(57)【要約】  本発明は、複数の標的に結合する能力を有する４価の二重特異性抗原結合タンパク質及び４価の四重特異性抗原結合タンパク質に関する。二重特異性の抗原結合タンパク質を含む医薬組成物、及び四重特異性の抗原結合タンパク質を含む医薬組成物、ならびにそれらの産生方法も開示される。
2018529764.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重特異性の４価抗原結合タンパク質であって、
ａ）第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）及び第１のＣＨ１ドメインを含む第１の抗体の第１の重鎖を含む第１のポリペプチドであって、前記第１の抗体が、第１の抗原に特異的に結合し、第２の抗体の第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含むポリペプチドのＮ末端に前記第１の重鎖がそのＣ末端を介して融合され、第２のＣＨ１ドメインのＮ末端に前記ＶＨ２がそのＣ末端を介して融合され、前記第２の抗体が第２の抗原に特異的に結合し、
ｉ）前記ＶＨ１又は第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３９、位置４４、及び位置１８３からなる群から選択される残基に正に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、かつ
ｉｉ）前記ＶＨ２又は第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３９、位置４４、及び位置１８３に対応する残基からなる群から選択される残基に負に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、
前記第１のポリペプチドと、
ｂ）ａ）に記載の第１の抗体の第１の軽鎖を含む第２のポリペプチドであって、前記第１の軽鎖が、第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１のＣＬ領域を含み、前記ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３８、位置１００、及び位置１７６からなる群から選択される残基に負に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、
前記第２のポリペプチドと、
ｃ）ａ）に記載の第２の抗体の第２の軽鎖を含む第３のポリペプチドであって、前記第２の軽鎖が、第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２のＣＬ領域を含み、前記ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３８、位置１００、及び位置１７６からなる群から選択される残基に正に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、
前記第３のポリペプチドと、
を含む、抗原結合タンパク質。
【請求項２】
前記第１の重鎖が、ペプチドリンカーを介して前記ＶＨ２に融合される、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３】
前記ペプチドリンカーが、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）６、及び（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項４】
ａ）前記ＶＨ１又は第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｋ、Ｇ４４Ｋ、及びＳ１８３Ｋからなる群から選択される変異を含み、
ｂ）前記ＶＨ２又は第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｅ、Ｇ４４Ｅ、及びＳ１８３Ｅからなる群から選択される変異を含み、
ｃ）前記ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｅ、Ｇ１００Ｅ、及びＳ１７６Ｅからなる群から選択される変異を含み、かつ
ｄ）前記ＶＬ２又は第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｋ、Ｇ１００Ｋ、及びＳ１７６Ｋからなる群から選択される変異を含む、
請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項５】
ａ）前記第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｋ変異を含み、
ｂ）前記第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｅ変異を含み、
ｃ）前記第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｅ変異を含み、かつ
ｄ）前記第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｋ変異を含む、
請求項４に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項６】
ａ）前記ＶＨ１が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｋ変異を含み、前記第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｋ変異を含み、
ｂ）前記ＶＨ２が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｅ変異を含み、前記第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｅ変異を含み、
ｃ）前記ＶＬ１が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｅ変異を含み、前記第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｅ変異を含み、かつ
ｄ）前記ＶＬ２が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｋ変異を含み、前記第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｋ変異を含む、
請求項４に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項７】
ａ）前記第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｋ変異及びＳ１８３Ｋ変異を含み、
ｂ）前記第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｅ変異及びＳ１８３Ｅ変異を含み、
ｃ）前記第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｅ変異及びＳ１７６Ｅ変異を含み、かつ
ｄ）前記第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｋ変異及びＳ１７６Ｋ変異を含む、
請求項４に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項８】
二重特異性の４価抗原結合タンパク質であって、
ａ）第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）及び第１のＣＨ１ドメインを含む第１の抗体の第１の重鎖を含む第１のポリペプチドであって、前記第１の抗体が第１の抗原に特異的に結合し、第２の抗体の第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含むポリペプチドのＮ末端に前記第１の重鎖がそのＣ末端を介して融合され、第２のＣＨ１ドメインのＮ末端に前記ＶＨ２がそのＣ末端を介して融合され、前記第２の抗体が第２の抗原に特異的に結合し、
ｉ）前記ＶＨ１又は第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３９、位置４４、及び位置１８３からなる群から選択される残基に負に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、かつ
ｉｉ）前記ＶＨ２又は第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３９、位置４４、及び位置１８３に対応する残基からなる群から選択される残基に正に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、
前記第１のポリペプチドと、
ｂ）ａ）に記載の第１の抗体の第１の軽鎖を含む第２のポリペプチドであって、前記第１の軽鎖が、第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１のＣＬ領域を含み、前記ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３８、位置１００、及び位置１７６からなる群から選択される残基に正に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、
前記第２のポリペプチドと、
ｃ）ａ）に記載の第２の抗体の第２の軽鎖を含む第３のポリペプチドであって、前記第２の軽鎖が、第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２のＣＬ領域を含み、前記ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３８、位置１００、及び位置１７６からなる群から選択される残基に負に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、
前記第３のポリペプチドと、
を含む、抗原結合タンパク質。
【請求項９】
前記第１の重鎖が、ペプチドリンカーを介して前記ＶＨ２に融合される、請求項８に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
前記ペプチドリンカーが、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）６、及び（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６からなる群から選択される配列を含む、請求項９に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
ａ）前記ＶＨ１又は第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｅ、Ｇ４４Ｅ、及びＳ１８３Ｅからなる群から選択される変異を含み、
ｂ）前記ＶＨ２又は第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｋ、Ｇ４４Ｋ、及びＳ１８３Ｋからなる群から選択される変異を含み、
ｃ）前記ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｋ、Ｇ１００Ｋ、及びＳ１７６Ｋからなる群から選択される変異を含み、かつ
ｄ）前記ＶＬ２又は第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｅ、Ｇ１００Ｅ、及びＳ１７６Ｅからなる群から選択される変異を含む、
請求項８に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
ａ）前記第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｅ変異を含み、
ｂ）前記第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｋ変異を含み、
ｃ）前記第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｋ変異を含み、かつ
ｄ）前記第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｅ変異を含む、
請求項１１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１３】
ａ）前記ＶＨ１が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｅ変異を含み、前記第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｅ変異を含み、
ｂ）前記ＶＨ２が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｋ変異を含み、前記第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｋ変異を含み、
ｃ）前記ＶＬ１が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｋ変異を含み、前記第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｋ変異を含み、かつ
ｄ）前記ＶＬ２が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｅ変異を含み、前記第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｅ変異を含む、
請求項１１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１４】
ａ）前記第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｅ変異及びＳ１８３Ｅ変異を含み、
ｂ）前記第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｋ変異及びＳ１８３Ｋ変異を含み、
ｃ）前記第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｋ変異及びＳ１７６Ｋ変異を含み、かつ
ｄ）前記第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｅ変異及びＳ１７６Ｅ変異を含む、
請求項１１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１５】
二重特異性の４価抗原結合タンパク質であって、
ａ）第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）及び第１のＣＨ１ドメインを含む第１の抗体の第１の重鎖を含む第１のポリペプチドであって、前記第１の抗体が第１の抗原に特異的に結合し、第２の抗体の第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含むポリペプチドのＮ末端に前記第１の重鎖がそのＣ末端を介して融合され、第２のＣＨ１ドメインのＮ末端に前記ＶＨ２がそのＣ末端を介して融合され、前記第２の抗体が第２の抗原に特異的に結合し、
ｉ）前記ＶＨ１又は第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３９、位置４４、及び位置１８３からなる群から選択される残基に荷電アミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、かつ
ｉｉ）前記ＶＨ２又は第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３９、位置４４、及び位置１８３に対応する残基からなる群から選択される残基に荷電アミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、前記電荷が前記第１の重鎖の前記ＶＨ１又は第１のＣＨ１の前記置換残基のものとは反対のものである、
前記第１のポリペプチドと、
ｂ）ａ）に記載の第１の抗体の第１の軽鎖を含む第２のポリペプチドであって、前記第１の軽鎖が、第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１のＣＬ領域を含み、前記ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３８、位置１００、及び位置１７６からなる群から選択される残基に荷電アミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、
位置３８の電荷が、前記第１の重鎖の前記ＶＨ１又は第１のＣＨ１の位置３９の置換残基のものとは反対のものであり、位置１００の電荷が、前記第１の重鎖の前記ＶＨ１又は第１のＣＨ１の位置４４の置換残基のものとは反対のものであり、位置１７６の電荷が、前記第１の重鎖の前記ＶＨ１又は第１のＣＨ１の位置１８３の置換残基のものとは反対のものである、
前記第２のポリペプチドと、
ｃ）ａ）に記載の第２の抗体の第２の軽鎖を含む第３のポリペプチドであって、前記第２の軽鎖が、第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２のＣＬ領域を含み、前記ＶＬ２又は第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３８、位置１００、及び位置１７６からなる群から選択される残基に荷電アミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、
位置３８の電荷が、前記第２の重鎖の前記ＶＨ２又は第２のＣＨ１の位置３９の置換残基のものとは反対のものであり、位置１００の電荷が、前記第２の重鎖の前記ＶＨ２又は第２のＣＨ１の位置４４の置換残基のものとは反対のものであり、位置１７６の電荷が、前記第２の重鎖の前記ＶＨ２又は第２のＣＨ１の位置１８３の置換残基のものとは反対のものである、
前記第３のポリペプチドと、
を含む、前記抗原結合タンパク質。
【請求項１６】
前記第１の重鎖が、ペプチドリンカーを介して前記ＶＨ２に融合される、請求項１５に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１７】
前記ペプチドリンカーが、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）６、及び（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６からなる群から選択される配列を含む、請求項１６に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１８】
ａ）前記ＶＨ１が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｅ変異を含み、前記第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｋ変異を含み、
ｂ）前記ＶＨ２が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｋ変異を含み、前記第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｅ変異を含み、
ｃ）前記ＶＬ１が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｋ変異を含み、前記第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｅ変異を含み、かつ
ｄ）前記ＶＬ２が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｅ変異を含み、前記第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｋ変異を含む、
請求項１５に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１９】
ａ）前記第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｅ変異及びＳ１８３Ｋ変異を含み、
ｂ）前記第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｋ変異及びＳ１８３Ｅ変異を含み、
ｃ）前記第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｋ変異及びＳ１７６Ｅ変異を含み、かつ
ｄ）前記第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｅ変異及びＳ１７６Ｋ変異を含む、
請求項１６に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２０】
ａ）前記ＶＨ１が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｋ変異を含み、前記第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｅ変異を含み、
ｂ）前記ＶＨ２が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｅ変異を含み、前記第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｋ変異を含み、
ｃ）前記ＶＬ１が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｅ変異を含み、前記第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｋ変異を含み、かつ
ｄ）前記ＶＬ２が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｋ変異を含み、前記第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｅ変異を含む、
請求項１６に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２１】
ａ）前記第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｋ変異及びＳ１８３Ｅ変異を含み、
ｂ）前記第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｅ変異及びＳ１８３Ｋ変異を含み、
ｃ）前記第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｅ変異及びＳ１７６Ｋ変異を含み、かつ
ｄ）前記第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｋ変異及びＳ１７６Ｅ変異を含む、
請求項１６に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２２】
二重特異性の４価抗原結合タンパク質の調製方法であって、
１）ａ）第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）及び第１のＣＨ１ドメインを含む第１の抗体の第１の重鎖を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、前記第１の抗体が第１の抗原に特異的に結合し、第２の抗体の第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含むポリペプチドのＮ末端に前記第１の重鎖がそのＣ末端を介して融合され、第２のＣＨ１ドメインのＮ末端に前記ＶＨ２がそのＣ末端を介して融合され、前記第２の抗体が第２の抗原に特異的に結合し、
ｉ）前記ＶＨ１又は第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３９、位置４４、及び位置１８３からなる群から選択される残基に正に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、かつ
ｉｉ）前記ＶＨ２又は第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３９、位置４４、及び位置１８３に対応する残基からなる群から選択される残基に負に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、
前記第１のポリヌクレオチドと、
ｂ）ａ）に記載の第１の抗体の軽鎖を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、前記軽鎖が、第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１のＣＬ領域を含み、前記ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３８、位置１００、及び位置１７６からなる群から選択される残基に負に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、
前記第２のポリヌクレオチドと、
ｃ）ａ）に記載の第２の抗体の軽鎖を含む第３のポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドであって、前記軽鎖が、第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２のＣＬ領域を含み、前記ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３８、位置１００、及び位置１７６からなる群から選択される残基に正に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、
前記第３のポリヌクレオチドと
を宿主細胞において同時発現させる工程と、
２）前記ポリペプチドが産生する条件下で前記宿主細胞を培養する工程と、
３）前記宿主細胞から前記抗原結合タンパク質を回収する工程と
を含む、方法。
【請求項２３】
前記第１のポリヌクレオチドが、前記第１の重鎖をコードする核酸配列と前記ＶＨ２をコードする核酸配列との間に挿入される、ペプチドリンカーをコードする核酸配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ペプチドリンカーが、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）６、及び（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６からなる群から選択される配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ａ）前記ＶＨ１又は第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｋ、Ｇ４４Ｋ、及びＳ１８３Ｋからなる群から選択される変異を含み、
ｂ）前記ＶＨ２又は第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｅ、Ｇ４４Ｅ、及びＳ１８３Ｅからなる群から選択される変異を含み、
ｃ）前記ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｅ、Ｇ１００Ｅ、及びＳ１７６Ｅからなる群から選択される変異を含み、かつ
ｄ）前記ＶＬ２又は第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｋ、Ｇ１００Ｋ、及びＳ１７６Ｋからなる群から選択される変異を含む、
請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
ａ）前記第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｋ変異を含み、
ｂ）前記第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｅ変異を含み、
ｃ）前記第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｅ変異を含み、かつ
ｄ）前記第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｋ変異を含む、
請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
ａ）前記ＶＨ１が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｋ変異を含み、前記第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｋ変異を含み、
ｂ）前記ＶＨ２が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｅ変異を含み、前記第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｅ変異を含み、
ｃ）前記ＶＬ１が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｅ変異を含み、前記第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｅ変異を含み、かつ
ｄ）前記ＶＬ２が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｋ変異を含み、前記第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｋ変異を含む、
請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
ａ）前記第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｋ変異及びＳ１８３Ｋ変異を含み、
ｂ）前記第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｅ変異及びＳ１８３Ｅ変異を含み、
ｃ）前記第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｅ変異及びＳ１７６Ｅ変異を含み、かつ
ｄ）前記第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｋ変異及びＳ１７６Ｋ変異を含む、
請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
二重特異性の４価抗原結合タンパク質の調製方法であって、
１）ａ）第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）及び第１のＣＨ１ドメインを含む第１の抗体の第１の重鎖を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、前記第１の抗体が第１の抗原に特異的に結合し、第２の抗体の第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含むポリペプチドのＮ末端に前記第１の重鎖がそのＣ末端を介して融合され、第２のＣＨ１ドメインのＮ末端に前記ＶＨ２がそのＣ末端を介して融合され、前記第２の抗体が第２の抗原に特異的に結合し、
ｉ）前記ＶＨ１又は第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３９、位置４４、及び位置１８３からなる群から選択される残基に負に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、かつ
ｉｉ）前記ＶＨ２又は第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３９、位置４４、及び位置１８３に対応する残基からなる群から選択される残基に正に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、
前記第１のポリヌクレオチドと、
ｂ）ａ）に記載の第１の抗体の第１の軽鎖を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、前記第１の軽鎖が、第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１のＣＬ領域を含み、前記ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３８、位置１００、及び位置１７６からなる群から選択される残基に正に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、
前記第２のポリヌクレオチドと、
ｃ）ａ）に記載の第２の抗体の第２の軽鎖を含む第３のポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドであって、前記第２の軽鎖が、第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２のＣＬ領域を含み、前記ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３８、位置１００、及び位置１７６からなる群から選択される残基に負に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、
前記第３のポリヌクレオチドと
を宿主細胞において同時発現させる工程と
２）前記ポリペプチドが産生する条件下で前記宿主細胞を培養する工程と、
３）前記宿主細胞から前記抗原結合タンパク質を回収する工程と
を含む、方法。
【請求項３０】
前記第１の重鎖が、ペプチドリンカーを介して前記ＶＨ２に融合される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ペプチドリンカーが、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）６、及び（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６からなる群から選択される配列を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ａ）前記ＶＨ１又は第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｅ、Ｇ４４Ｅ、及びＳ１８３Ｅからなる群から選択される変異を含み、
ｂ）前記ＶＨ２又は第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｋ、Ｇ４４Ｋ、及びＳ１８３Ｋからなる群から選択される変異を含み、
ｃ）前記ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｋ、Ｇ１００Ｋ、及びＳ１７６Ｋからなる群から選択される変異を含み、かつ
ｄ）前記ＶＬ２又は第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｅ、Ｇ１００Ｅ、及びＳ１７６Ｅからなる群から選択される変異を含む、
請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
ａ）前記第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｅ変異を含み、
ｂ）前記第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｋ変異を含み、
ｃ）前記第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｋ変異を含み、かつ
ｄ）前記第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｅ変異を含む、
請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ａ）前記ＶＨ１が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｅ変異を含み、前記第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｅ変異を含み、
ｂ）前記ＶＨ２が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｋ変異を含み、前記第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｋ変異を含み、
ｃ）前記ＶＬ１が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｋ変異を含み、前記第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｋ変異を含み、かつ
