(57)【要約】  本明細書には、乳酸菌由来の細胞外小胞を有効成分として含む脱毛防止又は育毛促進用組成物、及び前記乳酸菌由来の細胞外小胞の製造方法が開示される。前記組成物は、頭皮から毛髪が抜ける現象、又は毛髪が疎になる又は細くなる現象を予防し防止する効果がある。また、前記組成物は、新しい毛髪を生成する発毛機能、又は前記発毛を促進させる機能だけでなく、毛髪周期の成長期から退行期への遅延を促進し且つ既存の毛髪が健康に育つようにする機能を具現する効果がある。
2018529720.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）を有効成分として含む、脱毛防止又は育毛促進用組成物。
【請求項２】
前記乳酸菌は、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ラクトバチルス（Ｌａｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、リュウコノストク（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｓｐｐ．）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、及びラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）属菌株からなる群から選択される一つ以上を含む、請求項１に記載の脱毛防止又は育毛促進用組成物。
【請求項３】
前記乳酸菌は、ラクトバチルス（Ｌａｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ.）属菌株を含む、請求項２に記載の脱毛防止又は育毛促進用組成物。
【請求項４】
前記ラクトバチルス属菌株は、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ.  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌ.  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、及びラクトバチルス・サケイ（Ｌ.  ｓａｋｅｉ）からなる群から選択される一つ以上を含む、請求項３に記載の脱毛防止又は育毛促進用組成物。
【請求項５】
前記細胞外小胞は、乳酸菌培養液から分離したものである、請求項１に記載の脱毛防止又は育毛促進用組成物。
【請求項６】
前記細胞外小胞は、エクソソーム様小胞（ｅｘｏｓｏｍｅ−ｌｉｋｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）である、請求項１に記載の脱毛防止又は育毛促進用組成物。
【請求項７】
前記細胞外小胞は、２０〜５００ｎｍの直径を有するものである、請求項１に記載の脱毛防止又は育毛促進用組成物。
【請求項８】
前記細胞外小胞は、乳酸菌培養液の１００，０００×ｇ以上の超遠心分離で沈降するものである、請求項１に記載の脱毛防止又は育毛促進用組成物。
【請求項９】
前記有効成分は、毛乳頭細胞（ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ  ｃｅｌｌｓ、ＤＰＣｓ）を活性化して毛髪成長を誘導するものである、請求項１に記載の脱毛防止又は育毛促進用組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の乳酸菌由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）を製造する方法であって、
（１）乳酸菌培養液を遠心分離して上澄液を収得する段階；
（２）前記収得された上澄液を濾過する段階；及び
（３）前記収得された濾過物を超遠心分離して沈殿物を収得する段階；を含む、乳酸菌由来の細胞外小胞の製造方法。
【請求項１１】
前記段階（１）における遠心分離は、１，０００〜２０，０００×ｇで実施する、請求項１０に記載の乳酸菌由来の細胞外小胞の製造方法。
【請求項１２】
前記段階（３）における超遠心分離は、１００，０００×ｇ以上で実施する、請求項１０に記載の乳酸菌由来の細胞外小胞の製造方法。
【請求項１３】
前記段階（３）の後、（４）前記収得された沈殿物を懸濁する段階をさらに含む、請求項１０に記載の乳酸菌由来の細胞外小胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書には、乳酸菌由来の細胞外小胞を有効成分として含む脱毛防止又は育毛促進用組成物、及び乳酸菌由来の細胞外小胞の製造方法が開示される。
【背景技術】
【０００２】
多くの動物細胞は、多様な大きさや成分を有する細胞内起源の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）を分泌できる能力を持っており、このような細胞外小胞は、血液、小便、唾液及び細胞培養液を含むすべての生物学的流体（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄｓ）から発見される（非特許文献１及び２）。
【０００３】
細胞外小胞は、小さくは直径約２０ｎｍから大きくは直径約５μｍの大きさを有する膜構造小胞体であって、その大きさと構成において異質性があり、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ、約３０〜１００ｎｍ）、エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅ）、微小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ、約１００〜１、０００ｎｍ）、微粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）などの多数の相違する種を含む。
【０００４】
