(57)【要約】  本発明は、微生物バイオマスを含む動物用飼料、ならびに微生物を培養して微生物バイオマスを生成することによって動物用飼料を生産する方法を提供する。具体的には、本発明は、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質の発酵によって、特に、グラム陽性、嫌気性、及び／またはクロストリジウム属の微生物によって、生産される動物用飼料に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物バイオマス及び少なくとも１つの賦形剤を含む動物用飼料であって、前記微生物バイオマスが、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質上に成長した微生物を含む、動物用飼料。
【請求項２】
前記微生物がグラム陽性である、請求項１に記載の動物用飼料。
【請求項３】
前記微生物が、酢酸生成性かつ／または一酸化炭素資化性（ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｒｏｐｈｉｃ）である、請求項１に記載の動物用飼料。
【請求項４】
前記微生物が嫌気性である、請求項１に記載の動物用飼料。
【請求項５】
前記微生物がクロストリジウム属の一種である、請求項１に記載の動物用飼料。
【請求項６】
前記微生物が、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリィ、クロストリジウム・ラグスダレイ、もしくはクロストリジウム・コスカチイであるか、またはそれらに由来する、請求項１に記載の動物用飼料。
【請求項７】
前記微生物がメタン資化性ではない、請求項１に記載の動物用飼料。
【請求項８】
前記ガス状基質がＣＯを含む、請求項１に記載の動物用飼料。
【請求項９】
前記ガス状基質がメタンを含まない、請求項１に記載の動物用飼料。
【請求項１０】
前記ガス状基質が、産業廃棄ガス、産業オフガス、もしくは合成ガスであるか、またはそれに由来する、請求項１に記載の動物用飼料。
【請求項１１】
前記動物用飼料が、家畜またはペットへの給餌に適している、請求項１に記載の動物用飼料。
【請求項１２】
前記動物用飼料が、肉牛、乳牛、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラバ、ロバ、シカ、水牛／バイソン、ラマ、アルパカ、トナカイ、ラクダ、バンテン、ガヤル、ヤク、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、ホロホロチョウ、ヒナバト／ハト、魚、エビ、甲殻類、ネコ、イヌ、及び齧歯動物のうちの１つ以上に給餌するのに適している、請求項１に記載の動物用飼料。
【請求項１３】
前記賦形剤が、炭水化物、繊維、脂肪、タンパク質、ビタミン、ミネラル、水、風味、甘味料、抗酸化剤、酵素、防腐剤、プロバイオティクス、または抗生物質のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の動物用飼料。
【請求項１４】
前記賦形剤が、アルファルファ、動物性脂肪、ベーカリー廃棄物、大麦、甜菜パルプ、バミューダグラス、血粉または血漿、ビール粕、ビール酵母、ブロムグラス、ソバの実、カナリークサヨシ、キャノーラ、カゼイン、柑橘果肉、クローバ、ココナッツ、トウモロコシ、トウモロコシの穂軸、綿の実、羽毛粉、フェスク、魚粉または可溶分、ひき割りトウモロコシ、肉紛または骨粉、乳、雑穀、糖蜜、オートムギ、カモガヤ、エンドウ、ピーナッツ、家禽肉ミール、米、ライムギ、ドクムギ、ベニバナ、ゴマ、モロコシ、大豆、ヒマワリ、オオアワガエリ、ライコムギ、尿素、小麦、乳清、または酵母のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の動物用飼料。
【請求項１５】
ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質の存在下で微生物を培養して、微生物バイオマスを形成することと、前記微生物バイオマスから動物用飼料を生産することとを含む、請求項１に記載の動物用飼料を生産するための方法。
【請求項１６】
前記方法が、前記微生物バイオマスの核酸含有量を減少させることをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、前記微生物バイオマスを滅菌するステップ、前記微生物バイオマスを遠心分離するステップ、及び前記微生物バイオマスを乾燥するステップからなる群から選択される、１つ以上のステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記乾燥が、噴霧乾燥またはパドル乾燥である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法が、前記微生物バイオマスと前記賦形剤を配合することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
培養が、微生物バイオマスの生産を最大化する発酵条件下で実行される、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
単細胞タンパク質（ＳＣＰ）は、脱脂大豆または魚粉などの従来のタンパク質補給源にしばしば取って代わる、高タンパク質な人間及び動物用飼料用の微生物バイオマスに関する。
【０００２】
微生物バイオマスの大量生産は、食料または飼料のためのタンパク質を生産する伝統的な方法と比較して多くの利点を有する。例えば、微生物は、高成長率を有し、アミノ酸組成を調整するように遺伝子学的に改変されることができ、高タンパク質含有量を有し、広範囲の炭素及びエネルギー源を利用することができる。加えて、高タンパク質の供給原料への農業及び工業廃棄物の生物変換は、ＳＣＰを生産するために基質として使用された、廃棄物の否定的な原価価格も埋め合わせる、最終生産物をより安く作るという付加的な恩恵を有する。さらに、ＳＣＰの使用は、土地資源に応じて飼料生産を縮小し、農業への圧力を軽減する。
