(57)【要約】本発明は、特に、補体媒介性疾患を治療するための方法及び組成物を提供する。一部の実施形態では、天然の血漿由来ヒトＣ１エステラーゼインヒビターと同様のまたはそれよりも長い半減期を有する組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビタータンパク質と、それを作製する方法とが提供されている。一部の実施形態では、本発明は、組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビタータンパク質の有効量を、補体媒介性疾患に罹患しているかまたは感受性を有する個体に投与し、その結果、該補体媒介性疾患の少なくとも１つの症状または特性が予防され、及び／または強度、重症度、もしくは頻度において低減される方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または配列番号２に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する精製された組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）を含む組成物であって、前記精製された組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビターが、血漿由来ヒトＣ１エステラーゼインヒビターと同様のまたはそれよりも長い半減期を有する、前記組成物。
【請求項２】
配列番号１または配列番号２に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する精製された組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）を含む組成物であって、前記精製された組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビターが、少なくとも約１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、４５時間、５０時間、５５時間、６０時間、６５時間、または７０時間の半減期を有する、前記組成物。
【請求項３】
前記組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質が配列番号１と同一のアミノ酸配列を含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨが配列番号２と同一のアミノ酸配列を含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨが、約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％以下の中性グリカン種を含むグリコシル化プロファイルを有する、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質が融合タンパク質である、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質が、Ｃ１−ＩＮＨドメインに直接的または間接的に融合されたＦｃドメインを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質が、Ｃ１−ＩＮＨドメインに直接的または間接的に融合されたアルブミンドメインを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨが、約５％〜約２５％の中性グリカン種を含むグリコシル化プロファイルを有する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨが、約２０％、１５％、１０％、５％、または０％未満の、マンノース、α−ガラクトース、ＮＧＮＡ、及び／またはオリゴマンノース型のグリコシル化のうちの１つ以上を含有する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨが、約３０％以下の中性グリカン種と、前記精製されたｒｈＣ１−ＩＮＨが血漿由来Ｃ１−ＩＮＨと同様のまたはそれよりも長い半減期を有するのに十分なシアリル化グリカン種とを含むグリコシル化プロファイルを有する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨが、
約５％〜約３０％の中性グリカン種、
約１０％〜約３０％のモノシアリル化グリカン種、
約３０％〜約５０％のジシアリル化グリカン種、
約１５％〜約３５％のトリシアリル化グリカン種、または
約５％〜約１５％のテトラシアリル化グリカン種、のうちの少なくとも１つを含むグリコシル化プロファイルを有する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨが、
３０％以下の中性グリカン種、
約２０％〜約３０％のモノシアリル化グリカン種、
約３０％〜約４０％のジシアリル化グリカン種、
約１０％〜約２０％のトリシアリル化グリカン種、及び
約５％〜約１０％のテトラシアリル化グリカン種、を含むグリコシル化プロファイルを有する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
配列番号１または配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を有する精製された組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）を含む組成物であって、前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨが、平均して１分子当たり少なくとも約１０個、１１個、１２個、１３個、または１４個のシアリル化グリカン残基を含み、ヒト血漿由来Ｃ１エステラーゼインヒビターと同様のまたはそれよりも長い半減期を有する、前記組成物。
【請求項１５】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨが、平均して１分子当たり少なくとも約１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、または２９個のシアリル化グリカン残基を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨが、平均して１分子当たり少なくとも約３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、または４０個のシアリル化グリカン残基を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
配列番号１または配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を有する精製された組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）を含む組成物であって、前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨが、平均して１分子当たり少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の荷電グリカンを含み、ヒト血漿由来Ｃ１エステラーゼインヒビターと同様のまたはそれよりも長い半減期を有する、前記組成物。
【請求項１８】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨが、平均してタンパク質１モル当たり少なくとも約１５モル、１６モル、１７モル、１８モル、１９モル、２０モル、２１モル、２２モル、２３モル、２４モル、２５モル、２６モル、２７モル、２８モル、２９モル、３０モル、３１モル、３２モル、３３モル、３４モル、３５モル、３６モル、３７モル、３８モル、３９モル、または４０モルのシアル酸を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨが、血漿由来ヒトＣ１エステラーゼインヒビターの半減期の５０％〜１５０％の範囲内の半減期を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨが、血漿由来ヒトＣ１エステラーゼインヒビターの半減期の８０％〜１２０％の範囲内の半減期を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨが、血漿由来ヒトＣ１エステラーゼインヒビターの半減期と同様のまたはそれよりも長い半減期を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質が、約２０ｍｇ／ｍＬを超える濃度で液体産物として安定している、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質が、約６０ｍｇ／ｍＬを超える濃度で液体産物として安定している、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質が、約７０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で液体産物として安定している、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質が、約１００ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で液体産物として安定している、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質が、約５０Ｕ／ｍＬ、１００Ｕ／ｍＬ、１５０Ｕ／ｍＬ、２００Ｕ／ｍＬ、２５０Ｕ／ｍＬ、３００Ｕ／ｍＬ、３５０Ｕ／ｍＬ、４００Ｕ／ｍＬ、４５０Ｕ／ｍＬ、５００Ｕ／ｍＬ、５５０Ｕ／ｍＬ、６００Ｕ／ｍＬ、６５０Ｕ／ｍＬ、７００Ｕ／ｍＬ、または７５０Ｕ／ｍＬを超える濃度で液体産物として安定している、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
配列番号１または配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）をコードする核酸。
【請求項２８】
請求項２７に記載の核酸を含む細胞。
【請求項２９】
配列番号１または配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）をコードする発現ベクターを含む宿主細胞であって、一旦細胞培養条件下で培養されると、約０．１ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌの力価で前記組換えｒｈＣ１−ＩＮＨを発現することができる、前記宿主細胞。
【請求項３０】
配列番号１または配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）をコードする発現ベクターを含む宿主細胞であって、一旦細胞培養条件下で培養されると、約２ピコグラム、３ピコグラム、４ピコグラム、５ピコグラム、６ピコグラム、７ピコグラム、８ピコグラム、９ピコグラム、または１０ピコグラム／細胞／日を超える比産生率で前記組換えｒｈＣ１−ＩＮＨを発現することができる、前記宿主細胞。
【請求項３１】
前記宿主細胞が、一旦細胞培養条件下で培養されると、約１０ピコグラム、１５ピコグラム、２０ピコグラム、２５ピコグラム、３０ピコグラム、３５ピコグラム、４０ピコグラム、４５ピコグラム、または５０ピコグラム／細胞／日を超える比産生率で前記組換えｒｈＣ１−ＩＮＨを発現することができる、請求項２９または請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
前記宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項２９から請求項３１に記載の宿主細胞。
【請求項３３】
前記哺乳類細胞がＣＨＯ細胞である、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
前記哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
前記ヒト細胞がＨＴ１０８０細胞またはＨＥＫ細胞である、請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
前記宿主細胞が、前記発現した組換えｒｈＣ１−ＩＮＨのシアリル化を増加させるように操作されている、請求項２９から請求項３５のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項３７】
配列番号１または配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）をコードする発現ベクターを含む宿主細胞であって、前記組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質がシアリル化を増加させるように操作されている、前記宿主細胞。
【請求項３８】
前記宿主細胞が、シアリル化を増加させるべく異種酵素を発現するように操作され、シアリル化を増加させるべく変異異種酵素を発現するように操作され、シアリル化を増加させるべく内因性酵素を過剰発現するように操作され、シアリル化を増加させるべく変異型内因性酵素を発現するように操作され、及び／またはシアリル化を低減、阻害、もしくは劣化させる内因性酵素の発現を低減させるか、もしくは妨げるように操作されている、請求項３６に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
請求項２９から請求項３８のいずれかに記載の宿主細胞を培養することを含む、組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）を産生する方法。
【請求項４０】
配列番号１または配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むｒｈＣ１−ＩＮＨを発現するように操作された宿主細胞を提供する工程と、
前記宿主細胞がｒｈＣ１−ＩＮＨを産生するのに適切な条件下であって、少なくともある期間の間、グリコシル化調節因子を含む培養培地で前記細胞に栄養を与えることを含む前記条件下で前記細胞を培養する工程と、を含む、組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）を産生する方法。
【請求項４１】
前記細胞が、少なくともある期間の間、約３０℃〜３４℃で培養される、請求項３２または請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
哺乳類細胞における組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）タンパク質の大規模産生のための方法であって、大規模培養容器に入れた懸濁液で、組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を発現する哺乳類細胞を培養することを含み、前記組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビターが、ヒト血漿由来Ｃ１エステラーゼインヒビターと同様のまたはそれよりも長い半減期を有する、前記方法。
【請求項４３】
前記細胞がグリカン修飾構築物を共発現する、請求項３９から請求項４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記グリカン修飾構築物がシアリル化を増加させる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記哺乳類細胞が血清を含まない細胞培養培地で培養される、請求項３９から請求項４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記大規模培養容器がバイオリアクターである、請求項３９から請求項４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記バイオリアクターが、約５Ｌ、１０Ｌ、２００Ｌ、５００Ｌ、１，０００Ｌ、１，５００Ｌ、２，０００Ｌ、５，０００Ｌ、１０，０００Ｌ、１５，０００Ｌ、もしくは２０，０００Ｌの規模か、またはそれを超える規模である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記培養する工程が灌流プロセスを含む、請求項３９から請求項４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記培養する工程が流加培養プロセスを含む、請求項３９から請求項４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞が、少なくともある期間の間、３０℃〜３４℃の流加培養プロセスで培養される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞が、平均して約５ピコグラム／細胞／日を超える比産生率で前記組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を産生する、請求項３９から請求項５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞が、平均して約１０ピコグラム／細胞／日を超える比産生率で前記組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を産生する、請求項３９から請求項５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞が、１日につき１リットル当たり少なくとも約５ｍｇ、６ｍｇ、８ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１１０ｍｇ、１２０ｍｇ、１３０ｍｇ、１４０ｍｇ、１５０ｍｇ、１６０ｍｇ、１７０ｍｇ、１８０ｍｇ、１９０ｍｇ、２００ｍｇ、２１０ｍｇ、２２０ｍｇ、２３０ｍｇ、２４０ｍｇ、２５０ｍｇ、２６０ｍｇ、２７０ｍｇ、２８０ｍｇ、２９０ｍｇ、または３００ｍｇの平均収穫力価で前記組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を産生する、請求項３９から請求項５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項３９から請求項５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記哺乳類細胞がＣＨＯ細胞である、請求項３９から請求項５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記培地が動物由来の成分を含まない、請求項３９から請求項５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記培地が合成培地である、請求項３９から請求項５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記培地が無タンパク質である、請求項３９から請求項５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記培地が少なくとも１つのグリコシル化調節因子を含む、請求項３９から請求項５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記培地が少なくとも１つの増殖調節因子を含む、請求項３９から請求項５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記少なくとも１つの増殖調節因子がヒポキサンチンを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ヒポキサンチンの濃度が約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
前記少なくとも１つの増殖調節因子がチミジンを含む、請求項６０から請求項６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記チミジンの濃度が約１μＭ〜約１００ｍＭの範囲である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記培地のｐＨが約６．８〜７．５の範囲である、請求項３９から請求項６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記培地のｐＨが約６．９〜７．３の範囲である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記培養する工程が、約２０％〜約４０％の溶存酸素の溶存酸素セットポイントを維持することを含む、請求項３９から請求項６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記培養する工程が増殖期と産生期とを含む、請求項３９から請求項６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記哺乳類細胞が３０℃〜３７℃の温度範囲で培養される、請求項３９から請求項６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記哺乳類細胞が、前記増殖期及び前記産生期の間に異なる温度で培養される、請求項６８または請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記哺乳類細胞が、前記増殖期の間に約３７℃、前記産生期の間に約３２℃〜３４℃で培養される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記増殖期の培地と前記産生期の培地とが異なるｐＨを有する、請求項６８から請求項７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記方法が前記組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を収穫する工程をさらに含む、請求項３９から請求項７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質が、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３９から請求項７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記培養液のｐＨ、ガス処理、及び温度のうちの１つ以上が、ヒト血漿由来Ｃ１エステラーゼインヒビターと同様のまたはそれよりも長い半減期を付与するのに十分な前記ｒｈＣ１−ＩＮＨ分子のシアリル化が可能になるように制御される、請求項３９から請求項７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
不純物の混ざった調製物から組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）を精製する方法であって、アフィニティクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーのうちの１つ以上の工程を含み、前記精製されたｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質が少なくとも９０％純粋であり、かつヒト血漿由来Ｃ１エステラーゼインヒビターと同様のまたはそれよりも長い半減期を有する、前記方法。
【請求項７７】
前記不純物の混ざった調製物が細胞培養培地を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記方法が、プロセス不純物及び不必要なグリカン種を低減させるために、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーを行うことを含む、請求項７６または請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記方法が、プロセス不純物及び不必要なグリカン種を低減させるために、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーを行うことを含む、請求項７６から請求項７８のいずれかに記載の方法。
【請求項８０】
前記方法が、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー、及び疎水性相互作用（ＨＩＣ）クロマトグラフィーを行うことを含む、請求項７６から請求項７９のいずれかに記載の方法。
【請求項８１】
１つ以上のウイルス不活性化工程及び／または除去工程をさらに含む、請求項７６から請求項８０のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
前記ウイルス不活性化工程及び／または除去工程が、濾過工程、溶媒ウイルス不活性化工程、及び界面活性剤不活性化工程から選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質が、平均して約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％以下の中性グリカン種を含む、請求項７６から請求項８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨが、血漿由来ヒトＣ１エステラーゼインヒビターの半減期の５０％〜１５０％の範囲内の半減期を有する、請求項３９から請求項８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨが、血漿由来ヒトＣ１エステラーゼインヒビターの半減期の８０％〜１２０％の範囲内の半減期を有する、請求項３９から請求項８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質が、約２０ｍｇ／ｍＬを超える濃度で液体産物として安定している、請求項３９から請求項８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質が、約６０ｍｇ／ｍＬを超える濃度で液体産物として安定している、請求項３９から請求項８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質が、約７０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で液体産物として安定している、請求項３９から請求項８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
請求項１から請求項２６のいずれか１項に記載の精製された組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビタータンパク質を含む組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項９０】
請求項１から請求項２６、または請求項８９のいずれか１項に記載の組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビタータンパク質を、５０ｍＭのＴｒｉｓと、５０ｍＭのソルビトールと、１５０ｍＭのグリシンとを含む製剤緩衝液中に含む医薬組成物であって、前記組成物のｐＨが７．２である、前記医薬組成物。
【請求項９１】
前記組成物が液体である、請求項１から請求項２６、または請求項８９から請求項９０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９２】
前記組成物が凍結乾燥されている、請求項１から請求項２６、または請求項８９から請求項９０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９３】
前記組成物が再構成に適切な緩衝液で元に戻されている、請求項９２に記載の医薬組成物。
【請求項９４】
前記再構成に適切な緩衝液が、滅菌水、滅菌食塩水、滅菌緩衝溶液、または１つ以上の薬学的に許容される担体を含む滅菌溶液から選択される、請求項９３に記載の医薬組成物。
【請求項９５】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質が、約２０ｍｇ／ｍＬを超える濃度で液体産物として安定している、請求項８９から請求項９１、または請求項９３から請求項９４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９６】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質が、約６０ｍｇ／ｍＬを超える濃度で液体産物として安定している、請求項８９から請求項９１、または請求項９３から請求項９４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９７】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質が、約７０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で液体産物として安定している、請求項８９から請求項９１、または請求項９３から請求項９４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９８】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質が、約１００ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で液体産物として安定している、請求項８９から請求項９１、または請求項９３から請求項９４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９９】
前記精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質が、約５０Ｕ／ｍＬ、１００Ｕ／ｍＬ、１５０Ｕ／ｍＬ、２００Ｕ／ｍＬ、２５０Ｕ／ｍＬ、３００Ｕ／ｍＬ、３５０Ｕ／ｍＬ、４００Ｕ／ｍＬ、４５０Ｕ／ｍＬ、５００Ｕ／ｍＬ、５５０Ｕ／ｍＬ、６００Ｕ／ｍＬ、６５０Ｕ／ｍＬ、７００Ｕ／ｍＬ、または７５０Ｕ／ｍＬを超える濃度で液体産物として安定している、請求項８９から請求項９１、または請求項９３から請求項９４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１００】
請求項８９から請求項９９のいずれかに記載の医薬組成物を含むキット。
【請求項１０１】
シリンジをさらに含む、請求項１００に記載のキット。
【請求項１０２】
前記シリンジに、請求項８９から請求項９１、または請求項９５から請求項９９のいずれか１項に記載の医薬組成物が予め担持されている、請求項１０１に記載のキット。
【請求項１０３】
請求項９２に記載の医薬組成物と、
再構成用の緩衝液とを含むキットであって、前記凍結乾燥された組成物と前記再構成用の前記緩衝液とを混合することにより、請求項８９から請求項９１、または請求項９５から請求項９９のいずれか１項に記載の組成物を産生させる、前記キット。
【請求項１０４】
シリンジをさらに含む、請求項１０３に記載のキット。
【請求項１０５】
補体媒介性障害を治療する方法であって、治療を必要とする対象に請求項８９から請求項１０４のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１０６】
前記補体媒介性障害が、遺伝性血管性浮腫、抗体関連型拒絶反応、視神経脊髄炎関連疾患、外傷性脳損傷、脊椎損傷、虚血性脳損傷、火傷、中毒性表皮壊死症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、脳卒中、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、重症筋無力症、多巣性運動ニューロパチーから選択される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
請求項１から請求項２６のいずれかに記載の組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビターを含む組成物の、補体媒介性障害を治療するための薬剤の製造における使用。
【請求項１０８】
前記補体媒介性障害が、遺伝性血管性浮腫、抗体関連型拒絶反応、視神経脊髄炎関連疾患、外傷性脳損傷、脊椎損傷、虚血性脳損傷、火傷、中毒性表皮壊死症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、脳卒中、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、重症筋無力症、及び／または多巣性運動ニューロパチーから選択される、請求項１０７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年１１月１９日に出願された米国仮出願第６２／２５７，７１１号に対する優先権及びその利益を主張するものであり、該仮出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
配列表の引用による援用
２０１６年１１月１６日に作成され、サイズが１５ＫＢである「ＳＨＲ−１２３４ＷＯ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のテクストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
Ｃ１−インヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）は、Ｃ１エステラーゼインヒビターとしても知られ、セルピンタンパク質スーパーファミリーの最も大きなメンバーである。これは重度にグリコシル化されたセリンプロテイナーゼインヒビターであり、その主な機能は、補体系の自発的活性化を阻害することである。Ｃ１−ＩＮＨは、補体カスケード系を調節し、接触（カリクレイン・キニン）増幅カスケードの調節に重要な役割を果たし、凝固系及び線溶系の調節に関与している。Ｋａｒｎａｕｋｈｏｖａ，Ｅ．，Ｃ１−Ｅｓｔｅｒａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｄｉｓ，１：１１３（２０１３）を参照されたい。
【０００４】
対象におけるＣ１−ＩＮＨの機能不全及び／または欠損は、Ｃ１−ＩＮＨが補体系の活性化を阻害できなくなることから、種々の自己免疫性疾患と関連付けられてきた。こうした疾患の一例は、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）であり、これは、予測不可能な反復性の炎症発作によって特徴付けられる稀な障害だが場合によっては生命を脅かす障害である。ＨＡＥ発作の症状として、顔面、口、及び／または気道の腫脹が挙げられ、これらは自然発症的に生じるか、または軽度の外傷によって誘発される。こうした腫脹は、身体の任意の部分にも生じ得る。ＨＡＥは、Ｃ１−インヒビターの血漿レベルが低いことに関連している場合がある一方で、そのタンパク質が正常または基準以上の量で循環しているが機能不全となっている場合もある。炎症の発症に加えて、自己免疫性疾患または紅斑性狼瘡などのさらに重篤であるか、または生命を脅かす症候を引き起こす可能性もある。
【０００５】
ＣＩＮＲＹＺＥ（登録商標）は、ヒト血漿由来Ｃ１エステラーゼインヒビターであり、ＨＡＥの急性発作の予防的使用及び治療用に承認されている。ベリナート（登録商標）（同じく血漿由来ヒトＣ１−ＩＮＨ、ＣＳＬベーリング社）は、急性ＨＡＥ発作の治療に適応している。だが、ヒト血漿由来Ｃ１エステラーゼインヒビターの供給は、献血された血液及び血漿の利用可能性に制限されることになる。ルコネスト（登録商標）（コネスタットアルファ、Ｐｈａｒｍｉｎｇ  Ｎ．Ｖ．社）は、改変ウサギで発現した組換えＣ１−ＩＮＨであり、急性ＨＡＥ発作の治療にＩＶ投与用として適応するものである。ルコネスト（登録商標）は、ヒト血漿由来Ｃ１−ＩＮＨと同一のアミノ酸配列を有するが、ウサギで作製されるため、そのグリコシル化プロファイルはヒト血漿由来Ｃ１−ＩＮＨのプロファイルとは全く異なっている。その結果として、ルコネストは約２．４時間〜２．７時間という極めて短い半減期を有する。ルコネスト（登録商標）ＦＤＡラベル及び処方情報を参照されたい。
