(57)【要約】本発明は、内皮細胞特異的遺伝子発現を増強することができる核酸調節エレメント、これらの調節エレメントを用いる方法およびこれらのエレメントの使用に関する。これらの核酸調節エレメントを含む発現カセットおよびベクターも開示する。本発明は、遺伝子治療、さらに詳細には内皮細胞を標的とする遺伝子治療を使用する用途、およびワクチン接種の目的のために特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜３３、好ましくは配列番号２２からなる群から選択される配列、またはこれらの配列のいずれかに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、なお一層好ましくは少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、内皮細胞特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメント。
【請求項２】
最長で１０００ヌクレオチド、好ましくは最長で８００ヌクレオチド、さらに好ましくは最長で７００ヌクレオチド、最も好ましくは最長で６１０ヌクレオチドを有し、さらに前記調節エレメントを含む、請求項１に記載の核酸調節エレメント。
【請求項３】
配列番号１〜３３のいずれか１つ、好ましくは配列番号２２によって定義される配列の相補配列を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、または配列番号１〜３３のいずれか１つ、好ましくは配列番号２２によって定義される配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするための、内皮細胞における遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメント。
【請求項４】
核酸発現カセット、またはベクターにおける請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸調節エレメントの使用であって、さらに詳細には、前記核酸発現カセットまたはベクターの内皮細胞における遺伝子発現を増強するための、使用。
【請求項５】
プロモータに作動可能に連結された、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５またはそれ以上の請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸調節エレメントを含む核酸発現カセット。
【請求項６】
前記核酸調節エレメントがプロモータおよび導入遺伝子に作動可能に連結された、請求項５に記載の核酸発現カセット。
【請求項７】
前記プロモータが、ＩＦＩ２７、ＩＣＡＭ２、ＶＷＦ、ＥＤＮ１、ＥＮＧ、ＥＣＳＣＲ、ＣＤＨ５、ＰＥＣＡＭ１、ＨＨＩＰ、ＴＩＥ１およびＨＹＡＬ２からなる群から選択される前記遺伝子のいずれか１つの前記プロモータなどの内皮細胞特異的プロモータである、請求項５または６のいずれか１項に記載の核酸発現カセット。
【請求項８】
前記導入遺伝子が治療用タンパク質または免疫原性タンパク質をコードする、請求項５〜７のいずれか１項に記載の核酸発現カセット。
【請求項９】
前記導入遺伝子が、分泌可能なタンパク質または構造タンパク質、例えば肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）、凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）、凝固因子ＸＩ（ＦＸＩ）、組織因子（ＴＦ）、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＶＥＧＦ、ＰＬＧＦ、ＦＧＦ、ｓＦＬＴ１、α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ａｐｏＡ−Ｉ）、限定されるものではないがマトリックスメタロプロテイナーゼ−３（ＴＩＭＰ−３）を含むマトリックスメタロプロテイナーゼ、インスリン、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）、抗体、成長因子、および限定されるものではないが、例えば前記導入遺伝子、因子およびそれらの同族受容体に対する抗体または任意の分泌されたタンパク質もしくはウイルスタンパク質に対する抗体、低分子干渉ＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、エンドヌクレアーゼ、およびＣａｓ９をコードする、請求項５〜８のいずれか１項に記載の核酸発現カセット。
【請求項１０】
ポリアデニル化シグナル、好ましくは前記サルウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項５〜９のいずれか１項に記載の核酸発現カセット。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸調節エレメント、または請求項５〜１０のいずれか１項に記載の核酸発現カセットを含むベクター。
【請求項１２】
ウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、またはアデノウイルスベクターである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
非ウイルスベクター、好ましくはプラスミド、ミニサークル、エピソームベクター、またはトランスポゾン系ベクター、例えばＰｉｇｇｙＢａｃ系ベクターまたはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ系ベクターである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項５〜１０のいずれか１つに記載の核酸発現カセット、または請求項１１〜１３のいずれか１つに記載のベクター、および薬剤的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
薬物療法において使用するための、さらに好ましくは遺伝子治療で使用するための、特に内皮細胞機能障害、好ましくは、肝臓疾患、血友病Ａ、フォン・ヴィルブランド病、微小血管血栓症、血栓性血小板減少性紫斑病、末梢血管疾患、冠状動脈疾患、アテローム硬化性疾患、脳卒中、心臓疾患、糖尿病、インスリン抵抗性、慢性腎不全、腫瘍増殖、転移、静脈血栓症、虚血、腫瘍成長、腫瘍血管新生、がんおよびウイルス感染性疾患、例えばエボラ、デング熱およびデング出血熱を含む群から選択される疾患または障害のいずれか１つなどの治療で使用するための、請求項１〜３のいずれか１つに記載の核酸調節エレメント、請求項５〜１０のいずれか１つに記載の核酸発現カセット、請求項１１〜１３のいずれか１つに記載のベクター、または請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ワクチン、好ましくは予防ワクチンとして使用するため、もしくは免疫寛容誘導、ワクチン接種療法、好ましくは予防接種において使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸調節エレメント、請求項４〜１０のいずれか１項に記載の核酸発現カセット、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のベクター、または請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
内皮細胞において導入遺伝子産物を発現するための、好ましくはインビトロまたはエクスビボの方法であって：
請求項４〜１０のいずれか１つに記載の核酸発現カセット、または請求項１１〜１３のいずれか１つに記載のベクターであって、請求項１〜３のいずれか１つに記載の核酸調節エレメントを含むものを前記細胞に導入すること、および
前記細胞において前記導入遺伝子産物を発現すること
を含む、前記方法。
【請求項１８】
治療有効量の請求項４〜１０のいずれか１つに記載の核酸発現カセット、請求項１１〜１３のいずれか１つに記載のベクター、または請求項１４に記載の医薬組成物であって、各々が請求項１〜３のいずれか１つに記載の核酸調節エレメントを含むものを、それを必要とする対象に投与することを含む、内皮細胞関連疾患または障害を治療するための方法。
【請求項１９】
前記内皮細胞関連疾患または障害が、内皮細胞機能障害、好ましくは肝臓疾患、血友病Ａ、フォン・ヴィルブランド病、微小血管血栓症、血栓性血小板減少性紫斑病、末梢血管疾患、冠状動脈疾患、アテローム硬化性疾患、脳卒中、心臓疾患、糖尿病、インスリン抵
抗性、慢性腎不全、腫瘍増殖、転移、静脈血栓症、虚血、腫瘍成長、腫瘍血管新生、がんおよびウイルス感染性疾患、例えばエボラ、デングおよびデング出血熱からなる群から選択される前記疾患または障害のいずれか１つなどを含む群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の内皮特異的発現を増強することができる核酸調節エレメント、これらの調節エレメントを用いる方法およびその使用に関する。本発明はさらに、これらの調節エレメントを含む発現カセット、ベクターおよび医薬組成物を包含する。本発明は、遺伝子治療を用いる用途のため、そしてさらに詳細には内皮特異的遺伝子治療のため、そしてワクチン接種の目的のために特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
内皮細胞は、全ての血管の内側を覆う単細胞層を形成し、血流と周囲組織との間の交換を調節する。内皮細胞からのシグナルは、血管壁の周囲層を形成する結合組織細胞の成長および発達を組織する。新しい血管は、培養の中で単離された場合でも、中空の毛細管を形成する能力を有する内皮細胞の成長によって既存の小血管の壁から発生することができる。発達中の動脈および静脈の内皮細胞は異なる細胞表面タンパク質を発現し、毛細血管床を形成するためにそれらが結合する方法を制御し得る。（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ．  ４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）。恒常性維持機構は、身体のあらゆる領域に血管が広がることを保証する。酸素が不足している細胞は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の産生を刺激する、低酸素誘導因子１（ＨＩＦ−１）の濃度を増加させる。ＶＥＧＦは内皮細胞に作用して、内皮細胞を増殖させ、低酸素組織に侵入させて、新しい血管を供給する。（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ．４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）。
【０００３】
内皮細胞表現型は、異なる器官の間で、同じ器官内の血管ループの異なるセグメント間で、そして同じ器官および血管型の隣接する内皮細胞の間で異なる。構造の違いに加えて、内皮細胞は機能において顕著な多様性を示す。例えば、肝臓類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ）と呼ばれる肝臓中の内皮細胞は、肝臓毛細血管、すなわち類洞の連続した内層を形成し、実質細胞および脂肪摂取細胞を類洞血液から分離する。ＬＳＥＣは体内で独特の高度に特殊化した内皮細胞である。ＬＳＥＣは大きな血管の内側を覆う内皮細胞とは微細構造が異なり、また、明確な基底膜がなく、類洞壁を構成する細い細胞質突起に開放孔、すなわち窓も含む点で他の毛細血管内皮とは異なる。この独特の形態は、病原体に対する全般的な障壁を形成し、血液から実質細胞および脂肪摂取細胞へ、そしてその逆へと移行する物質の選択的篩として機能する細胞である、肝臓内皮によって果たされる保護的役割を支持する。類洞内皮細胞は、さらに、肝臓の代謝およびクリアランス機能に大いに関与する。それらは、糖タンパク質、リポタンパク質、細胞外マトリックス成分、および不活性コロイドをはじめとする広範の高分子のエンドサイトーシスおよび代謝に関与することが示されており、肝臓における細胞間相互作用および共同作用の複雑なネットワークで生体リンクとしての内皮細胞を確立する。
【０００４】
加えて、ＬＳＥＣは、肝臓損傷後の肝臓再生に貢献することが長年注目されている。正常な肝臓では、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の主要な細胞源は肝星細胞であるが、肝臓損傷後、ＨＧＦ発現は増殖するＬＳＥＣにおいて顕著に増加すると考えられてきた（ＤｅＬｅｖｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｉｖｅｒ  ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｊ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２０１３）。ＬＳＥＣの別の予期せぬ機能が最近報告され（Ｓｈａｈａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈｅｍｏｓｔ  ２０１４）、肝細胞ではなくＬＳＥＣが凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）を発現することを実証した。さらに、ＬＳＥＣを含む内皮細胞はフォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）も発現する。分泌されたＦＶＩＩＩは、ｖＷＦと結合しない限り、比較的不安定であることが知られている。内因性凝固経
路における補因子であるＦＶＩＩＩの欠損は、血友病Ａをもたらす。ＦＶＩＩＩ欠損イヌと血友病Ａの患者の両方での肝臓移植は、これらの障害を治す。肝臓はＦＶＩＩＩ産生の主要部位であることが知られているが、ＦＶＩＩＩ分泌の調節にとっては他の器官もおそらくは重要である。最近の研究で、肺内皮細胞がＦＶＩＩＩを合成できることが示されている。肺、心臓、腸、および皮膚由来の微小血管内皮細胞ならびに肺動脈由来の内皮細胞はＦＶＩＩＩを構成的に分泌し、そしてホルボールミリステートアセテートおよびエピネフリンでの処置後にＦＶＩＩＩを放出した。対照的に、大動脈、臍動脈および臍静脈由来の内皮細胞は、おそらくはＦＶＩＩＩ合成が欠如しているために、ＦＶＩＩＩを構成的に分泌しなかったか、またはアゴニストでの処置後にＦＶＩＩＩを放出しなかった。したがって、ある特定の血管床由来の肝外内皮細胞は、慢性および急性状態におけるＦＶＩＩＩ分泌を調節する潜在力を有する重要なＦＶＩＩＩ産生および保存部位であるようである（Ｓｈａｈａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ．  ２０１０  Ｊｕｎ  １０；１１５（２３）：４９０２−９）。加えて、ＬＳＥＣはまた、Ｎｏｔｃｈ経路を介して免疫抑制性ＩＬ−１０産生Ｔｈ１細胞を誘導することが報告され（Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１５  Ｊｕｌ；４５（７）：２００８−１６）、重要な免疫調節的役割が示唆される。したがって、ＬＳＥＣ機能障害は、複数の肝臓障害における重大な事象とみなされている。将来の研究は、肝臓血流力学の調節において、肝臓代謝および血液クリアランスにおいて、肝臓構造の維持において、様々な肝臓疾患の病因において、そして肝臓の老化過程においてのＬＳＥＣの役割をより完全に開示する可能性がある（Ｄｅ  Ｌｅｅｕｗ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃ  Ｔｅｃｈ．  １９９０  Ｍａｒ；１４（３）：２１８−３６）。
【０００５】
内皮は、病態生理学の一次決定因子として、または二次標的としてのいずれかで、多くの病態に関与する。特に、内皮細胞機能障害は、後天性、複合多因子、遺伝的または感染性疾患によって引き起こされ得る。場合によって、根底にある内皮細胞の欠陥は、生命を脅かす可能性があり、それに対する有効な治療法は現在のところ利用可能でない。血管内皮の機能障害は多くのヒト疾患の顕著な特徴である。内皮は、末梢血管疾患、脳卒中、心臓疾患、糖尿病、インスリン抵抗性、慢性腎不全、腫瘍増殖、転移、静脈血栓症、および重度のウイルス感染性疾患をはじめとする多種多様な疾患に直接関与する。その結果、内皮は治療標的として実質的に未だ利用されていない可能性を有する。特に、内皮細胞は、同族の治療遺伝子の頑強および／または持続的発現を可能にする遺伝子治療の魅力的な標的細胞である。
【０００６】
特に、内皮機能障害は、冠状動脈疾患および他のアテローム硬化性疾患に至る主要な病態生理学的メカニズムの１つである。アテローム性動脈硬化症は、脂質、炎症性細胞、および線維要素の蓄積を特徴とする進行性血管疾患である。西洋社会で、これは総死亡者の約５０％の根本的原因である。血管内皮細胞の機能障害または損傷はアテローム性動脈硬化症の発症に重要である。内皮は、トランスサイトーシスを調節でき、血栓症、炎症、血管緊張および血管リモデリングを調節する一酸化窒素（ＮＯ）などのエフェクター分子を生成できるので、血液と組織との間の選択的透過性バリアとして機能する。例えば、ＳＴＡＭＰ２の過剰発現は、糖尿病マウスにおけるアテローム性動脈硬化症を抑制し、粥腫を安定化させる。同様に、アテローム硬化性血管壁への体細胞遺伝子導入によるＡＢＣＧ１の過剰発現の結果、粥腫形態および組成の著しい改善ならびにインビボでの血管機能の改善がもたらされることが報告されている（Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｔ．  ２０１２  Ｊｕｎ  ５；  ７（２）：  ｅ１２．）。
【０００７】
内皮細胞はさらに、血管新生および脈管形成においても重要な役割を果たす。血管新生は既存の血管から新しい血管が生じる生理的過程である。これは、中胚葉細胞前駆体からの内皮細胞のデノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）形成である脈管形成とは異なる。血管新生および脈管形成は、成長及び発生における正常かつ必須の過程である。しかしながら、がん進行
の基本的なステップでもあり、がんの治療における血管新生または脈管形成阻害剤の使用を正当化する。反対に、血管新生および脈管形成を促進することは、ある特定の器官または組織への血液供給の減少に関連する虚血の治療に役立つ可能性がある。その結果、血管新生および／または脈管形成を促進または阻害する内皮細胞への遺伝子の送達は、それぞれ心血管疾患およびがんの治療の新しい展望を開く。これには、ＶＥＧＦ、ＰＬＧＦ、ＦＧＦ、ｓＦＬＴ１、これらの因子およびそれらの同族受容体、サイトカイン、ケモカインなどに対する抗体を含む過剰な治療遺伝子が含まれる。
【０００８】
さらに、内皮細胞は、各遺伝子における変異の結果として起こる遺伝障害において欠けている、または欠損している治療用タンパク質を発現するための遺伝子治療の有望な標的でもある。例えば、これには、ＦＶＩＩＩ、ｖＷＦまたはＡＤＡＭＴＳ１３（トロンボスポンジン１型モチーフ、メンバー１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）が含まれる。上述のように、血友病ＡはＦＶＩＩＩの欠乏に起因する。さらに、ｖＷＦの欠乏は、フォン・ヴィルブランド病（ＶＷＤ）に罹患している患者において出血性素因を引き起こす。反対に、ＡＤＡＭＴＳ１３の欠乏は、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）に特徴的な微小血管血栓症の発症に関連する。その結果、これらの遺伝疾患の有効な治療法を確立するために、内皮細胞におけるＦＶＩＩＩ、ｖＷＦまたはＡＤＡＭＴＳ１３の頑強な発現が必要とされる。加えて、血液との近接性を考慮すると、内皮細胞は、内皮細胞によって通常は発現されないが、血液中に直接分泌され得る他の治療用タンパク質を発現するために理想的に適している。これには、他の凝固因子（例えば、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩ因子など）、血清タンパク質（α１−アンチトリプシン、ＡＡＴ、抗体、成長因子など）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０００９】
