(57)【要約】本発明は、移植術において使用するために、ウイルスを含有しない細胞を、ヌクレアーゼを使用して生成するための方法に関する。ヌクレアーゼは、細胞内でウイルスゲノムを標的とし、不活性化するための、ガイド用ＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体であり得る。移植に先立って、ヌクレアーゼが、細胞内のウイルスを分解または破壊する。本発明によれば、細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏで処理してから送達することができ、したがって、人は、移植後に細胞に由来するウイルス感染を経験することがない。レシピエントに送達する前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヌクレアーゼを使用して、細胞内のウイルス核酸を標的とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスを含有しない細胞を生成するための方法であって、
ドナーから細胞を得るステップと、
前記細胞に、ウイルス核酸を切断するヌクレアーゼを送達するステップと、
患者内への移植術のために、前記細胞を提供するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記患者が、前記ドナーと一致するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）型を有する所定の人である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記患者が、前記ドナーである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、造血幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、前記ドナーの骨髄または末梢血から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼからなる群から選択されるヌクレアーゼを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞に、前記ウイルス核酸の部分へと、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを標的にするガイドＲＮＡを送達するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞に、前記ヌクレアーゼおよび前記ガイドＲＮＡがリボ核タンパク質として送達される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、ウイルスに感染しており、その中に前記ウイルス核酸を有し、前記ウイルス核酸を、前記ヌクレアーゼを使用して切断するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ドナーからの複数の細胞に、前記ヌクレアーゼを送達するステップと、前記複数の細胞を培養するステップと、前記複数の細胞の中から、前記ウイルス核酸の切断成功に基づいて前記細胞を選択するステップとをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞を選択するステップが、前記ヌクレアーゼと共に送達される蛍光マーカーを使用することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ウイルスが、ヘルペスファミリーのウイルスまたはヒトポリオーマウイルスである、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記ウイルスが、前記細胞中で潜伏段階にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記送達するステップが、ウイルスベクター中で前記ヌクレアーゼを送達することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルスおよびアデノ随伴ウイルスからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記送達するステップが、プラスミド、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属ナノ粒子、ナノロッド、リポソーム、細胞貫通ペプチド、リポスフェアおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群から選択されるベクターを含むベクター中で前記ヌクレアーゼを送達することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
切断するステップが、ウイルスゲノム中に、二重鎖の１つまたは複数の切れ目を引き起こすことを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
切断するステップが、ウイルスゲノム中に、挿入、欠失または置換を引き起こすことを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、ウイルスに感染しており、その中に前記ウイルス核酸を有し、前記ウイルス核酸を、前記ヌクレアーゼを使用して切断するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ドナーからの複数の細胞に、前記ヌクレアーゼを送達するステップと、前記複数の細胞を培養するステップと、前記複数の細胞の中から、前記ウイルス核酸の切断成功に基づいて前記細胞を選択するステップとをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞を選択するステップが、前記ヌクレアーゼと共に送達される蛍光マーカーを使用することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞を処理して、外来核酸を除去するための方法であって、
ヌクレアーゼおよびＲＮＡを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成するステップと、
ドナーから細胞を得るステップと；前記細胞に前記ＲＮＰを送達するステップと、
前記細胞内のウイルス核酸を、前記ＲＮＰを用いて切断するステップと
を含む方法。
【請求項２４】
患者内への移植術のために、前記細胞を提供するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記送達するステップが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記外来核酸が、ウイルス核酸を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞が造血幹細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞が、細胞の培養物の一部であり、かつ前記細胞が、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）における使用のために提供される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記送達するステップが、エレクトロポレーションを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記送達するステップが、リポソーム中に前記ＲＮＰをパッケージングすることを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＲＮＡが、前記ウイルス核酸内の標的に実質的に相補的であり、かつヒトゲノム上の任意の場所に実質的に相補的でない部分を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記ウイルスが、ヘルペスファミリーのウイルスである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ウイルスが、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルスおよびサイトメガロウイルスからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ウイルスが、前記細胞中で潜伏段階にある、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、Ｃａｓ９である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ドナーから得られる複数の細胞に、前記ＲＮＰを送達するステップと、
前記複数の細胞を培養するステップと、
前記複数の細胞の中から、前記ウイルス核酸の切断成功に基づいて前記細胞を選択するステップと
をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
細胞を処理して、外来核酸を除去するための組成物であって、ヌクレアーゼおよびＲＮＡを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含み；前記ＲＮＡが、非ヒト核酸内の標的に実質的に相補的であり、かつヒトゲノム上の任意の場所に実質的に相補的でない部分を有し；前記ＲＮＡが、前記ヌクレアーゼをガイドして、前記非ヒト核酸を切断する、組成物。
【請求項３９】
前記ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質である、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記非ヒト核酸が、ウイルスに由来するウイルス核酸を含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、Ｃａｓ９である、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ウイルスが、ヘルペスファミリーのウイルスである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記ウイルスが、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルスおよびサイトメガロウイルスからなる群から選択される、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ＲＮＰが、リポソームに包まれている、請求項４０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１５年５月２９日に出願された米国仮出願番号第６２／１６８，２５３に基づく利益および優先権を主張しており、その内容は参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、造血幹細胞移植に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
がんを有する人に化学療法を行うと、次いで、造血幹細胞（ＨＳＣ）を当該の人の骨髄中に送達する骨髄移植を施さなければない場合がある。化学療法により、がん性細胞のみならずまた、正常な免疫機能に必要である健常細胞も死滅することから、こうした移植が必要になる。骨髄移植には、ＨＬＡが一致するドナーまたはＨＬＡが一致しないドナーから得られる組織が関与し得る（同種異系：アロジェネイック移植）。ＨＬＡが一致しない組織を受けた患者には、グラフトに対する認容性を促進するために免疫抑制療法が日常的に投与され、この状況は、ドナー組織に由来するウイルスリザーバーが再活性化し、疾患を引き起こすリスクを増加させる恐れがある。
【０００４】
供与されたＨＣＳがウイルスに感染している場合には、重篤な結果に至る恐れがある。実際に、骨髄のレシピエント全員のうち、１／４が移植術後のウイルス感染により死亡している。ウイルスの潜伏性、すなわち、細胞内においてウイルスが休止状態で存在することが可能であることに起因して、ドナーがウイルスを運んでいることに全く気がついていない場合がある。ウイルスがそれら自体でがんを引き起こす恐れがある場合には、この問題は複雑である。例えば、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）は、ヒトヘルペスウイルス４（ＨＨＶ−４）ともまた呼ばれ、ホジキンリンパ腫およびバーキットリンパ腫と関連があるウイルスである。潜伏中のウイルスは、ＨＳＣ移植を介して化学療法患者に伝染する場合、続いて、再活性化され、子孫の産生を開始する恐れがある。したがって、白血病患者は、１つの形態のがんを打ち負かすが、治療の間に別の形態のがんに罹患することになるに過ぎない恐れがある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要旨）
本発明は、ウイルス感染について、細胞を処理するための方法を提供する。細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏで処理してから送達することができ、したがって、人は、移植後に細胞に由来するウイルス感染を経験することがない。レシピエントに送達する前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヌクレアーゼを使用して、細胞内のウイルス核酸を標的とする。細胞がウイルスに感染している場合には、ヌクレアーゼが、ウイルス核酸を切断し、したがって、ウイルス核酸の機能を妨げ、このことにより、移植レシピエントがウイルスに感染することを阻止する。本発明の方法を使用して、ドナーから得たＨＳＣ内の潜伏中のウイルス感染を標的とし、レシピエントに送達する前に、これらのＨＳＣがウイルスを含有しない状態（ｖｉｒｕｓ−ｆｒｅｅ）を確保することができる。したがって、治療処置のために供与される幹細胞を処理して、ウイルスを、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）等の潜伏中のウイルスさえも排除することができる。ヌクレアーゼは、核酸、例として、プラスミド中にコードされる活性なタンパク質（またはリボ核タンパク質、例えば、Ｃａｓ９の場合）としてか、またはメッセンジャーＲＮＡとして送達することができる。一部の実施形態では、標的化が可能なヌクレアーゼを使用して、ウイルスのゲノムを変化させ、ウイルスを不活性化する。例えば、幹細胞に、エンドヌクレアーゼ、例として、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、およびこのエンドヌクレアーゼをエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）のゲノム上の特定の標的へと標的する１つまたは複数のガイドＲＮＡをトランスフェクトすることができる。好ましい実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを含むリボ核タンパク質を送達する。送達は、好ましくは、適切な材料または方法、例として、リポソームおよび／またはエレクトロポレーションを使用する。ウイルスが標的とされ、破壊されると、次いで、細胞を治療処置において、ウイルスが移植レシピエントに伝染するリスクなしに使用することができる。したがって、患者は、ドナー細胞に由来するウイルス感染のリスクもがんに関連する特定のリスクもなく、骨髄移植から利益を得ることが可能になる。
【０００６】
ある特定の態様では、本発明は、ウイルスを含有しない細胞を生成するための方法を提供する。方法は、ドナーから細胞を得るステップと、細胞にウイルス核酸を切断するヌクレアーゼを送達するステップとを含むことができる。次いで、移植術のために、細胞を患者に提供する。
【０００７】
