(57)【要約】本発明は、チロシンキナーゼ受容体METの活性化を誘導し得る、肝細胞増殖因子／分散因子(HGF/SF)由来のK1ドメインの多量体化合物、及びその使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞増殖因子／分散因子(HGF/SF)の少なくとも２つのK1ペプチドドメイン(クリングル1)を含み、且つ式(I)：
【化１】
2018507842.tif 000012
(式中、
- m＝0又は１
- n＝0又は１
- K1a、K1b、並びに、存在する場合はK1c及びK1dは、ポリペプチドであり、
- K1a及びK1b、並びに、存在する場合はK1c及びK1dは、K1ペプチドドメインを含み、前記K1ペプチドドメインは、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１と少なくとも80%の同一性、好ましくは90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
- Biotは１分子のビオチンを表し、Streptは、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジン及びそれらの任意の合成誘導体又は組換誘導体からなる群から選択される１分子を表し、
- K1a及びK1b、並びに、存在する場合はK1c及びK1dは、Ｃ末端で共有結合によりBiotに連結しており、それぞれのBiotは、非共有結合によりStreptに連結している）
で表される多量体化合物であって、
前記多量体化合物は、チロシンキナーゼ受容体METの活性化を誘導することができる、
多量体化合物。
【請求項２】
Streptが１分子のストレプトアビジンを表す、請求項１に記載の多量体化合物。
【請求項３】
式(II)：
【化２】
2018507842.tif 000013
(式中、
- K1a及びK1bは、ポリペプチドであり、
- K1a及びK1bは、K1ペプチドドメインを含み、前記K1ペプチドドメインは、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１と少なくとも80%の同一性、好ましくは90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
- Biotは１分子のビオチンを表し、Streptは１分子のストレプトアビジンを表し、
- K1a及びK1bは、Ｃ末端で共有結合によりBiotに連結しており、それぞれのBiotは、非共有結合によりStreptに連結している)
で表されるK1二量体である、請求項１又は２のいずれかに記載の多量体化合物。
【請求項４】
式(III)：
【化３】
2018507842.tif 000014
(式中、
- K1a、K1b及びK1cは、ポリペプチドであり、
- K1a、K1b及びK1cは、K1ペプチドドメインを含み、前記K1ペプチドドメインは、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１の少なくとも80%の同一性、好ましくは90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
- Biotは１分子のビオチンを表し、Streptは１分子のストレプトアビジンを表し、
- K1a、K1b及びK1cは、Ｃ末端で共有結合によりBiotに連結しており、それぞれのBiotは、非共有結合によりStreptに連結している)
で表されるK1三量体である、請求項１又は２のいずれか１項に記載の多量体化合物。
【請求項５】
式(IV)：
【化４】
2018507842.tif 000015
(式中、
- K1a、K1b、K1c及びK1dは、ポリペプチドであり、
- K1a、K1b、K1c及びK1dは、K1ペプチドドメインを含み、前記K1ペプチドドメインは、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１の少なくとも80%の同一性、好ましくは90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
- Biotは１分子のビオチンを表し、Streptは１分子のストレプトアビジンを表し、
- K1a、K1b、K1c及びK1dは、Ｃ末端で共有結合によりBiotに連結しており、それぞれのBiotは、非共有結合によりStreptに連結している)
で表されるK1四量体である、請求項１又は２のいずれかに記載の多量体化合物。
【請求項６】
K1a及びK1b、並びに、存在する場合はK1c及びK1dが同一である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多量体化合物。
【請求項７】
前記多量体化合物が、解離定数KD≦200 nM、好ましくは≦100 nM、より好ましくは≦10 nMで、チロシンキナーゼ受容体METと結合できる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の多量体化合物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１つに定義される多量体化合物を含む組成物。
【請求項９】
前記多量体化合物が、
式(II)：
【化５】
2018507842.tif 000016
(式中、
- K1a及びK1bは、ポリペプチドであり、
- K1a及びK1bは、K1ペプチドドメインを含み、前記K1ペプチドドメインは、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１との少なくとも80%の同一性、好ましくは90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
- Biotは１分子のビオチンを表し、Streptは１分子のストレプトアビジンを表し、
- K1a及びK1bは、Ｃ末端で共有結合によりBiotに連結しており、それぞれのBiotは、非共有結合によりStreptに連結している)
で表されるK1二量体、
式(III)：
【化６】
2018507842.tif 000017
(式中、
- K1a、K1b及びK1cは、ポリペプチドであり、
- K1a、K1b及びK1cは、K1ペプチドドメインを含み、前記K1ペプチドドメインは、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１の少なくとも80%の同一性、好ましくは90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
- Biotは１分子のビオチンを表し、Streptは１分子のストレプトアビジンを表し、
- K1a、K1b及びK1cは、Ｃ末端で共有結合によりBiotに連結しており、それぞれのBiotは、非共有結合によりStreptに連結している)
で表されるK1三量体、及び
式(IV)：
【化７】
2018507842.tif 000018
(式中、
- K1a、K1b、K1c及びK1dは、ポリペプチドであり、
- K1a、K1b、K1c及びK1dは、K1ペプチドドメインを含み、前記K1ペプチドドメインは、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１の少なくとも80%の同一性、好ましくは90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
- Biotは１分子のビオチンを表し、Streptは１分子のストレプトアビジンを表し、
- K1a、K1b、K1c及びK1dは、Ｃ末端で共有結合によりBiotに連結合しており、それぞれのBiotは、非共有結合によりStreptに連結している)
で表されるK1四量体
の混合物の形態にある、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
インビボでの診断方法において、特に癌、急性及び慢性肝臓病、急性及び慢性腎臓病、慢性肺疾患及び慢性皮膚創傷を含む上皮器官の疾患、ニューロン疾患及び硬化症を含む中枢神経の疾患、虚血性心疾患、末梢血管疾患、糖尿病及び末梢神経障害などの関連する合併症から選択される病変のインビボでの診断方法において用いるための請求項１〜７のいずれか１つに定義される多量体化合物。
【請求項１１】
医用撮像に用いるための請求項１〜７のいずれか１つに定義される多量体化合物。
【請求項１２】
インビトロ診断ツールとしての、特に癌、急性及び慢性肝臓病、急性及び慢性腎臓病、慢性肺疾患及び慢性皮膚創傷を含む上皮器官の疾患、ニューロン疾患及び硬化症を含む中枢神経の疾患、虚血性心疾患、末梢血管疾患、糖尿病及び末梢神経障害などの関連する合併症から選択される病変のインビトロ診断における、請求項１〜７のいずれか１つに定義される多量体化合物の使用。
【請求項１３】
医薬品として用いるための請求項１〜７のいずれか１つに定義される多量体化合物。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１つに定義される、少なくとも２つのK1ペプチドドメインを含む多量体化合物を含む組成物を取得する方法であって、次の工程：
- ビオチンに結合したK1ペプチドドメインを含む分子を合成して、ビオチン化K1分子を取得する工程であって、前記ビオチンがK1分子のＣ末端に結合している、前記工程と、
- 前記ビオチン化K1分子をストレプトアビジンホモ四量体と混合して、少なくとも２つのK1ペプチドドメインを含む多量体化合物の組成物を取得する工程と
を含み、
好ましくは、前記ビオチン化K1分子と前記ストレプトアビジンホモ四量体とを、モル比2：1で混合してK1ドメインの二量体化合物を取得するか、モル比3：1で混合してK1ドメインの三量体化合物を取得するか、又はモル比4：1で混合してK1ドメインの四量体化合物を取得する、
方法。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか１つに定義される、少なくとも２つのK1ペプチドドメインを含む多量体化合物を取得する方法であって、次の工程：
- ビオチンに結合したK1ペプチドドメインを含む分子を合成して、ビオチン化K1分子を取得する工程であって、前記ビオチンがK1分子のＣ末端に結合している、前記工程と、
- 前記ビオチン化K1分子をストレプトアビジンホモ四量体と混合して、少なくとも２つのK1ペプチドドメインを含む多量体化合物の組成物を取得する工程と、
- 多量体化合物を精製及び分離して、K1ドメインの二量体化合物、K1ドメインの三量体化合物、及びK1ドメインの四量体化合物を取得する工程と
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞増殖因子／分散因子(HGF/SF)由来のK1ドメインの多量体化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞増殖因子／分散因子(HGF/SF)は、不活性前駆体として合成された後、タンパク質分解的に二本鎖(α/β)活性種に変換される複雑なドメイン構造を有する分泌90kDaタンパク質である(Nakamura, T., Structure and function of hepatocyte growth factor. Prog Growth Factor Res 3, 67-85 (1991); Holmes et al., Insights into the structure/function of hepatocyte growth factor/scatter factor from studies with individual domains. J Mol Biol 367, 395-408 (2007))。α鎖は、１つのＮ末端ドメイン(Ｎ)とクリングルドメインの４つのコピー(K1、K2、K3及びK4)とからなる。β鎖は、触媒的に不活性なセリンプロテイナーゼドホモロジーメイン(SPH)である。２つの受容体結合部位がHGF/SFに同定され、それらは、α鎖のＮ末端領域に局在する高親和性部位と、β鎖に局在する低親和性部位である。
【０００３】