【０００３】
藻類、菌類、及び細菌は、ＳＣＰの主給源である（Ｒａｖｉｎｄｒａ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ、１８：４５９〜４７９、２０００年）。ＳＣＰ用に以前使用した細菌種は、メチロフィラス・メチロトロフィカス（インペリアル・ケミカル・インダストリーズ社）、メチロフィラス・クララ（ヘキスト社）、メチロフィラス・メタニカ（ノルスク−ハイドロ社）を含む。しかしながら、これらの微生物のそれぞれは、グラム陰性かつ好気性であり、炭素源としてメタノールを消費する。したがって、様々な菌株から微生物バイオマスを含み、様々な炭素源において増殖した、付加的な動物飼料が求められている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、微生物バイオマス及び少なくとも１つの賦形剤を含む、動物用飼料を提供する。通常、微生物バイオマスは、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質などの、ガス状基質で成長した微生物を含む。
【０００５】
微生物は、グラム陽性、酢酸生産性、一酸化炭素資化性（ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｒｏｐｈｉｃ）、及び／または嫌気性であり得る。通常、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリィ、クロストリジウム・ラグスダレイ、またはクロストリジウム・コスカチイであるかそれに由来する微生物などの、クロストリジウム属の一種である。好ましい実施形態において、微生物は、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２３６９３下で寄託された、クロストリジウム・オートエタノゲナムである。ある実施形態において、微生物はメタン資化性ではない。
【０００６】
ガス状基質は、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２のうちの１つ以上を含む。典型的に、ガス状基質は少なくともある程度の量のＣＯを含む。いくつかの実施形態において、ガス状基質はメタンを含まない。しかし、ある実施形態において、ガス状基質は、メタン改質によって生成され得る。ガス状基質は、産業廃棄ガス、産業オフガス、または合成ガスであり得るかまたはそれに由来し得る。
【０００７】
動物用飼料は、以下に限定されないが、肉牛、乳牛、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラバ、ロバ、シカ、水牛／バイソン、ラマ、アルパカ、トナカイ、ラクダ、バンテン、ガヤル、ヤク、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、ホロホロチョウ、ヒナバト／ハト、魚、エビ、甲殻類、ネコ、イヌ、及び齧歯動物を含む、家畜またはペットに給餌するのに適している。
【０００８】
動物用飼料は、炭水化物、繊維、脂肪、タンパク質、ビタミン、ミネラル、水、風味、甘味料、抗酸化剤、酵素、防腐剤、プロバイオティクス、または抗生物質などの、１つ以上の賦形剤をさらに含み得る。より一般的には、賦形剤は、動物用飼料の形式、特性、または栄養素含有量を増進または改変させるために、微生物バイオマスに加えられた任意の基質であり得る。
【０００９】
本発明は、微生物バイオマスを形成し、微生物バイオマスから動物用飼料を生産するために、ガス状基質の存在下で微生物を培養することを含む、動物用飼料を生産する方法をさらに提供する。通常、ガス状基質は、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２のうちの１つ以上を含む。
【００１０】
この方法は、付加的ステップを含む。例えば、この方法は、微生物バイオマスの核酸含有料を減らすステップを含み得る。この方法は、微生物バイオマスを滅菌するステップ、微生物バイオマスを遠心分離するステップ、及び微生物バイオマスを乾燥するステップのうちの１つ以上のステップも含み得る。特に、乾燥は、噴霧乾燥またはパドル乾燥であり得る。さらに、この方法は、微生物バイオマスと賦形剤を配合することを含み得る。この方法は、微生物バイオマスの生産を最大化する発酵条件下で、微生物を培養することも含み得る。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ガス状基質、特にＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質の発酵から生産された微生物バイオマスは、特に動物用飼料用のＳＣＰ源に適することを、発明者は発見した。
【００１２】
本発明は、微生物バイオマスがＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質などの、ガス状基質上で成長した微生物を含む、微生物バイオマス及び少なくとも１つの賦形剤を含む、動物用飼料を提供する。
【００１３】
「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」または「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」は、微視的な有機体であり、特に、細菌、古細菌、ウイルス、または真菌類である。微生物は典型的には細菌である。本明細書に使用されるように、「微生物」の列挙は、「細菌」を包含すると解されなければならない。
【００１４】
「微生物バイオマス」は、微生物細胞を含む生物的物質に属する。例えば、微生物バイオマスは、細菌、古細菌、ウイルス、または真菌類の、純粋培養または実質的に純粋培養を含むかそれらからなり得る。最初に発酵ブロスから分離されている場合、微生物バイオマスは、通常、大量の水を含有する。この水は、微生物バイオマスを乾燥または処理することによって除去または減らされ得る。
【００１５】
