(57)【要約】  本発明はホスト細胞におけるタンパク質、例えば、アミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素の産生を誘発する組成物、および産生されたタンパク質、例えば酵素の収量を増加するための方法に関する。当該組成物はカラメル化糖生成物を含む。本明細書で説明される方法を使用して、バイオマス材の処理を、例えば糖生成物を産生するために増強することもできる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオマス分解酵素の産生を誘発するための方法であって、バイオマス分解酵素を産生する微生物を、バイオマス分解酵素の産生に適した条件下で、カラメル化糖生成物を含む組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項２】
前記微生物が細胞培養中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
糖を前記細胞培養に加えてから前記微生物をカラメル化糖生成物を含む前記組成物と接触させる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞培養が糖をほとんど含まないときに前記微生物をカラメル化糖生成物を含む前記組成物と接触させる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記カラメル化糖生成物がグルコース、キシロース、マルトース、ラクトース、またはこれらの組み合わせをカラメル化することによって産生される、請求項１または４に記載の方法。
【請求項６】
前記カラメル化糖生成物がキシロースおよびグルコースを含む糖化バイオマスをカラメル化することによって産生される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記カラメル化糖生成物がオリゴ糖類、オリゴ糖類の脱水和生成物、オリゴ糖類の水和生成物、オリゴ糖類の不均化生成物、着色芳香族生成物、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項１、５、または６に記載の方法。
【請求項８】
前記オリゴ糖類が二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記カラメル化糖生成物がグルコースをカラメル化することによって産生され、ここで前記オリゴ糖類が、グルコースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記カラメル化糖生成物がマルトースをカラメル化することによって産生され、ここで前記オリゴ糖類が、マルトースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記カラメル化糖生成物がラクトースをカラメル化することによって産生され、ここで前記オリゴ糖類が、ラクトースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記カラメル化糖生成物がキシロースをカラメル化することによって産生され、ここで前記オリゴ糖類が、キシロースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記オリゴ糖類が１種以上のオリゴ糖類を含むとき、三糖類が最も多量な種である、請求項７〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記バイオマス分解酵素がアミラーゼ、例えば、α、β、もしくはγアミラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビアーゼ、セロビオヒドロラーゼ、キシラナーゼ、リグニナーゼ、またはヘミセルラーゼ、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物がさらに誘発物質バイオマスを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記誘発物質バイオマスがデンプン材またはセルロース成分を含むデンプン材を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記誘発物質バイオマス、例えばデンプン材またはセルロース成分を含むデンプン材が、農産物もしくは農業廃棄物、紙製品もしくは紙廃棄物、農林物資、または一般廃棄物、またはこれらのいずれかの組み合わせの１つまたは複数を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
農産物または農業廃棄物が、サトウキビジュート、大麻、亜麻、竹、サイザル麻、アルファルファ、干し草、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、アンデスカタバミ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤマノイモ、マメ、ソラマメ、ヒラマメ、エンドウマメ、グラス、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀物残渣、キャノーラ藁、コムギ藁、オオムギ藁、オートムギ藁、コメ藁、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ繊維、ヤシ毛、ビートパルプ、バガス、ダイズ茎葉、穀類残渣、コメ籾殻、オートムギ籾殻、コムギ籾殻、オオムギ籾殻、または外皮、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
紙製品または紙廃棄物が、紙、着色紙、塗被紙、コーティング紙、充填された紙、雑誌、印刷物、プリンタ紙、ポリコート紙、カードストック、厚紙、板紙、または紙パルプ、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
農林物資が、アスペン木材、パーティクルボード、木材チップ、またはおがくず、またはこれらの組み合わせを含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
一般廃棄物が、肥料、汚水、または臓物、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記誘発物質バイオマスが誘発物質バイオマスの抵抗性を低下するために前処理され、ここで前記誘発物質バイオマスの前記前処理が、電子ビームへの暴露、電子による衝撃、超音波処理、酸化、熱分解、水蒸気爆発、化学処理、機械的処理、または凍結粉砕を含む、請求項１５〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物がさらにセロビオース、β−セロビオノ−１，５−ラクトン、ラクトース、Ｄ−キシロース、キシロビオース、ガラクトース、およびソホロースを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記微生物が真菌細胞である、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
バイオマス分解酵素を産生する前記微生物が、バチルス、コプリナス、マセリオフトーラ、セファロスポリウム、シタリジウム、ペニシリウム、アスペルギルス、シュードモナス、フミコーラ、フザリウム、チエラビア、アクレモニウム、クリソスポリウム、またはトリコデルマから選択される属における種由来である、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
バイオマス分解酵素を産生する前記微生物が、アスペルギルス、フミコーラ・インソレンス（シタリジウム・サーモフィラム）、コプリナス・シネレウス、フザリウム・オキシスポラム、マセリオフトーラ・サーモフィラ、メリピルス・ギガンテス、チエラビア・テレストリス、アクレモニウム・ペリシナム、アクレモニウム・アクレモニウム、アクレモニウム・ブラシペニウム、アクレモニウム・ジクロモスポラム、アクレモニウム・オブクラバタム、アクレモニウム・ピンケルトニエ、アクレモニウム・ロセオグリセウ、アクレモニウム・インコロラタム、アクレモニウム・フラタム、クリソスポリウム・ラクノウェンス、トリコデルマ・ビリデ、トリコデルマ・リーゼイ、またはトリコデルマ・コニンギから選択される、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記微生物がＴ．リーゼイまたはこの変異体、例えばＲＵＴ−ＮＧ１４、ＰＣ３−７、ＱＭ９４１４、およびＲＵＴ−Ｃ３０である、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
産生されるバイオマス分解酵素の量が、カラメル化糖生成物を接触しない微生物によって産生されるバイオマス分解酵素の量と比べて、少なくとも１倍、例えば少なくとも１．２倍、１．５倍、１．８倍、２倍、またはこれ以上増加される、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
産生されるバイオマス分解酵素の量が、前記微生物を誘発物質バイオマスと接触させることによって産生されるバイオマス分解酵素の量と比べて、少なくとも１倍、例えば少なくとも１．２倍、１．５倍、１．８倍、２倍増加される、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記バイオマス分解酵素が表１に列記された酵素の１種類以上またはすべてを含む、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記バイオマス分解酵素を前記細胞培養の成分、例えば前記微生物または残存誘発物質バイオマスから、例えばクロマトグラフィーまたはろ過によって分離することをさらに含む、請求項２〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記バイオマス分解酵素が前記細胞培養から精製される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ａ）前記微生物が増殖するような条件下で前記微生物を第一容器中で糖と接触させ、
ｂ）前記微生物を第二容器に移し、ここで第二容器は、例えば容積が第一容器よりも大きいものであることを含むステップをさらに含み、
ここで当該ステップは前記微生物を前記組成物と接触させる前に実施される、請求項１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記ステップが１回またはそれ以上、例えば２、３、４、５回繰り返される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
バイオマスから生成物（例えば、水素、糖、アルコール）を産生するための方法であって、
ａ）請求項１に従う方法を用いてバイオマス分解酵素の産生を誘発し、
ｂ）バイオマスを用意し、
ｃ）バイオマスをステップ（ａ）の前記微生物またはステップ（ａ）の前記微生物から分離もしくは精製されている前記バイオマス分解酵素と、生成物の産生に適した条件下で接触させることを含む、方法。
【請求項３６】
前記生成物が糖生成物である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記生成物がグルコースおよび／またはキシロースである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記生成物を分離することをさらに含む、請求項３５〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記生成物の前記分離が、沈殿、結晶化、クロマトグラフィー、遠心分離、および／または抽出を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記バイオマス分解酵素が、エンドグルカナーゼ、セロビアーゼ、セロビオヒドロラーゼ、キシラナーゼ、リグニナーゼ、またはヘミセルラーゼ、またはこれらの組み合わせである、請求項３５〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記バイオマス分解酵素が表１に列記された酵素の１種類以上またはすべてを含む、請求項３５〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
ステップ（ｃ）の前に前記バイオマスを処理して前記バイオマスの抵抗性を低下させるステップをさらに含む、請求項３５〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記処理が電子ビームへの暴露、電子による衝撃、超音波処理、酸化、熱分解、水蒸気爆発、化学処理、機械的処理、または凍結粉砕を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記バイオマスがデンプン材またはセルロース成分を含むデンプン材を含む、請求項３５〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記バイオマスが農産物もしくは農業廃棄物、紙製品もしくは紙廃棄物、農林物資、または一般廃棄物、またはこれらいずれかの組み合わせの１つまたは複数を含み、ここで、
ａ）農産物もしくは農業廃棄物が、サトウキビジュート、大麻、亜麻、竹、サイザル麻、アルファルファ、干し草、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、アンデスカタバミ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤマノイモ、マメ、ソラマメ、ヒラマメ、エンドウマメ、グラス、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀物残渣、キャノーラ藁、コムギ藁、オオムギ藁、オートムギ藁、コメ藁、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ繊維、ヤシ毛、ビートパルプ、バガス、ダイズ茎葉、穀類残渣、コメ籾殻、オートムギ籾殻、コムギ籾殻、オオムギ籾殻、または外皮、またはこれらの組み合わせを含み、
ｂ）紙製品もしくは紙廃棄物が、紙、着色紙、塗被紙、コーティング紙、充填された紙、雑誌、印刷物、プリンタ紙、ポリコート紙、カードストック、厚紙、板紙、または紙パルプ、またはこれらの組み合わせを含み、
ｃ）農林物資が、アスペン木材、パーティクルボード、木材チップ、またはおがくず、またはこれらの組み合わせを含み、
ｄ）一般廃棄物が、肥料、汚水、または臓物、またはこれらの組み合わせを含む、
請求項３５〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記カラメル化糖生成物がグルコース、キシロース、マルトース、ラクトース、またはこれらの組み合わせをカラメル化することによって産生される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４７】
前記カラメル化糖生成物がキシロースおよびグルコースを含む糖化バイオマスをカラメル化することによって産生される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記カラメル化糖生成物がオリゴ糖類、オリゴ糖類の脱水和生成物、オリゴ糖類の水和生成物、オリゴ糖類の不均化生成物、着色芳香族生成物、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項３５または４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記オリゴ糖類が二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記カラメル化糖生成物がグルコースをカラメル化することによって産生され、ここで前記オリゴ糖類が、グルコースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む、請求項３５〜４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記カラメル化糖生成物がマルトースをカラメル化することによって産生され、ここで前記オリゴ糖類が、マルトースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む、請求項３５〜４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記カラメル化糖生成物がラクトースをカラメル化することによって産生され、ここで前記オリゴ糖類が、ラクトースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む、請求項３５〜４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記カラメル化糖生成物がキシロースをカラメル化することによって産生され、ここで前記オリゴ糖類が、キシロースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む、請求項３５〜４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記オリゴ糖類が１種以上のオリゴ糖類を含むとき、三糖類が最も多量な種である、請求項４８〜５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
前記組成物がさらに誘発物質バイオマスを含む、請求項４７〜５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
前記誘発物質バイオマスがデンプン材またはセルロース成分を含むデンプン材を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記誘発物質バイオマスが農産物もしくは農業廃棄物、紙製品もしくは紙廃棄物、農林物資、または一般廃棄物、またはこれらのいずれかの組み合わせの１つまたは複数を含み、ここで、
ａ）農産物もしくは農業廃棄物が、サトウキビジュート、大麻、亜麻、竹、サイザル麻、アルファルファ、干し草、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、アンデスカタバミ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤマノイモ、マメ、ソラマメ、ヒラマメ、エンドウマメ、グラス、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀物残渣、キャノーラ藁、コムギ藁、オオムギ藁、オートムギ藁、コメ藁、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ繊維、ヤシ毛、ビートパルプ、バガス、ダイズ茎葉、穀類残渣、コメ籾殻、オートムギ籾殻、コムギ籾殻、オオムギ籾殻、または外皮、またはこれらの組み合わせを含み、
ｂ）紙製品もしくは紙廃棄物が、紙、着色紙、塗被紙、コーティング紙、充填された紙、雑誌、印刷物、プリンタ紙、ポリコート紙、カードストック、厚紙、板紙、または紙パルプ、またはこれらの組み合わせを含み、
ｃ）農林物資が、アスペン木材、パーティクルボード、木材チップ、またはおがくず、またはこれらの組み合わせを含み、
ｄ）一般廃棄物が、肥料、汚水、または臓物、またはこれらの組み合わせを含む、
請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記誘発物質バイオマスが誘発物質バイオマスの抵抗性を低下するために前処理され、ここで前記バイオマスの前記前処理は、電子ビームへの暴露、電子による衝撃、超音波処理、酸化、熱分解、水蒸気爆発、化学処理、機械的処理、または凍結粉砕を含む、請求項５５〜５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記誘発物質バイオマスがステップ（ｂ）で示されるバイオマスと同じである、請求項３５〜５８のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
前記組成物がセロビオース、β−セロビオノ−１，５−ラクトン、ラクトース、Ｄ−キシロース、キシロビオース、ガラクトース、およびソホロースをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項６１】
前記微生物が真菌細胞である、請求項３５〜６０のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
バイオマス分解酵素を産生する前記微生物が、バチルス、コプリナス、マセリオフトーラ、セファロスポリウム、シタリジウム、ペニシリウム、アスペルギルス、シュードモナス、フミコーラ、フザリウム、チエラビア、アクレモニウム、クリソスポリウム、またはトリコデルマから選択される属における種由来である、請求項３５〜６０のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
バイオマス分解酵素を産生する前記微生物が、アスペルギルス、フミコーラ・インソレンス（シタリジウム・サーモフィラム）、コプリナス・シネレウス、フザリウム・オキシスポラム、マセリオフトーラ・サーモフィラ、メリピルス・ギガンテス、チエラビア・テレストリス、アクレモニウム・ペリシナム、アクレモニウム・アクレモニウム、アクレモニウム・ブラシペニウム、アクレモニウム・ジクロモスポラム、アクレモニウム・オブクラバタム、アクレモニウム・ピンケルトニエ、アクレモニウム・ロセオグリセウ、アクレモニウム・インコロラタム、アクレモニウム・フラタム、クリソスポリウム・ラクノウェンス、トリコデルマ・ビリデ、トリコデルマ・リーゼイ、またはトリコデルマ・コニンギから選択される、請求項３５〜６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記微生物がＴ．リーゼイまたはこの変異体である、請求項３５〜６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
請求項１〜６４のいずれかの方法で使用するためのカラメル化糖生成物を含む、組成物。
【請求項６６】
前記カラメル化糖生成物がグルコース、マルトース、キシロース、ラクトース、またはこれらの組み合わせをカラメル化することによって産生される、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６７】
前記カラメル化糖生成物がキシロースおよびグルコースを含む糖化バイオマスをカラメル化することによって産生される、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記カラメル化糖生成物がオリゴ糖類、オリゴ糖類の脱水和生成物、オリゴ糖類の水和生成物、オリゴ糖類の不均化生成物、着色芳香族生成物、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項６５または６６に記載の組成物。