ｄ）前記ＶＬ２が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｅ変異を含み、前記第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｅ変異を含む、
請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
ａ）前記第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｅ変異及びＳ１８３Ｅ変異を含み、
ｂ）前記第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｋ変異及びＳ１８３Ｋ変異を含み、
ｃ）前記第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｋ変異及びＳ１７６Ｋ変異を含み、かつ
ｄ）前記第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｅ変異及びＳ１７６Ｅ変異を含む、
請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
二重特異性の４価抗原結合タンパク質の調製方法であって、
１）ａ）第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）及び第１のＣＨ１ドメインを含む第１の抗体の第１の重鎖を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、前記第１の抗体が第１の抗原に特異的に結合し、第２の抗体の第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含むポリペプチドのＮ末端に前記第１の重鎖がそのＣ末端を介して融合され、第２のＣＨ１ドメインのＮ末端に前記ＶＨ２がそのＣ末端を介して融合され、前記第２の抗体が第２の抗原に特異的に結合し、
ｉ）前記ＶＨ１又は第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３９、位置４４、及び位置１８３からなる群から選択される残基に荷電アミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、かつ
ｉｉ）前記ＶＨ２又は第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３９、位置４４、及び位置１８３に対応する残基からなる群から選択される残基に荷電アミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、前記電荷が前記第１の重鎖の前記ＶＨ１又は第１のＣＨ１の前記置換残基のものとは反対のものである、
前記第１のポリヌクレオチドと、
ｂ）ａ）に記載の第１の抗体の軽鎖を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、前記軽鎖が、第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１のＣＬ領域を含み、前記ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３８、位置１００、及び位置１７６からなる群から選択される残基に荷電アミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、
位置３８の電荷が、前記第１の重鎖の前記ＶＨ１又は第１のＣＨ１の位置３９の置換残基のものとは反対のものであり、位置１００の電荷が、前記第１の重鎖の前記ＶＨ１又は第１のＣＨ１の位置４４の置換残基のものとは反対のものであり、位置１７６の電荷が、前記第１の重鎖の前記ＶＨ１又は第１のＣＨ１の位置１８３の置換残基のものとは反対のものである、
前記第２のポリヌクレオチドと、
ｃ）ａ）に記載の第２の抗体の軽鎖を含む第３のポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドであって、前記軽鎖が、第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２のＣＬ領域を含み、前記ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３８、位置１００、及び位置１７６からなる群から選択される残基に正に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、
位置３８の電荷が、前記第２の重鎖の前記ＶＨ２又は第２のＣＨ１の位置３９の置換残基のものとは反対のものであり、位置１００の電荷が、前記第２の重鎖の前記ＶＨ２又は第２のＣＨ１の位置４４の置換残基のものとは反対のものであり、位置１７６の電荷が、前記第２の重鎖の前記ＶＨ２又は第２のＣＨ１の位置１８３の置換残基のものとは反対のものである、
前記第３のポリヌクレオチドと
を宿主細胞における同時発現させる工程と
２）前記ポリペプチドが産生する条件下で前記宿主細胞を培養する工程と、
３）前記宿主細胞から前記抗原結合タンパク質を回収する工程と
を含む、方法。
【請求項３７】
前記第１の重鎖が、ペプチドリンカーを介して前記ＶＨ２に融合される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ペプチドリンカーが、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）６、及び（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６からなる群から選択される配列を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ａ）前記ＶＨ１が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｅ変異を含み、前記第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｋ変異を含み、
ｂ）前記ＶＨ２が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｋ変異を含み、前記第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｅ変異を含み、
ｃ）前記ＶＬ１が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｋ変異を含み、前記第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｅ変異を含み、かつ
ｄ）前記ＶＬ２が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｅ変異を含み、前記第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｋ変異を含む、
請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
ａ）前記第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｅ変異及びＳ１８３Ｋ変異を含み、
ｂ）前記第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｋ変異及びＳ１８３Ｅ変異を含み、
ｃ）前記第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｋ変異及びＳ１７６Ｅ変異を含み、かつ
ｄ）前記第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｅ変異及びＳ１７６Ｋ変異を含む、
請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ａ）前記ＶＨ１が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｋ変異を含み、前記第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｅ変異を含み、
ｂ）前記ＶＨ２が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｅ変異を含み、前記第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｋ変異を含み、
ｃ）前記ＶＬ１が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｅ変異を含み、前記第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｋ変異を含み、かつ
ｄ）前記ＶＬ２が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｋ変異を含み、前記第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｅ変異を含む、
請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
ａ）前記第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｋ変異及びＳ１８３Ｅ変異を含み、
ｂ）前記第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｅ変異及びＳ１８３Ｋ変異を含み、
ｃ）前記第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｅ変異及びＳ１７６Ｋ変異を含み、かつ
ｄ）前記第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｋ変異及びＳ１７６Ｅ変異を含む、
請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４価の二重特異性抗体及び４価の四重特異性抗体、４価の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド及び４価の四重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド、ならびに４価の二重特異性抗体及び４価の四重特異性抗体の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の二重特異性抗体技術の大部分は、ＶＨ（重鎖の可変領域）のそれぞれがその同系（ｃｏｇｎａｔｅ）ＶＬ（軽鎖の可変領域）に共有結合で連結されたｓｃＦｖ（可変領域の単鎖断片）形式（Ｃｏｌｏｍａ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１５９，１９９７、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：１９６６５，２００５）に依存している。この理由は、Ｆａｂ形式では、遊離の軽鎖がその同系重鎖のみと特異的に対形成するように導くことができる技術が依然として存在せず、それ故に、異なる抗原特異性を有する遊離の軽鎖が重鎖と無作為に対形成してしまうためである。しかしながら、単鎖抗体の発現は、技術的に難易度が高いことが多く、このことは、結合親和性が減少する可能性、タンパク質の凝集、安定性の低さ、及び産生レベルの低さに起因するものである（Ｄｅｍａｒｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．１１：６７５，２００８、Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，ｍＡｂｓ  １：２，１２８−１４１，２００９）。このことは、出発抗体がハイブリドーマ由来のものであるときに特に当てはまり、ハイブリドーマに由来する出発抗体は、単鎖抗体への再編成が必要である（ファージディスプレイライブラリー由来の単鎖抗体とは対照的である）。一方で、ファージから単離されるｓｃＦｖの哺乳類細胞での発現は不十分であることが多い。
【０００３】
いくつかの革新的な技術が登場したことで、二重特異性を設計するための骨格を得るためにＦｃヘテロ２量体をほぼ排他的に構築することが可能になった。こうした技術は、例えば、ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）（Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９：６１７，１９９６）、静電ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ）（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：１９６３７，２０１０）、及び鎖交換操作ドメイン（ｓｔｒａｎｄ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）（ＳＥＥＤ）（Ｄａｖｉｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．＆  Ｓｅｌ．２３：１９５，２０１０）である。二重可変ドメイン（ＤＶＤ）−ｌｇ手法では、第２の抗体のＶＬ及びＶＨが、それぞれ第１の抗体の軽鎖のＮ末端及び第１の抗体の重鎖のＮ末端に可動性リンカーを介して融合されることで、外側ＶＤ及び内側ＶＤと呼ばれる２つの可変ドメイン（ＶＤ）が直列で創出される（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ（同書））。外側ＶＤが内側ＶＤのリガンド結合部位に近接していることによって立体障害が生じることから、内側ＶＤの結合親和性を保持するためには、多数の利用可能なモノクローナル抗体からＶＤの選択、ＶＤの配向決定、及びリンカーの設計を伴う広範な最適化が必要であり、こうしたもののほとんどが経験的に決定される必要がある（ＤｉＧｉａｍｍａｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８９９：１４５，２０１２）。
【０００４】
別の方法では、ラット／マウスのクアドローマにおける重鎖と軽鎖との種限定型の対形成が利用される（Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：２１９，１９９５）。しかしながら、産生する二重特異性抗体は、ラット／マウス抗体であり、こうした抗体が治療剤として免疫原性の問題を抱えていることは明らかである。
【０００５】
Ｃｒｏｓｓｍａｂ手法は、ノブ・インテゥ・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）によってヘテロ２量体化される重鎖に基づいており、この手法では、二重特異性ＩｇＧ抗体の産生を目的とする遺伝子的手法として、免疫グロブリンドメインのクロスオーバーが追加で使用される（Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０８：１１１８７，２０１１）。それにもかかわらず、正しく対形成されたＨ鎖ヘテロ２量体及び同系Ｆｖは排他的に生じず、精製の間に不要な副産物を除去する必要がある。
【０００６】
ＣｒｏｓｓｍａｂのＣ末端に対して、Ｆａｂ断片とＣｒｏｓｓｍａｂのＦａｂ断片との追加セットを付加することによって、Ｃｒｏｓｓｍａｂの発展手法を使用して４価の二重特異性抗体が産生されたが（Ｒｅｇｕｌａ  ｅｔ  ａｌ，米国特許出願第２０１０／０３２２９３４号）、正しく対形成されたＨ鎖ヘテロ２量体及び同系Ｆｖを排他的に得るという課題は残されたままである。
【０００７】
二重特異性に対するさらなる手法は、２つの異なる抗原を標的とする単一の結合部位を使用するものであり、この手法は、「ｔｗｏ−ｉｎ−ｏｎｅ（ツー・イン・ワン）」抗体によって示された。そのような「ツー・イン・ワン」抗体の１つは、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）という抗体の変異体であり、この変異体は、Ｈｅｒ２とＶＥＧＦとの両方と相互作用する（Ｂｏｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２３：１６１０，２００９）。この手法によれば、通常のＩｇＧと同一の形式を有する二重特異性抗体が得られるため、この手法は臨床用途で魅力的である。しかしながら、そのような変異体のスクリーニングは非常に労働集約的であり、対象である両方の抗原に結合可能な単一の結合部位を得ることができるという保証はない。
【０００８】
米国公開特許出願ＵＳ２０１１／００７６７２２では、単一セットのＦａｂ断片に基づく単一特異性のみを有する安定な多価抗体について記載された。別の技術では、異なる特異性を有するＦａｂ断片が事前形成され、当該Ｆａｂ断片がドック・アンド・ロック（Ｄｏｃｋ−ａｎｄ−Ｌｏｃｋ）ドメインの使用によって抗体に連結されることで６価の二重特異性抗体が形成された（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８：８３８４，２００８）。圧倒的多数の抗体（すなわち、その起源が通常のマウス、ラット、及びウサギであるか、又は遺伝子導入された（ヒト化された）マウスもしくはラットであるか、又は患者であるかを問わず、ハイブリドーマ、Ｆａｂライブラリー、及びＢ細胞のクローン化から生じたもの）が、その同系重鎖と対形成した遊離の軽鎖を有するため、二重特異性抗体を得るためのＦａｂに基づく技術であって、軽鎖が無作為に対形成するという問題を回避する技術が緊急に必要とされている。そのような技術があれば、２つ現存抗体からの二重特異性抗体の簡単かつ効率的な産生が促進されることになり、こうした二重特異性抗体は、第１に、二重標的化の潜在的相乗作用を探索するための多用途ツール分子として使用することができ、第２に、治療されることになる疾患状況において完全抗体と関連させて二重標的化を利用する治療剤として使用することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／０３２２９３４号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１１／００７６７２２号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｃｏｌｏｍａ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１５９，１９９７
【非特許文献２】Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：１９６６５，２００５
【非特許文献３】Ｄｅｍａｒｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．１１：６７５，２００８
【非特許文献４】Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，ｍＡｂｓ  １：２，１２８−１４１，２００９
【非特許文献５】Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９：６１７，１９９６
【非特許文献６】Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：１９６３７，２０１０
【非特許文献７】Ｄａｖｉｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．＆  Ｓｅｌ．２３：１９５，２０１０
【非特許文献８】ＤｉＧｉａｍｍａｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８９９：１４５，２０１２
【非特許文献９】Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：２１９，１９９５
【非特許文献１０】Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０８：１１１８７，２０１１
【非特許文献１１】Ｂｏｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２３：１６１０，２００９
【非特許文献１２】Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８：８３８４，２００８
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、二重特異性の抗原結合タンパク質を対象とし、当該抗原結合タンパク質は、第１の標的に対する抗体と、第２の標的に対する抗体に由来するＦａｂ断片と、から構成される。このＩｇＧ−Ｆａｂ形式では、二重特異性の多価抗原結合タンパク質は、（ｉ）第１の抗体に由来する第１の重鎖（ＶＨ２−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む第１のポリペプチドであって、第２の抗体のＶＨ２−ＣＨ１ドメインを含むポリペプチドに対して第１の重鎖がそのカルボキシル末端で（任意選択でペプチドリンカーを介して）融合されることで改変重鎖を形成する第１のポリペプチドと、（ｉｉ）第１の抗体（ＶＬ１−ＣＬ）に由来する軽鎖を含む第２のポリペプチドと、（ｉｉｉ）第２の抗体のＶＬ２−ＣＬドメインを含む第３のポリペプチドと、を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗体のＣＬドメインとＣＨ１ドメインとは、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間で交換してよい。そのような実施形態では、第２のポリペプチドはＶＬ１−ＣＨ１を含み、一方、第１のポリペプチドは、ＶＨ１−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ２−ＣＨ１を含む。第３のポリペプチドは、ＶＬ２−ＣＬを含む。あるいは、いくつかの実施形態では、第２の抗体のＣＬドメインとＣＨ１ドメインとは、第１のポリペプチドと第３のポリペプチドとの間で交換してよい。そのような実施形態では、第３のポリペプチドは、ＶＬ２−ＣＨ１を含み、一方、第１のポリペプチドは、ＶＨ１−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ２−ＣＬを含む。第１のポリペプチドは、ＶＬ１−ＣＬを含む。さらに別の実施形態では、両方の抗体のＣＬドメインとＣＨ１ドメインとは、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、及び第３のポリペプチドの間で交換される。そのような実施形態では、第１のポリペプチドは、ＶＨ１−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ２−ＣＬを含み、第２のポリペプチドは、ＶＬ１−ＣＨ１を含み、第３のポリペプチドは、ＶＬ２−ＣＨ１を含む。
【００１２】
１つの態様では、本発明は、二重特異性の４価抗原結合タンパク質を含み、当該抗原結合タンパク質は、ａ）第１の抗体の第１の重鎖（ＶＨ１）であって、第１の抗体が第１の抗原に特異的に結合し、第２の抗体の第２の重鎖（ＶＨ２）を含む部分のＮ末端に対して第１の重鎖がそのＣ末端を介して融合され、第２の抗体が第２の抗原に特異的に結合する第１の重鎖（ＶＨ１）と、ｂ）ａ）に記載の第１の抗体の２つの軽鎖と、ｃ）ａ）に記載の第２の抗体の２つの軽鎖と、を含む。
【００１３】
別の態様では、本発明は、二重特異性の抗原結合タンパク質を含み、当該抗原結合タンパク質は、（ｉ）第１の軽鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＬ１）及び第１の重鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＨ１）を含む、第１の抗原に特異的に結合する第１の結合ドメインと、（ｉｉ）第２の軽鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＬ２）及び第２の重鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＨ２）を含む、第２の抗原に特異的に結合する第２の結合ドメインと、（ｉｉｉ）ヒト免疫グロブリンＦｃ領域と、を含み、結合ドメインの一方は、Ｆｃ領域のアミノ末端に位置し、もう一方の結合ドメインは、Ｆｃ領域のカルボキシル末端に位置し、カルボキシル末端結合ドメインはＦａｂであり、ペプチドリンカーを介してＦｃ領域のカルボキシル末端に融合され、Ｆａｂは、ＦａｂのＶＨ領域のアミノ末端を介してＦｃ領域に融合される。
【００１４】
別の態様では、本発明は、四重特異性かつ４価の抗原結合タンパク質を含み、当該抗原結合タンパク質は、ａ）第１の抗体の第１の重鎖（ＶＨ１）であって、第１の抗体が第１の抗原に特異的に結合し、第１の重鎖のＣＨ１ドメインが軽鎖のＣＬドメインによって交換され、第２の抗体の第２の重鎖（ＶＨ２）を含む部分のＮ末端に対して第１の重鎖がそのＣ末端を介して融合され、第２の抗体が第２の抗原に特異的に結合する第１の重鎖（ＶＨ１）と、ｂ）ａ）に記載の第１の抗体の第１の軽鎖であって、第１の軽鎖のＣＬドメインが重鎖のＣＨ１ドメインによって交換される第１の軽鎖と、ｃ）ａ）に記載の第２の抗体の第２の軽鎖と、ｄ）第３の抗体の第２の重鎖（ＶＨ３）であって、第３の抗体が第３の抗原に特異的に結合し、第２の重鎖のＣＨ１ドメインが軽鎖のＣＬドメインによって交換され、第４の抗体の第４の重鎖（ＶＨ４）を含む部分のＮ末端に対して第３の重鎖がそのＣ末端を介して融合され、第４の抗体が第４の抗原に特異的に結合する第２の重鎖（ＶＨ３）と、ｅ）ｄ）に記載の第３の抗体の第３の軽鎖であって、第３の軽鎖のＣＬドメインが重鎖のＣＨ１ドメインによって交換される第３の軽鎖と、ｆ）ｄ）に記載の第４の抗体の第４の軽鎖と、を含む。
【００１５】
別の態様では、本発明は、二重特異性の４価抗原結合タンパク質を含み、当該抗原結合タンパク質は、
【００１６】
ａ）第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）及び第１のＣＨ１ドメインを含む第１の抗体の第１の重鎖を含む第１のポリペプチドであって、第１の抗体が第１の抗原に特異的に結合し、第２の抗体の第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含むポリペプチドのＮ末端に対して第１の重鎖がそのＣ末端を介して融合され、第２のＣＨ１ドメインのＮ末端に対してＶＨ２がそのＣ末端を介して融合され、第２の抗体が第２の抗原に特異的に結合し、
【００１７】
ｉ）ＶＨ１又は第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３９、位置４４、及び位置１８３からなる群から選択される残基位置に荷電アミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、かつ
【００１８】
ｉｉ）ＶＨ２又は第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３９、位置４４、及び位置１８３に対応する残基からなる群から選択される残基の位置に荷電アミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、電荷が第１の重鎖のＶＨ１又は第１のＣＨ１の置換残基のものとは反対のものである、
第１のポリペプチドと、
【００１９】
ｂ）ａ）に記載の第１の抗体の第１の軽鎖を含む第２のポリペプチドであって、第１の軽鎖が、第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１のＣＬ領域を含み、ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３８、位置１００、及び位置１７６からなる群から選択される残基位置に荷電アミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、
【００２０】
位置３８の電荷が、第１の重鎖のＶＨ１又は第１のＣＨ１の位置３９の置換残基のものとは反対のものであり、位置１００の電荷が、第１の重鎖のＶＨ１又は第１のＣＨ１の位置４４の置換残基のものとは反対のものであり、位置１７６の電荷が、第１の重鎖のＶＨ１又は第１のＣＨ１の位置１８３の置換残基のものとは反対のものである、
第２のポリペプチドと、
【００２１】
ｃ）ａ）に記載の第２の抗体の第２の軽鎖を含む第３のポリペプチドであって、第２の軽鎖が、第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２のＣＬ領域を含み、ＶＬ２又は第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３８、位置１００、及び位置１７６からなる群から選択される残基位置に荷電アミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、位置３８の電荷が、第２の重鎖のＶＨ２又は第２のＣＨ１の位置３９の置換残基のものとは反対のものであり、位置１００の電荷が、第２の重鎖のＶＨ２又は第２のＣＨ１の位置４４の置換残基のものとは反対のものであり、位置１７６の電荷が、第２の重鎖のＶＨ２又は第２のＣＨ１の位置１８３の置換残基のものとは反対のものである、
第３のポリペプチドと、
を含む。
【００２２】
ある特定の実施形態では、第１の重鎖は、ペプチドリンカーを介してＶＨ２に融合される。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）６、及び（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６からなる群から選択される配列を含む。
【００２３】
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ａ）ＶＨ１が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｅ変異を含み、第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｋ変異を含み、ｂ）ＶＨ２が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｋ変異を含み、第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｅ変異を含み、ｃ）ＶＬ１が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｋ変異を含み、第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｅ変異を含み、かつｄ）ＶＬ２が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｅ変異を含み、第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｋ変異を含む、請求項１５に記載の抗原結合タンパク質である。
【００２４】
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ａ）第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｅ変異及びＳ１８３Ｋ変異を含み、ｂ）第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｋ変異及びＳ１８３Ｅ変異を含み、ｃ）第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｋ変異及びＳ１７６Ｅ変異を含み、かつｄ）第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｅ変異及びＳ１７６Ｋ変異を含む、請求項１６に記載の抗原結合タンパク質である。
【００２５】
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ａ）ＶＨ１が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｋ変異を含み、第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｅ変異を含み、ｂ）ＶＨ２が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｅ変異を含み、第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｋ変異を含み、ｃ）ＶＬ１が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｅ変異を含み、第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｋ変異を含み、かつｄ）ＶＬ２が、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｋ変異を含み、第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｅ変異を含む、請求項１６に記載の抗原結合タンパク質である。
【００２６】
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ａ）第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｋ変異及びＳ１８３Ｅ変異を含み、ｂ）第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｅ変異及びＳ１８３Ｋ変異を含み、ｃ）第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｅ変異及びＳ１７６Ｋ変異を含み、かつｄ）第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｋ変異及びＳ１７６Ｅ変異を含む、請求項１６に記載の抗原結合タンパク質である。
【００２７】
本発明は、本明細書に記載の二重特異性の抗原結合タンパク質又はその構成成分のいずれかをコードする１つ又は複数の核酸、ならびに核酸を含むベクターを含む。本発明は、二重特異性の抗原結合タンパク質のいずれかを発現する、ＣＨＯ細胞などの組換え宿主細胞も包含する。
【００２８】
本発明は、二重特異性の抗原結合タンパク質、及び医薬的に許容可能な希釈剤、賦形剤、又は担体を含む医薬組成物も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の二重特異性のＩｇＧ−Ｆａｂ形式の略図を示す。この形式では、第２の抗体に由来するＦａｂ断片のポリペプチド鎖の一方（例えば、重鎖（ＶＨ２−ＣＨ１））が、第１の抗体の重鎖のカルボキシル末端にペプチドリンカーを介して融合されることで改変重鎖が産生される。完全分子は、２つの改変重鎖と、第１の抗体に由来する２つの軽鎖と、第２の抗体に由来するＦａｂ断片の残り半分（例えば、軽鎖（ＶＬ２−ＣＬ））を含む２つのポリペプチド鎖と、を含むホモ６量体である。重鎖−軽鎖の正しい対形成が促進されるように、第１の抗体のＦａｂ領域（Ｆａｂ１）及び／又は第２の抗体のＦａｂ領域（Ｆａｂ２）に対して、電荷対変異（ｃｈａｒｇｅ  ｐａｉｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）（円によって示される）を導入することができる。
【図２】免疫グロブリンドメインのクロスオーバーを使用した、本発明の二重特異性のＩｇＧ−Ｆａｂ形式の略図を示す。この形式では、第２の抗体に由来するＦａｂ断片のポリペプチド鎖の一方（例えば、重鎖（ＶＨ２−ＣＨ１））が、第１の抗体のＣＨ１ドメインの代わりにＣＬを含む重鎖のカルボキシル末端にペプチドリンカーを介して融合されることで改変重鎖が産生される。完全分子は、２つの改変重鎖と、ＣＬドメインの代わりにＣＨ１ドメインを含む第１の抗体に由来する２つの軽鎖と、第２の抗体に由来するＦａｂ断片の残り半分（例えば、軽鎖（ＶＬ２−ＣＬ））を含む２つのポリペプチド鎖と、を含むホモ６量体である。重鎖−軽鎖の正しい対形成が促進されるように、第１の抗体のＦａｂ領域（Ｆａｂ１）及び／又は第２の抗体のＦａｂ領域（Ｆａｂ２）に対して、電荷対変異（円によって示される）を導入することができる。
【図３】重鎖ヘテロ２量体との免疫グロブリンドメインのクロスオーバーを使用した、本発明の四重特異性のＩｇＧ−Ｆａｂ形式の略図を示す。この形式では、第２の抗体に由来するＦａｂ断片のポリペプチド鎖の一方（例えば、重鎖（ＶＨ２−ＣＨ１））が、第１の抗体のＣＨ１ドメインの代わりにＣＬを含む重鎖のカルボキシル末端にペプチドリンカーを介して融合されることで第１の改変重鎖が産生される。同様に、第４の抗体に由来するＦａｂ断片の別のポリペプチド鎖（例えば、重鎖（ＶＨ４−ＣＨ１））が、第３の抗体のＣＨ１ドメインの代わりにＣＬを含む重鎖のカルボキシル末端にペプチドリンカーを介して融合されることで第２の改変重鎖が産生される。２つの重鎖は、ホモ２量体の形成に対抗してヘテロ２量体が優先的に形成されるように操作することができる。完全分子は、ヘテロ２量体を形成する２つの改変重鎖と、ＣＬドメインの代わりにＣＨ１ドメインを含む第１の抗体に由来する１つの軽鎖と、ＣＬドメインの代わりにＣＨ１ドメインを含む第３の抗体に由来する１つの軽鎖と、第２の抗体に由来するＦａｂ断片の残り半分（例えば、軽鎖（ＶＬ２−ＣＬ））を含む１つのポリペプチド鎖と、第４の抗体に由来するＦａｂ断片の残り半分（例えば、軽鎖（ＶＬ４−ＣＬ））を含む１つのポリペプチド鎖と、を含む６量体である。正しい重鎖−軽鎖の対形成が促進されるように、抗体のＦａｂ領域に対して、電荷対変異（円によって示される）を導入することができる。
