(57)【要約】本発明は、ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞の指向性分化と成熟に関する。本発明により得られた肝細胞は、以前に示されたものよりも一次肝細胞の表現型に類似した表現型を示す。特に、本発明は、ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞の、Srcキナーゼ阻害剤、前駆体、代謝産物と類似体を含むビタミンD、低酸素誘導化合物、スフィンゴシンとスフィンゴシン誘導体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の活性化因子、血小板活性化因子（PAF）、PKC阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された、少なくとも１つの成熟因子に対する曝露に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞の成熟を促進する方法であって、
前記肝細胞を、Srcキナーゼ阻害剤、前駆体、代謝産物と類似体を含むビタミンD、低酸素誘導化合物、スフィンゴシンとスフィンゴシン誘導体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の活性化因子、血小板活性化因子（PAF）、PKC阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された少なくとも１つの成熟因子に暴露することを含む方法。
【請求項２】
哺乳動物肝前駆細胞を分化条件下で培養して前記肝細胞を得ることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物肝細胞の製造方法であって、
哺乳動物肝前駆細胞を分化条件下で培養して肝細胞を得ることと、
前記肝細胞を、Srcキナーゼ阻害剤、前駆体、代謝産物と類似体を含むビタミンD、低酸素誘導化合物、スフィンゴシンとスフィンゴシン誘導体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の活性化因子、血小板活性化因子（PAF）、PKC阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された、からなる群から選択された少なくとも１つの成熟因子に暴露すること
を含む方法。
【請求項４】
胚体内胚葉（DE）の細胞を分化条件下で最初に培養して前記肝前駆細胞を得ることをさらに含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物多能性幹（PS）細胞を分化条件下で最初に培養して前記肝前駆細胞を得ることをさらに含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６】
PS細胞の前記最初の培養は、哺乳動物PS細胞を分化条件下で培養して胚体内胚葉の細胞（DE細胞）を得て、さらに得られた細胞を分化条件下で培養して前記肝前駆細胞を得ることを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物多能性幹細胞は、胚性幹（ES）細胞である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳動物多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項９】
前記人工多能性幹細胞は、誘導多能性幹（iPS）細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物細胞は、ヒト細胞である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤に暴露される、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物肝細胞は、PP1、PP2、1-NA-PP1、1-NM-PP1、Src阻害剤-1（Src-I1）、Srcキナーゼ阻害剤I、Srcキナーゼ阻害剤II、A-419529、A-770041、AZM475271、ボスチニブ、CGP77675、ダムナカンタル、ダサチニブ、ダサチニブ一水和物、ER27319マレイン酸塩、フィンゴリモド（FTY720）、ゲルダナマイシン、ハービマイシンA、KB SRC4、KX2-391、KX1-004、ラベンダスチンA、ラベンダスチンC、LCK阻害剤2、Lynペプチド阻害剤、MLR-1023、MNS、N-アセチル-O-ホスホノ-Tyr-Glu ジペンチルアミド、N-アセチル-O-ホスホノ-Tyr-Glu-Glu-Ile-Glu、NVP-BHG712、PD166285、PD173952、PD180970、ピセアタノール、pp60 c-src、ケルセチン、ジヘテロスポラ・クラミドスポリア固体由来のラディシコール、サラカチニブ、SU6656、TC-S7003、TG100572、WH-4-023、ZM306416、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤に暴露される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳動物肝細胞は、PP1又はPP2に暴露される、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つのビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD代謝産物又はビタミンD類似体に暴露される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つのビタミンD3、ビタミンD3前駆体、ビタミンD3代謝産物又はビタミンD3類似体に暴露される、請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つのビタミンD3、ビタミンD3前駆体、ビタミンD3代謝産物又はビタミンD3類似体に暴露される、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記哺乳動物肝細胞は、コレカルシフェロール、カルシフェジオール、カルシトリオール、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのビタミンD3に暴露される、請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つの低酸素誘導化合物に暴露される、請求項１１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物肝細胞は、RAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンド、CoCl2、及びNaN3からなる群から選択される少なくとも１つの低酸素誘導化合物に暴露される、請求項１１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物肝細胞は、CGP52608、CGP52608類似体、メラトニン、メラトニン類似体、コレステロール、コレステロール誘導体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドに曝露される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記哺乳動物肝細胞は、CGP52608又はCGP52608類似体に曝露される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つのスフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体に曝露される、項目１１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記スフィンゴシンは、D-エリスロ-スフィンゴシンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記スフィンゴシン誘導体は、スフィンゴシン-1-リン酸又はスフィンゴ脂質である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記スフィンゴ脂質は、セラミド又はセラミド類似体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記セラミド類似体は、L-エリスロMAPP又はD-エリスロMAPPである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記哺乳動物肝細胞は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の少なくとも１つの活性化因子に暴露される、請求項１１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記哺乳動物の肝細胞は、チアゾリジンジオン、遊離脂肪酸（FFA）、エイコサノイド前駆体とエイコサノイド類似体を含むエイコサノイド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の少なくとも１つの活性化因子に曝露される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つのチアゾリジンジオンに曝される、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つの遊離脂肪酸に曝される、請求項２７〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳動物肝細胞は、テトラデカン酸に曝露される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの遊離脂肪酸は、10Z-ヘプタデセン酸、アラキドン酸（AA）、9(Z),11(E)-結合リノール酸、エイコサジエン酸、エイコサトリエン酸（ETE）、エイコサペンタエン酸（EPA）、ドコサペンタエン酸（DPA）、ドコサヘキサエン酸（DHA）、リノール酸、ガンマリノレン酸、ジホモガンマリノレン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ミード酸、リシノール酸、ドコサトリエン酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される不飽和脂肪酸である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つのエイコサノイド、エイコサノイド前駆体又はエイコサノイド類似体に曝露される、請求項１１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳動物肝細胞は、ジアシルグリセロール、エイコサペンタエン酸、ジホモガンマリノレン酸、アラキドン酸、ETYA（5,8,11,14-エイコサテトライン酸）、5-HETEと15-HETEを含むヒドロキシエイコサテトラエン酸（HETE）ファミリーのメンバー、9-HODEと13-HODEを含むヒドロキシオクタデカジオン酸（HODE）ファミリーのメンバー、古典的エイコサノイド、及び非古典的エイコサノイドからなる群から選択される少なくとも１つのエイコサノイド、エイコサノイド前駆体又はエイコサノイド類似体に暴露される、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つの血小板活性化因子（PAF）に暴露される、請求項１１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つのプロテインキナーゼC（PKC）阻害剤に曝される、請求項１１〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記哺乳動物肝細胞のマトリックスオーバーレイへの曝露を含む、請求項１〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記哺乳動物肝前駆細胞は、前記少なくとも１つの成熟因子及び／又はマトリックスオーバーレイに曝される、請求項２〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
得られた哺乳動物肝細胞は、治療用である、請求項１〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
哺乳動物肝細胞を成熟させるための、Srcキナーゼ阻害剤、前駆体、代謝産物と類似体を含むビタミンD、低酸素誘導化合物、スフィンゴシンとスフィンゴシン誘導体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の活性化因子、血小板活性化因子（PAF）、PKC阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの成熟因子の使用。
【請求項４１】
Srcキナーゼ阻害剤、前駆体、代謝産物と類似体を含むビタミンD、低酸素誘導化合物、スフィンゴシンとスフィンゴシン誘導体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の活性化因子、血小板活性化因子（PAF）、PKC阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの成熟因子を含む組成物。
【請求項４２】
前記組成物は、少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤を含む、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤は、PP1、PP2、1-NA-PP1、1-NM-PP1、Src阻害剤-1（Src-I1）、Srcキナーゼ阻害剤I、Srcキナーゼ阻害剤II、A-419529、A-770041、AZM475271、ボスチニブ、CGP77675、ダムナカンタル、ダサチニブ、ダサチニブ一水和物、ER27319マレイン酸塩、フィンゴリモド（FTY720）、ゲルダナマイシン、ハービマイシンA、KB SRC4、KX2-391、KX1-004、ラベンダスチンA、ラベンダスチンC、LCK阻害剤2、Lynペプチド阻害剤、MLR-1023、MNS、N-アセチル-O-ホスホノ-Tyr-Glu ジペンチルアミド、N-アセチル-O-ホスホノ-Tyr-Glu-Glu-Ile-Glu、NVP-BHG712、PD166285、PD173952、PD180970、ピセアタノール、pp60 c-src、ケルセチン、ジヘテロスポラ・クラミドスポリア固体由来のラディシコール、サラカチニブ、SU6656、TC-S7003、TG100572、WH-4-023、ZM306416、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤は、PP1である、請求項４２又は４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記組成物は、少なくとも１つのビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD代謝産物又はビタミンD類似体を含む、請求項４１〜４４のいずれかに記載の組成物。
【請求項４６】
前記組成物は、少なくとも１つのビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD代謝産物又はビタミンD類似体を含む、請求項４２〜４４のいずれかに記載の組成物。
【請求項４７】
前記ビタミンDは、ビタミンD3である、請求項４５又は４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記ビタミンD3は、コレカルシフェロール、カルシフェジオール、カルシトリオール、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
前記組成物は、少なくとも１つの低酸素誘導化合物を含む、請求項４２〜４８のいずれかに記載の組成物。
【請求項５０】
前記低酸素誘導化合物は、少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドである、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドは、CGP52608、CGP52608類似体、メラトニン、メラトニン類似体、コレステロール、コレステロール誘導体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
前記組成物は、スフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体を含む、請求項４２〜５１のいずれかに記載の組成物。
【請求項５３】
前記スフィンゴシンは、D-エリスロ-スフィンゴシンである、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記スフィンゴシン誘導体は、シンゴシン-1-リン酸又はスフィンゴ脂質である、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５５】
前記スフィンゴ脂質は、セラミド又はセラミド類似体である、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記セラミド類似体は、L-エリスロMAPP又はD-エリスロMAPPである、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
前記組成物は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の少なくとも１つの活性化因子を含む、請求項４２〜５６のいずれかに記載の組成物。
【請求項５８】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体の前記少なくとも１つの活性化因子は、チアゾリジンジオン、遊離脂肪酸（FFA）、エイコサノイド前駆体とエイコサノイド類似体を含むエイコサノイド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体の前記少なくとも１つの活性化因子は、10Z-ヘプタデセン酸、アラキドン酸（AA）、9(Z),11(E)-結合リノール酸、エイコサジエン酸、エイコサトリエン酸（ETE）、エイコサペンタエン酸（EPA）、ドコサペンタエン酸（DPA）、ドコサヘキサエン酸（DHA）、リノール酸、ガンマリノレン酸、ジホモガンマリノレン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ミード酸、リシノール酸、ドコサトリエン酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの不飽和脂肪酸である、請求項５７又は５８に記載の組成物。
【請求項６０】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体の前記少なくとも１つの活性化因子は、ドデカン酸、トリデカン酸、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸、ヘプタデカン酸、エイコサン酸、ヘンエイコサン酸、ドコサン酸、トリコサン酸、テトラコサン酸、ペンタコサン酸、ヘキサコサン酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの飽和脂肪酸である、請求項５７又は５８に記載の組成物。
【請求項６１】
前記組成物は、テトラデカン酸を含む、請求項５７〜６０のいずれかに記載の組成物。
【請求項６２】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体の前記少なくとも１つの活性化因子は、少なくとも１つのエイコサノイド、エイコサノイド前駆体又はエイコサノイド類似体である、請求項５７又は５８に記載の組成物。
【請求項６３】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体の前記少なくとも１つの活性化因子は、少なくとも、ジアシルグリセロール、エイコサペンタエン酸、ジホモガンマリノレン酸、アラキドン酸、ETYA（5,8,11,14-エイコサテトライン酸）、5-HETEと15-HETEを含むヒドロキシエイコサテトラエン酸（HETE）ファミリーのメンバー、9-HODEと13-HODEを含むヒドロキシオクタデカジオン酸（HODE）ファミリーのメンバー、古典的エイコサノイド、及び非古典的エイコサノイドからなる群から選択されるエイコサノイド、エイコサノイド前駆体又はエイコサノイド類似体である、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
前記組成物は、少なくとも１つの血小板活性化因子（PAF）を含む、請求項４２〜６３のいずれかに記載の組成物。
【請求項６５】
前記少なくとも１つのPAFは、C16-PAFである、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
前記組成物は、少なくとも１つのPKC阻害剤を含む、請求項４２〜６５のいずれかに記載の組成物。
【請求項６７】
前記組成物は、ビスインドリルマレイミドI、ビスインドリルマレイミドII、ビスインドリルマレイミドIII、ビスインドリルマレイミドV、ビスインドリルマレイミドVI、ビスインドリルマレイミドVII、ビスインドリルマレイミドVIII、ビスインドリルマレイミドX、HBDDE、ロトレリン、パルミトイル-DL-カルニチン、R-ステアロイルカルニチンクロライド、ピセアタノール、H-9,H-8,1-(5-イソキノリンスルホニル)-3-メチルピペラジン、HA-100二塩酸塩、HA-1004、HA-1077、5-ヨードツベリシジン、Ro-32-0432、Ro-31-7549、エンザスタウリン（LY317615）、ソトラスタウリン、塩化デクアリニウム、Go 6976、Go 6983、Go 7874、ミリシトリン、4-ヒドロキシタモキシフェン、N-デスメチルタモキシフェンHCl、サフィンゴール、フロレチン、UCN-01、7-オキソスタウロスポリン、K-252a、K-252b、K-252c、メリチン、ヒスピジン、カルホスチンC、エラグ酸、PKC阻害ペプチド19-31、PKC阻害ペプチド19-36、PKCイプシロン転位阻害剤II、EGF-R断片651-658、PKCベータ阻害剤（CAS257879-35-9）、PKC20-28、PKCβII/EGFR阻害剤（CAS145915-60-2）、PKCθ偽基質阻害剤、PKCθ/δ阻害剤、[Ala107]-MBP（104-118）、[Ala113]-MBP（104-118）、ZIP、C-1、ブリオスタチン1、LY333531塩酸塩、CGP53535、ケレリトリンクロライド、TCS21311、CID755673、ゴシポール、ET-18-OCH3、1-O-ヘキサデシル-2-O-メチル-rac-グリセロール、NPC-15437二塩酸塩、NGIC-I、MDL-27,032、DAPH-7,7-アミノインドール、5-アミノ-2-メチルインドール、rac-2-メトキシ-3-ヘキサデカンアミド-1-プロピルホスホコリン、銅ビス-3,5-ジイソプロピルサリチレート、D,L-3,4-ジヒドロキシマンデル酸、rac-3-オクタデカンアミド-2-メトキシプロパン-1-オールホスホコリン、KRIBB3、イルモホシン、rac-2-メトキシ-3-ヘキサデカンアミド-1-プロピルホスホコリン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのPKC阻害剤を含む、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
PP1、CGP52608、10Z-ヘプタデセン酸、アラキドン酸（AA）、コレカルシフェロール、カルシトリオール及びD-エリスロスフィンゴシンを含む、請求項４１〜６７のいずれかに記載の組成物。
【請求項６９】
前記組成物は、少なくとも１つの細胞外マトリックス（ECM）成分又はECM成分混合物を含む、請求項４１〜６８のいずれかに記載の組成物。
【請求項７０】
請求項４１〜６９のいずれかに記載の組成物を含む培地。
【請求項７１】
Srcキナーゼ阻害剤、前駆体、代謝産物と類似体を含むビタミンD、低酸素誘導化合物、スフィンゴシンとスフィンゴシン誘導体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の活性化因子、血小板活性化因子（PAF）、PKC阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された少なくとも１つの成熟因子を含むキット。
【請求項７２】
請求項４１〜６９のいずれかに記載の組成物又は請求項７０に記載の培地を含む、請求項７１に記載のキット。
【請求項７３】
少なくとも１つの細胞外マトリックス（ECM）成分又はECM成分混合物を含む、請求項７１又は７２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞の指向性分化と成熟に関する。本発明により得られた肝細胞は、幹細胞由来の肝細胞について以前に示されたものよりも一次肝細胞の表現型に類似した表現型を示す。特に、本発明は、ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞の、Srcキナーゼ阻害剤、前駆体、代謝産物と類似体を含むビタミンD、低酸素誘導化合物、スフィンゴシンとスフィンゴシン誘導体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の活性化因子、血小板活性化因子（PAF）、PKC阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された、少なくとも１つの成熟因子に対する曝露に関する。ここに開示されるように、本発明者らは、ここに開示されるような少なくとも１つの成熟因子にヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞を暴露すると、現在利用可能な技術水準と比較して、肝細胞のより成熟した機能的な特徴が発現することを見出した。
【背景技術】
【０００２】
新規医薬品の開発には、多くの課題、特に、有害な毒物学的影響の克服という問題に直面する。実際、肝臓の副作用が最も顕著な副作用である。大部分の小分子薬物の代謝と最終クリアランスは肝臓で起こるため、薬物開発における主な焦点領域の１つは、このような化合物又はそれらの代謝産物が肝毒性効果を有するかどうかである。さらに、このような化合物の二次代謝産物が、薬物が臨床試験プログラムを開始する前に細胞毒性作用も示すかどうかを発見することも最も重要である。
【０００３】
したがって、哺乳動物の肝臓細胞、特にヒト肝臓細胞を模倣し、新薬又は化学物質の開発における候補分子の影響を予測することができる肝臓モデル系が緊急に必要とされている。伝統的に、研究者は、このようなスクリーニングのために肝臓由来の肝細胞に頼らざるを得なかったが、これらは、長期間の培養で細胞を維持することの難しさ、一貫した均質な細胞集団を得ることの困難さを含む、多くの重大な欠点を有している。これに対する解決策は、ヒト多能性幹細胞由来の肝細胞の形態で提供されてきた。ヒト多能性幹細胞（hPS）は、関連するヒト細胞型を得る方法に革命を起こし始めている。多能性ヒト胚性幹（hES）細胞とヒト誘導性多能性幹（hiPS）細胞を無期限に増殖させ、続いてそれらを所望の標的細胞型に分化させる可能性は、現在、インビボとインビトロでの広範囲の用途のための安定した実質的に無制限の細胞供給を提供している。
【０００４】
残念なことに、現在利用可能な肝細胞の細胞型は、形態と機能の違いにより、肝臓環境を常に正確にモデル化するとは限らない。例えば、代謝酵素を非常に低レベルで含み（又は完全に欠き）、インビボで本来の肝細胞と実質的に異なる他の重要なタンパク質を発現することが多い肝細胞株が、初代細胞の代替としてよく使用される。これは、肝細胞株における主要な欠点の１つが薬物スクリーニング目的に必須である薬物輸送体タンパク質の非存在又は異常に高い発現であるため、薬物代謝に関して特に重要である。他の利用可能な肝細胞株は、より臨床的に関連する成人肝細胞よりも胎児又は幼若肝細胞をより彷彿させる形態と生理機能を有することに悩まされる。これらの理由から、培養と増殖が容易であるだけでなく、より成熟した表現型を有し、成人の初代肝細胞に近い様式で挙動する肝細胞細胞株を開発する強い必要性がある。
【０００５】