前記細胞外小胞の相違する類型は、その起源、直径、蔗糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）での密度、形状、沈降速度、脂質組成物、タンパク質マーカーまたは分泌方式（すなわち、シグナル（誘導性）によるものか自発的（構成的）なものか）などに基づいて区別される。例えば、微小胞は、約１００〜１，０００ｎｍの不規則な形状を有する膜小胞であって、円形質膜の外側に向けて出芽（円形質膜から起源）し、インテグリン、セレクチン、ＣＤ４０リガンドなどを含むマーカー（ｍａｒｋｅｒ）、ホスファチジルセリンを含むリン脂質を有すると知られている。一方、エクソソームは、約３０〜１００ｎｍ（＜２００ｎｍ）のカップ形状を有する最も小さい膜小胞であって、後期エンドソームの内側から出芽（エンドソーム起源）し、一般に、ＣＤ６３、ＣＤ９のテトラスパニン、ＴＳＧ１０１、ＥＳＣＲＴを含むマーカー、コレステロール、スフィンゴミエリン、セラマイド、ホスファチジルセリンを含む脂質を有すると知られている。
【０００５】
このような細胞外小胞は、分泌する起源細胞（ドナー細胞）の状態を反映し、どの細胞から分泌したかによって多様な生物学的活性を示し、細胞間で遺伝物質とタンパク質を移しながら細胞間相互作用（ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）に重要な役割をする。
【０００６】
原核細胞又は真核細胞もまた、細胞外小胞を分泌すると知られている（非特許文献３〜６）。一方、人体に有益な代表的な微生物である乳酸菌は、ブドウ糖又は乳糖のような糖を分解して乳酸や酢酸のような有機酸を生成する菌であって、糖から有機酸を作る発酵過程を経て発酵乳、チーズ、バターのような発酵食品を製造するのに使用されているが、これより由来した細胞外小胞自体の特定の用途についての研究はまだ十分でない実情である。菌株由来の細胞外小胞に関する先行技術は、特許文献１に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】韓国公開特許第１０−２０１１−００２５６０３号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Loyer X, Vion AC, Tedgui A, Boulanger CM. Microvesicles as cell-cell messengers in cardiovascular diseases. Circ Res 2014; 114: 345-53
【非特許文献２】Ohno S, Ishikawa A, Kuroda M. Roles of exosomes and microvesicles in disease pathogenesis. Adv Drug Deliv Rev 2013; 65: 398-401
【非特許文献３】Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., & Biancone, L. (2010). Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International, 78(9), 838-848
【非特許文献４】Bang, Claudia, and Thomas Thum. "Exosomes: New players in cell-cell communication." The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 44.11 (2012): 2060-2064
【非特許文献５】Kim, D. K., Lee, J., Simpson, R. J., Lotvall, J., & Gho, Y. S. (2015, April), EVpedia: A community web resource for prokaryotic and eukaryotic extracellular vesicles research. Seminars in Cell & Developmental Biology (Vol. 40, pp. 4-7). Academic Press
【非特許文献６】Kim, J. H., Lee, J., Park, J., & Gho, Y. S. (2015, April). Gram-negative and Gram-positive bacterial extracellular vesicles. Seminars in Cell & Developmental Biology (Vol. 40, pp. 97-104). Academic Press
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
一側面において、本明細書は、乳酸菌由来の複合生理活性物質である細胞外小胞を有効成分として含む、脱毛防止又は育毛促進用組成物を提供することを目的とする。
【００１０】
他の側面において、本明細書は、前記乳酸菌由来の細胞外小胞を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書に開示された技術は、乳酸菌由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）を有効成分として含む、脱毛防止又は育毛促進用組成物を提供する。
【００１２】
一側面において、前記乳酸菌は、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ラクトバチルス（Ｌａｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、リュウコノストク（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｓｐｐ．）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、及びラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）属菌株からなる群から選択される一つ以上を含んでいてよい。
【００１３】
他の側面において、前記乳酸菌は、ラクトバチルス（Ｌａｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）属菌株を含んでいてよい。
