(57)【要約】  認知機能を高めるため、および不安症に関連する障害を治療するためのＨ３Ｋ９ｍｅ３調節の使用を提供する。対象に治療的有効量のＥＴＰ６９の類似体などのＳＵＶ３９Ｈ１阻害剤を含む組成物を投与する。治療的有効量は、加齢における認知機能障害および加齢性疾患を治療するのに有効である。【選択図】図１
2018516940.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
認知障害を有する動物対象を選択する工程と、
前記動物対象に急性治療のための単回用量および慢性治療のための反復用量を含む治療的有効量のＳＵＶ３９Ｈ１阻害化合物を投与する工程と
を含む、それを必要とする動物対象における認知障害を好転させる方法。
【請求項２】
記憶機能の喪失を有する患者を選択する工程と、
前記患者に急性治療のための単回用量および慢性治療のための反復用量を含む治療的有効量のＳＵＶ３９Ｈ１阻害化合物を医薬的認知機能促進法と共に投与する工程と
を含む、それを必要とする患者における認知障害を好転させる方法。
【請求項３】
前記認知機能促進法はコリンエステラーゼ阻害剤である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記コリンエステラーゼ阻害剤は、タクリン、ドネペジル、リバスチグミンおよびガランタミンを含む群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記認知機能促進法はＮＭＤＡ拮抗薬またはＮＭＤＡ作動薬である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記認知機能促進法はアンパカインである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記認知機能促進法はＢＺＤ／ＧＡＢＡ受容体複合体調節薬である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記認知機能促進法はセロトニン拮抗薬である、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記認知機能促進法はニコチン性クラスの化合物である、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記認知機能促進法はムスカリン性クラスの化合物である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記認知機能促進法はＰＤＥ阻害薬である、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記認知機能促進法はＧタンパク質クラスの化合物である、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記認知機能促進法はチャネル調節薬である、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記認知機能促進法は免疫治療薬クラスの化合物である、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記認知機能促進法は抗アミロイドまたはアミロイド低下薬である、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記認知機能促進法はスタチンまたはＰＰＡＲＳ調節薬である、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
記憶の向上を必要とする対象を選択する工程と、
前記対象に治療的有効量のＳＵＶ３９Ｈ１阻害化合物をライフスタイルによる認知機能促進法と共に投与する工程と
を含む、それを必要とする対象における認知を向上させる方法。
【請求項１８】
前記認知機能促進法は身体的運動である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記認知機能促進法は精神的運動である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記認知機能促進法は栄養補助食品である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記栄養補助食品は抗酸化薬である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記栄養補助食品はミトコンドリア機能賦活薬である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記栄養補助食品はカフェインである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記栄養補助食品はオメガ−３である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記栄養補助食品はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
認知障害の兆候を有する生きている動物対象を選択する工程と、
そのような生きている動物対象に治療的有効量のＳＵＶ３９Ｈ１阻害化合物を投与する工程と
を含む、ヒトを含む生きている動物対象の認知機能障害の治療、予防または軽減方法。
【請求項２７】
不安症に関連する障害を有する動物対象を選択する工程と、
前記動物対象に急性治療のための単回用量および慢性治療のための反復用量を含む治療的有効量のＳＵＶ３９Ｈ１阻害化合物を投与する工程と
を含む、それを必要とする動物対象における不安症に関連する障害の治療および軽減方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１５年６月８日に出願された米国仮出願第６２／１７２，６９０号の利益を主張するものであり、この内容は開示の完全性のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載）
本発明は、ＮＩＨのアメリカ国立老化研究所によって与えられた認可番号ＡＧ０１２６９４およびＡＧ０００５３８の下で政府の支援によりなされたものである。政府は本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
本発明の実施形態は、老化における認知機能障害、加齢性疾患および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）依存性疾患を治療することに関する。より具体的には、本発明は、単独または他の認知機能促進法と組み合わせたＥＴＰ６９（Ｒａｃ−（３Ｓ，６Ｓ，７Ｓ，８ａＳ）−６−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−２，３，７−トリメチル−１，４−ジオキソヘキサヒドロ−６Ｈ−３，８ａ−エピジチオピロロ［１，２−ａ］ピラジン−７−カルボニトリル）と呼ばれるＳＵＶ３９Ｈ１阻害剤の投与により認知機能障害を治療することに関する。
【背景技術】
【０００４】
エピジェネティックな調節不全は加齢性記憶障害のいくつかの態様に寄与していることが知られている。ここ数年の間に、多くの研究により加齢においてヒストンメチル化状態の変化が確認されている。ヒストンテールのメチル化は典型的にＨ３Ｋ４、Ｈ３Ｋ９、Ｈ３Ｋ２７、Ｈ３Ｋ３６、Ｈ３Ｋ７９およびＨ４Ｋ２０などの特定のリジン残基で起こり、転写を活性化または抑制することができる。特に、Ｈ３Ｋ９のトリメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）は重要な抑制ヒストンマークであり、遺伝子サイレンシングに関与している。Ｈ３Ｋ９ｍｅ３の確立は、中心周囲ヘテロクロマチンにおいてＨ３Ｋ９トリメチル化を調節するヒストンメチル基転移酵素ＳＵＶ３９Ｈ１の活性に依存している。
【０００５】
Ｈ３Ｋ９メチル化の変化は持続的血管炎症、糖尿病およびメタボリックメモリーなどのいくつかの加齢性変化の根底にあるエピジェネティックな機序であることが示唆されているが、脳におけるヒストンリジンメチル化の調節に対する加齢の直接的な影響は過去に探求されたことがない。記憶および認知機能に対するＳＵＶ３９Ｈ１阻害およびＨ３Ｋ９ｍｅ３の対応する下方制御の効果に直接取り組んだ研究も存在していない。従って、ヒストンメチル化に寄与する酵素の機能を調節するメチル基転移酵素およびメチル基分解酵素の小分子阻害剤の開発の最近の進歩は加齢性障害を改善するための強力な手段になり得る。
【０００６】
認知機能障害、例えば加齢に関連する認知障害、加齢性疾患およびアルツハイマー病のための治療法および治療レジメンを見つけることが緊急に求められている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の１つ以上の実施形態は、加齢における認知機能を向上させるため、および加齢性疾患、例えば認知症および脳および神経機能に関連する他の障害の治療のためのＨ３Ｋ９ｍｅ３調節の使用に関する。
【０００８】
いくつかの最近の研究からヒストンメチル基転移酵素およびメチル基分解酵素が加齢および寿命に関与していることが分かっている。メチル基転移酵素は特定のゲノム座のヒストンメチル化を触媒する。それにも関わらず、ヒストンメチル化が加齢における学習および記憶に寄与する方法は探究されたことがない。Ｈ３Ｋ９のトリメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）は重要な抑制ヒストンマークであり、典型的に遺伝子サイレンシングに関与している。本発明の実施形態は、ヒストンＨ３Ｋ９ｍｅ３およびそのヒストンメチル基転移酵素（ＳＵＶ３９Ｈ１）に関する海馬の記憶機能を媒介する重要な役割を初めて究明する。新規かつ選択的阻害剤を用いるＳＵＶ３９Ｈ１の薬理学的阻害は、老齢動物の海馬におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３レベルを減少させ、かつ物体位置記憶課題、恐怖条件付け課題および複雑な空間環境学習課題におけるパフォーマンスを向上させた。ＳＵＶ３９Ｈ１の阻害は、老齢動物の海馬においてマッシュルーム型スパイン以外の薄（ｔｈｉｎ）型および隆起（ｓｔｕｂｂｙ）型スパイン密度の増加を誘導し、かつスパイン表面におけるＧｌｕＲ１を含むＡＭＰＡ受容体レベル（長期増強（ＬＴＰ）の主要指標）を増加させた。
