(57)【要約】本発明は、抗炎症剤、組成物、および炎症性疾患を治療するための方法に関する。
2018508522.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞のレベルの増加を必要とする被験体におけるＴｒｅｇ細胞のレベルを増加させる方法であって、
（ｉ）シアル化されたＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む第１の単離されたポリペプチド；または
（ｉｉ）前記ＩｇＧ  Ｆｃ領域と少なくとも７５％同一である修飾された配列を含む第２の単離されたポリペプチドもしくは前記第２のポリペプチドをコードする核酸
の有効量を前記被験体に投与することを含み、前記修飾された配列がＦＡ２４１変異を有する、方法。
【請求項２】
前記第１の単離されたポリペプチドにおけるＩｇＧ領域を前記被験体のＩｇＧのレベルよりも高いレベルでシアル化する、請求項１に記載の方法または請求項２０に記載の使用。
【請求項３】
前記被験体が炎症性疾患を有する、請求項１もしくは２に記載の方法または請求項２０に記載の使用。
【請求項４】
前記炎症性疾患が自己免疫疾患である、請求項３に記載の方法または使用。
【請求項５】
前記自己免疫疾患がＴ細胞媒介性自己免疫疾患である、請求項４に記載の方法または使用。
【請求項６】
前記Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患が多発性硬化症および１型糖尿病からなる群から選択される、請求項５に記載の方法または使用。
【請求項７】
前記ＩｇＧ  Ｆｃ領域が配列番号：１の配列を含む、請求項１〜６および２０のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項８】
前記第１または第２の単離されたポリペプチドがＤＣ−ＳＩＧＮ、ｈＦｃγＲＩＩＡまたはｈＦｃγＲＩＩＢに結合する能力を有する、請求項１〜７および２０のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項９】
前記単離されたポリペプチドが２×１０−５Ｍ以下のＫＤ（すなわち、５．０×１０４Ｍ−１以上のＫＡ）でｈＦｃγＲＩＩＡまたはｈＦｃγＲＩＩＢに結合する能力を有する、請求項８に記載の方法または使用。
【請求項１０】
前記修飾された配列が（ａ）実質的にシアル化されていない、または（ｂ）前記被験体のＩｇＧのレベルよりも低いレベルでシアル化されている、請求項１〜９および２０のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項１１】
前記修飾された配列が配列番号：２と少なくとも７５％同一である、請求項１〜１１および２０のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項１２】
Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患の治療を必要とする被験体におけるＴ細胞媒介性自己免疫疾患を治療する方法であって、
（ｉ）シアル化されたＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む第１の単離されたポリペプチド；または
（ｉｉ）前記ＩｇＧ  Ｆｃ領域と少なくとも７５％同一である修飾された配列を含む第２の単離されたポリペプチドもしくは前記第２のポリペプチドをコードする核酸
の治療上の有効量を前記被験体に投与することを含み、前記修飾された配列がＦＡ２４１変異を有する、方法。
【請求項１３】
前記第１の単離されたポリペプチドにおけるＩｇＧ領域が前記被験体のＩｇＧのレベルよりも高いレベルでシアル化される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患が多発性硬化症および１型糖尿病からなる群から選択される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＩｇＧ  Ｆｃ領域が配列番号：１の配列を含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１または第２の単離されたポリペプチドがＤＣ−ＳＩＧＮ、ｈＦｃγＲＩＩＡまたはｈＦｃγＲＩＩＢに結合する能力を有する、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記単離されたポリペプチドが２×１０−５Ｍ以下のＫＤ（すなわち、５．０×１０４Ｍ−１以上のＫＡ）でｈＦｃγＲＩＩＡまたはｈＦｃγＲＩＩＢに結合する能力を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記修飾された配列が（ａ）実質的にシアル化されていない、または（ｂ）前記被験体のＩｇＧのレベルよりも低いレベルでシアル化されている、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記修飾された配列が配列番号：２と少なくとも７５％同一である、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患を治療するまたは制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞のレベルを増加させるための薬剤の製造における（ｉ）シアル化されたＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む第１の単離されたポリペプチド；または（ｉｉ）前記ＩｇＧ  Ｆｃ領域と少なくとも７５％同一である修飾された配列を含む第２の単離されたポリペプチドもしくは前記第２のポリペプチドをコードする核酸の使用であって、前記修飾された配列がＦＡ２４１変異を有する、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年１２月１９日に出願された米国仮出願番号第６１／５７７，３６１号の優先権を主張する、２０１２年１２月１０日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６８７１８に基づく米国国内段階である、２０１４年６月２５日に出願された米国特許出願第１４／３６８，７０１号の一部継続出願である、２０１５年３月４日に出願された米国特許出願第１４／６３８，９０５号に対する優先権を主張する。前記優先権出願の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、抗炎症剤、組成物、および炎症性疾患を治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
自己免疫疾患を含む炎症性疾患は、白血球の異常な活性化およびその後の身体の患部への移動を伴う疾患である。これらの症状は、世界中の何百万人もの人々の生活に影響を与える広範囲の病気を包含する。様々な治療法が現在利用可能であるが、多くはかなりの副作用を持っているか、または全ての症状を緩和するほど十分に有効ではない。したがって、炎症性疾患を治療するための抗炎症剤に対する要求、およびそのような薬剤を同定し評価する方法に対する要求が存在する。
【０００４】
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、そのＦｃ断片によって媒介される相互作用を介して炎症促進および抗炎症活性（ｐｒｏ−  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）の両方を媒介すると、長い期間認識されている。Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用は免疫複合体および細胞毒性抗体の炎症促進性特性の原因であるが、静脈内ガンマグロブリン（ＩＶＩＧ）およびそのＦｃ断片は抗炎症性であり、炎症性疾患を抑制するために広く使用される。ＩｇＧのグリコシル化がＩｇＧの細胞毒性および炎症性能力の調節に重要であることが提案されている。例えば、ＩＶＩＧの抗炎症活性は、Ｆｃ断片およびその結合グリカンの特性であり、端末α．２，６シアル酸結合を必要とし、免疫抑制のためには特定のポリペプチド骨格とグリカン構造とが複合的に要求されることを示している（アンソニーら，２００８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２０：３７３−３７６、およびＷＯ２００７／１１７５０５）。
【０００５】
しかしながら、ＩＶＩＧ中のＩｇＧの小規模な集団のみが、α２，６シアル酸で終端したグリカン（ｓＦｃ）および抗炎症活性を有する。その結果、様々な臨床状況において自己抗体によって引き起こされる炎症の抑制のためには、シアル化ＩｇＧを強化するために高用量（ｌ〜２ｇ／ｋｇ）でＩＶＩＧを投与するか、そうでなかったらＩｇＧのシアル化を高めなければならない（米国出願第２００８０２０６２４６、および２００９０００４１７９、ならびにニマージャーン（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ）ら  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２６，５１３−５３３（２００８））。
【０００６】
本発明はシアル化されていない抗炎症ペプチドを同定することにより、上記の要求に取り組み、応える。
【発明の概要】
【０００７】
概要
本発明は、炎症性疾患、例えば、自己免疫疾患を治療するためのポリペプチドおよび抗体のような薬剤、および方法に関する。
【０００８】
従って、本発明の一態様は、ＩｇＧ  Ｆｃ領域と少なくとも７５％（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、および１００％を包括した、例えば、７５％および１００％間の任意の数字）同一である修飾された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）配列を含む単離されたポリペプチドを特徴とする。修飾された配列はシアル化されておらず、ポリペプチドは親（ｐａｒｅｎｔ）ポリペプチドのものよりも高い抗炎症活性を有する。親ポリペプチドは、以下に示す配列番号：１の配列のようなＩｇＧ  Ｆｃ領域を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＤＣ−ＳＩＧＮと結合する能力を有し、およびｈＦｃγＲＩＩＡまたはＲＩＩＢに結合する能力を有する。一実施形態では、単離されたポリペプチドは、２×１０−５Ｍ以下のＫＤ（すなわち、５．０×１０４Ｍ−１以上のＫＡ）でｈＦｃγＲＩＩＡまたはＲＩＩＢに結合する能力を有する。好ましくは、修飾された配列は、ＦＡ２４１変異を有する。修飾された配列は、配列番号：２と少なくとも７５％（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、および１００％を包括した、例えば、７５％および１００％間の任意の数字）同一であり得る。いくつかの例において、修飾された配列は配列番号：２を含む、または本質的に配列番号：２からなる。
【０００９】
別の態様において、本発明は、抗炎症活性を有するポリペプチドを作製する方法を提供する。この方法は、とりわけ、ＩｇＧ  Ｆｃ領域の配列を有する親ポリペプチド、または親ポリペプチドをコードする第１の核酸配列を提供する工程；および修飾されたポリペプチドを得るために、修飾されたポリペプチドがシアル化されておらず且つＩｇＧ  Ｆｃ領域のシアル化形態の構造を模倣する（ｍｉｍｉｃｓ）ように、親ポリペプチドを修飾する工程を含む。修飾する工程は、修飾されたポリペプチドをコードする第２の核酸を得るために、第１の核酸配列を修飾されることによって行われ得る。本発明はまた、直前に記載した方法により作製されたポリペプチドを提供する。
【００１０】
第三の態様において、本発明は、上記ポリペプチドをコードする配列を含む、単離された核酸；当該核酸を含む発現ベクター；および当該核酸を含む宿主細胞を特徴とする。本発明はまた、ポリペプチドを製造する方法を特徴とする。当該方法は、核酸によってコードされるポリペプチドの発現を可能にする条件下、培地中で宿主細胞を培養すること、および培養した細胞または細胞の培地からポリペプチドを精製することを含む。
【００１１】
第四の態様において、本発明は、（ｉ）上記のポリペプチドまたは核酸、および（ｉｉ）薬学的に許容される担体、を含む医薬製剤を特徴とする。
【００１２】
第五の態様において、本発明は、炎症性疾患を治療する方法を提供する。当該方法は、上記のポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸の治療上の有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む。また、炎症性疾患を治療するための医薬の製造における、ポリペプチドまたは核酸の使用が提供される。本発明はまた、本明細書に実質的に示されおよび記載される、単離されたポリペプチド、核酸、発現ベクター、宿主細胞、組成物、または炎症性疾患を治療するための方法を特徴とする。
【００１３】
別の態様では、本発明はさらに、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞のレベルの増加を必要とする被験体におけるＴｒｅｇ細胞のレベルを増加させる方法を提供する。当該方法は、有効量の（ｉ）シアル化されたＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む第１の単離されたポリペプチド；または（ｉｉ）ＩｇＧ  Ｆｃ領域と少なくとも７５％（例えば、７５％および１００％の間の任意の数、例えば７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％）同一であり、ＦＡ２４１変異を有する修飾された配列を含む第２の単離されたポリペプチドまたは前記第２のポリペプチドをコードする核酸を前記被験体に投与することを含む。一実施形態では、被験体は、Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患を含む、自己免疫疾患などの炎症性疾患を有する。Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患の例には、多発性硬化症および１型糖尿病が含まれる。したがって、本発明はまた、Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患の治療を必要とする被験体におけるＴ細胞媒介性自己免疫疾患を治療する方法を提供する。当該方法は、有効量の上記第１の単離されたポリペプチドまたは第２の単離されたポリペプチドもしくは核酸を前記被験体に投与することを含む。
【００１４】
好ましい実施形態では、第１の単離されたポリペプチドにおけるＩｇＧ領域は、被験体のＩｇＧのレベルよりも高いレベルでシアル化されてもよい。修飾された配列は、異なるレベルでシアル化される、または非シアル化であってもよい。いくつかの実施形態では、（ａ）実質的にシアル化されていない、または被験体のＩｇＧのレベルよりも低いレベルでシアル化されている。ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、配列番号：１の配列を含むことができる。修飾された配列は、配列番号：２と少なくとも７５％（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、および１００％を包括した、例えば、７５％および１００％間の任意の数字）同一でありうる。第１または第２の単離されたポリペプチドは、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ｈＦｃγＲＩＩＡまたはｈＦｃγＲＩＩＢに結合する能力を有する。好ましくは、単離されたポリペプチドは、２×１０−５Ｍ以下のＫＤ（すなわち、５．０×１０４Ｍ−１以上のＫＡ）でｈＦｃγＲＩＩＡまたはｈＦｃγＲＩＩＢに結合する能力を有する。
【００１５】
本発明は、Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患の治療または制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞のレベルの増加を必要とする被験体におけるＴ細胞媒介性自己免疫疾患を治療するまたは制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞のレベルを増加させるための薬剤の製造における上記第１の単離されたポリペプチドまたは第２の単離されたポリペプチドの使用をさらに提供する。
