(57)【要約】本発明は、医薬の分野、詳細には細菌感染及びその治療の分野に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞及び／又は宿主細胞の細胞内区画の細胞内ｐＨを増加させる有効量の薬剤を投与するステップ、並びに
有効量の殺菌剤を投与するステップ
を含む、必要とする対象における細菌感染の治療方法。
【請求項２】
前記細菌感染が、細胞内及び／若しくは持続性細菌感染並びに／又はスタフィロコッカス感染、好ましくはＳ．アウレウス感染である、請求項１に記載の治療方法。
【請求項３】
前記宿主細胞が治療を必要とする対象内の真核宿主細胞であり、及び／又は前記細胞内区画がファゴリソソームである、請求項１又は２に記載の治療方法。
【請求項４】
前記細胞内ｐＨ及び／又は前記細胞内区画のｐＨを増加させる前記薬剤が、アルカリ化薬剤、好ましくはリソソーム作用アルカリ化薬剤であり、好ましくはクロロキン、バフィロマイシンＡ１、塩化アンモニウムの群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項５】
前記殺菌剤が、前記宿主細胞及び／又は前記宿主細胞の細胞内区画に侵入できる殺菌剤である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項６】
前記殺菌剤が、バクテリオシン又はその機能的部分、細菌自己溶解素又はその機能的部分、バクテリオファージ溶解素又はその機能的部分、抗菌ペプチド及び抗生物質からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項７】
前記抗生物質が、ペニシリン誘導体、セファロスポリン、モノバクタム、カルバペネム等のβ−ラクタム抗生物質、バンコマイシン、ダプトマイシン、フルオロキノロン、メトロニダゾール、ニトロフラントイン、コトリモキサゾール、テリスロマイシン、アミノグリコシド系抗生物質、より好ましくはフルクロキサシリンからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項８】
前記殺菌剤が、細胞壁溶解酵素由来の機能的酵素ドメインを含み、好ましくはタンパク質形質導入ドメインを更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項９】
前記殺菌剤が、抗菌ペプチドを更に含む、請求項８に記載の治療方法。
【請求項１０】
前記殺菌剤が、細胞壁結合ドメインを更に含む、請求項８又は９に記載の治療方法。
【請求項１１】
前記タンパク質形質導入ドメインが、配列番号１２〜２５又はそのバリアントからなる群から選択される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項１２】
細胞壁溶解酵素由来の前記機能的酵素ドメインが、配列番号１〜７又はそのバリアントからなる群から選択される、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項１３】
前記細胞壁結合ドメインが、配列番号８〜１１又はそのバリアントからなる群から選択される、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項１４】
前記抗菌ペプチドが、配列番号７０〜９０又はそのバリアントからなる群から選択される、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項１５】
配列番号１〜７若しくはそのバリアントからなる群から選択される細胞壁溶解酵素由来の機能的酵素ドメイン及び配列番号１２〜２５若しくはそのバリアントからなる群から選択されるタンパク質形質導入ドメインを含み、任意選択で配列番号８〜１１若しくはそのバリアントからなる群から選択される細胞壁結合ドメイン及び／又は配列番号７０〜９０若しくはそのバリアントからなる群から選択される抗菌ペプチドを含む、キメラ殺菌ポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号２７〜４７からなる群から選択される配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するか、又は配列番号５０〜６７からなる群から選択される配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされた殺菌剤である、請求項１５に記載のキメラ殺菌ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１５に記載のキメラ細菌ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬の分野、詳細には細菌感染及びその治療の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト病原体であるスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）は全てのヒトのおよそ３分の１に定着し、先進国における菌血症及び感染性心内膜炎の主要な原因の１つである（１）。抗生物質耐性を発生することに加えて、持続性及び再発性の感染は罹患率及び死亡率を大いに増加させる（２、３）。特に骨髄炎又は心内膜炎後の再発率は高く、感染は見かけ上の治癒の数年後でさえも再発することがある（４）。感染の再発は、いくつかの理由のためにＳＣＶ（小型コロニー変種（ｓｍａｌｌ  ｃｏｌｏｎｙ  ｖａｒｉａｎｔ））及び／又は非複製生残菌（non-replicating persister）に関連している（５〜８）。ＳＣＶ及び／又は非複製生残菌の成長の停止又は遅延及び代謝の低減は抗生物質の効率を悪くする（９〜１３）。更に、ＳＣＶ及び／又は非複製生残菌は、膿瘍及び宿主細胞内等の特権的な場所に優先的に潜伏する（１４〜１６）。ＳＣＶ及び／又は非複製生残菌の特権的な場所は、宿主の先天性免疫系及び細胞外の活性抗生物質からＳＣＶ及び／又は非複製生残菌を保護する。加えて、抗生物質は膿瘍に効果的に浸透せず、低ｐＨに起因して活性が低くなる（１７〜２１）。従って、高活性抗生物質にも関わらず、古代から策定されている膿瘍の外科的切除の必要性、すなわち「膿のある場所を切除すること（ｕｂｉ  ｐｕｓ  ｉｂｉ  ｅｖａｃｕａ）」が現在でも依然として適用されている。膿瘍と対照的に、細胞内細菌は機械的に除去できず、多くの場合、現在利用可能な抗生物質による根絶に耐性がある。診療所において単離されたほとんどのＳＣＶは、継代培養により大型コロニー表現型に戻る。ＳＣＶの不安定な特性に起因して、電子伝達系に欠陥がある安定的な遺伝子修飾型ＳＣＶ変異体が、ＳＣＶを標的とする新規戦略を発見するために使用され、宿主細胞リソソームに局在化することが見出されている（２２）。しかしながら、安定なＳＣＶは臨床ＳＣＶを部分的にのみ反映している。安定なＳＣＶは弱毒性であり（２３）、強毒性及び急速に成長する表現型に戻らない。従って、臨床ＳＣＶ及び生残菌を研究する手段並びに最終的にＳＣＶ及び生残菌の効果的な治療方法についての差し迫った必要性が存在している。
【図面の簡単な説明】
【０００３】
【図１ａ】低ｐＨによるＳ．アウレウスのＳＣＶ及び非複製生残菌の誘導並びにｐＨ増加による細菌再増殖の図である。ＭＲＳＡ。Ｓ．アウレウス株６８５０を、示した異なるｐＨで緩衝化した培地に接種した。生存細菌のコロニー表現型を決定し、ＳＣＶの百分率を経時的にプロットした。３連で行った３回の独立した実験を平均±ＳＥＭとして提示する。
【図１ｂ】低ｐＨによるＳ．アウレウスのＳＣＶ及び非複製生残菌の誘導並びにｐＨ増加による細菌再増殖の図である。ＭＲＳＡ。Ｓ．アウレウス株ＪＥ２を、示した異なるｐＨで緩衝化した培地に接種した。生存細菌のコロニー表現型を決定し、ＳＣＶの百分率を経時的にプロットした。３連で行った３回の独立した実験を平均±ＳＥＭとして提示する。
【図１ｃ】低ｐＨによるＳ．アウレウスのＳＣＶ及び非複製生残菌の誘導並びにｐＨ増加による細菌再増殖の図である。ＭＲＳＡ。Ｓ．アウレウス株Ｃｏｗａｎを、示した異なるｐＨで緩衝化した培地に接種した。生存細菌のコロニー表現型を決定し、ＳＣＶの百分率を経時的にプロットした。３連で行った３回の独立した実験を平均±ＳＥＭとして提示する。
【図１ｄ】低ｐＨによるＳ．アウレウスのＳＣＶ及び非複製生残菌の誘導並びにｐＨ増加による細菌再増殖の図である。低ｐＨで誘導したＭＲＳＡ。Ｓ．アウレウス株６８５０生残菌を、示した様々な緩衝化したｐＨ培地に再接種し、増殖を経時的に追跡した。３連で行った３回の独立した実験を平均±ＳＥＭとして提示する。
【図１ｅ】低ｐＨによるＳ．アウレウスのＳＣＶ及び非複製生残菌の誘導並びにｐＨ増加による細菌再増殖の図である。低ｐＨで誘導したＭＲＳＡ。Ｓ．アウレウス株ＪＥ２生残菌を、示した様々な緩衝化したｐＨ培地に再接種し、増殖を経時的に追跡した。３連で行った３回の独立した実験を平均±ＳＥＭとして提示する。
【図１ｆ】低ｐＨによるＳ．アウレウスのＳＣＶ及び非複製生残菌の誘導並びにｐＨ増加による細菌再増殖の図である。低ｐＨで誘導したＭＲＳＡ。Ｓ．アウレウス株Ｃｏｗａｎ生残菌を、示した様々な緩衝化したｐＨ培地に再接種し、増殖を経時的に追跡した。３連で行った３回の独立した実験を平均±ＳＥＭとして提示する。
【図２ａ】ファゴリソソーム内のＳ．アウレウスの細胞内の残存の図である。Ａ５４９細胞をＳ．アウレウスＣｏｗａｎに感染させ、細胞外細菌をフルクロキサシリンの添加によって殺傷した。生存細胞内残存細菌の数を、示した時点において決定した。データを３連で実施した２回の実験からプールした（平均±ＳＥＭ）。
【図２ｂ】ファゴリソソーム内のＳ．アウレウスの細胞内の残存の図である。Ａ５４９細胞をＳ．アウレウスＣｏｗａｎに感染させ、細胞外細菌をフルクロキサシリンの添加によって殺傷した。生存細胞内残存細菌の表現型を、示した時点において決定した。データを３連で実施した２回の実験からプールした（平均±ＳＥＭ）。
