(57)【要約】本開示は、少なくとも１のヒト化ＣＤ３結合ドメインを有する、特異的にＣＤ３に結合するタンパク質分子に関する。かかる分子は、がんの治療に有用である。ＣＤ３に結合するタンパク質分子は、他の標的に結合する第２の結合ドメインを有し得る。一実施形態においては、多特異性ポリペプチド分子は腫瘍抗原発現細胞及びＴ細胞上のＴ細胞受容体複合体のＣＤ３サブユニットの双方に結合し、標的依存性Ｔ細胞細胞障害性、活性化、及び増殖を誘導する。また本開示は、ＣＤ３結合ポリペプチド分子を含む医薬品組成物、これらのポリペプチドをコードする核酸分子及びこれらの分子の生成方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＤ３に特異的に結合し、かつ免疫グロブリンＬ鎖可変領域及び免疫グロブリンＨ鎖可変領域を含むＣＤ３結合ドメインであって； 
前記免疫グロブリンＬ鎖可変領域は、 
（ａ）配列番号８８におけるアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一もしくは少なくとも約９９％同一である；または
（ｂ）配列番号８９におけるアミノ酸配列と少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一もしくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、；かつ
前記免疫グロブリンＨ鎖可変領域は、配列番号８６におけるアミノ酸配列と少なくとも約８２％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約約８７％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一もしくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、前記ＣＤ３結合ドメイン。
【請求項２】
配列番号８３または配列番号８４におけるアミノ酸配列と少なくとも約８７％同一、 少なくとも約９０％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、 少なくとも約９８％同一もしくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＤ３結合ドメイン。
【請求項３】
前記免疫グロブリンＬ鎖可変領域が、（ａ）配列番号９４のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号９５のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号９６のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリンＨ鎖可変領域が配列番号９１のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号９２のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；または
（ｂ）配列番号２０２のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２０３のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号２０４のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリンＨ鎖可変領域が配列番号１９９のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２００のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号２０１のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＤ３結合ドメイン。
【請求項４】
ヒトＣＤ３に特異的に結合し、かつ免疫グロブリンＬ鎖可変領域及び免疫グロブリンＨ鎖可変領域を含むＣＤ３結合ドメインであって；
（ａ）前記免疫グロブリンＬ鎖可変領域が配列番号９４のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号９５のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号９６のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリンＨ鎖可変領域が配列番号９１のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号９２のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；または
（ｂ）前記免疫グロブリンＬ鎖可変領域が配列番号２０２のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２０３のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号２０４のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリンＨ鎖可変領域が配列番号１９９のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２００のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号２０１のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み：かつ
任意の以下の性質：
（ｉ）ＣＤ３結合ドメインの熱転移中間点は、少なくとも約５４℃、少なくとも約５５℃、少なくとも約５６℃、または少なくとも約５７℃であり得、及び約７２℃以下である；
（ｉｉ）ＣＤ３結合ドメインは約２５℃のＰＢＳでの保管において、少なくとも約６日、少なくとも約１０日、または少なくとも約１３日及び約９０日以下にわたり安定的である；
（ｉｉｉ）ＣＤ３結合ドメインは、約１０ｎＭ以下のＥＣ５０を有するヒトＣＤ３に結合する；及び
（ｉｖ）ＣＤ３結合ドメインは、約３０ｎＭ以下のＥＣ５０を有するカニクイザルＣＤ３に結合するの、１以上を有する、前記ＣＤ３結合ドメイン。
【請求項５】
前記免疫グロブリンＬ鎖可変領域及び前記免疫グロブリンＨ鎖可変領域は、フレームワーク領域を含み、前記免疫グロブリンＬ鎖可変領域及び前記免疫グロブリンＨ鎖可変領域の少なくとも一方はヒト化されている、先行請求項いずれか一項に記載のＣＤ３結合ドメイン。
【請求項６】
前記免疫グロブリンＬ鎖可変領域は、ヒトＩＧＫＶ３Ｄ‐２０＊１生殖系列アミノ酸配列に基づくフレームワーク領域を含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載のＣＤ３結合ドメイン。
【請求項７】
前記免疫グロブリンＨ鎖可変領域は、ヒトＩＧＨＶ１‐６９＊０２生殖系列アミノ酸配列に基づくフレームワーク領域を含む、請求項３〜６のいずれか一項に記載のＣＤ３結合ドメイン。
【請求項８】
前記免疫グロブリンＬ鎖可変領域の、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従い位置５２におけるアミノ酸残基はアルギニンであり、かつ／または前記免疫グロブリンＬ鎖可変領域の、ＩＭＧＴナンバリングシステムによる位置５３におけるアミノ酸残基はトリプトファンである、先行請求項いずれか一項に記載のＣＤ３結合ドメイン。
【請求項９】
ＣＤ３結合ドメインにおける前記免疫グロブリンＨ鎖可変領域の、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従い位置２７におけるアミノ酸残基はチロシンである、請求項１に記載のＣＤ３結合ドメイン。
【請求項１０】
前記ＣＤ３結合ドメインは、以下：
（ａ）前記免疫グロブリンＨ鎖可変領域の、ＩＭＧＴナンバリングシステムによる位置９におけるアミノ酸残基はプロリンである；
（ｂ）前記免疫グロブリンＨ鎖可変領域の、ＩＭＧＴナンバリングシステムによる位置５３におけるアミノ酸残基はイソロイシンである；及び
（ｂ）前記免疫グロブリンＨ鎖可変領域の、ＩＭＧＴナンバリングシステムによる位置２１におけるアミノ酸残基はメチオニンであるの１以上を含む、請求項１に記載のＣＤ３結合ドメイン。
【請求項１１】
前記免疫グロブリンＨ鎖可変領域の、ＩＭＧＴナンバリングシステムによる位置８７におけるアミノ酸残基はチロシンである、請求項１に記載のＣＤ３結合ドメイン。
【請求項１２】
前記免疫グロブリンＨ鎖可変領域の、ＩＭＧＴナンバリングシステムによる位置８６におけるアミノ酸残基はアスパラギン酸である、請求項１に記載のＣＤ３結合ドメイン。
【請求項１３】
前記免疫グロブリンＨ鎖可変領域の、ＩＭＧＴナンバリングシステムによる位置８６におけるアミノ酸残基はアスパラギン酸であり、かつ前記免疫グロブリンＨ鎖可変領域の、ＩＭＧＴナンバリングシステムによる位置８７におけるアミノ酸残基はチロシンである、請求項１に記載のＣＤ３結合ドメイン。
【請求項１４】
前記ＣＤ３結合ドメインは、配列番号８３または配列番号８４を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ３結合ドメイン。
【請求項１５】
前記ＣＤ３結合ドメインは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ３結合ドメイン。
【請求項１６】
前記ｓｃＦｖは、前記ｓｃＦｖのＨ鎖可変領域とＬ鎖可変領域との間にリンカーを含み、前記リンカーはアミノ酸配列ＱＲＨＮＮＳＳＬＮＴＧＴＱＭＡＧＨＳＰＮＳ（配列番号１４８）を含む、請求項１５に記載のＣＤ３結合ドメイン。
【請求項１７】
前記ｓｃＦｖのＨ鎖可変領域は前記ｓｃＦｖのＬ鎖可変領域にアミノ末端である、請求項１５に記載のＣＤ３結合ドメイン。
【請求項１８】
前記ＣＤ３結合ドメインは、配列番号９０を含むＬ鎖可変領域及び配列番号８７を含むＨ鎖可変領域を含むＣＤ３結合ドメインの熱安定性と比較する場合、少なくとも約１０％増加する熱安定性を有する、請求項１に記載のＣＤ３結合ドメイン。
【請求項１９】
前記ＣＤ３結合ドメインの熱転移中間点（Ｔｍ）は、配列番号９０を含むＬ鎖可変領域及び配列番号８７を含むＨ鎖可変領域を含むＣＤ３結合ドメインのＴｍと比較した場合、少なくとも約３℃、少なくとも約４℃、少なくとも約５℃、または少なくとも約６℃上昇し、約２０℃以下上昇する、請求項１に記載のＣＤ３結合ドメイン。
【請求項２０】
前記ＣＤ３結合ドメインの熱転移中間点は、少なくとも約５４℃、少なくとも約５５℃、少なくとも約５６℃、または少なくとも約５７℃であり、及び約７２℃以下である、請求項１に記載のＣＤ３結合ドメイン。
【請求項２１】
前記熱安定性または熱転移中間点は、示差走査熱量測定もしくは示差走査蛍光定量法により計測される、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のＣＤ３結合ドメイン。
【請求項２２】
前記ＣＤ３結合ドメインが、配列番号９０を含むＬ鎖可変領域及び配列番号８７を含むＨ鎖可変領域を含むＣＤ３結合ドメインの保存性と比較した場合、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、及び約１００％以下増加する保存性を有する、請求項１に記載のＣＤ３結合ドメイン。
【請求項２３】
前記ＣＤ３結合ドメインが、ＰＢＳ中において約２５℃で保管される、請求項２２に記載のＣＤ３結合ドメイン。
【請求項２４】
前記ＣＤ３結合ドメインは、ＰＢＳ中で約２５℃での保管において、少なくとも約６日、少なくとも約１０日、または少なくとも約１３日及び９０日以下にわたり安定的である、請求項１に記載のＣＤ３結合ドメイン。
【請求項２５】
前記ＣＤ３結合ドメインは、配列番号９０を含むＬ鎖可変領域及び配列番号８７を含むＨ鎖可変領域を含むＣＤ３結合ドメインの、組換え発現の間に生成される高分子量凝集体のレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％減少、少なくとも約３０％減少、ならびに約５０％以下減少した組換え発現の間に生成される高分子量凝集体のレベルを有する、請求項１に記載のＣＤ３結合ドメイン。
【請求項２６】
前記ＣＤ３結合ドメインは約１０ｎＭ以下のＥＣ５０を有するヒトＣＤ３に結合する、請求項１に記載のＣＤ３結合ドメイン。
【請求項２７】
前記ＣＤ３結合ドメインが、カニクイザルＣＤ３に特異的に結合する、請求項1に記載のＣＤ３結合ドメイン。
【請求項２８】
前記ＣＤ３結合ドメインは約３０ｎＭ以下のＥＣ５０を有するカニクイザルＣＤ３に結合する、請求項２７に記載のＣＤ３結合ドメイン。
【請求項２９】
先行請求項のいずれか一項に記載のＣＤ３結合ドメインを含むＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項３０】
前記ＣＤ３結合ポリペプチドが免疫グロブリン定常領域を含む、請求項２９に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項３１】
Ｔ細胞上のＣＤ３タンパク質に結合する場合、前記ＣＤ３結合ポリペプチドは、前記Ｔ細胞からサイトカイン放出を誘導しないか、またはごくわずかに検出可能なサイトカイン放出を誘導する、請求項２９または３０に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項３２】
前記ＣＤ３結合ポリペプチドがＴ細胞活性化またはＴ細胞増殖を誘導する、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項３３】
第２の結合ドメインをさらに含む、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項３４】
前記ＣＤ３結合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、（ｉ）前記第２の結合ドメイン、（ｉｉ）ヒンジ領域、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域、（ｉｖ）カルボキシル末端リンカー、及び（ｖ）ＣＤ３結合ドメインを含む、請求項３３に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項３５】
（ｉ）前記ＣＤ３結合ドメインは、（ａ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリンＬ鎖可変領域、ならびに（ｂ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリンＨ鎖可変領域を含み；かつ
（ｉｉ）前記第２の結合ドメインは、（ａ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリンＬ鎖可変領域、ならびに（ｂ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリンＨ鎖可変領域を含む、請求項３３または３４に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項３６】
前記ヒンジ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域由来である、請求項３４または３５に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項３７】
前記カルボキシル末端リンカーは、配列番号１９６を含むか、またはそれからなる、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項３８】
前記免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２またはＩｇＤの免疫グロブリンＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、請求項２７〜３７のいずれか一項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項３９】
前記免疫グロブリン定常領域は、ＥＵナンバリングシステムに従い、置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、及びＫ３２２Ａを含むヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインを含む、請求項３８に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項４０】
前記ＣＤ３結合ポリペプチドがリダイレクトＴ細胞細胞障害性（ＲＴＣＣ）を誘導する、請求項３３〜３９のいずれか一項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項４１】
前記ＣＤ３結合ポリペプチドは約３０ｎＭ以下のＥＣ５０を有するＲＴＣＣを誘導する、請求項４０に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項４２】
前記第２の結合ドメインは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項３３〜４１のいずれか一項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項４３】
前記第２の結合ドメインが腫瘍関連抗原に結合するか、または相互作用する、請求項３３〜４２のいずれか一項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項４４】
前記ＣＤ３結合ポリペプチドは、前記腫瘍関連抗原を発現する細胞のＴ細胞依存性溶解を誘導する、請求項４３に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項４５】
前記腫瘍関連抗原は、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、Ｈｅｒ２、ＲＯＲ１、ＲＯＮ、糖タンパク質Ａ３３抗原（ｇｐＡ３３）、及びＣＥＡからなる群から選択される、請求項４３に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項４６】
前記ＣＤ３結合ポリペプチドが免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインをさらに含む、請求項２９〜４５のいずれか一項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項４７】
前記免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインが、免疫グロブリンＣＨ１ドメインまたは免疫グロブリンＣＬドメインを含む、請求項４６に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項４８】
前記ＣＤ３結合ポリペプチドが、（ｉ）アミノ末端からカルボキシル末端またはカルボキシル末端からアミノ末端の順で、（ａ）特異的にヒトＣＤ３に結合するＣＤ３結合ドメイン、（ｂ）第１のヒンジ領域、（ｃ）第１の免疫グロブリン定常領域、及び（ｄ）第１の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインを含む第１のポリペプチド鎖；ならびに（ｉｉ）アミノ末端からカルボキシル末端またはカルボキシル末端からアミノ末端の順で、（ａ’）第２のヒンジ領域、（ｂ’）第２の免疫グロブリン定常領域、及び（ｃ’）前記第１の単鎖ポリペプチドの第１の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインと異なる第２の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインを含む第２のポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体ＣＤ３結合タンパク質であり、前記第１及び第２の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは互いに関連し、ヘテロ二量体を形成する、請求項２９〜４７のいずれか一項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項４９】
前記第１の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは免疫グロブリンＣＨ１ドメインを含み、前記第２の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは免疫グロブリンＣＬドメインを含むか、または前記第１の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは免疫グロブリンＣＬドメインを含み、前記第２の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは免疫グロブリンＣＨ１ドメインを含む、請求項４８に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項５０】
前記第１及び第２の免疫グロブリン定常領域の少なくとも一方は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤもしくは任意のそれらの組み合わせの免疫グロブリンＣＨ２及びＣＨ３ドメイン；ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭもしくは任意のそれらの組み合わせの免疫グロブリンＣＨ３ドメイン；またはＩｇＥ、ＩｇＭもしくは任意のそれらの組み合わせの免疫グロブリンＣＨ３及びＣＨ４ドメインを含む、請求項４９に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項５１】
前記第２のポリペプチド鎖は、第２の結合ドメインをさらに含む、請求項４８に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項５２】
前記第２の結合ドメインは、前記第２のヒンジ領域にアミノ末端である、請求項５１に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項５３】
前記ＣＤ３結合ポリペプチドが、ＣＤ３結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含む二重特異性単鎖抗体分子であり、前記結合ドメインは、ＶＨ  ＣＤ３‐ＶＬ  ＣＤ３‐ＶＨ  第２の結合ドメイン‐ＶＬ  第２の結合ドメインもしくはＶＬ  ＣＤ３‐ＶＨ  ＣＤ３‐ＶＨ  第２の結合ドメイン‐ＶＬ  第２の結合ドメインまたはＶＨ  第２の結合ドメイン‐ＶＬ  第２の結合ドメイン‐ＶＨ  ＣＤ３‐ＶＬ  ＣＤ３もしくはＶＨ  第２の結合ドメイン‐ＶＬ  第２の結合ドメイン‐ＶＬ  ＣＤ３‐ＶＨ  ＣＤ３の順で配置されている、請求項２９〜４５のいずれか一項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【請求項５４】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載のＣＤ３結合ドメインもしくは請求項２９〜５３のいずれか一項に記載のＣＤ３結合ポリペプチドまたは前記ＣＤ３結合ドメインもしくはポリペプチドの一部をコードする単離核酸分子。
【請求項５５】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載のＣＤ３結合ドメインまたは請求項２９〜４７のいずれか一項に記載のＣＤ３結合ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含む発現ベクターであって、前記核酸セグメントは、宿主細胞において前記核酸セグメントの発現に好適な制御配列に作動可能に結合している、前記発現ベクター。
【請求項５６】
請求項５５に記載の発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項５７】
第１及び第２の発現ユニットを含む発現ベクターであって、
前記第１及び第２の発現ユニットは、それぞれ請求項４８〜５２のいずれか一項に記載のヘテロ二量体ＣＤ３結合ポリペプチドの前記１及び第２のポリペプチド鎖をコードする１及び第２の核酸セグメントを含み、
前記１及び第２の核酸セグメントは宿主細胞において前記核酸セグメントの発現に好適な制御配列に作動可能に結合している、前記発現ベクター。
【請求項５８】
請求項５７に記載の発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項５９】
ＣＤ３結合ポリペプチドの生成方法であって、請求項５６に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞を、核酸セグメントが発現する条件下で培養し、それによりＣＤ３結合ポリペプチドを生成する、前記方法。
【請求項６０】
ＣＤ３結合ポリペプチドを回収することをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ヘテロ二量体ＣＤ３結合タンパク質の生成方法であって、
第１及び第２の発現ユニットを含む発現ベクターを含む組換え宿主細胞を培養することを含み、前記第１及び第２の発現ユニットはそれぞれ、請求項４８〜５２のいずれか一項に記載のヘテロ二量体ＣＤ３結合タンパク質の前記第１及び第２のポリペプチド鎖をコードする第１及び第２の核酸セグメントを含み、前記第１及び第２の核酸セグメントは、宿主細胞中の核酸セグメントの発現に好適な制御配列に、動作可能に結合し、
前記培養は、前記第１及び第２の核酸セグメントが発現し、前記コードされたポリペプチド鎖がヘテロ二量体ＣＤ３結合タンパク質として生成される条件下で行われる、前記方法。
【請求項６２】
前記ヘテロ二量体ＣＤ３結合タンパク質を回収することをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
請求項２９〜５３のいずれか一項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド及び医薬的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬品組成物。
【請求項６４】
腫瘍関連抗原を発現する細胞に対するリダイレクトＴ細胞細胞障害性（ＲＴＣＣ）を誘導する方法であって、前記腫瘍関連抗原発現細胞を、請求項４４〜５３のいずれか一項に記載のＣＤ３結合ポリペプチドに接触させることを含み、前記接触は、前記腫瘍関連抗原発現細胞に対するＲＴＣＣが誘導される条件下で行われる、前記方法。
【請求項６５】
腫瘍増殖の阻害をそれを必要とする対象において行うための方法であって、治療的有効量の請求項２９〜５３のいずれか一項に記載のＣＤ３結合ポリペプチドまたは請求項６３に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項６６】
がんまたは自己免疫異常の治療をそれを必要とする対象において行うための方法であって、治療的有効量の請求項２９〜５３のいずれか一項に記載のＣＤ３結合ポリペプチドまたは請求項６３に記載の医薬品組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項６７】
前記がんは、前立腺がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、膀胱がん、唾液腺がん、膵がん、卵巣がん、非小細胞肺がん、乳がん（例えば、三種陰性乳がん）、メラノーマ、副腎がん、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂリンパ球白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）、またはヘアリーセル白血病である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、または６０を含むヒトＣＤ３に特異的に結合するＣＤ３結合ドメイン。
【請求項６９】
２つの同一のポリペプチドの二量体であるＣＤ３結合タンパク質であって、それぞれのポリペプチドは、請求項２９〜４５のいずれか一項に記載のＣＤ３結合ポリペプチドである、前記ＣＤ３結合タンパク質。
【請求項７０】
前記ＣＤ３結合ポリペプチドは、抗体依存細胞媒介細胞障害性（ＡＤＣＣ）活性及び／または補体依存細胞障害性（ＣＤＣ）活性を示さないか、またはごくわずかに示す、請求項２９〜５３のいずれか一項に記載のＣＤ３結合ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年９月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／２２１，１９０号に対する優先権を主張する。本出願の内容は、開示内容全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
電子提出されたテキストファイルの説明
本出願で電子提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読フォーマットのコピー（ファイル名：ＡＰＶＯ＿０５２＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０１６年９月２１日、ファイルサイズ５４４キロバイト）。
【０００３】
本開示は、少なくとも１のヒト化ＣＤ３結合ドメインを有する、特異的にＣＤ３に結合する分子に関する。ＣＤ３に結合するタンパク質治療は、単一特異性タンパク質治療または多特異性タンパク質治療であり得る。多特異性タンパク質治療は、腫瘍抗原及びＴ細胞上のＴ細胞受容体複合体のＣＤ３サブユニットに結合し、標的依存性Ｔ細胞の細胞障害性、活性化及び増殖を誘導し得る。
【背景技術】
【０００４】
抗ＣＤ３抗体を用いてヒトＴ細胞上のＴ細胞受容体複合体（ＴＣＲ）を標的とすることは、臓器同種移植片拒絶の治療などの、自己免疫疾患及び関連の疾患における治療として提唱されてきた。ＣＤ３を標的とした単一特異性治療以外に、選択的にＴ細胞及び腫瘍細胞の両方に結合する多特異性ポリペプチドは、腫瘍細胞にＴ細胞細胞障害性をリダイレクトする機構を示す可能性がある。かかる多特異性ポリペプチドは、がんの治療に有用であり得る。
【０００５】
一部の抗ＣＤ３抗体の治療的使用は、重大な副作用により妨害されてきた。例えば、ヒトＣＤ３に特異的なマウスモノクローナル抗体であるＯＫＴ３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞増殖及びサイトカイン産生を誘導し、ｉｎ  ｖｉｖｏでサイトカインの大規模放出をもたらした（Ｈｉｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４２：  ７３７‐４３）。次にサイトカイン放出（「サイトカインストーム」とも呼ばれる）は、発熱、悪寒、頭痛、吐気、嘔吐症状、下痢、呼吸困難、無菌性髄膜炎及び低血圧を特徴とする「インフルエンザ様」症候群を引き起こす（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３：１２３‐１３２）。
【０００６】
良好な製造可能性プロファイル及び有害作用の軽減を有する熱安定性が改良されたＣＤ３結合分子が必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、ＣＤ３結合ドメイン及び好都合な製造可能性プロファイルを有するポリペプチドを包含する。本明細書に開示のＣＤ３結合ドメインを含むポリペプチドは熱的に安定であり得る。ある場合には、ポリペプチドは他のＣＤ３結合ポリペプチドと比較して、改良された熱安定性を有する。本明細書に開示のＣＤ３結合ドメイン及びポリペプチドは副作用（例えば、対象に投与する際、低レベルのサイトカインの放出を引き起こし得る）を減少させ得る。
【０００８】
特定の実施形態においては、本開示はヒトＣＤ３に特異的に結合し、かつ免疫グロブリンＬ鎖可変領域及び免疫グロブリンＨ鎖可変領域を含むＣＤ３結合ドメインに関し；免疫グロブリンＬ鎖可変領域は、（ａ）配列番号８８におけるアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、 少なくとも約９８％同一もしくは少なくとも約９９％同一；または（ｂ）配列番号８９におけるアミノ酸配列と少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一もしくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み；免疫グロブリンＨ鎖可変領域は、配列番号８６におけるアミノ酸配列と少なくとも約８２％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８７％同一、 少なくとも約９０％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一もしくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。ＣＤ３結合ドメインは、配列番号８３または配列番号８４におけるアミノ酸配列と少なくとも約８７％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一もしくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。ＣＤ３結合ドメインは、配列番号８３または配列番号８４を含み得る。
【０００９】
一実施形態においては、ＣＤ３結合ドメインは、配列番号９４のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号９５のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号９６のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む免疫グロブリンＬ鎖可変領域ならびに配列番号９１のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号９２のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む免疫グロブリンＨ鎖可変領域を含む。別の実施形態においては、ＣＤ３結合ドメインは、配列番号２０２のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２０３のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号２０４のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む免疫グロブリンＬ鎖可変領域ならびに配列番号１９９のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２００のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号２０１のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む免疫グロブリンＨ鎖可変領域を含む。
【００１０】
特定の態様においては、ＣＤ３結合ドメインは、フレームワーク領域を含む免疫グロブリンＬ鎖可変領域及び免疫グロブリンＨ鎖可変領域を含み、免疫グロブリンＬ鎖可変領域及び免疫グロブリンＨ鎖可変領域の少なくとも一方はヒト化され得る。一実施形態においては、免疫グロブリンＬ鎖可変領域は、ヒトＩＧＫＶ３Ｄ‐２０＊１生殖系列アミノ酸配列に基づくフレームワーク領域を含む。別の実施形態においては、免疫グロブリンＨ鎖可変領域は、ヒトＩＧＨＶ１‐６９＊０２生殖系列アミノ酸配列に基づくフレームワーク領域を含む。
【００１１】
