(57)【要約】  臍帯血およびナイーブ免疫細胞を含む他の試料から、ウイルス特異的または他の抗原に特異的なＴ細胞を生産するための安全、迅速および効率的な方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞を生産する方法であって、以下を含む方法：
（ａ）臍帯血試料またはナイーブ免疫細胞を含む他の試料からの単核細胞を２つの部分に分け；
（ｂ）前記試料の第１の部分をＰＨＡまたは他のマイトジェン、および任意にＩＬ―２、と接触させ、ＡＴＣ（「活性化Ｔ細胞」）を生産し、該ＡＴＣを、その成長を阻害する放射線または他の剤で処理し；
（ｃ）Ｔ細胞およびＴ細胞前駆細胞（例えば、非付着細胞、ＣＤ３＋細胞）を、樹状細胞および樹状前駆細胞（例えば、非付着細胞、ＣＤ１１Ｃ＋またはＣＤ１４＋細胞）から分離し；
（ｄ）前記非付着細胞を凍結保存または他の手段で保存し；
（ｅ）前記第２の部分中の付着細胞を、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦまたは他のサイトカインおよび／もしくは樹状細胞を生成し成熟させる他の剤、ならびに少なくとも１種のＣＭＶペプチド抗原もしくは他のペプチド抗原と接触させて、少なくとも１種のペプチド抗原を提示する抗原提示樹状細胞を生産し、前記抗原提示樹状細胞をその成長を阻害するに十分な放射線または他の剤で処理し；
（ｆ）（ｄ）から得られた凍結保存または他の手段で保存された非付着細胞を、（ｅ）において生産された樹状抗原提示細胞とＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で接触させ、少なくとも１種のペプチド抗原を認識する、ウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞を生産し；
（ｇ）（ｆ）により生産されたウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞を、Ｋ５６２細胞または他のアクセサリー細胞の存在下での少なくとも１種のペプチド抗原の存在下、かつＩＬ−１５の存在下で、（ｂ）のＡＴＣと接触させ；任意に（ｇ）を１回以上繰り返し；
（ｈ）少なくとも１種のウイルスまたは他の種類のペプチド抗原を認識する、ウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞を回収し；および
（ｉ）任意に、前記抗原特異的Ｔ細胞を、それを必要とする対象に投与するか、または、前記抗原特異的Ｔ細胞を預けるかもしくは保存する。
【請求項２】
（ａ）の前に、さらに、臍帯血またはナイーブＴ細胞を含む他の試料から単核細胞を分離することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単核細胞が臍帯血から得られたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記単核細胞が少なくとも１種のウイルスまたは他のペプチド抗原にナイーブな幹細胞から得られたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記単核細胞が、その免疫系が少なくとも１種のウイルスまたは他のペプチド抗原にナイーブな対象からの幹細胞、前駆Ｔ細胞、またはＴ細胞を含む試料から得られたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
（ｂ）が、前記試料の第１の部分をＰＨＡおよびＩＬ−２と接触させてＡＴＣ（「活性化Ｔ細胞」）を生産することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
（ｂ）において、約１，０００，０００〜２０，０００，０００、好ましくは約５，０００，０００〜１５，０００，０００、最も好ましくは約８，０００，０００〜１２，０００，０００の単球臍帯血細胞をＰＨＡおよびＩＬ−２に接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
（ｂ）が、Ｔ−芽球、Ｂ−芽球，リンパ芽球細胞または、ＣＤ３−ＣＤ２８芽球の生産を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の部分を固体培地に、所定時間、前記第２の部分中の細胞が前記固体培地に付着するために十分な条件で接触させ、その後、Ｔ細胞およびＴ細胞前駆細胞を前記固体培地から除去し、前記固体培地に付着した樹状細胞および樹状前駆細胞を回収することにより、Ｔ細胞およびＴ細胞前駆細胞が樹状細胞および樹状前駆細胞から分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
（ｅ）において、前記樹状細胞および樹状前駆細胞を、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦからなる群から選択される少なくとも１種の樹状細胞生成サイトカインに接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
（ｅ）において、前記樹状細胞および樹状前駆細胞を、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦと共に、ＬＰＳ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＰＧＥ−１およびＰＧＥ−２からなる群から選択される樹状細胞成熟サイトカインまたは剤と接触させる、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
（ｆ）において、または（ｆ）の前に、前記樹状細胞および樹状前駆細胞を処理してＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を増殖する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
（ｆ）において、または（ｆ）の前に、前記樹状細胞および樹状前駆細胞を処理してＣＤ４５ＲＯ陽性細胞を枯渇させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１種のウイルスまたは他のペプチド抗原が一連のオーバーラッピングペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１種のウイルスまたは他のペプチド抗原が腫瘍関連もしくは腫瘍特異的抗原を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１種のウイルスまたは他のペプチド抗原が、ＰＲＡＭＥ、ＮＹＥＳＯ、ＭＡＧＥ  Ａ４、ＭＡＧＥ  Ａ３、ＭＡＧＥ  Ａ１、サバイビン、ＷＴ１、ニューロエラスターゼ（ｎｅｕｒｏｅｌａｓｔａｓｅ）、プロテイナーゼ  ３、ｐ５３、ＣＥＡ、クローディン６、ヒストン  Ｈ１、ヒストン  Ｈ２、ヒストン  Ｈ３、ヒストン  Ｈ４、ＭＡＲＴ１、ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＳＯＸ２、ＳＳＸ２、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｍｙｃ、およびＲａｓからなる群から選択される腫瘍関連もしくは腫瘍特異的抗原の決定基である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１種のウイルスまたは他のペプチド抗原がウイルスの決定基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１種のウイルスまたは他のペプチド抗原が、フィロウイルスの決定基、例えば、エボラウイルス由来のＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、またはＶＰ２４の決定基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１種のウイルスまたは他のペプチド抗原が、麻疹ウイルスの決定基、例えば、抗原Ｐ、Ｖ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｆ、Ｐ、またはＬの決定基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１種のウイルスまたは他のペプチド抗原が、ＣＭＶを含む日和見性のウイルス病原体からのウイルス抗原、新生児先天性または子宮内病原体、例えば、風疹、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、パルボウイルスＢ１９、水痘帯状疱疹（ＶＺＶ）、エンテロウイルス、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、ラッサ熱、および日本脳炎からのウイルス抗原；または、周産期もしくは新生児の病原体、たとえば、ヒト単純ヘルペス、ＶＺＶ、エンテロウイルス、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎またはＨＴＬＶ−１からのウイルス抗原に対応する一連のオーバーラッピングペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１種のウイルスまたは他のペプチド抗原が、ＣＭＶ抗原に対応する一連のオーバーラッピングペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１種のウイルスまたは他のペプチド抗原が、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）抗原またはアデノウイルス抗原に対応する一連のオーバーラッピングペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１種のウイルスまたは他のペプチド抗原が、日和見性または新興ウイルス病原体の複数のウイルス抗原からのペプチドまたは一連のペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１種のウイルスまたは他のペプチド抗原が、細菌抗原の決定基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１種のウイルスまたは他のペプチド抗原が、マイコバクテリウムの決定基、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓからのＥＳＡＴ６、ＨＬＰＭｔ、ＰＰＥ５、ＭＶＡ８５Ａ、ＡＧ８５、ＰＳＴＳ１、ＡＣＲ、ＨＳＰ６５、ＧｒｏＥＳ、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、ＭＰＢ７０の決定基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１種のウイルスまたは他のペプチド抗原が、真菌性、寄生性、または他の真核性の病原体の決定基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１種のウイルスまたは他のペプチド抗原が、哺乳動物の組織適合性抗原または他の哺乳動物抗原を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
（ｆ）において、（ｄ）からの前記非付着細胞を（ｅ）において作成された樹状抗原提示細胞に、（ｄ）：（ｅ）が１：１〜２００：１の範囲、好ましくは５：１〜１００：１の範囲、最も好ましくは５：１〜２０：１の範囲の比率で接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
（ｇ）が、さらに前記ウイルスまたは他のペプチド抗原に特異的なＴ細胞を、ＨＬＡ−陰性に改変されたＫ５６２細胞、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、及び／もしくは４−１ＢＢＬを発現するＫ５６２ｃｓ細胞、または他のアクセサリー細胞に接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
（ｇ）が、（ｆ）において製造された前記Ｔ細胞を、ＡＴＣおよびＫ５６８細胞に、Ｔ細胞とＡＴＣとの比率が１０：１〜１：１の範囲、好ましくは５：１〜２：１の範囲、および最も好ましくは約４：１で接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
さらに、（ｈ）において回収された前記ウイルスまたは他のペプチド抗原に特異的なＴ細胞について、ＩＬ−２の存在下で（ｇ）を繰り返すことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１に記載の方法により得られた、ウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞を含む組成物。
【請求項３３】
請求項１に記載の方法により得られたウイルスまたは他の抗原に特異的な生存Ｔ細胞が冷凍または他の手段で保存された複数の試料を含む、ウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞バンク。
【請求項３４】
請求項１に記載の方法により得られた、ウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、処置の方法。
【請求項３５】
前記対象が、前記のウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞と部分的に組織適合性である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記対象が、前記のウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞と完全に組織適合性である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記対象の免疫系が、前記ウイルス抗原特異的Ｔ細胞を製造するために使用したのと同一の臍帯血細胞または同一のナイーブ免疫細胞により再構築されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記対象が免疫不全の状態である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記対象の免疫系が除去され、またはリンパ球が枯渇している、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記対象が同種移殖または他の移植を受けている、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記対象の免疫系が、製造された前記ウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞により認識される抗原に対してナイーブである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
前記ウイルスもしくは他の抗原に特異的なＴ細胞がサイトメガロウイルス抗原もしくは抗原決定基を認識するか、または、前記ウイルスもしくは他の抗原に特異的なＴ細胞がエプスタインバーウイルスの抗原もしくはその抗原決定基を認識する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
前記ウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞がアデノウイルス抗原または抗原決定基を認識する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４４】
前記ウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞が、１種以上の日和見性のウイルス病原体の多重抗原または抗原決定基を認識する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４５】