【図３ａ】ファゴリソソームアルカリ化によるＳ．アウレウス生残菌の減少の図である。Ｓ．アウレウスＣｏｗａｎに感染させたＡ５４９細胞を、フルクロキサシリン単独（対照）で、又はリソソーム作用アルカリ化薬剤（クロロキン）を追加して処理した。生存細胞内残存細菌のコロニー表現型を決定し、示した時点において数え上げた。データを３連で行った３回の独立した実験からプールした（平均±ＳＥＭ）。二元配置分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）により、要因時間及び処理は有意であることを見出した（ｐ値＜０．０１）。
【図３ｂ】ファゴリソソームアルカリ化によるＳ．アウレウス生残菌の減少の図である。Ｓ．アウレウスＣｏｗａｎに感染させたＡ５４９細胞を、フルクロキサシリン単独（対照）で、又はリソソーム作用アルカリ化薬剤（バフィロマイシンＡ１）を追加して処理した。生存細胞内残存細菌のコロニー表現型を決定し、示した時点において数え上げた。データを３連で行った３回の独立した実験からプールした（平均±ＳＥＭ）。二元配置分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）により、要因時間及び処理は有意であることを見出した（ｐ値＜０．０１）。
【図３ｃ】ファゴリソソームアルカリ化によるＳ．アウレウス生残菌の減少の図である。Ｓ．アウレウスＣｏｗａｎに感染させたＡ５４９細胞を、フルクロキサシリン単独（対照）で、又はリソソーム作用アルカリ化薬剤（塩化アンモニウム）を追加して処理した。生存細胞内残存細菌のコロニー表現型を決定し、示した時点において数え上げた。データを３連で行った３回の独立した実験からプールした（平均±ＳＥＭ）。二元配置分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）により、要因時間及び処理は有意であることを見出した（ｐ値＜０．０１）。
【図４ａ】ｉｎ  ｖｉｖｏ感染モデルにおけるクロロキンによるＳ．アウレウス生残菌の減少の図である。マウスをＳ．アウレウスＣｏｗａｎに腹腔内で感染させた。感染の６時間及び２日後、マウスを１ｍｇのフルクロキサリシン及び０．２ｍｇのクロロキン（＋ＣＱ）で処理した。フルクロキサリシンのみで処理したマウスを対照（−ＣＱ）とした。ダガー：屠殺。
【図４ｂ】ｉｎ  ｖｉｖｏ感染モデルにおけるクロロキンによるＳ．アウレウス生残菌の減少の図である。マウスをＳ．アウレウスＣｏｗａｎに腹腔内で感染させた。感染の６時間及び２日後、マウスを１ｍｇのフルクロキサリシン及び０．２ｍｇのクロロキン（＋ＣＱ）で処理した。フルクロキサリシンのみで処理したマウスを対照（−ＣＱ）とした。標的組織から回収した細菌のコロニー表現型を決定し、数え上げた。各点は１匹のマウスを表す。水平バーは平均±ＳＥＭを示し、１群当たり、ｎ＝１１のマウスである。二元配置分散分析により、要因処理が有意であることを見出した（ｐ値＜０．０１）。
【図４ｃ】ｉｎ  ｖｉｖｏ感染モデルにおけるクロロキンによるＳ．アウレウス生残菌の減少の図である。マウスをＳ．アウレウスＣｏｗａｎに腹腔内で感染させた。感染の６時間及び２日後、マウスを１ｍｇのフルクロキサリシン及び０．２ｍｇのクロロキン（＋ＣＱ）で処理した。フルクロキサリシンのみで処理したマウスを対照（−ＣＱ）とした。末梢血及び腹腔洗浄から回収した細菌のコロニー表現型を決定し、数え上げた。各点は１匹のマウスを表す。水平バーは平均±ＳＥＭを示し、１群当たり、ｎ＝１１のマウスである。ＰＬ、腹腔洗浄。二元配置分散分析により、要因処理が有意であることを見出した（ｐ値＜０．０１）。
【図５ａ】操作したエンドリシンの混合物による骨肉腫細胞におけるＳ．アウレウスの細胞内ターゲティングの図である。１時間及び４時間、エンドリシン混合物によって処理したＳ．アウレウスＮｅｗｍａｎ（ＭＯＩ  ０．１）に３時間感染させた細胞。
【図５ｂ】操作したエンドリシンの混合物による骨肉腫細胞におけるＳ．アウレウスの細胞内ターゲティングの図である。２０μＭのクロロキンの存在下で１時間及び４時間、エンドリシン混合物によって処理したＳ．アウレウスＮｅｗｍａｎ（ＭＯＩ  ０．１）に３時間感染させた細胞。
【図５ｃ】操作したエンドリシンの混合物による骨肉腫細胞におけるＳ．アウレウスの細胞内ターゲティングの図である。１時間及び４時間、エンドリシン混合物によって処理したＳ．アウレウスＣｏｗａｎ（ＭＯＩ  ０．０１）に３時間感染させた細胞。
【図５ｄ】操作したエンドリシンの混合物による骨肉腫細胞におけるＳ．アウレウスの細胞内ターゲティングの図である。２０μＭのクロロキンの存在下で１時間及び４時間、エンドリシン混合物によって処理したＳ．アウレウスＣｏｗａｎ（ＭＯＩ  ０．０１）に３時間感染させた細胞。
【図６ａ】操作したエンドリシンの混合物による骨肉腫細胞（ＭＯＩ  １．０）におけるＳ．アウレウスの細胞内ターゲティングの図である。４時間、エンドリシン混合物によって処理したＳ．アウレウスＮｅｗｍａｎに２４時間感染させた細胞。
【図６ｂ】操作したエンドリシンの混合物による骨肉腫細胞（ＭＯＩ  １．０）におけるＳ．アウレウスの細胞内ターゲティングの図である。２０μＭのクロロキンの存在下で４時間、エンドリシン混合物によって処理したＳ．アウレウスＮｅｗｍａｎに２４時間感染させた細胞。
【図６ｃ】操作したエンドリシンの混合物による骨肉腫細胞（ＭＯＩ  １．０）におけるＳ．アウレウスの細胞内ターゲティングの図である。４時間、エンドリシン混合物によって処理したＳ．アウレウスＣｏｗａｎに７２時間感染させた細胞。
【図６ｄ】操作したエンドリシンの混合物による骨肉腫細胞（ＭＯＩ  １．０）におけるＳ．アウレウスの細胞内ターゲティングの図である。２０μＭのクロロキンの存在下で４時間、エンドリシン混合物によって処理したＳ．アウレウスＣｏｗａｎに７２時間感染させた細胞。
【図７ａ】細胞壁溶解酵素由来の機能的酵素ドメインを含み、分子のＮ末端側にタンパク質形質導入ドメインを更に含む本発明による殺菌剤の活性の図である：Ｒ９−ＣＨＡＰ−ＣＢＤ。
【図７ｂ】細胞壁溶解酵素由来の機能的酵素ドメインを含み、分子のＮ末端側にタンパク質形質導入ドメインを更に含む本発明による殺菌剤の活性の図である：Ｒ９−Ｍ２３−ＣＢＤ。
【図７ｃ】細胞壁溶解酵素由来の機能的酵素ドメインを含み、分子のＮ末端側にタンパク質形質導入ドメインを更に含む本発明による殺菌剤の活性の図である：ＴＡＴ−Ａｍｉ−ＣＢＤ。
【図７ｄ】細胞壁溶解酵素由来の機能的酵素ドメインを含み、分子のＮ末端側にタンパク質形質導入ドメインを更に含む本発明による殺菌剤の活性の図である：ＴＡＴ−ＣＨＡＰ−ＣＢＤ。
【図７ｅ】細胞壁溶解酵素由来の機能的酵素ドメインを含み、分子のＮ末端側にタンパク質形質導入ドメインを更に含む本発明による殺菌剤の活性の図である：ＴＡＴ−Ｍ２３−ＣＢＤ。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
驚くべきことに、本発明者らは、可逆的な生残菌及び可逆的なＳＣＶを低ｐＨによって誘導することができること、及び低ｐＨに適応した細菌が細胞内、特にリソソーム（低ｐＨ細胞小器官）内に残存することを立証した。低ｐＨは、ｐＨが上昇すると強毒性表現型に戻るＳＣＶ及び生残菌を誘導した。細胞内でのｐＨの上昇は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで低ｐＨに適応した細菌を戻し、ＳＣＶ及び生残菌を、通常、細胞内で効果的ではない抗菌剤に対して感受性にした。このことは、限定されないが、皮膚、呼吸器官又は扁桃上皮の感染（咽頭扁桃炎）、（ウシ）乳腺炎等の、細胞内区画において主に若しくは少なくとも部分的に細胞内に残存する感染を予防及び／若しくは治療するか、又は新生児敗血症を予防するために妊娠女性における膣Ｓ．アガラクチア（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）感染（マクロファージ内）を根絶するか、又はＳ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）誘導性単球由来マクロファージアポトーシスを予防／治療するか、又は結核、ハンセン病、リステリア症、腸チフス、細菌性赤痢菌、伝染病、ブルセラ症、発疹チフス、ロッキー山紅斑熱、クラミジア感染症、トラコーマを治療する完全に新規な方法を提供する。
【０００５】
従って、第１の態様において、本発明は、
宿主細胞及び／又は宿主細胞の細胞内区画の細胞内ｐＨを増加させる有効量の薬剤を投与するステップ、並びに
有効量の殺菌剤を投与するステップ
を含む、必要とする対象における細菌感染の治療方法を提供する。上記方法は本明細書において本発明による方法と称されている。
【０００６】
本発明の実施形態において、ｐＨの増加は、非複製細胞内細菌を活性化し、殺菌剤が活性化した細胞内細菌を殺傷することが好ましい。
【０００７】