【図４】重鎖ヘテロ２量体の変異残基の電荷が逆転している点を除き、図３のものと同一である四重特異性のＩｇＧ−Ｆａｂ形式の略図を示す。
【図５】重鎖の位置２３０（ＡＨｏの番号付け）及び軽鎖の位置２３０（ＡＨｏの番号付け）への荷電アミノ酸の挿入を使用して構築される、本発明の４価かつ二重特異性のＩｇＧ−Ｆａｂ形式（ＩｇＧ−Ｆａｂ  ＣＰＭｖ１）の略図を示す。
【図６】重鎖の位置２３０（ＡＨｏの番号付け）及び軽鎖の位置２３０（ＡＨｏの番号付け）への荷電アミノ酸の挿入、ならびに分子のＮ末端領域におけるＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの交換を使用して構築される、本発明の４価かつ二重特異性のＩｇＧ−Ｆａｂ形式（ＩｇＧ−Ｆａｂ  ＣＰＭｖ１  Ｎ末端側でＣＨ／ＣＬ交換実施）の略図を示す。
【図７】重鎖の位置２３０（ＡＨｏの番号付け）及び軽鎖の位置２３０（ＡＨｏの番号付け）への荷電アミノ酸の挿入、ならびに分子のＣ末端領域におけるＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの交換を使用して構築される、本発明の４価かつ二重特異性のＩｇＧ−Ｆａｂ形式（ＩｇＧ−Ｆａｂ  ＣＰＭｖ１  Ｃ末端側でＣＨ／ＣＬ交換実施）の略図を示す。
【図８】重鎖の位置２３０（ＡＨｏの番号付け）及び軽鎖の位置２３０（ＡＨｏの番号付け）への荷電アミノ酸の挿入、ならびに分子のＮ末端領域とＣ末端領域との両方におけるＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの交換を使用して構築される、本発明の４価かつ二重特異性のＩｇＧ−Ｆａｂ形式（ＩｇＧ−Ｆａｂ  ＣＰＭｖ１  両末端側でＣＨ／ＣＬ交換実施）の略図を示す。
【図９】重鎖の位置４６及び位置２３０（ＡＨｏの番号付け）ならびに軽鎖の位置４６及び位置２３０（ＡＨｏの番号付け）への荷電アミノ酸の挿入を使用して構築される、本発明の４価かつ二重特異性のＩｇＧ−Ｆａｂ形式（ＩｇＧ−Ｆａｂ  ＣＰＭｖ２）の略図を示す。
【図１０】重鎖の位置４６及び位置２３０（ＡＨｏの番号付け）ならびに軽鎖の位置４６及び位置２３０（ＡＨｏの番号付け）への荷電アミノ酸の挿入、ならびに分子のＮ末端領域におけるＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの交換を使用して構築される、本発明の４価かつ二重特異性のＩｇＧ−Ｆａｂ形式（ＩｇＧ−Ｆａｂ  ＣＰＭｖ２  Ｎ末端側でＣＨ／ＣＬ交換実施）の略図を示す。
【図１１】重鎖の位置４６及び位置２３０（ＡＨｏの番号付け）ならびに軽鎖の位置４６及び位置２３０（ＡＨｏの番号付け）への荷電アミノ酸の挿入、ならびに分子のＣ末端領域におけるＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの交換を使用して構築される、本発明の４価かつ二重特異性のＩｇＧ−Ｆａｂ形式（ＩｇＧ−Ｆａｂ  ＣＰＭｖ２  Ｃ末端側でＣＨ／ＣＬ交換実施）の略図を示す。
【図１２】重鎖の位置４６及び位置２３０（ＡＨｏの番号付け）ならびに軽鎖の位置４６及び位置２３０（ＡＨｏの番号付け）への荷電アミノ酸の挿入、ならびに分子のＮ末端領域とＣ末端領域との両方におけるＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの交換を使用して構築される、本発明の４価かつ二重特異性のＩｇＧ−Ｆａｂ形式（ＩｇＧ−Ｆａｂ  ＣＰＭｖ２  両末端側でＣＨ／ＣＬ交換実施）の略図を示す。
【図１３】重鎖の位置５１及び位置２３０（ＡＨｏの番号付け）ならびに軽鎖の位置１４１及び位置２３０（ＡＨｏの番号付け）への荷電アミノ酸の挿入を使用して構築される、本発明の４価かつ二重特異性のＩｇＧ−Ｆａｂ形式（ＩｇＧ−Ｆａｂ  ＣＰＭｖ３）の略図を示す。
【図１４】重鎖の位置５１及び位置２３０（ＡＨｏの番号付け）ならびに軽鎖の位置１４１及び位置２３０（ＡＨｏの番号付け）への荷電アミノ酸の挿入、ならびに分子のＮ末端領域におけるＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの交換を使用して構築される、本発明の４価かつ二重特異性のＩｇＧ−Ｆａｂ形式（ＩｇＧ−Ｆａｂ  ＣＰＭｖ３  Ｎ末端側でＣＨ／ＣＬ交換実施）の略図を示す。
【図１５】重鎖の位置５１及び位置２３０（ＡＨｏの番号付け）ならびに軽鎖の位置１４１及び位置２３０（ＡＨｏの番号付け）への荷電アミノ酸の挿入、ならびに分子のＣ末端領域におけるＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの交換を使用して構築される、本発明の４価かつ二重特異性のＩｇＧ−Ｆａｂ形式（ＩｇＧ−Ｆａｂ  ＣＰＭｖ３  Ｃ末端側でＣＨ／ＣＬ交換実施）の略図を示す。
【図１６】重鎖の位置５１及び位置２３０（ＡＨｏの番号付け）ならびに軽鎖の位置１４１及び位置２３０（ＡＨｏの番号付け）への荷電アミノ酸の挿入、ならびに分子のＮ末端領域とＣ末端領域との両方におけるＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの交換を使用して構築される、本発明の４価かつ二重特異性のＩｇＧ−Ｆａｂ形式（ＩｇＧ−Ｆａｂ  ＣＰＭｖ３  両末端側でＣＨ／ＣＬ交換実施）の略図を示す。
【図１７】ドメイン交換形式に基づくＩｇＧ−Ｆａｂの発現力価の比較を示す。
【図１８】電荷対変異（複数可）の型に基づくＩｇＧ−Ｆａｂの発現力価の比較を示す。
【図１９】ドメイン交換形式に基づくＩｇＧ−Ｆａｂの純度の比較を示す。
【図２０】ドメイン交換形式に基づくＩｇＧ−Ｆａｂの抗ＴＬ１Ａ効力の比較を示す。
【図２１】ドメイン交換形式に基づくＩｇＧ−Ｆａｂの抗ＴＮＦα効力の比較を示す。
【図２２】電荷対変異（複数可）の型に基づくＩｇＧ−Ｆａｂの抗ＴＬ１Ａ効力の比較を示す。
【図２３】電荷対変異（複数可）の型に基づくＩｇＧ−Ｆａｂの抗ＴＮＦα効力の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
詳細な説明
本明細書で使用される「抗原結合タンパク質」という用語は、１つ又は複数の標的抗原に特異的に結合するタンパク質を指す。抗原結合タンパク質には、抗体及びその機能性断片が含まれ得る。「機能性抗体断片」は、全長の重鎖及び／又は軽鎖に存在するアミノ酸の少なくともいくつかを欠くが、抗原に特異的に結合する能力を依然として有する、抗体の一部分を指す。機能性抗体断片には、限定はされないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、Ｆｄ断片、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片が含まれ、機能性抗体断片は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、又はラクダ科の動物などの任意の哺乳類源に由来し得る。機能性抗体断片は、標的抗原への結合で未変化の抗体と競合し得るものであり、断片は、未変化の抗体の改変（例えば、酵素的切断もしくは化学的切断）によって産生させるか、又は組換えＤＮＡ技術もしくはペプチド合成を使用してデノボ合成してよい。
【００３１】
「重」鎖及び「軽」鎖は、ＩｇＧを構成する２つのポリペプチドを指す。重鎖は、Ｎ末端からＣ末端への順序で記載される下記のドメインへと要素分けすることができる：ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３。軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端への順序で記載される下記のドメインへと要素分けすることができる：ＶＬ及びＣＬ。ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとは相互作用し、その結果、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは機能性の立体構造を形成することになる。
【００３２】
抗原結合タンパク質には、単一のポリペプチド鎖又は複数のポリペプチド鎖に組み込まれた１つ又は複数の機能性抗体断片を含むタンパク質も含まれ得る。例えば、抗原結合タンパク質には、限定はされないが、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）（例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９０：６４４４−６４４８，１９９３を参照のこと）、細胞内抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、ドメイン抗体（単一のＶＬドメインもしくはＶＨドメイン、又は２つ以上のＶＨドメインがペプチドリンカーによって連結されたもの。Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４１：５４４−５４６，１９８９を参照のこと）、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｙ）（２つのｓｃＦｖがＦｃ領域に融合したもの。Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１７：９５−１０６，２００４、及びＰｏｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．２５１：１２３−１３５，２００１を参照のこと）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）（ｓｃＦｖがＣＨ３ドメインに融合したもの。Ｏｌａｆｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．，Ｖｏｌ．１７：３１５−２３，２００４を参照のこと）、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）（Ｆｃ領域に１つ又は複数のペプチドが付加されたもの。ＷＯ００／２４７８２を参照のこと）、直鎖抗体（１対の直列Ｆｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）であり、相補性の軽鎖ポリペプチドと一緒になることで１対の抗原結合領域を形成する。Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，Ｖｏｌ．８：１０５７−１０６２，１９９５を参照のこと）、小型のモジュラー免疫医薬（米国特許公開第２００３０１３３９３９号を参照のこと）、ならびに免疫グロブリン融合タンパク質（例えば、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ、ＩｇＧ−Ｆａｂ、２ｓｃＦｖ−ＩｇＧ、４ｓｃＦｖ−ＩｇＧ、ＶＨ−ＩｇＧ、ＩｇＧ−ＶＨ、及びＦａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ）が含まれ得る。
【００３３】
ある特定の態様では、本発明の抗原結合タンパク質は「二重特異性」であり、このことは、それが２つの異なる抗原に特異的に結合する能力を有することを意味する。別の態様では、本発明の抗原結合タンパク質は、「四重特異性」であり、このことは、それが４つの異なる抗原に特異的に結合する能力を有することを意味する。類似の結合アッセイ条件下での他の無関係のタンパク質に対するその親和性と比較して、抗原結合タンパク質がその抗原に対して顕著に高い結合親和性を有し、その結果としてその抗原を識別する能力を有するとき、本明細書で使用されるように、抗原結合タンパク質は、標的抗原に「特異的に結合する」。抗原に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、１ｘ１０−６Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）を有し得る。抗原結合タンパク質は、ＫＤが１ｘ１０−８Ｍ以下であるとき、「高親和性」で抗原に特異的に結合する。１つの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、５ｘ１０−７Ｍ以下のＫＤで標的抗原（複数可）に結合する。別の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、１ｘ１０−７ＭのＫＤで標的抗原（複数可）に結合する。
【００３４】
親和性は、さまざまな手法を使用して決定され、こうした手法の例は、ＥＬＩＳＡによる親和性アッセイである。さまざまな実施形態において、親和性は、表面プラズモン共鳴によるアッセイ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）に基づくアッセイ）によって決定される。この方法論を使用することで、会合速度定数（Ｍ−１ｓ−１で示されるｋａ）及び解離速度定数（ｓ−１で示されるｋｄ）を測定することができる。その後、動力学的速度定数の比（ｋｄ／ｋａ）から平衡解離定数（Ｍで示されるＫＤ）を計算することができる。いくつかの実施形態では、親和性は、Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３７３：５２−６０，２００８に記載の結合平衡除外法（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）（ＫｉｎＥｘＡ）などの動力学的な方法によって決定される。ＫｉｎＥｘＡによるアッセイを使用することで、平衡解離定数（Ｍで示されるＫＤ）及び会合速度定数（Ｍ−１ｓ−１で示されるｋａ）を測定することができる。こうした値（ＫＤ  ｘ  ｋａ）から解離速度定数（ｓ−１で示されるｋｄ）を計算することができる。他の実施形態では、親和性は、平衡／溶液法によって決定される。ある特定の実施形態では、親和性は、ＦＡＣＳによる結合アッセイによって決定される。本発明のある特定の実施形態では、Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３７３：５２−６０，２００８に記載の方法よって実施される結合平衡除外法によって決定すると、抗原結合タンパク質は、２０ｎＭ（２．０ｘ１０−８Ｍ）以下のＫＤ、１０ｎＭ（１．０ｘ１０−８Ｍ）以下のＫＤ、１ｎＭ（１．０ｘ１０−９Ｍ）以下のＫＤ、５００ｐＭ（５．０ｘ１０−１０Ｍ）以下のＫＤ、２００ｐＭ（２．０ｘ１０−１０Ｍ）以下のＫＤ、１５０ｐＭ（１．５０ｘ１０−１０Ｍ）以下のＫＤ、１２５ｐＭ（１．２５ｘ１０−１０Ｍ）以下のＫＤ、１０５ｐＭ（１．０５ｘ１０−１０Ｍ）以下のＫＤ、５０ｐＭ（５．０ｘ１０−１１Ｍ）以下のＫＤ、又は２０ｐＭ（２．０ｘ１０−１１Ｍ）以下のＫＤで、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ジャーカット）が発現する標的抗原（複数可）に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の二重特異性の抗原結合タンパク質は望ましい特性を示し、こうした特性は、標的抗原（複数可）に対する結合親和性が、ｋｄ（解離速度定数）によって測定すると、約１０−２ｓ−１、約１０−３ｓ−１、約１０−４ｓ−１、約１０−５ｓ−１、約１０−６ｓ−１、約１０−７ｓ−１、約１０−８ｓ−１、約１０−９ｓ−１、約１０−１０ｓ−１もしくはそれより低い値（値が低いほど結合親和性が高いことを示す）であること、及び／又は標的抗原（複数可）に対する結合親和性が、ＫＤ（平衡解離定数）によって測定すると、約１０−９Ｍ、約１０−１０Ｍ、約１０−１１Ｍ、約１０−１２Ｍ、約１０−１３Ｍ、約１０−１４Ｍ、約１０−１５Ｍ、約１０−１６Ｍ、もしくはそれより低い値（値が低いほど結合親和性が高いことを示す）であることである。
【００３５】
本発明のある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、多価である。結合タンパク質の結合価は、結合タンパク質に含まれる個々の抗原結合ドメインの数を示す。例えば、本発明の抗原結合タンパク質に関する「１価」、「２価」、及び「４価」という用語は、それぞれ１つ、２つ、及び４つの抗原結合ドメインを有する結合タンパク質を指す。したがって、４価の抗原結合タンパク質は、４つ以上の抗原結合ドメインを含む。他の実施形態では、二重特異性の抗原結合タンパク質は、多価である。例えば、ある特定の実施形態では、二重特異性の抗原結合タンパク質は、４つの抗原結合ドメインを含む４価であり、これら４つの抗原結合ドメインの内訳は、第１の標的抗原に結合する抗原結合ドメインが２つ、及び第２の標的抗原に結合する抗原結合ドメインが２つである。四重特異性の抗原結合タンパク質は４価であり、４つの抗原結合ドメインを含み、これら４つの抗原結合ドメインの内訳は、第１の標的抗原に結合する抗原結合ドメインが１つ、第２の標的抗原に結合する抗原結合ドメインが１つ、第３の標的抗原に結合する抗原結合ドメインが１つ、及び第４の標的抗原に結合する抗原結合ドメインが１つである。
【００３６】
１つの実施形態では、４価の二重特異性抗体は、２つの異なる細胞型に存在する２つの異なる標的に結合する。実施形態の例には、腫瘍細胞とナチュラルキラー細胞との間を架橋することでナチュラルキラー細胞を腫瘍へと指向化する４価の二重特異性抗体が含まれる。本発明のさらに別の実施形態では、４価の二重特異性抗体は、同一の分子標的に存在する２つの異なるエピトープに結合する（すなわち、二重パラトピック）。４価の二重特異性抗体の標的の一方又は両方が可溶性であり得るか、又は細胞表面に発現し得ることも当業者には明らかなことである。
【００３７】
本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」という用語は、「結合ドメイン」と互換的に使用され、抗原と相互作用し、抗原に対するその特異性及び親和性を抗原結合タンパク質に与えるアミノ酸残基を含む、抗原結合タンパク質の領域を指す。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、標的抗原（複数可）の天然のリガンドに由来し得る。本明細書で使用される「標的抗原（複数可）」という用語は、二重特異性分子の第１の標的抗原及び／又は第２の標的抗原を指すと共に、四重特異性分子の第１の標的抗原、第２の標的抗原、第３の標的抗原、及び／又は第４の標的抗原も指す。
【００３８】
本発明の二重特異性の抗原結合タンパク質及び四重特異性の抗原結合タンパク質のある特定の実施形態では、結合ドメインは、抗体又はその機能性断片に由来し得る。例えば、本発明の二重特異性の抗原結合タンパク質及び四重特異性の抗原結合タンパク質の結合ドメインは、標的抗原（複数可）に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域に由来する１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。本明細書で使用される「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変配列内の相補性決定領域（「最小認識単位」又は「超可変領域」とも呼ばれる）を指す。重鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）が存在し、軽鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）が存在する。本明細書で使用される「ＣＤＲ領域」という用語は、単一の可変領域に生じる３つのＣＤＲ（すなわち、３つの軽鎖ＣＤＲ又は３つの重鎖ＣＤＲ）の一群を指す。２つの鎖のそれぞれにおけるＣＤＲは、典型的には、フレームワーク領域によって整列されることで、標的タンパク質に存在する特定のエピトープ又はドメインと特異的に結合する構造を形成する。天然起源の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の両方において、こうした要素は、典型的には、Ｎ末端からＣ末端にかけて下記の順序で存在する：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４。
【００３９】
Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に示されるＥＵインデックスと、ＡＨｏの番号付けスキーム（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  Ａ．ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００１  Ｊｕｎ  ８；３０９（３）：６５７−７０）と、の両方を本発明において使用することができる。所与の抗体のアミノ酸位置ならびに相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）は、いずれかのシステムを使用して同定してよい。例えば、３９、４４、１８３、３５６、３５７、３７０、３９２、３９９、及び４０９というＥＵによる重鎖位置は、それぞれ４６、５１、２３０、４８４、４８５、５０１、５２８、５３５、及び５５１というＡＨｏによる重鎖位置と等価である。同様に、３８、１００、及び１７６というＥＵによる軽鎖位置は、それぞれ４６、１４１、及び２３０というＡＨＯによる軽鎖位置と等価である。以下の表１、表２、及び表３は、位置の番号付け間の等価関係を示す。
【００４０】
【表１】
2018529764.tif 000003
【００４１】
【表２】
2018529764.tif 000004
【００４２】
【表３】
2018529764.tif 000005
【００４３】
抗体をパパインで消化すると、「Ｆａｂ」断片と呼ばれ、そのそれぞれが単一の抗原結合部位を有する２つの同一の抗原結合断片と、免疫グロブリン定常領域を含む残存「Ｆｃ」断片と、が得られる。Ｆａｂ断片は、可変ドメインのすべて、ならびに軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。したがって、「Ｆａｂ断片」は、１つの免疫グロブリン軽鎖（軽鎖可変領域（ＶＬ）及び定常領域（ＣＬ））と、１つの免疫グロブリン重鎖のＣＨ１領域及び可変領域（ＶＨ）と、から構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することはできない。Ｆｃ断片は、糖質をディスプレイしており、多くの抗体エフェクター機能（補体及び細胞受容体との結合などの）を担い、こうした抗体エフェクター機能は、あるクラスの抗体と別のクラスの抗体とでは異なるものである。「Ｆｄ断片」は、免疫グロブリン重鎖に由来するＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む。Ｆｄ断片は、Ｆａｂ断片の重鎖成分に相当する。
【００４４】
「Ｆａｂ’断片」は、抗体ヒンジ領域に由来する１つ又は複数のシステイン残基をＣＨ１ドメインのＣ末端に有するＦａｂ断片である。
【００４５】
「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、重鎖間のジスルフィド架橋によってヒンジ領域で連結された２つのＦａｂ’断片を含む２価の断片である。
【００４６】
「Ｆｖ」断片は、抗原認識及び抗原結合を行う抗体由来部位を完全に含む最小断片である。この断片は、１つの免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）及び１つの免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）が堅固かつ非共有結合性に会合した２量体からなる。この立体配置では、それぞれの可変領域の３つのＣＤＲが相互作用することで、ＶＨ−ＶＬという２量体の表面に抗原結合部位を定義する。単一の軽鎖可変領域もしくは重鎖可変領域（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含む半分のＦｖ断片）は、抗原を認識して結合する能力を有するが、ＶＨとＶＬとの両方を含む全結合部位と比較すると、その結合認識の親和性は低い。
【００４７】
「可変領域」は、「可変ドメイン」（軽鎖の可変領域（ＶＬ）、重鎖の可変領域（ＶＨ））と互換的に本明細書で使用され、軽免疫グロブリン鎖及び重免疫グロブリン鎖のそれぞれにおいて抗原への抗体の結合に直接的に関与する領域を指す。上で議論したとおり、可変軽鎖領域及び可変重鎖領域は、同一の一般構造を有しており、それぞれの領域が４つフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。こうしたＦＲ領域の配列は広く保存されており、３つのＣＤＲによって連結される。フレームワーク領域は、ベータ−シートの立体構造をとり、ＣＤＲは、そのベータ−シート構造を連結するループを形成し得る。それぞれの鎖におけるＣＤＲは、フレームワーク領域によってその３次元構造が保持され、もう一方の鎖に由来するＣＤＲと一緒になることで抗原結合部位を形成する。
【００４８】
「免疫グロブリンドメイン」は、免疫グロブリンのものと類似のアミノ酸配列を含むペプチドであって、少なくとも２つのシステイン残基を含む約１００のアミノ酸残基を含むペプチドに相当する。免疫グロブリンドメインの例には、免疫グロブリン重鎖のＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３、ならびに免疫グロブリン軽鎖のＶＬ及びＣＬが含まれる。さらに、免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリン以外のタンパク質においても見られる。免疫グロブリン以外のタンパク質における免疫グロブリンドメインの例には、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）、ＣＤ１、Ｂ７、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、及び同様のものなどの免疫グロブリンスーパーファミリーに属するタンパク質に含まれる免疫グロブリンドメインが含まれる。免疫グロブリンドメインはいずれも、本発明の多価抗体のための免疫グロブリンドメインとして使用することができる。
【００４９】
ヒト抗体では、ＣＨ１は、ＥＵインデックスの位置１１８〜２１５のアミノ酸配列を有する領域を意味する。ＣＨ１とＣＨ２との間には、「ヒンジ領域」と呼ばれる高度可動性のアミノ酸領域が存在する。ＣＨ２は、ＥＵインデックスの位置２３１〜３４０のアミノ酸配列を有する領域に相当し、ＣＨ３は、ＥＵインデックスの位置３４１〜４４６のアミノ酸配列を有する領域に相当する。
【００５０】
「ＣＬ」は、軽鎖の定常領域に相当する。ヒト抗体のκ鎖の場合、ＣＬは、ＥＵインデックスの位置１０８〜２１４のアミノ酸配列を有する領域に相当する。λ鎖では、ＣＬは、位置１０８〜２１５のアミノ酸配列を有する領域に相当する。
【００５１】
標的抗原（複数可）に特異的に結合する結合ドメインは、ａ）こうした抗原に対する既知の抗体から得るか、あるいはｂ）抗原タンパク質もしくはその断片を使用するデノボの免疫化方法、ファージディスプレイ、又は他の日常的な方法によって得られた新たな抗体又は抗体断片から得ることができる。二重特異性の抗原結合タンパク質及び四重特異性の抗原結合タンパク質のための結合ドメインが得られる抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体であり得る。ある特定の実施形態では、結合ドメインが得られる抗体は、モノクローナル抗体である。こうした実施形態及び他の実施形態では、抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体であり、ＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型、又はＩｇＧ４型のものであり得る。
【００５２】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」（又は「ｍＡｂ」）という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量に存在し得る天然に生じる可能性のある変異を除いて同一である。典型的には異なるエピトープを標的とする異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体は高度に特異的であり、個々の抗原部位又はエピトープを標的としている。モノクローナル抗体は、当該技術分野において知られる任意の手法を使用して産生させてよく、例えば、免疫化スケジュールの完了後に遺伝子導入動物から収集した脾臓細胞を不死化することによって産生させてよい。脾臓細胞は、当該技術分野において知られる任意の手法を使用して不死化することができ、例えば、脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを産生させることによって不死化できる。ハイブリドーマが産生する融合手順における使用を目的とする骨髄腫細胞は、抗体を産生することはなく、高い融合効率を有すると共に、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持するある特定の選択培地での増殖が不可能となる酵素欠損を有する。マウス融合における使用に適した細胞株の例には、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４  １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７、及びＳ１９４／５ＸＸＯ  Ｂｕｌが含まれる。ラット融合において使用される細胞株の例には、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ、及び４Ｂ２１０が含まれる。細胞融合に有用な他の細胞株は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２、及びＵＣ７２９−６である。
【００５３】
いくつかの実例では、標的抗原（複数可）免疫原での動物（例えば、ヒト免疫グロブリン配列を有する遺伝子導入動物）の免疫化、免疫化動物からの脾臓細胞の収集、骨髄腫細胞株への収集脾臓細胞の融合によるハイブリドーマ細胞の産生、ハイブリドーマ細胞からのハイブリドーマ細胞株の確立、及び標的抗原（複数可）に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株の同定によってハイブリドーマ細胞株が産生される。
【００５４】
ハイブリドーマ細胞株によって分泌されるモノクローナル抗体は、当該技術分野において知られる任意の手法を使用して精製することができ、こうした手法は、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又は親和性クロマトグラフィーなどである。ハイブリドーマ又はｍＡｂは、特定の特性を有するｍＡｂを同定するためにさらに選別してよい。こうした特性は、標的抗原（複数可）を発現する細胞に結合する能力、標的抗原（複数可）のそのそれぞれの受容体もしくはリガンドへの結合を遮断もしくは妨害する能力、又は標的抗原（複数可）のいずれかを機能的に遮断する能力などである。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性の抗原結合タンパク質及び四重特異性の抗原結合タンパク質の結合ドメインは、標的抗原（複数可）に対するヒト化抗体に由来し得る。「ヒト化抗体」は、ヒト免疫グロブリンに由来する対応領域を含むように改変された領域（例えば、フレームワーク領域）を含む抗体を指す。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト動物において最初に産生したモノクローナル抗体から産生させることができる。このモノクローナル抗体におけるある特定のアミノ酸残基であって、典型的には抗体の非抗原認識部分に由来するアミノ酸残基が、対応アイソタイプのヒト抗体における対応残基に相同性となるように改変される。ヒト化は、例えば、げっ歯類の可変領域の少なくとも一部をヒト抗体の対応領域の代わりに使用するさまざまな方法を使用して実施することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号及び第５，６９３，７６２号、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３２１：５２２−５２５，１９８６、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３３２：３２３−２７，１９８８、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３９：１５３４−１５３６，１９８８を参照のこと）。別の種で産生した抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のＣＤＲをコンセンサスヒトＦＲに移植することができる。コンセンサスヒトＦＲを創出するために、ヒトの重鎖アミノ酸配列又は軽鎖アミノ酸配列のいくつかに由来するＦＲのアライメントをとることでコンセンサスアミノ酸配列を同定してよい。
【００５６】
標的抗原（複数可）に対して産生した新たな抗体であって、本発明の二重特異性の抗原結合タンパク質及び四重特異性の抗原結合タンパク質のための結合ドメインを得ることができる抗体は、完全ヒト抗体であり得る。「完全ヒト抗体」は、ヒトの生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を含む抗体である。完全ヒト抗体の産生が実現する特定の手段の１つは、マウスの体液性免疫系の「ヒト化」である。内在性のＩｇ遺伝子が不活性化したマウスへのヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の導入は、任意の所望抗原で免疫化することができる動物であるマウスにおいて完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生させる手段の１つである。完全ヒト抗体を使用することで、マウスのｍＡｂ又はマウス由来のｍＡｂを治療薬剤としてヒトに投与することによって生じることがあり得る免疫応答及びアレルギー応答を最小化することができる。
【００５７】
完全ヒト抗体は、内在性の免疫グロブリンを産生せず、ヒト抗体のレパートリーを産生する能力を有する遺伝子導入動物（通常はマウス）を免疫化することによって産生させることができる。これを目的とする抗原は、典型的には、６残基以上の連続アミノ酸を有し、任意選択でハプテンなどの担体に複合化される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１−２５５５、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８、及びＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３を参照のこと。そのような方法の１つの例では、遺伝子導入動物は、マウスの重免疫グロブリン鎖及び軽免疫グロブリン鎖をそこにコードするマウスの内在性の免疫グロブリン遺伝子座を無能化し、ヒトの重鎖タンパク質及び軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を含むヒトゲノムＤＮＡをマウスゲノムの大型断片に挿入することによって産生される。部分的に改変された動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の補完が完全には至っておらず、その後に交雑させることで所望の免疫系改変のすべてを有する動物が得られる。免疫原が投与されると、こうした遺伝子導入動物は、その免疫原に免疫特異的な抗体を産生するが、こうした抗体は、可変領域を含めて、マウスのアミノ酸配列ではなく、ヒトのアミノ酸配列を有する。そのような方法の追加詳細については、例えば、ＷＯ９６／３３７３５及びＷＯ９４／０２６０２を参照のこと。ヒト抗体の調製を目的とする遺伝子導入マウスに関する追加の方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、第６，７１３，６１０号、第６，６７３，９８６号、第６，１６２，９６３号、第５，９３９，５９８号、第５，５４５，８０７号、第６，３００，１２９号、第６，２５５，４５８号、第５，８７７，３９７号、第５，８７４，２９９号、及び第５，５４５，８０６、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１０７４１、ＷＯ９０／０４０３６、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３０４９８、ＷＯ９８／２４８９３、ならびにＥＰ５４６０７３Ｂ１及びＥＰ５４６０７３Ａ１に記載される。