【請求項６９】
前記オリゴ糖類が二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７０】
前記カラメル化糖生成物がグルコースをカラメル化することによって産生され、ここで前記オリゴ糖類が、グルコースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７１】
前記カラメル化糖生成物がマルトースをカラメル化することによって産生され、ここで前記オリゴ糖類が、マルトースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７２】
前記カラメル化糖生成物がラクトースをカラメル化することによって産生され、ここで前記オリゴ糖類が、ラクトースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７３】
前記カラメル化糖生成物がキシロースをカラメル化することによって産生され、ここで前記オリゴ糖類が、キシロースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７４】
前記オリゴ糖類が１種以上のオリゴ糖類を含むとき、三糖類が最も多量な種である、請求項６８〜７３のいずれかに記載の組成物。
【請求項７５】
前記組成物が誘発物質バイオマスをさらに含む、請求項６５〜７４のいずれかに記載の組成物。
【請求項７６】
前記誘発物質バイオマスがセルロースを含むデンプン材を含む、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７７】
前記誘発物質バイオマスが農産物もしくは農業廃棄物、紙製品もしくは紙廃棄物、農林物資、または一般廃棄物、またはこれらのいずれかの組み合わせの１つまたは複数を含み、ここで、
ａ）農産物もしくは農業廃棄物が、サトウキビジュート、大麻、亜麻、竹、サイザル麻、アルファルファ、干し草、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、アンデスカタバミ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤマノイモ、マメ、ソラマメ、ヒラマメ、エンドウマメ、グラス、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀物残渣、キャノーラ藁、コムギ藁、オオムギ藁、オートムギ藁、コメ藁、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ繊維、ヤシ毛、ビートパルプ、バガス、ダイズ茎葉、穀類残渣、コメ籾殻、オートムギ籾殻、コムギ籾殻、オオムギ籾殻、または外皮、またはこれらの組み合わせを含み、
ｂ）紙製品もしくは紙廃棄物が、紙、着色紙、塗被紙、コーティング紙、充填された紙、雑誌、印刷物、プリンタ紙、ポリコート紙、カードストック、厚紙、板紙、または紙パルプ、またはこれらの組み合わせを含み、
ｃ）農林物資が、アスペン木材、パーティクルボード、木材チップ、またはおがくず、またはこれらの組み合わせを含み、
ｄ）一般廃棄物が、肥料、汚水、または臓物、またはこれらの組み合わせを含む、
請求項７６に記載の組成物。
【請求項７８】
前記誘発物質バイオマスが誘発物質バイオマスの抵抗性を低下するために前処理され、ここで前記バイオマスの前記前処理は、電子ビームへの暴露、電子による衝撃、超音波処理、酸化、熱分解、水蒸気爆発、化学処理、機械的処理、または凍結粉砕を含む、請求項７５〜７７に記載の組成物。
【請求項７９】
前記組成物がさらにセロビオース、β−セロビオノ−１，５−ラクトン、ラクトース、Ｄ−キシロース、キシロビオース、ガラクトース、およびソホロースを含む、請求項７５〜７７のいずれかに記載の組成物。
【請求項８０】
バイオマス分解酵素およびカラメル化糖生成物を産生することができる微生物を含む、細胞培養。
【請求項８１】
細胞培養培地をさらに含む、請求項８０に記載の細胞培養。
【請求項８２】
前記バイオマス分解酵素が、エンドグルカナーゼ、セロビアーゼ、セロビオヒドロラーゼ、キシラナーゼ、リグニナーゼ、またはヘミセルラーゼ、またはこれらの組み合わせである、請求項８０または８１に記載の細胞培養。
【請求項８３】
前記バイオマス分解酵素が表１に列記された酵素の１種類以上またはすべてを含む、請求項８０〜８２のいずれかに記載の細胞培養。
【請求項８４】
前記カラメル化糖生成物がグルコース、キシロース、マルトース、ラクトース、またはこれらの組み合わせをカラメル化することによって産生される、請求項８０〜８３のいずれかに記載の細胞培養。
【請求項８５】
前記カラメル化糖生成物がキシロースおよびグルコースを含む糖化バイオマスをカラメル化することによって産生される、請求項８４に記載の細胞培養。
【請求項８６】
前記カラメル化糖生成物がオリゴ糖類、オリゴ糖類の脱水和生成物、オリゴ糖類の水和生成物、オリゴ糖類の不均化生成物、着色芳香族生成物、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項８０〜８５のいずれかに記載の細胞培養。
【請求項８７】
前記微生物がＴ．リーゼイまたはこの変異体、例えばＲＵＴＣ３０である、請求項８０〜８６のいずれかに記載の細胞培養。
【請求項８８】
誘発物質バイオマスをさらに含む、請求項８０〜８７のいずれかに記載の方法。
【請求項８９】
前記誘発物質バイオマスがデンプン材またはセルロース成分を含むデンプン材を含む、請求項８８に記載の細胞培養。
【請求項９０】
前記誘発物質バイオマスが農産物もしくは農業廃棄物、紙製品もしくは紙廃棄物、農林物資、または一般廃棄物、またはこれらのいずれかの組み合わせの１つまたは複数を含み、ここで、
ａ）農産物もしくは農業廃棄物が、サトウキビジュート、大麻、亜麻、竹、サイザル麻、アルファルファ、干し草、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、アンデスカタバミ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤマノイモ、マメ、ソラマメ、ヒラマメ、エンドウマメ、グラス、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀物残渣、キャノーラ藁、コムギ藁、オオムギ藁、オートムギ藁、コメ藁、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ繊維、ヤシ毛、ビートパルプ、バガス、ダイズ茎葉、穀類残渣、コメ籾殻、オートムギ籾殻、コムギ籾殻、オオムギ籾殻、または外皮、またはこれらの組み合わせを含み、
ｂ）紙製品もしくは紙廃棄物が、紙、着色紙、塗被紙、コーティング紙、充填された紙、雑誌、印刷物、プリンタ紙、ポリコート紙、カードストック、厚紙、板紙、または紙パルプ、またはこれらの組み合わせを含み、
ｃ）農林物資が、アスペン木材、パーティクルボード、木材チップ、またはおがくず、またはこれらの組み合わせを含み、
ｄ）一般廃棄物が、肥料、汚水、または臓物、またはこれらの組み合わせを含む、
請求項８９に記載の細胞培養。
【請求項９１】
前記微生物によって産生されるバイオマス分解酵素をさらに含む、請求項８０〜９０のいずれかに記載の細胞培養。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年３月３１日出願した米国特許仮出願第６２／１４０，７８５号の優先権を主張する。この出願の全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
本出願はＡＳＣＩＩで電子的に提出されている配列リストを含み、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。２０１６年３月１７日に作製されたこのＡＳＣＩＩコピーは、Ｘ２００２−７００２ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、サイズは６３，３６９バイトである。
【０００３】
本発明の分野
本発明は、全般的にはタンパク質、例えばアミラーゼあるいはセルラーゼまたはヘミセルラーゼなどのバイオマス分解酵素などの酵素の増強された産生のための組成物、増強されたバイオマス分解酵素産生のための方法に関する。このような組成物はカラメル化糖生成物を含む。本明細書で説明される方法は、バイオマス材を処理するために使用することができる。
【背景技術】
【０００４】
セルラーゼ、キシラナーゼ、およびリグニナーゼのようなバイオマス分解酵素は、供給原料のようなバイオマスの分解のために重要である。セルロースおよびリグノセルロース材は、多くの用途において大量に製造、加工、および使用されている。しばしば、このような材料は一度使用され、次いで廃棄物として廃棄されるか、または単に下水汚物、バガス、おがくず、および藁などの廃材であると考えられる。バイオマス分解酵素を内因的または異種的に産生する微生物を使用してバイオマス材を処理し、例えば糖生成物を産生することができる。しかし、バイオマス分解酵素産生を増強してバイオマス処理の効率を高める組成物および／または方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、カラメル化糖生成物が、バイオマス分解酵素を産生できる微生物、例えばＴ．リーゼイに導入されたとき、バイオマス分解酵素の産生を誘発できるという驚くべき発見に、少なくとも部分的に基づいている。さらに、産生されるバイオマス分解酵素の収量は、例えばトウモロコシ穂軸などのバイオマス材を含むセルロースを用いる従来の誘発方法から産生されるよりも高かった。そのため、微生物からバイオマス分解酵素の産生を増強するための組成物および方法が本明細書で提供される。
【０００６】
従って、一態様では、本発明はタンパク質を産生する微生物を、カラメル化糖生成物を含む組成物とタンパク質産生に適した条件下で接触させることを含む、タンパク質産生を誘発するための方法を特徴とする。実施形態では、タンパク質は酵素である。いくつかの実施形態では、酵素はアミラーゼまたはバイオマス分解酵素である。
【０００７】
実施形態では、微生物は細胞培養中に存在する。いくつかの実施形態では、糖を細胞培養に添加してから、微生物をカラメル化糖生成物を含む組成物と接触させる。いくつかの実施形態では、細胞培養がほとんど糖を含まないとき、微生物をカラメル化糖生成物を含む組成物と接触させる。
【０００８】
実施形態では、カラメル化糖生成物はグルコース、キシロース、マルトース、ラクトース、またはこれらの組み合わせをカラメル化することによって産生される。いくつかの実施形態では、カラメル化糖生成物は、キシロースおよびグルコースを含む糖化バイオマスをカラメル化することによって産生される。いくつかの実施形態では、カラメル化糖生成物は、オリゴ糖類、オリゴ糖類の脱水和生成物、オリゴ糖類の水和生成物、オリゴ糖類の不均化生成物、着色芳香族生成物、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、オリゴ糖類は、二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む。一実施形態では、カラメル化糖生成物はグルコースをカラメル化することによって産生され、オリゴ糖はグルコースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む。一実施形態では、カラメル化糖生成物はマルトースをカラメル化することによって産生され、オリゴ糖はマルトースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む。一実施形態では、カラメル化糖生成物はラクトースをカラメル化することによって産生され、オリゴ糖はラクトースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む。一実施形態では、カラメル化糖生成物はキシロースをカラメル化することによって産生され、オリゴ糖はキシロースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、オリゴ糖類が２種以上のオリゴ糖を含む場合、三糖類が最も多量な種である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、バイオマス分解酵素は、アミラーゼ、例えばα、βまたはγアミラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビアーゼ、セロビオヒドロラーゼ、キシラナーゼ、リグニナーゼ、またはヘミセルラーゼ、あるいはこれらの組み合わせを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、組成物はさらに誘発物質バイオマスを含む。いくつかの実施形態では、誘発物質バイオマスはデンプン材またはセルロース成分を含むデンプン材を含む。いくつかの実施形態では、誘発物質バイオマス、例えばデンプン材またはセルロース成分を含むデンプン材は、農産物もしくは農業廃棄物、紙製品もしくは紙廃棄物、農林物資、または一般廃棄物、またはこれらの任意の組み合わせの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、農産物または農業廃棄物は、サトウキビジュート、大麻、亜麻、竹、サイザル麻、アルファルファ、干し草、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、アンデスカタバミ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤマノイモ、マメ、ソラマメ、ヒラマメ、エンドウマメ、グラス、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀物残渣、キャノーラ藁、コムギ藁、オオムギ藁、オートムギ藁、コメ藁、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ繊維、ヤシ毛、ビートパルプ、バガス、ダイズ茎葉、穀類残渣、コメ籾殻、オートムギ籾殻、コムギ籾殻、オオムギ籾殻、または外皮、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、農産物または農業廃棄物は、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ繊維、または外皮を含む。いくつかの実施形態では、農産物または農業廃棄物はトウモロコシ穂軸を含む。いくつかの実施形態では、農産物または農業廃棄物は、外皮を含む。いくつかの実施形態では、紙製品または紙廃棄物は、紙、着色紙、塗被紙、コーティング紙、充填された紙、雑誌、印刷物、プリンタ紙、ポリコート紙、カードストック、厚紙、板紙、または紙パルプ、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、農林物資はアスペン木材、パーティクルボード、木材チップ、またはおがくず、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、一般廃棄物は、肥料、汚水、または臓物、またはこれらの組み合わせを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、誘発物質バイオマスを前処理して誘発物質バイオマスの抵抗性を低下させる。いくつかの実施形態では、誘発バイオマスの前処理は電子ビームへの暴露、電子による衝撃、超音波処理、酸化、熱分解、水蒸気爆発、化学処理、機械的処理、または凍結粉砕を含む。いくつかの実施形態では、誘発物質バイオマスの前処理は電子ビームへの暴露または電子による衝撃を含む。
【００１２】
一実施形態では、本組成物はさらにセロビオース、β−セロビオノ−１，５−ラクトン、ラクトース、Ｄ−キシロース、キシロビオース、ガラクトース、およびソホロースを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、バイオマス分解酵素を産生する微生物は、バチルス、コプリナス、マセリオフトーラ、セファロスポリウム、シタリジウム、ペニシリウム、アスペルギルス、シュードモナス、フミコーラ、フザリウム、チエラビア、アクレモニウム、クリソスポリウム、またはトリコデルマから選択される属における種由来である。いくつかの実施形態では、微生物は真菌細胞である。いくつかの実施形態では、バイオマス分解酵素を産生する微生物は、アスペルギルス、フミコーラ・インソレンス（シタリジウム・サーモフィラム）、コプリナス・シネレウス、フザリウム・オキシスポラム、マセリオフトーラ・サーモフィラ、メリピルス・ギガンテス、チエラビア・テレストリス、アクレモニウム・ペリシナム、アクレモニウム・アクレモニウム、アクレモニウム・ブラシペニウム、アクレモニウム・ジクロモスポラム、アクレモニウム・オブクラバタム、アクレモニウム・ピンケルトニエ、アクレモニウム・ロセオグリセウ、アクレモニウム・インコロラタム、アクレモニウム・フラタム、クリソスポリウム・ラクノウェンス、トリコデルマ・ビリデ、トリコデルマ・リーゼイ、またはトリコデルマ・コニンギから選択される。いくつかの実施形態では、微生物はＴ．リーゼイである。特定の実施形態では、微生物はＴ．リーゼイ、またはその変異体、例えばＲＵＴ−ＮＧ１４、ＰＣ３−７、ＱＭ９４１４、およびＲＵＴ−Ｃ３０である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、産生されるバイオマス分解酵素の量は、カラメル化糖生成物と接触していない微生物によって産生されるバイオマス分解酵素の量と比較して、少なくとも１倍、例えば、少なくとも１．２倍、１．５倍、１．８倍、２倍、またはそれ以上増加する。いくつかの実施形態では、産生されるバイオマス分解酵素の量は、微生物を誘発物質バイオマスと接触させることによって産生されるバイオマス分解酵素の量と比較して、少なくとも１倍、例えば、少なくとも１．２倍、１．５倍、１．８倍、２倍増加する。いくつかの実施形態では、バイオマス分解酵素は、表１に列記された酵素の１種類以上、またはすべてを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本方法はさらにバイオマス分解酵素を細胞培養の成分から分離することを含む。いくつかの実施形態では、本方法はバイオマス分解酵素を微生物または残存誘発物質バイオマスから分離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法はバイオマス分解酵素をクロマトグラフィーまたはろ過によって、微生物または残存誘発物質バイオマスから分離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、バイオマス分解酵素は、細胞培養から精製される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本方法はさらに、ａ）微生物を第一容器中の糖と、微生物が増殖する条件下で接触させ、ｂ）微生物を第二容器に移すステップを含み、ここで第二容器は第一容器よりも、例えば容積が大きく、このステップは微生物を組成物と接触させる前に実施される。いくつかの実施形態では、このステップは１回以上、例えば２、３、４、５回繰り返される。
【００１７】
別の態様では、本発明はバイオマスから生成物を産生するための方法を特徴とし、ａ）バイオマス分解酵素を産生する微生物を、カラメル化糖生成物を含む組成物とバイオマス分解酵素の産生に適した条件下で接触させることを含む方法を用いてバイオマス分解酵素の産生を誘発し、ｂ）バイオマスを用意し、ｃ）バイオマスをステップａ）の微生物、あるいはステップａ）の微生物から分離または精製されているバイオマス分解酵素と、生成物の産生に適した条件下で接触させることを含む。いくつかの実施形態では、生成物は糖生成物である。いくつかの実施形態では、生成物はグルコースおよび／またはキシロースである。いくつかの実施形態では、本方法はさらに生成物を分離することを含む。いくつかの実施形態では、生成物の分離は、沈殿析出、結晶化、クロマトグラフィー、遠心分離、および／または抽出を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、バイオマス分解酵素はエンドグルカナーゼ、セロビアーゼ、セロビオヒドロラーゼ、キシラナーゼ、リグニナーゼ、またはヘミセルラーゼ、あるいはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、バイオマス分解酵素は表１に列記された酵素の１種類以上、またはすべてを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本方法はさらにステップｃ）の前にバイオマスを処理するステップを含み、バイオマスの抵抗性を低下させる。いくつかの実施形態では、処理は電子ビームへの暴露、電子による衝撃、超音波処理、酸化、熱分解、水蒸気爆発、化学処理、機械的処理、または凍結粉砕を含む。いくつかの実施形態では、処理は電子ビームへの暴露または電子による衝撃を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、バイオマスはデンプン材またはセルロース成分を含むデンプン材を含む。いくつかの実施形態では、バイオマスは農産物もしくは農業廃棄物、紙製品もしくは紙廃棄物、農林物資、または一般廃棄物、またはこれらの任意の組み合わせの１つまたは複数を含み、ここでａ）農産物もしくは農業廃棄物はサトウキビジュート、大麻、亜麻、竹、サイザル麻、アルファルファ、干し草、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、アンデスカタバミ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤマノイモ、マメ、ソラマメ、ヒラマメ、エンドウマメ、グラス、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀物残渣、キャノーラ藁、コムギ藁、オオムギ藁、オートムギ藁、コメ藁、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ繊維、ヤシ毛、ビートパルプ、バガス、ダイズ茎葉、穀類残渣、コメ籾殻、オートムギ籾殻、コムギ籾殻、オオムギ籾殻、または外皮、またはこれらの組み合わせを含み、ｂ）紙製品もしくは紙廃棄物は、紙、着色紙、塗被紙、コーティング紙、充填された紙、雑誌、印刷物、プリンタ紙、ポリコート紙、カードストック、厚紙、板紙、または紙パルプ、またはこれらの組み合わせを含み、ｃ）農林物資はアスペン木材、パーティクルボード、木材チップ、またはおがくず、またはこれらの組み合わせを含み、ｄ）一般廃棄物は、肥料、汚水、または臓物、またはこれらの組み合わせを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、カラメル化糖生成物はグルコース、マルトース、キシロース、ラクトース、またはこれらの組み合わせをカラメル化することによって産生される。