメイン)、細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載する共刺激シグナル伝達ドメイン)および／または細胞内一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載する一次シグナル伝達ドメイン)を含む。
【０１６９】
ある態様において、メソテリン本発明のＣＡＲは、ＣＤ１３７(４−１ＢＢ)シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７シグナル伝達ドメイン、ＩＣＯＳシグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータシグナルドメインおよびこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、本発明のＣＡＲは、ＣＤ１３７(４−１ＢＢ)、ＣＤ２８、ＣＤ２７またはＩＣＯＳから選択される以上の共刺激分子からの少なくとも１細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０１７０】
抗原結合ドメイン
ある態様において、本発明のＣＡＲは、抗原結合ドメインとも称する標的特異的結合要素を含む。ある実施態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインを含む部分は、メソテリンを標的とし、例えば、特異的に結合する、抗原結合ドメインを含む。ある実施態様において、抗原結合ドメインは、ヒトメソテリンを標的とし、例えば、特異的に結合する。
【０１７１】
抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体および重鎖可変ドメイン(ＶＨ)、軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)およびラクダ類由来ナノボディの可変ドメイン(ＶＨＨ)などの単一ドメイン抗体を含むその機能的フラグメントおよび組み換えフィブロネクチンドメインなどなどの抗原結合ドメインとして機能することが当分野で知られる代替スキャフォールドを含むが、これらに限定されない、抗原に結合するあらゆるドメインであり得る。ある場合、抗原結合ドメインが、ＣＡＲを最終的に使用するのと同じ種由来であることが有利である。例えば、ヒトにおける使用のために、ＣＡＲの抗原結合ドメインが、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインについてヒトまたはヒト化残基を含むことが有利である。それ故に、ある態様において、抗原結合ドメインは、ヒト抗体または抗体フラグメントを含む。
【０１７２】
ある実施態様において、メソテリン結合ドメインは、配列番号３９〜６２から選択されるメソテリン結合ドメインの軽鎖相補性決定領域１(ＬＣ  ＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣ  ＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣ  ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)および配列番号３９〜６２から選択されるメソテリン結合ドメインの重鎖相補性決定領域１(ＨＣ  ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ  ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ  ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)を含む。ある実施態様において、メソテリン結合ドメインは、ここに記載する軽鎖可変領域(例えば、表２)および／またはここに記載する重鎖可変領域(例えば、表２)を含む。ある実施態様において、メソテリン結合ドメインは、表２のアミノ酸配列の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含むｓｃＦｖを含む。ある実施態様において、メソテリン結合ドメイン(例えば、ｓｃＦＶ)は、表２に提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換)を有するが、修飾(例えば、置換)が３０、２０または１０修飾(例えば、置換)を超えないアミノ酸配列または表２のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；および／または表２に提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換)を有するが、修飾(例えば、置換)が３０、２０または１０修飾(例えば、置換)を超えないアミノ酸配列または表２のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０１７３】
ある実施態様において、メソテリン結合ドメインは、リンカー、例えば、ここに記載するリンカーにより、ここに、例えば、表２または３に記載するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に結合した、ここに、例えば、表２または３に記載するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある実施態様において、ヒト化抗メソテリン結合ドメインはＧｌｙ４−Ｓｅｒ)ｎリンカー(配列番号２６)を含み、ここで、ｎは１、２、３、４、５または６、好ましくは３または４である。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、次の配向の何れでもよい。軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域。
【０１７４】
他の実施態様において、メソテリン結合ドメインは、メソテリンに結合する当分野で知られる何れかの抗体またはその抗体フラグメントを含む。当分野で知られる他の抗メソテリン抗体またはその抗体フラグメントの例は、ＷＯ２００９／１２０７６９号(例えば、抗体ｍ９１２、その軽鎖および重鎖アミノ酸配列はＷＯ２００９／１２０７６９号の配列番号１および配列番号２)；米国特許６,０８３,５０２号、米国特許公開ＵＳ２００８／０２６１２４５号、ＷＯ２００９／０６８２０４号、ＷＯ２０１０／１１１２８２号、ＷＯ２０１４／００４５４９号および米国特許公開ＵＳ２０１５／０２７４８３６号に開示される。
【０１７５】
ある態様において、本発明の抗体は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖｓ(ｓｄＦｖ)、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、直線状抗体、ｓｄＡｂなどの単一ドメイン抗体(ＶＬまたはＶＨ)、ラクダ類ＶＨＨドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合した２Ｆａｂフラグメントを含む二価フラグメントなどの抗体フラグメントから形成された多特異的抗体および単離ＣＤＲまたは抗体の他のエピトープ結合フラグメントを含む、多様な他の形態で存在し得る。ある態様において、ここに提供する抗体フラグメントはｓｃＦｖである。ある場合、ヒトｃＦｖは、酵母ディスプレイライブラリー由来でもあり得る。
【０１７６】
ある場合、ｓｃＦｖは、当分野で知られる方法により製造できる(例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426 and Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照)。ＳｃＦｖ分子は、例えば、可撓性ポリペプチドリンカーを使用して、ＶＨ領域とＶＬ領域を共に連結することにより製造され得る。ｓｃＦｖ分子は、最適長および／またはアミノ酸組成のリンカー(例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー)を含み得る。リンカー長は、ｓｃＦｖの可変領域がどのように折りたたまれ、相互作用するかに大きく影響し得る。実際、短ポリペプチドリンカーが用いられるとき(例えば、５〜１０アミノ酸)、鎖内折りたたみは阻止される。鎖間折りたたみも、２可変領域が一体となって機能的エピトープ結合部位を形成するのに必要である。リンカー配向およびサイズの例は、例えば、Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448、米国特許出願公開２００５／０１００５４３号、２００５／０１７５６０６号、２００７／００１４７９４号およびＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０２０２５８号およびＷＯ２００７／０２４７１５号を参照し、引用により本明細書に包含させる。
【０１７７】
ｓｃＦｖは、ＶＬ領域とＶＨ領域の間に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上のアミノ酸残基のリンカーを含み得る。リンカー配列は、天然に存在する何れかのアミノ酸を含み得る。ある実施態様において、リンカー配列は、アミノ酸グリシンおよびセリンを含む。他の実施態様において、リンカー配列は、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎなどのグリシンおよびセリン反復のセットを含み、ここで、ｎは１以上の正の整数である(配列番号１３５)。ある実施態様において、リンカーは、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)４(配列番号２７)または(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(配列番号２８)であり得る。リンカー長の変動は、活性を保持または増強でき、活性試験で優れた有効性をもたらす。
【０１７８】
メソテリン抗原結合ドメインおよびＣＡＲ構築物の例
ここに開示するメソテリンＣＡＲ構築物の例は、この表２または３に開示するｓｃＦｖ(例えば、ヒトｃＦｖ)を含み、所望により任意のリーダー配列(例えば、リーダーアミノ酸およびヌクレオチド配列の例についてそれぞれ配列番号１および配列番号１２)が前にある。ｓｃＦｖフラグメントの配列(配列番号３９〜６２のアミノ酸配列)は、ここに表２に提供する。メソテリンＣＡＲ構築物は、さらに任意のヒンジドメイン、例えば、ＣＤ８ヒンジドメイン(例えば、配列番号２のアミノ酸配列を含むまたは配列番号１３の核酸配列によりコード)；膜貫通ドメイン、例えば、ＣＤ８膜貫通ドメイン(例えば、配列番号６のアミノ酸配列を含むまたは配列番号１７のヌクレオチド配列によりコード)；細胞内ドメイン、例えば、４−１ＢＢ細胞内ドメイン(例えば、配列番号７のアミノ酸配列を含むまたは配列番号１８のヌクレオチド配列；および機能的シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメイン(例えば、配列番号９または１０のアミノ酸配列を含むまたは配列番号２０または２１のヌクレオチド配列によりコード)を含む。ある実施態様において、これらドメインは連続するかまたは同一リーディングフレームにあり、単一融合タンパク質を形成する。他の実施態様において、これらドメインは、例えば、ここに記載するＲＣＡＲ分子におけるように、別のポリペプチドにある。
【０１７９】
ある実施態様において、完全長メソテリンＣＡＲ分子は、表２または３に提供する、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９、Ｍ１０、Ｍ１１、Ｍ１２、Ｍ１３、Ｍ１４、Ｍ１５、Ｍ１６、Ｍ１７、Ｍ１８、Ｍ１９、Ｍ２０、Ｍ２１、Ｍ２２、Ｍ２３、Ｍ２４またはｓｓ１のアミノ酸配列を含むかまたはそのヌクレオチド配列によりコードされるまたは前記配列の何れかと実質的に同一(例えば、それと９５〜９９％同一または最大２０、１５、１０、８、６、５、４、３、２または１アミノ酸変化)の配列を含むかまたはそれによりコードされる。
【０１８０】
ある実施態様において、メソテリンＣＡＲ分子またはメソテリン抗原結合ドメインは、表２または３に提供する、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９、Ｍ１０、Ｍ１１、Ｍ１２、Ｍ１３、Ｍ１４、Ｍ１５、Ｍ１６、Ｍ１７、Ｍ１８、Ｍ１９、Ｍ２０、Ｍ２１、Ｍ２２、Ｍ２３、Ｍ２４またはｓｓ１のｓｃＦｖアミノ酸配列を含むかまたはそのヌクレオチド配列によりコードされるまたは前記配列の何れかと実質的に同一(例えば、それと９５〜９９％同一または最大２０、１５、１０、８、６、５、４、３、２または１アミノ酸変化)の配列を含むかまたはそれによりコードされる。
【０１８１】
ある実施態様において、メソテリンＣＡＲ分子またはメソテリン抗原結合ドメインは、表２に提供するＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９、Ｍ１０、Ｍ１１、Ｍ１２、Ｍ１３、Ｍ１４、Ｍ１５、Ｍ１６、Ｍ１７、Ｍ１８、Ｍ１９、Ｍ２０、Ｍ２１、Ｍ２２、Ｍ２３、Ｍ２４またはｓｓ１の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域または前記配列の何れかと実質的に同一(例えば、９５〜９９％同一または最大２０、１５、１０、８、６、５、４、３、２または１アミノ酸変化)の配列を含む。
【０１８２】
ある実施態様において、メソテリンＣＡＲ分子またはメソテリン抗原結合ドメインは、表４に提供するＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９、Ｍ１０、Ｍ１１、Ｍ１２、Ｍ１３、Ｍ１４、Ｍ１５、Ｍ１６、Ｍ１７、Ｍ１８、Ｍ１９、Ｍ２０、Ｍ２１、Ｍ２２、Ｍ２３、Ｍ２４またはｓｓ１の重鎖可変領域からの１、２または３  ＣＤＲ(例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３)；および／または表５に提供するＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９、Ｍ１０、Ｍ１１、Ｍ１２、Ｍ１３、Ｍ１４、Ｍ１５、Ｍ１６、Ｍ１７、Ｍ１８、Ｍ１９、Ｍ２０、Ｍ２１、Ｍ２２、Ｍ２３、Ｍ２４またはｓｓ１の軽鎖可変領域からの１、２または３  ＣＤＲ(例えば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／またはＬＣＤＲ３)；または前記配列の何れかと実質的に同一(例えば、９５〜９９％同一または最大５、４、３、２または１アミノ酸変化)の配列を含む。
【０１８３】
ｓｃＦｖドメインのＣＤＲ配列の配列を、重鎖可変ドメインについて表４および軽鎖可変ドメインについて表５に示す。
【０１８４】
【表６】
2018538339.tif 000007
【０１８５】
【表７】
2018538339.tif 000008
【０１８６】
メソテリンｓｃＦｖドメインおよびメソテリンＣＡＲ分子のアミノ酸および核酸配列は、表２(アミノ酸配列)および表３(核酸配列)。ある実施態様において、メソテリンＣＡＲ分子は、例えば、表２に提供する配列において下線を引く、ここに記載するリーダー配列を含む。ある実施態様において、メソテリンＣＡＲ分子はリーダー配列を含まない。
【０１８７】
【表８】
2018538339.tif 000009
【表９】
2018538339.tif 000010
【０１８８】
【表１０】
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【表１１】
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【０１８９】
【表１２】
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【表１３】
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【０１９０】
【表１４】
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【表１５】
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【０１９１】
【表１６】
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【表１７】
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【０１９２】
【表１８】
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【表１９】
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【０１９３】
【表２０】
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【表２１】
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【０１９４】
【表２２】
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【表２３】
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【０１９５】
【表２４】
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【表２５】
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【０１９６】
【表２６】
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【表２７】
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【０１９７】
【表２８】
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【表２９】
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【０１９８】
【表３０】
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【表３１】
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【０１９９】
【表３２】
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【表３３】
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【０２００】
【表３４】
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【表３５】
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【０２０１】
【表３６】
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【表３７】
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【０２０２】
【表３８】
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【表３９】
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【０２０３】
【表４０】
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【０２０４】
二特異的ＣＡＲ
ある実施態様において、多特異的抗体分子は、二特異的抗体分子である。二特異的抗体は、２を超える抗原に特異性を有しない。二特異的抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する第一免疫グロブリン可変ドメイン配列および第二エピトープに結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。ある実施態様において、第一および第二エピトープは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質(または多量体タンパク質のサブユニット)にある。ある実施態様において、第一および第二エピトープは重複する。ある実施態様において、第一および第二エピトープは重複しない。ある実施態様において、第一および第二エピトープは異なる抗原、例えば、異なるタンパク質(または多量体タンパク質の異なるサブユニット)にある。ある実施態様において、二特異的抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列ならびに第二エピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を含む。ある実施態様において、二特異的抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する半抗体および第二エピトープに結合特異性を有する半抗体を含む。ある実施態様において、二特異的抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する半抗体またはそのフラグメントおよび第二エピトープに結合特異性を有する半抗体またはそのフラグメントを含む。ある実施態様において、二特異的抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖまたはそのフラグメントおよび第二エピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖまたはそのフラグメントを含む。
【０２０５】
ある実施態様において、抗体分子は多特異的(例えば、二特異的または三特異的)抗体分子である。二特異的またはヘテロ二量体抗体分子を産生するプロトコールは当分野で知られ、例えば、ＵＳ５７３１１６８号に記載の、例えば、“ノブ・イン・ホール”アプローチ；例えば、ＷＯ０９／０８９００４号、ＷＯ０６／１０６９０５号およびＷＯ２０１０／１２９３０４号に記載の静電誘導Ｆｃ対合；例えば、ＷＯ０７／１１０２０５号に記載の鎖交換改変ドメイン(ＳＥＥＤ)ヘテロ二量体形成；例えば、ＷＯ０８／１１９３５３号、ＷＯ２０１１／１３１７４６号およびＷＯ２０１３／０６０８６７号に記載のＦａｂアーム交換；例えば、ＵＳ４４３３０５９号に記載の、例えば、アミン反応性基およびスルフヒドリル反応性基を有するヘテロ二官能性試薬を使用する二特異的構造産生のための抗体架橋結合による、二重抗体コンジュゲート；例えば、ＵＳ４４４４８７８号に記載の、２重鎖間のジスルフィド結合の還元および酸化のサイクルによる、異なる抗体からの半抗体(重−軽鎖対またはＦａｂ)組み換えにより産生した二特異的抗体決定基；例えば、ＵＳ５２７３７４３号に記載の、三機能的抗体、例えば、スルフヒドリル反応性基により架橋した３Ｆａｂ’フラグメント；例えば、ＵＳ５５３４２５４号に記載の、生合成結合タンパク質、例えば、Ｃ末端テイルにより、好ましくはジスルフィドまたはアミン反応性化学架橋結合により架橋したｓｃＦｖの対；例えば、ＵＳ５５８２９９６号に記載の、二機能性抗体、例えば、定常ドメインが置換されたロイシンジッパー(例えば、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎ)により二量体化された異なる結合特異性を有するＦａｂフラグメント；例えば、ＵＳ５５９１８２８号に記載の、二特異的およびオリゴ特異的モノおよびオリゴ価受容体、例えば、ある抗体のＣＨ１領域と一般に軽鎖を伴う他の抗体のＶＨ領域の間のポリペプチドスペーサーにより結合された、２抗体(２Ｆａｂフラグメント)のＶＨ−ＣＨ１領域；例えば、ＵＳ５６３５６０２号に記載の、二特異的ＤＮＡ−抗体コンジュゲート、例えば、ＤＮＡの二本鎖片による抗体またはＦａｂフラグメントの架橋；例えば、ＵＳ５６３７４８１号に記載の、二特異的融合タンパク質、例えば、２ｓｃＦｖとその間の親水性らせんペプチドリンカーおよび完全定常領域を含む発現構築物；例えば、ＵＳ５８３７２４２号に記載の、多価および多特異的結合タンパク質、例えば、一般に二重特異性抗体と呼ばれる、Ｉｇ重鎖可変領域の結合領域を有する第一ドメインおよびＩｇ軽鎖可変領域の結合領域の第二ドメインを有するポリペプチドの二量体(二特異的、三特異的または四特異的分子を作る高次構造も包含される)；例えば、ＵＳ５８３７８２１号に記載する、二量体化して二特異的／多価分子を形成できる、ペプチドスペーサーにより抗体ヒンジ領域およびＣＨ３領域にさらに結合した、ＶＬ鎖およびＶＨ鎖に結合したミニボディ構築物；二特異的二重特異性抗体を形成するために二量体を形成できる、短ペプチドリンカー(例えば、５または１０アミノ酸)によりまたはリンカー無しで何れかの配向で結合されたＶＨおよびＶＬドメイン；例えば、ＵＳ５８４４０９４号に記載の三量体および四量体；例えば、ＵＳ５８６４０���９号に記載の、ペプチド結合により環境可能基にＣ末端で結合し、さらにＶＬドメインと結合して一連のＦＶ(またはｓｃＦｖ)を形成する、ＶＨドメイン(またはファミリーメンバーのＶＬドメイン)のストリング；および例えば、ＵＳ５８６９６２０号に記載の、ｓｃＦＶまたは二重特異性抗体タイプ形式を使用して、例えば、ホモ二価、ヘテロ二価、三価および四価構造を形成する、非共有結合または化学架橋により多価構造に合わせられたペプチドリンカーにより結合したＶＨおよびＶＬ両ドメインを有する一本鎖結合ポリペプチドを含むが、これらに限定されない。多特異的および二特異的分子およびその製造方法のさらなる例は、例えば、ＵＳ５９１０５７３号、ＵＳ５９３２４４８号、ＵＳ５９５９０８３号、ＵＳ５９８９８３０号、ＵＳ６００５０７９号、ＵＳ６２３９２５９号、ＵＳ６２９４３５３号、ＵＳ６３３３３９６号、ＵＳ６４７６１９８号、ＵＳ６５１１６６３号、ＵＳ６６７０４５３号、ＵＳ６７４３８９６号、ＵＳ６８０９１８５号、ＵＳ６８３３４４１号、ＵＳ７１２９３３０号、ＵＳ７１８３０７６号、ＵＳ７５２１０５６号、ＵＳ７５２７７８７号、ＵＳ７５３４８６６号、ＵＳ７６１２１８１号、ＵＳ２００２００４５８７Ａ１号、ＵＳ２００２０７６４０６Ａ１号、ＵＳ２００２１０３３４５Ａ１号、ＵＳ２００３２０７３４６Ａ１号、ＵＳ２００３２１１０７８Ａ１号、ＵＳ２００４２１９６４３Ａ１号、ＵＳ２００４２２０３８８Ａ１号、ＵＳ２００４２４２８４７Ａ１号、ＵＳ２００５００３４０３Ａ１号、ＵＳ２００５００４３５２Ａ１号、ＵＳ２００５０６９５５２Ａ１号、ＵＳ２００５０７９１７０Ａ１号、ＵＳ２００５１００５４３Ａ１号、ＵＳ２００５１３６０４９Ａ１号、ＵＳ２００５１３６０５１Ａ１号、ＵＳ２００５１６３７８２Ａ１号、ＵＳ２００５２６６４２５Ａ１号、ＵＳ２００６０８３７４７Ａ１号、ＵＳ２００６１２０９６０Ａ１号、ＵＳ２００６２０４４９３Ａ１号、ＵＳ２００６２６３３６７Ａ１号、ＵＳ２００７００４９０９Ａ１号、ＵＳ２００７０８７３８１Ａ１号、ＵＳ２００７１２８１５０Ａ１号、ＵＳ２００７１４１０４９Ａ１号、ＵＳ２００７１５４９０１Ａ１号、ＵＳ２００７２７４９８５Ａ１号、ＵＳ２００８０５０３７０Ａ１号、ＵＳ２００８０６９８２０Ａ１号、ＵＳ２００８１５２６４５Ａ１号、ＵＳ２００８１７１８５５Ａ１号、ＵＳ２００８２４１８８４Ａ１号、ＵＳ２００８２５４５１２Ａ１号、ＵＳ２００８２６０７３８Ａ１号、ＵＳ２００９１３０１０６Ａ１号、ＵＳ２００９１４８９０５Ａ１号、ＵＳ２００９１５５２７５Ａ１号、ＵＳ２００９１６２３５９Ａ１号、ＵＳ２００９１６２３６０Ａ１号、ＵＳ２００９１７５８５１Ａ１号、ＵＳ２００９１７５８６７Ａ１号、ＵＳ２００９２３２８１１Ａ１号、ＵＳ２００９２３４１０５Ａ１号、ＵＳ２００９２６３３９２Ａ１号、ＵＳ２００９２７４６４９Ａ１号、ＥＰ３４６０８７Ａ２号、ＷＯ０００６６０５Ａ２号、ＷＯ０２０７２６３５Ａ２号、ＷＯ０４０８１０５１Ａ１号、ＷＯ０６０２０２５８Ａ２号、ＷＯ２００７０４４８８７Ａ２号、ＷＯ２００７０９５３３８Ａ２号、ＷＯ２００７１３７７６０Ａ２号、ＷＯ２００８１１９３５３Ａ１号、ＷＯ２００９０２１７５４Ａ２号、ＷＯ２００９０６８６３０Ａ１号、ＷＯ９１０３４９３Ａ１号、ＷＯ９３２３５３７Ａ１号、ＷＯ９４０９１３１Ａ１号、ＷＯ９４１２６２５Ａ２号、ＷＯ９５０９９１７Ａ１号、ＷＯ９６３７６２１Ａ２号、ＷＯ９９６４４６０Ａ１に見ることができる。上記引用出願の内容は、その全体を引用により本明細書に包含させる。
【０２０６】
二特異的抗体分子の各抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)内で、ＶＨはＶＬの上流でも下流でもよい。ある実施態様において、上流抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)は、ＶＨ(ＶＨ１)がＶＬ(ＶＬ１)の上流に配置され、下流抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)はＶＬ(ＶＬ２)がＶＨ(ＶＨ２)の上流に配置され、その結果、全体的二特異的抗体分子は配置ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２を有する。他の実施態様において、上流抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)は、ＶＬ(ＶＬ１)がＶＨ(ＶＨ１)の上流に配置され、下流抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)は、ＶＨ(ＶＨ２)がＶＬ(ＶＬ２)の上流に配置され、その結果、全体的二特異的抗体分子は配置ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２を有する。所望により、リンカーは、２抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖｓ)間、例えば、構築物がＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２として配置されるならばＶＬ１およびＶＬ２間または構築物がＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２として配置されるならばＶＨ１およびＶＨ２間に配置される。リンカーは、ここに記載のリンカー、例えば、(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)ｎリンカー(ここで、ｎは１、２、３、４、５または６、好ましくは４である)であり得る(配列番号２６)。一般に、２ｓｃＦｖ間のリンカーは、２ｓｃＦｖのドメイン間の誤対合を避けるのに十分長くなければならない。所望により、リンカーは、第一ｓｃＦｖのＶＬおよびＶＨの間に配置する。所望により、リンカーは、第二ｓｃＦｖのＶＬおよびＶＨの間に配置する。複数リンカーを有する構築物において、当該２以上のリンカーは同一でも異なっていてもよい。従って、ある実施態様において、二特異的ＣＡＲはＶＬ、ＶＨおよび所望により１以上のリンカーを、ここに記載する配置で含む
【０２０７】
ある態様において、二特異的抗体分子は、第一免疫グロブリン可変ドメイン配列、例えば、メソテリンに対する結合特異性を有する、例えば、ここに記載する、例えば、表２または３に記載する、ｓｃＦｖまたはここに記載するメソテリンｓｃＦｖからの軽鎖ＣＤＲおよび／または重鎖ＣＤＲを含むｓｃＦｖおよび異なる抗原の第二エピトープに結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。ある態様において、第二免疫グロブリン可変ドメイン配列は、メソテリン以外の抗原、例えば、癌または腫瘍細胞により発現される抗原に結合特異性を有する。ある態様において、第二免疫グロブリン可変ドメイン配列は、間質細胞のメソテリン以外の標的、例えば、ＦＡＰ；前立腺癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、アンドロゲン受容体、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＰＤＧＲＦ−β、ＴＡＲＰ、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＡＤ−ＣＴ−１またはＭＡＤ−ＣＴ−２；卵巣癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、Ｔｎ、ＰＲＳＳ２１、ＣＤ１７１、ルイスＹ、葉酸受容体α、クローディン６、ＧｌｏｂｏＨまたは精子タンパク質１７、例えば、肺癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＤＬＬ４またはＴｒｏｐ−２から選択される抗原に結合特異性を有する。
【０２０８】
キメラＴＣＲ
ある態様において、本発明のメソテリン抗体および抗体フラグメント(例えば、表２または３に記載のもの)は、Ｔ細胞受容体(“ＴＣＲ”)鎖の１以上の定常ドメイン、例えば、ＴＣＲアルファまたはＴＣＲベータ鎖に移植し、メソテリンに特異的に結合するキメラＴＣＲを作ることができる。理論に拘束されないが、キメラＴＣＲは抗原結合によりＴＣＲ複合体を介してシグナル伝達すると考えられる。例えば、ここに開示するメソテリンｓｃＦｖは、ＴＣＲ鎖、例えば、ＴＣＲアルファ鎖および／またはＴＣＲベータ鎖の定常ドメイン、例えば、細胞外定常ドメインの少なくとも一部、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに移植され得る。他の例として、メソテリン抗体フラグメント、例えば、ここに記載するＶＬドメインを、ＴＣＲアルファ鎖の定常ドメインに移植でき、メソテリン抗体フラグメント、例えば、ここに記載するＶＨドメインを、ＴＣＲベータ鎖の定常ドメインに移植できる(またはあるいは、ＶＬドメインを、ＴＣＲベータ鎖の定常ドメインに移植してよく、ＶＨドメインをＴＣＲアルファ鎖に移植してよい)。他の例として、メソテリン抗体または抗体フラグメントのＣＤＲ、例えば、表４または５に記載のメソテリン抗体または抗体フラグメントのＣＤＲをＴＣＲアルファおよび／またはベータ鎖に移植し、メソテリンに特異的に結合するキメラＴＣＲを作り得る。例えば、ここに開示するＬＣＤＲをＴＣＲアルファ鎖の可変ドメインに移植してよく、ここに開示するＨＣＤＲをＴＣＲベータ鎖の可変ドメインに移植してよく、またはその逆が可能である。このようなキメラＴＣＲは,当分野で知られる方法により産生され得る(例えば、Willemsen RA et al, Gene Therapy 2000; 7: 1369-1377; Zhang T et al, Cancer Gene Ther 2004; 11: 487-496; Aggen et al, Gene Ther. 2012 Apr;19(4):365-74)。
【０２０９】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、種々の実施態様において、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに結合する膜貫通ドメインを含むように設計され得る。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接した１以上のさらなるアミノ酸、例えば、該膜貫通タンパク質が由来したタンパク質の細胞外領域と関連する１以上のアミノ酸(例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５アミノ酸)および／または該膜貫通タンパク質が由来したタンパク質の細胞内領域と関連する１以上のさらなるアミノ酸(例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５アミノ酸)を含み得る。ある態様において、膜貫通ドメインは、使用したＣＡＲの他のドメインの１つと関連するものであり、例えば、ある実施態様において、膜貫通ドメインは、シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメインまたはヒンジドメインが由来するのと同じタンパク質由来であり得る。他の態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの他のドメインの何れかが由来するものと同じタンパク質に由来しない。ある場合、膜貫通ドメインは、このようなドメインの同一または異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインとの結合を避ける、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するために、選択するかまたはアミノ酸置換により修飾され得る。ある態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ発現細胞の細胞表面の他のＣＡＲとホモ二量体化できる。異なる態様において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じＣＡＲ発現細胞に存在する天然結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小化するために、修飾または置換され得る。
【０２１０】
膜貫通ドメインは天然供給源または組み換え供給源に由来し得る。供給源が天然であるとき、ドメインは何れかの膜結合または膜貫通タンパク質由来であり得る。ある態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲが標的と結合しているときはいつでも細胞内ドメインにシグナル伝達できる。本発明で特に有用な膜貫通ドメインは、少なくとも、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８(例えば、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ)、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通ドメインを含む。ある実施態様において、膜貫通ドメインは、例えば、少なくともＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫＧ２Ｃの膜貫通領域である。
【０２１１】
ある場合、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質からのヒンジにより、ＣＡＲの細胞外領域、例えば、ＣＡＲの抗原結合ドメインに結合させ得る。例えば、ある実施態様において、ヒンジは、ヒトＩｇ(免疫グロブリン)ヒンジ(例えば、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＤヒンジ)、ＧＳリンカー(例えば、ＧＳここに記載するリンカー)、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジまたはＣＤ８ａヒンジであり得る。ある実施態様において、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号２のアミノ酸配列を含む(例えば、それからなる)。ある態様において、膜貫通ドメインは、配列番号６の膜貫通ドメインを含む(例えば、それからなる)。
【０２１２】
ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＧ４ヒンジを含む。例えば、ある実施態様において、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号３のアミノ酸配列のヒンジを含む。
【０２１３】
ある実施態様において、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号１４のヌクレオチド配列によりコードされるヒンジを含む。
【０２１４】
ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＤヒンジを含む。例えば、ある実施態様において、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号４のアミノ酸配列のヒンジを含む。
【０２１５】
ある実施態様において、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号１５のヌクレオチド配列のヌクレオチド配列によりコードされるヒンジを含む。
【０２１６】
ある態様において、膜貫通ドメインは組み換えであってよく、この場合、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基が主として含まれる。ある態様において、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが、組み換え膜貫通ドメインの各末端で見られ得る。
【０２１７】
所望により、２〜１０アミノ酸兆の短オリゴまたはポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達領域の間に結合を形成し得る。グリシン−セリンダブレットが特に適当なリンカーを提供する。例えば、ある態様において、リンカーは、GGGGSGGGGS(配列番号５)のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、リンカーは、GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(配列番号１６)のヌクレオチド配列によりコードされる。
【０２１８】
ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジおよびその部分を含む。
【０２１９】
細胞質ドメイン
ＣＡＲの細胞質ドメインまたは領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般にＣＡＲが導入されている免疫細胞の正常エフェクター機能の少なくとも１つの活性化を担う。用語“エフェクター機能”は、細胞の特殊化機能をいう。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカイン分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。それ故に、用語“細胞内シグナル伝達ドメイン”はエフェクター機能シグナルを導入し、細胞に特殊化機能の実施を指示する、タンパク質の部分をいう。通常細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いてよいが、多くの場合、鎖全体を用いる必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分を使用する限り、このような切断部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクト鎖の代わりに使用され得る。用語細胞内シグナル伝達ドメインは、それ故に、エフェクター機能シグナルの伝達に十分な細胞内シグナル伝達ドメインのあらゆる切断部分を含むことを意味する。
【０２２０】
本発明のＣＡＲにおいて使用する細胞内シグナル伝達ドメインの例は、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)の細胞質配列および抗原受容体結合後に協調してシグナル伝達開始に働く共受容体、ならびにこれらの配列の何れかの誘導体またはバリアントおよび同等の機能的能力を有するあらゆる組み換え配列を含む。
【０２２１】
ＴＣＲ単独により産生されるシグナルはＴ細胞の完全活性可に不十分であり、二次および／または共刺激シグナルも必要であることが知られている。それ故に、Ｔ細胞活性化は、ＴＣＲ(一次細胞内シグナル伝達ドメイン)により抗原依存性一次活性化を開始するものおよび二次または共刺激シグナル(二次細胞質ドメイン、例えば、共刺激ドメイン)を提供するために抗原非依存的様式で働くものの２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列が介在するということができる。
【０２２２】
一次細胞質シグナル伝達ドメインは、刺激方向または阻害性方向でＴＣＲ複合体の一次活性化を制御する。刺激方向で作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。
【０２２３】
本発明に特に有用なＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインの例は、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃガンマＲIIａ、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８(“ＩＣＯＳ”としても知られる)、ＦｃεＲＩ、ＣＤ６６ｄ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２のものを含む。ある実施態様において、本発明のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータ配列を含む。
【０２２４】
ある実施態様において、一次シグナル伝達ドメインは、天然ＩＴＡＭドメインと比較して改変(例えば、増加または低減)された活性を有する修飾ＩＴＡＭドメイン、例えば、変異ＩＴＡＭドメインを含む。ある実施態様において、一次シグナル伝達ドメインは、修飾ＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化および／または切断ＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、一次シグナル伝達ドメインは、１、２、３、４またはそれ以上のＩＴＡＭモチーフを含む。
【０２２５】
本発明に特に有用である一次細胞内シグナル伝達ドメイン含有分子のさらなる例は、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２およびＣＤ３２のものを含む。
【０２２６】
ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインそれ自体を含んでよく、または本発明のＣＡＲの設定で有用な何れかの他の所望の細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わせてよい。例えば、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの部分をいう。共刺激分子は、リンパ球の抗原に対する効率的応答に必要な抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。このような分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１(ＰＤ１としても知られる)、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどを含む。例えば、ＣＤ２７共刺激は、インビトロでヒトＣＡＲＴ細胞の増大、エフェクター機能および生存を増強することならびにインビボでヒトＴ細胞残留性および抗腫瘍活性を増強することが示されている(Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706)。このような共刺激分子のさらなる例は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含む。例えば、ＣＤ２７共刺激は、インビトロでヒトＣＡＲＴ細胞の増大、エフェクター機能および生存を増強することならびにインビボでヒトＴ細胞残留性および抗腫瘍活性を増強することが示されている(Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706)。
【０２２７】
本発明のＣＡＲの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達ドメインは、互いに無作為のまたは特定の順序で結合され得る。所望により、短オリゴまたはポリペプチドリンカー、例えば、２〜１０アミノ酸(例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸)長が、細胞内シグナル伝達ドメイン間の結合を形成し得る。ある実施態様において、グリシン−セリンダブレットは適当なリンカーとして使用され得る。ある実施態様において、単一アミノ酸、例えば、アラニン、グリシンが適当なリンカーとして使用され得る。
【０２２８】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２以上、例えば、２、３、４、５またはそれ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある実施態様において、２以上、例えば、２、３、４、５またはそれ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、リンカー分子、例えば、ここに記載するリンカー分子により分離される。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、リンカー分子はグリシン残基である。ある実施態様において、リンカーはアラニン残基である。
【０２２９】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある態様において、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号７のシグナル伝達ドメインである。ある態様において、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号９(変異体ＣＤ３ゼータ)または配列番号１０(野生型ヒトＣＤ３ゼータ)のシグナル伝達ドメインである。
【０２３０】
ある態様において、細胞内は、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある態様において、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。ある態様において、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号１８の核酸配列によりコードされる。
【０２３１】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２７のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある態様において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、配列番号１９の核酸配列によりコードされる。
【０２３２】
ある態様において、細胞内は、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある態様において、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、配列番号４５の核酸配列によりコードされる。
【０２３３】
ある態様において、細胞内は、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＩＣＯＳのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある態様において、ＩＣＯＳのシグナル伝達ドメインは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＩＣＯＳのシグナル伝達ドメインは、配列番号４３の核酸配列によりコードされる。
【０２３４】
ナチュラルキラー細胞受容体(ＮＫＲ)ＣＡＲ
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ分子はナチュラルキラー細胞受容体(ＮＫＲ)の１以上の成分を含み、それによりＮＫＲ−ＣＡＲを形成する。ＮＫＲ成分は、次のナチュラルキラー細胞受容体の何れかからの膜貫通ドメイン、ヒンジドメインまたは細胞質ドメインであり得る：キラー細胞免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲ)、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＤＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１／Ｓ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＰ１およびＫＩＲ３ＤＰ１；天然細胞毒性受容体(ＮＣＲ)、例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６；免疫細胞受容体のシグナル伝達リンパ球活性化分子(ＳＬＡＭ)ファミリー、例えば、ＣＤ４８、ＣＤ２２９、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ−Ａ、ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥおよびＣＤ２Ｆ−１０；Ｆｃ受容体(ＦｃＲ)、例えば、ＣＤ１６およびＣＤ６４；およびＬｙ４９受容体、例えば、ＬＹ４９Ａ、ＬＹ４９Ｃ。ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲ分子は、アダプター分子または細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＤＡＰ１２と相互作用し得る。ＮＫＲ成分を含むＣＡＲ分子の配置および配列の例は、内容を引用により本明細書に包含させる、国際公開ＷＯ２０１４／１４５２５２号に記載される。
【０２３５】
スプリットＣＡＲ
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、スプリットＣＡＲを使用する。スプリットＣＡＲアプローチは、引用により本明細書に包含させる公報ＷＯ２０１４／０５５４４２号およびＷＯ２０１４／０５５６５７号により詳細に記載される。簡潔には、スプリットＣＡＲシステムは、第一抗原結合ドメインおよび共刺激ドメイン(例えば、４１ＢＢ)を有する第一ＣＡＲを発現する細胞を含み、該細胞は第二抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ＣＤ３ゼータ)を有する第二ＣＡＲも発現する。細胞が第一抗原に遭遇したとき、共刺激ドメインが活性化され、細胞が増殖する。細胞が第二抗原に遭遇したとき、細胞内シグナル伝達ドメインが活性化され、殺細胞活性が開始される。それ故に、ＣＡＲ発現細胞は、両抗原存在下でのみ完全に活性化される。ある実施態様において、第一抗原結合ドメインは、ここに記載する腫瘍抗原またはＢ細胞抗原を認識し、例えば、ここに記載する抗原結合ドメインを含み、第二抗原結合ドメインは第二抗原、例えば、ここに記載する第二腫瘍抗原または第二Ｂ細胞抗原を認識する。