HGF/SFは、肝マイトジェン(肝細胞増殖因子、HGF)(Miyazawa et al., Molecular cloning and sequence analysis of cDNA for human hepatocyte growth factor. Biochem Biophys Res Commun 163, 967-973 (1989); Nakamura et al., Purification and subunit structure of hepatocyte growth factor from rat platelets. FEBS Lett 224, 311-316 (1998); Zarnegar et al., Purification and biological characterization of human hepatopoietin a, a polypeptide growth factor for hepatocytes. Cancer Res 49, 3314-3320 (1989))、及び線維芽細胞由来上皮運動因子(分散因子、SF)(Stoker et al., Scatter factor is a fibroblast-derived modulator of epithelial cell mobility. Nature 327, 239-242 (1987); Gherardi et al., Purification of scatter factor, a fibroblast-derived basic protein that modulates epithelial interactions and movement. Proc Natl Acad Sci USA 86, 5844-5848 (1989))として独立に発見された強力な増殖及び運動因子である。プロトオンコジーンによりコードされる受容体チロシンキナーゼMETは、HGF/SFに対する受容体であると後に立証された(Bottaro et al., Identification of the hepatocyte growth factor as the c-met proto-oncogene product. Science 251, 802-804 (1991))。
【０００４】
興味深いことには、一次HGF/SF転写物は、２つの選択的スプライスバリアントをコードする。第一のバリアントは未成熟翻訳停止に起因し、HGF/SFのＮドメイン及び最初のクリングルドメイン(K1)を有するNK1タンパク質を生成する。NK1タンパク質は顕著なアゴニスト活性を有しているが、完全なMET活性化の誘導にはヘパラン硫酸相互作用が必要である。構造的に、NK1タンパク質は、ヘパリン存在下で、MET二量化及び活性化の原因と推定される「頭-尾」ホモ二量体を形成する２つの球状ドメインからなる(Chirgadze et al., Crystal structure of the NK1 fragment of HGF/SF suggests a novel mode for growth factor dimerization and receptor binding. Nat Struct Biol 6, 72-79 (1999))。未成熟終止によっても生成される第二のスプライスバリアントは、Ｎドメイン及び最初の２つのクリングルドメインを有するNK2タンパク質を生産する。NK2は、天然のMETアンタゴニストと考えられている。実際、NK2はMET結合能を保持するが、その立体配座特性により、METを活性化させる能力を欠く。しかし、構造ベースの標的突然変異によって、NK1のものに近い立体配座におけるK1ドメインを再配置することで、NK2をMETアンタゴニストからアゴニストに効率的に切り替えることができる。
【０００５】
統一的かつ収束的な相互作用モデルを提案する多くの試みがなされたが、HGF/SFのMET結合機構はいまだ不明であり、論争が続いている。特に、可溶性MET細胞外ドメインと複合したNK1の結晶構造は、まだ得られていない。HGF/SFは、α鎖(Ｎ及び／又はK1ドメイン)のＮ-末端領域及びβ鎖(SPHドメイン)にそれぞれ局在する、METに対する高親和性結合部位及び低親和性結合部位を含む二価リガンドである。溶液中のMETエクトドメインへのHGF/SF結合は、2：2化学量論の複合体を生じる(Gherardi et al., Structural basis of hepatocyte growth factor/scatter factor and met signalling. Proc Natl Acad Sci USA 103, 4046-4051 (2006))。SPHドメインは、METを明確なインターフェイスで結合する。しかし、MET上のNK1結合部位の局在はいまだ不明確であり、正確なHGF/SF-MET相互作用モデルについては議論が続いている((Holmes et al., Insights into the structure/function of hepatocyte growth factor/scatter factor from studies with individual domains. J Mol Biol 367, 395-408 (2007); Stamos et al., Crystal structure of the HGF beta-chain in complex with the sema domain of the met receptor. The EMBO Journal 23, 2325-2335 (2004); Merkulova-Rainon et al., The N-terminal domain of hepatocyte growth factor inhibits the angiogenic behavior of endothelial cells independently from binding to the c-Met-receptor. J Biol Chem 278, 37400-37408 (2003))。
【０００６】
HGF/SF及びMETは、発生と組織／臓器再生との両方において重要な生理的役割を果たす。特に、HGF/SF-METは、肝切除後の肝臓及び皮膚の再生(Huh et al., Hepatocyte growth factor/c-met signaling pathway is required for efficient liver regeneration and repair. Proc Natl Acad Sci USA 101, 4477-4482 (2004); Borowiak et al., Met provides essential signals for liver regeneration. Proc Natl Acad Sci USA 101, 10608-10613 (2004))と、皮膚創傷(Chmielowiec et al., C-met is essential for wound healing in the skin. J Cell Biol 177, 151-162 (2007))に不可欠である。さらに、HGF/SFは、実験的損傷から心筋及び骨格筋を保護し(Urbanek et al., Cardiac stem cells possess growth factor-receptor systems that after activation regenerate the infarcted myocardium, improving ventricular function and long-term survival. Circ Res 97, 663-673 (2005))、運動ニューロン疾患のトランスジェニックモデル(Sun et al., Overexpression of HGF retards disease progression and prolongs life span in a transgenic mouse model of als. J Neurosci 22, 6537-6548 (2002))及び多発性硬化症の免疫学的モデル(Bai et al., Hepatocyte growth factor mediates mesenchymal stem cell-induced recovery in multiple sclerosis models. Nature neuroscience 15, 862-870 (2012))の進行を遅らせる。総合すると、これらの研究は、多くの前臨床及び最新の臨床研究により支持された概念である、再生医療におけるHGF/SFの大きな潜在力を強調する。さらに、このリガンド-受容体のペアは、腫瘍形成及び転移のプロセスにもよく関連しており、したがって、癌治療の開発のための主要な標的となる。
【０００７】
特に、組織再生、とりわけ肝切除後の肝臓再生又は糖尿病疾患に関与する損傷での組織再生を可能にするHGF/SFアゴニスト合成について、多くの研究がなされている。
【０００８】
HGF/SF-MET相互作用についての現在の知見では、HGF/SF-METシグナル伝達阻害剤又はアゴニストの合理的設計ができないので、HGF/SHの有用性は、天然のHGF/SF、遺伝子送達法及びNK1ベースのMETアゴニストを使用して確立されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、天然のHGF/SFは、局所的に作用する組織モルフォゲンとしての役割を反映する、制限された組織拡散性を有するタンパク質である(Birchmeier et al., Met, metastasis, mobility and more. Nat Rev Mol Cell Biol 4, 915-925 (2003); Ross et al., Protein Engineered Variants of Hepatocyte Growth Factor/Scatter Factor Promote Proliferation of Primary Human Hepatocytes and in Rodent Liver. Gastroenterology 142, 897-906 (2012))。実際、局所又は全身投与後、HGF/SFは、細胞外マトリクスに存在するヘパラン硫酸により固定化されて、より遠隔の組織におけるMET受容体への拡散は著しく減少する(Roos et al., Induction of liver growth in normal mice by infusion of hepatocyte growth factor/scatter factor. The American Journal of Physiology 268, G380-386 (1995); Hartmann et al., Engineered mutants of HGF/SF with reduced binding to heparan sulphate proteoglycans, decreased clearance and enhanced activity in vivo. Curr Biol 8, 125-134 (1998))。さらに、天然のHGF/SHは、その複雑なマルチドメインの構造により、生産が困難であり、割高でもある。
【００１０】
HGF/SFをコードする裸のDNAの筋肉内注射を含めた遺伝子送達法は、タンパク質療法としての天然のHGF/SFの使用に関連する複数の問題に取り組むものである(例えば、HGF/SFタンパク質の生産コスト)。現在、糖尿病性末梢神経障害の患者と筋萎縮性側索硬化症の患者とにおいて、HGF/SF DNAを用いた臨床試験が実施されている。この試験の結果は興味が持たれているが、現在の遺伝子送達法には、遺伝子産物の安定的治療レベルの達成と、制限された拡散のため特定の組織領域及び臓器に対する相対的利用能の点において限界がある。例えば、かかる遺伝子送達法は、プラスミド送達システム(特許出願WO2009/093880, WO2009/125986及びWO2013/065913)又はアデノウイルスをベースにした送達システム(Yang et al., Improvement of heart function in postinfarct heart failure swine models after hepatocyte growth factor gene transfer: comparison of low-, medium- and high-doses groups. Mol Biol Rep 37, 2075-2081 (2010))に基づいている。
【００１１】
現在入手可能なNK1ベースのMETアゴニスト、例えば1K1(すなわち、NK1ミュータント)は強い親和性を有し、HGF/SFよりも有利な点がある(Lietha et al., Crystal structures of NK1-heparin complexes reveal the basis for NK1 activity and enable engineering of potent agonists of the MET receptor. The EMBO journal 20, 5543-5555 (2001) and patent US 7,179,786)。天然のHGF/SFと異なり、このNK1ミュータントは異種発現系での効率的生産が可能であり、また生理学的緩衝溶液中で安定であるので、投与量及び血漿濃度を完全に制御して投与できる。しかし、NK1の潜在的な限界は、組織拡散を回避するヘパラン硫酸に対する強力な残余親和性である。
