(57)【要約】  細胞の活性の非侵襲的調節方法であって、前記細胞にＭＡＲ遺伝子を送達する工程および前記細胞に磁気刺激を適用する工程を含んでなる方法が提供される。疾患の処置における磁気遺伝学の医学的使用もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の活性の調節方法であって、ＭＡＲ遺伝子を前記細胞に送達する工程および前記細胞に磁気刺激を与える工程を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記細胞が、ニューロン細胞、筋肉細胞または幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、インビトロで処置される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、対象内にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記対象が、ヒトである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＭＡＲ遺伝子が、ヒトにおける発現のためにコドンが最適化されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＭＡＲ遺伝子の配列が、配列番号１〜１１からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＭＡＲ遺伝子が、細胞種特異的プロモーターまたは領域特異的プロモーターを含んでなるベクターを介して標的位置に送達される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ベクターが、レンチウイルス、レトロウイルスまたはアデノ随伴ウイルスまたはプラスミド含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
対象の処置方法であって、ＭＡＲ遺伝子を前記対象の標的領域に送達する工程および前記領域に磁気刺激を与える工程を含んでなる、方法。
【請求項１１】
前記対象が、健常である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象が、疾患または損傷を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象が、脊髄損傷、神経変性疾患、網膜変性疾患、心疾患、シェーグレン症候群および嗜癖からなる群から選択される疾患または損傷を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＭＡＲ遺伝子が、細胞種特異的プロモーターまたは領域特異的プロモーターを含んでなるベクターにより１以上の罹患領域に標的化される、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＭＡＲ遺伝子が、前記対象にＭＡＲ発現細胞を移植することにより送達される、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
対象における神経変性疾患の処置方法であって、ベクターを介してＭＡＲ遺伝子を前記対象に送達する工程および前記対象に磁気刺激を与える工程を含んでなる、方法。
【請求項１７】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、運動ニューロン病、ハンチントン病、脊髄小脳運動失調および脊髄性筋萎縮症からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＭＡＲ遺伝子が、細胞種特異的プロモーターまたは領域特異的プロモーターを含んでなるベクターにより運ばれる、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＭＡＲ遺伝子が、細胞種特異的プロモーターまたは領域特異的プロモーターを含んでなるベクターにより１以上の罹患領域に標的化される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＭＡＲ遺伝子が、前記対象にＭＡＲ発現細胞を移植することにより送達される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２１】
対象における脊髄損傷の修復方法であって、ベクターを介してＭＡＲ遺伝子を損傷標的領域に送達する工程および前記対象に磁気刺激を与える工程を含んでなる、方法。
【請求項２２】
対象における失明および色素性網膜炎を含む網膜変性疾患の標的磁気遺伝学的処置方法であって、ベクターを介してＭＡＲ遺伝子を標的領域に送達する工程および前記領域に磁気刺激を与える工程を含んでなる、方法。
【請求項２３】
不規則な心拍リズムを含む心疾患の標的磁気遺伝学的処置方法であって、ベクターを介してＭＡＲ遺伝子を心臓の標的領域に送達する工程および心筋に磁気刺激を与える工程を含んでなる、方法。
【請求項２４】
ＭＡＲ依存的磁気刺激と組み合わせた診断的または治療的磁気共鳴イメージング方法であって、磁気共鳴イメージングで神経反応をモニタリングする工程、およびＭＡＲを発現する標的脳領域を変更する工程、および脳を外部磁場で刺激してニューロン活動を活性化する工程を含んでなる、方法。
【請求項２５】
対象におけるシェーグレン症候群の処置方法であって、ベクターを介してＭＡＲ遺伝子を前記対象に送達する工程および前記対象に磁気刺激を与える工程を含んでなる、方法。
【請求項２６】
対象における薬物嗜癖およびアルコール嗜癖などの嗜癖の処置方法であって、側座核などの脳領域において磁気受容体ＭＡＲを発現させる工程および脳を外部磁場で刺激する工程を含んでなる、方法。
【請求項２７】
パーキンソン病、慢性疼痛、大うつ病、トゥーレット症候群または癲癇などの疾患を処置する磁場による脳深部刺激方法であって、ＭＡＲ遺伝子を含んでなるベクターを標的罹患領域に送達する工程および前記領域に磁気刺激を与える工程を含んでなる、方法。
【請求項２８】
ＭＡＲ標的脳領域の非侵襲的磁気刺激方法であって、ＭＡＲ遺伝子を含んでなるベクターをＭＡＲ標的脳領域に送達する工程および前記領域に磁気刺激を与える工程を含んでなる、方法。
【請求項２９】
対象における標的領域の磁気的阻害方法であって、対象におけるＭＡＲ遺伝子および／または磁気受容体ファミリーメンバーを分子操作する工程ならびに前記領域に磁気刺激を与える工程を含んでなる、方法。
【請求項３０】
ＭＡＲタンパク質およびＭＡＲ相互作用受容体を発現させることによる、細胞における二次メッセンジャーの生成方法であって、ＭＡＲ遺伝子を含んでなるベクターを前記細胞に送達する工程および前記細胞に磁気刺激を与える工程を含んでなり、ここで、ＭＡＲタンパク質の発現が二次メッセンジャーの生産および／または前記細胞におけるシグナル伝達経路の摂動をもたらす、方法。
【請求項３１】
記憶の形成および再生を中断させるための記憶機能制御方法であって、海馬、扁桃体および／または帯状皮質などの脳領域において磁気受容体ＭＡＲを発現させる工程、ならびに脳を外部磁場で刺激する工程を含んでなる、方法。
【請求項３２】
神経幹／前駆細胞における興奮および神経形成の制御方法であって、幹細胞において磁気受容体ＭＡＲを発現させる工程および外部磁場で活性化して神経形成を促進する工程を含んでなる、方法。
【請求項３３】
ＭＡＲを血管障壁を経て脳および肺などの組織に移行させ、適用した外部磁場により血管緊張、動脈直径、および血管成長などの血管特性を制御することによる、内皮細胞の磁気遺伝学的制御方法。
【請求項３４】
前記ＭＡＲ遺伝子が、細胞種特異的プロモーターまたは領域特異的プロモーターを含んでなるベクターにより１以上の標的領域に送達される、請求項２１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＭＡＲ遺伝子が、前記対象にＭＡＲ発現細胞を移植することにより送達される、請求項２１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
ＭＡＲタンパク質および細胞種特異的プロモーターまたは領域特異的プロモーターをコードする核酸配列を含んでなる、磁気受容体ＭＡＲ送達ベクター。
【請求項３７】
ウイルスまたはプラスミドを含んでなる、請求項３６に記載のベクター。
【請求項３８】
レンチウイルス、レトロウイルスまたはアデノ随伴ウイルスを含んでなる、請求項３６に記載のベクター。
【請求項３９】
ＭＡＲおよび誘導プロモーターの遺伝子を含んでなる核酸配列。
【請求項４０】
前記誘導プロモーターが、投与された薬物に応答し得るトランス作用因子により誘導され得る、請求項３９に記載の核酸配列。
【請求項４１】
ｍＣｈｅｒｒｙ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、またはＣＦＰなどの蛍光タンパク質である他の機能的タンパク質に結合されたＭＡＲタンパク質を含んでなる、融合タンパク質。
【請求項４２】
前記他の機能的タンパク質が、ＰＤＺまたはＡＩＳドメインを有する、請求項４１に記載の融合タンパク質。
【請求項４３】
前記他の機能的タンパク質が、細胞下領域を標的とする、請求項４１に記載の融合タンパク質。
【請求項４４】
ＭＡＲ遺伝子を含んでなるベクター、またはＭＡＲ発現細胞と、
薬学的に許容可能な担体と
を含んでなる、対象を処置するための医薬組成物。
【請求項４５】
外因性ＭＡＲ遺伝子を発現し、かつ、外部磁気刺激に応答し得るトランスジェニック動物。
【請求項４６】
前記動物が、ハエ、蠕虫、ゼブラフィッシュ、マウス、ラットまたはマーモセットである、請求項４５に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４７】
対象において神経変性疾患を処置するための薬剤の製造における、ＭＡＲ遺伝子またはＭＡＲ遺伝子を含んでなるベクターまたはＭＡＲ発現細胞の使用。
【請求項４８】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、運動ニューロン病、ハンチントン病、脊髄小脳運動失調および脊髄性筋萎縮症からなる群から選択される、請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
対象において脊髄損傷を修復するための薬剤の製造における、ＭＡＲ遺伝子またはＭＡＲ遺伝子を含んでなるベクターまたはＭＡＲ発現細胞の使用。
【請求項５０】
対象において失明および色素性網膜炎を含む網膜変性疾患の標的磁気遺伝学的処置のための薬剤の製造における、ＭＡＲ遺伝子またはＭＡＲ遺伝子を含んでなるベクターまたはＭＡＲ発現細胞の使用。
【請求項５１】
対象における標的心臓処置のための薬剤の製造における、ＭＡＲ遺伝子またはＭＡＲ遺伝子を含んでなるベクターまたはＭＡＲ発現細胞の使用。
【請求項５２】
対象においてシェーグレン症候群を処置するための薬剤の製造における、ＭＡＲ遺伝子またはＭＡＲ遺伝子を含んでなるベクターまたはＭＡＲ発現細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁気遺伝学の分野に関する。特に、本発明は、外部磁気刺激に応答する磁気受容体、ならびにニューロン活動を調節する、生体プロセスを摂動するおよび疾患を処置する非侵襲的方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