多能性幹細胞からの肝細胞の誘導は、当技術分野において十分に確立されている。インビトロの目的のために、いくつかのグループが、hES細胞から（Hay et al., 2007; Hay et al., 2008; Brolen et al. 2010; Funakoshi et al. 2011）、同様にhiPS細胞から（US8148151B; Song et al. 2009; Sullivan et al. 2010; Si-Tayeb et al. 2010; Chen et al. 2012）、肝細胞を誘導するためのプロトコルを開発している。しかし、これらの全てに共通するのは、成熟肝細胞に典型的な遺伝子、例えば、I期およびII期の遺伝子（例えば、CYP1A2、2B6、2C9、2D6、3A4）、核内受容体（例えば、CARとPXR）、他の成人肝臓マーカー（例えば、アルブミン）の、特異的な低mRNAとタンパク質発現である。さらに、これらのhESCとhiPSC由来肝細胞は、α-フェトプロテイン（AFP）とCYP3A7のような胎児肝遺伝子の高い発現を有し、その結果、そこに記載されている細胞型は、胎児性であり成人表現型ではない（概要については、例えば、Baxter et al. 2010を参照）。さらに、hESCとhiPSC由来の肝細胞に関する公表された研究の大部分において、薬物輸送体の発現と機能性は、全く調査されていない。
【０００６】
レチノイン酸応答性受容体の活性化因子への肝細胞の暴露は、肝細胞のより成熟した機能的特徴の発達と、肝細胞のより純粋で均質な集団をもたらすことが最近示された（WO2014/083132）。
【０００７】
しかしながら、発達中の肝細胞の成熟をさらに改善する必要性が依然として残っている。
【発明の概要】
【０００８】
上記目的は、CYP1A、CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19、CYP2B6、CYP2D6のような成熟肝マーカーのレベルを改善する成熟因子が同定されている点において、本発明者らによって検討された。
【０００９】
したがって、本発明は、特に、ヒト肝細胞などの、例えば、多能性幹細胞（PS）に由来する哺乳動物肝細胞をエクスビボの初代肝臓肝細胞のものにより密接に類似した表現型を有する肝細胞へさらに成熟させることができる、改良された方法、組成物とキットを提供する。より具体的には、本発明は、以下の項目によって要約することができる。
【００１０】
１．ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞の成熟を促進する方法であって、
前記肝細胞を、Srcキナーゼ阻害剤、前駆体、代謝産物と類似体を含むビタミンD、低酸素誘導化合物、スフィンゴシンとスフィンゴシン誘導体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の活性化因子、血小板活性化因子（PAF）、PKC阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された少なくとも１つの成熟因子に暴露することを含む方法。
【００１１】
２．哺乳動物肝前駆細胞を分化条件下で培養して前記肝細胞を得ることを含む、項目１に記載の方法。
【００１２】
３．哺乳動物肝細胞の製造方法であって、
哺乳動物肝前駆細胞を分化条件下で培養して肝細胞を得ることと、
前記肝細胞を、Srcキナーゼ阻害剤、前駆体、代謝産物と類似体を含むビタミンD、低酸素誘導化合物、スフィンゴシンとスフィンゴシン誘導体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の活性化因子、血小板活性化因子（PAF）、PKC阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された、からなる群から選択された少なくとも１つの成熟因子に暴露すること
を含む方法。
【００１３】
４．胚体内胚葉（DE）の細胞を分化条件下で最初に培養して前記肝前駆細胞を得ることをさらに含む、項目２又は３に記載の方法。
【００１４】
５．哺乳動物多能性幹（PS）細胞を分化条件下で最初に培養して前記肝前駆細胞を得ることをさらに含む、項目２又は３に記載の方法。
【００１５】
６．PS細胞の前記最初の培養は、哺乳動物PS細胞を分化条件下で培養して胚体内胚葉の細胞（DE細胞）を得て、さらに得られた細胞を分化条件下で培養して前記肝前駆細胞を得ることを含む、項目５に記載の方法。
【００１６】
７．前記哺乳動物多能性幹細胞は、胚性幹（ES）細胞である、項目５又は６に記載の方法。
【００１７】
８．前記哺乳動物多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞である、項目５又は６に記載の方法。
【００１８】
９．前記人工多能性幹細胞は、誘導多能性幹（iPS）細胞である、項目８に記載の方法。
【００１９】
１０．前記哺乳動物細胞は、ヒト細胞である、項目１〜９のいずれかに記載の方法。
【００２０】
１１．前記哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤に暴露される、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
【００２１】
１２．前記哺乳動物肝細胞は、PP1、PP2、1-NA-PP1、1-NM-PP1、Src阻害剤-1（Src-I1）、Srcキナーゼ阻害剤I、Srcキナーゼ阻害剤II、A-419529、A-770041、AZM475271、ボスチニブ、CGP77675、ダムナカンタル、ダサチニブ、ダサチニブ一水和物、ER27319マレイン酸塩、フィンゴリモド（FTY720）、ゲルダナマイシン、ハービマイシンA、KB SRC4、KX2-391、KX1-004、ラベンダスチンA、ラベンダスチンC、LCK阻害剤2、Lynペプチド阻害剤、MLR-1023、MNS、N-アセチル-O-ホスホノ-Tyr-Glu ジペンチルアミド、N-アセチル-O-ホスホノ-Tyr-Glu-Glu-Ile-Glu、NVP-BHG712、PD166285、PD173952、PD180970、ピセアタノール、pp60 c-src、ケルセチン、ジヘテロスポラ・クラミドスポリア固体由来のラディシコール、サラカチニブ、SU6656、TC-S7003、TG100572、WH-4-023、ZM306416、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤に暴露される、項目１１に記載の方法。
【００２２】
１３．前記哺乳動物肝細胞は、PP1又はPP2に暴露される、項目１１又は１２に記載の方法。
【００２３】
１４．前記哺乳動物肝細胞は、0.05〜50μMの範囲の濃度の前記Srcキナーゼ阻害剤に暴露される、項目１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【００２４】
１５．前記哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つのビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD代謝産物又はビタミンD類似体に暴露される、項目１〜１４のいずれかに記載の方法。
【００２５】
１６．前記哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つのビタミンD3、ビタミンD3前駆体、ビタミンD3代謝産物又はビタミンD3類似体に暴露される、項目１５に記載の方法。
【００２６】
１７．前記哺乳動物肝細胞は、コレカルシフェロール、カルシフェジオール、カルシトリオール、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのビタミンD3に暴露される、項目１５又は１６に記載の方法。
【００２７】
１８．前記哺乳動物肝細胞は、コレカルシフェロール、カルシトリオール又はそれらの組み合わせに暴露される、項目１５〜１７のいずれかに記載の方法。
【００２８】
１９．前記哺乳動物肝細胞は、0.05〜15μMの濃度の前記少なくとも１つのビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD代謝産物又はビタミンD類似体に暴露される、項目１５〜１８のいずれかに記載の方法。
【００２９】
２０．前記哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つの低酸素誘導化合物に暴露される、項目１〜１９のいずれかに記載の方法。
【００３０】
２１．前記哺乳動物肝細胞は、レチノイン酸受容体（RAR）関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンド、CoCl2、及びNaN3からなる群から選択される少なくとも１つの低酸素誘導化合物に暴露される、項目１〜２０のいずれかに記載の方法。
【００３１】
２２．前記哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドに曝露される、項目２１に記載の方法。
【００３２】
２３．前記哺乳動物肝細胞は、CGP52608、CGP52608類似体、メラトニン、メラトニン類似体、コレステロール、メラトニン類似体、コレステロール、及びコレステロール誘導体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドに曝露される、項目２１又は２２に記載の方法。
【００３３】
２４．前記哺乳動物肝細胞は、CGP52608又はCGP52608類似体に曝露される、項目２２又は２３に記載の方法。
【００３４】
２５．前記哺乳動物肝細胞は、0.05〜50μMの範囲の濃度の前記RAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドに暴露される、項目２２〜２４のいずれかに記載の方法。
【００３５】
２６．前記哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つのスフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体に曝露される、項目１〜２５のいずれかに記載の方法。
【００３６】
２７．前記スフィンゴシンは、D-エリスロ-スフィンゴシンである、項目２６に記載の方法。
【００３７】
２８．前記スフィンゴシン誘導体は、スフィンゴシン-1-リン酸である、項目２６に記載の方法。
【００３８】
２９．前記スフィンゴシン誘導体は、スフィンゴ脂質である、項目２６に記載の方法。
【００３９】
３０．前記スフィンゴ脂質は、セラミド又はセラミド類似体である、項目２９に記載の方法。
【００４０】
３１．前記哺乳動物肝細胞は、D-エリスロ-セラミド又はその類似体に曝露される、項目２６〜３０のいずれかに記載の方法。
【００４１】
３２．前記D-エリスロ-セラミドは、N-パルミトイル-D-エリスロ-スフィンゴシンである、項目３１に記載の方法。
【００４２】
３３．前記セラミド類似体は、L-エリスロMAPP又はD-エリスロMAPPである、項目３０に記載の方法。
【００４３】
３４．前記哺乳動物肝細胞は、0.05〜15μMの濃度の前記スフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体に暴露される、項目２６〜３３のいずれかに記載の方法。
【００４４】
３５．前記哺乳動物肝細胞は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の少なくとも１つの活性化因子に暴露される、項目１〜３４のいずれかに記載の方法。
【００４５】
３６．前記哺乳動物の肝細胞は、チアゾリジンジオン、遊離脂肪酸（FFA）、エイコサノイド前駆体とエイコサノイド類似体を含むエイコサノイド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の少なくとも１つの活性化因子に曝露される、項目３５に記載の方法。
【００４６】
３７．前記哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つのチアゾリジンジオンに曝される、項目３５又は３６に記載の方法。
【００４７】
３８．前記哺乳動物肝細胞は、CGP52608、CGP52608類似体、シグリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、ロベグリタゾン、トログリタゾン、TS5444、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのチアゾリジンジオンに暴露される、項目３７に記載の方法。
【００４８】
３９．前記哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つの遊離脂肪酸に曝される、項目３５〜３８のいずれかに記載の方法。
【００４９】
４０．前記少なくとも１つの遊離脂肪酸は、ドデカン酸、トリデカン酸、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸、ヘプタデカン酸、エイコサン酸、ヘンエイコサン酸、ドコサン酸、トリコサン酸、テトラコサン酸、ペンタコサン酸、ヘキサコサン酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される飽和脂肪酸である、項目３９に記載の方法。
【００５０】
４１．前記哺乳動物肝細胞は、テトラデカン酸に曝露される、項目３９又は４０に記載の方法。
【００５１】
４２．前記少なくとも１つの遊離脂肪酸は、10Z-ヘプタデセン酸、アラキドン酸（AA）、9(Z),11(E)-結合リノール酸、エイコサジエン酸、エイコサトリエン酸（ETE）、エイコサペンタエン酸（EPA）、ドコサペンタエン酸（DPA）、ドコサヘキサエン酸（DHA）、リノール酸、ガンマリノレン酸、ジホモガンマリノレン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ミード酸、リシノール酸、ドコサトリエン酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される不飽和脂肪酸である、項目３９に記載の方法。
【００５２】
４３．前記哺乳動物肝細胞は、10Z-ヘプタデセン酸に曝露される、項目３９〜４２のいずれかに記載の方法。
【００５３】
４４．前記哺乳動物肝細胞は、アラキドン酸（AA）に暴露される、項目３９〜４３のいずれかに記載の方法。
【００５４】
４５．前記哺乳動物肝細胞は、ドコサヘキサエン酸（DHA）に暴露される、項目３９〜４４のいずれかに記載の方法。
【００５５】
４６．前記哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つのエイコサノイド、エイコサノイド前駆体又はエイコサノイド類似体に曝露される、項目１〜４５のいずれかに記載の方法。
【００５６】
４７．前記哺乳動物肝細胞は、ジアシルグリセロール、エイコサペンタエン酸、ジホモガンマリノレン酸、アラキドン酸、ETYA（5,8,11,14-エイコサテトライン酸）、5-HETEと15-HETEを含むヒドロキシエイコサテトラエン酸（HETE）ファミリーのメンバー、9-HODEと13-HODEを含むヒドロキシオクタデカジオン酸（HODE）ファミリーのメンバー、古典的エイコサノイド、及び非古典的エイコサノイドからなる群から選択される少なくとも１つのエイコサノイド、エイコサノイド前駆体又はエイコサノイド類似体に暴露される、項目４６記載の方法。
【００５７】
４８．前記哺乳動物肝細胞は、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、ロイコトリエン、エオキシン、トロンボキサン、及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つの古典的エイコサノイドに曝露される、項目４６又は４７に記載の方法。
【００５８】
４９．前記プロスタグランジンは、pgd2、pgd3、pge1、pge2、pge3、pgf1c、pgf2a、pgf3、及びpgj2からなる群から選択される、項目４８に記載の方法。
【００５９】
５０．前記プロスタサイクリンは、pgi2とpgi3からなる群から選択される、項目４８に記載の方法。
【００６０】
５１．前記ロイコトリエンは、Lta4、Lta5、Ltb4、Ltb5、Ltc4、Ltc5、Ltd4、Ltd5、Lte4、及びLte5からなる群より選択される、項目４８に記載の方法。
【００６１】
５２．前記エオキシンは、14,15-ロイコトリエンA4、14,15-ロイコトリエンC4、14,15-ロイコトリエンD4、及び14,15-ロイコトリエンE4からなる群から選択される、項目４８に記載の方法。
【００６２】
５３．前記トロンボキサンは、Txa1、Txa2、及びTxa3からなる群から選択される、項目４８に記載の方法。
【００６３】
５４．前記哺乳動物肝細胞は、エンドカンナビノイド、ヘポキシチン、リゾルビン、イソフラン、イソプラスタン、リポキシン、エピリポキシン、エポキシエイコサトリエン酸（EET）からなる群から選択される少なくとも１つの非古典的エイコサノイドに暴露される、項目４６〜５３のいずれかに記載の方法。
【００６４】
５５．前記エンドカンナビノイドは、アナンダミド、WIN55,212-2、パルミチルエタノールアミド、ミードエタノールアミド、R-マサンドアミド、BML-190、N-アラキドニルグリシン、及びアラキドンアミドからなる群より選択される、項目５４に記載の方法。
【００６５】
５６．前記哺乳動物肝細胞は、0.05〜15μMの濃度のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の前記活性化因子に暴露される、項目３５〜５５のいずれかに記載の方法。
【００６６】
５７．前記哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つの血小板活性化因子（PAF）に暴露される、項目１〜５６のいずれかに記載の方法。
【００６７】
５８．前記哺乳動物肝細胞は、0.05〜50μMの濃度の前記血小板活性化因子に曝露される、項目５７に記載の方法。
【００６８】
５９．前記哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つのプロテインキナーゼC（PKC）阻害剤に曝される、項目１〜５８のいずれかに記載の方法。
【００６９】
６０．前記哺乳動物肝細胞は、0.05〜50μMの濃度の前記PKC阻害剤に曝露される、項目５９に記載の方法。
【００７０】
６１．前記哺乳動物肝細胞のマトリックスオーバーレイへの曝露を含む、項目１〜６０のいずれかに記載の方法。
【００７１】
６２．前記マトリックスオーバーレイは、フィブロネクチンとコラーゲンIを含む、項目６１に記載の方法。
【００７２】
６３．フィブロネクチンの濃度は、2〜10μg/cm2であり、コラーゲンIの濃度は、30〜150μg/cm2である、項目６２に記載の方法。
【００７３】
６４．前記哺乳動物肝前駆細胞は、前記少なくとも１つの成熟因子及び／又はマトリックスオーバーレイに曝される、項目２〜６３のいずれかに記載の方法。
【００７４】
６５．得られた哺乳動物肝細胞は、治療用である、項目１〜６４のいずれかに記載の方法。
【００７５】
６６．哺乳動物肝細胞を成熟させるための、Srcキナーゼ阻害剤、前駆体、代謝産物と類似体を含むビタミンD、低酸素誘導化合物、スフィンゴシンとスフィンゴシン誘導体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の活性化因子、血小板活性化因子（PAF）、PKC阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの成熟因子の使用。
【００７６】
６７．Srcキナーゼ阻害剤、前駆体、代謝産物と類似体を含むビタミンD、低酸素誘導化合物、スフィンゴシンとスフィンゴシン誘導体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の活性化因子、血小板活性化因子（PAF）、PKC阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの成熟因子を含む組成物。
【００７７】
６８．前記組成物は、少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤を含む、項目６７に記載の組成物。
【００７８】
６９．前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤は、PP1、PP2、1-NA-PP1、1-NM-PP1、Src阻害剤-1（Src-I1）、Srcキナーゼ阻害剤I、Srcキナーゼ阻害剤II、A-419529、A-770041、AZM475271、ボスチニブ、CGP77675、ダムナカンタル、ダサチニブ、ダサチニブ一水和物、ER27319マレイン酸塩、フィンゴリモド（FTY720）、ゲルダナマイシン、ハービマイシンA、KB SRC4、KX2-391、KX1-004、ラベンダスチンA、ラベンダスチンC、LCK阻害剤2、Lynペプチド阻害剤、MLR-1023、MNS、N-アセチル-O-ホスホノ-Tyr-Glu ジペンチルアミド、N-アセチル-O-ホスホノ-Tyr-Glu-Glu-Ile-Glu、NVP-BHG712、PD166285、PD173952、PD180970、ピセアタノール、pp60 c-src、ケルセチン、ジヘテロスポラ・クラミドスポリア固体由来のラディシコール、サラカチニブ、SU6656、TC-S7003、TG100572、WH-4-023、ZM306416、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目６８に記載の組成物。
【００７９】
７０．前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤は、PP1である、項目６８又は６９に記載の組成物。
【００８０】
７１．前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤の濃度は、0.05〜50μMの範囲である、項目６８〜７０のいずれかに記載の組成物。
【００８１】
７２．前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤の濃度は、0.1〜10μMの範囲、例えば2.5〜7.5μMの範囲である、項目７１に記載の組成物。
【００８２】
７３．前記組成物は、少なくとも１つのビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD代謝産物又はビタミンD類似体を含む、項目６７〜７２のいずれかに記載の組成物。
【００８３】
７４．前記ビタミンDは、ビタミンD3である、項目７３に記載の組成物。
【００８４】
７５．前記ビタミンD3は、コレカルシフェロール、カルシフェジオール、カルシトリオール、及びそれらの組み合わせから選択される、項目７４に記載の組成物。
【００８５】
７６．前記少なくとも１つのビタミンDの濃度は、0.05〜15μMの範囲である、項目７３〜７５のいずれかに記載の組成物。
【００８６】
７７．前記少なくとも１つのビタミンDの濃度は、0.1〜10μMの範囲、例えば0.1〜1μMの範囲である、項目７６に記載の組成物。
【００８７】
７８．前記組成物は、少なくとも１つの低酸素誘導化合物を含む、項目６７〜７７のいずれかに記載の組成物。
【００８８】
７９．前記低酸素誘導化合物は、少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドである、項目７８に記載の組成物。
【００８９】
８０．前記少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドは、CGP52608、CGP52608類似体、メラトニン、メラトニン類似体、コレステロール、コレステロール誘導体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目７９に記載の組成物。
【００９０】
８１．前記少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドは、CGP52608又はCGP52608類似体である、項目７９又は８０に記載の組成物。
【００９１】
８２．前記少なくとも１つの低酸素誘導化合物の濃度は、0.05〜50μMの範囲である、項目７８〜８１のいずれかに記載の組成物。
【００９２】
８３．前記少なくとも１つの低酸素誘導化合物の濃度は、0.1〜10μMの範囲、例えば2.5〜7.5μMの範囲である、項目８２に記載の組成物。
【００９３】
８４．前記組成物は、スフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体を含む、項目６７〜８３のいずれかに記載の組成物。
【００９４】
８５．前記スフィンゴシンは、D-エリスロ-スフィンゴシンである、項目８４に記載の組成物。
【００９５】
８６．前記スフィンゴシン誘導体は、シンゴシン-1-リン酸である、項目８５に記載の組成物。
【００９６】
８７．前記スフィンゴシン誘導体は、スフィンゴ脂質である、項目８５に記載の組成物。
【００９７】
８８．前記スフィンゴ脂質は、セラミド又はセラミド類似体である、項目８７に記載の組成物。
【００９８】
８９．前記セラミドは、N-パルミトイル-D-エリスロ-スフィンゴシンである、項目８８に記載の組成物。
【００９９】
９０．前記セラミド類似体は、L-エリスロMAPP又はD-エリスロMAPPである、項目８８に記載の組成物。
【０１００】
９１．前記スフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体の濃度は、0.05〜15μMの範囲である、項目８４〜９０のいずれかに記載の組成物。
【０１０１】
９２．前記スフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体の濃度は、0.1〜10μMの範囲、例えば0.1〜1μMの範囲である、項目９１に記載の組成物。
【０１０２】
９３．前記組成物は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の少なくとも１つの活性化因子を含む、項目６７〜９２のいずれかに記載の組成物。
【０１０３】
９４．ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体の前記少なくとも１つの活性化因子は、チアゾリジンジオン、遊離脂肪酸（FFA）、エイコサノイド前駆体とエイコサノイド類似体を含むエイコサノイド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目９３に記載の組成物。
【０１０４】
９５．ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体の前記少なくとも１つの活性化因子は、10Z-ヘプタデセン酸、アラキドン酸（AA）、9(Z),11(E)-結合リノール酸、エイコサジエン酸、エイコサトリエン酸（ETE）、エイコサペンタエン酸（EPA）、ドコサペンタエン酸（DPA）、ドコサヘキサエン酸（DHA）、リノール酸、ガンマリノレン酸、ジホモガンマリノレン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ミード酸、リシノール酸、ドコサトリエン酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの不飽和脂肪酸である、項目９３又は９４に記載の組成物。
【０１０５】
９６．前記組成物は、10Z-ヘプタデセン酸を含む、項目９３〜９５のいずれかに記載の組成物。
【０１０６】
９７．前記組成物は、アラキドン酸（AA）を含む、項目９３〜９６のいずれかに記載の組成物。
【０１０７】
９８．前記組成物は、ドコサヘキサエン酸（DHA）を含む、項目９３〜９７のいずれかに記載の組成物。
【０１０８】
９９．10Z-ヘプタデセン酸とアラキドン酸（AA）を含む、項目９３〜９８のいずれかに記載の組成物。
【０１０９】
１００．ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体の前記少なくとも１つの活性化因子は、ドデカン酸、トリデカン酸、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸、ヘプタデカン酸、エイコサン酸、ヘンエイコサン酸、ドコサン酸、トリコサン酸、テトラコサン酸、ペンタコサン酸、ヘキサコサン酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの飽和脂肪酸である、項目９３又は９４に記載の組成物。
【０１１０】
１０１．前記組成物は、テトラデカン酸を含む、項目９３〜１００のいずれかに記載の組成物。
【０１１１】
１０２．ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体の前記少なくとも１つの活性化因子は、少なくとも１つのエイコサノイド、エイコサノイド前駆体又はエイコサノイド類似体である、項目９３又は９４に記載の組成物。
【０１１２】
