(57)【要約】  本開示は、腫瘍、自己免疫疾患又は他の疾患を治療するための療法に関する。いくつかの実施形態において、本開示は、クローン系統特異的マーカータンパク質を標的とするヒト化抗体の対象特異的選択に関し得る。
2018526034.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．クローン系統特異的マーカータンパク質（ＣＬＳＭＰ）に対する親和性を有する第１のドメイン；並びに
ｂ．ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＩＬ−２Ｒ及びＦｃ受容体からなる群から選択されるエフェクター抗原に対する親和性を有する第２のドメイン
を含むヒト化構築物。
【請求項２】
ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９７及びＦＭＣ７からなる群から選択される細胞表面抗原に対する親和性を有する第３のドメインをさらに含む、請求項１に記載のヒト化構築物。
【請求項３】
ヒト化構築物が、ヒト化抗ネオエピトープ剤（ＡＮＡ）を含む、請求項１に記載のヒト化構築物。
【請求項４】
ヒト化構築物が、ヒト化モノクローナル抗体又はその断片を含む、請求項１に記載のヒト化構築物。
【請求項５】
第１のドメインが、断片抗原結合性（ｆＡｂ）ドメイン及び一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ドメインからなる群から選択されるヒト化抗体断片を含む、請求項１に記載のヒト化構築物。
【請求項６】
ヒト化抗体断片が、複数のヒト化抗体断片を含む複合ライブラリーから選択される、請求項５に記載のヒト化構築物。
【請求項７】
ヒト化構築物がｆＡｂドメインを含み、複合ライブラリーが、ｆＡｂドメインを発現する複数のファージを含むファージミドディスプレイライブラリーを含む、請求項６に記載のヒト化構築物。
【請求項８】
ヒト化構築物がｓｃＦｖドメインを含み、複合ライブラリーが、複数のｓｃＦｖドメインを含むｓｃＦｖライブラリーを含む、請求項６に記載のヒト化構築物。
【請求項９】
ＣＬＳＭＰが、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−２、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ３−１１、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ１−３、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−４６、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ３−９、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ１−２４、ＩＧＨＶ２−５、ＩＧＨＶ２−７０、ＩＧＨＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−３０−３、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ５−１０−１、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ１−４５、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ２−２６、ＩＧＨＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−４９、ＩＧＨＶ３−５３、ＩＧＨＶ３−７２、ＩＧＨＶ３−７３、ＩＧＨＶ４−３１、ＩＧＨＶ４−３８−２、ＩＧＨＶ７−４、及びそれらの任意の遺伝子断片からなる群から選択される遺伝子に少なくとも部分的に由来する、請求項１に記載のヒト化構築物。
【請求項１０】
ＣＬＳＭＰが、遺伝子クラスから選択される遺伝子に少なくとも部分的に由来し、前記遺伝子クラスが、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６及びＩＧＨＶ７からなる群から選択される、請求項１に記載のヒト化構築物。
【請求項１１】
ＣＬＳＭＰが、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）イディオタイプを含む、請求項１に記載のヒト化構築物。
【請求項１２】
ＢＣＲイディオタイプが、ＩＧＬＶ遺伝子産物又はＩＧＫＶ遺伝子産物の少なくとも一方に関連するＩＧＨＶ遺伝子産物を含む、請求項１１に記載のヒト化構築物。
【請求項１３】
ＣＬＳＭＰが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）イディオタイプを含む、請求項１に記載のヒト化構築物。
【請求項１４】
ＣＬＳＭＰが、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原又は系統特異的タンパク質を含む、請求項１に記載のヒト化構築物。
【請求項１５】
ＣＬＳＭＰが１つ以上の細胞上に位置する、請求項１に記載のヒト化構築物。
【請求項１６】
１つ以上の細胞が腫瘍細胞を含む、請求項１５に記載のヒト化構築物。
【請求項１７】
腫瘍細胞が悪性Ｂ細胞を含む、請求項１６に記載のヒト化構築物。
【請求項１８】
悪性Ｂ細胞が、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）細胞及び濾胞性リンパ腫（ＦＬ）細胞からなる群から選択される、請求項１７に記載のヒト化構築物。
【請求項１９】
腫瘍細胞が、悪性Ｔ細胞を含む、請求項１６に記載のヒト化構築物。
【請求項２０】
悪性Ｔ細胞が、リンパ球細胞又は白血病細胞である、請求項１９に記載のヒト化構築物。
【請求項２１】
１つ以上の細胞が自己免疫疾患に対応する、請求項１５に記載のヒト化構築物。
【請求項２２】
自己免疫疾患が、Ｉ型糖尿病、シェーグレン症候群又は関節リウマチからなる群から選択される、請求項２１に記載のヒト化構築物。
【請求項２３】
複数のヒト化ポリペプチドを含むライブラリーであって、前記複数のヒト化ポリペプチドの各々が、独立して、
ａ．クローン系統特異的マーカータンパク質（ＣＬＳＭＰ）に対する親和性を有する第１のドメイン；並びに
ｂ．ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＩＬ−２Ｒ及びＦｃ受容体からなる群から選択されるエフェクター抗原に対する親和性を有する第２のドメイン
を含む、ライブラリー。
【請求項２４】
複数のヒト化ポリペプチドの各々が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９７及びＦＭＣ７からなる群から選択される細胞表面抗原に対する親和性を有する第３のドメインをさらに含む、請求項２３に記載のライブラリー。
【請求項２５】
ａ．疾患を有する対象由来の生物学的試料を得るステップであって、生物学的試料が疾患由来細胞を含むステップ；
ｂ．前記生物学的試料由来の１つ以上の核酸を配列決定し、それにより複数の配列読み取りを生成するステップ；
ｃ．前記複数の配列読み取りから、疾患由来細胞により発現されるクローン系統特異的マーカータンパク質（ＣＬＳＭＰ）に対応する配列を、コンピューターシステムを用いて決定するステップ；
ｄ．ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する抗体断片を同定するステップ；並びに
ｅ．（ｄ）において同定された抗体断片、並びにＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＩＬ−２Ｒ及びＦｃ受容体からなる群から選択されるエフェクター抗原に対する親和性を有するエフェクタードメインを含むヒト化構築物を作製するステップ
を含む方法によって調製されるヒト化構築物。
【請求項２６】
疾患が、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）及び濾胞性リンパ腫（ＦＬ）細胞からなる群から選択される、請求項２５に記載のヒト化構築物。
【請求項２７】
疾患由来細胞が、悪性Ｂ細胞を含む、請求項２６に記載のヒト化構築物。
【請求項２８】
疾患が、Ｔ細胞リンパ腫及びＴ細胞白血病からなる群から選択される、請求項２５に記載のヒト化構築物。
【請求項２９】
疾患由来細胞が、悪性Ｔ細胞を含む、請求項２８に記載のヒト化構築物。
【請求項３０】
疾患が、自己免疫疾患を含む、請求項２５に記載のヒト化構築物。
【請求項３１】
自己免疫疾患が、Ｉ型糖尿病、シェーグレン症候群又は関節リウマチからなる群から選択される、請求項３０に記載のヒト化構築物。
【請求項３２】
配列決定が次世代配列決定を含む、請求項２５に記載のヒト化構築物。
【請求項３３】
ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する抗体断片を同定するステップが、
ａ．ＣＬＳＭＰに対応する決定された配列を用いてＣＬＳＭＰをタンパク質として発現させるステップ；
ｂ．前記タンパク質又はその断片を基質上に固定化するステップ；及び
ｃ．複合ライブラリーから選択される複数のヒト化抗体断片の各々を、（ｂ）の固定化タンパク質と接触させて、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する抗体断片を同定するステップ
を含む、請求項２５に記載のヒト化構築物。
【請求項３４】
複数のヒト化抗体断片が断片抗原結合性（ｆＡｂ）ドメインを含み、複合ライブラリーが、ｆＡｂドメインを発現する複数のファージを含むファージミドディスプレイライブラリーを含む、請求項３３に記載のヒト化構築物。
【請求項３５】
複数のヒト化抗体断片が一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ドメインを含み、複合ライブラリーが、複数のｓｃＦｖドメインを含むｓｃＦｖライブラリーを含む、請求項３３に記載のヒト化構築物。
【請求項３６】
ヒト化構築物を調製することが、
ａ．（ｄ）において同定されたｆＡｂドメインを含む抗体を、ハイブリドーマを用いて生成するステップ；
ｂ．エフェクタードメインを、ｆＡｂドメインを含む抗体又はその抗体の断片にライゲートし、それによりヒト化構築物を調製するステップ
を含む、請求項２５に記載のヒト化構築物。
【請求項３７】
ｆＡｂドメインを含む抗体又はその抗体の断片に、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９７及びＦＭＣ７からなる群から選択される抗原に対する親和性を有する細胞表面抗原（ＣＳＡ）ドメインをライゲートすることをさらに含む、請求項３６に記載のヒト化構築物。
【請求項３８】
ヒト化構築物が、ヒト化抗ネオエピトープ剤（ＡＮＡ）を含む、請求項２５に記載のヒト化構築物。
【請求項３９】
ヒト化構築物が、ヒト化モノクローナル抗体又はその断片を含む、請求項２５に記載のヒト化構築物。
【請求項４０】
ＣＬＳＭＰが、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−２、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ３−１１、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ１−３、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−４６、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ３−９、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ１−２４、ＩＧＨＶ２−５、ＩＧＨＶ２−７０、ＩＧＨＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−３０−３、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ５−１０−１、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ１−４５、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ２−２６、ＩＧＨＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−４９、ＩＧＨＶ３−５３、ＩＧＨＶ３−７２、ＩＧＨＶ３−７３、ＩＧＨＶ４−３１、ＩＧＨＶ４−３８−２、ＩＧＨＶ７−４、及びそれらの任意の遺伝子断片からなる群から選択される遺伝子に少なくとも部分的に由来する、請求項２５に記載のヒト化構築物。
【請求項４１】
ＣＬＳＭＰが、遺伝子クラスから選択される遺伝子に少なくとも部分的に由来し、前記遺伝子クラスが、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６及びＩＧＨＶ７からなる群から選択される、請求項２５に記載のヒト化構築物。
【請求項４２】
ＣＬＳＭＰがＢ細胞受容体（ＢＣＲ）イディオタイプを含む、請求項２５に記載のヒト化構築物。
【請求項４３】
ＢＣＲイディオタイプが、ＩＧＬＶ遺伝子産物又はＩＧＫＶ遺伝子産物の少なくとも一方に関連するＩＧＨＶ遺伝子産物を含む、請求項４２に記載のヒト化構築物。
【請求項４４】
ＣＬＳＭＰがＴ細胞受容体（ＴＣＲ）イディオタイプを含む、請求項２５に記載のヒト化構築物。
【請求項４５】
ＣＬＳＭＰが、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原又は系統特異的タンパク質変化を含む、請求項２５に記載のヒト化構築物。
【請求項４６】
ａ．クローン系統特異的マーカータンパク質（ＣＬＳＭＰ）に対する親和性を有する第１のドメインをコードする第１の配列；並びに
ｂ．ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＩＬ−２Ｒ及びＦｃ受容体からなる群から選択されるエフェクター抗原に対する親和性を有する第２のドメインをコードする第２の配列
を含む、ヒト化構築物をコードする核酸分子。
【請求項４７】
ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９７及びＦＭＣ７からなる群から選択される細胞表面抗原に対する親和性を有する第３のドメインを含む第３の配列をさらに含む、請求項４６に記載の核酸。
【請求項４８】
ヒト化構築物が、ヒト化抗ネオエピトープ剤（ＡＮＡ）を含む、請求項４６に記載の核酸。
【請求項４９】
ヒト化構築物が、ヒト化モノクローナル抗体又はその断片を含む、請求項４６に記載の核酸。
【請求項５０】
第１のドメインが、断片抗原結合性（ｆＡｂ）ドメイン及び一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ドメインからなる群から選択されるヒト化抗体断片を含む、請求項４６に記載の核酸。
【請求項５１】
ヒト化抗体断片が、複数のヒト化抗体断片を含む複合ライブラリーから選択される、請求項５０に記載の核酸。
【請求項５２】
核酸がｆＡｂドメインを含み、複合ライブラリーが、ｆＡｂドメインを発現する複数のファージを含むファージミドディスプレイライブラリーを含む、請求項５１に記載の核酸。
【請求項５３】
核酸がｓｃＦｖドメインを含み、複合ライブラリーが、複数のｓｃＦｖドメインを含むｓｃＦｖライブラリーを含む、請求項５１に記載の核酸。
【請求項５４】
ＣＬＳＭＰが、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−２、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ３−１１、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ１−３、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−４６、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ３−９、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ１−２４、ＩＧＨＶ２−５、ＩＧＨＶ２−７０、ＩＧＨＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−３０−３、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ５−１０−１、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ１−４５、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ２−２６、ＩＧＨＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−４９、ＩＧＨＶ３−５３、ＩＧＨＶ３−７２、ＩＧＨＶ３−７３、ＩＧＨＶ４−３１、ＩＧＨＶ４−３８−２、ＩＧＨＶ７−４、及びそれらの任意の遺伝子断片からなる群から選択される遺伝子に少なくとも部分的に由来する、請求項４６に記載の核酸。
【請求項５５】
ＣＬＳＭＰが、遺伝子クラスから選択される遺伝子に少なくとも部分的に由来し、前記遺伝子クラスが、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６及びＩＧＨＶ７からなる群から選択される、請求項４６に記載の核酸。
【請求項５６】
ＣＬＳＭＰがＢ細胞受容体（ＢＣＲ）イディオタイプを含む、請求項４６に記載の核酸。
【請求項５７】
ＢＣＲイディオタイプが、ＩＧＬＶ遺伝子産物又はＩＧＫＶ遺伝子産物の少なくとも一方と関連するＩＧＨＶ遺伝子産物を含む、請求項５６に記載の核酸。
【請求項５８】
ＣＬＳＭＰがＴ細胞受容体（ＴＣＲ）イディオタイプを含む、請求項４６に記載の核酸。
【請求項５９】
ＣＬＳＭＰが、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原又は系統特異的タンパク質変化を含む、請求項４６に記載の核酸。
【請求項６０】
ＣＬＳＭＰが１つ以上の細胞上に位置する、請求項４６に記載の核酸。
【請求項６１】
１つ以上の細胞が腫瘍細胞を含む、請求項６０に記載の核酸。
【請求項６２】
腫瘍細胞が悪性Ｂ細胞を含む、請求項６１に記載の核酸。
【請求項６３】
悪性Ｂ細胞が、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）細胞及び濾胞性リンパ腫（ＦＬ）細胞からなる群から選択される、請求項６２に記載の核酸。
【請求項６４】
腫瘍細胞が悪性Ｔ細胞を含む、請求項６１に記載の核酸。
【請求項６５】
悪性Ｔ細胞がリンパ球細胞又は白血病細胞を含む、請求項６４に記載の核酸。
【請求項６６】
１つ以上の細胞が自己免疫疾患に対応する、請求項６０に記載の核酸。
【請求項６７】
自己免疫疾患が、Ｉ型糖尿病、シェーグレン症候群又は関節リウマチからなる群より選択される、請求項６６に記載の核酸。
【請求項６８】
核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）又はそのハイブリッドを含む、請求項４６に記載の核酸。
【請求項６９】
核酸がバーコード配列を含む、請求項４６に記載の核酸。
【請求項７０】
バーコード配列が、約１〜約５０ヌクレオチドを含む、請求項６９に記載の核酸。
【請求項７１】
バーコード配列が、核酸によってコードされるヒト化構築物を一意的に特定する、請求項６９に記載の核酸。
【請求項７２】
複数のヒト化ポリヌクレオチドを含むライブラリーであって、前記複数のヒト化ポリヌクレオチドの各々が、独立して、
ａ．クローン系統特異的マーカータンパク質（ＣＬＳＭＰ）に対する親和性を有する第１のドメインをコードする第１の配列；並びに
ｂ．ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＩＬ−２Ｒ及びＦｃ受容体からなる群から選択されるエフェクター抗原に対する親和性を有する第２のドメインをコードする第２の配列
を含む、ライブラリー。
【請求項７３】
複数のヒト化ポリヌクレオチドの各々が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９７及びＦＭＣ７からなる群から選択される細胞表面抗原に対する親和性を有する第３のドメインをコードする第３の配列をさらに含む、請求項７２に記載のライブラリー。
【請求項７４】
ａ．疾患を有する対象由来の生物学的試料を得るステップであって、生物学的試料が正常細胞及び潜在的な疾患由来細胞を含むステップ；
ｂ．クローン系統特異的マーカータンパク質（ＣＬＳＭＰ）を含む複数の細胞に対して前記生物学的試料を濃縮するステップ；
ｃ．前記濃縮された複数の細胞から調製される複数のアンプリコンを配列決定し、それにより第１の配列分析を生じさせるステップ；
ｄ．コンピューターを用いて、前記第１の配列分析と基準を比較するステップ；及び
ｅ．比較に基づいて、対象における疾患の治療のためにヒト化構築物を選択するステップ
を含む方法。
【請求項７５】
配列決定が、
ａ．濃縮された複数の細胞において発現されたＣＬＳＭＰに対応する複数のＲＮＡ分子について逆転写を行い、それにより複数のｃＤＮＡ分子を生成するステップ；
ｂ．（ａ）において生成された複数のｃＤＮＡ分子を増幅し、それにより複数のアンプリコンを生成するステップ；及び
ｃ．複数のアンプリコンを配列決定し、それにより複数の配列読み取りを生成するステップ
を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
配列決定が非サンガーベースの配列決定を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
類似性によって複数配列の読み取りをクラスタリングして、一連のクラスター代表配列を生成させるステップをさらに含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
比較が、
ａ．基準に対して、一連のクラスター代表配列を整列させるステップ；
ｂ．存在量によって一連のクラスター代表配列をランク付けするステップ；及び
ｃ．濃縮された複数の細胞において発現された、存在量が最も多いＣＬＳＭＰを決定するステップ
を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
基準が、対象由来の基準生物学的試料から調製された第２の複数の核酸分子を配列決定することによって生成された第２の配列分析に対応し、前記基準生物学的試料が第２の複数の細胞を含み、前記基準生物学的試料が、ＣＬＳＭＰを含む複数の細胞について濃縮されていない、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
ヒト化構築物を選択するステップが、濃縮された複数の細胞において発現された、存在量が最も多いＣＬＳＭＰに基づく、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
ヒト化構築物を選択するステップが、複数の異なるヒト化構築物を含むライブラリーをスクリーニングするステップ、及び
ａ．ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメイン；並びに
ｂ．ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＩＬ−２Ｒ及びＦｃ受容体からなる群から選択されるエフェクター抗原に対する親和性を有する第２のドメイン
を含むヒト化構築物を選択するステップ
を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項８２】
ヒト化構築物が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９７及びＦＭＣ７からなる群から選択される細胞表面抗原に対する親和性を有する第３のドメインをさらに含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
ヒト化構築物がヒト化抗ネオエピトープ剤（ＡＮＡ）を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
ヒト化構築物が、ヒト化モノクローナル抗体又はその断片を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８５】
第１のドメインが、断片抗原結合性（ｆＡｂ）ドメイン及び一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ドメインからなる群から選択されるヒト化抗体断片を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８６】
ヒト化抗体断片が、複数のヒト化抗体断片を含む複合ライブラリーから選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
方法がｆＡｂドメインを含み、複合ライブラリーが、ｆＡｂドメインを発現する複数のファージを含むファージミドディスプレイライブラリーを含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
方法がｓｃＦｖドメインを含み、複合ライブラリーが、複数のｓｃＦｖドメインを含むｓｃＦｖライブラリーを含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
ＣＬＳＭＰが、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−２、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ３−１１、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ１−３、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−４６、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ３−９、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ１−２４、ＩＧＨＶ２−５、ＩＧＨＶ２−７０、ＩＧＨＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−３０−３、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ５−１０−１、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ１−４５、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ２−２６、ＩＧＨＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−４９、ＩＧＨＶ３−５３、ＩＧＨＶ３−７２、ＩＧＨＶ３−７３、ＩＧＨＶ４−３１、ＩＧＨＶ４−３８−２、ＩＧＨＶ７−４、及びそれらの任意の遺伝子断片からなる群から選択される遺伝子に少なくとも部分的に由来する、請求項８１に記載の方法。
【請求項９０】
ＣＬＳＭＰが、遺伝子クラスから選択される遺伝子に少なくとも部分的に由来し、前記遺伝子クラスが、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６及びＩＧＨＶ７からなる群から選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項９１】
ＣＬＳＭＰが、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）イディオタイプを含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項９２】
ＢＣＲイディオタイプが、ＩＧＬＶ遺伝子産物又はＩＧＫＶ遺伝子産物の少なくとも一方に関連するＩＧＨＶ遺伝子産物を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
ＣＬＳＭＰが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）イディオタイプを含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項９４】
ＣＬＳＭＰが、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原又は系統特異的タンパク質変化を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項９５】
ＣＬＳＭＰが１つ以上の細胞上に位置する、請求項８１に記載の方法。
【請求項９６】
１つ以上の細胞が腫瘍細胞を含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
腫瘍細胞が悪性Ｂ細胞を含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
悪性Ｂ細胞が、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＢＬＢＣＬ）細胞及び濾胞性リンパ腫（ＦＬ）からなる群から選択される、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
腫瘍細胞が悪性Ｔ細胞を含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項１００】
悪性Ｔ細胞が、リンパ球細胞又は白血病細胞を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
１つ以上の細胞が自己免疫疾患に対応する、請求項９５に記載の方法。
【請求項１０２】
自己免疫疾患が、Ｉ型糖尿病、シェーグレン症候群又は関節リウマチからなる群から選択される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
選択されたヒト化構築物を対象に投与するステップをさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項１０４】
抗がん療法又は放射線療法を対象に投与するステップをさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項１０５】
ヒト化構築物を発現する遺伝子改変細胞であって、前記構築物が、
ａ．クローン系統特異的マーカータンパク質（ＣＬＳＭＰ）に対する親和性を有する第１のドメイン；並びに
ｂ．ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＩＬ−２Ｒ及びＦｃ受容体からなる群から選択されるエフェクター抗原に対する親和性を有する第２のドメイン
を含む、遺伝子改変細胞。
【請求項１０６】
ヒト化構築物が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９７及びＦＭＣ７からなる群から選択される細胞表面抗原に対する親和性を有する第３のドメインをさらに含む、請求項１０５に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１０７】
遺伝子改変細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球を含む、請求項１０５に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１０８】
ヒト化構築物がヒト化抗ネオエピトープ剤（ＡＮＡ）を含む、請求項１０５に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１０９】
ヒト化構築物がヒト化モノクローナル抗体又はその断片を含む、請求項１０５に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１１０】
第１のドメインが、断片抗原結合性（ｆＡｂ）ドメイン及び一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ドメインからなる群から選択されるヒト化抗体断片を含む、請求項１０５に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１１１】
ヒト化抗体断片が、複数のヒト化抗体断片を含む複合ライブラリーから選択される、請求項１０９に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１１２】
遺伝子改変細胞がｆＡｂドメインを含み、複合ライブラリーが、ｆＡｂドメインを発現する複数のファージを含むファージミドディスプレイライブラリーを含む、請求項１１１に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１１３】
遺伝子改変細胞がｓｃＦｖドメインを含み、複合ライブラリーが、複数のｓｃＦｖドメインを含むｓｃＦｖライブラリーを含む、請求項１１１に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１１４】
ＣＬＳＭＰが、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−２、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ３−１１、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ１−３、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−４６、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ３−９、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ１−２４、ＩＧＨＶ２−５、ＩＧＨＶ２−７０、ＩＧＨＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−３０−３、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ５−１０−１、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ１−４５、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ２−２６、ＩＧＨＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−４９、ＩＧＨＶ３−５３、ＩＧＨＶ３−７２、ＩＧＨＶ３−７３、ＩＧＨＶ４−３１、ＩＧＨＶ４−３８−２、ＩＧＨＶ７−４、及びその任意の遺伝子断片からなる群から選択される遺伝子に少なくとも部分的に由来する請求項１０５に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１１５】
ＣＬＳＭＰが、遺伝子クラスから選択される遺伝子に少なくとも部分的に由来し、前記遺伝子クラスが、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６及びＩＧＨＶ７からなる群から選択される、請求項１０５に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１１６】
ＣＬＳＭＰがＢ細胞受容体（ＢＣＲ）イディオタイプを含む、請求項１０５に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１１７】
ＢＣＲイディオタイプが、ＩＧＬＶ遺伝子産物又はＩＧＫＶ遺伝子産物の少なくとも一方に関連するＩＧＨＶ遺伝子産物を含む、請求項１１６に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１１８】
ＣＬＳＭＰが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）イディオタイプを含む、請求項１０５に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１１９】
ＣＬＳＭＰが、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原又は系統特異的タンパク質変化を含む、請求項１０５に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１２０】
ＣＬＳＭＰが１つ以上の細胞上に位置する、請求項１０５に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１２１】
１つ以上の細胞が腫瘍細胞を含む、請求項１２０に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１２２】
腫瘍細胞が悪性Ｂ細胞を含む、請求項１２１に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１２３】
悪性Ｂ細胞が、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＢＬＢＣＬ）細胞及び濾胞性リンパ腫（ＦＬ）細胞からなる群から選択される、請求項１２２に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１２４】
腫瘍細胞が悪性Ｔ細胞を含む、請求項１２１に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１２５】
悪性Ｔ細胞が、リンパ球細胞又は白血病細胞を含む、請求項１２４に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１２６】
１つ以上の細胞が、自己免疫疾患に対応する、請求項１２０に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１２７】
自己免疫疾患が、Ｉ型糖尿病、シェーグレン症候群又は関節リウマチからなる群から選択される、請求項１２６に記載の遺伝子改変細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、仮特許出願ではなく、２０１５年９月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／２１６，９９２号（代理人整理番号４８８６５−７０１．１０１）の利益を主張し、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
がん治療におけるヒト化腫瘍標的分子の使用は、近年顕著な成功を収めている。特に、抗体ベースの療法は、悪性血液疾患及び腫瘍を有する患者を治療するための重要な戦略であることが判明している。しかしながら、現在の治療法はまた、広範囲の正常細胞（例えば、患者のＢリンパ球）に対して免疫反応を誘発し、重篤な副作用をもたらすこともある。したがって、標的選択性（例えば、がん細胞を選択的に標的とする能力）が増大したがん治療薬について、即座の臨床的必要性が存在する。本開示は、従来の療法の限界を克服する、より安全であり、毒性が小さい組成物及びがん治療のための方法を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本開示は、組成物及び方法を提供する。いくつかの態様において、本開示はヒト化構築物を提供する。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は第１のドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、クローン系統特異的マーカータンパク質（ＣＬＳＭＰ）に対する親和性を有する第１のドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は第２のドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、エフェクター抗原に対する親和性を有する第２のドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、エフェクター抗原は、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＩＬ−２Ｒ又はＦｃ受容体であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は第３のドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、細胞表面抗原に対する親和性を有する第３のドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、細胞表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９７及びＦＭＣ７であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ヒト化抗ネオエピトープ剤（ＡＮＡ）を含み得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ヒト化モノクローナル抗体又はその断片を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は第１のドメインを含むことができ、第１のドメインは、断片抗原結合（ｆＡｂ）ドメイン及び一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ドメインからなる群から選択されるヒト化抗体断片を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物はヒト化抗体断片を含むことができ、ヒト化抗体断片は、複数のヒト化抗体断片を含む複合ライブラリーから選択される。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物はｆＡｂドメインを含むことができ、複合ライブラリーは、ｆＡｂドメインを発現する複数のファージを含むファージミドディスプレイライブラリーを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物はｓｃＦｖドメインを含むことができ、複合ライブラリーは、複数のｓｃＦｖドメインを含むｓｃＦｖライブラリーを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、クローン系統特異的マーカータンパク質（ＣＬＳＭＰ）に対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは、遺伝子から少なくとも部分的に由来し得、遺伝子は、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−２、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ３−１１、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ１−３、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−４６、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ３−９、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ１−２４、ＩＧＨＶ２−５、ＩＧＨＶ２−７０、ＩＧＨＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−３０−３、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ５−１０−１、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ１−４５、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ２−２６、ＩＧＨＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−４９、ＩＧＨＶ３−５３、ＩＧＨＶ３−７２、ＩＧＨＶ３−７３、ＩＧＨＶ４−３１、ＩＧＨＶ４−３８−２、ＩＧＨＶ７−４、又はそれらの任意の遺伝子断片であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは、遺伝子クラスから選択される遺伝子に少なくとも部分的に由来する。いくつかの実施形態において、遺伝子クラスは、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６又はＩＧＨＶ７であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）イディオタイプを含むことができる。いくつかの実施形態において、ＣＬＳＭＰはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）イディオタイプを含むことができ、ＢＣＲイディオタイプは、ＩＧＬＶ遺伝子産物又はＩＧＫＶ遺伝子産物の少なくとも一方に関連するＩＧＨＶ遺伝子産物を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）イディオタイプに対応する。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原又は系統特異的タンパク質変化を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは１つ以上の細胞上に位置する。いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞が腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞が腫瘍細胞を含み、腫瘍細胞が悪性Ｂ細胞を含む。いくつかの実施形態において、悪性Ｂ細胞は、リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）細胞又は濾胞性リンパ腫（ＦＬ）細胞であり得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞が腫瘍細胞を含み、腫瘍細胞は悪性Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態において、悪性Ｔ細胞はリンパ球性細胞又は白血病細胞を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞は自己免疫疾患に対応し得る。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は、Ｉ型糖尿病、シェーグレン症候群又は関節リウマチであり得る。