任意のタイプの細胞を、ドナーから得ることができることを理解すべきである。例えば、外分泌性上皮細胞、ホルモン分泌性細胞、上皮細胞、感覚トランスデューサー細胞、神経細胞、グリア細胞、水晶体細胞、肝細胞、脂肪細胞、脂質細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、前立腺細胞、膵臓細胞、エナメル芽上皮細胞、半月面上皮細胞、コルチ器歯間上皮細胞、疎性結合組織線維芽細胞、角膜線維芽細胞（角膜実質細胞）、腱線維芽細胞、骨髄細網組織線維芽細胞、周皮細胞、髄核細胞、象牙芽細胞／オドントサイト（ｏｄｏｎｔｏｃｙｔｅ）、軟骨細胞、骨芽前駆細胞、硝子体細胞、星状細胞、肝臓星状細胞、骨格筋細胞、サテライト細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、筋上皮細胞、筋上皮細胞、赤血球、巨核球、単核球、結合組織マクロファージ、上皮ランゲルハンス細胞、破骨細胞、樹状細胞、ミクログリア細胞、好中球顆粒球、好酸球顆粒球、好塩基球顆粒球、ハイブリドーマ細胞、肥満細胞、ヘルパーＴ細胞、抑制性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、網状赤血球、体細胞幹細胞、胚性幹細胞または造血幹細胞を、本発明の方法において使用することができる。一部の実施形態では、細胞が、ウイルスに感染しており、細胞内にウイルス核酸を含有する。ウイルスは、ヘルペスファミリーのウイルスであり得る。一部の実施形態では、ウイルスは、細胞中で潜伏段階にある。
【０００８】
また、任意のタイプのヌクレアーゼを使用して、ウイルス核酸を切断することができることも理解すべきである。ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼであり得る。ヌクレアーゼは、構造特異的ヌクレアーゼまたは配列特異的ヌクレアーゼであり得る。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである。本発明の方法は、ウイルス核酸を、ヌクレアーゼを使用して切断するステップをさらに含むことができる。
【０００９】
本発明の一部の方法では、患者は、所定の人、例として、移植術のための細胞を必要とする患者である。患者は、ドナーと一致するか、または一致しないヒト白血球抗原（ＨＬＡ）型を有し得る。ＨＬＡが一致するまたはＨＬＡが一致しない（アロジェニックな）ドナー／レシピエントに関する移植手順において使用するために、細胞を処理することができる。このことは、レシピエントに免疫抑制療法を施すことが必要になり、そうしないと、ウイルス感染のリスクが増加する恐れがあるであろうアロジェニック移植に有用であり得る。この場合には、ドナー、例えば、ドナーの骨髄または末梢血から、細胞を収集することができる。
【００１０】
一部の実施形態では、方法は、ウイルス核酸の部分へと、ヌクレアーゼを標的にするガイドＲＮＡを、細胞に送達するステップを含む。一部の実施形態では、例えば、ガイドＲＮＡは、ウイルス核酸の部分へと、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを標的にする。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡを、ヒトゲノムとは全く一致しないように設計する。ガイドＲＮＡは、ウイルスのゲノム中の調節エレメントに向けて、ヌクレアーゼを標的させることができる。
【００１１】
一部の実施形態では、方法は、ドナーからの複数の細胞に、ヌクレアーゼを送達するステップを含む。複数の細胞を培養し、ヌクレアーゼが首尾よくウイルス核酸を切断している細胞を選択する。一部の実施形態では、蛍光マーカーを、ヌクレアーゼと共に送達し、したがって、切断されたウイルス核酸を有する細胞の選択が可能になる。一部の実施形態では、次いで、選択された細胞を移植術において使用する。
【００１２】
ヌクレアーゼを、ウイルスベクターにより細胞に送達することができる。ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルスまたはアデノ随伴ウイルスであり得る。一部の実施形態では、プラスミド、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属ナノ粒子、ナノロッド、リポソーム、細胞貫通ペプチド、リポスフェア（ｌｉｐｏｓｐｈｅｒｅ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）により、ヌクレアーゼを送達することができる。
【００１３】
本発明の方法を使用して、任意の適切なウイルス、例として、アデノウイルス、単純ヘルペス１型、単純ヘルペス２型、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、ヒトパピローマウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、天然痘、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトボカウイルス、パルボウイルスＢ１９、ヒトアストロウイルス、ノーウォークウイルス、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、重症急性呼吸症候群ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、風疹ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、グアナリトウイルス、フインウイルス、ラッサウイルス、マチュポウイルス、サビアウイルス、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、狂犬病ウイルス、Ｄ型肝炎、ロタウイルス、オルビウイルス、コルティウイルスまたはバンナウイルスを処理することができる。
【００１４】
一部の態様では、本発明は、移植術において使用するために、ウイルスを含有しない細胞を生成するための方法であって、ドナーから細胞を得るステップと、次いで、細胞に、細胞内のウイルスゲノムの１つまたは複数の部分を特異的に標的とする抗ウイルスエンドヌクレアーゼを送達するステップとを含む方法を提供する。抗ウイルスエンドヌクレアーゼは、ウイルスゲノムに結合し、それを変化させる。次いで、細胞を移植術のために提供することができる。一部の実施形態では、処理される細胞は、幹細胞、例として、造血幹細胞である。一部の実施形態では、ガイド用配列を使用して、ウイルスゲノムへと、抗ウイルスエンドヌクレアーゼを標的にすることができる。
【００１５】
一部の実施形態では、本発明の方法は、細胞培養のために抗ウイルスエンドヌクレアーゼを用いて処理した細胞を使用するステップをさらに含むことができ、この場合、処理した細胞から、細胞の集団を成長させる。一部の実施形態では、光学的検出のために、処理した細胞に蛍光マーカーを添加する。
【００１６】
一部の実施形態では、抗ウイルスエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである。移植片の細胞内のウイルスのゲノムの１つまたは複数の部分を特異的に標的とするガイドＲＮＡを使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体が、ウイルスゲノムに結合し、それを変化させる。他の実施形態では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を活用することができ、これらは一緒になって、ウイルスゲノム材料を標的とし、選択的に編集または破壊する。ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化規則的点在短回文配列リピート）は、細菌をファージ感染から保護する細菌の免疫系のエレメントである。ガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体をウイルスの標的配列に局在させる。ウイルスゲノムの標的配列への複合体の結合が、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをそこに局在させて、ウイルスゲノム中に切れ目を引き起こす。好ましい実施形態では、ウイルス核酸を破綻させ、ウイルス核酸が機能的に組み換わる機会を低下させるために、ガイドＲＮＡを、ウイルスゲノム上の複数の部位を標的とするように設計する。
【００１７】
提示する方法により、ウイルスゲノムの破壊が可能になり、その結果、ウイルスは増殖することができなくなるが、細胞に対する細胞傷害性は観察されない。本発明の態様は、ウイルスを無能力化するために、ＣＲＩＳＰＲ／ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体を、ウイルスゲノム材料（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を選択的に標的とするように設計し；ウイルスゲノムを含有する細胞に、ＣＲＩＳＰＲ／ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体を送達し；ウイルスゲノムを切断することを提供する。提示する方法により、ウイルスゲノムの機能を標的にする破壊を、または好ましい実施形態では、ウイルス核酸を、複数の切れ目を介して消化することが可能になり、これらの切れ目は、ウイルスゲノム中でエンドヌクレアーゼを作用させるための複数の部位を標的とすることによって生じる。本発明の態様は、ＣＲＩＳＰＲ／ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体カクテルのトランスフェクションを提供し、ウイルスを完全に抑制された増殖を得る。それらの以下の詳細な説明を検討すれば、本発明の追加の態様および利点が明らかになる。
【００１８】
ある特定の態様では、本発明は、細胞を処理するための方法を提供する。方法は、ドナーから細胞を得るステップと；細胞にＲＮＰを送達するステップと；ヌクレアーゼおよびＲＮＡを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成するステップと；細胞内のウイルス核酸を、ＲＮＰを用いて切断するステップとを含む。方法は、患者内への移植術のために、細胞を提供するステップを含むことができる。代わって、方法を使用して、調査研究を行うこともできる。
【００１９】
送達するステップは、エレクトロポレーションを含むことができ、またはＲＮＰをリポソーム中にパッケージングして、送達することができる。一部の実施形態では、ウイルス核酸は、エピソームのウイルスゲノム、すなわち、ウイルスのエピソームまたはエピソーム性ベクターとして存在する。ＲＮＡは、ウイルス核酸内の標的に実質的に相補的であり、好ましくは、ヒトゲノム上の任意の場所にも実質的に相補的でない部分を有する。好ましい実施形態では、ウイルスは、ヘルペスファミリーのウイルス、例として、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルスおよびサイトメガロウイルスからなる群から選択されるウイルスである。ウイルスは、細胞中で潜伏段階にあり得る。
【００２０】
好ましい実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃｒｉｓｐｅｒ関連タンパク質、例として、好ましくは、Ｃａｓ９である。ＲＮＡは、（ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの機能を提供する）単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であり得る。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼおよびＲＮＡを、ＲＮＰとして細胞に送達する。
【００２１】
一部の実施形態では、患者は、ドナーと一致するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）型を有する所定の人である。患者は、ドナーである場合がある。細胞は、（例えば、ドナーの骨髄または末梢血から得られる）造血幹細胞であり得る。好ましい実施形態では、細胞は、その中にウイルス核酸を有し、方法は、ウイルス核酸を、ヌクレアーゼを使用して切断するステップをさらに含む。
【００２２】
方法は、ドナーからの複数の細胞に、ＲＮＰを送達するステップと、複数の細胞を培養するステップと、複数の細胞から、ウイルス核酸の切断成功に基づいて細胞を選択するステップとを含むことができる。細胞を選択するステップは、ヌクレアーゼと共に送達される蛍光マーカーを使用することを含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、本発明の方法のフローチャートを示す。
【図２】図２は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓプラスミドのスキームを示す。
【図３】図３は、Ｒａｊｉ細胞中でのトランスフェクション効率に対するｏｒｉＰの効果のグラフを示す。
【図４】図４は、ＥＢＶのリファレンスゲノムに沿って、ＣＲＩＳＰＲのガイドＲＮＡの標的を示す。
【図５】図５は、ガイドＲＮＡのｓｇＥＢＶ２の周囲のゲノムコンテキスト、およびＰＣＲプライマーの場所を示す。
【図６】図６は、ｓｇＥＢＶ２が誘発した大きな欠失を示す。
【図７】図７は、ガイドＲＮＡのｓｇＥＢＶ３／４／５の周囲のゲノム、およびＰＣＲプライマーを示す。
【図８】図８は、ｓｇＥＢＶ３／５およびｓｇＥＢＶ４／５が誘発した大きな欠失を示す。
【図９】図９は、サンガー配列決定により確認した、処理の８日後の切断および修復を示す。
【図１０】図１０は、サンガー配列決定により確認した、ｓｇＥＢＶ４／５処理の８日後のゲノムの切断および修復ライゲーションを示す。
【図１１】図１１は、異なるＣＲＩＳＰＲ処理の後の細胞の増殖曲線を示す。
【図１２】図１２は、ｓｇＥＢＶ１〜７処理の前の、フローサイトメトリーの散乱シグナルを示す。
【図１３】図１３は、ｓｇＥＢＶ１〜７処理の５日後の、フローサイトメトリーの散乱シグナルを示す。
【図１４】図１４は、ｓｇＥＢＶ１〜７処理の８日後の、フローサイトメトリーの散乱シグナルを示す。
【図１５】図１５は、ｓｇＥＢＶ１〜７処理の前の、染色の結果を示す。
【図１６】図１６は、ｓｇＥＢＶ１〜７処理の５日後の、染色の結果を示す。
【図１７】図１７は、ｓｇＥＢＶ１〜７処理の８日後の、染色の結果を示す。
【図１８】図１８は、ｓｇＥＢＶ１〜７処理の後の、顕微鏡法により明らかになったアポトーシスの形態を示す。
【図１９】図１９は、ｓｇＥＢＶ１〜７処理の後の、顕微鏡法により明らかになったアポトーシスの形態を示す。
【図２０】図２０は、ｓｇＥＢＶ１〜７処理の前の、核の形態を示す。
【図２１】図２１は、ｓｇＥＢＶ１〜７処理の後の、核の形態を示す。
【図２２】図２２は、ｓｇＥＢＶ１〜７処理の後の、核の形態を示す。
【図２３】図２３は、ｓｇＥＢＶ１〜７処理の後の、核の形態を示す。
【図２４】図２４は、異なるＣＲＩＳＰＲ処理の後の、デジタルＰＣＲによるＥＢＶのロードを示す。
【図２５】図２５は、顕微鏡法により捕捉した、全ゲノム増幅のための単一細胞を示す。
【図２６】図２６は、顕微鏡法により捕捉した、全ゲノム増幅のための単一細胞を示す。
【図２７】図２７は、処理の前の、単一細胞から得られたＥＢＶの定量的ＰＣＲのＣｔ値を示す。
【図２８】図２８は、単一生存細胞から得られたＥＢＶの定量的ＰＣＲのＣｔ値を示す。
【図２９】図２９は、ＥＢＶのＣＲＩＳＰＲのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを示す。
【図３０】図３０は、ＥＢＶ陰性バーキットリンパ腫ＤＧ−７５を用いたＣＲＩＳＰＲの細胞傷害性試験を示す。
【図３１】図３１は、初代ヒト肺線維芽細胞ＩＭＲ−９０を用いたＣＲＩＳＰＲの細胞傷害性試験を示す。
【図３２】図３２は、細胞を処理するための方法を示す。
【図３３】図３３は、実験計画の略図である。
【図３４】図３４は、処理の後の６日間のＥＢＶ＋がん細胞の生存を示す。
【図３５】図３５は、処理の後の第６日の各細胞集団のパーセントを示す。
【図３６】図３６は、処理の後の３日間のパーセント細胞生存率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（詳細な説明）
