(57)【要約】  本発明は、エクスビボ生体試料の輸送および保存用デバイスならびに対応する方法に関する。デバイス（１）は、断熱材製の壁（４）によって画定された、生体試料（１００）を収容するためのチャンバ（２）を具備する。前記デバイスは、チャンバ（２）内の温度をデバイス（１）外の温度より低く保つ冷却手段（６）をさらに含む。最後に、超音波を発生させて生体試料（１００）に適用するのに好適な超音波システムを備えている。本発明はまた、生体試料中の細胞破損を低減させるために冷却の適用と超音波の適用を併用する、輸送および保存のための方法も提示する。
2018501257.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生きている人間または動物への後の移植のためのエクスビボ生体試料（１００）の輸送および保存のためのデバイス（１）であって、前記デバイス（１）は、
断熱材製の壁（４）によって画定された、前記生体試料（１００）を収容するためのチャンバ（２）と、
前記チャンバ（２）内の温度を前記デバイス（１）外の温度より低く保つための冷却手段（６）
とを具備し、
保存溶液を収容する補助容器（１４）であって、外部からの酸素送達がなく、前記保存溶液に浸漬された前記生体試料（１００）を収容するためのものである、補助容器（１４）と、
超音波を発生させて前記生体試料（１００）に適用するのに適している少なくとも１つの超音波システム
とをさらに具備することを特徴とする、デバイス（１）。
【請求項２】
前記補助容器（１４）が密閉可能であることを特徴とする、請求項１に記載のデバイス（１）。
【請求項３】
前記超音波システムが、２５ｋＨｚ〜１ＭＨｚの間に含まれる周波数、および０．０１〜２Ｗ／ｃｍ２の間に含まれる音波強度で前記超音波を放出するのに好適であることを特徴とする、請求項１または２に記載のデバイス（１）。
【請求項４】
前記音波強度が、０．０２〜１Ｗ／ｃｍ２の間、特に好ましくは０．０２〜０．１Ｗ／ｃｍ２の間に含まれることを特徴とする、請求項３に記載のデバイス（１）。
【請求項５】
前記冷却手段（６）が、前記チャンバ（２）内の温度を０〜１５℃の間に保つのに好適であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のデバイス（１）。
【請求項６】
前記冷却手段（６）が、前記チャンバ（２）内の温度を２〜１０℃の間、特に好ましくは２〜６℃の間に保つのに好適であることを特徴とする、請求項５に記載のデバイス（１）。
【請求項７】
前記生体試料（１００）を収容する前記密閉可能な補助容器（１４）を支持するのに好適なシート状支持体（１０）であって、前記超音波が適用されたときに自由に振動することができる、前記シート状支持体（１０）を、前記チャンバ（２）内に具備すること、および
前記超音波システムが、前記シート状支持体（１０）の壁（４）の少なくとも１つに載置された少なくとも１つの変換器（８）を具備すること
を特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載のデバイス（１）。
【請求項８】
前記少なくとも１つの変換器（８）が、前記超音波を支持体表面（１２）に向けて適用するために、前記生体試料（１００）の前記支持体表面（１２）とは反対側の前記シート状支持体（１０）の面に載置されることを特徴とする、請求項７に記載のデバイス（１）。
【請求項９】
前記シート状支持体（１０）が金属製であることを特徴とする、請求項７または８に記載のデバイス（１）。
【請求項１０】
前記シート状支持体（１０）が流体を収容するように適合されたトレーであることを特徴とする、請求項７〜９のいずれかに記載のデバイス（１）。
【請求項１１】
前記シート状支持体（１０）が水を収容するように適合されたトレーであることを特徴とする、請求項１０に記載のデバイス（１）。
【請求項１２】
前記補助容器（１４）が、前記補助容器（１４）の基部から離れて位置する上げ底（１８）を具備し、前記上げ底（１８）が、前記補助容器（１４）の残部と流体連通していることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載のデバイス（１）。
【請求項１３】
生きている人間または動物への後の移植のためのエクスビボ生体試料（１００）を輸送する方法であって、以下の工程：
［ａ］冷温条件下で前記生体試料（１００）から血液を除去し、前記生体試料（１００）を迅速に冷却する工程、
［ｂ］断熱材製の壁（４）によって画定されたチャンバ（２）内に前記生体試料を置くことによって、外部からの酸素送達なしに保存溶液に浸漬された状態で前記生体試料（１００）を保持する工程、および
［ｃ］前記試料に超音波を照射する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記生体試料（１００）が、好ましくは密閉可能な、前記保存溶液が入っている補助容器（１４）内に浸漬された状態で置かれ、前記補助容器（１４）が前記チャンバ（２）内に置かれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記生体試料（１００）に照射するための前記照射工程において、超音波が、２５ｋＨｚ〜１ＭＨｚの間に含まれる周波数および０．０１〜２Ｗ／ｃｍ２の間に含まれる音波強度を有することを特徴とする、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記超音波が、０．０２〜１Ｗ／ｃｍ２の間、特に好ましくは０．０２〜０．１Ｗ／ｃｍ２の間に含まれる強度を有することを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記チャンバ（２）内の温度を０〜１５℃の間の温度に冷却するための冷却工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記冷却工程において、前記チャンバ（２）内の温度が２〜１０℃の間、特に好ましくは２〜６℃の間に保たれることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記補助容器（１４）をシート状支持体（１０）上に置く工程をさらに含むことを特徴とし、前記シート状支持体（１０）が、流体を収容するように適合されたトレーであり、前記トレーが、前記超音波を適用したときに自由に振動することができる、請求項１３〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１２のいずれかに記載のエクスビボ生体試料（１００）の輸送および保存のためのデバイス（１）の使用であって、前記生体試料（１００）を保存溶液に浸漬された状態で、酸素送達なしで、低温条件下で維持すること、および前記試料（１００）を後の実験研究で使用するために、前記生体試料（１００）の生存性、機能性、および前記生体試料（１００）の異なる細胞間の相互作用が保存されるように、前記生体試料（１００）に超音波を照射することを特徴とする、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エクスビボ生体試料の輸送および保存用デバイスであって、断熱材製の壁によって画定された、前記生体試料を収容するためのチャンバと、前記チャンバ内の温度を前記デバイス外の温度より低く保つための冷却手段とを具備する前記デバイス、および前記生体試料の保存のための対応する方法に関する。
