(57)【要約】（ｉ）ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失；（ｉｉ）ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失；および／または（ｉｉｉ）参照（すなわち、対照）発現レベルと比べたＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物の発現のレベル減少を示すがんを有する患者を処置する方法が、本明細書に提供される。本方法は、治療有効量のＰＯＬＲ２Ａ阻害剤（例えば、ＰＯＬＲ２Ａタンパク質の発現を阻害する核酸、アマトキシン、アルファ−アマニチンまたはＥｐＣＡＭ抗体等の細胞標的化部分にコンジュゲートされたアルファ−アマニチン）を、（ｉ）ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失；（ｉｉ）ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失；および／または（ｉｉｉ）参照（すなわち、対照）レベルと比べたＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物の発現のレベル減少を有するまたはこれを有すると決定された患者に投与するステップを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを有する患者の処置における使用のための組成物であって、該がんの細胞が、（ｉ）ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失；（ｉｉ）ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失；または（ｉｉｉ）参照発現レベルと比べたＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物の発現のレベル減少を示し、該組成物が治療有効量のＰＯＬＲ２Ａ阻害剤を含む、組成物。
【請求項２】
前記ＰＯＬＲ２Ａ阻害剤が、ＰＯＬＲ２Ａタンパク質の発現を阻害する核酸を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＰＯＬＲ２Ａ阻害剤が、アマトキシンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記アマトキシンが、アルファ−アマニチンである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記アマトキシンが、抗体にコンジュゲートされている、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗体が、抗ＥｐＣＡＭ抗体である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗体が、腫瘍関連抗原に特異的に結合する、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物が、ｍＲＮＡである、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ｍＲＮＡの発現のレベルが、ノーザンブロッティング、逆転写定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）、ヌクレアーゼプロテクション、トランスクリプトーム解析、ハイブリダイゼーションアッセイ、チップに基づく発現プラットフォームまたはインベーダーＲＮＡアッセイプラットフォームによって決定される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物が、タンパク質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記タンパク質の発現のレベルが、質量分析、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫組織化学的検査またはラジオイムノアッセイによって決定される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記参照発現レベルが、非がん性細胞における発現レベルである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＴＰ５３遺伝子の前記ヘミ接合性喪失または前記ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子の前記ヘミ接合性喪失が、ゲノムハイブリダイゼーション技法、ＰＣＲ解析または制限断片解析によって決定される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記がん細胞が、前記ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失を示す、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記がん細胞が、前記ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失を示す、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記患者が、参照発現レベルと比べたＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物の発現のレベル減少を示すがん細胞を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記がん細胞が、肺がん細胞、脳がん細胞、乳がん細胞、肝臓がん細胞、卵巣がん細胞、結腸直腸がん細胞、前立腺がん細胞または膵臓がん細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記がん細胞が、転移性、再発性または多剤耐性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
少なくとも第２の抗がん療法薬をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記第２の抗がん療法薬が、化学療法剤である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記化学療法剤が、５−フルオロウラシル、オキサリプラチンまたはＳＮ−３８である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記患者が、ヒトである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記患者が、非ヒト哺乳動物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記患者が、少なくとも１ラウンドの抗がん療法を以前に受けたことがある、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
（ｉ）ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失；（ｉｉ）ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失；または（ｉｉｉ）参照発現レベルと比べたＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物の発現のレベル減少を示すがん細胞を有する患者を処置する方法であって、治療有効量のＰＯＬＲ２Ａ阻害剤をかかる患者に投与するステップを含む方法。
【請求項２６】
前記患者が、少なくとも再度処置される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記患者が、１週間〜６ヶ月間の期間にわたって処置される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも第２の抗がん療法を前記被験体に投与するステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２の抗がん療法が、外科的療法、化学療法、放射線療法、寒冷療法、ホルモン療法、毒素療法、免疫療法またはサイトカイン療法である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記化学療法が、５−フルオロウラシル、オキサリプラチンまたはＳＮ−３８である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
がんを有する患者を処置する方法であって、
（ａ）（ｉ）ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失；（ｉｉ）ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失；または（ｉｉｉ）参照レベルと比べたＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物の発現のレベル減少を含むがん細胞を有すると決定された患者を選択するステップと、
（ｂ）治療有効量のＰＯＬＲ２Ａ阻害剤を該患者に投与するステップと
を含む方法。
【請求項３２】
ＰＯＬＲ２Ａ阻害剤による処置のための患者を選択するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、該患者由来のがん細胞が、（ｉ）ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失；（ｉｉ）ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失；または（ｉｉｉ）参照レベルと比べたＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物の発現のレベル減少を含むかどうかを決定するステップを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項３３】
患者を選択するステップが、前記がんの試料を得るステップと、該がんの細胞が、（ｉ）前記ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失；（ｉｉ）前記ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失；または（ｉｉｉ）参照レベルと比べたＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物の発現のレベル減少を含むかどうかを決定するステップとを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記決定するステップに関する報告を提供するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記報告が、書面または電子の報告である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記報告が、前記患者、医療費支払者、医師、保険代理人または電子システムに提供される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
患者を選択するステップが、前記がんの細胞が、（ｉ）前記ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失；（ｉｉ）前記ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失；または（ｉｉｉ）参照レベルと比べたＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物の発現のレベル減少を含むかどうかを決定する検査の結果を得るステップを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記がん細胞が、前記ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失を含むかどうかを決定するステップを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記がん細胞が、前記ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失を含むかどうかを決定するステップを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
前記がん細胞が、参照レベルと比べたＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物の発現のレベル減少を含むかどうかを決定するステップを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
がん患者のための薬物療法を選択するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）該がんの試料を得るステップと、
（ｂ）該がんの細胞における（ｉ）ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失；（ｉｉ）ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失；または（ｉｉｉ）参照レベルと比べたＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物の発現のレベル減少の存在を検出するステップと、
（ｃ）該がんの細胞において（ｉ）該ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失が検出される；（ｉｉ）該ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失が検出される；または（ｉｉｉ）参照レベルと比べたＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物の発現のレベル減少が検出される場合、ＰＯＬＲ２Ａ阻害剤を選択するステップと
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項４２】
治療有効量のＰＯＬＲ２Ａ阻害剤を前記患者に投与するステップをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記がんの細胞が、前記ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記がんの細胞が、前記ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記がんの細胞が、参照レベルと比べたＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物の発現のレベル減少を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
被験体におけるがんの処置における使用のためのＰＯＬＲ２Ａ阻害剤を含む組成物であって、該がんの細胞が、（ｉ）ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失；（ｉｉ）ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失；または（ｉｉｉ）参照レベルと比べたＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物の発現のレベル減少を含むことが決定されている、組成物。
【請求項４７】
がんの処置のための医薬の製造におけるＰＯＬＲ２Ａ阻害剤の使用であって、該がんの細胞が、（ｉ）ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失；（ｉｉ）ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失；または（ｉｉｉ）参照レベルと比べたＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物の発現のレベル減少を含むことが決定されている、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本願は、２０１５年３月４日に提出された米国仮出願第６２／１２８，４８０号に対する優先権の利益を主張する。この出願の内容全体は、ここに参考として援用される。
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって授与された助成金番号Ｒ０１  ＣＡ１３６５４９およびＵ５４  ＣＡ１５１６６８の下での政府支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、全般的には、薬およびがん生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、ＴＰ５３のヘミ接合性喪失を保有するがんを処置する方法に関係する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
周知の腫瘍サプレッサー遺伝子であるＴＰ５３は、ヒト腫瘍の大部分において変異または欠失によって高頻度で不活性化されている（Petitgeanら、２００７年；Vazquezら、２００８年）。がん療法において、ｐ５３活性を回復するために多大な労力が払われてきた（Chene、２００３年；Wadeら、２０１３年）。野生型ｐ５３を発現するアデノウイルスベクターを使用した遺伝子療法が、いくつかの治験において活性を示した一方、全ての腫瘍細胞への、ばらつきがあり不十分な遺伝子送達およびアデノウイルスに対する宿主抗体の存在は、その臨床使用を限定した（Laneら、２０１０年；HauptおよびHaupt、２００４年）。ｐ５３活性をブーストする多数の小分子化合物も開発された。しかし、これらの物質は、野生型ｐ５３を保有するヒトがんにしか適用できない（Cheokら、２０１１年；Goldsteinら、２０１１年）。しかし、ｐ５３調節因子の複雑さおよびその不十分な薬物適用性（drugability）のため、有効なｐ５３に基づく療法を臨床的がん処置へと橋渡しすることに成功していない。そのため、ｐ５３欠損がんを処置するための新たな戦略が必要とされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Petitjeanら,  “Impact  of  mutant  p53  functional  properties  on  TP53  mutation  patterns  and  tumor  phenotype:  lessons  from  recent  developments  in  the  IARC  TP53  database,”  Hum.  Mutat.,  28(6):622,  2007.
【非特許文献２】Vazquezら,  “The  genetics  of  the  p53  pathway,  apoptosis  and  cancer  therapy,”  Nat.  Rev.  Drug  Discov.,  7(12):979,  2008.
【非特許文献３】Chene,  “Inhibiting  the  p53-MDM2  interaction:  an  important  target  for  cancer  therapy,”  Nat.  Rev.  Cancer,  3(2):102,  2003.
【非特許文献４】Wadeら,  "MDM2,  MDMX  and  p53  in  oncogenesis  and  cancer  therapy,”  Nat.  Rev.  Cancer,  13(2):83,  2013.
【非特許文献５】Laneら,  “p53-based  cancer  therapy,”  Cold  Spring  Harb.  Perspect.  Biol.,  2(9):a001222,  2010.
【非特許文献６】HauptおよびHaupt,  “Manipulation  of  the  tumor  suppressor  p53  for  potentiating  cancer  therapy,”  Semin.  Cancer  Biol.,  14(4):244,  2004.
【非特許文献７】Cheokら,  “Translating  p53  into  the  clinic,”  Nat.  Rev.  Clin.  Oncol.,  8(1):25,  2011.