【００１２】
このことから、改善された安定性、改善された貯蔵寿命、最適なバイオアベイラビリティーを備え、且つ安価な生産と容易な投与が可能である強力なMETアゴニストに対するニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の目的の１つは、チロシンキナーゼ受容体METの活性化を誘導できるK1ベースの多量体化合物の提供である。
また、本発明の別の目的は、K1ベースの多量体化合物を含む組成物の提供である。
さらに、本発明の別の目的は、特に診断と治療応用における、K1ベースの多量体化合物に関する。
【００１４】
本発明は、肝細胞増殖因子／分散因子(HGF/SF)の少なくとも２つのK1ペプチドドメイン(クリングル1)を含み、且つ式(I)：
【００１５】
【化１】
2018507842.tif 000002
【００１６】
(式中、
- m＝0又は１
- n＝0又は１
- K1a及びK1b、並びに、存在する場合はK1c及びK1dは、ポリペプチドであり、
- K1a及びK1b、並びに、存在する場合はK1c及びK1dは、K1ペプチドドメインを含み、前記K1ペプチドドメインは、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１の少なくとも80%の同一性、好ましくは90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
- Biotは１分子のビオチンを表し、Streptは、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジン及びそれらの任意の合成誘導体又は組換誘導体からなる群から選択される１分子を表し、
- K1a及びK1b、並びに、存在する場合はK1c及びK1dは、Ｃ末端で共有結合によりBiotに連結しており、それぞれのBiotは、非共有結合によりStreptに連結しており、
【００１７】
【化２】
2018507842.tif 000003
【００１８】
で表される多量体化合物に関するものであり、前記多量体化合物は、チロシンキナーゼ受容体METの活性化を誘導することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、K1ドメインが強力なMETアゴニストの基礎単位を構成し、且つ、ストレプトアビジン技術により、NK1二量体においてK1ドメインの活性化シグナル伝達コンフォメーションを模倣する頭-尾のホモ二量体の再構築を可能にするという、発明者らによる予期しなかった二方面からの観察に基づく。
【００２０】
NK1ホモ二量体の結晶構造の検査によって、HGF/SFの２つのNK1 Ｃ末端の間の距離は約2.3 nmと示され、これは、ストレプトアビジン四量体の同一面上の２つのビオチン結合部位間の距離に極めて近い。驚くべきことに、K1-Bストレプトアビジン複合体は、強力なMETアゴニストであることが発見された。
【００２１】
本発明の多量体化合物は、多くの技術的及び金銭的な面で有利である。
最も重要な技術的利点は、本発明の多量体化合物が強力なMETアゴニスト活性を有する点である。したがって、多量体化合物は、種々のインビトロ及びインビボアッセイにおいて、MET受容体を活性化することができ、且つ／又は、MET活性化に関連するいかなる表現型も誘導し得る。
【００２２】
次を実行可能な場合には、多量体化合物はMETアゴニスト活性を有する：
- MET受容体に多量体化合物が結合し、
- METリン酸化と、細胞における下流のシグナル伝達とを活性化し、及び
- 生存、増殖、形態形成及び／又は移動などの少なくとも１つの細胞表現型を誘導する。
【００２３】
これらの基準の確認は、タンパク質-タンパク質相互作用試験(SPR(表面プラズモン共鳴など)、AlphaScreen、プルダウン技術又はゲルろ過クロマトグラフィー)、リン酸化試験(ウエスタンブロット法、ELISA又はAlphaScreenなど)、及び表現型試験(分散、MTTアッセイ又はマトリゲル誘導性形態形成など)を使用して示せる。
【００２４】
例えば、細胞におけるMET活性化及び下流のシグナル伝達は、ウエスタンブロット法によりインビトロで分析し、ホモジニアス時間分解蛍光法(HTRF)により定量化できる。インビボの場合には、局所血管新生の分析及びFas誘発性劇症肝炎からのマウスの保護が可能である。
【００２５】
別の技術的な利点は、本発明の多量体化合物が、投与量及び／又は血漿濃度を完全に制御して投与できるタンパク質複合体である点である。
【００２６】
加えて、天然のHGF/SFの大きな欠点の１つは、細胞外マトリクスにおいてヘパラン硫酸に強く結合するという事実である。これは、より離れた部位への分子の拡散を厳しく制限する。一方、本発明の多量体化合物は、高親和性ヘパラン硫酸部位を欠損している。
【００２７】
よって、本発明の多量体化合物は、HGF/SFとは逆に、細胞外マトリクスのヘパラン硫酸鎖により固定化されない。したがって、患者に注射されたとき、多量体化合物は、注入領域から離れた組織にあるMET受容体に向かって拡散できるが、天然のHGF/SFの場合は拡散できない。
【００２８】
いくつかの金銭的な利点は、本発明の多量体化合物は、合成が容易で大量に入手可能である点である。
化学合成は、発現系として一般的に使用される宿主細胞(細菌又は酵母など)からの汚染の可能性が無いクリーンな環境を提供する。
さらに、化学合成は、得られた化合物の多量体構造を調節する制御環境を提供し、特に二量体化合物、三量体化合物、又は四量体化合物を取得する。
【００２９】
本発明では、用語「K1-B」、「K1B」、「K1-Biot」又は「K1ドメインのビオチン化変形」は全て、HGF/SFのK1ドメインの配列を含むか又はそれからなるビオチン化ペプチドをいう。
【００３０】
本発明では、用語「少なくとも２つのK1ペプチドドメインを含む多量体化合物」、「K1B/S複合体」又は「K1-Bストレプトアビジン複合体」は、HGF/SFのK1ドメインのビオチン化変形を少なくとも２つ含み、それぞれが、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジン、或いはそれらの任意の合成誘導体又は組換誘導体である同じ分子に非共有結合で結合した分子複合体をいう。
【００３１】
本発明では、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジン、或いはそれらの任意の合成誘導体又は組換誘導体は、優先的に４価の形態で使用されるが、３価又は２価の形態でも使用される。
【００３２】
一実施形態で、本発明は、Streptが１分子のストレプトアビジンを表す、多量体化合物に関する。
一実施形態で、本発明は、Streptが１分子のアビジンを表す、多量体化合物に関する。
【００３３】
【化３】
2018507842.tif 000004
【００３４】
式(I)中、m＝1及びn＝1の場合、多量体化合物は、4K1-Biotを含むので、K1ドメインの四量体である。
式(I)中、m＝1及びn＝0の場合、又はm＝0及びn＝1の場合、多量体化合物は、3K1-Biotを含むので、K1ドメインの三量体である。
式(I)中、m＝0及びn＝0の場合、多量体化合物は、2K1-Biotを含むので、K1ドメインの二量体である。
【００３５】
一実施形態で、本発明は、かかる多量体化合物が２つのK1ペプチドドメインを含む二量体である、多量体化合物に関する。
一実施形態で、本発明は、かかる多量体化合物が３つのK1ペプチドドメインを含む三量体である、多量体化合物に関する。
一実施形態で、本発明は、かかる多量体化合物が４つのK1ペプチドドメインを含む四量体である、多量体化合物に関する。
【００３６】
一実施形態で、本発明は、式(II)で表されるK1二量体である多量体化合物に関する：
【００３７】
【化４】
2018507842.tif 000005
【００３８】
式中、
- K1a及びK1bは、ポリペプチドであり、
- K1a及びK1bは、K1ペプチドドメインを含み、かかるK1ペプチドドメインは、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１の少なくとも80%の同一性、好ましくは90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
- Biotは１分子のビオチンを表し、Streptは１分子のストレプトアビジンを表し、
- K1a及びK1bは、Ｃ末端で共有結合によりBiotに連結しており、それぞれのBiotは、非共有結合によりStreptに連結している。
【００３９】
一実施形態で、本発明は、式(III)で表されるK1三量体である多量体化合物に関する。
【００４０】
【化５】
2018507842.tif 000006
【００４１】
式中、
- K1a、K1b及びK1cは、ポリペプチドであり、
- K1a、K1b及びK1cは、K1ペプチドドメインを含み、かかるK1ペプチドドメインは、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１の少なくとも80%の同一性、好ましくは90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
- Biotは１分子のビオチンを表し、Streptは１分子のストレプトアビジンを表し、
- K1a、K1b及びK1cは、Ｃ末端で共有結合によりBiotに連結しており、それぞれのBiotは、非共有結合によりStreptに連結している。
【００４２】
一実施形態で、本発明は、式(IV)で表されるK1四量体である多量体化合物に関する。
【００４３】
【化６】
2018507842.tif 000007
【００４４】
式中、
- K1a、K1b、K1c及びK1dは、ポリペプチドであり、
- K1a、K1b、K1c及びK1dは、K1ペプチドドメインを含み、かかるK1ペプチドドメインは、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１の少なくとも80%の同一性、好ましくは90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
- Biotは１分子のビオチンを表し、Streptは１分子のストレプトアビジンを表し、
- K1a、K1b、K1c及びK1dは、Ｃ末端で共有結合によりBiotに連結しており、それぞれのBiotは、非共有結合によりStreptに連結している。
【００４５】
本発明ではK1a、K1b、K1c及びK1dは、K1ドメインを含むポリペプチドであり、よって、これらは、K1ドメインを含むか、又は好ましくはK1ドメインからなる。
【００４６】
配列番号１は、配列番号３で表されるHGF/SFの128位のアミノ酸から206位のアミノ酸までの領域である、ヒトK1ドメインの配列に対応する。
配列番号１は79アミノ酸のサイズを有し、２つのシステインで挟まれている。
配列番号２は、５アミノ酸が欠損した、ヒトK1ドメインのバリアントに対応する。
【００４７】
【表１】
2018507842.tif 000008
【００４８】
配列番号２で表されるヒトK1ドメインのバリアントは、５つの連続したアミノ酸(SFLPS)の欠失により、配列番号１で表されるヒトK1ドメインとは異なる。
【００４９】
本発明では、K1a、K1b、K1c及びK1dは、K1ペプチドドメインを含む。かかるK1ペプチドドメインは、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１の少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列からなり得る。
【００５０】
本発明で定義する２つのペプチド配列間の「パーセンテージ同一性」は、比較ウインドウを通して、適切に整列させた２つの配列の比較により決定される。したがって比較ウインドウ中のアミノ酸配列は、２つの配列の間での最適なアライメントを得るために、基準配列(これは付加又は欠失を含まない)に対して付加又は欠失(例えば「gaps」)を含んでもよい。
【００５１】
パーセンテージ同一性は、比較される２つの配列においてアミノ酸残基が同一である位置の数を決定し、この数を比較ウインドウ中の位置の総数で割り、その結果に100を掛けて、２つのアミノ酸配列の互いのパーセンテージ同一性を得ることによって算出される。