そして、内皮細胞はウイルス感染においても重要な役割を果たす。例えば、エボラウイルスは、ヒトおよび非ヒト霊長類において致死率が高い出血熱症候群を引き起こす攻撃的な病原体である。ウイルスは微小血管内皮細胞に感染し、血管完全性を損なう。内皮細胞の感染はまた、細胞変性効果および内皮バリアへの損傷を誘発する。同様に、デングウイルスは血管内皮の漏出を引き起こし、その結果、デング出血熱やデングショック症候群が起こる。脈管構造の内皮細胞内層は、毛細血管透過性を調節し、内皮の流体バリア機能に影響を及ぼす免疫応答およびケモカイン応答によって変更される。ヒト内皮細胞はデングウイルスによる感染に対して感受性である。ヒト内皮細胞受容体に付着した後、デングウイルスは、ウイルス伝播およびウイルス血症を増大させる可能性を有する増殖性感染を引き起こす。これは、デングウイルスに感染した内皮細胞が、内皮のバリア機能を直接変更し、免疫細胞活性化の増強に貢献し、そしてデング熱病因において中心的役割を果たす免疫応答の潜在的な標的として機能する可能性を提供する。
【００１０】
したがって、内皮細胞における同族治療遺伝子の頑強な発現を可能にするために、遺伝子治療による有効な治療法を確立する必要がある。これには、関心対象の遺伝子を含む強力な発現カセットの開発が必要である。その結果、内皮における転写を実質的に増大させることができる頑強な核酸調節エレメントを同定する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
内皮細胞において頑強かつ特異的な発現を達成するために、本発明者らは、内皮特異的プロモータと組み合わせた場合に内皮細胞における転写を実質的に増大させることができるシス調節エレメント（ＣＲＥ）（ＥＣ−ＣＲＥまたはＥＣ−ＲＥとも呼ばれる）などの頑強な核酸調節エレメントを同定するためのコンピュータによる計算法を開発した。内皮特異的核酸調節エレメントはコンピュータで同定され、続いてインビトロにおいては細胞株で、インビボにおいてはマウスで確認した。
【００１２】
これらの核酸調節エレメントは、内皮細胞型に特異的な方法での遺伝子発現の調節に非常に重要である。それらは典型的には転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）モチーフのクラスターから構成される。ＴＦＢＳの種類および配置およびエピジェネティックな改変パターンは、遺伝子発現レベルおよび特異性に影響を及ぼす。従来のベクターデザイン法は、転写エンハンサーをプロモータと組み合わせて発現レベルを高める偶発的試行錯誤のアプローチに依拠していた。これは場合によって有効であり得るが、多くの場合は非生産的組み合わせをもたらし、その結果、関心対象の遺伝子の発現レベルはわずかしか増大しないかもしくは全く増大しない、および／または組織特異性が失われた。さらに、これらの従来法は、進化的に保存された調節モチーフを発現モジュールに含めることの重要性を考慮していなかった。内皮細胞において頑強かつ特異的な発現をもたらし得る核酸調節エレメントの開発は、内皮細胞機能障害に関連する障害の治療のための内皮細胞への安全かつ効率的な遺伝子送達を達成するために非常に有用である。
【００１３】
本発明者らは、コンピュータによる計算法（図１を参照）に依拠して、内皮細胞（本明細書中では「ＥＣ」と表示）において転写レベルで遺伝子発現を高める頑強な核酸調節エレメントを特定した。これには以下のコンピュータによる計算ステップが必要である：（１）内皮細胞からの発現データに基づいて高度かつ特異的に発現される内皮細胞特異的遺伝子を同定した；（２）選択された遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）の上流の配列を抽出するために公開されているデータベース（ＥＮＳＥＭＢＬ）を使用した。３）その後、ヒトゲノム中の転写開始部位を位置づけるために、これらの配列をＵＣＳＣゲノムブラウザデータベースに提出した。本明細書において核酸調節エレメントとして定義される、対応する内皮細胞核酸調節エレメントを抽出するために、配列を以下の基準に基づいて選択した：ａ）豊富なＴＦＢＳ含有量、ｂ）高ＤＮａｓｅ過敏性またはクロマチンアクセシビリティと関連するエピジェネティックなシグネチャー（すなわち、ヒストン改変）、およびｃ）高度に発現された内皮細胞特異的遺伝子に関連するＴＦＢＳの進化的に保存されたクラスター。
【００１４】
実験の節で示すように、本発明者らは、内皮細胞における遺伝子発現を特異的に増強する核酸調節エレメントを特定した。
【００１５】
内皮細胞調節エレメントを、その後インビボで検証し、効率的かつ組織特異的遺伝子発現を得る。よって、この方法は、治療効果を最大にしつつ、より低用量で、それ故より安全な量のベクターの使用を可能にする。
したがって、本発明は以下の態様を提供する：
【００１６】
態様１．配列番号１〜３３からなる群から選択される配列、またはこれらの配列のいずれかに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、なお一層好ましくは少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、内皮細胞特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメント。前記態様の好ましい実施形態において、内皮細胞特異的遺伝子発現を増強するための前記核酸調節エレメントは、配列番号２２の配列、またはこれらの配列のいずれかに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、なお一層好ましくは少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる。
【００１７】
態様２．最長で１０００ヌクレオチド、好ましくは最長で８００ヌクレオチド、さらに好ましくは最長で７００ヌクレオチド、最も好ましくは最長で６１０ヌクレオチドを有し、さらに配列番号１〜３３のいずれか１つにより定義される調節エレメントを含む、態様１に記載の核酸調節エレメント。
【００１８】
態様３．配列番号１〜３３のいずれか１つにより定義される配列の相補配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる内皮細胞における遺伝子発現を増強するため、あるいは配列番号１〜３３のいずれか１つにより定義される配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするための核酸調節エレメント。
【００１９】
態様４．核酸発現カセット、またはベクターにおける態様１〜３のいずれか１つに記載の核酸調節エレメントの使用であって、さらに詳細には、前記核酸発現カセットまたはベクターの内皮細胞における遺伝子発現を増強するための、使用。
【００２０】
態様５．プロモータに作動可能に連結された、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５またはそれ以上の態様１〜３のいずれか１つに記載の核酸調節エレメントを含む核酸発現カセット。
【００２１】
態様６．前記核酸調節エレメントがプロモータおよび導入遺伝子に作動可能に連結された、態様５に記載の核酸発現カセット。
【００２２】
態様７．前記プロモータが、例えばＩＦＩ２７、ＩＣＡＭ２、ＶＷＦ、ＥＤＮ１、ＥＮＧ、ＥＣＳＣＲ、ＣＤＨ５（血管内皮カドヘリンプロモータ、カドヘリン５タイプ２）、ＰＥＣＡＭ１、ＨＨＩＰ、ＴＩＥ１およびＨＹＡＬ２を含む群から選択される遺伝子のいずれか１つのプロモータなどの内皮細胞特異的プロモータである、態様５または６のいずれか１つに記載の核酸発現カセット。
【００２３】
態様８．前記導入遺伝子が治療用タンパク質または免疫原性タンパク質をコードする、態様５〜７のいずれか１つに記載の核酸発現カセット。
【００２４】
態様９．前記導入遺伝子が分泌可能なタンパク質または構造タンパク質をコードする、態様５〜８のいずれか１つに記載の核酸発現カセット。
【００２５】
態様１０．前記導入遺伝子が、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）、組織因子（ＴＦ）、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）、凝固因子ＸＩ（ＦＸＩ）、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＶＥＧＦ、ＰＬＧＦ、ＦＧＦ、ｓＦＬＴ１、α１−アンチトリプシン、ＡＡＴ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ａｐｏＡ−Ｉ）、限定されるものではないがマトリックスメタロプロテイナーゼ−３（ＴＩＭＰ−３）を含むマトリックスメタロプロテイナーゼ、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）、抗体、成長因子、サイトカイン、ケモカインおよび抗体、例えば限定されるものではないが、前記導入遺伝子、因子およびそれらの同族受容体のいずれか１つに対する抗体または任意の分泌されたタンパク質もしくはウイルスタンパク質に対する抗体、低分子干渉ＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、エンドヌクレアーゼ、およびＣａｓ９を含む群から選択される、態様８または９に記載の核酸発現カセット。
【００２６】
態様１１．ポリアデニル化シグナル、好ましくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナル、合成ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルをさらに含む、態様５〜１０のいずれか１つに記載の核酸発現カセット。
【００２７】
態様１２．態様１〜３のいずれか１つに記載の核酸調節エレメント、または態様５〜１１のいずれか１つに記載の核酸発現カセットを含むベクター。
【００２８】
態様１３．ウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクター（ＬＶ）、アデノ随
伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、またはアデノウイルスベクター（ＡＶ）である、態様１２に記載のベクター。前記態様の具体例において、ベクターは、自己不活性化または非自己不活性化レンチウイルスベクター、好ましくは自己不活性化レンチウイルスベクターである。
【００２９】
具体例において、ＬＶは以下の成分：ＥＣ−ＣＲＥ−ＰＭ−ＴＧを有し、ＥＣ−ＣＲＥは、配列番号１〜３３で定義される新たに同定された調節配列のうちの１つであり、ＰＭは、限定されるものではないが態様７で記載されるものなどの内皮細胞特異的プロモータであり、そしてＴＧは、限定されるものではないが、本明細書中で特定される導入遺伝子、特に態様１０で定義されるものなどの導入遺伝子である。
【００３０】
内皮細胞特異的プロモータＩＣＡＭ２の例を挙げ、自己不活性化レンチウイルスベクター骨格ｐＣＤＨを使用する場合、ベクターは以下のものであり得る：
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＣＤＨ５−ＥＣ−ＣＲＥ１ａ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ、
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＣＤＨ５−ＥＣ−ＣＲＥ１ｂ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ、
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＣＤＨ５−ＥＣ−ＣＲＥ１ｃ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ、
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＣＤＨ５−ＥＣ−ＣＲＥ１ｄ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ、
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＣＤＨ５−ＥＣ−ＣＲＥ１ｅ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ、
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＨＹＡＬ２−ＥＣ−ＣＲＥ１ｆ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ、
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＥＣＳＣＲ−ＥＣ−ＣＲＥ１ａ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ、
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＥＣＳＣＲ−ＥＣ−ＣＲＥ１ｂ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ、
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＥＤＮ１−ＥＣ−ＣＲＥ１ａ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ、
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＥＮＧ−ＥＣ−ＣＲＥ１ａ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ、
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＥＮＧ−ＥＣ−ＣＲＥ１ｂ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ、
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＥＮＧ−ＥＣ−ＣＲＥ１ｃ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ、
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＨＨＩＰ−ＥＣ−ＣＲＥ１ａ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ、
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＨＨＩＰ−ＥＣ−ＣＲＥ１ｂ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ、
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＨＹＡＬ２−ＥＣ−ＣＲＥ１ａ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ、
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＨＹＡＬ２−ＥＣ−ＣＲＥ１ｂ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ、
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＨＹＡＬ２−ＥＣ−ＣＲＥ１ｃ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ、
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＩＣＡＭ２−ＥＣ−ＣＲＥ１ａ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ、
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＩＣＡＭ２
−ＥＣ−ＣＲＥ１ｂ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ、
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＩＣＡＭ２−ＥＣ−ＣＲＥ１ｃ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ、
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＩＦＩ２７−ＥＣ−ＣＲＥ１ａ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ、
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＩＦＩ２７−ＥＣ−ＣＲＥ１ｂ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ、
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＰＥＣＡＭ１−ＥＣ−ＣＲＥ１ａ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ、
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＴＩＥ１−ＥＣ−ＣＲＥ１ａ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ、
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＴＩＥ１−ＥＣ−ＣＲＥ１ｂ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ、
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＶＷＦ−ＥＣ−ＣＲＥ１ａ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ、または
例えば、ＴＧが態様１０で特定されるもののいずれか１つである、ｐＣＤＨ−ＶＷＦ−ＥＣ−ＣＲＥ１ｂ−ＩＣＡＭ２−ＴＧ。
【００３１】
前記ＶＬ構築物のいずれか１つにおいて、ＩＣＡＭ２−プロモータは、限定されるものではないが、態様７で例示されているものなどの別の内皮細胞特異的プロモータで置換することができる。前記ＶＬ構築物のいずれか１つにおいて、ベクター骨格は、当業者に公知のものなどの別の好適な骨格で置換することができる。
【００３２】
態様１４．非ウイルスベクター、好ましくはプラスミド、ミニサークル、エピソームベクター、またはトランスポゾン系ベクター、例えばＰｉｇｇｙＢａｃ系ベクターまたはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ系ベクターである、態様１２に記載のベクター。
【００３３】