【００５８】
上記の遺伝子導入マウスは、本明細書では「ＨｕＭａｂ」マウスと称され、内在性のミュー鎖及びカッパー鎖の遺伝子座を不活性化する標的化変異と共に、ヒトの重鎖（ミュー及びガンマ）ならびにカッパー軽鎖の非再編成免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子の小遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）を含む（Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９）。したがって、このマウスでは、免疫化に応じて生じるマウスのＩｇＭ又はカッパーの発現が低減されており、導入されたヒトの重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子は、クラス転換及び体細胞変異を受けることで高親和性のヒトＩｇＧカッパーモノクローナル抗体を産生する（前出のＬｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３、Ｈａｒｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６）。ＨｕＭａｂマウスの調製は、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２８７−６２９５、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：６４７−６５６、Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９、Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９４，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９−５９１、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３、Ｈａｒｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１に詳細に記載されており、前述の参考文献は、参照によってそれらの全体があらゆる目的を対象として本明細書に組み込まれる。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，７８９，６５０号、第５，８７７，３９７号、第５，６６１，０１６号、第５，８１４，３１８号、第５，８７４，２９９号、及び第５，７７０，４２９号、ならびに米国特許第５，５４５，８０７号、国際公開第ＷＯ９３／１２２７号、第ＷＯ９２／２２６４６号、及び第ＷＯ９２／０３９１８号を参照のこと。すべてのこうした文献の開示内容は、参照によってそれらの全体があらゆる目的を対象として本明細書に組み込まれる。こうした遺伝子導入マウスにおけるヒト抗体の産生を利用する技術は、ＷＯ９８／２４８９３、及びＭｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６においても開示されており、こうした文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５９】
ヒト由来の抗体は、ファージディスプレイ手法を使用しても産生させることができる。ファージディスプレイは、例えば、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９１／１７２７１、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９２／０１０４７、及びＣａｔｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６４５０−６４５４（１９９０）に記載されており、こうした文献はそれぞれ、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。ファージ技術によって産生する抗体は、通常、細菌において、例えば、Ｆｖ断片又はＦａｂ断片といった抗原結合断片として産生するため、エフェクター機能を欠いている。エフェクター機能は、２つの方針のうちの１つによって導入することができる。すなわち、断片は、望まれるのであれば、操作することによって、哺乳類細胞における発現を目的とする完全抗体とするか、又はエフェクター機能を引き起こす能力を有する第２の結合部位を有する二重特異性抗体断片及び四重特異性抗体断片とすることができる。典型的には、抗体のＦｄ断片（ＶＨ−ＣＨ１）及び軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）は、ＰＣＲによって別々にクローン化され、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリーにおいて無作為に組換えられ、続いて、こうしたライブラリーにおいて特定の抗原への結合を選択することができる。抗体断片は、ファージ表面に発現し、抗原結合によるＦｖ又はＦａｂ（したがって、その抗体断片をコードするＤＮＡを含むファージ）の選択は、数ラウンドの抗原結合及び再増幅を行うパニングと呼ばれる手順を介して達成される。抗原に特異的な抗体断片が濃縮され、最終的に単離される。ファージディスプレイ手法は、げっ歯類のモノクローナル抗体のヒト化手法においても使用することができ、これは、「ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（ガイド選択）」と呼ばれる（Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２，８９９−９０３（１９９４）を参照のこと）。これについては、ヒトの軽鎖ライブラリーと組み合わせてマウスのモノクローナル抗体のＦｄ断片をディスプレイすることができ、得られたハイブリッドＦａｂライブラリーを続けて抗原で選択してよい。そうすることによってマウスＦｄ断片は、選択をガイドするための鋳型となる。その後、選択されたヒト軽鎖は、ヒトのＦｄ断片ライブラリーと組み合わせられる。得られたライブラリーを選択することで、完全ヒトＦａｂが得られる。
【００６０】
本明細書で使用される「同一性」という用語は、２つ以上のポリペプチド分子又は２つ以上の核酸分子の配列間の関連性を指し、こうした関連性は、配列のアライメント及び比較によって決定される。本明細書で使用される「同一性パーセント」は、比較分子におけるアミノ酸間又はヌクレオチド間の同一残基のパーセントを意味し、比較される分子の中で最小の分子のサイズに基づいて計算される。こうした計算を行うためには、特定の数学モデル又はコンピュータープログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって、アライメントにおけるギャップ（存在するのであれば）に対処しなくてはならない。アライメントされる核酸又はポリペプチドの同一性を計算するために使用することができる方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），１９８８，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、及びＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８：１０７３に記載のものが含まれる。例えば、配列同一性は、２つのポリペプチドのアミノ酸位置における類似性を比較するために一般に使用される標準的な方法によって決定することができる。２つのポリペプチド配列又は２つのポリヌクレオチド配列は、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどのコンピュータープログラムを使用し、そのそれぞれの残基の一致が最適となるようにアライメントされる（１つもしくは両方の配列の全長に沿って実施されるか、又は１つもしくは両方の配列の所定部分に沿って実施される）。プログラムでは、デフォルトのオープニングペナルティ及びデフォルトのギャップペナルティが与えられ、コンピュータープログラムと併せてＰＡＭ２５０（標準的なスコアリングマトリックスであり、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐ．３（１９７８）を参照のこと）などのスコアリングマトリックスを使用することができる。続いて、例えば、同一性パーセントは、同一一致総数に１００を掛けてから、一致スパン内の長い方の配列の長さと、２つの配列のアライメントをとるために長い方の配列に導入されたギャップ数と、の合計で割ったものとして計算することができる。同一性パーセントの計算���は、比較される配列は、配列間の一致が最大となる方法でアライメントされる。
【００６１】
ＧＣＧプログラムパッケージは、同一性パーセントを決定するために使用することができるコンピュータープログラムであり、このパッケージは、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含む。コンピューターアルゴリズムであるＧＡＰは、配列同一性パーセントが決定されることになる２つのポリペプチド又は２つのポリヌクレオチドのアライメントをとるために使用される。配列は、そのそれぞれのアミノ酸又はヌクレオチドの一致が最適となるようにアライメントされる（「一致スパン」は、アルゴリズムによって決定される）。ギャップオープニングペナルティ（３ｘ平均対角要素として計算され、「平均対角要素」は、使用される比較マトリックスの対角要素の平均である。「対角要素」は、特定の比較マトリックスによってそれぞれの完全アミノ酸一致に割り当てられるスコア又は数である）及びギャップ延長ペナルティ（通常、ギャップオープニングペナルティの１／１０倍である）、ならびにＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２などの比較マトリックスがアルゴリズムと併せて使用される。ある特定の実施形態では、アルゴリズムによっても標準的な比較マトリックス（Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：３４５−３５２  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＰＡＭ  ２５０  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５−１０９１９  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＢＬＯＳＵＭ  ６２  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘを参照のこと）が使用される。
【００６２】
ＧＡＰプログラムを使用し、ポリペプチド又はヌクレオチド配列の同一性パーセントを決定するための推奨パラメーターには、下記のものが含まれる：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３
比較マトリックス：前出のＨｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２によるＢＬＯＳＵＭ６２
ギャップペナルティ：１２（しかし、末端のギャップにはペナルティなし）
ギャップ長ペナルティ：４
類似性の許容限界値：０
【００６３】
２つのアミノ酸配列のアライメントをとるためにある特定のアライメントスキームを用いると、２つの配列において短い領域のみが一致する可能性がある。アライメントされたこの短い領域は、２つの全長配列間に顕著な関連性が存在しないとしても非常に高い配列同一性を有する可能性がある。したがって、そうであるならば、選択されるアライメント方法（ＧＡＰプログラム）は、標的ポリペプチドにおいて少なくとも５０残基の連続アミノ酸にまたがるアライメントが得られるように調節されることが望ましくあり得る。
【００６４】
ある特定の実施形態では、本発明の二重特異性の抗原結合タンパク質及び四重特異性の抗原結合タンパク質は、抗体を含む。本明細書で使用される「抗体」という用語は、２つの軽鎖ポリペプチド（それぞれ約２５ｋＤａ）及び２つの重鎖ポリペプチド（それぞれ約５０〜７０ｋＤａ）を含む４量体の免疫グロブリンタンパク質を指す。「軽鎖」又は「免疫グロブリン軽鎖」という用語は、アミノ末端からカルボキシル末端への順序で、単一の免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）及び単一の免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含むポリペプチドを指す。免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、カッパー（κ）又はラムダ（λ）であり得る。「重鎖」又は「免疫グロブリン重鎖」という用語は、アミノ末端からカルボキシル末端への順序で、単一の免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）、及び任意選択で免疫グロブリン重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）を含むポリペプチドを指す。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、及びイプシロン（ε）に分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定義する。ＩｇＧクラスの抗体及びＩｇＡクラスの抗体は、サブクラスへとさらに分類され、すなわち、それぞれＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ならびにＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分類される。ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、及びＩｇＤ抗体における重鎖は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する一方、ＩｇＭ抗体及びＩｇＥ抗体における重鎖は、４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４）を有する。免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、サブタイプを含む任意の免疫グロブリンアイソタイプに由来し得る。抗体鎖は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間（すなわち、軽鎖と重鎖との間）のポリペプチド間ジスルフィド結合、ならびに抗体重鎖のヒンジ領域間のポリペプチド間ジスルフィド結合を介して共に連結される
【００６５】
特定の実施形態では、本発明の二重特異性の抗原結合タンパク質及び四重特異性の抗原結合タンパク質は、ヘテロ２量体抗体（本明細書では、「ヘテロ免疫グロブリン」又は「ヘテロＩｇ」と互換的に使用される）であり、これは、２つの異なる軽鎖及び２つの異なる重鎖を含む抗体を指す。
【００６６】
ヘテロ２量体抗体は、任意の免疫グロブリン定常領域を含み得る。本明細書で使用される「定常領域」という用語は、可変領域以外の、抗体のすべてのドメインを指す。定常領域は、抗原結合には直接的に関与しないが、さまざまなエフェクター機能を示す。上記のとおり、抗体は、その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて特定のアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）ならびにサブタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１  ＩｇＡ２）に分類される。軽鎖定常領域は、例えば、カッパー型又はラムダ型の軽鎖定常領域であり得、例えば、ヒトのカッパー型又はラムダ型の軽鎖定常領域であり、こうした軽鎖定常領域は、５つすべての抗体アイソタイプに見られる。以下の表では、ヒトの免疫グロブリン軽鎖定常領域の配列の例が示される。
【００６７】
【表４】
2018529764.tif 000006
【００６８】
ヘテロ２量体抗体の重鎖定常領域は、例えば、アルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型、又はミュー型の重鎖定常領域であり得、例えば、ヒトのアルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型、又はミュー型の重鎖定常領域である。いくつかの実施形態では、ヘテロ２量体抗体は、ＩｇＧ１免疫グロブリン、ＩｇＧ２免疫グロブリン、ＩｇＧ３免疫グロブリン、又はＩｇＧ４免疫グロブリンに由来する重鎖定常領域を含む。１つの実施形態では、ヘテロ２量体抗体は、ヒトのＩｇＧ１免疫グロブリンに由来する重鎖定常領域を含む。別の実施形態では、ヘテロ２量体抗体は、ヒトのＩｇＧ２免疫グロブリンに由来する重鎖定常領域を含む。以下の表５では、ヒトのＩｇＧ１重鎖定常領域及びＩｇＧ２重鎖定常領域の配列の例が示される。
【００６９】
【表５】
2018529764.tif 000007
2018529764.tif 000008
【００７０】
上記の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域に可変領域を付加することで、それぞれ完全な抗体軽鎖及び抗体重鎖を形成させてよい。さらに、そのようにして産生させた重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドのそれぞれを組み合わせることで、完全な二重特異性及び四重特異性の抗体構造を形成させてよく、例えば、ヘテロ２量体抗体を形成させてよい。本明細書で提供される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、上記の例示配列とは異なる配列を有する他の定常ドメインにも付加することができると理解されるべきである。
【００７１】
本発明のある特定の実施形態では、本発明のヘテロ２量体分子を形成するために２つの異なる重鎖が使用される。二重特異性及び四重特異性のヘテロ２量体抗体への軽鎖と重鎖と会合を促進するために、それぞれの抗体に由来する軽鎖及び／又は重鎖は、誤った対を有する分子の形成が低減するように操作することができる。例えば、ホモ２量体形成に勝ってヘテロ２量体形成を促進させるための手法の１つは、いわゆる「ノブ・インテゥ・ホール」法であり、この方法では、接触境界面を対象として、２つの異なる抗体重鎖のＣＨ３ドメインに変異が導入される。具体的には、一方の重鎖における１つ又は複数の嵩高いアミノ酸が、短い側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン又はスレオニン）と交換されることで「ホール」が創出され、もう一方の重鎖には、大きな側鎖を有する１つ又は複数のアミノ酸（例えば、チロシン又はトリプトファン）が導入されることで「ノブ」が創出される。改変重鎖が同時発現すると、ホモ２量体（ホール−ホール又はノブ−ノブ）と比較してヘテロ２量体（ノブ−ホール）が高い割合で形成される。「ノブ・インテゥ・ホール」の方法論は、ＷＯ９６／０２７０１１、Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，Ｖｏｌ．９：６１７−６２１，１９９６、及びＭｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１６：６７７−６８１，１９９８において詳細に記載されており、こうした文献はすべて、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００７２】
ヘテロ２量体の形成を促進してホモ２量体の形成を除外するための別の手法は、静電ステアリング機構を利用するものである（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８５：１９６３７−１９６４６，２０１０を参照のこと。当該文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。この手法では、それぞれの重鎖におけるＣＨ３ドメインに荷電残基が導入されるか、又はそこに存在する荷電残基が利用され、その結果、２つの異なる重鎖が、静電気的な引力を引き起こす反対電荷を介して会合する。同一の重鎖は同一の電荷を有し、それ故に反発するため、同一の重鎖がホモ２量体化することは不利である。この同一の静電ステアリング手法を、結合境界面を対象として、反対の電荷を有する残基を正しい軽鎖−重鎖対に導入することによって軽鎖と非同系重鎖との誤った対形成を防止するために使用することができる。ヘテロ２量体の形成及び軽鎖／重鎖の正しい対形成を促進するための静電ステアリング手法及び適した電荷対変異は、ＷＯ２００９０８９００４及びＷＯ２０１４０８１９５５に記載されており、こうした文献は両方共、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００７３】
本発明の二重特異性の抗原結合タンパク質が、第１の標的抗原に特異的に結合する第１の抗体に由来する第１の軽鎖（ＬＣ１）及び第１の重鎖（ＨＣ１）と、標的２に特異的に結合する第２の抗体に由来する第２の軽鎖（ＬＣ２）及び第２の重鎖（ＨＣ２）と、を含むヘテロ２量体抗体である実施形態では、ＨＣ１又はＨＣ２は、正に荷電したアミノ酸を負に荷電したアミノ酸と交換するための１つ又は複数のアミノ酸置換を含み得る。例えば、１つの実施形態では、ＨＣ１のＣＨ３ドメイン又はＨＣ２のＣＨ３ドメインは、野生型のＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含み、その結果、野生型のヒトＩｇＧアミノ酸配列における１つ又は複数の正に荷電したアミノ酸（例えば、リジン、ヒスチジン、及びアルギニン）は、ＣＨ３ドメインにおける対応位置（複数可）で、１つ又は複数の負に荷電したアミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）と交換されている。こうした実施形態及び他の実施形態では、３７０、３９２、及び４０９（ＥＵの番号付けシステム）から選択される１つ又は複数の位置のアミノ酸（例えば、リジン）が、負に荷電したアミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）と交換される。アミノ酸配列におけるアミノ酸置換は、典型的には、特定位置のアミノ酸残基の１文字略語と、それに続く、対象の元の配列に対するアミノ酸位置を示す数字と、さらにそれに続く、置換導入されるアミノ酸残基の１文字記号と、を用いて本明細書で指定される。例えば、「Ｔ３０Ｄ」は、対象の元の配列に対する、アミノ酸位置３０での、アスパラギン酸残基によるスレオニン残基の置換を記号で表すものである。別の例を挙げると、「Ｓ２１８Ｇ」は、対象の元のアミノ酸配列に対する、アミノ酸位置２１８での、グリシン残基によるセリン残基の置換を記号で示すものである。
【００７４】
ある特定の実施形態では、ヘテロ２量体抗体のＨＣ１又はＨＣ２は、負に荷電したアミノ酸を正に荷電したアミノ酸と交換するための１つ又は複数のアミノ酸置換を含み得る。例えば、１つの実施形態では、ＨＣ１のＣＨ３ドメイン又はＨＣ２のＣＨ３ドメインは、野生型のＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含み、その結果、野生型のヒトＩｇＧアミノ酸配列における１つ又は複数の負に荷電したアミノ酸は、ＣＨ３ドメインにおける対応位置（複数可）で、１つ又は複数の正に荷電したアミノ酸と交換されている。こうした実施形態及び他の実施形態では、ＣＨ３ドメインの３５６、３５７、及び３９９（ＥＵの番号付けシステム）から選択される１つ又は複数の位置のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）が、正に荷電したアミノ酸（例えば、リジン、ヒスチジン、及びアルギニン）と交換される。
【００７５】
特定の実施形態では、ヘテロ２量体抗体は、位置３９２及び位置４０９に負に荷電したアミノ酸（例えば、Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄという置換）を含む第１の重鎖と、位置３５６及び位置３９９に正に荷電したアミノ酸（例えば、Ｅ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋという置換）を含む第２の重鎖と、を含む。別の特定の実施形態では、ヘテロ２量体抗体は、位置３９２、位置４０９、及び位置３７０に負に荷電したアミノ酸（例えば、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ、及びＫ３７０Ｄという置換）を含む第１の重鎖と、位置３５６、位置３９９、及び位置３５７に正に荷電したアミノ酸（例えば、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３９９Ｋ、及びＥ３５７Ｋという置換）を含む第２の重鎖と、を含む。関連する実施形態では、第１の重鎖は、抗第１の標的抗原抗体に由来し、第２の重鎖は、抗第２の標的抗原抗体に由来する。
【００７６】
特定の重鎖とその同系軽鎖との会合を促進させるために、重鎖と軽鎖との両方に、相補性のアミノ酸置換を含めてよい。本明細書で使用される「相補性のアミノ酸置換」は、一方の鎖に正に荷電したアミノ酸を導入する置換と、もう一方の鎖に負に荷電したアミノ酸を導入する置換と、が対となる置換を指す。例えば、いくつかの実施形態では、重鎖は、荷電アミノ酸を導入するための少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、対応する軽鎖は、荷電アミノ酸を導入するための少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、重鎖に導入される荷電アミノ酸は、軽鎖に導入されるアミノ酸とは反対の電荷を有する。ある特定の実施形態では、ＬＣ１／ＨＣ１の結合境界面を対象として、１つ又は複数の正に荷電した残基（例えば、リジン、ヒスチジン、又はアルギニン）を第１の軽鎖（ＬＣ１）に導入することができ、１つ又は複数の負に荷電した残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を、対となる重鎖（ＨＣ１）に導入することができ、一方、ＬＣ２／ＨＣ２の結合境界面を対象として、１つ又は複数の負に荷電した残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を第２の軽鎖（ＬＣ２）に導入することができ、１つ又は複数の正に荷電した残基（例えば、リジン、ヒスチジン、又はアルギニン）を、対となる重鎖（ＨＣ２）に導入することができる。境界面において反対に荷電した残基（極性）は引力を生じさせるため、静電相互作用によって、ＬＣ１はＨＣ１と対形成するように、及びＬＣ２はＨＣ２と対形成するように導かれることになる。境界面において同一に荷電した残基（極性）を有する重鎖／軽鎖対（例えば、ＬＣ１／ＨＣ２及びＬＣ２／ＨＣ１）は反発することになり、その結果、ＨＣ／ＬＣの不要な対形成が抑制される。
【００７７】
こうした実施形態及び他の実施形態では、重鎖のＣＨ１ドメイン又は軽鎖のＣＬドメインは、野生型のＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含み、その結果、野生型のＩｇＧアミノ酸配列における１つ又は複数の正に荷電したアミノ酸は、１つ又は複数の負に荷電したアミノ酸と交換されている。あるいは、重鎖のＣＨ１ドメイン又は軽鎖のＣＬドメインは、野生型のＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含み、その結果、野生型のＩｇＧアミノ酸配列における１つ又は複数の負に荷電したアミノ酸は、１つ又は複数の正に荷電したアミノ酸と交換されている。いくつかの実施形態では、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｌ１２８、Ａ１４１、Ｌ１４５、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｈ１６８、Ｆ１７０、Ｐ１７１、Ｖ１７３、Ｑ１７５、Ｓ１７６、Ｓ１８３、Ｖ１８５、及びＫ２１３から選択されるＥＵ位置で、ヘテロ２量体抗体における第１の重鎖及び／又は第２の重鎖のＣＨ１ドメインにおける１つ又は複数のアミノ酸が荷電アミノ酸と交換される。ある特定の実施形態では、負に荷電したアミノ酸又は正に荷電したアミノ酸との置換の対象となる重鎖残基は、Ｓ１８３（ＥＵの番号付けシステム）である。いくつかの実施形態では、Ｓ１８３は、正に荷電したアミノ酸で置換される。代替の実施形態では、Ｓ１８３は、負に荷電したアミノ酸で置換される。例えば、１つの実施形態では、第１の重鎖におけるＳ１８３は、負に荷電したアミノ酸で置換（例えば、Ｓ１８３Ｅ）され、第２の重鎖におけるＳ１８３は、正に荷電したアミノ酸で置換（例えば、Ｓ１８３Ｋ）される。
【００７８】
軽鎖がカッパー軽鎖である実施形態では、Ｆ１１６、Ｆ１１８、Ｓ１２１、Ｄ１２２、Ｅ１２３、Ｑ１２４、Ｓ１３１、Ｖ１３３、Ｌ１３５、Ｎ１３７、Ｎ１３８、Ｑ１６０、Ｓ１６２、Ｔ１６４、Ｓ１７４、及びＳ１７６から選択される位置（カッパー軽鎖におけるＥＵの番号付け）で、ヘテロ２量体抗体における第１の軽鎖及び／又は第２の軽鎖のＣＬドメインにおける１つ又は複数のアミノ酸が荷電アミノ酸と交換される。軽鎖がラムダ軽鎖である実施形態では、Ｔ１１６、Ｆ１１８、Ｓ１２１、Ｅ１２３、Ｅ１２４、Ｋ１２９、Ｔ１３１、Ｖ１３３、Ｌ１３５、Ｓ１３７、Ｅ１６０、Ｔ１６２、Ｓ１６５、Ｑ１６７、Ａ１７４、Ｓ１７６、及びＹ１７８から選択される位置（ラムダ鎖におけるＥＵの番号付け）で、ヘテロ２量体抗体における第１の軽鎖及び／又は第２の軽鎖のＣＬドメインにおける１つ又は複数のアミノ酸が荷電アミノ酸と交換される。いくつかの実施形態では、負に荷電したアミノ酸又は正に荷電したアミノ酸との置換の対象となる残基は、カッパー軽鎖又はラムダ軽鎖のいずれかのＣＬドメインのＳ１７６（ＥＵの番号付けシステム）である。ある特定の実施形態では、ＣＬドメインのＳ１７６は、正に荷電したアミノ酸と交換される。代替の実施形態では、ＣＬドメインのＳ１７６は、負に荷電したアミノ酸と交換される。１つの実施形態では、第１の軽鎖におけるＳ１７６は、正に荷電したアミノ酸で置換（例えば、Ｓ１７６Ｋ）され、第２の軽鎖におけるＳ１７６は、負に荷電したアミノ酸で置換（例えば、Ｓ１７６Ｅ）される。
【００７９】
ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインにおける相補性のアミノ酸置換に加えて、又はその代替えとして、ヘテロ２量体抗体における軽鎖及び重鎖の可変領域は、荷電アミノ酸を導入するための１つ又は複数の相補性のアミノ酸置換を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、ヘテロ２量体抗体の重鎖のＶＨ領域又は軽鎖のＶＬ領域は、野生型のＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含み、その結果、野生型のＩｇＧアミノ酸配列における１つ又は複数の正に荷電したアミノ酸は、１つ又は複数の負に荷電したアミノ酸と交換されている。あるいは、重鎖のＶＨ領域又は軽鎖のＶＬ領域は、野生型のＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含み、その結果、野生型のＩｇＧアミノ酸配列における１つ又は複数の負に荷電したアミノ酸は、１つ又は複数の正に荷電したアミノ酸と交換されている。
【００８０】
ＶＨ領域に含まれるＶ領域境界面残基（すなわち、ＶＨ領域とＶＬ領域との会合を媒介するアミノ酸残基）には、ＥＵ位置１、ＥＵ位置３、ＥＵ位置３５、ＥＵ位置３７、ＥＵ位置３９、ＥＵ位置４３、ＥＵ位置４４、ＥＵ位置４５、ＥＵ位置４６、ＥＵ位置４７、ＥＵ位置５０、ＥＵ位置５９、ＥＵ位置８９、ＥＵ位置９１、及びＥＵ位置９３が含まれる。ＶＨ領域におけるこうした境界面残基の１つ又は複数を荷電（正荷電又は負荷電）アミノ酸で置換することができる。ある特定の実施形態では、第１の重鎖及び／又は第２の重鎖のＶＨ領域におけるＥＵ位置３９のアミノ酸は、例えばリジンといった正に荷電したアミノ酸に対する置換が実施される。代替の実施形態では、第１の重鎖及び／又は第２の重鎖のＶＨ領域におけるＥＵ位置３９のアミノ酸は、例えばグルタミン酸といった負に荷電したアミノ酸に対する置換が実施される。いくつかの実施形態では、第１の重鎖のＶＨ領域におけるＥＵ位置３９のアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸に対する置換（例えば、Ｇ３９Ｅ）が実施され、第２の重鎖のＶＨ領域におけるＥＵ位置３９のアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸に対する置換（例えば、Ｇ３９Ｋ）が実施される。いくつかの実施形態では、第１の重鎖及び／又は第２の重鎖のＶＨ領域におけるＥＵ位置４４のアミノ酸は、例えばリジンといった正に荷電したアミノ酸に対する置換が実施される。代替の実施形態では、第１の重鎖及び／又は第２の重鎖のＶＨ領域におけるＥＵ位置４４のアミノ酸は、例えばグルタミン酸といった負に荷電したアミノ酸に対する置換が実施される。ある特定の実施形態では、第１の重鎖のＶＨ領域におけるＥＵ位置４４のアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸に対する置換（例えば、Ｇ４４Ｅ）が実施され、第２の重鎖のＶＨ領域におけるＥＵ位置４４のアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸に対する置換（例えば、Ｇ４４Ｋ）が実施される。
【００８１】
ＶＬ領域に含まれるＶ領域境界面残基（すなわち、ＶＨ領域とＶＬ領域との会合を媒介するアミノ酸残基）には、ＥＵ位置３２、ＥＵ位置３４、ＥＵ位置３５、ＥＵ位置３６、ＥＵ位置３８、ＥＵ位置４１、ＥＵ位置４２、ＥＵ位置４３、ＥＵ位置４４、ＥＵ位置４５、ＥＵ位置４６、ＥＵ位置４８、ＥＵ位置４９、ＥＵ位置５０、ＥＵ位置５１、ＥＵ位置５３、ＥＵ位置５４、ＥＵ位置５５、ＥＵ位置５６、ＥＵ位置５７、ＥＵ位置５８、ＥＵ位置８５、ＥＵ位置８７、ＥＵ位置８９、ＥＵ位置９０、ＥＵ位置９１、及びＥＵ位置１００が含まれる。ＶＬ領域における境界残基の１つ又は複数を荷電アミノ酸で置換することができ、こうした荷電アミノ酸は、好ましくは、同系重鎖のＶＨ領域に導入されるものとは反対の電荷を有するアミノ酸である。いくつかの実施形態では、第１の軽鎖及び／又は第２の軽鎖のＶＬ領域におけるＥＵ位置１００のアミノ酸は、例えばリジンといった正に荷電したアミノ酸に対する置換が実施される。代替の実施形態では、第１の軽鎖及び／又は第２の軽鎖のＶＬ領域におけるＥＵ位置１００のアミノ酸は、例えばグルタミン酸といった負に荷電したアミノ酸に対する置換が実施される。ある特定の実施形態では、第１の軽鎖のＶＬ領域におけるＥＵ位置１００のアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸に対する置換（例えば、Ｇ１００Ｋ）が実施され、第２の軽鎖のＶＬ領域におけるＥＵ位置１００のアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸に対する置換（例えば、Ｇ１００Ｅ）が実施される。
【００８２】
ある特定の実施形態では、本発明のヘテロ２量体抗体は、第１の重鎖及び第２の重鎖ならびに第１の軽鎖及び第２の軽鎖を含み、第１の重鎖は、位置４４（ＥＵ）、位置１８３（ＥＵ）、位置３９２（ＥＵ）、及び位置４０９（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、第２の重鎖は、位置４４（ＥＵ）、位置１８３（ＥＵ）、位置３５６（ＥＵ）、及び位置３９９（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、第１の軽鎖及び第２の軽鎖は、位置１００（ＥＵ）及び位置１７６（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、これらのアミノ酸置換によってこれらの位置に荷電アミノ酸が導入される。関連する実施形態では、第１の重鎖の位置４４（ＥＵ）のグリシンは、グルタミン酸と交換され、第２の重鎖の位置４４（ＥＵ）のグリシンは、リジンと交換され、第１の軽鎖の位置１００（ＥＵ）のグリシンは、リジンと交換され、第２の軽鎖の位置１００（ＥＵ）のグリシンは、グルタミン酸と交換され、第１の軽鎖の位置１７６（ＥＵ）のセリンは、リジンと交換され、第２の軽鎖の位置１７６（ＥＵ）のセリンは、グルタミン酸と交換され、第１の重鎖の位置１８３（ＥＵ）のセリンは、グルタミン酸と交換され、第１の重鎖の位置３９２（ＥＵ）のリジンは、アスパラギン酸と交換され、第１の重鎖の位置４０９（ＥＵ）のリジンは、アスパラギン酸と交換され、第２の重鎖の位置１８３（ＥＵ）のセリンは、リジンと交換され、第２の重鎖の位置３５６（ＥＵ）のグルタミン酸は、リジンと交換され、かつ／又は第２の重鎖の位置３９９（ＥＵ）のアスパラギン酸は、リジンと交換される。