微生物バイオマスは、実施例１の表の第１の列に記載された、すべての成分を含み得る。とりわけ、実施例１の微生物バイオマスは、重量で１５％の湿度（水）を含む。したがって、実施例１に記載された値は、含水（すなわち、未乾燥）微生物バイオマスの量当たりのそれぞれの成分の量を指している。本明細書において、微生物バイオマスの組成は、含水（すなわち、未乾燥）微生物バイオマスの重量当たりの成分の重量に関して記述される。もちろん、乾燥微生物バイオマスの重量当たりの成分の重量に関して、微生物バイオマスの組成を計算することも可能である。
【００１６】
微生物バイオマスは、重量で５０％超（タンパク質５０ｇ／バイオマス１００ｇ）、６０％超（タンパク質６０ｇ／バイオマス１００ｇ）、７０％超（タンパク質７０ｇ／バイオマス１００ｇ）、または８０％超（タンパク質８０ｇ／バイオマス１００ｇ）のタンパク質などの、大部分のタンパク質を概して含む。好ましい実施形態において、微生物バイオマスは、重量で少なくとも７２％（タンパク質７２ｇ／バイオマス１００ｇ）のタンパク質を含む。タンパク質部分は、アスパラギン酸、アラニン、アルギニン、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、チロシン、及び／またはバリンを含む、アミノ酸を含む。具体的には、微生物バイオマスは、１０ｍｇを上回るメチオニン／ｇバイオマス、１５ｍｇを上回るメチオニン／ｇバイオマス、２０ｍｇを上回るメチオニン／ｇバイオマス、または、２５ｍｇを上回るメチオニン／ｇバイオマスを含み得る。好ましい実施形態において、微生物バイオマスは、少なくとも１７．６ｍｇメチオニン／ｇバイオマスを含む。
【００１７】
微生物バイオマスは、ビタミンＡ（レチノール）、Ｃ、Ｂ１（チアミン）、Ｂ２（リボフラビン）、Ｂ３（ニコチン酸）、Ｂ５（パントテン酸）、及び／またはＢ６（ピリドキシン）を含む、多くのビタミンを含み得る。
【００１８】
微生物バイオマスは、比較的に少量の炭水化物及び脂肪を含み得る。例えば、微生物バイオマスは、１５重量％未満（炭水化物１５ｇ／バイオマス１００ｇ）、１０重量％未満（炭水化物１０ｇ／バイオマス１００ｇ）、または５重量％未満（炭水化物５ｇ／バイオマス１００ｇ）の炭水化物を含み得る。例えば、微生物バイオマスは、１０重量％未満（脂肪１０ｇ／バイオマス１００ｇ）、５重量％未満（脂肪５ｇ／バイオマス１００ｇ）、２重量％未満（脂肪２ｇ／バイオマス１００ｇ）、または１重量％未満（脂肪１ｇ／バイオマス１００ｇ）の脂肪を含み得る。
【００１９】
微生物は、機能特性に基づいて分類され得る。例えば、微生物は、Ｃ１固定微生物、嫌気性菌、酢酸生成菌、エタノール生成菌、及び／もしくは一酸化炭素資化性菌であり得るか、またはそれらに由来し得る。表１は、微生物の代表的なリストを提供し、それらの機能特性を識別する。
【表１−１】
2018516567.tif 000002
【表１−２】
2018516567.tif 000003
【００２０】
「Ｃ１」は、例えば、ＣＯ、またはＣＯ２などの一炭素分子を指している。「Ｃ１酸素化物」は、例えば、ＣＯまたはＣＯ２などの少なくとも１つの酸素原子も含む、一炭素分子を指している。「Ｃ１炭素源」は、微生物に対して部分または単独の炭素源としての役割を果たす、一炭素分子を指している。例えば、Ｃ１炭素源は、ＣＯ、ＣＯ２のうちの１つ以上、またはＣＨ２Ｏ２を含み得る。Ｃ１炭素源は、ＣＯ及びＣＯ２のうちの１つまたは両方を含むことが好ましい。「Ｃ１固定微生物」は、Ｃ１炭素源から１つ以上の生成物を生成する能力を有する微生物である。典型的には、微生物はＣ１固定細菌である。好ましい実施形態において、微生物は、表１に確認されるＣ１固定微生物であるかそれに由来する。
【００２１】
「嫌気性菌」は、成長に酸素を必要としない微生物である。嫌気性菌は、酸素が特区の閾値を超えて存在する場合、否定的な反応を示すか死滅することさえあり得る。典型的には、微生物は嫌気性菌である（すなわち、嫌気性である）。好ましい実施形態において、微生物は、表１に確認される嫌気性菌であるかそれに由来する。
【００２２】
「酢酸生成菌」は、嫌気性呼吸の生成物としてアセテート（または酢酸）を生成するか、または生成することができる微生物である。典型的には、酢酸生成菌は、省エネルギーのため、及び、アセテートなどのアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡ導出生成物との合成のため、それらの主機構として、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を使用する、偏性嫌気性菌である（Ｒａｇｓｄａｌｅ、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、１７８４：１８７３〜１８９８、２００８年）。酢酸生成菌は、（１）ＣＯ２からのアセチルＣｏＡの還元的合成のための機構、（２）最終電子受容の、省エネルギー過程、（３）セル炭素の合成におけるＣＯ２の固定（同化）のための機構、としてアセチルＣｏＡ経路を使用する（Ｄｒａｋｅ、Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ、Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ、第３版、３５４項、ニューヨーク、２００６年）。すべての自然発生の酢酸生成菌は、Ｃ１固定、嫌気性、独立栄養性、及び非メタン資化性である。好ましい実施形態において、微生物は酢酸生成菌である。好ましい実施形態において、微生物は、表１に確認される酢酸生成菌であるかそれに由来する。
【００２３】
「エタノール生成菌」は、エタノールを生成するかまたは生成することができる。好ましい実施形態において、微生物はエタノール生成菌である。好ましい実施形態において、微生物は、表１に確認されるエタノール生成菌であるかまたはそれに由来する。
【００２４】
「独立栄養菌」は、有機炭素がなくとも成長できる微生物である。その代わりに、独立栄養菌は、ＣＯ及び／またはＣＯ２などの無機炭素源を使用する。好ましい実施形態において、微生物は、独立栄養菌である。好ましい実施形態において、微生物は、表１に確認される独立栄養菌であるかまたはそれに由来する。