態様１５．態様５〜１１のいずれか１つに記載の核酸発現カセット、または態様１２〜１４のいずれか１つに記載のベクター、および薬剤的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【００３４】
態様１６．薬物療法において使用するための、さらに好ましくは遺伝子治療で使用するための、特に内皮細胞機能障害、好ましくは、肝臓疾患、血友病Ａ、フォン・ヴィルブランド病、微小血管血栓症、血栓性血小板減少性紫斑病、末梢血管疾患、冠状動脈疾患、アテローム硬化性疾患、脳卒中、心臓疾患、糖尿病、インスリン抵抗性、慢性腎不全、腫瘍増殖、転移、静脈血栓症、虚血、腫瘍成長、腫瘍血管新生、がんおよびウイルス感染性疾患、例えばエボラ、デングおよびデング出血熱を含む群から選択される疾患または障害のいずれか１つなどの治療で使用するための、態様１〜３のいずれか１つに記載の核酸調節エレメント、態様５〜１１のいずれか１つに記載の核酸発現カセット、態様１２〜１４のいずれか１つに記載のベクター、または態様１５に記載の医薬組成物。
【００３５】
態様１７．ワクチン、好ましくは予防ワクチンとして使用するため、またはワクチン接種療法、好ましくは予防接種において使用するための、態様１〜３のいずれか１つに記載の核酸調節エレメント、態様４〜１１のいずれか１つに記載の核酸発現カセット、態様１２〜１４のいずれか１つに記載のベクター、または態様１５に記載の医薬組成物。あるいは、態様１〜３のいずれか１つに記載の核酸調節エレメント、態様４〜１１のいずれか１つに記載の核酸発現カセット、態様１２〜１４のいずれか１つに記載のベクター、または態様１５に記載の医薬組成物は、導入遺伝子に対する免疫寛容の誘導で使用するためのものであり得る。
【００３６】
態様１８．内皮細胞において導入遺伝子産物を発現するための方法、好ましくはインビボの方法であって：
・態様４〜１１のいずれか１つに記載の核酸発現カセット、または態様１２〜１４のいずれか１つに記載のベクターであって、態様１〜３のいずれか１つに記載の核酸調節エレメントを含むものを、前記細胞に導入すること、
を含む、前記方法。
【００３７】
態様１９．内皮細胞において導入遺伝子産物を発現するための方法、好ましくはインビトロまたはエクスビボの方法であって：
・態様４〜１１のいずれか１つに記載の核酸発現カセット、または態様１２〜１４のいずれか１つに記載のベクターであって、態様１〜３のいずれか１つに記載の核酸調節エレメントを含むものを、前記細胞に導入し、そして
・前記細胞において前記導入遺伝子産物を発現すること
を含む、前記方法。
【００３８】
態様２０．治療有効量の態様５〜１１のいずれか１つに記載の核酸発現カセット、態様１２〜１４のいずれか１つに記載のベクター、または態様１５に記載の医薬組成物であって、各々が態様１〜３のいずれか１つに記載の核酸調節エレメントを含むものを、それを必要とする対象に投与することを含む、内皮細胞関連疾患または障害を治療するための方法。
【００３９】
態様２１．前記内皮細胞関連疾患または障害が、内皮細胞機能障害、好ましくは、肝臓疾患、血友病Ａ、フォン・ヴィルブランド病、微小血管血栓症、血栓性血小板減少性紫斑病、末梢血管疾患、冠状動脈疾患、アテローム硬化性疾患、脳卒中、心臓疾患、糖尿病、インスリン抵抗性、慢性腎不全、腫瘍増殖、転移、静脈血栓症、虚血、腫瘍成長、腫瘍血管新生、がんおよびウイルス感染性疾患、例えばエボラデングおよびデング出血熱を含む群から選択される疾患または障害のうちのいずれか１つなどを含む群から選択される、態様２０に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】内皮特異的ＣＲＥの選択法  実験の節（実施例１）で示すように、本発明者らは内皮細胞における遺伝子発現を特異的に増強する核酸調節エレメントを特定した。内皮特異的調節エレメントを次にマウスにおいてインビトロおよびインビボアッセイで検証した。インビトロおよびインビボ検証の詳細は、下記実施例２〜６に記載する。したがって、内皮ＣＲＥの効果的な使用によって、治療効果を最大にしつつ、より少量で、したがってより安全なベクター量の使用が可能になる。
【図２】レンチウイルスベクターデザイン  レンチウイルスベクターを以前に記載されているようにして産生した（ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ２００２）。手短に言うと、レンチウイルスベクターを含むプラスミドをＶＳＶ−Ｇ発現プラスミド、ｇａｇ−ｐｏｌおよびＲｅｖ発現プラスミドと同時形質移入した。１０％熱非働化させたウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたＨＥＫ２９３Ｔ（２９３Ｔ）細胞の一過性の同時形質移入によってレンチウイルスを産生した。合計６０μｇのレンチウイルスプラスミドを１つのダブルトレイ培養チャンバーの形質移入のために使用した：６０μｇのレンチウイルスプラスミド、３０μｇのｐＲＳＶ−ＲＥＶ、３０μｇのｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥおよび３０μｇのｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ。プラスミドをリン酸カルシウム（リン酸カルシウム形質移入キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３０分間室温にてあらかじめ複合体化した。形質移入培地を細胞に１６時間添加し、次いでＮＵ−血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および酪酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を含む新鮮な培地と置換した。ウイルス上清を形質移入後４８時間および７２時間で収集し、そしてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した（４℃で１時間２０００ｒｐｍ）。ウイルスのアリコートを−８０℃で保存した。全てのＬＶの１マイクロリットルあたりの物理的力価（ナノグラム）は、製造業者の指示にしたがってｐ２４比色酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて決定した。次にこの値を使用して、１ミリリットルあたりの形質導入単位（ＴＵ）で表した予想されるベクター力価当量を算出した。ポリブレン（８μｇ／ｍＬ）を濃縮ベクターに添加して、形質導入を増強した。
【図３Ａ】形質導入後７２時間の時点でのＬＶ  ＣＭＶ−ＧＦＰベクター（ＭＯＩ５０）で形質導入されたＨＵＶＥＣおよびＬＳＥＣのフローサイトメトリー分析。
【図３Ｂ】図３Ａの続き。
【図４】異なるレンチウイルスベクターデザインで形質導入されたＨＵＶＥＣおよびＬＳＥＣＳにおけるＦＶＩＩＩ抗原発現（ｎｇ／ｍｌで表す）。ＦＶＩＩＩ抗原発現レベルを形質導入の２４、４８および７２時間後で測定した。
【図５】ＨＵＶＥＣにおける各ＥＣ−ＣＲＥ−ＩＣＡＭ２−ＦＶＩＩＩ構築物のＦＶＩＩＩ発現レベル。ＥＣ−ＣＲＥのないＩＣＡＭ２構築物と比較したパーセンテージ。発現値は平均と平均の標準誤差（ＳＥＭ；各群についてｎ＝３）として表した。
【図６】レンチウイルスインビボ形質導入後のＦＶＩＩＩ発現。ＦＶＩＩＩタンパク質発現は、レンチウイルスベクター注入の５週間後に集めた血漿サンプルに関してヒトＦＶＩＩＩ特異的ＥＬＩＳＡを使用して決定した。マウスコホート（１コホートあたりｎ＝４匹のマウス）には、ＩＣＡＭ２−ＦＶＩＩＩ（無ＣＲＥ対照）、ＨＹＡＬ２−ＥＣ−ＣＲＥ１ａ−ＩＣＡＭ２−ＦＶＩＩＩ、ＨＹＡＬ２−ＥＣ−ＣＲＥ１ｂ−ＩＣＡＭ２−ＦＶＩＩＩおよびＩＦＩ２７−ＥＣ−ＣＲＥ１ｂ−ＩＣＡＭ２−ＦＶＩＩＩが含まれていた。
【図７】肝臓および脾臓から単離されたＣＤ１４６陽性内皮細胞のｍＲＮＡ分析。レンチウイルスベクターによってコードされたヒトＦＶＩＩＩ発現を内因性マウスＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した。
【図８Ａ】レンチウイルスベクターのプラスミドマップ  全ての内皮ＣＲＥを、マップで示される、ｐＣＤＨと呼ばれる自己不活性化レンチウイルスベクターでクローニングした。Ａ：ｐＣＤＨ−ＨＹＡＬ２−ＥＣ−ＣＲＥ１ａ−ＩＣＡＭ２−ＦＶＩＩＩ（配列番号５０）；Ｂ：ｐＣＤＨ−ＩＣＡＭ２−ＦＶＩＩＩ（配列番号４９）；Ｃ：ｐＣＤＨ−ＩＦＩ２７−ＥＣ−ＣＲＥ１ｂ−ＩＣＡＭ２−ＦＶＩＩＩ（配列番号５２）；Ｄ：ｐＣＤＨ−ＨＹＡＬ２−ＥＣ−ＣＲＥ１ｂ−ＩＣＡＭ２−ＦＶＩＩＩ（配列番号５１）。
【図８Ｂ】図８Ａの続き。
【図８Ｃ】図８Ｂの続き。
【図８Ｄ】図８Ｃの続き。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
一般的定義
本明細書中で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明確に指示がない限り、単数および複数両方の指示対象を含む。
【００４２】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓおよびｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」という用語は本明細書中で用いられる場合、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ、ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であり、包括的または無制限であり、列挙されていない更なるメンバー、要素または方法ステップを除外するものではない。これらの用語は、特許用語において充分に確立された意味を享受する、「〜からなる（（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」も包含する。
【００４３】
終点による数値範囲の記載は、それぞれの範囲内に含まれるすべての数値および分数、ならびに記載された終点を含む。
【００４４】
本明細書中で使用する場合、「約」または「およそ」という用語は、例えばパラメータ、量、一時的な期間などの測定可能な値について言及する際、特定された値の変動および特定された値からの変動、例えば＋／−１０％以下、好ましくは＋／−５％以下、さらに好ましくは＋／−１％以下、なお一層好ましくは＋／−０．１％以下および特定の値からの＋／−０．１％以下の特定された値の変動または特定された値からの変動を包含することを意味し、ただし、そのような変動は、開示された発明で実施するために適切である場合に限る。修飾語「約」が言及する値は、それ自体も、具体的かつ好ましく開示されていると理解されるべきである。
【００４５】
「１もしくはそれ以上」または「少なくとも１つ」という用語、例えば、メンバーの群の１つもしくはそれ以上のメンバーまたは少なくとも１つのメンバーは、それ自体明白であるが、さらなる例示として、この用語は、とりわけ、前記メンバーのいずれか１つ、または前記メンバーのいずれか２つもしくはそれ以上、例えば、前記メンバーの任意の３以上、４以上、５以上、６以上または７以上など、そして最大前記メンバーの全部についての言及を包含する。別の例では、「１つもしくはそれ以上」または「少なくとも１つ」は、１、２、３、４、５、６、７またはそれ以上を指す可能性がある。
【００４６】
本明細書中での発明の背景の議論は、本発明の文脈を説明するために含まれる。これは、言及される資料のいずれかが、クレームのいずれかの優先日の時点で、いずれの国においても、公開されていた、知られていた、または一般常識の一部であったことを認めるものと解釈されるべきではない。
【００４７】
本開示全体にわたって、様々な刊行物、特許および公開された特許明細書が特定する引用によって参照される。本明細書中で引用するすべての文献は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。特に、本明細書中で具体的に言及されるそのような文献の教示または節は、参照により組み込まれる。
【００４８】
特に定義しない限り、本発明の開示で使用する、技術用語および科学用語を含むすべての用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらなる指針として、本発明の教示をよりよく理解するために用語の定義を含める。特定の用語が本発明の特定の態様または本発明の特定の実施形態に関連して定義される場合、他に定義されない限り、そのような含意は本明細書全体にわたって、すなわち、本発明の他の態様または実施形態の文脈においても適用されることを意図する。
【００４９】
以下の節で、本発明の様々な態様または実施形態をさらに詳細に定義する。明確に反対の指示がない限り、そのように定義された各々の態様または実施形態を任意の他の態様または実施形態と組み合わせることができる。特に、好ましいかまたは有利であるとして示されている任意の特徴は、好ましいかまたは有利であるとして示されている任意の他の１つもしくは複数の特徴と組み合わせることができる。
【００５０】
本明細書全体にわたる「１つの実施形態」、「一実施形態」という言及は、その実施形態に関連して記載されている特定の特徴、構造または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたって様々な箇所での「１つの実施形態において」または「一実施形態において」という表現の出現は、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らないが、指す場合もある。さらに、特定の特徴、構造または特性は、本開示から当業者には明らかなように、１つもしくはそれ以上の実施形態では任意の好適な方法でブレンドすることができる。さらに、当業者には理解されるように、本明細書中で記載するいくつかの実施形態は他の実施形態に含まれるある特徴を含むが、他の特徴は含まない一方で、異なる実施形態の特徴の組み合わせは、本発明の範囲内に
含まれ、そして異なる実施形態を形成することを意味する。例えば、添付の特許請求の範囲において、請求された実施形態のいずれも任意の組み合わせで使用することができる。
【００５１】
本発明に関連する一般的方法については、なかでも例えば“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．”（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９），“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）をはじめとする周知のテキストが参照される。
【００５２】
一態様では、本発明は、配列番号１〜３３からなる群から選択される配列、これらの配列のいずれかに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、なお一層好ましくは少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列、または配列番号１〜３３からなる群から選択される配列の機能的フラグメントを含むか、それから本質的になる（すなわち、調節エレメントは、例えば、クローニング目的で使用される配列をさらに含んでもよいが、表示された配列が調節エレメントの不可欠な部分を構成し、例えば、それらはプロモータなどのさらに大きな調節領域の一部を形成しない）か、またはそれからなる、内皮細胞または組織における遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントに関する。
【００５３】
下記表２および３は、内皮細胞または組織における遺伝子発現を増強するための異なる核酸調節エレメントのコアヌクレオチド配列を示す。表１は対応する遺伝子および長さを列挙している。
【００５４】
「核酸調節エレメント」、「シス作用調節エレメント」、「ＣＲＥ」または「調節エレメント」は、本明細書中で用いられる場合、遺伝子の転写、特に遺伝子の組織特異的転写を調節および／または制御することができる転写制御エレメント、特に非コーディングシス作用転写制御エレメントを指す。調節エレメントは、少なくとも１つの転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）、さらに詳細には組織特異的転写因子の少なくとも１つの結合部位、最も詳細には内皮細胞特異的転写因子の少なくとも１つの結合部位を含む。典型的には、本明細書中で用いられる調節エレメントは、調節エレメントなしでプロモータ単独からの遺伝子の転写と比較した場合、プロモータに駆動される遺伝子発現を増加または増強する。したがって、調節エレメントは特にエンハンサー配列を含むが、転写を増強する調節エレメントは典型的なはるか上流のエンハンサー配列に限定されず、それらが調節する遺伝子の任意の距離で起こり得ると理解すべきである。実際に、転写を調節する配列は、それらがインビボで調節する遺伝子の上流（例えば、プロモータ領域中）または下流（例えば、３’ＵＴＲ中）のいずれかに位置してもよく、遺伝子のすぐ近傍またはさらに遠くに位置していてもよいことは、当該技術分野では公知である。注目すべきは、本明細書中で開示される調節エレメントは典型的には天然に存在する配列を含むが、そのような調節エレメント（の一部）の組み合わせまたは調節エレメントのいくつかのコピー、すなわち非自然発生の配列を含む調節エレメントは、それ自体も調節エレメントとして想定される。本明細書中で用いられる調節エレメントは、転写制御に関与するさらに大きな配列の一部、例えばプロモータ配列の一部を含み得る。しかしながら、調節エレメント単独では、典型的には転写を開始するために充分ではなく、この目的のためにプロモータが必要である。本明細書中で開示される調節エレメントは、核酸分子、すなわち単離された核酸、または単離された核酸分子として提供される。したがって、前記核酸調節エレメントは、天然に存在するゲノム配列のほんの一部に過ぎず、したがってそのようなものとして天然に存在しないが、そこから単離される配列を有する。
【００５５】
「核酸」という語は、本明細書中で用いられる場合、典型的には、本質的にヌクレオチドから構成される任意の長さのオリゴマーまたはポリマー（好ましくは直鎖上ポリマー）
を指す。ヌクレオチド単位は、通常、ヘテロ環式塩基、糖基、および少なくとも１つ、例えば１、２、または３個の、改変もしくは置換されたホスフェート基を含むホスフェート基を含む。ヘテロ環式塩基は、とりわけプリンおよびピリミジン塩基、例えば天然に存在する核酸中に存在するアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）、他の天然に存在する塩基（例えば、キサンチン、イノシン、ヒポキサンチン）ならびに化学的もしくは生化学的に改変された（例えば、メチル化された）、非天然もしくは誘導体化された塩基を含み得る。糖基は、とりわけペントース（ペントフラノース）基、例えば好ましくは天然に存在する核酸に共通するリボースおよび／または２−デオキシリボース、またはアラビノース、２−デオキシアラビノース、トレオースもしくはヘキソース糖基、ならびに改変もしくは置換された糖基を含み得る。本明細書中で意図する核酸は、天然に存在するヌクレオチド、改変ヌクレオチドまたはそれらの混合物を含み得る。改変ヌクレオチドは、改変ヘテロ環式塩基、改変糖部分、改変ホスフェート基またはそれらの組み合わせを含み得る。ホスフェート基または糖の改変を導入して、安定性、酵素分解に対する耐性、またはいくつかの他の有用な特性を改善することができる。「核酸」という用語は、さらに好ましくは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび、特にｈｎＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、増幅産物、オリゴヌクレオチド、および合成（例えば、化学的に合成された）ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含むＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子を包含する。核酸は、天然に存在するものであり得、例えば、自然界に存在し得るかもしくは自然界から単離することができる；あるいは天然に存在しない可能性があり、例えば、組換え型であり得、すなわち組換えＤＮＡ技術によって産生することができる、および／または部分的もしくは全体的に、化学的もしくは生化学的に合成することができる。「核酸」は、二本鎖、部分的二本鎖、または一本鎖であり得る。一本鎖である場合、核酸はセンス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。加えて、核酸は環状または直鎖状であり得る。
