(57)【要約】本発明は抗メソテリン完全ヒト抗体およびメソテリンを標的とする免疫エフェクター細胞を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
特異的にメソテリンと結合する完全ヒト抗体であって、
(a) 配列番号54で示されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号55で示されるアミノ酸配列を含むCDR2、配列番号56で示されるアミノ酸配列を含むCDR3を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(b) 配列番号51で示されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号52で示されるアミノ酸配列を含むCDR2、配列番号53で示されるアミノ酸配列を含むCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(c) (a)に記載の抗体の重鎖可変領域および(b)に記載の抗体の軽鎖可変領域を含む抗体、
(d) 配列番号60で示されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号61で示されるアミノ酸配列を含むCDR2、配列番号62で示されるアミノ酸配列を含むCDR3を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(e) 配列番号57で示されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号58で示されるアミノ酸配列を含むCDR2、配列番号59で示されるアミノ酸配列を含むCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(f) (d)に記載の抗体の重鎖可変領域および(e)に記載の抗体の軽鎖可変領域を含む抗体、
(g) （a）〜（f）のうちいずれか１つに記載の抗体によって認識される抗原決定基と同様の抗原決定基を認識する抗体
からなる群から選択される、前記完全ヒト抗体。
【請求項２】
完全ヒト抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号6の1〜123番目で示され、および軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号6の139〜254番目で示されるか、または
重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号8の1〜124番目で示され、および軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号8の140〜247番目で示される、
請求項1に記載の完全ヒト抗体。
【請求項３】
請求項1または2に記載の抗体をコードする、核酸。
【請求項４】
請求項3に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項５】
請求項4に記載の発現ベクターを含むか、または請求項3に記載の核酸がゲノム中に組み込まれた、宿主細胞。
【請求項６】
メソテリンを発現する腫瘍細胞を特異的に標的とする標的薬物、抗体薬物抱合体または多機能抗体の製造における、または
メソテリンを発現する腫瘍を診断するための試薬の製造における、または
キメラ抗原受容体で修飾された免疫細胞の製造における、
請求項1または2に記載の抗体の使用。
【請求項７】
請求項1または2に記載の抗体、膜貫通領域および細胞内シグナル領域がこの順に連結されたものを含む、キメラ抗原受容体。
【請求項８】
細胞内シグナル領域が、CD3ζ、FcεRIγ、CD27、CD28、CD137、CD134、MyD88、CD40の細胞内シグナル領域からなる群から選択されるか、またはこれらの組み合わせである、請求項7に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項９】
膜貫通領域が、CD8またはCD28の膜貫通領域を含む、請求項7に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１０】
1キメラ抗原受容体が、以下の抗体、膜貫通領域および細胞内シグナル領域がこの順で結合したもの：
請求項1または2に記載の抗体、CD8およびCD3ζ、
請求項1または2に記載の抗体、CD8、CD137およびCD3ζ、
請求項1または2に記載の抗体、CD28分子の膜貫通領域、CD28分子の細胞内シグナル領域およびCD3ζ、あるいは
請求項1または2に記載の抗体、CD28分子の膜貫通領域、CD28分子の細胞内シグナル領域、CD137およびCD3ζ、
を含む、請求項7に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１１】
1抗体が、一本鎖抗体またはドメイン抗体である、請求項7に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１２】
キメラ抗原受容体が、
配列番号41、またはその22〜353番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号42、またはその22〜454番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号43、またはその22〜498番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号44、またはその22〜501番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号45、またはその22〜543番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号46、またはその22〜346番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号47、またはその22〜447番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号48、またはその22〜491番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号49、またはその22〜494番目に示されるアミノ酸配列、あるいは
配列番号50、またはその22〜536番目に示されるアミノ酸配列
を有する、請求項7に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１３】
1請求項7〜12のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードする、核酸。
別の好適な例において、前記のキメラ抗原受容体をコードする核酸は、
配列番号31、またはその473〜1468番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号32、またはその473〜1771番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号33、またはその473〜1903番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号34、またはその473〜1912番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号35、またはその473〜2038番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号36、またはその473〜1447番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号37、またはその473〜1750番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号38、またはその473〜1882番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号39、またはその473〜1891番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号40、またはその473〜2017番目に示されるヌクレオチド配列
を有する。
【請求項１４】
請求項13に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１５】
請求項14に記載のベクターを含む、ウイルス。
【請求項１６】
メソテリンを発現する腫瘍細胞を標的とする遺伝子修飾された免疫細胞の製造における、請求項7〜12のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、または請求項13に記載の核酸、または請求項14に記載の発現ベクター、または請求項15に記載のウイルスの使用。
【請求項１７】
メソテリンを発現する腫瘍が、膵臓がん、卵巣がん、胸腺中皮腫を含む、請求項16に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１８】
請求項13に記載の核酸、または請求項14に記載の発現ベクターまたは請求項15に記載のウイルスが形質導入されているか、または
表面に請求項7〜12のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体がその表面に発現されている、遺伝子修飾された免疫細胞。
【請求項１９】
外因性サイトカインのコード配列をさらに担持し、好ましくは前記サイトカインが、IL-12、IL-15またはIL-21を含む、請求項18に記載の免疫細胞。
【請求項２０】
別のキメラ抗原受容体をも発現し、前記受容体が、CD3ζは含まないが、CD28の細胞内シグナルドメイン、CD137の細胞内シグナルドメインまたはこの両者の組み合わせを含む、請求項18に記載の免疫細胞。
【請求項２１】
ケモカイン受容体をさらに発現し、好ましくは、前記ケモカイン受容体が、CCR2を含む、請求項18に記載の免疫細胞。
【請求項２２】
PD-1の発現を低下させるsiRNAまたはPD-L1を遮断するタンパク質をさらに発現する、請求項18に記載の免疫細胞。
【請求項２３】
安全スイッチをさらに発現し、好ましくは、前記安全スイッチが、誘導性カスパーゼ9、短縮型EGFRまたはRQR8を含む、請求項18に記載の免疫細胞。
【請求項２４】
免疫細胞が、T細胞、NK細胞またはNKT細胞を含む、請求項18に記載の免疫細胞。
【請求項２５】
腫瘍を阻害する薬物の製造における、請求項18〜24のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された免疫細胞の使用であって、前記腫瘍が、メソテリンを発現する腫瘍である、前記使用。
【請求項２６】
請求項1または2に記載の抗体、および
それと連結した機能性分子
を含む多機能免疫複合体であって、
前記機能性分子が、腫瘍表面マーカーを標的とする分子、腫瘍を抑制する分子、免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子、または検出可能な標識物から選択される、前記多機能免疫複合体。
【請求項２７】
腫瘍表面マーカーを標的とする分子が、腫瘍表面マーカーと結合する抗体または配位子であるか、または
腫瘍を抑制する分子が、抗腫瘍サイトカインまたは抗腫瘍毒素であり、好ましくは、前記サイトカインが、IL-12、IL-15、IFN-β、TNF-αを含む、請求項26に記載の多機能免疫複合体。
【請求項２８】
検出可能な標識物が、蛍光標識物、呈色標識物を含む、請求項26に記載の多機能免疫複合体。
【請求項２９】
腫瘍表面マーカーと結合する抗体が、メソテリン以外の抗原を認識する抗体を指し、前記抗原が、EGFR、EGFRvIII、メソテリン、HER2、EphA2、Her3、EpCAM、MUC1、MUC16、CEA、クローディン18.2、葉酸受容体、クローディン6、CD3、WT1、NY-ESO-1、MAGE 3、ASGPR1またはCDH16を含む、請求項27に記載の多機能免疫複合体。
【請求項３０】
免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子が、T細胞の表面マーカーと結合する抗体であり、T細胞を結合させる二重機能抗体を請求項1または2に記載の抗体とともに形成する、請求項26に記載の多機能免疫複合体。
【請求項３１】