複雑な神経のマイクロ回路は、脳がどのように働くかの不可欠な構成要素であるが、それらは、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）において、相互に依存する異なる細胞種、相互接続された配線図および相互ネットワークを形成した複雑なコネクトームと絡み合っている(Bargmann et al., 2014; Luo et al., 2008)。従って、どのように神経回路が外部刺激に応答し、電気発火パターン、プロセス情報、計算コードを作り出し、行動を編成するかを理解することは、依然として神経科学者にとっての大きな挑戦となっている(Harris and Mrsic-Flogel, 2013; Huang and Zeng, 2013)。継続的開発および成熟をもって、光遺伝学(Zhang et al., 2011)、化学遺伝学(Lerchner et al., 2007; Vardy et al., 2015)、脳深部刺激(Wichmann and Delong, 2006)および機能的磁気共鳴イメージング（ｆＭＲＩ）(Kwong et al., 1992; Logothetis, 2008)を含む多くの神経技術ツールボックスは、健常脳および罹患脳において相互に連絡した神経マイクロ回路の詳細分析、摂動および調節に重要な役割を果たすことが実証されている。十分に開発された神経技術ツールボックスの中で、古典的脳深部刺激および最新の光遺伝学の両方が生理学的および機能不全神経マイクロ回路活性のマッピング、モニタリングおよび操作を可能とする(Gradinaru et al., 2009; Logothetis, 2008)。しかしながら、それらは総てそれら固有の限界または欠点を持つ。古典的脳深部刺激はパーキンソン病およびその他の神経疾患を治療するために首尾良く使用されてきたが、その限界は、それぞれ電線の外科的移植の必要、空間的選択性または特異性の欠如、ならびにニューロンの興奮または阻害に対する低周波刺激および高周波刺激のその矛盾する効果である(Kringelbach et al., 2007)。最も評価の高い光遺伝学がミリ秒精度で神経活動を時空間的に活性化または不活性化することができ(Bi et al., 2006; Boyden et al., 2005; Han and Boyden, 2007; Li et al., 2005; Zhang et al., 2007)、神経科学を速やかに変換させたとしても、オプシン発現パターン、レザーにより誘導される発熱、過剰発現されるポンプもしくはチャネルにより引き起こされる異常なイオン分布、および／または望まれないネットワークホメオスタシスからの副作用が実験的解釈を極めて難しくし得る(Hausser, 2014)。光遺伝学および脳深部刺激の両方は、長期的手術で恒久的に移植される電線または光ファイバーを介して完全な哺乳動物脳において特定の小領域のニューロン活動を侵襲的に操作するために用いられてきた(Grosenick et al., 2015; Logothetis, 2008; Okun, 2012)。結果として、マイクロ回路およびマクロ回路の両レベルで脳全体に対する新世代の全く非侵襲的な神経摂動および神経調節ツールボックスへの高い需要があり続けている。
【発明の概要】
【０００３】
一つの側面において、本発明は、細胞の活性の調節方法であって、ＭＡＲ遺伝子を前記細胞に送達する工程および前記細胞に磁気刺激を与える工程を含んでなる方法を提供する。
【０００４】
前記細胞は、インビボで、例えば、ヒトなどの動物内で処置されてもよいし、またはインビトロ、例えば、培養ディッシュ内で処置されてもよい。
【０００５】
特に、前記細胞は、ニューロン細胞、筋肉細胞または幹細胞であり得る。ある実施形態では、前記細胞は、対象、例えば、ヒトなどの霊長類、またはマウス、ラットもしくはウサギなどの齧歯類内にあり得る。
【０００６】
ある実施形態では、ＭＡＲ遺伝子は、細胞種特異的プロモーターまたは領域特異的プロモーターを含んでなるベクターを介して、標的位置、例えば、ニューロンなどの特定の細胞種または健常もしくは罹患器官の特定の領域に送達することができる。ベクターは、レンチウイルス、レトロウイルスまたはアデノ随伴ウイルスまたはプラスミドを含んでなり得る。
【０００７】
別の側面では、本発明は、対象における神経変性疾患の処置方法であって、ベクターを介してＭＡＲ遺伝子を前記対象に送達する工程および前記対象に磁気刺激を与える工程を含んでなる方法を提供する。
【０００８】
前記神経変性疾患としては、限定されるものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、運動ニューロン病、ハンチントン病、脊髄小脳運動失調、および脊髄性筋萎縮症が含まれる。
【０００９】
ある実施形態では、ＭＡＲ遺伝子は、細胞種特異的プロモーターまたは領域特異的プロモーターを含んでなるベクターにより１以上の罹患領域に標的化される。
【００１０】
ある実施形態では、ＭＡＲ遺伝子は、ＭＡＲ発現細胞を前記対象に移植することにより送達される。
【００１１】
別の側面では、本発明は、対象における脊髄損傷の修復方法であって、ベクターを介してＭＡＲ遺伝子を損傷標的領域に送達する工程および前記対象に磁気刺激を与える工程を含んでなる方法を提供する。
【００１２】
別の側面では、本発明は、失明および色素性網膜炎を含む網膜変性疾患の標的磁気遺伝学的処置方法であって、ベクターを介してＭＡＲ遺伝子を標的領域に送達する工程および前記領域に磁気刺激を与える工程を含んでなる方法を提供する。
【００１３】
別の側面では、本発明は、標的心臓処置方法であって、ベクターを介してＭＡＲ遺伝子を心臓の標的領域に送達する工程および前記領域に磁気刺激を与える工程を含んでなる方法を提供する。
【００１４】
別の側面では、本発明は、対象におけるシェーグレン症候群の処置方法であって、ベクターを介してＭＡＲ遺伝子を前記対象に送達する工程および前記対象に磁気刺激を与える工程を含んでなる方法を提供する。
【００１５】
別の側面では、本発明は、ＭＡＲタンパク質および細胞種特異的プロモーターまたは領域特異的プロモーターをコードする核酸配列を含んでなる磁気受容体ＭＡＲを送達するためのベクターを提供する。
【００１６】
ある実施形態では、前記ベクターは、ウイルス、例えば、レンチウイルス、レトロウイルスまたはアデノ随伴ウイルス、またはプラスミドを含んでなる。
【００１７】
別の側面では、本発明は、外因性ＭＡＲ遺伝子を発現し、かつ、外部磁気刺激に応答し得るトランスジェニック動物を提供する。いくつかの実施形態では、前記動物は、ハエ、蠕虫、ゼブラフィッシュ、マウス、ラットまたはマーモセットである。
【００１８】
別の側面では、本発明は、ＭＡＲ依存的磁気刺激と組み合わせた診断的または治療的磁気共鳴イメージング方法であって、磁気共鳴イメージングで神経反応をモニタリングする工程、およびＭＡＲを発現する標的脳領域を変更する工程、および脳を外部磁場で刺激してニューロン活動を活性化する工程を含んでなる方法を提供する。
【００１９】
別の側面では、本発明は、不規則な心拍リズムを含む心疾患の標的磁気遺伝学的処置方法であって、ベクターを介してＭＡＲ遺伝子を心臓の標的領域に送達する工程および心筋に磁気刺激を与える工程を含んでなる方法を提供する。
【００２０】
別の側面では、本発明は、ＭＡＲ遺伝子を含んでなるベクター、またはＭＡＲ発現細胞と、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる、対象を処置するための医薬組成物を提供する。
【００２１】
別の側面では、本発明は、パーキンソン病、慢性疼痛、大うつ病、トゥーレット症候群または癲癇などの疾患を処置する磁場による脳深部刺激方法であって、ＭＡＲ遺伝子を含んでなるベクターを標的罹患領域に送達する工程および前記領域に磁気刺激を与える工程を含んでなる方法を提供する。
【００２２】
別の側面では、本発明は、ＭＡＲ標的脳領域の非侵襲的磁気刺激方法であって、ＭＡＲ遺伝子を含んでなるベクターをＭＡＲ標的脳領域に送達する工程および前記領域に磁気刺激を与える工程を含んでなる方法を提供する。
【００２３】
別の側面では、本発明は、対象の処置方法であって、ＭＡＲ遺伝子を前記対象の標的領域に送達する工程および前記領域に磁気刺激を与える工程を含んでなる方法を提供する。前記対象は、健常であってもまたは疾患もしくは損傷を有していてもよい。
【００２４】
別の側面では、本発明は、対象における標的領域の磁気的阻害方法であって、対象におけるＭＡＲ遺伝子および／または磁気受容体ファミリーメンバーを分子操作する工程ならびに前記領域に磁気刺激を与える工程を含んでなる方法を提供する。
【００２５】
別の側面では、本発明は、ＭＡＲタンパク質およびＭＡＲ相互作用受容体を発現させることによる、細胞における二次メッセンジャーの生成方法であって、ＭＡＲ遺伝子を含んでなるベクターを前記細胞に送達する工程および前記細胞に磁気刺激を与える工程を含んでなり、ここで、ＭＡＲタンパク質の発現が二次メッセンジャーの生産および／または前記細胞におけるシグナル伝達経路の摂動をもたらす方法を提供する。
【００２６】
別の側面では、本発明は、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、またはＣＦＰなどの蛍光タンパク質である他の機能的タンパク質に結合されたＭＡＲタンパク質を含んでなる融合タンパク質を提供する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、前記他の機能的タンパク質は、ＰＤＺまたはＡＩＳドメインである。
【００２８】
いくつかの実施形態では、他の機能的タンパク質は細胞下領域を標的とする。
【００２９】
別の側面では、本発明は、記憶の形成および再生を中断させるために記憶機能を制御する方法であって、海馬、扁桃体および／または帯状皮質などの脳領域において磁気受容体ＭＡＲを発現させる工程、ならびに脳を外部磁場で刺激する工程を含んでなる方法を提供する。
【００３０】
別の側面では、本発明は、対象における薬物嗜癖およびアルコール嗜癖などの嗜癖の処置方法であって、側座核などの脳領域において磁気受容体ＭＡＲを発現させる工程および脳を外部磁場で刺激する工程を含んでなる方法を提供する。
【００３１】
別の側面では、本発明は、神経幹／前駆細胞における興奮および神経形成の制御方法であって、幹細胞において磁気受容体ＭＡＲを発現させる工程および外部磁場で活性化して神経形成を促進する工程を含んでなる方法を提供する。
【００３２】
別の側面では、本発明は、ＭＡＲを血管障壁を経て脳および肺などの組織に移行させ、適用した外部磁場により血管緊張、動脈直径、および血管成長などの血管特性を制御することによる、内皮細胞の磁気遺伝学的制御方法を提供する。
【００３３】
別の側面では、本発明は、ＭＡＲおよび誘導プロモーターの遺伝子を含んでなる核酸配列を提供する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、前記誘導プロモーターは、投与された薬物に応答し得るトランス作用因子により誘導され得る。
【００３５】