ある特定の疾患は、患者のＨＰＣを交換する造血幹細胞移植術（ＨＳＣＴ）として公知の手順により治癒可能であり得る。幹細胞の交換は、多様ながんおよび免疫不全のための治療戦略として臨床的に数十年にわたり行われており、その成功は、中等度であるが、向上しつつある。ＨＳＣＴは典型的には、ＨＳＣ、およびその他の細胞、例として、Ｔ細胞を含む混合された造血集団の移植術を含む。問題になる１つの制限要因は、患者と一致するＨＬＡ型であるドナーを見つけることである。可能性のあるドナーのプールが小さいことから、希少なドナー（例えば、家族）がウイルス感染を有していたら不運である。本発明は一般に、移植術のために、ヌクレアーゼを使用してウイルスを含有しない細胞を生成するための方法に関する。本発明の方法を使用して、細胞内のウイルスを、ゲノム中に大きなまたは反復する挿入、欠失または置換を体系的に引き起こすことによって無能力化または破綻させ、完全なゲノムが再構築される確率を低下させる。ゲノム中の挿入または欠失により、ウイルスは無能力化または破壊される。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９であり得る。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、相補的である配列、例として、ガイド用ＲＮＡによりガイドされる。次いで、ウイルスを含有しない細胞は、移植術のために、例えば、骨髄移植において使用することができる。したがって、移植術のために、本発明の方法を使用して、ウイルスを含有しない造血幹細胞を選択および単離することができる。
【００２５】
図１は、本発明の方法のフローチャートを示す。一般に、方法１００は、ドナーから細胞を得るステップ１０５を含む。次いで、細胞に、ヌクレアーゼを送達し１１０、この場合、ヌクレアーゼは、細胞内のウイルスゲノムの１つまたは複数の部分を標的とする。ヌクレアーゼは、ウイルスゲノムに結合し、それを変化させることが可能である。次いで、移植のためにウイルスを含有しない細胞を提供する１１５。移植を提供するステップ１１５は、治療のプロセス、例として、骨髄移植であり得る。
【００２６】
ｉ．細胞の入手
本発明の方法で使用するための細胞は、任意の適切な供給源から得ることができる。好ましい実施形態では、ＨＳＣの骨髄移植またはその他の注入を必要とする患者に適切なドナーであることに基づいて選ぶことができるドナーから、細胞を得る。好ましくは、ドナーは、患者の既知の家族であり、患者自身であってもよい。例えば、患者は、患者自身の細胞を、移植手順において後に送達するために提供することができる。例えば、細胞を、患者から採取した臍帯試料から得、保存し、次いで、患者への移植／埋込みの前に、本発明の方法に従って処理することができる。
【００２７】
本発明の方法において、任意のタイプの細胞を使用することができる。細胞は、真核生物、原核生物、哺乳動物、ヒト等であり得る。一部の実施形態では、本発明の方法において、幹細胞を使用する。幹細胞は、幹細胞バンクから得ることができ、こうした幹細胞は、ドナーに究極的には由来する幹細胞であり；またはドナーから直接得た幹細胞であってもよい。幹細胞は、当技術分野で公知の任意の方法により収集、精製および処理することができる。
【００２８】
幹細胞は、当技術分野で公知の任意の方法によりドナーから収集することができる。例えば、米国特許出願公開第２０１３／０１４９２８６号は、哺乳動物の死体から幹細胞を得、精製するための手順について詳述している。ヒトから、骨髄を収集するかまたは末梢血幹細胞を収集することによって、幹細胞を収集することができ、それらの両方が当技術分野で周知の技法である。幹細胞を、供給源、例として、ドナーのある特定の組織から得るに至ったら、それらを、幹細胞を拡大増殖する技法を使用して培養することができる。幹細胞を拡大増殖する技法は、Emersonらに対する米国特許第６，３２６，１９８号、標題「Methods  and  compositions  for  the  ex  vivo  replication  of  stem  cells,  for  the  optimization  of  hematopoietic  progenitor  cell  cultures,  and  for  increasing  the  metabolism,  GM-CSF  secretion  and/or  IL-6  secretion  of  human  stromal  cells」、２００１年１２月４日発行；Krausらに対する米国特許第６，３３８，９４２号、標題「Selective  expansion  of  target  cell  populations」、２００２年１月１５日発行；およびRodgersらに対する米国特許第６，３３５，１９５号、標題「Method  for  promoting  hematopoietic  and  mesenchymal  cell  proliferation  and  differentiation」、２００２年１月１日発行に開示されており、それらは、全体が参照により本明細書に組み込まれている。一部の実施形態では、ドナーから得た幹細胞を、幹細胞の集団に拡大増殖させるために培養する。他の好ましい実施形態では、ドナーの供給源から回収した幹細胞は、そのような技法を使用して拡大増殖させない。標準的な方法を使用して、幹細胞を凍結保存することができる。
【００２９】
本発明の実施形態では、胚性幹細胞または成体幹細胞のいずれかを使用することができる。成体幹細胞は、体細胞幹細胞としてもまた公知であり、ドナーの臓器および組織中に見出すことができる。例えば、中枢神経系、骨髄、末梢血、血管、臍帯血、骨格筋、皮膚の表皮、歯髄、心臓、腸、肝臓、膵臓、肺、脂肪組織、卵巣上皮、網膜、角膜および精巣。体細胞幹細胞として、これらに限定されないが、間葉系幹細胞、造血幹細胞、皮膚幹細胞および脂肪由来間質幹細胞が挙げられる。幹細胞は、未分化であり得、または分化していてもよい。
【００３０】
ｉｉ．ヌクレアーゼ
本発明の方法は、プログラム可能または標的することが可能なヌクレアーゼを使用して、ウイルス核酸を特異的に標的とし、破壊することを含む。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスター化規則的点在短回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、その他のエンドヌクレアーゼもしくはエキソヌクレアーゼ、またはそれらの組合せを含めた、任意の適切な標的化ヌクレアーゼを使用することができる。参照により組み込まれているSchiffer、２０１２年、「Targeted  DNA  mutagenesis  for  the  cure  of  chronic  viral  infections」、J  Virol、８８巻（１７号）：８９２０〜８９３６頁を参照されたい。
【００３１】
ヌクレアーゼは、ウイルスのゲノムのある部分を標的として、ゲノムを変化させ、破壊する。細胞は、無能力化または破壊されると、ウイルスに侵されていない(ｖｉｒｕｓ  ｆｒｅｅ)またはウイルスを含有しない（ｖｉｒａｌ−ｆｒｅｅ）と考えられる。細胞中にウイルスのゲノムの断片または部分が残留する場合があるが、抗ウイルスエンドヌクレアーゼが、ウイルスゲノムを破綻させ、したがって、ウイルスは、複製も、組換えも、ウイルスでの宿主への感染ももはや可能でない。一部の実施形態では、抗ウイルスエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲであり得る。ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化規則的点在短回文配列リピート）は、細菌中に見出され、細菌をファージ感染から保護すると考えられている。ＣＲＩＳＰＲは、最近、真核生物ＤＮＡ中の遺伝子発現を変化させるための手段として使用されるようになったが、抗ウイルス療法として、またはより広く、ゲノム材料を破綻させるための方法として提案されたことはない。むしろ、標的細胞または細胞の集団のＤＮＡ中の転写を増加または減少させる方法として、ＣＲＩＳＰＲは、挿入または欠失を導入するために使用されてきた。例えば、Horvathら、Science（２０１０年）３２７巻：１６７〜１７０頁；Ternsら、Current  Opinion  in  Microbiology（２０１１年）１４巻：３２１〜３２７頁；Bhayaら、Annu  Rev  Genet（２０１１年）４５巻：２７３〜２９７頁；Wiedenheftら、Nature（２０１２年）４８２巻：３３１〜３３８頁；Jinek  Mら、Science（２０１２年）３３７巻：８１６〜８２１頁；Cong  Lら、Science（２０１３年）３３９巻：８１９〜８２３頁；Jinek  Mら（２０１３年）eLife、２巻：ｅ００４７１頁；Mali  Pら（２０１３年）Science、３３９巻：８２３〜８２６頁；Qi  LSら（２０１３年）Cell、１５２巻：１１７３〜１１８３頁；Gilbert  LAら（２０１３年）Cell、１５４巻：４４２〜４５１頁；Yang  Hら（２０１３年）Cell、１５４巻：１３７０〜１３７９頁；およびWang  Hら（２０１３年）Cell、１５３巻：９１０〜９１８頁）を参照されたい。
【００３２】
本発明の態様では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ゲノム中の少なくとも２つの場所において二本鎖の切れ目を引き起こす。二本鎖のこれら２つの切れ目から、ゲノムの断片が生じ、これが欠失するに至る。ウイルスを修復する経路により２つの末端がアニールされる場合であっても、依然としてゲノム中には欠失がある。この機構を使用した１つまたは複数の欠失により、ウイルスゲノムは無能力化される。結果として、細胞は、ウイルス感染を含有しない。
【００３３】
本発明の実施形態では、ヌクレアーゼが、標的のウイルスのゲノムを切断する。ヌクレアーゼは、核酸のヌクレオチドのサブユニット間のリン酸ジエステル結合を切断することが可能な酵素である。エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のリン酸ジエステル結合を切断する酵素である。一部のヌクレアーゼ、例として、デオキシリボヌクレアーゼＩは、比較的非特異的に（配列を問わず）ＤＮＡを切断し、一方、多くのヌクレアーゼは、典型的には、制限エンドヌクレアーゼまたは制限酵素と呼ばれ、限られた特定のヌクレオチド配列においてのみ切断する。本発明の好ましい実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを含むリボ核タンパク質が、本発明の組成物および方法に組み込まれるが、しかし、任意のヌクレアーゼが利用され得ることを理解すべきである。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使用して、ゲノムを切断する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ゲノム中に二本鎖の切れ目を作り出すことが可能である。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、２つの機能性ドメイン、すなわち、ＲｕｖＣおよびＨＮＨを有し、それぞれが、異なる鎖を切断する。これらのドメインの両方が活性である場合、Ｃａｓ９は、ゲノム中に二本鎖の切れ目を引き起こす。
【００３５】
本発明の一部の実施形態では、無能力化またはゲノムの発現の変化を引き起こすように、ゲノム中への挿入を設計することができる。加えてまた、挿入／欠失を使用して、二本鎖の切れ目において挿入／欠失を作り出すこと、またはリーディングフレームをシフトさせて、二本鎖の切れ目の下流に挿入／欠失を作り出すことのいずれかにより、未熟な終止コドンも導入される。ＮＨＥＪ修復経路のこれらの結末のうちのいずれかを生かして、標的遺伝子を破綻させために利用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９系を使用することによって導入される変化は、ゲノムにとって恒久的である。
【００３６】
本発明の一部の実施形態では、少なくとも１つの挿入が、ＣＲＩＳＰＲ／ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体により引き起こされる。好ましい実施形態では、多数の挿入が、ゲノム中に引き起こされ、それにより、ウイルスが無能力化される。本発明の態様では、挿入の数により、ゲノムが修復され得る確率が低下する。
【００３７】
本発明の一部の実施形態では、少なくとも１つの欠失が、ＣＲＩＳＰＲ／ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体により引き起こされる。好ましい実施形態では、多数の欠失が、ゲノム中に引き起こされ、それにより、ウイルスが無能力化される。本発明の態様では、欠失の数により、ゲノムが修復され得る確率が低下する。極めて好ましい実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ系は、顕著なゲノムの破綻を引き起こし、その結果、ウイルスゲノムの有効な破壊が生じ、一方、ゲノムは、インタクトなままである。
【００３８】
本発明の一部の実施形態では、鋳型配列を、ゲノム中に挿入する。ゲノムＤＮＡにヌクレオチドの改変を導入するためには、ＨＤＲの間に、所望の配列を含有するＤＮＡ修復用鋳型が存在しなければならない。通例、細胞内に、ＤＮＡ鋳型を、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９と一緒にトランスフェクトする。それぞれのホモロジーアームの長さおよび結合位置は、導入される変化のサイズに依存する。適切な鋳型の存在下で、ＨＤＲは、Ｃａｓ９が誘発した二本鎖の切れ目において、特定のヌクレオチド変化を導入することができる。
【００３９】
本発明の一部の実施形態は、ヌクレアーゼの改変されたバージョンを利用することができる。単一の不活性な触媒ドメインを含有するＣａｓ９酵素の改変されたバージョン、すなわち、ＲｕｖＣ−またはＨＮＨ−のいずれかは、「ニッカーゼ」と呼ばれる。Ｃａｓ９ニッカーゼは、活性なヌクレアーゼドメインを１つだけ有し、標的ＤＮＡの一方の鎖のみを切断して、一本鎖の切れ目または「ニック」を作り出す。ニッカーゼは、ＤＮＡ鎖のうちの１つのみを切断するが、不活性なｄＣａｓ９（ＲｕｖＣ−かつＨＮＨ−）と同様、Ｃａｓ９ニッカーゼも依然として、ｇＲＮＡの特異性に基づいてＤＮＡに結合することが可能である。大半のＣＲＩＳＰＲプラスミドが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来し、ＲｕｖＣドメインは、Ｄ１０Ａ突然変異により不活性化することができ、ＨＮＨドメインは、Ｈ８４０Ａ突然変異により不活性化することができる。
【００４０】
一本鎖の切れ目またはニックは通例、ＨＤＲ経路を通して、インタクトな相補的ＤＮＡ鎖を鋳型として使用して急速に修復される。しかし、「ダブルニック」または「二重ニッカーゼ」ＣＲＩＳＰＲ系としばしば呼ばれる系において、Ｃａｓ９ニッカーゼにより導入された２つの近位の、向かい合う鎖のニックは、二本鎖の切れ目として扱われる。ダブル−ニックが誘発した二本鎖の切れ目は、遺伝子標的に対する所望の作用に応じてＮＨＥＪまたはＨＤＲのいずれかにより、修復され得る。これらの二本鎖の切れ目において、挿入および欠失を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体が引き起こす。本発明の態様では、欠失を、二本鎖の２つの切れ目を相互に近接するように位置させることによって引き起こし、それにより、ゲノムの断片の欠失を引き起こす。
【００４１】
Ｃａｓ９タンパク質は、（ヌクレアーゼ、ニッカーゼまたはプラットフォームのいずれかとして）用途が非常に広く、作用させるためには、ｇＲＮＡの標的特異性を必要とし得る。下記に論じるように、ガイドＲＮＡまたは単一ガイドＲＮＡを、ウイルスゲノムを標的とするように特異的に設計することができる。
【００４２】
本発明の一部の実施形態では、ヌクレアーゼを、ガイド用配列と併せて使用する。一部の態様では、ガイド用配列は、ガイド用ＲＮＡである。例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集複合体は、ウイルスゲノムを標的とするガイドＲＮＡがある場合に最適に働く。ウイルスゲノムの破綻を引き起こすために、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体をウイルスゲノムに導く。本発明の態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を、細胞内で特定のウイルスを標的とするように設計する。本発明の組成物を使用して、任意のウイルスを標的とすることができることを理解すべきである。ウイルスゲノムの特定の領域の識別が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の開発および設計を援助する。
【００４３】