【００２５】
「一酸化炭素資化性菌」は、単独の炭素源としてＣＯを利用することができる微生物である。好ましい実施形態において、微生物は一酸化炭素資化性菌である。好ましい実施形態において、微生物は、表１に確認される一酸化炭素資化性菌であるかまたはそれに由来する。
【００２６】
ある実施形態において、微生物は、メタンまたはメタノールなどの特定の基質を消費しない。１つの実施形態において、微生物は、メタン資化性菌ではなく、及び／またはＣ１化合物資化性菌ではない。
【００２７】
微生物はグラム陽性であることが好ましい。動物用飼料におけるＳＣＰの使用に関する大半の事前作業は、メチロフィラス・メチロトロフィカス、メチロフィラス・クララ、及びメチロフィラス・メタニカなどのグラム陰性種を含んだ。しかし、グラム陰性細菌は、動物用飼料におけるそれらの使用を問題とする、エンドトキシンをしばしば生成するかまたは含有する。エンドトキシンは、一部のグラム陰性細菌の細胞組成の一部であり、生きている細菌細胞によって培養基の中に放出されないので、それらの除去は幾分難しい。これらの形成は、不要なトキシンの形成を制御している遺伝子の活動が改変または抑制されることができる、遺伝子工学によって防止されることができるのみである。これは、それらが細菌細胞壁の合成構造の成分であるとき、実現が困難な課題となり得る（Ｒａｖｉｎｄｒａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ、１８：４５９〜４７９項、２０００年）。
【００２８】
さらに幅広く見れば、微生物は、表１に確認される任意の属または種であり得るか、またはそれに由来し得る。例えば、微生物は、クロストリジウム属の一種であり得る。
【００２９】
好ましい実施形態において、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリィ、及びクロストリジウム・ラグスダレイの種を含む、クロストリジウム菌の群れかまたはそれに由来する。これらの種は、Ａｂｒｉｎｉ、Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１６１：３４５〜３５１項、１９９４年（クロストリジウム・オートエタノゲナム）、Ｔａｎｎｅｒ、Ｉｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、４３：２３２〜２３６項、１９９３年（クロストリジウム・リュングダディ）、及びＨｕｈｎｋｅ、ＷＯ２００８／０２８０５５（クロストリジウム・ラグスダレイ）によって最初に報告され、特徴付けられた。
【００３０】
これら３種は、多くの類似点を有する。特に、これらの種は全て、クロストリジウム属の、Ｃ１固定、嫌気性、酢酸生成性、エタノール生成性、一酸化炭素資化性の一種である。これらの種は、類似の遺伝子型及び表現型を有し、省エネルギー及び発酵代謝の方法を有する。さらに、これらの種は、９９％を超えて同一である、１６Ｓ  ｒＲＮＡ  ＤＮＡのクロストリジウム属ｒＲＮＡ相同群Ｉにクラスター化され、約２２〜３０ｍｏｌ％の含有量のＤＮＡ  Ｇ＋Ｃを有し、グラム陽性であり、類似の形態及びサイズ（０．５〜０．７μｍ×３〜５μｍの対数増殖細胞）を有し、中温性（３０〜３７℃で最適に成長）であり、約４〜７．５の類似のｐＨ範囲を有し（約５．５〜６の最適ｐＨと）、チトクロムが不足し、かつ、Ｒｎｆ複合体によってエネルギーを節約する。また、対応するアルコールへのカルボン酸の還元は、これらの種において示されている（Ｐｅｒｅｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、１１０：１０６６〜１０７７項、２０１２年）。これらの種もすべて、ＣＯ含有ガスにおける強い独立栄養増殖を示し、主発酵生成物としてエタノール及び酢酸塩（または酢酸）を生成し、さらに、特定の条件下において少量の２，３−ブタンジオール及び乳酸を生成することが重要である。
【００３１】
しかし、これら３種は多くの違いも有する。これらの種は、ウサギの内臓からクロストリジウム・オートエタノゲナム、養鶏場の廃棄物からクロストリジウム・リュングダリィ、淡水成堆積物からクロストリジウム・ラグスダレイといった、異なる源から分離された。これらの種は、様々な糖類（例えば、ラムノース、アラビノース）、酸（例えば、グルコン酸、クエン酸塩）、アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン）、及び他の基質（例えば、ベタイン、ブタノール）の利用において異なる。さらに、これらの種は、特定のビタミン（例えば、チアミン、ビオチン）に対する栄養要求性において異なる。これらの種は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の遺伝子及びタンパク質の、細胞核におけるアミノ酸配列において違いを有するが、これらの遺伝子及びタンパク質の一般的組織及び数は、すべての種において同じであることが発見されている（Ｋｏｐｋｅ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２２：３２０〜３２５項、２０１１年）。
【００３２】
したがって、要約すると、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリィ、またはクロストリジウム・ラグスダレイの特性の多くは、それらの種に特有ではなく、クロストリジウム属の、Ｃ１固定、嫌気性、酢酸生成性、エタノール生成性、及び一酸化炭素資化性のメンバーのこの群れにとってより一般的な特性である。しかし、実際に、これらの種は独特なので、これらの種のうちの１つの遺伝子改変または遺伝子操作は、これらの種の別のものと同一の効果を有し得ない。例えば、成長、性能、または製品生産における違いが観察され得る。
【００３３】