【０２３６】
ＣＡＲと他の分子または薬剤の共発現
第二ＣＡＲの共発現
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、第二ＣＡＲ、例えば、同一標的(メソテリン)または異なる標的(例えば、間質細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＦＡＰ；前立腺癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、アンドロゲン受容体、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＰＤＧＲＦ−β、ＴＡＲＰ、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＡＤ−ＣＴ−１またはＭＡＤ−ＣＴ−２；卵巣癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、Ｔｎ、ＰＲＳＳ２１、ＣＤ１７１、ルイスＹ、葉酸受容体α、クローディン６、ＧｌｏｂｏＨまたは精子タンパク質１７、例えば、肺癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＤＬＬ４またはＴｒｏｐ−２)への異なる抗原結合ドメインを含む、例えば、第二ＣＡＲをさらに含み得る。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、第一抗原を標的とし、共刺激シグナル伝達ドメインを有するが、一次シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第一ＣＡＲおよび第二の、異なる抗原を標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有するが、共刺激シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ−４０またはＩＣＯＳの第一ＣＡＲへのおよび一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータの第二ＣＡＲへの配置は、細胞に対するＣＡＲ活性を両標的が発現されたときに限定し得る。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、メソテリン結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激ドメインを含む第一メソテリンＣＡＲおよびメソテリン以外の抗原(例えば、間質細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＦＡＰ；前立腺癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、アンドロゲン受容体、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＰＤＧＲＦ−β、ＴＡＲＰ、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＡＤ−ＣＴ−１またはＭＡＤ−ＣＴ−２；卵巣癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、Ｔｎ、ＰＲＳＳ２１、ＣＤ１７１、ルイスＹ、葉酸受容体α、クローディン６、ＧｌｏｂｏＨまたは精子タンパク質１７、例えば、肺癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＤＬＬ４またはＴｒｏｐ−２)を標的とし、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。他の実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、メソテリン結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第一メソテリンＣＡＲおよびメソテリン以外の抗原(例えば、間質細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＦＡＰ；前立腺癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、アンドロゲン受容体、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＰＤＧＲＦ−β、ＴＡＲＰ、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＡＤ−ＣＴ−１またはＭＡＤ−ＣＴ−２；卵巣癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、Ｔｎ、ＰＲＳＳ２１、ＣＤ１７１、ルイスＹ、葉酸受容体α、クローディン６、ＧｌｏｂｏＨまたは精子タンパク質１７、例えば、肺癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＤＬＬ４またはＴｒｏｐ−２)を標的とし、該抗原に対する抗原結合ドメイン、膜貫通ド���インおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。
【０２３７】
ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ここに記載するメソテリンＣＡＲおよび阻害性ＣＡＲを含む。ある実施態様において、阻害性ＣＡＲは、癌細胞に見られないが、正常細胞、例えば、メソテリンを同様に発現する正常細胞に見られる抗原に結合する抗原結合ドメインを含む。ある実施態様において、阻害性ＣＡＲは、阻害性分子の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンまたはＴＧＦＲベータの細胞内ドメインであり得る。
【０２３８】
ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞が２以上の異なるＣＡＲを含むとき、異なるＣＡＲの抗原結合ドメインは、これら抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようなものであり得る。例えば、第一および第二ＣＡＲを発現する細胞は、第二ＣＡＲの抗原結合ドメイン、例えば、ＶＨＨである第二ＣＡＲの抗原結合ドメインと結合を形成しない、第一ＣＡＲの抗原結合ドメインを、例えば、フラグメント、例えば、ｓｃＦｖとして有し得る。
【０２３９】
ある実施態様において、抗原結合ドメインは、相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドである分子を含む、単一ドメイン抗原結合(ＳＤＡＢ)分子を含む。例は、重鎖可変ドメイン、軽鎖を天然に欠く結合分子、慣用の４鎖抗体由来単一ドメイン、改変ドメインおよび抗体由来のもの以外の単一ドメインスキャフォールドを含むが、これらに限定されない。ＳＤＡＢ分子は、当分野の何れでもまたはあらゆる将来的な単一ドメイン分子でもよい。ＳＤＡＢ分子は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚、サメ、ヤギ、ウサギおよびウシを含むが、これらに限定されないあらゆる種に由来し得る。この用語は、ラクダ科およびサメ以外の種からの天然に存在する単一ドメイン抗体分子も含む。
【０２４０】
ある態様において、ＳＤＡＢ分子は、例えば、サメ血清に見られる新規抗原受容体(ＮＡＲ)として知られる免疫グロブリンアイソタイプ由来のものなどの、魚に見られる免疫グロブリンの可変領域に由来し得る。ＮＡＲの可変領域由来の単一ドメイン分子(“ＩｇＮＡＲ”)を産生する方法は、ＷＯ０３／０１４１６１およびStreltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909に記載される。
【０２４１】
他の態様によって、ＳＤＡＢ分子は、軽鎖を欠く重鎖として知られる、天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子である。このような単一ドメイン分子は、例えば、ＷＯ９４０４６７８号およびHamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448に記載される。明確化のために、天然に軽鎖を欠く重鎖分子由来のこの可変ドメインは、慣用の４鎖免疫グロブリンのＶＨと区別するために、ここではＶＨＨまたはナノボディとして知られる。このようなＶＨＨ分子は、ラクダ科種、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナコ由来であり得る。ラクダ科以外の他の種は、軽鎖を天然に欠く重鎖分子を形成し、このようなＶＨＨは、本発明の範囲内である。
【０２４２】
ＳＤＡＢ分子は組み換え、ＣＤＲ移植、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化および／またはインビトロ産生(例えば、ファージディスプレイにより選択)であり得る。
【０２４３】
受容体の抗原結合ドメインと相互作用する抗原結合ドメインを含む複数のキメラ膜包埋受容体を有する細胞は、例えば、抗原結合ドメインの１以上がその同族抗原に結合する能力を阻害するため、望ましくないことも判明している。従って、ここに開示されるのは、このような相互作用を最小化した、抗原結合ドメインを含む第一および第二非天然に存在するキメラ膜包埋受容体を有する細胞である。またここに開示されるのは、このような相互作用を最小化する抗原結合ドメインを含む第一および第二非の天然に存在するキメラ膜包埋受容体をコードする核酸、ならびにこのような細胞および核酸を製造および使用する方法である。ある実施態様において、第一および第二の非天然に存在するキメラ膜包埋受容体の一方の抗原結合ドメイは、ｓｃＦｖを含み、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ類、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメインもしくはヒトまたはマウス配列由来単一ＶＨドメインを含む。
【０２４４】
ある実施態様において、本発明は第一および第二ＣＡＲを含み、ここで、第一および第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、可変軽ドメインおよび可変重ドメインを含まない。ある実施態様において、第一および第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方はｓｃＦｖではない。ある実施態様において、第一および第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ類、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトもしくはマウス配列由来単一ＶＨドメインを含む。ある実施態様において、第一および第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ナノボディを含む。ある実施態様において、第一および第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ラクダ類ＶＨＨドメインを含む。
【０２４５】
ある実施態様において、第一および第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ類、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトもしくはマウス配列由来単一ＶＨドメインを含む。ある実施態様において、第一および第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はナノボディを含む。ある実施態様において、第一および第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はラクダ類ＶＨＨドメインを含む。
【０２４６】
ある実施態様において、細胞表面に存在するとき、第一ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、第二ＣＡＲの存在により実質的に低減されない。ある実施態様において、第二ＣＡＲ存在下の第一ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、第二ＣＡＲ非存在下の第一ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合の８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。
【０２４７】
ある実施態様において、細胞表面に存在するとき、第一および第二ＣＡＲの抗原結合ドメインは、両方がｓｃＦｖ抗原結合ドメインである場合より少なく、互いに結合する。ある実施態様において、第一および第二ＣＡＲの抗原結合ドメインは、両方がｓｃＦｖ抗原結合ドメインである場合より８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％少なく、互いに結合する。
【０２４８】
ＣＡＲ活性を増強する薬剤の共発現
他の態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性または適応度を増強する薬剤をさらに発現し得る。
【０２４９】
例えば、ある実施態様において、薬剤は、Ｔ細胞機能を調整または制御、例えば阻害する分子を阻害する薬剤であり得る。ある実施態様において、Ｔ細胞機能を調整または制御する分子は阻害性分子である。阻害性分子、例えば、ＰＤ１は、ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を減少させ得る。阻害性分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンまたはＴＧＦＲベータを含む。
【０２５０】
ある実施態様において、薬剤、例えば、阻害性核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡまたは例えば、ここに記載する、例えば、阻害性タンパク質または系、例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を、ＣＡＲ発現細胞におけるＴ細胞機能を調整または制御、例えば阻害する分子の発現阻害に使用し得る。ある実施態様において、薬剤はｓｈＲＮＡ、例えば、ここに記載するｓｈＲＮＡである。ある実施態様において、Ｔ細胞機能を調整または制御、例えば阻害する薬剤は、ＣＡＲ発現細胞内で阻害される。例えば、Ｔ細胞機能を調整または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子は、ＣＡＲの成分、例えば、全成分をコードする核酸に結合される。
【０２５１】
ある実施態様において、阻害性分子を阻害する薬剤は、細胞、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインに正のシグナルを提供する第二ポリペプチドと結合する第一ポリペプチド、例えば、阻害性分子を含む。ある実施態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンまたはＴＧＦＲベータなどの阻害性分子タまたはこれら何れかのフラグメント(例えば、少なくともこれら何れかの細胞外ドメインの一部)の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメイン(例えば、例えば、ここに記載する４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む)である第二ポリペプチド。ある実施態様において、薬剤は、ＰＤ１の第一ポリペプチドまたはそのフラグメント(例えば、少なくともＰＤ１の細胞外ドメインの一部)およびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)の第二ポリペプチドを含む。ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含む受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーである。ＰＤ−１は活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞に発現される(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75)。ＰＤ１の２リガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ１への結合によりＴ細胞活性化を下方制御することが示されている(Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43)。ＰＤ−Ｌ１はヒト癌で豊富である(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１の局所相互作用阻害により回復され得る。
【０２５２】
ある実施態様において、阻害性分子、例えば、プログラム死１(ＰＤ１)の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)を含む薬剤は、さらに、膜貫通ドメインおよび４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータなどの細胞内シグナル伝達ドメインと融合され得る(ここではＰＤ１  ＣＡＲとも称する)。ある実施態様において、ＰＤ１  ＣＡＲは、ここに記載するメソテリンＣＡＲと組み合わせて使用されたとき、Ｔ細胞の残留性を改善する。ある実施態様において、ＣＡＲは、配列番号２４で下線により示すＰＤ１の細胞外ドメインおよび配列番号２４のアミノ酸１〜２１にシグナル配列を含む、ＰＤ１  ＣＡＲである。ある実施態様において、ＰＤ１  ＣＡＲは、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。
【０２５３】
ある実施態様において、Ｎ末端シグナル配列を伴わないＰＤ１  ＣＡＲ配列番号２２に提供するアミノ酸配列を含む。
【０２５４】
ある実施態様において、薬剤は、Ｎ末端シグナル配列を伴うＰＤ１  ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＰＤ１  ＣＡＲをコードする核酸配列を含む。ある実施態様において、ＰＤ１  ＣＡＲの核酸配列は表１に示し、ＰＤ１  ＥＣＤは配列番号２３に下線を引く。
【０２５５】
他の例において、ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強できる薬剤は、共刺激分子または共刺激分子リガンドであり得る。共刺激分子の例は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体、ならびにＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)および４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)を含む。このような共刺激分子のさらなる例は、例えば、ここに記載の、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含む。共刺激分子の例リガンドは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬおよびＬＩＧＨＴを含む。ある実施態様において、共刺激分子リガンドは、ＣＡＲの共刺激分子ドメインと異なる共刺激分子に対するリガンドである。ある実施態様において、共刺激分子リガンドは、ＣＡＲの共刺激分子ドメインと同じ共刺激分子に対するリガンドである。ある実施態様において、共刺激分子リガンドは４−１ＢＢＬである。ある実施態様において、共刺激リガンドはＣＤ８０またはＣＤ８６である。ある実施態様において、共刺激分子リガンドはＣＤ７０である。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、１以上のさらなる共刺激分子または共刺激分子リガンドを含むように、改変され得る。
【０２５６】
ケモカイン受容体とのＣＡＲの共発現
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞は、さらにケモカイン受容体分子を含む。Ｔ細胞におけるケモカイン受容体ＣＣＲ２ｂまたはＣＸＣＲ２のトランスジェニック発現は、黒色腫および神経芽腫を含むＣＣＬ２−またはＣＸＣＬ１分泌固形腫瘍への輸送を増強する(Craddock et al., J Immunother. 2010 Oct; 33(8):780-8 and Kershaw et al., Hum Gene Ther. 2002 Nov 1; 13(16):1971-80)。それ故に、理論に拘束されることを意図しないが、腫瘍、例えば、固形腫瘍により分泌されるケモカインを認識するＣＡＲ発現細胞において発現されるケモカイン受容体は、ＣＡＲ発現細胞の腫瘍へのホーミングを改善でき、ＣＡＲ発現細胞の腫瘍への浸潤を促進し、ＣＡＲ発現細胞の抗腫瘍有効性を増強すると考えられる。ケモカイン受容体分子は、天然に存在するまたは組み換えケモカイン受容体またはそのケモカイン結合フラグメントを含み得る。ここに記載するＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ−Ｔｘ)における発現に適するケモカイン受容体分子は、ＣＸＣケモカイン受容体(例えば、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６またはＣＸＣＲ７)、ＣＣケモカイン受容体(例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０またはＣＣＲ１１)、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体(例えば、ＣＸ３ＣＲ１)、ＸＣケモカイン受容体(例えば、ＸＣＲ１)またはそのケモカイン結合フラグメントを含む。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲと発現するケモカイン受容体分子は、腫瘍により分泌されるケモカインに基づき選択される。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、さらに、ＣＣＲ２ｂ受容体またはＣＸＣＲ２受容体を含む、例えば、発現する。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲおよびケモカイン受容体分子は同じベクターにあるかまたは２個の異なるベクターにある。ここに記載するＣＡＲおよびケモカイン受容体分子が同じベクターにあるある実施態様において、ＣＡＲおよびケモカイン受容体分子は各々２個の異なるプロモーターの制御下にあるかまたは同じプロモーターの制御下にある。
【０２５７】
ＣＡＲをコードする核酸構築物
本発明は、本発明の１以上のＣＡＲ構築物をコードする核酸配列を含むＣＡＲ導入遺伝子を提供する。ある態様において、ＣＡＲ導入遺伝子はメッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。ある態様において、ＣＡＲ導入遺伝子はＤＮＡ構築物として提供される。
【０２５８】
従って、ある態様において、本発明はキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)をコードする単離核酸分子に関し、ここで、ＣＡＲは抗メソテリン結合ドメイン(例えば、ヒト抗メソテリン結合ドメイン)、膜貫通ドメインおよび刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、抗メソテリン結合ドメインはここに記載する抗メソテリン結合ドメイン、例えば、配列番号８７〜１１１からなる群から選択される配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む抗メソテリン結合ドメインである。ある実施態様において、単離核酸分子は、さらに共刺激ドメインをコードする配列を含む。ある実施態様において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインである。ある実施態様において、膜貫通ドメインは、配列番号６の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある実施態様において、抗メソテリン結合ドメインは、膜貫通ドメインにヒンジ領域、例えば、ここに記載するヒンジにより結合される。ある実施態様において、ヒンジ領域は、配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある実施態様において、単離核酸分子は、さらに共刺激ドメインをコードする配列を含む。ある実施態様において、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)および４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインである。このような共刺激分子のさらなる例は、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６およびＰＡＧ／Ｃｂｐを含む。ある実施態様において、共刺激ドメインは、配列番号７の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を��む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７の配列または配列番号８またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列および配列番号９または配列番号１０の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含み、ここで、これら細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は同じフレームにかつ単一ポリペプチド鎖として発現される。他の態様において、本発明は、配列番号１のリーダー配列、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２(またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)からなる群から選択される配列を有するｓｃＦｖドメイン、配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５(またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)のヒンジ領域、配列番号６の配列(またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)を有する膜貫通ドメイン、配列番号７の配列(またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)を有する４−１ＢＢ共刺激ドメインまたは配列番号８の配列(またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)を有するＣＤ２７共刺激ドメインおよび配列番号９または配列番号１０の配列(またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)を有するＣＤ３ゼータ刺激ドメインを含むＣＡＲ構築物をコードする単離核酸分子に関する。
【０２５９】
他の態様において、本発明は、該核酸分子によりコードされる単離ポリペプチド分子に関する。ある実施態様において、単離ポリペプチド分子は、配列番号６３；配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５および配列番号８６からなる群から選択される配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【０２６０】
他の態様において、本発明は、抗メソテリン結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)分子をコードする単離核酸分子に関し、ここで、核酸は、配列番号１１１；配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含む抗メソテリン結合ドメインをコードする。
【０２６１】
ある実施態様において、コードＣＡＲ分子は、さらに共刺激ドメインをコードする配列を含む。ある実施態様において、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)および４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインである。ある実施態様において、共刺激ドメインは、配列番号７の配列を含む。ある実施態様において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインである。ある実施態様において、膜貫通ドメインは、配列番号６の配列を含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよび機能的シグナル伝達ドメインｏｆゼータを含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７の配列および配列番号９の配列を含み、ここで、これら細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は同じフレームにかつ単一ポリペプチド鎖として発現される。ある実施態様において、抗メソテリン結合ドメインは、ヒンジ領域により膜貫通ドメインに結合される。ある実施態様において、ヒンジ領域は、配列番号２を含む。ある実施態様において、ヒンジ領域は、配列番号３、配列番号４または配列番号５を含む。
【０２６２】
他の態様において、本発明は、配列番号１のリーダー配列、配列番号３９〜６２またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列からなる群から選択される配列を有するｓｃＦｖドメイン、配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５のヒンジ領域、配列番号６の配列を有する膜貫通ドメイン、配列番号７の配列を有する４−１ＢＢ共刺激ドメインまたは配列番号８の配列を有するＣＤ２７共刺激ドメインおよび配列番号９または配列番号１０の配列を有するＣＤ３ゼータ刺激ドメインを含む、単離ＣＡＲ分子に関する。ある実施態様において、コードＣＡＲ分子は、配列番号６３〜８６からなる群から選択される配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【０２６３】
本発明は、さらに、ＣＡＲ導入遺伝子を含むベクターに関する。ある態様において、ＣＡＲベクターは、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に直接形質導入され得る。ある態様において、ベクターは、クローニングまたは発現ベクター、例えば、プラスミド(例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、ダブルマイニュート染色体)、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物の１以上を含むが、これらに限定されないベクターである。ある態様において、ベクターは、哺乳動物Ｔ細胞またはＮＫ細胞におけるＣＡＲ構築物の発現を可能とする。ある態様において、哺乳動物Ｔ細胞はヒトＴ細胞またはヒトＮＫ細胞である。
【０２６４】
本発明はまた、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に直接トランスフェクトされ得るＣＡＲコードＲＮＡ構築物を含む。トランスフェクションに使用するためのｍＲＮＡを産生する方法、一般に５０〜２０００塩基長の、３’および５’非翻訳配列(“ＵＴＲ”)、５’キャップおよび／または配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)、発現する遺伝子およびポリＡテイルを含む構築物を産生するための、特に設計されたプライマーでの鋳型のインビトロ転写(ＩＶＴ)、続くポリＡ付加を含む。このように産生されたＲＮＡは、異なる種の細胞を効率的にトランスフェクトし得る。ある態様において、鋳型はＣＡＲの配列を含む。
【０２６５】
ある態様において、メソテリンＣＡＲ導入遺伝子は、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)によりコードされる。ある態様において、メソテリンＣＡＲ導入遺伝子をコードするｍＲＮＡは、ＣＡＲＴ細胞の産生のためにＴ細胞にまたはＮＫ細胞に導入される。
【０２６６】
ベクター
本発明はまた本発明のＤＮＡが挿入される、ベクターも提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルス由来のベクターは、導入遺伝子の長期の、安定な組込みおよびその娘細胞における増殖を可能とするため、長期遺伝子導入の達成に適当なツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞に形質導入できる点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルス由来ベクターを超える利点を提供する。それらはまたさらに低免疫原性である利点もある。
【０２６７】
ある実施態様において、所望の本発明のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである。レトロウイルスベクターは、例えば、ガンマレトロウイルスベクターでもよい。ガンマレトロウイルスベクターは、例えば、プロモーター、パッケージングシグナル(ψ)、プライマー結合部位(ＰＢＳ)、１以上(例えば、２)末端反復配列(ＬＴＲ)および目的の導入遺伝子、例えば、ＣＡＲをコードする遺伝子を含み得る。ガンマレトロウイルスベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖなどのウイルス構造遺伝子を欠いてよい。ガンマレトロウイルスベクターの例は、マウス白血病ウイルス(ＭＬＶ)、脾フォーカス形成ウイルス(ＳＦＦＶ)および骨髄増殖性肉腫ウイルス(ＭＰＳＶ)およびこれら由来のベクターを含む。他のガンマレトロウイルスベクターは、Tobias Maetzig et al., “Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application” Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713に記載される。
【０２６８】
他の実施態様において、所望の本発明のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター(Ａ５／３５)である。他の実施態様において、ＣＡＲをコードする核酸の発現は、sleeping beauty、ＣＲＩＳＰＲ、ＣＡＳ９および亜鉛フィンガーヌクレアーゼなどのトランスポゾンを使用して達成できる。例えば、引用により全体を本明細書に包含させる、June et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716参照。
【０２６９】
短く要約すると、ＣＡＲをコードする天然または合成核酸の発現は、一般に、ＣＡＲをコードする核酸ポリペプチドまたはその一部をプロモーターに操作可能に結合させ、該構築物を発現ベクターに取り込むことにより達成される。ベクターは、真核生物における複製および組込みに適し得る。典型的クローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の制御に有用な転写および翻訳ターミネーター、開始配列およびプロモーターを含む。
【０２７０】
本発明の発現構築物は、標準遺伝子送達プロトコールを使用する、核酸免疫化および遺伝子治療にも使用され得る。遺伝子送達の方法は、当分野で知られる。例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させる米国特許５,３９９,３４６号、５,５８０,８５９号、５,５８９,４６６号参照。他の実施態様において、本発明は、遺伝子治療ベクターを提供する。
【０２７１】
核酸は多数のタイプのベクターにクローン化され得る。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドを含むが、これらに限定されないベクターにクローン化され得る。特に興味深いベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ産生ベクターおよび配列決定ベクターを含む。
【０２７２】
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形で細胞に提供され得る。ウイルスベクターテクノロジーは当分野で周知であり、例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NYおよび他のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載される。ベクターとして有用なウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスを含むが、これらに限定されない。一般に、適当なベクターは、少なくとも１生物で機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位および１以上の選択可能マーカーを含む(例えば、ＷＯ０１／９６５８４号、ＷＯ０１／２９０５８号および米国特許６,３２６,１９３号)。
【０２７３】
多数のウイルスベースのシステムが、哺乳動物細胞への遺伝子導入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための便利なプラットフォームを提供する。選択した遺伝子は、当分野で知られる技法を使用して、ベクターに挿入され、レトロウイルス粒子に包装され得る。次いで、組み換えウイルスを単離し、インビボまたはエクスビボで対象の細胞に送達され得る。多数のレトロウイルス系は、当分野で知られる。ある実施態様において、アデノウイルスベクターが使用される。多数のアデノウイルスベクターは、当分野で知られる。ある実施態様において、レンチウイルスベクターが使用される。
【０２７４】
さらなるプロモーター要素、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を制御する。一般に、これらは開始部位の３０〜１１０bp上流の領域に位置するが、多数のプロモーターが、同様に開始部位下流に機能的要素を含むことが示されている。プロモーター要素間の空間は、要素が互いに倒置されまたは移動したとき、プロモーター機能が保持されるように、しばしば可撓性である。チミジンキナーゼ(ｔｋ)プロモーターにおいて、プロモーター要素間の空間は、活性が減少し始めるまで、５０bp離れるまで増加できる。プロモーターによって、個々の要素が、転写活性に協調的または独立して機能できるように見える。プロモーターの例は、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣまたはホスホグリセロキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターを含む。
【０２７５】
哺乳動物Ｔ細胞におけるＣＡＲ導入遺伝子の発現が可能なプロモーターの例は、ＥＦ１アルファプロモーター(ＥＦ１ａまたはＥＦｌα)である。天然ＥＦ１ａプロモーターは、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素送達を担う、伸張因子−１複合体のアルファサブユニットの発現を駆動する。ＥＦ１ａプロモーターは哺乳動物発現プラスミドで広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローン化された導入遺伝子からのＣＡＲ発現駆動に効果的であることが示されている。例えば、Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)参照。ある態様において、ＥＦ１ａプロモーターは、配列番号１１として提供される配列を含む。
【０２７６】
プロモーターの他の例は、最初期サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに操作可能に結合したあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動できる、強力な構成的プロモーター配列である。しかしながら、サルウイルス４０(ＳＶ４０)初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス(ＭＭＴＶ)、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)末端反復配列(ＬＴＲ)プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸張因子−１αプロモーター、ヘモグロビンプロモーターおよびクレアチンキナーゼプロモーターなどの、しかしこれらに限定されないヒト遺伝子プロモーターを含むが、これらに限定されない、他の構成的プロモーター配列も使用し得る。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターも、本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用は、操作可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現を、該発現が望まれるとき発現をオンにし、発現が望まれないとき発現をオフにする分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例は、メタロチオナインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテトラサイクリンプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【０２７７】
プロモーターの他の例は、ホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターである。ある実施態様において、切断ＰＧＫプロモーター(例えば、野生型ＰＧＫプロモーター配列と比較したとき、１以上、例えば、１、２、５、１０、１００、２００、３００または４００のヌクレオチド欠失を有するＰＧＫプロモーター)が望ましいものであり得る。例示的ＰＧＫプロモーターのヌクレオチド配列は、下に提供する。
【０２７８】
ＷＴ  ＰＧＫプロモーター
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT
(配列番号５９７)
【０２７９】
例示的切断ＰＧＫプロモーター：
ＰＧＫ１００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG
(配列番号５９８)
ＰＧＫ２００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG
(配列番号５９９)
ＰＧＫ３００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG
(配列番号６００)
ＰＧＫ４００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG
(配列番号６０１)
【０２８０】
ベクターは、例えば、分泌を促進するシグナル配列、ポリアデニル化シグナルおよび転写ターミネーター(例えば、ウシ成長ホルモン(ＢＧＨ)遺伝子)、エピソーム複製および原核生物における複製を可能にする要素(例えばＳＶ４０起源およびＣｏｌＥ１または当分野で知られるその他)および／または選択を可能にする要素(例えば、アンピシリン耐性遺伝子および／またはゼオシンマーカー)も含み得る。
【０２８１】
ＣＡＲポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入すべき発現ベクターは、ウイルスベクターによりトランスフェクトまたは感染したと考えられる細胞の集団から、発現細胞の同定および選択を容易にするために、選択可能マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子または両方も含み得る。他の態様において、選択可能マーカーは、別のＤＮＡ片に担持され、同時トランスフェクション法により使用され得る。選択可能マーカーおよびレポーター遺伝子の両方は、宿主細胞における発現を可能にする適切な制御配列が横にあってよい。有用な選択可能マーカーは、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子などを含む。
【０２８２】
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞を同定し、制御配列の機能性を評価するために、使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在するかまたは発現され、発現が何らかの容易に検出可能な性質、例えば、酵素活性により顕在化するポリペプチドをコードする、遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後適当なときにアッセイされ得る。適当なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼまたは緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含み得る(例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82)。適当な発現系は周知であり、既知技法を使用して製造できまたは商業的に得られる。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最少５’フランキング領域を有する構築物がプロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域はレポーター遺伝子と連結させ、プロモーター駆動転写を制御する能力について薬剤を評価するのに使用し得る。
【０２８３】
ある実施態様において、ベクターは、さらに、第二ＣＡＲをコードする核酸を含み得る。ある実施態様において、第二ＣＡＲは、例えば、間質細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＦＡＰ；前立腺癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、アンドロゲン受容体、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＰＤＧＲＦ−β、ＴＡＲＰ、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＡＤ−ＣＴ−１またはＭＡＤ−ＣＴ−２；卵巣癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、Ｔｎ、ＰＲＳＳ２１、ＣＤ１７１、ルイスＹ、葉酸受容体α、クローディン６、ＧｌｏｂｏＨまたは精子タンパク質１７；例えば、肺癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＤＬＬ４またはＴｒｏｐ−２への、抗原結合ドメインを含む。ある実施態様において、ベクターは、第一抗原を標的とし、共刺激シグナル伝達ドメインを有するが、一次シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第一ＣＡＲをコードする核酸および第二の、異なる抗原を標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有するが、共刺激シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲをコードする核酸を含む。ある実施態様において、ベクターは、メソテリン結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激ドメインを含む第一メソテリンＣＡＲをコードする核酸およびメソテリン以外の抗原(例えば、間質細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＦＡＰ；前立腺癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、アンドロゲン受容体、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＰＤＧＲＦ−β、ＴＡＲＰ、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＡＤ−ＣＴ−１またはＭＡＤ−ＣＴ−２；卵巣癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、Ｔｎ、ＰＲＳＳ２１、ＣＤ１７１、ルイスＹ、葉酸受容体α、クローディン６、ＧｌｏｂｏＨまたは精子タンパク質１７；例えば、肺癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＤＬＬ４またはＴｒｏｐ−２)を標的とし、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む核酸コードする第二ＣＡＲを含む。他の実施態様において、ベクターは、メソテリン結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第一メソテリンＣＡＲをコードする核酸およびメソテリン以外の抗原(例えば、間質細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＦＡＰ；前立腺癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、アンドロゲン受容体、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＰＤＧＲＦ−β、ＴＡＲＰ、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＡＤ−ＣＴ−１またはＭＡＤ−ＣＴ−２；卵巣癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、Ｔｎ、ＰＲＳＳ２１、ＣＤ１７１、ルイスＹ、葉酸受容体α、クローディン６、ＧｌｏｂｏＨまたは精子タンパク質１７；例えば、肺癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＤＬＬ４またはＴｒｏｐ−２)を標的とし、該抗原に対する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲをコードする核酸を含む。
【０２８４】
ある実施態様において、ベクターは、ここに記載するメソテリンＣＡＲをコードする核酸および阻害性ＣＡＲをコードする核酸を含む。ある実施態様において、阻害性ＣＡＲは、癌細胞に見られないが、正常細胞に見られる抗原、例えば、同様にＣＬＬを発現する正常細胞に結合する抗原結合ドメインを含む。ある実施態様において、阻害性ＣＡＲは、阻害性分子の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータの細胞内ドメインであり得る。
【０２８５】
ある実施態様において、ベクターは２以上の核酸配列を含んでよく、ここで、核酸配列の１つは、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するメソテリンＣＡＲをコードする。ある実施態様において、他の核酸は、第二ＣＡＲ、例えば、阻害性ＣＡＲをコードするか、またはメソテリン以外の抗原(例えば、間質細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＦＡＰ；前立腺癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、アンドロゲン受容体、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＰＤＧＲＦ−β、ＴＡＲＰ、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＡＤ−ＣＴ−１またはＭＡＤ−ＣＴ−２；卵巣癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、Ｔｎ、ＰＲＳＳ２１、ＣＤ１７１、ルイスＹ、葉酸受容体α、クローディン６、ＧｌｏｂｏＨまたは精子タンパク質１７；例えば、肺癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＤＬＬ４またはＴｒｏｐ−２)またはここに記載するメソテリンＣＡＲの活性を制御できるポリペプチドに特異的に結合し得る。このような実施態様において、２以上の核酸配列、例えば、コードするここに記載するメソテリンＣＡＲおよび第二ＣＡＲまたは他のポリペプチドは、同じフレームの単一核酸分子によりコードされ単一ポリペプチド鎖として発現される。ある実施態様において、２以上のポリペプチドは、１以上のペプチド開裂部位(例えば、自己開裂部位または細胞内プロテアーゼの基質)により分離され得る。ペプチド開裂部位の例は次のものを含み、ここで、ＧＳＧ残基は任意である。
Ｔ２Ａ: (GSG) E G R G S L L T C G D V E E N P G P(配列番号６０２)
Ｐ２Ａ: (GSG) A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P(配列番号６０３)
Ｅ２Ａ: (GSG) Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P(配列番号６０４)
Ｆ２Ａ: (GSG) V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P(配列番号６０５)
【０２８６】
細胞に遺伝子を導入し、発現させる方法は、当分野で知られる。発現ベクターの場合、ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母または昆虫細胞に、当分野で知られる何れかの方法により容易に導入され得る。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的または生物学的手段により、宿主細胞に導入され得る。