前記ウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞が、ＣＭＶ、アデノウイルス、ＢＫウイルス、ヒトヘルペスウイルス−６（ＨＨＶ６）もしくは他のヘルペスウイルス、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、および水痘帯状疱疹ウイルスからなる群から選択される、日和見性のウイルス病原体の少なくとも１種のウイルス抗原を認識する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞が、院内もしくは医原的に獲得した、または、病院内の対象に伝達した（例えば、院内感染）日和見性のウイルス病原体の少なくとも１種の抗原を認識する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４７】
臍帯血またはナイーブ免疫細胞を含む他の試料から単離された単核細胞、ＰＨＡまたは他のマイトジェン、ＩＬ−２および前記細胞の生存を維持する培地、ならびに、任意に、Ｔ細胞を同時刺激するＫ５６２細胞または他の非自己細胞を含む組成物であって、ここで、任意に、前記細胞は増殖を妨げるように処理されている、組成物。
【請求項４８】
以下を含む組成物：
（ｉ）樹状細胞および樹状前駆細胞（例えば、付着細胞、ＣＤ１１Ｃ＋またはＣＤ１４＋細胞）から分離された、Ｔ細胞およびＴ細胞前駆細胞（例えば、非付着細胞、ＣＤ３＋細胞）、
（ｉｉ）ＩＬ−７およびＩＬ−１５、ならびに
（ｉｉｉ）前記Ｔ細胞およびＴ細胞前駆細胞の生存を維持する培地。
【請求項４９】
前記単核細胞、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞を、少なくとも１種のペプチド抗原に接触させ、またはそれで刺激した樹状細胞に接触させ、ここで、前記単核細胞、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞が前記少なくとも１種のペプチド抗原を認識する、請求項４７または４８に記載の組成物。
【請求項５０】
Ｔ細胞およびＴ細胞前駆細胞（例えば、非付着細胞、ＣＤ３＋細胞）から分離された樹状細胞および樹状前駆細胞（例えば付着細胞、ＣＤ１１Ｃ＋またはＣＤ１４＋細胞）、樹状細胞を生成および成熟させる少なくとも１種の剤、および前記細胞の生存を維持する培地を含み、ここで、任意に、前記細胞は１種以上のペプチド抗原に接触され、および、任意に増殖を妨げるように処理される、組成物。
【請求項５１】
請求項４７〜５１のいずれか１項に記載の前記組成物の１種以上の試料と貯蔵または冷凍培地との組み合わせを含む細胞バンクまたは細胞貯蔵施設であって、前記１以上の試料が、任意に、ＤＮＡの全配列または部分配列情報、主要および／もしくは非主要組織適合抗原またはマーカーを含む組織適合性を記述する情報、ならびに／またはそれが含むもしくは認識する抗原に関する情報を含む、そのソースを記述する情報により関連付け、同定または索引付けられる、細胞バンクまたは細胞貯蔵施設。
【発明の詳細な説明】
【関連出願への相互参照】
【０００１】
この出願は、２０１５年３月２０日に出願された米国分割出願６２／１３５，８５１、および２０１５年３月２０日に出願された米国分割出願６２／１３５，８８８に基づく優先権を主張するものであり、その全体の開示は参照により本明細書に組み込まれる。この出願は、２０１４年１０月２８日に出願された「ＣＭＶ血清陰性のドナーからのＣＭＶ−特異的Ｔ細胞の増殖」と題するＰＣＴ／ＵＳ２０１４／６２６９８に関連するものであり、これは２０１３年１０月２８日に出願された米国分割出願６１／８９６，２９６に基づく優先権を主張するものである。上記のすべての文献の開示は参照により本願明細書に組み込まれる。
【発明の背景】
【０００２】
【技術分野】
【０００３】
本発明は、ウイルスおよび他の抗原に特異的なＴ細胞、ナイーブＴ細胞からのその製造方法、およびウイルスおよび他の抗原に特異的なＴ細胞を用いた細胞ベースの療法の分野一般に関連するものである。
【関連技術の記載】
【０００４】
既存のＴ細胞に基づく免疫療法は、Ｔ細胞および前駆Ｔ細胞を含む試料から増殖されたウイルス及び腫瘍に特異的なＴ細胞を使用している。ウイルス特異的Ｔ細胞は、幹細胞移植後のウイルス感染に対して有効であることが示されており、ウイルス特異的Ｔ細胞集団を用いたＴ細胞に基づく細胞療法は、ウイルス感染細胞からの保護を提供し、多くの抗ウイルス薬療法よりも、副作用が少ないことが示されている。増殖したウイルス特異的集団を使用したＴ細胞に基づく療法は、循環白血病芽球を一掃するという移殖片対白血病効果も示した。これらの免疫療法は、メモリー集団の生成により生涯にわたる保護を提供するという利益を有する。さらに、これらの細胞は、エクスビボで容易に増殖する。なぜなら、それが由来するドナーは血清陽性であり（これは記憶が存在することを意味する）、ウイルス特異的Ｔ細胞は、抗原の存在下で急速に増殖するからである。しかし、これらの方法は、その免疫系がすでにウイルスまたは腫瘍抗原を認識する免疫系を有するドナー（例えば、特定のウイルスに対して血清陽性のドナー）から得られたＴ細胞に関する要件に悩まされている（Ｎｇｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ３７（４）：  １９２−２０３  （２０１４）を参照）。
【０００５】
例えば臍帯血におけるナイーブＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞集団が、抗原もしくは抗原性ペプチドに曝露され、刺激されていないと、ウイルスおよび他の抗原に特異的なＴ細胞は増殖することができない。そのようなナイーブ集団は、それが認識する抗原と接触した場合に急速に増殖できる抗原特異的メモリーＴ細胞を欠いている。例えば、対象が臍帯血移殖を受けている場合、前記臍帯血はウイルス、他の病原体または腫瘍に対する保護を提供しないナイーブＴ細胞をほぼ全体として含んでいる。同様の移殖、例えば、特定のウイルス、病原体または腫瘍抗原に対して血清陰性なナイーブドナーからの幹細胞移殖もまた、急速に増殖するメモリーＴ細胞を欠いている。結果として、臍帯血または、ナイーブドナーからの移植のためのウイルス特異的Ｔ細胞の増殖は制限され、臨床的に利用できない。
【０００６】
これらの集団からのウイルス特異的Ｔ細胞の生成に伴う困難は、（１）ナイーブ抗原特異的Ｔ細胞の刺激の必要性、および（２）臍帯血の限定された量、から生じる。臍帯血ユニットは、典型的にはトータルで２５ｍＬの血液を含む。この２５ｍＬから、２０ｍＬが、典型的には、免疫系を再生するための移植物として患者に直接投与される一方、５ｍＬが潜在的Ｔ細胞増殖のために残るのみである。さらに、同様にその量が限られている前記生産物中に存在する前記ナイーブＴ細胞が、従来、この処理を臨床的状態に対して望ましくないものとしており、免疫療法がうまくいくために必要なウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞の種類及び数を生成するための新たな処理の発展の必要性が強調されてきた。
【０００７】
ナイーブＴ細胞からのウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞を刺激および増殖させるための方法は現在のところまだ成功していない（ＭｃＧｏｌｄｒｉｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｐｒｉｍｅｄ  ｅａｒｌｙ  ａｆｔｅｒ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｂｕｔ  ｆａｉｌ  ｔｏ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ”、  Ｂｌｏｏｄ  １２１（１４）：  ２７９６−２８０３  （Ｅｐｕｂ  ２０１３）を参照）。これは、発達中の新生児の免疫系は免疫学的記憶をほとんど有さず、感染性因子に対するその脆弱性が増加するという観察と整合する（Ｂａｓｈａ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｎｅｏｎａｔｅｓ”、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０（９）：１１７１−１１８４  （２０１４）を参照）。新生児期、先天性および／または子宮内の病原体は、風疹、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、パルボウイルスＢ１９、水痘帯状疱疹（ＶＺＶ）、エンテロウイルス、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、ラッサ熱、および日本脳炎を含む。周産期および新生児期の感染性因子は、単純ヘルペスウイルス（ヒト単純ヘルペス１型および２型を含む）、ＶＺＶ、エンテロウイルス、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎およびＨＴＬＶ−１を含む。他の病原体は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、メタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ライノウイルス、パラインフルエンザ（ＰＩＶ）、およびヒトコロナウイルス、ノロウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ジカウイルスおよび脳炎ウイルスを含む。