T細胞の表面マーカーと結合する抗体が、抗CD3抗体である、請求項30に記載の多機能免疫複合体。
【請求項３２】
融合ポリペプチドであり、請求項1または2に記載の抗体とそれと連結した機能性分子との間に連結ペプチドをさらに含む、請求項31に記載の多機能免疫複合体。
【請求項３３】
請求項26〜32のいずれか一項に記載の多機能免疫複合体をコードする、核酸。
【請求項３４】
であって、
抗腫瘍薬、またははメソテリンを発現する腫瘍を診断する薬剤の製造における、あるいは
キメラ抗原受容体で修飾された免疫細胞の製造における、
請求項26〜32のいずれか一項に記載の多機能免疫複合体の使用であって、好ましくは、前記免疫細胞が、T細胞、NK細胞またはNKT細胞を含む、前記使用。
【請求項３５】
請求項1または2に記載の抗体または前記抗体をコードする核酸、あるいは
請求項26〜32のいずれか一項に記載の免疫複合体または前記複合体をコードする核酸、あるいは
請求項7〜12のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体または前記キメラ抗原受容体をコードする核酸、あるいは
請求項18〜24のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された免疫細胞
を含む、医薬組成物。
【請求項３６】
請求項1または2に記載の抗体と競合してメソテリンに結合することが可能な抗体。
【請求項３７】
配列番号66に示されるメソテリンエピトープと結合することが可能な抗体であり、好ましくは、前記抗体が、配列番号72に示されるメソテリンエピトープと結合し得る、前記抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、腫瘍免疫治療または診断の分野に属し、より具体的に、抗メソテリン完全ヒト抗体およびメソテリンを標的とする免疫エフェクター細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
［背景技術］
免疫エフェクター細胞の腫瘍の免疫応答における作用は重要視されてきた。免疫エフェクター細胞に基づいた養子免疫療法は一部の腫瘍においてある程度の効果が得られ、しかもこのような免疫治療法は抗体治療の上記欠点を克服することができるが、大半の腫瘍における治療効果は満足できるものと言えない[Grupp SAら Adoptive cellular therapy. Curr Top Microbiol Immunol. 2011, 344:149-72.]。近年、細胞毒性Tリンパ球(cytotoxic lymphocyte、CTL)の標的細胞に対する認識特異性はT細胞受容体(T Cell Receptor、TCR)に依存するという発見に基づき、腫瘍細胞関連抗原に対する抗体のscFvをT細胞受容体のCD3ζまたはFcεRIγなどの細胞内シグナルの活性化モチーフと融合させてキメラ抗原受容体(Chimeric antigen receptor、CAR)とし、そしてそれをたとえばレンチウイルス感染などの方法によってT細胞の表面に遺伝子的に修飾する。このようなCAR T細胞は主要組織適合遺伝子複合体(Major Histocompatibility Complex、MHC)に制限されない様態で選択的にTリンパ球の標的を腫瘍細胞に変えて特異的に腫瘍を殺傷することができる。CAR T細胞は腫瘍免疫治療の分野における一つの新たな免疫治療策略である。CAR修飾NK細胞またはNKT細胞も前臨床研究において抗腫瘍活性を示した。
【０００３】
CAR修飾免疫エフェクター細胞、特にT細胞を設計する場合、標的となる抗原遺伝子は実に重要な選択で、体内の遺伝子発現の複雑性および様々な制御不能な要素を考えると、CARに適する遺伝子の選択は非常に困難である。そして、多くの腫瘍特異的抗原はそれに対するCAR修飾免疫エフェクター細胞の構築に適する特異性分子がなかなか見つからない。
【０００４】
メソテリン（mesothelin）は分子量が40-kDaの細胞表面糖タンパク質である。膵臓がん、卵巣がんおよび胸腺中皮腫などの多くの腫瘍において高発現される。正常組織では、胸膜、心膜および腹膜の正常中皮細胞だけにおいて発現される。メソテリンは71 kDaの前駆体タンパク質として合成され、その成熟部分は細胞表面に発現される。当該前駆体タンパク質はフーリン プロテアーゼによって加水分解されて31 kDaの脱離部分（巨核球増強因子、またはMPFと呼ばれる）および40 kDaのメソテリン部分に切断される。後者の部分はGPIによって細胞表面に結合するか、タンパク質加水分解酵素の機構によって脱離する。
【０００５】
メソテリンを標的とする抗体またはほかの標的治療はすでに報告されている。中では、CAR-Tも臨床研究の報告があった（Maus MV, Haas AR, Beatty GL, Albelda SM, Levine BL, Liu X, Zhao Y, Kalos M, June CH. T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans.  Cancer Immunol Res. 2013;1(1):26-31；Beatty GL, Haas AR, Maus MV, Torigian DA, Soulen MC, Plesa G, Chew A, Zhao Y, Levine BL, Albelda SM, Kalos M, June CH. Mesothelin-specific chimeric antigen receptor mRNA-engineered T cells induce anti-tumor activity in solid malignancies. Cancer Immunol Res. 2014 Feb;2(2):112-20）。しかし、マウスの抗ヒトメソテリン抗体によって構築されたCAR-Tは臨床において抗マウス抗体およびアレルギーなどの毒性・副作用が現れることも見出された。メソテリンは潜在的な治療標的であるが、抗体自身の属性はその治療効果および毒性・副作用に影響する可能性があることが示された。そのため、本分野では、抗体による治療効果不良および毒性・副作用の問題を克服できる方法を探すことがまだ必要である。
【発明の概要】
【０００６】
［発明の概要］
本発明の目的は抗メソテリン完全ヒト抗体およびメソテリンを標的とする免疫エフェクター細胞を提供することにある。
【０００７】
本発明の第一の側面では、特異的にメソテリンと結合する完全ヒト抗体であって、
(a) 配列番号54で示されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号55で示されるアミノ酸配列を含むCDR2、配列番号56で示されるアミノ酸配列を含むCDR3を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(b) 配列番号51で示されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号52で示されるアミノ酸配列を含むCDR2、配列番号53で示されるアミノ酸配列を含むCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(c) (a)に記載の抗体の重鎖可変領域および(b)に記載の抗体の軽鎖可変領域を含む抗体、
(d) 配列番号60で示されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号61で示されるアミノ酸配列を含むCDR2、配列番号62で示されるアミノ酸配列を含むCDR3を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(e) 配列番号57で示されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号58で示されるアミノ酸配列を含むCDR2、配列番号59で示されるアミノ酸配列を含むCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(f) (d)に記載の抗体の重鎖可変領域および(e)に記載の抗体の軽鎖可変領域を含む抗体、
(g) （a）〜（f）のうちいずれか１つに記載の抗体によって認識される抗原決定基と同様の抗原決定基を認識する抗体
から選択される完全ヒト抗体を提供する。
【０００８】
一つの好適な例において、当該完全ヒト抗体は、アミノ酸配列が配列番号6の1〜123番目に示される重鎖可変領域、およびアミノ酸配列が配列番号6の139〜254番目に示される軽鎖可変領域を含むか、あるいは
当該完全ヒト抗体は、アミノ酸配列が配列番号8の1〜124番目に示される重鎖可変領域、およびアミノ酸配列が配列番号8の140〜247番目に示される軽鎖可変領域を含む。
もう一つの好適な例において、前記の特異的にメソテリンと結合する完全ヒト抗体は、一本鎖抗体(scFV)、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、Fab断片、Fd断片、Fv断片、F(ab’)2断片およびその誘導体、あるいはほかの形態の抗体でもよく、好ましくは一本鎖抗体である。
【０００９】
本発明のもう一つの側面では、前記の抗体をコードする核酸を提供する。
本発明のもう一つの側面では、前記の核酸を含む発現ベクターを提供する。
本発明のもう一つの側面では、前記の発現ベクターを含むか、あるいは前記の核酸がゲノム中に組み込まれた宿主細胞を提供する。
本発明のもう一つの側面では、メソテリンを発現する腫瘍細胞を特異的に標的とする標的薬物、抗体薬物抱合体または多機能抗体の製造における、あるいはメソテリンを発現する腫瘍を診断する試薬の製造における、あるいはキメラ抗原受容体で修飾された免疫細胞の製造における、前記の抗体の使用を提供する。
【００１０】
本発明のもう一つの側面では、前記の抗体のキメラ抗原受容体（Chimeric antigen receptor、CAR）であって、本発明に係る抗体、膜貫通領域および細胞内シグナル領域がこの順に連結されたものを含むキメラ抗原受容体を提供する。
一つの好適な例において、前記の細胞内シグナル領域は、CD3ζ、FcεRIγ、CD27、CD28、CD137、CD134、MyD88、CD40の細胞内シグナル領域、またはこれらの組み合わせから選択される。
一つの好適な例において、前記の膜貫通領域はCD8またはCD28の膜貫通領域を含む。
【００１１】
もう一つの好適な例において、前記のキメラ抗原受容体は、以下の抗体、膜貫通領域および細胞内シグナル領域がこの順で結合したもの：
前記の抗体、CD8およびCD3ζ、
前記の抗体、CD8、CD137およびCD3ζ、
前記の抗体、CD28分子の膜貫通領域、CD28分子の細胞内シグナル領域およびCD3ζ、あるいは
前記の抗体、CD28分子の膜貫通領域、CD28分子の細胞内シグナル領域、CD137およびCD3ζを含む。
【００１２】
もう一つの好適な例において、前記の抗体は一本鎖抗体またはドメイン抗体である。
もう一つの好適な例において、前記のキメラ抗原受容体は、
配列番号41、またはその22〜353番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号42、またはその22〜454番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号43、またはその22〜498番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号44、またはその22〜501番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号45、またはその22〜543番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号46、またはその22〜346番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号47、またはその22〜447番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号48、またはその22〜491番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号49、またはその22〜494番目に示されるアミノ酸配列、あるいは
配列番号50、またはその22〜536番目に示されるアミノ酸配列、
を有する。
【００１３】
本発明のもう一つの側面では、前記のキメラ抗原受容体をコードする核酸を提供する。
もう一つの好適な例において、前記のキメラ抗原受容体をコードする核酸は、