【０００９】
さらに、対照動物と比較して薬物治療した動物の海馬における総ＢＤＮＦタンパク質レベルに一致するＢＤＮＦ遺伝子プロモーター領域における変化も認められた。ＢＤＮＦはニューロトロフィンファミリーの主要メンバーであり、加齢とは別の気分障害、鬱病、双極性障害および神経精神病（統合失調症など）を含む広範囲の神経変性疾患に関与している。樹状突起の分枝、シナプスの強化（synaptic consolidation）およびＴｒｋＢシグナル伝達の強化などの各種プロセスにより、ＢＤＮＦは脳におけるニューロンの可塑性、ニューロンの健康および生存に寄与する。本明細書に示されているデータは、ＳＵＶ３９Ｈ１阻害が脳におけるＢＤＮＦ調節を媒介することを示している。従って、本化合物は加齢性認知障害に関連する疾患に加えて、鬱病、統合失調症、気分障害などを含むＢＤＮＦレベルが正常なパフォーマンスを維持するのに不十分である疾患において有用性を有し得る。同時にこれらのデータは、ＳＵＶ３９Ｈ１阻害および同時に生じるＨ３Ｋ９ｍｅ３による下方制御が海馬における遺伝子転写を媒介し、かつ海馬の記憶における年齢依存性障害を好転させると共に、限定されるものではないが上で言及したような他のＢＤＮＦ依存性疾患を好転させるのに有用であり得ることを実証している。
【００１０】
海馬に依存することが知られている物体位置記憶（ＯＬＭ）と呼ばれる空間記憶課題を使用して老齢動物におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３操作の効果を評価した。これを行って、ＥＴＰ６９治療が試行前対試行後投与パラダイムにおけるＯＬＭ課題のパフォーマンス正確性に差次的に影響を与えるか否かを決定した。ＯＬＭ課題のための試行前対試行後パラダイムは空間記憶形成の２つの異なる構成要素の試験を可能にする。具体的には、訓練前の薬物投与は記憶の獲得および想起を評価し、訓練後の薬物投与は記憶の固定および想起を対象にした。獲得段階の約３０分前（試行前）または獲得直後（試行後）のいずれかで投与した１０ｍｇ／ｋｇの本薬物の腹膜内注射（「ｉ．ｐ．」）によりＯＬＭ課題におけるパフォーマンスが向上することが分かった。
【００１１】
学習および記憶に対する本化合物の効果についての別の試験は、教師なし学習課題（ＵＳＬ）と呼ばれる課題を使用した。ＵＳＬ課題は、マウスに指定された期間にわたって４区画環境を自由に探索させる行動パラダイムである。この時間における全体的活動および試験アリーナの探索の減少を学習および短期記憶の尺度とみなす。２つの群においてこの減少が同様の割合で起きれば、これは短期学習および記憶において有意差がないことを示す。本発明らは、ＥＴＰ６９（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で治療した動物が治療から２４時間後に馴化／探索の有意な減少（移動距離で測定した場合）を示すことを見出した。一元配置ＡＮＯＶＡにより有意な群間差（Ｆ３，１９＝４．０５、ｐ＜０．０５）が認められ、事後検定によりＥＴＰ６９で治療した動物における１日目のパフォーマンスと２日目のパフォーマンスとにおける差が確認されたが（ｐ＜０．０５）、年齢適合対照群では確認されなかった。
【００１２】
文脈的恐怖条件付け試験を用いる別の試験では、本化合物は海馬依存性の学習および記憶の向上において有効であった。本発明者らは、ＥＴＰ６９で治療した老齢動物（ｎ＝７／群）が老齢対照と比較して課題におけるパフォーマンスの向上を示すことを見出した（ｐ≦０．０１）。
【００１３】
全体として、これらの行動データは、一連の試験にわたってＥＴＰ６９投与が海馬依存性の学習および記憶を向上させることを示している。このデータは記憶および認知パフォーマンスを測定する他の課題もＥＴＰ６９の投与によって良い影響を受けることができることも示唆している。
【００１４】
ＯＬＭ、恐怖条件付けおよびＵＳＬは全て海馬特異的課題であるため、老齢動物から得た海馬組織試料において薬物治療後の海馬におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３の総レベルも試験した。その結果から、薬物治療した動物の海馬から得られたヒストン抽出物において薬物治療の有意な効果が認められた。ｔ検定分析から、ＥＴＰ６９で治療した動物におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３レベルの低下が認められた（試行前、ｐ＜０．０５）。
【００１５】
本発明の実施形態は、記憶および認知機能の向上におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３の役割の最初の証拠を提供し、かつこのヒストンメチル化マークを薬理学的介入によって好転させることができることを示す。本研究は、ヒストンメチル化を調節する酵素を操作することによって対象のクロマチン状態を変えて老齢脳における記憶機能を回復させることができるという証拠も提供する。最後に、本化合物を単独または様々なライフスタイルまたは薬理学的介入と共に使用して認知パフォーマンスを向上させることができる。認知機能は、記憶（作業記憶およびエピソード記憶を含む）、学習、実行機能、注意力、処理速度および全般的認知機能（日常生活動作など）などの細かい領域に分けてそれらを含んでもよい。組み合わせ介入を用いる手法はいずれかの介入単独の場合よりも認知を向上させることができる。
【００１６】
本発明の上記および他の態様、特徴および利点は以下の図面と共に示されている以下のそのより特定の説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＥＴＰ６９（Ｒａｃ−（３Ｓ，６Ｓ，７Ｓ，８ａＳ）−６−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−２，３，７−トリメチル−１，４−ジオキソヘキサヒドロ−６Ｈ−３，８ａ−エピジチオピロロ［１，２−ａ］ピラジン−７−カルボニトリル）の構造を示す。
【図２】マウスにおける新規場所位置課題において獲得段階の３０分前に投与した１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）の本薬物の効果のグラフ表示である。
【図３】媒体または１０ｍｇ／ｋｇのＥＴＰ６９のいずれかで治療したマウス間の探索における差を示すＯＬＭ試験の結果のグラフ表示である。
【図４】図４Ａ〜図４Ｂは老齢マウスにおける新規物体位置課題において獲得段階の３０分前（試行前）または獲得直後（試行後）のいずれかで投与した１０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ）の本薬物の効果のグラフ表示である。
【図５】図５Ａ〜図５Ｂは若齢マウスにおける新規物体位置課題において獲得段階の３０分前（試行前）または獲得直後（試行後）のいずれかで投与した１０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ）の本薬物の効果のグラフ表示である。
【図６Ａ】教師なし学習課題におけるＥＴＰ６９の効果のグラフ表示である。
【図６Ｂ】教師なし学習課題におけるＥＴＰ６９の効果のグラフ表示である。
【図７】恐怖条件付け課題におけるＥＴＰ６９の効果のグラフ表示である。
【図８Ａ】若齢マウス対老齢マウスの海馬抽出物におけるＨ３Ｋ９のトリメチル化レベルのグラフ表示である。
【図８Ｂ】若齢マウス対老齢マウスの小脳抽出物におけるＨ３Ｋ９のトリメチル化レベルのグラフ表示である（ｎ＝３／群、ｐ＜０．０５）。
【図８Ｃ】薬物投与から２４時間後の１０ｍｇ／ｋｇの本薬物（ｉ．ｐ．）または媒体を摂取した老齢マウスにおけるＨ３Ｋ９のトリメチル化レベルのグラフ表示である（ｎ＝７／群、＊ｐ＜０．０５）。
【図９】図９Ａ〜図９Ｃは、年齢適合対照と比較して（スチューデントの対応のないｔ検定）有意に異なり（＊ｐ＜０．０５）、年齢適合対照と比較して（スチューデントの対応のないｔ検定）有意に異なる（＊＊ｐ＜０．０１）、海馬ＣＡ１領域におけるスパイン数（薄型、マッシュルーム型および隆起型）に対するＥＴＰ６９治療の効果のグラフ表示である。
【図１０】海馬ＣＡ１におけるスパインに対するＥＴＰ６９治療の効果を示す代表的な画像を示す。
【図１１】（Ａ）サイズゲートを設定したシナプトソームを示す代表的な密度プロット、（Ｂ）ＥＴＰ６９治療後のシナプトソームのＰＳＤ−９５陽性亜集団における増加を示す代表的なヒストグラム、（Ｃ）老齢マウスから得られたシナプトソームにおけるＥＴＰ６９治療後のＰＳＤ−９５陽性イベントの増加、（Ｄ）サイズゲートを設定したシナプトソームにおける表面ＧｌｕＲ１およびＰＳＤ−９５発現を示す代表的な密度プロット、（Ｅ）老齢マウスから得られたシナプトソームにおけるＥＴＰ６９治療後のＧｌｕＲ１およびＰＳＤ−９５二重陽性イベントの増加（上右四分の一）（老齢対照マウスに対してｐ＝０．０５）、（Ｆ）サイズゲートを設定したシナプトソームにおけるｐＡｋｔおよびＰＳＤ−９５を示す代表的な密度プロット。ＥＴＰ６９治療後のｐＡｋｔおよびＰＳＤ−９５二重陽性イベントの増加（上右四分の一）、（Ｇ）老齢マウスから得られたシナプトソームにおけるＥＴＰ６９治療後のｐＡｋｔおよびＰＳＤ−９５二重陽性イベントの増加（老齢対照マウスに対してｐ＜０．０５）。