１０３．ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体の前記少なくとも１つの活性化因子は、少なくとも、ジアシルグリセロール、エイコサペンタエン酸、ジホモガンマリノレン酸、アラキドン酸、ETYA（5,8,11,14-エイコサテトライン酸）、5-HETEと15-HETEを含むヒドロキシエイコサテトラエン酸（HETE）ファミリーのメンバー、9-HODEと13-HODEを含むヒドロキシオクタデカジオン酸（HODE）ファミリーのメンバー、古典的エイコサノイド、及び非古典的エイコサノイドからなる群から選択されるエイコサノイド、エイコサノイド前駆体又はエイコサノイド類似体である、項目１０２に記載の組成物。
【０１１３】
１０４．前記古典的エイコサノイドは、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、ロイコトリエン、エオキシン、トロンボキサン、及びその類似体からなる群から選択される、項目１０３に記載の組成物。
【０１１４】
１０５．前記プロスタグランジンは、pgd2、pgd3、pge1、pge2、pge3、pgf1c、pgf2a、pgf3、及びpgj2からなる群から選択される、項目１０４に記載の組成物。
【０１１５】
１０６．前記プロスタサイクリンは、pgi2とpgi3からなる群から選択される、項目１０４に記載の組成物。
【０１１６】
１０７．前記ロイコトリエンは、Lta4、Lta5、Ltb4、Ltb5、Ltc4、Ltc5、Ltd4、Ltd5、Lte4、及びLte5からなる群から選択される、項目１０４に記載の組成物。
【０１１７】
１０８．前記エトキシンは、14,15-ロイコトリエンA4、14,15-ロイコトリエンC4、14,15-ロイコトリエンD4、及び14,15-ロイコトリエンE4からなる群から選択される、項目１０４に記載の組成物。
【０１１８】
１０９．前記トロンボキサンは、Txa1、Txa2、及びTxa3からなる群から選択される、項目１０４に記載の組成物。
【０１１９】
１１０．前記非古典的エイコサノイドは、エンドカンナビノイド、ヘポキシチン、リゾルビン、イソフラン、イソプラザン、リポキシン、エピリポキシン、エポキシエイコサトリーリオン酸（EET）からなる群から選択される、項目１０３に記載の組成物。
【０１２０】
１１１．前記エンドカンナビノイドは、アナンダミド、WIN55,212-2、パルミチルエタノールアミド、ミードエタノールアミド、R-マサンドアミド、BML-190、N-アラキドニルグリシン、及びアラキドンアミドからなる群から選択される、項目１１０に記載の組成物。
【０１２１】
１１２．ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体の前記少なくとも１つの活性化因子の濃度は、0.05〜15μMの範囲である、項目９３〜１１１のいずれかに記載の組成物。
【０１２２】
１１３．ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体の前記少なくとも１つの活性化因子の濃度は、0.1〜10μMの範囲、例えば0.1〜1μMの範囲である、項目１１２に記載の組成物。
【０１２３】
１１４．前記組成物は、少なくとも１つの血小板活性化因子（PAF）を含む、項目６７〜１１３のいずれかに記載の組成物。
【０１２４】
１１５．前記少なくとも１つのPAFは、C16-PAFである、項目１１４に記載の組成物。
【０１２５】
１１６．前記少なくとも１つの血小板活性化因子（PAF）の濃度は、0.05〜50μMの範囲である、項目１１４又は１１５に記載の組成物。
【０１２６】
１１７．前記少なくとも１つの血小板活性化因子（PAF）の濃度は、0.1〜10μMの範囲、例えば2.5〜7.5μMの範囲である、項目１１６に記載の組成物。
【０１２７】
１１８．前記組成物は、少なくとも１つのPKC阻害剤を含む、項目６７〜１１７のいずれかに記載の組成物。
【０１２８】
１１９．前記組成物は、ビスインドリルマレイミドI、ビスインドリルマレイミドII、ビスインドリルマレイミドIII、ビスインドリルマレイミドV、ビスインドリルマレイミドVI、ビスインドリルマレイミドVII、ビスインドリルマレイミドVIII、ビスインドリルマレイミドX、HBDDE、ロトレリン、パルミトイル-DL-カルニチン、R-ステアロイルカルニチンクロライド、ピセアタノール、H-9,H-8,1-(5-イソキノリンスルホニル)-3-メチルピペラジン、HA-100二塩酸塩、HA-1004、HA-1077、5-ヨードツベリシジン、Ro-32-0432、Ro-31-7549、エンザスタウリン（LY317615）、ソトラスタウリン、塩化デクアリニウム、Go 6976、Go 6983、Go 7874、ミリシトリン、4-ヒドロキシタモキシフェン、N-デスメチルタモキシフェンHCl、サフィンゴール、フロレチン、UCN-01、7-オキソスタウロスポリン、K-252a、K-252b、K-252c、メリチン、ヒスピジン、カルホスチンC、エラグ酸、PKC阻害ペプチド19-31、PKC阻害ペプチド19-36、PKCイプシロン転位阻害剤II、EGF-R断片651-658、PKCベータ阻害剤（CAS257879-35-9）、PKC20-28、PKCβII/EGFR阻害剤（CAS145915-60-2）、PKCθ偽基質阻害剤、PKCθ/δ阻害剤、[Ala107]-MBP（104-118）、[Ala113]-MBP（104-118）、ZIP、C-1、ブリオスタチン1、LY333531塩酸塩、CGP53535、ケレリトリンクロライド、TCS21311、CID755673、ゴシポール、ET-18-OCH3、1-O-ヘキサデシル-2-O-メチル-rac-グリセロール、NPC-15437二塩酸塩、NGIC-I、MDL-27,032、DAPH-7,7-アミノインドール、5-アミノ-2-メチルインドール、rac-2-メトキシ-3-ヘキサデカンアミド-1-プロピルホスホコリン、銅ビス-3,5-ジイソプロピルサリチレート、D,L-3,4-ジヒドロキシマンデル酸、rac-3-オクタデカンアミド-2-メトキシプロパン-1-オールホスホコリン、KRIBB3、イルモホシン、rac-2-メトキシ-3-ヘキサデカンアミド-1-プロピルホスホコリン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのPKC阻害剤を含む、項目１１８に記載の組成物。
【０１２９】
１２０．前記少なくとも１つのPKC阻害剤の濃度は、0.01〜50μMの範囲である、項目１１８又は１１９に記載の組成物。
【０１３０】
１２１．前記少なくとも１つのPKC阻害剤の濃度は、約0.5〜約10μMの範囲である、項目１２０に記載の組成物。
【０１３１】
１２２．PP1、CGP52608、10Z-ヘプタデセン酸、アラキドン酸（AA）、コレカルシフェロール、カルシトリオール及びD-エリスロスフィンゴシンを含む、項目６７〜１２１のいずれかに記載の組成物。
【０１３２】
１２３．前記組成物は、少なくとも１つの細胞外マトリックス（ECM）成分又はECM成分混合物を含む、項目６７〜１２２のいずれかに記載の組成物。
【０１３３】
１２４．前記少なくとも１つの細胞外マトリックス（ECM）成分又はECM成分の合物は、コラーゲンI、II、III、IV、V又はVIなどのコラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン、ヘパリンプロテオグリカン、グリピカン、シンデカン又はパーレカンなどのヘパラン硫酸プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ニドゲン/エンタクチン、ラミニン、ビグリカン、テネイシン、ヒアルロナン、及びそれらの組み合わせから選択される、項目１２３に記載の組成物。
【０１３４】
１２５．前記組成物は、コラーゲンIとフィブロネクチンを含む、項目１２３又は１２４に記載の組成物。
【０１３５】
１２６．コラーゲンIの濃度は、約2〜約150μg/cm2培養面積の範囲である、項目１２５に記載の組成物。
【０１３６】
１２７．フィブロネクチンの濃度は、約2〜約30μg/cm2培養面積の範囲である、項目１２５又は１２６に記載の組成物。
【０１３７】
１２８．項目６７〜１２７のいずれかに記載の組成物を含む培地。
【０１３８】
１２９．Srcキナーゼ阻害剤、前駆体、代謝産物と類似体を含むビタミンD、低酸素誘導化合物、スフィンゴシンとスフィンゴシン誘導体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の活性化因子、血小板活性化因子（PAF）、PKC阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された少なくとも１つの成熟因子を含むキット。
【０１３９】
１３０．項目６７〜１２７のいずれかに記載の組成物又は項目１２８に記載の培地を含む、項目１２９に記載のキット。
【０１４０】
１３１．少なくとも１つの細胞外マトリックス（ECM）成分又はECM成分混合物を含む、項目１２９又は１３０に記載のキット。
【発明を実施するための形態】
【０１４１】
本発明は、Srcキナーゼ阻害剤、前駆体、代謝産物と類似体を含むビタミンD、低酸素誘導化合物、スフィンゴシンとスフィンゴシン誘導体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の活性化因子、血小板活性化因子（PAF）、PKC阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された、少なくとも１つの成熟因子に細胞を暴露することによって、ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞を成熟させる方法を提供する。
【０１４２】
その方法は、支持培養と分化培地中で、ヒト肝前駆細胞などの哺乳動物肝前駆細胞を培養して、前記肝細胞を得ることをさらに含むことができ、細胞は、Srcキナーゼ阻害剤、前駆体、代謝産物と類似体を含むビタミンD、低酸素誘導化合物、スフィンゴシンとスフィンゴシン誘導体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の活性化因子、血小板活性化因子（PAF）、PKC阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された、少なくとも１つの成熟因子に暴露される。
【０１４３】
したがって、ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞の成熟を促進する方法は、
前記ヒト肝細胞などの前記哺乳動物肝細胞を、Srcキナーゼ阻害剤、前駆体、代謝産物と類似体を含むビタミンD、低酸素誘導化合物、スフィンゴシンとスフィンゴシン誘導体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の活性化因子、血小板活性化因子（PAF）、PKC阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された、少なくとも１つの成熟因子に暴露するステップ
を含むものとして説明されることができる。
【０１４４】
ヒト肝細胞の成熟を促進する方法は、ヒト肝前駆細胞などの哺乳動物肝前駆細胞を、分化条件下で培養して前記肝細胞を得るステップをさらに含むことができる。
【０１４５】
また、本発明は、ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞を製造する方法を提供し、ヒト肝前駆細胞などの哺乳動物肝前駆細胞を分化条件下で培養して肝細胞を得て、得られた肝細胞を、Srcキナーゼ阻害剤、前駆体、代謝産物と類似体を含むビタミンD、低酸素誘導化合物、スフィンゴシンとスフィンゴシン誘導体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の活性化因子、血小板活性化因子（PAF）、PKC阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された、少なくとも１つの成熟因子に暴露する。
【０１４６】
したがって、ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞の製造方法は、
ヒト肝前駆細胞などの哺乳動物肝前駆細胞を分化条件下で培養して肝細胞を得るステップと、
前記肝細胞を、Srcキナーゼ阻害剤、前駆体、代謝産物と類似体を含むビタミンD、低酸素誘導化合物、スフィンゴシンとスフィンゴシン誘導体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の活性化因子、血小板活性化因子（PAF）、PKC阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された、からなる群から選択された少なくとも１つの成熟因子に暴露するステップ
を含むものとして説明されることができる。
【０１４７】
したがって、ヒト肝前駆細胞などの哺乳動物肝前駆細胞は、本発明の出発材料として使用することができる。肝前駆前駆材料は、例えば、肝臓前駆細胞の樹立細胞株、ヒト肝臓などの肝臓から新たに単離された肝前駆細胞であってもよく、或いは、ヒト多能性幹（hPS）細胞などの哺乳動物多能性幹（PS）細胞、又はヒト胚体内胚葉（DE）細胞などの哺乳動物胚体内胚葉（DE）細胞などから新たに調製されてもよい。
【０１４８】
肝細胞の分化と成熟は、肝前駆細胞が肝細胞に分化する第１段階（「肝前駆細胞段階」）と、得られた肝細胞がさらに成熟する第２段階（成熟段階）の２つの段階に分けることができる。成熟段階の間、得られた肝細胞は、成熟肝細胞の特徴的マーカーの遺伝子とタンパク質の発現の増加を示す。
【０１４９】
ヒトの胚性幹（hES）細胞由来（Hay et al., 2007; Hay et al., 2008; Brolen et al. 2010; Funakoshi et al. 2011）、及びヒト誘導多能性幹（hiPS）細胞由来（US8148151B; Song et al. 2009; Sullivan et al. 2010; Si-Tayeb et al. 2010; Chen et al. 2012）の肝前駆細胞を肝細胞に分化させるための適切な条件は公知である。例えば、WO2009/013254A1は、肝前駆細胞から肝細胞を得るための適切な基本的なプロトコルを記載している（実施例1〜4）。
【０１５０】
一般に、肝前駆細胞は、HGFなどの１つ以上の増殖因子、及び／又はジメチルスルホキシド（DMSO）、デキサメタゾン（DexM）、オメプラゾール、オンコスタチンM（OSM）、リファンピシン、デスオキシフェノバルビタール、エタノール又はイソニアジドなどの１つ以上の分化誘導因子を含む分化培地で培養される。HGFなどの１つ以上の増殖因子の濃度は、通常、約10〜約50ng/ml、例えば約10〜約30ng/mlの範囲である。１つ以上の分化誘導剤の濃度は、使用される個々の化合物によって変化してもよい。例えば、DMSOの濃度は、通常、約0.1〜約1％v/v、例えば約0.25〜約0.75％v/vの範囲である。例えば、OSMの濃度は、通常、約1〜約20ng/ml、例えば約5〜約15ng/mlの範囲である。例えば、DexMの濃度は、通常、約0.05〜約1μM、例えば約0.05〜約0.2μMの範囲である。
【０１５１】
分化培地は、FBS、FCS又はBSAなどのアルブミン源をさらに含んでいてもよい。アルブミン源の濃度は、存在する場合には、通常、約0.1〜約5％v/v、例えば約0.1〜約1％、0.2〜3％v/v、約0.5〜約2.5％v/v、約0.5〜1％v/v又は約1〜約2.5％v/vである。
【０１５２】
分化培地は、アスコルビン酸をさらに含んでいてもよい。アスコルビン酸の濃度は、存在する場合には、通常、約0.01〜約0.1mg/ml、例えば約0.1〜約0.05mg/mlの範囲である。
【０１５３】
分化培地は、ヒドロコルチゾンヘミサクシネートをさらに含んでいてもよい。ヒドロコルチゾンヘミサクシネートの濃度は、存在する場合には、通常、約0.1〜約1μg/ml、例えば約0.5〜0.8μg/mlの範囲である。
【０１５４】
分化培地は、トランスフェリンをさらに含んでいてもよい。トランスフェリンの濃度は、存在する場合には、通常、約1〜20μg/ml、例えば約5〜15μg/mlの範囲である。
【０１５５】
分化培地は、インスリンをさらに含んでいてもよい。インシュリンの濃度は、存在する場合には、通常、約1〜約10μg/ml、例えば約2.5〜約7.5μg/mlの範囲である。
【０１５６】
分化培地は、上皮増殖因子（EGF）をさらに含んでいてもよい。EGFの濃度は、存在する場合には、通常、約0.001〜約0.005μg/ml、例えば約0.0025〜約0.0035μg/ mlの範囲である。
【０１５７】
分化培地は、PEST及び／又はGlutaMAXなどの他のサプリメントをさらに含んでいてもよい。PESTの濃度は、通常約0.1〜約0.5％v/v、例えば約0.1〜約0.25％v/vの範囲である。GlutaMAXの濃度は、通常約0.5〜約1.5％v/v、例えば約0.75〜1.25％v/vの範囲、例えば約1％v/vである。
【０１５８】
分化培地は、レチノイン酸応答性受容体の少なくとも１つの活性化因子、すなわち、ヒトレチノイン酸受容体（RAR）及び／又はヒトレチノイドX受容体（RXR）に結合して活性化することができる化合物、例えば、RARとRXRの両方に結合して活性化することができる化合物など、をさらに含んでいてもよい。分化培地で使用されるレチノイン酸応答性受容体の適切な活性化因子は、9-シス-レチノイン酸、13-シス-レチノイン酸、又は他のレチノイン酸異性体などのレチノイン酸であり、全トランスレチノイン酸、7-シスレチノイン酸及び11-シス-レチノイン酸、又はレチノイン酸類似体、例えばTTNPB、AM580、レチリン酸又はCBS-211A、又はレチノイドなどが挙げられる。したがって、9-シス-レチノイン酸は、レチノイン酸応答性受容体の活性化因子として使用されてもよい。その代わりに、又はそれに加えて、13-シス-レチノイン酸をレチノイン酸応答性受容体の活性化因子として使用することもできる。レチノイン酸応答性受容体の活性化因子の濃度は、存在する場合には、通常、約0.1〜約2.5μMの範囲、例えば約0.1〜約0.5の範囲、例えば約0.2μMである。
【０１５９】
分化培地は、少なくとも１つのGSK-3阻害剤及び／又はCDK阻害剤をさらに含んでいてもよい。
【０１６０】
本発明における使用に適したGSK-3阻害剤は、ケンパロン又はNSC664704としても知られている9-ブロモ-7,12-ジヒドロ-インドロ[3,2-d]-[1]ベンズアゼピン-6(5H)-オン、1-アザ-ケンパロン(9-ブロモ-7,12-ジヒドロ-ピリド[3',2':2,3]アゼピノ[4,5-b]インドール-6(5H)-オン）、アルスターパウロン(9-ニトロ-7,12-ジヒドロインドロ[3,2-d][1]ベンズアゼピン-6(5)-オン）、AT-7519としても知られている4-(2,6-ジクロロベンズアミド)-N-(ピペリジン-4-イル)-1H-ピラゾール-3-カルボキサミド、SNS-032（BMS-387032）としても知られているN-(5-((5-tert-ブチルオキサゾール-2-イル)メチルチオ)チアゾール-2-イル)ピペリジン-4-カルボキサミド、AZD5438としても知られている4-(1-イソプロピル-2-メチル-1H-イミダゾール-5-イル)-N-(4-(メチルスルホニル)フェニル)ピリミジン-2-アミン、BIO（GSK3阻害剤IX）としても知られている(2'Z,3'E)-6-ブロモインジルビン-3'-オキシム、BIO-アセトキシム（GSK3阻害剤X）としても知られている(2'Z,3'E)-6-ブロモインジルビン-3'-アセトキシム、(5-メチル-1H-ピラゾール-3-イル)-(2-フェニルキナゾリン-4-イル)アミン（GSK3阻害剤XIII）、ピリドカルバゾール-シクロペンタジエニルルテニウム錯体（GSK3阻害剤XV）、TDZD-8 4-ベンジル-2-メチル-1,2,4-チアジアゾリジン-3,5-ジオン（GSK3ベータ阻害剤I）、2-チオ(3-ヨードベンジル)-5-(1-ピリジル)-[1,3,4]-オキサジアゾール（GSK3ベータ阻害剤II）、OTDZT 2,4-ジベンジル-5-オキソチアジアゾリジン-3-チオン（GSK3ベータ阻害剤III）、アルファ-4-ジブロモアセトフェノン（GSK3ベータ阻害剤VII）、AR-AO14418としても知られているN-(4-メトキシベンジル)-N'-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)尿素（GSK-3ベータ阻害剤VIII）、3-(1-(3-ヒドロキシプロピル)-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル]-4-ピラジン-2-イル-ピロール-2,5-ジオン（GSK-3ベータ阻害剤XI）、TWSl19 ピロロピリミジン化合物（GSK3ベータ阻害剤XII）、L803 H-KEAPPAPPQSpP-NH2又はそのミリストイル化形態（GSK3ベータ阻害剤XIII）、2-クロロ-1-(4,5-ジブロモ-チオフェン-2-イル)-エタノン（GSK3ベータ阻害剤VI）、アミノピリミジンCHIR99021、SB216763としても知られている3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン、インジルビン-3'-モノオキシム、3F8 (5-エチル-7,8-ジメトキシ-1H-ピロロ[3,4-c]イソキノリン-1,3-(2H)-ジオン）、A1070722、ベリリウム、銅、リチウム、水銀、タングステン（ウォルフラム）、及び亜鉛などの無機イオン、AR-A014418、AZD2858、アキシンGID-25残基（ペプチド）、ビスインドリルマレイミド、CHIR98014（CT98014）、CHIR98023（CT98023）、FRATide-39残基（ペプチド）、ハロメチルケトン誘導体、例えば、HMK-32、KT5720、L803-MTS（ペプチド）及び変異体、LY20900314、NP-12（チデグルシブ、NP031112）、NP00111、NP031115、ポリオキシ化ビス-7-アザインドリル-マレイミド、RO31-8220、SB415286（マレイミド）、TC-G24、TCS2002、TCS21311、TDZD-8、TOS119及びTWS119（ジフルオロアセテート）である。GSK-3阻害剤は、例えば、ケンパロン、1-アザ-ケンパロン、アルスターパウロン、アミノピリミジンCHIR99021及びインジルビン-3'-モノオキシムから選択される１つであってもよい。
【０１６１】
本発明における使用に適したCDK阻害剤は、ケンパロン又はNSC664704としても知られている9-ブロモ-7,12-ジヒドロ-インドロ[3,2-d]-[1]ベンズアゼピン-6(5H)-オン、ロスコビチンとしても知られている(R)-2-(6-(ベンジルアミノ)-9-イソプロピル-9H-プリン-2-イルアミノ)ブタン-1-オール、フラボピリドールとしても知られている2-(2-クロロフェニル)-5,7-ジヒドロキシ-8-((3S,4R)-3-ヒドロキシ-1-メチルピペリジン-4-イル)-4H-クロメン-4-オン、AT-7519としても知られている4-(2,6-ジクロロベンズアミド)-N-(ピペリジン-4-イル)-1H-ピラゾール-3-カルボキサミド、PD0332991 HClとしても知られている6-アセチル-8-シクロペンチル-5-メチル-2-(5-(ピペラジン-1-イル)ピリジン-2-イルアミノ)ピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン塩酸塩、SNS-032（BMS-387032）としても知られているN-(5-((5-tert-ブチルオキサゾール-2-イル)メチルチオ)チアゾール-2-イル)ピペリジン-4-カルボキサミド、JNJ-7706621、PHA-793887としても知られているN-(6,6-ジメチル-5-(1-メチルピペリジン-4-カルボニル)-1,4,5,6-テトラヒドロピロロ[3,4-c]ピラゾール-3-イル)-3-メチルブタンアミド、ジナシクリブ（SCH727965）、BMS-265246としても知られている(4-ブトキシ-1H-ピラゾロ[3,4-b]ピリジン-5-イル)(2,6-ジフルオロ-4-メチルフェニル)メタノン、PHA-848125としても知られているN,1,4,4-テトラメチル-8-(4-(4-メチルピペラジン-1-イル)フェニルアミノ)-4,5-ジヒドロ-1H-ピラゾロ[4,3-h]キナゾリン-3-カルボキサミド、PHA-767491としても知られている2-(ピリジン-4-イル)-6,7-ジヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4(5H)-オン、SCH 900776、フラボピリドールHClとしても知られている2-(2-クロロフェニル)-5,7-ジヒドロキシ-8-((3S,4R)-3-ヒドロキシ-1-メチルピペリジン-4-イル)-4H-クロメン-4-オン塩酸塩、R547としても知られている(4-アミノ-2-(1-(メチルスルホニル)ピペリジン-4-イルアミノ)ピリミジン-5-イル)(2,3-ジフルオロ-6-メトキシフェニル)メタノン、A-674563としても知られている(2S)-1-(5-(3-メチル-1H-インダゾール-5-イル)ピリジン-3-イルオキシ)-3-フェニルプロパン-2-アミン、AZD5438としても知られている4-(1-イソプロピル-2-メチル-1H-イミダゾール-5-イル)-N-(4-(メチルスルホニル)フェニル)ピリミジン-2-アミン、BS-181HClとしても知られているN5-(6-アミノヘキシル)-N7-ベンジル-3-イソプロピルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-5,7-ジアミン塩酸塩、CY-202、AG-024322、P276-00、ZK304709、GPC-286199、及びBAY 80-3000、2-ヒドロキシブテン、A674563、アミノプルバノール、BAY1000394、BMS-265246、BS-181ブチロラクトンI、CR8 S-異性体、ジアシクリブ（SCH727965）、JNJ-7706621、N9-イソプロピル-オロモウシン、NU6140、NU6102、オロモウシンII、オキシインドールI、P276-00、PD332991、PHA-793887、PHA-767491、PHA-848125、PNU112455A、プルバノロールAとB、R547、(R)-DRF053とSCH900776（MK-8776）である。GSK-3阻害剤は、例えば、ケンパロン、1-アザ-ケンパロン、インジルビン-3'-モノオキシム、アルスターパウロン、SNS-032（BMS-387032）、AT-7519及びAZD5438から選択される１つであってもよい。
【０１６２】
GSK3阻害剤及び／又はCDK阻害剤の濃度は、存在する場合には、通常、約0.01〜約10μMの範囲である。例えば、ケンパウロンがCDK阻害剤として使用される場合、肝細胞は、約0.05〜約5μMの範囲の濃度において、例えば、約0.5〜約1.5μMの範囲において暴露される。同様の濃度は、例えば、1-アザ-ケンパロン又はアルスターパウロンを使用する場合に用いることができる。
【０１６３】
分化培地の基礎をなす培養培地は、RPMI 1640培地、RPMI 1640高度培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）、最小必須培地（例えば、MEM、EMEM又はGMEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（例えば、DMEM又はDMEM/F-12）、ハム培地（例えば、ハムF12又はハムF10）、HCM培地、HBM培地、又はウィリアムズE培地などの、哺乳類肝前駆細胞を培養するのに適した任意の培地であってもよい。したがって、基本培地は、例えば、RPMI1640培地又はRPMI1640高度培地であってもよい。或いは、基本培地は、ウィリアムズE培地であってもよい。
【０１６４】
ヒト肝前駆細胞などの哺乳動物肝前駆細胞の分化と、得られた肝細胞のさらなる成熟（「分化と成熟」）は、合計で35日かかることがある。したがって、肝細胞を得るために、ヒト肝前駆細胞などの哺乳動物肝前駆細胞を、分化培地中で最大35日間培養する。例えば、ヒト肝前駆細胞などの哺乳動物肝前駆細胞を、約7〜約35日間の任意の時間、分化培地中で培養することができる。したがって、それらを約10〜約30日間培養することもできる。それらを約10〜約25日間培養することもできる。或いは、それらを、約10〜約20日間又は約10〜約15日間培養することができる。それらを約15〜約35日間培養することもできる。したがって、それらを約15〜約30日間培養することもできる。或いは、それらを約15〜約25日間培養することができる。それらを約15〜約20日間培養することもできる。培養の間、分化培地は、通常、2日毎又は3日毎に新鮮な培地に交換される。
【０１６５】