微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリィ、またはクロストリジウム・ラグスダレイの分離体または突然変異体でもあり得るか、またはそれに由来し得る。クロストリジウム・オートエタノゲナムの分離体及び突然変異体は、ＪＡ１−１（ＤＳＭ１００６１）（Ａｂｒｉｎｉ、Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１６１：３４５〜３５１項、１９９４年）、ＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）（ＷＯ２００９／０６４２００）、及び、ＬＺ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）を含む。クロストリジウム・リュングダリィの分離体及び突然変異体は、ＡＴＣＣ４９５８７（Ｔａｎｎｅｒ、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、４３：２３２〜２３６項、１９９３年）、ＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８、ＡＴＣＣ５５３８３）、ＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ５５３８０）（ＵＳ５，５９３，８８６）、Ｃ−０１（ＡＴＣＣ５５９８８）（ＵＳ６，３６８，８１９）、Ｏ−５２（ＡＴＣＣ５５９８９）（ＵＳ６，３６８，８１９）、及びＯＴＡ−１（Ｔｉｒａｄｏ−Ａｃｅｖｅｄｏ、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ  ｆｒｏｍ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇａｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、ＰｈＤ  ｔｈｅｓｉｓ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、２０１０年）を含む。クロストリジウム・ラグスダレイの分離体及び突然変異体は、ＰＩ  １（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６２２、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７８２６）（ＷＯ２００８／０２８０５５）を含む。
【００３４】
用語「由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ）」は、新しい微生物を生成するために、異なる（例えば、両親型または野生型）微生物から改変または改造された微生物を指している。このような改変または改造は、核酸または遺伝子の挿入、削除、突然変異、または置換を典型的に含む。
【００３５】
「基質」は、微生物に対する炭素及び／またはエネルギー源を指している。典型的には、基質は、ガス状であり、例えば、ＣＯまたはＣＯ２などのＣ１炭素源を含む。基質は、ＣＯまたはＣＯ＋ＣＯ２のＣ１炭素源を含むことが好ましい。基質は、Ｈ２、Ｎ２、または電子などの、他の非炭素成分をさらに含み得る。
【００３６】
基質は、約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍｏｌ％のＣＯなどの、少なくともある程度の量のＣＯを一般に含む。基質は、約２０〜８０、３０〜７０、または４０〜６０ｍｏｌ％のＣＯなどの、ＣＯの範囲を含み得る。基質は、約４０〜７０ｍｏｌ％のＣＯ（例えば、製鋼所または溶鉱炉のガス）、約２０〜３０ｍｏｌ％のＣＯ（例えば、塩基性酸素転炉ガス）、または約１５〜４５ｍｏｌ％のＣＯ（例えば、合成ガス）を含むのが好ましい。いくつかの実施形態において、基質は、約１〜１０または１〜２０ｍｏｌ％のＣＯなどの、比較的少量のＣＯを含み得る。微生物は、典型的に、ＣＯの少なくとも一部を改変させ、かつ／または、基質において生成物に対して改変させる。いくつかの実施形態において、基質はＣＯを含まないか、ほぼ含まない。
【００３７】
基質は、ある程度の量のＨ２を含み得る。例えば、基質は、約１、２、５、１０、１５、２０、または３０ｍｏｌ％のＨ２を含み得る。いくつかの実施形態において、基質は、約６０、７０、８０、または９０ｍｏｌ％のＨ２などの、比較的多量のＨ２を含み得る。さらなる実施形態において、基質はＨ２を含まないか、ほぼ含まない。
【００３８】
基質は、ある程度の量のＣＯ２を含み得る。例えば、基質は、約１〜８０または１〜３０ｍｏｌ％のＣＯ２を含み得る。いくつかの実施形態において、基質は、約２０、１５、１０、または５ｍｏｌ％未満ＣＯ２を含み得る。別の実施形態において、基質は、ＣＯ２を含まないか、ほぼ含まない。
【００３９】
いくつかの実施形態において、基質は、メタンまたはメタノールを含まない。
【００４０】
基質は典型的にはガス状であるが、基質は代替形態においても提供され得る。例えば、基質は、マイクロバブル分散発生装置を使用して、ＣＯ含有ガスで飽和した液体に溶解し得る。さらなる例として、基質は、固体支持体に吸着され得る。
【００４１】
基質及び／またはＣ１炭素源は、工業過程の副産物として得られたか、または、自動車排蒸気またはバイオマスガス化からなどの、いくつかの他の源から得られた、廃棄物またはオフガスであり得るかそれに由来し得る。ある実施形態において、工業過程は、製鋼所製造業、非鉄製品製造業、石油精製過程、石炭ガス化、電力生産、カーボンブラック製造、アンモニア製造、メタノール製造、及びコークス製造などの、鉄合金製品製造業からなる群から選択される。これらの実施形態において、基質及び／またはＣ１炭素源は、それらが任意の従来の方法を使用して大気中に放出される前に、工業過程から捕捉され得る。
【００４２】
基質及び／またはＣ１炭素源は、石炭もしくは精錬所残渣のガス化、バイオマスまたはリグノセルロース物質のガス化、または天然ガスの改質によって得られた合成ガスなどの、合成ガスであり得るかそれに由来し得る。別の実施形態において、合成ガスは、公共固形廃棄物または産業固形廃棄物のガス化から得られ得る。