【図１２Ａ】ＯＬＭ課題における獲得段階の３０分前または直後に１０ｍｇ／ｋｇの本薬物（ｉ．ｐ．）を摂取した群においてＢＤＮＦタンパク質レベルが対照と比較して海馬において増加し（ｐ＜０．０１）、対照と比較して有意に異なることを示すグラフである。
【図１２Ｂ】ＢＤＮＦのエクソン１におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３レベルが対照と比較してＥＴＰ６９で治療した動物において有意により低いことを示すグラフ表示である（ｐ＝０．０５６）。ｎ＝７（対照）、ｎ＝９（ＥＴＰ６９で治療した動物）。
【図１３】酸素−グルコース欠乏（ＯＧＤ）後のニューロンの生存に対するＥＴＰ６９の効果のグラフ表示である。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｂは１４ＤＩＶ海馬ニューロンにおけるＨ３Ｋ９ｍｅ３レベルに対するＥＴＰ６９の効果の図である（Ａ：ゲル画像、Ｂ：定量化、ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５）。
【図１５Ａ】ＥＴＰ６９治療（２０ｎＭ、２４時間）によりＰＳＤ−９５免疫反応性１４ＤＩＶ海馬ニューロンが増加したことを示す画像である。
【図１５Ｂ】ＥＴＰ６９治療（２０ｎＭ、２４時間）により樹状Ｆアクチン染色（樹状スパインのマーカー）が増加したことを示す画像である。
【図１６】ウェスタンブロットによって測定したＳｅｒ１３３におけるＥＴＰ６９により増加したＣＲＥＢリン酸化を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、認知機能を向上させるためのＨ３Ｋ９ｍｅ３調節の使用を含む本発明について説明する。以下の例示的な説明では、本発明の実施形態のより完全な理解を与えるために数多くの具体的な詳細が示されている。但し、本明細書に記載されている具体的な詳細の全ての態様を組み込むことなく本発明を実施し得ることは当業者には明らかであろう。さらに、工程またはプロセスは１つ以上のシステムおよび方法の理解を与えるために例示的な順序で示されているが、例示的な順序は限定的なものではない。当業者であれば、本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく工程またはプロセスを異なる順序で実施でき、かつ１つ以上の工程またはプロセスを同時または複数のプロセスフローで実施できることが分かるであろう。他の例では、本発明を曖昧にしないために当業者に周知の具体的な特徴、量または測定については詳細に記載していない。本発明の例が本明細書に記載されているが、読者は特許請求の範囲および全範囲のあらゆる均等物が本発明の境界および限界を定めるものであることに留意すべきである。
【００１９】
開示されている実施形態、その機能上の利点およびその使用によって達成される特定の目的のさらなる理解のために、開示されている例示的な実施形態が図示されている添付の図面および説明的事項を参照すべきである。開示されている実施形態は本明細書に記載されている特定の形態に限定されるものではない。当然ながら状況が好都合であることを示唆するか好都合になる場合には、様々な省略および均等物の置換が想定され、その適用また実装を包含するものとする。
【００２０】
「第１の」、「第２の」などの用語は、本明細書ではいかなる順序、量または重要性を示すものではなく、１つの要素を別の要素とは区別するために使用されるものであり、「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という用語は本明細書では量の限定を示すものではなく、参照されている項目の少なくとも１つの存在を示すものである。
【００２１】
本明細書で使用される「用量単位」という用語は、各単位が必要な希釈液、例えば担体または媒体と共に所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性物質を含む動物のための単位用量として適した物理的に分離した単位を指す。本発明の単位用量の詳細は、（ａ）活性物質の固有の特性、および（ｂ）動物における治療的使用のためのそのような活性物質の配合に関する当該技術分野における固有の限界によって決まるかそれらに直接依存している。
【００２２】
本明細書で使用される「治療的有効量」という用語は、投与される組成物に含まれる本発明のＳＵＶ３９Ｈ１阻害化合物の量が意図した目的を達成する、例えばこの場合は加齢に関連する認知障害、アルツハイマー病および他のＢＤＮＦ依存性疾患を改善するのに十分な量であることを意味する。本発明の目的のために、加齢性認知障害の治療をヒストンメチル化マークの好転または除去によって測定してもよい。例えばヒストンメチル化に寄与する酵素の機能を有効に調節することによって、加齢性認知障害を好転させることができる。
【００２３】
従って、患者における想起の増加を測定することにより、本発明の化合物の量が治療的に有効であるか否かを容易に決定することができる。一実施形態では、本発明の化合物ＥＴＰ６９の治療的有効量は、例えば、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇおよび他の好適な値であってもよい。
【００２４】
本発明の１つ以上の実施形態は、老齢脳におけるヒストンメチル基転移酵素ＳＵＶ３９Ｈ１の生体内での阻害およびその結果として生じるヒストンＨ３Ｋ９のトリメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）による下方制御を用いて、加齢に関連する認知障害、アルツハイマー病および他のＢＤＮＦ依存性疾患を有効に改善する方法を提供する。Ｈ３Ｋ９ｍｅ３は重要な抑制ヒストンマークであり、遺伝子サイレンシングに関与している。Ｈ３Ｋ９ｍｅ３の確立は、中心周囲ヘテロクロマチンにおけるＨ３Ｋ９トリメチル化を調節するヒストンメチル基転移酵素ＳＵＶ３９Ｈ１の活性に依存している。故に、ヒストンメチル化に寄与する酵素の機能を調節することは加齢性認知障害を改善するための強力な手段になり得る。加齢に関連する認知障害、ＢＤＮＦ調節不全および他の加齢性疾患は、特に感覚情報の処理、注意力、記憶の獲得および固定、情報の想起ならびに計画、問題解決、阻害制御、自己監視および全般的機能に関連する認知の他の態様などの実行機能における障害を含む。
【００２５】
本発明の１つ以上の実施形態によれば、老齢動物モデルにおける学習および記憶におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３の役割を、図１に示すＥＴＰ６９と呼ばれる、エピジチオジケトピペラジンアルカロイド（カエトシン（ｃｈａｅｔｏｃｉｎ）Ａ）の新しく開発された類似体を用いて研究する。ヒストンメチル基転移酵素ＳＵＶ３９Ｈ１の選択的阻害剤であるこの化合物、すなわちＥＴＰ６９は、最初に報告されたＳＵＶ３９Ｈ１阻害剤であるカエトシンＡよりも１７種のヒトのヒストンメチル基転移酵素のパネルに対して有意により大きな選択性を示す。さらに、ＥＴＰ６９はヒストンアセチル転移酵素ｐ３００およびＤＮＡメチル基転移酵素ＤＮＭＴ１に対して阻害活性を示さない。
【００２６】
海馬は哺乳類の記憶にとって非常に重要であり、老齢脳において損なわれることが知られている。そのデータから、海馬の機能障害は空間記憶における深刻な障害を生じさせることが分かっている。これらの発見が空間記憶が海馬の機能に関して単一の状態を有することを意味し得ることも示唆される。従って、本発明の研究は空間記憶課題を使用して老齢動物におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３操作の効果を評価した。さらに本研究は、教師なし学習課題と呼ばれる自発的活動課題を用いてこれらの発見を拡大および確認する。この課題は海馬依存性の学習を測定するものであり、海馬におけるシナプスの変化に大きく相関することが知られており、加齢性障害の影響を受けやすい。また、本化合物の有効性を測定するために用いた別の試験は恐怖条件付け課題である。この課題は、嫌悪刺激（例えば電気ショック）を特定の中立的な文脈（例えば部屋）に関連づけ、元々中立である刺激すなわち文脈に対する恐怖反応の発現を生じさせる学習および記憶の形態を測定する。また、学習および記憶を調べる他のそのような課題も本薬物の恩恵を受けることが予測される。
【００２７】
次いで、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３阻害による記憶の向上の根底にある下流細胞／分子イベントを特定するために、本研究はゴルジ染色およびflow  synaptometryを用いて海馬のスパイン形成に対するＥＴＰ６９の効果を評価した。活性依存性のスパインの再構築に対するＢＤＮＦの重要な役割によれば、シナプスにおけるＡｋｔ活性化（ＢＤＮＦ下流エフェクター）と共に、海馬におけるｂｄｎｆエクソンのＨ３Ｋ９トリメチル化およびタンパク質レベルに対するＥＴＰ６９の効果の研究およびそのデータから、記憶機能におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３の新規な役割が判明し、かつ海馬依存性の記憶および学習における特定の役割が示唆されている。
【００２８】
材料および方法
動物
老齢（１８〜２０月齢、ｎ＝３４）または若齢（３〜４月齢、ｎ＝１８）の雄のＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスを餌および水を好きなだけ与えながら群飼し、実験手順の前に動物飼養場に１週間順応させた。光を１２：１２の明／暗サイクルで維持し、サイクルの明段階中に全ての行動試験を行った。
【００２９】
化合物