【００５２】
パーセンテージ同一性は、全体のアミノ酸配列の全体に対して、又は選択されたドメインに対して、好ましくは全体のアミノ酸配列に対して決定されてもよい。Smith‐Watermanアルゴリズムは、局所アライメントに特に有効である(Smith T F, Waterman M S (1981) J. Mol. Biol. 147(1); 195-7)。
【００５３】
一実施形態で、本発明は、K1a及びK1bが同一である、多量体化合物に関する。
一実施形態で、本発明は、K1a、K1b及びK1cが同一である、多量体化合物に関する。
一実施形態で、本発明は、K1a、K1b、K1c及びK1dが同一である、多量体化合物に関する。
一実施形態で、本発明は、K1a、K1b、K1c及びK1dの全てが互いに異なる、多量体化合物に関する。
【００５４】
一実施形態で、本発明は、K1a、K1b、K1c及び1dが配列番号１のアミノ酸配列からなる、多量体化合物に関する。
一実施形態で、本発明は、K1a、K1b、K1c及びK1dが配列番号２のアミノ酸配列からなる、多量体化合物に関する。
【００５５】
本発明では、ポリペプチドK1a、K1b、K1c及びK1dの大きさは、少なくとも70アミノ酸である。
K1ペプチドドメインの大きさは、少なくとも70アミノ酸であり、好ましくは少なくとも74アミノ酸、より好ましくは少なくとも79アミノ酸である。
特に、K1ペプチドドメインの大きさは、70〜100アミノ酸である。かかるK1ペプチドドメインは、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100アミノ酸からなり得る。
【００５６】
一実施形態で、本発明は、チロシンキナーゼ受容体METの活性化がヘパラン硫酸に依存しない、多量体化合物に関する。
【００５７】
インビボの条件下では、HGF/SFは、細胞外マトリクスに存在するヘパラン硫酸鎖により固定化され、著しい拡く減少した散及び／又は組織分布をもたらす。
本発明のタンパク質は、高親和性ヘパラン硫酸結合部位(Ｎドメイン)を欠損しているので、離れた組織におけるMET受容体への拡散が可能である。
【００５８】
一実施形態で、本発明は、KD≦200 nM、好ましくは≦100 nM、より好ましくは≦10 nMの解離定数でチロシンキナーゼ受容体METに結合できる、多量体化合物に関する。
特に、かかる多量体化合物は、KD≦200 nM、≦150 nM、≦100 nM、≦90 nM、≦80 nM、≦70 nM、≦60 nM、≦50 nM、≦40 nM、≦30 nM、≦10 nM、又は≦5 nMの解離定数でチロシンキナーゼ受容体METに結合できる。
【００５９】
一実施形態で、本発明は、少なくとも２つのK1ペプチドドメインのＣ末端間の距離が1.3 nm〜3.5 nmであり、好ましくは2.0 nm〜2.3 nmである、多量体化合物に関する。
特に、少なくとも２つのK1ペプチドドメインのＣ末端間の距離は、1.3 nm、1.4 nm、1.5 nm、1.6 nm、1.7 nm、1.8 nm、1.9 nm、2.0 nm、2.1 nm、2.2 nm、2.3 nm、2.4 nm、2.5 nm、2.6 nm、2.7 nm、2.8 nm、2.9 nm、3.0 nm、3.1 nm、3.2 nm、3.3 nm、3.4 nm又は3.5 nmである。
【００６０】
別の態様で、本発明は、少なくとも２つのK1ペプチドドメインを含む多量体化合物を取得する方法に関し、これは次の工程を含む：
- ビオチンに結合したK1ペプチドドメインを含む分子を合成して、ビオチン化K1分子を取得する工程であって、かかるビオチンがK1分子のＣ末端に結合している、前記工程、
- かかるビオチニル化K1分子をストレプトアビジンホモ四量体と混合して、少なくとも２つのK1ペプチドドメインを含む多量体化合物の組成物を取得する工程、
- 多量体化合物を精製及び分離して、K1ドメインの二量体化合物、K1ドメインの三量体化合物、及びK1ドメインの四量体化合物を取得する工程。
【００６１】
本発明の多量体化合物の化学合成は、異種発現で生産されたNK1ベースのMETアゴニストと比較して、細菌又は酵母による汚染のいかなる痕跡も排除する利点を提供する。
【００６２】
一実施形態では、ビオチンに結合したK１ペプチドドメインの化学合成は、ワンポット逐次ペプチドセグメント会合法において、好ましくは、ワンポット逐次３ペプチドセグメント会合法において、固相ペプチド合成法(SPPS)を用いて行われる。
【００６３】
ワンポット逐次ペプチドセグメント会合法は、たった１つの反応器の中で、ペプチドセグメントを連続的な化学反応に付す方策であり、中間体化合物に係る長い分離工程と精製とを回避する。
例えば、セグメント1、セグメント2及びセグメント3からなる、K1ドメインの3つのセグメントを調製し、最後のものはビオチン伸長を含む。セグメント1及び2を連結させたら、セグメント1-2をビオチン化したセグメント3と連結させ、ビオチン化K1分子を得る。
【００６４】
別の態様で、本発明は、少なくとも２つのK1ペプチドドメインを含む多量体化合物を含む組成物を取得する方法に関し、これは次の工程：
- ビオチンに結合したK1ペプチドドメインを含む分子を合成して、ビオチン化K1分子を取得する工程であって、かかるビオチンがK1分子のＣ末端に結合している、前記工程と、
- かかるビオチニル化K1分子をストレプトアビジンホモ四量体と混合して、少なくとも２つのK1ペプチドドメインを含む多量体化合物の組成物を取得する工程と
を含み、
好ましくは、かかるビオチニル化K1分子と、かかるストレプトアビジンホモ四量体と(K1B：S)を、モル比2：1で混合してK1ドメインの二量体化合物を取得するか、モル比3：1で混合してK1ドメインの三量体化合物を取得するか、又はモル比4：1で混合してK1ドメインの四量体化合物を取得する。
【００６５】
特に、かかるビオチニル化K1分子と、かかるストレプトアビジンホモ四量体とは、モル比2：1〜8：1で混合することが好ましい。
【００６６】
K1ドメインの二量体、三量体、及び／又は四量体化合物はSDS-PAGE分析及び質量分析で同定できる。
別の態様で、本発明は、上で定義した多量体化合物を含む組成物にも関する。
【００６７】
一実施形態で、本発明は、多量体化合物が、下記の式(II)で表されるK1二量体、下記の式(III)で表されるK1三量体、及び下記の式(IV)で表されるK1四量体の混合物の形態にある組成物に関する：
式(II)で表されるK1二量体、
【００６８】
【化７】
2018507842.tif 000009
【００６９】
(式中、
- K1a及びK1bは、ポリペプチドであり、
- K1a及びK1bは、K1ペプチドドメインを含み、かかるK1ペプチドドメインは、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１の少なくとも80%の同一性、好ましくは90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
- Biotは１分子のビオチンを表し、Streptは１分子のストレプトアビジンを表し、
- K1a及びK1bは、Ｃ末端で共有結合によりBiotに連結しており、それぞれのBiotは、非共有結合によりStreptに連結している)、
【００７０】
式(III)で表されるK1三量体、
【００７１】
【化８】
2018507842.tif 000010
【００７２】
(式中、
- K1a、K1b及びK1cは、ポリペプチドであり、
- K1a、K1b及びK1cは、K1ペプチドドメインを含み、かかるK1ペプチドドメインは、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１の少なくとも80%の同一性、好ましくは90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
- Biotは１分子のビオチンを表し、Streptは１分子のストレプトアビジンを表し、
- K1a、K1b及びK1cは、Ｃ末端で共有結合によりBiotに連結しており、それぞれのBiotは、非共有結合によりStreptに連結している)、
【００７３】
及び、式(IV)で表されるK1四量体、
【００７４】
【化９】
2018507842.tif 000011
(IV)
【００７５】
(式中、
- K1a、K1b、K1c及びK1dは、ポリペプチドであり、
- K1a、K1b、K1c及びK1dは、K1ペプチドドメインを含み、かかるK1ペプチドドメインは、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１の少なくとも80%の同一性、好ましくは90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
- Biotは１分子のビオチンを表し、Streptは１分子のストレプトアビジンを表し、
- K1a、K1b、K1c及びK1dは、Ｃ末端で共有結合によりBiotに連結しており、それぞれのBiotは、非共有結合によりStreptに連結している)。
【００７６】
一実施形態で、本発明は、かかる多量体化合物の少なくとも10%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも90%がK1二量体の形態にある、上に定義した組成物に関する。
特に本発明は、かかる多量体化合物の少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%又は95%がK1二量体の形態にある、上に定義した組成物に関する。
【００７７】
別の態様で、本発明は、インビトロ診断ツールとしての、上に定義した多量体化合物の使用に関する。
本発明の多量体化合物は、その強力なMETアゴニスト活性により、METとHGF/SFとの相互作用の機構を理解するために使用できる。
別の態様で、本発明はまた、インビボでの診断方法に用いるための、上に定義した多量体化合物に関する。
本発明の多量体化合物は、そのMETに結合する能力により、診断方法のための、特にHGF/SF及びMET分子の発現に関与する病変の診断方法のための有用なツールである。
【００７８】
一実施形態で、本発明は、癌、急性及び慢性肝臓病、急性及び慢性腎臓病、慢性肺疾患及び慢性皮膚創傷を含む上皮器官の疾患、ニューロン疾患及び硬化症を含む中枢神経の疾患、虚血性心疾患、末梢血管疾患、糖尿病及び末梢神経障害などの関連する合併症から選択される病変のインビボでの診断方法に用いるための多量体化合物に関する。
【００７９】
一実施形態で、本発明は、かかる癌がチロシンキナーゼ受容体METを発現する腫瘍である、インビボでの診断方法に用いるための多量体化合物に関する。
別の態様で、本発明はまた、医用撮像に用いるための多量体化合物に関する。
別の態様で、本発明はまた、インビボ撮像に用いるための多量体化合物に関する。
実際、本発明の多量体化合物は、マーカーで標識することができ、MET受容体の検出、局在化、定量化を可能にする。
例えば、多量体化合物は、放射線医薬品トレーサ又は蛍光トレーサで標識できる。
【００８０】
かかる放射線医薬品トレーサとしてはカルシウム47、炭素11、炭素14、クロム51、コバルト57、コバルト58、エルビウム169、フッ素18、ガリウム67、ガリウム68、水素3、インジウム111、ヨウ素123、ヨウ素125、ヨウ素131、鉄59、クリプトン81m、窒素13、酸素15、リン32、ラジウム223、ルビジウム82、サマリウム153、セレン75、ナトリウム22、ナトリウム24、ストロンチウム89、テクネチウム99m、タリウム201、キセノン133、イットリウム90が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
かかる蛍光トレーサとしては、蛍光色素(ローダミン誘導体、クリマン誘導体、フルオレセイン誘導体など)、又は蛍光タンパク質(GFP(緑色)、YFP(黄色)、RFP(赤色)など)が挙げられるが、これらに限定されない。
特に赤外(IR)色素及び近赤外(NIR)色素、並びに蛍光タンパク質は、高い浸透性と低い自己蛍光により、インビボ撮像に好ましいトレーサである。
【００８２】
一実施形態で、本発明はまた、かかる多量体化合物により薬物及び／又は造影剤の検出及び／又は追跡を可能にする、上に定義した医用撮像に用いるための多量体化合物に関する。
特に、本発明の多量体化合物は、画像誘導手術に使用できる。現在、術前及び術中の画像化は、手術器具の入念な位置決め及び特定組織の除去において、外科医師の支援に利用されている。蛍光(IR/NIR)プローブは、術中の生体画像化に使用できる。
【００８３】