したがって、当該技術分野において、種々のＣ１エステラーゼ媒介性症候の治療に適する改良型の組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビターが依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋａｒｎａｕｋｈｏｖａ，Ｅ．，Ｃ１−Ｅｓｔｅｒａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｄｉｓ，１：１１３（２０１３）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、特に、種々の補体媒介性障害を効果的に治療するのに使用可能であり、かつ高い費用対効果で製造することができる、改良型の長時間作用性組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）を提供するものである。
【０００８】
本発明は、詳細には、ルコネスト（登録商標）（コネスタットアルファ）よりも長い半減期を呈する組換えＣ１エステラーゼインヒビタータンパク質を提供するものである。一部の実施形態では、本発明のｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、血漿由来Ｃ１−ＩＮＨに匹敵するか、またはそれよりも長い半減期を呈する。例えば、発明者らは、本発明のｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質の特定の例が、少なくとも４日という長期間にわたる血清中半減期を有することを明らかにした。ｒｈＣ１−ＩＮＨの長い血清半減期は、優れたｉｎ  ｖｉｖｏ有効性をもたらし、また好ましい投与レジメン及び投与経路を可能にすると考えられる。特定の実施形態では、本発明のｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、承認された静脈内投与Ｃ１エステラーゼインヒビターと同様の頻度またはそれよりも少ない頻度で皮下投与され得るが、なおも所望の有効性（例えば、予防）を達成することができる。さらに、本発明のｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は宿主細胞で組換え産生することができることから、開示されたｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、血液の供給に依存することがなく、感染病原体が伝染する危険性がなく、また製造するのに安価である。ルコネストは、ウサギ宿主に関連する不純物の存在による過敏反応及び／またはアナフィラキシー反応の危険性も伴う。ルコネストは、ウサギまたはウサギ由来の産物に対する既知の過敏性またはアレルギーを有するいかなる患者にも投与することができず、また小児への投与にも適応していない。
【０００９】
本発明は宿主細胞で組換え産生される組換えＣ１エステラーゼインヒビタータンパク質を提供するため、ヒト血液、ヒト血液成分（例えば、血漿）、または動物乳から精製された産物よりも、産生及び最終産物において均質性が得られる。さらに、本明細書で提供されるｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、ルコネストとは異なり、動物の年齢及び／または成熟度、乳汁産生、動物の疾病などを含めた、その全てがウサギ発現Ｃ１−ＩＮＨの量及び品質（例えば、グリコシル化プロファイル、発現タンパク質の異質性、宿主関連不純物など）に影響を及ぼし得る畜産検討事項に左右されるものではない。
【００１０】
一実施形態では、本発明は、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する精製された組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）を含む組成物を提供し、そこで、該精製された組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビターは、血漿由来ヒトＣ１エステラーゼインヒビターと同様のまたはそれよりも長い半減期を有する。
【００１１】
一実施形態では、本発明は、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する精製された組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）を含む組成物を提供し、そこで、該精製された組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビターは、少なくとも約１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、４５時間、５０時間、５５時間、６０時間、６５時間、または７０時間の半減期を有する。
【００１２】
一態様では、組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、配列番号１と同一のアミノ酸配列を含む。別の態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、配列番号２と同一のアミノ酸配列を含む。別の態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％以下の中性グリカン種を含むグリコシル化プロファイルを有する。別の態様では、組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、融合タンパク質である。別の態様では、組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、Ｃ１−ＩＮＨドメインに直接的または間接的に融合されたＦｃドメインを含む。別の態様では、組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、Ｃ１−ＩＮＨドメインに直接的または間接的に融合されたアルブミンドメインを含む。別の態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、約５％〜約２５％の中性グリカン種を含むグリコシル化プロファイルを有する。別の態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、約２０％、１５％、１０％、５％、または０％未満の、マンノース、α−ガラクトース、ＮＧＮＡ、及び／またはオリゴマンノース型のグリコシル化のうちの１つ以上を含有する。別の態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、約３０％以下の中性グリカン種と、精製されたｒｈＣ１−ＩＮＨが血漿由来Ｃ１−ＩＮＨと同様のまたはそれよりも長い半減期を有するのに十分なシアリル化グリカン種とを含むグリコシル化プロファイルを有する。別の態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、以下のうちの少なくとも１つを含むグリコシル化プロファイルを有する：約５％〜約３０％の中性グリカン種、約１０％〜約３０％のモノシアリル化グリカン種、約３０％〜約５０％のジシアリル化グリカン種、約１５％〜約３５％のトリシアリル化グリカン種、または約５％〜約１５％のテトラシアリル化グリカン種。
【００１３】
別の態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、以下を含むグリコシル化プロファイルを有する：３０％以下の中性グリカン種、約２０％〜約３０％のモノシアリル化グリカン種、約３０％〜約４０％のジシアリル化グリカン種、約１０％〜約２０％のトリシアリル化グリカン種、及び約５％〜約１０％のテトラシアリル化グリカン種。
【００１４】
一実施形態では、本発明は、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を有する精製された組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）を含む組成物を提供し、そこで、該精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、平均して１分子当たり少なくとも約１０個、１１個、１２個、１３個、または１４個のシアリル化グリカン残基を含み、ヒト血漿由来Ｃ１エステラーゼインヒビターと同様のまたはそれよりも長い半減期を有する。
【００１５】
一態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、平均して１分子当たり少なくとも約１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、または２９個のシアリル化グリカン残基を含む。別の態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、平均して１分子当たり少なくとも約３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、または４０個のシアリル化グリカン残基を含む。
【００１６】
一実施形態では、本発明は、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を有する精製された組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）を含む組成物を提供し、そこで、該精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、平均して１分子当たり少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の荷電グリカンを含み、ヒト血漿由来Ｃ１エステラーゼインヒビターと同様のまたはそれよりも長い半減期を有する。
【００１７】
一態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、平均してタンパク質１モル当たり少なくとも約１５モル、１６モル、１７モル、１８モル、１９モル、２０モル、２１モル、２２モル、２３モル、２４モル、２５モル、２６モル、２７モル、２８モル、２９モル、３０モル、３１モル、３２モル、３３モル、３４モル、３５モル、３６モル、３７モル、３８モル、３９モル、または４０モルのシアル酸を含む。別の態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、血漿由来ヒトＣ１エステラーゼインヒビターの半減期の５０％〜１５０％の範囲内の半減期を有する。別の態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、血漿由来ヒトＣ１エステラーゼインヒビターの半減期の８０％〜１２０％の範囲内の半減期を有する。別の態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、血漿由来ヒトＣ１エステラーゼインヒビターの半減期と同様のまたはそれよりも長い半減期を有する。別の態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、約２０ｍｇ／ｍＬを超える濃度で液体産物として安定している。別の態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、約６０ｍｇ／ｍＬを超える濃度で液体産物として安定している。別の態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、約７０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で液体産物として安定している。別の態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、約１００ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で液体産物として安定している。別の態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、約５０Ｕ／ｍＬ、１００Ｕ／ｍＬ、１５０Ｕ／ｍＬ、２００Ｕ／ｍＬ、２５０Ｕ／ｍＬ、３００Ｕ／ｍＬ、３５０Ｕ／ｍＬ、４００Ｕ／ｍＬ、４５０Ｕ／ｍＬ、５００Ｕ／ｍＬ、５５０Ｕ／ｍＬ、６００Ｕ／ｍＬ、６５０Ｕ／ｍＬ、７００Ｕ／ｍＬ、または７５０Ｕ／ｍＬを超える濃度で液体産物として安定している。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）をコードする核酸を提供する。
【００１９】
一態様では、本発明は、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）をコードする核酸を含む細胞を提供する。
【００２０】
一実施形態では、本発明は、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）をコードする発現ベクターを含む宿主細胞を提供し、そこで、該宿主細胞は、一旦細胞培養条件下で培養されると、約０．１ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌの力価で組換えｒｈＣ１−ＩＮＨを発現することができる。
【００２１】
一実施形態では、本発明は、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）をコードする発現ベクターを含む宿主細胞を提供し、そこで、該宿主細胞は、一旦細胞培養条件下で培養されると、約２ピコグラム、３ピコグラム、４ピコグラム、５ピコグラム、６ピコグラム、７ピコグラム、８ピコグラム、９ピコグラム、または１０ピコグラム／細胞／日を超える比産生率で組換えｒｈＣ１−ＩＮＨを発現することができる。
【００２２】
一態様では、宿主細胞は、一旦細胞培養条件下で培養されると、約１０ピコグラム、１５ピコグラム、２０ピコグラム、２５ピコグラム、３０ピコグラム、３５ピコグラム、４０ピコグラム、４５ピコグラム、または５０ピコグラム／細胞／日を超える比産生率で組換えｒｈＣ１−ＩＮＨを発現することができる。別の態様では、宿主細胞は哺乳類細胞である。別の態様では、哺乳類細胞はＣＨＯ細胞である。別の態様では、哺乳類細胞はヒト細胞である。別の態様では、ヒト細胞は、ＨＴ１０８０細胞またはＨＥＫ細胞である。別の態様では、宿主細胞は、発現した組換えｒｈＣ１−ＩＮＨのシアリル化を増加させるように操作されている。
【００２３】
一実施形態では、本発明は、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）をコードする発現ベクターを含む宿主細胞を提供し、そこで、該組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質はシアリル化を増加させるように操作されている。
【００２４】
一態様では、宿主細胞は、シアリル化を増加させるべく異種酵素を発現するように操作され、シアリル化を増加させるべく変異異種酵素を発現するように操作され、シアリル化を増加させるべく内因性酵素を過剰発現するように操作され、シアリル化を増加させるべく変異型内因性酵素を発現するように操作され、及び／またはシアリル化を低減、抑制、もしくは劣化させる内因性酵素の発現を低減させるか、もしくは妨げるように操作されている。一態様では、本発明は、宿主細胞を培養することを含む、組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）を産生する方法を提供する。
【００２５】
一態様では、組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）を産生する方法は、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むｒｈＣ１−ＩＮＨを発現させるように操作された宿主細胞を提供する工程と、細胞がｒｈＣ１−ＩＮＨを産生するのに適切な条件下であって、少なくともある期間の間、グリコシル化調節因子を含む培養培地で細胞に栄養を与えることを含む該条件下で宿主細胞を培養する工程とを含む。別の態様では、少なくともある期間の間、細胞は約３０℃〜３４℃で培養される。
【００２６】
一実施形態では、本発明は、哺乳類細胞における組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）タンパク質の大規模産生のための方法を提供し、該方法には、大規模培養容器に入れた懸濁液で、組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を発現する哺乳類細胞を培養することが含まれ、該組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビターは、ヒト血漿由来Ｃ１エステラーゼインヒビターと同様のまたはそれよりも長い半減期を有する。
【００２７】
一態様では、細胞はグリカン修飾構築物を共発現する。別の態様では、グリカン修飾構築物は、シアリル化を増加させる。別の態様では、哺乳類細胞は血清を含まない細胞培養培地で培養される。別の態様では、大規模培養容器はバイオリアクターである。別の態様では、バイオリアクターは、約５Ｌ、１０Ｌ、２００Ｌ、５００Ｌ、１，０００Ｌ、１，５００Ｌ、２，０００Ｌ、５，０００Ｌ、１０，０００Ｌ、１５，０００Ｌ、もしくは２０，０００Ｌの規模か、またはそれを超える規模である。別の態様では、培養工程は灌流プロセスを含む。別の態様では、培養工程は、流加培養プロセスを含む。別の態様では、細胞は、少なくともある期間の間、３０℃〜３４℃の流加培養プロセスで培養される。別の態様では、細胞は、平均して約５ピコグラム／細胞／日を超える比産生率で組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を産生する。別の態様では、細胞は、平均して約１０ピコグラム／細胞／日を超える比産生率で組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を産生する。別の態様では、細胞は、１日につき１リットル当たり少なくとも約５ｍｇ、６ｍｇ、８ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１１０ｍｇ、１２０ｍｇ、１３０ｍｇ、１４０ｍｇ、１５０ｍｇ、１６０ｍｇ、１７０ｍｇ、１８０ｍｇ、１９０ｍｇ、２００ｍｇ、２１０ｍｇ、２２０ｍｇ、２３０ｍｇ、２４０ｍｇ、２５０ｍｇ、２６０ｍｇ、２７０ｍｇ、２８０ｍｇ、２９０ｍｇ、または３００ｍｇの平均収穫力価で組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を産生する。別の態様では、哺乳類細胞はヒト細胞である。別の態様では、哺乳類細胞はＣＨＯ細胞である。
【００２８】
一態様では、培地は動物由来成分を含まない。別の態様では、培地は合成培地である。別の態様では、培地は無タンパク質である。別の態様では、培地は少なくとも１つのグリコシル化調節因子を含む。一態様では、培地は少なくとも１つの増殖調節因子を含む。別の態様では、少なくとも１つの増殖調節因子はヒポキサンチンを含む。一態様では、ヒポキサンチンの濃度は約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲である。一態様では、少なくとも１つの増殖調節因子はチミジンを含む。一態様では、チミジンの濃度は約１μＭ〜約１００ｍＭの範囲である。一態様では、培地のｐＨは約６．８〜７．５の範囲である。一態様では、培地のｐＨは約６．９〜７．３の範囲である。一態様では、培養工程は、約２０％〜約４０％の溶存酸素の溶存酸素セットポイントを維持することを含む。一態様では、培養工程は増殖期と産生期とを含む。一態様では、哺乳類細胞は、３０℃〜３７℃の温度範囲で培養される。一態様では、哺乳類細胞は、増殖期及び産生期の間に異なる温度で培養される。一態様では、哺乳類細胞は、増殖期の間に約３７℃、産生期の間に約３２℃〜３４℃で培養される。一態様では、増殖期の培地と産生期の培地とは異なるｐＨを有する。
【００２９】
一態様では、方法は、組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を収穫する工程をさらに含む。一態様では、組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、培養液のｐＨ、ガス処理、及び温度のうちの１つ以上は、ヒト血漿由来Ｃ１エステラーゼインヒビターと同様のまたはそれよりも長い半減期を付与するのに十分なｒｈＣ１−ＩＮＨ分子のシアリル化が可能になるように制御される。
【００３０】
一実施形態では、本発明は、不純物の混ざった調製物から組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）を精製する方法であって、アフィニティクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーのうちの１つ以上の工程を含む該方法を提供し、そこで、精製されたｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は少なくとも９０％純粋であり、かつヒト血漿由来Ｃ１エステラーゼインヒビターと同様のまたはそれよりも長い半減期を有する。
【００３１】
一態様では、不純物の混ざった調製物は細胞培養培地を含む。別の態様では、方法は、プロセス不純物及び不必要なグリカン種を低減させるために、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーを行うことを含む。別の態様では、方法は、プロセス不純物及び不必要なグリカン種を低減させるために、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーを行うことを含む。別の態様では、方法は、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー、及び疎水性相互作用（ＨＩＣ）クロマトグラフィーを行うことを含む。別の態様では、方法は、１つ以上のウイルス不活性化工程及び／または除去工程をさらに含む。別の態様では、ウイルス不活性化工程及び／または除去工程は、濾過工程、溶媒ウイルス不活性化工程、及び界面活性剤不活性化工程から選択される。一態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、平均して約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％以下の中性グリカン種を含む。一態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、血漿由来ヒトＣ１エステラーゼインヒビターの半減期の５０％〜１５０％の範囲内の半減期を有する。一態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、血漿由来ヒトＣ１エステラーゼインヒビターの半減期の８０％〜１２０％の範囲内の半減期を有する。一態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、約２０ｍｇ／ｍＬを超える濃度で液体産物として安定している。一態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、約６０ｍｇ／ｍＬを超える濃度で液体産物として安定している。一態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、約７０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で液体産物として安定している。
【００３２】
一態様では、本発明は、精製された組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビタータンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００３３】
一態様では、医薬組成物は、５０ｍＭのＴｒｉｓと、５０ｍＭのソルビトールと、１５０ｍＭのグリシンとを含む製剤緩衝液中に組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビタータンパク質を含み、該組成物のｐＨは７．２である。一態様では、医薬組成物は液体である。一態様では、医薬組成物は凍結乾燥されている。一態様では、医薬組成物は再構成に適切な緩衝液で元に戻される。一態様では、再構成に適切な緩衝液は、滅菌水、滅菌食塩水、滅菌緩衝溶液、または１つ以上の薬学的に許容される担体を含む滅菌溶液から選択される。一態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、約２０ｍｇ／ｍＬを超える濃度で液体産物として安定している。一態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、約６０ｍｇ／ｍＬを超える濃度で液体産物として安定している。一態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、約７０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で液体産物として安定している。一態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、約１００ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で液体産物として安定している。一態様では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、約５０Ｕ／ｍＬ、１００Ｕ／ｍＬ、１５０Ｕ／ｍＬ、２００Ｕ／ｍＬ、２５０Ｕ／ｍＬ、３００Ｕ／ｍＬ、３５０Ｕ／ｍＬ、４００Ｕ／ｍＬ、４５０Ｕ／ｍＬ、５００Ｕ／ｍＬ、５５０Ｕ／ｍＬ、６００Ｕ／ｍＬ、６５０Ｕ／ｍＬ、７００Ｕ／ｍＬ、または７５０Ｕ／ｍＬを超える濃度で液体産物として安定している。
【００３４】
一態様では、キットが提供される。一態様では、キットはシリンジをさらに含む。一態様では、シリンジには医薬組成物が予め担持されている。一態様では、医薬組成物を含むキットはまた、再構成用の緩衝液を含み、凍結乾燥された組成物と再構成用の緩衝液とを混合することにより、その組成物を産生させる。一態様では、キットはシリンジをさらに含む。
【００３５】
一実施形態では、本発明は、補体媒介性障害を治療する方法であって、治療を必要とする対象に医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。一態様では、補体媒介性障害は、遺伝性血管性浮腫、抗体関連型拒絶反応、視神経脊髄炎関連疾患、外傷性脳損傷、脊椎損傷、虚血性脳損傷、火傷、中毒性表皮壊死症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、脳卒中、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、重症筋無力症、多巣性運動ニューロパチーから選択される。
【００３６】
一実施形態では、本発明は、組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビターを含む組成物を、補体媒介性障害を治療するための薬剤の製造において使用することを提供する。一態様では、補体媒介性障害は、遺伝性血管性浮腫、抗体関連型拒絶反応、視神経脊髄炎関連疾患、外傷性脳損傷、脊椎損傷、虚血性脳損傷、火傷、中毒性表皮壊死症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、脳卒中、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、重症筋無力症、及び／または多巣性運動ニューロパチーから選択される。
【００３７】
したがって、本発明は、ｒｈＣ１−ＩＮＨインヒビターの費用対効果及び信頼性の高い製造と、ＨＡＥ及び補体媒介性障害の安全でより効果的な治療とをもたらすものである。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、以下の詳細な説明において明らかになる。しかしながら、以下の詳細な説明は本発明の実施形態を示すが、単に例示のためであり、制限するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内の様々な変更及び修正は、以下の詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
図面は、単に例示を目的とするものであり、制限するためのものではない。
【００３９】
【図１】Ｃ１−ＩＮＨの概略図である。左から右に３つのドメインがあり、それらはシグナルペプチド、Ｎ末端（Ｎ末端ドメインとも称される）、及びセルピンドメインである。Ｎ結合型グリカンはダイヤモンド形の先端部を持つ長い垂直線として表示されており、Ｏ結合型グリカンは短い垂直線として表示されている。
【００４０】
【図２】ｒｈＣ１−ＩＮＨ精製のための下流プロセスフローの概略図である。
【００４１】
【図３】例示的なＧｉｇａｃａｐ  Ｑ溶出プロファイルを、中性かつシアリル化された種の対応する分離と共に示す。
【００４２】
【図４】宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）などのプロセス不純物を分離する陰イオン交換クロマトグラフィー工程の性能を示す。
【００４３】
【図５】所望のシアリル化グリカン種の濃縮を示す例示的なＰｏｒｏｓ  ＸＳ溶出プロファイルである。
【００４４】
【図６】Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ溶出後のＨＣＰ含有量の低減を示す。
【００４５】
【図７】ｒｈＣ１−ＩＮＨのＮＧＡ−ＮＰ／ＡＥについての試料積算の例を示す。
【００４６】
【図８】標識化された混合モードクロマトグラムを、ｒｈＣ１−ＩＮＨ由来のＨＰＬＣ分画グリカンプールのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析から同定されるピークと共に示す。
【００４７】
【図９】血漿由来Ｃ１−ＩＮＨのグリカンプロファイルである。
【００４８】
【図１０】例示的なｒｈＣ１−ＩＮＨのＮ−グリカンをＨＩＬＩＣ分析したクロマトグラムである。標識されたピークは、オンラインＬＣ／ＭＳによって同定された。
【００４９】
【図１１】ｒｈＣ１−ＩＮＨのＮ−グリカンプロファイル（ＰＮＧａｓｅ−Ｆ）及びＮ＋Ｏ−グリカンプロファイル（ＯＲＥＬＡ脱グリコシル化）として得られたプロファイルである。
【００５０】
【図１２】ｒｈＣ１−ＩＮＨ製剤の２℃〜８℃での安定性（パネルＡ）と、２５℃での安定性（パネルＢ）とを示す一連のグラフである。
【００５１】
【図１３】ウサギにおいてＣＩＮＲＹＺＥ（登録商標）と比較したｒｈＣ１−ＩＮＨの半減期を示す。
【００５２】
【図１４】ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質精製プロセスの概略を示す。
【００５３】
【図１５Ａ】以下のプロファイルでの実行の収率と関連記述とを示す一連のクロマトグラムである：Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ（パネルＡ）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣ（パネルＢ）、及びＮａｔｒｉｘ（パネルＣ）。
【図１５Ｂ】同上。
【図１５Ｃ】同上。
【００５４】
【図１６Ａ−Ｂ】３０ＭＶ／分でのＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ（パネルＡ）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣ（パネルＢ）、及び５ＭＶ／分でのＳａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣ（パネルＣ）についての産物試験結果を示す一連のクロマトグラムである。
【図１６Ｃ】同上。
【００５５】
【図１７】Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑを用いたＤＮＡスパイクのブランクでの実行結果を示すクロマトグラムである。
【００５６】
【図１８Ａ−Ｂ】ＤＮＡスパイク検討の後にｒｈＣ１−ＩＮＨを精製した結果を示す一連のクロマトグラムである。図１８のパネルＡはＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑを用いてスパイク検討した結果（無希釈負荷）を示すクロマトグラムであり、図１８のパネルＢはＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑを用いてスパイク検討した結果（希釈負荷）を示すクロマトグラムであり、図１８のパネルＣはＳａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣを用いてスパイク検討した結果を示すクロマトグラムである。
【図１８Ｃ】同上。
【００５７】
【図１９】Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑを用いた最大負荷での実行結果を示すクロマトグラムである。
【００５８】
【図２０】ＧｉｇａｃａｐＱ後のＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ膜の性能を評価するように設計された実験の結果を示すクロマトグラムである。
【００５９】
定義
本発明をより容易に理解するために、特定の用語を以下にまず定義する。以下の用語及び他の用語のさらなる定義は、本明細書全体を通して記載される。
【００６０】
本明細書で使用される場合、特定の用語は下記の定義された意味を有する。本
明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、特に文脈で明らかに規定されない限り、複数への言及を含むものである。例えば、用語「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」は、その混合物を含めた複数の細胞（ｃｅｌｌｓ）を含む。
【００６１】
動物：本明細書で使用される場合、用語「動物」は、動物界の任意のメンバーを意味する。一部の実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階でのヒトを意味する。一部の実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階での非ヒト動物を意味する。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳類（例えば、ゲッ齒類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／またはブタ）である。一部の実施形態では、動物には、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類、及び／または蠕虫類が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子組換え動物、及び／またはクローンであり得る。
【００６２】
およそまたは約：本出願において使用される場合、「約」及び「およそ」という用語は同意語として用いられている。本出願において使用される任意の数字は、約／およそを伴っても伴わなくても、当業者により認識される任意の正常変動を含むことが意図されている。本明細書で使用される用語「およそ」または「約」は、関心対象となる１つ以上の値に適用される場合、記述された参照値と同等の値を意味する。特定の実施形態では、用語「およそ」または「約」は、特記されない限り、ないしは特に文脈から明らかでない限り、記述された参照値のいずれかの方向（超または未満）における２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下に入る値の範囲を意味する（かかる数字が取り得る値の１００％を超える場合を除く）。
【００６３】
生物学的利用度：本明細書で使用される場合、用語「生物学的利用度」は、概して、投与された用量のうち対象の血流に到達する割合を意味する。
【００６４】