【００４３】
基質及び／またはＣ１炭素源に関連して、用語「に由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ）」は、若干改変または配合された、基質及び／またはＣ１炭素源を指している。例えば、基質及び／またはＣ１炭素源は、ある成分を加えるか除去するように処理され得、または他の基質及び／またはＣ１炭素源と配合され得る。
【００４４】
基質の組成は、反応の効率性及び／またはコストに重大な影響を及ぼし得る。例えば、酸素（Ｏ２）の存在は、嫌気性発酵過程の効率性を減少させ得る。基質の組成に応じて、トキシン、不要の成分、または粉塵などの任意の不要の不純物を除去し、かつ／または好ましい成分の濃度を増加させるために、基質を処理し、しっかり洗い、または濾過することが望ましい。
【００４５】
本発明は、微生物バイオマスを形成し、微生物バイオマスからの動物用飼料を生成するために、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２のうちの１つ以上を含む、ガス状基質の存在下で、微生物を培養することを含む、動物用飼料を生成するための方法をさらに提供する。
【００４６】
通常、培養は生物反応器において実行される。用語「生物反応器（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）」は、連続撹拌槽型反応器（ＣＳＴＲ）、固定化細胞反応器（ＩＣＲ）、トリクルベッド反応器（ＴＢＲ）、気泡塔、ガスリフト発酵槽、静的ミキサ、もしくは気液接触に適した他の容器または他の装置などの、１つ以上の容器、塔、または配管の配設からなる培養／発酵装置を含む。いくつかの実施形態において、生物反応器は、第１の成長反応器及び第２の培養／発酵反応器を備え得る。基質は、これらの反応器のうちの１つまたは両方に提供され得る。本明細書において使用されるように、用語「培養（ｃｕｌｔｕｒｅ）」及び「発酵（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」は、交換可能に使用される。これらの用語は、培養／発酵過程の増殖相及び生成物生合成相の両方を含む。
【００４７】
培養は、微生物の成長を可能にするのに十分な、栄養素、ビタミン、及び／またはミネラルを含む、水性培養基の中に概して維持される。水性培養基は、最小の嫌気性微生物の増殖培養基などの、嫌気性微生物増殖培養基であることが、好ましい。適切な培養基は当技術分野においてよく知られている。
【００４８】
培養／発酵は、望ましくは、目的生成物の生成のための適切な条件下で実行されるべきである。考えられる反応条件は、圧力（または分圧）、温度、ガス流量、培養基のｐＨ、培養基の酸化還元電位、撹拌速度（連続撹拌槽型反応器を使用する場合）、接種レベル、液相におけるガスが制限的にならないことを確実にするための最大ガス基質濃度、及び生成物阻害を回避するための最大生成物濃度、を含む。具体的には、生成物が、ガス制限条件下での培養によって消費され得ることから、基質の導入率は、液相におけるガスが制限的にならないことを確実にするように制御され得る。
【００４９】
本明細書において、微生物バイオマス自体は、目的の生成物とみなされる。しかし、微生物は、１つ以上の価値のある他の生成物を生成する。例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナムは、エタノール（ＷＯ２００７／１１７１５７）、アセテート（ＷＯ２００７／１１７１５７）、ブタノール（ＷＯ２００８／１１５０８０及びＷＯ２０１２／０５３９０５）、ブチラート（ＷＯ２００８／１１５０８０）、２、３−ブタンジオール（ＷＯ２００９／１５１３４２）、乳酸塩（ＷＯ２０１１／１１２１０３）、ブテン（ＷＯ２０１２／０２４５２２）、ブタジエン（ＷＯ２０１２／０２４５２２）、メチルエチルケトン（２−ブタノン）（ＷＯ２０１２／０２４５２２及びＷＯ２０１３／１８５１２３）、エチレン（ＷＯ２０１２／０２６８３３）、アセトン（ＷＯ２０１２／１１５５２７）、イソプロパノール（ＷＯ２０１２／１１５５２７）、脂質（ＷＯ２０１３／０３６１４７）、３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）（ＷＯ２０１３／１８０５８１）、イソプレン（ＷＯ２０１３／１８０５８４）、脂肪酸（ＷＯ２０１３／１９１５６７）、２−ブタノール（ＷＯ２０１３／１８５１２３）、１、２−プロパンジオール（ＷＯ２０１４／０３６９１５２）、及び１−プロパノール（ＷＯ２０１４／０３６９１５２）を生成するか、生成するように設計されることができる。
【００５０】
高圧で生物反応器を操作することは、ガス相から液相へのガス質量移動の速度増大を可能にする。したがって、大気圧より高圧で培養／発酵を実行することが概して好ましい。また、所与のガス変換速度は、ある程度、基質滞留時間の関数であり、滞留時間は生物反応器の必要な容積を決定するので、加圧システムの使用は、必要とされる生物反応器の容積を大きく減らすことができ、その結果として、培養／発酵の設備の資本費用を減らすことができる。これは、今度は、入力ガス流量で割った生物反応器における液体容積として定義される、滞留時間は、生物反応器が大気圧より高圧で維持される場合、減らされることができることを意味する。最適な反応条件は、使用される特定の微生物に一部依存するだろう。また、所与のガス変換速度は、ある程度、基質滞留時間の関数であり、次に、望ましい滞留時間を達成することは、生物反応器の必要な容積を決定するので、加圧システムの使用は、必要とされる生物反応器の容積を大きく減らすことができ、その結果として、発酵の設備の資本費用を減らすことができる。
【００５１】
微生物の培養は、微生物バイオマスの生成を最大化する、発酵条件下で実行され得る。方法は、微生物バイオマスの生成、またはそれに対する選択率を最大化する、発酵条件下で微生物を培養することも含み得る。バイオマスに対する選択率を最大化することは、最大比増殖速度または最大微生物希釈速度での操作を必要とする。しかし、高い微生物希釈速度での操作は、分離を妨害する、培養中の細胞濃度も減らす。また、細胞濃度は、高い反応器の生産性にとって重要な必要条件である。１日当たり１より大きい、比増殖速度または微生物希釈速度が、目標とされるべきであり、１日当たり２の速度で最適により近くなる。