上記の条件下で、肝細胞は、培養7日目以降に肝前駆細胞から得られる。したがって、肝細胞の分化と成熟は、肝前駆細胞が肝細胞に分化する7日間の肝前駆細胞期と、得られた肝細胞がさらに成熟する全培養期間の終わりまで（例えば、35日目まで）持続する成熟期とに分けることができる。
【０１６６】
本発明の方法で使用される少なくとも１つの成熟因子は、Srcキナーゼ阻害剤、前駆体、代謝産物と類似体を含むビタミンD、低酸素誘導化合物、スフィンゴシンとスフィンゴシン誘導体、ペルオキシソーム増殖因子の活性化因子（PPAR）、血小板活性化因子（PAF）、PKC阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される任意の化合物であってもよい。
【０１６７】
したがって、本発明の方法において使用される少なくとも１つの成熟因子は、PP1（1-(1,1-ジメチルエチル)-1-(4-メチルフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン）、PP2（3-(4-クロロフェニル) 1-(1,1-ジメチルエチル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン）、1-NA PP1（1-ナフチルPP1、1-(1,1-ジメチルエチル)-3-(1-ナフタレニル）-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン）、1-NM-PP1（1-(1,1-ジメチルエチル)-3-(1-ナフタレニルメチル)-1H-ピラゾロ[3,4-d] ピリミジン-4-アミン）、Src阻害剤-1（Src-I1、6,7-ジメトキシ-N-(4-フェノキシフェニル)-4-キナゾリンアミン）、Srcキナーゼ阻害剤I（CAS179248-59-0）、Srcキナーゼ阻害剤II（CAS459848-35-2）、A-419529、A-770041、AZM475271、ボスチニブ、CGP77675、ダムナカンタル、ダサチニブ、ダサチニブ一水和物、ER27319マレイン酸塩、フィンゴリモド（FTY720）、ゲルダナマイシン、ハービマイシンA、KB SRC4、KX2-391、KX1-004、ラベンダスチンA、ラベンダスチンC、LCK阻害剤2、Lynペプチド阻害剤、MLR-1023、MNS、N-アセチル-O-ホスホノ-Tyr-Gluジペンチルアミド、N-アセチル-O-ホスホノ-Tyr-Glu-Glu-Ile-Glu、NVP-BHG712、PD166285、PD173952、PD180970、ピセアタノール、pp60 c-src、ケルセチン、ジヘテロスポラクラミドスポリア固体由来のラディシコール、サラカチニブ、SU6656、TC-S7003、TG100572、WH-4-023、ZM306416、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば少なくとも２つ）のSrcキナーゼ阻害剤などの少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤であってもよい。
【０１６８】
したがって、哺乳動物肝細胞は、少なくともPP1に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともPP2に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくとも1-NA PP1に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくとも1-NM-PP1に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともSrc阻害剤-1に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともSrcキナーゼ阻害剤I（CAS179248-59-0）に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともSrcキナーゼ阻害剤II（CAS459848-35-2）に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともA-419529に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともA-770041に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともAZM475271に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともボスチニブに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともCGP77675に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともダムナカンタルに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともダサチニブに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともダサチニブ一水和物に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともER27319マレイン酸塩に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともフィンゴリモド（FTY720）に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともゲルダナマイシンに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともハービマイシンAに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともKBRC4に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともKX2-391に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともKX1-004に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともラベンダスチンAに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともラベンダスチンCに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともLCK阻害剤2に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともLynペプチド阻害剤に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともMLR-1023に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともMNS、N-アセチル-O-ホスホノ-Tyr-Gluジペンチルアミドに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともN-アセチル-O-ホスホノ-Tyr-Glu-Glu-Ile-Gluに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともNVP-BHG712に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともPD166285に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともPD173952に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともPD180970に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともピセアタノールに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともpp60 c-srcに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともケルセチンに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともジヘテロスポラクラミドスポリア固体由来のラジシコールに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともサラカチニブに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともSU-6656に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともTC-S7003に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともTG100572に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともWH-4-023に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともZM306416に曝露されてもよい。
【０１６９】
哺乳動物肝細胞は、Srcキナーゼ阻害剤の任意の組み合わせ、例えば上記の化合物の任意の組み合わせに曝露されてもよい。例えば、哺乳動物肝細胞は、少なくともPP1とPP2に曝露されてもよい。
【０１７０】
一般に、前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤の濃度は、本発明に従って使用される場合、約0.05〜約50μMの範囲、例えば約0.5〜約10μMの範囲である。
【０１７１】
したがって、ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞は、約0.05〜約25μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.05〜約15μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.05〜約10μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.05〜約7.5μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約25μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約15μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約15μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約10μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約7.5μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.5〜約25μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.5〜約15μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.5〜約10μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.5〜約7.5μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約1〜約10μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約1〜約7.5μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約1.5〜約7.5μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約2.5〜約7.5μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約3.5〜約6.5μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約4〜約6μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約4.5〜約5.5μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのSrcキナーゼ阻害剤に曝露されてもよい。例えば、哺乳動物肝細胞は、約5μMの前記少なくとも１種のSrcキナーゼ阻害剤に曝露されてもよい。
【０１７２】
例えば、PP1を本発明に従って使用する場合には、約0.05〜約50μMの範囲、例えば約0.5〜約10μMの範囲、例えば約5μMの濃度で使用してもよい。
【０１７３】
例えば、PP2を使用する場合には、同様の濃度を用いることができる。
【０１７４】
また、本発明の方法において使用される少なくとも１つの成熟因子は、少なくとも１つのビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD代謝産物又はビタミンD類似体、例えば、ビタミンD1、D2、D3、D4又はD5、それらの前駆体、代謝産物及び類似体であってもよい。
【０１７５】
したがって、哺乳動物肝細胞は、少なくともビタミンD3（コレカルシフェロール）、ビタミンD3前駆体（7-デヒドロコレステロールなど）、ビタミンD3代謝産物（カルシフェジオール又はカルシトリオールなど）及び／又はビタミンD3類似体（カルシポトリオール、タカルシトール、ZK191784又はZK203278まなど）に暴露されてもよい。
【０１７６】
哺乳類肝細胞は、コレカルシフェロール、カルシフェジオール、カルシトリオール、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのビタミンD3に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、コレカルシフェロール、カルシトリオール、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのビタミンD3に曝露されてもよい。
【０１７７】
哺乳動物肝細胞は、少なくともコレカルシフェロールに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともカルシフェジオールに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともカルシトリオールに曝露されてもよい。
【０１７８】
哺乳動物肝細胞は、少なくともコレカルシフェロールとカルシフェジオールに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともコレカルシフェロールとカルシトリオールに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともカルシフェジオールとカルシトリオールに曝露されてもよい。哺乳類肝細胞は、少なくともコレカルシフェロール、カルシフェジオール及びカルシトリオールに曝露されてもよい。
【０１７９】
哺乳類肝細胞は、少なくとも7-デヒドロコレステロールなどの少なくとも１つのビタミンD3前駆体に曝露されてもよい。
【０１８０】
哺乳動物肝細胞は、22-オキサカルシトリオール（OCT）、パリカルシトール、ドキセルカルシフォール、カルシポトリオール、タカルシトール、ZK191784及びZK203278からなる群から選択される少なくとも１つのビタミンD3類似体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともカルシポトリオールに曝露されてもよい。
【０１８１】
一般に、前記少なくとも１つのビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD代謝産物又はビタミンD類似体の濃度は、本発明に従って使用される場合には、約0.05〜約15μMの範囲、例えば約0.1〜約5μMの範囲である。
【０１８２】
したがって、ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞は、約0.05〜約10μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD代謝産物又はビタミンD類似体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.05〜約7.5μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD代謝産物又はビタミンD類似体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.05〜約5μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD代謝産物又はビタミンD類似体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約10μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD代謝産物又はビタミンD類似体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約7.5μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD代謝産物又はビタミンD類似体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約5μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD代謝産物又はビタミンD類似体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約2.5μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD代謝産物又はビタミンD類似体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約1μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD代謝産物又はビタミンD類似体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約0.75μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD代謝産物又はビタミンD類似体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.25〜約10μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD代謝産物又はビタミンD類似体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.25〜約7.5μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD代謝産物又はビタミンD類似体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.25〜約0.5μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD代謝産物又はビタミンD類似体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.25〜約2.5μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD代謝産物又はビタミンD類似体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.25〜約1μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD代謝産物又はビタミンD類似体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.25〜約0.75μMの範囲の濃度の前記少なくとも１つのビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD代謝産物又はビタミンD類似体に曝露されてもよい。
【０１８３】
例えば、本発明に従ってコレカルシフェロールを使用する場合には、約0.05〜約15μMの範囲、例えば約0.1〜約5μM、約0.1〜約2.5μM、約0.1〜約1μM又は約0.1〜約0.5μMの範囲、例えば約0.2μMの濃度で使用してもよい。
【０１８４】
例えば、本発明に従ってカルシフェジオールが使用される場合には、約0.05〜約15μMの範囲、例えば約0.1〜約5μM、約0.1〜約2.5μM、約0.1〜約1μM又は約0.25〜約0.75μMの範囲、例えば約0.5μMの濃度で使用してもよい。
【０１８５】
例えば、本発明に従ってカルシトリオールが使用される場合には、約0.05〜約15μMの範囲、例えば約0.1〜約5μM、約0.1〜約2.5μM、約0.1〜約1μM又は約0.25〜約0.75μMの範囲、例えば約0.5μMの濃度で使用してもよい。
【０１８６】
本発明の方法において使用される少なくとも１つの成熟因子は、例えば、RAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンド、CoCl2、NaN3などの、少なくとも１つの低酸素誘導化合物であってもよい。
【０１８７】
したがって、哺乳動物肝細胞は、CGP52608、CGP52608類似体、メラトニン、メラトニン類似体、コレステロール、コレステロール誘導体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドなどの、少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドに暴露されてもよい。
【０１８８】
したがって、哺乳動物肝細胞は、少なくともCGP52608又はCGP52608類似体に曝露されてもよい。したがって、哺乳動物肝細胞は、少なくともCGP52608に曝露されてもよい。また、哺乳動物肝細胞は、CGP53065、CGP52528、CGP 53079、CGP58238、CGP52113、CGP52749、CGP55644、CGP55706、CGP55707、CGP56753、CGP55066又はGP20468などの、少なくともCGP52608類似体に暴露されてもよい。
【０１８９】
したがって、哺乳動物肝細胞は、少なくともメラトニン又はメラトニン類似体に曝露されてもよい。したがって、哺乳動物肝細胞は、少なくともメラトニンに曝露されてもよい。また、哺乳動物肝細胞は、少なくともメラトニン類似体、例えば6-メトノベンゾオキサゾリノン、ラメルテオン((S)-N-[2-(1,6,7,8-テトラヒドロ-2H-インデノ[5,4- b]フラン-8-イル)-エチル]プロピオンアミド)、アゴメラチン(N-(2-[7-メトキシ-1-ナフタレニル]エチル)アセトアミド)又は合成キヌレニン、例えば2-アセトアミド-4-(3-メトキシフェニル)-4-オキソ酪酸、2-アセトアミド-4-(2-アミノ-5-メトキシフェニル)-4-オキソ酪酸、2-ブチルアミド-4-(3-メトキシ-フェニル)-4-オキソ酪酸又は2-ブチルアミド-4-(2-アミノ-5-メトキシフェニル)-4-オキソ酪酸に暴露されてもよい。
【０１９０】
したがって、哺乳動物肝細胞は、少なくともコレステロール又はコレステロール誘導体に曝露されてもよい。
【０１９１】
したがって、哺乳動物肝細胞は、少なくともCoCl2又はNaN3に曝露されてもよい。
【０１９２】
一般に、前記少なくとも１つ低酸素誘導化合物、特に前記少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドの濃度は、本発明に従って使用される場合には、約0.05〜約50μMの範囲、例えば約0.5〜約10μMの範囲である。
【０１９３】
したがって、ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞は、約0.05〜約25μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの低酸素誘導化合物、特に前記少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドに暴露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.05〜約15μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの低酸素誘導化合物、特に前記少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.05〜約10μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの低酸素誘導化合物、特に前記少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.05〜約7.5μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの低酸素誘導化合物、特に前記少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約25μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの低酸素誘導化合物、特に前記少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約15μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの低酸素誘導化合物、特に前記少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約10μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの低酸素誘導化合物、特に前記少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約7.5μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの低酸素誘導化合物、特に前記少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.5〜約25μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの低酸素誘導化合物、特に前記少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.5〜約15μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの低酸素誘導化合物、特に前記少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.5〜約10μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの低酸素誘導化合物、特に前記少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.5〜約7.5μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの低酸素誘導化合物、特に前記少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約1〜約10μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの低酸素誘導化合物、特に前記少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約1〜約7.5μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの低酸素誘導化合物、特に前記少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約1.5〜約7.5μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの低酸素誘導化合物、特に前記少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドに曝露されてもよい���哺乳動物肝細胞は、約2.5〜約7.5μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの低酸素誘導化合物、特に前記少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約3.5〜約6.5μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの低酸素誘導化合物、特に前記少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約4〜約6μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの低酸素誘導化合物、特に前記少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約4.5〜約5.5μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの低酸素誘導化合物、特に前記少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドに曝露されてもよい。例えば、哺乳動物肝細胞は、約5μMの、前記少なくとも１つの低酸素誘導化合物、特に前記少なくとも１つのRAR関連オーファン受容体アルファ（ROR-アルファ）リガンドに曝露されてもよい。