本発明の実施形態において、細菌感染は好ましくは持続性細菌感染であり、限定されないが、皮膚、気道上皮、扁桃組織、乳腺炎等の様々な組織の持続性Ｓ．アウレウス感染に関連することがある。本発明の実施形態において、細菌感染は、好ましくは、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アガラクチア及びＳ．ニューモニエ等）、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（Ｂ．アントラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）等）、コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）（コクシエラ・バーネッティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ）等）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）（Ｍ．ツベルクロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）及びＭ．レプラエ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）等）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）（Ｌ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）等）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（Ｓ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）等）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）（Ｓ．ディゼンテリエ（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）等）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）（Ｙ．ペスティス（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）等）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）（Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）等）、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）（Ａ．アクチノミセテムコミタンス（Ａ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）等）、ガードネレラ（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）（Ｇ．バジナリス（Ｇ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）等）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）（Ｃ．トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）等）、及びクラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｉｄｏｐｈｉｌａ）からなる細菌群から選択される種による感染であり、より好ましい細菌はスタフィロコッカス種であり、スタフィロコッカスの好ましい種はＳ．アウレウスである。
【０００８】
本発明の実施形態において、細菌感染を引き起こす細菌は、好ましくは、細胞質基質等の宿主細胞の細胞内に存在し、より好ましくは、細菌感染を引き起こす細菌は、好ましくは、細胞内区画Ｓ．アウレウス内に存在する。細菌感染は、限定されないが、ＭＲＳＡ等の、殺菌剤（例えば抗生物質）に耐性がある細菌の少なくとも１つの亜集団を含む細菌の集団を含むことが好ましい。本発明の実施形態において、細胞内区画は、細菌が持続的に存在でき、及び／又は持続的に存在する、任意の細胞内区画であってもよく、好ましくは、細胞内区画は低ｐＨを有する区画である。好ましい細胞内区画は、エンドソーム、リソゾーム（ｌｙｓｏｚｏｍｅ）、ファゴソーム、ファゴリソソーム、オートファゴソームからなる群から選択される区画であり、オートリソソームのより好ましい細胞内区画は、ファゴソーム、ファゴリソソームのリソゾームであり、更により好ましい細胞内区画はファゴリソソームである。
【０００９】
治療を必要とする対象内の本発明の実施形態において、感染宿主細胞は、好ましくは、真核宿主細胞であり、真核宿主細胞は、好ましくは、専門及び非専門の食細胞、リンパ系細胞、扁桃組織細胞、呼吸上皮細胞、口腔上皮細胞、骨髄細胞、骨芽細胞、角化細胞、筋細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、星状膠細胞及び小膠細胞からなる群から選択され、より好ましい真核宿主細胞は専門又は非専門の食細胞である。対象は、限定されないが、ヒト又は動物等の、持続性細菌感染に感受性があるか、又は持続性細菌感染を患っている任意の対象であってもよい。動物は家畜であってもよいか、又は繁殖動物、ペット、畜牛、家禽若しくは同種のものであってもよい。好ましい対象はヒトであり、新生児、年少者、成人又は高齢の対象であってもよい。
【００１０】
本発明の実施形態において、細胞内ｐＨ及び／又は細胞内区画のｐＨを増加させる薬剤は、細胞内ｐＨ及び／又は細胞内区画のｐＨを効果的に増加させる当業者に公知の任意の薬剤であってもよい。
【００１１】
本発明の実施形態において、細胞内ｐＨ及び／又は細胞内区画のｐＨを増加させる薬剤はアルカリ化薬剤、好ましくはリソソーム作用（ｌｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｉｃ）アルカリ化薬剤であることが好ましく、クロロキン、バフィロマイシンＡ１、塩化アンモニウムの群から選択されることが好ましく、より好ましいアルカリ化薬剤はクロロキンである。好ましいアルカリ化薬剤は宿主細胞に侵入できるアルカリ化薬剤であり、感染している細菌が存在する細胞内区画を標的とすることがより好ましい。アルカリ化薬剤は細胞に受動的に侵入することができるか、又はビヒクルが使用されてもよい。ビヒクルは宿主細胞に送達できる当業者に公知の任意のビヒクルであってもよい。
【００１２】
本発明の実施形態において、「低ｐＨ」という用語は、ｐＨ７．４より低いｐＨと定義されており、低ｐＨは約ｐＨ７．０、６．８、６．６、６．４、６．２、６．０、５．８、５．６、５．４、５．２、５．０、４．８、４．６、４．４、４．２、４．０、３．８、３．６、３．４、３．２、３．０又は約２．８であることが好ましい。低ｐＨは、好ましくは、約６．５より低いｐＨである。より好ましい低ｐＨは約５．０である。
【００１３】
本発明の実施形態において、ｐＨを上昇させ、及びｐＨを増加させるという用語は交換可能に使用され、ｐＨを約０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６又は約４．８上昇させることと定義されている。約ｐＨ６〜約ｐＨ７の範囲内まで、好ましくは約６．５〜約７の範囲内までｐＨを上昇させることが好ましい。
【００１４】
細胞内ｐＨ及び／又は細胞内区画のｐＨを増加させる薬剤の文脈における本発明の実施形態において「有効量」という用語は、細胞内ｐＨ及び／又は細胞内区画のｐＨを、本明細書上記に表されている範囲に到達するように少なくとも約０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０上昇させるのに十分である任意の量と定義されている。使用される正確な量は、とりわけ、使用される薬剤及び対象の体重に依存する。
【００１５】
殺菌剤の文脈における本発明の実施形態において「有効量」という用語は、細胞内及び／又は細胞内区画内で殺菌作用を有するのに十分である任意の量と定義されている。使用される正確な量は、とりわけ、使用される薬剤及び対象の体重に依存する。
【００１６】
細胞内ｐＨ及び細胞内区画のｐＨは当業者に公知の任意の手段によって評価することができる。本発明の実施形態において、殺菌剤は当業者に公知の任意の殺菌剤であってもよく、好ましくは、宿主細胞及び／又は宿主細胞の細胞内区画に侵入できる殺菌剤である。好ましい殺菌剤はキメラ殺菌剤である。好ましい殺菌剤は、バクテリオシン又はその機能的部分、細菌溶解素若しくは自己溶解素又はそれらの機能的部分、バクテリオファージ溶解素又はその機能的部分、ウイルス溶解素又はその部分、抗菌ペプチド及び抗生物質からなる群から選択される。更なる好ましい殺菌剤は、バクテリオファージにより誘導される溶解構造タンパク質（尾部溶解素（ｔａｉｌ  ｌｙｓｉｎ）及びビリオンに連合した溶解タンパク質等）又はこのような溶解構造タンパク質若しくはバクテリオファージ溶解素由来の単離された溶解ドメインである。本発明の殺菌剤は単独で使用されてもよいか、又は本発明の２種若しくは３種又はそれ以上の殺菌剤の組み合わせで使用されてもよい。好ましい殺菌剤は宿主細胞に侵入できる殺菌剤であり、より好ましくは、感染している細菌が存在している細胞内区画を標的とすることである。殺菌剤は細胞に受動的に侵入することができるか、又はビヒクルが使用されてもよい。ビヒクルは宿主細胞への送達を可能にする当業者に公知の任意のビヒクルであってもよい。
【００１７】
抗生物質は当業者に公知の任意の抗生物質であってもよい。好ましい抗生物質は、ペニシリン誘導体、セファロスポリン、モノバクタム、カルバペネム等のβ−ラクタム抗生物質、バンコマイシン、ダプトマイシン、フルオロキノロン、メトロニダゾール、ニトロフラントイン、コトリモキサゾール、テリスロマイシン、アミノグリコシド系抗生物質からなる群から選択され、より好ましい抗生物質はフルクロキサシリンである。バクテリオシンは当業者に公知の任意のバクテリオシンであってもよく、好ましくは任意のクラスＩ〜ＩＶのバクテリオシンである。
【００１８】
本明細書におけるクラスＩのバクテリオシンは小ペプチド阻害剤であり、ナイシン及び他のランチビオティクスを含む。
【００１９】