本発明の態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を、細胞内で潜伏中のウイルスを標的とするように設計する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、細胞内にトランスフェクトされると、挿入もしくは欠失を繰り返し引き起こして、ゲノムを無能力化するか、または挿入もしくは欠失の数に起因して、修復の確率を顕著に低下させる。
【００４４】
ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡ結合ドメインに融合した非特異的なＤＮＡ切断ヌクレアーゼを使用し、このヌクレアーゼは、本質的に任意の配列を標的にすることができる。ＴＡＬＥＮ技術の場合、標的部位を識別し、発現ベクターを作製する。（例えば、ＮｏｔＩ（Notl）による）直鎖状の発現ベクターを、ｍＲＮＡ合成のための鋳型として使用することができる。市販されているキット、例として、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）製のｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ  ＳＰ６転写キットを使用することができる。JoungおよびSander、２０１３年、「TALENs:  a  widely  applicable  technology  for  targeted  genome  editing」、Nat  Rev  Mol  Cell  Bio、１４巻：４９〜５５頁を参照されたい。
【００４５】
ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲを用いる方法は、標的部位に対する１対１の関係をもたらす；すなわち、ＴＡＬＥＮドメイン中のタンデムリピートの１つの単位は、標的部位中の１つのヌクレオチドを認識し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ＤＮＡ標的中の相補配列にハイブリダイズする。これらの方法は、一対のＴＡＬＥＮまたはＣａｓ９タンパク質を、１つのｇＲＮＡと共に使用して、標的中に二本鎖の切れ目を生成するステップを含むことができる。次いで、切れ目は、非相同末端連結または相同的組換え（ＨＲ）を介して修復される。
【００４６】
ＺＦＮを使用して、ウイルス核酸を切ることができる。手短に述べると、ＺＦＮ法は、感染している宿主細胞内に、標的のＺＦＮ、および任意選択の少なくとも１つのアクセサリーポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのベクター（例えば、ＲＮＡ分子）を導入するステップを含む。例えば、参照により組み込まれているWeinsteinに対する米国特許出願公開第２０１１／００２３１４４号を参照されたい。細胞をインキュベートして、ＺＦＮを発現させ、この場合、二本鎖状の切れ目が、ＺＦＮにより標的の染色体配列中に導入される。一部の実施形態では、ドナーのポリヌクレオチドまたは交換ポリヌクレオチドを導入する。ウイルス核酸のある部分を無関係な配列でスワップすると、ウイルス核酸の転写または複製を完全に妨げることができる。標的ＤＮＡは、交換ポリヌクレオチドと一緒に、エラープローン非相同末端連結ＤＮＡ修復プロセスまたは相同性特異的ＤＮＡ修復プロセスにより修復され得る。
【００４７】
典型的には、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメイン（すなわち、ジンクフィンガー）および切断ドメイン（すなわち、ヌクレアーゼ）を含み、この遺伝子は、ｍＲＮＡ（例えば、５’キャップｍＲＮＡ、ポリアデニル化ｍＲＮＡまたは両方）として導入することができる。ジンクフィンガー結合ドメインは、任意の選択の核酸配列を認識し、それに結合するように操作することができる。例えば、参照により組み込まれているQuら、２０１３年、「Zinc-finger-nucleases  mediate  specific  and  efficient  excision  of  HIV-1  proviral  DAN  from  infected  and  latently  infected  human  T  cells」、Nucl  Ac  Res、４１巻（１６号）：７７７１〜７７８２頁を参照されたい。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有し得る。操作の方法として、これらに限定されないが、合理的設計および多様なタイプの選択が挙げられる。標的のＤＮＡ配列を、ジンクフィンガーの認識領域（すなわち、ジンクフィンガー）を介して認識するように、ジンクフィンガー結合ドメインを設計することができる。例えば、参照により組み込まれている米国特許第６，６０７，８８２号；米国特許第６，５３４，２６１号、および米国特許第６，４５３，２４２号を参照されたい。ジンクフィンガーの認識領域を選択する例示的な方法として、ファージディスプレイ系およびツーハイブリッド系を挙げることができ、これらは、米国特許第５，７８９，５３８号；米国特許第５，９２５，５２３号；米国特許第６，００７，９８８号；米国特許第６，０１３，４５３号；米国特許第６，４１０，２４８号；米国特許第６，１４０，４６６号；米国特許第６，２００，７５９号；および米国特許第６，２４２，５６８号に開示されており、それらのそれぞれが、参照により組み込まれている。
【００４８】
ＺＦＮはまた、切断ドメインも含む。ＺＦＮの切断ドメインの部分は、任意の適切なエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ、例として、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼから得ることができる。例えば、BelfortおよびRoberts、１９９７年、「Homing  endonucleases:  keeping  the  house  in  order」、Nucleic  Acids  Res、２５巻（１７号）：３３７９〜３３８８頁を参照されたい。切断ドメインは、切断活性のために二量体化を必要とする酵素に由来し得る。切断には、２つのＺＦＮが必要になり得、その理由は、それぞれのヌクレアーゼが、活性な酵素の二量体のうちの単量体を含むからである。代わって、単一のＺＦＮに、活性な酵素の二量体を作り出すための両方の単量体を含めることもできる。存在する制限エンドヌクレアーゼを、結合部位においてまたはその近傍でＤＮＡの配列特異的な結合および切断を行い得るかも知れない。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、ＤＮＡを認識部位から除去された部位において切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型の酵素ＦｏｋＩは、二量体として活性であり、ＤＮＡの二本鎖切断を、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチドで、かつ他方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドで触媒する。ＺＦＮ中で使用するＦｏｋＩ酵素を、切断単量体とみなすことができる。したがって、ＦｏｋＩ切断ドメインを使用して、二本鎖切断を標的とする場合には、それぞれがＦｏｋＩ切断単量体を含む２つのＺＦＮを使用して、活性な酵素の二量体を再構成することができる。Wahら、１９９８年、「Structure  of  FokI  has  implications  for  DNA  cleavage」、PNAS、９５巻：１０５６４〜１０５６９頁；米国特許第５，３５６，８０２号；米国特許第５，４３６，１５０号；米国特許第５，４８７，９９４号；米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号；米国特許出願公開第２００６／０１８８９８７号；および米国特許出願公開第２００８／０１３１９６２号を参照されたい；これらは、それぞれが参照により組み込まれている。
【００４９】
ＺＦＮを使用してウイルスを標的とする場合、ある配列を含む、ドナーのポリヌクレオチドを少なくとも１つ、細胞内に導入することを含めることができる。ドナーのポリヌクレオチドは、好ましくは、染色体中の組み込み部位のいずれかの側と配列類似性を共有する上流および下流の配列が隣接する、導入しようとする配列を含む。ドナーのポリヌクレオチド中の上流および下流の配列は、目的の染色体配列とドナーのポリヌクレオチドとの間の組換えを促すように選択する。典型的には、ドナーのポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。ドナーのポリヌクレオチドは、ＤＮＡプラスミド、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスベクター、ＤＮＡの直鎖の小片、ＰＣＲ断片、裸の核酸であり得、送達ビヒクル、例として、リポソームを利用することができる。ドナーのポリヌクレオチドの配列は、エクソン、イントロン、調節配列、またはそれらの組合せを含むことができる。二本鎖状の切れ目は、ドナーのポリヌクレオチドとの相同的組換えを介して修復され、したがって、所望の配列が、染色体内に組み込まれる。染色体配列を改変するためのＺＦＮが媒介するプロセスにおいて、ＺＦＮにより染色体配列内により導入された二本鎖状の切れ目は、交換ポリヌクレオチドとの相同的組換えを介して修復され、したがって、交換ポリヌクレオチド中の配列が染色体配列の部分で交換され得る。二本鎖状の切れ目の存在により、切れ目の相同的組換えおよび修復が促進される。交換ポリヌクレオチドが、物理的に組み込まれる場合があり、または代わって、交換ポリヌクレオチドが、切れ目の修復のための鋳型として使用される場合もあり、結果として、交換ポリヌクレオチド中の配列情報と染色体配列のその部分中の配列情報との交換が生じる。したがって、ウイルス核酸の部分が、交換ポリヌクレオチドの配列に変換され得る。ＺＦＮ法は、ベクターを使用して、ＺＦＮをコードし、任意選択の少なくとも１つの交換ポリヌクレオチドまたは少なくとも１つのドナーのポリヌクレオチドをコードする核酸分子を、感染している細胞に送達するステップを含むことができる。
【００５０】
メガヌクレアーゼは、大きな認識部位（１２〜４０個の塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）により特徴付けられるエンドデオキシリボヌクレアーゼであり；結果として、この部位は一般に、任意の所与のゲノム中であっても１回だけ生じる。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼが認識する、１８個の塩基対の配列は、偶然に１回見出されるのに、平均して、ヒトゲノムのサイズの２０倍のゲノムを必要とするであろう（一方、単一のミスマッチを有する配列は、ヒトサイズのゲノム１つ当たり約３回生じる）。したがって、メガヌクレアーゼは、最も特異的な天然に存在する制限酵素であると考えられる。メガヌクレアーゼは、配列および構造のモチーフ、すなわち、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ−ＹＩＧ、ＨＮＨ、ヒスチジン−Ｃｙｓボックス、およびＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ＸＫに基づいて、５つのファミリーに分けることができる。最も十分に研究されているファミリーは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧタンパク質のファミリーであり、これらは、生命体の全ての界において見出されており、一般に、イントロンまたはインテイン内にコードされるが、また、独立して存在するメンバーも存在する。配列モチーフＬＡＧＬＩＤＡＤＧは、酵素活性を示すための必須のエレメントに相当する。タンパク質の中には、そのようなモチーフを、１つのみ含有するものもあれば、２つ含有するものもあり；両方の場合において、これらのモチーフには、その他のファミリーメンバーとの配列類似性はほとんどまたは全く示さない約７５〜２００個のアミノ酸残基が続いた。結晶構造から、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーについての配列特異性および切断機構のモードが示されている：（ｉ）特異性をもたらす接触は、伸びたβ−鎖がＤＮＡの主溝内に埋まることから生じ、ＤＮＡに結合する鞍部は、ＤＮＡへリックスのねじれを模倣するピッチおよび輪郭を有し；（ｉｉ）タンパク質とＤＮＡとの間で完全な水素結合が生じる可能性があるが、これが十分に実現されることはなく；（ｉｉｉ）特徴的な４−ｎｔ３’−ＯＨのオーバーハングを生成する切断が、副溝を横切って生じ、ここで、ＤＮＡが中心の「４つの塩基」の領域において歪曲することによって、切断を受けるリン酸結合がタンパク質の触媒性コアに接近し；（ｉｖ）切断が、提案されている２つの金属による機構を介して生じ、これには時に、ユニークな「金属共有」パラダイムが関与し；（ｖ）最後に、追加の親和性および／または特異性をもたらす接触も、コアのα／βフォールドの外側の領域において、「適応された」足場から生じ得る。参照により組み込まれているSilvaら、２０１１年、「Meganucleases  and  other  tools  for  targeted  genome  engineering」、Curr  Gene  Ther、１１巻（１号）：１１〜２７頁を参照されたい。
【００５１】
ｉｉｉ．アポトーシス経路
少数の細胞が感染しており、細胞全体（および潜伏中のウイルスゲノム）を消去すれば十分であろう場合には、本発明の態様は、潜伏中のウイルスの状況下で活性を示すプロモーターを含有するベクターの投与を企図し、この場合、プロモーターにより、細胞を死滅させる遺伝子が駆動される。ＨＳＶが、このアプローチについての特に興味深い標的であり；その理由は、数千〜数万個のニューロンのみが、潜伏感染していると推定されているからである。参照により組み込まれているHoshinoら、２００８年、「The  number  of  herpes  simplex  virus-infected  neurons  and  the  number  of  viral  genome  copies  per  neuron  correlate  with  latent  viral  load  in  ganglia」、Virology、３７２巻（１号）：５６〜６３頁を参照されたい。細胞を死滅させる遺伝子の例として、（１）細胞ゲノムを標的とする、標的化が可能なヌクレアーゼと；（２）アポトーシスエフェクター、例として、ＢＡＸおよびＢＡＫ、ならびに細胞またはミトコンドリアの膜の完全性を破壊するタンパク質、例として、アルファヘモリジンとの両方が挙げられる（Bayles、「Bacterial  programmed  cell  death:  making  sense  of  a  paradox」、Nature  Reviews  Microbiology、１２巻、６３〜６９頁（２０１４年））。潜伏感染している細胞中でのみ活性化されるプロモーターがあれば、そうしたプロモーターを、この状況下において使用することができるのみならず、また、活性を、感染している細胞に特異的なものにすることによって、ヌクレアーゼ療法の選択性を増加させるためにも使用することができるであろう；そのようなプロモーターの例が、潜伏性関連プロモーター１または「ＬＡＰ１」である（PrestonおよびEfstathiou、「Molecular  Basis  of  HSV  Latency  and  Reactivation」、Human  Herpesviruses:  Biology,  Therapy  and  Immunoprophylaxis、２００７年）。一部の実施形態では、本発明は、宿主細胞であるが、感染している細胞のみの死を引き起こすために使用することができる方法および治療剤を提供する。例えば、処理は、細胞死を引き起こすタンパク質の遺伝子を送達することを含むことができ、この場合、遺伝子は、ウイルスの調節エレメント、例として、感染しているウイルスのゲノムに由来するプロモーターの制御下にあるか；または遺伝子は、ウイルスの複製開始点を含むベクター中にコードされる。ウイルスが存在する場合には、遺伝子が発現し、遺伝子産物が細胞の死を引き起こす。この遺伝子は、アポトーシスにおいて重要なタンパク質をコードすることができ、または宿主ゲノムを消化するヌクレアーゼをコードすることができる。