【０１９４】
例えば、本発明に従ってCGP52608が使用される場合には、約0.05〜約50μMの範囲、例えば約0.5〜約50μMの範囲、例えば約0.5〜10μMの範囲、例えば約5μMの濃度で使用されてもよい。
【０１９５】
また、本発明の方法において使用される少なくとも1つの成熟因子は、少なくとも１つのスフィンゴシン、例えばD-エリスロ-スフィンゴシン又はL-エリスロ-スフィンゴシン、又はスフィンゴシン誘導体、例えばスフィンゴシン-1-リン酸又はスフィンゴ脂質であってもよい。
【０１９６】
したがって、哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つのスフィンゴシンに曝露されてもよい。より具体的には、哺乳動物肝細胞は、少なくともD-エリスロ-スフィンゴシンに曝露されてもよい。哺乳動物の肝細胞は、少なくともL-エリスロ-スフィンゴシンに曝露されてもよい。
【０１９７】
哺乳動物肝細胞は、少なくともスフィンゴシン誘導体に曝露されてもよい。
【０１９８】
哺乳動物肝細胞は、少なくとも、スフィンゴシン-1-リン酸、DL-エリスロ-ジヒドロスフィンゴシン、L-スレオ-スフィンゴシンC-18、アジド-エリスロ-スフィンゴシン、3-O-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-エリスロ-スフィンゴシン、(2S,3R,4E)-2-アジド-3-(tert-ブチルジメチルシリル)-1-ピバロイル-エリスロ-スフィンゴシン、3-O-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-2-Fmoc-エリスロ-スフィンゴシン、(2S,3R,4E)-2-アジド-3-(tert-ブチルジメチルシリル)-エリスロ-スフィンゴシン、N-Boc-エリスロ-スフィンゴシン、サフィンゴール、及びセラミドからなる群から選択される、スフィンゴシン誘導体に曝露されてもよい。
【０１９９】
したがって、哺乳動物肝細胞は、少なくともスフィンゴシン-1-リン酸、例えばD-エリスロ-スフィンゴシン又はL-エリスロ-スフィンゴシンに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともD-エリスロ-スフィンゴシン-1-リン酸に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともL-エリスロ-スフィンゴシン-1-リン酸に曝露されてもよい。
【０２００】
哺乳類肝細胞は、少なくともスフィンゴ脂質、例えばセラミド又はセラミド類似体に曝露されてもよい。セラミドは、N-C2-24-セラミド、例えばN-C12-、N-C14-、N-C16-又はN-C18-セラミドであってもよい。より具体的には、セラミドは、D-エリスロセラミド、例えばN-C16-D-エリスロセラミドであってもよい。セラミドは、L-エリスロセラミド、例えばN-C16-L-エリスロセラミドであってもよい。セラミド類似体は、MAPP、例えばL-エリスロMAPP又はD-エリスロMAPPであってもよい。
【０２０１】
したがって、哺乳動物肝細胞は、少なくともセラミド類似体又はセラミド類似体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともセラミドに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともセラミド類似体に曝露されてもよい。したがって、哺乳動物肝細胞は、少なくともN-C2-24-セラミド、例えばN-C10-、N-C12-、N-C14-、N-C16-、N-C18-又はN-C20-セラミドに曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともN-C16-セラミド、例えばN-C16-D-エリスロセラミド（N-パルミトイル-D-エリスロ-スフィンゴシン）に曝露されてもよい。
【０２０２】
一般に、本発明に従って使用される場合には、前記少なくとも１つのスフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体の濃度は、約0.05〜約15μMの範囲、例えば約0.1〜約5μMの範囲である。
【０２０３】
したがって、ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞は、約0.05〜約10μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つのスフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.05〜約7.5μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つのスフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.05〜約5μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つのスフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約10μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つのスフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約7.5μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つのスフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約5μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つのスフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約2.5μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つのスフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約1μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つのスフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約0.75μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つのスフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.25〜約10μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つのスフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.25〜約7.5μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つのスフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.25〜約5μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つのスフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.25〜約2.5μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つのスフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.25〜約1μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つのスフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.25〜約0.75μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つのスフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体に曝露されてもよい。
【０２０４】
例えば、D-エリスロ-スフィンゴシンなどのスフィンゴシンが本発明に従って使用される場合には、約0.05〜約15μMの範囲の濃度、例えば約0.1〜約5μMの範囲、約0.1〜約2.5μM、約0.1〜約1μM又は約0.25〜約0.75、例えば約0.5μMの濃度で使用されてもよい。
【０２０５】
例えば、D-エリスロ-スフィンゴシン-1-リン酸のようなスフィンゴシン-1-リン酸が本発明に従って使用される場合には、約0.05〜約15μMの範囲の濃度、例えば約0.1〜約5μMの範囲、約0.1〜約2.5μM、約0.1〜約1μM又は約0.25〜約0.75、例えば約0.5μMの濃度で使用されてもよい。
【０２０６】
例えば、N-C16-D-エリスロセラミドのようなセラミドが本発明に従って使用される場合には、約0.05〜約15μMの範囲の濃度、例えば約0.1〜約5μMの範囲、約0.1〜約2.5μM、約0.1〜約1μM又は約0.25〜約0.75、例えば約0.5μMの濃度で使用されてもよい。
【０２０７】
また、本発明の方法で使用される少なくとも１つの成熟因子は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の少なくとも１つの活性化因子、例えば、チアゾリジンジオン、遊離脂肪酸（FFA）、エイコサノイド前駆体及びエイコサノイド類似体を含むエイコサノイド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の少なくとも１つの活性化因子であってもよい。
【０２０８】
したがって、ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つのチアゾリジンジオン、例えば、CGP52608、CGP52608類似体、シグリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、ロベグリタゾン、トログリタゾン、TS5444、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１つのチアゾリジンジオン曝露されてもよい。
【０２０９】
ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つの遊離脂肪酸、例えば、飽和脂肪酸又は不飽和脂肪酸に曝露されてもよい。
【０２１０】
哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つの飽和脂肪酸、例えば、ドデカン酸、トリデカン酸、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸、ヘプタデカン酸、エイコサン酸、ヘンエイコサン酸、ドコサン酸、トリコサン酸、テトラコサン酸、ペンタコサン酸、ヘキサコサン酸、及びこれらの組み合わせからな群から選択される、少なくとも１つの飽和脂肪酸に曝露されてもよい。
【０２１１】
哺乳動物肝細胞は、例えば、少なくともテトラデカン酸に曝露されてもよい。
【０２１２】
哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つの不飽和脂肪酸、例えば、10Z-ヘプタデセン酸、アラキドン酸（AA）、9(Z),11(E)-共役リノール酸、エイコサジエン酸、エイコサトリエン酸（ETE）、エイコサペンタエン酸（EPA）、ドコサペンタエン酸（DPA）、ドコサヘキサエン酸（DHA）、リノール酸、ガンマ-リノレン酸、ジホモ-ガンマ-リノレン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ミード酸、リシノール酸、ドコサトリエン酸、及びそれらの組み合わせからな群から選択される、少なくとも１つの不飽和脂肪酸に曝露されてもよい。
【０２１３】
哺乳類肝細胞は、例えば、10Z-ヘプタデセン酸、アラキドン酸（AA）、ドコサヘキサエン酸（DHA）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの不飽和脂肪酸に曝露されてもよい。したがって、哺乳動物肝細胞は、少なくとも10Z-ヘプタデセン酸に曝露されてもよい。したがって、哺乳動物肝細胞は、少なくともアラキドン酸（AA）に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくともドコサヘキサエン酸（DHA）に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、少なくとも10Z-ヘプタデセン酸とアラキドン酸（AA）に曝露されてもよい。したがって、哺乳動物肝細胞は、少なくとも10Z-ヘプタデセン酸とドコサヘキサエン酸（DHA）に曝露されてもよい。したがって、哺乳動物肝細胞は、少なくともアラキドン酸（AA）とドコサヘキサエン酸（DHA）に曝露されてもよい。したがって、哺乳動物肝細胞は、少なくとも10Z-ヘプタデセン酸、アラキドン酸（AA）とドコサヘキサエン酸（DHA）に曝露されてもよい。
【０２１４】
哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つのエイコサノイド、エイコサノイド前駆体又はエイコサノイド類似体、例えば、ジアシルグリセロール、エイコサペンタエン酸、ジホモ-ガンマ-リノレン酸、アラキドン酸、ETYA（5,8,11,14-エイコサテトライン酸）、5-HETEと15-HETEを含むヒドロキシエイコサテトラエン酸（HETE）ファミリーのメンバー、9-HODEと13-HODEを含むヒドロキシオクタデカジエン酸（HODE）ファミリーのメンバー、古典的エイコサノイド、及び非古典的エイコサノイドからなる群から選択される、少なくとも１つのエイコサノイド、エイコサノイド前駆体又はエイコサノイド類似体に曝露されてもよい。
【０２１５】
哺乳動物肝細胞は、例えば、少なくとも１つの古典的エイコサノイド、例えば、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、ロイコトリエン、エオキシン、トロンボキサン、及びそれらの類似体、前駆体又は誘導体からなる群より選択される、少なくとも１つの古典的エイコサノイドに曝露されてもよい。
【０２１６】
哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つのプロスタグランジン、例えば、pgd2、pgd3、pge1、pge2、pge3、pgf1c、pgf2a、pgf3、及びpgj2からなる群から選択される、少なくとも１つのプロスタグランジンに曝露されてもよい。
【０２１７】
哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つのプロスタサイクリン、例えば、pgi2とpgi3からなる群より選択される少なくとも１つのプロスタサイクリンに曝露されてもよい。
【０２１８】
哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つのロイコトリエン、例えば、Lta4、Lta5、Ltb4、Ltb5、Ltc4、Ltc5、Ltd4、Ltd5、Lte4、及びLte5からなる群から選択される、少なくとも１つのロイコトリエンに曝露されてもよい。
【０２１９】
哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つのエオシン、例えば、14,15-ロイコトリエンA4、14,15-ロイコトリエンC4、14,15-ロイコトリエンD4、及び14,15-ロイコトリエンE4からなる群から選択される、少なくとも１つのエオシンに曝露されてもよい。
【０２２０】
哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つのトロンボキサン、例えば、Txa1、Txa2、及びTxa3からなる群から選択される少なくとも１つのトロンボキサンに曝露されてもよい。
【０２２１】
哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つの非古典的エイコサノイド、例えば、エンドカンナビノイド、ヘポキシチン、リゾルビン、イソフラン、イソプラザン、リポキシン、エピリポキシン、エポキシエイコサトリエン酸（EET）からなる群から選択される少なくとも１つの非古典的エイコサノイドに暴露されてもよい。
【０２２２】
哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つのエンドカンナビノイド、例えば、アナンダミド、WIN55,212-2、パルミチルエタノールアミド、ミードエタノールアミド、R-マサンドアミド、BML-190、N-アラキドニルグリシン、及びアラキドンアミドからなる群から選択される少なくとも１つのエンドカンナビノイドに曝露されてもよい。
【０２２３】
一般に、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の前記少なくとも１つの活性化因子の濃度は、本発明に従って使用される場合には、約0.05〜約50μMの範囲、例えば約0.5〜約10μMの範囲である。
【０２２４】
したがって、ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞は、約0.05〜約10μMの範囲の濃度の、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の前記少なくとも１つの活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.05〜約7.5μMの範囲の濃度の、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の前記少なくとも１つの活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.05〜約5μMの範囲の濃度の、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の前記少なくとも１つの活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約10μMの範囲の濃度の、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の前記少なくとも１つの活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約7.5μMの範囲の濃度の、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の前記少なくとも１つの活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約5μMの範囲の濃度の、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の前記少なくとも１つの活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約2.5μMの範囲の濃度の、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の前記少なくとも１つの活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約1μMの範囲の濃度の、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の前記少なくとも１つの活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約0.75μMの範囲の濃度の、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の前記少なくとも１つの活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.25〜約10μMの範囲の濃度の、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の前記少なくとも１つの活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.25〜約7.5μMの範囲の濃度の、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の前記少なくとも１つの活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.25〜約5μMの範囲の濃度の、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の前記少なくとも１つの活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.25〜約2.5μMの範囲の濃度の、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の前記少なくとも１つの活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.25〜約1μMの範囲の濃度の、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の前記少なくとも１つの活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.25〜約0.75μMの範囲の濃度の、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の前記少なくとも１つの活性化因子に曝露されてもよい。
【０２２５】
例えば、少なくとも１つのチアゾリジンジオンが本発明に従って使用される場合には、約0.05〜約50μMの範囲、例えば約0.5〜約10μMの範囲の濃度で使用されてもよい。
【０２２６】
例えば、テトラデカン酸などの少なくとも１つの飽和脂肪酸が本発明に従って使用される場合には、約0.05〜約50μMの範囲、例えば約0.5〜約10μM、約1〜約10μM、又は約2.5〜約7.5μMの範囲の濃度で使用されてもよい。
【０２２７】
例えば、少なくとも１つの不飽和脂肪酸が本発明に従って使用される場合には、約0.05〜約15μMの範囲、例えば、約0.1〜約5μM、約0.1〜約2.5μM、約0.1〜約1μM、又は約0.25〜の範囲、例えば、約0.5μMの濃度で使用されてもよい。
【０２２８】
より具体的には、例えば、10Z-ヘプタデセン酸が本発明に従って使用される場合には、約0.05〜約15μMの範囲、例えば約0.1μM〜約5μM、約0.1μM〜約2.5μM、約0.1μM〜約1μM又は約0.25〜約0.75μMの範囲、例えば約0.5μMの濃度で使用されてもよい。
【０２２９】
例えば、アラキドン酸（AA）が本発明に従って使用される場合には、約0.05〜約15μMの範囲、例えば約0.1μM〜約5μM、約0.1μM〜約2.5μM、約0.1μM〜約1μM又は約0.25〜約0.75μMの範囲、例えば約0.5μMの濃度で使用されてもよい。
【０２３０】
例えば、ドコサヘキサエン酸（DHA）が本発明に従って使用される場合には、約0.05〜約15μMの範囲、例えば約0.1μM〜約5μM、約0.1μM〜約2.5μM、約0.1μM〜約1μM又は約0.25〜約0.75μMの範囲、例えば約0.5μMの濃度で使用されてもよい。
【０２３１】
また、本発明の方法において使用される少なくとも１つの成熟因子は、少なくとも１つの血小板活性化因子（1-アルキル-2-アセチル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、PAF）、例えば1-C1-C24-アルキル-2-アセチル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（C1-24-PAF）であってもよい。
【０２３２】
ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞は、少なくとも１つの1-C1-24-アルキル-2-アセチル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（C1-24-PAF）、例えば少なくとも１つの1-C1-C24-アルキル-2-アセチル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（C12-20-PAF）に暴露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、例えば、1-ヘキサデシル-2-アセチル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（C16-PAF）に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、例えば、1-オクタデシル-2-アセチル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（C18-PAF）に曝露されてもよい。
【０２３３】
一般に、前記少なくとも１つの血小板活性化因子の濃度は、本発明に従って使用される場合には、約0.05〜約15μMの範囲、例えば約0.1〜約5μMの範囲である。
【０２３４】
したがって、ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞は、約0.05〜約10μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの血小板活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.05〜約7.5μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの血小板活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.05〜約5μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの血小板活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約10μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの血小板活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約7.5μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの血小板活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約5μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの血小板活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約2.5μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの血小板活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約1μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの血小板活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.1〜約0.75μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの血小板活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.25〜約10μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの血小板活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.25〜約7.5μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの血小板活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.25〜約5μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの血小板活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.25〜約2.5μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの血小板活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.25〜約1μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの血小板活性化因子に曝露されてもよい。哺乳動物肝細胞は、約0.25〜約0.75μMの範囲の濃度の、前記少なくとも１つの血小板活性化因子に曝露されてもよい。