いくつかの実施形態では、カラメル化糖生成物は、キシロースおよびグルコースを含む糖化バイオマスをカラメル化することによって産生される。いくつかの実施形態では、カラメル化糖生成物は、オリゴ糖類、オリゴ糖類の脱水和生成物、オリゴ糖類の水和生成物、オリゴ糖類の不均化生成物、着色芳香族生成物、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、オリゴ糖類は、二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、カラメル化糖生成物はグルコースをカラメル化することによって産生され、オリゴ糖はグルコースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、カラメル化糖生成物はマルトースをカラメル化することによって産生され、オリゴ糖はマルトースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、カラメル化糖生成物はラクトースをカラメル化することによって産生され、オリゴ糖はラクトースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、カラメル化糖生成物はキシロースをカラメル化することによって産生され、オリゴ糖はキシロースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、オリゴ糖類が２種類以上のオリゴ糖を含む場合、三糖類が最も多量な種類である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本組成物はさらに誘発物質バイオマスを含む。いくつかの実施形態では、誘発物質バイオマスはデンプン材またはセルロース成分を含むデンプン材を含む。いくつかの実施形態では、誘発物質バイオマスは農産物もしくは農業廃棄物、紙製品もしくは紙廃棄物、農林物資、または一般廃棄物、またはこれらの任意の組み合わせの１つまたは複数を含み、ここでａ）農産物もしくは農業廃棄物はサトウキビジュート、大麻、亜麻、竹、サイザル麻、アルファルファ、干し草、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、アンデスカタバミ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤマノイモ、マメ、ソラマメ、ヒラマメ、エンドウマメ、グラス、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀物残渣、キャノーラ藁、コムギ藁、オオムギ藁、オートムギ藁、コメ藁、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ繊維、ヤシ毛、ビートパルプ、バガス、ダイズ茎葉、穀類残渣、コメ籾殻、オートムギ籾殻、コムギ籾殻、オオムギ籾殻、または外皮、またはこれらの組み合わせを含み、ｂ）紙製品もしくは紙廃棄物は、紙、着色紙、塗被紙、コーティング紙、充填された紙、雑誌、印刷物、プリンタ紙、ポリコート紙、カードストック、厚紙、板紙、または紙パルプ、またはこれらの組み合わせを含み、ｃ）農林物資はアスペン木材、パーティクルボード、木材チップ、またはおがくず、またはこれらの組み合わせを含み、ｄ）一般廃棄物は、肥料、汚水、または臓物、またはこれらの組み合わせを含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、誘発物質バイオマスを前処理して誘発物質バイオマスの抵抗性を低下させる。いくつかの実施形態では、誘発物質バイオマスの前処理は電子ビームへの暴露、電子による衝撃、超音波処理、酸化、熱分解、水蒸気爆発、化学処理、機械的処理、または凍結粉砕を含む。いくつかの実施形態では、誘発物質バイオマスの前処理は電子ビームへの暴露または電子による衝撃を含む。いくつかの実施形態では、本発明の誘発物質バイオマスはステップ（ｂ）で得られるバイオマスと同一である。
【００２４】
一実施形態では、本組成物はさらにセロビオース、β−セロビオノ−１，５−ラクトン、ラクトース、Ｄ−キシロース、キシロビオース、ガラクトース、およびソホロースを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、バイオマス分解酵素を産生する微生物は、バチルス、コプリナス、マセリオフトーラ、セファロスポリウム、シタリジウム、ペニシリウム、アスペルギルス、シュードモナス、フミコーラ、フザリウム、チエラビア、アクレモニウム、クリソスポリウム、またはトリコデルマから選択される属における種由来である。いくつかの実施形態では、微生物は真菌細胞である。いくつかの実施形態では、バイオマス分解酵素を産生する微生物は、アスペルギルス、フミコーラ・インソレンス（シタリジウム・サーモフィラム）、コプリナス・シネレウス、フザリウム・オキシスポラム、マセリオフトーラ・サーモフィラ、メリピルス・ギガンテス、チエラビア・テレストリス、アクレモニウム・ペリシナム、アクレモニウム・アクレモニウム、アクレモニウム・ブラシペニウム、アクレモニウム・ジクロモスポラム、アクレモニウム・オブクラバタム、アクレモニウム・ピンケルトニエ、アクレモニウム・ロセオグリセウ、アクレモニウム・インコロラタム、アクレモニウム・フラタム、クリソスポリウム・ラクノウェンス、トリコデルマ・ビリデ、トリコデルマ・リーゼイ、またはトリコデルマ・コニンギから選択される。いくつかの実施形態では、微生物はＴ．リーゼイである。特定の実施形態では、微生物はＴ．リーゼイ、またはその変異体、例えばＲＵＴ−ＮＧ１４、ＰＣ３−７、ＱＭ９４１４、およびＲＵＴ−Ｃ３０である。
【００２６】
さらに別の実施形態では、本発明は本明細書で開示される方法で使用するためのカラメル化糖生成物を含む組成物を特徴とする。いくつかの実施形態では、カラメル化糖生成物はグルコース、マルトース、キシロース、ラクトース、またはこれらの組み合わせをカラメル化することによって産生される。いくつかの実施形態では、カラメル化糖生成物は、キシロースおよびグルコースを含む糖化バイオマスをカラメル化することによって産生される。いくつかの実施形態では、カラメル化糖生成物は、オリゴ糖類、オリゴ糖類の脱水和生成物、オリゴ糖類の水和生成物、オリゴ糖類の不均化生成物、着色芳香族生成物、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、オリゴ糖類は、二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、カラメル化糖生成物はグルコースをカラメル化することによって産生され、オリゴ糖はグルコースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、カラメル化糖生成物はマルトースをカラメル化することによって産生され、オリゴ糖はマルトースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、カラメル化糖生成物はラクトースをカラメル化することによって産生され、オリゴ糖はラクトースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、カラメル化糖生成物はキシロースをカラメル化することによって産生され、オリゴ糖はキシロースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、オリゴ糖類が２種以上のオリゴ糖を含む場合、三糖類が最も多量な種である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本組成物はさらに誘発物質バイオマスを含む。いくつかの実施形態では、誘発物質バイオマスはデンプン材またはセルロース成分を含むデンプン材を含む。いくつかの実施形態では、誘発物質バイオマスは農産物もしくは農業廃棄物、紙製品もしくは紙廃棄物、農林物資、または一般廃棄物、またはこれらの任意の組み合わせの１つまたは複数を含む。農産物または農業廃棄物はサトウキビジュート、大麻、亜麻、竹、サイザル麻、アルファルファ、干し草、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、アンデスカタバミ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤマノイモ、マメ、ソラマメ、ヒラマメ、エンドウマメ、グラス、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀物残渣、キャノーラ藁、コムギ藁、オオムギ藁、オートムギ藁、コメ藁、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ繊維、ヤシ毛、ビートパルプ、バガス、ダイズ茎葉、穀類残渣、コメ籾殻、オートムギ籾殻、コムギ籾殻、オオムギ籾殻、または外皮、またはこれらの組み合わせを含む。紙製品または紙廃棄物は、紙、着色紙、塗被紙、コーティング紙、充填された紙、雑誌、印刷物、プリンタ紙、ポリコート紙、カードストック、厚紙、板紙、または紙パルプ、またはこれらの組み合わせを含む。農林物資はアスペン木材、パーティクルボード、木材チップ、またはおがくず、またはこれらの組み合わせを含む。一般廃棄物は、肥料、汚水、または臓物、またはこれらの組み合わせを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、誘発物質バイオマスを前処理して誘発物質バイオマスの抵抗性を低下させる。いくつかの実施形態では、バイオマスの前処理は電子ビームへの暴露、電子による衝撃、超音波処理、酸化、熱分解、水蒸気爆発、化学処理、機械的処理、または凍結粉砕を含む。いくつかの実施形態では、誘発物質バイオマスの前処理は電子ビームへの暴露または電子による衝撃を含む。
【００２９】
一実施形態では、本発明はさらにセロビオース、β−セロビオノ−１，５−ラクトン、ラクトース、Ｄ−キシロース、キシロビオース、ガラクトース、およびソホロースを含む。
【００３０】
さらに別の態様では、本発明はバイオマス分解酵素を産生することができる微生物およびカラメル化糖生成物を含む細胞培養を特徴とする。いくつかの実施形態では、細胞培養はさらに細胞培養培地を含む。いくつかの実施形態では、バイオマス分解酵素はエンドグルカナーゼ、セロビアーゼ、セロビオヒドロラーゼ、キシラナーゼ、リグニナーゼ、またはヘミセルラーゼ、あるいはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、バイオマス分解酵素は表１に列記された酵素の１種類以上、またはすべてを含む。いくつかの実施形態では、カラメル化糖生成物はグルコース、マルトース、キシロース、ラクトース、またはこれらの組み合わせをカラメル化することによって産生される。いくつかの実施形態では、カラメル化糖生成物は、キシロースおよびグルコースを含む糖化バイオマスをカラメル化することによって産生される。いくつかの実施形態では、オリゴ糖類は、二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、カラメル化糖生成物は、オリゴ糖類、オリゴ糖類の脱水和生成物、オリゴ糖類の水和生成物、オリゴ糖類の不均化生成物、着色芳香族生成物、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、カラメル化糖生成物はグルコースをカラメル化することによって産生され、オリゴ糖はグルコースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、カラメル化糖生成物はマルトースをカラメル化することによって産生され、オリゴ糖はマルトースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、カラメル化糖生成物はラクトースをカラメル化することによって産生され、オリゴ糖はラクトースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、カラメル化糖生成物はキシロースをカラメル化することによって産生され、オリゴ糖はキシロースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類、またはこれらの組み合わせを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、微生物はバチルス、コプリナス、マセリオフトーラ、セファロスポリウム、シタリジウム、ペニシリウム、アスペルギルス、シュードモナス、フミコーラ、フザリウム、チエラビア、アクレモニウム、クリソスポリウム、またはトリコデルマから選択される属における種由来である。いくつかの実施形態では、微生物は真菌細胞である。いくつかの実施形態では、微生物はアスペルギルス、フミコーラ・インソレンス（シタリジウム・サーモフィラム）、コプリナス・シネレウス、フザリウム・オキシスポラム、マセリオフトーラ・サーモフィラ、メリピルス・ギガンテス、チエラビア・テレストリス、アクレモニウム・ペリシナム、アクレモニウム・アクレモニウム、アクレモニウム・ブラシペニウム、アクレモニウム・ジクロモスポラム、アクレモニウム・オブクラバタム、アクレモニウム・ピンケルトニエ、アクレモニウム・ロセオグリセウ、アクレモニウム・インコロラタム、アクレモニウム・フラタム、クリソスポリウム・ラクノウェンス、トリコデルマ・ビリデ、トリコデルマ・リーゼイ、またはトリコデルマ・コニンギから選択される。いくつかの実施形態では、微生物はＴ．リーゼイである。特定の実施形態では、微生物はＴ．リーゼイ、またはその変異体、例えばＲＵＴ−ＮＧ１４、ＰＣ３−７、ＱＭ９４１４、およびＲＵＴ−Ｃ３０である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、細胞培養はさらに誘発物質バイオマスを含む。いくつかの実施形態では、誘発物質バイオマスはデンプン材またはセルロース成分を含むデンプン材を含む。いくつかの実施形態では、誘発物質バイオマスは農産物もしくは農業廃棄物、紙製品もしくは紙廃棄物、農林物資、または一般廃棄物、またはこれらの任意の組み合わせの１つまたは複数を含み、ここでａ）農産物もしくは農業廃棄物はサトウキビジュート、大麻、亜麻、竹、サイザル麻、アルファルファ、干し草、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、アンデスカタバミ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤマノイモ、マメ、ソラマメ、ヒラマメ、エンドウマメ、グラス、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀物残渣、キャノーラ藁、コムギ藁、オオムギ藁、オートムギ藁、コメ藁、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ繊維、ヤシ毛、ビートパルプ、バガス、ダイズ茎葉、穀類残渣、コメ籾殻、オートムギ籾殻、コムギ籾殻、オオムギ籾殻、または外皮、またはこれらの組み合わせを含み、ｂ）紙製品もしくは紙廃棄物は、紙、着色紙、塗被紙、コーティング紙、充填された紙、雑誌、印刷物、プリンタ紙、ポリコート紙、カードストック、厚紙、板紙、または紙パルプ、またはこれらの組み合わせを含み、ｃ）農林物資はアスペン木材、パーティクルボード、木材チップ、またはおがくず、またはこれらの組み合わせを含み、ｄ）一般廃棄物は、肥料、汚水、または臓物、またはこれらの組み合わせを含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、細胞培養はさらに微生物によって産生されるバイオマス分解酵素を含む。いくつかの実施形態では、バイオマス分解酵素はエンドグルカナーゼ、セロビアーゼ、セロビオヒドロラーゼ、キシラナーゼ、リグニナーゼ、またはヘミセルラーゼ、あるいはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、バイオマス分解酵素は表１に列記された酵素の１種類以上、またはすべてを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】セルロース誘発物質トウモロコシ穂軸を加えない（ＣＣ無添加）カラメル化糖によるセルラーゼ産生を示す図である。カラメル化糖を無添加（カラメル化糖無添加）、あるいはカラメル化グルコース、カラメル化マルトース、またはカラメル化ラクトースをＴ．リーゼイの培養に５ｇ／Ｌ／日で加えた。セルラーゼ産生をタンパク質力価（ｇ／Ｌ）によって４、６、８、および１１日目に測定し、ｙ軸に示す。
【図２】マススペクトロメトリーによって測定したカラメル化グルコース、マルトース、およびラクトースのオリゴ糖組成を示す図である。糖単位数（２〜６）をｘ軸に示す。
【図３】Ｔ．リーゼイにおけるセルラーゼ産生の誘発に対するセルロース誘発物質トウモロコシ穂軸（ＣＣ）およびカラメル化糖の効果を示す図である。トウモロコシ穂軸単独（ＣＣ単独）、カラメル化されていないグルコース（グルコース）、カラメル化グルコース（カラメル化グルコース）、およびトウモロコシ穂軸とカラメル化されていないグルコース（ＣＣ＋グルコース）の組み合わせ、およびトウモロコシ穂軸とカラメル化されたグルコース（ＣＣ＋カラメル化グルコース）の組み合わせをＴ．リーゼイに加えた。セルラーゼ産生をタンパク質力価（ｇ／Ｌ）によって４、６、８、および１１日目に測定し、ｙ軸に示す。
【図４】Ｔ．リーゼイにおけるセルラーゼ産生の誘発に対するセルロース誘発物質外皮（ＢＷ）およびカラメル化糖の効果を示す図である。外皮（ＢＷ）単独および外皮とカラメル化グルコースの組み合わせ（ＢＷ＋塩基カラメル化グルコース）をＴ．リーゼイに加えた。セルラーゼ産生をタンパク質力価（ｇ／Ｌ）によって４、６、８、および１２日目に測定し、ｙ軸に示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
詳細な説明
定義
特に定められない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が関係する従来技術の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
【００３６】
単数形（「ａ」および「ａｎ」）は、本明細書の文法的対象の１つまたは１つを超えること（すなわち、少なくとも１つ）を意味する。例として、「構成要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの構成要素、または１つを超える構成要素を意味する。
【００３７】
用語「バイオマス」は、本明細書で使用されるとき、任意の非化石化有機物質を意味する。バイオマスはデンプン材および／またはセルロース材、ヘミセルロース材、またはリグノセルロース材であることができる。例えば、バイオマスは農産物、紙製品、農林物資、あるいはこれらの中間物質、副産物、残渣、または廃棄物、あるいは一般廃棄物であることができる。バイオマスはこのような材料の組み合わせであり得る。一実施形態では、バイオマスは、例えば、本明細書で説明される糖化および／または発酵反応によって、糖、アルコール、有機酸、またはバイオ燃料のような産物を産生するように処理される。
【００３８】
用語「バイオマス分解酵素」は、本明細書で使用されるとき、本明細書で説明されるバイオマス物質の成分を中間物質または最終産物に分解する酵素を意味する。例えば、バイオマス分解酵素は、少なくともアミラーゼ、例えばα、βまたはγアミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リグニナーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビアーゼ、キシラーゼ、およびセロビオヒドロラーゼを含む。バイオマス分解酵素は幅広く様々な微生物によって産生され、Ｔ．リーゼイのような微生物から分離することができる。バイオマス分解酵素は内因的に発現または異種的に発現することができる。
【００３９】
用語「バイオマス分解活性」は、本明細書で使用されるとき、本明細書で説明されるバイオマス物質の成分を中間物質または最終産物に分解する酵素活性を意味する。バイオマス分解活性は、少なくともセルラーゼ活性、へミセルラーゼ活性、リグニナーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、セロビアーゼ活性、セルビオヒドロラーゼ活性、およびキシラーゼ活性を含む。
【００４０】
用語「カラメル化糖生成物」は、本明細書で使用されるとき、糖分子を、例えば少なくとも１１０℃に加熱して（水のような溶媒の存在または不存在で）糖の褐色化を生じることによって産生される小分子または化合物、あるいはこれらの混合物を意味する。カラメル化糖生成物を産生するために適した糖分子は、例えば、グルコース、キシロース、マルトース、ラクトース、フルクトース、スクロース、糖化トウモロコシ穂軸のような糖化バイオマス由来の糖混合物、またはこれらの任意の組み合わせを含む。カラメル化糖生成物はオリゴ糖類、例えば、糖分子出発物質のオリゴ糖類、オリゴ糖類の脱水和生成物、オリゴ糖類の水和生成物、オリゴ糖類の不均化生成物、着色芳香族生成物、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。
【００４１】
用語「セロビアーゼ」は、本明細書で使用されるとき、グルコースの二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、またはオリゴマー、あるいはグルコースとキシロースのオリゴマーの、グルコースおよび／またはキシロースへの加水分解を触媒する酵素を意味する。例えば、セロビアーゼはβ−グルコシダーゼであり、セロビオースにおけるβ−１，４結合を触媒して２つのグルコース分子を放出する。
【００４２】
用語「セロビオヒドロラーゼ」は、本明細書で使用されるとき、セルロースにおけるグリコシド結合を加水分解する酵素を意味する。例えば、セロビオヒドロラーゼは１，４−β−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼであり、セルロース、セルロオリゴ糖、または任意のβ−１，４−結合グルコース含有ポリマーにおける１，４−β−Ｄ−グルコシド結合、例えば、末端単位の１，４−β−Ｄ−グルコシド結合の加水分解を触媒してポリマー鎖からオリゴ糖を放出する。
【００４３】