生物学的活性：本明細書で使用される場合、語句「生物学的活性」は、生体系、特に生物体において活性を有する任意の作用剤の特徴を意味する。例えば、生物体に投与された場合に、その生物体に対して生物学的作用を有する作用剤は、生物学的活性があると見なされる。ペプチドが生物学的活性である特定の実施形態では、該ペプチドの少なくとも１つの生物活性を共有する該ペプチドの一部分が「生物学的活性」部分と称されるのが典型的である。
【００６５】
担体または希釈剤：本明細書で使用される場合、「担体」及び「希釈剤」という用語は、医薬製剤の調製に有用な薬学的に許容される（例えば、ヒトへの投与に対して安全かつ無毒である）担体または希釈物質を意味する。希釈剤の例として、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー溶液、またはデキストロース溶液が挙げられる。
【００６６】
Ｃ１−インヒビターまたはＣ１エステラーゼインヒビターまたはＣ１−ＩＮＨ：本明細書で使用される場合、「Ｃ１−インヒビター」または「Ｃ１エステラーゼインヒビター」または「Ｃ１−ＩＮＨ」という用語は、全て交換可能に使用することができ、別段の指定がない限り、実質的にＣ１−ＩＮＨの生物学的活性を保持する、野生型、天然型、もしくは天然に存在する、または修飾型の任意のＣ１−ＩＮＨポリペプチド（例えば、１つ以上のアミノ酸変異、トランケーション、欠失、挿入、及び／または融合タンパク質を持つＣ１−ＩＮＨタンパク質）を意味する。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨ融合タンパク質はＣ１−ＩＮＨポリペプチドとＦｃドメインとを含む。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨ融合タンパク質はＣ１−ＩＮＨポリペプチドとアルブミンドメインとを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質はリンカーをさらに含む。Ｃ１−ＩＮＨは、細胞で組換え発現され得る。特定の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨは、哺乳類細胞で、好ましくはＣＨＯ細胞またはヒト細胞で、好ましくはＨＴ１０８０細胞またはＨＥＫ細胞で発現する。
【００６７】
機能的等価物または機能的誘導体：本明細書で使用される場合、「機能的等価物」または「機能的誘導体」という用語は、アミノ酸配列の機能的誘導体の文脈では、元来の配列の生物学的活性と実質的に同様の生物活性（機能的または構造的いずれか）を保持する分子を意味する。機能的誘導体または機能的等価物は、天然の誘導体であり得るか、または合成で調製される。例示的な機能的誘導体として、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有するが、タンパク質の生物学的活性が保持されているアミノ酸配列が挙げられる。置換したアミノ酸は、望ましくは、置換されたアミノ酸と類似する化学物理的性質を有する。類似した望ましい化学物理的性質として、電荷、嵩高さ、疎水性、親水性などにおける類似性が挙げられる。
【００６８】
融合タンパク質：本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」という用語は、２種以上の元来は別々のタンパク質またはそれらの一部分を連結することによって作製されたタンパク質を意味する。一部の実施形態では、リンカーまたはスペーサーが各タンパク質の間に存在することになる。
【００６９】
半減期：本明細書で使用される場合、用語「半減期」は、タンパク質濃度またはタンパク質活性などの量が、ある期間の開始時に測定された値の半分まで下がるのに要する時間である。
【００７０】
遺伝性血管性浮腫またはＨＡＥ：本明細書で使用される場合、「遺伝性血管性浮腫」または「ＨＡＥ」という用語は、予測不可能な反復性の炎症発作によって特徴付けられる血液障害を意味する。ＨＡＥはＣ１−ＩＮＨ欠損と関連しているのが典型的であり、この欠損は、Ｃ１−ＩＮＨが低レベルであることか、またはＣ１−ＩＮＨの活性が損なわれている、もしくは低下していることに起因し得る。症状として、顔面、四肢、生殖器、胃腸管、及び上気道などの身体の任意の部位に生じ得る腫脹が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
改善、増加、または低減：本明細書で使用される場合、「改善」、「増加」、もしくは「低減」という用語、または文法的等価物は、本明細書に記載される治療の開始前の同一個体での測定値、または本明細書に記載される治療を受けていない対照被験体（または複数の対照被験体）での測定値などの基準測定値に対する相対的な値を示唆するものである。「対照被験体」とは、治療を受けている対象と同じ疾患形態を患っており、治療を受けている対象とほぼ同じ年齢の対象のことである。
【００７２】
ｉｎ  ｓｉｔｕ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ  ｓｉｔｕ」は、元来の、天然であり、現存する場所もしくは位置、または環境で生じる事象を意味する。
【００７３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、多細胞生物体内ではなく、例えば、試験管または反応容器中、細胞培養液中などの人工的な環境で生じる事象を意味する。
【００７４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、ヒト及び非ヒト動物などの多細胞生物体内で生じる事象を意味する。細胞型系の文脈において、該用語は、生細胞内で生じる事象を意味するのに（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ系の対語として）使用され得る。
【００７５】
リンカー：本明細書で使用される場合、用語「リンカー」は、融合タンパク質において、天然タンパク質の特定の位置に見られるもの以外のアミノ酸配列を意味し、可撓性を持つか、または２つのタンパク質部分構造の間にα−ヘリックスなどの構造を挿入するように設計されているのが一般的である。リンカーは、スペーサーとも称される。リンカーまたはスペーサーは、一般的に、それ自体には生物学的機能を持たない。
【００７６】
ポリペプチド：用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、ペプチド結合を介して互いに連結したアミノ酸の連続鎖を意味する。この用語は、任意の長さのアミノ酸鎖について言及するのに使用されるが、当業者が理解するように、この用語は長い鎖に限定されることはなく、ペプチド結合を介して互いに連結した２つのアミノ酸を含めた極めて短い鎖についても言及することができる。当業者に知られるように、ポリペプチドはプロセシング及び／または修飾されてもよい。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は交換可能に使用される。
【００７７】
予防：本明細書で使用される場合、「予防する」または「予防」という用語は、疾患、障害、及び／または症状の発病に関連して使用される場合、疾患、障害、及び／または症状発症の危険性を低下させることを意味する。後述の「危険性」の定義を参照されたい。
【００７８】
タンパク質：本明細書で使用される用語「タンパク質」は、個別単位として機能する１つ以上のポリペプチドを意味する。単一のポリペプチドが個別の機能性単位であり、個別の機能性単位を形成するために他のポリペプチドと永続的または一時的に物理的会合することを必要としない場合、用語「ポリペプチド」と用語「タンパク質」は交換可能に用いることができる。個別の機能性単位が相互に物理的会合した２つ以上のポリペプチドで構成される場合、用語「タンパク質」は、物理的に結合し、かつ個別単位として合わせて機能する複数のポリペプチドを意味する。
【００７９】
危険性：文脈から理解されるとおり、疾患、障害、及び／または症状の「危険性」は、特定の個体が疾患、障害、及び／または症状（例えば、筋ジストロフィー）を発症する可能性を包含する。一部の実施形態では、危険性は割合として表される。一部の実施形態では、危険性は０％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％から１００％までである。一部の実施形態では、危険性は、参照試料または参照試料群に関連する危険性と比較した危険性として表される。一部の実施形態では、参照試料または参照試料群は、疾患、障害、症状、及び／または事象（例えば、筋ジストロフィー）の既知の危険性を有している。一部の実施形態では、参照試料または参照試料群は、ある特定の個体と比較可能な個体由来である。一部の実施形態では、相対危険性は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上である。
【００８０】
安定性：本明細書で使用される場合、用語「安定」は、治療剤（例えば、組換えタンパク質）が治療有効性（例えば、意図した生物学的活性及び／または生理化学的完全性の全てまたは大部分）を長期間にわたって維持できることを意味する。治療剤の安定性、及び医薬組成物がかかる治療剤の安定性を維持する性能は、長期（例えば、少なくとも１か月、３か月、６か月、１２か月、１８か月、２４か月、３０か月、３６か月、またはそれ以上）にわたって評価されてもよい。製剤の文脈において、安定製剤とは、保管の際及びプロセス（凍結融解、機械的混合、及び凍結乾燥など）中に、製剤に含まれる治療剤が物理的及び／または化学的完全性と生物学的活性とを実質的に保持している製剤のことである。タンパク質安定性については、高分子量（ＨＭＷ）凝集体の形成、酵素活性の減少、ペプチド断片の生成、及び電荷プロファイルの変化によって測定され得る。
【００８１】
対象：本明細書で使用される場合、用語「対象」は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類）を意味する。ヒトには、出生前及び出生後の形態が含まれる。多くの実施形態では、対象はヒトである。対象は患者である場合があり、これは、疾患の診断または治療のために医療機関に来院するヒトを意味する。用語「対象」は、本明細書において「個体」または「患者」と交換可能に使用される。対象は、疾患または障害に罹患している可能性があるか、またはそれに感受性を有するが、疾患または障害の症状を表していてもいなくてもよい。
【００８２】
実質的：本明細書で使用される場合、用語「実質的」は、関心対象の特徴または特性の全てもしくはほぼ全ての範囲または程度を示す、定性的な状態を意味する。生物学分野の当業者であれば、生物学的及び化学的な現象が、完了すること及び／もしくは完了の域に到達すること、または絶対的な結果を達成もしくは回避することが、仮にあったとしても稀であることを理解するであろう。したがって、用語「実質的」は、本明細書において、多くの生物学的及び化学的現象に固有の潜在的な完全性の欠如を捉えるのに用いられる。
【００８３】
実質的相同性：語句「実質的相同性」は、本明細書において、アミノ酸配列または核酸配列間の比較を示すのに用いられる。当業者には理解されるように、２つの配列が対応する位置に相同な残基を有する場合、それらは通例「実質的相同」であると見なされる。相同の残基は、同一残基であってもよい。あるいは、相同の残基は、同一残基ではなく、相応に類似した構造及び／または機能特性を有していてもよい。例えば、当業者には周知のとおり、ある特定のアミノ酸は、「疎水性」または「親水性」アミノ酸として、及び／または「極性」または「非極性」の側鎖を有するとして分類されるのが典型的である。１つのアミノ酸を同一種の別のアミノ酸で置換することは、多くの場合「相同性」置換と見なされ得る。
【００８４】
当該分野で周知のとおり、アミノ酸配列または核酸配列は様々なアルゴリズムのいずれかを用いて比較することができ、そのようなアルゴリズムとして、市販のコンピュータープログラムで使用可能なアルゴリズム、例えば、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰ、ギャップＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどが挙げられる。こうしたプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；及びＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。上述のプログラムは、相同な配列を特定することに加えて、相同性の度合いの表示も提供するのが一般的である。一部の実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基のうちの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が、関連する連続区間の残基にわたって相同である場合、実質的に相同であると見なされる。一部の実施形態では、該連続区間は完全配列である。一部の実施形態では、該連続区間は、少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個、２７５個、３００個、３２５個、３５０個、３７５個、４００個、４２５個、４５０個、４７５個、５００個またはそれ以上の残基である。一部の実施形態では、アミノ酸の保存的置換には、以下の群内のアミノ酸間で行われる置換が含まれる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ、（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ、（ｄ）Ａ、Ｇ、（ｅ）Ｓ、Ｔ、（ｆ）Ｑ、Ｎ、及び（ｇ）Ｅ、Ｄ。一部の実施形態では、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換が行われる箇所でタンパク質の相対的電荷またはサイズ特性が変更されないアミノ酸置換を意味する。
【００８５】
実質的同一性：語句「実質的同一性」は、本明細書において、アミノ酸配列または核酸配列間の比較を示すのに用いられる。当業者には理解されるように、２つの配列が対応する位置に同一残基を有する場合、それらは通例「実質的に同一」であると見なされる。当該分野で周知のとおり、アミノ酸配列または核酸配列は様々なアルゴリズムのいずれかを用いて比較することができ、そのようなアルゴリズムとして、市販のコンピュータープログラムで使用可能なアルゴリズム、例えば、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰ、ギャップＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどが挙げられる。こうしたプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；ａｎｄ  Ｍｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。上述のプログラムは、同一配列を特定することに加えて、同一性の度合いの表示も提供するのが一般的である。一部の実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基のうちの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が、関連する連続区間の残基にわたって同一である場合、実質的に同一であると見なされる。一部の実施形態では、該連続区間は完全配列である。一部の実施形態では、該連続区間は、少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個、２７５個、３００個、３２５個、３５０個、３７５個、４００個、４２５個、４５０個、４７５個、５００個またはそれ以上の残基である。
【００８６】
本明細書で使用される場合、本明細書において特定される参照タンパク質配列（例えば、参照Ｃ１−ＩＮＨタンパク質配列）に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、それらの配列を整列させ、必要であればギャップを導入して配列同一性の最大パーセントを達成した後の、参照配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義され、配列同一性の一部としての任意の保存的置換を考慮していない。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当該技術分野の技術範囲内にある種々の方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアなどの公開されている入手可能なコンピューターソフトウエアを用いて実現することができる。当業者であれば、比較する配列の完全長にわたる最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを評価するための適切なパラメータを決定することができる。好ましくは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２ソフトウエアを用いてアミノ酸配列同一性を算出する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６６，４６０−４８０（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、複数の検索パラメータを使用するが、そのほとんどがデフォルト値に設定される。調整可能なパラメータは次の値に設定される：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワールド閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰスコア（Ｓ）及びＨＳＰ  Ｓ２パラメータは動的値であり、特定配列の組成に応じてプログラム自体によって確定されるが、最小値は調節可能であり、上述のとおりに設定される。
【００８７】
罹患：疾患、障害、及び／または症状に「罹患」している個体は、その疾患、障害、及び／または症状を持つと診断されているか、またはその疾患、障害、及び／または症状の１つ以上の徴候を示している。
【００８８】
感受性を有する：疾患、障害、及び／または症状に感受性を有する個体は、その疾患、障害、及び／または症状を持つとは診断されていない。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／または症状に感受性を有する個体は、その疾患、障害、及び／または症状の徴候を呈していない場合がある。一部の実施形態では、疾患、障害、症状、または事象（例えば、ＤＭＤ）に感受性を有する個体は、以下のうちの１つ以上によって特徴付けることができる：（１）疾患、障害、及び／または症状の発症と関連する遺伝子変異；（２）疾患、障害、及び／または症状の発症と関連する遺伝子多型；（３）疾患、障害、及び／または症状と関連するタンパク質の発現及び／または活性の増加及び／または減少；（４）疾患、障害、症状、及び／または事象の発症と関連する習慣及び／または生活様式；（５）移植を受けたか、受ける予定であるか、または移植を必要としていること。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／または症状に感受性を有する個体は、その疾患、障害、及び／または症状を発症することになる。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／または症状に感受性を有する個体は、その疾患、障害、及び／または症状を発症することがない。
【００８９】
治療有効量：本明細書で使用される場合、治療剤の「治療有効量」という用語は、疾患、障害、及び／もしくは症状に罹患しているか、または感受性を有する対象に投与される場合、その疾患、障害、及び／または症状の徴候（複数可）を治療する、診断する、予防する、及び／またはその開始を遅延するのに十分な量を意味する。当業者は、治療有効量が少なくとも１つの単位用量を含む投与レジメンによって投与されるのが典型的であることを理解するであろう。
【００９０】
治療：本明細書で使用される場合、用語「治療する」、「治療」または「治療している」は、ある特定の疾患、障害、及び／または症状の１つ以上の徴候または特徴を、部分的にまたは完全に軽減する、寛解させる、緩和する、抑制する、予防する、その開始を遅延する、その重症度を低減する、及び／またはその発症率を低減するために使用する任意の方法を意味する。疾患の症状を提示していない対象、及び／または疾患の初期の症状のみを提示している対象に対して、該疾患に関連する病態を発症させる危険性を減らすために、治療が行われる場合もある。
【発明を実施するための形態】
【００９１】
本発明は、特に、タンパク質治療剤としてｒｈＣ１−ＩＮＨを用いて、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）を含めた補体媒介性障害を治療するための方法及び組成物を提供する。
【００９２】
本発明の種々の態様を、以下の節で詳細に説明する。節の使用は、本発明を限定することを意味するものではない。各節は、本発明の任意の態様に対して適用することができる。本出願で使用される「または」は、別段の記載がない限り、「及び／または」を意味する。本明細書で引用される技術の全ての開示は、参照によりその全体が援用される。
【００９３】
Ｃ１−ＩＮＨ
ヒトＣ１−ＩＮＨは、広範な抑制性及び非抑制性の生物学的活性を有する重要な抗炎症性血漿タンパク質である。ヒトＣ１−ＩＮＨは、配列相同性、そのＣ末端ドメインの構造、及びプロテアーゼ阻害の機序により、血漿プロテアーゼインヒビターの最大クラスであるセルピンスーパーファミリーに属する。このセルピンスーパーファミリーには、抗トロンビン、α１−プロテイナーゼインヒビター、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター、及び多種多様な生理学系を調節する構造上類似した多くの他のタンパク質も含まれる。Ｃ１−ＩＮＨは、補体系、キニン生成の接触系、及び固有凝固経路におけるプロテアーゼのインヒビターである。Ｃａｉ，Ｓ．＆  Ｄａｖｉｓ，Ａ．Ｅ．，Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ１  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  Ｓｅｌｅｃｔｉｎｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７１：４７８６−４７９１（２００３）。具体的には、Ｃ１−ＩＮＨは、補体系のＣ１ｒ及びＣ１ｓを阻害することが示されている。Ｃ１−ＩＮＨは、凝固第ＸＩ因子及び凝固第ＸＩＩ因子、ならびにカリクレイン、及び凝固系と線溶系の他のセリンプロテアーゼ（例えば、組織型プラスミノーゲン活性化因子及びプラスミンなど）の主要レギュレーターでもある。
【００９４】
Ｃ１−ＩＮＨの低い血漿含有量またはその機能不全により、補体カスケード及び接触血漿カスケードの両方が活性化され、同様に他の系も影響を受ける恐れがある。Ｃ１−ＩＮＨの血漿含有量が５５μｇ／ｍＬ（正常値の約２５％）未満のレベルに低下すると、Ｃ１の自発的活性化が誘導されることがわかっている。
【００９５】
Ｃ１−ＩＮＨの構造を示す概略図を図１に示す。シグナルペプチド、Ｎ末端ドメイン、及びセルピンドメインが示されている。２２個のアミノ酸シグナルペプチドは分泌に必要であり、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質の残部から切断される。Ｃ１−ＩＮＨは２つのドメインを有しており、それらは、典型的なセルピンドメインである３６５個のアミノ酸を有するＣ末端ドメインと、１１３個のアミノ酸を有するＮ末端ドメインである。このタンパク質は、ドメインを接続する２つのジスルフィド架橋によって安定化されている。これらのジスルフィド架橋は、Ｎ末端ドメインのＣｙｓ１０１とＣ末端（セルピン）ドメインのＣｙｓ４０６とが形成するジスルフィド結合、及びＮ末端ドメインのＣｙｓ１０８とＣ末端ドメインのＣｙｓ１８３とが形成するジスルフィド結合により形成される。セルピンドメインは、Ｃ１−ＩＮＨのプロテアーゼ活性を担っている。Ｐ１−Ｐ１’は、Ａｒｇ４４４−Ｔｈｒ４４５被切断結合を表す。
【００９６】
グリコシル化タンパク質の重量のうちの２６％超は炭水化物である。グリカンは、ヒトＣ１−ＩＮＨの全体にわたって不均一に分布している。Ｎ末端は重度にグリコシル化されており、３つのＮ結合型（ダイヤモンド形の先端部を持つ長い垂直線として表示）炭水化物基と少なくとも７つのＯ結合型（短い垂直線として表示）炭水化物基とを有する。３つのＮ結合型グリカンは、セルピンドメインのアスパラギン残基であるＡｓｎ２１６、Ａｓｎ２３１、及びＡｓｎ３３０に結合している（ダイヤモンド形の先端部を持つ長い垂直線として表示）。極めて長くかつ重度にグリコシル化されたＮ末端ドメインの機能的役割は依然として不明ではあるが、これは、タンパク質の高次構造安定性、認識、エンドトキシン及びセレクチンに対する親和性、ならびにクリアランスに不可欠である可能性がある。炭水化物部分構造の固有の不均一性はＣ１−ＩＮＨ全体の不均一性の大きな原因となっており、血漿由来Ｃ１−ＩＮＨの性質を模倣するｒｈＣ１−ＩＮＨの産生が困難である理由の１つになっている。
【００９７】
本明細書で使用される場合、本発明に適したｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、実質的にＣ１−ＩＮＨ生物学的活性を保持する任意の野生型及び修飾型ヒトＣ１−ＩＮＨポリペプチド（例えば、アミノ酸の変異、欠失、トランケーション、及び／または挿入を有するＣ１−ＩＮＨタンパク質）を含む。典型的には、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、組換え技術を用いて産生される。
【００９８】
典型的には、好適なｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、約１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、２日、２．５日、３日、３．５日、４日、４．５日、５日、５．５日、６日、６．５日、７日、７．５日、８日、８．５日、９日、９．５日、または１０日以上のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する。一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、０．５日〜１０日、１日〜１０日、１日〜９日、１日〜８日、１日〜７日、１日〜６日、１日〜５日、１日〜４日、１日〜３日、２日〜１０日、２日〜９日、２日〜８日、２日〜７日、２日〜６日、２日〜５日、２日〜４日、２日〜３日、２．５日〜１０日、２．５日〜９日、２．５日〜８日、２．５日〜７日、２．５日〜６日、２．５日〜５日、２．５日〜４日、３日〜１０日、３日〜９日、３日〜８日、３日〜７日、３日〜６日、３日〜５日、３日〜４日、３．５日〜１０日、３．５日〜９日、３．５日〜８日、３．５日〜７日、３．５日〜６日、３．５日〜５日、３．５日〜４日、４日〜１０日、４日〜９日、４日〜８日、４日〜７日、４日〜６日、４日〜５日、４．５日〜１０日、４．５日〜９日、４．５日〜８日、４．５日〜７日、４．５日〜６日、４．５日〜５日、５日〜１０日、５日〜９日、５日〜８日、５日〜７日、５日〜６日、５．５日〜１０日、５．５日〜９日、５．５日〜８日、５．５日〜７日、５．５日〜６日、６日〜１０日、７日〜１０日、８日〜１０日、９日〜１０日のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する。
【００９９】
一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、血漿由来ヒトＣ１エステラーゼインヒビターの半減期と同様のまたはそれよりも長い半減期を有する。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、血漿由来ヒトＣ１エステラーゼインヒビターの半減期に匹敵するか、またはそれよりも長い半減期を有する。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、血漿由来ヒトＣ１エステラーゼインヒビターの半減期と同等のまたはそれよりも長い半減期を有する。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、血漿由来ヒトＣ１エステラーゼインヒビターの半減期と生物学的同等のまたはそれよりも長い半減期を有する。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、血漿由来ヒトＣ１エステラーゼインヒビターの半減期と同一の半減期を有する。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、血漿由来ヒトＣ１エステラーゼインヒビターの半減期の５０％〜１５０％の範囲内の半減期を有する。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、血漿由来ヒトＣ１エステラーゼインヒビターの半減期の６０％〜１３０％の範囲内の半減期を有する。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、血漿由来ヒトＣ１エステラーゼインヒビターの半減期の７０％〜１３０％の範囲内の半減期を有する。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、血漿由来ヒトＣ１エステラーゼインヒビターの半減期の８０％〜１２０％の範囲内の半減期を有する。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、血漿由来ヒトＣ１エステラーゼインヒビターの半減期の８０％〜１３０％の範囲内の半減期を有する。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、血漿由来ヒトＣ１エステラーゼインヒビターの半減期の８０％〜１４０％の範囲内の半減期を有する。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、血漿由来ヒトＣ１エステラーゼインヒビターの半減期の８０％〜１５０％の範囲内の半減期を有する。
【０１００】
一部の実施形態では、本発明に適したｒｈＣ１−ＩＮＨポリペプチドとして、以下の野生型ヒトＣ１−ＩＮＨタンパク質（アミノ酸１〜４７８）（アミノ酸１〜９７を下線引きで表示）に対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列が挙げられる：
【化１】
2018538270.tif 000003
【０１０１】
一部の実施形態では、本発明に適したｒｈＣ１−ＩＮＨポリペプチドとして、Ｅ１６５Ｑ変異（変異したアミノ酸を太字にし下線引きで表示）を有する以下のヒトＣ１−ＩＮＨタンパク質（アミノ酸１〜４７８）に対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列が挙げられる：
【化２】
2018538270.tif 000004
【０１０２】
一部の実施形態では、本発明に適したｒｈＣ１−ＩＮＨポリペプチドとして、以下の短縮された野生型ヒトＣ１−ＩＮＨタンパク質（アミノ酸９８〜４７８）に対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列が挙げられる：
【化３】
2018538270.tif 000005
【０１０３】
一部の実施形態では、本発明に適したｒｈＣ１−ＩＮＨポリペプチドとして、Ｅ１６５Ｑ変異（変異したアミノ酸を太字にし下線引きで表示）を有する以下の短縮された野生型ヒトＣ１−ＩＮＨタンパク質（アミノ酸９８〜４７８）に対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列が挙げられる：
【化４】
2018538270.tif 000006
【０１０４】
本明細書で開示するとおり、配列番号１は、ヒトＣ１−ＩＮＨタンパク質の標準アミノ酸配列を示す。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨポリペプチドは、配列番号３または配列番号４などの短縮されたＣ１−ＩＮＨであり得る。一部の実施形態では、好適なｒｈＣ１−ＩＮＨポリペプチドは、野生型または天然に存在するタンパク質の相同体または類似体であり得る。例えば、ヒト野生型または天然に存在するＣ１−ＩＮＨポリペプチドの相同体または類似体は、実質的にＣ１−ＩＮＨタンパク質活性を保持しつつ、野生型または天然に存在するＣ１−ＩＮＨタンパク質（例えば、配列番号１）と比較して、１つ以上のアミノ酸もしくはドメインの置換、欠失、及び／または挿入を含む場合がある（例えば、配列番号２）。したがって、一部の実施形態では、本発明に適したｒｈＣ１−ＩＮＨポリペプチドは、野生型ヒトＣ１−ＩＮＨタンパク質（配列番号１）と実質的に相同である。
【０１０５】
一部の実施形態では、本発明に適したｒｈＣ１−ＩＮＨポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、本発明に適したｒｈＣ１−ＩＮＨポリペプチドは、野生型ヒトＣ１−ＩＮＨタンパク質（配列番号１）と実質的に同一である。一部の実施形態では、本発明に適したｒｈＣ１−ＩＮＨポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１０６】
一部の実施形態では、本発明に適した組換えヒトＣ１−ＩＮＨポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、本発明に適したｒｈＣ１−ＩＮＨポリペプチドは、配列番号２のヒトＣ１−ＩＮＨタンパク質と実質的に同一である。一部の実施形態では、本発明に適したｒｈＣ１−ＩＮＨポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１０７】
ヒトＣ１−ＩＮＨタンパク質の相同体または類似体は、当業者に既知のポリペプチド配列変更方法（かかる方法をまとめた参考文献において参照されるものなど）により調製することができる。一部の実施形態では、アミノ酸の保存的置換には、以下の群内のアミノ酸間で行われる置換が含まれる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ、（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ、（ｄ）Ａ、Ｇ、（ｅ）Ｓ、Ｔ、（ｆ）Ｑ、Ｎ、及び（ｇ）Ｅ、Ｄ。一部の実施形態では、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換が行われる箇所でタンパク質の相対的電荷またはサイズ特性が変更されないアミノ酸置換を意味する。
【０１０８】
一部の実施形態では、本発明に適したｒｈＣ１−ＩＮＨポリペプチドは、配列番号１の野生型ヒトＣ１−ＩＮＨタンパク質、または配列番号２のＣ１−ＩＮＨタンパク質と比較して、１つ以上のアミノ酸欠失、挿入、または置換を含む。例えば、好適なｒｈＣ１−ＩＮＨポリペプチドは、配列番号３または配列番号４のポリペプチドのように短縮され得る。
【０１０９】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨポリペプチドは、実質的にＣ１−ＩＮＨタンパク質活性を保持しつつ、短縮されたＣ１−ＩＮＨ（配列番号３または配列番号４など）であり得る。したがって、一部の実施形態では、本発明に適したｒｈＣ１−ＩＮＨポリペプチドは、配列番号３または配列番号４と実質的に相同である。一部の実施形態では、本発明に適したｒｈＣ１−ＩＮＨポリペプチドは、配列番号３または配列番号４に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、本発明に適したｒｈＣ１−ＩＮＨポリペプチドは、配列番号３または配列番号４と実質的に同一である。一部の実施形態では、本発明に適したｒｈＣ１−ＩＮＨポリペプチドは、配列番号３または配列番号４に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１１０】