【００１４】
他の側面において、前記ラクトバチルス属菌株は、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ.  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌ.  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、及びラクトバチルス・サケイ（Ｌ.  ｓａｋｅｉ）からなる群から選択される一つ以上を含んでいてよい。
【００１５】
他の側面において、前記細胞外小胞は、乳酸菌培養液から分離したものであってよい。
【００１６】
他の側面において、前記細胞外小胞は、エクソソーム様小胞（ｅｘｏｓｏｍｅ−ｌｉｋｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）であってよい。
【００１７】
他の側面において、前記細胞外小胞は、２０〜５００ｎｍの直径を有するものであってよい。
【００１８】
他の側面において、前記細胞外小胞は、乳酸菌培養液の１００，０００×ｇ以上の超遠心分離で沈降するものであってよい。
【００１９】
他の側面において、前記有効成分は、毛乳頭細胞（ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ  ｃｅｌｌｓ、ＤＰＣｓ）を活性化して毛髪成長を誘導するものであってよい。
【００２０】
また、本明細書に開示された技術は、前記乳酸菌由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）を製造する方法であって、（１）乳酸菌培養液を遠心分離して上澄液を収得する段階；（２）前記収得された上澄液を濾過する段階；及び（３）前記収得された濾過物を超遠心分離して沈殿物を収得する段階；を含む、乳酸菌由来の細胞外小胞の製造方法を提供する。
【００２１】
一側面において、前記段階（１）における遠心分離は、１，０００〜２０，０００×ｇで実施していてよい。
【００２２】
他の側面において、前記段階（３）における超遠心分離は、１００，０００×ｇ以上で実施していてよい。
【００２３】
他の側面において、前記段階（３）の後、（４）前記収得された沈殿物を懸濁する段階をさらに含んでいてよい。
【発明の効果】
【００２４】
一側面において、本明細書に開示された技術は、乳酸菌由来の複合生理活性物質である細胞外小胞を有効成分として含む、脱毛防止又は育毛促進用組成物を提供する効果がある。
【００２５】
前記脱毛防止又は育毛促進用組成物は、頭皮から毛髪が抜ける現象、又は毛髪が疎になる又は細くなる現象を予防し防止する効果がある。
【００２６】
前記脱毛防止又は育毛促進用組成物は、新しい毛髪を生成する発毛機能、又は前記発毛を促進させる機能だけでなく、毛髪周期の成長期から退行期への遅延を促進し且つ既存の毛髪が健康に育つようにする機能を具現する効果がある。
【００２７】
他の側面において、本明細書に開示された技術は、前記乳酸菌由来の細胞外小胞を製造する方法を提供する効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本明細書の一実施例に係る乳酸菌から細胞外小胞を分離する過程を段階別に示した図である。
【図２】本明細書の一実施例に係る分離された乳酸菌由来の細胞外小胞の大きさを測定した結果を示した図である。
【図３】本明細書の一試験例に係る乳酸菌由来の細胞外小胞を毛嚢毛乳頭細胞に低濃度の範囲（０．１〜２０μｇ／ｍｌ）で処理したときの毛嚢細胞増殖結果を示した図である。
【図４ａ】本明細書の一試験例に係る乳酸菌由来の細胞外小胞を毛嚢毛乳頭細胞に高濃度の範囲（１０〜１００μｇ／ｍｌ）で処理したときの毛嚢細胞増殖結果を示した図である。
【図４ｂ】本明細書の一試験例に係る乳酸菌由来の細胞外小胞を毛嚢毛乳頭細胞に高濃度の範囲（１０〜１００μｇ／ｍｌ）で処理したときの毛嚢細胞増殖結果を示した図である。
【図５】本明細書の一試験例に係る乳酸菌由来の細胞外小胞を毛嚢器官培養（ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｏｒｇａｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）に処理したときの毛髪成長長さ増加（ｈａｉｒ  ｓｈａｆｔ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）を示した写真である。
【図６】本明細書の一試験例に係る乳酸菌由来の細胞外小胞を毛嚢器官培養（ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｏｒｇａｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）に処理したときの毛髪成長長さ増加（ｈａｉｒ  ｓｈａｆｔ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００３０】
本明細書は、乳酸菌由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）を有効成分として含む、脱毛防止又は育毛促進用組成物を提供する。
【００３１】
例示的な一具現例において、前記細胞外小胞は、エクソソーム様小胞（ｅｘｏｓｏｍｅ−ｌｉｋｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）であってよい。
【００３２】
毛髪の周期は、成長期、退行期、休止期と知られている３つの主な周期に分けられる。成長期には、細胞の早い増殖とともに皮膚中へと深く毛嚢が成長しながら毛髪形成がなされる。次の現象は退行期であって、この退行期は細胞分裂の中断が目立つ過渡期であり、この過程で毛嚢は徐々に退行していって育毛が中断される。次の現象である休止期において退行毛嚢は稠密に満たされた毛乳頭（ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ）細胞を有する胚（ｇｅｒｍ）を含む。休止期から新たな成長期現象への開始は、前記胚から早い細胞の増殖、毛乳頭の膨張及び基底膜要素の合成によって誘導される。一般に、「育毛」は成長期でなされ、休止期から成長期への誘導及び成長期から退行期への遅延によって促進される。