【００５６】
本明細書中で使用する場合、「転写因子結合部位」、「転写因子結合配列」または「ＴＦＢＳ」は、転写因子が結合する核酸領域の配列を指す。ＴＦＢＳの非限定的例としては：ＰＯＬＲ２Ａ、Ｐｏｌ２（ｂ）、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ−２、ＦＯＳ、ｃ−Ｆｏｓ、ＮＲ３Ｃ１、Ｆｒｅａｃ−２、ＭＡＸ、ＦＯＸ２Ｐ、ＭＹＣ、ＳＲＹ、ＳＯＸ９、ＳＲＦ、ＪＵＮ、ＴＥＡＤ４、ＥＺＨ２、ＴＢＰ、ＴＣＦ７Ｌ２、ＳＰＩ１、ＲＥＬＡ、ＪＵＮＤ、ＭＸＩ１、ＪＵＮＢ、ＢＨＬＨＥ４０、ＲＣＯＲ１、ＴＣＦ１２、ＴＡＬ１、ＥＰ３００、ＨＤＡＣ２、ＧＴＦ２Ｆ１、ＳＩＮ３ＡＫ２０、ＦＯＳＬ２、ＥＴＳ１、ＣＴＢＰ２、ＧＡＴＡ３、ＣＥＢＰＢ、ＦＯＸＡ１、ＹＹ１、ＲＦＸ５、ＴＡＦ１、ＲＥＳＴ、ＥＬＦ１、ＣＴＣＦ、ＳＭＣ３、ＦＯＸＰ２、ＲＵＮＸ３、ＮＲＦ１、ＨＤＡＣ６、ＩＲＦ４、ＰＡＸ５、ＲＡＤ２１、ＷＲＮＩＰ１、ＥＲアルファ＿ａ、ＰＵ．１、ＴＣＦ４、ＴＡＬ１、ＨＤＡＣ２、ＧＡＴＡ３、Ｍｘｉ１、ＧＴＦ２Ｆ１、ＥＬＦ１、ＮＲＳＦ、ＣＴＣＦ、ＳＭＣ３、Ｉｎｉ１、ＩＲＦ４、ＰＡＸ５、ＣＴＣＦ、Ｐｏｌ２−４Ｈ８、ＹＹ１、ＣＴＣＦ、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＪ２、ＧＡＴＡ−Ｘ、Ｇｆｉ−１、Ｈａｎｄ１／Ｅ４７、ＭＡＺ、ＵＳＦ１、ＲＥＳＴ、ＴＦＡＰ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＣＨＤ２、ＺＮＦ２７４、ＢＡＣＨ１、ＥＢＦ、ＥＢＦ１、ＡＴＦ２：ｃ−Ｊｕｎ、ＣＲＥＢ１、ＡＴＦ、Ｔａｘ／ＣＲＥＢ、ＣＲＥＢ１、ＥＧＲ１、ＮＦ−カッパＢ、ｃ−Ｒｅｌ、Ｐａｘ−３、ＦＯＸＯ４、ＳＯＸ５、ＧＲ、ＺＮＦ２６３、Ｌｍｏ２複合体、ＡＰ−４、ＨＥＮ１、Ｅ２Ｆ６、ＰＭＬ、ＴＲＩＭ２８、ＳＭＡＲＣＡ４、ＲＢＢＰ５、ＮＲＦ２Ｆ、ＴＢＬ１ＸＲ１、ＳＴＡＴ５Ａ、ＭＡＦＦ、ＲＥＳＴ、ＪＵＮＤ、ＩＲＦ１、ＭＡＦＫ、ｅＧＦＰ−ＪｕｎＤＡＴＦ１、ＡＲＩＤ３Ａ、ＡＴＦ３、Ｅ２Ｆ６、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ−１、Ｂｒｇ１、ＴＡＬ１、ＪｕｎＢ、ＮＲ２Ｆ２、ＨＤＡＣ８、ＢＣＬ３、ＡＴＦ２、ＣＢＸ３、ＨＮＦ４、ＦＯＸＡ２、ＫＡＰ１、ＵＢＴＦ、ＧＡＢＰ、ＧＡＢＰＡ、ＢＣＬＡＦ１、ＳＰ１、ＦＯＸＭ１、ＭＥＦ２Ａ、ＺＮＦ１４３、ＺＢＴＢ７Ａ、ＮＡＮＯＧ、ＣＴＣＦＬ、ＮＦＫＢ、ＣＣＮＴ２、ＥＢＦ１、ＦＯＸＡ１、Ｍａｘ、ｃ−Ｍｙｃ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＭＺＦ１、ＳＭＡＲＣＣ１、Ｅ２Ｆ４、ＦＯＳＬ１、ＳＴＡＴ３、Ｐ３００、ＡＰ２
ガンマ、ＭａｆＦ１、ＪｕｎＤ、ＡＰ２アルファ、ＦＯＸＡ２、ＨＭＧＮ３、ＺＢＴＢ３３、Ｐ３００、Ｎｋｘ２−２、Ｎｋｘ２−５、ＳＲＦ、ＹＹ１、ＨＴＦ、ＣＨＸ１０、ＨＮＦ１、ＯＣＴ、Ｎｃｘ、ＡＰ−２ｒｅｐ、Ｌｍｏ２複合体、ＳＯＸ５、ＧＡＴＡ−１、ＣＤＰ  ＣＲ１、Ｃａｒｔ−１、ＮＦＩＶ、ＲＸＲＡ、ＳＲＥＢＰ１、ＭＹＢＬ２、ＨＮＦ４Ｇ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＥＹ１、ＺＥＢ１、ＰＨＦ８、ＣＨＤ１、ＰＵ−１、ＲＳＲＦＣ４、ＭＥＦ−２、および／またはＬｙｆ−１等またはそれらの結合部位が挙げられる。本明細書中に記載される核酸調節エレメントは、前記ＴＦＢＳのいずれか１つ以上、またはそれらの組み合わせを含み得る。転写因子結合部位は、Ｔｒａｎｓｆａｃ（登録商標）などのデータベースで見出すことができる。
【００５７】
本明細書中で開示する配列は、インビボで内皮細胞特異的遺伝子の転写を制御できる調節エレメントの配列の一部であり得る。内皮特異的調節エレメントの特定の例は、特に以下の遺伝子：ＩＦＩ２７、ＩＣＡＭ２、ＶＷＦ、ＥＤＮ１、ＥＮＧ、ＥＣＳＣＲ、ＣＤＨ５、ＰＥＣＡＭ１、ＨＨＩＰ、ＴＩＥ１またはＨＹＡＬ２を制御し得る。
【００５８】
したがって、実施形態において、本明細書中で開示される核酸調節エレメントは、ＣＤＨ５調節エレメント、すなわちインビボでＣＤＨ５遺伝子（カドヘリン５またはＶＥ−カドヘリン遺伝子）の発現を制御する調節エレメント、例えば配列番号１〜６のいずれか１つもしくはそれ以上を含む調節エレメント、またはその機能的フラグメントからの配列を含む。他の実施形態において、本明細書中で開示される核酸調節エレメントは、ＥＣＳＣＲ調節エレメント、すなわちインビボでＥＣＳＣＲ遺伝子（内皮細胞特異的走化性レギュレータ遺伝子）の発現を制御する調節エレメント、例えば配列番号７もしくは８のいずれか１つもしくはそれ以上を含む調節エレメント、またはその機能的フラグメントからの配列を含む。他の実施形態において、本明細書中で開示される核酸調節エレメントは、ＥＤＮ１調節エレメント、すなわち、インビボでＥＤＮ１遺伝子（エンドセリン１遺伝子）の発現を制御する調節エレメント、例えば配列番号９を含む調節エレメント、またはその機能的フラグメントからの配列を含む。他の実施形態において、本明細書中で開示される核酸調節エレメントは、ＥＮＧ調節エレメント、すなわちインビボでＥＮＧ遺伝子（エンドグリン遺伝子）の発現を制御する調節エレメント、例えば配列番号１０〜１２のいずれか１つもしくはそれ以上を含む調節エレメント、またはその機能的フラグメントを含む調節エレメントからの配列を含む。他の実施形態において、本明細書中で開示される核酸調節エレメントは、ＨＨＩＰ調節エレメント、すなわち、インビボでＨＨＩＰ遺伝子（ヘッジホッグ相互作用タンパク質遺伝子）の発現を制御する調節エレメント、例えば、配列番号１３または１４の１つもしくはそれ以上を含む調節エレメント、またはその機能的フラグメントからの配列を含む。他の実施形態において、本明細書中で開示される核酸調節エレメントは、ＨＹＡＬ２調節エレメント、すなわち、インビボでＨＹＡＬ２遺伝子（ヒアルロノグルコサミニダーゼ２遺伝子）の発現を制御する調節エレメント、例えば、配列番号１５〜１７のいずれか１つもしくはそれ以上を含む調節エレメント、またはその機能的フラグメントからの配列を含む。他の実施形態において、本明細書中で開示される核酸調節エレメントは、ＩＣＡＭ２調節エレメント、すなわち、インビボでＩＣＡＭ２遺伝子（細胞間接着分子２遺伝子）の発現を制御する調節エレメント、例えば配列番号１８〜２０のいずれか１つもしくはそれ以上を含む調節エレメント、またはその機能的フラグメントからの配列を含む。他の実施形態において、本明細書中で開示される核酸調節エレメントは、ＩＦＩ２７調節エレメント、すなわち、インビボでＩＦＩ２７遺伝子（インターフェロン、アルファ誘導タンパク質２７遺伝子）の発現を制御する調節エレメント、例えば配列番号２１〜２３のいずれか１つもしくはそれ以上を含む調節エレメント、またはその機能的フラグメントからの配列を含む。他の実施形態において、本明細書中で開示される核酸調節エレメントは、ＰＥＣＡＭ１調節エレメント、すなわち、インビボでＰＥＣＡＭ１遺伝子（血小板／内皮細胞接着分子１遺伝子）の発現を制御する調節エレメント、例えば、配列番号２４を含む調節エレメント、またはその機能的フラグメントからの配列を含む。
他の実施形態において、本明細書中で開示される核酸調節エレメントは、ＴＩＥ１調節エレメント、すなわち、インビボでＴＩＥ１遺伝子（イムノグロブリン様およびＥＧＦ様ドメイン１遺伝子を有するチロシンキナーゼ）の発現を制御する調節エレメント、例えば、配列番号２５または２６の１つもしくはそれ以上を含む調節エレメント、またはその機能的フラグメントからの配列を含む。他の実施形態において、本明細書中で開示される核酸調節エレメントは、ＶＷＦ調節エレメント、すなわち、インビボでＶＷＦ遺伝子（フォン・ヴィルブランド因子遺伝子）の発現を制御する調節エレメント、例えば、配列番号２７もしくは２８のいずれか１つもしくはそれ以上を含む調節エレメント、またはその機能的フラグメントからの配列を含む。他の実施形態において、本明細書中で開示される核酸調節エレメントは、配列番号２９〜３３のいずれか１つ以上を含む配列、またはその機能的フラグメントを含む。
【００５９】
本明細書中で使用する場合、「同一性」および「同一」などの用語は、２つのポリマー分子間、例えば２つの核酸分子間、例えば２つのＤＮＡ分子間の配列類似性を指す。配列アライメントおよび配列同一性の判定は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９０（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：  ４０３−１０）によって最初に記載されたＢａｓｉｃ
Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、例えばＴａｔｕｓｏｖａおよびＭａｄｄｅｎ  １９９９（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １７４：  ２４７−２５０）によって記載された「Ｂｌａｓｔ２配列」アルゴリズムを用いて実施することができる。典型的には、配列同一性のパーセンテージは、配列の全長にわたって算出される。本明細書中で使用する場合、「実質的に同一」という用語は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を意味する。
【００６０】
「機能的フラグメント」という語は、本願で使用する場合、内皮細胞特異的発現を調節する可能性を保持する調節エレメント配列のフラグメントを指し、すなわち、それらは依然として組織特異性を付与することができ、それらが由来する配列と同じように（同じ程度ではないかもしれないが）（導入）遺伝子の発現を調節することができる。機能的フラグメントは、好ましくは、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、または少なくとも４００のそれらが由来する配列からの連続したヌクレオチドを含み得る。機能的フラグメントが、少なくとも１、さらに好ましくは少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４、なお一層好ましくは少なくとも５、少なくとも１０、または少なくとも１５の、それらが由来する配列中に存在する転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）を含み得る。
【００６１】
「内皮細胞特異的発現」は、本願で用いられる場合、他の（すなわち、非内皮）細胞または組織と比較して、内皮細胞、および内皮細胞を含むかまたは内皮細胞から構築される組織における、（導入）遺伝子（ＲＮＡおよび／またはポリペプチドとして）の優先または優勢発現を指す。特定の実施形態によると、（導入）遺伝子発現の少なくとも５０％、さらに詳細には少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％は内皮細胞または内皮組織内に存在する。
【００６２】
「内皮細胞」という用語は、本明細書中で用いられる場合、全ての内皮細胞タイプ、例えば、全ての血管の内側を覆い、血流と周囲組織との間の交換を調節する、単細胞層を形成する細胞を包含する。多くの内皮細胞タイプが存在し、それらの表現型は、異なる器官間、同じ器官内の血管ループの異なるセグメント間、そして同じ器官および血管タイプの
隣接する内皮細胞間で異なる。そのような内皮細胞の非限定的例は：肝臓類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ）、例えば肺、心臓、腸、皮膚、網膜由来の（微細）血管内皮細胞、動脈内皮細胞、例えば肺動脈、大動脈、臍動脈および臍静脈由来の内皮細胞、ある特定の血管床由来の肝外内皮細胞、血液脳関門ＥＣ、骨髄ＥＣ、および高内皮細静脈細胞（ＨＥＶ）である。
【００６３】
特定の実施形態によると、内皮細胞特異的発現は、発現された遺伝子産物の１０％未満、５％未満、２％未満またはさらには１％未満の、筋肉、心臓、肺、肝臓、脳、腎臓および／または脾臓などの内皮細胞を含むかまたはこれらにより構築されるもの以外の器官または組織への「漏出」があることを必然的に伴う。
【００６４】
内皮細胞特異的発現の特定の形態とみなすことができる内皮前駆細胞（ＥＰＣ）特異的発現にも同じことが準用される、したがって、本願全体にわたって、内皮細胞特異的が発現に関連して言及される場合、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）特異的発現も明らかに想定される。
【００６５】
実施形態において、本発明は、内皮細胞またはそれに由来する組織における遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントであって、配列番号１〜３３からなる群から選択される配列；配列番号１〜３３からなる群から選択される配列のいずれかと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、なお一層好ましくは少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列；またはその機能的フラグメントを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、前記機能的フラグメントが、少なくとも２０、好ましくは少なくとも２５、さらに好ましくは少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００または少なくとも２５０の、それが由来する配列由来の連続したヌクレオチドを含み、前記機能的フラグメントが、少なくとも１、好ましくは少なくとも２、３、４、または５、さらに好ましくは少なくとも１０または少なくとも１５の、それが由来する配列中に存在するＴＦＢＳなどの転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）を含む、核酸調節エレメントに関する。
【００６６】
本明細書中で開示される２つもしくはそれ以上の同一もしくは異なる配列またはその機能的フラグメントを組み合わせることによって、人工配列を含む核酸調節エレメントを作製することも可能である。したがって、ある実施形態において、配列番号１〜３３からなる群から選択される少なくとも２つの配列を含む、内皮細胞における遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントが提供される。
【００６７】
例えば、配列番号１〜３３のいずれか１つの２、３、４、または５の反復配列、例えばタンデム反復配列、またはそれらの組み合わせを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる核酸調節エレメントを本明細書中で開示する。
【００６８】
人工配列を含む核酸調節エレメントの特定の例には、本明細書中で開示する配列中に存在する転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）を再構成することによって得られる調節エレメントが含まれる。前記再構成は、ＴＦＢＳの順を変更する、および／または１もしくはそれ以上のＴＦＢＳの位置を他のＴＦＢＳに対して変更する、および／または１もしくはそれ以上のＴＦＢＳのコピー数を変更することを包含し得る。内皮細胞特異的遺伝子発現、特に、例えば、Ｓｐ１、ＥＧＲ−１、ＥＴＳおよびＧＡＴＡの結合部位を含む、内皮細胞特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントも、本明細書中で開示する。さらに、例えば、特に、Ｓｐ１、ＥＧＲ−１、ＥＴＳおよびＧＡＴＡの１つもしくはそれ以上の結合部位ならびにそれらの組み合わせを含む、内皮細胞特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントも本明細書中で開示する。いくつかの実施形態において、これらの核酸調節エレメントは、列挙したＴＦＢＳのいずれか１つもしくはそれ以上の少なくとも２
、例えば２、３、４またはそれ以上のコピーを含む。
【００６９】
いくつかの実施形態において、使用するベクターはレンチウイルスベクターである。他の実施形態において、使用するベクターはアデノ随伴ウイルスベクターである。さらに別の実施形態において、使用するベクターはアデノウイルスベクターである。レンチウイルスベクターを使用する場合、それは自己不活性化または非自己不活性化レンチウイルスベクターであり得る。自己不活性化レンチウイルスベクターは、より安全と考えられるので、臨床用途に好ましい場合がある。
【００７０】
調節エレメントが一本鎖核酸として提供される場合、例えば一本鎖ＡＡＶベクターを使用する場合、相補鎖は開示された配列と等価であるとみなされる。したがって、内皮細胞特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントであって、本明細書中に記載する配列、特に、配列番号１〜３３からなる群から選択される配列；これらの配列のいずれかに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、なお一層好ましくは少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列；または本明細書中で定義するようなその機能的フラグメントの相補配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる核酸調節エレメントも本明細書中で開示される。
【００７１】
本明細書中で記載する核酸調節エレメントに対して、特に、配列番号１〜３３からなる群から選択される配列；これらの配列のいずれかに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列；本明細書中で定義するようなその機能的フラグメント；またはその相補配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる核酸調節エレメントに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする内皮細胞特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントも本明細書中で開示する。前記核酸調節エレメントは、それらがハイブリダイズする配列と等しい長さを有するものである必要はない。好ましい実施形態において、前記ハイブリダイズする核酸調節エレメントのサイズは、それらがハイブリダイズする配列と、長さにおいて２５％、特に長さにおいて２０％、さらに詳細には長さにおいて１５％、最も詳細には長さにおいて１０％を超えては異ならない。