【０００４】
いくつかの態様において、本開示は、複数のヒト化ポリペプチドを含むライブラリーを提供する。いくつかの実施形態において、複数のヒト化ポリペプチドの各々は、独立して第１のドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、第１のドメインは、クローン系統特異的マーカータンパク質（ＣＬＳＭＰ）に対する親和性を有することができる。いくつかの実施形態において、複数のヒト化ポリペプチドの各々は、独立して第２のドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、第２のドメインは、エフェクター抗原に対する親和性を有することができる。いくつかの実施形態において、エフェクター抗原は、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＩＬ−２Ｒ又はＦｃ受容体であり得る。いくつかの実施形態において、複数のヒト化ポリペプチドの各々は、第３のドメインをさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、第３のドメインは、細胞表面抗原に対する親和性を有することができる。いくつかの実施形態において、細胞表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９７又はＦＭＣ７であり得る。
【０００５】
いくつかの態様において、本開示は、疾患を有する対象由来の生物学的試料を得ることを含む方法によって調製されるヒト化構築物を提供する。いくつかの実施形態において、生物学的試料は疾患由来細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、本開示は、生物学的試料の１つ以上の核酸を配列決定し、それにより複数の配列読み取りを生成することを含む方法により調製されるヒト化構築物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、クローン系統特異的マーカータンパク質（ＣＬＳＭＰ）に対応する配列を決定することを含む方法によって調製されるヒト化構築物を提供する。いくつかの実施形態において、決定するステップは、コンピューターシステムを使用して行われてもよい。いくつかの実施形態において、ＣＬＳＭＰは、疾患由来細胞によって発現され得る。いくつかの実施形態において、決定は、複数の配列読み取りを使用して行うことができる。いくつかの実施形態において、本開示は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する抗体断片を同定することを含む方法によって調製されるヒト化構築物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、同定された抗体断片及びエフェクター抗原に対する親和性を有するエフェクタードメインを含むヒト化構築物を作製することを含む方法によって調製されるヒト化構築物を提供する。いくつかの実施形態において、エフェクター抗原は、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＩＬ−２Ｒ又はＦｃ受容体であり得る。いくつかの実施形態において、対象は疾患を有することができ、疾患は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）又は濾胞性リンパ腫（ＦＬ）細胞であり得る。いくつかの実施形態において、疾患由来細胞は、悪性Ｂ細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、対象は疾患を有することができ、疾患はＴ細胞リンパ腫又はＴ細胞白血病であり得る。いくつかの実施形態において、疾患由来細胞は悪性Ｔ細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、対象は疾患を有することができ、疾患は自己免疫疾患であり得る。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は、Ｉ型糖尿病、シェーグレン症候群又は関節リウマチであり得る。いくつかの実施形態において、配列決定は次世代配列決定を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する抗体断片を同定することは、ＣＬＳＭＰに対応する決定された配列を用いてタンパク質としてＣＬＳＭＰを発現させることを含み得る。いくつかの実施形態において、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する抗体断片を同定することは、タンパク質又はその断片を基質上に固定化することを含むことができる。いくつかの実施形態において、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する抗体断片を同定することは、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する抗体断片を同定するために、複合ライブラリーから選択された複数のヒト化抗体断片のそれぞれを固定化タンパク質に接触させることを含むことができる。いくつかの実施形態において、複数のヒト化抗体断片は、断片抗原結合（ｆＡｂ）ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、複合ライブラリーは、ｆＡｂドメインを発現する複数のファージを含むファージミドディスプレイライブラリーを含むことができる。いくつかの実施形態において、複数のヒト化抗体断片は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、複合ライブラリーは、複数のｓｃＦｖドメインを含むｓｃＦｖライブラリーを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物を調製することは、ハイブリドーマを用いて、同定されたｆＡｂドメインを含む抗体を生成することを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物を調製することは、エフェクタードメインを、ｆＡｂドメインを含む抗体又はその抗体の断片にライゲートし、それによりヒト化構築物を調製することを含み得る。いくつかの実施形態において、本開示は、方法によって調製されるヒト化構築物を提供し、この方法は、ｆＡｂドメインを含む抗体又はその抗体の断片に、細胞表面抗原（ＣＳＡ）ドメインをライゲートすることを含み得る。いくつかの実施形態において、ＣＳＡドメインは抗原に対する親和性を有することができ、抗原は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９７又はＦＭＣ７であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ヒト化抗ネオエピトープ剤（ＡＮＡ）を含み得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ヒト化モノクローナル抗体又はその断片を含み得る。いくつかの実施形態において、ＣＬＳＭＰは、遺伝子に少なくとも部分的に由来し得る。いくつかの実施例において、遺伝子は、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−２、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ３−１１、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ１−３、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−４６、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ３−９、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ１−２４、ＩＧＨＶ２−５、ＩＧＨＶ２−７０、ＩＧＨＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−３０−３、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ５−１０−１、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ１−４５、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ２−２６、ＩＧＨＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−４９、ＩＧＨＶ３−５３、ＩＧＨＶ３−７２、ＩＧＨＶ３−７３、ＩＧＨＶ４−３１、ＩＧＨＶ４−３８−２、ＩＧＨＶ７−４、又はそれらの任意の遺伝子断片であり得る。いくつかの実施形態において、ＣＬＳＭＰは、遺伝子クラスから選択される遺伝子に少なくとも部分的に由来し得る。いくつかの実施形態において、遺伝子クラスは、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６又はＩＧＨＶ７であり得る。いくつかの実施形態において、ＣＬＳＭＰは、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）イディオタイプを含み得る。いくつかの実施形態において、ＢＣＲイディオタイプは、ＩＧＬＶ遺伝子産物又はＩＧＫＶ遺伝子産物の少なくとも一方に関連するＩＧＨＶ遺伝子産物を含み得る。いくつかの実施形態において、ＣＬＳＭＰは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）イディオタイプを含み得る。いくつかの実施形態において、ＣＬＳＭＰは、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原又は系統特異的タンパク質変化を含み得る。
【０００６】
いくつかの態様において、本開示は、ヒト化構築物をコードする核酸分子を提供する。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物をコードする核酸分子は、第１の配列を含み得る。いくつかの実施形態において、第１の配列は第１のドメインをコードし得る。いくつかの実施形態において、第１のドメインは、クローン系統特異的マーカータンパク質（ＣＬＳＭＰ）に対する親和性を有することができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物をコードする核酸分子は、第２の配列を含み得る。いくつかの実施形態において、第２の配列は第２のドメインをコードし得る。いくつかの実施形態において、第２のドメインは、エフェクター抗原に対する親和性を有することができる。いくつかの実施形態において、エフェクター抗原は、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＩＬ−２Ｒ又はＦｃ受容体であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物をコードする核酸分子は、第３の配列を含み得る。いくつかの実施形態において、第３の配列は、細胞表面抗原に対する親和性を有する第３のドメインをコードすることができる。いくつかの実施形態において、細胞表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９７又はＦＭＣ７であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物はヒト化抗ネオエピトープ剤（ＡＮＡ）を含み得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ヒト化モノクローナル抗体又はその断片を含み得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は第１のドメインを含むことができ、第１のドメインは、断片抗原結合（ｆＡｂ）ドメイン及び一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ドメインからなる群から選択されるヒト化抗体断片を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物はヒト化抗体断片を含むことができ、ヒト化抗体断片は、複数のヒト化抗体断片を含む複合ライブラリーから選択される。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物はｆＡｂドメインを含むことができ、複合ライブラリーは、ｆＡｂドメインを発現する複数のファージを含むファージミドディスプレイライブラリーを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物はｓｃＦｖドメインを含むことができ、複合ライブラリーは、複数のｓｃＦｖドメインを含むｓｃＦｖライブラリーを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、クローン系統特異的マーカータンパク質（ＣＬＳＭＰ）に対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは、遺伝子に少なくとも部分的に由来し得、遺伝子は、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−２、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ３−１１、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ１−３、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−４６、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ３−９、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ１−２４、ＩＧＨＶ２−５、ＩＧＨＶ２−７０、ＩＧＨＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−３０−３、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ５−１０−１、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ１−４５、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ２−２６、ＩＧＨＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−４９、ＩＧＨＶ３−５３、ＩＧＨＶ３−７２、ＩＧＨＶ３−７３、ＩＧＨＶ４−３１、ＩＧＨＶ４−３８−２、ＩＧＨＶ７−４、又はそれらの任意の遺伝子断片であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは、遺伝子クラスから選択される遺伝子に少なくとも部分的に由来する。いくつかの実施形態において、遺伝子クラスは、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６又はＩＧＨＶ７であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）イディオタイプを含むことができる。いくつかの実施形態において、ＣＬＳＭＰは、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）イディオタイプを含むことができ、ＢＣＲイディオタイプは、ＩＧＬＶ遺伝子産物又はＩＧＫＶ遺伝子産物の少なくとも一方に関連するＩＧＨＶ遺伝子産物を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）イディオタイプに対応する。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原又は系統特異的タンパク質変化を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは１つ以上の細胞上に位置する。いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞は腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞は腫瘍細胞を含み、腫瘍細胞は悪性Ｂ細胞を含む。いくつかの実施形態において、悪性Ｂ細胞は、リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）細胞又は濾胞性リンパ腫（ＦＬ）細胞であり得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞は腫瘍細胞を含み、腫瘍細胞は悪性Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態において、悪性Ｔ細胞は、リンパ球性細胞又は白血病細胞を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞は自己免疫疾患に対応し得る。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は、Ｉ型糖尿病、シェーグレン症候群又は関節リウマチであり得る。いくつかの実施形態において、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）又はそのハイブリッドを含むことができる。いくつかの実施形態において、核酸はバーコード配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、バーコード配列は、約１−約５０ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、バーコード配列は、核酸によってコードされるヒト化構築物を固有に同定することができる。
【０００７】
いくつかの態様において、本開示は、複数のヒト化ポリヌクレオチドを含むライブラリーを提供する。いくつかの実施形態において、複数のヒト化ポリヌクレオチドの各々は、独立して第１の配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、第１の配列は、クローン系統特異的マーカータンパク質（ＣＬＳＭＰ）に対する親和性を有する第１のドメインをコードすることができる。いくつかの実施形態において、複数のヒト化ポリヌクレオチドの各々は、独立して第２の配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、第２の配列は、エフェクター抗原に対する親和性を有する第２のドメインをコードすることができる。いくつかの実施形態において、エフェクター抗原は、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＩＬ−２Ｒ又はＦｃ受容体であり得る。いくつかの実施形態において、複数のヒト化ポリヌクレオチドの各々は、第３の配列をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、第３の配列は、細胞表面抗原に対する親和性を有する第３のドメインをコードすることができる。いくつかの実施形態において、細胞表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９７又はＦＭＣ７であり得る。
【０００８】
いくつかの態様において、本開示は、疾患を有する対象から、正常細胞及び潜在的に疾患由来細胞を含む生物学的試料を得ることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、クローン系統特異的マーカータンパク質（ＣＬＳＭＰ）を含む複数の細胞について生物学的試料を濃縮することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、濃縮された複数の細胞から調製される複数のアンプリコンを配列決定し、それにより第１の配列分析を生成することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、コンピューターを用いて、第１の配列分析を参照と比較することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、比較に基づいて対象における疾患の治療のためのヒト化構築物を選択することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、配列決定は、濃縮された複数の細胞において発現されたＣＬＳＭＰに対応する複数のＲＮＡ分子に対して逆転写を行い、それにより複数のｃＤＮＡ分子を生成することを含むことができる。いくつかの実施形態において、配列決定は、複数のｃＤＮＡ分子を増幅し、それにより複数のアンプリコンを生成することを含むことができる。いくつかの実施形態において、配列決定は、複数のアンプリコンを配列決定し、それにより複数の配列読み取りを生成することを含むことができる。いくつかの実施形態において、配列決定は、非サンガーベースの配列決定を含み得る。いくつかの実施形態において、配列決定は、複数の配列読み取りを類似性によってクラスタリングし、一連のクラスター代表配列を生成することを含むことができる。いくつかの実施形態において、比較は、一連のクラスター代表配列を参照に整列させることを含み得る。いくつかの実施形態において、比較は、一連のクラスター代表配列を存在量によってランク付けすることを含むことができる。いくつかの実施形態において、比較は、濃縮された複数の細胞において発現される最も豊富なＣＬＳＭＰを決定することを含むことができる。いくつかの実施形態において、参照は、対象からの参照生物学的試料から調製される第２の複数の核酸分子を配列決定することによって生成される第２の配列分析に対応し得、ここで、参照生物学的試料は第２の複数の細胞を含み得、参照生物学的試料は、ＣＬＳＭＰを含む複数の細胞について濃縮されない。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物の選択は、濃縮された複数の細胞において発現される最も豊富なＣＬＳＭＰに基づくことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物を選択することは、複数の異なるヒト化構築物を含むライブラリーをスクリーニングすること、及びヒト化構築物を選択することを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、エフェクター抗原に対する親和性を有する第２のドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、エフェクター抗原は、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＩＬ−２Ｒ又はＦｃ受容体であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物はさらに第３のドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、第３のドメインは、細胞表面抗原に対する親和性を有することができる。いくつかの実施形態において、細胞表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９７又はＦＭＣ７であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ヒト化抗ネオエピトープ剤（ＡＮＡ）を含み得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ヒト化モノクローナル抗体又はその断片を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は第１のドメインを含むことができ、第１のドメインは、断片抗原結合（ｆＡｂ）ドメイン及び一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ドメインからなる群から選択されるヒト化抗体断片を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物はヒト化抗体断片を含み得、ヒト化抗体断片は複数のヒト化抗体断片を含む複合ライブラリーから選択される。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ｆＡｂドメインを含み得、複合ライブラリーは、ｆＡｂドメインを発現する複数のファージを含むファージミドディスプレイライブラリーを含み得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物はｓｃＦｖドメインを含むことができ、複合ライブラリーは複数のｓｃＦｖドメインを含むｓｃＦｖライブラリーを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、クローン系統特異的マーカータンパク質（ＣＬＳＭＰ）に対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは、遺伝子に少なくとも部分的に由来し得、遺伝子は、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−２、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ３−１１、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ１−３、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−４６、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ３−９、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ１−２４、ＩＧＨＶ２−５、ＩＧＨＶ２−７０、ＩＧＨＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−３０−３、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ５−１０−１、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ１−４５、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ２−２６、ＩＧＨＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−４９、ＩＧＨＶ３−５３、ＩＧＨＶ３−７２、ＩＧＨＶ３−７３、ＩＧＨＶ４−３１、ＩＧＨＶ４−３８−２、ＩＧＨＶ７−４、又はそれらの任意の遺伝子断片であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは、遺伝子クラスから選択される遺伝子に少なくとも部分的に由来する。いくつかの実施形態において、遺伝子クラスは、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６又はＩＧＨＶ７であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）イディオタイプを含むことができる。いくつかの実施形態において、ＣＬＳＭＰは、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）イディオタイプを含むことができ、ＢＣＲイディオタイプは、ＩＧＬＶ遺伝子産物又はＩＧＫＶ遺伝子産物の少なくとも一方に関連するＩＧＨＶ遺伝子産物を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）イディオタイプに対応する。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原又は系統特異的タンパク質変化を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは１つ以上の細胞上に位置する。いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞は腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞は腫瘍細胞を含み、腫瘍細胞は悪性Ｂ細胞を含む。いくつかの実施形態において、悪性Ｂ細胞は、リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）細胞又は濾胞性リンパ腫（ＦＬ）細胞であり得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞は腫瘍細胞を含み、腫瘍細胞は悪性Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態において、悪性Ｔ細胞はリンパ球性細胞又は白血病細胞を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞は、自己免疫疾患に対応し得る。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は、Ｉ型糖尿病、シェーグレン症候群又は関節リウマチであり得る。いくつかの実施形態において、本方法は、選択されたヒト化構築物を対象に投与することをさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、本方法は、抗がん療法又は放射線療法を対象に投与することをさらに含むことができる。
【０００９】
いくつかの態様において、本開示は、ヒト化構築物を発現する遺伝子改変細胞を提供する。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、第１のドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、第１のドメインは、クローン系統特異的マーカータンパク質（ＣＬＳＭＰ）に対する親和性を有することができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は第２のドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、第２のドメインは、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＩＬ−２Ｒ又はＦｃ受容体からなる群から選択されるエフェクター抗原に対する親和性を有することができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、第３のドメインをさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、第３のドメインは、細胞表面抗原に対する親和性を有することができる。いくつかの実施形態において、細胞表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９７又はＦＭＣ７であり得る。いくつかの実施形態において、遺伝子改変細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ヒト化抗ネオエピトープ剤（ＡＮＡ）を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ヒト化モノクローナル抗体又はその断片を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は第１のドメインを含むことができ、第１のドメインは、断片抗原結合（ｆＡｂ）ドメイン及び一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ドメインからなる群から選択されるヒト化抗体断片を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物はヒト化抗体断片を含むことができ、ヒト化抗体断片は、複数のヒト化抗体断片を含む複合ライブラリーから選択される。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ｆＡｂドメインを含むことができ、複合ライブラリーは、複数のファージ発現ｆＡｂドメインを含むファージミドディスプレイライブラリーを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物はｓｃＦｖドメインを含むことができ、複合ライブラリーは、複数のｓｃＦｖドメインを含むｓｃＦｖライブラリーを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、クローン系統特異的マーカータンパク質（ＣＬＳＭＰ）に対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは、遺伝子に少なくとも部分的に由来し得、遺伝子は、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−２、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ３−１１、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ１−３、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−４６、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ３−９、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ１−２４、ＩＧＨＶ２−５、ＩＧＨＶ２−７０、ＩＧＨＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−３０−３、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ５−１０−１、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ１−４５、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ２−２６、ＩＧＨＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−４９、ＩＧＨＶ３−５３、ＩＧＨＶ３−７２、ＩＧＨＶ３−７３、ＩＧＨＶ４−３１、ＩＧＨＶ４−３８−２、ＩＧＨＶ７−４、又はそれらの任意の遺伝子断片であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは、遺伝子クラスから選択される遺伝子に少なくとも部分的に由来する。いくつかの実施形態において、遺伝子クラスは、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６又はＩＧＨＶ７であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）イディオタイプを含むことができる。いくつかの実施形態において、ＣＬＳＭＰはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）イディオタイプを含むことができ、ＢＣＲイディオタイプは、ＩＧＬＶ遺伝子産物又はＩＧＫＶ遺伝子産物の少なくとも一方に関連するＩＧＨＶ遺伝子産物を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）イディオタイプに対応する。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原又は系統特異的タンパク質変化を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは１つ以上の細胞上に位置する。いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞は腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞は腫瘍細胞を含み、腫瘍細胞は悪性Ｂ細胞を含む。いくつかの実施形態において、悪性Ｂ細胞は、リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）細胞又は濾胞性リンパ腫（ＦＬ）細胞であり得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞は腫瘍細胞を含み、腫瘍細胞は悪性Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態において、悪性Ｔ細胞は、リンパ球性細胞又は白血病細胞を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞は自己免疫疾患に対応し得る。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は、Ｉ型糖尿病、シェーグレン症候群又は関節リウマチであり得る。
【００１０】