図面は、本明細書に開示される技術の限定されない例示的実施形態を表し、本開示を理解する上で読者を助けるために示される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１Ａ〜１Ｆは、遠隔磁気刺激によるＨＥＫ−２９３細胞の磁気遺伝学的活性化を示すグラフである。  （Ａ）電気コイルにより誘導される膜脱分極。左、ＭＡＲ−ＧＣａＭＰ６ｓで同時トランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞の、一対の電気コイルによる磁気刺激の模式図。中央および右、磁場刺激前および後の蛍光強度（ΔＦ／Ｆ０）の変化を示すヒートマップ。スケールバー５０μｍ。  （Ｂ）一対の棒磁石により形成された磁場によるＨＥＫ−２９３細胞の活性化。中央および右、外部磁場により誘発されたＧＣａＭＰ６ｓの蛍光変化のカラーマップ。スケールバー５０μｍ。  （Ｃ）集団の活動は、対照群の蛍光強度は基底レベルに留まったが、磁気刺激後にＭＡＲ陽性細胞のみで蛍光強度の増大を示した。実線は平均；影付きの灰色の領域はｓ．ｅ．ｍ。青のバーは、磁場オンを示す。挿入図は、刺激オンセット後約１３秒のオンセット潜時を示す拡大図であった。破線は、ΔＦ／Ｆ０がベースライン変動の標準偏差の１０倍であった場合の応答オンセットを示した。
【図２】図２Ａ〜２Ｅは、ＭＡＲがニューロン活動の磁気制御を可能とすることを示すグラフである。  （Ａ）タイロード溶液中で培養した海馬ニューロンによるカルシウムイメージングの模式図。  （Ｂ）ＧＣａＭＰ６ｓとＭＡＲの同時局在を示す共焦点画像。  （Ｃ）時間の関数としての平均ピークΔＦ／Ｆ０の経時的推移（実線は平均値を示し、影付きの灰色の領域はｓ．ｅ．ｍを示す）。カルシウム移行はＭＡＲトランスフェクト群でのみ見られた。橙、ＭＡＲ群、ｎ＝４２；黒、対照群、ｎ＝４０。青のバーは、磁場オンを示す。  （Ｄ）ピークΔＦ／Ｆ０の分布、オンセット潜時および持続時間。各灰色のドットは単一のニューロンからの結果を表し、黒のドットは平均値を示す。平均ピークΔＦ／Ｆ０は５０．５±７．０％であり；平均オンセット潜時は７．８±０．８秒であり；ＭＡＲにより誘発されるカルシウム移行の平均持続時間は１１．１±０．９秒であった。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ。  （Ｅ）ＭＡＲとＧＣａＭＰ６ｓを同時発現する２つのニューロンからの代表的なトレース。ＭＡＲは、外部磁場で繰り返しカルシウムスパイクを誘発することができた。青のバーは、磁場オンを示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、方向選択および極性配向様式におけるニューロン活動の磁気遺伝学的制御を示すグラフである。  （Ａ）カルシウム流入の方向選択的磁気活性化。二方向磁気刺激設定の模式図（図Ｓ１も参照）。  （Ｂ）Ｘ−Ｙ平面における異なる方向の磁場に応答した３つのニューロンの蛍光強度のサンプルトレース。緑の矢印は、Ｘ軸における磁場の方向。橙の矢印は、Ｙ軸における磁場の方向。緑のバーは、Ｘ方向の磁場；橙のバーは、Ｙ方向の磁場。左、代表的なニューロンは、Ｘ軸に磁場がかけられた際に大きなカルシウムピークを示したが、磁場がＹ軸に切り替えられた際は小さなピークが見られたに過ぎなかった。中央、例示的ニューロンは、Ｙ軸に沿った磁気刺激にのみ応答した。右、Ｘ軸およびＹ軸の両方に沿った磁場に対してカルシウムスパイクを示す代表的なトレース。  （Ｃ）ニューロン活動のオン応答およびオフ応答のパターン。磁場のスイッチオンおよびスイッチオフがニューロン活動のオン応答およびオフ応答を誘導したことを示す模式図。  （Ｄ）示された蛍光トレースは、異なる応答パターンを有する３つの代表的ニューロンであった。上、磁場がかけられた際にカルシウム移行を示す（オン応答）が、磁場が解除された際はカルシウム移行を示さない（オフ応答）ニューロン。中央、オフ応答を示すがオン応答を示さないニューロン。下、オン応答とオフ応答の両方を示すニューロン。青のバーは磁場オン；橙のバーは磁場オフ。
【図４】図４Ａ〜４Ｅは、ＭＡＲを介して磁場により誘導されるニューロンスパイク活性を示すグラフである。  （Ａ）全細胞パッチクランプ記録の実験スキーム。磁気刺激は一対の手持ち磁石で行った。  （Ｂ）典型的なＭＡＲ−ｐ２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ発現ニューロンの共焦点画像。スケールバーは３０μｍ。  （Ｃ）磁気刺激に対する膜電位の変化を示す電流固定記録。３つの例示的ニューロンは、膜脱分極および磁場のオンセットに対する発火頻度の増加を示した。スケールバーは２０秒、５０ｍＶ。  （Ｄ）ＭＡＲにより誘導される活動電位は、オン応答およびオフ応答発火パターンを示した。３つの代表的ニューロンの電位トレースは、磁場オンおよび磁場オフに応答して異なる発火パターンを示した。上、ニューロンは、磁場のオンセットに対してのみ活動電位を発火した。これとは逆に、中央のパネルに示されたニューロンは主として磁石の除去に応答した。しかしながら、別の群は、磁場のスイッチオンおよびスイッチオフの両方が活動電位を惹起する典型的な発火パターンを示した（下のパネル）。青のバーは磁場オン；橙のバーは磁場オフ。  （Ｅ）磁場は自発的発火頻度に比べて、平均オンセット潜時５．３±１．１秒および平均持続時間８．５±１．５秒で、活動電位の数の有意な増加を誘導した（１．０±０．５スパイクに対して１３．２±４．２スパイク；ｎ＝１９；＊＊、Ｐ＜０．０１、対応のあるｔ検定）。エラーバーはｓ．ｅ．ｍ。
【図５】図５Ａ〜５Ｆは、Ｃ．エレガンス(C. elegans)における行動応答の磁気遺伝学的制御を示すグラフである。  （Ａ）プロモーターｍｙｏ−３下での、Ｃ．エレガンスの体壁におけるＭＡＲ発現の落射蛍光画像。  （Ｂ）磁場が白視野照明下で適用された場合の体筋の同時収縮。アステリスクは、Ｃ．エレガンスの頭部および尾部を示す。左、磁場がかけられる直前の体弛緩；右、磁場がかけられた後の体収縮。  （Ｃ）磁場をかける１０秒前および磁場をかけた５０秒後、また、磁場を解除した２０秒後に１秒間隔で体長を測定した。測定された体長を刺激オンセット前の平均体長で割ることにより、相対的体長を計算した。橙のトレースは最初の長さの９４％に体長が短縮することを示したが、Ｎ２野生型は磁気刺激により体長の明らかな変化を示さなかった（ｍｙｏ−３、ｎ＝２４；Ｎ２、ｎ＝２０）。  （Ｄ）ＭＡＲは、ｍｅｃ−４プロモーター下、ジェントルタッチ受容体ニューロンで選択的に発現された。ＰＬＭニューロンを示す。スケールバーは５μｍ。  （Ｅ）ｍｅｃ−４トランスジェニック動物で、磁場をかけた際に逃避行動が惹起された。刺激オンセット後０秒、３秒、および６秒の時点での３つのフレームからの動物の位置をそれぞれ白、橙、青の線で示した。  （Ｆ）磁気刺激による明らかな逃避または前進行動（少なくとも体長の１／４の移動距離を伴う）を伴う５回の連続試験における、応答するトランスジェニック動物のパーセンテージ。初回試験でのｚｄＥｘ２２トランスジェニックＣ．エレガンスのこの部分は８６％であり、繰り返し試験すると段階的な馴れが見られた。
【図６】図Ｓ１Ａ〜Ｓ１Ｃは、培養海馬ニューロンにおける反復磁気刺激によるカルシウム流入を示すグラフである。  （Ａ）反復磁気刺激による代表的なニューロンの蛍光強度の変化を示すヒートマップ。スケールバーは３０μｍ。  （Ｂ）反復磁気刺激によるＡにおける相対的蛍光変化のトレース。青のバーは磁場オン。  （Ｃ）代表的なニューロンの自発的蛍光強度をｔ＝０の１．０に対して正規化した。正規化後の蛍光を、単一指数方程式を用いて当てはめた。次に、トレースを光退色効果に関して導いた時定数で補正した。
【図７】図Ｓ２は、磁気刺激によるニューロン活動の方向依存的活性化およびオン−オフ応答パターンの部分分布を示す。応答ニューロンの軸索配向と対応する磁場の刺激方向との角度の定量。Ｘ応答群、Ｙ応答群およびＸとＹの両応答群の間に有意差は見られなかった（Ｐ＞０．３、ＡＮＯＶＡ検定、それぞれｎ＝９、６および４）。エラーバーはｓ．ｄ。
【図８】図Ｓ３は、応答ニューロンの軸索配向と磁場方向との角度分布の概要を示す。
【図９】図Ｓ４Ａ〜Ｓ４Ｄは、磁場により誘導される電流およびＭＡＲトランスフェクトニューロンの固有の特性を示すグラフである。  （Ａ〜Ｂ）それぞれ−７０ｍＶおよび０ｍＶにおけるクランプニューロンによる内向きの電流（トレース＃１〜３）および外向きの電流（トレース＃４〜６）を示す代表的なトレース。  （Ｃ）磁場により誘発される内向きの電流と自発電流の比較。自発電流の３３．３±１７．８ｐＡに対して、磁気刺激により誘導される平均の内向きピーク電流は２７９．６±４５．２ｐＡであった（＊＊＊、Ｐ＜０．００１、対応のあるｔ検定、ｎ＝１３）。誘導されたイベントの平均数は、０．４６±０．２４に対して９．３±３．９５であった（＊、Ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定）。  （Ｄ）ＭＡＲ陽性ニューロンとＭＡＲ陰性ニューロンの間の固有特性の比較。ＭＡＲ発現ニューロンの静止膜電位（−５３．４±３．２ｍＶ、ｎ＝１４）は、ＭＡＲを発現しないニューロン（−５２．３±２．４ｍＶ、ｎ＝１０）とは有意に異なっていた。Ｐ＞０．４、スチューデントのｔ検定。１０ｍＶ電位ステップを注入することにより、電位固定モード下で膜抵抗を測定した。ＭＡＲ陽性ニューロンとＭＡＲ陰性ニューロンの間に統計的な差は見られなかった（１１９．８±１２．９ＭΩに対して１３０．６±１８．９ＭΩ）。Ｐ＞０．３、スチューデントのｔ検定。
【図１０】図Ｓ５ＡおよびＳ５Ｂは、ＭＡＲ発現筋肉細胞および機械刺激ニューロンの落射蛍光画像を示すグラフである。  （Ａ）プロモーターｍｙｏ−３下、矢印により示される体壁筋細胞におけるＭＡＲ局在を示す落射蛍光写真（導入遺伝子ｚｄＥｘ１２）。  （Ｂ）６つの機械刺激ニューロンにおけるＭＡＲ発現の拡大図。左、矢印は３つのニューロン（ＡＶＭ、ＡＬＭＲ、ＰＬＭＲ）を示す。右、他の３つのニューロン（ＰＶＭ、ＡＬＭＬ、ＰＬＭＬ）の蛍光画像。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
本明細書に開示される技術の特定の側面、様式、実施形態、変形形態および特徴は、本技術の実質的理解を提供するために種々のレベルで詳細に以下に記載されると認識されるべきであり、添付の特許請求の範囲に定義される保護の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００３８】
概要
光遺伝学および脳深部刺激などの現行の神経調節技術は、基礎的および翻訳的な神経科学を変容させつつある。しかしながら、これらの２つの神経調節アプローチは、光ファイバーまたはワイヤ電極の外科的移植が必要とされるので侵襲的である。ここで、本発明者らは、磁気受容体の遺伝的標的化と遠隔磁気刺激を組み合わせた非侵襲的磁気遺伝学を発明した。ニューロンの非侵襲的活性化は、以前に発見された進化的によく保存された外因性磁気受容体のニューロン発現により達成された。この磁気受容体を発現するＨＥＫ−２９３細胞および培養海馬ニューロンにおいて、外部磁場を適用すると、超高感度蛍光カルシウムインジケーターＧＣａＭＰ６ｓにより示されるような、再現性があり、かつ、可逆的な様式で膜の脱分極およびカルシウム流入をもたらした。さらに、ニューロン活動の磁気遺伝学的制御は磁場の方向に依存する可能性があり、適用された外部磁場に対してオン応答およびオフ応答パターンを示す。この磁気受容体の活性化はニューロンを脱分極し、全細胞パッチクランプ記録において遠隔磁場で繰り返し誘導され得る活動電位のトレインを惹起する。ｍｙｏ−３特異的筋細胞またはｍｅｃ−４特異的ニューロンにおいてこの磁気受容体を発現するトランスジェニックカエノラブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)において、外部磁場の適用は、それぞれ筋細胞および接触受容体ニューロンの磁石依存的活性化の指標となる蠕虫の筋収縮および逃避行動を誘導した。光遺伝学に優る磁気遺伝学の利点は、他に類を見ないその非侵襲性、深部浸透、無制限の接近性、空間的均一性および相対的安全性である。１０年に及ぶ改良を経た光遺伝学同様、磁気遺伝学は、継続的な改良および成熟をもって、神経調節ツールボックスの現在の展望を再形成、基礎的および翻訳的な神経科学ならびに他の生物科学に広範な適用を持つ。本発明者らは、新世代の磁気遺伝学が近いことを企図している。