【０００８】
ウイルスおよび他の抗原に特異的なＴ細胞を増殖するための多くの既存の方法に伴うさらなる問題は、多くの現在の方法が感染性ウイルス、ウイルス感染細胞、またはウイルスで形質転換された細胞、例えば、エプスタインバーウイルスで形質転換されたンパ芽球細胞株（Ｎｇｏ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４））の使用を含むことである。ウイルスおよび他の抗原に特異的なＴ細胞を生産するためのウイルスの使用を含む治療的使用のための方法は望ましくない。なぜならば、それらは、臨床的リスクおよび重大な規制的障害を伴うからである。
【０００９】
本発明による１つの実施形態は、ナイーブ集団からのウイルスおよび他の抗原に特異的なＴ細胞の急速かつ強力な増殖を有利に可能とし、それにより、治療的に重要な抗原、例えば日和見性のウイルスの抗原および腫瘍抗原を認識する、ウイルスおよび他の抗原に特異的なＴ細胞を提供することができる。この実施形態は、生きたウイルスまたはウイルスで形質転換した細胞の使用を必要とせず、それにより、より臨床的に受け入れられやすい。また、これは、米国や国際的な規制機関により妨げられ、または禁止されている感染性または危険な因子の使用を必要としない。さらに、上記実施形態により増殖されたＴ細胞は、臨床的実施において容易に使用され、または、預けられて在庫製品として便利に使用されることができる。
【発明の要約】
【００１０】
本発明の要約
いくつかの実施形態において、本発明は、特定の抗原、たとえばウイルス、他の病原体または腫瘍由来の抗原を特異的に認識するＴ細胞を生成する強力な方法を提供する。本発明は、また、病原体の異なるまたは複数のエピトープを認識するＴ細胞の集団を生成し、広範囲の細胞免疫を提供する。例えば、広範囲の細胞免疫応答を得るために、ナイーブ細胞集団は、特定の病原体、例えばサイトメガロウイルス、の１種以上の抗原に対応するオーバーラッピングペプチドで刺激されそれを提示する抗原提示細胞に曝露することができる。これらのペプチドは、異なる抗原提示細胞（樹状細胞、単球、Ｋ５６２細胞、ＰＨＡ芽球、Ｂ−芽球、リンパ芽球細胞、およびＣＤ３−２８芽球）を刺激することができ、この方法は、異なる刺激および増殖サイトカイン（ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５を含むが、これらに制限されない）、および異なる選択方法（ＣＤ４５ＲＯの枯渇等）を利用することができる。このような方法で生産されたウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞は、ナイーブ臍帯血、ドナーの幹細胞もしくは他の細胞の移植を受けた対象における、移殖後ウイルス感染、非ウイルス病原体による感染、もしくは腫瘍の再発を治療するために用いることができる。
【００１１】
さらに、前記抗原特異的Ｔ細胞は、治療を必要とする対象、例えば特定のウイルスまたは腫瘍を認識するＴ細胞を必要とする対象に後に投与するために、有利に預け、または貯蔵することができる。
【００１２】
他の実施形態において、本発明は、抗原の複数の決定基を認識する抗原特異的Ｔ細胞の集団を含む抗原特異的Ｔ細胞を提供し、これは、必要な場合、臍帯血またはナイーブ血液学的細胞移殖を受けていないものを含む他の対象の免疫系を増強または補助するために用い得る。そのような対象の例は、臓器移殖を受けたもの、免疫系切除を受けたもの、および免疫抑制されたまたは免疫不全のもの、例えば、日和見性の感染をしたもの、を含む。本発明は、ナイーブＴ細胞からは以前には決して行われていなかった臨床的に関連する方法において、ナイーブＴ細胞から複数のウイルス抗原に特異的なＴ細胞を生産する。いくつかの実施形態において、本発明自体は、他の日和見性のウイルス、これらに制限されるものではないが、例えばＨＨＶ６およびＢＫウイルスに容易に適用できる方法および使用である。それは、これらに制限されるものではないが、例えばＥＢＶおよびＨＩＶによるか関連するものに伴う悪性腫瘍に関連する病気からのウイルス特異的抗原を含むように拡張することができる。他の医療的使用は、生着の促進と、移殖前の免疫不全の患者に対する療法の提供を含む。
【００１３】
限定するものではないが、本発明の実施形態は、他の療法、例えば、細胞生産物、リンパ球除去レジメン、エピジェネティック修飾薬、または他の抗菌もしくは抗腫瘍療法、と組み合わせることができる。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本発明は、異なる抗原提示細胞（樹状細胞、単球、Ｋ５６２細胞、ＰＨＡ芽球、Ｂ−芽球、リンパ芽球細胞、およびＣＤ３−ＣＤ２８芽球）を刺激する異なるオーパーラッピングペプチドライブラリ、異なる刺激および増殖サイトカイン（制限されるものではないが、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５を含む）、ならびに異なる選択方法（ＣＤ４５ＲＯ枯渇等）を使用して抗原特異的Ｔ細胞を生成する。これらの細胞は、移殖後のウイルスまたは他の菌への感染を治療するために用いられる。
【００１５】
他の実施形態において、本発明は、最も適合するドナーを選択する方法により、ナイーブＴ細胞から生産された抗原特異的Ｔ細胞の第三者預託を含む。
【００１６】
本発明に基づく本発明の多くの実施形態の他の有利な特徴は、良好な製造の実施に適合する単純かつ反復可能な工程を含むということである。複数の複雑な、潜在的に非反復的であるか標準化できない工程を実施する必要はない。本発明の方法は、安全、単純、迅速および再現可能であり、種々の異なる患者のためのウイルスおよび他の抗原に特異的なＴ細胞を生産するために使用することができる。
【００１７】
本発明による方法は、異なる移殖、例えば、臍帯血、幹細胞または他のナイーブドナー細胞の移植、を受けた異なる患者を標的にできる点で、広範な範囲のものである。例えば、これは、同一の臍帯血単位が移殖に用いられた場合の臍帯血移植を受けた患者のためのウイルスおよび他の抗原に特異的なＴ細胞を生産する唯一の方法であり、患者を日和見性の感染から保護するウイルスおよび他の抗原に特異的なＴ細胞の製造にも用いられる。
【００１８】
本発明の具体的な非限定的実施形態は以下を含む：
１．ウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞を生産する方法であって、以下を含む方法：
（ａ）臍帯血試料またはナイーブ免疫細胞を含む他の試料からの単核細胞を２つの部分に分け；
（ｂ）前記試料の第１の部分をＰＨＡまたは他のマイトジェン、および／またはＩＬ―２、と接触させ、ＡＴＣ（「活性化Ｔ細胞」）を生産し、該ＡＴＣを、その成長を阻害する放射線または他の剤で処理し；
（ｃ）Ｔ細胞およびＴ細胞前駆細胞（例えば、非付着細胞、ＣＤ３＋細胞）を、樹状細胞および樹状前駆細胞（例えば、付着細胞、ＣＤ１１Ｃ＋またはＣＤ１４＋細胞）から分離し；
（ｄ）前記非付着細胞を凍結保存または他の手段で保存し；
（ｅ）前記第２の部分中の付着細胞を、サイトカインもしくは樹状細胞を生成し成熟させる他の剤、ならびに少なくとも１種のウイルスもしくは他のペプチド抗原と接触させて、少なくとも１種のペプチド抗原を提示する抗原提示樹状細胞を生産し、前記抗原提示樹状細胞をその成長を阻害するに十分な放射線または他の剤で処理し；