【０２３５】
例えば、1-ヘキサデシル-2-アセチル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（C16-PAF）が本発明に従って使用される場合には、約0.05〜約15μMの範囲、例えば約0.1〜約5μM、約0.1〜約2.5μM、約0.1〜約1μM又は約25〜約0.75μMの範囲、例えば約0.5μMの濃度で使用されてもよい。
【０２３６】
また、本発明の方法において使用される少なくとも１つの成熟因子は、少なくとも１つのプロテインキナーゼC（PKC）阻害剤、例えば、ビスインドリルマレイミドI、ビスインドリルマレイミドII、ビスインドリルマレイミドIII、ビスインドリルマレイミドV、ビスインドリルマレイミドVI、ビスインドリルマレイミドVII、ビスインドリルマレイミドVIII、ビスインドリルマレイミドX、HBDDE、ロトレリン、パルミトイル-DL-カルニチン、R-ステアロイルカルニチンクロライド、ピセアタンノール、H-9、H-8、1-(5-イソキノリンスルホニル)-3-メチルピペラジン、HA-100二塩酸塩、HA-1004、HA-1077、5-ヨードツベリシジン、Ro-32-0432、Ro-31-7549、エンザスタウリン（LY317615）、ソトラスタウリン、塩化デクアリニウム、Go6976、Go6983、Go7874、ミルシトリン、4-ヒドロキシ-タモキシフェン、N-デスメチルタモキシフェンHCl、サフィンゴール、フロレチン、UCN-01、7-オキソスタウロスポリン、K-252a、K-252b、K-252c、メリチン、ヒスピジン、カルホスチンC、エラグ酸、PKC阻害ペプチド19-31、PKC阻害ペプチド19-36、PKCイプシロン転位阻害剤II、EGF-R断片651-658、PKCベータ阻害剤（CAS257879-35-9）、PKC20-28、PKCβII/EGFR阻害剤（CAS145915-60-2）、PKCθ偽基質阻害剤、PKCθ/δ阻害剤、[Ala107]-MBP（104-118）、[Ala113]-MBP（104-118）、ZIP、C-1、ブリオスタチン1、LY333531塩酸塩、CGP53535、ケレリトリンクロライド、TCS21311、CID755673、ゴシポール、ET-18-OCH3、1-O-ヘキサデシル-2-O-メチル-rac-グリセロール、NPC-15437二塩酸塩、NGIC-I、MDL-27,032、DAPH-7,7-アミノインドール、5-アミノ-2-メチルインドール、rac-2-メトキシ-3-ヘキサデカンアミド-1-プロピルホスホコリン、銅ビス-3,5-ジイソプロピルサリチレート、D,L-3,4-ジヒドロキシマンデル酸、rac-3-オクタデカンアミド-2-メトキシプロパン-1-オールホスホコリン、KRIBB3、イルモホシン、rac-2-メトキシ-3-ヘキサデカンアミド-1-プロピルホスホコリン、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される少なくとも１つのPKC阻害剤であってもよい。
【０２３７】
一般に、前記少なくとも１つのプロテインキナーゼC（PKC）阻害剤の濃度は、本発明に従って使用される場合には、約0.01〜約50μMの範囲、例えば約0.5〜約10μMの範囲である。
【０２３８】
ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞は、１つの成熟因子に暴露されるだけでなく、ここに記載される成熟因子の組み合わせ、例えば少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、又は少なくとも８つの、ここに記載される成熟因子の組み合わせに暴露されてもよい。
【０２３９】
したがって、ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞は、少なくとも２つの成熟因子を含む組み合わせに曝露されてもよい。ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞は、少なくとも３つの成熟因子を含む組み合わせに曝露されてもよい。ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞は、少なくとも４つの成熟因子を含む組み合わせに曝露されてもよい。ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞は、少なくとも５つの成熟因子を含む組み合わせに曝露されてもよい。ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞は、少なくとも６つの成熟因子を含む組み合わせに曝露されてもよい。ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞は、少なくとも７つの成熟因子を含む組み合わせに曝露されてもよい。ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞は、少なくとも８つの成熟因子を含む組み合わせに曝露されてもよい。
【０２４０】
ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞は、以下の項目のいずれかの組み合わせに曝露されてもよい。
【０２４１】
ａ）Srcキナーゼ阻害剤、前駆体、代謝産物と類似体を含むビタミンD、低酸素誘導化合物、スフィンゴシンとスフィンゴシン誘導体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の活性化因子、血小板活性化因子（PAF）、PKC阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも２つの成熟因子を含む組み合わせ。
【０２４２】
ｂ）少なくとも１つ（例えば少なくとも２つ）のSrcキナーゼ阻害剤を含む、項目ａ）に記載の組み合わせ。
【０２４３】
ｃ）少なくとも１種（例えば少なくとも２種）のビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD代謝産物又はビタミンD類似体を含む、項目ａ）又はｂ）に記載の組み合わせ。
【０２４４】
ｄ）少なくとも１つ（例えば少なくとも２つ）のスフィンゴシンとスフィンゴシン誘導体を含む、項目ａ）〜ｃ）のいずれかに記載の組み合わせ。
【０２４５】
ｅ）ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の少なくとも１つ（例えば少なくとも２つ）の活性化因子を含む、項目ａ）〜ｄ）のいずれかに記載の組み合わせ。
【０２４６】
ｆ）少なくとも１つ（例えば少なくとも２つ）の血小板活性化因子（PAF）を含む、項目ａ）〜ｅ）のいずれかに記載の組み合わせ。
【０２４７】
ｇ）少なくとも１つ（少なくとも２つ）のPKC阻害剤を含む、項目ａ）〜ｆ）のいずれかに記載の組み合わせ。
【０２４８】
分化と成熟をする肝細胞は、例えば、少なくとも１つの成熟因子に約35日間まで曝露されてもよい。それらは、例えば、少なくとも１つの成熟因子に約2日間〜約30日間曝露されてもよい。それらは、少なくとも１つの成熟因子に約2日間〜約25日間曝露されてもよい。それらは、少なくとも１つの成熟因子に約2日間〜約20日間曝露されてもよい。それらは、少なくとも１つの成熟因子に約2日間〜約15日間曝露されてもよい。それらは、少なくとも１つの成熟因子に約7日間〜約35日間曝露されてもよい。それらは、少なくとも１つの成熟因子に約7日間〜約30日間曝露されてもよい。それらは、少なくとも１つの成熟因子に約7日間〜約25日間曝露されてもよい。それらは、少なくとも１つの成熟因子に約7日間〜約20日間曝露されてもよい。それらは、少なくとも１つの成熟因子に約10日間〜約35日間曝露されてもよい。それらは、少なくとも１つの成熟因子に約10日間〜約30日間曝露されてもよい。それらは、少なくとも１つの成熟因子に約10日間〜約25日間曝露されてもよい。それらは、少なくとも１つの成熟因子に約10日間〜約20日間曝露されてもよい。
【０２４９】
本発明によれば、前記哺乳動物肝細胞を得るために分化条件下で哺乳動物肝前駆細胞を培養し始めた後の任意の時点で、例えば培養4日後に、少なくとも１つの成熟因子を分化培地に添加してもよい。したがって、前記哺乳動物肝細胞を前記少なくとも１つの成熟因子に曝露することに加えて、前記哺乳動物肝前駆細胞を前記少なくとも１つの成熟因子に曝露することもできる。しかしながら、通常、前記哺乳動物肝細胞を得るために分化条件下で哺乳類肝前駆細胞を培養し始めた後の時間t≧7日に、少なくとも１つの成熟因子が分化培地に添加される。
【０２５０】
ここに記載の少なくとも１つの成熟因子に曝露することに加えて、哺乳動物肝細胞は（及び場合により前記哺乳動物肝細胞が由来する前記哺乳動物肝前駆細胞も）、場合により、哺乳動物細胞外マトリックスの特徴的な１つ以上の成分のオーバーレイ（マトリックスオーバーレイ）に曝露されてもよい。したがって、少なくとも１つの成熟因子への曝露は、さらにマトリックスオーバーレイへの曝露と組み合わせられる。
【０２５１】
初代肝細胞は、細胞の下に１つの細胞外マトリックス（ECM）層と、細胞の上に１つのECM層を有する、いわゆるサンドイッチ構造において、より良好な機能性を維持し、より長く生存することが見出されて以来、コラーゲンI又はマトリゲル（Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫から抽出された基底膜混合物）からなるマトリックスオーバーレイは、数十年にわたり初代肝細胞を培養するために使用されている（例えば、Dunn et al. 1991、Page et al. 2007）。古典的には、コラーゲンIとマトリゲルのオーバーレイは厚く、例えば、125μgマトリゲル/cm2又は50μgコラーゲンI/cm2を含んでいる。しかしながら、これは、肝臓ECMの生理学的組成又は厚さを反映していない（例えば、Turner et al. 2011、Wang et al. 2011を比較）。
【０２５２】
本発明の方法で使用されるマトリックスオーバーレイは、成人の肝臓のECMに存在する成分の新規でより生理学的な組合せであり、正常な哺乳動物細胞外マトリックス環境の一部を形成する１つ以上のECM成分を含むか、その１つ以上のECM成分から構成される。本発明におけるマトリックスオーバーレイとして使用するのに適したECM成分は、コラーゲン、例えばコラーゲンI、II、III、IV、V又はVI、フィブロネクチン、エラスチン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン、ヘパリンプロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、例えばグリピカン、シンデカン又はパーレカン、グリコサミノグリカン、ニドゲン／エンタクチン、ラミニン、ビグリカン、テネイシン、ヒアルロン酸、又は他のECM成分、又は、例えばコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、テネイシン、プロテオグリカン、及びグリコサミノグリカンを含むかそれらからなるECM成分混合物である。
【０２５３】
したがって、哺乳動物肝細胞（及び場合により前記哺乳動物肝細胞が由来する前記哺乳動物肝前駆細胞）は、１つ以上、例えば２、３、４、５、６、７、８、９又は１０、又は２０までの上記のECM成分を含むかそのECM成分からなるマトリックスオーバーレイに暴露されてもよい。したがって、哺乳動物肝細胞は、上記のECM成分の２つを含むかそれらからなるマトリックスオーバーレイに曝露されてもよい。
【０２５４】
例えば、哺乳動物肝細胞は、コラーゲンとフィブロネクチンを含むかそれらからなるマトリックスオーバーレイ（コラーゲン−フィブロネクチン−マトリックスオーバーレイ）、例えばコラーゲンIとフィブロネクチンを含むかそれらからなるマトリックスオーバーレイ（コラーゲンI−フィブロネクチン−マトリックスオーバーレイ）に暴露されてもよい。
【０２５５】
本発明の方法において使用されるマトリックスオーバーレイは、これまで使用されている厚いマトリックスと比較して薄い。それに関して、マトリックスオーバーレイの厚さは、使用されるECM成分の濃度と相関する。マトリックスオーバーレイに適した濃度は、例えば、0.01〜35μg、例えば0.01μg〜20μg、ECM成分/cm2培養面積である。しかし、より高い濃度を使用することも考えられる。
【０２５６】
例えば、コラーゲンIは、マトリックスオーバーレイに、約2〜約150μg/cm2培養面積、例えば約30〜150μg/cm2培養面積、例えば約31.25μg/cm2培養面積の濃度で存在してもよい。
【０２５７】
例えば、フィブロネクチンは、マトリックスオーバーレイに、約2〜約30μg/cm2培養面積、例えば約2〜10μg/cm2培養面積、例えば約6μg/cm2培養面積の濃度で存在してもよい。
【０２５８】
上記の「μg/cm2培養面積」の濃度は、乾燥状態の各成分に関するものであることを理解されたい。
【０２５９】
本発明の方法で用いることができるさらなるマトリックスオーバーレイは、WO2014/083132（43頁7行〜47頁29行）に記載されており、その内容は参照によりここに組み込まれる。
【０２６０】
一般に、細胞は、培養容器の表面を覆う成長支持体としてのコーティング上で培養することができる。成長支持体としては、ゼラチン又はフィブロネクチンに基づくコーティングが広く使用されている。したがって、細胞、特に肝前駆細胞と肝細胞は、ゼラチン又はフィブロネクチンに基づくコーティング上で培養することができる。しかし、細胞は、上に定義したマトリックスオーバーレイと類似又は同一の組成を有するコーティング上でも培養することができる。例えば、マトリックスオーバーレイが使用される場合には、細胞は、使用されるマトリックスオーバーレイの組成と同一の組成を有するコーティング上で培養されてもよい。そこで、いわゆる「サンドイッチ」型培養環境が提供される。細胞は、例えば、コラーゲンI−フィブロネクチンに基づくコーティングで培養することができる。そのようなコラーゲンI−フィブロネクチンに基づくコーティングは、cm2培養面積あたり、約2〜約10μg、例えば約2μgのフィブロネクチンと、約2〜約12μg、例えば10μgのコラーゲンIの濃度を有してもよい。
【０２６１】
本発明において用いられる哺乳動物細胞は、例えば、ヒト細胞、霊長類細胞、マウス細胞、ラット細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ブタ細胞、ウシ細胞又はウマ細胞であってもよい。したがって、本発明の方法は、ヒト細胞に基づいてもよく、ヒト細胞に向けられてもよい。
【０２６２】
任意の前段階として、本発明の方法において使用される哺乳動物肝前駆細胞は、哺乳動物胚性幹（ES）細胞などの哺乳動物多能性幹（PS）、又は哺乳動物誘導性多能性幹（iPS）細胞などの哺乳動物人工多能性幹細胞に、最初に由来してもよい。したがって、本発明の方法は、さらに、前記肝前駆細胞を得るための、分化条件下での哺乳動物PS細胞を培養する最初のステップを含んでいてもよい。それにしたがって、哺乳動物PS細胞は、最初に前記肝前駆細胞に分化する。このステップを、ここでは最初の肝臓分化と呼ぶ。
【０２６３】
本発明において用いられる哺乳動物多能性幹細胞は、例えば、ヒト多能性幹細胞、霊長類多能性幹細胞、マウス多能性幹細胞、ラット多能性幹細胞、イヌ多能性幹細胞、ネコ多能性幹細胞、ブタ多能性幹細胞、ウシ多能性幹細胞又はウマ多能性幹細胞であってもよい。
【０２６４】
特に、本発明において用いられる哺乳動物多能性幹細胞は、任意の種類の、ヒト胚性幹（hES）細胞などのヒト多能性幹細胞、又はヒト誘導多能性幹（hiPS）細胞などの人工多能性幹細胞であってもよい。
【０２６５】
上記のように、内胚葉及び／又は肝前駆細胞を得るための出発材料としても使用できる多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞などの胚性幹細胞であってもよい。hES細胞などのES細胞を得るための様々な技術が当業者に知られている。例えば、本発明による使用のためのhES細胞は、例えば、Chung et al (2008)に記載され、さらにMercader et al.によってEssential Stem Cell Methods (First Edition, 2009)に記載されている、単一胚芽除去技術を使用することによって誘導（又は取得）してもよい。或いは、確立され公的に利用可能な幹細胞株を使用してもよい。使用のための適切なhES細胞株は、Klimanskaya et al (2006)によって確立された細胞株MA01とMA09、及びChung et al. (2008)によって確立された細胞株MA126、MA127、MA128及びMA129などであり、これらはすべて、国際肝細胞レジストリ（米国  マサチューセッツ州  ウースター、アドバンスドセルテクノロジー社に譲渡された）にリストされている。使用のための他の適切なhES細胞株は、例えば、細胞株SA167、SA181、SA461（スウェーデン  ヨーテボリ、タカラバイオヨーロッパ社）である。
【０２６６】
或いは、最終的な内胚葉細胞及び／又は肝前駆細胞を得るための出発材料として使用される多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞であってもよい。人工多能性幹細胞を得るための様々な技術は、当業者に知られており、体細胞核移植（SCNT）、ES細胞融合媒介性再プログラミング（FMR）、卵母細胞（単為発生性幹細胞）の化学的刺激、及び誘導性多能性（iPS）などの、人工的再プログラミング法がある。hiPS細胞を得るための技術は、例えば、Takahashi et al. (2007)、Zhou et al. (2009)、Yu and Thomson, Essentials of Stem Cell Biology (2nd Edition)に記載されている。
【０２６７】
また、内胚葉及び／又は肝前駆細胞は、成体幹細胞、癌幹細胞などの他の多能性幹細胞に由来してもよく、又は他の胚、胎児、若年又は成人の供給源に由来してもよいことも想定される。例えば、本発明に従って使用される肝前駆細胞は、肝臓由来の肝前駆細胞、いわゆるLDPCであってもよい。そのようなLDPCは、インビトロとインビボの両方で肝臓分化が可能であることが示されている。
【０２６８】
哺乳動物の多能性幹細胞、特にhPS細胞を肝前駆細胞に分化させるのに適した条件が知られている（例えば、Hay 2008, Brolen 2010とDuan 2010を参照）。例えば、WO2009/013254A1には、hPS細胞から肝前駆細胞の細胞を得るための適切なプロトコルが記載されている（実施形態1〜4）。
【０２６９】
哺乳動物の多能性幹細胞、例えば、hPS細胞は、肝前駆細胞を得るために、適切な分化培地中で最大14日間培養される。例えば、哺乳動物の多能性幹細胞、特にhPS細胞は、約6〜約14日間、例えば約7〜11日間、適切な分化培地中で培養することができる。
【０２７０】
最初の肝臓分化は、前内胚葉段階、すなわち、胚体内胚葉（DE細胞）の細胞を得るための分化条件下における、hPS細胞などの哺乳動物多能性幹細胞の培養、を含むことによって定義することができ、それに、前肝臓段階、すなわち、肝臓前駆細胞を得るための分化条件下における、得られたDE細胞の培養、が続く。
【０２７１】
したがって、hPS細胞は、最初に胚体内胚葉に分化し、胚体内胚葉の肝前駆細胞へのさらなる分化に続く。
【０２７２】
哺乳動物の多能性幹細胞、特にhPS細胞をDE細胞に分化させるための適切な条件が知られている（例えば、D'Amour 2005、Siller 2015を参照）。例えば、WO2009/013254A1には、hPS細胞から胚体内胚葉の細胞を得るための適切なプロトコルが記載されている（実施形態1〜4）。アクチビンを使用せずに哺乳動物の多能性幹細胞、特にhPS細胞をDE細胞に分化させる代替プロトコルは、Siller et al (2015)によって説明されている。
【０２７３】
一般に、DE細胞を得るために、hPS細胞のような哺乳動物の多能性幹細胞は、アクチビンA又はBなどのアクチビン、FBS、FCS、N2、B27又はBSAなどのアルブミン源、例えばCHIR99021などのGSK3阻害剤、の１つ以上を含む、１つ以上の分化培地で培養されてもよい。１つ以上の分化培地は、アクチビンAなどのアクチビンを含んでいてもよい。１つ以上の分化培地は、酪酸ナトリウム（NaB）、フェニルブチレート（PB）、バルプロエート、トリコスタチンA、エンチノスタット又はパノビノスタットなどのヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤を含んでいてもよい。１つ以上の分化培地は、FGF1、FGF2及びFGF4などの１つ以上の増殖因子を含んでいてもよい。分化培地は、FBS、FCS、N2、B27又はBSAなどのアルブミン源を含んでいてもよい。１つ以上の分化培地は、例えばCHIR99021などのGSK3阻害剤、又はWnt3AなどのWntシグナリングの活性化因子を含んでいていもよい。１つ以上の分化培地は、LY294002のようなPI3K（ホスホイノシチド3-キナーゼ）阻害剤を含んでいてもよい。
【０２７４】
アクチビンの濃度は、存在する場合には、通常、約50〜約150ng/ml、例えば約80〜約120ng/mlの範囲である。アクチビンは、例えば、約50ng/ml又は約100ng/mlの濃度で分化培地中に存在していてもよい。HDAC阻害剤の濃度は、存在する場合には、通常、約0.5〜約2mMの範囲である。HDAC阻害剤は、例えば、約0.5mM又は約1mMの濃度で分化培地中に存在していてもよい。１つ以上の増殖因子の濃度は、存在する場合には、使用される特定の化合物に依存して変化してもよい。FGF2の濃度は、例えば、通常、約2〜約50ng/ml、例えば約2〜約10ng/mlの範囲である。FGF2は、例えば、約4ng/ml又は約5ng/mlの濃度で分化培地中に存在していてもよい。FGF1の濃度は、例えば、通常、約50〜約200ng/ml、例えば約80〜約120ng/mlの範囲である。FGF1は、例えば、約100ng/mlの濃度で分化培地中に存在していてもよい。FGF4の濃度は、例えば、通常、約20〜約40ng/mlの範囲である。FGF4は、例えば、約30ng/mlの濃度で分化培地中に存在していてもよい。アルブミン源の濃度は、存在する場合には、通常、約0.1〜約2％v/v、例えば約0.1〜約0.5％、約0.2〜約1.5％v/v、約0.2〜約1％v/v、約0.5〜1％v/v、又は約0.5〜約1.5％v/vの範囲である。アルブミン源は、例えば、約0.2％v/v、約0.5％v/v又は約1％v/vの濃度で分化培地中に存在していてもよい。GSK3阻害剤の濃度は、存在する場合には、通常、約0.01〜約10μM、例えば約0.05〜約5μMの範囲である。Wntシグナリングの活性化因子の濃度は、存在する場合には、通常約0.05〜約10ng / mlの範囲、例えば約0.5〜約5μMである。PI3K阻害剤の濃度は、例えば、通常、約0.1〜10μM、例えば約1〜5μMの範囲である。
【０２７５】
分化培地は、PEST及び／又はGlutaMAXのような他のサプリメントをさらに含んでいてもよい。分化培地は、ROCK阻害剤をさらに含んでいてもよい。PESTの濃度は、通常、約0.1〜約0.5％v/v、例えば約0.1〜約0.25％v/vの範囲である。GlutaMAXの濃度は、通常、約0.5〜約1.5％v/v、例えば約0.75〜1.25％v/vの範囲、例えば約1％v/vである。分化培地は、さらにROCK阻害剤を含んでいてもよい。ROCK阻害剤の濃度は、通常、約1〜約10μM、例えば約2.5〜約7.5μMの範囲、例えば約5μMである。
【０２７６】
分化培地の基礎をなす培養培地は、RPMI 1640培地、RPMI 1640高度培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）、最小必須培地（例えば、MEM、EMEM又はGMEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（例えば、DMEM又はDMEM/F-12）、ハム培地（例えば、ハムF12又はハムF10）、HCM培地、HBM培地、又はウィリアムズE培地などの、hPS細胞を培養するのに適した任意の培地であってもよい。したがって、基本培地は、例えば、RPMI1640培地又はRPMI1640高度培地であってもよい。或いは、基本培地は、ウィリアムズE培地であってもよい。
【０２７７】
分化する哺乳動物の多能性幹細胞、例えば、hPS細胞は、DNA脱メチル化剤に曝露されてもよい。細胞は、多能性幹細胞段階と最終的な内胚葉段階との間の任意の段階で前記薬剤に曝露（又は処理）されてもよい。したがって、前記DNA脱メチル化剤への暴露は、PS細胞のDE細胞への分化の間に、すなわち、前内胚葉ステップの間に行われてもよい。細胞は、その後、内胚葉段階を経由して肝前駆細胞段階に達するまで、すなわち、肝前駆細胞が得られるまで培養され、その時点で、少なくとも１つの成熟因子への曝露を含む肝細胞へのさらなる分化と成熟が行われる。
【０２７８】
DNA脱メチル化剤は、DNAメチルトランスフェラーゼ酵素活性を妨害する任意の化合物であってもよい。適切なDNA脱メチル化剤は、ヌクレオシド類似型のもの、例えばシチジン類似体、例えば5-アザ-2-デオキシシチジン（デシタビン）、5-アザシチジン（アザシチジン）又はゼブラリン、及び非ヌクレオシド型のもの、例えばプロカイン、RG108、S-5-アデノシル-L-ホモシステイン、カフェイン酸、クロロゲン酸、没食子酸エポガロカテキン、塩酸ヒドララジン、塩酸プロカインアミド又はプサマプリンAである。
【０２７９】
分化する哺乳動物PS細胞は、一般に、約1nM〜約10μMの範囲、例えば約1nM〜約5μMの範囲の濃度の、DNA脱メチル化剤に曝露されてもよい。例えば、5-アザ-2-デオキシシチジンがDNA脱メチル化剤として使用される場合には、分化するPS細胞は、1nM〜約1μMの範囲、例えば1nM〜50nMの範囲、例えば約10nMの濃度のものに暴露されてもよい。
【０２８０】
内胚葉分化のために、哺乳動物の多能性幹細胞、例えばhPS細胞は、通常、上記のようなアクチビン含有分化培地中で10日間まで培養される。哺乳動物の多能性幹細胞、例えばhPS細胞は、例えば、前記分化培地中で約2〜約10日間、例えば約7〜約9日間培養されてもよい。
【０２８１】
多能性幹細胞からのDE細胞の新規調製の代わりに、商業的供給源から入手可能なDE細胞を、本発明の出発物質として使用してもよい。ヒト胚体内胚葉細胞は、例えば、タカラバイオヨーロッパ社、アルビド  ヴァーグレーンス  ベッカ  ２０、４１３４６、ヨーテボリ、スウェーデンから要求に応じて得ることができる。
【０２８２】
肝前駆細胞を得るために、DE細胞は、一般に、DMSOを含む分化培地中で培養される。或いは、DE細胞は、FGF1、FGF2及びFGF4などの１つ以上の増殖因子、及び場合によってはBMP2及びBMP4などの1１つ以上の骨形成タンパク質を含む分化培地で培養されてもよい。分化培地は、さらにHGF、EGF及び／又は血清を含んでいてもよい。
【０２８３】