【００１６】
本発明の一つ以上の実施形態の詳細は、以下の説明に記載されている。他の特徴、物（ｏｂｊｅｃｔ）、および本発明の利点は、明細書および特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄは、Ｆ２４１Ａが血清誘発性関節炎を抑制できることを示す。（図１Ａ）Ｃγ２ドメインの２４１位のフェニルアラニン残基を有する非シアル化コアグリカン（アシアロ（Ａｓｉａｌｏ）−Ｆｃ）のマンノース残基間の相互作用の模式図。シアル化（シアル−Ｆｃ）に際して、この相互作用はもはや起こらず、いわゆるオープン構造とクローズ構造との間で切り替わるためのＦｃ部分の配座柔軟性をもたらす。（図１ｂ）ｈＤＣ−ＳＩＧＮ＋骨髄由来マクロファージは、シアル化（ｓＦｃ）もしくは非シアル化（Ｆｃ）の野生型ＦｃまたはＦ２４１Ａ−Ｆｃで１時間パルス（ｐｕｌｓｅ）された。全細胞抽出物を使用して、ウエスタンブロッティングによってＩＬ−３３産生を分析した。アクチンをローディングコントロールとした。（図１ｃ）ＳＩＧＮ−Ｒ１−／−またはｈＤＣ−ＳＩＧＮ＋マウスからのＢＭＭΦは、非シアル化野生型Ｆｃ（アシアロ−Ｆｃ）、シアル化野生型Ｆｃ（ｓＦｃ）またはＦ２４１Ａでパルスされた。十分な洗浄後、細胞は、Ｋ／ＢｘＮチャレンジＣ５７ＢＬ／６マウスに養子導入された。（図１ｄ）ｈＤＣ−ＳＩＧＮ＋ＢＭＭΦは、野生型ＦｃまたはＦ２４１Ａの非シアル化（ａｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）（アシアロＦｃ）またはシアル化（α２，６ｓＦｃ）変異体のいずれかでパルスされた。細胞は、Ｋ／ＢｘＮチャレンジＣ５７ＢＬ／６マウスに養子導入された。平均＋／−ＳＥＭをプロットした；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１（テューキーの事後検定により決定された）。
【図２】図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、Ｆ２４１ＡがＩＩ型Ｆｃ受容体の関与を介して抗炎症応答を誘導することを示す。（図２ａ）Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスは、ＰＢＳ、ＩＬ−４ｉｃまたはＦ２４１Ａ（０．０３３ｇ／ｋｇ）で処置され、１時間後にＫ／ＢｘＮ血清でチャレンジされた。処置の６日後にこれらのマウスから血液を採取し、血清ＩＬ−６レベルをＥＬＩＳＡにより分析した。（図２ｂ）マウスの臨床スコアは、血清誘発性関節炎の重症度を反映させて、モニターされた。（図２ｃ）ＳＩＧＮ−Ｒ１−／−およびｈＤＣ−ＳＩＧＮ＋マウスは、Ｋ／ＢｘＮ血清でチャレンジされ、シアル化野生型Ｆｃ（ｓＦｃ）またはＦ２４１Ａ（両方とも０．０３３ｇ／ｋｇ）で処置された。疾患の進行は、疾患誘導後６日目まで毎日モニターされた。
【図３】図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃは、ｓＦｃ／Ｆ２４１ＡがＴｒｅｇ細胞を活性化および拡大（ｅｘｐａｎｄ）することを示す。（図３ａ）Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスは、ＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）、ＩＶＩＧ−Ｆ（ａｂ’２）（０．６６ｇ／ｋｇ）、ＩＶＩＧ−Ｆｃ（０．３３ｇ／ｋｇ）またはコントロールとしてＰＢＳの静脈内注射を受けた。注射後５日目に、脾臓におけるＴｒｅｇ細胞数をフローサイトメトリーによって分析した。（図３ｂ）Ｋ／ＢｘＮチャレンジＣ５７ＢＬ／６野生型マウスは、ＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）、ノイラミニダーゼ処理ＩＶＩＧ（ＮＡ−ＩＶＩＧ）（１ｇ／ｋｇ）、非シアル化Ｆ２４１Ａ（０．０３３ｇ／ｋｇ）またはコントロールとしてＰＢＳを与えられた。関節炎の臨床的徴候をモニターした。（図３ｃ）処置後５日目に、マウスを安楽死させ、脾臓におけるＴｒｅｇ細胞をフローサイトメトリーによって分析した。平均＋／−ＳＥＭをプロットした；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１（テューキーの事後検定により決定された）。
【図４】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄ、４Ｅおよび４Ｆは、ＩＶＩＧ−／Ｆ２４１Ａ−活性化Ｔｒｅｇ細胞が実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスにおいてＴ細胞媒介性自己免疫を効率的に抑制することを示す。（図４ａ）Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスは、ＥＡＥを誘導するためにＭＯＧ３５−５５ペプチドで免疫化された。ＥＡＥ誘導の５日後に開始して、マウスは、５日ごとにＰＢＳ、ＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）またはノイラミニダーゼ処理ＩＶＩＧ（ＮＡ−ＩＶＩＧ）（１ｇ／ｋｇ）の静脈内注射を受けた。ＥＡＥの臨床スコアを示す。（図４ｂ、図４ｃ）マウスを安楽死させ、流入領域リンパ節からのＣＤ４＋エフェクターＴ細胞（図４ｂ）およびＴｒｅｇ細胞（図４ｃ）をフローサイトメトリーによって分析した。（図４ｄ）ＥＡＥは、ＭＯＧ３５−５５ペプチドでの免疫化によってＣ５７ＢＬ／６野生型マウスにおいて誘導された。５日ごとに、マウスは、非シアル化Ｆ２４１Ａ（０．０３３ｇ／ｋｇ）またはＰＢＳの静脈内投与を受けた。Ｔｒｅｇ細胞枯渇のために、マウスは、ＥＡＥ誘導の３日前および誘導後５日ごとに、Ｔｒｅｇ細胞枯渇抗体ＰＣ６１（４００μｇ）を与えられた。疾患の臨床スコアを示す。（図４ｅ、図４ｆ）ＥＡＥマウスの流入領域リンパ節からの細胞を単離し、フローサイトメトリーによってＣＤ４＋エフェクターＴ細胞（図４ｅ）およびＴｒｅｇ細胞（図４ｆ）の割合について分析した。平均＋／−ＳＥＭをプロットした；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１（テューキーの事後検定により決定された）。
【図５】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃおよび５Ｄは、ＩＶＩＧ−／Ｆ２４１Ａ媒介Ｔｒｅｇ細胞活性化のためのＩＩ型Ｆｃ受容体の必要条件を示す。ＥＡＥは、全ての実験において、ＭＯＧ３５−５５ペプチドでの免疫化によって誘導された。マウスは、５、１０、１５および２０日目に静脈内注射を受けた。ＥＡＥの臨床スコアを示す。（図５ａ）Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスおよびＳＩＧＮ−Ｒ１−／−マウスは、ＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）またはＰＢＳで処置された。（図５ｂ）ＥＡＥ誘導後５日目に開始して、ＳＩＧＮ−Ｒ１−／−マウスは、上記のＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）またはＩＬ−３３（０．５μｇ）を２日ごとに腹腔内投与された。（図５ｃ）ＳＩＧＮ−Ｒ１−／−およびＳＩＧＮ−Ｒ１−／−ｈＤＣ−ＳＩＧＮ＋マウスは、ＰＢＳまたはＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）で処置された。（図５ｃ）ＳＩＧＮ−Ｒ１−／−ｈＤＣ−ＳＩＧＮ＋マウスは、非シアル化Ｆ２４１Ａ（アシアロ−Ｆ２４１Ａ）（０．０３３ｇ／ｋｇ）またはＰＢＳ（コントロール）を投与された。平均＋／−ＳＥＭをプロットした；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１（テューキーの事後検定により決定された）。
【図６】図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆおよび６Ｇは、Ｆ２４１Ａ誘導ＩＬ−３３産生がＴｒｅｇ細胞を活性化することを示す。（図６ａ、図６ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスは、４日間連続してＩＬ−３３（０．５μｇ）を腹腔内投与された。５日目にマウスを安楽死させ、脾臓Ｔｒｅｇ細胞の割合をフローサイトメトリーで分析した。（図６ｃ）Ｃ５７ＢＬ／６野生型またはｈＤＣ−ＳＩＧＮ＋マウスからの骨髄由来マクロファージは、ＰＢＳ、ＩＶＩＧまたは非シアル化Ｆ２４１Ａでパルスされた。（図６ｃ）全ＲＮＡを単離し、ＩＬ−３３  ｍＲＮＡレベルを測定するために定量的ｒｔＰＣＲのために使用した。ハウスキーピング遺伝子Ｇａｐｄｈは、正規化のために使用された。（図６ｄ、図６ｅ）処理後、骨髄由来マクロファージは、十分に洗浄され、Ｃ５７ＢＬ／６野生型レシピエントマウスに養子移入された。移植後５日目に、マウスを犠牲にして、Ｔｒｅｇ細胞およびＳＴ２発現をフローサイトメトリーによって分析した。（図６ｆ）ＥＡＥは、ＭＯＧ３５−５５ペプチドでの免疫化によってＣ５７ＢＬ／６野生型マウスにおいて誘導された。誘導後２日ごとに、マウスは、ＩＬ−３３（０．５μｇ  ｉ．ｐ．）を投与された。疾患の臨床スコアを示す。（図６ｇ）ＥＡＥマウスの流入領域リンパ節からのＴｒｅｇ細胞の割合をフローサイトメトリーによって分析した。平均＋／−ＳＥＭをプロットした；＊＊＊ｐ＜０．００１（テューキーの事後検定により決定された）。
【図７】図７Ａ、７Ｂ、７Ｃおよび７Ｄは、ＩＶＩＧ／Ｆ２４１ＡがＩＬ−３３／ＳＴ２軸を介したシグナル伝達によってＴｒｅｇ細胞活性化を誘導することを示す。（図７ａ、図７ｂ）Ｋ／ＢｘＮチャレンジＣ５７ＢＬ／６野生型マウスは、ＰＢＳまたはＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）で処置された。ＩＬ−３３シグナル伝達をブロックするために、マウスは、抗ＳＴ２ブロッキング抗体（１００μｇ  ｉ．ｖ．）またはアイソタイプ（コントロール）を投与された。ＲＡの臨床スコアを示す（図７ａ）。疾患誘導後５日目に、マウスを犠牲にし、脾臓Ｔｒｅｇ細胞をフローサイトメトリーで分析した（図７ｂ）。（図７ｃ）ＥＡＥは、ＭＯＧ３５−５５ペプチドでの免疫化によってＣ５７ＢＬ／６野生型マウスにおいて誘導された。マウスは、ＰＢＳまたは非シアル化Ｆ２４１Ａ（アシアロ−Ｆ２４１Ａ）（０．０３３ｇ／ｋｇ）を、５，１０，１５および２０日目に４回静脈内投与された。各投与は、抗ＳＴ２ブロッキング抗体の静脈内注射に先行した。ＥＡＥの臨床スコアを示す。（図７ｄ）ＥＡＥマウスは、犠牲にされ、流入領域リンパ節から細胞を単離した。Ｔｒｅｇ細胞ならびにそれらのＦｏｘｐ３およびＳＴ２発現をフローサイトメトリーによって分析した。平均＋／−ＳＥＭをプロットした；＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１（テューキーの事後検定により決定された）。
【図８】図８は、Ｆ２４１Ａがシアル化とは無関係にＤＣ−ＳＩＧＮに結合することを示す。組換えＤＣ−ＳＩＧＮを固定化し、非シアル化（アシアルＦ２４１Ａ）、シアル化Ｆ２４１Ａ（シアルＦ２４１Ａ）および非シアル化野生型Ｆｃ（アシアルＷＴ  Ｆｃ）の結合親和性をＥＬＩＳＡによって測定した。
【図９】図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃは、Ｅ３１８／Ｌｙｓ３４０ポケットがシアル化Ｆｃの抗炎症効果に重要であることを示す。（図９ａ）ＳＩＧＮ−Ｒ１−／−およびｈＤＣ−ＳＩＧＮ＋マウスからの骨髄細胞を単離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでマクロファージ（ＢＭＭΦ）に分化させた。ＢＭＭΦは、野生型または突然変異のＦｃで一晩パルスされた。全細胞抽出物をウエスタンブロッティングに使用した。アクチンをローディングコントロールとした。（図９ｂ）Ｋ／ＢｘＮチャレンジＣ５７ＢＬ／６マウスは、異なるＦｃ調製物で処置された。疾患の臨床スコアは、処置後６日目にモニターされた。（図９ｃ）血清ＩＬ−６レベルは、処置の８日後にＥＬＩＳＡにより検査された。
【図１０】図１０Ａ、図１０Ｂおよび図１０Ｃ：ＩＶＩＧは、誘導性Ｔｒｅｇ細胞を選択的に拡大する。ＥＡＥは、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスにおいて、ＣＦＡ中の乳化したＭＯＧ３５−５５ペプチドでの免疫化によって誘導された。マウスは、ＰＢＳまたはＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）で処置された。（ａ）ＥＡＥの臨床スコアを示す。平均＋／−ＳＥＭをプロットした；＊＊ｐ＜０．０１（テューキーの事後検定により決定された）。（ｂ）ＥＡＥマウスからの脊髄のＨＥおよびＬｕｘｏｌ  Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ染色の代表的画像。ＨＥ  炎症の染色。Ｌｕｘｏｌ  Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ染色におけるシグナルの消失は、進行した脱髄を示す。（ｃ）流入領域リンパ節からの細胞を単離し、Ｔｒｅｇ細胞数およびそれらのｎＴｒｅｇ特異的転写因子Ｈｅｌｉｏｓの発現を分析した。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、ＳＩＧＮ−Ｒ１の喪失がＴｒｅｇ細胞に対するＩＶＩＧの正の効果を無効にすることを示す。Ｃ５７ＢＬ／６野生型およびＳＩＧＮ−Ｒ１−／−マウスは、ＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）またはＰＢＳを静脈内投与された。１時間後、マウスは、Ｋ／ＢｘＮ血清をチャレンジされた。（図１１ａ）関節炎疾患の臨床的徴候は、チャレンジの５日後にモニターされた。（図１１ｂ）脾臓からのＴｒｅｇ細胞をフローサイトメトリーにより分析した。平均＋／−ＳＥＭをプロットした；＊＊ｐ＜０．０１（スチューデントのｔ検定により決定された）。
【図１２】図１２は、ＩＬ−３３がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴｒｅｇ細胞分化に相乗的に寄与することを示す。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスの脾臓から単離された。抗ＣＤ３／ＣＤ２８の存在下で細胞を３日間培養した。Ｔｒｅｇ細胞の分化を促進するために、ＴＧＦ−βを単独で、またはＩＬ−３３およびＩＬ−２３と組み合わせて細胞に添加した。Ｔｒｅｇ細胞数およびＳＴ２発現をフローサイトメトリーによって分析した。
【図１３】図１３Ａ、１３Ｂおよび１３Ｃは、好塩基球枯渇がＩＶＩＧ媒介Ｔｒｅｇ細胞刺激に影響を与えないことを示す。Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスは、好塩基球を枯渇するために抗ＦｃεＲＩ抗体でまたはアイソタイプ（コントロール）で処置された。また、マウスは、ＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）またはＰＢＳを投与され、Ｋ／ＢｘＮ血清でチャレンジされた。（図１３ａ）投与後５日目の脾臓の好塩基球のＦＡＣＳ解析。（図１３ｂ）関節炎疾患の臨床徴候は、疾患誘導後５日目にモニターされた。（図１３ｃ）脾臓Ｔｒｅｇ細胞をフローサイトメトリーによって分析した。平均＋／−ＳＥＭをプロットした；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１（テューキーの事後検定により決定された）。