【００３３】
本明細書において「脱毛」とは、頭皮から毛髪が抜ける現象、又は毛髪が疎になる又は細くなる現象を意味し、「脱毛防止」とは、上述したような脱毛現象を予防し抑制することを意味し、「育毛促進」とは、新しい毛髪を生成する発毛機能、又は発毛を促進させる機能だけでなく、成長期から退行期への遅延を促進し且つ既存の毛髪が健康に育つようにする機能を意味する。
【００３４】
本明細書において「細胞外小胞」は、細胞から分泌して細胞外空間へ放出されたベジクル（ｖｅｓｉｃｌｅｓ）を意味し、膜構造小胞体であって内部と外部とに区分され、細菌の細胞膜脂質（ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｌｉｐｉｄ）と細胞膜タンパク質（ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、及び細胞質成分などを有しており、本来細菌より大きさが小さいものを意味するが、これに制限されるものではない。細胞外小胞は、他の細胞に結合して膜構成要素、ｍＲＮＡｓ、ｍｉＲＮＡｓなどを伝達し、これらの伝達物質を受容細胞に伝達することで細胞−細胞間の疎通を媒介する細胞外伝達体として作用する。
【００３５】
本明細書において「エクソソーム様小胞」は、ナノ大きさの細胞外小胞を意味するものであって、ナノ大きさのエクソソームを含むだけでなく、ナノ大きさの小胞構造及びその組成物がエクソソームと類似の小胞をいずれも含む最広義の概念である。
【００３６】
本明細書において乳酸菌は、分離菌株又は市販中の多様な乳酸菌を制限なく使用可能である。
【００３７】
例示的な一具現例において、前記乳酸菌は、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ラクトバチルス（Ｌａｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、リュウコノストク（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｓｐｐ．）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、及びラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）属菌株からなる群から選択される一つ以上を含んでいてよい。
【００３８】
具体的に、前記乳酸菌は、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Ｂ.  ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ.  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンチス（Ｂ.  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌ.  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ.  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌ.  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌ.  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・サケイ（Ｌ.  ｓａｋｅｉ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌ.  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓ.  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・フェシウム（Ｓ.  ｆａｅｃｉｕｍ）、ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓ.  ｆａｅｃａｌｉｓ）、リュウコノストク・メセンテロイデス（Ｌ.  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ペディオコッカス・セレビジエ（Ｐ.  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、及びラクトコッカス・ラクティス（Ｌ.  ｌａｃｔｉｓ）からなる群から選択される一つ以上を含んでいてよい。
【００３９】
例示的な一具現例において、前記細胞外小胞は、乳酸菌培養液から分離したものであってよい。分離された細胞外小胞は、全体的に又は部分的に本来存在する組織または細胞から物理的に分離したものであってよい。
【００４０】
一側面において、前記細胞外小胞は、２０〜５００ｎｍの直径を有するものであってよい。他の側面において、前記細胞外小胞は、２０ｎｍ以上、３０ｎｍ以上、４０ｎｍ以上、５０ｎｍ以上、６０ｎｍ以上、７０ｎｍ以上、８０ｎｍ以上、９０ｎｍ以上、または１００ｎｍ以上であり、且つ５００ｎｍ以下、４５０ｎｍ以下、４００ｎｍ以下、３５０ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、２５０ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、または１００ｎｍ以下の直径を有するものであってよい。
【００４１】
他の側面において、前記細胞外小胞は、乳酸菌培養液の１００，０００×ｇ以上、具体的に、１００，０００〜２００，０００×ｇ、または１００，０００〜１５０，０００×ｇ、または１５０，０００〜２００，０００×ｇの超遠心分離で沈降するものであってよい。
【００４２】