【０２８７】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを含む。ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞の産生方法は、当分野で周知である。例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NY参照。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための好ましい方法は、例えば、Lipofectamine(Life Technologies)を使用するリポフェクションである。
【０２８８】
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクターおよび特にレトロウイルスベクターは、遺伝子の哺乳動物、例えば、ヒト細胞への挿入に、最も広く使用されている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許５,３５０,６７４号および５,５８５,３６２号参照。
【０２８９】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する化学的手段は、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系および水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質ベースの系を含む。インビトロおよびインビボで送達媒体として使用するコロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。標的化ナノ粒子または他の適当なサブミクロンサイズ送達系でのポリヌクレオチドの送達などの核酸の最先端の標的化送達の他の方法が利用可能である。
【０２９０】
非ウイルス送達系が利用される場合、送達媒体の例はリポソームである。脂質製剤の使用が、核酸の宿主細胞への導入に企図される(インビトロ、エクスビボまたはインビボ)。他の態様において、核酸は、脂質と結合させ得る。脂質と結合した核酸を、リポソームの水性内部に封入する、リポソームの二重層内に分散させる、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両方に結合する結合分子でリポソームに結合させる、リポソームに封入する、リポソームと複合体化させる、脂質含有溶液に分散させる、脂質と混合する、脂質と合わせる、脂質における懸濁液として包含させる、ミセルに包含されるまたは複合体化させるまたは脂質と他に結合させることができる。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液中の何らかの特定の構造に限定されない。例えば、二重層構造に、ミセルとしてまたは“崩壊”構造で存在し得る。それらはまた単に溶液に分散し、おそらく、均一サイズまたは形ではない凝集体を形成する。脂質は、天然に存在するまたは合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質は、細胞質に天然に存在する脂肪滴ならびに長鎖脂肪族炭化水素を含む一群の化合物およびその誘導体、例えば脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドを含む。
【０２９１】
使用に適する脂質は、商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(“ＤＭＰＣ”)はSigma, St. Louis, MOから得ることができ、ジセチルホスフェート(“ＤＣＰ”)はK & K Laboratories(Plainview, NY)から得ることができ、コレステロール(“Ｃｈｏｉ”)はCalbiochem-Behringから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール(“ＤＭＰＧ”)および他の脂質はAvanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, AL.)から得ることができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質原液は、約−２０℃で保存され得る。クロロホルムは、メタノールより容易に蒸発するため、唯一の溶媒として使用され得る。“リポソーム”は、封入脂質二重層または凝集体の産生により形成された多様な単一および多層状脂質媒体を包含する一般的用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部水性媒体を備えた小胞構造を有するとして特徴付けられ得る。多層状リポソームは、水性媒体により分離された複数脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されたとき、自然に形成される。脂質成分は、密閉構造の形成前に自己再配置され、水を捕捉し、脂質二重層間に溶質を溶解する(Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10)。しかしながら、通常の小胞構造ではなく、溶液で異なる構造を有する組成物も包含される。例えば、脂質はミセル構造と考えられ得るか単に脂質分子の不均一凝集体として存在し得る。また企図されるのは、リポフェクタミン−核酸複合体である。
【０２９２】
外因性核酸を宿主細胞に導入するのに使用したまたはその他細胞を本発明の阻害剤に暴露した方法にかかわらず、宿主細胞における組み換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、多様なアッセイが実施され得る。このようなアッセイは、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲなどの当業者に周知の“分子生物学的”アッセイ；例えば、本発明の範囲内に入る薬剤を同定するための免疫学的手段(ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット)またはここに記載するアッセイによる特定のペプチドの存在または非存在を検出するなどの“生化学”アッセイを含む。
【０２９３】
本発明は、さらにＣＡＲコード核酸分子を含むベクターを提供する。ある態様において、ＣＡＲベクターは、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に直接形質導入され得る。ある態様において、ベクターは、クローニングまたは発現ベクター、例えば、プラスミド(例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、ダブルマイニュート染色体)、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物の１以上を含むが、これらに限定されないベクターである。ある態様において、ベクターは、ＣＡＲ構築物を哺乳動物Ｔ細胞で発現できる。ある態様において、哺乳動物Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。ある態様において、哺乳動物細胞はヒトＮＫ細胞である。
【０２９４】
ＲＮＡトランスフェクション
ここに開示されるのは、インビトロ転写ＲＮＡ  ＣＡＲを産生する方法である。本発明はまた、細胞に直接トランスフェクトされ得るＣＡＲコードＲＮＡ構築物も含む。トランスフェクションに使用するためのｍＲＮＡを産生する方法は、一般に５０〜２０００塩基長(配列番号３５)の、３’および５’非翻訳配列(“ＵＴＲ”)、５’キャップおよび／または配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)含有構築物を産生するための、特別に設計されたプライマーを用いる鋳型のインビトロ転写(ＩＶＴ)、ポリＡ付加を含み得る。このように産生されたＲＮＡは、異なる種の細胞を効率的にトランスフェクトし得る。ある態様において、鋳型はＣＡＲの配列を含む。
【０２９５】
ある態様において、メソテリンＣＡＲは、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)によりコードされる。ある態様において、メソテリンＣＡＲをコードするｍＲＮＡを、ＣＡＲＴ細胞産生のためにＴ細胞に導入する。
【０２９６】
ある実施態様において、インビトロ転写ＲＮＡ  ＣＡＲは、一過性トランスフェクションの形で細胞に導入され得る。ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)産生鋳型を使用してインビトロ転写により産生される。あらゆる供給源からの目的のＤＮＡを、ＰＣＲにより、適切なプライマーおよびＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロｍＲＮＡ合成のための鋳型に直接変換させ得る。ＤＮＡの供給源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列または他の何れか適切なＤＮＡの供給源であり得る。インビトロ転写のための所望の鋳型は本発明のＣＡＲである。例えば、ＲＮＡ  ＣＡＲのための鋳型は、抗腫瘍抗体の一本鎖可変ドメインを含む細胞外領域；ヒンジ領域、膜貫通ドメイン(例えば、ＣＤ８ａの膜貫通ドメイン)；および細胞内シグナル伝達ドメインを含む、例えば、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含む細胞質領域を含む。
【０２９７】
ある実施態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡは、オープンリーディングフレームを含む。ＤＮＡは、生物ゲノムからの天然に存在するＤＮＡ配列に由来し得る。ある実施態様において、核酸は、５’および／または３’非翻訳領域(ＵＴＲ)の一部または全てを含み得る。核酸はエキソンおよびイントロンを含み得る。ある実施態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡはヒト核酸配列である。他の実施態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡは、５’および３’ＵＴＲを含むヒト核酸配列である。ＤＮＡは、あるいは、天然に存在する生物に通常発現されない人工ＤＮＡ配列であり得る。人工ＤＮＡ配列の例は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するよう一緒にライゲートされる遺伝子の部分を含むものである。一緒にライゲートされるＤＮＡの部分は、単一生物または１を超える生物由来であり得る。
【０２９８】
ＰＣＲは、トランスフェクションに使用されるｍＲＮＡのインビトロ転写用鋳型の産生に使用される。ＰＣＲを実施する方法は当分野で周知である。ＰＣＲにおいて使用するためのプライマーは、ＰＣＲの鋳型として使用するＤＮＡの領域と実質的に相補性である領域を有するように設計される。用語“実質的に相補性”は、プライマー配列における塩基の大部分または全てが相補性であるかまたは１以上の塩基が非相補性または不適合である、ヌクレオチドの配列をいう。実質的に相補配列は、ＰＣＲに使用するアニーリング条件下、意図するＤＮＡ標的とアニールまたはハイブリダイズできる。プライマーは、ＤＮＡ鋳型の何れかの部分と実質的に相補性であるように設計され得る。例えば、プライマーは、細胞において通常転写される(オープンリーディングフレーム)、５’および３’ＵＴＲを含む、核酸の部分の増幅のために設計され得る。プライマーはまた目的の特定のドメインをコードする核酸部分の増幅のためにも設計され得る。ある実施態様において、プライマーは、５’および３’ＵＴＲの全てまたは一部を含む、ヒトｃＤＮＡのコード領域増幅のために設計される。ＰＣＲに有用なプライマーは、当分野で周知である合成方法により産生され得る。“順方向プライマー”は、増幅するＤＮＡ配列の上流であるＤＮＡ鋳型上のヌクレオチドに実質的に相補性であるヌクレオチドの領域を含むプライマーである。用語“上流”は、コード鎖に対して増幅するＤＮＡ配列の５’位置をいう。“逆方向プライマー”は、増幅するＤＮＡ配列の下流である二本鎖ＤＮＡ鋳型上に実質的に相補性であるヌクレオチドの領域を含むプライマーである。用語“下流”は、コード鎖に対して増幅するＤＮＡ配列の３’位置をいう。
【０２９９】
ＰＣＲに有用なあらゆるＤＮＡポリメラーゼが、ここに開示する方法において使用され得る。試薬およびポリメラーゼは、多数の供給源から商業的に入手可能である。
【０３００】
安定性および／または翻訳効率を促進することができる化学構造も使用され得る。ＲＮＡは、好ましくは５’および３’ＵＴＲを有する。ある実施態様において、５’ＵＴＲは１〜３０００ヌクレオチド長である。コード領域に付加する５’および３’ＵＴＲ配列の長さは、ＵＴＲの異なる領域にアニールするＰＣＲ用プライマーの設計を含むが、これに限定されない方法毎に変わり得る。この試みを使用して、当業者は、転写ＲＮＡトランスフェクション後最適翻訳効率を達成するのに必要な５’および３’ＵＴＲ長を修飾できる。
【０３０１】
５’および３’ＵＴＲは、目的の核酸について、天然に存在する、内因性５’および３’ＵＴＲであり得る。あるいは、目的の核酸に対して内因性ではないＵＴＲ配列を、ＵＴＲ配列を順方向および逆方向プライマーに取り込むことによりまたは鋳型の何れかの他の修飾により付加できる。目的の核酸に対して内因性ではないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率修飾に有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列におけるＡＵ富要素がｍＲＮＡの安定性を減少させることは知られている。それ故に、３’ＵＴＲを、当分野で周知であるＵＴＲの性質に基づき、転写ＲＮＡの安定性を増加させるために選択または設計し得る。
【０３０２】
ある実施態様において、５’ＵＴＲは、内因性核酸のコザック配列を含み得る。あるいは、５’ＵＴＲが上記のとおりＰＣＲにより付加される目的の核酸に対して内因性でないとき、コンセンサスコザック配列が、５’ＵＴＲ配列付加により、再設計され得る。コザック配列は一部ＲＮＡ転写物の翻訳効率を増加させ得るが、全てのＲＮＡの効率的翻訳に必要であるとは考えられない。多くのｍＲＮＡについてコザック配列の必要性は当分野で知られる。他の実施態様において、５’ＵＴＲは、ＲＮＡゲノムが細胞で安定な、ＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲであり得る。他の実施態様において、種々のヌクレオチドアナログを、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨害するために３’または５’ＵＴＲに使用できる。
【０３０３】
遺伝子クローニングの必要性なしにＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を可能とするために、転写のプロモーターを、転写する配列の上流のＤＮＡ鋳型に結合しなければならない。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列が順方向プライマーの５’末端に結合されるとき、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、転写するオープンリーディングフレームの上流のＰＣＲ産物に取り込まれることになる。ある好ましい実施態様において、プロモーターは、本明細書の他の箇所に記載するＴ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターは、Ｔ３およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むが、これらに限定されない。Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は、当分野で知られる。
【０３０４】
好ましい実施態様において、ｍＲＮＡは、リボソーム結合、翻訳の開始および細胞におけるｍＲＮＡ安定性を決定するキャップを５’末端および３’ポリ(Ａ)テイル両方に有する。環状ＤＮＡ鋳型、例えば、プラスミドＤＮＡにおいて、ＲＮＡポリメラーゼは、真核生物細胞での発現に適さない長鎖状体産物を産生する。３’ＵＴＲの末端で直線化されたプラスミドＤＮＡの転写は、転写後ポリアデニル化されてさえ、真核生物トランスフェクションに効果的ではない通常サイズｍＲＮＡとなる。
【０３０５】
直線状ＤＮＡ鋳型において、ファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型の最後の塩基を超えて転写物の３’末端で伸長できる(Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)。
【０３０６】
ポリＡ／ＴストレッチのＤＮＡ鋳型への組込みの慣用の方法は分子クローニングである。しかしながら、プラスミドＤＮＡに統合されたポリＡ／Ｔ配列はプラスミドを不安定にさせ、これが、細菌細胞から得たプラスミドＤＮＡ鋳型が、しばしば欠失および他の異常で高度に汚染されているかの理由である。これは、クローニング工程を労力と時間がかかるもとするだけでなく、しばしば信頼できないものとする。これが、クローニング無しでポリＡ／Ｔ  ３’ストレッチを伴うＤＮＡ鋳型の構築を可能とする方法が高度に望まれる理由である。
【０３０７】
転写ＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントは、１００Ｔテイル(配列番号３１)(サイズは５０〜５０００Ｔ(配列番号３２)であり得る)などのポリＴテイルを含む逆方向プライマーを使用してＰＣＲ中またはＰＣＲ後、ＤＮＡライゲーションまたはインビトロ組換えを含むが、これらに限定されない何れかの他の方法で産生され得る。ポリ(Ａ)テイルはＲＮＡを安定性にし、分解を減少させる。一般に、ポリ(Ａ)テイルの長さは、転写ＲＮＡの安定性と正に相関する。ある実施態様において、ポリ(Ａ)テイルは１００〜５０００アデノシン(配列番号３３)である。
【０３０８】
ＲＮＡのポリ(Ａ)テイルは、大腸菌ポリＡポリメラーゼ(Ｅ−ＰＡＰ)などのポリ(Ａ)ポリメラーゼの使用により、インビトロ転写後さらに延長され得る。ある実施態様において、ポリ(Ａ)テイルの長さの１００ヌクレオチドから３００〜４００ヌクレオチド(配列番号３４)への増加は、ＲＮＡの翻訳効率の約２倍増加をもたらす。さらに、異なる化学基の３’末端への結合は、ｍＲＮＡ安定性を増加させ得る。このような結合は、修飾／人工ヌクレオチド、アプタマーおよび他の化合物を含み得る。例えば、ＡＴＰアナログを、ポリ(Ａ)ポリメラーゼを使用してポリ(Ａ)テイルに取り込み得る。ＡＴＰアナログは、ＲＮＡの安定性をさらに増加させ得る。
【０３０９】
５’キャップも、ＲＮＡ分子に安定性を提供する。好ましい実施態様において、ここに開示する方法により産生されるＲＮＡは、５’キャップを含む。５’キャップは、当分野で知られ、ここに記載する技法を使用して提供される(Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005))。
【０３１０】
ここに開示する方法により産生されたＲＮＡは、配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)配列も含み得る。ＩＲＥＳ配列は、キャップ無関係のｍＲＮＡへのリボソーム結合を開始し、翻訳の開始を促進するあらゆるウイルス、染色体または人工的に設計した配列であり得る。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤および界面活性剤などのような細胞透過性および生存能を促進する因子を含み得る、細胞エレクトロポレーションのための適当なあらゆる溶質が包含され得る。
【０３１１】
ＲＮＡは、多数の異なる方法、例えば、エレクトロポレーション(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems, Cologne, Germany))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments, Boston, Mass.)またはGene Pulser II(BioRad, Denver, Colo.)、Multiporator(Eppendort, Hamburg Germany)、リポフェクションを使用するカチオン性リポソーム介在トランスフェクション、ポリマー封入、ペプチド介在トランスフェクションまたは“遺伝子銃”などの微粒子銃粒子送達系を含むが、これらに限定されない、商業的に利用可能な方法の何れかを使用して、標的細胞に導入され得る(例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)参照)。
【０３１２】
非ウイルス送達方法
ある態様において、非ウイルス方法を使用して、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸を細胞または組織または対象に送達し得る。
【０３１３】
ある実施態様において、非ウイルス方法は、トランスポゾン(転位性要素とも称される)の使用を含む。ある実施態様において、トランスポゾンは、ゲノムの位置にそれ自体挿入され得るＤＮＡの一部、例えば、自己複製し、そのコピーをゲノムに挿入できるＤＮＡの一部または核酸から切り出され、ゲノムの他の位置に挿入され得るＤＮＡの一部であり得る。例えば、トランスポゾンは、転位のための逆方向反復フランキング遺伝子からなるＤＮＡ配列を含む。
【０３１４】
トランスポゾンを使用する核酸送達方法の例は、Sleeping Beautyトランスポゾン系(ＳＢＴＳ)およびpiggyBac(ＰＢ)トランスポゾン系を含む。例えば、Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65; and Ding et al. Cell. 122.3(2005):473-83参照、この全て、引用により本明細書に包含させる。
【０３１５】
ＳＢＴＳは、１)導入遺伝子を含むトランスポゾンおよび２)トランスポサーゼ酵素供給源の２成分を含む。トランスポサーゼは、トランスポゾンを担体プラスミド(または他のドナーＤＮＡ)から宿主細胞染色体／ゲノムなどの標的ＤＮＡに転位できる。例えば、トランスポサーゼは担体プラスミド／ドナーＤＮＡに結合し、トランスポゾン(導入遺伝子を含む)をプラスミドから切り出し、それを宿主細胞のゲノムに挿入する。例えば、Aronovich et al. supra.参照。
【０３１６】
トランスポゾンの例は、ｐＴ２ベースのトランスポゾンを含む。例えば、Grabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47;およびSingh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971参照、この全て、引用により本明細書に包含させる。トランスポザーゼの例は、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒタイプトランスポザーゼ、例えば、ＳＢ１０トランスポザーゼまたはＳＢ１１トランスポサーゼ(例えば、サイトメガロウイルスプロモーターから発現され得る、機能亢進トランスポサーゼ)を含む。例えば、Aronovich et al.; Kebriaei et al.;およびGrabundzija et al.参照、この全て、引用により本明細書に包含させる。
【０３１７】
ＳＢＴＳの使用は、導入遺伝子、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸の効率的組込みおよび発現を可能にする。ここに提供されるのは、例えば、ＳＢＴＳなどのトランスポゾン系を使用する、ここに記載するＣＡＲを安定に発現する細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を産生する方法である。
【０３１８】
ここに記載する方法によって、ある実施態様において、ＳＢＴＳ成分を含む１以上の核酸、例えば、プラスミドが細胞(例えば、ＴまたはＮＫ細胞)に送達される。例えば、核酸は、核酸(例えば、プラスミドＤＮＡ)送達の標準法、例えば、ここに記載する方法、例えば、エレクトロポレーション、トランスフェクションまたはリポフェクションにより送達される。ある実施態様において、核酸は、導入遺伝子、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸を含むトランスポゾンを含む。ある実施態様において、核酸は、導入遺伝子(例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸)をコードする核酸配列を含むトランスポゾンならびにトランスポサーゼ酵素を含む。他の実施態様において、２核酸を備えた系、例えば、デュアルプラスミド系であって、例えば、第一プラスミドが導入遺伝子を含むトランスポゾンを含み、第二プラスミドがトランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列を含むものを提供する。例えば、第一および第二核酸は、宿主細胞に共送達される。
【０３１９】
ある実施態様において、ヌクレアーゼ(例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ＺＦＮ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系または改変メガヌクレアーゼ再設計ホーミングエンドヌクレアーゼ)を使用するＳＢＴＳおよび遺伝子編集を使用する遺伝子挿入の組み合わせを使用することにより、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞、例えば、ＴまたはＮＫ細胞が産生される。
【０３２０】
ある実施態様において、送達の非ウイルス方法は、細胞、例えば、ＴまたはＮＫ細胞の再プログラミングおよび該細胞の対象への直接注入を可能とする。非ウイルスベクターの利点は、患者集団に見合うために必要な十分量の容易かつ比較的安価な産生、保存中の安定性および免疫原性欠如を含むが、これらに限定されない。
【０３２１】
細胞の供給源
例えば、ここに記載するＣＡＲを発現させるための増大および遺伝的修飾の前に、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、対象から得ることができる。用語“対象”は、免疫応答が誘発され得る生存動物(例えば、哺乳動物)を含むことを意図する。対象の例は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびこれらのトランスジェニック種を含む。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む、多くのの供給源から得ることができる。本発明のある態様において、当分野で利用可能なあらゆる多くのＴ細胞株が用いられ得る。本発明のある態様において、Ｔ細胞は、ＦｉｃｏｌｌTM分離などの当業者に知られる多くの技法の何れかを使用して、対象から採取した血液から得ることができる。ある好ましい態様において、個体の循環血からの細胞は、アフェレーシスにより得る。アフェレーシス産物は、一般に、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球を含むリンパ球、赤血球および血小板を含む。ある態様において、アフェレーシスにより採取した細胞は、血漿フラクションを除くために洗浄し、細胞をその後の処理段階に適する緩衝液または媒体に入れてよい。本発明のある態様において、細胞は、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)で洗浄される。別の態様において、洗浄溶液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠いてよくまたは全てではないにしても大部分の二価カチオンを欠く。カルシウム非存在下の初期活性化工程は、活性化を増強させ得る。当業者には容易に認識されるとおり、洗浄段階は当業者に既知の方法により達成でき、例えば、製造業者の指示に従い、半自動化“フロースルー”遠心分離(例えば、Cobe 2991 cell processor、Baxter CytoMateまたはHaemonetics Cell Saver 5)を使用するなどである。洗浄後、細胞を、例えば、無Ｃａ、無ＭｇＰＢＳ、PlasmaLyte Aまたは緩衝剤を伴うまたは伴わない他の食塩水溶液に、再懸濁し得る。あるいは、アフェレーシスサンプルの望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁してよい。
【０３２２】
本出願の方法は、５％以下、例えば２％のヒトＡＢ血清を含む培養培地条件を利用でき、既知培養培地条件および組成物、例えばSmith et al., “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement” Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31に記載のものを用いることは認識される。
【０３２３】
ある態様において、Ｔ細胞は、例えば、PERCOLLTM勾配による遠心または対向流遠心溶出法による、赤血球の溶解および単球の枯渇により、末梢血リンパ球から単離される。ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などのＴ細胞の特定の亜集団は、陽性または陰性選択技法によりさらに単離され得る。例えば、ある態様において、Ｔ細胞は、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な時間、DYNAビーズS(登録商標)M-450 CD3/CD28 Tなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８(例えば、３ｘ２８)コンジュゲートビーズとのインキュベーションにより単離される。ある態様において、時間は約３０分である。さらなる態様において、時間は、３０分〜３６時間の範囲またはそれ以上およびその間の全ての整数値である。さらなる態様において、時間は少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間または６時間である。さらに他の好ましい態様において、時間は１０〜２４時間である。ある態様において、インキュベーション時間は２４時間である。長いインキュベーション時間を、腫瘍組織からのまたは免疫不全個体からの腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ)単離におけるように、他の細胞型と比較してＴ細胞が少ないあらゆる状況において、Ｔ細胞単離に使用できる。さらに、長いインキュベーション時間は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の捕捉効率を上げ得る。それ故に、単にＴ細胞がＣＤ３／ＣＤ２をビーズと結合させる時間を短くまたは長くすることによりおよび／またはビーズ対Ｔ細胞比を上げるまたは下げることにより(さらにここに記載)、Ｔ細胞の亜集団が、培養開示時または該過程の他の時点で優性に選択され得る。さらに、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体の比を挙げるまたは下げることにより、Ｔ細胞の亜集団が、培養開示時または他の所望の時点で優性に選択され得る。当業者は、複数回の選択が、本発明の状況においてまた使用され得ることを認識する。ある態様において、選択過程を実施し、“未選択”細胞を活性化および増大過程に使用することが望ましいことがある。“未選択”細胞をまたさらなる選択に付してもよい。
【０３２４】
陰性選択によるＴ細胞集団富化は、陰性選択される細胞特有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせを用いて達成され得る。ある方法は、陰性選択される細胞に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用する、陰性磁気免疫粘着性またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択である。例えば、陰性選択によりＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは一般にＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を含む。ある態様において、一般にＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋およびＦｏｘＰ３＋を発現する制御Ｔ細胞を富化するか陽性選択することが望ましいことがある。あるいは、ある態様において、Ｔ制御細胞は、抗Ｃ２５コンジュゲートビーズまたは他の類似の選択法により枯渇される。
【０３２５】
ここに記載する方法は、例えば、ここに記載する、例えば、陰性選択技法を使用する、例えば、免疫エフェクター細胞の特異的亜集団、例えば、Ｔ制御細胞枯渇集団、ＣＤ２５＋枯渇細胞であるＴ細胞の選択を含み得る。好ましくは、Ｔ制御枯渇細胞の集団は、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含む。
【０３２６】
ある実施態様において、Ｔ制御細胞、例えば、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞は、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ−２を使用して、集団から除去される。ある実施態様において、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドを、基質、例えば、ビーズにコンジュゲートするかまたは基質、例えば、ビーズに他の方法でコートする。ある実施態様において、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントを、ここに記載する基質とコンジュゲートする。
【０３２７】
ある実施態様において、Ｔ制御細胞、例えば、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞を、MiltenyiTMの枯渇試薬を使用して集団から除去する。ある実施態様において、細胞対ＣＤ２５枯渇試薬比は１ｅ７細胞対２０uLまたは１ｅ７細胞対１５uLまたは１ｅ７細胞対１０uLまたは１ｅ７細胞対５uLまたは１ｅ７細胞対２.５uLまたは１ｅ７細胞対１.２５uLである。ある実施態様において、例えば、Ｔ制御細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇のために、５億細胞／ml超を使用する。さらなる態様において、６億、７億、８億または９億細胞／mlの細胞濃度を使用する。
【０３２８】
ある実施態様において、枯渇する免疫エフェクター細胞の集団は、約６×１０９  ＣＤ２５＋  Ｔ細胞を含む。他の態様において、枯渇する免疫エフェクター細胞の集団は、約１×１０９〜１ｘ１０１０  ＣＤ２５＋  Ｔ細胞およびその間の何れかの整数を含む。ある実施態様において、得られた集団Ｔ制御枯渇細胞は、２×１０９またはそれ以下のＴ制御細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞を有する(例えば、１×１０９、５×１０８、１×１０８、５×１０７、１×１０７またはそれ以下のＣＤ２５＋細胞)。
【０３２９】
ある実施態様において、Ｔ制御細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞は、例えば、チュービング１６２−０１などの枯渇チュービングセットを伴うＣｌｉｎｉＭＡＣ系を使用して,集団から除去する。ある実施態様において、ＣｌｉｎｉＭＡＣ系は、例えば、ＤＥＰＬＥＴＩＯＮ２.１などの、枯渇設定で流す。
【０３３０】
特定の理論に拘束されることを意図しないが、アフェレーシス前またはＣＡＲ発現細胞産物産生前の対象における免疫細胞の陰性レギュレーターの減少(例えば、意図しない免疫細胞、例えば、ＴＲＥＧ細胞の数の減少)は、対象の再発のリスクを減少し得る。例えば、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させる方法は、当分野で知られる。ＴＲＥＧ細胞を枯渇させる方法は、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体(ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体)、ＣＤ２５枯渇およびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【０３３１】
ある実施態様において、製造方法は、ＣＡＲ発現細胞製造前に、ＴＲＥＧ細胞の数の減少(例えば、枯渇)をすることを含む。例えば、製造方法は、例えば、ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)産物製造前に、サンプル、例えば、アフェレーシスサンプルと抗ＧＩＴＲ抗体および／または抗ＣＤ２５抗体(またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド)を接触させ、例えば、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させることを含む。
【０３３２】
ある実施態様において、対象をＣＡＲ発現細胞産物製造前の細胞の採取前にＴＲＥＧ細胞を減少させる１以上の治療で前処置し、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置から再発するリスクを減少させる。ある実施態様において、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させる方法は、対象へのシクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇またはこれらの組み合わせの１以上の投与を含むが、これらに限定されない。シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇またはこれらの組み合わせの１以上の投与は、ＣＡＲ発現細胞産物点滴の前、途中または後に行ってよい。
【０３３３】
ある実施態様において、対象をＣＡＲ発現細胞産物製造前の細胞の採取前にシクロホスファミドで前処理し、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置に対して再発するリスクを減少させる。ある実施態様において、対象をＣＡＲ発現細胞産物製造前の細胞の採取前に抗ＧＩＴＲ抗体で前処理し、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置に対して再発するリスクを減少させる。
【０３３４】
ある実施態様において、除去する細胞の集団は、制御Ｔ細胞または腫瘍細胞ではなく、ＣＡＲＴ細胞の増大および／または機能に他に負に影響する細胞、例えばＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１５または免疫抑制性の可能性のある細胞により発現される他のマーカーを発現する細胞である。ある実施態様において、このような細胞は、制御Ｔ細胞および／または腫瘍細胞と同時にまたは該枯渇後にまたは他の順序で除去されることが想定される。
【０３３５】
ここに記載する方法は、１以上の選択工程、例えば、１以上の枯渇工程を含み得る。陰性選択によるＴ細胞集団の富化は、例えば、陰性選択される細胞特有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせにより達成され得る。ある方法は、陰性選択される細胞に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用する、陰性磁気免疫粘着性またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択である。例えば、陰性選択によりＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を含み得る。
【０３３６】
ここに記載する方法は、さらに腫瘍抗原、例えば、ＣＤ２５を含まない腫瘍抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂを発現する細胞を集団から除去し、それによりＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲの発現に適するＴ制御枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇および腫瘍抗原枯渇細胞の集団を提供することを含む。ある実施態様において、腫瘍抗原発現細胞は、Ｔ制御、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗腫瘍抗原抗体またはそのフラグメントは、細胞または抗ＣＤ２５抗体もしくはそのフラグメントの除去に使用し得るのと同じ基質、例えば、ビーズに結合してよくまたは抗腫瘍抗原抗体もしくはそのフラグメントは、異なるビーズに結合してよく、その混合物を細胞除去に使用し得る。他の実施態様において、Ｔ制御細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞除去および腫瘍抗原発現細胞除去は逐次的であり、例えば、何れの順序で実施してもよい。
【０３３７】
また提供されるのは、Ｔ制御枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞およびチェックポイント阻害剤枯渇細胞、例えば、ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋および／またはＴＩＭ３＋枯渇細胞の集団を提供することを含む方法である。チェックポイント阻害剤の例は、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−１、ＣＤ１６０、Ｐ１Ｈ、２Ｂ４、ＰＤ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡおよびＬＡＩＲ１を含む。ある実施態様において、チェックポイント阻害剤発現細胞は、Ｔ制御、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗チェックポイント阻害剤抗体またはそのフラグメントを、細胞または抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントの除去に使用し得るのと同じビーズに結合してよくおよび抗チェックポイント阻害剤抗体またはそのフラグメントを別のビーズの結合し、その混合物を細胞の除去に使用し得る。他の実施態様において、Ｔ制御細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去およびチェックポイント阻害剤発現細胞の除去は逐次的であり、例えば、何れの順序で実施してもよい。
【０３３８】
ある実施態様において、Ｔ細胞集団は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢおよびパーフォリンまたは他の適切な分子、例えば、他のサイトカインの１以上を発現するように選択され得る。細胞発現をスクリーニングする方法は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／１２６７１２号に記載の方法により決定され得る。
【０３３９】
陽性または陰性選択による所望の細胞の集団の単離のために、細胞および表面(例えば、ビーズなどの粒子)の濃度を変えてよい。ある態様において、ビーズおよび細胞が混合される容積を顕著に減らし(例えば細胞濃度を増加させ)、細胞およびビーズの最大接触を確実にすることが望ましいことがある。例えば、ある態様において、２０億細胞／mlの濃度を使用する。ある態様において、１０億細胞／mlの濃度を使用する。さらなる態様において、１億細胞／ml超を使用する。さらなる態様において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万または５０００万細胞／mlの細胞濃度を使用する。さらにある態様において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億細胞／mlの細胞濃度を使用する。さらなる態様において、１億２５００万または１億５０００万細胞／ml濃度が使用され得る。高濃度の使用は、細胞収率、細胞活性化および細胞増大の増加をもたらし得る。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞または多くの腫瘍細胞が存在するサンプル(例えば、白血病性血液、腫瘍組織など)からの効率的捕捉を可能とする。このような細胞の集団は治療価値を有し、得ることが意図しれ得る。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常弱いＣＤ２８発現であるＣＤ８＋  Ｔ細胞の効率的選択を可能とする。
【０３４０】
関連態様において、低濃度の細胞を使用することが望ましいことがある。Ｔ細胞および表面(例えば、ビーズなどの粒子)の混合物を顕著に希釈することにより、粒子と細胞の相互作用が減少される。これは、粒子に結合する所望の抗原が高い量で発現される細胞について選択される。例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞はＣＤ２８を抗レベルで発現し、希釈濃度でＣＤ８＋  Ｔ細胞より効率的に捕捉される。ある態様において、使用する細胞濃度は５×１０ｅ６／mlである。他の態様において、使用する濃度は約１×１０５／ml〜１×１０６／mlおよびその間の何れかの整数であり得る。
【０３４１】
他の態様において、細胞を、回転子上で種々の時間、種々の速度で、２〜１０℃または室温でインキュベートし得る。
【０３４２】
刺激のためのＴ細胞も洗浄工程後凍結させ得る。理論に拘束されることを意図しないが、凍結および続く解凍工程は、細胞集団から顆粒球およびある程度単球を除去することにより、より均一な産物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄工程後、細胞を凍結溶液に懸濁させ得る。多くの凍結溶液およびパラメータが当分野で知られ、この状況において有用であるが、ある方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含むＰＢＳまたは１０％Dextran 40および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７.５％ＤＭＳＯまたは３１.２５％Plasmalyte-A、３１.２５％デキストロース５％、０.４５％ＮａＣｌ、１０％Dextran 40および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７.５％ＤＭＳＯを含む培養培地または例えば、HespanおよびPlasmaLyte Aを含む他の適当な細胞凍結培地の使用を含む地、次いで細胞を１°／分の速度で−８０℃まで凍結させ、液体窒素保存貯蔵タンクの蒸気層で保存する。制御凍結の他の方法ならびに即時に−２０℃または液体窒素での無制御凍結を使用し得る。
【０３４３】
ある態様において、凍結保存細胞を解凍し、ここに記載するとおり洗浄し、１時間室温で急速させ、その後、ここに記載する方法を使用して活性化する。
【０３４４】
本発明においてまた企図されるのは、ここに記載する増大細胞が必要であるときより前の時点での、対象からのサンプルまたはアフェレーシス産物の採取である。すなわち、増大させる細胞を必要な何れかの時点で採取し、Ｔ細胞などの所望の細胞を単離し、ここに記載するようなＴ細胞治療により利益を受ける多くの何れかの疾患または状態のＴ細胞治療に後に使用するために、単離および凍結し得る。ある態様において、血液サンプルまたはアフェレーシスは、一般に健常対象から採る。ある態様において、血液サンプルまたはアフェレーシは、一般に健常であるが、疾患を発症するリスクがあるが、まだ疾患を発症していない対象から採取し、目的の細胞を単離し、後の使用のために凍結する。ある態様において、Ｔ細胞は、増殖され、凍結され、後の時点で使用され得る。ある態様において、サンプルを、ここに記載する特定の疾患の診断直後、しかし、何らかの処置前に患者から採る。さらなる態様において、細胞を、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体またはキャンパス、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８および照射などの他の免疫奪格剤などの薬剤での処置を含むが、これらに限定されない、多くの何れかの関連処置モダリティ前の対象からの血液サンプルまたはアフェレーシスから単離する、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８および照射などの他の免疫奪格剤。
【０３４５】
本発明のさらなる態様において、機能的Ｔ細胞を対象に残す処置後に、Ｔ細胞を直接患者から得る。これに関して、ある癌処置、特に免疫系を損傷させる薬物での処置後、患者が通常該処置から回復する期間である処置直後、得られるＴ細胞の品質が、エクスビボで増大する能力について最適または改善され得ることが観察されている。同様に、ここに記載する方法を使用するエクスビボ操作後、これらの細胞は、生着およびインビボ増大が増大する好ましい状態にあり得る。それ故に、本発明において、この回復期にＴ細胞、樹状細胞または造血系の他の細胞を含む血液細胞を採取することが企図される。さらに、ある態様において、動員(例えば、ＧＭ−ＣＳＦでの動員)およびコンディショニングレジメンを、特に、治療後の一定の時間枠の間、特定の細胞型再増殖、再循環、再生および／または増大を指示する、対象における条件を作るために使用し得る。細胞型の例は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞および免疫系の他の細胞を含む。
【０３４６】
ある実施態様において、Ｔ細胞集団はジアグリセロールキナーゼ(ＤＧＫ)欠損である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫ  ＲＮＡまたはタンパク質を発現しないまたはＤＧＫ活性が低減もしくは阻害されている細胞を含む。ＤＧＫ欠損細胞は、例えば、ＤＧＫ発現を低減または阻止するＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡを投与する、遺伝的アプローチにより産生され得る。あるいは、ＤＧＫ欠損細胞は、ここに記載するＤＧＫ阻害剤での処置により産生され得る。
【０３４７】
ある実施態様において、Ｔ細胞集団はＩｋａｒｏｓ欠損である。Ｉｋａｒｏｓ欠損細胞は、Ｉｋａｒｏｓ  ＲＮＡまたはタンパク質を発現しないまたはＩｋａｒｏｓ活性が低減もしくは阻害されている細胞を含み、Ｉｋａｒｏｓ欠損細胞は、例えば、Ｉｋａｒｏｓ発現を低減または阻止するＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡを投与する、遺伝的アプローチにより産生され得る。あるいは、Ｉｋａｒｏｓ欠損細胞は、Ｉｋａｒｏｓ阻害剤、例えば、レナリドマイドでの処置により産生され得る。
【０３４８】
ある実施態様において、Ｔ細胞集団はＤＧＫ欠損およびＩｋａｒｏｓ欠損であり、例えば、ＤＧＫおよびＩｋａｒｏｓを発現しないまたはＤＧＫおよびＩｋａｒｏｓ活性が低減もしくは阻害されている。このようなＤＧＫおよびＩｋａｒｏｓ欠損細胞は、ここに記載する方法の何れかにより産生され得る。
【０３４９】
ある実施態様において、ＮＫ細胞は、対象から得られる。他の実施態様において、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞株、例えば、ＮＫ−９２細胞株(Ｃｏｎｋｗｅｓｔ)である。
【０３５０】
同種ＣＡＲ免疫エフェクター細胞
ここに記載するある実施態様において、免疫エフェクター細胞は同種免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞であり得る。例えば、細胞は、同種Ｔ細胞、例えば、機能的Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)および／またはヒト白血球抗原(ＨＬＡ)、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIの発現を欠く同種Ｔ細胞であり得る。
【０３５１】
機能的ＴＣＲを欠くＴ細胞は、例えば、表面に何ら機能的ＴＣＲを発現しないように改変され、機能的ＴＣＲを含む１以上のサブユニットを発現しないように改変されまたは表面に極少量の機能的ＴＣＲを産生するように改変され得る。あるいは、Ｔ細胞は、例えば、ＴＣＲのサブユニットの１以上の変異または切断形態の発現により、実質的に障害されたＴＣＲを発現し得る。用語“実質的に障害されたＴＣＲ”は、このＴＣＲが宿主で有害免疫反応を誘発しないことを意味する。
【０３５２】
ここに記載するＴ細胞は、例えば、機能的ＨＬＡを表面に発現しないように改変され得る。例えば、ここに記載するＴ細胞は、細胞表面発現ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIが下方制御されるように改変され得る。
【０３５３】
ある実施態様において、Ｔ細胞は、機能的ＴＣＲおよび機能的ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIを欠いてよい。
【０３５４】
機能的ＴＣＲおよび／またはＨＬＡの発現を欠く修飾Ｔ細胞は、ＴＣＲまたはＨＬＡの１以上のサブユニットのノックアウトまたはノックダウンを含む、適当な何れかの手段により得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用するＴＣＲおよび／またはＨＬＡのノックダウンを含み得る。
【０３５５】
ある実施態様において、同種細胞は、例えばここに記載する何れかの方法により、阻害性分子を発現しないまたは低レベルで発現する細胞であり得る。例えば、細胞は、例えば、免疫エフェクター応答を開始するためにＣＡＲ発現細胞の能力を減少させ得る、阻害性分子を発現しないまたは低レベルで発現する細胞であり得る。阻害性分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータを含む。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による阻害性分子の阻害は、ＣＡＲ発現細胞性能を最適化させ得る。ある実施態様において、例えば、ここに記載する、阻害性核酸、例えば、阻害性核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)が使用され得る。