【非特許文献８】Goldsteinら,  “Understanding  wild-type  and  mutant  p53  activities  in  human  cancer:  new  landmarks  on  the  way  to  targeted  therapies,”  Cancer  Gene  Ther.,  18(1):2,  2011.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一部の実施形態では、（ｉ）ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失；（ｉｉ）ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失；および／または（ｉｉｉ）参照発現レベル（例えば、非がん性試料における発現レベル）と比べたＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物の発現のレベル減少を示すがん細胞を有する患者を処置する方法であって、治療有効量のＰＯＬＲ２Ａ阻害剤をかかる患者に投与するステップを含む方法が提供される。ある特定の態様では、患者は、ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失を示すがん細胞を有する。ある特定の態様では、患者は、ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失を示すがん細胞を有する。ある特定の態様では、患者は、参照発現レベルと比べたＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物の発現のレベル減少を示すがん細胞を有する。
【０００６】
ある特定の態様では、ＰＯＬＲ２Ａ阻害剤は、ＰＯＬＲ２Ａタンパク質の発現を阻害する核酸を含む。ある特定の態様では、ＰＯＬＲ２Ａ阻害剤は、アルファ−アマニチンを含む。一部の態様では、アルファ−アマニチンは、がん細胞を標的とする抗体（例えば、腫瘍関連抗原抗体）等の抗体にコンジュゲートされている。一部の態様では、抗体は、ＥｐＣＡＭ特異的抗体であり得る。
【０００７】
ある特定の態様では、ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物は、ｍＲＮＡである。ｍＲＮＡの発現のレベルは、ノーザンブロッティング、逆転写定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）、ヌクレアーゼプロテクション、トランスクリプトーム解析、ハイブリダイゼーションアッセイ、チップに基づく発現プラットフォームまたはインベーダー（invader）ＲＮＡアッセイプラットフォームによって決定することができる。ある特定の態様では、ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物は、タンパク質である。タンパク質の発現のレベルは、質量分析、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫組織化学的検査またはラジオイムノアッセイによって決定することができる。ある特定の態様では、ゲノムコピー数を検出して、ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失またはＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失を決定する。一部の態様では、ゲノムコピー数は、ゲノムハイブリダイゼーション技法（例えば、ＦＩＳＨ解析）、ＰＣＲ解析（例えば、リアルタイムＰＣＲ）または制限断片解析によって決定される。
【０００８】
ある特定の態様では、がんは、肺がん、脳がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、結腸直腸がん、前立腺がんまたは膵臓がんである。ある特定の態様では、がんは、転移性、再発性または多剤耐性である。
【０００９】
ある特定の態様では、本方法は、少なくとも第２の抗がん療法を被験体に投与するステップをさらに含む。ある特定の態様では、第２の抗がん療法は、外科的療法、化学療法、放射線療法、寒冷療法、ホルモン療法、毒素療法、免疫療法またはサイトカイン療法である。ある特定の態様では、化学療法は、５−フルオロウラシル、オキサリプラチンまたはＳＮ−３８である。
【００１０】
ある特定の態様では、患者は、ヒトである。ある特定の態様では、患者は、非ヒト哺乳動物である。
【００１１】
ある特定の態様では、患者は、少なくとも再度（second  time）処置される。ある特定の態様では、患者は、１週間〜６ヶ月間の期間にわたって処置される。ある特定の態様では、患者は、少なくとも１ラウンドの抗がん療法を以前に受けたことがある。
【００１２】
一部の実施形態では、がんを有する患者を処置する方法であって、（ａ）（ｉ）ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失；（ｉｉ）ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失；および／または（ｉｉｉ）参照レベルと比べたＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物の発現レベルの減少を含むがん細胞を有すると決定された患者を選択するステップと、（ｂ）治療有効量のＰＯＬＲ２Ａ阻害剤を患者に投与するステップとを含む方法が提供される。
【００１３】
ある特定の態様では、患者を選択するステップは、がんの試料を得るステップと、がんの細胞が、（ｉ）ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失；（ｉｉ）ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失；および／または（ｉｉｉ）参照レベルと比べたＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物の発現レベルの減少を含むかどうかを決定するステップとを含む。ある特定の態様では、本方法は、決定に関する報告を提供するステップをさらに含む。ある特定の態様では、報告は、書面または電子の報告である。ある特定の態様では、報告は、患者、医療費支払者（health  care  payer）、医師、保険代理人または電子システムに提供される。
【００１４】
ある特定の態様では、患者を選択するステップは、がんの細胞が、（ｉ）ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失；（ｉｉ）ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失；および／または（ｉｉｉ）参照レベルと比べたＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物の発現のレベル減少を含むかどうかを決定する検査の結果を得るステップを含む。
【００１５】
ある特定の態様では、がんの細胞は、ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失を含む。ある特定の態様では、がんの細胞は、ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失を含む。ある特定の態様では、がんの細胞は、参照レベル（例えば、非がん性試料における発現レベル）と比べたＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物の発現のレベル減少を含む。
【００１６】
一部の実施形態では、がん患者のための薬物療法を選択する方法であって、（ａ）がんの試料を得るステップと、（ｂ）がんの細胞における（ｉ）ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失；（ｉｉ）ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失；および／または（ｉｉｉ）参照レベルと比べたＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物の発現のレベル減少の存在を検出するステップと、（ｃ）がんの細胞において（ｉ）ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失が検出される；（ｉｉ）ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失が検出される；および／または（ｉｉｉ）参照レベルと比べたＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物の発現のレベル減少が検出される場合、ＰＯＬＲ２Ａ阻害剤を選択するステップとを含む方法が提供される。
【００１７】
ある特定の態様では、本方法は、治療有効量のＰＯＬＲ２Ａ阻害剤を患者に投与するステップをさらに含む。
【００１８】
ある特定の態様では、がんの細胞は、ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失を含む。ある特定の態様では、がんの細胞は、ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失を含む。ある特定の態様では、がんの細胞は、参照レベル（例えば、非がん性試料における発現レベル）と比べたＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物の発現のレベル減少を含む。
【００１９】
一部の実施形態では、被験体におけるがんの処置における使用のためのＰＯＬＲ２Ａ阻害剤を含む組成物であって、がんの細胞が、（ｉ）ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失；（ｉｉ）ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失；または（ｉｉｉ）参照レベル（例えば、非がん性試料の細胞における発現レベル）と比べたＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物の発現のレベル減少を含むことが決定されている、組成物が提供される。
【００２０】
一部の実施形態では、がんの処置のための医薬の製造におけるＰＯＬＲ２Ａ阻害剤の使用であって、がんの細胞が、（ｉ）ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性喪失；（ｉｉ）ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失；または（ｉｉｉ）参照レベル（例えば、非がん性試料の細胞における発現レベル）と比べたＰＯＬＲ２Ａ遺伝子産物の発現のレベル減少を含むことが決定されている、使用が提供される。
【００２１】
本明細書において使用する場合、「を基本的に含まない」は、指定された構成成分の観点から、指定された構成成分のいずれも、組成物において意図的に製剤化されていない、および／またはそれが単なる夾雑物としてもしくは微量で存在することを意味するように本明細書で使用されている。組成物のいずれか意図されない混入に起因する指定された構成成分の総量は、したがって、０．０５％をはるかに下回り、好ましくは、０．０１％を下回る。指定された構成成分の量を標準分析方法により検出することができない組成物が最も好ましい。
【００２２】
本明細書において、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１または複数を意味することができる。本明細書の請求項（単数または複数）において使用する場合、単語「を含む（comprising）」と併せて使用される場合、単語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１または１より大を意味することができる。
【００２３】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、選択肢のみを指すことまたは選択肢が相互排他的であることを明確に示さない限り、「および／または」を意味するように使用されているが、本開示は、選択肢のみおよび「および／または」を指す規定を支持する。本明細書において使用する場合、「別の」は、少なくとも第２のまたはそれを超える数のものを意味することができる。
【００２４】
本願を通して、用語「約」は、値が、この値の決定に用いられている装置、方法に固有の誤差変動、または研究対象の間に存在する変動を含むことを示すように使用されている。
【００２５】
本発明の他の目的、特色および利点は、次の詳細な説明から明らかである。しかし、本発明の精神および範囲内の様々な変更および修正が、この詳細な説明から当業者に明らかであり得るため、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、単なる例示として提示されていることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
以下の図は本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、これらの図の１つまたは複数を本明細書で提示されている特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、よりよく理解することができる。
【００２７】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｈ。ＰＯＬＲ２Ａの発現は遺伝子コピー数と相関するが、ＴＰ５３の発現は遺伝子コピー数と相関しない。（図１Ａ）ＴＣＧＡデータベースの解析は、種々のヒトがんにおけるＴＰ５３遺伝子座のヘミ接合性欠失の頻度を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｈ。ＰＯＬＲ２Ａの発現は遺伝子コピー数と相関するが、ＴＰ５３の発現は遺伝子コピー数と相関しない。（図１Ｂ）ヒトゲノムにおいてＴＰ５３に隣接する遺伝子の模式図。
【図１Ｃ】図１Ａ〜Ｈ。ＰＯＬＲ２Ａの発現は遺伝子コピー数と相関するが、ＴＰ５３の発現は遺伝子コピー数と相関しない。（図１Ｃ）ＴＰ５３のヘミ接合性喪失を保有する結腸直腸腫瘍におけるＰＯＬＲ２Ａの随伴性欠失（concomitant  deletion）。
【図１Ｄ】図１Ａ〜Ｈ。ＰＯＬＲ２Ａの発現は遺伝子コピー数と相関するが、ＴＰ５３の発現は遺伝子コピー数と相関しない。（図１Ｄ）ＴＣＧＡにおける臨床結腸直腸腫瘍およびＣＣＬＥにおけるがん細胞株についてのＰＯＬＲ２Ａコピー数対ｍＲＮＡ発現の散布図。線形回帰およびピアソン相関係数（ｒ）が表示されている。
【図１Ｅ】図１Ａ〜Ｈ。ＰＯＬＲ２Ａの発現は遺伝子コピー数と相関するが、ＴＰ５３の発現は遺伝子コピー数と相関しない。（図１Ｅ）マッチした正常組織試料およびＣＲＣ組織試料におけるＰＯＬＲ２Ａタンパク質レベルの定量（中立またはヘミ接合性−喪失ＰＯＬＲ２Ａ）。
【図１Ｆ】図１Ａ〜Ｈ。ＰＯＬＲ２Ａの発現は遺伝子コピー数と相関するが、ＴＰ５３の発現は遺伝子コピー数と相関しない。（図１Ｆ）ヒトＣＲＣ細胞株におけるＰＯＬＲ２ＡおよびＴＰ５３のコピー数変動。左の柱はＴＰ５３であり；右の柱はＰＯＬＲ２Ａである。
【図１Ｇ】図１Ａ〜Ｈ。ＰＯＬＲ２Ａの発現は遺伝子コピー数と相関するが、ＴＰ５３の発現は遺伝子コピー数と相関しない。（図１Ｇ）ＣＲＣ細胞株におけるＰＯＬＲ２Ａの相対発現レベル（ＨＣＴ１１６に対して正規化）。
【図１Ｈ】図１Ａ〜Ｈ。ＰＯＬＲ２Ａの発現は遺伝子コピー数と相関するが、ＴＰ５３の発現は遺伝子コピー数と相関しない。（図１Ｈ）ＣＲＣ細胞株におけるＰＯＬＲ２Ａ、ｐ５３およびβ−アクチンのタンパク質レベル。
【００２８】
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｊ。ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞は、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対し高度に感受性である。（図２Ａ）ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞（ＳＷ８３７、ＳＮＵ２８３）は、ＰＯＬＲ２Ａ中立細胞（ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０）よりも、α−アマニチン処理に対して有意に感受性が高い。細胞のクリスタルバイオレット染色が示されている。
【図２Ｂ】図２Ａ〜Ｊ。ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞は、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対し高度に感受性である。（図２Ｂ）α−アマニチン処理によるＰＯＬＲ２Ａ中立およびＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞の細胞増殖。
【図２Ｃ】図２Ａ〜Ｊ。ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞は、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対し高度に感受性である。（図２Ｃ）ＰＯＬＲ２ＡのＤｏｘ誘導性抑制は、ＳＮＵ２８３細胞の増殖を阻害したが、ＨＣＴ１１６細胞の増殖は阻害しなかった。
【図２Ｄ】図２Ａ〜Ｊ。ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞は、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対し高度に感受性である。（図２Ｄ）Ｄｏｘ誘導性ＰＯＬＲ２Ａ  ｓｈＲＮＡを発現するＨＣＴ１１６細胞およびＳＮＵ２８３細胞におけるＰＯＬＲ２Ａ  ｍＲＮＡ発現および細胞増殖の間の相関。データは、平均±ＳＤを表す。左の柱はＰＯＬＲ２Ａ  ｍＲＮＡであり；右の柱は増殖である。
【図２Ｅ】図２Ａ〜Ｊ。ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞は、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対し高度に感受性である。（図２Ｅおよび図２Ｆ）増加量のＰＯＲＬ２Ａ発現ベクターＤＮＡによるトランスフェクション後の、増加用量のα−アマニチン処理に応答したＳＵＮ２８３およびＳＷ８３７細胞の生存曲線。
【図２Ｆ】図２Ａ〜Ｊ。ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞は、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対し高度に感受性である。（図２Ｅおよび図２Ｆ）増加量のＰＯＲＬ２Ａ発現ベクターＤＮＡによるトランスフェクション後の、増加用量のα−アマニチン処理に応答したＳＵＮ２８３およびＳＷ８３７細胞の生存曲線。
【図２Ｇ】図２Ａ〜Ｊ。ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞は、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対し高度に感受性である。（図２Ｇ）ＰＯＬＲ２Ａ喪失ＨＣＴ１１６細胞は、親ＰＯＬＲ２Ａ中立ＨＣＴ１１６細胞よりも、α−アマニチン処理に対して有意に感受性が高い。細胞のクリスタルバイオレット染色が示されている。
【図２Ｈ】図２Ａ〜Ｊ。ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞は、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対し高度に感受性である。（図２Ｈ）α−アマニチンで処理したＰＯＬＲ２Ａ中立ＨＣＴ１１６細胞およびＰＯＬＲ２Ａ喪失ＨＣＴ１１６細胞の細胞増殖。
【図２Ｉ】図２Ａ〜Ｊ。ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞は、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対し高度に感受性である。（図２Ｉおよび図２Ｊ）ＰＯＬＲ２Ａ中立ＨＣＴ１１６細胞およびＰＯＬＲ２Ａ喪失ＨＣＴ１１６細胞におけるＰＯＬＲ２Ａ  ｍＲＮＡ発現および細胞増殖（図２Ｉ；左の柱はＰＯＬＲ２Ａ  ｍＲＮＡであり；右の柱は増殖である）またはアポトーシス（図２Ｊ；左の柱はｓｈＣｔｒｌであり；中央の柱はｓｈＲＮＡ−１であり；右の柱はｓｈＲＮＡ−２である）の間の相関。データは、平均±ＳＤを表す。
【図２Ｊ】図２Ａ〜Ｊ。ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞は、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対し高度に感受性である。（図２Ｉおよび図２Ｊ）ＰＯＬＲ２Ａ中立ＨＣＴ１１６細胞およびＰＯＬＲ２Ａ喪失ＨＣＴ１１６細胞におけるＰＯＬＲ２Ａ  ｍＲＮＡ発現および細胞増殖（図２Ｉ；左の柱はＰＯＬＲ２Ａ  ｍＲＮＡであり；右の柱は増殖である）またはアポトーシス（図２Ｊ；左の柱はｓｈＣｔｒｌであり；中央の柱はｓｈＲＮＡ−１であり；右の柱はｓｈＲＮＡ−２である）の間の相関。データは、平均±ＳＤを表す。
【００２９】
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｅ。ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対するＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞の感受性は、ｐ５３に非依存的である。（図３Ａ）同質遺伝子的ヒト原発性結腸直腸がんｘｈＣＲＣ細胞株のパネルにおけるＰＯＬＲ２Ａ、ｐ５３、ＥｐＣＡＭおよびβ−アクチンのタンパク質レベル。