他の側面において、前記細胞外小胞は、例えば、標的細胞で所望の機能を効率的に行い得るように膜成分が化学的又は物理的に変形されたものであってよい。例えば、細胞外小胞の膜成分がチオール基（−ＳＨ）又はアミン基（−ＮＨ２）を用いて化学的な方法で変形されたものであるか、又は細胞外小胞に標的誘導物質、細胞膜融合物質、ポリエチレングリコールを化学的に結合させて膜成分が化学的に変形されたものであってよい。
【００４３】
例示的な一具現例において、前記細胞外小胞は、遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）、超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）、分画遠心分離（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）、平衡密度勾配遠心分離（Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）、密度勾配（ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）、濾過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）、及び自由流動電気泳動（ｆｒｅｅ−ｆｌｏｗ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）からなる群から選択される一つ以上の方法を用いて分離していてよいが、細胞外小胞の分離方法がこれらに制限されるものではない。
【００４４】
密度勾配は、密度が異なる物質を区分するときに最も多く用いられる方法であって、この方法の具体的な例としては、フィコール（ｆｉｃｏｌｌ）、グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、塩化セシウム（ｃｅｓｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、イオジキサノール（ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）などの密度勾配分離材料を用いて実施することができるが、これらに制限されるものではない。一側面において、密度勾配は、超遠心分離などとともに用いられていてよい。他の側面において、細胞外小胞を選別するためにゲル濾過（ｇｅｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）又は限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いていてよい。また他の側面において、大きさが小さい分子を除去するために、濾過に代えて透析を用いていてもよい。また他の側面において、自由流動電気泳動を用いていてよい。
【００４５】
例示的な一具現例において、前記細胞外小胞の製造方法は、（１）乳酸菌培養液を遠心分離して上澄液を収得する段階；（２）前記収得された上澄液を濾過する段階；及び（３）前記収得された濾過物を超遠心分離して沈殿物を収得する段階；を含み、有効な活性を示す乳酸菌由来の細胞外小胞を製造することができる。
【００４６】
例示的な一具現例において、前記段階（１）における遠心分離は、１，０００〜２０，０００×ｇ、または１，５００〜２０，０００×ｇ、または１，５００〜１５，０００×ｇ、または１，５００〜１０，０００×ｇで３０〜６０分間実施していてよい。このとき、前記遠心分離は、速度又は時間を変化させて段階的に実施していてもよい。例えば、１，５００〜２，０００×ｇの低速で遠心分離して培養液から乳酸菌の菌株を分離及び除去し細胞と上澄培養液を分離した後、１０，０００〜２０，０００×ｇの高速で遠心分離してさらに細胞又は細胞関連残骸及び残余物などを除去していてよい。
【００４７】
例示的な一具現例において、前記段階（２）における濾過は、０．３〜０．５μｍ大きさのフィルターで濾過していてよい。前記濾過工程によって遠心分離された培養液の純度を高めることができる。
【００４８】
例示的な一具現例において、前記段階（３）における超遠心分離は、１００，０００×ｇ以上、具体的に、１００，０００〜２００，０００×ｇ、または１００，０００〜１５０，０００×ｇ、または１５０，０００〜２００，０００×ｇで１〜５時間実施していてよい。
【００４９】
例示的な一具現例において、前記段階（３）の後、（４）前記収得された沈殿物を懸濁する段階をさらに含んでいてよい。
【００５０】
他の側面において、本明細書は、脱毛防止又は育毛促進に有効な量の乳酸菌由来の細胞外小胞を、これを必要とする対象に投与することを含む脱毛防止方法又は育毛促進方法を提供する。
【００５１】
他の側面において、本明細書は、対象の脱毛防止又は育毛促進のための乳酸菌由来の細胞外小胞を提供する。
【００５２】
他の側面において、本明細書は、対象の脱毛防止又は育毛促進のための乳酸菌由来の細胞外小胞含有組成物を製造するための用途を提供する。
【００５３】
例示的な一具現例において、前記乳酸菌由来の細胞外小胞は、薬学組成物、化粧料組成物又は食品組成物の形態で対象に適用又は投与するものであってよい。
【００５４】
例示的な一具現例において、前記乳酸菌由来の細胞外小胞は、対象の皮膚又は頭皮に適用又は投与するものであってよい。
【００５５】
例示的な一具現例において、前記組成物は、凍結乾燥された剤形であってよい。前記組成物は、すぐに使えるように（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）密封された包装材又は包装容器に入れられた凍結乾燥された剤形であってよい。
【００５６】
また、本明細書は、乳酸菌由来の細胞外小胞を有効成分として含み、凍結乾燥された剤形を有する組成物；及び滅菌水又は精製水を含む脱毛防止用キット又は育毛促進用キットを提供する。前記キットは、すぐに使えるように（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）密封された包装材又は包装容器に入れられたキットであってよい。
【００５７】
例示的な一具現例によれば、前記組成物は、薬学組成物であってよい。
【００５８】