配列番号31、またはその473〜1468番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号32、またはその473〜1771番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号33、またはその473〜1903番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号34、またはその473〜1912番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号35、またはその473〜2038番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号36、またはその473〜1447番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号37、またはその473〜1750番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号38、またはその473〜1882番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号39、またはその473〜1891番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号40、またはその473〜2017番目に示されるヌクレオチド配列、
を有する。
【００１４】
本発明のもう一つの側面では、前記の核酸を含む発現ベクターを提供する。
もう一つの好適な例において、前記の発現ベクターはレンチウイルスプラスミドpWPT（またはpWPT-eGFP）由来のものである。
本発明のもう一つの側面では、前記ベクターを含むウイルスを提供する。
本発明のもう一つの側面では、メソテリンを発現する腫瘍細胞を標的とする遺伝子修飾された免疫細胞の製造における、前記のキメラ抗原受容体、または前記の核酸、または前記の発現ベクター、または前記のウイルスの使用を提供する。
一つの好適な例において、前記のメソテリンを発現する腫瘍は膵臓がん、卵巣がん、胸腺中皮腫を含むが、これらに限定されない。
【００１５】
本発明のもう一つの側面では、遺伝子修飾された免疫細胞であって、前記の核酸、あるいは前記のベクターまたは前記のウイルスを形質導入されたか、その表面に前記のキメラ抗原受容体が発現された細胞を提供する。
一つの好適な例において、前記の免疫細胞は、さらに、外因性サイトカインのコード配列を担持する。好ましくは、前記のサイトカインは、IL-12、IL-15またはIL-21を含む。
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞はさらにもう1種類のキメラ抗原受容体を発現し、当該受容体はCD3ζを含まないが、CD28の細胞内シグナルドメイン、CD137の細胞内シグナルドメインまたはこの両者の組み合わせを含む。
【００１６】
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞はさらにケモカイン受容体を発現する。好ましくは、前記のケモカイン受容体はCCR2を含む。
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞はさらにPD-1の発現を低下させるsiRNAまたはPD-L1を遮断するタンパク質を発現する。
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞はさらに安全スイッチを発現する。好ましくは、前記の安全スイッチは誘導性カスパーゼ9（iCaspase-9）、短縮型EGFR（Truancated EGFR）またはRQR8を含む。
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞は、T細胞、NK細胞またはNKT細胞を含む。
【００１７】
本発明のもう一つの側面では、腫瘍を抑制する薬物の製造における、前記の遺伝子修飾された免疫細胞の使用を提供し、前記の腫瘍はメソテリンを発現する腫瘍である。
本発明のもう一つの側面では、前記の抗体と、それと結合（共役結合、カップリング、付着、吸着を含む）した、腫瘍表面マーカーを標的とする分子、腫瘍を抑制する分子、免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子または検出可能な標識物から選択される機能性分子とを含む、多機能免疫複合体を提供する。
一つの好適な例において、前記の多機能免疫複合体では、前記の腫瘍表面マーカーを標的とする分子は腫瘍表面マーカーと結合する抗体または配位子であるか、前記の腫瘍を抑制する分子は抗腫瘍サイトカインまたは抗腫瘍毒素で、好ましくは、前記のサイトカインはIL-12、IL-15、IFN-β、TNF-αを含むが、これらに限定されない。
【００１８】
もう一つの好適な例において、前記の多機能免疫複合体では、前記の検出可能な標識物は、蛍光標識物、呈色標識物を含む。
もう一つの好適な例において、前記の多機能免疫複合体では、前記の腫瘍表面マーカーと結合する抗体は、メソテリン以外のほかの抗原を認識する抗体で、前記のほかの抗原は、EGFR、EGFRvIII、メソテリン、HER2、EphA2、Her3、EpCAM、MUC1、MUC16、CEA、クローディン18.2、葉酸受容体、クローディン6、CD3、WT1、NY-ESO-1、MAGE 3、ASGPR1またはCDH16を含む。
もう一つの好適な例において、前記の多機能免疫複合体では、前記の免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子は、T細胞の表面マーカーと結合する抗体であり、前記の抗体とT細胞が関与する二重機能抗体（Bispecific T cell engager、BiTE）を形成する。
【００１９】
もう一つの好適な例において、前記の多機能免疫複合体では、前記のT細胞の表面マーカーと結合する抗体は抗CD3抗体である。
もう一つの好適な例において、前記の抗CD3抗体は、一本鎖抗体(scFV)、モノクローナル抗体、Fab断片、Fd断片、Fv断片、F(ab’)2断片およびその誘導体、あるいはほかの形態の抗体で、好ましくは一本鎖抗体である。
もう一つの好適な例において、前記の抗CD3抗体はヒト化のもの、キメラのもの、完全ヒト由来のものまたはネズミ由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記の多機能免疫複合体は融合ポリペプチドで、本発明に係る抗体およびそれと連結した機能性分子の間に、さらに連結ペプチド（リンカー）が含まれている。
【００２０】
もう一つの好適な例において、前記の連結ペプチドの配列は(GlyGlyGlyGlySer)nで、ここで、nは1〜5の整数で、好ましくは、n=3である。
もう一つの好適な例において、前記の多機能免疫複合体はポリペプチド投与または遺伝子投与の形態を使用する。
本発明のもう一つの側面では、前記の多機能免疫複合体をコードする核酸を提供する。
【００２１】
本発明のもう一つの側面では、抗腫瘍薬の製造、あるいはメソテリンを発現する腫瘍を診断する薬剤の製造、あるいはキメラ抗原受容体で修飾された免疫細胞の製造における、前記の多機能免疫複合体の使用を提供する。好ましくは、前記免疫細胞は、T細胞、NK細胞またはNKT細胞を含む。
本発明のもう一つの側面では、
前記の抗体または当該抗体をコードする核酸、あるいは
前記の免疫複合体または当該複合体をコードする核酸、あるいは
前記のキメラ抗原受容体または当該キメラ抗原受容体をコードする核酸、あるいは
前記の遺伝子修飾された免疫細胞、
を含む医薬組成物（医薬または診断試薬を含む）を提供する。
【００２２】
本発明のもう一つの側面では、本発明に係る抗体と競合してメソテリンに結合する抗体を提供する。
本発明のもう一つの側面では、配列番号66で示されるメソテリンエピトープと結合する抗体を提供する。一つの好適な例において、配列番号72で示されるメソテリンエピトープと結合する抗体を提供する。
本発明の他の主旨は、本文の公開される内容によって、この分野の技術者にとっては明らかになっている。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
［図面の説明］
【図１】図1は、単一ファージELISA実験における抗体P1A6EおよびP3F2のヒトメソテリン(hu-mesothelin)および対照BSAに対する結合の状態である。抗体P1A6EおよびP3F2のヒトメソテリンおよび陰性対照BSAに対する値から、選別された二つの抗体が特異的にヒトメソテリンと結合することが証明された。
【図２】図2は、ELISA実験において検出された異なる二つの一本鎖抗体P1A6EおよびP3F2のヒトメソテリンおよびBSAに対する結合の状態である。
【図３】図3は、抗ヒトメソテリン抗体の精製SDS-PAGE電気泳動像である。
【００２４】
【図４】図4は、モノクローナル抗体P1A6EおよびP3F2のSDS-PAGE電気泳動像である。
【図５】図5は、Biacoreにおけるモノクローナル抗体P1A6Eの異なる濃度のヒトメソテリンに対する結合曲線である。
【図６】図6は、Biacoreにおけるモノクローナル抗体P3F2の異なる濃度のヒトメソテリンに対する結合曲線である。
【図７】図7は、蛍光活性化細胞選別装置（FACS）によって示された4種類の一本鎖抗体(P1A6E、P3F2および対照抗体SS、C10)とPANC-1-MSLN細胞の特異的結合の測定である。
【００２５】
【図８】図8は、蛍光活性化細胞選別装置（FACS）によって示された4種類のモノクローナル抗体(P1A6E、P3F2および対照抗体SS、C10)とPANC-1-MSLN細胞の特異的結合の測定である。
【図９】図9は、ELISAによって示された抗体scFv-P1A6E-FcおよびscFv-P3F2-Fcと領域R1、R2、R3の結合の状態である。
【図１０】図10は、ELISAによって示された抗体scFv-P1A6E-FcおよびscFv-P3F2-Fcと領域R1A、R1B、R1C、R1AB、R1BCの結合の状態である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
［具体的な実施形態］
本発明者らは、初期で多くの腫瘍特異的遺伝子を考察したところ、このような遺伝子のうち、相当な部分が一部の組織の正常細胞でも発現され、キメラ抗原受容体で修飾された免疫エフェクター細胞技術への応用が困難である。一部の腫瘍特異的遺伝子は優れた腫瘍特異的発現特性を有するが、それに基づいて設計されるCAR修飾免疫エフェクター細胞は腫瘍細胞に対する殺傷活性がないか活性が低く、これは当該標的が腫瘍細胞による免疫エフェクター細胞に対して抑制作用を果たす因子、たとえばPD-L1の分泌を引き起こすためかもしれない。
考察と選別を繰り返したところ、本発明者らは多くの候補分子からCARを設計する標的としてメソテリンを見つけた。本発明者らは、研究によって、メソテリン抗体に基づいて製造されたCAR修飾T細胞は確実に選択的にメソテリン陽性の腫瘍細胞を標的とし、かつ腫瘍細胞に対して強い細胞毒性を有することを証明した。本発明者らは、相応するCAR修飾免疫エフェクター細胞、特にT細胞は人体腫瘍の治療に使用することができると考える。
【００２７】
＜抗メソテリン抗体＞
本発明者らは、完全ヒト由来抗体ライブラリーから選別してメソテリン結合性能が良好で遺伝子修飾された免疫エフェクター細胞の製造に適する特異的抗体を得、そしてその結合性能を発揮する重要なCDR領域を発見した。
本発明の抗体は完全な免疫グロブリン分子でもよく、抗原結合断片でもよく、Fab断片、Fd断片、Fv断片、F(ab')2断片、相補性決定領域（CDR）断片、一本鎖抗体（scFv）、ドメイン抗体、2価一本鎖抗体、一本鎖ファージ抗体、二重特異性二本鎖抗体、三本鎖抗体、四本鎖抗体を含むが、これらに限定されない。
【００２８】
抗体の抗原結合特性は、重鎖および軽鎖可変領域に位置する3つの特定の領域によって特徴付けられ、相補性決定領域（complementarity determining region、CDR）と呼ばれ、前記のCDR領域によって可変領域が4つのフレームワーク領域(FR)に分かれ、4つのFRのアミノ酸配列が比較的に保存され、直接結合反応に関与しない。これらのCDRは環状構造を形成し、その中のFRで形成されるβシートによって空間構造上で近づき、重鎖におけるCDRおよび相応の軽鎖におけるCDRが抗体の抗原結合部位を構成する。同類の抗体のアミノ酸配列の比較によってどのアミノ酸がFR或いはCDR領域を構成するか確認することが出来る。CDR領域は免疫学で注目されるタンパク質の配列で、本発明の抗体のCDR領域は斬新なものである。前記抗体は本明細書で開示されたCDR領域の2つ、3つ、4つ、5つまたはすべての6つを含んでもよい。