カエトシンＡなどのエピジチオジケトピペラジンアルカロイドのラセミ類似体であるＥＴＰ６９（Ｒａｃ−（３Ｓ，６Ｓ，７Ｓ，８ａＳ）−６−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−２，３，７−トリメチル−１，４−ジオキソヘキサヒドロ−６Ｈ−３，８ａ−エピジチオピロロ［１，２−ａ］ピラジン−７−カルボニトリル）を、Overman LE, Baumann M, S. , Nam D, Horne R, Jove LJ, Xie C, Kwolik (2014) “Preparation of Epipolythiodioxopiperazine ETP Derivatives for Treatment of Cancer（癌の治療のためのエピポリチオジオキソピペラジンＥＴＰ誘導体の調製）,” PCT Int., vol. 2014066435, (Int, P., ed), USA［現在ではM. Baumann, A. P. Dieskau, B. M. Loertscher, M. C. Walton, S. Nam, J. Xie, D. HorneおよびLarry E. Overman “Tricyclic Analogues of Epidithiodioxopiperazine Alkaloids with Promising In Vitro and In Vivo Antitumor Activity（有望な生体外および生体内での抗腫瘍活性を有するエピジチオジオキソピペラジンアルカロイドの三環式の類似体）,” Chemical Science, 2015, 6, DOI: 10.1039/C5SC01536Gにも公開されている］（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているように調製し、メタノールから再結晶化させた。Ｏｖｅｒｍａｎらによる「ETP Derivatives（ＥＴＰ誘導体）」という発明の名称のＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ第２０１３／０６６２５２号（この内容全体も参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。本化合物を５０％ＤＭＳＯをベースとする生理食塩水の混合物に溶解した。対照被験動物にはＤＭＳＯをベースとする生理食塩水を与えた。
【００３０】
ＥＴＰ６９の類似体としては、以下の式を有する化合物が挙げられる。
【化１】
2018516940.tif 000003
【００３１】
符号ｐは２、３または４である。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１６およびＲ１８は独立して水素、ハロゲン、−Ｎ３、−ＣＦ３、−ＣＣｌ３、−ＣＢｒ３、−ＣＩ３、−ＣＮ、−ＣＨＯ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＳＨ、−ＳＯ２、−ＳＯ２Ｃｌ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のヘテロアリールである。
【００３２】
試験
物体位置記憶（ＯＬＭ）：標準的なＯＬＭプロトコルを用いて訓練および試験手順を行った。簡単に言うと、２２匹の老齢マウスおよび１８匹の若齢マウスを１日当たり約２〜３分で５日間管理した後、訓練前に１日当たり５分間で連続５日間実験装置（３０×２３×２１．５ｃｍの大きさの白色の矩形のオープンフィールド）に馴化させた。
【００３３】
ＯＬＭにおける用量反応：試験日にマウスを（空の試験アリーナにおいて）３分間馴化させた後、ＥＴＰ６９（１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８）もしくは２０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝７））または媒体（ｎ＝７）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を行った。次いで、薬物または媒体の腹腔内注射から３０分後にマウスに３分間の獲得試行（２つの同様の物体を互いに対向するアリーナに配置した状態）を行い、次いで全ての動物を２４時間の試行間間隔でそれらのホームケージに戻した。２４時間後、３分間の保持試験を行い、そこでは１つの物体を新規位置に移動させ、ＯＬＭ課題における用量反応を評価するために新規位置対馴染み位置を探索するのに動物が費やした時間を記録した。ＯＬＭ課題において１０ｍｇ／ｋｇを摂取した動物の方が他の群よりも良好に行動したため、残りの研究では１０ｍｇ／ｋｇを使用した。このＯＬＭパラダイムは学習のための閾値下であることが以前から分かっている。
【００３４】
獲得（訓練前）または固定（訓練後）：訓練前および訓練後パラダイムにおける本化合物の有効性を決定することを目的とした別の試験では、２２匹の老齢動物からなる同じ群を第１の試験から３週間後にＯＬＭ課題で再試験した。本薬物が獲得または固定機序に影響を与えたか否かを決定するために、マウスに１０ｍｇ／ｋｇの化合物（ｉ．ｐ．、ｎ＝７）または媒体（ｎ＝８）を注射した。保持試験の直後（すなわち注射から２４時間後）に動物を屠殺し、海馬を除去し、ドライアイスで素早く凍結させ、トリメチル化レベルおよびＢＤＮＦアッセイのための処理まで−８０℃で保存した。図２は、マウスにおける新規場所位置課題において獲得段階の３０分前に投与した１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ）の本薬物の効果のグラフ表示である。このグラフから、ＯＬＭにおける獲得段階の３０分前に投与した１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）のＥＴＰ６９で治療したマウスが獲得段階で物体探索（秒で測定）において差を示さないことが分かる。データは平均±ＳＥＭである（ｎ＝７または８／群）。
【００３５】
１８匹の若齢マウスも上記のとおり同じＯＬＭパラダイムで試験した。本薬物が獲得または固定機序に影響を与えたか否かを決定するために、若齢マウスに獲得試行の直前または直後のいずれかで１０ｍｇ／ｋｇの化合物または媒体を注射し（ｉ．ｐ、ｎ＝６／群）、獲得後に２４時間試験した。図３は媒体または１０ｍｇ／ｋｇのＥＴＰ６９のいずれかで治療したマウス間の探索における差を示すＯＬＭ試験の結果のグラフ表示である。このデータから課題の保持段階（薬物投与から２４時間後）に、１０ｍｇ／ｋｇのＥＴＰ６９（ｉ．ｐ．）で治療したマウスが馴染み物体よりも新規物体を有意に探索したことが分かる（秒で測定）（＊＊ｐ≦０．０１、ボンフェローニｔ検定）。２０ｍｇ／ｋｇのＥＴＰ６９で治療したマウスは老齢対照と同様に行動した。データは平均±ＳＥＭである（ｎ＝７または８／群）。
【００３６】
教師なし学習課題：教師なし学習課題では１２匹の老齢動物からなる新しい群を使用した。手順は公開されている研究に記載されている手順であった。教師なし学習（ＵＳＬ）行動装置は、仕切っている壁のそれぞれの小さい入口によって全てアクセス可能な壁で４つのチャンバーに仕切られた大きなオープンフィールドからなる。動物は開放された入口によって、より小さい付属の取り囲まれた暗い区画にアクセスすることもできる。管理の５日後に、動物にＥＴＰ６９（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）または媒体を注射し、ビデオ監視されるＵＳＬボックスの中に３０分間置き、ホームケージに戻した。２４時間後、動物をＵＳＬボックスの中に再び置き、直後に安楽死させた。それらの脳を素早く除去し、海馬を素早く解剖し、ドライアイスで凍結してさらなる処理まで−８０℃で保存した。
【００３７】
恐怖条件付け：１４匹の老齢（１８〜２０月齢）の雄のマウスを恐怖条件付けチャンバーの中に置き、２分間探索させた後、１回の電気足ショック（２秒、０．２ｍＡ）を与えた。足ショックの後、動物をホームケージに２分間戻した。２４時間後、条件チャンバーにおける行動を５分間観察し、その後に呼吸以外の全ての動きが存在しないものとして定義されるフリーズ行動について分析した。
【００３８】
ヒストントリメチル化：製造業者のプロトコルに従い、ＥｐｉＱｕｉｋ抽出キット（ＯＰ−０００６−１００）を用いて、３匹の若齢マウスおよび３匹の老齢マウスの凍結した海馬から全てのヒストンを抽出した。簡単に言うと、組織の重量を測り、切断して小片にし、１×溶解前緩衝液中で均質化し、２ｍｌの管に移し、１０，０００ｇおよび４℃で１分間遠心分離した。上澄みを除去し、組織ペレットを３体積の溶解緩衝液に再懸濁させ、氷上で３０分間インキュベートし、１２，０００ｇおよび４℃で５分間遠心分離した。バランス−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）緩衝液（０．３体積）を上澄みに添加し、これを−８０℃で保存した。標準液としてＢＳＡを用いるブラッドフォードタンパク質検出キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて溶出したヒストンのタンパク質濃度を推定した。製造業者の情報（ａｂ１１５０６４）に従ってヒストン（Ｈ３Ｋ９）のトリメチル化分析を行った。簡単に言うと、トリメチル化ヒストンを特異的抗体を用いて捕捉し、標識した検出抗体で検出した後、顕色試薬により発色させた。４５０ｎｍで吸光度を読み取り、製造業者の説明書に従い、標準曲線を用いて結果を計算した。
【００３９】
スパイン数：別の一連の実験では、１０匹の老齢マウス（２０〜２２月齢）にＥＴＰ６９（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ）または媒体（ｉ．ｐ）を注射し、２４時間後に動物を安楽死させ、脳を２つの半球に分けた。右半球をゴルジ染色のために使用し、左半球をflow synaptometryのために処理した。製造業者の情報に従って染色を行った（Ｇｏｌｇｉ−Ｃｏｘ、Ｂｉｏｅｎｎａ）。
【００４０】