【００３９】
ＭＡＲ
磁気受容の機構は依然として捉えどころのないままであるが、地球磁場を知覚する動物の能力を最大化するためには、周知の磁気センサーであるクリプトクロム（Ｃｒｙ）が別の磁気受容体と相互作用する必要があるとういうことが提案されている。Ｃｒｙには安定な複合体を形成するための多くの相互作用相手が存在し、そのうちの１つが、鉄硫黄タンパク質である細菌性ＩｓｃＡ１であり(COzar-Castellano et al., 2004)、これはＣｒｙと結合して安定な複合体を形成し、細胞内で鉄クラスターアセンブリを調節し得る。興味深いことに、ＩｓｃＡ１は、チョウ、ラット、マウス、ハト、ショウジョウバエおよびヒトの間で極めてよく保存され、極めて高い相同性を有する。本発明者らは、それらの極めてよく保存されているＩｓｃＡ１が万能磁気受容体（ＭＡＲと呼称される）として機能し、外部磁場による刺激の後にニューロン活動を誘導し得ると推論する。ハトは最も強力な磁気知覚システムを有しているので、本発明者らはマウス、ラット、マーモセットおよびヒトに関して、コドンが最適化されたハト磁気受容体型（ＭＡＲ、その後に本発明者らの研究の中で命名）を発現させた。
【００４０】
用語「ＩｓｃＡ１」および「ＭＡＲ」は、本明細書では互換的に使用され、生物間で保存性の高い同じタンパク質を指す。ハトのＩｓｃＡ１タンパク質（またはＭＡＲタンパク質）は、１３３個のアミノ酸を含有する。用語「ＩｓｃＡ１」または「ＭＡＲ」は、例えば、ハトＩｓｃＡ１と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはさらには９８％を超える高い配列同一性を有し、磁気刺激に応答する実質的に同じ生物学的機能を保持する、種々の生物のＩｓｃＡ１のいずれのホモログも包含する。
【００４１】
本明細書において、用語「ＭＡＲタンパク質」は、全長タンパク質、または天然全長ＭＡＲと実質的に同じ生物学的機能を維持するその変異体を包含する。
【００４２】
当業者には、細菌、チョウ、ハト、マウス、ラット、マーモセット、サルもしくはヒトを含む種々の生物に由来する天然ＭＡＲタンパク質、またはその機能的変異体が本発明で使用可能であることが認識されるであろう。
【００４３】
本明細書において、用語「タンパク質」は、用語「ポリペプチド」または「ペプチド」と互換的である。
【００４４】
用語「ＭＡＲタンパク質」は、天然タンパク質の変異体を包含する。好ましくは、この変異体は、天然タンパク質と少なくとも７５％、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、またはさらには９０％、９５％または９８％の配列同一性を有する。配列同一性は当技術分野で公知の標準技術、例えば、ＢＬＡＳＴを用いて決定することができる。
【００４５】
好ましい実施形態では、本発明のＭＡＲタンパク質は、天然ＭＡＲに対比されるが天然ＭＡＲと実質的に同じ生物学的機能を維持する変異体（機能的変異体とも呼ばれる）である。すなわち、変異体ＭＡＲタンパク質は、天然ＭＡＲ配列において、１または複数のアミノ酸、例えば、３、５、８、１０、１２または１５個のアミノ酸の置換、欠失または挿入を含む。
【００４６】
これらの変異体は、通常、変異体をコードするＤＮＡを生産するためのコードＤＮＡのヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発または当技術分野で周知の他の技術、およびその後の組換え細胞培養での塩基ＤＮＡの発現により作製される。これらの変異体は一般に、天然類似体と同じ質的生物活性を示す。
【００４７】
本発明のＭＡＲタンパク質は、非天然アミノ酸ならびに天然アミノ酸を組み込むことができる。非天然アミノ酸は、イオン選択性、安定性、適合性を向上させるため、または毒性を低減するために使用することができる。
【００４８】
本発明の一つの側面は、ＭＡＲタンパク質を含んでなる融合タンパク質である。いくつかのタンパク質の活性を合わせた単一のタンパク質を作り出す融合タンパク質を作製可能であることは当技術分野で周知である。半減期の延長などの望ましい特性がこの融合タンパク質より達成され得る。
【００４９】
ＭＡＲタンパク質を含んでなる融合タンパク質の一つの実施形態は、細胞の細胞下領域を標的とする融合タンパク質である。融合タンパク質は、例えば、ニューロンの軸索、樹状突起、およびシナプスを標的とすることができる。好ましい一つの実施形態では、ＰＤＺ（ＰＳＤ−９５、ＤｌｇおよびＺＯ−１）ドメインが、樹状突起を標的とするＭＡＲと融合される。別の好ましい実施形態では、軸索起始部(Axon initial segment)（ＡＩＳ）ドメインが、軸索を標的とするＭＡＲと融合される。
【００５０】
本発明の別の側面は、ＭＡＲタンパク質をコードする核酸配列を提供する。当業者には、ＭＡＲタンパク質が種々の核酸によりコードされ得ることが理解されるであろう。多くのアミノ酸が２つ以上のコドンにより表されるので、所与のタンパク質をコードする一つのユニークな核酸配列があるわけではない。タンパク質のアミノ酸配列を知ることによりＭＡＲタンパク質をコードし得る核酸をどのように作出するかは、当業者にはよく理解されている。ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列は、そのポリペプチドまたはタンパク質の「遺伝子」である。遺伝子は、そのポリペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ、ＤＮＡ、または他の核酸であり得る。イントロンなど、ＭＡＲタンパク質のアミノ酸配列を実質的に変化させない他の配列をＭＡＲ遺伝子に付加してもよい。用語「ＭＡＲ遺伝子」は、ＭＡＲタンパク質をコードする核酸配列（例えば、配列番号１〜６参照）を意味する。
【００５１】
【表１】
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2018526439.tif 000003
【００５２】
当業者には、異なる生物のコドンシステムは若干異なり得ること、および従って、ある生物に由来するあるタンパク質の発現が望まれる場合には、核酸配列はその生物内での発現のために改変できることが知られている。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態では、ハト由来のＭＡＲコード配列は、Ｃ．エレガンスでの発現のためにコドン使用頻度に関して最適化され、およびその発現を促進するために２つの人工イントロンが付加された（例えば、配列番号１１参照）。
【００５４】
本発明の一つの側面は、例えば、マウス、ラット、マーモセットおよびヒトでの発現のために最適化された、ハトＭＡＲタンパク質をコードする核酸配列を提供する（例えば、配列番号７〜１０参照）。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
本発明の別の側面は、ＭＡＲタンパク質の遺伝的に標的化された発現のための試薬を提供する。遺伝的標的化は、特定の細胞種、生物内の特定の空間的領域、および細胞内の細胞下領域にＭＡＲ遺伝子を送達するために使用することができる。遺伝的標的化はまた、発現されるＭＡＲタンパク質の量、およびその発現の時機の制御にも関する。
【００５７】
ＭＡＲタンパク質の遺伝的標的化発現のための試薬の好ましい実施形態は、ＭＡＲタンパク質の遺伝子を含有するベクターを含んでなる。
【００５８】
本明細書において、用語「ベクター」は、それが作動可能に連結された別の核酸を、異なる遺伝的環境間で輸送することができる核酸分子を意味する。用語「ベクター」はまた、核酸分子を輸送することができるプラスミド、ウイルスまたは生物も意味する。好ましいベクターの一つのタイプは、エピソーム、すなわち、染色体外複製を可能とする核酸分子である。好ましいベクターは、それらが連結された核酸の自律的複製および／または発現を可能とするものである。それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を命令することを可能とするベクターは、本明細書には「発現ベクター」として言及される。他の好ましいベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、狂犬病ウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびファージなどのウイルスである。好ましいベクターは、インビボまたはインビトロにおいてＭＡＲ遺伝子を遺伝的に挿入することができる。
【００５９】
本明細書において、用語「対象」は、動物、好ましくは、ヒトなどの哺乳動物を意味するが、他の動物、例えば、ゼブラフィッシュ、ハエ、蠕虫、マウス、ラット、およびマーモセットでもあり得る。
【００６０】
真核細胞に適合する発現ベクターも使用可能である。真核細胞発現ベクターは当技術分野で周知であり、市販されている。一般に、このようなベクターは、所望のＤＮＡホモログの挿入のために好都合な制限部位を含有するものが提供される。
【００６１】
本発明の一つの好ましい発現ベクターは、ＭＡＲ遺伝子およびｍｅｃ−４プロモーターを含んでなる。
【００６２】
本発明の一つの側面は、ＭＡＲタンパク質の遺伝子およびＭＡＲタンパク質の遺伝的に標的化された発現のためのプロモーターを含んでなる核酸配列である。ＭＡＲタンパク質の遺伝的に標的化された発現は、プロモーターの選択により促進することができる。用語「プロモーター」は、本明細書において、特定の遺伝子の転写を可能とする核酸配列である。このプロモーターは通常、転写されるＤＮＡの領域付近にある。適当なプロモーターを使用することで、ＭＡＲタンパク質の発現レベルを制御することができる。細胞は、特定のタンパク質がどこで、いつ、どれだけ発現されるかを制御するためにプロモーターを用いる。従って、主としてある細胞種、細胞のあるサブタイプ、生物内の所与の空間的領域、または細胞内の細胞下領域で選択的に発現されるプロモーターを選択すれば、ＭＡＲの発現の制御は相応に行うことができる。プロモーターの使用はまた、発現されるＭＡＲの量、および発現の時機の制御も可能とする。プロモーターは、原核生物または真核生物プロモーターであり得る。
【００６３】