【図３Ｂ】図３Ａ〜Ｅ。ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対するＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞の感受性は、ｐ５３に非依存的である。（図３Ｂ）ＰＯＬＲ２Ａ中立およびＰＯＬＲ２Ａ喪失ｘｈＣＲＣ細胞の成長曲線。
【図３Ｃ】図３Ａ〜Ｅ。ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対するＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞の感受性は、ｐ５３に非依存的である。（図３Ｃ）α−アマニチンで処理したＰＯＬＲ２Ａ中立およびＰＯＬＲ２Ａ喪失ｘｈＣＲＣ細胞の細胞増殖。
【図３Ｄ】図３Ａ〜Ｅ。ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対するＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞の感受性は、ｐ５３に非依存的である。（図３Ｄ）α−アマニチン処理と組み合わせたまたは組み合わせていない、５−ＦＵ、オキサリプラチン（Ｏｘａ）またはＳＮ−３８処理に対するＰＯＬＲ２Ａ中立およびＰＯＬＲ２Ａ喪失ｘｈＣＲＣ細胞の感受性。
【図３Ｅ】図３Ａ〜Ｅ。ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対するＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞の感受性は、ｐ５３に非依存的である。（図３Ｅ）様々な濃度のａｍａ−ＨＥＡ１２５（抗ＥｐＣＡＭ）抗体−薬物コンジュゲートで処理したＰＯＬＲ２Ａ中立およびＰＯＬＲ２Ａ喪失ｘｈＣＲＣ細胞の細胞増殖。
【００３０】
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｅ。ＰＯＬＲ２Ａの抑制は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍成長を選択的に阻害する。（図４Ａ）皮下に植え込まれたＨＣＴ１１６細胞（１×１０６個の細胞）およびＳＮＵ２８３細胞（２×１０６個の細胞）に由来する異種移植腫瘍の成長曲線。どちらの細胞株も、対照またはＤｏｘ誘導性ＰＯＬＲ２Ａ  ｓｈＲＮＡを発現する。腫瘍（１００ｍｍ３）の初期確立後に、マウスを、飲料水中１μｇ  ｍｌ−１のＤｏｘで処置した。１群当たりｎ＝５匹のマウス。
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｅ。ＰＯＬＲ２Ａの抑制は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍成長を選択的に阻害する。（図４Ｂおよび図４Ｃ）Ｄｏｘ誘導性対照またはＰＯＬＲ２Ａ  ｓｈＲＮＡを発現する、同所性に植え込まれたＰＯＬＲ２Ａ中立ＨＣＴ１１６細胞およびＰＯＬＲ２Ａ喪失ＨＣＴ１１６細胞（１×１０６個の細胞を注射）に由来する異種移植腫瘍の腫瘍成長曲線（図４Ｂ）。腫瘍の初期確立後に、マウスを、飲料水中１μｇ  ｍｌ−１のＤｏｘで処置した。腫瘍重量（図４Ｃ）を測定した（１群当たりｎ＝５匹のマウス）。＊＊ｐ＜０．０１。
【図４Ｃ】図４Ａ〜Ｅ。ＰＯＬＲ２Ａの抑制は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍成長を選択的に阻害する。（図４Ｂおよび図４Ｃ）Ｄｏｘ誘導性対照またはＰＯＬＲ２Ａ  ｓｈＲＮＡを発現する、同所性に植え込まれたＰＯＬＲ２Ａ中立ＨＣＴ１１６細胞およびＰＯＬＲ２Ａ喪失ＨＣＴ１１６細胞（１×１０６個の細胞を注射）に由来する異種移植腫瘍の腫瘍成長曲線（図４Ｂ）。腫瘍の初期確立後に、マウスを、飲料水中１μｇ  ｍｌ−１のＤｏｘで処置した。腫瘍重量（図４Ｃ）を測定した（１群当たりｎ＝５匹のマウス）。＊＊ｐ＜０．０１。
【図４Ｄ】図４Ａ〜Ｅ。ＰＯＬＲ２Ａの抑制は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍成長を選択的に阻害する。（図４Ｄおよび図４Ｅ）抗ＥｐＣＡＭ抗体（３．６ｍｇ  ｋｇ−１）またはａｍａ−ＨＥＡ１２５抗体−薬物コンジュゲート（３、１０、３０および９０μｇ  ｋｇ−１、これは、０．１２、０．４、１．２および３．６ｍｇ  ＩｇＧ  ｋｇ−１に対応）の二重腹腔内注射を与えた、同所性に植え込まれたＰＯＬＲ２Ａ中立ＨＣＴ１１６細胞およびＰＯＬＲ２Ａ喪失ＨＣＴ１１６細胞（図４Ｄ；１．０×１０６個の細胞を注射）またはｘｈＣＲＣ細胞（図４Ｅ；０．５×１０６個の細胞を注射）に由来する異種移植された腫瘍の腫瘍成長曲線。１群当たりｎ＝１０匹のマウス。
【図４Ｅ】図４Ａ〜Ｅ。ＰＯＬＲ２Ａの抑制は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍成長を選択的に阻害する。（図４Ｄおよび図４Ｅ）抗ＥｐＣＡＭ抗体（３．６ｍｇ  ｋｇ−１）またはａｍａ−ＨＥＡ１２５抗体−薬物コンジュゲート（３、１０、３０および９０μｇ  ｋｇ−１、これは、０．１２、０．４、１．２および３．６ｍｇ  ＩｇＧ  ｋｇ−１に対応）の二重腹腔内注射を与えた、同所性に植え込まれたＰＯＬＲ２Ａ中立ＨＣＴ１１６細胞およびＰＯＬＲ２Ａ喪失ＨＣＴ１１６細胞（図４Ｄ；１．０×１０６個の細胞を注射）またはｘｈＣＲＣ細胞（図４Ｅ；０．５×１０６個の細胞を注射）に由来する異種移植された腫瘍の腫瘍成長曲線。１群当たりｎ＝１０匹のマウス。
【００３１】
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｂ。ＰＯＬＲ２Ａの発現は、ヒト結腸腫瘍におけるその遺伝子コピー数と相関する。ヒト結腸組織マイクロアレイにおける第１７染色体セントロメアに対するプローブおよびＰＯＬＲ２Ａに対する遺伝子座特異的プローブを使用して、２色ＦＩＳＨ解析を行った。ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失を決定し、結果を表２に示す。（図５Ａ）ヒト結腸正常、ＰＯＬＲ２Ａ−中立または−喪失腫瘍組織試料におけるＰＯＬＲ２Ａ発現の定量。エラーバー、ｓ．ｄ．。
【図５Ｂ】図５Ａ〜Ｂ。ＰＯＬＲ２Ａの発現は、ヒト結腸腫瘍におけるその遺伝子コピー数と相関する。ヒト結腸組織マイクロアレイにおける第１７染色体セントロメアに対するプローブおよびＰＯＬＲ２Ａに対する遺伝子座特異的プローブを使用して、２色ＦＩＳＨ解析を行った。ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失を決定し、結果を表２に示す。（図５Ｂ）マッチした正常組織試料およびＣＲＣ組織試料におけるＰＯＬＲ２Ａおよびβ−アクチンのタンパク質レベル。
【００３２】
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｃ。ＴＰ５３の発現は、その遺伝子コピー数に関連しない。（図６Ａおよび図６Ｂ）ＴＣＧＡデータベースの結腸直腸腫瘍におけるＴＰ５３コピー数対タンパク質発現（図６Ａ）またはｍＲＮＡ発現（図６Ｂ）の散布図。ピアソン相関係数（ｒ）およびｐ値が表示されている。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｃ。ＴＰ５３の発現は、その遺伝子コピー数に関連しない。（図６Ａおよび図６Ｂ）ＴＣＧＡデータベースの結腸直腸腫瘍におけるＴＰ５３コピー数対タンパク質発現（図６Ａ）またはｍＲＮＡ発現（図６Ｂ）の散布図。ピアソン相関係数（ｒ）およびｐ値が表示されている。
【図６Ｃ】図６Ａ〜Ｃ。ＴＰ５３の発現は、その遺伝子コピー数に関連しない。（図６Ｃ）結腸直腸がん細胞株におけるＴＰ５３の相対ｍＲＮＡ発現（ＨＣＴ１１６細胞株における発現に対して正規化）。データは、３回の独立した実験の平均およびｓ．ｄ．である。
【００３３】
【図７Ａ】図７Ａ〜Ｇ。ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞は、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対し高度に感受性である。（図７Ａ）アクチノマイシンＤで処理したＰＯＬＲ２Ａ中立およびＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞の細胞増殖。
【図７Ｂ】図７Ａ〜Ｇ。ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞は、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対し高度に感受性である。（図７Ｂ）ＨＣＴ１１６細胞、ＳＷ４８０細胞、ＳＷ８３７細胞およびＳＮＵ２８３細胞におけるＰＯＬＲ２Ａ特異的ｓｈＲＮＡのノックダウン効率。
【図７Ｃ】図７Ａ〜Ｇ。ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞は、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対し高度に感受性である。（図７Ｃ）４種の結腸直腸がん細胞株の増殖におけるＰＯＬＲ２Ａノックダウンの効果。ＧＦＰおよび対照またはＰＯＬＲ２Ａ特異的ｓｈＲＮＡを発現する細胞を選別し、対照ＧＦＰ陰性細胞と混合し（１：１）、ＧＦＰ陽性細胞を、継代２、４および６において定量した。＊＊ｐ＜０．０１、ｎｓ：有意でない。
【図７Ｄ】図７Ａ〜Ｇ。ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞は、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対し高度に感受性である。（図７Ｄ）Ｄｏｘ誘導性ＰＯＬＲ２Ａ  ｓｈＲＮＡを発現するＨＣＴ１１６細胞およびＳＮＵ２８３細胞におけるＰＯＬＲ２Ａおよびβ−アクチンのタンパク質レベル（１．０μｇ  ｍｌ−１Ｄｏｘ）。
【図７Ｅ】図７Ａ〜Ｇ。ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞は、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対し高度に感受性である。（図７Ｅ）３００ｎｇ  ｍｌ−１Ｄｏｘの存在下でＤｏｘ誘導性ＰＯＬＲ２Ａ  ｓｈＲＮＡを発現するＨＣＴ１１６細胞およびＳＮＵ２８３細胞の細胞増殖。＊＊ｐ＜０．０１。
【図７Ｆ】図７Ａ〜Ｇ。ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞は、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対し高度に感受性である。（図７Ｆおよび図７Ｇ）対照またはＰＯＬＲ２Ａ  ｓｈＲＮＡ発現ＨＣＴ１１６細胞およびＳＮＵ２８３細胞の細胞周期プロファイル（図７Ｆ；各柱の上部分はＧ２／Ｍであり；各柱の中央部分はＳであり；各柱の下部分はＧ０／Ｇ１である）およびアポトーシス（図７Ｇ）。＊＊ｐ＜０．０１。データは、３回の独立した実験の平均およびｓ．ｄ．である。
【図７Ｇ】図７Ａ〜Ｇ。ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞は、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対し高度に感受性である。（図７Ｆおよび図７Ｇ）対照またはＰＯＬＲ２Ａ  ｓｈＲＮＡ発現ＨＣＴ１１６細胞およびＳＮＵ２８３細胞の細胞周期プロファイル（図７Ｆ；各柱の上部分はＧ２／Ｍであり；各柱の中央部分はＳであり；各柱の下部分はＧ０／Ｇ１である）およびアポトーシス（図７Ｇ）。＊＊ｐ＜０．０１。データは、３回の独立した実験の平均およびｓ．ｄ．である。
【００３４】
【図８Ａ】図８Ａ〜Ｂ。ＰＯＬＲ２Ａの異所性発現は、α−アマニチン処理に対するＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞の抵抗性を回復させる。（図８Ａ）増加量の外因的ＰＯＬＲ２Ａを発現するＳＮＵ２８３細胞およびＳＷ８３７細胞におけるＰＯＬＲ２Ａおよびβ−アクチンのタンパク質レベル。
【図８Ｂ】図８Ａ〜Ｂ。ＰＯＬＲ２Ａの異所性発現は、α−アマニチン処理に対するＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞の抵抗性を回復させる。（図８Ｂ）増加量のＰＯＬＲ２Ａ発現ベクターＤＮＡによるトランスフェクション後に増加用量のα−アマニチンで処理したＳＮＵ２８３細胞およびＳＷ８３７細胞のクリスタルバイオレット染色。
【００３５】
【図９Ａ】図９Ａ〜Ｈ。ＰＯＬＲ２Ａの単一アレルノックアウトは、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対しＨＣＴ１１６細胞を感受性にする。（図９Ａ）ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子におけるＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ標的化部位の概略図。２種のｓｇＲＮＡ標的化配列が示されており（矢印は、方向性を示す；配列は、配列番号２５〜２６として提供されている）、プロトスペーサー（protospacer）隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列は、各配列の最後の３ヌクレオチドである。
【図９Ｂ】図９Ａ〜Ｈ。ＰＯＬＲ２Ａの単一アレルノックアウトは、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対しＨＣＴ１１６細胞を感受性にする。（図９Ｂ）Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって測定された、ＨＣＴ１１６細胞におけるＰＯＬＲ２ＡのＣａｓ９媒介性切断の効率。
【図９Ｃ】図９Ａ〜Ｈ。ＰＯＬＲ２Ａの単一アレルノックアウトは、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対しＨＣＴ１１６細胞を感受性にする。（図９Ｃ）コロニー１４および５の細胞における変異体ＰＯＬＲ２Ａアレルの配列（配列は、配列番号２７〜３０として提供されている）。
【図９Ｄ】図９Ａ〜Ｈ。ＰＯＬＲ２Ａの単一アレルノックアウトは、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対しＨＣＴ１１６細胞を感受性にする。（図９Ｄ）ＰＯＬＲ２Ａ中立ＨＣＴ１１６細胞およびＰＯＬＲ２Ａ喪失ＨＣＴ１１６細胞におけるＰＯＬＲ２Ａおよびβ−アクチンのタンパク質レベル。
【図９Ｅ】図９Ａ〜Ｈ。ＰＯＬＲ２Ａの単一アレルノックアウトは、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対しＨＣＴ１１６細胞を感受性にする。（図９Ｅ）ＰＯＬＲ２Ａ中立ＨＣＴ１１６細胞およびＰＯＬＲ２Ａ喪失ＨＣＴ１１６細胞の成長曲線。
【図９Ｆ】図９Ａ〜Ｈ。ＰＯＬＲ２Ａの単一アレルノックアウトは、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対しＨＣＴ１１６細胞を感受性にする。（図９Ｆ）アクチノマイシンＤで処理したＰＯＬＲ２Ａ中立およびＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞の相対増殖。
【図９Ｇ】図９Ａ〜Ｈ。ＰＯＬＲ２Ａの単一アレルノックアウトは、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対しＨＣＴ１１６細胞を感受性にする。（図９Ｇ）ＰＯＬＲ２Ａ中立ＨＣＴ１１６細胞およびＰＯＬＲ２Ａ喪失ＨＣＴ１１６細胞におけるＰＯＬＲ２Ａノックダウンの効果。図７Ｃに記載されている通りに実験を行った。＊＊ｐ＜０．０１、ｎｓ：有意にでない。
【図９Ｈ】図９Ａ〜Ｈ。ＰＯＬＲ２Ａの単一アレルノックアウトは、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対しＨＣＴ１１６細胞を感受性にする。（図９Ｈ）ＰＯＬＲ２ＡのＤｏｘ誘導性部分的抑制は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失ＨＣＴ１１６細胞の成長を阻害したが、親ＰＯＬＲ２Ａ中立ＨＣＴ１１６細胞の成長は阻害しなかった。データは、３回の独立した実験の平均およびｓ．ｄ．である。
【００３６】
【図１０Ａ】図１０Ａ〜Ｇ。ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対するＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞の感受性は、ｐ５３に非依存的である。（図１０Ａ）ＴＰ５３遺伝子におけるＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ標的化部位の概略図。２種のｓｇＲＮＡ標的化配列が示されており（矢印は、方向性を示す；配列は、配列番号３１〜３２として提供されている）、ＰＡＭ配列は、各配列の最後の３ヌクレオチドである。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜Ｇ。ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対するＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞の感受性は、ｐ５３に非依存的である。（図１０Ｂ）Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって測定された、ＨＣＴ１１６細胞におけるＴＰ５３のＣａｓ９媒介性切断の効率。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜Ｇ。ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対するＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞の感受性は、ｐ５３に非依存的である。（図１０Ｃ）同質遺伝子的ＨＣＴ１１６細胞のパネルにおけるＰＯＬＲ２Ａ、ｐ５３およびβ−アクチンのタンパク質レベル。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜Ｇ。ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対するＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞の感受性は、ｐ５３に非依存的である。（図１０Ｄ）ＰＯＬＲ２Ａ中立ＨＣＴ１１６細胞およびＰＯＬＲ２Ａ喪失ＨＣＴ１１６細胞の成長曲線。
【図１０Ｅ】図１０Ａ〜Ｇ。ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対するＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞の感受性は、ｐ５３に非依存的である。（図１０Ｅおよび図１０Ｆ）α−アマニチン処理後のＰＯＬＲ２Ａ中立ＨＣＴ１１６細胞およびＰＯＬＲ２Ａ喪失ＨＣＴ１１６細胞のクリスタル染色画像（図１０Ｅ）および細胞生存曲線（図１０Ｆ）。
【図１０Ｆ】図１０Ａ〜Ｇ。ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対するＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞の感受性は、ｐ５３に非依存的である。（図１０Ｅおよび図１０Ｆ）α−アマニチン処理後のＰＯＬＲ２Ａ中立ＨＣＴ１１６細胞およびＰＯＬＲ２Ａ喪失ＨＣＴ１１６細胞のクリスタル染色画像（図１０Ｅ）および細胞生存曲線（図１０Ｆ）。
【図１０Ｇ】図１０Ａ〜Ｇ。ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対するＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞の感受性は、ｐ５３に非依存的である。（図１０Ｇ）ａｍａ−ＨＥＡ１２５処理に応答したＰＯＬＲ２Ａ中立ＨＣＴ１１６細胞およびＰＯＬＲ２Ａ喪失ＨＣＴ１１６細胞の細胞生存曲線。
【００３７】