【００２９】
本発明のもう一つの側面は本明細書に記載の抗体のバリアントを含み、バリアントは親抗体と競合してメソテリンに特異的に結合することができ、かつ腫瘍細胞の発現するメソテリンを認識する能力は本発明の実施例で提供された具体的な抗体に近い。前記機能的バリアントは保存配列修飾を有してもよく、ヌクレオチドおよびアミノ酸の置換、挿入および欠失を含む。これらの修飾は本分野で既知の標準技術によって導入されてもよいが、たとえば部位特異的変異導入およびランダムPCRによる異変導入が挙げられ、かつ天然および非天然のヌクレオチドおよびアミノ酸を含む。好ましくは、配列の修飾は前記抗体のCDR領域以外の領域に生じた。
本発明の抗体は様々な標的抗腫瘍薬および腫瘍の診断薬の製造、特にメソテリンを標的とする免疫エフェクター細胞の製造に使用することができる。
【００３０】
＜キメラ抗原受容体および遺伝子修飾された免疫細胞＞
本発明は、免疫エフェクター細胞（免疫細胞）の表面に発現されるキメラ抗原受容体であって、順に連結した細胞外結合領域、膜貫通領域および細胞内シグナル領域を含み、中では、前記細胞外結合領域は本発明の抗体を含む受容体を提供する。当該キメラ抗原受容体を免疫エフェクター細胞の表面に発現させることによって、免疫エフェクター細胞がメソテリンを発現する腫瘍細胞に対して高度特異性の細胞毒性作用を有するようにすることができる。
本明細書で用いられるように、前記の「免疫細胞」と「免疫エフェクター細胞」は入れ替えて使用することができ、T細胞、NK細胞またはNKT細胞を含む。
【００３１】
本発明の好適な形態として、前記のキメラ抗原受容体では、含まれる抗体は一本鎖抗体で、CD8のヒンジ領域でCD8またはCD28の膜貫通領域と連結し、膜貫通領域の次に細胞内シグナル領域が隣接する。
本発明には、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸も含まれる。本発明は、さらに、本発明と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはポリペプチドの断片、類似物および誘導体をコードする上記ポリヌクレオチドの変異体に関する。
【００３２】
キメラ抗原受容体の膜貫通領域は、CD8またはCD28などのタンパク質の膜貫通領域から選ばれる。ヒトCD8タンパク質はヘテロ二量体で、αβまたはγδの二本鎖からなる。本発明の一つの実施形態において、膜貫通領域はCD8αまたはCD28の膜貫通領域から選ばれる。また、CD8αヒンジ領域（hinge）は、可撓性の領域であるため、CD8またはCD28と膜貫通領域とヒンジ領域はキメラ抗原受容体CARの標的識別ドメインscFvと細胞内シグナル領域の連結に使用される。
【００３３】
細胞内シグナル領域は、CD3ζ、FcεRIγ、C27、CD28、CD137、CD134、MyD88、CD4タンパク質の細胞内シグナル領域、およびこれらの組み合わせから選ばれる。CD3分子は5つのサブユニットからなり、中では、CD3ζサブユニット(CD3 ゼータとも呼ばれ、Zと略す)は3つのITAMモチーフを含み、当該モチーフはTCR-CD3複合体における重要なシグナル伝達領域である。CD3δZは短縮されたITAMモチーフを有さないCD3ζ配列で、実践において通常陰性対照として構築される。FcεRIγは主に肥満細胞および好塩基球の表面に分布し、一つのITAMモチーフを含み、構造、分布および機能ではCD3ζと類似である。また、前記のように、CD28、CD137、CD134は共刺激シグナル分子で、それぞれリガンドと結合した後その細胞内シグナル領域による共刺激作用で免疫エフェクター細胞（主にT細胞）の持続的な増殖が生じ、かつ免疫エフェクター細胞のIL-2およびIFN-γなどのサイトカインの分泌レベルを上げると同時に、CAR免疫エフェクター細胞の体内における生存期間および抗腫瘍効果を向上させる。
【００３４】
本発明のキメラ抗原受容体は、
本発明の抗体、CD8およびCD3ζ、
本発明の抗体、CD8、CD137およびCD3ζ、
本発明の抗体、CD28分子の膜貫通領域、CD28分子の細胞内シグナル領域およびCD3ζ、あるいは
本発明の抗体、CD28分子の膜貫通領域、CD28分子の細胞内シグナル領域、CD137およびCD3ζ、
のような順で連結することができる。
およびこれらの組み合わせ、ここで、関連キメラ抗原受容体タンパク質におけるCD28aはCD28分子の膜貫通領域を、CD28bはCD28分子の細胞内シグナル領域を表す。上記各キメラ抗原受容体はscFv(メソテリン)-CARと総称される。
【００３５】
本発明は、さらに、上記免疫エフェクター細胞の表面に発現されるキメラ抗原受容体タンパク質をコードする核酸を含むベクターを提供する。一つの具体的な実施形態において、本発明で使用されるベクターは、レンチウイルスプラスミドベクターpWPT-eGFPである。当該プラスミドは、第三世代の自己不活性化レンチウイルスベクターシステムに属し、当該システムは計3つのプラスミド、すなわちタンパク質Gag/Pol、Revタンパク質をコードするパッケージングプラスミドpsPAX2、VSV-Gタンパク質をコードするエンベローププラスミドPMD2.G、および空ベクターpWPT-eGFPを有し、核酸配列への組み込み、すなわちCARの核酸配列のコーディングに使用することができる。空ベクターpWPT-eGFPにおいて、伸長因子-1 α（elongation factor-1α、EF-1α）プロモーターで強化型緑色蛍光タンパク質（enhanced green fluorescent protein、eGFP）の発現を調節する。一方、CARをコードする目的核酸配列を含む組み換え発現ベクターpWPT-eGFP-F2A-CARは、口蹄疫ウイルス(food-and-mouth disease virus、FMDV)由来のリボソームスキッピング配列(ribosomal skipping sequence 2A）（F2Aと略す）によってeGFPとCARの共発現が実現される。もちろん、ほかの発現ベクターも使用することができる。
【００３６】
本発明は、さらに、上記ベクターを含むウイルスを含む。本発明のウイルスは、パッケージング後の感染力を有するウイルスを含み、感染力を有するウイルスへのパッケージングに必要な成分を含むパッケージングされるウイルスも含む。本分野で既知のほかの外因性遺伝子の免疫エフェクター細胞への形質導入に使用できるウイルスおよびそれに相応するプラスミドベクターも本発明に使用することができる。
【００３７】
本発明は、さらに、本発明の核酸または本発明の当該核酸を含有する上記組み換えプラスミド、あるいは当該プラスミドを含むウイルスを形質導入した遺伝子修飾された免疫エフェクター細胞を提供する。本分野の通常の核酸形質導入方法は、非ウイルスの形質導入方法もウイルスによる形質導入方法も本発明に使用することができる。非ウイルスの形質導入方法は、エレクトロポレーション法およびトランスポゾン法を含む。最近、Amaxa社によって研究開発されたNucleofectorヌクレオフェクション装置は、直接外因性遺伝子を細胞核に導入して目的遺伝子の効率的なトランスフェクションを実現することができる。さらに、眠り姫トランスポゾン（Sleeping Beauty system）またはPiggyBacトランスポゾンなどのトランスポゾンシステムのトランスフェクション効率は通常のエレクトロポレーション法よりも大幅に向上し、nucleofectorトランスフェクション装置とSB眠り姫トランスポゾンシステムの併用が既に報告され[Davies JK.ら Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies. Cancer Res, 2010, 70(10): OF1-10.]、当該方法は高いトランスフェクション効率も有し、目的遺伝子の部位特異的組み込みも実現できる。
【００３８】
本発明の一つの実施形態において、キメラ抗原受容体の遺伝子修飾を実現する免疫エフェクター細胞のトランスフェクション方法はウイルス、たとえばレトロウイルスまたはレンチウイルスに基づいたトランスフェクション方法である。当該方法はトランスフェクション効率が高い、外因性遺伝子を安定して発現する、および体外で免疫エフェクター細胞を臨床級の数に培養する時間を短縮させるなどの利点がある。当該遺伝子組み換え免疫エフェクター細胞の表面では、形質導入された核酸は転写、翻訳によってその表面に発現される。様々な培養の腫瘍細胞に対して体外細胞毒性実験を行うことによって、本発明の免疫エフェクター細胞は高度特異性の腫瘍細胞殺傷効果（細胞毒性とも呼ばれる）を有することが証明された。そのため、本発明のキメラ抗原受容体タンパク質をコードする核酸、当該核酸を含むプラスミド、当該プラスミドを含むウイルスおよび上記核酸、プラスミドまたはウイルスを形質導入した遺伝子組み換え免疫エフェクター細胞は有効に腫瘍の免疫治療に使用することができる。
【００３９】
本発明に係る免疫細胞は、さらに、外因性サイトカインのコード配列を持ってもよい。前記のサイトカインは、IL-12、IL-15やIL-21などを含む。これらのサイトカインは免疫調節または抗腫瘍の活性を有し、エフェクターT細胞および活性化NK細胞の機能を強化させるか、直接抗腫瘍作用を発揮することができる。そのため、当業者には、これらのサイトカインの応用は前記の免疫細胞のさらなる作用の発揮に有利であることがわかる。
本発明に係る免疫細胞は上記キメラ抗原受容体以外のもう1種類のキメラ抗原受容体を発現してもよいが、当該受容体はCD3ζを含まないが、CD28の細胞内シグナルドメイン、CD137の細胞内シグナルドメインまたはこの両者の組み合わせを含む。
【００４０】
本発明に係る免疫細胞はケモカイン受容体を発現してもよい。前記のケモカイン受容体はCCR2を含むが、これに限定されない。当業者には、前記のCCR2ケモカイン受容体は体内のCCR2を競合的結合させることができ、腫瘍転移の阻止に有利であることがわかる。
本発明に係る免疫細胞はPD-1の発現を低下させるsiRNAまたはPD-L1を遮断するタンパク質を発現してもよい。当業者には、競合的にPD-L1とその受容体PD1の相互作用を遮断し、抗腫瘍T細胞反応の回復に有利であるため、腫瘍の生長を抑制することがわかる。
本発明に係る免疫細胞は安全スイッチを発現してもよい。好ましくは、前記の安全スイッチは誘導性カスパーゼ9（iCaspase-9）、短縮型EGFR（Truancated EGFR）またはRQR8を含む。
【００４１】
＜免疫複合体＞
また、本発明は、本明細書に記載の抗体および少なくとも1つのほかの種類の機能性分子を含む多機能免疫複合体を提供する。前記の機能性分子は、腫瘍表面マーカーを標的とする分子、腫瘍を抑制する分子、免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子または検出可能な標識物から選ばれる機能性分子とを含むが、これらに限定されない。前記抗体と前記機能性分子は共役結合、カップリング、付着、架橋などの形態で複合体を構成してもよい。
【００４２】
一つの好適な形態として、前記免疫複合体は、本発明の抗体および少なくとも1つの腫瘍表面マーカーを標的とする分子または腫瘍を抑制する分子を含んでもよい。前記の腫瘍を抑制する分子は抗腫瘍サイトカインまたは抗腫瘍毒素でもよく、好ましくは、前記のサイトカインはIL-12、IL-15、IFN-β、TNF-αを含むが、これらに限定されない。前記の腫瘍表面マーカーを標的とする分子は、たとえば本発明の抗体と協同作用し、より精確に腫瘍細胞を標的としてもよい。
【００４３】
一つの好適な形態として、前記免疫複合体は、本発明の抗体および検出可能な標識物を含んでもよい。前記の検出可能な標識物は、蛍光標識物、呈色標識物を含むが、これらに限定されず、たとえば酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、陽電子放出金属や非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。1つ以上の標識物を含んでもよい。検出および/または分析および/または診断のために標識抗体に使用される標識は、使用される検出/分析/診断の技術および/または方法、たとえば免疫組織化学染色（組織）サンプル、フローサイトメトリーなどによるものである。本分野で既知の検出/分析/診断の技術および/または方法に適する標識は当業者に熟知のものである。