本発明の一つの実施形態は、ＭＡＲタンパク質の遺伝子および細胞特異的プロモーターを含んでなる核酸配列である。細胞特異的プロモーターの例は、ソマトスタチン、パルブアルブミン、ＧＡＢＡα６、Ｌ７、およびカルビンジンのプロモーターである。他の細胞特異的プロモーターは、ＰＫＣ、ＰＫＡ、およびＣａＭＫＩＩなどのキナーゼのプロモーター；ＮＭＤＡＲ１、ＮＭＤＡＲ２Ｂ、ＧｌｕＲ２などの他のリガンド受容体のプロモーター；カルシウムチャネル、カリウムチャネル、クロライドチャネル、およびナトリウムチャネルを含むイオンチャネルのプロモーター；ならびにカルレチニン、ネスチン、およびβ３−チューブリンなどの古典的成熟および分裂細胞種を標識する他のマーカーのプロモーターである。
【００６４】
細胞
本発明の細胞は、ＤＮＡ発現ベクター、ウイルスまたは生物を含むベクターを用いて作出することができる。好ましいベクターとしては、プラスミド、レンチウイルスおよびレトロウイルスが含まれる。場合によっては、特に、強い細胞株が関わる場合には、ＭＡＲの発現は、細胞株を、リポフェクタミンを含有するミセルまたはＦｕ遺伝子に曝した後、ＦＡＣＳ選別を行って安定発現する細胞株を単離することによるなどの、リポフェクション技術を用いることで誘導することができる。
【００６５】
いずれの起源の細胞も、好ましくは、組織培養で増殖可能な細胞が、ＭＡＲ遺伝子を用いたトランスフェクションまたは感染の候補細胞となる。培養で増殖可能な特定の細胞種の限定されない例としては、線維芽細胞、骨格組織（骨および軟骨）、骨格筋、心筋および平滑筋、上皮組織（例えば、肝臓、肺、乳房、皮膚、膀胱および腎臓）、神経系細胞（グリアおよびニューロン）、内分泌細胞（副腎、下垂体、膵島細胞）、骨髄細胞、およびメラノサイトが含まれる。好適な細胞はまた、対象由来の特定の身体組織に代表的な細胞であり得る。身体組織のタイプとしては、限定されるものではないが、血液、筋肉、神経、脳、心臓、肺、肝臓、膵臓、脾臓、胸腺、食道、胃、腸、腎臓、精巣、卵巣、毛、皮膚、骨、乳房、子宮、膀胱、脊髄および様々な種類の体液が含まれる。
【００６６】
生物の異なる発達段階（胚または成体）、またはより具体的には、外胚葉、内胚葉および中胚葉を含む種々の発生起源の細胞も適用可能である。
【００６７】
特定の疾患または特定の病状に関連する細胞、天然および誘導された免疫不全状態、心血管疾患、ニューロン疾患、炎症状態および様々な病原体により引き起こされる疾患に由来する細胞が特に注目される。疾患細胞はまた、着目する疾患を引き起こす病原体（例えば、ＡＩＤＳのＨＩＶおよびＢ型肝炎のＨＢＶ）の存在によっても確認され得る。
【００６８】
好ましい細胞は、哺乳動物細胞および哺乳動物細胞に由来する細胞株である。他の好ましい細胞は、胚性幹細胞、および造血幹細胞、骨髄、神経幹細胞、上皮幹細胞、皮膚幹細胞を含む成体幹細胞である。ＭＡＲ発現に適当な好ましい細胞株には、ＨＥＫ細胞、神経幹細胞株、膵島細胞株、および他の興奮性または分泌性細胞が含まれる。
【００６９】
細胞生存率は、膜の健全性の測定により確認することができる。膜の健全性を評価するための方法は当技術分野で公知である。
【００７０】
トランスジェニック動物
本発明の一つの側面は、ＭＡＲタンパク質を発現するトランスジェニック動物である。ＭＡＲタンパク質、特に、ニューロンのサブセットの発現は、回路機能、行動、可塑性、および精神医学的疾患の動物モデルを分析するために使用可能である。
【００７１】
ＭＡＲタンパク質を発現する本発明の好ましいトランスジェニック動物種には、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)、ハエ（例えば、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)）、蠕虫（例えば、カエノラブディティス・エレガンス）、マウス、ラット、およびマーモセットが含まれる。
【００７２】
ＭＡＲタンパク質を発現する本発明の別の好ましいトランスジェニック動物種は、マウスである。好ましい一つの実施形態では、ＭＡＲタンパク質を発現するマウスは、ＢＡＣ（細菌人工染色体）トランスジェニック技術ならびに斑入り位置効果技術を用いて作出される。
【００７３】
ＭＡＲタンパク質を発現する本発明のトランスジェニック動物の一つの好ましい実施形態は、カエノラブディティス・エレガンスである。
【００７４】
本発明の別の好ましい実施形態は、ＭＡＲが特異的プロモーター下で発現されるトランスジェニック動物である。本発明の別の好ましい実施形態は、トランスジェニック動物で発現されるＭＡＲがＢＡＣを介して導入されるトランスジェニック動物である。本発明の別の好ましい実施形態は、ＭＡＲ遺伝子が既知の遺伝子座へノックインされるトランスジェニック動物である。
【００７５】
処置の方法
本発明の別の側面は、対象内の例えば興奮性細胞にＭＡＲ遺伝子を含んでなるベクターを送達すること、および前記細胞を外部磁場に曝すことを含んでなる、対象を処置するための方法である。
【００７６】
対象を処置するための方法の好ましい実施形態は、物理的に送達される磁気刺激の使用を伴った、ＭＡＲの遺伝的付加により細胞の機能が救済または制御されるヒト治療機能を果たすことを含んでなる。ヒト患者におけるウイルスベクターを介したＭＡＲタンパク質の送達は、磁気刺激による興奮性細胞の制御を可能とし得る。例えば、ＭＡＲを発現するようにウイルスにより形質導入された皮膚疼痛抑制神経のような末梢ニューロンは、有痛性Ｃ線維応答を抑制するために磁気刺激に脊柱内側毛帯ニューロンを活性化させる。改変ヘルペスウイルスは、疼痛経路ニューロンにＭＡＲを送達するために使用することができる。同様に、桿体または錐体欠損を有する患者（色素性網膜炎または黄斑変性などにおける）は、網膜神経節細胞でＭＡＲタンパク質を発現させるためにウイルスにより形質導入することができ、これにより、視覚を媒介する経路における光の伝達を回復させる。よって、ＭＡＲの発現に基づく戦略は、網膜変性疾患に好適である。
【００７７】
一つの実施形態では、患者においてＭＡＲタンパク質発現細胞を興奮させるために使用される磁気装置は市販されている。磁場を生成するいずれの従来の磁気装置も、ＭＡＲタンパク質発現細胞を刺激するために本発明で使用可能である。
【００７８】
本明細書で提供される方法および組成物は、アルツハイマー患者に有益な効果をもたらし得る。好ましくは、アルツハイマー患者は、本明細書に記載の方法によりヒト患者の脳にＭＡＲタンパク質を送達し、興奮させることにより処置される。
【００７９】
同様に、本明細書で提供される方法および組成物は、パーキンソン患者に有益な効果をもたらし得る。好ましくは、パーキンソン患者は、本明細書に記載の方法によりヒト患者の視床下核および／または淡蒼球にＭＡＲタンパク質を送達し、興奮させることにより処置される。
【００８０】
ＭＡＲタンパク質を用いたヒト療法の別の経路は、患者において移植するためのＭＡＲタンパク質発現分泌細胞（例えば、免疫応答を回避するためにナノカプセル化された）を作出することであり、この場合、分泌は、物理的に送達される磁気刺激の使用により細胞内で刺激される。例えば、甲状腺ホルモン（例えば、Ｔ４、ＴＲＨ、およびその他）を放出するＭＡＲ発現神経内分泌細胞を、何ヶ月〜何年というタイムスケールにわたって制御されたペプチドを可能とするように皮下移植することができる。同様に、ＭＡＲタンパク質発現膵島細胞を、遠隔磁場で刺激した際にインスリンを放出するように作製することができ；移植された細胞は、ポンプ移植またはその他の侵襲的療法の必要なく、分刻みのタイムスケールで糖尿病症状の制御を可能とする。
【００８１】
一つの実施形態では、ＭＡＲタンパク質発現細胞は、患者への移植前にカプセル化される。これらの細胞は、マクロカプセル化またはナノカプセル化することができる。カプセル剤の例としては、限定されるものではないが、半透膜、中空線維、ビーズおよび平面拡散装置が含まれる。
【００８２】
別の実施形態では、ドーパミン分泌能のある分化したＭＡＲタンパク質発現幹細胞が患者の脳に直接移植され、その後、磁気刺激を用いてそれらの活性化を駆動する。ドーパミン分泌細胞は、本明細書に記載のように、分化工程の前または後にＭＡＲタンパク質でトランスフェクトしまたは感染させることができ、その後、これらの細胞を患者の脳に移植することができる。
【００８３】
別の実施形態では、ＭＡＲタンパク質発現分泌細胞が患者の組織または器官に移植される。分泌細胞は、本明細書に記載のようにＭＡＲでトランスフェクトまたは感染され、これらの細胞が患者の組織または器官に移植される。次に、ＭＡＲタンパク質発現分泌細胞は、磁気装置により化学物質を分泌するように誘導される。
【００８４】
ＭＡＲタンパク質発現分泌細胞を移植することができる組織または器官の例としては、限定されるものではないが、上皮、結合組織、神経組織、心臓、肺、脳、眼、胃、脾臓、膵臓、腎臓、肝臓、腸、皮膚、子宮、および膀胱が含まれる。
【００８５】
一つの実施形態では、ＭＡＲタンパク質発現分泌細胞は糖尿病または患者の皮膚に移植される。次に、ＭＡＲタンパク質発現分泌細胞は、磁気装置によりインスリンを分泌するように誘導される。
【実施例】
【００８６】
導入
磁気受容の機構は捉えどころのないままであったが、地球磁場を知覚する動物の能力を最大化するためには、周知の磁気センサーであるクリプトクロム（Ｃｒｙ）が別の磁気受容体と相互作用する必要があるとういうことが提案されている。Ｃｒｙには安定な複合体を形成するための多くの相互作用相手候補が存在し、そのうちの１つが、Ｉｓｃａ１、すなわち、鉄硫黄クラスターアセンブリ１(iron-sulfur cluster assembly 1)（Ｉｓｃａ１）タンパク質である(COzar-Castellano et al., 2004)。Ｉｓｃａ１遺伝子は、Ｃ．エレガンス、ショウジョウバエ、チョウ、ゼブラフィッシュ、ハト、ニワトリ、ラット、マウス、イヌ、ウシ、チンパンジーおよびヒトの間で極めてよく保存され、極めて高い相同性を有するため、それはＣｒｙと結合し、電子伝達反応に重要な役割を果たし得る。本発明者らは、Ｉｓｃａ１により行われる電子伝達反応がＩｓｃａ１発現細胞内で活動電位を誘導し、外部磁場での刺激の後にニューロン活動を誘導するという仮説を立てた。本発明者らは、これらの種類のよく保存された鉄硫黄アセンブリタンパク質を、磁気応答性であり得る磁気受容体（ＭＡＲ）として再定義した。ＭＡＲファミリーには、異なる種間でよく保存されているＩｓｃａ１ホモログの総てが含まれる。この研究で、本発明者らは、磁気遺伝学とそれ以来命名した、磁気受容体の遺伝的標的化と遠隔磁気刺激を組み合わせた非侵襲的技術を発明した。ハトは最も強力な磁気知覚システムを有しているので、本発明者らは、インビボおよびインビトロにおいて本発明者らの磁気遺伝学を探究するために、ハトＩｓｃａ１ならびにマウス、ラット、マーモセットおよびヒトに関する４つの異なるコドン最適化型（配列番号７〜１０参照）を発現させた。本発明者らは、ＨＥＫ−２９３および培養初代海馬ニューロンの両方で、遠隔磁場により活性化した際に、Ｉｓｃａ１が膜の脱分極および活動電位を誘発し、カルシウム流入を作り出し、ニューロン活動を誘導することができることを見出した。よって、この遠隔磁気刺激と遺伝的標的化の組合せの成功は、光遺伝学および脳深部刺激を含む現在利用可能な神経摂動および神経調節ツールボックスの展望を再形成する。この新規な技術は、複雑な脳回路の、他に例を見ない非侵襲的解剖ならびに脳深部領域の調節を可能とし、無傷の哺乳動物脳および他の生物の生体プロセスにおけるニューロン活動の非侵襲的、遠隔かつ磁気的な制御の新たな扉を開く。
【００８７】
試験手順
ＤＮＡ構築物