【００５２】
アポトーシスの実施形態を使用して、感染細胞と非感染細胞とが混ざり合ったものを含有する試料内から、感染している細胞を除去することができる。標的化が可能なヌクレアーゼを使用して、ウイルス駆動性プロモーター、標的化が可能なヌクレアーゼ、および細胞（例えば、ヒト）のゲノムを標的とするガイドＲＮＡを含む組成物を提供することができる。ウイルスの存在下で、ヌクレアーゼは細胞を死滅させる。非感染細胞のみを含有する試料が残る。
【００５３】
アポトーシスタンパク質を、治療剤として使用することができる。治療剤は、ベクター内にコードして提供することができ、この場合、ベクターは、ウイルスに感染している細胞内で治療剤を発現させる配列もまたコードする。配列は、ウイルスのゲノムに由来する調節エレメント（例えば、プロモーターおよび複製開始点）であり得る。治療剤は、ウイルスに感染している細胞の死を選択的に引き起こす機構をもたらすことができる。例えば、細胞中の欠損アポトーシス経路を復元するタンパク質を使用することができる。遺伝子は、例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＣＬ−２またはアルファ−ヘモリジンであり得る。好ましくは、治療剤は、ウイルスに感染している細胞においてアポトーシスを誘発し、非感染細胞においてはアポトーシスを誘発しない。
【００５４】
一部の実施形態では、本発明は、アポトーシスを促す少なくとも１つの遺伝子コードするウイルスベクター、プラスミドまたはその他のコード核酸、およびウイルスゲノムに付随する少なくとも１つのプロモーターを含む組成物を提供する。アポトーシス調節因子Ｂｃｌ−２は、ミトコンドリア外膜透過性（ＭＯＭＰ）を統制するタンパク質のファミリーに属し、このファミリーは、アポトーシス促進性タンパク質、例として、Ｂａｘ、ＢＡＤ、Ｂａｋ、Ｂｏｋ、Ｂｃｌ−ｒａｍｂｏ、Ｂｃｌ−ｘｓおよびＢＯＫ／Ｍｔｄを含む。
【００５５】
アポトーシス調節因子ＢＡＸは、ｂｃｌ−２様タンパク質４としてもまた公知であり、ヒトにおいてＢＡＸ遺伝子がコードするタンパク質である。ＢＡＸは、Ｂｃｌ−２遺伝子ファミリーのメンバーである。このタンパク質は、ＢＣＬ２とヘテロ二量体を形成し、アポトーシス活性化因子として機能する。このタンパク質は、ミトコンドリアの電位依存性アニオンチャネル（ＶＤＡＣ）と相互作用し、その開口を増加させ、このことにより、膜電位の喪失およびチトクロームｃの放出が生じることが報告されている。
【００５６】
Ｂｃｌ−２相同性アンタゴニスト／キラーは、ヒトにおいて第６染色体上のＢＡＫ１遺伝子がコードするタンパク質である。このタンパク質は、ミトコンドリアに局在し、アポトーシスを誘発する機能がある。このタンパク質は、ミトコンドリアの電位依存性アニオンチャネルと相互作用し、その開口を加速させ、このことにより、膜電位の喪失およびチトクロームｃの放出が生じる。
【００５７】
このファミリーに属するタンパク質をコードするヒト遺伝子は、ＢＡＫ１、ＢＡＸ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ａ１、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＢＣＬ２Ｌ１０、ＢＣＬ２Ｌ１３、ＢＣＬ２Ｌ１４、ＢＯＫおよびＭＣＬ１を含む。
【００５８】
ｉｖ．標的特異性
移植しようとするＨＳＣまたは細胞のゲノムまたは機能を妨げることなく、ウイルス核酸を切断するために、ヌクレアーゼは、ｇＲＮＡの標的特異性を使用することができる。ヌクレアーゼは、核酸の一本鎖を切断するか、または核酸中に二本鎖の切れ目を引き起こすことができる。
【００５９】
例として、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）は、ヒトヘルペスウイルス４（ＨＨＶ−４）ともまた呼ばれ、細胞中で本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体により不活性化される。ＥＢＶは、ヘルペスファミリーのウイルスであり、ヒトにおける最も一般的なウイルスの１つである。ウイルスは、直径がおよそ１２２ｎｍ〜１８０ｎｍであり、タンパク質キャプシド中に包まれるＤＮＡのダブルへリックスにより構成される。この実施例では、適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとして、Ｒａｊｉ細胞株が役立つ。Ｒａｊｉ細胞株は、最初の連続的な、造血起源のヒト細胞株であり、細胞株は、エプスタイン−バーウイルスの珍しい株を産生し、かつ最も広範に研究されているＥＢＶモデルのうちの１つである。Ｒａｊｉ細胞中でＥＢＶゲノムを標的とするためには、ＥＢＶに対する特異性を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体が必要である。ＥＢＶを標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドの設計は、Ｕ６プロモーターが駆動するキメラのガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、およびユビキタスプロモーターが駆動するＣａｓ９からなり、これらは、Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｉｎｃから得た。市販されているガイドＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼを、本発明と共に使用することができる。Ｃａｓ９タンパク質の後に融合させたＥＧＦＰマーカーにより、Ｃａｓ９陽性細胞の選択が可能になった（図２）。
【００６０】
本発明の態様では、ガイドＲＮＡを、商業的に購入するかどうかを問わず、特定のウイルスゲノムを標的とするように設計する。ウイルスゲノムを識別し、ウイルスゲノムの選択された部分を標的とするためのガイドＲＮＡを開発し、本発明の組成物内に組み込む。本発明の態様では、ウイルスの特定の株のリファレンスゲノムを選択して、ガイドＲＮＡの設計を行う。
【００６１】
例えば、ＥＢＶゲノムを標的とするガイドＲＮＡは、提示する実施例における系の構成成分である。ＥＢＶに関して、例えば、株Ｂ９５−８に由来するリファレンスゲノムを、設計のガイドとして使用した。目的のゲノム、例として、ＥＢＶ内の、選択した領域または遺伝子を標的とする。例えば、ゲノム編集の異なる目的の７つのガイドＲＮＡの設計を用いて、６つの領域を標的とすることができる（図４および表１）。追加情報、例として、プライマーの設計は、WangおよびQuake、２０１４年、「RNA-guided  endonuclease  provides  a  therapeutic  strategy  to  cure  latent  herpesviridae  infection」、PNAS、１１１巻（３６号）：１３１５７〜１３１６２頁、ならびにＰＮＡＳウェブサイトでオンライン公開されている当該論文に対する裏付け情報に示されている；それらの文献の両方の内容が、全ての目的で参照により組み込まれている。
【表１】
2018516597.tif 000002
【００６２】
ＥＢＶに関して、ＥＢＮＡ１は、潜伏中および溶解性の両方の感染モードにおいて発現するエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）の唯一の核タンパク質である。ＥＢＮＡ１は、潜伏感染においていくつかの重要な役割を果たすことが公知であり、かつ遺伝子の調節および潜伏中のゲノムの複製を含めた、ＥＢＶの多くの機能にとって極めて重要である。したがって、ゲノムのこの領域全体を切除するために、ガイドＲＮＡのｓｇＥＢＶ４およびｓｇＥＢＶ５を、ＥＢＮＡ１のコード領域の両方の末端を標的とするように選択した。これらの「構造的」標的により、ＥＢＶゲノムの、より小さな小片への系統的な消化が可能になる。ＥＢＮＡ３ＣおよびＬＭＰ１は、細胞の形質転換にとって必須であり、ガイドＲＮＡのｓｇＥＢＶ３およびｓｇＥＢＶ７をそれぞれ、これら２つのタンパク質の５’エクソンを標的とするように設計した。
【００６３】
一部の実施形態では、抗ウイルスエンドヌクレアーゼを、細胞内に導入する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を、細胞内に導入する。ガイドＲＮＡを、ウイルスゲノムの配列のうちの少なくとも１つのカテゴリーを標的とするように設計する。
【００６４】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡのカクテルを、細胞内に導入することができる。ガイドＲＮＡを、ウイルスゲノムの配列のうちの多数のカテゴリーを標的とするように設計する。ゲノムに沿っていくつか領域を標的とすることによって、複数の場所における二本鎖の切れ目が、ゲノムを断片化して、修復の可能性を低下させる。修復機構を用いたとしても、大きな欠失が、ウイルスを無能力化する。
【００６５】
一部の実施形態では、いくつかのガイドＲＮＡを添加して、カクテルを作り出し、異なるカテゴリーの配列を標的とする。例えば、２つ、５つ、７つまたは１１個のガイドＲＮＡを、ＣＲＩＳＰＲカクテル中に存在させて、配列の３つの異なるカテゴリーを標的とすることができる。しかし、任意の数のｇＲＮＡを導入して、カクテルを得、配列のカテゴリーを標的とすることができる。好ましい実施形態では、配列のカテゴリーはそれぞれ、ゲノムの構造および感染の潜伏性とって重要である。
【００６６】
本発明の一部の態様では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの実験により、ウイルスゲノム内の最も必須の標的の決定が可能になる。例えば、ゲノムの有効な無能力化にとって最も必須の標的を理解するために、サブセットのガイドＲＮＡを、モデル細胞内にトランスフェクトする。アッセイにより、どのガイドＲＮＡまたはどのカクテルが、配列の必須のカテゴリーを標的とするのに最も有効であるかを決定することができる。
【００６７】
例えば、ＥＢＶゲノムを標的とする場合、ＣＲＩＳＰＲカクテル中の７つのガイドＲＮＡが、配列の３つの異なるカテゴリーを標的とした；これらのカテゴリーはそれぞれ、ＥＢＶゲノムの構造、細胞の形質転換および感染の潜伏性にとって重要であることが識別されている。有効なＥＢＶの処理にとって最も必須の標的を理解するために、Ｒａｊｉ細胞に、サブセットのガイドＲＮＡをトランスフェクトした。ｓｇＥＢＶ４／５は、ＥＢＶゲノムを８５％だけ低下させたが、細胞の増殖を、完全なカクテルと同じように有効に抑制することはできなかった（図１１〜図２３）。構造的配列を標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＥＢＶ１／２／６）は、ＥＢＶのロード（ｌｏａｄ）を完全には排除しない（２６％の減少）にもかかわらず、細胞の増殖を完全に止めることができた。ゲノム編集および増殖停止の高い効率を考慮すると（図５〜図１０）、ｓｇＥＢＶ１／２／６におけるＥＢＶゲノムの残余のシグネチャーは、インタクトなゲノムではなく、ＥＢＶゲノムから消化されるに至った、遊離のＤＮＡに起因し、すなわち、擬陽性であるだろうと考えられる。
【００６８】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を構築したら、この複合体を細胞内に導入する。本発明の態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を、トランスフェクションの後にはウイルスのインタクトなゲノムが残らないように設計し、効率的なトランスフェクションが行われるように設計する。
【００６９】
ｖ．送達ベクター
本発明の態様によって、細胞内にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡが、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを含めた、多様な方法によりトランスフェクトされるのが可能になる。ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスを含むことができる。任意のウイルスベクターを、本発明に組み込んで、細胞内へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の送達を達成することができることを理解すべきである。消化または無能力化のために設計するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体に依存して、いくつかウイルスベクターが、その他のウイルスベクターよりも有効である場合がある。本発明の態様では、ベクターは、細胞中でベクターを複製および維持するのに必要である必須の構成成分、例として、複製開始点を含有する。
【００７０】
本発明の態様では、ウイルスベクターを、送達ベクターとして使用して、細胞内へ複合体を送達する。ウイルスベクターの送達ベクターとしての使用は、当技術分野で公知である。例えば、内容が参照により組み込まれている米国特許出願公開第２００９／００１７５４３号を参照されたい。
【００７１】
レトロウイルスは、一本鎖ＲＮＡウイルスであり、その核酸を（５’キャップおよび３’ポリＡテールを含む）ｍＲＮＡゲノムの形態で保存し、偏性寄生生物として、細胞を標的とする。当技術分野のいくつかの方法において、レトロウイルスは、細胞内に核酸を導入するために使用されてきた。ウイルスは、細胞質内に入ると、それ自体の逆転写酵素を使用して、そのＲＮＡゲノムからＤＮＡを産生する；これは、通常のパターンの逆、したがって、レトロ（逆行）である。次いで、この新しいＤＮＡは、細胞のゲノム内にインテグラーゼ酵素により組み込まれ、この時点で、レトロウイルスＤＮＡはプロウイルスと呼ばれる。例えば、組換えレトロウイルス、例として、モロニーマウス白血病ウイルスは、ゲノム内に安定な形で組み込まれる能力を有する。レトロウイルスは、ゲノム内への組み込みを可能にする逆転写酵素を含有する。レトロウイルスベクターは、複製コンピテントまたは複製欠損のいずれかであり得る。本発明の一部の実施形態では、細胞内へのトランスフェクションを達成するためにレトロウイルスが組み込まれるが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、ウイルスゲノムを標的とするように設計される。
【００７２】
本発明の一部の実施形態では、レトロウイルスのサブクラスであるレンチウイルスを、ウイルスベクターとして使用する。非分裂細胞のゲノム内に組み込まれるレンチウイルスの能力を考慮すると、レンチウイルスを送達ビヒクル（ベクター）として改作することができる；その他のレトロウイルスは、分裂細胞だけに感染することができることから、この能力は、レンチウイルスのユニークな特徴である。ウイルスが、細胞に進入すると、ＲＮＡの形態のウイルスゲノムが逆転写されて、ＤＮＡを産生し、次いで、ＤＮＡが、ウイルスのインテグラーゼ酵素により、ゲノム内のランダムな位置に挿入される。ベクターは、この時点で、プロウイルスと呼ばれ、ゲノム中に留まり、細胞が分裂すると、細胞の子孫に渡される。
【００７３】
レンチウイルスとは対照的に、アデノウイルスのＤＮＡは、ゲノム内に組み込まれず、細胞分裂の間に複製されない。アデノウイルスおよび関連のＡＡＶは、細胞のゲノム内に組み込まれないことから、送達ベクターとして、見込みのあるアプローチとなるであろう。本発明の一部の態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が、標的としようとするウイルスゲノムのみに作用し、細胞中のその他の遺伝子材料には作用しない。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、小型のウイルスであり、ヒトおよびいくつかのその他の霊長類種に感染する。ＡＡＶは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染することがき、宿主細胞のゲノム内にそのゲノムを組み込むことができる。例えば、ＡＡＶが遺伝子療法のベクターとして使用される可能性があることから、研究者らは、自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）と呼ばれる、変化させたＡＡＶを作り出すに至った。ＡＡＶは、ＤＮＡの一本鎖をパッケージングし、第２の鎖を合成するプロセスを必要とする一方で、ｓｃＡＡＶは、両方の鎖をパッケージングし、これらが、一緒になってアニールして、二本鎖ＤＮＡを形成する。ｓｃＡＡＶは、第２の鎖の合成をスキップすることによって、細胞中での迅速な発現が可能になる。ｓｃＡＡＶは、これ以外には、そのＡＡＶ対応物の多くの特徴を担持する。本発明の方法は、送達ベクターの手段として、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルスまたはワクシニアウイルスを組み込むことができる。