【００４４】
一つの好適な形態として、前記免疫複合体は、本発明の抗体および免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子を含んでもよい。前記免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子は免疫細胞を識別することができ、本発明の抗体を免疫細胞に持っていき、同時に本発明の抗体は免疫細胞が腫瘍細胞を標的とするようにさせることによって、免疫細胞が特異的に腫瘍を殺傷するようにすることができる。
【００４５】
直接または間接に（たとえばリンカーで）複合させて化学的に免疫複合体を形成する形態の一つとして、前記免疫複合体は本発明の抗体および適切なほかのタンパク質を含む融合タンパク質として生成してもよい。融合タンパク質は本分野で既知の方法によって生成することができ、たとえば核酸分子を構築して前記核酸分子を発現させることによって組み換えて生成し、前記核酸分子は読み枠に合う抗体をコードするヌクレオチド配列および適切な標識をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００４６】
本発明のもう一つの側面では、本発明の少なくとも一つの抗体、その機能的バリアントまたは免疫複合体をコードする核酸分子を提供する。関連の配列を獲得すれば、組換え法で大量に関連配列を獲得することができる。この場合、通常、その配列をベクターにクローンした後、細胞に導入し、さらに通常の方法で増殖させた宿主細胞から関連配列を単離して得る。
【００４７】
さらに、本発明は、上述の適当なDNA配列及び適当なプロモーター或いは制御配列を含むベクターに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現するように、適当な宿主細胞の形質転換に用いることができる。宿主細胞は、原核細胞、例えば細菌細胞、或いは、低等真核細胞、例えば酵母細胞、或いは、高等真核細胞、例えば哺乳動物細胞でもよい。
【００４８】
＜医薬組成物＞
本発明の抗体、当該抗体を含む免疫複合体および遺伝子修飾された免疫細胞は医薬組成物または診断試薬の製造に使用することができる。前記の組成物は、有効量の前記抗体、免疫複合体または免疫細胞以外、薬学的に許容される担体を含んでもよい。用語「薬学的に允許される」とは、分子自体と組成物を適当に動物或いはヒトに投与する場合、不利な反応、アレルギー反応或いは他の不良反応が生じないことを指す。
【００４９】
薬学的に許容される担体またはその成分にできる一部の物質の具体的な例は、糖類、たとえば乳糖、ブドウ糖やショ糖、デンプン、たとえばコーンスターチやバレイショデンプン、セルロースおよびその誘導体、たとえばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースやメチルセルロース、トラガカントゴム粉末、麦芽、ゼラチン、タルク、固体潤滑剤、たとえばステアリン酸やステアリン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、植物油、たとえば落花生油、綿実油、ゴマ油、オリーブオイル、コーン油やカカオオイル、多価アルコール、たとえばプロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールやポリエチレングリコール、アルギン酸、乳化剤、たとえばTween（登録商標）、湿潤剤、たとえばドデシル硫酸ナトリウム、着色剤、調味剤、打錠剤、安定剤、酸化防止剤、防腐剤、発熱性物質除去蒸留水、等張塩溶液、およびリン酸塩緩衝液などがある。
【００５０】
本発明の組成物は、必要により各種の剤形に調製することができ、かつ医者が患者の種類、年齢、体重及び基本病状、投与形態などの要素によって患者に有益な投与量を決めて使用することができる。投与形態は、たとえば注射またはほかの治療形態を使用してもよい。
【００５１】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばJ.  Sambrookら編著、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」、第三版、科学出版社、2002年に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。
【００５２】
＜実施例1．メソテリン安定発現細胞系の構築＞
1.1  プラスミドベクターの構築
本実施例で使用されたベクターシステムは、第三世代の自己不活性化レンチウイルスベクターシステムに属し、当該システムは計3つのプラスミド、すなわちタンパク質Gag/Pol、VSV-Gタンパク質をコードするパッケージングプラスミドPMD2.Gおよび空ベクターpPWT（Addgene社から購入）に基づいた目的遺伝子のヒトメソテリンの細胞外領域と膜貫通領域をコードする組換えベクターpWPT-MSLNを有する。
【００５３】
Genbank登録番号NM_005823に準じ、ブリッジPCRに基づいた遺伝子合成方法を使用し、シグナルペプチド、フラッグタグ、ヒトメソテリンの細胞外領域と膜貫通領域を含む目的遺伝子断片（配列番号1（ヌクレオチド）、2（アミノ酸））を合成し、プライマー対のpWmslnF(配列番号3、GCTTACGCGTCCTAGCGCTACCGGTCGCCACC ATGAGGGCCTGGATC)およびpWmslnR(配列番号4、CGAGGTCGAC CTAGGCCAGGGTGG AGGCTAGGAGCAGTGCCAGGACGG)でPCR増幅を行い、増幅条件は予備変性：94℃、4min、変性：94℃、30s、アニーリング：58℃、30s、伸長：68℃、80sで、30サイクルを行った。得られる断片の理論上のサイズは1113 bpで、増幅産物はアガロースゲル電気泳動によって理論上のサイズと一致することが確認された。ここで、読み枠の上・下流にMluIおよびSalIの酵素切断サイトが導入された。上記で得られた目的遺伝子はMluIおよびSalIで二重酵素切断し、同様に二重酵素切断されたpWPTベクターにライゲーションし、構築に成功したレンチウイルスベクターpWPT-MSLNは、MluIおよびSalIの酵素切断によって同定され、そして配列決定によって精確と確認されたらレンチウイルスのパッケージングを行った。
【００５４】
1.2  プラスミドの293T細胞への形質移入およびレンチウイルスのパッケージング
6〜10代目まで培養した293T細胞（ATCC：CRL-11268）を10 cmシャーレに6×106の密度で接種し、37℃、5％ CO2で一晩培養し、トランスフェクションへの使用に備えた。培地は10％牛胎児血清（Sigma社）含有DMEM（Invitrogen社）で、翌日、トランスフェクションの約2時間前に、培養液を無血清DMEMに変えた。
【００５５】
形質移入の手順は以下の通りである。
1）  5 μgの目的遺伝子プラスミドpWPT-MSLNを、それぞれ7.5 μgのパッケージングプラスミドPAX２および2.5 μgのエンベローププラスミドpMD2.Gとともに500 μLのMillQ水に溶解させ、均一に混合した。
2）  62 μLの2.5M CaCl2（Sigma社）を一滴ずつ入れ、1200 rpm/minで均一に渦流混合した。
3）  最後に500 μLの 2×HBS（280mM NaCl、10mM KCl、1.5mM Na2HPO4-、12mMブドウ糖、50mM Hepes（Sigma 社）、pH 7.05、0.22 μMろ過除菌）を一滴ずつ入れ、1200 rpm/minで10s振とうして均一に混合した。
4）  直ちにシャーレに一滴ずつ入れ、軽く均一に振とうし、37℃、5％ CO2で4〜6 h培養した後、10％牛胎児血清含有DMEMに変えた。
形質移入から48 hまたは72 h後、遠心で細胞破片を除去した後、0.45 μmフィルター（Millipore社）でろ過してウイルスを収集した。
【００５６】
1.3  PANC-1細胞への組み換えレンチウイルスの感染
上記収集されたウイルス液を濃縮して滴定した後、それぞれ6 cmの平皿に敷いたPANC-1細胞（ATCCから購入）に感染させた。感染3日後、細胞を収集し、一部を取ってクローンを混合し、細胞分解液で分解させた後、40 μgの細胞のタンパク質を取ってSDS-PAGEゲル電気泳動を行った後、電気泳動ゲルに対してイムノブロットを行い、かつマウス抗フラッグタグ抗体で染色した。PBSで洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヒツジ抗マウス抗体でインキュベートし、洗浄後ECL試薬で呈色させ、最後に現像した。ウェスタンブロッティングの結果から、ヒトメソテリンMSLNに感染したPANC-1細胞（すなわちPANC-1-MSLN）では分子量の大きさが約38 kDaのバンドが検出され、未感染の空細胞では相応するバンドが検出されなかったことが示された。ほかの細胞を増幅培養した後、一部を冷凍保存し、そして次の実験に使用した。
【００５７】
＜実施例2．ヒトメソテリン抗原の製造＞
Genbank登録番号NM_005823に準じ、ブリッジPCRに基づいた遺伝子合成方法を使用し、ヒトメソテリンの遺伝子断片（配列番号1の88〜942番目（ヌクレオチド）、配列番号12の30〜314番目（アミノ酸））を合成し、かつPCR増幅を行った。増幅産物をNheI/BglIIでプラスミドベクターpCMV-V5(当該ベクターはマルチクローニングサイトの下流に発現6Hisタグが融合され、上海鋭勁生物技術有限公司から購入)に挿入し、かつ宿主菌TOP10に形質転換し、クローンを選択してPCRで陽性クローンを同定して配列決定で確認し、組換え発現プラスミドそれぞれV5-MSLNを得た。
【００５８】
上記発現プラスミドを良好に生長するHEK-293F細胞に形質移入し、37℃、5％CO2、125rpmでシェーカーで7日連続培養し、4000rpmで10min遠心し、沈殿を除去し、上清を収集し、かつ0.45 μmろ膜でろ過し、処理されたサンプルをHisTrap(GEから購入)アフィニティークロマトグラフィーカラムによって精製し、最終的に精製されたヒトメソテリンタンパク質を得たが、同定結果を図1に示す。
【００５９】
＜実施例3．ヒトメソテリン一本鎖抗体の選別＞
3.1  ファージディスプレイに基づいたヒトメソテリンと特異的に結合する抗体の選別
ファージディスプレイ技術によって、完全ヒト由来抗体ライブラリーからヒトメソテリン特異的抗体を選別した。この目的のために、400 mlの2×YT/アンピシリン培地にファージディスプレイ完全ヒト由来一本鎖抗体天然ライブラリーのグリセロールストック（上海鋭勁生物技術有限公司から購入）を接種し、細胞密度をOD600 = 0.1にし、37℃および200 rpmの条件で細胞密度がOD600 = 0.5になるように振とう培養した。 1012 pfuのM13KO7補助ファージ（Invitrogenから購入）で感染させ、30℃および50 rpmの条件で30分間培養した。50 mg/lのカナマイシンを入れた後、37℃および200 rpmの条件で30分間振とう培養した後、遠心(15分間、1600×g、4℃)で分離して沈殿させ、400 mlの2×YT/アンピシリン/カナマイシン培地に再懸濁させ、37℃および200 rpmの条件で16時間振とう培養した。最後に、細胞を遠心(20分間、5000×g、4℃)で分離して沈殿させてから除去し、上清を規格0.45 μmのろ膜でろ過した後、1/4体積20％(w/v)PEG8000、2.5 M NaCl溶液を入れて氷浴で1時間保温してファージ顆粒を沈殿させた。その後、遠心して沈殿させ(20分間、8000×g、4℃)、上清を捨て、ファージを25 mlの予め冷やしたPBS(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na2HPO4、2 mM KH2PO4)に再懸濁させ、遠心した(5分間、20000×g、4℃)。上清液に1/4体積20％(w/v)PEG8000、2.5 M NaCl溶液を入れ、かつ氷浴で30分間ファージ顆粒を再沈殿させた。遠心して沈殿させ(30分間、20000×g、4℃)、再びファージ沈殿を2 mlの予め冷やしたPBSに再懸濁させ、氷上に30分間置いて遠心した(30分間、17000×g、4℃)。上清液を含4％(w/v)BSA含有PBS溶液と1:1で混合させ、回転混合器に置き、室温で30分間保温した後、そのまま選別に使用した。
【００６０】