【図１４】図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃおよび１４Ｄは、ＶＩＧがｉＴｒｅｇ細胞を優先的に活性化し、実験的大腸炎から保護することを示す。Ｃ５７ＢＬ／６  Ｒａｇ１−／−マウスは、Ｔ細胞トランスファー大腸炎を誘導するために、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＣＤ２５−Ｔ細胞を注入された。マウスは、Ｔ細胞トランスファー後４週間目に開始して、ＰＢＳまたはＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）で週１回処置された。Ｒａｇ１−／−コントロールマウス（ＣＴＲＬ）はＴ細胞を全く投与されなかった。（図１４ａ）体重は、週１回測定された。体重減少は、疾患重症度の手段として用いられた。（図１４ｂ）流入領域リンパ節からの細胞は、ＦＡＣＳによるＴｒｅｇ細胞およびＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の割合のために分析された。（図１４ｃ）全結腸を切開し、測定した。結腸収縮は、疾患重症度を示し、体重減少と相関した。（図１４ｄ）ｃに記載の解剖した結腸の代表的画像。平均＋／−ＳＥＭをプロットした；＊＊＊ｐ＜０．００１（テューキーの事後検定により決定された）。
【図１５】図１５は、ｓＦｃ誘導抗炎症経路のモデルを示す：シアル化ＩｇＧ、ｓＦｃおよびシアル化ＦｃアナログＦ２４１Ａが調節性（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）マクロファージのＳＩＧＮ−Ｒ１またはヒトＤＣ−ＳＩＧＮのようなＩＩ型ＦｃＲに選択的に関与し、ＩＬ−３３産生を誘導する。ＩＬ−３３は、２つの異なる抗炎症経路を誘発する中心的なメディエーターである。好塩基球は、ＩＬ−４の産生と共にＩＬ−３３に応答し、これは次にエフェクターマクロファージの抑制性ＦｃγＲＩＩＢの上方制御を誘導する。その活性化閾値の結果としての劇的な変化は、炎症を抑制する。加えて、ＩＬ−３３はまた、Ｔｒｅｇ細胞の活性化および拡大を誘発し、これはＴＨ１およびＴＨ１７細胞を効果的に抑制し、よってＴ細胞媒介性自己免疫を改善する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的には、非シアル化ＩｇＧ  Ｆｃ変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）が抗炎症活性を付与し、抗炎症性メディエーターとして２，６シアル化Ｆｃの効果を模倣するという予想外の発見に基づく。
【００１９】
本明細書に開示するように、ＩＶＩＧの抗炎症活性は、コアＩｇＧ−Ｆｃグリカン中のシアル酸の存在に依存し、ＣＨ２ドメインの構造の柔軟性の増加をもたらし、Ｉ型からＩＩ型受容体へのＦｃＲ結合特異性の対応する調節をもたらす。シアル化ＩｇＧ−Ｆｃ（ｓＦｃ）は、抑制受容体ＦｃγＲＩＩＢの上方制御を刺激することにより、自然（ｉｎｎａｔｅ）エフェクター細胞の免疫複合体への活性化閾値を上昇させる。本発明者らは、シアル化によって誘導される構造変化が、ＣＨ２ドメインに対する特異的アミノ酸修飾によって模倣できることを見出した。例えば、２４１位に点突然変異（Ｆ−Ａ）を有するＩｇＧ−Ｆｃ変異体は、シアル化の非存在下でも抗炎症活性を示す。Ｆ２４１ＡおよびｓＦｃは、コラーゲンおよびＫＢｘＮ誘発モデルの両方において関節炎からマウスを保護し、Ｔ細胞媒介性ＥＡＥマウスモデルでは、Ｔｒｅｇ細胞を特異的に活性化することによって疾患を抑制した。抗体誘導性およびＴ細胞媒介性自己免疫疾患の両方におけるこれらの抗炎症性Ｆｃｓによる保護は、ＩＩ型ＦｃＲおよびＩＬ−３３の誘導を必要とした。これらの結果はさらに、抗体誘導性およびＴ細胞媒介炎症性疾患の両方におけるＩＶＩＧの作用機序を明らかにし、シアル化によって誘導される構造変化を模倣するＦｃ変異体、例えばＦ２４１Ａが様々な自己免疫疾患の治療に使用できることを示す。
【００２０】
ＩｇＧおよびＦｃシアル化
ＩｇＧは、主要な血清免疫グロブリンである。２つの同一の重鎖および２つの軽鎖からなる糖タンパク質であり、可変および定常ドメインで順番に構成される。ＩｇＧは、その２つの重鎖のそれぞれの上のＣＨ２ドメイン内のＡｓｎ２９７において単一のＮ−結合グリカンを含む。共有結合した複合糖質は、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびマンノース（ｍａｎ）を含むコア、二分岐ペンタ−多糖で構成されている。フコース、分岐したＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース（ｇａｌ）および可変的に見出される末端シアル酸（ｓａ）部分の存在により、コア糖質構造のさらなる改変が血清抗体で観察される。４０を超える異なる糖型が、このように、この単一のグリコシル化部位に共有結合されていることが検出されている（フジイら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６５，６００９，１９９０）。ＩｇＧのグリコシル化は、２つの重鎖の開いたコンフォメーションを維持することによって、すべてのＦｃｙＲへの結合に必須であることが示されている。ジェフリーズ（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ）とルンド（Ｌｕｎｄ），Ｉｍｍｕｎｅ．  Ｌｅｔｔ．  ８２，５７（２００２）、  ソンダーマン（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ）ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ３０９，７３７（２００１）。ＦｃγＲ結合のためのこのＩｇＧグリコシル化は、脱グリコシル化ＩｇＧ抗体が、ＡＤＣＣ、食作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）および炎症性メディエーターの放出などのｉｎ  ｖｉｖｏにおいて誘発される炎症反応を媒介することができないことについての主要因であると考えられている。ニマージャーン（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ）とラヴェッチ（Ｒａｖｅｔｃｈ），  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２４，１９（２００６）。ＩｇＧの個々の糖型は炎症反応を調節することに寄与し得るというさらなる所見が、フコースを含むまたは欠くＩｇＧ抗体について報告された個々のＦｃγＲに対する変化した親和性、および細胞毒性に対するそれらの結果的な影響によって、示唆されている。シールズ（Ｓｈｉｅｌｄｓ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７７，２６７３３（２００２）、  ニマージャーン（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ）とラヴェッチ（Ｒａｖｅｔｃｈ），  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０，１５１０（２００５）。自己免疫状態とＩｇＧ抗体の特定のグリコシル化パターンとの間の関連性が、ＩｇＧ抗体の減少したガラクトシル化およびシアル化が報告されている関節リウマチおよびいくつかの自己免疫血管炎（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｅｓ）を有する患者において、観察されている。パレク（Ｐａｒｅｋｈ）ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１６，４５２（１９８５）、  ラーデマッヘル（Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，６１２３（１９９４）、  マツモトら，１２８，６２１（２０００）、  ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２月２７日。ＩｇＧ糖型の多様性はまた、加齢および免疫化の際に関連することが報告されているが、これらの変化のｉｎ  ｖｉｖｏでの重要性は究明されていない。シカタら，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１５，６８３（１９９８）、  ラストラ（Ｌａｓｔｒａ）ら，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２８，２５（１９９８）。
【００２１】
ＩｇＧ  Ｆｃ変異体
本明細書に開示されるように、特定のＩｇＧ  Ｆｃ変異体（シアル化または非シアル化）も、驚くべきことに抗炎症活性を与える。ＦＡ２４１変異体を含むこのような変異体は、シアル化Ｆｃの構造的および生物学的特性を模倣することにより、シアル化を必要とせずに、抗炎症治療薬として開発され得る分子のより大きな属（ｇｅｎｕｓ）内の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）を表す。
【００２２】
ＩＶＩＧは、初期に低ガンマグロブリン血症患者の免疫グロブリン補充療法として開発されたが、その免疫調節活性のために広く使用されている。それは、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、川崎病、ギラン・バレー症候群などの自己免疫疾患の治療に承認された治療薬であり、ますます多くの自己免疫疾患および炎症性疾患に使用されている。その抗炎症活性は、ＦｃのＣＨ２ドメインに存在する特定のグリカンであるα２，６シアル化複合二分岐構造の存在に起因していることが示されており、ＩＶＩＧの異種抗体調製物のごく一部で発見された。ＣＨ２ドメインのＦｃグリカンのシアル化は、Ｉ型ＦｃＲに対するＩｇＧの結合親和性を減少させながら、ＳＩＧＮ−Ｒ１、ＤＣ−ＳＩＧＮ、およびＣＤ２３などのＩＩ型Ｆｃ受容体に関与することができるＩｇＧをもたらす。血清誘導性関節炎、抗体依存性ＩＴＰ、腎毒性腎炎および自己免疫性水疱性疾患（ＡＢＤ）のマウスモデルに関する研究は、ＩＶＩＧからのものまたは組み換え技術により発現されたＩｇＧ１から生成されたものであろうとなかろうと、シアル化Ｆｃの抗炎症活性を確認した。さらに、ＩＶＩＧまたは組み換え発現ＩｇＧ１のいずれかにおけるシアル化Ｆｃ断片の割合を増加させると、これらの調製物の治療の有効性が増強された。ｓＦｃが抗炎症応答を誘導する機構の解明は、関節炎のマウスモデルにおいて最初に報告され、シアル化ＦｃのＩＩ型ＦｃＲへの選択的結合が、調節性マクロファージによるＩＬ−３３の産生をもたらし、次に好塩基球からのＩＬ−４分泌を刺激したことを示す。ＩＬ−４は、エフェクターマクロファージの抑制性受容体ＦｃγＲＩＩＢの上方制御を誘導し、それにより、これらの細胞の活性化閾値を上昇させ、炎症を抑制する。その後の研究により、ヒト集団のＩＶＩＧ処置が、マウスのデータと一致して、血清ＩＬ−３３レベルおよびリンパ系および骨髄性細胞のＦｃγＲＩＩＢ発現の両方の増加をもたらすことが確認された。
【００２３】
本明細書に開示されるように、シアル化および非シアル化ＩｇＧ  Ｆｃ断片に関する結晶学的および生物物理学的研究は、シアル化Ｆｃの抗炎症活性の構造的基礎についての洞察を提供した。ＩｇＧ  Ｆｃの複合、二分岐グリカンのシアル化は、ＣＨ２ドメインの構造柔軟性増加をもたらし、それにより、ＩＩ型ＦｃＲ結合に必要なＣＨ２ドメインのクローズ構造をサンプリングする。対照的に、非シアル化Ｆｃ構造は、一様にオープンＦｃ構造をもたらし、Ｉ型ＦｃＲに対するそれらの結合特異性と一致する。グリカンとＣＨ２ドメインのアミノ酸残基との相互作用は、シアル化の際に破壊され、タンパク質構造で見られ、ＩＩ型ＦｃＲに対するシアル化Ｆｃの結合特異性について提案されたモデルと一致する、観察された構造変化の基礎を提供する。これらの所見に基づいて、本発明者らは、ＩＩ型ＦｃＲ結合への影響および結果として生じる抗炎症活性を決定する目的で、グリカンと相互作用するＣＨ２ドメインのアミノ酸を標的とする、一連のＦｃ変異体を作製した。この研究では、機能獲得型および欠失型変異体両方を調べた。特異的な炭水化物修飾を必要とせずに、シアル化によって誘導された構造状態を模倣することができる、機能獲得型変異体の同定は、治療用の抗炎症ＩｇＧ  Ｆｃの開発を単純化することができる。本発明者らは、α１，３アームの可動性を増加させると予測され、シアル化の非存在下でもシアル化Ｆｃの抗炎症活性を再現する突然変異（Ｆ２４１Ａ）を同定することに成功した。本発明者らは、自己免疫性炎症の抗体およびＴ細胞モデルの両方において、シアル化Ｆｃと比較して、この変異体を特徴付けた。
【００２４】
抗体誘導性の炎症モデルにおけるＩＶＩＧ保護の基礎は、上記に要約されているように広範に研究されてきたが、最近の研究により、ＩＶＩＧはまた、ＥＡＥのような古典的なＴ細胞媒介性自己免疫疾患および気道過敏性（ＡＨＲ）のモデルにおいても保護できることが示されている。ＩＶＩＧのこの治療効果としては、Ｔｒｅｇ細胞の活性化および拡大に起因し、よってＩＦＮγ分泌ＴＨ１およびＩＬ−１７分泌ＴＨ１７細胞によるＴ細胞応答を抑制するものであることが提案される。したがって、本発明者らは、Ｔｒｅｇ細胞の活性化および拡大がシアル化ＦｃｓまたはＦ２４１Ａ変異体の結果でもあるかどうかを調べようとした。本発明者らは、Ｆ２４１Ａ、シアル化および非シアル化ＩＶＩＧを用いて、Ｔｒｅｇ細胞活性化およびＴ細胞依存性自己免疫の抑制に対する免疫調節効果の作用機序を研究した。本発明者らは、ＩＶＩＧのシアル化がＴｒｅｇ細胞の活性化および拡大に決定的に必要であり、Ｆ２４１Ａ変異体がＥＡＥおよび実験的大腸炎モデルにおけるＴ細胞依存性炎症を抑制するのに十分であることを示す。さらに、ｓＦｃおよびＦ２４１Ａの両方がインターロイキン−３３（ＩＬ−３３）の産生を刺激し、次にＳＴ２受容体を介してＴｒｅｇ細胞を活性化して、Ｔ細胞媒介性自己免疫応答の抑制に寄与する。
【００２５】
以下の実施例に開示するように、本発明者らは、機能的データを提示して、Ｆｃ骨格とＦｃグリカンとの間の特異的相互作用がシアル化ＩｇＧのエフェクター特性に影響を及ぼすことを示す。本発明者らは、α２，３−シアルＦｃではなくα２，６−シアルＦｃのみがＤＣ−ＳＩＧＮに結合し、自己抗体誘導関節炎の炎症を抑制するため、シアルＦｃの抗炎症活性がシアル酸のα２，６−結合に厳密に依存することを確認した。Ｆｃグリカンでの異なるシアル酸結合がＦｃ構造にどのように影響し得るか？本発明者らは、シアル酸糖残基がタンパク質骨格に近接することにより、シアル酸がＦｃの特定のアミノ酸側鎖とどのように相互作用するかを決定できることを見出した。実際に、分子モデリングは、α２，６−結合シアル酸のみが、Ｃγ２−Ｃγ３界面でＧｌｕ３１８およびＬｙｓ３４０によって形成される溝（ｇｒｏｏｖｅ）に収まりうることを示唆している。この溝がα２，６−シアルＦｃの抗炎症活性において役割を果たすかどうかを決定するために、本発明者らは、Ｅ３１８Ｎ点突然変異を有するシアルＦｃの免疫抑制機能を特徴付けた。興味深いことに、Ｅ３１８Ｎ  α２，６−シアルＦｃは、ＩＬ−３３発現の誘導または刺激されたＤＣ−ＳＩＧＮ＋ＢＭＭΦのＫ／ＢｘＮ血清チャレンジマウスへの養子移入による関節炎の炎症からの保護のような、ＷＴα２，６−シアルＦｃに関連する抗炎症経路をイニシエートできない。したがって、シアル酸のα２，３−結合と同様に、本発明者らは、Ｅ３１８Ｎ突然変異がＦｃがその「クローズの（ｃｌｏｓｅｄ）」抗炎症状態を選択するのに必要なα２，６−結合シアル酸とＦｃ骨格との間の相互作用を破壊したことを示す。
【００２６】