Flow  Synaptometry：本発明者らの長く存続しているプロトコルを用いてマウスの海馬全体から新鮮なシナプトソームＰ２画分を得た。簡単に言うと、組織（１：１０ｗ／ｖ）を氷冷スクロース（３２０ｍＭ）中に均質化させることによりその画分を海馬から得た。全ての工程を４℃で行い、スクロース緩衝液、粉砕機、乳棒およびマイクロチューブを全て氷上で予め冷却した。一匹のマウスから得た海馬を素早く解剖し、ＨＥＰＥＳ［１０ｍＭ］およびプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤カクテルを含む３２０ｍＭのスクロース（１．５ｍｌ）（ｐＨ７．４）中で均質化させた。均質化はガラス−テフロン（登録商標）粉砕機における６〜８回の手動ストロークからなり、隙間（プランジャーとガラスとの間）は０．１５〜０．２５ｍｍであった。粉砕機を氷上に維持しながらストローク中にプランジャーを穏やかに回転させた。ホモジネートを１２００ｇで１０分間遠心分離した。上澄み（Ｓ１、ミトコンドリアおよびシナプトソームを含む）を２つの清潔なマイクロチューブに移し、１２，０００ｇで２０分間遠心分離した。プラスチックチップおよび真空を用いて上澄み（Ｓ２）を慎重に除去した。ペレット（Ｐ２、粗製のシナプトソーム画分に対応する）を１．５ｍＬのＰＢＳ中で穏やかにピペットを上下に動かしながら再懸濁させた。標準液としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いるＢＣＡアッセイを用いてタンパク質濃度を測定した。免疫標識する前に、全ての試料を希釈液としてＰＢＳを用いて同じタンパク質濃度に調整した。細胞外／細胞内抗原の染色方法に従い、２００μｌのシナプトソーム画分（５０〜１００μｇのタンパク質）を用いてflow synaptometry分析のために免疫標識を行った。抗体：ＧｌｕＲ１（細胞外）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＡＢＮ２４１、ＤＩＬ＝１：４００）、ｐ−Ａｋｔ−ｓｅｒ４７３（Cell Signaling社、４０６０、ＤＩＬ＝１：４００）、ＰＳＤ−９５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＭＡＢ１５９８、ＤＩＬ＝１：４００）、抗ウサギIgG Alexa-488 ad抗マウスIgG Alexa 647（Life Science社、ＤＩＬ＝１：４００）。アルゴン４８８ｎｍおよびヘリウム−ネオン６３５ｎｍレーザーを備えたFACS Caliburフローサイトメーター（BD Biosciences社）を用いてデータを取得した。前方散乱光（ＦＳＣ）および側方散乱光（ＳＳＣ）特性によって相対的サイズおよび粒度を測定した。対数増幅を用いてＦＳＣ、ＳＳＣ、ＦＬ１およびＦＬ４シグナルを回収した。ＦＬ１およびＦＬ４検出器でそれぞれＡｌｅｘａ４８８およびＡｌｅｘａ６４７フルオロクロムを検出した。ＦＳＣ−ＳＳＣプロットを使用し、較正されたビーズを用いてシナプトソーム（０．５〜３．０μｍ）のサイズに一致する粒子を選択した（図６Ａ）。ビーズ標準および試料に関するデータの取得のために同一のＦＳＣ設定を使用した。ＦＳＣ−Ｈ閾値（３２５）を設定して小さい断片および破片を除外した。サイズゲートを設定した一万個の粒子を回収し、各試料を分析した。CellQuest Proソフトウェア（BD Biosciences社）を用いて分析を行った。
【００４１】
ＢＤＮＦのためのＥＬＩＳＡ
製造業者の説明書に従い、BDNF Emaxイムノアッセイシステム（Ｇ７６１０、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてＥＬＩＳＡを行った。各動物の海馬から２組の試料を調製し、全ての反応を２連で行った。
【００４２】
第１の一連の実験ではＢＤＮＦがＥＴＰ６９の標的であることを立証し、次いで、第２の組の実験（ＵＳＬ課題）から得られた脳を使用して、どのＢＤＮＦエクソンがメチル化され、ＢＤＮＦのどの下流の標的がＥＴＰ６９治療後に変化を示すかを検出した。
【００４３】
ＢＤＮＦプロモーター領域のためのクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）：１％ホルムアルデヒドによる架橋後にクロマチンを剪断して２００〜５００ｂｐの断片にした。ヒストンＨ３Ｋ９ｍｅ３（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に対する抗体を用いて免疫沈降を４℃で一晩行った。洗浄、ビーズからの溶出および架橋の逆転による解離後に、免疫沈降したＤＮＡを精製し、プールした入力試料から作成した内部標準曲線を用いるｑＲＴ−ＰＣＲによって３連で分析した。各試料をそれぞれの入力値で正規化した。エクソンＩ、ＩＶおよびＶＩのためのｂｄｎｆプロモーターのためのプライマーは各固有のエクソン配列に対応している。ＲＴ−ｑＰＣＲプライマーセットは、Ｒｏｃｈｅユニバーサルプローブライブラリーアッセイデザインセンターを用いて設計されたものであり、Integrated DNA Technologies社（アイオワ州コーラルビル）から得た。ＲＴ−ｑＰＣＲ反応をStratagene MX3005Pサーモサイクラーを用いて９５℃で３分間行い、次いで９５℃で１０秒間および５８℃で１５秒間からなる４５サイクルを行った。各ＲＴ−ｑＰＣＲ試験は全ての試料の３連での実行および標準曲線を含んでいた。データを２−ΔΔＣｔ法で分析し、先に記載したように入力試料による正規化後に対照に対する倍数変化として表した。
【００４４】
統計分析
対データおよび不対データのそれぞれに対してノンパラメトリックｔ検定としてマンホイットニー検定を使用し、パラメトリックデータに対してスチューデントｔ検定を使用した。３つ以上の群の平均比較のために一元配置ＡＮＯＶＡの後に事後テューキー検定を行い、二元配置ＡＮＯＶＡの後にボンフェローニ事後検定を行った。GraphPad Prism 6を用いて全ての統計的検定および図６Ｂの非線形当てはめを行った。データは平均±ＳＥＭで示されている。ｐ値＜０．０５を有意とみなした。
【００４５】
結果
物体位置記憶（ＯＬＭ）課題におけるＥＴＰ６９
空間ＯＬＭ課題における腹膜内に投与したＥＴＰ６９の急性効果の用量反応研究を行った。用量範囲はマウスにおいて耐容性が良好であることが知られている量を含んでいた。本発明者らの結果から、老齢マウスにおけるＯＬＭ課題において１０ｍｇ／ｋｇは記憶の向上を誘導したが２０ｍｇ／ｋｇは誘導しないことが実証された。これを二元配置ＡＮＯＶＡを用いて確認し（交互作用効果、（Ｆ（２，１９）＝１０．２５、ｐ＜０．０１、ｎ＝７〜８／群））、事後検定により１０ｍｇ／ｋｇの本薬物を摂取している群が対照と比較して有意に良好に行動したことが分かった（ｐ＜０．０５、ボンフェローニｔ検定）。これは獲得試行分析にも反映されている。試験の獲得段階では有意な交互作用効果（Ｆ（２，１９）＝０．１３９、ｐ＝ＮＳ、ｎ＝７〜８／群）または物体位置の主効果（Ｆ（１，１９）＝０．１９、ｐ＝ＮＳ）は認められなかった。しかし、より高い用量の本薬物（２０ｍｇ／ｋｇ）を与えた動物では、全体的な探索時間の減少を示す有意な治療効果（Ｆ（２，１９）＝３．１８、ｐ＜０．０５）が認められた（ｐ＜０．０５、ボンフェローニｔ検定）。これは、より高い用量のＨ３Ｋ９ｍｅ３が全体的探索を損なうことがあり、場合により老齢動物において歩行活動を損なうことがあることを示唆しているため、最適な用量を慎重に特定しなければならない。
【００４６】
次に、本研究は、試行前対試行後投与パラダイムにおけるＥＴＰ６９治療がＯＬＭ課題のパフォーマンス正確性に差次的に影響を与えるか否かを決定することを試みた。ＯＬＭ課題のための試行前対試行後パラダイムにより記憶形成の２つの別個の構成要素の試験が可能になる。具体的には、訓練前の薬物投与は記憶の獲得および想起を評価し、訓練後の薬物投与は記憶の固定および想起を対象にする。従って、本発明者らはＯＬＭ試験の獲得段階の３０分前または直後のいずれかで本薬物を投与した。本発明者らは、獲得段階の３０分前（試行前、ｎ＝６／群）または獲得直後（試行後、ｎ＝８／群）のいずれかで投与した１０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ）の本薬物がＯＬＭ課題においてパフォーマンスを向上させることを見出した（交互作用効果（Ｆ（２，１９）＝９．８１、ｐ＜０．０１、図４ｂ）。さらなる事後検定では試行前および試行後群の両方において有意な効果が認められた（ｐ＜０．００１、ボンフェローニｔ検定）。試験の獲得段階では有意な群間差が認められなかった（交互作用Ｆ（２，１９）＝０．２６、薬物の主効果Ｆ（２，１９）＝０．０１、物体位置の主効果Ｆ（１，１９）＝０．０１、ｐ＝ＮＳ、図４ａ）。
【００４７】
図４Ａ〜図４Ｂは老齢マウスにおける新規物体位置課題において獲得段階の３０分前（試行前）または獲得直後（試行後）のいずれかで投与した１０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ）の本薬物の効果のグラフ表示である。獲得段階における物体探索の差（Ａ）。課題の保持段階（２４時間±３０分、薬物投与後）では、薬物治療した動物は馴染み物体よりも新規物体を有意に探索した（Ｂ）（ｐ＜０．００１、馴染み物体に対して新規物体を探索するのに費やした時間における有意差）。
【００４８】