【図１１Ａ】図１１Ａ〜Ｃ。ＰＯＬＲ２Ａの用量依存的抑制は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍における腫瘍形成を阻害するが、ＰＯＬＲ２Ａ中立腫瘍では阻害しない。（図１１Ａ）対照またはＰＯＬＲ２Ａ  ｓｈＲＮＡを発現する皮下に異種移植されたＨＣＴ１１６腫瘍およびＳＮＵ２８３腫瘍におけるＰＯＬＲ２Ａ  ｍＲＮＡ発現レベルの定量（１群当たりｎ＝５匹のマウス）。＊＊ｐ＜０．０１。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜Ｃ。ＰＯＬＲ２Ａの用量依存的抑制は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍における腫瘍形成を阻害するが、ＰＯＬＲ２Ａ中立腫瘍では阻害しない。（図１１Ｂ）免疫組織化学的染色により、視野当たりのＫｉ６７（細胞増殖）または切断型カスパーゼ−３（アポトーシス）が陽性の細胞、およびＰＯＬＲ２Ａ発現を定量した。＊＊ｐ＜０．０１。データは、平均およびｓ．ｄ．である。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜Ｃ。ＰＯＬＲ２Ａの用量依存的抑制は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍における腫瘍形成を阻害するが、ＰＯＬＲ２Ａ中立腫瘍では阻害しない。（図１１Ｃ）皮下に植え込まれたＰＯＬＲ２Ａ中立ＨＣＴ１１６細胞およびＰＯＬＲ２Ａ喪失ＨＣＴ１１６細胞（１×１０６個の細胞を注射）に由来する異種移植腫瘍の腫瘍サイズの定量。どちらの細胞株も、対照またはＤｏｘ誘導性ＰＯＬＲ２Ａ  ｓｈＲＮＡを発現する。腫瘍の初期確立後に（１００ｍｍ３）、マウスを、飲料水中（０．５、１および２μｇ  ｍｌ−１）Ｄｏｘで処置した。１群当たりｎ＝５匹のマウス。データは、平均およびｓ．ｄ．である。
【００３８】
【図１２Ａ】図１２Ａ〜Ｆ。ＤＯＰＣ被包ＰＯＬＲ２Ａ  ｓｉＲＮＡによるＰＯＬＲ２Ａの抑制は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍の成長を阻害する。（図１２Ａ）ＨＣＴ１１６細胞における対照ｓｉＲＮＡまたはＰＯＬＲ２Ａ  ｓｉＲＮＡ（＃１および＃２）のトランスフェクション後のＰＯＬＲ２Ａおよびβ−アクチンのウエスタンブロット。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜Ｆ。ＤＯＰＣ被包ＰＯＬＲ２Ａ  ｓｉＲＮＡによるＰＯＬＲ２Ａの抑制は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍の成長を阻害する。（図１２Ｂ）ＨＣＴ１１６細胞（１×１０６個の細胞）の同所性注射と、続くＤＯＰＣナノリポソーム処置間隔の概略図。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜Ｆ。ＤＯＰＣ被包ＰＯＬＲ２Ａ  ｓｉＲＮＡによるＰＯＬＲ２Ａの抑制は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍の成長を阻害する。（図１２Ｃおよび図１２Ｄ）対照（１，０００μｇ  ｋｇ−１）またはＰＯＬＲ２Ａ  ｓｉＲＮＡ（１２５、２５０、５００および１，０００μｇ  ｋｇ−１）の腹腔内注射を１週間に２回与えたＰＯＬＲ２Ａ中立ＨＣＴ１１６細胞およびＰＯＬＲ２Ａ喪失ＨＣＴ１１６細胞（図１２ＣはｓｉＰｏｌ２−１であり；図１２ＤはｓｉＰｏｌ２−２である）に由来する同所性異種移植腫瘍の腫瘍成長曲線。１群当たりｎ＝１０匹のマウス。
【図１２Ｄ】図１２Ａ〜Ｆ。ＤＯＰＣ被包ＰＯＬＲ２Ａ  ｓｉＲＮＡによるＰＯＬＲ２Ａの抑制は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍の成長を阻害する。（図１２Ｃおよび図１２Ｄ）対照（１，０００μｇ  ｋｇ−１）またはＰＯＬＲ２Ａ  ｓｉＲＮＡ（１２５、２５０、５００および１，０００μｇ  ｋｇ−１）の腹腔内注射を１週間に２回与えたＰＯＬＲ２Ａ中立ＨＣＴ１１６細胞およびＰＯＬＲ２Ａ喪失ＨＣＴ１１６細胞（図１２ＣはｓｉＰｏｌ２−１であり；図１２ＤはｓｉＰｏｌ２−２である）に由来する同所性異種移植腫瘍の腫瘍成長曲線。１群当たりｎ＝１０匹のマウス。
【図１２Ｅ】図１２Ａ〜Ｆ。ＤＯＰＣ被包ＰＯＬＲ２Ａ  ｓｉＲＮＡによるＰＯＬＲ２Ａの抑制は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍の成長を阻害する。（図１２Ｅおよび図１２Ｆ）対照またはＰＯＬＲ２Ａ  ｓｉＲＮＡ処置後の異種移植腫瘍におけるＰＯＬＲ２Ａおよびβ−アクチンの代表的なタンパク質レベル（図１２ＥはｓｉＰｏｌ２−１であり；図１２ＦはｓｉＰｏｌ２−２である）。
【図１２Ｆ】図１２Ａ〜Ｆ。ＤＯＰＣ被包ＰＯＬＲ２Ａ  ｓｉＲＮＡによるＰＯＬＲ２Ａの抑制は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍の成長を阻害する。（図１２Ｅおよび図１２Ｆ）対照またはＰＯＬＲ２Ａ  ｓｉＲＮＡ処置後の異種移植腫瘍におけるＰＯＬＲ２Ａおよびβ−アクチンの代表的なタンパク質レベル（図１２ＥはｓｉＰｏｌ２−１であり；図１２ＦはｓｉＰｏｌ２−２である）。
【００３９】
【図１３Ａ】図１３Ａ〜Ｄ。ＰＯＬＲ２Ａの抑制は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍成長を選択的に阻害する。（図１３Ａおよび図１３Ｂ）同所性に植え込まれたＨＣＴ１１６腫瘍（図１３Ａ）およびｘｈＣＲＣ腫瘍（図１３Ｂ）の腫瘍重量を測定した（１群当たりｎ＝１０匹のマウス）。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜Ｄ。ＰＯＬＲ２Ａの抑制は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍成長を選択的に阻害する。（図１３Ａおよび図１３Ｂ）同所性に植え込まれたＨＣＴ１１６腫瘍（図１３Ａ）およびｘｈＣＲＣ腫瘍（図１３Ｂ）の腫瘍重量を測定した（１群当たりｎ＝１０匹のマウス）。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜Ｄ。ＰＯＬＲ２Ａの抑制は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍成長を選択的に阻害する。（図１３Ｃおよび図１３Ｄ）体重（図１３Ｃ）、ならびに末梢血中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアルカリホスファターゼを含む肝臓酵素（図１３Ｄ）を、方法に記載されている通りに記録した。示されているデータは、各群における５匹のマウスの平均である。
【図１３Ｄ】図１３Ａ〜Ｄ。ＰＯＬＲ２Ａの抑制は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍成長を選択的に阻害する。（図１３Ｃおよび図１３Ｄ）体重（図１３Ｃ）、ならびに末梢血中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアルカリホスファターゼを含む肝臓酵素（図１３Ｄ）を、方法に記載されている通りに記録した。示されているデータは、各群における５匹のマウスの平均である。
【００４０】
【図１４Ａ】図１４Ａ〜Ｆ。ａｍａ−ＨＥＡ１２５によるＰＯＬＲ２Ａの抑制は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍の成長を阻害する。（図１４Ａ、図１４Ｃおよび図１４Ｅ）ＨＣＴ１１６細胞（図１４Ａ）、ＳＷ４８０細胞（図１４Ｃ）またはＳＷ８３７細胞（図１４Ｅ）におけるＰＯＬＲ２Ａおよびβ−アクチンのタンパク質レベル。これらの細胞株は、ＰＯＬＲ２Ａ−中立、ＰＯＬＲ２Ａ−喪失またはＰＯＬＲ２Ａ−回復である。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜Ｆ。ａｍａ−ＨＥＡ１２５によるＰＯＬＲ２Ａの抑制は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍の成長を阻害する。（図１４Ｂ、図１４Ｄおよび図１４Ｆ）表示されている対応する細胞に由来する同所性異種移植腫瘍の腫瘍成長曲線。これら全てに、抗ＥｐＣＡＭ抗体（３．６ｍｇ  ｋｇ−１）またはａｍａ−ＨＥＡ１２５抗体−薬物コンジュゲート（１０および９０μｇ  ｋｇ−１、これは、０．４および３．６ｍｇ  ＩｇＧ  ｋｇ−１に対応）の二重腹腔内注射を与えた。１群当たりｎ＝１０匹のマウス。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜Ｆ。ａｍａ−ＨＥＡ１２５によるＰＯＬＲ２Ａの抑制は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍の成長を阻害する。（図１４Ａ、図１４Ｃおよび図１４Ｅ）ＨＣＴ１１６細胞（図１４Ａ）、ＳＷ４８０細胞（図１４Ｃ）またはＳＷ８３７細胞（図１４Ｅ）におけるＰＯＬＲ２Ａおよびβ−アクチンのタンパク質レベル。これらの細胞株は、ＰＯＬＲ２Ａ−中立、ＰＯＬＲ２Ａ−喪失またはＰＯＬＲ２Ａ−回復である。
【図１４Ｄ】図１４Ａ〜Ｆ。ａｍａ−ＨＥＡ１２５によるＰＯＬＲ２Ａの抑制は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍の成長を阻害する。（図１４Ｂ、図１４Ｄおよび図１４Ｆ）表示されている対応する細胞に由来する同所性異種移植腫瘍の腫瘍成長曲線。これら全てに、抗ＥｐＣＡＭ抗体（３．６ｍｇ  ｋｇ−１）またはａｍａ−ＨＥＡ１２５抗体−薬物コンジュゲート（１０および９０μｇ  ｋｇ−１、これは、０．４および３．６ｍｇ  ＩｇＧ  ｋｇ−１に対応）の二重腹腔内注射を与えた。１群当たりｎ＝１０匹のマウス。
【図１４Ｅ】図１４Ａ〜Ｆ。ａｍａ−ＨＥＡ１２５によるＰＯＬＲ２Ａの抑制は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍の成長を阻害する。（図１４Ａ、図１４Ｃおよび図１４Ｅ）ＨＣＴ１１６細胞（図１４Ａ）、ＳＷ４８０細胞（図１４Ｃ）またはＳＷ８３７細胞（図１４Ｅ）におけるＰＯＬＲ２Ａおよびβ−アクチンのタンパク質レベル。これらの細胞株は、ＰＯＬＲ２Ａ−中立、ＰＯＬＲ２Ａ−喪失またはＰＯＬＲ２Ａ−回復である。
【図１４Ｆ】図１４Ａ〜Ｆ。ａｍａ−ＨＥＡ１２５によるＰＯＬＲ２Ａの抑制は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍の成長を阻害する。（図１４Ｂ、図１４Ｄおよび図１４Ｆ）表示されている対応する細胞に由来する同所性異種移植腫瘍の腫瘍成長曲線。これら全てに、抗ＥｐＣＡＭ抗体（３．６ｍｇ  ｋｇ−１）またはａｍａ−ＨＥＡ１２５抗体−薬物コンジュゲート（１０および９０μｇ  ｋｇ−１、これは、０．４および３．６ｍｇ  ＩｇＧ  ｋｇ−１に対応）の二重腹腔内注射を与えた。１群当たりｎ＝１０匹のマウス。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
例示的な実施形態の説明
本明細書に提示されている研究は、ＴＰ５３のゲノム欠失が、隣接する必須遺伝子を高頻度で包含し、ヘミ接合性ＴＰ５３欠失を有するがん細胞を、かかる遺伝子のさらなる抑制に対して脆弱にすることを実証する。ＰＯＬＲ２Ａは、多くの種類のヒトがんにおいて、ＴＰ５３と実質的に共欠失されるかかる必須ハウスキーピング遺伝子として同定される。この遺伝子は、α−アマニチンによって特異的に阻害される、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体の最大かつ触媒性のサブユニットをコードする（Bensaude、２０１１年；Lindellら、１９７０年）。したがって、ｐ５３またはその調節因子の薬理学的介入の代わりに、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対する副次的な脆弱性の原理は、がん療法の最新の戦略を提供する。
【００４２】
臨床試料ならびにＴｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）およびＣａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ（ＣＣＬＥ）におけるがん細胞株の本発明の解析は、ＰＯＬＲ２Ａ発現レベルが、ヒト結腸直腸腫瘍におけるその遺伝子コピー数と密接に相関することを明らかにする。α−アマニチン、低分子干渉ＲＮＡまたは低分子ヘアピン型ＲＮＡによるＰＯＬＲ２Ａの抑制は、ｐ５３非依存的様式で、ヘミ接合性ＴＰ５３喪失を有する結腸直腸がん細胞の増殖、生存および腫瘍形成能を選択的に阻害した。さらに、α−アマニチンによる本発明の前臨床試験は、結腸直腸がんを処置するための、α−アマニチンに基づく薬物またはＰＯＬＲ２Ａに対する阻害剤の治療有効性を予測し、これは、ＴＰ５３のヘミ接合性喪失を有する多くの種類のヒトがんに適用可能となる筈である。
【００４３】
α−アマニチンの以前の臨床適用は、その肝毒性のために限定されていた（Letschertら、２００６年）。遊離α−アマニチンは、肝細胞の膜に排他的に発現されるトランスポーターであるＯＡＴＰ１Ｂ３によって特異的に結合されるため、肝臓に対し毒性を有する（Letschertら、２００６年）。しかし、α−アマニチンは、特異的抗体とコンジュゲートされると、もはやＯＡＴＰ１Ｂ３の基質ではない（Letschertら、２００６年；Moldenhauerら、２０１２年；FaulstichおよびFiume、１９８５年）。ここで、低用量のα−アマニチン−抗体コンジュゲート（例えば、α−アマニチンにコンジュゲートされた抗ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）抗体）が、ＰＯＬＲ２Ａのヘミ接合性欠失を有するヒト結腸直腸がんのマウスモデルにおいて腫瘍退縮をもたらすことが示される。ＰＯＬＲ２Ａの阻害は、かかる共通ゲノム変更を保有するがんの新規治療アプローチである。
【００４４】
Ｉ．細胞標的化コンジュゲート
少なくとも１個の細胞標的化剤にα−アマニチン分子（またはいずれかのアマトキシン）をコンジュゲートして、α−アマニチンの有用性を増強し、肝毒性を低下させることが望まれ得る。かかるコンジュゲートは、「免疫毒素」と呼ばれることがある。例えば、治療剤としてのα−アマニチンの有効性および有用性を増加させるために、これは、所望の細胞標的化部分にコンジュゲートまたは共有結合することができる。かかる部分は、がん細胞等の細胞型における外部受容体または結合部位に結合することにより、所望の前記細胞型を標的化するのに十分な選択性、特異性または親和性を有するいずれかの部分であり得る（米国特許出願公開第２００９／０３０４６６６号）。かかる部分の例として、抗体またはその抗原結合性断片、抗体様タンパク質およびアプタマーが挙げられるがこれらに限定されない。抗原結合性抗体断片の例として、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなる「Ｆｄ」断片；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなる「Ｆｖ」断片；（ｉｖ）ＶＨドメインからなる「ｄＡｂ」断片；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）２個の連結されたＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｖｉｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、この２個のドメインが会合して結合ドメインを形成することを可能にするペプチドリンカーによって連結されている、単鎖Ｆｖ分子（「ｓｃＦｖ」）；（ｖｉｉｉ）二特異性単鎖Ｆｖ二量体（米国特許第５，０９１，５１３号を参照）ならびに（ｉｘ）遺伝子融合によって構築された多価または多特異性断片であるダイアボディ（diabody）（米国特許出願公開第２００５／０２１４８６０号）が限定されることなく挙げられる。Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはダイアボディ分子は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の取込みによって安定化させることができる。細胞標的化部分は、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＥｐＣＡＭ、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ｇｐＡ３３、ムチン、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ５６、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ｃ−Ｍｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＡＫＴ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ３、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、変異したｐ５３、変異したｒａｓ、デクチン−１、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）、チロシナーゼ、ＴＡＧ−７２、ＣＡＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド（例えば、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２）、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ、ｐ１５、β−カテニン、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、ＨＰＶ−Ｅ６、ＨＰＶ−Ｅ７、ＺＦＰ１６１、ユビキリン（Ubiquilin）−１、ＨＯＸ−Ｂ６、ＩＦＩ２７、ＹＢ−１、ＫＩＡＡ０１３６、オステオネクチン、Ｆ−ボックスのみのタンパク質２１、ＩＬＦ３、ＳＳＸ−２、ＰＳＭＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、メソセリン、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、インテグリンアルファＶベータ３、インテグリンアルファ５ベータ１またはＰＬＫ１等、いずれかの腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる。
【００４５】
コンジュゲート（例えば、α−アマニチン）への細胞標的化部分（例えば、腫瘍関連抗原に対する抗体）の結合またはコンジュゲーションのためのいくつかの方法が、当該技術分野で公知である（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／１１９７８７を参照）。例えば、免疫毒素は、当該技術分野で周知の切断可能なジスルフィドリンカーを用いることができる。毒素を処理してスルフヒドリル基をもたらし、細胞標的化部分を処理してピリジルジスルフィド残基をもたらすことにより、毒素を細胞標的化部分にコンジュゲートすることができる。一般的に利用され、細胞標的化部分への毒素のコンジュゲートに有用であると予想される他の連結は、イミノ（immino）チオラン／スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートおよびカルボジイミド連結である。様々な長さ、安定性、可撓性および化学的反応性のタンパク質をコンジュゲートするための多くの他の連結は、当該技術分野で周知であり、多くの場合、市販されている。結合方法のいくつかの例は、ジスルフィド交換反応；チオエーテル結合を形成することによる；例えば、ジエチレントリアミン五酢酸無水物（ＤＴＰＡ）等の有機キレート化剤を用いる金属キレート錯体；エチレントリアミン四酢酸（ethylenetriaminetetraacetic  acid）；Ｎ−クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミド；および／または細胞標的化部分に結合されたテトラクロロ−３−６α−ジフェニルグリコウリル−３（tetrachloro-3-6α-diphenylglycouril-3）の使用が関与する。細胞標的化部分は、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩等のカップリング剤の存在下で酵素と反応させることもできる。いずれのα−アマニチン−細胞標的化部分コンジュゲートも、血清への延長された曝露の際に安定であることが望ましい。したがって、α−アマニチンは、血清安定的である安定な尿素リンカーによって、細胞標的化部分のリシン残基にコンジュゲートすることができるが、これは、細胞標的化部分のリソソーム分解後に標的化細胞内部で遊離α−アマニチンを放出する。
【００４６】
ＩＩ．疾患の処置
本実施形態のある特定の態様を使用して、ＴＰ５３のヘミ接合性喪失およびそれに伴うＰＯＬＲ２Ａ喪失に関連する疾患または障害を防止または処置することができる。ＰＯＬＲ２Ａの機能をいずれか適した物質によって低下させて、ＴＰ５３および／またはＰＯＬＲ２Ａのヘミ接合性喪失を有するがんを処置することができる。かかる例示的な物質は、いずれかのアマトキシン、α−アマニチンまたはいずれかのアマトキシンもしくはα−アマニチンにコンジュゲートされた細胞標的化部分であり得る。
【００４７】
ＴＰ５３および／またはＰＯＬＲ２Ａのヘミ接合性喪失を有するがんは、ＴＰ５３および／またはＰＯＬＲ２Ａの喪失に関して相同（homogenous）でなくてもよい。様々な態様では、がんを含む細胞の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％は、ＴＰ５３および／またはＰＯＬＲ２Ａのヘミ接合性喪失を有することができる。よって、一部の態様では、がんを含む細胞の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％は、ＴＰ５３および／またはＰＯＬＲ２Ａの両方のコピーを含むことができる。他の態様では、がんを含む細胞の様々なパーセンテージは、ＴＰ５３のホモ接合性喪失およびＰＯＬＲ２Ａのヘミ接合性喪失を有することができる。