【０００２】
本発明は、エクスビボ生体試料の輸送および保存ならびに生きている人間もしくは動物への後の移植のための、または後の実験研究のための、本発明によるデバイスの使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
（現状技術）
本発明において、「エクスビボ生体試料」の概念は、生きている人間もしくは動物への後の移植のためにまたは後の実験研究のために輸送されうる臓器または組織に関する。
【０００４】
例えば、虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）症候群が、原発性移植片機能不全（ｐｒｉｍａｒｙ  ｇｒａｆｔ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ、ＰＧＤ）と一次生着不全（ｐｒｉｍａｒｙ  ｇｒａｆｔ  ｆａｉｌｕｒｅ、ＰＧＦ）の両方の主原因の１つであり、ＰＧＦの場合には別の移植が必要であることは、移植分野では周知である。これまでの数十年間にわたり外科的手法に関して成し遂げられた進歩にも関わらず、ドナー臓器がレシピエントに埋め込まれるまでの輸送される期間（冷虚血時間）にその移植片が被る損傷は今なお、まだ解決されていない大きな社会的および臨床的に重要な問題である。移植された臓器の中で、ＰＧＦの発生率は５〜１０％であり、ＰＧＤの発生率は２０〜３０％である。これはいずれも、患者の不良な生活の質、再度の移植の必要、および移植用臓器の入手可能性のより多くの問題という負の結果をもたらす。
【０００５】
移植片をドナーから取り出す時点からレシピエントに埋め込むまで保管するための様々な方法がある。動的常温保存の場合、移植片のインビボ状態が全保存期間を通して可能な最大限まで模倣される。それを達成するために、低温は回避され、低酸素を防止するための移植片への酸素の入口および老廃物の出口のための貯蔵部が設けられる。
【０００６】
従来の保存法である静的低温保存の場合、ドナー移植片は、レシピエントに移植される前に、ドナーの臓器（単数または複数）および組織（複数）は固有の虚血時間に晒される。そのような条件下で臓器および組織の保存に使用される方法は、次の要件を順守しなければならない：移植片から血液を除去し、４℃の溶液での移植片の灌流によって移植片を急冷し、移植片を氷で覆って冷温条件（２〜６℃）および虚血状態を確保すること。結果として、冷虚血中に移植片が被る損傷、すなわち、冷温条件下での血液供給不足および酸素送達不足に起因する損傷は、低減される。
【０００７】
臓器がドナーから取り出される時点から、移植片は冷却器内に置かれ、保存溶液に浸漬され、そしてレシピエントに埋め込まれるまで通常は４℃に保たれる。当技術分野において最も広く使用されている溶液は、ウィスコンシン大学液（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）であり、これを以降ＵＷ液と呼ぶ。
【０００８】
レシピエントに埋め込まれるまでの冷却器での輸送（冷虚血時間、通常は６時間未満ではない）中に移植片が被る損傷が、重要な要因である。この要因は、ＰＧＤおよびＰＧＦに関与しており、患者の手術後の結果、生活の質および生存期間に悪影響を与える。臓器が冷却器内に留まる時間が長いほど、移植される移植片の生存性が低くなることは公知である。冷虚血段階の間に移植片が被る損傷は、相当数の臓器（３５％）をそれらの病的状態（高齢者、糖尿病および／または高血圧ドナーからの腎臓移植片、脂肪肝移植片など）を考えると移植に適していると見なすことができない、主な理由である。そのような臓器は、レシピエントに埋め込まれる前の輸送中にそれらが被る損傷に極めて脆弱であり、ＰＧＤおよびＰＧＦを経験するリスクがより高い。それ故、それらの移植は実行可能でない。これらの知見は、移植片がレシピエントに埋め込まれる前の冷虚血中に被る損傷を低減させるための代替法を見いだす必要があることを示している。
【０００９】
保存液中に存在する成分の多くは、移植片をレシピエントに埋め込むまでの輸送中に冷却器内で冷虚血下で保護することを目的とするものであり、移植片に侵入せず、侵入したとしても、移植片を保護するための最適な濃度では作用部位に到達しない。実際、成分の一部がそのような保存液から除去されたときの手術後および移植後の結果は、それらが除去されなかった場合と同じであることが判明した。
【００１０】
特許文献国際公開第２００７／１４３７１５号Ａ２パンフレットは、創傷部への酸素の送達および創傷治癒の促進を可能にする超音波の適用に関する。例として、この特許文献には、ドナーから取り出された後の臓器を保存するためのデバイスが極めて簡潔に開示されている。それを達成するために、臓器は、酸素で過飽和されたガスまたは液体が供給される器の中に置かれる。これは、中に収容されている酸素で飽和された酸素または液体溶液が酸素貯蔵部からその器に制御された流量で徐々に侵入し、老廃物が徐々に除去されるので、動的保存システムである。その臓器の器は、半剛性容器内に置かれる。この外側の容器は、容器に超音波を指向させるための超音波システムをさらに具備する。内側の器と外側の容器の間の超音波伝送手段はなく、そのためシステムが機能せず、超音波が創傷治癒のために創傷部に直接適用されたとしても機能しない。
【００１１】
超音波の適用が皮膚などの組織を通した血流への薬物および物質の送達を促進することを示す研究も、公知である。それにもかかわらず、前記研究では超音波がインビボで、すなわち血流の存在下で、適用される。超音波を適用する手段による経皮薬物送達分野に関する特許文献米国特許第４，７６７，４０２号Ａ明細書は、その使用に関連するリスクにも関する。この特許文献は、この技術に起因しうる皮膚温度上昇および潜在的傷害に関連するリスクのため、超音波を長時間使用しないように特に忠告している。同特許文献には、超音波が空気を通ってあまり伝送されないこと、したがって、超音波の好ましい適用には液体媒体が必要であることも開示されている。結果として、臓器および組織保存のための超音波の適用は、組織の局所加熱、組織または臓器の少なからぬ厚みに浸透することの難しさ、および気体媒体中での伝送の難しさといった上述の要因のため、望ましくない。