（ｆ）（ｄ）から得られた凍結保存または他の手段で保存された非付着細胞を、（ｅ）において生産された樹状抗原提示細胞とＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で接触させ、少なくとも１種のウイルス抗原またはペプチド抗原を認識する、ウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞を生産し；
（ｇ）（ｆ）により生産されたウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞を、任意に、Ｋ５６２細胞または他のアクセサリー細胞の存在下での少なくとも１種のペプチド抗原の存在下、かつＩＬ−１５の存在下で、（ｂ）のＡＴＣと接触させ；任意に（ｇ）を１回以上繰り返し；
（ｈ）少なくとも１種のウイルスまたは他のペプチド抗原を認識する、ウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞を回収し；および
（ｉ）任意に、前記抗原特異的Ｔ細胞を、それを必要とする対象に投与するか、または、前記抗原特異的Ｔ細胞を預けるかもしくは保存する。
２．（ａ）の前に、さらに、臍帯血またはナイーブＴ細胞を含む他の試料から単核細胞を分離することを含む、実施形態１の方法。
３．前記単核細胞が臍帯血から得られたものである、実施形態１または２の方法。
４．前記単核細胞が少なくとも１種のウイルスまたは他のペプチド抗原にナイーブな幹細胞から得られたものである、実施形態１、２または３の方法。
５．前記単核細胞が、その免疫系が少なくとも１種のウイルスまたは他のペプチド抗原にナイーブな対象からの幹細胞、前駆Ｔ細胞、またはＴ細胞を含む試料から得られたものである、実施形態１、２、３または４の方法。
６．（ｂ）が、前記試料の第１の部分をＰＨＡおよびＩＬ−２と接触させてＡＴＣ（「活性化Ｔ細胞」）を生産することを含む、実施形態１、２、３、４または５の方法。これらのＡＴＣは、後に使用するために冷凍保存または他の方法で預託してもよいし、すぐに使用してもよい。好ましくは、ＡＴＣまたはウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞のいずれも冷凍保存する必要なく、ＡＴＣはすぐに（ｆ）において生産されたウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞と混合して使用する。例えば、（ｂ）において調製されたＰＨＡ芽球は、プロセスの開始後１４〜１６日後に、（ｆ）において生産されたウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞に第２の刺激を与えるために使用することができる。
７．（ｂ）において、約１，０００，０００〜２０，０００，０００、好ましくは約５，０００，０００〜１５，０００，０００，最も好ましくは約８，０００，０００〜１２，０００，０００の単球臍帯血細胞をＰＨＡおよびＩＬ−２に接触させることを含む、実施形態１、２、３、４、５または６の方法。
８．（ｂ）が、Ｔ−芽球、Ｂ−芽球、リンパ芽球細胞または、ＣＤ３−ＣＤ２８芽球の生産を含む、実施形態１、２、３、４、５、または７の方法。
９．前記第２の部分を固体培地に、所定時間、前記第２の部分中の細胞が前記固体培地に付着するために十分な条件で接触させ、その後、Ｔ細胞およびＴ細胞前駆細胞を前記固体培地から除去し、前記固体培地に付着した樹状細胞および樹状前駆細胞を回収することにより、Ｔ細胞およびＴ細胞前駆細胞が樹状細胞および樹状前駆細胞から分離される、実施形態１〜８の何れか１の方法。あるいは、これらの２つの細胞集団は、各集団を特異的に認識する抗体もしくは他のリガンドの使用により、または、他の公知のセルソーティングの方法により、磁気的に分離することができる。分離された細胞集団は、後に使用するために冷凍保存または他の方法で預託してもよいし、Ｔ細胞または樹状細胞の生産のためにすぐに使用してもよい。これらの集団は、ウイルスもしく他のペプチド抗原により負荷された成熟樹状細胞、またはウイルスもしくは他の抗原に特異的なＴ細胞を生産する、ここに記載された次の処理ステップの後に、冷凍保存または他の方法で預託してもよい。
１０．（ｅ）において、前記樹状細胞および樹状前駆細胞を、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦからなる群から選択される少なくとも１種の樹状細胞生成サイトカインに接触させる、実施形態１〜９のいずれか１の方法。
１１．（ｅ）において、前記樹状細胞および樹状前駆細胞を、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦと共に、ＬＰＳ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＰＧＥ−１およびＰＧＥ−２からなる群から選択される樹状細胞成熟サイトカインまたは剤と接触させる、実施形態１〜１０のいずれか１の方法。
１２．（ｆ）において、または（ｆ）の前に、前記樹状細胞および樹状前駆細胞を処理してＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を増殖する、実施形態１〜１１のいずれか１の方法。
１３．（ｆ）において、または（ｆ）の前に、前記樹状細胞および樹状前駆細胞を処理してＣＤ４５ＲＯ陽性細胞を枯渇させる、実施形態１〜１２のいずれか１の方法。
１４．前記少なくとも１種のウイルスまたは他のペプチド抗原が一連のオーバーラッピングペプチドを含む、実施形態１〜１４のいずれか１の方法。
１５．前記少なくとも１種のウイルスまたは他の抗原特異的ペプチド抗原が腫瘍関連もしくは腫瘍特異的抗原を含む、実施形態１〜１４のいずれか１の方法。
１６．前記少なくとも１種のウイルスまたは他のペプチド抗原が、ＰＲＡＭＥ、ＮＹＥＳＯ、ＭＡＧＥ  Ａ４、ＭＡＧＥ  Ａ３、ＭＡＧＥ  Ａ１、サバイビン、ＷＴ１、ニューロエラスターゼ（ｎｅｕｒｏｅｌａｓｔａｓｅ）、プロテイナーゼ  ３、ｐ５３、ＣＥＡ、クローディン６、ヒストン  Ｈ１、ヒストン  Ｈ２、ヒストン  Ｈ３、ヒストン  Ｈ４、ＭＡＲＴ１、ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＳＯＸ２、ＳＳＸ２、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｍｙｃ、およびＲａｓからなる群から選択される腫瘍関連もしくは腫瘍特異的抗原の決定基である、実施形態１〜１５のいずれか１の方法。
１７．実施形態１〜１６のいずれか１の方法であって、前記少なくとも１種のペプチド抗原が、ＭＨＣ−ＩもしくはＭＨＣ−ＩＩ限定ウイルスに、由来もしくは関連するペプチドを含むウイルスの決定基を含む、方法。それらのウイルスは、日和見性またはジカウイルスのような新興ウイルス病原体や他の疾患関連ウイルスを含む。
１８．前記少なくとも１種のペプチド抗原が、フィロウイルスの決定基、例えば、エボラウイルス由来のＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０、またはＶＰ２４の決定基を含む、実施形態１〜１７のいずれか１の方法。
１９．前記少なくとも１種のペプチド抗原が、麻疹ウイルスの決定基、例えば、抗原Ｐ、Ｖ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｆ、Ｐ、またはＬの決定基を含む、実施形態１〜１８のいずれか１の方法。
２０．前記少なくとも１種のウイルスまたは他のペプチド抗原が、日和見性のウイルス病原体からのウイルス抗原、新生児先天性または子宮内病原体、例えば、風疹、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、パルボウイルスＢ１９、水痘帯状疱疹（ＶＺＶ）、エンテロウイルス、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、ラッサ熱、および日本脳炎からのウイルス抗原；または、周産期もしくは新生児の病原体、たとえば、ヒト単純ヘルペス、ＶＺＶ、エンテロウイルス、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＴＬＶ−１、ジカウイルスもしくは脳炎ウイルスからのウイルス抗原に対応する一連のオーバーラッピングペプチドである、実施形態１〜１９のいずれか１の方法。