別の態様で、本発明はまた、病変のインビトロ診断用のための、上で定義した多量体化合物の使用に関し、前記病変は、癌、急性及び慢性肝臓病、急性及び慢性腎臓病、慢性肺疾患及び慢性皮膚創傷を含む上皮器官の疾患、ニューロン疾患及び硬化症を含む中枢神経の疾患、虚血性心疾患、末梢血管疾患、糖尿病及び末梢神経障害などの関連する合併症から選択される。
【００８４】
一実施形態で、本発明は、癌のインビトロ診断のための多量体化合物の使用に関し、かかる癌が、チロシンキナーゼ受容体METを発現する腫瘍である。
別の態様で、本発明はまた、インビトロ又はエクスビボ撮像のための、上で定義した多量体化合物の使用に関する。
【００８５】
別の態様で、本発明は、上で定義した多量体化合物を患者に投与する工程を含む、病変の診断方法に関し、かかる病変が、癌、急性及び慢性肝臓病、急性及び慢性腎臓病、慢性肺疾患及び慢性皮膚創傷を含む上皮器官の疾患、ニューロン疾患及び硬化症を含む中枢神経の疾患、虚血性心疾患、末梢血管疾患、糖尿病、末梢神経障害などの関連する合併症から選択される。
【００８６】
診断方法及び医用画像では、多量体化合物は、投与量(例えば生検を用いる)により又は画像(PETスキャン又はIRMなどの技術で入手したもの)により、生体試料において検出及び定量が可能である。
別の態様で、本発明は、上で定義した多量体化合物を患者に投与する工程を含む、医用撮像の方法に関する。
【００８７】
一実施形態で、本発明はまた、かかる多量体化合物により、チロシンキナーゼ受容体METの検出が可能である、医用撮像の方法に関する。
一実施形態で、本発明はまた、かかる多量体化合物により、抗体のプレターゲティングが可能である、医用撮像の方法に関する。
実際、本発明の多量体化合物は、トレーサの特定のエピトープを認識する抗体への結合が可能である。
【００８８】
別の実施形態で、本発明はまた、かかる多量体化合物により、ビオチン化トレーサの検出が可能である、医用撮像の方法に関する。
多量体化合物のこのような能力は、ビオチンひいてはビオチン化分子を結合するストレプトアビジン誘導体の能力の結果である。
【００８９】
別の態様で、本発明は、医薬的に許容可能な賦形剤と共に、上に定義した多量体化合物を含む医薬組成物に関する。
別の態様で、本発明は、医薬品として用いるための、上に定義した多量体化合物に関する。
別の態様で、本発明は、細胞生存又は組織再生を促進することによる組織損傷の治療に用いるための、上に定義した多量体化合物に関する。
【００９０】
別の態様で、本発明は、急性及び慢性肝臓病、急性及び慢性腎臓病、慢性肺疾患及び慢性皮膚創傷を含む上皮器官の疾患、ニューロン疾患及び硬化症を含む中枢神経の疾患、虚血性心疾患、末梢血管疾患、糖尿病及び末梢神経障害などの関連する合併症から選択される病変の治療に用いるための、上に定義した多量体化合物に関する。
【００９１】
一実施形態で、本発明は、かかる多量体化合物が約1 mg/kg〜1 g/kg、好ましくは約10 mg/kg〜約100 mg/kgの用量で投与可能である、組織損傷の治療に用いるための又は上に定義した病変の治療に用いるための多量体化合物に関する。
【００９２】
一実施形態で、本発明は、かかる多量体化合物が1 mg〜1,000 mg、特に10 mg〜1,000 mg、また特に100 mg〜1,000 mgの単位用量で経口又は静脈内経路により投与可能となり得る形態で使用される、組織損傷の治療に用いるための又は上に定義した病変の治療に用いるための多量体化合物に関する。
特に多量体化合物は、1 mg、5 mg、10 mg、20 mg、30 mg、40 mg、50 mg、100 mg、150 mg、200 mg、250 mg、300 mg、350 mg、400 mg、450 mg、500 mg、550 mg、600 mg、650 mg、700 mg、750 mg、800 mg、850 mg、900 mg、950 mg又は1000 mgの単位用量で投与可能である。
【００９３】
別の態様で、本発明はまた、インビボ、エクスビボ又はインビトロ条件下で血管新生を促進する多量体化合物の使用に関する。
別の態様で、本発明は、インビトロ研究用ツールとしての、上に定義した多量体化合物の使用に関する。
別の態様で、本発明は、かかる多量体化合物が、少なくとも２つのK1 ドメインによりチロシンキナーゼ受容体METと複合体化された、上に定義した多量体化合物とチロシンキナーゼ受容体METとの間の分子複合体に関する。
【００９４】
本発明を以下の図及び実施例によりで分かり易く説明される。いずれの場合でも、以下の実施例は発明の範囲を限定することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１Ａ】K1B全化学合成。(a) HGF/SFのK1ドメインの構造(PDB 1BHTから抽出した、残基125-209)。３つの内部システインブリッジ及びＣ末ビオチンの注釈は、UniProtデータベース(エントリーP14210)によってなされた。
【図１Ｂ】(b) K1Bのワンポット会合及び折り畳みの図解。
【図１Ｃ】(c) 未精製の線状K1Bドメイン(左)及び精製K1Bドメイン(中央)のRP-HPLC特性、並びに、折り畳まれたKIBドメインのMS分析(右)。
【図２】Hela細胞を100 pM又は500 pMのHGF/SF(HGF)、100 nM又は1μMのK1、及び100 nM又は1μMのK1Bで７分間処理した。次に、細胞溶解物を、特異的な全MET、Akt及びERK、又はリン酸化MET、リン酸化Akt及びリン酸化ERKのウエスタンブロット法で分析した。
【図３】細胞分散アッセイ。MDCK単離細胞膵島を1μMのK1又は1μMのK1Bを用いて、培養培地(Ctrl)の存在下で18時間インキュベートした。次に、細胞を染色して、顕微鏡下で観察(40倍)した。
【図４】K1B及びNB MET結合性。(a) NK1二量体(中央、PDB 1BHT)の構造と、二量体内のＮ(左)及びK1(右)単量体それぞれの空間相対的配向。破線矢印は、サブドメインＣ末端間の距離を示す。(b) NB、K1B及びMET-Fc結合アッセイ。NB又はK1Bの濃度を増加させて、ヒトIgG1-Fcと融合した細胞外METドメイン(MET-Fc)と混合し、ストレプトアビジンAlphaScreenドナービーズ及びプロテインＡアクセプタービーズと共にインキュベートした。エラーバーは、トリプリケートの標準偏差(+/-SD)に対応する。(c) 内因性MET捕捉。NB又はK1Bを積載したストレプトアビジン被覆ビーズを、Hela又はCapan-１の全細胞溶解物とインキュベートした。NB又はK1積載ビーズからのインプット、フロースルー及び溶出フラクションを、特異的な全METウエスタンブロット法で分析した。
【図５】４つの結合ビオチン(左、PDB 1SWE)があるストレプトアビジンホモ四量体の構造と、結合部位間の距離(右)。
【図６】AlphaScreen競合アッセイ。K1B/S複合体(2：1の比)の濃度を増加させて、予め混合したK1B(20 nM)/MET-Fc(2 nM)/アルファビーズに添加した。アルファ信号のIC50を測定した。グラフは、K1Bの２つの異なるロットを用いて、少なくとも３回再現された実験を表す。エラーバーは、トリプリケートの標準偏差(+/-SD)に対応する。
【図７】K1B/S複合体の分析。K1B及びストレプトアビジンの比率を大きくして(0：1から8：1まで)、MES緩衝液中のNuPage(登録商標)ゲルでのSDS‐PAGEにより、非変性条件下で分析した。ゲルを固定して、クーマシーブリリアントブルーで染色した。それぞれの複合体組成についてのK1B：S比を、図６に示す位置での、対応するA、B、C、Dの相対的ビオチン結合部位で示した。
【図８Ａ】(a) 自然条件下でのK1Bの質量スペクトル。
【図８Ｂ】(b) K1Bによるストレプトアビジンの力価測定。K1Bを添加すると、ストレプトアビジンに対して、K1Bの1〜4分子の結合に相当する新規の種が明確に見える。
【図８Ｃ】(c) K1B：S比に依存する、それぞれの種の相対的強度。
【図９】最適なK1B：S比の決定。Hela細胞を、50 nMストレプトアビジン(S)、500 pMの成熟HGF/SF(HGF)、400 nM のK1B、及び(1：1から8：1まで)比率を大きくしたK1B/S混合物で、50 nMのストレプトアビジンと共に７分間処理した。次に、細胞溶解物を、特異的な全MET、Akt及びERK、又はリン酸化MET、リン酸化Akt及びリン酸化ERKのウエスタンブロット法で分析した。
【図１０】ヒトIgGの構造：２つのパラトープ間の距離は13.7 nm(PDB1IGt)である。
【図１１Ａ】K1B/S刺激に対するMETシグナル伝達分析。(a) Hela細胞を、50 nMのストレプトアビジン(S)、50 nMの抗ビオチン抗体(Ab)、500 pMの成熟HGF/SF(HGF)、100 nM及び1μMのK1B、100 nMのK1B/S、100 nMのK1B/Ab、及び100 nMのNK1で７分間処理した。次に、細胞溶解物を、特異的な全MET、Akt及びERK、又はリン酸化MET、リン酸化Akt及びリン酸化ERKのウエスタンブロット法で分析した。Ctrl：ビヒクル、MW：分子量。(b) Hela細胞を、成熟HGF/SF、K1B/S、NK１及びK1B/Abの濃度を増加させて７分間処理した。ERK及びAktの活性化レベルを、HTRF技術を用いて測定し、665/620 nm HTRFシグナル比としてプロットした。
【図１１Ｂ】(c) K1B/S及びNK1、K1B/Abの反応速度分析。Hela細胞を、100 nMのK1B又はNK1で１分間、５分間、10分間、20分間、30分間、40分間又は90分間処理した。次に、細胞溶解物を、特異的な全MET、Akt及びERK、又はリン酸化MET、リン酸化Akt及びリン酸化ERKのウエスタンブロット法で分析した。(d) HGF/SF、K1B/S、NK1及びK1B/Abの反応速度分析。Hela細胞を、100 pMのHGF/SF、50 nMのK1B/S、50 nMのNK1又は400 nMのK1B/Abで１分間、３分間、５分間、７分間、10分間、15分間、20分間、30分間、60分間又は90分間処理した。ERK及びAktの活性化レベルを、HTRF技術を用いて測定し、665/620 nm HTRFシグナル比としてプロットした。
【図１２】METチロシンリン酸化プロファイルの分析。Hela細胞を、50 nMのストレプトアビジン(S)、50 nMの抗ビオチン抗体(Ab)、500 pMの成熟HGF/SF(HGF)、10又は100 nMのK1B、100 nMのK1B/S、100 nMのK1B/Ab又は100 nMのNK1で７分間処理した。次に、細胞溶解物を、全MET及びリン特異的MET Y1234-1235及びY1349-1356残基を用いてウエスタンブロット法で分析した。
【図１３】HGF/SF、K1B/Abの反応速度分析。Hela細胞を、500 pMのHGF/SF又は100 nMのK1B/Abで１分間、５分間、10分間、20分間、30分間、40分間又は90分間処理した。次に、細胞溶解物を、特異的な全MET、Akt及びERK、又はリン酸化MET、リン酸化Akt及びリン酸化ERKのウエスタンブロット法で分析した。
【図１４】Hela細胞を、100 pMのHGF/SF(HGF)、1μMのNB及び1μMのNB/S(2:1比)、500 nMのストレプトアビジン(S)で７分間処理した。Ctrl：ビヒクル。次に、細胞溶解物を、特異的な全MET、Akt及びERK、又はリン酸化MET、リン酸化Akt及びリン酸化ERKのウエスタンブロット法で分析した。
【図１５】細胞分散アッセイ。MDCK単離細胞島を、培養培地(Ctrl)、500 pMのHGF/SF (HGF)、500 nMのストレプトアビジン(S)、1μMのNB又は1μMのNB/Sで18時間インキュベートした。次に、細胞を染色して、顕微鏡下で観察(40倍)した。
【図１６】K1B/Sで誘導される細胞表現型。(a) 細胞分散アッセイ。MDCK単離細胞島を、50 nMのストレプトアビジン(S)、50 nMの抗ビオチン抗体(Ab)、500 pMの成熟HGF/SF(HGF)、100 nMのK1B、100 nMのK1B/S、100 nMのNK1及び100 nMのK1B/Abで18時間インキュベートした。次に、細胞を染色して、顕微鏡下で観察(40倍)した。(b) マトリゲル形態形成アッセイ。MDCK細胞をマトリゲルの層に播種して、50 nMのストレプトアビジン(S)、50 nMの抗ビオチン抗体(Ab)、500 pMの成熟HGF/SF(HGF)、100 nMのK1B、100 nMのK1B/S、100 nMのNK1及び100 nMのK1B/Abで18時間処理した。次に、細胞を顕微鏡下で観察(40倍)した。(c) MITアッセイ。MDCK細胞を、アニソマイシン(0.7μM)添加又は無添加の0.1%FBS含有培地中に、500 pMの成熟HGF/SF(HGF)、100 nMのK1B、100 nMのK1B/S、100 nMのNK1及び100 nMのK1B/Abの存在下で一晩(15時間)培養した。次に、MITアッセイを実施して、細胞生存を評価した。結果を未処理対照のパーセンテージで表される。ANOVA試験をP値<0.05を統計的有意と考えて実施して、３つの平均を比較した。(d) 血管新生。マウスに、マトリゲルと、1 nMのHGF/SF (HGF)、10 nMのVEGF、100 nMのNK1、100 nMのK1B/S、100 nMのK1B又は50 nMのSとの混合液を注射した。ヘモグロビン吸光度を測定し、レートへモブロビン標準曲線及びプラグ重量を用いて濃度を決定した。ANOVA試験を全ての平均の比較に実施し、P値<0.001は統計的有意差を示すと考えられた。