【００８３】
他の実施形態では、本発明のヘテロ２量体抗体は、第１の重鎖及び第２の重鎖ならびに第１の軽鎖及び第２の軽鎖を含み、第１の重鎖は、位置１８３（ＥＵ）、位置３９２（ＥＵ）、及び位置４０９（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、第２の重鎖は、位置１８３（ＥＵ）、位置３５６（ＥＵ）、及び位置３９９（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、第１の軽鎖及び第２の軽鎖は、位置１７６（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、これらのアミノ酸置換によってこれらの位置に荷電アミノ酸が導入される。関連する実施形態では、第１の軽鎖の位置１７６（ＥＵ）のセリンは、リジンと交換され、第２の軽鎖の位置１７６（ＥＵ）のセリンは、グルタミン酸と交換され、第１の重鎖の位置１８３（ＥＵ）のセリンは、グルタミン酸と交換され、第１の重鎖の位置３９２（ＥＵ）のリジンは、アスパラギン酸と交換され、第１の重鎖の位置４０９（ＥＵ）のリジンは、アスパラギン酸と交換され、第２の重鎖の位置１８３（ＥＵ）のセリンは、リジンと交換され、第２の重鎖の位置３５６（ＥＵ）のグルタミン酸は、リジンと交換され、かつ／又は第２の重鎖の位置３９９（ＥＵ）のアスパラギン酸は、リジンと交換される。
【００８４】
さらに他の実施形態では、本発明のヘテロ２量体抗体は、第１の重鎖及び第２の重鎖ならびに第１の軽鎖及び第２の軽鎖を含み、第１の重鎖は、位置１８３（ＥＵ）、位置３９２（ＥＵ）、位置４０９（ＥＵ）、及び位置３７０（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、第２の重鎖は、位置１８３（ＥＵ）、位置３５６（ＥＵ）、位置３９９（ＥＵ）、及び位置３５７（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、第１の軽鎖及び第２の軽鎖は、位置１７６（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、これらのアミノ酸置換によってこれらの位置に荷電アミノ酸が導入される。関連する実施形態では、第１の軽鎖の位置１７６（ＥＵ）のセリンは、リジンと交換され、第２の軽鎖の位置１７６（ＥＵ）のセリンは、グルタミン酸と交換され、第１の重鎖の位置１８３（ＥＵ）のセリンは、グルタミン酸と交換され、第１の重鎖の位置３９２（ＥＵ）のリジンは、アスパラギン酸と交換され、第１の重鎖の位置４０９（ＥＵ）のリジンは、アスパラギン酸と交換され、第１の重鎖の位置３７０（ＥＵ）のリジンは、アスパラギン酸と交換され、第２の重鎖の位置１８３（ＥＵ）のセリンは、リジンと交換され、第２の重鎖の位置３５６（ＥＵ）のグルタミン酸は、リジンと交換され、第２の重鎖の位置３９９（ＥＵ）のアスパラギン酸は、リジンと交換され、かつ／又は第２の重鎖の位置３５７（ＥＵ）のグルタミン酸は、リジンと交換される。
【００８５】
定常ドメインはいずれも、ヘテロ２量体抗体の正しい構築を促進するために、上記の電荷対変異の１つ又は複数を含むように改変することができる。
【００８６】
本発明のヘテロ２量体抗体は、例えば、抗体が発現する宿主細胞の型に起因する翻訳後修飾により、重鎖及び軽鎖のいずれか１つに関して、Ｎ末端もしくはＣ末端又はそれらの両方から１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸残基を欠く重鎖（複数可）及び／又は軽鎖（複数可）を含む抗体も包含する。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞では、抗体重鎖からＣ末端のリジンが切断除去されることが多い。
【００８７】
ある特定の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、（ｉ）第１の標的抗原に特異的に結合する第１の結合ドメインと、（ｉｉ）第２の標的抗原に特異的に結合する第２の結合ドメインと、（ｉｉｉ）ヒト免疫グロブリンＦｃ領域と、を含み、結合ドメインの一方は、Ｆｃ領域のアミノ末端に位置し、もう一方の結合ドメインは、Ｆｃ領域のカルボキシル末端に位置する。いくつかのそのような実施形態では、第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインはそれぞれ、免疫グロブリン可変領域を含む。例えば、ある特定の実施形態では、第１の結合ドメインは、抗第１の標的抗原抗体に由来する第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）を含み、第２の結合ドメインは、抗第２の標的抗原抗体に由来する第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含む。
【００８８】
本明細書で使用される「Ｆｃ領域」という用語は、未変化の抗体をパパインで消化することによって産生し得る、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインという２つの定常ドメインを含み、任意選択でＣＨ４ドメインを含む。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１免疫グロブリン、ＩｇＧ２免疫グロブリン、ＩｇＧ３免疫グロブリン、又はＩｇＧ４免疫グロブリンに由来するＦｃ領域である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン又はヒトＩｇＧ２免疫グロブリンに由来するＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃ領域は、エフェクター機能を保持し得、こうしたエフェクター機能は、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及び食作用などである。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、エフェクター機能が低減又は除去されるように改変してよく、このことについては、本明細書でさらに詳細に記載される。
【００８９】
本発明の二重特異性の抗原結合タンパク質のある特定の実施形態では、Ｆｃ領域のアミノ末端に位置する結合ドメイン（すなわち、アミノ末端結合ドメイン）は、本明細書に記載のペプチドリンカー又は免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃ領域のアミノ末端に融合したＦａｂ断片である。「免疫グロブリンヒンジ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを連結するアミノ酸配列を指す。ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域は、一般に、Ｇｌｕ２１６付近又はＣｙｓ２２６付近からＰｒｏ２３０付近までのアミノ酸配列として定義される。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド結合を形成する最初のシステイン残基及び最後のシステイン残基を同一の位置に配置することによってＩｇＧ１配列とのアライメントを実施してよく、こうしたヒンジ領域は、当業者であれば決定可能である。いくつかの実施形態では、アミノ末端結合ドメインは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域を介してＦｃ領域のアミノ末端に連結される。他の実施形態では、アミノ末端結合ドメインは、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域を介してＦｃ領域のアミノ末端に連結される。１つの実施形態では、アミノ末端結合ドメイン（例えば、Ｆａｂ断片）は、ＦａｂのＣＨ１領域のカルボキシル末端を介してＦｃ領域に融合される。
【００９０】
本明細書で使用される「改変重鎖」という用語は、免疫グロブリン重鎖、特に、ヒトＩｇＧ１重鎖又はヒトＩｇＧ２重鎖と、機能性抗体断片（例えば、Ｆａｂ）又はその一部分（例えば、免疫グロブリン軽鎖もしくはＦｄ断片）と、を含む融合タンパク質であって、断片又はその一部分が、任意選択でペプチドリンカーを介して、重鎖のＣ末端にそのＮ末端で融合される融合タンパク質を指す。
【００９１】
本発明の抗原結合タンパク質の実施形態のいくつかでは、Ｆｃ領域のカルボキシル末端に位置する結合ドメイン（すなわち、カルボキシル末端結合ドメイン）は、Ｆａｂ断片である。そのような実施形態では、Ｆａｂは、Ｆａｂ断片のＶＨ領域のアミノ末端を介してペプチドリンカーを介してＦｃ領域のカルボキシル末端（例えば、ＣＨ３ドメインのカルボキシル末端）に融合されるか、又は別の形で連結される。したがって、１つの実施形態では、Ｆａｂは、ＦａｂのＶＨ領域のアミノ末端を介してＦｃ領域に融合され、その結果、得られる融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端への順序で、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ペプチドリンカー、ＶＨ領域、及びＣＨ１領域を含む。
【００９２】
カルボキシル末端ＦａｂにＦｃ領域を連結するペプチドリンカーは、本明細書に記載のペプチドリンカーのいずれかであり得る。特定の実施形態では、カルボキシル末端Ｆａｂ断片にＦｃ領域を連結するペプチドリンカーは、長さが少なくとも５残基のアミノ酸である。他の実施形態では、カルボキシル末端Ｆａｂ断片にＦｃ領域を連結するペプチドリンカーは、長さが少なくとも８残基のアミノ酸である。カルボキシル末端Ｆａｂ断片へのＦｃ領域の連結に特に適したペプチドリンカーは、（ＧｌｙｘＳｅｒ）ｎ（ｘ＝３又は４であり、ｎ＝２、３、４、５、又は６）などのグリシン−セリンリンカーである。１つの実施形態では、カルボキシル末端Ｆａｂ断片にＦｃ領域を連結するペプチドリンカーは、Ｌ１０（Ｇ４Ｓ）２リンカー（配列番号１０）である。別の実施形態では、カルボキシル末端Ｆａｂ断片にＦｃ領域を連結するペプチドリンカーは、Ｌ９又はＧ３ＳＧ４Ｓリンカー（配列番号１１）である。
【００９３】
カルボキシル末端結合ドメインがＦａｂ断片である、本発明の二重特異性の抗原結合タンパク質の実施形態のいくつかでは、Ｆｃ領域のアミノ末端に位置する結合ドメイン（すなわち、アミノ末端結合ドメイン）もまた、Ｆａｂ断片である。アミノ末端Ｆａｂ断片は、本明細書に記載のペプチドリンカー又は免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃ領域のアミノ末端に融合させることができる。いくつかの実施形態では、アミノ末端Ｆａｂ断片は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域を介してＦｃ領域のアミノ末端に連結される。他の実施形態では、アミノ末端Ｆａｂ断片は、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域を介してＦｃ領域のアミノ末端に連結される。１つの実施形態では、アミノ末端Ｆａｂ断片は、ＦａｂのＣＨ１領域のカルボキシル末端を介してＦｃ領域に融合される。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性の抗原結合タンパク質は、第２の標的に特異的に結合する第２の抗体に由来するＦａｂ断片のポリペプチド鎖の一方（例えば、重鎖（ＶＨ２−ＣＨ１））が第１の抗体の重鎖のカルボキシル末端に融合した、第１の標的に特異的に結合する第１の抗体を含む。そのような実施形態では、二重特異性の抗原結合タンパク質は、第２の抗体に由来するＦａｂ断片の残り半分（例えば、軽鎖（ＶＬ２−ＣＬ））を含むポリペプチド鎖も含む。本明細書では、この形式は「ＩｇＧ−Ｆａｂ」形式と称され、この型の分子の実施形態の１つは、図１に模式的に示される。したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、二重特異性の多価抗原結合タンパク質を含み、当該抗原結合タンパク質は、（ｉ）第１の抗体に由来する軽鎖と、（ｉｉ）第２の抗体のＶＨ−ＣＨ１ドメインを含む第１のポリペプチドにペプチドリンカーを介して重鎖がそのカルボキシル末端で融合されることで改変重鎖を形成する、第１の抗体に由来する重鎖と、（ｉｉｉ）第２の抗体のＶＬ−ＣＬドメインを含む第２のポリペプチドと、を含む。二重特異性の抗原結合タンパク質は、２量体化すると、２つの改変重鎖と、第１の抗体に由来する２つの軽鎖と、第２の抗体に由来するＦａｂ断片の残り半分（Ｆｄ断片）を含む２つのポリペプチド鎖と、を含むホモ６量体となる。１つの実施形態では、第１のポリペプチドは、重鎖のカルボキシル末端に融合され、第２の抗体に由来するＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含み、第２のポリペプチドは、第２の抗体に由来するＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む。
【００９５】
重鎖−軽鎖の正しい対形成を促進するために、本明細書に記載の電荷対変異又は相補性のアミノ酸置換を第１の抗体のＦａｂ領域（Ｆａｂ１）又は第２の抗体のＦａｂ領域（Ｆａｂ２）に導入することができる。例えば、いくつかの実施形態では、Ｆａｂ１におけるＶＬドメインのＥＵ位置３８のアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸）と交換され、Ｆａｂ１におけるＶＨドメインのＥＵ位置３９のアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸（例えば、リジン）と交換される。他の実施形態では、Ｆａｂ１におけるＶＬドメインのＥＵ位置３８のアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸（例えば、リジン）と交換され、Ｆａｂ１におけるＶＨドメインのＥＵ位置３９のアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸）と交換される。ある特定の実施形態では、Ｆａｂ２におけるＶＬドメインのＥＵ位置３８のアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸）と交換され、Ｆａｂ２におけるＶＨドメインのＥＵ位置３９のアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸（例えば、リジン）と交換される。他の実施形態では、Ｆａｂ２におけるＶＬドメインのＥＵ位置３８のアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸（例えば、リジン）と交換され、Ｆａｂ２におけるＶＨドメインのＥＵ位置３９のアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸）と交換される。
【００９６】
第２の抗体に由来するＶＨ−ＣＨ１領域（すなわち、Ｆｄ断片）が第１の抗体の重鎖に融合される実施形態では、第１の抗体に由来する重鎖は、Ｓ１８３Ｅ変異（ＥＵの番号付け）を含み、第１の抗体に由来する軽鎖は、Ｓ１７６Ｋ変異（ＥＵの番号付け）を含み、第２の抗体に由来する軽鎖は、Ｓ１７６Ｅ変異（ＥＵの番号付け）を含み、かつ第２の抗体に由来するＦｄ領域（第１の抗体に由来する重鎖のＣ末端に融合される）は、Ｓ１８３Ｋ変異（ＥＵの番号付け）を含む。他の実施形態では、第１の抗体に由来する重鎖は、Ｇ４４Ｅ変異（ＥＵ）及びＳ１８３Ｅ変異（ＥＵの番号付け）を含み、第１の抗体に由来する軽鎖は、Ｇ１００Ｋ変異（ＥＵ）及びＳ１７６Ｋ変異（ＥＵの番号付け）を含み、第２の抗体に由来する軽鎖は、Ｇ１００Ｅ変異（ＥＵ）及びＳ１７６Ｅ変異（ＥＵの番号付け）を含み、かつ第２の抗体に由来するＦｄ領域（第１の抗体に由来する重鎖のＣ末端に融合される）は、Ｇ４４Ｋ変異（ＥＵ）及びＳ１８３Ｋ変異（ＥＵの番号付け）を含む。前述の例における電荷は、逆転させてよいが、但し、対応する軽鎖又は重鎖に存在する電荷も逆転させ、その結果、重鎖／軽鎖の正しい対が反対の電荷を有することが条件である。
【００９７】
１つの実施形態では、本発明は、二重特異性の４価抗原結合タンパク質を対象とし、当該抗原結合タンパク質は、
【００９８】
ａ）第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）及び第１のＣＨ１ドメインを含む第１の抗体の第１の重鎖を含む第１のポリペプチドであって、第１の抗体が第１の抗原に特異的に結合し、第２の抗体の第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含むポリペプチドのＮ末端に対して第１の重鎖がそのＣ末端を介して融合され、第２のＣＨ１ドメインのＮ末端に対してＶＨ２がそのＣ末端を介して融合され、第２の抗体が第２の抗原に特異的に結合し、
【００９９】
ｉ）ＶＨ１又は第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３９、位置４４、及び位置１８３からなる群から選択される残基位置に正に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、かつ
【０１００】
ｉｉ）ＶＨ２又は第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３９、位置４４、及び位置１８３に対応する残基からなる群から選択される残基の位置に負に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、
第１のポリペプチドと、
【０１０１】
ｂ）ａ）に記載の第１の抗体の第１の軽鎖を含む第２のポリペプチドであって、第１の軽鎖が、第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１のＣＬ領域を含み、ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３８、位置１００、及び位置１７６からなる群から選択される残基位置に負に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、
第２のポリペプチドと、
【０１０２】
ｃ）ａ）に記載の第２の抗体の第２の軽鎖を含む第３のポリペプチドであって、第２の軽鎖が、第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２のＣＬ領域を含み、ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３８、位置１００、及び位置１７６からなる群から選択される残基位置に正に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、
第３のポリペプチドと、
を含む。
【０１０３】
ＶＨ２及び第２のＣＨ１ドメインに関する「に対応する」は、リンカーが存在しないのであれば、ＶＨ２及び第２のＣＨ１ドメインのアミノ酸残基が第１の重鎖のＣ末端から数えられることを意味する。ペプチドリンカーが存在するのであれば、ＶＨ２及び第２のＣＨ１ドメインのアミノ酸残基は、ペプチドリンカーのＣ末端から数えられる。いずれの場合においても、当該アミノ酸残基が第１の重鎖のＮ末端から数えられることはない。そうではなく、むしろ、ＶＨ２及び第２のＣＨ１ドメインについては、計数はＶＨ２ドメインの最初のアミノ酸残基から始まる。アミノ酸残基の計数は、ＥＵ又はＡＨｏの慣習を使用して実施される。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、ａ）ＶＨ１又は第１のＣＨ１ドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｋ、Ｇ４４Ｋ、及びＳ１８３Ｋからなる群から選択される変異を含み、ｂ）ＶＨ２又は第２のＣＨ１ドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｅ、Ｇ４４Ｅ、及びＳ１８３Ｅからなる群から選択される変異を含み、ｃ）ＶＬ１又は第１のＣＬドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｅ、Ｇ１００Ｅ、及びＳ１７６Ｅからなる群から選択される変異を含み、かつｄ）ＶＬ２又は第２のＣＬドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｋ、Ｇ１００Ｋ、及びＳ１７６Ｋからなる群から選択される変異を含む。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、ａ）第１のＣＨ１ドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｋ変異を含み、ｂ）第２のＣＨ１ドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｅ変異を含み、ｃ）第１のＣＬドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｅ変異を含み、かつｄ）第２のＣＬドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｋ変異を含む。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、ａ）ＶＨ１は、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｋ変異を含み、第１のＣＨ１ドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｋ変異を含み、ｂ）ＶＨ２は、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｅ変異を含み、第２のＣＨ１ドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｅ変異を含み、ｃ）ＶＬ１は、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｅ変異を含み、第１のＣＬドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｅ変異を含み、かつｄ）ＶＬ２は、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｋ変異を含み、第２のＣＬドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｋ変異を含む。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、ａ）第１のＣＨ１ドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｋ変異及びＳ１８３Ｋ変異を含み、ｂ）第２のＣＨ１ドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｅ変異及びＳ１８３Ｅ変異を含み、ｃ）第１のＣＬドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｅ変異及びＳ１７６Ｅ変異を含み、かつｄ）第２のＣＬドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｋ変異及びＳ１７６Ｋ変異を含む。
【０１０８】
１つの実施形態では、本発明は、二重特異性の４価抗原結合タンパク質を対象とし、当該抗原結合タンパク質は、
【０１０９】
ａ）第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）及び第１のＣＨ１ドメインを含む第１の抗体の第１の重鎖を含む第１のポリペプチドであって、第１の抗体が第１の抗原に特異的に結合し、第２の抗体の第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含むポリペプチドのＮ末端に対して第１の重鎖がそのＣ末端を介して融合され、第２のＣＨ１ドメインのＮ末端に対してＶＨ２がそのＣ末端を介して融合され、第２の抗体が第２の抗原に特異的に結合し、
【０１１０】
ｉ）ＶＨ１又は第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３９、位置４４、及び位置１８３からなる群から選択される残基位置に負に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、かつ
【０１１１】
ｉｉ）ＶＨ２又は第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３９、位置４４、及び位置１８３に対応する残基からなる群から選択される残基の位置に正に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、
第１のポリペプチドと、
【０１１２】
ｂ）ａ）に記載の第１の抗体の第１の軽鎖を含む第２のポリペプチドであって、第１の軽鎖が、第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１のＣＬ領域を含み、ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３８、位置１００、及び位置１７６からなる群から選択される残基位置に正に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、
第２のポリペプチドと、
【０１１３】
ｃ）ａ）に記載の第２の抗体の第２の軽鎖を含む第３のポリペプチドであって、第２の軽鎖が、第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２のＣＬ領域を含み、ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３８、位置１００、及び位置１７６からなる群から選択される残基位置に負に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、
第３のポリペプチドと、
を含む。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、ａ）ＶＨ１又は第１のＣＨ１ドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｅ、Ｇ４４Ｅ、及びＳ１８３Ｅからなる群から選択される変異を含み、ｂ）ＶＨ２又は第２のＣＨ１ドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｋ、Ｇ４４Ｋ、及びＳ１８３Ｋからなる群から選択される変異を含み、ｃ）ＶＬ１又は第１のＣＬドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｋ、Ｇ１００Ｋ、及びＳ１７６Ｋからなる群から選択される変異を含み、かつｄ）ＶＬ２又は第２のＣＬドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｅ、Ｇ１００Ｅ、及びＳ１７６Ｅからなる群から選択される変異を含む。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、ａ）第１のＣＨ１ドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｅ変異を含み、ｂ）第２のＣＨ１ドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｋ変異を含み、ｃ）第１のＣＬドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｋ変異を含み、かつｄ）第２のＣＬドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｅ変異を含む。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、ａ）ＶＨ１は、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｅ変異を含み、第１のＣＨ１ドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｅ変異を含み、ｂ）ＶＨ２は、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｋ変異を含み、第２のＣＨ１ドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｋ変異を含み、ｃ）ＶＬ１は、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｋ変異を含み、第１のＣＬドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｋ変異を含み、かつｄ）ＶＬ２は、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｅ変異を含み、第２のＣＬドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｅ変異を含む。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、ａ）第１のＣＨ１ドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｅ変異及びＳ１８３Ｅ変異を含み、ｂ）第２のＣＨ１ドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｋ変異及びＳ１８３Ｋ変異を含み、ｃ）第１のＣＬドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｋ変異及びＳ１７６Ｋ変異を含み、かつｄ）第２のＣＬドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｅ変異及びＳ１７６Ｅ変異を含む。
【０１１８】
１つの実施形態では、本発明は、二重特異性の４価抗原結合タンパク質を対象とし、当該抗原結合タンパク質は、
【０１１９】
ａ）第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）及び第１のＣＨ１ドメインを含む第１の抗体の第１の重鎖を含む第１のポリペプチドであって、第１の抗体が第１の抗原に特異的に結合し、第２の抗体の第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含むポリペプチドのＮ末端に対して第１の重鎖がそのＣ末端を介して融合され、第２のＣＨ１ドメインのＮ末端に対してＶＨ２がそのＣ末端を介して融合され、第２の抗体が第２の抗原に特異的に結合し、
【０１２０】
ｉ）ＶＨ１又は第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３９、位置４４、及び位置１８３からなる群から選択される残基位置に荷電アミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、かつ
【０１２１】
ｉｉ）ＶＨ２又は第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３９、位置４４、及び位置１８３に対応する残基からなる群から選択される残基の位置に荷電アミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、電荷が第１の重鎖のＶＨ１又は第１のＣＨ１の置換残基のものとは反対のものである、
第１のポリペプチドと、
【０１２２】
ｂ）ａ）に記載の第１の抗体の第１の軽鎖を含む第２のポリペプチドであって、第１の軽鎖が、第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１のＣＬ領域を含み、ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３８、位置１００、及び位置１７６からなる群から選択される残基位置に荷電アミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、
【０１２３】
位置３８の電荷が、第１の重鎖のＶＨ１又は第１のＣＨ１の位置３９の置換残基のものとは反対のものであり、位置１００の電荷が、第１の重鎖のＶＨ１又は第１のＣＨ１の位置４４の置換残基のものとは反対のものであり、位置１７６の電荷が、第１の重鎖のＶＨ１又は第１のＣＨ１の位置１８３の置換残基のものとは反対のものである、
第２のポリペプチドと、
【０１２４】
ｃ）ａ）に記載の第２の抗体の第２の軽鎖を含む第３のポリペプチドであって、第２の軽鎖が、第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２のＣＬ領域を含み、ＶＬ２又は第２のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３８、位置１００、及び位置１７６からなる群から選択される残基位置に荷電アミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、
【０１２５】
位置３８の電荷が、第２の重鎖のＶＨ２又は第２のＣＨ１の位置３９の置換残基のものとは反対のものであり、位置１００の電荷が、第２の重鎖のＶＨ２又は第２のＣＨ１の位置４４の置換残基のものとは反対のものであり、位置１７６の電荷が、第２の重鎖のＶＨ２又は第２のＣＨ１の位置１８３の置換残基のものとは反対のものである、
第３のポリペプチドと、