一部の実施形態においては、ＣＤ３結合ドメインにおける免疫グロブリンＬ鎖可変領域のＩＭＧＴナンバリングシステムに従い、位置５２におけるアミノ酸残基はアルギニンであり、かつ／またはＣＤ３結合ドメインにおける免疫グロブリンＬ鎖可変領域のＩＭＧＴナンバリングシステムに従い、位置５３におけるアミノ酸残基はトリプトファンである。ＣＤ３結合ドメインにおける免疫グロブリンＨ鎖可変領域のＩＭＧＴナンバリングシステムに従い、位置２７におけるアミノ酸残基はチロシンであり得る。一部の実施形態においては、ＣＤ３結合ドメインは以下の１以上を含む：（ａ）免疫グロブリンＨ鎖可変領域のＩＭＧＴナンバリングシステムに従い、位置９におけるアミノ酸残基はプロリンである；（ｂ）免疫グロブリンＨ鎖可変領域のＩＭＧＴナンバリングシステムに従い、位置５３におけるアミノ酸残基はイソロイシンである；及び（ｃ）免疫グロブリンＬ鎖可変領域のＩＭＧＴナンバリングシステムに従い、位置２１におけるアミノ酸残基はメチオニンである。ＣＤ３結合ドメインにおける免疫グロブリンＨ鎖可変領域のＩＭＧＴナンバリングシステムに従い、位置８７におけるアミノ酸残基はチロシンであり得る。ＣＤ３結合ドメインにおける免疫グロブリンＨ鎖可変領域のＩＭＧＴナンバリングシステムに従い、位置８６におけるアミノ酸残基はアスパラギン酸であり得る。一実施形態においては、ＣＤ３結合ドメインにおける免疫グロブリンＨ鎖可変領域のＩＭＧＴナンバリングシステムに従い、位置８６におけるアミノ酸残基はアスパラギン酸であり、ＣＤ３結合ドメインにおける免疫グロブリンＨ鎖可変領域のＩＭＧＴナンバリングシステムに従い、位置８７におけるアミノ酸残基はチロシンである。
【００１２】
本開示は、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であるＣＤ３結合ドメインを包含する。一部の態様においては、ｓｃＦｖはＨ鎖可変領域とＬ鎖可変領域との間のリンカーを含み得る。一実施形態においては、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域との間のリンカーはアミノ酸配列ＱＲＨＮＮＳＳＬＮＴＧＴＱＭＡＧＨＳＰＮＳ（配列番号１４８）を含む。一部の実施形態においては、ｓｃＦｖのＨ鎖可変領域はｓｃＦｖのＬ鎖可変領域にアミノ末端である。他の実施形態においては、ｓｃＦｖのＬ鎖可変領域はｓｃＦｖのＨ鎖可変領域にアミノ末端である。
【００１３】
本開示は、配列番号９０を含むＬ鎖可変領域及び配列番号８７を含むＨ鎖可変領域を含むＣＤ３結合ドメインの熱安定性と比較する場合、少なくとも約１０％増加する熱安定性を有するＣＤ３結合ドメインを包含する。ＣＤ３結合ドメインの熱転移中間点（Ｔｍ）は、配列番号９０を含むＬ鎖可変領域及び配列番号８７を含むＨ鎖可変領域を含むＣＤ３結合ドメインのＴｍと比較した場合、少なくとも約３℃、少なくとも約４℃、少なくとも約５℃、または少なくとも約６℃、及び約２０℃以下上昇した。ＣＤ３結合ドメインの熱転移中間点は、少なくとも約５４℃、少なくとも約５５℃、少なくとも約５６℃、または少なくとも約５７℃であり得、及び約７２℃以下であり得る。ＣＤ３結合ドメインの熱安定性または熱転移中間点は、示差走査熱量測定はまた示差走査蛍光定量法によって測定され得る。
【００１４】
本明細書に開示のＣＤ３結合ドメインは、配列番号９０を含むＬ鎖可変領域及び配列番号８７を含むＨ鎖可変領域を含むＣＤ３結合ドメインの保存性と比較した場合、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、及び約１００％以下増加する保存性を有し得る。保存性はＣＤ３結合ドメインを約２５℃のＰＢＳで保管した後に計測され得る。一実施形態においては、ＣＤ３結合ドメインは、約２５℃のＰＢＳでの保管において、少なくとも約６日、少なくとも約１０日、または少なくとも約１３日及び９０日以下にわたり安定的である。
【００１５】
一部の態様においては、本明細書に開示のＣＤ３結合ドメインは、配列番号９０を含むＬ鎖可変領域及び配列番号８７を含むＨ鎖可変領域を含むＣＤ３結合ドメインの、組換え発現の間に産生される高分子量凝集体のレベルと比較した場合、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％減少、少なくとも約３０％減少、ならびに約５０％以下減少した組換え発現の間に産生される高分子量凝集体のレベルを有する。
【００１６】
また本開示は、約１０ｎＭ以下のＥＣ５０を有するヒトＣＤ３に結合するＣＤ３結合ドメインに関する。一部の実施形態においては、本開示のＣＤ３結合ドメインは特異的にカニクイザルＣＤ３にも結合し得る。例えば、ＣＤ３結合ドメインは、約３０ｎＭ以下のＥＣ５０を有するカニクイザルＣＤ３に結合し得る。
【００１７】
本開示は、特異的にヒトＣＤ３に結合し、免疫グロブリンＬ鎖可変領域及び免疫グロブリンＨ鎖可変領域を含むＣＤ３結合ドメインを包含し、（ａ）免疫グロブリンＬ鎖可変領域は配列番号９４のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号９５のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号９６のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、かつ免疫グロブリンＨ鎖可変領域は配列番号９１のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号９２のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；または（ｂ）免疫グロブリンＬ鎖可変領域は配列番号２０２のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２０３のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号２０４のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、かつ免疫グロブリンＨ鎖可変領域は配列番号１９９のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２００のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号２０１のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；かつＣＤ３結合ドメインは本明細書に記載した性質のいずれか１以上を有する。例えば、（ｉ）ＣＤ３結合ドメイン（またはＣＤ３結合ドメイン含有タンパク質）の熱転移中間点は、少なくとも約５４℃、少なくとも約５５℃、少なくとも約５６℃、または少なくとも約５７℃、及び約７２℃以下である；（ｉｉ）ＣＤ３結合ドメイン（またはＣＤ３結合ドメイン含有タンパク質）は、約２５℃のＰＢＳでの保管において、少なくとも約６日、少なくとも約１０日、または少なくとも約１３日及び９０日以下にわたり安定的である；（ｉｉｉ）ＣＤ３結合ドメイン（またはＣＤ３結合ドメイン含有タンパク質）は、約１０ｎＭ以下のＥＣ５０を有するヒトＣＤ３に結合する；かつ（ｉｖ）ＣＤ３結合ドメイン（またはＣＤ３結合ドメイン含有タンパク質）は、約３０ｎＭ以下のＥＣ５０を有するカニクイザルＣＤ３に結合する。
【００１８】
また、本開示は本明細書に記載したＣＤ３結合ドメインのいずれかを含むＣＤ３結合ポリペプチドに関する。一部の変形例においては、ＣＤ３結合ポリペプチドは免疫グロブリン定常領域を含み得る。この免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２またはＩｇＤの免疫グロブリンＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み得る。一部の実施形態においては、免疫グロブリン定常領域は、ＥＵナンバリングシステムに従い、置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、及びＫ３２２Ａを含むヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインを含む。特定の実施形態においては、免疫グロブリン定常領域は、ＥＵナンバリングシステムに従い、置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、及びＫ３２２Ａの１以上を含むヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインを含む。一部の実施形態においては、Ｔ細胞上のＣＤ３タンパク質に結合する場合、ＣＤ３結合ポリペプチドは、前記Ｔ細胞からサイトカイン放出を誘導しないか、またはごくわずかに検出可能なサイトカイン放出を誘導する。特定の態様においては、ＣＤ３結合タンパク質またはポリペプチドは、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３を患者に投与した場合に放出されるサイトカインと比較して、患者において減少したサイトカイン放出を示す。ある場合には、ＣＤ３結合ポリペプチドはＴ細胞活性化またはＴ細胞増殖を誘導し得る。
【００１９】
特定の態様においては、ＣＤ３結合ポリペプチドは第２の結合ドメインをさらに含む。第２の結合ドメインは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であり得る。一部の実施形態においては、第２の結合ドメインは、腫瘍関連抗原（例えば、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、Ｈｅｒ２、ＲＯＲ１、ＲＯＮ、糖タンパク質Ａ３３抗原（ｇｐＡ３３）もしくはＣＥＡ）と結合するか、または相互作用する。
【００２０】
本開示は、（ｉ）ＣＤ３結合ドメイン及び（ｉｉ）第２の結合ドメインを含むＣＤ３結合ポリペプチドをさらに包含する。一部の実施形態においては、ＣＤ３結合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、またはカルボキシル末端からアミノ末端の順で、（ｉ）ＣＤ３結合ドメイン、（ｉｉ）ヒンジ領域及び（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域を含む。一部の実施形態においては、ＣＤ３結合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、（ｉ）第２の結合ドメイン、（ｉｉ）ヒンジ領域、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域、（ｉｖ）カルボキシル末端リンカー、及び（ｖ）ＣＤ３結合ドメインを含む。他の実施形態においては、ＣＤ３結合ポリペプチドは、カルボキシル末端からアミノ末端の順で、（ｉ）第２の結合ドメイン、（ｉｉ）ヒンジ領域、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域、（ｉｖ）アミノ末端リンカー、及び（ｖ）ＣＤ３結合ドメインを含む。特定の変形例においては、第１の及び／または第２の結合ドメインはｓｃＦｖである。カルボキシル末端及びアミノ末端リンカーの非限定例としては、グリシン‐セリン（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ））反復及び（ｉ）タイプＩＩＣ型レクチンのストーク領域または（ｉｉ）免疫グロブリンヒンジ領域由来のリンカーを含む可動性リンカーが挙げられる。特定の態様においては、カルボキシル末端リンカー（またはアミノ末端リンカー）は、配列番号１９６を含むか、または配列番号１９６からなる。一部の態様においては、本開示はＣＤ３結合ポリペプチド（例えば、多特異性）に関し、（ｉ）ＣＤ３結合ドメインは（ａ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリンＬ鎖可変領域、及び（ｂ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリンＨ鎖可変領域を含む；かつ（ｉｉ）第２の結合ドメインは（ａ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリンＬ鎖可変領域、及び（ｂ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリンＨ鎖可変領域を含む。
【００２１】
本開示は、リダイレクトＴ細胞細胞障害性（ＲＴＣＣ）を誘導するＣＤ３結合ポリペプチドを包含する。例えば、ＣＤ３結合ポリペプチドは、約３０ｐＭ以下のＥＣ５０を有するＲＴＣＣを誘導し得る。一部の実施形態においては、ＣＤ３結合ポリペプチドは、抗体依存細胞媒介細胞障害性（ＡＤＣＣ）活性及び／または補体依存細胞障害性（ＣＤＣ）活性を示さないか、またはごくわずかに示す。特定の態様においては、ヌルＡＤＣＣ及び／またはＣＤＣ活性はヒンジ領域及びＩｇ定常領域（例えば、Ｆｃ）における突然変異を介して達成される。
【００２２】
ＣＤ３結合ポリペプチドは、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインをさらに含み得る。一部の実施形態においては、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは免疫グロブリンＣＨ１ドメインまたは免疫グロブリンＣＬドメインを含む。一部の態様においては、ＣＤ３結合ポリペプチドは、（ｉ）アミノ末端からカルボキシル末端またはカルボキシル末端からアミノ末端の順で、（ａ）特異的にヒトＣＤ３に結合するＣＤ３結合ドメイン、（ｂ）第１のヒンジ領域、（ｃ）第１の免疫グロブリン定常領域、及び（ｄ）第１の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインを含む第１のポリペプチド鎖、ならびに（ｉｉ）アミノ末端からカルボキシル末端またはカルボキシル末端からアミノ末端の順で、（ａ’）第２のヒンジ領域、（ｂ’）第２の免疫グロブリン定常領域、及び（ｃ’）第１の単鎖ポリペプチドの第１の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインと異なる第２の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインを含む第２のポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体ＣＤ３結合タンパク質であり、第１及び第２の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは互いに関連し、ヘテロ二量体を形成する。一実施形態においては、第１の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは免疫グロブリンＣＨ１ドメインを含み、第２の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは免疫グロブリンＣＬドメインを含むか、または第１の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは免疫グロブリンＣＬドメインを含み、第２の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは免疫グロブリンＣＨ１ドメインを含む。第１及び第２の免疫グロブリン定常領域の少なくとも一方は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤもしくは任意のそれらの組み合わせの免疫グロブリンＣＨ２及びＣＨ３ドメイン；ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭもしくは任意のそれらの組み合わせの免疫グロブリンＣＨ３ドメイン；またはＩｇＥ、ＩｇＭもしくは任意のそれらの組み合わせの免疫グロブリンＣＨ３及びＣＨ４ドメインを含み得る。一部の態様においては、ヘテロ二量体ＣＤ３結合タンパク質の第２のポリペプチド鎖は、第２の結合ドメインをさらに含み得る。特定の実施形態においては、第２の結合ドメインは、第２のヒンジ領域にアミノ末端またはカルボキシ末端であり得る。
【００２３】
一部の変形例においては、ＣＤ３結合ポリペプチドは、ＣＤ３結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含む二重特異性単鎖抗体分子であり得、結合ドメインは、ＶＨ  ＣＤ３‐ＶＬ  ＣＤ３‐ＶＨ  第２の結合ドメイン‐ＶＬ  第２の結合ドメインもしくはＶＬ  ＣＤ３‐ＶＨ  ＣＤ３‐ＶＨ  第２の結合ドメイン‐ＶＬ  第２の結合ドメインもしくはＶＨ  第２の結合ドメイン‐ＶＬ  第２の結合ドメイン‐ＶＨ  ＣＤ３‐ＶＬ  ＣＤ３またはＶＨ  第２の結合ドメイン‐ＶＬ  第２の結合ドメイン‐ＶＬ  ＣＤ３‐ＶＨ  ＣＤ３の順で配置されている。
【００２４】
また本開示は、本明細書に記載のＣＤ３結合ドメインもしくはＣＤ３結合ポリペプチドまたは前記ＣＤ３結合ドメインもしくはポリペプチドの一部をコードする単離された核酸分子にも関する。一部の態様においては、本開示は、本明細書に記載のＣＤ３結合ドメインまたはＣＤ３結合ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含む発現ベクターを包含し、核酸セグメントは、宿主細胞中の核酸セグメントの発現に好適な制御配列に、動作可能に結合している。発現ベクターを含む組換え宿主細胞は本開示に含まれる。
【００２５】
本開示は、第１及び第２の発現ユニットを含む発現ベクターを包含し、第１及び第２の発現ユニットはそれぞれ、ヘテロ二量体ＣＤ３結合ポリペプチドの第１及び第２のポリペプチド鎖をコードする第１及び第２の核酸セグメントを含み、第１及び第２の核酸セグメントは、宿主細胞中の核酸セグメントの発現に好適な制御配列に、動作可能に結合している。第１及び第２の発現ユニットを含む発現ベクターを含む組換え宿主細胞は、本開示の一部である。
【００２６】
本開示は、さらにＣＤ３結合ポリペプチドの生成方法に関し、方法は、核酸セグメントが発現し、それによりＣＤ３結合ポリペプチドが産生する条件下で、本明細書に記載した発現ベクターを含む組換え宿主細胞を培養することを含む。一部の実施形態においては、ヘテロ二量体ＣＤ３結合タンパク質の産生方法は、第１及び第２の発現ユニットを含む組換え宿主細胞を培養することを含み、第１及び第２の発現ユニットは、それぞれヘテロ二量体ＣＤ３結合タンパク質の第１及び第２のポリペプチド鎖をコードする第１及び第２の核酸セグメントを含み、第１及び第２の核酸セグメントは、宿主細胞中の核酸セグメントの発現に好適な制御配列に、動作可能に結合し、前記培養は、第１及び第２の核酸セグメントが発現し、コードされたポリペプチド鎖がヘテロ二量体ＣＤ３結合タンパク質として生成する条件下で行われる。これらの方法はさらに、ＣＤ３結合ポリペプチドまたはヘテロ二量体ＣＤ３結合タンパク質を回収することを含む。
【００２７】
本開示は本明細書に開示のＣＤ３結合ポリペプチド及び医薬的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬品組成物を包含する。また、本開示は、腫瘍関連抗原を発現する細胞に対するリダイレクトＴ細胞細胞障害性（ＲＴＣＣ）を誘導する方法にも関し、この方法は、前記腫瘍関連抗原発現細胞をＣＤ３結合ポリペプチドに接触させることを含み、前記接触は、腫瘍関連抗原発現細胞に対するＲＴＣＣが誘導される条件下で行われる。本開示の一態様としては、治療的有効量のＣＤ３結合ポリペプチドまたは本明細書に記載した医薬品組成物を対象に投与することを含む、腫瘍増殖の阻害をそれを必要とする対象において行うための方法が挙げられる。本開示は、治療的有効量のＣＤ３結合ポリペプチドまたは本明細書に記載した医薬品組成物を被検体に投与することを含む、がんまたは自己免疫異常の治療をそれを必要とする対象において行うための方法を包含する。本明細書に記載した方法及びＣＤ３結合ポリペプチドで治療され得るがんの非限定例としては、前立腺がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、膀胱がん、唾液腺がん、膵がん、卵巣がん、非小細胞肺がん、乳がん（例えば、三種陰性乳がん）、メラノーマ、副腎がん、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂリンパ球白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）、及びヘアリーセル白血病が挙げられる。
【００２８】
本開示は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、または６０を含むヒトＣＤ３に特異的に結合するＣＤ３結合ドメインを包含する。
【００２９】
また、本開示は、２つの同じポリペプチドの二量体であるＣＤ３結合タンパク質にも関し、それぞれのポリペプチドは本明細書に開示のＣＤ３結合ポリペプチドのいずれかである。
【００３０】
本開示のこれら及び他の実施形態及び／または他の態様は、以下の本開示の詳細な説明及び添付の図面を参照することによって明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＣＤ３結合ドメインコンストラクトのジャーカットＴ細胞への結合を計測するフローサイトメトリー調査の結果を示すグラフである（上パネル）。生細胞における結合分子の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をｙ軸に示す。ＣＤ３結合ドメインコンストラクトの濃度（ｎＭ）をｘ軸に示す。表（下パネル）はグラフのデータより得られたＥＣ５０値を示す。
【図２】ＣＤ３結合ドメインコンストラクトの、高水準でＣＤ３が発現するジャーカットＴ細胞株のサブクローンへの結合を計測するフローサイトメトリー調査の結果を示すグラフである（上パネル）。生細胞における結合分子の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をｙ軸に示す。ＣＤ３結合ドメインコンストラクトの濃度（ｎＭ）をｘ軸に示す。表（下パネル）はグラフのデータより得られたＥＣ５０値を示す。
【図３】ＣＤ３結合ドメインコンストラクトで実施した示差走査蛍光定量調査の結果を示すグラフである。また、グラフのデータより得られた熱転移中間点（Ｔｍ）値も示す。
【図４】ＣＤ３結合ドメインコンストラクトの、高水準でＣＤ３が発現するジャーカットＴ細胞株のサブクローンへの結合を計測するフローサイトメトリー調査の結果を示すグラフである。生細胞における結合分子の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をｙ軸に示す。ＣＤ３結合ドメインコンストラクトの濃度（ｎＭ）をｘ軸に示す。
【図５】ＣＤ３結合ドメインコンストラクトの、高水準でＣＤ３が発現するジャーカットＴ細胞株のサブクローンへの結合を計測するフローサイトメトリー調査の結果を示すグラフである。生細胞における結合分子の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をｙ軸に示す。ＣＤ３結合ドメインコンストラクトの濃度（ｎＭ）をｘ軸に示す。
【図６】４時間でＣ４‐２Ｂ細胞に対しヒトＰＢＭＣで標的依存性Ｔ細胞細胞障害性を誘導する際の二重特異性抗ＰＳＭＡ及び抗ＣＤ３コンストラクトの有効性を計測する、クロム５１放出アッセイの結果を示すグラフである（上パネル）。総溶解制御に対する特異的溶解パーセントをｙ軸に示す。ＣＤ３結合ドメインコンストラクトの濃度（ｐＭ）をｘ軸に示す。表（下パネル）はグラフのデータより得られたＥＣ５０値を示す。
【図７】図７Ａ及び図７Ｂは、ＣＤ３結合ドメインコンストラクトのカニクイザルＴ細胞への結合を計測するフローサイトメトリー調査の結果を示すグラフである。生細胞における結合分子の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をそれぞれのグラフのｙ軸に示す。ＣＤ３結合ドメインコンストラクトの濃度（ｎＭ）をそれぞれのグラフのｘ軸に示す。
【図８】図８Ａ及び図８Ｂは、４時間でＣ４‐２Ｂ細胞に対しカニクイザルＰＢＭＣで標的依存性Ｔ細胞細胞障害性を誘導する際のＣＤ３結合ドメインコンストラクトの有効性を計測する、クロム５１放出アッセイの結果を示すグラフである。総溶解制御に対する特異的溶解パーセントをそれぞれのグラフのｙ軸に示す。ＣＤ３結合ドメインコンストラクトの濃度（ｐＭ）をそれぞれのグラフのｘ軸に示す。
【図９】二重特異性抗ＣＤ３７及び抗ＣＤ３コンストラクトのカニクイザルＴ細胞への結合を計測するフローサイトメトリー調査の結果を示すグラフである。生細胞における結合分子の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をｙ軸に示す。ＣＤ３結合ドメインコンストラクトの濃度（ｎＭ）をｘ軸に示す。ＴＳＣ３９４ＤＹは、Ｅ８６Ｄ及びＦ８７Ｙ置換を含むＴＳＣ３９４コンストラクトを指す。
【図１０】４時間でラモス細胞に対しカニクイザルＰＢＭＣで標的依存性Ｔ細胞細胞障害性を誘導する際の二重特異性抗ＣＤ３７及び抗ＣＤ３コンストラクトの有効性を計測する、クロム５１放出アッセイの結果を示すグラフである（上パネル）。総溶解制御に対する特異的溶解パーセントをそれぞれのグラフのｙ軸に示す。ＣＤ３結合ドメインコンストラクトの濃度（ｐＭ）をそれぞれのグラフのｘ軸に示す。表（下パネル）はグラフのデータより得られたＥＣ５０値を示す。ＴＳＣ３９４ＤＹは、Ｅ８６Ｄ及びＦ８７Ｙ置換を含むＴＳＣ３９４コンストラクトを指す。
【図１１】２５℃で特定の数日間にわたるＣＤ３結合ドメインコンストラクトの保存性を測定した調査の結果をｘ軸に示すグラフである。ＣＡＳ１０５は、ＤＲＡ２２２ＣＤ３結合ドメイン含む対照コンストラクトである。
【図１２】特定の数日間を超えたヒト血清における抗ＲＯＲ１×抗ＣＤ３二重特異性分子の血清安定性を測定した調査の結果をｘ軸に示すグラフである。
【図１３】ＤＲＡ２２２  ｓｃＦｖ（配列番号８５）、ＴＳＣ４５５  ｓｃＦｖ（配列番号８３）、及びＴＳＣ４５６  ｓｃＦｖ（配列番号８４）のアミノ酸配列の配列比較を示す。これらのコンストラクトの配列は、表１４にも示す。
【図１４】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗ＰＳＭＡ×抗ＣＤ３二重特異性結合分子の血清濃度を計測する調査の結果を、時間の関数として示すグラフである。結果は、それぞれの処置群の経時的な平均血清濃度（μｇ／ｍＬ）として表される。それぞれの点は、個々の動物の平均値（＋標準偏差）を示す。
【図１５】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗ＰＳＭＡ×抗ＣＤ３二重特異性結合分子の、薬物動態パラメータの比較を示す表である。
【図１６】ＮＳＧマウスにおける抗ＲＯＲ１×抗ＣＤ３二重特異性結合分子の血清濃度を計測する調査の結果を、時間の関数として示すグラフである。結果を、それぞれの投与群の経時的な平均血清濃度（μｇ／ｍＬ）として表す。
【図１７】図１７Ａ及び図１７Ｂは、ＮＳＧマウスにおける抗ＲＯＲ１×抗ＣＤ３二重特異性結合分子の、薬物動態パラメータの比較を示す表である。図１７Ａは、それぞれの投与群について疎らなサンプリング及び一様な増量化を伴うＩＶ投与におけるＮＣＡを用いて計算された薬物動態パラメータ推定値を示す。図１７Ｂは、それぞれの投与群について１／Ｙ増量化を伴う２コンパートメントＩＶモデルを用いて決定された薬物動態パラメータ推定値を示す。
【図１８】ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１異種移植腫瘍増殖における抗ＲＯＲ１×抗ＣＤ３二重特異性結合分子の効果を分析する調査の結果を示すグラフである。
【図１９】Ｋａｓｕｍｉ‐２異種移植腫瘍増殖における抗ＲＯＲ１×抗ＣＤ３二重特異性結合分子の効果を分析する調査の結果を示すグラフである。結果を、ヒトＴ細胞ドナー＃３３６として示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本開示は、特異的にＣＤ３（表面抗原分類（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）３）結合する結合ドメインならびに特異的にＣＤ３に結合する結合分子（例えば、ポリペプチド及びタンパク質）を提供する。これらの結合分子は、ＣＤ３及び少なくとも１の他の標的に特異的に結合し得る。一部の実施形態においては、本明細書に記載したＣＤ３結合分子は、以下に記載の性質の１以上を有する、好ましい製造可能性プロファイルを有する。特定の実施形態においては、Ｃｒｉｓ７抗ＣＤ３抗体からのＣＤＲは、改良され新規の性質を有するＣＤ３結合分子を操作するために使用されてきた。したがって、本開示は、他の抗ＣＤ３結合ドメイン及びタンパク質と比較して、改良された性質（例えば、熱安定性、保存性、血中半減期、高分子量凝集体が減少した形態）を有するヒト化抗ＣＤ３結合ドメイン及びタンパク質に関する。本開示の一部の態様においては、ＣＤ３結合分子は熱的に安定性である。例えば、分子は他のＣＤ３結合分子（例えば、ＤＲＡ２２２）と比較して改良された熱安定性を有し得る。ＣＤ３結合分子は高い生成率及び長い血中半減期ならびに長い貯蔵半減期を有し得る。さらに、本明細書に記載したＣＤ３結合分子は、被検体に投与する際の有害な副作用のリスクが低い可能性がある。例えば、ＣＤ３結合分子は低レベルのサイトカインの放出を引き起こし得る。
【００３３】
本説明においては、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、または整数値範囲は、特に断りのない限り、列挙された範囲内の任意の整数の値、及び適宜、それらの分数（整数の１０分の１及び１００分の１などの）を含むものと理解されるべきである。本明細書で用いられる用語「ａ」及び「ａｎ」は、特に断りのない限り、列挙された成分の「１以上」を指すことを理解される。代替の使用（例えば、「ｏｒ（または）」）は、１の、両方の、またはそれらの代替の任意の組合せのいずれかを意味すると理解される。本明細書で用いられる「ｉｎｃｌｕｄｅ（含む）」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」は同義語として用いられる。加えて、成分の様々な組み合わせを含むポリペプチド（例えば、ドメインまたは領域）ならびに本明細書に記載した置換基は、それぞれのポリペプチドが個々に明記されるのと同一の範囲で、本明細書により開示されることが理解される。したがって、個々のポリペプチドにおける特定の成分の選択は、本開示の範囲内である。
【００３４】
特許、特許出願書類、記事、書籍、及び専門書が挙げられるが、これに限定されない、本明細書に引用されるすべての文書、または文書の一部は、全体が任意の目的で参照として本明細書に明確に組み入れられる。組み込まれた文書または文書の一部の１以上が、本明細書におけるその用語の定義と矛盾する用語を定義する場合においては、本明細書で示される定義が優先される。しかし、本明細書に引用する任意の参考文献、記事、出版物、特許、特許公報、及び特許出願書類の言及は、有効な先行技術を構成しているか、もしくは世界のどの国でも共通の一般知識の一部を形成していると認められるもの、または何らかの提案の形式ではなく、またそうであるべきでない。
【００３５】
本明細書で用いられる「結合ドメイン」もしくは「結合領域」という用語は、ドメイン、領域、一部分、もしくはタンパク質の部位、ポリペプチド、オリゴペプチド、または抗原、配位子、受容体、基質、もしくは阻害剤（例えば、ＣＤ３）などの標的分子を特異的に認識し、結合する能力を有する抗体由来のペプチドまたは抗体もしくは結合ドメインを指す。結合ドメインの代表例としては、単鎖抗体可変領域（例えば、ドメイン抗体である、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ）、受容体外部ドメイン、及び配位子（例えば、サイトカイン、ケモカイン）が挙げられる。特定の実施形態においては、結合ドメインは、抗原結合部位（例えば、可変Ｈ鎖配列及び可変Ｌ鎖配列をまたは３のＬ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）含む）ならびに代替的フレームワーク領域（ＦＲ）（例えば、場合により１以上のアミノ酸置換を含むヒトＦＲ）に配置された抗体由来の３のＨ鎖ＣＤＲを含むか、またはそれらからなる。種々のアッセイは、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ファージディスプレイライブラリ選別、及びＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）相互作用分析を含む、本開示の、特定の標的に特異的に結合する結合ドメインを特定するものとして知られる。本明細書で用いられるＣＤ３結合ポリペプチドは、「第１の結合ドメイン」及び、場合により、「第２の結合ドメイン」を有し得る。特定の実施形態においては、「第１の結合ドメイン」はＣＤ３結合ドメインであり、形式は抗体もしくは抗体様タンパク質またはドメインである。第１及び第２双方の結合ドメインを含む特定の実施形態においては、第２の結合ドメインは腫瘍抗原結合ドメインである。他の実施形態においては、第２の結合ドメインは第２のＣＤ３結合ドメインである。さらに他の実施形態においては、第２の結合ドメインは腫瘍抗原結合ドメイン以外の結合ドメインである。
【００３６】
結合ドメインまたはタンパク質は、１０５Ｍ−１と等しいか、または超える親和力またはＫａ（すなわち、１／Ｍの単位の特定の結合相互作用の平衡会合定数）で標的と結合する場合、標的に「特異的に結合」する一方で、試験試料に存在する他の成分と著しく結合しない。結合ドメインは、「高親和性」結合ドメイン及び「低親和性」結合ドメインとして分類され得る。「高親和性」結合ドメインは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、または少なくとも１０１３Ｍ−１のＫａを有する結合ドメインを指す。「低親和性」結合ドメインは、１０７Ｍ−１以下、１０６Ｍ−１以下、１０５Ｍ−１以下のＫａを有する結合ドメインを指す。あるいは、親和性は、Ｍの単位（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ）を有する特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）として定義され得る。本開示による結合ドメインポリペプチド及び単鎖ポリペプチドの親和性は、従来の技術（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９４９）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０；及び米国特許第５，２８３，１７３号、米国特許第５，４６８，６１４号、または同等のもの参照）を用いて容易に決定することができる。
【００３７】
「ＣＤ３」は、Ｔ細胞受容体複合体のサブユニットである６鎖の多タンパク質複合体（例えば、Ａｂｂａｓ  ａｎｄ  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，２００３；Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，ｐ．１７２  ａｎｄ  １７８，１９９９参照）として当該技術分野において公知である。哺乳類においては、Ｔ細胞受容体複合体のＣＤ３サブユニットは、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２のＣＤ３ε鎖、及びＣＤ３ζ鎖のホモ二量体である。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及びＣＤ３ε鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連した細胞表面タンパク質である。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ε鎖の膜貫通領域は負に荷電しており、これは、これらの鎖の、正に荷電しているＴ細胞受容体鎖との会合を可能にする特性である。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ε鎖の細胞内尾部は、それぞれ免疫受容体チロシン基準活性化モチーフすなわちＩＴＡＭとして公知の保存モチーフを単一で含み、一方各ＣＤ３ζ鎖は３つ有する。ＩＴＡＭはＴＣＲ複合体のシグナル伝達能力に重要であると考えられている。本開示で用いられるＣＤ３は、ヒト、サル、マウス、ラット、または他の哺乳類を含む、様々な動物種由来であってよい。
【００３８】
本明細書で用いられる、「保存的置換」は、当該技術分野において、１のアミノ酸の同様の性質を有する他のアミノ酸への置換と認識されている。代表的な保存的置換は当該技術分野において公知である（例えば、ＷＯ９７／０９４３３，ｐａｇｅ  １０，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｍａｒｃｈ  １３，１９９７；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ：ＮＹ（１９７５），ｐｐ．７１−７７；Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ（１９９０），ｐ．８参照）。特定の実施形態においては、保存的置換はロイシンとセリンとの置換を含む。