用語「セルラーゼ」は、本明細書で使用されるとき、セルロースおよび関連多糖類のそれより短い多糖類、オリゴ糖類、または単糖類への分解、例えば加水分解を触媒する酵素を意味する。セルラーゼの例には、エンドグルカナーゼ、セロビアーゼ、およびセロビオヒドロラーゼ（またはエキソグルカナーゼ）を含む。セルラーゼ活性はセルロースの活性、例えばセルロース分解を意味し、セルロース、ヘミセルロース、リケニン、およびシリアルβ−Ｄ−グルカンにおける１，４−β−Ｄ−グリコシド結合の短い多糖類、オリゴ糖類、または単糖類への加水分解を含む。
【００４４】
用語「エンドグルカナーゼ」は、本明細書で使用されるとき、内在β−１，４グルコシド結合の加水分解を触媒する酵素を意味する。例えば、エンドグルカナーゼはエンド−１，４−（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼであり、セルロース、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロース）、リケナン、シリアルβ−Ｄグルカンまたはキシログルカンのような混合β−１，３グルカン中のβ−１，４結合、およびセルロース成分を含む他の植物材料における１，４−β−Ｄ−グリコシド結合の内部加水分解を触媒する。
【００４５】
用語「誘発物質バイオマス」は、本明細書で使用されるとき、微生物に導入されてバイオマス分解酵素のような酵素などのタンパク質の産生を誘発する任意の非化石化有機物質を意味する。誘発物質バイオマスはデンプン材および／またはセルロースを含むセルロース材であることができる。誘発物質バイオマスはまた、セルロース誘発物質として意味することができる。誘発物質バイオマスは糖生成物の産生のために使用されるバイオマスと同じ成分を含むことができる。一実施形態では、誘発物質バイオマスはカラメル化糖生成物とともに導入して、バイオマス分解酵素の産生を誘発することができる。
【００４６】
用語「リグニナーゼ」は、本明細書で使用されるとき、酸化反応によるような、植物の細胞壁に一般的に認められるリグニンの分解を触媒する酵素を意味する。リグニナーゼはリグニン改変化酵素、リグニンペルオキシダーゼ、およびラッカーゼを含む。
【００４７】
用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は置き換え可能で使用され、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）および一本鎖型または二本鎖型のいずれかにおけるこれらのポリマーを意味する。特に制限がない限り、本用語は対照核酸と同じ結合特性を有して、自然発生ヌクレオチドと同様な方法で代謝される天然ヌクレオチドの既知のアナログを含む核酸を包含する。他に指示がない限り、特定の核酸配列は保存的に改変されたこれらの変異体（例えば、縮退コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、および相補的配列も暗黙のうちに包含し、その配列は明示的に示される。具体的には、縮退コドン置換は配列を縮退することによって達成され得、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第三位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基によって置換されている（Ｂａｔｚｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）、Ｏｈｔｓｕｋａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）、およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ８：９１−９８（１９９４））。
【００４８】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は置き換え可能で使用でき、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基からなる化合物を意味する。タンパク質またはペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を含むことができるアミン酸の最大数に制限はない。ポリペプチドはペプチド結合によって互いに結合された２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を含む。「ポリペプチド」は数ある中でも、例えば、生物学的に活性なフラグメト、ほとんど相同的なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの変異体、改変ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは天然ペプチド、組換えペプチド、またはこれらの組み合わせを含む。「複数のポリペプチド」は、２つ以上のポリペプチド、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、２００、または５００個、あるいはそれ以上のポリペプチドを意味する。
【００４９】
用語「キシラナーゼ」は、本明細書で使用されるとき、キシラン含有物質を加水分解する酵素を意味する。キシランはキシロースの単位を含む多糖である。キシラナーゼはエンドキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、フェルロイルエステラーゼ、またはα−グルクロニルエステラーゼであることができる。
【００５０】
説明
セルロースまたはヘミセルロース、例えば、トウモロコシ穂軸、コムギ藁、おがくずなどを含む材料は、糸状真菌であるトリコデルマ・リーゼイ（Ｔ．リーゼイ）におけるセルラーゼおよびヘミセルラーゼの産生のために使用することができる（Ｌｙｎｄら，２００２，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ＆Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ，６６：５０６−５７７）。グルコース、キシロース、およびフルクトースのような糖は、Ｔ．リーゼイにおける可溶性炭素源として一般的に考えられている。いくつかの研究は、グルコースおよびフルクトースのような容易に代謝可能な炭素源の存在がセルロース分解遺伝子の発現を抑制することを示している（Ｃｈａｍｂｅｒｇｏら，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．７：１３８３−１３９８８）。
【００５１】
本発明は、糖分子、例えばグルコースおよび／またはキシロースを加熱することによって産生されるカラメル化糖生成物が微生物、例えばＴ．リーゼイに導入されたとき、タンパク質、例えばアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素の産生を誘発できるという驚くべき発見に、少なくとも部分的に基づいている。さらに、タンパク質、例えばバイオマス分解酵素の収量は、従来の誘発方法、例えば、トウモロコシ穂軸などのセルロース含有誘発物質を用いて産生されるよりも高かった。従って本発明は、微生物においてタンパク質、例えばアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素の産生を誘発するためにカラメル化糖生成物を含む組成物、およびこの利用方法を提供する。
【００５２】
カラメル化糖生成物
実施形態では、カラメル化糖生成物を含む組成物を微生物に導入して、例えばバイオマス分解酵素の産生を誘発する。カラメル化は調理で一般的に使用される非酵素的プロセスであり、糖分子を適切な温度に加熱して褐色化させてカラメルを生成させる。一般的に、糖は３、４、５、６、または７−炭素炭水化物、例えばグリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトン、エリスロース、トレオース、アラビノース、リボース、リブロース、キシロース、キシルロース、リキソース、アロース、アルトロース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、グロース、イドース、マンノース、ソルボース、タロース、タガトース、セドヘプツロースおよびマンノヘプツロース、またはこれらの任意の混合物であることができる。例えば、カラメル化のための出発材料として使用することができる適切な糖分子には、グルコース、マルトース、ラクトース、キシロース、フルクトース、およびスクロースが含まれる。一実施形態では、グルコースがカラメル化される。一実施形態では、マルトースがカラメル化される。一実施形態では、ラクトースがカラメル化される。一実施形態では、キシロースがカラメル化される。一実施形態では、糖化バイオマス、例えば糖化トウモロコシ穂軸、コムギ藁、および／またはデンプン材由来の糖がカラメル化される。グルコース、マルトース、ラクトース、キシロース、フルクトース、および／またはスクロースの任意の組み合わせをカラメル化することができる。例えば、一実施形態では、キシロースとグルコースを含む混合物がカラメル化される。
【００５３】
糖分子は、糖を褐色化するのに適した温度に加熱することによってカラメル化される。実施形態では、糖分子は少なくとも１１０℃、１２０℃、１３０℃、１４０℃、１５０℃、１６０℃、１７０℃、１８０℃、１９０℃、または２００℃に加熱する。使用する温度は、糖出発材料に依存し得、異なる糖分子は異なる温度でカラメル化され得、例えばフルクトースは１１０℃でカラメル化し、一方グルコースは１６０℃でカラメル化する。糖分子は、所望レベルのカラメル化が達成されるまでの時間、本明細書で説明されるカラメル化温度で加熱することができる。例えば、糖分子は、本明細書で説明されるカラメル化温度で少なくとも３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、３６時間、または４８時間加熱する。例えば、糖分子は１７０℃で１７時間加熱することによってカラメル化することができる。加熱は、固体糖などの純粋な糖、あるいは水または他の溶媒などの溶液中の糖を加熱することによって実施することができる。
【００５４】
カラメル化プロセスはカラメル化糖生成物の混合物を産生する。プロセスは糖の酸化、水の除去、および糖の分解を含む反応を含み、数百種のカラメル化糖生成物を生じる。最近の研究は、例えばＧｏｌｏｎ  ａｎｄ  Ｋｕｈｎｅｒｔ，２０１２，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，６０：３２６６−３２７４参照、カラメルの化学的組成を特徴付けることを試みている。カラメル化糖生成物は、１）出発糖分子を含むオリゴ糖、２）出発糖分子の脱水和生成物および出発糖分子を含むオリゴ糖、３）出発糖分子を含むオリゴ糖の水和生成物、４）出発糖分子を含むオリゴ糖の酸化還元不均化生成物から生じる断片生成物、ならびに５）芳香族化合物、の１つまたは複数を含む。ホスト細胞におけるバイオマス分解酵素などのタンパク質の産生を誘発するために本明細書で開示されている方法で利用されるカラメル化糖生成物は、本明細書で説明されるカラメル化糖生成物のいずれかまたはこれらの組み合わせであることができる。理論によって拘束されることは望まないが、カラメル化プロセスによって産生されるオリゴ糖は、微生物におけるバイオマス分解酵素などのタンパク質の産生を誘発する役割を演じると考えられる。説明されるオリゴ糖は２つの役割を実施すると考えられる。第一に、オリゴ糖は生物によって部分的に利用されることができ、このため細胞量を増殖させると考えられる。第二に、オリゴ糖は生物が酵素を産生するようにさせ、生物はオリゴ糖を分解して、細胞増殖を高める単糖をより多く放出することができる。増強された細胞増殖はより多くのタンパク質を生じる。
【００５５】
一実施形態では、カラメル化糖生成物は出発糖分子を含む１種類以上のオリゴ糖を含み、オリゴ糖は出発糖分子の２、３、４、５、または６単位、あるいはこれらの一部を含む。出発糖分子を含むオリゴ糖は非選択的なグリコシド結合形成によって形成される。例えば、カラメル化グルコースは２、３、４、５、または６個のグルコース分子、あるいはこれらの組み合わせ、例えばグルコースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、または六糖類、あるいはこれらの組み合わせを含むオリゴ糖を含む。別の例では、カラメル化マルトースは２、３、４、５、または６個のマルトース分子、例えばマルトースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、または六糖類、あるいはこれらの組み合わせを含むオリゴ糖を含む。別の例では、カラメル化キシロースは２、３、４、５、または６個のキシロース分子、例えばキシロースを含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、または六糖類、あるいはこれらの組み合わせを含むオリゴ糖を含む。さらなる別の例では、カラメル化ラクトースは２、３、４、５、または６個のラクトース分子、あるいはこれらの組み合わせ、例えばラクトース反復を含む二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、または六糖類、あるいはこれらの組み合わせを含むオリゴ糖を含む。
【００５６】
一実施形態では、カラメル化糖生成物は出発糖分子を含むオリゴ糖の混合物、例えば１、２、３、４、または５種のオリゴ糖を含む。カラメル化糖生成物が１種以上のオリゴ糖を含む実施形態では、オリゴ糖のそれぞれの種は残存オリゴ糖種に対して異なる比で存在し得る。このような実施形態では、カラメル化糖生成物が１種以上のオリゴ糖を含み、三糖類が最も多量なオリゴ糖種である。カラメル化糖生成物が二糖類および三糖類を含む実施形態では、二糖類が二番目に量が多いオリゴ糖種である。カラメル化糖生成物が二糖類、三糖類、および四糖類を含む実施形態では、四糖類が三番目に量が多いオリゴ糖種である。
【００５７】
一実施形態では、カラメル化糖生成物は出発糖分子および／または出発糖分子を含むオリゴ糖の１種類以上の脱水和生成物を含む。脱水和生成物は、単糖単位の数に応じて、１、２、３、４、５、６、７、または８個の水分子の減少を含むことができる。水分子の減少は同じ糖部分で生じ得る、あるいは２つ以上の異なる糖部分、例えば出発糖分子を含むオリゴ糖の糖部分にわたって分布され得る。例えば、グルコースでは、単一水分子の減少の結果として、７種までの脱水和生成物がカラメル化によって得ることができる。
【００５８】
一実施形態では、カラメル化糖生成物は出発糖分子を含むオリゴ糖の１種類以上の水和生成物を含む。水和生成物は出発糖分子を含むオリゴ糖に加えられた１または２個の付加水分子を含むことができる。
【００５９】
一実施形態では、カラメル化糖生成物は出発糖分子を含むオリゴ糖の１種類以上の断片生成物、または酸化還元不均化生成物を含む。出発糖分子を含むオリゴ糖は酸化および／または還元され得る。一実施形態では、出発糖分子を含むオリゴ糖は同時に還元および酸化される。
【００６０】
一実施形態では、カラメル化糖生成物は１種類以上の芳香族生成物を含む。芳香族生成物はカラメルの褐色を付与する芳香族色素分子を含む。カラメル化グルコースおよびフルクトースの分析は、芳香族色素分子が異なる出発糖分子間で異なり得ることを示した（Ｇｏｌｏｎら，２０１２）。芳香族生成物はまた、「バタースコッチ」風味などのカラメルの風味を付与する芳香族香り分子を含むことができる。芳香族香り分子の例には、ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）およびヒドロキシアセチルフラン（ＨＡＦ）などのジアセチルフラン、ヒドロキシジメチルフラノン（ＨＤＦ）、ジヒドロキシジメチルフラノン（ＤＤＦ）などのフラノン、ならびに二糖由来のマルトールおよび単糖由来のヒドロキシマルトールが含まれる。
【００６１】
カラメル化糖の化学組成はマススペクトロメトリーによって測定できる。例えば、カラメル化糖はグルコースなどの出発糖分子を１７０℃で１７時間、または１８０℃で２時間加熱することによって調製できる。ついで、カラメル化糖を水またはメタノール／水（１：１、ｖ／ｖ、１ｍＬ）の混合液に溶解し、マススペクトロメトリーで分析する。カラメル化糖試料を分析するために使用できるマススペクトロメトリー技術の例には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ｍｉｃｒＯＴＯＦ、および直接注入イオントラップマススペクトロメトリー（ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳまたはＨＰＬＣ−ＭＳ）、または液体クロマトグラフィー−飛行時間型質量分析法（ＬＣ−ＴＯＦまたはＨＰＬＣ−ＴＯＦ）が含まれる。
【００６２】
ホスト細胞または微生物においてバイオマス分解酵素などのタンパク質の産生を誘発するためのカラメル化糖生成物を含む組成物は、さらにバイオマス分解酵素などのタンパク質の産生を誘発することができる従来技術で知られている１種類以上の物質を含むことができる。このような物質の例には、限定されないが、セロビオース（β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノース）、β−セロビオノ−１，５−ラクトン（β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン）、ラクトース（β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコース）、ソホロース（２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−α−Ｄ−グルコース）、Ｄ−キシロース、キシロビオース、ガラクトース、１−アラビトール、および１−ソルボースが含まれる（Ｓｈｍｏｌｌ  ａｎｄ  Ｋｕｂｉｃｅｋ，２００３，Ａｃｔａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｈｕｎｇ．７：１２５−１４５、Ｅｌ−Ｇｏｇａｒｙら，１９８９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，７：６１３８−６１４１、Ａｒｏら，２００５，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．２９：７１９−７３９、Ｎｏｇａｗａら，２００１，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．７：３２９−３３４）。
【００６３】
また、本明細書で説明される方法のいずれかで使用するために、タンパク質、例えばアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素の産生を誘発するためのカラメル化糖生成物を含む組成物も提供される。この組成物はさらに本明細書で説明される誘発物質バイオマス、および／またはタンパク質、例えばアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素の産生を誘発する従来技術で知られている添加物質を含むことができる。
【００６４】
実施形態では、ホスト細胞または微生物において、タンパク質、例えばアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素の産生を誘発するカラメル化糖生成物を含む組成物は、本明細書で説明される誘発物質バイオマスをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、誘発物質バイオマス材は、水素、糖、およびアルコールのような様々な生成物を産生するために処理できる同一材料であり得る。誘発物質バイオマスはセルロースを含むデンプン材であることができ、また本明細書ではセルロース誘発物質として意味される。誘発物質バイオマスの適切な例がさらに本明細書で説明される。誘発物質バイオマスは抵抗性を低下するために、電子ビームへの暴露、電子による衝撃、超音波処理、酸化、熱分解、水蒸気爆発、化学処理、機械的処理、および／または凍結粉砕などの本明細書で説明される処理方法のいずれかによって前処理され得る。
【００６５】
タンパク質、例えばアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素の産生を誘発するカラメル化糖生成物を含む組成物の使用は、産生されるタンパク質、例えばアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素の量の増加をもたらすことができる。一実施形態では、ホスト細胞または微生物をカラメル化糖生成物を含む組成物と接触させることによって産生されるバイオマス分解酵素の量の増加は、カラメル化糖生成物を含む組成物を使用せずに産生されるバイオマス分解酵素の量と比べて、少なくとも１倍、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、または３倍以上である。一実施形態では、ホスト細胞または微生物をカラメル化糖生成物を含む組成物と接触させることによって産生されるバイオマス分解酵素の量は、カラメル化糖生成物を含む組成物を使用せずに産生されるバイオマス分解酵素の量、あるいは誘発物質バイオマスを用いることによって産生されるバイオマス分解酵素の量よりも、少なくとも１％、２％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２００％、３００％、４００％、または５００％多い。
【００６６】
カラメル化糖生成物および誘発物質バイオマスを含む組成物の使用は、産生されるタンパク質、例えばアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素の量の増加をもたらすことができる。一実施形態では、ホスト細胞または微生物をカラメル化糖生成物および誘発物質バイオマスを含む組成物と接触させることによって産生されるバイオマス分解酵素の量の増加は、誘発物質バイオマスを単独またはカラメル化糖生成物を単独で用いることによって産生されるバイオマス分解酵素の量と比べて、少なくとも１倍、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、または３倍以上である。一実施形態では、ホスト細胞または微生物をカラメル化糖生成物および誘発物質バイオマスを含む組成物と接触させることによって産生されるバイオマス分解酵素の量は、誘発物質バイオマスを単独またはカラメル化糖生成物を単独で用いることによって産生されるバイオマス分解酵素の量よりも、少なくとも１％、２％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２００％、３００％、４００％、または５００％多い。
【００６７】