２１．前記少なくとも１種のウイルスペプチド抗原が、ＣＭＶ抗原の全体もしくは部分のオーバーラッピング断片に対応する、もしくはその構成要素となる、一連のオーバーラッピングペプチドである、実施形態１〜２０のいずれか１の方法。
２２．前記少なくとも１種のウイルスまたは他のペプチド抗原が、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）抗原またはアデノウイルス抗原に対応する一連のオーバーラッピングペプチドである、実施形態１〜２１のいずれか１の方法。
２３．前記少なくとも１種のウイルスまたは他のペプチド抗原が、日和見性または新興ウイルス病原体の複数のウイルス抗原からのペプチドまたは一連のペプチドを含む、実施形態１〜２２のいずれか１の方法。
２４．前記少なくとも１種のペプチド抗原が、細菌抗原の決定基を含む、実施形態１〜２３のいずれか１の方法。
２５．前記少なくとも１種のペプチド抗原が、マイコバクテリウムの決定基、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓからのＥＳＡＴ６、ＨＬＰＭｔ、ＰＰＥ５、ＭＶＡ８５Ａ、ＡＧ８５、ＰＳＴＳ１、ＡＣＲ、ＨＳＰ６５、ＧｒｏＥＳ、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、ＭＰＢ７０の決定基、を含む、実施形態１〜２４のいずれか１の方法。
２６．前記少なくとも１種のペプチド抗原が、真菌性、寄生性、または他の真核性の病原体の決定基を含む、実施形態１〜２５のいずれか１の方法。
２７．前記少なくとも１種のペプチド抗原が、哺乳動物の組織適合性抗原または他の哺乳動物抗原を含む、実施形態１〜２６のいずれか１の方法。
２８．（ｆ）において、（ｄ）からの前記非付着細胞を（ｅ）において作成された樹状抗原提示細胞に、（ｄ）：（ｅ）が１：１〜２００：１の範囲、好ましくは５：１〜１００：１の範囲、最も好ましくは５：１〜２０：１の範囲の比率で接触させる、実施形態１〜２７のいずれか１の方法。
２９．（ｇ）が、さらに前記ウイルス抗原に特異的なＴ細胞を、ＨＬＡ−陰性に改変されたＫ５６２細胞、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、及び／もしくは４−１ＢＢＬを発現するＫ５６２ｃｓ細胞、または他のアクセサリー細胞に接触させることを含む、実施形態１〜２８のいずれか１の方法。
３０．（ｇ）が、（ｆ）において製造された前記Ｔ細胞を、ＡＴＣおよびＫ５６８細胞に、Ｔ細胞とＡＴＣとの比率が１０：１〜１：１の範囲、好ましくは５：１〜２：１の範囲、および最も好ましくは約４：１で接触させることを含む、実施形態１〜２９のいずれか１の方法。
３１．さらに、（ｈ）において回収された前記ウイルスまたは他のペプチド抗原に特異的なＴ細胞について、ＩＬ−２の存在下で（ｇ）を繰り返すことをさらに含む、実施形態１〜３０のいずれか１の方法。
３２．実施形態１〜３１のいずれか１の方法により得られた、ウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞を含む組成物。
３３．実施形態１〜３１のいずれか１の方法により得られたウイルスまたは他の抗原に特異的な生存Ｔ細胞が冷凍または他の手段で保存された複数の試料を含む、ウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞バンク。
３４．実施形態１〜３１のいずれか１の方法により得られた、ウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、処置の方法。
３５．前記対象が、前記のウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞と部分的に組織適合性である、実施形態３４の方法。
３６．前記対象が、前記のウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞と完全に組織適合性である、実施形態３４の方法。
３７．前記対象の免疫系が、前記ウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞を製造するために使用したのと同一の臍帯血細胞または同一のナイーブ免疫細胞により再構築されている、実施形態３４〜３６のいずれか１の方法。
３８．前記対象が免疫不全の状態である、実施形態３４〜３７のいずれか１の方法。
３９．例えば、放射線、化学療法、感染または免疫抑制により、前記対象の免疫系が除去され、またはリンパ球が枯渇している、実施形態３４の方法。
４０．前記対象が同種移殖または他の移植を受けている、実施形態３４〜３９のいずれか１の方法。
４１．前記対象の免疫系が、製造された前記ウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞により認識される抗原に対してナイーブである、実施形態３４〜４０のいずれか１の方法。
４２．前記ウイルスもしくは他の抗原に特異的なＴ細胞がサイトメガロウイルス抗原もしくは抗原決定基を認識するか、または、前記ウイルスもしくは他の抗原に特異的なＴ細胞がエプスタインバーウイルスの抗原もしくはその抗原決定基を認識する、実施形態３４〜４１のいずれか１の方法。
４３．前記ウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞がアデノウイルス抗原または抗原決定基を認識する、実施形態３４〜４２のいずれか１の方法。
４４．前記ウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞が、１種以上の日和見性のウイルス病原体の多重抗原または抗原決定基を認識する、実施形態３４〜４３のいずれか１の方法。
４５．前記ウイルスに特異的なＴ細胞が、ＣＭＶ、アデノウイルス、ＢＫウイルス、ヒトヘルペスウイルス−６（ＨＨＶ６）もしくは他のヘルペスウイルス、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、および水痘帯状疱疹ウイルスからなる群から選択される、日和見性のウイルス病原体の少なくとも１種のウイルス抗原を認識する、実施形態３４〜４４のいずれか１の方法。
４６．前記ウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞が、院内もしくは医原的に獲得した、または、病院内の対象に伝達した（例えば、院内感染）日和見性のウイルス病原体の少なくとも１種の抗原を認識する、実施形態３４〜４５のいずれか１の方法。
４７．臍帯血またはナイーブ免疫細胞を含む他の試料から単離された単核細胞、ＰＨＡまたは他のマイトジェン、ＩＬ−２および前記細胞の生存を維持する培地、ならびに、任意に、Ｔ細胞を同時刺激するＫ５６２細胞または他の非自己細胞を含む組成物であって、ここで、任意に、前記細胞は増殖を妨げるように処理されている、組成物。
４８．以下を含む組成物：
（ｉ）樹状細胞および樹状前駆細胞（例えば、付着細胞、ＣＤ１１Ｃ＋またはＣＤ１４＋細胞）から分離された、Ｔ細胞およびＴ細胞前駆細胞（例えば、非付着細胞、ＣＤ３＋細胞）、
（ｉｉ）ＩＬ−７およびＩＬ−１５、ならびに
（ｉｉｉ）前記Ｔ細胞およびＴ細胞前駆細胞の生存を維持する培地。
４９．前記単核細胞、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞を、少なくとも１種のペプチド抗原により接触、または刺激された樹状細胞に接触させ、ここで、前記組成物は、前記少なくとも１種のペプチド抗原を認識する単核細胞、Ｔ細胞もしくはＴ細胞前駆細胞を含む、実施形態４７または４８のいずれか１の組成物。
５０．Ｔ細胞およびＴ細胞前駆細胞（例えば、非付着細胞、ＣＤ３＋細胞）から分離された樹状細胞および樹状前駆細胞（例えば付着細胞、ＣＤ１１Ｃ＋またはＣＤ１４＋細胞）、樹状細胞を生成および成熟させる少なくとも１種の剤、および前記細胞の生存を維持する培地を含み、ここで、任意に、前記細胞は１種以上のペプチド抗原に接触され、および、任意に増殖を妨げるように処理される、組成物。