Ｆｃ構造は、典型的には、ＣＨ２ドメインによって形成される内部空洞内のＦｃグリカンのα１，３アームを分解する。この空洞を占有することにより、α１，３アームは、「オープン」構造において離れた距離でＣＨ２ドメインを安定化させて、Ｉ型ＦｃＲとの結合を促進する。提案されたモデルが正確であるためには、シアル化α１，３アームは、末端のシアル酸がＥ３１８／Ｋ３４０溝に接触するように、この空洞からＣＨ２−ＣＨ３界面に向かって移動しなければならない。したがって、シアル化α１，３アームをＣＨ２−ＣＨ３界面に再配置することにより、ＣＨ２ドメインは、より近くに引き寄せられて、現在非占有の空洞を充填し、「クローズの」構造を形成することができる。Ｆｃ骨格との複数の非共有結合相互作用を形成するＦｃグリカンのα１，６アームとは異なり、α１，３アームは、シアル化−Ｆ２４１の芳香族側鎖の非存在下、ただ１つの既知の接触を形成する。しかし、シアルＦｃの結晶構造において、Ｆｃグリカンと接触して配向の有意な変化を示す唯一のアミノ酸側鎖は、Ｆ２４１の環構造である。本発明者らは、観察されたＦ２４１の９０°回転が通常炭水化物と形成する疎水性スタッキング相互作用を排除すると考える。本発明者らは、この安定化相互作用の破壊がＦｃグリカンのシアル化α１，３アームに対するより大きな自由度または移動度を付与するはずであるため、これが構造的に重要であると考える。このより大きな移動度により、シアル化α１，３アームは、より大きい頻度で内部空洞の外側の空間をサンプリングし、ＣＨ２−ＣＨ３界面でのＥ３１８／Ｋ３４０ポケットに出会う（ｅｎｃｏｕｎｔｅｒ）であろう。α２，６−シアルＦｃの構造におけるＦ２４１の重要な役割と一致して、本発明者らは、このタンパク質−糖接触点を特異的に破壊するＦ２４１Ａ変異がシアル化とは無関係にシアルＦｃの抗炎症活性を再現することを見出した。α２，６−シアルおよび非シアルＦ２４１Ａ  Ｆｃの両方がＤＣ−ＳＩＧＮに結合し、ＩＬ−３３発現を誘導し、刺激されたＤＣ−ＳＩＧＮ＋ＢＭＭΦによる抗炎症活性をＫ／ＢｘＮ血清チャレンジマウスに伝えて、ＩＶＩＧおよびシアル化ＩｇＧの抗炎症活性を再現した。最近、免疫応答を調節するためのＦｃシアル化の本質的な役割の論点についての報告が公表されている。本データおよびいくつかの他のグループのデータは、抗体誘導性炎症の複数のモデルにおいてシアル化Ｆｃの抗炎症性の役割を裏付けている。これらの相違は、ＩＶＩＧが選択的モデルで非直線的に投与された結果であり、したがってＩＶＩＧが使用される生理学的に関連する状態を反映していない可能性が高い。
【００２７】
我々は、シアル化ＦｃおよびＦ２４１Ａなどの変異体がｉＴｒｅｇ細胞の拡大を特異的に刺激し、ＥＡＥのモデルおよびＩＩ型Ｆｃ受容体、ＳＩＧＮ−Ｒ１、またはそのヒトオルソログＤＣ−ＳＩＧＮの選択的関与による実験的大腸炎におけるＴ細胞媒介性免疫応答を抑制するのに十分であることを確認した。さらに、本発明者らは、ＩＬ−３３がこの経路の必須メディエーターであることを確認した。ＩＶＩＧ、シアル化ＦｃまたはＦ２４１ＡによるＩＩ型ＦｃＲの関与に応答して誘導されるＩＬ−３３は、図１５にまとめられるように、多形質発現的に作用する。それは、好塩基球によるＩＬ−４分泌を媒介して、マクロファージをＭ２表現型に分極させ、抑制性ＦｃγＲＩＩＢ発現を誘導でき、抗体誘導性自己免疫炎症で優位を占める経路を誘導でき、または、それはＴｒｅｇ細胞に直接作用してその活性化および拡大を媒介することができる。本発明者らは、Ｔｒｅｇ細胞がＩＬ−３３／ＳＴ２軸を介したシグナル伝達に決定的に依存するシアル化Ｆｃによる治療処置によって活性化され得ることを実証した。本発明者らは、ＩＬ−３３依存性Ｔｒｅｇ細胞活性化が以前にＭａｔｔａおよび共同研究者によって報告されたように、主に樹状細胞を介して間接的に媒介される可能性を排除することはできない。しかしながら、本発明者らは、最近提案されたモデルとは対照的に、ＩＶＩＧと任意のＴ細胞サブセット（エフェクターでもＴｒｅｇ細胞でもない）との直接的な相互作用を検出せず、また、「Ｔレジトープ（Ｔｒｅｇｉｔｏｐｅ）」を提供するＩＶＩＧを裏付ける証拠も観察できなかった。具体的には、本発明者らは、ＩＶＩＧまたはＦ２４１Ａ処理ｈＤＣ−ＳＩＧＮ＋骨髄由来マクロファージがナイーブなレシピエントに移入された実験におけるＴｒｅｇ細胞の活性化および拡大を検出することができた。パルスしたＢＭＭΦがＩＬ−３３の分泌を伴うこの処置に応答したので、データは、このサイトカインがＴｒｅｇ細胞の活性化および拡大を導く経路の主要なメディエーターであるという結論を支持する。
【００２８】
以前の研究は、Ｔｒｅｇ細胞の濃縮を常に伴う異なるマウスモデルにおけるＩＬ−３３とＴ細胞媒介性炎症の改善との間の関係を証明している。さらに、ＩＬ−３３の血清レベルは、ヒト自己免疫患者におけるＩＶＩＧ投与時に非常に上昇し、それにより、様々な抗炎症応答の強力な誘導物質となることが示されている。抗体がＩＬ−３３シグナル伝達を妨げるＳＴ２をブロックするために使用された場合、本発明者らは、この治療が血清トランスフェリン関節炎モデルおよびＥＡＥモデルの両方におけるＩＶＩＧ／Ｆ２４１Ａの保護効果を有意に損なうことを見出した。
【００２９】
「定常（ｃｏｎｓｔａｎｔ）」ドメインどころではなく、抗体のＦｃ領域が異種の構造および機能を示すことがますます明らかになっている。本明細書中に開示される本発明は、Ｆｃ断片の構造多様性が異なる免疫学的アウトカムをもたらすために受容体特異性をシフトさせるための抗体に対する一般的な戦略として役立つという見解を進める。ＩｇＧ  Ｆｃダイナミクスは、タンパク質グリカン相互作用によって微調整され、次にＦｃグリカンの糖組成によって調節される。本発明者らは、増加したＦｃグリカン移動度のモデルがシアル化ＩｇＧの抗炎症活性に関連する生物物理学的および機能的特性の主な原因となることを見出した。これらの構造的および機構的観察に基づいて、本発明者らは、Ｆ２４１Ａなどのシアル化ＩｇＧの代用品を開発し、このことはＩＶＩＧよりも効力および均一性の利点を提供し、自己抗体およびＴ細胞媒介炎症性の両方のための臨床開発に使用できる。
【００３０】
ポリペプチドおよび核酸
ポリペプチド
本明細書に開示されるように、本発明は、上記のＡｓｎ２９７でのα２，６結合を介してガラクトース部分に接続された末端シアル酸を有する多糖鎖を欠く、ヒトＩｇＧ  Ｆｃの変異体の配列を有する単離されたポリペプチドを提供する。このような非シアル化ＩｇＧ  Ｆｃ変異体は、天然に存在する抗体に由来するか、または細胞株において発現されてもよい。
【００３１】
一実施形態において、Ｆｃ領域はｈＩｇＧ１アミノ酸配列の１つ以上の置換を含む。これに限定されるものではないが、典型的なＩｇＧ１  Ｆｃ領域は以下のように提供される：
【００３２】
【化１】
2018508522.tif 000003
【００３３】
【化２】
2018508522.tif 000004
【００３４】
【化３】
2018508522.tif 000005
【００３５】
用語「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」、「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」および「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、本明細書においてはポリマー中のアミノ酸残基の配置（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を説明するために交換可能に使用される。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、天然に存在する標準的な２０個のアミノ酸に加えて、希少アミノ酸および合成アミノ酸類似体から構成され得る。それらは長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関わらず、アミノ酸の任意の鎖であり得る。「本発明の」ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢに結合する特定のドメインまたは部分を有する、組換え的にまたは合成的に産生された型（ｖｅｒｓｉｏｎｓ）を含む。この用語はまた、追加されたアミノ末端メチオニン（原核細胞における発現に有用）を有するポリペプチドを包含する。
【００３６】
「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」ポリペプチドまたはタンパク質は、それが天然において結合されている他のタンパク質、脂質、および核酸から分離されているポリペプチドまたはタンパク質を指す。ポリペプチド／タンパク質は、精製された調製物の乾燥重量で少なくとも１０％（すなわち、１０％〜１００％の間の任意のパーセンテージ、例えば２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、および９９％）を構成することができる。純度は任意の適切な標準的方法により、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析によって、測定され得る。本発明に記載の単離されたポリペプチド／タンパク質は、天然源から精製され、組換えＤＮＡ技術または化学的方法によって生産され得る。ＩｇＧ  Ｆｃの機能的等価物は、ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド誘導体を意味し、例えば、１つ以上の点変異、挿入、欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）、切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ）、融合タンパク質、またはそれらの組み合わせを有するタンパク質である。これは、ＩｇＧ  Ｆｃの活性、すなわち、それぞれの受容体に結合しそれぞれの細胞応答を誘発する能力を、実質的に保持する。単離されたポリペプチドは、配列番号：２を含み得る。一般的に、機能的等価物は、配列番号：２と少なくとも７５％（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、および９９％を包括した、例えば、７５％および１００％間の任意の数字）同一である。
【００３７】
２つのアミノ酸配列のまたは２つの核酸の「同一性パーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−７７，１９９３において修正された、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−６８，１９９０のアルゴリズムを用いて決定される。このようなアルゴリズムは、アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−１０，１９９０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るためには、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長−１２によって行われ得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るためには、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３によって行われ得る。２つの配列間にギャップが存在する場合は、アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２，１９９７に記載されるようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメーターが使用され得る。
【００３８】
本明細書に記載のポリペプチドのアミノ酸組成は、それぞれの受容体に結合しそれぞれの細胞応答を誘発するポリペプチドの能力を破壊することなく、変化してもよい。例えば、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含むことができる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において明らかにされている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。従って、例えば配列番号：２において予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、変異は、飽和突然変異誘発などによって配列の全てまたは一部に沿ってランダムに導入されることができ、結果として生じる変異体は、実施例において後述するような活性を保持する変異体を同定するために、それぞれの受容体に結合しそれぞれの細胞応答を誘発する能力についてスクリーニングされることができる。
【００３９】
本発明に記載されるようなポリペプチドは、組換えポリペプチドとして得られ得る。組換えポリペプチドを調製するため、それ（例えば、ＦＡ２４１、配列番号：２）をコードする核酸は、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×ＨｉｓエピトープタグまたはＭ１３遺伝子３タンパク質のような融合パートナーをコードする別の核酸に連結され得る。結果として得られる融合核酸は、当技術分野で公知の方法により単離され得る融合タンパク質を、適切な宿主細胞中で発現する。単離された融合タンパク質は、融合パートナーを除去し本発明の組換えポリペプチドを得るために、例えば酵素消化により、さらに処置され得る。
【００４０】
核酸
本発明の別の態様は、上述のポリペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含む単離された核酸を特徴とする。核酸は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、またはＤＮＡもしくはＲＮＡの類似体（ａｎａｌｏｇ）を指す。ＤＮＡまたはＲＮＡ類似体は、ヌクレオチド類似体から合成され得る。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。「単離された核酸（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」は、天然に存在する核酸のいずれのものまたは天然に存在するゲノム核酸のいずれの断片とも相同ではない構造の、核酸を意味する。従って、この用語は、例えば、（ａ）ＤＮＡは、天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の一部の配列を有するが、天然に存在する生物のゲノム中の分子のその部分に隣接する（ｆｌａｎｋ）コード配列の両方によって、隣接されていない；（ｂ）結果として得られる分子がいずれの天然に存在するベクターまたはゲノムＤＮＡとも相同でないような方法で、ベクター中または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた核酸；（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成された断片または制限断片などの、分離された（ｓｅｐａｒａｔｅ）分子；および（ｄ）ハイブリッド遺伝子、すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子、の一部である組換えヌクレオチド配列である。上記の核酸は、本発明の融合タンパク質を発現するために使用され得る。この目的のためには、発現ベクターを作り出すため、適切な調節配列に作動的に核酸を連結することができる。
【００４１】
ベクターは、それに連結された別の核酸を輸送できる核酸分子を指す。ベクターは、自己複製が可能であるか、または宿主ＤＮＡへ統合（ｉｎｔｅｇｒａｔｅ）できる。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、またはウイルスベクターが挙げられる。ベクターは、宿主細胞において核酸の発現に適した形態で核酸を含む。好ましくは、ベクターは、発現されるべき核酸配列に作動的に連結された、１以上の調節配列を含む。
【００４２】
「調節配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節因子（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。調節配列は、ヌクレオチド配列の恒常的発現を導くもの、ならびに組織特異的調節および／または誘導性配列を含むものである。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質またはＲＮＡの発現レベルなどのような因子に依存し得る。発現ベクターは、本発明のポリペプチドを産生する宿主細胞に導入され得る。プロモーターは、ＤＮＡに結合してＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼを導くＤＮＡ配列として定義される。強力なプロモーターは、ｍＲＮＡを高頻度で開始させるものである。
【００４３】