【図１７Ａ】インビボMET活性化アッセイ。(a) FVBマウスに体重グラム当たりで、PBS(ctrl)、25 pmolのK1B(250 ng)、25 pmolのK1B/S複合体(250 ngのK1/700 ngのS)、25 pmolのNK1(500 ng)又は2.5 pmolの成熟HGF/SF(250 ng)を静脈注射した。10分後に肝臓を取り出し、急速冷凍して破砕した。細胞溶解物中のMET、Akt及びERKのリン酸化状態をウエスタンブロット法で分析した。２匹のマウスから得たデータは、３つの独立した実験を表す。(b) FVBマウスに、体重グラム当たり25 pmolのK1B(250 ng)、25 pmolのK1B/S複合体(250 ng/700 ng)、25 pmolのNK1(500 ng)若しくは2.5 pmolの成熟HGF/SF(250 ng)、又はPBSと混合した125 ngの抗Fasモノクローナル抗体(aFas)を静脈注射した。抗Fasが入っていない２回目の注射を90分後に実施した。３時間経過後、肝臓を取り出してホルマリンで固定した。
【図１７Ｂ】(c) 冷凍した肝臓切片を、組織学的観察(40倍)のためにヘマトキシリン-エオシンで染色した。(d) 冷凍した肝臓切片を、アポトーシス核標識(緑色)のためにApoptag(登録商標)キットで処理し、全ての核の標識(青色)のためにDAPIで対比染色した(100倍、挿入：アポトーシス細胞で200倍)。
【図１８】マウスに、濃度を増加させたK1B/S複合体(5 ngのK1B/14 ngのS、25 ngのK1B/70 ngのS、及び250 ngのK1B/700 ngのSに相当する0.5、2.5又は25 pmol/g)、25 pmolのK1B/g(250 ng/g)又は25 pmol/gのNK1(500 ng/g)を注射した。10分後に肝臓を取り出し、急速冷凍して破砕した。細胞溶解物を、特異的な全MET、Akt及びERK、又はリン酸化MET、リン酸化Akt及びリン酸化ERKのウエスタンブロット法で分析した。
【図１９】インビボMET活性化動力学。マウスに、体重グラム当たり25 pmolのK1B/S(250 ng/700 ng)を注射し、０、10、20又は30分後に肝臓を取り出し、急速冷凍して破砕した。細胞溶解物を、特異的な全MET、Akt及びERK、又はリン酸化MET、リン酸化Akt及びリン酸化ERKのウエスタンブロット法で分析した。
【図２０】Fas誘発性劇症肝炎。FVBマウスに、体重グラム当たり25 pmolのK1B、25 pmolのK1B/S複合体、25 pmolのNK1、12.5 pmolのストレプトアビジン(S)若しくは2.5 pmolの成熟HGF/SF、又はPBSと混合した125 ngの抗Fasモノクローナル抗体(aFas)を静脈注射した。抗Fasが入っていない２回目の注射を90分後に実施した。肝臓を取り出し、急速冷凍して破砕した。タンパク質を、特異的な全MET、PARP 1/2、カスパーゼ3、切断カスパーゼ3及び全ERKのウエスタンブロット法で分析した。
【実施例】
【００９６】
実施例１  ビオチニル化K1とNドメインの全化学合成
K1ドメイン(HGF/SF 125-209)は85アミノ酸残基から構成され、その三次構造は、３つのジスルフィド結合で安定化されている(図1A)。K1Bでは、K1一次構造は、２つのグリシン残基と、ビオチン基で側鎖が修飾された１つのリジン残基との付加により、Ｃ末端において延長された。K1Bの化学合成は、ワンポット逐次３ペプチドセグメント会合法において固相ペプチド合成法(SPPS)を用いて実施され、これは、HGF/SFセグメント125-148(セグメント1)、149-176(セグメント2)及び177-209(セグメント3)の調製を要し、最後のものはGGK(ビオチン)伸長を有する(図1B)。チオエステル及びビス(2-スルファニルエチル)アミド環状ジスルフィド(SEAoff)基を、それぞれペプチドセグメント1及びセグメント2のＣ末端に導入した。K1B線状ポリペプチドの会合は、天然型化学的ライゲーション反応を用いて、チオエステルセグメント1をセグメント2に結合させて開始させた。この反応は、ブロックされたＣ末端SEAoff基を特徴とするセグメント1-2の良好な形成をもたらした。トリス(2‐カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)を用いた還元によるSEAoff基の活性化、及びビオチン化セグメント3の添加により、天然ペプチドライゲーション工程と、未精製反応混合物のLC-MS(図1C、左)により示される線状K1B HGF/SFドメインの良好な形成とを誘発させた。線状K1BをHPLCで精製して、3.6mg(全体の40%)の均質材料を得て(図1C、中央)、続いて、グルタチオン-グルタチオンジスルフィド酸化還元系を用いて折り畳まれた。折り畳まれたKIBドメインのプロテオミクス分析により、天然ジスルフィド結合パターンの形成を立証された(図1C、右)。
【００９７】
興味深いことに、HeLa細胞を用いたMETリン酸化アッセイ(図２)及びMDCK細胞を用いた細胞分散アッセイ(図３)により、K1B活性は、非修飾合成K1ドメインと区別できず、また、組換K1ドメインで知られているように、ミクロモルのMETアゴニストとして振る舞うことが示された。その結果、ビオチン基の導入は、現時点では、K1Bの生物学的活性に検出可能な影響を与えなかった。
【００９８】
実施例２  K1多価複合体の設計
NK1ホモ二量体結晶構造におけるＮ及びK1ドメインの相対的位置の分析により、２つのＮドメインのＣ末端と２つのK1ドメインのＣ末端とが、僅か1.3〜2 nmの距離で隔てられていることが明らかになった(図4A)。興味深いことに、ストレプトアビジンホモ四量体(S)内の個々のビオチン結合部位は2.0〜3.5 nmの距離で隔てられている(図5)。このことから、K1B/S又はNB/S複合体の形成は、NK1二量体に見られるＮ及びK1ドメインの相対的距離及び位置を互いに独立して再現すると予想された。
【００９９】
METへのK1B/S複合体の結合を、AlphaScreen技術を用いて測定した。K1Bを、ストレプトアビジンで被覆したドナービーズに積載し、かつプロテインＡ被覆アクセプタービーズに積載された組換型細胞外MET-Fcキメラとインキュベートした。K1B/Sドナービーズが、MET-Fc/プロテインＡアクセプタービーズと相互作用する場合、化学エネルギー移動がビーズ間で可能になり、レーザ励起による蛍光放射をもたらす。
【０１００】
K1Bは、単量体K1タンパク質-MET相互作用について報告されたKDよりも約100倍低い見かけの解離定数KD(16 nM未満)において、強い信号強度を誘導した(図4B)。ビーズに基づくAlphaScreenアッセイは結合活性を生じ、飽和実験における見かけのKDの推定にバイアスを持ち込むので、相互競合アッセイを、予め形成されたK1B/S複合体(モル比2：1)の濃度を大きくして、K1B/MET-Fc/AlphaScreenビーズ混合物へ添加することにより実施した(図6)。この競合アッセイにより、IC50(〜14 nM)が測定され、飽和アッセイからの見掛けのK1B/MET-Fc KDと完全に一致した。
【０１０１】
この試験は、全細胞溶解物からの内因性METへのK1B/S複合体の結合を調べることにより完了した(図4C)。ストレプトアビジン被覆アガロースビーズをK1Bとインキュベートして、固定化複合体を形成した後、Hela又はCapan-1細胞からの全溶解物とインキュベートした。溶出物のウエスタンブロット分析により、K1B/S複合体が、細胞溶解物からMETを捕捉できたことが示された。
総合すると、これらのデータより、半合成K1B/S複合体はMETと低ナノモル濃度で相互作用が示され、かつK1-MET相互作用系における多価性の重要性が示唆された。
【０１０２】
実施例３  半合成K1B/S複合体は強力なMETアゴニストである
これらの結果は、ヒトHeLa細胞株におけるインビトロ細胞アッセイを用いる、K1B/S複合体のアゴニスト活性を評価するためのステージを提供する。このために、K1B/S複合体形成の化学量論を2：1に固定し、これにより、ストレプトアビジン四量体当たりのK1Bタンパク質結合数が異なる複数の種を生成した。このモル比を用い、且つそれぞれのビオチン結合単位が独立していると仮定すると、ストレプトアビジン当たり結合している0、1、2、3又は4K1Bタンパク質の可能性はそれぞれ6%、25%、38%、25%及び6%に対応し、これは理論上、69%のK1B/S多量体を意味する。実際、このK1B/S多量体は、SDS-PAGE分析(図7)及び非変性質量スペクトル分析(図８)により同定された。後者の技術を用いることで、2：1のK1B：Sモル比は、K1B/S多量体の中で少なくともペアとして存在する75%のK1ドメインをもたらすと推定された。実際には、混合物中のK1Bの比率を3：1から最大で8：1まで高くしても効力は高くならなかったので、2：1のK1B：Sモル比は、最大細胞応答の達成には十分であることが分かった(図９)。
【０１０３】
K1Bと抗ビオチン抗体(Ab)とを2：1のモル比で混合して生産される別の複合体も設計した。抗体による一定のK1B二量体は、各K1Bタンパク質間の距離が13〜20 nmであり、NK1結晶構造又はK1B/S複合体で見られる距離よりも顕著に大きいが、その生産が期待されている(図10)。
【０１０４】
HGF/SF、K1B、K1B/S、K1B/Ab又は組換NK1とのインキュベーションにおけるHeLa細胞でのMET活性化及び下流のシグナル伝達を、ウエスタンブロット法で分析し、HTRFアプローチで定量化した(図11A及びB)。典型的には、HGF/SFはpM濃度まで、最大のERK及びAkt活性化を誘発した。興味深いことに、K1B/S複合体は、ERK及びAktのリン酸化レベルを、低いnMの範囲まで誘発するできたので、NK1タンパク質と同様のアゴニスト活性を示した。さらに、K1BではなくK1B/Sは、100 nMで強力なMETリン酸化を誘導した。組換K1の文献に記載されるように、K1BによるMET活性化はμM濃度でのみ検出され、強い受容体活性化の達成に関する多価性の重要な役割を強調する。類似する多価プロセスは、K1Bとは異なり、K1B/Ab複合体について明白であり、また100 nMで有意なMETリン酸化を誘導した。
【０１０５】
しかし、K1B/Abは、顕著なERK及びAktの下流シグナル伝達を誘発できなかったので、K1B/Sに比べて有意に低活性であった(図11A)。METリン酸化パターンをチロシンレベルで分析した。実際、チロシン1234及び1235の自己リン酸化は、MET活性化に繋がる最初の事象であり、持続したキナーゼ活性を解除及び維持するのに重要である。次に、METシグナル伝達を伝搬させ、増幅させ、多様化させる足場パートナーへの認識部位の提供に、Ｃ末端チロシン1349及び1356のリン酸化が必要となる。K1B/Ab及びK1B/Sの両方とも、チロシン1234及び1235でのMET自己リン酸化を活性化させた。しかし、K1B/Sとは異なり、K1B/Abはチロシン1349及び1356のリン酸化を誘発できなかったので(図12)、下流シグナル伝達カスケードを誘発できなかった。このことは、抗体複合体におけるK1Bドメイン間の長い距離に起因しており、よって、MET二量体の最適下限の安定化に起因しているかもしれない。
【０１０６】
また、ウエスタンブロット法(図11C)及びHTRF(図11D)を用いて、MET及び下流シグナル伝達の活性化動力学(0〜90分間)を測定した。典型的には、HGF/SFの誘導により５分から10分の間でMET自己リン酸化が最大となり(図13)、続いてAkt及びERKのリン酸化が約10分から15分の間で最大となり、その後ゆっくり時間と共に低下した。比較すると、METリン酸化は、K1B/S及びNK1では非常に速やかに、すなわち最初の１分間以内に進行した後、HGF/SFのレベルよりも低下した。このことから、最大のERK及びAkt活性化は早い時期に、つまり僅か３分から７分後に観察された。これに対して、K1B/Ab複合体は弱いMET活性を誘導し(図13)、下流シグナル伝達はHGF/SF、NK1又はK1B/Sよりも早く衰退した。