DMSOの濃度は、通常、約0.1％〜約2％v/v、例えば約0.5〜約1.5％v/vの範囲である。DMSOは、例えば、約1％の濃度で分化培地中に存在していてもよい。１つ以上の成長因子の濃度は、使用される特定の化合物に依存して変化してもよい。FGF2の濃度は、例えば、通常、約2〜約50ng/ml、例えば約2〜約10ng/mlの範囲である。FGF2は、例えば、4又は5ng/mlの濃度で分化培地中に存在していてもよい。FGF1の濃度は、例えば、通常、約50〜約200ng/ml、例えば約80〜約120ng/mlの範囲である。FGF1は、例えば、約100ng/mlの濃度で分化培地中に存在していてもよい。FGF4の濃度は、例えば、通常、約20〜約40ng/mlの範囲である。FGF4は、例えば、約30ng/mlの濃度で分化培地中に存在していてもよい。HGFの濃度は、存在する場合には、通常、約10〜約30ng/mlの範囲である。HGFは、例えば、約20ng/mlの濃度で分化培地中に存在していてもよい。EGFの濃度は、存在する場合には、通常、約5〜約15ng/mlの範囲である。EGFは、例えば、約10ng/mlの濃度で分化培地中に存在していてもよい。血清の濃度は、存在する場合には、通常、約0.1〜約2%v/v、例えば約0.1〜約0.5％、約0.2〜約1.5％v/v、約0.2〜約1％v/v、約0.5〜1％v/v又は約0.5〜約1.5％v/vの範囲である。血清は、例えば、約0.2％v/v、約0.5％v/v又は約1％v/vの濃度で分化培地中に存在していてもよい。
【０２８４】
分化培地は、PEST及び／又はGlutaMAXなどの他のサプリメントをさらに含んでいてもよい。PESTの濃度は、通常約0.1〜約0.5％v/v、例えば約0.1〜約0.25％v/vの範囲である。GlutaMAXの濃度は、通常約0.5〜約1.5％v/v、例えば約0.75〜1.25％v/vの範囲、例えば約1％v/vである。
【０２８５】
分化培地は、ノックアウト血清置換、非必須アミノ酸（NEAA）及び／又はベータ-メルカプトエタノールなどの他のサプリメントをさらに含んでいてもよい。ノックアウト血清置換の濃度は、通常、約10〜約30％v/v、例えば約15〜約25％v/vの範囲、例えば約20％v/vである。非必須アミノ酸（NEAA）の濃度は、通常、約0.5〜約1.5％v/v、例えば約0.75〜1.25％v/vの範囲、例えば約1％v/vである。非必須アミノ酸（NEAA）の濃度は、通常、約0.1〜0.5％v/v、例えば約0.1〜0.3％v/vの範囲、例えば約0.2％v/vである。
【０２８６】
分化培地の基礎をなす培養培地は、RPMI 1640培地、RPMI 1640高度培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）、最小必須培地（例えば、MEM、EMEM又はGMEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（例えば、DMEM又はDMEM/F-12）、ハム培地（例えば、ハムF12又はハムF10）、HCM培地、HBM培地、又はウィリアムズE培地などの、ヒト内胚葉細胞を培養するのに適した任意の培地であってもよい。したがって、基本培地は、例えば、RPMI1640培地又はRPMI1640高度培地であってもよい。或いは、基本培地は、ウィリアムズE培地であってもよい。
【０２８７】
肝前駆細胞への分化のために、DE細胞は、通常、上記のように分化培地中で7日間まで培養される。DE細胞は、例えば、分化培地中で約4〜約7日間培養されてもよい。
【０２８８】
DE細胞、肝前駆細胞と肝細胞を得るための基本的な非限定的な培養条件は、ここでの実施例2においても提供される。
【０２８９】
さらに、本発明の肝細胞は、異種非含有条件下で得られてもよい。このように、本発明の方法で使用される出発材料は、異種非含有、例えば異種非含有PS細胞又は細胞株、又は、異種非含有肝前駆細胞又は細胞株であって、動物非含有条件下で得られたか確立されたものであってもよい。さらに、本発明の方法を通して、細胞は、異種非含有条件下で完全に培養され、真に異種非含有肝細胞を生じてもよい。このような細胞又は細胞株は、治療又は再生医療用途にさらに適しており、非ヒトシアル酸Neu5Gc又は他の非ヒトマーカーの異種非含有細胞中に存在することによって、非異種遊離組成物と区別可能である（Martin et al 2005）。
【０２９０】
本発明の方法の結果として、哺乳類の肝細胞は、現在利用可能な最先端の方法と比較して、より成熟した機能的特徴を伴って得られる。
【０２９１】
本発明の方法を用いることによって得られる哺乳動物肝細胞は、CYP1A、CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19、CYP2B6及び／又はCYP2D6などの、肝細胞関連遺伝子の発現の上昇を示す（図1〜4参照）。
【０２９２】
本発明の方法と本発明で説明されている原理を用いて得られた哺乳動物肝細胞は、創薬プロセス、初期の肝臓形成などの肝臓形成を研究するためのインビトロモデルとして、薬物輸送体、薬物代謝酵素を研究するため、ヒトの肝臓形成障害を研究するため、試験管内での肝毒性試験のため、の毒性試験を含む多くの目的に使用されてもよい。
【０２９３】
さらに、本発明の方法を用いることによって得られる哺乳動物肝細胞は、医薬において、肝臓組織の変性などの組織変性によって引き起こされる病状及び／又は疾患の予防及び／又は治療のための医薬又は医薬品の製造のため、を含む治療目的のために使用されてもよい。また、本発明の哺乳動物肝細胞は、肝障害の治療のための医薬又は医薬品の製造のために使用されてもよい。肝障害は、例えば、自己免疫障害であり、原発性胆汁性肝硬変、異常脂質血症を含む代謝障害、アルコールの乱用などにより引き起こされる肝障害、B型肝炎、C型肝炎とA型肝炎などのウイルスによって引き起こされる疾患、医薬品などに対する急性毒性反応によって引き起こされる肝臓壊死、肝細胞癌などに罹患している患者の腫瘍除去が含まれる。
【０２９４】
或いは、本発明の方法を用いて得られた哺乳動物肝細胞は、代謝の病状及び／又は疾患の治療及び／又は予防のための医薬又は医薬品の製造に使用されてもよい。医薬又は医薬品は、例えば、置換組織又は細胞注射の形態であってもよい。
【０２９５】
本発明による哺乳動物肝細胞の分化と成熟は、肝細胞への成熟を研究するため、又はその肝細胞機能を調節する能力について化合物をスクリーニングするために、代謝的に改善された肝細胞を得るために有用である可能性があり、ここで提供される指示に従って得られたインビトロ由来の肝細胞を化合物に暴露し、その化合物との接触から生じる細胞の表現型変化又は代謝変化を決定し、その変化を肝細胞機能を調節する能力と相関させることが含まれる。
【０２９６】
また、本発明は、組成物とキットを提供する。この組成物又はキットは、例えば、本発明による哺乳動物肝細胞を成熟させるために、本発明の方法を実施する際に特に有用である。
【０２９７】
本発明の組成物は、上記の少なくとも１つの成熟因子を含む。したがって、本発明の組成物は、Srcキナーゼ阻害剤、前駆体、代謝産物と類似体を含むビタミンD、低酸素誘導化合物、スフィンゴシンとスフィンゴシン誘導体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の活性化因子、血小板活性化因子（PAF）、PKC阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つ（例えば少なくとも２つ）の成熟因子を含む。
【０２９８】
したがって、本発明の組成物は、以下の項目のいずれか１つであってもよい。
【０２９９】
ａ）本発明の組成物は、Srcキナーゼ阻害剤、前駆体、代謝産物と類似体を含むビタミンD、低酸素誘導化合物、スフィンゴシンとスフィンゴシン誘導体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の活性化因子、血小板活性化因子（PAF）、PKC阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つ（例えば少なくとも２つ）の成熟因子を含む。
【０３００】
ｂ）少なくとも１つ（例えば少なくとも２つ）のSrcキナーゼ阻害剤を含む、項目ａ）に記載の組成物。
【０３０１】
ｃ）少なくとも１種（例えば少なくとも２種）のビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD代謝産物又はビタミンD類似体を含む、項目ａ）又はｂ）に記載の組成物。
【０３０２】
ｄ）少なくとも１つ（例えば少なくとも２つ）のスフィンゴシンとスフィンゴシン誘導体を含む、項目ａ）〜ｃ）のいずれかに記載の組成物。
【０３０３】
ｅ）ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の少なくとも１つ（例えば少なくとも２つ）の活性化因子を含む、項目ａ）〜ｄ）のいずれかに記載の組成物。
【０３０４】
ｆ）少なくとも１つ（例えば少なくとも２つ）の血小板活性化因子（PAF）を含む、項目ａ）〜ｅ）のいずれかに記載の組成物。
【０３０５】
ｇ）少なくとも１つ（少なくとも２つ）のPKC阻害剤を含む、項目ａ）〜ｆ）のいずれかに記載の組成物。
【０３０６】
すべての組合せと実施形態、特に成熟因子のタイプとそれぞれの濃度を含む、本発明の方法で使用される成熟因子に関して上に示したすべての詳細は、本発明の組成物に含まれる成熟因子にも適用されることが理解される。
【０３０７】
必要に応じて、組成物は、さらに、上記のような少なくとも１つの（例えば少なくとも２つの）細胞外マトリックス（ECM）成分又はECM成分混合物を含んでいてもよい。組成物は、例えば、さらに、コラーゲンI及びフィブロネクチンを含んでいてもよい。
【０３０８】
また、本発明は、本発明の組成物を含む培地を提供する。この培地は、本発明の方法を実施するのに、例えば、本発明による哺乳動物肝細胞を成熟させるために、特に有用である。
【０３０９】
培養培地は、RPMI 1640培地、RPMI 1640高度培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）、最小必須培地（例えば、MEM、EMEM又はGMEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（例えば、DMEM又はDMEM/F-12）、ハム培地（例えば、ハムF12又はハムF10）、HCM培地、HBM培地、又はウィリアムズE培地などの、任意の適切な培地に基づいていてもよい。したがって、基本培地は、例えば、RPMI1640培地又はRPMI1640高度培地であってもよい。或いは、基本培地は、ウィリアムズE培地であってもよい。
【０３１０】
培養培地は、本発明の組成物を含む以外に、必要に応じて、肝前駆細胞から肝細胞を得るための分化培地に関して上述した任意の成分などの追加の成分を含んでいてもよい。
【０３１１】
本発明は、さらにキットを提供する。このキットは、本発明の方法を実施するのに、例えば、本発明によるヒト肝細胞様細胞を成熟させるために、特に有用である。本発明によるキットは、Srcキナーゼ阻害剤、前駆体、代謝産物と類似体を含むビタミンD、低酸素誘導化合物、スフィンゴシンとスフィンゴシン誘導体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）の活性化因子、血小板活性化因子（PAF）、PKC阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つ（例えば少なくとも２つ）の成熟因子を含む。
【０３１２】
すべての組合せと実施形態、特に成熟因子のタイプとそれぞれの濃度を含む、本発明の方法で使用される成熟因子に関して上に示したすべての詳細は、本発明のキットに含まれる成熟因子にも適用されることが理解される。
【０３１３】
本発明によるキットは、本発明の組成物を含んでいてもよい。
【０３１４】
本発明によるキットは、本発明の培地を含んでいてもよい。
【０３１５】
本発明によるキットは、本発明の方法において使用される濃度よりも約2〜約100倍、例えば約10〜約50倍高い濃度の、少なくとも１つ（例えば少なくとも２つ）の成熟因子を含んでいてもよい。この場合、濃度は、使用前に、例えば希釈によって、実際の濃度に調整しなければならないことがある。
【０３１６】
本発明のキットは、さらに、ヒトDE細胞などの哺乳動物胚体内胚葉細胞（DE細胞）を含んでいてもよい。DE細胞は、細胞懸濁液として適切に提供されてもよく、又は凍結状態で提供されてもよい。
【０３１７】
本発明のキットは、さらに、ヒト多能性幹細胞などの哺乳動物多能性幹細胞を含んでいてもよい。したがって、本発明のキットは、哺乳動物胚性幹細胞又は哺乳動物誘発性多能性幹細胞を含んでいてもよい。哺乳動物の多能性幹細胞は、細胞懸濁液として適切に提供されてもよく、又は凍結状態で提供されてもよい。
【０３１８】
本発明のキットの成分は、同じ容器又は別々の容器に入れて提供されてもよい。例えば、少なくとも１つ（例えば少なくとも２つ）の成熟因子が同じ容器に提供されてもよい。少なくとも１つの細胞外マトリックス（ECM）成分又はECM成分混合物もキットに含まれている場合には、このECM成分又はECM成分混合物は、一般に、別個の容器中に提供されてもよい。
【０３１９】
同様に、哺乳動物の胚体内胚葉細胞又は哺乳動物の多能性幹細胞がキットに含まれる場合には、DE細胞又は多能性幹細胞は、一般に、他の成分を含む容器とは異なる容器中に提供される。
【０３２０】
［定義］
ここで使用される「多能性の」又は「多能性」は、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）のすべてのタイプの特殊細胞を形成する可能性を指し、「全能性の」又は「全能性」、すなわち子孫を生じさせることができる完全な胚を形成する能力とは区別される。
【０３２１】
ここで使用される場合、「多能性幹細胞」（PSC）は、適切な条件下で自己複製する能力だけでなく、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）の任意のタイプの特殊細胞を形成する能力を有する細胞を指す。PS細胞は、8〜12週齢のSCIDマウスに奇形腫を形成する能力及び／又は組織培養物中の３つの胚葉すべての同定可能な細胞を形成する能力を有することがある。多能性幹細胞の定義には、ヒト胚性幹（hES）細胞を含む様々なタイプの胚細胞が含まれる（例えば、Thomson et al. (1998)、Heins et.al. (2004)を参照、誘導多能性幹細胞も同様（例えば、Takahashi et al., (2007)、Zhou et al. (2009)、Yu  and Thomson in Essentials of Stem Cell Biology (2nd Edition)を参照））。ここに記載の様々な方法は、様々な供給源からのPS細胞を利用することができる。例えば、使用に適したPS細胞、特にヒトPS細胞は、例えば、Chung et al (2008)に記載され、さらにMercader et alによってEssential Stem Cell Methods (First Edition, 2009)に記載されている、単一胚芽除去技術を使用することによるなどの、非破壊技術の使用によって胚を発達させて得られたものでもよい。それに加えて又はそれに代えて、適切なPS細胞は、確立された細胞株から得られてもよく、又は成体幹細胞であってもよい。
【０３２２】
ここで使用される「iPS細胞」は、誘導多能性幹細胞を指す。iPS細胞は、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、Oct-4、Sox2、Nanog及びLin28などの多能性に関連する遺伝子の発現の誘導により、非多能性細胞−典型的には成体の体細胞から誘導される多能性幹細胞の一種である。
【０３２３】
ここで使用される「hiPS細胞」は、ヒト誘導多能性幹細胞を指す。hiPS細胞は、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、Oct-4、Sox2、Nanog及びLin28などの多能性に関連する遺伝子の発現の誘導により、非多能性細胞−典型的には成体の体細胞−から誘導される多能性幹細胞の一種である。
【０３２４】
ここで使用される「胚体内胚葉（DE）」と「胚体内胚葉細胞（DE細胞）」は、胚体内胚葉の細胞、又は胚体内胚葉の細胞に似ている有意な数の細胞からなる組成物に典型的な、タンパク質及び／又は遺伝子の発現のみならず、形態を示す細胞を指す。胚体内胚葉は、腸、膵臓、肝臓及び肺の細胞を生じる生殖細胞層である。DE細胞は、一般に、内胚葉マーカーFOXA2、CXCR4、HHEX、SOX17、GATA4及びGATA6の陽性遺伝子とタンパク質の発現によって特徴づけられ、したがって、同定されてもよい。２つのマーカーSOX17とCXCR4は、DEに特異的であり、hPSC、肝前駆細胞又は肝細胞では検出されない。最後に、DE細胞は、未分化細胞マーカーOct4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81の遺伝子とタンパク質の発現を示さないが、低いNanogの発現を示すことができる。
【０３２５】
ここで使用される場合、「肝前駆体」又は「肝前駆細胞」は、肝細胞経路に入り、肝細胞を生じる細胞を指す。したがって、「肝前駆体」は、腸、膵臓及び肺の細胞になる可能性を失った点で、「内胚葉細胞」と区別される。「肝前駆細胞」は、初期肝マーカーEpCAM、c-Met（HGF受容体）、AFP、CK19、HNF6、C/EBPα及びβの陽性遺伝子とタンパク質の発現によって特徴づけられ、したがって同定されてもよい。それらは、DEマーカーCXCR4及びSOX17の遺伝子とタンパク質の発現を示さない。最後に、「肝前駆細胞」は、未分化細胞マーカーOct4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60及びTRA-1-81、又は成熟肝マーカーCYP1A2、CYP2C9、CYP19、CYP3A4、CYP2B6及びPXRの遺伝子とタンパク質の発現を示さない。
【０３２６】
ここで使用される場合、「肝細胞」は、完全に分化した肝細胞を指す。「肝細胞」は、一般に、成熟肝臓マーカー、中でもCYP1A2、CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19、CYP2B6、GSTA1-1、OATP-2、NTCP、アルブミン、PXR、CAR、及びHNF4a（アイソフォーム1+2）の陽性遺伝子とタンパク質の発現によって説明され、したがって同定されてもよい。さらに、「肝細胞」は、未分化細胞マーカーOct4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60及びTRA-1-81の遺伝子とタンパク質の発現を示さない。DE細胞と比較して、「肝細胞」は、DE細胞マーカーSOX17及びCXCR4の遺伝子とタンパク質の発現を示さない。「肝前駆細胞」と比較して、「肝細胞」は、肝前駆細胞マーカーであるサイトケラチン19及びAFPの遺伝子とタンパク質の発現を示さない。
【０３２７】
ここで意味するように、遺伝子又はタンパク質は、前記遺伝子又はタンパク質の発現レベルを測定する実験において、測定された発現レベルが測定の標準偏差の３倍より高い場合に「発現された」と解釈され、発現レベルと標準偏差は、発現レベルの１０回の別個の測定において決定される。１０個の別個の測定における発現レベルの決定は、バックグラウンドシグナルについて補正することが好ましい。
【０３２８】
ここで使用されるHDAC阻害剤は、酪酸ナトリウム（「NaB」）、酪酸フェニル（「PB」）、トリコスタチンA及びバルプロ酸（「VA」）などのヒストンデアセチラーゼ阻害剤を指す。
【０３２９】
ここで使用される場合、「GSK阻害剤」は、GSK（特に、GSK3α又はGSK3βを含むGSK3）を阻害する化合物を指す。
【０３３０】
ここで使用される場合、DNA脱メチル化剤は、シチジン類似体、特に5-アザ-2-デオキシシチジン（デシタビン）及び5-アザシチジン（アザシチジン）のようなヌクレオシド類似体、並びにRG108、S-5-アデノシル-L-ホモシステイン、及びプロカインなどの非ヌクレオシド型などの、DNAメチルトランスフェラーゼ酵素活性を妨害する化合物を意味することが意図される。
【０３３１】
ここで使用される「CYP」は、シトクロムP、より具体的には、多くの異なるイソ酵素、例えばCYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP2A6/2A7/2A13、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7及びCYP7A1、を構成する肝臓の主要な第１相代謝酵素である、シトクロムP450を意味することが意図される。
【０３３２】
ここで使用される場合、用語「GST」は、グルタチオントランスフェラーゼを意味することが意図され、そのサブタイプの例は、GST A1-1、GST M1-1、及びGST P1-1である。
【０３３３】
ここで使用される場合、用語「UGT」は、ウリジンジホスホグルクロノイルトランスフェラーゼを意味することが意図され、これは、グルクロニド化活性を触媒する肝臓酵素の群である。
【０３３４】
ここで使用される用語「NTCP」は、遺伝子SLC10A1によってコードされるナトリウム／胆汁酸共輸送体であるNa+-タウロコレート共輸送ポリペプチドを意味すると解釈される。
【０３３５】
ここで使用される用語「CAR」は、構成的アンドロスタン受容体を意味すると解釈される。
【０３３６】
用語「機能性薬物代謝酵素」は、生体異物と薬物の化学修飾、いわゆる薬物又は生体異物代謝、を行う第I相と第II相の酵素に属する機能性酵素を意味することが意図される。
【０３３７】
ここで使用される用語「機能的活性」は、薬物輸送体に対する薬物の測定可能な輸送、及び初代ヒト肝細胞で一般的に検出されるシトクロムP450（CYP）の酵素の測定可能な代謝、などの有効な測定可能な肝細胞機能を意味する。
【０３３８】
ここで使用される場合、用語「胚外内胚葉（ExE）」は、胚体内胚葉の反対側に卵黄嚢などのヒト発生における胚の外側の区画を構成する、分化した内胚葉細胞を意味することが意図される。
【０３３９】
ここで使用される場合、用語「AAT」は、肝臓マーカーであるアルファ-抗トリプシンを意味することが意図される。
【０３４０】
ここで使用される場合、用語「AFP」は、肝臓マーカーであるアルファ-フェトプロテインを意味することが意図される。
【０３４１】
ここで使用される場合、用語「BSEP」は、胆汁輸送体胆汁塩輸出ポンプを意味することが意図される。
【０３４２】
ここで使用される場合、用語「CK」は、サイトケラチン18（CK18/KRT18）、サイトケラチン19（CK19/KRT19）、サイトケラチン8（CK8）及びサイトケラチン7（CK7）などの異なるサブタイプを有する、肝マーカーであるサイトケラチン（交換可能に使用される）を意味することが意図される。
【０３４３】
ここで使用される場合、用語「FGF」は、好ましくはヒト及び／又は組換え起源の線維芽細胞増殖因子を意味し、それに属するサブタイプは、例えば、「bFGF」（基本的な線維芽細胞増殖因子、ときにはFGF2とも呼ばれる）とFGF4である。「aFGF」は、酸性線維芽細胞増殖因子（ときにはFGF1とも呼ばれる）を意味する。
【０３４４】
ここで使用される場合、用語「BMP」は、好ましくはヒト及び／又は組換え起源の骨形成タンパク質を意味し、それに属するサブタイプは、例えば、BMP4とBMP2である。
【０３４５】
ここで使用される場合、用語「HGF」は、好ましくはヒト及び／又は組換え起源の肝細胞増殖因子を意味する。
【０３４６】
ここで使用される場合、用語「EGF」は、好ましくはヒト及び／又は組換え起源の上皮成長因子を意味する。
【０３４７】
ここで使用される場合、交換可能に使用される「HNF4アルファ」又は「HNF4a」は、内胚葉由来の組織、例えば肝臓、膵島、及び脂肪細胞、の遺伝子発現を調節する転写因子であるNR2A1（核内受容体サブファミリー2、群A、メンバー1）としても知られている肝細胞核因子4を意味することが意図される。コードされたタンパク質は、肝細胞核因子1アルファを含むいくつかの遺伝子の発現を制御する。
【０３４８】
ここで使用される場合、用語「MDR」は、多剤耐性トランスポーターを意味することが意図される。MDR1とMDR3は、輸送体のATP結合カセット（ABC）ファミリーのメンバーであり、両方とも薬物流出輸送体である。MDR1は、薬物、ペプチドと生体異物の体内への輸送を規制し、生体異物の傷害と薬物毒性から身体を保護する上で重要であり、MDR3は、胆汁中へのリン脂質分泌に必須である。
【０３４９】
ここで使用される場合、用語「アクチビン」は、「アクチビンA」又は「アクチビンB」などの細胞の増殖と分化の調節を含む広範囲の生物学的活性を示すTGF-ベータのファミリーメンバーを意味することが意図される。アクチビンは、リガンドの共通のTGF-ベータスーパーファミリーに属する。
【０３５０】
ここで使用される場合、用語「レチノイン酸応答性受容体の活性化因子」は、ヒトレチノイン酸受容体（RAR）及び／又はレチノイドX受容体（RXR）に結合し、活性化することができる化合物を意味することが意図される。
【０３５１】
ここで使用される場合、用語「レチノイン酸受容体」又は「RAR」は、レチノイン酸受容体のファミリーのメンバー、特にRAR-アルファ、RAR-ベータ、及びRAR-ガンマを意味することが意図されており、それらは、RARA、RARB、RARG遺伝子により、それぞれコードされる。各受容体のアイソフォームは、いくつかのスプライス変異体、アルファが２つ、ベータが４つ、ガンマが２つ、を有する。これらのアイソフォームも、「レチノイン酸受容体」の定義に含まれる。
【０３５２】
ここで使用される場合、用語「レチノイン酸」は、オールトランスレチノイン酸、7-シス-レチノイン酸、9-シスレチノイン酸、11-シス-レチノイン酸及び13-シスレチノイン酸を含むがこれらに限定されない、レチノイン酸異性体を意味することが意図される。
【０３５３】
ここで使用される場合、用語「サイクリン依存性キナーゼの阻害剤」又は「CDK阻害剤」は、サイクリン依存性キナーゼ2（CDK2）などのサイクリン依存性キナーゼの機能（例えば、活性）を阻害することができる化合物を意味することが意図される。
【０３５４】
ここで使用される場合、用語「ROCK阻害剤」は、ROCK Rho関連タンパク質キナーゼ活性の阻害剤を意味することが意図される。
【０３５５】
ここで使用される場合、用語「マトリックス」は、正常な哺乳動物細胞外マトリックス環境の一部を形成する、単離された又は組み合わせられた、任意の成分を指すことが意図される。このマトリックス成分には、コラーゲン、フィブロネクチン、及びラミニンが含まれるがこれらに限定されるものではなく、天然源又は合成源由来であってもよい。
【０３５６】
ここで使用される場合、用語「オーバーレイ」は、培養細胞の上に適用される、例えば細胞外マトリックス成分の層を指すことが意図される。
【０３５７】
ここで使用される場合、用語「コーティング」は、培養容器の表面を覆い、その上に細胞が培養される、例えば細胞外マトリックス成分の層を指すことが意図される。
【０３５８】
ここで使用される用語「異物を含まない」は、非ヒト動物成分への直接的又は間接的な暴露を完全に回避することを意味することが意図される。
【０３５９】
ここで使用される場合、用語「肝細胞毒性」は、壊死毒性、アポトーシス、ミトコンドリア毒性、リン脂質症、脂肪症及び胆汁酸輸送などの細胞応答を示す。
【図面の簡単な説明】
【０３６０】
【図１】A〜U：分化プロトコルの29日目及び／又は36日目における、hiPSC由来肝細胞のCYP活性に対する、10Z-ヘプタデセン酸（A、B）、アラキドン酸（C、D）、カルシフェジオール（E、F）、カルシトリオール（E、F）、コレカルシフェロール（G、H）、CGP 52608（I、J）、ドコサヘキサエン酸（K、L）、PP1（M、N、O、P）、PP2（Q、R）、D-エリスロ-スフィンゴシン（S、T）、及びテトラデカン酸（U）による処理の効果。  略語：CGP=CGP 52608、CYP=シトクロムP450、スフィンゴシン=D-エリスロ-スフィンゴシン。
【図２】A〜D：分化プロトコルの29日目及び／又は36日目における、hiPSC由来肝細胞のCYP活性に対する、10Z-ヘプタデセン酸（A）、アラキドン酸（A）、カルシトリオール（C）、コレカルシフェロール（A）、CGP 52608（A）、PP1（A）、D-エリスロ-スフィンゴシン、13シス-RA（B）、L-エリスロMAPP（B）、PAF C16（B）、C16セラミド（B）、及びこれらの化合物の組み合わせ（A、C、D）による処理の効果。  E〜G：核内受容体PXRのmRNA発現レベル（E、G）及び輸送体タンパク質OATP1B1（F）に対する、10Z-ヘプタデセン酸（E、F）及びCGP 52608、PP1、コレカルシフェロール、アラキドン酸、10Z-ヘプタデセン酸、及びD-エリスロ-スフィンゴシンの組み合わせ（G）による処理の効果。  略語：10Z=10Z-ヘプタデセン酸、13シス=13シスレチノイン酸、Ara=アラキドン酸、Caltr=カルシトリオール、セラミド=C16セラミド、CGP=CGP 52608、Chole=コレカルシフェロール、CYP=シトクロムP450、MAPP=L-エリスロMAPP、PAF=血小板活性化因子、OATP1B1=有機アニオン輸送ポリペプチド1B1、PXR=プレグナンX受容体、Sph=D-エリスロ-スフィンゴシン。