本発明に適したｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、例えばｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質の半減期、安定性、効力及び／もしくは送達を増大もしくは増加させるか、または免疫原性、クリアランス、もしくは毒性を低減もしくは排除することによって、Ｃ１−ＩＮＨの治療効果を提示する。一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、血漿由来Ｃ１−ＩＮＨと同様のまたはそれよりも長い半減期を有する。一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、血漿由来Ｃ１−ＩＮＨと同様のまたはそれよりも大きい活性を有する。
【０１１１】
例示的な組換えＣ１−ＩＮＨタンパク質
特定の実施形態では、好適なｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、配列番号１の野生型ヒトＣ１−ＩＮＨポリペプチド、または配列番号２のＣ１−ＩＮＨポリペプチド、または配列番号３もしくは配列番号４の短縮されたＣ１−ＩＮＨポリペプチドに対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、好適なｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、約０．５日〜１０日（例えば、約０．５日〜５．５日、約０．５日〜５日、約１日〜５日、約１．５日〜５日、約１．５日〜４．５日、約１．５日〜４．０日、約１．５日〜３．５日、約１．５日〜３日、約１．５日〜２．５日、約２日〜６日、約２日〜５．５日、約２日〜５日、約２日〜４．５日、約２日〜４日、約２日〜３．５日、約２日〜３日）の範囲のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する。一部の実施形態では、好適なｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、約２日〜１０日の範囲（例えば約２．５日〜１０日、約３日〜１０日、約３．５日〜１０日、約４日〜１０日、約４．５日〜１０日、約５日〜１０日、約３日〜８日、約３．５日〜８日、約４日〜８日、約４．５日〜８日、約５日〜８日、約３日〜６日、約３．５日〜６日、約４日〜６日、約４．５日〜６日、約５日〜６日の範囲）のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する。
【０１１２】
一部の実施形態では、好適なｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同または同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１１３】
本発明に適したｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、様々な濃度で長期間の間安定である。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、約２０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬまたはそれ以上の濃度で液体産物として安定している。
【０１１４】
グリコシル化／グリカンマッピング（プロファイル）
本発明により産生されたｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質またはポリペプチドは、シアル酸含有量及びグリカンマップなどの固有の特徴を有する。一部の実施形態では、組換え発現Ｃ１−ＩＮＨタンパク質またはポリペプチドは、血漿由来Ｃ１−ＩＮＨのグリコシル化プロファイルと同様のグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、組換え発現Ｃ１−ＩＮＨタンパク質またはポリペプチドは、組換え発現Ｃ１−ＩＮＨタンパク質が血漿由来Ｃ１−ＩＮＨの半減期と同様の半減期を提示するようなグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、組換え発現Ｃ１−ＩＮＨタンパク質またはポリペプチドは、組換え発現Ｃ１−ＩＮＨタンパク質が血漿由来Ｃ１−ＩＮＨの半減期よりも長い半減期を提示するようなグリコシル化プロファイルを有する。
【０１１５】
一部の実施形態では、精製されたｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、一般的にグリカンマッピングと称されるプロテオグリカン組成によって特徴付けられ得る。いかなる理論に束縛されることも望まないが、枝分かれ構造の形状及び複雑性を伴うグリカン結合は、ｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス、生物学的利用度、及び／または有効性に影響を及ぼし得ると考えられる。
【０１１６】
グリカンマップは、通例、酵素消化法及びそれに続くクロマトグラフィー分析によって測定され得る。種々の酵素を酵素消化法に用いることができ、酵素には、好適であるグリコシラーゼ、ペプチダーゼ（例えば、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ）、プロテアーゼ、及びホスファターゼが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、好適な酵素はアルカリホスファターゼである。一部の実施形態では、好適な酵素はノイラミニダーゼである。グリカンはクロマトグラフィー分析によって検出され得る。例えば、グリカンは、パルスアンペロメトリック検出を備えた高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥ−ＰＡＤ）か、またはサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって検出され得る。グリカンマップの各ピークにより表されるグリカンの量は、当該技術分野で既知の方法及び本明細書で開示された方法に従って、グリカンの検量線を用いて計算することができる。
【０１１７】
一部の実施形態では、本発明の精製されたＣ１−ＩＮＨはグリカンマップで特徴付けられる。各ピーク群に対応するグリカンの相対量は、既定の参照標準での該当ピーク群の面積に対する該各ピーク群の面積に基づいて算出することができる。グリカンマッピング用の種々の参照標準が当該技術分野で知られており、本発明の実施に用いることができる。一部の実施形態では、精製されたｒｈＣ１−ＩＮＨは、中性、モノシアリル化、ジシアリル化、トリシアリル化、またはテトラシアリル化のｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を示すピーク群から選択される５つ以下のピーク群を含むグリカンマップで特徴付けられる。
【０１１８】
一部の実施形態では、精製されたｒｈＣ１−ＩＮＨは、中性グリカン種、モノシアリル化種、ジシアリル化種、トリシアリル化種、及び／またはテトラシアリル化種のうちの少なくとも１つを含むグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、精製されたｒｈＣ１−ＩＮＨは、中性グリカン種、モノシアリル化種、ジシアリル化種、トリシアリル化種、及び／またはテトラシアリル化種を含むグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、約１０％〜約２０％の中性グリカン種を含むグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％以下の中性グリカン種を含むグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、約５％〜約３０％の中性グリカン種を含むグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、約５％〜約２５％の中性グリカン種を含むグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、約１０％〜約３０％のモノシアリル化種を含むグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、約３０％〜約５０％のジシアリル化種を含むグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、約１５％〜約３５％のトリシアリル化種を含むグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、約５％〜約１５％のテトラシアリル化種を含むグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、平均して１分子当たり少なくとも約８０％の（例えば、１分子当たり約８５％、９０％、９５％、または９９％を超える）荷電グリカンを含む。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、約３０％以下の中性グリカン種と、精製されたｒｈＣ１−ＩＮＨが血漿由来Ｃ１−ＩＮＨと同様のまたはそれよりも長い半減期を有するようなシアリル化グリカン種とを含むグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、３０％以下の中性グリカン種、約２０％〜約３０％のモノシアリル化グリカン種、約３０％〜約４０％のジシアリル化グリカン種、約１０％〜約２０％のトリシアリル化グリカン種、及び約５％〜約１０％のテトラシアリル化グリカン種を含むグリコシル化プロファイルを有する。
【０１１９】
一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、約２０％、１５％、１０％、５％、または０％未満の、マンノース、α−ガラクトース、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）、及び／またはオリゴマンノース型のグリコシル化のうちの１つ以上を含有する。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、約２０％、１５％、１０％、５％、または０％以下の、マンノース、α−ガラクトース、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）、及び／またはオリゴマンノース型のグリコシル化のうちの１つ以上を含有する。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、免疫原性ではないグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、血漿由来ヒトＣ１−ＩＮＨと比べた場合に血清クリアランス速度を増加させないグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、血漿由来ヒトＣ１−ＩＮＨと比べた場合に血清クリアランス速度を減少させるグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、精製された組換えｒｈＣ１−ＩＮＨは、コネスタットアルファと比べた場合に血清クリアランス速度を減少させるグリコシル化プロファイルを有する。
【０１２０】
一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨを発現するように操作された細胞は、発現したｒｈＣ１−ＩＮＨのシアリル化を増加させるようにも操作され得る。一部の実施形態では、細胞は、シアリル化を増加させるべく異種酵素を発現するように操作されている。一部の実施形態では、細胞は、シアリル化を増加させるべく変異異種酵素を発現するように操作されている。一部の実施形態では、細胞は、シアリル化を増加させるべく内因性酵素を過剰発現するように操作されている。一部の実施形態では、細胞は、シアリル化を増加させるべく変異型内因性酵素を発現するように操作されている。一部の実施形態では、細胞は、シアリル化を低減、阻害、もしくは劣化させる内因性酵素の発現を低減させるか、または妨げるように操作されている（例えば、アンチセンス構築物を用いて）。
【０１２１】
タンパク質のグリコシル化プロファイルを操作する様々な方法が当該技術分野で知られている。これらの方法に加えて、まだ見出されていない他の方法も、本発明により考慮される。本発明のＣ１−ＩＮＨタンパク質及びポリペプチドのグリコシル化プロファイルを操作する方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、及びｉｎ  ｖｉｖｏでの方法が含まれる。一部の実施形態では、発現したタンパク質またはポリペプチドのグリコシル化プロファイルは、発現したタンパク質またはポリペプチドの発現後化学修飾により変わる。一部の実施形態では、細胞培養条件は、所望のグリコシル化プロファイルを有するタンパク質を発現させるように操作される。これらの細胞培養条件には、培養の期間、培養培地への添加物、及び／またはグリコシル化を増やすための遺伝子の共発現を含めた、産生及び培養プロセスの制御が含まれる。宿主細胞、及び形質移入された宿主細胞の特異的クローンの選択も、グリコシル化を増大させるために利用されてもよい。グリコシル化を増やすいくつかの方法として、所望のグリコシル化プロファイルを有するタンパク質またはポリペプチドを濃縮する精製プロセスが挙げられる。
【０１２２】
Ｃ１−ＩＮＨの半減期は、グリコシル化プロファイルによって影響を受け得る。例えば、ルコネスト（登録商標）（Ｐｈａｒｍｉｎｇ  Ｎ．Ｖ．社）は、あまりシアリル化されていないか、及び／または血漿由来ヒトＣ１−ＩＮＨとは異なるシアリル化分布を有する組換えＣ１−ＩＮＨポリペプチドであり、血漿由来ヒトＣ１−ＩＮＨよりも著しく短い半減期を有することがわかっている。例えば、Ｄａｖｉｓ，Ｂ．＆  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ａ．，Ｃｏｎｅｓｔａｔ  ａｌｆａ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ  ａｔｔａｃｋｓ，Ｔｈｅｒ  Ｃｌｉｎ  Ｒｉｓｋ  Ｍａｎａｇ．７：２６５−２７３（２０１１）；Ｋｏｌｅｓ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｌａｃｔａｔｉｏｎ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ｃ１  ｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍｉｌｋ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｒａｂｂｉｔｓ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４（１１）：９７９−９８６（２００４）；Ｋｏｌｅｓ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ−  ａｎｄ  Ｏ−ｇｌｙｃａｎｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ｃ１  ｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｉｌｋ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｒａｂｂｉｔｓ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４（１）：５１−６４（２００４）を参照されたい。ルコネスト（登録商標）は、ヒト血漿由来Ｃ１−ＩＮＨと同一のアミノ酸配列を有するが、ウサギで作製されるため、そのグリコシル化プロファイルはヒト血漿由来Ｃ１−ＩＮＨのプロファイルとは全く異なっている。その結果として、ルコネスト（登録商標）は約２．４時間〜２．７時間という極めて短い半減期を有する。ルコネスト（登録商標）ＦＤＡラベル及び処方情報を参照されたい。対照的に、ヒト血漿由来Ｃ１−ＩＮＨは、約５６時間〜６２時間の範囲内の平均半減期を有することが示されている。ＣＩＮＲＹＺＥ（登録商標）処方情報を参照されたい。本明細書で論じるように、本発明の細胞は、発現したｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質のグリコシル化プロファイルを改良するように操作され、その結果、本発明のｒｈＣ１−ＩＮＨが血漿由来Ｃ１−ＩＮＨと同様のまたはそれよりも長い半減期を有するようになる。
【０１２３】
シアリル化／シアル酸含有量
一部の実施形態では、組換え発現Ｃ１−ＩＮＨタンパク質またはポリペプチドは、血漿由来Ｃ１−ＩＮＨのシアリル化プロファイルと同様のシアリル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、組換え発現Ｃ１−ＩＮＨタンパク質またはポリペプチドは、組換え発現Ｃ１−ＩＮＨタンパク質が血漿由来Ｃ１−ＩＮＨの半減期と同様の半減期を提示するようなシアリル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、組換え発現Ｃ１−ＩＮＨタンパク質またはポリペプチドは、組換え発現Ｃ１−ＩＮＨタンパク質が血漿由来Ｃ１−ＩＮＨの半減期よりも長い半減期を提示するようなシアリル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、精製された組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨまたはＣ１−ＩＮＨ）は、平均して１分子当たり少なくとも約１０個、１１個、１２個、１３個、または１４個のシアリル化グリカン残基を含む。一部の実施形態では、精製された組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨまたはＣ１−ＩＮＨ）は、平均して１分子当たり少なくとも約１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、または２９個のシアリル化グリカン残基を含む。一部の実施形態では、精製された組換えヒトＣ１エステラーゼインヒビター（ｒｈＣ１−ＩＮＨまたはＣ１−ＩＮＨ）は、平均して１分子当たり少なくとも約３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、または４０個のシアリル化グリカン残基を含む。
【０１２４】
タンパク質のシアリル化プロファイルを操作する様々な方法が当該技術分野で知られている。これらの方法に加えて、まだ見出されていない他の方法も、本発明により考慮される。本発明のＣ１−ＩＮＨタンパク質及びポリペプチドのシアリル化プロファイルを操作する方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、及びｉｎ  ｖｉｖｏでの方法が含まれる。一部の実施形態では、発現したタンパク質またはポリペプチドのシアリル化プロファイルは、発現したタンパク質またはポリペプチドの発現後化学修飾により変わる。一部の実施形態では、細胞培養条件は、所望のシアリル化プロファイルを有するタンパク質を発現させるように操作される。これらの細胞培養条件には、培養の期間、培養培地への添加物、及び／またはシアリル化を増やすための遺伝子の共発現を含めた、産生及び培養プロセスの制御が含まれる。宿主細胞、及び形質移入された宿主細胞の特異的クローンの選択も、シアリル化を増大させるために利用されてもよい。シアリル化を増やすいくつかの方法として、所望のシアリル化プロファイルを有するタンパク質またはポリペプチドを濃縮する精製プロセスが挙げられる。
【０１２５】
組換えＣ１−ＩＮＨタンパク質の産生
本発明に適したｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を任意の使用可能な手段によって産生することができる。例えば、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質コード核酸を発現するように操作された宿主細胞系を利用することにより組換え産生することができる。別の方法として、または加えて、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を、内因性遺伝子を活性化することによって産生してもよい。別の方法として、または加えて、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を、化学合成によって部分的にまたは完全に調製してもよい。
【０１２６】
タンパク質が組換え産生される場合、任意の発現系を用いることができる。数例を挙げると、既知の発現系として、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、卵、バキュロウイルス、植物、酵母、または哺乳類の細胞が挙げられる。
【０１２７】
一部の実施形態では、本発明に適したｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、哺乳類細胞で産生される。本発明に従って使用され得る哺乳類細胞の非限定的な例として、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ番号８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６、ＣｒｕＣｅｌｌ社、オランダ、ライデン）；ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（懸濁培養での増殖用にサブクローンされたＨＥＫ２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９，１９７７）；ヒト線維肉腫細胞株（例えば、ＨＴ１０８０）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ２１、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６，１９８０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１，１９８０）；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳癌腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８，１９８２）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）が挙げられる。
【０１２８】
一部の実施形態では、本発明はヒト細胞から産生されたｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ＣＨＯ細胞、ＨＴ１０８０細胞、またはＨＥＫ細胞から産生されたｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を提供する。
【０１２９】
典型的には、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を発現するように操作された細胞には、本明細書に記載のｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質をコードする導入遺伝子が含まれ得る。ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質をコードする核酸は、調節配列、遺伝子制御配列、プロモーター、非コード配列、及び／またはｒｈＣ１−ＩＮＨを発現するのに適正な他の配列を含むことができると理解されるべきである。典型的には、コード領域は、これらの核酸成分のうちの１つ以上と作用可能に連結されている。
【０１３０】
導入遺伝子のコード領域は、特定の細胞型に対するコドン使用頻度を最適化するように１つ以上のサイレント変異を含んでいてもよい。例えば、Ｃ１−ＩＮＨ導入遺伝子のコドンは、脊椎動物細胞での発現向けに最適化されていてもよい。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨ導入遺伝子のコドンは、哺乳類細胞での発現向け最適化され得る。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨ導入遺伝子のコドンは、ヒト細胞での発現向けに最適化され得る。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨ導入遺伝子のコドンは、ＣＨＯ細胞での発現向けに最適化され得る。
【０１３１】
組換えＣ１−インヒビタータンパク質をコードする核酸
一部の実施形態では、本明細書の様々な実施形態に記載された、Ｃ１−インヒビタータンパク質などの関心対象の組換え遺伝子（本明細書では導入遺伝子と称される）をコードする核酸配列を含む核酸分子が提供される。一部の実施形態では、導入遺伝子をコードする核酸は、コードされるＣ１−インヒビタータンパク質の発現を増加させるように修飾される（コドン最適化とも称される）場合がある。例えば、コード配列のオープンリーディングフレームを変えることによって、導入遺伝子をコードする核酸を修飾することができる。本明細書で使用される場合、用語「オープンリーディングフレーム」は、「ＯＲＦ」と同義語であり、タンパク質またはタンパク質の一部分をコードできる可能性がある任意のヌクレオチド配列を意味する。オープンリーディングフレームは、通例、開始コドン（例えば、標準コードではＲＮＡ分子についてはＡＵＧとして、及びＤＮＡ分子についてはＡＴＧとして表される）で開始し、停止コドン（例えば、標準コードではＲＮＡ分子についてはＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧとして、及びＤＮＡ分子についてはＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧとして表される）を有するフレーム末端までコドントリプレットで読まれる。本明細書で使用される場合、用語「コドン」は、タンパク質合成の間に特定のアミノ酸を定める核酸分子における３つのヌクレオチド配列を意味しており、トリプレットまたはコドントリプレットとも呼ばれている。例えば、標準の遺伝子コードにおいて考えられる６４個のコドンのうち、２つのコドンＧＡＡ及びＧＡＧはアミノ酸のグルタミンをコードするが、コドンＡＡＡ及びＡＡＧはアミノ酸のリジンを指定する。標準の遺伝子コードでは３つのコドンが停止コドンであり、これらはアミノ酸を特定するものではない。本明細書で使用される場合、用語「同義コドン」は単一のアミノ酸をコードするコドンのいずれか及び全てを意味する。メチオニン及びトリプトファンを除いて、アミノ酸は２つ〜６つの同義コドンによってコードされる。例えば、標準の遺伝子コードでは、アミノ酸のアラニンをコードする４つの同義コドンはＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、及びＧＣＵであり、グルタミンを指定する２つの同義コドンはＧＡＡ及びＧＡＧであり、リジンをコードする２つの同義コドンはＡＡＡ及びＡＡＧである。
【０１３２】
一部の実施形態では、Ｃ１−インヒビタータンパク質のオープンリーディングフレームをコードする核酸を、標準のコドン最適化法を用いて修飾することができる。コドン最適化には種々の市販のアルゴリズムが利用可能であり、本発明の実施に使用することができる。一般的には、コドン最適化によって、コードされるアミノ酸配列が変わることはない。一部の実施形態では、コドン最適化により、置換、欠失、または挿入などのアミノ酸の変更が生じる可能性がある。通常、こうしたアミノ酸の変更がタンパク質活性を実質的に変えることはない。
【０１３３】
例示的な核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上同一または相同であるアミノ酸配列を有するＣ１−インヒビタータンパク質をコードする。
【０１３４】
一部の実施形態では、ヌクレオチドを変えることによってオープンリーディングフレーム内の同義コドンが変わり、Ｃ１−インヒビタータンパク質を発現するように選択された特定の異種細胞の内因性コドン使用頻度と符合するようになり得る。別の方法として、または加えて、ヌクレオチドを変えることによってオープンリーディングフレームの中でのＧ＋Ｃ含有量が変わることで、異種宿主細胞に存在する内因性核酸配列に見られるオープンリーディングフレームの平均Ｇ＋Ｃ含有量によく一致するようになり得る。また、ヌクレオチドを変えることにより、Ｃ１−インヒビタータンパク質配列内に見られるポリモノヌクレオチド領域または内部調節部位もしくは内部構造部位も変わり得る。したがって、原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞おいて、Ｃ１−インヒビタータンパク質の発現を増加させる核酸配列を含むが、これに限定されない種々の修飾または最適化されたヌクレオチド配列が想定される。
【０１３５】
修飾された核酸は、通例、アミノ酸配列の変更を伴うかまたは伴わずにＣ１−インヒビタータンパク質をコードする。アミノ酸変更を伴う事象において、こうした変更によってＣ１−インヒビタータンパク質の活性が実質的に低下することはない。一部の実施形態では、こうした変更によってＣ１−インヒビタータンパク質の活性が増加及び／または増大する。活性は、以下に列記される非限定的なパラメータを指してもよい：半減期の増加、宿主細胞によるタンパク質発現の増加／上昇、発現タンパク質の安定性向上、発現タンパク質の溶解性向上、発現タンパク質の凝集減少、発現タンパク質の製剤簡略化、発現タンパク質の精製簡略化、発現タンパク質のｐＨ変化に対する耐性向上、タンパク質の高ｐＨ及び低ｐＨ条件に対する耐性能力の向上、高濃度での製剤化に適するタンパク質の発現。
【０１３６】
発現ベクター
本出願に記載のＣ１−インヒビタータンパク質をコードする核酸配列は、宿主細胞での増殖または発現に適切なベクターに分子的にクローニング（挿入）され得る。本発明を実施するために多様な発現ベクターを使用することができ、こうしたベクターとして、以下に限定されないが、原核生物発現ベクター、酵母発現ベクター、昆虫発現ベクター、及び哺乳類発現ベクターが挙げられる。本発明に適したベクターの例として、以下に限定されないが、ウイルス系ベクター（例えば、ＡＡＶ系ベクター、レトロウイルス系ベクター、プラスミド系ベクター）が挙げられる。一部の実施形態では、Ｃ１−インヒビタータンパク質をコードする核酸配列は適切なベクターに挿入することができる。Ｃ１−インヒビタータンパク質をコードする核酸は、様々な調節配列または調節エレメントに作用可能に連結しているのが典型的である。
【０１３７】
調節配列または調節エレメント
様々な調節配列または調節エレメントを、本発明に適した発現ベクターに組み込むことができる。調節配列または調節エレメントの例として、以下に限定されないが、プロモーター、エンハンサー、リプレッサーまたはサプレッサー、５’非翻訳（または非コード）配列、イントロン、３’非翻訳（または非コード）配列が挙げられる。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」または「プロモーター配列」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼを（例えば、直接的にまたは他のプロモーター結合タンパク質もしくは物質を介して）結合させることができ、かつコード配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。プロモーター配列は、通例、その３’末端において転写開始部位で結合し、上流に向かって（５’方向に）延びて、任意のレベルで転写を開始するのに必要な塩基またはエレメントの最小個数を含んでいる。プロモーターは、エンハンサー配列及びリプレッサー配列を含めた発現制御配列に作用可能に会合するか、もしくは作用可能に連結するか、または発現させる核酸に作用可能に会合し得る。一部の実施形態では、プロモーターは誘導性であり得る。一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、一方向性または双方向性であり得る。一部の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターであり得る。一部の実施形態では、プロモーターは、転写調節領域を含有する配列をある供給源から得、転写開始領域を含有する配列を第２の供給源から得るハイブリッドプロモーターであり得る。導入遺伝子内で制御エレメントをコード配列に連結する系は当該技術分野で周知である（一般的な分子生物学的技法及び組換えＤＮＡ技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されており、この文献は参照により本明細書に援用される）。種々の増殖条件下及び誘導条件下で、様々な宿主細胞に発現用の導入遺伝子を挿入するのに適した市販のベクターも、当該技術分野で周知である。
【０１３９】
一部の実施形態では、哺乳類宿主細胞内の導入遺伝子の発現を制御するために特異的プロモーターが使用される場合があり、こうしたプロモーターとして、以下に限定されないが、例えば、ＳＲα−プロモーター（Ｔａｋｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．８：４６６−４７２（１９８８）を参照）、ヒトＣＭＶ最初期プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４１：５２１−５３０（１９８５）；Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ４５：１０１−１０５（１９８６））、ヒトＣＭＶプロモーター、ヒトＣＭＶ５プロモーター、マウスＣＭＶ最初期プロモーター、ＥＦ１−α−プロモーター、肝臓特異的発現用ハイブリッドＣＭＶプロモーター（例えば、ＣＭＶ最初期プロモーターと、ヒトα−１−抗トリプシン（ＨＡＴ）またはアルブミン（ＨＡＬ）プロモーターのいずれかの転写プロモーター配列とを結合させることにより作製）、もしくは肝細胞腫特異的発現用プロモーター（例えば、ヒトアルブミン（ＨＡＬ、約１０００ｂｐ）またはヒトα−１−抗トリプシン（ＨＡＴ、約２０００ｂｐ）のいずれかの転写プロモーターエレメントと、ヒトα−１−ミクログロブリン及びビクニン前駆体遺伝子（ＡＭＢＰ）の１４５長エンハンサーエレメントとの組み合わせ（ＨＡＬ−ＡＭＢＰ及びＨＡＴ−ＡＭＢＰ））；ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔ  ａｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０（１９８１）を参照）、オルギア・シュードツガタ（Ｏｒｇｙｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ）最初期プロモーター、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ  ａｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１４４１−１４４５（１９８１）を参照）；またはメタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２（１９８２）を参照）などがある。一部の実施形態では、哺乳類プロモーターは、構成的プロモーターであり、例えば、以下に限定されないが、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＴＲ）プロモーター、アデノシンデアミナーゼプロモーター、ピルビン酸キナーゼプロモーター、ベータ−アクチンプロモーター、及び当業者に既知の他の構成的プロモーターなどである。
【０１４０】
一部の実施形態では、特異的プロモーターは、原核宿主細胞内で導入遺伝子の発現を制御するのに用いることができ、こうしたプロモーターとして、以下に限定されないが、β−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７−３７３１（１９７８）を参照）；ｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５（１９８３）を参照）；Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｍ１３プロモーター、またはＭ１６プロモーターなどがあり、酵母宿主細胞におけるプロモーターとして、以下に限定されないが、ＧＡＬ１、ＧＡＬ４、もしくはＧＡＬ１０プロモーター、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼＩＩＩ（ＴＤＨ３）プロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＴＤＨ２）プロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼＩ（ＴＤＨ１）プロモーター、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）、エノラーゼ（ＥＮＯ）、またはトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）などがある。