【００７４】
本発明のある特定の実施形態では、非ウイルスベクターを使用して、トランスフェクションを達成することができる。核酸の非ウイルス送達の方法は、リポフェクション、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｉｏｎ、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム；ポリカチオンまたは脂質：核酸のコンジュゲート；裸のＤＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの薬剤増強型の取込みを含む。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、米国特許第４，９４６，７８７号；および米国特許第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクションの試薬が商業的に販売されている（例えば、ＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍおよびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識型リポフェクションに適切であるカチオン性および中性の脂質は、Felgner、米国特許第４，８９７，３５５号；米国特許第４，９４６，７８７号；米国特許第５，０４９，３８６号；および米国特許第５，２０８，０３６号に記載されているものを含む。
【００７５】
合成ベクターは典型的には、負に荷電した核酸と複合体を形成して、１００ｎｍのオーダーでの径を有する粒子を形成することができるカチオン性の脂質またはポリマーに基づく。複合体は、核酸を、ヌクレアーゼによる分解から保護する。さらに、細胞性および局所性の送達戦略は、適切な細胞内コンパートメントにおいて、内部移行、放出および分布についての必要性にも対処しなければならない。本発明の一部の実施形態では、非ウイルスベクターを改変して、標的化された送達およびトランスフェクションを達成する。ペグ化（すなわち、ポリエチレングリコールを用いる表面の改変）が、非ウイルスベクターのオプソニン化および凝集を低下させるために使用する卓越した方法である。
【００７６】
しかし、表面上のＰＥＧは、標的細胞による取込みを減少させ、生物学的活性を低下させ得る。したがって、標的するリガンドを、ペグ化された構成成分の遠位端に結び付けることが必要になる；リガンドは、ＰＥＧの「シールド」を超えて突出して、標的細胞表面上の受容体に対する結合を可能にする。カチオン性リポソームを、遺伝子のキャリアとして使用する場合は、中性のヘルパー脂質の適用が、六角形フェーズ形成を促して、エンドソームを回避することを可能にすることに加えて、核酸の放出にも有用である。また、新規のカチオン性の脂質およびポリマーを設計および合成することも、遺伝子と、ペプチド、標的するリガンド、ポリマーまたは環境感受性部分とを共有結合または非共有結合により結合することも、非ウイルスベクターが遭遇している問題を解決するために、多くの関心を集めている。送達ベクター中での無機ナノ粒子（例えば、金属ナノ粒子、酸化鉄、リン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、リン酸マンガン、複水酸化物、カーボンナノチューブおよび量子ドット）の適用例を、多くの異なる方法で調製し、表面に官能基をもたせることができる。
【００７７】
本発明の一部の実施形態では、組織のユニークな環境および外部の刺激に応答して、標的に対して制御放出を行う系を利用する。金ナノロッドは、近赤外領域に強力な吸収バンドを有し、次いで、吸収された光エネルギーが、金ナノロッドにより熱に変換される；これは、いわゆる「光熱効果」である。近赤外光は、組織内に深く貫通することができることから、金ナノロッドの表面を、核酸を用いて改変して、制御放出を行うことができるであろう。改変した金ナノロッドに、近赤外光を照射すると、光熱効果が誘発する熱変性に起因して、核酸が放出される。放出される核酸の量は、光照射の出力および露光時間に依存する。
【００７８】
本発明の一部の実施形態では、リポソームを使用して、細胞または組織内へのトランスフェクションを達成する。核酸のリポソーム製剤の薬理学的作用は、核酸がリポソームの二重層内部にカプセル化される程度により主として決定される。カプセル化された核酸は、ヌクレアーゼによる分解から保護され、一方、リポソームの表面と単に会合しているに過ぎない核酸は、保護されない。カプセル化された核酸は、インタクトなリポソームの循環寿命の延長および生体内分布を共有し、一方、表面会合核酸は、リポソームから解離すると、裸の核酸の薬理学的作用を示す。
【００７９】
一部の実施形態では、本発明の複合体を、リポソーム中にカプセル化する。低分子薬物とは異なり、核酸が大きなサイズおよび親水性の性質を有することに主に起因して、核酸は、インタクトな脂質二重層を横断することができない。したがって、核酸を、リポソーム内に捕捉することができ、これは、従来の受動的な充填技術、例として、エタノール滴下法（ＳＡＬＰ中の核酸として）、逆相蒸発法、およびエタノール希釈法（ＳＮＡＬＰ中の核酸として）を用いて行う。
【００８０】
一部の実施形態では、直鎖ポリエチレンイミン（Ｌ−ＰＥＩ）を、その多用途性および比較的高いトランスフェクション効率に起因して、非ウイルスベクターとして使用する。Ｌ−ＰＥＩは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効率的な縮合、安定化および核酸の送達が可能である。
【００８１】
超音波が媒介する送達に加えて、磁性により標的する送達を使用して、送達を行うこともできるであろう。磁性ナノ粒子は通常、核酸の送達を撮像するために、遺伝子ベクター中に捕捉される。核酸のキャリアは、超音波場および磁場の両方に応答することができ、すなわち、磁性活性および音響活性を示すリポスフェア（ＭＡＡＬ）である。基本的な前提は、治療剤を、磁性の微小粒子またはナノ粒子に付着されるか、またはその内部に封入することである。これらの粒子は、官能化され得るポリマーもしくは金属による被覆を有する磁性コアを有する場合、または細孔内に沈殿した磁性ナノ粒子を含有する多孔性ポリマーからなる場合がある。ポリマーまたは金属による被覆を官能化することによって、例えば、標的化学療法のための細胞傷害性の薬物、または遺伝子の欠陥を矯正するための治療用ＤＮＡを付着することが可能になる。一般に高磁場、高勾配の希土類磁石からの磁場を、標的部位上に集中させ、粒子が磁場に進入する際に粒子にかかる力により、標的における粒子の捕捉および浸出が可能になる。
【００８２】
従来のリポソームと比較して、トランスフェクション効率が増強され、かつ細胞傷害性が低下している、合成カチオン性ポリマーに基づくナノ粒子（約１００ｎｍの直径）が開発されるに至った。種々の物理的および化学的な特徴を示す脂質分子から構成される明確に異なる層を組み込んで、ポリマー製のナノ粒子製剤を得た結果、より良好な細胞膜との融合および細胞内への進入を通しての効率の改善；細胞内での分子の放出の増強；ならびにナノ粒子複合体の細胞内での分解の低下がもたらされた。
【００８３】
一部の実施形態では、複合体を、ナノ系、例として、とりわけ、リポソーム、アルブミンに基づく粒子、ペグ化されたタンパク質、生分解性ポリマー−薬物の複合材料、高分子ミセル、デンドリマーにコンジュゲートさせる。Davis  ME、Chen  ZG、Shin  DM、Nat  Rev  Drug  Discov、２００８年；７巻：７７１〜７８２頁。ある特定の実施形態では、本発明の複合体を、リポソームまたはポリマーソーム（polymerosome）にコンジュゲートして、またはリポソームまたはポリマーソーム内に封入して、細胞に送達する。例えば、リポソーム型アントラサイクリンが、極めて効率的な封入を達成するに至り、これらには、非常に長期の循環を示すバージョン、例として、リポソーム型ダウノルビシンおよびペグ化リポソーム型ドキソルビシンが含まれる。Krishnaら、「Carboxymethylcellulose-sodium  based  transdermal  drug  delivery  system  for  propranolol」、J  Pharm  Pharmacol.、１９９６年４月；４８巻（４号）：３６７〜７０頁を参照されたい。
【００８４】
リポソームおよびポリマーソームは、複数の溶液および化合物を含有することができる。ある特定の実施形態では、本発明の複合体を、ポリマーソームにカップリングさせるか、またはポリマーソーム中に封入する。ポリマーソームは、人工的なベシクルの１つのクラスであり、溶液を包み込む、微小な中空の球形をなす；両親媒性の合成のブロックコポリマーを使用し、ベシクルの膜を形成して、ポリマーソームを作製する。一般的なポリマーソームは、それらのコア中に水溶液を含有し、傷つきやすい分子、例として、薬物、酵素、その他のタンパク質およびペプチド、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡの断片を封入し、かつ保護するのに有用である。ポリマーソームの膜は、外部の材料、例として、生物学的な系中に見出されるものから、封入されている材料を隔離する物理的なバリアを提供する。ポリマーソームは、公知の技法により、二重エマルジョンから生成することができる；参照により組み込まれているLorenceauら、２００５年、「Generation  of  Polymerosomes  from  Double-Emulsions」、Langmuir、２１巻（２０号）：９１８３〜６頁を参照されたい。
【００８５】
本発明の一部の実施形態は、遺伝子銃、または微粒子銃による粒子送達系を提供する。遺伝子銃は、細胞に遺伝情報を注入するためのデバイスであり、この場合、ペイロードは、プラスミドＤＮＡを用いてコーティングした、重金属の元素粒子であり得る。この技法はまた、バイオバリスティック（ｂｉｏｂａｌｌｉｓｔｉｃ）または微粒子銃と呼ぶこともできる。遺伝子銃はまた、ＤＮＡワクチンを送達するためにも使用されてきた。遺伝子銃により、細胞に、多種多様な有機種および非有機種、例として、ＤＮＡプラスミド、蛍光タンパク質、色素等をトランスフェクトすることが可能になる。
【００８６】
本発明の態様は、送達ベクターの多数の使用を提供する。送達ベクターの選択は、標的とする細胞または組織、および抗ウイルスエンドヌクレアーゼの特定の構成に基づく。例えば、上記で論じたＥＢＶの例では、リンパ球は、リポフェクションに対して抵抗性であることが公知であることから、Ｒａｊｉ細胞内にＤＮＡを送達するためには、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｉｏｎ（基質を直接細胞核および細胞質内に移入するための、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｏｒと呼ばれるデバイスが発生させる電気的パラメータと細胞型に特異的な試薬との組合せ）が必要であった。Ｌｏｎｚａのｐｍａｘプロモーターにより、Ｃａｓ９の発現を駆動させる；その理由は、このプロモーターは、Ｒａｊｉ細胞内で強力な発現をもたらすからであった。蛍光顕微鏡法により、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｉｏｎから２４時間後に、少ない比率の細胞から、明らかなＥＧＦＰシグナルが観察された。しかし、ＥＧＦＰ陽性の細胞集団は劇的に減少した；ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎから４８時間後に、１０％未満のトランスフェクション効率を測定した（図３）。ＥＢＶの複製開始点の配列ｏｒｉＰを含むＣＲＩＳＰＲプラスミドは、６０％超のトランスフェクション効率をもたらした（図３）。
【００８７】
ｖｉ．ウイルス核酸の切断
本発明の方法を使用して、感染していることが知られていなくても、移植の前に、予防的に、すなわち、全ての細胞を処理することができる。一部の実施形態では、感染の状況が分かっており、感染している細胞のみを処理する。感染している細胞を処理する場合、ヌクレアーゼにより、ウイルス核酸が切断される。
【００８８】
切断されるウイルス核酸は、ウイルスのＤＮＡもしくはＲＮＡの遊離の粒子である場合、または宿主ゲノム内に組み込まれるに至ったウイルス核酸を含む場合がある。標的とするウイルスは、感染の活性な段階にある場合または潜伏段階にある場合がある。
【００８９】
細胞内に入ると、ヌクレアーゼは、ウイルスゲノムを標的とする。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、ウイルスゲノムを標的とすることができる。潜伏感染に加えてまた、本発明を使用して、パッケージングの前または放出の後に、活発に複製しているウイルスを、ウイルスゲノムを標的とすることによって制御することもできる。好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、潜伏中のウイルスゲノムを標的とし、それにより、増殖の機会を低下させる。ガイドされるＲＮＡ複合体は、決定された数の配列カテゴリーのウイルスゲノムを標的として、ウイルスゲノムを無能力化する。上記で論じたように、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ウイルスゲノム中に二本鎖の切れ目を引き起こす。ウイルスゲノムに沿っていくつかの場所を標的とし、一本鎖の切れ目ではなく、二本鎖の切れ目を引き起こすことによって、ゲノムに沿っていくつかの場所において、ゲノムが効率的に切られる。好ましい実施形態では、小さな欠失が生じるか、または小さな断片がゲノムから除去されるように、二本鎖の切れ目を設計し、したがって、天然の修復機構がゲノムを一緒にして連結する場合であっても、ゲノムは無能力化される。
【００９０】
本発明の好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を、ウイルスゲノムを含有する細胞内にトランスフェクトする。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを、ウイルスゲノムに沿っていくつかの場所に局在させるように、ｇＲＮＡを設計する。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ゲノム中に二本鎖の切れ目を引き起こして、ウイルスゲノムから小さな断片を欠失させる。修復機構が用いられるにしても、欠失により、ウイルスゲノムは無能力化する。
【００９１】
次いで、本発明の方法に従って抗ウイルスエンドヌクレアーゼを用いて処理した細胞を、移植術のために提供する。（時には、骨髄移植と呼ばれる）幹細胞移植は、病的な骨髄を、健常な骨髄に発達する高度に特殊化した幹細胞により交換する医学的な手順である。骨髄移植のための方法および手順は、当技術分野で周知である。例えば、米国特許第６３８３４８１号、標題「Method  for  transplantation  of  hemopoietic  stem  cells」を参照されたい。細胞は、抗ウイルスエンドヌクレアーゼを用いて処理した後、移植術において使用するまで、保存することができる。
【００９２】
本発明の一部の方法では、抗ウイルスエンドヌクレアーゼを用いて処理した細胞を、培養して成長させる。一部の実施形態では、実験室の技法を使用して、抗ウイルスエンドヌクレアーゼを用いて処理した細胞に由来するかまたは抗ウイルスエンドヌクレアーゼに曝露させた細胞に由来する細胞の集団を作り出す。細胞培養の技法は、当技術分野で周知である。例えば、米国特許出願公開第２０１１／０１７７５９４号、標題「Stem  Cells  Culture  Systems」；米国特許出願公開第２０１２／０１２２２１３号、標題「Method  for  Culturing  Stem  Cells」；および米国特許出願公開第２００９／０３２５２９４号、標題「Single  Pluripotent  Stem  Cell  Culture」を参照されたい。次いで、処理した細胞から成長させた細胞は、移植術において使用するまで保存することができる。重要なことに、処理した細胞から成長させた細胞は、抗ウイルスエンドヌクレアーゼが標的とするウイルスは含有しない。