【図３】A、B：分化プロトコルの29日目及び／又は36日目における、hiPSC由来肝細胞のCYP活性に対する、分化プロトコルの異なる時点で開始する、10Z-ヘプタデセン酸、アラキドン酸、カルシトリオール、コレカルシフェロール、CGP 52608、PP1、及びD-エリスロ-スフィンゴシンによる処理の効果。  略語：10Z=10Z-ヘプタデセン酸、Ara=アラキドン酸、Caltr=カルシトリオール、CGP=CGP 52608、Chole=コレカルシフェロール、CYP=シトクロムP450、Sph=D-エリスロ-スフィンゴシン。
【図４】A〜G：分化プロトコルの29日目における、hiPS細胞株であるChiPSC4（A）、ChiPSC6b（B）、ChiPSC22（C）、P11015（D）、P11021（E）、P11032（F）、及びhES細胞株であるSA121（G）由来肝細胞の、10Z-ヘプタデセン酸、アラキドン酸、カルシトリオール、コレカルシフェロール、CGP 52608、PP1、及びD-エリスロ-スフィンゴシンによる処理の効果。  略語：10Z=10Z-ヘプタデセン酸、Ara=アラキドン酸、Caltr=カルシトリオール、CGP=CGP 52608、Chole=コレカルシフェロール、CYP =シトクロムP450、Sph=D-エリスロ-スフィンゴシン。
【図５】A、B：分化プロトコルの31日目における、hiPSC由来肝細胞のCYP1A、3A、及び2C9（A）並びにCYP2B6、2D6及び2C19（B）活性に対する、10Z-ヘプタデセン酸、アラキドン酸、カルシトリオール、コレカルシフェロール、CGP 52608、PP1、及びD-エリスロ-スフィンゴシンによる処理、並びにオンコスタチンM及び／又はHGFの有無による処理の効果。  略語：CYP=シトクロムP450、HGF=肝細胞成長因子、OSM=オンコスタチンM。
【実施例】
【０３６１】
一般的な培養と継代技術の例は、WO2004/099394、WO2003/055992、WO/2007/042225、WO2007/140968及びWO2011116930の出願に開示されている。
【０３６２】
以下の実施例に示すように、出発材料は、任意の肝前駆細胞タイプ、特に、ヒト多能性幹細胞などの、哺乳動物多能性幹細胞から最終的又は胚性の株への初期分化を介して誘導されるもの、を含んでいてもよい。出発物質は、肝前駆細胞株の任意の細胞であってもよい。
【実施例１】
【０３６３】
hPS細胞型の維持
すべてのhPS細胞（上記で定義した）は、本発明のための出発材料として使用することができる。以下の実施例では、特に、肝細胞は、mEFフィーダー細胞上に確立された未分化ヒト胚性幹細胞（hESC）からインビトロで誘導され（Heins et al. 2004）、フィーダーフリー条件下で維持された。この実験に使用される細胞株は、hES細胞株であるSA121、SA167、SA181、SA461（セルアーティス社、ヨーテボリ、スウェーデン）であってもよいがそれらに限定されず、それらは、Heins et al. 2004及びCaisander et al. 2006によって説明されているように増殖することができる。
【０３６４】
hESCから得られたhPSに加えて、hiPS（ヒト誘導多能性幹）細胞も、本発明の実施例の肝細胞の誘導に使用されている。本発明で使用したhiPSC株のChiPSC4は、以下のようにして誘導された。ヒト真皮線維芽細胞（CRL2429、ATCC）を、10％ウシ胎仔血清、1×グルタマックス、5U/mlペニシリン及び5μg/mlストレプトマイシンを補充したDMEMに、37℃の空気中5％CO2の加湿雰囲気中で維持した。マウスのOct4、Sox2、Klf4及びc-mycをコードする組換えレンチウイルスを線維芽細胞に形質導入し、5日間培養した。次いで、形質導入された細胞をトリプシンで分散させ、通常の増殖培地中の5×103細胞/cm2の密度の、マイトマイシンC処理したヒト真皮線維芽細胞フィーダー細胞上に播種した。24時間後、培地を、20％ノックアウト血清代替物、1×非必須アミノ酸、1×グルタマックス、5U/mlペニシリン、5μg/mlストレプトマイシン、100μM 2-メルカプトエタノール及び30ng/ml bFGFを補充したノックアウトDMEMに、37℃の空気中5％CO2の加湿雰囲気中で交換した。培地の体積の半分を毎日交換し、約30日後にiPS細胞のコロニーが出現した。iPSコロニーを採取し、DEF-CSTMで増殖させ、細胞バンクを調製した。次いで、バンクされた細胞を特徴付けて、内因性Oct4、Sox2、Klf4及びc-Mycの発現、導入遺伝子のサイレンシング、インビトロで３つの胚葉すべてを代表する細胞種に分化する可能性を調べ、STRプロファイリングと親線維芽細胞株（ATCC）との比較によってその真正性を確認した。
【０３６５】
本発明において使用されるhiPSC株のChiPSC6bは、エレクトロポレーション（ネオントランスフェクションシステム、インビトロジェン）を用いて、OCT4、SOX2、KLF4、LIN28、及びL-MYCをコードするエピソームベクターをトランスフェクトした、線維芽細胞株のP11031（セレクティス社）に由来した。本発明において使用される他のすべてのhiPSC株は、セレクティス社から入手されたものであり、エピソーム（P11021）又はレトロウイルス再プログラミング（ChiPSC18、ChiPSC22、P11015、P11021、P11032）のいずれかと、OCT4、SOX2、KLF4、LIN28、及びL-MYCを用いた、梢血細胞（P11021）又は成体真皮線維芽細胞（ChiPSC18、ChiPSC22、P11015、P11021、P11032）のいずれかに由来した。これらの６つのhiPSC株は、マトリゲルベースの培養系で最初に樹立され、続いてDEF-CSに移された。
【０３６６】
レンチウイルス、レトロウイルス及びエピソームベクターを用いた再プログラミングの代わりに、hiPSC株は、センダイウイルス、アデノウイルス、タンパク質及びmRNA、又は他の技術を用いて再プログラミングすることもできる。使用のための他の適切な細胞株は、Chung et al. (2008)によって確立された細胞株MA126、MA127、MA128及びMA129（アドバンスドセルテクノロジー社、米国  マサチューセッツ州  ウースター）などであり、これらはすべて、国際肝細胞レジストリにリストされている。これらの細胞株は、単一の割球除去技術を使用することによって、ヒト胚の破壊なしに誘導される（又は得られる）。
【０３６７】
本発明で使用されるすべてのhPSC株は、DEF-CS中の標準的な条件下で、週2回連続継代培養され、OCT4、TRA1-60、TRA1-81、及びSSEA-4に対して免疫陽性であり、SSEA-1に対して免疫陰性であった。多能性は、インビトロでの分化によって確認された。Caisander et al. 2006によって説明されるような核型分析は、正常な染色体プロファイルを示した。
【実施例２】
【０３６８】
肝細胞を産生するhPS細胞の分化
肝細胞は、以下の例示的な基本的プロトコルAとBを使用することによって、hPS細胞から得てもよい。
【０３６９】
プロトコルA：
未分化hPS細胞を解離させ、0日目にフィブロネクチンベースのコーティング上に直接播種する。異なる培地を新たに調製し、0、1、2、3、4、5、7日目、その後、2又は3日ごとに、肝臓前段階、分化及び成熟期に追加した。
【０３７０】
0日目
前処理媒体
3μM CHIR99021
5μM ROCK阻害剤
1日目
RPMI 1640（＋0.1％PEST＋1％グルタマックス）
1×B27
50ng/mlアクチビンA
3μM CHIR99021
5μM LY294002
3μM CHIR99021
2日目
RPMI 1640（＋0.1％PEST＋1％グルタマックス）
1×B27
50ng/mlアクチビンA
5μM LY294002
10nM 5-アザ-2-デオキシシチジン
3日目
RPMI 1640（＋0.1％PEST＋1％グルタマックス）
1×B27
50ng/mlアクチビンA
4〜7日目
RPMI 1640（＋0.1％PEST＋1％グルタマックス）
1×B27
50ng/mlアクチビンA
【０３７１】
前処理媒体は、タカラバイオヨーロッパ社（アルビド  ヴァーグレーンス  ベッカ  ２０、４１３４６、ヨーテボリ、スウェーデン）から要求に応じて入手可能である。
【０３７２】
7日目に細胞を継代する。細胞をTrypLE Selectと共に37℃で3〜7分間インキュベートし、同体積のBasHESを添加し、細胞懸濁液を200〜300g、5〜6分で遠心分離する。その後、細胞をフィブロネクチンベースのコーティング上に、50,000〜350,000細胞/cm2、例えば75,000〜300,000細胞/cm2、好ましくは100,000細胞/cm2の細胞密度で再プレーティングする。フィブロネクチンベースのコーティングは、培養面積1cm2あたり7.5μgのフィブロネクチンの濃度を有する。コーティングを調製するために、DPBS 1mlあたり1mg/mlのフィブロネクチンストックを50μl添加し、培養領域1cm2あたりこのコーティング溶液を150μl添加する。
【０３７３】
7〜14日目（肝臓前）
ノックアウト-DMEM＋1％PEST＋1％グルタマックス
20％ノックアウト血清交換
1％非必須アミノ酸（NEAA）
0.2％ベータメルカプトエタノール
1％DMSO
14〜45日目（分化と成熟）
WME＋1％グルタマックス＋0.1％PEST
0.55mg/mL BSA-FAF
0.025mg/mLアスコルビン酸
0.67μg/mLヒドロコルチゾンヘミコハク酸塩
10μg/mLトランスフェリン
5μg/mLインスリン
0.003μg/mL EGF
0.1μM DexM
10ng/ml OsM
20ng/ml HGF
0.5％DMSO
1.4μM BIO
0.5μMケンパロン
0.2μM 9シスレチノイン酸
【０３７４】
14日目と16日目に、マトリックスオーバーレイが行われる。この目的のために、14〜45日目の培地（RT）1mlあたり1mg/mlのフィブロネクチンストック53μlと3mg/mlのコラーゲンIストック9μlを添加し、培地をよく混合し、次に標準的な培地交換を行う。マトリックス成分の添加は、オーバーレイ添加ごとに、1cm2の培養面積あたり25μgのフィブロネクチンと12.5μgのコラーゲンIの添加に相当する。
【０３７５】
プロトコルB：
未分化hPS細胞を解離させ、0日目にフィブロネクチンベースのコーティング上に直接播種する。異なる培地を新たに調製し、0、1、2、3、4、5、7日目、その後、2又は3日ごとに、肝臓前段階、分化及び成熟期に追加した。
【０３７６】
0日目
前処理媒体
3μM CHIR99021
5μM ROCK阻害剤
1日目
RPMI 1640（＋0.1％PEST＋1％グルタマックス）
1×B27
50ng/mlアクチビンA
3μM CHIR99021
5μM LY294002
3μM CHIR99021
2日目
RPMI 1640（＋0.1％PEST＋1％グルタマックス）
1×B27
50ng/mlアクチビンA
5μM LY294002
10nM 5-アザ-2-デオキシシチジン
3日目
RPMI 1640（＋0.1％PEST＋1％グルタマックス）
1×B27
50ng/mlアクチビンA
4〜7日目
RPMI 1640（＋0.1％PEST＋1％グルタマックス）
1×B27
50ng/mlアクチビンA
【０３７７】
前処理媒体は、タカラバイオヨーロッパ社（アルビド  ヴァーグレーンス  ベッカ  ２０、４１３４６、ヨーテボリ、スウェーデン）から要求に応じて入手可能である。
【０３７８】
7日目に細胞を継代する。細胞をTrypLE Selectと共に37℃で3〜7分間インキュベートし、同体積のBasHESを添加し、細胞懸濁液を200〜300g、5〜6分で遠心分離する。その後、細胞をコラーゲンI−フィブロネクチンベースのコーティング上に、50,000〜350,000細胞/cm2、例えば75,000〜300,000細胞/cm2、好ましくは100,000細胞/cm2の細胞密度で再プレーティングする。コラーゲンI−フィブロネクチンベースのコーティングは、培養面積1cm2あたり2μgのフィブロネクチンと10μgのコラーゲンIの濃度を有する。コーティングを調製するために、DPBS 1mlあたり1mg/mlのフィブロネクチンストックを12μlと3mg/mlのコラーゲンIストックを21.5μl添加し、培養領域1cm2あたりこのコーティング溶液を150μl添加する。
【０３７９】
7〜14日目（肝臓前）
ノックアウト-DMEM＋1％PEST＋1％グルタマックス
20％ノックアウト血清交換
1％非必須アミノ酸（NEAA）
0.2％ベータメルカプトエタノール
1％DMSO
14〜45日目（分化と成熟）
WME＋1％グルタマックス＋0.1％PEST
0.55mg/mL BSA-FAF
0.025mg/mLアスコルビン酸
0.67μg/mLヒドロコルチゾンヘミコハク酸塩
10μg/mLトランスフェリン
5μg/mLインスリン
0.003μg/mL EGF
0.1μM DexM
10ng/ml OsM
20ng/ml HGF
0.5％DMSO
1.4μM BIO
0.5μMケンパロン
0.2μM 9シスレチノイン酸
【０３８０】
14日目と16日目に、マトリックスオーバーレイが行われる。この目的のために、14〜45日目の培地（RT）1mlあたり1mg/mlのフィブロネクチンストック12μlと3mg/mlのコラーゲンIストック3μlを添加し、培地をよく混合し、次に標準的な培地交換を行う。マトリックス成分の添加は、オーバーレイ添加ごとに、1cm2の培養面積あたり6μgのフィブロネクチンと31.25μgのコラーゲンIの添加に相当する。
【実施例３】
【０３８１】
10Z-ヘプタデセン酸、アラキドン酸、カルシフェジオール、カルシトリオール、コレカルシフェロール、CGP 52608、ドコサヘキサエン酸、PP1、PP2、D-エリスロ-スフィンゴシン及びテトラデカン酸によるhiPSC由来肝細胞の処理効果
手順：
基本プロトコルAに続いて、フィブロネクチンベースのコーティング上で培養したhiPS細胞由来肝細胞を、分化プロトコルの21日以降、0.5又は5μMの10Z-ヘプタデセン酸、0.5又は5μMのアラキドン酸、5μMのカルシフェジオール、5μMのカルシトリオール、0.2又は0.5μMのコレカルシフェロール、5又は50μMのCGP 52608、0.5又は5μMのドコサヘキサエン酸、0.5、1.25、2.5、5又は10μMのPP1、0.5又は5μMのPP2、0.5又は5μMのD-エリスロ-スフィンゴシン、或いは0.5又は5μMのテトラデカン酸により処理した（図１）。
【０３８２】
分化プロトコルの29日目と36日目に、細胞培養物を以下のプロトコルに従ってCYP活性アッセイに供する。細胞を温かいウィリアムズ培地E、フェノールレッドなし（＋0.1％PEST）で２回洗浄する。次いで、温かいウィリアムズ培地E、フェノールレッド無し（＋0.1％PEST）、2mM L-グルタミン、25mM HEPES、10μMフェナセチン（CYP1Aのモデル基質）、10μMブプロピオン（2B6のモデル基質）、10μMジクロフェナク（CYP2C9のモデル基質）、10μMブフラロール（2D6のモデル基質）、及び5μMミダゾラム（CYP3Aのモデル基質）からなるCYP活性アッセイを細胞に添加し（例えば、110μl/cm2）、37℃で16時間インキュベートする。その後、100μlの上清を、密封テープで密封され代謝産物、CYP1Aについてはアセトアミノフェン（パラセタモール）、CYP2B6についてはOH-ブプロピオン、CYP2C9についてはOH-ジクロフェナク、CYP2D6についてはOH-ブフラロール、及びCYP3AについてはOH-ミダゾラム、のLC/MS分析まで−80℃で保存される96ウェルプレートに移す。
【０３８３】
結果：
図１A〜U）10Z-ヘプタデセン酸、アラキドン酸、カルシフェンジオール、カルシトリオール、コレカルシフェロール、CGP 52608、ドコサヘキサエン酸、PP1、PP2、D-エリスロ-スフィンゴシン、及びテトラデカン酸は、hiPS細胞由来肝細胞のCYP活性レベルを、分化プロトコルの29日目と36日目の両方において増加させる。いくつかのケースでは、2B6活性レベルが検出レベル未満であった。
【０３８４】
これらの１１種の化合物は、hiPS細胞由来の肝細胞におけるCYP活性レベルを増加させる。したがって、CYP活性を改善することを望む当業者は、彼らの興味に従って、これらの化合物から選択してもよい。
【実施例４】
【０３８５】
10Z-ヘプタデセン酸、アラキドン酸、カルシトリオール、コレカルシフェロール、CGP 52608、PP1、D-エリスロ-スフィンゴシン、13シス-RA、L-エリスロMAPP、PAF C16、C16セラミド、及びそれらの組み合わせによるhiPSC由来肝細胞の処理効果
手順：
基本プロトコルBに続いて、コラーゲンI−フィブロネクチンベースのコーティング上で培養したChiPSC-4由来肝細胞を、分化プロトコルの21日以降、0.5μMの10Z-ヘプタデセン酸、0.5μMのアラキドン酸、0.5μMのカルシトリオール、5μMのCGP 52608、0.2μMのコレカルシフェロール、5μMのPP1、0.5μMのD-エリスロ-スフィンゴシン、0.2μMの13シス-RA、0.5μMのL-エリスロMAPP、0.5μMのPAF C16、0.5μMのC16セラミド、又はそれらの化合物の異なった組み合わせにより処理した（図２）。
【０３８６】
分化プロトコルの29日目に、細胞培養物を実施例３に記載のプロトコルに従ってCYP活性アッセイに供する。いくつかの実験において、50μMメフェニトイン（2C19のモデル基質）を上記の基質に追加してから、CYP2C19活性を測定するために代謝物OH-メフェニトインの形成をLC/MSによって測定した。
【０３８７】
結果：
図２A〜D）10Z-ヘプタデセン酸（10Z）、アラキドン酸（Ara）、カルシトリオール（Caltr）、コレカルシフェロール（Chole）、CGP 52608（CGP）、PP1、D-エリスロ-スフィンゴシン（Sph）、13シス-RA（13シス）、L-エリスロMAPP（MAPP）、PAF C16（PAF）、C16セラミド（Cera）、又はそれらの化合物の異なった組み合わせは、hiPS細胞由来肝細胞のCYP活性レベルを、分化プロトコルの29日目において増加させる。いくつかのケースでは、2B6活性レベルが検出レベル未満であった。
【０３８８】
図２E、F）プロトコルBと、プロトコルBに10Z-ヘプタデセン酸を加えた場合は、プロトコルAと比較して、分化プロトコルの36日目にhiPS細胞由来肝細胞のOATP1B1とPXR mRNAレベルを増加させる。
【０３８９】
図２G）プロトコルBにCGP 52608、PP1、コレカルシフェロール、アラキドン酸、10Z-ヘプタデセン酸、及びスフィンゴシンを加えた場合は、プロトコルAと比較して、分化プロトコルの29日目と36日目にhiPS細胞由来肝細胞のPXR mRNAレベルを増加させる。
【０３９０】
これらの１１種の化合物は、hiPS細胞由来の肝細胞におけるCYP活性レベルを増加させる。したがって、CYP活性を改善することを望む当業者は、彼らの興味に従って、これらの化合物から選択してもよい。
【実施例５】
【０３９１】
分化プロトコルの異なる時点で開始する、10Z-ヘプタデセン酸、アラキドン酸、カルシトリオール、コレカルシフェロール、CGP 52608、PP1、及びD-エリスロ-スフィンゴシンによるhiPSC由来肝細胞の処理効果
手順：
基本プロトコルBに続いて、コラーゲンI−フィブロネクチンベースのコーティング上で培養したChiPSC-4由来肝細胞を、分化プロトコルのそれぞれ11、14、21、25及び28日以降に開始して、0.5μMの10Z-ヘプタデセン酸、0.5μMのアラキドン酸、0.5μMのカルシトリオール、5μMのCGP 52608、0.2μMのコレカルシフェロール、5μMのPP1、及び0.5μMのD-エリスロ-スフィンゴシンにより処理した（図３）。
【０３９２】
分化プロトコルの29日目と36日目に、細胞培養物を実施例３に記載のプロトコルに従ってCYP活性アッセイに供する。
【０３９３】
結果：
図３A、B）分化プロトコルの11日目と28日目の間に開始した、10Z-ヘプタデセン酸（10Z）、アラキドン酸（Ara）、カルシトリオール（Caltr）、コレカルシフェロール（Chole）、CGP 52608（CGP）、PP1、及びD-エリスロ-スフィンゴシン（Sph）による処理は、hiPS細胞由来肝細胞のCYP活性レベルを、分化プロトコルの29日目と36日目において増加させる。
【０３９４】
分化プロトコルの11日目と28日目の間に開始した、これらの７種の化合物による処理は、hiPS細胞由来の肝細胞におけるCYP活性レベルを増加させる。したがって、CYP活性を改善することを望む当業者は、彼らの興味に従って、これらの化合物から選択してもよい。
【実施例６】
【０３９５】
10Z-ヘプタデセン酸、アラキドン酸、カルシトリオール、コレカルシフェロール、CGP 52608、PP1、及びD-エリスロ-スフィンゴシンによるいくつかのhiPSとhES細胞株に由来する肝細胞の処理効果
手順：
基本プロトコルBに続いて、hiPS細胞株のChiPSC4、ChiPSC6b、ChiPSC22、P11015、P11021、P11032と、hES細胞株のSA121に由来する肝細胞を、コラーゲンI−フィブロネクチンベースのコーティング上で培養し、分化プロトコルの21日以降、0.5μMの10Z-ヘプタデセン酸、0.5μMのアラキドン酸、0.5μMのカルシトリオール、5μMのCGP 52608、0.2μMのコレカルシフェロール、5μMのPP1、及び0.5μMのD-エリスロ-スフィンゴシンの組み合わせにより処理した（図４）。
【０３９６】
分化プロトコルの29日目に、細胞培養物を実施例３に記載のプロトコルに従ってCYP活性アッセイに供する。いくつかの実験において、50μMメフェニトイン（2C19のモデル基質）を上記の基質に追加してから、CYP2C19活性を測定するために代謝物OH-メフェニトインの形成をLC/MSによって測定した。
【０３９７】
結果：
図４A〜G）10Z-ヘプタデセン酸（10Z）、アラキドン酸（Ara）、カルシトリオール（Caltr）、コレカルシフェロール（Chole）、CGP 52608（CGP）、PP1、及びD-エリスロ-スフィンゴシン（Sph）による処理は、hiPS細胞株のChiPSC4（A）、ChiPSC6b（B）、ChiPSC22（C）、P11015（D）、P11021（E）、P11032（F）と、hES細胞株のSA121（G）に由来する肝細胞のCYP活性レベルを、分化プロトコルの29日目において増加させる。
【０３９８】
これらの７種の化合物は、hiPSとhES細胞由来肝細胞の両方におけるCYP活性レベルを増加させる。したがって、CYP活性を改善することを望む当業者は、彼らの興味に従って、これらの化合物から選択してもよい。
【実施例７】
【０３９９】
オンコスタチンM及び／又はHGFの添加の有無による、10Z-ヘプタデセン酸、アラキドン酸、カルシトリオール、コレカルシフェロール、CGP 52608、PP1及びD-エリスロ-スフィンゴシンによるhiPSC由来肝細胞の処理効果
手順：
基本プロトコルBに続いて、hiPS細胞株のChiPSC18に由来する肝細胞を、コラーゲンI−フィブロネクチンベースのコーティング上で培養し、分化プロトコルの21日以降、0.5μMの10Z-ヘプタデセン酸、0.5μMのアラキドン酸、0.5μMのカルシトリオール、5μMのCGP 52608、0.2μMのコレカルシフェロール、5μMのPP1、及び0.5μMのD-エリスロ-スフィンゴシンの組み合わせにより、オンコスタチンM及び／又はHGFの存在下と非存在下で処理した（図５）。
【０４００】
分化プロトコルの31日目に、細胞培養物を実施例３に記載の以下のプロトコルに従ってCYP活性アッセイに供する。50μMメフェニトイン（2C19のモデル基質）を上記の基質に追加してから、CYP2C19活性を測定するために代謝物OH-メフェニトインの形成を測定した。
【０４０１】
結果：
図５A、B）10Z-ヘプタデセン酸、アラキドン酸、カルシトリオール、コレカルシフェロール、CGP 52608、PP1、及びD-エリスロ-スフィンゴシンにより、オンコスタチンM及び／又はHGFの存在下と非存在下での処理の結果、分化プロトコルの31日目における、hiPS細胞株のChiPSC18に由来する肝細胞のCYP活性レベルは同様になる。
【０４０２】
これらの７種の化合物は、オンコスタチンM及び／又はHGFの存在とは無関係に、hiPSとhES細胞由来肝細胞の両方におけるCYP活性レベルを増加させる。したがって、CYP活性を改善することを望む当業者は、彼らの興味に従ってこれらの化合物から選択し、オンコスタチンM及び／又はHGFを包含又は排除してもよい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０４０３】
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【図１Ａ】
2018516073.tif 000002
【図１Ｂ】
2018516073.tif 000003
【図１Ｃ】
2018516073.tif 000004
【図１Ｄ】
2018516073.tif 000005
【図１Ｅ】
2018516073.tif 000006
【図１Ｆ】
2018516073.tif 000007
【図１Ｇ】
2018516073.tif 000008
【図１Ｈ】
2018516073.tif 000009
【図１Ｉ】
2018516073.tif 000010
【図１Ｊ】
2018516073.tif 000011
【図１Ｋ】
2018516073.tif 000012
【図１Ｌ】
2018516073.tif 000013
【図１Ｍ】
2018516073.tif 000014
【図１Ｎ】
2018516073.tif 000015
【図１Ｏ】
2018516073.tif 000016
【図１Ｐ】
2018516073.tif 000017
【図１Ｑ】
2018516073.tif 000018
【図１Ｒ】
2018516073.tif 000019
【図１Ｓ】
2018516073.tif 000020
【図１Ｔ】
2018516073.tif 000021
【図１Ｕ】
2018516073.tif 000022
【図２Ａ１】
2018516073.tif 000023
【図２Ａ２】
2018516073.tif 000024
【図２Ｂ１】
2018516073.tif 000025
【図２Ｂ２】
2018516073.tif 000026
【図２Ｃ１】
2018516073.tif 000027
【図２Ｃ２】
2018516073.tif 000028
【図２Ｄ１】
2018516073.tif 000029
【図２Ｄ２】
2018516073.tif 000030
【図２Ｅ】
2018516073.tif 000031
【図２Ｆ】
2018516073.tif 000032
【図２Ｇ】
2018516073.tif 000033
【図３Ａ１】
2018516073.tif 000034
【図３Ａ２】
2018516073.tif 000035
【図３Ｂ１】
2018516073.tif 000036
【図３Ｂ２】
2018516073.tif 000037
【図４Ａ１】
2018516073.tif 000038
【図４Ａ２】
2018516073.tif 000039
【図４Ｂ１】
2018516073.tif 000040
【図４Ｂ２】
2018516073.tif 000041
【図４Ｃ１】
2018516073.tif 000042
【図４Ｃ２】
2018516073.tif 000043
【図４Ｄ１】
2018516073.tif 000044
【図４Ｄ２】
2018516073.tif 000045
【図４Ｅ１】
2018516073.tif 000046
【図４Ｅ２】
2018516073.tif 000047
【図４Ｆ１】
2018516073.tif 000048
【図４Ｆ２】
2018516073.tif 000049
【図４Ｇ１】
2018516073.tif 000050
【図４Ｇ２】
2018516073.tif 000051
【図５Ａ】
2018516073.tif 000052
【図５Ｂ】
2018516073.tif 000053
【配列表】
2018516073000001.app
【国際調査報告】
2018516073.tif 000054
2018516073.tif 000055
2018516073.tif 000056
2018516073.tif 000057
2018516073.tif 000058
2018516073.tif 000059