【０３５６】
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するためのｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ
ある実施態様において、ＴＣＲ発現および／またはＨＬＡ発現は、細胞、例えば、Ｔ細胞において、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡおよび／またはここに記載する阻害性分子(例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、をアデノシンおよびＴＧＦＲベータ)をコードする核酸を標的とするｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを使用して阻害させ得る。ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの発現系およびｓｈＲＮＡ例は、例えば、全体を引用により本明細書に包含させる、２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ６４９および６５０に記載される。
【０３５７】
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ
ここで使用する“ＣＲＩＳＰＲ”または“ＴＣＲおよび／またはＨＬＡに対するＣＲＩＳＰＲ”または“ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するＣＲＩＳＰＲ”は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートのセットまたは該反復のセットを含む系をいう。ここで使用する“Ｃａｓ”は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をいう。
【０３５８】
ここで使用する“ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ”系は、細胞、例えば、Ｔ細胞におけるＴＣＲおよび／またはＨＬＡ遺伝子および／またはここに記載する阻害性分子(例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータ)のサイレンスまたは変異に使用され得る、ＣＲＩＳＰＲおよびＣａｓ由来の系をいう。
【０３５９】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系およびその使用は、例えば、全体を引用により本明細書に包含させる、２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ６５１〜６５８に記載される
【０３６０】
ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するためのＴＡＬＥＮ
ＴＡＬＥＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲに対するＴＡＬＥＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するＴＡＬＥＮ”は、細胞、例えば、Ｔ細胞におけるＨＬＡおよび／またはＴＣＲ遺伝子および／またはここに記載する阻害性分子(例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータ)の編集に使用され得る人工ヌクレアーゼである転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼをいう。
【０３６１】
ＴＡＬＥＮおよびその使用は、例えば、全体を引用により本明細書に包含させる、２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ６５９〜６６５に記載される。
【０３６２】
ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害する亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
“ＺＦＮ”または“亜鉛フィンガーヌクレアーゼ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲに対するＺＦＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するＺＦＮ”は、細胞、例えば、Ｔ細胞におけるＨＬＡおよび／またはＴＣＲ遺伝子および／またはここに記載する阻害性分子(例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータ)の編集に使用され得る人工ヌクレアーゼである亜鉛フィンガーヌクレアーゼをいう。
【０３６３】
ＺＦＮおよびその使用は、例えば、全体を引用により本明細書に包含させる、２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ６６６〜６７１に記載される。
【０３６４】
テロメラーゼ発現
何らかの特定の理論に拘束されることを意図しないが、ある実施態様において、治療Ｔ細胞は、Ｔ細胞における短テロメアにより、患者で短期残留性を有し、従って、テロメラーゼ遺伝子でのトランスフェクションは、Ｔ細胞のテロメアを延長し、患者におけるＴ細胞の残留性を改善し得る。Carl June, “Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic”, Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007)参照。それ故に、ある実施態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は、テロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴを異所性に発現する。ある態様において、本発明は、細胞とテロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を接触させることを含む、ＣＡＲ発現細胞を産生する方法を提供する。細胞は、ＣＡＲをコードする構築物と接触させる前、同時または後に該核酸と接触させ得る。
【０３６５】
ある態様において、本発明は、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の集団を産生する方法に関する。ある実施態様において、方法は、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の集団を提供し、免疫エフェクター細胞の集団とＣＡＲをコードする核酸を接触させ、そして免疫エフェクター細胞の集団をテロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸と、ＣＡＲおよびテロメラーゼ発現を可能にする条件した、接触させることを含む。
【０３６６】
ある実施態様において、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸はＤＮＡである。ある実施態様において、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸は、テロメラーゼサブユニットの発現を駆動できるプロモーターを含む。
【０３６７】
ある実施態様において、ｈＴＥＲＴは、ここに示す配列番号１１０のGenBank Protein ID AAC51724.1の(Meyerson et al., “hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795)のアミノ酸配列を有する。
【０３６８】
ある実施態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号１１０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を有する。ある実施態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号１１０の配列を有する。ある実施態様において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端または両方に欠失(例えば、５、１０、１５、２０または３０アミノ酸を超えない)を含む。ある実施態様において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端または両方にトランスジェニックアミノ酸配列(例えば、５、１０、１５、２０または３０アミノ酸を超えない)を含む。
【０３６９】
ある実施態様において、ｈＴＥＲＴは、ここに示す配列番号１１１に示すGenBank Accession No. AF018167(Meyerson et al., “hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795)の核酸配列によりコードされる。
【０３７０】
ある実施態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号１１１の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６、９７％、９８％または９９％同一性を有する核酸によりコードされる。ある実施態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号１１１の核酸によりコードされる。
【０３７１】
免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞)の活性化および増大
Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、例えば、一般に米国特許６,３５２,６９４号、６,５３４,０５５号、６,９０５,６８０号、６,６９２,９６４号、５,８５８,３５８号、６,８８７,４６６号、６,９０５,６８１号、７,１４４,５７５号、７,０６７,３１８号、７,１７２,８６９号、７,２３２,５６６号、７,１７５,８４３号、５,８８３,２２３号、６,９０５,８７４号、６,７９７,５１４号、６,８６７,０４１号および米国出願公開２００６０１２１００５号に記載の方法を使用して活性化および増大され得る。
【０３７２】
一般に、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の集団は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤および免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドが結合した表面との接触により増大され得る。特に、Ｔ細胞集団は、表面に固定された抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントまたは抗ＣＤ２抗体との接触によりまたはカルシウムイオノフォアと組み合わせたタンパク質キナーゼＣアクティベーター(例えば、ブリオスタチン)との接触によるなど、ここに記載するとおり刺激され得る。Ｔ細胞表面のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞増殖の刺激に適する条件下、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させ得る。ＣＤ４＋  Ｔ細胞またはＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用する。抗ＣＤ２８抗体の例は９.３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８(Diaclone, Besancon, France)を含み、他の一般的方法と同様使用され得る(Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999)。
【０３７３】
ある態様において、Ｔ細胞の一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、種々のプロトコールにより提供され得る。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液にあっても表面に結合してもよい。表面に結合するとき、薬剤は同じ表面(すなわち、“ｃｉｓ”形態)または別の表面(すなわち、“ｔｒａｎｓ”形態)に結合し得る。あるいは、一方の薬剤が表面に結合し、他方の薬剤が溶液にあってよい。ある態様において、共刺激シグナルを提供する薬剤は細胞表面に結合し、一次活性化シグナルを提供する薬剤は溶液にあるか表面と結合する。ある態様において、両剤が溶液であり得る。ある態様において、薬剤は可溶性形態であり、そして、該薬剤と結合するＦｃ受容体または抗体または他の結合剤を発現する細胞などの表面に架橋され得る。これに関して、本発明におけるＴ細胞の活性化および増大への使用が企図される人工抗原提示細胞(ａＡＰＣ)について、例えば、米国特許出願公開２００４０１０１５１９号および２００６００３４８１０号参照。
【０３７４】
ある態様において、２剤は同一ビーズに、すなわち、“ｃｉｓ”または別々のビーズ、すなわち、“ｔｒａｎｓ”で固定化される。例として、一次活性化シグナルを提供する薬剤は抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントであり、共刺激シグナルを提供する薬剤は抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合フラグメントであり、両剤は同じビーズに等分子量で共固定化される。ある態様において、ＣＤ４＋  Ｔ細胞増大およびＴ細胞増殖のためにビーズに結合した各抗体の１：１比を使用する。本発明のある態様において、ビーズに結合する抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体比を、１：１比を使用して観察される増大よりも増加したＴ細胞増大が観察されるように使用する。ある特定の態様において、１：１比を使用して観察される増大と比較して、約１〜約３倍の増加が観察される。ある態様において、ビーズに結合するＣＤ３：ＣＤ２８抗体比は、１００：１〜１：１００の範囲およびその間の全ての整数値である。本発明のある態様において、抗ＣＤ３抗体より多くの抗ＣＤ２８抗体を粒子に結合させ、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８比は１未満である。本発明のある態様において、ビーズに結合する抗ＣＤ２８抗体対抗ＣＤ３抗体の比は、２：１より大きい。ある特定の態様において、ビーズに結合する抗体の１：１００  ＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。ある態様において、ビーズに結合する抗体の１：７５  ＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。さらなる態様において、ビーズに結合する抗体の１：５０  ＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。ある態様において、ビーズに結合する抗体の１：３０  ＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。ある好ましい態様において、ビーズに結合する抗体の１：１０  ＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。ある態様において、ビーズに結合する抗体の１：３  ＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。さらにある態様において、ビーズに結合する抗体の３：１  ＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。
【０３７５】
Ｔ細胞または他の標的細胞の刺激のために、１：５００〜５００：１およびその間の何れかの整数値の粒子対細胞比を使用し得る。当業者には容易に認識され得るとおり、粒子対細胞比は、標的細胞に対する粒子径に依存し得る。例えば、小型ビーズは少ない細胞しか結合できず、一方大型ビーズは多数結合できる。ある態様において細胞対粒子比は１：１００〜１００：１の範囲およびその間の何れかの整数値であり、さらなる態様において該比は１：９〜９：１およびその間の何れかの整数値を含み、またＴ細胞の刺激に使用され得る。Ｔ細胞刺激をもたらす抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８結合粒子対Ｔ細胞比は上記のとおり変わり得るが、しかしながらある好ましい値は、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１および１５：１を含み、ある好ましい比は少なくとも１：１粒子対Ｔ細胞である。ある態様において、１：１またはそれ以下の粒子対細胞比を使用する。ある特定の態様において、好ましい粒子：細胞比は１：５である。さらなる態様において、粒子対細胞比は、刺激の日により変わり得る。例えば、ある態様において、粒子対細胞比は、１日目は１：１〜１０：１であり、その後さらなる粒子を連日または隔日で細胞に最大１０日添加し,最終比１：１〜１：１０である(添加日の細胞数に基づく)。ある特定の態様において、粒子対細胞比は、刺激１日目１：１であり、刺激３日目および５日目１：５に調節される。ある態様において、粒子を、１日目１：１および刺激３日目および５日目１：５の最終比となるよう、連日または隔日基準で添加する。ある態様において、粒子対細胞比粒子を、１日目２：１および刺激３日目および５日目１：１０の最終比となるよう、連日または隔日基準で添加する。ある態様において、粒子を、１日目１：１および刺激３日目および５日目１：１０最終比となるよう、連日または隔日基準で添加する。当業者は、多様な他の比が本発明の使用に適し得ることを理解する。特に、比は、粒子径ならびに細胞サイズおよびタイプにより変わる。ある態様において、使用のための最も典型的な比は、１日目約１：１、２：１および３：１である
【０３７６】
本発明のさらなる態様において、Ｔ細胞などの細胞を薬剤被覆ビーズと合わせ、ビーズおよび細胞をその後分離し、続いて細胞を培養する。別の態様において、培養前に、薬剤被覆ビーズおよび細胞を分離せず、一緒に培養する。さらなる態様において、ビーズおよび細胞をまず磁力などの力の適用により濃縮し、細胞表面マーカーのライゲーションを増加させ、それにより細胞刺激を誘発する。
【０３７７】
例として、細胞表面タンパク質を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が結合する常磁性ビーズ(３ｘ２８ビーズ)をＴ細胞と接触させることにより、ライゲートさせ得る。ある態様において、細胞(例えば、１０４〜１０９  Ｔ細胞)およびビーズ(例えば、DYNABEADS(登録商標)Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ常磁性ビーズを１：１比)を、緩衝液、例えばＰＢＳ(カルシウムおよびマグネシウムなどの二価カチオン不含)中で合わせる。同様に、当業者はあらゆる細胞濃度を使用し得ることを容易に認識できる。例えば、標的細胞はサンプル中に稀であり、わずかサンプルの０.０１％しか含まれない可能性があるかまたはサンプル全体(すなわち、１００％)が目的の標的細胞から構成され得る。従って、あらゆる細胞数が本発明の設定の範囲内である。ある態様において、粒子および細胞が混合される容積を顕著に減らし(例えば細胞濃度を増加させ)、細胞および粒子の最大接触を確実にすることが望ましいことがある。例えば、ある態様において、約２０億細胞／mlの濃度を使用する。ある態様において、１億細胞／ml超を使用する。さらなる態様において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万または５０００万細胞／mlの細胞濃度を使用する。さらにある態様において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億細胞／mlの細胞濃度を使用する。さらなる態様において、１億２５００万または１億５０００万細胞／ml濃度が使用され得る。高濃度の使用は、細胞収率、細胞活性化および細胞増大の増加をもたらし得る。さらに、高濃度の細胞の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞の効率的捕捉を可能とする。このような細胞の集団は治療価値を有し、得ることが意図しれ得る。ある態様において、例えば、高濃度の細胞の使用は、通常弱いＣＤ２８発現であるＣＤ８＋  Ｔ細胞の効率的選択を可能とする。
【０３７８】
ある実施態様において、ＣＡＲをコードする核酸、例えば、ここに記載するＣＡＲで形質導入された細胞は、例えば、ここに記載する方法により増大される。ある実施態様において、細胞は、数時間(例えば、約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、１８時間、２１時間)〜約１４日(例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日または１４日)の期間の培養により増大される。ある実施態様において、細胞は４〜９日の期間増大される。ある実施態様において、細胞は８日以下、例えば、７日、６日または５日の期間増大される。ある実施態様において、細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は５日の培養により増大され、得られた細胞は、同じ条件下で９日培養して増大した同じ細胞より強力である。効力は、例えば、種々のＴ細胞機能、例えば増殖、殺標的細胞、サイトカイン産生、活性化、遊走またはこれらの組み合わせにより定義され得る。ある実施態様において、５日増大された細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、同じ培養条件下、９日の培養により増大された同じ細胞と比較して、抗原刺激による細胞倍加の少なくとも１倍、２倍、３倍または４倍増加を示す。ある実施態様において、細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は５日の培養により増大され、得られた細胞は、同じ培養条件下、９日の培養により増大された同じ細胞と比較して、高い炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルを示す。ある実施態様において、５日増大された細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、同じ培養条件下、９日の培養により増大された同じ細胞と比較して、炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルのpg／mlでの少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれ以上の増加を示す。
【０３７９】
本発明のある態様において、混合物を、数時間(約３時間)〜約１４日間またはその間の何れかの整数の時間、培養し得る。ある態様において、混合物を２１日培養し得る。本発明のある態様において、ビーズおよびＴ細胞を約８日一緒に培養する。ある態様において、ビーズおよびＴ細胞を２〜３日一緒に培養する。数サイクルの刺激も、Ｔ細胞の培養時間が６０日以上であり得るようにまた望まれ得る。Ｔ細胞培養に適する条件は適切な培地(例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはX-vivo 15(Lonza))を含み、これは血清(例えば、胎仔ウシまたはヒト血清)、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβおよびＴＮＦ−αまたは当業者に知られる細胞増殖のための何れかの他の添加物を含む増殖および生存能に必要な因子を含み得る。他の細胞増殖のための添加物は、界面活性剤、plasmanateおよびＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノールなどの還元剤を含むが、これらに限定されない。培地は、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５およびＸ−Ｖｉｖｏ  ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含み、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンが添加され、無血清または適切な量の血清(または血漿)または規定のホルモンセットおよび／またはＴ細胞増殖および増大に十分な量のサイトカインが添加されているものであり得る。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは実験培養にのみ含まれ、対象に注入される際簿の培養には含まれない。標的細胞を、増殖を支持するのに必要な条件下、例えば、適切な温度(例えば、３７℃)および雰囲気(例えば、空気＋５％ＣＯ２)に維持する。
【０３８０】
ある実施態様において、細胞を、１以上のインターロイキンを含む適切な培地(例えば、ここに記載する培地)で増大され、例えば、フローサイトメトリーなどのここに記載する方法により測定して、１４日にわたる増大期間で細胞の少なくとも２００倍(例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍)の増加をもたらす。ある実施態様において、細胞は、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７(例えば、ＩＬ−１５およびＩＬ−７)の存在下増大される。
【０３８１】
ある実施態様において、ここに記載する方法、例えば、ＣＡＲ発現細胞製造方法は、例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ−２を使用して、細胞集団からＴ制御細胞、例えば、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞を除去することを含む。細胞集団からＴ制御細胞、例えば、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞を除去する方法はここに記載される。ある実施態様において、方法、例えば、製造方法は、さらに、細胞集団(例えば、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞などのＴ制御細胞が枯渇されている細胞集団；または抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドと先に接触されている細胞集団)とＩＬ−１５および／またはＩＬ−７を接触させることを含む。例えば、細胞集団(例えば、抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドと予め接触されているもの)を、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７の存在下増大させる。
【０３８２】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、例えば、エクスビボで、ＣＡＲ発現細胞製造中、インターロイキン−１５(ＩＬ−１５)ポリペプチド、インターロイキン−１５受容体アルファ(ＩＬ−１５Ｒａ)ポリペプチドまたはＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチド両方の組み合わせ、例えば、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、例えば、エクスビボで、ＣＡＲ発現細胞製造中、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、例えば、エクスビボで、ＣＡＲ発現細胞製造中、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチド両方の組み合わせを含む組成物と接触させる。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、例えば、エクスビボで、ＣＡＲ発現細胞製造中、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。
【０３８３】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増大中、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増大中、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増大中、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両方を含む組成物と接触させる。ある実施態様において、接触は、リンパ球亜集団、例えば、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の生存および増殖をもたらす。
【０３８４】
ある実施態様において、細胞を、血清含有培地で培養(例えば、増殖、刺激および／または遺伝子導入)する。血清は、例えば、ヒトＡＢ血清(ｈＡＢ)であり得る。ある実施態様において、ｈＡＢ血清は、約２％、約５％、約２〜３％、約３〜４％、約４〜５％または約２〜５％で存在する。２％および５％血清は、各々、Ｔ細胞の数倍増大を可能にするのに適当なレベルである。さらに、Smith et al., “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement” Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31に示すとおり、２％ヒトＡＢ血清含有培地はＴ細胞のエクスビボ増大に適する。
【０３８５】
多様な回数の刺激に曝されているＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。例えば、典型的血液またはアフェレーシス末梢血単核細胞産物は、細胞毒性またはサプレッサーＴ細胞集団(ＴＣ、ＣＤ８＋)より大きいヘルパーＴ細胞集団(ＴＨ、ＣＤ４＋)を有する。ＣＤ３およびＣＤ２８受容体での刺激によるＴ細胞のエクスビボ増大は、約８〜９日目までは主にＴＨ細胞からなり、一方、約８〜９日目後、増え続ける大きなＴＣ細胞の集団を含むＴ細胞の集団を生じる。従って、処置の目的によって、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団の対象への注入は有利であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されているならば、かなりそのサブセットを増大することが有利であり得る。
【０３８６】
さらに、ＣＤ４およびＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーが相当変わるが、大部分、該細胞増大過程の間に再現性がある。それ故に、このような再現性は、特定の目的のために活性化Ｔ細胞産物をあつらえる能力を可能とする。
【０３８７】
ある実施態様において、ＣＡＲをコードする核酸、例えば、ここに記載するＣＡＲで形質導入された細胞は、例えば、ＣＣＬ２０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＴＮＦαおよび／またはこれらの組み合わせの１以上のタンパク質発現レベルに基づき、投与するために選択され得る。ある実施態様において、ＣＡＲをコードする核酸、例えば、ここに記載するＣＡＲで形質導入された細胞は、例えば、ＣＣＬ２０、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−６およびこれらの組み合わせのタンパク質発現レベルに基づき、投与するために選択され得る
【０３８８】
さらに、ＣＤ４およびＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーが相当変わるが、大部分、該細胞増大過程の間に再現性がある。それ故に、このような再現性は、特定の目的のために活性化Ｔ細胞産物をあつらえる能力を可能とする。
【０３８９】
メソテリンＣＡＲが構築されたら、種々のアッセイを、適切なインビトロおよび動物モデルにおける抗原刺激後Ｔ細胞を増大する、再刺激非存在下でＴ細胞増大を持続させる能力および抗癌活性などの、しかし、これらに限定されない分子の活性評価に使用し得る。メソテリンＣＡＲの効果を評価するアッセイは、例えば、引用により全体を本明細書に包含させる、２０１４年１２月１９日出願の国際公開ＷＯ２０１５／０９０２３０号のパラグラフ[０４１７]〜[００４２３]に記載される。
【０３９０】
ＣＡＲ細胞の集団
他の態様において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞の集団、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞の集団を提供する。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、種々のＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。
【０３９１】
例えば、ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ここに記載する抗メソテリン結合ドメインを有する第一ＣＡＲ発現細胞および異なる抗メソテリン結合ドメイン、例えば、第一細胞により発現されるＣＡＲにおける抗メソテリン結合ドメインと異なるここに記載する抗メソテリン結合ドメインを有する第二ＣＡＲ発現細胞を含み得る。
【０３９２】
他の例として、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、ここに記載する抗メソテリン結合ドメインを含む第一ＣＡＲ発現細胞およびメソテリン以外の標的(例えば、間質細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＦＡＰ；前立腺癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、アンドロゲン受容体、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＰＤＧＲＦ−β、ＴＡＲＰ、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＡＤ−ＣＴ−１またはＭＡＤ−ＣＴ−２；卵巣癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、Ｔｎ、ＰＲＳＳ２１、ＣＤ１７１、ルイスＹ、葉酸受容体α、クローディン６、ＧｌｏｂｏＨまたは精子タンパク質１７、例えば、肺癌細胞のメソテリン以外の標的、例えば、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＤＬＬ４またはＴｒｏｐ−２)に対する抗原結合ドメインを含む第二ＣＡＲ発現細胞を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む第一ＣＡＲ発現細胞および二次シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲ発現細胞を含む。
【０３９３】
ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、抗メソテリン結合ドメインを含む第一ＣＡＲ発現細胞およびＢ細胞に発現される抗原またはＢ細胞抗原を標的、例えば、特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第二ＣＡＲ発現細胞を含む。ある実施態様において、Ｂ細胞抗原はＣＤ１９である。
【０３９４】
他の態様において、本発明は、集団内の少なくともある細胞がここに記載する抗メソテリン結合ドメインを有するＣＡＲを発現し、第二細胞が他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性または機能を増強する薬剤を発現する、細胞の集団を提供する。例えば、ある実施態様において、薬剤は、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば、阻害する薬剤であり得る。ある実施態様において、Ｔ細胞機能を調整または制御する分子は阻害性分子、例えば、ここに記載する薬剤である。阻害性分子、例えばは、ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を減少させ得る。阻害性分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンまたはＴＧＦＲベータを含む。ある実施態様において、阻害性分子を阻害する薬剤は、細胞、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインに正のシグナルを提供する第二ポリペプチドと結合する第一ポリペプチド、例えば、阻害性分子を含む。ある実施態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンまたはＴＧＦＲベータなどの阻害性分子タまたはこれら何れかのフラグメント(例えば、少なくともこれら何れかの細胞外ドメインの一部)の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメイン(例えば、例えば、ここに記載する４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む)である第二ポリペプチドを含む。ある実施態様において、薬剤は、ＰＤ１の第一ポリペプチドまたはそのフラグメント(例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部)およびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)の第二ポリペプチドを含む。
【０３９５】
ある態様において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞の集団、例えば、ＣＡＲＴ細胞、例えば、種々のＣＡＲを発現する細胞の混合物を、他の薬剤、例えば、ここに記載するＰＤ−Ｌ１阻害剤などのＰＤ−Ｌ１阻害剤と組み合わせて投与することを含む、方法を提供する。他の態様において、本発明は、方法は、集団における少なくとも１細胞はここに記載する抗メソテリン結合ドメインを有するＣＡＲを発現し、そして第二細胞は他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性または適応度を像児湯する薬剤を発現する細胞の集団を、他の薬剤、例えば、ここに記載するＰＤ−Ｌ１阻害剤などのＰＤ−Ｌ１阻害剤と組み合わせて投与することを含む。
【０３９６】
ＰＤ−Ｌ１阻害剤
免疫系は、腫瘍細胞を認識し、排除する能力を有するが、しかしながら、腫瘍は、免疫を回避するために複数の戦略を使用し得る。免疫チェックポイントの遮断は、治療抗腫瘍免疫活性化または再活性化のアプローチの１つである。プログラム死リガンド１(ＰＤ−Ｌ１)は、免疫阻害性受容体プログラム死１(ＰＤ−１)のリガンドとして記載されている。ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合は、Ｔ細胞受容体介在リンパ球増殖およびサイトカイン分泌の阻害に至る(Freeman et al. (2000) J Exp Med 192:1027-34)。それ故に、ＰＤ−Ｌ１の遮断は抗腫瘍免疫の増強をもたらし得る。
【０３９７】
いくつかの細胞型がＰＤ−Ｌ１を発現する。例えば、ＰＤ−Ｌ１は活性化Ｔ細胞、樹状細胞(ＤＣｓ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球および血管内皮細胞で発現される。ＰＤ−Ｌ１は、ヒト肺、卵巣および結腸癌および種々の骨髄腫を含む多数の癌で発現される(Iwai et al. (2002) PNAS 99:12293-7; Ohigashi et al. (2005) Clin Cancer Res 11:2947-53; Okazaki et al. (2007) Intern. Immun. 19:813-24; Thompson et al. (2006) Cancer Res. 66:3381-5)。ＰＤ−Ｌ１発現は、腎臓、卵巣、膀胱、乳、胃および膵臓癌を含む種々のタイプの癌の望ましくない予後と強く相関する。
【０３９８】
多くの腫瘍浸潤性Ｔリンパ球は、正常組織におけるＴリンパ球および末梢血Ｔリンパ球と比較して、ＰＤ−１を優性に発現する。これは、腫瘍反応性Ｔ細胞上のＰＤ−１の上方制御が、障害された抗腫瘍免疫応答に寄与し得ることを示す(Ahmadzadeh et al. (2009) Blood 114:1537-44)。それ故に、ＰＤ−１発現Ｔ細胞と相互作用するＰＤ−Ｌ１シグナル伝達が介在するＰＤ−Ｌ１発現腫瘍細胞は、Ｔ細胞活性化減弱および免疫監視の回避に貢献し得る(Sharpe et al. (2002) Nat Rev Immunol. 2:116-26; Keir et al. (2008) Annu Rev Immunol. 26:677-704)。ＰＤ−１遮断は、エフェクターＴ細胞動員の増強により、免疫原性が低い腫瘍細胞の血行性拡散を阻止し得る(Iwai et al. (2005) Int. Immunol. 17:133-144)。
【０３９９】
ＰＤ−Ｌ１阻害は、例えば、そのＰＤ−１およびＢ７−１両方との阻害性相互作用の遮断により、Ｔ細胞免疫を増強し得る。ＰＤ−Ｌ１阻害は、ＰＤ−Ｌ２／ＰＤ−１による免疫制御も可能にし得る。ＰＤ−１およびＢ７−１の両方はＴ細胞、Ｂ細胞、ＤＣｓおよびマクロファージに発現され、これは、これらの細胞型でのＢ７−１およびＰＤ−Ｌ１の双方向的相互作用の可能性を提供する。非造血細胞上のＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞上のＢ７−１ならびにＰＤ−１と相互作用し得る。
【０４００】
用語“プログラム死リガンド１”または“ＰＤ−Ｌ１”は、アイソフォーム、哺乳動物、例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１、ヒトＰＤ−１の種ホモログおよびＰＤ−Ｌ１と少なくとも１つの共通エピトープを含むアナログを含む。ＰＤ−Ｌ１、例えば、ヒトＰＤ−１のアミノ酸配列は、文献、例えば、Dong et al. (1999) Nat Med. 5(12):1365-9; Freeman et al. (2000) J Exp Med. 192(7):1027-34)により知られる。
【０４０１】
本発明は、ＰＤ−Ｌ１阻害剤投与を含む例えば、メソテリン発現と関連する疾患の処置のための方法および組み合わせを提供する。ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、次の性質の１以上を有し得る。受容体、例えば、ＰＤ−１またはＣＤ８０(Ｂ７−１)または両方へのＰＤ−Ｌ１の結合の阻害または低減；ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ１結合受容体、例えば、ＰＤ−１またはＣＤ８０(Ｂ７−１)または両方への結合；例えば、腫瘍浸潤性リンパ球増加、Ｔ細胞受容体介在増殖増加または癌性細胞による免疫回避減少の１以上をもたらすＰＤ−Ｌ１の１以上の活性の阻害または低減；またはＰＤ−Ｌ１発現、例えば、ＰＤ−Ｌ１の転写または翻訳阻害または低減。
【０４０２】
ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１の受容体、例えば、ＰＤ−１またはＣＤ８０(Ｂ７−１)または両方への結合を低減する。例えば、受容体、例えば、ＰＤ−１またはＣＤ８０(Ｂ７−１)または両方へのＰＤ−Ｌ１結合は、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の非存在下の結合と比較して、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の存在により少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％低減される。ある実施態様において、受容体、例えば、ＰＤ−１またはＣＤ８０(Ｂ７−１)または両方へのＰＤ−Ｌ１結合は、無視できる、例えば、当分野で知られる標準結合アッセイにより検出不可能である。リガンド−受容体結合アッセイは当分野で周知であり、免疫沈殿およびウェスタンブロッティングアッセイを含む。
【０４０３】
ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１の１以上の活性を低減する。例えば、ＰＤ−Ｌ１活性は、ＰＤ−Ｌ１阻害剤非存在下と比較して、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％低減される。
【０４０４】
ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤はＰＤ−Ｌ１発現を低減する、例えば、ＰＤ−Ｌ１の転写または翻訳を低減する。例えば、ＰＤ−Ｌ１転写は、ＰＤ−Ｌ１阻害剤非存在下のＰＤ−Ｌ１転写と比較して、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％低減される。他の例において、ＰＤ−Ｌ１翻訳は、ＰＤ−Ｌ１阻害剤非存在下のＰＤ−Ｌ１翻訳と比較して、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％低減される。ＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡ発現を決定するアッセイは当分野で知られ、ＰＣＲ増幅ベースのアッセイ、例えば、ＱＰＣＲおよび核酸ハイブリダイゼーションベースのアッセイ、例えば、ノーザンブロットを含む。ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現を決定するアッセイは当分野で知られ、ウェスタンブロッティングおよび免疫組織化学的解析を含む。このような実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤投与は、細胞で発現されるＰＤ−Ｌ１のレベルまたは量の低減またはＰＤ−Ｌ１発現細胞数の減少をもたらす
【０４０５】
ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は小分子；ポリペプチド、例えば、融合タンパク質；抗体分子；または阻害性核酸；例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであり得る。
【０４０６】
ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は小分子である。ある実施態様において、小分子阻害剤はＰＤ−Ｌ１に結合する。他の実施態様において、小分子阻害剤はＰＤ−Ｌ１の受容体、例えば、ＰＤ−１またはＣＤ８０(Ｂ７−１)または両方に結合する。さらに他の実施態様において、小分子阻害剤はＰＤ−Ｌ１のその受容体、例えば、ＰＤ−１またはＣＤ８０(Ｂ７−１)または両方への結合を阻止または低減する。
【０４０７】
ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤はポリペプチドまたはペプチドである。ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１のポリペプチドまたはペプチド阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１またはその受容体、例えば、ＰＤ−１またはＣＤ８０(Ｂ７−１)または両方に結合する。ある実施態様において、ポリペプチドまたはペプチドは、ＰＤ−Ｌ１のその受容体、例えば、ＰＤ−１またはＣＤ８０(Ｂ７−１)または両方への結合を阻止または低減する。ある実施態様において、ポリペプチドは、野生型ＰＤ−Ｌ１と比較してＰＤ−１またはＣＤ８０(Ｂ７−１)への親和性増加を示し得る、ＰＤ−Ｌ１の一部、例えば、ＰＤ−Ｌ１の受容体結合部分またはその修飾部分を含む。このような実施態様において、ポリペプチドＰＤ−Ｌ１活性は、受容体との結合の競合により阻害または低減される。
【０４０８】
ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、阻害性核酸、例えば、ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)剤である。阻害性核酸は二本鎖または一本鎖核酸であり得る。阻害性核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッドであり得る。阻害性核酸は、ＰＤ−Ｌ１の発現、例えば、翻訳を阻止または低減する。ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)剤は、一般に標的遺伝子、例えば、ＰＤ−Ｌ１の発現、例えば、翻訳を阻害または制限するために、標的ｍＲＮＡ分子を破壊させる。ＲＮＡｉ剤の例は、長ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｍｉｃｒｏＲＮＡを含む。ここに記載する阻害性核酸は、アプタマー、モルホリノ、リボザイムおよび核酸配列、例えば、長ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡを含むまたはコードするプラスミドまたはベクターを含むが、これらに限定されない。
【０４０９】
ある実施態様において、阻害性核酸は、ＰＤ−Ｌ１遺伝子またはそのフラグメントと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％配列同一性または相補性であるＲＮＡである。
【０４１０】
ある実施態様において、阻害性核酸は、約１５〜約６５、約１５〜約４０または約１５〜約２８ヌクレオチド長のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである。阻害性核酸がｓｉＲＮＡである、ある実施態様において、ｓｉＲＮＡは約１９〜２５ヌクレオチド、例えば、１９、２０、２１または２２ヌクレオチドの長さを有する。阻害性核酸がｓｈＲＮＡである、ある実施態様において、ｓｈＲＮＡは、約４２〜約７０ヌクレオチドの長さを有する。ある実施態様において、ｓｈＲＮＡは、不対合ヌクレオチドのループにより接続された対合アンチセンスおよびセンスＲＮＡ鎖を含む。ある実施態様において、二本鎖幹は約１９〜約２９ヌクレオチドの長さを有し、完全対合または内部ミスマッチおよびループを伴う。ある実施態様において、ループは、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチド、例えば、４または７ヌクレオチドを含む。
【０４１１】
阻害性核酸は、例えば、プラスミドまたはベクターから合成または発現され得る。合成ＲＮＡｉ剤は、当業者に知られる多数の技法を使用して産生され得る。例えば、ｓｉＲＮＡ分子を、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホロアミデートおよび慣用のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを使用するなどの当分野で知られる方法を使用して化学的に合成または組み換えにより産生され得る(Elbashir, S. M. et al. (2001) Nature 411:494-498; Elbashir, S. M., W. Lendeckel and T. Tuschl (2001) Genes & Development 15:188-200; Harborth, J. et al. (2001) J. Cell Science 114:4557-4565; Masters, J. R. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:8012-8017; and Tuschl, T. et al. (1999) Genes & Development 13:3191-3197)。あるいは、いくつかの市販ＲＮＡ合成供給業者が利用可能であり、Proligo(Hamburg, Germany)、Dharmacon Research(Lafayette, Co., USA)、Pierce Chemical(part of Perbio Science, Rockford, Ill., USA)、Glen Research(Sterling, Va., USA)、ChemGenes(Ashland, Mass., USA)およびCruachem(Glasgow, UK)を含むが、これらに限定されない。
【０４１２】
発現、例えば、ＲＮＡまたはタンパク質レベルを評価するアッセイは当分野で周知である。例えば、ＰＤ−Ｌ１ヌクレオチド配列に基づくプローブを、転写物または同一もしくは相同タンパク質をコードするゲノム配列の検出に使用し得る。好ましい実施態様において、プローブは、さらには、結合した標識期を含み、例えば、標識基は放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補因子であり得る。このようなプローブを、ＰＤ−Ｌ１  ｍＲＮＡでベルの測定のために、例えば、ＰＣＲベースのアッセイにおいて、使用する。ウェスタンブロッティング技法は当分野で周知であり、ＰＤ−Ｌ１タンパク質レベルの測定に使用される。
【０４１３】
ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は抗体分子である。ある実施態様において、抗体分子は哺乳動物、例えば、ヒト、ＰＤ−Ｌ１に結合する。例えば、抗体分子は、ＰＤ−Ｌ１上のエピトープ、例えば、直線状または立体構造エピトープ(例えば、ここに記載するエピトープ)に特異的に結合する。
【０４１４】
ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤はＹＷ２４３.５５.Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＳＢ−００１０７１８ＣまたはＭＤＸ−１１０５から選択される。ＭＥＤＩ４７３６(Medimmune)は、ＰＤＬ１に結合し、該リガンドとＰＤ１の相互作用を阻害するヒトモノクローナル抗体である