いくつかの実施形態では、カラメル化糖生成物および誘発物質バイオマスの組み合わせは、産生されるタンパク質、例えばアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素の量における相乗的な増加をもたらす。相乗効果では、２種類以上の誘発組成物の組み合わせを用いて認められる効果は、各個別誘発組成物を別々に用いる効果の合計よりも大きい。一実施形態では、本明細書で説明されるカラメル化糖生成物および誘発物質バイオマスを含む組成物は、微生物のバイオマス分解酵素産生における相乗効果を誘発することができ、カラメル化糖生成物単独および誘発物質バイオマス単独で微生物を誘発することから産生される収量の合計よりも大きいバイオマス分解酵素の収量をもたらす。一実施形態では、ホスト細胞または微生物をカラメル化糖生成物および誘発物質バイオマスを含む組成物と接触させることによって産生されるバイオマス分解酵素の量は、カラメル化糖生成物を単独または誘発物質バイオマスを単独で用いることによって産生されるバイオマス分解酵素の量の合計よりも、少なくとも１％、２％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２００％、３００％、４００％、または５００％多い。
【００６８】
微生物によって産生されるタンパク質、例えばアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素の量または力価は、本明細書で説明される例で記載されるアッセイを用いて測定することができる。例えば、産生されるバイオマス分解酵素の量はブラッドフォードアッセイおよび／またはナノドロップ装置を用いて測定することができる。ナノドロップタンパク質定量では、モル吸光係数はバイオマス分解酵素のアミノ酸配列をＥｘＰＡＳｙＰｒｏｔＰａｒａｍオンラインツールに挿入することによって評価できる。従来技術で知られている活性アッセイも、産生されたバイオマス分解酵素の活性を測定するために実施できる。
【００６９】
バイオマス分解酵素の産生の誘発
本開示はタンパク質、例えばアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素の産生を誘発するための組成物および方法を提供する。実施形態では、本明細書で説明されるカラメル化糖生成物を含む組成物を、バイオマス分解酵素の産生に適した条件下で微生物またはホスト細胞に導入することができる。本明細書で使用されるとき、微生物によるバイオマス分解酵素の産生または生産は、バイオマス分解酵素の発現、翻訳、および／または分泌を含む。
【００７０】
微生物およびホスト細胞
本開示における使用に適した微生物またはホスト細胞は、タンパク質、例えば本明細書で説明されるアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素を産生することができる。一実施形態では、微生物はバイオマス分解酵素を本来的に産生し、例えば内因性バイオマス分解酵素を発現する。一実施形態では、微生物はバイオマス分解酵素を産生するように、例えば異種バイオマス分解酵素を発現するように遺伝子改変されている。このような実施形態では、異種バイオマス分解酵素をコードする核酸が、従来技術で知られた標準的な方法、例えばエレクトロポレーション、遺伝子導入、または形質導入を用いて、微生物に導入される。異種バイオマス分解酵素は、異なる微生物で本来的に産生されるバイオマス分解酵素であり得、あるいは相当する自然発生バイオマス分解酵素とは異なるアミノ酸配列または異なる機能および／または活性、例えば増加または低下した活性を含む改変バイオマス分解酵素であり得る。
【００７１】
微生物は１種類以上のタンパク質、例えばアミラーゼまたはバイオマス分解酵素のような１種類以上の酵素を産生する真菌、細菌、原生動物、酵母、合成生物、または半合成生物であることができる。一実施形態では、微生物はバチルス、コプリナス、マセリオフトーラ、セファロスポリウム、シタリジウム、ペニシリウム、アスペルギルス、シュードモナス、フミコーラ、フザリウム、チエラビア、アクレモニウム、クリソスポリウム、またはトリコデルマから選択される属における種由来である。
【００７２】
一実施形態では、微生物はアスペルギルス、フミコーラ・インソレンス（シタリジウム・サーモフィラム）、コプリナス・シネレウス、フザリウム・オキシスポラム、マセリオフトーラ・サーモフィラ、メリピルス・ギガンテス、チエラビア・テレストリス、アクレモニウム・ペリシナム、アクレモニウム・アクレモニウム、アクレモニウム・ブラシペニウム、アクレモニウム・ジクロモスポラム、アクレモニウム・オブクラバタム、アクレモニウム・ピンケルトニエ、アクレモニウム・ロセオグリセウ、アクレモニウム・インコロラタム、アクレモニウム・フラタム、クリソスポリウム・ラクノウェンス、トリコデルマ・ビリデ、トリコデルマ・リーゼイ、またはトリコデルマ・コニンギから選択される。
【００７３】
実施形態では、微生物は糸状真菌などの真菌である。一実施形態では、微生物はトリコデルマ・リーゼイまたはこの任意の工業株または変異体である。例えば、微生物はＴ．リーゼイＱＭ６ａ、Ｔ．リーゼイＲＬ−Ｐ３７、Ｔ．リーゼイＭＣＧ−８０、Ｔ．リーゼイＲＵＴＣ３０、Ｔ．リーゼイＲＵＴ−ＮＧ１４、Ｔ．リーゼイＰＣ３−７、またはＴ．リーゼイＱＭ９４１４であることができる。
【００７４】
バイオマス分解酵素
微生物におけるタンパク質、例えばアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素の産生を誘発するための組成物および方法が本明細書で提供される。バイオマス分解酵素は微生物によって本来的に発現されることができる。バイオマス分解酵素はセルラーゼ（例えば、セロビアーゼ、セロビオヒドロラーゼ、またはエンドグルカナーゼ）、ヘミセルラーゼ（例えば、キシラナーゼ）、またはリグニナーゼ、あるいはこれらの任意の組み合わせであることができる。
【００７５】
一実施形態では、バイオマス分解酵素はセルラーゼである。セルラーゼは、セルロース分解、あるいはセルロースおよび関連多糖類のグルコースまたはβグルコースなどの単糖類、またはより短い多糖類およびオリゴ糖への分解を触媒する酵素を総称して呼ぶ。セルラーゼは一般的には真菌、細菌、および他の原生動物によって産生される。セルラーゼの例には、セロビアーゼ、セロビオヒドロラーゼ（エキソグルカナーゼ）、およびエンドグルカナーゼが含まれる。
【００７６】
一実施形態では、バイオマス分解酵素はセロビアーゼである。セロビアーゼはセロビオースなどのその基質におけるβ−１，４−結合を加水分解して２つのグルコース分子を放出する。セロビオースはグルコースの水溶性１，４−結合ダイマーである。一実施形態では、バイオマス分解酵素はＣｅ１３ａである。Ｃｅ１３ａ（ＢｇＩＩとしても知られている）はトリコデルマ・リーゼイで特定されたセロビアーゼである。
【００７７】
一実施形態では、バイオマス分解酵素はセロビオヒドロラーゼであり、エキソグルカナーゼまたはアビセラーゼとしても知られている。セロビオヒドロラーゼは１−４−β−Ｄ−グルコシド結合を含むセルロースおよびセロテトラオースなどのオリゴ糖における当該結合の加水分解を触媒し、これによって鎖の非還元端からセロビオースを放出する。セロビオヒドロラーゼの例には、トリコデルマ・リーゼイ由来のセルビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）およびセルビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨＩＩ）が含まれる。
【００７８】
一実施形態では、バイオマス分解酵素はエンドグルカナーゼである。エンドグルカナーゼは、セルロースの加水分解を触媒する酵素である。具体的には、エンドグルカナーゼはセルロース鎖の内部結合を切断する。エンドグルカナーゼは真菌、細菌、および原生動物によって産生される。エンドグルカナーゼは、β−１−４エンドグルカナーゼ、４−β−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ、エキソ−セロビオヒドロラーゼ、β−１，４−グルカンセロビオヒドロラーゼ、β−１，４−グルカンセロビオシルヒドロラーゼ、１，４−β−グルカンセロビオシダーゼ、Ｃ１セルラーゼ、セロビオヒドロラーゼＩ、セロビオヒドロラーゼ、エキソ−β−１，４−グルカンセロビオヒドロラーゼ、１，４−β−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ、またはセロビオシダーゼとしても知られている。エンドグルカナーゼの例には、トリコデルマ・リーゼイ由来のＣｅｌ５Ａ、Ｃｅｌ５Ｂ、Ｃｅｌ７Ｂ、Ｃｅｌ１２Ａ、Ｃｅｌ４５Ａ、Ｃｅｌ６１Ａ、Ｃｅｌ６１Ｂ、およびＣｅｌ７４Ａが含まれる。
【００７９】
一実施形態では、バイオマス分解酵素はヘミセルラーゼである。ヘミセルラーゼはヘミセルロース、例えばセルロースを除く植物における細胞壁の様々な成分であるキシラン、グルカン、ガラクタン、マンナン、およびペントサンなどを加水分解する酵素を総称して呼ぶ。ヘミセルラーゼには、キシラナーゼおよびガラクタナーゼが含まれる。
【００８０】
一実施形態では、バイオマス分解酵素はキシラナーゼである。キシラナーゼはまた、エンド−（１−４）−β−キシラン４−キシラノヒドロラーゼ、エンド−１，４−キシラナーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、β−１，４−キシラナーゼ、エンド−１，４−β−Ｄ−キシラナーゼ、１，４−β−キシランキシラノヒドロラーゼ、β−キシラナーゼ、β−１，４−キシラソキシラノヒドロラーゼ、β−Ｄ−キシラナーゼとしても知られている。キシラナーゼは、ヘミセルロースと呼ばれる植物細胞壁の成分を分解し、例えば、β−１，４−キシラン、グルクロンオキシラン、アラビノキシラン、グルコマンナン、およびキシログルカンなどのキシランのような多糖類を分解し、キシロースを放出する。キシラナーゼの例には、トリコデルマ・リーゼイ由来のＸｙｎ１、Ｘｙｎ２、およびＸｙｎ３、テレジニバクター・ツルネラエＴ７９０１由来のＴＥＲＴＵ＿１５９９、ＴＥＲＴＵ＿３６０３、ＴＥＲＴＵ＿２５４６、およびＴＥＲＴＵ＿４５０６が含まれる。
【００８１】
一実施形態では、バイオマス分解酵素はリグニナーゼである。リグニナーゼはリグニンを分解する酵素であり、モノリグノールとして知られている芳香族アルコールの複合ポリマーであり、植物およびある種の藻類の二次細胞壁の不可欠な部分を担う。リグニナーゼには、リグニンペルオキシダーゼ、１，２−ビス（３，４−ジメトキシフェニル）プロパン−１，３−ジオール：過酸化水素酸化還元酵素、ジアリールプロパンオキシゲナーゼ、リグニナーゼＩ、ジアリールプロパンペルオキシダーゼ、ＬｉＰ、過酸化水素酸化還元酵素（Ｃ−Ｃ−結合−切断）、およびいくつかのラッカーゼが含まれる。リグニナーゼの例には、トリコデルマ・リーゼイ由来のＣＩＰ２、ファネロケーテ・クリソスポリウム由来のＬＰＯＡ、ＧＬＧ２、ＧＬＧ４、ＬＩＰＡ、ＧＬＧ５、ＧＬＧ３、ＧＬＧ６、およびＬＩＰＢ、フレビア・ラジアータ由来のリグニナーゼ−３、コリオルス・バーシカラー由来のリグニナーゼＡおよびＢ、ならびにコリオルス・バーシカラー由来のＬＰＧＩおよびＬＰＧＩＶが含まれる。
【００８２】
実施形態では、本明細書で説明される方法を使用して、１種類以上のセルラーゼまたはヘミセルラーゼ、例えばセロビアーゼ、セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、キシラナーゼ、および／またはリグニナーゼの１種類以上の産生を誘発する。一実施形態では、本明細書で説明される方法を使用して、セロビアーゼ、セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、キシラナーゼ、および／またはリグニナーゼの１種類以上の任意の組み合わせを含むバイオマス分解酵素の混合物の産生を誘発する。実施形態では、バイオマス分解酵素の混合物は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１５、または少なくとも２０種類のバイオマス分解酵素、例えば本明細書に記載されるバイオマス分解酵素を含む。
【００８３】
例示的なバイオマス分解酵素を表１に列記する。
【表１】
2018509919.tif 000002
【００８４】
一実施形態では、本明細書で説明される方法によって産生されるバイオマス分解酵素はＣｅｌ３ａ、例えばトリコデルマ・リーゼイ由来のＣｅｌ３ａである。一実施形態では、バイオマス分解酵素の混合物は、表１に列記されたバイオマス分解酵素の少なくも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５種類を含む。
【００８５】
表１に列記されたバイオマス分解酵素のアミノ酸配列を下記に示す。
Ｂ２ＡＦ０３  （ポドスポラ・アンセリナ）
ＭＫＳＳＶＦＷＧＡＳＬＴＳＡＶＶＲＡＩＤＬＰＦＱＦＹＰＮＣＶＤＤＬＬＳＴＮＱＶＣＮＴＴＬＳＰＰＥＲＡＡＡＬＶＡＡＬＴＰＥＥＫＬＱＮＩＶＳＫＳＬＧＡＰＲＩＧＬＰＡＹＮＷＷＳＥＡＬＨＧＶＡＹＡＰＧＴＱＦＷＱＧＤＧＰＦＮＳＳＴＳＦＰＭＰＬＬＭＡＡＴＦＤＤＥＬＬＥＫＩＡＥＶＩＧＩＥＧＲＡＦＧＮＡＧＦＳＧＬＤＹＷＴＰＮＶＮＰＦＫＤＰＲＷＧＲＧＳＥＴＰＧＥＤＶＬＬＶＫＲＹＡＡＡＭＩＫＧＬＥＧＰＶＰＥＫＥＲＲＶＶＡＴＣＫＨＹＡＡＮＤＦＥＤＷＮＧＡＴＲＨＮＦＮＡＫＩＳＬＱＤＭＡＥＹＹＦＭＰＦＱＱＣＶＲＤＳＲＶＧＳＩＭＣＡＹＮＡＶＮＧＶＰＳＣＡＳＰＹＬＬＱＴＩＬＲＥＨＷＮＷＴＥＨＮＮＹＩＴＳＤＣＥＡＶＬＤＶＳＬＮＨＫＹＡＡＴＮＡＥＧＴＡＩＳＦＥＡＧＭＤＴＳＣＥＹＥＧＳＳＤＩＰＧＡＷＳＱＧＬＬＫＥＳＴＶＤＲＡＬＬＲＬＹＥＧＩＶＲＡＧＹＦＤＧＫＱＳＬＹＳＳＬＧＷＡＤＶＮＫＰＳＡＱＫＬＳＬＱＡＡＶＤＧＴＶＬＬＫＮＤＧＴＬＰＬＳＤＬＬＤＫＳＲＰＫＫＶＡＭＩＧＦＷＳＤＡＫＤＫＬＲＧＧＹＳＧＴＡＡＹＬＨＴＰＡＹＡＡＳＱＬＧＩＰＦＳＴＡＳＧＰＩＬＨＳＤＬＡＳＮＱＳＷＴＤＮＡＭＡＡＡＫＤＡＤＹＩＬＹＦＧＧＩＤＴＳＡＡＧＥＴＫＤＲＹＤＬＤＷＰＧＡＱＬＳＬＩＮＬＬＴＴＬＳＫＰＬＩＶＬＱＭＧＤＱＬＤＮＴＰＬＬＳＮＰＫＩＮＡＩＬＷＡＮＷＰＧＱＤＧＧＴＡＶＭＥＬＶＴＧＬＫＳＰＡＧＲＬＰＶＴＱＹＰＳＮＦＴＥＬＶＰＭＴＤＭＡＬＲＰＳＡＧＮＳＱＬＧＲＴＹＲＷＹＫＴＰＶＱＡＦＧＦＧＬＨＹＴＴＦＳＰＫＦＧＫＫＦＰＡＶＩＤＶＤＥＶＬＥＧＣＤＤＫＹＬＤＴＣＰＬＰＤＬＰＶＶＶＥＮＲＧＮＲＴＳＤＹＶＡＬＡＦＶＳＡＰＧＶＧＰＧＰＷＰＩＫＴＬＧＡＦＴＲＬＲＧＶＫＧＧＥＫＲＥＧＧＬＫＷＮＬＧＮＬＡＲＨＤＥＥＧＮＴＶＶＹＰＧＫＹＥＶＳＬＤＥＰＰＫＡＲＬＲＦＥＩＶＲＧＧＫＧＫＧＫＶＫＧＫＧＫＡＡＱＫＧＧＶＶＬＤＲＷＰＫＰＰＫＧＱＥＰＰＡＩＥＲＶ    （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １）
ＣＩＰ１  （トリコデルマ・リーゼイ）
ＭＶＲＲＴＡＬＬＡＬＧＡＬＳＴＬＳＭＡＱＩＳＤＤＦＥＳＧＷＤＱＴＫＷＰＩＳＡＰＤＣＮＱＧＧＴＶＳＬＤＴＴＶＡＨＳＧＳＮＳＭＫＶＶＧＧＰＮＧＹＣＧＨＩＦＦＧＴＴＱＶＰＴＧＤＶＹＶＲＡＷＩＲＬＱＴＡＬＧＳＮＨＶＴＦＩＩＭＰＤＴＡＱＧＧＫＨＬＲＩＧＧＱＳＱＶＬＤＹＮＲＥＳＤＤＡＴＬＰＤＬＳＰＮＧＩＡＳＴＶＴＬＰＴＧＡＦＱＣＦＥＹＨＬＧＴＤＧＴＩＥＴＷＬＮＧＳＬＩＰＧＭＴＶＧＰＧＶＤＮＰＮＤＡＧＷＴＲＡＳＹＩＰＥＩＴＧＶＮＦＧＷＥＡＹＳＧＤＶＮＴＶＷＦＤＤＩＳＩＡＳＴＲＶＧＣＧＰＧＳＰＧＧＰＧＳＳＴＴＧＲＳＳＴＳＧＰＴＳＴＳＲＰＳＴＴＩＰＰＰＴＳＲＴＴＴＡＴＧＰＴＱＴＨＹＧＱＣＧＧＩＧＹＳＧＰＴＶＣＡＳＧＴＴＣＱＶＬＮＰＹＹＳＱＣＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２）
ＣＩＰ２  （トリコデルマ・リーゼイ）
ＭＡＳＲＦＦＡＬＬＬＬＡＩＰＩＱＡＱＳＰＶＷＧＱＣＧＧＩＧＷＳＧＰＴＴＣＶＧＧＡＴＣＶＳＹＮＰＹＹＳＱＣＩＰＳＴＱＡＳＳＳＩＡＳＴＴＬＶＴＳＦＴＴＴＴＡＴＲＴＳＡＳＴＰＰＡＳＳＴＧＡＧＧＡＴＣＳＡＬＰＧＳＩＴＬＲＳＮＡＫＬＮＤＬＦＴＭＦＮＧＤＫＶＴＴＫＤＫＦＳＣＲＱＡＥＭＳＥＬＩＱＲＹＥＬＧＴＬＰＧＲＰＳＴＬＴＡＳＦＳＧＮＴＬＴＩＮＣＧＥＡＧＫＳＩＳＦＴＶＴＩＴＹＰＳＳＧＴＡＰＹＰＡＩＩＧＹＧＧＧＳＬＰＡＰＡＧＶＡＭＩＮＦＮＮＤＮＩＡＡＱＶＮＴＧＳＲＧＱＧＫＦＹＤＬＹＧＳＳＨＳＡＧＡＭＴＡＷＡＷＧＶＳＲＶＩＤＡＬＥＬＶＰＧＡＲＩＤＴＴＫＩＧＶＴＧＣＳＲＮＧＫＧＡＭＶＡＧＡＦＥＫＲＩＶＬＴＬＰＱＥＳＧＡＧＧＳＡＣＷＲＩＳＤＹＬＫＳＱＧＡＮＩＱＴＡＳＥＩＩＧＥＤＰＷＦＳＴＴＦＮＳＹＶＮＱＶＰＶＬＰＦＤＨＨＳＬＡＡＬＩＡＰＲＧＬＦＶＩＤＮＮＩＤＷＬＧＰＱＳＣＦＧＣＭＴＡＡＨＭＡＷＱＡＬＧＶＳＤＨＭＧＹＳＱＩＧＡＨＡＨＣＡＦＰＳＮＱＱＳＱＬＴＡＦＶＱＫＦＬＬＧＱＳＴＮＴＡＩＦＱＳＤＦＳＡＮＱＳＱＷＩＤＷＴＴＰＴＬＳ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３）
Ｃｅｌ１ａ  （トリコデルマ・リーゼイ）
ＭＬＰＫＤＦＱＷＧＦＡＴＡＡＹＱＩＥＧＡＶＤＱＤＧＲＧＰＳＩＷＤＴＦＣＡＱＰＧＫＩＡＤＧＳＳＧＶＴＡＣＤＳＹＮＲＴＡＥＤＩＡＬＬＫＳＬＧＡＫＳＹＲＦＳＩＳＷＳＲＩＩＰＥＧＧＲＧＤＡＶＮＱＡＧＩＤＨＹＶＫＦＶＤＤＬＬＤＡＧＩＴＰＦＩＴＬＦＨＷＤＬＰＥＧＬＨＱＲＹＧＧＬＬＮＲＴＥＦＰＬＤＦＥＮＹＡＲＶＭＦＲＡＬＰＫＶＲＮＷＩＴＦＮＥＰＬＣＳＡＩＰＧＹＧＳＧＴＦＡＰＧＲＱＳＴＳＥＰＷＴＶＧＨＮＩＬＶＡＨＧＲＡＶＫＡＹＲＤＤＦＫＰＡＳＧＤＧＱＩＧＩＶＬＮＧＤＦＴＹＰＷＤＡＡＤＰＡＤＫＥＡＡＥＲＲＬＥＦＦＴＡＷＦＡＤＰＩＹＬＧＤＹＰＡＳＭＲＫＱＬＧＤＲＬＰＴＦＴＰＥＥＲＡＬＶＨＧＳＮＤＦＹＧＭＮＨＹＴＳＮＹＩＲＨＲＳＳＰＡＳＡＤＤＴＶＧＮＶＤＶＬＦＴＮＫＱＧＮＣＩＧＰＥＴＱＳＰＷＬＲＰＣＡＡＧＦＲＤＦＬＶＷＩＳＫＲＹＧＹＰＰＩＹＶＴＥＮＧＴＳＩＫＧＥＳＤＬＰＫＥＫＩＬＥＤＤＦＲＶＫＹＹＮＥＹＩＲＡＭＶＴＡＶＥＬＤＧＶＮＶＫＧＹＦＡＷＳＬＭＤＮＦＥＷＡＤＧＹＶＴＲＦＧＶＴＹＶＤＹＥＮＧＱＫＲＦＰＫＫＳＡＫＳＬＫＰＬＦＤＥＬＩＡＡＡ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４）
Ｃｅｌ３ａ  （トリコデルマ・リーゼイ）
ＭＲＹＲＴＡＡＡＬＡＬＡＴＧＰＦＡＲＡＤＳＨＳＴＳＧＡＳＡＥＡＶＶＰＰＡＧＴＰＷＧＴＡＹＤＫＡＫＡＡＬＡＫＬＮＬＱＤＫＶＧＩＶＳＧＶＧＷＮＧＧＰＣＶＧＮＴＳＰＡＳＫＩＳＹＰＳＬＣＬＱＤＧＰＬＧＶＲＹＳＴＧＳＴＡＦＴＰＧＶＱＡＡＳＴＷＤＶＮＬＩＲＥＲＧＱＦＩＧＥＥＶＫＡＳＧＩＨＶＩＬＧＰＶＡＧＰＬＧＫＴＰＱＧＧＲＮＷＥＧＦＧＶＤＰＹＬＴＧＩＡＭＧＱＴＩＮＧＩＱＳＶＧＶＱＡＴＡＫＨＹＩＬＮＥＱＥＬＮＲＥＴＩＳＳＮＰＤＤＲＴＬＨＥＬＹＴＷＰＦＡＤＡＶＱＡＮＶＡＳＶＭＣＳＹＮＫＶＮＴＴＷＡＣＥＤＱＹＴＬＱＴＶＬＫＤＱＬＧＦＰＧＹＶＭＴＤＷＮＡＱＨＴＴＶＱＳＡＮＳＧＬＤＭＳＭＰＧＴＤＦＮＧＮＮＲＬＷＧＰＡＬＴＮＡＶＮＳＮＱＶＰＴＳＲＶＤＤＭＶＴＲＩＬＡＡＷＹＬＴＧＱＤＱＡＧＹＰＳＦＮＩＳＲＮＶＱＧＮＨＫＴＮＶＲＡＩＡＲＤＧＩＶＬＬＫＮＤＡＮＩＬＰＬＫＫＰＡＳＩＡＶＶＧＳＡＡＩＩＧＮＨＡＲＮＳＰＳＣＮＤＫＧＣＤＤＧＡＬＧＭＧＷＧＳＧＡＶＮＹＰＹＦＶＡＰＹＤＡＩＮＴＲＡＳＳＱＧＴＱＶＴＬＳＮＴＤＮＴＳＳＧＡＳＡＡＲＧＫＤＶＡＩＶＦＩＴＡＤＳＧＥＧＹＩＴＶＥＧＮＡＧＤＲＮＮＬＤＰＷＨＮＧＮＡＬＶＱＡＶＡＧＡＮＳＮＶＩＶＶＶＨＳＶＧＡＩＩＬＥＱＩＬＡＬＰＱＶＫＡＶＶＷＡＧＬＰＳＱＥＳＧＮＡＬＶＤＶＬＷＧＤＶＳＰＳＧＫＬＶＹＴＩＡＫＳＰＮＤＹＮＴＲＩＶＳＧＧＳＤＳＦＳＥＧＬＦＩＤＹＫＨＦＤＤＡＮＩＴＰＲＹＥＦＧＹＧＬＳＹＴＫＦＮＹＳＲＬＳＶＬＳＴＡＫＳＧＰＡＴＧＡＶＶＰＧＧＰＳＤＬＦＱＮＶＡＴＶＴＶＤＩＡＮＳＧＱＶＴＧＡＥＶＡＱＬＹＩＴＹＰＳＳＡＰＲＴＰＰＫＱＬＲＧＦＡＫＬＮＬＴＰＧＱＳＧＴＡＴＦＮＩＲＲＲＤＬＳＹＷＤＴＡＳＱＫＷＶＶＰＳＧＳＦＧＩＳＶＧＡＳＳＲＤＩＲＬＴＳＴＬＳＶＡ    （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５）
Ｃｅｌ５ａ  （トリコデルマ・リーゼイ）
ＭＮＫＳＶＡＰＬＬＬＡＡＳＩＬＹＧＧＡＡＡＱＱＴＶＷＧＱＣＧＧＩＧＷＳＧＰＴＮＣＡＰＧＳＡＣＳＴＬＮＰＹＹＡＱＣＩＰＧＡＴＴＩＴＴＳＴＲＰＰＳＧＰＴＴＴＴＲＡＴＳＴＳＳＳＴＰＰＴＳＳＧＶＲＦＡＧＶＮＩＡＧＦＤＦＧＣＴＴＤＧＴＣＶＴＳＫＶＹＰＰＬＫＮＦＴＧＳＮＮＹＰＤＧＩＧＱＭＱＨＦＶＮＤＤＧＭＴＩＦＲＬＰＶＧＷＱＹＬＶＮＮＮＬＧＧＮＬＤＳＴＳＩＳＫＹＤＱＬＶＱＧＣＬＳＬＧＡＹＣＩＶＤＩＨＮＹＡＲＷＮＧＧＩＩＧＱＧＧＰＴＮＡＱＦＴＳＬＷＳＱＬＡＳＫＹＡＳＱＳＲＶＷＦＧＩＭＮＥＰＨＤＶＮＩＮＴＷＡＡＴＶＱＥＶＶＴＡＩＲＮＡＧＡＴＳＱＦＩＳＬＰＧＮＤＷＱＳＡＧＡＦＩＳＤＧＳＡＡＡＬＳＱＶＴＮＰＤＧＳＴＴＮＬＩＦＤＶＨＫＹＬＤＳＤＮＳＧＴＨＡＥＣＴＴＮＮＩＤＧＡＦＳＰＬＡＴＷＬＲＱＮＮＲＱＡＩＬＴＥＴＧＧＧＮＶＱＳＣＩＱＤＭＣＱＱＩＱＹＬＮＱＮＳＤＶＹＬＧＹＶＧＷＧＡＧＳＦＤＳＴＹＶＬＴＥＴＰＴＧＳＧＮＳＷＴＤＴＳＬＶＳＳＣＬＡＲＫ    （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６）
Ｃｅｌ６ａ  （トリコデルマ・リーゼイ）
ＭＩＶＧＩＬＴＴＬＡＴＬＡＴＬＡＡＳＶＰＬＥＥＲＱＡＣＳＳＶＷＧＱＣＧＧＱＮＷＳＧＰＴＣＣＡＳＧＳＴＣＶＹＳＮＤＹＹＳＱＣＬＰＧＡＡＳＳＳＳＳＴＲＡＡＳＴＴＳＲＶＳＰＴＴＳＲＳＳＳＡＴＰＰＰＧＳＴＴＴＲＶＰＰＶＧＳＧＴＡＴＹＳＧＮＰＦＶＧＶＴＰＷＡＮＡＹＹＡＳＥＶＳＳＬＡＩＰＳＬＴＧＡＭＡＴＡＡＡＡＶＡＫＶＰＳＦＭＷＬＤＴＬＤＫＴＰＬＭＥＱＴＬＡＤＩＲＴＡＮＫＮＧＧＮＹＡＧＱＦＶＶＹＤＬＰＤＲＤＣＡＡＬＡＳＮＧＥＹＳＩＡＤＧＧＶＡＫＹＫＮＹＩＤＴＩＲＱＩＶＶＥＹＳＤＩＲＴＬＬＶＩＥＰＤＳＬＡＮＬＶＴＮＬＧＴＰＫＣＡＮＡＱＳＡＹＬＥＣＩＮＹＡＶＴＱＬＮＬＰＮＶＡＭＹＬＤＡＧＨＡＧＷＬＧＷＰＡＮＱＤＰＡＡＱＬＦＡＮＶＹＫＮＡＳＳＰＲＡＬＲＧＬＡＴＮＶＡＮＹＮＧＷＮＩＴＳＰＰＳＹＴＱＧＮＡＶＹＮＥＫＬＹＩＨＡＩＧＰＬＬＡＮＨＧＷＳＮＡＦＦＩＴＤＱＧＲＳＧＫＱＰＴＧＱＱＱＷＧＤＷＣＮＶＩＧＴＧＦＧＩＲＰＳＡＮＴＧＤＳＬＬＤＳＦＶＷＶＫＰＧＧＥＣＤＧＴＳＤＳＳＡＰＲＦＤＳＨＣＡＬＰＤＡＬＱＰＡＰＱＡＧＡＷＦＱＡＹＦＶＱＬＬＴＮＡＮＰＳＦＬ    （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）
Ｃｅｌ７ａ  （トリコデルマ・リーゼイ）
ＭＹＲＫＬＡＶＩＳＡＦＬＡＴＡＲＡＱＳＡＣＴＬＱＳＥＴＨＰＰＬＴＷＱＫＣＳＳＧＧＴＣＴＱＱＴＧＳＶＶＩＤＡＮＷＲＷＴＨＡＴＮＳＳＴＮＣＹＤＧＮＴＷＳＳＴＬＣＰＤＮＥＴＣＡＫＮＣＣＬＤＧＡＡＹＡＳＴＹＧＶＴＴＳＧＮＳＬＳＩＧＦＶＴＱＳＡＱＫＮＶＧＡＲＬＹＬＭＡＳＤＴＴＹＱＥＦＴＬＬＧＮＥＦＳＦＤＶＤＶＳＱＬＰＣＧＬＮＧＡＬＹＦＶＳＭＤＡＤＧＧＶＳＫＹＰＴＮＴＡＧＡＫＹＧＴＧＹＣＤＳＱＣＰＲＤＬＫＦＩＮＧＱＡＮＶＥＧＷＥＰＳＳＮＮＡＮＴＧＩＧＧＨＧＳＣＣＳＥＭＤＩＷＥＡＮＳＩＳＥＡＬＴＰＨＰＣＴＴＶＧＱＥＩＣＥＧＤＧＣＧＧＴＹＳＤＮＲＹＧＧＴＣＤＰＤＧＣＤＷＮＰＹＲＬＧＮＴＳＦＹＧＰＧＳＳＦＴＬＤＴＴＫＫＬＴＶＶＴＱＦＥＴＳＧＡＩＮＲＹＹＶＱＮＧＶＴＦＱＱＰＮＡＥＬＧＳＹＳＧＮＥＬＮＤＤＹＣＴＡＥＥＡＥＦＧＧＳＳＦＳＤＫＧＧＬＴＱＦＫＫＡＴＳＧＧＭＶＬＶＭＳＬＷＤＤＹＹＡＮＭＬＷＬＤＳＴＹＰＴＮＥＴＳＳＴＰＧＡＶＲＧＳＣＳＴＳＳＧＶＰＡＱＶＥＳＱＳＰＮＡＫＶＴＦＳＮＩＫＦＧＰＩＧＳＴＧＮＰＳＧＧＮＰＰＧＧＮＰＰＧＴＴＴＴＲＲＰＡＴＴＴＧＳＳＰＧＰＴＱＳＨＹＧＱＣＧＧＩＧＹＳＧＰＴＶＣＡＳＧＴＴＣＱＶＬＮＰＹＹＳＱＣＬ    （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８）