Ｈ３Ｋ９ｍｅ３阻害が若齢および老齢マウスにおいて記憶に良い影響を与えるという仮説を試験するために、行動試験を若齢マウスまで拡大した。老齢動物の場合とは異なり、ＥＴＰ６９の投与は若齢マウスにおいてＯＬＭパフォーマンスを向上させなかった。獲得段階の３０分前（試行前）または獲得直後（試行後）のいずれかで投与した１０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ）の本薬物は、若齢対照と比較してどんな統計的差も示さなかった（交互作用効果（Ｆ（２，１５）＝０．３２、ｐ＝ＮＳ、薬物の主効果Ｆ（２，１５）＝２．２１、物体位置の主効果Ｆ（２，１５）＝６．０２、ｐ＜０．０５、図５Ｂ、ｎ＝６／群）。試験の獲得段階でも有意な群間差は認められず（交互作用Ｆ（２，１５）＝０．４４、薬物の主効果Ｆ（２，１５）＝２５．０１、ｐ＜０．０１、ｎ＝６／群）、位置１対位置２の探索間でも差が認められなかった（ボンフェローニｔ検定によって測定、ｐ＝ＮＳ、物体位置の主効果Ｆ（２，１５）＝１．５６、図５Ａ）。これは、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３操作が若齢脳対老齢脳においてかなり異なる効果を有し得ることを示唆している。
【００４９】
図５Ａ〜図５Ｂは若齢マウスにおける新規物体位置課題において獲得段階の３０分前（試行前）または獲得直後（試行後）のいずれかで投与した１０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ）の本薬物の効果のグラフ表示である。獲得段階における物体探索（Ａ）または課題の保持段階（Ｂ）において差は認められなかった（２４時間±３０分、薬物投与後）。
【００５０】
教師なし学習課題（ＵＳＬ）におけるＥＴＰ６９
Ｈ３Ｋ９ｍｅ３が空間学習の尺度に関与するか否かを評価し、かつ分子エンドポイントを評価するために、ＵＳＬ課題を行動エンドポイントとする第２の一連の実験を行った。ＵＳＬ課題は、マウスに指定された期間にわたって４区画環境を自由に探索させる単純な行動パラダイムである。この時間における全体的活動および試験アリーナの探索の減少を学習および短期記憶の尺度とみなす。２つの群においてこの減少が同様の割合で起これば、これは短期学習および記憶において有意差がないことを示す。マウスの歩行運動パターンはそれらが示す馴化および学習を反映し、海馬におけるシナプスの変化と大きく相関する。
【００５１】
図６Ａは教師なし学習課題におけるＥＴＰ６９の効果のグラフ表示である。老齢マウスは両日において試験アリーナを探索し続けるが、ＥＴＰ６９（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で治療した老齢マウスは、１日目と比較して２日目に馴化／探索における有意な減少を示した（移動距離によって測定した場合）。老齢対照マウスは１日目および２日目に試験アリーナを探索するのに等しい時間を費やした。３０分にわたって馴化を測定し、示されているデータは５分間隔である（＊ｐ＜０．０５、指定された時点での１日目および２日目における馴化／探索間の有意差（テューキーのｔ検定）、ｎ＝５または６／群）。
【００５２】
図６Ｂは教師なし学習課題におけるＥＴＰ６９の効果のグラフ表示である。このグラフは、ＥＴＰ６９（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）または媒体の投与後の１日目および２日目の３０分間における総移動距離を示す（＊ｐ＜０．０５、１日目と２日目との間の３０分間の総移動距離の有意な減少（テューキーのｔ検定））。データは平均±ＳＥＭである（ｎ＝５または６／群）。
【００５３】
この試験の間に、十分に管理したマウスを４区画の検定ボックスの中に置き、それらの移動を１日目に３０分間、次いで２４時間後である２日目に再び３０分間監視した。ＥＴＰ６９（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で治療した動物が治療から２４時間に馴化／探索における有意な減少を示すが１日目の最初の３０分では示さないことが分かった（移動距離によって測定した場合）（図６Ａ）。一元配置ＡＮＯＶＡにより有意な群間差が認められ（Ｆ３，１９＝４．０５、ｐ＜０．０５）、かつ事後検定によりＥＴＰ６９で治療した動物における１日目および２日目のパフォーマンス間の差が確認された（ｐ＜０．０５）が、年齢適合対照群では確認されなかった（図６Ｂ、ｎ＝５／群）。１日目の３０分の探索はマウスにおいて試験アリーナのいくつかの長期記憶を誘導するのに十分であり、試験の２日目に測定することができる。本発明者らは、学習が群間で同じままであっても２日目に活動レベルにおける差を見出し、これをＥＴＰ６９で治療した動物における保持および想起の向上と解釈する。
【００５４】
恐怖条件付け課題におけるＥＴＰ６９
文脈的恐怖条件付け試験を用いる別の試験では、本化合物は海馬依存性の学習および記憶を向上させるのに有効であった。本発明者らは、ＥＴＰ６９で治療した老齢動物（ｎ＝７／群）が老齢対照と比較して課題におけるパフォーマンスの向上を示すことを見出した（ｐ≦０．０１）。恐怖条件付けは数多くの生物種で試験されたことがあり、多くの場合フリーズ状態（注意深い不動状態の期間）で測定される。多くの研究から条件付けされた恐怖が臨床的不安障害の機序と実質的に一致することが分かっている。条件付けされた恐怖の獲得、固定および消去の研究は、これが学習および記憶に加えて解離、パニック発作障害、恐怖症およびさらには心的外傷後ストレス障害などの一連の病的状態の治療のための手段になり得ることを示唆している。さらに、腹内側前頭前皮質（ｍＰＦＣ）（扁桃体内側基底（ＢＭＡ）突起部）は、ベースラインおよびストレス誘発性不安症の両方において不安状態および学習したフリーズ状態のトップダウン制御を行い、上で述べた全ての条件に関連する広く関連する新しいトップダウン行動制御経路を定めることが知られている。
【００５５】
ＯＬＭおよびＵＳＬ課題からの本発明者らの発見を確認するために、本発明者らは文脈的恐怖条件付けを使用して海馬依存性の学習および記憶に対するＨ３Ｋ９ｍｅ３による下方制御の効果を試験した。恐怖条件付けは扁桃体および関連する機能も調節されるか否かも示す。本発明者らはＥＴＰ６９で治療した老齢動物（ｎ＝７／群）が老齢対照と比較して課題におけるパフォーマンスの向上を示すことを見出した（ｐ≦０．０１）。全体として、これらの行動データはＥＴＰ６９投与が一連の試験にわたって海馬依存性の学習および記憶を向上させることを示唆している。
【００５６】
図７は、恐怖条件付け課題におけるＥＴＰ６９のグラフ表示である。ＥＴＰ６９で治療した（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）老齢マウスは、文脈的恐怖条件付けを評価した際にパフォーマンスの向上を示した（＊ｐ＝０．０１、ボンフェローニｔ検定）。データは±ＳＥＭとして示されている（ｎ＝７／群）。
【００５７】
海馬におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３レベル
本発明者らは最初に若齢マウス対老齢マウスの海馬および小脳におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３レベルを比較し、老齢マウスの海馬において有意により高いレベルのＨ３Ｋ９ｍｅ３を認めたが小脳では認めなかった（図８Ａ、ｐ＜０．０５、ｎ＝３／群）。ＯＬＭおよびＵＳＬはどちらも海馬特異的課題であり、かつ本発明者らは若齢マウス対老齢マウスの海馬におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３レベルの差を見出したため、本発明者らはＯＬＭ課題において上記動物のコホートから得た海馬組織試料において薬物治療後の海馬におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３の総レベルを試験した。本発明者らの結果は、本薬物で治療した動物の海馬から得られたヒストン抽出物における本薬物の有意な効果を示した。ｔ検定分析はＥＴＰ６９で治療した動物におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３レベルの低下を示した（ｐ＜０．０５、ｎ＝７／群、図８Ｂ）。比較では、ＥＴＰ６９で治療したマウス対未治療マウスの小脳におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３レベル間に有意差は認められなかった。
【００５８】
Ｈ３Ｋ９ｍｅ３阻害は海馬のシナプトソームにおけるスパイン密度およびＧＬｕＲ１受容体表面発現を増加させる
新規な記憶形成が海馬におけるスパイン密度の一過性の増加と関連している可能性があることが報告されている。特に、ＯＬＭおよびＵＳＬ課題におけるパフォーマンスの向上は、興奮性グルタミン酸作動性シナプスにおける構造的および／または機能的変化と関連している。従って本発明者らは、ヒストンメチル基転移酵素（ＳＵＶ３９Ｈ１）の薬理学的阻害が海馬における樹状スパイン形成の増加を誘導するのに十分であるか否かを調べた。
【００５９】
具体的には、本発明者らはＣＡ１錐体ニューロン上のスパインを計数および分類した。海馬ＣＡ１のニューロンからの樹状突起部分を共焦点顕微鏡で画像化し、盲検調査者はそれらの形態に従って樹状スパインを計数および分類した。スパインを手で数えて、以前に記載された判断基準に従って薄型、マッシュルーム型または隆起型として分類した。
【００６０】
各動物について、少なくとも３つの錐体ニューロンおよび２００μｍの総樹状突起長さおよび２５０〜５００個のスパインを分析した（ｎ＝５動物／群）。全てのニューロンをＣＡ１海馬領域の背側部（空間記憶におけるその重要な役割に一致する）から選択し、基底および先端樹状突起に沿って完全に染色した。図１０は海馬ＣＡ１におけるスパインに対するＥＴＰ６９治療の効果を示す代表的な画像を示す。この図では、上のパネルは対照動物から得られた海馬ニューロンを示し、下のパネルはＥＴＰ６９で治療した動物で観察されたスパインを示す。
【００６１】