【０１４１】
一部の実施形態では、プロモーターがウイルスプロモーターである場合があり、ウイルスプロモーターの多くが哺乳類細胞を含めた複数の宿主細胞型において導入遺伝子の発現を調節することができる。真核細胞中でのコード配列の恒常的発現を駆動することがわかっているウイルスプロモーターとして、例えば、サルウイルスプロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、パピローマウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス及び他のレトロウイルスの末端長反復配列（ＬＴＲ）、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター、ならびに当業者に既知の他のウイルスプロモーターが挙げられる。
【０１４２】
一部の実施形態では、発現ベクターの遺伝子制御エレメントには、転写開始に関与する５’非転写配列及び翻訳開始に関与する５’非翻訳配列（例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列、Ｋｏｚａｋ配列など）も含まれる場合がある。エンハンサーエレメントを任意選択的に使用して、発現させるポリペプチドまたはタンパク質の発現レベルを増加させることができる。哺乳類細胞で機能することがわかっているエンハンサーエレメントの例として、Ｄｉｊｋｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８５）４：７６１に記載されているＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２ｂ）７９：６７７７に記載されているラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の末端長反復配列（ＬＴＲ）由来のエンハンサー／プロモーター、及びＢｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１に記載されているヒトサイトメガロウイルスが挙げられる。発現ベクターの遺伝子制御エレメントには、転写の終止に関与する３’非転写配列及び翻訳の終止に関与する３’非翻訳配列も含まれるはずである。例えば、プロモーターから転写されたｍＲＮＡの３’末端の安定化及びプロセシングのためのポリポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどである。例えばポリＡシグナルには、ウサギベータグロビンポリＡシグナル、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル、ニワトリベータグロビンターミネーター／ポリＡシグナル、またはＳＶ４０後期ポリＡ領域が含まれていた。
【０１４３】
選択マーカー
発現ベクターは、好ましくは、しかし任意選択的に、少なくとも１つ選択マーカーを含むことになる。一部の実施形態では、選択マーカーは、１つ以上の遺伝子調節エレメントに作用可能に連結した耐性遺伝子をコードする核酸配列であり、細胞毒性化学物質及び／または薬剤の存在下で増殖する際に生存能力を維持する能力を宿主細胞に付与する。一部の実施形態では、選択作用剤を用いて宿主細胞内の発現ベクターの保持力を保つことができる。一部の実施形態では、選択作用剤を用いて、発現ベクター内の導入遺伝子配列の修飾（すなわちメチル化）及び／またはサイレンシングを防ぐことができる。一部の実施形態では、選択作用剤を用いて宿主細胞内のベクターのエピソーム発現を維持する。一部の実施形態では、選択作用剤を用いて、導入遺伝子配列を宿主細胞ゲノムに安定に組み込むことを促進させる。一部の実施形態では、作用剤及び／または耐性遺伝子として、以下に限定されないが、真核宿主細胞についてはメトトレキサート（ＭＴＸ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号、同第４，６５６，１３４号、同第４，９５６，２８８号、同第５，１４９，６３６号、同第５，１７９，０１７号）、アンピシリン、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ゼオマイシン、ミコフェノール酸、またはグルタミンシンテターゼ（ＧＳ、米国特許第５，１２２，４６４号；同第５，７７０，３５９号；同第５，８２７，７３９号）；原核宿主細胞についてはテトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、またはクロラムフェニコール；及び酵母宿主細胞についてはＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＨＩＳ３、ＬＹＳ２、ＨＩＳ４、ＡＤＥ８、ＣＵＰ１、またはＴＲＰ１を挙げることができる。
【０１４４】
発現ベクターは宿主細胞に形質移入されるか、形質転換されるか、形質導入され得る。本明細書で使用される場合、「形質移入」、「形質転換」、及び「形質導入」という用語は全て、外来性核酸配列を宿主細胞に導入することを意味する。一部の実施形態では、Ｃ１−インヒビタータンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターは、宿主細胞に形質移入されるか、形質転換されるか、または形質導入される。
【０１４５】
形質転換方法、形質移入方法、及び形質導入方法の例は、当該技術分野で周知であり、こうした例として、リポソーム送達（すなわち、Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎ，Ｆｏｃｕｓ  １５：７３（１１９３）に記載のリポフェクタミン（商標）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）法）、電気穿孔法、Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｒｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４５７（１９７８）に記載のＣａＰＯ４送達法、ＤＥＡＥ−デキストラン介在送達、微量注入法、遺伝子銃粒子送達、ポリブレン介在送達、カチオン介在脂質送達、形質導入、ならびにウイルス感染（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスアデノ随伴ウイルス、及びバキュロウイルス（昆虫細胞））などが挙げられる。細胞宿主形質転換の一般的な態様は、当該技術分野において説明されており、例えば、Ａｘｅｌによる米国特許第４，３９９，２１６号、上述のＳａｍｂｒｏｏｋ著の第１章〜４章及び第１６章〜１８章；上述のＡｕｓｕｂｅｌ著の第１章、９章、１３章、１５章、及び１６章で説明されている。哺乳類細胞を形質転換する様々な技術については、Ｋｅｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）、Ｋｅｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：５２７−５３７（１９９０）、及びＭａｎｓｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８−３５２（１９８８）を参照されたい。
【０１４６】
発現ベクターは、一旦細胞内に導入されると、ゲノムに安定的に組み込まれ得るか、または染色体外構築物として存在し得る。ベクターは増幅される場合もあり、複数のコピーが存在するか、またはゲノムに組み込まれる場合がある。一部の実施形態では、本発明の細胞は、Ｃ１−インヒビタータンパク質をコードする核酸の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、またはそれ以上のコピーを含み得る。一部の実施形態では、本発明の細胞は、Ｃ１−インヒビタータンパク質と、発現Ｃ１−インヒビタータンパク質のグリコシル化を好ましくはシアリル化の増加によって増大させる１つ以上のタンパク質とをコードする核酸の複数のコピー（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、またはそれ以上）を含み得る。シアリル化は、本明細書に記載される様々な方法を用いて操作することもできる。いかなる理論に束縛されることも望まないが、シアリル化の減少は、開示される構築物のヘパリン結合の増加と関連しており、それによりＣ１−ＩＮＨ結合部位が標的に結合するのを妨げることがわかった。ヘパリン結合はまた、リソソーム内への内部移行の可能性も高め、その結果クリアランス速度を増加させる。
【０１４７】
宿主細胞
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」は、組換えＣ１−インヒビタータンパク質を産生するのに用いられ得る細胞を意味する。詳細には、宿主細胞は組換えＣ１−インヒビタータンパク質を大規模で産生するのに適している。適正な宿主細胞は、以下に限定されないが、哺乳類、植物、鳥類（例えば、鳥類系）、昆虫類、酵母、細菌類を含めた種々の生物体由来であり得る。一部の実施形態では、宿主細胞は、哺乳類細胞である。一部の実施形態では、適切な宿主細胞は、発現したｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質のグリコシル化プロファイルを改善するように操作されている。本発明の一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨポリペプチドは、天然の血漿由来Ｃ１−ＩＮＨの類似部分と同一または同様のグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨポリペプチドは、天然の血漿由来Ｃ１−ＩＮＨと同等の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のグリカンを有する。一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質のグリコシル化プロファイルは、ヒト化グリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、天然の血漿由来Ｃ１−ＩＮＨに比べてシアリル化が増加している。
【０１４８】
グリコシル化プロファイルの改善とは、シアリル化を増加させること、及び／またはグリコシル化プロファイルをヒト化することを意味し、例えば、操作された細胞でＣ１−ＩＮＨポリペプチドを含むｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を発現することで、未操作細胞で発現したＣ１−ＩＮＨポリペプチドと比べて天然のヒトＣ１−ＩＮＨにさらに近いグリコシル化プロファイルを生じさせることを意味する。改善とは、ルコネストに比べてＣ１−ＩＮＨのグリコシル化プロファイルを増加、増大、及び／または最適化することも意味し得る。
【０１４９】
タンパク質のグリコシル化プロファイルを変更、制御、操作、改善、増大、及び／または最適化する種々の方法は、当該技術分野で既知である。最適化可能なグリコシル化プロファイルの特性として、グリカン残基の数、グリカン残基結合位置、グリカン結合様式（例えば、結合の種類）、グリカン結合プロセス、及びタンパク質またはポリペプチドに結合しているグリカン残基の同一性が挙げられる。本発明のタンパク質の任意の部分のグリコシル化プロファイルは、グリコシル化を最適化するのに適した標的として考慮される。グリコシル化プロファイルを制御するこれらの方法に加えて、当業者が本開示に照らして本発明のタンパク質のグリコシル化を最適化するのに有用と判断する未だ発見されていない他の方法も考慮される。本発明のＣ１−ＩＮＨタンパク質及びポリペプチドのグリコシル化プロファイルを変更、制御、操作、改善、増大、及び／または最適化する方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、及びｉｎ  ｖｉｖｏでの方法が含まれる。
【０１５０】
一部の実施形態では、発現したタンパク質またはポリペプチドのグリコシル化プロファイルは、発現したタンパク質またはポリペプチドの翻訳後修飾及び／または化学修飾により変わる。
【０１５１】
一部の実施形態では、翻訳後修飾及び／または化学修飾を受けたＣ１−ＩＮＨタンパク質は、翻訳後修飾及び／または化学修飾を受けていない同一の配列を有するＣ１−ＩＮＨタンパク質と比べて、変更、改善、増大、ヒト化及び／または最適化されたグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、翻訳後修飾及び／または化学修飾を受けたＣ１−ＩＮＨタンパク質は、翻訳後修飾及び／または化学修飾を受けていない同一の配列を有するＣ１−ＩＮＨタンパク質と比べて、変更、改善、増大、ヒト化及び／または最適化されたシアリル化プロファイルを有する。
【０１５２】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、グリコシル化を増大するように操作された細胞株から発現し、グリコシル化を増大するように操作されていない同一の細胞株から発現した同一の配列を有するＣ１−ＩＮＨタンパク質に比べて、変更、改善、増大、ヒト化及び／または最適化されたグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、シアリル化を増大するように操作された細胞株から発現し、シアリル化を増大するように操作されていない同一の細胞株から発現した同一の配列を有するＣ１−ＩＮＨタンパク質に比べて、変更、改善、増大、ヒト化及び／または最適化されたシアリル化プロファイルを有する。
【０１５３】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、グリコシル化を増大する条件下で培養された細胞株から発現し、グリコシル化を増大する条件下で培養されている細胞株から発現した同一の配列を有するＣ１−ＩＮＨタンパク質に比べて、変更、改善、増大、ヒト化及び／または最適化されたグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、シアリル化を増大する条件下で培養された細胞株から発現し、シアリル化を増大する条件下で培養されている細胞株から発現した同一の配列を有するＣ１−ＩＮＨタンパク質に比べて、変更、改善、増大、ヒト化及び／または最適化されたシアリル化プロファイルを有する。
【０１５４】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、ルコネストと比べて変更、改善、増大、ヒト化及び／または最適化されたグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、ヒト血漿由来Ｃ１−ＩＮＨと比べて変更、改善、増大、ヒト化及び／または最適化されたグリコシル化プロファイルを有する。
【０１５５】
一部の実施形態では、細胞培養条件は、所望のグリコシル化プロファイルを有するタンパク質を発現させるように操作される。これらの細胞培養条件には、培養の期間、培養培地への添加物、高グリコシル化によりグリコシル化を増大させるための遺伝子の共発現、及び／またはグリカン分解（例えば、シアリラダーゼ（ｓｉａｌｙｌａｄａｓｅ））と関連した酵素をノックアウトするか、該酵素の発現を抑制するか、不活性化するか、もしくは破壊する細胞操作を含めた、産生及び培養プロセスの制御が含まれる。好適なグリコシル化操作方法として、以下に限定されないが、例えば米国特許第５，０４７，３３５号、同第５，０９６，８１６号、同第５，７０５，３６４号、同第７，６４５，６０９号、同第８，２７３，７２３号、同第８，５２４，４７７号、同第８，６１７，８７８号、同第８，８７１，７２３号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／１０６３４８号、同ＷＯ２００７／０９５５０６号、同ＷＯ２００８／０２５８５６号、同ＷＯ２０１０／００７２１４号、同ＷＯ２０１０／０９９３９４号、及び同ＷＯ２０１３／０９３７６０号に記載された方法が挙げられ、これらの開示は、参照により本明細書に援用される。
【０１５６】
宿主細胞、及び形質移入された宿主細胞の特異的クローンの選択も、グリコシル化を増大させるために利用されてもよい。グリコシル化を増やすいくつかの方法として、所望のグリコシル化プロファイルを有するタンパク質またはポリペプチドを濃縮する精製プロセスが挙げられる。
【０１５７】
タンパク質のシアリル化プロファイルを操作する様々な方法が当該技術分野で知られている。これらの方法に加えて、まだ見出されていない他の方法も、本発明により考慮される。本発明のＣ１−ＩＮＨタンパク質及びポリペプチドのシアリル化プロファイルを操作する方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、及びｉｎ  ｖｉｖｏでの方法が含まれる。一部の実施形態では、発現したタンパク質またはポリペプチドのシアリル化プロファイルは、発現したタンパク質またはポリペプチドの発現後化学修飾により変わる。一部の実施形態では、細胞培養条件は、所望のシアリル化プロファイルを有するタンパク質を発現させるように操作される。これらの細胞培養条件には、培養の期間、培養培地への添加物、及び／またはシアリル化を増やすための遺伝子の共発現を含めた、産生及び培養プロセスの制御が含まれる。宿主細胞、及び形質移入された宿主細胞の特異的クローンの選択も、シアリル化を増大させるために利用されてもよい。シアリル化を増やすいくつかの方法として、所望のシアリル化プロファイルを有するタンパク質またはポリペプチドを濃縮する精製プロセスが挙げられる。
【０１５８】
シアリル化も、本明細書に記載される様々な方法により操作することができる。いかなる理論に束縛されることも望まないが、シアリル化の減少は、開示される構築物のヘパリン結合の増加と関連しており、それによりＣ１−ＩＮＨ結合部位が標的に結合するのを妨げることがわかった。ヘパリン結合はまた、リソソーム内への内部移行の可能性も高め、その結果クリアランス速度を増加させる。
【０１５９】
哺乳類細胞株
細胞培養及びポリペプチド発現に感受性を有する任意の哺乳類細胞または細胞型を、本発明に従って宿主細胞として利用することができる。本発明に従って使用され得る哺乳類細胞の非限定的な例として、ヒト胎児由来腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３）、ヒーラー細胞；ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ番号８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ社、オランダ、ライデン））；ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（懸濁培養での増殖用にサブクローンされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳癌腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）が挙げられる。一部の実施形態では、好適な哺乳類細胞はエンドソーム酸性化欠損細胞ではない。
【０１６０】
また、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する多数の市販された及び市販されていないハイブリドーマ細胞株を、本発明に従って利用することができる。ハイブリドーマ細胞株が至適な増殖とポリペプチドまたはタンパク質の発現とに異なる栄養要件を有する場合があり、及び／または異なる培養条件を要する場合があることを当業者は認識し、必要に応じて条件を変更することができる。
【０１６１】
非哺乳類細胞株
細胞培養及びポリペプチド発現に感受性を有する任意の非哺乳類由来細胞または細胞型を、本発明に従って宿主細胞として利用することができる。本発明に従って使用され得る非哺乳類宿主細胞及び細胞株の非限定的な例として、酵母については、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、メチロトローフ酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、及び子嚢菌類酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）；昆虫類については、ヨトウガ（Ｓｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉｓ  ｎｉ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｇｏｓｔｅｒ）、及びタバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ）；細菌については、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、リケニホルミス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｎｎｉｓ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ディフィシル菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）；両生類からはアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  Ｌａｅｖｉｓ）に由来する細胞及び細胞株が挙げられる。
【０１６２】
接着増殖対懸濁増殖への適合性
特定の実施形態では、宿主細胞は、細胞培養用に選択される特定の条件下での特定の好ましい特質または増殖に基づいて、細胞株生成のために選択される。こうした特質は、樹立株（すなわち、特性決定された市販の細胞株）の既知の特徴及び／もしくは形質に基づいて、または実験による評価を通して確認され得ることを当業者は認識するであろう。一部の実施形態では、細胞株は、支持細胞層で増殖する能力に関して選択され得る。一部の実施形態では、細胞株は、懸濁液で増殖する能力に関して選択され得る。一部の実施形態では、細胞株は、細胞の接着単層として増殖する能力に関して選択され得る。一部の実施形態では、こうした細胞を、任意の組織培養容器または好適な接着基質で処理された任意の容器と共に使用することができる。一部の実施形態では、好適な接着基質は、コラーゲン（例えばコラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩ、またはＩＶ）、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、ＢＤマトリゲル（商標）、基底膜マトリクス、デルマタン硫酸プロテオグリカン、ポリ−Ｄ−リジン及び／またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態では、接着宿主細胞は、特定増殖条件下で選択及び修飾されて、懸濁液中で増殖することができる。接着細胞を修飾して懸濁液中で増殖させるこうした方法は、当該技術分野で既知である。例えば、増殖培地から動物血清を経時的に徐々に除去することによって、細胞を懸濁液培養で増殖するように調節することができる。
【０１６３】
細胞株の選択及び評価
本発明によると、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を発現するように操作される細胞は、商業的に実行可能な規模でｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を産生する能力に関して選択される。詳細には、本発明の操作される細胞は、高レベルで及び／または高酵素活性を伴って、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を産生することができる。一部の実施形態では、所望の細胞は、細胞培養条件下（例えば、標準的な大規模懸濁液または接着培養条件）で培養されると、約５ピコグラム／細胞／日以上の（例えば、約１０ピコグラム、１５ピコグラム、２０ピコグラム、２５ピコグラム、３０ピコグラム、３５ピコグラム、４０ピコグラム、４５ピコグラム、５０ピコグラム、５５ピコグラム、６０ピコグラム、６５ピコグラム、７０ピコグラム、７５ピコグラム、８０ピコグラム、８５ピコグラム、９０ピコグラム、９５ピコグラム、または１００ピコグラム／細胞／日を超える）量で、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質を産生することができる。一部の実施形態では、所望の細胞は、細胞培養条件下（例えば、標準的な大規模懸濁液または接着培養条件）で培養されると、約５〜１００ピコグラム／細胞／日（例えば、約５〜９０ピコグラム／細胞／日、約５〜８０ピコグラム／細胞／日、約５〜７０ピコグラム／細胞／日、約５〜６０ピコグラム／細胞／日、約５〜５０ピコグラム／細胞／日、約５〜４０ピコグラム／細胞／日、約５〜３０ピコグラム／細胞／日、約１０〜９０ピコグラム／細胞／日、約１０〜８０ピコグラム／細胞／日、約１０〜７０ピコグラム／細胞／日、約１０〜６０ピコグラム／細胞／日、約１０〜５０ピコグラム／細胞／日、約１０〜４０ピコグラム／細胞／日、約１０〜３０ピコグラム／細胞／日、約２０〜９０ピコグラム／細胞／日、約２０〜８０ピコグラム／細胞／日、約２０〜７０ピコグラム／細胞／日、約２０〜６０ピコグラム／細胞／日、約２０〜５０ピコグラム／細胞／日、約２０〜４０ピコグラム／細胞／日、約２０〜３０ピコグラム／細胞／日）の範囲内の量でＣ１−ＩＮＨタンパク質を産生することができる。
【０１６４】
細胞培養培地及び条件
種々の細胞培養培地及び条件を使用して、本発明の操作された細胞を用いてｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を産生することができる。例えば、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を血清含有培地または無血清培地で産生することができる。一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は無血清培地で産生される。一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、動物を含まない培地（すなわち動物由来の成分を含まない培地）で産生される。一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は合成培地で産生される。本明細書で使用される場合、用語「合成栄養培地」は、その化学成分の実質的に全てが既知である培地を意味する。一部の実施形態では、合成栄養培地は、血清、血清由来タンパク質（例えば、アルブミンまたはフェチュイン）、及び他の成分などの動物由来成分を含まない。一部の実施形態では、合成培地は１つ以上のタンパク質（例えば、タンパク質増殖因子またはサイトカインなど）を含む。一部の実施形態では、合成栄養培地は、１つ以上のタンパク質加水分解物を含む。一部の実施形態では、合成栄養培地は、無タンパク質培地であり、すなわちタンパク質、加水分解物、または未知組成物の成分を含有しない無血清培地である。
【０１６５】
一部の実施形態では、合成培地には、１つ以上の動物由来の成分が追加され得る。こうした動物由来の成分として、以下に限定されないが、ウシ胎仔血清、ウマ血清、ヤギ血清、ロバ血清、ヒト血清、及びアルブミンなどの血清由来タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン、またはヒト血清アルブミン）が挙げられる。
【０１６６】
種々の細胞培養条件を使用して、回転瓶培養、バイオリアクターバッチ培養、灌流培養、及びバイオリアクター流加培養を含めるがこれらに限定されない大規模様式で、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を産生することができる。一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、懸濁液で培養された細胞によって産生される。一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、接着細胞によって産生される。一部の実施形態では、灌流培養を用いて、発現タンパク質のグリコシル化を制御する。灌流培養の例示的な方法として、以下に限定されないが、例えば、米国特許第６，５２８，２８６号及びＰＣＴ公開第ＷＯ１９９６／０３９４８８Ａ１号に記載された方法が挙げられ、これらの開示は参照により本明細書に援用される。
【０１６７】
例示的な細胞培地及び培養条件については実施例の章で説明している。後述の実施例は限定することを意図するものではない。
【０１６８】
培養開始
所望の細胞発現Ｃ１−ＩＮＨタンパク質を、まず当業者に周知の様々な方法のうちのいずれかによって初期培養で増殖することができる。細胞の生存、増殖、及び生存率に寄与する温度及び培地で成長させることによって細胞を増殖する。初期培養容量は任意のサイズであり得るが、最終産生で用いる産生バイオリアクターの培養容量よりも小さいことが多く、細胞を数回継代して培養容量を増加させてから、産生バイオリアクターに播種するのが一般的である。細胞培養液を攪拌または振盪して、培地の酸素化と、細胞に対する栄養物の分散とを増大することができる。別の方法として、または加えて、当該技術分野で周知の専用スパージング装置を用いて、培養物の酸素化を増強及び制御することができる。
【０１６９】
開始時の細胞密度は、当業者によって選択され得る。本発明によると、開始時の細胞密度は、１培養容量当たり単一の細胞と同程度に少ない可能性がある。一部の実施形態では、開始時の細胞密度は、１ｍＬ当たり約１×１０２個の生細胞〜約１×１０３個、約１×１０４個、約１×１０５個、約１×１０６個の生細胞、及びそれよりも高い密度の範囲であり得る。
【０１７０】
初期細胞培養物及び中間細胞培養物を任意の所望の密度まで増殖させた後、次の中間産生バイオリアクターまたは最終産生バイオリアクターに播種することができる。一部の実施形態では、産生バイオリアクターに播種する前の最終生存率は、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上である。例えば、低速遠心分離により細胞を上清から取り出すことができる。取り出された細胞を培地で洗浄してから次のバイオリアクターに播種して、不必要な代謝廃棄産物または培地成分を除去することが望ましい場合もある。培地は、細胞を予め増殖させた培地であるか、または本発明の実施者により選択された異なる培地または洗浄溶液であってもよい。
【０１７１】
続いて、細胞を産生バイオリアクターに播種するのに適正な密度まで希釈することができる。一部の実施形態では、産生バイオリアクターで使用されるのと同じ培地に細胞を希釈する。別の方法として、本発明の実施者の必要性や所望に応じて、または細胞自体の特定の要件（例えば、細胞が産生バイオリアクターに播種する前に短期間の間保管されるべき場合）に適応させるために、細胞を別の培地または溶液に希釈することができる。
【０１７２】
増殖期
典型的には、上述のように産生バイオリアクターに播種されると、細胞培養物は、細胞培養物の生存、増殖、及び生存率に寄与する条件下で初期増殖期の状態で維持される。本発明によると、産生バイオリアクターは、タンパク質の大規模産生に適切な任意の容量であり得る。後述の「バイオリアクター」についての小節を参照されたい。
【０１７３】
増殖期における細胞培養の温度は、主として細胞培養物が生存可能な状態である温度範囲に基づいて選択される。増殖期の温度は、単一の一定温度であるか、またはある温度範囲内で維持され得る。例えば、温度は、増殖期の間に徐々に上昇するか、または減少してもよい。一般的に、哺乳類細胞の多くは、約２５℃〜４２℃（例えば、３０℃〜４０℃、約３０℃〜３７℃、約３５℃〜４０℃）の範囲内で十分増殖する。一部の実施形態では、哺乳類細胞は、約３０℃〜３７℃（例えば、約３１℃〜３７℃、約３２℃〜３７℃、約３３℃〜３７℃、約３４℃〜３７℃、約３５℃〜３７℃、約３６℃〜３７℃）の温度範囲で培養される。一部の実施形態では、哺乳類細胞は、約３０℃〜３４℃（例えば、約３１℃〜３４℃、約３１℃〜３５℃、約３２℃〜３４℃、約３３℃〜３４℃、約３３℃〜３５℃）の温度範囲で培養される。典型的には、増殖期の間、細胞は約２８℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、または約４０℃で増殖する。
【０１７４】
実施者の必要性及び細胞自体の要件に応じて、初期増殖期の間に、長い期間または短い期間の間、細胞を増殖してもよい。一実施形態では、最大生細胞密度のある所定の割合の生細胞密度を得るのに十分な期間、細胞を増殖し、該最大生細胞密度は、細胞がそのまま増殖した場合に最終的に到達する密度である。例えば、細胞は、最大生細胞密度の１パーセント、５パーセント、１０パーセント、１５パーセント、２０パーセント、２５パーセント、３０パーセント、３５パーセント、４０パーセント、４５パーセント、５０パーセント、５５パーセント、６０パーセント、６５パーセント、７０パーセント、７５パーセント、８０パーセント、８５パーセント、９０パーセント、９５パーセント、または９９パーセントの所望の生細胞密度を得るのに十分な期間増殖され得る。
【０１７５】
一部の実施形態では、細胞は所定の期間増殖される。例えば、細胞培養の開始時濃度、細胞を増殖する温度、及び細胞固有の増殖速度に応じて、細胞を０日、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、またはそれ以上の間、増殖することができる。一部の場合には、細胞を１か月またはそれ以上の間増殖してもよい。
【０１７６】
一部の実施形態では、細胞を所望の生細胞密度まで増殖させる。例えば、増殖期の終了までの所望の生細胞密度は、約１．０×１０６個の生細胞／ｍＬ、１．５×１０６個の生細胞／ｍＬ、２．０×１０６個の生細胞／ｍＬ、２．５×１０６個の生細胞／ｍＬ、５×１０６個の生細胞／ｍＬ、１０×１０６個の生細胞／ｍＬ、２０×１０６個の生細胞／ｍＬ、３０×１０６個の生細胞／ｍＬ、４０×１０６個の生細胞／ｍＬ、または５０×１０６個の生細胞／ｍＬよりも大きい。
【０１７７】
細胞培養液を、酸素化と細胞に対する栄養物の分散とを増大させるために、初期培養期の間に攪拌または振盪してもよい。本発明によると、初期増殖期の間に、バイオリアクターの特定の内部条件（例えばｐＨ、温度、酸素化などであるが、これらに限定されない条件）を制御または調節することが有益である可能性があることを当業者は理解するであろう。例えば、ｐＨは適切な量の酸または塩基を供給することによって制御され、酸素化は当該技術分野で周知のスパージング装置を用いて制御され得る。一部の実施形態では、増殖期に所望のｐＨは、約６．８〜７．５（例えば、約６．９〜７．４、約６．９〜７．３、約６．９５〜７．３、約６．９５〜７．２５、約７．０〜７．３、約７．０〜７．２５、約７．０〜７．２、約７．０〜７．１５、約７．０５〜７．３、約７．０５〜７．２５、約７．０５〜７．１５、約７．０５〜７．２０、約７．１０〜７．３、約７．１０〜７．２５、約７．１０〜７．２０、約７．１０〜７．１５）の範囲である。一部の実施形態では、増殖期に所望のｐＨは、約６．８、６．８５、６．９、６．９５、７．０、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、７．４、７．４５、または７．５である。
【０１７８】
一部の実施形態では、増殖期所望の溶存酸素セットポイントは、約０％〜７０％、約５％〜６０％、約２５％〜５０％、約２０％〜４０％、約３０％〜６０％の範囲である。一部の実施形態では、増殖期の所望の溶存酸素セットポイントは、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または６０％である。
【０１７９】
移行期