【００７２】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という表現は、規定された温度および塩濃度の条件下で標的核酸分子にハイブリダイズする核酸分子の能力を指す。典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、天然の二本鎖の融解温度（Ｔｍ）から２５℃〜３０℃を超えずに（例えば、２０℃、１５℃、１０℃または５℃）低い。Ｔｍを算出する方法は、当該技術分野で周知である。非限定的例として、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを達成するための代表的な塩および温度条件は：６５℃で１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳである。略語ＳＳＣは、核酸ハイブリダイゼーション溶液中で用いられる緩衝液を指す。１リットルの２０×（２０倍濃度）ストックＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．０）は１７５．３ｇの塩化ナトリウムおよび８８．２ｇのクエン酸ナトリウムを含む。ハイブリダイゼーションを達成するための代表的な時間は１２時間である。
【００７３】
好ましくは、本明細書中で記載するような調節エレメントは、ごく限られた長さでありつつ完全に機能的である。これにより、それらのペイロード容量を過度に制限することなくベクターまたは核酸発現カセット中での使用が可能になる。したがって、実施形態において、本明細書中で開示する調節エレメントは、１５００ヌクレオチド以下、１０００ヌクレオチド以下、９００ヌクレオチド以下、８００ヌクレオチド以下、７００ヌクレオチド以下、さらに好ましくは６１０ヌクレオチド以下、例えば５５０ヌクレオチド以下、５００ヌクレオチド以下、４５０ヌクレオチド以下、４００ヌクレオチド以下、３５０ヌクレオチド以下、または３００ヌクレオチド以下のものである（すなわち、核酸調節エレメ
ントは、最長で１５００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、好ましくは６１０ヌクレオチド、例えば５５０ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド、または３００ヌクレオチドの長さを有する）。
【００７４】
しかしながら、開示された核酸調節エレメントは、調節活性（すなわち、転写の特異性および／または活性に関して）を保持し、したがってそれらは特に最短で２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、３５０ヌクレオチドまたは４００ヌクレオチドの長さを有すると理解されるべきである。
【００７５】
ある実施形態において、本発明は、配列番号１〜３３からなる群から選択される配列；前記配列のいずれかに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、なお一層好ましくは少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列；または本明細書中で定義するようなその機能的フラグメントの１０００ヌクレオチド以下、好ましくは９００ヌクレオチド以下、好ましくは８００ヌクレオチド以下、好ましくは７００ヌクレオチド以下の核酸調節エレメントを提供する。
【００７６】
本明細書中で開示される核酸調節エレメントは核酸発現カセットで使用することができる。したがって、一態様において、本発明は、本明細書中で記載するような核酸調節エレメントの核酸発現カセットにおける使用を提供する。
【００７７】
一態様において、本発明は、プロモータに作動可能に連結された、本明細書中で記載するような核酸調節エレメントを含む核酸発現カセットを提供する。実施形態において、核酸発現カセットは導入遺伝子を含まない。そのような核酸発現カセットは内因性遺伝子の発現を駆動するために使用することができる。好ましい実施形態において、核酸発現カセットは、プロモータおよび導入遺伝子に作動可能に連結された、本明細書中で記載されているような核酸調節エレメントを含む。
【００７８】
本明細書中で使用する場合、「核酸発現カセット」という用語は、１つもしくはそれ以上の所望の細胞型、組織または器官における（導入）遺伝子発現を行う１つもしくはそれ以上の転写制御エレメント（例えば、限定されるものではないが、プロモータ、エンハンサーおよび／または調節エレメント、ポリアデニル化配列、およびイントロン）を含む核酸分子を指す。典型的には、それらは導入遺伝子も含むが、核酸カセットが挿入される細胞における内因性遺伝子の発現を核酸発現カセットが行うことも想定される。
【００７９】
「作動可能に連結された」という用語は、本明細書中で用いられる場合、そのエレメントが機能的に接続され、互いに相互作用することができるような、互いに対する様々な核酸分子エレメントの配置を指す。そのようなエレメントには、限定されるものではないが、プロモータ、エンハンサーおよび／または調節エレメント、ポリアデニル化配列、１つもしくはそれ以上のイントロンおよび／またはエクソン、および発現される関心対象の遺伝子（すなわち、導入遺伝子）のコーディング配列が含まれ得る。核酸配列エレメントは、適切に配向または作動可能に連結された場合、一緒になって互いの活性を調節するように作用し、そして最終的に導入遺伝子の発現のレベルに影響を及ぼす可能性がある。「調節する」とは、特定のエレメントの活性レベルを増加、減少、または維持することを意味する。各エレメントの他のエレメントに対する位置は、各エレメントの５’末端および３’末端に関して表すことができ、任意の特定のエレメント間の距離は、エレメント間の介在するヌクレオチド、または塩基対の数によって言及することができる。当業者には理解
されるように、作動可能に連結されているとは、機能活性を意味し、必ずしも自然の位置的結合に関連するとは限らない。実際、核酸発現カセットで用いられる場合、調節エレメントは、典型的にはプロモータのすぐ上流にあり得る（これは一般的な場合であるが、核酸発現カセット内の位置の限定または排除とは決して解釈されるべきではない）が、これはインビボの場合である必要はない。例えば、その転写に影響を及ぼす遺伝子の下流に天然に存在する調節エレメント配列は、プロモータの上流に位置する場合、同様に機能することができる。したがって、特定の実施形態によると、調節エレメントの調節または増強効果は、位置に依存する。
【００８０】
特定の実施形態において、核酸発現カセットは本明細書中に記載するような１つの核酸調節エレメントを含む。別の実施形態では、核酸発現カセットは、２つまたはそれ以上、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の本明細書中で記載する核酸調節エレメントを含む、すなわち、それらをモジュール式に組み合わせて、それらの調節（および／または増強）効果を高める。さらなる実施形態では、２つまたはそれ以上の核酸調節エレメントのうちの少なくとも２つは同一であるかまたは実質的に同一である。さらなる実施形態において、２つまたはそれ以上の調節エレメントのすべては同一であるかまたは実質的に同一である。同一または実質的に同一の核酸調節エレメントのコピーは核酸発現カセットにおいてタンデム反復配列として提供することができる。別のさらなる実施形態において、２つまたはそれ以上の核酸調節エレメントのうちの少なくとも２つは互いに異なり、すなわち、異なる配列番号によって規定される。核酸発現カセットはまた、同一および実質的に同一の核酸調節エレメントならびに非同一核酸調節エレメントの組み合わせも含み得る。
【００８１】
例えば、核酸発現カセットは、配列番号１を含む核酸調節エレメントと、配列番号２〜３３のいずれか１つもしくはそれ以上を含む核酸調節エレメントとを含み得る。あるいは、これは、配列番号２〜３３によって規定される残存する調節エレメントについて行うことができ、これらは他の調節エレメントのいずれか１つもしくはそれ以上と組み合わせることができる。
【００８２】
本願で用いられる場合、「プロモータ」という用語は、それらが作動可能に連結された対応する核酸コーディング配列（例えば、導入遺伝子または内因性遺伝子）の転写を直接的または間接的のいずれかで調節する核酸配列を指す。プロモータは、単独で機能して転写を調節し得るか、または１つもしくはそれ以上の他の調節配列（例えば、エンハンサーもしくはサイレンサー、または調節エレメント）と協働して作用することができる。本願の関連で、プロモータは典型的には本明細書中で記載する調節エレメントに作動可能に連結されて、（導入）遺伝子の転写を調節する。本明細書中に記載する調節エレメントがプロモータおよび導入遺伝子の両方に作動可能に連結されている場合、調節エレメントは、（１）インビボで（および／またはインビトロで内皮細胞または組織由来の細胞株において）有意な程度の導入遺伝子内皮細胞特異的発現を付与できる、および／または（２）内皮細胞において（および／またはインビトロで内皮細胞もしくは組織由来の細胞株において）導入遺伝子の発現レベルを増大させることができる。
【００８３】
プロモータは、相同性（すなわち、核酸発現カセットで形質移入される動物、特に哺乳類と同じ種由来）または異種性（すなわち、発現カセットで形質移入される動物、特に哺乳類の種とは異なる供給源由来）であり得る。したがって、プロモータの供給源は、任意のウイルス、任意の単細胞原核もしくは真核生物、任意の脊椎動物もしくは無脊椎生物、または任意の植物であり得るか、あるいは合成プロモータ（すなわち非自然発生の配列を有する）であってもよく、ただし、プロモータは本明細書中に記載する調節エレメントと組み合わせて機能するものとする。好ましい実施形態において、プロモータは哺乳類プロモータ、特にネズミまたはヒトプロモータである。
【００８４】
プロモータは誘導性または構成的プロモータであり得る。
非限定的に例示される内皮細胞特異的プロモータは、下記表１に示す遺伝子のプロモータである。
【００８５】
特に好ましい実施形態では、プロモータは哺乳類プロモータであり、特にネズミまたはヒトプロモータである。
【００８６】
好ましい実施形態において、プロモータは、血管内皮カドヘリン遺伝子、特にネズミまたはヒトカドヘリン−５遺伝子、例えば配列番号３４で定義されるプロモータ（表４参照）由来である。
【００８７】
好ましい実施形態において、プロモータは、エンドセリン−１遺伝子、特にネズミまたはヒトエンドセリン−１遺伝子、例えば配列番号３５で定義されるプロモータ（表４参照）由来である。
【００８８】
好ましい実施形態において、プロモータは、エンドグリン遺伝子、特にネズミまたはヒトエンドグリン遺伝子、例えば配列番号３６で定義されるプロモータ（表４参照）由来である。
【００８９】
好ましい実施形態において、プロモータは、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１遺伝子、特にネズミまたはヒトＦｍｓ関連チロシンキナーゼ１遺伝子、例えば配列番号３７で定義されるプロモータ（表４参照）由来である。
【００９０】
好ましい実施形態において、プロモータは、細胞間接着分子２遺伝子、特にネズミまたは細胞間接着分子２遺伝子（ＩＣＡＭ２）、例えば配列番号３８で定義されるプロモータ（表４参照）由来である。
【００９１】
さらに、プロモータは核酸発現カセット中の導入遺伝子のプロモータである必要はないが、導入遺伝子をそれ自身のプロモータから転写することが可能である。
【００９２】
核酸発現カセットの長さを最短にするために、調節エレメントを最小プロモータ、または本明細書中に記載するプロモータの短縮バージョンに連結してもよい。「最小プロモータ」（基本プロモータまたはコアプロモータとも称する）は、本明細書中で用いる場合、（例えば組織特異的）発現の調節に寄与する配列の少なくとも一部が欠けているが、それでも発現を駆動することができるフルサイズのプロモータの一部である。この定義は、（組織特異的）調節エレメントが欠失しており、遺伝子の発現を駆動することができるが、その遺伝子を組織特異的に発現する能力を失ったプロモータと、（組織特異的）調節エレメントが欠失しており、遺伝子の発現を駆動（おそらくは減少）することができるが、その遺伝子を組織特異的に発現する能力は必ずしも失われていないプロモータの両方を対象とする。好ましくは、本明細書中で開示する核酸発現カセット中に含まれるプロモータは、長さが１０００ヌクレオチド以下、９００ヌクレオチド以下、８００ヌクレオチド以下、７００ヌクレオチド以下、６００ヌクレオチド以下、５００ヌクレオチド以下、４００ヌクレオチド以下、３００ヌクレオチド以下、または２５０ヌクレオチド以下である。そのような最小プロモータの特定の非限定的な一例はＥＤＮ１ｍｉｎｉプロモータである（表４参照）。
【００９３】
「導入遺伝子」という語は、本明細書中で記載する場合、核酸配列が導入される細胞において発現されるポリペプチドまたはポリペプチドの一部をコードする特定の核酸配列を指す。しかしながら、導入遺伝子をＲＮＡとして発現して、典型的には核酸配列が挿入さ
れる細胞における特定のポリペプチドの量を制御（例えば、低下）させることも可能である。これらのＲＮＡ分子には、ＲＮＡ干渉（ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ）、ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ調節（ｍｉＲ）（特定の遺伝子の発現を制御するために使用できる）、触媒ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９または類似のＤＮＡもしくはＲＮＡカッターなどによってそれらの機能を発揮する分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９４】
核酸配列がどのようにして細胞に導入されるかは、本発明に必須ではなく、例えば、ゲノム中またはエピソームプラスミドとして組み込むことによってもよい。注目すべきことに、導入遺伝子の発現は、核酸配列が導入される細胞のサブセットに限定される可能性がある。「導入遺伝子」という用語は、（１）細胞中で天然に見いだされない核酸配列（すなわち、異種性核酸配列）；（２）導入された細胞で天然に見いだされる核酸配列の変異形態である核酸配列；（３）導入された細胞中に天然に存在する同じ（すなわち、相同性）または類似の核酸配列のさらなるコピーを付加する働きをする核酸配列；あるいは（４）天然に存在するかまたは相同性のサイレント核酸配列であって、導入された細胞においてその発現が誘導されるものを含むことを意味する。
【００９５】
導入遺伝子は、プロモータに対して（および／または、例えば核酸発現カセットを遺伝子治療のために使用する場合に、導入される動物、特に哺乳類に対して）相同性または異種性であり得る。
【００９６】
導入遺伝子は、全長ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ配列、または少なくともいくつかの生物学的活性を有するその任意のフラグメント、サブユニットもしくは変異体であり得る。特に、導入遺伝子は、ミニ遺伝子、すなわち、そのイントロン配列の一部、ほとんどまたは全部が欠けている遺伝子配列であり得る。したがって、導入遺伝子は場合によって、イントロン配列を含んでもよい。場合によって、導入遺伝子は、ハイブリッド核酸配列、すなわち、相同性および／または異種性ｃＤＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡフラグメントから構築されたものであってよい。「変異形態」とは、野生型または天然に存在する配列とは異なる１つもしくはそれ以上のヌクレオチドを含む核酸配列を意味し、すなわち、変異核酸配列は１つもしくはそれ以上のヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入を含む。ヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入は、野生型アミノ酸／核酸配列とはそのアミノ酸／核酸配列が異なる遺伝子産物（すなわち、タンパク質または核酸）を生じさせることができる。そのような変異体の調製は当該技術分野において周知である。場合によって、導入遺伝子は、導入遺伝子産物が細胞から分泌されるように、リーダーペプチドまたはシグナル配列をコードする配列も含み得る。
【００９７】
本明細書中で記載する核酸発現カセットに含まれ得る導入遺伝子は、典型的には、ＲＮＡまたはポリペプチド（タンパク質）などの遺伝子産物をコードする。
【００９８】
実施形態において、導入遺伝子は治療用タンパク質をコードする。治療用タンパク質は分泌可能なタンパク質であり得る。分泌可能なタンパク質、特に分泌可能な治療用タンパク質の非限定的例としては、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）、凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）、凝固因子ＸＩ（ＦＸＩ）、組織因子（ＴＦ）、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＶＥＧＦ、ＰＬＧＦ、ＦＧＦ、ｓＦＬＴ１、α１−アンチトリプシン、ＡＡＴ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ａｐｏＡ−Ｉ）、限定されるものではないが、マトリックスメタロプロテイナーゼ−３（ＴＩＭＰ−３）を含むマトリックスメタロプロテイナーゼ、インスリン、エリスロポエチン、リポタンパク質リパーゼ、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）、抗体またはナノボディ、例えば限定されるものではないが、前記導入遺伝子、因子およびそれらの同族受容体のいずれか１つに対する抗体または任意の分
泌されたタンパク質もしくはウイルスタンパク質、低分子干渉ＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、エンドヌクレアーゼ、およびＣａｓ９に対する抗体、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、血漿因子などが挙げられる。治療用タンパク質は構造タンパク質であってもよい。構造タンパク質、特に治療用構造タンパク質の非限定的例としては、血管弛緩および血管収縮、アテローム性動脈硬化症を調節するタンパク質が挙げられる。好ましい実施形態において、導入遺伝子は一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）を含む。
【００９９】
実施形態において、導入遺伝子は免疫原性タンパク質をコードする。免疫原性タンパク質の非限定的例としては、病原体由来のエピトープおよび抗原が挙げられる。
【０１００】
本明細書中で使用する場合、「免疫原性」という語は、免疫応答を誘発することができる物質または組成物を指す。
【０１０１】
他の配列を同様に本明細書中で開示する核酸発現カセットに組み入れて、典型的には導入遺伝子産物（例えば、イントロンおよび／またはポリアデニル化配列）の発現をさらに増大または安定化させることができる。
【０１０２】
あらゆるイントロンを本明細書中で記載する発現カセットにおいて利用することができるが、必要でない場合もある。「イントロン」という用語は、核スプライシング装置によって認識されスプライシングされるために充分大きな全イントロンの任意の部分を包含する。典型的には、発現カセットの構築および操作を容易にする、できるだけ小さな発現カセットのサイズを保持するためには、短い機能的イントロン配列が好ましい。いくつかの実施形態において、イントロンは、発現カセット内の配列をコーディング配列によってコードされるタンパク質をコードする遺伝子から得られる。イントロンは、コーディング配列に対して５’側、コーディング配列に対して３’側、またはコーディング配列内に位置し得る。イントロンをコーディング配列に対して５’側に配置する利点は、イントロンがポリアデニル化シグナルの機能を妨害する可能性を最小限に抑えることである。実施形態において、本明細書中で開示する核酸発現カセットはイントロンをさらに含む。好適なイントロンの非限定的例は、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン、β−グロビンイントロン（βＩＶＳ−ＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）イントロンＡ、サルウイルス４０（ＳＶ４０）スモールｔイントロン、およびβ−アクチンイントロンである。好ましくは、イントロンはＭＶＭイントロンである。