【００５２】
２つの反応器システムにおいて、バイオマス生産速度は、第１及び第２の両方の反応器において高いバイオマス生産速度を有することによって、最大化される。これは、第２の反応器において、（１）低い細胞生存率か、（２）速い比増殖速度のいずれかを有することによって達成されることができる。低い細胞生存率は、高い生成物力価の毒性から達成され得、望ましくない可能性がある。速い比増殖速度は、第１の反応器に比べて、第２の反応器において微生物希釈速度の高い値で操作することによって達成され得る。
【００５３】
この関係は、次の方程式、μ２＝Ｄｗ２−Ｄｗ１＊（Ｘ１／Ｘ２）＊（Ｖ１／Ｖ２）によって捉えられ、ここで、μ２は、バイオマスに対する選択率を増加させるように最大化される必要がある、２つの反応器システムにおける第２の反応器の比増殖速度であり、Ｄｗ２及びＤｗ１はそれぞれ、２つの反応器システムにおける第２及び第１の反応器の微生物希釈速度であり、Ｘ２及びＸ１はそれぞれ、２つの反応器システムにおける第２及び第１の反応器のバイオマス力価であり、Ｖ２及びＶ１はそれぞれ、２つの反応器システムにおける第２及び第１の反応器の反応器容積である。
【００５４】
この方程式によれば、第２の反応器におけるバイオマスに対する選択率と、第２の反応器における微生物希釈速度とを最大化させるために、Ｄｗ２は、１日当たり０．５より大きい、理想的には１日当たり１〜２を目標とする、第２の反応器において、比増殖速度μ２を達成するように増加させられる必要があるだろう。
【００５５】
生成物は、例えば、分留、蒸発、浸透気化、ガスストリッピング、相分離、及び、例えば液抽出を含む抽出発酵、を含む、当技術分野において知られている任意の方法または方法の組み合わせを使用して、発酵ブロスから分離または精製され得る。ある実施形態において、生成物は、連続的に、生物反応器からブロスの一部を取り除き、ブロスから微生物細胞を分離し（便宜的に濾過によって）、さらにブロスから１つ以上の目標生成物を回復させることによって、発酵ブロスから回復される。アルコール及び／またはアセトンは、例えば、蒸留によって回復され得る。酸は、例えば、活性炭上の吸着によって回復され得る。生成物が取り除かれた後に残った無細胞透過物も生物反応器に戻されるのが好ましい。付加的な栄養分（ビタミンＢなど）が、それが生物反応器に戻される前に、培養基を補充するために、無細胞透過物に加えられ得る。
【００５６】
本発明の方法は、付加的な分離、処理、または処置のステップをさらに含み得る。例えば、方法は、微生物バイオマスを無菌化することと、微生物バイオマスを遠心分離することと、かつ／または微生物バイオマスを乾燥させることと、を含み得る。ある実施形態において、微生物バイオマスは、噴霧乾燥またはパドル乾燥を使用して乾燥させられる。核酸含有量の高い食物の摂取が、核酸分解生成物の蓄積及び／または胃腸苦痛をもたらす場合があることから、方法は、当技術分野において知られている任意の方法を使用して、微生物バイオマスの核酸含有量を低減することも含み得る。さらに、方法は、微生物バイオマスと１つ以上の賦形剤とを配合するか、または化合させることを含み得る。
【００５７】
動物用飼料は、家畜またはペットなどの動物に給餌するのに適している。具体的には、動物用飼料は、肉牛、乳牛、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラバ、ロバ、シカ、水牛／バイソン、ラマ、アルパカ、トナカイ、ラクダ、バンテン、ガヤル、ヤク、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、ホロホロチョウ、ヒナバト／ハト、魚、エビ、甲殻類、ネコ、イヌ、及び齧歯動物のうちの１つ以上に給餌するのに適するものであり得る。動物用飼料の組成は、様々な動物の栄養上の要件に適合され得る。
【００５８】
一般に、動物用飼料は、少なくとも１つの賦形剤を含む。本明細書では、「賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）」とは、動物用飼料の形態、特性、または栄養内容を高めるか、または変えるために、微生物バイオマスに加えられ得るいずれの物質も指す。例えば、賦形剤は、炭水化物、繊維、脂肪、タンパク質、ビタミン、ミネラル、水、風味、甘味料、抗酸化剤、酵素、防腐剤、プロバイオティクス、または抗生物質のうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態において、賦形剤は、干し草、ワラ、サイレージ、穀粒、油脂、または他の植物性材料であり得る。
【００５９】
賦形剤は、アルファルファ、動物性脂肪、ベーカリー廃棄物、大麦、甜菜パルプ、バミューダグラス、血粉もしくは血漿、ビール粕、ビール酵母、ブロムグラス、ソバの実、カナリークサヨシ、キャノーラ、カゼイン、柑橘果肉、クローバ、ココナッツ、トウモロコシ、トウモロコシの穂軸、綿の実、羽毛粉、フェスク、魚粉もしくは可溶分、ひき割りトウモロコシ、肉紛もしくは骨粉、乳、雑穀、糖蜜、オートムギ、カモガヤ、エンドウ、ピーナッツ、家禽肉ミール、米、ライムギ、ドクムギ、ベニバナ、ゴマ、モロコシ、大豆、ヒマワリ、オオアワガエリ、ライコムギ、尿素、小麦、乳清、または酵母を含む、Ｃｈｉｂａ、Ｓｅｃｔｉｏｎ  １８：Ｄｉｅｔ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｆｅｅｄ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ、Ａｎｉｍａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、改訂３版、５７５〜６３３頁、２０１４年、に確認されているいずれの飼料成分でもあり得る。
【実施例】