一部の実施形態では、細胞は産生期に入る状態になると、培養条件は、関心対象の組換えタンパク質の産生を最大化するように変えられ得る。こうした培養条件の変更は、移行期に行われるのが典型的である。一部の実施形態では、こうした変更は、温度、ｐＨ、オスモル濃度、及び培地などを含むが、これらに限定されない幾種の培養条件のうちの１つ以上の変更であり得る。一実施形態では、培養のｐＨを変化させる。例えば、培地のｐＨを増殖期から産生期に向けて増加させるか、または減少させてもよい。一部の実施形態では、このｐＨの変化は急速である。一部の実施形態では、ｐＨを長期間にわたって徐々に変化させる。一部の実施形態では、ｐＨの変化は重炭酸ナトリウムの添加によって調節される。一部の実施形態では、ｐＨの変化は、移行期の開始時に始まり、続く産生期の間も維持される。
【０１８０】
一実施形態では、細胞培養培地のグルコース濃度を変化させる。この実施形態によると、移行期の開始の際、細胞培養内のグルコース濃度は７．５ｍＭよりも高い量に調整される。
【０１８１】
一部の実施形態では、温度を増殖期から産生期に向けて上昇させるか、または下降させる。例えば、増殖期から産生期までに、約０．１℃、０．２℃、０．３℃、０．４℃、０．５℃、１．０℃、１．５℃、２．０℃、２．５℃、３．０℃、３．５℃、４．０℃、４．５℃、５．０℃、５．５℃、６．０℃、６．５℃、７．０℃、７．５℃、８．０℃、またはそれ以上温度を上昇させるか、または下降させてもよい。
【０１８２】
産生期
本発明によれば、細胞培養が移行期を伴ってまたは伴わずに所望の細胞密度及び生存率に到達すると、細胞培養は、続く産生期の間、細胞培養物の生存及び生存率に寄与しかつ商業的に十分なレベルでＣ１−ＩＮＨタンパク質を発現させるのに適正な培養条件下で維持される。
【０１８３】
一部の実施形態では、産生期の間、培養は増殖期の温度または温度範囲よりも低い温度または温度範囲で維持される。例えば、産生期の間、細胞は、約２５℃〜３５℃（例えば、約２８℃〜３５℃、約３０℃〜３５℃、約３２℃〜３５℃）の範囲内でｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を十分に発現することができる。一部の実施形態では、産生期の間、細胞は、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃の温度でｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を十分に発現することができる。他の実施形態では、産生期の間、培養は、増殖期の温度または温度範囲よりも高い温度または温度範囲で維持される。
【０１８４】
加えてまたは代わりに、産生期の間、培養は増殖期のｐＨまたはｐＨ範囲とは異なる（より低いまたはより高い）ｐＨまたはｐＨ範囲で維持される。一部の実施形態では、産生期の培地のｐＨは、約６．８〜７．５（例えば、約６．９〜７．４、約６．９〜７．３、約６．９５〜７．３、約６．９５〜７．２５、約７．０〜７．３、約７．０〜７．２５、約７．０〜７．２、約７．０〜７．１５、約７．０５〜７．３、約７．０５〜７．２５、約７．０５〜７．１５、約７．０５〜７．２０、約７．１０〜７．３、約７．１０〜７．２５、約７．１０〜７．２０、約７．１０〜７．１５）の範囲である。一部の実施形態では、培地のｐＨは、約６．８、６．８５、６．９、６．９５、７．０、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、７．４、７．４５、または７．５である。
【０１８５】
一部の実施形態では、産生期の所望の溶存酸素セットポイントは、約０％〜７０％、約５％〜６０％、約２５％〜５０％、約２０％〜４０％、約３０％〜６０％の範囲である。一部の実施形態では、産生期の所望の溶存酸素セットポイントは、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または６０％である。
【０１８６】
一部の実施形態では、細胞は産生期間を通して所望の生細胞密度範囲内に維持され得る。例えば、細胞培養の産生期の間、所望の生細胞密度は、約１．０〜５０×１０６個の生細胞／ｍＬ（例えば、約１．０〜４０×１０６個の生細胞／ｍＬ、約１．０〜３０×１０６個の生細胞／ｍＬ、約１．０〜２０×１０６個の生細胞／ｍＬ、約１．０〜１０×１０６個の生細胞／ｍＬ、約１．０〜５×１０６個の生細胞／ｍＬ、約１．０〜４．５×１０６個の生細胞／ｍＬ、約１．０〜４×１０６個の生細胞／ｍＬ、約１．０〜３．５×１０６個の生細胞／ｍＬ、約１．０〜３×１０６個の生細胞／ｍＬ、約１．０〜２．５×１０６個の生細胞／ｍＬ、約１．０〜２．０×１０６個の生細胞／ｍＬ、約１．０〜１．５×１０６個の生細胞／ｍＬ、約１．５〜１０×１０６個の生細胞／ｍＬ、約１．５〜５×１０６個の生細胞／ｍＬ、約１．５〜４．５×１０６個の生細胞／ｍＬ、約１．５〜４×１０６個の生細胞／ｍＬ、約１．５〜３．５×１０６個の生細胞／ｍＬ、約１．５〜３．０×１０６個の生細胞／ｍＬ、約１．５〜２．５×１０６個の生細胞／ｍＬ、約１．５〜２．０×１０６個の生細胞／ｍＬ）の範囲であり得る。
【０１８７】
一部の実施形態では、細胞は、最大生細胞密度の１パーセント、５パーセント、１０パーセント、１５パーセント、２０パーセント、２５パーセント、３０パーセント、３５パーセント、４０パーセント、４５パーセント、５０パーセント、５５パーセント、６０パーセント、６５パーセント、７０パーセント、７５パーセント、８０パーセント、８５パーセント、９０パーセント、９５パーセント、または９９パーセントの生細胞密度を得るのに十分な期間維持され得る。生細胞密度を最大値に到達させることが望ましい場合がある。一部の実施形態では、生細胞密度を最大値に到達させた後に、生細胞密度をあるレベルまで減少させてから培養を収穫することが望ましい場合がある。一部の実施形態では、産生期の終了時の全生存率は、約９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％未満である。
【０１８８】
一部の実施形態では、産生期の間に、細胞をある所定の期間の間増殖させる。例えば、次の増殖期開始時の細胞培養物の濃度、細胞を増殖する温度、細胞固有の増殖速度に応じて、細胞を約５〜９０日間（例えば、約５〜８０日間、約５〜７０日間、約５〜６０日間、約５〜５０日間、約５〜４０日間、約５〜３０日間、約５〜２０日間、約５〜１５日間、約５〜１０日間、約１０〜９０日間、約１０〜８０日間、約１０〜７０日間、約１０〜６０日間、約１０〜５０日間、約１０〜４０日間、約１０〜３０日間、約１０〜２０日間、約１５〜９０日間、約１５〜８０日間、約１５〜７０日間、約１５〜６０日間、約１５〜５０日間、約１５〜４０日間、約１５〜３０日間）増殖することができる。一部の実施形態では、産生期を、約５日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、３５日、４０日、４５日、５０日、５５日、６０日、６５日、７０日、７５日、８０日、８５日、または９０日の間続ける。
【０１８９】
一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質に対する力価が最大値に達するまで細胞を産生期に維持する。他の実施形態では、この時点になる前に、培養物を収穫することができる。例えば、一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質に対する力価が所望の力価に達するまで細胞を産生期に維持する。したがって、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質に対する所望の平均収穫力価は、１日につき１リットル当たり少なくとも６ｍｇ（ｍｇ／Ｌ／日）（例えば、少なくとも８ｍｇ、１０ｍｇ、１２ｍｇ、１４ｍｇ、１６ｍｇ、１８ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、５５ｍｇ、６０ｍｇ、６５ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、８５ｍｇ、９０ｍｇ、９５ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、または５００ｍｇ／Ｌ／日、またはそれ以上）の値となり得る。一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質に対する所望の平均収穫力価は、約６〜５００ｍｇ／Ｌ／日（例えば、約６〜４００ｍｇ／Ｌ／日、約６〜３００ｍｇ／Ｌ／日、約６〜２００ｍｇ／Ｌ／日、約６〜１００ｍｇ／Ｌ／日、約６〜９０ｍｇ／Ｌ／日、約６〜８０ｍｇ／Ｌ／日、約６〜７０ｍｇ／Ｌ／日、約６〜６０ｍｇ／Ｌ／日、約６〜５０ｍｇ／Ｌ／日、約６〜４０ｍｇ／Ｌ／日、約６〜３０ｍｇ／Ｌ／日、約１０〜５００ｍｇ／Ｌ／日、約１０〜４００ｍｇ／Ｌ／日、約１０〜３００ｍｇ／Ｌ／日、約１０〜２００ｍｇ／Ｌ／日、約１０〜１００ｍｇ／Ｌ／日、約１０〜９０ｍｇ／Ｌ／日、約１０〜８０ｍｇ／Ｌ／日、約１０〜７０ｍｇ／Ｌ／日、約１０〜６０ｍｇ／Ｌ／日、約１０〜５０ｍｇ／Ｌ／日、約１０〜４０ｍｇ／Ｌ／日、約１０〜３０ｍｇ／Ｌ／日、約２０〜５００ｍｇ／Ｌ／日、約２０〜４００ｍｇ／Ｌ／日、約２０〜３００ｍｇ／Ｌ／日、約２０〜２００ｍｇ／Ｌ／日、約２０〜１００ｍｇ／Ｌ／日、約２０〜９０ｍｇ／Ｌ／日、約２０〜８０ｍｇ／Ｌ／日、約２０〜７０ｍｇ／Ｌ／日、約２０〜６０ｍｇ／Ｌ／日、約２０〜５０ｍｇ／Ｌ／日、約２０−４０ｍｇ／Ｌ／日、約２０〜３０ｍｇ／Ｌ／日）の範囲であり得る。
一部の実施形態では、産生期の間に、細胞培養液に栄養物か、または細胞により枯渇または代謝された他の培地成分を補充することが有益であるか、または必要になり得る。例えば、細胞培養液に栄養物か、または細胞培養の間に枯渇されたと見られる他の培地成分を補充することは有利である可能性がある。別の方法として、または加えて、産生期に先立って細胞培養液に補充することが有益であるか、または必要になり得る。非限定的な例として、酸化還元調節因子、増殖調節因子（例えば、ホルモン及び／または他の増殖因子）、グリコシル化調節因子、特定イオン類（例えばナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、マンガン、リン酸塩）、緩衝液、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素（通例、極めて低最終濃度で存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質、ペプトン、酵母抽出物、植物加水分解物、大豆加水分解物、血清、脂質補助剤、ヌクレオチド糖、ヌクレオチド糖前駆体、アンモニア、グルコサミン、ウリジン、シアル酸前駆体、Ｎ−アセチルマンノサミン、グルコース、ガラクトース、アミノ酸（例えば、グルタミン、システイン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸）、糖（例えば、グルコース、ガラクトース、シアル酸）、またはエネルギー源を、細胞培養液に補充することが有益であるか、または必要になり得る。
【０１９０】
これらの補充成分を全て一度に細胞培養液に加えてもよく、またはそれらを一連の添加によって細胞培養液に供給してもよい。一部の実施形態では、補充成分は、比例した量で細胞培養液に複数回供給される。他の実施形態では、細胞培養液にこれらの補充成分を連続的に供給する。典型的には、このプロセスは灌流として知られ、灌流に関わる細胞培養は「灌流培養」として知られている。本明細書で使用される場合、用語「灌流培養」は、培養プロセスの開始後に、追加の成分が培養液に連続的または半連続的に供給される細胞培養方法を意味する。培地中の細胞及び／または成分の一部は、通常、連続方式または半連続方式で収穫され、任意選択的に精製される。
【０１９１】
一部の実施形態では、培地は、産生期の間に灌流プロセスにより連続的に交換される。一般的には、１日当たりのリアクター稼働容量に対する新鮮培地の容量（ＶＶＤ）は、灌流速度として定義される。様々な灌流速度を本発明に従って用いることができる。一部の実施形態では、灌流プロセスは、細胞培養液に加えられる全容量が最小量に保たれるような灌流速度を有する。一部の実施形態では、灌流プロセスは、０．５〜２の新鮮培地容量／リアクター稼働容量／日（ＶＶＤ）（例えば、約０．５〜１．５ＶＶＤ、約０．７５〜１．５ＶＶＤ、約０．７５〜１．２５ＶＶＤ、約１．０〜２．０ＶＶＤ、約１．０〜１．９ＶＶＤ、約１．０〜１．８ＶＶＤ、約１．０〜１．７ＶＶＤ、約１．０〜１．６ＶＶＤ、約１．０〜１．５ＶＶＤ、約１．０〜１．４ＶＶＤ、約１．０〜１．３ＶＶＤ、約１．０〜１．２ＶＶＤ、約１．０〜１．１ＶＶＤ）の範囲の灌流速度を有する。一部の実施形態では、灌流プロセスは、約０．５ＶＶＤ、０．５５ＶＶＤ、０．６ＶＶＤ、０．６５ＶＶＤ、０．７ＶＶＤ、０．７５ＶＶＤ、０．８ＶＶＤ、０．８５ＶＶＤ、０．９ＶＶＤ、０．９５ＶＶＤ、１．０ＶＶＤ、１．０５ＶＶＤ、１．１０ＶＶＤ、１．１５ＶＶＤ、１．２ＶＶＤ、１．２５ＶＶＤ、１．３ＶＶＤ、１．３５ＶＶＤ、１．４ＶＶＤ、１．４５ＶＶＤ、１．５ＶＶＤ、１．５５ＶＶＤ、１．６ＶＶＤ、１．６５ＶＶＤ、１．７ＶＶＤ、１．７５ＶＶＤ、１．８ＶＶＤ、１．８５ＶＶＤ、１．９ＶＶＤ、１．９５ＶＶＤ、または２．０ＶＶＤの灌流速度を有する。
【０１９２】
灌流プロセスはまた、１日につき１個の細胞当たりに加えられる新鮮培地の容量（細胞特異的な灌流速度として定義される）によっても特徴付けられ得る。様々な細胞特異的な灌流速度が用いられ得る。一部の実施形態では、灌流プロセスは、１日につき１個の細胞当たり約０．０５〜５ナノリットル（ｎＬ／細胞／日）（例えば、約０．０５〜４ｎＬ／細胞／日、約０．０５〜３ｎＬ／細胞／日、約０．０５〜２ｎＬ／細胞／日、約０．０５〜１ｎＬ／細胞／日、約０．１〜５ｎＬ／細胞／日、約０．１〜４ｎＬ／細胞／日、約０．１〜３ｎＬ／細胞／日、約０．１〜２ｎＬ／細胞／日、約０．１〜１ｎＬ／細胞／日、約０．１５〜５ｎＬ／細胞／日、約０．１５〜４ｎＬ／細胞／日、約０．１５〜３ｎＬ／細胞／日、約０．１５〜２ｎＬ／細胞／日、約０．１５〜１ｎＬ／細胞／日、約０．２〜５ｎＬ／細胞／日、約０．２〜４ｎＬ／細胞／日、約０．２〜３ｎＬ／細胞／日、約０．２〜２ｎＬ／細胞／日、約０．２〜１ｎＬ／細胞／日、約０．２５〜５ｎＬ／細胞／日、約０．２５〜４ｎＬ／細胞／日、約０．２５〜３ｎＬ／細胞／日、約０．２５〜２ｎＬ／細胞／日、約０．２５〜１ｎＬ／細胞／日、約０．３〜５ｎＬ／細胞／日、約０．３〜４ｎＬ／細胞／日、約０．３〜３ｎＬ／細胞／日、約０．３〜２ｎＬ／細胞／日、約０．３〜１ｎＬ／細胞／日、約０．３５〜５ｎＬ／細胞／日、約０．３５〜４ｎＬ／細胞／日、約０．３５〜３ｎＬ／細胞／日、約０．３５〜２ｎＬ／細胞／日、約０．３５〜１ｎＬ／細胞／日、約０．４〜５ｎＬ／細胞／日、約０．４〜４ｎＬ／細胞／日、約０．４〜３ｎＬ／細胞／日、約０．４〜２ｎＬ／細胞／日、約０．４〜１ｎＬ／細胞／日、約０．４５〜５ｎＬ／細胞／日、約０．４５〜４ｎＬ／細胞／日、約０．４５〜３ｎＬ／細胞／日、約０．４５〜２ｎＬ／細胞／日、約０．４５〜１ｎＬ／細胞／日、約０．５〜５ｎＬ／細胞／日、約０．５〜４ｎＬ／細胞／日、約０．５〜３ｎＬ／細胞／日、約０．５〜２ｎＬ／細胞／日、約０．５〜１ｎＬ／細胞／日）の範囲の細胞特異的な灌流速度を有する。一部の実施形態では、灌流プロセスは、約０．０５ｎＬ、０．１ｎＬ、０．１５ｎＬ、０．２ｎＬ、０．２５ｎＬ、０．３ｎＬ、０．３５ｎＬ、０．４ｎＬ、０．４５ｎＬ、０．５ｎＬ、０．５５ｎＬ、０．６ｎＬ、０．６５ｎＬ、０．７ｎＬ、０．７５ｎＬ、０．８ｎＬ、０．８５ｎＬ、０．９ｎＬ、０．９５ｎＬ、１．０ｎＬ、１．１ｎＬ、１．２ｎＬ、１．３ｎＬ、１．４ｎＬ、１．５ｎＬ、１．６ｎＬ、１．７ｎＬ、１．８ｎＬ、１．９ｎＬ、２．０ｎＬ、２．１ｎＬ、２．２ｎＬ、２．３ｎＬ、２．４ｎＬ、２．５ｎＬ、２．６ｎＬ、２．７ｎＬ、２．８ｎＬ、２．９ｎＬ、３．０ｎＬ、３．１ｎＬ、３．２ｎＬ、３．３ｎＬ、３．４ｎＬ、３．５ｎＬ、３．６ｎＬ、３．７ｎＬ、３．８ｎＬ、３．９ｎＬ、４．０ｎＬ、４．１ｎＬ、４．２ｎＬ、４．３ｎＬ、４．４ｎＬ、４．５ｎＬ、４．６ｎＬ、４．７ｎＬ、４．８ｎＬ、４．９ｎＬ、または５．０ｎＬ／細胞／日の細胞特異的な灌流速度を有する。
【０１９３】
細胞培養液を、酸素化と細胞に対する栄養物の分散とを増大させるために、産生期の間に攪拌または振盪してもよい。本発明によると、増殖期の間に、バイオリアクターの特定の内部条件（例えばｐＨ、温度、酸素化などであるが、これらに限定されない条件）を制御または調節することが有益である可能性があることを当業者は理解するであろう。例えば、ｐＨは適切な量の酸または塩基を供給することによって制御され、酸素化は当該技術分野で周知のスパージング装置を用いて制御され得る。１つ以上の消泡剤も供給され得る。
【０１９４】
同一の培養培地を、増殖期、産生期、及び灌流を含めた産生プロセスを通して使用することができる。一部の実施形態では、少なくとも２つの異なる培地をｒｈＣ１−ＩＮＨの産生に使用する。例えば、細胞増殖用に調製された栄養培地を使用して細胞増殖期にわたって細胞の増殖を補助することが多く、また、タンパク質産生用に調製された栄養培地をプロセスの産生期の間に使用してＣ１−ＩＮＨの発現及び収穫を補助する。いずれの場合にも、栄養培地は、血清または他の動物由来成分（例えば、フェチュイン）を含んでいても、含んでいなくてもよい。
【０１９５】
本発明によると、細胞を懸濁液で増殖するのが典型的である。しかしながら、細胞を基体に付着させる場合がある。一例では、細胞を、栄養培地に懸濁したマイクロビーズまたは粒子に付着させる場合がある。
【０１９６】
バイオリアクター
本発明は、ｒｈＣ１−ＩＮＨを産生するのに有用なバイオリアクターも提供する。バイオリアクターは、例えば、灌流型、バッチ型、流加培養型、反復バッチ型、または連続型（例えば、連続攪拌槽リアクターモデル）であり得る。バイオリアクターは、培地（例えば、合成栄養培地）を収容するように設計及び構成されたされた少なくとも１つの容器を含むのが一般的である。容器は、新鮮栄養培地を容器に流し入れるように設計及び構成された少なくとも１つの導入口を含むのが一般的である。容器はまた、廃棄培地を容器から流し出すように設計及び構成された少なくとも１つの排出口を含むのが一般的である。一部の実施形態では、容器は、容器内の単離された細胞が少なくとも１つの排出口から廃棄培地と共に排出される程度を最小化するように設計及び構成された、少なくとも１つのフィルタをさらに含んでもよい。バイオリアクターは、細胞増殖に適した条件を維持するように設計された１つ以上の他の構成要素を備えていてもよい。例えば、バイオリアクターは、栄養培地を容器内で循環または混合させるように設計及び構成された１つ以上の循環装置または混合装置を備えていてもよい。典型的には、ｒｈＣ１−ＩＮＨを発現するように操作された単離された細胞は、栄養培地に懸濁される。したがって、ある場合には、循環装置は、単離された細胞が確実に栄養培地中に懸濁されたままになるようにする。細胞を基体に付着させる場合がある。細胞を、栄養培地に懸濁された１つ以上の基体（例えば、マイクロビーズ）に付着させる場合がある。バイオリアクターは、容器から細胞懸濁液の試料を得るための１つ以上のポートを含んでもよい。バイオリアクターは、ガス（例えば、空気、酸素、窒素、二酸化炭素）含有量、流量、温度、ｐＨ、溶存酸素レベル、及び攪拌速度／循環速度などの条件を含めた培養条件を、モニタリング及び／または制御するための１つ以上の構成要素を伴って構成されていてもよい。
【０１９７】
任意の適正なサイズの容器をバイオリアクターで使用することができる。容器サイズは、ｒｈＣ１−ＩＮＨ製造の生産需要を満たすのに適したサイズであるのが一般的である。一部の実施形態では、容器は栄養培地の最大１Ｌ、最大１０Ｌ、最大１００Ｌ、最大５００Ｌ、最大１０００Ｌ、最大１５００Ｌ、最大２０００Ｌ、またはそれ以上の量まで含有するように設計及び構成されている。一部の実施形態では、産生バイオリアクターの容量は、少なくとも１０Ｌ、少なくとも５０Ｌ、１００Ｌ、少なくとも２００Ｌ、少なくとも２５０Ｌ、少なくとも５００Ｌ、少なくとも１０００Ｌ、少なくとも１５００Ｌ、少なくとも２０００Ｌ、少なくとも２５００Ｌ、少なくとも５０００Ｌ、少なくとも８０００Ｌ、少なくとも１０，０００Ｌ、少なくとも１２，０００Ｌ、少なくとも１５，０００Ｌ、もしくは少なくとも２０，０００Ｌ、もしくはそれ以上であるか、またはそれらの間の任意の容量である。産生バイオリアクターは、産生Ｃ１−ＩＮＨタンパク質の発現または安定性もしくは活性を妨げることのない、細胞増殖及び生存率に寄与する任意の材料で構成されていてもよい。材料の例として、以下に限定されないが、ガラス、プラスチック、または金属が挙げられ得る。
【０１９８】
一部の実施形態では、バイオリアクターの容器に収容された合成培地で細胞を培養することができる。培養方法には、新鮮栄養培地を少なくとも１つの導入口を介して容器内に灌流することと、廃棄栄養培地を少なくとも１つの排出口を介して容器から排出することとが含まれることが多い。排出は、最大１日当たり約０．１容器容量、１日当たり約０．２容器容量、１日当たり約０．３容器容量、１日当たり約０．４容器容量、１日当たり約０．５容器容量、１日当たり約１容器容量、１日当たり約１．５容器容量、またはそれ以上の容器容量までの速度で行われる。方法には、ｒｈＣ１−ＩＮＨを含む栄養培地を収穫することも含まれる。収穫は、最大１日当たり約０．１容器容量、１日当たり約０．２容器容量、１日当たり約０．３容器容量、１日当たり約０．４容器容量、１日当たり約０．５容器容量、１日当たり約１容器容量、１日当たり約１．５容器容量、またはそれ以上の容器容量までの速度で行われ得る。灌流も排出速度と収穫速度との合計と同等の速度で行われるのが典型的である。例えば、灌流速度は、１日当たり約０．１容器容量、０．２容器容量、０．３容器容量、０．４容器容量、０．５容器容量、０．６容器容量、０．７容器容量、０．８容器容量、０．９容器容量、１．０容器容量、１．１容器容量、１．２容器容量、１．３容器容量、１．４容器容量、１．５容器容量、１．６容器容量、１．７容器容量、１．８容器容量、１．９容器容量、２．０容器容量を超えてもよい。一部の実施形態では、灌流速度は、１日当たり約５．０容器容量、４．５容器容量、４．０容器容量、３．５容器容量、３．０容器容量、２．５容器容量、２．０容器容量、１．５容器容量、１．４容器容量、１．３容器容量、１．２容器容量、１．１容器容量、１．０容器容量、０．９容器容量、０．８容器容量、０．７容器容量、０．６容器容量、０．５容器容量未満である。灌流速度の例は、本明細書を通して記載されている。
【０１９９】
培養条件のモニタリング
本発明の特定の実施形態では、実施者が、増殖細胞培養液の特定の条件を定期的にモニタリングすることが有益であるかまたは必要であると認識する場合がある。細胞培養条件をモニタリングすることにより、実施者は、細胞培養が組換えポリペプチドもしくはタンパク質を準最適なレベルで産生しているかどうか、または培養が準最適な産生期に入ろうとしているのかどうかを判定できるようになる。特定の細胞培養条件をモニタリングするために、分析用に培養液の少量アリコートを採取する必要がある。
【０２００】
非限定的な例として、温度、ｐＨ、細胞密度、細胞生存率、積算生細胞密度、オスモル濃度、または発現Ｃ１−ＩＮＨタンパク質の力価もしくは活性をモニタリングすることが有益であるかまたは必要である場合がある。当業者がこれらの条件を測定できるようにする数多くの技術が当該技術分野で周知である。例えば、細胞密度は、血球計数器、コールターカウンター、または細胞密度試験（ＣＥＤＥＸ）を用いて測定され得る。生細胞密度は、培養試料をトリパンブルーで染色することにより測定することができる。死細胞のみがトリパンブルーを吸収するため、生細胞密度は、細胞の総数を数え、染料を吸収した細胞の数をその細胞の総数で除算し、その反数を取ることによって算出され得る。別の方法として、発現Ｃ１−ＩＮＨタンパク質のレベルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色、ウエスタンブロット法、ブラッドフォードアッセイ、ローリーアッセイ、ビウレットアッセイ、及びＵＶ吸光度法などの標準的な分子生物学的技法により測定することができる。リン酸化及びグリコシル化を含めた発現Ｃ１−ＩＮＨタンパク質の翻訳後修飾をモニタリングすることも有益であるかまたは必要である場合がある。
【０２０１】
例示的な細胞培地及び培養条件については実施例の章で説明している。後述の実施例は限定することを意図するものではない。
【０２０２】
発現Ｃ１−ＩＮＨタンパク質の精製
様々な方法を用いて、本明細書に記載の種々の方法によって産生されたＣ１−ＩＮＨタンパク質を精製または単離することができる。一部の実施形態では、発現Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は培地中に分泌されるため、精製プロセスの第１の工程として、例えば遠心分離または濾過によって細胞及び他の固形物を除去することができる。別の方法として、または加えて、発現Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は宿主細胞の表面に結合している。一部の実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する宿主細胞を精製用に溶解する。哺乳類宿主細胞の溶解は、ガラスビーズによる物理的破壊及び高ｐＨ条件への曝露を含めた当業者に周知の多くの手段によって成し遂げることができる。
【０２０３】
Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、以下に限定されないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、サイズ排除、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）、ゲル濾過、遠心分離、もしくは溶解度差法、エタノール沈殿を含めた標準方法により、またはタンパク質の精製に使用可能な任意の他の技術（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．（ｅｄｓ．），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９；ａｎｄ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．（ｅｄｓ．），Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ  １８２），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７を参照されたく、これら全ての文献は参照により本明細書に援用される）により、単離かつ精製され得る。特に、免疫アフィニティクロマトグラフィーに関しては、タンパク質を、該タンパク質に対して産生され、かつ固定担体に固定された抗体を含むアフィニティカラムに結合することによって単離することができる。別の方法では、例えば、インフルエンザコート配列、ポリヒスチジン、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどのアフィニティタグを標準的な組換え技法によってタンパク質に付着させて、適正なアフィニティカラムを通過させることで簡易的な精製を可能にすることができる。精製プロセス中のポリペプチドまたはタンパク質の分解を低減または排除するために、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、ペプスタチン、またはアプロチニンなどのプロテアーゼインヒビターを、任意の段階または全ての段階で添加することができる。プロテアーゼインヒビターは、発現ポリペプチドまたはタンパク質を単離かつ精製するために、細胞を溶解しなければならない場合に特に所望される。
【０２０４】
Ｃ１−ＩＮＨタンパク質の精製に関連する問題を回避する精製方法の例が、後述の実施例の節で説明される。精製用の好適な樹脂には、以下に限定されないが、陰イオン交換樹脂、アルブミンアフィニティ樹脂、Ｃ１エステラーゼインヒビターアフィニティ樹脂、及びタンパク質Ａ樹脂が含まれる。一部の実施形態では、ｐＨの低減を要さない精製方法が好ましい。一部の実施形態では、溶出のために酸性ｐＨを要さない精製方法が好ましい。他の実施形態では、凝集を防止する安定剤が利用される。一部の実施形態では、凝集を防止する安定剤がｐＨの低減を要する方法で使用される。好適な安定剤の非限定的な例としてＥＤＴＡが挙げられる。
【０２０５】
本発明のＣ１−ＩＮＨタンパク質の好適な精製方法として、以下に限定されないが、例えば米国特許第５，２７６，１４１号、同第７３８４７５４号、同第８，８０２，８１６号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１２１０７５７２号、同第ＷＯ２０１３００９５２６号に記載された方法が挙げられ、これらの開示は参照により本明細書に援用される。
【０２０６】
混入物の低減
本開示はまた、下流プロセスにおいて非標的タンパク質混入物または不純物を低減する方法を提供する。一実施形態では、下流プロセスは、ｒｈＣ１−ＩＮＨのプロセスである。非標的タンパク質混入物として、例えば、混入ＤＮＡ、ＲＮＡ、宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）、及び／もしくはウイルス、ならびに／または標的タンパク質ではない任意の他の物質が含まれる。一実施形態では、非標的タンパク質混入物を、ｒｈＣ１−ＩＮＨ下流プロセスに追加の精製工程を導入することによって低減する。追加の精製工程を伴わないｒｈＣ１−ＩＮＨの１つの下流プロセスの例を図１４に示す。
【０２０７】
下流プロセスの任意の段階で、ＤＮＡ、ＨＣＰ、及び／またはウイルスの混入物を低減させることができる。一実施形態では、陰イオン交換（ＡＥＸ）膜吸収体を使用して混入物を低減させる。ＡＥＸ膜吸収体の例として、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣ、及び／またはＮａｔｒｉｘが挙げられ得る。一実施形態では、ＤＮＡ及び／または宿主細胞由来タンパク質の混入物を、図１４に示したＰＯＲＯＳ  ＸＳ精製工程の後にＡＥＸ膜工程を導入することよって低減させる。一実施形態では、ＤＮＡ、宿主細胞由来タンパク質、及び／またはウイルスの混入物を、図１４に示した下流プロセスにおいて、ＰＯＲＯＳ  ＸＳ精製工程の後にＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ膜吸収体を導入することによって低減させる。一実施形態では、ＤＮＡ混入物を、図１４に示した下流プロセスにおいて、ＰＯＲＯＳ  ＸＳ精製工程の後にＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ膜吸収体を導入することによって低減させる。一実施形態では、宿主細胞由来タンパク質混入物を、図１４に示した下流プロセスにおいて、ＰＯＲＯＳ  ＸＳ精製工程の後にＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ膜吸収体を導入することによって低減させる。一実施形態では、ＤＮＡ混入物を、図１４に示した下流プロセスにおいて、ＰＯＲＯＳ  ＸＳ精製工程の後にＳａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣ膜吸収体を導入することによって低減させる。一実施形態では、宿主細胞由来タンパク質混入物を、図１４に示した下流プロセスにおいて、ＰＯＲＯＳ  ＸＳ精製工程の後にＳａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣ膜吸収体を導入することによって低減させる。
【０２０８】
追加の混入物精製工程を導入することにより、ｒｈＣ１−ＩＮＨの収率及び純度が影響を受け得る。一実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨの収率及び純度は、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＱのＡＥＸ膜を使用することにより、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣ膜またはＮａｔｒｉｘ膜の使用と比べて増加する。一実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨの収率及び純度は、ＰＯＲＯＳ  ＸＳ下流プロセス段階の後にＳａｒｔｏｂｉｎｄ  ＱのＡＥＸ膜を使用することにより増加する。
【０２０９】
混入物は、ＡＥＸ膜精製工程の間にｐＨ及び／または導電率パラメータを操作することによって、さらに減少することができる。例えば、約５ｍＳ／ｃｍまで導電率を下げることにより、混入ＤＮＡ、ＨＣＰ、及び／またはウイルスなどの混入物がさらに減少する。一実施形態では、混入物は、約０．５〜２０ｍＳ／ｃｍの導電率を有することにより、さらに減少する。例えば、導電率は、約０．５ｍＳ／ｃｍ、１．０ｍＳ／ｃｍ、１．５ｍＳ／ｃｍ、２．０ｍＳ／ｃｍ、２．５ｍＳ／ｃｍ、３．０ｍＳ／ｃｍ、３．５ｍＳ／ｃｍ、４．０ｍＳ／ｃｍ、４．５ｍＳ／ｃｍ、５．０ｍＳ／ｃｍ、５．５ｍＳ／ｃｍ、６．０ｍＳ／ｃｍ、６．５ｍＳ／ｃｍ、７．０ｍＳ／ｃｍ、７．５ｍＳ／ｃｍ、８．０ｍＳ／ｃｍ、８．５ｍＳ／ｃｍ、９．０ｍＳ／ｃｍ、９．５ｍＳ／ｃｍ、１０．０ｍＳ／ｃｍ、１０．５ｍＳ／ｃｍ、１１．０ｍＳ／ｃｍ、１１．５ｍＳ／ｃｍ、１２．０ｍＳ／ｃｍ、１２．５ｍＳ／ｃｍ、１３．０ｍＳ／ｃｍ、１３．５ｍＳ／ｃｍ、１４．０ｍＳ／ｃｍ、１４．５ｍＳ／ｃｍ、１５．０ｍＳ／ｃｍ、１５．５ｍＳ／ｃｍ、１６．０ｍＳ／ｃｍ、１６．５ｍＳ／ｃｍ、１７．０ｍＳ／ｃｍ、１７．５ｍＳ／ｃｍ、１８．０ｍＳ／ｃｍ、１８．５ｍＳ／ｃｍ、１９．０ｍＳ／ｃｍ、１９．５ｍＳ／ｃｍ、もしくは２０ｍＳ／ｃｍ、またはその間の任意の数であり得る。一実施形態では、混入物は、約０．５〜８ｍＳ／ｃｍの導電率を有することにより、さらに減少する。例えば、導電率は、約０．５ｍＳ／ｃｍ、１．０ｍＳ／ｃｍ、１．５ｍＳ／ｃｍ、２．０ｍＳ／ｃｍ、２．５ｍＳ／ｃｍ、３．０ｍＳ／ｃｍ、３．５ｍＳ／ｃｍ、４．０ｍＳ／ｃｍ、４．５ｍＳ／ｃｍ、５．０ｍＳ／ｃｍ、５．５ｍＳ／ｃｍ、６．０ｍＳ／ｃｍ、６．５ｍＳ／ｃｍ、７．０ｍＳ／ｃｍ、７．５ｍＳ／ｃｍ、もしくは８．０ｍＳ／ｃｍ、またはその間の任意の数であり得る。一実施形態では、混入物は、約３．０〜６．０ｍＳ／ｃｍの導電率を有することにより、さらに減少する。例えば、導電率は、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、またはその間の任意の数であり得る。
【０２１０】
一実施形態では、混入物は、ＡＥＸ膜精製工程で約５．０〜９．０のｐＨを有することにより、さらに減少する。例えば、ｐＨは、約５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、または９．０であり得る。一実施形態では、混入物は、約５．０〜７．５のｐＨを有することにより、さらに減少する。例えば、ｐＨは、約５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、または７．５であり得る。
【０２１１】
医薬組成物
本発明は、本明細書に記載のｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質と生理学的に許容される担体または賦形剤とを含有する医薬組成物をさらに提供する。担体及びｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、無菌であり得る。製剤は、投与様式に適したものであるべきである。
【０２１２】
好適な薬学的に許容される担体として、以下に限定されないが、水、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）、食塩水、緩衝食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（ラクトース、アミロース、またはデンプンなど）、糖（マンニトール、スクロース、またはその他など）、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、珪酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど、及びこれらの組み合わせが挙げられる。医薬製剤は、所望に応じて、活性化合物と有害な反応を起こさないか、またはそれらの活性を妨げない助剤（例えば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩類、緩衝剤、着色料、香味料、及び／または芳香剤など）と混合され得る。好ましい実施形態では、静脈内投与に適した水溶性担体が用いられる。