５１．実施形態４７〜５０のいずれか１の前記組成物の１種以上の試料と貯蔵または冷凍培地との組み合わせを含む細胞バンクまたは細胞貯蔵施設であって、前記１以上の試料が、任意に、ＤＮＡの全配列または部分配列情報、少なくとも１つの主要および／もしくは非主要組織適合抗原またはマーカーを含む組織適合性を記述する情報、ならびに／またはそれが含むもしくは認識する抗原に関する情報を含む、そのソースを記述する情報により関連付け、同定または索引付けられる、細胞バンクまたは細胞貯蔵施設。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
図面は、特に、本発明の非制限的な実施形態を示すものである。
【図１】図１  樹状細胞、ＰＨＡ芽球惹起、および非付着細胞の冷凍保存。
【図２】図２  樹状細胞の成熟およびペプチド抗原による刺激。
【図３】図３  樹状細胞による第１のＴ細胞刺激。
【図４】図４  第２の次のＴ細胞刺激。
【図５】図５  本発明の１実施形態の一般的記述。
【好ましい具体例の詳細な説明】
【００２０】
「アクセサリー細胞」は、Ｋ５６２細胞のような、Ｔ細胞によるペプチド抗原の認識のための共刺激を提供する、または、他のやり方でＴ細胞の認識を補助する細胞であり、ペプチド抗原の存在下で刺激または増殖される。
【００２１】
本発明における「活性化Ｔ細胞」または「ＡＴＣ」は、臍帯血もしくはナイーブな免疫細胞を含む他の試料中の単核細胞を、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）およびインターロイキン（ＩＬ）−２のようなマイトジェンに対し曝露することにより得られる。
【００２２】
「抗原」は、ヒト免疫系の細胞性もしくは体液性部門等により認識されるポリペプチド、ペプチド、またはグリコもしくはリポペプチドのような分子を含む。「抗原」という用語は、ＭＨＣ分子に結合する、ＭＨＣクラスＩもしくはＩＩ複合体の部分を形成する、もしくはそれらの分子と複合したときに認識される、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２またはそれ以上のアミノ酸残基長のペプチドのような抗原決定基を含む。
【００２３】
「抗原提示細胞（ＡＰＣ）」は、免疫系の特定のエフェクター細胞により認識されるペプチド−ＭＨＣ複合体の形態における１以上の抗原を提示することができる細胞のクラスのことであり、それにより、抗原または提示される抗原に対する効果的な細胞免疫応答を誘導する。プロフェッショナルＡＰＣの例は樹状細胞およびマクロファージであるが、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子を発現する細胞であれば潜在的にペプチド抗原を提示できる。
【００２４】
「対照」は、試験される試料または対象と比較されるために用いられる参照試料または参照対象である。陽性対照は予想される反応を測定し、陰性対照は反応しないことが予想される試料に対する基準点を提供する。
【００２５】
「臍帯血」は、本技術分野における通常の意味を有し、胎盤および出産後臍帯中に残存する血液を意味し、造血幹細胞を含む。臍帯血は、そのままか、冷凍保存され、または臍帯血バンクから入手できる。
【００２６】
「サイトカイン」という用語は、本技術分野における通常の意味を有する。本発明で用いられるサイトカインの例には、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５が含まれる。
【００２７】
「樹状細胞」または「ＤＣ」という用語は、多くのリンパまたは非リンパ組織において見られる形態学的に類似の細胞型の多様な集団を意味する（Ｓｔｅｉｎｍａｎ、  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９：２７１−２９６  （１９９１）を参照）。本発明の１つの実施形態は、臍帯血由来の樹状細胞および樹状細胞前駆細胞を含む。
【００２８】
「エフェクター細胞」という用語は、抗原に結合するか、または抗原を認識することができ、免疫反応を媒介する細胞を意味する。ウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞はエフェクター細胞である。
【００２９】
「単離された」という用語は、材料が通常含まれている成分から分離されることを意味し、例えば、単離された臍帯血単核細胞は、赤血球細胞、血漿、および他の臍帯血の成分から分離することができる。
【００３０】
「ナイーブ」なＴ細胞または他の免疫エフェクター細胞とは、その細胞を活性化することができるペプチド抗原を提示する抗原提示細胞に曝露または刺激されていないものである。
【００３１】
本願の意味における「ペプチドライブラリ」または「オーパーラッピングペプチドライブラリ」は、タンパク抗原、特に日和見性のウイルスのもの、の部分または完全配列を全体としてカバーする複合混合物である。前記混合物中の連続するペプチドは互いに重複しており、例えば、ペプチドライブラリは１５アミノ酸長のペプチドで構成され、ライブラリ中において隣接するペプチドは１１アミノ酸残基オーバーラップし、タンパク抗原の全長に亘っていてよい。ペプチドライブラリは、商業的に利用可能であり、特定の抗原に対して特別生産することができる。抗原提示細胞を接触、刺激または負荷する方法は周知であり、Ｎｇｏ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）への参照によりここに組み込まれる。ペプチドライブラリはＪＰＴから得ることができ、ウェブサイトｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｊｐｔ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｅｐｔｒａｃｋ−ｐｅｐｔｉｄｅ−ｌｉｂｒａｒｉｅｓ／（最終アクセス、２０１６年３月２１日）への参照によりここに組み込まれる。
【００３２】
「前駆細胞」という用語は、特定の種類の細胞に分化または変化し得る細胞を意味する。例えば、「Ｔ細胞前駆細胞」は、Ｔ細胞に分化でき、「樹状前駆細胞」は樹状細胞に分化できる。
【００３３】
「対象」は脊椎動物であり、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトである。哺乳動物は、以下に制限されないが、ヒト、類人猿、馬、牛、豚、犬、猫、マウス、他の家畜、競技動物（ｓｐｏｒｔ  ａｎｉｍａｌｓ）、またはペットを含む。対象は、例えばリンパ球減少症に罹っているもの、免疫系除去をうけたもの、移植および／もしくは免疫抑制レジメンを受けているもの、ナイーブもしくは発達中の免疫系を有するもの、例えば新生児、または臍帯血もしくは幹細胞移植を受けているもののような、ウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞を必要とするものを含む。
【００３４】
本発明の実施形態において、図１、２、３および４に記載され以下に詳細に説明されるように、臍帯血は、ウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞を生産するために使用される。
【００３５】
工程１。図１に示されるように、臍帯血単位は、単核細胞（ＭＮＣ）を単離するために処理される。ＭＮＣから３つのサブセットが単離され増殖される：１）未成熟樹状細胞（ＤＣ）、これはプラスチックへの付着により単離される、２）Ｔ細胞を含む分画、非付着細胞、これは後に使用するために冷凍保存される、および３）ＰＨＡ芽球、これは、後に抗原提示細胞として使用される非特異的な活性化Ｔ細胞である。これらは約５，０００，０００のＭＮＣから生成される。一旦付着すると、付着細胞（ＤＣ）にＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦが与えられる。この方法は、ＰＨＡ芽球が出発材料（典型的には冷凍保存されたもの）から生成される点で新規である。
【００３６】
