(57)【要約】  本発明は、一部は、抗生物質による破壊から消化管マイクロバイオームを保護するための各種組成物および方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗生物質分解剤を含む有効量の医薬組成物をそれを必要としている対象に投与することを含む、対象の消化管マイクロバイオームの保護方法であって、
前記対象がカルバペネム抗生物質を使って現在処置を受けているか、または最近処置を受けたことがあり、および
前記抗生物質分解剤が、前記カルバペネムを分解または不活化できる、方法。
【請求項２】
前記抗生物質分解剤が酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素が、広域スペクトルカルバペネマーゼ、場合により、メタロ−β−ラクタマーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
広域スペクトルカルバペネマーゼが、Ｐ２Ａ、ニューデリー・メタロ−β−ラクタマーゼおよびクレブシェラ肺炎杆菌カルバペネマーゼから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記広域スペクトルカルバペネマーゼが、ＮＤＭ−１またはＮＤＭ−２である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記広域スペクトルカルバペネマーゼが、ＫＰＣ−１／２である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記広域スペクトルカルバペネマーゼが、配列番号３７と約９８％の配列類似性を有するアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記広域スペクトルカルバペネマーゼが、Ｐ２Ａである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗生物質分解剤が、配列番号１９〜３９、３７〜６５、６６、または６８の内の１つのアミノ酸配列に対し、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象のマイクロバイオームの保護が、マイクロバイオーム媒介障害の処置または予防を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記マイクロバイオーム媒介障害が、抗生物質誘発性有害作用、クロストリジウム・ディフィシレ感染症（ＣＤＩ）、クロストリジウム・ディフィシレ関連疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、および過敏性腸症候群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記マイクロバイオーム媒介障害が、抗生物質誘発性有害作用、クロストリジウム・ディフィシレ感染症（ＣＤＩ）、およびクロストリジウム・ディフィシレ関連疾患の内の１種または複数である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗生物質誘発性有害作用および／またはＣＤＩまたはクロストリジウム・ディフィシレ関連疾患が、抗生物質関連下痢、クロストリジウム・ディフィシレ下痢（ＣＤＤ）、クロストリジウム・ディフィシレ炎症性腸疾患、大腸炎、偽膜性大腸炎、発熱、腹痛、脱水および電解質障害、巨大結腸症、腹膜炎、および結腸の穿孔および／または破裂の内の１つまたは複数である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象のマイクロバイオームの保護が、健全な微生物叢バランス（例えば、健全な比率および／または分布）などの正常な腸微生物叢の維持を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
対象の前記ＧＩ管中の１種または複数種の病原微生物の異常増殖を処置および／または予防する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
院内感染症および／または２次新興感染症を処置または予防する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗生物質分解剤が、前記抗生物質の血液中または血漿中レベルと実質的に干渉しない、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗生物質分解剤が、前記ＧＩ管中の余剰または残留抗生物質を分解または不活化する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗生物質分解剤が、１種または複数のβ−ラクタム系抗生物質に対して、約５００μＭ、または約１００μＭ、または約１０μＭ、または約１μＭ、または約０．１μＭ、または約０．０１μＭ、または約１ｎＭ未満のＫＭを有する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗生物質分解剤が、１種または複数のβ−ラクタム系抗生物質に対し、約１００ｓ−１、または約１０００ｓ−１、または約１００００ｓ−１、または約１０００００ｓ−１、または約１００００００ｓ−１を超えるＶｍａｘを有する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗生物質分解剤が、１種または複数の抗生物質に対し、約１０６Ｍ−１ｓ−１を超える触媒効率を有する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記β−ラクタム系抗生物質が、ペニシリン、セファロスポリン、モノバクタムおよびカルバペネムから選択される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ペニシリンが、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、テモシリン、およびチカルシリンから選択される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ペニシリンが、アムジノシリン、アモキシシリン（例えば、ＮＯＶＡＭＯＸ、ＡＭＯＸＩＬ）；アンピシリン（例えば、ＰＲＩＮＣＩＰＥＮ）；アズロシリン；カルベニシリン（例えば、ＧＥＯＣＩＬＬＩＮ）；クロキサシリン（例えば、ＴＥＧＯＰＥＮ）；シクラシリン、ジクロキサシリン（例えば、ＤＹＮＡＰＥＮ）；フルクロキサシリン（例えば、ＦＬＯＸＡＰＥＮ）；メズロシリン（例えば、ＭＥＺＬＩＮ）；メチシリン（例えば、ＳＴＡＰＨＣＩＬＬＩＮ）；ナフシリン（例えば、ＵＮＩＰＥＮ）；オキサシリン（例えば、ＰＲＯＳＴＡＰＨＬＩＮ）；ペニシラン酸、ペニシリンＧ（例えば、ＰＥＮＴＩＤＳまたはＰＦＩＺＥＲＰＥＮ）；ペニシリンＶ（例えば、ＶＥＥＴＩＤＳ（ＰＥＮ−ＶＥＥ−Ｋ））；ピペラシリン（例えば、ＰＩＰＲＡＣＩＬ）；スルバクタム、テモシリン（例えば、ＮＥＧＡＢＡＮ）；およびチカルシリン（例えば、ＴＩＣＡＲ）の内の１種または複数である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記セファロスポリンが、セフォペラゾン、セフトリアキソンまたはセファゾリンから選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
前記セファロスポリンが、例えば、第一世代セファロスポリン（例えば、セファドロキシル（例えば、ＤＵＲＩＣＥＦ）；セファゾリン（例えば、ＡＮＣＥＦ）；セフトロザン、セファロチン（Ｃｅｆａｌｏｔｉｎ）／セファロチン（Ｃｅｆａｌｏｔｈｉｎ）（例えば、ＫＥＦＬＩＮ）；セファレキシン（例えば、ＫＥＦＬＥＸ））；第二世代セファロスポリン（例えば、セファクロール（例えば、ＤＩＳＴＡＣＬＯＲ）；セファマンドール（例えば、ＭＡＮＤＯＬ）；セフォキシチン（例えば、ＭＥＦＯＸＩＮ）；セフプロジル（例えば、ＣＥＦＺＩＬ）；セフロキシム（例えば、ＣＥＦＴＩＮ、ＺＩＮＮＡＴ））；第三世代セファロスポリン（例えば、セフィキシム（例えば、ＳＵＰＲＡＸ）；セフジニル（例えば、ＯＭＮＩＣＥＦ、ＣＥＦＤＩＥＬ）；セフジトレン（例えば、ＳＰＥＣＴＲＡＣＥＦ）；セフォペラゾン（例えば、ＣＥＦＯＢＩＤ）；セフォタキシム（例えば、ＣＬＡＦＯＲＡＮ）；セフポドキシム（例えば、ＶＡＮＴＩＮ）；セフタジジム（例えば、ＦＯＲＴＡＺ）；セフチブテン（例えば、ＣＥＤＡＸ）；セフチゾキシム（例えば、ＣＥＦＩＺＯＸ）；およびセフトリアキソン（例えば、ＲＯＣＥＰＨＩＮ））；ならびに第四世代セファロスポリン（例えば、セフェピム（例えば、ＭＡＸＩＰＩＭＥ））または第五世代セファロスポリン（例えば、セフタロリンフォサミル（例えば、ＴＥＦＬＡＲＯ）；セフトビプロール（例えば、ＺＥＦＴＥＲＡ））から選択される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記セファロスポリンが、セフォペラゾン、セフトリアキソンまたはセファゾリンの内の１種または複数である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記モノバクタムが、アズトレオナム（例えば、ＡＺＡＣＴＡＭ、ＣＡＹＳＴＯＮ）、チゲモナム、ノカルディシンＡ、およびタブトキシンの内の１種または複数である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記モノバクタムが、アズトレオナムである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記カルバペネムが、メロペネム、イミペネム、エルタペネム、およびドリペネムから選択される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記カルバペネムが、メロペネム（例えば、ＭＥＲＲＥＭ）、イミペネム（例えば、イミペネム／シラスタチン、ＰＲＩＭＡＸＩＮ）、エルタペネム（例えば、ＩＮＶＡＮＺ）、ドリペネム（例えば、ＤＯＲＩＢＡＸ）、パニペネム／ベタミプロン、ビアペネム、ラズペネム（ＰＺ−６０１）、テビペネム、レナペネム、トモペネム、およびチエナマイシンの内の１種または複数である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗生物質分解剤がＮＤＭ−１であり、前記β−ラクタム系抗生物質がセフェピムおよび／またはセフォペラゾンである、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗生物質分解剤がＫＰＣ−１／２であり、前記β−ラクタム系抗生物質がアズトレオナムである、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗生物質分解剤がＰ２Ａであり、前記β−ラクタム系抗生物質がエルタペネムである、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
初期療法剤および／または補助的療法剤が前記対象に投与される、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記初期療法剤および／または補助的療法剤が、メトロニダゾール、バンコマイシン、フィダキソマイシン、リファキシミン、木炭系結合剤／吸着剤、糞便細菌療法剤、プロバイオティック療法剤、および抗体療法剤の内の１種または複数種である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗生物質分解剤が、ＧＩ管送達用に処方され、必要に応じて、腸溶コーティングを含む、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記送達が、安定および／または活性抗生物質分解剤の放出を可能とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗生物質分解剤が、前記ＧＩ管中の、残留または余剰抗生物質を分解または不活化する部位で放出されるように処方される、請求項３７または３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗生物質分解剤が、前記ＧＩ管中の、残留または余剰抗生物質のＧＩ管微生物叢に対する殺菌作用を阻止する部位で放出されるように処方される、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗生物質分解剤が、前記ＧＩ管中の、前記抗生物質の全身作用を実質的に妨げない部位で放出されるように処方される、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗生物質分解剤が、前記ＧＩ管中の、前記抗生物質の放出より遠位となる部位で放出されるように処方される、請求項３７〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗生物質分解剤が、前記小腸で放出される、請求項３７〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗生物質分解剤が、前記十二指腸、空腸、または回腸で放出される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗生物質分解剤が、前記大腸で放出される、請求項３７〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記抗生物質分解剤が、前記横行結腸、下行結腸、上行結腸、Ｓ状結腸、または盲腸で放出される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記抗生物質分解剤が、ｐＨ依存性の溶解度を有する放出調節コーティングを使って処方される、請求項３７〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗生物質分解剤が、時間依存性侵食プロファイルを有する放出調節コーティングを使って処方される、請求項３７〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗生物質分解剤が、腸管内菌叢中に存在する微生物酵素により分解される放出調節コーティングを使って処方される、請求項３７〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗生物質分解剤が、微生物による放出用として処方される、請求項３７〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗生物質分解剤が、細菌、真菌、および藻類から任意に選択される遺伝子改変微生物による放出用として処方される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記遺伝子改変微生物が、酵母であり、場合により、出芽酵母、亜系ブラウディ（Ｓ．ブラウディ）またはピキア・パストリスである、請求項５０または５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記遺伝子改変微生物が、バチルス属である、請求項５０または５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記遺伝子改変微生物が、前記十二指腸、空腸および回腸の内の１種または複数から任意に選択される小腸中、および／または前記横行結腸、下行結腸、上行結腸、Ｓ状結腸および盲腸の内の１種または複数から任意に選択される大腸中で放出される、請求項５０〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗生物質分解剤より近位の前記ＧＩ管中で放出される抗生物質分解剤阻害剤の投与をさらに含む、請求項１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗生物質分解剤阻害剤が、タゾバクタム、スルバクタム、ＥＤＴＡ、またはクラブラン酸の内の１種または複数である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗生物質が、経口または非経口投与される、請求項１〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記抗生物質が、静脈内投与される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記対象が、以前にマイクロバイオーム媒介障害を罹患したことがある、請求項１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記対象が、マイクロバイオーム媒介障害の再発症状を呈している、請求項１〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で抗生物質分解剤を産生する方法であって、
（ａ）前記抗生物質分解剤をコードする配列を含むベクターで形質転換された宿主大腸菌細胞を用意すること、
（ｂ）前記大腸菌細胞を培養して、前記抗生物質分解剤の発現を誘導すること、および
（ｃ）前記大腸菌細胞から調製された可溶性画分から前記抗生物質分解剤を回収することであって、
前記抗生物質分解剤が、Ｐ２Ａ、ニューデリー・メタロ−β−ラクタマーゼ（例えば、ＮＤＭ−１、ＮＤＭ−２、ＮＤＭ−３、ＮＤＭ−４、ＮＤＭ−５、ＮＤＭ−６、ＮＤＭ−７、ＮＤＭ−８、ＮＤＭ−９、ＮＤＭ−１０、ＮＤＭ−１１、ＮＤＭ−１２、およびＮＤＭ−１３の内の１種または複数）、およびクレブシェラ肺炎杆菌カルバペネマーゼ（例えば、ＫＰＣ−１／２、ＫＰＣ−３、ＫＰＣ−４、ＫＰＣ−５、ＫＰＣ−６、ＫＰＣ−７、ＫＰＣ−８、ＫＰＣ−９、ＫＰＣ−１０、ＫＰＣ−１１、ＫＰＣ−１２、ＫＰＣ−１３、ＫＰＣ−１４、ＫＰＣ−１５、およびＫＰＣ−１７の内の１種または複数）から選択される広域スペクトルカルバペネマーゼであり、
前記培養が、亜鉛の不存在下での培養に比べて、前記可溶性画分中の抗生物質分解剤タンパク質の量を実質的に増加させるのに十分で、および封入体中の前記抗生物質分解剤の量を低減させるのに十分な量の亜鉛の存在下で実施されること、を含む方法。
【請求項６２】
前記抗生物質分解剤が、ＮＤＭ−１である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記抗生物質分解剤が、ＮＤＭ−２である、請求項６１または６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記抗生物質分解剤が、ＫＰＣ−１／２である、請求項６１〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記抗生物質分解剤が、Ｐ２Ａである、請求項６１〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記抗生物質分解剤が、配列番号１９〜６５の内の１つと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６１〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記抗生物質分解剤をコードする配列が、配列番号１〜１８、６７、または６９の内の１つと少なくとも６０％の同一性を有する、請求項６１〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
１リットルの培養液当たり、少なくとも約１０ｇの実質的に活性な抗生物質分解剤を産出する、請求項６１〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
１リットルの培養液当たり、少なくとも約１５ｇの実質的に活性な抗生物質分解剤を産出する、請求項６１〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記回収した抗生物質分解剤タンパク質が、実質的に可溶性である、請求項６１〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記抗生物質分解剤タンパク質が、前記大腸菌の細胞質または細胞周辺腔に実質的に可溶性である、請求項６１〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記亜鉛の添加が、亜鉛不含の方法に比較して、抗生物質分解剤タンパク質の収率を高める、請求項６１〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記亜鉛が、ＺｎＳＯ４として培地に添加される、請求項６１〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記培養が、バイオリアクターまたは振盪フラスコ中で実施される、請求項６１〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記抗生物質分解剤がＫＰＣであり、前記培養が振盪フラスコ中で実施される、請求項６１〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記大腸菌細胞が、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を使って、前記抗生物質分解剤を発現するように誘導される、請求項６１〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は２０１５年２月２３日出願の米国特許仮出願第６２／１１９，６０２号、２０１５年５月１日出願の同第６２／１５５，６２１号および２０１５年７月１０日出願の同第６２／１９０，８０６号の利益を主張する。これらの仮出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる
【０００２】
発明の分野
本発明は、一部は、抗生物質による破壊から消化管マイクロバイオームを保護するための各種組成物および方法に関する。
【０００３】
電子申請したテキストファイルの説明
本明細書と共に電子申請された下記のテキストファイルはその全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列リストのコンピュータ可読形式コピー（ファイル名：ＳＹＮ−０１０ＰＣ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；記録日付：２０１６年２月２２日；ファイルサイズ：１４４ＫＢ）。
【背景技術】
【０００４】
１０００を超える異なる細菌種および推定１ｘ１０１４を超える微生物を住まわせる消化（ＧＩ）管は、ヒト宿主の健康状態の決定に最も重要であり、マイクロバイオームの重要な部分であると思われる。このマイクロバイオームの破壊は、多くの障害の原因になると考えられている。
【０００５】
実際に、抗生物質は、多くの場合、微生物のヒトの健康に対する有害作用を防ぐためのファーストライン治療薬であり、ＧＩ管中のものを含むマイクロバイオームの破壊を引き起こし、その結果、さらなる疾患を招く可能性がある。例えば、β−ラクタム系抗生物質は胆汁に排泄され、これにより、結腸微生物叢に損害を与え、クロストリジウム・ディフィシル感染症などの深刻な疾病に繋がる場合がある。
【０００６】
このシナリオを回避するための現時点での手法には、小腸中でβ−ラクタム系抗生物質を分解してマイクロバイオームを保護する経口薬が含まれる。しかし、現在の治療薬は、特定の抗生物質のみを標的とするものであるため、これらのマイクロバイオーム保護剤（ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ−ｓｐａｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）の薬効範囲を拡張する必要性がある。
【０００７】
抗生物質によるマイクロバイオーム破壊を防ぐと同時に、対象におけるこれらの抗生物質の有益な抗感染性効果を減らさない、または根絶してしまわない薬剤に対するニーズが残されている。
【発明の概要】
【０００８】
したがって、本発明は、対象の消化管マイクロバイオームを保護する組成物および方法を提供する。一態様では、ＧＩ管のマイクロバイオームを保護する方法が提供され、該方法では、抗生物質分解剤を含む有効量の医薬組成物が、抗生物質を使った処置を受けているまたは処置を最近受けたことがある対象に投与され、抗生物質分解剤は抗生物質を不活化または分解または加水分解できる。いくつかの実施形態では、抗生物質分解剤は、限定されないが、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ−１、およびＫＰＣ−１／２を含む、広域スペクトルカルバペネマーゼである。種々の実施形態では、抗生物質は、β−ラクタム系抗生物質であり、これは、経口または非経口投与され得る。ある実施形態では、抗生物質は静脈内に投与される。
【０００９】
いくつかの態様では、本発明は、１つには、１種または複数の抗生物質分解剤（例えば、広域スペクトルカルバペネマーゼ、例えば、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ−１、およびＫＰＣ−１／２）がＧＩ管内の１つまたは複数の部位で放出され、そこで経口または非経口的に送達された抗生物質（例えば、β−ラクタム系抗生物質）を不活性化（例えば、加水分解）することによりマイクロバイオームを保護するように、該抗生物質分解剤を配合できるという発見に基づいている。しかし、いくつかの実施形態では、抗生物質分解剤は、抗生物質の腸内吸収を妨げず、したがって、抗生物質の全身血液中または血漿中レベルに影響しない。例えば、抗生物質分解剤は、例えば、経口投与量後にＧＩ管から吸収されない余剰もしくは残留抗生物質、または例えば、経口または非経口投与後に活性型として体循環から腸管に戻される余剰もしくは残留抗生物質を加水分解し得る。本発明は、このような抗生物質分解剤放出または活性化の部位を特定する。実例としてのいくつかの実施形態では、次の２つの手法：ＧＩ管の所望の部位で抗生物質分解剤を放出するように設計された配合物の利用および抗生物質と抗生物質分解剤阻害剤との組み合わせ、を別々にまたは組み合わせて用い得る。後者の場合は、いくつかの実施形態では、阻害剤は抗生物質を追跡し、抗生物質分解剤から抗生物質を保護する役割をする。阻害剤の濃度が低下するに伴い、抗生物質分解剤が活性になる。腸内に残っているまたは胆汁と共に再入した全ての残留または余剰抗生物質は、結腸マイクロバイオームと出会う前に不活化される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ｐ２Ａタンパク質発現を示す図である。菌株を１００μＭのＺｎＳＯ４を補充した培地中で増殖させた。可溶性画分（左パネル）または不溶性画分（右パネル）由来の等体積の細胞ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。タンパク質サイズマーカーをＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（マーカー）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とし、参照基準（Ｒｅｆ  Ｓｔｄ）をβ−ラクタマーゼタンパク質、Ｐ３Ａとした。ネガティブコントロールを非形質転換細胞由来のライセートとした。Ｐ２Ａ産物は、矢印で示されている。
【図２】ＮＤＭタンパク質発現を示す図である。菌株を１００ｕＭのＺｎＳＯ４を補充した培地中で増殖させた。可溶性画分（左パネル）または不溶性画分（右パネル）由来の等体積の細胞ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＳＴＹ−６８不溶性画分を可溶性画分ゲル上で泳動させ、ＳＴＹ−６８不溶性画分を不溶性ゲル上で泳動させた。タンパク質サイズマーカーをＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（マーカー）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とし、参照基準（Ｒｅｆ  Ｓｔｄ）をβ−ラクタマーゼタンパク質、Ｐ３Ａとした。ＮＤＭ産物は、矢印で示されている。
【図３】ＫＰＣタンパク質発現を示す図である。菌株を亜鉛補充なしの培地中で増殖させた。可溶性画分（左パネル）または不溶性画分（右パネル）由来の等体積の細胞ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。タンパク質サイズマーカーをＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（マーカー）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とし、参照基準（Ｒｅｆ  Ｓｔｄ）をβ−ラクタマーゼタンパク質、Ｐ３Ａとした。ＫＰＣ産物は、矢印で示されている。
【図４】振盪フラスコによるＮＤＭタンパク質発現を示す図である。菌株を１００ｕＭのＺｎＳＯ４を補充した培地中で増殖させた。可溶性画分（左パネル）または不溶性画分（右パネル）由来の等体積の細胞ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。タンパク質サイズマーカーをＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（マーカー）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とし、参照基準（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）をβ−ラクタマーゼタンパク質、Ｐ３Ａとした。二通りの振盪フラスコＡおよびＢを設計する。
【図５】振盪フラスコによるＰ２ＡおよびＫＰＣタンパク質発現を示す図である。菌株を１００ｕＭのＺｎＳＯ４を補充した培地中で増殖させた。可溶性画分（左パネル）または不溶性画分（右パネル）由来の等体積の細胞ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。タンパク質サイズマーカーをＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（マーカー）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、参照基準（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）をβ−ラクタマーゼタンパク質、Ｐ３Ａとし、また、ＢＬ２１ネガティブコントロールを非形質転換細胞株由来の細胞ライセートとした。二通りの振盪フラスコＡおよびＢを設計する。
【図６】発酵槽によるＰ２ＡおよびＮＤＭタンパク質発現を示す図である。菌株を発酵槽中で増殖させた。ライセートを、１６時間および４８時間で採取した細菌から調製した。可溶性画分（左パネル）または不溶性画分（右パネル）由来の等体積の細胞ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、振盪フラスコ調査由来の細胞ライセートと比較した。振盪フラスコ比較として、ＮＤＭ−６８の代わりにＮＤＭ−６９を使用した。タンパク質サイズマーカーをＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（マーカー）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とし、およびＮｕｌｌを非形質転換細胞株由来の細胞ライセートとした。
【図７】発酵槽によるＫＰＣタンパク質発現を示す図である。菌株ＫＰＣ−１０１を発酵槽中で増殖させた。細胞増殖が遅かったので、初期採取を３２時間まで遅らせ、ほかの発酵槽の１６時間と比較した。ライセートを、３２時間および４８時間で採取した細菌から調製した。可溶性画分または不溶性画分由来の等体積の細胞ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、振盪フラスコ調査由来の細胞ライセートと比較した。タンパク質サイズマーカーをＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（マーカー）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とし、およびＮｕｌｌを非形質転換細胞株由来の細胞ライセートとした。
【図８】精製カルバペネマーゼのＰ２Ａ、ＮＤＭ、およびＫＰＣを示す図である。清澄化細胞ライセートを、ＳＰ−セファロースカラムを使ったカチオン交換クロマトグラフィーに供した。ＮＤＭを疎水性カラムのフェニルセファロースを使って追加の精製ステップに供した。酵素を２０ｍＭのヘペス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中で配合した。Ｐ２ＡおよびＮＤＭ試料は、最終配合を含む精製プロセスのすべてのステップで１００ｕＭのＺｎＳＯ４を補充した。
【図９】Ｐ３Ａ、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、およびＫＰＣのＣＥＮＴＡに対する相対的比活性を示す図である。精製β−ラクタマーゼのたんぱく質濃度をＸ軸、ＯＤ４０５をＹ軸にして、データをプロットした。それぞれの酵素の相対効力を黄色のボックス中に示し、Ｐ３Ａ＞ＮＤＭ−６８＞ＫＰＣ−１０１＞Ｐ２Ａ−２１（左から右へ）の順であった。
【図１０】Ｐ２Ａタンパク質誘導試験を示す図である。ｐＥＴ３０ａ−Ｐ２ＡＬ（パネルＡ）またはｐＥＴ３０ａ−Ｐ２Ａ（パネルＢ）ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株を異なるＩＰＴＧ誘導（０．１ｍＭまたは１．０ｍＭのＩＰＴＧ）および増殖条件下（３７℃または２５℃）で評価した。組織培地（ｍ）または全細胞ライセート（ＣＰ）をＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析し、クーマシーブルー染色により可視化した。Ｕｎｉ＝非誘導細胞、ｍ＝培地、ｃｐ＝細胞ペレット、Ｍ＝タンパク質サイズマーカー。矢印はＰ２Ａタンパク質を示す。
【図１１】Ｐ２Ａ発現および溶解度試験を示す図である。７．５ｕｌの誘導細胞培養（ＷＣＬ）由来の総タンパク質およびそれぞれの緩衝系（ＡＧ−Ｂ、Ｒｉｐａ−Ｂ、またはＢｕｇ−Ｂ）由来の可溶性ライセートの等価物（７．５ｕｌ培養液）の総タンパク質をＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析し、クーマシーブルー染色により可視化した。右パネルは、Ｒｉｐａ−Ｂ緩衝液中で溶解後の封入体（ＩＢ）由来の不溶性画分を示す。＋Ｌはリーダー付きＰ２Ａを示し、−ＬはリーダーのないＰ２Ａを示す。
【図１２】Ｐ２Ａ発現ＢＬＲ（ＤＥ３）大腸菌株の３種のクローンのそれぞれに対する増殖曲線を示す図である。増殖条件は、隣の表にまとめている。
【図１３】Ｐ２Ａ発現ＢＬＲ（ＤＥ３）大腸菌株の３種のクローンのＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析を示す図である。全細胞ライセート（Ｔ）、可溶性（Ｓ）、および不溶性の（ＩＳ）画分を示す。誘導前発現レベルを左側ゲル（ゲルＡ）上に示し、０．１ｍＭのＩＰＴＧを使って３７℃で３時間の誘導後の発現レベルを右側ゲル（ゲルＢ）上に示す。
【図１４】図１３に示すＳＤＳ／ＰＡＧＥからのバンド強度を使って推定したＰ２Ａタンパク質濃度を示す図である。クローン１（最初のバー）、クローン２（２本目のバー）、およびクローン３（３本目のバー）に対し、全体、可溶性、および不溶性画分を推定した。適切なクローンの可溶性タンパク質％をバー上に示した。
【図１５】それぞれの誘導条件に対する増殖曲線を示す図である。増殖条件は、隣の表にまとめている。
【図１６】異なる誘導条件下でのＰ２Ａ発現のＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析を示す図である。誘導前（Ｐ）、全細胞ライセート（Ｔ）、可溶性（Ｓ）、および不溶性の（ＩＳ）画分を示す。右側のゲル（ゲルＡ）および左側のゲル（ゲルＢ）は二通りの試料を示す。
【図１７】図１６に示すＳＤＳ／ＰＡＧＥからのバンド強度を使って推定したＰ２Ａタンパク質濃度を示す図である。全体、可溶性、および不溶性画分を異なる誘導条件に対し推定した。最初のバー：１８℃で５時間、２本目のバー：２５℃で５時間、３本目のバー：３７℃で５時間、４本目のバー：１８℃で一晩、５本目のバー：２５℃で一晩、および６本目のバー：３７℃で３時間。
【図１８】大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）Ｐ２Ａクローン１の増殖曲線を示す図である。２つの２５Ｌの実験は、ロット０６−１６−０１１およびロット０６−１６−０１３である。増殖条件は、隣の表にまとめている。
【図１９】異なる誘導条件下でのＰ２Ａ発現のＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析を示す図である。誘導前（Ｐ）、全細胞ライセート（Ｔ）、可溶性（Ｓ）、および不溶性の（ＩＳ）画分を示す。右側のゲルはロット０６−１６−０１１を示し、左側のゲルはロット０６−１６−０１３を示す。
【図２０】図１９に示すＳＤＳ／ＰＡＧＥからのバンド強度を使って推定したＰ２Ａタンパク質濃度を示す図である。５時間（最初のバー）および発酵の終わり（ＥＯＦ）（２本目のバー）で、全体、可溶性、および不溶性画分を推定した。
【図２１Ａ】酵素活性を示す図である。図２１Ａは、細菌増殖の評価によるＰ３Ａ（すなわち、ＳＹＮ−００４）、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、およびＫＰＣ抗生物質不活化活性の比較を示す。上段のグラフは１０ｎｇ／ｍｌのβ−ラクタマーゼ酵素の存在下、中段のグラフは１００ｎｇ／ｍｌの同酵素の存在下、および下段のグラフは１０００ｎｇ／ｍｌの同酵素の存在下での細菌増殖を示す。抗生物質の略称は次の通り：ＡＭＰ：アンピシリン、ＳＡＭ：アンピシリン／スルバクタム、ＰＩＰ：ピペルシリン、ＴＺＰ：ピペルシリン／タキソバクタム、ＣＲＯ：セフトリアキソン、ＣＴＸ：セフォタキシム、ＣＦＺ：セフォゾリン、ＣＸＭ：セフロキシム、ＣＦＰ：セフォペラゾン、ＦＥＰ：セフェピム、ＣＡＺ：セフタジジム、ＭＥＭ：メロペネム、ＩＰＭ：イミペネム、ＥＲＴ：エルタペネム、ＤＯＲ：ドリペネム、およびＡＴＭ：アズトレオナム。棒グラフはそれぞれの抗生物質に対し左から右へ順次：ＳＹＮ−００４、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、およびＫＰＣである。
【図２１Ｂ】酵素活性を示す図である。図２１Ｂは、図２１Ａと同じデータに、ＣＤＲ：セフジニル；ＬＥＸ：セファレキシン；およびＣＡＺ／ＡＶＩ：セフォペラゾン／アビバクタムを追加したものである。
【図２１Ｃ】酵素活性を示す図である。図２１Ｃは、図２１Ａと同じデータを、異なる酵素濃度で直接比較したβ−ラクタマーゼ酵素毎にグループ化した図である。バーは、左から右へ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、および１００ｎｇを、それぞれの抗生物質に対し繰り返した結果を示す。
【図２２】ヒトキームスにおけるＰ２Ａ活性の安定性を示す図である。左パネルは、Ｚｎの有無の場合の混合キームスを示す。右パネルでは、５人の異なるドナー由来のキームス試料中でＰ２Ａペレットがインキュベートされた。０、３０、６０、１２０、１８０、２４０、３００、および３６０分に一定分量を採取し、ＣＥＮＴＡアッセイを使ってβ−ラクタマーゼ活性を測定した。
【図２３】ｐＨ調節したヒトキームス３におけるＰ２Ａ活性の安定性を示す図である。精製Ｐ２ＡをｐＨ５．６のキームス３およびｐＨ７．０のキームス３中でインキュベートした。ｐＨはＮａＯＨを使って調節した。０、３０、６０、１２０、１８０、２４０、３００、および３６０分に一定分量を採取し、ＣＥＮＴＡアッセイを使ってβ−ラクタマーゼ活性を測定した。
【図２４】ヒトキームスにおけるＫＰＣおよびＮＤＭ活性の安定性を示す図である。ＰＢＳ、ｐＨ７．５中の精製ＫＰＣ（パネルＡ）またはＮＤＭ（パネルＢ）を、緩衝液（ヘペス緩衝液、１００ｕＭのＺｎＳＯ４、ｐＨ６．２）または１００ｕＭのＺｎＳＯ４を補充した混合ヒトキームス中でインキュベートした。試料中のＫＰＣおよびＮＤＭの最終濃度は８０ｎｇ／ｍＬであった。０、３０、６０、１２０、１８０、および２４０分に一定分量を採取し、ＣＥＮＴＡβ−ラクタマーゼ基質を使って、β−ラクタマーゼ活性を評価した。緩衝液中の活性は４角記号で、キームス中の活性は円記号で示されている。
【図２５】プロテアーゼ阻害剤の有無の場合における混合ヒトキームスの希釈液中でインキュベートしたＮＤＭの生物活性を示す図である。１００μｇ／ｍＬの濃度のＮＤＭを、ＥＤＴＡ不含ＳｉｇｍａＦＡＳＴプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）反応混液無し（パネルＡ）または有り（パネルＢ）の場合について、１００％、５０％、２５％、１２．５％、６．２５％、３．１３％、１．５６％、０．７８％および０％中のキームス希釈液中、次の表に従って、３７℃で３０分間インキュベートした。２０マイクロリットルの各試料（２μｇ）を取り出し、５０ｎｇ／μｌの最終濃度とするために、２０μＬの２Ｘ変性試料緩衝液に移した。試料を煮沸し、１０μＬ（１μｇのＮＤＭ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析に供した。残りの試料の生物活性をＣＥＮＴＡ試薬を使って評価した。各試料の生物活性をそれぞれのゲルの下に示している。
【図２６】２％ヒトキームス中でインキュベートしたＮＤＭのタンパク質切断フラグメントを示す図である。５００μｇ／ｍＬの濃度のＮＤＭを２％キームス中で０〜１８０分の範囲の時間にわたりインキュベートした。インキュベーション時間をレーンの上に示している。Ｍは、分子量マーカーで、サイズをｋＤａで示す（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）。
【図２７】ＮＤＭのタンパク質切断フラグメントを含むクマシー染色ＰＶｄＦ膜を示す図である。ＮＤＭを２％ヒトキームス中または精製ブタ膵臓エラスターゼ（０．２５Ｕ／ｍＬ）中でインキュベートし、ＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析し、タンパク質をＰＶｄＦ膜に転写してクマシー染色した。パネルＡは、タンパク質フラグメントおよびタンパク質サイズマーカーを含む染色ＰＶｄＦ膜を示す。左パネル（キームス）は、２％ヒト混合キームス中の消化産物を示し、右パネルはエラスターゼ消化産物を示す。パネルＢは、Ａで示された染色ＰＶｄＦ膜を示し、単離フラグメントを番号を付けたボックスにより示す。このフラグメントは、Ｎ末端アミノ酸シーケンシングに供された。
【図２８】示したキームス切断部位を含むＮＤＭアミノ酸配列を示す。キームス切断部位はボックスにより示されている。ＳＬＴＦＡ部位は、エラスターゼ切断部位（フラグメント４、５および７、表２１および図２９）に対応する。ＮＬＧＤＡ部位は、キームス切断部位（フラグメント５；表２１および図２９）に対応する。フラグメント２（表２１）は、ネイティブＮＤＭタンパク質のＮ−末端（ＧＱＱＭＥ；配列番号７０）を有するが、しかし、開裂フラグメント（エラスターゼ切断部位とキームス切断部位との間であると予測された）は検出されなかった。
【図２９】ＮＤＭ開裂フラグメントの配列を示す。ＮＤＭフラグメント番号は図２７に対応する。フラグメント３（キームス消化）およびフラグメント６（エラスターゼ消化）は、フラグメント４（キームス消化）およびフラグメント７（エラスターゼ消化）と同様に、同じフラグメントである。フラグメント５は、６．１ｋＤａと５．４ｋＤａの少なくとも２種のフラグメントを含む。
【図３０】Ｐ２ＡおよびＮＤＭの配列アラインメントを示す。２つのマッピングしたＮＤＭ切断部位は太字で示され、予測開裂領域は下線で示されている。
【図３１】抗生物質分解剤（例えば、広域スペクトルカルバペネマーゼ、例えば、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ−１、およびＫＰＣ−１／２）を含む遅延放出カプセルを製造するための種々の非限定的実施形態を示す図である。
【図３２】抗生物質および／または抗生物質分解剤阻害剤の分離および抗生物質分解剤放出のための種々の非限定的製剤化手法を示す図である。
【図３３】種々の非限定的組み合わせ剤形を示す図である。
【図３４】種々の非限定的微粒子剤形を示す図である。
【図３５】細菌増殖の評価によるＰ３Ａ（すなわち、ＳＹＮ−００４）、Ｐ４Ａ、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、およびＫＰＣ抗生物質不活化活性の比較を示す図である。グラフは、１０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌのβ−ラクタマーゼ酵素の存在下における細菌増殖を示す。抗生物質の略称は次の通り：ＡＭＰ：アンピシリン、ＣＲＯ：セフトリアキソン、ＣＴＸ：セフォタキシム、ＣＦＺ：セフォゾリン、ＣＸＭ：セフロキシム、ＣＦＰ：セフォペラゾン、ＦＥＰ：セフェピム、およびＣＡＺ：セフタジジム。ヒストグラムの順序は、それぞれのセットのデータに対し、左から右へ、ＳＹＮ−００４、Ｐ４Ａ、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、およびＫＰＣである。
【図３６】Ｐ２Ａ処理イヌおよび対照イヌのアンピシリンの血清中レベルを示す図である。イヌ１（ピーク位置では、これは上段の曲線である）およびイヌ２（ピーク位置では、これは中段の曲線である）と標識の曲線は、アンピシリンおよびＰ２Ａで処理された動物を表す。Ｐ２Ａなしと標識された曲線（ピーク位置では、これは下段の曲線である）は、アンピシリンでのみ処理されたイヌを表す。
【図３７】Ｐ２Ａおよびアンピシリンのイヌの空腸中レベルを示す図である。示した時間に取得した空腸キームス試料中のアンピシリンおよびＰ２Ａの両方を測定した（両パネルで、Ｐ２Ａ曲線は最初のピークを有するものである）。それぞれのイヌ（イヌ１、左パネル；イヌ２、右パネル）は、記載されているように、アンピシリンおよびＰ２Ａの投与を受けた。
【図３８】Ｐ２Ａ処理イヌおよび対照イヌのセフトリアキソンの血清中レベルを示す図である。グラフは、セフトリアキソン単独で処理されたイヌ（■）またはセフトリアキソン＋Ｐ２Ａで処理されたイヌ（◆）のセフトリアキソンの平均血清中レベルを示す。
【図３９】Ｐ２Ａおよびセフトリアキソンのイヌの空腸中レベルを示す図である。示した時間に取得した空腸キームス試料中のＰ２Ａおよび／またはセフトリアキソンを測定した。パネルＡ：セフトリアキソン単独で処理した２匹のイヌ由来のキームス中のセフトリアキソンレベル。パネルＢ：セフトリアキソン＋Ｐ２Ａで処理した２匹のイヌ由来のキームス中のセフトリアキソンレベル。パネルＣ：セフトリアキソン＋Ｐ２Ａで処理したＢの２匹のイヌ由来のキームス中のＰ２Ａレベル。
【図４０】Ｐ２Ａ処理イヌおよび対照イヌのメロペネムの血清中レベルを示す図である。グラフは、メロペネム単独で処理されたイヌ（ｎ＝３）（円記号）またはメロペネム＋Ｐ２Ａで処理されたイヌ（ｎ＝３）（４角記号）のメロペネムの平均血清中レベルを示す。
【図４１】Ｐ２Ａ処理イヌおよび対照イヌのセフォタキシムの血清中レベルを示す図である。グラフは、セフォタキシム単独で処理されたイヌ（■）またはセフォタキシム＋Ｐ２Ａで処理されたイヌ（◆）のセフォタキシムの平均血清中レベルを示す。
【図４２】Ｐ２Ａおよびセフォタキシムのイヌの空腸中レベルを示す図である。示した時間に取得した空腸キームス試料中のＰ２Ａおよび／またはセフォタキシムを測定した。パネルＡ：セフォタキシム単独で処理した２匹のイヌ由来のキームス中のセフォタキシムレベル。パネルＢ：セフォタキシム＋Ｐ２Ａで処理した３匹のイヌ由来のキームス中のセフォタキシムレベル。パネルＣ：セフォタキシム＋Ｐ２Ａで処理したＢの３匹のイヌ由来のキームス中のＰ２Ａレベル。
【図４３】セフォタキシム単独で処理したイヌのセフォタキシムの空腸中レベルを示す図である。グラフは、６匹のイヌからの平均値および標準偏差を示す。セフォタキシムは時間０分および時間３００分で投与された。
【図４４】４匹の代表的処理イヌのセフォタキシムおよびＰ２Ａの空腸中レベルを示す図である。グラフは、個別のイヌにおける、セフォタキシムレベル（ダイヤモンド記号、４つ全てのパネルで、最初のピークを有する曲線）およびピンク色のＰ２Ａレベル（４角記号）を示す。イヌのＳｅｎｎｉおよびＳｉｓｓｉ（左パネル）はセフォタキシム（１２０ｍｇ／ｋｇ）および０．５ｍｇ／ｋｇのＰ２Ａを投与された。イヌのＳｈａｎｉａおよびＰａａｖｏ（右パネル）はセフォタキシム（１２０ｍｇ／ｋｇ）および０．２５ｍｇ／ｋｇのＰ２Ａを投与された。
【図４５】ブタ血清中のエルタペネムレベルを示す図である。ＨＰＬＣベースアッセイ（Ｘｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）を使って、ブタ血清中のエルタペネムを定量化した。データは平均＋標準偏差として示される。
【図４６】株の相対存在量によるパーセント類似度を示す図である。糞便ＤＮＡ試料の配列解析から特定された菌株の相対存在量に基づくパーセント類似度を、−７日目から９日目のエルタペネム処理動物（ｎ＝５）に対し比較した。
【図４７】株存在量色分け地図を示す。それぞれの菌株の相対存在量に基づいて細菌分類群の色分け地図を作成し、調査日による時間の経過順に整理した。ブタは図の右側に標識し、調査日は図の右側の異なる色のバーで示している。個々の菌株は下部に示している。図の右側のより明るいボックスは、エルタペネム処理群で減少した菌株を示す。図の左側の白色ボックスは、エルタペネム動物でより増えた菌株を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、１つには、抗生物質分解剤（例えば、カルバペネマーゼなどのβ−ラクタマーゼ）が、抗生物質で処置を受けているまたは処置を受けたことがある対象の消化管マイクロバイオームを保護できるという発見に基づいている。抗生物質の投与は、腸（例えば、遠位の小腸および／または大腸）内に排泄される残留非吸収抗生物質が原因で、正常な腸微生物叢の生態学的均衡を破壊することが多い。抗生物質分解剤は、ＧＩ管中の非吸収抗生物質を不活性化し、それにより、対象の正常な腸微生物叢（例えば、健全なバランス（例えば、健全な比率および／または分布））を復元および／または維持し、病原性を有する可能性のあるいかなる微生物の異常増殖も防ぐ。
【００１２】
抗生物質分解剤および医薬組成物
本発明は、一部は、１種または複数の抗生物質分解剤の医薬組成物、製剤、および使用に関する。本明細書で使用される場合、抗生物質分解剤は、抗生物質を分解または不活性化し、抗生物質を生物学的に不活性にするタンパク質または酵素を意味する。種々の実施形態では、抗生物質分解剤は、広域スペクトルカルバペネムおよびセフェムを分解するβ−ラクタマーゼである。ある実施形態では、抗生物質分解剤は、広域スペクトルカルバペネマーゼである。