【００１２】
特許文献米国特許第５，２６７，９８５号Ａ明細書には、２つ以上の異なる周波数の超音波によって材料または組織の局所領域への物質の拡散を増進する方法および装置が開示されている。この特許文献には、超音波が適用されたときの局所温度上昇が、拡散される物質の浸透増加の促進に有益であることも開示されている。
【００１３】
論文（Ｓｅｎ  Ｗａｎｇら、Ｍｅｄｉａｌ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ、７４、２０１０、１４７−１４９）には、インビボでの中強度（０．３〜１．２Ｗ／ｃｍ２）の超音波を適用してドナー臓器の特定の領域を破損させ、その結果、幹細胞のみを活性化し、臓器を再生してレシピエントとより適合性でありうるハイブリッド臓器を形成することができると提言されている。
【００１４】
特許文献国際公開第２００５／０１３７９９号Ａ１パンフレットには、虚血時間後の再灌流中の、すなわち血液供給量が組織に入って行く間の、インビボでの超音波の適用に基づく方法が開示されている。超音波は、血液および酸素の組織への侵入に有利に働くように、および再灌流に起因する微小循環障害を低減させるために、短期間（１５分以下）しか適用されない。
【００１５】
したがって、超音波の適用が水性媒体中でも組織中でも熱を生じさせることは、当技術から推測することができる。わずか１〜１０分（ほとんどの医学的応用で使用される時間）の間、当技術分野において通例である周波数および強度で適用される超音波は、それだけで、組織の加熱の原因となり、これはエクスビボ生体試料の適切な保管にとってマイナス要因と解釈される。温度が３８℃を超えると、超音波への曝露は、組織を破損させるので通常は中断される。例えば、特許文献米国特許第５，２６７，９８５号明細書には、１〜２ｃｍの間の組織浸透を達成する１５〜３０分間の超音波使用の可能性が開示されている。
【００１６】
実際、超音波は、まさに組織の加熱を生じさせる治療法として、臨床診療に適用されることが多い。超音波のみに起因する加熱に加えて、セラミック変換器には振動で加熱する傾向があり、その結果、組織に対する熱の影響をさらにいっそう増加させる（Ｗａｔｓｏｎ  Ｔら、２００８、４８：３２１−３２９；Ｂａｋｅｒ  ＫＧら、２００１、８１：１３５１−１３５８；Ｌｅｇａｙ  Ｍら、２０１１、ＩＤ６７０１０８、１−１７）。
【発明の概要】
【００１７】
本発明の目的は、エクスビボ生体試料の輸送および保存用デバイス、ならびに前記生体試料の損傷を低減させる、したがって公知デバイスで得ることができるものと比較して前記生体試料の生存性を増加させる、上述のタイプの方法を提供することである。本発明は、移植の場合、移植患者の生活の質を向上させる問題、および最悪の場合、別の移植の必要性を有意に低減させる問題も考慮している。
【００１８】
この目的は、超音波を発生させて前記生体試料に適用するための好適な少なくとも１つの超音波システムをさらに具備することを特徴とする上述のタイプのエクスビボ輸送用デバイスによって達成される。したがって、生体試料の局所加熱およびその後のその生体試料の破損の原因となる温度上昇を防止するために、内側チャンバの冷却と併せて超音波の適用を行うことができる。詳細には、デバイスは、外部からの酸素送達がない、保存溶液を収容する補助容器であって、前記保存溶液に浸漬されている前記生体試料を収容するための補助容器も具備する。
【００１９】
したがって、予想に反して、超音波の適用は、試料内で局所加熱を生じさせないように適用されると、生体試料の冷却の好ましい効果に悪影響を与えず、したがってその生体試料を破損もさせないことが本発明において確認された。しかし、さらに、非常に有意な向上が超音波で達成されることが驚くべきことに確認され、これは、本明細書において後で分かるように、デバイスのチャンバ内への冷温条件の適用と超音波の適用との相乗効果を確信できる程のものであった。それを達成するために、低強度での生体試料の近くへの超音波の適用、またはより高強度での試料から離れているが試料を含有する保存液には接触している変換器の配置などの、多数の考えられる構成がある。
【００２０】
さらに、同じく予想に反して、超音波を適用する期間に関する問題を本発明では検証しなかった。言い換えると、臓器輸送に関して、試料を数時間、冷虚血条件下に置く必要性は公知である。本発明によれば、超音波を好適な強度で継続的に適用することができ、予想にかかわらず、超音波は生体試料を破損させもしない。
【００２１】
したがって、超音波を適用すること、および試料の局所加熱を防止することによって、細胞破損の有意な低減が確認された。さらに、行ったアッセイに基づいて、両方の処置を同時に適用することによる冷虚血によって誘導される損傷からの臓器の保護が、別々にそれらの処置によって得られるすべての保護の合計より意外にも良好であることが確認された。
【００２２】
さらに、本発明は、従属請求項の趣旨である一連の好ましい特徴、および下記の本発明の実施形態の詳細な説明において強調されることになる有用性を包含する。
【００２３】
好ましくは、前記補助容器は密閉可能である。
【００２４】
好ましい実施形態では、前記超音波システムは、２５ｋＨｚ〜１ＭＨｚの間に含まれる周波数、および０．０１〜２Ｗ／ｃｍ２の間、好ましくは０．０２〜１Ｗ／ｃｍ２の間、特に好ましくは０．０２〜０．１Ｗ／ｃｍ２の間に含まれる音波強度で前記超音波を放出するのに好適であることが確認された。これらの周波数および強度範囲は、細胞破損を低減させるのに特に有益であることが確認された。特に、より低い強度で、より良好な結果が得られ、試料の冷却および／または変換器と生体試料の離隔がより少なくてすむことから、デバイスをより小型にすることが可能になる。
【００２５】
超音波が連続方式でまたは代替的にパルス方式で適用されることを想定できることも好ましい。さらに、本発明は、デバイスの変換器の各々に対する対応する個別制御によって異なる周波数を有する超音波を同時に適用することを除外しない。
【００２６】
温度が低いほど、超音波で得られる相乗効果が大きいことも確認された。したがって、特に好ましい様式では、冷却手段は、前記チャンバ内の温度を０〜１５℃の間、好ましくは２〜１０℃の間、特に好ましくは２〜６℃の間に保つのに好適である。確認されたように相乗効果が大きいので、冷温条件と超音波との併用によって、別々に冷温条件の効果と超音波の効果を合計した最良の場合に予想されるものより良好な結果が得られる。