【００４８】
「処置」および「処置する」は、疾患または健康関連の状態の治療利益を得る目的で、被験体への治療剤の投与もしくは適用、または被験体における手順もしくはモダリティの実行を指す。例えば、処置は、ＰＯＬＲ２Ａ機能を阻害する物質の薬学的有効量の投与を含むことができる。
【００４９】
「被験体」は、霊長類、哺乳動物および脊椎動物等、ヒトまたは非ヒトのいずれかを指す。特定の実施形態では、被験体は、ヒトである。
【００５０】
用語「治療利益」または「治療上有効」は、本願を通して使用される場合、この状態の医学的処置に関して被験体の福祉を促進または増強する任意のものを指す。したがってこうしたものとしては、疾患の徴候または症状の頻度または重症度の低下が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、がんの処置は、例えば、腫瘍サイズの低下、腫瘍侵襲性の低下、がん成長速度の低下、または転移の防止が関与し得る。がんの処置は、がんを有する被験体の生存延長を指すこともできる。
【００５１】
アルファ−アマニチンコンジュゲートは、がんを処置するために投与され得る。本処置方法が有用ながんは、固形腫瘍または血液学的腫瘍に見出されるもの等、任意の悪性細胞型を含む。例示的な固形腫瘍として、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、頭部、頸部、卵巣、腎臓、喉頭、肉腫、肺、膀胱、メラノーマ、前立腺および乳房からなる群から選択される臓器の腫瘍を挙げることができるがこれらに限定されない。例示的な血液学的腫瘍は、骨髄の腫瘍、ＴまたはＢ細胞悪性病変、白血病、リンパ腫、芽腫、骨髄腫等を含む。本明細書に提供されている方法を使用して処置することができるがんのさらなる例として、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜のがん、胃（gastric）または胃（stomach）がん（胃腸管がんおよび胃腸管間質がんを含む）、膵がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓または腎がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、様々な種類の頭頸部がんならびにメラノーマが挙げられるがこれらに限定されない。
【００５２】
がんは、特に、次の組織学的な型のものであり得るが、これらに限定されない：新生物、悪性；癌腫；癌腫、未分化；巨細胞および紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；石灰化上皮（pilomatrix）癌；移行細胞癌；乳頭移行細胞癌；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管細胞癌；肝細胞癌；肝細胞癌および胆管細胞癌の組合せ；線維柱帯腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープにおける腺癌；腺癌、家族性大腸ポリポーシス；固形癌；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支肺胞（branchiolo-alveolar）腺癌；乳頭腺癌；嫌色素性癌；好酸球癌；好酸性腺癌；好塩基球癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞性腺癌；乳頭および濾胞性腺癌；非被包性硬化性癌；副腎皮質癌；類内膜（endometroid）癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳道腺癌；粘膜表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭嚢胞腺癌；乳頭漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液性腺癌；印環細胞癌；浸潤性乳管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；パジェット病、乳腺；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；腺癌ｗ／扁平上皮異形成；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；莢膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫瘍、悪性；アンドロブラストーマ、悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫瘍、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；パラガングリオーマ、悪性；乳房外パラガングリオーマ、悪性；褐色細胞腫；血管球血管肉腫（glomangiosarcoma）；悪性メラノーマ；無色素性メラノーマ；表在拡大型メラノーマ；悪性黒子メラノーマ；末端黒子型メラノーマ；結節性メラノーマ；巨大色素性母斑における悪性メラノーマ；類上皮細胞メラノーマ；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胚性横紋筋肉腫；肺胞横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胚性癌；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫瘍；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮肉腫；アメロブラストーマ、悪性；エナメル芽細胞線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；神経膠芽腫；乏突起神経膠腫；乏突起膠細胞芽腫（oligodendroblastoma）；原始神経外胚葉性；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；ニューロブラストーマ；網膜芽細胞腫；嗅覚神経原性腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン型；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞型、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉腫；他の指定された非ホジキンリンパ腫；Ｂ細胞リンパ腫；低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；マスト細胞肉腫；免疫増生性小腸性疾患；白血病；リンパ系白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；マスト細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；ヘアリー細胞白血病；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；および慢性骨髄芽球性白血病。
【００５３】
ＩＩＩ．併用処置
ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、第２のまたは追加的な治療法と組み合わせた、α−アマニチンにコンジュゲートされた細胞標的化部分が関与する。かかる治療法は、ＴＰ５３および／またはＰＯＬＲ２Ａのヘミ接合性喪失に関連するいずれかの疾患の処置において適用することができる。例えば、疾患は、がんであり得る。
【００５４】
併用療法を含む方法および組成物は、別の抗がんまたは抗過剰増殖療法の治療もしくは保護的効果を増強する、および／または治療効果を増加させる。治療および予防的な方法および組成物は、がん細胞の殺滅および／または細胞過剰増殖の阻害等、所望の効果の達成に有効な組み合わせた量で提供することができる。このプロセスは、細胞を、α−アマニチンにコンジュゲートされた細胞標的化部分および第２の療法の両方と接触させるステップが関与し得る。組織、腫瘍もしくは細胞は、作用物質（すなわち、抗がん剤）のうち１種もしくは複数種を含む１種もしくは複数種の組成物もしくは薬理学的製剤（複数可）と接触させることができる、または組織、腫瘍および／もしくは細胞を、２種もしくはそれを超える別個の組成物もしくは製剤と接触させることができ、１種の組成物が、１）α−アマニチンにコンジュゲートされた細胞標的化部分；２）抗がん剤または３）α−アマニチンにコンジュゲートされた細胞標的化部分および抗がん剤の両方を提供する。また、かかる併用療法が、化学療法、放射線療法、外科的療法または免疫療法と併せて使用され得ることが企図される。
【００５５】
用語「接触される」および「曝露される」は、細胞に適用される場合、治療用抗体および化学療法もしくは放射線療法剤が標的細胞に送達される、または標的細胞と直接近位に置かれるプロセスを説明するように本明細書において使用される。細胞殺滅を達成するために、例えば、両方の作用物質が、細胞の殺滅またはその分裂の防止に有効な組み合わせた量で細胞に送達される。
【００５６】
α−アマニチンにコンジュゲートされた細胞標的化部分は、抗がん処置と比べてその前に、その最中に、その後に、または様々な組合せで投与することができる。投与は、同時発生的から数分間から数日間から数週間に及ぶ間隔であり得る。遺伝子発現の阻害剤が、抗がん剤とは別々に患者に与えられる実施形態では、一般に、２種の化合物が依然として、患者に対して、有利に組み合わされた効果を発揮することができるように、各送達時の間でかなりの期間が経ち有効期限を越えてしまわなかったことを確実にするであろう。かかる場合、互いに約１２〜２４または７２時間以内に、より詳細には、互いに約６〜１２時間以内に、α−アマニチンにコンジュゲートされた細胞標的化部分および抗がん療法を患者に与えることができることが企図される。ある状況では、有意に処置の期間を延長することが望ましいことがあり、その場合、それぞれの投与間で数日間（２、３、４、５、６または７）から数週間（１、２、３、４、５、６、７または８）が経過する。
【００５７】
ある特定の実施形態では、処置の経過は、１〜９０日間またはそれを超えて（このかかる範囲は、介在する日数を含む）持続し得る。１種の作用物質は、１日目から９０日目（このかかる範囲は、介在する日数を含む）のいずれかの日またはそのいずれかの組合せに与えることができ、別の作用物質は、１日目から９０日目（このかかる範囲は、介在する日数を含む）のいずれかの日またはそのいずれかの組合せに与えられることが企図される。１日間以内（２４時間期間）に、患者に、作用物質（単数または複数）の１回または複数回の投与を与えることができる。さらに、処置の経過後に、抗がん処置が投与されない期間を設けることが企図される。この期間は、その予後、強さ、健康等、患者の状態に依存して、１〜７日間および／または１〜５週間および／または１〜１２カ月間またはそれを超えて（このかかる範囲は、介在する日数を含む）持続することができる。必要に応じて処置サイクルが反復されることが予想される。
【００５８】
様々な組合せを用いることができる。下の例に関して、α−アマニチンにコンジュゲートされた細胞標的化部分による治療法は「Ａ」であり、抗がん療法は「Ｂ」である：
A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/B
B/B/B/A  B/B/A/B  A/A/B/B  A/B/A/BA/B/B/AB/B/A/A
B/A/B/A  B/A/A/B  A/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A
【００５９】
患者への本発明のいずれかの化合物または治療法の投与は、作用物質の毒性があるとすればそれを考慮に入れつつ、かかる化合物の投与の一般プロトコールに従い得る。したがって、一部の実施形態では、併用療法に起因し得る毒性をモニタリングするステップが存在する。
【００６０】
特定の態様では、標準療法が、化学療法、放射線療法、免疫療法、外科的療法または遺伝子療法を含み、本明細書に記載されている通り、阻害抗体、抗がん療法または阻害抗体および抗がん療法の両方と組み合わせて用いられ得ることが企図される。
【００６１】
Ａ．化学療法
多種多様な化学療法剤を、本発明に従って使用することができる。用語「化学療法」は、がんを処置するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、がんの処置において投与される化合物または組成物を暗示するように使用される。これらの作用物質または薬物は、細胞内におけるその活性機序によって、例えば、これが細胞周期に影響を与えるか否かおよびいずれのステージでそれが為されるかによってカテゴリー化される。あるいは、作用物質は、ＤＮＡを直接架橋する、ＤＮＡ内にインターカレートする、または核酸合成に影響を与えることにより染色体および有糸分裂異常を誘導するその能力に基づき特徴付けることができる。大部分の化学療法剤は、次のカテゴリーに該当する：アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤およびニトロソウレア。
【００６２】
化学療法剤の例として、チオテパおよびシクロホスファミド（cyclosphosphamide）等のアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン（piposulfan）等のスルホン酸アルキル；ベンゾドパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドパ（meturedopa）およびウレドパ（uredopa）等のアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド（trietylenephosphoramide）、トリエチレンチオホスホラミド（triethiylenethiophosphoramide）およびトリメチロールメラミン（trimethylolomelamine）を含むエチレンイミンおよびメチロールメラミン（methylamelamine）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン（bullatacinone））；カンプトテシン（合成アナログトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（callystatin）；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン（carzelesin）およびビセレシン合成アナログを含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン（pancratistatin）；サルコジクチイン（sarcodictyin）；スポンジスタチン（spongistatin）；クロラムブシル、クロルナファジン（chlornaphazine）、チョロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキサイド塩酸塩、メルファラン、ノベンビキン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムスチン（ranimnustine）等のニトロソウレア（nitrosurea）；エンジイン抗生物質（例えば、カリチアマイシン、特に、カリチアマイシンガンマｌＩおよびカリチアマイシンオメガＩ１）等の抗生物質；ジネマイシンＡを含むジネマイシン（dynemicin）；クロドロネート等のビスホスホネート；エスペラミシン；ならびにネオカルチノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質（antiobiotic）発色団、アクラシノマイシン（aclacinomysin）、アクチノマイシン、アントラマイシン（authrarnycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（cactinomycin）、カルビシン（carabicin）、カルミノマイシン（carminomycin）、カルジノフィリン（carzinophilin）、クロモマイシン（chromomycinis）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（detorubicin）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン（2-pyrrolino-doxorubicin）およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（esorubicin）、イダルビシン、マルセロマイシン（marcellomycin）、マイトマイシンＣ等のマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキセートおよび５−フルオロウラシ��（５−ＦＵ）等の代謝拮抗薬；デノプテリン、プテロプテリン、トリメトレキセート等の葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（thiamiprine）、チオグアニン等のプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン等のピリミジンアナログ；カルステロン（calusterone）、ドロモスタノロンプロピオン酸塩、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン等のアンドロゲン；ミトタン、トリロスタン等の抗副腎（anti-adrenals）；フロリン酸（frolinic  acid）等の葉酸補充薬；アセグラトン；アルドホスファミド（aldophosphamide）グリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（bestrabucil）；ビサントレン（bisantrene）；エダトレキセート（edatraxate）；デフォファミン（defofamine）；デメコルチン；ジアジコン（diaziquone）；エルフォルミシン（elformithine）；エリプチニウム（elliptinium）酢酸塩；エポチロン；エトグルシド；ガリウム硝酸塩；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（lonidainine）；マイタンシンおよびアンサマイトシン（ansamitocin）等のマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（mopidanmol）；ニトラエリン（nitraerine）；ペントスタチン；フェナメット（phenamet）；ピラルビシン；ロソキサントロン（losoxantrone）；ポドフィリン酸（podophyllinic  acid）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン（rhizoxin）；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特に、Ｔ−２毒素、ベラキュリン（verracurin）Ａ、ロリジン（roridin）Ａおよびアングイジン（anguidine））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン等の白金配位複合体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン（novantrone）；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（difluorometlhylornithine）（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸等のレチノイド；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリカマイシン（plicomycin）、ゲムシタビン（gemcitabien）、ナベルビン、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ（tansferase）阻害剤、トランス白金（transplatinum）、ならびに上述のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。
【００６３】