プラスミドは総て、標準的な分子生物学的手順により構築し、その後、二本鎖ＤＮＡシークエンシングにより確認した。ＧＣａＭＰ６ｓおよびＡＳＡｐ１はＡｄｄｇｅｎｅからのものであった。ＡＡＶ−ＣＡＧ−ＭＡＲ−Ｐ２Ａ−ＧＣａＭＰ６ｓとＬｅｎｔｉ−ＣＡＧ−ＭＡＲ−Ｐ２Ａ−ＧＣａＭＰ６ｓは、キメラプロモーターＣＡＧ（サイトメガロウイルス初期エンハンサーエレメントとニワトリβ−アクチンプロモーターの組合せ）下、２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）を介して連結した。ＡＳＡＰ１発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｐｕｒｏ−ＣＡＧ−ＡＳＡＰ１）は、Ａｄｄｇｅｎｅ５２５１９からのものであった。ＡＡＶ−ＣＡＧ−ＭＡＲ−Ｐ２Ａ−ＡＳＡＰ１およびＬｅｎｔｉ−ＣＡＧ−ＭＡＲ−Ｐ２Ａ−ＡＳＡＰ１は、マルチプルＰＣＲクローニングを用いて作出した。
【００８８】
ＨＥＫ−２９３およびトランスフェクション
ＨＥＫ−２９３細胞を、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ）を含有する高グルコースダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）で維持し、連続的に継代した。トランスフェクションは、リポフェクタミン−２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ）または古典的リン酸カルシウムトランスフェクションのいずれかを用いて行った。
【００８９】
初代ニューロン培養およびトランスフェクション
ラット海馬を胎生１８日ラットから摘出し、記載されているように(Zhang et al., 2007; Du et al., 2000)初代培養海馬ニューロンを培養した。トランスフェクションは、異なるインビトロ培養日数で、リポフェクタミン−２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ）または古典的リン酸カルシウムトランスフェクションのいずれかを用いて行った。
【００９０】
ｒＡＡＶの生産
ｒＡＡＶベクターを、ＡＡＶ１キャプシドを用いて偽型化した(Zhang et al., 2011)。キメラｒＡＡＶ２／１は、標準的リン酸カルシウム法をアデノウイルスヘルパープラスミドｐＨｅｌｐｅｒ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）とともに用いる同時トランスフェクションにより作製されたヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ−２９３の同時トランスフェクションにより作製した。トランスフェクション１２時間後に、ＤＮＡ／ＣａＣｌ２混合物を通常の増殖培地に置き換えた。さらに培養６０時間後に、トランスフェクト細胞を回収し、３回の凍結／解凍を施した。次に、清澄な上清を、ヘパリンアフィニティーカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、およびＳｗｅｄｅｎ）を用いて精製した。精製されたｒＡＡＶ２／１をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４遠心分離フィルター１００Ｋ装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）で濃縮し、ウイルス力価を、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステムおよびＴａｑＭａｎユニバーサルマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてリアルタイム定量的ＰＣＲにより決定した。力価測定済みのウイルスを希釈し、１×リン酸緩衝生理食塩水で１．０×１０１２ウイルスゲノム粒子／ｍｌに力価を合わせた。
【００９１】
免疫蛍光
免疫染色のために、切片を１×ＰＢＳ中、室温で１０分間、３回すすぎ、ＰＢＳＴ（０．５％トリトンＸ−１００を含む１×ＰＢＳ）中、１０％正常ヤギ血清にて２時間プレインキュベートした。インキュベーションステップ間のすすぎは総てＰＢＳＴを用いた(Zhang et al., 2009)。すすぎの後、処理済みの切片を、４℃、抗体ブロッキングバッファー中で７２時間、ＭＡＲ（自家製、１：２００）、ＮｅｕＮ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：５００）およびｍＣｈｅｒｒｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、１：２０００）に対する種々の一次抗体とともにインキュベートした。室温、１×ＰＢＳＴ中で１５分、３回の洗浄の後、切片を室温で２時間、それぞれフルオレセインイソチオシアネートまたはＣｙ３(Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania, USA, 1:2000)のいずれかを結合させた二次抗体中でインキュベートした。１×ＰＢＳＴで徹底的にすすいだ後、切片をスライドガラスにマウントし、カバーガラスをかけた。
【００９２】
Ｃ．エレガンス系統の増殖および遺伝子導入
総てのＣ．エレガンス系統は、２０℃で培養する線虫増殖培地（ＮＧＭ）寒天プレートで増殖させ、維持した。ＮＧＭ寒天プレートにＯＰ５０大腸菌(Escherichia coli)を播種した。トランスジェニック系統は、標準的な手順(Evans et al., 2006)に従い、Ｎ２蠕虫への標準的マイクロインジェクションにより作製した。導入遺伝子ｚｄＥｘ１２［ｐｍｙｏ−３：：ＭＡＲ；ｐｍｙｏ−３：：ｇｆｐ］およびｚｄＥｘ２２［ｐｍｅｃ−４：：ＭＡＲ；ｐｍｅｃ−４：：ｇｆｐ；ｓｕｒ−５：：ｍＣｈｅｒｒｙ］中の非タグＭＡＲをＮ２に注入し、それぞれ染色体外アレイＺＤ２４、ＺＤ３４を有する系統を得た。それらの特定の細胞がトランスジェニックアレイとともに上手く受け継がれることを保証するために、マーカーとしてプラスミドｐｍｙｏ−３：：ｇｆｐ、ｐｍｅｃ−４：：ｇｆｐおよびｓｕｒ−５：：ｍＣｈｅｒｒｙを同時に注入した。ＭＡＲの発現パターンをモニタリングするために、特定のプロモーターにより駆動されるＧＦＰ（ｍｙｏ−３およびｍｅｃ−４に関して２系統、表Ｓ１参照）を使用した。磁気刺激に応答したＣ．エレガンスの行動を明視野照明下で記録した。
【００９３】
【表３】
2018526439.tif 000005
【００９４】
培養海馬ニューロンにおける全細胞クランプ記録
タイロード溶液(Boyden et al., 2005)に浸漬したＡｘｏｎ  ＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ  ７００Ｂ増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＳＡ）を用いてニューロンの記録を行った。ガラスピペットの細胞内溶液（３〜８ＭΩの範囲の抵抗）は、（ｍＭで）１２５  グルコン酸カリウム、０．５  ＥＧＴＡ、４  マグネシウムＡＴＰ、５  ＮａＣｌ、０．３  ナトリウムＧＴＰ、１０  ホスホクレアチン、１０  ＨＥＰＥＳを含有した（ＫＯＨでｐＨ７．２）。図５Ｃでは、電位固定を行った場合、細胞内溶液は（ｍＭで）１２５  グルコン酸Ｃｓ、４  マグネシウムＡＴＰ、０．３  ナトリウムＧＴＰ、１０  ホスホクレアチン、１０  ＨＥＰＥＳ、０．５  ＥＧＴＡ、３．５  ＱＸ−３１４、５  ＴＥＡ、２  ＣｓＣｌを含有した（ＮａＯＨでｐＨ７．２）。−７０ｍＶおよび０ｍＶでそれぞれニューロンをクランプしながら内向き電流および外向き電流を記録した。膜抵抗は、電位固定モードで１００ｍｓ継続する１０ｍＶステップを注入することにより測定した。
【００９５】
カルシウムイメージング
カルシウムイメージングは、４０×水浸対物レンズおよびＯｌｙｍｐｕｓ  ＤＰ−８０  ＣＣＤを備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ６１ＷＩ直立顕微鏡を用いて行った。蛍光強度（ΔＦ／Ｆ０）の相対的変化を、ＩｍａｇｅＪを用いて抽出した。Ｍａｔｌａｂ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ、ＵＳＡ）を用いてヒートマップを作製した。
【００９６】
結果
ＨＥＫ−２９３における磁場を介したＭＡＲによるカルシウム流入の誘導
本発明者らは、ＭＡＲが、磁石応答性のタンパク質として機能し得るか、従って、遠隔磁場によるニューロン活動の磁気遺伝学的制御のために使用可能かどうかを調べた。本発明者らは、まず、このＭＡＲを遺伝的にコードされた超高感度カルシウムインジケーターＧＣａＭＰ６ｓとともにヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）由来細胞株ＨＥＫ−２９３細胞に同時トランスフェクトした(Chen et al., 2013; Tian et al., 2009)。本発明者らは、標準的な３５ｍｍ培養ディッシュを保持できる２対のコイルからなる特注の磁気発生装置を構築した（図１Ａ）。本発明者らの自家製磁気発生装置は、ディッシュの中心で約１ミリテスラ（ｍＴ）、端部でおよそ２．５ｍＴの最大磁場強度を生成できる。本発明者らの自家製磁気装置または手持ち静磁気バーのいずれかで刺激した場合、培養ディッシュ中の異なる位置の細胞は、異なる量の磁場強度を受ける（図１Ｃ）。
【００９７】
磁気発生装置を作動する前は、ＨＥＫ−２９３細胞中のＧＣａＭＰ６ｓの蛍光強度は基底レベルで安定を維持する。磁場を適用した後、本発明者らは、ＭＡＲトランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞で蛍光強度の劇的な増加を検出し（図１Ｂ）、基底蛍光強度に比べてほぼ３５０％増を示した（図１Ｅ）。蛍光強度は、平均持続時間１３秒で、基底蛍光強度の標準偏差の１０倍を超えて増加し、図１Ｅの挿入図の灰色の破線により示される。重要なこととして、ＭＡＲの発現のない対照群では増加は見られなかった（図１Ｅ）。
【００９８】
本発明者らは、本発明者らの自家製装置から培養ディッシュの中心において測定される０〜１ｍＴの範囲の磁場強度に応答した蛍光強度の変化を調べることにより磁気強度の閾値を測定した（図１Ｆ）。ＭＡＲトランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞を活性化するために、必要とされる最小磁気強度は０．３ｍＴ付近であり、これは地球の磁気強度（約５０μＴ）(Mouritsen and Ritz, 2005)の約６倍であった。本発明者らの試験環境下で地球の磁場のみが存在する場合には増加は見られず（データは示されていない）、このことは、地球磁場はＭＡＲを活性化することができず、ＭＡＲトランスフェクト細胞で応答を惹起するためには相対的に強い磁場が必要とされたことを示す。診断的および治療的ｆＭＲＩにおける数テスラの強い磁場強度に比べ（Ｌｏｇｏｔｈｅｔｉｓ、２００８）、ＭＡＲを刺激するために本発明者らの試験に存在する磁気強度はわずか数ミリテスラのレベルであり、このことは、ＭＡＲ依存的磁気遺伝学的制御が地球磁場からの影響に対して頑強でないだけでなく安全でもあることを示唆する。
【００９９】