前記薬学組成物は、乳酸菌由来の細胞外小胞の他、防腐剤、安定化剤、水和剤、又は浸透圧調節のための塩及び／又は緩衝剤などの薬剤学的補助剤、及びその他治療的に有用な物質をさらに含有していてよく、通常の方法によって多様な経口投与剤又は非経口投与剤の形態で剤形化していてよい。
【００５９】
前記経口投与剤は、例えば、錠剤、丸剤、硬・軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、粉剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、ペレット剤などが挙げられ、これらの剤形は、有効成分以外に、界面活性剤、希釈剤（例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及びグリシン）、滑沢剤（例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸及びそのマグネシウム又はカルシウム塩、並びにポリエチレングリコール）を含有していてよい。錠剤は、マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカンス、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びポリビニルピロリドンといった結合剤をさらに含有していてよく、場合に応じて、澱粉、寒天、アルギン酸又はそのナトリウム塩といった崩壊剤、吸収剤、着色剤、香味剤、及び甘味剤などの薬剤学的添加剤を含有していてよい。前記錠剤は、通常の混合、顆粒化又はコーティング方法によって製造されていてよい。
【００６０】
また、前記非経口投与剤の形態としては、経皮投与型の剤形が挙げられ、例えば、注射剤、点滴剤、軟膏、ローション、ゲル、クリーム、スプレー、懸濁剤、乳剤、坐剤、パッチなどの剤形であってもよいが、これらに制限されるものではない。
【００６１】
前記有効性分の投与量の決定は当業者の水準内にあり、薬物の１日投与用量は、投与しようとする対象の症状進行程度、発病時期、年齢、健康状態、合併症などの様々な要因により変わるが、成人を基準としたとき、一般には、前記組成物１μｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、他の一側面において、５０μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇを１日１〜３回分けて投与していてよく、前記投与量は、如何なる方法であっても本明細書の範囲を限定するものではない。
【００６２】
前記薬学組成物は皮膚外用剤であってよく、前記皮膚外用剤とは、皮膚外部において塗布されるものであればいずれも含まれ得る製剤の総称であり、多様な剤形の医薬品がこれに含まれ得る。
【００６３】
例示的な一具現例によれば、前記組成物は化粧料組成物であってよい。
【００６４】
前記化粧料組成物には、乳酸菌由来の細胞外小胞の他、機能性添加物及び一般の化粧料組成物に含まれる成分がさらに含まれていてよい。前記機能性添加物としては、水溶性ビタミン、油溶性ビタミン、高分子ペプチド、高分子多糖、スフィンゴ脂質、及び海藻エキスからなる群から選択された成分を含んでいてよい。それ以外に含まれる配合成分としては、油脂成分、保湿剤、エモリエント剤、界面活性剤、有機及び無機顔料、有機粉体、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、植物抽出物、ｐＨ調整剤、アルコール、色素、香料、血行促進剤、冷感剤、制汗剤、精製水などが挙げられる。
【００６５】
前記化粧料組成物は、剤形が特に限定されず、目的とするところに応じて適宜選択していてよい。例えば、スキンローション、スキンソフナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、ファウンデーション、エッセンス、栄養エッセンス、パック、せっけん、クレンジングフォーム、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディーローション、及びボディークレンザーからなる群から選択されたいずれか一つ以上の剤形に製造されていてよいが、これらに制限されるものではない。
【００６６】
剤形がペースト、クリーム、又はゲルである場合は、担体成分として、動物繊維、植物繊維、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、又は酸化亜鉛などが用いられていてよい。
【００６７】
本発明の剤形がパウダー又はスプレーである場合は、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、又はポリアミドパウダーが用いられていてよく、特にスプレーである場合は、さらに、クロロフルオロハイドロカーボン、プロパン／ブタン、又はジメチルエーテルのような推進剤を含んでいてよい。
【００６８】
本発明の剤形が溶液又は乳濁液である場合は、担体成分として、溶媒、溶媒和剤、又は乳濁化剤が用いられていてよく、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、又はソルビタンの脂肪酸エステルがある。
【００６９】
本発明の剤形が懸濁液である場合は、担体成分として、水、エタノール又はプロピレングリコールのような液状希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天、又はトラガカントなどが用いられていてよい。
【００７０】
本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合は、担体成分として、脂肪族アルコールスルフェート、脂肪族アルコールエーテルスルフェート、スルホサクシネートモノエステル、イセチオン酸、イミダゾリウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルスルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体、又はエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが用いられていてよい。
【００７１】