本明細書におけるクラスＩＩのバクテリオシンは小さな（＜１０ｋＤａ）熱安定タンパク質である。このクラスは５つのサブクラスに細分される。クラスＩＩａのバクテリオシン（ペジオシン様バクテリオシン）は最大のサブグループであり、このグループにわたってＮ末端コンセンサス配列−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｃｙｓを含有している。Ｃ末端は、標的細胞壁を透過することによって細胞漏出を引き起こす、種特異的活性に関与している。クラスＩＩｂのバクテリオシン（２つのペプチドバクテリオシン）は活性のために２つの異なるペプチドを必要とする。１つのこのような例はラクトコシンＧ（ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉｎ  Ｇ）であり、このラクトコシンＧはＮａ及びＫ等の一価イオンについて細胞膜を透過させるが、二価イオンについては透過させない。これらのバクテリオシンのほぼ全てはＧｘｘｘＧモチーフを有する。このモチーフはまた、それらのモチーフがヘリックス間相互作用に関与する膜貫通タンパク質において見出されている。バクテリオシンのＧｘｘｘＧモチーフは細菌細胞の膜においてモチーフと相互作用することができ、そうすることによって細菌を殺傷することができる。クラスＩＩｃは、共有結合しているＮ末端及びＣ末端領域を保有する、環状ペプチドを包含する。エンテロシンＡＳ−４８はこのグループの原型である。クラスＩＩｄは単一のペプチドバクテリオシンを含み、この単一のペプチドバクテリオシンは翻訳後修飾されておらず、ペジオシン様特徴を示さない。このグループの最適な例は高度に安定なオーレオシンＡ５３（ａｕｒｅｏｃｉｎ  Ａ５３）である。このバクテリオシンは強酸環境（ＨＣｌ  ６Ｎ）下で安定であり、プロテアーゼによる影響を受けず、耐熱性である。ごく最近提案されているサブクラスはクラスＩＩｅであり、このクラスＩＩｅは、３つ又は４つの非ペジオシン様ペプチドによって構成されるそれらのバクテリオシンを包含する。最適な例は、生物学的応用の可能性がある、４つのペプチドバクテリオシンであり、Ｌ．モノサイトゲネスに対する活性が高いオーレオシンＡ７０である。
【００２０】
クラスＩＩＩのバクテリオシンは、大きな熱不安定性（＞１０ｋＤａ）タンパク質バクテリオシンである。このクラスは２つのサブクラス：サブクラスＩＩＩａ又は溶菌素及びサブクラスＩＩＩｂに細分される。サブクラスＩＩＩａは、細胞壁分解によって細菌細胞を殺傷し、それにより細胞溶解を引き起こす、ペプチドを含む。最適な研究された溶菌素は、いくつかのスタフィロコッカス種の細胞壁、主にＳ．アウレウスを加水分解する２７ｋＤａのペプチドである、リソスタフィンである。対照的に、サブクラスＩＩＩｂは、細胞溶解を引き起こさず、膜電位を乱すことによって標的細胞を殺傷し、ＡＴＰ流出を引き起こす、ペプチドを含む。
【００２１】
クラスＩＶのバクテリオシンは脂質又は炭水化物モチーフを含有する複合バクテリオシンと定義されている。確認実験データが、つい最近、２つの独立したグループによるスブランシン（Ｓｕｂｌａｎｃｉｎ）及びグリコシンＦ（Ｇｌｙｃｏｃｉｎ  Ｆ）（ＧｃｃＦ）の特徴付けによって確立された。
【００２２】
好ましいバクテリオシンは、アシドシン（ａｃｉｄｏｃｉｎ）、アクタガルジン（ａｃｔａｇａｒｄｉｎｅ）、アグロシン、アルベイシン（ａｌｖｅｉｃｉｎ）、オーレオシン、オーレオシンＡ５３、オーレオシンＡ７０、カルノシン（ｃａｒｎｏｃｉｎ）、カルノサイクリンサーキュラリンＡ（ｃａｒｎｏｃｙｃｌｉｎ  ｃｉｒｃｕｌａｒｉｎ  Ａ）、コリシン、クルバチシン（Ｃｕｒｖａｔｉｃｉｎ）、ディヴァーシン（ｄｉｖｅｒｃｉｎ）、デュラマイシン（ｄｕｒａｍｙｃｉｎ）、エンテロシン、エンテロリシン（ｅｎｔｅｒｏｌｙｓｉｎ）、エピデルミン／ガリデルミン、エルウィニオシン（ｅｒｗｉｎｉｏｃｉｎ）、ガセリシンＡ（ｇａｓｓｅｒｉｃｉｎ  Ａ）、グリシネシン（ｇｌｙｃｉｎｅｃｉｎ）、ハロシン（ｈａｌｏｃｉｎ）、ハロデュラシン（ｈａｌｏｄｕｒａｃｉｎ）、ラクトシンＳ（ｌａｃｔｏｃｉｎ  Ｓ）、ラクトコシン（ｌａｃｔｏｃｏｃｉｎ）、ラクチシン、レウコッシン（ｌｅｕｃｏｃｃｉｎ）、リソスタフィン、マセドシン（ｍａｃｅｄｏｃｉｎ）、メルサシジン、メセンテリシン（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃｉｎ）、ミクロビスポリシン（ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒｉｃｉｎ）、ミクロシンＳ、ミュータシン、ナイシン、パエニバシリン（ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｉｎ）、プラノスポリシン（ｐｌａｎｏｓｐｏｒｉｃｉｎ）、ペジオシン、ペントシン（ｐｅｎｔｏｃｉｎ）、プランタリシン（ｐｌａｎｔａｒｉｃｉｎ）、ピオシン、ロイテリシン６（ｒｅｕｔｅｒｉｃｉｎ  ６）、サカシン（ｓａｋａｃｉｎ）、サリバリシン（ｓａｌｉｖａｒｉｃｉｎ）、スブチリン、スルホロビシン（ｓｕｌｆｏｌｏｂｉｃｉｎ）、ツリシン１７（ｔｈｕｒｉｃｉｎ  １７）、トリホリトキシン（ｔｒｉｆｏｌｉｔｏｘｉｎ）、バリアシン（ｖａｒｉａｃｉｎ）、ビブリオシン（ｖｉｂｒｉｏｃｉｎ）、ワルネリシン（ｗａｒｎｅｒｉｃｉｎ）及びワーネリン（ｗａｒｎｅｒｉｎ）からなる群から選択される。
【００２３】
バクテリオシンは、限定されないが、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のピオシン、好ましくはピオシンＳＡ１８９（２５）等の細菌自体に由来してもよい（２４）。
【００２４】
抗菌ペプチドは当業者に公知の任意の抗菌ペプチドであってもよい。当該技術分野において時々、抗菌ペプチドは本明細書上記に挙げたようなバクテリオシンと考慮される。好ましい抗菌ペプチドは、カチオン性又はポリカチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、ｓｕｓｈｉペプチド、デフェンシン及び疎水性ペプチドからなる群から選択される。
【００２５】
細菌自己溶解素は当業者に公知の任意の細菌自己溶解素であってもよい。好ましい細菌自己溶解素はＬｙｔＭである。
【００２６】
バクテリオファージ溶解素は当業者に公知の任意のバクテリオファージ溶解素であってもよい。本明細書において、バクテリオファージ溶解素、バクテリオファージエンドリシン及びエンドリシンという用語は、交換可能に使用されている。好ましいエンドリシンは、国際公開第２０１２／１５０８５８号、国際公開第２０１３／１６９１０４号、国際公開第２０１１／０２３７０２号、及び国際公開第２０１２１４６７３８号に定義されている群から選択され、それらの国際公開はそれらの全体の内容が参照により本明細書に組み込まれている。
【００２７】
殺菌剤は、本明細書上記に記載されている任意の薬剤であってもよいか、又はその機能的断片であってもよい。本明細書において機能的断片という用語は、機能的ドメインという用語と交換可能に使用されている。機能的断片は、同一の条件においてアッセイした場合、機能的断片が由来する親と比較して少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５若しくは９９又は少なくとも９９．９％の殺菌活性を依然として有する断片と本明細書において定義されている。殺菌剤の好ましい機能的断片は、国際公開第２０１２／１５０８５８号及び国際公開第２０１３／１６９１０４号に記載されている。
【００２８】
殺菌剤は、殺菌剤及び殺菌剤の機能的断片の融合であってもよいか、又は異なる、類似若しくは同一の殺菌剤若しくは殺菌剤の機能的断片の融合であってもよい。
【００２９】
本発明者らは、本発明による治療方法の効果が、殺菌剤が宿主細胞を標的とした場合、大いに向上するという驚くべき発見に至った。このようなターゲティングは、既に本明細書上記に表しているように当業者に公知の任意の手段によって達成することができる。好ましい手段は殺菌剤に作動可能に連結されているタンパク質形質導入ドメイン（protein transduction domain）であり、更に本明細書において、本発明によるタンパク質形質導入ドメインと称されている。本明細書において「タンパク質形質導入ドメイン」という用語は、「細胞透過性タンパク質（ＣＰＰ）」という用語及び「膜輸送配列」という用語と交換可能に使用されている。本明細書において作動可能に連結されているとは、タンパク質形質導入ドメインの殺菌剤とのこのような会合と定義されており、その殺菌剤は細胞を標的としている。好ましい作動可能な連結は、タンパク質形質導入ドメインの殺菌剤との共有結合による融合である。
【００３０】
本発明の実施形態において、殺菌剤は、好ましくは、細胞壁溶解酵素の機能的酵素ドメインを含む。本明細書において細胞壁溶解酵素は、殺菌剤が効果的である細菌の細胞壁に対して作用する任意の殺菌剤と定義されている。
【００３１】
本発明の実施形態において、殺菌剤は細胞壁溶解酵素由来の機能的ドメインを含み、本発明によるタンパク質形質導入ドメインを更に含むことが好ましい。本発明による実施形態において、殺菌剤は抗菌ペプチドを更に含むことができることが好ましい。このような融合殺菌剤は、好ましくは、カチオン性又はポリカチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、ｓｕｓｈｉペプチド、デフェンシン及び疎水性ペプチドからなる群から選択される抗菌ペプチドと融合した細胞壁溶解酵素であり、より好ましくは、全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第８，３８３，１０２号に定義されている融合タンパク質である。抗菌ペプチドと融合したこのような殺菌剤は本発明によるタンパク質形質導入ドメインを更に含んでもよい。
【００３２】
本発明の実施形態において、細胞壁溶解酵素の機能的酵素ドメイン及び／又はタンパク質形質導入ドメイン及び／又は抗菌ペプチドを含む本明細書上記に記載されている殺菌剤は、更に好ましくは、細胞壁結合ドメインを更に含んでもよい。上記細胞壁結合ドメインは、好ましくは、治療すべき細菌感染を引き起こす細菌のペプチドグリカン細胞壁に結合する細胞壁結合ドメインである。
【００３３】