同じニューロンにおいて分離比分析を行って基底樹状突起を先端樹状突起と区別した。平均して、ＥＴＰ６９で治療したマウスは、形態によるスパイン密度の対照分析と比較して樹状突起長さ（μｍ）当たり４５％以上のスパイン総数を有しており、対照マウスと比較してＥＴＰ６９で治療したマウスにおいて薄型スパイン（ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定）および隆起型スパイン（ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）の有意により高い密度が判明した（図９Ａ〜図９Ｃ）。測定した樹状突起のマッシュルーム型スパインの数／長さにおいて差は認められなかった（図９Ａ〜図９Ｃ）。
【００６２】
次に、本発明者らは、単離したシナプトソーム（シナプス後の樹状スパインに付着したシナプス前終末）を分子的に特徴づける革新的な手法であるflow synaptometryを用いてシナプスに対するＥＴＰ６９の影響を調べた。活性依存性のスパインの成長はＰＳＤを多く含む領域におけるＡＭＰＡ受容体の取り込みに依存し、かつこのプロセスがスパインの成長をシナプス伝達効率の増加に結び付けるので、本発明者らはＰＳＤ９５（足場タンパク質）およびＧｌｕＲ１（ＡＭＰＡ受容体のサブユニット）の発現に焦点を当てる。薬物治療後に、海馬のシナプトソーム画分を免疫染色し、flow synaptometryで分析した。最初にflow synaptometryによる試料獲得により、先に記載したように較正したビーズを用いてシナプトソームをサイズによって同定する。大部分（＞７０％）のサイズゲートを設定した粒子における高レベルのシナプトフィジンおよびＰＳＤ９５によって示されるように、０．５〜３．０μｍの粒子のサブセットがシナプトソームに非常に多く含まれていることが分かった。ＥＴＰ６９で誘導されるスパイン数の増加（図９Ａ〜図９Ｃ）と一致して、本発明者らのサイズゲートを設定した粒子に対する分析により、ＥＴＰ６９がＰＳＤ９５を発現し、シナプトソームの割合を増加させる（このようにしてシナプス数の増加を反映している）ことが分かる（ｐ＜０．０５、図１１Ｃ）。平均蛍光強度によって測定した場合に、粒子当たりのＰＳＤ９５レベルにおいて検出可能な変化は認められなかった。次に、本発明者らはＥＴＰ６９が表面ＧｌｕＲ１−ＡＭＰＡ受容体を発現しているスパインの相対的レベルを増加させるか否かを試験した。本発明者らは、細胞外（透過処理なし）および細胞内免疫検出を組み合わせた二重標識により、サイズゲートを設定した表面ＧｌｕＲ１および細胞内ＰＳＤ９５を共発現しているシナプトソームの割合を定量化した。本発明者らは、媒体で治療した対照と比較してＥＴＰ６９で治療したマウスにおいて表面ＧｌｕＲ１を共発現しているＰＳＤ９５陽性（ＰＳＤ９５＋）イベントの量の増加を見出した（ｐ＝０．０５、図１１Ｅ）。次に、本発明者らは、ＮＭＤＡ受容体活性化後のＰＳＤ９５の樹状突起への活性依存性輸送のための重要な工程であるＡｋｔ活性化（セリン４７３におけるＡｋｔリン酸化、ｐ−Ａｋｔ）に対するＥＴＰ６９の効果を分析した。ＥＴＰ６９治療後のＰＳＤ９５＋ＧｌｕＲ１＋イベントの割合の増加に伴い、ＥＴＰ６９によるＳＵＶ３９Ｈ１阻害により、媒体で治療したマウスから得られた試料に対してｐ−ＡｋｔおよびＰＳＤ−９５（ｐ−Ａｋｔ＋ＰＳＤ９５＋）を発現しているイベントの割合も増加した（ｐ＜０．０５、図１１Ｇ）。これらの結果は全体として、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３阻害がスパインの発生および可塑性を促進する分子プロセスを正に調節することによって少なくとも部分的に作用することを示唆している。
【００６３】
ＥＴＰ６９はＢＤＮＦプロモーターにおけるＨ３Ｋ９ｍｅ３レベルおよび老齢マウスの海馬におけるＢＤＮＦタンパク質レベルを増加させる
当然のことながら、ＳＵＶ３９Ｈ１阻害剤による治療が海馬におけるスパイン形成を刺激すれば、それが記憶に対応する別個のシグナル伝達カスケードにおける遺伝子特異的変化も生じさせるはずである。成人の脳では、ＢＤＮＦはシナプス形成および可塑性において主要な役割を担い、シナプス前およびシナプス後部位の両方において作用する。従って、本発明者らは、学習および記憶に依存する海馬の固定にとって重要なＢＤＮＦに対するＨ３Ｋ９ｍｅ３による下方制御の効果を試験した。ｂｄｎｆ遺伝子はそれぞれがそれ自体のプロモーターによって調節され、かつ異なる刺激に反応するいくつかの非コードエクソンからなる。従って本発明者らは、ＥＴＰ６９治療がプロモーターＩ、ＩＶおよびＶＩにおけるＨ３Ｋ９のトリメチル化を減少させるか否かを評価した。治療の有意な効果がｂｄｎｆのＩにおけるＨ３Ｋ９ｍｅ３について認められた（ｐ＝０．０５、マンホイットニーｔ検定、ｎ＝７（対照）、ｎ＝９（ＥＴＰ６９）、図１２Ｂ）。重要なことに、ＢＤＮＦプロモーターにおけるＥＴＰ６９で誘導されるエピジェネティックな変化は海馬におけるＢＤＮＦタンパク質レベルの増加に関連していた。本発明者らは、対照に対してＥＴＰ６９で治療したマウスの海馬において有意に評価されるレベルのＢＤＮＦを見出した（ｐ＜０．０１、Ｆ（２，１６）＝８．０９、ＡＮＯＶＡおよびその後の事後ボンフェローニｔ検定、図１２Ａ）。
【００６４】
この研究では、本発明者らは加齢における学習および記憶障害を減弱させるための生体内での急性のＳＵＶ３９Ｈ１阻害およびその結果として生じるＨ３Ｋ９ｍｅ３による下方制御の可能性を試験した。本発明者らは、Ｈ３Ｋ９ｍｅ操作後に観察される認知に関する利点に寄与し得る可能性のある機序をさらに評価した。物体位置記憶課題、恐怖条件付けおよび教師なし学習課題におけるパフォーマンスはＨ３Ｋ９ｍｅ３による下方制御後に向上した。これは、錐体ニューロンの樹状スパイン密度の増加および海馬における表面ＧｌｕＲ１を含むＡＭＰＡ受容体を発現しているシナプスの増加に一致していた。ＳＵＶ３９Ｈ１阻害剤を投与した動物の海馬においてＢＤＮＦのレベルも上方制御され、これらの動物の海馬から得られたシナプトソームの抽出物はリン酸化Ａｋｔのレベルの上昇を示した。従って、これらの結果は認知障害の寛解を支持するものであり、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３による下方制御がＢＤＮＦ、スパインのリモデリングおよび成長に関与するイベントのカスケードを誘発することを示唆している。
【００６５】
本発明者らが知る限りでは、学習および／または記憶機能に対するＨ３Ｋ９ｍｅ３阻害の効果を評価した研究は存在していない。本明細書において本発明者らは、海馬におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３の減少が老齢マウスにおいて空間記憶を向上させるという最初の証拠を示す。ＯＬＭ課題の訓練前および訓練後の両パラダイムにおいて、ＥＴＰ６９で治療した動物は試験（２４時間の獲得後試行）中に等しく良好に行動した。これによりＥＴＰ６９による急性治療が老齢動物におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３レベルの海馬特異的変化を誘導しているという結論が導かれた。ＵＳＬ課題のデータから、学習が群間で同じままである場合、ＥＴＰ６９で治療した動物は２４時間後に保持および想起の向上を示しているが薬物治療の３０分後には示していないことが確認された。Ｈ３Ｋ９ｍｅ３によって補充されるリプレッサーおよび共同因子としては、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）およびヘテロクロマチンタンパク質−１α（ＨＰ１α）が挙げられる。実際に、ＨＰ１はＳＵＶ３９Ｈ１と直接結合し、自律的抑制サイクルを引き起こし、あらゆる行動発現を示すために３０分以上を必要とする場合がある。従って、この結果は分子レベル（ひいては行動レベル）の変化は素早く生じないが、保持および想起の向上を支持する機序を発達させるのに時間を必要とするという仮説と一致している。
【００６６】
スパイン密度の一過性の増加は、特に老齢マウスの海馬における学習および記憶の向上に関連しているが、シナプス機能およびスパインに対するＨ３Ｋ９ｍｅ３操作の効果は現在探究されていない。本明細書において本発明者らは、ＥＴＰ６９がＥＴＰ６９で治療した動物のＣＡ１領域において薄型および隆起型スパイン数を増加させたことを報告する。薄型スパインは柔軟であり、それらをＥＴＰ６９治療で観察される認知の急性向上を促進するのによく適したものにする新しいシナプスの形成にとって重要である。当然のことながら、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３の遮断後に観察される行動変化は、部分的にスパイン密度の変化に起因して生じた。さらに、スパインのリモデリングにはＰＳＤを多く含む領域におけるＡＭＰＡ受容体の取り込みが必要である（Ｐａｒｋら、２００４）。シナプス結合はシナプスへのＡＭＰＡ受容体の追加によって強化することができ、かつ実際にそのスパインのリモデリングにはシナプスの表面におけるＡＭＰＡ受容体の取り込みが必要であることが以前から分かっている。本発明者らのデータから、ＥＴＰ６９で治療した動物の海馬の試料ではシナプス終末において表面ＧｌｕＲ１を発現しているＰＳＤ＋シナプトソームおよびＰＳＤ９５＋シナプトソームの両方のレベルが増加し、このようにしてＨ３Ｋ９ｍｅ３が海馬におけるシナプスのネットワーク／シグナル伝達に対する変化を媒介し、それにより加齢における認知機能の向上を引き起こすという仮説を支持することが分かる。海馬に対するその効果に加えて、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３の拮抗作用により、サイズゲートを設定した海馬から得られたＰＳＤ９５を含むシナプトソームにおいてｐ−ＡＫＴの上方制御も生じる。ＢＤＮＦはシナプスの可塑性およびニューロンの活性のために働く主要分子である。本発明者らは、老齢脳におけるＨＤＡＣ阻害がＢＤＮＦ依存的に空間記憶を向上させることを以前に証明している。