いくつかの態様において、本開示は、医薬として使用するためのヒト化構築物を提供する。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、第１のドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、クローン系統特異的マーカータンパク質（ＣＬＳＭＰ）に対する親和性を有する第１のドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は第２のドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、エフェクター抗原に対する親和性を有する第２のドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、エフェクター抗原は、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＩＬ−２Ｒ又はＦｃ受容体であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は第３のドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、細胞表面抗原に対する親和性を有する第３のドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、細胞表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９７及びＦＭＣ７であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ヒト化抗ネオエピトープ剤（ＡＮＡ）を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ヒト化モノクローナル抗体又はその断片を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は第１のドメインを含むことができ、第１のドメインは、断片抗原結合（ｆＡｂ）ドメイン及び一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ドメインからなる群から選択されるヒト化抗体断片を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物はヒト化抗体断片を含むことができ、ヒト化抗体断片は、複数のヒト化抗体断片を含む複合ライブラリーから選択される。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ｆＡｂドメインを含むことができ、複合ライブラリーは、ｆＡｂドメインを発現する複数のファージを含むファージミドディスプレイライブラリーを含み得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物はｓｃＦｖドメインを含むことができ、複合ライブラリーは、複数のｓｃＦｖドメインを含むｓｃＦｖライブラリーを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、クローン系統特異的マーカータンパク質（ＣＬＳＭＰ）に対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは、遺伝子に少なくとも部分的に由来することができ、遺伝子は、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−２、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ３−１１、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ１−３、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−４６、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ３−９、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ１−２４、ＩＧＨＶ２−５、ＩＧＨＶ２−７０、ＩＧＨＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−３０−３、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ５−１０−１、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ１−４５、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ２−２６、ＩＧＨＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−４９、ＩＧＨＶ３−５３、ＩＧＨＶ３−７２、ＩＧＨＶ３−７３、ＩＧＨＶ４−３１、ＩＧＨＶ４−３８−２、ＩＧＨＶ７−４、又はそれらの任意の遺伝子断片であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは、遺伝子クラスから選択される遺伝子に少なくとも部分的に由来する。いくつかの実施形態において、遺伝子クラスは、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６又はＩＧＨＶ７であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）イディオタイプを含むことができる。いくつかの実施形態において、ＣＬＳＭＰはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）イディオタイプを含むことができ、ＢＣＲイディオタイプは、ＩＧＬＶ遺伝子産物又はＩＧＫＶ遺伝子産物の少なくとも一方に関連するＩＧＨＶ遺伝子産物を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）イディオタイプに対応する。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原又は系統特異的タンパク質変化を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは１つ以上の細胞上に位置する。いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞は腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞は腫瘍細胞を含み、腫瘍細胞は悪性Ｂ細胞を含む。いくつかの実施形態において、悪性Ｂ細胞は、リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）細胞又は濾胞性リンパ腫（ＦＬ）細胞であり得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞は腫瘍細胞を含み、腫瘍細胞は悪性Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態において、悪性Ｔ細胞は、リンパ球性細胞又は白血病細胞を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞は、自己免疫疾患に対応し得る。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は、Ｉ型糖尿病、シェーグレン症候群又は関節リウマチであり得る。
【００１１】
いくつかの態様において、本開示は、医薬品の製造におけるヒト化構築物の使用を提供する。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、第１のドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、クローン系統特異的マーカータンパク質（ＣＬＳＭＰ）に対する親和性を有する第１のドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は第２のドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、エフェクター抗原に対する親和性を有する第２のドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、エフェクター抗原は、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＩＬ−２Ｒ又はＦｃ受容体であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は第３のドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、細胞表面抗原に対する親和性を有する第３のドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、細胞表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９７及びＦＭＣ７であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ヒト化抗ネオエピトープ剤（ＡＮＡ）を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ヒト化モノクローナル抗体又はその断片を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は第１のドメインを含むことができ、第１のドメインは断片抗原結合（ｆＡｂ）ドメイン及び一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ドメインからなる群から選択されるヒト化抗体断片を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物はヒト化抗体断片を含むことができ、ヒト化抗体断片は、複数のヒト化抗体断片を含む複合ライブラリーから選択される。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ｆＡｂドメインを含むことができ、複合ライブラリーは、ｆＡｂドメインを発現する複数のファージを含むファージミドディスプレイライブラリーを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物はｓｃＦｖドメインを含むことができ、複合ライブラリーは、複数のｓｃＦｖドメインを含むｓｃＦｖライブラリーを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、クローン系統特異的マーカータンパク質（ＣＬＳＭＰ）に対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは、遺伝子に少なくとも部分的に由来することができ、遺伝子は、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−２、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ３−１１、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ１−３、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−４６、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ３−９、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ１−２４、ＩＧＨＶ２−５、ＩＧＨＶ２−７０、ＩＧＨＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−３０−３、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ５−１０−１、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ１−４５、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ２−２６、ＩＧＨＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−４９、ＩＧＨＶ３−５３、ＩＧＨＶ３−７２、ＩＧＨＶ３−７３、ＩＧＨＶ４−３１、ＩＧＨＶ４−３８−２、ＩＧＨＶ７−４、又はそれらの任意の遺伝子断片であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは、遺伝子クラスから選択される遺伝子に少なくとも部分的に由来する。いくつかの実施形態において、遺伝子クラスは、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６又はＩＧＨＶ７であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）イディオタイプを含むことができる。いくつかの実施形態において、ＣＬＳＭＰはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）イディオタイプを含むことができ、ＢＣＲイディオタイプは、ＩＧＬＶ遺伝子産物又はＩＧＫＶ遺伝子産物の少なくとも一方に関連するＩＧＨＶ遺伝子産物を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）イディオタイプに対応する。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原又は系統特異的タンパク質変化を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヒト化構築物は、ＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメインを含むことができ、ＣＬＳＭＰは１つ以上の細胞上に位置する。いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞は腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞は腫瘍細胞を含み、腫瘍細胞は悪性Ｂ細胞を含む。いくつかの実施形態において、悪性Ｂ細胞は、リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）細胞又は濾胞性リンパ腫（ＦＬ）細胞であり得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞は腫瘍細胞を含み、腫瘍細胞は悪性Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態において、悪性Ｔ細胞は、リンパ球性細胞又は白血病細胞を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞は、自己免疫疾患に対応し得る。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は、Ｉ型糖尿病、シェーグレン症候群又は関節リウマチであり得る。
【００１２】
参照による組込み
本明細書において言及される全ての刊行物、特許又は特許出願は、各々の個々の刊行物、特許又は特許出願が、具体的に及び個別に、参照により組み込まれることが示されているかのように同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【００１３】
本開示の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に記載されている。本開示の特徴及び利点のより良い理解は、本開示の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明及び以下の添付の図面を参照することによって得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）イディオタイプの概要を示す図である。
【図２】Ｂ細胞新生物の病因を示す図である。
【図３】突然変異していない慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）における最も一般的なＩＧＨＶクラスを示す図である。
【図４】突然変異していない慢性リンパ球白血病（ＣＬＬ）におけるＩＧＨＶクラスの適用範囲を示す図である。
【図５】本明細書に開示される組成物及び方法のための適切な標的であり得るＩＧＨＶ遺伝子にわたる保存された構造的「モチーフ」を示す図である。
【図６】突然変異した及び突然変異していない慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）間のＩＧＨＶクラスの比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において提供される組成物及び方法は、一般的に、がん及び自己免疫疾患の治療に適したヒト化抗体療法に関する。組成物及び方法は、がん及び自己免疫疾患の治療のためのヒト化抗体療法の対象特異的選択をさらに提供する。いくつかの態様において、ヒト化抗体は、ＣＬＳＭＰを含有する細胞上のクローン系統特異的マーカータンパク質（ＣＬＳＭＰ）に選択的に結合する第１のドメイン、及びエフェクター抗原を含有する細胞上のエフェクター抗原に選択的に結合する第２のドメインを含む。いくつかの場合において、エフェクター抗原を含有する細胞はＣＬＳＭＰを含有する細胞と同じ細胞であり、一方、他の場合において、エフェクター抗原を含有する細胞及びＣＬＳＭＰを含有する細胞は異なる細胞である。任意選択的に、ヒト化抗体は、ＣＬＳＭＰを含有する細胞上の細胞表面抗原に選択的に結合する第３のドメインを含む。
【００１６】
定義
用語「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、物の文法的対象の１つ又は１を超える（すなわち、少なくとも１つ）を指すことができる。例として、「１つの要素」は、１つの要素又は１を超える要素を指すことができる。
【００１７】
本明細書で使用するとき、用語「約」とは、当業者に知られている又は知ることができる状況に応じて、プラス又はマイナス１％未満又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０％又は３０％を超えることを意味し得る。
【００１８】
本明細書で使用するとき、「治療する」、「治療すること」又は「治療」とは、疾患又は状態の治療の成功又は改善の兆しを指す。例えば、「治療する」、「治療すること」又は「治療」とは、疾患もしくは状態の１つ以上の症状の重篤度を軽減、遅延もしくは緩和することを指すことができ、疾患の症状、欠陥、障害もしくは有害な状態などが対象により経験される頻度の減少を含むことができ、及び／又は疾患もしくは状態の完全な予防が含まれ得る。本明細書で使用するとき、用語「予防する」又は「予防すること」とは、対象における疾患又は状態、例えば腫瘍形成の予防を指すことができる。例えば、腫瘍又は他の形態のがんを発症する危険性がある対象が本開示の方法を用いて治療され、後に腫瘍又は他の形態のがんを発症しない場合、その対象において、疾患は少なくとも一定の期間にわたって予防されている。
【００１９】
本明細書で使用するとき、用語「治療的に有効な」とは、組成物が投与される対象に対して、有益な効果を提供する又は他には有害であり有益でない事象を減少させるのに十分な組成物又はその活性な成分の量を指すことができる。用語「治療的に有効な」とは、１つ以上の所望の又は望ましい（例えば、有益な）効果を生じさせる投薬量を指すことができ、ここで、投薬量は、所与の期間にわたって１回以上投与され得る。正確な投薬量は、治療の目的に依存し、当業者は、公知の技術を用いて決定することができる。
【００２０】
本明細書で使用するとき、「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質」又は「ＴＦＰ」は、一般的に、ｉ）標的細胞上の表面抗原に結合することができ、ｉｉ）典型的にはＴ細胞の表面中又は表面上に同時に位置する場合、無傷のＴＣＲ複合体の他のポリペプチド成分と相互作用することができる、ＴＣＲを含む様々なポリペプチドに由来する組換えポリペプチドを指すことができる。本明細書で使用するとき、「Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）融合タンパク質」又は「ＢＦＰ」は、一般的に、ｉ）標的細胞上の表面抗原に結合することができ、ｉｉ）典型的にはＢ細胞の表面中又は表面上に同時に位置する場合、無傷のＢＣＲ複合体の他のポリペプチド成分と相互作用することができる、ＢＣＲを含む様々なポリペプチドに由来する組換えポリペプチドを指すことができる。いくつかの態様において、ＴＦＰ又はＢＦＰは抗体結合ドメイン（例えば、パラトープ）を含み得る。いくつかの態様において、ＴＦＰ又はＢＦＰは抗体を含み得る。いくつかの態様において、ＴＦＰ又はＢＦＰはヒト化抗体を含み得る。一例において、ＢＦＰは、クローン系統特異的マーカータンパク質に選択的に結合する第１のドメイン、及びエフェクタータンパク質に選択的に結合する第２のドメインを含む１つ以上のポリペプチド鎖（例えば、重鎖及び／又は軽鎖）を含むことができる。別の例において、ＢＦＰは、クローン系統特異的マーカータンパク質に選択的に結合する第１のドメイン、エフェクタータンパク質に選択的に結合する第２のドメイン、及び細胞表面抗原に選択的に結合する第３のドメインを含む１つ以上のポリペプチド鎖（例えば、重鎖及び／又は軽鎖）を含むことができる。
【００２１】
本明細書で使用するとき、用語「ＣＤ５」、「ＣＤ１９」、「ＣＤ２２」、「ＣＤ２３」及び「ＦＭＣ７」とは、正常Ｂ細胞、未成熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、胚中心Ｂ細胞、記憶Ｂ細胞、Ｂ細胞白血病前駆細胞、慢性リンパ球性白血病細胞及び／又は悪性Ｂ細胞において検出可能な遺伝子及び／又は遺伝子産物（例えば、抗原決定基）を指すことができる。ヒト及びマウスのアミノ酸配列及び核酸配列は、公開データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ及び／又はＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）において見出すことができる。例えば、ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ１５３９１として見出すことができ、ヒトＣＤ１９をコードするヌクレオチド配列はアクセッション番号ＮＭ００１１７８０９８に見出すことができる。ＣＤ１９は、例えば、ＡＬＬ、ＣＬＬ及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）のようなほとんどのＢ系統がん上に発現する。ＣＤ１９を発現する他の細胞は、「ＣＤ１９の発現に関連する疾患」の定義において、以下に提供される。これはまた、正常Ｂ細胞前駆体の初期マーカーである。一例において、ＴＦＰの抗原結合部分は、悪性及び正常なＢ細胞上に発現されるようなＣＤ１９タンパク質の細胞外ドメイン内のエピトープを認識し、結合する。いくつかの態様において、本開示は、「＋」又は「−」が続く用語を含むことができる。「＋」記号は、化合物、遺伝子及び／又は遺伝子産物の存在を示すために使用され得る（例えば、ＣＤ５＋は、例えば慢性リンパ球性白血病細胞の免疫表現型において、ＣＤ５遺伝子及び／又は遺伝子産物の存在を示すことができる）。「−」記号は、化合物、遺伝子及び／又は遺伝子産物の非存在を示すために使用することができる（例えば、ＣＤ２２−は、例えば慢性リンパ球性白血病細胞の免疫表現型において、ＣＤ２２遺伝子及び／又は遺伝子産物の非存在を示すことができる）。
【００２２】
用語「構築物」とは、本明細書で使用するとき、一般的に、１つ以上の結合ドメイン（例えば、第１のドメイン、第２のドメイン、第３のドメイン、親和性ドメイン、エフェクタードメイン及び／又は細胞表面抗原ドメイン）を含むタンパク質、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを指すことができる。いくつかの例において、２つ以上の結合ドメインはポリヌクレオチド又はポリペプチドによって結合され得る。いくつかの例において、２つ以上の結合ドメインは、静電力（例えば、共有結合又は非共有結合）によって結合され得る。いくつかの例において、構築物はＴＦＰであり得る。いくつかの例において、構築物はＢＦＰであり得る。いくつかの例において、構築物は抗体であり得る。用語「抗体」とは、本明細書で使用するとき、抗原に特異的に結合するタンパク質、又は免疫グロブリン分子に由来するポリペプチド配列を指すことができる。抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル起源の無傷な免疫グロブリン又はそれらの断片であり得、天然由来又は組換え供給源由来であり得る。用語「抗体断片」、「抗体結合ドメイン」とは、抗原結合ドメイン又はパラトープ（例えば、抗原及びその画定されたエピトープのような標的への抗体断片の認識及び特異的結合を付与するのに十分である、無傷の抗体の抗原決定可変領域）を含有する、抗体の少なくとも一部分又はその組換え変異体を指すことができる。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片、一本鎖（ｓｃ）Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）抗体断片、線状抗体、ｓｄＡｂ（ＶＬ又はＶＨのいずれか）のような単一ドメイン抗体、ラクダＶＨＨドメイン、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体などが含まれる。用語「ｓｃＦｖ」とは、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片、及び重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片を含む融合タンパク質を指すことができ、ここで、軽鎖及び重鎖可変領域は、短い可動性ポリペプチドリンカーを介して、隣接して連結され、単一のポリペプチド鎖として発現することができ、ここで、ｓｃＦｖは、それが由来する無傷の抗体の特異性を保持する。抗体に関する「重鎖可変領域」又は「ＶＨ」は、フレームワーク領域として知られている隣接ストレッチ間に挿入された３つのＣＤＲを含有する重鎖の断片を指すことができ、これらのフレームワーク領域は、一般的に、ＣＤＲよりも高度に保存され、ＣＤＲを支持するために足場を形成する。特定されない限り、本明細書で使用するとき、ｓｃＦｖは、例えば、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に関していずれかの順序でＶＬ及びＶＨ可変領域を有し得、ｓｃＦｖはＶＬ−リンカー−ＶＨを含み得る又はＶＨ−リンカー−ＶＬを含み得る。いくつかの例において、本明細書に開示されている構築物又は抗体は、ヒト化され得る。用語「ヒト化」とは、一般的に、その配列が改変されて、ヒトにおいて対応するポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列との類似性が増加されているポリヌクレオチド又はポリペプチドを記載するために使用され得る。いくつかの例において、本開示の構築物又は抗体は、２つ以上の結合ドメイン（例えば、第１の結合ドメイン、第２のドメイン、第３のドメイン、親和性ドメイン、エフェクタードメイン及び／又は細胞表面抗原ドメイン）を含み得る。当業者は、結合ドメインが単一のエピトープ／抗原に特異的であり得る又は複数のエピトープ／抗原（例えば、二重特異性結合ドメイン）に結合し得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態において、２つ以上のドメイン（例えば、第１の抗原に対する親和性を有する第１のドメイン及び第２の抗原に対する親和性を有する第２のドメイン）は、第１の抗原と第２の抗原の両方に対する親和性を有する構築物上の単一の結合ドメイン又は抗体を指すことができる。いくつかの例において、本開示のドメイン（例えば、第１の結合ドメイン、第２のドメイン、第３のドメイン、親和性ドメイン、エフェクタードメイン及び／又は細胞表面抗原ドメイン）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又は１０を超える抗原又はエピトープに対して親和性を有することができる。
【００２３】
抗体又はその抗体断片を含むＴＦＰ又はＢＦＰの部分は様々な形態で存在することができ、この場合、抗原結合ドメインは、例えば、単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）、マウス由来の一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体又はヒト抗体を含む、連続ポリペプチド鎖の一部として発現される。一態様において、ＴＦＰ又はＢＦＰの抗原結合ドメインは抗体断片を含む。さらなる態様において、ＴＦＰ又はＢＦＰは、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂを含む抗体断片を含むことができる。
【００２４】
用語「抗体重鎖」は、天然に存在する立体構造である抗体分子中に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうちより大きなものであって、抗体が属するクラスを通常決定するものを指すことができる。用語「抗体軽鎖」とは、天然に存在する立体構造である抗体分子中に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうちより小さなものを指すことができる。カッパ（「κ」）及びラムダ（「λ」）軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指すことができる。
【００２５】
用語「組換え抗体」とは、例えば、バクテリオファージ又は酵母の発現系によって発現される抗体のような組換えＤＮＡ技術を用いて生成される抗体を指すことができる。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成された抗体であって、ＤＮＡ分子が、抗体タンパク質、又は抗体を特定するアミノ酸配列を発現する抗体を意味することが理解される必要があり、ここで、ＤＮＡ配列又はアミノ酸配列は、入手可能であり、当該技術分野において周知である組換えＤＮＡ配列又はアミノ酸配列技術を用いて得られた。
【００２６】
用語「抗原」又は「Ａｇ」とは、抗体によって特異的に結合することができる又は他には免疫応答を引き起こす分子を指すことができる。この免疫応答は、抗体産生もしくは特異的な免疫学的にコンピテントな細胞の活性化のいずれか又はその両方を伴うことができる。当業者は、タンパク質又はペプチドのような任意の巨大分子が抗原として機能し得ることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換えＤＮＡ又はゲノムＤＮＡから誘導され得る。当業者は、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列又は部分ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、したがって「抗原」なる用語が本明細書において使用される場合には「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要がないことを理解するであろう。本開示は、限定されないが、１を超える遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を含み、これらのヌクレオチド配列は、所望の免疫応答を誘発するポリペプチドをコードする種々の組合せで配置されることを容易に明らかとなる。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原は、生成され、合成され得、又は生物学的試料から誘導され得、又はポリペプチド以外の巨大分子であり得ることは容易に明らかとなる。このような生物学的試料には、限定されないが、組織試料、腫瘍試料、細胞又は他の生物学的成分を含む流体を含み得る。
【００２７】
用語「抗腫瘍効果」とは、様々な手段によって現れ得る生物学的効果を指すことができ、例えば、限定されないが、腫瘍容積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均寿命の増加、腫瘍細胞増殖の減少、腫瘍細胞生存の減少、又はがん性状態に関連する様々な生理学的症状の改善が挙げられる。「抗腫瘍効果」はまた、最初に腫瘍の発生を予防する上で本開示のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞及び抗体の能力によって現れ得る。
【００２８】
用語「自己」とは、後に対象に再導入されるのと同じ対象に由来の任意の物質を指すことができる。
【００２９】
用語「同種異系」とは、同種の異なる動物に由来する、又は物質が導入される対象と異なる対象に由来する任意の物質を指すことができる。２つ以上の対象は、１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、互いに同種異系であると言われる。いくつかの態様において、同種の対象由来の同種異系物質は、抗原的に相互作用するには遺伝子的に十分に相違し得る。
【００３０】
用語「異種」とは、異なる種の動物に由来する移植片を指すことができる。
【００３１】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、キメラ性免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそれらの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合性サブ配列など）であり、非ヒト免疫グロブリン由来の最少量の配列を含有する。多くの部分について、ヒト化抗体及びそれらの抗体断片はヒトの免疫グロブリン（レシピエント抗体又は抗体断片）であり、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有する、例えば、マウス、ラット又はウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換される。いくつか例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体／抗体断片は、レシピエント抗体にも、インポートされたＣＤＲ及びフレームワーク配列にも見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体又は抗体断片の性能をさらに精緻化及び最適化することができる。一般的に、ヒト化抗体又はその抗体断片は、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全て又は大部分がヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域に対応する、少なくとも１つの、典型的には２つの、可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体又は抗体断片はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含むことができる。
【００３２】
「ヒト」又は「完全ヒト」とは、分子全体がヒト起源である又は抗体もしくは免疫グロブリンのヒト形態と同一のアミノ酸配列からなる抗体又は抗体断片のような免疫グロブリンを意味することができる。
【００３３】
用語「がん」とは、異常細胞の急速であり、制御されない増殖を特徴とする疾患を指し得る。がん細胞は、局所的に又は血流及びリンパ系を介して体の他の部分に広がることができる。種々のがんの例は本明細書に記載され、限定されないが、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、血液のがん、骨がん、脳腫瘍、乳がん、心血管系のがん、子宮頸がん、結腸がん、消化器系のがん、内分泌系のがん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、胆嚢がん、胃腸腫瘍、腎臓がん、喉頭がん、白血病、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、中皮腫、筋肉系のがん、骨髄異形成症候群、骨髄腫、鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経系のがん、リンパ系のがん、口腔がん、口腔咽頭がん、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、生殖器系のがん、呼吸器系のがん、肉腫、唾液腺がん、骨格系がん、皮膚がん、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、腫瘍、泌尿器系のがん、子宮がん、膣がん又は外陰がんが挙げられる。用語「リンパ腫」とは、Ｂ細胞リンパ腫（例えば、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、周縁部Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、毛様細胞白血病もしくは原発性中枢神経系リンパ腫）又はＴ細胞リンパ腫（例えば、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫もしくは末梢Ｔ細胞リンパ腫）を含む任意のタイプのリンパ腫を指すことができる。用語「白血病」とは、急性白血病又は慢性白血病を含む任意のタイプの白血病を指すことができる。白血病のタイプには、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、急性未分化白血病又は慢性リンパ球性白血病が含まれる。
【００３４】
いくつかの態様において、疾患（例えば、がん）は、ＣＤ１９の発現に「関連」し得る。ＣＤ１９の発現に関連する疾患又はＣＤ１９を発現する細胞に関連する状態には、例えば、がんもしくは悪性腫瘍のような増殖性疾患、又は骨髄異形成症、骨髄異形成症候群もしくは前白血病のような前がん状態；あるいはＣＤ１９を発現する細胞に関連する非がん関連徴候が含まれ得る。一態様において、ＣＤ１９の発現に関連するがんは血液がんである。一態様において、血液がんは白血病又はリンパ腫である。一態様において、ＣＤ１９の発現に関連するがんには、限定されないが、例えばＢ細胞ＡＬＬ、Ｔ細胞急性リンパ球性白血病（ＴＡＬＬ）に限定されずに含む１つ以上の急性白血病、例えばＣＬＬ又は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）に限定されずに含む１つ以上の慢性白血病を例えば含むがん及び悪性腫瘍が含まれる。ＣＤ１９の発現に関連するさらなるがん又は血液学的状態には、限定されないが、例えば、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞又は大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレーム・マクログロブリン血症、並びに骨髄の血液細胞の非効率的な産生（又は異形成）によって結びついた血液学的状態の多様な集合である「前白血病」などが含まれる。ＣＤ１９発現の発現に関連するさらなる疾患には、限定されないが、ＣＤ１９の発現に関連する非定型及び／又は非古典的ながん、悪性疾患、前がん状態又は増殖性疾患が挙げられる。ＣＤ１９の発現に関連する非がん関連徴候には、限定されないが、例えば、自己免疫疾患（例えば、狼瘡、慢性関節リウマチ、大腸炎）、炎症性障害（アレルギー及び喘息）、及び移植が挙げられる。
【００３５】
用語「刺激」とは、刺激ドメイン又は刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）とその同族リガンドの結合によって誘導される一次応答を指すことができ、それにより、限定されないが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体によるシグナル伝達のようなシグナル伝達事象を媒介する。刺激は、特定の分子の変化した発現及び／又は細胞骨格構造の再編成などを媒介することができる。
【００３６】
用語「刺激分子」又は「刺激ドメイン」とは、細胞シグナル伝達経路の少なくともいくつかの態様について刺激様式で受容体複合体（例えば、ＢＣＲ又はＴＣＲ）の一次活性化を調節する一次細胞質シグナル伝達配列（複数可）を提供する細胞（例えば、Ｂ細胞又はＴ細胞）によって発現される分子又はその部分を意味することができる。一例において、一次シグナルは、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の、ペプチドを負荷したＭＨＣ分子との結合によって開始することができ、これは、限定されないが、増殖、活性化、分化などを含むＴ細胞応答の媒介をもたらす。刺激様式で作用する主要な一次細胞質シグナル伝達配列（「一次シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又は「ＩＴ  ＡＭ」として知られているシグナル伝達モチーフを含有することができる。一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴ  ＡＭの例は、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」としても知られている）及びＣＤ６６ｄに由来する配列を含むことができる。
【００３７】
用語「抗原提示細胞」又は「ＡＰＣ」とは、アクセサリー細胞の表面上に主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と複合体化した外来抗原を提示するアクセサリー細胞（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞など）のような免疫系細胞を指すことができる。Ｂ細胞は、それらのＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を用いてこれらの複合体を認識することができる。Ｔ細胞は、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いてこれらの複合体を認識することができる。
【００３８】
用語「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の同種結合パートナーを指すことができ、それによりＴ細胞による共刺激応答、例えば、限定されないが、増殖を媒介する。共刺激分子は、効率的な免疫応答のために必要とされる抗原受容体又はそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子には、限定されないが、ＭＨＣクラス１分子、ＢＴＬＡ及びＴｏｌｌリガンド受容体、並びにＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）が含まれる。共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激分子は、以下のタンパク質ファミリー：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）及び活性化Ｋ細胞受容体において表すことができる。このような分子の例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが含まれる。細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の完全な細胞内部分、もしくは完全な天然細胞内シグナル伝達ドメイン、又はその機能的断片を含むことができる。用語「４−１ＢＢ」とは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ６２４７８．２として提供されるアミノ酸配列、又は非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などに由来する同等の残基を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーを指すことができる；「４−１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸残基２１４−２５５又は非ヒト種（例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿など）に由来する同等の残基として定義される。
【００３９】
用語「コードする」とは、ヌクレオチドの画定された配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）又はアミノ酸の画定された配列のいずれか及びそれに起因する生物学的特性を有する、生物学的プロセス中の他のポリマー及び巨大分子を合成するための鋳型として機能する遺伝子、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡのようなポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指すことができる。したがって、遺伝子、ｃＤＮＡ又はＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が、細胞又は他の生物学的系においてタンパク質を生成する場合、タンパク質をコードする。コーディング鎖、そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に提供されるもの、及び遺伝子又はｃＤＮＡを転写するための鋳型として使用される非コーディング鎖はともに、タンパク質又はその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産物をコードすると称することができる。