上記ファージ抗体ライブラリーを使用し、ビオチンで標識されたヒトメソテリン組換えタンパク質に対し、4回の指向選別を行ったが、選別のプロトコールは以下の通りである。当該ファージライブラリーとビオチンで標識された抗ヒトメソテリンを室温で2時間保温した後、ブロッキング液である2％(w/v)BSA(ウシ血清アルブミン)でブロッキングされたストレプトアビジン磁気ビーズMyOne C1(Invitrogenから購入)と室温で30分間保温した。その後、PBST(0.1％ツイン-20含有)緩衝液で磁気ビーズを洗浄し、非特異的に結合するファージまたは結合能力の弱いファージを除去した。結合能力の強いファージは、グリシン-塩酸(pH 2.2)でビーズから溶離し、Tris中和液(pH 9.1)で中和した後、対数増殖中期にある大腸菌ER2738に感染させ、そして次の選別に使用された。上記4回の選別において、ビーズの使用量はそれぞれ50μl、20μl、10μlおよび10μlで、ビオチンで標識されたヒトメソテリン濃度はそれぞれ100nM、10nM、5nMおよび1nMで、PBSTの洗浄回数はそれぞれ10回、10回、15回および20回であった。
【００６１】
3.2  ヒトメソテリンと特異的に結合する抗体の同定
4回目の選別で得られたクローンからランダムに96個を選択し、かつ単一ファージELISA(酵素結合免疫吸着実験)によってそのヒトメソテリンとの結合能力を分析した。この目的のために、96ウェルディープウェルプレートにおいて各単一集落を300 μlの2×YT/アンピシリン培地(2％ブドウ糖含有)に接種し、かつ37℃および250 rpmで16時間振とう培養した。20 μlの培養物を500 μlの2×YT/アンピシリン培地(0.1％ブドウ糖含有)に接種し、37℃および250 rpmで1.5時間振とう培養した。補助ファージ溶液を用意し、75 μlのM13KO7(力価：3×1012 pfu/ml)を取って15 mlの2×YT培地に混合し、50 μl/ウェルでプレートに入れた。37℃および150 rpmの条件で30分間培養した後、用意されたカナマイシン溶液を50 μl/ウェルで入れ(180 μlの50 mg/mlカナマイシンを取って、15 mlの2×YT培地に入れた)、37℃および250 rpmで16時間振とう培養した。最後に、細胞を遠心して沈殿させ(30分間、5000×g、4℃)、上清を新しい96ウェルディープウェルプレートに移した。
【００６２】
単一ファージELISAを行うため、96ウェルMediSorp ELISAプレート(Nuncから購入)においてそれぞれ100 ng/ウェルの抗原ヒトメソテリンおよび陰性対照であるタンパク質BSA（100 μl/ウェル）を使用し、4℃で一晩コーティングした。各ウェルを2％BSA(w/v)含有PBSTでブロッキングした。そしてPBSTでウェルを3回洗浄して洗浄液を捨てた。その後、100 μl/ウェルで以上で調製された各ファージ溶液をプレートにおける各ウェルに入れた。37℃で2時間保温した後、PBSTで3回洗浄した。結合したファージを検出するため、抗M13抗体-スーパーオキシドディスムターゼ抱合体(GE Healthcareから購入)を1:5000でPBSTに希釈し、かつ100 μl取って各ウェルに入れた。37℃で1時間保温した後、PBSTで3回洗浄し、さらにPBSで3回洗浄した。最後に、50 μlのTMB基質を吸い取ってウェルに入れ、かつ室温で10分間呈色させた後、各ウェルに50 μlの2M H2SO4を入れて呈色反応を止めた。酵素結合免疫測定装置(Bio-Rad)によって450 nmで吸光値を測定した。配列決定分析と合わせると、二つの異なる一本鎖抗体P1A6E（配列番号5（ヌクレオチド）、6（アミノ酸））およびP3F2（配列番号7（ヌクレオチド）、8（アミノ酸））が観察され、ELISA実験ではヒトメソテリン（hu-mesothelin）に対する結合シグナルは強く、BSAに対して結合しなかった（図2）。
【００６３】
配列番号：5（ヌクレオチド）
caggtacagctggaacagtcaggtctaggactggtgaagccctcgcagaccctctctctcacctgtgccatctccggggacactgtctctagcgacagtgctgcttggaactggatcaggcagtccccatcgagaggccttgagtggctgggaaggacatactacaggtccaagtggtttaatgattatgcagtatctgtgaaaggtcgaataaccatcaactcagacacatccaagaaccagttctccctgcagttgaactctgtgactcccgaggacacggctgtgtattattgtgcaagaagtaatagttactactactacgctatggacgtctggggccaaggcaccctggtcaccgtctcgagtggtggaggcggttcaggcggaggtggttctggcggtggcggatcgcaggctgtgctgactcagccgtcttccctctctgcatctcctggagcatcagccagtctcacctgcaccttgcgcagtggcatcaatgttggtatctacaggatatactggtaccaacagaggccagggagtcctccccagattctcctgacttacaaatcagactcagataagtaccagggctctggagtccccagtcgcttctctggatccaaagatgcttcggccaatgcagggattttactcatctctgggctccagtctgaagatgaggctgactattactgcatgatttggcacagcggcggttgggtgttcggcggagggaccaaggtcaccgtcctaggt
【００６４】
配列番号：6（アミノ酸）
QVQLEQSGLGLVKPSQTLSLTCAISGDTVSSDSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWFNDYAVSVKGRITINSDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSNSYYYYAMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVLTQPSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGIYRIYWYQQRPGSPPQILLTYKSDSDKYQGSGVPSRFSGSKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCMIWHSGGWVFGGGTKVTVLG
ここで、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号6のうちの1〜123番目で示され、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号6のうちの139〜254番目で示される。
【００６５】
ここで、軽鎖のCDR1のアミノ酸配列はTLRSGINVGIYRIY(配列番号51)で、軽鎖のCDR2のアミノ酸配列はYKSDSDKYQGS(配列番号52)で、軽鎖のCDR3のアミノ酸配列はMIWHSGGWV(配列番号53)で、重鎖のCDR1のアミノ酸配列はGDTVSSDSAAWN(配列番号54)で、重鎖のCDR2のアミノ酸配列はRTYYRSKWFNDYAVSVKG(配列番号55)で、重鎖のCDR3のアミノ酸配列はSNSYYYYAMDV(配列番号56)である。
【００６６】
配列番号：7（ヌクレオチド）
cagatgcagctagtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacgtccacgagcacagtctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagtagtcggagtgggactacggtggtaaatcatgatgcttttgatatctgggggaaagggaccacggtcaccgtctcgagtggtggaggcggttcaggcggaggtggttctggcggtggcggatcggacatccagttgacccagtctccatcctccctgtctgcgtctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagccaggtcattagccgtgctttagcctggtatcaacaaacaccagggaaacctcctaaactcctgatctatgatgcctccaatttgcagagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagccgcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtcaacagtttaatagttaccctctcactttcggcggagggaccaagctggagatcaaacgt
【００６７】
配列番号：8（アミノ酸）
QMQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCASSRSGTTVVNHDAFDIWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQVISRALAWYQQTPGKPPKLLIYDASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKLEIKR
ここで、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号8のうちの1〜124番目で示され、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号8のうちの140〜247番目で示される。
【００６８】
ここで、軽鎖のCDR1のアミノ酸配列はRASQVISRALA(配列番号57)で、軽鎖のCDR2のアミノ酸配列はDASNLQS(配列番号58)で、軽鎖のCDR3のアミノ酸配列はQQFNSYPLT(配列番号59)で、重鎖のCDR1のアミノ酸配列はGYTFTSYYMH(配列番号60)で、重鎖のCDR2のアミノ酸配列はIINPSGGSTSYAQKFQG(配列番号61)で、重鎖のCDR3のアミノ酸配列はSRSGTTVVNHDAFDI(配列番号62)である。
【００６９】
＜実施例4．一本鎖抗体とモノクローナル抗体の製造＞
4.1．ヒトメソテリン一本鎖抗体の製造
プライマー対のV5-P1A6E-F(配列番号9)およびV5-P1A6E-R(配列番号10)で得られたクローンからscFv-P1A6E断片を増幅し、プライマー対のV5-P3F2-F(配列番号11)およびV5-P3F2-R(配列番号12)でscFv-P3F2断片を増幅し、NheI/BamHIで二重酵素切断し、T4 DNAリガーゼで同様にNheI/BamHIで二重酵素切断されたベクタープラスミドpCMV-V5-Fc(当該ベクターはマルチクローニングサイトの下流にヒト抗体IgG1を発現するFc断片が融合され、以下V5-Fcと略し、上海鋭勁生物技術有限公司から購入)と連結し、かつ宿主菌TOP10に形質転換し、クローンを選択してPCRで陽性クローンを同定して配列決定で確認し、それぞれV5-scFv-P1A6E-FcおよびV5-scFv-P3F2-Fc真核発現プラスミドを得た。
【００７０】
配列番号9：ACAGTGCTAGCACAGGTACAGCTGGAACAG；
配列番号10：TTGTCGGATCCACCTAGGACGGTGACC；
配列番号11：ACAGTGCTAGCACAGATGCAGCTAGTGC；
配列番号12：TTGTCGGATCCACGTTTGATCTCCAGC。
上記発現プラスミドをそれぞれ良好に生長するHEK-293F細胞に形質移入し、37℃、5％CO2、125rpmでシェーカーで7日連続培養し、4000rpmで10min遠心し、沈殿を除去し、上清を収集し、かつ0.45 μmろ膜でろ過し、処理されたサンプルをprotein A(GEから購入)親和カラムによって親和精製し、最終的に精製された抗体-Fc融合タンパク質としてscFv-P1A6E-FcおよびscFv-P3F2-Fcを得たが、同定結果を図3に示す。
【００７１】
4.2  ヒトメソテリンモノクローナル抗体の製造
本実施例において、モノクローナル抗体の発現は二プラスミド系を使用し、それぞれ抗体の重鎖可変領域の遺伝子をヒトIgG1 CH遺伝子を含むpIHプラスミドに、抗体の軽鎖可変領域の遺伝子をヒトIgG1 CL遺伝子を含むpIKプラスミドに構築した（プラスミドは上海鋭勁生物技術有限公司から購入）。
【００７２】