上記の任意のポリヌクレオチド、または同じ意図の目的のために当業者に利用可能な生物学的に等価なポリヌクレオチドは、適切な発現ベクターに挿入され、この受容体を発現する「組換えＤＮＡ分子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」を形成するように他のＤＮＡ分子と連結されてもよい。これらのベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡから構成されてもよく；ほとんどのクローニング目的のＤＮＡベクターは好ましい。典型的なベクターは、プラスミド、改変ウイルス、バクテリオファージおよびコスミド、酵母人工染色体、ならびにエピソーム性のまたは統合ＤＮＡの他の形態を含む。これは、特定使用のための適切なベクターを決定するための、当業者にとっての知識の範囲内である。
【００４４】
様々な哺乳類発現ベクターが、哺乳類細胞中で上記のＩｇＧ  Ｆｃを発現するために使用されてもよい。上述したように、発現ベクターは、適切な宿主中において、クローニングされたＤＮＡの転写およびそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列であり得る。そのようなベクターは、細菌、藍藻類、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞のような様々な宿主において真核生物ＤＮＡを発現するために使用され得る。特別に設計されたベクターは、細菌−酵母または細菌−動物細胞のような宿主間のＤＮＡの往復を可能にする。適切に構築された発現ベクターは：宿主細胞中での自己複製のための複製起点、選択マーカー、有用な制限酵素部位の限られた数、高コピー数の能力、および活性プロモーターを含むはずである。発現ベクターは、特に限定されないが、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特別に設計されたプラスミドまたはウイルスを含んでも良い。好適であり得る市販の哺乳類発現ベクターは、限定されないが、ｐｃＤＮＡ３．ｎｅｏ（インビトロジェン社）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン）、ｐＣＩ−ｎｅｏ（プロメガ）、ｐＬＩＴＭＵＳ２８、ｐＬＩＴＭＵＳ２９、ｐＬＩＴＭＵＳ３８およびｐＬＩＴＭＵＳ３９（ニューイングランドバイオラボ）、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ（インビトロジェン）、ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（ストラタジーン）、ｐＸＴ１（ストラタジーン）、ｐＳＧ５（ストラタジーン）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７５９３）  ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ  ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ  ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ  ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ  ３７４６０）、ならびにＩＺＤ３５（ＡＴＣＣ  ３７５６５）が挙げられる。
【００４５】
上記の核酸を含有する宿主細胞もまた、本発明の範囲内である。例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞、または哺乳類細胞が挙げられる。例えば、ゲッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ），（１９９０）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  アカデミック・プレス，サンディエゴ，カリフォルニア州を参照。本発明のポリペプチドを製造するため、本発明の核酸によってコードされるポリペプチドの発現を可能にする条件下、培地中で宿主細胞を培養し、培養した細胞または細胞の培地からポリペプチドを精製することができる。あるいは、本発明の核酸は、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写および翻訳され得る。
【００４６】
天然に存在するＩｇＧ  Ｆｃ、遺伝子操作されたＩｇＧ  Ｆｃ、および化学的に合成されたＩｇＧ  Ｆｃは全て、本明細書に開示された発明を実施するために使用され得る。組換えＤＮＡ技術によって得られたＩｇＧ  Ｆｃは、［ＦＡ２４１］配列番号：２）と同じアミノ酸配列またはその機能的等価物を有していてもよい。用語「ＩｇＧ  Ｆｃ」はまた、化学的に改変された型を含む。化学的に改変されたＩｇＧ  Ｆｃの例としては、コンフォメーション変化を受けたＩｇＧ  Ｆｃ、糖鎖の付加または欠失、およびポリエチレングリコールなどの化合物が結合されているＩｇＧ  Ｆｃが挙げられる。
【００４７】
このようにして作られたポリペプチド／タンパク質の有効性を、以下に説明するように、トランスジェニックマウスなどの動物モデルを用いて、検証することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＬ−３３好塩基球の発現やエフェクターマクロファージ上のＦｃγＲＩＩＢ受容体の発現における任意の統計的に有意な増加は、ポリペプチド／タンパク質が後述する疾患を治療するための候補であることを示す。一実施形態では、上述のアッセイは、ＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質またはＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞への結合の測定に基づいてもよい。本技術は、ＤＣ−ＳＩＧＮまたはＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞への化合物の能力、および例えばＩＬ−３３などのＤＣ−ＳＩＮＧパスウェイによって調節される遺伝子の発現における関連した変化を測定することに適した、当業者が利用可能な様々な技術に富んでいる。当業者は、過度の実験なしにこれらの様々な研究ツールを組み合わせ、適合させることができるであろう。精製され、標準的方法または下記実施例に記載のアッセイおよび方法に従って試験された後、非シアル化ＩｇＧ  Ｆｃ変異体は、炎症性疾患を治療するための医薬組成物に含有させられることもできる。
【００４８】
本明細書で使用される「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、最も広い意味で用いられ、具体的には、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を、それらが所望の生物学的活性を示す限り含む。
【００４９】
本明細書で使用される「抗体断片（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、インタクトな抗体の一部を含んでもよく、一般的には、インタクトな抗体の抗原結合もしくは可変領域またはＦｃＲ結合能力を保持する抗体のＦｃ領域を含む。抗体断片の例としては、線状抗体；一本鎖抗体分子；および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。抗体断片は、好ましくは、少なくともヒンジの部分、および任意にＩｇＧ重鎖のＣＨ１領域を保有する。より好ましくは、抗体断片は、ＩｇＧ重鎖の定常領域全体を保有し、およびＩｇＧ軽鎖を含む。
【００５０】
本明細書で使用される用語「Ｆｃ断片」または「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。「Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域または変異型Ｆｃ領域であってもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化してもよいが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常は、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端に伸長すると定義される。
【００５１】
「天然配列Ｆｃ領域（ｎａｔｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｆｃ  ｒｅｇｉｏｎ）」は、自然界に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を含む。当業者によって理解されるように、「変異型Ｆｃ領域」は、少なくとも１つの「アミノ酸改変」によって天然配列Ｆｃ領域のものとは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異型Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば約１個〜約１０個のアミノ酸置換、好ましくは天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域において約１個〜約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書における変異型Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約７５または８０％の相同性を有し、より好ましくはそれらと少なくとも約９０％の相同性を有し、より好ましくはそれらと少なくとも約９５％の相同性を有し、さらにより好ましくはそれらと少なくとも約９９％の相同性を有する。
【００５２】
用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に対して結合する受容体を記述するために使用される。本発明の一実施形態では、ＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。別の実施形態において、ヒトＦｃＲを含むＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合し（ガンマ受容体）、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスを含み、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、その細胞質ドメインが主に異なる類似のアミノ酸配列を有するＦｃγＲＩＩＡ（「活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「抑制性（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）受容体」）を含む。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。抑制性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベース抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。（ダロン（Ｄａｒｏｎ），Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５，２０３−２３４（１９９７）の総論を参照；ＦｃＲは、ラヴェッチ（Ｒａｖｅｔｃｈ）とキネット（Ｋｉｎｅｔ），Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，９，４５７−９２（１９９１）；カペル（Ｃａｐｅｌ）ら，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ，４，２５−３４（１９９４）、およびデハース（ｄｅ  Ｈａａｓ）ら，Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ，１２６，３３０−４１（１９９５）、ニマージャーン（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ）とラヴェッチ（Ｒａｖｅｔｃｈ）２００６，Ｒａｖｅｔｃｈ  Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｄｅｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ウィリアムポール編集第５版、にまとめられており、これら各々は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００５３】
用語「天然（ｎａｔｉｖｅ）」または「親（ｐａｒｅｎｔ）」は、Ｆｃアミノ酸配列を含む非改変ポリペプチドを指す。親ポリペプチドは、天然配列Ｆｃ領域または既存のアミノ酸配列改変（例えば、付加、欠失および／または置換のような）がされたＦｃ領域を含んでもよい。
【００５４】
組成物
適切な担体および非シアル化ＩｇＧ  Ｆｃ変異体のような上記の薬剤の１つ以上を含有する組成物は、本発明の範囲内である。組成物は、薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物、または化粧品として許容される担体を含有する化粧品組成物であり得る。
【００５５】
用語「医薬組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、活性薬剤と不活性または活性な担体との組み合わせを指し、組成物をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの診断または治療用途に特に適したものにする。「薬学的に許容される担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｃａｒｒｉｅｒ）」は、被験体へまたは被験体上へ投与された後、望ましくない生理学的効果を生じさせない。医薬組成物中の担体は、活性成分と適合性であり、それを安定化することが可能であり得るという意味においても「許容され（ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」なければならない。１つ以上の可溶化剤が、活性化合物のデリバリーのための薬学的担体として利用され得る。薬学的に許容される担体の例としては、剤形として使用可能な組成物を得るための、生体適合性のビヒクル、アジュバント、添加剤、および希釈剤が挙げられるが、これらに限定されない。他の担体の例としては、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、およびラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。
【００５６】
上記の組成物は、上述の形態のいずれかにおいても、炎症により特徴付けられる疾患を治療するために使用され得る。有効量は、治療される被験体に治療効果を与えるのに必要とされる活性化合物／薬剤の量を指す。当業者によって認識されるように、有効用量は、治療される疾患の種類、投与の経路、賦形剤の使用、および他の治療処置との併用の可能性に依存して、異なるであろう。
【００５７】
本発明の医薬組成物は、非経口、経口、経鼻、経直腸、局所または口腔で投与され得る。本明細書で使用する用語「非経口（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内または頭蓋内注射、ならびに任意の適切な注入技術を指す。
【００５８】
無菌の注射可能な組成物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の溶液または懸濁液であり得る。このような溶液としては、これらに限定されないが、１，３−ブタンジオール、マンニトール、水、リンガー溶液、および等張性塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、固定油は、溶媒または懸濁媒体として従来用いられている（例えば、合成モノ−またはジ−グリセリド）。脂肪酸、これらに限定されないが、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などは、これらに限定されないが、オリーブ油もしくはヒマシ油のような天然の薬学的に許容される油、それらのポリオキシエチル化型として、注射剤の調製に有用である。これらの油溶液または懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤、もしくは、限定されないがカルボキシメチルセルロースのような分散剤、または類似の分散薬剤を含み得る。これらに限定されないが、ＴＷＥＥＮＳもしくはＳＰＡＮＳのようなその他の一般的に使用される界面活性剤、または薬学的に許容される固体、液体もしくは他の剤形の製造に一般的に使用される他の同様の乳化剤もしくはバイオアベイラビリティ増強剤もまた、製剤化の目的のために使用され得る。