Ｃｅｌ７ｂ  （トリコデルマ・リーゼイ）
ＭＡＰＳＶＴＬＰＬＴＴＡＩＬＡＩＡＲＬＶＡＡＱＱＰＧＴＳＴＰＥＶＨＰＫＬＴＴＹＫＣＴＫＳＧＧＣＶＡＱＤＴＳＶＶＬＤＷＮＹＲＷＭＨＤＡＮＹＮＳＣＴＶＮＧＧＶＮＴＴＬＣＰＤＥＡＴＣＧＫＮＣＦＩＥＧＶＤＹＡＡＳＧＶＴＴＳＧＳＳＬＴＭＮＱＹＭＰＳＳＳＧＧＹＳＳＶＳＰＲＬＹＬＬＤＳＤＧＥＹＶＭＬＫＬＮＧＱＥＬＳＦＤＶＤＬＳＡＬＰＣＧＥＮＧＳＬＹＬＳＱＭＤＥＮＧＧＡＮＱＹＮＴＡＧＡＮＹＧＳＧＹＣＤＡＱＣＰＶＱＴＷＲＮＧＴＬＮＴＳＨＱＧＦＣＣＮＥＭＤＩＬＥＧＮＳＲＡＮＡＬＴＰＨＳＣＴＡＴＡＣＤＳＡＧＣＧＦＮＰＹＧＳＧＹＫＳＹＹＧＰＧＤＴＶＤＴＳＫＴＦＴＩＩＴＱＦＮＴＤＮＧＳＰＳＧＮＬＶＳＩＴＲＫＹＱＱＮＧＶＤＩＰＳＡＱＰＧＧＤＴＩＳＳＣＰＳＡＳＡＹＧＧＬＡＴＭＧＫＡＬＳＳＧＭＶＬＶＦＳＩＷＮＤＮＳＱＹＭＮＷＬＤＳＧＮＡＧＰＣＳＳＴＥＧＮＰＳＮＩＬＡＮＮＰＮＴＨＶＶＦＳＮＩＲＷＧＤＩＧＳＴＴＮＳＴＡＰＰＰＰＰＡＳＳＴＴＦＳＴＴＲＲＳＳＴＴＳＳＳＰＳＣＴＱＴＨＷＧＱＣＧＧＩＧＹＳＧＣＫＴＣＴＳＧＴＴＣＱＹＳＮＤＹＹＳＱＣＬ    （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９）
Ｃｅｌ１２ａ  （トリコデルマ・リーゼイ）
ＭＫＦＬＱＶＬＰＡＬＩＰＡＡＬＡＱＴＳＣＤＱＷＡＴＦＴＧＮＧＹＴＶＳＮＮＬＷＧＡＳＡＧＳＧＦＧＣＶＴＡＶＳＬＳＧＧＡＳＷＨＡＤＷＱＷＳＧＧＱＮＮＶＫＳＹＱＮＳＱＩＡＩＰＱＫＲＴＶＮＳＩＳＳＭＰＴＴＡＳＷＳＹＳＧＳＮＩＲＡＮＶＡＹＤＬＦＴＡＡＮＰＮＨＶＴＹＳＧＤＹＥＬＭＩＷＬＧＫＹＧＤＩＧＰＩＧＳＳＱＧＴＶＮＶＧＧＱＳＷＴＬＹＹＧＹＮＧＡＭＱＶＹＳＦＶＡＱＴＮＴＴＮＹＳＧＤＶＫＮＦＦＮＹＬＲＤＮＫＧＹＮＡＡＧＱＹＶＬＳＹＱＦＧＴＥＰＦＴＧＳＧＴＬＮＶＡＳＷＴＡＳＩＮ    （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０）
Ｃｅｌ４５ａ  （トリコデルマ・リーゼイ）
ＭＫＡＴＬＶＬＧＳＬＩＶＧＡＶＳＡＹＫＡＴＴＴＲＹＹＤＧＱＥＧＡＣＧＣＧＳＳＳＧＡＦＰＷＱＬＧＩＧＮＧＶＹＴＡＡＧＳＱＡＬＦＤＴＡＧＡＳＷＣＧＡＧＣＧＫＣＹＱＬＴＳＴＧＱＡＰＣＳＳＣＧＴＧＧＡＡＧＱＳＩＩＶＭＶＴＮＬＣＰＮＮＧＮＡＱＷＣＰＶＶＧＧＴＮＱＹＧＹＳＹＨＦＤＩＭＡＱＮＥＩＦＧＤＮＶＶＶＤＦＥＰＩＡＣＰＧＱＡＡＳＤＷＧＴＣＬＣＶＧＱＱＥＴＤＰＴＰＶＬＧＮＤＴＧＳＴＰＰＧＳＳＰＰＡＴＳＳＳＰＰＳＧＧＧＱＱＴＬＹＧＱＣＧＧＡＧＷＴＧＰＴＴＣＱＡＰＧＴＣＫＶＱＮＱＷＹＳＱＣＬＰ    （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１）
Ｃｅｌ７４ａ  （トリコデルマ・リーゼイ）
ＭＫＶＳＲＶＬＡＬＶＬＧＡＶＩＰＡＨＡＡＦＳＷＫＮＶＫＬＧＧＧＧＧＦＶＰＧＩＩＦＨＰＫＴＫＧＶＡＹＡＲＴＤＩＧＧＬＹＲＬＮＡＤＤＳＷＴＡＶＴＤＧＩＡＤＮＡＧＷＨＮＷＧＩＤＡＶＡＬＤＰＱＤＤＱＫＶＹＡＡＶＧＭＹＴＮＳＷＤＰＳＮＧＡＩＩＲＳＳＤＲＧＡＴＷＳＦＴＮＬＰＦＫＶＧＧＮＭＰＧＲＧＡＧＥＲＬＡＶＤＰＡＮＳＮＩＩＹＦＧＡＲＳＧＮＧＬＷＫＳＴＤＧＧＶＴＦＳＫＶＳＳＦＴＡＴＧＴＹＩＰＤＰＳＤＳＮＧＹＮＳＤＫＱＧＬＭＷＶＴＦＤＳＴＳＳＴＴＧＧＡＴＳＲＩＦＶＧＴＡＤＮＩＴＡＳＶＹＶＳＴＮＡＧＳＴＷＳＡＶＰＧＱＰＧＫＹＦＰＨＫＡＫＬＱＰＡＥＫＡＬＹＬＴＹＳＤＧＴＧＰＹＤＧＴＬＧＳＶＷＲＹＤＩＡＧＧＴＷＫＤＩＴＰＶＳＧＳＤＬＹＦＧＦＧＧＬＧＬＤＬＱＫＰＧＴＬＶＶＡＳＬＮＳＷＷＰＤＡＱＬＦＲＳＴＤＳＧＴＴＷＳＰＩＷＡＷＡＳＹＰＴＥＴＹＹＹＳＩＳＴＰＫＡＰＷＩＫＮＮＦＩＤＶＴＳＥＳＰＳＤＧＬＩＫＲＬＧＷＭＩＥＳＬＥＩＤＰＴＤＳＮＨＷＬＹＧＴＧＭＴＩＦＧＧＨＤＬＴＮＷＤＴＲＨＮＶＳＩＱＳＬＡＤＧＩＥＥＦＳＶＱＤＬＡＳＡＰＧＧＳＥＬＬＡＡＶＧＤＤＮＧＦＴＦＡＳＲＮＤＬＧＴＳＰＱＴＶＷＡＴＰＴＷＡＴＳＴＳＶＤＹＡＧＮＳＶＫＳＶＶＲＶＧＮＴＡＧＴＱＱＶＡＩＳＳＤＧＧＡＴＷＳＩＤＹＡＡＤＴＳＭＮＧＧＴＶＡＹＳＡＤＧＤＴＩＬＷＳＴＡＳＳＧＶＱＲＳＱＦＱＧＳＦＡＳＶＳＳＬＰＡＧＡＶＩＡＳＤＫＫＴＮＳＶＦＹＡＧＳＧＳＴＦＹＶＳＫＤＴＧＳＳＦＴＲＧＰＫＬＧＳＡＧＴＩＲＤＩＡＡＨＰＴＴＡＧＴＬＹＶＳＴＤＶＧＩＦＲＳＴＤＳＧＴＴＦＧＱＶＳＴＡＬＴＮＴＹＱＩＡＬＧＶＧＳＧＳＮＷＮＬＹＡＦＧＴＧＰＳＧＡＲＬＹＡＳＧＤＳＧＡＳＷＴＤＩＱＧＳＱＧＦＧＳＩＤＳＴＫＶＡＧＳＧＳＴＡＧＱＶＹＶＧＴＮＧＲＧＶＦＹＡＱＧＴＶＧＧＧＴＧＧＴＳＳＳＴＫＱＳＳＳＳＴＳＳＡＳＳＳＴＴＬＲＳＳＶＶＳＴＴＲＡＳＴＶＴＳＳＲＴＳＳＡＡＧＰＴＧＳＧＶＡＧＨＹＡＱＣＧＧＩＧＷＴＧＰＴＱＣＶＡＰＹＶＣＱＫＱＮＤＹＹＹＱＣＶ    （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２）
ｐａＭａｎ５ａ  （ポドスポラ・アンセリナ）
ＭＫＧＬＦＡＦＧＬＧＬＬＳＬＶＮＡＬＰＱＡＱＧＧＧＡＡＡＳＡＫＶＳＧＴＲＦＶＩＤＧＫＴＧＹＦＡＧＴＮＳＹＷＩＧＦＬＴＮＮＲＤＶＤＴＴＬＤＨＩＡＳＳＧＬＫＩＬＲＶＷＧＦＮＤＶＮＮＱＰＳＧＮＴＶＷＦＱＲＬＡＳＳＧＳＱＩＮＴＧＰＮＧＬＱＲＬＤＹＬＶＲＳＡＥＴＲＧＩＫＬＩＩＡＬＶＮＹＷＤＤＦＧＧＭＫＡＹＶＮＡＦＧＧＴＫＥＳＷＹＴＮＡＲＡＱＥＱＹＫＲＹＩＱＡＶＶＳＲＹＶＮＳＰＡＩＦＡＷＥＬＡＮＥＰＲＣＫＧＣＮＴＮＶＩＦＮＷＡＴＱＩＳＤＹＩＲＳＬＤＫＤＨＬＩＴＬＧＤＥＧＦＧＬＰＧＱＴＴＹＰＹＱＹＧＥＧＴＤＦＶＫＮＬＱＩＫＮＬＤＦＧＴＦＨＭＹＰＧＨＷＧＶＰＴＳＦＧＰＧＷＩＫＤＨＡＡＡＣＲＡＡＧＫＰＣＬＬＥＥＹＧＹＥＳＤＲＣＮＶＱＫＧＷＱＱＡＳＲＥＬＳＲＤＧＭＳＧＤＬＦＷＱＷＧＤＱＬＳＴＧＱＴＨＮＤＧＦＴＩＹＹＧＳＳＬＡＴＣＬＶＴＤＨＶＲＡＩＮＡＬＰＡ    （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １３）
ｐａＭａｎ２６ａ  （ポドスポラ・アンセリナ）
ＭＶＫＬＬＤＩＧＬＦＡＬＡＬＡＳＳＡＶＡＫＰＣＫＰＲＤＧＰＶＴＹＥＡＥＤＡＩＬＴＧＴＴＶＤＴＡＱＶＧＹＴＧＲＧＹＶＴＧＦＤＥＧＳＤＫＩＴＦＱＩＳＳＡＴＴＫＬＹＤＬＳＩＲＹＡＡＩＹＧＤＫＲＴＮＶＶＬＮＮＧＡＶＳＥＶＦＦＰＡＧＤＳＦＴＳＶＡＡＧＱＶＬＬＮＡＧＱＮＴＩＤＩＶＮＮＷＧＷＹＬＩＤＳＩＴＬＴＰＳＡＰＲＰＰＨＤＩＮＰＮＬＮＮＰＮＡＤＴＮＡＫＫＬＹＳＹＬＲＳＶＹＧＮＫＩＩＳＧＱＱＥＬＨＨＡＥＷＩＲＱＱＴＧＫＴＰＡＬＶＡＶＤＬＭＤＹＳＰＳＲＶＥＲＧＴＴＳＨＡＶＥＤＡＩＡＨＨＮＡＧＧＩＶＳＶＬＷＨＷＮＡＰＶＧＬＹＤＴＥＥＮＫＷＷＳＧＦＹＴＲＡＴＤＦＤＩＡＡＴＬＡＮＰＱＧＡＮＹＴＬＬＩＲＤＩＤＡＩＡＶＱＬＫＲＬＥＡＡＧＶＰＶＬＷＲＰＬＨＥＡＥＧＧＷＦＷＷＧＡＫＧＰＥＰＡＫＱＬＷＤＩＬＹＥＲＬＴＶＨＨＧＬＤＮＬＩＷＶＷＮＳＩＬＥＤＷＹＰＧＤＤＴＶＤＩＬＳＡＤＶＹＡＱＧＮＧＰＭＳＴＱＹＮＥＬＩＡＬＧＲＤＫＫＭＩＡＡＡＥＶＧＡＡＰＬＰＧＬＬＱＡＹＱＡＮＷＬＷＦＡＶＷＧＤＤＦＩＮＮＰＳＷＮＴＶＡＶＬＮＥＩＹＮＳＤＹＶＬＴＬＤＥＩＱＧＷＲＳ    （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４）
Ｓｗｏｌｌｅｎｉｎ  （トリコデルマ・リーゼイ）
ＭＡＧＫＬＩＬＶＡＬＡＳＬＶＳＬＳＩＱＱＮＣＡＡＬＦＧＱＣＧＧＩＧＷＳＧＴＴＣＣＶＡＧＡＱＣＳＦＶＮＤＷＹＳＱＣＬＡＳＴＧＧＮＰＰＮＧＴＴＳＳＳＬＶＳＲＴＳＳＡＳＳＳＶＧＳＳＳＰＧＧＮＳＰＴＧＳＡＳＴＹＴＴＴＤＴＡＴＶＡＰＨＳＱＳＰＹＰＳＩＡＡＳＳＣＧＳＷＴＬＶＤＮＶＣＣＰＳＹＣＡＮＤＤＴＳＥＳＣＳＧＣＧＴＣＴＴＰＰＳＡＤＣＫＳＧＴＭＹＰＥＶＨＨＶＳＳＮＥＳＷＨＹＳＲＳＴＨＦＧＬＴＳＧＧＡＣＧＦＧＬＹＧＬＣＴＫＧＳＶＴＡＳＷＴＤＰＭＬＧＡＴＣＤＡＦＣＴＡＹＰＬＬＣＫＤＰＴＧＴＴＬＲＧＮＦＡＡＰＮＧＤＹＹＴＱＦＷＳＳＬＰＧＡＬＤＮＹＬＳＣＧＥＣＩＥＬＩＱＴＫＰＤＧＴＤＹＡＶＧＥＡＧＹＴＤＰＩＴＬＥＩＶＤＳＣＰＣＳＡＮＳＫＷＣＣＧＰＧＡＤＨＣＧＥＩＤＦＫＹＧＣＰＬＰＡＤＳＩＨＬＤＬＳＤＩＡＭＧＲＬＱＧＮＧＳＬＴＮＧＶＩＰＴＲＹＲＲＶＱＣＰＫＶＧＮＡＹＩＷＬＲＮＧＧＧＰＹＹＦＡＬＴＡＶＮＴＮＧＰＧＳＶＴＫＩＥＩＫＧＡＤＴＤＮＷＶＡＬＶＨＤＰＮＹＴＳＳＲＰＱＥＲＹＧＳＷＶＩＰＱＧＳＧＰＦＮＬＰＶＧＩＲＬＴＳＰＴＧＥＱＩＶＮＥＱＡＩＫＴＦＴＰＰＡＴＧＤＰＮＦＹＹＩＤＩＧＶＱＦＳＱＮ    （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５）
【００８６】
実施形態では、バイオマス分解酵素は本明細書に記載される、例えば表１に列記されたバイオマス分解酵素と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列、あるいはこの機能的フラグメント、本明細書に記載される、例えば表１に列記されたバイオマス分解酵素と、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列あるいはこの機能的フラグメントを含む。
【００８７】
２つ以上のアミノ酸配列または核酸配列の前後関係における同一性パーセントは、同一である２つ以上の配列を意味する。２つの配列は、下記の配列比較アルゴリズムの１つまたはマニュアル配列および目視調査によって判断された比較範囲または指定領域にわたって最大の一致に関して比較および整列されたとき、２つの配列が同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセンテージを有する場合（例えば、特定された領域、または特定されないときは全配列にわたって、６０％の同一性、任意に７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）、「ほぼ同一」である。任意に、同一性は長さが少なくとも約５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチドである領域にわたって存在する。より好ましくは、同一性は、長さが少なくとも約２００個以上のアミノ酸、または少なくとも約５００または１０００個以上のヌクレオチドである領域にわたって存在する。
【００８８】
配列比較では、１つの配列が一般的には参照配列としての役割を担い、これに対して１つまたは複数の試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用することができ、あるいは、代替パラメータを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。比較のための配列のアラインメント方法は、従来技術で良く知られている。比較に最適な配列アラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局地的相同性アルゴリズム（１９７０），Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃ、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム（１９７０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似法のための探索（１９８８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，およびＴＦＡＳＴＡ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、またはマニュアルアラインメントおよび目視精査（例えば、Ｂｒｅｎｔら，（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照）によって実施できる。
【００８９】
配列同一性および配列類似性パーセントを決定するのに適したアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０にそれぞれ説明されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは国立生物工学情報センターを通して公的に利用可能である。
【００９０】
機能的変異体は１つまたは複数の変異を含み得、これによって変異体は酵素が起源とする微生物によって産生される本明細書に記載されるバイオマス分解酵素などの酵素のバイオマス分解活性などの活性レベルを保持する。一実施形態では、機能的変異体は相当する自然発生バイオマス分解酵素としてのバイオマス分解活性の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）を有する。実施形態では、機能的変異体は相当する自然発生バイオマス分解酵素としてのバイオマス分解活性の少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、またはそれ以上を有する。バイオマス分解活性は従来技術で知られている機能的アッセイを用いて試験することができる。例えば、バイオマス分解酵素がセルラーゼである場合、そのときセルラーゼ活性を測定する機能的アッセイが実施できる。
【００９１】
機能的変異体に存在する変異はアミノ酸置換、付加、および欠失を含む。変異は部位特異的変異誘発およびＰＣＲ仲介変異誘発のような、従来技術で知られている標準的な技術によって導入することができる。変異誘発はまた、ＣＲＩＳＰＲ（群生性等間隔短回文反復配列）／Ｃａｓシステムを用いて達成することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは細菌および古細菌に本来的に認められ、マウスまたは霊長類のような真核生物における遺伝子編集（特定遺伝子のサイレンシング、エンハンシング、または変異形成）での使用のために改変されている。Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔら（２０１２），Ｎａｔｕｒｅ  ４８２：３３１−８。これは特異的に設計されたＣＲＩＳＰＲおよび１つまたは複数の適切なＣａｓを含むプラスミドを細胞に導入することによって達成される。
【００９２】
この突然変異は保存的アミノ酸置換であることができ、アミノ酸残基は類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、従来技術で定められている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。従って、バイオマス分解酵素内の１つまたは複数のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸で置換することができ、得られるバイオマス分解活性は野生型バイオマス分解酵素に匹敵する（例えば、当該バイオマス分解活性の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％）。あるいは、突然変異は、アミノ酸残基が異なる側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたアミノ酸置換であることができる。
【００９３】
このような変異は、セロビアーゼ、リグニナーゼ、エンドグルカナーゼ、またはセロビオヒドロラーゼなどのバイオマス分解酵素の様々な酵素的特性に変化または影響を及ぼし得る。例えば、このような変異は、バイオマス分解酵素などの酵素の活性、例えばバイオマス分解活性、熱安定性、反応の最適ｐＨ、酵素反応速度、または基質認識に変化または影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態では、変異は変異体のバイオマス分解活性を、Ｔ．リーゼイによって産生されるセルラーゼなどのバイオマス分解酵素に比べて増加させる。いくつかの実施形態では、変異は変異体の熱安定性を、Ｔ．リーゼイによって産生されるセルラーゼなどの野生型バイオマス分解酵素に比べて増加または低下させる。一実施形態では、変異は変異体がバイオマス分解反応を最適に実施するｐＨ範囲を、Ｔ．リーゼイによって産生されるセルラーゼなどの野生型バイオマス分解酵素に比べて変化させる。一実施形態では、変異はバイオマス分解反応の反応速度（例えば、Ｋｃａｔ、ＫＭ、Ｋｃａｔ／ＫＭ、またはＫＤ）を、Ｔ．リーゼイによって産生されるセルラーゼなどの野生型バイオマス分解酵素に比べて増加または低下させる。一実施形態では、変異は基質を認識または結合するセロビアーゼの能力を、Ｔ．リーゼイによって産生されるセルラーゼなどの野生型バイオマス分解酵素に比べて増加または低下させる。
【００９４】
細胞培養および誘発
タンパク質、例えばアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素を産生することができる微生物は細胞培養中に存在することができる。細胞培養は細胞培養培地に１つまたは複数の細胞を含む。細胞培養培地は、細胞維持、細胞生存、細胞生育、および／または細胞増殖を支持する成分を含む水性細胞培養培地であることができる。細胞培養培地は、一般的には、アンモニウム塩、リン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、亜鉛塩、またはコバルト塩などの生理学的な塩、アミノ酸、水、および任意に炭素源を含むことができる。一実施形態では、本明細書に記載される微生物の増殖に適した細胞培養培地は、硫酸アンモニウムおよび／または水酸化アンモニウムなどのアンモニウム塩、水酸化カリウムなどのカリウム塩、塩化カルシウムなどのカルシウム塩、硫酸マグネシウムなどのマグネシウム塩、硫酸マンガンなどのマンガン塩、硫酸鉄などの鉄塩、硫酸亜鉛などの亜鉛塩、塩化コバルトなどのコバルト塩、フタル酸、乳糖、ＡＣＥＴＯＢＡＮ（登録商標）などの抗生物質、およびグルコースなどの炭素源を含む。例示的な増殖培地を表２および表３に要約する。
【００９５】
微生物または細胞培養は、例えばフィード添加、糖のような炭素源と接触させて微生物の生育または増殖を支持する。一実施形態では、微生物または細胞培養はフィード添加、糖などと接触させる。
【００９６】
微生物が培養中で増殖するとき、細胞培養は細胞培養容器などの１つの容器から大きい容器に移して微生物を増殖し続けさせて促進させる。例えば、微生物は最初の容器中で、本明細書で説明されている微生物が増殖するような適切な条件下で接触させる。増殖はモニタリングでき、所望の生育レベル、例えば特定の生育期、あるいは所望の増殖量が例えば培養の濁度または細胞数によって測定されたときには、微生物は第一容器よりも容積などが大きい第二容器に移すことができる。微生物をさらに大きい第二容器に移すことによって、微生物を増殖し続けさせて促進させる。実施形態では、微生物は１回、例えば第一容器からそれより大きい第二容器に移す。実施形態では、微生物は１回以上、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回移し、各移動では、微生物は移される前の容器よりも大きい容器に移される。
【００９７】
本明細書で説明される微生物を移して培養するのに適した容器は従来技術で知られている任意の細胞容器を含む。適切な容器の例には、限定されないが、細胞培養フラスコ、ローラーボトル、バイオリアクター、またはタンクを含む。
【００９８】
細胞生存を維持または細胞増殖を促進するのに適した他の培養条件は、従来技術で知られている。考慮する細胞培養条件には、ｐＨ、温度、酸素量、および運動が含まれる。細胞培養、例えば培地のｐＨは、一般的には生理学的なｐＨ、例えばｐＨ４〜８の間、またはｐＨ５〜７の間、例えばｐＨ５、ｐＨ６、またはｐＨ７である。バイオマス分解酵素を産生する微生物の生育のための温度は、一般的には２０〜４０℃の間、例えば３０℃である。いくつかの実施形態では、微生物の特定の株は３２℃または３７℃などの高い温度、あるいは２７℃などの低い温度で酵素産生の高められた増殖を示し得る。バイオマス分解酵素を産生する微生物の生育のために最適な酸素量は、一般的には１５〜３０％の間、例えば２０％である。細胞培養は静置であることができ、あるいは維持または増殖を促進するために運動を使用し得る。例えば、細胞培養はローリング、振とう、または撹拌して細胞増殖を高め得る。本明細書で開示される細胞培養条件は単なる例示であり、限定されたものと解釈されるべきでない。細胞培養条件を本明細書に明確に示されたものから変えることは、想像または経験的に判断され得、使用される微生物の種または株に依存し得る。バイオマス分解酵素を産生できる微生物の増殖に適した細胞培養条件は、微生物の培養の細胞数の増加をもたらす。バイオマス分解酵素の産生に適した細胞培養条件は、バイオマス分解酵素を産生する微生物の１つまたは複数の細胞をもたらす。
【００９９】
細胞培養が所望の生育レベル、例えば特定の生育期または培養容積サイズに達したとき、あるいは細胞培養、例えば水性部分に増殖を刺激するために利用される炭素源、例えば糖がほとんど含まれないとき、細胞培養はタンパク質、例えば本明細書で説明されるアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素を産生するために誘発することができる。カラメル化糖生成物を含む本明細書で説明される組成物を、バイオマス分解酵素を産生することができる微生物または細胞培養に添加、例えばフィード添加し、これによってバイオマス分解酵素を産生するように微生物を誘発する。一実施形態では、カラメル化糖生成物を含む組成物は培養に直接加える。一実施形態では、カラメル化糖生成物を含む組成物は、バイオマス分解酵素などのタンパク質の産生を維持および促進する成分を含む酵素産生培養培地に加える。そして微生物を酵素産生培養培地に移すまたは培養する。酵素産生培養培地は生理学的な塩、例えばアンモニウム塩、およびカラメル化糖生成物および／または誘発物質バイオマスを含む組成物を含むことができ、ｐＨ４〜７、例えばｐＨ６．０に調整する。一実施形態では、酵素産生培養培地は硫酸アンモニウム、コメぬか、およびカラメル化糖生成物および／または誘発物質バイオマス、例えばトウモロコシ穂軸または外皮を含む組成物を含み、６Ｍ水酸化アンモニウムなどでｐＨ６に調整する。
【０１００】