工程２。図２に示されるように、開始後約５日で、樹状細胞は、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＰＧＥ−２、ＩＬ−６、およびＬＰＳを含むサイトカインカクテルの添加により成熟する。ＬＰＳはこの応用において新規である。末梢血の設定においてＤＣに対する付着を使用している点もまた相違している（それはＤＣ前駆細胞の富化のためにＣＤ１４選択を使用している）。
【００３７】
工程３において、図３に示されるように、当初、成熟樹状細胞はオーバーラッピングペプチドにより刺激され、それが増殖しないように放射線照射され、そしてその後、ＩＬ−７とＩＬ−１５の存在下で、（解凍された）非付着細胞と組み合わせられる。ＩＬ−１２はもはや使用されない。
【００３８】
工程４において図４に示されるように、培養の開始から約１４〜１６日（第１のＴ細胞刺激から７〜９日）で、（同一の臍帯血由来の）ＰＨＡ芽球は、同一のオーバーラッピングペプチドにより刺激され、放射線照射され、そしてＫ５６２細胞と組み合わせられる；これら２つの組合せは、予め増殖されたＴ細胞に対する抗原提示細胞として作用する。ペプチドで刺激されたＰＨＡ芽球およびＫ５６２の使用は、以前の臍帯血生成手続とは異なっている。この実施形態においては、Ｔ細胞を増殖後に凍結する必要がない点で有利である。従来の方法は、継続して行う前にＬＣＬが準備できるのを待つ必要があった。ＬＣＬを待つ必要がないため、抗原特異的細胞は、６０日ではなく約３０日で生産できる。以前の方法との他の相違は、ＣＤ３／ＣＤ２８芽球の代わりにＰＨＡ芽球が用いられることであり、Ｔ細胞の多くがメモリー細胞である末梢血が使用される従来の手順とは、ＰＨＡに応答するＴ細胞はナイーブなＴ細胞である点で相違する。
【例】
【００３９】
臍帯血からのウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞の生産および増殖
臍帯血から単離された非付着単核細胞（例えば、ナイーブＴ細胞）は、臍帯血中の非付着細胞（例えば、単球、樹状細胞等）から調製された、放射線処理されたペプチド刺激抗原提示細胞との接触により刺激され、その後、臍帯血から非特異的に増殖された放射線処理されたペプチド刺激抗原提示細胞により刺激された。この方法により、臍帯血から、ウイルスまたは他の抗原に特異的なＴ細胞が生産された。
【００４０】
特に、単核細胞が、臍帯血から、フィコール密度勾配上で、ほとんど加速及びブレーキなしの室温での８００ｘｇで２０分の遠心分離により単離された。約１０，０００，０００の単離された単核細胞は、「活性化Ｔ細胞」または「ＡＴＣ」としても知られる非特異的な増殖Ｔ細胞（抗原提示細胞）を生産するために保存された。この場合、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）が、ＡＴＣを刺激するために使用された。
【００４１】
残りの単離された単核細胞は、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ  ＣｅｌｌＧｒｏ無血清培地を含む組織培養プレート上に蒔かれた。１〜２時間後、組織培養プレートは非付着細胞を除去するためにＰＢＳで洗浄され、後の使用のために冷凍保存され保管された。
【００４２】
洗浄後に細胞培養プレートに付着している細胞は、サイトカインと混合され、樹状細胞（ＤＣ）を生成した。これは、細胞を１０００Ｕ／ｍＬのインターロイキン（ＩＬ）−４、および８００Ｕ／ｍＬの顆粒球マクロファージ／コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）と接触させ、その後、１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−４および８００Ｕ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦに加えて、３０ｎｇ／ｍＬのリポ多糖（ＬＰＳ）、１０ｎｇ／ｍＬの腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１β、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６、および１ｕｇ／ｍＬのプロスタグランジン（ＰＧＥ）−２もしくはＰＧＥ−１と接触させることによりなされた。
【００４３】
樹状細胞は、開始から７日間成熟され、細胞当たり約２００ｎｇのオーパーラッピングペプチドライブラリから得られた各ペプチドを含むオーバーラッピングペプチドのプールにより刺激された。この場合、我々は、ＣＭＶからのＩＥ−１およびｐｐ６５、アデノウイルスからのヘキソンおよびペントン、ならびにＥＢＶからのＬＭＰ２およびＢＺＬＦ−１を含むＪＴＰ由来のオーバーラッピングペプチドを使用した。これらのオーバーラッピングペプチド混合物または「ペプミックス（Ｐｅｐｍｉｘｅｓ）」は、タンパク（抗原）全体にわたる１５アミノ酸のペプチドからなり、隣接するペプチドと１１アミノ酸がオーバーラップしている。これは、ＭＨＣクラスの制限に関わらず、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の双方の増殖を可能にする。成熟樹状細胞のオーバーラッピングペプチドのプールによる刺激に続いて、前記細胞は、その増殖を防止するために２５Ｇｙで放射線照射を受けた。
【００４４】
このとき、予め細胞培養プレートから洗い流された冷凍保存された非付着細胞は解凍され、ペプチド刺激樹状細胞と共に、おおよそＤＣが１に対し非付着細胞が１０の割合で、サイトカイン、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７および５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５の存在下で、蒔かれた。これは、冷凍保存された非付着単核細胞（例えば、ナイーブＴ細胞）の当初抗原刺激に相当する。細胞は、４５％のＡｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩ、４５％のＣｌｉｃｋ’ｓ（ＥＨＡＡ）培地、１０％のヒトＡＢ血清、および２００ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘを含むナイーブＴ細胞特異的な培地中で培養された。
【００４５】
冷凍保存された非付着細胞は、放射線照射された（ＤＣに対し２５Ｇｙ、ＡＴＣおよびＫ５６２に対して７５Ｇｙ）ペプチド刺激非付着細胞（例えば、ナイーブＴ細胞）の存在下で、８〜１０日間培養され、その後、収集され、Ｔ細胞の数が決定され、Ｔ細胞培地中で再懸濁された。
【００４６】
再懸濁されたＴ細胞は、放射線照射されたＡＴＣと接触させられ、これは、臍帯血の付着単核細胞由来の放射線照射された成熟樹状細胞上に提示されるオーバーラッピングペプチドの同一のプールにより、１のＴ細胞に対し、放射線照射されたＡＴＣが１、Ｋ５６２細胞が５の割合で、サイトカインＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍＬ）の存在下で、続けてＩＬ−２サイトカイン（５０−１００Ｕ／ｍＬ）を週２回与えることにより刺激された。この第２の刺激の後で、オーバーラッピングペプチドのプール中の抗原決定基を認識するＴ細胞が回収された。これは、ＩＦＮ−γによるＴ細胞活性化を評価するＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、およびクロム放出細胞毒性アッセイにおけるＴ細胞の細胞溶解能力を評価することにより達成された。
【００４７】
本明細書において言及した全ての文献及び特許出願は、各文献または特許出願が具体的かつ個別に、参照により本願に組み込まれることが示された場合と同様に、参照により本願に組み込まれる。
【００４８】
ここに十分に開示した本発明によれば、本技術分野の当業者にとって、以下の請求項の精神および範囲から逸脱しない限り、それについて多くの変更および修正が可能であることは明らかである。
【図１】
2018509938.tif 000002
【図２】
2018509938.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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