【０１０７】
最後に、結合実験から予期されるように、NB/S複合体はアゴニスト活性を示さず(図14)、いかなる細胞表現型も促進しなかった(図15)。
総合すると、これらの結果は、K1B/S複合体がNK1アゴニスト活性を再現することを示し、K1がMET活性に必要な最小のHGF/SF機能ドメインであることを示す。さらに、これらのデータは、(天然又は合成の)二量体構造内の２つのK1ドメインを分離する距離及び／又は配向が、完全なMET活性化の誘導に重要であることを示す。
【０１０８】
実施例４  K1B/Sは細胞分散、形態形成、生存及び血管新生の表現型を促進する
MDCK細胞(この表現型アッセイでの対照株化細胞)において細胞分散を誘導するMETアゴニストの能力を評価した(図16A)。18〜24時間のHGF/SF(100 pM)存在下で、MDCK細胞は、間葉様表現型及び分散性を取得した。K1B及びK1B/Abでの分散が弱い一方で、この際立った表現型は、NK1タンパク質及びK1B/S複合体によっても誘導された。特に、分散表現型を誘導するアゴニストの能力は、MET、ERK及びAktキナーゼの持続的リン酸化を誘導する能力と強く相関すると思われる。
【０１０９】
さらなる細胞アッセイを、基底細胞外マトリクスの模倣として管腔基底細胞様マトリクス(マトリゲル)を用いて行った。この条件下で無処理の場合、MDCK細胞は、24時間以内にマトリゲル上に密な球状クラスターを自発的に形成する。これに対して、HGF/SFで刺激すると、MDCK細胞は、分岐した連結構造に自己組織化する。特に、NK1及びK1B/Sは、かかる構造の形成を広範囲にわたって促進したが(図16B)、K1B及びK1B/Abは促進できなかった。
【０１１０】
アポトーシスストレス後の細胞の生存を促進するアゴニストの能力を試験した。この表現型は、血清除去、紫外線照射、虚血又は一部の化学物質により誘導される死に対して多くの細胞型を保護するHGF/SFの特徴である。MDCK細胞に、DNA及びタンパク質合成の阻害剤であってアポトーシスを誘導するアニソマイシンを用いてストレスを加えた。アニソマイシン処理は、16時間後に90%以下の細胞死を誘導したが、HGF/SFで前処理した場合は僅か50%の細胞死であった(図16C)。K1B/S又はNK1は同様の生存率を示したが、K1B又はK1B/Ab複合体は細胞の保護に著しく失敗した。
【０１１１】
明らかに、これらの結果は、インビトロでK1B/Sが、強力なMETアゴニストとしてNK1の性質を完全に模倣することを示している。この観察をインビボに適用するため、異なるアゴニストを免疫不全SCIDマウスにマトリゲルプラグを用いて皮下注入して、血管新生を誘導した。実際、HGF/SFは、内皮細胞の増殖及び移動を刺激する強力な血管新生因子である。11日後にプラグを取り出し、誘導された血管新生の指標として、プラグに浸透したヘモグロビンの量を測定した(図16D)。予想通りに、VEGF又はHGF/SFは、対照プラグに比べて、強力な血管新生特性を示した。K1B/Sは、VEGFでの量に匹敵するヘモグロビン量の血管形成を誘導し、NK1又はK1Bで誘導されたものと比べると有意に高かった。このように、NK1及びK1B/Sは、インビトロ細胞アッセイでは同様の効力を示したが、これらの血管新生特性はインビボでは有意に異なった。
【０１１２】
実施例５  KIB/S複合体は肝臓でMETを活性化して、FAS誘発性劇症肝炎を損なう
この最後のアッセイでは、全身性に注射したときに、K1B/S複合体がインビボで、離れた組織において作用できるのかを、つまり、可能性のある治療上の関心がもたれる強力なMETアゴニストを設計するための基礎となり得るのかを調べた。最初のアプローチでは、異なるアゴニストを静脈注射して、MET受容体が強く発現していることが知られた臓器である肝臓におけるMET及び下流経路の活性化を調べた。10分後に肝臓を取り出して、MET、ERK及びAktのリン酸化状態をウエスタンブロット法で分析した(図17A)。K1B/S、NK１及びHGF/SFの注射により、肝臓での強いAkt及びERK活性化に関連する明らかなMETリン酸化が誘導された。重大なことには、K1B/Sによる活性化は、mg体重当たり最低2.5 pmol(250 ng)の用量で(図18)、且つ注射後30分まで検出可能であった(図19)。これに対して、K1B及びストレプトアビジン対照では、検出可能なシグナルをが生じなかった。
【０１１３】
K1B/S複合体が血液循環により肝臓に拡散でき、且つMET活性化を誘導できる点を考慮して、アポトーシスストレスを肝臓に誘導したときに、該複合体が、肝細胞生存を促進できるかを調べた。実際、マウスへの抗Fas抗体(抗CD95)の注射により、広範囲の肝細胞アポトーシスを誘導し、劇症肝炎及び動物の死に繋がる。過去の研究では、HGF/SFがFAS誘発性劇症肝炎を抑止できたことを示したが、顕著な効果を出すには膨大な量(通常は1 nmol、つまりマウス当たり100μg以下)を必要とした。このアッセイでは、抗FAS抗体を、mg体重当たり25 pmolのK1B、K1B/SもしくはNK1、又は2.5 pmolの成熟HGF/SFと混合した。これらの濃度は、少なくとも30分間、強いMETシグナル伝達を促進するのに十分であった。90分後、それぞれのタンパク質の２回目の注射をして、シグナル伝達を維持した。組織学的及び分子分析のために、３時間経過後に肝臓を取り出した。
【０１１４】
肉眼で見ると、抗FAS抗体及びK1B、NK1又は成熟HGF/SFで処理されたマウスでは、PBS潅流及び血管血液成分の除去後も濃褐色の変性した肝臓を示した(図17B)。注目すべきことに、K1B/Sで処理されたマウスでは、ほぼ完全な状態のきれいな肝臓を維持した。組織学的分析により、この黒ずんだ色は主として、広範囲での肝細胞の喪失に起因する血管うっ血とその後の血液の浸潤により誘導されたことが立証された。対照及びHGF/SF処理マウスでは、顕著な血液の浸潤を伴って全体的に組織が破壊された肝臓を示した。これに対して、K1B/Sマウスでは、部分的な血液の浸潤が見られたが、良好に組織化された構造を維持した。NK1処理マウスでは、一部の組織化された領域を維持したが広範囲に血液の浸潤があるという、中間の表現型を示した。さらなる分析により、これらの組織破壊された領域が、アポトーシスした肝細胞の大きなクラスターに該当することを確認した(図17D)。興味深いことに、抗Fas抗体で攻撃された全てのマウスでは、K1B/S複合体で保護された動物であっても、切断カスパーゼ3及びPARP 1/2などのアポトーシスに特有の初期分子マーカーを示した(図20)。これらの結果は、FAS受容体活性化に続く初期の段階ではK1B/Sは作用せず、むしろ、下流の細胞内アポトーシスシグナル伝達に作用することを示す。
【０１１５】
これらの組織学的及び分子分析により、K1B/S複合体が、全身的に作用し、肝臓においてMETシグナル伝達を効果的に活性化させ、且つ、極端なアポトーシスストレス条件下においても強力な生存因子であることが示された。K1B/SがNK1よりも強力であるという事実は、将来的なMETアゴニスト設計において、これらの所見の意義を強調している。
【０１１６】
方法
タンパク質の化学合成
K1のＣ末端ビオチン(K1B)の全化学合成は、HGF-SFの生物学的に活性なK1ドメインの合成について記載したとおり(Ollivier et al., A one-pot three-segment ligation strategy for protein chemical synthesis. Angew Chem Int Ed 51, 209-213, 2012)、ワンポットプロトコール処理において３つのフラグメントを用いて実施した。全長合成した88残基のポリペプチドの最終精製、及び３つのジスルフィドブリッジの同時形成による折り畳みにより、合成の生物活性K1Bを生成した。当該タンパク質を等分にして、−80℃で保存した。
【０１１７】
KIB/S複合体の設計
NK1(エントリー１BHT)とストレプトアビジン(エントリー1SWE)の構造は、PDBデータベースから取得した。K1ドメイン部分の抽出、可視化及び距離の測定は、PyMOL v1.7ソフトウエア上で実施した。
【０１１８】
結合及び競合アッセイ
組換MET-Fcタンパク質へのK1Bの結合に対する競合アッセイは、384-ウェルマイクロタイタープレートにおいて実施した(OptiPlate(商標)-384, PerkinElmer, CA, USA, 50 μLの最終反応容積)。最終濃度は、K1Bが0〜300 nM、MET-Fcが2.5 nM、ストレプトアビジンで被覆したドナービーズ及びプロテインＡ結合アクセプタービーズが10μg/mLであった。すべてのタンパク質溶液とビーズ懸濁液との調製に使用した緩衝液は、PBS、5 mMのHEPES pH7.4、0.1% BSAであった。
【０１１９】
K1B及びMET-Fc結合アッセイについて、K1B(10μL、0〜1.5μM)をhMET-Fc溶液(10μL、10 nM)と混合した。混合液を10分間インキュベートした(最終体積15μL)。次に、プロテインＡ結合アクセプタービーズ(10μL、50μg/mL)をバイアルに添加した。プレートを暗箱内において30分間、23℃でインキュベートした。最後に、ストレプトアビジンで被覆したドナービーズ(10μL、50μg/mL)を添加した後、プレートを暗箱内において30分間、23℃でインキュベートした。放射信号強度を、EnSpire(登録商標)マルチモードプレートリーダ(PerkinElmer)を標準アルファ設定にして測定した。競合アッセイについては、K1B/S複合体(比2：1)の濃度を増加させて、予め混合したK1B(20 nM)/MET-Fc(2 nM)/ALPHAビーズ(10μg/mL)複合体に添加した。
【０１２０】
内因性MET捕捉
NB又はK1Bを積載したストレプトアビジン被覆ビーズを、Hela又はCapan-１全細胞溶解物とインキュベートした。NB又はK1積載ビーズからのインプット、フロースルー及び溶出フラクションを、特異的な全METウエスタンブロット法により分析した。
【０１２１】
細胞培養及び薬剤処理
ATCC(登録商標)(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Rockville、MD、USA)から購入したメイディン・ダービー・イヌ腎臓(MDCK)細胞及びヒト子宮頸癌Hela細胞は、10%FBS(ウシ胎児血清、Gibco(登録商標)、Life technologies、Grand Island、NY、USA)及び5 mLのZellShield(商標)(Minerva Biolabs GmbH、Germany)を補充したDMEM培地(ダルベッコ改変イーグル培地、Gibco, Karlsruhe、Germany)で培養した。薬剤処理の24時間前に培地を0.1%FBS含有DMEMに交換し、細胞を、異なる化合物を用いて異なる時間で処理した。
【０１２２】
HTRF法によるAkt及びERKリン酸化アッセイ
HTRF(登録商標)(Cisbio bioassays, Bedford, MA, USA)に記載の製造業者のプロトコールに則って、アッセイを実施した。手短に言えば、細胞をプレートに播種して、異なるアゴニスト(HGF/SF、NK1、K1B/S及びK1B/Ab)で刺激した後、同じ96ウエル培養プレート中で溶解した。溶解物(16μL)を384-ウエルマイクロプレートに移して、リン酸化Art(Ser473)及びERK(Thr202/Tyr204)の検出を、２つの異なる特異的モノクローナル抗体、d2(アクセプター)で標識された抗体及びEu3＋クリプテート(ドナー)で標識された抗体を用いるサンドイッチアッセイのフォーマットを介するHTRF(登録商標)試薬により行った。抗体をあらかじめ混合し(抗体はそれぞれ2μLで)、単一の分注工程にて添加した。色素がきわめて近接している場合、光源(レーザ)を用いたドナーの励起により、アクセプターの方への蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を誘発させ、そしてこれにより、特定の波長(665 nm)の蛍光が発せられる。レーザで励起すると、d2分子とEu3＋クリプテート分子との間のエネルギー移動が起こり、EnVision(登録商標)マルチラベルリーダ(PerkinElmer)において蛍光が620及び665 nmで検出される。データは、信号正規化のため、620/665 nm比として表される。
【０１２３】
血管新生