タンパク質、例えばアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素の産生が、微生物を本明細書で説明されるカラメル化糖生成物と誘発物質バイオマスの組み合わせと接触させることによって誘発することができる。誘発物質バイオマスはセルロースを含むデンプン材であることができる。バイオマスはまたヘミセルロースおよび／またはリグニンを含み得る。誘発物質バイオマスは、農産物もしくは農業廃棄物、紙製品もしくは紙廃棄物、農林物資、または一般廃棄物、またはこれらの任意の組み合わせの１つまたは複数を含むことができる。農産物または農業廃棄物は、例えばヒトまたは動物による使用または消費のために栽培、収穫、または加工することができる材料、あるいは栽培、収穫、または加工方法から生じる任意の中間物質、副産物、または廃棄物を含む。農産物または農業廃棄物は、限定されないが、サトウキビジュート、大麻、亜麻、竹、サイザル麻、アルファルファ、干し草、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、アンデスカタバミ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤマノイモ、マメ、ソラマメ、ヒラマメ、エンドウマメ、グラス、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀物残渣、キャノーラ藁、コムギ藁、オオムギ藁、オートムギ藁、コメ藁、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ繊維、ヤシ毛、ビートパルプ、バガス、ダイズ茎葉、穀類残渣、コメ籾殻、オートムギ籾殻、コムギ籾殻、オオムギ籾殻、または外皮、あるいはこれらの組み合わせを含む。紙製品または紙廃棄物は、紙製品を製造するために使用される材料、任意の紙製品、あるいは紙製品の製造または分解から生じる任意の中間物質、副産物、または廃棄物を含む。紙製品または紙廃棄物は、限定されないが、紙、着色紙、塗被紙、コーティング紙、段ボール紙、充填された紙、雑誌、印刷物、プリンタ紙、ポリコート紙、カードストック、厚紙、板紙、または紙パルプ、あるいはこれらの組み合わせを含む。農林物資または廃棄物は木材の栽培、収穫、または加工から生じる材料、あるいは木材の栽培、収穫、または加工から生じる任意の中間物質、副産物、または廃棄物を含む。農林物資または廃棄物は、限定されないが、アスペン木材、木の任意の属または種由来の木材、パーティクルボード、木材チップ、またはおがくず、あるいはこれらの組み合わせを含む。一般廃棄物は、限定されないが、肥料、汚水、または臓物、あるいはこれらの組み合わせを含む。
【０１０１】
一実施形態では、カラメル化糖生成物および誘発物質バイオマスは微生物または細胞培養に同時に加えられる。カラメル化糖生成物および誘発物質バイオマスは同一組成物に存在することができ、あるいは別々の組成物に存在することができる。カラメル化糖生成物および誘発物質バイオマスが同一組成物に存在するとき、カラメル化糖生成物および誘発物質バイオマスは酵素産生培養培地の成分であることができる。別の実施形態では、カラメル化糖生成物および誘発物質バイオマスは別々の組成物に存在し、微生物または細胞培養に連続して加えられる。例えば、カラメル化糖生成物は、誘発物質バイオマスを微生物または細胞培養に加える前または後に微生物または細胞培養に加えることができる。このような連続的な誘発工程では、カラメル化糖生成物の添加と誘発物質バイオマスの添加の間の期間は数時間、例えば１、２、３、４、５、６、１２、１８時間、またはそれ以上の時間、あるいは数日、例えば１、２、３、４、５、６、７日、またはそれ以上の日数であることができる。
【０１０２】
カラメル化糖生成物は微生物に、例えば培養への直接添加または酵素産生培養培地によって、１日に２回、１日に１回、１日おき、３日毎、または週に１回、導入することができる。カラメル化糖生成物は微生物培養培地の１〜２０ｇ／Ｌ、１〜１５ｇ／Ｌ、１〜１０ｇ／Ｌ、１〜５ｇ／Ｌ、２〜１５ｇ／Ｌ、２〜１０ｇ／Ｌ、２〜５ｇ／Ｌ、５〜２０ｇ／Ｌ、５〜１５ｇ／Ｌ、５〜１０ｇ／Ｌ、４〜５ｇ／Ｌ、１０〜２０ｇ／Ｌ、または１０〜１５ｇ／Ｌの濃度で加えることができる。カラメル化糖生成物は微生物培養培地の０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、または２０ｇ／Ｌ、あるいはこれ以上の濃度で加えることができる。一実施形態では、カラメル化糖生成物は微生物に１日１回４ｇ／Ｌ、または１日１回５ｇ／Ｌで加える。
【０１０３】
誘発物質バイオマスは微生物に、例えば培養への直接添加または酵素産生培養培地によって、１日に２回、１日に１回、１日おき、３日毎、または週に１回、導入することができる。誘発物質バイオマスは微生物培養培地の１〜２０ｇ／Ｌ、１〜１５ｇ／Ｌ、１〜１０ｇ／Ｌ、１〜５ｇ／Ｌ、２〜１５ｇ／Ｌ、２〜１０ｇ／Ｌ、２〜５ｇ／Ｌ、５〜２０ｇ／Ｌ、５〜１５ｇ／Ｌ、５〜１０ｇ／Ｌ、１０〜２０ｇ／Ｌ、または１０〜１５ｇ／Ｌの濃度で加えることができる。誘発物質バイオマスは微生物培養培地の０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、または２０ｇ／Ｌ、あるいはこれ以上の濃度で加えることができる。一実施形態では、誘発物質バイオマスは微生物に１日１回５ｇ／Ｌで加える。
【０１０４】
実施形態では、タンパク質、例えばアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素の産生を誘発するために使用するカラメル化糖生成物または誘発物質バイオマスの濃度は、０．１％重量／容量（ｗ／ｖ）、０．５％ｗ／ｖ、１％ｗ／ｖ、２％ｗ／ｖ、または５％ｗ／ｖ以上、ならびに２５％ｗ／ｖ、２０％ｗ／ｖ、１５％ｗ／ｖ、および１０％ｗ／ｖ以下である。
【０１０５】
微生物はタンパク質、例えばアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素を産生するために、１日以上、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４，１５、２０、または３０日、あるいはそれ以上の日数の間誘発することができる。誘発期間は微生物培養の容積または細胞数などのサイズ、使用する微生物、必要とされるタンパク質、例えばアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素の量に依存することができる。一実施形態では、微生物はバイオマス分解酵素を産生するために１１または１２日間誘発する。
【０１０６】
タンパク質、例えばアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素の産生は、細胞によって産生された細胞培養中に存在するタンパク質、例えばバイオマス分解酵素の量を測定することによって細胞培養から測定できる。例えば、培養の水性部分を、例えば細胞培養あるいは細胞培養の小分けまたは試料を遠心分離することによって分離できる。ブラッドフォードアッセイまたはナノドロップタンパク質定量のような従来技術で知られているタンパク質アッセイが、培養の水性部分におけるタンパク質の量または力価、例えばｇ／Ｌを測定するために使用できる。タンパク質力価は微生物または細胞培養によって産生されたバイオマス分解酵素の量を示す。コントロール試料を使用して、バイオマス分解酵素を産生するように誘発されていない細胞培養におけるタンパク質の量に対して基準化することができる。
【０１０７】
本明細書で説明されるように微生物によって産生されるタンパク質、例えばアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素は、本明細書で説明されるバイオマス材を糖生成物またはバイオ燃料などの生成物に加工するような生物学的または工業的プロセスで使用することができる。バイオマス材の生成物への処理、例えばバイオマス材の糖またはバイオ燃料への分解または転化するための方法が、本明細書でさらに説明される。本明細書で説明されるバイオマス分解酵素などのタンパク質を産生するために誘発されている微生物またはこの培養は、処理すべきバイオマスに直接加えることができる。あるいは、処理すべきバイオマスを、バイオマス分解酵素を産生するために誘発されている微生物または培養に直接加えることができる。
【０１０８】
本明細書で説明されるように微生物によって産生されるタンパク質、例えばアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素は、バイオマス処理で使用する前に分離または精製することもできる。バイオマス分解酵素のようなタンパク質は、微生物の細胞などの微生物、酵素誘発後に残存するカラメル化糖生成物などの酵素産生を誘発するために使用されたカラメル化糖生成物、酵素誘発後に残存する誘発物質バイオマスなどの酵素産生を誘発するために使用された誘発物質バイオマス、グルコース、生理学的な塩などの細胞培養培地の成分、およびバイオマス分解活性を有さない培養中に存在する１種類以上のタンパク質からなる成分の１種類以上を分離することができる。バイオマス分解酵素などのタンパク質は、バイオマス分解酵素がバイオマス分解活性を有さない他のタンパク質、細胞デブリ、微生物由来などの核酸、カラメル化糖生成物、および／または誘発物質バイオマスをほとんど含まないように精製できる。酵素の分離または精製の方法は従来技術で知られており、遠心分離、ろ過、タンパク質分画化、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【０１０９】
バイオマスの生成物への転換
本発明はタンパク質、例えばアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素を用いてバイオマスを生成物に変換するための方法および組成物を提供し、ここでタンパク質、例えばアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素は、本明細書で説明されるように、微生物をカラメル化糖生成物を含む組成物と接触させることによって産生される。バイオマスを生成物、例えば糖生成物などの生成物に転換する方法は、例えば米国特特許出願２０１４／００１１２５８で説明されるように従来技術で知られており、その内容はその全体が参照によって組み込まれる。簡単に説明すると、バイオマスは抵抗性を低下させるなどの最適な前処理を行い、処理したバイオマスを糖生成物（例えば、グルコースおよび／またはキシロース）を産生するバイオマス分解酵素またはセルロース分解酵素とインキュベーションすることを含む糖化工程によって糖化する。ついで、糖生成物はさらに発酵、蒸留などによって処理して他の精製物を生じる。このような生成物にはアルコール（例えば、エタノール、イソブタノール、またはｎ−ブタノール）、糖アルコール（例えば、エリトリトール、キシリトール、またはソルビトール）、または有機酸（例えば、乳酸、ピルビン酸、コハク酸）を含む。
【０１１０】
生成物
本明細書で説明される処理を用いて、バイオマス材をエネルギー、燃料、食品、および材料のような１種類以上の生成物に転換することができる。生成物の具体的な例には、限定されないが、水素、糖類（例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、二糖類、オリゴ糖類、および多糖類）、アルコール（例えば、エタノール、ｎ−プロパノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、またはｎ−ブタノールのような一価アルコールまたは二価アルコール）、水和化または含水アルコール（例えば、１０％、２０％、３０％、または４０％以上の水を含む）、バイオディーゼル、有機酸（例えば、乳酸）、炭化水素（例えば、メタン、エタン、プロパン、イソブテン、ペンタン、ｎ−ヘキサン、バイオディーゼル、バイオガソリン、およびこれらの混合物）、共生成物（例えば、セルロース分解タンパク質（酵素）または単一細胞タンパク質のようなタンパク質）、ならびにいずれかの組み合わせまたは相対濃度、および任意にいずれかの添加物（例えば、燃料添加物）との組み合わせにおけるこれらのいずれかの混合物を含む。
【０１１１】
別の例には、カルボン酸、カルボン酸の塩、カルボン酸とカルボン酸の塩の混合物、カルボン酸のエステル（例えばメチル、エチル、およびｎ−プロピルエステル）、ケトン（例えば、アセトン）、アルデヒド（例えば、アセトアルデヒド）、αおよびβ不飽和酸（例えば、アクリル酸）、およびオレフィン（例えば、エチレン）を含む。
【０１１２】
他のアルコールおよびアルコール誘導体には、プロパノール、プロピレングリコール、１，４−ブタンジオール、１，３−プロパンジオール、糖アルコール、およびポリオール（例えば、グリコール、グリセロール、エリスリトール、スレイトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、イジトール、イノシトール、ボレミトール、イソマルト、マルチトール、ラクチトール、マルトトリトール、マルトテトラトール、およびポリグリシトール、ならびに他のポリオール）、ならびにこれらのアルコールのいずれかのメチルまたはエチルエステルを含む。
【０１１３】
他の生成物には、メチルアクリレート、メチルメタクリレート、乳酸、クエン酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、コハク酸、吉草酸、カプロン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、シュウ酸、マロン酸、グルタル酸、オレイン酸、リノール酸、グリコール酸、γ−ヒドロキシ酪酸、およびこれらの混合物、これらの酸のいずれかの塩、これらの酸のいずれかとこれらのそれぞれの塩の混合物を含む。
【０１１４】
一実施形態では、本明細書で示されるバイオマスを転換するために、タンパク質、例えば本明細書で説明されるように産生されるアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素を用いることを含む方法の生成物は、糖生成物である。一実施形態では、糖生成物はグルコースである。一実施形態では、糖生成物はキシロースである。一実施形態では、糖生成物はグルコースとキシロースの混合物である。
【０１１５】
一実施形態では、本明細書で示されるバイオマスを転換するために、タンパク質、例えば本明細書で説明されるように産生されるアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素を用いることを含む方法の生成物は、有機酸生成物である。一実施形態では、有機酸生成物は乳酸である。
【０１１６】
バイオマス
本明細書で説明される方法を用いて処理されるバイオマスは、デンプン材および／またはセルロース、例えばリグノセルロース材を含むセルロース材である。バイオマスはまた、ヘミセルロースおよび／またはリグニンを含み得る。バイオマスは農産物もしくは農業廃棄物、紙製品もしくは紙廃棄物、農林物資、または一般廃棄物、またはこれらの任意の組み合わせの１つまたは複数を含むことができる。農産物または農業廃棄物は、例えばヒトまたは動物による使用または消費のために栽培、収穫、または加工することができる材料、あるいは栽培、収穫、または加工方法から生じる任意の中間物質、副産物、または廃棄物を含む。農産物または農業廃棄物は、限定されないが、サトウキビジュート、大麻、亜麻、竹、サイザル麻、アルファルファ、干し草、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、アンデスカタバミ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤマノイモ、マメ、ソラマメ、ヒラマメ、エンドウマメ、グラス、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀物残渣、キャノーラ藁、コムギ藁、オオムギ藁、オートムギ藁、コメ藁、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ繊維、ヤシ毛、ビートパルプ、バガス、ダイズ茎葉、穀類残渣、コメ籾殻、オートムギ籾殻、コムギ籾殻、オオムギ籾殻、または外皮、あるいはこれらの組み合わせを含む。紙製品または紙廃棄物は、紙製品を製造するために使用される材料、任意の紙製品、あるいは紙製品の製造または分解から生じる任意の中間物質、副産物、または廃棄物を含む。紙製品または紙廃棄物は、限定されないが、紙、着色紙、塗被紙、コーティング紙、段ボール紙、充填された紙、雑誌、印刷物、プリンタ紙、ポリコート紙、カードストック、厚紙、板紙、または紙パルプ、あるいはこれらの組み合わせを含む。農林物資または廃棄物は木材の栽培、収穫、または加工から生じる材料、あるいは木材の栽培、収穫、または加工から生じる任意の中間物質、副産物、または廃棄物を含む。農林物資は、限定されないが、アスペン木材、木の任意の属または種由来の木材、パーティクルボード、木材チップ、またはおがくず、あるいはこれらの組み合わせを含む。一般廃棄物は、限定されないが、肥料、汚水、または臓物、あるいはこれらの組み合わせを含む。
【０１１７】
生成物に転換されるバイオマスは誘発物質バイオマスと同一であることができる。あるいは、生成物に転換されるバイオマスは誘発物質バイオマスとは異なる。
【０１１８】
一実施形態では、バイオマスは本明細書で説明されるプロセスで使用する前に処理する。例えば、バイオマスを処理してバイオマスの抵抗性、そのカサ密度を低下、および／またはその表面積を増加させる。適切なバイオマス処理プロセスには、限定されないが、電子による衝撃、超音波処理、酸化、熱分解、水蒸気爆発、化学処理、機械的処理、および凍結粉砕を含む。好ましくは、処置方法は電子による衝撃である。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、電子衝撃はバイオマスが少なくとも０．５Ｍｒａｄ、例えば少なくとも５、１０、２０、３０、または少なくとも４０Ｍｒａｄの全線量を受けるまで実施する。いくつかの実施形態では、処置はバイオマスが約０．５〜約１５０Ｍｒａｄ、約１〜約１００Ｍｒａｄ、約５〜約７５Ｍｒａｄ、約２〜約７５Ｍｒａｄ、約１０〜約５０Ｍｒａｄ、例えば、約５〜約５０Ｍｒａｄ、約２０〜約４０Ｍｒａｄ、約１０〜約３５Ｍｒａｄ、または約２０〜約３０Ｍｒａｄの線量を受けるまで実施する。いくつかの実施では、２５〜３０Ｍｒａｄの全線量が好ましく、理想的には２秒にわたって、例えば５Ｍｒａｄ／照射で各照射を約１秒間で適用する。７〜９Ｍｒａｄを超える線量の適用は、場合によっては供給原材料の熱分解を生じ得る。
【０１２０】
バイオマス材（例えば、農産物または農業廃棄物、紙製品または紙廃棄物、農林物資、あるいは一般廃棄物）を供給原料として使用して、有用な中間物質および生成物、例えば有機酸、有機酸の塩、無水物、有機酸のエステル、および燃料、例えば内燃エンジンまたは燃料セル用の供給原料を産生することができる。都市廃棄物流、および新聞紙、クラフト紙、段ボール紙、またはこれの混合物を含む流れのような紙廃棄物流などの、容易に利用可能であるが、しばしば処理が困難であり得るセルロース材および／またはリグノセルロース材を供給原料として使用できるシステムおよびプロセスが本明細書で説明される。
【０１２１】
バイオマスを容易に処理することができる形態に転換するため、バイオマスにおけるグルカン−またはキシラン−含有セルロースを、糖化といわれるプロセスにおける糖化剤によって、糖などの低分子量炭水化物に加水分解することができる。糖化剤はバイオマス分解酵素などの１種類以上の酵素、または酸、あるいはこれらの混合物を含むことができる。そして低分子量炭水化物は、例えば単一細胞タンパク質プラント、酵素製造プラント、またはエタノール製造施設などの燃料プラントのような既存の製造プラントで使用することができる。
【０１２２】
バイオマスはバイオマス分解酵素などの酵素を用いて、バイオマス材と酵素を水性溶液などの溶媒中で混合することによって加水分解することができる。酵素を本明細書で説明される方法に従って誘発および／または産生することができる。一実施形態では、バイオマスは微生物を本明細書で説明されるカラメル化糖生成物を含む組成物と接触させることによって産生されているバイオマス分解酵素を用いて加水分解する。
【０１２３】
具体的には、バイオマス分解酵素はバイオマス（バイオマスのセルロースおよび／またはリグニン部分など）を分解することができる、あるいは様々なセルロース分解酵素（セルラーゼ）、リグニナーゼ、または種々の小分子バイオマス分解代謝物を含むまたは産生する微生物によって供給され得る。これらの酵素はバイオマスの結晶セルロースまたはリグニン部分を相乗的に分解するように作用する酵素の複合体であり得る。セルロース分解酵素の例には、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびセロビアーゼ（β−グルコシダーゼ）を含む。
【０１２４】
糖化の際、バイオマスなどのセルロース基質はオリゴマー中間物質を産生するランダムな位置でエンドグルカナーゼによって最初に加水分解され得る。そしてこれらの中間物質はセロビオヒドロラーゼのようなエキソ分裂グルカナーゼのための基質であり、セルロースポリマーの端からセロビオースを産生する。セロビオースはグルコースの水溶性１，４−結合ダイマーである。最後に、セロビアーゼがセロビオースを切断してグルコースを生じる。このプロセスの効率（例えば、加水分解する時間および／または加水分解の完全性）はセルロース材の抵抗性に依存する。
【０１２５】
糖化
抵抗性低下したバイオマスは前述のバイオマス分解酵素を用いて、一般的には抵抗性低下したバイオマスおよび例えば１種類以上のバイオマス分解酵素を含む糖化剤を水性溶液などの流体メディウム中で混合することによって処理する。いくつかの例では、全体の内容が本明細書に組み込まれている２０１２年４月２６日に公表されたＭｅｄｏｆｆおよびＭａｓｔｅｒｍａｎによる米国特許出願公開２０１２／０１００５７７Ａ１に記載されているように、糖化の前にバイオマスを沸騰、浸漬、または熱水中で変性させる。
【０１２６】
微生物におけるタンパク質、例えばアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素の産生を増強するための方法および組成物が本明細書で提供される。本明細書で説明される誘発組成物および方法を用いて産生されるタンパク質、例えばアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素を、糖化剤のような糖化プロセスに使用することができる。糖化剤は処理済みバイオマスなどのバイオマスに直接加えて糖化プロセスを開始および実施し、糖生成物を産生する。
【０１２７】
糖化剤は本明細書で説明される誘発組成物および方法を用いて産生されるバイオマス分解酵素などのタンパク質を含み得る。本明細書で説明される誘発組成物および方法を用いて産生されるバイオマス分解酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、またはリグニナーゼであることができる。一実施形態では、本明細書で説明される誘発組成物および方法を用いて産生されるバイオマス分解酵素は、表１に列記された酵素の１種類以上であることができる。糖化剤は、別のタンパク質、例えば本明細書で説明される誘発組成物または方法を用いて得られなかったアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素を、糖化プロセスに加える１種類以上の追加の薬剤としてさらに含み得る。
【０１２８】