【００４０】
他に特定しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮重したバージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質又はＲＮＡをコードするフレーズヌクレオチド配列はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列がいくつかのバージョンにおいて１つ以上のイントロンを含み得る程度までイントロンを含み得る。
【００４１】
用語「内在性」とは、生物、細胞、組織もしくは系由来である、又はその中で生成される任意の物質を意味することができる。
【００４２】
用語「外因性」とは、生物、細胞、組織もしくは系から導入される、又はその外部で生成される任意の材料を指すことができる。
【００４３】
用語「発現」とは、プロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を指すことができる。
【００４４】
用語「移入ベクター」とは、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用され得る事項の構成を指すことができる。多数のベクターは、当該技術分野において公知であり、限定されないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド及びウイルスが挙げられる。したがって、用語「移入ベクター」は、自律的に複製するプラスミド又はウイルスを含む。この用語はまた、例えばポリリジン化合物、リポソームなどのような、細胞内への核酸の移入を容易にする非プラスミド及び非ウイルス化合物をさらに含むと解釈する必要がある。ウイルス移入ベクターの例には、限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが含まれる。
【００４５】
用語「発現ベクター」とは、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現調節配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指すことができる。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用性エレメントを含み；発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって又はインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込む、コスミド、プラスミド（例えば、裸の又はリポソームに含まれる）及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）を含む、当該技術分野において公知のもの全てが含まれる。
【００４６】
用語「レンチウイルス」とは、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）科の属を意味することができる。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという点で、レトロウイルスの中で固有である；それらは、宿主細胞のＤＮＡに有意な量の遺伝情報を送達することができるため、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ及びＦＩＶは全てレンチウイルスの例である。
【００４７】
用語「レンチウイルスベクター」とは、自己不活性化レンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指すことができる。臨床において使用され得るレンチウイルスベクターの他の非限定的な例としては、ＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子送達技術（Ｏｘｆｏｒｄ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａ）、ＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクターシステム（Ｌｅｎｔｉｇｅｎ）などが挙げられる。非臨床型のレンチウイルスベクターもまた利用可能であり、当業者に公知である。
【００４８】
用語「相同」又は「同一性」とは、２つのポリマー分子間、例えば、２つのＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子のような２つの核酸分子間、又は２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列同一性を意味することができる。２つの分子の両方におけるサブユニット位置が同じモノマーサブユニットによって占有される場合、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々の位置がアデニンによって占有されている場合、それらはその位置で相同である又は同一である。２つの配列間の相同性は、一致する又は相同な位置の数に対応する；例えば、２つの配列における位置の半分（例えば、長さが１０サブユニットのポリマー中の５つの位置）が相同である場合、２つの配列は５０％相同であり；位置の９０％（例えば、１０のうちの９）が一致する又は相同である場合、２つの配列は９０％相同である。
【００４９】
用語「単離された」とは、天然状態から変化した又は取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物において天然に存在する核酸又はペプチドは「単離されて」いないが、その自然状態の共存する物質から部分的又は完全に分離された同じ核酸又はペプチドは「単離されている」。単離された核酸又はタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得る又は非天然環境、例えば宿主細胞中に存在し得る。
【００５０】
本開示の文脈において、一般的に生じる核酸塩基に関する以下の略語が使用される。「Ａ」はアデノシンを指すことができ、「Ｃ」はシトシンを指すことができ、「Ｇ」はグアノシンを指すことができ、「Ｔ」はチミジンを指すことができ、「Ｕ」はウリジンを指すことができる。
【００５１】
用語「作動可能に連結された」又は「転写制御」とは、異種核酸配列の発現をもたらす、調節配列と異種核酸配列の間の機能的連結を指すことができる。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたＤＮＡ配列は、互いに連続していてもよく、例えば、２つのタンパク質コード領域を連結するのに必要な場合、同じリーディングフレームにある。
【００５２】
用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」とは、一本鎖又は二本鎖形態のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）及びそれらのポリマーを指すことができる。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸を包含する。他に明記しない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ及び相補的配列並びに明示的に示される配列を暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（又は全ての）コドンの第３の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成され得る。
【００５３】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基を含む化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質又はペプチドの配列を構成することができるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに接続された２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を含む。本明細書で使用するとき、この用語は、当該技術分野において一般にペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーも指す短い鎖と、多くのタイプがあるタンパク質として一般に指すより長い鎖の両方を指すことができる。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド又はそれらの組合せを含む。
【００５４】
用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始させるのに必要とされる、細胞の転写機構又は導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を意味することができる。
【００５５】
用語「プロモーター／調節配列」とは、プロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を指すことができる。いくつかの例において、この配列はコアプロモーター配列であってもよく、他の場合において、この配列はまたエンハンサー配列、及び遺伝子産物の発現に必要な他の調節エレメントを含み得る。プロモーター／調節配列は、例えば、組織特異的様式で遺伝子産物を発現するものであり得る。
【００５６】
用語「構成的」プロモーターとは、遺伝子産物をコードする又は特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合、細胞の大部分又は全ての生理学的条件下で遺伝子産物を細胞中で産生させるヌクレオチド配列を指すことができる。
【００５７】
用語「誘導性」プロモーターとは、遺伝子産物をコードする又は特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合、実質的に、プロモーターに対応する誘導物質が細胞内に存在する場合にのみ、遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列を指すことができる。
【００５８】
用語「組織特異的」プロモーターとは、遺伝子にコードされる又は遺伝子によって特定されるポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合、実質的に、細胞がプロモーターに対応する組織タイプの細胞である場合にのみ、遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列を指すことができる。
【００５９】
用語「リンカー」及び「可動性ポリペプチドリンカー」とは、ｓｃＦｖの文脈において使用されるとき、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域をともに連結するために、単独で又は組み合わせて使用されるグリシン及び／又はセリン残基のようなアミノ酸からなるペプチドリンカーを指すことができる。一実施形態において、可動性ポリペプチドリンカーはＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎを含み、ここで、ｎは１に等しい又は１を超える正の整数である。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５、ｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９、ｎ＝１０である。一実施形態において、可動性ポリペプチドリンカーは、限定されないが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４又は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含む。別の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）、（ＧｌｙＳｅｒ）又は（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）の複数の反復を含む。また、本開示の範囲には、国際公開第ＷＯ２０１２／１３８４７５号に記載されるリンカーが含まれる。
【００６０】
本明細書で使用するとき、５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ  ７−メチルグアノシンキャップ又はＲＮＡ  ｍ７Ｇキャップとも呼ばれる）は、転写の開始直後に真核生物メッセンジャーＲＮＡの「先頭」すなわち５’末端に付加された修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、最初に転写されたヌクレオチドに連結された末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識及びＲＮａｓｅからの保護にとって重要である。キャップ付加は転写と結びつき、共転写的に起こり、したがって各々が他方に影響を及ぼす。転写の開始直後に、合成されるｍＲＮＡの５’末端は、ＲＮＡポリメラーゼに関連するキャップ合成複合体によって結合される。この酵素複合体は、ｍＲＮＡキャッピングに必要とされる化学反応を触媒する。合成は、多段階生化学反応として進行する。キャッピング部分は、その安定性又は翻訳の効率のようなｍＲＮＡの機能性を調節するように修飾され得る。
【００６１】
本明細書で使用するとき、「インビトロで転写されたＲＮＡ」は、インビトロで合成されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを指すことができる。一般的に、インビトロで転写されたＲＮＡは、インビトロ転写ベクターから生成される。インビトロ転写ベクターは、インビトロで転写されたＲＮＡを生成するために使用される鋳型を含む。
【００６２】
本明細書で使用するとき、「ポリ（Ａ）」は、ポリアデニル化によってｍＲＮＡに結合した一連のアデノシンである。一過性発現のための構築物の好ましい実施形態において、ポリＡは、５０−５０００個、好ましくは６４個超、より好ましくは１００個超、最も好ましくは３００個又は４００個超である。ポリ（Ａ）配列は、局在、安定性又は翻訳の効率のようなｍＲＮＡ機能性を調節するために、化学的に又は酵素的に修飾され得る。
【００６３】
本明細書で使用するとき、「ポリアデニル化」とは、ポリアデニリル部分又はその修飾された変異体のメッセンジャーＲＮＡ分子への共有結合を指すことができる。真核生物において、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子は、３’末端でポリアデニル化されている。３’ポリ（Ａ）尾部は、ポリアデニル酸ポリメラーゼである酵素の作用によりプレ−ｍＲＮＡに付加されるアデニンヌクレオチド（しばしば数百個）の長い配列である。高等真核生物において、ポリ（Ａ）尾部は、ポリアデニル化シグナルである特定の配列を含有する転写物に付加される。ポリ（Ａ）尾部及びそれに結合したタンパク質は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼによる分解から保護する助けとなる。ポリアデニル化はまた、転写終結、核からのｍＲＮＡのエクスポート及び翻訳にとって重要である。ポリアデニル化は、ＤＮＡのＲＮＡへの転写の直後に核内で起こるが、さらに細胞質中で後にも起こりうる。転写が終了した後、ｍＲＮＡ鎖はＲＮＡポリメラーゼに関連するエンドヌクレアーゼ複合体の作用により切断される。切断部位は、通常、切断部位近傍の塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在によって特徴付けられる。ｍＲＮＡが切断された後、アデノシン残基が切断部位の遊離３’末端に付加される。
【００６４】
本明細書で使用するとき、「一過性」とは、数時間、数日又は数週間の期間の組み込まれていない導入遺伝子の発現を指すことができ、ここで、発現の期間は、宿主中でゲノムに組み込まれている又は安定なプラスミドレプリコン内に含有されている場合の遺伝子の発現の期間よりも短い。
【００６５】
用語「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす様々なシグナル伝達分子間の生化学的関係を指すことができる。語句「細胞表面受容体」は、シグナルを受け取り、細胞の膜を横切ってシグナルを伝達することができる分子及び分子の複合体を含む。
【００６６】
用語「実質的に精製された」細胞とは、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指すことができる。実質的に精製された細胞はまた、天然に存在する状態で通常会合している他の細胞型から分離された細胞を指すことができる。いくつかの例において、実質的に精製された細胞の集団は、細胞の均質な集団を指すことができる。他の場合において、この用語は、それらが自然状態で自然に会合している細胞から分離された細胞を単に指すことができる。いくつかの態様において、細胞はインビトロで培養される。他の態様において、細胞はインビトロで培養されない。
【００６７】
抗体の多様性、イディオタイプ免疫グロブリン、Ｂ細胞多様性及びＢ細胞悪性腫瘍
ヒトにおいて、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）によって生成される幅広い抗体のレパートリーは、複数の別個の免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）及び軽鎖遺伝子のクラスターから各１つの再構成及び超突然変異から生じる。全ての成熟免疫グロブリンにおいて、可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）及び連結（Ｊ）遺伝子ファミリーの中から各１つの遺伝子が無作為に組み合わせられ、トリミングされ、その後、超突然変異されて、高度に無作為的な相補性決定領域（ＣＤＲ）を確実にする。したがって、ＣＤＲ３は、ＩｇＨ可変ドメインの最も多様なセグメントである。
【００６８】
Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病におけるイディオタイプ免疫グロブリン
慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ；ＣＬＬ）は、モノクローナルＢリンパ球の急速に進行する蓄積によって特徴付けられるヒト悪性腫瘍であり、特徴的な免疫表現型を有する。通常、ＣＤ５＋ＣＤ２３＋ＣＤ１９＋ＣＤ２２−ＦＭＣ７＋として示され、これらの細胞はまた、通常、抗アポトーシスＢｃｌ−２マーカー及び表面免疫グロブリン（ｓＩｇ；Ｉｇ；Ｉｄ）を過剰発現する。これらの表面免疫グロブリン（クローン特異的であり、イディオタイプタンパク質と呼ばれる）は性質上クローンであり、表面発現では、通常ＩｇＤ及びＩｇＭアイソタイプである。
【００６９】
ＩｇＨ重鎖（ＶＨ）のＶドメインのＣＤＲ３は、免疫グロブリン結合多様性において中心的な役割を果たす。Ｂ細胞発生に固有のＶＤＪ組換え及び体細胞超突然変異プロセスの蓄積された効果により、２つの独立した（正常な）Ｂ細胞クローンが同一のＶＨ  ＣＤＲ３を有する通常の確立をほとんど無視することができる。
【００７０】
正常Ｂ細胞と同様に、Ｂ−ＣＬＬにおける組換えＩＧＨＶ遺伝子は、体細胞超突然変異を受け、生殖系列ＩＧＨＶ遺伝子からの発散の程度は、臨床経過が異なる疾患の以下の２つの別個のサブタイプを広く定義する：無痛経過を経る突然変異したＩＧＨＶ（生殖細胞系ＩＧＨＶ遺伝子に対して＜９８％の相同性）及びより急速な経過を経る突然変異していないＩＧＨＶ  ＣＬＬ。
【００７１】
ヒト化抗体は、限定されないが、ＣＤＲ移植、ベニアリング又はリサーフェシング、及び鎖シャッフリングを含む当該技術分野において公知である様々な技術を用いて生成することができる。フレームワーク領域のフレームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換されて、抗原結合を変更、例えば改善する。これらのフレームワーク置換は、当該技術分野で周知の方法によって、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲ及びフレームワーク残基の相互作用のモデリング、及び特定の位置での異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される。
【００７２】
ヒト化抗体又は抗体断片は、非ヒトである供給源からの、その中に留まる１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトのアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と呼ばれ、典型的には「インポート」可変ドメインから取り出される。本明細書において提供されるように、ヒト化抗体又は抗体断片は、非ヒト免疫グロブリン分子由来の１つ以上のＣＤＲ及びフレームワーク領域を含み、ここで、フレームワークを含むアミノ酸残基は完全に又は大部分がヒト生殖系列由来である。抗体又は抗体断片のヒト化のための複数の技術は当該技術分野において周知であり、例えば、げっ歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列と置換すること（例えば、ＣＤＲ移植）によって実施することができる。このようなヒト化抗体及び抗体断片において、無傷なヒト可変ドメインより実質的に少ないドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。ヒト化抗体は、しばしば、いくつかのＣＤＲ残基及び可能であればいくつかのフレームワーク（ＦＲ）残基が、げっ歯類抗体の類似部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。抗体及び抗体断片のヒト化はまた、ベニアリング又はリサーフェシング又は鎖シャッフリングによって達成することができる。
【００７３】
ヒト化抗体を作製する際に使用される軽鎖と重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるためである。いわゆる「最良適合」方法によれば、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列は、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングされる。次に、げっ歯類の配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れられる。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用することができる。いくつかの実施形態において、重鎖可変領域のフレームワーク領域、例えば４つ全てのフレームワーク領域は、ＶＨ４−４−５９生殖系列配列に由来する。一実施形態において、フレームワーク領域は、１、２、３、４又は５つの修飾、例えば対応するマウス配列のアミノ酸からの、例えば置換を含むことができる。一実施形態において、フレームワーク領域、例えば軽鎖可変領域の４つ全てのフレームワーク領域は、ＶＫ３−−１．２５生殖系列配列に由来する。一実施形態において、フレームワーク領域は、１、２、３、４又は５つの修飾、例えば対応するマウス配列のアミノ酸からの、例えば置換を含むことができる。
【００７４】
いくつかの態様において、抗体又はその断片を含むＢＦＰ又はＴＦＰの部分はヒト化され、標的抗原に対する高親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持する。本開示の一態様によれば、ヒト化抗体及び抗体断片は、親配列及びヒト化配列の３次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的にヒト化された産物の分析プロセスによって調製される。３次元免疫グロブリンモデルは、一般的に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能性のある３次元立体構造を図示し、表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示の検査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、例えば、候補免疫グロブリンが標的抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、標的抗原に対する増加した親和性のような所望の抗体又は抗体断片の特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント配列及びインポート配列から選択及び組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、抗原結合における影響に直接的及び最も実質的に関与する。
【００７５】
ＩＧＨＶ＊標的化モノクローナル抗体
ＩＧＨＶ１−６９遺伝子は、図３に示されるように、他のＩＧＨＶ＊遺伝子を有する突然変異していないＣＬＬ症例の約２０−３０％によって発現される。突然変異していないＣＬＬ症例においてよくみられる他のＩＧＨＶを表す遺伝子には、ＩＧＨＶ１−２（９．２２％）、ＩＧＨＶ３−３０（４．２６％）、ＩＧＨＶ３−４８（４．９６％）（突然変異していないＩＧＨＶのパーセント）などが含まれる。本開示の一態様において、これらの変異体に対する特定のヒト化モノクローナル抗体のパネル（二重特異性又は三重特異性ｍＡｂドメインを有する及び／又は有しない）を製造することができ、続いて、対象由来の生物学的試料は、予め製造された抗体パネルの中でどの抗体が対象に投与するために選択され得るかを決定するために配列決定を行うことができる。急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）又は急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）を治療するために同様のアプローチを用いることができる。
【００７６】
本開示のヒト化抗体を用いて標的化され得るＩＧＨＶ遺伝子の非限定的な例には、ＩＧＨＶ１−１８＊０１、ＩＧＨＶ１−１８＊０２、ＩＧＨＶ１−１８＊０３、ＩＧＨＶ１−２＊０１、ＩＧＨＶ１−２＊０２、ＩＧＨＶ１−２＊０３、ＩＧＨＶ１−２＊０４、ＩＧＨＶ１−２＊０５、ＩＧＨＶ１−２４＊０１、ＩＧＨＶ１−３＊０１、ＩＧＨＶ１−３＊０２、ＩＧＨＶ１−４５＊０１、ＩＧＨＶ１−４５＊０２、ＩＧＨＶ１−４５＊０３、ＩＧＨＶ１−４６＊０１、ＩＧＨＶ１−４６＊０２、ＩＧＨＶ１−４６＊０３、ＩＧＨＶ１−５８＊０１、ＩＧＨＶ１−５８＊０２、ＩＧＨＶ１−６９＊０１、ＩＧＨＶ１−６９＊０２、ＩＧＨＶ１−６９＊０３、ＩＧＨＶ１−６９＊０４、ＩＧＨＶ１−６９＊０５、ＩＧＨＶ１−６９＊０６、ＩＧＨＶ１−６９＊０７、ＩＧＨＶ１−６９＊０８、ＩＧＨＶ１−６９＊０９、ＩＧＨＶ１−６９＊１０、ＩＧＨＶ１−６９＊１１、ＩＧＨＶ１−６９＊１２、ＩＧＨＶ１−６９＊１３、ＩＧＨＶ１−８＊０１、ＩＧＨＶ１−８＊０２、ＩＧＨＶ１−ｃ＊０１、ＩＧＨＶ１−ｆ＊０１、ＩＧＨＶ１−ｆ＊０２、ＩＧＨＶ１／ＯＲ１５−１＊０１、ＩＧＨＶ１／ＯＲ１５−１＊０２、ＩＧＨＶ１／ＯＲ１５−１＊０３、ＩＧＨＶ１／ＯＲ１５−１＊０４、ＩＧＨＶ１／ＯＲ１５−５＊０１、ＩＧＨＶ１／ＯＲ１５−５＊０２、ＩＧＨＶ１／ＯＲ１５−９＊０１、ＩＧＨＶ１／ＯＲ２１−１＊０１、ＩＧＨＶ２−２６＊０１、ＩＧＨＶ２−５＊０１、ＩＧＨＶ２−５＊０２、ＩＧＨＶ２−５＊０３、ＩＧＨＶ２−５＊０４、ＩＧＨＶ２−５＊０５、ＩＧＨＶ２−５＊０６、ＩＧＨＶ２−５＊０７、ＩＧＨＶ２−５＊０８、ＩＧＨＶ２−５＊０９、ＩＧＨＶ２−５＊１０、ＩＧＨＶ２−７０＊０１、ＩＧＨＶ２−７０＊０２、ＩＧＨＶ２−７０＊０３、ＩＧＨＶ２−７０＊０４、ＩＧＨＶ２−７０＊０５、ＩＧＨＶ２−７０＊０６、ＩＧＨＶ２−７０＊０７、ＩＧＨＶ２−７０＊０８、ＩＧＨＶ２−７０＊０９、ＩＧＨＶ２−７０＊１０、ＩＧＨＶ２−７０＊１１、ＩＧＨＶ２−７０＊１２、ＩＧＨＶ２−７０＊１３、ＩＧＨＶ２／ＯＲ１６−５＊０１、ＩＧＨＶ３−１１＊０１、ＩＧＨＶ３−１１＊０３、ＩＧＨＶ３−１１＊０４、ＩＧＨＶ３−１１＊０５、ＩＧＨＶ３−１３＊０１、ＩＧＨＶ３−１３＊０２、ＩＧＨＶ３−１３＊０３、ＩＧＨＶ３−１３＊０４、ＩＧＨＶ３−１５＊０１、ＩＧＨＶ３−１５＊０２、ＩＧＨＶ３−１５＊０３、ＩＧＨＶ３−１５＊０４、ＩＧＨＶ３−１５＊０５、ＩＧＨＶ３−１５＊０６、ＩＧＨＶ３−１５＊０７、ＩＧＨＶ３−１５＊０８、ＩＧＨＶ３−１６＊０１、ＩＧＨＶ３−１６＊０２、ＩＧＨＶ３−２０＊０１、ＩＧＨＶ３−２１＊０１、ＩＧＨＶ３−２１＊０２、ＩＧＨＶ３−２１＊０３、ＩＧＨＶ３−２１＊０４、ＩＧＨＶ３−２３＊０１、ＩＧＨＶ３−２３＊０２、ＩＧＨＶ３−２３＊０３、ＩＧＨＶ３−２３＊０４、ＩＧＨＶ３−２３＊０５、ＩＧＨＶ３−２５＊０４、ＩＧＨＶ３−３０＊０１、ＩＧＨＶ３−３０＊０２、ＩＧＨＶ３−３０＊０３、ＩＧＨＶ３−３０＊０４、ＩＧＨＶ３−３０＊０５、ＩＧＨＶ３−３０＊０６、ＩＧＨＶ３−３０＊０７、ＩＧＨＶ３−３０＊０８、ＩＧＨＶ３−３０＊０９、ＩＧＨＶ３−３０＊１０、ＩＧＨＶ３−３０＊１１、ＩＧＨＶ３−３０＊１２、ＩＧＨＶ３−３０＊１３、ＩＧＨＶ３−３０＊１４、ＩＧＨＶ３−３０＊１５、ＩＧＨＶ３−３０＊１６、ＩＧＨＶ３−３０＊１７、ＩＧＨＶ３−３０＊１８、ＩＧＨＶ３−３０＊１９、ＩＧＨＶ３−３０−３＊０１、ＩＧＨＶ３−３０−３＊０２、ＩＧＨＶ３−３３＊０１、ＩＧＨＶ３−３３＊０２、ＩＧＨＶ３−３３＊０３、ＩＧＨＶ３−３３＊０４、ＩＧＨＶ３−３３＊０５、ＩＧＨＶ３−３３＊０６、ＩＧＨＶ３−３５＊０１、ＩＧＨＶ３−３８＊０１、ＩＧＨＶ３−３８＊０２、ＩＧＨＶ３−４３＊０１、ＩＧＨＶ３−４３＊０２、ＩＧＨＶ３−４８＊０１、ＩＧＨＶ３−４８＊０２、ＩＧＨＶ３−４８＊０３、ＩＧＨＶ３−４８＊０４、ＩＧＨＶ３−４９＊０１、ＩＧＨＶ３−４９＊０２、ＩＧＨＶ３−４９＊０３、ＩＧＨＶ３−４９＊０４、ＩＧＨＶ３−４９＊０５、ＩＧＨＶ３−５３＊０１、ＩＧＨＶ３−５３＊０２、ＩＧＨＶ３−５３＊０３、ＩＧＨＶ３−５３＊０４、ＩＧＨＶ３−６４＊０１、ＩＧＨＶ３−６４＊０２、ＩＧＨＶ３−６４＊０３、ＩＧＨＶ３−６４＊０４、ＩＧＨＶ３−６４＊０５、ＩＧＨＶ３−６６＊０１、ＩＧＨＶ３−６６＊０２、ＩＧＨＶ３−６６＊０３、ＩＧＨＶ３−６６＊０４、ＩＧＨＶ３−７＊０１、ＩＧＨＶ３−７＊０２、ＩＧＨＶ３−７＊０３、ＩＧＨＶ３−７２＊０１、ＩＧＨＶ３−７２＊０２、ＩＧＨＶ３−７３＊０１、ＩＧＨＶ３−７３＊０２、ＩＧＨＶ３−７４＊０１、ＩＧＨＶ３−７４＊０２、ＩＧＨＶ３−７４＊０３、ＩＧＨＶ３−９＊０１、ＩＧＨＶ３−９＊０２、ＩＧＨＶ３−ＮＬ１＊０１、ＩＧＨＶ３−ｄ＊０１、ＩＧＨＶ３／ＯＲ１５−７＊０１、ＩＧＨＶ３／ＯＲ１５−７＊０２、ＩＧＨＶ３／ＯＲ１５−７＊０３、ＩＧＨＶ３／ＯＲ１５−７＊０５、ＩＧＨＶ３／ＯＲ１６−１０＊０１、ＩＧＨＶ３／ＯＲ１６−１０＊０２、ＩＧＨＶ３／ＯＲ１６−１０＊０３、ＩＧＨＶ３／ＯＲ１６−１２＊０１、ＩＧＨＶ３／ＯＲ１６−１３＊０１、ＩＧＨＶ３／ＯＲ１６−６＊０２、ＩＧＨＶ３／ＯＲ１６−８＊０１、ＩＧＨＶ３／ＯＲ１６−８＊０２、ＩＧＨＶ３／ＯＲ１６−９＊０１、ＩＧＨＶ４−２８＊０１、ＩＧＨＶ４−２８＊０２、ＩＧＨＶ４−２８＊０３、ＩＧＨＶ４−２８＊０４、ＩＧＨＶ４−２８＊０５、ＩＧＨＶ４−２８＊０６、ＩＧＨＶ４−３０−２＊０１、ＩＧＨＶ４−３０−２＊０２、ＩＧＨＶ４−３０−２＊０３、ＩＧＨＶ４−３０−２＊０４、ＩＧＨＶ４−３０−２＊０５、ＩＧＨＶ４−３０−４＊０１、ＩＧＨＶ４−３０−４＊０２、ＩＧＨＶ４−３０−４＊０３、ＩＧＨＶ４−３０−４＊０４、ＩＧＨＶ４−３０−４＊０５、ＩＧＨＶ４−３０−４＊０６、ＩＧＨＶ４−３１＊０１、ＩＧＨＶ４−３１＊０２、ＩＧＨＶ４−３１＊０３、ＩＧＨＶ４−３１＊０４、ＩＧＨＶ４−３１＊０５、ＩＧＨＶ４−３１＊０６、ＩＧＨＶ４−３１＊０７、ＩＧＨＶ４−３１＊０８、ＩＧＨＶ４−３１＊０９、ＩＧＨＶ４−３１＊１０、ＩＧＨＶ４−３４＊０１、ＩＧＨＶ４−３４＊０２、ＩＧＨＶ４−３４＊０３、ＩＧＨＶ４−３４＊０４、ＩＧＨＶ４−３４＊０５、ＩＧＨＶ４−３４＊０６、ＩＧＨＶ４−３４＊０７、ＩＧＨＶ４−３４＊０８、ＩＧＨＶ４−３４＊０９、ＩＧＨＶ４−３４＊１０、ＩＧＨＶ４−３４＊１１、ＩＧＨＶ４−３４＊１２、ＩＧＨＶ４−３４＊１３、ＩＧＨＶ４−３９＊０１、ＩＧＨＶ４−３９＊０２、ＩＧＨＶ４−３９＊０３、ＩＧＨＶ４−３９＊０４、ＩＧＨＶ４−３９＊０５、ＩＧＨＶ４−３９＊０６、ＩＧＨＶ４−３９＊０７、ＩＧＨＶ４−４＊０１、ＩＧＨＶ４−４＊０２、ＩＧＨＶ４−４＊０３、ＩＧＨＶ４−４＊０４、ＩＧＨＶ４−４＊０５、ＩＧＨＶ４−４＊０６、ＩＧＨＶ４−４＊０７、ＩＧＨＶ４−５９＊０１、ＩＧＨＶ４−５９＊０２、ＩＧＨＶ４−５９＊０３、ＩＧＨＶ４−５９＊０４、ＩＧＨＶ４−５９＊０５、ＩＧＨＶ４−５９＊０６、ＩＧＨＶ４−５９＊０７、ＩＧＨＶ４−５９＊０８、ＩＧＨＶ４−５９＊０９、ＩＧＨＶ４−５９＊１０、ＩＧＨＶ４−６１＊０１、ＩＧＨＶ４−６１＊０２、ＩＧＨＶ４−６１＊０３、ＩＧＨＶ４−６１＊０４、ＩＧＨＶ４−６１＊０５、ＩＧＨＶ４−６１＊０６、ＩＧＨＶ４−６１＊０７、ＩＧＨＶ４−６１＊０８、ＩＧＨＶ４−ｂ＊０１、ＩＧＨＶ４−ｂ＊０２、ＩＧＨＶ４／ＯＲ１５−８＊０１、ＩＧＨＶ４／ＯＲ１５−８＊０２、ＩＧＨＶ４／ＯＲ１５−８＊０３、ＩＧＨＶ５−５１＊０１、ＩＧＨＶ５−５１＊０２、ＩＧＨＶ５−５１＊０３、ＩＧＨＶ５−５１＊０４、ＩＧＨＶ５−５１＊０５、ＩＧＨＶ５−ａ＊０１、ＩＧＨＶ５−ａ＊０３、ＩＧＨＶ５−ａ＊０４、ＩＧＨＶ６−１＊０１、ＩＧＨＶ６−１＊０２、ＩＧＨＶ７−４−１＊０１、ＩＧＨＶ７−４−１＊０２、ＩＧＨＶ７−４−１＊０３、ＩＧＨＶ７−４−１＊０４、ＩＧＨＶ７−４−１＊０５、又はＩＧＨＶ７−８１＊０１、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−２、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ３−１１、ＩＧＨＶ１−３、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−４６、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ３−９、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ１−２４、ＩＧＨＶ２−５、ＩＧＨＶ２−７０、ＩＧＨＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−３０−３、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ５−１０−１、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ１−４５、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ２−２６、ＩＧＨＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−４９、ＩＧＨＶ３−５３、ＩＧＨＶ３−７２、ＩＧＨＶ３−７３、ＩＧＨＶ４−３１、ＩＧＨＶ４−３８−２、及びＩＧＨＶ７−４が含まれ得る。
【００７７】
また、本明細書において、標的抗原（例えば、ＣＤ１９又は融合部分結合ドメインの標的について本明細書の他の場所に記載されている任意の標的抗原）に特異的な抗体抗原結合ドメインを得るための方法が提供され、この方法は、本明細書に設定されているＶＨドメインのアミノ酸配列に１つ以上のアミノ酸を付加、欠失、置換又は挿入することによって、ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体であるＶＨドメインを提供し、このように提供されたＶＨドメインを１つ以上のＶＬドメインと任意選択的に組み合わせ、特異的な結合メンバー又は目的とする標的抗原（例えば、ＣＤ１９）に特異的であり、任意選択的に１つ以上の所望の特性を有する抗体抗原結合ドメインを同定するためにＶＨドメイン又はＶＨ／ＶＬ組合せもしくは複数の組合せを試験することを含む。
【００７８】
いくつかの例において、ＶＨドメイン及びｓｃＦｖは、当該技術分野において公知の方法に従って調製することができる。ｓｃＦｖ分子は、可動性ポリペプチドリンカーを用いて、ＶＨ及びＶＬ領域を一緒に連結することによって生成され得る。ｓｃＦｖ分子は、最適化された長さ及び／又はアミノ酸組成を有するリンカー（例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー）を含む。リンカーの長さは、ｓｃＦｖの可変領域がどのように折り畳まれ、相互作用するかに大きく影響する可能性がある。実際に、短いポリペプチドリンカーが使用される（例えば、５−１０アミノ酸の間）場合、鎖内折り畳みは防止される。２つの可変領域を一緒にして機能的なエピトープ結合部位を形成させるために、鎖間の折り畳みも必要である。
【００７９】
ｓｃＦｖは、そのＶＬ領域とＶＨ領域の間に約１０、１１、１２、１３、１４、１５残基又は１５を超える残基のリンカーを含むことができる。リンカー配列は、任意の天然に存在するアミノ酸を含むことができる。いくつかの実施形態において、リンカー配列はアミノ酸グリシン及びセリンを含む。別の実施形態において、リンカー配列は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（ここで、ｎは１に等しい又は１を超える正の整数である）のようなグリシン及びセリン反復のセットを含む。一実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４又は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３であり得る。リンカーの長さの変動は、活性を保持する又は高めることができ、活性研究において優れた有効性を生じさせる。
【００８０】
突然変異
一態様において、ＢＦＰ又はＴＦＰの抗原結合ドメインは、本明細書に記載されている抗原結合ドメインアミノ酸配列に相同であるアミノ酸配列を含む。１つの特定の態様において、ＢＦＰ又はＴＦＰは抗体断片を含む。さらなる態様において、その抗体断片はｓｃＦｖを含む。
【００８１】
様々な態様において、ＢＦＰ又はＴＦＰの抗原結合ドメインは、１つ又は両方の可変領域（例えば、ＶＨ及び／又はＶＬ）内、例えば、１つ以上のＣＤＲ領域内及び／又は１つ以上のフレームワーク領域内の１つ以上のアミノ酸を修飾することによって遺伝子操作される。１つの特定の態様において、本開示のＢＦＰ又はＴＦＰ組成物は、抗体断片を含む。さらなる態様において、その抗体断片はｓｃＦｖを含む。
【００８２】
当業者は、本開示の抗体又は抗体断片が、アミノ酸配列（例えば、野生型）において変化するが、所望の活性において変化しないように、さらに修飾され得ることを理解するであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換をもたらす追加のヌクレオチド置換をタンパク質に施すことができる。例えば、分子中の非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換され得る。別の実施形態において、アミノ酸のストリングは、側鎖ファミリーメンバーの順序及び／又は組成が異なる構造的に類似したストリングで置換することができ、例えば、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換された保存的置換を施すことができる。
【００８３】
類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。
【００８４】
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における同一性パーセントは、同一である２つ以上の配列を指すことができる。以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いてもしくは手動整列及び目視検索によって、比較ウインドウ又は指定された領域にわたる最大対応について比較及び整列するとき、２つの配列が、同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドの特定のパーセンテージ（例えば、特定の領域と比較して、又は特定されていない場合は配列全体と比較して６０％の同一性、任意選択的に７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性）を有する場合、２つの配列は「実質的に同一」である。任意選択的に、同一性は、長さが少なくとも約５０ヌクレオチド（又は１０アミノ酸）である領域、又はより好ましくは長さが１００−５００もしくは１０００又はそれ以上のヌクレオチド（又は２０、５０、２００又はそれ以上のアミノ酸）である領域に存在する。
【００８５】
配列比較のために、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じて、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用することができ、又は代替パラメータを指定することができる。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列と比較した試験配列の配列同一性パーセントを計算する。比較のための配列を整列させる方法は、当該技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、（１９７０年）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所ホモロジーアルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３のホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性サーチの方法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）によって、又は手動整列及び目視検査（例えば、Ｂｒｅｎｔら（２００３年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）によって実行することができる。配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７年）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻：３３８９−３４０２頁；及びＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３−４１０頁に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて一般に入手可能である。
【００８６】