【００９３】
ｖｉｉ．レシピエントへの送達
本発明の方法は、患者内に移植するための細胞を提供するステップを含む。一部の実施形態では、医学的に使用するために、処理した細胞を標識し、それらの細胞を保存し、輸送し、またはこれ以外の準備を行う。ある特定の実施形態では、本発明の方法は、患者の体内に１つまたは複数の細胞を送達するステップを含む。
【００９４】
一部の実施形態では、骨髄または免疫系が損傷しているか、またはそこに欠陥のある患者の造血機能を再建するための造血幹細胞移植術（ＨＳＣＴ）には、自家のまたはアロジェネイックな幹細胞の静脈内（ＩＶ）注入が関与する。造血幹細胞移植術（ＨＳＣＴ）は、患者からの造血幹細胞（ＨＳＣ）の抽出（アフェレーシス）、およびフリーザー中での収集した細胞の保存を必要とする。次いで、放射線療法を行ってもまたは行わなくても、骨髄を部分的または完全に犠牲にして切除して、患者の悪性細胞集団を根絶する意図をもって、高い用量の化学療法を用いて、患者を処置する（新しい血液細胞を成長させるための患者の骨髄機能が破壊される）。次いで、患者自身の保存した幹細胞を、本発明の方法に従ってヌクレアーゼを用いて処理し、次いで、患者の血流内に輸血する；この場合、幹細胞により、破壊された組織が交換され、患者の正常な血液細胞の産生が再開される。
【００９５】
一部の実施形態では、健常なドナーおよび患者であるレシピエントが関与するアロジェネイックなＨＳＣＴを、本発明の方法に組み込む。アロジェネイックなＨＳＣドナーは、レシピエントと一致する組織（ＨＬＡ）型を有さなければならない。ＨＬＡ遺伝子の３つまたはそれ超の遺伝子座における変動に基づいて一致させ、これらの遺伝子座における完璧な一致が好ましい。アロジェネイックな移植ドナーは、血縁のドナー（通常、ＨＬＡが緊密に一致する兄弟姉妹）、シンジェニックなドナー（患者の一卵性のもしくは「同質の」双生児：同質な双生児をもつ患者はほとんどいないので、必然的に極めて希少であるが、ＨＬＡが完全に一致する幹細胞を供給する）、または無関係なドナー（血縁ではなく、ＨＬＡが一致する程度が非常に高いことが見出されるドナー）であり得る。無関係なドナーは、骨髄ドナーの登録簿、例として、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍを通して見出すことができる。一般に、移植に直接的に関連する合併症が解消されると、アロジェネイックなＨＳＣＴにより、レシピエントの血流に健常な幹細胞を輸血して、健常な免疫系を再編成することによって、治癒または長期の寛解についての機会が向上し得る。
【００９６】
収集した細胞または得られた細胞は、細胞を損なうことなく、長期間凍結（凍結保存）することができる。一部の実施形態では、移植治療に数ヵ月または数年先であっても、レシピエントまたはドナーから細胞を収集することができる。ＨＳＣを凍結保存するために、保存剤、すなわち、ＤＭＳＯを添加することができ、細胞を、速度が制御されるフリーザー中で非常にゆっくり冷却して、氷の結晶が形成される間の、浸透圧による細胞の損傷を阻止することができる。ＨＳＣは、液体窒素を典型的には使用する低温フリーザー中に何年も保存することができる。
【００９７】
医学的に使用するために提供することは、標識すること、保存すること、輸送すること、または使用するためのその他の準備を行うことを含むことができる。好ましい実施形態では、患者内に移植するための細胞を提供することは、容器、例として、ＢＤ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）により商標ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ下で販売されている血液回収用のチューブ中に細胞を入れることを含み、容器には、レシピエントを識別するために使用することができる情報を有するラベルを付ける。移植術のために細胞が必要になるまでの一定期間、容器を保存することができる。一部の実施形態では、患者内に移植するための細胞を提供することは、ヌクレアーゼを送達した後で、容器中に細胞を保持することを含む。
【００９８】
患者内への送達は、ウイルスを含有しない細胞を、静脈内（ＩＶ）注入により患者内に送達することを含むことができる。他の実施形態では、手術を介して、または試料を患者の体内の場所へ配置することによって、ウイルスを含有しない細胞を患者内に移植することができる。他の実施形態では、外科的手順の間に、細胞を患者内に配置する。
【００９９】
参照による組み込み
本開示全体を通して、その他の文献、例として、特許、特許出願、特許公開、学術誌、書籍、論文、ウェブコンテンツを参照し、引用してきた。本明細書中のそのような文献は全て、それらの全体が、全ての目的で参照により本明細書に組み込まれている。
【０１００】
均等物
本発明の多様な改変形態、およびそれらの多くのさらなる実施形態が、本明細書に示し、記載するものに加えて、本明細書で引用する科学文献および特許文献への参照を含めた、本明細書の完全な内容から当業者に明らかになる。本明細書の主題は、重要な情報、例証および手引きを含有しており、それらを、本発明の多様な実施形態およびそれらの均等物における本発明の実行に適応させることができる。
【実施例】
【０１０１】
（実施例１）
バーキットリンパ腫細胞株のＲａｊｉ、ＮａｍａｌｗａおよびＤＧ−７５をＡＴＣＣから得、ＡＴＣＣの推奨に従って１０％のＦＢＳおよびＰＳＡを補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。ヒト初代肺線維芽細胞ＩＭＲ−９０をＣｏｒｉｅｌｌから得、１０％のＦＢＳおよびＰＳＡを補充したＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ−１２中で培養した。
【０１０２】
Cong  Lら（２０１３年）、「Multiplex  Genome  Engineering  Using  CRISPR/Cas  Systems」、Science、３３９号：８１９〜８２３頁による記載に従う、Ｕ６プロモーターが駆動するキメラのガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）およびユビキタスプロモーターが駆動するＣａｓ９からなるプラスミドを、Ａｄｄｇｅｎｅから得た。Ｃａｓ９タンパク質の後に融合させたＥＧＦＰマーカーにより、Ｃａｓ９陽性細胞の選択が可能になった（図２）。より効率的なＰｏｌ−ＩＩＩ転写およびより安定なステムループ構造のために、キメラのガイドＲＮＡの改変された設計に本発明者らは適合させた（Chen  Bら（２０１３年）、「Dynamic  Imaging  of  Genomic  Loci  in  Living  Human  Cells  by  an  Optimized  CRISPR/Cas  System」、Cell、１５５巻：１４７９〜１４９１頁）。
【０１０３】
図２〜図４に、ＥＢＶを標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の設計を示す。図２は、Cong  Lら（２０１３年）、「Multiplex  Genome  Engineering  Using  CRISPR/Cas  Systems」、Science、３３９巻：８１９〜８２３頁から適合させたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓプラスミドのスキームを示す。図３は、Ｒａｊｉ細胞中でのトランスフェクション効率に対するｏｒｉＰの効果のグラフを示す。Ｃａｓ９プラスミドおよびＣａｓ９−ｏｒｉＰプラスミドの両方が、スクランブルされたガイドＲＮＡを有する。図４は、ＥＢＶのリファレンスゲノムに沿って、ＣＲＩＳＰＲのガイドＲＮＡの標的を示す。緑色、赤色および青色により、３つの異なる標的配列のカテゴリーを示す。
【０１０４】
ｐＸ４５８を、Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｉｎｃから得、合成イントロンを有する改変されたＣＭＶプロモーター（ｐｍａｘ）を、Ｌｏｎｚａの対照プラスミドであるｐｍａｘ−ＧＦＰからＰＣＲ増幅した。改変されたガイドＲＮＡであるｓｇＲＮＡ（Ｆ＋Ｅ）は、ＩＤＴから注文した。ＥＢＶの複製開始点ｏｒｉＰを、Ｂ９５−８形質転換リンパ芽球様細胞株ＧＭ１２８９１からＰＣＲ増幅した。標準的なクローニングのプロトコールを使用して、ｐＸ４５８に、ｐｍａｘ、ｓｇＲＮＡ（Ｆ＋Ｅ）およびｏｒｉＰをクローニングし、元々のＣＡＧプロモーター、ｓｇＲＮＡおよびｆ１開始点を交換した。ＥＢＶのｓｇＲＮＡを、Ｂ９５−８リファレンスに基づいて設計し、ＤＮＡオリゴは、ＩＤＴから注文した。ｐＸ４５８中の元々のｓｇＲＮＡのプレースホルダーを、陰性対照として用いた。
【０１０５】
リンパ球は、リポフェクションに対して抵抗性であることが公知であり、したがって、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎを使用して、Ｒａｊｉ細胞内にＤＮＡを送達した。Ｃａｓ９の発現を駆動するために、Ｌｏｎｚａのｐｍａｘプロモーターを選んだ；その理由は、このプロモーターは、Ｒａｊｉ細胞内で強力な発現もたらすからであった。ＬｏｎｚａのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩを使用して、ＤＮＡを送達した。５００万個のＲａｊｉ細胞またはＤＧ−７５細胞に、各１００μｌの反応物中の５μｇのプラスミドをトランスフェクトした。Ｌｏｎｚａの推奨に従って、Ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  Ｋｉｔ  ＶおよびプログラムＭ−０１３を使用した。ＩＭＲ−９０については、１００万個の細胞に、１００μｌの溶液Ｖ中の５μｇのプラスミドをトランスフェクトし、プログラムは、Ｔ−０３０またはＸ−００５を用いた。蛍光顕微鏡法により、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎから２４時間後に、少ない比率の細胞から、明らかなＥＧＦＰシグナルが観察された。しかし、その後、ＥＧＦＰ陽性の細胞集団が、劇的に減少し、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎから４８時間後に、本発明者らは、１０％未満のトランスフェクション効率を測定した（図３）。トランスフェクション効率のこの減少は、細胞分裂に伴ってプラスミドが希釈されたことが原因であった。細胞内のプラスミドのレベルを積極的に維持するために、ＣＲＩＳＰＲプラスミドを再設計して、ＥＢＶの複製開始点の配列ｏｒｉＰを含めた。細胞内での活発なプラスミドの複製により、トランスフェクション効率は、６０％超に上昇した（図３）。
【０１０６】
ＥＢＶゲノムを標的とするガイドＲＮＡを設計するために、株Ｂ９５−８に由来するＥＢＶのリファレンスゲノムを利用した。ゲノム編集の異なる目的の７つのガイドＲＮＡの設計を用いて、６つの領域を標的とした。
【０１０７】
追加情報、例として、プライマーの設計は、WangおよびQuake、２０１４年、「RNA-guided  endonuclease  provides  a  therapeutic  strategy  to  cure  latent  herpesviridae  infection」、PNAS、１１１巻（３６号）：１３１５７〜１３１６２頁、ならびにＰＮＡＳウェブサイトでオンライン公開されている当該論文に対する裏付け情報に示されている；それらの文献の両方の内容が、全ての目的で参照により組み込まれている。
【０１０８】
ＥＢＮＡ１は、遺伝子の調節および潜伏中のゲノムの複製を含めた、ＥＢＶの多くの機能にとって極めて重要である。ゲノムのこの領域全体を切除するために、ＥＢＮＡ１のコード領域の両方の末端を、ガイドＲＮＡのｓｇＥＢＶ４およびｓｇＥＢＶ５の標的とした。ガイドＲＮＡのｓｇＥＢＶ１、２および６は、反復領域内にあり、したがって、少なくとも１回ＣＲＩＳＰＲが切ることの成功率を多重化させる。これらの「構造的」標的により、ＥＢＶゲノムの、より小さな小片への系統的な消化が可能になる。ＥＢＮＡ３ＣおよびＬＭＰ１は、細胞の形質転換にとって必須であり、ガイドＲＮＡのｓｇＥＢＶ３およびｓｇＥＢＶ７をそれぞれ、これら２つのタンパク質の５’エクソンを標的とするように設計した。
【０１０９】
ＥＢＶゲノムの編集
ＣＲＩＳＰＲが生成した二本鎖ＤＮＡの切れ目は、小さな欠失に関しては修復される。図５〜図９は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が誘発した大きな欠失を示す。図５は、ガイドＲＮＡのｓｇＥＢＶ２の周囲のゲノムコンテキスト、およびＰＣＲプライマーの場所（フランキング）を示す。図６は、ｓｇＥＢＶ２が誘発した大きな欠失を示す。レーン１〜３はそれぞれ、ｓｇＥＢＶ２による処理の前、５日後および７日後である。図７は、ガイドＲＮＡのｓｇＥＢＶ３／４／５の周囲のゲノムコンテキスト、およびＰＣＲプライマーの場所を示す。図８は、ｓｇＥＢＶ３／５およびｓｇＥＢＶ４／５が誘発した大きな欠失を示す。レーン１および２は、ｓｇＥＢＶ３／５による処理の前および８日後の３Ｆ／５Ｒ  ＰＣＲアンプリコンである。レーン３および４は、ｓｇＥＢＶ４／５による処理の前および８日後の４Ｆ／５Ｒ  ＰＣＲアンプリコンである。図９および図１０は、サンガー配列決定が、ｓｇＥＢＶ３／５による処理（図９）およびｓｇＥＢＶ４／５による処理（図１０）の８日後の、ゲノムの切断および修復ライゲーションを確認したことを示す。領域６９０および７００（図９）ならびに領域６９０および７００（図１０）は、修復ライゲーションの前の２つの末端を示す。
【０１１０】
これらの欠失は、タンパク質のコーディングを破綻させ、したがって、ノックアウト効果を生み出す。ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイにより、個々の部位の効率的な編集が確認された（図２９）。標的部位間の大きな欠失は、それぞれのガイドＲＮＡが誘発した独立の小さな欠失を超えて、ＥＢＶゲノムを体系的に破壊することができる。ガイドＲＮＡのｓｇＥＢＶ２は、１２５ｂｐの反復単位を１２個有する領域を標的とする（図５を参照されたい）。反復領域全体のＰＣＲアンプリコンは、約１．８ｋｂのバンドをもたらした（図６を参照されたい）。ｓｇＥＢＶ２のトランスフェクションの５日後または７日後に、本発明者らは、同じＰＣＲ増幅から約０．４ｋｂのバンドを得た（図６）。約１．４ｋｂの欠失が生じることが、最初に切られた反復単位と最後に切られた反復単位との間の修復ライゲーションから予測される（図５）。
【０１１１】
ｓｇＲＮＡの標的に隣接するＤＮＡ配列を、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅した（図３３）。ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイは、製造元の使用説明に従って実施した。大きな欠失を有するＤＮＡアンプリコンを、ＴＯＰＯクローニングし、単一のコロニーを使用して、サンガー配列決定を行った。ＦｌｕｉｄｉｇｍのＢｉｏＭａｒｋ上で、ＴａｑｍａｎデジタルＰＣＲを用いて、ＥＢＶのロードを測定した。保存されているヒト遺伝子座を標的とするＴａｑｍａｎアッセイを使用して、ヒトＤＮＡの正規化を行った。Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃ１から得られた、単一細胞からの全ゲノム増幅の産物の１ｎｇを使用して、ＥＢＶの定量的ＰＣＲを行った。
【０１１２】
ユニークな標的間の領域を欠失させることは可能である（図７）。ｓｇＥＢＶ４およびｓｇＥＢＶ５のトランスフェクションの６日後、隣接領域全体のＰＣＲ増幅（プライマーＥＢＶ４ＦおよびＥＢＶ５Ｒを用いた）から、より短いアンプリコンが返され、加えて、予測された２ｋｂのさらにより淡いバンドも返された（図８）。アンプリコンクローンのサンガー配列決定により、２つの予測された切断部位の直接的な接続が確認された（図１０）。また、ｓｇＥＢＶ３およびｓｇＥＢＶ５を用いる類似の実験からも、さらにより大きな欠失ＥＢＮＡ３Ｃ〜ＥＢＮＡ１が返された（図８〜図９）。
ＥＢＶゲノムの破壊に伴う、細胞の増殖の停止
【０１１３】