【００５９】
経口投与のための組成物は、カプセル、錠剤、乳化物および水性懸濁液、分散液ならびに溶液を含む任意の経口的に許容される剤形であり得る。錠剤の場合、通常使用される担体としては、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられるが、これらに限定されない。限定されないが、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤もまた典型的に添加される。カプセル形態での経口投与の場合、有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられるが、これらに限定されない。水性懸濁液または乳化物が経口投与される場合、活性成分は、乳化剤または懸濁化剤と組み合わされて、油相に懸濁されるかまたは溶解され得る。所望であれば、ある種の甘味料、香味料、または着色剤が添加され得る。
【００６０】
記載された発明に係る局所投与のための医薬組成物は、溶液、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾルまたは油として製剤化され得る。代替的には、局所製剤は、活性成分（複数可）を含浸させたパッチまたは包帯の形態であり得、１つ以上の賦形剤または希釈剤を任意に含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、局所製剤は、皮膚または他の患部を通って活性薬剤（複数可）の吸収または浸透を高めるであろう物質を含む。局所用組成物は、これらに限定されないが、湿疹、にきび、酒さ、乾癬、接触性皮膚炎およびツタウルシに対する反応を含む、皮膚の炎症性疾患を治療するのに有用である。
【００６１】
局所用組成物は、皮膚への塗布に適した皮膚科学的に許容される担体の安全かつ有効量を含む。「化粧品として許容される（ｃｏｓｍｅｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」または「皮膚科学的に許容される（ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ−ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」組成物または成分は、過度の毒性、不適合性、不安定性、アレルギー反応などを伴わずにヒトの皮膚と接触して使用するのに好適である組成物または成分を意味する。担体は、活性薬剤および任意成分が、適切な濃度（複数可）で皮膚にデリバリーされることを可能する。担体はそれゆえ、選択された標的上に適切な濃度で活性物質が塗布され、均一に広げられていることを確保するための、希釈剤、分散剤、溶媒などとして作用することができる。担体は、固体、半固体、または液体であり得る。担体は、ローション、クリームまたはゲルの形態、特に、活性物質が沈降することを防止するのに十分な厚さまたは降伏点を有するものであり得る。担体は不活性であるか、または皮膚科学的利点を有することがある。また、本明細書に記載された活性成分と物理的および化学的に適合可能であるべきであり、安定性、有効性または組成物に関連する他の使用利点を、過度に損なうべきではない。局所用組成物は、溶液、エアロゾル、クリーム、ゲル、パッチ、軟膏、ローションまたは泡状を含む、局所または経皮塗布のために当技術分野で公知の形態の化粧品または皮膚用製品であってもよい。
【００６２】
治療方法
記載された発明は、被験体における炎症性疾患を治療するための方法を提供する。用語「炎症性疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」は、自己免疫疾患などの異常なまたは望ましくない炎症により特徴づけられる疾患を指す。自己免疫疾患は、非活性化条件下での免疫細胞の慢性的活性化によって特徴付けられる疾患である。例としては、乾癬、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、関節リウマチ、乾癬性関節炎、多発性硬化症、狼瘡、Ｉ型糖尿病、原発性胆汁性肝硬変、および移植が挙げられる。
【００６３】
本発明の方法によって治療することができる炎症性疾患の他の例としては、喘息、心筋梗塞、脳卒中、炎症性皮膚疾患（例えば、皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹、壊死性血管炎、皮膚血管炎、過敏性血管炎、好酸球性筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎および好酸球性筋膜炎）、急性呼吸窮迫症候群、劇症肝炎、過敏性肺疾患（例えば、過敏性肺炎、好酸球性肺炎、遅延型過敏症、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、特発性肺線維症、および関節リウマチに関連したＩＬＤ）、ならびにアレルギー性鼻炎が挙げられる。追加の例としてはまた、重症筋無力、若年発症糖尿病、糸球体腎炎、自己免疫性甲状腺炎、強直性脊椎炎、全身性硬化症、急性および慢性炎症性疾患（例えば、全身性アナフィラキシーまたは過敏性反応、薬物アレルギー、虫刺されアレルギー、同種移植片拒絶、および移植片対宿主病）、ならびにシェーグレン症候群が挙げられる。
【００６４】
一実施形態では、本発明は、Ｔ細胞媒介性疾患を治療するための方法を提供する。本明細書中で使用される場合、Ｔ細胞媒介性疾患とは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の異常な低レベルまたは異常に活性化されたＴエフェクター（Ｔｅｆｆｅｃｔｏｒ）細胞によって特徴付けられる任意の炎症性疾患をいう。この疾患の例には、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、重症筋無力症、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、および乾癬が含まれる（例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０１２，ｐ８３２参照）。
【００６５】
「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、ヒトおよび非ヒト動物を指す。非ヒト動物としては、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト哺乳動物、非ヒト霊長類（特に高等霊長類）、イヌ、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）、モルモット、ネコおよびウサギのような哺乳動物、ならびに鳥類、両生類、爬虫類などのような非哺乳類が挙げられる。一実施形態では、被験体はヒトである。別の実施形態においては、被験体は、実験的な、非ヒト動物または疾患モデルとして適した動物である。
【００６６】
炎症性疾患のために治療されるべき被験体は、疾患を診断するための標準的な技術によって同定され得る。任意に、被験体は、１つ以上のサイトカインまたは細胞のレベルまたはパーセンテージについて、被験体から得た試験試料が本分野で公知の方法によって調べられてもよい。レベルまたはパーセンテージが閾値（正常被験体から得られる）以下である場合、被験体は、本明細書に記載の治療のための候補である。阻害または治療を確認するために、治療後の被験体における１つ以上の上記サイトカインまたは細胞のレベルまたはパーセンテージを評価および／または確認することができる。
【００６７】
「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾患、疾患に続発する病状、または疾患にかかりやすい素因を治癒し、緩和し、軽減し、取り除き、その発症を遅延させ、予防し、または改善する目的での、疾患を有する被験体への化合物または薬剤の投与を意味する。
【００６８】
「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」または「治療上の有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」とは、治療される被験体において医学的に望ましい結果を生じることができる化合物または薬剤の量を指す。治療方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、単独でまたは他の薬剤もしくは治療法と組み合わせて行われ得る。治療上の有効量は、１回以上の投与、塗布または投薬で投与されることができ、特定の製剤または投与経路に限定されることを意図してはいない。
【００６９】
薬剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、単独で、または、他の薬剤または治療法と組み合わせた同時投与、すなわちカクテル療法で投与され得る。本明細書で使用される場合、用語「同時投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」または「同時投与された（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）」は、少なくとも２つの薬剤または治療法の被験体への投与を指す。いくつかの実施形態では、２つ以上の薬剤／治療法の同時投与は同時である。他の実施形態では、第二の薬剤／治療法の前に、第一の薬剤／治療法が投与される。当業者は、使用される様々な薬剤／治療法の、製剤および／または投与経路が異なってもよいことを理解する。
【００７０】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのアプローチにおいて、化合物または薬剤は、被験体に投与される。一般に、化合物または薬剤は、薬学的に許容される担体（例えば、制限されるものではないが、生理的食塩水など）中に懸濁され、経口でもしくは静脈内点滴によって投与され、または皮下、筋肉内、髄腔内、腹腔内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内もしくは肺内に注射されもしくは移植される。
【００７１】
必要な用量は、投与経路の選択；製剤の性質；患者の病気の性質；被験体の大きさ、体重、表面積、年齢、および性別；他の薬剤が投与されていること；ならびに担当医の判断に依存する。適切な投与量は０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。必要とされる用量の変動は、利用可能な化合物／薬剤および投与の様々な経路の異なる効率の種々の観点から予想される。例えば、経口投与は、静脈内注射による投与よりも、高い用量を必要とすると予想される。当技術分野でよく理解されているように、これらの用量レベルの変動は、最適化のための標準的経験的ルーチンを用いて調整され得る。適切なデリバリービヒクル中への化合物のカプセル化（例えば、ポリマー微粒子または埋め込み型装置）は、特に経口デリバリーのためには、デリバリーの効率を高めることができる。
【実施例】
【００７２】
実施例
実施例１：一般的な方法および材料
この実施例は、以下の実施例２〜８で使用される一般的な方法および材料を記載する。
【００７３】
マウス
６週齢から１０週齢までの性別および年齢の一致したＣ５７ＢＬ／６、ＳＩＧＮ−Ｒ１−／−、およびＳｉｇｍａ−Ｒ１−／−ｈＤＣ−ＳＩＧＮ＋マウスは、ロックフェラー大学によって承認された連邦法および実験規定に従って、すべての実験に使用された。ＳＩＧＮ−Ｒ１−／−ｈＤＣ−ＳＩＧＮ＋マウスを作製するためにＳＩＧＮ−Ｒ１−／−マウスをＣＤ１１ｃ−ｈＤＣ−ＳＩＧＮ＋マウスと交配した。ＫＲＮ  Ｔ細胞レセプタートランスジェニックマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドであり、Ｋ／ＢｘＮマウスを作製するためにＮＯＤマウスと交配した（Ｋｏｒｇａｎｏｗ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９９，１０（４）：４５１−４６１）。Ｋ／ＢｘＮ血清は、Ｋ／ＢｘＮマウスから血液サンプルを採取することにより調製した。血清を血液から分離し、プールして、さらなる使用のために一定分量凍結させた。血清移入関節炎を誘発するために、２００μｌのプールしたＫ／ＢｘＮ血清を腹腔内に注入した。関節炎の重篤度は、足の臨床検査によって採点した。すべての４つの足インデックスの追加は、疾患の重篤度を反映した。０は影響を受けず、１は１つの関節の腫れ、２つは複数の関節の腫れ、３は足全体の重度の腫れである。全ての実験において、４〜５匹のマウスの群を用いて、平均値および平均値の標準誤差（ＳＥＭ）をグラフにプロットした。
【００７４】
試薬および処置
ＩＶＩＧ（Ｏｃｔａｇａｍ、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）およびＦ２４１Ａ（Ｍｅｒｃｋ）を各図面の説明文に示す濃度で使用した。３７℃で２時間、ＩＶＩＧのパパイン消化により、ＩＶＩＧ−ＦｃおよびＩＶＩＧ−Ｆ（ａｂ’）２調製物を調製した。ＩＶＩＧおよびＦ２４１Ａの脱シアル化は、ノイラミニダーゼ処理によって行った。１００ｍｇの抗体調製物を７００ユニットのノイラミニダーゼ（ＮＥＢ）とともに３７℃で２０時間インキュベートした。抗体をプロテインＧアフィニティー精製により精製し、注入前にＰＢＳに対して透析した。全ての抗体調製物のシアル酸含量を、ＳＮＡ−ビオチン（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いたＳＮＡレクチンブロッティングにより確認した。全てのＩＶＩＧおよびＦ２４１Ａ調製物を静脈内（ｉ．ｖ．）に投与した。
【００７５】
好塩基球は、１０μｇの抗ＦｃεＲＩ（ＭＡＲ−１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはハムスターＩｇＧアイソタイプコントロール（Ｓｉｇｍａ）を毎日ｉ．ｐ．投与することにより枯渇された。
【００７６】
Ｔｒｅｇ細胞は、実験終了までＥＡＥ誘導の３日前および各ＩＶＩＧ／Ｆ２４１Ａ注入の１日後に４００μｇの抗ＣＤ２５（Ｓｅｔｉａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１０，４０（３）：７８０−７８６）（ＰＣ６１、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）をｉ．ｐ．投与することにより枯渇された。
【００７７】
ＩＬ−３３受容体ＳＴ２のブロッキングは、０日目およびＥＡＥ誘導後５日毎に１００μｇの抗Ｔ１／ＳＴ２（ＤＪ８、ＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をｉ．ｖ．投与することにより達成した。
【００７８】
サイトカイン処置のために、マウスは、２．５μｇのＩＬ−４ｉｃ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の単一ｉ．ｖ．投与、またはＥＡＥ実験において４日連続でまたは２日ごとに０．５μｇのＩＬ−３３のｉ．ｐ．投与を受けた。
【００７９】
ＩＬ−６血清レベルを（Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３、Ｃｈａｐｔｅｒ  ６：Ｕｎｉｔ  ６．２８）に記載のｉｎ  ｖｉｖｏサイトカイン捕捉アッセイによって測定した。細胞培養上清中のＩＬ−３３を製造業者（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が提案するように、ＥＬＩＳＡによってそれぞれ検出および測定した。
【００８０】
フローサイトメトリー