プライマー対のP1A6E-HF(配列番号13、gcctttcctggtttcctgtctcaggtacagctgg aacagtc)およびP1A6E-HR(配列番号14、GATGGGCCCTTGGTGGAGGCACTCG AGACGGTGACCAG)で鋳型プラスミドV5-scFv- P1A6E-FcからVH-P1A6E断片を増幅した。プライマー対のHF1F(配列番号15、ggctaactagagaacccactgc)およびHF1R(配列番号16、AGACAGGAAACCAGGAAAGGC)で鋳型プラスミドpIHからHF1断片を、プライマー対のHF3F(配列番号17、gcctccaccaagggcccatc)およびHF3R(配列番号18、gacaatcttagcgcagaagtc)で鋳型プラスミドpIHからHF3断片を増幅した。三つの断片を等モル比で混合した後アセンブリしてPCRを行い、断片を回収した後制限酵素NheI/NotIで二重酵素切断し、T4 DNAリガーゼで同様にNheI/NotIで二重酵素切断されたベクタープラスミドpIHと連結し、かつ宿主菌TOP10に形質転換し、クローンを選択してPCRで陽性クローンを同定して配列決定で確認し、pIH-P1A6E真核発現プラスミドを得た。同様の方法でpIH-P3F2真核発現プラスミドも得た。
【００７３】
pIK-P1A6E真核発現プラスミドを得るために、プライマー対のP1A6E-LF(配列番号19、ctttggtttccaggtgcaagatgtcaggctgtgctgactcag)およびP1A6E-LR(配列番号20、GAAGACAGATGGT GCAGCCACCGTACCTAGGACGGTGACCTTG)で鋳型プラスミド5-scFv- P1A6E-FcからVL-P1A6E断片を、プライマー対のLF1F(配列番号21、ggctaactagagaacccactgc)およびLF1R(配列番号22、ACATCTTGCACC TGGAAACCAAAG)で鋳型プラスミドpIKからLF1断片を、プライマー対のLF3F(配列番号23、acggtggctgcaccatctgtcttc)およびLF3R(配列番号24、GACAATCTTAGCGCAGAAGTC)で鋳型プラスミドpIKからLF3断片を増幅した。三つの断片を等モル比で混合した後アセンブリしてPCRを行い、断片を回収した後制限酵素EcoRV/NotIで二重酵素切断し、T4 DNAリガーゼで同様にEcoRV/NotIで二重酵素切断されたベクタープラスミドpIKと連結し、かつ宿主菌TOP10に形質転換し、クローンを選択してPCRで陽性クローンを同定して配列決定で確認した。同様の方法でpIK-P3F2真核発現プラスミドも得た。
【００７４】
発現プラスミドpIH-P1A6EおよびpIK-P1A6Eを等モルで混合し、pIH-P3F2およびpIK-P3F2を等モルで混合し、それぞれ良好に生長するHEK-293F細胞に形質移入し、37℃、5％CO2、125rpmでシェーカーで7日連続培養し、4000rpmで10min遠心し、沈殿を除去し、上清を収集し、かつ0.45 μmろ膜でろ過し、処理されたサンプルをprotein A(GEから購入)親和カラムによって親和精製し、最終的に精製された組換えモノクローナル抗体P1A6EおよびP3F2を得たが、同定結果を図4に示す。
【００７５】
＜実施例5．ヒトメソテリン抗体の親和性＞
P7D4系列の抗体とヒトメソテリンの結合を定量的に分析するために、Biacore T200システム(GEから購入)で捕獲法によってそれぞれP1A6EとP3F2の一本鎖抗体およびモノクローナル抗体の親和性および動態学のパラメーターを測定した。メーカーの説明に従い、NHS/EDCカップリングで第1級アミノ基によって抗ヒトIgG(Fc)の抗体(GEから購入)をセンサーチップCM5のカルボキシメチルグルカンの表面にカップリングした。測定は25℃、30μl/min、 1×HBS-EP+使用緩衝液において行われ、再生条件は3 M MgCl2、10μl/minで30秒作用するものである。各測定サイクルにおいて、測定される抗体はまずチップに捕獲され、所定濃度の分析物（ヒトメソテリン）にチップの表面を通させ、SPRシグナルが発生するため、ヒトメソテリンと捕獲された抗体の相互作用が検出される。検出シグナルはレゾナンスユニット（RU）と定義され、時間（単位：秒）に対してプロットし、相応する結合曲線および解離曲線を得ることができた。別の測定サイクルにおいて、ヒトメソテリンの濃度はそれぞれ10nM、20nM、40nM、80nMおよび160nMであった。Biacore T200 evaluation softwareによって得られた作用曲線を評価し、かつ親和性のKD値を計算した。図5および図6はそれぞれモノクローナル抗体P1A6EとP3F2のBiacore親和性測定実験における動態学曲線を示す。P1A6EとP3F2の一本鎖抗体とモノクローナル抗体のそれぞれのヒトメソテリンに対する結合のデータを表1にまとめた。
【００７６】
【表１】
2018529327.tif 000002
【００７７】
＜実施例6．ヒトメソテリンの細胞結合特性（一本鎖抗体およびモノクローナル抗体）＞
蛍光活性化細胞選別装置(FACS) (Guava 8HT、Millipore社によって提供)によって抗体scFv-P1A6E-FcおよびscFv-P3F2-Fcのそれぞれの細胞表面のメソテリンとの結合能力を分析した。
【００７８】
具体的な方法は以下の通りである。
1) 対数増殖期の細胞PANC-1-MSLNおよびPANC-1をそれぞれ6 cmシャーレに接種し、接種の細胞密度が約90％で、37℃のインキュベーターで一晩培養した。
2) 10 mMのEDTAで細胞を消化し、200 g×5 minで遠心して細胞を収集した。1×106〜1×107/mLの濃度で1％ウシ胎児血清含有リン酸塩緩衝液（NBS PBS)に再懸濁させ、100 μl/管の量でフローサイトメーター専用管に入れた。
3) 200 g×5 minで遠心し、上清を捨てた。
4) 2つの実験群はそれぞれ被験抗体P1A6EおよびP3F2を入れ、同時に2つの陽性対照群は抗体ssおよびC10（上海鋭勁生物技術有限公司から購入）を陽性対照として入れ、もう1つの対照群は抗体が入っていないPBSブランク対照である。各抗体の最終濃度はいずれも20 μg/mlで、各管に100ulずつ入れた。氷浴で45分間置いた。
5) 各管に1％NBS/PBSを2mlずつ入れ、200 g×5 minで遠心し、計二回行った。
6) 上清を捨て、1:100で希釈したヒツジ抗ヒト抗体-FITC（上海業力生物科技有限公司から）を各管に100 μlずつ入れた。氷浴で45分間置いた。
7) 各管に1％NBS/PBSを2mlずつ入れ、200 g×5 minで遠心し、計二回行った。
8) 上清を捨て、300 μlの1％NBS PBSに最懸濁させ、フローサイトメーターで検出した。
9) フローサイトメーターのデータ解析ソフトFlowjo7.6でデータを解析した。
【００７９】
フローサイトメトリー分析の結果から、4種類の抗体P1A6EとP3F2、および対照抗体SSとC10は、一本鎖抗体の形態(図7)でもモノクローナル抗体の形態(図8）でも、その蛍光ピークはPANC-1-MSLN細胞においてブランク対照(PBS)と比べて顕著な差があり(図7B、図8B)、PANC-1細胞において顕著な差がなく(図7A、図8A)、いずれも特異的にヒトメソテリンを安定して発現するPANC-1-MSLN細胞を認識することができたが、ヒトメソテリン発現陰性のPANC-1細胞と結合しなかったことが示され、この4つの抗体が特異的にヒトメソテリンを認識することができることがわかる。抗体P1A6EとP3F2の蛍光ピークは顕著に対照抗体SSとC10よりも強く、P1A6EとP3F2のPANC-1-MSLN細胞に対する結合効率はSSとC10よりも高いことが示された。
【００８０】
＜実施例7．ヒトメソテリン抗体を含有するCARTの製造＞
キメラ抗原受容体を構築し、本発明で例示されたキメラ抗原受容体の各部分の連結順は表2に示す。
【表２】
2018529327.tif 000003
【００８１】
本実施例で使用されたレンチウイルスプラスミドベクターシステムは、第三世代のレンチウイルス四ベクターシステムに属し、当該システムは計4つのプラスミド、すなわちVSV-Gタンパク質をコードするパッケージングプラスミドpCMV-VSV-G（addgeneから購入）、Revタンパク質をコードするパッケージングプラスミドpRSV-Rev（addgeneから購入）、GalおよびPolをコードするpMDLg/pRRE（addgeneから購入）および空ベクターpRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE（addgeneから購入）に基づいた目的遺伝子CARをコードする組換え発現ベクターを有する。すべてのCARの遺伝子ベクターのプロモーターはいずれもすでに公開された特許201310164725.Xにおけるベクターにある伸長因子-1α(elongation factor-1α、EF-1α)を利用した。構築の具体的な方法は以下の通りである。
【００８２】
(1) プロモーター断片の獲得：特許201310164725.XにおけるベクターpWPT-eGFP-F2A-CAR、プライマーpwpxlF(配列番号25、5’-gcaggggaaagaatagtaga ca-3’)およびpWPT-MluIR(配列番号26、5’-aggccagcggcaggagcaaggcggtcactggta aggccatggtggcgaccggtagc-3’)を利用し、PCR増幅によってプロモーターEF-1αを有する断片を得た。
(2) 目的CAR断片の獲得：それぞれ前記で得られたV5-scFv- P1A6E -FcおよびV5-scFv- P3F2-Fcを鋳型として利用し、プライマーP1A6E-F(配列番号27、5’-ctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgcaggtacagc tggaaca-3’)およびプライマーの配列番号28のP1A6E-R(5’-gcggcgctggcgtcgtggtacctaggacggtgacc-3’)、プライマーP3F2-F (配列番号29、5’ ctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgcagatgcagctagt gca-3’)およびP3F2-R (配列番号30、5’ gcggcgctggcgtcgtggtacgtttgatctccag-3’)で、目的CAR断片のP1A6E部分およびP3F2部分を増幅した。
(3) PCRによるCARの第一世代、第二世代、第三世代の共有配列および陰性対照配列の獲得：それぞれ特許201310164725.XにおけるpWPT-eGFP-F2A-GPC3-δZ、 pWPT-eGFP-F2A-GPC3-Z、pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28Z、pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28BBZを鋳型とし、プライマーHF(配列番号63、5’ accacgacgccagcgccgcgaccac)およびプライマーpwpxlR(配列番号64、5’- tagcgtaaaaggagcaacatag)で、それぞれ断片CD8-CD3δ ゼータ(δZ)、CD8-CD3 ゼータ(Z)、CD28a-CD28b-CD3 ゼータ(28Z)およびCD28a-CD28b-CD137-CD3 ゼータ(28BBZ)の配列を得た。
(4) 特許US 8,911,993 B2(COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF CANCER)におけるBBZ配列を参照し、ブリッジPCRに基づいた遺伝子合成方法を使用し、共有配列CD8-CD137-CD3 ゼータ(BBZ)断片の部分を合成した。
【００８３】
(5) 上記で得られたプロモーター断片、目的CAR断片に対してそれぞれ共有配列断片CD8-CD3δ ゼータ(δZ)、CD8-CD3 ゼータ(Z)、CD8-CD137-CD3 ゼータ(BBZ)、CD28a-CD28b-CD3 ゼータ(28Z)およびCD28a-CD28b-CD137-CD3 ゼータ(28BBZ)配列部分と通常のブリッジを行った後、さらにプライマーpwpxlFおよびpwpxlRで増幅し、EF-1αおよび目的遺伝子CATの断片を得たが、それぞれ
P1A6E-δZ (配列番号31)、
P1A6E-Z (配列番号32)、
P1A6E-BBZ (配列番号33)、
P1A6E-28Z (配列番号34)、
P1A6E-28BBZ (配列番号35)、
P3F2-δZ (配列番号36)、
P3F2-Z (配列番号37)、
P3F2-BBZ (配列番号38)、
P3F2-28Z (配列番号39)、