本発明者らの自家製磁気発生装置の電気コイルにより生成される磁場における電位変動からのバックグラウンド干渉のためにあり得る人為要素を排除するために、本発明者らは、本発明者らの自家製磁気発生装置を、ディッシュの中心でほぼ２．５ｍＴを生じ、本磁気発生装置により誘導されるものと同様の劇的な蛍光増加の所見を認めた（図１Ｄ）、手持ち静磁気バー（図１Ｃ）に置き換えた。これらの所見はともに、磁気受容体（ＭＡＲ）が磁気応答性のアクチベーターとして機能し、膜電位を脱分極し、その後、磁場依存的にカルシウム流入を生じさせることを示唆する。
【０１００】
ニューロンにおけるＭＡＲにより誘発されるカルシウム流入
本発明者らは、次に、ＭＡＲがニューロンを活性化できるか、また、外部磁場の適用後にＭＡＲトランスフェクトニューロンにおいてカルシウム流入を誘導できるかということに答えを求めた。本発明者らは、濃縮プロセスが機能的に形成された場合に、ＭＡＲをＧＣａＭＰ６ｓとともに用い、初代培養ラット海馬ニューロンの同時トランスフェクトまたは感染を行った(Du et al., 2010; Zhang et al., 2007)。免疫蛍光染色は、ＭＡＲが主として体細胞樹枝状に(somato-dendritically)発現されるとみられることを示した（図２Ｂ）。ＭＡＲ陰性ニューロンは、検出可能なＭＡＲ発現をほとんど示さず、このことは、ＭＡＲが海馬ニューロンにおいて少なくとも内因的でなく外因的に生産されたことを示す。同様に、本発明者らは、外的に適用される磁場（図２Ａ）のオンセット後に、７．８±０．８秒内に（図２Ｄ）、Ｃａ２＋移行の増強（ΔＦ／Ｆ０＝５０．５±７．０％、ｎ＝４２、図２Ｅ）を見出すことができた。トレースを図Ｓ１Ｃに記載される光退色に関して補正した。ＭＡＲトランスフェクト培養ニューロンにおけるＧＣａＭＰ６ｓの持続時間は１１．１±０．９秒であった（図２Ｄ）。対照として、ＭＡＲ陰性ニューロンではカルシウムスパイキングの有意な増加は見られなかった（ｎ＝４８、図２Ｃ）。本発明者らは、ニューロンを活性化させるために必要とされる最小磁気強度はＨＥＫ−２９３の場合と同等であったことを見出した。さらに、本発明者らは、ＭＡＲトランスフェクトニューロンおよび感染ニューロンの両方を繰り返し活性化することができ、同様のカルシウムスパイクトレインパターンを検出することができ（図Ｓ１ＡおよびＳ１Ｂ）、このことは、ニューロン活動の磁気的活性化が即座可逆的でもあることを示唆する。よって、ＭＡＲの磁気遺伝学的活性化は、ニューロン膜を脱分極し、即座かつ可逆的に活動電位を誘導することができた。
【０１０１】
ニューロン活動の磁気方向選択的制御
磁場は配向を有する(Winkhofer et al., 2012)ので、本発明者らは、誘発活動電位の磁気遺伝学的制御は適用される外部磁場の方向により影響を受け得ると推論した。この可能性を検討するために、本発明者らは、異なる方向の磁場に対するニューロン応答を調べた。
本発明者らは、まず、適用した磁場の方向が、本発明者らの二次元コイルに基づく磁気発生装置（図３Ａ）にて、ＧＣａＭＰ６ｓのカルシウム移行のＭＡＲにより誘発される応答に影響を及ぼすかどうかを確認した。磁場は本発明者らの自家製磁気装置でその都度、２対の直交コイル（ａ−ｂおよびｃ−ｄ）のうち一方だけにより生成されたので、本発明者らは、直交方向のうちいずれか一方、すなわち、Ｘ方向（ａからｂ）およびＹ方向（ｃからｄ）に磁場を生成した。
【０１０２】
本発明者らは、２２の磁気応答性ニューロンのうち７つがＸ方向の磁場によってのみ活性化され（図３Ｂ、上のパネル）、２２のニューロンのうち１１がＹ方向の磁場によってのみ活性化された（図３Ｂ、中央のパネル）を見出した。興味深いことに、残りの４つのニューロン（４／２２）は、Ｘ方向およびＹ方向の両方の磁場に応答して強いカルシウムスパイクを示した（図３Ｂ、下のパネル）。本発明者らは、ＭＡＲトランスフェクトニューロンの軸索配向と適用された磁場の方向との間の相関がＭＡＲにより誘導される応答に影響を及ぼしたかどうかをさらに定量した。ＭＡＲにより誘導される応答と適用される磁場の方向に対する軸索配向との間に明らかな相関は見られなかった（図Ｓ３）。本発明者らはまたＨＥＫ−２９３細胞でも同様の磁気方向依存的効果を見出したので、このような方向の効果はニューロン特異的ではなく、むしろ磁気刺激による、細胞膜上に発現したＭＡＲのロッド様再配列であり得る。本発明者らは、ＭＡＲの発現レベル、細胞膜上での磁石により誘導されるＭＡＲのロッド様クラスター再分布、より高い磁気強度および／または均一な磁気活性化がニューロン活性化に対するこのような磁気方向依存的な異種効果を排除し得るという可能性を排除することができなかった。本発明者らの所有の自家製装置では最大磁気強度が１ｍＴを超えることができないことを考えれば、これらの所見は、活動電位の磁気遺伝学的制御が本発明者らの特定の設定で適用された外部磁場の方向に依存し得ることを示唆した。本発明者らの今後の実験で、より高性能の磁気装置を用いてニューロン活動に対する磁気極性の効果を試験することが興味深いであろう。
【０１０３】
ニューロン活動に対する磁場のオン応答およびオフ応答効果
磁場のオンまたはオフを切り替えると膜の伸長が変化し、その後、膜の一部のイオンチャネルが開き得ることから、本発明者らは、適用された外部磁場のオンセットまたはオフセットもまたニューロン活動に影響を及ぼし得るとの仮説を立てた(Winkhofer et al., 2012)。予想通り、本発明者らは、上記で供試した２２のニューロンで、磁場をオンまたはオフにする場合に、ニューロン活動のオン応答、オフ応答およびオン／オフ応答パターンを見出した（図３Ｃ）。本発明者らは、２２のＭＡＲ−ＧＣａＭＰ６ｓ同時トランスフェクトニューロンのうち１２が、磁場をオンにした場合にのみ蛍光強度に劇的な増加を示したことを見出した。しかしながら、増加したカルシウム移行は、磁場をオフにすると基底レベルに戻った（図３Ｄ、上のパネル）。興味深いことに、これとは逆に、２２のＭＡＲトランスフェクトニューロンのうち６つは、磁場のオンセット後に活性の増大を示さなかったが、ＧＣａＭＰ６ｓ蛍光は、同じニューロン群に対して磁場をオフにした場合に一時的増加を示した（図３Ｄ、中央のパネル）。興味深いことに、小群のニューロン（ｎ＝４）は、磁場をオンからオフへ切り替えた場合に、オフからオンへ切り替えた場合と同様に活発に応答した（図３Ｄ、下のパネル）。４つの異なる応答パターンの分布を図Ｓ２にまとめる。本発明者らは、ニューロン内のＭＡＲのヘテロな発現または細胞膜上での磁石により刺激されたＭＡＲからのロッド様鉄硫黄クラスター再配列および／または本発明者らの自家製磁気発生装置における磁場の不均一な分布が、ニューロン活動のこのような示差的オン−オフ応答を生じ得るという可能性を排除することができなかった(Winkhofer et al., 2012)。より高い出力およびより正確な制御を備えた磁気発生装置でさらなる実験を行うべきである。
【０１０４】
ＭＡＲはニューロンにおいて磁気電流およびスパイキングを惹起する
本発明者らは、さらに、培養海馬ニューロンにおいて、磁石により刺激されたＭＡＲがニューロンを脱分極し、活動電位トレインを誘発し得るかどうかを、本発明者らの自家製装置の電気コイルにより生成される磁場における電位変動からの干渉を回避するために使用される一対の手持ち静磁気バー(Mora et al., 2004; Semm and Beason, 1990)とともに電位固定および電流固定の両方を用いて調べた（図４Ａ）。本発明者らは、確認された総てのｍＣｈｅｒｒｙ陽性ニューロンがＭＡＲと同時発現されることを保証する、ニワトリβアクチン−ＣＭＶキメラプロモーター（ＣＢＡ）により駆動されるＰ２Ａ結合ＭＡＲ−ｍＣｈｅｒｒｙでニューロンをトランスフェクトした（図４Ｂ）。
【０１０５】
磁場は、ＭＡＲ陽性ニューロンにおいて急速な内向き電流を誘発した。代表的な記録は、−７０ｍＶでクランプされたｍＣｈｅｒｒｙ陽性ニューロンにおいて、磁場の適用により全細胞電流が惹起されたことを示した（図Ｓ４Ａ、トレース＃１〜３）。平均内向きピーク電流は２７９．６±４５．２ｐＡであり、平均イベント数は９．３±３．９５であった（図Ｓ４Ｃ）。磁場は、培養ディッシュ中の、ＭＡＲを発現する興奮性および阻害性両方のニューロンを刺激する傾向にあったので、０ｍＶで電位固定されたニューロンでは外向き電流も記録できた(Jackson, 2001)（図Ｓ４Ｂ、トレース＃４〜６）。
【０１０６】
本発明者らは、次に、上記で磁気電流を惹起するために使用したものと同じ刺激を用い、電流固定モードにて、ＭＡＲがニューロンの発火を駆動できるかどうか検討した。図４Ｃに示された電位トレースは、外部磁場により刺激された発火頻度の増加を伴う、３つの代表的ニューロンであった（トレース＃１〜３）。カルシウムイメージングから得られた結果（図３Ｄ）と一致して、本発明者らはまた、外部磁場で刺激された３つの同様のオン−オフ発火パターンを見出した（図４Ｄ）：１つはオン応答のみで活性化されるもの、第２にオフ応答のみで活性化されるものおよび第３にオン応答およびオフ応答の両方で活性化されるもの。集団データは、ＭＡＲにより誘発されたスパイクの数は自発的イベントよりも有意に高いことを示し（ｎ＝１９；＊＊、Ｐ＝０．００３、スチューデントのｔ検定）、１．０±０．５スパイクに対して１３．２±４．２スパイクであった。これらのスパイクトレインは８．５±１．５秒持続し、磁場オンセット後５．３±１．１秒の遅延があった（図４Ｅ）。本発明者らは、ＭＡＲ陽性およびＭＡＲ陰性ニューロンで電位固定モード下、１０ｍＶの電気ステップを注入することにより、固有の電気特性を定量した。静止膜電位および膜抵抗の両方がＭＡＲ発現ニューロンとＭＡＲ非発現ニューロンの間に有意差がないことを示した（図Ｓ３Ｄ）。従って、ＭＡＲは、膜の脱分極を即座に誘導し、繰り返し活動電位を誘発し、ニューロン活動を遠隔で制御する能力があった。
【０１０７】
Ｃ．エレガンスにおいてＭＡＲは運動を誘発し、逃避行動を誘導する
ＭＡＲの磁石依存的活性化がトランスジェニック動物において巡回およびネットワーク行動を誘発できるかどうかを調べるため、本発明者らは、その発現をＣ．エレガンスの筋細胞に限定するプロモーターｍｙｏ−３(Nagel et al., 2005)の制御下でＭＡＲを発現させることにより、トランスジェニック線虫カエノラブディティス・エレガンスを構築した。Ｃ．エレガンスにおけるＭＡＲの発現レベルを改善するために、本発明者らは、ハト由来のその推定アミノ酸配列に基づきそのコドン使用頻度を最適化すること、およびＣ．エレガンスにおいてその発現を促進することが確認された２つの人工イントロン(Husson et al. 2013; Liu et al., 2009; Okkema et al., 1993)を付加することにより、人工ＭＡＲ遺伝子を合成した（配列番号１１）。ＭＡＲ発現は、ｍｙｏ−３のプロモーター下で筋細胞に限定された（図５Ａおよび図Ｓ５Ａ）。
【０１０８】
【表４】
2018526439.tif 000006
【０１０９】
外部磁石を適用した後、ｚｄＥｘ１２トランスジェニック動物は、強くて再現性のある運動活性を示し、細菌を供給したＮＧＭ寒天プレート上で全体長の明らかな縮小を伴う体筋の同時収縮を示した（図５Ｂ）。
【０１１０】
運動に及ぼすＭＡＲ依存的活性化の影響を定量するために(Nagel et al., 2005; Zhang et al., 2007)、本発明者らは、体縮小のパーセンテージを計算した。これにより、最大６％の体長の縮小が明らかとなった（図５Ｃ）。これに対し、野生型Ｎ２  Ｃ．エレガンスにおいては、外部磁場を適用した際に検出可能な収縮はなかった（ｐ＜０．００１、対応のあるｔ検定）。これらの結果は、ＭＡＲが磁石により誘発される体収縮またはインビボにおけるＣ．エレガンスの縮小を誘発できることを実証した。