【００２７】
好ましい実施形態において、本発明によるデバイスは、生体試料の支持に好適なシート状支持体を前記チャンバ内に具備し、前記シート状支持体は、前記超音波が適用されたときに自由に振動することが可能であり、超音波システムは、前記シート状支持体の壁の少なくとも１つに載置された少なくとも１つの変換器を具備する。結果として、支持体の減衰効果は最小化され、超音波は、生体試料内の過度の局所加熱が防止されることを条件に、より効率的に生体試料に導入され、その結果、より嵩高い生体試料におけるその効果が向上される。
【００２８】
特に好ましい様式では、前記少なくとも１つの変換器は、前記超音波を支持体表面に向けて適用するために、前記生体試料の前記支持体表面とは反対側の前記シート状支持体の面に載置される。それによって均一な超音波場が得られ、これは、生体試料の冷温条件と超音波の併用効果に、よりいっそう有利に働く。シート状支持体がトレーであることおよびそのようなトレーが水などの流体を収容できることは、適用される超音波の伝送を向上させるために適切でありうる。流体の機能は、一方では冷却剤として作用することであり、同時に、生体試料への超音波の伝送に有利に働くことである。
【００２９】
特に好ましい様式では、前記シート状支持体は、その剛性を増し、減衰を最大限に防止するために、および生体試料に対する超音波のより直接的な伝送を達成するために、金属製である。
【００３０】
特に好ましい実施形態において、デバイスは、保存溶液を収容する密閉可能な補助容器を具備する。この場合もやはり、保存溶液への生体試料の浸漬に加えて冷温条件と超音波の併用によって、生体試料の破損を低減させることに関してそれらの個々の効果の合計より良好な結果が得られることが確認された。
【００３１】
本発明によるデバイスの実施形態において、シート状支持体は、流体を収容するように適合されたトレーである。
【００３２】
別の好ましい実施形態において、シート状支持体は、水を収容するトレーである。
【００３３】
別の好ましい実施形態において、補助容器は、前記補助容器の基部から離れて位置する上げ底を具備し、前記上げ底は、前記補助容器の残部と流体連通している。
【００３４】
また、特に好ましい様式では、補助容器は、容器の支持表面から離れて生体試料を保持するための上げ底を含むことができ、前記上げ底は、前記補助容器の残部と流体連通している。結果として、試料が保存溶液中に浮遊しているかのごとく試料を補助容器内に置くことができる。したがって、試料は、超音波の上述の直接作用を受けず、より高い強度で動作することができる。
【００３５】
さらに、本発明は、エクスビボ移植可能生体試料の輸送および保存のための方法であって、生体試料から血液を除去し、洗い流す工程、外部からの酸素送達がない断熱材製の壁によって画定されたチャンバ内に前記生体試料を置く工程、および前記試料に超音波を照射する工程を含むことを特徴とする方法も考慮している。より詳細には、本発明による方法では、断熱材製の壁によって画定されたチャンバ内に生体試料を置くことによって、外部からの酸素送達なしに保存溶液に浸漬された状態で前記生体試料を保持する。
【００３６】
好ましくは、前記生体試料は、好ましくは密閉可能な、前記保存溶液が入っている補助容器内に浸漬された状態で置かれ、前記補助容器は、前記チャンバ内に置かれる。
【００３７】
前記方法の一実施形態において、前記生体試料に照射するための照射工程では、超音波は、２５ｋＨｚ〜１ＭＨｚの間に含まれる周波数、および０．０１〜２Ｗ／ｃｍ２の間、特に好ましくは０．０２〜１Ｗ／ｃｍ２の間、特に好ましくは０．０２〜０．１Ｗ／ｃｍ２の間に含まれる音波強度を有する。
【００３８】
別の実施形態において、前記方法は、チャンバ内の温度を０〜１５℃の間、より好ましくは２〜１０℃の間、特に好ましい様式では２〜６℃の間の温度に冷却するための冷却工程を含む。
【００３９】
別の実施形態において、前記方法は、前記生体試料を保存溶液に浸漬された状態で保持することからなる工程をさらに含む。
【００４０】
最後に、前記方法は、前記補助容器をシート状支持体上に置く工程をさらに含み、前記シート状支持体は、流体を収容するように適合されたトレーであり、前記トレーは、前記超音波を適用したときに自由に振動することができる。
【００４１】
本発明は、エクスビボ生体試料の輸送および保存のためのデバイスの使用にも関する。このデバイスを用いて、生体試料を保存溶液に浸漬された状態で、酸素送達なしに、低温条件下で維持し、および前記試料を後の実験研究で使用するために、前記生体試料の生存性、機能性、および前記生体試料の異なる細胞間の相互作用が保存されるように前記試料に超音波を照射する。
【００４２】
さらに、本発明は、本発明の実施形態の詳細な説明および添付の図面で例証される他の詳細な特徴も包含する。
【００４３】
本発明のさらなる利点および特徴は、特性を一切限定することなく本発明の好ましい実施形態を添付の図面に関連して開示する、後続の説明から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、エクスビボ生体試料の輸送用デバイスの第１の実施形態の分解透視図を示す。
【図２】図２は、図４のデバイスの縦断面正面図を示す。
【図３】図３は、図１のデバイスの生体試料のための支持トレーの第１の実施形態の頂面図を示す。
【図４】図４は、図３のトレーの側面図を示す。
【図５】図５は、生体試料のための支持トレーの第２の実施形態を示す図である。
【図６】図６は、本発明による輸送用デバイスの第２の実施形態を示す図である。
【図７Ａ】図７Ａは、本発明による輸送用デバイスの第３の実施形態を示す図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７Ａのデバイスの補助容器の代替実施形態を示す図である。
【図８】図８は、当技術分野の現状の状態に関して肝臓の生体試料の保護率を示す図である。
【図９】図９は、当技術分野の現状の状態に関して腎臓の生体試料の保護率を示す図である。
【図１０】図１０は、当技術分野の現状の状態に関して肝臓の生体試料の保護率を示す図である。
【図１１】図１１は、当技術分野の現状の状態に関して腎臓の生体試料の保護率を示す図である。
【図１２】図１２は、当技術分野の現状の状態に関して肝臓の生体試料の保護率を示す図である。