本発明の実施形態において、タンパク質形質導入ドメインは当業者に公知の任意のこのようなドメインであってもよい。本発明による殺菌剤において、タンパク質形質導入ドメインは、配列番号１２〜２５又はそのバリアントからなる群から選択されることが好ましく、バリアントは機能的タンパク質形質導入ドメインであり、配列番号１２〜２５からなる群から選択される配列とそれぞれ少なくとも４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。
【００３４】
本発明による殺菌剤において、細胞壁溶解酵素由来の機能的酵素ドメインは、配列番号１〜７又はそのバリアントからなる群から選択されることが好ましく、バリアントは細胞壁溶解酵素由来の機能的酵素ドメインであり、配列番号１〜７からなる群から選択される配列とそれぞれ少なくとも４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。
【００３５】
本発明による殺菌剤において、細胞壁結合ドメインは、配列番号８〜１１又はそのバリアントからなる群から選択されることが好ましく、バリアントは、機能的細胞壁結合ドメインであり、配列番号８〜１１からなる群から選択される配列とそれぞれ少なくとも４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。
【００３６】
本発明による殺菌剤において、抗菌ペプチドは、配列番号７０〜９０又はそのバリアントからなる群から選択されることが好ましく、バリアントは、機能的細胞壁結合ドメインであり、配列番号７０〜９０からなる群から選択される配列とそれぞれ少なくとも４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。
【００３７】
本発明による好ましい殺菌剤は、配列番号２７、２８、２９、３０〜４７からなる群から選択される配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有する殺菌剤、又は配列番号５０〜６７からなる群から選択される配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされた殺菌剤である。
【００３８】
本発明による好ましい殺菌剤は、配列番号９１〜１０８からなる群から選択される配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性の配列を有するベクター由来の発現産物である。
【００３９】
本発明による更なる好ましい殺菌剤は、配列番号１２〜２５若しくはそのバリアントからなる群から選択されるタンパク質形質導入ドメイン、配列番号１〜７若しくはそのバリアントからなる群から選択される細胞壁溶解酵素由来の機能的酵素ドメイン、及び任意選択で配列番号８〜１１若しくはそのバリアントからなる群から選択される細胞壁結合ドメイン並びに／又は配列番号７０〜９０若しくはそのバリアントからなる群から選択される抗菌ペプチドを含む殺菌剤からなる群から選択される殺菌剤であり、バリアントは、それぞれの元の配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有する。
【００４０】
治療方法に加えて、この態様は、必要とする対象における細菌感染を治療するための医薬を製造するためのこの態様の実施形態に関する。治療方法に加えて、この態様は、必要とする対象における細菌感染の治療における使用のためのこの態様の実施形態に関する。
【００４１】
第２の態様において、本発明は、配列番号１〜７若しくはそのバリアントからなる群から選択される細胞壁溶解酵素由来の機能的酵素ドメインであって、バリアントは、細胞壁溶解酵素由来の機能的酵素ドメインであり、配列番号１〜７からなる群から選択される配列とそれぞれ少なくとも４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有する、機能的酵素ドメイン；及び配列番号１２〜２５若しくはそのバリアントからなる群から選択されるタンパク質形質導入ドメインであって、バリアントは、機能的タンパク質形質導入ドメインであり、配列番号１２〜２５からなる群から選択される配列とそれぞれ少なくとも４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％若しくは１００％の配列同一性を有する、タンパク質形質導入ドメイン；及び任意選択で配列番号８〜１１若しくはそのバリアントからなる群から選択される細胞壁結合ドメインであって、バリアントは、機能的細胞壁結合ドメインであり、配列番号８〜１１からなる群から選択される配列とそれぞれ少なくとも４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有する、機能的細胞壁結合ドメイン；及び／又は配列番号７０〜９０若しくはそのバリアントからなる群から選択される抗菌ペプチドであって、バリアントは、機能的細胞壁結合ドメインであり、配列番号７０〜９０からなる群から選択される配列とそれぞれ少なくとも４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有する、抗菌ペプチドを含むキメラ殺菌ポリペプチドを提供する。
【００４２】
本発明は、配列番号２７、２８、２９、３０〜４７からなる群から選択される配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％若しくは１００％の配列同一性を有するキメラ殺菌ポリペプチド、又は配列番号５０〜６７からなる群から選択される配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされたキメラ殺菌剤を更に提供する。
【００４３】
本発明は、配列番号１２〜２５若しくはそのバリアントからなる群から選択されるタンパク質形質導入ドメイン、配列番号１〜７若しくはそのバリアントからなる群から選択される細胞壁溶解酵素由来の機能的酵素ドメイン及び任意選択で配列番号８〜１１若しくはそのバリアントからなる群から選択される細胞壁結合ドメインを含む殺菌剤からなる群から選択されるキメラ殺菌ポリペプチド並びに／又は配列番号７０〜９０若しくはそのバリアントからなる群から選択される抗菌ペプチドを更に提供し、バリアントは、それぞれの元の配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有する。
【００４４】
本発明は、本発明のこの態様によるキメラ殺菌ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを更に提供する。
【００４５】
本発明は、本発明によるキメラ殺菌ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築物を更に提供する。本発明は、本発明によるキメラ殺菌ポリペプチドの発現及び産生のためのベクターを更に提供する。本発明によるベクターは、好ましくは、本発明によるキメラ殺菌ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む本発明によるポリヌクレオチド構築物を含む。本発明による好ましいベクターは、配列番号９１〜１０８からなる群から選択される配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の配列同一性の配列を有するベクターである。
【００４６】
本発明は、本発明によるポリヌクレオチド構築物又はベクターを含む、本発明によるキメラ殺菌ポリペプチドの産生のための宿主細胞を更に提供する。宿主細胞は、原核及び真核宿主細胞等の本発明によるキメラ殺菌ポリペプチドの産生に適した任意の宿主細胞であってもよい。
【００４７】
本発明は、本発明によるキメラ殺菌ポリペプチドの産生を促す条件下で本発明によるポリヌクレオチド構築物又はベクターを含む、本発明による宿主細胞を培養するステップ、並びに任意選択で産生したキメラ殺菌ポリペプチドを単離及び／又は精製するステップを含む、本発明によるキメラ殺菌ポリペプチドの産生を更に提供する。
【００４８】
限定されないが、経口、肺への送達のためのエアロゾル若しくは他の装置、鼻内噴霧器、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、膣内、直腸、局所、腰椎穿刺、髄腔内並びに脳及び／又は髄膜への直接適用を含む、任意の適切な投与経路が、本発明によるアルカリ化薬剤及び本発明による殺菌剤を投与するために使用されてもよい。本発明によるアルカリ化薬剤及び本発明による殺菌剤は、少なくとも１日に１回、１週間に１回、１カ月に１回、６カ月毎に１回、１年に１回又は養生法が治療に適しているときはいつでも、必要とする対象又は上記対象の細胞、組織若しくは器官に投与されてもよい。
【００４９】
本文書及びその特許請求の範囲において、「含むこと」という動詞及びその活用は、その非限定的な意味において、その用語の次に続く項目が含まれるが、具体的に述べられていない項目は除外されないことを意味するために使用されている。加えて、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」による要素に対する参照は、文脈が要素の１つ及び１つのみであることを明確に必要としない限り、要素の１つより多くが存在する可能性を除外しない。従って不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【００５０】
数値と関連して使用される場合、「約」又は「およそ」（例えば約１０）という単語は、好ましくは、その値が、その値（１０の）の０．１％超又は未満の所与の値であってもよいことを意味する。
【００５１】
本明細書に引用されている全ての特許及び論文の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００５２】