【００１３】
カルバペネマーゼは、オキシイミノ−セファロスポリンおよびセファマイシンに対してのみならず、カルバペネムに対しても活性である多様なβ−ラクタマーゼ群である。本発明はクラスＡ、Ｂ、Ｃ、および／またはＤカルバペネマーゼの使用を意図している。例示的実施形態では、カルバペネマーゼは、メタロβ−ラクタマーゼまたはセリンβ−ラクタマーゼであってもよい。種々の実施形態では、広域スペクトルカルバペネマーゼは、例えば、ＩＭＰ型カルバペネマーゼ（メタロ−β−ラクタマーゼ）、ＶＩＭ（ベローナインテグロンにコードされたメタロ−β−ラクタマーゼ）、ＯＸＡ（オキサシリナーゼ）グループのβ−ラクタマーゼ、ＫＰＣ（クレブシェラ肺炎杆菌カルバペネマーゼ）、ＣＭＹ（クラスＣ）、ＳＭＥ、ＩＭＩ、ＮＭＣ、ＧＥＳ（ギアナの広域の）、ＣｃｒＡ、ＳＦＣ−１、ＳＨＶ−３８、ならびにＮＤＭ（ニューデリー・メタロ−β−ラクタマーゼ、例えば、ＮＤＭ−１）β−ラクタマーゼから選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、広域スペクトルカルバペネマーゼは、例えば、国際公開第２００７／１４７９４５号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のようなＰ２Ａまたはその誘導体である。Ｐ２Ａ酵素はクラスＢに属し、酵素活性の補助因子として１個または２個の亜鉛イオンを必要とする金属酵素である。ある実施形態では、広域スペクトルカルバペネマーゼはＰ２Ａである。Ｐ２Ａ酵素は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の次のアミノ酸配列に対する同一性を有してよい：
Ｐ２Ａ
ＥＴＧＴＩＳＩＳＱＬＮＫＮＶＷＶＨＴＥＬＧＹＦＮＧＥＡＶＰＳＮＧＬＶＬＮＴＳＫＧＬＶＬＶＤＳＳＷＤＮＫＬＴＫＥＬＩＥＭＶＥＫＫＦＱＫＲＶＴＤＶＩＩＴＨＡＨＡＤＲＩＧＧＩＴＡＬＫＥＲＧＩＫＡＨＳＴＡＬＴＡＥＬＡＫＮＳＧＹＥＥＰＬＧＤＬＱＴＩＴＳＬＫＦＧＮＴＫＶＥＴＦＹＰＧＫＧＨＴＥＤＮＩＶＶＷＬＰＱＹＱＩＬＡＧＧＣＬＶＫＳＡＥＡＫＤＬＧＮＶＡＤＡＹＶＮＥＷＳＴＳＩＥＮＶＬＫＲＹＧＮＩＮＳＶＶＰＧＨＧＥＶＧＤＫＧＬＬＬＨＴＬＤＬＬＫ（配列番号３７）。
【００１５】
いくつかの実施形態では、Ｐ２Ａは、例えば、本方法を必要としている患者のキームスを含む、ヒトキームス中で安定である。いくつかの実施形態では、Ｐ２Ａは、必要に応じて経口投与され、ＧＩ管中のアンピシリン、セフトリアキソン、メロペネム、およびセフォタキシムの内の１種または複数を分解する。いくつかの実施形態では、Ｐ２Ａは抗生物質に対する感受性から、例えば、抗生物質を投与されていない対象に比べて、ＧＩ微生物叢の変化を防ぐことにより、マイクロバイオームを保護する。いくつかの実施形態では、Ｐ２Ａは、クロストリジウム・ディフィシル感染症（ＣＤＩ）および／またはクロストリジウム・ディフィシル関連疾患の予防に使用される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、広域スペクトルカルバペネマーゼは、クレブシェラ肺炎杆菌カルバペネマーゼ（ＫＰＣ）である。ＫＰＣの例としては、ＫＰＣ−１／２、ＫＰＣ−３、ＫＰＣ−４、ＫＰＣ−５、ＫＰＣ−６、ＫＰＣ−７、ＫＰＣ−８、ＫＰＣ−９、ＫＰＣ−１０、ＫＰＣ−１１、ＫＰＣ−１２、ＫＰＣ−１３、ＫＰＣ−１４、ＫＰＣ−１５、およびＫＰＣ−１７が挙げられるが、これらに限定されない。ＫＰＣ−１およびＫＰＣ−２酵素は、同一のアミノ酸配列を有し、ＫＰＣ−１、ＫＰＣ−２、またはＫＰＣ−１／２と呼ぶこともある。ある実施形態では、広域スペクトルカルバペネマーゼはＫＰＣ−１／２である。ある実施形態では、広域スペクトルカルバペネマーゼはＫＰＣ−３である。ＫＰＣ酵素は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の次のアミノ酸配列に対する同一性を有してよい：
ＫＰＣ−１／２
ＭＳＬＹＲＲＬＶＬＬＳＣＬＳＷＰＬＡＧＦＳＡＴＡＬＴＮＬＶＡＥＰＦＡＫＬＥＱＤＦＧＧＳＩＧＶＹＡＭＤＴＧＳＧＡＴＶＳＹＲＡＥＥＲＦＰＬＣＳＳＦＫＧＦＬＡＡＡＶＬＡＲＳＱＱＱＡＧＬＬＤＴＰＩＲＹＧＫＮＡＬＶＰＷＳＰＩＳＥＫＹＬＴＴＧＭＴＶＡＥＬＳＡＡＡＶＱＹＳＤＮＡＡＡＮＬＬＬＫＥＬＧＧＰＡＧＬＴＡＦＭＲＳＩＧＤＴＴＦＲＬＤＲＷＥＬＥＬＮＳＡＩＰＳＤＡＲＤＴＳＳＰＲＡＶＴＥＳＬＱＫＬＴＬＧＳＡＬＡＡＰＱＲＱＱＦＶＤＷＬＫＧＮＴＴＧＮＨＲＩＲＡＡＶＰＡＤＷＡＶＧＤＫＴＧＴＣＧＶＹＧＴＡＮＤＹＡＶＶＷＰＴＧＲＡＰＩＶＬＡＶＹＴＲＡＰＮＫＤＤＫＨＳＥＡＶＩＡＡＡＡＲＬＡＬＥＧＬＧＶＮＧＱ（配列番号３８）
ＫＰＣ−３
ＭＳＬＹＲＲＬＶＬＬＳＣＬＳＷＰＬＡＧＦＳＡＴＡＬＴＮＬＶＡＥＰＦＡＫＬＥＱＤＦＧＧＳＩＧＶＹＡＭＤＴＧＳＧＡＴＶＳＹＲＡＥＥＲＦＰＬＣＳＳＦＫＧＦＬＡＡＡＶＬＡＲＳＱＱＱＡＧＬＬＤＴＰＩＲＹＧＫＮＡＬＶＰＷＳＰＩＳＥＫＹＬＴＴＧＭＴＶＡＥＬＳＡＡＡＶＱＹＳＤＮＡＡＡＮＬＬＬＫＥＬＧＧＰＡＧＬＴＡＦＭＲＳＩＧＤＴＴＦＲＬＤＲＷＥＬＥＬＮＳＡＩＰＧＤＡＲＤＴＳＳＰＲＡＶＴＥＳＬＱＫＬＴＬＧＳＡＬＡＡＰＱＲＱＱＦＶＤＷＬＫＧＮＴＴＧＮＨＲＩＲＡＡＶＰＡＤＷＡＶＧＤＫＴＧＴＣＧＶＹＧＴＡＮＤＹＡＶＶＷＰＴＧＲＡＰＩＶＬＡＶＹＴＲＡＰＮＫＤＤＫＹＳＥＡＶＩＡＡＡＡＲＬＡＬＥＧＬＧＶＮＧＱ（配列番号３９）
ＫＰＣ−４
ＭＳＬＹＲＲＬＶＬＬＳＣＬＳＷＰＬＡＧＦＳＡＴＡＬＴＮＬＶＡＥＰＦＡＫＬＥＱＤＦＧＧＳＩＧＶＹＡＭＤＴＧＳＧＡＴＶＳＹＲＡＥＥＲＦＰＬＣＳＳＦＫＧＦＬＡＡＡＶＬＡＲＳＱＱＱＡＧＬＬＤＴＰＩＲＹＧＫＮＡＬＶＲＷＳＰＩＳＥＫＹＬＴＴＧＭＴＶＡＥＬＳＡＡＡＶＱＹＳＤＮＡＡＡＮＬＬＬＫＥＬＧＧＰＡＧＬＴＡＦＭＲＳＩＧＤＴＴＦＲＬＤＲＷＥＬＥＬＮＳＡＩＰＧＤＡＲＤＴＳＳＰＲＡＶＴＥＳＬＱＫＬＴＬＧＳＡＬＡＡＰＱＲＱＱＦＶＤＷＬＫＧＮＴＴＧＮＨＲＩＲＡＡＶＰＡＤＷＡＶＧＤＫＴＧＴＣＧＧＹＧＴＡＮＤＹＡＶＶＷＰＴＧＲＡＰＩＶＬＡＶＹＴＲＡＰＮＫＤＤＫＨＳＥＡＶＩＡＡＡＡＲＬＡＬＥＧＬＧＶＮＧＱ（配列番号４０）
ＫＰＣ−５
ＭＳＬＹＲＲＬＶＬＬＳＣＬＳＷＰＬＡＧＦＳＡＴＡＬＴＮＬＶＡＥＰＦＡＫＬＥＱＤＦＧＧＳＩＧＶＹＡＭＤＴＧＳＧＡＴＶＳＹＲＡＥＥＲＦＰＬＣＳＳＦＫＧＦＬＡＡＡＶＬＡＲＳＱＱＱＡＧＬＬＤＴＰＩＲＹＧＫＮＡＬＶＲＷＳＰＩＳＥＫＹＬＴＴＧＭＴＶＡＥＬＳＡＡＡＶＱＹＳＤＮＡＡＡＮＬＬＬＫＥＬＧＧＰＡＧＬＴＡＦＭＲＳＩＧＤＴＴＦＲＬＤＲＷＥＬＥＬＮＳＡＩＰＧＤＡＲＤＴＳＳＰＲＡＶＴＥＳＬＱＫＬＴＬＧＳＡＬＡＡＰＱＲＱＱＦＶＤＷＬＫＧＮＴＴＧＮＨＲＩＲＡＡＶＰＡＤＷＡＶＧＤＫＴＧＴＣＧＶＹＧＴＡＮＤＹＡＶＶＷＰＴＧＲＡＰＩＶＬＡＶＹＴＲＡＰＮＫＤＤＫＨＳＥＡＶＩＡＡＡＡＲＬＡＬＥＧＬＧＶＮＧＱ（配列番号４１）
ＫＰＣ−６
ＭＳＬＹＲＲＬＶＬＬＳＣＬＳＷＰＬＡＧＦＳＡＴＡＬＴＮＬＶＡＥＰＦＡＫＬＥＱＤＦＧＧＳＩＧＶＹＡＭＤＴＧＳＧＡＴＶＳＹＲＡＥＥＲＦＰＬＣＳＳＦＫＧＦＬＡＡＡＶＬＡＲＳＱＱＱＡＧＬＬＤＴＰＩＲＹＧＫＮＡＬＶＰＷＳＰＩＳＥＫＹＬＴＴＧＭＴＶＡＥＬＳＡＡＡＶＱＹＳＤＮＡＡＡＮＬＬＬＫＥＬＧＧＰＡＧＬＴＡＦＭＲＳＩＧＤＴＴＦＲＬＤＲＷＥＬＥＬＮＳＡＩＰＧＤＡＲＤＴＳＳＰＲＡＶＴＥＳＬＱＫＬＴＬＧＳＡＬＡＡＰＱＲＱＱＦＶＤＷＬＫＧＮＴＴＧＮＨＲＩＲＡＡＶＰＡＤＷＡＶＧＤＫＴＧＴＣＧＧＹＧＴＡＮＤＹＡＶＶＷＰＴＧＲＡＰＩＶＬＡＶＹＴＲＡＰＮＫＤＤＫＨＳＥＡＶＩＡＡＡＡＲＬＡＬＥＧＬＧＶＮＧＱ（配列番号４２）
ＫＰＣ−７
ＭＳＬＹＲＲＬＶＬＬＳＣＬＳＷＰＬＡＧＦＳＡＴＡＬＴＮＬＶＡＥＰＦＡＫＬＥＱＤＦＧＧＳＩＧＶＹＡＩＤＴＧＳＧＡＴＶＳＹＲＡＥＥＲＦＰＬＣＳＳＦＫＧＦＬＡＡＡＶＬＡＲＳＱＱＱＡＧＬＬＤＴＰＩＲＹＧＫＮＡＬＶＰＷＳＰＩＳＥＫＹＬＴＴＧＭＴＶＡＥＬＳＡＡＡＶＱＹＳＤＮＡＡＡＮＬＬＬＫＥＬＧＧＰＡＧＬＴＡＦＭＲＳＩＧＤＴＴＦＲＬＤＲＷＥＬＥＬＮＳＡＩＰＧＤＡＲＤＴＳＳＰＲＡＶＴＥＳＬＱＫＬＴＬＧＳＡＬＡＡＰＱＲＱＱＦＶＤＷＬＫＧＮＴＴＧＮＨＲＩＲＡＡＶＰＡＤＷＡＶＧＤＫＴＧＴＣＧＶＹＧＴＡＮＤＹＡＶＶＷＰＴＧＲＡＰＩＶＬＡＶＹＴＲＡＰＮＫＤＤＫＹＳＥＡＶＩＡＡＡＡＲＬＡＬＥＧＬＧＶＮＧＱ（配列番号４３）
ＫＰＣ−８
ＭＳＬＹＲＲＬＶＬＬＳＣＬＳＷＰＬＡＧＦＳＡＴＡＬＴＮＬＶＡＥＰＦＡＫＬＥＱＤＦＧＧＳＩＧＶＹＡＭＤＴＧＳＧＡＴＶＳＹＲＡＥＥＲＦＰＬＣＳＳＦＫＧＦＬＡＡＡＶＬＡＲＳＱＱＱＡＧＬＬＤＴＰＩＲＹＧＫＮＡＬＶＰＷＳＰＩＳＥＫＹＬＴＴＧＭＴＶＡＥＬＳＡＡＡＶＱＹＳＤＮＡＡＡＮＬＬＬＫＥＬＧＧＰＡＧＬＴＡＦＭＲＳＩＧＤＴＴＦＲＬＤＲＷＥＬＥＬＮＳＡＩＰＧＤＡＲＤＴＳＳＰＲＡＶＴＥＳＬＱＫＬＴＬＧＳＡＬＡＡＰＱＲＱＱＦＶＤＷＬＫＧＮＴＴＧＮＨＲＩＲＡＡＶＰＡＤＷＡＶＧＤＫＴＧＴＣＧＧＹＧＴＡＮＤＹＡＶＶＷＰＴＧＲＡＰＩＶＬＡＶＹＴＲＡＰＮＫＤＤＫＹＳＥＡＶＩＡＡＡＡＲＬＡＬＥＧＬＧＶＮＧＱ（配列番号４４）
ＫＰＣ−９
ＭＳＫＹＲＲＬＶＬＬＳＣＬＳＷＰＬＡＧＦＳＡＴＡＬＴＮＬＶＡＥＰＦＡＫＬＥＱＤＦＧＧＳＩＧＶＹＡＭＤＴＧＳＧＡＴＶＳＹＲＡＥＥＲＦＰＬＣＳＳＦＫＧＦＬＡＡＡＶＬＡＲＳＱＱＱＡＧＬＬＤＴＰＩＲＹＧＫＮＡＬＶＰＷＳＰＩＳＥＫＹＬＴＴＧＭＴＶＡＥＬＳＡＡＡＶＱＹＳＤＮＡＡＡＮＬＬＬＫＥＬＧＧＰＡＧＬＴＡＦＭＲＳＩＧＤＴＴＦＲＬＤＲＷＥＬＥＬＮＳＡＩＰＧＤＡＲＤＴＳＳＰＲＡＶＴＥＳＬＱＫＬＴＬＧＳＡＬＡＡＰＱＲＱＱＦＶＤＷＬＫＧＮＴＴＧＮＨＲＩＲＡＡＶＰＡＤＷＡＶＧＤＫＴＧＴＣＧＡＹＧＴＡＮＤＹＡＶＶＷＰＴＧＲＡＰＩＶＬＡＶＹＴＲＡＰＮＫＤＤＫＹＳＥＡＶＩＡＡＡＡＲＬＡＬＥＧＬＧＶＮＧＱ（配列番号４５）
ＫＰＣ−１０（アシネトバクター・バウマンニ）
ＭＳＬＹＲＲＬＶＬＬＳＣＬＳＷＰＬＡＧＦＳＡＴＡＬＴＮＬＶＡＥＰＦＡＫＬＥＱＤＦＧＧＳＩＧＶＹＡＭＤＴＧＳＧＡＴＶＳＹＲＡＥＥＲＦＰＬＣＳＳＦＫＧＦＬＡＡＡＶＬＡＲＳＱＱＱＡＧＬＬＤＴＰＩＲＹＧＫＮＡＬＶＲＷＳＰＩＳＥＫＹＬＴＴＧＭＴＶＡＥＬＳＡＡＡＶＱＹＳＤＮＡＡＡＮＬＬＬＫＥＬＧＧＰＡＧＬＴＡＦＭＲＳＩＧＤＴＴＦＲＬＤＲＷＥＬＥＬＮＳＡＩＰＧＤＡＲＤＴＳＳＰＲＡＶＴＥＳＬＱＫＬＴＬＧＳＡＬＡＡＰＱＲＱＱＦＶＤＷＬＫＧＮＴＴＧＮＨＲＩＲＡＡＶＰＡＤＷＡＶＧＤＫＴＧＴＣＧＶＹＧＴＡＮＤＹＡＶＶＷＰＴＧＲＡＰＩＶＬＡＶＹＴＲＡＰＮＫＤＤＫＹＳＥＡＶＩＡＡＡＡＲＬＡＬＥＧＬＧＶＮＧＱ（配列番号４６）
ＫＰＣ−１１
ＭＳＬＹＲＲＬＶＬＬＳＣＬＳＷＰＬＡＧＦＳＡＴＡＬＴＮＬＶＡＥＰＦＡＫＬＥＱＤＦＧＧＳＩＧＶＹＡＭＤＴＧＳＧＡＴＶＳＹＲＡＥＥＲＦＰＬＣＳＳＦＫＧＦＬＡＡＡＶＬＡＲＳＱＱＱＡＧＬＬＤＴＰＩＲＹＧＫＮＡＬＶＬＷＳＰＩＳＥＫＹＬＴＴＧＭＴＶＡＥＬＳＡＡＡＶＱＹＳＤＮＡＡＡＮＬＬＬＫＥＬＧＧＰＡＧＬＴＡＦＭＲＳＩＧＤＴＴＦＲＬＤＲＷＥＬＥＬＮＳＡＩＰＧＤＡＲＤＴＳＳＰＲＡＶＴＥＳＬＱＫＬＴＬＧＳＡＬＡＡＰＱＲＱＱＦＶＤＷＬＫＧＮＴＴＧＮＨＲＩＲＡＡＶＰＡＤＷＡＶＧＤＫＴＧＴＣＧＶＹＧＴＡＮＤＹＡＶＶＷＰＴＧＲＡＰＩＶＬＡＶＹＴＲＡＰＮＫＤＤＫＨＳＥＡＶＩＡＡＡＡＲＬＡＬＥＧＬＧＶＮＧＱ（配列番号４７）
ＫＰＣ−１２（クレブシェラ肺炎杆菌）
ＭＳＬＹＲＲＬＶＬＬＳＣＬＳＷＰＬＡＧＦＳＡＴＡＬＴＮＬＶＡＥＰＦＡＫＬＥＱＤＦＧＧＳＩＧＶＹＡＭＤＴＧＳＧＡＴＶＳＹＲＡＥＥＲＦＰＬＣＳＳＦＫＧＦＬＡＡＡＶＬＡＲＳＱＱＱＡＧＬＬＤＴＰＩＲＹＧＫＮＡＬＶＰＷＳＰＩＳＥＫＹＬＴＴＧＭＴＶＡＥＬＳＡＡＡＶＱＹＳＤＮＡＡＡＮＬＬＬＫＥＬＧＧＰＡＧＬＴＡＦＭＲＳＩＧＤＴＴＦＲＬＤＲＷＥＬＥＭＮＳＡＩＰＧＤＡＲＤＴＳＳＰＲＡＶＴＥＳＬＱＫＬＴＬＧＳＡＬＡＡＰＱＲＱＱＦＶＤＷＬＫＧＮＴＴＧＮＨＲＩＲＡＡＶＰＡＤＷＡＶＧＤＫＴＧＴＣＧＶＹＧＴＡＮＤＹＡＶＶＷＰＴＧＲＡＰＩＶＬＡＶＹＴＲＡＰＮＫＤＤＫＨＳＥＡＶＩＡＡＡＡＲＬＡＬＥＧＬＧＶＮＧＱ（配列番号４８）
ＫＰＣ−１３（エンテロバクター・クロアカ）
ＭＳＬＹＲＲＬＶＬＬＳＣＬＳＷＰＬＡＧＦＳＡＴＡＬＴＮＬＶＡＥＰＦＡＫＬＥＱＤＦＧＧＳＩＧＶＹＡＭＤＴＧＳＧＡＴＶＳＹＲＡＥＥＲＦＰＬＣＳＳＦＫＧＦＬＡＡＡＶＬＡＲＳＱＱＱＡＧＬＬＧＴＰＩＲＹＧＫＮＡＬＶＰＷＳＰＩＳＥＫＹＬＴＴＧＭＴＶＡＥＬＳＡＡＡＶＱＹＳＤＮＡＡＡＮＬＬＬＫＥＬＧＧＰＡＧＬＴＡＦＭＲＳＩＧＤＴＴＦＲＬＤＲＷＥＬＥＬＮＳＡＩＰＧＤＡＲＤＴＳＳＰＲＡＶＴＥＳＬＱＫＬＴＬＧＳＡＬＡＡＰＱＲＱＱＦＶＤＷＬＫＧＮＴＴＧＮＨＲＩＲＡＡＶＰＡＤＷＡＶＧＤＫＴＧＴＣＧＶＹＧＴＡＮＤＹＡＶＶＷＰＴＧＲＡＰＩＶＬＡＶＹＴＲＡＰＮＫＤＤＫＹＳＥＡＶＩＡＡＡＡＲＬＡＬＥＧＬＧＶＮＧＱ（配列番号４９）
ＫＰＣ−１４（クレブシェラ肺炎桿菌）
ＭＳＬＹＲＲＬＶＬＬＳＣＬＳＷＰＬＡＧＦＳＡＴＡＬＴＮＬＶＡＥＰＦＡＫＬＥＱＤＦＧＧＳＩＧＶＹＡＭＤＴＧＳＧＡＴＶＳＹＲＡＥＥＲＦＰＬＣＳＳＦＫＧＦＬＡＡＡＶＬＡＲＳＱＱＱＡＧＬＬＤＴＰＩＲＹＧＫＮＡＬＶＰＷＳＰＩＳＥＫＹＬＴＴＧＭＴＶＡＥＬＳＡＡＡＶＱＹＳＤＮＡＡＡＮＬＬＬＫＥＬＧＧＰＡＧＬＴＡＦＭＲＳＩＧＤＴＴＦＲＬＤＲＷＥＬＥＬＮＳＡＩＰＧＤＡＲＤＴＳＳＰＲＡＶＴＥＳＬＱＫＬＴＬＧＳＡＬＡＡＰＱＲＱＱＦＶＤＷＬＫＧＮＴＴＧＮＨＲＩＲＡＡＶＰＡＤＷＡＶＧＤＫＴＧＴＣＧＶＹＡＮＤＹＡＶＶＷＰＴＧＲＡＰＩＶＬＡＶＹＴＲＡＰＮＫＤＤＫＨＳＥＡＶＩＡＡＡＡＲＬＡＬＥＧＬＧＶＮＧＱ（配列番号５０）
ＫＰＣ−１５（クレブシェラ肺炎桿菌）
ＭＳＬＹＲＲＬＶＬＬＳＣＬＳＷＰＬＡＧＦＳＡＴＡＬＴＮＬＶＡＥＰＦＡＫＬＥＱＤＦＧＧＳＩＧＶＹＡＭＤＴＧＳＧＡＴＶＳＹＲＡＥＥＲＦＰＬＣＳＳＦＫＧＦＬＡＡＡＶＬＡＲＳＱＱＱＡＧＬＬＤＴＰＩＲＹＧＫＮＡＬＶＲＷＳＰＩＳＥＫＹＬＴＴＧＭＴＶＬＥＬＳＡＡＡＶＱＹＳＤＮＡＡＡＮＬＬＬＫＥＬＧＧＰＡＫＬＴＡＦＭＲＳＩＧＤＴＴＦＲＬＤＲＷＥＬＥＬＮＳＡＩＰＧＤＡＲＤＴＳＳＰＲＡＶＴＥＳＬＱＫＬＴＬＧＳＡＬＡＡＰＱＲＱＱＦＶＤＷＬＫＧＮＴＴＧＮＨＲＩＲＡＡＶＰＡＤＷＡＶＧＤＫＴＧＴＣＧＧＹＧＴＡＮＤＹＡＶＶＷＰＴＧＲＡＰＩＶＬＡＶＹＴＲＡＰＮＫＤＤＫＹＳＥＡＶＩＡＡＡＡＲＬＡＬＥＧＬＧＶＮＧＱ（配列番号５１）
ＫＰＣ−１７（クレブシェラ肺炎桿菌）
ＭＳＬＹＲＲＬＶＬＬＳＣＬＳＷＰＬＡＧＦＳＡＴＡＬＴＮＬＶＡＥＰＦＡＫＬＥＱＤＦＧＧＳＩＧＶＹＡＭＤＴＧＳＧＡＴＶＳＹＲＡＥＥＲＦＰＬＣＳＳＦＫＧＦＬＡＡＡＶＬＡＲＳＱＱＱＡＧＬＬＤＴＰＩＲＹＧＫＮＡＬＶＰＷＳＰＩＳＥＫＹＬＴＴＧＭＴＶＡＥＬＳＡＡＡＶＱＹＳＤＮＡＡＡＮＬＬＬＫＥＬＧＧＰＡＧＬＴＡＦＭＲＳＩＧＤＴＴＦＲＬＤＲＷＥＬＥＬＮＳＡＩＰＧＤＡＲＤＴＳＳＰＲＡＶＴＥＳＬＱＫＬＴＬＧＳＡＬＡＡＰＱＲＱＱＬＶＤＷＬＫＧＮＴＴＧＮＨＲＩＲＡＡＶＰＡＤＷＡＶＧＤＫＴＧＴＣＧＶＹＧＴＡＮＤＹＡＶＶＷＰＴＧＲＡＰＩＶＬＡＶＹＴＲＡＰＮＫＤＤＫＨＳＥＡＶＩＡＡＡＡＲＬＡＬＥＧＬＧＶＮＧＱ（配列番号５２）
【００１７】
いくつかの実施形態では、広域スペクトルカルバペネマーゼは、ニューデリー・メタロ−β−ラクタマーゼ（ＮＤＭ）である。ＮＤＭの例としては、ＮＤＭ−１、ＮＤＭ−２、ＮＤＭ−３、ＮＤＭ−４、ＮＤＭ−５、ＮＤＭ−６、ＮＤＭ−７、ＮＤＭ−８、ＮＤＭ−９、ＮＤＭ−１０、ＮＤＭ−１１、ＮＤＭ−１２、およびＮＤＭ−１３が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、広域スペクトルカルバペネマーゼはＮＤＭ−１である。ある実施形態では、広域スペクトルカルバペネマーゼはＮＤＭ−４である。ＮＤＭ酵素は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の次のアミノ酸配列に対する同一性を有してよい：
ＮＤＭ−１
ＭＥＬＰＮＩＭＨＰＶＡＫＬＳＴＡＬＡＡＡＬＭＬＳＧＣＭＰＧＥＩＲＰＴＩＧＱＱＭＥＴＧＤＱＲＦＧＤＬＶＦＲＱＬＡＰＮＶＷＱＨＴＳＹＬＤＭＰＧＦＧＡＶＡＳＮＧＬＩＶＲＤＧＧＲＶＬＶＶＤＴＡＷＴＤＤＱＴＡＱＩＬＮＷＩＫＱＥＩＮＬＰＶＡＬＡＶＶＴＨＡＨＱＤＫＭＧＧＭＤＡＬＨＡＡＧＩＡＴＹＡＮＡＬＳＮＱＬＡＰＱＥＧＭＶＡＡＱＨＳＬＴＦＡＡＮＧＷＶＥＰＡＴＡＰＮＦＧＰＬＫＶＦＹＰＧＰＧＨＴＳＤＮＩＴＶＧＩＤＧＴＤＩＡＦＧＧＣＬＩＫＤＳＫＡＫＳＬＧＮＬＧＤＡＤＴＥＨＹＡＡＳＡＲＡＦＧＡＡＦＰＫＡＳＭＩＶＭＳＨＳＡＰＤＳＲＡＡＩＴＨＴＡＲＭＡＤＫＬＲ（配列番号５３）
ＮＤＭ−２（アシネトバクター・バウマンニ）
ＭＥＬＰＮＩＭＨＰＶＡＫＬＳＴＡＬＡＡＡＬＭＬＳＧＣＭＡＧＥＩＲＰＴＩＧＱＱＭＥＴＧＤＱＲＦＧＤＬＶＦＲＱＬＡＰＮＶＷＱＨＴＳＹＬＤＭＰＧＦＧＡＶＡＳＮＧＬＩＶＲＤＧＧＲＶＬＶＶＤＴＡＷＴＤＤＱＴＡＱＩＬＮＷＩＫＱＥＩＮＬＰＶＡＬＡＶＶＴＨＡＨＱＤＫＭＧＧＭＤＡＬＨＡＡＧＩＡＴＹＡＮＡＬＳＮＱＬＡＰＱＥＧＭＶＡＡＱＨＳＬＴＦＡＡＮＧＷＶＥＰＡＴＡＰＮＦＧＰＬＫＶＦＹＰＧＰＧＨＴＳＤＮＩＴＶＧＩＤＧＴＤＩＡＦＧＧＣＬＩＫＤＳＫＡＫＳＬＧＮＬＧＤＡＤＴＥＨＹＡＡＳＡＲＡＦＧＡＡＦＰＫＡＳＭＩＶＭＳＨＳＡＰＤＳＲＡＡＩＴＨＴＡＲＭＡＤＫＬＲ（配列番号５４）
ＮＤＭ−３（大腸菌）
ＭＥＬＰＮＩＭＨＰＶＡＫＬＳＴＡＬＡＡＡＬＭＬＳＧＣＭＰＧＥＩＲＰＴＩＧＱＱＭＥＴＧＤＱＲＦＧＤＬＶＦＲＱＬＡＰＮＶＷＱＨＴＳＹＬＤＭＰＧＦＧＡＶＡＳＮＧＬＩＶＲＤＧＧＲＶＬＶＶＤＴＡＷＴＮＤＱＴＡＱＩＬＮＷＩＫＱＥＩＮＬＰＶＡＬＡＶＶＴＨＡＨＱＤＫＭＧＧＭＤＡＬＨＡＡＧＩＡＴＹＡＮＡＬＳＮＱＬＡＰＱＥＧＭＶＡＡＱＨＳＬＴＦＡＡＮＧＷＶＥＰＡＴＡＰＮＦＧＰＬＫＶＦＹＰＧＰＧＨＴＳＤＮＩＴＶＧＩＤＧＴＤＩＡＦＧＧＣＬＩＫＤＳＫＡＫＳＬＧＮＬＧＤＡＤＴＥＨＹＡＡＳＡＲＡＦＧＡＡＦＰＫＡＳＭＩＶＭＳＨＳＡＰＤＳＲＡＡＩＴＨＴＡＲＭＡＤＫＬＲ（配列番号５５）
ＮＤＭ−４（大腸菌）
ＭＥＬＰＮＩＭＨＰＶＡＫＬＳＴＡＬＡＡＡＬＭＬＳＧＣＭＰＧＥＩＲＰＴＩＧＱＱＭＥＴＧＤＱＲＦＧＤＬＶＦＲＱＬＡＰＮＶＷＱＨＴＳＹＬＤＭＰＧＦＧＡＶＡＳＮＧＬＩＶＲＤＧＧＲＶＬＶＶＤＴＡＷＴＤＤＱＴＡＱＩＬＮＷＩＫＱＥＩＮＬＰＶＡＬＡＶＶＴＨＡＨＱＤＫＭＧＧＭＤＡＬＨＡＡＧＩＡＴＹＡＮＡＬＳＮＱＬＡＰＱＥＧＬＶＡＡＱＨＳＬＴＦＡＡＮＧＷＶＥＰＡＴＡＰＮＦＧＰＬＫＶＦＹＰＧＰＧＨＴＳＤＮＩＴＶＧＩＤＧＴＤＩＡＦＧＧＣＬＩＫＤＳＫＡＫＳＬＧＮＬＧＤＡＤＴＥＨＹＡＡＳＡＲＡＦＧＡＡＦＰＫＡＳＭＩＶＭＳＨＳＡＰＤＳＲＡＡＩＴＨＴＡＲＭＡＤＫＬＲ（配列番号５６）
ＮＤＭ−５（大腸菌）
ＭＥＬＰＮＩＭＨＰＶＡＫＬＳＴＡＬＡＡＡＬＭＬＳＧＣＭＰＧＥＩＲＰＴＩＧＱＱＭＥＴＧＤＱＲＦＧＤＬＶＦＲＱＬＡＰＮＶＷＱＨＴＳＹＬＤＭＰＧＦＧＡＶＡＳＮＧＬＩＶＲＤＧＧＲＶＬＬＶＤＴＡＷＴＤＤＱＴＡＱＩＬＮＷＩＫＱＥＩＮＬＰＶＡＬＡＶＶＴＨＡＨＱＤＫＭＧＧＭＤＡＬＨＡＡＧＩＡＴＹＡＮＡＬＳＮＱＬＡＰＱＥＧＬＶＡＡＱＨＳＬＴＦＡＡＮＧＷＶＥＰＡＴＡＰＮＦＧＰＬＫＶＦＹＰＧＰＧＨＴＳＤＮＩＴＶＧＩＤＧＴＤＩＡＦＧＧＣＬＩＫＤＳＫＡＫＳＬＧＮＬＧＤＡＤＴＥＨＹＡＡＳＡＲＡＦＧＡＡＦＰＫＡＳＭＩＶＭＳＨＳＡＰＤＳＲＡＡＩＴＨＴＡＲＭＡＤＫＬＲ（配列番号５７）
ＮＤＭ−６（大腸菌）
ＭＥＬＰＮＩＭＨＰＶＡＫＬＳＴＡＬＡＡＡＬＭＬＳＧＣＭＰＧＥＩＲＰＴＩＧＱＱＭＥＴＧＤＱＲＦＧＤＬＶＦＲＱＬＡＰＮＶＷＱＨＴＳＹＬＤＭＰＧＦＧＡＶＡＳＮＧＬＩＶＲＤＧＧＲＶＬＶＶＤＴＡＷＴＤＤＱＴＡＱＩＬＮＷＩＫＱＥＩＮＬＰＶＡＬＡＶＶＴＨＡＨＱＤＫＭＧＧＭＤＡＬＨＡＡＧＩＡＴＹＡＮＡＬＳＮＱＬＡＰＱＥＧＭＶＡＡＱＨＳＬＴＦＡＡＮＧＷＶＥＰＡＴＡＰＮＦＧＰＬＫＶＦＹＰＧＰＧＨＴＳＤＮＩＴＶＧＩＤＧＴＤＩＡＦＧＧＣＬＩＫＤＳＫＡＫＳＬＧＮＬＧＤＡＤＴＥＨＹＡＡＳＶＲＡＦＧＡＡＦＰＫＡＳＭＩＶＭＳＨＳＡＰＤＳＲＡＡＩＴＨＴＡＲＭＡＤＫＬＲ（配列番号５８）
ＮＤＭ−７（大腸菌）
ＭＥＬＰＮＩＭＨＰＶＡＫＬＳＴＡＬＡＡＡＬＭＬＳＧＣＭＰＧＥＩＲＰＴＩＧＱＱＭＥＴＧＤＱＲＦＧＤＬＶＦＲＱＬＡＰＮＶＷＱＨＴＳＹＬＤＭＰＧＦＧＡＶＡＳＮＧＬＩＶＲＤＧＧＲＶＬＶＶＤＴＡＷＴＤＤＱＴＡＱＩＬＮＷＩＫＱＥＩＮＬＰＶＡＬＡＶＶＴＨＡＨＱＤＫＭＧＧＭＮＡＬＨＡＡＧＩＡＴＹＡＮＡＬＳＮＱＬＡＰＱＥＧＬＶＡＡＱＨＳＬＴＦＡＡＮＧＷＶＥＰＡＴＡＰＮＦＧＰＬＫＶＦＹＰＧＰＧＨＴＳＤＮＩＴＶＧＩＤＧＴＤＩＡＦＧＧＣＬＩＫＤＳＫＡＫＳＬＧＮＬＧＤＡＤＴＥＨＹＡＡＳＡＲＡＦＧＡＡＦＰＫＡＳＭＩＶＭＳＨＳＡＰＤＳＲＡＡＩＴＨＴＡＲＭＡＤＫＬＲ（配列番号５９）
ＮＤＭ−８（大腸菌）
ＭＥＬＰＮＩＭＨＰＶＡＫＬＳＴＡＬＡＡＡＬＭＬＳＧＣＭＰＧＥＩＲＰＴＩＧＱＱＭＥＴＧＤＱＲＦＧＤＬＶＦＲＱＬＡＰＮＶＷＱＨＴＳＹＬＤＭＰＧＦＧＡＶＡＳＮＧＬＩＶＲＤＧＧＲＶＬＶＶＤＴＡＷＴＤＤＱＴＡＱＩＬＮＷＩＫＱＥＩＮＬＰＶＡＬＡＶＶＴＨＡＨＱＤＫＭＧＧＭＧＡＬＨＡＡＧＩＡＴＹＡＮＡＬＳＮＱＬＡＰＱＥＧＬＶＡＡＱＨＳＬＴＦＡＡＮＧＷＶＥＰＡＴＡＰＮＦＧＰＬＫＶＦＹＰＧＰＧＨＴＳＤＮＩＴＶＧＩＤＧＴＤＩＡＦＧＧＣＬＩＫＤＳＫＡＫＳＬＧＮＬＧＤＡＤＴＥＨＹＡＡＳＡＲＡＦＧＡＡＦＰＫＡＳＭＩＶＭＳＨＳＡＰＤＳＲＡＡＩＴＨＴＡＲＭＡＤＫＬＲ（配列番号６０）
ＫＰＣ−９（クレブシェラ肺炎桿菌）
ＭＥＬＰＮＩＭＨＰＶＡＫＬＳＴＡＬＡＡＡＬＭＬＳＧＣＭＰＧＥＩＲＰＴＩＧＱＱＭＥＴＧＤＱＲＦＧＤＬＶＦＲＱＬＡＰＮＶＷＱＨＴＳＹＬＤＭＰＧＦＧＡＶＡＳＮＧＬＩＶＲＤＧＧＲＶＬＶＶＤＴＡＷＴＤＤＱＴＡＱＩＬＮＷＩＫＱＥＩＮＬＰＶＡＬＡＶＶＴＨＡＨＱＤＫＭＧＧＭＤＡＬＨＡＡＧＩＡＴＹＡＮＡＬＳＮＱＬＡＰＱＫＧＭＶＡＡＱＨＳＬＴＦＡＡＮＧＷＶＥＰＡＴＡＰＮＦＧＰＬＫＶＦＹＰＧＰＧＨＴＳＤＮＩＴＶＧＩＤＧＴＤＩＡＦＧＧＣＬＩＫＤＳＫＡＫＳＬＧＮＬＧＤＡＤＴＥＨＹＡＡＳＡＲＡＦＧＡＡＦＰＫＡＳＭＩＶＭＳＨＳＡＰＤＳＲＡＡＩＴＨＴＡＲＭＡＤＫＬＲ（配列番号６１）
ＮＤＭ−１０（クレブシェラ肺炎桿菌亜種ニューモニエ）
ＭＥＬＰＮＩＭＨＰＶＡＫＬＳＴＡＬＡＡＡＬＭＬＳＧＣＭＰＧＥＩＳＰＴＩＤＱＱＭＥＴＧＤＱＲＦＧＤＬＶＦＲＱＬＡＰＮＶＷＱＨＴＳＹＬＤＭＰＳＦＧＡＶＴＳＮＧＬＩＶＲＤＧＧＲＶＬＶＶＤＴＡＷＴＤＤＱＴＡＱＩＬＮＷＩＫＱＥＩＮＬＰＶＡＬＡＶＶＴＨＡＨＱＤＫＭＧＧＭＤＡＬＨＡＡＧＩＡＴＹＡＮＡＬＳＮＱＬＡＰＱＥＧＭＶＡＡＱＨＳＬＴＦＡＡＮＧＷＶＥＰＡＴＡＰＮＦＧＰＬＫＶＦＹＰＧＰＧＨＴＳＤＮＩＴＶＧＩＤＲＴＤＩＡＦＧＧＣＬＩＫＤＳＫＡＫＳＬＧＮＬＧＤＡＤＴＥＨＹＡＡＳＡＲＡＦＧＡＡＦＰＫＡＳＭＩＶＭＳＨＳＡＰＤＳＲＡＡＩＴＨＴＡＲＭＡＤＫＬＲ（配列番号６２）
ＮＤＭ−１１
ＭＥＬＰＮＩＭＨＰＶＡＫＬＳＴＡＬＡＡＡＬＭＬＳＧＣＭＰＧＥＩＲＰＴＩＧＱＱＭＥＴＧＤＱＲＦＧＤＬＶＦＲＱＬＡＰＮＶＷＱＨＴＳＹＬＤＭＰＧＦＧＡＶＡＳＮＧＬＩＶＲＤＧＧＲＶＬＶＶＤＴＡＷＴＤＤＱＴＡＱＩＬＮＷＩＫＱＥＩＮＬＰＶＡＬＡＶＶＴＨＡＨＱＤＫＭＧＧＭＤＡＬＨＡＡＧＩＡＴＹＡＮＡＬＳＮＱＬＡＰＱＥＧＬＶＡＡＱＨＳＬＴＦＡＡＮＧＷＶＥＰＡＴＡＰＮＦＧＰＬＫＶＦＹＰＧＰＧＨＴＳＤＮＩＴＶＧＩＤＧＴＤＩＡＦＧＧＣＬＩＫＤＳＫＡＫＳＬＧＮＬＤＤＡＤＴＥＨＹＡＡＳＡＲＡＦＧＡＡＦＰＫＡＳＭＩＶＭＳＨＳＡＰＤＳＲＡＡＩＴＨＴＡＲＭＡＤＫＬＲ（配列番号６３）
ＮＤＭ−１２
ＭＥＬＰＮＩＭＨＰＶＡＫＬＳＴＡＬＡＡＡＬＭＬＳＧＣＭＰＧＥＩＲＰＴＩＧＱＱＭＥＴＧＤＱＲＦＧＤＬＶＦＲＱＬＡＰＮＶＷＱＨＴＳＹＬＤＭＰＧＦＧＡＶＡＳＮＧＬＩＶＲＤＧＧＲＶＬＶＶＤＴＡＷＴＤＤＱＴＡＱＩＬＮＷＩＫＱＥＩＮＬＰＶＡＬＡＶＶＴＨＡＨＱＤＫＭＧＧＭＤＡＬＨＡＡＧＩＡＴＹＡＮＡＬＳＮＱＬＡＰＱＥＧＬＶＡＡＱＨＳＬＴＦＡＡＮＧＷＶＥＰＡＴＡＰＮＦＧＰＬＫＶＦＹＰＧＰＧＨＴＳＤＮＩＴＶＧＩＤＧＴＤＩＡＦＧＧＣＬＩＫＤＳＫＡＫＳＬＧＮＬＤＤＡＤＴＥＨＹＡＡＳＡＲＡＦＧＡＡＦＰＫＡＳＭＩＶＭＳＨＳＡＰＤＳＲＡＡＩＴＨＴＡＲＭＡＤＫＬＲ（配列番号６４）
ＮＤＭ−１３
ＭＥＬＰＮＩＭＨＰＶＡＫＬＳＴＡＬＡＡＡＬＭＬＳＧＣＭＰＧＥＩＲＰＴＩＧＱＱＭＥＴＧＤＱＲＦＧＤＬＶＦＲＱＬＡＰＮＶＷＱＨＴＳＹＬＤＭＰＧＦＧＡＶＡＳＮＧＬＩＶＲＤＧＧＲＶＬＶＶＤＴＡＷＴＮＤＱＴＡＱＩＬＮＷＩＫＱＥＩＮＬＰＶＡＬＡＶＶＴＨＡＨＱＤＫＭＧＧＭＤＡＬＨＡＡＧＩＡＴＹＡＮＡＬＳＮＱＬＡＰＱＥＧＬＶＡＡＱＨＳＬＴＦＡＡＮＧＷＶＥＰＡＴＡＰＮＦＧＰＬＫＶＦＹＰＧＰＧＨＴＳＤＮＩＴＶＧＩＤＧＴＤＩＡＦＧＧＣＬＩＫＤＳＫＡＫＳＬＧＮＬＧＤＡＤＴＥＨＹＡＡＳＡＲＡＦＧＡＡＦＰＫＡＳＭＩＶＭＳＨＳＡＰＤＳＲＡＡＩＴＨＴＡＲＭＡＤＫＬＲ（配列番号６５）
【００１８】
いくつかの実施形態では、広域スペクトルカルバペネマーゼは、ＩＭＰ型カルバペネマーゼである。ＩＭＰ型酵素の例としては、ＩＭＰ−１、ＩＭＰ−４、ＩＭＰ−８、ＩＭＰ−１１、ＩＭＰ−４３およびＩＭＰ−４４が挙げられるが、これらに限定されない。さらなるＩＭＰ型酵素は、例えば、Ｑｕｅｅｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２０（３）：４４０−４５８に記載されている。この全開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、広域スペクトルカルバペネマーゼは、ＶＩＭ（ベローナインテグロンにコードされたメタロβ−ラクタマーゼ）である。ＶＩＭ酵素の例としては、ＶＩＭ−１、ＶＩＭ−２、ＶＩＭ−３、ＶＩＭ−４、およびＶＩＭ−１９が挙げられるが、これらに限定されない。さらなるＶＩＭ酵素は、例えば、Ｑｕｅｅｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２０（３）：４４０−４５８に記載されている。この全開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２０】
いくつかの実施形態では、広域スペクトルカルバペネマーゼは、ＯＸＡ（オキサシリナーゼ）グループのβ−ラクタマーゼである。ＯＸＡβ−ラクタマーゼの例としては、ＯＸＡ−２３、ＯＸＡ−２４、ＯＸＡ−２７、ＯＸＡ−４０、ＯＸＡ−４８、ＯＸＡ−４９、ＯＸＡ−５０、ＯＸＡ−５１、ＯＸＡ−５８、ＯＸＡ−６４、ＯＸＡ−７１、およびＯＸＡ−１８１が挙げられるが、これらに限定されない。さらなるＯＸＡタイプカルバペネマーゼは、例えば、Ｗａｌｔｈｅｒ−Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（２００６），５７：３７３−３８３およびＱｕｅｅｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２０（３）：４４０−４５８に記載されている。これらの全開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、広域スペクトルカルバペネマーゼは、ＣＭＹ（クラスＣカルバペネマーゼ）酵素である。カルバペネマーゼ活性を有するＣＭＹ酵素の例は、例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１）：１−２２に記載されているＣＭＹ−１０である。この文献の全開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、広域スペクトルカルバペネマーゼは、ＳＭＥ酵素（セラチア菌に対する）である。ＳＭＥ酵素の例としては、例えば、Ｑｕｅｅｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２０（３）：４４０−４５８に記載されている、ＳＭＥ−１、ＳＭＥ−２、またはＳＭＥ−３が挙げられるが、これらに限定されない。  この文献の全開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２３】
いくつかの実施形態では、広域スペクトルカルバペネマーゼは、ＩＭＩ酵素（イミペネム加水分解β−ラクタマーゼ）である。ＩＭＩ酵素の例としては、例えば、Ｑｕｅｅｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２０（３）：４４０−４５８に記載されている、ＩＭＩ−１またはＩＭＩ−２が挙げられるが、これらに限定されない。  この文献の全開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、広域スペクトルカルバペネマーゼは、ＮＭＣ酵素（金属酵素ではないカルバペネマーゼ）である。ＮＭＣ酵素の例としては、  例えば、Ｑｕｅｅｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２０（３）：４４０−４５８に記載されているＮＭＣ−Ａが挙げられる。この文献の全開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２５】
いくつかの実施形態では、広域スペクトルカルバペネマーゼは、ＧＥＳ酵素（ギアナの広域の）である。ＧＥＳ酵素の例としては、例えば、Ｑｕｅｅｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２０（３）：４４０−４５８およびＪｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｃｌａｓｓ  Ａ，Ｂ，ａｎｄ  Ｄ  β−Ｌａｃｔａｍａｓｅｓ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅ．ｃａ／ｃｒｙｓｔａｌ＿ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．ｈｔｍｌに記載されている、ＧＥ−２、ＧＥＳ−４、ＧＥＳ−５、ＧＥＳ−６、ＧＥＳ−７、ＧＥＳ−８、ＧＥＳ−９、ＧＥＳ−１１、ＧＥＳ−１４、およびＧＥＳ−１８が挙げられるが、これらに限定されない。これらの文献の全開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、広域スペクトルカルバペネマーゼは、ＣｃｒＡ（ＣｆｉＡ）メタロβ−ラクタマーゼである。
【００２７】
いくつかの実施形態では、広域スペクトルカルバペネマーゼは、例えば、Ｗａｌｔｈｅｒ−Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，６０：４７０−４８２に記載されている、セラチア・フォンチコラ由来のＳＦＣ−１酵素またはクレブシェラ肺炎桿菌由来のＳＨＶ−３８酵素である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、抗生物質分解剤の変異誘発または改変を実施して、本発明の方法により利用される有利な酵素を誘導する。例えば、変異誘発または改変を実施して、改善された酵素活性を有する抗生物質分解剤を誘導、または酵素により分解される抗生物質の範囲を拡大し得る。いくつかの実施形態では、抗生物質分解剤の誘導体は、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、構造−活性関係分析、および／または定方向進化アプローチによって得られる。例えば、いくつかの実施形態では、変異設計は、当業者に入手可能な既知のデータベース、例えば、例えば、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ、ＮＣＢＩ、およびＰＤＢで利用可能な構造データ（例えば、結晶構造データ、相同体モデル、など）に基づいている。
【００２９】
いくつかの実施形態では、抗生物質分解剤は、その分解剤の野性型配列に対する１個または複数（例えば、約１、または約２、または約３、または約４、または約５、または約６、または約７、または約８、または約９、または約１０、または約１５、または約２０、または約３０、または約４０、または約５０、または約６０、または約７０、または約８０、または約９０、または約１００、または約１１０、または約１２０、または約１３０、または約１４０、または約１５０個）の変異を含む。いくつかの実施形態では、抗生物質分解剤は、その分解剤の野性型配列に対して少なくとも３０％、３５％、４０％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、または９９．９％同一性（またはその分解剤の野性型配列に対して約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一性）を有する配列を含み得る。パーセント同一性は、従来の生物情報学的方法により評価してよい。
【００３０】
いくつかの実施形態では、抗生物質分解剤は、本明細書で開示の配列番号１９〜３９、３７〜６５、６６、または６８に対して、１個または複数（例えば、約１、または約２、または約３、または約４、または約５、または約６、または約７、または約８、または約９、または約１０、または約１５、または約２０、または約３０、または約４０、または約５０、または約６０、または約７０、または約８０、または約９０、または約１００、または約１１０、または約１２０、または約１３０、または約１４０、または約１５０個）の変異を含む。いくつかの実施形態では、抗生物質分解剤は、その分解剤の野性型配列に対してに対して、少なくとも３０％、３５％、４０％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、または９９．９％同一性（または配列番号１９〜３９、３７〜６５、６６、または６８に対して約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一性）を有する配列を含み得る。
【００３１】
種々の実施形態では、抗生物質分解剤は、１個または複数のアミノ酸置換を含み得る。ある実施形態では、アミノ酸置換は、天然のアミノ酸、例えば、親水性のアミノ酸（例えば、極性で正電荷の親水性のアミノ酸、例えば、アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）；極性で中性電荷の親水性のアミノ酸、例えば、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、およびシステイン（Ｃ）、極性および負電荷の親水性のアミノ酸、例えば、アスパラギン酸（Ｄ）もしくはグルタミン酸（Ｅ）、または芳香族の極性で正電荷の親水性のアミノ酸、例えば、ヒスチジン（Ｈ））または疎水性のアミノ酸（例えば、疎水性の脂肪族アミノ酸、例えば、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、もしくはバリン（Ｖ）、疎水性の芳香族アミノ酸、例えば、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、もしくはチロシン（Ｙ））または非古典的アミノ酸（例えば、セレノシステイン、ピロールリジン、Ｎ−ホルミルメチオニンβ−アラニン、ＧＡＢＡおよびδ−アミノレブリン酸、４−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（βメチルアミノ酸、、Ｃ  α−メチルアミノ酸、Ｎ  α−メチルアミノ酸など）、および一般的にアミノ酸類似体）を含んでよい。コドン縮退を考慮に入れることを含む遺伝子コードを参照することにより抗生物質分解剤の遺伝子配列に対し変異を加え得る。
【００３２】
種々の実施形態では、抗生物質分解剤は、例えば、広範囲の抗生物質を効率的に標的とする能力を含む、望ましい特性を有する。種々の実施形態では、抗生物質分解剤は、望ましい酵素動力学的特性を有する。例えば、いくつかの実施形態では、抗生物質分解剤は、少なくとも１種の抗生物質に対して、例えば、約５００μＭ、または約１００μＭ、または約１０μＭ、または約１μＭ、または約０．１μＭ（１００ｎＭ）、または約０．０１μＭ（１０ｎＭ）、または約１ｎＭ未満のＫＭなどの低いＫＭを有する。種々の実施形態では、抗生物質分解剤は、少なくとも１種の抗生物質に対して、例えば、約１００ｓ−１、または約１０００ｓ−１、または約１００００ｓ−１、または約１０００００ｓ−１、または約１００００００ｓ−１を超えるＶｍａｘなどの高いＶｍａｘを有する。種々の実施形態では、抗生物質分解剤は、少なくとも１種の抗生物質に対して、約１０６Ｍ−１ｓ−１より大きい触媒効率を有する。
【００３３】
種々の実施形態では、抗生物質分解剤は、ＧＩ管中、例えば、口、食道、胃、小腸（例えば、十二指腸、空腸、回腸）、および大腸（例えば、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、Ｓ状結腸、および直腸）の内の１つまたは複数の器官中で安定および／または活性である。特定の実施形態では、抗生物質分解剤は、大腸中、場合により、横行結腸、下行結腸、上行結腸、Ｓ状結腸および盲腸から選択される１つまたは複数の器官中で安定および／または活性である。特定の実施形態では、抗生物質分解剤は、小腸中、場合により、十二指腸、空腸、および回腸から選択される１つまたは複数の器官中で安定および／または活性である。特定の実施形態では、抗生物質分解剤は、回腸、および／または回腸末端部、および／または盲腸、および／または回盲部で安定および／または活性である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、抗生物質分解剤は、例えば、小腸を含むＧＩ管中でプロテアーゼに対し耐性がある。いくつかの実施形態では、抗生物質分解剤は、約６．０〜約７．５、例えば、約６．０、または約６．１、または約６．２、または約６．３、または約６．４、または約６．５、または約６．６、または約６．７、または約６．８、または約６．９、または約７．０、または約７．１、または約７．２、または約７．３、または約７．４、または約７．５のｐＨで実質的に活性である（例えば、本明細書で記載のように、製剤を介することを含む）。種々の実施形態では、抗生物質分解剤は、例えば、アビバクタム、タゾバクタム、スルバクタム、ＥＤＴＡ、およびクラブラン酸から任意に選択される、１種または複数種の抗生物質分解剤阻害剤に対して耐性がある。特定の実施形態では、抗生物質分解剤はＮＤＭであり、これはスルバクタムまたはタゾバクタムにより実質的に阻害されない。本明細書に記載の他の実施形態では、本発明の抗生物質分解剤は、１種または複数の阻害剤の影響を受けやすく、この特性は、抗生物質の加水分解が抗生物質の治療の恩恵を妨げないことを保証するのに活用される。いくつかの実施形態では、安定は、十分長い半減期を有し、治療効果に対し十分な活性を維持する酵素を意味する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、本明細書で記載の抗生物質分解剤は、改変されている誘導体、すなわち、共有結合が酵素の活性を妨げないように、任意のタイプの分子の抗生物質分解剤への共有結合により改変されている誘導体を含む。例えば、限定するものではないが、誘導体には、特に、グリコシル化、脂質化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質切断、細胞リガンドまたはその他のタンパク質への結合、などにより改変されている抗生物質分解剤が含まれる。特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、などを含む多くの化学的改変のいずれかを実施することができるが、これらに限定されない。さらに、誘導体は１種または複数の非古典的アミノ酸を含むことができる。
【００３６】
さらにその他の実施形態では、本明細書で記載の抗生物質分解剤を改変して、化学リンカーなどのエフェクター部分、例えば、蛍光染料、酵素、基質、生物発光物質、放射性物質、および化学発光部分などの検出可能な部分、または例えば、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、細胞毒、細胞傷害性薬物、および放射性物質などの機能性部分を付加することができる。
【００３７】
本明細書で記載の抗生物質分解剤は、充分に塩基性の官能基を有することができ、これは無機もしくは有機酸またはカルボキシル基と反応することができ、またこれは、無機または有機塩基と反応することができ、薬学的に許容可能な塩を形成することができる。当該技術分野でよく知られているように、薬学的に許容可能な酸付加塩は、薬学的に許容可能な酸から形成される。このような塩には、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，２−１９（１９７７）およびＴｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ．Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｖｅｒｌａｇ，Ｚｕｒｉｃｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）２００２、に挙げられた薬学的に許容可能な塩を含む。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３８】
薬学的に許容可能な塩には、限定されないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、ホスフェート、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルカロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、樟脳スルホン酸塩、パモ酸塩、フェニル酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、アクリル酸塩、クロロ安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ｏ−アセトキシ安息香酸塩、ナフタレン−２−安息香酸塩、イソ酪酸塩、フェニル酪酸塩、α−ヒドロキシ酪酸塩、ブチン−１，４−ジカルボキシレート、ヘキシン−１，４−ジカルボキシレート、カプリン酸塩、カプリル酸塩、ケイ皮酸塩、グリコール酸塩、ヘプタン酸塩、ヒプル酸塩、リンゴ酸塩、ヒドロキシマレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、ニコチン酸塩、フタル酸塩、テラフタル酸塩、プロピオール酸塩、プロピオン酸塩、フェニルプロピオン酸塩、セバシン酸塩、スベリン酸塩、ｐ−ブロモベンゼンスルホン酸塩、クロロベンゼンスルホン酸塩、エチルスルホン酸塩、２−ヒドロキシエチルスルホン酸塩、メチルスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、ナフタレン−１，５−スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、および酒石酸塩が挙げられる。
【００３９】
「薬学的に許容可能な塩」という用語はまた、カルボン酸官能基などの酸性官能基、および塩基を有する抗生物質分解剤の塩を意味する。適切な塩基には、限定されないが、ナトリウム、カリウム、およびリチウムなどのアルカリ金属の水酸化物；カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属の水酸化物；ニッケル、コバルト、マンガン、アルミニウムおよび亜鉛などのその他の金属の水酸化物；アンモニア、および非置換またはヒドロキシ置換のモノ−、ジ−、またはトリ−アルキルアミン、ジシクロヘキシルアミンなどの有機アミン；トリブチルアミン；ピリジン；Ｎ−メチル、Ｎ−エチルアミン；ジエチルアミン；トリエチルアミン；モノ−、ビス−、またはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミン、２−ヒドロキシ−ｔｅｒｔ−ブチルアミン、またはトリス−（ヒドロキシメチル）メチルアミンなどのモノ−、ビス−、またはトリス−（２−ＯＨ−低級アルキルアミン）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アミンまたはトリ−（２−ヒドロキシエチル）アミンなどのＮ，Ｎ−ジ−低級アルキル−Ｎ−（ヒドロキシル−低級アルキル）−アミン；Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン；およびアルギニン、リシンなどのアミノ酸などが挙げられる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本明細書で記載の組成物は、薬学的に許容可能な塩の形である。
【００４１】
さらに、本明細書で記載のいずれの抗生物質分解剤も、薬学的に許容可能なキャリアまたはビークルを含む組成物の成分として、対象に投与することができる。このような組成物は、適切な投与用の形態を与えるように、必要に応じ適切な量の薬学的に許容可能な賦形剤を含むことができる
【００４２】
医薬賦形剤は、ピーナッツオイル、大豆油、ミネラルオイル、ゴマ油などの石油、動物、植物、または人工起源のものを含む、水および油などの液体とすることができる。医薬賦形剤は、例えば、食塩水、アカシアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、滑石、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素などとすることができる。さらに、補助材料、安定化剤、増粘化剤、潤滑剤、および着色料を使用することができる。一実施形態では、薬学的に許容可能な賦形剤は、対象に投与される場合、無菌である。本明細書で記載のいずれかの薬剤が静脈内に投与される場合、水は有用な賦形剤である。生理食塩水および水性デキストロースならびにグリセリン溶液はまた、液体賦形剤として、特に注射可能溶液に用いることができる。適切な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、セルロース、ヒプロメロース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセリンモノステアレート、滑石、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセリン、プロピレン、グリコール、ポビドン、クロスポビドン、水、エタノールなども挙げられる。本明細書で記載のいずれの薬剤も、必要に応じ、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むことができる。適切な医薬賦形剤のそのほかの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １４４７−１６７６（Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄｓ．，１９ｔｈ  ｅｄ．１９９５）に記載されている。この文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００４３】
抗生物質分解剤および／または医薬組成物（および／または追加の治療薬）は、必要に応じて、可溶化剤を含めることができる。また、薬剤は好適なビークルまたはデリバリー装置を使って送達することができる。投与用の組成物には、必要に応じ、注射部位での疼痛を緩和するために、例えば、リグノカインなどの局所麻酔剤を含めることも可能である。本明細書で概要を述べた併用療法剤は、単一の送達ビークルまたはデリバリー装置で同時に送達することができる。
【００４４】
抗生物質
種々の実施形態では、抗生物質分解剤は、１種または複数の抗生物質を分解または不活化する。種々の実施形態では、対象は、１種または複数の抗生物質を使って現在処置を受けているか、または最近処置を受けたことがある。種々の実施形態では、記載抗生物質分解剤および／または医薬組成物（および／または追加の治療薬）は、１種または複数の抗生物質の治療（例えば、全身性）作用を保護すると同時に、抗生物質がＧＩ微生物叢を破壊する可能性のあるＧＩ管下流でのこれらの余剰量の抗生物質の作用を防止するように処方される。例えば、このような抗生物質は、経口または非経口（例えば、静脈内）で投与され、残留または余剰抗生物質はＧＩ管中に残される（例えば、血流中への吸収の不足からおよび／または直接的または胆汁を介した腸管腔中への分泌により）。このような余剰または残留抗生物質は、ＧＩ微生物叢を破壊する（例えば、対象の腸微生物叢の健全なバランス（例えば、健全な比率および／または健全な分布）を破壊する）可能性がある。特定の実施形態では、経口投与抗生物質は、ペニシリン、セファロスポリン、モノバクタム、およびカルバペネムから選択される。
【００４５】
ペニシリンとしては、例えば、アムジノシリン、アモキシシリン（例えば、ＮＯＶＡＭＯＸ、ＡＭＯＸＩＬ）；アンピシリン（例えば、ＰＲＩＮＣＩＰＥＮ）；アズロシリン；カルベニシリン（例えば、ＧＥＯＣＩＬＬＩＮ）；クロキサシリン（例えば、ＴＥＧＯＰＥＮ）；シクラシリン、ジクロキサシリン（例えば、ＤＹＮＡＰＥＮ）；フルクロキサシリン（例えば、ＦＬＯＸＡＰＥＮ）；メズロシリン（例えば、ＭＥＺＬＩＮ）；メチシリン（例えば、ＳＴＡＰＨＣＩＬＬＩＮ）；ナフシリン（例えば、ＵＮＩＰＥＮ）；オキサシリン（例えば、ＰＲＯＳＴＡＰＨＬＩＮ）；ペニシラン酸、ペニシリンＧ（例えば、ＰＥＮＴＩＤＳまたはＰＦＩＺＥＲＰＥＮ）；ペニシリンＶ（例えば、ＶＥＥＴＩＤＳ（ＰＥＮ−ＶＥＥ−Ｋ））；ピペラシリン（例えば、ＰＩＰＲＡＣＩＬ）；スルバクタム、テモシリン（例えば、ＮＥＧＡＢＡＮ）；およびチカルシリン（例えば、ＴＩＣＡＲ）が挙げられる。
ペニシリンの例としては、下記が挙げられる。
【表１】
2018507204.tif 000003
セファロスポリンとしては、例えば、第一世代セファロスポリン（例えば、セファドロキシル（例えば、ＤＵＲＩＣＥＦ）；セファゾリン（例えば、ＡＮＣＥＦ）；セフトロザン、セファロチン（Ｃｅｆａｌｏｔｉｎ）／セファロチン（Ｃｅｆａｌｏｔｈｉｎ）（例えば、ＫＥＦＬＩＮ）；セファレキシン（例えば、ＫＥＦＬＥＸ））；第二世代セファロスポリン（例えば、セファクロール（例えば、ＤＩＳＴＡＣＬＯＲ）；セファマンドール（例えば、ＭＡＮＤＯＬ）；セフォキシチン（例えば、ＭＥＦＯＸＩＮ）；セフプロジル（例えば、ＣＥＦＺＩＬ）；セフロキシム（例えば、ＣＥＦＴＩＮ、ＺＩＮＮＡＴ））；第三世代セファロスポリン（例えば、セフィキシム（例えば、ＳＵＰＲＡＸ）；セフジニル（例えば、ＯＭＮＩＣＥＦ、ＣＥＦＤＩＥＬ）；セフジトレン（例えば、ＳＰＥＣＴＲＡＣＥＦ）；セフォペラゾン（例えば、ＣＥＦＯＢＩＤ）；セフォタキシム（例えば、ＣＬＡＦＯＲＡＮ）；セフポドキシム（例えば、ＶＡＮＴＩＮ）；セフタジジム（例えば、ＦＯＲＴＡＺ）；セフチブテン（例えば、ＣＥＤＡＸ）、セフチゾキシム（例えば、ＣＥＦＩＺＯＸ）；およびセフトリアキソン（例えば、ＲＯＣＥＰＨＩＮ））；第四世代セファロスポリン（例えば、セフェピム（例えば、ＭＡＸＩＰＩＭＥ））または第五世代セファロスポリン（例えば、セフタロリンフォサミル（例えば、ＴＥＦＬＡＲＯ）；セフトビプロール（例えば、ＺＥＦＴＥＲＡ））が挙げられる。ラタモキセフ（またはモキサラクタム）も含まれる。特定の実施形態では、セファロスポリンには、例えば、セフォペラゾン、セフトリアキソンまたはセファゾリンが含まれる。
セファロスポリンの例としては、下記が挙げられる。
【表２】
2018507204.tif 000004
2018507204.tif 000005
2018507204.tif 000006
【００４６】
モノバクタムとしては、例えば、アズトレオナム（例えば、ＡＺＡＣＴＡＭ、ＣＡＹＳＴＯＮ）、チゲモナム、ノカルディシンＡ、およびタブトキシンが挙げられる。
【００４７】
カルバペネムとしては、例えば、メロペネム、イミペネム（非限定的例として、イミペネム／シラスタチン）、エルタペネム、ドリペネム、パニペネム／ベタミプロン、ビアペネム、ラズペネム（ＰＺ−６０１）、テビペネム、レナペネム、およびトモペネムが挙げられる。カルバペネムには、チエナマイシンも含まれる。
カルバペネムの例としては、下記が挙げられる。
【表３】
2018507204.tif 000007
【００４８】