この定義には、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン（onapristone）およびトレミフェンを含む、抗エストロゲン薬および選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）；例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール、エキセメスタン、ホルメスタン（formestanie）、ファドロゾール、ボロゾール、レトロゾールおよびアナストロゾール等、副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリドおよびゴセレリン等、抗アンドロゲン薬等、腫瘍におけるホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤；と共に、トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えば、ＰＫＣ−アルファ、ＲａｌｆおよびＨ−Ｒａｓ等、異常な（abherant）細胞増殖に関係づけられるシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド；ＶＥＧＦ発現阻害剤およびＨＥＲ２発現阻害剤等、リボザイム；遺伝子療法ワクチン等、ワクチン、ならびに上述のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体も含まれる。
【００６４】
Ｂ．放射線療法
ＤＮＡ損傷を生じる、広範に使用されてきた他の因子は、γ線、Ｘ線および／または腫瘍細胞への放射性同位元素の定方向送達として一般的に公知のものを含む。マイクロ波、陽子線照射（米国特許第５，７６０，３９５号および同第４，８７０，２８７号）およびＵＶ照射等、他の形態のＤＮＡ損傷因子も企図される。これらの因子の全てが、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体のアセンブリおよび維持における広範囲の損傷に影響を与える可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は、延長された期間にわたる（３〜４週間）５０〜２００レントゲンの一日線量から、２０００〜６０００レントゲンの単一線量に及ぶ。放射性同位元素の線量範囲は、広く変動し、同位元素の半減期、放射する放射線の強度および種類、ならびに新生物細胞による取込みに依存する。
【００６５】
用語「接触される」および「曝露される」は、細胞に適用される場合、治療構築物および化学療法剤または放射線療法剤が、標的細胞に送達される、または標的細胞と直接近位に置かれるプロセスを説明するように本明細書において使用される。細胞殺滅を達成するために、例えば、両方の作用物質が、細胞の殺滅または細胞分裂の防止に有効な組み合わせた量で細胞に送達される。
【００６６】
Ｃ．免疫療法
がん処置の文脈において、免疫療法は、一般に、がん細胞を標的および破壊するための免疫エフェクター細胞および分子の使用に頼る。トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））は、かかる例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面におけるあるマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体は単独で、治療法のエフェクターとして機能することができる、または他の細胞を動員して、細胞殺滅に実際に影響させることができる。抗体は、薬物または毒素（化学療法薬、放射性核種、リシン（ricin）Ａ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素等）にコンジュゲートし、単に標的化作用物質として機能することもできる。あるいは、エフェクターは、直接的または間接的のいずれかで、腫瘍細胞標的と相互作用する表面分子を有するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む。治療モダリティ、すなわち、直接的な細胞傷害活性およびＥｒｂＢ２の阻害または低下の組合せは、ＥｒｂＢ２過剰発現がんの処置における治療利益をもたらすであろう。
【００６７】
別の免疫療法を、上述の遺伝子サイレンシング療法による併用療法の一部として使用することもできる。免疫療法の一態様では、腫瘍細胞は、標的化に受け入れられる、すなわち、他の細胞の大部分には存在しない、一部のマーカーを有する必要がある。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれかが、本発明の文脈における標的化に適することができる。一般腫瘍マーカーは、癌胎児性抗原、前立腺特異抗原、尿中腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂ  Ｂおよびｐ１５５を含む。免疫療法の代替的な態様は、抗がん効果を免疫刺激効果と組み合わせることである。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦおよびガンマ−ＩＦＮ等のサイトカイン、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１およびＩＬ−８等のケモカイン、ならびにＦＬＴ３リガンド等の増殖因子を含む、免疫刺激分子も存在する。腫瘍サプレッサーと組み合わせて、タンパク質としてまたは遺伝子送達を使用して免疫刺激分子を組み合わせることは、抗腫瘍効果を増強することが示された（Juら、２０００年）。さらに、これらの化合物のいずれかに対する抗体を使用して、本明細書に論じられている抗がん剤を標的とすることができる。
【００６８】
現在研究中または使用されている免疫療法の例は、免疫アジュバント、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ジニトロクロロベンゼンおよび芳香族化合物（米国特許第５，８０１，００５号および同第５，７３９，１６９号；HuiおよびHashimoto、１９９８年；Christodoulidesら、１９９８年）、サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、βおよびγ、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦならびにＴＮＦ（Bukowskiら、１９９８年；Davidsonら、１９９８年；Hellstrandら、１９９８年）；遺伝子療法、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ｐ５３（Qinら、１９９８年；Austin-WardおよびVillaseca、１９９８年；米国特許第５，８３０，８８０号および同第５，８４６，９４５号）；ならびにモノクローナル抗体、例えば、抗ガングリオシドＧＭ２、抗ＨＥＲ−２、抗ｐ１８５（Hanibuchiら、１９９８年；米国特許第５，８２４，３１１号）である。１種または複数の抗がん療法を、本明細書に記載されている遺伝子サイレンシング療法と共に用いることができることが企図される。
【００６９】
能動免疫療法において、抗原ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、または自家もしくは同種異系腫瘍細胞組成物もしくは「ワクチン」が、一般に、別個の細菌アジュバントと共に投与される。養子免疫療法において、患者の循環リンパ球または腫瘍浸潤リンパ球が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで単離され、ＩＬ−２等のリンホカインによって活性化されるまたは腫瘍壊死のための遺伝子を形質導入され、再投与される。
【００７０】
Ｄ．手術
がんを有する人のおよそ６０％が、予防的、診断的または進行度診断的、根治的および姑息的手術を含むある種の手術を受ける。根治的手術は、本発明の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法および／または代替的治療法等、他の治療法と併せて使用することができるがん処置である。
【００７１】
根治的手術は、がん性組織の全体または部分が物理的に除去される、切り取られるおよび／または破壊される切除を含む。腫瘍切除は、腫瘍の少なくとも部分の物理的除去を指す。腫瘍切除に加えて、手術による処置は、レーザー手術、凍結手術、電気手術および顕微鏡により制御された手術（モース手術）を含む。本発明のある特定の態様が、表在性がん、前がんまたは付随的な量の正常組織の除去と併せて使用され得ることがさらに企図される。
【００７２】
がん性細胞、組織または腫瘍の部分または全体を切り取ると、身体に腔が形成され得る。処置は、追加的な抗がん療法によるこの区域の灌流、直接注射または局所的適用により達成することができる。かかる処置は、例えば、１、２、３、４、５、６もしくは７日毎に、または１、２、３、４および５週毎に、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２カ月毎に反復することができる。これらの処置はまた、変動する投与量のものとなることもできる。
【００７３】
Ｅ．他の作用物質
本発明のある特定の態様と組み合わせて他の作用物質を使用して、処置の治療有効性を改善することができることが企図される。これらの追加的な作用物質は、免疫調節剤、細胞表面受容体およびＧＡＰ結合の上方調節に影響を与える作用物質、細胞分裂阻害および分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘導物質に対する過剰増殖細胞の感受性を増加させる作用物質、または他の生物学的作用物質を含む。免疫調節剤は、腫瘍壊死因子；インターフェロンアルファ、ベータおよびガンマ；ＩＬ−２および他のサイトカイン；Ｆ４２Ｋおよび他のサイトカインアナログ；またはＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳおよび他のケモカインを含む。Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド、ＤＲ４またはＤＲ５／ＴＲＡＩＬ（Ａｐｏ−２リガンド）等、細胞表面受容体またはそのリガンドの上方調節が、過剰増殖性細胞における自己分泌または傍分泌効果の確立によって、本発明のアポトーシス誘導能力を強めるであろうことがさらに企図される。ＧＡＰ結合の数を上昇させることによる細胞間シグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖細胞集団における抗過剰増殖効果を増加させるであろう。他の実施形態では、細胞分裂阻害または分化剤は、本発明のある特定の態様と組み合わせて使用して、処置の抗過剰増殖有効性を改善することができる。細胞接着の阻害剤は、本発明の有効性を改善することが企図される。細胞接着阻害剤の例は、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンである。抗体ｃ２２５等、アポトーシスに対する過剰増殖細胞の感受性を増加させる他の作用物質は、本発明のある特定の態様と組み合わせて使用して、処置有効性を改善することができることがさらに企図される。
【００７４】
ホルモン療法は、本発明のある特定の態様と併せて、または先に記載された他のいずれかのがん療法と組み合わせて使用することもできる。ホルモンの使用を、乳がん、前立腺がん、卵巣がんまたは子宮頸がん等のある特定のがんの処置において用いて、テストステロンまたはエストロゲン等のある特定のホルモンのレベルを下げるまたはその効果を遮断することができる。この処置は、処置選択肢として、または転移のリスクを低下させるために、少なくとも１種の他のがん療法と組み合わせて使用されることが多い。
【実施例】
【００７５】
ＩＶ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示されている技法は、本発明者により、本発明の実施においてよく機能することが発見された技法であり、したがって、それを実施するための好ましいモードを構成するとみなすことができることが当業者には理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、それでもなお、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを理解するべきである。
【００７６】
材料および方法
細胞培養、抗体およびウエスタンブロット解析。ＨＣＴ１１６細胞株、ＳＷ４８０細胞株、ＳＷ８３７細胞株、ＨＴ２９細胞株、ＤＬＤ１細胞株およびＨＴ２９細胞株をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（American  Type  Culture  Collection）から入手し、製造業者によって指定された標準条件下で培養した。ＳＮＵ２８３細胞株およびＳＮＵ１１９７細胞株を韓国細胞株バンク（Korean  Cell  Line  Bank）から入手し、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＲＭＰＩ  １６４０培地中で培養した。異種移植されたヒト初代ＣＲＣ（ｘｈＣＲＣ）細胞の単離、培養および維持を以前に記載された通りに行った（Luら、２０１３年）。手短に説明すると、患者由来の異種移植片を無菌条件下で収集し、機械的に解離させ、続いてコラゲナーゼＩＩ中で３７℃にて３０分間インキュベーションを行った。この検体を無菌１００μｍ漉し器で濾過した。低浸透圧性赤血球溶解バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により赤血球を排除した。マウスＭＨＣクラスＩ分子Ｈ−２Ｋ抗体を使用した負の選択と、続く磁気ビーズ精製キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）の使用によって、異種移植したヒトＣＲＣ検体におけるマウス細胞を除去した。ＭＡＣＳ磁気ビーズ分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用した負の選択によって、線維芽細胞を除去した。単離したばかりのｘｈＣＲＣ細胞を、コラーゲン−１でコーティングした培養プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で維持し、１０％ＦＢＳ、ビタミン（１×）、非必須アミノ酸（１×）、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（１×）、ピルビン酸ナトリウム（１×）およびＬ−グルタミン（１×）を補充したＭＥＭにおいて培養した。全ての培地サプリメントは、Ｓｉｇｍａから購入した。
【００７７】
抗ＰＯＬＲ２Ａ抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（＃ｓｃ−４７７０１）およびＡｂｃａｍ（＃ａｂ１４０５０９）から購入した。抗Ｋｉ６７抗体（＃Ｄ３Ｂ５）および抗切断型カスパーゼ−３（Ａｓｐ１７５、＃５Ａ１Ｅ）抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇから入手した。抗ｐ５３抗体（＃ｓｃ−１２６）、抗β−アクチン抗体（＃ｓｃ−１６１６）、ＨＲＰ−抗ヤギＩｇＧ抗体（＃ｓｃ−２０２０）、ＨＲＰ−抗ウサギＩｇＧ抗体（＃ｓｃ−２０５４）およびＨＲＰ−抗マウスＩｇＧ抗体（＃ｓｃ−２０５５）は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚから購入した。細胞ライセート調製、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングは、以前に記載された通りに行った（Liuら、２０１２年）。
【００７８】
ＲＮＡ単離および定量的ＰＣＲ。ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して全ＲＮＡを単離し、次いでｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して逆転写した。その結果得られるｃＤＮＡを、遺伝子特異的プライマーとｉＴａｑ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とを使用したｑＰＣＲに使用し、結果を対照としてのβ−アクチンに対して正規化した。ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて、ＴＰ５３のプライマー配列は：５’−ＧＡＧＧＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＴＡＣＣ−３’（配列番号１）および５’−ＴＣＣＧＴＣＣＣＡＧＴＡＧＡＴＴＡＣＣＡＣ−３’（配列番号２）であり、ＰＯＬＲ２Ａのプライマー配列は：５’−ＴＴＧＴＡＴＣＣＧＴＡＣＣＣＡＣＡＧＣＡ−３’（配列番号３）および５’−ＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＣＡＴＴＣＴ−３’（配列番号４）である。
【００７９】
ＰＯＬＲ２ＡのｓｈＲＮＡ媒介性ノックダウン。ＰＯＬＲ２Ａ特異的ｓｈＲＮＡクローンは、ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｓｈＲＮＡ  ａｎｄ  ＯＲＦｅｏｍｅ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（元来はＯｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から入手した。ＰＯＬＲ２Ａを標的とする１２種のｓｈＲＮＡをスクリーニングし、そのうち２種のｓｈＲＮＡが、検査した全４種の結腸直腸がん細胞株において、タンパク質レベルを少なくとも５０％ノックダウンした。クローン識別番号およびｓｈＲＮＡ配列は、Ｖ３ＬＨＳ＿６４５６７４（５’−ＴＴＡＧＣＴＴＴＧＴＴＣＴＴＣＣＣＧＡ−３’［配列番号５］）およびＶ３ＬＨＳ＿６４０２９（５’−ＴＧＴＴＧＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＣＣＣＣ−３’［配列番号６］）である。製造業者によって提供されるプロトコールを使用して、ＧＩＰＺベクターにおけるヘアピン配列をＴＲＩＰＺベクター（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）へとクローニングした。ＴＲＩＰＺベクターは、赤色蛍光タンパク質レポーターを備えるＤｏｘ誘導性の系である。
【００８０】
Ｄｏｘ誘導性ｓｈＲＮＡを安定に発現する細胞の作製。２９３Ｔ細胞から組換えレンチウイルス粒子を産生させた。手短に説明すると、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、７２μｇのｓｈＲＮＡコードベクターＤＮＡ、５４μｇのＤｅｌｔａ  ８．９ベクターＤＮＡおよび１８μｇのＶＳＶＧコードベクターＤＮＡを、２９３Ｔ細胞（２４５ｍｍ２ディッシュにプレーティングした）にトランスフェクトした。トランスフェクション７２時間後に、ウイルス粒子を含有する上清を採取し、濾過し、９０，０００ｇの超遠心分離によって濃縮し、細胞成長培地に再懸濁した。安定なＤｏｘ誘導性細胞を作製するために、ＨＣＴ１１６細胞およびＳＮＵ２８３細胞に、１の感染多重度（ＭＯＩ）でｓｈＲＮＡ発現ウイルス粒子を感染させた。ウイルス溶液を、４μｇ／ｍＬポリブレンを含有する細胞培養培地に添加した。２μｇ／ｍＬピューロマイシンにより、細胞を、感染４８時間後に選択した。単一コロニーを培養し、繁殖させ、単一コピーのレンチウイルスＤＮＡインサートを有するコロニーを同定し、ノックダウン効率に関して解析した。
【００８１】
ＰＯＬＲ２Ａ  ｓｈＲＮＡを使用した競合アッセイ。ｓｈＲＮＡ−１またはｓｈＲＮＡ−２のいずれかを発現する単一レンチウイルスコピーは、検査した全４種の結腸直腸細胞株におけるＰＯＬＲ２Ａ発現レベルの抑制に十分であった（図６Ａ）。がん細胞に、２のＭＯＩで、対照またはＰＯＬＲ２Ａ  ｓｈＲＮＡ発現レンチウイルス（ＧＦＰを発現するｐＧＩＰＺ骨格）を感染させた。感染２日後に、ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  ＦａｃｉｌｉｔｙにおけるＢＤ  ＦＡＣＳＪａｚｚ（商標）細胞選別機（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＧＦＰ陽性細胞を選別した。次に、ＧＦＰ陽性細胞を、未感染およびＧＦＰ陰性細胞と１：１の比で混合し、６継代の間培養した。各継代におけるＧＦＰ陽性細胞および総細胞の数を解析し、フローサイトメトリーによって定量し、ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを計算した。
【００８２】