を含む。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、ａ）ＶＨ１は、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｅ変異を含み、第１のＣＨ１ドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｋ変異を含み、ｂ）ＶＨ２は、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｋ変異を含み、第２のＣＨ１ドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｅ変異を含み、ｃ）ＶＬ１は、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｋ変異を含み、第１のＣＬドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｅ変異を含み、かつｄ）ＶＬ２は、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｅ変異を含み、第２のＣＬドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｋ変異を含む。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、ａ）第１のＣＨ１ドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｅ変異及びＳ１８３Ｋ変異を含み、ｂ）第２のＣＨ１ドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｋ変異及びＳ１８３Ｅ変異を含み、ｃ）第１のＣＬドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｋ変異及びＳ１７６Ｅ変異を含み、かつｄ）第２のＣＬドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｅ変異及びＳ１７６Ｋ変異を含む。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、ａ）ＶＨ１は、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｋ変異を含み、第１のＣＨ１ドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｅ変異を含み、ｂ）ＶＨ２は、ＥＵの番号付けを使用したＱ３９Ｅ変異を含み、第２のＣＨ１ドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＳ１８３Ｋ変異を含み、ｃ）ＶＬ１は、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｅ変異を含み、第１のＣＬドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｋ変異を含み、かつｄ）ＶＬ２は、ＥＵの番号付けを使用したＱ３８Ｋ変異を含み、第２のＣＬドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＳ１７６Ｅ変異を含む。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、ａ）第１のＣＨ１ドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｋ変異及びＳ１８３Ｅ変異を含み、ｂ）第２のＣＨ１ドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＧ４４Ｅ変異及びＳ１８３Ｋ変異を含み、ｃ）第１のＣＬドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｅ変異及びＳ１７６Ｋ変異を含み、かつｄ）第２のＣＬドメインは、ＥＵの番号付けを使用したＧ１００Ｋ変異及びＳ１７６Ｅ変異を含む。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、第１の重鎖は、ペプチドリンカーを介してＶＨ２に融合される。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）６、及び（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６からなる群から選択される配列を含む。こうした配列は、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号９３３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９３４）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号９３５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９３６）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号９３７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９３８）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号９３９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９４０）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号９４１）、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９４２）としても記載することができる。
【０１３１】
１つの実施形態では、本発明は、二重特異性の４価抗原結合タンパク質の調製方法を対象とし、当該方法は、
【０１３２】
１）宿主細胞における同時発現であって、
【０１３３】
ａ）第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）及び第１のＣＨ１ドメインを含む第１の抗体の第１の重鎖を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、第１の抗体が第１の抗原に特異的に結合し、第２の抗体の第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含むポリペプチドのＮ末端に対して第１の重鎖がそのＣ末端を介して融合され、第２のＣＨ１ドメインのＮ末端に対してＶＨ２がそのＣ末端を介して融合され、第２の抗体が第２の抗原に特異的に結合し、
【０１３４】
ｉ）ＶＨ１又は第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３９、位置４４、及び位置１８３からなる群から選択される残基位置に正に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、かつ
【０１３５】
ｉｉ）ＶＨ２又は第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３９、位置４４、及び位置１８３に対応する残基からなる群から選択される残基の位置に負に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、
第１のポリヌクレオチドと、
【０１３６】
ｂ）ａ）に記載の第１の抗体の軽鎖を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、軽鎖が、第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１のＣＬ領域を含み、ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３８、位置１００、及び位置１７６からなる群から選択される残基位置に負に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、
第２のポリヌクレオチドと、
【０１３７】
ｃ）ａ）に記載の第２の抗体の軽鎖を含む第３のポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドであって、軽鎖が、第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２のＣＬ領域を含み、ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３８、位置１００、及び位置１７６からなる群から選択される残基位置に正に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、
第３のポリヌクレオチドと、
の同時発現、
【０１３８】
２）ポリペプチドが産生する条件下での宿主細胞の培養、ならびに
【０１３９】
３）宿主細胞からの抗原結合タンパク質の回収
を含む。
【０１４０】
１つの実施形態では、本発明は、二重特異性の４価抗原結合タンパク質の調製方法を対象とし、当該方法は、
【０１４１】
１）宿主細胞における同時発現であって、
【０１４２】
ａ）第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）及び第１のＣＨ１ドメインを含む第１の抗体の第１の重鎖を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、第１の抗体が第１の抗原に特異的に結合し、第２の抗体の第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含むポリペプチドのＮ末端に対して第１の重鎖がそのＣ末端を介して融合され、第２のＣＨ１ドメインのＮ末端に対してＶＨ２がそのＣ末端を介して融合され、第２の抗体が第２の抗原に特異的に結合し、
【０１４３】
ｉ）ＶＨ１又は第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３９、位置４４、及び位置１８３からなる群から選択される残基位置に負に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、かつ
【０１４４】
ｉｉ）ＶＨ２又は第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３９、位置４４、及び位置１８３に対応する残基からなる群から選択される残基の位置に正に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、
第１のポリヌクレオチドと、
【０１４５】
ｂ）ａ）に記載の第１の抗体の第１の軽鎖を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、第１の軽鎖が、第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１のＣＬ領域を含み、ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３８、位置１００、及び位置１７６からなる群から選択される残基位置に正に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、
第２のポリヌクレオチドと、
【０１４６】
ｃ）ａ）に記載の第２の抗体の第２の軽鎖を含む第３のポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドであって、第２の軽鎖が、第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２のＣＬ領域を含み、ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３８、位置１００、及び位置１７６からなる群から選択される残基位置に負に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、
第３のポリヌクレオチドと、
の同時発現、
【０１４７】
２）ポリペプチドが産生する条件下での宿主細胞の培養、ならびに
【０１４８】
３）宿主細胞からの抗原結合タンパク質の回収
を含む。
【０１４９】
１つの実施形態では、本発明は、二重特異性の４価抗原結合タンパク質の調製方法を対象とし、当該方法は、
【０１５０】
１）宿主細胞における同時発現であって、
【０１５１】
ａ）第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）及び第１のＣＨ１ドメインを含む第１の抗体の第１の重鎖を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、第１の抗体が第１の抗原に特異的に結合し、第２の抗体の第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含むポリペプチドのＮ末端に対して第１の重鎖がそのＣ末端を介して融合され、第２のＣＨ１ドメインのＮ末端に対してＶＨ２がそのＣ末端を介して融合され、第２の抗体が第２の抗原に特異的に結合し、
【０１５２】
ｉ）ＶＨ１又は第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３９、位置４４、及び位置１８３からなる群から選択される残基位置に荷電アミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、かつ
【０１５３】
ｉｉ）ＶＨ２又は第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３９、位置４４、及び位置１８３に対応する残基からなる群から選択される残基の位置に荷電アミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、電荷が第１の重鎖のＶＨ１又は第１のＣＨ１の置換残基のものとは反対のものである、
第１のポリヌクレオチドと、
【０１５４】
ｂ）ａ）に記載の第１の抗体の軽鎖を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、軽鎖が、第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１のＣＬ領域を含み、ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３８、位置１００、及び位置１７６からなる群から選択される残基位置に荷電アミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、
【０１５５】
位置３８の電荷が、第１の重鎖のＶＨ１又は第１のＣＨ１の位置３９の置換残基のものとは反対のものであり、位置１００の電荷が、第１の重鎖のＶＨ１又は第１のＣＨ１の位置４４の置換残基のものとは反対のものであり、位置１７６の電荷が、第１の重鎖のＶＨ１又は第１のＣＨ１の位置１８３の置換残基のものとは反対のものである、
第２のポリヌクレオチドと、
【０１５６】
ｃ）ａ）に記載の第２の抗体の軽鎖を含む第３のポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドであって、軽鎖が、第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２のＣＬ領域を含み、ＶＬ１又は第１のＣＬドメインが、ＥＵの番号付けを使用した位置３８、位置１００、及び位置１７６からなる群から選択される残基位置に正に荷電したアミノ酸を導入するためのアミノ酸置換を少なくとも１つ含み、
【０１５７】
位置３８の電荷が、第２の重鎖のＶＨ２又は第２のＣＨ１の位置３９の置換残基のものとは反対のものであり、位置１００の電荷が、第２の重鎖のＶＨ２又は第２のＣＨ１の位置４４の置換残基のものとは反対のものであり、位置１７６の電荷が、第２の重鎖のＶＨ２又は第２のＣＨ１の位置１８３の置換残基のものとは反対のものである、
第３のポリヌクレオチドと、
の同時発現、
【０１５８】
２）ポリペプチドが産生する条件下での宿主細胞の培養、ならびに
【０１５９】
３）宿主細胞からの抗原結合タンパク質の回収
を含む。
【０１６０】
さらに、又はあるいは、重鎖−軽鎖の正しい対形成は、カルボキシル末端Ｆａｂ結合ドメインにおいてＣＨ１ドメインとＣＬドメインとを交換することによって促進し得る。例として、第１のポリペプチドは、重鎖のカルボキシル末端に融合され、第２の抗体に由来するＶＬドメイン及びＣＨ１ドメインを含み得、第２のポリペプチドは、第２の抗体に由来するＶＨドメイン及びＣＬドメインを含み得る。別の実施形態では、第１のポリペプチドは、重鎖のカルボキシル末端に融合され、第２の抗体に由来するＶＨドメイン及びＣＬドメインを含み得、第２のポリペプチドは、第２の抗体に由来するＶＬドメイン及びＣＨ１ドメインを含み得る。
【０１６１】
本明細書に記載の二重特異性の抗原結合タンパク質の重鎖定常領域又はＦｃ領域は、抗原結合タンパク質のグリコシル化及び／又はエフェクター機能に影響を与える１つ又は複数のアミノ酸置換を含み得る。免疫グロブリンのＦｃ領域の機能の１つは、免疫グロブリンがその標的にいつ結合したかを免疫系に情報伝達することである。これは、一般に、「エフェクター機能」と称される。情報伝達が行われると、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が生じる。ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰは、免疫系細胞の表面に存在するＦｃ受容体へのＦｃ領域の結合を介して媒介される。ＣＤＣは、例えばＣ１ｑといった、補体系のタンパク質とＦｃとの結合を介して媒介される。いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性の抗原結合タンパク質は、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＰ活性を含むエフェクター機能、及び／又は抗原結合タンパク質のクリアランスもしくは半減期を増進させるための１つ又は複数のアミノ酸置換を定常領域に含む。エフェクター機能を増進させることができるアミノ酸置換の例（ＥＵの番号付け）には、限定はされないが、Ｅ２３３Ｌ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３５Ｓ、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｖ、Ｐ２４７Ｉ、Ｄ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｎ、Ｋ２９０Ｙ、Ｒ２９２Ｐ、Ｅ２９４Ｌ、Ｙ２９６Ｗ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｖ、Ｓ２９８Ｇ、Ｓ２９８Ｔ、Ｔ２９９Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ｑ３１１Ｍ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｅ、Ｋ３２６Ｗ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｍ、Ａ３３０Ｆ、Ｉ３３２Ｅ、Ｄ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｋ３３４Ｖ、Ａ３３９Ｄ、Ａ３３９Ｑ、Ｐ３９６Ｌ、又はこうしたアミノ酸置換の任意の組み合わせが含まれる。
【０１６２】
他の実施形態では、本発明の二重特異性の抗原結合タンパク質は、エフェクター機能を低減するための１つ又は複数のアミノ酸置換を定常領域に含む。エフェクター機能を低減することができるアミノ酸置換の例（ＥＵの番号付け）には、限定はされないが、Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｑ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、又はこうしたアミノ酸置換の任意の組み合わせが含まれる。
【０１６３】
グリコシル化は、抗体、特に、ＩｇＧ１抗体のエフェクター機能に寄与し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性の抗原結合タンパク質は、結合タンパク質のグリコシル化のレベル又は型に影響を与える１つ又は複数のアミノ酸置換を含み得る。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ−結合型又はＯ−結合型のいずれかである。Ｎ−結合型は、アスパラギン残基の側鎖に糖質部分が付加していることを指す。アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）というトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖に糖質部分が酵素的に付加されるための認識配列である。したがって、こうしたトリペプチド配列のいずれかがポリペプチドに存在すると、潜在的なグリコシル化部位が創出される。Ｏ−結合型のグリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースのうちの１つが、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに付加されることを指すが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンも使用され得る。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の二重特異性の抗原結合タンパク質のグリコシル化は、１つ又は複数のグリコシル化部位を、例えば、結合タンパク質のＦｃ領域に追加することによって増加する。抗原結合タンパク質へのグリコシル化部位の追加は、（Ｎ−結合型のグリコシル化部位については）１つ又は複数の上記のトリ−ペプチド配列を抗原結合タンパク質が含むようにアミノ酸配列を改変することによって好都合に達成することができる。改変は、（Ｏ−結合型のグリコシル化部位については）１つもしくは複数のセリン残基もしくはスレオニン残基を出発配列に追加するか、又は１つもしくは複数のセリン残基もしくはスレオニン残基によって出発配列を置換することによって実施してもよい。簡便には、抗原結合タンパク質のアミノ酸配列は、ＤＮＡレベルでの変更を介して改変してよく、具体的には、標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを事前選択塩基で変異させることによって改変してよく、その結果、所望のアミノ酸へと翻訳されることになるコドンが産生される。
【０１６５】
本発明は、エフェクター活性の改変をもたらす改変糖質構造を有する二重特異性の抗原結合タンパク質分子の産生も包含し、こうした抗原結合タンパク質には、フコシル化が欠如又は低減しており、ＡＤＣＣ活性の改善を示す抗原結合タンパク質が含まれる。フコシル化を低減又は除去するための方法は、当該技術分野においてさまざまなものが知られている。例えば、ＡＤＣＣエフェクター活性は、ＦｃγＲＩＩＩ受容体への抗体分子の結合によって媒介され、これは、ＣＨ２ドメインのＮ２９７残基のＮ−結合型のグリコシル化によって生じる糖質構造に依存することが示されている。天然のフコシル化抗体と比較して、非フコシル化抗体は高親和性でこの受容体に結合し、ＦｃγＲＩＩＩ媒介性のエフェクター機能をより効率的に引き起こす。例えば、アルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ酵素がノックアウトされたＣＨＯ細胞において非フコシル化抗体を組換えで産生させると、ＡＤＣＣ活性が１００倍に増加した抗体が得られる（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．８７（５）：６１４−２２，２００４を参照のこと）。アルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ酵素又はフコシル化経路における他の酵素の活性の低減を介して類似の効果を達成することができ、こうした類似の効果は、例えば、ｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスＲＮＡでの処理、細胞株の酵素（複数）のノックアウト操作、又は選択的なグリコシル化阻害剤を含めた培養を介して達成することができる（Ｒｏｔｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１２）：１１１３−２３，１９８９を参照のこと）。例えば、Ｌｅｃ１３又はラットのハイブリドーマであるＹＢ２／０細胞株といった、いくつかの宿主細胞株は、フコシル化レベルが低下した抗体を自然に産生する（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７７（３０）：２６７３３−４０，２００２、及びＳｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７８（５）：３４６６−７３，２００３を参照のこと）。例えば、ＧｎＴＩＩＩ酵素を過剰発現する細胞において抗体を組換えで産生させることで分岐型糖質のレベルを増加させても、ＡＤＣＣ活性が増加することが突き止められた（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（２）：１７６−８０，１９９９を参照のこと）。
【０１６６】
他の実施形態では、本明細書に記載の二重特異性の抗原結合タンパク質のグリコシル化は、例えば、結合タンパク質のＦｃ領域から１つ又は複数のグリコシル化部位を除去することによって低減又は除去される。Ｎ−結合型のグリコシル化部位を除去又は改変するアミノ酸置換は、抗原結合タンパク質のＮ−結合型のグリコシル化を低減又は除去することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の二重特異性の抗原結合タンパク質は、位置Ｎ２９７（ＥＵの番号付け）において、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ａ、又はＮ２９７Ｇなどの変異を含む。１つの特定の実施形態では、本発明の二重特異性の抗原結合タンパク質は、Ｎ２９７Ｇ変異を有するヒトＩｇＧ１抗体に由来するＦｃ領域を含む。Ｎ２９７に変異を含む分子の安定性を改善するために、分子のＦｃ領域をさらに操作してよい。例えば、いくつかの実施形態では、２量体の状態におけるジスルフィド結合の形成を促進するために、Ｆｃ領域におけるアミノ酸の１つ又は複数がシステインで置換される。したがって、ＩｇＧ１のＦｃ領域のＶ２５９、Ａ２８７、Ｒ２９２、Ｖ３０２、Ｌ３０６、Ｖ３２３、又はＩ３３２（ＥＵの番号付け）に対応する残基をシステインで置換してよい。１つの実施形態では、特定の残基対がシステインで置換され、その結果、そうした残基対が互いにジスルフィド結合を優先的に形成することによってジスルフィド結合の混成が限定又は防止される。ある特定の実施形態では、対には、限定はされないが、Ａ２８７ＣとＬ３０６Ｃ、Ｖ２５９ＣとＬ３０６Ｃ、Ｒ２９２ＣとＶ３０２Ｃ、ならびにＶ３２３ＣとＩ３３２Ｃが含まれる。特定の実施形態では、本明細書に記載の二重特異性の抗原結合タンパク質は、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃという変異を有するヒトＩｇＧ１抗体に由来するＦｃ領域を含む。そのような実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｎ２９７Ｇ変異も含み得る。
【０１６７】
例えば、サルベージ受容体結合エピトープの組み込み又は付加（例えば、適切な領域の変異によるものか、又は抗原結合タンパク質のいずれかの末端もしくは中間に融合することになるペプチドタグに対して、例えば、ＤＮＡ合成もしくはペプチド合成によってエピトープを組み込むことによるものである。例えば、ＷＯ９６／３２４７８を参照のこと）、あるいはＰＥＧ又は多糖ポリマーを含む他の水溶性ポリマーなどの分子の付加によって血清中半減期を増加させるために本発明の二重特異性の抗原結合タンパク質を改変することも望ましくあり得る。Ｆｃ領域の１つ又は２つのループに由来するアミノ酸残基のいずれか１つ又は複数が抗原結合タンパク質における類似の位置に導入された領域をサルベージ受容体結合エピトープが構成することが好ましい。１つの実施形態では、Ｆｃ領域の１つ又は２つのループに由来する残基の３つ以上の残基が導入される。１つの実施形態では、エピトープは、Ｆｃ領域（例えば、ＩｇＧのＦｃ領域）のＣＨ２ドメインから得られ、抗原結合タンパク質のＣＨ１、ＣＨ３、もしくはＶＨ領域、又は複数のそのような領域に導入される。あるいは、エピトープは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから得られ、抗原結合タンパク質のＣＬ領域もしくはＶＬ領域、又はそれらの両方に導入される。Ｆｃ変異体及びサルベージ受容体とのその相互作用の説明については、ＷＯ９７／３４６３１及びＷＯ９６／３２４７８を参照のこと。
【０１６８】
本発明は、本明細書に記載の二重特異性の抗原結合タンパク質及びその構成成分をコードする１つ又は複数の単離された核酸を含む。本発明の核酸分子には、１本鎖形態と２本鎖との両方のＤＮＡ及びＲＮＡ、ならびに対応する相補性配列が含まれる。ＤＮＡには、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせが含まれる。本発明の核酸分子には、全長の遺伝子又はｃＤＮＡ分子、ならびにそれらの断片の組み合わせが含まれる。１つの実施形態では、本発明の核酸は、ヒトの供給源に由来するが、本発明は、非ヒト種に由来するものも含む。
【０１６９】
免疫グロブリンもしくはその領域（例えば、可変領域、Ｆｃ領域等）又は対象のポリペプチドに由来する関連アミノ酸配列は、タンパク質を直接的に配列決定することによって決定してよく、一般的なコドン表に従って適切なコードヌクレオチド配列を設計することができる。あるいは、本発明の二重特異性の抗原結合タンパク質の結合ドメインの由来元となり得るモノクローナル抗体をコードするゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡは、通常の手順（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力を有するオリゴヌクレオチドプローブを使用することによるもの）を使用し、そのような抗体を産生する細胞から単離及び配列決定することができる。
【０１７０】
本明細書では、「単離された核酸」は、「単離されたポリヌクレオチド」と互換的に使用され、天然に生じる供給源から単離された核酸の場合、核酸が単離された生物のゲノムに存在する隣接遺伝配列から分離された核酸である。例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、又はオリゴヌクレオチドなどの、鋳型から酵素的に合成される核酸又は化学的に合成される核酸の場合、そのようなプロセスから得られる核酸は、単離された核酸であると理解される。単離された核酸分子は、独立した断片又は大型の核酸構築物の構成成分の形態における核酸分子を指す。１つの実施形態では、核酸には、内在性の材料は実質的に混入していない。核酸分子は、実質的に純粋な形態、かつ標準的な生化学的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）において概要が示されるものなど）によってその構成成分であるヌクレオチド配列の同定、操作、及び回収が可能になる量又は濃度で、少なくとも一度は単離されたＤＮＡ又はＲＮＡから得られたものである。そのような配列は、典型的には真核生物の遺伝子に存在する内部非翻訳配列又はイントロンによって中断されないオープンリーディングフレームの形態において提供及び／又は構築される。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームの５’側又は３’側に存在し得、この場合、こうした配列がコード領域の操作又は発現を妨害することはない。別段の記載がない限り、本明細書で議論される任意の１本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５’末端であり、２本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は、５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物は、５’から３’の方向で産生し、この方向は、転写方向と称される。ＲＮＡ転写物と同一の配列を有するＤＮＡ鎖に存在し、ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’側に位置する配列領域は、「上流配列」と称される。ＲＮＡ転写物と同一の配列を有するＤＮＡ鎖に存在し、ＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’側に位置する配列領域は、「下流配列」と称される。
【０１７１】
本発明は、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸に対して、中程度の厳密条件下及び高度の厳密条件下でハイブリダイズする核酸も含む。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を与える基本パラメーター、及び適切な条件を考案するためのガイダンスは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ  ９  ａｎｄ  １１、及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ２．１０  ａｎｄ  ６．３−６．４）によって示されており、こうした条件は、当業者であれば、例えば、ＤＮＡの長さ及び／又は基本組成に基づいて容易に決定することができる。中程度の厳密条件を達成する方法の１つでは、５ｘＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含む事前洗浄液、約５０％のホルムアミド、６ｘＳＳＣを含むハイブリダイゼーション緩衝液、及び約５５℃のハイブリダイゼーション温度（又は約５０％のホルムアミドを含むものなどの、他の類似のハイブリダイゼーション溶液が約４２℃のハイブリダイゼーション温度で使用される）、ならびに０．５ｘＳＳＣ、０．１％のＳＤＳにおいて約６０℃で行う洗浄条件が使用される。一般に、高度の厳密条件は上記のハイブリダイゼーション条件として定義されるが、洗浄は、０．２ｘＳＳＣ、０．１％のＳＤＳにおいて約６８℃で実施される。ハイブリダイゼーション緩衝液及び洗浄緩衝液において、ＳＳＣ（ｌｘＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌ及び１５ｍＭのクエン酸ナトリウムである）の代わりにＳＳＰＥ（ｌｘＳＳＰＥは、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、及び１．２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を使用することができる。洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後に１５分間実施される。ハイブリダイゼーション反応及び２本鎖の安定性を決定する基本原理を適用することによって所望の度合いの厳密性を達成するために、必要に応じて洗浄温度及び洗浄塩濃度を調節することができると理解されるべきであり、こうしたことは当業者に知られており、以下にさらに記載される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照のこと）。配列が未知の標的核酸に核酸をハイブリダイズさせるとき、ハイブリッドの長さは、ハイブリダイズさせる核酸のものになると想定される。配列が既知の核酸をハイブリダイズさせるとき、ハイブリッドの長さは、核酸の配列をアライメントし、最適な配列相補性を有する１つ又は複数の領域を同定することによって決定できる。ハイブリッドの長さが５０塩基対未満となることが予測される場合、ハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）を５〜１０℃下回るようにするべきであり、Ｔｍは、下記の式に従って決定される。長さが１８塩基対未満のハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔの塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃの塩基数）。長さが１８塩基対を超えるハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃの％）−（６００／Ｎ）（Ｎは、ハイブリッドの塩基数であり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液におけるナトリウムイオンの濃度である（ｌｘＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ））。１つの実施形態では、ハイブリダイズさせるそのような核酸はそれぞれ、少なくとも１５ヌクレオチド（もしくは少なくとも１８ヌクレオチド、もしくは少なくとも２０ヌクレオチド、もしくは少なくとも２５ヌクレオチド、もしくは少なくとも３０ヌクレオチド、もしくは少なくとも４０ヌクレオチド、もしくは少なくとも５０ヌクレオチド）の長さを有するか、又はそのハイブリダイズ対象となる本発明の核酸の長さの少なくとも２５％（もしくは少なくとも５０％、もしくは少なくとも６０％、もしくは少なくとも７０％、もしくは少なくとも８０％）を有し、そのハイブリダイズ対象となる本発明の核酸と少なくとも６０％の配列同一性（あるいは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％）を有するものであり、配列同一性は、上により詳細に記載される配列ギャップを最小化しつつ、重なり及び同一性が最大化するようにアライメントを実施し、ハイブリダイズさせる核酸の配列を比較することによって決定される。
【０１７２】