種々の実施形態では、抗生物質は、経口または非経口投与してよい。例えば、抗生物質は、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、舌下、鼻腔内、大脳内、膣内、経皮、直腸、吸入、または局所経路を介して投与してよい。ある実施形態では、抗生物質は経口投与される。別の実施形態では、抗生物質は非経口投与される。ある実施形態では、抗生物質は静脈内に投与される。
【００４９】
抗生物質分解剤の阻害剤
種々の実施形態では、記載の抗生物質分解剤および／または医薬組成物（および／または追加の治療薬）は、１種または複数の抗生物質の治療（例えば、全身性）作用を保護すると同時に、抗生物質がＧＩ微生物叢を破壊する可能性のあるＧＩ管下流でのこれらの残留または余剰量の抗生物質の作用を防止するように処方される。この二重の目的は、一部には、１種または複数の抗生物質分解剤の阻害剤の使用により達成し得る（阻害剤による手法を補うまたはそれに取って代わる別の手法は、本明細書での他の箇所で記載のように、ＧＩ管の特定の領域で選択的に放出するための製剤によるものである）。例えば、記載した抗生物質分解剤は、１種または複数の阻害剤がＧＩ管の上流（例えば、回腸およびそれより上流）で、抗生物質分解剤の活性を低減または除去することにより抗生物質保護作用をするように、抗生物質分解剤の１種または複数の阻害剤の投与を受けている（例えば、逐次または同時投与、または共製剤を受けている）患者に投与し得る。しかし、１種または複数の阻害剤は、ＧＩ管の下流（例えば、遠位小腸および／または結腸）では抗生物質分解剤の活性に対するこのような阻害効果を持たず、したがって、記載した抗生物質分解剤が、ＧＩ管の下流の残留または余剰抗生物質を分解または不活化するのを可能とし、したがって、ＧＩ微生物叢に対する損傷を防止または軽減する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、抗生物質分解剤阻害剤は抗生物質を追跡し、両方が近位小腸で吸収可能となる。抗生物質分解剤阻害剤は、近位小腸において抗生物質分解剤から抗生物質を保護する役割をする。抗生物質および阻害剤はその後、両方が血流中に吸収され、それにより、近位小腸から除去される。阻害剤の濃度が小腸で低下するに伴い、抗生物質分解剤が活性になる。腸内に残っているまたは胆汁と共に再入した全ての残留または余剰抗生物質は、結腸マイクロバイオームと出会う前に不活化される。
【００５１】
いくつかの実施形態では、抗生物質分解剤阻害剤には、例えば、タゾバクタム、スルバクタム、ＥＤＴＡ、クラブラン酸、アビバクタム、トランス−７−オキソ−６−（スルホオキシ）−１，６−ジアザビシクロ−［３．２．１］−オクタン−２−カルボキサミド、モノバクタム誘導体、ＡＴＭＯ誘導体、ペネム（例えば、ＢＲＬ４２７１５およびその誘導体、Ｓｙｎ１０１２、オキサペネム、トリネム、１−β−メチルカルバペネム）、ペニシリンおよびセファロスポリンスルホン誘導体（例えば、Ｃ−２／Ｃ−３−置換ペニシリンおよびセファロスポリンスルホン、Ｃ−６−置換ペニシリンスルホン）、非βラクタム阻害剤（例えば、ボロン酸遷移状態類似体、ホホネート、ＮＸＬ１０４、ヒドロキシメート）およびチオール誘導体などのメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤、ピリジンジカルボキシレート、トリフルオロメチルケトンおよびアルコール、カルバペネム類似体、三環式天然産物、コハク酸誘導体、ならびにペニシリン酸Ｃ−６−メルカプトメチルが挙げられる。抗生物質と、１種または複数の抗生物質分解剤阻害剤との共製剤も、いくつかの実施形態で提供される（例えば、オーグメンチンはアモキシシリンとクラブラン酸の混合物であり、スルタミシリンはアンピシリンとスルバクタムとの混合物である）。
【００５２】
さらに、Ｄｒａｗｚ，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．Ｊａｎ  ２０１０；２３（１）：１６０−２０１および国際公開第２００９／０９１８５６Ａ号に記載のいずれかの抗生物質分解剤阻害剤は、本発明に包含される。これらの文献の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、抗生物質分解剤阻害剤は、米国特許第８，９１２，１６９号に記載の１種または複数のβ−ラクタマーゼ阻害剤である。この特許の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、抗生物質分解剤阻害剤は、米国特許第７，０２２，６９１号および同第８，０９３，２９４号および米国特許出願公開第２０１２／０３２９７７０号に記載の１種または複数のメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤である。これら特許の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５５】
いくつかの実施形態では、抗生物質分解剤阻害剤は、米国特許出願公開第２０１４／０２２１３３０号に記載の１種または複数のＮＤＭ阻害剤である。この特許の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５６】
製剤および投与
種々の実施形態では、記載の抗生物質分解剤および／または医薬組成物（および／または追加の治療薬）は、１種または複数の抗生物質の治療（例えば、全身性）作用を保護すると同時に、抗生物質がＧＩ微生物叢を破壊する可能性のあるＧＩ管下流でのこれらの残留または余剰量の抗生物質の作用を防止するように処方される。この二重の目的は、一部には、ＧＩ管の特定の領域で選択的放出するように、１種または複数の抗生物質分解剤、抗生物質、および阻害剤を処方することにより達成し得る。
【００５７】
各種方法を使って、本明細書で記載の薬剤を処方および／または目的の部位へ送達することができる。例えば、本明細書で記載の抗生物質分解剤および／または医薬組成物（および／または追加の治療薬）は、消化管に送達に適合された組成物として処方し得る。消化管は、食道、胃、十二指腸、小腸、大腸および直腸などの消化器系の器官を含み、その全ての細区分を含む（例えば、小腸は十二指腸、空腸および回腸を含んでよく、大腸は横行結腸、下行結腸、上行結腸、Ｓ状結腸および盲腸を含んでよい）。例えば、本明細書で記載の抗生物質分解剤および／または医薬組成物（および／または追加の治療薬）は、小腸、大腸および直腸などの消化器系の器官およびその全ての細区分（例えば、十二指腸、空腸および回腸、横行結腸、下行結腸、上行結腸、Ｓ状結腸および盲腸）の内の１つまたは複数に送達するように処方することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で記載の組成物は上部または下部ＧＩ管に送達するように処方することができる。ある実施形態では、抗生物質分解剤および／または医薬組成物（および／または追加の治療薬）は、対象に、例えば、消化管の粘膜組織に直接にまたは間接的に接触することにより投与し得る。
【００５８】
例えば、種々の実施形態では、本発明は、少なくとも１種の抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）を含む放出調節製剤を提供し、該製剤は、実質的な量の抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）をＧＩ管の１つまたは複数の領域に放出する。例えば、製剤は、胃以降およびＧＩ管の１つまたは複数の領域に少なくとも約６０％の抗生物質分解剤を放出し得る。種々の実施形態では、１種または複数の抗生物質（または抗生物質分解剤阻害剤）の治療（全身作用）作用を可能にするが、ＧＩ管の微生物叢に対する余剰抗生物質の有害作用を防止または軽減するように、少なくとも１種の抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）を含む放出調節製剤が放出される。種々の実施形態では、少なくとも１種の抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）を含む放出調節製剤は、１種または複数の抗生物質（または抗生物質分解剤阻害剤）の放出および／または吸収位置より遠位に放出される。例えば、種々の実施形態では、少なくとも１種の抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）を含む放出調節製剤は、回腸より遠位およびそれ以降に放出される。例えば、種々の実施形態では、少なくとも１種の抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）を含む放出調節製剤は、遠位の小腸および／または結腸に放出される。
【００５９】
種々の実施形態では、本発明の放出調節製剤は、胃以降の腸の１つまたは複数の領域に少なくとも６０％の抗生物質分解剤（または追加の治療薬）を放出する。例えば、放出調節製剤は、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の抗生物質分解剤（または追加の治療薬）を腸中に放出する。
【００６０】
種々の実施形態では、本発明の放出調節製剤は、小腸中に、少なくとも６０％の抗生物質分解剤（または追加の治療薬）を放出する。例えば、放出調節製剤は、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の抗生物質分解剤（または追加の治療薬）を小腸中に放出する。
【００６１】
一実施形態では、本発明の放出調節製剤は、十二指腸中に、少なくとも６０％の抗生物質分解剤（または追加の治療薬）を放出する。例えば、放出調節製剤は、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の抗生物質分解剤（または追加の治療薬）を十二指腸中に放出する。
【００６２】
一実施形態では、本発明の放出調節製剤は、空腸中に、少なくとも６０％の抗生物質分解剤（または追加の治療薬）を放出する。例えば、放出調節製剤は、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の抗生物質分解剤（または追加の治療薬）を空腸中に放出する。
【００６３】
一実施形態では、本発明の放出調節製剤は、回腸中および／または回盲部に、少なくとも６０％の抗生物質分解剤（または追加の治療薬）を放出する。例えば、放出調節製剤は、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の抗生物質分解剤（または追加の治療薬）を回腸中および／または回盲部に放出する。
【００６４】
種々の実施形態では、本発明の放出調節製剤は、大腸中に、少なくとも６０％の抗生物質分解剤（または追加の治療薬）を放出する。例えば、放出調節製剤は、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の抗生物質分解剤（または追加の治療薬）を大腸中に放出する。
【００６５】
一実施形態では、本発明の放出調節製剤は、盲腸中に、少なくとも６０％の抗生物質分解剤（または追加の治療薬）を放出する。例えば、放出調節製剤は、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の抗生物質分解剤（または追加の治療薬）を盲腸中に放出する。
【００６６】
一実施形態では、本発明の放出調節製剤は、上行結腸中に、少なくとも６０％の抗生物質分解剤（または追加の治療薬）を放出する。例えば、放出調節製剤は、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の抗生物質分解剤（または追加の治療薬）を上行結腸中に放出する。
【００６７】
一実施形態では、本発明の放出調節製剤は、横行結腸中に、少なくとも６０％の抗生物質分解剤（または追加の治療薬）を放出する。例えば、放出調節製剤は、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の抗生物質分解剤（または追加の治療薬）を横行結腸中に放出する。
【００６８】
一実施形態では、本発明の放出調節製剤は、下行結腸中に、少なくとも６０％の抗生物質分解剤（または追加の治療薬）を放出する。例えば、放出調節製剤は、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の抗生物質分解剤（または追加の治療薬）を下行結腸中に放出する。
【００６９】
一実施形態では、本発明の放出調節製剤は、Ｓ状結腸中に、少なくとも６０％の抗生物質分解剤（または追加の治療薬）を放出する。例えば、放出調節製剤は、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の抗生物質分解剤（または追加の治療薬）をＳ状結腸中に放出する。
【００７０】
一実施形態では、本発明の放出調節製剤は、回腸、および／または回腸末端部、および／または盲腸、および／または回盲部に、少なくとも６０％の抗生物質分解剤（または追加の治療薬）を放出する。例えば、放出調節製剤は、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の抗生物質分解剤（または追加の治療薬）を回腸、および／または回腸末端部、および／または盲腸、および／または回盲部に放出する。
【００７１】
種々の実施形態では、放出調節製剤は、抗生物質分解剤（または追加の治療薬）を胃中に実質的に放出しない。
【００７２】
特定の実施形態では、放出調節製剤は、抗生物質分解剤（または追加の治療薬）を特定のｐＨで放出する。例えば、いくつかの実施形態では、放出調節製剤は、酸性環境で実質的に安定であり、中性近傍からアルカリ環境で実質的に不安定である（例えば、急速に溶解するか、または物理的に不安定である）。いくつかの実施形態では、安定性は、実質的に放出しないことの指標であり、一方で、不安定性は、実質的に放出することの指標である。例えば、いくつかの実施形態では、放出調節製剤は、約７．０以下、または約６．５以下、または約６．０以下、または約５．５以下、または約５．０以下、または約４．５以下、または約４．０以下、または約３．５以下、または約３．０以下、または約２．５以下、または約２．０以下、または約１．５以下、または約１．０以下のｐＨで実質的に安定である。いくつかの実施形態では、本製剤は、低いｐＨ領域で安定であり、したがって、例えば、胃中では実質的に放出しない。いくつかの実施形態では、放出調節製剤は、約１〜約４またはそれ未満のｐＨで実質的に安定であり、より高いｐＨ値で実質的に不安定である。これらの実施形態では、放出調節製剤は、胃中で実質的に放出しない。これらの実施形態では、放出調節製剤は、小腸（例えば、十二指腸、空腸、および回腸の１箇所または複数箇所）および／または大腸（盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、およびＳ状結腸の内の１箇所または複数箇所）で実質的に放出する。いくつかの実施形態では、放出調節製剤は、約４〜約５またはそれ未満のｐＨで実質的に安定であり、結果的に、より高いｐＨ値で実質的に不安定であり、したがって、胃および／または小腸（例えば、十二指腸、空腸、および回腸の内の１箇所または複数箇所）で実質的に放出されない。これらの実施形態では、放出調節製剤は、大腸（例えば、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、およびＳ状結腸の内の１箇所または複数箇所）で実質的に放出される。種々の実施形態では、本明細書で記述したｐＨ値は、対象の状態、例えば、空腹または食後の状態などを考慮に入れるために、当技術分野において既知のように調節してよい。
【００７３】
いくつかの実施形態では、放出調節製剤は、胃液中で実質的に安定で、腸液中で実質的に不安定であり、そのために、小腸（例えば、十二指腸、空腸、および回腸の内の１箇所または複数箇所）および／または大腸（例えば、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、およびＳ状結腸の内の１箇所または複数箇所）で実質的に放出される
【００７４】
いくつかの実施形態では、放出調節製剤は、回腸、および／または回腸末端部、および／または盲腸、および／または回盲部で実質的に不安定である。理論に束縛されることを意図するものではないが、このＧＩ管の特定の領域は、これが抗生物質吸収位置より遠位で、ＧＩマイクロバイオームより近位であり、また同時に、ＧＩ管中で混合を可能とするのに十分に上流にあるので、好都合である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、放出調節製剤は、胃液中で安定でありまたは酸性環境で安定である。これらの放出調節製剤は、放出調節製剤中の約３０重量％以下の抗生物質分解剤および／または追加の治療薬を、約４〜約５またはそれ未満のｐＨの胃液中で、または約４〜約５またはそれ未満のｐＨの模擬胃液中で、約１５分、または約３０分、または４５分、または約６０分、または約９０分で放出する。本発明の放出調節製剤は、約０重量％〜約３０重量％、約０重量％〜約２５重量％、約０重量％〜約２０重量％、約０重量％〜約１５重量％、約０重量％〜約１０重量％、約５重量％〜約３０重量％、約５重量％〜約２５重量％、約５重量％〜約２０重量％、約５重量％〜約１５重量％、約５重量％〜約１０重量％の放出調節製剤中の抗生物質分解剤および／または追加の治療薬を、約４〜約５またはそれ未満のｐＨの胃液中で、または約４〜約５またはそれ未満のｐＨの模擬胃液中で、約１５分、または約３０分、または４５分、または約６０分、または約９０分で放出する。本発明の放出調節製剤は、放出調節製剤中の約１重量％、約２重量％、約３重量％、約４重量％、約５重量％、約６重量％、約７重量％、約８重量％、約９重量％、または約１０重量％の全抗生物質分解剤および／または追加の治療薬を、５未満のｐＨの胃液中で、または５未満のｐＨの模擬胃液中で、約１５分、または約３０分、または４５分、または約６０分、または約９０分で放出する。
【００７６】
いくつかの実施形態では、放出調節製剤は、腸液中で不安定である。これらの放出調節製剤は、放出調節製剤中の約７０重量％以上の抗生物質分解剤および／または追加の治療薬を、腸液または模擬腸液中で、約１５分、または約３０分、または４５分、または約６０分、または約９０分で放出する。いくつかの実施形態では、放出調節製剤は、中性近傍からアルカリ環境中で不安定である。これらの放出調節製剤は、放出調節製剤中の約７０重量％以上の抗生物質分解剤および／または追加の治療薬を、約４〜５またはそれ超のｐＨの腸液中または約４〜５またはそれ超のｐＨの模擬腸液中で、約１５分、または約３０分、または４５分、または約６０分、または約９０分で放出する。中性近傍またはアルカリ環境中で不安定な放出調節製剤は、放出調節製剤中の７０重量％以上の抗生物質分解剤および／または追加の治療薬を、約５超のｐＨを有する体液（例えば、約５〜約１４、約６〜約１４、約７〜約１４、約８〜約１４、約９〜約１４、約１０〜約１４、または約１１〜約１４のｐＨを有する体液）中で、約５分〜約９０分、または約１０分〜約９０分、または約１５分〜約９０分、または約２０分〜約９０分、または約２５分〜約９０分、または約３０分〜約９０分、または約５分〜約６０分、または約１０分〜約６０分、または約１５分〜約６０分、または約２０分〜約６０分、または約２５分〜約９０分、または約３０分〜約６０分で放出し得る。
【００７７】
模擬胃液および模擬腸液の例には、限定されないが、２００５  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  ２３ＮＦ／２８ＵＳＰ  ｉｎ  Ｔｅｓｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓの２８５８頁で開示されているもの、および／またはその他の当業者に既知の模擬胃液および模擬腸液、例えば、酵素なしで調製された模擬胃液および／または腸液が含まれる。
【００７８】
種々の実施形態では、抗生物質分解剤を含む放出調節製剤は、キームス中で実質的に安定である。例えば、いくつかの実施形態では、投与後、約１０時間、または９時間、または８時間、または７時間、または６時間、または５時間、または４時間、または３時間、または２時間、または１時間で、約５０％未満、または約４０％未満、または約３０％未満、または約２０％未満、または約１０％未満の抗生物質分解剤の減少がある。
【００７９】
種々の実施形態では、本発明の放出調節製剤は、１種または複数の遅延放出コーティングなどの放出調節コーティングを使用して、必要に応じ追加の治療薬と共に、抗生物質分解剤のＧＩ管に対する効果的で遅延した十分な送達を提供する。一実施形態では、遅延放出コーティングは、酸性環境で実質的に安定で、中性近傍からアルカリ環境で実質的に不安定な腸溶剤を含む。ある実施形態では、遅延放出コーティングは、胃液中で実質的に安定な腸溶剤を含む。腸溶剤は、例えば、メタクリル酸コポリマー、セルロースアセタートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ポリビニルアセテートフタレート、カルボキシメチルエチルセルロース、およびオイドラギット型ポリマー（ポリ（メタクリル酸、メチルメタクリレート））、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート、セルロースアセテートトリメリテート、シェラックまたはその他の好適な腸溶コーティングポリマーから選択できる。オイドラギット型ポリマーには、例えば、オイドラギットＦＳ３０Ｄ、Ｌ３０Ｄ−５５、Ｌ１００−５５、Ｌ１００、Ｌ１２．５、Ｌ１２．５Ｐ、ＲＬ３０Ｄ、ＲＬＰＯ、ＲＬ１００、ＲＬ１２．５、ＲＳ３０Ｄ、ＲＳＰＯ、ＲＳ１００、ＲＳ１２．５、ＮＥ３０Ｄ、ＮＥ４０Ｄ、ＮＭ３０Ｄ、Ｓ１００、Ｓ１２．５、およびＳ１２．５Ｐが挙げられる。いくつかの実施形態では、オイドラギットＦＳ３０Ｄ、Ｌ３０Ｄ−５５、Ｌ１００−５５、Ｌ１００、Ｌ１２．５、Ｌ１２．５ＰＲＬ３０Ｄ、ＲＬＰＯ、ＲＬ１００、ＲＬ１２．５、ＲＳ３０Ｄ、ＲＳＰＯ、ＲＳ１００、ＲＳ１２．５、ＮＥ３０Ｄ、ＮＥ４０Ｄ、ＮＭ３０Ｄ、Ｓ１００、Ｓ１２．５およびＳ１２．５Ｐの内の１種または複数が使われる。腸溶剤は、前述の溶液または分散体の組み合わせであってよい。種々の実施形態では、異なるタイプのオイドラギットを組み合わせることができ、または複数の異なるタイプのオイドラギットコーティングを組み合わせて、標的化送達を実現し得る。例えば、放出調節製剤は、２種の腸溶性ポリマー（例えば、オイドラギット）のコーティング、外層および部分的中和腸溶性ポリマーおよび緩衝剤の内層を含んでよい。このような製剤は、腸溶性ポリマーの単一コーティングに比べて、標的ｐＨで開始されるより迅速な薬剤の放出を可能とし、例えば、回腸および／または回盲部への標的化送達に使用することができる。
【００８０】
一実施形態では、放出調節製剤は、胃液中で基本的に無傷のままである、または胃液に基本的に不溶性であり得る１種または複数の遅延放出コーティングを含んでよい。遅延放出コーティングの安定性は、ｐＨ依存とすることができる。ｐＨ依存性である遅延放出コーティングは、酸性環境（ｐＨ約５以下）では実質的に安定であり、中性近傍からアルカリ環境（ｐＨ約５超）では実質的に不安定である。例えば、遅延放出コーティングは、小腸（例えば、十二指腸、空腸、および回腸の１箇所または複数箇所）および／または大腸（盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、およびＳ状結腸の内の１箇所または複数箇所）で認められるような中性近傍からアルカリ環境で基本的に崩壊または溶解し得る。
【００８１】
非限定的例であるが、ｐＨの上昇に伴い溶解する種々のオイドラギット製剤：ｐＨ＞５．５（オイドラギットＬ３０Ｄ−５５０）、ｐＨ＞６．０（オイドラギットＬ１２．５）、およびｐＨ＞７．０（オイドラギットＦＳ３０Ｄ）で溶解する製剤が存在する。回腸は小腸中で最高の７．３〜７．８の範囲のｐＨを有するので、オイドラギットＦＳ３０Ｄを使って抗生物質分解酵素を含む製剤をコートすることにより、回腸に到達するまで製剤の溶解を遅らせて、それにより、抗生物質分解酵素の放出を回腸に限局化し得る。しかし、空腸は、６．６〜７．４の範囲のｐＨを有し、したがって、ｐＨが７．０以上の場合、一部の患者で、放出が空腸で開始される場合がある。このような実施形態では、抗生物質分解酵素は、記載のように、抗生物質／阻害剤の組み合わせと共に送達し得る。異なるタイプのオイドラギットを相互に組み合わせることができ、または複数の異なるタイプのオイドラギットコーティングを組み合わせて、溶解プロファイルを微調整し、標的化送達を実現して最適機能を達成できる。例えば、ＤＵＯＣＯＡＴ（ＫＵＥＣＥＰＴ）は、２種の腸溶性ポリマー（オイドラギットに類似）のコーティング、外層および部分的中和腸溶性ポリマーおよび緩衝剤の内層を使用する。ＤＵＯＣＯＡＴ技術は、腸溶性ポリマーの単一コーティングに比べて、標的ｐＨで開始されるより迅速な治療薬の放出を可能とする（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍａ．７４：３１１；この文献の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。放出が、回腸および／または回盲部に標的化されることが１０人の健康なボランティアで実証された（Ｖａｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍａ．８４：５７３）。この文献の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８２】
別の実施形態では、遅延放出コーティングは、水溶液中の場合、溶液中のｐＨおよび／または酵素の存在と関係なく、時間に応じて分解してよい。このようなコーティングは、水不溶性ポリマーを含んでよい。その水溶液中の溶解度は、したがって、ｐＨに無関係である。本明細書で使用される場合、用語の「ｐＨに無関係」は、ポリマーの水透過性およびその薬剤成分を放出する能力が、ｐＨのに依存しないおよび／または極めてわずかにのみｐＨに依存することを意味する。このようなコーティングを使って、例えば、持続放出製剤を調製し得る。好適な水不溶性ポリマーには、水性媒体、例えば、溶液のｐＨにかかわらず水に実質的に不溶性である薬学的に許容可能な非毒性ポリマーが含まれる。好適なポリマーとしては、セルロースエーテル、セルロースエステル、またはセルロースエーテルエステル、すなわち、セルロース骨格上のいくつかのヒドロキシ基がアルキル基で置換され、いくつかのヒドロキシル基がアルカノイル基で修飾されているセルロース誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。例としては、エチルセルロース、アセチルセルロース、ニトロセルロース、などが挙げられる。不溶性ポリマーのその他の例としては、ラッカー、およびアクリル酸および／またはメタクリル酸エステルポリマー、低四級アンモニウム含量を有するアクリル酸もしくはメタクリル酸のポリマーもしくはコポリマーまたはこれらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されない。不溶性ポリマーのその他の例には、オイドラギットＲＳ、オイドラギットＲＬ、およびオイドラギットＮＥが挙げられる。本発明に有用な不溶性ポリマーには、ポリビニルエステル、ポリビニルアセタール、ポリアクリル酸エステル、ブタジエンスチレンコポリマー、などが挙げられる。一実施形態では、結腸送達は、ゆっくり侵食されるワックスプラグ（例えば、ＰＥＧ６０００を含む、種々のＰＥＧＳ）またはペクチンの使用により達成される。
【００８３】
あるいは、放出調節製剤の安定性は酵素依存性とすることができる。酵素依存性の遅延放出コーティングは、特定の酵素を含まない体液中では実質的に安定であり、酵素を含む体液中では実質的に不安定である。遅延放出コーティングは適切な酵素を含む体液中では基本的に崩壊または溶解する。酵素依存性制御は、例えば、腸中で酵素に曝露時にのみ有効成分を放出するガラクトマンナンなどの物質を使うことにより行うことができる。また、放出調節製剤の安定性は、腸管内菌叢中の微生物酵素の存在下での酵素安定性に依存する可能性がある。例えば、種々の実施形態では、遅延放出コーティングは、腸管内菌叢中の微生物酵素により分解され得る。ある実施形態では、遅延放出コーティングは、小腸中に存在する細菌により分解され得る。別の実施形態では、遅延放出コーティングは、大腸中に存在する細菌により分解され得る。
【００８４】
種々の実施形態では、本発明の放出調節製剤は、即時放出（例えば、摂取時放出）用に設計される。種々の実施形態では、放出調節製剤は、徐放プロファイル、すなわち、長期間にわたる体内（例えば、ＧＩ管）での有効成分（単一または複数）の持続放出プロファイルを有し得る。種々の実施形態では、放出調節製剤は、遅延放出プロファイル、すなわち、摂取時の有効成分（単一または複数）の即時放出ではなく、むしろ、例えば、小腸（例えば、十二指腸、空腸、回腸の内の１箇所または複数箇所）または大腸（例えば、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、結腸Ｓ字部および直腸の内の１箇所または複数箇所）での放出のために、組成物が消化管の下流に達するまで有効成分（単一または複数）の放出を遅延させるプロファイル、を有し得る。例えば、組成物は、腸溶コーティングを行って、小腸または大腸に達するまで有効成分（単一または複数）の放出を遅延させることができる。いくつかの実施形態では、便中に本製剤の実質的な量の有効成分（単一または複数）が存在しない。
【００８５】
種々の実施形態では、放出調節製剤は、結腸中で放出するように設計される。種々の結腸特異的送達手法を利用してよい。例えば、放出調節製剤は、例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＡＰＳ  ＰｈａｒｍＳｃｉＴｅｃｈ（２００２），３（４）：１−９に記載されている結腸特異的薬物送達システム（ＣＯＤＥＳ）を使って処方し得る。この文献の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。このようなシステムによる薬物放出は、ｐＨ感受性ポリマーコーティングと組み合わせた結腸微生物叢により引き起こされる。例えば、製剤は、３層のポリマーを有するコア錠として設計され得る。第１のコーティングは、酸可溶性ポリマー（例えば、オイドラギットＥ）であり、外側コーティングは腸溶性であり、加えて、ヒドロキシプロピルメチルセルロースバリア層が中間に挿入される。別の実施形態では、結腸送達は、抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）と、結腸中で分解する、例えば、ペクチンなどの特定のポリマーとを配合することにより実現し得る。ペクチンは、亜鉛カチオンなどのカチオンを使って、ゲル化または架橋し得る。ある実施形態では、製剤は、イオン結合により架橋したペクチンビーズの形態であり、これはポリマー（例えば、オイドラギットポリマー）でさらにコートされる。さらなる結腸特異的製剤としては、圧力制御薬剤送達システム（例えば、エチルセルロースで調製された）および浸透圧制御薬剤送達システム（すなわち、ＯＲＤＳ−ＣＴ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
本明細書に記載のような、抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）の結腸特異的送達のための製剤は、例えば、インビトロ溶出試験を使って評価し得る。例えば、異なる緩衝液中での並列溶解調査を行って、異なるｐＨレベルでの製剤の挙動特性を明らかにし得る。別の選択肢としては、インビトロ酵素試験を行ってよい。例えば、製剤を細菌に好適する培地を含む発酵槽中でインキュベートし、異なる時間間隔での薬物放出の量を測定し得る。薬物放出調査は、酵素を含む緩衝培地またはラットもしくはモルモットもしくはウサギの盲腸内容物で行うこともでき、特定の時間における薬物放出量が測定される。さらなる実施形態では、イヌ、モルモット、ラット、およびブタなどの動物モデルを使ってインビボ評価を実施してもよい。さらに、結腸特異的薬物送達製剤の臨床評価は、薬物送達インデックス（ＤＤＩ）を計算することにより評価してもよい。ＤＤＩは、ＲＳＣ（血液中の薬物の相対量、すなわち、薬物への相対全身曝露量である）に対するＲＣＥ（薬物への結腸組織の相対曝露量）の相対比である。より高い薬物ＤＤＩは、より良好な結腸薬物送達を示す。結腸からの薬物の吸収は、大腸内視鏡検査および挿管によりモニターし得る。
【００８７】
種々の実施形態では、本製剤は、ＧＩ管中の放出領域で抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）の実質的に均一な溶解を可能とする。ある実施形態では、本製剤は、不完全なまたは不均一な抗生物質分解剤の放出を最小限にする。例えば、遠位小腸または特に結腸で放出される場合、抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）の分布が不均一な場合があり、したがって、局所効果を最小化する製剤が必要である。
【００８８】
いくつかの実施形態では、二重放出製剤が提供される。種々の実施形態では、本発明は、複数用量の抗生物質分解剤を腸に沿った異なる部位、異なる時間、および異なるｐＨで放出する放出調節製剤を提供する。例示的実施形態では、放出調節製剤は、第１の用量の抗生物質分解剤および第２の用量の抗生物質分解剤を含み、第１の用量および第２の用量は腸に沿った異なる部位、異なる時間、および／または異なるｐＨで放出される。例えば、第１の用量は十二指腸で放出され、第２の用量は回腸で放出される。別の例では、第１の用量は空腸で放出され、第２の用量は回腸で放出される。他の実施形態では、第１の用量は小腸に沿った部位（例えば、十二指腸）で放出され、第２の用量は大腸に沿った部位（例えば、上行結腸）で放出される。種々の実施形態では、放出調節製剤は、少なくとも１種の用量、少なくとも２種の用量、少なくとも３種の用量、少なくとも４種の用量、少なくとも５種の用量、少なくとも６種の用量、少なくとも７種の用量、少なくとも８種の用量の抗生物質分解剤を、腸に沿った異なる部位、異なる時間、および／または異なるｐＨで放出し得る。さらに、本明細書の二重放出の説明は、抗生物質分解剤および追加の治療薬を放出する放出調節製剤に当てはまる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、二重放出製剤が提供され、抗生物質分解剤の用量および抗生物質（または抗生物質分解剤の阻害剤）の用量が、腸に沿った異なる部位、異なる時間、および／または異なるｐＨで放出される。例えば、抗生物質（または抗生物質分解剤の阻害剤）の用量は、抗生物質分解剤の用量より遠位で放出される。別の例では、抗生物質（または抗生物質分解剤の阻害剤）の用量は、抗生物質分解剤の用量より近位で放出される。例えば、抗生物質（または抗生物質分解剤の阻害剤）の用量は、回腸および上流に放出され、抗生物質分解剤の用量は、遠位小腸および／または結腸に放出される。
【００９０】
種々の実施形態では、本発明は、１種または複数の抗生物質分解剤を含むベースコートを有するコア粒子およびコートされたコア粒子上に配置された遅延放出コーティングを含む製剤を提供する。遅延放出コーティングは、酸性環境および／または胃液中で実質的に安定であり、および／または中性近傍からアルカリ環境または腸液中で実質的に不安定であり、そのため、コートされた粒子を腸液に曝露してよい。１種または複数の抗生物質分解剤を含むベースコートは、１種または複数の追加の治療薬を含んでよい。必要に応じて、複数のベースコートをコア粒子に適用してよく、それらのベースコートのそれぞれが抗生物質分解剤および／または追加の治療薬を含んでよい。ある実施形態では、コア粒子はスクロースを含む。ある実施形態では、抗生物質分解剤は、不活性のコア（例えば、スクロースコア）上に噴霧し、腸溶性層（例えば、オイドラギットＬ３０Ｄ−５５）を噴霧乾燥して、抗生物質分解剤含有ペレットまたはビーズを形成できる。
【００９１】
必要に応じて、コア粒子は、１種または複数の抗生物質分解剤および／または１種または複数の追加の治療薬を含んでよい。一実施形態では、抗生物質分解剤の１種または複数の用量を、コア粒子中に、例えば、微小球またはミニスフェアの形でカプセル化してよい。例えば、スクロースコアを使わないで、抗生物質分解剤をポリマー（例えば、ラテックス）と組み合わせて、粒子、マイクロカプセル化酵素製剤に形成してよい。このようにして形成されたマイクロスフェアまたはミニスフェアは、必要に応じて遅延放出コーティングで被覆してよい。
【００９２】
粒子（例えば、マイクロスフェア、ミニスフェア、凝集体、など）を生成する種々の手法を酵素タンパク質を取り込むために利用し得る。それらは通常、少なくとも２つの相を含み、１つはタンパク質を含み、もう１つは粒子の骨格を形成するポリマーを含む。最も一般的なものは、ポリマーが第３の成分の添加により溶媒層から分離するように作られるコアセルベーション、または内側の水相はタンパク質を含み、中間有機相はポリマーを含み、外側水相は溶媒が除去されて、例えば、マイクロスフェアまたはミニスフェアが形成できるまで、ｗ／ｏ／ｗ二重エマルジョンを支持する安定剤を含む水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）などの複数相エマルジョンである。あるいは、抗生物質分解剤および安定化賦形剤（例えば、トレハロース、マンニトール、ツイーン８０、ポリビニルアルコール）が混合され、水溶液から噴霧され、収集される。その後、粒子は、乾燥したポリマーおよび放出調節化合物含有水不混和性有機溶媒中に懸濁され、懸濁液の超音波処理により粒子が分散される。追加の手法は、水性相を使用するが有機溶媒は使用しない。特に、酵素タンパク質、緩衝成分、ポリマーラテックス、ならびに安定化および放出調節賦形剤が水中に溶解／分散される。水性分散液が噴霧乾燥され、ラテックスが凝集し、凝集したラテックスの粒子中にタンパク質および賦形剤が組み込まれる。放出調節剤が酸性条件に不溶性であるがより高いｐＨで可溶性である場合（例えば、カルボン酸）、マトリックスからの放出は胃中環境では抑制される。ある実施形態では、抗生物質分解剤は、エマルジョン、マイクロエマルジョン、または懸濁液として最初に可溶化され、その後、固体ミニスフェアまたはマイクロスフェアに形成されてよい。製剤はその後、例えば、遅延放出、徐放、または制御放出コーティングでコートされ、例えば、腸などの特定の場所への送達が達成されてよい。
【００９３】
種々の実施形態では、製剤は複数の放出調節粒子またはビーズまたはペレットまたはマイクロスフェアを含んでよい。ある実施形態では、製剤は、複数のビーズを含むカプセルの形態である。別の実施形態では、製剤は、複数のペレットを含むカプセルの形態である。別の実施形態では、製剤は、複数のマイクロスフェアまたはミニスフェアを含むカプセルの形態である。
【００９４】
いくつかの実施形態では、コートされたコア粒子に遅延放出コーティングを適用する前に、粒子は、必要に応じて、例えば、ｐＨ緩衝化合物などのアルカリ性化合物を含む医薬賦形剤を含む１種または複数の分離層で被覆できる。分離層は基本的にコートされたコア粒子を遅延放出コーティングから分離する。
【００９５】
分離層は、コーティングプロセスのための水および／または有機溶媒を使用してコーティングパン、コーティング造粒機または流動床装置などのコーティング装置で通常使用されるコーティング手順または層化手順を用いて、コートされたコア粒子に適用できる。別の方法として、分離層は、粉末コーティング技術によりコア材料に適用できる。分離層用の材料は、薬学的に許容可能な化合物で、例えば、糖、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどが、単独でまたは混合して使用される。可塑剤、着色剤、顔料、フィラー、粘着防止剤および静電気防止剤などの添加剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムステアリルフマレート、二酸化チタン、滑石およびその他の添加物を同様に分離層中に含めることができる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、遅延放出コーティングでコートされた粒子は、オーバーコート層でさらにコートされてよい。オーバーコート層は、その他のコーティング組成物に対し記載のように適用できる。オーバーコート材料は、薬学的に許容可能な化合物で、糖、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどが、単独でまたは混合して使用される。オーバーコート材料は、遅延放出コーティングでコートされた粒子の起こり得る凝集を防ぎ、圧密化プロセス中のクラック発生から遅延放出コーティングを保護し、錠剤化プロセスを強化できる。
【００９７】
種々の実施形態では、本明細書で記載の抗生物質分解剤は、例えば、当該技術分野において既知の方法を使用して凍結乾燥される。いくつかの実施形態では、凍結乾燥抗生物質分解剤は、腸溶性にコートされた軟質ゲルまたはカプセル中に配置される。
【００９８】
種々の実施形態では、本明細書で記載の抗生物質分解剤は、微生物ベースの放出に適した組成物として処方される。いくつかの実施形態では、抗生物質分解剤は、遺伝子改変された、真菌、細菌、および藻類から任意に選択される微生物による放出用として処方される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変微生物は、１種または複数の抗生物質に耐性がある。例えば、本発明は、本明細書に記載のようにＧＩ管送達用に処方され、抗生物質分解剤を、例えば、分泌により放出する１種または複数の抗生物質分解剤を含む遺伝子改変微生物を含む組成物に関連し得る。例えば、１種または複数の抗生物質分解剤を含む遺伝子改変微生物は、遠位の小腸および／または結腸で放出するように処方され得、放出されると、分泌または別の方法で（例えば、遺伝子改変微生物の死亡または消化により）抗生物質分解剤を放出し、その結果、残留または余剰抗生物質を除去し、ＧＩ管微生物叢の破壊を防止し得る。
【００９９】
種々の実施形態では、１種または複数の抗生物質分解剤を含む遺伝子改変微生物は、生存可能な微生物が腸に送達され、そこで、遺伝子改変微生物により抗生物質分解剤が分泌されるように処方される。一実施形態では、１種または複数の抗生物質分解剤を含む遺伝子改変微生物は、組み換え遺伝子改変微生物を腸中に直接放出する腸溶コーティングカプセルとして処方される。他の実施形態では、１種または複数の抗生物質分解剤を含む遺伝子改変微生物は、ゼラチンカプセルとして処方でき、または１種または複数の抗生物質分解剤を含む遺伝子改変微生物は液体中に溶解され、摂取できる。このような実施形態では、１種または複数の抗生物質分解剤を含む遺伝子改変微生物は、ＧＩ管に沿ったいずれかの部位に送達される。本明細書に記載のように、１種または複数の抗生物質分解剤を含む遺伝子改変微生物は、遠位の小腸および／または結腸で放出され得るが、しかし、ＧＩ管中のいずれかの部位への送達により、例えば、１種または複数の抗生物質分解剤を含む遺伝子改変微生物が、抗生物質の全身作用の活性の低下または妨害をすることなく、目的領域まで通過できることも想定される。例示として、いくつかの実施形態では、組換え型イースト菌、例えば、サッカロマイセス・ブラウディは、胃酸に耐え、腸までの通過の間生存可能なまま残り、そこで、活性抗生物質分解剤を分泌し、下部ＧＩ管中の残留または余剰抗生物質を中和する。
【０１００】
いくつかの実施形態では、１種または複数の抗生物質分解剤を含む遺伝子改変微生物は、素早く小腸を通過するが、結腸中をゆっくり通過し、したがって、結腸中により長く留まり、微生物が分泌または放出するする全ての抗生物質分解剤が結腸中に集中する。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変微生物は、イースト菌である。種々の実施形態では、イースト菌は、サッカロマイセス属菌種、ハンゼヌラ属菌種、クリベロマイセス属菌種、シゾサッカロミセス属菌種、チゴサッカロミセス属菌種、ピキア属菌種、モナスカス属菌種、ゲオトリクム属菌種およびヤロウイア属菌種から選択される。種々の実施形態では、本発明は、抗生物質分解剤の組換え型イースト菌中での発現を意図している。組換え型イースト菌は、１種または複数の抗生物質分解剤をコードし、発現できる発現カセット（単一または複数）の酵母染色体ＤＮＡへの安定統合により生成し得る。あるいは、組換え型イースト菌は、酵母が１種または複数の抗生物質分解剤を安定なエピソームにコードし、発現できる発現カセット（単一または複数）を維持するプロセスを使って生成し得る。組換え型イースト菌は、哺乳動物の腸中で生存可能な任意のイースト菌であってよい。種々の実施形態では、馬乳酒、紅茶キノコまたは乳製品から選択される酵母株などのイースト菌は、既知の生菌能力を有する。
【０１０２】
一実施形態では、組換え型イースト菌は、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。別の実施形態では、組換え型イースト菌は、出芽酵母亜種サッカロマイセス・ブラウディである（非限定的例であるが、ＡＴＣＣ７４３５２および／または米国特許第６，０１０，６９５号および同７，７９９，３２８号中の任意の細胞；これら文献の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。出芽酵母は、４０年以上にわたり生菌として販売されている。これは、抗生物質関連下痢およびクロストリジウム・ディフィシル感染症を含む下痢の予防と処置のために使用されてきた（Ｋｅｌｅｓｉｄｉｓ  ａｎｄ  Ｐｏｔｈｏｕｌａｋｉｓ，Ｔｈｅｒ．Ａｄｖａｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．（２０１２），５：１１１−１２５  ａｎｄ  Ｈａｔｏｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０１２），３：１−１２）。Ｓ．ブラウディは、他の出芽酵母株とは異なり、Ｓ．ブラウディの最適増殖温度が３７℃であるのに対して、他の株はより低温（３０℃〜３３℃）を好み、Ｓ．ブラウディは低ｐＨに耐性があり、胆汁酸に対しては極めて耐性がある（Ｅｄｗａｒｄｓ−Ｉｎｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００７），７３：２４５８−２４６７，Ｇｒａｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００８），５４：２２１−２２７）。Ｓ．ブラウディは、ヒトの腸管で生存することが実証され（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３），１０：１６１５−１６１９）、１０１０細胞の単剤投与後に、０．１％の生存可能な酵母が糞便から回収された。同時抗生物質処置は、回収を２倍に高めた（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３），１０：１６１５−１６１９）。
【０１０３】
一実施形態では、組換え型イースト菌は、ピキア・パストリスである。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変微生物は、細菌細胞である。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、バチルス属菌種である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変微生物は、藻類細胞（例えば、クラミドモナス属菌種、例えば、コナミドリムシ）またはその葉緑体である。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変微生物は、サッカロマイセス・ブラウディ；ピキア・パストリス；ラクトバシラス・ラムノーサスラムノーサス菌ＧＧ；ラクトバシラス・プランタラム２９９ｖ；クロストリジウム・ブチリクムＭ５８８；クロストリジウム・ディフィシレＶＰ２０６２１（無毒のクロストリジウム・ディフィシレ株）；ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバシラス・アシドフィルスの組み合わせ（Ｂｉｏ−Ｋ＋ＣＬ１２８５）；ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバシラス・ブルガリカス、ストレプトコッカス好熱性細菌の組み合わせ（Ａｃｔｉｍｅｌ）；ラクトバシラス・アシドフィルス、ビフィドバクテリウム・ビフィダムの組み合わせ（Ｆｌｏｒａｊｅｎ３）；ラクトバシラス・アシドフィルス、ラクトバシラス・ブルガリカス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス、ラクトバシラス・ブルガリカス・カゼイ、ラクトバシラス・ブルガリカス・プランタルム、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ブレベ、およびストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サーモフィラスの組み合わせ（ＶＳＬ＃３））の内の１種または複数である。
このような遺伝子改変微生物は、例えば、経口などによる腸内を含む、本明細書に記載のように投与してよい。
【０１０６】
種々の実施形態では、本明細書で記載の１種または複数の抗生物質分解剤を含むこのような遺伝子改変微生物は、本明細書に記載の処方パラメータのいずれかを使って処方される。いくつかの実施形態では、本明細書で記載の１種または複数の抗生物質分解剤を含む遺伝子改変微生物は、凍結乾燥される。非限定的例であるが、凍結乾燥は、米国特許第７，７９９，３２８号に記載のものを含む、当該技術分野において既知の方法により行うことができる。この特許の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、凍結乾燥した本明細書で記載の１種または複数の抗生物質分解剤を含む遺伝子改変微生物は、腸溶性にコートされた軟質ゲルまたはカプセル中に配置される。
【０１０７】
種々の実施形態では、本発明の製剤は、米国特許仮出願第６２／０６１，５０７号に記載の形態をとる。この特許の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０８】
種々の実施形態では、本発明の製剤は、米国特許第８，５３５，７１３号および同８，９１１７，７７号および米国特許出願公開第２０１２／０１４１５８５号、同２０１２／０１４１５３１号、同２００６／００１８９６号、同２００７／０２９２５２３号、同２００８／００２００１８号、同２００８／０１１３０３１号、同２０１０／０２０３１２０号、同２０１０／０２５５０８７号、同２０１０／０２９７２２１号、同２０１１／００５２６４５号、同２０１３／０２４３８７３号、同２０１３／０３３０４１１号、同２０１４／００１７３１３号、および同２０１４／０２３４４１８号の内の１件または複数件に記載の形態をとる。これら特許の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０９】