一態様において、本開示は、機能的に同等な分子を生成する出発抗体又は断片（例えば、ｓｃＦｖ）アミノ酸配列の修飾を企図する。例えば、ＢＦＰ又はＴＦＰに含まれる抗ＣＤ１９結合ドメイン、例えばｓｃＦｖのＶＨ又はＶＬは、抗ＣＤ１９結合ドメインの開始ＶＨ又はＶＬフレームワーク領域、例えば、ｓｃＦＶの少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性を保持するように修飾され得る。本開示は、機能的に同等な分子を生成するために、ＢＦＰ又はＴＦＰ構築物全体の修飾、例えば、ＴＦＰ構築物の様々なドメインの１つ以上のアミノ酸配列における修飾を企図する。ＢＦＰ又はＴＦＰ構築物は、開始ＢＦＰ又はＴＦＰ構築物の少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性を保持するように修飾され得る。
【００８７】
抗Ｉｄ  Ｘ表面系統マーカー二重特異性抗体
親和性ライブラリースクリーニングは、しばしば、多様性の高い親和性試薬を生じさせるが、これらはインビボにおいて、それらの意図された標的に対する最適な結合／親和性よりも劣っている可能性がある。現代の二重特異性抗体は、１つの単一タンパク質分子において異なる特異性を有する２つの抗原結合部位を組み合わせることができる。いくつかの場合において、本開示のヒト化抗体は、２つの抗原結合ドメインを有する二重特異性抗体である。
【００８８】
二重特異性Ｔ細胞誘導因子（ｅｎｇａｇｅｒ）
ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞誘導因子；ブリナツモマブ；一本鎖（ｓｃ）ＦｖベースのＣＤ１９Ｘｃｄ３標的分子）は、ＣＤ３及びＣＤ１９陽性細胞への二重特異性結合が可能であり、ヒトＢリンパ腫細胞（例えば、細胞株）の溶解のための予め刺激されたヒトＴ細胞と刺激されていないヒトＴ細胞の両方に対し再指向化することができる。全体として、この分子は、腫瘍のＴ細胞溶解に影響を与える際に、同等のタンデムダイアボディ分子よりも７００倍及び８０００倍高い効力を有することができる。
【００８９】
いくつかの態様において、ＩＧＨＶ＊及びＩｄを保持するリンパ腫細胞に対する類似の転帰をもたらすために、イディオタイプ特異的分子とＣＤ３ドメインとの対合が想定される。
【００９０】
次世代配列決定によるＩＧＨ＊レパートリープロファイリング
対象組織試料（血液、腫瘍など）中のＩＧＨ遺伝子の大規模なパラレル配列決定を可能にするいくつかの商業的に入手可能な試験（Ｓｅｑｕｅｎｔａ，Ｉｎｃ．及びＡｄａｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を含む多数のアプローチが存在する。これらのアプローチは、対象におけるＢリンパ球集団の広範なプロファイリングを可能にし、診断された腫瘍のクローン性モニタリング及び腫瘍進行の治療後フォローアップに有用である。個別に分離したＰＣＲ増幅及び単一のＩＧＨ遺伝子の大規模なパラレル配列決定によるこれらの試験は、次世代配列決定装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｒｏｃｈｅ  ４５４、Ｉｏｎ  ＰＧＭ／Ｔｏｒｒｅｎｔ）において実施され、腫瘍又は血液試料中の個々のＢリンパ球に対応するＩＧＨ遺伝子の代表的なサブセットをプロファイリングすることができる。具体的には、試料由来の個々のＩＧＨＶ／Ｄ／Ｊ遺伝子のその後の配列決定の増幅を容易にするコンセンサスＩＧＨ特異的プライマーが存在する（例えば、ＢＩＯＭＥＤ−２コンソーシアム由来）。増幅及び配列決定の後、個々の配列セットは、品質管理され、類似性によってクラスター化され、参照（例えば、生殖系列ヒト）ＩｇＨＶ／Ｄ／Ｊ遺伝子に対して遺伝子整列され得る。いくつかの実施形態において、ＢＩＯＭＥＤ−２プライマーを使用して、ＣＬＬ対象における突然変異状態を同定するための診断用ＩＧＨ配列を増幅している。他のものは、クローン性について多数の血液学的悪性腫瘍を増幅及び大規模にパラレル配列決定するためにＢＩＯＭＥＤ−２プライマーを使用している。
【００９１】
本開示のいくつかの態様において、突然変異されていないＣＬＬ対象由来の生物学的試料は、その対象の疾患に最も適切な抗ＩＧＨＶ抗体が選択され得るように、ＩＧＨＶ＊使用を決定するために配列決定される。例えば、ＣＬＬと診断された対象は、腫瘍試料（おそらく、最初の腫瘍病期分類中に得られた試料、又は新しい試料、又は血液試料）を提供することができ、その試料から、ＩＧＨＶクローン性配列プロファイル（例えば、試料中に最も一般的に見出されるＩＧＨＶ配列）、及びＩＧＨＶ遺伝子の突然変異状態（例えば、ＩｇＢｌａｓｔによる参照生殖系列ＩＧＨＶに対する＞９８％同一性）を決定することができる。一例において、対象が主にＩＧＨＶ１−６９＋リンパ球を有するリンパ腫に罹患し、ＩＧＨＶ１−６９配列が生殖系列参照のＩＧＨＶ１−６９と＞９８％同一であると決定された場合、本開示の抗ＩＧＨＶ１−６９抗体を用いて対象を治療することが推奨され得る。
【００９２】
クローン系統特異的マーカータンパク質（ＣＬＡＭＰ）
本明細書に記載されているヒト化抗体は、細胞のクローン集団上のクローン系統特異的マーカータンパク質（ＣＬＳＭＰ）にヒト化抗体を標的化することによって、治療を必要とする対象の治療に適し得る。本明細書で使用するとき、用語「クローン系統特異的マーカータンパク質」又はＣＬＳＭＰは、一般的に、特定のクローン細胞系統の細胞において一意的に発現される遺伝的にコードされたタンパク質を指し得る。
【００９３】
非限定的な例において、ＣＬＳＭＰは、クローンＢ細胞集団によって一意的に発現される抗体を画定するイディオタイプであり得る。Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）としても知られているＢ細胞イディオタイプは、重鎖と軽鎖の２つのタンパク質鎖で構成されている。重鎖は、ＶＤＪＣ組換えを介してＩＧＨＶセグメントとＤ、Ｊ及びＣ遺伝子との体細胞組換えを介して作製された遺伝子によってコードされる。軽鎖は、ＩＧＬＶ遺伝子のＪ及びＣ領域とのＶＪＣ組換えによる体細胞組換えによって作製された遺伝子によってコードされる。ＩＧＬＶ遺伝子は、ラムダとカッパＩＧＬＶ遺伝子の両方を含む。Ｂ細胞の各クローン集団は、固有のイディオタイプを発現する。それらは、Ｂ細胞ゲノムによってコードされ、これらはこの系統のＢ細胞に固有であり、それらは細胞表面上に発現される。
【００９４】
ＣＬＳＭＰの別の非限定的な例は、Ｔ細胞のクローン系統の表面に発現されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である。ＴＣＲは、アルファ鎖及びベータ鎖又はガンマ鎖及びデルタ鎖の２つの鎖で構成される。ＴＣＲアルファ鎖又はガンマ鎖は、Ｖ及びＪ遺伝子の体細胞組換えによって作製される遺伝子によってコードされる。ＴＣＲベータ鎖又はデルタ鎖は、Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子の組換えにより作製される遺伝子によってコードされる。Ｔ細胞の各クローン集団は、固有のＴＣＲを発現する。ＴＣＲは、Ｔ細胞ゲノムによってコードされ、それらはこの系統のＴ細胞に固有であり、細胞表面上に発現される。
【００９５】
がんは体細胞突然変異を受け、がんゲノムは多くの、しばしば数千の点突然変異、挿入、欠失及びゲノム再編成を有する点において正常組織と異なる。これらの突然変異又はゲノム異常は、腫瘍系統のマーカーになる。これらの非同義点突然変異又はゲノム異常がタンパク質をコードする遺伝子を伴う場合、それらはＣＬＳＭＰを生成する。このように、タンパク質をコードする遺伝子を伴う非同義点突然変異又はゲノム異常は、ＣＬＳＭＰの別の例である。がんゲノムにおける突然変異の結果として腫瘍によって発現される異常なタンパク質（「腫瘍ネオ抗原」と称する）の集合は、しばしばがん性ミュータノーム（ｍｕｔａｎｏｍｅ）と呼ばれる。いくつかの場合において、ＣＬＳＭＰは、腫瘍ネオ抗原又は系統特異的タンパク質変化である。いくつかの場合において、腫瘍ネオ抗原は、ネオエピトープ（例えば、ネオ抗原特異的エピトープ）を含むことができる。いくつかの例において、本開示の抗体又は構築物は抗ネオ抗原剤であり得る。いくつかの例において、本開示の抗体又は構築物は抗ネオエピトープ剤であり得る。
【００９６】
ＣＬＳＭＰの別の非限定的な例は、体細胞の組換え又は転座を介してがん細胞によって発現される新規又は異常なタンパク質を含み得る。例えば、フィラデルフィア染色体（ＰＣ）は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）系統においてがん細胞のマーカーとして長く使用されている。ＰＣは、第９染色体と第２２染色体の間の相互転座によって形成され、ＢＣＲ及びＡＢＬ遺伝子を融合させたｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）と明示される。ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質はＣＬＳＭＰであり得る。
【００９７】
ＣＬＳＭＰのさらに別の非限定的な例は、正常細胞において発現されない腫瘍におけるタンパク質の異常なスプライシングによって合成されたタンパク質を含み得る。別の例において、がんにおける遺伝的事象は、正常な転写及び転写物のスプライシングに必要とされる遺伝子の不活性化又は欠失をもたらす可能性がある。これらの事象はがん細胞の系統特異的マーカーである。正常な転写物プロセシングに必要とされる遺伝子の不活性化又は欠失の結果として、多くのがんは、異常なタンパク質産物の産生をもたらす異常な転写及び異常なスプライシングの広範なパターンを示す。これらの異常なタンパク質産物は、結果として系統特異的事象であるため、これらの異常なタンパク質はＣＬＳＭＰであり得る。別の例において、がんにおける遺伝的事象は、タンパク質の正常なプロセシングに必要とされる遺伝子の不活性化又は欠失をもたらす可能性がある。これらの事象はがん細胞の系統特異的マーカーである。正常なタンパク質プロセシングに必要とされる遺伝子の不活性化又は欠失の結果として、多くのがんは、異常なグリコシル化、異常なリン酸化又は他の異常な翻訳後修飾を伴うタンパク質を発現する。これらの異常に処理されたタンパク質はＣＬＳＭＰである。別の例において、がんにおける遺伝的事象は、タンパク質の正常な輸送及び局在化に必要とされる遺伝子の不活性化又は欠失をもたらす可能性がある。これらの事象はがん細胞の系統特異的マーカーである。正常なタンパク質の輸送及び局在化に必要とされる遺伝子の不活性化又は欠失の結果として、多くのがんは、異常な局在化を伴うタンパク質を発現する。例えば、核、特定の細胞小器官又は細胞質にのみ通常存在するタンパク質は、がん細胞の細胞表面上で異常に発現され得る。これらの異常に局在化するタンパク質はＣＬＳＭＰであり得る。
【００９８】
細胞表面抗原
本明細書に記載されているヒト化抗体は、細胞上の細胞表面抗原に選択的に結合するドメインを含有することができる。いくつかの場合において、細胞はＣＬＳＭＰ発現細胞である。１つの非限定的な例において、ＣＤ２０は、ヒト化抗体によって標的化される細胞表面抗原であり得る。ＣＤ２０は全てのＢリンパ球上に発現する。細胞型としてのＢリンパ球は、クローン集団ではなく、むしろ共通の分化経路を介して複数の独立した前駆細胞から誘導された一群の細胞である。したがって、ＣＤ２０はＢ細胞型特異的マーカーである。同様に、ＣＤ１４は、マクロファージ、樹状細胞により発現され、好中球により低レベルで発現される。ＣＤ１４陽性細胞は骨髄前駆細胞の一般的なセットに由来し、したがってＣＤ１４は細胞表面抗原であり得る。細胞表面抗原の別の例は、ＨＥＲ２／ｎｅｕである。ＨＥＲ２／ｎｅｕは、通常、胃腸、呼吸器、生殖器及び尿路、並びに皮膚、乳房及び胎盤の上皮細胞の表面上に発現される。ＨＥＲ２／ｎｅｕは複数の他の組織で発現するため、特定の細胞系統に特異的ではない。
【００９９】
エフェクター抗原
本明細書に開示されているヒト化抗体は、エフェクター抗原に選択的に結合するタンパク質結合ドメインを含む。いくつかの場合において、エフェクター抗原は細胞の表面に提示される。エフェクター抗原を含有する細胞は、ＣＬＳＭＰを含有する細胞と同じ細胞であってもよく又は異なる細胞であってもよい。本明細書における組成物及び方法による使用に適したエフェクター抗原の非限定的な例には、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１又はＩＬ−２Ｒが含まれる。いくつかの場合において、エフェクター抗原は、シュードモナス外毒素又はジフテリア毒素のような毒素である。いくつかの場合において、エフェクター抗原はＦｃ受容体を含むことができる。Ｆｃ受容体は、一般的に、免疫系の保護機能に寄与するいくつかの細胞（例えば、Ｂリンパ球、濾胞樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、ヒト血小板及び肥満細胞）の表面上に見出されるタンパク質を指すことができる。Ｆｃ受容体は、感染細胞又は侵入する病原体に付着した抗体に結合し得る。それらの活性は、貪食細胞又は細胞傷害性細胞を刺激して、抗体媒介食作用又は抗体依存性細胞媒介性細胞毒性によって微生物又は感染細胞を破壊する。例えば、本開示の一実施形態は、腫瘍細胞上に見出されるＣＬＳＭＰに対する親和性を有する第１のドメイン及びエフェクター細胞（例えば、Ｂリンパ球、濾胞性樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、ヒト血小板又は肥満細胞）上に見出されるＦｃ受容体に対する親和性を有する第２のドメインを含むことができる。いくつかの異なるタイプのＦｃ受容体があり、それらが認識する抗体のタイプに基づいて分類することができる。Ｆｃ受容体の非制限的な例には、Ｆｃ−ガンマ受容体、Ｆｃ−アルファ受容体、Ｆｃ−イプシロン受容体、ＦｃγＲＩ（例えばＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（例えばＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ１（例えばＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ２（例えばＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（例えばＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（例えばＣＤ１６ｂ）、ＦｃεＲＩ、ＦｃεＲＩＩ（例えばＣＤ２３）、ＦｃαＲＩ（例えばＣＤ８９）、Ｆｃα／μＲ及びＦｃＲｎが含まれる。
【０１００】
いくつかの態様において、ヒト化抗体は、Ｔ細胞上のエフェクター抗原に選択的に結合して、Ｔ細胞を悪性細胞又は異常細胞に標的化する。例えば、抗体は、Ｔリンパ球上のＣＤ３に選択的に結合し、がん細胞上のＣＬＳＭＰに選択的に結合し得る。対象に投与した場合、Ｔリンパ球は活性化され、ＣＬＳＭＰを発現するがん細胞を殺滅することができる。
【０１０１】
徴候
本明細書に記載される組成物及び方法は、がん及び自己免疫疾患を治療するために使用することができる。いくつかの場合において、がんはＢ細胞悪性腫瘍である。Ｂ細胞悪性腫瘍には、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）が含まれる。これらの疾患は、無痛性であるが過酷な経過によって特徴付けられる。ＣＬＬ、ＭＣＬ及びＦＬは、Ｂリンパ球又はＢリンパ球前駆細胞の異常なクローン増殖によって引き起こされる。これらのがんの細胞は、腫瘍系統に固有のイディオタイプを有するＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を発現する。腫瘍細胞は、生検を介して、又はＣＬＬの場合には血液試料を用いて容易に得ることができる。微小不均一性の評価を含むイディオタイプの配列は、選択的配列増幅、続く分子配列分析によって評価することができる。がんからのＰＣＲクローン化イディオタイプ遺伝子を用いて、本明細書に記載されている抗イディオタイプ治療薬を開発することができる。治療薬は静脈内投与することができる。投与した場合、治療薬は、免疫細胞を誘導して、がん細胞を攻撃し、殺滅することができる。
【０１０２】
本明細書における組成物及び方法によって治療することができるがんの他の非限定的な例には以下が含まれる：Ｂ細胞リンパ腫、例えば、小リンパ球性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、胃型ＭＡＬＴリンパ腫、非胃型ＭＡＬＴリンパ腫、結節縁帯リンパ腫、脾臓縁部帯リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、ＡＩＤＳ関連Ｂ細胞リンパ腫、毛状細胞白血病、原発性皮膚Ｂ細胞リンパ腫、ワルデンストレーム・マクログロブリン血症／リンパ形質細胞性リンパ腫；Ｔ細胞リンパ腫、例えば、末梢Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫／セザリー症候群、原発性皮膚ＣＤ３０細胞＋Ｔ細胞、リンパ増殖性障害、Ｔ細胞大顆粒性リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、Ｔ細胞前線維化性白血病、外節ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、移植後リンパ増殖性障害、キャッスルマン病；白血病、例えば急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群；及び本明細書に開示されている任意の他の疾患、形成異常又は悪性腫瘍。
【０１０３】
いくつかの場合において、本明細書に記載されている組成物及び方法は、関節リウマチ、シェーグレン症候群及びＩ型糖尿病を含む自己免疫疾患を治療するために使用することができる。いくつかの場合において、この疾患は、移植片対宿主病のような自己免疫様疾患である。関節リウマチ及びシェーグレン症候群を含む自己免疫疾患は、異常な抗自己抗体の存在によって特徴付けられる。多くの対象において、これらの自己抗体は、Ｂリンパ球の単一の異常なクローン系統によって生成される。これらの異常なＢリンパ球は、炎症を起こした関節のような炎症部位で濃縮され、これらの細胞は関節吸引によって容易に得ることができる。異常な抗体を産生するＢリンパ球はまた、その抗体をそれらの細胞表面上に発現する。微小不均一性の評価を含むイディオタイプの配列は、選択的配列増幅、続く分子配列分析によって評価することができる。がんからのＰＣＲクローン化イディオタイプ遺伝子を用いて、本明細書に記載されている抗イディオタイプ治療薬を開発することができる。治療薬は静脈内投与することができる。投与した場合、治療薬は免疫細胞を誘発し、異常な抗自己抗体を産生するＢリンパ球のクローン系統を攻撃し、殺滅して、関節炎の発症又は進行を妨げる。
【０１０４】
対象
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている方法及び組成物は、対象のがんの治療に使用され得る。対象は、任意のヒト対象、特にがん患者、がんの危険性がある対象、又はがんの家族歴もしくは個人歴を有する対象であり得る。いくつかの場合において、対象はがん治療の特定の段階にある。いくつかの場合において、対象は、別の治療（例えば、放射線療法）と同時に、本開示の組成物を投与され得る。
【０１０５】
対象は、任意のタイプのがんを有し得る。がんの例には、限定されないが、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、血液のがん、骨がん、脳腫瘍、乳がん、心血管系のがん、子宮頸がん、結腸がん、消化器系のがん、内分泌系のがん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、胆嚢がん、胃腸腫瘍、腎臓がん、喉頭がん、白血病、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、中皮腫、筋肉系のがん、骨髄異形成症候群、骨髄腫、鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経系のがん、リンパ系のがん、口腔がん、口腔咽頭がん、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、生殖器系のがん、呼吸器系のがん、肉腫、唾液腺がん、骨格系がん、皮膚がん、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、腫瘍、泌尿器系のがん、子宮がん、膣がん又は外陰がんを挙げることができる。用語「リンパ腫」とは、Ｂ細胞リンパ腫（例えば、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、周縁部Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、毛様細胞白血病もしくは原発性中枢神経系リンパ腫）又はＴ細胞リンパ腫（例えば、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫又は末梢Ｔ細胞リンパ腫）を含む任意のタイプのリンパ腫を指すことができる。用語「白血病」とは、急性白血病又は慢性白血病を含む任意のタイプの白血病を指すことができる。白血病のタイプには、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、急性未分化白血病又は慢性リンパ球性白血病が含まれ得る。
【０１０６】
本明細書に記載されている方法又は組成物のいずれかによって治療される対象は、任意の年齢であり得、成人、幼児又は子供であり得る。いくつかの場合において、対象は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９歳、又はそれらの範囲内（例えば２−２０歳、２０−４０歳もしくは４０−９０歳）である。さらに、本明細書に記載される方法又は組成物のいずれかによって治療される患者は、男性又は女性であり得る。
【０１０７】
また、本明細書に開示されている組成物のいずれも、実験動物又は家畜のような非ヒト対象に投与することができる。非ヒト対象の非限定的な例としては、イヌ、ヤギ、モルモット、ハムスター、マウス、ブタ、非ヒト霊長類（例えば、ゴリラ、類人猿、オランウータン、キツネザル又はヒヒ）、ラット、ヒツジ、ウシ又はゼブラフィッシュが含まれる。
【０１０８】
試料
本明細書に記載されている方法において使用される試料は、核酸を含有し得る任意の生物学的材料を含むことができる。試料は、様々な供給源から発生することができる。いくつかの実施形態において、供給源は、例えば、ヒト、非ヒト哺乳動物、哺乳動物、動物、げっ歯類、両生類、魚類、爬虫類、微生物、細菌、植物、真菌、酵母及び／又はウイルスであり得る。いくつかの実施形態において、試料は生物学的試料であり得る。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、例えば、細胞培養物、組織切片、凍結切片、生検試料及び剖検試料を含み得る。試料は、臨床試料、環境試料又は研究試料であり得る。臨床試料には、とりわけ、鼻咽頭洗浄、血液、血漿、無細胞血漿、バフィーコート、唾液、尿、糞便、痰、粘液、創傷スワブ、組織生検、母乳、流体吸引物、スワブ（例えば、鼻咽頭スワブ）及び／又は組織が含まれ得る。研究試料には、培養細胞、初代細胞、細菌、胞子、ウイルス、微生物、上記で列挙された臨床試料のいずれかが含まれ得る。試料は、診断目的（例えば、感染性因子のような臨床分析物の定量的測定）又はモニタリング目的（例えば、疾患又は障害の経過をモニタリングするため）のために収集することができる。例えば、ポリヌクレオチドの試料は、疾患もしくは障害を有する対象、疾患もしくは障害を有する危険性がある対象、又は疾患もしくは障害を有する疑いがある対象から収集又は取得することができる。
【０１０９】
本開示において提供される核酸試料は、生物に由来し得る。いくつかの実施形態において、生物全体を使用することができる。いくつかの実施形態において、生物の一部を使用することができる。例えば、生物の一部は、臓器、複数の組織を含む組織片、単一の組織を含む組織片、混合組織源の複数の細胞、単一の組織源の複数の細胞、単一の組織源の単一の細胞、混合組織源の複数の細胞由来の無細胞核酸、単一の組織源の複数の細胞由来の無細胞核酸及び単一の組織源の単一の細胞由来の無細胞核酸、並びに／又は体液を含むことができる。いくつかの実施形態において、生物の部分は、ミトコンドリア、核又は本明細書に記載されている他のコンパートメントのようなコンパートメントである。いくつかの実施形態において、生物の部分は、流体中に存在する無細胞核酸、例えば、循環中の無細胞核酸である。
【０１１０】
組織は、胚葉のいずれかに由来し得る。いくつかの実施形態において、胚葉は、神経堤、内胚葉、外胚葉及び／又は中胚葉であり得る。胚葉は、以下の組織、結合組織、骨格筋組織、平滑筋組織、神経系組織、上皮組織、外胚葉組織、内胚葉組織、中胚葉組織、内皮組織、心筋組織、脳組織、脊髄組織、脳神経組織、脊髄神経組織、ニューロン組織、皮膚組織、呼吸器組織、生殖組織及び／又は消化器組織のいずれかを生じさせ得る。いくつかの実施形態において、器官は、胚葉のいずれかに由来し得る。いくつかの実施形態において、胚葉は、以下の臓器、副腎、肛門、虫垂、膀胱、骨、脳、気管支、耳、食道、目、胆嚢、性器、心臓、視床下部、腎臓、喉頭、肝臓、肺、大腸、リンパ節、髄膜、口、鼻、膵臓、副甲状腺、下垂体、直腸、唾液腺、皮膚、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、胸腺、甲状腺、舌、気管、尿管及び／又は尿道のいずれかを生じさせ得る。いくつかの実施形態において、器官は新生物を含み得る。いくつかの実施形態において、新生物は腫瘍であり得る。いくつかの実施形態において、腫瘍はがんであり得る。いくつかの実施形態において、試料は腫瘍試料を含み得る。いくつかの実施形態において、試料は悪性Ｂ細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、試料は悪性Ｔ細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、試料は細胞を含み得、細胞は疾患を有する組織に由来し得る。いくつかの実施形態において、疾患は白血病であり得る。いくつかの実施形態において、疾患はリンパ腫であり得る。
【０１１１】
細胞は、任意の組織に由来し得る。いくつかの実施形態において、細胞は、外分泌上皮細胞、ホルモン分泌細胞、ケラチン化上皮細胞、湿潤重層化バリア上皮細胞、感覚トランスデューサ細胞、自律神経細胞、感覚器官及び末梢ニューロン支持細胞、中枢神経系ニューロン、グリア細胞、レンズ細胞、代謝及び貯蔵細胞、腎臓細胞、細胞外マトリックス細胞、収縮性細胞、血液系及び免疫系細胞、生殖細胞、ナース細胞並びに／又は間質細胞を含み得る。
【０１１２】
体液は、液体中の生物学的粒子の懸濁液であってもよい。例えば、体液は血液であってもよい。いくつかの実施形態において、血液は、血漿及び／又は細胞（例えば、赤血球、白血球又は循環中の希少細胞）及び／又は血小板を含み得る。いくつかの実施形態において、血液試料は、１つ以上の細胞型が枯渇した血液を含有する。いくつかの実施形態において、血液試料は、１つ以上の細胞型が濃縮された血液を含有する。いくつかの実施形態において、血液試料は、細胞の不均質な、均質な又はほぼ均質な混合物を含有する。体液は、例えば、全血、分画した血液、血清、血漿、汗、涙、耳の流体、痰、リンパ、骨髄懸濁液、リンパ、尿、唾液、精液、膣の流体、糞便、経膣洗浄液、脳脊髄液、脳液、腹水、母乳、硝子体液、房水、皮脂、内リンパ、腹水、胸膜液、耳介、心外膜液、並びに呼吸器系、腸及び／又は泌尿生殖器管の分泌物を含み得る。いくつかの実施形態において、体液は、細胞の混合物を含有する様々な器官（例えば、肺）と接触することができる。
【０１１３】
体液は、少なくとも１つの細胞を含有することができる。細胞は、例えば、悪性表現型の細胞；胎児細胞（例えば、母体末梢血中の胎児細胞）；腫瘍細胞（例えば、腫瘍から血液及び／又は他の体液中に放出された腫瘍細胞）；がん細胞；不死細胞；幹細胞；ウイルスに感染した細胞（例えば、ＨＩＶに感染した細胞）；目的とする遺伝子をトランスフェクトされた細胞；自己反応性障害に罹患した対象の末梢血に存在する異常なサブタイプのＴ細胞及び／又はＢ細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、細胞は、以下の赤血球、白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）、白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）、リンパ球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、肥満細胞、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、樹状細胞、幹細胞、赤血球細胞、がん細胞、腫瘍細胞又は内胚葉、中胚葉、外胚葉及び／もしくは神経堤組織に由来する任意の組織から単離された細胞の１つであり得る。細胞は、一次供給源及び／又は二次供給源（例えば、細胞株）由来であってもよい。体液はまた、ポリヌクレオチド、例えば母体血液中を循環する無細胞胎児ポリヌクレオチド又はＤＮＡを含有し得る。
【０１１４】
試料内の核酸は、細胞又は細胞コンパートメントの領域内に位置し得る。細胞の領域又はコンパートメントは、膜、オルガネラ及び／又は細胞質ゾルを含み得る。例えば、膜は、限定されないが、核膜、原形質膜、小胞体膜、細胞壁、細胞膜及び／又はミトコンドリア膜を含むことができる。膜は、完全な膜又は膜の断片を含むことができる。例えば、オルガネラは、限定されないが、核小体、核、葉緑体、色素体、小胞体、粗面小胞体、平滑小胞体、中心体、ゴルジ装置、ミトコンドリア、液胞、先体、オートファゴソーム、セントリオール、繊毛、アイスポット装置、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、リソソーム、メラノソーム、マイトソーム、筋原繊維、パレンテソーム、ペルオキシソーム、プロテアソーム、リボソーム、小胞、カルボキシソーム、クロロソーム、鞭毛、マグネトソーム（ｍａｇｅｎｅｔｏｓｏｍｅ）、核様体、プラスミド、チラコイド、メソソーム、細胞骨格、及び／又は小胞を含み得る。いくつかの実施形態において、オルガネラは、完全な膜又は膜の断片を含み得る。例えば、細胞質ゾルは、原形質膜、細胞膜及び／又は細胞壁によってカプセル化されてもよい。
【０１１５】
試料は、タンパク質に結合していない核酸を含み得る。核酸は、タンパク質結合を減少させ、結合したタンパク質を除去し及び／又はタンパク質結合を防止するための薬剤で処理することができる。いくつかの実施形態において、薬剤は、化学薬品、温度変化源、音エネルギー源、光学エネルギー源、光エネルギー源及び／又は熱エネルギー源であってもよい。いくつかの実施形態において、化学剤は酵素であってもよい。いくつかの実施形態において、酵素は、タンパク質のアミノ酸間の結合を切断することができる。
【０１１６】
核酸を含む試料は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、相補ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、消化されたＤＮＡ、断片化されたＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、二重鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ及び／又は一本鎖ＲＮＡを含み得る。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）は、ウイルス、酵母、細菌、動物及び植物のような種のゲノム全体であり得る。核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）は、さらにより高い生命形態（例えば、ヒトゲノムＤＮＡ）由来であってもよい。いくつかの実施形態において、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）は、１つ以上の染色分体繊維、あるいは生物もしくは細胞の種の少なくとも２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％又は９８％の核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）を含み得る。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、核酸は、抗体又はその断片の重鎖又は軽鎖の核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、核酸は、抗体又はその断片の１を超える重鎖又は軽鎖の核酸配列を含み得る。例えば、抗体は、限定されないが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＹ又はＩｇＭのいずれかのタイプであり得る。核酸は、各抗体が同じサブタイプである１を超える抗体の配列を含有し得る。核酸は、各抗体が異なるサブタイプである１を超える抗体の配列を含有し得る。
【０１１９】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの主要なクラスの免疫グロブリンがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメイン（Ｆｃ）は、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び３次元立体構造は周知である。
【０１２０】
任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ又は（「κ」）及びラムダ又は「λ」と呼ばれる２つの明確に異なるタイプのうちの１つに割り当てることができる。
【０１２１】
用語「抗体の抗原結合部分」、「抗原結合断片」、「抗原結合ドメイン」、「抗体断片」又は「抗体の機能断片」は、本開示において互換的に用いられ、一般的に、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指すことができる。抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれるが、これに限定されない抗体断片の非限定的な例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片；並びに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、それらは、組換え法を用いて、ＶＬ及びＶＨ領域が一価分子（例えば、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ））を形成するように対形成する単一タンパク質鎖として作製され得る合成リンカーによって接続され得る。このような一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図される。特定のｓｃＦｖの任意のＶＨ及びＶＬ配列は、完全なＩｇＧ分子又は他のアイソタイプをコードする発現ベクターを生成するために、ヒト免疫グロブリン定常領域ｃＤＮＡ又はゲノム配列に連結することができる。ＶＨ及びＶＬはまた、タンパク質化学又は組換えＤＮＡ技術のいずれかを用いて、Ｆａｂ、Ｆｖ又は免疫グロブリンの他の断片の生成に使用することができる。ダイアボディのような一本鎖抗体の他の形態もまた包含される。
【０１２２】
「Ｆ（ａｂ’）２」及び「Ｆａｂ」部分は、免疫グロブリン（モノクローナル抗体）をペプシン及びパパインのようなプロテアーゼを用いて処理することにより生成することができ、２つのＨ鎖の各々においてヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の近傍で免疫グロブリンを消化することによって生成される抗体断片を含む。例えば、パパインは、２つのＨ鎖の各々においてヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の上流でＩｇＧを切断して、ＶＬ（Ｌ鎖可変領域）及びＣＬ（Ｌ鎖定常領域）で構成されるＬ鎖並びにＶＨ（Ｈ鎖可変領域）及びＣＨγ１（Ｈ鎖の定常領域のγ１領域）で構成されるＨ鎖断片が、Ｃ末端領域でジスルフィド結合により連結されている２つの相同な抗体断片を生成する。これらの２つの相同な抗体断片の各々をＦａｂ’と呼ぶ。ペプシンはまた、２つのＨ鎖の各々においてヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の下流でＩｇＧを切断して、上記２つのＦａｂ’がヒンジ領域で連結された断片よりわずかに大きい抗体断片を生成する。この抗体断片をＦ（ａｂ’）２と呼ぶ。
【０１２３】
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステイン（複数可）を含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端でいくつかの残基を付加することによりＦａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’について本明細書中の名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片はもともと、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的カップリングもまた知られている。
【０１２４】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小限の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合している１つの重鎖及び１つの軽鎖の可変ドメインの二量体からなる。この構成においては、各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上で抗原結合部位を画定する。集合的に、６つの超可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識して結合する能力を有するが、結合部位全体よりも低い親和性である。
【０１２５】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にするＶＨドメイン及びＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、核酸は抗体の一部を含み得る。例えば、抗体の一部は、相補性決定領域（ＣＤＲ）、可変断片（Ｆｖ）、ａｂ断片（Ｆａｂ）又は結晶化可能な断片（Ｆｃ）であり得る。
【０１２７】
ライブラリー
本明細書で使用するとき、「ライブラリー」は、２つの又は２つ以上の同一ではないが関連するメンバーの集団を含む複数のポリヌクレオチド、タンパク質又は細胞を指す。いくつかの実施形態において、ライブラリーは複合ライブラリーであり得る。「合成ライブラリー」とは、複数の合成ポリヌクレオチド又は上記複数の合成ポリヌクレオチドを含む細胞の集団を指す。「半合成ライブラリー」とは、複数の半合成ポリヌクレオチド又は上記複数の半合成ポリヌクレオチドを含む細胞の集団を指す。
【０１２８】
静的ライブラリーは、典型的には、それらのサイズ及び範囲において制限されている。ファージディスプレイライブラリーは、例えば、１０１２程度のメンバーを提示することができ、リボソームライブラリーは、約１０１６メンバーを潜在的に含むように構築されている。細菌及び哺乳動物細胞の表面上に提示されるライブラリーは、通常、これほど複雑ではなく、典型的には１０９メンバー未満である。さらに、堅牢なライブラリーの構築及び選択には、通常、ライブラリーが数倍の重複を含むことが必要であり、この理論上の複雑性がさらに制限され、このため、ライブラリー全体のスクリーニングが低速で高価なものとなり、いくつかの場合において実用的なものでなくなる。
【０１２９】
これらのレベルの複雑さにもかかわらず、このような静的ライブラリーは、可能な配列空間のわずかな部分だけを、すなわち目的とするポリヌクレオチド領域内の、潜在的な数の可能な並べ換えを探索し得る。例えば、重鎖ＩｇＧ配列は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の相補性領域内に３０超のアミノ酸を含有し得、この一本鎖に２０３０超の可能な並べ換えを与え、最大の潜在的な静的ライブラリーでさえ小さくする。この制限のために、研究者は、タンパク質配列及びライブラリーを進化させるための方法論を探究している。
【０１３０】
本明細書に提供される開示において、試料のライブラリーは、限定されないが、ＸｂａＩ、ＢｓｐＥＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｌＩ及びＡｇｅ１を含む、遺伝子操作された制限部位で単一プライマーによって増幅された抗体断片を、ファージディスプレイ、細菌発現及び哺乳動物発現のための適切なベクターにクローニングすることによって生成され得る。他の制限部位は以下に記載され、本明細書に記載される方法において使用するために考慮される。
【０１３１】
このライブラリーは、以下の特性を有することができる：ｉ）ライブラリーの構築は、特に鋳型の調製が混合プライマーを用いて多重化される場合に容易である。ｉｉ）伝統的なＰＣＲ法を用いて作製されたライブラリーと比較して、１０１０−１０１２まで不偏抗体レパートリーをカバーするライブラリーは潜在的により多様である。伝統的なＰＣＲ増幅は、しばしば最適化するために問題となる、様々なアニーリング温度を有する２つの遺伝子特異的プライマーを必要とする。これは、偏った増幅及び非特異的増幅へと導き、構築されたライブラリーの品質の低下をもたらす。ｉｉｉ）潜在的な多様性がより高いため、実施例において示されるように、複数の抗原を使用して１匹のマウスを免疫し得、単一ライブラリーを使用して各抗原に対する抗体の大きなパネルを単離することができる。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、ライブラリーのタイプは、非ヒト対象（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト、ニワトリ、サメ、ラマ、ウマ、サル、ヤギ、カエル又は魚）由来の抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ断片を含み得る。いくつかの実施形態において、ライブラリーは、非ヒト対象（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト、ニワトリ、サメ、ラマ、ウマ、サル、ヤギ、カエル又は魚）由来の抗体のヒト化ｓｃＦｖ断片を含み得る。
【０１３３】
細胞ベースの発現系には、任意の適切な原核生物又は真核生物の発現系が含まれる。特定の実施形態において、好ましい細胞ベースの発現系は、容易であり、確実に増殖させることができ、適度に速い増殖速度を有し、十分に特徴付けられた発現系を有し、容易であり効率的に形質転換又はトランスフェクトすることができるものである。
【０１３４】
ファージディスプレイ