本明細書において、特定の配列との配列同一性は、好ましくは、上記特定のポリペプチド又はポリヌクレオチド配列の全長にわたる配列同一性を意味する。従って本明細書に提供されている配列情報は、誤って識別された塩基の包含を必要とするようにより狭く解釈されるべきではない。当業者はこのような誤って識別された塩基を識別することができ、このような誤りを正す方法を知っている。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのペプチド又はポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換を、第２のペプチド又はポリペプチドの配列と比較することによって決定される。同一性又は類似性は本明細書に識別されている全配列番号にわたって計算されることが好ましい。「同一性」及び「類似性」は、限定されないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、ｅｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．、ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．、ｅｄｓ．、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年；並びにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．、ｅｄｓ．、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１年；並びにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、第４８巻：１０７３頁（１９８８年）に記載されている方法を含む、公知の方法によって容易に計算することができる。
【００５３】
同一性を決定するための好ましい方法は、試験した配列間で最大一致を与えるように設計される。同一性及び類似性を決定するための方法は公表されているコンピュータープログラムに体系化されている。２つの配列間の同一性及び類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法には、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第１２巻（１）：３８７頁（１９８４年））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）が含まれる。ＢＬＡＳＴ  ＸプログラムはＮＣＢＩ及び他の供給源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ  ２０８９４頁；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）から公表されている。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用されてもよい。
【００５４】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメーターには以下が含まれる：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第４８巻：４４３〜４５３頁（１９７０年）；比較マトリクス：Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｔｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．第８９巻：１０９１５〜１０９１９頁（１９９２年）からのＢＬＯＳＳＵＭ６２；ギャップペナルティ：１２；並びにギャップ長さペナルティ：４。これらのパラメーターで有用なプログラムは、マディソン、ＷＩに存在するＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐから「Ｏｇａｐ」プログラムとして公表されている。上述のパラメーターは、（エンドギャップのためのペナルティなしと一緒に）アミノ酸比較についてのデフォルトパラメーターである。
【００５５】
核酸比較についての好ましいパラメーターには以下が含まれる：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第４８巻：４４３〜４５３頁（１９７０年）；比較マトリクス：一致＝＋１０、不一致＝０；ギャップペナルティ：５０；ギャップ長さペナルティ：３。マディソン、Ｗｉｓに存在するＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ＧｒｏｕｐからＧａｐプログラムとして利用可能。上記に与えられているのは核酸比較についてのデフォルトパラメーターである。
【００５６】
任意選択で、アミノ酸類似性の程度を決定する際に、当業者はまた、当業者に明確であるように、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れることができる。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リシン、アルギニン及びヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン及びアスパラギン−グルタミンである。本明細書に開示されているアミノ酸配列の置換バリアントは、開示されている配列における少なくとも１つの残基が除去されており、異なる残基がその位置に挿入されている置換バリアントである。アミノ酸の変化は保存的であることが好ましい。天然に存在するアミノ酸の各々についての好ましい保存的置換は以下の通りである：Ａｌａからｓｅｒ；Ａｒｇからｌｙｓ；Ａｓｎからｇｌｎ又はｈｉｓ；Ａｓｐからｇｌｕ；Ｃｙｓからｓｅｒ又はａｌａ；Ｇｌｎからａｓｎ；Ｇｌｕからａｓｐ；Ｇｌｙからｐｒｏ；Ｈｉｓからａｓｎ又はｇｌｎ；Ｉｌｅからｌｅｕ又はｖａｌ；Ｌｅｕからｉｌｅ又はｖａｌ；Ｌｙｓからａｒｇ；ｇｌｎ又はｇｌｕ；Ｍｅｔからｌｅｕ又はｉｌｅ；Ｐｈｅからｍｅｔ、ｌｅｕ又はｔｙｒ；Ｓｅｒからｔｈｒ；Ｔｈｒからｓｅｒ；Ｔｒｐからｔｙｒ；Ｔｙｒからｔｒｐ又はｐｈｅ；及びＶａｌからｉｌｅ又はｌｅｕ。
【００５７】
ポリヌクレオチドはヌクレオチド配列によって表される。ポリペプチドはアミノ酸配列によって表される。
【００５８】
【表１−１】
2018509415.tif 000002
【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【実施例】
【００５９】
本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない以下の実施例によって本発明を更に記載する。
【００６０】
他に明記しない限り、本発明の実施は、分子生物学、ウイルス学、微生物学又は生化学の標準的な従来の方法を利用する。このような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９４年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ＵＳＡの第１巻及び第２巻；並びにＢｒｏｗｎ（１９９８年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＬａｂＦａｘ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（ＵＫ）の第Ｉ巻及び第ＩＩ巻；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編者）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｈａｍｅｓ及びＨｉｇｇｉｎｓ、ｅｄｓ．）に記載されている。
【００６１】
実施例１．
低ｐＨによるスタフィロコッカス・アウレウス生残菌の誘導、ファゴリソソームアルカリ化による覚醒及び殺菌剤と組み合わせたファゴリソソームアルカリ化による効果的な処理。
【００６２】
１．１  Ｓ．アウレウス小型コロニー変種（ＳＣＶ）のｐＨ依存性の誘導
明確に定義されたＭＳＳＡ株６８５０並びにＣｏｗａｎ及びＭＲＳＡ株ＪＥ２を、リソソーム、膿瘍及び血液等の生理学的部位に見出されているｐＨを模倣している４．０、５．５、６．５及び７．４のｐＨの培地中で成長させた。Ｓ．アウレウス接種の直後、ｐＨとは関係なく大型コロニー表現型を示した。ＳＣＶの頻度はｐＨ４．０の成長培地中で経時的に有意に増加し、５日後、３９％（ＪＥ２及び６８５０）及び２８％（Ｃｏｗａｎ）に達した。対照的に、ｐＨ７．４の成長培地は試験した全ての株においてＳＣＶを２％未満に維持した（図１ａ〜ｃ）。ＳＣＶの中間百分率はｐＨ５．５及び６．５で見出された。従って、本発明者らは、低ｐＨとＳＣＶ形成との間に明確な相関関係を示した。この方法により、様々なＳ．アウレウス株における不安定な非遺伝子修飾型ＳＣＶの容易及び制御された形成が可能となった。
【００６３】
１．２  低ｐＨによる非複製Ｓ．アウレウスの誘導
Ｓ．アウレウスＣｏｗａｎのｐＨ依存性の成長を、蛍光細胞壁結合ドメイン（ＣＢＤ）で細菌細胞壁を標識することによって経時的に追跡した。染色直後、細菌細胞壁は完全に標識された。ｐＨ４．０の成長培地中で３日後、大多数の細菌は依然として蛍光細胞壁を示し、細菌複製の不在と一致した。対照的に、ｐＨ７．４で成長した細菌は広範囲に増殖し、高度に断片化され、８９の減少した蛍光細胞壁標識化によって実証された。低ｐＨ条件下で得た、小型コロニーに由来する細菌の走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）により、正常な細胞分裂を示す大型コロニー細菌と対照的に、桿菌様のＳ．アウレウスを生じる正常に機能しない細胞分裂が示された。