種々の実施形態では、本発明の製剤は、国際公開第２００８／１３５０９０号に記載の形態をとる。この特許の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１０】
種々の実施形態では、本発明の製剤は、米国特許第４，１９６，５６４号；同４，１９６，５６５号；同４，２４７，００６号；同４，２５０，９９７号；同４，２６８，２６５号；同５，３１７，８４９号；同６，５７２，８９２号；同７，７１２，６３４号；同８，０７４，８３５号；同８，３９８，９１２号；同８，４４０，２２４号；同８，５５７，２９４号；同８，６４６，５９１号；同８，７３９，８１２号；同８，８１０，２５９号；同８，８５２，６３１号；および同８，９１１，７８８号ならびに米国特許出願公開第２０１４／０３０２１３２号；同２０１４／０２２７３５７号；同２０１４／００８８２０２号；同２０１３／０２８７８４２号；同２０１３／０２９５１８８号；同２０１３０３０７９６２号；および同２０１３／０１８４２９０号の内の１件または複数件に記載の形態をとる。これら特許の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１１】
本明細書で記載のいずれの抗生物質分解剤および／または医薬組成物（および／または追加の治療薬）も、液剤、懸濁剤、乳濁液、点滴剤、錠剤、丸薬、ペレット、カプセル剤、液体含有カプセル剤、複数粒子含有カプセル剤、散剤、坐剤、乳剤、エアロゾル、噴霧剤、懸濁剤、遅延放出製剤、徐放製剤、制御放出製剤または使用に適するその他の任意の形態をとることができる。一実施形態では、組成物はカプセルまたは錠剤の形態である（例えば、米国特許第５，６９８，１５５号を参照）
【０１１２】
抗生物質分解剤および／または医薬組成物（および／または追加の治療薬）を含む製剤は、好都合にも、単位剤形で提供し得る。例えば、剤形は、１種または複数の補助構成成分を構成するキャリア中に治療薬を混合するステップを含む方法により調製し得る。通常、製剤は、治療薬と、液体キャリア、微粉化固体キャリア、または両方とを均一に、完全に混合し、その後、必要に応じ、生成物を所望の製剤の剤形に成形（例えば、湿式または乾式造粒、散剤ブレンド、などに続けて、加圧錠剤化）することにより調製することができる。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、抗生物質分解剤および／または医薬組成物（および／または追加の治療薬）の投与は、経口、静脈内、および非経口の内のいずれか１種である。いくつかの実施形態では、抗生物質分解剤および／または医薬組成物（および／または追加の治療薬）の投与は、例えば、全身投与された抗生物質との干渉を防ぐために、静脈内経路ではない。他の実施形態では、投与経路には、例えば、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、舌下、鼻腔内、脳内、膣内、経皮、直腸内、吸入、または特に、耳部、鼻、目、または皮膚に対しては局所が含まれる。いくつかの実施形態では、投与は、経口または非経口注射により行われる。
【０１１４】
種々の実施形態では、抗生物質分解剤および／または医薬組成物（および／または追加の治療薬）の投与は、例えば、経口送達、経鼻胃管、腸内挿管（例えば、腸内チューブまたは栄養管、例えば、空腸チューブまたは胃空腸チューブ、など）、内視法、結腸内視術、または浣腸を介して、ＧＩ管へ行われる。
【０１１５】
ある実施形態では、本明細書で記載の抗生物質分解剤および／または医薬組成物（および／または追加の治療薬）は、経口投与することができる。他の実施形態では、抗生物質分解剤および／または医薬組成物（および／または追加の治療薬）はまた、他の任意の都合のよい経路、例えば、静脈内注入またはボーラス注入により、上皮または皮膚粘膜表層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜、など）を介した吸収により投与することができ、また、追加の治療薬と一緒に投与することができる。投与は全身性または局所的とすることができる。いくつかの実施形態では、投与は、例えば、感染部位での抗生物質の加水分解を避けるために、感染の部位には行わない。例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、カプセルへの封入などの各種の送達システムが知られており、投与する目的で使用することができる。
【０１１６】
一実施形態では、本明細書で記載の抗生物質分解剤および／または医薬組成物（および／または追加の治療薬）も、ヒトの経口投与に適した組成物として処方される。経口送達用の組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、水性または油性懸濁剤、粒剤、散剤、スプリンクル、乳剤、カプセル剤、シロップ剤、またはエリキシル剤の形態であってよい。経口投与される組成物は、薬学的に美味な製剤を提供するために、１種または複数種の薬剤、例えば、フルクトース、アスパルテームまたはサッカリンなどの甘味料、ペパーミント、冬緑油またはチェリー油などの調味料、着色料および保存剤を含んでよい。さらに、タブレットまたは丸薬形態では、組成物をコートして崩壊を遅延させて、長期間にわたり持続作用を提供することができる。本明細書で記載のいずれの抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）をも送り出す浸透的に活性な薬剤を取り囲む選択的透過性膜も、経口投与組成物として好適する。これらの後者のプラットフォームでは、カプセルの周りの環境からの液体が追い出し化合物により吸収され、この化合物は膨潤し、開口部を介して薬剤または薬剤組成物と置換する。これらの送達プラットフォームは、即時放出製剤の急上昇プロファイルとは対照的に、実質的に０次の送達プロファイルを提供することができる。グリセロールモノステアレートまたはグリセロールステアレートなどの時間遅延物質も使用することができる。経口組成物には、標準的な賦形剤、例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、エタクリル酸およびこれらの誘導体ポリマー、ならびに炭酸マグネシウムを含めることができる。一実施形態では、賦形剤は医薬品グレードである。活性化合物に加えて、懸濁剤には、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロオキシド、ベントナイト、寒天、トラガント、など、およびこれらの混合物などの沈殿防止剤を含めることができる。
【０１１７】
種々の実施形態では、抗生物質分解剤および／または医薬組成物（および／または追加の治療薬）は、錠剤、ペレット、分散性散剤、顆粒剤、およびカプセル剤などの固形剤形として処方される。一実施形態では、抗生物質分解剤および／または医薬組成物（および／または追加の治療薬）は、カプセルとして処方される。別の実施形態では、抗生物質分解剤および／または医薬組成物（および／または追加の治療薬）は、錠剤として処方される。さらに別の実施形態では、抗生物質分解剤および／または医薬組成物（および／または追加の治療薬）は、軟質ゲルカプセルとして処方される。さらなる実施形態では、抗生物質分解剤および／または医薬組成物（および／または追加の治療薬）は、ゼラチンカプセルとして処方される。
【０１１８】
非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下および関節内注射および注入）に好適な剤形には、例えば、液剤、懸濁剤、分散剤、乳剤、などが含まれる。それらは、無菌の固体組成物（例えば、凍結乾燥組成物）の形態で製造することもでき、これは、使用直前に、無菌の注射可能媒体中に溶解または懸濁し得る。それらは、例えば、懸濁剤または分散剤を含んでよい。
【０１１９】
投与および投与量
本発明により投与される抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）の実際の用量は、例えば、特定の剤形および投与方法に応じて変わることは理解されよう。当業者なら、抗生物質分解剤の作用を変える多くの要因（例えば、体重、性別、食事、投与時期、投与経路、排出速度、対象の状態、薬剤の組み合わせ、遺伝的素因および反応感度）を考慮に入れることができる。投与は、最大耐量の範囲内で連続的にまたは１種または複数の別々の用量で実施できる。与えられた一連の条件に対する最適投与速度は、従来の用量投与試験を使って、当業者により確認できる。
【０１２０】
抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）の個々の用量は、例えば、単位剤形当たり、約０．０１ｍｇ〜約５，０００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約４，０００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約３，０００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約２，０００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約９５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約９００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約８５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約８００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約７５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約７００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約６５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約６００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約５５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約４５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約４００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約３５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約３００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約２５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約２００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約１５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約１００ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約９０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約８０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約７０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約６０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約５０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約４０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約３０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約５ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約３ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約１ｍｇの活性成分、または約５ｍｇ〜約８０ｍｇの活性成分を含む単位剤形（例えば、錠剤またはカプセル）として投与できる。例えば、単位剤形は、約０．０１ｍｇ、約０．０２ｍｇ、約０．０３ｍｇ、約０．０４ｍｇ、約０．０５ｍｇ、約０．０６ｍｇ、約０．０７ｍｇ、約０．０８ｍｇ、約０．０９ｍｇ、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．８ｍｇ、約０．９ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇ、約６００ｍｇ、約６５０ｍｇ、約７００ｍｇ、約７５０ｍｇ、約８００ｍｇ、約８５０ｍｇ、約９００ｍｇ、約９５０ｍｇ、約１，０００ｍｇ、約２，０００ｍｇ、約３，０００ｍｇ、約４，０００ｍｇ、または約５，０００ｍｇ（これらの間の全ての値および範囲を含む）の有効成分を含むことができる。
【０１２１】
一実施形態では、抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）は、約０．０１ｍｇ〜約１００ｍｇ毎日の量、約０．０１ｍｇ〜約５，０００ｍｇ毎日、約０．０１ｍｇ〜約４，０００ｍｇ毎日、約０．０１ｍｇ〜約３，０００ｍｇ毎日、約０．０１ｍｇ〜約２，０００ｍｇ毎日、約０．０１ｍｇ〜約１，０００ｍｇ毎日、約０．０１ｍｇ〜約９５０ｍｇ毎日、約０．０１ｍｇ〜約９００ｍｇ毎日、約０．０１ｍｇ〜約８５０ｍｇ毎日、約０．０１ｍｇ〜約８００ｍｇ毎日、約０．０１ｍｇ〜約７５０ｍｇ毎日、約０．０１ｍｇ〜約７００ｍｇ毎日、約０．０１ｍｇ〜約６５０ｍｇ毎日、約０．０１ｍｇ〜約６００ｍｇ毎日、約０．０１ｍｇ〜約５５０ｍｇ毎日、約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇ毎日、約０．０１ｍｇ〜約４５０ｍｇ毎日、約０．０１ｍｇ〜約４００ｍｇ毎日、約０．０１ｍｇ〜約３５０ｍｇ毎日、約０．０１ｍｇ〜約３００ｍｇ毎日、約０．０１ｍｇ〜約２５０ｍｇ毎日、約０．０１ｍｇ〜約２００ｍｇ毎日、約０．０１ｍｇ〜約１５０ｍｇ毎日、約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇ毎日、約０．１ｍｇ〜約９５ｍｇ毎日、約０．１ｍｇ〜約９０ｍｇ毎日、約０．１ｍｇ〜約８５ｍｇ毎日、約０．１ｍｇ〜約８０ｍｇ毎日、約０．１ｍｇ〜約７５ｍｇ毎日、約０．１ｍｇ〜約７０ｍｇ毎日、約０．１ｍｇ〜約６５ｍｇ毎日、約０．１ｍｇ〜約６０ｍｇ毎日、約０．１ｍｇ〜約５５ｍｇ毎日、約０．１ｍｇ〜約５０ｍｇ毎日、約０．１ｍｇ〜約４５ｍｇ毎日、約０．１ｍｇ〜約４０ｍｇ毎日、約０．１ｍｇ〜約３５ｍｇ毎日、約０．１ｍｇ〜約３０ｍｇ毎日、約０．１ｍｇ〜約２５ｍｇ毎日、約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇ毎日、約０．１ｍｇ〜約１５ｍｇ毎日、約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ毎日、約０．１ｍｇ〜約５ｍｇ毎日、約０．１ｍｇ〜約３ｍｇ毎日、約０．１ｍｇ〜約１ｍｇ毎日、または約５ｍｇ〜約８０ｍｇ毎日の量で投与される。種々の実施形態では、抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）は、約０．０１ｍｇ、約０．０２ｍｇ、約０．０３ｍｇ、約０．０４ｍｇ、約０．０５ｍｇ、約０．０６ｍｇ、約０．０７ｍｇ、約０．０８ｍｇ、約０．０９ｍｇ、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．８ｍｇ、約０．９ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇ、約６００ｍｇ、約６５０ｍｇ、約７００ｍｇ、約７５０ｍｇ、約８００ｍｇ、約８５０ｍｇ、約９００ｍｇ、約９５０ｍｇ、約１，０００ｍｇ、約２，０００ｍｇ、約３，０００ｍｇ、約４，０００ｍｇ、または約５，０００ｍｇ（これらの間の全ての値および範囲を含む）の一日量で投与される。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）の好適な投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／（対象のｋｇ体重）の範囲、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．６ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ、約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．９ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．１ｍｇ／ｋｇ、約１．２ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇ、約１．４ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約３０ｍｇ／ｋｇ体重、約４０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約６０ｍｇ／ｋｇ体重、約７０ｍｇ／ｋｇ体重、約８０ｍｇ／ｋｇ体重、約９０ｍｇ／ｋｇ体重、または約１００ｍｇ／ｋｇ体重（これらの間の全ての値および範囲を含む）である。他の実施形態では、抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）の好適な投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約９０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約９ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約８ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約７ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約４ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１．５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、または約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
【０１２３】
本発明の特定の実施形態では、抗生物質分解剤は、例えば、１日２回以上（例えば、ほぼ毎日２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回）、ほぼ１日１回、ほぼ１日おき、ほぼ３日おき、ほぼ週１回、ほぼ２週毎に１回、ほぼ月１回、ほぼ２ヶ月毎に１回、ほぼ３ヶ月毎に１回、ほぼ６ヶ月毎に１回、またはほぼ年１回投与してよい。
【０１２４】
追加の治療薬および併用療法または共製剤
本製剤の投与は、追加の治療薬と組み合わせてよい。追加の治療薬および本製剤の同時投与は、同時または逐次であってよい。さらに、本製剤は、追加の治療薬を含んでもよい（例えば、共製剤により）。例えば、追加の治療薬および抗生物質分解剤は、単一の製剤に組み合わせてよい。あるいは、追加の治療薬および抗生物質分解剤は、別々に処方してよい。
【０１２５】
一実施形態では、追加の治療薬および抗生物質分解剤は、対象に同時に投与される。本明細書で使用される場合、用語の「同時に」は、追加の治療薬および抗生物質分解剤が約６０分以下、例えば、約３０分以下、約２０分以下、約１０分以下、約５分以下、または約１分以下の時間間隔で投与されることを意味する。追加の治療薬および抗生物質分解剤の投与は、単一製剤（例えば、追加の治療薬および抗生物質分解剤を含む製剤）または別々の製剤（例えば、追加の治療薬を含む第１の製剤および抗生物質分解剤を含む第２の製剤）の同時投与により行うことが可能である。
【０１２６】
さらなる実施形態では、追加の治療薬および抗生物質分解剤は、対象に同時に投与されるが、追加の治療薬および抗生物質分解剤のそれらそれぞれの剤形（または同時に処方される場合は、単一単位剤形）からのＧＩ管中での放出は順次に発生する。
【０１２７】
同時投与は、追加の治療薬および抗生物質分解剤の投与のタイミングが、それらの薬理学的活性が時がたてば重なりあうような場合には、同時に投与される追加の治療薬を必要としない。例えば、追加の治療薬および抗生物質分解剤は、順次に投与できる。本明細書で使用される場合、用語の「順次に」は、追加の治療薬および抗生物質分解剤が約６０分を超える時間間隔で投与されることを意味する。例えば、追加の治療薬と抗生物質分解剤との逐次投与の間の時間を、約６０分を超えて、約２時間を超えて、約５時間を超えて、約１０時間を超えて、約１日を超えて、約２日を超えて、約３日を超えて、約１週間を超えて離すことができる。最適投与時間は、投与される追加の治療薬および抗生物質分解剤の代謝、排泄速度、および／または薬力学的活性に依存するであろう。追加の治療薬または抗生物質分解剤のいずれかを、最初に投与してよい。
【０１２８】
同時投与はまた、同じ投与経路により対象に投与される追加の治療薬を必要としない。むしろ、追加の治療薬は、任意の適切な経路、例えば、非経口的または非経口ではない経路で投与できる。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、追加の治療薬は抗菌剤であり、抗菌剤には、限定されないが、セファロスポリン系抗生物質（セファレキシン、セフロキシム、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン、セファクロール、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、およびセフトビプロール）；フルオロキノロン系抗生物質（シプロ、レヴァキン、フロキシン、テクイン、アベロックスおよびノルフロックス）；テトラサイクリン系抗生物質（テトラサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、およびドキシサイクリン）；ペニシリン系抗生物質（アモキシシリン、アンピシリン、ペニシリンＶ、ジクロキサシリン、カルベニシリン、バンコマイシン、およびメチシリン）；モノバクタム系抗生物質（アズトレオナム）；およびカルバペネム系抗生物質（エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、およびメロペネム）が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書で記載のペニシリン、セファロスポリン、モノバクタム、およびカルバペネム系抗生物質のいずれかが、追加の治療薬であってよい。いくつかの実施形態では、追加の治療薬は抗菌剤であり、抗菌剤には、限定されないが、本明細書の他の箇所で記載の抗生物質が含まれる。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、追加の治療薬は抗生物質分解剤阻害剤である。阻害剤の例には、本明細書で記載のいずれかの薬剤が含まれる。阻害剤の例には、タゾバクタム、スルバクタム、ＥＤＴＡ、クラブラン酸、アビバクタム、モノバクタム誘導体、ＡＴＭＯ誘導体、ペネム（例えば、ＢＲＬ４２７１５およびその誘導体、Ｓｙｎ１０１２、オキサペネム、トリネム、１−β−メチルカルバペネム）、ペニシリンおよびセファロスポリンスルホン誘導体（例えば、Ｃ−２／Ｃ−３−置換ペニシリンおよびセファロスポリンスルホン、Ｃ−６−置換ペニシリンスルホン）、非βラクタム阻害剤（例えば、ボロン酸遷移状態類似体、ホホネート、ＮＸＬ１０４、ヒドロキシメート）およびチオール誘導体などのメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤、ピリジンジカルボキシレート、トリフルオロメチルケトンおよびアルコール、カルバペネム類似体、三環式天然産物、コハク酸誘導体、ならびにペニシリン酸Ｃ−６−メルカプトメチルが挙げられる。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、例えば、本明細書で記載のＣＤＩの処置に使われる補助的療法剤である。いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、メトロニダゾール（例えば、ＦＬＡＧＹＬ）、フィダキソマイシン（例えば、ＤＩＦＩＣＩＤ）、またはバンコマイシン（例えば、バンコシン）、リファキシミン、木炭系結合剤／吸着剤（例えば、ＤＡＶ１３２）、糞便細菌療法剤、プロバイオティック療法剤（例えば、Ｉｎｔｎａｔ’ｌ  Ｊ  Ｉｎｆ  Ｄｉｓ，１６（１１）：ｅ７８６を参照されたい。この内容は参照により本明細書に組み込まれる。プロバイオティクス剤の例は、サッカロマイセス・ブラウディ、ラクトバシラス・ラムノーサスラムノーサス菌ＧＧ；ラクトバシラス・プランタラム２９９ｖ；クロストリジウム・ブチリクムＭ５８８；クロストリジウム・ディフィシレＶＰ２０６２１（無毒のクロストリジウム・ディフィシレ株）；ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバシラス・アシドフィルスの組み合わせ（Ｂｉｏ−Ｋ＋ＣＬ１２８５）；ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバシラス・ブルガリカス、ストレプトコッカス・サーモフィルスの組み合わせ（Ａｃｔｉｍｅｌ）；ラクトバシラス・アシドフィルス、ビフィドバクテリウム・ビフィダムの組み合わせ（Ｆｌｏｒａｊｅｎ３）；ラクトバシラス・アシドフィルス、ラクトバシラス・ブルガリカス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス、ラクトバシラス・ブルガリカス・カゼイ、ラクトバシラス・ブルガリカス・プランタルム、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ブレベ、ストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サーモフィラスの組み合わせ（ＶＳＬ＃３））および抗体またはその他の生物学的療法剤（例えば、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１０；３６２（３）：１９７（この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているクロストリジウム・ディフィシレ毒素ＡおよびＢに対するモノクローナル抗体）；例えば、米国特許出願公開第２０１３／００５８９６２号（この内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載の、１つまたは複数の配列番号（例えば、配列番号５９、６０、９５、６７、６８および８７の１つまたは複数）に向けられているマルチマーとして配置された中和結合タンパク質）または任意のクロストリジウム・ディフィシレ二元毒素に対する中和結合タンパク質である。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、追加の治療薬は下痢止め剤である。本発明での使用に好適する下痢止め剤には、限定されないが、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤；アヘン、パレゴリックおよびコデインのチンキなどの天然オピオイド；ジフェノキシラート、ジフェノキシンおよびロペラミドなどの合成オピオイド；次サリチル酸ビスマス、ランレオチド、バプレオチドおよびオクトレオチド；モチリンアンタゴニスト；セレコキシブなどのＣＯＸ２阻害剤；グルタミン、サリドマイド；およびカオリン、ペクチン、ベルベリンおよびムスカリン性薬物などの従来の下痢止め治療薬が挙げられる。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、ステロイド性抗炎症剤または非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤＳ）などの抗炎症剤である。ステロイド、特に副腎皮質ホルモン剤およびそれらの合成類似体は当該技術分野においてよく知られている。本発明で有用な副腎皮質ステロイドの例には、ヒドロキシルトリアムシノロン、α−メチルデキサメタゾン、β−メチルβ−メタゾン、ベクロメタゾンジプロピオネート、β−メタゾンベンゾエート、β−メタゾンジプロピオネート、β−メタゾンバレレート、クロベタゾールバレレート、デソニド、デソキシメタゾン、デキサメタゾン、ジフロラソンジアセテート、ジフルコルトロンバレレート、フルアドレノロン、フルクロロロンアセトニド、フルメタゾンピバレート、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルコルチンブチルエステル、フルオコルトロン、フルプレドニデン（フルプレドニリデン）アセテート、フルランドレノロン、ハルシノニド、ヒドロコルチゾンアセテート、ヒドロコルチゾンブチレート、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、コルチゾン、コルトドキソン、フルセトニド、フルドロコルチゾン、ジフルオロゾンジアセテート、フルラドレノロンアセトニド、メドリゾン、アムシナフェル、アムシナフィド、ベタメタゾンおよびそのエステル残部、クロロプレドニソン、クロコルテロン、クレシノロン、ジクロリゾン、ジフルプレドネート、フルクロロニド、フルニソリド、フルオロメタロン、フルペロロン、フルプレドニソロン、ヒドロコルチゾン、メプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ベクロメタゾンジプロピオネートが挙げられるが、これらに限定されない。本発明で使用してよい（ＮＳＡＩＤＳ）には、限定されないが、サリチル酸、アセチルサリチル酸、サリチル酸メチル、グリコールサリチレート、サリチルアミド、ベンジル−２，５−ジアセトキシ安息香酸、イブプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、ケトプロフェン、エトフェナメート、フェニルブタゾン、およびインドメタシンが挙げられる。追加の抗炎症剤は、例えば，米国特許第４，５３７，７７６号に記載されている。この特許の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、追加の治療薬は鎮痛剤であってよい。本発明の組成物および方法で有用な鎮痛剤には、限定されないが、モルヒネ、コデイン、ヘロイン、メサドンおよび関連化合物、テバイン、オルピアビン（ｏｒｐｉａｖｉｎｅ）、ならびにこれらの誘導体、ブプレノルフィン、ピペリジン、モルフィナン、ベンゾモルファン、テトラヒドロイソキノリン、チアンブタン（ｔｈｉａｍｂｕｔａｎｅ）、ベンジルアミン、チリジン、ビミノール、ネホパム、カプサイシン（８−メチル−Ｎ−バニリル−６Ｅ−ノネンアミド）、「合成」カプサイシン（Ｎ−バニリルノネンアミド）、および関連化合物が挙げられる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、抗ウイルス薬であってよく、抗ウイルス薬には、限定されないが、アバカビル、アシクロビル、アデホビル、アンプレナビル、アタザナビル、シドフォヴィル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エファビレンツ、エルビテグラビル、エムトリシタビン、エンフビルチド、エトラビリン、ファムシクロビル、およびホスカルネットが挙げられる。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、本発明は本明細書で記載の１種または複数の抗生物質分解剤の同時投与（例えば、共製剤または別々の製剤によって）を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は本明細書で記載の１種または複数の抗生物質分解剤と、当該技術分野において既知の他の抗生物質分解剤との同時投与を提供する。例えば、本明細書で記載の抗生物質分解剤は、クラスＥＣ３．５．２．６の１種または複数のβ−ラクタマーゼ酵素と同時投与し得る。いくつかの実施形態では、本明細書で記載の抗生物質分解剤は、Ｂｕｓｈらの提案（１９９５，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１２１１−１２３３；この文献の全内容は参照により本明細書に組み込まれる）による機能分類スキームによる１種または複数のグループ１、２、３、または４β−ラクタマーゼ、またはβ−ラクタマーゼをそれらのアミノ酸配列に基づいて分類するＡｍｂｌｅｒ分類（Ａｍｂｌｅｒ  １９８０，Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ．２８９：３２１−３３１；この文献の全内容は参照により本明細書に組み込まれる）によるクラスＡ、Ｂ、Ｃ、またはＤβ−ラクタマーゼと同時投与し得る。
【０１３７】
種々の実施形態では、本明細書で記載の抗生物質分解剤は、ペニシリンおよび／またはセファロスポリンを不活化または加水分解する１種または複数のβ−ラクタマーゼ酵素と同時投与し得る。ある実施形態では、本明細書で記載の抗生物質分解剤は、Ｐ１Ａ、Ｐ３ＡまたはＳＹＮ−００４（同じ酵素の別名）、またはＰ４Ａから選択される１種または複数のβ−ラクタマーゼ酵素と同時投与し得る。ある実施形態では、β−ラクタマーゼはＰ１Ａまたはその誘導体である。Ｐ１Ａ酵素は、バチルス・リケニフォルミス７４９／Ｃの低分子エキソβ−ラクタマーゼの組換え型であり（国際公開第２００８／０６５２４７号参照）、これは、クラスＡに属し、機能分類におけるサブグループ２ａに分類される。バチルス・リケニフォルミスのβ−ラクタマーゼおよびそのＰ１Ａ誘導体は、例えばペニシリン、アンピシリン、アモキシシリン、またはピペラシリンを分解する高い加水分解能力を有するペニシリナーゼであると考えられ、それらは通常、クラブラン酸、スルバクタム、またはタゾバクタムなどの活性部位特異的β−ラクタマーゼ阻害剤によって阻害される。別の実施形態では、β−ラクタマーゼは、例えば、国際公開第２０１１／１４８０４１号および同２０１５／１６１２４３号に記載されているＰ３Ａまたはその誘導体である。これらの特許の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。さらなる実施形態では、β−ラクタマーゼは、例えば、国際公開第２０１５／１６１２４３号に記載されているＰ４Ａまたはその誘導体である。この特許の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３８】
すべての追加の治療薬組成物および方法に対し、本明細書で記載のように、ＧＩ管の種々の部分への標的化を用い得る。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本製剤を対象に投与して追加の治療薬による処置が回避される。例えば、クロストリジウム・ディフィシル感染症（ＣＤＩ）および／またはクロストリジウム・ディフィシル関連疾患の予防の場合、本製剤を対象に投与して、例えば、バンコマイシンの投与の必要性が回避される。
【０１４０】
処置方法
種々の態様では、本発明は、対象の消化管マイクロバイオームを保護する方法を提供し、該方法は、抗生物質分解剤を含む有効量の医薬組成物、例えば、本明細書で記載の製剤のいずれかを投与することを含む。種々の実施形態では、対象は抗生物質を使って現在処置を受けているか、または最近処置を受けたことがある。抗生物質分解剤は、抗生物質を分解または不活化することができ、本明細書で記載の抗生物質分解剤のいずれか１種であってよい。種々の実施形態では、抗生物質は、本明細書に記載のペニシリン、セファロスポリン、モノバクタム、およびカルバペネムの内の１種または複数である。ある実施形態では、抗生物質分解剤は、Ｐ２Ａであり、抗生物質はエルタペネムである。ある実施形態では、抗生物質分解剤は、ＮＤＭ−１であり、抗生物質はセフェピムおよび／またはセフォペラゾンである。ある実施形態では、抗生物質分解剤は、ＫＰＣ−１／２であり、抗生物質はアズトレオナムである。
【０１４１】
種々の実施形態では、対象には、限定されないが、抗生物質を使って処置を現在受けているかまたは最近処置を受けたことがある対象などのマイクロバイオーム媒介障害に対する特定のリスクのある対象が含まれる。例えば、対象は、過去３０日程度の間、抗生物質を摂取した可能性がある、および／または免疫系が低下した可能性がある（例えば、慢性疾患が原因で）、および／または女性である、および／または高齢者である（例えば、６５才を超える）、および／または高齢女性である、および／または胸焼けまたは胃酸障害で処置を受けている（または受けたことがある）（例えば、ＰＲＥＶＡＣＩＤ、ＴＡＧＡＭＥＴ、ＰＲＩＬＯＳＥＣ、またはＮＥＸＩＵＭなどの薬剤および関連薬剤を使って）、および／または集中治療室を含めて最近入院したことがある、または老人ホームで暮らしている。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法および使用により、院内感染症および／または二次新興感染症および／または医療関連感染症（ＨＡＩ）が処置または予防される。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、本発明の方法および使用は、初期療法剤および／または補助的療法剤が対象に投与される方法および使用を含む。初期療法および／または補助的療法は、例えば、マイクロバイオーム媒介障害または疾患の検出時に、このような障害または疾患を処置するために使用される療法を示す。いくつかの実施形態では、初期療法剤および／または補助的療法剤は、本明細書で記載の、メトロニダゾール、バンコマイシン、フィダキソマイシン、リファキシミン、木炭系結合剤／吸着剤、糞便細菌療法剤、プロバイオティック療法剤、および抗体療法剤の内の１種または複数種である。種々の実施形態では、本発明の方法および使用は、これらの初期療法剤および／または補助的療法剤のいずれかに対するアジュバントとしての抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）の使用を含む医薬組成物および製剤の使用を含む（同時投与または逐次投与を含む）。種々の実施形態では、本発明の方法および使用は、初期療法剤および／または補助的療法剤を受けている対象における抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）を含む医薬組成物および製剤の使用を含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本発明の方法および使用は、抗生物質および抗生物質分解剤の阻害剤が対象に投与される方法および使用を含む。種々の実施形態では、対象は、抗生物質と、１種または複数の抗生物質分解剤阻害剤（例えば、オーグメンチンはアモキシシリンとクラブラン酸との混合物である）との共製剤の投与を受けてもよい。このような共製剤には、アモキシシリン−クラブラン酸（オーグメンチン）、チカルシリン−クラブラン酸（チメンチン）、アンピシリン−スルバクタム（スルタミシリン、例えば、ユナシン）、ピペラシリン−タゾバクタム（ゾシン）、およびセフォペラゾン−スルバクタムが挙げられるが、これらに限定されない。種々の実施形態では、本発明の方法は、抗生物質分解剤より近位のＧＩ管中で放出される抗生物質分解剤阻害剤のさらなる投与を含む。ある実施形態では、抗生物質分解剤阻害剤は、抗生物質が活性となり得るＧＩ管の種々の部位で放出されてよい。例えば、抗生物質分解剤阻害剤は、胃、十二指腸、空腸および回腸放出されてよい。抗生物質分解剤阻害剤の例には、例えば、タゾバクタム、スルバクタム、ＥＤＴＡ、クラブラン酸、アビバクタム、モノバクタム誘導体、ＡＴＭＯ誘導体、ペネム（例えば、ＢＲＬ４２７１５およびその誘導体、Ｓｙｎ１０１２、オキサペネム、トリネム、１−β−メチルカルバペネム）、ペニシリンおよびセファロスポリンスルホン誘導体（例えば、Ｃ−２／Ｃ−３−置換ペニシリンおよびセファロスポリンスルホン、Ｃ−６−置換ペニシリンスルホン）、非βラクタム阻害剤（例えば、ボロン酸遷移状態類似体、ホホネート、ＮＸＬ１０４、ヒドロキシメート）およびチオール誘導体などのメタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤、ピリジンジカルボキシレート、トリフルオロメチルケトンおよびアルコール、カルバペネム類似体、三環式天然産物、コハク酸誘導体、ならびにペニシリン酸Ｃ−６−メルカプトメチルが挙げられる。
【０１４４】
種々の実施形態では、本発明の方法は、マイクロバイオーム媒介障害の処置または予防を含む。マイクロバイオーム媒介障害の例には、限定されないが、例えば、国際公開第２０１４／１２１２９８号の表３に認められるものが含まれる。この文献の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、マイクロバイオーム媒介障害は、抗生物質誘発性有害作用、クロストリジウム・ディフィシレ感染症（ＣＤＩ）、クロストリジウム・ディフィシレ関連疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、および過敏性腸症候群から選択してよい。種々の実施形態では、マイクロバイオーム媒介障害は、抗生物質誘発性有害作用、クロストリジウム・ディフィシレ感染症（ＣＤＩ）、またはクロストリジウム・ディフィシレ関連疾患である。ある実施形態では、本発明は、ＧＩ管中の抗生物質誘発性有害作用を処置するための方法を提供し、該方法は、本明細書で記載の抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）を含む有効量の医薬組成物または製剤を、抗生物質を使って現在処置を受けているまたは最近処置を受けたことがある対象に投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、ＧＩ管中の抗生物質誘発性有害作用を予防するための方法を提供し、該方法は、本明細書で記載の抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）を含む有効量の医薬組成物または製剤を、抗生物質を使って現在処置を受けているまたは最近処置を受けたことがある対象に投与することを含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、対象は、ヒト小児である。例えば、マイクロバイオーム破壊は、複数の代謝、免疫、神経などの障害に関係している。抗生物質への初期の曝露（例えば、生まれて最初の約２年間以内の）が、マイクロバイオームを破壊し、最終的な疾患に繋がる。Ｂａｉｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．ＪＡＭＡ  Ｐｅｄｉａｔｒ．１６８（１１），Ｎｏｖ  ２０１４（この文献の全内容は参照により本明細書に組み込まれる）には、初期の抗生物質への曝露がどのように肥満症に繋がるかを記載されている。したがって、いくつかの実施形態では、本方法は、小児のマイクロバイオームを保護し、肥満症などの疾患を防ぐ。
【０１４６】
ある実施形態では、本発明は、クロストリジウム・ディフィシル感染症（ＣＤＩ）および／またはクロストリジウム・ディフィシル関連疾患を処置するための方法を提供し、該方法は、本明細書で記載の抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）を含む有効量の医薬組成物または製剤を、抗生物質を使って現在処置を受けているまたは最近処置を受けたことがある対象に投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、クロストリジウム・ディフィシル感染症（ＣＤＩ）および／またはクロストリジウム・ディフィシル関連疾患を予防するための方法を提供し、該方法は、本明細書で記載の抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）を含む有効量の医薬組成物または製剤を、抗生物質を使って現在処置を受けているまたは最近処置を受けたことがある対象に投与することを含む。
【０１４７】
種々の実施形態では、抗生物質誘発性有害作用および／またはＣＤＩまたはクロストリジウム・ディフィシレ関連疾患は、抗生物質関連下痢、クロストリジウム・ディフィシレ下痢（ＣＤＤ）、クロストリジウム・ディフィシレ炎症性腸疾患、大腸炎、偽膜性大腸炎、発熱、腹痛、脱水および電解質障害、巨大結腸症、腹膜炎、および結腸の穿孔および／または破裂の内の１つまたは複数である。本発明の組成物および方法による処置に好適する追加の疾患、障害および状態には、国際公開第２０１４／１２１２９８号の表３に挙げられたものが含まれる。この文献の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４８】
種々の実施形態では、本使用および方法は、本明細書で記載の抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）を含む医薬組成物もしくは製剤および／または任意の初期療法剤および／または補助的療法剤を使った共処置（同時または逐次）、または本明細書で記載の抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）を含む医薬組成物もしくは製剤および／または本明細書で記載の種々の疾患の処置のための任意の初期療法剤もしくは／または補助的療法剤の共製剤を使った処置に関する。
【０１４９】
種々の実施形態では、マイクロバイオーム媒介障害は、初期発症または再燃／再発（例えば、抗生物質療法の継続または再開が原因で）の状況において、処置または予防される。例えば、以前にマイクロバイオーム媒介障害（例えば、ＣＤＩ）を患っていた対象において、抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）を含む本医薬組成物または製剤を、対象の最初の再発症状の際に投与し得る。非限定的例としての再発の症状には、軽度の症例では、１日当たり約５〜約１０回の水様便通、大きな発熱なし、および軽度の腹部疝痛のみであるのと同時に血液検査が白血球数の約１５，０００まで（正常レベルは約１０，０００まで）のわずかな上昇を示す場合があり、また、重症では、１日当たり約１０回を超える水様便、悪心、嘔吐、高熱（例えば、約１０２〜１０４°Ｆ）、直腸出血、重篤な腹痛（例えば、圧痛を伴う）、腹部膨満、および高白血球数（例えば、１５，０００〜約４０，０００）が含まれる。
【０１５０】
最初の発症または再燃／再発に関わらず、マイクロバイオーム媒介障害は、本明細書で記載のいずれかの症状（例えば、２日間以上の、１日当たり約３回以上の水様下痢、腹部の軽度から悪性筋痙攣および疼痛、発熱、便中の血液または膿、悪心、脱水、食欲不振、体重減、など）により診断し得る。初期の発症または再燃／再発に関わらず、マイクロバイオーム媒介障害はまた、酵素イムノアッセイにより（例えば、クロストリジウム・ディフィシレ生物により産生されるクロストリジウム・ディフィシレ毒素ＡまたはＢ抗原および／またはグルタミン脱水素酵素（ＧＤＨ）を検出して）、ポリメラーゼ連鎖反応により（例えば、クロストリジウム・ディフィシレ毒素ＡまたはＢ遺伝子またはその一部分（例えば、ｔｃｄＡまたはｔｃｄＢ）を検出、ＩＬＬＵＭＩＧＥＮＥ  ＬＡＭＰアッセイを含む）、細胞毒性アッセイにより診断し得る。例えば、次の試験のいずれかを使用してよい：Ｍｅｒｉｄｉａｎ  ＩｍｍｕｎｏＣａｒｄ  Ｔｏｘｉｎｓ  Ａ／Ｂ；Ｗａｍｐｏｌｅ  Ｔｏｘｉｎ  Ａ／Ｂ  Ｑｕｉｋ  Ｃｈｅｋ；Ｗａｍｐｏｌｅ  Ｃ．ｄｉｆｆ  Ｑｕｉｋ  Ｃｈｅｋ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ；Ｒｅｍｅｌ  Ｘｐｅｃｔ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｔｏｘｉｎ  Ａ／Ｂ；Ｍｅｒｉｄｉａｎ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｔｏｘｉｎｓ  Ａ／Ｂ；Ｗａｍｐｏｌｅ  Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｔｏｘ  Ａ／Ｂ  ＩＩ；Ｒｅｍｅｌ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔ  Ｔｏｘｉｎ  Ａ／Ｂ  ＥＩＡ；Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ  Ｖｉｄａｓ  Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｔｏｘｉｎ  Ａ＆Ｂ；ＢＤ  Ｇｅｎｅｏｈｍ  Ｃ．ｄｉｆｆ；Ｐｒｏｄｅｓｓｅ  Ｐｒｏｇａｓｔｒｏ  ＣＤ；およびＣｅｐｈｅｌｄ  Ｘｐｅｒｔ  Ｃ．ｄｉｆｆ。種々の実施形態では、臨床試料は対象の便試料である。
【０１５１】
また、軟性Ｓ状結腸鏡検査「スコープ」試験および／または腹部Ｘ線および／または結腸の画像を提供するコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンを対象の評価に使用してよい（例えば、結腸壁に付着した特徴的なクリーム状の白色または黄色プラークを探す）。さらに、生検（例えば、ＧＩ管のいずれかの領域の生検）を使って、対象の潜在的マイクロバイオーム媒介障害（例えば、ＣＤＩおよび／またはクロストリジウム・ディフィシレ関連疾患）を評価し得る。
【０１５２】