本開示のいくつかの実施形態において、ライブラリー又は複合ライブラリーは、ファージディスプレイライブラリーを含み得る。「ファージディスプレイ」は、変異ポリペプチドがファージ粒子の、例えば糸状ファージ粒子の表面上のコートタンパク質の少なくとも一部に対して融合タンパク質として提示される技術である。ファージディスプレイの有用性は、ランダム化されたタンパク質変異体の大きなライブラリーが、高い親和性で標的分子に結合する配列に対して迅速であり効率的に選別され得るという事実にある。ファージ上のペプチド及びタンパク質ライブラリーの提示は、特異的結合特性を有するものについて数百万のポリペプチドをスクリーニングするために使用されている。多価ファージディスプレイ法は、糸状ファージの遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩのいずれかへの融合を介して、小さなランダムペプチド及び小さなタンパク質を提示するために用いられている。一価ファージディスプレイにおいて、タンパク質又はペプチドライブラリーは、遺伝子ＩＩＩ又はその一部に融合され、野生型の遺伝子ＩＩＩタンパク質の存在下で低レベルで発現され、それによりファージ粒子が融合タンパク質の１コピーを提示する又は全く提示しない。結合力（ａｖｉｄｉｔｙ）効果は多価ファージと比較して低下し、それにより、選別は内在性リガンド親和性に基づき、ＤＮＡ操作を単純化するファージミドベクターが使用される。
【０１３５】
「ファージミド」は、細菌の複製起点、例えばＣｏ１Ｅ１、及びバクテリオファージの遺伝子間領域のコピーを有するプラスミドベクターである。ファージミドは、糸状バクテリオファージ及びラムドイドバクテリオファージを含む、任意の公知のバクテリオファージ上で使用され得る。一般的に、プラスミドはまた、抗生物質耐性の選択マーカーを含有する。これらのベクターにクローニングされたＤＮＡのセグメントは、プラスミドとして増殖させることができる。ベクターを保有する細胞に、ファージ粒子の生成に必要とされる全ての遺伝子が供給されると、プラスミドの複製様式がローリングサークル複製に変わって、プラスミドＤＮＡ及びパッケージファージ粒子の一本鎖のコピーが生成される。ファージミドは、感染性又は非感染性のファージ粒子を形成し得る。この用語は、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面上に提示されるように、遺伝子融合物として異種ポリペプチド遺伝子に連結されたファージコートタンパク質遺伝子又はその断片を含有するファージミドを含む。
【０１３６】
用語「ファージベクター」とは、異種遺伝子を含有し、複製することができるバクテリオファージの二本鎖複製形態を指すために使用することができる。ファージベクターは、ファージ複製及びファージ粒子形成を可能にするファージ複製起点を有する。ファージは、好ましくは、Ｍ１３、ｆｌ、ｆｄ、Ｐｆ３ファージもしくはその誘導体のような糸状バクテリオファージ、又はラムダ、２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１、８２、４２４、４３４などもしくはその誘導体のラムドイドファージである。
【０１３７】
用語「コートタンパク質」は、ウイルス粒子の表面上に少なくともその一部が存在するタンパク質を意味する。機能的な観点から、コートタンパク質は、宿主細胞におけるウイルスアセンブリプロセス中にウイルス粒子と結合し、アセンブルされたウイルスが別の宿主細胞に感染するまで結合したままである任意のタンパク質である。コートタンパク質は、メジャーコートタンパク質であってもよく又はマイナーコートタンパク質であってもよい。「メジャー」コートタンパク質は、一般的に、タンパク質の好ましくは少なくとも約５コピー、より好ましくは少なくとも約７コピー、さらにより好ましくは少なくとも約１０コピー以上でウイルスコート中に存在するコートタンパク質である。メジャーコートタンパク質は、ビリオンあたり数十、数百又は数千コピーで存在し得る。メジャーコートタンパク質の例は、糸状ファージのｐ８タンパク質である。
【０１３８】
原核生物発現系
これらの一般的なガイドラインにおいて、有用な微生物宿主には、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属（例えば、大腸菌）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、エルウェニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属由来の細菌、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、エシェリキア・コリの様々な菌種（例えば、ＨＢ１０１、（ＡＴＣＣ番号３３６９４）ＤＨ５ａ、ＤＨ１０及びＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ番号５３３３８））が含まれる。
【０１３９】
真核生物発現系
酵母−当業者に公知である酵母細胞の多数の菌株はまた、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、クリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピチカ（Ｐｉｃｈｉａ）属、リノ−スポリジウム（Ｒｈｉｎｏ−ｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属及びシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、並びに他の真菌由来のものを含む、ポリペプチドを発現させるための宿主細胞として利用可能である。好ましい酵母細胞には、例えば、サッカロミセス・セリビサエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）及びピチカ・パストル（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒ）が含まれる。
【０１４０】
昆虫細胞−さらに、必要に応じて、昆虫細胞系を本開示の方法において利用することができる。好ましい昆虫細胞には、Ｓｆ−９及びＨＩ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が含まれる。
【０１４１】
哺乳動物細胞−多数の適切な哺乳動物宿主細胞もまた当該技術分野において公知であり、多くは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ．２０１１０−２２０９から入手可能である。例としては、限定されないが、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ−細胞（Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７巻：４２１６−４２２０頁（１９８０年））、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３もしくは２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞又は３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ９２）が挙げられる。適切な哺乳動物宿主細胞の選択、並びに形質転換、培養、増幅、スクリーニング並びに生成物の産生及び精製のための方法は、当該技術分野において公知である。他の適切な哺乳動物細胞株は、サルＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０）及びＣＯＳ−７細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）及びＣＶ−１細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７０）である。さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞には、形質転換細胞株を含む、霊長類細胞株及びげっ歯類細胞株が挙げられる。正常な二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養に由来する細胞株、及び初代外植体もまた適している。候補細胞は、選択遺伝子において遺伝子型欠損であり得る又は優性に作用する選択遺伝子を含有し得る。他の適切な哺乳動物細胞株には、限定されないが、ＡＴＣＣから利用可能である、マウス神経芽腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ由来の３Ｔ３株、ＢＡＬＢ／ｃもしくはＮＨＴマウス、ＢＨＫ又はＨａＫハムスター細胞株が含まれる。これらの細胞株の各々は、タンパク質発現によって公知であり、タンパク質発現に利用可能である。
【０１４２】
さらに興味深いのは、リンパ球又はリンパ球由来の細胞株であって、例えば、プレＢリンパ球起源の細胞株である。具体例は、限定されないが、ＲＡＭＯＳ（ＣＲＬ−１５９６）、Ｄａｕｄｉ（ＣＣＬ−２１３）、ＥＢ−３（ＣＣＬ−８５）、ＤＴ４０（ＣＲＬ−２１１１）、１８−８１（Ｊａｃｋら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ（１９８８年）８５巻、１５８１−１５８５頁）、Ｒａｊｉ細胞（ＣＣＬ−８６）及びそれらの誘導体が挙げられる。
【０１４３】
代表的な市販のウイルス発現ベクターには、限定されないが、Ｃｒｕｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．から入手可能なアデノウイルス系Ｐｅｒ．Ｃ６システム、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のレンチウイルス系ｐＬＰ１、及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のレトロウイルスベクターｐＦＢ−ＥＲＶプラスｐＣＦＢ−ＥＧＳＨが含まれる。
【０１４４】
本明細書に記載されているライブラリーの発現に適したエピソーム発現ベクターは、宿主細胞中で複製することができ、適切な選択圧の存在下、宿主細胞内で染色体外エピソームとして持続する。（例えば、Ｃｏｎｅｓｅら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１１巻、１７３５−１７４２頁（２００４年）を参照されたい）。代表的な市販のエピソーム発現ベクターには、限定されないが、エプスタインバー核抗原１（ＥＢＮＡ１）及びエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）複製起点（ｏｒｉＰ）を利用するエピソームプラスミドが含まれ、具体例としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のベクターｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ７が挙げられる。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のベクターｐｃＤＮＡ３．１及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のｐＢＫ−ＣＭＶは、ＥＢＮＡ１及びｏｒｉＰの代わりに、Ｔ抗原及びＳＶ４０複製起点を使用するエピソームベクターの非制限的な例を示す。
【０１４５】
本開示のいくつかの実施形態において、ライブラリーを用いて、クローン系統特異的マーカータンパク質（ＣＬＳＭＰ）に対する親和性（例えば、高親和性）を有する１つ以上の断片抗原結合（ｆＡｂ）ドメインを選択することができる。例えば、対象から腫瘍試料を得た後、次世代配列決定を行って、腫瘍に由来する細胞によって発現されるＣＬＳＭＰの配列を決定することができる。配列決定後、ＣＬＳＭＰは、タンパク質として発現され、基質上に（例えば、アレイの形態で）固定化され、複合ライブラリーから選択される複数のｆＡｂドメインと接触させて、どのｆＡｂ（複数可）がＣＬＳＭＰに対する高い結合親和性を有し得るかを決定することができる。ＣＬＳＭＰに結合する親和性を有する１つ以上のｆＡｂを同定した後、同定されたｆＡｂを有する構築物又は抗体を生成することができる。
【０１４６】
オリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドが、本明細書に記載の方法において（例えば、対象由来の試料を配列決定する又はライブラリーを調製するために）使用され得る。一部の実施形態では、１種のオリゴヌクレオチドが使用され得る。一部の実施形態では、１種を超えるオリゴヌクレオチドが使用され得る。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０種のオリゴヌクレオチドが使用され得る。一部の実施形態では、１０種を超えるオリゴヌクレオチドが使用され得る。例えば、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９及び／又は第１０のオリゴヌクレオチドが使用され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アダプターオリゴヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、アダプターオリゴヌクレオチドは、アダプターオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドにアニールする前に、一緒にアニールされてもよい。一部の実施形態では、アダプターオリゴヌクレオチドは、アダプターオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドにライゲートする前に、一緒にアニールされてもよい。
【０１４７】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、複数のヌクレオチドを含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９  ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９  ５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００個のヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９  ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９  ５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５個を超える又は１００個を超えるヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９  ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９  ５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５個未満又は１００個未満のヌクレオチドを含み得る。
【０１４８】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、所望の配列を含み得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つを超える所望の配列を含み得る。例えば、所望の配列は、制限エンドヌクレアーゼ制限部位、所定の配列、相補配列、既知の配列、プライマー結合配列、ユニバーサル配列又は検出配列であり得る。一部の実施形態では、所定の配列は、ユニバーサル配列であり得る。
【０１４９】
一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、１つを超える所望の配列をポリヌクレオチドに付加して人工鋳型を作製するために使用され得る。一部の実施形態では、所望の配列は、所定の配列であり得る。例えば、所定の配列は、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９又は第１０の所定の配列であり得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド内の任意の所定の配列は、オリゴヌクレオチドの５’端の近くに配置され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド内の任意の所定の配列は、オリゴヌクレオチドの３’端の近くに配置され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド内の任意の所定の配列は、オリゴヌクレオチドの中央の近くに配置され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの第１の所定の配列は、オリゴヌクレオチドの５’端の近くに配置され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの第１の所定の配列は、オリゴヌクレオチドの３’端の近くに配置され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの第１の所定の配列は、オリゴヌクレオチドの中央の近くに配置され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの第２の所定の配列は、オリゴヌクレオチドの５’端の近くに配置され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの第２の所定の配列は、オリゴヌクレオチドの３’端の近くに配置され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの第２の所定の配列は、オリゴヌクレオチドの中央の近くに配置され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの第３の所定の配列は、オリゴヌクレオチドの５’端の近くに配置され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの第３の所定の配列は、オリゴヌクレオチドの３’端の近くに配置され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの第３の所定の配列は、オリゴヌクレオチドの中央の近くに配置され得る。
【０１５０】
一部の実施形態では、第１の所定の配列及び第２の所定の配列は、第１又は第２のポリヌクレオチド内の任意の配列に実質的に類似していない。
【０１５１】
一部の実施形態では、所望の配列は、オリゴヌクレオチドの長さ未満の任意の長さのヌクレオチドであり得る。例えば、所望の配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９  ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９  ５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９個のヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、所望の配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９  ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９  ５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０個を超える又は９５個を超えるヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、所望の配列は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９  ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９  ５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０個未満又は９５個未満のヌクレオチドを含み得る。
【０１５２】
オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド内に含まれる、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド内の任意の部位に位置し得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’端に存在し得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’端に存在し得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’端の実質的に近くに存在し得る。例えば、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドの３’端は、オリゴヌクレオチドの中央から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８又は４９個のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’端の実質的に近くに存在し得る。例えば、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドの５’端は、オリゴヌクレオチドの中央から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８又は４９個のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの中央に存在し得る。
【０１５３】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さ未満の任意の長さのヌクレオチドであり得る。例えば、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９  ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９  ５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９個のヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９  ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９  ５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０個を超える又は９５個を超えるヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９  ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９  ５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０個未満又は９５個未満のヌクレオチドを含み得る。
【０１５４】
オリゴヌクレオチド内に含まれるポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド内の任意の部位に位置し得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’端に存在し得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’端に存在し得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’端の実質的に近くに存在し得る。例えば、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドの３’端は、オリゴヌクレオチドの中央から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８又は４９個のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’端の実質的に近くに存在し得る。例えば、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドの５’端は、オリゴヌクレオチドの中央から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８又は４９個のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの中央に存在し得る。
【０１５５】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つの部分を有し得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つを超える部分を有し得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９又は第１０の部分を有し得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの任意の部分は、オリゴヌクレオチドの５’端の近くに配置され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの任意の部分は、オリゴヌクレオチドの３’端の近くに配置され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの任意の部分は、オリゴヌクレオチドの中央の近くに配置され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの第１の部分は、オリゴヌクレオチドの５’端の近くに配置され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの第１の部分は、オリゴヌクレオチドの３’端の近くに配置され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの第１の部分は、オリゴヌクレオチドの中央の近くに配置され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの第２の部分は、オリゴヌクレオチドの５’端の近くに配置され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの第２の部分は、オリゴヌクレオチドの３’端の近くに配置され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの第２の部分は、オリゴヌクレオチドの中央の近くに配置され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの第３の部分は、オリゴヌクレオチドの５’端の近くに配置され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの第３の部分は、オリゴヌクレオチドの３’端の近くに配置され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの第３の部分は、オリゴヌクレオチドの中央の近くに配置され得る。
【０１５６】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、所望の配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに接触されてもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、限定されないが、ポリヌクレオチドにハイブリダイズ、アニール又はライゲートされてもよい。例えば、所望の配列（例えば、所定の配列）を有するオリゴヌクレオチドは、酵素を使用して、ポリヌクレオチドにライゲートされてもよい。例えば、酵素は、リガーゼ（例えば、ＤＮＡリガーゼ）であり得る。一部の実施形態では、所定の配列を含むオリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの３’端又は５’端にライゲートされてもよい。一部の実施形態では、１つを超える所定の配列が、ポリヌクレオチドにライゲートされてもよい。例えば、第１の所定の配列が、ポリヌクレオチドの一端にライゲートされてもよく、第２の所定の配列が、ポリヌクレオチドの他端にライゲートされてもよい。一部の実施形態では、第１の所定の配列は、第２の所定の配列に相補的であり得る。一部の実施形態では、第１の所定の配列は、第２の所定の配列に逆相補的であり得る。一部の実施形態では、第１の所定の配列は、第２の所定の配列に相補的でなくてもよい。
【０１５７】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドへの少なくとも１つの所定の配列の付加は、鋳型（例えば、人工鋳型）を作製し得る。例えば、鋳型は、鋳型内のポリヌクレオチドを増幅するように設計された任意の方法で使用され得る。所定の配列は、ポリヌクレオチドのプライマー増幅において使用されてもよい。一部の実施形態では、単一のプライマーは、ポリヌクレオチドに位置する少なくとも１つの所定の配列にアニールされてもよい。別の実施形態では、１つを超えるプライマーが、ポリヌクレオチドに位置する少なくとも１つの所定の配列にアニールされてもよい。
【０１５８】
一部の実施形態では、制限エンドヌクレアーゼ制限部位は、オリゴヌクレオチド内に位置してもよい。例えば、制限エンドヌクレアーゼ制限部位は、制限エンドヌクレアーゼによって認識される任意の部位にあってよく、ここでオリゴヌクレオチド内の制限エンドヌクレアーゼ制限部位は、ポリヌクレオチドにとって本来の制限エンドヌクレアーゼ制限部位である。例えば、以下に限定されないが、以下の制限エンドヌクレアーゼのいずれか１つによって認識される任意の部位が使用され得る；Ａａｒ  Ｉ、Ｂａｎ  ＩＩ、ＢｓｅＧ  Ｉ、ＢｓｐＰ  Ｉ、Ｃｆｒ  Ｉ、ＥｃｏＮ  Ｉ、Ｈｓｐ９２  ＩＩ、Ｎｌａ  ＩＶ、Ｒｓａ  Ｉ、Ｔａｉ  Ｉ、Ａａｓ  Ｉ、Ｂｂｓ  Ｉ、ＢｓｅＪ  Ｉ、ＢｓｐＴ  Ｉ、Ｃｌａ  Ｉ、ＥｃｏＯ１０９  Ｉ、Ｉ−Ｐｐｏ  Ｉ、ＮｍｕＣ  Ｉ、Ｒｓｒ  ＩＩ、Ｔａｑａ  Ｉ、Ａａｔ  ＩＩ、Ｂｂｕ  Ｉ、ＢｓｅＬ  Ｉ、ＢｓｒＢ  Ｉ、Ｃｐｏ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉ、Ｋａｓ  Ｉ、Ｎｏｔ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｔａｑ  Ｉ、Ａｃｃ６５  Ｉ、ＢｂｖＣ  Ｉ、ＢｓｅＭ  Ｉ、ＢｓｒＤ  Ｉ、Ｃｓｐ４５  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｖ、Ｋｐｎ２  Ｉ、Ｎｒｕ  Ｉ、Ｓａｃ  ＩＩ、Ｔａｓ  Ｉ、ＡｃｃＢ７  Ｉ、Ｂｂｖ  Ｉ、ＢｓｅＭ  ＩＩ、ＢｓｒＦ  Ｉ、Ｃｓｐ６  Ｉ、Ｅｈｅ  Ｉ、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｎｓｂ  Ｉ、Ｓａｌ  Ｉ、Ｔａｔ  Ｉ、Ａｃｃ  Ｉ、Ｂｃｅ  Ａ  Ｉ、ＢｓｅＮ  Ｉ、ＢｓｒＧ  Ｉ、Ｃｓｐ  Ｉ、Ｅｓｐ３  Ｉ、ＫｓｐＡ  Ｉ、Ｎｓｉ  Ｉ、Ｓａｐ  Ｉ、Ｔａｕ  Ｉ、Ａｃｃ  ＩＩＩ、Ｂｅｇ  Ｉ、ＢｓｅＲ  Ｉ、Ｂｓｒ  Ｉ、Ｄｄｅ  Ｉ、Ｆａｕ  Ｉ、Ｌｗｅ  Ｉ、Ｎｓｐ  Ｉ、Ｓａｔ  Ｉ、Ｔｆｉ  Ｉ、Ａｃｉ  Ｉ、Ｂｃｉ  ＶＩ、ＢｓｅＳ  Ｉ、ＢｓｒＳ  Ｉ、Ｄｐｎ  Ｉ、Ｆｎｕ４Ｈ  Ｉ、Ｍｂｉ  Ｉ、Ｏｌｉ  Ｉ、Ｓａｕ３  Ａ  Ｉ、Ｔｌｉ  Ｉ、ＡＣＬ  Ｉ、ＢＣＬ  Ｉ、ＢｓｅＸ  Ｉ、ＢｓｓＨ  ＩＩ、Ｄｐｎ  ＩＩ、Ｆｏｋ  Ｉ、Ｍｂｏ  Ｉ、Ｐａｃ  Ｉ、Ｓａｕ９６  Ｉ、Ｔｒｕｌ  Ｉ、Ａｄｅ  Ｉ、Ｂｃｎ  Ｉ、ＢｓｅＹ  Ｉ、ＢｓｓＫ  Ｉ、Ｄｒａ  Ｉ、Ｆｓｅ  Ｉ、Ｍｂｏ  ＩＩ、Ｐａｅ  Ｉ、Ｓｂｆ  Ｉ、Ｔｒｕ９  Ｉ、Ａｆｅ  Ｉ、Ｂｃｕ  Ｉ、Ｂｓｇ  Ｉ、ＢｓｓＳ  Ｉ、Ｄｒａ  ＩＩＩ、ＦｓｐＡ  Ｉ、Ｍｆｅ  Ｉ、ＰａｅＲ７  Ｉ、Ｓｃａ  Ｉ、Ｔｓｅ  Ｉ、Ａｆｌ  ＩＩ、Ｂｆａ  Ｉ、Ｂｓｈ１２３６  Ｉ、Ｂｓｔ  １１７  Ｉ、Ｄｒｄ  Ｉ、Ｆｓｐ  Ｉ、Ｍｌｓ  Ｉ、Ｐａｇ  Ｉ、Ｓｃｈ  Ｉ、Ｔｓｐ４５  Ｉ、Ａｆｌ  ＩＩＩ、Ｂｆｉ  Ｉ、Ｂｓｈ１２８５  Ｉ、Ｂｓｔ９８  Ｉ、Ｅａｅ  Ｉ、Ｇｓｕ  Ｉ、Ｍｌｕ  Ｉ、Ｐａｕ  Ｉ、ＳｃｒＦ  Ｉ、Ｔｓｐ５０９  Ｉ、Ａｇｅ  Ｉ、Ｂｆｍ  Ｉ、ＢｓｈＮ  Ｉ、ＢｓｔＡＰ  Ｉ、Ｅａｇ  Ｉ、Ｈａｅ  ＩＩ、Ｍｌｙ  Ｉ、Ｐｃｉ  Ｉ、Ｓｄａ  Ｉ、ＴｓｐＲ  Ｉ、Ａｈｄ  Ｉ、ＢｆｒＢ  Ｉ、ＢｓｈＴ  Ｉ、ＢｓｔＢ  Ｉ、Ｅａｍ  １１０４  Ｉ、Ｈａｅ  ＩＩＩ、Ｍｍｅ  Ｉ、Ｐｄｉ  Ｉ、Ｓｄｕ  Ｉ、Ｔｔｈ１  １１  Ｉ、Ａｌｅ  Ｉ、ＢｆｕＡ  Ｉ、ＢｓｉＥ  Ｉ、ＢｓｔＥ  ＩＩ、Ｅａｍ  １１０５  Ｉ、Ｈｇａ  Ｉ、Ｍｎｌ  Ｉ、Ｐｄｍ  Ｉ、ＳｅｘＡ  Ｉ、ＴｕｒｂｏＮａｅ  Ｉ、Ａｌｏ  Ｉ、ＢｆｕＣ  Ｉ、ＢｓｉＨＫＡ  Ｉ、ＢｓｔＦ５  Ｉ、Ｅａｒ  Ｉ、Ｈｈａ  Ｉ、Ｍｐｈ１  １０３  Ｉ、Ｐｆｌ２３  ＩＩ、ＳｆａＮ  Ｉ、ＴｕｒｂｏＮａｒ  Ｉ、Ａｌｕ  Ｉ、Ｂｆｕ  Ｉ、ＢｓｉＷ  Ｉ、ＢｓｔＮ  Ｉ、Ｅｃｉ  Ｉ、Ｈ��ｎ１  Ｉ、Ｍｓｃ  Ｉ、ＰｆｌＦ  Ｉ、Ｓｆｃ  Ｉ、Ｖａｎ９１  Ｉ、Ａｌｗ２１  Ｉ、Ｂｇｌ  Ｉ、Ｂｓｌ  Ｉ、ＢｓｔＯ  Ｉ、Ｅｃｌ１３６  ＩＩ、Ｈｉｎ４  Ｉ、Ｍｓｅ  Ｉ、ＰｆｌＭ  Ｉ、Ｓｆｉ  Ｉ、Ｖｓｐ  Ｉ、Ａｌｗ２６  Ｉ、Ｂｇｌ  ＩＩ、ＢｓｍＡ  Ｉ、ＢｓｔＵ  Ｉ、ＥｃｌＨＫ  Ｉ、Ｈｉｎ６  Ｉ、Ｍｓｌ  Ｉ、Ｐｆｏ  Ｉ、Ｓｆｏ  Ｉ、Ｘａｇ  Ｉ、Ａｌｗ４４  Ｉ、Ｂｌｐ  Ｉ、ＢｓｍＢ  Ｉ、ＢｓｔＸ  Ｉ、Ｅｃｏ１０５  Ｉ、Ｈｉｎｃ  ＩＩ、ＭｓｐＡ１  Ｉ、Ｐｌｅ  Ｉ、Ｓｇｆ  Ｉ、Ｘａｐ  Ｉ、Ａｌｗ  Ｉ、Ｂｍｅ１３９０  Ｉ、ＢｓｍＦ  Ｉ、ＢｓｔＹ  Ｉ、Ｅｃｏ１３０  Ｉ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｍｓｐ  Ｉ、Ｐｍｅ  Ｉ、ＳｇｒＡ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ、ＡｌｗＮ  Ｉ、Ｂｏｘ  Ｉ、Ｂｓｍ  Ｉ、ＢｓｔＺ  Ｉ、Ｅｃｏ１４７  Ｉ、Ｈｉｎｆ  Ｉ、Ｍｓｓ  Ｉ、Ｐｍｌ  Ｉ、Ｓｉｎ  Ｉ、Ｘｃｅ  Ｉ、Ａｐａ  Ｉ、Ｂｐｉ  Ｉ、ＢｓｏＢ  Ｉ、Ｂｓｕ１５  Ｉ、Ｅｃｏ２４  Ｉ、ＨｉｎＰ１  Ｉ、Ｍｕｎ  Ｉ、Ｐｐｉ  Ｉ、Ｓｍａ  Ｉ、Ｘｃｍ  Ｉ、ＡｐａＬ  Ｉ、Ｂｐｌ  Ｉ、Ｂｓｐ１  １９  Ｉ、Ｂｓｕ３６  Ｉ、Ｅｃｏ３１  Ｉ、Ｈｐａ  Ｉ、Ｍｖａ１２６９  Ｉ、ＰｐｕＭ  Ｉ、Ｓｍｉ  Ｉ、Ｘｈｏ  Ｉ、Ａｐｏ  Ｉ、Ｂｐｕ１０  Ｉ、Ｂｓｐ１２０  Ｉ、ＢｓｕＲ  Ｉ、Ｅｃｏ３２  Ｉ、Ｈｐａ  ＩＩ、Ｍｖａ  Ｉ、ＰｓｈＡ  Ｉ、Ｓｍｌ  Ｉ、Ｘｈｏ  ＩＩ、Ａｓｃ  Ｉ、Ｂｐｕ１  １０２  Ｉ、Ｂｓｐ１２８６  Ｉ、Ｂｔｇ  Ｉ、Ｅｃｏ４７  Ｉ、Ｈｐｈ  Ｉ、Ｍｗｏ  Ｉ、Ｐｓｉ  Ｉ、Ｓｍｕ  Ｉ、Ｘｍａ  Ｉ、Ａｓｅ  Ｉ、ＢｓａＡ  Ｉ、Ｂｓｐ１４０７  Ｉ、Ｂｔｓ  Ｉ、Ｅｃｏ４７  ＩＩＩ、Ｈｐｙ１８８  Ｉ、Ｎａｅ  Ｉ、Ｐｓｐ１４０６  Ｉ、ＳｎａＢ  Ｉ、ＸｍａＪ  Ｉ、ＡｓｉＳ  Ｉ、ＢｓａＢ  Ｉ、Ｂｓｐ１４３  Ｉ、Ｂｖｅ  Ｉ、Ｅｃｏ５２  Ｉ、Ｈｐｙ１  ８８  ＩＩＩ、Ｎａｒ  Ｉ、Ｐｓｐ５  ＩＩ、Ｓｐｅ  Ｉ、Ｘｍｉ  Ｉ、Ａｖａ  Ｉ、ＢｓａＨ  Ｉ、Ｂｓｐ１４３  ＩＩ、Ｃａｃ８  Ｉ、Ｅｃｏ５７  Ｉ、Ｈｐｙ８  Ｉ、Ｎｃｉ  Ｉ、ＰｓｐＧ  Ｉ、Ｓｐｈ  Ｉ、Ｘｍｎ  Ｉ、Ａｖａ  ＩＩ、Ｂｓａ  Ｉ、Ｂｓｐ６８  Ｉ、Ｃａｉ  Ｉ、Ｅｃｏ５７Ｍ  Ｉ、Ｈｐｙ９９  Ｉ、Ｎｃｏ  Ｉ、ＰｓｐＯＭ  Ｉ、Ｓｓｐ  Ｉ、Ａｖｒ  ＩＩ、ＢｓａＪ  Ｉ、ＢｓｐＤ  Ｉ、Ｃｆｏ  Ｉ、Ｅｃｏ７２  Ｉ、ＨｐｙＣＨ４  ＩＩＩ、Ｎｄｅ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｓｔｕ  Ｉ、Ｂａｅ  Ｉ、ＢｓａＭ  Ｉ、ＢｓｐＥ  Ｉ、Ｃｆｒ１０  Ｉ  Ｅｃｏ８１  Ｉ  ＨｐｙＣＨ４  ＩＶ、Ｎｄｅ  ＩＩ、Ｐｓｕ  Ｉ、ＳｔｙＤ４  Ｉ、Ｂａｌ  Ｉ、ＢｓａＷ  Ｉ、ＢｓｐＨ  Ｉ、Ｃｆｒ１３  Ｉ、Ｅｃｏ８８  Ｉ、ＨｐｙＣＨ４  Ｖ、ＮｇｏＭ  ＩＶ、Ｐｓｙ  Ｉ、Ｓｔｙ  Ｉ、ＢａｍＨ  Ｉ、ＢｓａＸ  Ｉ、ＢｓｐＬ  Ｉ、Ｃｆｒ４２  Ｉ、Ｅｃｏ９１  Ｉ、ＨｐｙＦ１０  ＶＩ、Ｎｈｅ  Ｉ、Ｐｖｕ  Ｉ、Ｓｗａ  Ｉ、Ｂａｎ  Ｉ、ＢｓｅＤ  Ｉ、ＢｓｐＭ  Ｉ、Ｃｆｒ９  Ｉ、ＥｃｏＩＣＲ  Ｉ、Ｈｓｐ９２  Ｉ、Ｎｌａ  ＩＩＩ、Ｐｖｕ  ＩＩ、Ｔａａ  Ｉ、Ｂｌｎ  Ｉ、及びＰｓｐＸ  Ｉ。
【０１５９】
一部の実施形態では、制限部位は、１つの制限エンドヌクレアーゼに対して特有であり得る。一部の実施形態では、制限部位は、１つを超える制限エンドヌクレアーゼによって認識され得る。一部の実施形態では、制限部位は、平滑切断（ｂｌｕｎｔ−ｃｕｔ）制限エンドヌクレアーゼによって認識され得る。一部の実施形態では、制限部位は、突出切断（ｓｔｉｃｋｙ−ｃｕｔ）制限エンドヌクレアーゼによって認識され得る。
【０１６０】
プライマー
本明細書で提供される開示において、少なくとも１つのプライマーが、（例えば、対象由来の試料を配列決定する又はライブラリーを調製するために）使用され得る。一部の実施形態では、１種のプライマーが使用され得る。一部の実施形態では、１種を超えるプライマーが使用され得る。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０種のプライマーが使用され得る。一部の実施形態では、１０種を超えるプライマーが使用され得る。例えば、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９及び／又は第１０のプライマーが使用され得る。
【０１６１】
一部の実施形態では、プライマーは、複数のヌクレオチドを含み得る。例えば、プライマーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９  ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９  ５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００個のヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、プライマーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９  ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９  ５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５個を超える又は１００個を超えるヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、プライマーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９  ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９  ５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５個未満又は１００個未満のヌクレオチドを含み得る。
【０１６２】
一部の実施形態では、プライマーは、所望の配列を含み得る。一部の実施形態では、プライマーは、１つを超える所望の配列を含み得る。例えば、所望の配列は、所定の配列、相補配列、既知の配列、結合配列、ユニバーサル配列又は検出配列であり得る。一部の実施形態では、所定の配列は、ユニバーサル配列であり得る。
【０１６３】
一部の実施形態では、所望の配列は、プライマーの長さ未満の任意の長さのヌクレオチドであり得る。例えば、所望の配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９  ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９  ５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９個のヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、所望の配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９  ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９  ５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０個を超える又は９５個を超えるヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、所望の配列は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９  ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９  ５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０個未満又は９５個未満のヌクレオチドを含み得る。
【０１６４】
プライマーは、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、プライマー内に含まれるポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、プライマー内の任意の部位に位置し得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、プライマーの３’端に存在し得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、プライマーの５’端に存在し得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、プライマーの３’端の実質的に近くに存在し得る。例えば、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドの３’端は、プライマーの中央から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８又は４９個のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、プライマーの５’端の実質的に近くに存在し得る。例えば、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドの５’端は、プライマーの中央から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８又は４９個のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、プライマーの中央に存在し得る。