【００３９】
本明細書で用いられる「誘導体」という用語は、酵素を用いるか用いないかいずれかの、化学的または生物学的手段による、例えばグリコシル化、アルキル化、アシル化、エステル形成、またはアミド形成などによる、ペプチドの１以上のアミノ酸残基の修飾を指す。
【００４０】
本明細書で用いられる、指定されたポリペプチドまたはタンパク質「由来の」ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、ポリペプチドの起源を指す。特定の実施形態においては、特定の配列（しばしば「出発」または「母体」もしくは「親」配列と呼ばれる）由来のポリペプチドもしくはアミノ酸は、出発配列またはそれらの一部分と本質的に同一であるアミノ酸配列を有し、その一部分は少なくとも１０〜２０のアミノ酸、少なくとも２０〜３０のアミノ酸、もしくは少なくとも３０〜５０のアミノ酸、または少なくとも５０〜１５０のアミノ酸、もしくは出発配列の起源を有するものとして当業者が同定可能な他の物である。例えば、結合ドメインは抗体（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、単一のドメイン抗体（ｓｄＡｂ）など）由来であり得る。
【００４１】
他のポリペプチド由来のポリペプチドは、出発ポリペプチド（例えば、他のアミノ酸残基と置換されたか、もしくは１以上のアミノ酸残基の挿入または欠損を有する１以上のアミノ酸残基）に対し、１以上の突然変異を有し得る。ポリペプチドは、天然ではないアミノ酸配列を含み得る。かかる多様性は、必然的に出発ポリペプチドと１００％未満の配列相同性または類似性を有する。一実施形態においては、変異体は、出発ポリペプチドのアミノ酸配列と約６０％〜１００％未満のアミノ酸配列相同性または類似性のアミノ酸配列を有することになる。別の実施形態においては、変異体は、出発ポリペプチドのアミノ酸配列と約７５％〜１００％未満、約８０％〜１００％未満、約８５％〜１００％未満、約９０％〜１００％未満、約９５％〜１００％未満のアミノ酸配列相同性または類似性のアミノ酸配列を有することになる。
【００４２】
本明細書で用いられる免疫グロブリン分子の可変領域におけるアミノ酸残基の位置は、他の断りのない限り、ＩＭＧＴ基準（Ｂｒｏｃｈｅｔ，Ｘ，ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２００８）３６，Ｗ５０３−５０８）を用いて番号付けされ、免疫グロブリン分子の定常領域におけるアミノ酸残基の位置は、ＥＵ命名法（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｔｈｅｒａｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：７７−９４）に従って番号付けされる。カバットナンバリング慣例（Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ：Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（１９９１））は、免疫グロブリン分子の可変領域におけるアミノ酸残基の位置を参照した代替的システムである。
【００４３】
本明細書で用いられる「二量体」という用語は、共有結合（例えば、ジスルフィド結合）及び他の相互作用（例えば、静電的相互作用、塩橋、水素結合、及び疎水性相互作用）を含む分子内力の１以上の形態を介して互いに関連している２のサブユニットからなる生物学的実体を指し、適切な状況下（例えば、生理学的状況下で、組換えタンパク質を発現、精製及び／または保存するのに適した水溶液中で、または非変性及び／または非還元電気泳動の条件下で）で安定性である。本明細書で用いられる「ヘテロ二量体」または「ヘテロ二量体タンパク質」は、２の異なるポリペプチドから形成された二量体を指す。ヘテロ二量体は、４のポリペプチド（すなわち、２のＬ鎖及び２のＨ鎖）から形成された抗体を含まない。本明細書で用いられる「ヘテロ二量体」または「ヘテロ二量体タンパク質」は、２の同一のポリペプチドから形成された二量体を指す。
【００４４】
一部の実施形態においては、ＣＤ３結合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、またはカルボキシル末端からアミノ末端の順で、（ｉ）第２の結合ドメイン、（ｉｉ）ヒンジ領域、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域、（ｉｖ）カルボキシル末端リンカー（またはアミノ末端リンカー）、及び（ｖ）ＣＤ３結合ドメインを含む。本明細書で用いられる場合、また文脈に応じて、「ヒンジ領域」または「ヒンジ」は、結合ドメイン（例えば、ＣＤ３結合ドメインまたは第２の結合ドメイン）と免疫グロブリン定常領域との間のポリペプチド領域を指す。本明細書で用いられる場合、また文脈に応じて、「リンカー」は（１）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）におけるＶＨとＶＬとの間のポリペプチド領域または（２）２の結合ドメインを含むＣＤ３結合ポリペプチドにおける免疫グロブリン定常領域と第２の結合ドメインとの間のポリペプチド領域を指し得る。また、２の結合ドメインを含むＣＤ３結合ポリペプチドにおける免疫グロブリン定常領域とＣＤ３結合ドメインとの間のポリペプチド領域は、「カルボキシル末端リンカー」または「アミノ末端リンカー」とも呼ばれ得る。カルボキシル末端リンカー及びアミノ末端リンカーの非限定例としては、グリシン‐セリンリピート、ならびに（ａ）膜貫通タンパク質（例えば、タイプＩ膜貫通タンパク質）のドメイン間領域；（ｂ）タイプＩＩＣ型レクチンのストーク領域；または（ｃ）免疫グロブリンヒンジに由来するリンカーを含む可動性リンカーが挙げられる。ヒンジ及びリンカーの非限定例を、表１及び２に示す。一部の実施形態においては、「リンカー」は、２のサブ結合ドメインの相互作用に適合性のスペーサー機能をもたらすため、得られるポリペプチドは、同様のＬ及びＨ鎖可変領域を含む抗体として、同様の標的分子への特定の結合親和力を保持する。特定の実施形態においては、リンカーは５〜約３５のアミノ酸、例えば、約１５〜約２５のアミノ酸からなる。
【００４５】
「野生型免疫グロブリンヒンジ領域」は、抗体のＨ鎖に見られる、間に挿入され、ＣＨ１及びＣＨ２ドメインを連結する（ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＤの場合）、または間に挿入され、ＣＨ１及びＣＨ３ドメインを連結する（ＩｇＥ、及びＩｇＭの場合）天然の上部及び中部ヒンジアミノ酸配列を指す。特定の実施形態においては、野生型免疫グロブリンヒンジ領域配列はヒト型であり、ヒトＩｇＧヒンジ領域を含み得る。
【００４６】
「変性野生型免疫グロブリンヒンジ領域」もしくは「変性免疫グロブリンヒンジ領域」は、（ａ）３０％以下のアミノ酸変（例えば、約２５％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％以下のアミノ酸置換もしくは欠損）を有する野生型免疫グロブリンヒンジ領域、もしくは（ｂ）約５のアミノ酸（例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０のアミノ酸）〜１２０以下のアミノ酸（例えば、約１０〜約４０のアミノ酸もしくは約１５〜約３０のアミノ酸もしくは約１５〜約２０のアミノ酸もしくは約２０〜約２５のアミノ酸の長さを有する）の長さを有する野生型免疫グロブリンヒンジ領域の一部を指し、約３０％以下のアミノ酸変化（例えば、約２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％以下のアミノ酸置換もしくは欠損またはそれらの組み合わせ）を有し、かつＵＳ２０１３／０１２９７２３及びＵＳ２０１３／００９５０９７に記載のＩｇＧ核ヒンジ領域を有する。
【００４７】
本明細書で用いられる、「ヒト化された」という用語は、ヒトに免疫原性が少なく、非ヒト種（例えば、マウスもしくはラット）由来のタンパク質及びポリペプチドに結合する抗体または免疫グロブリンを作製するプロセスを指し、さらに遺伝子工学技術を用いて、元の抗体の抗原結合特性を依然として保持している。一部の実施形態においては、抗体または免疫グロブリン結合タンパク質及びポリペプチド（例えば、ＬならびにＨ鎖可変領域、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ）結合ドメイン（複数可）はヒト化されている。非ヒト結合ドメインは、ＣＤＲグラフト化（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６））及び「再形成」（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８８  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３３７；Ｔｅｍｐｅｓｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ  １９９１  ９：２６６−２７１）、「高キメラ化」（Ｑｕｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３；Ｃｏ，ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：２８６９−２８７３；Ｃｏ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８：１１４９−１１５４）、ならびに「べニアリング」（Ｍａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｄ  ｖｅｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉ−ＣＤ１８  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．”Ｉｎ：Ｍｅｔｃａｌｆ  ＢＷ，Ｄａｌｔｏｎ  ＢＪ，ｅｄｓ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４：２９１−３１２）を含むそれらの変種として知られる技術を用いてヒト化され得る。非ヒト源から誘導される場合、ヒンジ領域ならびに定常領域ドメインなどのタンパク質及びポリペプチドに結合する抗体または免疫グロブリンの他の領域も、ヒト化され得る。
【００４８】
本明細書で用いられる「免疫グロブリン二量体化ドメイン」または「免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン」は、優先的に第２のポリペプチド鎖の異なる免疫グロブリンドメインと相互作用または関連するポリペプチド鎖の免疫グロブリンドメインを指し、異なる免疫グロブリン二量体化ドメインの相互作用は、第1及び第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化の実質的な原因となるか、もしくは効率的に促進する（すなわち、２の異なるポリペプチド鎖間の二量体の形成であり、またこれはヘテロ二量体と呼ばれる）。免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン間での相互作用は、第１のポリペプチド鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン及び／または第２のポリペプチド鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインの非存在下で、第1及び第２のポリペプチド鎖間の二量体化に統計学的に有意な減少がある場合、第1及び第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化の「実質的な原因となるか、または効率的に促進する」。特定の実施形態においては、第１及び第２のポリペプチド鎖が同時発現する場合、少なくとも６０％、少なくとも約６０％〜約７０％、少なくとも約７０％〜約８０％、少なくとも８０％〜約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の第１及び第２のポリペプチド鎖が互いにヘテロ二量体を形成する。代表的な免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインとしては、免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、免疫グロブリンＣＬドメイン（例えば、ＣκもしくはＣλアイソタイプ）、または、本明細書に提供される野生型免疫グロブリンＣＨ１及びＣＬドメインならびに変性（または突然変異）免疫グロブリンＣＨ１及びＣＬドメインを含む、それらの誘導体が挙げられる。
【００４９】
「免疫グロブリン定常領域」もしくは「定常領域」とは、本明細書で定義される用語であり、１以上の定常領域ドメインの一部またはすべてに対応するか、もしくは由来するペプチドまたはポリペプチド配列を指す。特定の実施形態においては、免疫グロブリン定常領域は１以上の定常領域ドメインの一部またはすべてに対応するか、または由来するが、ソース抗体の定常領域すべてではない。特定の実施形態においては、定常領域はＩｇＧ  ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、例えば、ＩｇＧ１  ＣＨ２ならびにＣＨ３ドメインを含む。特定の実施形態においては、定常領域はＣＨ１ドメインを含まない。特定の実施形態においては、定常領域を組成する定常領域ドメインは、ヒト型である。一部の実施形態（例えば、特定のＣＤ３結合ポリペプチドまたはタンパク質の変種）においては、本開示の融合タンパク質の定常領域ドメインは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体活性化及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）のエフェクター機能を欠乏するか、またはごく少量有し、さらに一部のＦＣ受容体（ＦＣＲｎ、新生児Ｆｃ受容体など）を結合する能力を保持し、かつｉｎ  ｖｉｖｏで比較的長い半減期を保持する。他の変形例においては、本開示の融合タンパク質は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの一方または両方のかかるエフェクター機能を保持する定常ドメインを含む。特定の実施形態においては、本開示の結合ドメインはヒトＩｇＧ１定常領域に融合され、ＩｇＧ１定常領域は以下のアミノ酸変異型：位置２３４のロイシン（Ｌ２３４）、位置２３５のロイシン（Ｌ２３５）、位置２３７のグリシン（Ｌ２３７）、位置３１８のグルタミン酸塩（Ｅ３１８）、位置３２０のリジン（Ｋ３２０）、位置３２２のリジン（Ｋ３２２）、または任意のそれらの組み合わせ（ＥＵによるナンバリング）の１以上を有する。例えば、任意のこれらのアミノ酸の１以上をアラニンに変更してよい。さらなる実施形態においては、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインはアラニン変異したＬ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、及びＫ３２２（ＥＵによるナンバリング）のそれぞれ（すなわち、それぞれＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、及びＫ３２２Ａ）、ならびに場合により同様に、Ｎ２９７Ａ突然変異（すなわち、ＣＨ２ドメインのグリコシル化を本質的に排除）を有する。
【００５０】
「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」は、細胞及び補体のＣ１ｑ成分上の抗体受容体との結合の原因となるソース抗体の一部に対応するか、または由来のポリペプチド配列を指す。Ｆｃは「結晶性フラグメント」の略語であり、タンパク質結晶を容易に形成することになる抗体のフラグメントである。タンパク質消化で最初に説明された別々のタンパク質フラグメントは、免疫グロブリンタンパク質の一般的な全構造を定義し得る。最初に文献中で定義されているように、Ｆｃフラグメントはジスルフィド連鎖Ｈ鎖ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインからなる。しかし、つい最近、用語はＣＨ３、ＣＨ２、及び第２のかかる鎖とジスルフィド連鎖二量体を形成するのに十分なヒンジの少なくとも一部からなる単鎖に適用されている。免疫グロブリン構造及び機能のレビューは、Ｐｕｔｎａｍ，Ｔｈｅ  Ｐｌａｓｍａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．Ｖ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７），ｐｐ．４９−１４０；ならびにＰａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１６９−２１７，１９９４を参照のこと。本明細書で用いられるＦｃという用語は、天然配列の変種を含む。
【００５１】
一部の実施形態においては、ＣＤ３結合タンパク質は、例えば米国特許出願公開第２００３／０１３３９３９号、２００３／０１１８５９２号、及び２００５／０１３６０４９号に一般的に開示されるように、タンパク質骨格を含む。ＣＤ３結合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、第１の結合ドメイン、ヒンジ領域、及び免疫グロブリン定常領域を含み得る。他の実施形態においては、ＣＤ３結合タンパク質は、例えば米国特許出願公開第２００９／０１４８４４７号に一般的に開示されるように、タンパク質骨格を含む。ＣＤ３結合タンパク質は、カルボキシル末端からアミノ末端の順で、免疫グロブリン定常領域、ヒンジ領域、及び第１の結合ドメインを含み得る。
【００５２】
本明細書に開示のＣＤ３結合ポリペプチド及びタンパク質は、多特異性結合タンパク質骨格を組み入れ得る。骨格を用いる多特異性結合タンパク及びポリペプチドは、例えば、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００７／１４６９６８号、米国特許出願公開第２００６／００５１８４４号、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１０／０４０１０５号、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１０／００３１０８号、米国特許第７，１６６，７０７号及び米国特許第８，４０９，５７７号に開示され、それぞれ開示内容全体が本明細書に参照として組み込まれる。ＣＤ３結合タンパク質は２の結合ドメイン（ドメインは同一または異なる標的に特異的に結合するように設計され得る）、２のヒンジ領域、及び免疫グロブリン定常領域を含み得る。ＣＤ３結合タンパク質は、２の同一のジスルフィド結合ポリペプチドを含むホモ二量体タンパク質を有し得る。
【００５３】
本明細書で用いられる、タイプＩＩＣ型レクチンの「ストーク領域」は、Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ；例えば、ナチュラルキラー細胞受容体のＣＴＬＤと類似）と膜貫通ドメインとの間に位置するタイプＩＩＣ型レクチンの細胞外ドメインの部分を指す。例えば、ヒト型ＣＤ９４分子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＣ５０２９１．１，ＰＲＩ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ３０，１９９５）において、細胞外ドメインは、アミノ酸残基３４〜１７９に対応し、ＣＴＬＤはアミノ酸残基６１〜１７６に対応する。したがって、ヒト型ＣＤ９４分子のストーク領域はアミノ酸残基３４〜６０を含み、これは膜とＣＴＬＤとの間に見られる（Ｂｏｙｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：７５，１９９９参照、また他のストーク領域の説明についてはＢｅａｖｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７５３，１９９２；及びＦｉｇｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：７７，２００２参照）。これらのタイプＩＩＣ型レクチンは、ストーク領域と膜貫通領域またはＣＴＬＤとの間に６から１０接合部アミノ酸を有し得る。別の例においては、２３３アミノ酸ヒト型ＮＫＧ２Ａタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｐ２６７１５．１，ＰＲＩ  Ｊｕｎｅ  １５，２０１０）は、アミノ酸７１〜９３にわたる膜貫通ドメイン及びアミノ酸９４〜２３３に及ぶ細胞外ドメインを有する。ＣＴＬＤは、アミノ酸１１９〜２３１からなり、５及び２のアミノ酸の接合部により隣接するストーク領域はアミノ酸９９〜１１６を含む。他のタイプＩＩＣ型レクチン、及び細胞外配位子結合ドメイン、ドメイン間またはストーク領域、ならびにＣＴＬＤは当該技術分野において公知である（ヒトＣＤ２３、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＮＫＧ２Ａ及びＮＫＧ２Ｄの配列ならびにそれらのそれぞれの説明について、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＮＰ＿００１９９３．２；ＡＡＨ０７０３７．１，ＰＲＩ  Ｊｕｌｙ  １５，２００６；ＮＰ＿００１７７３．１，ＰＲＩ  Ｊｕｎｅ  ２０，１０１０；ＡＡＬ６５２３４．１，ＰＲＩ  Ｊａｎｕａｒｙ  １７，２００２，及びＣＡＡ０４９２５．１，  ＰＲＩ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １４，２００６参照）。
【００５４】
本明細書で用いられる、膜貫通タンパク質（例えば、タイプＩ膜貫通タンパク質）の「ドメイン間領域」は、２の隣接ドメイン間に位置する膜貫通タンパク質の細胞外ドメインの一部を指す。ドメイン間領域の例としては、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーの隣接Ｉｇドメインと連鎖している領域（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥからの免疫グロブリンヒンジ領域；ＣＤ２のＩｇＶ及びＩｇＣ２ドメインを連結する領域；またはＣＤ８０もしくはＣＤ８６のＩｇＶ及びＩｇＣドメインを連結する領域）が挙げられる。他のドメイン間領域の例は、タイプＩシアル酸結合Ｉｇ様レクチンである、ＣＤ２２の非Ｉｇ及びＩｇＣ２ドメインと連結する領域である。
【００５５】
タイプＩＩＣ型レクチンのストーク領域「由来」、もしくは膜貫通タンパク質ドメイン間領域（例えば、免疫グロブリンヒンジ領域）「由来の」ポリペプチド領域は、約５〜約１５０アミノ酸配列、約５〜約１００アミノ酸配列、約５〜約５０アミノ酸配列、約５〜約４０アミノ酸配列、約５〜約３０アミノ酸配列、約５〜約２５アミノ酸配列、約５〜約２０アミノ酸配列、約１０〜約２５アミノ酸配列、約１０〜約２０アミノ酸配列、約８〜約２０アミノ酸配列、約９〜約２０アミノ酸配列、約１０〜約２０アミノ酸配列、約１１〜約２０アミノ酸配列、約１２〜約２０アミノ酸配列、約１３〜約２０アミノ酸配列、約１４〜約２０アミノ酸配列、約１５〜約２０アミノ酸配列、または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０アミノ酸配列を指し、そのすべてもしくは少なくとも一部は（ｉ）野生型ストーク領域もしくはドメイン間領域配列；（ｉｉ）野生型ストーク領域もしくはドメイン間領域配列のフラグメント；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、もしくは９５％のアミノ酸配列相同性を有するポリペプチド；または（ｉｖ）１、２、３、４、もしくは５のアミノ酸が欠損、挿入、置換、またはこれらの組み合わせを有する、例えば、１以上の変化は置換であるか、もしくは１以上の突然変異は１の欠損のみを含む、（ｉ）または（ｉｉ）のいずれかを含む。一部の実施形態においては、ストーク領域の誘導体は、約８〜約２０アミノ酸のＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２３、ＣＤ６４、ＣＤ７２、またはＣＤ９４由来のものなどの野生型ストーク領域配列と比較してタンパク質切断に対しより抵抗性である。
【００５６】
本明細書で用いられる「接合部アミノ酸」または「接合部アミノ酸残基」という用語は、ポリペプチドの２つの隣接領域もしくはドメイン間、例えば、ヒンジと隣接免疫グロブリン定常領域との間、もしくはヒンジと隣接結合ドメインとの間、またはペプチドリンカーと隣接免疫グロブリン可変ドメインもしくは隣接免疫グロブリン定常領域との間の１以上（例えば、約２〜１０）のアミノ酸残基を指す。接合部アミノ酸はポリペプチドのコンストラクト設計から得られ得る（例えば、ポリペプチドをコードする核酸分子の構築中に制限酵素部位の使用から生じるアミノ酸残基）。
【００５７】
本明細書で用いられる「ＣＨ３とＣＨ１またはＣＬとの間のリンカー」という表現は、ＣＨ３ドメイン（例えば、野生型ＣＨ３または突然変異ＣＨ３）のＣ末端とＣＨ１ドメインまたはＣＬドメイン（例えば、Ｃｋ）のＮ末端との間の１以上（約２〜１２、約２〜１０、約４〜１０、約５〜１０、約６〜１０、約７〜１０、約８〜１０、約９〜１０、約８〜１２、約９〜１２、または約１０〜１２）のアミノ酸残基を指す。
【００５８】
本明細書で用いられる「必要とする患者」または「必要とする対象」という用語は、本明細書で提供するＣＤ３結合タンパク質もしくはポリペプチドまたはそれらの組成物による治療または回復に適している疾病、疾患または病態の危険性がある、またはそれに罹患している患者または対象を指す。
【００５９】
本明細書で用いられる「医薬的に許容される」という用語は、当該技術分野において周知の経路を用いて投与する場合に、通常アレルギー性または他の重篤な副作用を起こさない分子実体及び組成物を指す。連邦もしくは州政府の規制当局に認可されるか、または米国薬局方または他の一般的に動物、より具体的にはヒトへの使用を認められる薬局方に収載される分子実体及び組成物は、「医薬的に許容される」と考えられる。
【００６０】
本明細書で用いられる「プロモーター」という用語は、転写を開始する結合ＲＮＡポリメラーゼに関与するＤＮＡの領域を指す。
【００６１】
本明細書で用いられる「核酸」、「核酸分子」、もしくは「ポリヌクレオチド」という用語は、単鎖または二重鎖形態のいずれかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド及びそれらのポリマーを指す。特に限定されない限り、用語は、参照の核酸と類似の結合性質を有し、天然ヌクレオチドと類似の方法で代謝される天然ヌクレオチドの類縁体を含む核酸を包含する。特に断りのない限り、特定の核酸配列は、保存的に変性されたそれらの変異体（例えば、縮重コドン置換）及び明確に示された配列に加えて相補的配列を黙示的に包含する。具体的に、縮重コドン置換は、１以上の選択された（またはすべての）コドンの第３位が混合基及び／またはデオキシイノシン残基と置換されている配列の生成によって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８；Ｃａｓｓｏｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８）。核酸という用語は、遺伝子によってコードされる遺伝子、ｃＤＮＡ、及びｍＲＮＡと相互的に使用される。本明細書で用いられる「核酸」、「核酸分子」、もしくは「ポリヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類縁体を用いて生成されたＤＮＡもしくはＲＮＡの類縁体、ならびにそれらの誘導体、フラグメント及び相同体を含むことを意図する。
【００６２】
「発現」という用語は核酸によってコードされた産物の生合成を指す。例えば、対象のポリペプチドをコードする核酸セグメントの場合、発現は核酸セグメントのｍＲＮＡへの転写及びｍＲＮＡの１以上のポリペプチドへの転位を含む。
【００６３】
「発現単位」及び「発現カセット」という用語は、本明細書において互換的に使用され、対象のポリペプチドをコードする核酸セグメントを示し、宿主細胞における核酸セグメントの発現をもたらすことができる。発現単位は通常、すべて操作可能な立体配置における転写プロモーター、対象のポリペプチドをコードする翻訳領域、及び転写ターミネーターを含む。転写プロモーター及びターミネーターに加えて、発現単位はさらに、例えば、エンハンサーまたはポリアデニル化信号などの他の核酸セグメントを含み得る。
【００６４】
本明細書で用いられる「発現ベクター」という用語は、１以上の発現単位を含む、直鎖または環状の核酸分子を指す。１以上の発現単位に加えて、発現ベクターも、例えば１以上の複製開始点または１以上の選択可能なマーカーなどのさらなる核酸セグメントを含み得る。発現ベクターは通常、プラスミドもしくはウィルス性ＤＮＡ由来であるか、または両方の要素を含み得る。
【００６５】
本明細書で用いられる「配列相同性」という用語は、２以上のポリヌクレオチド配列間または２以上のポリペプチド配列間の関係を指す。１の配列における位置が、対応する比較器配列の位置において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基によって占有されている場合、この配列はその位置にいて「同一」とされる。「配列相同性」パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在し、「同一の」位置の数を生じる位置の数を決定することによって計算される。次いで、「同一の」位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、１００倍して「配列同一性」のパーセンテージを得る。「配列相同性」のパーセンテージは、比較ウィンドウ上の２つの至適に整列した配列と比較することにより決定される。核酸配列の比較ウィンドウは、例えば、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００以上の核酸の長さであり得る。ポリペプチド配列の比較ウィンドウは、例えば、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００以上のアミノ酸の長さであり得る。比較のために至適に配列を整列させるため、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、参照配列が一定の間、ギャップと呼ばれる付加または欠損を含み得る。最適な整列とは、ギャップを有するとしても、参照配列と比較配列との間で可能最大数の「同一の」位置の数をもたらす整列である。２の配列間の「配列相同性」パーセントは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから入手可能（２００４年９月１日現在）なプログラム「ＢＬＡＳＴ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」のバージョンを用いて決定することができ、このプログラムは、プログラムＢＬＡＳＴＮ（核酸配列比較のため）及びＢＬＡＳＴＰ（ヌクレオチド配列比較のため）を組み込み、これらのプログラムはＫａｒｌｉｎならびにＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズムに基づく（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（１２）：５８７３−５８７７，１９９３）。「ＢＬＡＳＴ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」を使用する場合、２００４年９月１日時点でデフォルトであったパラメータを、ワードサイズ（３）、開放ギャップペナルティ（１１）、延長ギャップペナルティ（１）、ギャップ減（５０）、予想値（１０）及びマトリックス選択を含むがこれに限定されない任意の他の所望のパラメータに使用してよい。２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、２の配列が互いに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％配列相同性を有する場合、「実質的に類似の配列相同性」または「実質的配列相同性」を有すると考えられている。
【００６６】
本明細書で用いられる、「ポリペプチド」または「ポリペプチド鎖」は、共有結合したアミノ酸の単一の直鎖及び近接配列である。これは、非直鎖様式で、例えば鎖間ジスルフィド結合（例えば、Ｌ鎖がジスルフィド結合を介してＨ鎖と連結している半免疫グロブリン分子）により互いに連結する２のポリペプチド鎖を含まない。ポリペプチドは、１以上の鎖間ジスルフィド結合を有するか、または形成し得る。本明細書に記載したポリペプチドに関しては、配列番号によって特定されたものに対応するアミノ酸残基への言及は、かかる残基の翻訳後の変性を含み得る。
【００６７】
本明細書で用いられる「ＣＤ３結合タンパク質」は、「ＣＤ３結合ポリペプチド」と互換的に用いられる。かかる分子は、表面抗原分類３（ＣＤ３）タンパク質（例えば、ヒトＣＤ３）と特異的に結合する。
【００６８】
「タンパク質」は１以上のポリペプチド鎖を含む巨大分子である。またタンパク質は、炭水化物群などの非ペプチド成分も含む。炭水化物及び他の非ペプチド置換基を、タンパク質が生成される細胞によってタンパク質に付加され得、細胞のタイプによって変化する。タンパク質はそれらのアミノ酸主鎖構造に関して本明細書で定義される。炭水化物群などの置換基は一般に特定されていないが、それにもかかわらず存在し得る。タンパク質は、抗体または抗体の抗原結合フラグメントであり得る。一部の実施形態においては、タンパク質はまたｓｃＦｖ‐Ｆｃ‐ｓｃＦｖ分子、ｓｃＦｖ‐ｓｃＦｖ二量体、または二重特異性抗体であり得る。
【００６９】
「アミノ末端」及び「カルボキシル末端」という用語は、本明細書でポリペプチド内の位置を示すために用いられる。文脈が許せば、これらの用語は特定の配列または近接または関連した位置を示すポリペプチドの一部を参照して使用される。例えば、ポリペプチド内の参照配列に対してカルボキシル末端に位置する特定の配列は、参照配列のカルボキシル末端の近位に位置するが、完全なポリペプチドのカルボキシル末端にある必要はない。
【００７０】
「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ）は、通常、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識に関わるＴ細胞の表面にＣＤ３と共に見られる分子である。これは、ほとんどのＴ細胞において非常に可変性であるα鎖及びβ鎖のジスルフィド結合ヘテロ二量体からなる。他のＴ細胞においては、可変性γ鎖及びδ鎖で構成される代替的受容体が発現する。ＴＣＲのそれぞれの鎖は、免疫グロブリンスーパーファミリーの一員であり、１のＮ‐末端免疫グロブリン可変ドメイン、１の免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、及びＣ‐端末側末端に短い細胞質側末端を有する（Ａｂｂａｓ  ａｎｄ  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（５ｔｈ  Ｅｄ．），Ｅｄｉｔｏｒ：Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２００３；Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐ１４８，１４９，ａｎｄ  １７２，１９９９参照）。本開示で用いられるＴＣＲは、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳類を含む、様々な動物種由来であってよい。
【００７１】
本明細書で用いられる「ＴＣＲ複合体」は、ＣＤ３鎖及び他のＴＣＲ鎖との関連により形成される複合体を指す。例えば、ＴＣＲ複合体はＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２のＣＤ３ε鎖、ＣＤ３ζ鎖のホモ二量体、ＴＣＲα鎖、及びＴＣＲβ鎖から構成され得る。あるいは、ＴＣＲ複合体はＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２のＣＤ３ε鎖、ＣＤ３ζ鎖のホモ二量体、ＴＣＲγ鎖、及びＴＣＲδ鎖から構成され得る。