種々の実施形態では、本発明の方法および使用は、ＧＩ管中の部位で抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）を放出し、そこで余剰抗生物質残留物を分解または不活化する、抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）を含む医薬組成物および製剤に関する。ある実施形態では、本発明の方法および使用は、残留または余剰抗生物質が小腸および／または大腸を含むＧＩ管に入る前に、その残留または余剰抗生物質を分解または不活化する抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）を含む医薬組成物および製剤に関する。ある実施形態では、本発明の方法および使用は、残留または余剰抗生物質が大腸に入る前に、その残留または余剰抗生物質を分解または不活化する抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）を含む医薬組成物および製剤に関する。ある実施形態では、本発明の方法および使用は、その残留または余剰抗生物質をＧＩ管中で分解または不活化する抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）を含む医薬組成物および製剤に関する。種々の実施形態では、本明細書に記載の抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）を含む医薬組成物および製剤は、抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）を、抗生物質の放出より遠位のＧＩ管中の部位で放出する。種々の実施形態では、抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）は、ＧＩ管の部位で放出され、そこでＧＩ管微生物叢に対する残留または余剰抗生物質の殺菌作用を防ぐ。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、本発明の方法および使用は、対象のＧＩ管中の正常な腸内微生物叢を維持し、および／または１種または複数種の病原微生物の異常増殖を防止する抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）を含む医薬組成物および製剤に関する。種々の実施形態では、本発明は、対象の腸の種々の大腸菌型（毒性および／または抗生物質耐性の大腸菌型を含む）の異常増殖を減らすまたは防ぐ医薬組成物および方法を提供する。種々の態様では、本明細書で記載の医薬組成物および製剤は、耐性生物の二次感染を防ぐかまたは減らし、いくつかの実施形態では、抗生物質耐性の発生を減らし得る。さらに、本明細書で記載の方法、医薬組成物および製剤は、耐性の懸念が理由で現在回避されている抗生物質の使用を可能とし、および／または１種または複数の抗生物質分解剤阻害剤との同時投与または共製剤の必要性を減らし得る。
【０１５４】
種々の実施形態では、抗生物質分解剤および／または医薬組成物（および／または追加の治療薬）は、抗生物質の血液中または血漿中レベルと実質的に干渉しない。例えば、本発明の抗生物質分解剤および／または医薬組成物（および／または追加の治療薬）は、感染症のために必要と思われ、抗生物質の全身作用と干渉しない抗生物質の投与を対象が受けるのを可能とする。ある実施形態では、抗生物質分解剤および／または医薬組成物（および／または追加の治療薬）は、抗生物質の血液中または血漿中レベルと実質的に干渉しない。むしろ、抗生物質分解剤および／または医薬組成物（および／または追加の治療薬）は、ＧＩ管の一部を占め得る過剰の抗生物質を不活化し、それにより、本明細書で記載の種々の疾患状態と関連する微生物叢の破壊を防ぐ。
【０１５５】
種々の実施形態では、抗生物質分解剤および／または追加の治療薬を含む医薬組成物および製剤は、全身的に吸収されない。種々の実施形態では、抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）を含む医薬組成物および製剤は、抗生物質によるマイクロバイオームの微生物叢との干渉を解消するように機能する（例えば、大腸を含む腸）。いくつかの実施形態では、抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）を含む医薬組成物および製剤は、腸からの抗生物質吸収と干渉せず、および／または抗生物質循環の半減期を変えるほど腸肝的に充分に干渉しない。いくつかの実施形態では、抗生物質分解剤（および／または追加の治療薬）を含む医薬組成物および製剤は、腸からの抗生物質吸収と干渉せず、および／または臨床的に重要となるほど腸肝的に充分に干渉しない。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、用語の「患者」および「対象」は、同義に使用される。いくつかの実施形態では、対象および／または動物は哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、雌ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、または非ヒト霊長類、例えば、サル、チンパンジー、もしくはヒヒである。他の実施形態では、対象および／または動物は、非哺乳動物、例えば、ゼブラフィッシュなどである。いくつかの実施形態では、対象および／または動物は、蛍光タグ付き細胞（例えば、ＧＦＰで）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、対象および／または動物は、蛍光細胞を含む遺伝子導入動物である。
【０１５７】
種々の実施形態では、本発明の方法は、ヒト対象の処置に有用である。いくつかの実施形態では、ヒトは小児科のヒトである。他の実施形態では、ヒトは成人のヒトである。他の実施形態では、ヒトは老人のヒトである。他の実施形態では、ヒトは対象と呼ばれることもある。いくつかの実施形態では、ヒトは女性である。いくつかの実施形態では、ヒトは男性である。
【０１５８】
特定の実施形態では、ヒトは、約１〜約１８ヶ月、約１８〜約３６ヶ月、約１〜約５才、約５〜約１０才、約１０〜約１５才、約１５〜約２０才、約２０〜約２５才、約２５〜約３０才、約３０〜約３５才、約３５〜約４０才、約４０〜約４５才、約４５〜約５０才、約５０〜約５５才、約５５〜約６０才、約６０〜約６５才、約６５〜約７０才、約７０〜約７５才、約７５〜約８０才、約８０〜約８５才、約８５〜約９０才、約９０〜約９５才または約９５〜約１００才の範囲の年齢である。一実施形態では、ヒトは、小児である。一実施形態では、ヒトは、女性である。
【０１５９】
別の実施形態では、対象は非ヒト動物であり、したがって、本発明は、獣医学的使用に関する。特定の実施形態では、非ヒト動物は家庭用ペットである。別の特定の実施形態では、非ヒト動物は家畜動物である。
【０１６０】
キット
本発明は、本明細書で記載のいずれかの薬剤の投与を簡略化することができるキットを提供する。本発明のキットの例には、本明細書で記載の単位剤形のいずれかの組成物が含まれる。一実施形態では、単位剤形は、無菌とすることができ、本明細書で記載のいずれかの薬剤および薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤、またはビークルを含む、プレフィルシリンジまたは薬瓶またはブリスター包装などの容器である。キットは、ラベルまたは本明細書で記載のいずれかの試薬の使用方法が印刷された説明書をさらに含むことができる。キットはまた、本明細書で記載の１種または複数種の追加の治療薬をさらに含むことができる。一実施形態では、キットは、有効量の本発明の組成物および本明細書で記載のものなどの有効量の別の組成物を含む容器を含む。
【０１６１】
一実施形態では、キットは、必要に応じて、本明細書で記載のいずれかの追加の治療薬と共に、本明細書に記載の抗生物質分解剤（非限定的例として、Ｐ２Ａ、ＫＰＣ−１／２、またはＮＤＭ−１で、必要に応じ本明細書に記載のように処方されている）および／または本明細書に記載の抗生物質を含む。例えば、いくつかの実施形態では、キットは、抗生物質分解剤および両方の薬剤を摂取することを対象に知らせるブリスター包装で提供される抗生物質を含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、例えば、本明細書で記載のＣＤＩの処置に使われる補助的療法剤である。いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、メトロニダゾール（例えば、ＦＬＡＧＹＬ）、フィダキソマイシン（例えば、ＤＩＦＩＣＩＤ）、またはバンコマイシン（例えば、バンコシン）、リファキシミン、糞便細菌療法剤、木炭系結合剤／吸着剤（例えば、ＤＡＶ１３２）、プロバイオティック療法剤（例えば、Ｉｎｔｎａｔ’ｌ  Ｊ  Ｉｎｆ  Ｄｉｓ，１６（１１）：ｅ７８６を参照されたい。この内容は参照により本明細書に組み込まれる。プロバイオティクス剤の例は、サッカロマイセス・ブラウディ、ラクトバシラス・ラムノーサスラムノーサス菌ＧＧ；ラクトバシラス・プランタラム２９９ｖ；クロストリジウム・ブチリクムＭ５８８；クロストリジウム・ディフィシレＶＰ２０６２１（無毒のクロストリジウム・ディフィシレ株）；ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバシラス・アシドフィルスの組み合わせ（Ｂｉｏ−Ｋ＋ＣＬ１２８５）；ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバシラス・ブルガリカス、ストレプトコッカス・サーモフィルスの組み合わせ（Ａｃｔｉｍｅｌ）；ラクトバシラス・アシドフィルス、ビフィドバクテリウム・ビフィダムの組み合わせ（Ｆｌｏｒａｊｅｎ３）；ラクトバシラス・アシドフィルス、ラクトバシラス・ブルガリカス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス、ラクトバシラス・ブルガリカス・カゼイ、ラクトバシラス・ブルガリカス・プランタルム、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ブレベ、ストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サーモフィラスの組み合わせ（ＶＳＬ＃３））および抗体またはその他の生物学的療法剤（例えば、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１０；３６２（３）：１９７（この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているクロストリジウム・ディフィシレ毒素ＡおよびＢに対するモノクローナル抗体）；例えば、米国特許出願公開第２０１３／００５８９６２号（この内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載の、１つまたは複数の配列番号（例えば、配列番号５９、６０、９５、６７、６８および８７の１つまたは複数）に向けられているマルチマーとして配置された中和結合タンパク質）または任意のクロストリジウム・ディフィシレ二元毒素に対する中和結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、本明細書で記載のペニシリンおよびセファロスポリンを含む抗生物質のいずれかは、追加の治療薬であってよい。
【０１６３】
産生方法
本発明は、宿主細胞中でいずれかの抗生物質分解剤を産生する方法もまた提供する。ある実施形態では、宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。宿主細胞の例は、例えば、実施例１および実施例６〜９にさらに記載されている。他の実施形態では、宿主細胞は、例えば、イースト菌、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ヒーラ細胞、仔ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎培養細胞（ＣＯＳ）、またはヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）であってよい。一実施形態では、宿主細胞は、バチルス属菌種、特にバチルス・リケニフォルミスまたは枯草菌である。
【０１６４】
種々の実施形態では、本発明の方法は、抗生物質分解剤をコードした配列を含むベクターで形質転換した宿主細胞（例えば、大腸菌細胞）を用意すること、宿主細胞（例えば、大腸菌細胞）を培養して抗生物質分解剤の発現を誘導すること、および宿主細胞（例えば、大腸菌細胞）から調製された細胞画分から抗生物質分解剤を回収することを含む。ある実施形態では、抗生物質分解剤は、宿主細胞から調製された可溶性画分から回収される。様々な実施形態において、抗生物質分解剤は、本明細書に記載のいずれかの抗生物質分解剤であってよい。例えば、抗生物質分解剤は、Ｐ２Ａ、ニューデリー・メタロ−β−ラクタマーゼ（例えば、ＮＤＭ−１および／またはＮＤＭ−２）、およびクレブシェラ肺炎杆菌カルバペネマーゼ（ＫＰＣ−１／２、ＫＰＣ°−３、ＫＰＣ−４、ＫＰＣ−５、ＫＰＣ−６、ＫＰＣ−７、ＫＰＣ−８、ＫＰＣ−９、ＫＰＣ−１０、およびＫＰＣ−１１の内の１種または複数）から選択される広域スペクトルカルバペネマーゼであってよい。ある実施形態では、抗生物質分解剤は、Ｐ２Ａである。別の実施形態では、抗生物質分解剤は、ＫＰＣ−１／２である。さらなる実施形態では、抗生物質分解剤は、ＮＤＭ−１である。種々の実施形態では、抗生物質分解剤は、配列番号１９〜３９、３７〜６５、６６、または６８の内の１つまたは複数のアミノ酸配列に対し、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、誘導系を利用して、宿主細胞における抗生物質分解剤の発現が誘導される。このような実施形態では、抗生物質分解剤の発現は、ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＢＬＲ（ＤＥ３）などの大腸菌細胞中で誘導されてよい。ある実施形態では、誘導はイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により行われる。種々の実施形態では、約０．０１ｍＭ、約０．０２ｍＭ、約０．０３ｍＭ、約０．０４ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．０６ｍＭ、約０．０７ｍＭ、約０．０８ｍＭ、約０．０９ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、または約１０ｍＭのＩＰＴＧが誘導に使用される。ある実施形態では、約０．１ｍＭのＩＰＴＧが誘導に使用される。種々の実施形態では、誘導は、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、または約２４時間にわたり実施される。ある実施形態では、誘導は４時間実施される。別の実施形態では、誘導は２０時間実施される。種々の実施形態では、誘導は、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３５℃、または約３７℃で実施される。ある実施形態では、誘導は約１８℃で実施される。別の実施形態では、誘導は約２５℃で実施される。さらなる実施形態では、誘導は約３７℃で実施される。
【０１６６】
種々の実施形態では、本発明の方法は、均一抗生物質分解剤調製物を産出する。種々の実施形態では、方法は、（ａ）配列番号１９〜３９、３７〜６５、６６、または６８の内の１つまたは複数のアミノ酸配列に対し、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗生物質分解剤タンパク質を発現する発現コンストラクトを調製すること、（ｂ）宿主細胞を発現コンストラクトで形質転換すること、および（ｃ）培養液中の細菌宿主細胞により産生された抗生物質分解剤タンパク質調製物を単離することを含み、培養液中で宿主細胞により産生された抗生物質分解剤タンパク質調製物は実質的に均一である。
【０１６７】
本発明はまた、本明細書に記載のいずれかの抗生物質分解剤をコードするポリヌクレオチドを提供し、これには、例えば、このようなポリヌクレオチドを含む複製可能発現ベクターも含まれる。このようなポリヌクレオチドは、抗生物質分解剤をコードする配列に加えて、１つまたは複数の発現制御配列をさらに含んでよい。例えば、ポリヌクレオチドは、発現制御配列として、１つまたは複数のプロモーターまたは転写エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナル、およびポリアデニル化シグナルを含んでよい。さらに、ポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞から抗生物質分解剤の分泌を促進するためのリーダー配列を含んでよい。真核生物、酵母、および／または原核細胞における分泌を促進するためのリーダー配列を利用してよい。分泌シグナル配列の例としては、アルファファクターフル、アルファファクター、アルファアミラーゼ、グルコアミラーゼ、イヌリナーゼ、インベルターゼ、キラータンパク質、リゾチーム、および血清アルブミン配列が挙げられるが、これらに限定されない。追加のリーダー配列は、実施例１〜６に記載されている。本明細書に記載のいずれかの抗生物質分解剤をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクターに組み込むことができ、従来の遺伝子導入または形質転換技術により宿主細胞に導入できる。種々の実施形態では、発現ベクターは、配列番号１〜１８、６７、または６９の内の１つまたは複数のアミノ酸配列に対し、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１６８】
種々の実施形態では、宿主細胞（例えば、大腸菌細胞）は、亜鉛の存在下で培養される。ある実施形態では、亜鉛はＺｎＳＯ４として培地に添加される。特定の実施形態では、宿主細胞（例えば、大腸菌細胞）は、約５μＭ、または約１０μＭ、または約２０μＭ、または約３０μＭ、または約４０μＭ、または約５０μＭ、または約６０μＭ、または約７０μＭ、または約８０μＭ、または約９０μＭ、または約１００μＭ、または約１５０μＭ、または約２００μＭの亜鉛の存在下で培養される。特定の実施形態では、宿主細胞（例えば、大腸菌細胞）は、約５μＭ、または約１０μＭ、または約２０μＭ、または約３０μＭ、または約４０μＭ、または約５０μＭ、または約６０μＭ、または約７０μＭ、または約８０μＭ、または約９０μＭ、または約１００μＭ、または約１５０μＭ、または約２００μＭのＺｎＳＯ４の存在下で培養される。特定の実施形態では、亜鉛の不存在下での培養に比べて、亜鉛は、宿主細胞から調製された可溶性画分中の抗生物質分解剤タンパク質の量を増やし、封入体中での抗生物質分解剤タンパク質の量を減らす。種々の実施形態では、宿主細胞から回収された抗生物質分解剤は、実質的に可溶性である。ある実施形態では、抗生物質分解剤は、宿主細胞（例えば、大腸菌細胞）の細胞質中または細胞周辺腔中に実質的に可溶性である。特定の実施形態では、亜鉛を含まない方法に比べて、亜鉛の添加は、抗生物質分解剤タンパク質の収率を高める。種々の実施形態では、方法は、（ａ）配列番号１９〜３９、３７〜６５、６６、または６８の内の１つまたは複数のアミノ酸配列に対し、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗生物質分解剤タンパク質を発現する発現コンストラクトを調製すること、（ｂ）宿主細胞を発現コンストラクトで形質転換すること、および（ｃ）培養液中の細菌宿主細胞により産生された抗生物質分解剤タンパク質調製物を単離することを含み、培養液は亜鉛を含み、培養液中で宿主細胞により産生された抗生物質分解剤タンパク質調製物は、亜鉛を含まない培養液中の細菌宿主細胞により産生された抗生物質分解剤タンパク質調製物より、実質的に高い収率を有する。
【０１６９】
種々の実施形態では、本発明の方法は、実質的に活性な抗生物質分解剤を産出する。例えば、本発明の方法は、１リットルの培養液当たり、少なくとも約１ｇ、約２ｇ、約３ｇ、約４ｇ、約５ｇ、約６ｇ、約７ｇ、約８ｇ、約９ｇ、約１０ｇ、約１１ｇ、約１２ｇ、約１３ｇ、約１４ｇ、約１５ｇ、約１６ｇ、約１７ｇ、約１８ｇ、約１９ｇ、約２０ｇ、約２１ｇ、約２２ｇ、約２３ｇ、約２４ｇ、約２５ｇ、約２６ｇ、約２７ｇ、約２８ｇ、約２９ｇ、約３０ｇ、約３１ｇ、約３２ｇ、約３３ｇ、約３４ｇ、約３５ｇ、約３６ｇ、約３７ｇ、約３８ｇ、約３９ｇ、約４０ｇ、約４１ｇ、約４２ｇ、約４３ｇ、約４４ｇ、約４５ｇ、約４６ｇ、約４７ｇ、約４８ｇ、約４９ｇ、または約５０ｇの実質的に活性な抗生物質分解剤を産生し得る。ある実施形態では、本発明の方法は、１リットルの培養液当たり、少なくとも約１０ｇの実質的に活性な抗生物質分解剤を産出する。ある実施形態では、本発明の方法は、１リットルの培養液当たり、少なくとも約１５ｇの実質的に活性な抗生物質分解剤を産出する。
【０１７０】
種々の実施形態では、宿主細胞の培養は、振盪フラスコまたはバイオリアクター中で実施してよい。ある実施形態では、抗生物質分解剤は、ＫＰＣ−１／２であり、培養は、振盪フラスコ中で実施される。別の実施形態では、抗生物質分解剤は、Ｐ２ＡまたはＮＤＭ−１であり、培養は、バイオリアクター中で実施される。
【０１７１】
実施例
実施例１：Ｐ２Ａ、ＮＤＭ−１、およびＫＰＣ−１／２大腸菌発現プラスミドの設計および形質転換菌株の生成
この調査の目的は、特に、形質転換菌株を生成して、カルバペネマーゼの発現を選別することである。
【０１７２】
大腸菌媒介カルバペネマーゼの発現に対しては、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ−１（Ｙｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（２００９），５３：５０４６−５０５４）およびＫＰＣ１／２［Ｙｉｇｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（２００１）４５：１１５１−１１６１，Ｙｉｇｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（２００３），４７：３８８１−３８８９）］、合計３９個の発現プラスミドおよび１０４個の菌株を生成した。Ｐ２Ａに対しては、３種の遺伝子バリアント（配列番号１〜３）、９個のプラスミドおよび２５個の菌株、ＮＤＭ−１に対しては、８種の遺伝子バリアント（配列番号４〜１１）、１７個のプラスミドおよび４４個の菌株、ＫＰＣ１／２に対しては、７種の遺伝子バリアント（配列番号１２〜１８）、１３個のプラスミドおよび３５個の菌株を生成し、試験した。遺伝子発現コンストラクトは、プラスミドバックボーン（例えば、ｐＢＲ３２２またはｐＵＣ：それぞれ中程度コピーおよび高コピー用に）、プロモーター（例えば、Ｔ７またはｐｈｏＡ：ＩＰＴＧにより誘導可能、または培地中のリン酸塩還元により誘導可能）、周辺質でのタンパク質の蓄積を誘導するためのリーダー配列（例えば、ＳＴＩＩ，ｐｅｌＢ、ｔａｔ）、または細胞質発現のためにリーダーなし、カルバペネマーゼ酵素のＮ末端、および細菌ホスト（例えば、ＢＬ２１、ＢＬ２１  ｄｅｇＰ、ＢＬ２１  Ｔ７  ＬｙｓＹ、ＢＬ２１  Ｔ７  ＬｙｓＹ  ｄｅｇＰ、ＭＧ１６５５  Ｔ７＋、Ｗ３１１０  ｄｅｇＰ、ＮＥＢ  Ｓｈｕｆｆｌｅ、またはＮＥＢ  Ｓｈｕｆｆｌｅ  Ｔ７＋）を種々異なるものとした。発現カセットを合成し、示したように、プラスミドｐＣＹＴ１０、ｐＣＹＴ１１、ｐＣＹＴ１２、ｐＣＹＴ１３（ＣＹＴＯＶＡＮＣＥ）に挿入した。全てのプラスミドの配列は、ＤＮＡ塩基配列決定法によって確認した。表１〜３は、種々の菌株の特性を示す。
【０１７３】
特に、Ｎ末端配列および／またはシグナル配列が異なる（表１〜３）遺伝子バリアントをＰ２Ａは３種（配列番号１〜３）、ＮＤＭ−１は８種（配列番号４〜１１）、およびＫＰＣは７種（配列番号１２〜１８）を合成し、示したように、合計９個のＰ２Ａプラスミド、１７個のＮＤＭプラスミド、および１３個のＫＰＣプラスミド（表１〜３）について、発現プラスミドｐＣＹＴ１０、ｐＣＹＴ１１、ｐＣＹＴ１２、またはｐＣＹＴ１３（表４、ＣＹＴＯＶＡＮＣＥ）に挿入した。３９個のプラスミドを示した細菌中に形質転換し、合計１０４種の形質転換菌株を得た（表１〜３）。形質転換に使用する細菌には、ＢＬ２１、ＢＬ２１  ｄｅｇＰ、ＢＬ２１  Ｔ７  ＬｙｓＹ、ＢＬ２１  Ｔ７  ＬｙｓＹ  ｄｅｇＰ、ＭＧ１６５５  Ｔ７＋、Ｗ３１１０  ｄｅｇＰ、ＮＥＢ  Ｓｈｕｆｆｌｅ、またはＮＥＢ  Ｓｈｕｆｆｌｅ  Ｔ７＋（表１〜３）を含めた。コロニーを採取し、一晩増殖し、２４ウェルディッシュ（ウエル当たり３ｍｌの容積）中に１：５０に希釈し、一晩増殖した。株当たり合計２ｘ１．０ｍｌの試料を保存した。
【０１７４】
カルバペネマーゼ遺伝子バリアントの配列を以下に記載した：
Ｐ２Ａ（配列番号１〜３）：３種の遺伝子バリアント、ネイティブ、ＳＴＩＩリーダー、またはｔａｔリーダー
Ｐ２Ａ＿１＿１０（プラスミドｐＰ２Ａ−１、ｐＰ２Ａ−３、ｐＰ２Ａ−５、ｐＰ２Ａ−７に使用）−ネイティブ：リーダーなし
核酸配列：
ＡＴＧＧＡＡＡＣＧＧＧＣＡＣＣＡＴＴＡＧＣＡＴＴＡＧＣＣＡＡＣＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＧＴＴＴＧＧＧＴＣＣＡＣＡＣＣＧＡＧＴＴＡＧＧＣＴＡＴＴＴＣＡＡＣＧＧＴＧＡＡＧＣＣＧＴＧＣＣＧＡＧＣＡＡＴＧＧＴＴＴＧＧＴＴＣＴＧＡＡＴＡＣＧＴＣＣＡＡＧＧＧＴＣＴＧＧＴＧＴＴＧＧＴＡＧＡＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＡＣＡＡＴＡＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＴＣＧＡＡＡＴＧＧＴＴＧＡＧＡＡＡＡＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡＧＣＧＴＧＴＧＡＣＴＧＡＴＧＴＣＡＴＴＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＣＧＣＡＣＧＣＧＧＡＣＣＧＣＡＴＣＧＧＴＧＧＣＡＴＴＡＣＣＧＣＧＣＴＧＡＡＡＧＡＧＣＧＴＧＧＣＡＴＴＡＡＡＧＣＡＣＡＴＡＧＣＡＣＧＧＣＡＣＴＧＡＣＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＣＧＡＡＧＡＡＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＧＡＡＧＡＡＣＣＧＣＴＧＧＧＴＧＡＴＣＴＧＣＡＧＡＣＣＡＴＣＡＣＧＴＣＧＣＴＧＡＡＧＴＴＴＧＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＴＣＧＡＧＡＣＴＴＴＴＴＡＣＣＣＡＧＧＴＡＡＧＧＧＴＣＡＴＡＣＣＧＡＡＧＡＴＡＡＣＡＴＣＧＴＧＧＴＴＴＧＧＣＴＧＣＣＧＣＡＧＴＡＣＣＡＡＡＴＣＣＴＧＧＣＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＴＡＡＧＡＧＣＧＣＡＧＡＧＧＣＧＡＡＡＧＡＴＣＴＧＧＧＴＡＡＴＧＴＣＧＣＧＧＡＣＧＣＴＴＡＴＧＴＧＡＡＣＧＡＧＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＡＴＴＧＡＡＡＡＴＧＴＴＴＴＧＡＡＡＣＧＴＴＡＴＧＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＴＡＧＣＧＴＴＧＴＧＣＣＧＧＧＴＣＡＣＧＧＴＧＡＧＧＴＣＧＧＣＧＡＣＡＡＡＧＧＴＣＴＧＣＴＧＴＴＧＣＡＣＡＣＧＣＴＧＧＡＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＴＧＡＴＡＡ（配列番号１）
アミノ酸配列：
ＭＥＴＧＴＩＳＩＳＱ  ＬＮＫＮＶＷＶＨＴＥ  ＬＧＹＦＮＧＥＡＶＰ  ＳＮＧＬＶＬＮＴＳＫ  ＧＬＶＬＶＤＳＳＷＤ  ＮＫＬＴＫＥＬＩＥＭ
ＶＥＫＫＦＱＫＲＶＴ  ＤＶＩＩＴＨＡＨＡＤ  ＲＩＧＧＩＴＡＬＫＥ  ＲＧＩＫＡＨＳＴＡＬ  ＴＡＥＬＡＫＮＳＧＹ  ＥＥＰＬＧＤＬＱＴＩ
ＴＳＬＫＦＧＮＴＫＶ  ＥＴＦＹＰＧＫＧＨＴ  ＥＤＮＩＶＶＷＬＰＱ  ＹＱＩＬＡＧＧＣＬＶ  ＫＳＡＥＡＫＤＬＧＮ  ＶＡＤＡＹＶＮＥＷＳ
ＴＳＩＥＮＶＬＫＲＹ  ＧＮＩＮＳＶＶＰＧＨ  ＧＥＶＧＤＫＧＬＬＬ  ＨＴＬＤＬＬＫ（配列番号１９）
【０１７５】
Ｐ２Ａ＿２＿１０（プラスミドｐＰ２Ａ−２、ｐＰ２Ａ−４、ｐＰ２Ａ−６、ｐＰ２Ａ−８）−ＳＴＩＩリーダー
核酸配列：
ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＴＧＣＡＴＴＴＣＴＧＣＴＧＧＣＧＡＧＣＡＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＣＡＡＣＣＡＡＴＧＣＡＴＡＴＧＣＣＧＡＡＡＣＧＧＧＣＡＣＣＡＴＴＡＧＣＡＴＴＡＧＣＣＡＡＣＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＧＴＴＴＧＧＧＴＣＣＡＣＡＣＣＧＡＧＴＴＡＧＧＣＴＡＴＴＴＣＡＡＣＧＧＴＧＡＡＧＣＣＧＴＧＣＣＧＡＧＣＡＡＴＧＧＴＴＴＧＧＴＴＣＴＧＡＡＴＡＣＧＴＣＣＡＡＧＧＧＴＣＴＧＧＴＧＴＴＧＧＴＡＧＡＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＡＣＡＡＴＡＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＴＣＧＡＡＡＴＧＧＴＴＧＡＧＡＡＡＡＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡＧＣＧＴＧＴＧＡＣＴＧＡＴＧＴＣＡＴＴＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＣＧＣＡＣＧＣＧＧＡＣＣＧＣＡＴＣＧＧＴＧＧＣＡＴＴＡＣＣＧＣＧＣＴＧＡＡＡＧＡＧＣＧＴＧＧＣＡＴＴＡＡＡＧＣＡＣＡＴＡＧＣＡＣＧＧＣＡＣＴＧＡＣＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＣＧＡＡＧＡＡＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＧＡＡＧＡＡＣＣＧＣＴＧＧＧＴＧＡＴＣＴＧＣＡＧＡＣＣＡＴＣＡＣＧＴＣＧＣＴＧＡＡＧＴＴＴＧＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＴＣＧＡＧＡＣＴＴＴＴＴＡＣＣＣＡＧＧＴＡＡＧＧＧＴＣＡＴＡＣＣＧＡＡＧＡＴＡＡＣＡＴＣＧＴＧＧＴＴＴＧＧＣＴＧＣＣＧＣＡＧＴＡＣＣＡＡＡＴＣＣＴＧＧＣＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＴＡＡＧＡＧＣＧＣＡＧＡＧＧＣＧＡＡＡＧＡＴＣＴＧＧＧＴＡＡＴＧＴＣＧＣＧＧＡＣＧＣＴＴＡＴＧＴＧＡＡＣＧＡＧＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＡＴＴＧＡＡＡＡＴＧＴＴＴＴＧＡＡＡＣＧＴＴＡＴＧＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＴＡＧＣＧＴＴＧＴＧＣＣＧＧＧＴＣＡＣＧＧＴＧＡＧＧＴＣＧＧＣＧＡＣＡＡＡＧＧＴＣＴＧＣＴＧＴＴＧＣＡＣＡＣＧＣＴＧＧＡＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＴＧＡＴＡＡ（配列番号２）
アミノ酸配列：（ＳＴＩＩリーダーアミノ酸配列を太字で示す）
【化１】
2018507204.tif 000008
【０１７６】
Ｐ２Ａ＿３＿１３（プラスミドｐＰ２Ａ−９）−Ｔａｔリーダー
核酸配列：
ＡＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＡＴＴＡＣＧＡＧＴＡＧＣＡＴＴＴＧＧＴＴＴＴＣＴＣＡＴＡＣＴＧＴＧＧＧＣＡＴＣＡＧＴＴＣＴＧＣＡＴＧＣＴＧＡＡＡＣＧＧＧＣＡＣＣＡＴＴＡＧＣＡＴＴＡＧＣＣＡＡＣＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＧＴＴＴＧＧＧＴＣＣＡＣＡＣＣＧＡＧＴＴＡＧＧＣＴＡＴＴＴＣＡＡＣＧＧＴＧＡＡＧＣＣＧＴＧＣＣＧＡＧＣＡＡＴＧＧＴＴＴＧＧＴＴＣＴＧＡＡＴＡＣＧＴＣＣＡＡＧＧＧＴＣＴＧＧＴＧＴＴＧＧＴＡＧＡＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＡＣＡＡＴＡＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＴＣＧＡＡＡＴＧＧＴＴＧＡＧＡＡＡＡＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡＧＣＧＴＧＴＧＡＣＴＧＡＴＧＴＣＡＴＴＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＣＧＣＡＣＧＣＧＧＡＣＣＧＣＡＴＣＧＧＴＧＧＣＡＴＴＡＣＣＧＣＧＣＴＧＡＡＡＧＡＧＣＧＴＧＧＣＡＴＴＡＡＡＧＣＡＣＡＴＡＧＣＡＣＧＧＣＡＣＴＧＡＣＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＣＧＡＡＧＡＡＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＧＡＡＧＡＡＣＣＧＣＴＧＧＧＴＧＡＴＣＴＧＣＡＧＡＣＣＡＴＣＡＣＧＴＣＧＣＴＧＡＡＧＴＴＴＧＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＴＣＧＡＧＡＣＴＴＴＴＴＡＣＣＣＡＧＧＴＡＡＧＧＧＴＣＡＴＡＣＣＧＡＡＧＡＴＡＡＣＡＴＣＧＴＧＧＴＴＴＧＧＣＴＧＣＣＧＣＡＧＴＡＣＣＡＡＡＴＣＣＴＧＧＣＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＴＡＡＧＡＧＣＧＣＡＧＡＧＧＣＧＡＡＡＧＡＴＣＴＧＧＧＴＡＡＴＧＴＣＧＣＧＧＡＣＧＣＴＴＡＴＧＴＧＡＡＣＧＡＧＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＡＴＴＧＡＡＡＡＴＧＴＴＴＴＧＡＡＡＣＧＴＴＡＴＧＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＴＡＧＣＧＴＴＧＴＧＣＣＧＧＧＴＣＡＣＧＧＴＧＡＧＧＴＣＧＧＣＧＡＣＡＡＡＧＧＴＣＴＧＣＴＧＴＴＧＣＡＣＡＣＧＣＴＧＧＡＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＴＧＡＴＡＡ（配列番号３）
アミノ酸配列：（Ｔａｔリーダーアミノ酸配列を太字で示す）
【化２】
2018507204.tif 000009
【０１７７】
ＮＤＭ（配列番号４〜１１）：８種の遺伝子バリアント、ネイティブ（ｄｅｌｔａ３８）、ネイティブ（ｄｅｌｔａ３７）、ネイティブ（ｄｅｌｔａ３５）、ＳＴＩＩ  ｄｅｌｔａ３８、ＳＴＩＩ  ｄｅｌｔａ３７、ＳＴＩＩ  ｄｅｌｔａ３５、ＰｅｌＢ  ｄｅｌｔａ３８、またはＴａｔ  ｄｅｌｔａ３８
ＮＤＭ＿１＿１０（プラスミドｐＮＤＭ−１、ｐＭＤＭ−４、ｐＮＤＭ−７、ｐＮＤＭ−１０）−ネイティブ  ｄｅｌｔａ−３８
核酸配列：
ＡＴＧＧＡＡＡＣＣＧＧＴＧＡＴＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＧＴＧＡＴＴＴＡＧＴＣＴＴＴＣＧＴＣＡＡＴＴＧＧＣＣＣＣＡＡＡＣＧＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＴＡＣＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＴＡＴＧＣＣＧＧＧＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＴＴＧＣＣＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＴＧＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＧＣＴＧＧＴＴＧＴＴＧＡＴＡＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＣＧＡＴＧＡＴＣＡＧＡＣＧＧＣＧＣＡＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＧＧＡＴＣＡＡＡＣＡＡＧＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＧＣＣＧＧＴＴＧＣＧＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＣＡＣＣＣＡＣＧＣＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＣＡＣＴＧＣＡＣＧＣＧＧＣＴＧＧＴＡＴＴＧＣＧＡＣＧＴＡＣＧＣＡＡＡＴＧＣＡＣＴＧＡＧＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＧＧＴＴＧＣＧＧＣＧＣＡＧＣＡＴＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＧＧＣＧＡＡＴＧＧＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＧＡＡＣＴＴＣＧＧＣＣＣＧＴＴＧＡＡＡＧＴＧＴＴＣＴＡＴＣＣＧＧＧＴＣＣＧＧＧＴＣＡＣＡＣＣＴＣＧＧＡＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＧＴＣＧＧＴＡＴＴＧＡＴＧＧＣＡＣＣＧＡＣＡＴＴＧＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＣＴＧＡＴＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＣＴＧＧＧＴＧＡＴＧＣＧＧＡＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＣＧＣＡＣＧＣＧＣＡＴＴＣＧＧＴＧＣＧＧＣＡＴＴＴＣＣＴＡＡＧＧＣＣＴＣＣＡＴＧＡＴＴＧＴＴＡＴＧＡＧＣＣＡＴＴＣＴＧＣＧＣＣＧＧＡＣＡＧＣＣＧＴＧＣＣＧＣＧＡＴＣＡＣＧＣＡＣＡＣＧＧＣＧＣＧＴＡＴＧＧＣＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧＣＧＣＴＡＡＴＧＡ（配列番号４）
アミノ酸配列：
ＭＥＴＧＤＱＲＦＧＤ  ＬＶＦＲＱＬＡＰＮＶ  ＷＱＨＴＳＹＬＤＭＰ  ＧＦＧＡＶＡＳＮＧＬ  ＩＶＲＤＧＧＲＶＬＶ  ＶＤＴＡＷＴＤＤＱＴ
ＡＱＩＬＮＷＩＫＱＥ  ＩＮＬＰＶＡＬＡＶＶ  ＴＨＡＨＱＤＫＭＧＧ  ＭＤＡＬＨＡＡＧＩＡ  ＴＹＡＮＡＬＳＮＱＬ  ＡＰＱＥＧＭＶＡＡＱ
ＨＳＬＴＦＡＡＮＧＷ  ＶＥＰＡＴＡＰＮＦＧ  ＰＬＫＶＦＹＰＧＰＧ  ＨＴＳＤＮＩＴＶＧＩ  ＤＧＴＤＩＡＦＧＧＣ  ＬＩＫＤＳＫＡＫＳＬ
ＧＮＬＧＤＡＤＴＥＨ  ＹＡＡＳＡＲＡＦＧＡ  ＡＦＰＫＡＳＭＩＶＭ  ＳＨＳＡＰＤＳＲＡＡ  ＩＴＨＴＡＲＭＡＤＫ  ＬＲ（配列番号２２）
【０１７８】
ＮＤＭ＿２＿１０（プラスミドｐＮＤＭ−２、ｐＭＤＭ−５、ｐＮＤＭ−８、ｐＮＤＭ−１１）−ＳＴＩＩリーダー＋ｄｅｌｔａ−３８
核酸配列：
ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＴＧＣＡＴＴＴＣＴＧＣＴＧＧＣＧＡＧＣＡＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＣＡＡＣＣＡＡＴＧＣＡＴＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＣＣＧＧＴＧＡＴＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＧＴＧＡＴＴＴＡＧＴＣＴＴＴＣＧＴＣＡＡＴＴＧＧＣＣＣＣＡＡＡＣＧＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＴＡＣＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＴＡＴＧＣＣＧＧＧＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＴＴＧＣＣＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＴＧＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＧＣＴＧＧＴＴＧＴＴＧＡＴＡＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＣＧＡＴＧＡＴＣＡＧＡＣＧＧＣＧＣＡＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＧＧＡＴＣＡＡＡＣＡＡＧＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＧＣＣＧＧＴＴＧＣＧＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＣＡＣＣＣＡＣＧＣＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＣＡＣＴＧＣＡＣＧＣＧＧＣＴＧＧＴＡＴＴＧＣＧＡＣＧＴＡＣＧＣＡＡＡＴＧＣＡＣＴＧＡＧＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＧＧＴＴＧＣＧＧＣＧＣＡＧＣＡＴＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＧＧＣＧＡＡＴＧＧＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＧＡＡＣＴＴＣＧＧＣＣＣＧＴＴＧＡＡＡＧＴＧＴＴＣＴＡＴＣＣＧＧＧＴＣＣＧＧＧＴＣＡＣＡＣＣＴＣＧＧＡＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＧＴＣＧＧＴＡＴＴＧＡＴＧＧＣＡＣＣＧＡＣＡＴＴＧＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＣＴＧＡＴＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＣＴＧＧＧＴＧＡＴＧＣＧＧＡＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＣＧＣＡＣＧＣＧＣＡＴＴＣＧＧＴＧＣＧＧＣＡＴＴＴＣＣＴＡＡＧＧＣＣＴＣＣＡＴＧＡＴＴＧＴＴＡＴＧＡＧＣＣＡＴＴＣＴＧＣＧＣＣＧＧＡＣＡＧＣＣＧＴＧＣＣＧＣＧＡＴＣＡＣＧＣＡＣＡＣＧＧＣＧＣＧＴＡＴＧＧＣＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧＣＧＣＴＡＡＴＧＡ（配列番号５）
アミノ酸配列：（ＳＴＩＩリーダーアミノ酸配列を太字で示す）
【化３】
2018507204.tif 000010
【０１７９】
ＮＤＭ＿３＿１０（プラスミドｐＮＤＭ−３、ｐＭＤＭ−６、ｐＮＤＭ−９、ｐＮＤＭ−１２）−ＰｅｌＢリーダー＋ｄｅｌｔａ−３８
核酸配列：
ＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＣＣＧＧＴＧＡＴＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＧＴＧＡＴＴＴＡＧＴＣＴＴＴＣＧＴＣＡＡＴＴＧＧＣＣＣＣＡＡＡＣＧＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＴＡＣＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＴＡＴＧＣＣＧＧＧＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＴＴＧＣＣＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＴＧＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＧＣＴＧＧＴＴＧＴＴＧＡＴＡＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＣＧＡＴＧＡＴＣＡＧＡＣＧＧＣＧＣＡＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＧＧＡＴＣＡＡＡＣＡＡＧＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＧＣＣＧＧＴＴＧＣＧＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＣＡＣＣＣＡＣＧＣＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＣＡＣＴＧＣＡＣＧＣＧＧＣＴＧＧＴＡＴＴＧＣＧＡＣＧＴＡＣＧＣＡＡＡＴＧＣＡＣＴＧＡＧＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＧＧＴＴＧＣＧＧＣＧＣＡＧＣＡＴＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＧＧＣＧＡＡＴＧＧＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＧＡＡＣＴＴＣＧＧＣＣＣＧＴＴＧＡＡＡＧＴＧＴＴＣＴＡＴＣＣＧＧＧＴＣＣＧＧＧＴＣＡＣＡＣＣＴＣＧＧＡＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＧＴＣＧＧＴＡＴＴＧＡＴＧＧＣＡＣＣＧＡＣＡＴＴＧＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＣＴＧＡＴＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＣＴＧＧＧＴＧＡＴＧＣＧＧＡＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＣＧＣＡＣＧＣＧＣＡＴＴＣＧＧＴＧＣＧＧＣＡＴＴＴＣＣＴＡＡＧＧＣＣＴＣＣＡＴＧＡＴＴＧＴＴＡＴＧＡＧＣＣＡＴＴＣＴＧＣＧＣＣＧＧＡＣＡＧＣＣＧＴＧＣＣＧＣＧＡＴＣＡＣＧＣＡＣＡＣＧＧＣＧＣＧＴＡＴＧＧＣＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧＣＧＣＴＡＡＴＧＡ（配列番号６）
アミノ酸配列：（ＰｅｌＢリーダーアミノ酸配列を太字で示す）
【化４】
2018507204.tif 000011
【０１８０】
ＮＤＭ＿４＿１３（プラスミドｐＮＤＭ−１３）ネイティブ＋ｄｅｌｔａ−３７
核酸配列：
ＡＴＧＣＡＡＡＴＧＧＡＡＡＣＣＧＧＴＧＡＴＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＧＴＧＡＴＴＴＡＧＴＣＴＴＴＣＧＴＣＡＡＴＴＧＧＣＣＣＣＡＡＡＣＧＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＴＡＣＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＴＡＴＧＣＣＧＧＧＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＴＴＧＣＣＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＴＧＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＧＣＴＧＧＴＴＧＴＴＧＡＴＡＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＣＧＡＴＧＡＴＣＡＧＡＣＧＧＣＧＣＡＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＧＧＡＴＣＡＡＡＣＡＡＧＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＧＣＣＧＧＴＴＧＣＧＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＣＡＣＣＣＡＣＧＣＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＣＡＣＴＧＣＡＣＧＣＧＧＣＴＧＧＴＡＴＴＧＣＧＡＣＧＴＡＣＧＣＡＡＡＴＧＣＡＣＴＧＡＧＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＧＧＴＴＧＣＧＧＣＧＣＡＧＣＡＴＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＧＧＣＧＡＡＴＧＧＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＧＡＡＣＴＴＣＧＧＣＣＣＧＴＴＧＡＡＡＧＴＧＴＴＣＴＡＴＣＣＧＧＧＴＣＣＧＧＧＴＣＡＣＡＣＣＴＣＧＧＡＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＧＴＣＧＧＴＡＴＴＧＡＴＧＧＣＡＣＣＧＡＣＡＴＴＧＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＣＴＧＡＴＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＣＴＧＧＧＴＧＡＴＧＣＧＧＡＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＣＧＣＡＣＧＣＧＣＡＴＴＣＧＧＴＧＣＧＧＣＡＴＴＴＣＣＴＡＡＧＧＣＣＴＣＣＡＴＧＡＴＴＧＴＴＡＴＧＡＧＣＣＡＴＴＣＴＧＣＧＣＣＧＧＡＣＡＧＣＣＧＴＧＣＣＧＣＧＡＴＣＡＣＧＣＡＣＡＣＧＧＣＧＣＧＴＡＴＧＧＣＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧＣＧＣＴＡＡＴＧＡ（配列番号７）
アミノ酸配列：
ＭＱＭＥＴＧＤＱＲＦ  ＧＤＬＶＦＲＱＬＡＰ  ＮＶＷＱＨＴＳＹＬＤ  ＭＰＧＦＧＡＶＡＳＮ  ＧＬＩＶＲＤＧＧＲＶ  ＬＶＶＤＴＡＷＴＤＤ
ＱＴＡＱＩＬＮＷＩＫ  ＱＥＩＮＬＰＶＡＬＡ  ＶＶＴＨＡＨＱＤＫＭ  ＧＧＭＤＡＬＨＡＡＧ  ＩＡＴＹＡＮＡＬＳＮ  ＱＬＡＰＱＥＧＭＶＡ
ＡＱＨＳＬＴＦＡＡＮ  ＧＷＶＥＰＡＴＡＰＮ  ＦＧＰＬＫＶＦＹＰＧ  ＰＧＨＴＳＤＮＩＴＶ  ＧＩＤＧＴＤＩＡＦＧ  ＧＣＬＩＫＤＳＫＡＫ
ＳＬＧＮＬＧＤＡＤＴ  ＥＨＹＡＡＳＡＲＡＦ  ＧＡＡＦＰＫＡＳＭＩ  ＶＭＳＨＳＡＰＤＳＲ  ＡＡＩＴＨＴＡＲＭＡ  ＤＫＬＲ（配列番号２５）
【０１８１】
ＮＤＭ＿５＿１３（プラスミドｐＮＤＭ−１４）−  ＳＴＩＩリーダー＋ｄｅｌｔａ−３７
核酸配列：
ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＴＧＣＡＴＴＴＣＴＧＣＴＧＧＣＧＡＧＣＡＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＣＡＡＣＣＡＡＴＧＣＡＴＡＴＧＣＣＣＡＡＡＴＧＧＡＡＡＣＣＧＧＴＧＡＴＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＧＴＧＡＴＴＴＡＧＴＣＴＴＴＣＧＴＣＡＡＴＴＧＧＣＣＣＣＡＡＡＣＧＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＴＡＣＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＴＡＴＧＣＣＧＧＧＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＴＴＧＣＣＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＴＧＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＧＣＴＧＧＴＴＧＴＴＧＡＴＡＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＣＧＡＴＧＡＴＣＡＧＡＣＧＧＣＧＣＡＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＧＧＡＴＣＡＡＡＣＡＡＧＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＧＣＣＧＧＴＴＧＣＧＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＣＡＣＣＣＡＣＧＣＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＣＡＣＴＧＣＡＣＧＣＧＧＣＴＧＧＴＡＴＴＧＣＧＡＣＧＴＡＣＧＣＡＡＡＴＧＣＡＣＴＧＡＧＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＧＧＴＴＧＣＧＧＣＧＣＡＧＣＡＴＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＧＧＣＧＡＡＴＧＧＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＧＡＡＣＴＴＣＧＧＣＣＣＧＴＴＧＡＡＡＧＴＧＴＴＣＴＡＴＣＣＧＧＧＴＣＣＧＧＧＴＣＡＣＡＣＣＴＣＧＧＡＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＧＴＣＧＧＴＡＴＴＧＡＴＧＧＣＡＣＣＧＡＣＡＴＴＧＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＣＴＧＡＴＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＣＴＧＧＧＴＧＡＴＧＣＧＧＡＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＣＧＣＡＣＧＣＧＣＡＴＴＣＧＧＴＧＣＧＧＣＡＴＴＴＣＣＴＡＡＧＧＣＣＴＣＣＡＴＧＡＴＴＧＴＴＡＴＧＡＧＣＣＡＴＴＣＴＧＣＧＣＣＧＧＡＣＡＧＣＣＧＴＧＣＣＧＣＧＡＴＣＡＣＧＣＡＣＡＣＧＧＣＧＣＧＴＡＴＧＧＣＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧＣＧＣＴＡＡＴＧＡ（配列番号８）
アミノ酸配列：（ＳＴＩＩリーダーアミノ酸配列を太字で示す）
【化５】
2018507204.tif 000012
【０１８２】
ＮＤＭ＿６＿１３（プラスミドｐＮＤＭ−１５）−ネイティブｄｅｌｔａ−３５
核酸配列：
ＡＴＧＧＧＴＣＡＡＣＡＡＡＴＧＧＡＡＡＣＣＧＧＴＧＡＴＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＧＴＧＡＴＴＴＡＧＴＣＴＴＴＣＧＴＣＡＡＴＴＧＧＣＣＣＣＡＡＡＣＧＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＴＡＣＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＴＡＴＧＣＣＧＧＧＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＴＴＧＣＣＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＴＧＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＧＣＴＧＧＴＴＧＴＴＧＡＴＡＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＣＧＡＴＧＡＴＣＡＧＡＣＧＧＣＧＣＡＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＧＧＡＴＣＡＡＡＣＡＡＧＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＧＣＣＧＧＴＴＧＣＧＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＣＡＣＣＣＡＣＧＣＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＣＡＣＴＧＣＡＣＧＣＧＧＣＴＧＧＴＡＴＴＧＣＧＡＣＧＴＡＣＧＣＡＡＡＴＧＣＡＣＴＧＡＧＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＧＧＴＴＧＣＧＧＣＧＣＡＧＣＡＴＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＧＧＣＧＡＡＴＧＧＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＧＡＡＣＴＴＣＧＧＣＣＣＧＴＴＧＡＡＡＧＴＧＴＴＣＴＡＴＣＣＧＧＧＴＣＣＧＧＧＴＣＡＣＡＣＣＴＣＧＧＡＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＧＴＣＧＧＴＡＴＴＧＡＴＧＧＣＡＣＣＧＡＣＡＴＴＧＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＣＴＧＡＴＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＣＴＧＧＧＴＧＡＴＧＣＧＧＡＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＣＧＣＡＣＧＣＧＣＡＴＴＣＧＧＴＧＣＧＧＣＡＴＴＴＣＣＴＡＡＧＧＣＣＴＣＣＡＴＧＡＴＴＧＴＴＡＴＧＡＧＣＣＡＴＴＣＴＧＣＧＣＣＧＧＡＣＡＧＣＣＧＴＧＣＣＧＣＧＡＴＣＡＣＧＣＡＣＡＣＧＧＣＧＣＧＴＡＴＧＧＣＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧＣＧＣＴＡＡＴＧＡ（配列番号９）
アミノ酸配列：
ＭＧＱＱＭＥＴＧＤＱ  ＲＦＧＤＬＶＦＲＱＬ  ＡＰＮＶＷＱＨＴＳＹ  ＬＤＭＰＧＦＧＡＶＡ  ＳＮＧＬＩＶＲＤＧＧ  ＲＶＬＶＶＤＴＡＷＴ
ＤＤＱＴＡＱＩＬＮＷ  ＩＫＱＥＩＮＬＰＶＡ  ＬＡＶＶＴＨＡＨＱＤ  ＫＭＧＧＭＤＡＬＨＡ  ＡＧＩＡＴＹＡＮＡＬ  ＳＮＱＬＡＰＱＥＧＭ
ＶＡＡＱＨＳＬＴＦＡ  ＡＮＧＷＶＥＰＡＴＡ  ＰＮＦＧＰＬＫＶＦＹ  ＰＧＰＧＨＴＳＤＮＩ  ＴＶＧＩＤＧＴＤＩＡ  ＦＧＧＣＬＩＫＤＳＫ
ＡＫＳＬＧＮＬＧＤＡ  ＤＴＥＨＹＡＡＳＡＲ  ＡＦＧＡＡＦＰＫＡＳ  ＭＩＶＭＳＨＳＡＰＤ  ＳＲＡＡＩＴＨＴＡＲ  ＭＡＤＫＬＲ（配列番号２７）
【０１８３】
ＮＤＭ＿７＿１３（プラスミドｐＮＤＭ−１６）−ＳＴＩＩリーダー＋ｄｅｌｔａ−３５
核酸配列：
ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＴＧＣＡＴＴＴＣＴＧＣＴＧＧＣＧＡＧＣＡＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＣＡＡＣＣＡＡＴＧＣＡＴＡＴＧＣＣＧＧＴＣＡＡＣＡＡＡＴＧＧＡＡＡＣＣＧＧＴＧＡＴＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＧＴＧＡＴＴＴＡＧＴＣＴＴＴＣＧＴＣＡＡＴＴＧＧＣＣＣＣＡＡＡＣＧＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＴＡＣＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＴＡＴＧＣＣＧＧＧＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＴＴＧＣＣＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＴＧＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＧＣＴＧＧＴＴＧＴＴＧＡＴＡＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＣＧＡＴＧＡＴＣＡＧＡＣＧＧＣＧＣＡＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＧＧＡＴＣＡＡＡＣＡＡＧＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＧＣＣＧＧＴＴＧＣＧＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＣＡＣＣＣＡＣＧＣＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＣＡＣＴＧＣＡＣＧＣＧＧＣＴＧＧＴＡＴＴＧＣＧＡＣＧＴＡＣＧＣＡＡＡＴＧＣＡＣＴＧＡＧＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＧＧＴＴＧＣＧＧＣＧＣＡＧＣＡＴＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＧＧＣＧＡＡＴＧＧＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＧＡＡＣＴＴＣＧＧＣＣＣＧＴＴＧＡＡＡＧＴＧＴＴＣＴＡＴＣＣＧＧＧＴＣＣＧＧＧＴＣＡＣＡＣＣＴＣＧＧＡＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＧＴＣＧＧＴＡＴＴＧＡＴＧＧＣＡＣＣＧＡＣＡＴＴＧＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＣＴＧＡＴＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＣＴＧＧＧＴＧＡＴＧＣＧＧＡＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＣＧＣＡＣＧＣＧＣＡＴＴＣＧＧＴＧＣＧＧＣＡＴＴＴＣＣＴＡＡＧＧＣＣＴＣＣＡＴＧＡＴＴＧＴＴＡＴＧＡＧＣＣＡＴＴＣＴＧＣＧＣＣＧＧＡＣＡＧＣＣＧＴＧＣＣＧＣＧＡＴＣＡＣＧＣＡＣＡＣＧＧＣＧＣＧＴＡＴＧＧＣＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧＣＧＣＴＡＡＴＧＡ（配列番号１０）
アミノ酸配列：（ＳＴＩＩリーダーアミノ酸配列を太字で示す）
【化６】
2018507204.tif 000013
【０１８４】
ＮＤＭ＿８＿１３（プラスミドｐＮＤＭ−１７）−Ｔａｔリーダー＋ｄｅｌｔａ−３８
核酸配列：
ＡＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＡＴＴＡＣＧＡＧＴＡＧＣＡＴＴＴＧＧＴＴＴＴＣＴＣＡＴＡＣＴＧＴＧＧＧＣＡＴＣＡＧＴＴＣＴＧＣＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＡＡＣＣＧＧＴＧＡＴＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＧＴＧＡＴＴＴＡＧＴＣＴＴＴＣＧＴＣＡＡＴＴＧＧＣＣＣＣＡＡＡＣＧＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＴＡＣＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＴＡＴＧＣＣＧＧＧＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＴＴＧＣＣＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＴＧＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＧＣＴＧＧＴＴＧＴＴＧＡＴＡＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＣＧＡＴＧＡＴＣＡＧＡＣＧＧＣＧＣＡＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＧＧＡＴＣＡＡＡＣＡＡＧＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＧＣＣＧＧＴＴＧＣＧＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＣＡＣＣＣＡＣＧＣＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＣＡＣＴＧＣＡＣＧＣＧＧＣＴＧＧＴＡＴＴＧＣＧＡＣＧＴＡＣＧＣＡＡＡＴＧＣＡＣＴＧＡＧＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＧＧＴＴＧＣＧＧＣＧＣＡＧＣＡＴＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＧＧＣＧＡＡＴＧＧＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＧＡＡＣＴＴＣＧＧＣＣＣＧＴＴＧＡＡＡＧＴＧＴＴＣＴＡＴＣＣＧＧＧＴＣＣＧＧＧＴＣＡＣＡＣＣＴＣＧＧＡＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＧＴＣＧＧＴＡＴＴＧＡＴＧＧＣＡＣＣＧＡＣＡＴＴＧＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＣＴＧＡＴＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＣＴＧＧＧＴＧＡＴＧＣＧＧＡＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＣＧＣＡＣＧＣＧＣＡＴＴＣＧＧＴＧＣＧＧＣＡＴＴＴＣＣＴＡＡＧＧＣＣＴＣＣＡＴＧＡＴＴＧＴＴＡＴＧＡＧＣＣＡＴＴＣＴＧＣＧＣＣＧＧＡＣＡＧＣＣＧＴＧＣＣＧＣＧＡＴＣＡＣＧＣＡＣＡＣＧＧＣＧＣＧＴＡＴＧＧＣＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧＣＧＣＴＡＡＴＧＡ（配列番号１１）
アミノ酸配列：（Ｔａｔリーダーアミノ酸配列を太字で示す）
【化７】
2018507204.tif 000014
【０１８５】
ＫＰＣ（配列番号１２〜１８）：７種の遺伝子バリアント、ネイティブ、ＳＴＩＩ＋ネイティブ、ネイティブ  ｄｅｌｔａ２、ＳＴＩＩ＋ｄｅｌｔａ２、ネイティブ  ｄｅｌｔａ８、ＳＴＩＩ  ｄｅｌｔａ８、Ｔａｔリーダー＋ネイティブ
ＫＰＣ＿１＿１０（プラスミドｐＫＰＣ−１、ｐＫＰＣ−３、ｐＫＰＣ−５、ｐＫＰＣ−７）−ネイティブ
核酸配列：
ＡＴＧＧＣＡＡＣＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＡＴＴＴＡＧＴＴＧＣＡＧＡＡＣＣＴＴＴＣＧＣＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＴＴＧＧＴＧＴＧＴＡＴＧＣＧＡＴＧＧＡＴＡＣＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＡＡＣＧＴＴＴＴＣＣＧＣＴＧＴＧＴＴＣＣＡＧＣＴＴＣＡＡＧＧＧＴＴＴＴＣＴＧＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＴＣＣＴＧＧＣＧＣＧＴＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＣＣＧＡＴＣＣＧＴＴＡＣＧＧＣＡＡＡＡＡＴＧＣＧＣＴＧＧＴＧＣＣＧＴＧＧＡＧＣＣＣＧＡＴＴＡＧＣＧＡＧＡＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＣＡＣＴＧＧＴＡＴＧＡＣＧＧＴＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＴＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＧＧＴＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＧＡＣＡＡＣＧＣＡＧＣＧＧＣＧＡＡＴＣＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＧＣＣＣＧＧＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＧＧＣＧＴＴＴＡＴＧＣＧＣＡＧＣＡＴＣＧＧＴＧＡＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＣＧＣＴＧＧＧＡＡＴＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＣＴＣＴＧＣＴＡＴＣＣＣＧＡＧＣＧＡＴＧＣＣＣＧＴＧＡＴＡＣＧＴＣＴＡＧＣＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＴＴＡＣＴＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＡＡＡＣＴＴＡＣＧＣＴＧＧＧＴＡＧＣＧＣＧＣＴＧＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＡＡＣＧＴＣＡＡＣＡＧＴＴＣＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＣＧＧＴＡＡＣＣＡＣＣＧＴＡＴＴＣＧＴＧＣＣＧＣＡＧＴＴＣＣＧＧＣＧＧＡＣＴＧＧＧＣＴＧＴＴＧＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＧＣＡＣＧＴＧＣＧＧＴＧＴＣＴＡＣＧＧＴＡＣＣＧＣＧＡＡＴＧＡＣＴＡＴＧＣＡＧＴＧＧＴＣＴＧＧＣＣＡＡＣＣＧＧＴＣＧＴＧＣＧＣＣＧＡＴＣＧＴＴＣＴＧＧＣＡＧＴＴＴＡＣＡＣＣＣＧＴＧＣＴＣＣＧＡＡＣＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＧＣＣＧＴＧＡＴＴＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＣＧＣＣＴＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＧＴＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＴＡＡ（配列番号１２）
アミノ酸配列：
ＭＡＴＡＬＴＮＬＶＡ  ＥＰＦＡＫＬＥＱＤＦ  ＧＧＳＩＧＶＹＡＭＤ  ＴＧＳＧＡＴＶＳＹＲ  ＡＥＥＲＦＰＬＣＳＳ  ＦＫＧＦＬＡＡＡＶＬ
ＡＲＳＱＱＱＡＧＬＬ  ＤＴＰＩＲＹＧＫＮＡ  ＬＶＰＷＳＰＩＳＥＫ  ＹＬＴＴＧＭＴＶＡＥ  ＬＳＡＡＡＶＱＹＳＤ  ＮＡＡＡＮＬＬＬＫＥ
ＬＧＧＰＡＧＬＴＡＦ  ＭＲＳＩＧＤＴＴＦＲ  ＬＤＲＷＥＬＥＬＮＳ  ＡＩＰＳＤＡＲＤＴＳ  ＳＰＲＡＶＴＥＳＬＱ  ＫＬＴＬＧＳＡＬＡＡ
ＰＱＲＱＱＦＶＤＷＬ  ＫＧＮＴＴＧＮＨＲＩ  ＲＡＡＶＰＡＤＷＡＶ  ＧＤＫＴＧＴＣＧＶＹ  ＧＴＡＮＤＹＡＶＶＷ  ＰＴＧＲＡＰＩＶＬＡ
ＶＹＴＲＡＰＮＫＤＤ  ＫＨＳＥＡＶＩＡＡＡ  ＡＲＬＡＬＥＧＬＧＶ  ＮＧＱ（配列番号３０）
【０１８６】
ＫＰＣ＿２＿１０（プラスミドｐＫＰＣ−２、ｐＫＰＣ−４、ｐＫＰＣ−６、ｐＫＰＣ−８）−ＳＴＩＩリーダー＋ネイティブ
核酸配列：
ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＴＧＣＡＴＴＴＣＴＧＣＴＧＧＣＧＡＧＣＡＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＣＡＡＣＣＡＡＴＧＣＡＴＡＴＧＣＣＧＣＡＡＣＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＡＴＴＴＡＧＴＴＧＣＡＧＡＡＣＣＴＴＴＣＧＣＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＴＴＧＧＴＧＴＧＴＡＴＧＣＧＡＴＧＧＡＴＡＣＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＡＡＣＧＴＴＴＴＣＣＧＣＴＧＴＧＴＴＣＣＡＧＣＴＴＣＡＡＧＧＧＴＴＴＴＣＴＧＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＴＣＣＴＧＧＣＧＣＧＴＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＣＣＧＡＴＣＣＧＴＴＡＣＧＧＣＡＡＡＡＡＴＧＣＧＣＴＧＧＴＧＣＣＧＴＧＧＡＧＣＣＣＧＡＴＴＡＧＣＧＡＧＡＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＣＡＣＴＧＧＴＡＴＧＡＣＧＧＴＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＴＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＧＧＴＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＧＡＣＡＡＣＧＣＡＧＣＧＧＣＧＡＡＴＣＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＧＣＣＣＧＧＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＧＧＣＧＴＴＴＡＴＧＣＧＣＡＧＣＡＴＣＧＧＴＧＡＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＣＧＣＴＧＧＧＡＡＴＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＣＴＣＴＧＣＴＡＴＣＣＣＧＡＧＣＧＡＴＧＣＣＣＧＴＧＡＴＡＣＧＴＣＴＡＧＣＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＴＴＡＣＴＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＡＡＡＣＴＴＡＣＧＣＴＧＧＧＴＡＧＣＧＣＧＣＴＧＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＡＡＣＧＴＣＡＡＣＡＧＴＴＣＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＣＧＧＴＡＡＣＣＡＣＣＧＴＡＴＴＣＧＴＧＣＣＧＣＡＧＴＴＣＣＧＧＣＧＧＡＣＴＧＧＧＣＴＧＴＴＧＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＧＣＡＣＧＴＧＣＧＧＴＧＴＣＴＡＣＧＧＴＡＣＣＧＣＧＡＡＴＧＡＣＴＡＴＧＣＡＧＴＧＧＴＣＴＧＧＣＣＡＡＣＣＧＧＴＣＧＴＧＣＧＣＣＧＡＴＣＧＴＴＣＴＧＧＣＡＧＴＴＴＡＣＡＣＣＣＧＴＧＣＴＣＣＧＡＡＣＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＧＣＣＧＴＧＡＴＴＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＣＧＣＣＴＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＧＴＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＴＡＡ（配列番号１３）
アミノ酸配列：（ＳＴＩＩリーダーアミノ酸配列を太字で示す）
【化８】
2018507204.tif 000015
【０１８７】
ＫＰＣ＿３＿１３（プラスミドｐＫＰＣ−９）−ネイティブ  ｄｅｌｔａ２
核酸配列：
ＡＴＧＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＡＴＴＴＡＧＴＴＧＣＡＧＡＡＣＣＴＴＴＣＧＣＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＴＴＧＧＴＧＴＧＴＡＴＧＣＧＡＴＧＧＡＴＡＣＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＡＡＣＧＴＴＴＴＣＣＧＣＴＧＴＧＴＴＣＣＡＧＣＴＴＣＡＡＧＧＧＴＴＴＴＣＴＧＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＴＣＣＴＧＧＣＧＣＧＴＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＣＣＧＡＴＣＣＧＴＴＡＣＧＧＣＡＡＡＡＡＴＧＣＧＣＴＧＧＴＧＣＣＧＴＧＧＡＧＣＣＣＧＡＴＴＡＧＣＧＡＧＡＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＣＡＣＴＧＧＴＡＴＧＡＣＧＧＴＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＴＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＧＧＴＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＧＡＣＡＡＣＧＣＡＧＣＧＧＣＧＡＡＴＣＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＧＣＣＣＧＧＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＧＧＣＧＴＴＴＡＴＧＣＧＣＡＧＣＡＴＣＧＧＴＧＡＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＣＧＣＴＧＧＧＡＡＴＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＣＴＣＴＧＣＴＡＴＣＣＣＧＡＧＣＧＡＴＧＣＣＣＧＴＧＡＴＡＣＧＴＣＴＡＧＣＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＴＴＡＣＴＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＡＡＡＣＴＴＡＣＧＣＴＧＧＧＴＡＧＣＧＣＧＣＴＧＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＡＡＣＧＴＣＡＡＣＡＧＴＴＣＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＣＧＧＴＡＡＣＣＡＣＣＧＴＡＴＴＣＧＴＧＣＣＧＣＡＧＴＴＣＣＧＧＣＧＧＡＣＴＧＧＧＣＴＧＴＴＧＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＧＣＡＣＧＴＧＣＧＧＴＧＴＣＴＡＣＧＧＴＡＣＣＧＣＧＡＡＴＧＡＣＴＡＴＧＣＡＧＴＧＧＴＣＴＧＧＣＣＡＡＣＣＧＧＴＣＧＴＧＣＧＣＣＧＡＴＣＧＴＴＣＴＧＧＣＡＧＴＴＴＡＣＡＣＣＣＧＴＧＣＴＣＣＧＡＡＣＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＧＣＣＧＴＧＡＴＴＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＣＧＣＣＴＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＧＴＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＴＡＡ（配列番号１４）
アミノ酸配列：
ＭＡＬＴＮＬＶＡＥＰ  ＦＡＫＬＥＱＤＦＧＧ  ＳＩＧＶＹＡＭＤＴＧ  ＳＧＡＴＶＳＹＲＡＥ  ＥＲＦＰＬＣＳＳＦＫ  ＧＦＬＡＡＡＶＬＡＲ
ＳＱＱＱＡＧＬＬＤＴ  ＰＩＲＹＧＫＮＡＬＶ  ＰＷＳＰＩＳＥＫＹＬ  ＴＴＧＭＴＶＡＥＬＳ  ＡＡＡＶＱＹＳＤＮＡ  ＡＡＮＬＬＬＫＥＬＧ
ＧＰＡＧＬＴＡＦＭＲ  ＳＩＧＤＴＴＦＲＬＤ  ＲＷＥＬＥＬＮＳＡＩ  ＰＳＤＡＲＤＴＳＳＰ  ＲＡＶＴＥＳＬＱＫＬ  ＴＬＧＳＡＬＡＡＰＱ
ＲＱＱＦＶＤＷＬＫＧ  ＮＴＴＧＮＨＲＩＲＡ  ＡＶＰＡＤＷＡＶＧＤ  ＫＴＧＴＣＧＶＹＧＴ  ＡＮＤＹＡＶＶＷＰＴ  ＧＲＡＰＩＶＬＡＶＹ
ＴＲＡＰＮＫＤＤＫＨ  ＳＥＡＶＩＡＡＡＡＲ  ＬＡＬＥＧＬＧＶＮＧ  Ｑ（配列番号３２）
【０１８８】
ＫＰＣ＿４＿１３（プラスミドｐＫＰＣ−１０）−ＳＴＩＩリーダー＋ｄｅｌｔａ２
核酸配列：
ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＴＧＣＡＴＴＴＣＴＧＣＴＧＧＣＧＡＧＣＡＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＣＡＡＣＣＡＡＴＧＣＡＴＡＴＧＣＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＡＴＴＴＡＧＴＴＧＣＡＧＡＡＣＣＴＴＴＣＧＣＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＴＴＧＧＴＧＴＧＴＡＴＧＣＧＡＴＧＧＡＴＡＣＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＡＡＣＧＴＴＴＴＣＣＧＣＴＧＴＧＴＴＣＣＡＧＣＴＴＣＡＡＧＧＧＴＴＴＴＣＴＧＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＴＣＣＴＧＧＣＧＣＧＴＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＣＣＧＡＴＣＣＧＴＴＡＣＧＧＣＡＡＡＡＡＴＧＣＧＣＴＧＧＴＧＣＣＧＴＧＧＡＧＣＣＣＧＡＴＴＡＧＣＧＡＧＡＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＣＡＣＴＧＧＴＡＴＧＡＣＧＧＴＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＴＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＧＧＴＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＧＡＣＡＡＣＧＣＡＧＣＧＧＣＧＡＡＴＣＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＧＣＣＣＧＧＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＧＧＣＧＴＴＴＡＴＧＣＧＣＡＧＣＡＴＣＧＧＴＧＡＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＣＧＣＴＧＧＧＡＡＴＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＣＴＣＴＧＣＴＡＴＣＣＣＧＡＧＣＧＡＴＧＣＣＣＧＴＧＡＴＡＣＧＴＣＴＡＧＣＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＴＴＡＣＴＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＡＡＡＣＴＴＡＣＧＣＴＧＧＧＴＡＧＣＧＣＧＣＴＧＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＡＡＣＧＴＣＡＡＣＡＧＴＴＣＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＣＧＧＴＡＡＣＣＡＣＣＧＴＡＴＴＣＧＴＧＣＣＧＣＡＧＴＴＣＣＧＧＣＧＧＡＣＴＧＧＧＣＴＧＴＴＧＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＧＣＡＣＧＴＧＣＧＧＴＧＴＣＴＡＣＧＧＴＡＣＣＧＣＧＡＡＴＧＡＣＴＡＴＧＣＡＧＴＧＧＴＣＴＧＧＣＣＡＡＣＣＧＧＴＣＧＴＧＣＧＣＣＧＡＴＣＧＴＴＣＴＧＧＣＡＧＴＴＴＡＣＡＣＣＣＧＴＧＣＴＣＣＧＡＡＣＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＧＣＣＧＴＧＡＴＴＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＣＧＣＣＴＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＧＴＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＴＡＡ（配列番号１５）
アミノ酸配列：（ＳＴＩＩリーダーアミノ酸配列を太字で示す）
【化９】
2018507204.tif 000016
【０１８９】
ＫＰＣ＿５＿１３（プラスミドｐＫＰＣ−１１）−ネイティブ  ｄｅｌｔａ８
核酸配列：
ＡＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＴＴＴＣＧＣＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＴＴＧＧＴＧＴＧＴＡＴＧＣＧＡＴＧＧＡＴＡＣＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＡＡＣＧＴＴＴＴＣＣＧＣＴＧＴＧＴＴＣＣＡＧＣＴＴＣＡＡＧＧＧＴＴＴＴＣＴＧＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＴＣＣＴＧＧＣＧＣＧＴＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＣＣＧＡＴＣＣＧＴＴＡＣＧＧＣＡＡＡＡＡＴＧＣＧＣＴＧＧＴＧＣＣＧＴＧＧＡＧＣＣＣＧＡＴＴＡＧＣＧＡＧＡＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＣＡＣＴＧＧＴＡＴＧＡＣＧＧＴＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＴＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＧＧＴＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＧＡＣＡＡＣＧＣＡＧＣＧＧＣＧＡＡＴＣＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＧＣＣＣＧＧＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＧＧＣＧＴＴＴＡＴＧＣＧＣＡＧＣＡＴＣＧＧＴＧＡＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＣＧＣＴＧＧＧＡＡＴＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＣＴＣＴＧＣＴＡＴＣＣＣＧＡＧＣＧＡＴＧＣＣＣＧＴＧＡＴＡＣＧＴＣＴＡＧＣＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＴＴＡＣＴＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＡＡＡＣＴＴＡＣＧＣＴＧＧＧＴＡＧＣＧＣＧＣＴＧＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＡＡＣＧＴＣＡＡＣＡＧＴＴＣＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＣＧＧＴＡＡＣＣＡＣＣＧＴＡＴＴＣＧＴＧＣＣＧＣＡＧＴＴＣＣＧＧＣＧＧＡＣＴＧＧＧＣＴＧＴＴＧＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＧＣＡＣＧＴＧＣＧＧＴＧＴＣＴＡＣＧＧＴＡＣＣＧＣＧＡＡＴＧＡＣＴＡＴＧＣＡＧＴＧＧＴＣＴＧＧＣＣＡＡＣＣＧＧＴＣＧＴＧＣＧＣＣＧＡＴＣＧＴＴＣＴＧＧＣＡＧＴＴＴＡＣＡＣＣＣＧＴＧＣＴＣＣＧＡＡＣＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＧＣＣＧＴＧＡＴＴＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＣＧＣＣＴＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＧＴＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＴＡＡ（配列番号１６）
アミノ酸配列：
ＭＡＥＰＦＡＫＬＥＱ  ＤＦＧＧＳＩＧＶＹＡ  ＭＤＴＧＳＧＡＴＶＳ  ＹＲＡＥＥＲＦＰＬＣ  ＳＳＦＫＧＦＬＡＡＡ  ＶＬＡＲＳＱＱＱＡＧ
ＬＬＤＴＰＩＲＹＧＫ  ＮＡＬＶＰＷＳＰＩＳ  ＥＫＹＬＴＴＧＭＴＶ  ＡＥＬＳＡＡＡＶＱＹ  ＳＤＮＡＡＡＮＬＬＬ  ＫＥＬＧＧＰＡＧＬＴ
ＡＦＭＲＳＩＧＤＴＴ  ＦＲＬＤＲＷＥＬＥＬ  ＮＳＡＩＰＳＤＡＲＤ  ＴＳＳＰＲＡＶＴＥＳ  ＬＱＫＬＴＬＧＳＡＬ  ＡＡＰＱＲＱＱＦＶＤ
ＷＬＫＧＮＴＴＧＮＨ  ＲＩＲＡＡＶＰＡＤＷ  ＡＶＧＤＫＴＧＴＣＧ  ＶＹＧＴＡＮＤＹＡＶ  ＶＷＰＴＧＲＡＰＩＶ  ＬＡＶＹＴＲＡＰＮＫ
ＤＤＫＨＳＥＡＶＩＡ  ＡＡＡＲＬＡＬＥＧＬ  ＧＶＮＧＱ（配列番号３４）
【０１９０】
ＫＰＣ＿６＿１３（プラスミドｐＫＰＣ−１２）−ＳＴＩＩリーダー＋ｄｅｌｔａ８
核酸配列：
ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＴＧＣＡＴＴＴＣＴＧＣＴＧＧＣＧＡＧＣＡＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＧＣＡＡＣＣＡＡＴＧＣＡＴＡＴＧＣＣＧＣＡＧＡＡＣＣＴＴＴＣＧＣＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＴＴＧＧＴＧＴＧＴＡＴＧＣＧＡＴＧＧＡＴＡＣＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＡＡＣＧＴＴＴＴＣＣＧＣＴＧＴＧＴＴＣＣＡＧＣＴＴＣＡＡＧＧＧＴＴＴＴＣＴＧＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＴＣＣＴＧＧＣＧＣＧＴＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＣＣＧＡＴＣＣＧＴＴＡＣＧＧＣＡＡＡＡＡＴＧＣＧＣＴＧＧＴＧＣＣＧＴＧＧＡＧＣＣＣＧＡＴＴＡＧＣＧＡＧＡＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＣＡＣＴＧＧＴＡＴＧＡＣＧＧＴＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＴＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＧＧＴＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＧＡＣＡＡＣＧＣＡＧＣＧＧＣＧＡＡＴＣＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＧＣＣＣＧＧＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＧＧＣＧＴＴＴＡＴＧＣＧＣＡＧＣＡＴＣＧＧＴＧＡＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＣＧＣＴＧＧＧＡＡＴＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＣＴＣＴＧＣＴＡＴＣＣＣＧＡＧＣＧＡＴＧＣＣＣＧＴＧＡＴＡＣＧＴＣＴＡＧＣＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＴＴＡＣＴＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＡＡＡＣＴＴＡＣＧＣＴＧＧＧＴＡＧＣＧＣＧＣＴＧＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＡＡＣＧＴＣＡＡＣＡＧＴＴＣＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＣＧＧＴＡＡＣＣＡＣＣＧＴＡＴＴＣＧＴＧＣＣＧＣＡＧＴＴＣＣＧＧＣＧＧＡＣＴＧＧＧＣＴＧＴＴＧＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＧＣＡＣＧＴＧＣＧＧＴＧＴＣＴＡＣＧＧＴＡＣＣＧＣＧＡＡＴＧＡＣＴＡＴＧＣＡＧＴＧＧＴＣＴＧＧＣＣＡＡＣＣＧＧＴＣＧＴＧＣＧＣＣＧＡＴＣＧＴＴＣＴＧＧＣＡＧＴＴＴＡＣＡＣＣＣＧＴＧＣＴＣＣＧＡＡＣＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＧＣＣＧＴＧＡＴＴＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＣＧＣＣＴＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＧＴＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＴＡＡ（配列番号１７）
アミノ酸配列：（ＳＴＩＩリーダーアミノ酸配列を太字で示す）
【化１０】
2018507204.tif 000017
【０１９１】
ＫＰＣ＿７＿１３（プラスミドｐＫＰＣ−１３）−Ｔａｔ＋ネイティブ
核酸配列：
ＡＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＡＴＴＡＣＧＡＧＴＡＧＣＡＴＴＴＧＧＴＴＴＴＣＴＣＡＴＡＣＴＧＴＧＧＧＣＡＴＣＡＧＴＴＣＴＧＣＡＴＧＣＴＧＣＡＡＣＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＡＴＴＴＡＧＴＴＧＣＡＧＡＡＣＣＴＴＴＣＧＣＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＴＴＧＧＴＧＴＧＴＡＴＧＣＧＡＴＧＧＡＴＡＣＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＡＡＣＧＴＴＴＴＣＣＧＣＴＧＴＧＴＴＣＣＡＧＣＴＴＣＡＡＧＧＧＴＴＴＴＣＴＧＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＴＣＣＴＧＧＣＧＣＧＴＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＣＣＧＡＴＣＣＧＴＴＡＣＧＧＣＡＡＡＡＡＴＧＣＧＣＴＧＧＴＧＣＣＧＴＧＧＡＧＣＣＣＧＡＴＴＡＧＣＧＡＧＡＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＣＡＣＴＧＧＴＡＴＧＡＣＧＧＴＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＴＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＧＧＴＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＧＡＣＡＡＣＧＣＡＧＣＧＧＣＧＡＡＴＣＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＧＣＣＣＧＧＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＧＧＣＧＴＴＴＡＴＧＣＧＣＡＧＣＡＴＣＧＧＴＧＡＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＣＧＣＴＧＧＧＡＡＴＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＣＴＣＴＧＣＴＡＴＣＣＣＧＡＧＣＧＡＴＧＣＣＣＧＴＧＡＴＡＣＧＴＣＴＡＧＣＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＴＴＡＣＴＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＡＡＡＣＴＴＡＣＧＣＴＧＧＧＴＡＧＣＧＣＧＣＴＧＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＡＡＣＧＴＣＡＡＣＡＧＴＴＣＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＣＧＧＴＡＡＣＣＡＣＣＧＴＡＴＴＣＧＴＧＣＣＧＣＡＧＴＴＣＣＧＧＣＧＧＡＣＴＧＧＧＣＴＧＴＴＧＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＧＣＡＣＧＴＧＣＧＧＴＧＴＣＴＡＣＧＧＴＡＣＣＧＣＧＡＡＴＧＡＣＴＡＴＧＣＡＧＴＧＧＴＣＴＧＧＣＣＡＡＣＣＧＧＴＣＧＴＧＣＧＣＣＧＡＴＣＧＴＴＣＴＧＧＣＡＧＴＴＴＡＣＡＣＣＣＧＴＧＣＴＣＣＧＡＡＣＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＧＣＣＧＴＧＡＴＴＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＣＧＣＣＴＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＧＴＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＴＡＡ（配列番号１８）
アミノ酸配列：（Ｔａｔリーダーアミノ酸配列を太字で示す）
【化１１】
2018507204.tif 000018
【表４】
2018507204.tif 000019
【表５】
2018507204.tif 000020
2018507204.tif 000021
【表６】
2018507204.tif 000022
【表７】
2018507204.tif 000023
【０１９２】
実施例２：種々のＰ２Ａ、ＮＤＭ、およびＫＰＣをコードする菌株の選別
特に、１種または複数の生物学的に活性なカルバペネマーゼの十分な発現を実現する菌株を特定するために、実験を行った。
【０１９３】
スクリーニングアッセイにより、合計１０４種の形質転換菌株、２５種のＰ２Ａ株、４４種のＮＤＭ株、および３５種のＫＰＣ株（表１〜３に示す）のカルバペネマーゼタンパク質発現に関し評価した。１０４種の形質転換株のコロニーを採取し、一晩増殖し、２４ウェルディッシュ（ウエル当たり３ｍｌの容積）中に１：５０に希釈した後、一晩増殖した。株当たり合計２ｘ１．０ｍｌの試料を保存した。細菌をＢｕｇＢｕｓｔｅｒタンパク質抽出試薬（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号７０５８４）で溶解した。可溶性および不溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥを使って分析した。Ｐ２ＡおよびＮＤＭ菌株の初期選別からのデータを表５および６にまとめている。２５種のＰ２Ａ株の内８種が可溶性または不溶性のバンドを生成し（表５）、４４種のＮＭＤ株の内の１４種が可溶性または不溶性のバンドを生成した（表６）。Ｐ２ＡおよびＮＤＭを含むメタロβ−ラクタマーゼは活性のために亜鉛イオンを必要とする（Ｑｕｅｅｎａｎ  ａｎｄ  Ｂｕｓｈ，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．Ｒｅｖ．（２００７）２０：４４０−４５８）ので、第２ラウンドの選別では、１００ｕＭのＺｎＳＯ４を使って細菌増殖培地の補充を行った。
【表８】
2018507204.tif 000024
2018507204.tif 000025
【表９】
2018507204.tif 000026
2018507204.tif 000027
2018507204.tif 000028
【０１９４】
ある程度の酵素産生を示したＰ２Ａ株（すなわち、株＃：５、１５、１６、１７、２０、２１、２２、２３、および２５−表７）およびある程度の酵素産生を示したＮＤＭ株（すなわち、株＃：３５、４６、５３、５８、６２、６３、６８、および６９−表８）を使って選別を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図１および図２に示す。
【０１９５】
意外にも、ＺｎＳＯ４の培地への添加により、より高いタンパク質発現レベルが得られ、また、意外にも、細胞内の局在性および酵素の溶解度の変化が生じた。亜鉛の添加により、酵素の発現が封入体から可溶性画分へと変化した。具体的には、亜鉛の存在により、可溶性画分中のタンパク質の量が増え、封入体中で検出されるタンパク質の量が減少した。多くの場合、タンパク質は、亜鉛の非存在下では、封入体（ＩＢ）中で検出されたが、亜鉛の存在下では、細胞質または細胞周辺腔中に可溶性であった。さらに表７および８に示すように、淡黄色を付した細胞は、予測細胞内局在化から異なる局在化へ変化を示した。
【表１０】
2018507204.tif 000029
【表１１】
2018507204.tif 000030
【０１９６】
Ｐ２ＡおよびＮＤＭを含むメタロβ−ラクタマーゼは、活性のために亜鉛イオンを必要とする。しかし、細菌増殖培地への亜鉛の添加により、大腸菌で生成される場合、ＮＤＭ−１の細胞内局在化および／または溶解度の変化が生ずるということを示す報告は存在しない。
【０１９７】
ＫＰＣ株の最初の選別で、３５種の株中の１７種が極めて高いタンパク質発現レベルを示し（表９）、２回目の最高発現株（すなわち、株＃７４、８３、８６、８７、８８、８９、９０、９３、９４、９５、９６、９９、１００、１０１、１０２、１０３、および１０４）の選別によりこれらの結果を確認した（表１０）。ＫＰＣは補助因子として亜鉛を必要としないので、細菌増殖培地で亜鉛を使用しなかった。興味深いことに、いずれの場合も、ＫＰＣタンパク質は、予測した細胞内区画で検出された（表１０）。しかし、いくつかの事例では、封入体が観察され、その場合には、ＫＰＣ発現は極めて高かった（表１０）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図３に示す。
【表１２】
2018507204.tif 000031
2018507204.tif 000032
【表１３】
2018507204.tif 000033
【０１９８】
発色性基質としてＣＥＮＴＡを用いて、マイクロタイタープレートアッセイ（Ｂｅｂｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ（２００１）４５：１８６８−１８７１；ｖａｎ  Ｂｅｒｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０１３）５６：６９４５−６９５３）により、大腸菌細胞ライセート中に存在するカルバペネマーゼＰ２Ａ、ＮＤＭ、およびＫＰＣの生物活性を評価した。簡単に説明すると、１００ｕＭのＺｎＳＯ４を補充した５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．０中で、５０ｕｇ／ｍｌのＣＥＮＴＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号２１９４７５）を用いてアッセイを実施した。検量線用に、０ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬおよび４０ｎｇ／ｍＬのタンパク質濃度で精製Ｐ３Ａタンパク質を使って、アッセイを実施した。マイクロタイタープレートリーダーを使って３０分のインキュベーション後、プレートを４０５ｎｍで読み取った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで最も高いタンパク質発現レベルを示す菌株由来の細胞ライセートの生物活性を評価した。これらに菌株には、Ｐ２Ａ株の５、１５、２０、２１、および２３、ＮＤＭ株の５３、５８、６３、６８および６９、ならびにＫＰＣ株の９４、９６、９９、１００、１０１、１０２、１０３、および１０４を含めた（表１１）。さらに、株Ｐ２Ａ−２１由来の、新しいライセート、凍結（−８０℃）ライセート、または４℃で一晩保存したライセートを比較し、また、株ＮＤＭ−６３由来の新しいおよび凍結（−８０℃）ライセートを比較して、異なった貯蔵条件下での酵素活性の安定性を評価した。全てのその他のライセートは、アッセイまで−８０℃で凍結保存した（表１１）。最も高い生物活性を示した株は、Ｐ２Ａ２１、ＮＤＭ６３、６８、および６９、ならびにＫＰＣ１０１および１０２であった。Ｐ２ＡおよびＮＤＭの異なる貯蔵条件下に対しては、活性の差異は検出されなかった。