ｓｇＲＮＡ発現ベクターの作製およびＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ。Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを発現するバイシストロニック発現ベクターを、ＢｂｓＩで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、ｓｇＲＮＡコードＤＮＡ（Congら、２０１３年）をクローニングするために、線状化したベクターをゲル精製した。ＴＰ５３またはＰＯＬＲ２Ａを標的とするｓｇＲＮＡ毎に、オリゴＤＮＡのペアをアニールし、リン酸化し、線状化ベクターにライゲーションした。オリゴＤＮＡの配列を表１に列挙する。以前に記載された通りに、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを行って、ゲノム編集有効性を検査した（Ranら、２０１３年；Guschinら、２０１０年）。手短に説明すると、細胞を、ウェル当たり２×１０５個の細胞の密度で、６ウェルプレートに播種した。初期播種の１日後に、細胞に、２μｇのＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ発現ベクターＤＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクション４８時間後に収集した。ゲノムＤＮＡを単離し、ｓｇＲＮＡ標的化部位を含有する１ｋｂ  ＤＮＡ断片を高忠実度ＰＣＲによって増幅し、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩによって消化した。対照ベクターＤＮＡをトランスフェクトしたＨＣＴ１１６細胞から単離されたゲノムＤＮＡを対照として使用した。相補的だがミスマッチした鎖をアニールさせるために、ＰＣＲ産物を、９５℃で５分間、−２℃ｓ−１の速度で９５℃から８５℃に、および−０．１℃ｓ−１の速度で８５℃から２５℃にインキュベートした。Ｔ７エンドヌクレアーゼＩを添加し、試料を３７℃で６０分間インキュベートして、アニールしたＰＣＲ産物をミスマッチ部位において消化した。Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ消化したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって解析した。ＰＣＲ増幅に使用したオリゴヌクレオチド配列を表１に列挙する。陽性クローン由来のＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にライゲーションし、ＤＮＡ配列決定によってさらに確認した。
【表１】
2018508532.tif 000002
【００８３】
細胞増殖および生存アッセイ。１２ウェルプレートに３連で同数の細胞をプレーティングした。細胞を、表示の時間において、１０％メタノールで固定し、０．１％クリスタルバイオレット（１０％メタノールに溶解）で染色した。染色後に、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、酢酸で脱染した。クリスタルバイオレット溶液の吸光度を５９０ｎｍで測定した。細胞生存アッセイのため、細胞を、９６ウェルプレートにウェル当たり１，０００細胞の濃度で播種し、２４時間後に表示の濃度のα−アマニチンまたはアクチノマイシンＤで処理した。ＷＳＴ−１試薬（Ｒｏｃｈｅ）を製造業者の指示に従って使用して、細胞生存率を定量した。全実験を３連で行った。
【００８４】
アポトーシスおよび細胞周期解析。ＨＣＴ１１６細胞株およびＳＮＵ２８３細胞株を、表示の濃度のα−アマニチンありもしくはなしで２日間またはドキシサイクリンありもしくはなしで４日間処理し、アネキシンＶ−ＰＥおよび７−ＡＡＤ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）で染色した。Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を製造業者のプロトコールに従って使用したフローサイトメトリーによってアポトーシスを解析した。プレアポトーシス細胞（アネキシンＶ陽性かつ７−ＡＡＤ陰性）およびアポトーシス細胞（アネキシンＶ陽性かつ７−ＡＡＤ陽性）の両方を解析に含めた。細胞周期解析のため、細胞を７５％エタノールにおいて−２０℃で一晩固定した。細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、１００μｇのＲＮａｓｅ  Ａ（Ｑｉａｇｅｎ）で処理し、５０μｇのヨウ化プロピジウム（Ｒｏｃｈｅ）で染色した。Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用したフローサイトメトリーによって細胞周期プロファイルを解析した。
【００８５】
蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）。Ｅｍｐｉｒｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ製のフルオレセイン標識ＰＯＬＲ２Ａ（赤色）プローブおよび対照セントロメア（Ｃｈｒ１７、緑色）プローブを使用して、ＦＩＳＨ解析を行った。製造業者のプロトコールに従ってハイブリダイゼーションおよび検出を行った。スライドをＤＡＰＩで対比染色し、冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラを備えるＮｉｋｏｎ  Ｅ８００顕微鏡を使用して画像を取得した。ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子のヘミ接合性喪失を決定するために、各事例につき１００個の個々の核を解析した。間期核を取得し、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ）を使用して処理した。
【００８６】
患者試料。施設内審査委員会（ＩＲＢ＃ＰＡ１１−０７６７）による承認後の適切なインフォームドコンセントにより、患者由来のマッチした正常組織試料および結腸直腸腫瘍組織試料を、ＭＤアンダーソンがんセンター（MD  Anderson  Cancer  Center）（ＭＤＡＣＣ）から入手した。ＰＯＬＲ２Ａタンパク質の発現レベルを決定するために、組織試料（２０〜４０ｍｇ）を、セラミックビーズを含有するチューブ内に置き、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ  ２４ホモジナイザーデバイス（Ｂｅｒｔｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してホモジナイズした。ライセートを２回スピンダウンし（１５分間、１６，０００ｇ）、上清を採取した。
【００８７】
ゲノムＤＮＡ単離およびコピー数検証。ＤＮｅａｓｙ血液＆組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の精製指示に従って使用して、ヒト組織検体および細胞株から総ゲノムＤＮＡを抽出した。全てのＤＮＡ試料を−２０℃で貯蔵した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ配列検出システムにおいてＴａｑＭａｎプローブ（Ｈｓ０２０２３８４９＿ｃｎおよびＨｓ０１２５２６８４＿ｃｎ）および標準ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲキットを使用して、ＰＯＬＲ２Ａのコピー数変動を決定した。そして、参照遺伝子ＴＥＲＴを、ＤＮＡ試料毎に同じチューブにおいて、同時に定量した。
【００８８】
抗ＥｐＣＡＭ抗体（ＨＥＡ１２５）へのα−アマニチンのコンジュゲーション。安定なリンカー構造によるＨＥＡ１２５抗体のリシン残基へのα−アマニチンのカップリングにより、抗体−薬物コンジュゲート、ａｍａ−ＨＥＡ１２５を構築した。ＨＥＡ１２５は、高い親和性（およそ２．２×１０−９ＭのＫＤ）および高い特異性でＥｐＣＡＭ発現細胞に結合する。プロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した親和性クロマトグラフィーによってＨＥＡ１２５を精製した。抗体部分のリソソーム分解後に腫瘍細胞内部で遊離α−アマニチンを放出することを意図した血漿中安定な尿素連結によって、α−アマニチンを免疫グロブリン分子に結合させた。α−アマニチン：ＩｇＧ分子の薬物−抗体比（ＤＡＲ）は、４：１であった。ＰｌａｔｉｎＢｌｕｅ  ＨＰＬＣシステム（Ｋｎａｕｅｒ）を使用した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、ａｍａ−ＨＥＡ１２５の生化学的特徴を評価した。加えて、一般手順に従った還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によって、ＨＥＡ１２５およびａｍａ−ＨＥＡ１２５を解析した。標準技法を使用した３０ｎｇのＨＥＡ１２５およびａｍａ−ＨＥＡ１２５の抗アマニチンイムノブロッティング解析によって、薬物ローディングの検証を行った。
【００８９】
リポソームナノ粒子調製。ｉｎ  ｖｉｖｏ送達のためのｓｉＲＮＡをＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン）中に被包した。ＤＯＰＣおよびｓｉＲＮＡを、過剰な三級ブタノールの存在下、１：１０（ｗ／ｗ）ｓｉＲＮＡ／ＤＯＰＣの比で、混合した。Ｔｗｅｅｎ  ２０を、１：１９のＴｗｅｅｎ  ２０：ｓｉＲＮＡ／ＤＯＰＣの比で、混合物に添加した。混合物をボルテックスし、アセトン／ドライアイス浴中で凍結し、凍結乾燥した。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に先立ち、注射当たり１５０〜１０００μｇ  ｓｉＲＮＡ／ｋｇの濃度となるよう、この調製物を、室温でＰＢＳにより含水させた（各マウスに、腹腔内経路により２００μＬのＤＯＰＣ：ｓｉＲＮＡ：ＰＢＳ溶液を与えた）。
【００９０】
異種移植腫瘍研究。４〜６週齢の雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、無病原体条件下で収容した。全研究は、ＭＤアンダーソンがんセンターの施設内動物管理使用委員会（Institutional  Animal  Care  and  Use  Committee）によって承認および監督された。検出力計算において使用される場合、当該試料サイズの事前決定実験は、１群当たり５匹のマウスが、９０％検出力で、腫瘍サイズおよび重量（ｐ＜０．０５）におけるＰＯＬＲ２Ａの予想される効果を同定することができることを示した。動物を異なる群にランダムに分けた。５０μｌ成長培地（１：１でマトリゲルと混合）におけるＤｏｘ誘導性ＨＣＴ１１６細胞（１×１０６個）およびＳＮＵ２８３細胞（２×１０６個）を、１００μｌ  Ｈａｍｉｌｔｏｎマイクロリットルシリンジを使用して側腹部に皮下注射した。ノギスを使用して５日毎に腫瘍サイズを測定し、標準式：０．５×Ｌ×Ｗ２（式中、Ｌは最長直径であり、Ｗは最短直径である）を使用して腫瘍体積を計算した。同所性マウスモデルのため、ＳＣＩＤマウスを麻酔し、皮膚を切開して、盲腸を露出させた。１００μｌ  Ｈａｍｉｌｔｏｎマイクロリットルシリンジを使用して、ルシフェラーゼを発現するＤｏｘ誘導性ＨＣＴ１１６細胞（１×１０６個）を盲腸壁に注射し、次いで創傷クリップを使用して切開を閉じた。ルシフェリン注射後に１５分間、ＩＶＩＳシステムによって腫瘍をモニターした。腫瘍の初期確立後に（皮下植込み（subcutaneous  implant）のため１００ｍｍ３、同所性植込みのため２×１０８光子／秒、全光束）、マウスを、飲料水中１μｇ  ｍｌ−１ドキシサイクリンで３〜４週間処置した。ドキシサイクリン水を１日おきに交換した。
【００９１】
ＤＯＰＣ被包ｓｉＲＮＡを使用した異種移植腫瘍研究のため、１００μｌ  Ｈａｍｉｌｔｏｎマイクロリットルシリンジを使用して、ＨＣＴ１１６細胞（１×１０６個）の同質遺伝子ペアを盲腸壁に移植した。細胞注射１０日後に、マウスをランダムに分け、対照ｓｉＲＮＡ−ＤＯＰＣまたはＰＯＬＲ２Ａ  ｓｉＲＮＡ−ＤＯＰＣのいずれかを与えるように割り当てた。ｓｉＲＮＡ配列を次に示す：対照ｓｉＲＮＡ（５’−ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵ−３’［配列番号１９］および５’−ＡＣＧＵＧＡＣＡＣＧＵＵＣＧＧＡＧＡＡ−３’［配列番号２０］）；ＰＯＬ２  ｓｉＲＮＡ−１（５’−ＣＣＡＡＣＡＵＧＣＵＧＡＣＡＧＡＵＡＵ−３’［配列番号２１］および５’−ＡＵＡＵＣＵＧＵＣＡＧＣＡＵＧＵＵＧＧ−３’［配列番号２２］）；ＰＯＬ２  ｓｉＲＮＡ−２（５’−ＣＣＡＡＧＡＡＧＣＧＧＣＵＣＡＣＡＣＡ−３’［配列番号２３］および５’−ＵＧＵＧＵＧＡＧＣＣＧＣＵＵＣＵＵＧＧ−３’［配列番号２４］）。１５０〜１０００μｇ  ｓｉＲＮＡ／ｋｇマウスの用量を１週間に２回の間隔で腹腔内投与した。この濃度範囲は、以前に記載された通りに、効率的な送達および標的遺伝子ノックダウンを確実にする（Pecotら、２０１４年）。
【００９２】
α−アマニチン−ＨＥＡ１２５抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を使用した異種移植腫瘍試験のため、１００μｌ  Ｈａｍｉｌｔｏｎマイクロリットルシリンジを使用して、ＨＣＴ１１６細胞（１×１０６個）、ｘｈＣＲＣ細胞（０．５×１０６個）、ＳＷ４８０細胞（１×１０６個）またはＳＷ８３７細胞（２×１０６個）の同質遺伝子ペアを盲腸壁に移植した。１０日齢の腫瘍を有するマウスを５群（ｎ＝１０匹のマウス／群）にランダム化し、次の２回の腹腔内用量（１週間空けて）を与えた：１）３．６ｍｇ  ｋｇ−１体重の用量の対照非コンジュゲートＨＥＡ１２５  ｍＡｂ；２）α−アマニチンの観点から９０μｇ  ｋｇ−１の用量のＡｍａ−ＨＥＡ１２５（３．６ｍｇ  ｋｇ−１のＩｇＧに対応）；３）α−アマニチンの観点からＡｍａ−ＨＥＡ１２５、３０μｇ  ｋｇ−１（１．２ｍｇ  ｋｇ−１のＩｇＧに対応）；４）α−アマニチンの観点からＡｍａ−ＨＥ１２５、１０μｇ  ｋｇ−１（０．４ｍｇ  ｋｇ−１のＩｇＧに対応）；および５）α−アマニチンの観点からＡｍａ−ＨＥＡ１２５、３μｇ  ｋｇ−１（０．１２ｍｇ  ｋｇ−１のＩｇＧに対応）。ルシフェリン注射後に１５分間、ＩＶＩＳライブイメージングシステムによって腫瘍を１週間に２回モニタリングした。体重を、４日毎に記録した。２１日目に麻酔後に後眼窩出血によって血液を得、ＭＤアンダーソンがんセンターの臨床病理学、獣医内科および外科コア（Clinical  Pathology,  Veterinary  Medicine  and  Surgery  Core）にて、血中肝臓酵素（ＡＳＴ：アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ＡＬＴ：アミノアラニントランスフェラーゼおよびアルカリホスファターゼ）のレベルを決定した。
【００９３】
腫瘍サイズおよび全体的な健康状態に関する施設内安楽死判断基準を満たしたら、マウスを安楽死させた。腫瘍を除去し、写真撮影し、秤量した。解剖したばかりの腫瘍組織を１０％緩衝ホルマリンにおいて一晩固定し、ＰＢＳで洗浄し、７０％エタノールに移し、パラフィンに包埋し、切片を作製し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。本研究者らは、実験の間および成績評価の際に、群割当てに関して盲検化されていた。
【００９４】
免疫組織化学的検査およびヒト結腸組織マイクロアレイ。１１０種の結腸腫瘍試料および１０種の正常結腸組織試料を含む、結腸がん組織マイクロアレイ（ＢＣ０５１１１０ａ）をＢｉｏｍａｘから購入した。試料を脱パラフィンし、再度含水させた。抗原を、電子レンジで煮沸した後に、沸騰温度未満（sub-boiling  temperature）で１０分間、０．０１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）を使用して、回復させた。内在性ペルオキシダーゼ活性を遮断するために、切片を、３％過酸化水素と共に１０分間インキュベートした。非特異的染色を防止するための５％正常ヤギ血清中での１時間のプレインキュベーション後に、試料を、ＰＯＬＲ２Ａに対する抗体（＃ｓｃ−４７７０１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、Ｋｉ６７に対する抗体（＃Ｄ３Ｂ５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）または切断型カスパーゼ−３に対する抗体（＃５Ａ１Ｅ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）と共に４℃で一晩インキュベートした。切片を、ビオチン化二次抗体（４Ｐｌｕｓビオチン化抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ、ＢｉｏＣＡＲＥ）と共にインキュベートし、次いでアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体溶液と共にインキュベートし、ＤＡＢ（ジアミノベンジジン）基質キット（＃５５０８８０、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造業者のプロトコールに従って使用して発色させた。Ｈａｒｒｉｓ修飾ヘマトキシリンを使用して、対比染色による発色を行った。デジタル画像解析による定量のために、Ａｕｔｏｍａｔｅ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩＩ（ＡＣＩＳ  ＩＩＩ）において、全ての免疫染色したスライドをスキャンした。
【００９５】
バイオインフォマティクス解析。ＣＣＬＥ（ワールドワイドウェブ、broadinstitute.org/ccle）およびＴＣＧＡ（ワールドワイドウェブ、cbioportal.org/public-portal/）から得たデータを使用して、遺伝子コピー数および対応する遺伝子発現の間の相関を以前に記載された通りに解析した（Nijhawanら、２０１２年）。遺伝子名の並べ替えにより、ピアソン相関係数の強化を決定した。欠失した遺伝子が、ハウスキーピング遺伝子として機能するか決定するために、第一に、腫瘍および正常組織におけるその発現プロファイルならびにその一般機能を文献から解析した。第二に、モデル生物の利用できるデータベース（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓゲノムデータベース、ＷｏｒｍＢａｓｅ、ＦｌｙＢａｓｅおよびマウスゲノムインフォマティクス）を検索することにより、種を超えた遺伝子保存および遺伝子ノックアウトの致死性をチェックした。第三に、ＴＰ５３遺伝子に対する潜在的標的遺伝子の近接性をチェックし、ヒトがんにおけるＴＰ５３とのその共欠失を解析した。最後に、ＴＰ５３および標的遺伝子の欠失を有するがん細胞株を同定して、本仮説を検査した。
【００９６】
統計解析。各実験を３回またはそれより多く反復した。他に断りがなければ、データは、平均およびｓ．ｄ．またはｓ．ｅ．ｍ．として提示し、スチューデントｔ検定（対応のない、両側）を使用して、独立した試料の２群を比較した。対応のないｔ検定において、等しい分散が仮定され、試料は解析から除外されなかった。ＴＣＧＡデータ解析に使用した統計方法については上に記載されている。ｐ＜０．０５を、統計的に有意とみなした。
【００９７】
（実施例１）
ＰＯＬＲ２Ａの発現は遺伝子コピー数と相関するが、ＴＰ５３の発現は遺伝子コピー数と相関しない
腫瘍サプレッサー遺伝子のゲノム欠失は、がん発生に寄与しない可能性があるが細胞増殖および生存に必須な複数の隣接する遺伝子を包含することが多い（Negriniら、２０１０年）。かかるハウスキーピング遺伝子のこの部分的喪失は、がん細胞を、これらの遺伝子のさらなる阻害に対して高度に脆弱にすると仮定された（Nijhawanら、２０１２年）。ＴＣＧＡの解析は、ＴＰ５３遺伝子のヘミ接合性欠失が、多様なヒトがんにおいて高頻度で起こることを明らかにした（図１Ａ）。ＰＯＬＲ２Ａは、細胞生存に必須な、ＴＰ５３に近接した（ヒトゲノムにおいて約２００キロベース離れて存在）ハウスキーピング遺伝子として同定された（図１Ｂ）。ＰＯＬＲ２Ａの随伴性欠失は、ＴＰ５３のヘミ接合性欠失を保有する実質的に全てのヒト結腸直腸腫瘍において起こる（図１Ｃ）。
【００９８】
ヒトＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体における１２個のサブユニットのうち、ＰＯＬＲ２Ａは、ｍＲＮＡ合成におけるポリメラーゼ活性に不可欠な最大のサブユニットをコードする（Shalemら、２０１４年）。特異的な阻害剤であるα−アマニチンによるＰＯＬＲ２Ａの阻害は、広範な細胞死を引き起こし、さらに、ＰＯＬＲ２Ａのホモ接合性欠失は、ヒト細胞において致死的である（Lindellら、１９７０年；Shalemら、２０１４年）。１９５例の結腸直腸がん（ＣＲＣ）症例のうち１０４例（５３％）が、ＴＰ５３およびＰＯＬＲ２Ａの随伴性欠失をもたらす１７ｐ１３領域の部分的喪失を有することが判明した（図１Ｃ）。しかし、ＰＯＬＲ２Ａのホモ接合性欠失は観察されず、ＰＯＬＲ２Ａが、細胞生存に必須であるという概念と整合した。ＴＣＧＡおよびＣＣＬＥデータベースの解析は、ＰＯＬＲ２Ａの発現が、その遺伝子コピー数と密接に相関することを明らかにした（図１Ｄ）。この正の相関は、２０ペアのマッチした正常組織試料およびＣＲＣ組織試料ならびにヒトＣＲＣ組織マイクロアレイにおいても検証された（図１Ｅ、図５Ａおよび図５Ｂならびに表２）。結腸直腸がん細胞のセットにおけるＰＯＬＲ２Ａのコピー数を決定したところ（図１Ｆ）、全３種のＰＯＬＲ２Ａ喪失（ＰＯＬＲ２Ａのヘミ接合性喪失）細胞株が、ＰＯＬＲ２Ａ中立細胞株よりも有意に低いレベルで、ＰＯＬＲ２Ａタンパク質を発現したことが判明した（図１Ｇおよび図１Ｈ）。ＰＯＬＲ２Ａとは異なり、ｐ５３レベルは、転写後事象および翻訳後事象の複雑さによって決定される（ToledoおよびWahl、２００６年）。ＴＰ５３コピー数およびｍＲＮＡ発現の間の相関にもかかわらず、ｐ５３タンパク質レベルは、結腸直腸腫瘍および細胞株における遺伝子コピー数に関連しない（図６Ａ〜図６Ｃおよび図１Ｈ）。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【００９９】