【０１６５】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、プライマーの長さ未満の任意の長さのヌクレオチドであり得る。例えば、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９  ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９  ５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９個のヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９  ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９  ５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０個を超える又は９５個を超えるヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９  ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９  ５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０個未満又は９５個未満のヌクレオチドを含み得る。
【０１６６】
プライマー内に含まれるポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、プライマー内の任意の部位に位置し得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、プライマーの３’端に存在し得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、プライマーの５’端に存在し得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、プライマーの３’端の実質的に近くに存在し得る。例えば、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドの３’端は、プライマーの中央から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８又は４９個のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、プライマーの５’端の実質的に近くに存在し得る。例えば、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドの５’端は、プライマーの中央から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８又は４９個のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合するヌクレオチドは、プライマーの中央に存在し得る。
【０１６７】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、所望の配列を含む少なくとも１つのプライマーに接触されてもよい。一部の実施形態では、プライマーは、限定されないが、ポリヌクレオチドにハイブリダイズ又はアニールされてもよい。例えば、所望の配列（例えば、所定の配列）を有するプライマーは、酵素を使用して、ポリヌクレオチドを増幅するために使用されてもよい。例えば、酵素は、ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）であり得る。一部の実施形態では、所定の配列を含むプライマーは、ポリヌクレオチドの３’端又は５’端にアニール又はハイブリダイズされてもよい。一部の実施形態では、１つを超える所定の配列が、ポリヌクレオチドにアニール又はハイブリダイズされてもよい。例えば、第１の所定の配列が、ポリヌクレオチドの一端にアニール又はハイブリダイズされてもよく、第２の所定の配列が、ポリヌクレオチドの他端にアニール又はハイブリダイズされてもよい。一部の実施形態では、第１の所定の配列は、第２の所定の配列に相補的であり得る。一部の実施形態では、第１の所定の配列は、第２の所定の配列に逆相補的であり得る。一部の実施形態では、第１の所定の配列は、第２の所定の配列に相補的でなくてもよい。
【０１６８】
一部の実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド及び少なくとも１つのプライマーが、ポリヌクレオチドが１つを超える所定の配列を含むようにポリヌクレオチドから鋳型を作製するために使用され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのみが、ポリヌクレオチドが１つを超える所定の配列を含むようにポリヌクレオチドから鋳型を作製するために使用され得る。一部の実施形態では、プライマーのみが、ポリヌクレオチドが１つを超える所定の配列を含むようにポリヌクレオチドから鋳型を作製するために使用され得る。
【０１６９】
核酸分子
本開示は、１つ以上のＢＦＰ又はＴＦＰ構築物をコードする核酸分子をさらに提供する。一態様では、核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。一態様では、核酸分子は、ＤＮＡ構築物として提供される。
【０１７０】
所望の分子をコードする核酸配列は、例えば、遺伝子を発現する細胞由来のライブラリーをスクリーニングすることによる方法、この配列を含むことが既知のベクターから遺伝子を誘導することによる方法、又はこの配列を含む細胞及び組織から標準技術を使用して直接単離することによる方法のような、当該分野で既知の組換え方法を使用して得ることができる。代替的に、目的の遺伝子は、クローニングではなく合成的に製造されてもよい。
【０１７１】
本開示は、本開示のＤＮＡが挿入されているベクターをさらに提供する。レンチウイルスのようなレトロウイルス由来のベクターは、導入遺伝子の長期的な安定的組込み及び娘細胞におけるその増殖を可能にすることから、長期的遺伝子移入を達成するための適切なツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞のような非増殖細胞に形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスのようなオンコ−レトロウイルス由来のベクターを上回るさらなる利点を有する。レンチウイルスベクターは、低免疫原性というさらなる利点も有する。
【０１７２】
別の実施形態では、本開示の所望のＢＦＰ又はＴＦＰをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター（Ａ５／３５）である。別の実施形態では、ＢＦＰ又はＴＦＰをコードする核酸の発現は、スリーピングビューティー、クリスパー、ＣＡＳ９及びジンクフィンガーヌクレアーゼのようなトランスポゾンを使用して達成することができる。
【０１７３】
本開示の発現構築物はまた、標準的な遺伝子送達プロトコールを使用して、核酸免疫化及び遺伝子治療のために使用され得る。遺伝子送達のための方法は、当該分野で既知である。別の実施形態では、本開示は、遺伝子治療ベクターを提供する。
【０１７４】
核酸は、いくつかの種類のベクターにクローニングされてもよい。例えば、核酸は、限定されないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミドを含むベクターにクローニングされ得る。特定の目的のベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター及び配列決定ベクターを含む。
【０１７５】
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に与えられてもよい。ウイルスベクター技術は、当該分野で周知である。ベクターとして有用なウイルスは、限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びレンチウイルスを含む。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能する複製起源、プロモーター配列、都合の良い制限エンドヌクレアーゼ部位及び１つ以上の選択マーカーを含む。
【０１７６】
いくつかのウイルスに基づく系が、哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発されてきた。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための便利なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、ベクターに挿入され、当該分野で既知の技術を使用してレトロウイルス粒子にパッケージングされてもよい。次いで、組換えウイルスが単離され、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏのいずれかで対象の細胞に送達され得る。いくつかのレトロウイルス系は当該分野で既知である。一部の実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。いくつかのアデノウイルスベクターは当該分野で既知である。一実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。
【０１７７】
さらなるプロモーターエレメント、例えばエンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。通常、これらは開始部位の３０−１１０ｂｐ上流領域に位置しているが、いくつかのプロモーターは、同様に開始部位の下流に機能エレメントを含むことが示されている。プロモーターエレメント間のスペーシングは、エレメントが互いに対して反転又は移動するときにプロモーター機能が保存されるように、柔軟であることが多い。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターにおいて、プロモーターエレメント間のスペーシングは、活性が低下し始める前に５０ｂｐ離して増加されてもよい。プロモーターに依存して、個々のエレメントは、転写を活性化するために協調して又は個々にのいずれかで機能することができるようである。
【０１７８】
哺乳動物Ｔ細胞においてＴＦＰ導入遺伝子を発現することができるプロモーターの例は、ＥＦ１ａプロモーターである。天然のＥＦ１ａプロモーターは、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素的送達を担う伸長因子１複合体のアルファサブユニットの発現を駆動する。ＥＦ１ａプロモーターは、哺乳動物発現プラスミドにおいて広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローニングされた導入遺伝子からのＴＦＰ発現の駆動に有効であることが示されている。プロモーターの別の例は、即時初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、作動可能に連結されている任意のポリヌクレオチド配列の高レベル発現を駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。しかしながら、他の構成的プロモーター配列が使用されてもよく、例えば、限定されないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン−バーウイルス即時初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、並びに、限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子１ａプロモーター、ヘモグロビンプロモーター及びクレアチンキナーゼプロモーターのようなヒト遺伝子プロモーターが使用され得る。さらに、本開示は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきでない。誘導的プロモーターも本開示の一部として企図されている。誘導的プロモーターの使用は、作動可能に連結されているポリヌクレオチド配列の発現を、そのような発現が所望されるときはオンに、発現が所望されないときはオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導的プロモーターの例は、限定されないが、メタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター及びテトラサイクリン調節プロモーターを含む。
【０１７９】
ＢＦＰもしくはＴＦＰポリペプチド又はこれらの部分の発現を評価するために、細胞内に導入される発現ベクターは、ウイルスベクターを通じてトランスフェクション又は感染しようとする細胞の集団から発現細胞を同定及び選択することを容易にする選択マーカー遺伝子もしくはリポーター遺伝子のいずれか又はこれらの両方を含むこともできる。別の態様では、選択マーカーは、別個のＤＮＡ片に運ばれ、コトランスフェクション手法に使用されてもよい。選択マーカー及びリポーター遺伝子の両方が、宿主細胞における発現を可能にするための適切な調節配列に隣接していてもよい。有用な選択マーカーは、例えば、ｎｅｏのような抗生物質耐性遺伝子などを含む。
【０１８０】
リポーター遺伝子は、トランスフェクションされる可能性のある細胞を同定するために及び調節配列の機能を評価するために使用される。一般に、リポーター遺伝子は、レシピエント生物もしくは組織に存在しない又はレシピエント生物もしくは組織によって発現されない遺伝子であり、その発現が何らかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によって明らかにされるポリペプチドをコードする遺伝子である。リポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入されてから適切な時間後にアッセイされる。適切なリポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼをコードする遺伝子又は緑色蛍光タンパク質遺伝子を含み得る。適切な発現系は周知であり、既知の技術を使用して調製することができる又は商業的に得ることができる。一般に、リポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小の５’フランキング領域を有する構築物が、プロモーターとして特定される。そのようなプロモーター領域は、リポーター遺伝子に連結されてもよく、プロモーター駆動転写を調節する能力について作用剤を評価するために使用されてもよい。
【０１８１】
遺伝子を細胞に導入し、発現する方法は、当該分野で既知である。発現ベクターの文脈において、ベクターは、当該分野における任意の方法によって、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母又は昆虫細胞に容易に移入され得る。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的又は生物学的手段によって宿主細胞に導入され得る。
【０１８２】
ポリヌクレオチドを宿主細胞へ導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを含む。ベクター及び／又は外来性核酸を含む細胞を製造するための方法は、当該分野において周知である。例えば、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための１つの方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
【０１８３】
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒト細胞に遺伝子を挿入するための最も広く使用されている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスなどから誘導され得る。
【０１８４】
ポリヌクレオチドを宿主細胞へ導入するための化学的手段は、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズのようなコロイド分散系並びに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質ベース系を含む。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜ベシクル）である。標的化ナノ粒子又は他の適切なサブミクロンサイズの送達系を用いたポリヌクレオチド送達のような他の最先端の核酸標的化送達方法も利用可能である。
【０１８５】
非ウイルス送達系が利用される場合、代表的な送達ビヒクルはリポソームである。脂質製剤の使用が、宿主細胞への核酸の導入（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ）のために企図されている。別の態様では、核酸は、脂質を伴ってもよい。脂質を伴う核酸は、リポソームの水性の内部に封入されていてもよく、リポソームの脂質二重層内に散在していてもよく、リポソーム及びオリゴヌクレオチドの両方を伴う連結分子を介してリポソームに付着されていてもよく、リポソームに捕捉されていてもよく、リポソームと複合体化されていてもよく、脂質を含む溶液に分散されていてもよく、脂質と混合されていてもよく、脂質と組み合わされていてもよく、脂質中の懸濁液として含有されていてもよく、ミセルに含有もしくは複合体化されていてもよく、又は他の方法で脂質を伴っていてもよい。脂質、脂質／ＤＮＡ又は脂質／発現ベクター関連構成物は、溶液中の任意の特定の構造に限定されない。例えば、それらの構成物は、ミセルとして二重層構造で存在してもよく、又は「崩壊した」構造で存在してもよい。それらはまた、おそらくはサイズ又は形状が均一でない凝集体を形成して、単に溶液中に散在していてもよい。脂質は、天然に存在する脂質であっても又は合成の脂質であってもよい脂肪物質である。例えば、脂質は、細胞質に天然に存在する脂肪滴、並びに長鎖脂肪族炭化水素を含有する化合物及び脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール及びアルデヒドのようなこの誘導体のクラスを含む。
【０１８６】
使用に適した脂質は、商業的供給源から得られ得る。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．から得られ得る；ジセチルホスフェート（「ＤＣＰ」）は、Ｋ＆Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．）から得られ得る；コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから得られ得る；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及び他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、Ａｌａ．）から得られ得る。クロロホルム又はクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は、約−２０℃で保存することができる。クロロホルムは、メタノールよりも容易に蒸発するので、単に溶媒として使用される。「リポソーム」は、閉じた脂質二重層又は凝集体の生成によって形成される様々な単層又は多重層脂質ビヒクルを包含する総称である。リポソームは、リン脂質二重層膜及び内側の水性媒体を含む小胞構造を有するものとして特徴付けられ得る。多重層リポソームは、水性媒体によって分離されている複数の脂質層を有する。リン脂質が過剰の水溶液に懸濁化されるとき、多重層リポソームは自然に形成される。脂質成分は、閉じた構造を形成する前に自己再編成し、脂質二重層間の水及び溶解されている溶質を捕捉する。但し、通常の小胞構造と異なる構造を溶液中で有する構成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造をとってもよく、又は単に脂質分子の不均一な凝集体として存在してもよい。リポフェクタミン−核酸複合体も企図されている。
【０１８７】
外来性核酸を宿主細胞に導入するために使用される方法又は本開示の阻害剤を細胞に曝露する他の方法にかかわらず、宿主細胞における組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイが行われ得る。そのようなアッセイは、例えば、サザン及びノザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲのような当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット）又は本開示の範囲内に入る作用剤を同定するための本明細書に記載されるアッセイによる特定のペプチドの有無の検出のような「生化学的」アッセイを含む。
【０１８８】
本開示は、ＢＦＰ又はＴＦＰをコードする核酸分子を含むベクターをさらに提供する。一態様では、ＢＦＰ又はＴＦＰベクターは、細胞（例えば、Ｂ細胞又はＴ細胞）に直接形質導入され得る。一態様では、ベクターは、クローニング又は発現ベクターであり、例えば、限定されないが、１つ以上のプラスミド（例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重微小染色体）、レトロウイルス及びレンチウイルスベクター構築物を含むベクターである。一態様では、ベクターは、哺乳動物Ｔ細胞においてＴＦＰ構築物を発現することができる。一態様では、哺乳動物Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞である。
【０１８９】
細胞試料
拡張及び遺伝子修飾の前に、Ｂ細胞又はＴ細胞源を、対象から得てもよい。用語「対象」は、免疫反応が誘発され得る生存生物（例えば、哺乳動物）を含むことが意図されている。対象の例は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット及びこれらのトランスジェニック種を含む。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍を含む多数の供給源から得ることができる。本開示のある特定の態様では、任意の市販の又は対象で生成されたＢ細胞もしくはＴ細胞（又は細胞株）が使用され得る。本開示のある特定の態様では、Ｂ細胞又はＴ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ分離のような当業者に既知のいくつかの技術を使用して、対象から回収された血液単位から得ることができる。１つの好ましい態様では、対象の循環血由来の細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス生成物は、通常、Ｔ細胞などのリンパ球、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核の白血球、赤血球及び血小板を含む。一態様では、アフェレーシスによって回収された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、次の処理ステップのための適切な緩衝液又は培地中に細胞を入れてもよい。本開示の一態様では、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替的態様では、洗浄溶液は、カルシウムが無く、マグネシウムが無くてもよく、又は全部ではないが多くの二価カチオンが無くてもよい。カルシウムの非存在下での最初の活性化ステップは、活性の拡大を導き得る。当業者が容易に認識するように、洗浄ステップは、製造業者の指示に従った半自動化「フロースルー」遠心分離の使用のような当業者に既知の方法により達成され得る。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性の緩衝液、例えばＣａを含まない、Ｍｇを含まないＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａのような緩衝液、又は緩衝液を含むもしくは含まない他の生理食塩水溶液に再懸濁させてもよい。代替的に、アフェレーシス試料の好ましくない成分を除去して、細胞を培養培地に直接再懸濁させてもよい。
【０１９０】
一部の態様では、細胞、抗体又は構築物は、ハイブリドーマ技術を使用して、取得、単離及び／又は精製され得る。ハイブリドーマ技術は、多数の同一の抗体を産生するための方法である。このプロセスは、対象（例えば、マウス）に、免疫応答を誘発する抗原を注射することを含み得る。次いで、白血球の１種である、抗原に結合する抗体を産生するＢ細胞を、対象から採集する。続けて、これらの単離されたＢ細胞を、不死化Ｂ細胞がん細胞である骨髄腫と融合し、ハイブリドーマと呼ばれるハイブリッド細胞株を産生する。このハイブリッド細胞株は、Ｂ細胞の抗体産生能力と骨髄腫の拡大された寿命及び再生性との両方を有する。ハイブリドーマは培養で成長させることができ、１つの生存可能なハイブリドーマ細胞で開始した各培養物は、それぞれ、様々な抗体の混合物（ポリクローナル）ではなく培養物あたり１種の抗体（モノクローナル）を産生する、遺伝的に同一のハイブリドーマからなる培養物を生ずる。
【０１９１】
一態様では、細胞は、赤血球を溶解し、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を通じた遠心分離又は向流遠心水簸により単球を枯渇させることによって、末梢血リンパ球から単離される。ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ５＋、ＣＤ８＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ２２−、ＣＤ２３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋及び／又はＦＭＣ７＋  Ｂ細胞又はＴ細胞のような、Ｂ細胞又はＴ細胞の特定の小集団が、ポジティブ又はネガティブ選択技術によってさらに単離され得る。例えば、一態様では、Ｂ細胞は、所望のＢ細胞のポジティブ選択に十分な期間、抗ＣＤ５／抗ＣＤ１９（例えば５ｘｌ９）コンジュゲートビーズとインキュベーションすることによって単離される。一態様では、この期間は約３０分間である。さらなる態様では、この期間は３０分間から３６時間以上及びこの間の全ての整数値の範囲である。さらなる態様では、この期間は、少なくとも１、２、３、４、５又は６時間である。さらに別の好ましい態様では、この期間は１０から２４時間である。一態様では、インキュベーション期間は２４時間である。Ｂ細胞が他の細胞種と比較して少ない任意の状況において、Ｂ細胞を単離するために、より長いインキュベーション期間が使用されてもよい。さらに、ビーズ又は他の表面において抗ＣＤ５及び／又は抗ＣＤ１９抗体の比率を増加又は減少させることにより、Ｂ細胞の小集団が、培養開始時又は他の所望の時点で、優先的に有利又は不利に選択され得る。当業者は複数回の選択ラウンドが使用され得ることを認識するであろう。ある特定の態様では、選択手法を実施し、活性化及び拡張プロセスで「非選択」細胞を使用することが望ましい場合がある。「非選択」細胞は、さらなる選択ラウンドに付されてもよい。
【０１９２】
ネガティブ選択によるＢ細胞又はＴ細胞集団の濃縮は、ネガティブ選択される細胞特有の表面マーカーに向かう抗体の組合せを用いて達成することができる。１つの方法は、細胞選別及び／もしくはネガティブ磁気免疫接着を介した選択、又はネガティブ選択された細胞に存在する細胞表面マーカーに向かうモノクローナル抗体のカクテルを使用するフローサイトメトリーである。例えば、ネガティブ選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するため、モノクローナル抗体カクテルは、典型的に、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ８に対する抗体を含む。ある特定の態様では、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋及びＦｏｘＰ３＋を典型的に発現する制御性Ｔ細胞の濃縮又はポジティブ選択が所望され得る。代替的に、ある特定の態様では、制御性Ｔ細胞は、抗Ｃ２５コンジュゲートビーズ又は他の同様の選択方法により枯渇される。
【０１９３】
ポジティブ又はネガティブ選択によって所望の細胞の集団を単離するために、細胞の濃度及び表面（例えば、ビーズのような粒子）を変化させてもよい。ある特定の態様では、細胞とビーズを確実に最大接触させるために、ビーズと細胞が一緒に混合される体積を顕著に減少させる（例えば、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましい場合がある。例えば、一態様では、２０億個の細胞／ｍｌの濃度が使用される。一態様では、１０億個の細胞／ｍｌの濃度が使用される。さらなる態様では、１億個の細胞／ｍｌを超える濃度が使用される。さらなる態様では、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００又は５０００万個の細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。さらに１つの態様では、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００万個又は１億個の細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。さらなる態様では、１億２５００万個又は１億５０００万個の細胞／ｍｌの濃度が使用され得る。高濃度を使用することによって、細胞収率の増加、細胞活性化及び細胞拡大がもたらされ得る。さらに、高い細胞濃度を使用することによって、目的の標的抗原が低発現であり得る細胞又は多くの腫瘍細胞が存在する試料（例えば、白血病血液、腫瘍組織など）中の細胞のより効率的な捕捉が可能になる。そのような細胞集団は、治療的価値を有する場合があり、取得が望まれ得る。
【０１９４】
さらに、本開示の文脈において、対象からの血液試料又はアフェレーシス生成物の回収は、本明細書に記載の細胞が必要となり得るときより前の時点であることが企図されている。したがって、細胞の供給源は、任意の必要な時点で回収されてよく、本明細書に記載の方法のような細胞療法から利益を得るいくつかの疾患又は状態のためのＢ細胞又はＴ細胞療法において後にＢ細胞又はＴ細胞のような所望の細胞を使用するために、単離及び凍結されてもよい。
【０１９５】
Ｂ細胞及びＴ細胞の活性化及び拡張
一般に、本開示のＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する作用剤及びＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドが付いた表面との接触によって拡張され得る。特に、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載されるように、表面に固定された抗ＣＤ３抗体もしくはこの抗原結合断片又は抗ＣＤ２抗体との接触又はカルシウムイオノフォアと組み合わせたタンパク質キナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触などによって刺激されてもよい。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するための適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させてもよい。ＣＤ４＋  Ｔ細胞又はＣＤ８＋  Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体。抗ＣＤ２８抗体の例は、当該分野で一般的に知られる他の方法と同様に使用することができる９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を含む。
【０１９６】
様々な刺激時間で曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。例えば、典型的な血液又はアフェレーシスされた末梢血単核細胞生成物は、細胞障害性又はサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）より大きいヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３及びＣＤ２８受容体の刺激によるＴ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ拡張により、約８−９日目より前はＴＨ細胞から主になるＴ細胞の集団が生じるが、約８−９日目より後は、Ｔ細胞の集団に、増加した、より大きなＴＣ細胞の集団が含まれる。したがって、処置の目的によっては、ＴＨ細胞を主に含むＴ細胞集団を対象に注入することが有利であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離される場合、このサブセットをより大規模に拡大することが有利であり得る。
【０１９７】
さらに、ＣＤ４及びＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーは、細胞拡張プロセスの経過中、顕著だが大部分で再現性よく変化する。したがって、そのような再現性は、活性化Ｔ細胞生成物を特定の目的のために適合させる能力を可能にする。
【０１９８】
抗ＣＤ１９  ＴＦＰが構築されると、様々なアッセイが、限定されないが、抗原刺激後にＴ細胞を拡張する能力、再刺激の非存在下でＴ細胞の拡張を維持する能力のような分子活性並びに適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び動物モデルにおける抗がん活性を評価するために使用され得る。抗ＣＤ１９  ＴＦＰの効果を評価するためのアッセイは、以下にさらに詳細に記載される。
【０１９９】
初代Ｔ細胞におけるＴＦＰ発現のウエスタンブロット分析が、単量体及び二量体の存在を検出するために使用され得る。非常に簡潔に述べると、ＴＦＰを発現するＴ細胞（ＣＤ４＋とＣＤ８＋  Ｔ細胞の１：１混合物）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１０日間より長く拡張され、この後、溶解、及び還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥが行われる。ＴＦＰは、ＴＣＲ鎖への抗体を使用するウエスタンブロッティングにより検出される。同じＴ細胞サブセットが、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために使用されて、共有結合性二量体形成の評価が可能になる。
【０２００】
抗原刺激後のＴＦＰ＋  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ拡張は、フローサイトメトリーにより測定され得る。例えば、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の混合物は、アルファＣＤ３／アルファＣＤ２８及びＡＰＣで刺激され、この後、ＧＦＰ発現レンチウイルスベクターを用いて、分析されるプロモーターの管理下で形質導入される。代表的プロモーターは、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１アルファ、ユビキチンＣ又はホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを含む。ＧＦＰ蛍光は、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋  Ｔ細胞サブセットにおいて、フローサイトメトリーにより、培養６日目に評価される。例えば、Ｍｉｌｏｎｅら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい。代替的に、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の混合物は、０日目に、アルファＣＤ３／アルファＣＤ２８被覆磁気ビーズで刺激され、１日目に、２Ａリボソームスキッピング配列を使用したｅＧＦＰと共にＴＦＰを発現するバイシストロニックレンチウイルスベクターを使用して、ＴＦＰで形質導入される。培養物は、ＣＤ１９＋  Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２−ＣＤ１９）、野生型Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２野生型）又はｈＣＤ３２を発現するＫ５６２細胞のいずれか及び４−１ＢＢＬで、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体（Ｋ５６２−ＢＢＬ−３／２８）の存在下、洗浄後、再刺激される。外来性ＩＬ−２は、１日おきに、１００ＩＵ／ｍｌで培養物に添加される。ＧＦＰ＋  Ｔ細胞が、フローサイトメトリーにより、ビーズに基づく数を使用して計数される。
【０２０１】
再刺激の非存在下における持続的なＴＦＰ＋  Ｔ細胞拡張も測定され得る。例えば、Ｍｉｌｏｎｅら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい。簡潔に述べると、平均Ｔ細胞体積（ｆｌ）は、培養０日目にアルファＣＤ３／アルファＣＤ２８被覆磁気ビーズを用いて刺激を行い、１日目に指示されたＴＦＰで形質導入を行った後、８日目にＣｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ＩＩＩ粒子カウンターを使用して測定される。
【０２０２】
動物モデルも、ＴＦＰ−Ｔ活性を測定するために使用され得る。例えば、免疫不全マウスにおける初代ヒトプレＢ  ＡＬＬを処置するために、ヒトＣＤ１９特異的ＴＦＰ＋  Ｔ細胞を使用する異種移植モデルが使用され得る。非常に簡潔に述べると、ＡＬＬの定着後、マウスが、処置群についてランダム化される。様々な数の改変Ｔ細胞が、Ｂ−ＡＬＬ担持ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−．  ガンマ．−／−マウスに、１：１の比率で共注射される。マウス由来の脾臓ＤＮＡにおける各ベクターのコピー数が、Ｔ細胞注射後の様々な時間で評価される。動物は、週に１回の間隔で白血病について評価される。末梢血ＣＤ１９＋  Ｂ−ＡＬＬ芽球細胞数が、アルファＣＤ１９−ゼータ．ＴＦＰ＋  Ｔ細胞又はモック導入Ｔ細胞を注射されたマウスで測定される。群についての生存曲線が、ログランク検定を使用して比較される。さらに、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−．  ガンマ．−／−マウスにＴ細胞を注射した後４週間、絶対末梢血ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞数が分析されてもよい。マウスは、白血病細胞が注射され、３週間後、ｅＧＦＰに連結されたＴＦＰをコードするバイシストロニックレンチウイルスベクターによってＴＦＰを発現するように改変されたＴ細胞が注射される。Ｔ細胞は、注射前にモック導入細胞を混合することによって、４５−５０％入力ＧＦＰ＋  Ｔ細胞に対して正規化され、フローサイトメトリーによって確認される。動物は、週に１回の間隔で白血病について評価される。ＴＦＰ＋  Ｔ細胞群についての生存曲線が、ログランク検定を使用して比較される。
【０２０３】
用量依存的にＴＦＰ処置の応答が評価されてもよい。例えば、２１日目にＴＦＰ  Ｔ細胞、等数のモック導入Ｔ細胞あり又はＴ細胞なしで注射されたマウスにおいて白血病が定着した後３５−７０日目に末梢血が得られる。各群のマウスは、３５及び４９日目にランダムに採血され、末梢血ＣＤ１９＋  ＡＬＬ芽球数が決定され、この後、殺滅される。残りの動物は、５７及び７０日目に評価される。
【０２０４】
ＴＦＰ媒介増殖の評価は、洗浄されたＴ細胞とＣＤ１９（Ｋ１９）発現Ｋ５６２細胞又はＣＤ３２及びＣＤ１３７発現Ｋ５６２細胞（ＫＴ３２−ＢＢＬ）とを最終Ｔ細胞：Ｋ５６２の比率２：１で混合することによって、マイクロタイタープレートにおいて行われる。Ｋ５６２細胞は、使用前にガンマ放射線で照射される。抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）及び抗ＣＤ２８（クローン９．３）モノクローナル抗体が、ＫＴ３２−ＢＢＬ細胞を用いた培養物に加えられて、Ｔ細胞増殖刺激の陽性対照として扱われるが、その理由は、このシグナルがｅｘ  ｖｉｖｏで長期的にＣＤ８＋  Ｔ細胞拡張を支持することによる。Ｔ細胞は、製造業者によって記載されるようにＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）蛍光ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）及びフローサイトメトリーを使用して培養液中で計数される。ＴＦＰ＋  Ｔ細胞は、ｅＧＦＰ−２Ａ連結ＴＦＰ発現レンチウイルスベクターで改変されたＴ細胞を使用してＧＦＰ発現により同定される。ＧＦＰを発現しないＴＦＰ＋  Ｔ細胞の場合、ＴＦＰ＋  Ｔ細胞は、ビオチン化組換えＣＤ１９タンパク質及び第２のアビジンＰＥコンジュゲートを用いて検出される。Ｔ細胞におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋発現も、特別のモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて同時に検出される。サイトカインの測定は、製造業者の指示に従って、ヒトＴＨ１／ＴＨ２サイトカインサイトメトリービーズアレイキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）を使用して、再刺激後２４時間回収された上清で実施される。蛍光は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して評価され、データは製造業者の指示に従って分析される。
【０２０５】
細胞障害性は、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイによって評価され得る。簡潔に述べると、標的細胞（Ｋ５６２株及び初代前駆Ｂ−ＡＬＬ細胞）に３７℃で２時間、頻繁に撹拌されながら、５１Ｃｒ（ＮａＣｒＯ４として、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）が負荷され、完全ＲＰＭＩ中で２回洗浄され、マイクロタイタープレートに播種される。エフェクターＴ細胞が、ウェル中の標的細胞と、完全ＲＰＭＩ中、様々なエフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比率で混合される。媒体のみ（自発放出、ＳＲ）又は１％ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００界面活性剤溶液（全放出、ＴＲ）を含むさらなるウェルも調製される。３７℃で４時間のインキュベーション後、各ウェルから上清が採集される。次いで、放出された５１Ｃｒが、ガンマ粒子カウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．）を使用して測定される。各条件は少なくとも三連で実施され、溶解のパーセンテージが、式：％溶解＝（ＥＲ−ＳＲ）／（ＴＲ−ＳＲ）（式中、ＥＲは、各実験条件についての放出された平均５１Ｃｒを表す。）を使用して計算される。