【表１４】
2018507204.tif 000034
【０１９９】
実施例３：酵素発現レベル、生物活性、および再現性の評価
２４ウエルプレートから振盪フラスコへスケールアップした場合の、特に、大腸菌カルバペネマーゼ発現株の増殖および酵素産生特性を評価するために、実験を行った。
【０２００】
振盪フラスコへのスケールアップ用として、タンパク質発現レベルおよび生物活性に基づいて選択した株は、Ｐ２Ａ−２１、ＮＤＭ−６３、およびＮＤＭ−６８、およびＮＤＭ−６９ならびにＫＰＣ−１０１およびＫＰＣ−１０２であった。全ての株をテトラサイクリン（ｔｅｔ）（１２．５ｕｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上で画線培養し、３０℃で約１８時間インキュベートした。それぞれの株に対し、単離コロニーを使って、２ｍｌのＬＢテトラサイクリン培地中の前培養液（１２．５ｕｇ／ｍｌ）を播種し、３０℃で一晩インキュベートした。前培養液を１／５０で、通気キャップを備えた２個の５００ｍｌバッフル付フラスコ中の１００ｕＭのＺｎＳＯ４を補充した５０ｍｌのＬＢテトラサイクリン培地（１２．５ｕｇ／ｍｌ）に播種し、３０℃で振盪を加えながら、約２４時間インキュベートした。１ｍｌの一定分量を遠心分離後、デカントした。細菌ペレットを−２０℃で貯蔵した。各株由来の１個のペレットを生物活性アッセイ用として直ちに調製し、２個目のペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に調製した。振盪フラスコ培養液のＯＤ６００値は、２４ウェルディッシュ培養液で得られた値と類似であった（表１２）。
【表１５】
2018507204.tif 000035
【０２０１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより細菌ライセートのタンパク質発現を分析した。全ての株で強力なＮＤＭ発現が検出され、振盪フラスコ間で良好な再現性が認められた（図４）。同様に、Ｐ２ＡおよびＫＰＣの強力発現が検出され、振盪フラスコ間で良好な再現性が認められた（図５）。いずれの場合も、大多数のタンパク質が可溶性画分中で検出された（図４および図５）。基準としてのＰ３Ａで記載のように、ＣＥＮＴＡアッセイを使って、細胞ライセート中の生物活性が評価された。全ての酵素は生物活性を示した（表１３）。ＮＤＭの最も高い生物活性は、株ＮＤＭ−６８によるものである。ＫＰＣ−１０１およびＫＰＣ−１０２は、類似の生物活性を示した。
【表１６】
2018507204.tif 000036
【０２０２】
実施例４：選択Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、およびＫＰＣ発現菌株を使った発酵調査
５リットルバイオリアクターにスケールアップした場合の、大腸菌カルバペネマーゼ発現株の増殖および酵素産生特性を評価するために、実験を行った。
【０２０３】
発酵調査用として、振盪フラスコスケールアップ調査で観察されたタンパク質発現レベルおよび生物活性に基づいて選択した株は、Ｐ２Ａ−２１、ＮＤＭ−６８、およびＫＰＣ−１０１であった。合計５台の５リットルバイオリアクターを使用した。ＮＤＭ−６８を２つのバイオリアクター中、異なる条件下で増殖させた。使用発酵条件は、５０％ブドウ糖、２ｍＭのＺｎＳＯ４フィード、１ＭのＭｇＳＯ４の塩補充剤（ＯＤ６００が約４０に達する場合）、Ｐ２ＡおよびＮＤＭ発酵槽のＺｎＳＯ４補充を含む、低リン酸塩細菌増殖培地（ＣＲＡＰ）とした。最初のバッチ容積は３リットルで、接種材料比率１％、７５０ｒｐｍの固定撹拌、４．５リットルＬＰＭ空気流下、３０℃で実行し、溶存酸素レベルを３５ｐｐｍ以上に保持し、ｐＨを６．８＋０．０１に保持した。Ｐ２Ａ、最初のＮＤＭ、およびＫＰＣ発酵槽は標準的リン酸塩添加量（１７ｍＭ）を使用し、一方、反応器中の亜鉛がリン酸塩をキレート化して細胞増殖に利用できなくするかどうか不確実であったので、２回目のＮＤＭ発酵槽には、追加の亜鉛（最終濃度７４０ｕＭ）および追加のリン酸塩（３４ｍＭ）を添加した。発酵槽実験のまとめを下表１４に示す。
【表１７】
2018507204.tif 000037
【０２０４】
一定分量の細菌を、酵素発現誘導の前の発酵サイクルの初期、Ｐ２ＡおよびＮＤＭは１６時間、およびＫＰＣは３２時間、ならびに、サイクルの後期（４８時間）に収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図６および図７）および生物活性分析（表１５）に供した。ＫＰＣ−１０１を含む発酵槽Ｄは、高ＯＤに達しなかった。発酵槽Ａ、Ｂ、およびＣは、高ＯＤに達した。特に、発酵槽ＡおよびＢ、Ｐ２ＡおよびＮＤＭは、振盪フラスコに相当する比生産性を達成した。発酵槽Ｃの追加のリン酸塩は、酵素生産を抑制したが、バイオマスは約１５％改善され、より多くのリン酸塩を添加して、より長い発酵時間を加えれば合計収率が改善される可能性があることを示唆している。発酵槽Ｄは、振盪フラスコで観察されたのと同様に強力にＫＰＣを誘導するほど十分なバイオマスを得られなかった。バイオリアクター発現は、増殖条件を変え、リン酸塩条件を下げ、および／またはプロモーターを変えることにより達成される。
【表１８】
2018507204.tif 000038
【０２０５】
実施例５：発酵槽（Ｐ２ＡおよびＮＤＭ）または振盪フラスコ（ＫＰＣ）培養液由来のカルバペネマーゼの生物活性の特性評価
特に、カルバペネマーゼ酵素、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、およびＫＰＣが生物活性を保持したまま精製可能かどうかを評価するために実験を行った。
【０２０６】
発酵槽調査、発酵槽ＡのＰ２Ａ、発酵槽ＢのＮＤＭから、または振盪フラスコ調査、振盪フラスコＡのＫＰＣから維持した凍結細胞ペレットをＰａｎｄａ卓上細胞ホモジナイザー中、３ｘ７０００ｐｓｉで溶解した。ライセートを４５０００ｇで１時間遠心分離し、上清を集め、ｐＨを１ＭのＭＥＳで５．５に調節した。上清を４５０００ｇで３０分間遠心分離して、沈殿した破砕物を除去し、０．４５ｕｍフィルターを通して濾過した。濾過した上清をＳＰ−セファロースカラムを使ったカチオン交換クロマトグラフィーに供した。ＮＤＭを疎水性カラムのフェニルセファロースを使って追加の精製ステップに供した。ピークレベルのタンパク質を含む画分を濃縮し、２０ｍＭのヘペス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液に対し透析した。精製プロセスの全ステップで、Ｐ２ＡおよびＮＤＭ試料に１００ｕＭのＺｎＳＯ４を補充した。精製酵素収率をリットル当たり約６００ｍｇのタンパク質と計算した。精製タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図８）で分析し、さらに、生物活性の分析（表１６）を実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、全ての酵素に対し、観察可能な他のタンパク質の混入がほとんど無い、予測サイズの強力なタンパク質バンドが観察された（図８）。生物活性分析は、精製タンパク質がそれらの生物活性を保持していることを示した（表１６）。これらのデータは、カルバペネマーゼ酵素Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、およびＫＰＣが大腸菌から産生および精製でき、同時にそれらの生物活性を保持することを示す。
【表１９】
2018507204.tif 000039
【０２０７】
異なるβ−ラクタマーゼ酵素は、抗生物質およびＣＥＮＴＡ試薬を含む多様な基質に対し異なる親和性および動力学を示すので、精製タンパク質が利用でき、したがって、タンパク質濃度が既知となったからには、基質としてのＣＥＮＴＡに対するＰ３Ａと比較して、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、およびＫＰＣの相対的比活性を決定することが可能となった。Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、およびＫＰＣの相対的活性をＰ３Ａの値に対し比較するために、それぞれのβ−ラクタマーゼのタンパク質濃度を使ってＣＥＮＴＡアッセイ由来のデータをＸ軸上に、ＯＤ４０５の読み値（ＣＥＮＴＡ基質の分解に関する）をＹ軸上にプロットし、一連のシグモイド曲線を得た（図９）。それぞれの曲線の中間点から、それぞれの酵素のＣＥＮＴＡ分解に対する相対効力が得られる。この分析を使って、β−ラクタマーゼの相対効力は、Ｐ３Ａ＝１．０；ＮＤＭ−６８＝０．７１、ＫＰＣ−１０１＝０．３３およびＰ２Ａ−２１＝０．１２であった（図９）。ＣＥＮＴＡアッセイでのＰ３Ａ検量線を使ったこの３種のカルバペネマーゼの定量化は、３種のカルバペネマーゼの量を過小評価しているのであろう。これはＰ２Ａで最も過度であり、量が約８倍過小評価されている。
【０２０８】
実施例６：ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株中でのＩＰＴＧ誘導性Ｐ２Ａ細胞株の生成
ＳＹＴ２１−Ｐ２Ａプラスミド中のｐｈｏＡプロモーターは取り扱うのが難しいので、Ｔ７プロモーター誘導系の制御下でＰ２Ａ遺伝子をコードする２種の新しい大腸菌株を生成した。ＳＴＩＩリーダー（細胞周辺腔への分泌を誘導するための）を含み、細胞質発現用のリーダーを含まないｐＥＴ３０ａベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にＰ２Ａコード領域を挿入した。２個のプラスミド、ｐＥＴ３０ａ−Ｐ２ＡＬ（ＳＴＩＩリーダー含有Ｐ２Ａ）およびｐＥＴ３０ａ−Ｐ２Ａ（リーダー不含Ｐ２Ａ）を使って大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を形質転換した。Ｐ２Ａアミノ酸およびＤＮＡ配列ＤＮＡ配列を以下に示す：
ＳＴＩＩリーダー（リーダー配列を下線で示す）を有するＰ２Ａアミノ酸配列
【化１２】
2018507204.tif 000040
【化１３】
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【０２０９】
制限酵素切断地図により個々のコロニーをＰ２Ａプラスミドの存在で選別した。その後、プラスミドの健全性を配列解析により確認した。Ｐ２Ａタンパク質発現を異なる誘導条件下で評価した。１００ｕＭのＺｎＳＯ４を加えたＬＢ培地中、３７℃で１６時間細胞を培養した後、０．１ｍＭまたは１．０ｍＭのＩＰＴＧを使って３７℃または２５℃で４時間誘導した。一定分量の培地および細胞ペレットをＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルローディングバッファーと共にインキュベートし、９５℃で５分間変性した後ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルにアプライした（図１０）。
【０２１０】
全てのＩＰＴＧ誘導条件下で、Ｐ２Ａ発現の強力な誘導が検出された。Ｐ２Ａの最適誘導条件は、３７℃であったが、２５℃でのＰ２Ａ発現は、わずかに低いレベルに過ぎなかった。１．０対０．１ｍＭのＩＰＴＧでは、Ｐ２Ａ発現の差異は検出されなかった。分泌Ｐ２Ａは、組織培地中でｐＥＴ３０ａ−Ｐ２ＡＬ（リーダーあり）で検出可能であった（微弱バンド）が、ｐＥＴ３０ａ−Ｐ２Ａ（リーダーなし）では検出できなかった。細胞ペレット画分中のＰ２Ａ発現は、大腸菌細胞中の全タンパク質の５０％を超えると推定された。
【０２１１】
産生した全Ｐ２Ａタンパク質の内のどの位の割合が、可溶性画分対不溶性（封入体）画分中にあるのかを決定するために、次の調査を実施した。ｐＥＴ３０ａＰ２ＡＬ（クローン２）およびｐＥＴ３０ａＰ２Ａ（クローン４）をＬＢ＋１００ｕＭのＺｎＳＯ４中で１６時間増殖させ、０．１ｍＭのＩＰＴＧを使って２５℃で４時間誘導した。比較のために、ｐｈｏＡ促進Ｐ２Ａ細胞株ＳＹＴ２１−Ｐ２ＡをＡＰＳ−ＬＢ培地＋１００ｕＭのＺｎＳＯ４中で１６時間増殖後、２５℃で一晩インキュベートすることにより誘導した。採取時に、それぞれの培養液の細胞密度をＯＤ６００を使って測定した。それぞれの株から３つの１ｍｌ培養液を集め、遠心分離して培地を除去した。細胞ペレットを２００ｕｌの１）ＡＧ−Ｂリシスバッファー（５０ｍＭのヘペス、ｐＨ７．９；１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２％トリトンＸ１００、２％グリセロール、１００ｕＭのＺｎＳＯ４、および１ｍＭのＭｇＣｌ２）、ＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ  Ｒ０２７８）、およびＢｕｇＢｕｓｔｅｒ緩衝液（Ｎｏｖａｇｅｎ＃７０５８４−４）中に再懸濁した。それぞれの緩衝液にリゾチームを加えて、０．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度にした。３７℃での解凍および−８０℃での凍結を３サイクル行うことにより細胞を溶解した。可溶性タンパク質および不溶性タンパク質を微量遠心管中での１０分間の遠心分離により回収し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分析した（図１１）。
【０２１２】
Ｐ２Ａの発現は、ｐＥＴ３０ａＰ２ＡＬ（クローン２）およびｐＥＴ３０ａＰ２Ａ（クローン４）株を使って、ＩＰＴＧの存在下で大きく誘導された。ＳＹＴ２１−Ｐ２Ａ大腸菌株でｐｈｏＡ系を使った場合、Ｐ２Ａは誘導されなかった。誘導Ｐ２Ａタンパク質は、３種の異なるリシスバッファーを使って溶解可能であり、ｐＥＴ３０ａＰ２ＡＬ（クローン２）株は、ｐＥＴ３０ａＰ２Ａ（クローン４）株より少ない可溶性タンパク質を発現した。推定Ｐ２Ａ発現レベルおよび溶解度を表１７にまとめている。
【表２０】
2018507204.tif 000042
【０２１３】
Ｐ２Ａ発現レベルは、ｐｈｏＡ誘導系を使った場合よりＩＰＴＧ誘導系を使った場合の方が遥かに高い。さらに、ｐＥＴ３０ａＰ２Ａ（リーダーなし）は、ｐＥＲ３０ａ−Ｐ２ＡＬ（リーダーあり）より多くの可溶性タンパク質を発現した。
【０２１４】
それぞれのライセート中のＰ２Ａタンパク質の量の推定値を得るために、精製Ｐ２Ａ基準タンパク質の希釈液（２．０ｕｇ、１．０ｕｇ、０．５ｕｇ、０．２５ｕｇ、０．１３ｕｇ、）に比較して、ライセートの希釈液（５ｕｌ、２．５ｕｌ、１．３ｕｌ、および０．６３ｕｌ）をＳＤＳ／ＰＡＧＥで評価した。Ｐ２Ａタンパク質バンド強度を基準にして、それぞれのライセート中のＰ２Ａタンパク質の推定値を得た。異なる溶解条件下での細胞ライセート中のＰ２Ａタンパク質の生物活性を、Ｐ２Ａタンパク質基準の生物活性と比較して、ＣＥＮＴＡ発色アッセイを使って評価した。Ｐ２Ａタンパク質濃度推定値および推定Ｐ２Ａ比活性を基準にして、生物活性を正規化した。比活性はＰ２Ａ基準（１００％）と比較した％活性として示される。これらのデータを表１８にまとめている。全てのライセートは生物活性を示した。ｐＥＴ３０ａＰ２Ａ（リーダーなし）細胞由来のライセートは、ｐＥＴ３０ａＰ２ＡＬ細胞に比べて、より高い比活性を示した。リーダーなしのＰ２Ａ発現カセットを以降の調査で使用することになる。
【表２１】
2018507204.tif 000043
【０２１５】
実施例７：ＢＬＲ（ＤＥ３）大腸菌株中でのＩＰＴＧ誘導性Ｐ２Ａ細胞株の生成
大腸菌細胞株ＢＬＲ（ＤＥ３）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）は、ＢＬＲ（ＤＥ３）細胞株がｒｅｃＡ−であること以外は、ＢＬ２１（ＤＥ３）に類似である。ｒｅｃＡ−細胞株は、組換えの確率を低減するので、バイオリアクター条件下での増殖に好ましい細胞株である。したがって、ｐＥＴ３０ａＰ２Ａ（リーダーなし）プラスミドを使って、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）細胞を形質転換した。３個のコロニーを選択し、５０ｍｇのカナマイシンを補充した５０ｍＬのＬＢ培地中での一晩増殖を二通り実施した。５０ｍＬの培養液を使って、０．１ｍＭのＺｎＳＯ４およびカナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を補充した１００ｍＬのＴＢ培地に播種し、ＯＤ６００を約０．０５にした。約０．６のＯＤ６００に達するまで細胞を増殖させた。合計６ｍＬの培養液を取り出し、グリセロールストックの調製に使用した。残った培養液を０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、３７℃でさらに３時間増殖させた。細胞ペレット（１ｍＬの培地および細胞から）を調製し、−８０℃で凍結した。これらの培養の増殖曲線を図１２に示す。
【０２１６】
細胞ペレットを解凍し、溶解した。全細胞ライセート中の一定分量を採取した。その後、細胞ライセートを遠心分離し、一定分量の可溶性（上清）および不溶性（細胞ペレット）画分を得た。全細胞ライセート、可溶性および不溶性画分をＳＤＳ／ＰＡＧＥを使って分析した。収集した誘導前試料および０．１ｍＭのＩＰＴＧで３時間の誘導後試料を図１３に示す。３種のクローンおよび繰り返し実験クローンの全てで高レベルのＰ２Ａタンパク質が誘導された。ほとんどの産生Ｐ２Ａタンパク質は、不溶性画分中に存在した。図１３のゲル中のそれぞれのバンドのＰ２Ａタンパク質濃度は、バンド強度に基づいて推定した。それぞれのクローンの全体、可溶性、または不溶性タンパク質の推定発現レベルを図１４に示す。クローン１は、７．３ｍｇ／ｌの最高の全Ｐ２Ａ発現および最高の可溶性タンパク質パーセンテージ（４７％）を示した。
【０２１７】
実施例８：ＢＬＲ（ＤＥ３）Ｐ２Ａ発現細胞株のクローン１の誘導条件の最適化
ＢＬＲ（ＤＥ３）Ｐ２Ａ細胞株から産生したＰ２Ａタンパク質のクローン１の発現レベルを、異なる誘導温度および誘導時間下で比較した。
【０２１８】
５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを補充したＬＢ培地の合計５０ｍＬに、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）Ｐ２Ａクローン１を播種し、３７℃で一晩増殖させた。この一晩の種培養液を使って、０．１ｍＭのＺｎＳＯ４およびカナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）６ｘ１００ｍＬのＴＢ培地に播種し、約０．０７〜０．０９のＯＤ６００とした。培養液を０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、１８℃、２５℃、もしくは３７℃の温度下、２５０ｒｐｍで５時間または２０時間（一晩）インキュベートした。３７℃で３時間の条件は、試験した最初の条件と比較するために、繰り返した。示した条件で誘導後、細胞ペレットを集め、処理するまで−８０℃で貯蔵した。図１５は、異なる増殖および誘導条件下での培養の増殖曲線を示す。細胞ペレットを解凍し、溶解した。誘導前および誘導後の全細胞ライセート中の一定分量を採取した。その後、細胞ライセートを遠心分離し、一定分量の可溶性（上清）および不溶性（細胞ペレット）画分を得た。全細胞ライセート、可溶性および不溶性画分をＳＤＳ／ＰＡＧＥを使って分析した（図１６）。全ての条件下で高レベルのＰ２Ａタンパク質が誘導された。興味深いことに、誘導温度を１８℃または２５℃に下げて、一晩の誘導により、両温度で高レベルのタンパク質が発現し、また、大部分が不溶性画分中の存在から大部分が可溶性画分中の存在へとタンパク質が移動した。図１６のゲル中のそれぞれのバンドのＰ２Ａタンパク質濃度は、バンド強度に基づいて推定した。それぞれの誘導条件下での推定発現レベルを図１７に示す。最高のＰ２Ａ発現レベルおよび最も多くの可溶性タンパク質を産生した条件は、１８℃で一晩の誘導であった。しかし、２５℃で一晩の誘導も良好な可溶性タンパク質発現を生じた。
【０２１９】
図１３に示す３種のクローン由来のそれぞれの可溶性ライセート中、および異なる誘導条件（図１６）に供した試料由来の可溶性ライセート中のＰ２Ａタンパク質の量の推定を行うために、ライセートの希釈液（２．５ｕｌ、１．３ｕｌ、０．６３ｕｌ、および０．３１ｕｌ）を、精製Ｐ２Ａ基準タンパク質（２．０ｕｇ、１．０ｕｇ、０．５ｕｇ、０．２５ｕｇ、０．１３ｕｇ）と比較して、ＳＤＳ／ＰＡＧＥで評価した。Ｐ２Ａタンパク質バンド強度を基準にして、それぞれのライセート中のＰ２Ａタンパク質の推定値を得た。これらの細胞ライセート中のＰ２Ａタンパク質の生物活性を、Ｐ２Ａタンパク質基準の生物活性と比較して、ＣＥＮＴＡ発色アッセイを使って評価した。Ｐ２Ａタンパク質濃度推定値を基準にして、生物活性を正規化し、推定Ｐ２Ａ比活性を得た。比活性はＰ２Ａ基準（１００％）と比較した％活性として示される。これらのデータを表１９にまとめている。全てのライセートは生物活性を示した。
【表２２】
2018507204.tif 000044
【０２２０】
実施例９：大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）Ｐ２Ａ細胞株、クローン１の発酵
最適化Ｌの発酵を実施した。５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを補される誘導および増殖条件を使って、２ｘ２５充した１リットルのＬＢ培地に、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）Ｐ２Ａクローン１を播種し、３７℃で一晩増殖させた。この一晩の種培養液を使って、０．１ｍＭのＺｎＳＯ４および５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを補充した２５ＬのＴＢ培地に播種した。培養液を０．０６〜０．０８のＯＤで０．１ｍＭのＩＰＴＧを使って誘導し、温度を１８℃まで下げた。誘導後５時間および２０＋時間で一定分量を採取し、細胞ペレットを単離し、使用まで−８０℃で貯蔵した（図１８）。細胞を溶解し、誘導前、全体、可溶性および不溶性画分をＳＤＳ／ＰＡＧＥにより評価した（図１９）。両ロットは、誘導前のレベルに比べて、発酵の終わりにＰ２Ａ発現の良好な誘導を示した。さらに、ほとんどのＰ２Ａタンパク質は、可溶性画分で回収された。図１９に示すゲルのそれぞれのバンドのＰ２Ａタンパク質濃度は、バンド強度に基づいて推定した。それぞれの誘導条件下での推定発現レベルを図２０に示す。ほとんどのＰ２Ａタンパク質は、可溶性画分で回収された。合計１．０１ｋｇの細胞ペーストを収集し、−８０℃で貯蔵した。
【０２２１】
実施例１０：酵素活性のインビトロ特性評価
高濃度抗生物質の存在下でのカルバペネマーゼ酵素Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、およびＫＰＣの胃中での活性を模擬するために、９６ウエルプレート形式を使って、新規スクリーニングアッセイを実施した。１０、１００または１０００μｇ／ｍｌの抗生物質、ＡＭＰ：アンピシリン、ＳＡＭ：アンピシリン／スルバクタム、ＰＩＰ：ピペルシリン、ＴＺＰ：ピペルシリン／タキソバクタム、ＣＲＯ：セフトリアキソン、ＣＴＸ：セフォタキシム、ＣＦＺ：セフォゾリン、ＣＸＭ：セフロキシム、ＣＦＰ：セフォペラゾン、ＦＥＰ：セフェピム、ＣＡＺ：セフタジジム、ＭＥＭ：メロペネム、ＩＰＭ：イミペネム、ＥＲＴ：エルタペネム、ＤＯＲ：ドリペネム、ＡＴＭ：アズトレオナム、ＣＤＲ：セフジニル、ＬＥＸ：セファレキシン、およびＣＡＺ／ＡＶＩ：セフォペラゾン／アビバクタムを、１０、１００、または１０００ｎｇ／ｍｌの濃度の精製Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、ＫＰＣ、およびＰ３Ａと、９６ウエルマイクロタイタープレートのそれぞれのウエル中で混合することによりアッセイを実施した。β−ラクタマーゼ酵素の添加直後に、大腸菌（ＡＴＣＣ２５９２２）を加え、プレートを一晩インキュベートした。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ３８４Ｐｌｕｓプレートリーダーで６２５ｎｍの吸光度（ＯＤ６２５）を測定することにより、細菌増殖を定量した。それぞれの抗生物質に対し、分析を２回行った。個々のウエル中の細菌増殖の外観に基づいて、β−ラクタマーゼ活性を陽性または陰性として判定した。１．０以上のＯＤ６２５は最大細菌増殖を示し、したがって、完全な抗生物質分解およびβ−ラクタマーゼ活性を示した。１．０未満のＯＤ６２５は低細菌増殖を示し、したがって、不完全な抗生物質分解、すなわち、低β−ラクタマーゼ活性を示した。図２１Ａ、２１Ｂ、および２１Ｃは、１０、１００、または１０００ｎｇ／ｍＬのβ−ラクタマーゼ濃度の４種のβ−ラクタマーゼＰ３Ａ（ＳＹＮ−００４）、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、およびＫＰＣの、全１６種の抗生物質に対する比較を示す。
【０２２２】
データは、カルバペネマーゼＰ２Ａ、ＮＤＭ、およびＫＰＣが全て、カルバペネムに対する活性を有するカルバペネムＰ３Ａより広範囲の分解プロファイルを示すことを実証している。ＮＤＭは、最も強力なβ−ラクタマーゼであるように見え、試験した全てのセファロスポリンおよびカルバペネムを効率的に分解した。Ｐ２Ａは全てのカルバペネムおよびほとんどのセファロスポリンに対し良好な活性を示したが、ＮＤＭに比べると、セファロスポリン、セフェピムおよびセフタジジムに対して活性が低下した。ＳＹＮ−００４に比べて、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、およびＫＰＣは、メロペネム、イミペネム、エルタペネム、およびドリペネムを効率的に分解する強力なカルバペネマーゼであることを示し、メタロβ−ラクタマーゼＰ２ＡおよびＮＤＭは、スルバクタム、タゾバクタム、およびアビバクタムによる阻害に対し耐性があった（図２１Ａおよび２１Ｂ）。ＫＰＣは、モノバクタム、アズトレオナムに対し活性を示す唯一のβ−ラクタマーゼであった。３種全てのカルバペネマーゼはβ−ラクタマーゼ阻害剤スルバクタムおよびタゾバクタムに対し耐性を示したが、ＮＤＭはスルバクタムによる影響が最も少なかった。
【０２２３】
これらのデータは、３種全てのカルバペネマーゼは、経口治療薬に発展する十分な効力を有する。それぞれは、全部ではないにしてもほとんどのβ−ラクタム系抗生物質からマイクロバイオームを保護する能力を有し、クロストリジウム・ディフィシレ感染症に対する予防を提供する。
【０２２４】
さらに、カルバペネマーゼ酵素の種々の緩衝液およびキームス中での安定性の調査も実施した。酵素動力学も評価した。
【０２２５】
実施例１１：ヒトキームス中のＰ２Ａ安定性
０、０．５、１、２、３、４、５、および６時間でインキュベート試料から採取した一定分量に対し、ＣＥＮＴＡβ−ラクタマーゼ基質を使ってβ−ラクタマーゼ活性を評価することにより、３７℃のヒトキームス中でインキュベートした場合の精製Ｐ２Ａの安定性を評価した。５種の異なるキームス供試体を使って安定性を評価した。混合キームス試料は、一緒に混合したそれぞれ５種の等体積のキームス供試体を含有したものである。キームス試料について、ｐＨ、液体含量、およびプロテアーゼ活性に関し特性を明らかにした（表２０）。
【表２３】
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【０２２６】
Ｐ２Ａβ−ラクタマーゼ活性は、１００ｕＭのＺｎＳＯ４の存在下で混合キームス中で評価した場合、この調査で試験した最長時間の６時間にわたり安定であったが、追加の亜鉛が混合キームス中に含まれない場合には、活性はより急速に低下した。その後の全ての調査に対して、１００ｕＭのＺｎＳＯ４を全てのキームス供試体に対し加えた。Ｐ２Ａβ−ラクタマーゼ活性もまた、５種の個々のキームス試料の内の４種で比較的安定であった（図２２）。しかし、キームス３試料中でインキュベートした場合、Ｐ２Ａ活性は急速に低下した(図２２)。意外にも、キームス３のｐＨをＮａＯＨを使ってｐＨ７．０に調節した場合、ｐＨ調節キームス３中のＰ２Ａの安定性は改善された（図２３）。
【０２２７】
実施例１２：ヒトキームス中のＫＰＣおよびＮＤＭ安定性
５人の異なるドナーから収集した５種のそれぞれ当体積のヒトキームス供試体を含む混合ヒトキームスに、精製ＫＰＣまたはＮＤＭ（８０ｎｇ／ｍＬの最終濃度）を添加することにより、３７℃のヒトキームス中でのＫＰＣおよびＮＤＭの安定性を評価した。１００μＭのＺｎＳＯ４最終濃度となるようにＺｎＳＯ４を混合キームスに加えた。インキュベーションの０、３０、６０、１２０、１８０、および２４０分に一定分量の酵素／キームス混合物を収集し、ＣＥＮＴＡ試薬を基質として使った発色アッセイによりβ−ラクタマーゼ活性を評価した。混合キームス中の酵素の生物活性を、緩衝液（ヘペス緩衝液、１００μＭのＺｎＳＯ４、ｐＨ６．２）中の活性と比較した。
【０２２８】
ＫＰＣおよびＮＤＭの両方は、緩衝液中で少なくとも４時間にわたり、安定な活性を示した。対照的に、ＫＰＣおよびＮＤＭは、混合ヒトキームス中でインキュベートした場合、生物活性を失った。全てのＮＤＭ活性は、最初の３０分の時点までに失われ、一方、ＫＰＣ活性は、６０分までに検出できなくなった（図２４）。
【０２２９】
実施例１３：ヒトキームス中のＮＤＭ活性の消失は、ＮＤＭのタンパク質切断による
ＮＤＭ活性は、混合ヒトキームス中でインキュベーション時に直ぐに失われる（図２４）。活性の消失がヒトキームス中に存在するプロテアーゼによる消化が原因なのかどうかを判定するために、精製ＮＤＭ（１００ｕｇ／ｍｌ）を１００％〜０％の範囲のヒト混合キームス希釈液と共に、セリンプロテアーゼ阻害剤反応混液（ＥＤＴＡ不含ＳｉｇｍａＦＡＳＴプロテアーゼ阻害剤反応混液；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｓ８８３０）の非存在下または存在下で、３０分間インキュベートした。全てのインキュベーションを、１００μＭのＺｎＳＯ４（最終濃度）の存在下で実施した。３０分に取り出した試料をゲル電気泳動によるタンパク質分解の分析のためのβ−メルカプトエタノールを含むｌａｍｅｌｌｉ試料緩衝液に移し、クーマシーブルーで染色した。残りの試料を急速凍結し、ＣＥＮＴＡ基質を使ったβ‐ラクタマーゼ活性の評価用に使用した（図２５）。結果は、未処理ＮＤＭタンパク質は、６．２５％以下のキームス希釈液で検出可能であり、ＮＤＭは、３．１３％以下の希釈液で、キームス中に存在する内在性タンパク質から容易に識別可能であることを示す（図２５、パネルＡ）。さらに、ＮＤＭの活性の大部分は、３．１３％以下のキームス希釈液で保持された（図２５、パネルＡ）。プロテアーゼ阻害剤の存在下では、５０％以下のキームス希釈液で、大部分のＮＤＭ活性が保持された。これらのデータは、キームス中のＮＤＭの活性の消失が、ヒトキームス中に存在する内在性セリンプロテアーゼによるＮＤＭタンパク質のタンパク質切断が原因であったことを示す（図２５、パネルＢ）。
【０２３０】
実施例１４：混合キームス中でのインキュベーション後のＮＤＭのタンパク質切断産物の特性評価
ヒトキームスとのインキュベーション時のＮＤＭ活性の消失は、ヒトキームス中に存在する内在性プロテアーゼによるＮＤＭのタンパク質切断が原因であった。ＮＤＭタンパク質内の切断部位をマッピングするために、ＮＤＭ（５００ｕｇ／ｍＬ）を２％の混合ヒトキームス（インキュベーション緩衝液、２０ｍＭヘペスｐＨ６．２；１５０ｍＭのＮａＣｌ、１００ｕＭのＺｎＳＯ４で希釈したヒトキームス）と共に０〜１８０分の範囲の時間にわたりインキュベートした。２０マイクロリットルの各試料（１μｇ）を取り出し、２５ｎｇ／μｌの最終濃度とするために、２０μＬの２Ｘ変性試料緩衝液に移した。試料を煮沸し、１０μＬ（２５０ｎｇのＮＤＭ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析に供した。０〜１５分で、ＮＤＭは５個の別々の切断フラグメントに急速に分解された（図２６）。ＮＤＭおよびこれらのフラグメントは、インキュベーション過程中にさらに分解され、６０〜９０分で検出限界以下となった（図２６）。これらのデータは、キームス中のプロテアーゼ（単一または複数）は少なくとも３つの別々の部位でＮＤＭを切断することを示す。
【０２３１】
ＮＤＭフラグメントのタンパク質切断部位をマッピングするために、ＮＤＭを２％の混合ヒトキームスと共に記載のように０または１５分間インキュベートした。エラスターゼはヒトキームス中に存在するセリンプロテアーゼであるので、ＮＤＭを０．２５Ｕ／ｍＬの濃度の精製ブタ膵臓エラスターゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｅ１２５０）と共に１５または３０分間インキュベートした。ＮＤＭ消化をＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分析し、ゲルを１Ｘトリス−グリシン転写バッファー中で平衡化した後、トリスグリシン緩衝液中で湿式転写により平衡化したＳｅｑｕｉ−Ｂｌｏｔ  ＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写した。転写後、４０％メタノール中のクマシーブリリアントブルーＲ−２５０  ０．０２５％で膜を周囲温度下、１５分間染色した。膜を５０％のメタノール中で脱染後、空気乾燥して、バンドを切り出し、個別の１．５ｍＬのチューブに入れた（図２７）。オンラインＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ１４０Ｃ  ＰＴＨ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｚｅｒを備えたＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ４９４  Ｐｒｏｃｉｓｅタンパク質／ペプチドシークエンサーを使って、単離フラグメントを最初の５個のアミノ酸のＮ末端シーケンシングにより解析した。アミノ酸配列を決定するためにタンパク質シークエンサーにより用いられた化学的プロセスは、Ｅｄｍａｎにより開発された分解法から導出された。
【０２３２】
Ｎ末端配列解析の結果を表２１および図２８および２９に示す。ＮＤＭ切断フラグメントを、フラグメントサイズ（図２７）、Ｎ−末端シーケンシングデータ、およびＮＤＭ配列を使って特定した。３つの切断が特定され（図２７）、その内の２つの切断部位は特異的アミノ酸にマッピングされた。マッピングされた切断部位を図２８に示す。これらは、エラスターゼ切断部位（キームスフラグメント３と４は、エラスターゼフラグメント６と７に同じである）、およびキームス切断部位（フラグメント１と５）に対応する。フラグメント５は、切断予測により６．１ｋＤａと５．４ｋＤａのフラグメントが予測されるので、少なくとも２種のフラグメントで構成され（図２９）、両方のＮ末端配列は、Ｅｄｍａｎ分解反応後に検出された（図２８）。約１５ｋＤａの小さいフラグメントであるように見えるフラグメント２（図２７）は、ネイティブＮＤＭのＮ−末端（ＧＱＱＭＥ）を有していた。予測した切断部位は、マッピングされたエラスターゼ切断部位とマッピングされたキームス切断部位との間であることがフラグメント２のサイズに基づいて想定される（図２８、下線部）。しかし、この切断による他のフラグメントは検出されず、エラスターゼおよびキームス切断は遥かに強力であるように見えるので、他のフラグメントは極めて小さいと想定される。フラグメント２の切断部位のより正確なマッピングには、さらに多くの調査を要するであろう。これらのデータは、ヒトキームス中に存在するプロテアーゼは、ＮＤＭ内の限られた数の特異的切断部位に作用することを示す。ＮＤＭ中の３つの切断部位を特定した。その内の１つはエラスターゼ切断部位に対応している。理論に束縛されることを意図するものではないが、切断部位の周辺のアミノ酸配列の改変によるこれらの部位の除去は、切断を防ぎ、それにより、キームス中のＮＤＭの安定性を改善する可能性がある。
【表２４】
2018507204.tif 000046
【０２３３】
表２１はＮ末端配列解析の結果を示す。それぞれの消化産物の位置１〜５のアミノ酸は、Ｅｄｍａｎ分解反応、ＮＤＭアミノ酸配列、およびフラグメントサイズにより決定された。フラグメント番号は図２７に対応する。
【０２３４】
実施例１５：ＮＤＭ生物活性に悪影響を与えることなくキームス中のＮＤＭの安定性を改善するためのマッピングされた切断部位の近位のＮＤＭのアミノ酸配列の改変
ＮＤＭ中の３つの切断部位を特定した。その内の１つはエラスターゼ切断部位に対応している。これらの切断部位の周辺のアミノ酸配列の改変によるこれらの部位の除去は、切断を防ぎ、それにより、キームス中のＮＤＭの安定性を改善する可能性がある。メタロβ−ラクタマーゼＰ２Ａはヒトキームス中で少なくとも６時間安定であるので、ＮＤＭおよびＰ２Ａアミノ酸配列の整列化を実施した（図３０）。
【０２３５】
キームス切断部位の近位のアミノ酸が、これらの領域中のＰ２Ａ配列に対応するアミノ酸に変更される。例えば、ＳＬＴＦＡエラスターゼ切断部位周辺のＮＤＭアミノ酸配列がＹＥＥＰＬＧに変更される。複数のアミノ酸がこれらの部位のそれぞれで置換される。設計されたＮＤＭコード領域が合成され、大腸菌発現プラスミドに挿入される。新規ＮＤＭタンパク質が合成され、記載のように精製され、キームス中での生物活性および安定性が評価される。キームス中で生物活性および安定性を示すＮＤＭ分子は、記載のように、バイオリアクター発酵、精製、および製剤化に供される。
【０２３６】
実施例１６：Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣ含有腸溶コーティングペレットの製造
Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣ腸溶コーティングペレットを含むＰ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣ製剤が製造される。具体的には、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣは、約１．０〜１．３ｍｍの直径の腸溶コーティングペレットに処方される。簡単に説明すると、酵素がスクロースコア上に噴霧コートされ、腸溶性層、オイドラギットＬ３０  Ｄ−５５で噴霧乾燥されて医薬品有効成分が胃の酸性条件から保護される。オイドラギットＬ３０  Ｄ５５ポリマーは、小腸中でｐＨが５．５以上に上昇すると、解重合し始め、ペレットから薬剤を放出する。
【０２３７】
例えば、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣ腸溶コーティングペレットを含む遅延放出カプセルがＧＭＰプロセスで製造される。特に、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣ遅延放出カプセルのＧＭＰ製造は、下記を含む３段階逐次プロセスである：１）スプレー適用によるスクロースコアペレット上へのＰ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣ薬物の層形成、２）スプレーを適用してオイドラギットＬ３０  Ｄ−５５による腸溶コーティング、および３）サイズ０の硬ゼラチンカプセル中へのペレットの封入。
【０２３８】
Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣ医薬品有効成分の、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）を結合剤賦形剤として、水を溶媒として、およびスクロース球を出発材料として用いたスプレー適用により、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣ層化ペレットが作製される。スプレー適用は、少なくとも１５％の最終活性薬剤（ＡＰＩ）を得るために、６交替作業による流動床システムを使って実施される。６回目の交替作業によるＰ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣ／ＨＰＣ混合物のスプレー適用後、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣ層化ペレットは、室温下、トレー上で一晩乾燥され、次いで、１．４ｍｍふるいを通してふるい分けされた後に、ポリエチレン（ＰＥ）バッグおよびＰＥ容器でバルク包装される。薬物層化ペレットは、さらなる処理のために、約５±３℃で貯蔵される。
【０２３９】
その後のプロセスでは、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣ層化ペレットは、腸溶性ポリマーとしてのメタクリル酸エチルアクリレートコポリマー（オイドラギットＬ３０  Ｄ−５５）、可塑剤としてのクエン酸トリエチル、流動促進剤としてのモノステアリン酸グリセリン、乳化剤としてのポリソルベート−８０および希釈剤としての水を使ってコーティングされる。コーティングは、単一交代作業で流動床システムを使って実施される。腸溶コーティングしたＰ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣ層化ペレットは、室温下、トレー上で一晩乾燥され、次いで、１．６ｍｍふるいを通してふるい分けを行った後に、ＰＥバッグおよびＰＥ容器でバルクペレットとして包装される。腸溶コーティングされたＰ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣ層化ペレットは、さらなる処理のために、約５±３℃で貯蔵される。
【０２４０】
腸溶コーティングされたＰ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣ層化ペレットは、サイズ０カプセルに充填するためのカプセル輸送および注入ユニットを備えた自動化カプセル充填機を使って硬ゼラチンカプセル中に封入される。７５ｍｇの最終Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣ遅延放出カプセルは、バルク製剤として、ＰＥバッグおよびＰＥ容器に充填され、出荷準備完了状態で、約５±３℃で貯蔵される。
【０２４１】
Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣ遅延放出カプセル、２５ｍｇを製造する別のマニュアルプロセスでは、腸溶性Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣ層化ペレットが、化学てんびん、サイズ０カプセル充填用カプセル充填漏斗を使って硬ゼラチンカプセル中に封入される。２５ｍｇの最終Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣ遅延放出カプセルは、バルク製剤として、ＰＥバッグおよびＰＥ容器に充填され、出荷準備完了状態で、約５±３℃で貯蔵される。
【０２４２】
例えば、臨床試験および安定性調査での使用向けのＰ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣ遅延放出カプセルは、１００ｃｃの３８ｍｍのポリプロピレン（ＰＰ）小児安全蓋を備えた誘導シール付き高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）ラウンドボトルに充填される。
【０２４３】
本発明の製剤は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／５４６０６号および同第ＰＣＴ／ＵＳ１５／００２２８号に記載の形態をとってもよい。これら特許の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２４４】
実施例１７：追加のＰ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣ製剤
カルバペネマーゼ酵素、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、およびＫＰＣは、ＧＩ管中の残留経口抗生物質を不活化する部位での放出のための、特に、経口投与抗生物質の放出より遠位のＧＩ管中の部位での放出のための製剤である。
【０２４５】
Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣは、酵素をラテックス、またはその他のポリマーと混合することにより製剤化され、粒子状のマイクロカプセル化酵素製剤が形成される。マイクロスフェアはその後、ｐＨ依存性腸溶コーティングで被覆される。スクロースコアは必要なく、これにより、ペレット当たりより多くの薬物充填が可能となり、したがって、より小さな治療用カプセルサイズが可能となる。製剤は、賦形剤の負荷量を減らすために、マトリックスそれ自体に組み込まれた腸溶性機能（胃中では放出されず、遠位の小腸中で完全に放出される）を有する粒子を生成するように作られる。製剤が良好な活性および安定性の保持を示すが、酸性の条件からの保護が不十分な場合は、腸溶コーティングが粒子に適用される。
【０２４６】
粒子（例えば、マイクロスフェア、凝集体、など）を生成するために、タンパク質を取り込むのに適用できる種々の手法を使用してよい。これらの手法は少なくとも２つの相を含み、１つはタンパク質を含み、もう１つは粒子の骨格を形成するポリマーを含む。例えば、ポリマーが第３の成分の添加により溶媒層から分離するように作られるコアセルベーション、または内側の水相はタンパク質を含み、中間有機相はポリマーを含み、外側水相は溶媒がマイクロスフェアから除去されて、マイクロスフェアまたはミニスフェアが形成できるまで、ｗ／ｏ／ｗ二重エマルジョンを支持する安定剤を含む水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）などの複数相エマルジョンを使用してよい。
【０２４７】
別の手法では、タンパク質および安定化賦形剤（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）タイプＭＦ；Ａｑｕａｃｏａｔ（ＦＭＣ）、ナトリウムステアリルフマレート；トレハロース、マンニトール、ツイーン８０、ポリビニルアルコールポリビニルアルコール、および／またはその他）が混合され、その後、混合物が水溶液から噴霧されて、粒子が形成され、収集される。その後、粒子は、乾燥したポリマーおよび放出調節化合物含有の水不混和性有機溶媒中に懸濁され、懸濁液の超音波処理により粒子が分散される。例えば、この方法を使ってＰ３Ａの２つの製剤が開発され（表２２および２３）、また、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、およびＫＰＣに対し、類似の製剤が開発された。特に、ＨＰＭＣＡＳ−ＭＦが低ｐＨで水不溶性（すなわち、ゲルを形成する）であり、高ｐＨで水溶性になるので、これを細孔形成剤として使用した。これらの製剤を使って作製されたＰ３Ａ粒子の溶解後、ＣＥＮＴＡ発色アッセイ（表２２および２３）（Ｂｅｂｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ；（２００１）４５：１８６８）で測定して、少なくとも８０％のＰ３Ａ活性が回復された。
【表２５】
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【表２６】
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【０２４８】
別の手法は、水性相を使用するが有機溶媒は使用しない。この場合、酵素、緩衝成分、ポリマーラテックス、ならびに安定化および放出調節賦形賦形剤が水中に溶解／分散される。水性分散液が噴霧乾燥され、ラテックスが凝集し、凝集したラテックスの粒子中にタンパク質および賦形剤が組み込まれる。放出調節剤が酸性条件に不溶性であるがより高いｐＨで可溶性である場合（例えば、カルボン酸）、マトリックスからの放出は胃中環境では抑制されるはずである。製剤化手法の例を図３１〜３４に示す。
【０２４９】
１種または複数のこれらの戦略を使用することにより、経口送達に有用なＰ２Ａ、ＮＤＭ、およびＫＰＣ製剤（単一または複数）が得られることが期待される。
【０２５０】
実施例１８：製剤例
抗生物質および／または抗生物質分解剤阻害剤の分離および抗生物質分解剤放出のための製剤化手法は、抗生物質がその抗菌機能を保持し、同時に余剰抗生物質の悪影響からのＧＩマイクロバイオームの保護も可能なように行われる。図３２は、種々の非限定的手法を示す。図３３は、種々の非限定的剤形の組み合わせを示す。図３４は、種々の非限定的微粒子剤形を示す。
【０２５１】
実施例１９：酵素活性のインビトロ特性評価−セファロスポリンに対するＰ３Ａ、Ｐ４Ａ、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、およびＫＰＣ活性の比較
最も広域性の抗生物質に対する保護を提供することを目的として、カルバペネマーゼ、例えば、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣを１種または複数の追加のβ−ラクタマーゼと一緒に使用することにより、ペニシリン、セファロスポリン、およびカルバペネムの大部分に対する保護がもたらされる。２種以上の抗生物質分解酵素、例えば、Ｐ２ＡおよびＰ４Ａが１つの丸薬またはカプセル中に同時に製剤化される、または同時に、使用されるが別々の丸薬またはカプセルで送達される。２種以上の酵素の共製剤は、実施例１６〜１８に記載のように実施される。実施例１０に記載の大腸菌増殖抑制アッセイを使って、Ｐ２Ａが、メロペネム、イミペネム、エルタペネム、およびドリペネムを効率的に分解する強力なカルバペネマーゼであり（図２１Ａおよび２１Ｂ）、また、スルバクタムおよびタゾバクタムによる阻害に耐性がある（図２１Ａおよび２１Ｂ）ことが実証された。しかし、Ｐ２Ａは、ＳＹＮ−００４またはＰ４Ａに比べて、セファロスポリン、セフォゾリン、セフォペラゾン、セフェピム、およびセフタジジムに対しては活性ではなかった（図３５）。さらに、低β−ラクタマーゼ濃度では、ＳＹＮ−００４およびＰ４Ａは、Ｐ２Ａの場合よりアンピシリンに対してより高い活性を示した（図２１Ａ、２１Ｂおよび３５）。ＳＹＮ−００４およびＰ４Ａは優れたセファロスポリン活性を有するが、それらはカルバペネマーゼ活性を欠いていることが知られている。したがって、Ｐ２ＡおよびＰ４Ａの同時投与は、ペニシリン、セファロスポリン、およびカルバペネムのほとんどに対し保護を提供する。モノバクタム、アズトレオナムに対する保護が必要な場合、ＫＰＣはアズトレオナムを分解した唯一のβ−ラクタマーゼであったので、ＫＰＣは、Ｐ２ＡおよびＰ４Ａと同時投与される（図２１Ａおよび２１Ｂ）。同じ組み合わせ調査は、Ｐ４ＡとＮＤＭおよび／またはＫＰＣでも行われる。同じ組み合わせ調査は、Ｐ３Ａ（ａ／ｋ／ａ  ＳＹＮ−００４）とＰ２Ａおよび／またはＮＤＭおよび／またはＫＰＣとでも行われる。