【０１０３】
ｐｏｌｙＡテイルの合成を指示する任意のポリアデニル化シグナルが本明細書中で記載する発現カセットにおいて有用であり、それらの例は当業者には周知である。例示的ポリアデニル化シグナルとしては、限定されるものではないが、サルウイルス４０（ＳＶ４０）後期遺伝子由来のｐｏｌｙＡ配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、最小ウサギβ−グロビン（ｍＲＢＧ）遺伝子、およびＬｅｖｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ３：１０１９−１０２５）で記載されているような合成ｐｏｌｙＡ（ＳＰＡ）部位が挙げられる。好ましくは、ポリアデニル化シグナルはＳＶ４０から誘導される（すなわち、ＳＶ４０ｐＡ）。
【０１０４】
特定の実施形態において、本発明は、プロモータ、好ましくはカドヘリン−５、エンドセリン−１、エンドグリン、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１、もしくは細胞間接着分子１遺伝子からのプロモータからなる群から選択されるプロモータに作動可能に連結された配列番号１〜３３もしくは前記配列に対して９５％の同一性を有する配列からなる群から選択される核酸調節エレメント、またはプロモータ、および導入遺伝子、好ましくはルシフェラーゼをコードする導入遺伝子を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる核酸発現カセットを提供する。さらなる実施形態において、核酸発現カセットは、ポリアデニル化シグナル、好ましくはＳＶ４０由来のポリアデニル化シグナルをさらに含む。
【０１０５】
特定の実施形態において、本発明は、プロモータ、好ましくはカドヘリン−５、エンドセリン−１、エンドグリン、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１、もしくは細胞間接着分子１遺伝子由来のプロモータに作動可能に連結した、配列番号１〜３３もしくは前記配列に対して９５％の同一性を有する配列からなる群から選択される核酸調節エレメント、および導入遺伝子、好ましくは本明細書中で定義される治療用または構造タンパク質をコードする導入遺伝子を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、核酸発現カセットを提供する。さらなる実施形態において、核酸発現カセットはポリアデニル化シグナルをさらに含む。特定の実施形態において、以下の導入遺伝子、すなわち、分泌可能なタンパク質、特に分泌可能な治療用タンパク質、例えば肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）、凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）、凝固因子ＸＩ（ＦＸＩ）、組織因子（ＴＦ）、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＶＥＧＦ、ＰＬＧＦ、ＦＧＦ、ｓＦＬＴ１、α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、限定されるものではないが、マトリックスメタロプロテイナーゼ−３（ＴＩＭＰ−３）を含むマトリックスメタロプロテイナーゼ、インスリン、エリスロポエチン、リポタンパク質リパーゼ、抗体またはナノボディ、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、血漿因子などのいずれか１つを導入することができる。治療用タンパク質はまた構造タンパク質でもあり得る。構造タンパク質、特に、血管弛緩および血管収縮、アテローム性動脈硬化症を調節する治療用構造タンパク質の非限定的例。好ましい実施形態において、導入遺伝子は一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）を含む。
【０１０６】
本明細書中で開示する核酸調節エレメントおよび核酸発現カセットは、そのまま使用することができるか、または典型的には、核酸ベクターの一部であってよい。したがって、さらなる態様は、本明細書中で記載するような核酸調節エレメントまたは本明細書中で記載するような核酸発現カセットのベクター、特に核酸ベクターにおける使用に関する。
【０１０７】
一態様において、本発明はまた、本明細書中で開示するような核酸調節エレメントを含むベクターも提供する。さらなる実施形態では、ベクターは本明細書中で開示する核酸発現カセットを含む。
【０１０８】
「ベクター」という用語は、本願中で用いる場合、限定されるものではないが、その中にｃＤＮＡ分子などの別の核酸分子（挿入核酸分子）が挿入されていてもよい核酸分子、例えば二本鎖ＤＮＡを指す。ベクターを使用して、好適な宿主細胞中に挿入核酸分子を輸送する。ベクターは、挿入核酸分子の転写を可能にし、場合によって転写物をポリペプチドに翻訳することを可能にする必要なエレメントを含み得る。挿入核酸分子は、宿主細胞から誘導することができるか、または異なる細胞もしくは生物から誘導することができる。一旦、宿主細胞中に入ると、ベクターは、宿主染色体ＤＮＡとは無関係に、または宿主染色体と同時に複製することができ、ベクターのいくつかのコピーおよびその挿入された核酸分子を生成させることができる。ベクターは、エピソームベクター（すなわち、宿主細胞のゲノム中に組み込まれないもの）であり得るか、または宿主細胞ゲノム中に組み込まれるベクターであり得る。「ベクター」という用語は、したがって、標的細胞中への遺伝子導入を促進する遺伝子送達ビヒクルとして定義することもできる。この定義は非ウイルスベクターおよびウイルスベクターの両方を含む。非ウイルスベクターには、限定されるものではないが、カチオン性脂質、リポソーム、ナノ粒子、ＰＥＧ、ＰＥＩ、プラスミドベクター（例えば、ｐＵＣベクター、ブルースクリプトベクター（ｐＢＳ）およびｐＢＲ３２２または細菌配列（ミニサークル）を欠いたそれらの誘導体）トランスポゾン系ベクター（例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）ベクターまたはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）ベクター）などが含まれる。ウイルスベクターはウイルスに由来し、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。典型的には
、ただし必然的ではないが、複製に必須なウイルス遺伝子はウイルスベクターから排除されているので、ウイルスベクターは所定の細胞において増殖する能力を失っているため複製欠損である。しかしながら、いくつかのウイルスベクターは、所定の細胞、例えばがん細胞において特異的に複製するためにも適合させることができ、典型的には（がん）細胞特異的（腫瘍）溶解を引き起こすために用いられる。ビロソームは、ウイルスエレメントおよび非ウイルスエレメントの両方を含むベクターの非限定的例であり、特にそれらはリポソームを不活化ＨＩＶまたはインフルエンザウイルスと組み合わせる（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。別の例は、カチオン性脂質と混合されたウイルスベクターを包含する。
【０１０９】
好ましい実施形態において、ベクターはウイルスベクター、例えばレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、さらに好ましくはレンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、好ましくはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来であるが、他のレンチウイルスに基づく他のレンチウイルスベクター（限定されるものではないが、ウマ感染性貧血ウイルスを含む）も使用することができる。レンチウイルスベクターは内皮細胞を形質導入することができる。レンチウイルスベクターの産生は、関心対象の遺伝子をコードするレンチウイルスベクタープラスミドのｇａｇ−ｐｏｌ、ｒｅｖおよびｅｎｖコードヘルパー構築物との（ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，２００７）一過性の同時形質移入によって達成することができる。典型的には、水泡性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）または抗体もしくはナノボディを付与するエンベロープを含むがこれに限定されない内皮指向性（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｔｒｏｐｉｃ）エンベロープ（すなわち、単鎖抗体）媒介内皮再標的化標的化特異的内皮細胞表面マーカーなどの異種性エンベロープを使用する（ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅ  ＆  Ｃｈｕａｈ，Ｂｌｏｏｄ．２０１３  Ｓｅｐ  １９；１２２（１２）：１９９３−４；Ａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．  ２０１３  Ｓｅｐ  １９；１２２（１２）：２０３０−８；Ｂｕｃｈｈｏｌｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５  Ｄｅｃ；３３（１２）：７７７−９０；Ｍｕｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１１  Ａｐｒ；１９（４）：６８６−９３；  Ａｎｌｉｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ
Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１０  Ｎｏｖ；７（１１）：９２９−３５）。
【０１１０】
別の実施形態では、ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶベクターは、好ましくは自己相補的二本鎖ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）として、ＡＡＶ形質導入（すなわち、一本鎖ＡＡＶから二本鎖ＡＡＶへの変換）における制限段階の１つを克服するために使用する（ＭｃＣａｒｔｙ，２００１，２００３；Ｎａｔｈｗａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，２００２，２００６，２０１１；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）が、一本鎖ＡＡＶベクター（ｓｓＡＡＶ）の使用も本明細書中に含まれる。
【０１１１】
ＡＡＶベクター粒子の産生は、記載されているように、例えば、ＡＡＶ−ベクターおよびＡＡＶヘルパー構築物を一過性に同時形質移入し、ＡＡＶカプシドをＨＥＫ２９３細胞にコードし、続いて塩化セシウム（ＣｓＣｌ）密度勾配超遠心分離に基づく精製ステップによって達成することができる（Ｖａｎｄｅｎ  Ｄｒｉｅｓｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。カプシドはまた、異なる血清型から誘導することができるか、または特異的に修飾して、進化もしくは選択、抗体（ナノボディ工学）またはＤＡＲＰｉｎの使用のいずれかにより内皮細胞形質導入を増強する（Ｗｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．
２００６  Ａｐｒ；１３（４）：６８３−９３；Ｍｕｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５  Ｆｅｂ  １０；６：６２４６；Ｂｕｃｈｈｏｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５  Ｄｅｃ；３３（１２）：７７７−９０；Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００４  Ｆｅｂ  ３；１０９（４）：５１３−９．）。
【０１１２】
さらに別の実施形態において、ベクターはアデノウイルスベクターである。アデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス５血清型、または限定されるものではないがＡｄ５Ｔ＊Ｆ３５＋＋を含む、内皮細胞に対して増大した指向性を示す他の血清型に由来する（Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．  ２０１３  Ａｕｇ  ９；８：１８３．  ｄｏｉ：  １０．１１８６／１７４９−８０９０−８−１８３）。あるいは、カプシドを操作して、以下の文献を含むがこれに限定されないアデノウイルスベクターの内皮指向性特性を増強することができる（Ｎｉｃｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２００９  Ｊｕｎ  １８；５８３（１２）：２１００−７；Ｎｉｃｋｌｉｎ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００８  Ｄｅｃ；１６（１２）：１９０４−５；Ｗｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２００５；１０８：３９５−４１３；Ｗｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｔｈｅｒ．２００４  Ｏｃｔ  ８；２（１）：１４）。これらは初期世代またはヘルパー依存性アデノウイルスベクターのいずれかから誘導することができる（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１０  Ｄｅｃ；１８（１２）：２１２１−９）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるアデノウイルスベクターおよびヘルパー構築物の形質移入後のこれらのベクターの産生は以前に記載されている（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２０１０  Ｄｅｃ；１８（１２）：２１２１−９）。
【０１１３】
核酸調節エレメントは、事実上はモジュール式であるので、所望の標的組織における発現を最大にするための最良の内皮細胞特異的核酸調節エレメントと任意の他の内皮細胞特異的核酸調節エレメントとの組み合わせも試験する。その結果、これは、内皮細胞およびそれらを含む組織に影響を及ぼす疾患のためのテーラーメイドの多用途内皮細胞特異的核酸調節エレメントプラットフォームの生成に至る可能性がある。さらに、内皮細胞特異的核酸調節エレメントは、他の標的組織において活性な他のプロモータまたは核酸調節エレメントと組み合わせることもできる。
【０１１４】
他の実施形態において、ベクターは非ウイルスベクター、好ましくはプラスミド、ミニサークル、またはトランスポゾン系ベクター、例えばＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）系ベクターまたはｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）系ベクターである。
【０１１５】
さらに別の実施形態において、ベクターはウイルスエレメントと非ウイルスエレメントとを含む。
【０１１６】
特定の実施形態において、本発明は、配列番号１〜３３からなる群から選択される核酸調節エレメント、プロモータ、好ましくはカドヘリン−５、エンドセリン−１、エンドグリン、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１、または細胞間接着分子１遺伝子由来のプロモータ、導入遺伝子、好ましくは治療用構造または分泌可能なタンパク質をコードする導入遺伝子、およびポリアデニル化シグナルを含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる核酸発現カセットを含むベクターを提供する。特に、以下の導入遺伝子のいずれか１つを導入することができる：分泌可能なタンパク質、特に分泌可能な治療用タンパク質、例えば肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）、凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）、凝固因子ＸＩ（ＦＸＩ）、組織因子（ＴＦ）、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＶＥＧＦ、ＰＬＧＦ、ＦＧＦ、ｓＦＬＴ１、α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ａｐｏＡ−Ｉ）、限定されるものではないがマトリックスメタロプロテイナーゼ−３（ＴＩＭＰ−３）を含むマトリックスメタロプロテイナーゼ、インスリン、エリスロポエチン、リポタンパク質リパーゼ、抗体またはナノボディ、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、血漿因子など。治療用タンパク質は構造タンパク質であってもよい。構造タンパク質、特に血管弛緩、血管収縮またはアテローム性動脈硬
化症を調節するタンパク質を含む、治療用構造タンパク質の非限定的例。好ましい実施形態において、導入遺伝子は一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）を含む。
【０１１７】
特定の実施形態において、本発明は、配列番号１〜３３からなる群から選択される核酸調節エレメント、プロモータ、好ましくはカドヘリン−５、エンドセリン−１、エンドグリン、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１、または細胞間接着分子１遺伝子由来のプロモータ、導入遺伝子、好ましくは分泌可能なタンパク質をコードする導入遺伝子、特に分泌可能な治療用タンパク質、例えば肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）、凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）、凝固因子ＸＩ（ＦＸＩ）、組織因子（ＴＦ）、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＶＥＧＦ、ＰＬＧＦ、ＦＧＦ、ｓＦＬＴ１、α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ａｐｏＡ−Ｉ）、限定されるものではないがマトリックスメタロプロテイナーゼ−３（ＴＩＭＰ−３）を含むマトリックスメタロプロテイナーゼ、インスリン、エリスロポエチン、リポタンパク質リパーゼ、抗体またはナノボディ、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、血漿因子などを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる核酸調節エレメントを含む核酸発現カセットを含むベクターを提供する。治療用タンパク質はまた構造タンパク質であってもよい。構造タンパク質、特に治療用構造タンパク質、例えば血管弛緩、血管収縮またはアテローム性動脈硬化症を調節するタンパク質の非限定的例。好ましい実施形態において、導入遺伝子は一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）を含む。