【０４１５】
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＭＳＢ００１０７１８Ｃである。ＭＳＢ００１０７１８Ｃ(Ａ０９−２４６−２とも称する；Merck Seronoまたはアベルマブ)は、ＰＤ−Ｌ１に結合するモノクローナル抗体である。他の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および阻害剤は、ＷＯ２０１３／０７９１７４号、ＷＯ２００１／０１４５５７号、ＷＯ２００２／０８６０８３号、ＷＯ２００７００５８７４号、ＷＯ２０１００３６９５９号、ＷＯ２０１００７７６３４号およびＷＯ２０１１０６６３８９号に記載され、ここに開示する配列(または特定した該配列と実質的に同一または類似する配列、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％またはそれ以上同一である配列)を有する。ＭＳＢ００１０７１８Ｃの重鎖および軽鎖アミノ酸配列は、少なくとも次のものを含む
重鎖(ＷＯ２０１３／０７９１７４号に記載の配列番号２４)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS(配列番号６１１)
軽鎖(ＷＯ２０１３／０７９１７４号に記載の配列番号２５)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSN RPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL(配列番号６１２)
【０４１６】
ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤はＹＷ２４３.５５.Ｓ７０である。ＹＷ２４３.５５.Ｓ７０抗体はＷＯ２０１０／０７７６３４号に記載される抗ＰＤ−Ｌ１抗体(重鎖および軽鎖可変領域配列はそれぞれ配列番号２０および２１に示す)であり、ここに開示する配列(または特定した該配列と実質的に同一または類似する配列、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％またはそれ以上同一である配列)を有する。
【０４１７】
ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤はＭＤＸ−１１０５である。ＭＤＸ−１１０５はＢＭＳ−９３６５５９としても知られ、ＷＯ２００７／００５８７４号に記載する抗ＰＤ−Ｌ１抗体であり、ここに開示する配列(または特定した該配列と実質的に同一または類似する配列、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％またはそれ以上同一である配列)を有する。
【０４１８】
ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤はＭＤＰＬ３２８０Ａ(Genentech/Roche)(アテゾリズマブとしても知られる)である。ＭＤＰＬ３２８０Ａは、ＰＤ−Ｌ１に結合するヒトＦｃ最適化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＭＤＰＬ３２８０ＡおよびＰＤ−Ｌ１に対する他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許７,９４３,７４３号および米国公開２０１２００３９９０６号に開示される。
【０４１９】
ＰＤ−Ｌ１抗体分子の例
ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、次の性質の１以上を有する抗体分子(例えば、単離または組み換え抗体分子)を含む。
(ｉ)ＰＤ−Ｌ１、例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１に高親和性で、例えば、少なくとも約１０７Ｍ−１、一般に約１０８Ｍ−１およびより一般に、約１０９Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１またはそれ以上の親和性定数で結合する；
(ii)ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳまたはＢＴＬＡと実質的に結合しない；
(iii)ＰＤ−Ｌ１の受容体、例えば、ＰＤ−１またはＣＤ８０(Ｂ７−１)または両方への結合を阻害または低減する；
(iv)ＰＤ−Ｌ１のエピトープ、例えば、マウスモノクローナル抗体ＢＡＰ０５８またはキメラ抗体ＢＡＰ０５８、例えば、ＢＡＰ０５８−ｃｈｉにより認識されるエピトープと同じまたは類似するエピトープに特異的に結合する；
(ｖ)ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１７、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｋ、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｌ、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｍ、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−ＮまたはＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｏの何れかと同等の結合親和性または特異性または両方を示す；
(vi)表１に記載する抗体分子(例えば、重鎖可変領域および軽鎖可変領域)と同等の結合親和性または特異性または両方を示す；
(vii)表１に示すアミノ酸配列を有する抗体分子(例えば、重鎖可変領域および軽鎖可変領域)と同等の結合親和性または特異性または両方を示す；
(viii)表１に示すヌクレオチド配列によりコードされる抗体分子(例えば、重鎖可変領域および軽鎖可変領域)と同等の結合親和性または特異性または両方を示す；
(ix)ＰＤ−Ｌ１に対する第二抗体分子の結合を阻害、例えば、競合的阻害し、ここで、第二抗体分子は、ここに記載する抗体分子、例えば、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１７、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｋ、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｌ、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｍ、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−ＮまたはＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｏの何れかから選択される、例えば、抗体分子である；
(ｘ)ＰＤ−１に対する第二抗体分子と同一または重複エピトープに結合し、ここで、第二抗体分子は、ここに記載する抗体分子、例えば、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１７、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｋ、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｌ、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｍ、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−ＮまたはＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｏの何れかから選択される、例えば、抗体分子である；
(xi)ＰＤ−Ｌ１に対する第二抗体分子と結合を競合するおよび／または同じエピトープと結合し、ここで、第二抗体分子はここに記載する抗体分子、例えば、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１７、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｋ、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｌ、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｍ、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−ＮまたはＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｏの何れかから選択される、例えば、抗体分子である；
(xii)ここに記載する抗体分子、例えば、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１７、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｋ、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｌ、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｍ、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−ＮまたはＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｏの何れかから選択される、例えば、抗体分子の１以上の生物学的性質を有する；
(xiii)ここに記載する抗体分子、例えば、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１７、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｋ、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｌ、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｍ、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−ＮまたはＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｏの何れかから選択される、例えば、抗体分子の１以上の薬物動態性質を有する；
(xiv)例えば、腫瘍浸潤性リンパ球増加、Ｔ細胞受容体介在増殖増加または癌性細胞による免疫回避減少の１以上をもたらす、ＰＤ−Ｌ１の１以上の活性を阻害する；または
(xv)ヒトＰＤ−Ｌ１に結合し、カニクイザルＰＤ−Ｌ１と交差反応性である。
【０４２０】
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、表６に提供するまたは表６のヌクレオチド配列によりコードされる、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１７、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｋ、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｌ、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｍ、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−ＮまたはＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｏの何れかのアミノ酸配列；または前記配列の何れかと実質的に同一(例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一)である配列を含む、少なくとも１または２重鎖可変ドメイン(所望により定常領域を含む)、少なくとも１または２軽鎖可変ドメイン(所望により定常領域を含む)または両方を含む。
【０４２１】
さらに他の実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、ここに記載する抗体、例えば、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１７、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｋ、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｌ、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｍ、ＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−ＮまたはＢＡＰ０５８−Ｃｌｏｎｅ−Ｏの何れかから選択される抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域からの少なくとも１、２または３相補性決定領域(ＣＤＲ)；または表６に提供するまたは表６のヌクレオチド配列によりコードされる；または前記配列の何れかと実質的に同一(例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一)である配列を含む。
【０４２２】
さらに他の実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、表６に示すまたは表６に示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域からの少なくとも１、２または３ＣＤＲ(または集合的にＣＤＲ全部)を含む。ある実施態様において、ＣＤＲ(または集合的にＣＤＲ全部)の１以上は、表６に示すまたは表６に示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６またはそれ以上の変化、例えば、アミノ酸置換または欠失を有する。
【０４２３】
さらに他の実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、表６に示すまたは表６に示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域からの少なくとも１、２または３ＣＤＲ(または集合的にＣＤＲ全部)を含む。ある実施態様において、ＣＤＲ(または集合的にＣＤＲ全部)の１以上は、表６に示すまたは表６に示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６またはそれ以上の変化、例えば、アミノ酸置換または欠失を有する。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子ｉは、軽鎖ＣＤＲに置換、例えば、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３に１以上の置換を含む。
【０４２４】
他の実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、表６に示すまたは表６に示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む重および軽鎖可変領域からの少なくとも１、２、３、４、５または６ＣＤＲ(または集合的にＣＤＲ全部)を含む。ある実施態様において、ＣＤＲ(または集合的にＣＤＲ全部)の１以上は、表６に示すまたは表６に示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６またはそれ以上の変化、例えば、アミノ酸置換または欠失を有する。
【０４２５】
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、
(ｉ)各々表６に開示の配列番号２８７、配列番号２９０または配列番号２９０から選択されるＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２８８のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号２８９のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＶＨ)；および
(ii)各々表６に開示の配列番号１のＶＬＣＤＲ２９５アミノ酸配列、配列番号２のＶＬＣＤＲ２９６アミノ酸配列および配列番号３のＶＬＣＤＲ２９７アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)
を含む。
【０４２６】
他の実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、
(ｉ)各々表６に開示の配列番号２８７、配列番号２９０または配列番号２９０から選択されるＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２９１のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列および配列番号２９２のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＶＨ)；および
(ii)各々表６に開示の配列番号１のＶＬＣＤＲ２９８アミノ酸配列、配列番号２のＶＬＣＤＲ２９９アミノ酸配列および配列番号３のＶＬＣＤＲ３００アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)
を含む。
【０４２７】
前記抗体分子のある実施態様において、ＶＨＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、ＶＨＣＤＲ１は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。さらに他の実施態様において、ＶＨＣＤＲ１は、アミノ酸配列番号１９５の配列である。
【０４２８】
ある実施態様において、前記抗体分子は、配列番号１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２または１５４の何れかのアミノ酸配列または配列番号１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２または１５４の何れかのアミノ酸配列と比較して、少なくとも９０％同一であるまたは２を超えるアミノ酸置換、挿入または欠失を有しない配列を含む、少なくとも１フレームワーク(ＦＷ)領域を含む、重鎖可変領域を有する。
【０４２９】
他の実施態様において、前記抗体分子は、配列番号１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２または１５４の何れかのアミノ酸配列を含む少なくとも１フレームワーク領域を含む重鎖可変領域を含む。
【０４３０】
さらに他の実施態様において、前記抗体分子は、配列番号１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２または１５４の何れかのアミノ酸配列を含む少なくとも２、３または４フレームワーク領域を含む重鎖可変領域を含む。
【０４３１】
他の実施態様において、前記抗体分子は配列番号１２４、１２６、１２８または１３０のＶＨＦＷアミノ酸配列、配列番号１３２、１３４、１３６、１３８、１４０または１４２のＶＨＦＷ２アミノ酸配列および配列番号１４４、１４６、１４８、１５０または１５２のＶＨＦＷ３アミノ酸配列を含み、所望により、さらに配列番号１５４のＶＨＦＷ４アミノ酸配列を含む。
【０４３２】
他の実施態様において、前記抗体分子は、配列番号１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４または１８６の何れかのアミノ酸配列または配列番号１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４または１８６のアミノ酸配列と比較して、少なくとも９０％同一であるまたは２を超えるアミノ酸置換、挿入または欠失を有しない配列を含む少なくとも１フレームワーク領域を含む、軽鎖可変領域を含む。
【０４３３】
他の実施態様において、前記抗体分子は、配列番号１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４または１８６の何れかのアミノ酸配列を含む少なくとも１フレームワーク領域を含む軽鎖可変領域を含む。
【０４３４】
他の実施態様において、前記抗体分子は、配列番号１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４または１８６の何れかのアミノ酸配列を含む少なくとも２、３または４フレームワーク領域を含む軽鎖可変領域を含む。
【０４３５】
他の実施態様において、前記抗体分子は、配列番号１５６、１５８、１６０、１６２、１６４または１６６のＶＬＦＷ１アミノ酸配列、配列番号１６８または１７０のＶＬＦＷ２アミノ酸配列および配列番号１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２または１８４のＶＬＦＷ３アミノ酸配列を含み、所望により、さらに配列番号１８６のＶＬＦＷ４アミノ酸配列を含む。
【０４３６】
他の実施態様において、前記抗体分子は、配列番号１８、３０、３８、４６、５０、５４、６２、７０または７８のアミノ酸配列または配列番号１８、３０、３８、４６、５０、５４、６２、７０または７８のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
【０４３７】
他の実施態様において、前記抗体分子は、配列番号２２、２６、３４、４２、５８、６６、７４、８２または８６のアミノ酸配列または配列番号２２、２６、３４、４２、５８、６６、７４、８２または８６の何れかと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
【０４３８】
他の実施態様において、前記抗体分子は、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖまたは一本鎖Ｆｖフラグメント(ｓｃＦｖ)から選択される。
【０４３９】
他の実施態様において、前記抗体分子は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域を含む。
【０４４０】
他の実施態様において、前記抗体分子は、約０.２nM未満の解離定数(ＫＤ)でヒトＰＤ−Ｌ１と結合できる。
【０４４１】
ある実施態様において、前記抗体分子は、ヒトＰＤ−Ｌ１に、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ方法により測定して、約０.２nM、０.１５nM、０.１nM、０.０５nMまたは０.０２nM、例えば、約０.２nM〜０.１nM、例えば、約０.１６６nM〜０.１７６nM、例えば、約０.１７１nM未満のＫＤで結合する。
【０４４２】
他の実施態様において、前記抗体分子は、ＰＤ−１またはＢ７−１のＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ１を発現する細胞への結合を低減できる。ある実施態様において、前記抗体分子は、ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞へのＰＤ−１結合を、約１.５nM、１nM、０.８nM、０.６nM、０.４nM、０.２nMまたは０.１nM未満、例えば、約０.２nM〜約０.１nM、例えば、約０.１５nM以下、例えば、約０.１４５nMのＩＣ５０で低減(例えば、遮断)する。ある実施態様において、前記抗体は、ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞(例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１発現３００.１９細胞)へのＢ７−１結合を、約２nM、１.５nM、１nM、０.５nMまたは０.２nM未満、例えば、約０.５nM〜約０.０１nMまたは約０.２nM以下、例えば、約０.１nMのＩＣ５０で低減(例えば、遮断)する。
【０４４３】
他の実施態様において、前記抗体分子は、抗原特異的Ｔ細胞応答を増強できる。
【０４４４】
ある実施態様において、前記抗体分子は、ＰＤ−Ｌ１に、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ方法により測定して５×１０−４、１×１０−４、５×１０−５または１×１０−５ｓ−１、例えば、約６.３３×１０−５ｓ−１より遅いＫｄで結合する。ある実施態様において、前記抗体分子は、ＰＤ−Ｌ１に、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ方法により測定して、１×１０４、５×１０４、１×１０５または５×１０５Ｍ−１ｓ−１、例えば、約３.０７×１０４Ｍ−１ｓ−１より速いＫａで結合する。
【０４４５】
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、単特異的抗体分子または二特異的抗体分子である。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、ＰＤ−Ｌ１に対する第一結合特異性およびＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ２に対する第二結合特異性を有する。ある実施態様において、抗体分子は、抗体の抗原結合フラグメント、例えば、半抗体または半抗体の抗原結合フラグメントを含む。
【表４１】
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【表４２】
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【０４４６】
【表４３】
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【表４４】
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【０４４７】
【表４５】
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【表４６】
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【０４４８】
【表４７】
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【表４８】
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【０４４９】
【表４９】
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【表５０】
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【０４５０】
【表５１】
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【表５２】
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【０４５１】
【表５３】
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【表５４】
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【０４５２】
【表５５】
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【表５６】
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【０４５３】
【表５７】
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【表５８】
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【０４５４】
【表５９】
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【表６０】
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【０４５５】
【表６１】
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【表６２】
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【０４５６】
【表６３】
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【表６４】
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【０４５７】
【表６５】
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【表６６】
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【０４５８】
【表６７】
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【表６８】
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【０４５９】
【表６９】
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【表７０】
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【０４６０】
【表７１】
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【表７２】
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【０４６１】
【表７３】
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【表７４】
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【０４６２】
【表７５】
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【表７６】
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【０４６３】
【表７７】
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【表７８】
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【０４６４】
【表７９】
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【表８０】
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【０４６５】
【表８１】
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【０４６６】
メソテリン発現疾患および障害に対する治療適用
本発明は、メソテリンの発現と関連する疾患および障害処置用組成物および方法を提供する。メソテリンと関連する疾患または障害の例は、中皮腫である。
【０４６７】
悪性中皮腫は、中皮として知られる、体の内蔵を裏打ちする細胞の薄層に生じるタイプの癌である。中皮腫には３つの認識されているタイプがある。胸膜中皮腫(例えば、悪性胸膜中皮腫またはＭＰＭ)は、該疾患の最も多い形であり、症例の約７０％を占め、胸膜として知られる肺の裏層に生じる。腹膜中皮腫は、腹膜として知られる腹腔の裏層に生じる。心膜中皮腫は、心臓を裏打ちする心膜を起源とする。
【０４６８】
対象は、該対象がアスベストに曝されていたならば、中皮腫を発症するリスクがあり得る。アスベストへの暴露およびアスベスト粒子の吸入は、中皮腫を起こし得る。ほとんどの場合、中皮腫症状は、アスベストに曝された対象に、暴露が起こった後長年現れない。
【０４６９】
胸膜中皮腫の症状は、例えば、腰痛または側胸部痛および息切れを含む。他の症状は、嚥下困難、持続性咳嗽、発熱、体重減少または疲労を含む。一部の患者が経験するさらなる症状は、筋力低下、感覚能力喪失、喀血、顔面および腕腫脹および嗄声を含む。ステージ１中皮腫などの疾患初期段階において、症状は軽度であり得る。患者は、通常、解消すると思えない胸部の一領域の疼痛、体重減少および発熱を訴える。
【０４７０】
腹膜中皮腫は腹部を起源とし、結果として、症状は、しばしば腹痛、体重減少、悪心および嘔吐を含む。体液貯留が腹部に、癌の結果として生じ得る。腹膜中皮腫は腹部を起源とし、しばしば肝臓、脾臓または腸を含む領域の他の臓器に拡散する。重度腹痛が、患者が最初に経験する最も一般的な愁訴である。同様に不快レベルの体液貯留も起こり得る。腹膜中皮腫の他の症状は、腸管運動困難、悪心および嘔吐、発熱および足腫脹を含み得る。
【０４７１】
心膜中皮腫は、中皮腫で最も少ない。心膜中皮腫は、名前が示すとおり、心臓が関与する。この稀なタイプの中皮腫癌は、心臓周囲の嚢である心膜に浸潤する。癌が進行するに連れ、心臓は、酸素を体に効率的に送達できなくなり、さらに健康を急速に、速度を上げながら低下させる。心膜中皮腫と最も一般的に関連する症状は、心臓発作に類似して、悪心、胸部痛および息切れである。
【０４７２】
本発明による処置により利益を受ける対象は、例えば、ここに記載する症状の１以上の存在および／またはアスベストへの暴露により証明される、中皮腫の対象または中皮腫を有することが疑われる対象を含む。特定の実施態様において、中皮腫は胸膜中皮腫(例えば、悪性胸膜中皮腫)である。他の態様において、例えば、胸膜プラーク、良性中皮腫または中皮過形成などの前癌状態を有する対象を処置し得る。
【０４７３】
メソテリンと関連する疾患または障害の他の例は膵臓癌である。ここに記載する方法で処置し得る膵臓癌は、外分泌膵臓癌および内分泌膵臓癌を含むが、これらに限定されない。外分泌膵臓癌は、腺癌、腺房細胞癌、腺扁平上皮癌、膠質癌、破骨細胞様巨細胞を伴う未分化癌、肝様癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍、粘液性嚢胞腫瘍、膵芽腫、漿液性嚢胞腺腫、印環細胞癌、固形かつ偽乳頭状腫瘍、膵管癌および未分化癌を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、外分泌膵臓癌は膵管癌である。内分泌膵臓癌は、インスリノーマおよびグルカゴノーマを含むが、これらに限定されない。
【０４７４】
ある実施態様において、膵臓癌は、初期ステージ膵臓癌、非転移膵臓癌、原発膵臓癌、切除膵臓癌、進行型膵臓癌、局所進行型膵臓癌、転移膵臓癌、切除不能膵臓癌、寛解膵臓癌、再発膵臓癌、アジュバント設定としての膵臓癌またはネオアジュバント設定としての膵臓癌の何れかである。ある実施態様において、膵臓癌は、局所進行型膵臓癌、切除不能膵臓癌または転移膵管癌である。ある実施態様において、膵臓癌は、ゲムシタビンベースの治療に耐性である。ある実施態様において、膵臓癌は、ゲムシタビンベースの治療に難治性である。
【０４７５】
他の態様において、メソテリン発現と関連する障害は卵巣癌である。卵巣癌は、腫瘍の組織学により分類される。表面上皮性間質腫瘍は、卵巣上皮性癌としても知られ、最も一般的なタイプの卵巣癌である。それは、漿液性腫瘍(漿液性乳頭状嚢腺癌を含む)、類内膜腫瘍および粘液性嚢胞腺癌を含む。
【０４７６】
ここに記載する方法を、種々のステージの卵巣癌、例えば、ステージＩ、ステージII、ステージIIIまたはステージIVの処置に使用できる。ステージ分類は、例えば、卵巣癌摘出時に実施し得る。卵巣癌は次のとおり分類され得る。
ステージＩ癌は一方または両方の卵巣に限局される。癌は、卵巣の一方または両方が関与し、子宮および／または卵管または骨盤における他の部位に広がったならば、ステージIIである。癌は、卵巣の一方または両方が関与し、腸または肝臓表面などの、リンパ節または骨盤外であるが、なお腹腔内である他の部位に広がっているならば、ステージIII癌である。癌は、一方または両方の卵巣が関与し、癌が腹部外または肝臓内に広がっているならば、ステージIV癌である。
【０４７７】
ある実施態様において、卵巣癌は、１以上の化学療法剤に耐性である。ある実施態様において、卵巣癌は、１以上の化学療法剤に難治性である。
【０４７８】
ここに記載する組み合わせ治療で処置し得る他の癌は、例えば、脳癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、肝臓癌、腎臓癌、リンパ腫、白血病、肺癌(例えば、肺腺癌)、黒色腫、転移黒色腫、中皮腫、神経芽腫、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎臓癌、皮膚癌、胸腺腫、肉腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、子宮癌およびこれらの何れかの組み合わせを含む。
【０４７９】
ある態様において、本発明は、対象における癌を処置する方法に関する。方法は、対象に、対象における癌が処置されるように、メソテリンＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤を含む組み合わせ治療を投与することを含む。ここに記載する組み合わせ治療により処置可能な癌の例は、メソテリンの発現と関連する癌である。ある態様において、ソテリンの発現と関連する癌は、中皮腫、膵臓癌、卵巣癌および肺癌または前記癌の何れか由来の転移から選択される。
【０４８０】
ある実施態様において、メソテリンＣＡＲ発現細胞およびここに記載するＰＤ−Ｌ１阻害剤の組み合わせ治療は、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞またはＰＤ−Ｌ１阻害剤単独の単剤療法と比較して、メソテリンＣＡＲ発現細胞の抗腫瘍活性改善または増加、メソテリンＣＡＲ発現細胞の増殖増加または残留性増加、メソテリンＣＡＲ発現細胞浸潤の改善または増加、腫瘍進行阻止改善、腫瘍進行遅延、癌細胞増殖阻害または低減；および／または腫瘍負荷、例えば、腫瘍体積またはサイズ減少の１以上をもたらす。
【０４８１】
本発明は、メソテリン発現細胞集団の増殖を阻止するまたはそれを低減させる方法を提供する。ある実施態様において、方法は、組み合わせ治療、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞またはメソテリン−ＣＡＲ発現細胞の集団およびＰＤ−Ｌ１阻害剤を含む組み合わせの投与を含む。ある実施態様において、ここに記載する組み合わせ治療は、細胞および／または癌細胞の含量、量またはパーセンテージを、中皮腫または他のメソテリン発現細胞と関連する癌の対象または動物モデルにおいて、メソテリンＣＡＲ発現細胞またはＰＤ−Ｌ１阻害剤単独で処置された対象における細胞および／または癌細胞の含量、量またはパーセンテージと比較して、少なくとも少なくとも５％、１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％減少させる。ある態様において、対象はヒトである。
【０４８２】
本発明はまたメソテリン発現細胞と関連する障害(例えば、中皮腫)を予防、処置および／または管理する方法も提供し、該方法は,処置を必要とする対象にメソテリンＣＡＲ発現細胞またはメソテリンＣＡＲ発現細胞の集団およびＰＤ−Ｌ１阻害剤を投与することを含む。ある態様において、対象はヒトである。
【０４８３】
組み合わせ治療
ここに記載する方法の何れも、他の既知薬剤および治療と組み合わせて使用し得る。
【０４８４】
ここに記載する組み合わせ、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤および少なくとも１つの付加的治療剤を、同時に、同じまたは別々の組成物でまたは逐次的に投与し得る。逐次投与について、ＣＡＲ発現細胞および／またはここに記載するＰＤ−Ｌ１阻害剤を付加的治療剤の後に投与してよくまたは投与順序は、付加的治療剤がＣＡＲ発現細胞および／またはここに記載するＰＤ−Ｌ１阻害剤後に投与され得る逆でよい。あるいは、付加的治療剤を、ＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤の投与の間に投与し得る。
【０４８５】
さらなる態様において、ここに記載する組み合わせ、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤を、手術、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体またはキャンパス、抗ＣＤ３抗体または他の抗体治療剤、サイトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカインおよび照射などの他の免疫奪格剤と組み合わせた処置レジメンに使用され得る。Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971に記載のものなどのペプチドワクチン。
【０４８６】
ある実施態様において、ここに記載する組み合わせ、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤を、化学療法剤と組み合わせて使用し得る。化学療法剤の例は、アントラサイクリン(例えば、ドキソルビシン(例えば、リポソームドキソルビシン))、ビンカアルカロイド(例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン)、アルキル化剤(例えば、シクロホスファミド、ダカルバジン、メルファラン、イホスファミド、テモゾロミド)、免疫細胞抗体(例えば、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、トシツモマブ)、代謝拮抗剤(例えば、葉酸アンタゴニスト、ピリミジンアナログ、プリンアナログおよびアデノシンデアミナーゼ阻害剤(例えば、フルダラビン)を含む)、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦＲグルココルチコイド誘発ＴＮＦＲ関連タンパク質(ＧＩＴＲ)アゴニスト、プロテアソーム阻害剤(例えば、アクラシノマイシンＡ、グリオトキシンまたはボルテゾミブ)、サリドマイドまたはサリドマイド誘導体(例えば、レナリドマイド)などの免疫調節剤を含む。
【０４８７】
組み合わせ治療における使用に考慮される一般的化学療法剤は、アナストロゾール(アリミデックス(登録商標))、ビカルタミド(カソデックス(登録商標))、硫酸ブレオマイシン(Blenoxane(登録商標))、ブスルファン(ミレラン(登録商標))、ブスルファン注射(ブスルフェクス(登録商標))、カペシタビン(ゼローダ(登録商標))、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン(パラプラチン(登録商標))、カルムスチン(BiCNU(登録商標))、クロラムブシル(ロイケラン(登録商標))、シスプラチン(Platinol(登録商標))、クラドリビン(ロイスタチン(登録商標))、シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)またはNeosar(登録商標))、シタラビン、シトシンアラビノシド(Cytosar-U(登録商標))、シタラビンリポソーム注射(DepoCyt(登録商標))、ダカルバジン(DTIC-Dome(登録商標))、ダクチノマイシン(アクチノマイシンＤ、Cosmegan)、塩酸ダウノルビシン(Cerubidine(登録商標))、ダウノルビシンシトレートリポソーム注射(DaunoXome(登録商標))、デキサメサゾン、ドセタキセル(タキソテール(登録商標))、塩酸ドキソルビシン(アドリアマイシン(登録商標)、Rubex(登録商標))、エトポシド(ベプシド(登録商標))、リン酸フルダラビン(フルダラ(登録商標))、５−フルオロウラシル(Adrucil(登録商標)、Efudex(登録商標))、フルタミド(Eulexin(登録商標))、tezacitibine、ゲムシタビン(ジフルオロデオキシシチジン)、ヒドロキシ尿素(ハイドレア(登録商標))、イダルビシン(イダマイシン(登録商標))、イホスファミド(IFEX(登録商標))、イリノテカン(Camptosar(登録商標))、Ｌ−アスパラギナーゼ(ELSPAR(登録商標))、ロイコボリンカルシウム、メルファラン(アルケラン(登録商標))、６−メルカプトプリン(ピュリネソール(登録商標))、メトトレキサート(Folex(登録商標))、ミトキサントロン(Novantrone(登録商標))、マイロターグ、パクリタキセル(タキソール(登録商標))、phoenix(イットリウム９０／MX-DTPA)、ペントスタチン、カルムスチンインプラントを伴うpolifeprosan 20(グリアデル(登録商標))、タモキシフェンシトレート(ノルバデックス(登録商標))、テニポシド(Vumon(登録商標))、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン(Tirazone(登録商標))、注射用塩酸トポテカン(Hycamptin(登録商標))、ビンブラスチン(Velban(登録商標))、ビンクリスチン(オンコビン(登録商標))およびビノレルビン(ナベルビン(登録商標))を含む。
【０４８８】
アルキル化剤の例は、窒素マスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレアおよびトリアゼン)：ウラシルマスタード(Aminouracil Mustard(登録商標)、Chlorethaminacil(登録商標)、Demethyldopan(登録商標)、Desmethyldopan(登録商標)、Haemanthamine(登録商標)、Nordopan(登録商標)、Uracil nitrogen mustard(登録商標)、Uracillost(登録商標)、Uracilmostaza(登録商標)、Uramustin(登録商標)、Uramustine(登録商標))、シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)、Neosar(登録商標)、Clafen(登録商標)、Endoxan(登録商標)、Procytox(登録商標)、RevimmuneＴＭ)、イホスファミド(Mitoxana(登録商標))、メルファラン(アルケラン(登録商標))、クロラムブシル(ロイケラン(登録商標))、ピポブロマン(Amedel(登録商標)、Vercyte(登録商標))、トリエチレンメラミン(Hemel(登録商標)、Hexalen(登録商標)、Hexastat(登録商標))、トリエチレンチオホスホロアミン、テモゾロミド(Temodar(登録商標))、チオテパ(Thioplex(登録商標))、ブスルファン(Busilvex(登録商標)、ミレラン(登録商標))、カルムスチン(BiCNU(登録商標))、ロムスチン(CeeNU(登録商標))、ストレプトゾシン(Zanosar(登録商標))およびダカルバジン(DTIC-Dome(登録商標))を含むが、これらに限定されない。さらなるアルキル化剤の例は、オキサリプラチン(Eloxatin(登録商標))、テモゾロミド(Temodar(登録商標)およびTemodal(登録商標))、ダクチノマイシン(アクチノマイシン−Ｄ、Cosmegen(登録商標)としても知られる)、メルファラン(L-PAM、Ｌ−サルコリシンおよびフェニルアラニンマスタード、アルケラン(登録商標)としても知られる)、アルトレタミン(ヘキサメチルメラミン(ＨＭＭ)、Hexalen(登録商標))、カルムスチン(BiCNU(登録商標)としても知られる)、ベンダムスチン(Treanda(登録商標))、ブスルファン(ブスルフェクス(登録商標)およびミレラン(登録商標))、カルボプラチン(パラプラチン(登録商標))、ロムスチン(CCNU、CeeNU(登録商標)としても知られる)、シスプラチン(CDDP、Platinol(登録商標)およびPlatinol(登録商標)−ＡＱとしても知られる)、クロラムブシル(ロイケラン(登録商標))、シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)およびNeosar(登録商標))、ダカルバジン(DTIC、DICおよびイミダゾールカルボキサミド、DTIC-Dome(登録商標)としても知られる)、アルトレタミン(ヘキサメチルメラミン(ＨＭＭ)、Hexalen(登録商標)としても知られる)、イホスファミド(Ifex(登録商標))、Prednumustine、プロカルバジン(Matulane(登録商標))、メクロレタミン(窒素マスタード、mustineおよびメクロロエタミンヒドロクロライド、Mustargen(登録商標)としても知られる)、ストレプトゾシン(Zanosar(登録商標))、チオテパ(チオホスホアミド、TESPAおよびTSPA、Thioplex(登録商標)としても知られる)、シクロホスファミド(Endoxan(登録商標)、シトキサン(登録商標)、Neosar(登録商標)、Procytox(登録商標)、Revimmune(登録商標))およびベンダムスチンＨＣｌ(Treanda(登録商標))を含むが、これらに限定されない。
【０４８９】
ｍＴＯＲ阻害剤の例は、例えば、テムシロリムス；リダフォロリムス(以前はデフォロリムスとして知られる、(１Ｒ,２Ｒ,４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２−[(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ,２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｚ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３、２９,３５−ヘキサメチル−２,３,１０,１４,２０−ペンタオキソ−１１,３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−１２−イル]プロピル]−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート、ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても知られ、ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０６４３８３号に記載)；エベロリムス(アフィニトール(登録商標)またはＲＡＤ００１)；ラパマイシン(ＡＹ２２９８９、シロリムス(登録商標))；セマピモド(CAS 164301-51-3)；テムシロリムス、(５−{２,４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−イル}−２−メトキシフェニル)メタノール(ＡＺＤ８０５５)；２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(PF04691502、CAS 1013101-36-4)；およびＮ２−[１,４−ジオキソ−４−[[４−(４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル)モルホリニウム−４−イル]メトキシ]ブチル]−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−(配列番号６１３)、分子内塩(ＳＦ１１２６、CAS 936487-67-1)およびＸＬ７６５を含む。
【０４９０】
免疫調節剤の例は、例えば、アフツズマブ(Roche(登録商標)から入手可能)；ペグフィルグラスチム(Neulasta(登録商標))；レナリドマイド(ＣＣ−５０１３、レブラミド(登録商標))；サリドマイド(Thalomid(登録商標))、アクチミド(ＣＣ４０４７)；およびＩＲＸ−２(インターロイキン１、インターロイキン２およびインターフェロンγを含むヒトサイトカイン混合物、CAS 951209-71-5、IRX Therapeuticsから入手可能)を含む。
【０４９１】
アントラサイクリンの例は、例えば、ドキソルビシン(アドリアマイシン(登録商標)およびRubex(登録商標))；ブレオマイシン(lenoxane(登録商標))；ダウノルビシン(塩酸ダウノルビシン、ダウノマイシンおよび塩酸ルビドマイシン、Cerubidine(登録商標))；ダウノルビシンリポソーム(ダウノルビシンシトレートリポソーム、DaunoXome(登録商標))；ミトキサントロン(ＤＨＡＤ、Novantrone(登録商標))；エピルビシン(EllenceTM)；イダルビシン(イダマイシン(登録商標)、イダマイシンＰＦＳ(登録商標))；マイトマイシンＣ(Mutamycin(登録商標))；ゲルダナマイシン；ハービマイシン；ラビドマイシン；およびデスアセチルラビドマイシンを含む。
【０４９２】
ビンカアルカロイドの例は、例えば、ビノレルビンタートレート(ナベルビン(登録商標))、ビンクリスチン(オンコビン(登録商標))およびビンデシン(Eldisine(登録商標)))；ビンブラスチン(硫酸ビンブラスチン、ビンカレウコブラスチンおよびＶＬＢ、Alkaban-AQ(登録商標)およびVelban(登録商標)としても知られる)；およびビノレルビン(ナベルビン(登録商標))を含む。
【０４９３】
プロテオソーム阻害剤の例は、ボルテゾミブ(ベルケイド(登録商標))；カルフィルゾミブ(ＰＸ−１７１−００７、(Ｓ)−４−メチル−Ｎ−((Ｓ)−１−(((Ｓ)−４−メチル−１−((Ｒ)−２−メチルオキシラン−２−イル)−１−オキソペンタン−２−イル)アミノ)−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル)−２−((Ｓ)−２−(２−モルホリノアセトアミド)−４−フェニルブタンアミド)−ペンタンアミド)；マリゾミブ(ＮＰＩ−００５２)；クエン酸イキサゾミブ(ＭＬＮ−９７０８)；デランゾミブ(ＣＥＰ−１８７７０)；およびＯ−メチル−Ｎ−[(２−メチル−５−チアゾリル)カルボニル]−Ｌ−セリル−Ｏ−メチル−Ｎ−[(１Ｓ)−２−[(２Ｒ)−２−メチル−２−オキシラニル]−２−オキソ−１−(フェニルメチル)エチル]−Ｌ−セリンアミド(ＯＮＸ−０９１２)を含む。
【０４９４】