【０２１３】
所望に応じて、好適な医薬組成物または薬剤は、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むこともできる。組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、または粉末であり得る。組成物はまた、従来の結合剤及び担体（トリグリセリドなど）を用いて座薬としても製剤化され得る。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含み得る。
【０２１４】
医薬組成物または薬剤は、ヒトに対する投与に適した医薬組成物として、慣行的な手順に従って製剤化され得る。例えば、一部の実施形態では、静脈内投与用の組成物は、無菌等張水性緩衝溶液であるのが典型的である。必要に応じて、組成物はまた、可溶化剤、及び注射部位の痛みを軽減するための局所麻酔薬を含んでもよい。一般的に、成分は、例えば凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、活性作用剤の量を提示するアンプルまたはサシェ（ｓａｃｈｅｔｔｅ）などの密封容器に、別々に、または単位剤形の形態で混合されて供給される。組成物を注入によって投与しようとする場合、無菌医薬品グレードの水、食塩水、またはデキストロース／水を含有する注入瓶を用いて調剤することができる。組成物を注射によって投与する場合、注射用の無菌水か、または食塩水のアンプルを供給することができ、投与に先立って成分を混合できるようにする。
【０２１５】
本明細書に記載のｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、中性形態または塩形態として製剤化され得る。薬学的に許容される塩として、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、その他の由来の塩などの遊離アミノ基で形成される塩、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン、その他の由来の塩などの遊離カルボキシル基で形成される塩が挙げられる。
【０２１６】
好ましい製剤は、５０ｍＭのＮａＰＯ４（ｐＨ７．２）と、５０ｍＭのソルビトールと、１５０ｍＭのグリシンとを含む。一部の実施形態では、製剤は、約５０ｍＭのＮａＰＯ４（ｐＨ７．２）と、約５０ｍＭのソルビトールと、約１５０ｍＭのグリシンとを含む。例えば、一部の実施形態では、製剤は、約２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、または８０ｍＭのＮａＰＯ４（ｐＨ７．２）を含み、ＮａＰＯ４のｐＨは、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０であり、ソルビトール濃度は、約２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、または８０ｍＭであり、グリシン濃度は、約７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、１００ｍＭ、１０５ｍＭ、１１０ｍＭ、１１５ｍＭ、１２０ｍＭ、１２５ｍＭ、１３０ｍＭ、１３５ｍＭ、１４０ｍＭ、１４５ｍＭ、１５０ｍＭ、１５５ｍＭ、１６０ｍＭ、１６５ｍＭ、１７０ｍＭ、１７５ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、１９５ｍＭ、または２００ｍＭである。
【０２１７】
別の好ましい製剤は、１５０ｍＭのグリシンと、５０ｍＭのソルビトールと、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）との中に７０ｍｇ／ｍＬのｒｈＣ１−ＩＮＨを含む。一部の実施形態では、製剤は、約１５０ｍＭのグリシンと、約５０ｍＭのソルビトールと、約５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（約ｐＨ７．１）との中に約７０ｍｇ／ｍＬのｒｈＣ１−ＩＮＨを含む。例えば、一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨ濃度は、約４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、５５ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、６５ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、８５ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、９５ｍｇ／ｍＬ、または１００ｍｇ／ｍＬであり、グリシン濃度は、約７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、１００ｍＭ、１０５ｍＭ、１１０ｍＭ、１１５ｍＭ、１２０ｍＭ、１２５ｍＭ、１３０ｍＭ、１３５ｍＭ、１４０ｍＭ、１４５ｍＭ、１５０ｍＭ、１５５ｍＭ、１６０ｍＭ、１６５ｍＭ、１７０ｍＭ、１７５ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、１９５ｍＭ、または２００ｍＭであり、ソルビトール濃度は、約２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、または８０ｍＭであり、リン酸ナトリウム緩衝液は、約２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、または８０ｍＭであり、リン酸ナトリウム緩衝液のｐＨは、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０である。
【０２１８】
別の好ましい製剤は、１５０ｍＭのグリシンと、５０ｍＭのソルビトールと、１５０ｍＭのアルギニンＨＣｌと、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）との中にｒｈＣ１−ＩＮＨを含む。一態様では、製剤は２℃〜８℃、及び２５℃で安定性を増している。一部の実施形態では、製剤は、約１５０ｍＭのグリシンと、約５０ｍＭのソルビトールと、約１５０ｍＭのアルギニンＨＣｌと、約５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）との中にｒｈＣ１−ＩＮＨを含む。例えば、一部の実施形態では、製剤は、約４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、５５ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、６５ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、８５ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、９５ｍｇ／ｍＬ、または１００ｍｇ／ｍＬの濃度でｒｈＣ１−ＩＮＨを含み、グリシン濃度は、約７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、１００ｍＭ、１０５ｍＭ、１１０ｍＭ、１１５ｍＭ、１２０ｍＭ、１２５ｍＭ、１３０ｍＭ、１３５ｍＭ、１４０ｍＭ、１４５ｍＭ、１５０ｍＭ、１５５ｍＭ、１６０ｍＭ、１６５ｍＭ、１７０ｍＭ、１７５ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、１９５ｍＭ、または２００ｍＭであり、ソルビトール濃度は、約２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、または８０ｍＭであり、アルギニンＨＣｌ濃度は、約７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、１００ｍＭ、１０５ｍＭ、１１０ｍＭ、１１５ｍＭ、１２０ｍＭ、１２５ｍＭ、１３０ｍＭ、１３５ｍＭ、１４０ｍＭ、１４５ｍＭ、１５０ｍＭ、１５５ｍＭ、１６０ｍＭ、１６５ｍＭ、１７０ｍＭ、１７５ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、１９５ｍＭ、または２００ｍＭであり、リン酸ナトリウム濃度は、約２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、または８０ｍＭであり、リン酸ナトリウム緩衝液のｐＨは、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０である。
【０２１９】
製剤は液体であってもよく、または凍結乾燥され、投与前に元に戻されてもよい。
【０２２０】
投与経路
本明細書に記載のｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質（または本明細書に記載のｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を含有する組成物または薬剤）は、任意の適正な経路により投与される。一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質またはそれを含有する医薬組成物は、全身に投与される。全身投与は、静脈内、皮内、頭蓋内、鞘内、吸入、経皮（局所的）、眼内、筋肉内、皮下、筋肉内、経口、及び／または経粘膜的投与であり得る。一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質またはそれを含有する医薬組成物は、皮下に投与される。本明細書で使用される場合、用語「皮下組織」は、皮膚直下の疎性不規則性結合組織の層として定義される。例えば、皮下投与は、組成物を、以下に限定されないが、大腿部、腹部、殿部、または肩甲部を含めた領域に注射することによって行われ得る。一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質またはそれを含有する医薬組成物は、静脈内に投与される。一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質またはそれを含有する医薬組成物は、経口投与される。一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質またはそれを含有する医薬組成物は、頭蓋内に投与される。一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質またはそれを含有する医薬組成物は、鞘内に投与される。所望の場合には、２つ以上の経路を同時に用いることができる。
【０２２１】
一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質またはそれを含有する医薬組成物は、鞘内投与により対象に投与される。本明細書で使用される場合、「鞘内投与」または「鞘内注射」という用語は、脊椎管（脊髄周囲の鞘内空間）に注射することを意味する。穿頭孔穿刺または大槽穿刺または腰椎穿刺などを介した脳室内注射を含めるが、これに限定されない種々の技法を用いることができる。一部の実施形態では、本発明による「鞘内投与」または「鞘内送達」は、腰部または腰部領域を介したＩＴ投与または送達（すなわち腰部ＩＴ投与または送達）を意味する。本明細書で使用される場合、「腰部領域」または「腰部」という用語は、第３腰椎と第４腰椎（腰背部）との間の領域、より包括的には、脊椎のＬ２−Ｓ１領域を意味する。
【０２２２】
一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質またはそれを含有する医薬組成物は、皮下（すなわち皮膚下）投与により対象に投与される。かかる目的に対して、シリンジを用いて製剤を注射してもよい。しかしながら、注射デバイス（例えば、Ｉｎｊｅｃｔ−ｅａｓｅ（商標）デバイス及びＧｅｎｊｅｃｔ（商標）デバイス）、注射ペン（ＧｅｎＰｅｎ（商標）など）、無針デバイス（例えば、ＭｅｄｉＪｅｃｔｏｒ（商標）及びＢｉｏＪｅｃｔｏｒ（商標））、ならびに皮下パッチ送達系といった製剤投与用の他のデバイスが使用可能である。
【０２２３】
一部の実施形態では、鞘内投与は、他の投与経路（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、非経口、経皮または経粘膜（例えば、経口または経鼻））と併用して使用され得る。
【０２２４】
本発明は、本明細書に記載のｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質またはそれを含有する医薬組成物の治療有効量の単回投与及び複数回投与を企図している。ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質またはそれを含有する医薬組成物は、対象の症状（例えば、遺伝性血管性浮腫）の性質、重症度、及び程度に応じて規則的な間隔で投与され得る。一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質またはそれを含有する医薬組成物の治療有効量を、規則的な間隔で（例えば、年に１回、６か月に１回、５か月に１回、３か月に１回、隔月（２か月に１回）、毎月（毎月１回）、隔週（２週間に１回）、毎週、毎日、または連続して）、周期的に投与することができる。
【０２２５】
一部の実施形態では、投与により個体において単に局所的効果を得るだけであるが、他の実施形態では、投与により個体の複数の部位にわたる効果（例えば、全身効果）を得る。投与の結果、通例、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質が１つ以上の標的組織に送達される。一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、以下に限定されないが、心臓、脳、皮膚、血液、脊髄、横紋筋（例えば、骨格筋）、平滑筋、腎臓、肝臓、肺、及び／または脾臓を含めた１つ以上の標的組織に送達される。一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は心臓に送達される。一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は中枢神経系、特に脳及び／または脊髄に送達される。一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、三頭筋、前脛骨筋、ヒラメ筋、腓腹筋、二頭筋、僧帽筋、三角筋、四頭筋、及び／または横隔膜に送達される。
【０２２６】
剤形及び投与レジメン
一部の実施形態では、組成物は、治療有効量で、及び／または特定の所望の結果（例えば、ＨＡＥなどの補体媒介性慢性疾患の予防）と相関する投与レジメンに従って投与される。
【０２２７】
本発明に従って投与される特定の用量または量は様々であり、例えば、所望の結果の性質及び／もしくは程度、投与経路及び／もしくはタイミングの詳細、ならびに／または１つ以上の特徴（例えば、体重、年齢、個人歴、遺伝的特徴、ライフスタイルパラメータ、心臓障害の重症度、及び／もしくは心臓障害の危険性レベルなど、またはそれらの組み合わせ）に依存する。こうした用量または量は、当業者によって決定され得る。一部の実施形態では、適正な用量または量は、標準的な臨床技術に従って決定される。別の方法として、または加えて、一部の実施形態では、適正な用量または量は、所望のまたは至適な投与用量範囲または量を特定するのに役立つ１つ以上のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを通して決定される。
【０２２８】
種々の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は治療有効量で投与される。一般に、治療有効量は、対象に対して意義のある利益を得る（例えば、基礎疾患または症状を予防する、治療する、調節する、治癒する、防止する、及び／または寛解させる）のに十分な量である。一般に、治療剤（例えば、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質）の量であって、治療剤を必要とする対象に投与される量は、対象の特徴によって決まる。こうした特徴には、対象の症状、疾患の重症度、一般的な健康状態、年齢、性別、及び体重が含まれる。当業者は、これらの及び他の関連する要因によって適正な用量を容易に決定することができるはずである。加えて、至適な用量の範囲を特定するために、客観的及び主観的アッセイの両方が任意選択的に採用され得る。特定の一部の実施形態では、適正な投与用量または投与量を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデル評価系由来の用量反応曲線から外挿することができる。
【０２２９】
一部の実施形態では、組成物は医薬製剤として提供される。一部の実施形態では、医薬製剤は、ＨＡＥ発作の発症率または危険性を低減させることと相関した投与レジメンに従う投与用の単位用量であるか、または該単位用量を含む。
【０２３０】
一部の実施形態では、本明細書に記載のｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を含む製剤は、単回投与として投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載のｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を含む製剤は、規則的間隔で投与される。本明細書で使用される「間隔」での投与は、治療有効量が周期的（１回限りの投与とは区別される）に投与されることを示している。間隔は、標準的な臨床技術で決定され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を含む製剤は、隔月、毎月、月２回、３週間毎、隔週、毎週、週２回、週３回、毎日、１日２回、または６時間毎に投与される。単一個体に対する投与間隔は、一定の間隔である必要はなく、個体の必要性に応じて経時的に変動する可能性がある。
【０２３１】
治療有効量は、一般的に、複数単位用量が含まれ得る投与レジメンで投与される。任意の特定の治療用タンパク質に関して、治療有効量（及び／または有効投与レジメン内での適正な単位用量）は、例えば、投与経路、他の医薬作用剤との組み合わせに応じて変動し得る。また、任意の特定の患者に固有の治療有効量（及び／または単位用量）は、治療される障害及び障害の重症度；採用される特定の医薬作用剤の活性；採用される特定の組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、及び食事；投与時間、投与経路、及び／または採用される特定のタンパク質の排出または代謝速度；治療期間；ならびに医療分野において周知の類似要因を含む様々な要因に依存し得る。
【０２３２】
本明細書で使用される場合、用語「隔月」は２か月に１回（すなわち、２か月毎に一回）の投与を意味し、用語「毎月」は１か月に１回の投与を意味し、用語「３週間毎」は３週間に１回（すなわち３週間毎に１回）の投与を意味し、用語「隔週」は２週間に１回（すなわち、２週間毎に１回）の投与を意味し、用語「毎週」は週に１回の投与を意味し、用語「毎日」は１日に１回の投与を意味する。
【０２３３】
一部の実施形態では、本明細書に記載のｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を含む製剤は、無期限に規則的間隔で投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載のｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質を含む製剤は、決められた期間の間、規則的間隔で投与される。
【０２３４】
さらに当然のことながら、任意の特定の対象に対して、個体の必要性と、酵素補充療法を施行するかまたは施行を管理する人の専門的判断とに従って、固有の投与レジメンを経時的に調整すべきであり、また本明細書に記載された用量範囲は単に例を示したものであり、請求される発明の範囲または実施を制限することを意図するものではない。
【０２３５】
併用療法
一部の実施形態では、ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質は、補体媒介性疾患の治療に現在用いられている１つ以上の既知の治療剤（例えば、コルチコステロイド）と併用して投与される。一部の実施形態では、既知の治療剤（複数可）は、その標準的もしくは承認済投与レジメン及び／またはスケジュールに従って投与される。一部の実施形態では、既知の治療剤（複数可）は、その標準的もしくは承認済投与レジメン及び／またはスケジュールと比較して変更されたレジメンに従って投与される。一部の実施形態では、こうした変更されたレジメンは、１つ以上の単位用量が異なる（例えば減少または増加）という点で、及び／または投与頻度が異なるという点で（例えば、単位投与間の１つ以上の間隔を長くして低頻度にするか、または間隔を短くして高頻度にしているという点で）、標準的または承認済投与レジメンとは異なっている。
【０２３６】
障害
一部の実施形態では、本発明で提供される組換えタンパク質は、補体媒介性障害（例えば、ＮＭＯＳＤ、ＡＭＲ、またはＨＡＥ事象）に関連する急性発作に適している。これらの発作は長い場合もあり、短い場合もある。一部の実施形態では、疾患または障害は慢性的である。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は予防的に用いられる。本明細書に開示される組成物及び方法を用いて治療され得る補体媒介性疾患の例として、以下に限定されないが、遺伝性血管性浮腫、抗体関連型拒絶反応、視神経脊髄炎関連疾患、外傷性脳損傷、脊椎損傷、虚血性脳損傷、火傷、中毒性表皮壊死症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、脳卒中、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、重症筋無力症、多巣性運動ニューロパチーが挙げられる。
【実施例】
【０２３７】
本発明の他の特徴、目的、及び利点は、以下の実施例において明らかになる。しかしながら、本実施例は、本発明の実施形態を示すが、単に例示のためであり、制限するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内の様々な変更及び修正は、本実施例から当業者に明らかになるであろう。
【０２３８】
実施例１：組換えヒトＣ１−ＩＮＨの一過性発現
ヒト血漿由来Ｃ１−ＩＮＨのアミノ酸配列を用いて、ＣＨＯ最適化ヌクレオチド配列を作製した。続いて、この配列をｐＸＬＧ６発現ベクターに挿入し、ＣＨＯ細胞に形質移入した。
【０２３９】
２つの異なる形質移入方法（ＨＤ１及びＨＤ２）、ならびに２つの異なる培養温度（３１℃及び３７℃）を評価した。ＨＤ１とＨＤ２の両方に関して、形質移入した日に細胞を新鮮な増殖培地で継代培養し、直鎖状ポリエチレンイミン（分子量２５，０００）（ＰＥＩ）とＤＮＡとの混合物を細胞に加えた。形質移入物の全てが良好な生存率と良好な形質移入効率を示した。Ｃ１−ＩＮＨ活性アッセイと抗原ＥＬＩＳＡアッセイとを用いて、細胞培養上清における活性タンパク質の力価を算出した。
【０２４０】
評価した全ての条件について、Ｃ１インヒビターは高レベル（＞２００ｍｇ／Ｌ）で発現されていた。ＨＤ２とフィードとを組み合わせた結果、予想外に極めて高い発現レベル（＞６００ｍｇ／Ｌ）を得た。この条件では、３７℃で、５日目までに１０００ｍｇ／Ｌを超える量に達することができ、これは発現に利用できる短い期間を考慮すると驚くほど多い量である。３１℃では、観測した力価は概してそれよりは低いにしても、６００ｍｇ／Ｌを超えている。
【０２４１】
実施例２：Ｃ１−インヒビターを産生する安定クローンの確立
懸濁液培養と無血清増殖条件とに適合したＣＨＯ細胞株を親細胞株として用いて、組換えヒトＣ１−ＩＮＨを安定的に発現する細胞株を生成及び発生させた。
【０２４２】
親ＣＨＯ細胞株を、ＨＤ１とＨＤ２とを用いた化学的形質移入によりｐＸＬＧ６−Ｃ１−ＩＮＨで形質移入した。組換え細胞のプールをピューロマイシンを用いて数日間にわたって選択し、そのｒｈＣ１−ＩＮＨ発現レベルを評価した。次いで、クローン集団をプールの限界希釈により生成した。プール番号１とプール番号１２を、高い発現レベルと高い活性／抗原比とを併せ持つことから選択して、クローン細胞株の産生に用いた。
【０２４３】
９６ウェルプレートでの限界希釈法を用いて、単一細胞クローニングをプール番号１及びプール番号１２から行った。細胞密度、生存率、及び産生性を定期的に測定した。クローン番号１及びクローン番号３１を、高産生性、発現したｒｈＣ１−ＩＮＨの品質、及び安定性に基づき、さらなる開発用に選択した。
【０２４４】
実施例３：細胞培養最適化
スケーラブルな産生プロセスの開発用にクローン／培地のロバストな組み合わせ（例えば、高容積産生性と所望のシアリル化度）を見つけ出すために、４０個の市販培地の培地スクリーニングをクローン番号１及びクローン番号３１を用いて実施検討した。
【０２４５】
使用された培養培地に応じて、クローン番号１は約１０００〜１２００ｍｇ／Ｌの組換えＣ１−ＩＮＨを産生することができ、クローン番号３１は約６００〜８００ｍｇ／Ｌを産生した。一方、クローン番号３１によって産生されたＣ１−ＩＮＨのシアリル化は、クローン番号１によって産生されたＣ１−ＩＮＨよりも血漿由来Ｃ１−ＩＮＨに類似していた。したがって、クローン番号３１をさらなる開発用に選択した。
【０２４６】
実施例４：培地及びフィード最適化
４種のフィードについて、細胞増殖及びＣ１−ＩＮＨ発現への影響を評価するために検討した。これらは、表１に記載のＦｅｅｄ３、ＰＷ２、Ｐｅｐ１５１０、及びＰｅｐ４６０１である。細胞生存率及び力価を７日目と１０日目とに各条件について測定した。Ｆｅｅｄ３とＰｅｐ１５１０との混合物（Ｆｅｅｄ３：Ｐｅｐ１５１０（ｖ／ｖ）＝９：１）が、実験培養条件可で力価と生存率の両方を最大化した。
【表１】
2018538270.tif 000007
【０２４７】
実施例３に記載のスクリーニング結果に基づいて選択された３種の培地（表２に詳細を示す）を、タンパク質の品質を極大化する培養条件を特定するために、フィードと組み合わせて評価した。ＭａｘｉＴｕｂｅＳｐｉｎ（登録商標）バイオリアクター（ＭＴＳ）で、表３に略述した組み合わせを用いて実験を行った。培養液をモニタリングし、かつ補充して、グルコース及び重炭酸塩の適正なレベルを維持した。
【表２】
2018538270.tif 000008
【０２４８】
これらの培地を、タンパク質の品質を極大化する培養条件を特定するために、フィードと組み合わせて評価した。ＭａｘｉＴｕｂｅＳｐｉｎ（登録商標）バイオリアクター（ＭＴＳ）で、表３に略述した条件下で実験を行った。培養液をモニタリングし、かつ補充して、グルコース及び重炭酸塩の適正なレベルを維持した。
【表３】
2018538270.tif 000009
【０２４９】
３日目に、各条件下で培養された細胞を用いて、温度（３１℃、３４℃、及び３７℃）がタンパク質の品質及び産生性に及ぼす影響を評価するために、ＴｕｂｅＳｐｉｎ（登録商標）サテライト培養を開始した。１０日目に、これらのサテライト培養における生細胞密度及び生存率をフローサイトメーターを用いて測定した。各条件に対して、後の分析のためにＣＣＳ試料を採取した。データによると、ＰｏｗｅｒＣＨＯ１を用いた条件が産生量及び品質を極大化したことがわかった。
【０２５０】
実施例５：大規模組換えＣ１−インヒビター産生
クローン番号３１によるＣ１−ＩＮＨの大規模産生を最適化するために、いくつかの産生を実行し種々のパラメータを評価した。培養液のフィードに至適な混合物は、１容量のＨｙＰｅｐ１５１０（本明細書では「Ｐｅｐ１５１０」と称される）（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、カタログ番号５Ｘ５９０５３、水中２００ｇ／ｌ）に対して、９容量のｉｍＭＥＤＩＡｔｅ  ＡＤＶＡＮＴＡＧＥ（本明細書では「Ｆｅｅｄ３」と称される）（Ｓｉｇｍａ社（ＳＡＦＣ）、カタログ番号８３８３Ｃ）であることを見出した。ＰｏｗｅｒＣＨＯ１培地と共にＦｅｅｄ３＋Ｐｅｐ１５１０混合物を用いることで、１０日目におよそ１．３ｇ／ｌ（９０％の生存率）の収率、また１４日目に約２．０ｇ／ｌ（８７％の生存率）の収率を得た。ＰＣＯ２及びオスモル濃度を最小化するために、ｐＨをＨＣｌ／炭酸塩で制御した。空気と５％ＣＯ２の混合ガスを０．０３ｖｖｍで連続的に吹き込み、ｐＨを７．２に維持した。
【０２５１】
同一の播種密度及びｐＨ制御スキームを再び使用しつつ、複合体の非合成フィードであるＦｅｅｄ３を、合成フィードであるＰｏｗｅｒＦｅｅｄ  Ａ（本明細書では「ＰＷ２」として称される）（Ｌｏｎｚａ社、カタログ番号ＢＥ０２−０４４Ｑ）で置き換えられるかどうか調べるために別のバイオリアクター試験を計画した。全てのリアクターに対して、播種密度として０．５×１０６個の細胞／ｍｌを用いた。表４に示すように、驚くべきことに、ＰＷ２を使用して得られた産生力価の結果は期待値をはるかに下回った。
【表４】
2018538270.tif 000010
【０２５２】
評価した２つの他の培地／フィードの組み合わせにより良好な結果がもたらされた：ＣＤＣＩＭ／（平衡フィード＋フィード補充）：１０日目に１．２ｇ／ｌ（９４％生存率）及び１４日目に２．６ｇ／ｌ（９２％生存率）、ＣＤＣＩＭ＋ＣＢ／Ｆｅｅｄ  Ｃ：１０日目に１．０ｇ／ｌ（９８％生存率）及び１４日目に２．０ｇ／ｌ（８２％生存率）。
【０２５３】
概して、全条件は極めて良好に機能した。高細胞密度はＣｅｌｌ  ＢｏｏｓｔとＦｅｅｄＣとを用いた場合に得られ、最高力価は１４日目の終わりにＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔを用いずＢａｌａｎｃｅｄ  Ｆｅｅｄを用いた場合に得られた。１０日目に、力価の差異が有意ではなくなった。したがって、１ｇ／Ｌのプロセスに対して、両方のプロセスを用いることができると考えられる。
【０２５４】
得られたデータは、本発明の細胞株の例が、十分に最適化された流加培養プロセスにおいて２ｇ／リットルレベルを超えるＣ１インヒビターの収率をもたらすことができることを総じて明らかにした。重要なことは、以下の実施例によって示されるように、高力価の細胞培養プロセスを、所望の産物品質特性（特に、血漿由来ヒトＣ１−ＩＮＨと同様のまたはそれよりも長い半減期を達成するのに必要なシアリル化）を維持しつつ成し遂げたことである。
【０２５５】
実施例６：組換えＣ１−インヒビターの精製
細胞により発現したｒｈＣ１−ＩＮＨを精製するプロセスには、収穫物の濃縮、それに続く溶媒界面活性剤処理（ＳＤ）を用いた濃縮された収穫物のウイルス不活性化、３種のクロマトグラフィー下流精製工程、ウイルスフィルタ低減工程、及び最終濃縮／透析濾過工程が含まれ得る。図２は、ｒｈＣ１−ＩＮＨ精製の例示的なプロセスを示す。
【０２５６】
Ｇｉｇａｃａｐ  Ｑを用いたＡＥＸクロマトグラフィーの例示的なクロマトグラフィー動作パラメータを以下の表５に示す。
【表５】
2018538270.tif 000011
【０２５７】
確定されたクロマトグラフィー条件は、プロセス不純物を除去し、シアリル化グリカンを増やすことによって産物の品質を向上させるように設定されている。例示的な溶出プロファイルを、中性かつシアリル化された種の対応する分離と共に図３に示す（表６）。さらに、図４に示すように、開発された陰イオン交換工程は、宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）などのプロセス不純物を分離することができる。
【表６】
2018538270.tif 000012
【０２５８】
ＰＯＲＯＳ  ＸＳを用いる陽イオンクロマトグラフィーを使用して産物品質を最適化するためのクロマトグラフィー動作パラメータを以下の表７に示す。
【表７】
2018538270.tif 000013
【０２５９】
確定された動作条件は、産物混入物を除去し、所望のグリコシル化プロファイルを増やすことによって産物品質を向上させるように設定されている。Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ溶出後のＨＣＰ含有量の低減を図６に示す。図５は、所望のシアリル化グリカン種の濃縮を示す例示的なＰｏｒｏｓ  ＸＳ溶出プロファイルである。Ｐｏｒｏｓ  ＸＳによる所望のシアリル化グリカン種の濃縮について表８に示す。
【表８】
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【０２６０】
実施例７：組換えＣ１−インヒビターのグリカン分析
Ｃ１−ＩＮＨのインタクトな分子量のおよそ５０％がグリカンである。６つのＮ結合型部位（セルピンドメインに３つ（Ａｓｎ２１６、Ａｓｎ２３１、Ａｓｎ３３０）及びＮ末端ドメインに３つ（Ａｓｎ３、Ａｓｎ４７、Ａｓｎ５９））と、８つのＯ結合型部位（Ｎ末端ドメインに全て（Ｓｅｒ４２、Ｔｈｒ２５、Ｔｈｒ２６、Ｔｈｒ４９、Ｔｈｒ６１、Ｔｈｒ６６、Ｔｈｒ７０、Ｔｈｒ７４））とがある。
【０２６１】
本明細書に記載の方法に従ってＣＨＯ細胞により発現した組換えＣ１−インヒビターにおけるＮ−グリカン及びＯ−グリカンの分布の特徴を明らかにするために、数種類の分析方法を開発及び／または評価した。市販の血漿由来ヒトＣ１−ＩＮＨを比較対照として流した。これらの方法は、グリコシル化を分析するための例示的な方法であり、何ら限定することを意図するものではない。
【０２６２】
各方法には、タンパク質由来のグリカンの除去工程、フルオロフォア（例えば、２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ））を用いたグリカンの誘導体化工程、過剰な誘導体化試薬の固相抽出による除去工程、及び得られた分類済グリカンの特性決定工程といったアッセイ前工程が必要である。
【０２６３】
１．混合モード順相／陰イオン交換ＨＰＬＣ（ＮＰ／ＡＥ）によるＮ−グリカン分析
混合モード順相／陰イオン交換クロマトグラフィー（ＮＰ／ＡＥ）によるＮ−グリカン分析法（ＮＧＡ）を用いることで、分類されたグリカンを、主に電荷（シアル酸を含むため）に基づいて、さらにはサイズ、オリゴ糖組成、及び結合に基づいて分離することによって、ｒｈＣ１−ＩＮＨのＮ結合型グリカン含有物プロファイルを得た。溶出ピークをシアル酸含有量に基づき大まかに「電荷クラスター」に分類したが、電荷クラスター内のピークは、サイズ、オリゴ糖組成、または結合という点で様々である。蛍光検出器を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムを用いてグラジエント分離を行った。得られたクロマトグラムを積分することにより、シアル酸含有量に基づいて、相対的なＮ−グリカン分布の再現性の高い定量が可能であった。エラー！参照元が見つかりません。図７は、シアル酸含有量に基づいて分類されたピーク群を持つｒｈＣ１−ＩＮＨプロファイルの例を表す。観測されたピーク群の帰属を、分取したピーク画分のオフラインＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析で確認した（図８）。
【０２６４】
比較のため、血漿由来Ｃ１−ＩＮＨのグリカンプロファイルを図９に示す。
【０２６５】
２．親水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＬＩＣ）によるＮ−グリカン分析
親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＮＧＡ−ＨＩＬＩＣ）を用いたＮ−グリカン分析法（ＮＧＡ）により、主にグリカンサイズに基づいて、さらには単糖含有量、及び結合に基づいて、Ｃ３６のＮ結合型グリカン含有物の高分解能プロファイルを得た。蛍光検出器を備えた高速液体クロマトグラフィーシステムを用いてグラジエント分離を行った。得られたクロマトグラムを積分することにより、相対的なＮ−グリカン分布の再現性の高い定量が可能であった。
【０２６６】
図１０は、オンラインＬＣ／ＭＳ評価から得られたピーク帰属を有する代表的なｒｈＣ１−ＩＮＨのＨＩＬＩＣクロマトグラムを表す。クロマトグラムのベースライン分離状態により、フコシル化、アンテナリティ（ａｎｔｅｎｎａｒｉｔｙ）、シアリル化などの異なるグリカン属性の相対レベル、及び末端ガラクトースレベルを計算可能である。