【０２５２】
実施例２０：Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣの腸溶性製剤および／または放出調節製剤のインビボ評価
イヌおよび／またはブタ中の非経口送達カルバペネム抗生物質、例えば、メロペネムを分解する、カルバペネマーゼＰ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣの経口製剤の活性を評価する実験が実施される。
【０２５３】
選択したＰ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣの経口製剤（単一または複数）および非経口メロペネムが、正常な幼若ブタ（約５０ポンド）またはビーグル犬のコホート（ｎ＝３〜５匹）に送達される。動物はＰ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣおよび抗生物質で５〜７連続日にわたり処理される（表１９）。Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣ処理は、抗生物質送達の１日前に開始された。血漿および便は、処理の前の日（−１日目）に開始して、毎日収集される。１つの動物のコホートは、マイクロバイオーム損傷のポジティブコントロールとしてクリンダマイシンで処理される。血漿中のメロペネムレベルがモニターされ、便が１６Ｓ  ＲＮＡシーケンシングおよび／またはショットガンＤＮＡシーケンシングに供され、マイクロバイオームの多様性がモニターされる。便中の抗生物質レベルも測定される。メロペネム／Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣ投与量の１つまたは両方で、メロペネムの血漿中レベルが影響を受けず、同時にマイクロバイオームが保護され、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣがメロペネムのＩＶ送達後腸内に排泄されたメロペネムを分解することを示すことが予測される。その他のカルバペネムおよびセファロスポリン系抗生物質も同様にして評価される。下表２４は、実験設計を示す。
【表２７】
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【０２５４】
実施例２１：Ｐ２ＡおよびＰ４Ａの腸溶性製剤および／または放出調節製剤のインビボ評価
イヌおよび／またはブタ中の、カルバペネム系抗生物質、メロペネム、およびセファロスポリン系抗生物質、セフェピムを含む非経口送達抗生物質の組み合わせを分解する、セファロスポリナーゼＰ４Ａと同時に使用されるカルバペネマーゼＰ２Ａの経口製剤の活性を評価する実験が実施される。
【０２５５】
選択したＰ２ＡおよびＰ４Ａの経口製剤（単一または複数）および非経口メロペネム＋セフェピムが、正常な幼若ブタ（約５０ポンド）またはビーグル犬のコホート（ｎ＝３〜５匹）に送達される。動物はＰ２Ａ＋Ｐ４Ａおよび抗生物質で５〜７連続日にわたり処理される（表２５）。Ｐ２ＡおよびＰ４Ａ処理は、抗生物質送達の１日前に開始された（または同時に）。血漿および便は、処理の前の日（−１日目）に開始して、毎日収集される。１つの動物のコホートは、マイクロバイオーム損傷のポジティブコントロールとしてクリンダマイシンで処理される。血漿中のメロペネムおよびセフェピムレベルがモニターされ、便が１６Ｓ  ＲＮＡシーケンシングおよび／またはショットガンＤＮＡシーケンシングに供され、マイクロバイオームの多様性がモニターされる。便中の抗生物質レベルも測定される。メロペネム／セフェピム＋Ｐ２Ａ／Ｐ４Ａの投与量の１つまたは両方で、メロペネムおよびセフェピムの血漿中レベルが影響を受けず、同時にマイクロバイオームが保護され、Ｐ２ＡおよびＰ４Ａが抗生物質送達後腸内に排泄された抗生物質を分解することを示すことが予測される。その他のカルバペネムおよびセファロスポリン系抗生物質および抗生物質分解する酵素の組み合わせも同様にして評価される。下表２５は、実験設計を示す。
【表２８】
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【０２５６】
実施例２２：経口Ｐ２Ａはイヌ消化（ＧＩ）管中のアンピシリンを分解する
永久的空腸ろう孔を有する実験ビーグルを使って、イヌ腸管中のアンピシリンを分解するＰ２Ａの能力を評価した。ろう孔は、これらの動物からの空腸キームス供試体の反復収集を可能とした。イヌを液体製剤（ＰＢＳ緩衝液）中の経口Ｐ２Ａ（１ｍｇ／ｋｇ）、および／または静脈内アンピシリン（４０ｍｇ／ｋｇ）で処理した。血清試料を収集し、血清中アンピシリンレベルを定量した。空腸キームス試料を収集し、アンピシリンおよびＰ２Ａレベルを定量した。血清およびキームス中アンピシリンレベルは標準的逆相ＨＰＬＣ法を使って測定した。キームス中のＰ２Ａ活性レベルをメロペネムを基質として使用して分光測定により測定した。メロペネム加水分解を２９７ｎｍの波長でモニターした。
【０２５７】
血清中アンピシリンレベルは、３匹の処理イヌと同様であった（図３６）。イヌ１およびイヌ２は、アンピシリンおよびＰ２Ａの両方を投与されたが、「Ｐ２Ａなし」の標識の曲線により表されるイヌは、アンピシリンのみの投与を受けた。これらのデータは、経口投与Ｐ２Ａは、アンピシリン血清中レベルを低減させないことを示しており、Ｐ２Ａが全身性送達アンピシリンの効力に影響を与えないことを示唆する。アンピシリンおよびＰ２Ａのレベルは、アンピシリンおよびＰ２Ａで処理されたイヌから収集された空腸キームス中でも測定された（図３７）。イヌ１では、キームス中のアンピシリンレベルは極めて低いか、または検出不能であり、一方、Ｐ２Ａのレベルは、十分に検出限界を超えていた。イヌ２では、Ｐ２Ａがキームス中で検出された場合、アンピシリンレベルは検出不能であり、Ｐ２Ａレベルが低いかまたは検出不能の場合、アンピシリンレベルは高かった。これらのデータは、経口送達Ｐ２Ａがイヌ腸管中のアンピシリンを分解したことを示した。
【０２５８】
実施例２３：経口Ｐ２ＡはイヌＧＩ管中のセフトリアキソンを分解する
永久的空腸ろう孔を有する実験ビーグルを使って、イヌ腸管中のセフトリアキソンを分解するＰ２Ａの能力を評価した。ろう孔は、これらの動物からの空腸キームス供試体の反復収集を可能とした。イヌを液体製剤（ＰＢＳ緩衝液）中の経口Ｐ２Ａ（２．５ｍｇ／ｋｇ）、および／または静脈内セフトリアキソン（３０ｍｇ／ｋｇ）で処理した。セフトリアキソンおよび／またはＰ２Ａで処理する前に、それぞれのイヌに単回投与のオメプラゾール（１０ｍｇ）を経口送達して胃中のＨＣｌ活性を抑制し、Ｐ２Ａ分解の可能性を低減した。血清試料を収集し、血清中セフトリアキソンレベルを定量した。空腸キームス試料を収集し、セフトリアキソンおよびＰ２Ａレベルを定量した。血清およびキームス中セフトリアキソンレベルを、セフトリアキソン感受性ミクロコッカス・ルテウスＴＳ５０４を試験株として使用して、平板拡散法により測定した。キームス中のＰ２Ａ活性レベルをメロペネムを基質として使用して分光測定により測定した。メロペネム加水分解を２９７ｎｍの波長でモニターした。
【０２５９】
セフトリアキソンの血清中レベルは、セフトリアキソン単独またはセフトリアキソンおよびＰ２Ａの組み合わせで処理したイヌ中で、類似であった（図３８）。これらのデータは、経口投与Ｐ２Ａは、セフトリアキソン血清中レベルを低減させないことを示しており、Ｐ２Ａが全身性送達セフトリアキソンの効力に影響を与えないことを示唆する。セフトリアキソンおよび／またはＰ２Ａのレベルは、セフトリアキソン単独でまたはセフトリアキソンとＰ２Ａで処理されたイヌから収集された空腸キームス中でも測定された（図３９）。セフトリアキソンは、セフトリアキソン単独で処理されたイヌ由来のキームスで容易に測定された。セフトリアキソンおよびＰ２Ａで処理された２匹のイヌの内、１匹の動物は、キームス中にＰ２Ａがほとんどないかまたは全くなかったが、他の動物は、高レベルの腸内Ｐ２Ａを示した（図３９）。キームス中に検出可能なＰ２Ａを有するイヌは、キームス中にセフトリアキソンがほとんどないか、または全くなかったが、Ｐ２Ａを検出できない動物は、セフトリアキソン単独処理のイヌと類似のセフトリアキソンレベルを示した。これらのデータは、経口投与Ｐ２Ａが、腸管中に存在する際に、セフトリアキソンを分解したことを示した。
【０２６０】
実施例２４：経口Ｐ２ＡはイヌＧＩ管中のメロペネムを分解する
永久的空腸ろう孔を有する実験ビーグルを使って、イヌ腸管中のメロペネムを分解するＰ２Ａの能力を評価した。ろう孔は、これらの動物からの空腸キームス供試体の反復収集を可能とした。イヌを液体製剤（ＰＢＳ緩衝液）中の経口Ｐ２Ａ（１ｍｇ／ｋｇ）、および／または静脈内メロペネム（３０ｍｇ／ｋｇ）で処理した。血清試料を収集し、血清中メロペネムレベルを定量した。空腸キームス試料を収集し、メロペネムおよびＰ２Ａレベルを定量した。血清およびキームス中メロペネムレベルを、メロペネム感受性ミクロコッカス・ルテウスＴＳ５０４を試験株として使用して、平板拡散法により測定した。キームス中のＰ２Ａ活性レベルをメロペネムを基質として使用して分光測定により測定した。メロペネム加水分解を２９７ｎｍの波長でモニターした。
【０２６１】
メロペネムの血清中レベルは、セフトリアキソン単独またはセフトリアキソンおよびＰ２Ａの組み合わせで処理したイヌ中で、類似であった（図４０）。これらのデータは、経口投与Ｐ２Ａは、メロペネム血清中レベルを低減させないことを示しており、Ｐ２Ａが全身性送達メロペネムの効力に影響を与えないことを示唆する。メロペネムおよび／またはＰ２Ａのレベルは、メロペネム単独でまたはメロペネムとＰ２Ａで処理されたイヌから収集された空腸キームス中でも測定された（表２６）。０．５Ｕ／ｇ以上の空腸Ｐ２Ａ濃度では、メロペネムは腸内試料中で検出されなかった。これらのデータは、経口投与Ｐ２Ａが、腸管中に存在する際に、メロペネムを分解したことを示した。
【表２９】
2018507204.tif 000051
【０２６２】
実施例２５：経口Ｐ２ＡはイヌＧＩ管中のセフォタキシムを分解する
永久的空腸ろう孔を有する実験ビーグルを使って、イヌ腸管中のセフォタキシムを分解するＰ２Ａの能力を評価した。ろう孔は、これらの動物からの空腸キームス供試体の反復収集を可能とした。イヌを液体製剤（ＰＢＳ緩衝液）中の経口Ｐ２Ａ（１ｍｇ／ｋｇ）、および／または静脈内セフォタキシム（６０ｍｇ／ｋｇ）で処理した。セフトリアキソンおよび／またはＰ２Ａで処理する前に、それぞれのイヌに単回投与のオメプラゾール（１０ｍｇ）を経口送達して胃中のＨＣｌ活性を抑制し、Ｐ２Ａ分解の可能性を低減した。血清試料を収集し、血清中セフォタキシムレベルを定量した。空腸キームス試料を収集し、セフォタキシムおよびＰ２Ａレベルを定量した。血清およびキームス中セフォタキシムレベルを、セフォタキシム感受性ミクロコッカス・ルテウスＴＳ５０４を試験株として使用して、平板拡散法により測定した。キームス中のＰ２Ａ活性レベルをメロペネムを基質として使用して分光測定により測定した。メロペネム加水分解を２９７ｎｍの波長でモニターした。
【０２６３】
セフォタキシムの血清中レベルは、セフォタキシム単独またはセフォタキシムおよびＰ２Ａの組み合わせで処理したイヌ中で、類似であった（図４１）。これらのデータは、経口投与Ｐ２Ａは、セフォタキシム血清中レベルを低減させないことを示しており、Ｐ２Ａが全身性送達セフォタキシムの効力に影響を与えないことを示唆する。セフォタキシムおよび／またはＰ２Ａのレベルは、セフォタキシム単独でまたはセフォタキシムとＰ２Ａで処理されたイヌから収集された空腸キームス中でも測定された（図４２）。セフォタキシムは、セフォタキシム単独で処理されたイヌ由来のキームスで容易に測定された。セフォタキシムおよびＰ２Ａで処理された３匹のイヌの内、１匹の動物は、キームス中にＰ２Ａがほとんどないかまたは全くなかったが、他の２匹の動物は、高レベルの腸内Ｐ２Ａを示した（図４２）。キームス中に検出可能なＰ２Ａを有するイヌは、Ｐ２Ａが存在する時間中はキームス中にセフォタキシムがほとんどないか、または全くなかったが、Ｐ２Ａを検出できない動物は、ＧＩ管中に種々の量のセフトリアキソンを示した。これらのデータは、経口投与Ｐ２Ａが、腸管中に存在する際に、セフォタキシムを分解したことを示した。
【０２６４】
実施例２６：イヌＧＩ管中のセフォタキシムの分解のためのＰ２Ａ腸溶コーティング粒子の評価
Ｐ２Ａの腸溶コーティングペレット製剤をＰ１Ａ腸溶コーティングペレットの作製で成功裏に使用したのと類似の方法を使って作製した（例えば、スクロースコア粒子、ｐＨ依存性ポリマーオイドラギットＬ３０  Ｄ−５５コーティング、Ｔａｒｋｋａｎｅｎ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｊｕｎｅ  ２００９，ｐ．２４５５−２４６２を参照されたい。この文献の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２６５】
永久的空腸ろう孔を有する実験ビーグルを使って、イヌ腸管中のセフォタキシムを分解するＰ２Ａの能力を評価した。ろう孔は、これらの動物からの空腸キームス供試体の反復収集を可能とした。０．５ｍｇ／ｋｇまたは０．２５ｍｇ／ｋｇのＰ２Ａ含量の経口２回投与Ｐ２Ａ腸溶コーティングペレットおよび／または静脈内セフォタキシム（１２０ｍｇ／ｋｇ）でイヌを処理した。投与は２回実施された。動物はＰ２Ａが経口送達前２０分に給餌を受けた。それぞれの動物は、Ｐ２Ａ用量および体重に応じて、３〜５個のＰ２Ａカプセルを投与された。セフォタキシムはＰ２Ａ投与後１０分に静脈内送達された。キームス試料をセフォタキシム送達後１５分から示した範囲の時間に収集した。動物に２回目の給餌を、セフォタキシム送達の５時間４０分後に与え、続けて、１０分後にＰ２Ａ送達、および１０分後に第２のセフォタキシム処理を行った、キームス中セフォタキシムレベルを、セフォタキシム感受性ミクロコッカス・ルテウスＴＳ５０４を試験株として使用して、平板拡散法により測定した。キームス中のＰ２Ａ活性レベルをメロペネムを基質として使用して分光測定により測定した。メロペネム加水分解を２９７ｎｍの波長でモニターした。
【０２６６】
使用した１２０ｍｇ／ｋｇのセフォタキシム用量は、臨床用量の４倍であったので、高レベルのセフォタキシムがセフォタキシム単独で処理されたイヌ由来のキームスで測定された（図４３）。セフォタキシムおよびＰ２Ａ（０．５ｍｇ／ｋｇまたは０．２５ｍｇ／ｋｇ用量）の両方で処理されたイヌは、セフォタキシム単独でのレベルに比べて、それらのキームス中でより低い全体レベルを示した。個々の動物のセフォタキシムおよびＰ２Ａキームスレベルは、明確なパターンを示す（図４４）。Ｐ２Ａがキームス中で検出された場合は、セフォタキシムは検出されず、また、逆もまた同じで、Ｐ２Ａが検出できない場合には、セフォタキシムレベルが測定された（図４４）。これらのデータは、経口投与Ｐ２Ａが、腸管中に存在する際に、セフォタキシムを分解したことを示した。
【０２６７】
実施例２７：ハムスターの抗生物質処理後のクロストリジウム・ディフィシレ疾患（ＣＤＩ）に対する予防薬としてのカルバペネマーゼの評価
これらの調査は、ハムスター疾患モデルのＣＤＩの予防におけるカルバペネマーゼＰ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣ（例えば、これらの酵素の腸溶製剤または放出調節製剤）の効力を評価する。
【０２６８】
Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣの腸溶性および／またはその他の放出調節製剤を含む経口製剤がげっ歯類ＣＤＩモデルで試験される。げっ歯類モデルには、シリアンゴールデンハムスター（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ）クロストリジウム・ディフィシレモデル（Ｓａｍｂｏｌ  ａｎｄ  Ｔａｎｇ，２００１；Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅ  １８３：１７６０）が含まれる。ハムスターモデルは、ＣＤＩに対する種々の予防薬および治療的介入の効力を評価するための「ゴールドスタンダード」小動物モデルと呼ばれている。ＣＤＩは、次のプロトコルを使ってハムスターに誘導される。Ｈａｒｌａｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入した雄ゴールデンシリアンハムスターを５日または２４時間前処理し、その後、１０または３０ｍｇ／ｋｇのクリンダマイシンを単回皮下注射により感染させて、該動物のマイクロバイオームを枯渇させ、動物をクロストリジウム・ディフィシル感染症に罹患させる。いずれの抗生物質の使用もクロストリジウム・ディフィシル感染症のリスク因子であるので（Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｃｏｘ，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．（１９９９）１：３７７−３８４）、メロペネムをクリンダマイシンの代わりに使用して、動物をクロストリジウム・ディフィシル感染症に罹患させる。感染の日に、経口胃管投与により、ハムスター当たり１０６個のクロストリジウム・ディフィシレ（ＡＴＣＣ４３２５５）増殖型細胞を動物に接種する。クロストリジウム・ディフィシレ接種材料は、嫌気性条件下、１％のオキシラーゼを含むＤｉｆｃｏ強化クロストリジウム培地中で２４時間増殖させることにより調製される。６００ｎｍの光学密度が１．５に調節され、その後、１：１０に希釈される。ハムスターは０．７５ｍｌのこの懸濁液を経管栄養を介して経口で投与される。その後、一定分量の接種材料を系列希釈し、ヘミンおよびビタミンＫ１を補充したブルセラ寒天培地（Ｒｅｍｅｌ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）に播種し、気密性容器（Ｐａｃｋ−Ａｎａｅｒｏ  ＭＧＣ）中で４８時間嫌気的にインキュベートして、感染力価を測定する。最初の感染後２４時間は１日２回、その後、次の疾患の急性期中の次の２４時間は２時間毎に、続けて、残りの調査期間は１日２回、動物を観察した。ＣＤＩの徴候には、死亡および罹患の前兆、ウエットテイルにより示される下痢の存在、および活動性、取り扱いや接触に対する一般応答を含む全体外観、または被毛の逆立ちが含まれる。体重は、２〜３日毎にモニターされる。
【０２６９】
Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣの予防潜在能力を評価するために、カルバペネマーゼ酵素が、抗生物質投与の時間に始まり、クロストリジウム・ディフィシル感染の１日前、および２８日までの調査期間の間、継続して経口投与される。疾患はクリンダマイシンまたはメロペネム（抗生物質）を投与された動物の間で比較される。酵素処理群の効力が、処理を受けていない対照動物、標準治療のバンコマイシンの処理（２０ｍｇ／ｋｇの毎日の経口投与が、感染症の２４時間後に始まり、５日間継続される）を受けている動物、またはバンコマイシンおよび酵素処理の両方を受けている動物と比較される。血漿中の抗生物質レベルがモニターされ、便が１６Ｓ  ＲＮＡシーケンシングに供され、マイクロバイオームの多様性がモニターされる。便中のメロペネムの存在が分析される。効力評価には、死亡およびクロストリジウム・ディフィシレ細菌力価および／または死亡時もしくは安楽死後の調査終了時の盲腸内容物中のクロストリジウム・ディフィシレ毒素ＡおよびＢの評価が含まれる。メロペネムおよびＰ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣによる処理は、抗生物質の血中レベルに影響を与えず、ＣＤＩから動物を保護し、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣが抗生物質吸収後に腸内に排泄されたメロペネム抗生物質を分解することを示すことが予測される。下表２７は、実験設計を示す。
【表３０】
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【０２７０】
実施例２８：ヒト化ブタの抗生物質処理後のクロストリジウム・ディフィシレ（ＣＤＩ）を防ぐための予防薬としてのカルバペネマーゼの評価
これらの調査は、ヒト化ブタのＣＤＩの予防におけるカルバペネマーゼＰ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣの効力を評価する。
【０２７１】
Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣは、ＣＤＩのヒト化ブタモデルで試験される。ヒト化ブタモデルは、ノトバイオートブタがヒト糞便ホモジネートを使って再構成されているヒト消化管のモデルである（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｕｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ（２０１３）４：１９３）。ヒト化ブタは、抗生物質（クリンダマイシンまたはメロペネム）で処理され、それらの腸内マイクロバイオームが破壊され、その後、クロストリジウム・ディフィシレに曝露さた後、それらは、クロストリジウム・ディフィシレ関連下痢（ＣＤＡＤ）を含むＣＤＩを発症する。
【０２７２】
Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣの予防潜在能力を試験するために、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣが、抗生物質処理の１日前（−１日目）に（または抗生物質処理と同時に）投与され、抗生物質処理の期間の間維持される。クリンダマイシンはクロストリジウム・ディフィシレ接種の１〜５日前に投与され、マイクロバイオーム損傷のためのポジティブコントロールコホートとして機能する。メロペネムまたは別の抗生物質の投与はクロストリジウム・ディフィシレ接種の１〜５日前に開始され、５〜７日間維持される。抗生物質を使用して、腸内マイクロバイオームを破壊し、動物をクロストリジウム・ディフィシル感染症に罹患させる。クロストリジウム・ディフィシレ増殖型細胞または芽胞が１０６〜１０８の範囲の投与量で投与され、動物は、ＣＤＡＤを含むＣＤＩの症状がモニターされる。クロストリジウム・ディフィシレに曝露された動物は、細菌接種の４８時間以内に病徴を発症すると予測される（Ｓｔｅｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ  ２０１：４２８）。ＣＤＩはクリンダマイシンまたはメロペネム（抗生物質）を投与された動物の間で比較される。Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣ処理群の効力が、処理を受けていない対照動物、標準治療のバンコマイシンの処理（２０ｍｇ／ｋｇの毎日の経口投与が、感染の２４時間後に始まり、５日間継続される）を受けている動物、またはバンコマイシンおよびＰ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣ処理の両方を受けている動物と比較される。メロペネムおよびＰ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣによる処理は、抗生物質の血中レベルに影響を与えず、ＣＤＩから動物を保護し、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣが抗生物質吸収後に腸内に排泄されたメロペネム抗生物質を分解することを示すことが予測される。下表２８は、実験設計を示す。
【表３１】
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【０２７３】
実施例２９：カルバペネム媒介腸マイクロバイオーム破壊のブタモデルの開発
Ｐ２Ａは、腸マイクロバイオームを保護し、カルバペネム媒介腸内菌共生バランス失調を防ぐために、ＧＩ管中で、エルタペネム、メロペネム、イミペネム、およびドリペネムなどのカルバペネム系抗生物質を分解するように開発された強力なカルバペネマーゼである。エルタペネム媒介腸内菌共生バランス失調のブタモデルを確立した。このブタモデルは、ブタＧＩ管中のエルタペネムを分解し、腸内菌共生バランス失調を防ぐことを目的とした、Ｐ２Ａ腸溶コーティング製剤またはその他の製剤の経口送達の効力を評価するために使用されることになる。ブタモデルを開発するために、正常な子ブタを使用して、エルタペネムが腸内菌共生バランス失調を引き起こすかどうかを判定するための調査を行った。
【表３２】
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【０２７４】
合計５匹のそれぞれ約２０ｋｇの２月齢のヨークシャー子ブタをこの調査で使用した。該動物を、静脈内注入により１日１回、合計７日間のエルタペネム（３０ｍｇ／ｋｇ）で処理した。
【０２７５】
２つの処理前糞便試料、１つ目は動物が処理施設に到着の４日後（−７日目）、および２つ目は到着の７日後（−４日目）に試料を採取した。追加の３つの糞便試料を、４日目、８日目および９日目に収集した。糞便試料は、ＯＭＮＩｇｅｎｅ  ＧＵＴ試料収集キット（ＯＭＲ−２００，ＤＮＡ  Ｇｅｎｏｔｅｋ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を使って収集し、全ての試料が収集されるまで、光から隔離して室温で貯蔵した。糞便試料から単離されたＤＮＡを腸内マイクロバイオームのディープシークエンシングおよび分析に供した。
【０２７６】
２日目の、３回のエルタペネム投与後、動物から採血し、血清を収集した。麻酔した動物から血液を大静脈から無菌で収集した。アモキシシリン投与の１時間、３時間および８時間後の３回の採血を実施した。テラゾール反応混液を最小用量（５０ポンド当たり１ｍＬ以下）で筋肉内に投与し、軽い麻酔／鎮静状態を得た。各時点で、約９ｍＬの血液を血清分離装置のバキュテイナーチューブ中に採取した。凝固後、試料を遠心分離し、血清をクライオバイアルに移し、評価検査室（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｈａｒｔｆｏｒｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｈａｒｔｆｏｒｄ，ＣＴ）に送るまで−８０℃で貯蔵した。
【０２７７】
検証済ＨＰＬＣベースアッセイの改良版を使って、ブタ血清中のエルタペネムレベルを定量した（Ｘｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｒｔａｐｅｎｅｍ（ＭＫ−０８２６）ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉｃ  ｔｈｉｇｈ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，４６：２９９０−２９９９）。検量線は、エルタペネムの０．２５〜５０μｇ／ｍｌの範囲の６点から構成された。検量線はブランクブタ血清で調製された。品質管理（ＱＣ）：０．５μｇ／ｍｌ（ＱＣ低）、および４０．０μｇ／ｍｌ（ＱＣ高）。アッセイは、０．２５〜５０μｇ／ｍＬの範囲で直線であった（Ｒ＝０．９９９）。低（０．５μｇ／ｍｌ）および高（４０．０μｇ／ｍｌ）品質管理試料の日間変動係数は、それぞれ５．２％および７．１％であった。日間変動係数は、それぞれ４．７％および３．８％であった。ピーク高さを全ピークの積分に使用した。Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔを使って、薬物濃度を計算し、−１重み係数を使用した。全ての検量線が許容可能であった。
【０２７８】
アッセイの検出限界は０．５ｕｇ／ｍＬであった。エルタペネムレベルは、平均および標準偏差として報告された（図４５）。
【０２７９】
ＤＮＡは、糞便試料から単離され、サンプル当たり２千万シングルリード（１００ｂｐ）をターゲットとするＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑシステムを使った全ゲノムショットガンシークエンシングに供された。ＤＮＡ単離およびシーケンシングを実施した。配列決定したデータセットは、ＣｏｓｍｏｓＩＤ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）によるＧＥＮＩＵＳ（登録商標）ソフトウェアパッケージを使って分類学的に分類された（Ｈａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｌａｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０２８０】
相対的菌株存在量に基づいてパーセント類似度が計算された。エルタペネム処理動物の−７日目〜９日目のパーセント類似度を、−７日目、−４日目、４日目、８日目および９日目の各日と比較した（図４６）。マイクロバイオームの多様性は、両群で−７日目〜−４日目に減少した。動物は順化プロセス中であり、−４日目にはまだ処理していなかったので、これらのデータは、マイクロバイオームが新しい環境に応じて変化したことを示唆している。動物は１日目にエルタペネム処理が開始され、パーセント類似度は動物が評価される毎に低下した。これらのデータは、処理ブタのマイクロバイオームに対し、エルタペネムが多様性の低下を引き起こしていることを示す。
【０２８１】
それぞれの菌株の相対存在量に基づいて細菌分類群の色分け地図を作成し、調査日による時間の経過順におよび動物別に整理した（図４７）。いくつかの細菌種の存在量は４日目までにエルタペネム処置ブタで低下した。同様に、いくつかの細菌種の存在量はエルタペネム処置ブタで増加した。これらのデータは、エルタペネムはブタ腸中の微生物叢を破壊することを示す。
【０２８２】
抗生物質処理の前後でマイクロバイオームが同じで残るのかまたは異なるかの確率を決定するための統計分析を実施した。尤度比検定を実施するために、ディリクレ多項分布（Ｌａ  Ｒｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）のパラメトリゼーションを使ってマイクロバイオーム配列データを解析した。処理前−４日目および処理後８日目および９日目のエルタペネム処理ブタのマイクロバイオームを比較した。４日目のマイクロバイオームと−４日目のマイクロバイオームとの比較で得られたｐ値は、１．７ｘ１０−１９であった。８日目のマイクロバイオームと−４日目のマイクロバイオームとの比較で得られたｐ値は、１．０ｘ１０−２５未満であった。９日目のマイクロバイオームと−４日目のマイクロバイオームとの比較で得られたｐ値は、７．０ｘ１０−１６であった。これらのデータは、エルタペネムはブタ腸中の集団を有意に変えることを示す。
【０２８３】
実施例３０：エルタペネムの作用からマイクロバイオームを保護するためのブタへのＰ２Ａの経口送達の評価
調査は、正常な子ブタを使って、ＩＶエルタペネムと共に経口投与された場合、Ｐ２Ａがエルタペネム誘導腸内菌共生バランス失調からマイクロバイオームを保護するように機能するかどうかを判断するために実施される。調査はまた、Ｐ２Ａがエルタペネムの血清中レベルに影響を与えるかどうかについても試験する（表３０）。
【表３３】
2018507204.tif 000055
【０２８４】
合計１０匹のそれぞれ約２０ｋｇの２月齢のヨークシャー子ブタがこの調査で使用される。全１０匹の動物がＩＶエルタペネムで１日１回、合計７日間処理され、５匹の動物のうち１匹のコホートはまた、経口Ｐ２Ａで１日４回、合計９日間処理される。Ｐ２Ａ処理は、エルタペネム処理の前日に開始され、エルタペネム停止の翌日まで継続される。
【０２８５】
２つの処理前糞便試料、１つ目は動物が処理施設に到着の４日後（−７日目）、および２つ目は到着の７日後（−４日目）に試料を採取する。追加の３つの糞便試料を、４日目、８日目および９日目に収集する。糞便試料は、ＯＭＮＩｇｅｎｅ  ＧＵＴ試料収集キット（ＯＭＲ−２００，ＤＮＡ  Ｇｅｎｏｔｅｋ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を使って収集し、全ての試料が収集されるまで、光から離して室温で貯蔵される。糞便試料から単離されたＤＮＡを腸内マイクロバイオームのディープシークエンシングおよび分析に供される。
【０２８６】
２日目の、２回のエルタペネム投与後、動物から採血し、血清を収集する。麻酔した動物から血液を大静脈から無菌で収集する。エルタペネム投与の１時間、４時間および１０時間後の３回の採血を行う。テラゾール反応混液を最小用量（５０ポンド当たり１ｍＬ以下）で筋肉内に投与し、軽い麻酔／鎮静状態を得る。各時点で、約９ｍＬの血液を血清分離装置のバキュテイナーチューブ中に採取する。凝固後、試料を遠心分離し、血清をクライオバイアルに移し、評価検査室（Ｓａｎｎｏｖａ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，ＮＪ）に送るまで−８０℃で貯蔵する。
【０２８７】
Ｐ２Ａの投与がエルタペネムの作用からマイクロバイオームを保護し、また、Ｐ２Ａがエルタペネムの血清中レベルに影響を与えないことが予測される。このデータは、カルバペネム媒介腸内菌共生バランス失調に対する治療薬としてＰ２Ａの使用を支持する。
【０２８８】
実施例３１：腸管へのカルバペネマーゼの送達のための遺伝子改変酵母
遺伝子改変微生物がカルバペネマーゼＰ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣを腸管に投与し、マイクロバイオームを保護し、同時に抗生物質吸収に影響せず、そのため抗生物質の効力に影響を与えないようにするための送達ビークルとして試験される。
【０２８９】
遺伝子改変して抗生物質分解酵素、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣを産生する酵母が、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／５８９６７号のクロストリジウム・ディフィシレ毒素結合タンパク質に対して記載されたものと同様にして産生される。この特許の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。簡単に説明すると、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣコード領域が酵母の出芽酵母における発現のためにコドン最適化されて、ＤＮＡ相同性を低下されるように改変され、Ｎ結合型グリコシル化部位の存在が評価され、合成されて、強力な構成的ＴＥＦプロモーター、および選択可能なＵＲＡ３＋マーカーを含む酵母発現プラスミド、ｐＤ１２１４（ＤＮＡ２．０）中に挿入される。分泌を促進する別の出芽酵母リーダー配列が知られており、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣ分泌を媒介するために利用される。一連の出芽酵母分泌ベクターが利用可能で、これらは一連の異なる分泌促進リーダー配列を含む。分泌シグナルの例は、酵母交配因子アルファ（ＭＡＴアルファ）シグナルであり、これはシグナルおよびゴルジ体中で内在性酵母プロテアーゼのＫｅｘ２により切断されて、成熟分泌タンパク質を産出するプロ配列から構成される８９個のアミノ酸配列である。インベルターゼおよび他のシグナル配列は、タンパク質の転座および分泌中にシグナルペプチダーゼにより自然に切断され、追加のプロテアーゼ切断ステップを必要としない。
【０２９０】
少なくとも２つの戦略を使って、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣを分泌する出芽酵母、亜系Ｓ．ブラウディ、の形質転換体が生成される。
【０２９１】
１つの戦略は、形質転換体を生成してげっ歯類および／またはブタでの効力評価に使用するために、ＵＲＡ３選択マーカーを含むＰ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣ発現プラスミドの使用を可能とするＳ．ブラウディＵＲＡ３ノックアウト株の産生である。Ｓ．ブラウディＵＲＡ３ノックアウトは、ＣＲＩＳＰＲ組換えシステム（ＤｉＣａｒｌｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４１：４４３６）を使用して生成された。Ｄ．Ａ．Ｓｔｅｖｅｎｓ（ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３６：２６１３）によりＡＴＣＣに寄託されたＳ．ブラウディ株、名称Ｓｂ４８（ＡＴＣＣ  製品番号ＭＹＡ−７９６）をこれらの調査に使用した。ＵＲＡ３遺伝子の上流領域中の３つの潜在的野性型Ｃａｓ９切断部位が特定され、これらの標的部位の周辺の約５００ｂｐの領域を配列解析してこの酵母株中のその部位の存在が確かなものにされる。全てのフレーム中に最初の停止コドンが確実にＵＲＡ３読み枠中にある複数の停止コドンを含むインサートにより置換された約１０ｂｐ領域を中央部に含む相同性コンストラクトを設計した。ＣＲＩＳＰＲシステムを使って、組換え／挿入を生成し、ＵＲＡ３−クローンがＦＯＡ（５−フルオロオロチン酸）培地で選択される。活性ＵＲＡ３遺伝子（オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼをコード）は、ＦＯＡを、細胞死を引き起こす有毒性化合物に変換するので、５−ＦＯＡはＵＲＡ３変異体の選択を可能とする。次に、選択クローンを試験し、それらがウラシル不含培地では増殖しないことを保証する。選択クローンを配列解析し、予測した組み込みを確認した。
【０２９２】
Ｓ．ブラウディ株がＵＲＡ３−であると確証されると、酵母がＰ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣコードプラスミドで形質転換される。クローンはウラシル不含培地に播種することにより識別される。得られた形質転換体は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥを使って、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣの分泌で選別される。濾過酵母上清の活性が、ＣＥＮＴＡβ−ラクタマーゼ生物活性アッセイ（Ｂｅｂｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ（２００１）４５：１８６８−１８７１）を使って評価される。
【０２９３】
２つ目の戦略は、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）を選択マーカーとして使用して、野性型Ｓ．ブラウディ株中に安定な組み込み体を生成する。ｎｅｏ発現がない場合は、Ｓ．ブラウディはＧ４１８に感受性がある。Ｄ．Ａ．Ｓｔｅｖｅｎｓ（ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３６：２６１３）によりＡＴＣＣに寄託されたＳ．ブラウディ株、名称Ｓｂ４８（ＡＴＣＣ  製品番号ＭＹＡ−７９６）、または市販のＡＴＣＣがこれらの調査に使用される。組み込み領域は、Ｆｌａｇｆｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ（２００９，Ｙｅａｓｔ  ２６：５４５）に基づいて選択され、染色体組み込み部位は高レベルの異種の遺伝子発現で選別された。最高の発現レベルを示す組み込み部位の野性型Ｓ．ブラウディ株中の領域２０、２１、および１９が配列解析され、それらの存在が確認される。確認が終わると、ある領域が選択され、組み込みカセットを含むプラスミドが設計される。組み込みカセットは、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣ発現カセット、ｎｅｏ発現カセット、組み込み領域の上流部由来の少なくとも５００ｂｐの相同性配列および組み込み領域の下流部由来の少なくとも５００ｂｐの相同性配列を含み、それにより、組み込み領域が相同組換えイベントにより削除される。野性型Ｓ．ブラウディは、組み込みカセットで形質転換され、クローンがＧ４１８耐性で選択される。クローンが採取され、培養増殖され、上清がＳＤＳ／ＰＡＧＥを使ってＰ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣタンパク質の存在で選別される。濾過酵母上清の生物活性が、ＣＥＮＴＡβ−ラクタマーゼ生物活性アッセイ（Ｂｅｂｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ（２００１）４５：１８６８−１８７１）を使って評価される。タンパク質発現および生物活性レベルに基づいて、クローンが選択され、また、インサートが配列解析され、組み込み配列の健全性が確認される。
【０２９４】
Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣ発現酵母は、げっ歯類、ブタ、および／またはイヌモデル（単一または複数）で試験され、カルバペネム分解酵母が抗生物質吸収には影響を与えないで、抗生物質の分解に効果的であるかどうかが判定される。ブタまたはイヌの調査では、コホート（ｎ＝３〜５）の正常な幼若ブタまたはビーグル犬が遺伝子改変酵母およびメロペネムなどの抗生物質で５〜７連続日の間処理される（表２０）。酵母処理は、抗生物質処理の３日前に（または抗生物質処理と同時に）始まり、抗生物質処理の全期間にわたり維持される。血漿および便は、酵母処理の前の日（−４日目）および抗生物質処理の前の日（−１日目）に開始して、毎日収集される。動物の１頭のコホートは、マイクロバイオーム損傷のポジティブコントロールとしてクリンダマイシンで処理される。血漿中のメロペネムレベルがモニターされ、便が１６Ｓ  ＲＮＡシーケンシングおよび／またはショットガンＤＮＡシーケンシングに供され、マイクロバイオームの多様性がモニターされる。便中の抗生物質レベルも測定される。メロペネム／酵母投与量の１つまたは両方で、メロペネムの血漿中レベルが影響を受けず、同時にマイクロバイオームが保護され、Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣがメロペネムのＩＶ送達後腸内に排泄されたメロペネムを分解することを示すことが予測される。その他のカルバペネムおよびセファロスポリン系抗生物質も同様にして評価される。実験設計については表３１を参照されたい。
【表３４】
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【０２９５】
実施例３２：ハムスターＣＤＩモデルにおけるＰ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣ発現酵母のインビボ分析
Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣ発現酵母がクロストリジウム・ディフィシレ疾患ハムスターモデルにおけるクロストリジウム・ディフィシル感染症および疾患の予防に関し評価される。
【０２９６】
実施例１２に記載のように、シリアンゴールデンハムスター（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ）クロストリジウム・ディフィシレモデル（Ｓａｍｂｏｌ  ａｎｄ  Ｔａｎｇ，２００１；Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅ  １８３：１７６０）を含むクロストリジウム・ディフィシレ（ＣＤＩ）のげっ歯類モデルにおけるＰ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣ発現Ｓ．ブラウディ形質転換体が評価される。
【０２９７】
Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣを発現するＳ．ブラウディの予防潜在能力を評価するために、２ｘ１０８〜２ｘ１０１０ｃｆｕ／動物の範囲の投与量で、抗生物質投与の時間に始まり、クロストリジウム・ディフィシル感染の５または１日前、および２８日までの調査期間の間、継続して酵母が毎日、経口胃管投与により投与される。酵母は抗生物質に感受性がないので、酵母は抗生物質の存在下でも生き残ると思われる。疾患はクリンダマイシンまたはメロペネム（抗生物質）を投与された動物の間で比較される。Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣ発現酵母の効力が、処理を受けていない対照動物、標準治療のバンコマイシンの処理（２０ｍｇ／ｋｇの毎日の経口投与が、感染症の２４時間後に始まり、５日間継続される）を受けている動物、またはバンコマイシンおよび酵母処理の両方を受けている動物と比較される。効力評価には、死亡およびクロストリジウム・ディフィシレ細菌力価および／または死亡時もしくは安楽死後の調査終了時の盲腸内容物中のクロストリジウム・ディフィシレ毒素ＡおよびＢの評価が含まれる。メロペネムおよびＰ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣ発現酵母の投与は、抗生物質の血中レベルに影響を与えず、ＣＤＩから動物を保護し、酵母が、抗生物質吸収後に腸内に排泄されたメロペネム抗生物質を分解するように機能する抗生物質不活化酵素を発現したことを示すことが予測される。下表３２は、実験設計を示す。
【表３５】
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【０２９８】
実施例３３：ブタＣＤＩモデルにおけるＰ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣ発現酵母のインビボ分析
Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣ発現酵母がクロストリジウム・ディフィシレ疾患ヒト化ブタモデルにおけるクロストリジウム・ディフィシル感染症および疾患の予防に関し評価される。
【０２９９】
Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、および／またはＫＰＣ発現Ｓ．ブラウディ形質転換体が、ＣＤＩのヒト化ブタモデルで試験される。ヒト化ブタモデルは、実施例１３に記載されている。ヒト化ブタは、抗生物質（クリンダマイシンまたはメロペネム）で処理され、それらの腸内マイクロバイオームが破壊され、その後、クロストリジウム・ディフィシレに曝露された後、クロストリジウム・ディフィシレ関連下痢（ＣＤＡＤ）を含むＣＤＩを発症する。
【０３００】
Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣ発現酵母の予防潜在能力を試験するために、酵母が、抗生物質処理の１日前（−１日目）に、または抗生物質処理と同時に、投与され、さらに抗生物質処理の期間中、１日２回投与される。酵母は５ｘ１０９〜６ｘ１０１０ｃｆｕ／動物の範囲の投与量で投与される。クリンダマイシンはクロストリジウム・ディフィシレ接種の１〜５日前に投与され、マイクロバイオーム損傷およびクロストリジウム・ディフィシル感染症のためのポジティブコントロールとして機能する。メロペネムの投与はクロストリジウム・ディフィシレ接種の１〜５日前に開始され、５〜７日間維持される。抗生物質を使用して、腸内マイクロバイオームを破壊し、動物をクロストリジウム・ディフィシル感染症に罹患させる。クロストリジウム・ディフィシレ増殖型細胞または芽胞が１０６〜１０８の範囲の投与量で投与され、動物は、ＣＤＡＤを含むＣＤＩの症状がモニターされる。ＣＤＩはクリンダマイシンまたはメロペネム（抗生物質）を投与された動物の間で比較される。Ｐ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣ発現酵母処理群の効力が、処理を受けていない対照動物、標準治療のバンコマイシンの処理（２０ｍｇ／ｋｇの毎日の経口投与が、感染症の２４時間後に始まり、５日間継続される）を受けている動物、またはバンコマイシンおよびＰ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣ発現酵母処理の両方を受けている動物と比較される。メロペネムおよびＰ２Ａ、ＮＤＭ、またはＫＰＣ発現酵母による処理は、抗生物質の血中レベルに影響を与えず、ＣＤＩから動物を保護し、酵母が、抗生物質吸収後に腸内に排泄されたメロペネム抗生物質を分解するように機能する抗生物質不活化酵素を発現したことを示すことが予測される。下表３３は、実験設計を示す。
【表３６】
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【０３０１】
等価物
本発明をその特定の実施形態と関連付けて説明してきたが、その実施形態はさらに修正が可能であり、本出願は、一般的に、本発明の原理に従った本発明の任意の変形、使用、または改変を包含することが意図され、本発明が属する技術内の既知のまたは日常的な実施の範囲に入る、および上記に示されるおよび以下の添付の請求項の範囲に入る本質的な特徴に該当し得る本開示からの乖離を含むものと理解されよう。
【０３０２】
当業者は、特に本明細書に記載された特定の実施形態に対する多数の等価物を、ルーチン実験のみを用いて認識し、確認できるであろう。このような等価物は、次の請求項の範囲内に包含されることが意図されている。
【０３０３】
参照による組み込み
本明細書で引用されている全ての特許および刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で考察された出版物は、単に本出願の出願日に先行してそれらが開示されているという理由で提供されている。本明細書のいずれも、本発明が、先行発明の理由でこのような出版物に先行する権利がないことを容認すると解釈されるべきではない。
【０３０４】
本明細書で使用されている全ての見出しは、単に構成上の理由によるものであり、どんな形にせよ、本開示を限定することを意図するものではない。任意の個別のセクションの内容は、等しく全てのセクションに適用することができる。
【０３０５】
参考文献
以下の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
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【図１】
2018507204.tif 000059
【図２】
2018507204.tif 000060
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年1月18日(2018.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018507204000001.app
【国際調査報告】
2018507204.tif 000108
2018507204.tif 000109
2018507204.tif 000110