【０１１８】
本明細書中で開示される核酸発現カセットおよびベクターを使用して、例えば、内皮細胞で通常発現され利用されるタンパク質（すなわち、構造タンパク質）を発現することができるか、または内皮細胞で発現され、次に身体の他の部分へ輸送するために血流へ輸送されるタンパク質（すなわち、分泌可能なタンパク質）を発現することができる。例えば、本明細書中で開示される発現カセットおよびベクターを使用して、治療目的、特に遺伝子治療のために治療量の遺伝子産物（例えばポリペプチド、特に治療用タンパク質、またはＲＮＡ）を発現させることができる。典型的には、遺伝子産物は発現カセットまたはベクター内の導入遺伝子によってコードされるが、原則として治療目的で内因性遺伝子の発現を増大させることも可能である。別の例では、本明細書中で開示される発現カセットおよびベクターを使用して、ワクチン接種の目的のために免疫学的量の遺伝子産物（例えばポリペプチド、特に免疫原性タンパク質、またはＲＮＡ）を発現させることができる。
【０１１９】
本明細書中で教示する核酸発現カセットおよびベクターは、薬剤的に許容される賦形剤、すなわち、１もしくはそれ以上の薬剤的に許容される担体物質および／または添加剤、例えば、緩衝液、担体、賦形剤、安定剤などとともに医薬組成物中に配合することができる。医薬組成物はキットの形態で提供することができる。
【０１２０】
「薬剤的に許容される」という用語は、本明細書中で用いられる場合、当該技術分野と一致し、医薬組成物の他の成分と適合性であり、そのレシピエントにとって有害でないことを意味する。
【０１２１】
したがって、本発明のさらなる態様は、本明細書中で記載する核酸発現カセットまたはベクターを含む医薬組成物に関する。
【０１２２】
本明細書中で記載する核酸調節エレメントのこれらの医薬組成物を製造するための使用も本明細書中で開示する。
【０１２３】
実施形態において、医薬組成物はワクチンであってもよい。ワクチンは、免疫応答を増強するための１つもしくはそれ以上のアジュバントをさらに含み得る。好適なアジュバン
トとしては、例えば、限定されるものではないが、サポニン、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油または炭化水素エマルジョン、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、コリネバクテリウム・パルバム、および合成アジュバントＱＳ−２１などの表面活性物質が挙げられる。場合によって、ワクチンは１つもしくはそれ以上の免疫賦活性分子をさらに含んでもよい。免疫賦活性分子の非限定的例としては、免疫賦活性、免疫増強活性、および炎症促進活性を有する様々なサイトカイン、リンホカインおよびケモカイン、例えばインターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）；成長因子（例えば、顆粒球−マクロファージ（ＧＭ）−コロニー刺激因子（ＣＳＦ））；および他の免疫賦活性分子、例えばマクロファージ炎症性因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１；Ｂ７．２などが挙げられる。
【０１２４】
さらなる態様において、本発明は、薬物療法で使用するための本明細書中で記載する核酸調節エレメント、核酸発現カセット、ベクター、または医薬組成物に関する。
【０１２５】
本明細書中で使用する場合、「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、治療的処置および予防もしくは防止的手段の両方を指す。有益または所望の臨床結果としては、限定されるものではないが、検出可能であるかまたは検出不可能であるかを問わず、望ましくない臨床状態または障害の予防、障害の発生の減少、障害に関連する症状の軽減、障害の程度の縮小、障害の安定化した（すなわち、悪化しない）状態、障害の進行の遅延または減速、障害の状態の寛解または緩和、軽快（部分的または全体的を問わず）、またはそれらの組み合わせが挙げられる。「治療」は、治療を受けていない場合に予想される生存と比較して、生存期間の延長も意味し得る。
【０１２６】
本明細書中で使用する場合、「治療的処置」または「療法」などという用語は、目的が、対象の身体またはその要素を望ましくない生理学的変化または障害から望ましい状態、例えば比較的軽度または不快でない状態にすること（例えば、寛解もしくは緩和）、またはその正常で健康な状態に戻すこと（例えば、対象の健康、身体的完全性および肉体の健康を回復すること）、前記望ましくない生理学的変化または障害で保持すること（例えば、安定化、すなわち悪化しない）、または前記望ましくない生理学的変化もしくは障害、例えば内皮細胞に関連する疾患もしくは障害と比較して、より重篤または悪化した状態への進行を防止または減速することである処置を指す。
【０１２７】
本明細書中で使用する場合、「防止（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」、「防止的処置（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「予防的処置（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」などの用語は、前記疾患または障害で苦しむ前に、それに関連する疾患または障害または症状の重篤度を軽減することを含む、疾患または障害の開始を防止することを包含する。そのような苦痛に先立つ防止または軽減は、疾患または障害の明らかな症状に苦しんでいる投与時ではない患者へ、本明細書中で記載する核酸調節エレメント、核酸発現カセット、ベクター、または医薬組成物を投与することを指す。「防止する（Ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」とは、例えば再発を防止すること、すなわち改善の期間後に疾患または障害の再発防止も包含する。実施形態において、本明細書中で記載する配列番号１〜３３のいずれか１つによる核酸調節エレメント、核酸発現カセット、ベクター、または医薬組成物を遺伝子治療、特に内皮細胞指向性遺伝子治療で使用することができる。
【０１２８】
本明細書中で記載する配列番号１〜３３のいずれか１つによる核酸調節エレメント、核酸発現カセット、ベクター、または医薬組成物の、遺伝子治療、特に内皮細胞指向性遺伝子治療のための薬物の製造のための使用も本明細書中で開示する。
【０１２９】
遺伝子治療、特に、前記遺伝子治療を必要とする対象における内皮細胞指向性遺伝子治療のための方法であって：
・対象中に、特に前記対象の内皮細胞または組織中に、本明細書中で記載する核酸発現カセット、ベクターまたは医薬組成物であって、プロモータおよび導入遺伝子に作動可能に連結された、配列番号１〜３３のいずれか１つによる核酸調節エレメントを含む、前記核酸発現カセット、ベクターまたは医薬組成物を導入し；そして
・対象において、特に前記対象の内皮組織または細胞において治療有効量の導入遺伝子産物を発現することを含む方法も本明細書中で開示する。
【０１３０】
導入遺伝子産物は、導入することができる以下の導入遺伝子のいずれか１つであってよい：分泌可能なタンパク質、特に分泌可能な治療用タンパク質、例えば肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）、凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）、凝固因子ＸＩ（ＦＸＩ）、組織因子（ＴＦ）、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＶＥＧＦ、ＰＬＧＦ、ＦＧＦ、ｓＦＬＴ１、α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ａｐｏＡ−Ｉ）、インスリン、エリスロポエチン、リポタンパク質リパーゼ、抗体またはナノボディ、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、血漿因子など。治療用タンパク質は構造タンパク質であってもよい。構造タンパク質、特に、血管弛緩、血管収縮またはアテローム性動脈硬化症を調節するタンパク質を含む治療用構造タンパク質の非限定的例。好ましい実施形態において、導入遺伝子は一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）を含む。
【０１３１】
あるいは、導入遺伝子産物はＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ、またはヌクレアーゼ、例えばＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９または類似のＤＮＡもしくはＲＮＡ編集システムであってよい。
【０１３２】
本明細書中で記載する核酸調節エレメント、核酸発現カセット、ベクター、または医薬組成物を使用する遺伝子治療から恩恵を受けることができる例示的疾患および障害としては、肝臓疾患、血友病Ａ、フォン・ヴィルブランド病、微小血管血栓症、血栓性血小板減少性紫斑病、末梢血管疾患、冠状動脈疾患、アテローム硬化性疾患、脳卒中、心臓疾患、糖尿病、インスリン抵抗性、慢性腎不全、腫瘍増殖、転移、静脈血栓症、虚血、腫瘍成長、腫瘍血管新生、がんおよびウイルス感染性疾患、例えばエボラ、デング熱およびデング出血熱が挙げられる。
【０１３３】
遺伝子治療プロトコルは、当該技術分野において広範に記載されている。これらには、プラスミドの筋肉内注射（裸のまたはリポソーム中）、筋肉、間質注射、気道内点滴、内皮への塗布、肝内実質、および静脈内または動脈内投与を含む様々な組織における水力学的遺伝子送達が含まれるが、これらに限定されるものではない。様々な装置が標的細胞に対するＤＮＡの利用可能性を増強するために開発されている。簡単なアプローチは、ＤＮＡを含むカテーテルまたは植込み型の材料と標的細胞を物理的に接触させることである。別のアプローチは、高圧下で標的組織中に直接液体のカラムを発射する無針ジェット注射装置を利用することである。これらの送達パラダイムはベクターを送達するためにも使用できる。標的化された遺伝子送達のための別のアプローチは、核酸を細胞に対して特異的標的化のために核酸結合剤またはＤＮＡ結合剤を結合させたタンパク質または合成リガンドからなる分子複合体の使用である（Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。実施形態において、本明細書中で記載する核酸調節エレメント、核酸発現カセット、ベクター、または医薬組成物は、ワクチンとして使用するため、さらに詳細には予防ワクチンとして使用するためのものであってよい。
【０１３４】
薬物またはワクチンの製造のため、特に予防ワクチンの製造のための、本明細書中で記載する核酸調節エレメント、核酸発現カセット、ベクター、または医薬組成物の使用も本
明細書中で開示する。
【０１３５】
前記ワクチン接種を必要とする対象のワクチン接種、特に予防接種の方法であって：
・対象において、特に対象の内皮組織または細胞において、本明細書中で記載する核酸発現カセット、ベクターまたは医薬組成物であって、プロモータおよび導入遺伝子に作動可能に連結された、配列番号１〜３３のいずれか１つによる核酸調節エレメントを含む前記核酸発現カセット、ベクターまたは医薬組成物を導入し；そして
・対象において、特に前記対象の内皮細胞または組織において導入遺伝子産物の免疫学上有効な量を発現させることを含む方法も開示する。
【０１３６】
本明細書中で使用する場合、「治療を必要とする対象」などの表現は、記載した疾患または障害の治療から恩恵を受ける対象を含む。そのような対象には、限定されるわけではないが、前記疾患または障害と診断されたもの、前記疾患もしくは障害を罹患もしくは発症しやすいものおよび／または前記疾患もしくは障害が予防されるものが含まれ得る。
【０１３７】
「対象」および「患者」という語は、本明細書中で交換可能に用いられ、動物、好ましくは脊椎動物、さらに好ましくは哺乳類を指し、具体的にはヒト患者および非ヒト哺乳類が挙げられる。「哺乳類」対象には、限定されるものではないが、ヒト、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌ）、商業用動物、家畜（ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌ）、動物園の動物、競技用動物（ｓｐｏｒｔ  ａｎｉｍａｌ）、ペットおよび実験動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、ウシ；霊長類、例えば類人猿、サル、オランウータン、およびチンパンジー；イヌ科動物、例えばイヌおよびオオカミ；ネコ科動物、例えばネコ、ライオン、およびトラ；ウマ科動物、例えばウマ、ロバ、およびシマウマ；食用動物、例えばウシ、ブタ、およびヒツジ；有蹄動物、例えばシカおよびキリン；げっ歯類、例えばマウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなどが含まれる。好ましい患者または対象はヒト対象である。
【０１３８】
「治療量」または「治療有効量」は、本明細書中で使用する場合、対象において疾患または障害を治療するために、すなわち、所望の局所または全身性効果を得るために有効な遺伝子産物の量を指す。したがって、この用語は、研究者、獣医、医師または他の臨床医が求める、組織、系、動物、またはヒトにおける生物学的または医学的応答を誘発する遺伝子産物の量を指す。そのような量は、典型的には遺伝子産物および疾患の重篤度に依存するが、おそらくはルーチン的な実験を通して当業者で決定できる。
【０１３９】
「免疫学上有効な量」は、本明細書中で用いられる場合、（導入）遺伝子によってコードされた免疫原へのその後の曝露に対して対象の免疫応答を増強するために有効な（導入）遺伝子産物の量を指す。例えば粥腫中和、補体結合反応、酵素結合免疫吸着測定法、またはマイクロ中和アッセイにより分泌および／または血清抗体を中和する量を測定することによって、誘導された免疫のレベルを決定することができる。
【０１４０】
典型的には、本明細書中で記載する発現カセットまたはベクターを用いる（すなわち、少なくとも１つの核酸調節エレメントを用いた）場合、発現される（導入）遺伝子産物の量は、同一の発現カセットまたはベクターを使用するが、その中に核酸調節エレメントを含まない場合よりも高い。さらに詳細には、発現は、核酸調節エレメントを含まない同じ核酸発現カセットまたはベクターと比較した場合の少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、またはさらには少なくとも６０倍の高さである。好ましくは、より高い発現は、内皮組織または細胞に対して特異的なままである。さらに、本明細書中に記載する発現カセットおよびベクターは、長期間遺伝子産物の治療量の発現を行う。典型的には、治療的発現は、少なくとも２０日、少なくとも５０日、少なくとも１００日、少なくとも２００
日、そして場合によっては３００日以上持続することが想定される。遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）の発現は、例えば抗体に基づくアッセイ、例えばウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡアッセイによって、例えば遺伝子産物の治療的発現が達成されるか否かを評価するための任意の当該技術分野で認められている手段によって測定することができる。遺伝子産物の発現はまた、遺伝子産物の酵素活性または生物学的活性を検出するバイオアッセイで測定することができる。
【０１４１】
内皮細胞を形質移入するかもしくは形質導入するための、配列番号１〜３３による核酸調節エレメント、または核酸発現カセット、または核酸調節エレメントを含む本明細書中で開示するベクターの使用も本明細書中で開示する。
【０１４２】
内皮細胞において導入遺伝子産物を発現するための、配列番号１〜３３による核酸調節エレメントを含む、本明細書中で開示する核酸発現カセットまたはベクターの使用を本明細書中でさらに開示し、前記核酸発現カセットまたは前記ベクターは、プロモータおよび導入遺伝子に作動可能に連結された本明細書中で開示する前記核酸調節エレメントを含む。
【０１４３】
内皮細胞において導入遺伝子産物を発現するための方法であって：
・本明細書中で開示する核酸発現カセットまたはベクターであって、プロモータおよび導入遺伝子に作動可能に連結された配列番号１〜３３のいずれか１つによる核酸調節エレメントを含む前記核酸発現カセットまたは前記ベクターを用いて形質移入するかまたは形質導入し；そして
・前記細胞において導入遺伝子産物を発現すること
を含む方法を本明細書中でさらに開示する。
【０１４４】
内皮細胞の非ウイルス形質移入またはウイルスベクター媒介形質導入は、インビトロ、エクスビボまたはインビボ手順で実施することができる。インビトロアプローチは、内皮細胞、例えば対象からあらかじめ集めた細胞、細胞株または例えば誘導多能性幹細胞または胚細胞から分化した細胞のインビトロ形質移入または形質導入を必要とする。エクスビボアプローチは、対象からの内皮細胞の収集、インビトロ形質移入または形質導入、および場合によって対象に形質移入された細胞を再導入することを必要とする。インビボアプローチは本明細書中で開示する核酸発現カセットまたはベクターの対象への投与を必要とする。好ましい実施形態において、内皮細胞の形質移入はインビトロまたはエクスビボで実施される。
【０１４５】
本明細書中で開示される核酸調節エレメント、核酸発現カセットおよびベクターの使用には、例えば内皮細胞前駆体または内皮細胞への幹細胞の有効な分化、内皮細胞またはそれらの前駆体におけるタンパク質の過剰発現用のトランスジェニックモデルなど、遺伝子治療を越えた意味があることは当業者には理解される。
【０１４６】
本発明を以下の非限定的例でさらに説明する。
【実施例】
【０１４７】
実施例１：内皮細胞特異的核酸調節エレメントの同定
高度に発現された内皮細胞遺伝子を同定するために、いくつかのステップに従った。まず、内皮細胞において高度に発現される遺伝子のリストを、内皮に限定される遺伝子として同定された１０４の遺伝子を示すＢｈａｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０の刊行物（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２０１０、１１：３４２）から入手した。続いて、内皮限定遺伝子の発現の特異性および頑強性を遺伝子発現分析の参考データベース（ＲｅｆＥｘＡ）に基づいて、６種類の内皮細胞（すなわち、ＬＳＥＣ：肝臓類洞内皮細胞、ＨＣＡＥＣ：冠状動脈
内皮細胞、ＨＭＶＥＣ：皮膚微小血管内皮細胞、ＨＵＶＥＣ：ヒト臍帯静脈内皮細胞、ＩＥｎ：腸骨動脈内皮細胞、ＲＥ：網膜内皮細胞）のものと比較した。高度に発現され、これらの典型的な内皮細胞タイプ間で特異的な１１の遺伝子（表１）をこの内皮限定遺伝子リストから同定した。その結果、これらの１１の遺伝子を次に、内皮特異的シス−調節エレメント（ＣＲＥ：表２）を設計するために使用した。
【０１４８】
【表１】
2018538003.tif 000002
【０１４９】