【０２６７】
混合モードクロマトグラフィー及びＨＩＬＩＣによるＮＧＡから得られた結果は、１つ〜４つのシアル酸を有するグリカンに対して同様であった。
【０２６８】
３．親水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＬＩＣ）によるＮグリカン及びＯグリカン分析
Ｏ−グリカン分析をＯＲＥＬＡ遊離試薬（Ｌｕｄｇｅｒ社）を用いて行った。ＯＲＥＬＡ試薬を用いて化学的にグリカンを遊離した結果として、アスパラギン結合型（Ｎ結合型）グリカン、及びセリン／トレオニン結合型（Ｏ結合型）グリカンから構成されるグリカン試料を得る。ＯＲＥＬＡ試薬を用いて生成した評価試料の分析結果を、ＰＮＧａｓｅＦを用いて生成した試料と比較して、全グリカンプロファイルをＮ結合型（単独）グリカンプロファイルと比較できるようにする。したがって、付加的なグリカンピークは、ｒｈＣ１−ＩＮＨのＯ結合型グリコシル化部位からの寄与を表す。この分析を親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を用いて行う。
【０２６９】
ＨＩＬＩＣクロマトグラフィー方法は、分類されたグリカンを、主としてサイズに基づいて、さらには単糖含有量及び結合に基づいて分離することを可能にする。それ故に、最も多く見られるＯ結合型グリカンはクロマトグラムで早期に溶出すべきであり、Ｎ結合型グリカンと共溶出するべきではない。この方法は、１．７μｍの粒子サイズを有するＵＰＬＣカラムを利用する。蛍光検出器を備えたＨＰＬＣシステムまたはＵＰＬＣシステムのいずれかを用いてグラジエント分離を行ってもよい。
【０２７０】
ＯＲＥＬＡ試料で観測された新規なピークは、Ｏ結合型グリカンを表し、これらは、オンライン陰イオン液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を用いて同定され得るか、または採取され、オフラインマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析され得る。
【０２７１】
Ｎ結合型グリカン及びＯ結合型グリカンの遊離を、上述のようにＯＲＥＬＡ遊離試薬を用いて行った。Ｎ結合型グリカン及びＯ結合型グリカンの誘導体化を蛍光標識として２−ＡＡを用いて行った。ＰＮＧａｓｅ−Ｆ消化によりＮ結合型グリカンを脱グリコシル化したＮ結合型グリカンプロファイルの評価を、クロマトグラフィープロファイルの比較用に行った。図１１は、代表的なｒｈＣ１−ＩＮＨ試料のＮ−グリカンプロファイル（ＰＮＧａｓｅ−Ｆ）及びＮ＋Ｏ−グリカンプロファイル（ＯＲＥＬＡ脱グリコシル化）として得られたプロファイルを表す。図１１に示すように、有意な新規のピークが保持時間１６分で観察され、約５分で小さいピークが観察された。付加的なピークが溶出後期に観測されたが、これはＮ結合型プロファイルで観測されたグリカンの保持時間と一致した。
【０２７２】
新規ピークの帰属の評価を、陰イオンモードのオンラインＬＣ／ＭＳ分析を用いて行った。この分析の結果、新規ピークを、１つまたは２つのシアル酸を有するＣｏｒｅ−１  Ｏ−グリカンとして同定した（Ｃｏｒｅ−１＝Ｎ−アセチルヘキソサミン＋ヘキソース（ＨｅｘＮＡＣ／Ｈｅｘ））。注目すべきことに、２つのシアル酸を有するＣｏｒｅ−１  Ｏ−グリカンは２つのピークで観測された。この理由はまだ明らかではないが、グリカン成分の間の結合の違いに関連している可能性がある。Ｎ＋Ｏ−グリカン分析で観測された結果は、脱シアリル化後のｒｈＣ１−ＩＮＨのペプチドマッピングからの観測結果と一致し、Ｏ−グリコシル化したと考えられる糖ペプチドをＨｅｘＮＡＣ／Ｈｅｘ修飾型として観測した。
【０２７３】
実施例８：ｒｈＣ１−ＩＮＨの構造分析
例示的なｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質の構造の特徴を、種々の生理化学的方法を用いて明らかにした。１次構造及び翻訳後修飾を、脱Ｎ−グリコシル化したｒｈＣ１−ＩＮＨのペプチドマッピングＬＣＭＳ、ＭＳ／ＭＳにより評価した。この方法により、野生型Ｃ１−ＩＮＨ（Ｅ１６５Ｑ）とは単一のアミノ酸が異なっている、予測されたアミノ酸配列が確認された。Ｏ結合型グリカンをこの方法により同定し、ＬＣに基づくグリカンマッピングによって別途確認した。
【０２７４】
さらなる方法をグリコシル化、シアリル化、及び全体の電荷分布を評価するために用いた。ｒｈＣ１−ＩＮＨグリカンは、主に複合Ｎ結合型グリカン、ならびにジシアリル化及びトリシアリル化したＣｏｒｅ−１  Ｏ結合型構造からなることが、遊離Ｎ−グリカン及びＯ−グリカンのグリカンマッピングから明らかになった。この分析は、潜在的な免疫原性のα−ガラクトース構造が存在しなかったことも示している。高レベルのＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）をシアル酸含有量アッセイで確認したが、これらのデータは観測されたグリカンプロファイル及びｐＩ分布と整合性がある。また、全炭水化物の評価がインタクト質量評価と合わせて行われ、分子における高程度のグリコシル化を示している。
【０２７５】
平均インタクト質量をＭＡＬＤＩ−ＭＳで測定し、その結果を未修飾のポリペプチドの理論的質量と比較した。理論的質量と測定質量の差は炭水化物含有量を表し、血漿由来Ｃ１エステラーゼインヒビターとの整合性が見られている。また、ｒｈＣ１−ＩＮＨの見掛けの分子量とサイズ分布とを、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥとサイズ排除クロマトグラフィーとで調べた。ｒｈＣ１−ＩＮＨの高次構造をＤＳＣで評価し、血漿由来Ｃ１エステラーゼインヒビターと比較できるように算出した。
【０２７６】
生物学的に適切な酵素アッセイを用いて、国際標準と対照してかつ初期発生参照標準に対して組換えＣ１−ＩＮＨの効力を評価し、組換え分子が十分機能的であることを示した。種々の方法がこれらの経路をモニタリングできることがわかった。これらの検討を積み上げることにより、１次構造を確認し、ならびに生物学的活性、グリコシル化プロファイル、翻訳後修飾、及び分子のさらなる高次構造について評価することで、ｒｈＣ１−ＩＮＨ構造を明らかにすることができた。さらに、これらの検討により、ｒｈＣ１−ＩＮＨは血漿由来Ｃ１−ＩＮＨとは異なるグリコシル化構造を有するが、ｒｈＣ１−ＩＮＨは意外にも、血漿由来Ｃ１−ＩＮＨと同様のまたはそれよりも良好な活性、及び同様のまたはそれよりも良好な薬物動態特性（例えば、半減期）を呈することが明らかになった。
【０２７７】
実施例９：組換えＣ１−インヒビターの機能的結合アッセイ
ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質の活性を、ＴＥＣＨＮＯＣＨＲＯＭ（登録商標）Ｃ１−ＩＮＨ試薬キット（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ社、オーストリア、ウィーン）などの発色診断キットを用いて評価することができる。市販の診断キットを、国際標準と対照してかつ参照標準に対してｒｈＣ１−ＩＮＨの効力を測定するために、完全曲線発色アッセイに改良した。
【０２７８】
例示的なｒｈＣ１−ＩＮＨの原薬ロットの効力は７．２Ｕ／ｍｇであると算出され、これは初期発生参照標準に対して１２１％の効力である。また、発色性Ｃ１エステラーゼ阻害アッセイを用いて、本明細書に記載の産生工程及び強制分解試験から採取された種々の試料におけるｒｈＣ１−ＩＮＨの効力を測定した。血漿由来Ｃ１−ＩＮＨは、中間点が約７Ｕ／ｍｇの特異的活性を有することが観測された。ｒｈＣ１−ＩＮＨの種々のロットの特異的活性は、７．１〜７．３Ｕ／ｍｇの範囲であった。ＣＩＮＲＹＺＥ（登録商標）と比較すると、ｒｈＣ１−ＩＮＨのロットの特異的活性値に有意な差は観測されなかった。
【０２７９】
実施例１０：組換えＣ１−インヒビターの製剤及び安定性
一実施形態では、１５０ｍＭのグリシンと、５０ｍＭのソルビトールと、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）との中に７０ｍｇ／ｍＬのｒｈＣ１−ＩＮＨを含有する水溶液を調製した。タンパク質濃度は、ｒｈＣ１−ＩＮＨの溶解性及び安定性プロファイルに基づき、最大の臨床用量を提供するように選択された。５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．１）は、温度ストレス下で安定性を持つことから選択された。１５０ｍＭのグリシン及び５０ｍＭのソルビトールは、至適なタンパク質安定性だけでなく、静脈内及び皮下投与用の適正な等張性も得られるように選択された。
【０２８０】
この例示的な製剤は、−６５℃以下での長期保管（少なくとも１２か月）向けに、かつ静脈内注射または皮下注射のいずれかによって非経口投与する臨床状況での使用向けに妥当であるｒｈＣ１−ＩＮＨの溶解性及び安定性を持つことが示された。この例示的な製剤はまた、構造的及び機能的（例えば、効力）分析によって立証されたように、室温で少なくとも１か月間安定であり、また２℃〜８℃で少なくとも６か月間安定であることもわかった。
【０２８１】
ｒｈＣ１−ＩＮＨ製剤をさらに精製して、２℃〜８℃及び２５℃での安定性を最適化した。この精製した製剤は、１５０ｍＭのグリシンと、５０ｍＭのソルビトールと、１５０ｍＭのアルギニンＨＣｌと、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）との中にｒｈＣ１−ＩＮＨを含有した。精製された例示的な製剤の凝集プロファイルを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により２℃〜８℃及び２５℃で３か月間モニタリングした。これらの保管条件でのＳＥＣデータから、精製された製剤では高分子量凝集体（ＨＭＷ）のレベルが有意に低いことがわかった。（図１３を参照）
【０２８２】
実施例１１：ｒｈＣ１−ＩＮＨのｉｎ  ｖｉｖｏ試験
ウサギに血漿由来Ｃ１−ＩＮＨまたはｒｈＣ１−ＩＮＨを注射した。ｒｈＣ１−ＩＮＨは、１０〜２０％の中性グリカン、約２６％のモノシアリル化グリカン、約３５％のジシアリル化グリカン、約１７％のトリシアリル化グリカン、及び約５％のテトラシアリル化グリカンというグリコシル化プロファイルを有していた。ウサギＰＫ試験の結果を図１３に示す。
【０２８３】
ＰＫデータの分析結果により、ｒｈＣ１−ＩＮＨの半減期は血漿由来Ｃ１−ＩＮＨと比べてわずかに増加していることがわかった。
【０２８４】
ｒｈＣ１−ＩＮＨの生物学的効力は、半減期及び多数の補完パラメータの比較によって評価されたように、血漿由来Ｃ１−ＩＮＨと同様であることが明らかになった。したがって、ｒｈＣ１−ＩＮＨは、血漿由来Ｃ１−ＩＮＨと同一または同様の量及び濃度で投与するのに適しており、また同じ症候の治療に用いるのに適している。
【０２８５】
実施例１２：前臨床安全性試験
１４日ラット毒性／ＴＫと１４日回復期間試験において、１５０ｍＭのグリシンと、５０ｍＭのソルビトールと、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）との中に７０ｍｇ／ｍＬのｒｈＣ１−ＩＮＨを含有する水溶液として製剤化されたｒｈＣ１−ＩＮＨを、ラットに５００Ｕ／ｋｇ／日、１０００Ｕ／ｋｇ／日、または２０００Ｕ／ｋｇ／日で投与した。各群は１０匹のラットを含んだ。全ての動物が生存した。ｒｈＣ１−ＩＮＨに関連して及ぼされる、体重、摂食量、または臨床病理学パラメータ（血液学、凝固、血清化学、及び尿分析）への影響はいずれも見られなかった。ｒｈＣ１−ＩＮＨに関連した眼科的所見、巨視的観察、臓器重量の変化、または組織学的変化はいずれも見られなかった。抗薬物抗体を検出したが、非中和性であり、曝露には影響を及ぼさなかった。無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は、評価した最大投与量である２０００Ｕ／ｋｇ／日であった。
【０２８６】
１４日非ヒト霊長類（ＮＨＰ）毒性／ＴＫと１４日回復期間試験において、１５０ｍＭのグリシンと、５０ｍＭのソルビトールと、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）との中に７０ｍｇ／ｍＬのｒｈＣ１−ＩＮＨを含有する水溶液として製剤化されたｒｈＣ１−ＩＮＨを、カニクイザルに２５０Ｕ／ｋｇ／日、５００Ｕ／ｋｇ／日、または１０００Ｕ／ｋｇ／日で投与した。各群は４匹のサルを含んだ。全ての動物が生存した。ｒｈＣ１−ＩＮＨに関連して及ぼされる体重または他の関連する臨床的観察への影響はいずれもなかった。ｒｈＣ１−ＩＮＨに関連した眼科的所見、心電図上所見、巨視的所見、もしくは微視的所見、または臓器重量の変化はいずれも見られなかった。
【０２８７】
まとめると、非臨床動物データは、記載のｒｈＣ１−ＩＮＨがヒトにおける評価に十分忍容性があり、安全であることを示している。
【０２８８】
実施例１３：混入物の低減
本実施例では、組換えヒトＣ１インヒビタータンパク質（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）を精製するための混入物（例えば、ＤＮＡ及び／または宿主細胞由来タンパク質）低減工程の開発について詳細に述べる。現行の下流プロセスの概要を図１４に示す。
【０２８９】
陰イオン交換膜吸収体（Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣ、及びＮａｔｒｉｘ）について、図１４に示した下流プロセスに付加的なＤＮＡクリアランスを付与することに関して評価した。陰イオン交換（ＡＥＸ）膜吸収体（Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ及びＳａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣ）が、ｒｈＣ１−ＩＮＨ下流プロセス（図１４を参照）の第３のクロマトグラフィー工程（すなわちＰＯＲＯＳ  ＸＳ（ＣＥＸ））後において、ＤＮＡ低減を含めた混入物低減のための好適なプロセス手段であることを示すデータを以下に提示する。以下詳細に示すように、ＣＨＯ  ＤＮＡを用いたＤＮＡスパイク試験に基づくと、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＱはＳａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣに比べて優れたプロセス収率を有した。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑは、９０％よりも高いプロセス収率と、４．１ｌｏｇよりも高いＤＮＡクリアランスとを有した。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＱとＳａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣの両方に対して測定された宿主細胞由来タンパク質クリアランスは最少（＜１ｌｏｇ）であった。
【０２９０】
一般的な材料、方法、及び装置
ＵＶ分光光度法によるタンパク質含有量の算出
馴化培地を含まない全試料のタンパク質濃度を、測定された２８０ｎｍでの吸収と、吸光係数ε２８０＝０．５１４ｍＬ／（ｍｇ×ｃｍ）とを用いて算出した。
ＴＭＥ−０４９９−０１（チャイニーズハムスター卵巣細胞タンパク質（ＣＨＯＰ）ＥＬＩＳＡ−第３世代）
【０２９１】
開発プロセスにおいて分析された試料にはＴＭＥ−０４９９が用いられ、該試料におけるＣＨＯ細胞タンパク質の量を算出した。この方法には、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社で製造された第３世代チャイニーズハムスター卵巣宿主細胞由来タンパク質キット（カタログ番号Ｆ５５０）を用いた。
【０２９２】
ＤＮＡ濃度
ＣＨＯのＤＮＡ分析をまずＰｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎにより行った。この方法は、超高感度蛍光核酸染色法である。ｄｓＤＮＡを含み得る試料をまず希釈して、使い捨てのキュベットでＴＥ緩衝液の最終容量を１．０ｍｌにする。実験試料の希釈を行って、特定の混入物（例えば、ＮａＣｌ）の干渉の影響を減らす。続いて、Ｑｕａｎｔ−ＩＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ試薬の１．０ｍｌ希釈標準水溶液をキュベットに加え、遮光しながら２〜５分間インキュベートする。試料の蛍光を分光蛍光光度計で標準フルオレセイン波長（励起波長：約４８０ｎｍ、発光波長：約５２０ｎｍ）にて測定する。未知試料のシグナルを、同時にアッセイしたｄｓＤＮＡ標準と比較することによって正確に定量する。また、ＣＨＯ  ＤＮＡ分析をｑＰＣＲによって行った。
【０２９３】
ＤＮＡ低減工程の開発
表９は、ｒｈＣ１−ＩＮＨ発生用のプロセス中間体及び最終バルクの既存のＤＮＡレベルを示す。データは、ＤＮＡレベルがプロセスでの最初のカラム工程の後に検出限界値未満であることを示した。しかしながら、最終バルクの濃度が７０ｇ／Ｌまでになると、全ての試験で測定できるＤＮＡレベルとなった。
【０２９４】
典型的な投与の量が７０ｍｇ／ｍｌのバルク原薬であることに基づいて、目標値は１４ｎｇ（ＤＮＡ）／ｍｇ未満であることが推奨される。
【表９】
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【０２９５】
３つの陰イオン交換（ＡＥＸ）吸収体について、混入物を低減させる能力、特に混入ＤＮＡを低減させる能力に関して評価した。評価した吸収体は、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ膜、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣ膜、及びＮａｔｒｉｘ膜であった。
【０２９６】
ＡＥＸ吸収体の適用に至適であるとして特定されたＰＯＲＯＳ  ＸＳ溶出物
ＰＯＲＯＳ  ＸＳ溶出物を、ＡＥＸ吸収体を適用するのに至適であるとして特定した。ＰＯＲＯＳ  ＸＳ溶出物は、ｒｈＣ１−ＩＮＨのｐＩが約２．７〜３．６と低いことを考慮すると、Ｇｉｇａｃａｐ  Ｑ溶出物に対するｐＨ７．５と比べてｐＨ６で、ＡＥＸ吸収体の負荷としてより好適であると考えられた。ＡＥＸ膜吸収体の理想形態は、負に帯電した混入物を結合させる一方で、ｒｈＣ１−ＩＮＨを装置を貫通させて流すものである。ｐＨが低い実行条件により、混入物を結合させつつ、タンパク質が膜に結合する可能性を減じた。導電性はＰＯＲＯＳ  ＸＳ溶出物を選択した別の理由である。高負荷導電率は一般的にＡＥＸ膜クロマトグラフィーに望ましくないが、これは、混入物の膜への親和性が減少するからである。ＰＯＲＯＳ  ＸＳ溶出物の導電率は、ＧｉｇａｃａｐＱ溶出物よりもわずかに低いのが通例であり、それ故にこの点からさらに好適である。さらに、ＧｉｇａｃａｐＱ溶出物は５０ｍＭのリン酸塩という二価の負に帯電した緩衝液で処理される。高いリン酸塩濃度条件は、その高イオン強度と複数の負電荷とが陰イオン交換クロマトグラフィーと干渉する可能性があるため、極めて悪い条件と考えられる。
【０２９７】
Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ膜、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣ膜、及びＮａｔｒｉｘ膜でのプロファイルの実行
Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ膜、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣ膜、及びＮａｔｒｉｘ膜に対してフロースルーモードでＡＥＸ吸収体工程を実施できるかどうかを判定するために、プロファイルを実行させた。
【０２９８】
オクチルフロースルーをこれらの実験に使用した。オクチルフロースルーを２０ｍＭのＢｉｓ  Ｔｒｉｓと３０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）に透析し、１ｇ／Ｌまで濃縮した。この低塩濃度条件を極めて悪い評価条件として用いて、ｒｈＣ１−ＩＮＨが低塩濃度条件下で結合するかどうかを判定した。イオン強度を上昇させていく段階的洗浄を用いて、結合したｒｈＣ１−ＩＮＨの遊離を促進させる条件を特定した。緩衝液混合物を用いて、段階的洗浄を行った。各吸収体を、単一膜を５００Ｌスケール規模で使用するのに要する最少負荷条件（例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ及びＳＴＩＣについては、５００Ｌスケールに対して１．６Ｌの大型サイズを仮定して２５０ｇ（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）／Ｌを超える膜）で試験した。
【０２９９】
クロマトグラム、正確な実行条件、及び収率を図１５に示す。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ及びＳａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣに関する結果によると、約１５０ｍＭ  ＮａＣｌ未満の塩濃度でＣ３６の結合が最小化することがわかった。ＰＯＲＯＳ  ＸＳクロマトグラフィー樹脂を３０〜３００ｍＭのＮａＣｌ塩グラジエントを有する２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓで溶出し、その溶出液はほぼ１５０ｍＭの塩濃度であると考えられる。これらの実験に基づき、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ及びＳａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣを、さらなる評価に好ましい候補として選択した。
【０３００】
対照的に、Ｎａｔｒｉｘ膜に対しては、産物の結合を１５０ｍＭをはるかに下回る塩濃度で観察した。このことから、Ｎａｔｒｉｘ膜をさらなる評価対象から削除した。
【０３０１】
Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣと比較した場合のＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑの高収率性
産物の試験を、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ吸収体とＳａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣ吸収体とを比較して行った。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＱとＳａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣとを、平衡状態かつ予想されるＰＯＲＯＳ  ＸＳ溶出条件に合わせた洗浄条件で評価した。ＡＥＸ膜吸収体は使い捨てになるように設計されているが、これらの実験に高導電性洗浄及びストリップを含めることで、低イオン強度で膜が保持した材料の定量を可能にしている。これらの産物試験の実験条件を以下の表１０に示す。
【表１０】
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【０３０２】
これらの実験結果のクロマトグラムを図１６に示す。これらの結果は、下記の表１１にまとめられている。
【表１１】
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【０３０３】
各クロマトグラムにおけるＡ２８０のトレースは、負荷段階の間にタンパク質がフィルタをどの程度十分に通過しているか、また、結合した物質が高導電性洗浄及びストリップの段階で遊離されるかどうかを示している。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑは、ＳＴＩＣに比べてわずかに高い収率を有し、これは、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ試験で洗浄２のピークが小さいことと、ストリップピークがないこととに対応している。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑは流れ特性に関してもロバスト性が高く、３５ｐｓｉ未満の導入口圧力で３０ＭＶ／分の高流量にて動作することができた。対照的に、ＳＴＩＣを３０ＭＶ／分で動作させた場合には９０ｐｓｉを超える圧力を観測した。これに対処するために、プロセス流量を５ＭＶ／分に低減させた。５ＭＶ／分の流量は、１．６Ｌの大型サイズの膜に対する８ＬＰＭに相当し、通例５００Ｌ規模に対するものである。８ＬＰＭという流量はプロセス時間を最少化するのに十分高く、簡易な蠕動ポンプを用いて達成可能である。しかしながら、低い流量での動作の改善にもかかわらず、ＳＴＩＣの収率は、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑよりも未だ低かった（９１％対９５％）。
【０３０４】
宿主細胞由来タンパク質の分析をＣＨＯＰ  ＥＬＩＳＡによりフロースループールで行った。理想的条件下では、ＡＥＸ膜は数ｌｏｇのＨＣＰクリアランスを付与すると予測されている。しかしながら、観測されたクリアランスは両方の膜で１ｌｏｇ未満であった。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣは、この装置の耐塩性特質を考慮すると、０．２ｌｏｇというわずかに良好なクリアランスを有した。両方の吸収体に対する不十分なＨＣＰクリアランスは、負荷材料の高い塩濃度条件か、または負荷材料の比較的高いＨＣＰ含有量（＞２０００ｎｇ／ｍｌ）に起因すると考えられる。
【０３０５】
これらのデータによると、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＱはＳａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣと比べてわずかに高い収率を有した（９５％対８２％〜９１％）が、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣはわずかに優れたＨＣＰクリアランスを示した（０．２１対０．１４）。ＳＴＩＣはまた、高流量での圧力上昇の影響を受けやすかった。製造上の利便性のため、かつ動作中の高い導入口圧力を回避するために、両方の吸収体には最大流量５ＭＶ／分が推奨される。
【０３０６】
Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣと比較した場合のＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑの有するＤＮＡクリアランス優位性
Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＱとＳａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣとを、平衡状態でかつ予想されるＰＯＲＯＳ  ＸＳ溶出条件に合わせた洗浄条件で評価した。これらの実験に高導電性洗浄及びストリップを再度含めることで、低イオン強度で膜が保持した材料の定量を可能にしている。
【０３０７】
Ｌａｍｂｄａ  ＤＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ社、品番：ＳＤ００１１、ロット番号：１３０４００３ＶＳ）を産物を含まない初期スパイク実験（すなわち、緩衝液ブランク試験）に用いて、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによって評価した。続いてスパイク試験を、ＣＨＯ  ＤＮＡ（Ｃｙｇｎｕｓ社、品番：Ｄ５５２、ロット番号：７１２１１Ａ、９．４μｇ／ｍＬ）と、以前の試験由来のｒｈＣ１−ＩＮＨ負荷材料とを用いて行った。これらの実験からの画分をｑＰＣＲで評価した。ＣＨＯ  ＤＮＡスパイク実験の実行条件を表１２に示す。
【表１２】
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【０３０８】
最初の試験を、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＱのＤＮＡクリアランス能力を判定する目的のためだけに緩衝液を用いて行った。負荷材料は、２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓと３０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）のうちの２０ｍＬに添加された３６０μＬのラムダＤＮＡストック（２９８ｎｇ／μＬ）からなっていた。負荷材料として得られたＤＮＡ濃度をＡ２６０で測定した結果、５．５ｎｇ／μｌ（ＤＮＡ）であった。数回の高導電率洗浄を負荷及び洗浄段階の後に行った（図１７を参照）。溶出画分を収集し、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによってＤＮＡ含有量を評価した。ｒｈＣ１−ＩＮＨタンパク質をこの実験から除外したが、これは、そのタンパク質がＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイと干渉するからである。この実験の目的は、この工程の予想される緩衝液条件で実現可能なＤＮＡクリアランスのレベルを推定することであった。非結合画分で測定したＤＮＡ量は０．８７４ｐｇであり、５．１ｌｏｇのクリアランスを示していた。ＤＮＡは膜に強力に結合していたが、これは続く高塩濃度洗浄でＤＮＡが検出不可能なレベルであったことにより裏付けられている。一部のＤＮＡ（負荷の２６％）は２ＭのＮａＣｌによるストリップでフィルタから遊離した。
【０３０９】
ＣＨＯ  ＤＮＡを用いたスパイク試験を、Ｑ膜及びＳＴＩＣ膜を使用して行った。９．４μｇ／ｍｌ濃度のＣＨＯ  ＤＮＡのうちの１ｍＬをＰＯＲＯＳ  ＸＳサイクル１溶出液の２５〜３０ｍＬに加えて、各実験の負荷材料として供給した。試料をｑＰＣＲを用いてＳｈｉｒｅ社でアッセイした。これらの実験の各々のクロマトグラムを図１８に示している。この結果により、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＱのＤＮＡのｌｏｇクリアランスが、無希釈負荷材料及び希釈負荷材料に対してそれぞれ４．１超及び３．７であることがわかった。希釈負荷材料はＤＮＡクリアランスの向上が期待できないと思われるが、希釈負荷実験はプロセス中に異常な圧力スパイク（図１８のパネルＢを参照）を受け、これによって低い結果になった可能性がある。これに対して、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣのクリアランスは２．５ｌｏｇであった。この最後の結果は、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣがＰＯＲＯＳ  ＸＳ溶出液の高い塩濃度条件で優位であると予測されていたことを考慮すると、意外な結果であった。前述した結果と符合して、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣの収率はＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑよりもわずかに低かった。これらの結果を以下の表１３にまとめている。これらのデータは、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑが収率及びＤＮＡクリアランスに関して優れた性能を有することを示している。
【表１３】
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【０３１０】
Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑの最大負荷試験
最大負荷でのＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑフィルタを評価するために実験を行った。これらの実験に対する実験計画を以下の表１４に示す。
【表１４】
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【０３１１】
これらの実験は、最大６０５ｇ／Ｌｍ（５００Ｌ規模に要する量の２倍）までの負荷に対して好ましい結果を示した。圧力増加は、この実験を通して極わずかであった。これらの実験のデータを表１５及び図１９に示す。
【表１５】
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【０３１２】
Ｇｉｇａｃａｐ  Ｑの後のＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ
ＧｉｇａｃａｐＱの後の膜の性能を評価するために、追加の実験を行った。
【０３１３】
実験計画とＣＨＯ  ＤＮＡスパイク実験の実行条件とを表１６に示す。
【表１６】
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【０３１４】
これらの結果は、Ｇｉｇａｃａｐ  Ｑ溶出液を用いたＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑについて低い収率を示した。図２０に示すクロマトグラムによると、何らかの結合が膜に生じていることもわかった。プロセス条件は、５０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）及び負荷導電率１７ｍＳであった。ｒｈＣ１−ＩＮＨの低いｐＩを考慮すると、高いｐＨで低い収率となる可能性がある。高いｐＨ条件でＨＣＰクリアランスに関して改善は見られなかったが、この結果はＨＣＰと同様のｐＩ値を有するウイルスに対するウイルスクリアランスを示唆し得る。
【０３１５】
結果の要約
要約すると、この実施例は、ｒｈＣ１−ＩＮＨ下流プロセスの新規なＤＮＡクリアランス工程を特定することを目的とした一連の実験について詳細に述べている。陰イオン交換クロマトグラフィーはＤＮＡクリアランス工程としての一選択肢であるが、これは、ＤＮＡの極めて低いｐＩにより、ほぼ全てのｐＨでＤＮＡが陰イオン交換リガンドに結合するためである。しかしながら、ｒｈＣ１−ＩＮＨの低いｐＩにより、ｒｈＣ１−ＩＮＨも陰イオン交換膜に結合する可能性もある。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣ、及びＮａｔｒｉｘのＡＥＸ膜吸収体の適正を、現行のｒｈＣ１−ＩＮＨプロセスの第２のカラム工程の後に評価した。Ｎａｔｒｉｘは、ｒｈＣ１−ＩＮＨがその膜に結合し、その結果、この膜に対して低収率になったことから、初期に検討から除外された。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ及びＳａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣをＤＮＡスパイク試験でさらに評価し、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑが、ＳＴＩＣと比較して優位な収率とＤＮＡクリアランスとを有することから選択された。さらなる実験によって、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑは、収率及びＤＮＡクリアランスに関して優れた性能を有することが示された。
【０３１６】
等価物及び範囲
当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または単なる日常的な実験方法を使用して確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることを意図せず、むしろ以下の特許請求の範囲に記述されるとおりである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ−Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８Ａ−Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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