【００７２】
本明細書で用いられる「ＴＣＲ複合体の成分」は、ＴＣＲ鎖（すなわち、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγもしくはＴＣＲδ）、ＣＤ３鎖（すなわち、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３εもしくはＣＤ３ζ）、または２以上のＴＣＲ鎖もしくはＣＤ３鎖で形成された複合体（例えば、ＴＣＲα及びＴＣＲβの複合体、ＴＣＲγ及びＴＣＲδの複合体、ＣＤ３ε及びＣＤ３δの複合体、ＣＤ３γ及びＣＤ３εの複合体、もしくは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ならびに２のＣＤ３ε鎖のサブＴＣＲ複合体）を指す。
【００７３】
本明細書で用いられる「抗体依存性細胞傷害」及び「ＡＤＣＣ」は、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞障害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びマクロファージなどの単核球細胞）が、標的細胞上の結合した抗体（またはＦｃγＲに結合することができる他のタンパク質）を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介プロセスを指す。原則においては、活性化したＦｃγＲを伴う任意のエフェクター細胞は、ＡＤＣＣを媒介するようにトリガーされる。ＡＤＣＣ媒介のための一次細胞はＮＫ細胞であり、これはＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、一方単核球は、それらの活性化、局在化、または分化の状況に応じて、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩを発現することができる。造血細胞上のＦｃγＲ発現の概説に関して、例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：４５７−９２を参照のこと。
【００７４】
本明細書で用いられる「ＡＤＣＣ活性がある」という用語は、ポリペプチドもしくはタンパク質に関して、ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、ＩｇＧ由来のものなどの、ＣＨ２ならびにＣＨ３ドメインを有する免疫グロブリンヒンジ領域及び免疫グロブリン定常領域を含むもの（例えば、ＩｇＧ１））が、細胞溶解性Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＩ）のＦｃ受容体を発現する細胞溶解性免疫エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞）上への結合を介して抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介することができることを意味する。
【００７５】
本明細書で用いられる「補体依存性細胞傷害」及び「ＣＤＣ」は、正常血清（「補体」）において、成分が、抗体または標的抗原に結合した他のＣ１ｑ補体結合タンパク質と共に、標的抗原を発現する標的細胞の溶解を示すプロセスを指す。補体は、同時にかつ順序立てて作用し、それらの効果を発揮する血清タンパク質のグループからなる。
【００７６】
本明細書で用いられる「古典的補体経路」及び「古典的補体システム」は、同義であり、補体の活性化のための特定の経路を指す。古典的経路は、開始に抗原抗体複合体を必要とし、規則的な方法で、Ｃ１〜Ｃ９と命名された９の主要タンパク質成分の活性化を含む。活性化プロセスにおけるいくつかのステップについて、生成物は、後のステップを触媒する酵素である。このカスケードにより、相対的に小さな初期信号によって多量の補体の増幅及び活性化される。
【００７７】
本明細書で用いられる「ＣＤＣ活性がある」という用語は、ポリペプチドもしくはタンパク質に関して、ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、ＩｇＧ由来のものなどの、ＣＨ２ならびにＣＨ３ドメインを有する免疫グロブリンヒンジ領域及び免疫グロブリン定常領域を含むもの（例えば、ＩｇＧ１））が、Ｃ１ｑ補体タンパク質の結合及び古典的補体システムの活性を介して補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介することができることを意味する。
【００７８】
本明細書で用いられる「リダイレクトＴ細胞細胞障害性」及び「ＲＴＣＣ」は、細胞障害性Ｔ細胞ならびに標的細胞に特異的結合を可能にする多特異性タンパク質を用いて、細胞障害性Ｔ細胞を標的細胞に補充されるＴ細胞媒介プロセスを指し、それにより、標的依存性細胞傷害性Ｔ細胞応答が標的細胞に対して誘発される。本明細書に開示のＣＤ３結合ドメインを含むポリペプチド及びタンパク質ならびに腫瘍抗原結合ドメインはＲＴＣＣが可能である。
【００７９】
本明細書で用いられる「処置」「治療」、または「改善」という用語は、治療的処置または予防的／防止的処置のいずれかを指す。処置を受ける個体における疾患の少なくとも1つの症状が改善するか、もしくは処置により個体における進行性疾患の悪化を遅延させるか、またはさらなる関連疾患の発症を予防することができる場合、処置は治療的である。
【００８０】
本明細書で用いられる特異的結合分子もしくは組成物の「治療的有効量（もしくは治療的有効用量）」または「有効量（もしくは有効用量）」は、統計的に有意な方法で処置される疾患の１以上の症状の回復または臓器機能の統計的に有意な改善をもたらすのに十分な化合物の量を指す。単独で投与される個々の有効成分指す場合、治療的有効用量は、その成分のみを指す。組み合わせを指す場合、治療的有効用量は連続的にもしくは同時に投与されても（同じ製剤でまたは別の製剤で同時に）、治療的効果をもたらす有効成分の合計量を指す。
【００８１】
本明細書で用いられる「形質転換」、「トランスフェクション」及び「形質導入」という用語は、核酸（つまり、ヌクレオチドポリマー）の細胞への導入を指す。本明細書で用いられる「遺伝子形質転換」という用語は、ＤＮＡ、特に組換えＤＮＡの細胞への導入及び組込みを指す。導入された核酸は発現ベクターを介して細胞に導入される。
【００８２】
本明細書で用いられる「変異体」もしくは「変異種」という用語は、参照核酸またはポリペプチドと異なるが、それらの基本的な特性を保持する核酸またはポリペプチドを指す。通常、変異体は全体的に非常に類似しており、多くの領域において、参照核酸またはポリペプチドと同一である。例えば、変異体は、有効成分または全長参照核酸もしくはポリペプチドと比較して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列相同性を示し得る。
【００８３】
「Ｌ鎖可変領域」（「Ｌ鎖可変ドメイン」または「ＶＬ」もしくはＶＬとも呼ばれる）及び「Ｈ鎖可変領域」（「Ｈ鎖可変ドメイン」または「ＶＨ」またはＶＨとも呼ばれる）は、それぞれに、抗体Ｌ鎖ならびにＨ鎖からの可変結合領域を指す。可変結合領域は、通常ＦＲ１‐ＣＤＲ１‐ＦＲ２‐ＣＤＲ２‐ＦＲ３‐ＣＤＲ３‐ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシル末端に含む、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）及び「フレームワーク領域」（ＦＲ）として知られる明確に定義された別々のサブ領域で構成されている。一実施形態においては、ＦＲはヒト化されている。「ＣＬ」という用語は、「免疫グロブリンＬ鎖定常領域」または「Ｌ鎖定常領域」、すなわち、抗体Ｌ鎖からの定常領域を指す。「ＣＨ」という用語は、「免疫グロブリンＨ鎖定常領域」もしくは「Ｈ鎖定常領域」を指し、これは、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ）、またはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４ドメイン（ＩｇＥ、ＩｇＭ）への抗体アイソタイプに応じてさらに分けられる。「ＦＡＢ」（フラグメント抗原結合）は、抗原に結合し、可変領域及び鎖間ジスルフィド結合によってＬ鎖に結合するＨ鎖のＣＨ１ドメインを含む抗体の一部である。
【００８４】
本開示は、特異的にＣＤ３（例えば、ヒトＣＤ３）に結合する結合ドメインならびにこれらの結合ドメインを含むポリペプチド及びタンパク質を記載する。一部の実施形態においては、ＣＤ３結合タンパク質及びポリペプチドは、第２の結合ドメインを含み、第２の結合ドメインは、腫瘍抗原（例えば、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、Ｈｅｒ２、ＲＯＲ１、ＲＯＮ、糖タンパク質Ａ３３抗原（ｇｐＡ３３）またはＣＥＡ）と結合し得る。本開示の結合ドメインを含むポリペプチド及びタンパク質は、免疫グロブリン定常領域、リンカーペプチド、ヒンジ領域、免疫グロブリン二量体化／ヘテロ二量体化ドメイン、接合部アミノ酸、タグなどをさらに含み得る。開示されたポリペプチド及びタンパク質の成分はさらに以下に記載する。
【００８５】
さらに、本明細書に開示のＣＤ３結合ポリペプチド及びタンパク質は、任意の様々な異なる型式の抗体もしくは融合タンパク質の形態であり得る（例えば、融合タンパク質はＣＤ３結合二重特異性または多特異性分子の形態であり得る）。二重特異性分子の非限定例としては、ｓｃＦｖ‐Ｆｃ‐ｓｃＦｖ分子が挙げられる。一部の二重特異性分子は、通常、抗ＣＤ３ｓｃＦｖに結合する抗腫瘍抗原ｓｃＦｖを含むかまたはそれらからなり、かつ通常、免疫グロブリン定常領域などの他の配列は含まない。他の実施形態においては、ＣＤ３結合タンパク質は二重特異性抗体である。
【００８６】
本開示によるＣＤ３結合タンパク質は、通常、（ａ）本明細書に明記するように、ＣＤ３結合ドメインを含む少なくとも１のＣＤ３結合ポリペプチド鎖を含む。特定の変形例においては、ＣＤ３結合ポリペプチドはさらに（ｂ）ＣＤ３結合ドメインへのヒンジ領域カルボキシル末端、及び（ｃ）免疫グロブリン定常領域を含む。さらなる変形例においては、ＲＯＲ１結合ポリペプチドはさらに（ｄ）免疫グロブリン定常領域へのカルボキシル末端リンカーカルボキシル末端、及び（ｅ）カルボキシル末端リンカーへの第２の結合ドメインカルボキシル末端を含む。
【００８７】
さらに他の変形例においては、ＣＤ３結合ポリペプチドは（ｂ）ＣＤ３結合ドメインへのヒンジ領域アミノ末端、及び（ｃ）ヒンジ領域への免疫グロブリンサブ領域アミノ末端を含む。一部の変形例においては、ＣＤ３結合ポリペプチドは（ｂ）ＣＤ３結合ドメインへのヒンジ領域カルボキシル末端、及び（ｃ）ヒンジ領域への免疫グロブリンサブ領域カルボキシル末端を含む。
【００８８】
一部の実施形態においては、ＣＤ３結合ポリペプチドは、通常ジスルフィド結合を介して、免疫グロブリン定常領域及び／またはヒンジ領域によってホモ二量体化することができる（例えば、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン定常領域ならびにＩｇＧヒンジ領域によって）。したがって、本開示の特定の実施形態においては、２の同一の単鎖ＣＤ３結合ポリペプチドはホモ二量体化して二量体ＣＤ３結合タンパク質を形成する。
【００８９】
他の実施形態においては、ＣＤ３結合ポリペプチドは、第２の、非同一ポリペプチド鎖において、異なるヘテロ二量体化ドメインとヘテロ二量体化することができるヘテロ二量体化ドメインを含む。特定の変形例においては、ヘテロ二量体化のための第２のポリペプチド鎖は、第２の結合ドメインを含む。したがって、本開示の特定の実施形態においては、一方はＣＤ３結合ドメインを含み、もう一方は場合により第２の結合ドメインを含む２の非同一ポリペプチド鎖は二量体化してヘテロ二量体ＣＤ３結合タンパク質を形成する。ヘテロ二量体のタイプの例としては、ＵＳ２０１３／００９５０９７及びＵＳ２０１３／０１２９７２３に記載のものが挙げられる。
【００９０】
一部の実施形態においては、ＣＤ３結合ドメイン、タンパク質、もしくはポリペプチドは薬剤または毒性部分にコンジュゲートされる。
【００９１】
本開示で用いられるＣＤ３結合ポリペプチド、タンパク質、及びそれらの変形成分は、以下にさらに記載する。
【００９２】
上記の通り、本開示は特異的にＣＤ３（例えば、ヒトＣＤ３）に結合する結合ドメインに関する。ＣＤ３結合ドメインは、表１４に示すアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態においては、ＣＤ３結合ポリペプチドまたはタンパク質はシグナル配列を含む。また本開示は、それらの配列の一部であるシグナル配列を除外して、表１４に示す配列のいずれかを含むかまたはそれらにコードされたＣＤ３結合ドメイン及びタンパク質を包含する。ＣＤ３結合ドメイン及びポリペプチド、それらの内部記号、ならびにそれらの配列を表１５に要約する。一部の場合においては、本開示のＣＤ３結合ドメインはアミノ酸置換を含む。例えば、ＴＳＣ３７０は、ＩＭＧＴナンバリングシステムによる位置２７にチロシンと置換されたグリシン残基を伴うＴＳＣ３４２のアミノ酸配列を有する。
【００９３】
特定の実施形態においては、本開示はヒトＣＤ３に特異的に結合し、かつ免疫グロブリンＬ鎖可変領域及び免疫グロブリンＨ鎖可変領域を含むＣＤ３結合ドメインに関し；免疫グロブリンＬ鎖可変領域は、（ａ）配列番号８８におけるアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一もしくは少なくとも約９９％同一；または（ｂ）配列番号８９におけるアミノ酸配列と少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一もしくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み；免疫グロブリンＨ鎖可変領域は、配列番号８６におけるアミノ酸配列と少なくとも約８２％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８７％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一もしくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。ＣＤ３結合ドメインは、配列番号８３または配列番号８４におけるアミノ酸配列と少なくとも約８７％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一もしくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。ＣＤ３結合ドメインは、配列番号８３または配列番号８４を含むか、もしくはそれらからなり得る。一部の実施形態においては、ＣＤ３結合ドメインは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、または６０におけるアミノ酸配列と少なくとも約８７％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。
【００９４】
一部の実施形態においては、ＣＤ３結合ドメインは、少なくとも１のアミノ酸置換により配列番号９４と異なるＬＣＤＲ１アミノ酸配列、少なくとも１のアミノ酸置換により配列番号９５と異なるＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び少なくとも１のアミノ酸置換により配列番号９６と異なるＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む免疫グロブリンＬ鎖可変領域、ならびに少なくとも１のアミノ酸置換により配列番号９１と異なるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、少なくとも１のアミノ酸置換により配列番号９２と異なるＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び少なくとも１のアミノ酸置換により配列番号９３と異なるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む免疫グロブリンＨ鎖可変領域を含み得る。他の実施形態においては、ＣＤ３結合ドメインは、少なくとも１のアミノ酸置換により配列番号２０２と異なるＬＣＤＲ１アミノ酸配列、少なくとも１のアミノ酸置換により配列番号２０３と異なるＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び少なくとも１のアミノ酸置換により配列番号２０４と異なるＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む免疫グロブリンＬ鎖可変領域、ならびに少なくとも１のアミノ酸置換により配列番号１９９と異なるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、少なくとも１のアミノ酸置換により配列番号２００と異なるＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び少なくとも１のアミノ酸置換により配列番号２０１と異なるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む免疫グロブリンＨ鎖可変領域を含み得る。ＣＤ３結合ドメインのＣＤＲアミノ酸配列は、少なくとも１のアミノ酸置換により列挙した配列と異なり得る。少なくとも１のアミノ酸置換は、保存的または非保存的アミノ酸置換であり得る。一部の実施形態においては、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／またはＨＣＤＲ３は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０のアミノ酸による上記のＣＤＲ配列と異なる。特定の実施形態においては、本開示のＣＤＲは公知のモノクローナル抗体のＣＤＲ配列と比較して、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の挿入、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の欠損、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換もしくは非保存的アミノ酸置換）、または上記の変化の組み合わせを含む。
【００９５】
本開示におけるアミノ酸置換を記述する場合、免疫グロブリン分子の可変領域におけるアミノ酸残基の一部は、通常ＩＭＧＴ基準（Ｂｒｏｃｈｅｔ，Ｘ，ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２００８）３６，Ｗ５０３−５０８）を用いて番号付けされる。一部の実施形態においては、ＣＤ３結合ドメインにおける免疫グロブリンＬ鎖可変領域の位置５２におけるアミノ酸残基はアルギニンであり、かつ／またはＣＤ３結合ドメインにおける免疫グロブリンＬ鎖可変領域の位置５３におけるアミノ酸残基はトリプトファンである。ＣＤ３結合ドメインにおける免疫グロブリンＨ鎖可変領域の位置２７におけるアミノ酸残基はチロシンであり得る。一部の実施形態においては、ＣＤ３結合ドメインは以下の１以上を含む：（ａ）免疫グロブリンＨ鎖可変領域の位置９におけるアミノ酸残基はプロリンである；（ｂ）免疫グロブリンＨ鎖可変領域の位置５３におけるアミノ酸残基はイソロイシンである；及び（ｃ）免疫グロブリンＬ鎖可変領域の位置２１におけるアミノ酸残基はメチオニンである。ＣＤ３結合ドメインにおける免疫グロブリンＨ鎖可変領域の位置８７におけるアミノ酸残基はチロシンであり得る。ＣＤ３結合ドメインにおける免疫グロブリンＨ鎖可変領域の位置８６におけるアミノ酸残基はアスパラギン酸であり得る。一実施形態においては、ＣＤ３結合ドメインにおける免疫グロブリンＨ鎖可変領域の位置８６におけるアミノ酸残基はアスパラギン酸であり、ＣＤ３結合ドメインにおける免疫グロブリンＨ鎖可変領域の位置８７におけるアミノ酸残基はチロシンである。
【００９６】
特定の実施形態においては、ＣＤ３結合ドメインはヒト化免疫グロブリンＶＬ及び／またはＶＨ領域を含む。免疫グロブリンＶＬ及びＶＨ領域をヒト化するための技術は当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許出願公開第２００６／０１５３８３７において考察されている。特定の態様においては、ＣＤ３結合ドメインは、フレームワーク領域を含む免疫グロブリンＬ鎖可変領域及び免疫グロブリンＨ鎖可変領域を含み得、免疫グロブリンＬ鎖可変領域及び免疫グロブリンＨ鎖可変領域の少なくとも一方はヒト化され得る。一実施形態においては、免疫グロブリンＬ鎖可変領域は、ヒトＩＧＫＶ３Ｄ‐２０＊１生殖系列アミノ酸配列に基づくフレームワーク領域を含む。別の実施形態においては、免疫グロブリンＨ鎖可変領域は、ヒトＩＧＨＶ１‐６９＊０２生殖系列アミノ酸配列に基づくフレームワーク領域を含む。一部の態様においては、免疫グロブリンＨ鎖可変領域は、ヒトＩＧＨＶ１‐２＊０２（Ｈ７）、ヒトＩＧＨＶ１‐４６＊０２（Ｈ８）、ヒトＩＧＨＶ１‐３＊０１（Ｈ９）、またはヒトＩＧＨＶ１‐６９＊０２（Ｈ１０）生殖系列アミノ酸配列に基づくフレームワーク領域を含む。免疫グロブリンＬ鎖可変領域は、ヒトＩＧＫＶ３‐１１＊０１（Ｌ４）、ＩＧＫＶ１‐３３＊０１（Ｌ５）、ＩＧＫＶ１‐３９＊０１（Ｌ７）、またはＩＧＫＶ３Ｄ‐２０＊１（Ｌ８）生殖系列アミノ酸配列に基づくフレームワーク領域を含み得る。
【００９７】
本開示は、ＤＲＡ２２２  ＣＤ３結合ドメインと比較して改良された特性を有するＣＤ３結合ドメインに関する。ＤＲＡ２２２は、配列番号９０を含むＬ鎖可変領域及び配列番号８７を含むＨ鎖可変領域を有する。ＤＲＡ２２２はＷＯ２０１３／１５８８５６に記載されている。ＤＲＡ２２２は、本開示において時折ＴＳＣ３１１またはＴＳＣ３１２と呼ばれる。Ｆｃ  ＤＲＡ２２２は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。本開示は、配列番号９０を含むＬ鎖可変領域及び配列番号８７を含むＨ鎖可変領域を含むＣＤ３結合ドメインの熱安定性と比較する場合、少なくとも約１０％増加する熱安定性を有するＣＤ３結合ドメイン（または前記ドメインを含むタンパク質）を包含する。ＣＤ３結合ドメイン（または前記ドメインを含むタンパク質）の熱転移中間点（Ｔｍ）は、配列番号９０を含むＬ鎖可変領域及び配列番号８７を含むＨ鎖可変領域を含むＣＤ３結合ドメインのＴｍと比較した場合、少なくとも約３℃、少なくとも約４℃、少なくとも約５℃、または少なくとも約６℃上昇し得、及び約２０℃以下上昇した。ＣＤ３結合ドメイン（または前記ドメインを含むタンパク質）の熱転移中間点は、少なくとも約５４℃、少なくとも約５５℃、少なくとも約５６℃、または少なくとも約５７℃であり得、及び約７２℃以下であり得る。ＣＤ３結合ドメイン（もしくは前記ドメインを含むタンパク質）の熱安定性または熱転移中間点は、示差走査熱量測定または示差走査蛍光定量法によって測定され得る。
【００９８】
本明細書に開示のＣＤ３結合ドメイン（または前記ドメインを含むタンパク質）は、配列番号９０を含むＬ鎖可変領域及び配列番号８７を含むＨ鎖可変領域を含むＣＤ３結合ドメインの保存性と比較した場合、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、及び約１００％以下増加する保存性を有し得る。保存性はＣＤ３結合ドメイン（または前記ドメインを含むタンパク質）を約２５℃のＰＢＳで保管した後に計測され得る。一実施形態においては、ＣＤ３結合ドメイン（または前記ドメインを含むタンパク質）は約２５℃のＰＢＳでの保管において、少なくとも約６日、少なくとも約１０日、少なくとも約１３日及び９０日以下にわたり安定的である。
【００９９】
一部の態様においては、本明細書に開示のＣＤ３結合ドメイン（または前記ドメインを含むタンパク質）は、配列番号９０を含むＬ鎖可変領域及び配列番号８７を含むＨ鎖可変領域を含むＣＤ３結合ドメインの組換え発現の間に生成される高分子量凝集体のレベルと比較した場合、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％減少、少なくとも約３０％減少、及び約５０％以下減少した組換え発現の間に生成される高分子量凝集体のレベルを有する。
【０１００】
また本開示は、約１０ｎＭ以下のＥＣ５０を有するヒトＣＤ３に結合するＣＤ３結合ドメインに関する。本開示のＣＤ３結合ドメインはヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３の両方に特異的に結合し得る。例えば、ＣＤ３結合ドメインは、約３０ｎＭ以下のＥＣ５０を有するカニクイザルＣＤ３に結合し得る。カニクイザルＣＤ３への結合により、抗ＣＤ３治療薬が非ヒト霊長類において試験されることが可能となる。
【０１０１】
本開示は、特異的にヒトＣＤ３に結合し、かつ免疫グロブリンＬ鎖可変領域及び免疫グロブリンＨ鎖可変領域を含むＣＤ３結合ドメインを包含し、免疫グロブリンＬ鎖可変領域は配列番号９４のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号９５のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号９６のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、かつ免疫グロブリンＨ鎖可変領域は配列番号９１のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号９２のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、ＣＤ３結合ドメインは任意の１以上の本明細書に記載した性質を有する。例えば、（ｉ）ＣＤ３結合ドメイン（またはＣＤ３結合ドメイン含有タンパク質）の熱転移中間点は、少なくとも約５４℃、少なくとも約５５℃、少なくとも約５６℃、少なくとも約５７℃、及び約７２℃以下である；（ｉｉ）ＣＤ３結合ドメイン（またはＣＤ３結合ドメイン含有タンパク質）は、約２５℃のＰＢＳでの保管において、少なくとも約６日、少なくとも約１０日、少なくとも約１３日及び９０日以下にわたり安定的である；（ｉｉｉ）ＣＤ３結合ドメイン（またはＣＤ３結合ドメイン含有タンパク質）は、約１０ｎＭ以下のＥＣ５０を有するヒトＣＤ３に結合する；かつ（ｉｖ）ＣＤ３結合ドメイン（またはＣＤ３結合ドメイン含有タンパク質）は、約３０ｎＭ以下のＥＣ５０を有するカニクイザルＣＤ３に結合する。
【０１０２】
一部の実施形態においては、Ｔ細胞上のＣＤ３タンパク質に結合する場合、ＣＤ３結合ポリペプチドは、前記Ｔ細胞からサイトカイン放出を誘導しないか、またはごくわずかに検出可能なサイトカイン放出を誘導する。特定の態様においては、ＣＤ３結合タンパク質またはポリペプチドは、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３を患者に投与した場合に放出されるサイトカインと比較して、患者において減少したサイトカイン放出を示す。ＣＤ３結合ポリペプチドはＴ細胞活性化またはＴ細胞増殖を誘導し得る。
【０１０３】
特定の実施形態においては、ＣＤ３以外の標的に結合するＣＤ３結合タンパク質は１以上のさらなる結合ドメイン（例えば、第２の結合ドメイン）を含み得る。これらの他の結合ドメインは、例えば、特定のサイトカインまたは結合ドメインポリペプチドを特定の細胞型、毒素、さらなる細胞受容体、抗体などに標的化する分子を含み得る。
【０１０４】
特定の実施形態においては、本方法において使用されるＣＤ３結合ポリペプチド及び本明細書に記載した組成物は、ＣＤ３結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含む二重特異性単鎖分子である。一部の実施形態においては、ＣＤ３及び／または第２の結合ドメインは抗体から誘導され、かつ可変性Ｈ鎖（ＶＨ）及び可変性Ｌ鎖（ＶＬ）を含む。これらの結合ドメイン及び可変鎖は、標的（複数可）への一部の結合を依然として保持する任意の順で配置され得る。例えば、可変ドメインは、ＶＨ  ＳＢＤ‐ＶＬ  ＳＢＤ‐ＶＨ  ＣＤ３‐ＶＬ  ＣＤ３；ＶＬ  ＳＢＤ‐ＶＨ  ＳＢＤ‐ＶＨ  ＣＤ３‐ＶＬ  ＣＤ３；ＶＨ  ＳＢＤ‐ＶＬ  ＳＢＤ‐ＶＬ  ＣＤ３‐ＶＨ  ＣＤ３；ＶＬ  ＳＢＤ‐ＶＨ  ＳＢＤ‐ＶＬ  ＣＤ３‐ＶＨ  ＣＤ３；ＶＨ  ＣＤ３‐ＶＬ  ＣＤ３‐ＶＨ  ＳＢＤ‐ＶＬ  ＳＢＤ；ＶＬ  ＣＤ３‐ＶＨ  ＣＤ３‐ＶＬ  ＳＢＤ‐ＶＨ  ＳＢＤ；ＶＨ  ＣＤ３‐ＶＬ  ＣＤ３‐ＶＬ  ＳＢＤ‐ＶＨ  ＳＢＤ；またはＶＬ  ＣＤ３‐ＶＨ  ＣＤ３‐ＶＨ  ＳＢＤ‐ＶＬ  ＳＢＤ（ＳＢＤは「第２の結合ドメインを指す」）などの順で配置され得る。特定の態様においては、ＣＤ３に結合する結合ドメインにおいてＶＨ領域及びＶＬ領域の対は単鎖抗体の形態である（ｓｃＦｖ）。ＶＨ及びＶＬ領域はＶＨ‐ＶＬまたはＶＬ‐ＶＨの順で配置され得る。特定の実施形態においては、ＶＬ‐ＶＨ配向におけるｓｃＦｖは、ＶＨ‐ＶＬ配向におけるよりも効果的にＣＤ３に結合するか、逆もまた同じである。ＶＨ領域はリンカー配列に対しＮ末端に配置され得る。ＶＬ領域はリンカー配列に対しＣ末端に配置され得る。二重特異性単鎖分子のＣＤ３結合ドメインにおけるドメイン配置は、第２の結合ドメインに対しＣ末端に配置された前記ＣＤ３結合ドメインを有するＶＨ‐ＶＬであり得る。ある場合には、二重特異性分子はＣＤ３に結合するｓｃＦｖに結合した第２の結合ドメインへのｓｃＦｖ結合を含み得る。これらのｓｃＦｖは短ペプチドと結合され得る。一部の実施形態においては、二重特異性単鎖分子はヒンジ領域または定常領域を含まない（例えば、ＵＳ２０１３／０２９５１２１、ＵＳ２０１３／０１２９７３０、ＵＳ２０１１／０２９３６１９、ＵＳ７，６３５，４７２、ＷＯ２０１０／０３７８３６、ＷＯ２００４／１０６３８１及びＷＯ２０１１／１２１１１０を参照；それぞれ、全体が本明細書に参照として組み込まれる）。
【０１０５】
一部の実施形態においては、結合ドメインは、対象の標的に対して特異的なＶＨ及びＶＬ領域を含む単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。特定の実施形態においては、ＶＨ及びＶＬ領域はヒト型またはヒト化されている。一部の変形例においては、結合ドメインは、ペプチドリンカーによって結合された免疫グロブリンＶＬ及びＶＨ領域を含む単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。ＶＬ及びＶＨ領域の結合のためのペプチドリンカーの使用は、当該技術分野において公知であり、この特定の分野内で多くの出版物が存在する。リンカーは、アミノ酸配列ＱＲＨＮＮＳＳＬＮＴＧＴＱＭＡＧＨＳＰＮＳ（配列番号１４８）を有し得る。一部の実施形態においては、ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｓｅｒアミノ酸配列（（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３）（配列番号１９３）の３のリピートからなる１５量体である。他のリンカーが使用されており、かつファージディスプレイ技術、及び選択的感染性ファージ技術が、適切なリンカー配列を多様化及び選択するために使用されている（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１５６８２−１５６８６，１９９６；Ｈｅｎｎｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１１，４０５−４１０，１９９８）。特定の実施形態においては、ＶＬ及びＶＨ領域は式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含むアミノ酸配列を有するペプチドリンカーにより結合され、式中、ｎ＝１〜５である（配列番号１９４）。一部の実施形態においては、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ配列は６〜１０回リピートされ得る。ランダム変異誘発を介して単純なリンカー（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１９４））を最適化することにより他の好適なリンカーを得ることができる。一部の実施形態においては、ｓｃＦｖのＨ鎖可変領域はｓｃＦｖのＬ鎖可変領域にアミノ末端である。他の実施形態においては、ｓｃＦｖのＬ鎖可変領域はｓｃＦｖのＨ鎖可変領域にアミノ末端である。
【０１０６】
一部の実施形態においては、ＣＤ３結合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端の順で（またはカルボキシル末端からアミノ末端の順で）、（ｉ）第２の結合ドメイン、（ｉｉ）ヒンジ領域、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域、（ｉｖ）カルボキシル末端リンカー（またはアミノ末端リンカー）、及び（ｖ）ＣＤ３結合ドメインを含む。本明細書で用いられる、第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含むポリペプチドコンストラクトの文脈において、「ヒンジ領域」または「ヒンジ」は第１の結合ドメインとＦｃ領域との間のポリペプチド領域を指す。「カルボキシル末端リンカー」または「アミノ末端リンカー」は、Ｆｃ領域と第２の結合ドメインとの間のポリペプチド領域を指す。一部の実施形態においては、カルボキシル末端（またはアミノ末端リンカー）は、配列番号１９６を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態においては、ヒンジは野生型ヒト免疫グロブリンヒンジ領域である。特定の実施形態においては、１以上のアミノ酸残基を融合タンパク質コンストラクト設計の一部として、野生型免疫グロブリンヒンジ領域のアミノまたはカルボキシル末端に加えることができる。例えば、ヒンジアミノ末端におけるさらなる接合アミノ酸残基は「ＲＴ」、「ＲＳＳ」、「ＴＧ」、もしくは「Ｔ」であり得るか、またはヒンジカルボキシル末端では「ＳＧ」であり得、もしくはヒンジ欠損をカルボキシル末端に「ＳＧ」が付加されたΔＰなどの付加物と組み合わせることができる。
【０１０７】
特定の実施形態においては、ヒンジ、カルボキシル末端リンカー、またはアミノ末端リンカーは、野生型免疫グロブリンヒンジ領域における１以上のシステイン残基が１以上の他のアミノ酸残基（例えば、セリンまたはアラニン）と置換された変性免疫グロブリンヒンジである。
【０１０８】
代表的な変性免疫グロブリンヒンジ、カルボキシル末端リンカー、及びアミノ末端リンカーとしては、１、２、または３の異なるアミノ酸残基（例えば、セリンまたはアラニン）によって置換された、野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジに見られる、１、２、または３のシステイン残基を有する免疫グロブリンヒトＩｇＧ１ヒンジ領域が挙げられる。さらに、変性免疫グロブリンヒンジは他のアミノ酸（例えば、セリンまたはアラニン）で置換されたプロリンを有することができる。例えば、上記の変性ヒトＩｇＧ１ヒンジは、さらに他のアミノ酸（例えば、セリンまたはアラニン）で置換された野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域の３のシステインに対するカルボキシル末端に配置されたプロリンを有することができる。一実施形態においては、コアヒンジ領域のプロリンは置換されていない。
【０１０９】
特定の実施形態においては、ヒンジ、カルボキシル末端リンカー、もしくはアミノ末端リンカーポリペプチドは、野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジ、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジ、または野生型ヒトＩｇＧ４ヒンジなどの野生型免疫グロブリンヒンジ領域と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を含むか、またはこの配列である。
【０１１０】
さらなる実施形態においては、ＣＤ３結合ポリペプチドに存在するヒンジ、カルボキシル末端リンカー、またはアミノ末端リンカーは、免疫グロブリンヒンジに基づかないか、または由来しないヒンジであり得る（すなわち、野生型免疫グロブリンヒンジもしくは変性免疫グロブリンヒンジではない）。かかるヒンジ及びカルボキシル末端リンカーの例としては、膜貫通タンパク質のドメイン間領域またはタイプＩＩＣ型レクチンのストーク領域に由来する約５〜約１５０のアミノ酸のペプチド、例えば、約８〜２５のアミノ酸のペプチド及び約７〜１８のアミノ酸のペプチドが挙げられる。