例示的な一具現例によれば、前記組成物は食品組成物であってよい。
【００７２】
前記食品組成物は、液状又は固状の剤形であってよく、例えば、各種食品類、飲料、ガム、お茶、ビタミン複合剤、健康補助食品類などがあり、粉末、顆粒、錠剤、カプセル又は飲料の形態で用いられていてよい。各剤形の食品組成物は、有効成分の他に当該分野において通常的に用いられる成分を剤形又は使用目的に応じて当業者が難なく適宜選定して配合してよく、他の原料と同時に適用した場合、相乗効果が生じることがある。
【００７３】
本明細書に開示された有効成分の他に含有していてよい液体成分には、特に制限などなく、普通の飲料と同様に様々な香味剤又は天然炭水化物などを追加成分として含んでいてよい。前記天然炭水化物の例としては、葡萄糖、果糖などの単糖類；マルトース、スクロースなどの二糖類；デキストリン、シクロデキストリンなどの多糖類、及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールが挙げられる。前述した香味剤としては、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えばレバウジオシドＡ、グリシルリジンなど）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテーム）を有利に用いていてよい。前記天然炭水化物の割合は、本明細書に開示された組成物１００ｍｌ当たり、通常約１〜２０ｇ、一側面において、約５〜１２ｇであってよい。
【００７４】
前記食品組成物は、一側面において、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤、及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含んでいてよい。他の側面において、天然果物ジュースや野菜飲料の製造のための果肉を含んでいてよい。これらの成分は、独立で、或いは組み合わせて用いていてよい。これらの添加剤の割合は多様であってよいが、本明細書に開示された組成物１００重量部当たり０．００１〜約２０重量部の範囲で選択されるのが一般的である。
【００７５】
以下、実施例によって本発明をより詳しく説明することにする。なお、これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであるに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【００７６】
実施例１．乳酸菌由来の細胞外小胞の分離
本実施例では、乳酸菌としてラクトバチルス属菌株を用い、これからエクソソーム様小胞を含む細胞外小胞を分離した。ラクトバチルス属菌株としては、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ.  ｒｅｕｔｅｒｉ、ＫＣＴＣ  ３５９４）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌ.  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、ＫＣＴＣ  ５０３３）、ラクトバチルス・サケイ（Ｌ.  ｓａｋｅｉ、ＫＣＴＣ  ３６０３）を韓国生命工学研究院の微生物資源センターから購入して用いた。
【００７７】
（段階１）培養されたラクトバチルス属菌株の培養液を４℃、１，８００×ｇで２０分間遠心分離して、培養液からラクトバチルス属菌株を分離及び除去した。すなわち、低速の遠心分離工程によって細胞と上澄培養液を分離した。
【００７８】
（段階２）前記段階１において遠心分離された培養液を、高速遠心分離機を利用して４℃、１０，０００×ｇで２０分間遠心分離して、さらに細胞又は細胞関連残骸及び残余物などを除去した。
【００７９】
（段階３）前記段階２において遠心分離された培養液を０．４５μｍのボトルトップフィルターによって濾過することで培養液の純度を増加させた。
【００８０】
（段階４）前記段階３において濾過した培養液を４℃、１５０，０００×ｇで３時間超高速遠心分離して、エクソソーム様小胞を分離した。
【００８１】
（段階５）前記段階４において超高速遠心分離して上澄液を除去して残ったエクソソーム様小胞のペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を緩衝溶液（ＨＥＰＥＳバッファー）に再懸濁させた。
【００８２】
（段階６）前記段階５において緩衝溶液に再懸濁させたエクソソーム様小胞を−７０℃で保存し、下記試験に用いた。
【００８３】
試験例１．乳酸菌由来の細胞外小胞の大きさ測定
前記実施例１で収得したラクトバチルス属菌株から分離したエクソソーム様小胞を、Ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ方法によってその大きさを分析し、図２に示した。
【００８４】
その結果、ラクトバチルス属菌株から分離したエクソソーム様小胞は、平均直径が２０〜３００ｎｍで且つ略球形を成していることを確認した。
【００８５】
試験例２．毛嚢細胞増殖効果
前記実施例１で分離したラクトバチルス属菌株から排出されたエクソソーム様小胞を、毛嚢毛乳頭細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ  ｃｅｌｌ、ｈＤＰＣ）に多様な濃度で処理して、乳酸菌由来の細胞外小胞の毛嚢細胞増殖効果を確認した。
【００８６】
具体的に、毛嚢毛乳頭細胞（ｈＤＰＣｓ（ｐａｓｓａｇｅ  ６、７））を９６ウェルプレートで２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ２４時間培養（５％のＣＯ２、３７℃）した後、ラクトバチルス属菌株由来のエクソソーム様小胞を濃度別（０．１〜１００μｇ／ｍｌ）に処理した。次いで、４８時間培養してから培養培地を交換した後、ＭＴＴ  ａｓｓａｙ（１００μｇ／ｗｅｌｌ、５７０ｎｍでの吸光度測定）によって増殖効果を評価した。
【００８７】