ある実施態様において、ここに記載する組み合わせ、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤を、対象にブレンツキシマブと組み合わせて投与する。ブレンツキシマブは、抗ＣＤ３０抗体およびモノメチルアウリスタチンＥの抗体−薬物コンジュゲートである。ある実施態様において、対象は、ホジキンリンパ腫(ＨＬ)、例えば、再発性または難治性ＨＬを有する。ある実施態様において、対象は、ＣＤ３０＋ＨＬを含む。ある実施態様において、対象は、自己幹細胞移植(ＡＳＣＴ)を受けている。ある実施態様において、対象はＡＳＣＴを受けていない。ある実施態様において、ブレンツキシマブを、約１〜３mg／kg(例えば、約１〜１.５、１.５〜２、２〜２.５または２.５〜３mg／kg)の投与量で、例えば、静脈内に、例えば、３週毎に投与する。
【０４９５】
ある実施態様において、ここに記載する組み合わせ、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤を、対象にブレンツキシマブおよびダカルバジンまたはブレンツキシマブおよびベンダムスチンとの組み合わせてと組み合わせて投与する。ダカルバジンは、５−(３,３−ジメチル−１−トリアゼニル)イミダゾール−４−カルボキサミドの化学名のアルキル化剤である。ベンダムスチンは４−[５−[ビス(２−クロロエチル)アミノ]−１−メチルベンズイミダゾール−２−イル]ブタン酸の化学名のアルキル化剤である。ある実施態様において、対象はホジキンリンパ腫(ＨＬ)を有する。ある実施態様において、対象は、以前癌治療を受けていない。ある実施態様において、対象は少なくとも６０歳、例えば、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、８５歳またはそれ以上である。ある実施態様において、ダカルバジンを、約３００〜４５０mg／ｍ２(例えば、約３００〜３２５mg／ｍ２、３２５〜３５０mg／ｍ２、３５０〜３７５mg／ｍ２、３７５〜４００mg／ｍ２、４００〜４２５mg／ｍ２または４２５〜４５０mg／ｍ２)の投与量で、例えば、静脈内投与する。ある実施態様において、ベンダムスチンを、約７５〜１２５mg／ｍ２(例えば、７５〜１００または１００〜１２５mg／ｍ２、例えば、約９０mg／ｍ２)の投与量で、例えば、静脈内投与する。ある実施態様において、ブレンツキシマブを、約１〜３mg／kg(例えば、約１〜１.５、１.５〜２、２〜２.５または２.５〜３mg／kg)の投与量で、例えば、静脈内に、例えば、３週毎に投与する。
【０４９６】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にＣＤ２０阻害剤、例えば、抗ＣＤ２０抗体(例えば、抗ＣＤ２０単または二特異的抗体)またはそのフラグメントと組み合わせて投与する。抗ＣＤ２０抗体の例は、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、オビヌツズマブ、ＴＲＵ−０１５(Trubion Pharmaceuticals)、オカラツズマブおよびＰｒｏ１３１９２１(Genentech)を含む。例えば、Lim et al. Haematologica. 95.1(2010):135-43参照。
【０４９７】
ある実施態様において、抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブを含む。リツキシマブは、ＣＤ２０に結合し、ＣＤ２０発現細胞の細胞溶解をさせるキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体ＩｇＧ１カッパであり、例えば、www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdfに記載。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にリツキシマブと組み合わせて投与する。ある実施態様において、対象は、ＣＬＬまたはＳＬＬを有する。
【０４９８】
ある実施態様において、リツキシマブを、静脈内に、例えば、静脈内点滴として投与する。例えば、各点滴は、約５００〜２０００mg(例えば、約５００〜５５０mg、５５０〜６００mg、６００〜６５０mg、６５０〜７００mg、７００〜７５０mg、７５０〜８００mg、８００〜８５０mg、８５０〜９００mg、９００〜９５０mg、９５０〜１０００mg、１０００〜１１００mg、１１００〜１２００mg、１２００〜１３００mg、１３００〜１４００mg、１４００〜１５００mg、１５００〜１６００mg、１６００〜１７００mg、１７００〜１８００mg、１８００〜１９００mgまたは１９００〜２０００mg)のリツキシマブを提供する。ある実施態様において、リツキシマブを、１５０mg／ｍ２〜７５０mg／ｍ２、例えば、約１５０〜１７５mg／ｍ２、１７５〜２００mg／ｍ２、２００〜２２５mg／ｍ２、２２５〜２５０mg／ｍ２、２５０〜３００mg／ｍ２、３００〜３２５mg／ｍ２、３２５〜３５０mg／ｍ２、３５０〜３７５mg／ｍ２、３７５〜４００mg／ｍ２、４００〜４２５mg／ｍ２、４２５〜４５０mg／ｍ２、４５０〜４７５mg／ｍ２、４７５〜５００mg／ｍ２、５００〜５２５mg／ｍ２、５２５〜５５０mg／ｍ２、５５０〜５７５mg／ｍ２、５７５〜６００mg／ｍ２、６００〜６２５mg／ｍ２、６２５〜６５０mg／ｍ２、６５０〜６７５mg／ｍ２または６７５〜７００mg／ｍ２の用量で投与し、ここで、ｍ２は対象の体表面積を示す。ある実施態様において、リツキシマブを、少なくとも４日、例えば、４日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日またはそれ以上の投与間隔で投与する。例えば、リツキシマブを、少なくとも０.５週、例えば、０.５週、１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週またはそれ以上の投与間隔で投与する。ある実施態様において、リツキシマブを、ここに記載する用量および投与間隔で一定期間、例えば、少なくとも２週、例えば、少なくとも２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、１２週、１３週、１４週、１５週、１６週、１７週、１８週、１９週、２０週またはそれ以上投与する。例えば、リツキシマブを、ここに記載する用量および投与間隔で処置サイクルあたり少なくとも計４回(例えば、処置サイクルあたり４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回またはそれ以上)投与する。
【０４９９】
ある実施態様において、抗ＣＤ２０抗体は、オファツムマブを含む。オファツムマブは、約１４９kDaの分子量の抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１κヒトモノクローナル抗体である。例えば、オファツムマブは、トランスジェニックマウスおよびハイブリドーマテクノロジーを使用して産生し、組み換えマウス細胞株(ＮＳ０)から発現および精製する。例えば、www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf；およびClinical Trial Identifier number NCT01363128、NCT01515176、NCT01626352およびNCT01397591参照。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、オファツムマブと組み合わせて対象に投与する。ある実施態様において、対象は、ＣＬＬまたはＳＬＬを有する。
【０５００】
ある実施態様において、オファツムマブを静脈内点滴として投与する。例えば、各点滴は、約１５０〜３０００mg(例えば、約１５０〜２００mg、２００〜２５０mg、２５０〜３００mg、３００〜３５０mg、３５０〜４００mg、４００〜４５０mg、４５０〜５００mg、５００〜５５０mg、５５０〜６００mg、６００〜６５０mg、６５０〜７００mg、７００〜７５０mg、７５０〜８００mg、８００〜８５０mg、８５０〜９００mg、９００〜９５０mg、９５０〜１０００mg、１０００〜１２００mg、１２００〜１４００mg、１４００〜１６００mg、１６００〜１８００mg、１８００〜２０００mg、２０００〜２２００mg、２２００〜２４００mg、２４００〜２６００mg、２６００〜２８００mgまたは２８００〜３０００mg)のオファツムマブを提供する。ある実施態様において、オファツムマブを約３００mgの出発投与量で、続いて、２０００mgを、例えば、約１１回、例えば、２４週投与する。ある実施態様において、オファツムマブを、少なくとも４日、例えば、４日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日またはそれ以上の投与間隔で投与する。例えば、オファツムマブを少なくとも１週、例えば、１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、１２週、２４週、２６週、２８週、２０週、２２週、２４週、２６週、２８週、３０週またはそれ以上の投与間隔て投与する。ある実施態様においてオファツムマブを、ここに記載する用量および投与間隔で一定期間、例えば、少なくとも１週、例えば、１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、１２週、１３週、１４週、１５週、１６週、１７週、１８週、１９週、２０週、２２週、２４週、２６週、２８週、３０週、４０週、５０週、６０週またはそれ以上または１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月またはそれ以上または１年、２年、３年、４年、５年またはそれ以上投与する。例えば、オファツムマブを、ここに記載する用量および投与間隔で、処置サイクルあたり少なくとも計２回(例えば、処置サイクルあたり少なくとも２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１８回、２０回またはそれ以上)投与する。
【０５０１】
ある場合、抗ＣＤ２０抗体は、オクレリズマブを含む。オクレリズマブは、例えば、Clinical Trials Identifier Nos. NCT00077870、NCT01412333、NCT00779220、NCT00673920、NCT01194570およびKappos et al. Lancet. 19.378(2011):1779-87に記載される、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。
【０５０２】
ある場合、抗ＣＤ２０抗体は、ベルツズマブを含む。ベルツズマブは、ＣＤ２０に対するヒト化モノクローナル抗体である。例えば、Clinical Trial Identifier No. NCT00547066、NCT00546793、NCT01101581およびGoldenberg et al. Leuk Lymphoma. 51(5)(2010):747-55参照。
【０５０３】
ある場合、抗ＣＤ２０抗体は、ＧＡ１０１を含む。ＧＡ１０１(オビヌツズマブまたはＲＯ５０７２７５９とも称される)は、ヒト化および糖鎖改変抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。例えば、Robak. Curr. Opin. Investig. Drugs. 10.6(2009):588-96；Clinical Trial Identifier Numbers: NCT01995669、NCT01889797、NCT02229422およびNCT01414205；およびwww.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf参照。
【０５０４】
ある場合、抗ＣＤ２０抗体は、ＡＭＥ−１３３ｖを含む。ＡＭＥ−１３３ｖ(ＬＹ２４６９２９８またはオカラツズマブとも称される)は、リツキシマブと比較して、ＦｃγＲIIIａ受容体に対する親和性が増加し、抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)活性が増強されたヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25；およびForero-Torres et al. Clin Cancer Res. 18.5(2012):1395-403参照。
【０５０５】
ある場合、抗ＣＤ２０抗体は、ＰＲＯ１３１９２１を含む。ＰＲＯ１３１９２１は、リツキシマブと比較して、ＦｃγＲIIIａへの良好な結合を有し、ＡＤＣＣが増強されるように改変されたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25；およびCasulo et al. Clin Immunol. 154.1(2014):37-46；およびClinical Trial Identifier No. NCT00452127参照。
【０５０６】
ある場合、抗ＣＤ２０抗体は、ＴＲＵ−０１５を含む。ＴＲＵ−０１５は、ＣＤ２０に対する抗体のドメイン由来の抗ＣＤ２０融合タンパク質である。ＴＲＵ−０１５は、モノクローナル抗体より小さいが、Ｆｃ介在エフェクター機能を保持する。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25参照。ＴＲＵ−０１５は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに結合した抗ＣＤ２０一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)を有するが、ＣＨ１およびＣＬドメインを欠く。
【０５０７】
ある実施態様において、ここに記載する抗ＣＤ２０抗体を、治療剤、例えば、ここに記載する、化学療法剤(例えば、シトキサン、フルダラビン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、脱メチル化剤、ペプチドワクチン、抗腫瘍抗生物質、チロシンキナーゼ阻害剤、アルキル化剤、抗微小管または抗有糸分裂剤)、抗アレルギー剤、抗悪心剤(または制吐)、鎮痛剤または細胞保護剤とコンジュゲートまたは他に結合させる。
【０５０８】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、Ｂ細胞リンパ腫２(ＢＣＬ−２)阻害剤(例えば、ベネトクラクス、ＡＢＴ−１９９またはＧＤＣ−０１９９とも称する)および／またはリツキシマブと組み合わせて対象に投与する。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ベネトクラクスおよびリツキシマブと組み合わせて対象に投与する。ベネトクラクスは、抗アポトーシスタンパク質、ＢＣＬ−２を阻害する小分子である。ベネトクラクス(４−(４−{[２−(４−クロロフェニル)−４,４−ジメチルシクロヘキシ−１−エン−１−イル]メチル}ピペラジン−１−イル)−Ｎ−({３−ニトロ−４−[(テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イルメチル)アミノ]フェニル}スルホニル)−２−(１Ｈ−ピロロ[２,３−ｂ]ピリジン−５−イルオキシ)ベンズアミド)の構造を下に示す。
【化１】
2018538339.tif 000083
【０５０９】
ある実施態様において、対象はＣＬＬを有する。ある実施態様において、対象は再発性ＣＬＬを有する、例えば、対象は、以前に癌治療剤を投与されている。ある実施態様において、ベネトクラクスを、約１５〜６００mg(例えば、１５〜２０mg、２０〜５０mg、５０〜７５mg、７５〜１００mg、１００〜２００mg、２００〜３００mg、３００〜４００mg、４００〜５００mgまたは５００〜６００mg)の投与量で、例えば、連日投与する。ある実施態様において、リツキシマブを、約３５０〜５５０mg／ｍ２(例えば、３５０〜３７５mg／ｍ２、３７５〜４００mg／ｍ２、４００〜４２５mg／ｍ２、４２５〜４５０mg／ｍ２、４５０〜４７５mg／ｍ２または４７５〜５００mg／ｍ２)の投与量で、例えば、静脈内に、例えば、毎月投与する。
【０５１０】
ある実施態様において、ここに記載する組み合わせ、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤を、腫瘍溶解性ウイルスと組み合わせて投与する。ある実施態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞で選択的に複製し、細胞死を誘発するかまたは増殖を遅延させることができる。ある場合、腫瘍溶解性ウイルスは、非癌細胞に影響を有しないか影響が最小である。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス、腫瘍溶解性レトロウイルス、腫瘍溶解性パルボウイルス、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、腫瘍溶解性シンドビスウイルス、腫瘍溶解性インフルエンザウイルスまたは腫瘍溶解性ＲＮＡウイルス(例えば、腫瘍溶解性レオウイルス、腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルス(ＮＤＶ)、腫瘍溶解性麻疹ウイルスまたは腫瘍溶解性水疱性口内炎ウイルス(ＶＳＶ))を含むが、これらに限定されない。
【０５１１】
ある実施態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルス、例えば、引用により全体を本明細書に包含させるＵＳ２０１０／０１７８６８４Ａ１号に記載の、組み換え腫瘍溶解性ウイルスである。ある実施態様において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、例えば、引用により全体を本明細書に包含させるＵＳ２０１０／０１７８６８４Ａ１号に記載の、免疫または炎症性応答の阻害剤をコードする核酸配列(例えば、異種核酸配列)を含む。ある実施態様において、組み換え腫瘍溶解性ウイルス、例えば、腫瘍溶解性ＮＤＶは、アポトーシス促進性タンパク質(例えば、アポプチン)、サイトカイン(例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロン−ガンマ、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、腫瘍壊死因子−アルファ)、免疫グロブリン(例えば、ＥＤ−Ｂフィブロネクチンに対する抗体)、腫瘍関連抗原、二特異的アダプタータンパク質(例えば、ＣＤ３またはＣＤ２８などのＮＤＶ  ＨＮタンパク質およびＴ細胞共刺激受容体に対する二特異的抗体または抗体フラグメント；またヒトＩＬ−２およびＮＤＶ  ＨＮタンパク質に対する一本鎖抗体の融合タンパク質)を含む。例えば、引用により全体を本明細書に包含させるZamarin et al. Future Microbiol. 7.3(2012):347-67参照。ある実施態様において、腫瘍溶解性ウイルスｉは、各々引用により全体を本明細書に包含させる、ＵＳ８５９１８８１Ｂ２号、ＵＳ２０１２／０１２２１８５Ａ１号またはＵＳ２０１４／０２７１６７７Ａ１号に記載のキメラ腫瘍溶解性ＮＤＶである。
【０５１２】
ある実施態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞で排他的に複製するように設計されている制限増殖型アデノウイルス(ＣＲＡｄ)を含む。例えば、Alemany et al. Nature Biotechnol. 18(2000):723-27参照。ある実施態様において、腫瘍溶解性アデノウイルスは、引用により本明細書に包含させる、Alemany et al.の表１に記載のものを含む。
【０５１３】
腫瘍溶解性ウイルスの例は、次のものを含むが、これらに限定されない。
Ｂ群腫瘍溶解性アデノウイルス(ＣｏｌｏＡｄ１)(PsiOxus Therapeutics Ltd.)(例えば、Clinical Trial Identifier: NCT02053220参照)；顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)(Oncos Therapeutics)を含むアデノウイルスであるＯＮＣＯＳ−１０２(以前はＣＧＴＧ−１０２称される)(例えば、Clinical Trial Identifier: NCT01598129参照)；ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼをコードする遺伝子修飾腫瘍溶解性ヒトアデノウイルスであるＶＣＮ−０１(VCN Biosciences, S.L.)(例えば、Clinical Trial Identifiers: NCT02045602およびNCT02045589参照)；
網膜芽細胞腫／Ｅ２Ｆ経路が下方制御された癌細胞で選択的に複製するように修飾されている、野生型ヒトアデノウイルス血清型５(Ｈａｄ５)由来ウイルスである制限増殖型アデノウイルスＩＣＯＶＩＲ−５(Institut Catala d’Oncologia)(例えば、Clinical Trial Identifier: NCT01864759参照)；ＩＣＯＶＩＲ５、腫瘍溶解性アデノウイルスで感染させた骨髄由来自己間葉性幹細胞(ＭＳＣｓ)を含むCelyvir(Hospital Infantil Universitario Nino Jesus, Madrid, Spain/Ramon Alemany)(例えば、Clinical Trial Identifier: NCT01844661参照)；ヒトＥ２Ｆ−１プロモーターが必須Ｅ１ａウイルス遺伝子の発現を駆動し、それによりＲｂ経路欠損腫瘍細胞のウイルス複製および細胞毒性を制御する、制限増殖型腫瘍溶解性血清型５アデノウイルス(Ａｄ５)であるＣＧ００７０(Cold Genesys, Inc.)(例えば、Clinical Trial Identifier: NCT02143804参照)；または網膜芽細胞腫(Ｒｂ)経路欠損細胞で選択的に複製し、あるＲＧＤ結合インテグリンを発現する細胞により効率的に感染するように改変されているアデノウイルスであるＤＮＸ−２４０１(以前の名前デルタ−２４−ＲＧＤ)(Clinica Universidad de Navarra, Universidad de Navarra/DNAtrix, Inc.)(例えば、Clinical Trial Identifier: NCT01956734参照)。
【０５１４】
ある実施態様において、ここに記載する腫瘍溶解性ウイルスは、注射、皮下、動脈内、静脈内、筋肉内、髄腔内または腹腔内注射により投与される。ある実施態様において、ここに記載する腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍内、経皮、経粘膜、経口、鼻腔内または肺投与により投与される。
【０５１５】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、Ｔｒｅｇ細胞集団を減少させる分子と組み合わせて対象に投与される。Ｔｒｅｇ細胞数を減らす(例えば、枯渇させる)方法は当分野で知られ、例えば、ＣＤ２５枯渇、シクロホスファミド投与、ＧＩＴＲ機能調節を含む。理論に拘束されることを意図しないが、アフェレーシス前またはここに記載するＣＡＲ発現細胞投与前の対象におけるＴｒｅｇ細胞数の減少は、腫瘍微小環境における望ましくない免疫細胞(例えば、Ｔｒｅｇ)数を減らし、対象の再発のリスクを減らすと考えられる。
【０５１６】
ある実施態様において、ここに記載する組み合わせ、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤を、対象にＧＩＴＲアゴニストなどのＧＩＴＲを標的とするおよび／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子および／または制御Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)を枯渇させるＧＩＴＲ抗体と組み合わせて投与する。ある実施態様において、ＧＩＴＲ結合分子および／またはＧＩＴＲ機能調節分子(例えば、ＧＩＴＲアゴニストおよび／またはＴｒｅｇ枯渇ＧＩＴＲ抗体)を、ＣＡＲ発現細胞前に投与する。例えば、ある実施態様において、ＧＩＴＲアゴニストは、細胞のアフェレーシス前に投与される。ある実施態様において、対象はＣＬＬを有する。ＧＩＴＲアゴニストの例は、例えば、ＧＩＴＲ融合タンパク質および抗ＧＩＴＲ抗体(例えば、二価抗ＧＩＴＲ抗体)、例えば、米国特許６,１１１,０９０号、欧州特許０９０５０５Ｂ１号、米国特許８,５８６,０２３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／００３１１８号および２０１１／０９０７５４号に記載のＧＩＴＲ融合タンパク質または、例えば、米国特許７,０２５,９６２号、欧州特許１９４７１８３Ｂ１号、米国特許７,８１２,１３５号、米国特許８,３８８,９６７号、米国特許８,５９１,８８６号、欧州特許ＥＰ１８６６３３９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０２８６８３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／０３９９５４号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／００７１９０号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１３３８２２、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／０５５８０８号、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／４０１９６、ＰＣＴ公開ＷＯ２００１／０３７２０、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／２０７５８、ＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０８３２８９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／１１５４５１号、米国特許７,６１８,６３２およびＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０５１７２６号に記載の抗ＧＩＴＲ抗体を含む。
【０５１７】
ある実施態様において、ここに記載する組み合わせ、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤を、対象にｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ここに記載のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、エベロリムスなどのラパログと組み合わせて投与する。ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤はＣＡＲ発現細胞前に投与される。例えば、ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、細胞のアフェレーシス前に投与される。ある実施態様において、対象はＣＬＬを有する。
【０５１８】
ある実施態様において、ここに記載する組み合わせ、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤を、対象にＧＩＴＲアゴニスト、例えば、ここに記載するＧＩＴＲアゴニストと組み合わせて投与する。ある実施態様において、ＧＩＴＲアゴニストは、ＣＡＲ発現細胞前に投与される。例えば、ある実施態様において、ＧＩＴＲアゴニストは、細胞のアフェレーシス前に投与される。ある実施態様において、対象はＣＬＬを有する。
【０５１９】
ある実施態様において、ここに記載する組み合わせ、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤を、対象にタンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、例えば、ここに記載するタンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤と組み合わせて投与する。ある実施態様において、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤はＳＨＰ−１阻害剤、例えば、スチボグルコン酸ナトリウムなどの、例えば、ここに記載するＳＨＰ−１阻害剤である。ある実施態様において、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤はＳＨＰ−２阻害剤である。
【０５２０】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、キナーゼ阻害剤と組み合わせて投与され得る。ある実施態様において、キナーゼ阻害剤はＣＤＫ４阻害剤、例えば、ここに記載するＣＤＫ４阻害剤、例えば、６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−(５−ピペラジン−１−イル−ピリジン−２−イルアミノ)−８Ｈ−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−オン、ヒドロクロライド(パルボシクリブまたはＰＤ０３３２９９１とも称する)などの、例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤である。ある実施態様において、キナーゼ阻害剤はＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブなどの例えば、ここに記載するＢＴＫ阻害剤である。ある実施態様において、キナーゼ阻害剤はｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシン、ラパマイシンアナログ、ＯＳＩ−０２７などの、例えば、ここに記載のｍＴＯＲ阻害剤である。ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤、例えば、ここに記載するｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤であり得る。ある実施態様において、キナーゼ阻害剤はＭＮＫ阻害剤、例えば、４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンなどの、例えば、ここに記載するＭＮＫ阻害剤である。ＭＮＫ阻害剤は、例えば、ＭＮＫ１ａ、ＭＮＫ１ｂ、ＭＮＫ２ａおよび／またはＭＮＫ２ｂ阻害剤であり得る。ある実施態様において、キナーゼ阻害剤は、例えば、ＰＦ−０４６９５１０２など、ここに記載のデュアルＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤である。
【０５２１】
ある実施態様において、キナーゼ阻害剤はアロイシンＡ；フラボピリドールまたはＨＭＲ−１２７５、２−(２−クロロフェニル)−５,７−ジヒドロキシ−８−[(３Ｓ,４Ｒ)−３−ヒドロキシ−１−メチル−４−ピペリジニル]−４−クロメノン；クリゾチニブ(ＰＦ−０２３４１０６６；２−(２−クロロフェニル)−５,７−ジヒドロキシ−８−[(２Ｒ,３Ｓ)−２−(ヒドロキシメチル)−１−メチル−３−ピロリジニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、ヒドロクロライド(Ｐ２７６−００)；１−メチル−５−[[２−[５−(トリフルオロメチル)−１Ｈ−イミダゾール−２−イル]−４−ピリジニル]オキシ]−Ｎ−[４−(トリフルオロメチル)フェニル]−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン(ＲＡＦ２６５)；インジスラム(Ｅ７０７０)；ロスコビチン(ＣＹＣ２０２)；パルボシクリブ(ＰＤ０３３２９９１)；ディナシクリブ(ＳＣＨ７２７９６５)；Ｎ−[５−[[(５−ｔｅｒｔ−ブチルオキサゾール−２−イル)メチル]チオ]チアゾール−２−イル]ピペリジン−４−カルボキサミド(ＢＭＳ  ３８７０３２)；４−[[９−クロロ−７−(２,６−ジフルオロフェニル)−５Ｈ−ピリミド[５,４−ｄ][２]ベンズアゼピン−２−イル]アミノ]−安息香酸(ＭＬＮ８０５４)；５−[３−(４,６−ジフルオロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル)−１Ｈ−インダゾール−５−イル]−Ｎ−エチル−４−メチル−３−ピリジンメタンアミン(ＡＧ−０２４３２２)；４−(２,６−ジクロロベンゾイルアミノ)−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸Ｎ−(ピペリジン−４−イル)アミド(ＡＴ７５１９)；４−[２−メチル−１−(１−メチルエチル)−１Ｈ−イミダゾール−５−イル]−Ｎ−[４−(メチルスルホニル)フェニル]−２−ピリミジンアミン(ＡＺＤ５４３８)；およびＸＬ２８１(ＢＭＳ９０８６６２)から選択されるＣＤＫ４阻害剤である。
【０５２２】
ある実施態様において、キナーゼ阻害剤はＣＤＫ４阻害剤、例えば、パルボシクリブ(ＰＤ０３３２９９１)であり、パルボシクリブを、約５０mg、６０mg、７０mg、７５mg、８０mg、９０mg、１００mg、１０５mg、１１０mg、１１５mg、１２０mg、１２５mg、１３０mg、１３５mg(例えば、７５mg、１００mgまたは１２５mg)の用量で、一定期間連日、例えば、２８日サイクルの１４〜２１日目連日または２８日サイクルの７〜１２日目連日投与する。ある実施態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のサイクルのパルボシクリブが投与される。
【０５２３】
ある実施態様において、ここに記載する組み合わせ、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤を、対象にサイクリン依存性キナーゼ(ＣＤＫ)４または６阻害剤、例えば、ここに記載するＣＤＫ４阻害剤またはＣＤＫ６阻害剤と組み合わせて投与する。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＤＫ４／６阻害剤(例えば、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６両方を標的とする阻害剤)、例えば、ここに記載するＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせて対象に投与する。ある実施態様において、対象はＭＣＬを有する。ＭＣＬは、現在利用可能な治療にほとんど応答しない、すなわち、本質的に治癒不可能な攻撃的癌である。ＭＣＬの多くの場合、サイクリンＤ１(ＣＤＫ４／６のレギュレーター)が、ＭＣＬ細胞で発現される(例えば、免疫グロブリンおよびサイクリンＤ１遺伝子を含む染色体転座のため)。それ故に、理論に拘束されないが、ＭＣＬ細胞は、高特異性(すなわち、正常免疫細胞に最小の影響で)でＣＤＫ４／６阻害に高度に感受性であると考えられる。ＣＤＫ４／６阻害剤単独はＭＣＬの処置にある程度有効性を有しているが、部分寛解しか達成されず、高再発率は高い。ＣＤＫ４／６阻害剤の例はＬＥＥ０１１(リボシクリブとも称する)であり、その構造を下に示す。
【化２】
2018538339.tif 000084
【０５２４】
理論に拘束されないが、ここに記載するＣＡＲ発現細胞とＣＤＫ４／６阻害剤(例えば、ＬＥＥ０１１または他のここに記載するＣＤＫ４／６阻害剤)の投与は、例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤単独と比較して、高い応答性、例えば、高い寛解率および／または低い再発率を達成すると考えられる。
【０５２５】
ある実施態様において、キナーゼ阻害剤は、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５)；ＧＤＣ−０８３４；ＲＮ−４８６；ＣＧＩ−５６０；ＣＧＩ−１７６４；ＨＭ−７１２２４；ＣＣ−２９２；ＯＮＯ−４０５９；ＣＮＸ−７７４；およびＬＦＭ−Ａ１３から選択されるＢＴＫ阻害剤である。好ましい実施態様において、ＢＴＫ阻害剤はインターロイキン−２−誘導性キナーゼ(ＩＴＫ)のキナーゼ活性を低減または阻害せず、ＧＤＣ−０８３４；ＲＮ−４８６；ＣＧＩ−５６０；ＣＧＩ−１７６４；ＨＭ−７１２２４；ＣＣ−２９２；ＯＮＯ−４０５９；ＣＮＸ−７７４；およびＬＦＭ−Ａ１３から選択される。
【０５２６】
ある実施態様において、キナーゼ阻害剤はＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５)である。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＢＴＫ阻害剤(例えば、イブルチニブ)と組み合わせて対象に投与する。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５とも称する)と組み合わせて対象に投与する。イブルチニブ(１−[(３Ｒ)−３−[４−アミノ−３−(４−フェノキシフェニル)−１Ｈ−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−１−イル]ピペリジン−１−イル]プロプ−２−エン−１−オン)の構造を下に示す。
【化３】
2018538339.tif 000085
【０５２７】
ここに記載する方法、使用および組成物のある実施態様において、ＢＴＫ阻害剤は引用によりその全体を本明細書に包含させる国際出願ＷＯ２０１５／０７９４１７号に記載のＢＴＫ阻害剤である。例えば、ある実施態様において、ＢＴＫ阻害剤は式(Ｉ)
【化４】
2018538339.tif 000086
〔式中、
Ｒ１は水素、場合によりヒドロキシで置換されていてよいＣ１−Ｃ６アルキルであり；
Ｒ２は水素またはハロゲンであり；
Ｒ３は水素またはハロゲンであり；
Ｒ４は水素であり；
Ｒ５は水素またはハロゲンであり；
またはＲ４およびＲ５は互いに結合し、結合、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−；−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−；または−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−であり；
Ｒ６およびＲ７は互いに独立してＨ、場合によりヒドロキシで置換されていてよいＣ１−Ｃ６アルキルル、場合によりハロゲンもしくはヒドロキシで置換されていてよいＣ３−Ｃ６シクロアルキルまたはハロゲンであり；
Ｒ８、Ｒ９、Ｒ、Ｒ’、Ｒ１０およびＲ１１は互いに独立してＨまたは場合によりＣ１−Ｃ６アルコキシで置換されていてよいＣ１−Ｃ６アルキルであるか；またはＲ８、Ｒ９、Ｒ、Ｒ’、Ｒ１０およびＲ１１の何れかの２個はそれらが結合している原子と共に３〜６員飽和炭素環式環を形成してよく；
Ｒ１２は水素または場合によりハロゲンもしくはＣ１−Ｃ６アルコキシで置換されていてよいＣ１−Ｃ６アルキルであり；
またはＲ１２およびＲ８、Ｒ９、Ｒ、Ｒ’、Ｒ１０またはＲ１１の何れかの一個はそれらが結合している原子と共に４員、５員、６員または７員アザ環式環を形成してよく、該環は所望によりハロゲン、シアノ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ６アルコキシで置換されていてよく；
ｎは０または１であり；
Ｒ１３は場合によりＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシまたはＮ,Ｎ−ジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノで置換されていてよいＣ２−Ｃ６アルケニル；場合によりＣ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ６アルコキシで置換されていてよいＣ２−Ｃ６アルキニル；または場合によりＣ１−Ｃ６アルキルで置換されていてよいＣ２−Ｃ６アルキレニルオキシドである。〕
の化合物またはその薬学的に許容される塩である。
【０５２８】
ある実施態様において、式ＩのＢＴＫ阻害剤は、Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルアゼチジン−３−イル)オキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｅ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−((１−(ブト−２−エノイル)アゼチジン−３−イル)オキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−((１−プロピオロイルアゼチジン−３−イル)オキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−((１−(ブト−２−インオイル)アゼチジン−３−イル)オキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルピペリジン−４−イル)オキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルアクリルアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｅ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルブト−２−エンアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルプロピオルアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｅ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(４−メトキシ−Ｎ−メチルブト−２−エンアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルブト−２−インアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(２−((４−アミノ−６−(３−(４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)ピリミジン−５−イル)オキシ)エチル)−Ｎ−メチルオキシラン−２−カルボキサミド；Ｎ−(２−((４−アミノ−６−(３−(６−シクロプロピル−８−フルオロ−１−オキソイソキノリン−２(１Ｈ)−イル)フェニル)ピリミジン−５−イル)オキシ)エチル)−Ｎ−メチルアクリルアミド；Ｎ−(３−(５−(２−アクリルアミドエトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−エチルアクリルアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−(２−フルオロエチル)アクリルアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(５−((１−アクリルアミドシクロプロピル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(５−(２−アクリルアミドプロポキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(ブト−２−インアミド)プロポキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルアクリルアミド)プロポキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルブト−２−インアミド)プロポキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(３−(Ｎ−メチルアクリルアミド)プロポキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−((１−(ブト−２−インオイル)ピロリジン−２−イル)メトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−２−(３−(５−((１−アクリロイルピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−(ヒドロキシメチル)フェニル)−６−シクロプロピル−３,４−ジヒドロイソキノリン−１(２Ｈ)−オン；Ｎ−(２−((４−アミノ−６−(３−(６−シクロプロピル−１−オキソ−３,４−ジヒドロイソキノリン−２(１Ｈ)−イル)−５−フルオロ−２−(ヒドロキシメチル)フェニル)ピリミジン−５−イル)オキシ)エチル)−Ｎ−メチルアクリルアミド；Ｎ−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−アクリロイル−４−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−(ブト−２−インオイル)−４−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；２−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−アクリロイル−４−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−(ヒドロキシメチル)フェニル)−６−シクロプロピル−３,４−ジヒドロイソキノリン−１(２Ｈ)−オン；Ｎ−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｓ)−１−アクリロイル−４−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(((２Ｓ,４Ｓ)−１−(ブト−２−インオイル)−４−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)��リミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−アクリロイル−４−フルオロピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−(ブト−２−インオイル)−４−フルオロピロリジン−２−イル)メトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルアゼチジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−((１−プロピオロイルアゼチジン−２−イル)メトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−２−(３−(５−((１−アクリロイルアゼチジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−(ヒドロキシメチル)フェニル)−６−シクロプロピル−３,４−ジヒドロイソキノリン−１(２Ｈ)−オン；(Ｒ)−Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルアゼチジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｒ)−Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルピペリジン−３−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(５−(((２Ｒ,３Ｓ)−１−アクリロイル−３−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−アクリロイル−４−シアノピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；またはＮ−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｓ)−１−アクリロイル−４−シアノピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミドから選択される。
【０５２９】
特に断らない限り、式ＩのＢＴＫ阻害剤の記載において上に使用する化学用語は、引用によりその全体を本明細書に包含させる国際出願ＷＯ２０１５／０７９４１７号に示す意味に従い使用される。
【０５３０】
ある実施態様において、キナーゼ阻害剤は、テムシロリムス；ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても知られるリダフォロリムス(１Ｒ,２Ｒ,４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２−[(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ,２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｚ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３、２９,３５−ヘキサメチル−２,３,１０,１４,２０−ペンタオキソ−１１,３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−１２−イル]プロピル]−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート；エベロリムス(ＲＡＤ００１)；ラパマイシン(ＡＹ２２９８９)；セマピモド；(５−{２,４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−イル}−２−メトキシフェニル)メタノール(ＡＺＤ８０５５)；２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ０４６９１５０２)；およびＮ２−[１,４−ジオキソ−４−[[４−(４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル)モルホリニウム−４−イル]メトキシ]ブチル]−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−(配列番号６１３)、分子内塩(ＳＦ１１２６)；およびＸＬ７６５から選択されるｍＴＯＲ阻害剤である。
【０５３１】
ある実施態様において、キナーゼ阻害剤はｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンであり、ラパマイシンを、約３mg、４mg、５mg、６mg、７mg、８mg、９mg、１０mg(例えば、６mg)連日の用量で一定期間、例えば、２１日サイクルで連日または２８日サイクルで連日投与する。ある実施態様において、ラパマイシンの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のサイクルが投与される。ある実施態様において、キナーゼ阻害剤はｍＴＯＲ阻害剤、例えば、エベロリムスであり、エベロリムスを約２mg、２.５mg、３mg、４mg、５mg、６mg、７mg、８mg、９mg、１０mg、１１mg、１２mg、１３mg、１４mg、１５mg(例えば、１０mg)の用量で一定期間、例えば、２８日サイクルで連日投与する。ある実施態様において、エベロリムスの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のサイクルが投与される。
【０５３２】
ある実施態様において、キナーゼ阻害剤はＣＧＰ０５２０８８；４−アミノ−３−(ｐ−フルオロフェニルアミノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン(ＣＧＰ５７３８０)；セルコスポラミド；ＥＴＣ−１７８０４４５−２；および４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンから選択されるＭＮＫ阻害剤である。
【０５３３】
ある実施態様において、キナーゼ阻害剤は２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ−０４６９１５０２)；Ｎ−[４−[[４−(ジメチルアミノ)−１−ピペリジニル]カルボニル]フェニル]−Ｎ’−[４−(４,６−ジ−４−モルホリニル−１,３,５−トリアジン−２−イル)フェニル]尿素(ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７)；２−メチル−２−{４−[３−メチル−２−オキソ−８−(キノリン−３−イル)−２,３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−１−イル]フェニル}プロパンニトリル(ＢＥＺ−２３５)；アピトリシブ(ＧＤＣ−０９８０、ＲＧ７４２２)；２,４−ジフルオロ−Ｎ−{２−(メチルオキシ)−５−[４−(４−ピリダジニル)−６−キノリニル]−３−ピリジニル}ベンゼンスルホンアミド(ＧＳＫ２１２６４５８)；８−(６−メトキシピリジン−３−イル)−３−メチル−１−(４−(ピペラジン−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル)−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２(３Ｈ)−オンマレイン酸(ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６)；３[４−(４−モルホリニルピリド[３’,２’：４,５]フロ[３,２−ｄ]ピリミジン−２−イル]フェノール(ＰＩ−１０３)；５(９−イソプロピル−８−メチル−２−モルホリノ−９Ｈ−プリン−６−イル)ピリミジン−２−アミン(ＶＳ−５５８４、ＳＢ２３４３)；およびＮ−[２−[(３,５−ジメトキシフェニル)アミノ]キノキサリン−３−イル]−４−[(４−メチル−３−メトキシフェニル)カルボニル]アミノフェニルスルホンアミド(ＸＬ７６５)から選択されるデュアルホスファチジルイノシトール３−キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)およびｍＴＯＲ阻害剤である。
【０５３４】
ある実施態様において、キナーゼ阻害剤はｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンであり、ラパマイシンを、約３mg、４mg、５mg、６mg、７mg、８mg、９mg、１０mg(例えば、６mg)連日の用量で一定期間、例えば、２１日サイクルで連日または２８日サイクルで連日投与する。ある実施態様において、ラパマイシンの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のサイクルが投与される。ある実施態様において、キナーゼ阻害剤はｍＴＯＲ阻害剤、例えば、エベロリムスであり、エベロリムスを約２mg、２.５mg、３mg、４mg、５mg、６mg、７mg、８mg、９mg、１０mg、１１mg、１２mg、１３mg、１４mg、１５mg(例えば、１０mg)の用量で一定期間連日、例えば、２８日サイクルで連日である。ある実施態様において、エベロリムスの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のサイクルが投与される。