候補ＣＲＥは、ｉ）高ＤＮａｓｅ過敏性部位；ｉｉ）オープンクロマチン（アセチル化、メチル化）と関連する高含有量のエピジェネティックなマーカー；ｉｉｉ）高含有量の転写因子結合部位；ｉｖ）強力な進化的保存に基づく、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（ＵＣＳＣ）ゲノムブラウザデータベースを使用して選択した。理想的なＣＲＥは、予想されるモチーフとＤＮａｓｅクラスターとの共存、脊椎動物における高い保存レベル、および明白なヒストン改変パターンを示すことが予想された。したがって、２８の潜在的なＣＲＥ配列をそれらの基準（図１および表２）に基づいて選択した。
【０１５０】
【表２−１】
2018538003.tif 000003
【表２−２】
2018538003.tif 000004
【表２−３】
2018538003.tif 000005
【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１０】
2018538003.tif 000012
【０１５１】
あるいは、実験的に検証された遺伝子エンハンサー活性を有するヒトおよびマウス非コーディングフラグメントの主要な情報源であるＶＩＳＴＡエンハンサーブラウザ（ｈｔｔｐ：／／ｅｎｈａｎｃｅｒ．ｌｂｌ．ｇｏｖ）も適用した。これは、血管における高発現に関連した予測されるＤＮＡエレメントも提供した。ＶＩＳＴＡから予測された配列を、マウス胚染色を用いて検証されたデータに基づいて選択した。これらの検証データから最大３つのＶＩＳＴＡ配列を選択した。しかしながら、ＤＮＡフラグメントサイズは、ウイルスベクターに入れるには大きすぎるので、選択された配列を、前記基準を使用するＵＣＳＣゲノムブラウザを使用してサブフラグメントにさらに縮小または分離した。これにより、３つの選択されたＶＩＳＴＡ配列に由来する５つのＣＲＥが得られた（表３）。内皮特異的ＣＲＥ配列はすべて、インビトロおよびインビボの両方でさらに検証して、内皮細胞におけるそれらの特異性および頑強性を調べた。
【０１５２】
【表３−１】
2018538003.tif 000013
【表３−２】
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【表３−３】
2018538003.tif 000015
【０１５３】
実施例２：インビトロでのヒト内皮細胞のレンチウイルス形質導入
潜在的な内皮細胞特異的ＣＲＥを検証するために、我々はまず頑強な内皮特異的プロモータを検証した。選択された内皮細胞特異的ＣＲＥをこのプロモータの上流にクローニングした。我々は、ヒトＣＤＨ５プロモータ（１，３０３ｂｐ）およびヒトＥＤＮ１プロモータ（４５５ｂｐ）などのいくつかのヒト内皮特異的プロモータを同定した（ＣＤＨ５の配列はＧｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ．ｃｏｍ）から取得し、ＥＤＮ１ミニプロモータについては、ＣＲＥをＵＣＳＣから選択するのと同じコンセプトを用いてプロモータ配列を選択した）。加えて、我々はまた、ＥＮＧプロモータ（８８８ｂｐ）、ＦＬＴ１プロモータ（１，０３７ｂｐ）、およびＩＣＡＭ２プロモータ（３９９ｂｐ）などのいくつかの市販されている内皮プロモータ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ＵＳＡ）も特定した。これらのプロモータの配列を表４に提示する。内皮特異的プロモータをＦＶＩＩＩまたはＧＦＰレポーター遺伝子の上流のレンチウイルスベクタープラスミドにクローニングした（図２）。
９つの異なるレンチウイルス構築物を、従来型クローニングにより生成した（以下のように表示する：
１）ｐＬＶＸ−ＣＭＶ−ＧＦＰ（配列番号４０）、
２）ｐＬＶＸ−ＣＭＶ−ＦＶＩＩＩ（配列番号４１）、
３）ｐＬＶＸ−ｈＥＤＮ１ｍｉｎｉ−ＦＶＩＩＩ（配列番号４２）、
４）ｐＬＶＸ−ｈＥＤＮ１ｍｉｎｉ−Ｋｏｚａｋ−ＦＶＩＩＩ（配列番号４３）、
５）ｐＬＶＸ−ｈＩＣＡＭ２−ＦＶＩＩＩ（配列番号４４）、
６）ｐＬＶＸ−ｈＩＣＡＭ２−Ｋｏｚａｋ−ＦＶＩＩＩ（配列番号４５）
７）ｐＬＶＸ−ｈＩＣＡＭ２−Ｋｏｚａｋ−Ｌｕｃ２（配列番号４６）
８）ｐＬＶＸ−ＥＣ−ＣＲＥ−ｈ（ｕｍａｎ）ＩＣＡＭ２−Ｋｏｚａｋ−Ｌｕｃ２（配列番号４７）
９）ｐＬＶＸ−ＥＣ−ＣＲＥ−ｈ（ｕｍａｎ）ＩＣＡＭ２−Ｋｏｚａｋ−ＦＶＩＩＩ（配列番号４８）。ｐＬＶＸはまた、ｐＣＤＨ骨格または別の（ｌｅｎｔｉ）ウイルス骨格でもあり得る。
【０１５４】
【表４−１】
2018538003.tif 000016
【表４−２】
2018538003.tif 000017
【表４−３】
2018538003.tif 000018
【表４−４】
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【表４−５】
2018538003.tif 000020
【０１５５】
Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、真核性ｍＲＮＡ中に存在し、翻訳開始を増強することによって発現を改善することが知られている。それ故、我々は、レンチウイルスベクタープラスミド内のＦＶＩＩＩまたはＬＵＣ２遺伝子の上流にＫｏｚａｋコンセンサス配列（すなわち、ＧＣＣＡＣＣ、配列番号３９）を導入する。
【０１５６】
ＨＵＶＥＣまたはＬＳＥＣを感染多重度（ＭＯＩ）＝５０で形質導入した。培養培地を２４、４８、および７２時間で集め、そしてＦＶＩＩＩレベルを続いて馴化培地中で、ヒトＦＶＩＩＩ特異的ＥＬＩＳＡを製造業者（Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍｅ）の指示に従って使用して測定した。フローサイトメトリーを使用して、結果は、非形質導入ＨＵＶＥＣと比べてＨＵＶＥＣおよびＬＳＥＣ細胞のほぼ９０％超が形質導入されたことを示した（図３）。比較的頑強なＦＶＩＩＩ発現は、ＣＭＶ、ＩＣＡＭ２およびＥＤＮ１ｍｉｎｉを用いて形質導入されたＨＵＶＥＣおよびＬＳＥＣで達成することができた。Ｋｏｚａｋ翻訳コンセンサス配列はＦＶＩＩＩ発現レベルを有意に増強した（図４）。特に、Ｋｏｚａｋコンセンサス最適化ＩＣＡＭ２構築物は、ＨＵＶＥＣおよびＬＳＥＣの両方で最高のＦＶＩＩＩ発現をもたらした。これらの結果は、内皮細胞における選択されたプロモータの頑強さを裏付けた。
【０１５７】
実施例３：形質移入されたＨＵＶＥＣにおける内皮特異的（ＥＣ）ＣＲＥのインビトロ検証
ゲノムワイドのコンピュータ解析によって同定された異なるＥＣ−ＣＲＥが、ＥＣ特異的ヒトＩＣＡＭ２プロモータとカップリングした場合に増強したＦＶＩＩＩ発現をもたらすか否かを検証するために、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を対応するレンチウイルスベクター構築物で、インビトロで形質移入した：ＥＣ−ＣＲＥを用いたｐＣＤＨ−ＥＣ−ＣＲＥ−ＩＣＡＭ２−ＦＶＩＩＩは、図５に記載する代表的な調節エレメントであり、これをｐＣＤＨレンチウイルス自己不活性化骨格においてヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を駆動するＩＣＡＭ２プロモータの上流にクローニングした。図８は、ＨＹＡＬ２−ＥＣ−ＣＲＥ
１ａ（図８Ａ−配列番号５０）、ＨＹＡＬ２−ＥＣ−ＣＲＥ１ｂ（図８Ｄ−配列番号５１）およびＩＦＩ２７−ＥＣ−ＣＲＥ１ｂ（図８Ｃ−配列番号５２）を含むそのような発現カセットの４例を示す。対照ベクター（ＥＣ−ＣＲＥを含まない）を図８Ｂ（配列番号４９）に図示する。同様に、当業者は発現ベクター骨格においてと同様の方法で他のＥＣ−ＣＲＥをクローニングすることができる。
【０１５８】
ＨＵＶＥＣを６ウェルプレートに１．５×１０５細胞／ウェルで播種し、カチオン性脂質系リポフェクタミン３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）で２４時間後に形質移入した。ＨＵＶＥＣについて、２．５マイクログラムの各プラスミドを３．７５マイクロリットルのリポフェクタミン試薬と混合した。Ｐ３０００試薬を１マイクログラムのプラスミドあたり２マイクロリットルで各プラスミドと混合し、室温で５分間インキュベートした後、ＨＵＶＥＣに添加した。形質移入の１６時間後に、細胞培養培地を除去し、次いで新鮮な培地と交換した。７２時間後、１００マイクロリットルの培養培地を集め、ヒトＦＶＩＩＩ特異的ＥＬＩＳＡ（Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍｅ）を使用したＦＶＩＩＩ定量化のために−８０℃で保存した。結果は、ＣＲＭの約７０％が、ＣＲＥのない対照レンチウイルスベクターに比べて、インビトロで形質移入されたＨＵＶＥＣにおいて増大したＦＶＩＩＩ発現をもたらすことを示した（すなわち、３２のうち２３）。（図５）。
【０１５９】
実施例４：マウスにおけるレンチウイルス形質導入後の内皮特異的（ＥＣ）ＣＲＥのインビボ検証
次に、ゲノムワイドなコンピュータ解析によって同定されたＥＣ−ＣＲＥが、インビボにおいてマウスで増強されたＦＶＩＩＩ発現をもたらすか否かを検証した。自己不活性化レンチウイルスベクターを使用して、ＥＣ特異的ヒトＩＣＡＭ２プロモータからヒトコドン使用最適化Ｂ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩを発現した。ＥＣ−ＣＲＥのＦＶＩＩＩ発現に対する影響を試験するために、ＨＹＡＬ２−ＥＣ−ＣＲＥ１ａ（配列番号５０）、ＨＹＡＬ２−ＥＣ−ＣＲＥ１ｂ（配列番号５１）およびＩＦＩ２７−ＥＣ−ＣＲＥ１ｂ（配列番号５２）エレメントを、ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を駆動するＩＣＡＭ２プロモータの上流にクローニングした。前記発現カセットは、それぞれ、ＥＣ−ＣＲＥのＨＹＡＬ２−ＥＣ−ＣＲＥ１ａ、ＨＹＡＬ２−ＥＣ−ＣＲＥ１ｂおよびＩＦＩ２７−ＥＣ−ＣＲＥ１ｂを含む。同様に、当業者は、他のＥＣ−ＣＲＥを、発現ベクター骨格においてと同様にクローニングすることができる。これらの実施例では、ｐＣＤＨ−ＩＣＡＭ２−ＦＶＩＩＩ骨格を使用する。デザインでは同じであるが、上流ＥＣ−ＣＲＥのないレンチウイルスベクターを対照（配列番号４９）として使用して、ＦＶＩＩＩ発現レベルを比較した。レンチウイルスベクター粒子は、レンチウイルスベクターおよびヘルパープラスミド（Ｃｙａｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いたＨＥＫ２９３パッケージング細胞の一過性の同時形質移入によって製造した。ベクター力価を測定し、１ｍｌ当たりの形質導入単位（ＴＵ／ｍｌ）で表した。レンチウイルスベクターを２日齢の新生仔ＣＢ１７−ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）の後眼窩に注射した。ベクター調製物に８０マイクロリットルの合計体積中、４０マイクログラム／ｍｌのポリブレンを追加した。１×１０８ＴＵの総ベクター量を使用した。血漿を注射の５週間後に集め、ヒトＦＶＩＩＩ特異的ＥＬＩＳＡを使用してＦＶＩＩＩを測定した。
【０１６０】
ＥＣ−ＣＲＥのない対照レンチウイルスベクターと比較してＥＣ−ＣＲＥが存在する場合、インビボでＦＶＩＩＩ発現において有意な増加が検出された（図６）。特に、ＥＣ−ＣＲＥのない対照レンチウイルスベクター（ＩＣＡＭ２−ＦＶＩＩＩ）と比較して、ＩＦＩ２７−ＥＣ−ＣＲＥ１ｂを含むレンチウイルスベクターを用いたインビボ形質導入後にＦＶＩＩＩにおいて２７倍の増加を検出することができた。同様に、ＨＹＡＬ２−ＥＣ−ＣＲＥ１ａもＦＶＩＩＩ発現を増強したが、その程度はより低かった（５倍）。これは、ＥＣ−ＣＲＥのない対照（ＩＣＡＭ２−ＦＶＩＩＩ）と比較して、ＩＦＩ２７−ＥＣ−ＣＲＥ１ｂおよびＨＹＡＬ２−ＥＣ−ＣＲＥ１ａベクターを用いたインビトロＨＵＶＥＣ形
質移入後の増加したＦＶＩＩＩ発現と一致する（図５）。ＨＹＡＬ２−ＥＣ−ＣＲＥ１ｂは、インビトロで形質移入されたＨＵＶＥＣにおける低レベルのＦＶＩＩＩ発現と一致して、インビボでＦＶＩＩＩ発現を増加させなかった（図５）。
【０１６１】
実施例５：レンチウイルス形質導入マウスから単離された器官由来内皮細胞におけるＥＣ−ＣＲＥによる遺伝子発現の増加の確認
マウスに、ＩＣＡＭ２−ＦＶＩＩＩ（非ＣＲＥ対照−配列番号４９）またはＩＦＩ２７−ＥＣ−ＣＲＥ１ｂ−ＩＣＡＭ２−ＦＶＩＩＩ（配列番号５２）発現カセットを含むレンチウイルスベクターを注射した。安楽死させた後、肝臓および脾臓を処理して、それらの各内皮集団（すなわち、肝臓類洞内皮細胞、脾臓内皮細胞）を得た。まず、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳディソシエータ（製品番号１３０−０９３−２３５、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を製造業者のプロトコルにしたがって使用して肝臓および脾臓組織から単一細胞懸濁液を得た（肝臓分離キット：製品コード：１３０−１０５−８０７；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ．−ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ．ｃｏｍ／ｅｎ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ−ａｎｄ−ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｍａｃｓ−ｓａｍｐｌｅ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ／ｓａｍｐｌｅ−ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ／ｔｉｓｓｕｅ−ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ−ｋｉｔｓ／ｌｉｖｅｒ−ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ−ｋｉｔ−ｍｏｕｓｅ．ａｓｐｘ）、脾臓（脾臓分離キット：製品コード：１３０−０９５−９２６；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ．−ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ．ｃｏｍ／ｅｎ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ−ａｎｄ−ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｍａｃｓ−ｓａｍｐｌｅ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ／ｓａｍｐｌｅ−ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ／ｔｉｓｓｕｅ−ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ−ｋｉｔｓ／ｓｐｌｅｅｎ−ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ−ｋｉｔ−ｍｏｕｓｅ．ａｓｐｘ）。
【０１６２】
続いて、各器官からの単一細胞懸濁液をＭＡＣＳ細胞分離技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に供して、各内皮集団を選別した。したがって、肝臓および脾臓から得た単一細胞懸濁液を、製造業者の指示に従ってＣＤ１４６マイクロビーズで標識し（Ｐｒｏｄｕｃｔコード：１３０−０９２−００７；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ．−ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ．ｃｏｍ／ｅｎ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ−ａｎｄ−ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｍａｃｓ−ｃｅｌｌ−ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ／ｃｅｌｌ−ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ−ｒｅａｇｅｎｔｓ／ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−ｃｅｌｌｓ／ｃｄ１４６−ｌｓｅｃ−ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ−ｍｏｕｓｅ．ａｓｐｘ）、各々の肝臓由来および脾臓内皮細胞の正の選択を可能にした。１〜１．６×１０６のＣＤ１４６陽性内皮細胞を肝臓から得、６．９〜８．１×１０５のＣＤ１４６陽性内皮細胞を脾臓から得た。成長因子を追加した内皮基本培地２００マイクロリットル中に、２５０００細胞／ウェルの密度で、単離された細胞を４８ウェルプレートに播種した。
【０１６３】
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用して、細胞から全ＲＮＡを単離した。単離されたＲＮＡ濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  １０００（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して測定した。製造業者の指示に従って、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、７５ｎｇ〜３５ｎｇの単離されたＲＮＡからＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して合成した。ｑＲＴ−ＰＣＲは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲミックス（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、ｑＰＣＲ  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ／ＣＡ、ＵＳＡ）中で、ＦＶＩＩＩ特異的プライマー５’−ＡＡＣＧＧＣＴＡＣＧＴＧＡＡＣＡＧＡＡＧ−３’（フォワード−配列番号５３）および５’−ＧＡＴＡＧＧＧＣＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＧＣ−３’（リバース−配列番号５４）を用いて実施した。発現レベルは、フォワードプライマー５’−ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ−３’（配列番号５５）およびリバースプライマー５’−ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴ
Ｃ−３’（配列番号５６）を用いることによって得られる、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）ｍＲＮＡ発現に対して正規化した。
【０１６４】
結果は、ＩＣＡＭ２−ＦＶＩＩＩ対照と比較して、ＩＦＩ２７−ＥＣ−ＣＲＥ１ｂ−ＩＣＡＭ２−ＦＶＩＩＩカセットを含むレンチウイルスベクターを注射されたマウスにおいて増大したＦＶＩＩＩ  ｍＲＮＡレベルによって反映されるように、ＩＦＩ２７−ＥＣ−ＣＲＥ１ｂエレメントが肝臓または脾臓から得られるＣＤ１４６陽性内皮細胞においてＦＶＩＩＩ発現を増強したことを示す（図７）。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018538003.tif 000034
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