【０１１１】
特定の実施形態においては、ドメイン間またはストーク領域ヒンジ、カルボキシル末端リンカー、及びアミノ末端リンカーは、７〜１８のアミノ酸を有し、かつα‐ヘリカルコイルドコイル構造を形成する。特定の実施形態においては、ドメイン間またはストーク領域ヒンジ、カルボキシル末端リンカー、またはアミノ末端リンカーは、０、１、２、３、または４のシステインを含む。代表的なドメイン間またはストーク領域ヒンジ、カルボキシル末端リンカー、及びアミノ末端リンカーとしては、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ及びＮＫＧ２Ｄのストーク領域からの１０〜１５０のアミノ酸フラグメントなどのドメイン間またはストーク領域のペプチドフラグメントが挙げられる。また、ヒンジ、カルボキシル末端リンカー、またはアミノ末端リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）リピートを含む可動性リンカー配列であり得る。一部の実施形態においては、ヒンジは、Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｓｅｒアミノ酸配列（（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３）（配列番号１９３）の３のリピートからなる１５量体である。特定の実施形態においては、ヒンジは式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含むアミノ酸配列を有し、式中、ｎ＝１〜５である（配列番号１９４）。一部の実施形態においては、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ配列は６〜１０回リピートされ得る。ランダム変異誘発を介して単純なリンカー（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１９４））を最適化することにより他の好適なヒンジを得ることができる。
【０１１２】
特定の実施形態においては、ヒンジ、カルボキシル末端リンカー及びアミノ末端リンカー配列は、約５〜１５０のアミノ酸、５〜１０のアミノ酸、１０〜２０のアミノ酸、２０〜３０のアミノ酸、３０〜４０のアミノ酸、４０〜５０のアミノ酸、５０〜６０のアミノ酸、５〜６０アミノ酸、５〜４０のアミノ酸、８〜２０のアミノ酸、または１０〜１５のアミノ酸を有する。ヒンジまたはリンカーは主に可動性であるが、より強固な特性をもたらすことができるか、または最小のβシート構造を有する主にα-ヘリックス構造を含むことができる。ヒンジ及びリンカーの長さまたは配列は、ヒンジが直接的もしくは間接的に（ヘテロ二量体化ドメインなどの他の領域もしくはドメインを介して）結合する結合ドメインの結合親和性及びヒンジまたはリンカーが直接的もしくは間接的に結合する１以上のＦｃ領域部分の活性に影響し得る。
【０１１３】
特定の実施形態においては、ヒンジ、カルボキシル末端リンカー及びアミノ末端リンカー配列は、血漿及び血清中で安定であり、タンパク質切断に耐性がある。ＩｇＧ１上部ヒンジ領域における第１のリジンは、突然変異されてタンパク質切断を最小化し得、例えば、リジンはメチオニン、スレオニン、アラニンもしくはグリシンと置換され得るか、または除去される。
【０１１４】
本開示の一部の実施形態においては、ＣＤ３結合ポリペプチドは第２のポリペプチド鎖を有するヘテロ二量体を形成することができ、かつ（ａ）免疫グロブリン定常領域に対して直接的にアミノ末端である（例えば、免疫グロブリン定常領域がＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むＣＨ２ドメインに対するアミノ末端、または免疫グロブリンサブ領域がＣＨ３及びＣＨ４ドメインを含むＣＨ３ドメインに対するアミノ末端）、（ｂ）間に挿入され、結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）及び免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインと結合する、（ｃ）間に挿入され、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン及び免疫グロブリン定常領域（例えば、免疫グロブリン定常領域はＣＨ２及びＣＨ３ドメインまたはＣＨ３及びＣＨ４ドメインを含む）と結合する、（ｄ）間に挿入され、免疫グロブリン定常領域及び結合ドメインと結合する、（ｅ）ポリペプチド鎖のアミノ末端にある、または（ｆ）ポリペプチド鎖のカルボキシル末端にあるヒンジ領域を含む。本明細書に記載したヒンジ領域を含むポリペプチド鎖は、異なるポリペプチド鎖に関連し、本明細書で提供されるヘテロ二量体タンパク質を形成することができ、形成されたヘテロ二量体は、その標的特異性または特定の標的結合親和性を保持するまたは結合ドメインを含むことになる。
【０１１５】
特定の実施形態においては、他のポリペプチド鎖とヘテロ二量体を形成するポリペプチドに存在するヒンジは、野生型免疫グロブリンヒンジ領域またはそれらの変性免疫グロブリンヒンジ領域などの免疫グロブリンヒンジであり得る。特定の実施形態においては、ヘテロ二量体タンパク質の１のポリペプチド鎖におけるヒンジはヘテロ二量体の他のポリペプチド鎖における対応するヒンジと同一である。他の特定の実施形態においては、１の鎖のヒンジは他の鎖のものと異なる（長さ及び配列において）。異なる鎖における異なるヒンジにより、ヒンジが連結されている結合ドメインの結合親和性の異なる操作を可能となるので、ヘテロ二量体は、一方の結合ドメインの標的に他方の結合ドメインの標的より優先的に結合することができる。例えば、特定の実施形態においては、ヘテロ二量体タンパク質は一方の鎖にＣＤ３結合ドメイン及び他方の鎖に第２の結合ドメインを有する。２の鎖に２の異なるヒンジを有することにより、ヘテロ二量体はまず第２の標的、次いでＣＤ３成分に結合することが可能となり得る。したがって、ヘテロ二量体はＣＤ３＋Ｔ細胞を第２の標的発現細胞（例えば、腫瘍もしくはがん細胞）に補充し、次に第２の標的発現細胞を損傷または破壊させ得る。
【０１１６】
代表的な本開示による使用に好適なヒンジ、カルボキシル末端リンカー、及びアミノ末端リンカー配列の一部は、以下の表１及び表２に示す。代表的なさらなるヒンジ及びリンカーは、ＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号２４１〜２４４、６０１、７８、７６３〜７９１、２２８、３７９〜４３４、６１８〜７４９において説明される（前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）。
【表１】
2018531000.tif 000002
2018531000.tif 000003
【表２】
2018531000.tif 000004
2018531000.tif 000005
【０１１７】
特定の実施形態においては、本開示のＣＤ３結合ポリペプチドもしくはタンパク質は、「免疫グロブリン二量体化ドメイン」または「免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン」を含み得る。
【０１１８】
本明細書で用いられる「免疫グロブリン二量体化ドメイン」または「免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン」は、優先的に他のポリペプチド鎖の異なる免疫グロブリンドメインと相互作用もしくは関連するポリペプチド鎖の免疫グロブリンドメインを指し、異なる免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインとの相互作用は、第1及び第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化の実質的な原因となるか、もしくは効率的に促進する（すなわち、２の異なるポリペプチド鎖間の二量体の形成であり、またこれはヘテロ二量体またはヘテロ二量体タンパク質と呼ばれる）。免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン間での相互作用は、第１のポリペプチド鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン及び／または第２のポリペプチド鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインの非存在下で、第1及び第２のポリペプチド鎖間の二量体化に統計学的に有意な減少がある場合、第1及び第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化の「実質的な原因となるか、もしくは効率的に促進する」。特定の実施形態においては、第1及び第２のポリペプチド鎖が同時発現する場合、少なくとも６０％、少なくとも約６０％〜約７０％、少なくとも約７０％〜約８０％、少なくとも８０％〜約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の第1及び第２のポリペプチド鎖が互いにヘテロ二量体を形成する。代表的な免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインとしては、免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、免疫グロブリンＣＬ１ドメイン（例えば、ＣκもしくはＣλアイソタイプ）、または、本明細書に提供される野生型免疫グロブリンＣＨ１及びＣＬドメインならびに変性（もしくは突然変異）した免疫グロブリンＣＨ１及びＣＬドメインを含む、それらの誘導体が挙げられる。
【０１１９】
２の非同一ポリペプチド鎖からヘテロ二量体の形成が所望される場合、二量体化／ヘテロ二量体化ドメイン使用され得るが、この場合一方または両方のポリペプチド鎖は結合ドメインを含む。特定の実施形態においては、本明細書に記載した特定のヘテロ二量体の１のポリペプチド鎖メンバーは、結合ドメインを含まない。上記のように、本開示のヘテロ二量体タンパク質はそれぞれのポリペプチド鎖に免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインを含む。ヘテロ二量体のポリペプチド鎖における免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは互いに異なり、したがって、差別的に変性され、両方の鎖のヘテロ二量体化を促進し、いずれかの鎖のホモ二量体化を最小化する。本明細書で提供される免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、異なるポリペプチド間の効率的なヘテロ二量体化及び得られたヘテロ二量体タンパク質の精製の促進を可能にする。
【０１２０】
本明細書で提供される、本開示による２の異なる単鎖ポリペプチド（例えば、１の短鎖及び１の長鎖）のヘテロ二量体化を促進するのに有用な免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、免疫グロブリンＣＨ１及びＣＬドメイン、例えば、ヒトＣＨ１ならびにＣＬドメインを含む。特定の実施形態においては、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ  ＣＨ１ドメインなどの野生型ＣＨ１ドメインである。さらなる実施形態においては、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、それぞれＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号１１４、１８６〜１９２及び１９４に記述されているように、野生型ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ  ＣＨ１ドメインである（前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）。特定の実施形態においては、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、ＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号１１４に記述されているように、野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインである（前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）。
【０１２１】
さらなる実施形態においては、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、変性ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ  ＣＨ１ドメインなどの変性ＣＨ１ドメインである。特定の実施形態においては、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、変性ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ  ＣＨ１ドメインである。さらなる実施形態においては、野生型免疫グロブリンＣＬドメイン（例えば、ヒトＣＬ）とのジスルフィド結合の形成に関係している野生型ＣＨ１ドメイン（例えば、ヒトＣＨ１）のシステイン残基は、ジスルフィド結合が変性ＣＨ１ドメインと野生型ＣＬドメインとの間に形成されないように、変性免疫グロブリンＣＨ１ドメインにおいて除去または置換される。
【０１２２】
特定の実施形態においては、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、野生型Ｃκドメインまたは野生型Ｃλドメインなどの野生型ＣＬドメインである。特定の実施形態においては、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、それぞれＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号１１２及び１１３に記述されているように、野生型ヒトＣκまたはヒトＣλドメインである（前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）。さらなる実施形態においては、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、変性ＣκまたはＣλドメイン、例えば、変性ヒトＣκまたはヒトＣλドメインなどの変性免疫グロブリンＣＬドメインである。
【０１２３】
特定の実施形態においては、野生型免疫グロブリンＣＨ１ドメイン（例えば、ヒトＣＨ１）とのジスルフィド結合の形成に関係している野生型ＣＬドメイン（例えば、ヒトＣＬ）のシステイン残基は、変性免疫グロブリンＣＬドメインにおいて除去されるかまたは置換される。かかる変性ＣＬドメインは、それらのアミノ末端においてさらにアミノ酸欠損をさらに含み得る。代表的なＣκドメインはＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号１４１（前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）に記述されており、野生型ヒトＣκドメインの第１のアルギニン及び最後のシステインは両方除去されている。特定の実施形態においては、野生型ヒトＣκドメインから除去された第１のアルギニンが、そのカルボキシル末端にアルギニンを有し、変性Ｃκドメインのアミノ末端を他のドメイン（例えば、免疫グロブリンＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むサブ領域などの免疫グロブリンサブ領域）と結合するリンカーによって提供され得るため、野生型ヒトＣκドメインの最終のシステインのみが変性Ｃκドメイン中で除去される。代表的なＣλドメインは、ＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号１４０（前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）に記述されており、野生型ヒトＣλドメインの第１のアルギニンは除去され、ＣＨ１ドメインにおけるシステインとのジスルフィド結合に関係しているシステインは、セリンにより置換される。
【０１２４】
さらなる実施形態においては、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、野生型Ｃκドメインと比較して、Ｃκ‐Ｃκ境界面において鎖間水素結合ネットワークの形成に関係し得る位置に１以上のアミノ酸置換を含む変性Ｃκドメインである。例えば、特定の実施形態においては、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、他のアミノ酸と置換されたＮ２９、Ｎ３０、Ｑ５２、Ｖ５５、Ｔ５６、Ｓ６８またはＴ７０の位置に１以上のアミノ酸を有する変性ヒトＣκドメインである。アミノ酸のナンバリングは、ＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号１４１（前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）に記述されている変性ヒトＣκ配列におけるそれらの位置に基づく。特定の実施形態においては、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｖ５５、もしくはＴ７０の位置に１、２、３、または４のアミノ酸置換を有する変性ヒトＣκドメインである。上記の位置において置換として用いられるアミノ酸は、アラニン、もしくはアルギニン、トリプトファン、チロシン、グルタメート、グルタミン、またはリジンなどの大量の側鎖部分を有するアミノ酸残基であり得る。上記の位置（例えば、Ｎ３０）で野生型ヒトＣκ配列のアミノ酸残基を置換するのに用いられ得るさらなるアミノ酸残基としては、アスパラギン酸、メチオニン、セリン及びフェニルアラニンが挙げられる。代表的な変性ヒトＣκドメインは、ＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号１４２〜１７８に記述されている（前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）。変性ヒトＣκドメインは、ＣＨ１ドメインとのヘテロ二量体化を促進するが、他のＣκドメインとのホモ二量体化を最小化するものである。代表的な変性ヒトＣκドメインは、ＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号１６０（Ｎ２９Ｗ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ａ）、１６１（Ｎ２９Ｙ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ａ）、２０２（Ｔ７０Ｅ  Ｎ２９Ａ  Ｎ３０Ａ  Ｖ５５Ａ）、１６７（Ｎ３０Ｒ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ａ）、１６８（Ｎ３０Ｋ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ａ）、１７０（Ｎ３０Ｅ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ａ）、１７２（Ｖ５５Ｒ  Ｎ２９Ａ  Ｎ３０Ａ）、１７５（Ｎ２９Ｗ  Ｎ３０Ｙ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ｅ）、１７６（Ｎ２９Ｙ  Ｎ３０Ｙ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ｅ）、１７７（Ｎ３０Ｅ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ｅ）、１７８（Ｎ３０Ｙ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ｅ）、８３８（Ｎ３０Ｄ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ｅ）、８３９（Ｎ３０Ｍ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ｅ）、８４０（Ｎ３０Ｓ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ｅ）、及び８４１（Ｎ３０Ｆ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ｅ）に記述されている（前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）。
【０１２５】
特定の実施形態においては、本明細書に記載したＣκドメインにおける突然変異に加えて、またはその代替として、ポリペプチドヘテロ二量体の両方の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン（すなわち、免疫グロブリンＣＨ１及びＣＬドメイン）は突然変異を有するため、得られた免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、突然変異した部位のアミノ酸残基間の塩橋（すなわち、イオン相互作用）を形成する。例えば、ポリペプチドヘテロ二量体の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、突然変異Ｃκドメインと共に突然変異したＣＨ１ドメインであり得る。突然変異したＣＨ１ドメインにおいては、野生型ヒトＣＨ１ドメインの位置６８のバリン（Ｖ６８）は、負電荷を有するアミノ酸残基（例えば、アスパルテートまたはグルタメート）によって置換される一方、第１のアルギニン及び最終のシステインが除去されている突然変異ヒトＣκドメインの位置２９のロイシン（Ｌ２９）は、正電荷を有するアミノ酸残基（例えば、リジン、アルギニンまたはヒスチジン）によって置換される。得られる突然変異ＣＨ１ドメインの負電荷を有するアミノ酸残基と得られる突然変異Ｃκドメインの正電荷を有するアミノ酸残基との間の電荷‐電荷相互作用により、塩橋が形成され、これにより、突然変異ＣＨ１及びＣκドメイン間のヘテロ二量体境界面が安定化する。あるいは、野生型ＣＨ１のＶ６８は正電荷を有するアミノ酸残基により置換され得る一方、第１のアルギニン及び最終のシステインが除去されている突然変異ヒトＣκドメインのＬ２９は、負電荷を有するアミノ酸残基により置換され得る。Ｖ６８が負電荷または正電荷のいずれかを有するアミノ酸によって置換される代表的な突然変異ＣＨ１配列は、ＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号８４４及び８４５に記述されている（前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）。Ｌ２９が負電荷または正電荷のいずれかを有するアミノ酸によって置換される突然変異Ｃκ配列の代表例は、ＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号８４２及び８４３に記述されている（前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）。
【０１２６】
ヒトＣＨ１ドメインのＶ６８及びヒトＣκドメインのＬ２９以外の位置は、反対の電荷を有するアミノ酸と置換され得、ＣＨ１ドメインのＶ６８及びＣκドメインのＬ２９における突然変異に加えて、またはその代替として、アミノ酸間でイオン相互作用をもたらす。かかる位置は、一連の基準（例えば、イオン性相互作用に関与する傾向、潜在的なパートナー残基への接近性など）を用いる、ランダム変異誘発、ＣＨ１‐Ｃκ境界面のアミノ酸残基を同定するためのＣＨ１‐Ｃκ対の結晶構造の分析、及びＣＨ１‐Ｃκ境界面のアミノ酸残基の中で好適な位置のさらなる同定を含む任意の好適な方法によって同定され得る。
【０１２７】
特定の実施形態においては、本開示のポリペプチドヘテロ二量体は一対の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインのみ含む。例えば、ポリペプチドヘテロ二量体の第１の鎖は、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインとしてＣＨ１ドメインを含み得る一方、第２の鎖は、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインとしてＣＬドメイン（例えば、ＣκまたはＣλ）を含み得る。あるいは、第１の鎖は免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインとしてＣＬドメイン（例えば、ＣκまたはＣλ）を含み得る一方、第２の鎖は、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインとしてＣＨ１ドメインを含み得る。本明細書に記載の通り、第１及び第２の鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、本開示のヘテロ二量体タンパク質の形成に関連することができる。
【０１２８】
他の特定の実施形態においては、本開示のヘテロ二量体タンパク質は、２対の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインを含む。例えば、ヘテロ二量体の第１の鎖は２のＣＨ１ドメインを含み得る一方、第２の鎖は、第１の鎖における２のＣＨ１ドメインに付随する２のＣＬドメインを含み得る。あるいは、第１の鎖は２のＣＬドメインを含み得る一方、第２の鎖は、第１の鎖における２のＣＬドメインに付随する２のＣＨ１ドメインを含み得る。特定の実施形態においては、第１のポリペプチド鎖はＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインを含む一方、第２のポリペプチド鎖は、それぞれ第１のポリペプチド鎖のＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに付随するＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインを含む。
【０１２９】
ヘテロ二量体タンパク質は、１のヘテロ二量体化対のみ（すなわち、それぞれの鎖に１の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン）を含む実施形態においては、それぞれの鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインはその鎖の免疫グロブリン定常領域に対しアミノ末端に位置し得る。あるいは、それぞれの鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインはその鎖の免疫グロブリン定常領域に対しカルボキシル末端に位置し得る。
【０１３０】
ヘテロ二量体タンパク質は、２のヘテロ二量体化対（すなわち、それぞれの鎖に２の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン）を含む実施形態においては、それぞれの鎖の両方の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインはその鎖の免疫グロブリン定常領域に対しアミノ末端に位置し得る。あるいは、それぞれの鎖における両方の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインはその鎖の免疫グロブリン定常領域に対しカルボキシル末端に位置し得る。さらなる実施形態においては、それぞれの鎖における一方の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインはその鎖の免疫グロブリン定常領域に対しアミノ末端に位置し得る一方で、それぞれの鎖における他方の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインはその鎖の免疫グロブリン定常領域に対しカルボキシル末端に位置し得る。すなわち、これらの実施形態においては、免疫グロブリン定常領域はそれぞれの鎖の２の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン間に挿入される。
【０１３１】
本明細書で指示される通り、特定の実施形態においては、本開示のＣＤ３結合ポリペプチドはポリペプチド鎖に免疫グロブリン定常領域（定常領域とも呼ばれる）を含む。免疫グロブリン定常領域の包含により、対象への投与後の循環から、２のＣＤ３結合ポリペプチド鎖から形成されたホモ二量体及びヘテロ二量体タンパク質のクリアランスが遅くなる。突然変異または他の変化により、免疫グロブリン定常領域は比較的容易に二量体ポリペプチドエフェクター機能の調節（例えば、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ、補体結合、及びＦｃ受容体への結合）がさらに可能となり、これらは、当該技術分野において公知かつ本明細書に記載したように、治療している疾病に応じて、増加または減少する。特定の実施形態においては、本開示のポリペプチドホモ二量体及びヘテロ二量体のポリペプチド鎖の一方または両方の免疫グロブリン定常領域は、これらのエフェクター機能の１以上を媒介することができる可能性がある。他の実施形態においては、これらのエフェクター機能の１以上は本開示のポリペプチドホモ二量体及びヘテロ二量体のポリペプチド鎖の一方または両方の免疫グロブリン定常領域において、対応する野生型免疫グロブリン定常領域と比較して、減少または欠如している。例えば、第２の結合ドメインの包含を介するなどして、ＲＴＣＣを誘発するために設計された二量体ＣＤ３結合ポリペプチドの場合、免疫グロブリン定常領域は減少しているか、または対応する野生型免疫グロブリン定常領域に対してエフェクター機能がない可能性がある。
【０１３２】
本開示のＣＤ３結合ポリペプチドに存在する免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、もしくはこれらの任意の組み合わせを含むか、またはこれらの一部または全てから誘導され得る。例えば、免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの両方、ＣＨ３及びＣＨ４ドメインの両方、２のＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、２のＣＨ４ドメイン、及びＣＨ２ドメインならびにＣＨ３ドメインの一部を含み得る。
【０１３３】
本開示のＣＤ３結合ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域を形成できるＣＨ２ドメインは、特定の免疫グロブリンクラスもしくはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、もしくはＩｇＤ）、ならびに様々な種（ヒト、マウス、ラット及び他の哺乳類）由来の野生型免疫グロブリンＣＨ２ドメインまたは変性免疫グロブリンＣＨ２ドメインであり得る。
【０１３４】
特定の実施形態においては、ＣＨ２ドメインは、それぞれＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号１１５、１９９〜２０１及び１９５〜１９７に記述されているように、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、またはＩｇＤの野生型ＣＨ２ドメインなどの野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ２ドメインである（前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）。特定の実施形態においては、ＣＨ２ドメインは、ＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号１１５に記述されているように、野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインである（前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）。
【０１３５】
特定の実施形態においては、ＣＨ２ドメインは、位置２９７のアスパラギンでのアミノ酸置（例えば、アラニンに対しアスパラギン）を含む変性免疫グロブリンＣＨ２領域（例えば、変性ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）である。かかるアミノ酸置換により、この部位でのグリコシル化が減少または除去され、ＦｃγＲ及びＣ１ｑへの効率的なＦｃ結合が抑止される。位置２９７でのＡｓｎからＡｌａ置換を有する変性ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインの配列は、ＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号３２４に記述されている（前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）。
【０１３６】
特定の実施形態においては、ＣＨ２ドメインは、位置２３４〜２３８で少なくとも１の置換または欠損を含む変性免疫グロブリンＣＨ２領域（例えば、変性ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）である。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、位置２３４、２３５、２３６、２３７または２３８、位置２３４及び２３５、位置２３４及び２３６、位置２３４及び２３７、位置２３４及び２３８、位置２３４〜２３６、位置２３４、２３５及び２３７、位置２３４、２３６及び２３８、位置２３４、２３５、２３７、及び２３８、位置２３６〜２３８での置換、または位置２３４〜２３８での２、３、４、もしくは５のアミノ酸の他の任意の組み合わせを含み得る。加えて、または代わりに、変性ＣＨ２領域は、位置２３４〜２３８、例えば、他の位置が置換されている間は位置２３６もしくは位置２３７の一方に１以上（例えば、２、３、４、または５）のアミノ酸欠損を含み得る。上記の突然変異（複数可）は、変性ＣＨ２ドメインを含むポリペプチドヘテロ二量体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性もしくはＦｃ受容体結合能を減少させるか、または排除する。特定の実施形態においては、位置２３４〜２３８の１以上のアミノ酸残基は、１以上のアラニン残基と置換されている。さらなる実施形態においては、位置２３４〜２３８のアミノ酸残基の１のみ欠失させ、一方で、位置２３４〜２３８の残りのアミノ酸の１以上は、他のアミノ酸（例えば、アラニンまたはセリン）と置換され得る。
【０１３７】
他の特定の実施形態においては、ＣＨ２ドメインは、位置２５３、３１０、３１８、３２０、３２２、及び３３１で１以上のアミノ酸置換を含む変性免疫グロブリンＣＨ２領域（例えば、変性ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）である。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は位置２５３、３１０、３１８、３２０、３２２、もしくは３３１、位置３１８及び３２０、位置３１８及び３２２、位置３１８、３２０及び３２２での置換、または位置２５３、３１０、３１８、３２０、３２２、及び３３１での２、３、４、５もしくは６のアミノ酸の他の任意の組み合わせを含み得る。上記の突然変異（複数可）は、変性ＣＨ２ドメインを含むポリペプチドヘテロ二量体の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を減少させるか、または排除する。
【０１３８】