【０５３５】
ある実施態様において、キナーゼ阻害剤はＣＧＰ０５２０８８；４−アミノ−３−(ｐ−フルオロフェニルアミノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン(ＣＧＰ５７３８０)；セルコスポラミド；ＥＴＣ−１７８０４４５−２；および４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンから選択されるＭＮＫ阻害剤である。
【０５３６】
ある実施態様において、ここに記載する組み合わせ、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤を、対象に、ホスホイノシチド３−キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)阻害剤(例えば、ここに記載するＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば、イデラリシブまたはドゥベリシブ)および／またはリツキシマブと組み合わせて投与する。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、イデラリシブおよびリツキシマブと組み合わせて対象に投与する。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ドゥベリシブおよびリツキシマブと組み合わせて対象に投与する。イデラリシブ(ＧＳ−１１０１またはＣＡＬ−１０１とも称される；Gilead)は、ＰＩ３Ｋのデルタアイソフォームを遮断する小分子である。イデラリシブ(５−フルオロ−３−フェニル−２−[(１Ｓ)−１−(７Ｈ−プリン−６−イルアミノ)プロピル]−４(３Ｈ)−キナゾリノン)の構造を下に示す。
【化５】
2018538339.tif 000087
【０５３７】
ドゥベリシブ(ＩＰＩ−１４５とも称される；Infinity PharmaceuticalsおよびAbbvie)は、ＰＩ３Ｋ−δ,γを遮断する小分子である。ドゥベリシブ(８−クロロ−２−フェニル−３−[(１Ｓ)−１−(９Ｈ−プリン−６−イルアミノ)エチル]−１(２Ｈ)−イソキノリノン)の構造を下に示す。
【化６】
2018538339.tif 000088
【０５３８】
ある実施態様において、対象はＣＬＬを有する。ある実施態様において、対象は再発性ＣＬＬを有する、例えば、対象は癌治療を先に投与されている(例えば、抗ＣＤ２０抗体を先に投与されているまたはイブルチニブを先に投与されている)。例えば、対象は、染色体１７の短アームに欠失を有する(例えば、白血病細胞における、ｄｅｌ(１７ｐ))。他の例において、対象はｄｅｌ(１７ｐ)を有しない。ある実施態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子に変異を含む白血病細胞を含む。他の実施態様において、対象免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子に変異を含む白血病細胞を含まない。ある実施態様において、対象は、長アームの染色体１１に欠失を有する(ｄｅｌ(１１ｑ))。他の実施態様において、対象はｄｅｌ(１１ｑ)を有しない。ある実施態様において、イデラリシブを約１００〜４００mg(例えばmg、１００〜１２５mg、１２５〜１５０mg、１５０〜１７５mg、１７５〜２００mg、２００〜２２５mg、２２５〜２５０mg、２５０〜２７５mg、２７５〜３００mg、３２５〜３５０mg、３５０〜３７５mgまたは３７５〜４００mg)の投与量で、例えば、ＢＩＤで投与する。ある実施態様において、ドゥベリシブを、約１５〜１００mg(例えば、約１５〜２５mg、２５〜５０mg、５０〜７５mgまたは７５〜１００mg)の投与量で、例えば、１日２回投与する。ある実施態様において、リツキシマブを、約３５０〜５５０mg／ｍ２(例えばmg／ｍ２、３５０〜３７５mg／ｍ２、３７５〜４００mg／ｍ２、４００〜４２５mg／ｍ２、４２５〜４５０mg／ｍ２、４５０〜４７５mg／ｍ２または４７５〜５００mg／ｍ２)の投与量で、例えば、静脈内投与する。
【０５３９】
ある実施態様において、キナーゼ阻害剤は２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ−０４６９１５０２)；Ｎ−[４−[[４−(ジメチルアミノ)−１−ピペリジニル]カルボニル]フェニル]−Ｎ’−[４−(４,６−ジ−４−モルホリニル−１,３,５−トリアジン−２−イル)フェニル]尿素(ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７)；２−メチル−２−{４−[３−メチル−２−オキソ−８−(キノリン−３−イル)−２,３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−１−イル]フェニル}プロパンニトリル(ＢＥＺ−２３５)；アピトリシブ(ＧＤＣ−０９８０、ＲＧ７４２２)；２,４−ジフルオロ−Ｎ−{２−(メチルオキシ)−５−[４−(４−ピリダジニル)−６−キノリニル]−３−ピリジニル}ベンゼンスルホンアミド(ＧＳＫ２１２６４５８)；８−(６−メトキシピリジン−３−イル)−３−メチル−１−(４−(ピペラジン−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル)−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２(３Ｈ)−オンマレイン酸(ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６)；３[４−(４−モルホリニルピリド[３’,２’：４,５]フロ[３,２−ｄ]ピリミジン−２−イル]フェノール(ＰＩ−１０３)；５(９−イソプロピル−８−メチル−２−モルホリノ−９Ｈ−プリン−６−イル)ピリミジン−２−アミン(ＶＳ−５５８４、ＳＢ２３４３)；およびＮ−[２−[(３,５−ジメトキシフェニル)アミノ]キノキサリン−３−イル]−４−[(４−メチル−３−メトキシフェニル)カルボニル]アミノフェニルスルホンアミド(ＸＬ７６５)から選択されるデュアルホスファチジルイノシトール３−キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)およびｍＴＯＲ阻害剤である。
【０５４０】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、未分化リンパ腫キナーゼ(ＡＬＫ)阻害剤と組み合わせて対象に投与する。ＡＬＫキナーゼの例は、クリゾチニブ(Pfizer)、セリチニブ(Novartis)、アレクチニブ(中外)、ブリガチニブ(ＡＰ２６１１３とも称される；Ariad)、エントレクチニブ(Ignyta)、ＰＦ−０６４６３９２２(Pfizer)、ＴＳＲ−０１１(Tesaro)(例えば、Clinical Trial Identifier No. NCT02048488)、ＣＥＰ−３７４４０(Teva)およびＸ−３９６(Xcovery)を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、対象は固形癌、例えば、ここに記載する固形癌、例えば、肺癌を有する。
【０５４１】
クリゾチニブの化学名は３−[(１Ｒ)−１−(２,６−ジクロロ−３−フルオロフェニル)エトキシ]−５−(１−ピペリジン−４−イルピラゾール−４−イル)ピリジン−２−アミンである。セリチニブの化学名は５−クロロ−Ｎ２−[２−イソプロポキシ−５−メチル−４−(４−ピペリジニル)フェニル]−Ｎ４−[２−(イソプロピルスルホニル)フェニル]−２,４−ピリミジンジアミンである。アレクチニブの化学名は９−エチル−６,６−ジメチル−８−(４−モルホリノピペリジン−１−イル)−１１−オキソ−６,１１−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ[ｂ]カルバゾール−３−カルボニトリルである。ブリガチニブの化学名は５−クロロ−Ｎ２−{４−[４−(ジメチルアミノ)−１−ピペリジニル]−２−メトキシフェニル}−Ｎ４−[２−(ジメチルホスホリル)フェニル]−２,４−ピリミジンジアミンである。エントレクチニブの化学名はＮ−(５−(３,５−ジフルオロベンジル)−１Ｈ−インダゾール−３−イル)−４−(４−メチルピペラジン−１−イル)−２−((テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル)アミノ)ベンズアミドである。ＰＦ−０６４６３９２２の化学名は(１０Ｒ)−７−アミノ−１２−フルオロ−２,１０,１６−トリメチル−１５−オキソ−１０,１５,１６,１７−テトラヒドロ−２Ｈ−８,４−(メテノ)ピラゾロ[４,３−ｈ][２,５,１１]−ベンズオキサジアザシクロテトラデシン−３−カルボニトリルである。ＣＥＰ−３７４４０の化学構造は(Ｓ)−２−((５−クロロ−２−((６−(４−(２−ヒドロキシエチル)ピペラジン−１−イル)−１−メトキシ−６,７,８,９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾ[７]アヌレン−２−イル)アミノ)ピリミジン−４−イル)アミノ)−Ｎ−メチルベンズアミドである。Ｘ−３９６の化学名は(Ｒ)−６−アミノ−５−(１−(２,６−ジクロロ−３−フルオロフェニル)エトキシ)−Ｎ−(４−(４−メチルピペラジン−１−カルボニル)フェニル)ピリダジン−３−カルボキサミドである。
【０５４２】
カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害する(シクロスポリンおよびＦＫ５０６)または増殖因子誘発シグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する(ラパマイシン)薬物(Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993も使用され得る。さらなる態様において、本発明の細胞組成物を、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤、外部ビーム放射線療法(ＸＲＴ)、シクロホスファミドおよび／またはＯＫＴ３またはキャンパスなどの抗体を使用するＴ細胞剥奪療法と組み合わせて(例えば、前、同時または後に)患者に投与し得る。ある態様において、本発明の細胞組成物を、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンなどのＢ細胞剥奪療法後投与する。例えば、ある実施態様において、対象を、高用量化学療法と続く末梢血幹細胞移植の標準処置に付し得る。ある実施態様において、移植後、対象は、本発明の増大免疫細胞の点滴を受ける。さらなる実施態様において、増大細胞を手術の前または後に投与する。
【０５４３】
ある実施態様において、ここに記載する組み合わせ、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤を、対象にインドールアミン２,３−ジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)阻害剤と組み合わせて投与する。ＩＤＯは、アミノ酸、Ｌ−トリプトファンのキヌレニンへの分解を触媒する酵素である。多くの癌、例えば、前立腺、結腸直腸、膵臓、子宮頸、胃、卵巣、頭部および肺癌はＩＤＯを過発現する。ｐＤＣ、マクロファージおよび樹状細胞(ＤＣｓ)はＩＤＯを発現する。理論に拘束されないが、Ｌ−トリプトファンの減少(例えば、ＩＤＯによる触媒)は、Ｔ細胞アネルギーおよびアポトーシス誘発により免疫抑制性環境をもたらすと考えられる。それ故に、理論に拘束されないが、ＩＤＯ阻害剤は、例えば、ＣＡＲ発現免疫細胞の抑制または細胞死を減少させることにより、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の有効性を増強できると考えられる。ある実施態様において、対象は固形腫瘍、例えば、ここに記載する固形腫瘍、例えば、前立腺、結腸直腸、膵臓、子宮頸、胃、卵巣、頭部または肺癌を有する。ＩＤＯ阻害剤の例は、１−メチル−トリプトファン、インドキシモド(NewLink genetics)(例えば、Clinical Trial Identifier Nos. NCT01191216; NCT01792050参照)およびＩＮＣＢ０２４３６０(Incyte Corp.)(例えば、Clinical Trial Identifier Nos. NCT01604889; NCT01685255参照)を含むが、これらに限定されない。
【０５４４】
ある実施態様において、ここに記載する組み合わせ、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤を、対象に骨髄由来サプレッサー細胞(ＭＤＳＣ)モジュレーターと組み合わせて投与する。ＭＤＳＣは末梢および多くの固形腫瘍の腫瘍部位に蓄積する。これらの細胞はＴ細胞応答を抑制し、それによりＣＡＲ発現細胞治療の有効性を妨害する。理論に拘束されないが、ＭＤＳＣモジュレーターの投与は、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の有効性を増強すると案が得られる。ある実施態様において、対象は、固形腫瘍、例えば、ここに記載する固形腫瘍、例えば、神経膠芽腫を有する。ＭＤＳＣモジュレーターの例は、ＭＣＳ１１０およびＢＬＺ９４５を含むが、これらに限定されない。ＭＣＳ１１０は、マクロファージコロニー刺激因子(Ｍ−ＣＳＦ)に対するモノクローナル抗体(ｍＡｂ)である。例えば、Clinical Trial Identifier No. NCT00757757参照。ＢＬＺ９４５はコロニー刺激因子１受容体(ＣＳＦ１Ｒ)の小分子阻害剤である。例えば、Pyonteck et al. Nat. Med. 19(2013):1264-72参照。ＢＬＺ９４５の構造を下に示す。
【化７】
2018538339.tif 000089
【０５４５】
ある実施態様において、ここに記載する組み合わせ、例えば、ここでのメソテリンＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤を、免疫抑制性形質細胞の活性を阻害または低減する薬剤と組み合わせて対象に投与する。免疫抑制性形質細胞は、オキサリプラチンなどのＴ細胞依存性免疫原性化学療法を妨害することが示されている(Shalapour et al., Nature 2015, 521:94-101)。ある実施態様において、免疫抑制性形質細胞はＩｇＡ、インターロイキン(ＩＬ)−１０およびＰＤ−Ｌ１の１以上を発現できる。ある実施態様において、薬剤はＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞またはＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現細胞である。
【０５４６】
ある実施態様において、ここに記載する組み合わせ、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤を、対象にインターロイキン−１５(ＩＬ−１５)ポリペプチド、インターロイキン−１５受容体アルファ(ＩＬ−１５Ｒａ)ポリペプチドまたはＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５Ｒａポリペプチド両方の組み合わせ、例えば、ｈｅｔＩＬ−１５(Admune Therapeutics、ＬＬＣ)と組み合わせて投与する。ｈｅｔＩＬ−１５は、ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒａのヘテロ二量体非共有結合複合体である。ｈｅｔＩＬ−１５は、例えば、引用により本明細書に包含させる米国８,１２４,０８４号、米国２０１２／０１７７５９８号、米国２００９／００８２２９９号、米国２０１２／０１４１４１３号および米国。２０１１／００８１３１１号に記載される。ある実施態様において、ｈｅｔ−ＩＬ−１５は皮下投与される。ある実施態様において、対象は癌、例えば、固形癌、例えば、黒色腫または結腸癌を有する。ある実施態様において、対象は転移癌を有する。
【０５４７】
ある実施態様において、ここに記載する疾患を有する対象にここに記載する組み合わせ、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤を、薬剤、例えば、細胞毒性または化学療法剤、生物学的治療(例えば、抗体、例えば、モノクローナル抗体または細胞性治療)または阻害剤(例えば、キナーゼ阻害剤)と組み合わせて投与する。ある実施態様において、対象に、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を細胞毒性剤、例えば、ＣＰＸ−３５１(Celator Pharmaceuticals)、シタラビン、ダウノルビシン、ボサロキシン(Sunesis Pharmaceuticals)、サパシタビン(Cyclacel Pharmaceuticals)、イダルビシンまたはミトキサントロンと組み合わせて投与する。ＣＰＸ−３５１は、シタラビンおよびダウノルビシンを５：１モル比で含むリポソーム製剤である。ある実施態様において、対象に、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、低メチル化剤、例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば、アザシチジンまたはデシタビンと組み合わせて投与する。ある実施態様において、対象に、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、生物学的治療、例えば、抗体または細胞性治療、例えば、２２５Ａｃ−リンツズマブ(Ａｃｔｉｍａｂ−Ａ；Actinium Pharmaceuticals)、ＩＰＨ２１０２(Innate Pharma/Bristol Myers Squibb)、ＳＧＮ−ＣＤ３３Ａ(Seattle genetics)またはゲムツズマブオゾガマイシン(マイロターグ；Pfizer)と組み合わせて投与する。ＳＧＮ−ＣＤ３３Ａは、抗ＣＤ３３抗体に結合したピロロベンゾジアゼピン二量体を含む抗体−薬物コンジュゲート(ＡＤＣ)である。Ａｃｔｉｍａｂ−Ａは、アクチニウムで標識された抗ＣＤ３３抗体(リンツズマブ)である。ＩＰＨ２１０２は、キラー免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲｓ)を標的とするモノクローナル抗体である。ある実施態様において、対象にここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＦＬＴ３阻害剤、例えば、ソラフェニブ(Bayer)、ミドスタウリン(Novartis)、キザルチニブ(第一三共)、クレノラニブ(Arog Pharmaceuticals)、ＰＬＸ３３９７(第一三共)、ＡＫＮ−０２８(Akinion Pharmaceuticals)またはＡＳＰ２２１５(アステラス)と組み合わせて投与する。ある実施態様において、対象に、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、イソシトレートデヒドロゲナーゼ(ＩＤＨ)阻害剤、例えば、ＡＧ−２２１(Celgene/Agios)またはＡＧ−１２０(Agios/Celgene)と組み合わせて投与する。ある実施態様において、対象に、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、細胞周期レギュレーター、例えば、ポロ様キナーゼ１(Ｐｌｋ１)阻害剤、例えば、ボラセルチブ(Boehringer Ingelheim)；またはサイクリン依存性キナーゼ９(Ｃｄｋ９)阻害剤、例えば、アルボシジブ(Tolero Pharmaceuticals/Sanofi Aventis)と組み合わせて投与する。ある実施態様において、対象に、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、Ｂ細胞受容体シグナル伝達ネットワーク阻害剤、例えば、Ｂ細胞リンパ腫２(Ｂｃｌ−２)阻害剤、例えば、ベネトクラクス(Abbvie／Roche)；またはブルトンチロシンキナーゼ(Ｂｔｋ)阻害剤、例えば、イブルチニブ(Pharmacyclics/Johnson & Johnson Janssen Pharmaceutical)と組み合わせて投与する。ある実施態様において、対象に、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、Ｍ１アミノペプチダーゼ阻害剤、例えば、トセドスタット(CTI BioPharma/Vernalis)；ヒストンデアセチラーゼ(ＨＤＡＣ)阻害剤、例えば、プラシノスタット(MEI Pharma)；多キナーゼ阻害剤、例えば、リゴセルチブ(Onconova Therapeutics/Baxter/SymBio)；またはペプチド性ＣＸＣＲ４逆アゴニスト、例えば、ＢＬ−８０４０(BioLineRx)と組み合わせて投与する。
【０５４８】
一部患者は、本発明の化合物および／または他の抗癌剤に対し、投与中または投与後アレルギー反応を経験するかもしれず、それ故に、抗アレルギー剤をアレルギー反応のリスク最小化のためにしばしば投与する。適当な抗アレルギー剤は、コルチコステロイド、例えばデキサメサゾン(例えば、デカドロン(登録商標))、ベクロメタゾン(例えば、Beclovent(登録商標))、ヒドロコルチゾン(コルチゾン、ヒドロコルチゾンナトリウムスクシネート、ヒドロコルチゾンナトリウムホスフェートとしても知られ、商品名Ala-Cort(登録商標)、ヒドロコルチゾンホスフェート、Solu-Cortef(登録商標)、Hydrocort Acetate(登録商標)およびLanacort(登録商標)として販売)、プレドニゾロン(商品名Delta-Cortel(登録商標)、Orapred(登録商標)、Pediapred(登録商標)およびPrelone(登録商標)として販売)、プレドニゾン(商品名Deltasone(登録商標)、Liquid Red(登録商標)、Meticorten(登録商標)およびOrasone(登録商標)として販売)、メチルプレドニゾロン(６−メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾロンアセテート、メチルプレドニゾロンナトリウムスクシネートとしても知られ、商品名Duralone(登録商標)、Medralone(登録商標)、メドロール(登録商標)、Ｍ−Prednisol(登録商標)およびソルメドロール(登録商標)として販売)；抗ヒスタミン、例えばジフェンヒドラミン(例えば、ベナドリル(登録商標))、ヒドロキシジンおよびシプロヘプタジン；および気管支拡張剤、例えばベータ−アドレナリン受容体アゴニスト、アルブテロール(例えば、Proventil(登録商標))およびテルブタリン(Brethine(登録商標))を含む。
【０５４９】
一部患者は、本発明の化合物および／または他の抗癌剤の投与中または投与後、悪心を経験するかもしれず、それ故に、制吐剤を悪心(胃上部)および嘔吐予防のために使用し得る。適当な制吐剤は、アプレピタント(イメンド(登録商標))、オンダンセトロン(ゾフラン(登録商標))、グラニセトロンＨＣｌ(カイトリル(登録商標))、ロラゼパム(アチバン(登録商標)、デキサメサゾン(デカドロン(登録商標))、プロクロルペラジン(Compazine(登録商標))、カソピタント(Rezonic(登録商標)およびZunrisa(登録商標))およびこれらの組み合わせを含む。
【０５５０】
処置期間中に経験する疼痛を軽減するための医薬が、患者をより快適とするためにしばしば処方される。一般的な一般用医薬品鎮痛剤、例えばタイレノール(登録商標)がしばしば使用される。しかしながら、ヒドロコドン／パラセタモールまたはヒドロコドン／アセトアミノフェン(例えば、バイコジン(登録商標))、モルヒネ(例えば、Astramorph(登録商標)またはAvinza(登録商標))、オキシコドン(例えば、オキシコンチン(登録商標)またはパーコセット(登録商標))、オキシモルホンヒドロクロライド(Opana(登録商標))およびフェンタニル(例えば、デュラゲシク(登録商標))などのオピオイド鎮痛剤も中度または重度疼痛に有用である。
【０５５１】
正常細胞を処置毒性から保護し、臓器毒性を制限する努力において、細胞保護剤(例えば神経保護剤、フリーラジカルスカベンジャー、心保護剤、アントラサイクリン血管外漏出中和剤、栄養剤など)を補助剤治療として使用し得る。適当な細胞保護剤は、アミホスチン(Ethyol(登録商標))、グルタミン、ジメスナ(Tavocept(登録商標))、メスナ(Mesnex(登録商標))、デクスラゾキサン(Zinecard(登録商標)またはTotect(登録商標))、キサリプロデン(Xaprila(登録商標))およびロイコボリン(カルシウムロイコボリン、シトロボラム因子およびフォリン酸としても知られる)を含む。コード番号、一般名または商品名により特定した活性化合物の構造は、標準概説書“The Merck Index”の現行版またはデータベース、例えばPatents International(例えばIMS World Publications)からとり得る。
【０５５２】
本発明の化合物と組み合わせて使用し得る上記化合物は、上に引用した文献などの文献の記載に従い製造および投与し得る。
【０５５３】
ある実施態様において、本発明は、少なくとも１個の本発明の化合物(例えば、本発明の化合物)またはその薬学的に許容される塩を、単独でまたは他の抗癌剤と共にヒトまたは動物対象に投与するのに適する薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物である。
【０５５４】
ある実施態様において、本発明は、癌などの細胞増殖性疾患を有するヒトまたは動物対象を処置する方法である。本発明は、対象に治療有効量の本発明の化合物(例えば、本発明の化合物)またはその薬学的に許容される塩、単独でまたは他の抗癌剤と組み合わせて投与することを含む、処置を必要とするヒトまたは動物対象の処置方法である。
【０５５５】
特に、組成物を、組み合わせ治療として一緒に製剤しても、別々に投与してもよい。
【０５５６】
組み合わせ治療において、本発明の化合物および他の抗癌剤を、同時に、一緒にまたは特定の時間制限なく逐次的に投与してよく、ここで、このような投与が患者体内で２化合物の治療的効果的レベルを提供する。
【０５５７】
好ましい実施態様において、本発明の化合物および他の抗癌剤を、一般に、何れかの順序で点滴または経口で逐次的に投与する。投与レジメンは、疾患のステージ、患者の身体的適応度、個々の薬物の安全性プロファイルおよび個々の薬物の耐容性、ならびに組み合わせを投与する担当医師および医療従事者に周知の他の基準により変わり得る。本発明の化合物および他の抗癌剤を、処置に使用する特定のサイクルにより、互いに数分内に、数時間、数日または数週離れて投与し得る。さらに、サイクルは、処置サイクル中一方の薬物を他方の薬物より多くおよび薬物の投与あたり異なる用量で投与することを含む。
【０５５８】
本発明の他の態様において、ここに開示する１以上の本発明の化合物および組み合わせパートナーを含むキットが提供される。代表的キットは、(ａ)本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩、(ｂ)例えば、上記の少なくとも１個の組み合わせパートナーを含み、ここで、このようなキットは添付文書または投与指示を含むたのラベルを含み得る。
【０５５９】
本発明の化合物は、既知治療方法、例えば、ホルモンまたは特に放射線の適用と組み合わせてまた有利に使用され得る。本発明の化合物は、特に放射線増感剤として、特に放射線療法に低感受性を示す腫瘍の処置のために使用し得る。
【０５６０】
ある実施態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞の投与と関連する副作用を軽減または改善する薬剤を投与され得る。ＣＡＲ発現細胞投与と関連する副作用は、ＣＲＳおよび血球貪食性リンパ組織球症(ＨＬＨ)、別名マクロファージ活性化症候群(ＭＡＳ)を含むが、これらに限定されない。ＣＲＳの症状は、高熱、悪心、一過性低血圧、低酸素症などを含む。ＣＲＳは、発熱、疲労、摂食障害、筋肉痛、関節痛(arthalgias)、悪心、嘔吐および頭痛などの臨床的体質的徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、発疹などの臨床的皮膚徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、悪心、嘔吐および下痢などの臨床的消化器徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、頻呼吸および低酸素血症などの臨床的呼吸器徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、高窒素血症などの頻脈、脈圧拡大、低血圧、心拍出量増加(初期)およびおそらく心拍出量減少(後期)などの臨床的心血管徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、高ｄ−二量体、出血を伴うまたは伴わない低フィブリノーゲン血症などの臨床的凝固徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、臨床的腎臓徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは高トランスアミナーゼ血症および高ビリルビン血症などの臨床的肝臓徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、頭痛、精神状態変化、混乱、譫妄、喚語困難またはフランク失語症、幻覚、振戦、測定異常、歩調変化および発作などの臨床的神経性徴候および症状を含む。
【０５６１】
従って、ここに記載する方法は、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を対象に投与し、さらにＣＡＲ発現細胞での処置に起因する可溶性因子のレベル上昇を管理する１以上の薬剤を投与することを含む。ある実施態様において、対象で上昇する可溶性因子は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−６の１以上である。ある実施態様において、対象で上昇する因子は、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−５およびフラクタルカインの１以上である。それ故に、この副作用処置のために投与する薬剤は、これら可溶性因子の１以上を中和する薬剤であり得る。ある実施態様において、これらの可溶性形態の１以上を中和する薬剤は抗体またはその抗原結合フラグメントである。このような薬剤の例は、ステロイド(例えば、コルチコステロイド)、ＴＮＦα阻害剤およびＩＬ−６阻害剤を含むが、これらに限定されない。ＴＮＦα阻害剤の例は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴールおよびゴリムマブなどの、抗ＴＮＦα抗体分子である。ＴＮＦα阻害剤の他の例は、エタネルセプトなどの融合タンパク質である。小分子ＴＮＦα阻害剤は、キサンチン誘導体(例えばペントキシフィリン)およびブプロピオンを含むが、これらに限定されない。ＩＬ−６阻害剤の例は、トシリズマブ(ｔｏｃ)、サリルマブ、elsilimomab、ＣＮＴＯ  ３２８、ＡＬＤ５１８／ＢＭＳ−９４５４２９、ＣＮＴＯ  １３６、ＣＰＳＩ−２３６４、ＣＤＰ６０３８、ＶＸ３０、ＡＲＧＸ−１０９、ＦＥ３０１およびＦＭ１０１などの抗ＩＬ−６抗体分子を含む。ある実施態様において、抗ＩＬ−６抗体分子はトシリズマブである。ＩＬ−１Ｒベースの阻害剤の例はアナキンラである。
【０５６２】
ある実施態様において、対象は、数ある中で、例えば、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾンなどのコルチコステロイドを投与される。
【０５６３】
ある実施態様において、対象は、例えば、ノルエピネフリン、ドーパミン、フェニレフリン、エピネフリン、バソプレシンまたはこれらの組み合わせなどの、昇圧剤を投与される。
【０５６４】
ある実施態様において、対象は、解熱剤を投与され得る。ある実施態様において、対象は鎮痛剤を投与され得る。
【０５６５】
ある実施態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞の活性または適応度を増強する薬剤を投与され得る。例えば、ある実施態様において、薬剤は、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子を阻害する薬剤であり得る。ある実施態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御する分子は阻害性分子である。阻害性分子、例えば、プログラム死１(ＰＤ−１)は、ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を減少させる。阻害性分子の例は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータを含む。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害により、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の阻害は、ＣＡＲ発現細胞性能を最適化し得る。ある実施態様において、例えば、ここに記載の、薬剤、例えば、阻害性核酸、例えば、阻害性核酸、例えば、阻害性核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を、ＣＡＲ発現細胞における阻害性分子発現阻害に使用し得る。ある実施態様において、阻害剤はｓｈＲＮＡである。
【０５６６】
ある実施態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する薬剤はＣＡＲ発現細胞内で阻害される。これらの実施態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子は、ＣＡＲの成分、例えば、成分全部をコードする核酸に結合される。ある実施態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、プロモーター、例えば、Ｈ１またはＵ６由来プロモーターに、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子が発現される、例えば、ＣＡＲ発現細胞内で発現されるように、操作可能に連結される。例えば、Tiscornia G., “Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA,” Chapter 3, in Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA (eds. Friedmann and Rossi). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2007; Brummelkamp TR, et al. (2002) Science 296: 550-553;  Miyagishi M, et al. (2002) Nat. Biotechnol. 19: 497-500参照。ある実施態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの成分、例えば、全成分をコードする核酸分子を含むのと同じベクター、例えば、レンチウイルスベクターに存在する。このような実施態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ベクター、例えば、レンチウイルスベクターでＣＡＲの成分、例えば、全成分をコードする核酸の５’または３’に位置する。Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの成分、例えば、全成分をコードする核酸と同一または異なる方向で転写され得る。ある実施態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの成分、例えば、全成分をコードする核酸分子を含むベクターと異なるベクターに存在する。ある実施態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲ発現細胞内で一過性に発現される。ある実施態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲ発現細胞のゲノムに安定に統合される。ＣＡＲの成分、例えば、全成分を、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子と共に発現する例示的ベクターの配置は、例えば、引用により本明細書に包含させる２０１４年１２月１９日出願の国際公開ＷＯ２０１５／０９０２３０号の図４７に提供される。
【０５６７】
Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子がＰＤ−１であるときのＴ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現阻害に有用なｄｓＲＮＡ分子の例は、例えば、引用により本明細書に包含させる２０１４年１２月１９日出願の国際公開ＷＯ２０１５／０９０２３０号のパラグラフ[００４８９]および表１６および１７に記載する、ＰＤ−１を標的とするＲＮＡｉｄである。
【０５６８】
ある実施態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する薬剤は、例えば、阻害性分子に結合する抗体または抗体フラグメントであり得る。例えば、薬剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２またはＣＴＬＡ４に結合する抗体または抗体フラグメントである(例えば、イピリムマブ(ＭＤＸ−０１０およびＭＤＸ−１０１とも称され、ヤーボイ(登録商標)として市販；Bristol-Myers Squibb；トレメリムマブ(Pfizerから入手可能なＩｇＧ２モノクローナル抗体、以前はチシリムマブ、ＣＰ−６７５,２０６として知られる))。ある実施態様において、薬剤は、ＴＩＭ３に結合する抗体または抗体フラグメントである。ある実施態様において、薬剤は、ＬＡＧ３に結合する抗体または抗体フラグメントである。
【０５６９】
ＰＤ−１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含む受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーである。ＰＤ−１は活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞に発現される(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75)。ＰＤ−１の２リガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２がＰＤ−１への結合によりＴ細胞活性化を下方制御することが示されている(Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43)。ＰＤ−Ｌ１はヒト癌で豊富である(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１の局所相互作用阻害により回復され得る。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤が当分野で利用可能であり、ここに記載するＣＡＲと組み合わせて使用され得る。例えば、ニボルマブ(ＢＭＳ−９３６５５８またはＭＤＸ１１０６とも称される；Bristol-Myers Squibb)は、ＰＤ−１を特異的に遮断する完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ＰＤ−１に特異的に結合するニボルマブ(クローン５Ｃ４)および他のヒトモノクローナル抗体は、ＵＳ８,００８,４４９号およびＷＯ２００６／１２１１６８号に開示される。ピジリズマブ(ＣＴ−０１１；Cure Tech)は、ＰＤ−１に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。ピジリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体はＷＯ２００９／１０１６１１号に開示される。ペムブロリズマブ(以前はランブロリズマブとして知られ、ＭＫ０３４７５とも称される；Merck)は、ＰＤ−１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ペムブロリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ−１抗体は、ＵＳ８,３５４,５０９号およびＷＯ２００９／１１４３３５号に開示される。ＡＭＰ−２２４(Ｂ７−ＤＣＩｇ；Amplimmune；例えば、ＷＯ２０１０／０２７８２７号およびＷＯ２０１１／０６６３４２号に開示)は、ＰＤ−１およびＢ７−Ｈ１の相互作用を遮断するＰＤ−Ｌ２  Ｆｃ融合可溶性受容体である。他の抗ＰＤ−１抗体は、ＡＭＰ  ５１４(Amplimmune)、とりわけ、例えば、ＵＳ８,６０９,０８９号、ＵＳ２０１００２８３３０号および／またはＵＳ２０１２０１１４６４９号に開示の抗ＰＤ−１抗体を含む。
【０５７０】
ある実施態様において、抗ＰＤ−１抗体またはそのフラグメントは、引用によりその全体を本明細書に包含させる、“ＰＤ−１に対する抗体分子およびその使用”なる表題のＵＳ２０１５／０２１０７６９号に記載の抗ＰＤ−１抗体分子である。ある実施態様において、抗ＰＤ−１抗体分子は、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０４９−Ｃｌｏｎｅ−Ａ、ＢＡＰ０４９−Ｃｌｏｎｅ−Ｂ、ＢＡＰ０４９−Ｃｌｏｎｅ−Ｃ、ＢＡＰ０４９−Ｃｌｏｎｅ−ＤまたはＢＡＰ０４９−Ｃｌｏｎｅ−Ｅの何れかから選択される抗体からの重および軽鎖可変領域からの少なくとも１、２、３、４、５または６ＣＤＲ(または集合的にＣＤＲ全部)；またはＵＳ２０１５／０２１０７６９の表１に記載されるまたは表におけるヌクレオチド配列によりコードされるまたは前記配列の何れかと実質的に同一(例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一)である配列；または密接に関連するＣＤＲ、例えば、同一であるかまたは少なくとも１アミノ酸改変を含むが、改変(例えば、置換、欠失または挿入、例えば、保存的置換)が２、３または４を超えないＣＤＲを含む。
【０５７１】
さらに他の実施態様において、抗ＰＤ−１抗体分子は、ここに記載する抗体、例えば、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０４９−Ｃｌｏｎｅ−Ａ、ＢＡＰ０４９−Ｃｌｏｎｅ−Ｂ、ＢＡＰ０４９−Ｃｌｏｎｅ−Ｃ、ＢＡＰ０４９−Ｃｌｏｎｅ−ＤまたはＢＡＰ０４９−Ｃｌｏｎｅ−Ｅの何れかから選択される抗体からの少なくとも１、２、３または４可変領域；またはＵＳ２０１５／０２１０７６９の表１に記載されるまたは表におけるヌクレオチド配列によりコードされる；または前記配列の何れかと実質的に同一(例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一)である配列を含む。
【０５７２】
ＴＩＭ３(Ｔ細胞免疫グロブリン−３)も、特にＩＦＮ−ｇ分泌ＣＤ４＋Ｔヘルパー１およびＣＤ８＋Ｔ細胞毒性１細胞においてＴ細胞機能を負に制御し、Ｔ細胞消耗に重要な役割を有する。ＴＩＭ３とそのリガンド、例えば、ガレクチン−９(Ｇａｌ９)、ホスホチジルセリン(ＰＳ)およびＨＭＧＢ１の相互作用の阻害は免疫応答を増加させ得る。ＴＩＭ３およびそのリガンドの抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤は当分野で利用可能であり、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲと組み合わせて使用され得る。例えば、ＴＩＭ３を標的とする抗体、抗体フラグメント、小分子またはペプチド阻害剤は、そのリガンドとの相互作用阻害のためにＴＩＭ３のＩｇＶドメインと結合する。ＴＩＭ３を阻害する抗体およびペプチドは、ＷＯ２０１３／００６４９０号およびＵＳ２０１００２４７５２１号に開示される。他の抗ＴＩＭ３抗体は、ＲＭＴ３−２３のヒト化バージョン(Ngiow et al., 2011, Cancer Res, 71:3540-3551に開示)およびクローン８Ｂ.２Ｃ１２(Monney et al., 2002, Nature, 415:536-541に開示)を含む。ＴＩＭ３およびＰＤ−１を阻害する二特異的抗体はＵＳ２０１３０１５６７７４号に開示される。
【０５７３】
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体またはそのフラグメントは、引用によりその全体を本明細書に包含させる、“ＴＩＭ３に対する抗体分子およびその使用”なる表題のＵＳ２０１５／０２１８２７４号に記載の抗ＴＩＭ３抗体分子である。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体分子は、ＡＢＴＩＭ３、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０１、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０２、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０３、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０４、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０５、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０６、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０７、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０８、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０９、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１０、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１１、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１２、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１３、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１４、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１５、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１６、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１７、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１８、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１９、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２０、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２１、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２２、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２３の何れかから選択される抗体からの重および軽鎖可変領域からの少なくとも１、２、３、４、５または６ＣＤＲ(または集合的にＣＤＲ全部)；またはＵＳ２０１５／０２１８２７４号の表１〜４に記載の；または表１〜４におけるヌクレオチド配列によりコードされる；；または前記配列の何れかと実質的に同一(例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一)である配列または密接に関連するＣＤＲ、例えば、同一であるかまたは少なくとも１アミノ酸改変を含むが、改変(例えば、置換、欠失または挿入、例えば、保存的置換)が２、３または４を超えないＣＤＲを含む。
【０５７４】
さらに他の実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体分子は、ここに記載する抗体、例えば、ＡＢＴＩＭ３、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０１、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０２、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０３、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０４、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０５、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０６、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０７、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０８、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０９、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１０、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１１、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１２、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１３、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１４、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１５、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１６、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１７、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１８、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１９、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２０、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２１、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２２、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２３の何れかから選択される抗体からの少なくとも１、２、３または４可変領域；またはＵＳ２０１５／０２１８２７４号の表１〜４に記載の；または表１〜４におけるヌクレオチド配列によりコードされる；；または前記配列の何れかと実質的に同一(例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一)である配列を含む。
【０５７５】
他の実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５阻害剤)である。ある実施態様において、ＣＥＡＣＡＭの阻害剤は、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体分子である。抗ＣＥＡＣＡＭ−１抗体の例は、ＷＯ２０１０／１２５５７１号、ＷＯ２０１３／０８２３６６号、ＷＯ２０１４／０５９２５１号およびＷＯ２０１４／０２２３３２号に開示され、例えば、モノクローナル抗体３４Ｂ１、２６Ｈ７および５Ｆ４；または、例えば、ＵＳ２００４／００４７８５８号、ＵＳ７,１３２,２５５号およびＷＯ９９／０５２５５２号に記載の、その組み換え形態である。他の実施態様において、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体は、例えば、Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146)に記載のとおり、ＣＥＡＣＡＭ−５に結合するまたは例えば、ＷＯ２０１３／０５４３３１号およびＵＳ２０１４／０２７１６１８号に記載のとおり、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＣＥＡＣＡＭ−５と交差反応する。
【０５７６】