カセットもしくはＰＣＲによる変異導入又は当該技術分野においてよく知られる他の手法を使用し、ポリペプチドをコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的変異により変異体をコードするＤＮＡを産生させた後、本明細書に概要が示される細胞培養において組換えＤＮＡを発現させることによって本明細書に記載の抗原結合タンパク質の変異体を調製することができる。しかしながら、確立された手法を使用するインビトロの合成によって、最大で約１００〜１５０残基を有する変異ＣＤＲを含む抗原結合タンパク質を調製してよい。変異体は、典型的には、例えば抗原への結合といった、天然に生じるアナログと質的に同一の生物学的活性を示す。そのような変異体は、例えば、抗原結合タンパク質のアミノ酸配列内に、残基の欠失及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終的な構築物を得るために、欠失、挿入、及び置換が任意の組み合わせで実施されるが、但し、最終構築物が所望の特性を有することが条件である。アミノ酸の変更を実施すると、抗原結合タンパク質の翻訳後プロセスも改変され得る。こうした変更は、グリコシル化部位の数又は位置の変更などである。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質の変異体は、エピトープへの結合に直接的に関与するアミノ酸残基の改変を意図して調製される。他の実施形態では、本明細書で議論される目的では、エピトープへの結合に直接的に関与しない残基、又はいかなる様式でもエピトープへの結合に関与しない残基を改変することが望ましい。ＣＤＲ領域及び／又はフレームワーク領域のいずれかへの変異導入が企図される。当業者であれば、抗原結合タンパク質のアミノ酸配列における有用な改変を設計するために共分散分析手法を用いることができる。例えば、Ｃｈｏｕｌｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ４１：４７５−４８４，２０００、Ｄｅｍａｒｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：４１−４８，２００４、Ｈｕｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １６（５）：３８１−８６，２００３、Ａｕｒｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許公開第２００８／０３１８２０７Ａ１号、Ｇｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許公開第２００９／００４８１２２Ａ１号、Ｕｒｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ２００８／１１０３４８Ａ１、Ｂｏｒｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ２００９／００００９９Ａ２を参照のこと。共分散分析によって決定されるそのような改変は、抗原結合タンパク質の効力、薬物動態、薬力学、及び／又は製造可能特性を改善することができる。
【０１７３】
本発明の核酸配列。当業者であれば理解するであろうが、遺伝コードは縮重しているため、極めて多数の核酸を調製してよく、そのすべてが本発明のＣＤＲ（ならびに本明細書に記載の抗原結合タンパク質の重鎖及び軽鎖又は他の構成成分）をコードする。したがって、当業者であれば、特定のアミノ酸配列を同定し、コードされるタンパク質のアミノ酸配列に変更が生じない様式で、１つ又は複数のコドンの配列を単に改変することによって任意の数の異なる核酸を調製することが可能である。
【０１７４】
本発明は、本発明の二重特異性の抗原結合タンパク質の１つ又は複数の構成成分（例えば、可変領域、軽鎖、重鎖、改変重鎖、及びＦｄ断片）をコードする１つ又は複数の核酸を含むベクターも含む。「ベクター」という用語は、タンパク質のコード情報を宿主細胞に導入するために使用される任意の分子又は実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ、又はウイルス）を指す。ベクターの例には、限定はされないが、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳類ベクター、及び例えば、組換え発現ベクターといった発現ベクターが含まれる。本明細書で使用される「発現ベクター」又は「発現構築物」という用語は、所望のコード配列と、機能可能なように連結されたコード配列の特定の宿主細胞における発現に必要な適切な核酸制御配列と、を含む組換えＤＮＡ分子を指す。発現ベクターは、限定はされないが、それに対して機能可能なように連結されたコード領域の転写、翻訳に影響を与えるか、又はそれらを制御する配列、及びイントロンが存在するのであれば、当該コード領域のＲＮＡのスプライシングに影響を与える配列を含み得る。原核生物における発現に必要な核酸配列は、プロモーター、任意選択でオペレーター配列、リボソーム結合部位、及び恐らくは他の配列を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、ならびに終結シグナル及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。望まれるのであれば、細胞からの対象のポリペプチドの単離の容易性を向上させるために、分泌シグナルペプチド配列もまた、任意選択で発現ベクターによってコードさせ、対象のコード配列に機能可能なように連結することができ、その結果、組換え宿主細胞に発現ポリペプチドを分泌させることができる。例えば、いくつかの実施形態では、シグナルペプチド配列は、本発明のポリペプチド配列のいずれかのアミノ末端に付加／融合させてよい。ある特定の実施形態では、本発明のポリペプチド配列のいずれかのアミノ末端に対して、ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ（配列番号９４３）のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドが融合される。他の実施形態では、本発明のポリペプチド配列のいずれかのアミノ末端に対して、ＭＡＷＡＬＬＬＬＴＬＬＴＱＧＴＧＳＷＡ（配列番号９４４）のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドが融合される。さらに他の実施形態では、本発明のポリペプチド配列のいずれかのアミノ末端に対して、ＭＴＣＳＰＬＬＬＴＬＬＩＨＣＴＧＳＷＡ（配列番号９４５）のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドが融合される。本明細書に記載のポリペプチド配列のアミノ末端に融合することができる他の適したシグナルペプチド配列には、ＭＥＡＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号９４６）、ＭＥＷＴＷＲＶＬＦＬＶＡＡＡＴＧＡＨＳ（配列番号９４７）、ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号９４８）、ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号９４９）、ＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳ（配列番号９５０）、及びＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号９５１）が含まれる。他のシグナルペプチドが当業者に知られており、例えば、特定の宿主細胞における発現を促進又は最適化するために、本発明のポリペプチド鎖のいずれかにこうした他のシグナルペプチドを融合させてよい。
【０１７５】
典型的には、本発明の二重特異性の抗原タンパク質を産生させるために宿主細胞において使用される発現ベクターは、プラスミドを維持するための配列、ならびに二重特異性の抗原結合タンパク質の構成成分をコードする外来性のヌクレオチド配列のクローン化及び発現のための配列を含むことになる。そのような配列は、まとめて「隣接配列」と称され、ある特定の実施形態では、典型的には、下記のヌクレオチド配列の１つ又は複数を含むことになる：プロモーター、１つ又は複数のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナースプライス部位及びアクセプタースプライス部位を含む完全イントロン配列、ポリペプチドの分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現することになるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択可能マーカー要素。こうした配列はそれぞれ、以下に議論される。
【０１７６】
任意選択で、ベクターは、「タグ」をコードする配列を含み得、こうした配列は、すなわち、ポリペプチドをコードする配列の５’末端又は３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子である。オリゴヌクレオチドタグ配列は、ポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓなど）、ＦＬＡＧ、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ））、ｍｙｃ、又はそれに対する市販抗体が存在する別の「タグ」分子をコードする。このタグは、典型的には、ポリペプチドの発現に際してポリペプチドに融合され、宿主細胞からの親和性によるポリペプチドの精製又は検出の手段として役立てることができる。親和性による精製は、例えば、タグに対する抗体を親和性マトリックスとして使用するカラムクロマトグラフィーによって達成することができる。その後、任意選択で、切断のためにある特定のペプチダーゼを使用するなど、さまざまな手段によって精製ポリペプチドからタグを除去することができる。
【０１７７】
隣接配列は、同種性（すなわち、宿主細胞と同一の種及び／もしくは株に由来する）、異種性（すなわち、宿主細胞の種もしくは株以外の種に由来する）、ハイブリッド（すなわち、複数の供給源に由来する隣接配列の組み合わせ）、合成のもの、又は天然のものであり得る。したがって、隣接配列の供給源は、任意の原核生物もしくは真核生物、任意の脊椎生物もしくは無脊椎生物、又は任意の植物であり得るが、但し、隣接配列が機能性であり、宿主の細胞機構によって活性化可能であることが条件である。
【０１７８】
本発明のベクターにおいて有用な隣接配列は、当該技術分野においてよく知られるいくつかの方法のいずれによって得てもよい。典型的には、本明細書での有用な隣接配列は、マッピング及び／又は制限エンドヌクレアーゼによる消化によって事前に同定されることになるため、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用し、適切な組織源から単離することができる。場合によっては、隣接配列のヌクレオチド配列のすべてが既知であり得る。この場合、日常的な核酸合成方法又は核酸クローン化方法を使用し、隣接配列を合成してよい。
【０１７９】
隣接配列のすべてが既知であるか、又はその一部分のみが既知であるかを問わず、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して隣接配列を得てよく、かつ／又は同一の種もしくは別の種に由来するオリゴヌクレオチド及び／もしくは隣接配列断片などの適したプローブを用いたゲノムライブラリーのスクリーニングによって隣接配列を得てよい。隣接配列が未知である場合、隣接配列を含むＤＮＡの断片は、例えば、コード配列又は１つもしくは複数の別の遺伝子さえ含み得るＤＮＡの大型断片から単離してよい。制限エンドヌクレアーゼによる消化によって適切なＤＮＡ断片を産生させた後、アガロースゲルによる精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）のカラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）、又は当業者に知られる他の方法を使用した単離によって単離を達成してよい。当業者であればこの目的を達成するための適した酵素の選択を容易に考えつくであろう。
【０１８０】
複製起点は、典型的には、市販の原核生物発現ベクターの一部であり、起点は、宿主細胞におけるベクターの増幅に役立つ。選択するベクターが複製起点部位を含まないのであれば、既知の配列に基づいて化学的に合成し、ベクターに連結してよい。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に由来する複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適しており、さまざまなウイルス性の起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、又はＨＰＶもしくはＢＰＶなどのパピローマウイルス）が哺乳類細胞におけるベクターのクローン化に有用である。一般に、複製の起点成分は、哺乳類の発現ベクターには不要である（例えば、ＳＶ４０の起点は、それがウイルス性の初期プロモーターも含むという理由だけで使用されることが多い）。
【０１８１】
転写終結配列は、典型的には、ポリペプチドをコードする領域の末端に対して３’側に位置し、転写の終結に役立つ。通常、原核細胞における転写終結配列は、Ｇ−Ｃ含量の高い断片であり、ポリ−Ｔ配列が後に続く。この配列は、ライブラリーから容易にクローン化されるか、又はベクターの一部として商業的に購入さえされる一方で、既知の核酸合成法を使用して容易に合成することも可能である。
【０１８２】
選択可能マーカー遺伝子は、選択培養培地において増殖する宿主細胞の生存及び増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核宿主細胞については、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、もしくはカナマイシンといった抗生物質もしくは他の毒素に対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）細胞の栄養要求性の欠損を補完するタンパク質、又は（ｃ）複合培地もしくは定義培地からは利用不可能な重要栄養素を供給するタンパク質をコードする。特定の選択可能マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。好都合なことに、原核宿主細胞における選択と真核宿主細胞における選択との両方にネオマイシン耐性遺伝子を使用し得る。
【０１８３】
発現することになる遺伝子の増幅に他の選択可能遺伝子を使用してよい。増幅は、増殖又は細胞の生存に重要なタンパク質の産生に必要な遺伝子が、組換え細胞の後継世代の染色体内に直列で反復して生じるプロセスである。哺乳類細胞に適した選択可能マーカーの例には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、及びプロモーターの存在しないチミジンキナーゼ遺伝子が含まれる。哺乳類細胞の形質転換体は、ベクターに選択可能遺伝子が存在するという理由で形質転換体のみが独特に生存適応する選択圧力下に置かれる。培地中の選択薬剤濃度を連続的に増加させる条件下で形質転換細胞を培養することによって選択圧力をかけ、それによって選択可能遺伝子と、本明細書に記載の二重特異性の抗原結合タンパク質の１つ又は複数の構成成分などの別の遺伝子をコードするＤＮＡと、の両方が増幅される。結果として、増幅されたＤＮＡから合成されるポリペプチドの量が増加する。
【０１８４】
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳の開始に必要であり、シャイン・ダルガーノ配列（原核生物）又はコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。要素は、典型的には、プロモーターに対しては３’側に位置し、発現することになるポリペプチドのコード配列に対しては５’側に位置する。ある特定の実施形態では、１つ又は複数のコード領域は、配列内リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）に機能可能なように連結してよく、これによって単一のＲＮＡ転写物から２つのオープンリーディングフレームを翻訳することが可能になる。
【０１８５】
真核宿主細胞発現系においてグリコシル化が望まれる場合など、場合によっては、グリコシル化又は収量を改善するためにさまざまなプレ配列又はプロ配列の操作を実施してよい。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を改変するか、又はプロ配列を追加してよく、こうしたことは、グリコシル化にも影響を与え得る。最終的なタンパク質産物は、発現に伴って完全には除去されずに残存し得た１つ又は複数の追加のアミノ酸を（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）−１の位置に有し得る。例えば、最終的なタンパク質産物には、ペプチダーゼ切断部位に見られる１つ又は２つのアミノ酸残基がアミノ末端に付加されて存在し得る。あるいは、酵素による切断部位をいくつか使用すると、成熟ポリペプチド内のそのような領域を酵素が切断するのであれば、結果的に所望のポリペプチドが僅かに切り詰められた形態で生じ得る。
【０１８６】
本発明の発現ベクター及びクローン化ベクターは、典型的には、宿主生物によって認識され、ポリペプチドをコードする分子に機能可能なように連結されたプロモーターを含むことになる。本明細書で使用される「機能可能なように連結された」という用語は、核酸分子が所与の遺伝子を転写に導く能力を有し、かつ／又は所望のタンパク質分子の合成が生じる様式で、２つ以上の核酸配列が連結されることを指す。例えば、ベクターにおいてタンパク質コード配列に機能可能なように連結される制御配列は、制御配列の転写活性に適合する条件下でタンパク質コード配列の発現が達成されるようにそこに連結される。より具体的には、シス作用性の転写制御要素の任意の組み合わせを含むプロモーター配列及び／又はエンハンサー配列は、適切な宿主細胞又は他の発現系においてコード配列の転写をそれが刺激又は調節するのであれば、コード配列に機能可能なように連結されている。
【０１８７】
プロモーターは、構造遺伝子（一般に、約１００〜１０００ｂｐ以内）の開始コドンの上流（すなわち、５’側）に位置し、構造遺伝子の転写を制御する非転写配列である。プロモーターは、慣例的に、誘導性プロモーター及び恒常性プロモーターという２つのクラスのうちの１つに分離される。誘導性プロモーターは、栄養素の有無又は温度変化などの、培養条件の何らかの変化に応じて、その制御下のＤＮＡからの転写レベルの増加を引き起こす。一方、恒常性プロモーターは、それが機能可能なように連結された遺伝子を一様に転写し、すなわち、遺伝子の過剰発現制御はほとんどないか、又は全くない。さまざまな潜在的宿主細胞によって認識されるプロモーターは、非常に多く知られている。制限酵素による消化によって供給源のＤＮＡからプロモーターを取り出し、所望のプロモーター配列をベクターに挿入することによって、例えば、本発明の二重特異性の抗原結合タンパク質の重鎖、軽鎖、改変重鎖、又は他の構成成分をコードするＤＮＡに適切なプロモーターが機能可能なように連結される。
【０１８８】
酵母宿主での使用に適したプロモーターも当該技術分野においてよく知られている。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳類宿主細胞での使用に適したプロモーターはよく知られており、こうしたプロモーターには、限定はされないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２型など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及びサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られたものが含まれる。他の適した哺乳類プロモーターには、例えば、熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターといった異種性の哺乳類プロモーターが含まれる。
【０１８９】
対象となり得る追加のプロモーターには、限定はされないが、ＳＶ４０の初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）、ＣＭＶのプロモーター（Ｔｈｏｒｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６５９−６６３）、ラウス肉腫ウイルスの３’側末端反復配列に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７）、ヘルペスのチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−１４４５）、メタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）遺伝子に由来するプロモーター及び制御配列（Ｐｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）、ならびにベータ−ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物プロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１）、又はｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）が含まれる。下記の動物転写制御領域も対象であり、こうした転写制御領域は、組織特異性を示し、遺伝子導入動物において利用されてきた：膵腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−６４６、Ｏｒｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９、ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）、膵ベータ細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−１２２）、リンパ球系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−６５８、Ａｄａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−５３８、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４）、精巣細胞、乳房細胞、リンパ球系細胞、及びマスト細胞において活性なマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−４９５）、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）、肝臓において活性なアルファ−胎児タンパク質遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８、Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：５３−５８）、肝臓において活性なアルファ１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）、骨髄系細胞において活性なベータ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ，１９８５，Ｎａｔｕ��ｅ  ３１５：３３８−３４０、Ｋｏｌｌｉａｓ  ｅｔ  ａｌ，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４）、脳のオリゴデンドロサイト細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−７１２）、骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−２８６）、ならびに視床下部において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−１３７８）。
【０１９０】
二重特異性の抗原結合タンパク質の構成成分（例えば、軽鎖、重鎖、改変重鎖，Ｆｄ断片）をコードするＤＮＡの、高等真核生物による転写を増加させるために、ベクターにエンハンサー配列を挿入してよい。エンハンサーは、プロモーターに作用することで転写を増加させるシス作用性のＤＮＡ要素であり、通常、その長さは約１０〜３００ｂｐである。エンハンサーは、配向及び位置に相対的に依存性であり、転写単位の５’側と３’側との両方の位置に見られる。哺乳類遺伝子（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−胎児タンパク質、及びインスリン）から利用可能なエンハンサー配列がいくつか知られている。しかしながら、典型的には、ウイルスに由来するエンハンサーが使用される。ＳＶ４０のエンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターのエンハンサー、ポリオーマのエンハンサー、及びアデノウイルスのエンハンサーは、当該技術分野において知られており、こうしたエンハンサーは、真核生物プロモーターを活性化するための増進要素の例である。エンハンサーは、ベクターにおいてコード配列の５’側又は３’側のいずれに位置してもよいが、典型的には、プロモーターの５’側の部位に位置する。細胞外への抗体の分泌を促進するために、適した天然又は異種性のシグナル配列（リーダー配列又はシグナルペプチド）をコードする配列を発現ベクターに組み込むことができる。シグナルペプチド又はリーダーの選択は、抗体が産生することになる宿主細胞の型に依存し、天然のシグナル配列を異種性のシグナル配列と交換することができる。シグナルペプチドの例は、上記のものである。哺乳類宿主細胞において機能性である他のシグナルペプチドには、米国特許第４，９６５，１９５号に記載のインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列、Ｃｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８に記載のインターロイキン−２受容体のシグナル配列、ＥＰ特許第０３６７５６６号に記載のインターロイキン−４受容体のシグナルペプチド、米国特許第４，９６８，６０７号に記載のＩ型のインターロイキン−１受容体のシグナルペプチド、ＥＰ特許第０４６０８４６号に記載のＩＩ型のインターロイキン−１受容体のシグナルペプチドが含まれる。
【０１９１】
提供される発現ベクターは、市販のベクターなどの出発ベクターから構築してよい。そのようなベクターは、所望の隣接配列のすべてを含んでも含まなくてもよい。本明細書に記載の隣接配列の１つ又は複数が最初からベクターに存在しない場合、それらを個々に得てベクターに連結してよい。それぞれの隣接配列の取得に使用される方法は、当業者によく知られている。宿主細胞に発現ベクターを導入することによって、本明細書に記載の核酸がコードする、融合タンパク質を含むタンパク質を産生させることができる。
【０１９２】
ある特定の実施形態では、本発明の二重特異性の抗原結合タンパク質の異なる構成成分をコードする核酸を同一の発現ベクターに挿入してよい。例えば、抗第１の標的抗原軽鎖をコードする核酸と、抗第１の標的抗原重鎖をコードする核酸と、を同一のベクターにクローン化することができる。そのような実施形態では、２つの核酸は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離され、単一のプロモーターの制御下にあってよく、その結果、軽鎖及び重鎖は、同一のｍＲＮＡ転写物から発現する。あるいは、２つの核酸は、２つの独立したプロモーターの制御下にあってよく、その結果、軽鎖及び重鎖は、２つの独立したｍＲＮＡ転写物から発現する。いくつかの実施形態では、抗第１の標的抗原軽鎖をコードする核酸及び抗第１の標的抗原重鎖をコードする核酸は、１つの発現ベクターにクローン化され、抗第２の標的抗原軽鎖をコードする核酸及び抗第２の標的抗原重鎖をコードする核酸は、第２の発現ベクターにクローン化される。
【０１９３】
同様に、ＩｇＧ−Ｆａｂである二重特異性の抗原結合タンパク質については、３つの構成成分のそれぞれをコードする核酸を同一の発現ベクターにクローン化してよい。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ−Ｆａｂ分子の軽鎖をコードする核酸、及び第２のポリペプチド（Ｃ末端Ｆａｂドメインの片側半分を含む）をコードする核酸は、１つの発現ベクターにクローン化される一方で、改変重鎖（重鎖及びＦａｂドメインの半分を含む融合タンパク質）をコードする核酸は、第２の発現ベクターにクローン化される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の二重特異性の抗原結合タンパク質の構成成分はすべて、同一の宿主細胞集団から発現する。例えば、１つ又は複数の構成成分が別々の発現ベクターにクローン化されたとしても、両方の発現ベクターが宿主細胞に同時に遺伝子導入され、その結果、二重特異性の抗原結合タンパク質のすべての構成成分を１つの細胞が産生する。
【０１９４】
ベクターを構築し、本明細書に記載の二重特異性の抗原結合タンパク質の構成成分をコードする１つ又は複数の核酸分子を１つ又は複数のベクターの適切な部位（複数可）に挿入した後、増幅及び／又はポリペプチド発現を目的として、適した宿主細胞に完成ベクター（複数可）を挿入してよい。したがって、本発明は、二重特異性の抗原結合タンパク質の構成成分をコードする１つ又は複数の発現ベクターを含む単離された宿主細胞を包含する。本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、核酸で形質転換された細胞、又は核酸での形質転換を受ける能力を有する細胞であって、それによって対象の遺伝子を発現する細胞を指す。この用語は、親細胞の子孫を含み、こうした子孫が元の親細胞と同一の形態学又は遺伝的構成を有するかどうかは問われないが、但し、対象の遺伝子が存在することが条件である。１つの実施形態では、少なくとも１つの発現制御配列（例えば、プロモーター又はエンハンサー）に機能可能なように連結された本発明の単離された核酸を含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」である。
【０１９５】
抗原結合タンパク質を得るための、発現ベクターでの選択宿主細胞への形質転換は、遺伝子導入、感染、リン酸カルシウムによる共沈、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性の遺伝子導入、又は他の既知の手法を含む、よく知られた方法によって達成してよい。選択される方法の一部は、使用されることになる宿主細胞の型に依存することになる。こうした方法及び他の適した方法は、当業者によく知られており、例えば、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１に示されている。
【０１９６】
宿主細胞は、適した条件下で培養されると、抗原結合タンパク質を合成し、こうした抗原結合タンパク質は、（宿主細胞がそれを培地に分泌するのであれば）培養培地から続けて収集するか、又は（それが分泌されないのであれば）それを産生する宿主細胞から直接的に収集することができる。適した宿主細胞の選択は、さまざまな因子に依存することになり、こうした因子は、所望の発現レベル、活性に望ましいか又は必須のポリペプチド修飾（グリコシル化又はリン酸化など）、及び生物学的に活性な分子へのフォールディングのし易さなどである。
【０１９７】
宿主細胞の例には、原核細胞、酵母細胞、又は高等真核細胞が含まれる。原核宿主細胞には、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、及びＳｈｉｇｅｌｌａなどのＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓなど）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓといったグラム陰性生物又はグラム陽性生物などの真正細菌が含まれる。糸状菌又は酵母などの真核微生物は、組換えポリペプチドの適したクローン化宿主又は発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又は他の一般的なパン酵母は、下等真核宿主微生物の中で最も一般的に使用されるものである。しかしながら、多数の他の属、種、及び株が、一般に利用可能かつ本明細書での有用なものであり、こうしたものは、Ｐｉｃｈｉａ（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなど）、ならびに糸状菌（例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ宿主、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ宿主、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ宿主、ならびにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ及びＡ．ｎｉｇｅｒなど）など）などである。
【０１９８】
グリコシル化された抗原結合タンパク質を発現するための宿主細胞は、多細胞生物から得ることができる。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株及びその変異体ならびに対応する許容昆虫宿主細胞が同定されており、こうした許容昆虫宿主細胞は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（イモムシ）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉなどの宿主に由来する。そのような細胞への遺伝子導入を目的とするさまざまなウイルス株が公的に利用可能であり、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１変異体、及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株が利用可能である。
【０１９９】
脊椎動物宿主細胞もまた、適した宿主であり、そのような細胞からの抗原結合タンパク質の組換え産生は日常的な手順となってきている。発現のための宿主として利用可能な哺乳類細胞株は、当該技術分野においてよく知られており、こうした哺乳類細胞株には、限定はされないが、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から利用可能な不死化細胞株（限定はされないが、ＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１細胞、ＤＧ−４４細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲを含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６，１９８０）を含む）、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ヒト胎児腎臓株（２９３細胞又は浮遊培養における増殖を目的としてサブクローン化された２９３細胞）（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９，１９７７）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１，１９８０）、サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ｂｕｆｆａｌｏ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ  ｃｅｌｌ）（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）、ヒトヘパトーマ細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８，１９８２）、ＭＲＣ５細胞又はＦＳ４細胞、哺乳類骨髄腫細胞、ならびに多数の他の細胞株が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の二重特異性の抗原結合タンパク質をどの細胞株が高レベルで発現し、恒常的に産生するかを決定することによって細胞株を選択してよい。別の実施形態では、それ自体の抗体は産生しないが、異種性抗体の産生能力を有し、それを分泌するＢ細胞株由来の細胞株を選択することができる。いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性の抗原結合タンパク質を発現させるための宿主細胞はＣＨＯ細胞である。
【０２００】
宿主細胞は、二重特異性の抗原結合タンパク質を産生するための上記の核酸又はベクターを用いて形質転換又は遺伝子導入され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改変された通常の栄養培地において培養される。さらに、選択マーカーによって分離された転写単位のコピーを複数有する新規のベクター及び遺伝子導入細胞株が、抗原結合タンパク質に発現に特に有用である。したがって、本発明は、本明細書に記載の二重特異性の抗原結合タンパク質の調製方法も提供し、当該方法は、１つ又は複数の発現ベクターによってコードされる二重特異性の抗原結合タンパク質の発現が可能になる条件下での、培養培地における本明細書に記載の発現ベクターの１つ又は複数を含む宿主細胞の培養と、培養培地からの二重特異性の抗原結合タンパク質の回収と、を含む。
【０２０１】