他の特定の実施形態においては、位置２９７でのアミノ酸置換以外に、変性ＣＨ２領域（例えば、変性ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）は、位置２３４〜２３８でさらに１以上（例えば、２、３、４、または５）のさらなる置換を含み得る。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、位置２３４及び２９７、位置２３４、２３５、及び２９７、位置２３４、２３６及び２９７、位置２３４〜２３６及び２９７、位置２３４、２３５、２３７及び２９７、位置２３４、２３６、２３８及び２９７、位置２３４、２３５、２３７、２３８及び２９７、位置２３６〜２３８及び２９７での置換、または位置２９７に加えて位置２３４〜２３８での２、３、４、もしくは５のアミノ酸の任意の組み合わせを含み得る。加えて、または代わりに、変性ＣＨ２領域は、位置２３４〜２３８（位置２３６または位置２３７など）に１以上（例えば、２、３、４、または５）のアミノ酸欠損を含み得る。さらなる突然変異（複数可）は、変性ＣＨ２ドメインを含むポリペプチドヘテロ二量体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性もしくはＦｃ受容体結合能を減少させるか、または排除する。特定の実施形態においては、位置２３４〜２３８の１以上のアミノ酸残基は、１以上のアラニン残基と置換されている。さらなる実施形態においては、位置２３４〜２３８の１以上のアミノ酸残基の１のみが欠失され、一方で、位置２３４〜２３８の残りのアミノ酸の１以上は、他のアミノ酸（例えば、アラニンまたはセリン）と置換され得る。
【０１３９】
特定の実施形態においては、位置２３４〜２３８での１以上（例えば、２、３、４、もしくは５）のアミノ酸置換以外に、本開示の融合タンパク質における突然変異ＣＨ２領域（例えば、変性ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）は、補体結合に関係している１以上の位置（例えば、位置Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、もしくはＰ３３１）において、１以上（例えば、２、３、４、５、または６）のさらなるアミノ酸置換（例えば、アラニンと置換された）を含み得る。突然変異免疫グロブリンＣＨ２領域の例としては、位置２３４、２３５、２３７（存在する場合）、３１８、３２０及び３２２にアラニン置換を有する、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４及びマウスＩｇＧ２ａ  ＣＨ２領域が挙げられる。突然変異免疫グロブリンＣＨ２領域の代表例は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、及びＫ３２２にアラニン置換を有する、マウスＩＧＨＧ２ｃ  ＣＨ２領域である。
【０１４０】
さらなるの実施形態においては、位置２９７でのアミノ酸置換及び位置２３４〜２３８でのさらなる欠損（複数可）または置換（複数可）以外に、変性ＣＨ２領域（例えば、変性ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）は、位置２５３、３１０、３１８、３２０、３２２、及び３３１において１以上（例えば、２、３、４、５、または６）のさらなる置換をさらに含み得る。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、（１）位置２９７での置換、（２）位置２３４〜２３８での１以上の置換もしくは欠損またはこれらの組み合わせ、ならびに位置Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、もしくはＰ３３１での１以上（例えば、２、３、４、５、または６）アミノ酸置換（位置Ｅ３１８、Ｋ３２０、及びＫ３２２での１、２、３の置換など）を含み得る。上記の位置でのアミノ酸は、アラニンまたはセリンと置換され得る。
【０１４１】
特定の実施形態においては、免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドは：（ｉ）位置２９７のアスパラギンにおけるアミノ酸置換及び位置２３４、２３５、２３６または２３７におけるアミノ酸置換；（ｉｉ）位置２９７のアスパラギンにおけるアミノ酸置換及び位置２３４〜２３７の２におけるアミノ酸置換；（ｉｉｉ）位置２９７のアスパラギンにおけるアミノ酸置換及び位置２３４〜２３７の３におけるアミノ酸置換；（ｉｖ）位置２９７のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、位置２３４、２３５、及び２３７のおけるアミノ酸置換、及び位置２３６におけるアミノ酸欠損；（ｖ）位置２３４〜２３７の３におけるアミノ酸置換及び位置３１８、３２０及び３２２におけるアミノ酸置換；または（ｖｉ）位置２３４〜２３７の３におけるアミノ酸置換、位置２３６におけるアミノ酸欠損、ならびに位置３１８、３２０及び３２２におけるアミノ酸置換を含む。
【０１４２】
位置２９７のアスパラギンにおけるアミノ酸置換を有する変性免疫グロブリンＣＨ２領域の代表例としては：Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、及びＮ２９７にアラニン置換を有し、Ｇ２３６に欠損を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２領域（ＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号３２５、前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）、Ｖ２３４、Ｇ２３６、及びＮ２９７にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ２  ＣＨ２領域（ＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号３２６、前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）、Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７及びＮ２９７にアラニン置換を有し、Ｇ２３６に欠損を有するヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域（ＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号３２２、前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）、Ｆ２３４及びＮ２９７にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域（ＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号３４３、前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）、Ｌ２３５及びＮ２９７にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域（ＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号３４４、前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）、Ｇ２３６及びＮ２９７にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域（ＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号３４５、前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）、ならびにＧ２３７及びＮ２９７にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域（ＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号３４６、前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）が挙げられる。
【０１４３】
特定の実施形態においては、上記のアミノ酸置換に加えて、変性ＣＨ２領域（例えば、変性ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）は、上記の位置以外に１以上の位置に、１以上のさらなるアミノ酸置換を含み得る。かかるアミノ酸置換は保存的または非保存的アミノ酸置換であり得る。例えば、特定の実施形態においては、変性ＩｇＧ２  ＣＨ２領域におけるＰ２３３をＥ２３３に変更することができる（例えば、ＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号３２６参照、前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）。加えて、もしくは代替的に、特定の実施形態においては、変性ＣＨ２領域は１以上のアミノ酸挿入、欠損、またはその両方を含み得る。挿入（複数可）、欠損（複数可）または置換（複数可）は、ヒンジを介するＣＨ２領域と他の領域（例えば、結合ドメインもしくは免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン）との結合により得られた野生型免疫グロブリンＣＨ２領域のＮまたはＣ末端においてなど免疫グロブリンＣＨ２領域のどこでもよい。
【０１４４】
特定の実施形態においては、本開示のポリペプチドにおける変性ＣＨ２領域は、野生型免疫グロブリンＣＨ２領域（野生型ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ４、またはマウスＩｇＧ２ａ（例えば、ＩＧＨＧ２ｃ）のＣＨ２領域など）と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一の配列を含むか、またはこの配列である。
【０１４５】
本開示のＣＤ３結合ポリペプチドにおける変性免疫グロブリンＣＨ２領域は、様々な種（ヒト、マウス、ラット、及び他の哺乳類を含む）由来のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、及びＩｇＤなどの様々な免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ２領域由来であり得る。特定の実施形態においては、本開示の融合タンパク質における変性免疫グロブリンＣＨ２領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４、またはマウスＩｇＧ２ａ（例えば、ＩＧＨＧ２ｃ）のＣＨ２領域由来であり得、これらの配列はＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号１１５、１９９、２０１、及び３２０に記述される（前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）。
【０１４６】
特定の実施形態においては、変性ＣＨ２ドメインは位置２３５、３１８、３２０、及び３２２にアラニン置換（すなわち、Ｌ２３５Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ及びＫ３２２Ａ置換を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）（ＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号５９５、前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）ならびに任意にＮ２９７突然変異（例えば、アラニンに対し）を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインである。特定の他の実施形態においては、変性ＣＨ２ドメインは位置２３４、２３５、２３７、３１８、３２０及び３２２にアラニン置換（すなわち、Ｌ３２４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ及びＫ３２２Ａ置換を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）（ＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号５９６、前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）ならびに任意にＮ２９７突然変異（例えば、アラニンに対し）を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインである。
【０１４７】
特定の実施形態においては、変性ＣＨ２ドメインは当該技術分野において公知の、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ、補体結合、Ｆｃ受容体結合、またはこれらの任意の組み合わせなどの免疫学的活性を促進する突然変異を有する変性ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインである。
【０１４８】
本開示のＣＤ３結合ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域を形成できるＣＨ３ドメインは、様々な種（ヒト、マウス、ラット、及び他の哺乳類を含む）の特定の免疫グロブリンクラスもしくはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ）由来の野生型免疫グロブリンＣＨ３ドメインまたは変性免疫グロブリンＣＨ３ドメインであり得る。特定の実施形態においては、ＣＨ３ドメインは、それぞれＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号１１６、２０８〜２１０、２０４〜２０７、及び２１２に記述されているように、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭの野生型ＣＨ３ドメインなどの野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ３ドメインである（前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）。特定の実施形態においては、ＣＨ３ドメインは、ＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号１１６に記述されているように、野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインである（前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）。特定の実施形態においては、ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体の野生型ＣＨ３ドメインに基づくか、またはその由来の変性ＣＨ３ドメインなどの変性ヒト免疫グロブリンＣＨ３ドメインである。例えば、変性ＣＨ３ドメインは、位置Ｈ４３３及びＮ４３４（位置はＥＵナンバリングによって番号付けされる）に１または２の突然変異を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインであり得る。かかる位置の突然変異は補体結合に関係し得る。他の特定の実施形態においては、変性ＣＨ３ドメインはヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインであり得るが、位置Ｆ４０５またはＹ４０７に１または２のアミノ酸置換を有する。かかる位置のアミノ酸は、他のＣＨ３ドメインとの相互作用に関係している。特定の実施形態においては、変性ＣＨ３ドメインは、その最終のリジンが欠失した変性ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインであり得る。変性ヒトＣＨ３ドメインの配列は、ＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号７６１に記述されている（前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）。
【０１４９】
特定の実施形態においては、ポリペプチドヘテロ二量体を形成するＣＤ３結合ポリペプチドは、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」突然変異を有するＣＨ３対を含む（Ｍａｒｖｉｎ  ａｎｄ  Ｚｈｕ，Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ  ２６：６４９−５８，２００５；Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９：６１７−２１，１９６６参照）。より具体的には、ＣＨ３／ＣＨ３会合に必要な立体相補性がこれらの２のＣＨ３ドメインを互いに対にするため、突然変異はそれぞれのポリペプチド鎖の２のＣＨ３ドメインのそれぞれに導入され得る。例えば、ポリペプチドヘテロ二量体の１の単鎖ポリペプチドにおけるＣＨ３ドメインは、Ｔ３３６Ｗ突然変異（低分子アミノ酸を大きいものと置換する「ノブ（ｋｎｏｂ）」突然変異）を含み得、かつポリペプチドヘテロ二量体の他の単鎖ポリペプチドにおけるＣＨ３ドメインは、Ｙ４０７Ａ突然変異（大きいアミノ酸を小さなものと置換する「ホール（ｈｏｌｅ）」突然変異）を含み得る。ノブ・イントゥ・ホール突然変異の他の代表例としては、（１）１のＣＨ３ドメインにおけるＴ３３６Ｙ突然変異及び他のＣＨ３ドメインにおけるＹ４０７Ｔ、ならびに（２）１のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｗ突然変異ならびに他のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ突然変異が挙げられる。
【０１５０】
本開示のＣＤ３結合ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域を形成し得るＣＨ４ドメインは、それらのＩｇＥまたはＩｇＭ分子由来の野生型免疫グロブリンＣＨ４ドメインまたは変性免疫グロブリンＣＨ４ドメインであり得る。特定の実施形態においては、ＣＨ４ドメインは、それぞれＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号２１３及び２１４に記述されているように、ヒトＩｇＥ及びＩｇＭ分子の野生型ＣＨ４ドメインなどの野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ４ドメインである（前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）。特定の実施形態においては、ＣＨ４ドメインは、ＩｇＥもしくはＩｇＭ  Ｆｃ領域と関連していると知られる、免疫学的活性を増加または減少させる突然変異を有するヒトＩｇＥまたはＩｇＭ分子のＣＨ４ドメインに基づくか、もしくはこれらに由来する変性ＣＨ４ドメインなどの変性ヒト免疫グロブリンＣＨ４ドメインである。
【０１５１】
特定の実施形態においては、本開示のＣＤ３結合ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４ドメインの組み合わせ（すなわち、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４から選択される１を超える定常領域ドメイン）を含む。例えば、免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインまたはＣＨ３及びＣＨ４ドメインを含み得る。他の特定の実施形態においては、免疫グロブリン定常領域は２のＣＨ３ドメインを含み得、ＣＨ２またはＣＨ４ドメインを含まない（すなわち、２以上のＣＨ３のみ）。免疫グロブリン定常領域を形成する複数の定常領域ドメインは同一の免疫グロブリン分子、または同一のクラスもしくはサブクラスの免疫グロブリン分子に基づくか、または由来し得る。特定の実施形態においては、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ  ＣＨ２ＣＨ３（例えば、ＩｇＧ１  ＣＨ２ＣＨ３、ＩｇＧ２  ＣＨ２ＣＨ３、及びＩｇＧ４  ＣＨ２ＣＨ３）であり、ヒト型（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４）ＣＨ２ＣＨ３であり得る。例えば、特定の実施形態においては、免疫グロブリン定常領域は（１）野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、（２）Ｎ２９７Ａ置換を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２（すなわち、ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ））及び野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３、または（３）ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ）及び最終のリジンが欠失された変性ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３を含む。
【０１５２】
あるいは、複数の定常領域ドメインは、異なる免疫グロブリン分子、または異なるクラスもしくはサブクラス免疫グロブリン分子に基づくか、または由来し得る。例えば、特定の実施形態においては、免疫グロブリン定常領域はヒトＩｇＭ  ＣＨ３ドメイン及びヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインの両方を含む。免疫グロブリン定常領域を形成する複数の定常領域ドメインは、互いに直接結合し得るか、または互いに１以上（例えば、約２〜１０）のアミノ酸を介して結合し得る。
【０１５３】
免疫グロブリン定常領域の代表例は、ＵＳ２０１３／０１２９７２３の配列番号３０５〜３０９、３２１、３２３、３４１、３４２、及び７６２において説明される（前記配列は本明細書に参照として組み込まれる）。
【０１５４】
特定の実施形態においては、ポリペプチドホモ二量体またはヘテロ二量体の両方のＣＤ３結合ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域は、互いに同一である。特定の他の実施形態においては、ヘテロ二量体タンパク質の１のポリペプチド鎖における免疫グロブリン定常領域は、ヘテロ二量体の他のポリペプチド鎖における免疫グロブリン定常領域と異なる。例えば、ヘテロ二量体タンパク質の１の免疫グロブリン定常領域は、「ノブ」突然変異を有するＣＨ３ドメインを含み得、一方ヘテロ二量体タンパク質の他の免疫グロブリン定常領域は「ホール」突然変異を有するＣＨ３ドメインを含み得る。
【０１５５】
本開示は、表１４に示された配列のいずれかを含み得るＣＤ３結合タンパク質及びポリペプチドに関する。ポリペプチドコンストラクトのアミノ酸配列は、シグナル配列を含み得るか、または含み得ない。ＣＤ３結合タンパク質は、上記のＣＤ３結合ドメインのいずれかを含み得る。一部の態様においては、ＣＤ３結合タンパク質はヒト化ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列、またはその両方を含む。
【０１５６】
二重特異性ＣＤ３結合ポリペプチドの例は、表１２及び１３に示す。かかる例は、抗ＰＳＭＡｘ抗ＣＤ３結合分子（配列番号６２、６４、６６、及び６８）、抗ＣＤ３７ｘ抗ＣＤ３結合分子（配列番号７２、７４、７６、７８、８０、及び８２）、抗ＲＯＲ１ｘ抗ＣＤ３結合分子（配列番号１００、１０４、１０８、１１２、１１６、及び１２０）、ならびに抗ＣＤ１２３ｘ抗ＣＤ３結合分子（配列番号１９７及び１９８）を含む。
【０１５７】
ＣＤ３結合分子は、通常ＵＳ２０１３／０１２９７２３及びＵＳ２０１３／００９５０９７において開示されるように足場を用いて産生され得、これらは、それぞれ開示内容全体が本明細書に参照として組み込まれる。ＣＤ３結合タンパク質は、２の非同一ポリペプチド鎖（それぞれのポリペプチド鎖は免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインを含む）を含み得る。干渉免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは異なる。一実施形態においては、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインはＣＨ１ドメインまたはこれらの誘導体を含む。別の実施形態においては、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインはＣＬドメインまたはこれらの誘導体を含む。一実施形態においては、ＣＬドメインはＣκもしくはＣλアイソタイプまたはこれらの誘導体である。
【０１５８】
また本開示は、本明細書に記載したＣＤ３結合ドメインをコードする核酸（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、タンパク質及びポリペプチド、または本明細書に記載したホモ二量体もしくはヘテロ二量体ＣＤ３結合タンパク質の１以上のポリペプチド鎖を含む。本開示の核酸は、下の表１４で列挙されたようにポリヌクレオチドと実質的に同一である領域を有する核酸を含む。特定の実施形態においては、本開示による核酸は、表１４に列挙されたポリペプチドコードポリヌクレオチドと少なくとも８０％、通常少なくとも約９０％、及びより通常は少なくとも約９５％または少なくとも約９８％の同一性を有する。また本開示の核酸は、相補性核酸を含む。ある場合には、配列は配置される際に完全に相補性（不適合がない）である。他の場合には、配列において最大約２０％の不適合があり得る。本開示の一部の実施形態においては、本開示のヘテロ二量体ＣＤ３結合タンパク質の第１及び第２のポリペプチド鎖の両方をコードする核酸が提供される。本明細書で提供される核酸配列は、特定の宿主における発現を最適化するため、コドン最適化、変性した配列、サイレント変異、及び他のＤＮＡ技術を用いて開発され得、本開示はかかる配列変性を包含する。
【０１５９】
本開示は、ＣＤ３結合ドメインをコードする単離された核酸分子、本明細書に記載したタンパク質及びポリペプチド（またはそれらの一部）に関し、前記核酸分子は配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、または５９に記述されているヌクレオチド配列を含む。
【０１６０】
所望のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子は、ベクターに分子を設置することによって増殖される。プラスミドを含む、ウィルス性及び非ウィルス性ベクターが使用される。プラスミドの選択は、増殖が所望される細胞のタイプ及び増殖の目的に応じて決定されることになる。特定のベクターは、多量の所望されるＤＮＡ配列の増幅及び産生に有用である。他のベクターは培養における細胞での発現に好適である。さらに、他のベクターは、動物またはヒトの全ての細胞における導入及び発現に好適である。適切なベクターの選択は、当業者の技術範囲内である。多くのかかるベクターが市販されている。部分的なまたは全長のポリヌクレオチドを、通常、ベクター中の切断された制限酵素部位へのＤＮＡリガーゼの付着によりベクターに挿入する。あるいは、所望のヌクレオチド配列をｉｎ  ｖｉｖｏで相同組換えにより挿入させ得る。通常、これは、相同体の領域を、所望のヌクレオチド配列の側腹部上のベクターに付着させることにより達成される。相同体の領域は、例えば、オリゴヌクレオチドの連結により、または相同体の領域及び所望のヌクレオチド配列の一部の両方を含むプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応により添加される。
【０１６１】
発現に関して、発現カセットまたはシステムが採用され得る。本明細書に開示のポリペプチドをコードする核酸を発現するため、発現ベクターにおいて転写発現を制御する制御配列に動作可能に結合するポリペプチドをコードする核酸分子を宿主細胞に導入する。プロモーター及びエンハンサーなどの転写制御配列に加えて、発現ベクターは翻訳制御配列及び発現ベクターを運ぶ細胞の選択に好適なマーカー遺伝子を含み得る。本開示のポリヌクレオチドによりコードされる遺伝子生成物は、例えば、細菌群、酵母群、昆虫、両生類及び哺乳類系を含む任意の簡便な発現系において発現する。発現ベクターにおいては、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、所望の発現特性を得るのに適切な制御配列に結合している。これらは、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、オペレーター、リプレッサー、及び誘導因子を含み得る。プロモーターは制御され得る（例えば、ステロイド誘導性ｐＩＮＤベクター（インビトロゲン）由来のプロモーター））、または恒常的（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０、伸長因子、もしくはＬＴＲ配列由来のプロモーター）であり得る。これらは、ベクターへ結合するための上記の技術を用いて所望のヌクレオチド配列に結合する。任意の当該技術分野において公知の技術を用いてよい。したがって、発現ベクターは通常、転写開始領域の転写制御下でコード領域が作動可能に連結された誘導性または構成性であり得る転写及び翻訳の開始領域ならびに転写及び翻訳の終端領域をもたらす。
【０１６２】
発現カセット（「発現ユニット」）は種々のベクター（例えば、プラスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ、ラムダなどのバクテリオファージ、Ｐ１、Ｍ１３など）、植物またはウィルス性ベクター（例えば、レトロウィルスベースベクター、アデノウィルスベクター）などに導入され、そこでベクターは、通常、発現ベクターを含む細胞の選択を提供する能力によって特徴づけられる。ベクターは、特にプラスミドもしくはウィルスとして染色体外維持のために、または宿主染色体への組込みのために提供される。染色体外維持が所望される場合、元の配列は、低または高コピー数であり得るプラスミドの複製のために提供される。多種多様なマーカーは、特に毒素、より詳細には抗生物質から保護するものを選択するのに使用可能である。選択された特定のマーカーは、宿主の性質により選択され、ある場合には、栄養素要求性宿主との相補性が利用され得る。ＤＮＡコンストラクトの導入は、例えば、結合、細菌形質転換、カルシウム沈降ＤＮＡ、電気穿孔、融合、トランスフェクション、ウィルスベクターとの感染、遺伝子銃などを含む任意の簡便な方法を用い得る。本開示は、核酸セグメントを含む発現ベクターに関し、前記核酸セグメントは配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、または５９に記述されているヌクレオチド配列を含み得る。
【０１６３】
したがって、本開示内で使用するためのタンパク質は、従来技術によって遺伝子操作された宿主細胞中で産生され得る。好適な宿主細胞は、培養において外因性ＤＮＡと形質転換またはトランスフェクトされ増殖し得、かつ細菌群、真菌細胞、及び培養された高等真核細胞（培養された多細胞生物の細胞を含む）、特に培養された哺乳類細胞を含む細胞型である。クローンＤＮＡ分子を操作し、外因性ＤＮＡを種々の宿主細胞に導入する技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１），及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（４ｔｈ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９）により開示される。
【０１６４】
例えば、本明細書に記載した２の同一のＣＤ３結合ポリペプチドを含むホモ二量体ＣＤ３結合タンパク質の組換え型発現のために、発現ベクターは通常、作動可能にプロモーターに結合するＣＤ３結合ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含む。異なる第１及び第２のポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体ＣＤ３結合タンパク質の組換え型発現のために、第１及び第２のポリペプチド鎖は、ヘテロ二量体タンパク質全体の発現のために宿主細胞における別々のベクターから同時発現され得る。あるいは、ヘテロ二量体ＣＤ３結合タンパク質の発現のために、第１及び第２のポリペプチド鎖は、ヘテロ二量体タンパク質全体の発現のために宿主細胞における同一のベクターの別々の発現ユニットから同時発現される。発現ベクター（複数可）は従来の技術により宿主細胞へ導入され、次いでトランスフェクトされた細胞は従来の技術により培養され、対応するＣＤ３結合タンパク質を産生するコードされたポリペプチド（複数可）を産生する。
【０１６５】
組換え型タンパク質を宿主細胞の分泌経路へ配向するため、分泌シグナル配列（リーダー配列としても公知）を発現ベクターに提供する。分泌シグナル配列は、組換え型タンパク質の天然型のものであるか、または他の分泌されたタンパク質もしくは合成されたデノボ由来であり得る。分泌シグナル配列はポリペプチドコードＤＮＡ配列に作動可能に結合される、すなわち、２の配列は正しい読み枠において結合し、新たに合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導くように配置される。通常、分泌シグナル配列は、対象のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に対し５’に位置されるが、特定のシグナル配列が対象のＤＮＡ配列の他の位置に位置され得る（例えば、Ｗｅｌｃｈら、米国特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄら、米国特許第５，１４３，８３０号参照）。特定の変形例においては、本開示による使用のための分泌シグナル配列は、アミノ酸配列ＭＥＡＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号１９５）を有する。
【０１６６】
培養された哺乳類細胞は、本開示内での使用のための組換え型タンパク質の生成に好適な宿主である。外因性ＤＮＡの哺乳類宿主細胞への導入方法としては、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １４：７２５，１９７８；Ｃｏｒｓａｒｏ  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：６０３，１９８１：Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６，１９７３）、電気穿孔（Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１：８４１−８４５，１９８２）、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ）、及びリポソーム媒介トランスフェクション（Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｃｕｓ  １５：７３，１９９３；Ｃｉｃｃａｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｃｕｓ  １５：８０，１９９３）が挙げられる。培養された哺乳類細胞における組換えポリペプチドの産生は、例えば、Ｌｅｖｉｎｓｏｎら、米国特許第４，７１３，３３９号；Ｈａｇｅｎら、米国特許第４，７８４，９５０号；Ｐａｌｍｉｔｅｒら、米国特許第４，５７９，８２１号；及びＲｉｎｇｏｌｄ、米国特許第４，６５６，１３４号によって開示されている。好適な哺乳類宿主細胞の例としては、アフリカミドリザル腎臓細胞（Ｖｅｒｏ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８７）、ヒト胚腎臓細胞（２９３−ＨＥＫ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ−２１，ＢＨＫ−５７０；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８５４４，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０３１４）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１；ＣＨＯ  ＤＧ４４；ＣＨＯ  ＤＸＢ１１（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）；例えば、Ｃｈａｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１２：５５５，１９８６）も参照）、ラット下垂体細胞（ＧＨ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８２）、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２．２）、ラットヘパトーマ細胞（Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５４８）、ＳＶ４０形質転換サル腎臓細胞（ＣＯＳ−１；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）及びマウス胚細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）が挙げられる。さらなる好適な細胞株は当該技術分野において公知であり、バージニア州マナサスのアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関などの公共の保管場所から入手可能である。ＳＶ‐４０またはサイトメガロウィルス由来のプロモーターなどの、強力な転写プロモーターを用いてよい。例えば、米国特許第４，９５６，２８８号を参照のこと。他の好適なプロモーターとしては、メタロチオネイン遺伝子（米国特許第４，５７９，８２１号及び第４，６０１，９７８号）ならびに主要な後期プロモーターであるアデノウィルス由来のものが挙げられる。