図３は、エクソソーム様小胞を低濃度の範囲（０．１〜２０μｇ／ｍｌ）で処理したときの毛嚢細胞増殖結果を示し、図４は、エクソソーム様小胞を高濃度の範囲（１０〜１００μｇ／ｍｌ）で処理したときの毛嚢細胞増殖結果を示す。図３及び図４中の縦軸は毛嚢細胞増殖結果（陰性対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ、ＣＴＬ）に対する％）を示し、５％のＦＢＳ陽性対照群を用いて比較した。その結果、毛嚢毛乳頭細胞にラクトバチルス属菌株由来のエクソソーム様小胞を処理したときに毛嚢細胞増殖効果を示すことが分かった。
【００８８】
試験例３．毛髪成長長さ増加効果
前記実施例１で分離したラクトバチルス属菌株から排出されたエクソソーム様小胞を、毛嚢器官培養（ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｏｒｇａｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）に多様な濃度で処理して、乳酸菌由来の細胞外小胞の毛髪成長長さ増加（ｈａｉｒ  ｓｈａｆｔ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）効果を確認した。
【００８９】
具体的に、毛嚢（４５歳及び６３歳の男性）を分離し、試験群当たり１２個ずつ２回繰り返し実験を行い、ラクトバチルス属菌株由来のエクソソーム様小胞を濃度別（１０〜２０μｇ／ｍｌ）に処理して培養した。培養培地は、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、インシュリン（１０μｌ／ｍｌ）、抗生剤（１％）、ファンギゾン（０．１％）、（−）ヒドロコルチゾン（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むＷｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ  ｍｅｄｉａを用い、３日置きに培地を交換しながら毛髪長さを測定し、陽性対照群としては、脱毛防止及び育毛促進に効能のあるＭＮＸ（ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）を用いた。
【００９０】
乳酸菌由来の細胞外小胞を毛嚢器官培養（ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｏｒｇａｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）に処理したときの毛髪成長長さ増加効果を図５及び図６に示した。その結果、図５及び図６に示されるように、ラクトバチルス属由来のエクソソーム様小胞処理によって毛髪長さが成長することが分かった。
【００９１】
以下、本明細書の一側面に係る組成物の剤形例を説明するが、他の種々の剤形への応用も可能であり、これは本発明を限定するためではない単に具体的に説明するためのものに過ぎない。
【００９２】
［剤形例１］軟質カプセル剤
実施例１の乳酸菌由来のエクソソーム様小胞５０ｍｇ、Ｌ−カルニチン８０〜１４０ｍｇ、大豆油１８０ｍｇ、パーム油２ｍｇ、植物性硬化油８ｍｇ、黄蝋４ｍｇ、及びレシチン６ｍｇを混合し、通常の方法に従って、１カプセル当たり４００ｍｇずつ充填して軟質カプセル剤を製造した。
【００９３】
［剤形例２］錠剤
実施例１の乳酸菌由来のエクソソーム様小胞５０ｍｇ、ガラクトオリゴ糖２００ｍｇ、乳糖６０ｍｇ、及び麦芽糖１４０ｍｇを混合し、流動層乾燥機を利用して顆粒化した後、糖エステル（ｓｕｇａｒ  ｅｓｔｅｒ）６ｍｇを添加して、打錠機で打錠して錠剤を製造した。
【００９４】
［剤形例３］顆粒剤
実施例１の乳酸菌由来のエクソソーム様小胞５０ｍｇ、無水結晶ブドウ糖２５０ｍｇ、及び澱粉５５０ｍｇを混合し、流動層造粒機を使用して顆粒に成形した後、砲に充填して顆粒剤を製造した。
【００９５】
［剤形例４］ドリンク剤
実施例１の乳酸菌由来のエクソソーム様小胞５０ｍｇ、ブドウ糖１０ｇ、クエン酸０．６ｇ、及び液状オリゴ糖２５ｇを混合した後、精製水３００ｍｌを加えて各瓶に２００ｍｌずつ充填した。瓶に充填した後、１３０℃で４〜５秒間殺菌して、ドリンク剤飲料を製造した。
【００９６】
［剤形例５］軟膏
下記の表１に記載された組成にて通常の方法により軟膏を製造した。
【００９７】
【表１】
2018529720.tif 000003
【００９８】
［剤形例６］美容液型製剤
下記の表２に記載された組成にて通常の方法により美容液型製剤を製造した。
【００９９】
【表２】
2018529720.tif 000004
【０１００】
［剤形例７］シャンプー
下記の表３に記載された組成にて通常の方法によりシャンプーを製造した。
【０１０１】
【表３】
2018529720.tif 000005
【０１０２】
［剤形例８］リンス
下記表４に記載された組成にて通常の方法によりリンスを製造した。
【０１０３】
【表４】
2018529720.tif 000006
【０１０４】
以上、本発明内容の特定の部分を詳しく記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好適な実施態様であるに過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるものではないことは明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付の請求項とそれらのなど価物によって定義されるといえよう。
【図１】
2018529720.tif 000007
【図２】
2018529720.tif 000008
【図３】
2018529720.tif 000009
【図４ａ】
2018529720.tif 000010
【図４ｂ】
2018529720.tif 000011
【図５】
2018529720.tif 000012
【図６】
2018529720.tif 000013
【国際調査報告】
2018529720.tif 000014
2018529720.tif 000015
2018529720.tif 000016
2018529720.tif 000017
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