この実験には、体重が19〜21 gの免疫不全SCIDマウスを使用した。マウスを22℃で12時間の明暗周期の施設に収容し、餌と水の摂取を自由にした。成熟HGF/SF、VEGF-A、NK1、K1B、ストレプトアビジン及びK1/S複合体を、増殖因子低減Matrigel(商標)(BD Biosciences, Becton Dickinson, Belgium)に添加した。400μLのマトリゲルをマウス(n=6)の脇腹に皮下注射した。11日後に、マウスを犠牲にして、マトリゲルプラグを除去して重さを量り、300μLの水を加えて、低張圧での赤血球溶解及びヘモグロビン放出を誘導した。ヘモグロビン吸光度(405 nm)を測定し、濃度をへモブロビン標準曲線及びプラグ重量に対して決定した。
【０１２４】
すべての実験手続きは、Nord Pas de Calais Regionの動物実験に対する倫理委員会の承認を得て実施された(CEEA 75)。
【０１２５】
FAS誘発性劇症肝炎
この実験には、体重が19〜21 gのFVBマウス(Charles River)を用いた。イソフルラン(Aerrane, Baxter, USA)を用いた麻酔の後、PBS中に異なるアゴニスト(HGF/SF、NK1及びK1/S)と混合した抗Fas抗体を、体重当たり125 ng/gでマウス(n=3)に静脈注射した。最初の注射から90分後、マウスに、それぞれのアゴニストで２回目の注射をした。さらに３時間後に、マウスを犠牲にし、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を補充したPBSで肝臓を潅流した。
【０１２６】
並行して、肝臓でのMET活性化の可視化のために、マウスに10分間、それぞれのアゴニストの静脈注射をした。
【０１２７】
組織学的分析のため、肝臓組織を回収し、4％パラホルムアルデヒドで一晩固定し、イソペンタン中で急速冷凍し、液体窒素中に浸漬して、OCT(Tissue-Tek(登録商標)、VWR、PA、USA)に包埋した。冷凍した肝臓切片(5μm)を、一般的な形態に対するヘマトキシリン及びエオシン(HE)で染色した。アポトーシスに対するTUNEL染色も、製造業者(Apoptag(登録商標) Fluorescein Direct In Situ kit, Merck Millipore, Billerica, MA, USA)の指示書に則って、肝臓切片に実施した。分子分析のために、取り出した肝臓組織を液体窒素中で直ちに冷凍した。肝臓を、新たに添加したプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を補充した溶解用緩衝液中で破砕した。
【０１２８】
試薬及び抗体
組換ヒトHGF/SFはInvitrogen(Breda, Netherlands)から購入し、組換VEGF-AはR&Dシステム(Minneapolis, MN, USA)から購入し、ストレプトアビジン(ストレプトマイセス・アビジニ)はProZyme(Hayward, CA, USA)から購入し、アニソマイシン(ストレプトマイセス・グリセオルス)はCalbioChem(Germany)から購入した。組換ヒトNK1タンパク質(残基28-209)はErmanno Gherardi教授(University of Pavia(Italy))のご厚意で提供された。METのキナーゼドメインに対する抗体はInvitrogen から購入し、抗リン酸化MET(Tyr1234/1235)抗体、抗リン酸化MET(Tyr1349)抗体、抗トータルAkt抗体、抗リン酸化Akt(Ser473)抗体、抗リン酸化ERK1/2(Thr202/Tyr204)抗体及び抗カスパーゼ3抗体はCell Signaling(Massachusetts, USA)から購入し、抗ERK2(C-14)抗体及び抗PARP1/2抗体はSanta Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)から購入した。抗ビオチンモノクローナル抗体、及び、ウサギ又はマウスIgGに対する西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合抗体は、Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA, USA)から購入した。
【０１２９】
K1B/S複合体の特徴付け
K1B及びストレプトアビジン複合比は、試料を加熱せず、MES緩衝液中で行う10％NuPageプレキャストゲルを用いるSDSPAGEにより分析した。ゲルを20％メタノール及び5％酢酸中で30分間固定し、クーマシーブリリアントブルーにより染色した。
【０１３０】
非変性質量スペクトル分析
まず、ストレプトアビジン及びK1Bを、Zeba(商標)ベンチトップスピン脱塩カラム(Thermo Scientific)を使用して200 mM酢酸アンモニウム(pH7.4)でバッファー交換した。タンパク質濃度を、K1B及びストレプトアビジンに対して、それぞれ16,500 M-1cm-1及び165,000 M-1cm-1の吸光係数を使用して、280 nmにおける吸光度を測定して決定した。滴定は、ストレプトアビジンに０から５モル当量のK1Bを添加して実施した。サンプル当たり10μlの体積で調製し、最終濃度を１から20μMまでの範囲とした。非共有結合性MS分析は、陽イオンモードで運転する自動化チップベースのナノエレクトロスプレー装置(Triversa Nanomate, Advion Biosciences, Ithaca, USA)に連結したSynapt G2 HDMX(Waters, Manchester, UK)で実施した。
【０１３１】
機器パラメータについて、キャピラリー、サンプルコーン及び引出コーンの電圧は、それぞれ1.55 kV、65 V、5 Vに設定した。背圧を6 mbarまで上げて、衝突冷却による高分子量種の伝搬を向上させた。キャリブレーションは、2 mg/mlのヨウ化セシウム溶液を用いて実施し、データは、MassLynx software v.4.1(Waters, Manchester, UK)を用いて分析した。
【０１３２】
内因性MET捕捉
HeLa及びCapan-1細胞をスクレイピングで回収し、溶解用緩衝液(20 mM Tris HCl、50 mM NaCl、5 mM EDTA、1% Triton X-100)を用いて氷上で溶解した。溶解物を遠心分離(20,000g x 15分)により取り除き、タンパク質濃度を測定した(BCA protein assay Kit, Pierce(登録商標), Thermo scientific, IL, USA)。ストレプトアビジン-セファロースビーズ(GE Healthcare)を洗浄し、PBS中で平衡化した。ビーズ(PBS：ビーズスラリーが50：50である100μlビーズ)に15μgのK1B又はNBを室温で20分間積載し、直後にPBSで洗浄した。ビーズを250μgのタンパク質細胞溶解物と一晩、4℃でインキュベートした。ビーズを素早くPBSで洗浄し、結合したタンパク質を200 mMのグリシン緩衝液(pH2)で溶出した。次に、溶出フラクションをウエスタンブロット法で分析した。
【０１３３】
ウエスタンブロット法
細胞をスクレイピングで回収し、新たに添加されたプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤(それぞれ#P8340と#P5726、Sigma)を補充した溶解用緩衝液(20 mM HEPES pH 7.4, 142 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 5%グリセロール, 1% NP40 and 0.1% SDS)を用いて氷上で溶解した。溶解物を遠心(20,000g x 15分)により取り除き、タンパク質濃度を測定した(BCA protein assay Kit, Pierce(登録商標), Thermo scientific, IL, USA)。同じタンパク質量の細胞抽出物を古典的なSDS-PAGE又はNuPAGE(4-12％又は10％ビス-トリスプレキャストゲル)(Life technologies)かのいずれかで分離し、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜(Merck Millipore)に電気的に転写した。膜を、示された一次抗体によってプローブし、続いて適切なHRP結合二次抗体を用いてインキュベーションした。タンパク質-抗体複合体を、LAS-3000画像システム(Fujifilm, Tokyo, Japa)又はX線フイルム(CL-Xposure(商標) Film, Thermo scientific)を用いて、SuperSignal(登録商標)West Dura Extended Duration Substrate(Thermo scientific)による化学発光で可視化した。
【０１３４】
MTTアッセイ
細胞をPBSで洗浄して死細胞を除去した後、3-(4、5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2、5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物を含む培地(MTT、Invitrogen)で１時間インキュベートした。PBSによる洗浄工程の後、ホルマザン結晶をイソプロパノール中の0.04 MのHClで完全に可溶化し、混合した。それぞれの条件下で、60μlのホルマザン溶液をトリプリケートで96ウエルプレートに加えた。次に、試験波長及び標準波長として、それぞれ550nm及び620nmでの吸光度をマルチプレート分光光度計を用いて測定した。吸光度は細胞数に相関する。
【０１３５】
分散アッセイ
細胞を低密度(12ウエルプレート上に2,000細胞/ウエル)で播種し、コンパクトなコロニーを形成した。処理後、コロニー分散を確認した場合、細胞を固定して、製造業者の指示書に則ってHemacolor(登録商標)染色(Merck, Darmstadt, Germany)により染色した。代表的な画像を、40倍率の位相差顕微鏡(Nikon Eclipse TS100, Tokyo, Japan)を使用して、スナップショットした。
【０１３６】
形態形成アッセイ
細胞を増殖因子低減Matrigel(商標)(BD Biosciences)の層に播種し(24ウエルプレートの100,000細胞/ウエル)、処理して、位相差顕微鏡で観察した。代表的な画像を、40倍率の位相差顕微鏡(Nikon Eclipse TS100)を使用して、スナップショットした。
【０１３７】
統計分析
データは、少なくとも３回の独立した実験からトリプリケートで取得し、実施した実験に応じて、平均値又は対照値のパーセンテージ+/-SD又はSEMで表した。示される場合、データ群の違いは、Prism5(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA)を用いるANOVAにより決定され、P＜0.05において、統計的に有意と考えられる。
【図１Ａ】
2018507842.tif 000019
【図１Ｂ】
2018507842.tif 000020
【図１Ｃ】
2018507842.tif 000021
【図２】
2018507842.tif 000022
【図３】
2018507842.tif 000023
【図４】
2018507842.tif 000024
【図５】
2018507842.tif 000025
【図６】
2018507842.tif 000026
【図７】
2018507842.tif 000027
【図８Ａ】
2018507842.tif 000028
【図８Ｂ】
2018507842.tif 000029
【図８Ｃ】
2018507842.tif 000030
【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
2018507842.tif 000034
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2018507842.tif 000038
【図１６】
2018507842.tif 000039
【図１７Ａ】
2018507842.tif 000040
【図１７Ｂ】
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【図１８】
2018507842.tif 000042
【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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