【０１６７】
薬剤の選択は、通常、外来ＤＮＡが挿入された培養哺乳動物細胞を選択するために使用される。かかる細胞は、通常「形質移入体」と呼ばれる。選択剤の存在下で培養され、子孫まで対象の遺伝子を通過させることができる細胞は、「安定発現株」と呼ばれる。代表的な選択可能なマーカーとしては、Ｇ‐４１８などのネオマイシン型薬物の存在下で選択を行うことができる、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子；ミコフェノール酸／キサンチンの存在下で宿主細胞増殖を可能にするキサンチン‐グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼのｇｐｔ細胞；ならびに及びゼオシン、ブレオマイシン、ブラストシジン、及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するマーカーが挙げられる（例えば、Ｇａｔｉｇｎｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０７：３４２，１９８７；Ｄｒｏｃｏｕｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：４００９，１９９０参照）。また選択システムは、対象の遺伝子の発現レベルを増加させるために使用され得、このプロセスは、「増幅」と呼ばれる。増幅は、低レベルの選択剤の存在下における形質移入体の培養、続いて、導入された細胞の産物を高レベルで産生する細胞を選択するため、選択剤の量の増加によって行われる。代表的な増幅できる選択可能なマーカーは、メトトレキサートへの耐性を付与するジヒドロ葉酸還元酵素である。また、他の薬剤耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）を用いてよい。
【０１６８】
昆虫細胞、植物細胞及び鳥の細胞を含む、他の高等真核細胞もまた、宿主として用いてよい。植物細胞における、遺伝子の発現のためのベクターとしてアグロバクテリウムリゾゲネスの使用は、Ｓｉｎｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．（Ｂａｎｇａｌｏｒｅ）１１：４７−５８，１９８７により概説されている。昆虫細胞の形質転換及びその中での外来ポリペプチドの産生は、Ｇｕａｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ５，１６２，２２２及びＷＯ９４／０６４６３により開示される。
【０１６９】
昆虫細胞は、一般にオートグラファカリフォルニアニュークレア多核体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）に由来する組換えバキュロウィルスで感染させることができる。Ｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｏｓｓｅｅ，Ｔｈｅ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ  （Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９４）；及びＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９５）を参照のこと。組換えバキュロウィルスもまた、Ｌｕｃｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４５６６−４５７９，１９９３）により記述されるトランスポゾンに基づくシステムの使用により産生され得る。導入ベクターを利用するこのシステムは、キット形態（ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ  ｋｉｔ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で市販されている。導入ベクター（例えば、ＰＦＡＳＴＢＡＣ１；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、対象のタンパク質をコードするＤＮＡを、「バクミド」と呼ばれる大きいプラスミドとしてＥ．ｃｏｌｉに保持されるバキュロウィルスゲノムへと移動させるＴｎ７トランスポゾンを含む。Ｈｉｌｌ−Ｐｅｒｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｏｓｓｅｅ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９７１−９７６，１９９０；Ｂｏｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１５５１−１５５６，１９９４；及びＣｈａｚｅｎｂａｌｋ  ａｎｄ  Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５４３−１５４９，１９９５を参照のこと。加えて、導入ベクターは上記のように、ポリペプチド延長または親和性標識をコードするＤＮＡとのインフレームの融合を含み得る。当該技術分野において公知の技術を用いることにより、タンパク質コードＤＮＡ配列を含む導入ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞に形質転換し、細胞を、組換えバキュロウィルスを示す断続性ｌａｃＺ遺伝子を含むバクミドについて選別する。組換えバキュロウィルスゲノムを含むバクミドＤＮＡを、通常の技術を用いて単離し、Ｓｆ９細胞などのヨトウガ細胞のトランスフェクションに使用する。対象のタンパク質を発現する組換えウィルスは、続いて産生される。組換えウィルスストックは、当該技術分野において通常利用される方法により産生される。
【０１７０】
タンパク質産生に関し、通常、秋アワヨトウ、ヨトウガ（例えば、Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞）またはイラクサギンウワバ（例えば、ＨＩＧＨ  ＦＩＶＥ細胞；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）由来の細胞株である宿主細胞に感染するため、組換えウィルスが使用される。一般的に、Ｇｌｉｃｋ  ａｎｄ  Ｐａｓｔｅｒｎａｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９４）を参照のこと。また、米国特許第５，３００，４３５号も参照のこと。無血清培地を細胞の増殖及び維持のため使用する。好適な培地配合物は、当該技術分野において公知であり、民間の供給業者から得ることができる。細胞は約２〜５×１０５細胞の接種密度から１〜２×１０６細胞の密度まで増殖し、その時点で０．１〜１０の、より一般的には３に近い感染多重度（ＭＯＩ）で組換えウィルスストックを添加する。一般的に入手可能な実習マニュアルに記載の手順が用いられる（例えば、Ｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｏｓｓｅｅ，ｓｕｐｒａ；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，ｓｕｐｒａ参照）。
【０１７１】
酵母群細胞を含む真菌細胞もまた、本開示内で使用され得る。これに関する酵母種には、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、及びＰｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａが含まれる。外因性ＤＮＡとのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞の形質転換及びそこから組換えポリペプチドを産生するための方法は、例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４，５９９，３１１号；Ｋａｗａｓａｋｉら、米国特許第４，９３１，３７３号；Ｂｒａｋｅ，米国特許第４，８７０，００８号；Ｗｅｌｃｈら、米国特許第５，０３７，７４３号；及びＭｕｒｒａｙら、米国特許第４，８４５，０７５号によって開示されている。形質転換した細胞は選択可能なマーカーによって決定される表現型、通常、薬剤耐性または特定の栄養素（例えば、ロイシン）の非存在下での増殖能力によって選択される。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに使用するための代表的なベクター系は、Ｋａｗａｓａｋｉら（米国特許第４，９３１，３７３号）によって開示されるＰＯＴ１ベクター系であり、これは形質転換細胞がグルコース含有培地における増殖により選択されることを可能にする。酵母において使用するために好適なプロモーター及びターミネーターは、解糖酵素遺伝子（例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４，５９９，３１１号；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、米国特許第４，６１５，９７４号；及びＢｉｔｔｅｒ、米国特許第４，９７７，０９２号参照）由来のものならびにアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のものを含む。また、米国特許第４，９９０，４４６号；５，０６３，１５４号；５，１３９，９３６号；及び４，６６１，４５４号も参照のこと。Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ、及びＣａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａを含む他の酵母の形質転換系は、当該技術分野において公知である。例えば、Ｇｌｅｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９−３４６５，１９８６；Ｃｒｅｇｇ，米国特許第４，８８２，２７９号；及びＲａｙｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  １４：１１−２３，１９９８を参照のこと。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞は、ＭｃＫｎｉｇｈｔら、米国特許第４，９３５，３４９号の方法に従い利用され得る。Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍを形質転換するための方法は、Ｓｕｍｉｎｏら、米国特許第５，１６２，２２８号に開示される。ニューロスポラを形質転換するための方法は、Ｌａｍｂｏｗｉｔ、米国特許第４，４８６，５３３号に開示される。Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａおける組換えタンパク質の生成は、米国特許第５，７１６，８０８号；５，７３６，３８３号；５，８５４，０３９号；及び５，８８８，７６８号に開示される。
【０１７２】
細菌群Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、及び他の属の菌株を含む原核宿主細胞も、本開示内において有用な宿主細胞である。これらの宿主を形質転換し、その中にクローン化された外来性ＤＮＡ配列を発現するための技術は、当該技術分野において公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｓｕｐｒａ参照）。Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌群において組換えタンパク質を発現する場合、通常、不溶性顆粒剤としてタンパク質は細胞質に保持され得るか、または細菌分泌配列により細胞膜周辺腔に配向され得る。前者の場合は、細胞は溶解され、顆粒剤は回収され、例えばイソチオシ酸グアニジンまたは尿素を用いて変性される。次いで、尿素溶液ならびに還元グルタチオン及び酸化グルタチオンの組み合わせに対する透析、続いて緩衝生理食塩水に対する透析などの変性剤の希釈によって、変性タンパク質をリフォールディングし、二量化することができる。代替的には、タンパク質は、変性剤を用いずに可溶かつ単離された形態で細胞質から回収され得る。タンパク質は、水性抽出物（例えば、ホスフェート緩衝食塩水）として、細胞から回収される。対象のタンパク質を捕捉するため、抽出物を固定化抗体またはヘパリンセファロースカラムなどのクロマトグラフィー媒体に直接適用する。分泌したタンパク質は、細胞膜周辺腔の内容物を放出し、タンパク質を回収し、それにより変性及びリフォールディングの必要を除去するため、細胞の破壊（例えば、超音波処理または浸透圧衝撃）により、可溶性かつ機能性形態で細胞膜周辺腔から回収することができる。単鎖抗体を含む抗体は、公知の方法により細菌宿主細胞において産生され得る。例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３，１９８８；及びＰａｎｔｏｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１０１１７−１０１２５，１９９１を参照のこと。
【０１７３】
形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞は、選択した宿主細胞の増殖に所望される栄養素及び他の成分を含む培養培地で従来の手順に従い培養される。限定培地及び複合培地を含む種々の好適な培地は、当該技術分野において公知であり、通常、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及びミネラルを含む。また培地は、必要に応じて、増殖因子または血清などの成分を含むことができる。成長培地は、通常、例えば、発現ベクターに担持された、または宿主細胞に同時トランスフェクトされた選択可能なマーカーによって補完される必須栄養素の薬物選択または欠損によって、外因的に付加されたＤＮＡを含む細胞を選択することになる。
【０１７４】
ＣＤ３結合タンパク質は、従来のタンパク質精製方法により、通常クロマトグラフィー技術の組み合わせにより精製され得る。一般的に、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ，１９８８）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９４）を参照のこと。免疫グロブリンＦｃ領域を含むタンパク質は、固定化タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇでのアフィニティークロマトグラフィーにより精製される。所望の精製レベルを得るため、または脱塩、緩衝液交換などをもたらすため、ゲル濾過などのさらなる精製ステップを使用することができる。
【０１７５】
本明細書に開示のＣＤ３結合分子は、対象（例えば、ヒトもしくは非ヒト霊長類）を治療するため、または対象を治療するための医薬品を製造するための方法において使用され得る。通常、かかる方法は、かかる治療を必要とする対象に本明細書に記載したＣＤ３結合タンパク質を投与することを含む。
【０１７６】
本明細書に開示のＣＤ３結合分子は、対象（例えば、ヒトもしくは非ヒト霊長類）を治療するため、または対象を治療するための医薬品を製造するための方法において使用され得る。通常、かかる方法は、かかる治療を必要とする対象に本明細書に記載したＣＤ３結合タンパク質を投与することを含む。一部の実施形態においては、ＣＤ３結合タンパク質は、ＣＤ３結合タンパク質が対象においてＣＤ３発現細胞に対しＡＤＣＣ及び／またはＣＤＣを誘導するように、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）から選択される少なくとも１のエフェクター機能を含む。
【０１７７】
一部の態様においては、本開示はＣＤ３の過剰発現により特徴づけられる疾患を有する対象を治療するための方法を提供する。ある場合においては、単一特異性ＣＤ３結合ポリペプチドが自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ）に罹患する対象に投与される。特定の変形形態においては、本明細書で提供されるＣＤ３結合タンパク質は、Ｔ細胞機能及び運命の調節のために使用され得、それによってＴ細胞が重要な寄与因子である自己免疫疾患または炎症性疾患を含むＴ細胞媒介疾患の治療処置を提供する。本開示の一部のＣＤ３結合タンパク質はＴ細胞を活性化せずかつ／またはサイトカイン放出を誘導しないため、それらは、サイトカイン放出症候群及び急性毒性のような副作用を有さないかまたは減少させるために、ＴＣＲ複合体（例えば、抗ＣＤ３抗体）に対する他の分子よりも有利である。別の場合においては、ＣＤ３結合ポリペプチドは、まさに臓器移植を行おうとしている対象に投与される。
【０１７８】
別の態様においては、本開示は、がんなどの腫瘍抗原の過剰発現に特徴づけられる疾患を治療するための方法を提供する。二重特異性ＣＤ３結合タンパク質により認識され得る腫瘍抗原の例としては、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、Ｈｅｒ２、ＲＯＲ１、ＲＯＮ、糖タンパク質Ａ３３抗原（ｇｐＡ３３）及びＣＥＡが挙げられる。通常、かかる方法は、かかる治療を必要とする対象に、本明細書に記載した腫瘍抗原に結合する第２の結合ドメインを含む治療的有効量のＣＤ３結合タンパク質を投与することを含む。一部の実施形態においては、ＣＤ３結合タンパク質は、対象における腫瘍抗原発現細胞に対するリダイレクトＴ細胞細胞障害性（ＲＴＣＣ）を誘導する。本開示に従って治療され得る代表的ながんとしては、例えば、前立腺がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、膀胱がん、唾液腺がん、膵がん、卵巣がん、非小細胞肺がん、メラノーマ、乳がん（例えば、三種陰性乳がん）、副腎がん、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂリンパ球白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）、及びヘアリーセル白血病が挙げられる。
【０１７９】
また、本開示は、治療的有効量の組成物もしくは本明細書に記載したＣＤ３結合ポリペプチドを、それらを必要とする対象に投与することを含む、がんまたは自己免疫異常の治療方法を提供する。
【０１８０】
一部の実施形態においては、本開示は、ヒトＣＤ３に特異的に結合し、かつ免疫グロブリンＬ鎖可変領域及び免疫グロブリンＨ鎖可変領域を含むＣＤ３結合ドメインを含むＣＤ３結合ポリペプチドを対象に投与することを含む、がんを有する対象の治療方法を提供し；免疫グロブリンＬ鎖可変領域は、（ａ）配列番号８８におけるアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一もしくは少なくとも約９９％同一；または（ｂ）配列番号８９におけるアミノ酸配列と少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一もしくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み；免疫グロブリンＨ鎖可変領域は、配列番号８６におけるアミノ酸配列と少なくとも約８２％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８７％同一、 少なくとも約９０％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、 少なくとも約９８％同一もしくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１８１】
一部の実施形態においては、本明細書に記載した治療方法及び使用に関し、ＣＤ３結合タンパク質は、治療が求められる疾病または疾患の管理に関連する従来の方法と一致する方法で送達される。本開示に従い、疾病または疾患を予防または治療するのに十分な時間及び条件下で、治療的有効量のＣＤ３結合タンパク質の投与を必要とする対象に行う。
【０１８２】
本明細書に記載したＣＤ３結合タンパク質が投与される対象には、特定の疾患を発症する危険性の高い患者及びかかる疾患が存在する患者が含まれる。通常、対象は治療が必要な疾患を有するとして診断されている。さらに、対象は治療過程の間、疾患におけるいかなる変化（例えば、疾患の臨床症状における増加または減少）もモニタリングされる。また、一部の変形形態においては、対象は、ターゲティングＣＤ３発現細胞を含む治療を必要とする他の疾患に罹患していない。
【０１８３】
予防的用途においては、医薬品組成物または薬剤を、特定の疾患に罹患しやすい、もしくはそのリスクのある患者に、リスクを除去または減少、もしくは疾患の発症を遅らせるのに十分な量で投与する。治療的用途においては、組成物または薬剤を、かかる疾患の疑いのある、またはすでに罹患している患者に、疾患の症状及びその合併症を治癒、もしくはそれを少なくとも部分的に抑止するのに十分な量で投与する。これを達成するための適切な量は、治療的に有効な用量または量と呼ばれる。予防的管理体制及び治療的管理体制の両方においては、通常、十分な反応が得られるまで、薬剤を様々な投与量で投与する。通常、反応はモニタリングされ、所望の応答が消え始める場合には、反復投与量が与えられる。
【０１８４】
対象の患者に本開示の方法による治療を特定するため、認められた選別方法が使用され得、特定の疾患に関連するリスク因子を判定するか、または対象において特定された現存する疾患の状態を判定する。かかる方法は、例えば、個体（個人）が特定の疾患と診断された近縁種（近縁者）を有するかどうかを決定することを含む。選別方法は、例えば、遺伝的要素を有することを知られる特定の疾患における家族性状態を同定する従来の精密検査が挙げられる。例えば、様々ながんも特定の遺伝的要素を有することが知られる。がんの遺伝的要素は、例えば、形質転換している同義遺伝子における突然変異（例えば、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＥＧＦＲ、ｃＭｅｔ、及びその他）、特定のＨＬＡ及びキラー阻害受容体（ＫＩＲ）分子の存在もしくは非存在、またはがん細胞が直接的もしくは間接的にＮＫ細胞及びＴ細胞のような細胞の免疫抑制を調節することができる機構が挙げられる（例えば、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ  ａｎｄ  Ｍａｌｍｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３２９−３３９，２００７；Ｂｏｙｔｏｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１−８，２００７参照）。このような目的で、ヌクレオチドプローブは、特定の対象の疾患に関連する遺伝子マーカーを有する個体を同定するために常に使用され得る。加えて、特定の疾患のマーカーを特定するために有用な種々の免疫学的方法が当該技術分野において公知である。例えば、様々なＥＬＩＳＡ免疫測定法が利用可能であり、特定の腫瘍関連抗原を検出するため、モノクローナル抗体プローブを用いる当該技術分野において公知である。選別は、既知の患者の症候、年齢因子、関連する危険因子などによって示されるように実施することができる。これらの方法により、臨床医が、治療のために本明細書に記載の方法を必要とする患者を日常的に選択できるようになる。これらの方法に従って、病的な腫瘍抗原発現細胞を標的とすることは、独立した治療計画として、または他の治療に対する追跡、補助、もしくは調整治療レジメンとして実施することができる。
【０１８５】
投与のため、ＣＤ３結合タンパク質を医薬品組成物として製剤してよい。医薬品組成物は、（ｉ）ＣＤ３結合ポリペプチド；及び（ｉｉ）医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含み得る。ＣＤ３結合タンパク質を含む医薬品組成物は、医薬的に有用な組成物を調製し、それにより治療薬分子を混合剤中で医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせる既知の方法に従い配合され得る。担体は、その投与が移植患者に許容され得る場合、「医薬的に許容される担体」であると考えられる。無菌リン酸緩衝食塩水は、医薬的に許容される担体の一例である。他の好適な担体、希釈剤または賦形剤は、当業者に公知のものである（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９ｔｈ  ｅｄ．１９９５）参照）。配合物は、１以上の賦形剤、保存剤、溶解剤、緩衝剤、バイアル表面上のタンパク質損失を防ぐためのアルブミンなどをさらに含み得る。
【０１８６】
医薬品組成物は：経口単位剤形、静脈内単位剤形、鼻腔内単位剤形、坐薬単位剤形、皮内単位剤形、筋肉内単位剤形、腹腔内単位剤形、皮下単位剤形、硬膜外単位剤形、舌下単位剤形、及び脳内単位剤形からなる群から選択される剤形で配合され得る。経口単位剤形は：錠剤、丸剤、小丸薬、カプセル、散剤、トローチ剤、顆粒剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、徐放性製剤、エアロゾル、及びスプレーからなる群から選択され得る。
【０１８７】
ＣＤ３結合タンパク質治療薬を含む医薬品組成物は、治療的有効量で対象に投与され得る。本開示の方法に従い、ＣＤ３結合タンパク質は、例えば、筋肉内、皮下、静脈内、心房内、関節内、非経口、鼻腔内、肺内、経皮、胸膜内、くも膜下腔内、及び経口の投与経路を含む種々の投与方法によって対象に投与され得る。予防及び治療目的のために、拮抗薬を、単一ボーラス送達で、長期間の連続送達（例えば、連続経皮送達）により、または反復投与手順（例えば、1時間毎に、毎日、毎週、または毎月）で対象に投与し得る。
【０１８８】
文脈における有効投薬量の決定は、通常、ヒトでの臨床試験により追跡される動物モデル試験に基づき、モデル対象における対象の疾患の発生または重症度を有意に低下させる有効投薬量及び投与手順を決定することにより先導される。本開示の組成物の有効量は、投与の手段、標的部位、患者の生理状態、患者がヒトか動物であるか、他の投与される薬物、治療は予防的であるかまたは治療的であるかどうか、ならびに組成物自体の特定の活性及び固体における所望の応答を誘発する能力を含む、多くの異なる要因に応じて変化する。通常、患者はヒトであるが、一部の疾病においては、患者は非ヒト哺乳類であり得る。通常、投与計画は最適な治療応答をもたらす、すなわち安全性及び有効性を最適にするように調整される。したがって、治療的有効量は、望ましくない副作用を、本明細書に記載したＣＤ３結合タンパク質を投与することの有益な効果が上回る量でもある。ＣＤ３結合タンパク質を投与するため、投与量は患者の体重に対し約０．１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたは１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、より一般的には１０μｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。より特定の実施形態においては、薬剤の有効量は、約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０．１μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである。この範囲内の投与量は、単回または、例えば、１日当たり複数回の投与、または毎日、毎週、隔週または毎月の投与を含む複数回投与により達成され得る。例えば、特定の変形形態においては、レジメンは初期投与、次に複数回投与、続いて毎週または隔週間隔の投与からなる。他のレジメンは初期投与、次に複数回投与、続いて毎月または隔月間隔の投与からなる。あるいは、投与は疾患の臨床症状をモニタリングすることにより示される不規則な基準であり得る。
【０１８９】
医薬品組成物の投与量は担当臨床医により標的部位に所望の濃度を維持するように変えることができる。例えば、静脈内送達方法を選択する場合、標的組織における血流中の薬剤の局所濃度は、対象の状態及び予測された測定された応答に応じて、１リットル当たり約０．０１〜５０ナノモルの組成物、時には１リットル当たり約０．１ナノモル〜１リットル当たり１０、１５、または２５ナノモルである。より高いまたはより低い濃度は、送達方法、例えば、経表皮送達対粘膜表面への送達に基づいて選択することができる。また投与量は、投与された製剤、例えば鼻腔用スプレー対散剤、徐放性経口または注入された粒子、経皮製剤などの放出速度に基づき調製されるべきである。同一の血清濃度レベルを達成するため、例えば、５ナノモルの放出速度（標準の条件下で）を有する持続放出粒子は、放出速度１０ナノモルの粒子の約２倍の投与量で投与される。
【０１９０】
また抗ＣＤ３治療薬（例えば、ＣＤ３結合タンパク質）は、約０．００１〜約１０ミリグラム（ｍｇ）／体重１キログラム（ｍｐｋ）の1日投与量で、好ましくは単回1日用量として、または１日に約２〜６回の分割量で投与され得る。ヒトの成人患者に投与する場合、治療的有効量は０．２ｍｇ／投与、０．５ｍｇ／投与、１ｍｇ／投与、５ｍｇ／投与、１０ｍｇ／投与、２５ｍｇ／投与、１００ｍｇ／投与、２００ｍｇ／投与、及び４００ｍｇ／投与を含むがこれに限定されない０．２ｍｇ〜８００ｍｇ／投与の範囲内の用量での投与であり得、かつ多数の、通常は連続した1日量を一連の治療で投与することができる。抗ＣＤ３治療薬は１日の異なる時間に投与してもよい。一実施形態における最適治療薬用量は、夜に投与され得る。別の実施形態における最適治療薬用量は、朝に投与され得る。したがって、抗ＣＤ３治療薬の総1日投与量は、一実施形態においては、約１ｍｇ〜約２ｇの範囲、多くの場合は約１００ｍｇ〜約１．５ｇ、最も多くの場合は約２００ｍｇ〜約１２００ｍｇの範囲であり得る。典型的な７０ｋｇの成人の場合、抗ＣＤ３治療薬の総１日用量は約２ｍｇ〜約１２００ｍｇの範囲であり得、多くの場合は上記のように約０．２ｍｇ〜約８００ｍｇの範囲となる。
【０１９１】
特に固形腫瘍の治療に関しては、エンドポイント及び抗腫瘍活性の評価の手順は、当該技術分野において公知である。それぞれの手順が別々に腫瘍応答評価を定義する一方、ＲＥＣＩＳＴ（固形腫瘍における応答評価基準）基準が、現在、国立がん研究所により、腫瘍応答評価の推奨指針とみなされている（Ｔｈｅｒａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２：２０５−２１６，２０００参照）。ＲＥＣＩＳＴ基準による腫瘍応答は、全ての測定可能な病変または転移の減少または除去を意味する。一般的に、疾病は少なくとも１のディメンションにおいて、従来の技術を用いて２０ｍｍ以上、または医学的写真もしくはＸ線、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）による明確に定義されたマージンを有するスパイラルＣＴスキャン、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、または臨床検査（病変が表面的である場合）を用いて１０ｍｍ以上として、正確に計測され得る病変を含む場合、測定可能であるとみなされている。測定不可能な疾病は、従来の技術を用いて２０ｍｍ未満、またはスパイラルＣＴスキャンを用いても１０ｍｍ未満の病変及び全く計測できない（正確に測定するには小さすぎる）病変を含む疾病を意味する。測定不可能な疾病としては、胸水、腹水、及び間接的証拠により実証される疾病が挙げられる。
【０１９２】
目的状態の基準は、固形腫瘍の応答を評価する手順に必要とされる。代表的な基準としては、以下が挙げられる：（１）全ての測定可能な疾病の完全な消失と定義された完全寛解（ＣＲ）、新しい病変なし、症状に関連する疾病なし、測定不能な疾病の証拠なし；（２）標的病変の最長直径の合計が３０％減少すると定義された部分反応（ＰＲ）（３）標的病変の最長直径の合計が２０％増加するまたは任意の新しい病変が出現すると定義された進行性疾患（ＰＤ）；（４）ＣＲ、ＰＲ、または進行性疾患に適格ではないと定義された安定または無応答（Ｔｈｅｒａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ．参照）。
【０１９３】
腫瘍学分野内で受け入れられるさらなるエンドポイントは、全生存（ＯＳ）、無病生存（ＤＦＳ）、対象反応率（ＯＲＲ）、進行の時間（ＴＴＰ）、及び無進行生存（ＰＦＳ）を含む（Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｐｐｒｏｖａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ａｐｒｉｌ  ２００５，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＦＤＡ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ参照）。
【０１９４】
医薬品組成物は、本明細書に記載した医薬品組成物を含む容器を含むキットとして供給され得る。医薬品組成物は、例えば、単回もしくは複数回投与のための注射可能溶液の形態で、または注射の前に再構成される無菌散剤として提供され得る。あるいは、かかるキットは、乾燥粉末分散機、液体エアロゾル発生装置、または医薬品組成物の投与のための噴霧器を含み得る。かかるキットは、指示書に書かれた情報及び医薬品組成物の用法をさらに含み得る。
【０１９５】
本開示は、以下の実施例によってさらに明らかにされるであろう。これらの実施例は、本開示の単なる例示であり、決して限定するものではない。
【実施例】
【０１９６】
実施例１  安定化ＣＤ３結合分子の生成
ＣＤ３結合分子ＤＲＡ２２２の熱安定性を改良するため、ヒト化Ｃｒｉｓ７抗体の改変変異体であるＣｒｉｓ７可変ドメインを、代替的ヒト生殖系列フレームワーク配列を用いてし再ヒト化した。ＤＲＡ２２２可変Ｈ鎖ドメインは、配列番号８７であり、ＤＲＡ２２２可変Ｌ鎖ドメインは、配列番号９０である。Ｆｃ  ＤＲＡ２２２は、時にＴＳＣ３１１またはＴＳＣ３１２（アミノ酸配列は配列番号２；核酸配列は配列番号１）と呼ばれる。親Ｃｒｉｓ７の抗体の説明として、Ｒｅｉｎｈｅｒｚ，Ｅ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｔｙｐｉｎｇ  ＩＩ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８６）を参照のこと。さらなる変更もまた、親和性及び熱安定性を改良するためになされた。
【０１９７】
方法
以下の方法を使用し、この実施例に示される結果を得た。
【０１９８】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