リンパ球および骨髄細胞を分析するために、脾臓、リンパ節および骨髄から単細胞懸濁液を調製した。赤血球溶解後、細胞をそれぞれの抗体で染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。マウス細胞染色に用いた抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの抗ＣＤ４（ＧＫ１．５）、抗Ｆｏｘｐ３（ＦＪＫ−１６ｓ）および抗ＩＦＮγ（ＸＭＧ１．２）、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄの抗ＣＤ２５（ＰＣ６１）、抗ＩＬ−１７Ａ（ＴＣ１１−１８Ｈ１０．１）、抗ＣＤ２０９（９Ｅ９Ａ８）、抗Ｈｅｌｉｏｓ（２２Ｆ６）、抗ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）、抗Ｆ４／８０（ＢＭ８）ならびに抗Ｔ１／ＳＴ２（ＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）であった。
【００８１】
骨髄由来マクロファージの分化およびトランスファー
骨髄細胞を大腿骨および脛骨から単離し、１０ｃｍプレート、３７℃で５〜７日間、２０％ウシ胎児血清、２％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％Ｌ−グルタミン２００ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１％β−メルカプトエタノールおよびＭ−ＣＳＦ（４０ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充したＤＭＥＭで培養した。フローサイトメトリーを用いて、細胞培養物（＞９０％  ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋細胞）中の骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭΦ）を分析した。細胞をプレートから回収し、洗浄し、新たな組織培養プレートに播種し、続いて３７℃で３時間、ＰＢＳ、ＩＶＩＧ（１５ｍｇ／ｍＬ）またはＦ２４１Ａ（８０μｇ／ｍＬ）でパルスした。次いで、細胞を十分に洗浄し、１×１０６個のマクロファージをレシピエントマウスに静脈内投与した。トランスファーの１時間後、マウスをＫ／ＢｘＮ血清でチャレンジした。
【００８２】
定量的リアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて骨髄由来マクロファージから単離し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で逆転写した。定量的ＰＣＲを行い、ＩＬ−３３用（５’−ＴＣＡＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＧＴＡＣＡＧＣＡ−３’（フォワード，配列番号：４）および５’−ＡＧＴＡＧＣＡＣＣＴＧＧＴＣＴＴＧＣＴＣ−３’（リバース，配列番号：５））ならびにＧａｄｐｈ用（５’−ＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣＴＧＣＣ−３’（フォワード，配列番号：６）および５’−ＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＧ−３’（リバース，配列番号：７））のプライマーセットとＣ１０００  Ｔｏｕｃｈ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）とを用いてＩＬ−３３のｍＲＮＡレベルを測定した。遺伝子発現レベルは、Ｇａｐｄｈ  ｍＲＮＡレベルに対する正規化によって計算した。
【００８３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒｅｇ細胞分化
単細胞懸濁液を、ナイーブＣ５７ＢＬ／６野生型マウスの脾臓およびリンパ節から調製した。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を磁気細胞分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によって単離し、３日間、抗Ｈａｍｓｔｅｒ  ＩｇＧ（ＭＰ  Ｂｉｏ）でコーティングした２４ウェル細胞培養プレート、１０％ウシ胎仔血清、２％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％Ｌ−グルタミン２００ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および０．１％β−メルカプトエタノール、抗ＣＤ３（１７Ａ２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および抗ＣＤ２８（３７．５１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）抗体を補充したＲＰＭＩで培養した。Ｔｒｅｇ細胞の分化のために、ＴＧＦ−β（２．５ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加した。図面の説明文に示すように、ＩＬ−３３（１ｎｇ／ｍＬ、ＢｉｏＬｅｎｇｅｎｄ）またはＩＬ−２３（２０ｎｇ／ｍＬ  Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を細胞培養物に添加した。３日目に、細胞を回収し、Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）をＦＡＣＳにより分析した。
【００８４】
Ｔ細胞トランスファー大腸炎
Ｔ細胞トランスファー大腸炎については、Ｃ５７ＢＬ／６野生型動物からの５×１０５個のナイーブＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉＣＤ２５−Ｔ細胞を選別し、Ｃ５７ＢＬ／６  Ｒａｇ１−／−レシピエントマウスに腹腔内投与した。体重減少を週に２回測定し、疾患重症度の手段として使用した。
【００８５】
実験的自己免疫性脳脊髄炎
６〜８週齢のマウスＣ５７ＢＬ／６、ＳＩＧＮ−Ｒ１−／−、またはＳＩＧＮ−Ｒ１−／−ｈＤＣ−ＳＩＧＮ＋マウスを完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で乳化した２００μｇのＭＯＧ３５−５５ペプチド（ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ、ＡｎａＳｐｅｃ、配列番号：８）からなる２００μｌのエマルションで皮下免疫した。０日目および２日目に、マウスに２００μｇの百日咳毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を腹腔内投与した。疾患の進行を以下の基準に従って毎日モニターした：０−臨床徴候なし；０．５−部分的な尻尾挙上不全（ｌｉｍｐ  ｔａｉｌ）；１−麻痺した尻尾；２−協調運動の喪失；後肢不全麻痺（ｈｉｎｄ  ｌｉｍｂ  ｐａｒｅｓｉｓ）；２．５−一方の後肢の麻痺；３−両方の後肢の麻痺；３．５−後肢の麻痺および丸まり（ｈｕｎｃｈｅｄ  ｂａｃｋ）；４−前肢における重度の丸まりおよび衰弱；４．５−前肢の麻痺；５−瀕死（Ｓｔｒｏｍｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ２００６、１（４）：１８１０−１８１９）。
【００８６】
実施例２  Ｆ２４１Ａは、シアル化ＩｇＧ−Ｆｃを模倣し、自己抗体誘導性炎症から保護する
非シアル化およびシアル化ＩｇＧ分子の結晶構造は、重鎖の配向において差異を示す。非シアル化ＩｇＧ（Ｇ０Ｆ型）は、オープン構造のままであり、Ｉ型Ｆｃ受容体と相互作用可能な構造を持つが、シアル化ＩｇＧ（Ｇ２ＦＳ２型）は、より柔軟であり、交互の構造（オープンおよびクローズ）を可能にし（Ａｈｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２０１４，４２６（１８）：３１６６−３１７９）、それがＩＩ型Ｆｃ受容体に結合することを可能にする（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２０１３，１１０（２４）：９８６８−９８７２）。図１ａに示すように、非シアルＦｃ構造のＦ２４１の芳香族側鎖は、互いに対して並んでいる（図１ａ、左パネル）。この配向において、フェニルアラニン側鎖は、Ｆｃグリカンのα１，３アームの糖残基と疎水性相互作用を形成する。驚くべきことに、シアルＦｃ構造のＦ２４１の芳香環は、非シアルＦｃ構造のＦ２４１の芳香環に対してほぼ９０°の回転を示す（図１ａ、右パネル）。これは、シアル化の際に、Ｆ２４１とＦｃグリカンのα１，３アームとの間の相互作用を破壊することができ、抗体構造および機能の実際の変化に潜在的に寄与することを示唆する。
【００８７】
したがって、タンパク質−グリカン相互作用のこの破壊を模倣するために、本発明者らは、残基Ｆ２４１にアラニン点突然変異を導入し（Ｆ２４１Ａ）、この突然変異がどのようにしてシアルおよび非シアルＦｃの活性を変化させるかを決定した。本発明者らは、グリコシルトランスフェラーゼＳＴ６ＧａｌＩおよびβ４ＧａｌＴＩを安定して過剰発現する２９３細胞に組換えタンパク質を発現させることによってα２，６−シアル化Ｆ２４１Ａ  Ｆｃを作製した。比較のために、続いてこのシアルＦ２４１Ａ  Ｆｃ調製物の一部分をノイラミニダーゼで処理してシアル酸を除去し、非シアルＦ２４１Ａ  Ｆｃを得た。本発明者らは、レクチンブロッティングによって両方のＦ２４１Ａ  Ｆｃ調製物のシアル化状態を確認した。本発明者らは次に、非シアルＷＴ  Ｆｃと比較して増加した受容体結合親和性によって示されるように、シアルＦ２４１Ａ  ＦｃがＥＬＩＳＡ形式でＤＣ−ＳＩＧＮ結合活性を保持することを立証した（図８）。しかし、Ｆ２４１Ａ  Ｆｃのノイラミニダーゼ処理は、Ｆ２４１Ａ変異がシアル酸とは無関係にＤＣ−ＳＩＧＮ結合活性を付与することを立証するＤＣ−ＳＩＧＮ結合を破壊しなかった。
【００８８】
Ｆ２４１Ａ突然変異が機能的ＤＣ−ＳＩＧＮ結合およびシグナル伝達をもたらすかどうかを決定するために、本発明者らは、ＤＣ−ＳＩＧＮ発現骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭΦ）においてＩＬ−３３発現を誘導するＦ２４１ＡおよびｓＦｃの能力を調べた。シアル化および非シアル化Ｆ２４１Ａ  Ｆｃの両方がＤＣ−ＳＩＧＮに依存する形でＢＭＭΦにおけるＩＬ−３３発現を誘導したが、ｓＦｃのみがこれらの細胞においてＩＬ−３３発現を誘導する（図１ｂ）。さらに、非シアルＦ２４１Ａ  ＦｃおよびｓＦｃで刺激したｈＤＣ−ＳＩＧＮ＋ＢＭＭΦは、ＤＣ−ＳＩＧＮに依存する形で関節炎Ｋ／ＢｘＮ血清をチャレンジしたマウスにトランスファーしたときに足蹠の腫れを抑制した（図１ｃ）。さらに、保護は、シアル化野生型Ｆｃでのみ達成されたが、Ｆｃ変異体Ｆ２４１Ａは、非シアル化の場合でもマウスを保護することができた（図１ｄ）。したがって、Ｆ２４１Ａ突然変異は、シアルＦｃ活性を測定するために開発されたアッセイにおいていくつかのＦｃ機能を再現する。
【００８９】
抗炎症分子としてのＦ２４１Ａの活性をさらに明らかにするために、本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスをＫ／ＢｘＮ血清でチャレンジし、ＰＢＳ、ＩＬ−４ｉｃまたは非シアル化Ｆ２４１Ａ（０．０３３ｇ／ｋｇ）のいずれかで処理した。血清ＩＬ−６レベルは、ＩＬ−４ｉｃまたはＦ２４１Ａを投与されたマウスにおいて有意に減少した（図２ａ）。この観察と一致して、ＩＬ−４ｉｃおよびＦ２４１Ａ処置マウスは、関節炎の臨床徴候の減少を示し（図２ｂ）、Ｆ２４１ＡがＩＶＩＧおよびｓＦｃに匹敵して炎症を抑制するのに十分であることを示した（Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００６，３１３）：６７０−６７３およびＡｎｔｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００８，３２０（５８７４）：３７３−３７６）。
【００９０】
Ｆ２４１Ａによるこの抑制がＩＩ型ＦｃＲ依存性であることを確認するために、本発明者らは、ＳＩＧＮ−Ｒ１−／−またはＳＩＧＮ−Ｒ１−／−ｈＤＣ−ＳＩＧＮ＋レシピエントを使用した。マウスは、シアル化野生型Ｆｃまたはノイラミニダーゼ処理非シアル化Ｆ２４１Ａ（いずれも０．０３３ｇ／ｋｇ）のいずれかを投与され、Ｋ／ＢｘＮ血清でチャレンジされた。関節炎の炎症の抑制は、両方の調製物によって達成された；しかし、ＢＡＣ導入遺伝子ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ（ｈＤＣ−ＳＩＧＮ＋）を発現したマウスのみが保護されており（図２ｃ）、ＩＩ型Ｆｃ受容体ＳＩＧＮ−Ｒ１またはそのヒトオルソログＤＣ−ＳＩＧＮの存在がそれぞれシアル化ＦｃおよびＦ２４１Ａによって誘導される免疫調節効果に必要とされることを示す。
【００９１】
シアル酸は、α２，３、α２，６またはα２，８立体配座のいずれかで、複合、二分岐（ｃｏｍｐｌｅｘ，ｂｉ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｆｃグリカンの最後から２番目のガラクトースに結合することができる。本発明者らは、シアル酸のα２，６−結合グリコフォームのみが生物学的に活性であることを以前に報告している（Ａｎｔｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００８，３２０（５８７４）：３７３−３７６）。異なるＦｃシアロ形態（ｓｉａｌｏｆｏｒｍ）の構造解析に関する以前のモデリングデータ（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１３、１１０（２４）：９８６８−９８７２）では、Ｃγ２−Ｃγ３界面におけるＧｌｕ３１８／Ｌｙｓ３４０ポケットがα２，６−シアルＦｃの生物活性に必要であり、このグリコフォームを特異的に収容でき、一方α２，６結合シアル酸は、立体的にこのポケットに適合するのを阻害するであろうことが予測された。この予測を試験するために、本発明者らは、ＩｇＧ１  ＦｃにＥ３１８Ｎ点突然変異を導入し、α２，６シアル化された際の性質と野生型α２，６シアルＦｃとを比較した。野生型と比較して同等の程度のシアル化が突然変異体で達成されたが、野生型シアル化ＦｃのみがｈＤＣ−ＳＩＧＮ＋ＢＭＭΦにおけるＩＬ−３３発現を刺激することができた（図９ａ）。α２，６−シアル野生型Ｆｃで刺激されたがα２，６シアルＥ３１８Ｎ  Ｆｃで刺激されなかったＢＭＭΦを投与したマウスは、疾患の臨床的徴候が減少し（図９ｂ）、ＩＬ−６のレベルがより低かった（図３ｃ）ことを示した。これらの結果をまとめると、α２，６シアルＦｃの抗炎症活性に寄与する残基としてＦ２４１およびＥ３１８の両方が示される。
【００９２】
実施例３  シアル化Ｆｃ／Ｆ２４１Ａは、Ｔｒｅｇ細胞を活性化する
患者および動物モデルにおける最近の研究は、ＩＶＩＧの投与がＴｒｅｇ細胞の拡大をもたらすことができ（Ｅｐｈｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２００８，１１１（２）：７１５−７２２、およびＢａｙｒｙ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，ｖｏｌ．３９：Ｃａｎａｄａ，２０１２，ｐｐ４５０−４５１）、Ｔｒｅｇ細胞の数および抑制能力を増加させることによってＴ細胞依存性自己免疫反応を効果的に弱めること（Ｋｅｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７，１７９（８）：５５７１−５５７５）を示唆している。本発明者らは、ＩＶＩＧ調製物のどの成分がこの効果の原因であるかを決定するために、ＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）、ＩＶＩＧのＦ（ａｂ’）２（０．６６ｇ／ｋｇ）またはＦｃ（０．３３ｇ／ｋｇ）の調製物を用いて、それらをＣ５７ＢＬ／６野生型マウスに等モル濃度で静脈内投与した。注入の４日後、本発明者らは、フローサイトメトリーによる脾臓ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の割合を分析した。ＰＢＳ処置マウスと比較して、無傷の（ｉｎｔａｃｔ）ＩＶＩＧまたはそのＦｃフラグメントの投与は、Ｔｒｅｇ細胞の２倍の拡大をもたらし、ＩＶＩＧ−Ｆ（ａｂ’）２を使用することによって阻害された（図３ａ）。