ＣＲＩＳＰＲのトランスフェクションの２日後に、ＥＧＦＰ陽性細胞を流動選別して、さらなる培養を行い、生存細胞を毎日計数した。図１１〜図２３は、ＥＢＶゲノムの破壊に伴う、細胞の増殖の停止を示す。図１１は、異なるＣＲＩＳＰＲによる処理の後の細胞の増殖曲線を示す。ここでは、ｓｇＥＢＶ１〜７による、５つの独立した処理を示す。図１２〜図１７は、ｓｇＥＢＶ１〜７による処理の前（図１２）、５日後（図１３）および８日後（図１４）のフローサイトメトリーの散乱シグナルを示す。図１５〜図１７は、ｓｇＥＢＶ１〜７による処理の前（図１５）、５日後（図１６）および８日後（図１７）のアネキシンＶ  Ａｌｅｘａ６４７およびＤＡＰＩによる染色の結果を示す。領域３００および２００は、（図１２〜図１４）中の亜集団Ｐ３およびＰ４に対応する。図１８および図１９は、ｓｇＥＢＶ１〜７による処理の後の顕微鏡法により明らかになったアポトーシス細胞形態を示す。図２０〜図２３は、ｓｇＥＢＶ１〜７による処理の前（図２０）および後（図２１〜図２３）の核の形態を示す。
【０１１４】
予想通り、ｏｒｉＰまたはｓｇＥＢＶを欠くＣａｓ９プラスミドを用いて処理した細胞は、ＥＧＦＰの発現を数日以内に失い、未処置の対照群の速度に類似する速度で増殖した（図１１）。Ｃａｓ９−ｏｒｉＰおよびスクランブルされたガイドＲＮＡを有するプラスミドは、８日後に、ＥＧＦＰの発現を維持するが、細胞の増殖速度を低下させなかった。混合カクテルのｓｇＥＢＶ１〜７を用いて処理した結果、細胞の測定可能な増殖は生じず、総細胞数は、一定の状態を維持するかまたは減少するかのいずれかであった（図１１）。ｓｇＥＢＶ１〜７による処理の後に、フローサイトメトリーの散乱シグナルから、細胞の形態の変化が明らかに示された；というのは、大半の細胞のサイズが縮小し、顆粒化が増加したからである（図１２〜図１４、集団Ｐ４からＰ３へのシフト）。ＤＡＰＩ染色によりまた、集団Ｐ３中の細胞は膜透過性が損われていることも示された（図１５〜図１７）。ＣＲＩＳＰＲの細胞傷害性の可能性、とりわけ、複数のガイドＲＮＡに伴うそうした可能性を除外するために、同じ処理を、２つのその他の試料、すなわち、ＥＢＶ陰性バーキットリンパ腫細胞株ＤＧ−７５（図３０）および初代ヒト肺線維芽細胞ＩＭＲ９０（図３１）に対して実施した。トランスフェクションの８日および９日後に、細胞の増殖速度は、未処置の対照群と変わらず、このことから、無視し得る細胞傷害性であることが示唆された。
【０１１５】
以前の研究によれば、ＥＢＶの腫瘍形成能力は、ＥＢＶが細胞のアポトーシスを妨害することに由来する（Ruf  IKら（１９９９年）、「Epstein-Barr  Virus  Regulates  c-MYC,  Apoptosis,  and  Tumorigenicity  in  Burkitt  Lymphoma」、Molecular  and  Cellular  Biology、１９巻：１６５１〜１６６０頁）。したがって、ＥＢＶの活性を抑制することによって、アポトーシスのプロセスを復元することができる；このことにより、本発明者らの実験で観察された細胞死を説明することができるであろう。アネキシンＶによる染色によって、細胞膜はインタクトであるが、ホスファチジルセリンを曝露させている、細胞の明確に異なる亜集団が明らかになり、このことから、アポトーシスを介する細胞死が示唆された（図１５〜図１７）。明視野顕微鏡法により、明らかなアポトーシス細胞形態が示され（図１８〜図１９）、蛍光染色により、劇的なＤＮＡの断片化が示された（図２０〜図２３）。こうした証拠はいずれも、ＥＢＶゲノムが破壊された後の、細胞の正常なアポトーシス経路の復元を示唆している。
【０１１６】
図２４〜図２８は、ＣＲＩＳＰＲによる処理の後のＥＢＶのロードの定量を示す。図２４は、異なるＣＲＩＳＰＲによる処理の後の、デジタルＰＣＲによるＥＢＶのロードを示す。Ｃａｓ９およびＣａｓ９−ｏｒｉＰは、２回繰り返した結果であり、ｓｇＥＢＶ１〜７は、５回繰り返した結果である。図２５および図２６は、顕微鏡法により捕捉した、全ゲノム増幅のための単一細胞を示す。図２７は、処理の前に、単一細胞から得られたＥＢＶの定量的ＰＣＲのＣｔ値のヒストグラムを示す。図２８は、ｓｇＥＢＶ１〜７による処理の７日後に、単一生存細胞から得られたＥＢＶの定量的ＰＣＲのＣｔ値のヒストグラムを示す。（図２７）および（図２８）中の破線は、１つの細胞当たりの１つのＥＢＶゲノムのＣｔ値を示す。
【０１１７】
亜集団におけるＥＢＶの完全なクリアランス。細胞の増殖の停止とＥＢＶゲノムの編集との間に関連がある可能性について研究するために、ＥＢＶのロードを、異なる試料中で、ＥＢＮＡ１を標的とするデジタルＰＣＲを用いて定量した。保存されているヒト体細胞遺伝子座を標的とする別のＴａｑｍａｎアッセイを、内部対照として用いて、ヒトＤＮＡの正規化を行った。平均して、未処置のＲａｊｉ細胞はそれぞれ、ＥＢＶゲノムの４２個のコピーを有する（図２４）。ｏｒｉＰまたはｓｇＥＢＶを欠くＣａｓ９プラスミドを用いて処理した細胞は、ＥＢＶのロードの差において、未処置の対照とは明らかな差は示さなかった。ｏｒｉＰは有するが、ｓｇＥＢＶは有さないＣａｓ９−プラスミドを用いて処理した細胞は、約５０％だけ低下したＥＢＶのロードを示した。本発明者らは、本実験から得られた細胞が増殖速度の差は何ら示さなかったという先行する観察結果と併せて、このことを、プラスミドの複製の間のＥＢＮＡ１に対する結合についての競合に起因する可能性が高いと解釈している。トランスフェクションへのガイドＲＮＡのカクテルｓｇＥＢＶ１〜７の添加により、ＥＢＶのロードは劇的に低下した。生存細胞および死滅細胞の両方が、未処置の対照と比較して、６０％超のＥＢＶの減少を示している。
【０１１８】
７つのガイドＲＮＡを同じモル比で提供したが、プラスミドのトランスフェクションおよび複製のプロセスは、極めて確率論的であるようである。いくつかの細胞は必然的に、ガイドＲＮＡのカクテルの異なるサブセットまたは混合物を受容する；このことは、処理の効率に影響を及ぼす可能性があるであろう。そのような影響を制御するために、自動化されたマイクロ流体システムを用いる、単一細胞の全ゲノム増幅を採用することによって、単一細胞レベルでＥＢＶのロードを測定した。新しく培養したＲａｊｉ細胞を、マイクロ流体チップ上に充填し、８１個の単一細胞を捕捉した（図２５）。ｓｇＥＢＶ１〜７で処理した細胞の場合、トランスフェクションの８日後に、生存細胞を流動選別し、９１個の単一細胞を捕捉した（図２６）。製造元の使用説明に従って、約１５０ｎｇの増幅されたＤＮＡを、それぞれの単一細胞の反応チャンバーから得た。品質管理の目的で、本発明者らは、４つの遺伝子座についてのヒト体細胞ＤＮＡの定量的ＰＣＲを、単一細胞のそれぞれの増幅産物に対して実施し（Wang  J、Fan  HC、Behr  B、Quake  SR（２０１２年）、「Genome-wide  single-cell  analysis  of  recombination  activity  and  de  novo  mutation  rates  in  human  sperm」、Cell、１５０巻：４０２〜４１２頁）、少なくとも１つの遺伝子座からの陽性の増幅を求めた。未処置の単一細胞からの産物６９個が、品質管理に合格し、ＥＢＶのロードの対数正規分布を示し（図２７）、ほとんど全ての細胞が、顕著な量のＥＢＶのゲノムＤＮＡを示した。本発明者らは、単一の組み込まれたＥＢＶゲノムを含有する、Ｎａｍａｌｗａバーキットリンパ腫細胞のサブクローンを用いて、定量的ＰＣＲアッセイを較正した。単一コピーのＥＢＶの測定から、２９．８のＣｔが得られ、これにより、６９個の単一のＲａｊｉ細胞の試料の平均Ｃｔが、１つの細胞当たりＥＢＶの４２個のコピーに対応することを本発明者らが決定することが可能になり、このことは、バルクのデジタルＰＣＲ測定値と一致した。ｓｇＥＢＶ１〜７により処理した試料の場合、単一細胞からの産物７１個が、品質管理に合格し、ＥＢＶのロードの分布は劇的により広かった（図２８）。２２個の細胞は、未処置の細胞とＥＢＶの同じロードを有し、一方、１９個の細胞は、検出可能なＥＢＶを有さず、残りの３０個の細胞は、未処置の試料に比して、ＥＢＶのロードの劇的な減少を示した。
【０１１９】
図２９は、ＥＢＶのＣＲＩＳＰＲのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを示す。レーン１：１００ｂｐのＮＥＢのラダー、レーン２：ｓｇＥＢＶ１対照；レーン３：ｓｇＥＢＶ１；レーン４：ｓｇＥＢＶ５対照；レーン５：ｓｇＥＢＶ５；レーン６：ｓｇＥＢＶ７対照；レーン７：ｓｇＥＢＶ７；レーン８：ｓｇＥＢＶ４。図３０は、ＥＢＶ陰性のバーキットリンパ腫ＤＧ−７５を用いたＣＲＩＳＰＲの細胞傷害性試験を示す。図３１は、初代ヒト肺線維芽細胞ＩＭＲ−９０を用いたＣＲＩＳＰＲの細胞傷害性試験を示す。
【０１２０】
ＥＢＶの処理のための必須の標的。本発明者らのＣＲＩＳＰＲカクテル中の７つのガイドＲＮＡは、配列の３つの異なるカテゴリーを標的とし、これらはそれぞれ、ＥＢＶゲノムの構造、細胞の形質転換および感染の潜伏性にとって重要である。有効なＥＢＶの処理にとって最も必須の標的を理解するために、本発明者らは、Ｒａｊｉ細胞に、サブセットのガイドＲＮＡをトランスフェクトした。ｓｇＥＢＶ４／５は、ＥＢＶゲノムを８５％だけ低下させたが、細胞の増殖を、完全なカクテルと同じように有効に抑制することはできなかった（図１１）。構造的配列を標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＥＢＶ１／２／６）は、ＥＢＶのロードを完全には排除しない（２６％の減少）にもかかわらず、細胞の増殖を完全に止めることができた。ゲノム編集および増殖停止の高い効率を考慮すると（図２）、ｓｇＥＢＶ１／２／６における残余のＥＢＶゲノムのシグネチャーは、インタクトなゲノムではなく、ＥＢＶゲノムから消化されるに至った、遊離の浮遊ＤＮＡに起因し、すなわち、擬陽性であるだろうと本発明者らは考える。ＥＢＶを処理するためには、ＥＢＶゲノムの構造の系統的な破壊が、特定の主要なタンパク質を標的とするよりも有効であるようであると本発明者らは結論付けている。
【０１２１】
（実施例２）
図３２は、細胞３２３７を処理して、外来核酸、例として、ウイルス核酸３２５１を除去するための方法３２０１を示す。方法３２０１を使用して、造血幹細胞移植（ＨＳＣｔ）の手順を支援することができ、または方法３２０１は、対象の細胞、例として、ヒトに由来する細胞から外来核酸を除去するための調査研究および開発においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用することができる。
【０１２２】
方法３２０１は、ヌクレアーゼ３２０５およびＲＮＡ３２１３を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）３２３１を形成するステップ３２２５と、ドナーから細胞３２３７を得るステップと、細胞３２３７に、ＲＮＰ３２３１を（好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで）送達するステップ３２４５と、細胞３２３７内のウイルス核酸３２５１を、ＲＮＰ３２３１を用いて切断するステップとを含む。方法３２０１は、細胞３２３７を、患者内への移植術のために提供するステップを含むことができる。
【０１２３】
送達するステップ３２４５は、エレクトロポレーションを含むことができ、または送達するステップ３２４５のために、ＲＮＰをリポソーム中にパッケージングすることができる。一部の実施形態では、ウイルス核酸３２５１は、エピソームのウイルスゲノム、すなわち、ウイルスのエピソームまたはエピソーム性ベクターとして存在する。ＲＮＡ３２１３は、ウイルス核酸３２５１内の標的に実質的に相補的であり、好ましくは、ヒトゲノム上のいずれの場所にも実質的に相補的でない部分を有する。好ましい実施形態では、ウイルスは、ヘルペスファミリーのウイルス、例として、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルスおよびサイトメガロウイルスからなる群から選択されるウイルスである。ウイルスは、細胞中で潜伏段階にあり得る。
【０１２４】
好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ３２０５は、Ｃｒｉｓｐｅｒ関連タンパク質、例として、好ましくは、Ｃａｓ９である。ＲＮＡ３２１３は、（ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの機能を提供する）単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であり得る。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ３２０５およびＲＮＡ３２１３を、ＲＮＰ３２３１として、細胞に送達する。
【０１２５】
一部の実施形態では、患者は、ドナーと一致するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）型を有する所定の人である。患者は、ドナーである場合がある。細胞３２３７は、（例えば、ドナーの骨髄または末梢血から得られる）造血幹細胞であり得る。好ましい実施形態では、細胞３２３７は、その中にウイルス核酸３２５１を有し、方法は、ウイルス核酸を、ヌクレアーゼを使用して切断するステップをさらに含む。
【０１２６】
方法３２０１は、ドナーからの複数の細胞３２５９に、ＲＮＰ３２３１を送達するステップと、複数の細胞を培養するステップと、複数の細胞３２５９の中から、ウイルス核酸の切断成功に基づいて細胞３２３７を選択するステップとを含むことができる。細胞を選択するステップは、ヌクレアーゼと共に送達される蛍光マーカーを使用することを含むことができる。
【０１２７】
一部の実施形態では、ＲＮＰが、（例えば、プラスミドＤＮＡよりも）臨床での適用例、特に、非経口送達に好ましいことが見出され得る。ＲＮＰは、活性な、あらかじめ形成された薬物であり、ＤＮＡ（ＡＡＶ）またはｍＲＮＡと比して、利点をもたらす。細胞内で、薬物の構成成分を転写、翻訳またはアセンブルする必要がない。ＲＮＰ３２３１の送達により、薬物特性の向上、例えば、より早く出現する活性および（毒性の）クリアランスの制御をもたらすことができる。
【０１２８】
ＥＢＶ特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＲＮＰは、ＥＢＶ＋Ｂリンパ腫がん細胞を特異的に死滅させる。
【０１２９】
図３３は、ＥＢＶ特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＲＮＰが、ＥＢＶ＋Ｂリンパ腫がん細胞を特異的に死滅させることを示すための実験計画の略図である。Ｒａｊｉ細胞は、ＥＢＶ陽性である。Ｒａｊｉ細胞は、造血起源の連続的なヒト細胞株である。ＤＧ−７５細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅＣｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手可能なＥＢＶ陰性のＢリンパ球細胞株である。ＤＧ−７５は、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光マーカーを呈する。ＥＢＶ陰性細胞が蛍光マーカーを含有するので、切断成功事象を識別することができる。
【０１３０】
図３４は、処理の後の６日間のＥＢＶ＋がん細胞の生存を示す。ＲＮＰ３２３１を、エプスタイン−バーウイルスの核酸３２５１に実質的に相補的なガイドＲＮＡと共に与えたＥＢＶ＋細胞は、１０％未満の生存率を示し、一方、対照は、約６０〜７０％の生存率を示した。図３４中、ｙ軸は、「％細胞生存率」を、あたかもそのように標識されているかのように示す。
【０１３１】
図３５は、Ｃａｓ９、ｓｇＨＰＶ３、ｓｇＥＢＶ２＋６およびｓｇＥＢＶ１＋２＋６について、処理の後の第６日の各細胞集団のパーセントを示す。第６日におけるこのスナップショットから、エプスタイン−バーウイルスの核酸３２５１に実質的に相補的なガイドＲＮＡを伴うＲＮＰ３２３１を用いて処理すると、ＤＧ−７５が、培養物中でＲａｊｉ細胞に比してより多数を占めたことが示されている。
【０１３２】
図３６は、Ｃａｓ９の（０．０３および０．１ｎｇ／細胞を用いた）場合およびｓｇＥＢＶ２／６を有するＣａｓ９の（同じ用量を用いた）場合について、処理の後の３日間の（陰性対照に対して正規化した）パーセント細胞生存率を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【国際調査報告】
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