【００６０】
以下の実施例は、本発明をさらに例証するが、もちろん、多少なりともその範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００６１】
実施例１
この実施例は、クロストリジウム・オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３微生物バイオマスの組成を説明する。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【００６２】
実施例２
この例は、クロストリジウム・オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３バイオマスを、他の種類の飼料タンパク質添加物のアミノ酸組成物と比較する。
【表３−１】
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【表３−２】
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【００６３】
実施例３
この例は、クロストリジウム・オートエタノゲナム及びクロストリジウム・リュングダリイを培養する一般的な方法を説明する。当技術分野において、このような方法もよく知られている。
【００６４】
クロストリジウム・オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１及びＤＳＭ２３６９３（ＤＳＭ１００６１の誘導体）、ならびにクロストリジウム・リュングダリイＤＳＭ１３５２８は、ＤＳＭＺを源とした（ドイツ、ブラウンシュヴァイク、インホッヘンシュトラーセ７Ｂ、３８１２４のＧｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ドイツ細胞バンク））。
【００６５】
菌株は、標準嫌気性技法を使用して、ｐＨ５．６のＰＥＴＣ培養基において、３７℃で成長した（Ｈｕｎｇａｔｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３Ｂ：１１７〜１３２頁、１９６９年；Ｗｏｌｆｅ、Ａｄｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、６：１０７〜１４６頁、１９７１年）。果糖（従属栄養増殖）または３０ｐｓｉＣＯ含有スチールミルガス（ニュージーランド、グレンブロックのニュージーランド鉄鋼現場から採取された、ヘッドスペース（独立栄養増殖）における、４４％ＣＯ、３２％Ｎ２、２２％ＣＯ２、２％Ｈ２の組成物）が、基質として使用された。固体培養基では、１．２％バクト寒天（ＢＤ、米国、ニュージャージー州０７４１７、フランクリンレイクス）が加えられた。
【００６６】
本明細書に挙げられている公表文献、特許出願、及び特許を含む、すべての参照文献は、各事項が、参照により組み込まれるよう個別的かつ具体的に示され、その全体が本明細書に明示されているかのように、同じ範囲への参照により本明細書に組み込まれる。本明細書におけるいずれの先行技術への参照も、その先行技術が、任意の国における努力分野における共通一般知識の一部を形成するという自認ではなく、かつそのように解されるべきではない。
【００６７】
「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という用語の使用、さらに本発明を説明している文脈における（特に、以下の特許請求の範囲の文脈における）同様の参照は、本明細書において別段に示されるか、または文脈により明確に否定されない限り、単数及び複数の両方に及ぶものと解釈されるべきである。「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（備える）」、「ｈａｖｉｎｇ（有する）」、及び「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含む）」という用語は、別段の断りのない限り、オープンエンドの用語（すなわち、「含むが、限定されるものでない」を意味する）と解釈されるべきである。本明細書における値の列挙は、本明細書において別段に示されない限り、その範囲内にあるそれぞれの別個の値に個別的に参照する簡略表記法としての役割を果たすことが意図され、それぞれの別個の値は、それが本明細書において個別的に挙げられているかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書において説明されている方法のすべては、本明細書において別段に示されるか、または文脈により明確に否定されない限り、任意の適切な順番で実行され得る。本明細書に提供されている、あらゆる例、または例示的な表現（例えば、「など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、単に、本発明をよりよく明らかにすることが意図され、別段に主張されない限り、本発明の範囲に制限を課すものではない。本明細書には、請求項に記載されない要素を本発明の実施に不可欠であるとして示すように解釈されるべき表現はない。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態が、本明細書に説明されている。それらの好ましい実施形態の変形形態は、上の「発明を実施するための形態」を読んだ時点で、当業者には明らかになるであろう。本発明者は、必要に応じてこのような変形形態を採用することを当業者に期待し、本発明者は、本発明が、本明細書において具体的に説明されている以外に実施されるよう意図する。したがって、本発明は、適用法規によって許可される限り、添付された特許請求の範囲に挙げられている発明の対象のすべての修正形態及び均等物を含む。さらに、それらのすべての考えられる変形形態における、上記の要素のいずれの組み合わせも、本明細書において別段に示されるか、または文脈により明確に否定されない限り、本発明に含まれる。
【国際調査報告】
2018516567.tif 000009
2018516567.tif 000010