【００９３】
我々は次に、進行中の炎症反応において、Ｔｒｅｇ細胞の拡大におけるＦｃシアル化の役割を決定した。Ｋ／ＢｘＮチャレンジＣ５７ＢＬ／６マウスは、ＰＢＳ、ＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）、ノイラミニダーゼ処理非シアル化ＩＶＩＧ（ＮＡ−ＩＶＩＧ）（１ｇ／ｋｇ）またはＦ２４１Ａ（０．０３３ｇ／ｋｇ）のいずれかで処置され、疾患の進行およびＴｒｅｇ細胞の拡大について評価された。以前に観察されたように（Ｓｃｈｗａｂ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１４，４４（５）：１４４４−１４５３、およびＡｎｔｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１１，４７５（７３５４）：１１０−１１３）、関節炎の臨床スコアは、非シアル化ＩＶＩＧではなく、ＩＶＩＧおよびＦ２４１Ａが関節炎からマウスを保護したことを示した（図３ｂ）。Ｔｒｅｇ細胞の拡大は、ＩＶＩＧおよびＦ２４１Ａ処置マウスで観察されたが、非シアル−ＩＶＩＧ処置マウスでは観察されず（図３ｃ）、Ｔｒｅｇ細胞サブセットはシアル化ＦｃおよびＦ２４１Ａそれぞれにより選択的に拡大されることが示唆された。
【００９４】
実施例４  ＩＶＩＧ−／Ｆ２４１Ａ−活性化Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を抑制する
ＩＶＩＧ／Ｆ２４１Ａに応答するＴｒｅｇ細胞拡大がＣＤ４＋Ｔ細胞応答を抑制することができるかどうかを評価するために、本発明者らは、ＣＦＡで乳化されたＭＯＧ３５−５５ペプチドによる免疫によってＣ５７ＢＬ／６野生型マウスにＥＡＥを誘導した。誘導の５日後、マウスをＰＢＳ、ＩＶＩＧまたはＮＡ−ＩＶＩＧ（いずれも１ｇ／ｋｇ）のいずれかで処置して、シアル化ＩｇＧによって特異的に誘発される効果を識別した。ＥＡＥの臨床スコアは、ＩＶＩＧを投与されたマウスがＰＢＳ処置マウスと比較して臨床スコアが有意に低下したことを示した（図４ａ）。しかし、非シアル−ＩＶＩＧ（ＮＡ−ＩＶＩＧ）を投与した場合、保護効果は消失した。この効果の潜在的な基本メカニズムを決定するために、本発明者らは、処置した動物の流入領域リンパ節からの細胞を特徴付け、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の割合を分析した。ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞のすべての亜集団、ＴＨ１（ＩＦＮ−γ＋）、ＴＨ１７（ＩＬ−１７Ａ＋）、およびＩＦＮ−γ＋ＩＬ−１７Ａ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、同様の割合で存在した（図４ｂ）；しかし、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の割合は、ＰＢＳまたはＮＡ−ＩＶＩＧ処置群と比較してＩＶＩＧを与えられたマウスにおいて有意に上昇した（図４ｃ）。
【００９５】
疾患からの保護がＴｒｅｇ細胞の活性化および拡大を介して特異的に媒介されているかどうかを評価するために、本発明者らは、未処置およびＴｒｅｇ細胞枯渇マウスにおけるＩＶＩＧの代わりとしてＦ２４１Ａの保護能力を試験した。Ｔｒｅｇ細胞枯渇は、抗ＣＤ２５抗体（ＰＣ６１）の投与によって得られた。Ｆ２４１Ａ（０．０３３ｇ／ｋｇ）単独で処置したマウスは、ＰＢＳ処置マウスと比べると、保護され（図４ｄ）、Ｆ２４１ＡはＴ細胞応答から保護することにおいてＩＶＩＧと同様に強力であることが示された。しかし、Ｔｒｅｇ細胞枯渇マウスでは、この保護効果が有意に減少した。ＦＡＣＳ分析は、Ｆ２４１ＡおよびＰＣ６１処置のいずれもＣＤ４＋エフェクターＴ細胞に有意に影響しなかったが（図４ｅ）、Ｔｒｅｇ細胞レベルはＰＣ６１処置によって減少したことを示した（図４ｆ）。したがって、Ｔｒｅｇ細胞の枯渇は、Ｆ２４１Ａ処置動物で観察されたＥＡＥからの保護の喪失と相関した。天然（ｎＴｒｅｇ）および誘導性（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）細胞を区別するために、本発明者らは、ＩＶＩＧおよびＰＢＳ処置ＥＡＥマウスにおけるＴｒｅｇ細胞のｎＴｒｅｇ特異的転写因子Ｈｅｌｉｏｓの発現を分析した（Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１０，１８４（７）：３４３３−３４４１）。Ｔｒｅｇ細胞の拡大は、Ｈｅｌｉｏｓ発現の増加と相関せず（図１０ｃ）、このことは、ＥＡＥからマウスを明らかに保護したＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）（図１０ａおよびｂ）が特異的にＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｈｅｌｉｏｓ−誘導性Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）細胞を誘導することを示す。これらの結果をまとめると、シアル化ＩＶＩＧおよびＦ２４１Ａが、Ｔｒｅｇ細胞の活性化および増殖をもたらし、ＥＡＥにおけるＣＤ４＋エフェクターＴ細胞応答および臨床疾患の抑制をもたらすことを示している。
【００９６】
実施例５  ＩＩ型Ｆｃ受容体は、ＥＡＥからのｓＦｃ媒介保護のために必要とされる
炎症のｓＦｃ誘発抑制のためのＩＩ型Ｆｃ受容体ＳＩＧＮ−Ｒ１およびｈＤＣ−ＳＩＧＮの必要性は、自己抗体誘導性疾患という観点およびＩＬ−３３産生の刺激のために広範に研究されている（Ａｎｔｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１１，４７５（７３５４）：１１０−１１３）。したがって、本発明者らは、ｓＦｃ媒介Ｔｒｅｇ細胞刺激のためのＩＩ型Ｆｃ受容体、ＳＩＧＮ−Ｒ１の必要性を研究した。ＥＡＥは、Ｃ５７ＢＬ／６野生型またはＳＩＧＮ−Ｒ１−／−マウスで誘導され、次いでＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）またはコントロールとしてＰＢＳで処置された。野生型マウスは、ＩＶＩＧによってＥＡＥから再び保護されたが、この保護効果は、ＳＩＧＮ−Ｒ１ノックアウトマウスにおいて有意に減少した（図５ａ）。これは、ＳＩＧＮ−Ｒ１−／−バックグラウンドＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）がＫ／ＢｘＮ誘発性関節炎から保護せず（図１１ａ）またはＴｒｅｇ細胞活性化を誘導しない（図１１ｂ）という観察と一致する。一方、ＩＬ−３３レベルが外因性ＩＬ−３３の投与によって再構成された場合、ＳＩＧＮ−Ｒ１−／−マウスは、Ｔｒｅｇ細胞数の増加に関連する（データは示さず）、ＥＡＥから部分的に保護された（図５ｂ）。同様に、ｈＤＣ−ＳＩＧＮの導入遺伝子発現は、ＳＩＧＮ−Ｒ１の消失を補完し（Ａｎｔｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１１，４７５（７３５４）：１１０−１１３）、ＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）およびＦ２４１Ａ（０．０３３ｇ／ｋｇ）処置マウスの両方において、ＥＡＥ臨床スコアの低下をもたらす（図５ｃおよびｄ）。
【００９７】
実施例６  ＩＬ−３３は、ｓＦｃ誘発Ｔｒｅｇ細胞活性化の重要なメディエーターである
シアル化ＦｃによるエフェクターマクロファージでのＦｃγＲＩＩＢの上方制御は、アラーミンＩＬ−３３の産生および分泌に決定的に依存する（Ａｎｔｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１１，４７５（７３５４）：１１０−１１３）。さらに、最近の知見は、ＩＬ−３３自体がＴｒｅｇ細胞刺激および活性化に正の効果を有し（Ｔｕｒｎｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１１，１８７（９）：４５９８−４６１０、およびＭａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１４，１９３（８）：４０１０−４０２０）、それによって実験的大腸炎のマウスモデルにおける炎症の抑制に寄与する（Ｓｃｈｉｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１４，５１３（７５１９）：５６４−５６８）ことを示した。ＩＬ−３３のｓＦｃ誘発産生がまたＴｒｅｇ細胞刺激に寄与するであろう可能性を試験するために、本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスから単離され、Ｔｒｅｇ細胞分化を特異的に促進するために抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８抗体およびＴＧＦ−βの存在下３日間培養したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を観察した。細胞は、未処理のまま放置された、またはＩＬ−３３およびＩＬ−２３と組み合わせて処理された。培養物におけるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の割合のフローサイトメトリー分析は、ＩＬ−３３の添加が以前にＳｃｈｉｅｒｉｎｇおよび共同研究者によって報告されたように（Ｓｃｈｉｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１４，５１３（７５１９）：５６４−５６８）、Ｔｒｅｇ細胞分化およびＦｏｘｐ３発現（図１２）に対して相乗効果を有することを示した。さらに、ＩＬ−３３は、Ｔｒｅｇ細胞でのＩＬ−３３受容体ＳＴ２の上方制御を誘導した。Ｔｒｅｇ細胞培養物へのＩＬ−２３の添加は、ＩＬ−２３がＳＴ２の負の調節因子であることに一致して、ＩＬ−３３の効果を弱めた（図１２）（Ｓｃｈｉｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１４，５１３（７５１９）：５６４−５６８、およびＩｚｃｕｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００８，２８（４）：５５９−５７０）。
【００９８】
次に、本発明者らは、ＩＬ−３３の投与がｉｎ  ｖｉｖｏでＴｒｅｇ細胞にも影響するかどうかを決定した。ＩＬ−３３（０．５μｇ）をＣ５７ＢＬ／６野生型マウスに４日間連続して毎日与えた。５日目に、脾臓をＴｒｅｇ細胞数について分析した。ＩＬ−３３投与は、ＰＢＳ処置コントロールマウスと比較してＴｒｅｇ細胞の有意な増加をもたらした（図６ａおよびｂ）。ｈＤＣ−ＳＩＧＮ＋ＢＭＭΦをＰＢＳ、ＩＶＩＧまたは非シアル化Ｆ２４１Ａでパルスし、ＩＬ−３３発現を定量的ｒｔＰＣＲによって測定したところ、ＩＶＩＧおよびＦ２４１Ａは、明らかにＤＣ−ＳＩＧＮ依存的にＩＬ−３３発現を誘導した（図６ｃ）。処置後、ＢＭＭΦを続いてＣ５７ＢＬ／６野生型マウスにトランスファーした。細胞トランスファーの５日後、ＩＶＩＧ−またはＦ２４１Ａ−パルスｈＤＣ−ＳＩＧＮ＋ＢＭＭΦを与えられたマウスのみが、Ｔｒｅｇ細胞のレベルが有意により高かった（図６ｄおよびｅ）。この表現型は、これらの細胞でのＩＬ−３３受容体ＳＴ２の発現の増進と相関した（図６ｄ）。さらに、ＥＡＥのＩＬ−３３処理は、流入領域リンパ節におけるＴｒｅｇ細胞の増加と相関するＥＡＥ症状の有意な改善をもたらした（図６ｆおよびｇ）。
【００９９】
エフェクターマクロファージでのＦｃγＲＩＩＢ上方調節は、好塩基球の存在を必要とすることが示されているので（Ａｎｔｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１１，４７５（７３５４）：１１０−１１３）、本発明者らは、好塩基球がｓＦｃ媒介性Ｔｒｅｇ細胞活性化経路においても役割をはたすかどうかについて研究した。マウスは、ＰＢＳまたはＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）で処理され、Ｋ／ＢｘＮ血清でチャレンジされた。マウスはまた、好塩基球の枯渇のために抗ＦｃεＲＩ抗体で、またはアイソタイプコントロールで処置された（Ｓｏｋｏｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００８，９（３）：３１０−３１８）。本発明者らが以前示したように（Ａｎｔｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１１，４７５（７３５４）：１１０−１１３）、好塩基球枯渇（図１３ａ）は、Ｋ／ＢｘＮ関節炎モデルにおけるＩＶＩＧの保護効果を破壊したが（図１３ｂ）、Ｔｒｅｇ細胞を拡大させるＩＶＩＧの能力は、影響を受けなかった（図１３ｃ）。これは、ＩＬ−３３がＴｒｅｇ細胞の活性化に必要であることを示している；しかし、好塩基球はこの経路に寄与しない。
【０１００】
実施例７  ｓＦｃ／Ｆ２４１Ａは、誘導性Ｔｒｅｇ細胞をＩＬ−３３／ＳＴ２軸を介して活性化する
ｓＦｃおよびＩＩ型ＦｃＲの関与に応答するＴｒｅｇ細胞の拡大および活性化のメカニズムをさらに探究するために、本発明者らは、ＩＬ−３３受容体ＳＴ２の役割に焦点を当てた。最近報告されているように、ＰＢＳまたはＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）単独またはＳＴ２遮断抗体と組み合わせて処置したＫ／ＢｘＮチャレンジマウスは、ＩＬ−３３受容体の遮断が血清トランスファー関節炎モデルにおけるＩＶＩＧの保護効果を減少させることを示した（Ａｎｔｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１１，４７５（７３５４）：１１０−１１３）（図７ａ）。これらのマウスにおけるＴｒｅｇ細胞数のＦＡＣＳ分析は、ＩＬ−３３シグナル伝達の阻害がまたＴｒｅｇ細胞の拡大を阻止することを明らかにした（図７ｂ）。同様の結果がＥＡＥモデルで観察され、Ｆ２４１Ａ（０．０３３ｇ／ｋｇ）の治療効果は、Ｔｒｅｇ細胞の拡大に付随する減少（図７ｄ）とともにＩＬ−３３受容体をブロックすること（図７ｃ）によって有意に減少した。
【０１０１】
最後に、Ｔ細胞媒介性疾患に対するｓＦｃの影響に関する観察の一般性を決定するために、本発明者らは、実験的大腸炎マウスモデルを使用し、本発明者らは、実験の終了時まで、ＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）またはＰＢＳコントロールを用いて、Ｔ細胞トランスファーの４週間後に開始して、これらのマウスを毎週処置した。体重減少は、疾患の重症度の一つの指標として使用され、これはＩＶＩＧ処置媒介性保護（図１４ａ、ｃおよびｄ）を示し、またＴｒｅｇ細胞の有意な濃縮を伴い（図１４ｂ）、一方ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞レベルは、ＰＢＳ−およびＩＶＩＧ−処置群で同等であった。ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞のみが急性大腸炎を誘発するために養子導入されたという事実に基づいて、これらのマウスにおけるＩＶＩＧ拡大Ｔｒｅｇ細胞は末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞に由来し、したがってｉＴｒｅｇ細胞である。
【０１０２】
上述の実施例および好ましい実施形態の説明は、特許請求の範囲によって規定される本発明を限定するものではなく、例示として見なされるべきである。本明細書に引用される全ての刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。容易に理解されるように、特許請求の範囲に記載された本発明から逸脱することなく、上述した特徴の多くの変形および組み合わせを利用することができる。そのような変形は、本発明の範囲からの逸脱と見なされず、そのような変形の全ては、以下の特許請求の範囲内に含まれるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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