【００６４】
１．３  低ｐＨに適応したＳ．アウレウス生残菌の成長の再開
本発明者らの発見により、ＳＣＶ及び非複製生残菌の両方が低ｐＨによって誘導されることが示された。臨床において、これらの残存細菌の存在は増加した感染の再発と相関し、細菌が強毒性及び急速成長型１４に戻ることを示唆している。従って本発明者らは、低ｐＨにより誘導されたＳＣＶ及び／又は非複製生残菌が中性ｐＨにおいて正常な成長を回復できるかどうかをｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。非複製Ｓ．アウレウス生残菌を誘導し、３日間ｐＨ４．０に維持し、次いでｐＨ４．０、５．５、６．５又は７．４の成長培地に移した。ｐＨ７．４及び６．５において細菌は約１２時間後に成長を再開した（図１ｄ〜ｆ）が、低ｐＨ（＜６．５）に維持した細菌は増殖しない状態のままであった（図１ｄ〜ｆ）。これらのデータにより、両方の残存表現型が、ｐＨの中和時の再成長の能力によって支持されるように低ｐＨに対して可逆的な適応であったことが示唆される。
【００６５】
１．４  Ｓ．アウレウスＳＣＶの細胞内誘導
本発明者らは、内在化したＳ．アウレウスがＳＣＶ表現型を示すかどうかを調査した。ＭＳＳＡ株Ｃｏｗａｎは高度に浸潤性であるが、細胞毒性はなく、このことにより、ＭＳＳＡ株を肺上皮細胞株Ａ５４９において数日間にわたって細胞内に維持することが可能であった。高用量のフルクロキサシリンを感染宿主細胞に加えることによって細胞外細菌を殺傷した。フルクロキサシリンは典型的に患者におけるＳ．アウレウス心内膜炎を治療するために使用されている。細胞外細菌の不在は培養上清の無菌状態によって確認した。宿主細胞を溶解して細胞内細菌を放出させ、コロニーを計数し、同様にコロニー表現型を様々な時点において決定した。感染の５時間後、全ての生存細胞内細菌のうちの０．２％がＳＣＶ表現型を有していた（図２ａ〜ｂ）。生存細胞内残存細菌の数は感染経過の間に減少したが、ＳＣＶの頻度は増加し、７日後に５．６％に達した。
【００６６】
１．５  残存Ｓ．アウレウスのファゴリソソーム局在化
本発明者らのデータは、酸性度がＳＣＶ形成に有利であることを示し、酸性ファゴリソソーム環境が同じ効果を有することができることを示唆している。Ａ５４９細胞をＳ．アウレウスＣｏｗａｎに感染させた。細胞内細菌をＬＡＭＰ−２抗体陽性小胞内に局在化し、蛍光顕微鏡検査法によって可視化した。ＬＡＭＰ−２（ＣＤ  １０７ｂ）はファゴリソソームにおいて高度に発現し、細胞内残存Ｓ．アウレウスが主にファゴリソソーム内に存在していることを示唆している。
【００６７】
１．６  ファゴリソソームアルカリ化によるＳ．アウレウスＳＣＶの減少
低ｐＨで誘導されたＳＣＶ及び／又は非複製Ｓ．アウレウス並びに培地のｐＨ中和の結果、細菌再成長が生じたので、本発明者らは感染宿主細胞をリソソーム作用アルカリ化薬剤で処理した。クロロキン、バフィロマイシンＡ１又は塩化アンモニウムの全てはファゴリソソームのｐＨを中和した。リソソーム作用アルカリ化薬剤で処理した宿主細胞は、感染の７日後、ＳＣＶの有意に低い百分率を示した（図３ａ〜ｂ）。対照と処理細胞との間で全コロニー計数の相違は観測されなかった。リソソーム作用アルカリ化薬剤は使用した濃度において細菌成長を阻害しなかった。宿主細胞生存率の有意な相違は、アルカリ化薬剤での処理後、観測されなかった。
【００６８】
１．７  クロロキン処理によるファゴリソソーム内の残存Ｓ．アウレウスの成長再開の結果、細胞及びマウスにおけるＳＣＶ百分率の減少が生じる
クロロキンでの宿主細胞の処理によるＳ．アウレウス生残菌の成長再開を評価した。蛍光顕微鏡検査法により、Ｓ．アウレウスが、感染の３日後、対照及びクロロキン処理した宿主細胞の両方においてファゴリソソーム内に局在化することが明らかになった。本発明者らは、クロロキン処理をしていない感染宿主細胞内で細胞の分裂を観測しなかった。しかしながら、クロロキンは透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって評価すると細菌細胞分裂を促進した。
【００６９】
Ｓ．アウレウスＣｏｗａｎに感染させたマウスを、フルクロキサシリン単独で（対照）、又はクロロキンと組み合わせて処理した（図５ａ）。クロロキン処理はマウスの様々な器官（図５ｂ）及び区画（図５ｃ）においてＳＣＶの頻度を有意に低減させた。絶対細菌数はクロロキン処理とは関係なく同等であった。
【００７０】
１．８  考察
この研究は、膿瘍及びリソソーム内で見出されたように、低ｐＨが、残存Ｓ．アウレウス亜集団ＳＣＶ及び非複製生残菌を誘導したことを示した。アルカリ化薬剤を使用して培養培地又はファゴリソソーム内のｐＨを上昇させると、Ｓ．アウレウスは正常な成長に戻った。ＳＣＶ形成は抗生物質選択圧（antibiotic pressure）により誘発されることが示された。加えて、低温、極めて高い酸性若しくはアルカリ性環境への長期の曝露などの極度の環境ストレス、又は浸透圧ストレスは、Ｓ．アウレウス及びコグアラーゼ陰性ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）においてＳＣＶ及び／又は生残菌形成を誘発することがある。本発明者らの新規発見と共にこれらの観測は、複数の刺激がＳ．アウレウス生残菌形成をどのように導くかを示す。宿主細胞内の局在化は、不十分な細胞透過性により細胞外で活性なβ−ラクタム等の一般的に使用される抗生物質からＳ．アウレウスを保護する。加えて、低いファゴリソソーム内のｐＨはクリンダマイシン及びフルオロキノロン等の細胞内活性を有する抗生物質の活性を低くする。本発明者らは、フルクロキサシリン等の通常処方される抗生物質へのリソソーム作用アルカリ化薬剤の添加が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでＳ．アウレウスＳＣＶの頻度を低減させることを見出した。従って本発明者らは、Ｓ．アウレウス生残菌形成の宿主依存性成分を回避するために簡単な戦略を特定した。臨床状況において、骨髄炎及び器具関連感染におけるＳＣＶの存在は、抗生物質の投与にも関わらず、増加した再発率と関連している。細菌はＳＣＶ及び／又は生残菌形成によって抗生物質ストレスに適応する。ここで本発明者らは、Ｓ．アウレウスＳＣＶ及び非複製生残菌が強毒性及び急速成長形態に戻る能力を保持することを示した。急速成長に戻る能力（表現型スイッチング）の結果、再発性感染が生じる。加えて、急速成長に戻る能力はＳＣＶの特定を困難にする。臨床においてＳＣＶの問題を更に悪化させるのは、臨床微生物検査室におけるＳＣＶの過小評価である。なぜなら、ＳＣＶは微量で形成するので、ＳＣＶの急速成長対応物によって容易に過成長するコロニーを検出することは困難であるからである。本発明者らは、通常処方される抗生物質へのアルカリ化薬剤の添加がＳＣＶの頻度を低減させ、従って将来の再発率を低減させることができると主張する。残存細菌はＳ．アウレウスに特有ではないが、サルモネラ種、シュードモナス・エルギノーサ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）及び結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）等の様々な他のヒト病原体においても発生することが記載されている。低ｐＨに加えて、細菌生残菌は毒素抗毒素系を含む機構に起因して発生することがある。従って、酸化的ストレスに起因してＤＮＡ損傷に応答するＳＯＳ応答（ｐｐＧｐｐ）の活性化の結果、減少したＡＴＰレベルが生じる。この減少したＡＴＰレベルにより、代謝の停止が導かれ、その結果、低減した成長が生じる。様々な毒素抗毒素モジュールはサルモネラにおいて酸性化及び／又は栄養飢餓によって活性化され、生残菌の形成を引き起こす。本発明者らの発見によれば、サルモネラ生残菌形成は、バフィロマイシンＡ１  ４４��添加によって可逆的になるサルモネラ含有液胞の酸性及び栄養が不十分な環境によって誘発されるマクロファージにおいて報告されている。バフィロマイシンＡ１と対照的に、クロロキンはマラリア及びいくつかのリウマチ性疾患を治療するために患者において慣用的に使用されている。従ってクロロキンによるファゴリソソームのｐＨ中和は、細胞内残存ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）保有宿主に対して新規治療的根絶戦略を提供することができる。
【００７１】
実施例２．
タンパク質形質導入ドメインを含む殺菌剤と組み合わせたファゴリソソームアルカリ化によるスタフィロコッカス・アウレウス生残菌の効果的な処理。
【００７２】
配列番号３０〜４７からなる群から選択される配列を有する、感染宿主細胞への効率的な送達のためのタンパク質形質導入ドメインを有する本発明による殺菌剤を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで細胞内Ｓ．アウレウス感染の処理のためにファゴリソソームのｐＨ中和と組み合わせて使用する。この処理の結果、使用した本発明による特定の殺菌剤に応じて効率がいくらか変動する、細胞内Ｓ．アウレウス感染の効果的な処理が生じる。
【００７３】
実施例３．
スタフィロコッカス・アウレウスによる細胞内感染の効果的な処理。
【００７４】
配列番号２７〜４７からなる群から選択される配列を有する、感染宿主細胞への効率的な送達のためのタンパク質形質導入ドメインを有する本発明による殺菌剤を、ファゴリソソームのｐＨ中和と組み合わせて、又は組み合わせずに細胞内Ｓ．アウレウス感染の処理のために使用した。
【００７５】
方法  細胞内Ｓ．アウレウス殺傷アッセイ。
【００７６】