本発明の抗原結合タンパク質を産生させるために使用される宿主細胞は、さまざまな培地において培養してよい。ハムＦ１０（Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０）（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ））、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞の培養に適している。さらに、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４，１９７９、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５，１９８０、米国特許第４，７６７，７０４号、第４，６５７，８６６号、第４，９２７，７６２号、第４，５６０，６５５号、もしくは第５，１２２，４６９号、ＷＯ９０１０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、又は米国特許再発行第３０，９８５号に記載の培地のいずれかを宿主細胞の培養培地として使用してよい。こうした培地はいずれも、必要に応じてホルモン及び／又は他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン、又は上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン（商標）薬物など）、微量元素（マイクロモル濃度範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、ならびにグルコース又は同等のエネルギー源を添加してよい。当業者に知られているであろう適切な濃度で任意の他の必要サプリメントを含めてもよい。温度、ｐＨ、及び同様のものなどの培養条件は、発現の選択が実施された宿主細胞でこれまでに使用されてきたものであり、当業者には明らかであろう。
【０２０２】
宿主細胞を培養すると、二重特異性の抗原結合タンパク質は、細胞内に産生されるか、細胞膜周辺腔に産生されるか、又は培地に直接的に分泌され得る。抗原結合タンパク質が細胞内に産生されるであれば、第１段階として、宿主細胞又は溶解断片のいずれかである粒子性のデブリは、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去される。二重特異性の抗原結合タンパク質は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー又は陰イオン交換クロマトグラフィー、あるいは対象の抗原（複数可）又はプロテインＡもしくはプロテインＧを親和性リガンドとして使用する親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができる。プロテインＡは、ヒトのγ１重鎖、γ２重鎖、又はγ４重鎖に基づくポリペプチドを含むタンパク質を精製するために使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３，１９８３）。プロテインＧは、マウスのすべてのアイソタイプ及びヒトのγ３に推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５，１９８６）。親和性リガンドが付加されるマトリックスはアガロースであることが最も多いが、他のマトリックスも利用可能である。ポア制御型ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの力学的に安定なマトリックスでは、アガロースで達成し得るものと比較して、流速の高速化、及び処理時間の短縮が可能である。タンパク質がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。回収されることになる特定の二重特異性の抗原結合タンパク質に応じて、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などの、他のタンパク質精製手法も可能である。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、本発明は、医薬的に許容可能な希釈剤、担体、賦形剤、可溶化剤、乳化剤、保存剤、及び／又は補助剤と共に、１つ又は複数の本発明の二重特異性の抗原結合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物には、限定はされないが。液体組成物、凍結組成物、及び凍結乾燥組成物が含まれる。「医薬的に許容可能な」は、用いられる投与量及び濃度でヒトレシピエントに無毒であり、かつ／又はヒトに投与されたとき、アレルギー反応もしくは有害反応を与えない分子、化合物、及び組成物を指す。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、組成物の、例えば、ｐＨ、モル浸透圧濃度、粘性、透明性、色調、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解速度もしくは放出速度、吸収性、又は透過性の改変、維持、又は保存を目的とする製剤材料を含み得る。そのような実施形態では、適した製剤材料には、限定はされないが、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジンなど）、抗微生物剤、抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、もしくは亜硫酸水素ナトリウムなど）、緩衝剤（ホウ酸塩、炭酸水素塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、もしくは他の有機酸など）、嵩増し剤（マンニトールもしくはグリシンなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）、複合化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、もしくはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンなど）、増量剤、単糖、二糖、もしくは他の糖質（グルコース、マンノース、もしくはデキストリンなど）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど）、着色剤、香味剤、及び希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、低分子量ポリペプチド、造塩対イオン（ナトリウムなど）、保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、もしくは過酸化水素など）、溶剤（グリセリン、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールなど）、糖アルコール（マンニトールもしくはソルビトールなど）、懸濁剤、界面活性剤もしくは湿潤剤（プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート（ポリソルベート２０、ポリソルベート８０など）、トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）など）、安定性増進剤（スクロースもしくはソルビトールなど）、浸透圧増進剤（ハロゲン化アルカリ金属、塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム、マンニトールソルビトールなど）、送達媒体、希釈剤、賦形剤、ならびに／又は医薬補助剤が含まれる。治療的な使用を目的とする分子の製剤化を目的とする方法及び適した材料は医薬分野において知られており、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、無菌のリン酸緩衝生理食塩水、静菌水、及び同様のものなどの標準的な医薬担体を含む。例えば、水、緩衝水、０．４％の生理食塩水、０．３％のグリシン、及び同様のものといったさまざまな水性担体を使用してよく、こうした水性担体は、軽度の化学修飾又は同様ものが施されたアルブミン、リポタンパク質、グロブリン等などの安定性の増進を目的とする他のタンパク質を含み得る。
【０２０５】
製剤における二重特異性の抗原結合タンパク質の濃度の例は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１８０ｍｇ／ｍｌ、又は約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、又は約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ、あるいは約２ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。抗原結合タンパク質の水性製剤は、ｐＨ緩衝液において調製してよく、こうしたｐＨ緩衝剤のｐＨ範囲は、例えば、約４．５〜約６．５、又は約４．８〜約５．５、あるいは約５．０である。ｐＨをこの範囲内とするのに適した緩衝剤の例には、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（コハク酸ナトリウムなど）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩、及び他の有機酸緩衝剤が含まれる。緩衝剤の濃度は、例えば、緩衝剤、及び製剤の所望の等張性に応じて、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、又は約１０ｍＭ〜約６０ｍＭであり得る。
【０２０６】
浸透圧剤も抗原結合タンパク質を安定化し得るものであり、製剤に含めてよい。浸透圧剤の例には、マンニトール、スクロース、又はトレハロースなどのポリオールが含まれる。１つの実施形態では、水性製剤は等張性であるが、高浸透圧性又は低浸透圧性の溶液も適し得る。製剤におけるポリオールの濃度の例は、約１％〜約１５％ｗ／ｖの範囲であり得る。
【０２０７】
製剤化される抗原結合タンパク質の凝集の低減及び／又は製剤における微粒子形成の最小化及び／又は吸着の低減を目的として、抗原結合タンパク質製剤に界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤の例には、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０もしくはポリソルベート８０）又はポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）などの非イオン性の界面活性剤が含まれる。界面活性剤の濃度の例は、約０．００１％〜約０．５％ｗ／ｖ、又は約０．００５％〜約０．２％ｗ／ｖ、あるいは約０．００４％〜約０．０１％ｗ／ｖの範囲であり得る。
【０２０８】
１つの実施形態では、製剤は、上記の薬剤（すなわち、抗原結合タンパク質、緩衝剤、ポリオール、及び界面活性剤）を含み、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノール、及び塩化ベンゼトニウムなどの、１つ又は複数の保存剤は本質的に含まない。別の実施形態では、保存剤を製剤に含めてよく、例えば、こうした保存剤の濃度範囲は、約０．１％〜約２％、あるいは約０．５％〜約１％である。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載のものなどの、１つ又は複数の他の医薬的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤を製剤に含めてよいが、但し、それらが所望の製剤特性に有害な影響を与えないことが条件である。
【０２０９】
二重特異性の抗原結合タンパク質の治療製剤は、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態において、所望の純度を有する二重特異性の抗原結合タンパク質と、任意選択で使用する生理学的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と、を混合することによって保管を目的として調製される。許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに無毒であり、こうした担体、賦形剤、又は安定剤には、緩衝剤（リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸など）、抗酸化剤（アスコルビン酸及びメチオニンを含む）、保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなど）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールなど）、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど）、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなど）、単糖、二糖、及び他の糖質（グルコース、マンノース、マルトース、もしくはデキストリンを含む）、キレート剤（ＥＤＴＡなど）、糖（スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなど）、造塩対イオン（ナトリウムなど）、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）、ならびに／又は非イオン性界面活性剤（ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）が含まれる。
【０２１０】
１つの実施形態では、請求発明の適した製剤は、ポリオール、ソルビトール、スクロース、又は塩化ナトリウムなどの浸透圧剤（浸透圧調製及び安定化を行う）と組み合わせて、リン酸塩、酢酸塩、又はＴＲＩＳ緩衝剤などの等張緩衝剤を含む。そのような浸透圧剤の例の１つは、５％のソルビトール又はスクロースである。さらに、例えば、凝集の防止又は安定性の改善のために、０．０１％〜０．０２％重量／体積の界面活性剤を任意選択で製剤に含めることが可能である。製剤のｐＨ範囲は、４．５〜６．５又は４．５〜５．５であり得る。抗原結合タンパク質のための医薬製剤の他の説明例は、ＵＳ２００３／０１１３３１６及び米国特許第６，１７１，５８６号において見つけることができ、こうした文献はそれぞれ、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２１１】
本明細書に記載の製剤は、治療される特定の徴候に必要な複数の活性化合物も含み得、こうした活性化合物は、好ましくは、互いに有害な影響を与えない補完的な活性を有するものである。例えば、免疫抑制剤を追加提供することが望ましくあり得る。そのような分子は、意図される目的に有効な量で組み合わせられて適切に存在する。
【０２１２】
活性成分は、例えば、コアセルベーション手法もしくは界面重合によって調製されるマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース−マイクロカプセルもしくはゼラチン−マイクロカプセル、及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン微粒子、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル）、又はマクロエマルションに封入してもよい。そのような手法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）において開示されている。
【０２１３】
抗原結合タンパク質の懸濁液及び結晶形態も企図される。懸濁液及び結晶形態の調製方法は、当業者に知られている。
【０２１４】
インビボの投与に使用されることになる製剤は無菌でなくてはならない。本発明の組成物は、通常のよく知られる無菌化手法によって無菌化してよい。例えば、無菌化は、滅菌濾過膜を介する濾過によって容易に達成される。得られる溶液は、使用に向けて梱包するか、又は無菌条件下で濾過してから凍結乾燥してよく、凍結乾燥調製物は、投与前に無菌溶液と混合される。
【０２１５】
凍結乾燥のプロセスは、長期保管を目的としてポリペプチドを安定化するために用いられることが多く、特に、ポリペプチドが液体組成物において相対的に不安定であるときに用いられる。凍結乾燥サイクルは、通常、凍結、一次乾燥、及び二次乾燥という３つの段階から構成される（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｌｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ３８，Ｎｕｍｂｅｒ  ２，ｐａｇｅｓ  ４８−５９，１９８４を参照のこと）。凍結段階では、溶液が適切に凍結するまで冷却される。溶液形態に含まれる水の大部分がこの段階で氷る。氷は、一次乾燥段階で昇華し、この段階は、減圧機を使用し、氷の蒸気圧を下回るようにチャンバー内圧力を下げることによって実施される。最終的に、チャンバー内圧力を下げ、棚温度を上昇させて実施する二次乾燥段階で吸着水又は結合水が除去される。このプロセスによって、凍結乾燥ケーキとして知られる材料が得られる。その後、ケーキは使用前に再構成することができる。
【０２１６】
凍結乾燥された材料の標準的な再構成は、一定量の純水（典型的には、凍結乾燥の間に除去された量と同等の量）を戻し添加することで実施されるが、非経口投与を目的とする医薬品の調製では、抗菌剤の希釈溶液が使用されることがある（Ｃｈｅｎ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １８：１３１１−１３５４，１９９２を参照のこと）。
【０２１７】
賦形剤は、場合によっては、凍結乾燥産物の安定剤として作用することが認められている（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｏｌｕｍｅ  ７４：２２５−２３９，１９９１を参照のこと）。例えば、既知の賦形剤には、ポリオール（マンニトール、ソルビトール、及びグリセロールを含む）、糖（グルコース及びスクロースを含む）、ならびにアミノ酸（アラニン、グリシン、及びグルタミン酸を含む）が含まれる。
【０２１８】
さらに、ポリオール及び糖は、凍結及び乾燥が誘導するダメージからのポリペプチドの保護、ならびに乾燥状態での保管の間の安定性の増進を目的として使用されることも多い。一般に、糖、特に二糖は、凍結乾燥プロセスと保管の間との両方において有効である。単糖及び二糖ならびにＰＶＰなどのポリマーを含む他のクラスの分子もまた、凍結乾燥産物の安定剤として報告されている。
【０２１９】
注射については、医薬製剤及び／又は薬物は、上記の適した溶液を用いる再構成に適した粉末であり得る。こうしたものの例には、限定はされないが、凍結乾燥、回転乾燥、もしくは噴霧乾燥された粉末、非結晶粉末、顆粒、沈殿物、又は微粒子が含まれる。注射については、製剤は、安定剤、ｐＨ調節剤、界面活性剤、生物学的利用率の調節剤、及びこうしたものの組み合わせを任意選択で含み得る。
【０２２０】
持続放出性の調製物を調製してよい。持続放出性の調製物の適した例には、二重特異性の抗原結合タンパク質を含む固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、こうしたマトリックスは、例えば、フィルム又はマイクロカプセルといった成形物品の形態をとる。持続放出性のマトリックスの例には、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とｙエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性のエチレン−ビニルアセテート、Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドとから構成される注射用微粒子）などの分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−ビニルアセテート及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日間にわたって分子を放出することが可能である一方で、ある特定のヒドロゲルがタンパク質を放出する期間は短い。被包性ポリペプチドが体内に長く残存すると、３７℃の水分に曝露される結果として変性又は凝集が生じる可能性があり、結果的に、生物学的活性の減少、及び免疫原性が変化する可能性が生じる。関与する機構に応じて安定化に向けて合理的な方針を考案することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィドの相互交換を介して生じる分子間Ｓ−−Ｓ結合の形成であると判明したのであれば、安定化は、スルフヒドリル残基の改変、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含量の制御、適切な添加剤の使用、及び特定のポリマーマトリックス組成物の開発によって達成し得る。
【０２２１】
本発明の製剤は、本明細書に記載のように、短期作用性、高速放出性、長期作用性、又は持続放出性となるように設計してよい。したがって、医薬製剤は、制御放出又は緩徐放出を目的として製剤化してもよい。
【０２２２】
特定の投与量は、疾患の状態、対象の年齢、体重、総体的な健康状態、性別、及び食事、投与間隔、投与経路、排出速度、ならびに薬物の組み合わせに応じて調節してよい。有効量を含む上記の剤形はいずれも、日常的な実験法の範囲に明確に含まれるものであり、それ故に、本発明の範囲に明確に含まれるものである。
【０２２３】
二重特異性の抗原結合タンパク質は、非経口投与、皮下投与、腹腔内投与、肺内投与、及び鼻腔内投与、ならびに局所治療が望まれるのであれば、病巣内投与を含む、任意の適した手段によって投与される。非経口注入には、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮内投与、又は皮下投与が含まれる。さらに、二重特異性の抗原結合タンパク質は、特に、抗原結合タンパク質の用量を下げて、パルス注入によって適切に投与される。１つの実施形態では、投薬は、部分的には投与が簡潔であるか長期的であるかに応じて、注射、静脈内注射、又は皮下注射によって実施される。局所（ｔｏｐｉｃａｌ）投与、特に、経皮投与、経粘膜投与、直腸投与、経口投与、又は局所（ｌｏｃａｌ）投与を含む、他の投与方法も企図され、こうした投与は、例えば、所望の部位の近くに留置されるカテーテルを介する投与である。１つの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、毎日〜毎週〜毎月の頻度範囲（例えば、１日に１回、２日に１回、３日に１回、又は週に２回、週に３回、週に４回、週に５回、もしくは週に６回）で０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの用量範囲、週に１回、２週に１回、又は月に１回の頻度で０．１〜４５ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１５ｍｇ／ｋｇ、又は０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量範囲で、生理学的溶液において静脈内に投与される。
【０２２４】
本明細書で使用される「ｔｒｅａｔｉｎｇ（治療）」又は「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療）」という用語は、障害の発症予防又は障害の病態改変を意図して実施される行為である。したがって、「治療」は、治療的な治療と予防的処置又は防止的処置との両方を指す。治療を必要とする者には、障害又は病状の診断をすでに受けたもの又はそれに苦しむ者、ならびに障害又は病状が予防されることになる者が含まれる。「治療」は、損傷、病態、又は病状の寛解における成功の任意の兆候を含み、こうした兆候には、症状の軽減、緩和、縮小、あるいは損傷、病態、もしくは病状の患者耐容性の向上、悪化速度もしくは衰退速度の鈍化、悪化終点の衰弱軽減、又は患者の身体的もしくは精神的な健全性の改善などの、任意の客観的パラメーター又は主観的パラメーターが含まれる。症状の治療又は寛解は、身体検査、患者による自己申告、神経精神医学的検査、及び／又は精神医学的評価の結果を含む客観的パラメーター又は主観的パラメーターに基づき得る。
【０２２５】
本発明の二重特異性の抗原結合タンパク質は、生物学的試料における標的抗原（複数可）の検出、及び標的抗原（複数可）を発現する細胞又は組織の同定に有用である。
【０２２６】
本明細書に記載の二重特異性の抗原結合タンパク質は、標的抗原（複数可）と関連する疾患及び／又は病状を検出、診断、又は監視するという診断目的で使用することができる。当業者に知られる古典的な免疫組織学的方法を使用して試料中の標的抗原（複数可）の存在を検出する方法も提供される（例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９９３，Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｖｏｌ  １５（Ｅｄｓ  Ｒ．Ｈ．Ｂｕｒｄｏｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｈ．ｖａｎ  Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）、Ｚｏｌａ，１９８７，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｊａｌｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５、Ｊａｌｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６）。いずれの標的の検出も、インビボ又はインビトロで実施することができる。
【０２２７】
本明細書で提供される診断用途は、標的抗原（複数可）の発現を検出するための抗原結合タンパク質の使用を含む。受容体の存在検出に有用な方法の例には、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）及び放射免疫測定法（ＲＩＡ）などの免疫測定法が含まれる。
【０２２８】
診断用途については、抗原結合タンパク質は、典型的には、検出可能な標識基で標識されることになる。適した標識基の例には、限定はされないが、下記のものが含まれる：放射性同位元素もしくは放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体（ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒ））、酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基、又は二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーの対配列、二次抗体向けの結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの実施形態では、標識基は、潜在的な立体障害を低減するためにさまざまな長さのスペーサーアームを介して抗原結合タンパク質に連結される。当該技術分野ではタンパク質のさまざまな標識方法が知られており、それらを使用してよい。
【０２２９】
別の実施形態では、本明細書に記載の二重特異性の抗原結合タンパク質は、標的抗原（複数可）を発現する１つ又は複数の細胞の同定に使用することができる。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、標識基で標識され、標識された抗原結合タンパク質の標的抗原（複数可）への結合が検出される。追加の特定の実施形態では、抗原結合タンパク質の標的抗原（複数可）への結合は、インビボで検出される。追加の特定の実施形態では、二重特異性の抗原結合タンパク質は、当該技術分野において知られる手法を使用して単離及び測定される。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（ｅｄ．１９９１  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）、Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｄ．，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓを参照のこと。
【実施例】
【０２３０】
抗ＴＮＦα抗体及び抗ＴＬ１Ａ抗体のサブセットを用いて二重特異性の抗原結合タンパク質を調製した。このＩｇＧ−Ｆａｂ形式の実施形態のいくつかでは、第２の抗体に由来するＶＨ−ＣＨ１ドメインを含むポリペプチドが、第１の抗体の重鎖のカルボキシル末端にペプチドリンカーを介して融合されることで改変重鎖が形成される。第１の抗体に由来するＦａｂ断片の残りのドメイン（すなわち、ＶＬ−ＣＬドメイン）を含むポリペプチドが、第１の抗体の軽鎖及び改変重鎖と同時発現されることで完全な分子が得られる。完全分子が構築されると、２量体化した免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ末端側に位置する、第１の抗原に対する２つの抗原結合ドメインと、２量体化したＦｃ領域のカルボキシル末端側に位置する、第２の抗原に対する２つの抗原結合ドメインと、を有する４価の結合タンパク質が創出される。
【０２３１】
ＴＮＦα／ＴＬ１Ａ  ＩｇＧ−Ｆａｂは、２つの抗原結合ドメインからなり、一方はＴＮＦαを標的とし、もう一方は、ＴＬ１Ａを標的とする。ＴＮＦα／ＴＬ１Ａ  ＩｇＧ−Ｆａｂ分子をコードするＤＮＡ分子は、抗ＴＮＦα（又は抗ＴＬ１Ａ）抗体軽鎖をコードする断片と、（ｉ）抗ＴＬ１Ａ（もしくは抗ＴＮＦα）抗体軽鎖又は（ｉｉ）抗ＴＬ１Ａ（もしくは抗ＴＮＦα）Ｆｄ（ＶＨ−ＣＨ１）にＣ末端が融合される抗ＴＮＦα（又は抗ＴＬ１Ａ）抗体重鎖をコードする断片と、カルボキシ末端結合ドメインを完成させるためのＦａｂ断片の残り半分（例えば、（ｉ）抗ＴＬ１Ａ（もしくは抗ＴＮＦα）Ｆｄ又は（ｉｉ）抗ＴＬ１Ａ（もしくは抗ＴＮＦα）抗体軽鎖）を含む第３のポリペプチドをコードする断片と、を含む。ＩｇＧ−Ｆａｂ二重特異性分子は、それぞれのＦａｂ領域（図３に示されるＦａｂ１及びＦａｂ２）のＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに導入された電荷対変異を含む。電荷対は、抗ＴＮＦＡＲ軽鎖／ＶＨＣＨ１（Ｆｄ）の対、及び抗ＴＬ１Ａ軽鎖／ＶＨＣＨ１（Ｆｄ）の対の優先的な構築が可能となるように設計される。軽鎖／ＶＨＣＨ１（Ｆｄ）の対の正しい対形成を促進するための追加の手法として、産生させるＩｇＧ−Ｆａｂ分子のサブセットについて、カルボキシル末端Ｆａｂ（すなわち、Ｆａｂ２）におけるＣＬ領域とＣＨ１領域とを交換し、その結果、第２の抗体の重鎖のカルボキシル末端領域に融合したポリペプチドが第１の抗体に由来するＶＬ領域及びＣＨ１領域を含み、第２のポリペプチドが第１の抗体に由来するＶＨ領域及びＣＬ領域を含むようにした。表４及び表６に記載の分子を参照のこと。ＤＮＡ分子は、合成ｇＢｌｏｃｋによって産生させ、ｐＴＴ５．１ベクターにクローン化した。こうした発現ベクターは、ヒト２９３−６Ｅ細胞におけるＴＮＦα／ＴＬ１Ａ二重特異性分子の遺伝子導入及び発現に使用した。１４４の異なるＩｇＧ−Ｆａｂ二重特異性分子を産生させた。それぞれの分子の全配列は、表４に示される。
【０２３２】
ＩｇＧ−Ｆａｂ分子は、大型のオートサンプラー（ＬＦＡＳ，Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）を使用し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅクロマトグラフィー（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）による親和性捕捉を使用して精製した。２価陽イオンを含まないダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で平衡化した１ｍＬのＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に対して、清澄化した条件培地を負荷した。カラム体積の８倍量のＤ−ＰＢＳでＭａｂＳｅｌｅｃｔカラムを洗浄し、１００ｍＭの酢酸（ｐＨ３．６）で溶出を実施した。プロテインＡからの溶出液の２８０ｎｍでの吸光度が５ｍＡＵを超えたときに、溶出液をＨｉＴｒａｐ脱塩カラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に直接的に負荷し、カラム体積の１．２倍量の１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ  ５．０）を通液した。脱塩溶出液の２８０ｎｍでの吸光度が３ｍＡＵを超えたときに試料の収集を開始し、９６ウェルのディープウェルブロックのそれぞれに最大となる２ｍＬまで各画分を収集した。還元（２％の２−メルカプトエタノール含有）条件下、及び非還元（２５ｍＭのヨードアセトアミド含有）条件下で、Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐで分析することによって試料の純度を決定した。Ｚｅｎｉｘ−Ｃ  ＳＥＣ−３００カラム（Ｓｅｐａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）を使用し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ  ６．９）で８分間にわたってアイソクラティック溶出を行うことで分析ＳＥＣを実施した。
【０２３３】
ＩｇＧ−Ｆａｂ分子は、その発現能力（力価及び回収）ならびに活性を試験した。結果は、図１７〜２３及び表６に示される。
【０２３４】
ＴＬ１Ａ活性のアッセイは、ＴＦ−１  ＮＦ−κＢレポーター細胞株を使用して実施した。簡潔に記載すると、段階希釈した抗ＴＬ１Ａ抗体又はＴＬ１Ａ／ＴＮＦ−α二重特異性分子の存在下で、１０４個のＴＦ−１  ＮＦ−κＢレポーター細胞と共に、３０ｎｇ／ｍｌ（ＥＣ９０）のヒト又はカニクイザルのＴＬ１Ａを９６ウェルプレートにおいて３７℃で一晩インキュベートした。５０μｌのＳｔｅａｄｙ−ｇｌｏルシフェラーゼ試験溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加した。プレートを覆い、振とうしながら１０分間インキュベートした。マイクロベータ（ｍｉｃｒｏｂｅｔａ）リーダーによってルシフェラーゼ活性を分析した。
【０２３５】
ＴＮＦα活性のアッセイは、ＴＦ−１  ＮＦ−ｋＢレポーター細胞株を使用して実施した。簡潔に記載すると、段階希釈した抗ＴＮＦ−α抗体又はＴＬ１Ａ／ＴＮＦα二重特異性分子の存在下で、１０４個のＴＦ−１  ＮＦ−κＢレポーター細胞と共に、１ｎｇ／ｍｌ（ＥＣ９０）のヒト又はカニクイザルのＴＮＦ−αを９６ウェルプレートにおいて３７℃で一晩インキュベートした。５０μｌのＳｔｅａｄｙ−ｇｌｏルシフェラーゼ試験溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加した。プレートを覆い、振とうしながら１０分間インキュベートした。マイクロベータ（ｍｉｃｒｏｂｅｔａ）リーダーによってルシフェラーゼ活性を分析した。
【０２３６】
【表６】
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【０２３７】
【表７】
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【０２３８】
【表８】
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【０２３９】
【表９】
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【０２４０】
【表１０】
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【０２４１】
本明細書で議論及び引用される刊行物、特許、及び特許出願はすべて、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。記載の特定の方法論、プロトコール、及び材料は変わり得るため、開示の発明はこうしたものに限定されないと理解される。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態の説明のみを目的としており、添付の特許請求の範囲の限定は意図されないとも理解される。
【０２４２】
当業者であれば、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの同等形態を認識するか、又は日常的な実験法を使用するだけでそれらを把握することができるであろう。そのような同等形態は、続いて記載される特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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