実施形態では、バイオマスがタンパク質、例えば本明細書で説明されるアミラーゼまたはバイオマス分解酵素などの酵素を産生するために誘発されている微生物を含む培養に加えられる。他の糖化剤、例えばタンパク質（例えば、バイオマス分解酵素）または酸を、糖化プロセスのためのバイオマスおよび培養混合物に加えることができる。
【０１２９】
糖化プロセスは製造プラントにおけるタンク（例えば、少なくとも４０００Ｌ、４０，０００Ｌ、５００，０００Ｌ、２，０００，０００Ｌ、４，０００，０００Ｌ、または６，０００，０００Ｌ、あるいはこれ以上の容積を有するタンク）で部分的または全て実施すること、および／または気動車、タンクローリー、あるいは船舶の超大型タンカーまたは船倉などの輸送中に部分的または全てを実施することができる。完全な糖化に要する時間は処理条件および使用されるバイオマス材または酵素に依存する。糖化が製造プラントにおいて制御された条件下で実施される場合、セルロースはグルコースなどの糖に約１２〜９６時間でほぼ完全に転換され得る。糖化が輸送中に部分的または全て実施される場合、糖化は長くかかり得る。
【０１３０】
好ましい実施形態では、糖化反応は酵素反応を生じる最適ｐＨ、例えば、バイオマス分解酵素の活性に最適なｐＨで起きる。好ましくは、糖化反応のｐＨはｐＨ４〜４．５である。好ましい実施形態では、糖化反応は酵素を生じる最適な温度、例えばバイオマス分解酵素の活性に最適な温度で起こる。好ましくは、糖化反応の温度は４２〜５２℃である。
【０１３１】
タンク内容物は、例えば、本明細書に参照によって全開示が組み込まれているＷＯ２０１０／１３５３８０として英語で公表されて米国を指定した２０１０年５月１８日出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５３３１に記載されるジェット混合を用いて、糖化の際に混合されることが一般的に好ましい。
【０１３２】
界面活性剤の添加は糖化率を増強することができる。界面活性剤の例には、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０ポリエチレングリコールのような非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤、または両親媒性界面活性剤を含む。
【０１３３】
糖化から得られる糖溶液の濃度は比較的高く、例えば重量で５％、７．５％、１０％、１０．５％、または４０％超、または５０、６０、７０％超、あるいは８０％超でさえあることが一般的に好ましい。水を蒸発などによって除去して糖溶液の濃度を増加し得る。これは輸送する容積を低下し、また溶液における微生物生育を阻害する。
【０１３４】
あるいは、低濃度の糖溶液を使用し得、この場合、広範囲スペクトル抗生物質などの抗微生物剤を５０〜１５０ｐｐｍなどの低濃度で加えることが望ましい。他の適切な抗生物質には、アンフォテリシンＢ、アンピシリン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、ゲンタマイシン、ハイグロマイシンＢ、カナマイシン、ネオマイシン、ペニシリン、ピューロマイシン、ストレプトマイシンを含む。抗生物質は輸送および保存の間の微生物生育を阻害し、適切な濃度、例えば重量で１５〜１０，０００ｐｐｍ、例えば２５〜５００ｐｐｍ、または５０〜１５０ｐｐｍで使用できる。必要に応じて、抗生物質は糖濃度が比較的高い場合でも含むことができる。これに代えて、抗微生物の保存特性を有する他の添加剤を使用し得る。好ましくは、抗微生物添加剤は食品グレードである。
【０１３５】
比較的高い濃度の溶液はバイオマス材に酵素とともに加えられる水の量を制限することによって得ることができる。濃度は、実施する糖化量を制御することなどによってコントロールできる。例えば、濃度はバイオマス材を多く溶液に加えることによって増加できる。溶液中に産生されている糖を維持するため、界面活性剤、例えば前述の１種類を添加することができる。安定性も溶液の温度を上げることによって増加できる。例えば、溶液は４０〜５０℃、６０〜８０℃、またはさらに高い温度で維持できる。
【０１３６】
本明細書で説明されるプロセスでは、例えば糖化後、糖生成物（例えば、グルコースおよび／またはキシロース）を分離できる。例えば、糖は沈殿、結晶化、クロマトグラフィー（例えば、疑似移動床式クロマトグラフィー、高圧クロマトグラフィー、）、遠心分離、抽出、従来技術で知られているいずれかの他の分離方法、およびこれらの組み合わせによって分離することができる。
【０１３７】
追加処理
追加処理を糖化によって産生された糖に実施して、代替生成物を産生し得る。例えば、糖は水素化、発酵、または他の薬品で処理して他の生成物を産生することができる。
【０１３８】
グルコースを水素化してソルビトールにすることができる。キシロースを水素化してキシリトールにすることができる。水素化は触媒（例えば、Ｐｔ／γ−Ａｌ２Ｏ３、Ｒｕ／Ｃ、ラネーニッケル、または従来技術で知られている他の触媒）を高圧下（例えば、１０〜１２０００ｐｓｉ）でＨ２と組み合わせた使用によって実施することができる。ソルビトールおよび／またはキシリトール生成物は従来技術で知られている方法によって分離および精製することができる。
【０１３９】
糖化から得られる糖生成物はまた、発酵してアルコール、エリトリトールのような糖アルコール、乳酸、グルタミン酸、またはクエン酸などの有機酸、あるいはアミン酸を産生することができる。
【０１４０】
例えば、酵母およびザイモモナス菌を発酵または糖のアルコールへの転換のために使用することができる。他の微生物を下記で示す。発酵のための最適ｐＨは約４〜７である。例えば、酵母のための最適ｐＨは約４〜５であり、一方、ザイモモナスのための最適ｐＨは約５〜６である。一般的な発酵時間は２０〜４０℃（例えば、２６〜４０℃）の温度で約２４〜１６８時間（例えば、２４〜９６時間）であるが、好熱性微生物はさらに高い温度を好む。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、例えば嫌気性生物が使用されたとき、発酵の少なくとも一部はＮ２、Ａｒ、Ｈｅ、ＣＯ２、またはこれらの混合物のような不活性ガスのブランケット下などの酸素の不存在下で実施する。さらに、混合物は発酵の一部または全期間でタンクを通る不活性ガスの一定なパージが加えられ得る。いくつかの例では、嫌気性条件は発酵の際の二酸化酸素産生によって達成または維持することができ、追加の不活性ガスは必要とされない。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、発酵プロセスの全体または一部は低分子量の糖が生成物（例えば、エタノール）に完全に転換される前に中断することができる。中間発酵生成物には高濃度の糖および炭水化物を含む。糖および炭水化物は従来技術で知られている任意の手段によって分離することができる。これらの中間発酵生成物はヒトまたは動物消費用の食品の調製に使用することができる。追加または代替として、中間発酵生成物はステンレス鋼製実験室用ミルで微細粒子サイズに粉砕して粉末用物質を産生することができる。
【０１４３】
ジェット混合が発酵の際に使用され得、いくつかの例では糖化および発酵は同一タンクで実施することができる。
【０１４４】
微生物のための栄養素、例えば全開示が参照によって本明細書に組み込まれている２０１１年７月１５日出願された米国特許出願公開２０１２／００５２５３６に記載されている食品ベース栄養素パッケージを糖化および／または発酵の際に加え得る。
【０１４５】
「発酵」は、内容がともに本明細書で参照によって全体が組み込まれている２０１２年１２月２２日出願された米国仮特許出願番号６１／５７９，５９９および２０１２年１２月２２日出願された米国仮特許番号６１／５７９，５７６に開示されている方法および生成物を含む。
【０１４６】
内容が本明細書に全体として組み込まれている国際特許番号ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７４０２８（２００７年７月２０日に出願され、ＷＯ２００８／０１１５９８として英語で公表され、米国を指定）に記載されるように、移動式発酵装置を使用することができる。同様に、糖化装置は移動式であることができる。さらに、糖化および／または発酵は輸送中に一部または完全に実施し得る。
【０１４７】
発酵に使用される微生物は自然発生微生物および／または工学処理した微生物であることができる。例えば、微生物は細菌（限定されないが、例えばセルロース分解性細菌を含む）、真菌（限定されないが、例えば酵母を含む）、植物、原虫または真菌様原生動物などの原生動物（限定されないが、例えば粘菌を含む）、または藻類であることができる。生物の相性がいい場合、生物の混合を使用することができる。
【０１４８】
適切な発酵微生物は、グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、オリゴ糖類、または多糖類のような炭水化物を発酵生成物に転換する能力を有する。発酵性微生物には、サッカロマイセス属の種（限定されないが、Ｓ．セレビシエ（パン酵母）、Ｓ．ジスタチクス、Ｓ．ウバルム）、クルイベロマイシス属（限定されないが、Ｋ．マルキシアヌス、Ｋ．フラギリスを含む）、カンジダ属（限定されないが、Ｃ．シュードトリピカリスおよびＣ．ブラシカエを含む）、ピキア・スティピティス（カンジダ・シェハタエの近縁）、クラビスポラ属（限定されないが、Ｃ．レスタニアエおよびＣ．オプンチアエを含む）、パキソレン属（限定されないが、Ｐ．タンノフィルスを含む）、ブレタノマイセス属（限定されないが、Ｂ．クラウセンニイを含む（Ｐｈｉｌｉｐｐｉｄｉｓ，ＧＰ，１９９６，Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｉｏｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｗｙｍａｎ，ＣＥ編，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，１７９−２１２））の株を含む。他の適切な微生物には、例えば、ザイモモナス・モビリス、クロストリジウム種（限定されないが、Ｃ．サーモセラム（Ｐｈｉｌｉｐｐｉｄｉｓ、１９９６、前掲）、Ｃ．サッカロブチルアセトニカム、Ｃ．サッカロブチリクム、Ｃ．プニセウム、Ｃ．ベイジェリンキ、およびＣ．アセトブチリクムを含む）、モニリエラ・ポリニス、モニリエラ・メガチレンシス、ラクトバシルス種、ヤロウィア・リポリティカ、アウレオバシジウム種、トリコスポロノイデス種、トリゴノプシス・バリアビリス、トリコスポロン種、モニリラセアセアブタン種、ティフラ・バリビラリス、カンジダ・マグノリア、ウスチラギオミセーテス種、プソザイマ・ツクバエンシス、チゴサッカロマイセス属の酵母種、デバリオミセス、ハンゼヌラ、およびピキア、ならびにデマチオイドのトルラ属の真菌を含む。
【０１４９】
例えば、クロストリジウム種を使用してエタノール、ブタノール、酪酸、酢酸、およびアセトンを産生することができる。ラクトバシルス種を使用して乳酸を産生することができる。
【０１５０】
このような多くの微生物株は、市販またはいくつか名称を挙げると、ＡＴＣＣ（アメリカ培養細胞系統保存機関、マナッサス、バージニア州、米国）、ＮＲＲＬ（米国農業研究サービス培養コレクション、ピオリア、イリノイ州、米国）、またはＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション、ブラウンシュバイク、ドイツ）のような寄託機関を通して公に入手可能である。
【０１５１】
市販の酵母には、例えばＲｅｄ  Ｓｔａｒ（登録商標）／Ｌｅｓａｆｆｒｅ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ（米国のＲｅｄ  Ｓｔａｒ／Ｌｅｓａｆｆｒｅから入手可能）、ＦＡＬＩ（登録商標）（米国のＢｕｒｎｓ  Ｐｈｉｌｉｐ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｃ．，の部門であるＦｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ’ｓ  Ｙｅａｓｔから入手可能）、ＳＵＰＥＲＳＴＡＲＴ（登録商標）（Ａｌｌｔｅｃｈ、現在のＬａｌｅｍａｎｄから入手可能）、ＧＥＲＴ  ＳＴＲＡＮＤ（登録商標）（スウェーデンのＧｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ＡＢから入手可能）、およびＦＥＲＭＯＬ（登録商標）（ＤＳＭ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓから入手可能）を含む。
【０１５２】
バイオマス材を糖化して糖を産生するために使用することができる多くの微生物は、これらの糖を発酵して有用な生成物に転換することもできる。
【０１５３】
発酵後、得られる流体は、例えば「ビールカラム」を用いて蒸留して多くの水および残存固体からエタノールおよび他のアルコールを分離することができる。ビールカラムから排出する蒸気は、例えば重量で３５％のエタノールであることができ、精留カラムに供給することができる。精留カラムからのほぼ共沸（９２．５％）のエタノールと水の混合物は、気相分子篩を用いて純粋（９９．５％）なエタノールに精製することができる。ビールカラムの底部分は３−エフェクトエバポレーターの第一エファクターに送ることができる。精留カラムは還流凝縮器がこの第一エファクトのために熱を供給することができる。第一エフェクト後、固体は遠心分離機を用いて分離してロータリードライヤーで乾燥させることができる。遠心分離流出水の一部（２５％）は発酵のためにリサイクルすることができ、残りは第二および第三エバポレーターエフェクトに送られる。エバポレーター凝縮物のほとんどは、かなり純粋な凝縮物として、低沸騰化合物の蓄積を防ぐために廃水処理に分離される少量部分とともにプロセスに戻すことができる。
【０１５４】
本明細書で説明されるプロセスから生じる生成物の他のタイプの化学的変換を、例えば有機糖由来生成物（例えば、フルフラールおよびフルフラール由来生成物）の産生に使用することができる。糖由来生成物の化学的変換は、２０１３年７月３日出願された米国特許公開番号２０１４／００１１２４８に記載されており、その開示は参照によって本明細書にその全体が組み込まれている。
【０１５５】
実施例
本発明はさらに次の実験例を参考にすることによって詳細に説明される。これらの例は説明の目的のためのみに示され、特に特定しない限り、限定されることは意図されない。そのため、本発明は次の例に限定されるものとして決して解釈されるべきでなく、むしろ本明細書に示される教示の結果としてのエビデンスとなる、あらゆるすべての変更を包含すると解釈されるべきである。
【０１５６】
さらに説明がなくとも、従来技術の当業者は、前記説明および次の発明例を用いて本発明の化合物を調製および利用でき、請求された方法を実施できると考えられる。次の実施例は、本発明の様々な態様を具体的に示し、本開示の残余を何等か制限するものとして解釈されない。
【０１５７】
例１：一般的方法
本明細書で説明する例で使用する一般的な材料および方法を示す。
【０１５８】
微生物および培養条件
Ｔ．リーゼイ株ＲＵＴＣ３０（ＡＴＣＣ５６７６５）を使用してセルラーゼを産生した。Ｔ．リーゼイの胞子（＞１０８個／ｍＬ）を種培養培地（表２および３）に０．２５％の接種比を用いて３０℃で接種し、１７５ｒｐｍで振とうさせた。
【表２】
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【表３】
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【０１５９】
種培養を主培養培地（表４）に５％接種比で接種した。主培養は３Ｌバイオリアクター（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）中で２７℃、７００ｒｐｍ、０．３ＶＶＭで実施した。ｐＨを６ＭのＮＨ４ＯＨによって３．８で維持した。培養期間は１１日だった。
【表４】
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【０１６０】
カラメル化糖調製物
試薬グレードのグルコース、マルトース、およびラクトースを、それぞれカラメル化糖を調製するために使用した。カラメル化反応は撹拌ホットプレート上で実施した。５０％（ｗ／ｖ）糖溶液を調製し、ＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨをそれぞれ２．５または１２に調整した。温度は１７０℃に維持し、反応時間は１７時間だった。カラメル化糖（または糖）を主培養に４〜５ｇ／Ｌ／日の供給量で加えた。
【０１６１】
分析
発酵中の培養試料を主培養から採取し、タンパク質の定量のためにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）−ＨＰＬＣによって分析した。セルラーゼ活性アッセイのために、処理したトウモロコシ穂軸をセルラーゼの基質に使用した。Ｔ．リーゼイ培養で産生されたセルラーゼによる遊離グルコースとキシロースをＨＰＬＣによって分析した。
【０１６２】
例２：カラメル化糖はセルラーゼ産生を誘発する
この例では、Ｔ．リーゼイにおけるセルロース産生を誘発するためにカラメル化糖を使用する。Ｔ．リーゼイは、本明細書に示される方法で、例えば実施例１で説明されるように培養および生育させた。カラメル化グルコース、マルトース、およびラクトースを、本明細書に示される方法、例えば実施例１に従って調製した。
【０１６３】
カラメル化糖、例えばカラメル化グルコース、カラメル化マルトース、およびカラメル化ラクトース（セルロース誘発物質無添加）を５ｇ／Ｌ／日でＴ．リーゼイ培養に加えた。産生されたタンパク質の量（ｇ／Ｌ）を４、６、８、１１、または１２日目に測定した。いかなる糖も加えないと、タンパク質はほとんど産生されなかった（図１）。カラメル化グルコース、カラメル化マルトース、およびカラメル化ラクトースはすべて、タンパク質産生を誘発した。具体的には、カラメル化グルコースおよびカラメル化マルトースは、カラメル化ラクトースよりも高い誘発能力を示した。これらの結果は、カラメル化糖がセルラーゼ産生を誘発することができたことを示す。
【０１６４】
例３：カラメル化糖の組成物の分析
試薬グレードのグルコース、マルトース、およびラクトースを、それぞれカラメル化糖を調製するために使用した。カラメル化反応は撹拌ホットプレート上で実施した。５０％（ｗ／ｖ）糖溶液を調製し、ＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨをそれぞれ２．５または１２に調整した。温度を１７０℃に維持し、反応時間は１７時間だった。
【０１６５】
カラメル化グルコース、カラメル化マルトース、およびカラメル化ラクトースの成分を同定するために、マススペクトロメトリー分析を実施した。カラメル化糖試料を１０００倍に希釈し、ＥＳＩ−ＭＳによって分析した。抽出されたイオンクロマトグラムをＴＩＣから作製し、累積して、統合した。
【０１６６】
結果は、カラメル化糖試料がオリゴ糖を含有することを示している（図２）。オリゴ糖類の重合度は２〜６の範囲であり、三糖類がオリゴ糖類で最も豊富な種類だった。３試料すべて（カラメル化グルコース、カラメル化マルトース、およびカラメル化ラクトース）において、少なくとも五糖類までのオリゴ糖類が認められ、縮合反応がカラメル化プロセス中に生じていたことを示した。カラメル化マルトースおよびカラメル化ラクトース試料中の単糖含量によって示されるように、いくらかの加水分解も同様に生じた。カラメル化ラクトース試料中のオリゴ糖類の全濃度は、カラメル化グルコースおよびカラメル化マルトースと比較して最も低かった。このデータは、例２（図１）で説明されたＴ．リーゼイのカラメル化ラクトースによる誘発後に測定されたセルラーゼ産生の低い量と一致する。
【０１６７】
例４：セルラーゼ産生におけるカラメル化糖とセルロース誘発物質の相乗効果
セルロース誘発物質とカラメル化糖の複合効果を評価するため、セルロース誘発物質、例えばトウモロコシ穂軸および外皮をカラメル化糖とともにＴ．リーゼイ培養に加え、セルラーゼ産生を得られたタンパク質力価を測定することによって判断した。Ｔ．リーゼイを培養して、実施例２における説明と同様にセルラーゼを産生するように誘発した。
【０１６８】
トウモロコシ穂軸およびカラメル化糖をともにＴ．リーゼイ培養に加えた。セルロース誘発物質（トウモロコシ穂軸、ＣＣ）およびカラメル化糖による誘発は、タンパク質力価によって測定するとき、セルラーゼ産生に対して相乗効果を示した（図３）。トウモロコシ穂軸とカラメル化グルコースによる誘発は、トウモロコシ穂軸のみによる誘発と比較した場合、タンパク質力価で１．９倍の増加をもたらせた（図３）。トウモロコシ穂軸とカラメル化グルコースによる誘発は、カラメル化糖のみによる誘発と比較した場合、タンパク質力価で１．９倍の増加をもたらした（図３）。
【０１６９】
トウモロコシ穂軸誘発培養にグルコース（カラメル化されていない）を加えることも、タンパク質力価を増加させるのに役立つことが認められたが、その効果はカラメル化グルコースによる誘発から認められた効果よりも低かった。ネガティブコントロールとして、グルコース（カラメル化されていない）を培養に加えると、グルコースのみの添加はタンパク質産生をほとんど誘発せず、低いタンパク質力価の結果だった。
【０１７０】
第二セルロース誘発物質である外皮を、塩基性（ｐＨ１２）の条件で産生されたカラメル化糖と組み合わせて次に試験した。セルラーゼ産生におけるカラメル化糖と外皮の相乗効果もまた認められた（図４）。この実験において、カラメル化糖と外皮の組み合わせは、外皮などの単一誘発物質を用いて認められるタンパク質産生との比較で産生を誘発するために使用された場合、タンパク質産生は２．３倍高かった。
【０１７１】
これらの結果は、カラメル化糖生成物と誘発物質バイオマス、またはセルロース誘発物質の組み合わせが、微生物におけるバイオマス分解酵素の産生をさらに増強することを示す。
【０１７２】
均等物
本明細書で引用したそれぞれすべての特許、特許出願、および公開の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、特定の態様を参照して開示されているが、本発明の他の態様および変更が、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、従来技術における当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、すべてのそのような態様および同等な変化を含むと解釈されることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年10月12日(2017.10.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2018509919.tif 000011