ＨＤＡＣはＨ３Ｋ９ｍｅ３によって補充される共同因子の１つであるため、本発明者らは老齢脳におけるＢＤＮＦタンパク質レベルに対するＳＵＶ３９Ｈ１阻害の役割を試験した。本発明者らのデータから、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３が学習および記憶を調節し、かつこの効果がＢＤＮＦ依存性機序によって媒介されている可能性があることが分かる。さらに本発明者らの結果は、老齢マウスにおけるＥＴＰ６９治療後にエクソン１のみがＢＤＮＦ上方制御を促進することを示唆している。ＢＤＮＦ転写物の差次的産生がタンパク質の機能に影響を与えるか、異なる脳領域でのＢＤＮＦの産生における特異的調節機序のための手段を提供し得ることが示唆される。Ｈ３Ｋ９ｍｅ３阻害はＢＤＮＦ転写物１の調節に選択的に関与するが、この選択性の下流結果は未知のままであるように思われる。しかし、本発明者らはＡｒｃにおける変化を認めなかった（データは示さず）。本発明者らは、本発明者らがＡｒｃにおける変化を認めなかったのはそれが素早く誘導されて減少するからであるが、同程度に、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３による下方制御後にシナプスにおける複数の変化が存在する可能性があり、かつＡｒｃ誘導がそれらのうちの１つではないかもしれないという可能性を完全に排除することはできない。この研究はＨ３Ｋ９ｍｅ３阻害によって直接または間接的に調節される可能性のあるカスケードに関する最初の考察を提供するだけである。Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抑制的マークの除去後の特定の分子経路の活性化が海馬の記憶経路を活性化させ、次いでこれが老齢動物における記憶機能の向上の維持に必要なさらなる転写および翻訳を生じさせ得るという可能性がある。
【００６７】
ニューロンの生存および機能に対するＳＵＶ３９Ｈ１阻害剤ＥＴＰ６９の効果
本発明者らは、ＥＴＰ６９がニューロンに対して直接作用することができるということを確立することに努めた。ニューロンは癌細胞とは異なり非分裂細胞であり、従って別個の細胞標的である。本発明者らは他の細胞型を含まず、かつ薬物濃度を厳しく制御することができる初代ニューロン細胞培養物を使用した。ニューロンの生存およびシナプスの成長は化合物を評価するための一般的な方法である。
【００６８】
１４ＤＩＶ海馬ニューロンにおける酸素−グルコース欠乏（ＯＧＤ）をＮｅｗｃｏｍｂ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら（２００１）によって記載されているものと同様の手法によって誘導した。通常培地をＰＢＳで置き換え、培養皿を気密チャンバー内に置いた。チャンバーをＮ２およびＣＯ２で３分間洗い流し、密閉して３７℃のインキュベーターに２時間置いた。ＰＢＳをＤＭＥＭ（血清を含まない）で置き換え、培養物を正常酸素圧の環境に戻した。培養物を正常酸素圧環境に戻した後に培地を４８時間回収した。細胞傷害をＬＤＨアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ社）で測定した。細胞傷害率（％）を計算するために、自然に放出されるＬＤＨのＬＤＨ活性を差し引き、化学処理した試料のＬＤＨ活性からコントロール（水で処理）を放出させ、総ＬＤＨ活性で割り［（最大のＬＤＨ放出コントロール活性）−（自然に放出されるＬＤＨ放出コントロール活性）］、１００を掛けた。
【数１】
2018516940.tif 000004
【００６９】
最初に本発明者らは、ＯＧＤに誘導される細胞傷害に対するＥＴＰ６９の効果を試験した。ＥＴＰ６９の存在または非存在下で成熟した海馬ニューロン（１４ＤＩＶ）をＯＧＤで２時間処理した。ＯＧＤ後に細胞傷害をＬＤＨアッセイで４８時間測定した。４ｎＭのＥＴＰ６９ではＯＧＤで誘導される細胞傷害からニューロンは救出されたが１００ｎＭのＥＴＰ６９では救出されなかった。図１３は、ＯＧＤ後のニューロンの生存に対するＥＴＰ６９の効果のグラフ表示である。ＥＴＰの存在または非存在下で１４ＤＩＶ海馬ニューロンをＯＧＤで２時間処理した。ＯＧＤ後に細胞傷害をＬＤＨアッセイで４８時間測定した。結果は４種類の試料の平均＋ＳＥＭである（＊ｐ＜０．０５）。
【００７０】
次に、本発明者らは培養した海馬ニューロンにおいてＨ３Ｋ９ｍｅ３レベルに対するＥＴＰ６９の効果を調べた。２４時間のＥＴＰ６９処理によりニューロンのＨ３Ｋ９ｍｅ３レベルが用量依存的に減少した。図１４Ａ〜図１４Ｂは、１４ＤＩＶ海馬ニューロンにおけるＨ３Ｋ９ｍｅ３レベルに対するＥＴＰ６９の効果の図である（図１４Ａ：ゲル画像、図１４Ｂ：定量化、ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５）。図が示すように、ＥＴＰ６９処理（２４時間）によりウェスタンブロットで測定されるＨ３Ｋ９ｍｅ３レベルが減少した。
【００７１】
２０ｎＭのＥＴＰ６９がＨ３Ｋ９ｍｅ３レベルの最大の減少を引き起こしたため、本発明者らはシナプスのタンパク質ＰＳＤ−９５の発現および樹状スパインの形態に対する２０ｎＭのＥＴＰ６９の効果を調べた。ＥＴＰ６９処理はＰＳＤ−９５免疫反応性を増加させた。図１５Ａは、ＥＴＰ６９処理（２０ｎＭ、２４時間）によりＰＳＤ−９５免疫反応性（シナプスが形成される樹状スパインのマーカー）１４ＤＩＶ海馬ニューロンが増加したことを示す画像である。ニューロンをＰＳＤ−９５（赤色）およびＭＡＰ２（緑色）に対する抗体で染色した。スケールバー：１０μｍ（上のパネル）、２μｍ（下のパネル）。
【００７２】
図１５ＢはＥＴＰ６９処理（２０ｎＭ、２４時間）により樹状Ｆアクチン染色（樹状スパインのマーカー）が増加したことを示す画像である。多くのスパインの存在を示す数多くの点の存在に留意されたい。上のパネル：対照、下のパネル：ＥＴＰで処理したニューロン。スケールバー：２μｍ。この図は、ＥＴＰ６９がＦアクチン染色で標識された樹状スパインも増加させたことを示している。
【００７３】
さらに、ＥＴＰ６９処理によりＳｅｒ１３３における転写因子ＣＲＥＢのリン酸化が増加した。図１６は、ウェスタンブロットによって測定したＳｅｒ１３３におけるＥＴＰ６９により増加したＣＲＥＢのリン酸化を示す画像である。ＣＲＥＢはその活性化がシナプスの可塑性および記憶形成に関与する転写因子である。
【００７４】
これらのデータは、ＥＴＰ６９がニューロン、非分裂細胞型に作用してそれらの生存、成長およびシナプスの可塑性を促進することを実証しているため、神経系およびニューロンに対するＥＴＰの使用を癌用途とは区別するものである。
【００７５】
本研究は、記憶および認知機能（例えば、加齢に関連する記憶力の低下）を向上させるＨ３Ｋ９ｍｅ３の役割の証拠を提供し、かつこのヒストンメチル化マークを薬理学的介入によって好転させることができることを示す。本研究は、ヒストンメチル化を調節する酵素を操作することにより対象のクロマチン状態を変化させ、かつ老齢脳における記憶機能を回復させることができるという証拠も提供する。最後に、本化合物を単独または認知パフォーマンス、例えば記憶、学習、実行機能、注意力、処理速度、全般的認知機能、日常生活動作などを向上させるための様々なライフスタイル介入または薬理学的介入のいずれか（すなわち認知機能促進法）と共に使用することができる。これらの二重の手法はいずれかの介入単独よりも認知を向上させることができる。これは睡眠、疼痛および生活の質などの機能的結果の向上にも繋がる。
【００７６】
１つ以上の実施形態では、薬理学的認知機能促進法として、例えばタクリン、ドネペジル、リバスチグミンおよびガランタミンなどのコリンエステラーゼ阻害剤を挙げることができる。薬理学的認知機能促進法は、ＮＭＤＡ拮抗薬またはＮＭＤＡ作動薬、アンパカイン（ａｍｐａｋｉｎｅ）、ＢＺＤ／ＧＡＢＡ受容体複合体調節薬、セロトニン拮抗薬、ニコチン性クラスの化合物、ムスカリン性クラスの化合物、ＰＤＥ阻害薬、Ｇタンパク質クラスの化合物、チャネル調節薬、免疫治療薬クラスの化合物、抗アミロイドまたはアミロイド低下薬、スタチンまたはＰＰＡＲＳ調節薬であってもよい。
【００７７】
１つ以上の実施形態では、ライフスタイルによる認知機能促進法として、身体的および精神的運動、抗酸化薬、ミトコンドリア機能賦活薬、カフェイン、オメガ−３およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などの栄養補助食品も挙げられる。
【００７８】
１つ以上の実施形態では、認知機能促進法はライフスタイルおよび薬理学的介入の組み合わせを含んでもよい。
【００７９】
ここに開示されている本発明について具体的な実施形態およびその用途によって説明してきたが、特許請求の範囲に示されている本発明の範囲から逸脱することなく当業者によってそれに対する数多くの修正および変形が可能である。
【図１】
2018516940.tif 000005
【図２】
2018516940.tif 000006
【図３】
2018516940.tif 000007
【図４】
2018516940.tif 000008
【図５】
2018516940.tif 000009
【図６】
2018516940.tif 000010
【図７】
2018516940.tif 000011
【図８】
2018516940.tif 000012
【図９】
2018516940.tif 000013
【図１０】
2018516940.tif 000014
【図１１】
2018516940.tif 000015
【図１２】
2018516940.tif 000016
【図１３】
2018516940.tif 000017
【図１４】
2018516940.tif 000018
【図１５】
2018516940.tif 000019
【図１６】
2018516940.tif 000020
【国際調査報告】
2018516940.tif 000021