【０１１１】
本発明者らは、次に、磁石により誘発されるＭＡＲは神経細胞を脱分極し、次なる行動を引き起こし得るかどうかを評価した。本発明者らは、プロモーターｍｅｃ−４により駆動される６種の機械刺激ニューロンＡＶＭ、ＡＬＭＬ／Ｒ、ＰＶＭおよびＰＬＭＬ／ＲでのみＭＡＲが選択的に発現される別のｚｄＥｘ２２トランスジェニックＣ．エレガンスを作出した(O’Hagan et al., 2005; Zhang et al., 2007)。図５Ｄは、ＭＡＲ発現がｍｅｃ−４のプロモーター下で機械刺激ニューロンだけに限定されていたことを示した（図Ｓ５Ｂも参照）。ＭＡＲは、磁場がオンにされた場合にＣ．エレガンスにおいて逃避行動を誘発した（図５Ｅ）。ＭＡＲにより活性化されたニューロンからのこれまでの結果(Nagel et al., 2005)と一致して、２２個体のうち１９個体（８６％）のｚｄＥｘ２２トランスジェニック動物が、磁場の刺激下で、強くて再現性のある逃避行動を示した。注目すべきことに、本発明者らは、外部磁場が適用された後に蠕虫の全身の劇的なオメガ運動を認め、これは、磁場の無制限の接近性が６種の機械刺激ニューロンの総てを活性化できたことを示す。光遺伝学では同じ結果は得ることができず、光により影響を受ける透過の制限により６種の機械刺激ニューロンの一部のみを刺激するに留まった(Nagel et al., 2005)。時には、本発明者らは、少数のトランスジェニック動物で前進行動を伴う加速化を見出すことができた。逃避行動は外部磁場により再現性よく誘発することができた（図５Ｆ）。これに対し、野生型対照動物は、逃避行動も加速化行動も示さなかった。これらの結果を考え合わせると、ＭＡＲによるニューロン活動の磁気遺伝学的制御はインビボにおいて行動出力を誘導できたことが示唆される。
【０１１２】
考察
本発明者らの研究の主要な発見は、磁気遺伝学の神経技術的かつ概念的発明である。非侵襲的磁気遺伝学は、磁石依存的磁気受容体ＭＡＲを介したニューロン活動の遺伝学的活性化と外部磁場を組み合わせ、非侵襲的かつワイヤレスのニューロン活動の摂動を可能とする。
【０１１３】
ナノ粒子に基づく神経調節の磁気熱制御
Ａｎｉｋｅｅｖａおよび彼女の共同研究者ら(Chen et al., 2015)は、最近、熱感受性カプサイシン受容体ＴＲＰＶ１を特定の脳領域に送達すること、および、次に、同領域に発熱ナノ粒子を注入することを含んだ磁気熱的神経調節ツールを導入した。この二段階の磁気熱アプローチには固有の欠点がある。第一に、脳に永久的に組み込まれる外因性のＦｅ３Ｏ４磁気ナノ粒子から、また、発熱磁気ナノ粒子による、生理学的温度を十分に超える４３℃より高い高温から、主要な安全上の問題が持ち上がる。第二に、拡散される磁気ナノ粒子は、末梢および中枢の両神経系で発現される他の内因性の温度感受性イオンチャネルを活性化する可能性がある(Leibiger and Berggren, 2015; Temel and Jahanshahi, 2015)。第三に、磁場変更によりＴＲＰＶ１チャネルを開放するための熱を生み出すためには磁気ナノ粒子の共鳴が必要であるので(Chen et al., 2015)、ニューロン活性化に比較的強い磁場が求められる（本発明者らの研究では最大約２．５ｍＴであるのに対し、約１８０ｍＴ）。
【０１１４】
磁気受容の分子および細胞機構
Ｖｉｄａｌ−Ｇａｄｅａら(Vidal-Gadea et al., 2015)は、最近、Ｃ．エレガンスから、ＡＦＤ知覚ニューロンと呼ばれる、地球の磁場に応答して垂直移動を補助する一対の磁気知覚ニューロンを同定した。しかしながら、ＡＦＤ知覚ニューロンが行動を導くためにどのように地球の磁場を検知および使用するかは捉えどころのないままである。本発明者らの発見は、ニューロン活動を制御するための磁気受容体ＭＡＲをコードする単一の遺伝子が磁気アクチュエータとして働き得ることを初めて実証する。本発明者らは、ＭＡＲが動物において分子バイオコンパスとして働き、空間ナビゲーション、移動、配向および帰巣において重要な役割を果たし得るという仮説を立てている(Mouritsen and Ritz, 2005)。本発明者らは、この新規な鉄含有磁気受容体（ＭＡＲ）が、細胞骨格または微細線維のいずれかを介して細胞の原形質膜に結合し得る鉄硫黄クラスターアセンブリを形成している可能性があると推測している(Winkhofer, 2012; Johnsen and Lohmann, 2005)。外部磁場の適用後に、ＭＡＲを介して磁石により駆動される回転力による膜張力がイオンチャネルを開かせ、これにより膜の脱分極および活動電位トレインが誘導される(Fleissner et al., 2007; Winkhofer, 2012; Wu and Dickman, 2012)。本発明者らは、磁場の方向および磁場のオンまたはオフの切り替えがどのようにニューロン活動に影響を及ぼすのか正確な機構をまだ知らない。ＭＡＲの発現レベル、三次元磁場刺激とＭＡＲ発現ニューロンの軸索−樹状突起配向の間の正確な整列および／または磁気強度がニューロン活動の方向依存的磁気制御に影響を及ぼし得るかどうかを検討することによりさらなる洞察を得ることができる(Mouritsen and Ritz, 2005)。ＭＡＲ相互作用相手およびＭＡＲ固有の高度な構造に関するさらなる研究は、ニューロン活動の磁気遺伝学的制御に関する分子機構を明らかにする可能性がある。
【０１１５】
磁気遺伝学の利点
本発明者らの新たに発明された磁気遺伝学は、１０年にわたってなおまだ最適化されている光遺伝学に優るユニークないくつかの利点を有し、すなわち、磁気遺伝学は非侵襲的、遠隔、浸透性、均一、かつ安全である。光遺伝学に使用される光ファイバー(Fenno et al., 2011)および脳深部刺激において組み立てられた電線(Creed et al., 2015)に比べ、外部磁場は無傷の哺乳動物の脳またはその他の生体システムに深く透過し得るので、いずれの侵襲的装置の長期的な外科移植の必要もない。ＲｅａＣｈＲ (Lin et al., 2013)およびＪａｗｓ(Chuong et al., 2014)などの赤色シフトオプシンはそれぞれ経頭蓋活性化または神経活性の阻害を可能とするが、ＲｅａＣｈＲおよびＪａｗｓは両方とも、齧歯類の脳では３ｍｍまでの深さでのみ有効であり得る(Chuong et al., 2014)。その一方で、制御可能な磁場は正確な遺伝的標的化でいずれの中枢神経系または末梢神経系にも均一に働くことができ、光の吸収および散乱のために一様でない効果に打ち勝つ(Hausser 2014)。さらに、ミリテスラの範囲内の磁気遺伝学的刺激は、光毒性または温度毒性のような副作用を招かず、磁気遺伝学をずっと安全にする。
【０１１６】
磁気遺伝学と他のニューロン読み取りの組合せ
既存の総ての遺伝子学的および光遺伝学的アクチベーター、サイレンサー、センサーおよびエフェクターと同様に(Adamantidis et al., 2014)、この磁気受容体は、有効な磁気刺激のためにいずれの補因子も用いずに単一の１３３アミノ酸コードのオープンリーディングフレームを使用する。神経細胞種特異的、部分領域特異的またはサブレイヤー特異的プロモーターの使用により、ウイルスおよび／またはトランスジェニックに利用可能な動物へのこの磁気受容体の送達は、非侵襲的方法でのニューロン活動の回路特異的、投射標的化および時空間マッピング、操作、測定およびモニタリングを可能とする。磁気遺伝学と、遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターおよび電位センサー(Knopfel, 2012; St-Pierre et al., 2013)、多電極アレイ(Spira and Hai, 2013)、機能的磁気共鳴イメージング(Desai et al., 2011; Lee et al., 2010)または多部位単一単位記録(Zhang et al., 2013)との組合せは、大規模ニューロン活動の記録(Scanziani and Hausser, 2009; Hausser, 2014)および特異的行動機能に相当する活性パターンの同定を可能とする。磁気遺伝学の適用は、ニューラルコンピュテーションおよびコードしている基礎にある複雑な相互連絡しかつ相互依存する脳回路の系統的および因果的詳細分析を加速化する(Bargmann et al., 2014)。本発明者らの研究はＭＡＲによる磁気的活性化のみに焦点を当てるが、比較ゲノミクスによる変異型ＭＡＲまたは別の未発見の磁気受容体のいずれかからの磁気的不活性化に関する反対の方法も実現可能である。直接的光遺伝子工学(Zhang et al., 2011)と同様に、磁気受容体の多様なファミリーの継続的分子操作が磁気遺伝学的ツールボックスを拡大する。
【０１１７】
翻訳神経科学に対する磁気遺伝学の適用
パーキンソン病および他の神経疾患を処置するための脳深部刺激は有効であることが照明されているが、これは細胞種特異性なく標的領域を刺激する、外科的に移植される金属電極を用いる(Benabid, 2015; Creed et al., 2015; Gradinaru et al., 2009)。非侵襲的経頭蓋磁気刺激（ＴＭＳ）は、皮質の小領域を刺激するための小電流を誘導するために磁気パルスを使用するが(Ridding and Rothwell, 2007; Walsh and Cowey, 2000)、鬱病およびパーキンソン病などの疾患に関する基礎研究ならびに診断的および治療的使用のためのその適用は、特異性、信頼性および再現性の欠如により制限される。細胞種特異的プロモーターと組み合わせると(Luo et al., 2008)、磁気遺伝学は正確に標的化される神経調節を達成し、非特異性を克服し、かつ、パーキンソン病ならびに他の神経学的および神経精神病的疾患のための治療的処置に利益を持ち得る可能性を有し得る。
【０１１８】
磁気遺伝学の展望
要約すると、磁気受容体によるニューロン活動の非侵襲的磁気活性化は、磁気遺伝学を、複雑な神経回路の活性を摂動させ、細胞種特異性、時空間的精度、空間的均一性および非侵襲的可逆性を有する複雑なニューロンマイクロ回路の詳細分析を可能とする優れたツールボックスとする。特定の細胞種および領域の遺伝的標的化と組み合わせると、磁気遺伝学は、神経科学の最終目標を達成するため、すなわち、脳がどのようにニューロンアルゴリズムを計算し、情報を変換し、認知および行動を創出するかを理解するための本発明者らの追求を加速化するであろう。磁気遺伝学は基礎的および翻訳的な神経科学に広範な適用を持つだけでなく、生体システムの非侵襲的、時空間的制御のために磁場を使用するというその原理がまた、遺伝学、エピジェネティックおよび転写レベルを含む多レベルで(Cong et al., 2013)、生物科学および生体医工学における他の分野に影響を及ぼす(Cong et al., 2013)。過去１０年にわたる前進的改良を伴う光遺伝学と同様に、本発明者らは、継続的な研究、開発および最適化をもってすれば、新世代の磁気遺伝学が近い将来に到来すると自信を持って企図している。
【０１１９】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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