【図１３】図１３は、当技術分野の現状の状態に関して腎臓の生体試料の保護率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
図１および２は、本発明によるエクスビボ移植可能生体試料１００の輸送および保存用デバイス１の第１の実施形態を示す。特に好ましい様式では、本発明によるデバイスは携帯用冷却器である。
【００４６】
既に前に示したように、生体試料１００は、ドナーとレシピエント（ヒトまたは動物でありうる）間で移植することができる臓器と、組織の両方を含む。さらに、生体試料は、必ずしも移植される必要がなく研究のためのものであってもよい。
【００４７】
本発明による輸送および保存用のデバイス１は、上面が開いている平行六面体形の主恒温容器１６を有する。主容器１６の断熱材製の壁４（主容器１６の上蓋を含む）が、生体試料１００を収容するためのチャンバ２を画定する。
【００４８】
チャンバ２内の温度を前記デバイス１外の温度より低く保つのに好適である冷却手段６が主容器１６内に備えられている。これらの冷却手段６は、塊氷、冷却ゲルパック、または圧縮機および熱交換器を具備するより複雑な解決策程も多岐にわたる、解決手段を含むことができる。デバイス１は、外部電源を有するまたは有さない輸送可能な冷却器からなることもある。それにもかかわらず、この解決手段は、この組立品の輸送性に影響を与えないように可能な限り軽いことが望ましい。冷却手段６は、チャンバ２内の温度を０〜１５℃の間に保つことが可能である。別の好ましい実施形態において、チャンバ２内の温度は、２〜１０℃の間、特に好ましくは２〜６℃の間に保たれる。
【００４９】
デバイス１は、中央部にシート状支持体１０を金属トレーとして具備し、前記金属トレーは、自由に振動できるようにチャンバ２内に支持されている。この第１の実施形態のトレーを図３および４においてより詳細に見ることができる。厚みが１ｍｍ未満、好ましくは０．５ｍｍであるアルミニウムトレーがこの実施形態では使用されている。
【００５０】
さらに、デバイスは、超音波を発生させて生体試料１００に適用するのに好適な超音波システムを具備する。そのために、図の超音波システムは、電気信号発生器２０、増幅器２２、電池２４、およびこの場合は４つの圧電変換器８を有する。
【００５１】
振動は、４つの変換器８を通してアルミニウムトレーとしてのシート状支持体１０に適用される。前記変換器８は、トレーの下面に載置されている。この構成の結果として、振動が生体試料の下部のすぐ下で発生されるので、変換器と生体試料１００間の伝送はより直接的である。特に好ましい様式では、図６から分かるように、トレーはさらに水を収容することができるが、超音波の伝送を向上させるために、生体試料１００は、保存溶液を充填した袋または容器に収容されることが予見される。本明細書において企図される保存溶液は、例えば、乳酸リンゲル液、セルシオ液（Ｃｅｌｓｉｏｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）またはウィスコンシン大学液である。
【００５２】
図５に示されている代替実施形態において、トレーは、横振動場を発生させるために変換器８を側壁に有することができる。あるいは、変換器８を側壁の両側に配置してもよく、トレーの底部に配置してもよい。
【００５３】
超音波変換器８は、２５ｋＨｚ〜１ＭＨｚの間に含まれる周波数および０．１〜２Ｗ／ｃｍ２の間に含まれる音波強度を有する機械的波長を、前記生体試料１００の輸送中に前記チャンバ２に伝送する。前記強度は、好ましくは０．０２〜１Ｗ／ｃｍ２の間、よりいっそう好ましくは０．０２〜０．１Ｗ／ｃｍ２の間に含まれうる。使用される音波強度が高いほど、変換器８はさらに離れた所にあることになり、および／または生体試料１００内の局所加熱を防止する目的を満たすためにデバイス１内に置かれる保存液または冷却剤の量は多くなる。さらに、本発明によれば、超音波を継続的に適用することができる。あるいは、超音波を間欠的に適用することもでき、すなわち、輸送継続期間中ずっとは超音波を適用しない。あるいは、超音波をパルス方式でおよび／または異なる周波数で、継続的にまたは間欠的に適用することもできる。
【００５４】
特に好ましい様式では、生体試料１００は、保存溶液が入っている入れ物に収容され、これは超音波適用の結果を向上させる。
【００５５】
前の段落に説明したのと同じ特徴の多くを共有する本発明による輸送用デバイス１の他の実施形態を下に示す。したがって、以降はそのような実施形態間で異なる要素のみを説明することにするが、共通の要素については第１の実施形態の説明を参照する。
【００５６】
図６のデバイス１の実施形態は、シート状支持体１０が主容器１６の壁４の中に直接組み込まれている点が主として異なる。
【００５７】
最後に、図７Ａのデバイスの実施形態では、補助容器１４が、保存溶液を有する主容器１６内に備えられている。特に好ましい様式では、補助容器１４は密閉可能であり、剛性の壁、およびその壁の１つに蝶着された蓋を有する。特に好ましい様式において、変換器がトレーの下部に配置される場合、補助容器１４は、変換器８の放出面全体を占有することが意図された寸法を有する。保存溶液が充填されているその補助容器１４の結果として、超音波は、より効率的に生体試料１００に到達する。特に好ましい様式では、補助容器１４は、高密度ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレートなどのような成形可能プラスチックを使用する熱成形によって製造される。また、特に好ましい様式では、前記材料は、補助容器１４を開ける必要なく生体試料１００を見ることができるようにするために、透明であるだろう。
【００５８】
図７Ａは、補助容器１４の代替実施形態を示す。この場合、補助容器１４は、前記補助容器１４の基部から離れて位置する上げ底１８を具備し、前記上げ底１８は、前記補助容器１４の残部と流体連通している。そのために上げ底によって生体試料１００は補助容器１４の支持表面から離れた所に置かれる。この場合、上げ底１８は、補助容器１４の側壁で支持された硬質プラスチックのシートからなる。したがって、適切な流体連通を達成するために、この場合は保存溶液の通過を可能にする複数の開口部２０が設けられており、その結果、前記溶液は、下方の変換器８から来る超音波の直接作用を受ける。
【００５９】
最後に、特に好ましい様式では、補助容器１４は、乳酸リンゲル保存溶液、セルシオ保存溶液またはウィスコンシン大学保存溶液からなる群からの保存液を無菌条件下で収容している。これによって、生体試料の適切な保存により好適な条件下での生体試料のよりいっそう衛生的な取り扱いが可能になる。
【００６０】