Ｓ．アウレウスを、３７℃、２２０ｒｐｍでの振盪で一晩、ＬＢ培養液中で成長させた。一晩の培養物を新鮮なＬＢ中で希釈し（１：１０）、更に２時間成長させた。次いで、細菌を遠心分離し、ペレットをＰＢＳで洗浄し、培養物を、０．４（約２×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）にＯＤ６００を調整したＰＢＳ中に再懸濁した。感染前に４０％の電力にて１秒パルスで１分間、細菌細胞を超音波処理した（ＳＯＮＯＰＵＬＳ  ＨＤ  ２０７０）。ＭＧ−６３骨肉腫細胞を、感染前に２４時間、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を有する１ｍＬのＥＭＥＭ培養培地中に５×１０５細胞／ウェルの量を有する１２ウェルディッシュ中で成長させた。次いで、細胞を以下の条件でＳ．アウレウスＮｅｗｍａｎ及びＣｏｗａｎに感染させた：（Ａ）０．１のＭＯＩにて３時間、Ｓ．アウレウスＮｅｗｍａｎ、（Ｂ）１．０のＭＯＩにて２４時間、Ｓ．アウレウスＮｅｗｍａｎ、及び（Ｃ）１．０のＭＯＩにて７２時間、Ｓ．アウレウスＣｏｗａｎ。プレートを１２００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、ＣＯ２を流した状態で３７℃にてインキュベートした。浸潤後、真核細胞をＰＢＳで３回洗浄して、残存している細胞外Ｓ．アウレウスを除去し、フロキサシリン（１ｍｇ／ｍＬ）に２時間曝露して、全ての残っている非内在化細菌を殺傷した。各実験（Ａ、Ｂ及びＣ）に関して、試料の一部をクロロキン処理（２０μＭ）に曝露して、リソソームのｐＨを増加させ、エンドリシンによる更なる処理に対するその効果を評価した。抗生物質処理した細胞からの上清を平板培養して、フロキサシリン処理効率を調べた。次いで、真核細胞を再びＰＢＳ（３回）で洗浄して、死んだ細菌を除去し、エンドリシン処理に供した。適用したエンドリシン調製物の組成を表２にまとめる。
【００７７】
真核細胞を１ｍＬの１μＭエンドリシン調製物（１ｍｇ／ｍＬのフロキサシリン及び＋／−２０μＭのクロロキンを追加したＥＭＥＭ中で希釈した）で（Ａ）１時間及び４時間、（Ｂ及びＣ）４時間処理した。対照をＥＭＥＭ中の１ｍＬの１ｍｇ／ｍＬフロキサシリン、＋／−２０μＭのクロロキンで処理した。次いで培養物をＰＢＳで３回洗浄し、顕微鏡下で検査して、骨芽細胞溶解が存在するかどうかを決定した。次に、培養物をトリプシン処理し（トリプシン−ＥＤＴＡ  ０．２５％、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）（登録商標））、８００μＬの０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で溶解した。細胞溶解物をＬＢでの段階希釈プレーティング及び３７℃での一晩のインキュベーションに供した。
【００７８】
【表２】
2018509415.tif 000007
【００７９】
結果
全てのタンパク質構築物の発現の成功及び精製が達成された。全ての発現したエンドリシン構築物と共に対応する分子量及び濃度の概要を表３に示す。相対的に高い濃度をエンドリシン構築物のほとんどで得、正確なタンパク質発現及び精製戦略が使用されたことを示す。
【００８０】
【表３】
2018509415.tif 000008
【００８１】
全ての発現したエンドリシンはプレートアッセイ及び時間−殺傷アッセイにおいてＳ．アウレウスＣｏｗａｎを殺傷するのに効果的であった。
【００８２】
細胞内Ｓ．アウレウス殺傷アッセイ
表２に記載したエンドリシン構築物の混合物を、細胞組織培養物中でそれらの細菌殺傷効果について更に試験した。
【００８３】
本発明者らのモデルＭＧ−６３において、骨肉腫細胞を使用して骨髄炎の状態を模倣した。細胞を最初に病原体Ｓ．アウレウスＮｅｗｍａｎ又はＣｏｗａｎに特定の時間、感染させ、次いでクロロキンの存在下又は不在下でエンドリシン混合物により処理した。本発明者らは、クロロキンの適用による細胞内ｐＨの増加がエンドリシン活性についてのより有益な状態を作り出すと予想した。
【００８４】
骨肉腫細胞を、Ｓ．アウレウスＮｅｗｍａｍ及びＣｏｗａｎに３時間曝露し、続いて２時間フロキサシリン処理して、全ての非内在化細菌を不活性化した。次いで、組織細胞を、クロロキンを有する及び有さない１μＭのエンドリシン混合物で１時間及び４時間処理した。結果を図５ａ〜ｄに示す。図５ａはエンドリシン混合物のみによるＳ．アウレウスＮｅｗｍａｎの処理の結果を示し、図５ｂはクロロキンとの併用処理の結果を示す。明らかに、４時間の処理は両方の実験状況において、より効果的であった。更に、クロロキンの存在下でのエンドリシン処理の結果、細菌数の大幅な減少が生じた。興味深いことに、ＣＰＰを含まないエンドリシンの混合物は非常に良好な殺傷効果を示し、この殺傷効果は予想されなかった。しかしながら、ＣＢＤに関連する膨大な量の正電荷は酵素を負に帯電した細胞膜に引きつけ、その細胞内転移を誘導することができる。ＣＰＰを含まないエンドリシン転移についてのこのような推定機構はＣＰＰの転移に重要である。全てのエンドリシン混合物の活性はＣＢＤの存在及びＣＰＰタグの種類に応じて実質的に異なるが、全てのエンドリシン混合物はこのアッセイにおいて類似の殺傷特性を示した。異なる構築物は、ＣＰＰ、ＥＡＤ及びＣＢＤの存在に応じて異なる浸透特性を有する可能性がある。例えば、ＥＡＤ−ＣＢＤ混合物は非常に高い活性であるが、任意のＣＰＰ含有バリアントと同じ効率で細胞膜を介して輸送することはできない。一方、ＥＡＤ−ＣＰＰ構築物は高い活性を有さないが、より小さく、形質導入ドメインを含有し、このことにより、ＥＡＤ−ＣＰＰ構築物の細胞内輸送をより効率的にし、ＣＢＤ結合によって媒介される細胞表面での酵素の固定化の欠如に起因してＥＡＤ−ＣＰＰ構築物の拡散性を良好にする。結果として、異なる特性を有する酵素は最終的に所与の類似の結果を有することがある。図５ｃ及び図５ｄは病原体の異なる株：Ｓ．アウレウスＣｏｗａｎで実施した同じ実験の結果を示す。この場合、処理は効果的であるように見えなかった。クロロキンを有さない（図５ｃ）及びクロロキンを有する（図５ｄ）両方の試料について、生存数の減少はごくわずかである。クロロキンの存在下でＣＨＡＰ−ＣＢＤ−Ｒ９＋Ｍ２３−ＣＢＤ−Ｒ９の混合物による処理だけ、病原体の顕著な根絶が生じた。Ｓ．アウレウスＣｏｗａｎは細胞内のリソソームに存在することは知られている。Ｓ．アウレウスＮｅｗｍａｎの細胞内局在化は異なる可能性が非常に高く、Ｓ．アウレウスＮｅｗｍａｎは単に細胞質内に存在することができるだけであるので、２つの実験の結果は異なる。更に、ＣＰＰ標識されたエンドリシン構築物の細胞内運命はこの時点で未知であり、従って、Ｒ９タグと融合したエンドリシン構築物がリソソーム内に蓄積する唯一のエンドリシン構築物であるので、エンドリシン構築物はＳ．アウレウスＣｏｗａｎに対して良好な殺傷特性を示したと推測のみすることができる。
【００８５】
実際の感染を模倣するために、骨肉腫組織細胞を、処理前に２４時間及び７２時間、Ｓ．アウレウスに感染させた。このような長い感染時間により、細菌の最終的な目的地の細胞内に細菌が定着することが可能になった。再び、細胞をクロロキンの存在下及び不在下でエンドリシン構築物の混合物で処理した。図６ａ及び図６ｂは、それぞれクロロキンの不在下及び存在下でＳ．アウレウスＮｅｗｍａｎに２４時間感染させた骨肉腫細胞の処理の結果を示す。図６ｃ及び図６ｄは、Ｓ．アウレウスＣｏｗａｎに７２時間感染させた処理細胞の結果に対応する。両方の場合、エンドリシン混合物による処理は、特にクロロキンの添加で有効であるように見える。最適な結果を、クロロキンの存在下でＥＡＤ−ＣＢＤ−Ｒ９混合物によるＳ．アウレウスＮｅｗｍａｎの処理について得、この場合に病原体の約６０％は根絶した（図６ｂ）。同様に良好な結果を、ＥＡＤ−ＣＢＤ、ＥＡＤ−ＣＢＤ−ＴＡＴ、ＥＡＤ−ＣＢＤ−Ｒ９及びＥＡＤ−ＣＢＤ−ペネトラチンの混合物で処理したＳ．アウレウスＣｏｗａｎについて達成し、この場合に病原体の約５０％が殺傷された。一般に、形質導入ドメインと融合していない、ＥＡＤ−ＣＢＤ混合物を含むＣＢＤ含有エンドリシン構築物は良好な殺傷効果を示した。
【００８６】
まとめると、クロロキンと併せた、操作したエンドリシンによる細胞内Ｓ．アウレウスの処理は、クロロキンを用いない処理より効果的であることが実証された。このようなアルカリ化薬剤の適用は細胞内で溶解酵素の活性を向上させる可能性があり、エンドリシンのクロロキンとの併用処理は従来の抗生物質療法に対する良好な代替となることができる。
【００８７】
結論として、この研究は、細胞内及び細胞外Ｓ．アウレウスの処理におけるＣＰＰ融合エンドリシンの可能性を示した。このような療法は、例えば、骨髄炎、心内膜炎、菌血症又は敗血症及び乳牛のウシの乳腺炎のような状態を有する患者を治療するために使用することができる。
【００８８】
実施例４．
細胞壁溶解酵素由来の機能的酵素ドメインを含み、分子のＮ末端側にタンパク質形質導入ドメインを更に含む本発明によるいくつかの殺菌剤を調製し、本明細書のいずれかに記載されている方法に従って分析した（Ｒ９−ＣＨＡＰ−ＣＢＤ、Ｒ９−Ｍ２３−ＣＢＤ、ＴＡＴ−Ａｍｉ−ＣＢＤ、ＴＡＴ−ＣＨＡＰ−ＣＢＤ及びＴＡＴ−Ｍ２３−ＣＢＤ）。全てのデータを、国際公開第２０１３／１６９１０４号において以前に記載されているものに従って（１μＭを使用したＡｍｉ−ＣＢＤ構築物を除いて）Ｓ．アウレウスＳＡ１１３基質細胞及び１００ｎＭのタンパク質濃度での濁度低減アッセイにおいて回収した。図７ａ〜ｅは構築物の性能を示す。図７ａ〜ｅから観測することができるように、一般に、Ｎ末端ＣＰＰ標識化タンパク質は活性であるが、Ｓ．アウレウス細胞で分析した場合、非標識化又はＣ末端標識化バリアントと比較して低い性能である。細胞内殺傷の効率を分析するために、構築物を実施例３のように細胞内Ｓ．アウレウス殺傷アッセイにおいて試験すべきである。
【００８９】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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