（実施例２）
ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞は、ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対し高度に感受性である
ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対する、ＴＰ５３／ＰＯＬＲ２Ａヘミ接合性喪失ありまたはなしの細胞の感受性を評価するために、ＰＯＬＲ２Ａ中立細胞（ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０）およびＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞（ＳＷ８３７、ＳＮＵ２８３）のパネルをα−アマニチンで処理した。高濃度（≧１μｇ  ｍｌ−１）でのα−アマニチン処理は、全４種の細胞株において細胞成長を劇的に阻害し、完全な細胞死を引き起こした。しかし、０〜１．０μｇ  ｍｌ−１の濃度において、α−アマニチン阻害は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞において、対照ＰＯＬＲ２Ａ中立細胞よりも有意に高いレベルの細胞殺滅効果を有した（図２Ａおよび図２Ｂ）。最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）は、ＰＯＬＲ２Ａ中立細胞に対して約１．０μｇ  ｍｌ−１であり、これは、ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞のものよりも１０倍大きかった。対照的に、ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞は、非特異的転写阻害剤であるアクチノマイシンＤ処理に対し、いかなるより高い感受性も示さなかった（図７Ａ）。次に、直接的競合アッセイを使用して、ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞の脆弱性を評価した。細胞増殖速度を、対照またはＰＯＬＲ２Ａ特異的ｓｈＲＮＡを発現する対照細胞およびＧＦＰ陽性細胞の間で比較した。２種の独立したｓｈＲＮＡは、検査した全細胞株において、ＰＯＬＲ２Ａ発現を５０％〜７０％ノックダウンした（図７Ｂ）。６継代にわたって培養した後に、ＰＯＬＲ２Ａ  ｓｈＲＮＡを安定して発現するＰＯＬＲ２Ａ中立細胞（ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０）は、対照ｓｈＲＮＡを発現する対応する細胞の増殖と比較して、やや低下した増殖しか示さなかった（図７Ｃ）。しかし、ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞（ＳＮＵ２８３、ＳＷ８３７）におけるＰＯＬＲ２Ａのサイレンシングは、著しく低下した増殖をもたらし、ＰＯＬＲ２Ａのヘミ接合性喪失が、がん細胞を、さらなるＰＯＬＲ２Ａ阻害を受け易くすることを示唆した。ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性ＰＯＬＲ２Ａ  ｓｈＲＮＡを安定に発現するＨＣＴ１１６細胞株およびＳＮＵ２８３細胞株を作製した（図７Ｄ）。ＰＯＬＲ２Ａの有意なノックダウンにもかかわらず、ＨＣＴ１１６細胞が、増殖し続けた一方で、ＳＮＵ２８３細胞は、重度のＧ１細胞周期停止およびアポトーシスを示した（図２Ｃ、図２Ｄおよび図７Ｅ〜図７Ｇ）。およそ５０％のＰＯＬＲ２Ａ発現減少（３０〜１００ｎｇ  ｍｌ−１のＤｏｘの添加による）は、ＳＮＵ２８３細胞の増殖を際立って低下させたが、ＨＣＴ１１６細胞には中程度の効果しかなかった（図２Ｄ）。次に、ＰＯＬＲ２Ａ喪失ＳＮＵ２８３細胞株およびＳＷ８３７細胞株においてレスキュー実験を行った。両方の細胞株における外因的ＰＯＬＲ２Ａの漸進的な再発現は、α−アマニチンに対するそれらの抵抗性を、ＰＯＬＲ２Ａ中立ＨＣＴ１１６細胞およびＳＷ４８０細胞に匹敵するレベルまで回復させた（図２Ｅ、図２Ｆおよび図８Ａ〜図８Ｂ）。
【０１００】
細胞株にわたって遺伝的背景が様々であることによる効果を除外するために、ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔でクラスター化された短鎖反復回文配列（clustered  regularly  interspaced  short  palindromic  repeat））／Ｃａｓ９系を用いて、ＰＯＬＲ２Ａのヘミ接合性喪失を有する同質遺伝子的ＨＣＴ１１６細胞株を作製した（Wangら、２０１４年；Wangら、２０１３年）。ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子の第２のエクソンを標的とするように、２種のシングルガイド（single-guide）ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をデザインした（図９Ａ）。これら両方ともに、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ解析に示す通り、ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子を効率的に標的化および破壊した（図９Ｂ）。ＰＯＬＲ２Ａの単一アレル欠失を有するＨＣＴ１１６細胞の単一コロニーを選択し、ＤＮＡ配列決定によって検証した（図９Ｃ）。標的化領域における小規模の欠失は、オープンリーディングフレームシフトをもたらし、ＰＯＬＲ２Ａの全機能ドメインを含まないＮ末端ペプチドの短いストレッチのみを産生した。その結果、ＰＯＬＲ２Ａ発現は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞において有意に低下した（図９Ｄ）。ＰＯＬＲ２Ａ喪失およびＰＯＬＲ２Ａ中立ＨＣＴ１１６細胞は、同様の増殖速度を示し（図９Ｅ）、ＰＯＬＲ２Ａの一方のアレルが、細胞増殖および生存の維持に十分であることを示していた。しかし、ＰＯＬＲ２Ａのヘミ接合性欠失は、約０．１μｇ  ｍｌ−１のＩＣ５０で、α−アマニチン処理に対してＨＣＴ１１６細胞を劇的に感受性にし、このＩＣ５０は、親ＨＣＴ１１６細胞の８分の１であった（図２Ｇおよび図２Ｈ）。対照とは、アクチノマイシンＤに対するそれらの感受性に実質的な差は観察されなかった（図９Ｆ）。直接的競合アッセイの結果は、ＰＯＬＲ２Ａのノックダウンが、ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞において著しく低下した増殖をもたらしたが、同質遺伝子的ＰＯＬＲ２Ａ中立細胞においてはこれをもたらさなかったことを実証した（図９Ｇ）。Ｄｏｘ誘導性ＰＯＬＲ２Ａ  ｓｈＲＮＡを発現するＰＯＬＲ２Ａ喪失ＨＣＴ１１６細胞およびＰＯＬＲ２Ａ中立ＨＣＴ１１６細胞も作製した。増加した濃度のＤｏｘは、ＰＯＬＲ２Ａ発現を漸進的に低下させた。低用量のＤｏｘ（１００ｎｇ  ｍｌ−１）は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞の際立った殺滅に十分であったが、高用量のＤｏｘは、ＰＯＬＲ２Ａ中立細胞に最小の効果しかなかった（図２Ｉ、図２Ｊおよび図９Ｈ）。
【０１０１】
（実施例３）
ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対するＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞の感受性は、ｐ５３に非依存的である
ＲＮＡポリメラーゼの遮断は、ｐ５３蓄積および活性化をもたらし得る（Derheimerら、２００７年）。ＰＯＬＲ２Ａ阻害に対する細胞応答におけるｐ５３の効果を試験するために、ＴＰ５３およびＰＯＬＲ２Ａの随伴性欠失を、ＨＣＴ１１６細胞株およびｘｈＣＲＣ細胞株において再現した（図３Ａおよび図１０Ａ〜図１０Ｃ）。単離したばかりの異種移植したヒト結腸直腸腫瘍からｘｈＣＲＣ細胞株（ＴＰ５３＋／＋；ＰＯＬＲ２Ａ＋／＋）を確立し、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける増強された腫瘍形成能を実証した（Luら、２０１３年）。僅かに増加した細胞増殖を除いて、α−アマニチンに対するそれらの感受性の有意な変化は、ＴＰ５３のヘミ接合性欠失を有するｘｈＣＲＣ細胞およびＨＣＴ１１６細胞の両方において観察されなかった。対照的に、ＰＯＬＲ２Ａのヘミ接合性喪失は、それらのＴＰ５３状態に関係なく、α−アマニチン処理に対してこれらの細胞を著しく感受性にした（図３Ｂ、図３Ｃおよび図１０Ｄ〜図１０Ｆ）。ＲＮＡポリメラーゼＩＩは、治療抵抗性腫瘍細胞を含むいかなる種類の細胞にとっても必須の機能である、ｍＲＮＡ合成を担当する。結腸直腸がんのための３種の主要な化学療法薬物（５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、オキサリプラチンおよびＳＮ−３８）に対するＰＯＬＲ２Ａ中立細胞およびＰＯＬＲ２Ａ喪失細胞の薬物感受性を試験した。α−アマニチンによるＰＯＬＲ２Ａの阻害は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失ｘｈＣＲＣ細胞において全３種の薬物の細胞殺滅効果を有意に増強したが、ＰＯＬＲ２Ａ中立細胞には顕著な効果がなく（図３Ｄ）、がん療法におけるＰＯＬＲ２Ａ喪失結腸直腸腫瘍の治療に対する脆弱性を示唆していた。遊離α−アマニチンは、肝細胞の膜において排他的に発現されるトランスポーターであるＯＡＴＰ１Ｂ３によって特異的に結合されるため、肝臓に対して毒性がある（Letschertら、２００６年）。しかし、α−アマニチンは、特異的な抗体とコンジュゲートされた場合、もはやＯＡＴＰ１Ｂ３の基質ではない（Letschertら、２００６年；Moldenhauerら、２０１２年；FaulstichおよびFiume、１９８５年）。この戦略は、臨床適用の際のα−アマニチンの毒性を克服する。腺癌の大部分で過剰発現されるがん抗原であるＥｐＣＡＭに対するモノクローナル抗体（ＨＥＡ１２５）にコンジュゲートされたα−アマニチン（ａｍａ−ＨＥＡ１２５）（Moldenhauerら、２０１２年；Wentら、２００４年）を使用した。ａｍａ−ＨＥＡ１２５コンジュゲートは、ｐ５３非依存的様式でＰＯＬＲ２Ａ喪失ｘｈＣＲＣがん細胞およびＨＣＴ１１６がん細胞を選択的に死滅させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでα−アマニチンの有効用量を少なくとも１０，０００分の１に低下させた（ＩＣ５０約０．０１ｎｇ  ｍｌ−１）（図３Ｅおよび図１０Ｇ）。
【０１０２】
（実施例４）
ＰＯＬＲ２Ａの抑制は、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍成長を選択的に阻害する
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＰＯＬＲ２Ａ阻害の抗腫瘍効果を検査するために、Ｄｏｘ誘導性ＰＯＬＲ２Ａ  ｓｈＲＮＡを発現するＨＣＴ１１６細胞およびＳＮＵ２８３細胞を、免疫低下したＳＣＩＤ  ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射した。初期腫瘍確立後に、飲料水中Ｄｏｘの投与は、ＰＯＬＲ２Ａ発現を抑制し、結果的に、ＳＮＵ２８３由来腫瘍の成長を阻害した（図４Ａ）。しかし、対照およびＰＯＬＲ２ＡノックダウンＨＣＴ１１６由来腫瘍の間に実質的な差は観察されなかった。病理組織学的解析は、ＰＯＬＲ２Ａノックダウン（Ｄｏｘ：１．０μｇ  ｍｌ−１）ＳＮＵ２８３腫瘍が、対応する対照腫瘍と比較して、細胞増殖（Ｋｉ６７染色）が有意に低下し、しかしアポトーシス細胞（切断型カスパーゼ−３染色）は増えていたことを実証した（図１１Ａ〜図１１Ｂ）。対照的に、対照またはＰＯＬＲ２ＡノックダウンＨＣＴ１１６腫瘍において、有意な変化は観察されなかった。しかし、ＰＯＬＲ２Ａのヘテロ接合性欠失は、Ｄｏｘ誘導性ＰＯＬＲ２Ａ  ｓｈＲＮＡの抑制に対してＰＯＬＲ２Ａ＋／−ＨＣＴ１１６由来腫瘍を感受性にした（図１１Ｃ）。次に、同所性腫瘍モデルを用いて、ＰＯＬＲ２Ａ阻害の効果を検査した。ＰＯＬＲ２Ａ中立ＨＣＴ１１６細胞およびＰＯＬＲ２Ａ喪失ＨＣＴ１１６細胞を、ＳＣＩＤマウスの盲腸壁に注射した。同所性腫瘍が確立されたら、マウスに、飲料水中Ｄｏｘ（１．０μｇ  ｍｌ−１）を投与した。腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光イメージングは、Ｄｏｘ誘導性ＰＯＬＲ２Ａ阻害が、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍における腫瘍成長動態の有意な減少をもたらしたが、対照ＰＯＬＲ２Ａ中立腫瘍においてはもたらさなかったことを実証した（図４Ｂ〜図４Ｃ）。３週間のＤｏｘ処置後に、ＰＯＬＲ２Ａ中立腫瘍群において大きな腫瘍が視認可能だった一方、ＰＯＬＲ２Ａ喪失群においては、有意に低下した腫瘍成長が観察されたまたは視認可能な腫瘍は観察されなかった。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＰＯＬＲ２Ａサイレンシングの有効性をさらに検査するために、ナノリポソーム送達プラットフォーム、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン）を、ＰＯＬＲ２Ａ  ｓｉＲＮＡの全身性送達のために使用した（Pecotら、２０１４年）。２種の特異的ＰＯＬＲ２Ａ  ｓｉＲＮＡでは、同質遺伝子的ＨＣＴ１１６細胞株においてＰＯＬＲ２Ａタンパク質のノックダウンが８０％を超えた（図１２Ａ）。１．０×１０６個の同質遺伝子的ＨＣＴ１１６細胞の同所性注射の１０日後に、マウスを処置群にランダムに割り当てた（ｎ＝１０匹のマウス／群）。ＤＯＰＣナノリポソームに取り込まれたｓｉＲＮＡの１週間に２回の処置を開始した（図１２Ｂ）。４週間の全身療法後に、対照ｓｉＲＮＡ−ＤＯＰＣ処置と比較して、１２５μｇ  ｋｇ−１のＰＯＬＲ２Ａ  ｓｉＲＮＡ−ＤＯＰＣ処置群におけるマウスは、ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍の成長が著しく低下していたが、ＰＯＬＲ２Ａ中立腫瘍は、１，０００μｇ  ｋｇ−１のＰＯＬＲ２Ａ  ｓｉＲＮＡ−ＤＯＰＣの用量においてのみ有意に成長が阻害された（図１２Ｃ〜図１２Ｆ）。
【０１０３】
ａｍａ−ＨＥＡ１２５コンジュゲートは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＯＬＲ２Ａ喪失がん細胞における高レベルの選択性を示した（図３Ｅおよび図１０Ｇ）。次に、ＴＰ５３／ＰＯＬＲ２Ａ中立細胞およびＴＰ５３／ＰＯＬＲ２Ａ喪失ｘｈＣＲＣ細胞およびＨＣＴ１１６細胞の同質遺伝子ペアによって確立された同所性腫瘍モデルにおけるａｍａ−ＨＥＡ１２５の抗腫瘍活性を調査した（図４Ｄ〜図４Ｅおよび図１３Ａ〜図１３Ｂ）。用量増大実験において、ａｍａ−ＨＥＡ１２５を、マウス体重１ｋｇ当たりのα−アマニチンに関して３、１０、３０または９０μｇの用量での二重腹腔内注射として、腫瘍を有するマウスに投与した（１群当たりｎ＝１０匹のマウス）。対照マウスには、非コンジュゲートＨＥＡ１２５  ｍＡｂを与えた（ｎ＝１０匹のマウス）。ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍を有するマウスにおいて、対照ＨＥＡ１２５処置マウスは、抗体注射後２５日間以内に継続的腫瘍成長を示した。ａｍａ−ＨＥＡ１２５処置は、３μｇ  ｋｇ−１の最低用量であっても腫瘍成長における強い阻害を示した。全ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍は、ａｍａ−ＨＥＡ１２５処置に応答し、腫瘍体積が劇的に退縮した（図４Ｄ〜図４Ｅ）。ａｍａ−ＨＥＡ１２５の第１の投与から２５日後に、ＰＯＬＲ２Ａ喪失ＨＣＴ１１６腫瘍を有するマウスの１０匹中１０匹（９０μｇ  ｋｇ−１）、１０匹中８匹（３０μｇ  ｋｇ−１）および１０匹中６匹（１０μｇ  ｋｇ−１）において、完全な腫瘍退縮が観察された（図４Ｄ）。対照的に、ＰＯＬＲ２Ａ中立腫瘍を有するマウスにおいて、９０μｇ  ｋｇ−１の最高用量でのみ、有意な腫瘍阻害が観察されたが、３〜３０μｇ  ｋｇ−１の用量では観察されなかった。ｘｈＣＲＣ由来腫瘍を有するマウスにおいて、同様の結果が観察された（図４Ｅ）。以前の試験（Moldenhauerら、２０１２年）と一致して、検査した用量におけるａｍａ−ＨＥＡ１２５処置は、ｉｎ  ｖｉｖｏで顕著な毒性がなかった。体重および血中肝臓酵素の解析は、ａｍａ−ＨＥＡ１２５処置群および対照ＨＥＡ１２５処置群の間のいかなる実質的な差も明らかにせず（図１３Ｃおよび図１３Ｄ）、ａｍａ−ＨＥＡ１２５コンジュゲートの全身性毒性が無視できるものであることが示唆された。加えて、ＰＯＬＲ２Ａ中立ＳＷ４８０細胞およびＰＯＬＲ２Ａ喪失ＳＷ８３７細胞に由来する同所性腫瘍において、ａｍａ−ＨＥＡ１２５の抗腫瘍活性をさらに検査した（図１４Ａ〜図１４Ｆ）。１０μｇ  ｋｇ−１の用量のａｍａ−ＨＥＡ１２５処置は、全ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍における腫瘍成長の阻害に十分であったが、ＰＯＬＲ２Ａ中立（ＳＷ４８０）またはＰＯＬＲ２Ａ再導入（外因的ＰＯＬＲ２Ａを発現するＳＷ８３７）ＰＯＬＲ２Ａ喪失腫瘍は、９０μｇ  ｋｇ−１の用量のａｍａ−ＨＥＡ１２５によってのみ有意に阻害された。
*    *    *    
【０１０４】
本明細書において開示され、特許請求されている方法は全て、本開示に照らして、過度な実験を伴わずに準備し実行することができる。本発明の組成物および方法は好ましい実施形態に関して記載されているが、本発明の概念、主旨および範囲から逸脱することなく本明細書に記載の方法および方法のステップまたは一連のステップに変形を適用することができることが当業者には明らかになろう。より詳細には、本明細書に記載の作用物質を化学的かつ生理的に関連するある特定の作用物質で置換することができるが、同じまたは同様の結果が実現されることが明らかになろう。当業者に対して明らかであるそのような同様の置換および改変は全て、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の主旨、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載のものを補足する例示的な手続き上のまたは他の詳細をもたらすものである限りでは、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
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米国特許出願公開第2005/0214860号
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【図１Ａ】
2018508532.tif 000006
【図１Ｂ】
2018508532.tif 000007
【図１Ｃ】
2018508532.tif 000008
【図１Ｄ】
2018508532.tif 000009
【図１Ｅ】
2018508532.tif 000010
【図１Ｆ】
2018508532.tif 000011
【図１Ｇ】
2018508532.tif 000012
【図１Ｈ】
2018508532.tif 000013
【図２Ａ】
2018508532.tif 000014
【図２Ｂ】
2018508532.tif 000015
【図２Ｃ】
2018508532.tif 000016
【図２Ｄ】
2018508532.tif 000017
【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
2018508532.tif 000020
【図２Ｈ】
2018508532.tif 000021
【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
2018508532.tif 000023
【図３Ａ】
2018508532.tif 000024
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2018508532.tif 000027
【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
2018508532.tif 000077
【図１４Ｃ】
2018508532.tif 000078
【図１４Ｄ】
2018508532.tif 000079
【図１４Ｅ】
2018508532.tif 000080
【図１４Ｆ】
2018508532.tif 000081
【配列表】
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【国際調査報告】
2018508532.tif 000082
2018508532.tif 000083
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