今までに説明した実施形態は非限定的な例を表し、したがって、示す例以外に請求項記載の特徴の多数の組合せが本発明の範囲内で可能であることは当業者には理解されるであろう。
【実施例】
【００６１】
（実験例）
本発明による方法を実施するために行った様々な試験を下で説明する。
【００６２】
（方法論）
実験実施手順は、ランドレース種のブタの肝臓および腎臓から行った。腎臓および肝臓を４℃の保存溶液で灌流して、臓器内に含まれている血液を除去し、臓器を冷温条件下で保持し、臓器を異なる保存溶液に浸漬するまで氷に漬けておいた。次に、それらの生体試料を冷却器内に置き、その冷却器内で超音波を用いてまたは用いずに８時間（肝臓）および２４時間（腎臓）保持した。すべての手順を麻酔下で実施し、この研究は、動物を使用する実験に関する欧州連合規則（指令８６／６０９／ＥＥＣ）を順守した。
【００６３】
（実験計画）
（実施手順１）
形成した実験群は次のとおりであった：
第１群：従来の輸送システムにおける保存溶液を用いる冷虚血群。この群を、使用した保存溶液に依存して異なる部分群に分けた。
【００６４】
１．１）４℃の乳酸リンゲル液での肝臓移植片（ｎ＝１０）および腎臓移植片（ｎ＝１０）の灌流、そして乳酸リンゲル液を用いる従来の輸送システムにおけるそのような臓器の、肝臓および腎臓についてそれぞれ８および２４時間、２〜６℃の間での保存；
１．２）１．１と同じだが、臓器の洗浄および保存にセルシオ液を使用；
１．３）１．１と同じだが、臓器の洗浄および保存にＵＷ（ウィスコンシン大学）液を使用。
【００６５】
第２群：前記システムにおける、超音波（２５ｋＨｚおよび０．０４Ｗ／ｃｍ２）を用いる、および保存溶液を用いない冷虚血群：４℃の乳酸リンゲル液での肝臓移植片（ｎ＝１０）および腎臓移植片（ｎ＝１０）の、これらの臓器が含有する血液の除去を目的としたこれらの臓器を洗浄するための灌流。洗浄後、臓器を、肝臓および腎臓についてそれぞれ８および２４時間、輸送システム内で、保存溶液を用いず、超音波（２５ｋＨｚおよび０．０４Ｗ／ｃｍ２）を用いて、２〜６℃の間で保管した。
【００６６】
第３群：輸送システムにおける、超音波（２５ｋＨｚおよび０．０４Ｗ／ｃｍ２）を用いる、および保存溶液を用いる冷虚血群：この群を、使用した保存溶液に依存して異なる部分群に分けた。
【００６７】
３．１）４℃の乳酸リンゲル液での肝臓移植片（ｎ＝１０）および腎臓移植片（ｎ＝１０）の灌流。その後、乳酸リンゲル液を用いて、腎臓および肝臓についてそれぞれ８および２４時間、輸送システム内で、超音波を用いて、２〜６℃の間に含まれる温度で、臓器を保管した。
【００６８】
３．２）３．１と同じだが、臓器の洗浄および保存にセルシオ液を使用；
３．３）３．１と同じだが、臓器の洗浄および保存にＵＷ液を使用。
【００６９】
周波数２５ｋＨｚおよび強度０．０４Ｗ／ｃｍ２で達成されるものより大きい保護を他の周波数および／または強度によって得ることができるかどうかを評価するための実験も実施した。これを行うために、次の実験を実施した。
【００７０】
第４群：前記システムにおける、超音波（４０、８０、２００、５８０ｋＨｚおよび１ＭＨｚ）および強度０．０４Ｗ／ｃｍ２を用いる、および保存溶液を用いる冷虚血群：この群を、使用した周波数に依存して異なる部分群に分けた。
【００７１】
４．１）４℃のＵＷ液での肝臓移植片（ｎ＝１０）および腎臓移植片（ｎ＝１０）の灌流。その後、臓器を、ＵＷ液中で、腎臓および肝臓についてそれぞれ８および２４時間、輸送システム内で、４０ｋＨｚおよび強度０．０４Ｗ／ｃｍ２の超音波を用いて、２〜６℃の間で保管した。
【００７２】
４．２）４．１と同じだが、８０ｋＨｚ、および強度０．０４Ｗ／ｃｍ２、および２〜６℃の間を使用。
【００７３】
４．３）４．１と同じだが、２００ｋＨｚ、および強度０．０４Ｗ／ｃｍ２、および２〜６℃の間を使用。
【００７４】
４．４）４．１と同じだが、５８０ｋＨｚ、および強度０．０４Ｗ／ｃｍ２、および２〜６℃の間を使用。
【００７５】
４．５）４．１と同じだが、１ＭＨｚ、および強度０．０４Ｗ／ｃｍ２、および２〜６℃の間を使用。
【００７６】
０．０４より大きい強度の超音波の効果を検証するための実験も実施した。そのために以下の実験を実施した：
第５群：前記システムにおける、超音波（２５ｋＨｚおよび強度０．１Ｗ／ｃｍ２）を用いる、および保存溶液を用いる冷虚血群。４℃のＵＷ液での肝臓移植片（ｎ＝１０）および腎臓移植片（ｎ＝１０）の灌流。その後、臓器を、腎臓および肝臓についてそれぞれ８および２４時間、輸送システム内で、２５ｋＨｚおよび強度０．１Ｗ／ｃｍ２の超音波を用いて、２〜６℃の間に含まれる温度で保管した。
【００７７】
以下の実験群をさらに加えて、保存溶液および冷温条件の効果を評価した：
第６群：従来の輸送システム内での、しかし保存溶液を用いない冷虚血群。４℃の乳酸リンゲル液での肝臓移植片（ｎ＝１０）および腎臓移植片（ｎ＝１０）の、これらの臓器が含有する血液の除去を目的としたこれらの臓器を洗浄するための灌流。洗浄後、保存溶液を用いずに、従来の冷却器において（超音波を用いずに）、肝臓および腎臓についてそれぞれ８および２４時間、２〜６℃の間で臓器を保管した。
【００７８】
第７群：非冷温条件虚血群および超音波（２５ｋＨｚおよび強度０．０４Ｗ／ｃｍ２）を併用したものまたはしなかったもの。この群を２つの部分群に分けた。
【００７９】
７．１）２０〜２５℃間の温度のＵＷ液での肝臓移植片（ｎ＝１０）および腎臓移植片（ｎ＝１０）の灌流。その後、肝臓および腎臓についてそれぞれ８および２４時間、２０〜２５℃の間に含まれる温度で臓器を保管した。
【００８０】
７．２）２０〜２５℃間に含まれる温度のＵＷ液での肝臓移植片（ｎ＝１０）および腎臓移植片（ｎ＝１０）の灌流。その後、肝臓および腎臓についてそれぞれ８および２４時間、２０〜２５℃の間に含まれる温度で、２５ｋＨｚおよび強度０．０４Ｗ／ｃｍ２の超音波を用いて、臓器を保管した。
【００８１】
（試料の採取および処理）
虚血終了時に実験群および部分群すべてにおいて、肝臓および腎臓灌流液試料を採取して、広く標準化されている技術を使用して虚血によって誘導された肝臓および腎臓破損を評定した。腎臓破損は、灌流液中のトランスアミナーゼレベルを判定することによって、および肝臓組織におけるカスパーゼ３活性を判定することによって評価した。腎臓破損は、灌流液中の乳酸デヒドロゲナーゼおよび腎臓組織におけるカスパーゼ３活性を判定することによって評価した。肝臓および腎臓組織試料中のＭＤＡ（マロンジアルデヒド）レベルを酸化ストレス指数として判定し、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）レベルを臓器エネルギー代謝保存指数として判定した（Ｓａｌａｈｕｄｅｅｎ  ＡＫら、Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌ  ２００３、３：２７３−２８０；Ｏｍａｒ  Ｒら、Ｇｕｔ  １９８９、３０：５１０−５１４；Ｐｅｒａｌｔａら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０００、２７９：Ｇ１６３−７１）。