標準的な精製技術により精製された組換えタンパク質のサーモグラムを、オートサンプラーを備えたＧＥ  ＶＰキャピラリーＤＳＣ機器で得た。ＰＢＳ中のそれぞれのサンプル（通常０．５ｍｇ／ｍＬ）の約５５０μＬを、第２のキャピラリーにおける対照としてＰＢＳを用いて、サンプルキャピラリーに注入した。１℃／分の加熱率で２５℃〜１３０℃の温度で、分析を行った。フィードバックを低く設定し、サンプリング時間は８ｍｓを使用した。原物を用いてデータ分析を行った。サンプルサーモグラムを、製剤媒体を用いた以前の緩衝液／緩衝液スキャンを引いて緩衝液の熱容量について修正し、サンプル濃度及びベースライン補正に基づいて正規化した。
【０１９９】
示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）
ハイスループット形態においては、標準の精製技術により精製された組換えタンパク質のサーモグラムを、リアルタイムＰＣＲ機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ５）で実行するＤＳＦアッセイにより得た。約４０μＬの、ＰＢＳ中濃度０．８ｍｇ／ｍＬのそれぞれのサンプルを、５μＬの予備希釈したＳＹＰＲＯオレンジダイ（カタログ＃Ｓ‐６６５０，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合した。融解曲線プロトコールは、温度を２５℃から９０℃まで、１ステップ当たり０．２℃上昇させるように設定した。５７５／３０Ｘ励起フィルター及び６２０／３０Ｍ発光フィルターであるテキサスレッド蛍光染料フィルターセットを介して、蛍光信号を収集した。収集した蛍光強度データを、データ分析ソフトウェアＰｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）へエクスポートした。タンパク質熱Ｔｍ値は、温度−ｄ（ＲＵＦ）／ｄＴ２＝０に対する蛍光強度の二次微分値が０のときの温度として算出した。
【０２００】
ヒトジャーカットＴ細胞におけるフローサイトメトリー
ＣＤ３＋ジャーカットＴ細胞株を用いる標準的なフローサイトメトリーに基づく染色法により結合試験を行った。全ての標識及び洗浄は、３％ＢＳＡ及び２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む生理食塩水緩衝液中のＵ底９６ウェルプレートで行った。ジャーカット細胞を、２００，０００細胞／ウェルで播種し、氷上で３０分間、５０μＬ容量／ウェルの試験分子濃度の０．１ｎＭ〜２００ｎＭの範囲でインキュベートした。細胞を３回洗浄し、次いで、蛍光標識された最小交差反応性二次ポリクローナル抗体、Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及び生存性色素７‐ＡＤＤと共に氷上でさらに３０分間インキュベートした。次いで細胞を２回洗浄し、ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメトリーにおいてサンプルを得た。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してサンプルファイルを分析した。各ウェルにおけるジャーカット細胞の生きた集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、生細胞（前方対側方散乱、次いで７‐ＡＤＤ−細胞）上でゲーティングした後に計算した。
【０２０１】
相同体モデリング、空間的凝集傾向分析
アノテート抗体シーケンス、同定フレームワークテンプレート、モデル抗体フレームワーク、及びモデル抗体ループプロトコールを使用して、可変ドメインについてＡｃｃｅｌｒｙｓ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ４．０内で相同性モデルを構築した。また、計算凝集スコアプロトコールを用いて、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ４．０内で空間的凝集傾向分析を行った。
【０２０２】
ヒトＴ細胞のクロム放出アッセイ
標的陽性腫瘍細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｋａｓｕｍｉ−２、Ｃ４−２Ｂ及びラモス細胞株）を全て、与えられたプロトコールに従い培養した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準的なフィコール密度勾配を用いてヒト血液から単離した。単離した細胞を生理食塩水緩衝液内で洗浄した。Ｔ細胞を、Ｐａｎ  Ｔ細胞アイソレーションキット（ｃａｔａｌｏｇｕｅ＃１３０−０９６−５３５，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、製造業者の手順でさらに単離した。単離したＴ細胞を等分し、液体窒素内で長時間保管した。予備調製したＴ細胞を、アッセイの１日前に１０％ヒト血清を含む暖かいＲＰＭＩ培地に解凍した。アッセイの間、最終濃度が２００ｐＭ〜０．０１ｐＭである二重特異性分子の濃度を予備調製したＴ細胞に添加した（約１００，０００／ウェル）。処置として０．０４％のＮＰ‐４０を含めることにより、総溶解対照を生成した。
【０２０３】
約２．５×１０６の標的細胞を、０．１２５ｍＣｉの５１Ｃｒで処理し、５％ＣＯ２加湿恒温器で、３７℃で９０分インキュベートした。インキュベーションの後、希釈したアッセイ培地（１％ヒト血清を有するＲＰＭＩ）で細胞を４回洗浄し、１２．５ｍＬの完全アッセイ培地（１０％ヒト血清を有するＲＰＭＩ）で再度懸濁した。この懸濁液から、ウェル当たり５０μＬを９６Ｕ底プレートに分注し（約１０，０００細胞／ウェル）、合計容量を２００ｍＬ／ウェル、Ｔ細胞対標的細胞の比を１０：１にした。ゼロ溶解対照は、Ｔ細胞を除いた標的細胞のみによって作成された。
【０２０４】
加湿インキュベーターで３７℃、５％ＣＯ２でプレートを４時間（及び時折２４時間）インキュベートし、その後１０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、それぞれのウェルから２５μＬの上清を、９６ウェルＬｕｍａサンプルプレートの対応するウェルに移した。サンプルプレートを化学安全フードにおいて１８時間空気乾燥させ、次いで標準プロトコールを用いて放射能をＴｏｐＣｏｕｎｔマイクロプレートシンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で読み取った。
【０２０５】
特異的溶解パーセントを、式：（（薬物処理サンプル中のシグナル‐標的細胞のみのサンプルからのバックグラウンドシグナル）／（全溶解ウェル中のシグナル‐標的細胞のみのサンプルからのバックグラウンドシグナル））×１００を用いて算出した。
【０２０６】
カニクイザルＴ細胞におけるフローサイトメトリー 
ヘパリンチューブに収集したカニクイザルマカク末梢血を供給業者（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から一晩かけて輸送した。受領時、末梢血細胞（ＰＢＭＣ）を、密度分離チューブ（ＣＰＴチューブ、Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて単離した。血液をＣＰＴチューブに移す前に、生理食塩水緩衝液において１〜１．５に希釈した。ＣＰＴチューブを遠心分離し、分離したＰＢＭＣ個体群を収集し、０．２％ＢＳＡ及び５ｎＭのＥＤＴＡを含む生理食塩水緩衝液で洗浄した。調製物中の残りの赤血球を、アンモニウム‐クロライド‐カリウム赤血球溶解緩衝液を用いて溶解させた。細胞をさらに洗浄して残りの血小板を除去した。
【０２０７】
ＰＢＭＣ標識及び洗浄ステップは、０．２％ＢＳＡ及び２ｍＭのＥＤＴＡを含む生理食塩水緩衝液中のＵ底９６ウェルプレートで行った。ＰＢＭＣを、２００，０００細胞／ウェルで播種し、氷上で３０分間、５０μＬ容量／ウェルの試験分子濃度の０．１ｎＭ〜３００ｎＭの範囲でインキュベートした。細胞を３回洗浄し、次いで非ヒト霊長類ＣＤ２及びＣＤ１６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対する蛍光標識された抗体、抗ＰＳＭＡまたは抗ＣＦ３７結合ドメインのいずれかに対する抗イデオタイプ抗体、ならびに生存性色素７‐ＡＤＤと共にさらに３０分氷上でインキュベートした。サンプルを２回洗浄し、氷上で１％のホルムアルデヒド溶液を含む生理食塩水で２０分間固定し、再度洗浄し、ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで得た。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してサンプルファイルを分析した。各ウェルにおけるＴ細胞に結合する試験分子の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、生Ｔ細胞（前方対側方散乱、７‐ＡＤＤ−、ＣＤ２＋、ＣＤ１６−細胞）上でゲーティングした後に計算した。
【０２０８】
カニクイザルＰＢＭでＣのクロム放出アッセイ
Ｃ４‐２Ｂ及びラモス細胞株を与えられた手順に従い、両方培養した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヘパリンナトリウム（Ｃａｔ＃３６２７５３））を含むＢＤ  ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ（登録商標）ＣＰＴ（商標）細胞調製チューブを用いて、カニクイザルマカク末梢血から単離した。単離した細胞を生理食塩水緩衝液内で洗浄した。最終濃度が１００００ｐＭ〜０．０１２８ｐＭである二重特異性分子の濃度を単離したＰＢＭＣに添加した（約１００，０００）。処置として０．０４％のＮＰ‐４０を含めることにより、総溶解対照を生成した。
【０２０９】
約５×１０６の標的Ｃ４‐２Ｂまたはラモス細胞を５１Ｃｒの０．２５ｍＣｉで処理し、３７℃で７５分間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を細胞培養培地（１０％のＦＢＳ、１％のＮＥＡＡ、１％のピルビン酸ナトリウム、Ｎａグルタミン及び２０ｍＭのＨＥＰＥＳを有するＲＰＭＩ）で４回洗浄し、２５ｍＬの培地で再び懸濁した。この懸濁液から、ウェル当たり５０μＬを９６Ｕ底ウェルプレートに分注し（約１０，０００細胞／ウェル）、Ｔ細胞対標的細胞の比を１０：１にした。
【０２１０】
３７℃、５％ＣＯ２において、加湿インキュベーターでプレートを４時間インキュベートし、その後２２５×Ｇで３分間遠心分離し、それぞれのウェルから２５μＬの上清を、９６ウェルＬｕｍａサンプルプレートの対応するウェルに移した。サンプルプレートを化学安全フードにおいて１８時間空気乾燥させ、次いで放射能を、標準プロトコールを用いてＴｏｐＣｏｕｎｔマイクロプレートシンチレーションカウンターで読み取った。
【０２１１】
結果
ステップ１：初期ヒト化ＣＤ３結合コンストラクトの生成
【０２１２】
Ｃｒｉｓ７可変ドメインを、配列相同性に基づき、４のヒト可変Ｈ鎖生殖系列配列（ＩＧＨＶ１‐２＊０２（Ｈ７）、ＩＧＨＶ１‐４６＊０２（Ｈ８）、ＩＧＨＶ１‐３＊０１（Ｈ９）及びＩＧＨＶ１‐６９＊０２（Ｈ１０））ならびに２のヒト可変Ｌ鎖生殖系列配列（ＩＧＫＶ３‐１１＊０１（Ｌ４）及びＩＧＫＶ１‐３３＊０１（Ｌ５））を用いて再びヒト化した。合計１２の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）コンストラクトを、Ｈ７５リンカー（ＱＲＨＮＮＳＳＬＮＴＧＴＱＭＡＧＨＳＰＮＳ；配列番号１４８）を用いてＦｃ抗ＣＤ３ｓｃＦｖ形式で作成した（表３）。１２のコンストラクト及び対照分子Ｆｃ  ＤＲＡ２２２（ＴＳＣ３１１またはＴＳＣ３１２）の配列を表１４に示す。
【０２１３】
【表３】
2018531000.tif 000006
【０２１４】
全ての１２のコンストラクトをＨＥＫ２９３細胞において一過性に発現させ、精製し、ジャーカットＴ細胞への結合について試験し、熱安定性について評価した。Ｌ４Ｌ鎖またはＨ９Ｈ鎖を含むコンストラクトは、低レベルのタンパク質発現（表４における最終収率カラム参照）及び／または高レベルの高分子量凝集体（表４における分析ＳＥＣカラム参照）を有し、続く最適化ステップにおいて除去した。他のコンストラクトの大部分では、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いた熱変性（Ｔｍ）の中点（表５）によって測定されるように、元のヒト化ドメイン（ＴＳＣ３１２）よりもｓｃＦｖの熱安定性がいくらか改善されたが、ジャーカットＴ細胞で観察された結合飽和はレベルを変えることによって減少した（図１）。最も安定性のコンストラクトであるＴＳＣ３２４は、元のヒト化コンストラクト（ＴＳＣ３１２、ＤＲＡ２２２としても知られる）と比較して、飽和時の観測された蛍光強度の中央値がおよそ５０％減少し、結合のＥＣ５０が２倍増加した（３．６ｎＭ）。
【表４】
2018531000.tif 000007
【表５】
2018531000.tif 000008
【０２１５】
ステップ２：ＣＤ３への結合を回復させる初期最適化
【０２１６】
次のステップの目的は、ＤＲＡ２２２より改善された熱安定性を維持しながら、ＣＤ３への結合を改善することであった。３のさらなるＬ鎖配列をこのステップで導入した。第１のＬ鎖は、位置５２及び５３（ＬＬからＲＷ）の親マウス残基に戻った２のアミノ酸を含むＬ５配列に基づいており、このＬ鎖はＬ６と命名された。２のさらなる生殖系列Ｌ鎖（位置５２及び５３に戻った同じ２つのアミノ酸を含むＩＧＫＶ１‐３９＊０１（Ｌ７）及びＩＧＫＶ３Ｄ‐２０＊１（Ｌ８））もまた使用した。３の新規のＬ鎖（Ｌ６、Ｌ７及びＬ８）を３のＨ鎖（Ｈ７、Ｈ８及びＨ１０）と、Ｆｃ抗ＣＤ３ｓｃＦｖ形式で組み合わせ、以下のｓｃＦｖ組み合わせを得た（表６）：
【表６】
2018531000.tif 000009
【０２１７】
これらの９のコンストラクトはＨＥＫ２９３細胞において一過性に発現し、タンパク質品質、発現、結合及び熱安定性に関して検査された。これらの９のコンストラクトの配列は、表１４に示す。Ｈ１０シリーズの分子（ＴＳＣ３４０、ＴＳＣ３４１、ＴＳＣ３４２）は、全ての新規のコンストラクト（図２）で最良の結合を有し、ＴＳＣ３１２と同等のレベルの結合飽和をジャーカットＴ細胞で達成した。しかし、結合に対し測定されたＥＣ５０は、依然として元の分子であるＴＳＣ３１２よりも２倍高かった。また、Ｈ１０シリーズの分子では、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）を用いてＴＳＣ３１２を超えるＴｍの増加により測定された熱安定性が有意に改良された（図３）。これらの３の分子ののうち、ＴＳＣ３４２を、熱安定性の改良に起因するさらなる最適化のためのリード分子として選別した。
【０２１８】
次いで、親マウス配列を、突然変異し、結合を改良する潜在的ホットスポットについて試験した。３の残基を独立して、復帰及び逆突然変異として選択した：Ｇ２７Ｙ（ＴＳＣ３７０）、Ｍ５３Ｉ（ＴＳＣ３７１）及びＩ２１Ｍ（ＴＳＣ３７２）。ジャーカットＴ細胞上のこれらの３のコンストラクトの結合試験は、Ｈ鎖上のＧ２７Ｙ突然変異はＣＤ３への結合を元のコンストラクトＴＳＣ３１２と同等のレベルまで復活させたことを明らかにした（図４）。また、これらの３のコンストラクトの安定性をＤＳＣ、により評価した。Ｇ２７Ｙ突然変異はＴｍを改良しなかったが、驚くべきことに、残りの突然変異であるＨ鎖上のＭ５３Ｉ及びＬ鎖錠のＩ２１Ｍの両方は独立してＴｍを３〜４℃改良した（表７）。
【表７】
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【０２１９】
ステップ３：熱安定性を改良する最終最適化ステップ
【０２２０】
ＴＳＣ３７０の相同性モデルを、空間的凝集傾向を用いて試験し、潜在的凝集についてホットスポットを特定した。Ｈ鎖上の１の突然変異であるＡ９Ｐを特定し、相同性モデルにおける潜在的凝集ホットスポットを減少した。この突然変異をＴＳＣ３７０主鎖に導入し、ＴＳＣ３９０を生成した。この突然変異単独では、Ｔｍ（０．２５℃）の改良に軽度の効果を与えた。Ａ９Ｐ突然変異を、上記のＭ５３Ｉ及びＩ２１Ｍ突然変異と組み合わせ、以下のＦｃ抗ＣＤ３コンストラクトを生成した（表８）。
【表８】
2018531000.tif 000011
【表９】
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【０２２１】
これらの突然変異の２以上の組み合わせは、ＤＳＣ分析から実質的なＴｍの増加に示されるように、熱安定性に有益な効果を与えると考えられた（表９）。驚くことに、Ａ９Ｐ突然変異もまた、他の突然変異と相乗的であり、Ａ９Ｐ突然変異を特徴としない一致したコンストラクトと比較して、安定性において、１〜２．６Ｃ程度の増加をもたらす。より重要なことに、安定化した突然変異はＣＤ３への結合に影響しない（図５）。
【０２２２】
また、ＰＳＭＡ及びＣＤ３を標的とする二重特異性分子を、これらの新規の抗ＣＤ３ｓｃＦｖ分子を用いて構築し、リダイレクトＴ細胞細胞障害性（ＲＴＣＣ）活性に対する抗ＣＤ３ｓｃＦｖへの変化の影響（ある場合）を試験した。元のヒト化コンストラクト（ＤＲＡ２２２）はＴ細胞細胞障害性のリダイレクトに非常に効果的である（例えば、ＵＳ２０１４／０１６１８００参照）。新規のコンストラクトの同様の活性を示す能力について試験した。４の異なる抗ＰＳＭＡ×抗ＣＤ３コンストラクトを、ＴＳＣ３９１、ＴＳＣ３９２、ＴＳＣ３９３及びＴＳＣ３９４を用いて生成し、これらをそれぞれ、ＴＳＣ４０８、ＴＳＣ４０９、ＴＳＣ４１０及びＴＳＣ４１１と名付けた。全ての４のコンストラクトは、親ＤＲＡ２２２  ｓｃＦｖ（ＴＳＣ２４９）で構築された分子と類似のＲＴＣＣ活性を有し（図６）、これにより、細胞障害性活性及び結合は、ヒトＴ細胞と同等であることが証明された。
【０２２３】
ステップ４：カニクイザル交差反応及び活性を回復する最適化ステップ
【０２２４】
元のヒト化コンストラクト（ＤＲＡ２２２）は、またカニクイザルＴ細胞とも結合し、二重特異性形式で使用する場合、標的細胞に対してこれらの細胞障害性活性をリダイレクトしたことを以前に示した。ＴＳＣ４０８、ＴＳＣ４０９、ＴＳＣ４１０及びＴＳＣ４１１全てを、カニクイザルＴ細胞との結合及び細胞障害性活性について評価した。予期せずにして、ＴＳＣ４０８、ＴＳＣ４０９、ＴＳＣ４１０及びＴＳＣ４１１では全て、カニクイザルＴ細胞への結合が減少し（図７Ａ及び７Ｂ）、ＤＲＡ２２２を含む抗ＰＳＭＡ×抗ＣＤ３二重特異性分子と比較して、カニクイザルＴ細胞をエフェクター細胞として使用したＲＴＣＣ活性が有意に減少した（図８Ａ及び８Ｂ）。これにより、ヒトＴ細胞との結合及び活性は、直接的にＤＲＡ２２２を含むコンストラクトと同等であると予測されなかった。
【０２２５】
カニクイザルＣＤ３への結合を回復させる試みに２の方法が使用された。１の方法は、ＴＳＣ３９４からのＬ鎖とＤＲＡ２２２からのＨ鎖を組み合わせるか、またはＴＳＣ３９４からのＨ鎖とＤＲＡ２２２からのＬ鎖を組み合わせて、１のフレームワークに特異的なフレームワーク残基が結合に寄与しているかを確認することである。第２の方法は、ＴＳＣ３９４のＬ鎖上で位置８６及び８７で突然変異残基を戻すことである。これらの２の位置における残基は、カニクイザルＣＤ３との結合に影響する可能性のあるＬ鎖ＣＤＲと相互作用する。これらの変異体は抗ＣＤ３７×抗ＣＤ３二重特異性分子に組み込まれる（表１０）。変異体の一部、特にＴＳＣ４５５、ＴＳＣ４５６及びＴＳＣ４５２は、飽和濃度での高レベルの結合により示される抗ＣＤ３７×ＴＳＣ３９４（ＴＳＣ４４５）と比較して、カニクイザルＴ細胞への改良された結合を示した（図９）。また、ＴＳＣ４５６及びＴＳＣ４５２がＣＡＳ１０５と同等の活性を有することを示したカニクイザルＲＴＣＣアッセイも実施した（図１０）。加えて、これらの分子は、ＤＣＳにより分析する場合に高いＴｍ１を示すように、ＣＡＳ１０５（表１１）と比較して4優れた熱安定性を有した。ＤＲＡ２２２  ｓｃＦｖ、ＴＳＣ４５５  ｓｃＦｖ、及びＴＳＣ４５６  ｓｃＦｖの配列比較を図１３に示す。
【表１０】
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【表１１】
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【０２２６】
実施例２  保存性に対する改良された熱安定性の影響
原則として、改良された熱力学的安定性を有するタンパク質もまた、貯蔵時での凝集に対してより耐性であり、安定性のより低いタンパク質と比較して保存性が上昇するはずである。改良された保存性に相関するＴｍにおける増加が確認されるかどうかを特定するため、表１０に列挙したタンパク質を、２５℃で２週間を超えてＰＢＳにおける保存性について評価した。
【０２２７】
分取用サイズ排除クロマトグラフィーを用いて各タンパク質をＰＢＳに緩衝液交換し、タンパク質濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整した。評価するタンパク質毎に、それぞれ約１２０μＬを含む４のバイアルを準備した。１のバイアルを各安定性時点で用いた。ＰＢＳにおいて平衡化された分析サイズ排除ＨＰＬＣカラム上で、２５μＬ（または２５μｇ）を分析すること、及び２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより純度を決定した。三重注入をそれぞれの時点で各コンストラクトに実施した。ＳＥＣ方法の完了に続いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを用いてクロマトグラフを統合した。無処置の分子のピーク面積を全ピーク面積で割り、次いで１００を掛けることによって各タンパク質の純度パーセントを計算した。
（無処置の分子のピーク面積）／（総ピーク面積）×１００＝純度％
【０２２８】
報告された純度は、同一のバイアルからの３の注入から得られた値の平均値であった。純度は通常、Ｔ＝０、３、７及び１４日間で決定される。純度値は時間の関数としてグラフにプロットされ、線形回帰分析が行われた。回帰線の勾配は、純度における割合は各タンパク質で減少したことを示した。純度の減少率は、純度が２％低下する貯蔵日数を推定するために用いられた。異なる変異体の安定性を、それらを２％の低下を引き起こすと推定される最も多い日数から最も少ない日数でランク付けすることにより比較した。アッセイ間可変性を軽減するため、異なる安定性値を異なる実験にわたって比較しなかったが、同じ実験群内のコンストラクトは、互いにランク付けしただけであった。
【０２２９】
全ての新規の分子は、ＣＡＳ１０５と比較して２５℃でＰＢＳ中において優れた溶液安定性を示した（図１１）。凝集体の形成に対する時間もまた、それぞれのコンストラクトについて計測した（表１２）。
【表１２】
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【０２３０】
このデータは、ほとんど全てのコンストラクトは、元の抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（ＤＲＡ２２２）を含むコンストラクトと比較して、２５℃での保存性に２倍以上の増加があることを示す。
【０２３１】
実施例３  血清安定性に対する改良された熱安定性の影響 
保存性と類似して、より高い熱力学的安定性を有する分子もまた、ヒト血清における安定性を改良し得るタンパク質分解に、より耐性であることが多い。これにより、今度は、全体の血清薬物動態及び治療薬の全体の曝露が改良される。
【０２３２】
熱力学的安定性の改良が全体の血清安定性に影響したかを試験するため、安定化抗ＣＤ３ｓｃＦｖ分子（ＴＳＣ３９４  Ｆ４６３Ｙ）の１を、抗ＲＯＲ１×抗ＣＤ３二重特異性分子（ＲＯＲ１９３）の状況下における血清安定性について評価した。元の抗ＣＤ３ｓｃＦｖ、ＤＲＡ２２２を含む類似の二重特異性分子（ＲＯＲ１３３）もまた、同時に評価した。ＲＯＲ１結合ドメインを生成するために使用した親ウサギ抗ＲＯＲ１抗体Ｒ１１は、例えば、米国特許出願公開第２０１３／０２５１６４２号及びＹａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６（６）：ｅ２１０１８  （２０１１）に記載されている。
【０２３３】
ランダムな健常ドナーから提供されたヒト血清をＲｅｄ／Ｇｒｅｙ  Ｖａｃｕｔａｎｏｒ（ＢＤ＃３６７９８８）で収集し、供給業者に推奨されたプロトコールに従って調製した。試験品を、滅菌ＰＣＲチューブにおいて１μＭの濃度で５０μＬの血清に添加し、加湿した３７℃の組織培養インキュベーターで最大２１日間インキュベートした。特定の時点は、２１、１４、７、３及び０日であった。「アッセイ２１日目」として始める新しい順でサンプルをインキュベートし、全てのサンプルを、以上の実施例１に列挙したプロトコールに従って、「実験０日目」のインキュベーション終了時に、クロム遊離ＲＴＣＣアッセイを用いて同時に評価した。各時点でサンプルを用いて行った滴定曲線からＥＣ５０値を当てはめ、０日目に各コンストラクトについて測定したＥＣ５０値に対して正規化した。
【０２３４】
経時的にＥＣ５０値をプロットすることにより、観察されたＲＯＲ１３３対ＲＯＲ１９３の血清安定性に劇的な差が示された（図１２）。ＲＯＲ１３３については２１日間でＥＣ５０が２．５倍減少したが、ＲＯＲ１９３についてはＥＣ５０の変化は最小限であった。これにより、熱力学的安定性の中程度の変化は血清安定性に顕著な影響を与え得ることが実証される。
実施例４  タンパク質発現及び品質に対する改良された熱力学的安定性の影響
【０２３５】
以前に、熱力学的安定性の改良により、タンパク質生成の間に高分子量の凝集体の生成により測定されるように、タンパク質発現及び全体のタンパク質品質の改良をもたらすことが示された。
【０２３６】
新規の抗ＣＤ３ｓｃＦｖ領域の改良された熱力学的安定性が改良されたタンパク質発現またはタンパク質品質に翻訳されたかどうかを試験するため、抗ＣＤ３ドメイン（ＴＳＣ３９４ＤＹ）の１を、それぞれ同一の抗ＲＯＲ１  ｓｃＦｖを特徴とする抗ＲＯＲ１×抗ＣＤ３二重特異性分子の５の異なる対の状況下におけるＤＲＡ２２２と比較した（表１３）。
【表１３】
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【０２３７】
それぞれの分子対で、安定化された抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ（ＴＳＣ３９４ＤＹ）を特徴とするコンストラクトを有する、全体のタンパク質発現のより高い力価が３１％〜９３％高いことが観察された。また、それぞれの分子対内で、安定化された抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを特徴とするコンストラクトは、タンパク質Ａ精製の後、より低いレベルの高分子量凝集体を有した（凝集体レベルの２０％〜５０％程度の減少）。これにより、安定化された抗ＣＤ３  ｓｃＦｖの包含により、元の抗ＣＤ３  ｓｃＦｖと比較して改良されたタンパク質発現及び改良されたタンパク質品質をもたらし得ることが確証された。
【０２３８】
実施例５  抗ＰＳＭＡ×抗ＣＤ３結合分子の安定性及び薬物動態に対する安定化された抗ＣＤ３結合ドメインの効果
二重特異性結合分子の安定性及び薬物動態に対する安定化された抗ＣＤ３  ｓｃＦｖの効果を試験するため、ＴＳＣ２６６（抗ＰＳＭＡ×ＤＲＡ２２２  ＣＤ３結合ドメインを含む抗ＣＤ３二重特異性分子）のＰＳＭＡ結合ドメインをＴＳＣ４５６抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを利用する二重特異性分子に導入した。この新規の二重特異性分子をＴＳＣ４７１と呼ぶ。ＢＡＬＢ／ｃマウスに約１０ｍｇ／ｋｇでＴＳＣ２６６及びＴＳＣ４７１を静脈内投与した。ＴＳＣ２６６をＰＢＳに希釈し、一方ＴＳＣ４７１を製剤緩衝液に希釈し、これを全ての希釈液（５ｍＭのコハク酸塩、６．５％のスクロース、０．０２％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ４．８）に使用した。血清を３の動物から１０時点で収集した（ｎ＝合計３０）。時点は、二重特異性分子の投与の１５分後、ならびに２、６、２４、４８、７２、９６、１６８，３３６、及び５０４時間後であった。大容量を収集するため、末端ブリードを使用した。抗ＰＳＭＡ結合ドメインを捕え、抗ＣＤ３結合ドメインを検出するＥＬＩＳＡ法を用いて血清濃度を決定した。経時的な血清濃度を用いて、非コンパートメント分析（ＮＣＡ）及びコンパートメント分析により薬物動態（ＰＫ）パラメータ推定値を決定した。後期時点からの血清サンプルもまた、それぞれの二重特異性分子＋／−ビオチンを用いた標準的な架橋ＥＬＩＳＡを用いて抗薬物抗体について試験した。
【０２３９】
より具体的には、以下のＥＬＩＳＡ法を用いた。抗ＰＳＭＡ×抗ＣＤ３二重特異性の濃度を、マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ  １Ｈ５）で被覆した９６ウェルプレートを用いて決定し、それぞれのコンストラクトの抗ＰＳＭＡ部分を捕えた。コンストラクトの他の末端は、抗ＣＤ３結合ドメイン（ｍＡｂ  ５Ｈ５）を標的とするビオチン結合マウスモノクローナル抗体を用いて検出されたため、無処置のタンパク質のみがこのＥＬＩＳＡ法で測定された。血清サンプル及びアッセイ対照からの結合免疫複合体を定量するために、重合した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ポリＨＲＰ）及び蛍光発生ペルオキシダーゼ基質を使用し、結果を蛍光プレートリーダーで測定した。血清濃度を算出するために用いられる標準的な曲線は、ＥＬＩＳＡ希釈剤に添加された様々な公知の濃度の適正なＰＳＭＡ二重特異性コンストラクトからなった。ＳＯＦＴＭＡＸ（登録商標）プロソフトウェアを使用し、４パラメータロジスティック方程式、ならびに標準及び試験サンプルの精度及び正確性を用いて血清濃度を算出した。
【０２４０】
これらの試験の結果を図１４及び１５に示す。Ｐｈｏｅｎｉｘ−６４  ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアを用いる非コンパートメント分析（ＮＣＡ）により、ＴＳＣ４７１は、ＴＳＣ２６６に対し半減期が約２倍改良し、クリアランスパラメータが３〜４倍低下した。ＴＳＣ４７１のＦｃは改良された安定性を有するＴＳＣ２６６（非ＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性、当量ＦｃＲｎ結合）の機能性特性を保持した。ＴＳＣ４７１のＦｃは、ＣＨ２ドメインの安定性が改良されたバージョンを含む。突然変異は、ＴＳＣ２６６  Ｆｃにおけるように分子の「２３４〜２３６」領域において同一であるが、ＴＳＣ４７１  Ｆｃは、ＣＤＣ領域において突然変異の数が減少し、ヌルＦｃ  ＣＨ２に見出される３の全てではなく、Ｋ３２２Ａ突然変異のみを維持する。ＴＳＣ４７１の抗ＣＤ３  ｓｃＦｖはヒト及びカニクイザルＴ細胞に対する結合及び活性を保持した。ＴＳＣ４７１において使用されるリンカーは、ＣＨＯプロテアーゼ及び他のＰＴＭに対する耐性を強化し、Ｎ結合グリコシル化部位を含まない。
【０２４１】
実施例６  抗ＲＯＲ１×抗ＣＤ３結合分子の薬物動態に対する安定化された抗ＣＤ３結合ドメインの効果
より安定でないＤＲＡ２２２  ＣＤ３結合ドメインまたはより安定なＴＳＣ４５６  ＣＤ３結合ドメインのいずれかを含む抗ＲＯＲ１×抗ＣＤ３二重特異性分子の薬物動態を比較した。以下のコンストラクトを評価した。コンストラクトの配列を、表１４に示す。
【表１４】
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【０２４２】
ＮＳＧマウスに約１０ｍｇ／ｋｇで抗ＲＯＲ１×抗ＣＤ３二重特異性を静脈内投与した。全ての二重特異性をＰＢＳに希釈した。投与後１０の時点で（それぞれのコンストラクトに対してｎ＝３０）、かつ投与前の１の時点で、血清を３の動物から収集した。時点は、二重特異性分子投与の１５分後及び２、６、２４、４８、７２、９６、１６８，３３６、及び５０４時間後であった。大容量を収集するため、末端ブリードを使用した。ＥＬＩＳＡ法を用いて血清濃度を決定し、未処置の分子を検出した。経時的な血清濃度を用いて、非コンパートメント分析（ＮＣＡ）及びコンパートメント分析によりＰＫパラメータ推定値を決定した。
【０２４３】
より具体的には、以下のＥＬＩＳＡ法を用いた。抗ＲＯＲ１×抗ＣＤ３二重特異性の濃度を、ＲＯＲ１  ＥＣＤ‐ＡＦＨ（ＲＯＲ１７７）で被覆した９６ウェルプレートを用いて決定し、それぞれのコンストラクトの抗ＲＯＲ１部分を捕えた。ＲＯＲコンストラクトの他の末端は、抗ＣＤ３結合ドメイン（ｍＡｂ  ５Ｈ５）を標的とするビオチン結合マウスモノクローナル抗体を用いて検出されたため、無処置のタンパク質のみがこのＥＬＩＳＡ法で測定された。血清サンプル及びアッセイ対照からの結合免疫複合体を定量するために、重合した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ポリＨＲＰ）及び蛍光発生ペルオキシダーゼ基質を使用し、結果を蛍光プレートリーダーで測定した。血清濃度を算出するために用いられる標準的な曲線は、ＥＬＩＳＡ希釈剤に添加された様々な公知の濃度の適正なＲＯＲコンストラクトからなった。ＳＯＦＴＭＡＸ（登録商標）プロソフトウェアを使用し、４パラメータロジスティック方程式、ならびに標準及び試験サンプルの精度及び正確性を用いて血清濃度を算出した。
【０２４４】
これらの試験の結果を図１６、１７Ａ及び１７Ｂに示す。ＮＣＡ及びコンパートメント分析により、ＲＯＲ２０９ａは最長の半減期を有した。両分析法より、ＲＯＲ２０７ａは、最も低いクリアランス及び体積推定値を有した。ＤＲＡ２２２  ＣＤ３結合ドメインを有する両方の抗ＲＯＲ１二重特異性は、より短い半減期及びより速いクリアランスパラメータを有した。注目すべきことに、改良された抗ＣＤ３結合ドメイン（ＴＳＣ４５６）を有するコンストラクトは、より安定でない抗ＣＤ３結合ドメイン（ＤＲＡ２２２）を有するものよりも優れた薬物動態を有した。
【０２４５】
実施例７  抗ＲＯＲ１×抗ＣＤ３結合分子のＩｎ  Ｖｉｖｏ有効性に対する安定化された抗ＣＤ３結合ドメインの効果
ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１細胞をドナーＴ細胞及びマトリゲルと共混合し、試験の０日目にＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの側腹部に移植した。それぞれの群は１のドナーからのＴ細胞を有するＮ＝５動物を含んだ。図１８は、ドナーＴ細胞による腫瘍増殖に対するＴ細胞の最小の影響を示す例示的なグラフを示す。動物をＰＢＳまたは３０μｇもしくは３μｇのＲＯＲ２０８（ＤＲＡ２２２抗ＣＤ３結合ドメイン）またはＲＯＲ２０９（ＴＳＣ４５６抗ＣＤ３結合ドメイン）で処置した。０日目、４日目、及び８日目に投与量を投与した。腫瘍増殖は、試験時間の経過とともにキャリパーで測定した。
【０２４６】
腫瘍増殖の有意な阻害が、両方のＲＯＲ二重特異性での処置の後に認められた。腫瘍増殖の有意差は、腫瘍のみと比較して、ドナーからのＴ細胞（図１８）において認められなかった。いずれの用量レベルでもＲＯＲ２０９と比較してＲＯＲ２０８で処置した動物の間に有意差はなく、これは、抗ＣＤ３結合ドメインが改良された安定性は、非安定性抗ＣＤ３結合ドメインと同じ効力を有することを示した。
【０２４７】
実施例８  抗ＲＯＲ１×抗ＣＤ３結合分子のＩｎ  Ｖｉｖｏ有効性に対する安定化された抗ＣＤ３結合ドメインの効果
Ｋａｓｕｍｉ‐２細胞をドナーＴ細胞及びマトリゲルと共混合し、試験の０日目にＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの側腹部に移植した。それぞれの群は１のドナーからのＴ細胞を有するＮ＝１０動物を含んだ。図１９に示すように、動物をＰＢＳまたは３０μｇ、３μｇもしくは０．３μｇのＲＯＲ２４３（ＴＳＣ４５６抗ＣＤ３結合ドメイン）で処置した。０日目、４日目、及び８日目に投与量を投与した。投与経路は、皮下（ＳＣ）投与を行った１群を除いて静脈内（ＩＶ）経路であった。図１９はアッセイの結果を示す。腫瘍増殖は、試験時間の経過とともにキャリパーで測定した。
【０２４８】
ＲＯＲ２４３の非存在下でのＴ細胞の存在下で、またはＴ細胞の非存在下でのＲＯＲ２４３の処理で、腫瘍増殖の阻害は認められなかった。用量依存性滴定を有する０．３μｇ／容量で腫瘍増殖の有意な阻害が認められた。投与経路における差異は認められなかった。
【表１５】
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【表１６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年5月17日(2018.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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