P3F2-28BBZ (配列番号40)という。
【００８４】
(6)上記工程で得られたプロモーターおよび目的遺伝子CARを有する断片を、ClaIおよびSalIで二重酵素切断した後同じように酵素切断されたベクターpRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPREに連結することによって、各キメラ抗原受容体を発現するレンチウイルスベクターを構築した。構築できたベクターはMluおよびSalの酵素切断によって正確と同定し、配列決定によって確認したら、レンチウイルスのパッケージングへの使用に備えた。
得られた各目的CARを含有するベクターは以下の通りである。
pRRLSIN-EF1α-P1A6E-δZ、
pRRLSIN-EF1α-P1A6E-Z、
pRRLSIN-EF1α-P1A6E-BBZ、
pRRLSIN-EF1α-P1A6E-28Z、
pRRLSIN-EF1α-P1A6E-28BBZ、
pRRLSIN-EF1α- P3F2-δZ、
pRRLSIN-EF1α- P3F2-Z、
pRRLSIN-EF1α- P3F2-BBZ、
pRRLSIN-EF1α- P3F2-28Z、
pRRLSIN-EF1α- P3F2-28BB。
以上の構築によって、それぞれ10のCARポリペプチド配列を得たが、
P1A6E-δZ (配列番号41)、
P1A6E-Z (配列番号42)、
P1A6E-BBZ (配列番号43)、
P1A6E-28Z (配列番号44)、
P1A6E-28BBZ (配列番号45)、
P3F2-δZ (配列番号46)、
P3F2-Z (配列番号47)、
P3F2-BBZ (配列番号48)、
P3F2-28Z (配列番号49)、
P3F2-28BBZ (配列番号50)という。
【００８５】
＜293Tへのプラスミドの形質移入およびレンチウイルスのパッケージング＞
6〜10代目まで培養したHEK-293T細胞（ATCC：CRL-11268）を10 cmシャーレに6×106の密度で接種し、37℃、5％ CO2で一晩培養し、形質移入への使用に備えた。培地は10％牛胎児血清含有DMEMである。
形質移入の手順は以下の通りである。
A液の調製：10 μgの目的遺伝子プラスミドpRRLSIN-cPPT.EF-1α-CAR (pRRLSIN-EF1α-P1A6E-δZ 、pRRLSIN-EF1α-P1A6E-Z、pRRLSIN-EF1α-P1A6E-BBZ、pRRLSIN-EF1α-P1A6E-28Z、pRRLSIN-EF1α-P1A6E-28BBZ；pRRLSIN-EF1α- P3F2-Z、pRRLSIN-EF1α- P3F2-BBZ、pRRLSIN-EF1α- P3F2-28Z、pRRLSIN-EF1α- P3F2-28BBZから選ばれる)を、それぞれ7.5 μgのパッケージングプラスミドpMDLg RREとpRSV-REV、および3 μgのエンベローププラスミドpCMV-VSV-Gとともに、800 μLの無血清DMEM培養液に溶解させ、均一に混合した。
B液の調製：60μgのPEI(ポリエチレンイミン、Polysciencesから購入)を800μLの無血清DMEM培養液に溶解させ、軽く均一に混合し、室温で5minインキュベートした。
【００８６】
形質移入複合体の形成：A液をB液に入れて軽く混合し、入れた後すぐボルテックスで混合するか軽く均一に混合し、室温で20minインキュベートした。
1.6mLの形質移入複合体をHEK-293T細胞に滴下し、4〜5時間後、2％FBSのDMEM培地で形質移入の293T細胞の液置換を行った。
形質移入から72 h後、0.45 μmのフィルターでろ過してウイルスを収集し、その後Beckman Optima L-100XP超遠心機で28000 rpm、4℃で2時間遠心し、遠心上清を捨て、遠心で得られた沈殿を原液体積の1/10〜1/50のAIM-V培養液（Invitrogen社から購入）で再懸濁させ、100 μL/管で分注して-80℃で凍結保存し、ウイルスの滴定またはT細胞への感染に備えた。
【００８７】
＜実施例8．CTL細胞への組換えレンチウイルスの感染＞
健常者の末梢血から密度勾配遠心法によりヒト末梢血単核球（上海市血液センターから提供）を得、末梢血単核球からCTL細胞磁気ビーズ（Stem Cell Technologiesから購入）ネガティブ分離方法によってCTLを得、分離されたCTL細胞に対してフローサイトメトリーによってCTL細胞の純度を検出し、CTL細胞の陽性率≧95％のものが好適で、次の操作に進めた。Quantum 007リンパ球培地液（PAA社から購入）を約1×106/mLの密度で入れて培養し、且つ細胞：磁気ビーズの比率が1：1になるように抗CD3およびCD28抗体の両者で覆われた磁気ビーズ（Invitrogen社）と、最終濃度300 U/mLの組換えヒトIL-2（上海華新生物高技術有限公司から購入）を入れ、24 h刺激培養した。その後、MOI≒5になるように上記組換えレンチウイルスでCTLに感染させた。感染された細胞を一日おきに5×105/mLの密度で継代するとともに、リンパ球培養液に最終濃度300 U/mLの組換えヒトIL-2を追加した。
【００８８】
感染されたCTL細胞は、培養の8日目にフローサイトメトリーによって異なる各キメラ抗原受容体の発現を検出した。まず、感染後のCAR T細胞をビオチンで標識されたヒトメソテリン組換えタンパク質と37℃で1hインキュベートし、D-PBSで2回洗浄した後、PE-標識のストレプトアビジンを入れて37℃で40minインキュベートした。D-PBSで3回洗浄した後、フローサイトメーターによって陽性細胞の比率を検出した。感染されていないＴ細胞を陰性対照とし、異なるキメラ抗原受容体を発現するウイルスでCTL細胞を感染した陽性率は表3に示す。当該陽性率の結果から、レンチウイルス感染方法によってある程度の陽性率を有するCAR+ CＴL細胞が得られることが分かった。
【００８９】
【表３】
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【００９０】
CTL細胞は、それぞれ異なるキメラ抗原受容体でパッケージングされたウイルスにそれぞれ感染された後、細胞密度5×105/mlで一日おきに継代培養し、カウントし、そして継代した細胞培養液にIL-2を追加し（最終濃度300 U/ml）、培養の11日目に約20〜40倍増幅したが、異なるキメラ抗原受容体を発現するCTL細胞は体外である程度の増幅が可能であることが示され、その後の体外毒性試験および体内試験に保障を与えた。
【００９１】
＜実施例9．キメラ抗原受容体を発現するT細胞の体外毒性効果実験＞
体外毒性実験で使用された材料は以下の通りである。
表4に示されたメソテリン陰性膵臓がん細胞系(PANC-1)およびメソテリン遺伝子を形質移入されたPANC-1(PANC-1-MSLN)細胞系を標的細胞とし、エフェクター細胞は実施例4で検証された体外で12日間培養され、FACSによってキメラ抗原受容体の発現が検出された陽性細胞をキメラ抗原受容体陽性（CAR+）のCTLと記し、エフェクター細胞対標的細胞比は場合によってそれぞれ3：1、1：1および1：3とし、標的細胞数は10000個/ウェルとし、異なるエフェクター細胞対標的細胞比でエフェクター細胞を対応させた。各群ではいずれも重複ウェルを5つとし、5つの重複ウェルの平均値を取った。検出時間は18hであった。
【００９２】
ここで、各実験群および各対照群は以下の通りである。
各実験群：各標的細胞+異なるキメラ抗原受容体を発現するCTL。
コントロール群1：標的細胞最大放出LDH。
コントロール群2：標的細胞自発放出LDH。
対照群3：LDH自発放出のエフェクター細胞。
検出方法：CytoTox 96非放射性細胞毒性検出キット（Promega社）で行われた。当該方法は比色法に基づいた検出方法で、51Cr放出法の代わりとして使用することができる。CytoTox 96R検出で定量的に乳酸脱水素酵素(LDH)を測定した。LDHは安定した細胞質酵素で、細胞が溶解する時に放出され、その放出形態は放射性解析における51Crの放出形態と基本的に同様である。放出されたLDH培地上清において、30分間カップリングする酵素反応によって検出することができ、酵素反応においてLDHは一種のテトラゾリド（INT）を赤色のホルマザン（formazan）に変換させることができる。生成した赤色産物の量は分解した細胞数に正比例した。具体的には、CytoTox 96非放射性細胞毒性検出キットの取扱説明書を参照する。
【００９３】
細胞毒性の計算式は以下の通りである。
【数１】
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【００９４】
具体的に、表4に示すように、本発明の抗メソテリンの一本鎖抗体（P1A6E、P3F2）のCARはいずれも顕著なメソテリン陽性膵臓がん細胞を殺傷する活性を有し、中では、第二世代および第三世代の抗メソテリンのCAR T細胞は第一世代よりも抗腫瘍活性がやや強かった。mock群では顕著な殺傷がなかった。また、すべてのCAR T細胞はいずれもメソテリン陰性のPANC-1膵臓がん細胞に殺傷活性がなかった。これらの結果から、本発明の抗メソテリンのCAR-T細胞（第一、二、三世代のCAR Tを含む）は選択的にメソテリン陽性の膵臓がん細胞に対し、有効な殺傷を行うことができることが示された。また、本発明の抗メソテリンの第一、二、三世代のCAR Tはメソテリン陽性腫瘍細胞にエフェクター細胞対標的細胞比勾配依存性を示し、すなわちエフェクター細胞対標的細胞比が高くなるほど、細胞の毒性作用が強くなる。
【００９５】
【表４】
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【００９６】
＜実施例10．ヒトメソテリン抗体のエピトープ分析＞
PCRによって配列番号1からヒトメソテリン遺伝子断片を増幅し、NheI/BamHIで二重酵素切断し、ヒトメソテリン遺伝子断片をネズミFc断片を含有する真核発現ベクターpCMV-V5-muFcに連結した。実施例4を参照してHEK-293F細胞に一過性形質移入を行い、細胞培養上清を処理した後protein G(GEから購入)親和カラムによって親和精製し、最終的に精製されたヒトメソテリン断片-muFc融合タンパク質を得た後、ELISAによって抗体scFv-P1A6E-FcおよびscFv- P3F2-Fcの結合を同定した。Genbank登録番号NP_001170826.1（配列番号65）を参照し、成熟のヒトメソテリンを領域R1（E296-T390、配列番号66）、領域R2（S391-Q486、配列番号67）、領域R3（N487-G581、配列番号68）と3つの領域に分け、ELISA結果から抗体scFv-P1A6E-FcおよびscFv- P3F2-Fcのいずれも領域1（E296-T390）だけと結合したことが示された。さらに領域1を5つの小さい断片に分け、それぞれmuFcと融合発現させた。領域R1A(296E-337D、配列番号69)、領域R1B(328D-369I、配列番号70)、領域R1C(360Y-405T、配列番号71)、領域R1AB(296E-359L、配列番号72)、R1BC(328D-405T、配列番号73)。ELISA結果は図9および図10に示すように、中では、抗体scFv-P1A6E-FcおよびscFv- P3F2-Fcは領域R1ABと顕著な結合があり、領域R1Aと弱い結合があり、領域R1Bと結合しなかった。
【００９７】
そのため、抗体scFv-P1A6E-FcおよびscFv- P3F2-Fcの結合部位はR1AとR1Bが重なった位置の近くにあるはずである。この領域は10個のアミノ酸の「DAALLATQMD」を含有し、この配列に基づいて両末端にそれぞれ10個のアミノ酸、または5個のアミノ酸で伸長させ、2つのペプチド断片のR1J10:「YKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYE(配列番号74)」およびR1J5:「LEACVDAALLATQMDRVNAI(配列番号75)」を形成してそれぞれmuFcと融合発現させて精製した。ELISA結果から、抗体scFv-P1A6E-FcおよびscFv- P3F2-FcがR1J10およびR1J5のいずれとも結合しなかったことが示された。以上の結果から、抗体scFv-P1A6E-FcおよびscFv- P3F2-Fcのエピトープが領域R1AB(配列番号72)にある立体配座エピトープのはずである。
【００９８】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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