【００８２】
統計的研究を分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって行い、その後、スチューデント−ニューマン−コイルス検定で統計的有意性レベルを決定した。
【００８３】
得られたおよび図に模式的に示した結果を下で詳細に説明する。
【００８４】
図８Ａ〜８Ｅ：肝臓破損を示すパラメータ、すなわち、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、カスパーゼ３活性、ＭＤＡ（マロンジアルデヒド）およびＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を、８時間の冷虚血の終了時に評価したときの、次の条件：ＵＷ液＋冷温条件（２〜６℃）、によって誘導した損傷に対する保護率、または言い換えると、下記条件１〜６のもとでの肝臓移植片からなる生体試料における肝臓損傷の低減率を示す。
【００８５】
条件（１〜６）：
１：ＵＷ液、超音波周波数２５ｋＨｚ、および冷温条件（２〜６℃）。
【００８６】
２：ＵＷ液、超音波周波数４０ｋＨｚ、および冷温条件（２〜６℃）。
【００８７】
３：ＵＷ液、超音波周波数８０ｋＨｚ、および冷温条件（２〜６℃）。
【００８８】
４：ＵＷ液、超音波周波数２００ｋＨｚ、および冷温条件（２〜６℃）。
【００８９】
５：ＵＷ液、超音波周波数５８０ｋＨｚ、および冷温条件（２〜６℃）。
【００９０】
６：ＵＷ液、超音波周波数１ＭＨｚ、および冷温条件（２〜６℃）。
超音波強度０．０４Ｗ／ｃｍ２をケース１〜６すべてに適用した。
【００９１】
図９Ａ〜９Ｄ：腎臓破損を示すパラメータ、すなわち、ＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）、カスパーゼ３活性、ＭＤＡおよびＡＴＰを、２４時間の冷虚血の終了時に評価したときの、次の条件：ＵＷ液＋冷温条件（２〜６℃）、によって誘導した損傷に対する下記条件１〜６での腎臓移植片からなる生体試料の保護率を示す。
【００９２】
１：ＵＷ液、超音波周波数２５ｋＨｚ、および冷温条件（２〜６℃）。
【００９３】
２：ＵＷ液、超音波周波数４０ｋＨｚ、および冷温条件（２〜６℃）。
【００９４】
３：ＵＷ液、超音波周波数８０ｋＨｚ、および冷温条件（２〜６℃）。
【００９５】
４：ＵＷ液、超音波周波数２００ｋＨｚ、および冷温条件（２〜６℃）。
【００９６】
５：ＵＷ液、超音波周波数５８０ｋＨｚ、および冷温条件（２〜６℃）。
【００９７】
６：ＵＷ液、超音波周波数１ＭＨｚ、および冷温条件（２〜６℃）。
超音波強度０．０４Ｗ／ｃｍ２をケース１〜６すべてに適用した。
【００９８】
図１０：肝臓破損を示すパラメータであるＡＳＴを８時間の冷虚血の終了時に評価したときの、次の条件：保存溶液不使用＋冷温条件（２〜６℃）＋超音波なし、によって誘導した損傷に対する肝臓の保護率を示す。
【００９９】
１：乳酸リンゲル液、超音波を用いない、および冷温条件（２〜６℃）を用いる。
【０１００】
２：セルシオ液、超音波を用いない、および冷温条件（２〜６℃）を用いる。
【０１０１】
３：ＵＷ液、超音波を用いない、および冷温条件（２〜６℃）を用いる。
【０１０２】
４：乳酸リンゲル液、超音波（２５ｋＨｚおよび０．０４Ｗ／ｃｍ２）を用いる、および冷温条件（２〜６℃）を用いる。
【０１０３】
５：セルシオ液、超音波（２５ｋＨｚおよび０．０４Ｗ／ｃｍ２）を用いる、および冷温条件（２〜６℃）を用いる。
【０１０４】
６：ＵＷ液、超音波（２５ｋＨｚおよび０．０４Ｗ／ｃｍ２）を用いる、および冷温条件（２〜６℃）を用いる。
【０１０５】
注記：使用した保存溶液の中で、臨床診療における標準溶液はＵＷ（ウィスコンシン大学）保存溶液である。乳酸リンゲル液は、薬物を含有せず、無機塩のみを含有する。セルシオ液は、グルタチオンを含有し、ＵＷ液は、より多くの薬物、例えばアデノシン、グルタチオンおよびアロプリノールを含有する。
【０１０６】
図１１：腎臓破損を示すパラメータであるＬＤＨを２４時間の冷虚血の終了時に評価したときの、次の条件：保存溶液不使用＋冷温条件（２〜６℃）＋超音波なし、によって誘導した損傷に対する腎臓の保護率を示す。
【０１０７】
１：乳酸リンゲル液、超音波を用いない、および冷温条件（２〜６℃）を用いる。
【０１０８】
２：セルシオ液、超音波を用いない、および冷温条件（２〜６℃）を用いる。
【０１０９】
３：ＵＷ液、超音波を用いない、および冷温条件（２〜６℃）を用いる。
【０１１０】
４：乳酸リンゲル液、超音波（２５ｋＨｚおよび０．０４Ｗ／ｃｍ２）を用いる、および冷温条件（２〜６℃）を用いる。
【０１１１】
５：セルシオ液、超音波（２５ｋＨｚおよび０．０４Ｗ／ｃｍ２）を用いる、および冷温条件（２〜６℃）を用いる。
【０１１２】
６：ＵＷ液、超音波（２５ｋＨｚおよび０．０４Ｗ／ｃｍ２）を用いる、および冷温条件（２〜６℃）を用いる。
【０１１３】
図１２：肝臓破損を示すパラメータであるＡＳＴを８時間の冷虚血の終了時に評価したときの、次の条件：ＵＷ保存溶液＋冷温条件を用いない（２０〜２５℃）＋超音波なし、によって誘導した損傷に対する肝臓の保護率を示す。
【０１１４】
１：ＵＷ液、超音波を用いない、および冷温条件（２〜６℃）を用いる。
【０１１５】
２：ＵＷ液、超音波を用いる、および冷温条件を用いない（２０〜２５℃）。
【０１１６】
３：保存溶液を用いない、超音波を用いる、および冷温条件（２〜６℃）を用いる。
【０１１７】
４：ＵＷ液、超音波（２５ｋＨｚおよび０．０４Ｗ／ｃｍ２）を用いる、および冷温条件（２〜６℃）を用いる。予想結果：保護１＋保護２＝保護（１＋２）
５：ＵＷ液、超音波（２５ｋＨｚおよび０．０４Ｗ／ｃｍ２）を用いる、および冷温条件（２〜６℃）を用いる。実際に観察された結果。保護１＋保護２＜保護（１＋２）。
【０１１８】
図１３：腎臓破損を示すパラメータであるＬＤＨを２４時間の冷虚血の終了時に評価したときの、次の条件：ＵＷ保存溶液＋冷温条件を用いない（２０〜２５℃）＋超音波なし、によって誘導した損傷に対する腎臓の保護率を示す。
【０１１９】
１：ＵＷ液、超音波を用いない、および冷温条件（２〜６℃）を用いる。