理論に拘束されることを願わないが、癌胎児性抗原細胞接着分子(ＣＥＡＣＡＭ)、例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＣＥＡＣＡＭ−５は、少なくとも一部、抗腫瘍免疫応答の阻害に介在すると考えられる(例えば、Markel et al. J Immunol. 2002 Mar 15;168(6):2803-10; Markel et al. J Immunol. 2006 Nov 1;177(9):6062-71; Markel et al. Immunology. 2009 Feb;126(2):186-200; Markel et al. Cancer Immunol Immunother. 2010 Feb;59(2):215-30; Ortenberg et al. Mol Cancer Ther. 2012 Jun;11(6):1300-10; Stern et al. J Immunol. 2005 Jun 1;174(11):6692-701; Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529参照)。例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１は、ＴＩＭ−３のヘテロ親和性リガンドとしておよびＴＩＭ−３介在Ｔ細胞耐容性および消耗に役割を有すると記載されている(例えば、ＷＯ２０１４／０２２３３２号；Huang, et al. (2014) Nature doi:10.1038/nature13848参照)。ある実施態様において、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＴＩＭ−３の共遮断は、異種移植結腸直腸癌モデルにおける抗腫瘍免疫応答を増強することが示されている(例えば、ＷＯ２０１４／０２２３３２号；Huang, et al. (2014), supra参照)。他の実施態様において、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＰＤ−１の共遮断は、例えば、ＷＯ２０１４／０５９２５１号に記載のとおり、Ｔ細胞耐容性を減少させる。それ故に、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤をここに記載する他の免疫調節剤(例えば、抗ＰＤ−１および／または抗ＴＩＭ−３阻害剤と共に使用して、ここに記載する癌、例えば、黒色腫、肺癌(例えば、ＮＳＣＬＣ)、膀胱癌、結腸癌、卵巣癌および他の癌に対する免疫応答を増強し得る。
【０５７７】
ＬＡＧ３(リンパ球活性化遺伝子−３またはＣＤ２２３)は、ＣＤ８＋Ｔ細胞消耗における役割を有することが示されている、活性化Ｔ細胞およびＢ細胞に発現される細胞表面分子である。ＬＡＧ３およびそのリガンドの抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤は当分野で利用可能であり、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲと組み合わせて使用し得る。例えば、ＢＭＳ−９８６０１６(Bristol-Myers Squib)は、ＬＡＧ３を標的とするモノクローナル抗体である。ＩＭＰ７０１(Immutep)はアンタゴニストＬＡＧ３抗体であり、ＩＭＰ７３１(ImmutepおよびGlaxoSmithKline)は枯渇性ＬＡＧ３抗体である。他のＬＡＧ３阻害剤は、ＭＨＣクラスII分子に結合し、抗原提示細胞(ＡＰＣ)を活性化する、ＬＡＧ３の可溶性部分およびＩｇの組み換え融合タンパク質である、ＩＭＰ３２１(Immutep)である。他の抗体は、例えば、ＷＯ２０１０／０１９５７０号に開示される。
【０５７８】
ある実施態様において、抗ＬＡＧ３抗体またはそのフラグメントは、引用によりその全体を本明細書に包含させる、“ＬＡＧ３に対する抗体分子およびその使用”なる表題のＵＳ２０１５／０２５９４２０号に記載の抗ＬＡＧ３抗体分子である。ある実施態様において、抗ＬＡＧ３抗体分子は、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１７、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１８、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１９、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ２０、ｈｕＢＡＰ０５０(Ｓｅｒ)(例えば、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０１−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０２−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０３−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０４−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０５−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０６−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０７−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０８−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０９−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１０−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１１−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１２−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１３−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１４−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１５−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１８−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１９−ＳｅｒまたはＢＡＰ０５０−ｈｕｍ２０−Ｓｅｒ)、ＢＡＰ０５０−Ｃｌｏｎｅ−Ｆ、ＢＡＰ０５０−Ｃｌｏｎｅ−Ｇ、ＢＡＰ０５０−Ｃｌｏｎｅ−Ｈ、ＢＡＰ０５０−Ｃｌｏｎｅ−ＩまたはＢＡＰ０５０−Ｃｌｏｎｅ−Ｊの何れかから選択される抗体からの重および軽鎖可変領域からの少なくとも１、２、３、４、５または６ＣＤＲ(または集合的にＣＤＲ全部)；またはＵＳ２０１５／０２５９４２０号の表１に記載の；または表１におけるヌクレオチド配列によりコードされる；または前記配列の何れかと実質的に同一(例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一)である配列または密接に関連するＣＤＲ、例えば、同一であるかまたは少なくとも１アミノ酸改変を含むが、改変(例えば、置換、欠失または挿入、例えば、保存的置換)が２、３または４を超えないＣＤＲを含む。
【０５７９】
さらに他の実施態様において、抗ＬＡＧ３抗体分子は、ここに記載する抗体、例えば、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１７、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１８、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１９、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ２０、ｈｕＢＡＰ０５０(Ｓｅｒ)(例えば、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０１−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０２−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０３−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０４−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０５−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０６−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０７−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０８−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０９−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１０−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１１−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１２−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１３−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１４−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１５−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１８−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１９−ＳｅｒまたはＢＡＰ０５０−ｈｕｍ２０−Ｓｅｒ)、ＢＡＰ０５０−Ｃｌｏｎｅ−Ｆ、ＢＡＰ０５０−Ｃｌｏｎｅ−Ｇ、ＢＡＰ０５０−Ｃｌｏｎｅ−Ｈ、ＢＡＰ０５０−Ｃｌｏｎｅ−ＩまたはＢＡＰ０５０−Ｃｌｏｎｅ−Ｊの何れかから選択される抗体からの少なくとも１、２、３または４可変領域；またはＵＳ２０１５／０２５９４２０号の表１に記載の；または表１におけるヌクレオチド配列によりコードされる；または前記配列の何れかと実質的に同一(例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一)である配列を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、例えば、第一ドメインおよび第二ドメインを含む融合タンパク質であり、ここで、第一ドメインは阻害性分子またはそのフラグメントであり、第二ドメインは正のシグナルと関連するポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドであり得る。ある実施態様において、正のシグナルと関連するポリペプチドは、例えば、ここに記載する、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳの共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２７および／またはＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または、例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメインを含み得る。ある実施態様において、融合タンパク質は、ＣＡＲを発現するのと同じ細胞で発現される。他の実施態様において、融合タンパク質は、本発明のＣＡＲを発現しない細胞、例えば、Ｔ細胞により発現される。
【０５８０】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤はｍｉＲ−１７−９２である。
【０５８１】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲの活性を増強する薬剤はサイトカインである。サイトカインは、Ｔ細胞増大、分化、生存および恒常性に関連する重要な機能を有する。ここに記載するＣＡＲ発現細胞を受ける対象に投与され得るサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１またはこれらの組み合わせを含む。好ましい実施態様において、投与するサイトカインはＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−２１またはこれらの組み合わせである。サイトカインは１日１回または１日１回以上、例えば、１日２回、１日３回または１日４回投与され得る。サイトカインは、１日を超えて投与してよく、例えばサイトカインを２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週または４週投与する。例えば、サイトカインは、１日１回、７日投与される。
【０５８２】
ある実施態様において、サイトカインを、ここに記載する組み合わせ、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤と組み合わせて投与する。サイトカインはＣＡＲ発現細胞と同時にまたは一緒に投与してよく、例えば、同日に投与される。サイトカインはＣＡＲ発現細胞と同じ医薬組成物に製造されてよくまたは別の医薬組成物に製造され得る。あるいは、サイトカインを、ＣＡＲ発現細胞投与直後、例えば、ＣＡＲ発現Ｔ細胞投与１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日後に投与してよい。サイトカインを１日を超えて行う投与レジメンにおいて投与するある実施態様において、サイトカイン投与レジメンの初日ＣＡＲ発現細胞投与と同実であってよくまたはサイトカイン投与レジメンの一日目は、ＣＡＲ発現細胞１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日後であり得る。ある実施態様において、一日目に、ＣＡＲ発現細胞を対象に投与し、二日目に、サイトカインを１日１回、その後７日投与する。好ましい実施態様において、ＣＡＲ発現細胞と組み合わせて投与するサイトカインはＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−２１である。
【０５８３】
他の実施態様において、サイトカインを、ＣＡＲ発現細胞投与一定期間後、例えば、ＣＡＲ発現細胞投与少なくとも２週、３週、４週、６週、８週、１０週、１２週、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月または１年またはそれ以上後に投与する。ある実施態様において、サイトカインを、ＣＡＲ発現細胞に対する対象の応答の評価後に投与する。例えば、対象に、ＣＡＲ発現細胞をここに記載する用量およびレジメンに従って投与する。ＣＡＲＴ治療に対する対象の応答を、ＣＡＲ発現細胞投与２週、３週、４週、６週、８週、１０週、１２週、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月または１年またはそれ以上後、腫瘍増殖阻害、循環腫瘍細胞減少または腫瘍退縮を含むここに記載する方法の何れかを使用して評価する。ＣＡＲ発現細胞治療に十分な応答を示さない対象に、サイトカインを投与し得る。ＣＡＲ発現細胞治療に対する最適以下の応答の対象へのサイトカイン投与は、ＣＡＲ発現細胞有効性または抗腫瘍活性を改善する。好ましい実施態様において、ＣＡＲ発現細胞投与後投与されるサイトカインはＩＬ−７である。
【０５８４】
低用量のｍＴＯＲ阻害剤との組み合わせ
ある実施態様において、ここに記載する組み合わせ、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞およびＰＤ−Ｌ１阻害剤を、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて投与する。
【０５８５】
他の実施態様において、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、例えば、非処置ＣＡＲ発現細胞または非処置対象と比較して、例えば、培養または対象における、ＣＡＲ発現細胞の増殖増加または延長をもたらす。ある実施態様において、増殖増加は、ＣＡＲ発現細胞数の増加と関係する。増殖増加または延長を測定する方法は、ここでの実施例に記載される。他の実施態様において、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、例えば、非処置ＣＡＲ発現細胞または非処置対象と比較して、例えば、培養または対象における、ＣＡＲ発現細胞による癌細胞殺滅増加をもたらす。ある実施態様において、癌細胞殺滅増加は、腫瘍体積減少と関連する。
【０５８６】
ある実施態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的ｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて投与する。例えば、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤投与は、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与前に開始され、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与前に完了し、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与と同時に開始され、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与と重複し、またはここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与後継続され得る。
【０５８７】
これとは別にまたはこれに加えて、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、ここに記載するＣＡＲ分子の発現を最適化するために改変される免疫エフェクター細胞を最適化し得る。このような実施態様において、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤の投与は、対象から、ここに記載するＣＡＲ分子を発現するように改変する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の採取前に開始または完了する。
【０５８８】
他の実施態様において、例えば、対象から最初後にここに記載するＣＡＲ分子を発現するよう改変する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞または例えば、対象への投与前のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤存在下、培養してよい。
【０５８９】
ここで使用する用語“ｍＴＯＲ阻害剤”は、細胞におけるｍＴＯＲキナーゼを阻害する化合物またはリガンドまたはその薬学的に許容される塩をいう。ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤はアロステリック阻害剤である。ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は触媒的阻害剤である。
【０５９０】
アロステリックｍＴＯＲ阻害剤は、中性三環式化合物ラパマイシン(シロリムス)、例えば、ラパマイシン誘導体、ラパマイシンアナログ(ラパログとも称される)を含む、ラパマイシンと構造的および機能的類似性を有する化合物であるラパマイシン関連化合物およびｍＴＯＲ活性を阻害する他のマクロライド化合物を含む。
【０５９１】
ラパマイシンは、ストレプトマイセス・ヒグロスコピクスにより産生される、式Ａで示される構造を有する既知マクロライド抗生物質である。
【化８】
2018538339.tif 000090
【０５９２】
他の適当なラパマイシンアナログは、エベロリムス(アフィニトール(登録商標))としても知られ、化学名(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ,２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｅ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１２−{(１Ｒ)−２−[(１Ｓ,３Ｒ,４Ｒ)−４−(２−ヒドロキシエトキシ)−３−メトキシシクロヘキシル]−１−メチルエチル}−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３,２９,３５−ヘキサメチル−１１,３６−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−２,３,１０,１４,２０−ペンタオンを有するＲＡＤ００１、シロリムス(ラパマイシン、ＡＹ−２２９８９)、４０−[３−ヒドロキシ−２−(ヒドロキシメチル)−２−メチルプロパノエート]−ラパマイシン(テムシロリムスまたはＣＣＩ−７７９とも称される)およびリダフォロリムス(ＡＰ−２３５７３／ＭＫ−８６６９)を含むが、これらに限定されない。アロステリックｍＴＯＲ阻害剤の他の例は、引用により内容を本明細書に包含させるＵＳ２００５／０１０１６２４号に記載のゾタロリムス(ＡＢＴ５７８)およびウミロリムスを含む。他の適当なｍＴＯＲ阻害剤は、引用によりその全体を本明細書に包含させる、２０１５年３月１３日出願の国際公開ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ９４６〜９６４に記載される。低い、免疫増強量のｍＴＯＲ阻害剤、低用量のｍＴＯＲ阻害剤と関連するｍＴＯＲ阻害の適当なレベル、ｍＴＯＲ阻害レベルを検出する方法およびその適当な医薬組成物は、引用によりその全体を本明細書に包含させる、２０１５年３月１３日出願の国際公開ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ９３６〜９４５および９６５〜１００３に記載される。
【０５９３】
医薬組成物
本発明の医薬組成物は、ここに記載するＣＡＲ発現細胞、例えば、複数のＣＡＲ発現細胞を、１以上の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または添加物と組み合わせて含み得る。このような組成物は、中性緩衝化食塩水、リン酸緩衝化食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；グリシンなどのポリペプチドまたはアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)；および防腐剤を含み得る。本発明の組成物は、ある態様で静脈内投与用に製剤される。
【０５９４】
本発明の医薬組成物を、処置(または予防)する疾患に適する方法で投与し得る。投与の量および頻度は患者状態ならびに患者疾患のタイプおよび重症度などの因子により決定するが、適切な投与量は治験により決定され得る。
【０５９５】
ある実施態様において、医薬組成物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製コンピテントレンチウイルス(ＲＣＬ)、ｐ２４、ＶＳＶ−Ｇ核酸、ＨＩＶ  ｇａｇ、残存抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ、マウス抗体、貯蔵ヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地成分、ベクターパッケージング細胞またはプラスミド成分、細菌および真菌からなる群から選択される、汚染物が実質的にない、例えば、検出可能レベルでない。ある実施態様において、細菌は、アルガリゲネス・フェカリス、カンジダ・アルビカンス、エシェリキア・コリ、ヘモフィルス・インフルエンザエ、ナイセリア・メニンギティディス、シュードモナス・エルジノーサ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエおよびストレプトコッカス・ピオゲネスＡ群からなる群から選択される少なくとも一つである。
【０５９６】
処置方法
“免疫学的有効量”、“効果的用量”、“抗癌有効量”、“癌阻害有効量”または“治療量”をいうとき、本発明の組成物の投与すべき厳密な量は、患者(対象)の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度および状態の個々の差異を考慮して、医師により決定され得る。
【０５９７】
対象に投与すべき上記処置の投与量は、処置する状態および処置のレシピエントの厳密な性質により変わる。ヒト投与のための投与量のスケーリングは、当分野で認められる実務により決定され得る。キャンパスの用量は、例えば、一般に成人患者で１〜約１００mg範囲であり、通常１〜３０日の期間連日投与される。好ましい一日用量は１日あたり１〜１０mgであるが、ある場合、最大１日４０mgまでの高用量を使用し得る(米国特許６,１２０,７６６号に記載)。
【０５９８】
ここに記載する組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、点滴、インプラントまたは移植を含む、何れかの慣用の方式により実施され得る。ここに記載する組成物は、患者に経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内(ｉ.ｖ.)または腹腔内注射により投与され得る。ある実施態様において、例えば、ＣＡＲ発現細胞および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤を含む、ここに記載する組成物は、患者に皮内または皮下注射により投与される。ある実施態様において、例えば、ＣＡＲ発現細胞および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤を含む、ここに記載する組成物は、ｉ.ｖ.注射により投与される。例えば、ＣＡＲ発現細胞および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤を含む、ここに記載する組成物は、腫瘍、リンパ節または感染部位に直接注射され得る。
【０５９９】
一般にここに記載する免疫エフェクター細胞を含む医薬組成物を、１０４〜１０９細胞／kg体重、ある場合１０５〜１０６細胞／kg体重の、これらの範囲内の全整数値を含む、投与量で投与され得るということができる。免疫エフェクター細胞組成物は、これらの投与量で複数回投与してもよい。細胞を、免疫療法で一般に知られる点滴技法を使用して投与できる(例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988参照)。
【０６００】
ある態様において、活性化免疫エフェクター細胞を対象に投与し、次いで再び採血し(またはアフェレーシスを実施し)、本発明によりそこからの細胞を活性化し、これらの活性化および増大細胞を患者に再注入することが望ましいことがある。この工程を、数週毎に複数回実施し得る。ある態様において、細胞は、１０cc〜４００ccの採血血液から活性化させ得る。ある態様において、細胞を、２０cc、３０cc、４０cc、５０cc、６０cc、７０cc、８０cc、９０ccまたは１００ccの採血血液から活性化させる。
【０６０１】
特定の例示的態様において、対象を白血球除去に付し、ここで、白血球を採取し、エクスビボで富化または枯渇して、目的の細胞、例えば、Ｔ細胞を選択および／または単離する。これらのＴ細胞単離物を、１以上の本発明のＣＡＲ構築物が導入され、それにより、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞が産生されるように、当分野で知られる方法により増大し、処置し得る。これを必要とする対象は、その後、高用量化学療法と続く末梢血幹細胞移植の標準処置に付され得る。ある態様において、移植の後または同時に、対象は、本発明の増大ＣＡＲ発現細胞の点滴を受け得る。付加的態様において、増大細胞を手術の前または後に投与する。
【０６０２】
ある実施態様において、ＣＡＲを、例えば、インビトロ転写を使用して、免疫エフェクター細胞に導入し、対象は本発明のＣＡＲ発現細胞の最初の投与および本発明のＣＡＲ発現細胞のその後の投与を受け、ここで、１以上のその後の投与は、先の投与後１５日以内、例えば、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日または２日以内に投与する。ある実施態様において、本発明のＣＡＲ発現細胞の１を超える投与を、週あたり対象(例えば、ヒト)に投与し、例えば、本発明のＣＡＲ発現細胞の２、３または４投与量が週あたり投与される。ある実施態様において、対象(例えば、ヒト対象)は、週あたり１を超えるＣＡＲ発現細胞の投与を受け(例えば、週あたり２、３または４投与)(ここではサイクルとも称する)、続いて、１週ＣＡＲ発現細胞投与がなく、その後ＣＡＲ発現細胞の１以上のさらなる投与(例えば、週あたりＣＡＲ発現細胞の１を超える投与)が対象に投与される。他の実施態様において、対象(例えば、ヒト対象)は１を超えるサイクルのＣＡＲ発現細胞を受け、各サイクル間の期間は、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日または３日未満である。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞を、週あたり３回、隔日で投与し得る。ある実施態様において、本発明のＣＡＲ発現細胞を、少なくとも２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週またはそれ以上投与する。
【０６０３】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞(例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞)の用量は、約１×１０６、１.１×１０６、２×１０６、３.６×１０６、５×１０６、１×１０７、１.８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８または５×１０８細胞／kgを含む。ある実施態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞)の用量は、少なくとも約１×１０６、１.１×１０６、２×１０６、３.６×１０６、５×１０６、１×１０７、１.８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８または５×１０８細胞／kgを含む。ある実施態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞)の用量は、最大約１×１０６、１.１×１０６、２×１０６、３.６×１０６、５×１０６、１×１０７、１.８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８または５×１０８細胞／kgを含む。ある実施態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞)の用量は、約１.１×１０６〜１.８×１０７細胞／kgを含む。ある実施態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞)の用量は、約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９または５×１０９細胞を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞)の用量は、少なくとも約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９または５×１０９細胞を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞)の用量は、最大約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９または５×１０９細胞を含む。
【０６０４】
ある実施態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞)の用量は、最大約１×１０７、１.５×１０７、２×１０７、２.５×１０７、３×１０７、３.５×１０７、４×１０７、５×１０７、１×１０８、１.５×１０８、２×１０８、２.５×１０８、３×１０８、３.５×１０８、４×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９または５×１０９細胞を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、メソテリンＣＡＲ発現細胞)の用量は、最大約１〜３×１０７〜１〜３×１０８を含む。ある実施態様において、対象に、約１〜３×１０７のメソテリンＣＡＲ発現細胞を投与する。他の実施態様において、対象に、約１〜３×１０８のメソテリンＣＡＲ発現細胞を投与する。
【０６０５】
ある態様において、メソテリンＣＡＲ発現細胞は、レンチウイルスなどのレンチウイルスウイルスベクターを使用して産生される。この方法で産生されたＣＡＲ発現細胞は、安定なＣＡＲ発現を有する。
【０６０６】
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞は、形質導入後４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、ＣＡＲベクターを一過性に発現する。ＣＡＲの一過性発現は、ＲＮＡ  ＣＡＲベクター送達により行われ得る。ある態様において、ＣＡＲ  ＲＮＡは、エレクトロポレーションによりＴ細胞に形質導入される。
【０６０７】
一過性発現ＣＡＲ発現細胞(特にＣＡＲ発現細胞担持マウスｓｃＦｖを備える)を使用して処置される患者で生じる可能性のある問題は、複数処置後のアナフィラキシーである。
【０６０８】
この理論に拘束されることを意図しないが、このようなアナフィラキシー応答は、液性抗ＣＡＲ応答、すなわち、抗ＩｇＥアイソタイプを有する抗ＣＡＲ抗体を発症する患者が原因であると考えられる。患者の抗体産生細胞は、ＩｇＧアイソタイプ(アナフィラキシーの原因ではない)からＩｇＥアイソタイプに、抗原暴露の１０〜１４日中断があったときクラススイッチを受けると考えられる。
【０６０９】
患者が一過性ＣＡＲ治療(例えばＲＮＡ形質導入により産生されるもの)の間に抗ＣＡＲ抗体応答を生ずる高いリスクにあるならば、ＣＡＲ発現細胞点滴中断は、１０〜１４日を超えて継続してはならない。
【０６１０】
ヒト(マウスのかわりに)ｓｃＦｖを備えたＣＡＲの使用は、抗ＣＡＲ応答を有する患者の可能性および強度を軽減させ得る。
【０６１１】
ＰＤ−Ｌ１阻害剤、例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子の投与量および治療レジメンは、当業者により決定され得る。
【０６１２】
ＰＤ−Ｌ１阻害剤が抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子である、ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、注射(例えば、皮下または静脈内)により、約１〜３０mg／kg、例えば、約５〜２５mg／kg、約１０〜２０mg／kg、約１〜５mg／kgまたは約３mg／kgの用量で投与される。投与スケジュールは、例えば、週１回〜２週、３週または４週に１回まで変化し得る。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、約１０〜２０mg／kgの用量で隔週投与される。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、単独または組み合わせで(例えば、抗ＬＡＧ−３抗体分子と組み合わせで)、約５mg／kgまたはそれ未満；約４mg／kgまたはそれ未満；約３mg／kgまたはそれ未満；約２mg／kgまたはそれ未満；約１mg／kgまたはそれ未満の用量で、隔週投与される。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、１〜５mg／kg隔週；１〜４mg／kg隔週、１〜３mg／kg隔週または１〜２mg／kg隔週の用量で投与される。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、単独または組み合わせで(例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子と組み合わせで)１〜５mg／kg隔週；１〜４mg／kg隔週、１〜３mg／kg隔週または１〜２mg／kg隔週の用量で投与される。
【０６１３】
抗体分子は当分野で知られる多様な方法により投与され得るが、多くの治療適用について、好ましい投与経路／方式は静脈内注射または点滴である。例えば、抗体分子は、静脈内点滴により、２０mg／分を超える速度で、例えば、２０〜４０mg／分および一般に４０mg／分以上の速度で約３５〜４４０mg／ｍ２、一般に約７０〜３１０mg／ｍ２およびより一般に、約１１０〜１３０mg／ｍ２の用量に到達させ得る。ある実施態様において、約１１０〜１３０mg／ｍ２の点滴速度は、約３mg／kgのレベルを達成する。他の実施態様において、抗体分子を、１０mg／分未満、例えば、５mg／分以下の速度での静脈内点滴により投与し、約１〜１００mg／ｍ２、例えば、約５〜５０mg／ｍ２、約７〜２５mg／ｍ２または約１０mg／ｍ２の用量に到達させる。ある実施態様において、抗体を、３０分の時間にわたり点滴する。抗体分子を、１０mg／分未満、例えば、５mg／分以下の速度での静脈内点滴により投与し、約１〜１００mg／ｍ２、好ましくは約５〜５０mg／ｍ２、約７〜２５mg／ｍ２およびより好ましくは、約１０mg／ｍ２の用量に到達させ得る。投与量値は、軽減される状態のタイプおよび重症度により変わり得ることは注意すべきである。あらゆる特定の対象について、特定の投与量レジメンは経時的に個々の要求および組成物を投与するまたは監督する人の専門的判断により調節すべきであり、ここに示す投与量範囲は単なる例であり、本願組成物の範囲または実施を制限することを意図しないことは理解されるべきである。
【実施例】
【０６１４】
本発明を、さらに次の実施例の記載により詳細に説明する。これら実施例は説明のみを目的として提供され、特に断らない限り限定を意図しない。それ故に、本発明は、以下の実施例により限定されると如何なる意味においても解釈されるべきではなく、むしろ、ここに提供される教示の結果として明らかになるすべての変更が包含されると解釈すべきである。
【０６１５】
実施例１：膵臓癌におけるＭＳＬＮ  ＣＡＲＴおよびＰＤ−Ｌ１阻害剤組み合わせ治療の有効性
ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせたメソテリンＣＡＲＴ治療の抗腫瘍活性を、膵臓癌マウスモデル、ＰＡＮＣ０２.０３で評価した。ＰＡＮＣ０２.０３マウスモデルにおけるメソテリンＣＡＲ治療での先の試験は、メソテリンＣＡＲ  Ｔ細胞が腫瘍で増大および浸潤することを示した。これらの腫瘍浸潤性ＣＡＲ  Ｔ細胞のフローサイトメトリーによる分析は、ＰＤ−１(図１Ａ参照)およびＰＤ−Ｌ１発現を確認した。さらに、ＰＡＮ０２.０３癌細胞は、インビトロおよびインビボ両方で試験したとき、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を発現した(図１Ｂ参照)。
メソテリンＣＡＲ  Ｔ細胞とＰＤＬ１阻害の相乗性の試験のための続く実験において、５×１０６  ＰＡＮＣ０２.０３膵臓腫瘍細胞を、免疫無防備状態ＮＳＧマウスの脇腹に皮下にインプラントした。ＰＡＮＣ０２.０３マウスを、ＣＡＲＴ治療単独、ＰＤ−Ｌ１治療単独またはＣＡＲＴとＰＤ−Ｌ１阻害剤治療の組み合わせで処置した。ＰＤ−Ｌ１阻害剤治療のＣＡＲＴ治療に対する投与順の抗腫瘍活性に対する影響を、下記実験で評価した。
【０６１６】
ＣＡＲＴ治療前の抗体処置
Ｔ細胞を、レンチウイルス形質導入により、Ｍ５メソテリンＣＡＲ構築物(例えば、表２の配列番号６７)を発現するように改変した。対照ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＣＤ１９  ＣＡＲを発現するよう改変した。マウスを９群に分け、下記投与量および処置スケジュールに従い処置した。４×１０６  ＣＡＲＴ細胞の２用量を、腫瘍インプラント後２３日および２８日目に静脈内注射した。ＰＤ−Ｌ１抗体を、腫瘍インプラント後２１日目、例えば、ＣＡＲＴ治療４８時間前に腹腔内注射した。
【表８２】
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マウスを週２回処置投与前に体重測定およびカリパス測定し、腫瘍増殖をモニターした。投与後、マウスを週２回カリパス測定した。試験の最後に、骨髄(ＢＭ)、腫瘍および脾臓をＦＡＣ分析のために採取する。
図２に示す結果は、ｍｅｓｏＣＡＲＴとＰＤ−Ｌ１阻害剤の組み合わせ治療が、一過性腫瘍退縮とその後の腫瘍静止を示す。組み合わせ処置は、ｍｅｓｏＣＡＲＴ単独処置より、腫瘍進行阻止に効果的であることが示された。ＣＤ１９  ＣＡＲＴ単独またはＰＤ−Ｌ１阻害剤との組み合わせでの処置は、腫瘍進行に効果がなかった。
【０６１７】
ＣＡＲＴ治療後の抗体処置
次の実験において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤治療をメソテリンＣＡＲＴ治療後に投与した。４×１０６  Ｍ５  ＣＡＲＴ細胞を、腫瘍インプラント２１日後に投与した。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１抗体を、１０mg／kgで毎週ｉ.ｖ.投与し、第一用量をＣＡＲＴ投与２４時間後に投与した。
処置の腫瘍進行に対する効果を図３に示す。Ｍ５  ＣＡＲＴ治療とＰＤ−Ｌ１抗体処置の組み合わせは、僅かなかつ一過性抗腫瘍活性のみを示した。
２実験からのデータを合わせると、ＣＡＲＴ治療投与前のＰＤ−Ｌ１阻害剤が、より強固な抗腫瘍効果を示す。
【０６１８】
実施例２：癌患者におけるＰＤ−Ｌ１発現
４×１０６  Ｍ５メソテリンＣＡＲ陽性Ｔ細胞で処置したＮＳＧマウスからのＰＡＮＣ０２.０３腫瘍をさらに特徴付けるために、さらなる分析を実施した。ＰＡＮＣ０２.０３腫瘍サンプルを、Ｍ５メソテリンＣＡＲＴで処置したマウスから３５日目に得た。腫瘍サンプルを腫瘍におけるメソテリンおよびＰＤ−Ｌ１発現ならびにＣＡＲＴ浸潤およびアポトーシスの分析のために、調製し、連続的切片染色を行った。メソテリン抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体(#SP263, Ventana Medical Systems, Tuscon, AZ)、抗ヒトＣＤ３抗体(#2GV6, Ventana Medical Systems)および抗ＣＣ３抗体(アポトーシスマーカー)(#9661, Cell Signaling Technology, Danvers, MA)を、例えば、免疫組織化学当分野で知られる技法を使用する、免疫組織化学染色に使用した。メソテリンｍＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーション(#413101, ACDBio, Hayward, CA)も実施した。
図４は、腫瘍におけるメソテリン発現およびＰＤ−Ｌ１発現を示す。腫瘍は、メソテリンタンパク質発現レベルと逆相関しているように見える、高ＰＤ−Ｌ１染色領域を有する。図５は、ＣＡＲ  Ｔ細胞浸潤(ＣＤ３染色サンプル、上左パネル)、アポトーシス(ＣＣ３染色サンプル、下左パネル)、ＰＤ−Ｌ１発現(上右パネル)およびメソテリンｍＲＮＡ発現(下右パネル)を示す。この発現分析の結果は、ＰＤ−Ｌ１発現が腫瘍領域で高く、メソテリンタンパク質およびｍＲＮＡ発現が低く(図４)、さらに高いＣＡＲ  Ｔ細胞浸潤(図５)を示す。これらのＰＤ−Ｌ１高メソテリン低細胞は、類紡錘または間葉形態により特徴付けられ、上皮性間葉形質転換により生じた可能性がある。この過程は、膵臓腫瘍で詳しく報告されており、免疫抑制的腫瘍微小環境および疾患進行に寄与する可能性がある。それ故に、これらの結果は、メソテリンＣＡＲＴおよびＰＤ−Ｌ１阻害剤の組み合わせ処置が、一方でメソテリン発現腫瘍細胞を標的とし、致死させ、他方で、例えば、癌細胞および腫瘍間質細胞からの免疫抑制性シグナルを阻害して、メソテリン発現腫瘍における有効性増強に相乗効果を有することを示唆する。
【０６１９】
実施例３：低用量ＲＡＤ００１は、細胞培養モデルにおけるＣＡＲＴ増殖を刺激する
インビトロでのＣＡＲ  Ｔ細胞増殖に対する低用量のＲＡＤ００１の効果を、ＣＡＲＴ発現細胞と標的細胞を、種々の濃度のＲＡＤ００１の存在下、共培養することにより評価した。
【０６２０】
材料および方法
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の産生
ヒト化、抗ヒトＣＤ１９  ＣＡＲ(ｈｕＣＡＲＴ１９)レンチウイルス導入ベクターを、ＶＳＶｇ偽型レンチウイルス粒子に封入されたゲノム材料の産生に使用した。ヒト化抗ヒトＣＤ１９  ＣＡＲ(ｈｕＣＡＲＴ１９)のアミノ酸およびヌクレオチド配列は、２０１４年３月１５日出願のＰＣＴ公開ＷＯ２０１４／１５３２７０号に記載されるＣＡＲ  １、ＩＤ  １０４８７５であり、そこで配列番号８５および３１と指定されている。
レンチウイルス導入ベクターＤＮＡを、リポフェクタミン試薬と組み合わせて３パッケージング成分ＶＳＶｇ  ｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｒｅｖと混合し、レンチ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトする。培地を２４時間および３０時間後に交換し、ウイルス含有培地を採取し、濾過し、−８０℃で保存する。ＣＡＲＴを、健常ドナー血液またはleukopakの陰性磁気選択から得た新鮮または凍結ナイーブＴ細胞の形質導入により得る。Ｔ細胞を２４時間抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズとのインキュベーションにより活性化し、その後、ウイルス上清または濃縮ウイルス(各ＭＯＩ＝２または１０)を培養物に添加する。修飾Ｔ細胞を約１０日増大させる。細胞形質導入のパーセンテージ(細胞表面上のＣＡＲを表す)およびＣＡＲ発現レベル(相対的蛍光強度、Geo Mean)を、７〜９日にフローサイトメトリー分析により決定する。増殖速度減速および約３５０fLに近づくＴ細胞サイズの組み合わせが、後の分析のために凍結保存するＴ細胞の状態を決定する。
【０６２１】
ＣＡＲＴの増殖評価
ＣＡＲＴの機能性を評価するために、Ｔ細胞を解凍し、計数し、生存能をCellometerにより評価する。各培養物におけるＣＡＲ陽性細胞数を、非形質導入Ｔ細胞(ＵＴＤ)を使用して正規化する。ＣＡＲＴに対するＲＡＤ００１の影響を、５０nMから開始するＲＡＤ００１の力価測定により試験した。全共培養実験に使用した標的細胞株は、ＣＤ１９を発現し、ルシフェラーゼ発現のために形質導入されている、ヒトプレＢ細胞急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)細胞株、Ｎａｌｍ−６である。
ＣＡＲＴの増殖を測定するために、Ｔ細胞を、標的細胞と１：１比で培養する。アッセイを４日行い、その時点で細胞をＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＡＲ発現について染色する。Ｔ細胞数を、参照としてカウンティングビーズを使用するフローサイトメトリーにより評価する。
【０６２２】
結果
ＣＡＲＴ細胞の増殖能を、４日共培養アッセイで試験した。多数のＣＡＲ陽性ＣＤ３陽性Ｔ細胞(濃色バー)および総ＣＤ３陽性Ｔ細胞(薄色バー)を、ＣＡＲ遺伝子導入および非形質導入Ｔ細胞をＮａｌｍ−６と培養後に評価した(図６)。ｈｕＣＡＲＴ１９細胞は、０.０１６nMより少ないＲＡＤ００１の存在下で培養したとき増大し、高濃度の該化合物存在下、低度に増大した。重要なことに、０.００３２nMおよび０.０１６nM両方のＲＡＤ００１で、増殖はＲＡＤ００１添加せずに観察されたものより高かった。非形質導入Ｔ細胞(ＵＴＤ)は検出可能な増大を示さなかった。
【０６２３】
実施例４：低用量ＲＡＤ００１は、インビボでＣＡＲＴ増大を刺激する
本実施例は、種々の濃度のＲＡＤ００１存在下、ｈｕＣＡＲ１９細胞がインビボで増殖する能力を評価する。
材料および方法：
ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ細胞：ＮＡＬＭ６ヒト急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)細胞株を、再発性ＡＬＬを有する患者の末梢血から展開した。次いで、細胞をホタルルシフェラーゼで標識した。これらの懸濁液細胞を１０％熱不活性化胎仔ウシ血清添加ＲＰＭＩで培養した。
マウス：６週齢ＮＳＧ(ＮＯＤ.Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ)マウスを、Jackson Laboratory(stock number 005557)から得た。で
腫瘍インプラント：ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ細胞を、インビトロで１０％熱不活性化胎仔ウシ血清添加ＲＰＭＩで増殖および増大させた。次いで細胞を１５mlコニカルチューブに移し、冷無菌ＰＢＳで２回洗浄した。次いでＮＡＬＭ６−ｌｕｃ細胞を計数し、ＰＢＳ１mlあたり１０×１０６細胞濃度で再懸濁した。細胞を氷に乗せ、直ぐに(１時間以内に)マウスにインプラントした。ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ細胞を、１００μl容積で、マウスあたり計１×１０６細胞で尾静脈から静脈内注射した。
ＣＡＲ  Ｔ細胞投与：マウスに、腫瘍インプラント７日後５×１０６  ＣＡＲ  Ｔ細胞を投与した。細胞は、３７℃水浴で一部解凍され、次いで、細胞含有チューブへの１mlの冷無菌ＰＢＳ添加により完全に解凍された。解凍細胞を、１５mlファルコンチューブに移し、１０mlの最終容積にＰＢＳで調節した。細胞を各１０００rpmで１０分で２回洗浄し、次いで、血球計算板で計数した。次いで、Ｔ細胞を冷ＰＢＳ１mlあたり５０×１０６  ＣＡＲ  Ｔ細胞濃度で再懸濁し、マウスに投与するまで氷上に維持した。マウスに、１００μlのＣＡＲ  Ｔ細胞を、マウスあたり５×１０６  ＣＡＲ  Ｔ細胞用量で、尾静脈から静脈内注射した。群あたり８マウスを、１００μlのＰＢＳ単独(ＰＢＳ)またはヒト化ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した。
ＲＡＤ００１投与：１mg  ＲＡＤ００１に等しい５０mg濃縮マイクロエマルジョンを製剤し、次いで、Ｄ５Ｗ(デキストロース５％水溶液)に投与時に再懸濁した。マウスに、２００μlの所望の用量のＲＡＤ００１を連日経口投与した(強制経口投与)。
ＰＫ分析：マウスに、腫瘍インプラント７日後に開始して、連日ＲＡＤ００１を投与した。投与群は次のとおりである。０.３mg／kg、１mg／kg、３mg／kgおよび１０mg／kg。マウスは、最初の投与後０日目および１４日目ならびにＲＡＤ００１の最後の投与後下記の１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間および２４時間の時点でＰＫ分析のために採血した。
【０６２４】
結果：
ＲＡＤ００１の増大および薬物動態を、ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ腫瘍を有するＮＳＧマウスで試験した。ＲＡＤ００１単独の連日経口投与は、ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ腫瘍増殖に影響を有しなかった(図７)。ＲＡＤ００１の薬物動態分析は、腫瘍担持マウス血液で相当安定であることを示した(図８Ａおよび８Ｂ)。０日目および１４日目両方のＰＫ分析は、血中ＲＡＤ００１濃度が、試験した最低用量(０.３mg／kg)投与２４時間後でさえ、１０nmを超えることを示す。
これらの用量に基づき、ｈｕＣＡＲ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、これらの細胞の増殖能を決定するために、ＲＡＤ００１と共にまたは伴わずに投与した。使用した最高用量は、２４時間投与後の血液中のＲＡＤ００１のレベルに基づき、３mg／kgであった。ＲＡＤ００１濃度が、ＲＡＤ００１最終投与２４時間後１０nMを超えていたため、いくつかの低用量のＲＡＤ００１を、ＣＡＲ  Ｔ細胞でのインビボ試験に用いた。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、連日経口ＲＡＤ００１投与開始１日前にＩＶ投与した。マウスを、Ｔ細胞増についてＦＡＣＳでモニターした。
ＲＡＤ００１の最低用量は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖増強を示した(図９Ａおよび９Ｂ)。この増殖増強は、ＣＤ８＋ＣＡＲ  Ｔ細胞よりＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞で顕著かつ長期である。しかしながら、ＣＤ８＋ＣＡＲ  Ｔ細胞で、増殖増強はＣＡＲ  Ｔ細胞後の初期時点で見ることができる。ある実施態様において、ＲＮＡ  ＣＡＲＴ細胞も、チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用した。
【０６２５】
均等物
ここに引用する全特許、特許出願および刊行物の各々のおよび全ての発明を、引用によりその全体を本明細書に包含させる。本発明は特定の態様を参照して開示されているが、本発明の他の態様およびバリエーションが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく当業者により考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、全てのこのような態様および均等なバリエーションを含むと解釈されることが意図される。
【図１Ａ】
2018538339.tif 000092
【図１Ｂ】
2018538339.tif 000093
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2018538339.tif 000099
【図８】
2018538339.tif 000100
【図９】
2018538339.tif 000101
【配列表】
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【国際調査報告】
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2018538339.tif 000103
2018538339.tif 000104
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