【０１２０】
２：ＵＷ液、超音波を用いる、および冷温条件を用いない（２０〜２５℃）。
【０１２１】
３：保存溶液を用いない、超音波を用いる、および冷温条件（２〜６℃）を用いる。
【０１２２】
４：ＵＷ液、超音波（２５ｋＨｚおよび０．０４Ｗ／ｃｍ２）を用いる、および冷温条件（２〜６℃）を用いる。予想結果：保護１＋保護２＝保護（１＋２）。
【０１２３】
５：ＵＷ液、超音波（２５ｋＨｚおよび０．０４Ｗ／ｃｍ２）を用いる、および冷温条件（２〜６℃）を用いる。実際に観察された結果。保護１＋保護２＜保護（１＋２）。
【０１２４】
（実験結果の考察）
予想通り、超音波を適用しないと、冷却器内、保存液中および臓器内の温度が２〜６℃の間の範囲であったことを指摘することは重要である。加えて、冷温条件下（２〜６℃）下での超音波の適用は、冷却器内の温度を変更せず、冷却器内の温度はすべての実験について２〜６℃の間であったが、臓器および保存溶液の冷却は損なわれた。
【０１２５】
超音波を適用したとき、冷却器内の温度は２〜６℃の間の範囲であり、保存液の温度は１４〜１６℃の間、および臓器の温度は１６〜１８℃の間の範囲であった。
【０１２６】
超音波に起因する加熱の影響は、対象となる背景技術文献に従って予想される結果である。それにもかかわらず、低温虚血条件下で臓器を保管するための臓器の冷却（４℃）ならびに保存液および臓器温度の２〜６℃の間での保持の大きな重要性を考慮して予想されることに反して、結果は、超音波の適用が生体試料の冷却効果に悪影響を与えず、したがって、生体試料を破損させないことを示す。
【０１２７】
しかし、さらに、非常に有意な向上が達成されることが驚くべきことに確認され、これは、デバイスのチャンバ内への冷温条件の適用と超音波の適用との相乗効果を確信できる程のものであった。
【０１２８】
図８Ａ〜８Ｅ：これらの図に示すように、すべての条件下で（異なる周波数および同じ強度０．０４Ｗ／ｃｍ２で）、超音波の適用は、冷虚血条件下の肝臓移植片を保護し、前記保護効果は、条件１のもとで、すなわち、周波数２５ｋＨｚで、より明らかであった。図に示さない他の結果は、０．１Ｗ／ｃｍ２の場合のようなより高い強度でも肝臓移植片の保護が得られることを示す。例えば、肝臓破損のパラメータであるＡＳＴを８時間の冷虚血の終了時に評価したとき、条件：ＵＷ液＋冷温条件（２〜６℃）に対して周波数２５ｋＨｚおよび強度０．１Ｗ／ｃｍ２で保護率または損傷低減率５５％が得られる。
【０１２９】
図９Ａ〜９Ｄ：肝臓について図８Ａ〜８Ｅに示したのと同じ腎臓保護パターンを示す。
【０１３０】
図１０：予想通り、超音波を適用せずに保存溶液（条件１〜３）によってもたらされる肝臓の保護が観察される；肝臓移植片の保護は、ＵＷ保存溶液を使用した場合、両方の溶液（リンゲルまたはセルシオ）より良好であり、セルシオ液によって得られる保護は、乳酸リンゲル液によって得られるものより良好である。加えて、超音波の存在下での保存溶液（条件４〜６）によってもたらされる保護をよく見ると、超音波のより良好な保護を示す予想外の結果が得られるが、そのような保護は、すべての条件（４〜６）下で同様である。言い換えると、使用する保存溶液にかかわらず、それが乳酸リンゲル液であろうと、セルシオ液であろうと、またはＵＷ液であろうと、同程度の保護が得られる。
【０１３１】
図１１：肝臓について図１０に示したのと同じ腎臓保護パターンを示す。
【０１３２】
図１２：予想通り、超音波を適用しない（条件１）およびＵＷ液を使用する冷温条件は、４℃のＵＷを用いる室温（２０〜２５℃）での保存と比較したとき、肝臓移植片の保護を約３０％増加させる。意外にも、条件２（ＵＷ液、超音波の存在下、および室温で）によって得られる保護は、条件１（ＵＷ液、および超音波を用いない冷却）のものより良好である。言い換えると、４℃の保存溶液の存在下では、低温条件下（２〜６℃の間の温度のチャンバ）のもとで超音波を用いないより、室温のチャンバにおいて超音波を適用するほうが良好である。条件３（保存溶液を用いない、冷温条件下、および超音波を用いる）のもとで得られる保護は、条件１および２のもとで得られるものより良好であることを示す結果もまた予想外である。これらの結果は、超音波と冷温条件の併用が（保存溶液の存在がなくても）、保存溶液の存在と冷温条件（条件１）または超音波（条件２）の併用より良好であることを示す。条件４および５は、ＵＷ液、超音波および冷温条件を使用したときにそれぞれ予想および観察された保護を示す。予想された保護は、最良の場合、条件１で得られる保護と条件２で得られる保護の合計である。言い換えると、超音波によって誘導される熱効果のため、保護１＋２は、それぞれに考えられる条件１と条件２の合計に対応すると予想されなかった。しかし、これらは、観察された結果ではなかった。得られた結果は、両方の処置（冷温条件および超音波）を併用したとき、相乗効果を示した。なぜなら、両方の処置を併用したときに得られる保護が両方の処置を別々に適用したときに得られる保護の合計よりはるかに良好であるからである。さらに、両方の処置を併用したときに保存溶液の存在下で得られる保護は、保存溶液を用いずに両方の処置を併用したとき（条件３）に得られるものよりはるかに良好である。
【０１３３】
図１３：肝臓について図５に示したのと同じ腎臓保護パターンを示す。
【０１３４】
したがって、すべての結果を考慮して、保存溶液、超音波および冷温条件の併用は、冷虚血中の臓器の輸送および保存の極めて有効な戦略でありうる。
【０１３５】
低温条件下で、酸素送達なしで、現在利用可能なものより良好な条件下で、およびチャンバ内の臓器または組織への超音波の有効な伝達を用いて、生体試料を輸送および保管する方法および装置を提供する。このすべてにより、冷虚血の有害作用を低減させること、およびレシピエントに埋め込まれる前の移植片の生存性の増すこと、それによって、別の移植を行う必要がないようにすることが可能となる。
【０１３６】
前記保存装置および方法は、二次臓器においても有用でありうる。したがって、移植に利用可能な臓器の数が増し、その結果、待機リストを減らすことができるだろう。さらに、臓器の保存および輸送中に冷虚血によって誘導される損傷が低減されるので、臓器をレシピエントに埋め込むまでの冷却器内での輸送中の時間を伸ばすことができる。さらに、前記装置は、数ある要因の中でも特に、臓器の動的保存の結果として生ずる運搬上のやっかいな問題を防ぐように、輸送することが容易である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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