【０２０６】
イメージング技術が、腫瘍担持動物モデルにおける特定のトラフィッキング及びＴＦＰの増殖を評価するために使用され得る。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／．ガンマ．ｃ−／−（ＮＳＧ）マウスは、Ｎａｌｍ−６細胞をＩＶ注射され、７日後に、ＴＦＰ構築物でエレクトロポレーション４時間後のＴ細胞をＩＶ注射され得る。Ｔ細胞は、ホタルルシフェラーゼを発現するレンチウイルス構築物で安定的にトランスフェクションされ、マウスは、生物発光により画像化される。代替的に、Ｎａｌｍ−６異種移植モデルにおけるＴＦＰ＋  Ｔ細胞の単回注射の治療効果及び特異性が、以下のように測定され得る：ＮＳＧマウスは、ホタルルシフェラーゼを安定的に発現するように形質導入されたＮａｌｍ−６を注射され、７日後に、ＣＤ１９  ＴＦＰをエレクトロポレーションされたＴ細胞を尾静脈に単回注射される。動物は、注射後の様々な時点で画像化される。例えば、５日目（処置前２日）及び８日目（ＴＦＰ＋ＰＢＬ後２４時間）に、代表的マウスでホタルルシフェラーゼ陽性白血病の光子密度ヒートマップが生成されてもよい。
【０２０７】
本明細書の実施例の項目に記載のアッセイ及び当該分野で既知のアッセイを含む他のアッセイも、本開示の抗ＣＤ１９  ＴＦＰ構築物を評価するために使用されてもよい。
【０２０８】
添加剤
本開示の任意の組成物はさらに賦形剤を含んでもよい。用語「賦形剤」は、ほぼ全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗生剤及び抗菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。そのような媒体及び作用剤を活性物質又は生物学的化合物のために使用することは、当該分野で周知である。有効成分と適合性がないものを除いて、任意の従来の媒体又は作用剤は、本開示の治療組成物で使用することが企図されている。
【０２０９】
用語「賦形剤」は、目的の機能の遂行を促進するために化合物又は生物剤と共に投与され得るビヒクル及び担体を含むことが意図されている。医薬として活性な物質についてのそのような媒体の使用は、当該分野で周知である。そのようなビヒクル及び担体の例は、溶液、溶媒、分散媒、遅延剤、エマルジョンなどを含む。多重結合化合物で使用するために適切な任意の他の従来の担体も、本開示の範囲内に入る。
【０２１０】
本開示の組成物の作製において、有効成分（例えば、抗体を含む構築物）は、賦形剤により希釈されてもよい。適切な賦形剤の一部の例は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、滅菌生理食塩水、シロップ及びメチルセルロースを含む。さらに製剤は、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油のような滑沢剤、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、安息香酸メチル及びヒドロキシ安息香酸プロピルのような保存剤、甘味剤並びに芳香剤を含んでもよい。本開示の組成物は、当該分野で既知の手順を用いることによって、有効成分が対象への投与後に急速、持続又は遅延放出されるように製剤化されてもよい。
【０２１１】
一部の場合において、本明細書に記載の組成物は、長期保存の提供、強力な有効成分を含む製剤の嵩上げ、吸収の促進、粘度の低下、芳香の付与又は医薬組成物の溶解度増強を可能にする賦形剤を含んでもよい。賦形剤の非限定的な例は、抗接着剤、結合剤（例えば、スクロース、ラクトース、デンプン、セルロース、ゼラチンもしくはポリエチレングリコール）、コーティング剤（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくはゼラチン）、崩壊剤、色素、香料（例えば、ミント、ピーチ、ラズベリーもしくはバニラ）、流動促進剤、滑沢剤、保存剤（例えば、酸、エステル、フェノール、水銀化合物もしくはアンモニウム化合物）、吸着剤又はビヒクル（例えば、石油もしくは鉱油）を含み得る。
【０２１２】
配列決定
配列決定が、本開示の一部の実施形態では行われてもよく、配列決定が使用されてもよい。例えば、ゲノムＤＮＡ又は腫瘍由来核酸の配列決定が、対象の細胞によって発現されるＣＬＳＭＰに対応する核酸配列を決定するために行われてもよい。核酸の配列決定は、当該分野で既知の任意の方法を使用して行われ得る。一部の実施形態では、配列決定は、次世代配列決定を含み得る。一部の実施形態では、核酸の配列決定は、連鎖停止配列決定、ハイブリダイゼーション配列決定、イルミナ配列決定、イオントレント半導体配列決定、質量分析配列決定、超並列的遺伝子ビーズクローン分析（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＭＰＳＳ）、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定、ナノポア配列決定、ポロニー配列決定、ピロ配列決定、ショットガン配列決定、一分子リアルタイム（ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ、ＳＭＲＴ）配列決定、ＳＯＬｉＤ配列決定又はこれらの任意の組合せを使用して行われ得る。
【０２１３】
配列決定プロセスの間に核酸内の特定のヌクレオチドが読み取られる数又は平均回数（例えば、配列決定深度）は、配列決定される核酸の長さより複数倍大きくてもよい。一部の場合において、配列決定深度が、核酸の長さよりも十分大きいとき（例えば、少なくとも５倍）、配列決定は、「ディープ配列決定」と称され得る。本明細書に開示のいずれの実施形態でも、核酸の分析は、ディープ配列決定を含み得る。例えば、核酸は、配列決定深度が、核酸の長さより約２０倍大きくなるように配列決定されてもよい。一部の場合において、配列決定深度が、核酸の長さより少なくとも約１００倍大きいとき、配列決定は「ウルトラディープ配列決定」と称され得る。本明細書に開示のいずれの実施形態でも、核酸の分析は、ウルトラディープ配列決定を含み得る。一部の実施形態では、配列決定深度は、配列決定される核酸の長さより、平均で少なくとも約５倍大きい、少なくとも約１０倍大きい、少なくとも約２０倍大きい、少なくとも約３０倍大きい、少なくとも約４０倍大きい、少なくとも約５０倍大きい、少なくとも約６０倍大きい、少なくとも約７０倍大きい、少なくとも約８０倍大きい、少なくとも約９０倍大きい、少なくとも約１００倍大きい深度であり得る。
【０２１４】
抗イディオタイプ治療の例示的適用
Ｂ細胞悪性腫瘍の処置  −  Ｂ細胞悪性腫瘍は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）及び濾胞性リンパ腫（ＦＬ）を含む。これらの疾患は、無痛性であるが過酷な経過によって特徴付けられる。ＣＬＬ、ＭＣＬ及びＦＬは、Ｂリンパ球又はＢリンパ球前駆体の異常なクローン増殖によって引き起こされる。これらのがんの細胞は、腫瘍系統特有のイディオタイプを有するＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を発現する。腫瘍細胞は、生検を通じて又はＣＬＬの場合は血液試料を通じて、容易に得ることができる。イディオタイプの配列は、微小不均一性の評価を含め、選択的配列増幅とこの後の分子配列分析を通じて評価され得る。がんからＰＣＲクローニングされたイディオタイプ遺伝子は、本開示に記載されるような方法を使用して、本開示に記載されるような抗イディオタイプ治療薬を開発するために使用され得る。一例において、治療薬は、静脈内投与されてもよい。投与されるとき、治療薬は、がん細胞を攻撃及び殺滅する免疫細胞を誘導し得る。同様の機構が、広く使用されている薬物リツキシマブの基礎であるが、さらにリツキシマブは、対象のＢリンパ球の全てを含む広範な正常細胞に対して免疫反応を誘発し得る。結果として、リツキシマブは、多くの重大な副作用を有する。本開示の方法及び組成物の標的選択性（例えば、選択的にがん細胞を標的とする能力）の増加は、現行の処置に対して、より安全でより毒性が少ない代替的処置を提供する。
【０２１５】
Ｔ細胞悪性腫瘍の処置  −  Ｔ細胞悪性腫瘍は、Ｔ細胞リンパ腫のいくつかの別個の種類を含む。これらの疾患は、侵攻性の経過によって特徴付けられ得、現在利用可能な治療に対して耐性であることが多い。これらのがんの細胞は、腫瘍系統特有のイディオタイプを有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。腫瘍細胞は、生検又は血液試料を通じて容易に得ることができる。イディオタイプの配列は、微小不均一性の評価を含め、選択的な配列増幅とこの後の分子配列分析を通じて評価され得る。がんからＰＣＲクローニングされたイディオタイプ遺伝子は、本開示に記載されるような方法を使用して、本開示に記載されるような抗イディオタイプ治療薬を開発するために使用され得る。治療薬は、静脈内投与されてもよい。投与されるとき、治療薬は、がん細胞を攻撃及び殺滅する免疫細胞を誘導し得る。同様の機構が、広く使用されている薬物リツキシマブの基礎であるが、さらにリツキシマブは、対象のＢリンパ球の全てを含む広範な正常細胞に対して免疫反応を誘発し得る。結果として、リツキシマブは、多くの重大な副作用を有する。本開示の方法及び組成物の標的選択性（例えば、選択的にがん細胞を標的とする能力）の増加は、現行の処置に対して、より安全でより毒性が少ない代替的処置を提供する。
【０２１６】
自己免疫疾患の処置  −  自己免疫疾患、例えば関節リウマチ及びシェーグレン症候群は、異常な抗自己抗体の存在によって特徴付けられる。多くの対象において、これらの自己抗体は、Ｂリンパ球の単一の異常なクローン系統により産生され得る。これらの異常なＢリンパ球は、炎症を起こした関節のような炎症部位で濃縮され、関節吸引によって容易に得ることができる。異常な抗体を産生するＢリンパ球は、細胞表面にも抗体を発現する。イディオタイプの配列は、微小不均一性の評価を含め、選択的配列増幅とこの後の分子配列分析を通じて評価され得る。がんからＰＣＲクローニングされたイディオタイプ遺伝子は、本開示に記載されるような方法を使用して、本開示に記載されるような抗イディオタイプ治療薬を開発するために使用され得る。治療薬は、静脈内投与されてもよい。投与されるとき、治療薬は、異常な抗自己抗体を産生するＢリンパ球のクローン系統を攻撃及び殺滅して、関節炎の発生又は進行を予防する免疫細胞を誘導する。同様の機構が、他の処置は失敗した重症の関節リウマチで使用される薬物リツキシマブの基礎である。さらにリツキシマブは、対象のＢリンパ球の全てを含む広範な正常細胞に対して免疫反応を誘発する。結果として、リツキシマブは、多くの重大な副作用を有する。本開示の方法及び組成物の標的選択性（例えば、選択的にがん細胞を標的とする能力）の増加は、現行の処置に対して、より安全でより毒性が少ない代替的処置を提供する。
【０２１７】
非変異ＩＧＨＶ遺伝子を用いた抗イディオタイプ標的化治療の例示的適用
Ｂ細胞悪性腫瘍の処置  −  Ｂ細胞悪性腫瘍は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）及び濾胞性リンパ腫（ＦＬ）を含む。これらの疾患は、無痛性であるが過酷な経過によって特徴付けられる。ＣＬＬ、ＭＣＬ及びＦＬは、Ｂリンパ球又はＢリンパ球前駆体の異常なクローン増殖によって引き起こされる。これらのがんの細胞は、腫瘍系統特有のイディオタイプを有するＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を発現する。ＣＬＬの侵攻性のサブセット及びほとんどのＭＣＬがんにおいて、ＩＧＨＶ遺伝子は、再編成されるが、体細胞超変異を受けない。腫瘍細胞は、生検を通じて又はＣＬＬの場合は血液試料を通じて、容易に得ることができる。イディオタイプの配列は、微小不均一性の評価を含め、選択的配列増幅とこの後の分子配列分析を通じて評価され得る。配列分析は、ＩＧＨＶ遺伝子が体細胞超変異を受けていないがんの診断を可能にし、ＩＧＨＶクラス及びサブクラスを迅速に決定することを可能にする。次いで、適切なＩＧＨＶクラス標的治療薬が、ＩＧＨＶクラス特異的治療薬のプレ作製パネルから選択され得る。治療薬は、静脈内投与されてもよい。投与されるとき、治療薬は、がん細胞を攻撃及び殺滅する免疫細胞を誘導する。本開示の組成物及び／又は方法は、リツキシマブより安全性が高く、毒性を少なくすることができるが、この理由は、本開示の組成物及び／又は方法が、ＩＧＨＶ遺伝子の１つのクラス又はサブクラスを有するＢ細胞を選択的に標的とし、一方でＢ細胞レパートリーの残りは無傷のままにすることができるからである。
【０２１８】
ＣＤ１９関連疾患及び／又は障害
一部の態様では、本開示は、少なくとも部分的に、ＣＤ１９発現を伴う疾患（例えば、慢性リンパ性白血病）を処置するための方法を提供する。例えば、本開示のＴＦＰは、ＣＤ１９の発現上昇を伴う疾患について処置を受けた対象を処置するために有用であり、ここで、ＣＤ１９のレベル上昇について処置を受けた対象は、ＣＤ１９のレベル上昇を伴う疾患を示す。
【０２１９】
一態様では、本開示は、哺乳動物Ｔ細胞における発現のためのプロモーターに作動可能に連結されている抗ＣＤ１９  ＴＦＰを含むベクターに関する。一態様では、本開示は、ＣＤ１９発現腫瘍を処置するために使用されるＣＤ１９  ＴＦＰ発現組換えＴ細胞を提供し、ここでＣＤ１９  ＴＦＰ発現組換えＴ細胞はＣＤ１９  ＴＦＰ−Ｔと称される。一態様では、本開示のＣＤ１９  ＴＦＰ−Ｔは、ＴＦＰ−Ｔが腫瘍細胞を標的とし、腫瘍の成長が阻害されるように、この表面に発現された本開示の少なくとも１つのＣＤ１９  ＴＦＰを腫瘍細胞と接触させることができる。
【０２２０】
一態様では、本開示は、ＣＤ１９発現腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、ＴＦＰ−Ｔが抗原に対して活性化され、がん細胞を標的とするように、本開示のＣＤ１９  ＴＦＰ  Ｔ細胞を腫瘍細胞と接触させることを含み、それにより腫瘍の成長が阻害される、方法に関する。
【０２２１】
一態様では、本開示は、対象におけるがんを処置する方法に関する。本方法は、がんが対象において処置されるように、対象に、本開示のＣＤ１９  ＴＦＰ  Ｔ細胞を投与することを含む。本開示のＣＤ１９  ＴＦＰ  Ｔ細胞により処置可能ながんの例は、ＣＤ１９の発現を伴うがんである。一態様では、ＣＤ１９の発現を伴うがんは、血液がんである。一態様では、血液がんは、白血病又はリンパ腫である。一態様では、ＣＤ１９の発現を伴うがんは、例えば、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（「ＢＡＬＬ」）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（「ＴＡＬＬ」）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を含むがこれらに限定されない１つ以上の急性白血病及び例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含むがこれらに限定されない１つ以上の慢性白血病を含むがん及び悪性腫瘍を含む。ＣＤ１９の発現を伴うさらなるがん又は血液学的状態は、限定されないが、例えば、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞もしくは大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレーム・マクログロブリン血症並びに骨髄の血液細胞の非効率的な産生（又は異形成）によってまとめられる血液学的状態の多様なコレクションである「前白血病」などを含む。さらに、ＣＤ１９発現を伴う疾患は、限定されないが、例えば、ＣＤ１９発現を伴う非定型及び／もしくは非古典的がん、悪性腫瘍、前がん状態又は増殖性疾患を含む。
【０２２２】
一部の実施形態では、例えば本明細書に記載のＣＤ１９  ＴＦＰで処置され得るがんは、多発性骨髄腫である。多発性骨髄腫は、骨髄における形質細胞クローンの蓄積によって特徴付けられる血液のがんである。多発性骨髄腫のための現行の治療は、限定されないが、サリドマイドの類似体であるレナリドミドを用いた処置を含む。レナリドミドは、抗腫瘍活性、血管新生阻害及び免疫調節を含む活性を有する。一般に、骨髄腫細胞は、フローサイトメトリーにより、ＣＤ１９発現について陰性であると考えられている。本開示は、実施例６で実証されているように、わずかな割合の骨髄腫腫瘍細胞がＣＤ１９を発現するという認識を包含する。したがって、一部の実施形態では、例えば本明細書に記載されるようなＣ１９  ＴＦＰは、骨髄腫細胞を標的とするために使用され得る。一部の実施形態では、ＣＤ１９  ＴＦＰ治療は、１つ以上のさらなる治療、例えば、レナリドミド処置と組み合わせて使用され得る。
【０２２３】
本開示は、Ｔ細胞が遺伝的に改変されてＴＦＰを発現し、ＴＦＰ発現Ｔ細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される細胞治療の一種を含む。注入された細胞は、レシピエントにおける腫瘍細胞を殺滅することができる。抗体治療とは異なり、ＴＦＰ発現Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで複製可能で長期的に存続し、持続的な腫瘍制御をもたらし得る。様々な態様では、対象又はこの子孫に投与されたＴ細胞は、対象にＴ細胞が投与された後、対象において、少なくとも４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月、１３カ月、１４カ月、１５カ月、１６カ月、１７カ月、１８カ月、１９カ月、２０カ月、２１カ月、２２カ月、２３カ月、２年、３年、４年又は５年持続する。
【０２２４】
一部の態様では、本開示は、Ｔ細胞が、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡにより改変されて一過性にＴＦＰを発現し、ＴＦＰ発現Ｔ細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される細胞治療の一種も含む。注入された細胞は、レシピエントにおける腫瘍細胞を殺滅することができる。したがって、様々な態様では、対象に投与されたＴ細胞は、対象にＴ細胞が投与された後、１カ月未満、例えば３週間、２週間、１週間存在する。
【０２２５】
任意の特定の理論に束縛されることは望まないが、ＴＦＰ発現Ｔ細胞により誘発される抗腫瘍免疫応答は、能動又は受動免疫応答であり得る又は代替的に直接的対間接的免疫応答に起因するものであり得る。一態様では、ＴＦＰ形質導入Ｔ細胞は、ＣＤ１９抗原を発現するヒトがん細胞に応答して特別な炎症促進性サイトカイン分泌及び強力な細胞障害活性を示し、可溶性ＣＤ１９阻害に抵抗し、バイスタンダー殺滅を媒介し、定着したヒト腫瘍の退縮を媒介する。例えば、ＣＤ１９発現腫瘍の異種性領域内における抗原が少ない腫瘍細胞は、隣接する抗原陽性がん細胞に対して以前に反応したＣＤ１９再指向化Ｔ細胞による間接的な破壊を受けやすい可能性がある。
【０２２６】
一態様では、本開示のヒトＴＦＰ改変Ｔ細胞は、哺乳動物におけるｅｘ  ｖｉｖｏ免疫及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ治療のためのワクチンの１種であり得る。一態様では、哺乳動物はヒトである。
【０２２７】
ｅｘ  ｖｉｖｏ免疫に関して、細胞を哺乳動物へ投与する前に、ｉ）細胞の拡張、ｉｉ）細胞へのＴＦＰをコードする核酸の導入又はｉｉｉ）細胞の凍結保存の少なくとも１つをｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う。
【０２２８】
ｅｘ  ｖｉｖｏ手法は当該分野で周知であり、以下でより詳細に説明される。簡潔に述べると、細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト）から単離され、本明細書に開示のＴＦＰを発現するベクターで遺伝的に改変される（つまり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入される又はトランスフェクションされる）。ＴＦＰ改変細胞は、治療上の利益を提供するために哺乳動物レシピエントに投与されてもよい。哺乳動物レシピエントはヒトであってもよく、ＴＦＰ改変細胞はレシピエントに対して自己由来であってもよい。代替的に、細胞はレシピエントに対して同種異系、同系又は異種であってもよい。
【０２２９】
造血幹細胞及び始原細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ拡張は、本開示の細胞に適用され得る。他の適切な方法は当該分野で既知であり、したがって、本開示は、ｅｘ  ｖｉｖｏで細胞を拡張するいずれかの特定の方法に限定されない。簡潔に述べると、ｅｘ  ｖｉｖｏでのＴ細胞の培養及び拡張は、（１）末梢血採集物又は骨髄外植片から哺乳動物由来のＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞を回収すること、並びに（２）そのような細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡張することを含む。さらに、ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３及びｃ−ｋｉｔリガンドのような細胞成長因子が、細胞の培養及び拡張のために使用されてもよい。
【０２３０】
ｅｘ  ｖｉｖｏ免疫の観点で細胞ベースのワクチンを使用することに加えて、本開示は、対象において抗原に対する免疫応答を誘発するｉｎ  ｖｉｖｏ免疫化のための組成物及び方法も提供する。
【０２３１】
一般に、本明細書に記載されるように活性化及び拡張された細胞は、免疫不全状態の対象で生じる疾患の処置及び予防に利用され得る。特に、本開示のＴＦＰ改変Ｔ細胞は、ＣＤ１９の発現を伴う疾患、障害及び状態の処置に使用される。ある特定の態様では、本開示の細胞は、ＣＤ１９の発現を伴う疾患、障害及び状態を発生するリスクのある対象の処置に使用される。したがって、本開示は、ＣＤ１９の発現を伴う疾患、障害及び状態の処置又は予防のための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の本開示のＴＦＰ改変Ｔ細胞を投与することを含む方法を提供する。
【０２３２】
一態様では、本開示のＴＦＰ−Ｔ細胞は、がんもしくは悪性腫瘍のような増殖性疾患又は骨髄異形成、骨髄異形成症候群もしくは前白血病のような前がん状態を処置するために使用され得る。一態様では、がんは血液がんである。一態様では、血液がんは白血病又はリンパ腫である。一態様では、本開示のＴＦＰ−Ｔ細胞は、限定されないが、例えば、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（「ＢＡＬＬ」）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（「ＴＡＬＬ」）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を含むがこれらに限定されない急性白血病；例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含むがこれらに限定されない１つ以上の慢性白血病；例えば、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞もしくは大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレーム・マクログロブリン血症並びに骨髄の血液細胞の非効率的な産生（又は異形成）によってまとめられる血液学的状態の多様なコレクションである「前白血病」を含むがこれらに限定されないさらなる血液がん又は血液状態などのようながん及び悪性腫瘍を処置するために使用され得る。さらに、ＣＤ１９発現を伴う疾患は、限定されないが、例えば、ＣＤ１９を発現する非定型及び／もしくは非古典的がん、悪性腫瘍、前がん状態又は増殖性疾患を含む。ＣＤ１９の発現を伴う非がん関連適応症は、限定されないが、例えば、自己免疫疾患、（例えば、ループス）、炎症性障害（アレルギー及び喘息）並びに移植を含む。
【０２３３】
本開示のＴＦＰ改変Ｔ細胞は、単独で、又は希釈剤及び／もしくはＩＬ−２もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団のような他の成分と組み合わせた医薬組成物として、投与され得る。
【０２３４】
血液がん
血液がん状態は、白血病及び悪性リンパ増殖状態のような、血液、骨髄及びリンパ系に影響を与える種類のがんである。
【０２３５】
白血病は、急性白血病及び慢性白血病として分類され得る。急性白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）としてさらに分類され得る。慢性白血病は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含む。他の関連状態は、骨髄の血液細胞の非効率的な産生（又は異形成）によってまとめられる血液学的状態の多様なコレクションである骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、従前は「前白血病」としても知られる）及びＡＭＬへの変換のリスクを含む。
【０２３６】
本開示は、がんを処置するための組成物及び方法を提供する。一態様では、がんは血液がんであり、例えば、限定されないが、血液がんは白血病又はリンパ腫である。一態様では、本開示のＴＦＰ−Ｔ細胞は、限定されないが、例えば、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（「ＢＡＬＬ」）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（「ＴＡＬＬ」）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を含むがこれらに限定されない急性白血病；例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含むがこれらに限定されない１つ以上の慢性白血病；例えば、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞もしくは大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレーム・マクログロブリン血症並びに骨髄の血液細胞の非効率的な産生（又は異形成）によってまとめられる血液学的状態の多様なコレクションである「前白血病」を含むがこれらに限定されないさらなる血液がん又は血液状態などのようながん及び悪性腫瘍を処置するために使用され得る。さらに、ＣＤ１９発現を伴う疾患は、限定されないが、例えばＣＤ１９を発現する非定型及び／もしくは非古典的がん、悪性腫瘍、前がん状態又は増殖性疾患を含む。
【０２３７】
また本開示は、ＣＤ１９発現細胞の増殖を阻害する又はＣＤ１９発現細胞の集団を減少させるための方法であって、ＣＤ１９発現細胞を含む細胞の集団を、ＣＤ１９発現細胞に結合する本開示の抗ＣＤ１９  ＴＦＰ−Ｔ細胞と接触させることを含む方法を提供する。特別の態様では、本開示は、ＣＤ１９発現がん細胞の増殖を阻害する又はＣＤ１９発現がん細胞の集団を減少させるための方法であって、ＣＤ１９発現がん細胞集団を、ＣＤ１９発現細胞に結合する本開示の抗ＣＤ１９  ＴＦＰ−Ｔ細胞と接触させることを含む方法を提供する。一態様では、本開示は、ＣＤ１９発現がん細胞の増殖を阻害する又はＣＤ１９発現がん細胞の集団を減少させるための方法であって、ＣＤ１９発現がん細胞集団を、ＣＤ１９発現細胞に結合する本開示の抗ＣＤ１９  ＴＦＰ−Ｔ細胞と接触させることを含む方法を提供する。ある特定の態様では、本開示の抗ＣＤ１９  ＴＦＰ−Ｔ細胞は、ＣＤ１９発現細胞を有する対象又はＣＤ１９発現細胞を伴う骨髄性白血病又は他のがんについての動物モデルにおける細胞及び／又はがん細胞の分量、数、量又はパーセンテージを、陰性対照と比較して、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％減少させる。一態様では、対象はヒトである。
【０２３８】
また本開示は、ＣＤ１９発現細胞（例えば、ＣＤ１９を発現する血液がん又は非定型がん）を伴う疾患を予防、処置及び／又は管理するための方法であって、必要とする対象に、ＣＤ１９発現細胞に結合する本開示の抗ＣＤ１９  ＴＦＰ−Ｔ細胞を投与することを含む方法を提供する。一態様では、対象はヒトである。ＣＤ１９発現細胞を伴う障害の非限定的な例は、（ループスのような）自己免疫疾患、（アレルギー及び喘息のような）炎症性障害並びに（血液がん又はＣＤ１９を発現する非定型がんのような）がんを含む。
【０２３９】
また本開示は、ＣＤ１９発現細胞を伴う疾患を予防、処置及び／又は管理するための方法であって、必要とする対象に、ＣＤ１９発現細胞に結合する本開示の抗ＣＤ１９  ＴＦＰ−Ｔ細胞を投与することを含む方法を提供する。一態様では、対象はヒトである。
【０２４０】
本開示は、ＣＤ１９発現細胞を伴うがんの再発を予防するための方法であって、それを必要とする対象に、ＣＤ１９発現細胞に結合する本開示の抗ＣＤ１９  ＴＦＰ−Ｔ細胞を投与することを含む方法を提供する。一態様では、本方法は、それを必要とする対象に、ＣＤ１９発現細胞に結合する有効量の本明細書に記載の抗ＣＤ１９  ＴＦＰ−Ｔ細胞を、有効量の別の治療と組み合わせて投与することを含む。
【０２４１】
併用療法
本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞は、他の既知の作用剤及び治療と組み合わせて使用され得る。本明細書で使用されるとき、「組み合わせて」投与は、２つ（又はより多く）の異なる処置が、障害に罹患している対象の経過中に対象に送達されること、例えば、２つ以上の処置が、対象が障害を有すると診断された後、及び障害が治癒もしくは除去される又は処置が他の理由で停止する前に、送達されることを意味する。一部の実施形態では、１つの処置の送達は、第２の送達が開始するときに依然として生じており、したがって投与の点で重複がある。これは、本明細書で「併用（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）」又は「同時（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）送達」と時に称される。別の実施形態では、１つの処置の送達は、他の処置の送達が始まる前に終了する。いずれかの場合の一部の実施形態では、処置は、投与を組み合わせることにより、より効果的である。例えば、第２の処置がより効果的であり、例えば、より少ない第２の処置で同等の効果がみられる、又は第２の処置が第１の処置無しで投与される場合にみられる効果と比べて症状をより大きく減少させる、又は第１の処置を用いた場合に、これらと同様の状況がみられる。一部の実施形態では、送達は、症状の減少又は障害に関連する他のパラメータが、他方の非存在下で送達される一方の処置で観察される症状の減少又は障害に関連する他のパラメータより大きくなるような送達である。２つの処置の効果は、部分的に相加的であり、全体的に相加的であり、又は相加より大きい可能性がある。送達は、送達される第１の処置の効果が、第２の処置が送達されるときに依然として検出可能であるような送達であり得る。
【０２４２】
一部の実施形態では、「少なくとも１つのさらなる治療剤」は、ＴＦＰ発現細胞を含む。さらに、同じもしくは異なる標的抗原に結合する又は同じ標的抗原の同じもしくは異なるエピトープに結合する複数のＴＦＰを発現するＴ細胞も提供される。さらに、Ｔ細胞の第１のサブセットが第１のＴＦＰを発現し、Ｔ細胞の第２のサブセットが第２のＴＦＰを発現するＴ細胞の集団が提供される。
【０２４３】
本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞と少なくとも１つのさらなる治療剤は、同じ又は別個の組成物で同時に又は連続的に投与され得る。連続的投与について、本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞が最初に投与され、さらなる治療剤が２番目に投与されてもよく、又は投与の順序が逆にされてもよい。
【０２４４】
さらなる態様では、本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞は、手術、化学療法、放射、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート及びＦＫ５０６のような免疫抑制剤、抗体又はＣＡＭＰＡＴＨのような他の免疫消失剤、抗ＣＤ３抗体もしくは他の抗体治療、サイトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、放射線照射及びペプチドワクチンと組み合わせた処置レジメンで使用され得る。
【０２４５】
一実施形態では、対象に、ＴＦＰ発現細胞の投与に伴う副作用を減少又は緩和する作用剤が投与され得る。ＴＦＰ発現細胞の投与に伴う副作用は、限定されないが、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）及びマクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）とも称される血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）を含む。ＣＲＳの症状は、高熱、吐き気、一過性低血圧、低酸素血症などを含む。したがって、本明細書に記載される方法は、本明細書に記載されるＴＦＰ発現細胞を対象に投与すること、及びＴＦＰ発現細胞を用いた処置に起因する可溶性因子のレベル上昇を管理するための作用剤をさらに投与することを含み得る。一実施形態では、対象において上昇している可溶性因子は、ＩＦＮ−．ガンマ．、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−２及びＩＬ−６の１つ以上である。したがって、この副作用を処置するために投与される作用剤は、これらの可溶性因子の１つ以上を中和する作用剤であり得る。そのような作用剤は、限定されないが、ステロイド、ＴＮＦアルファの阻害剤及びＩＬ−６の阻害剤を含む。ＴＮＦ−アルファ阻害剤の一例は、エンタネルセプト（ｅｎｔａｎｅｒｃｅｐｔ）である。ＩＬ−６阻害剤の一例は、トシリツマブ（ｔｏｃ）である。
【０２４６】
一実施形態では、対象は、ＴＦＰ発現細胞の活性を増強する作用剤を投与され得る。例えば、一実施形態では、作用剤は、阻害分子を阻害する作用剤であり得る。阻害分子、例えば、プログラム死１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  １、ＰＤ１）は、一部の実施形態では、ＴＦＰ発現細胞の能力を減少させて、免疫エフェクター応答をマウントし得る。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４及びＴＧＦＲベータを含む。阻害分子の阻害、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質レベルでの阻害による阻害は、ＴＦＰ発現細胞の性能を最適化することができる。実施形態では、阻害核酸、例えば阻害核酸、例えばｄｓＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡが、ＴＦＰ発現細胞における阻害分子の発現を阻害するために使用され得る。一実施形態では、阻害剤はｓｈＲＮＡである。一実施形態では、阻害分子は、ＴＦＰ発現細胞内で阻害される。これらの実施形態では、阻害分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子は、ＴＦＰの成分、例えば、全ての成分をコードする核酸に連結されている。一実施形態では、阻害性シグナルの阻害剤は、例えば、阻害分子に結合する抗体又は抗体断片であり得る。例えば、作用剤は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２又はＣＴＬＡ４に結合する抗体又は抗体断片（例えば、イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０及びＭＤＸ−１０１とも称され、Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂとして市販されている）、トレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒから入手可能なＩｇＧ２モノクローナル抗体、従前はチシリムマブ、ＣＰ−６７５、２０６として知られる））であり得る。一実施形態では、作用剤は、ＴＩＭ３に結合する抗体又は抗体断片である。一実施形態では、作用剤は、ＬＡＧ３に結合する抗体又は抗体断片である。
【０２４７】
一部の実施形態では、ＴＦＰ発現細胞の活性を増強する作用剤は、例えば、第１のドメイン及び第２のドメインを含む融合タンパク質であってもよく、ここで第１のドメインは、阻害分子又はこの断片であり、第２ドメインは、ポジティブシグナルに関連するポリペプチド、例えば、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである。一部の実施形態では、ポジティブシグナルに関連するポリペプチドは、例えば、本明細書に記載のＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳの共刺激性ドメイン、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２７及び／又はＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメイン並びに／又は、例えばＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメインを含むことができる。一実施形態では、融合タンパク質は、ＴＦＰを発現した同じ細胞によって発現される。別の実施形態では、融合タンパク質は、細胞、例えば、抗ＣＤ１９  ＴＦＰを発現しないＴ細胞によって発現される。
【０２４８】
別の実施形態
本明細書で使用する節の見出しは、組織化の目的のためにすぎず、記述の主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０２４９】
本明細書に記載される方法及び組成物は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール、細胞株、構築物及び試薬に限定されることはなく、それ自体変更することができると理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記述するためのものにすぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本明細書に記載の方法及び組成物の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。本開示の好ましい実施形態を示し、本明細書に記載しているが、そのような実施形態が、例示として提供されるにすぎないことは当業者には明らかである。多数の変形、変化及び置換が、今や、本開示を逸脱することなく、当業者に思い浮かぶ。本明細書に記載の開示の実施形態に対する様々な代替が、本開示の実施に利用され得ると理解すべきである。以下の特許請求の範囲は、本開示の範囲を定義し、この特許請求の範囲及びその均等物の範囲内の方法及び構造がそれによって包含されることが意図されている。
【０２５０】
いくつかの態様は、説明のための例示的な適用を参照して説明されている。特に明記がない限り、任意の実施形態は、任意の他の実施形態と組み合わされ得る。本明細書に記載される特徴の完全な理解を提供するために、多くの特定の詳細事項、関係事項及び方法が示されていると理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本明細書に記載の特徴が１つ以上の特定の詳細なしに又は他の方法を用いて実施され得ることを容易に認識する。一部の操作は異なる順序及び／又は他の操作もしくは事象と同時に行うことができるので、本明細書に記載の特徴は、例示された行為又は事象の順序に限定されない。さらに、例示された行為又は事象の全てが、本明細書に記載の特徴に従って方法を実施するために必要とされるわけではない。
【０２５１】
一部の本発明の実施形態は、数値範囲を企図している。範囲が存在するとき、範囲は、この範囲の端点を含む。さらに、この範囲内の全ての下位範囲及び値が、あたかも明確に書き出されているように存在する。用語「約」又は「およそ」は、当業者によって決定される特定の値の許容誤差範囲内であることを意味することができ、値が測定又は決定される方法、例えば、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当該技術の実施につき、１又は１を超える標準偏差内を意味することができる。代替的に、「約」は、所与の値の最大２０％、最大１０％、最大５％又は最大１％の範囲を意味することができる。代替的に、特に生物学的システム又はプロセスに関して、用語は、値の桁内、５倍以内、又は２倍以内を意味することができる。特に明記がない限り、本出願及び特許請求の範囲に特定の値が記載される場合、特定の値について許容可能な誤差範囲内を意味する用語「約」が想定され得る。
【実施例】
【０２５２】
［実施例１］  非変異慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する対象におけるがんの処置
対象は、熱、疲労及びリンパ節拡大を含む複数の症状を示す。臨床医は、非侵襲的に血液試料を得て、末梢血塗抹及びフローサイトメトリーを実施し、最終的に、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する対象を診断する。血液試料の一部を、バフィーコートを単離するために分画し、ＣＬＬ白血病Ｂ細胞由来のゲノムＤＮＡのディープ配列決定を行い、それによりＩＧＨＶ１−６９対立遺伝子が生殖系列ＩＧＨＶ遺伝子に対して９８％より大きい配列ホモロジーを示すことを決定する。侵攻性疾患の経過を予知して、臨床医は、エフェクター細胞上のＦｃ受容体に結合する抗体及び対象のＣＬＬ  Ｂ細胞から配列決定されたＩＧＨＶ１−６９対立遺伝子の特異的遺伝子産物を使用する個別化治療を処方する。対象に、第１の抗体の注入の３０分前に、ジフェンヒドラミン（５０ｍｇ）及びアセトアミノフェン（５００ｍｇ−１０００ｍｇ）を前投薬する。対象に、週３日、隔日で１２週間にわたって、３０ミリグラムの抗体を低速注入で２時間にわたって、静脈内投与する。対象を、処置の間及び処置後２カ月間、感染についてルーチン的にモニタリングする。処置の数カ月後、血液試料を得る。末梢血塗抹及びフローサイトメトリーはＣＬＬの徴候を示さない。
【０２５３】
［実施例２］  対象における自己免疫疾患の処置
対象が、関節リウマチと診断される。関節リウマチは、細胞表面上に抗体を発現するＢリンパ球の単一の異常なクローン系統によって産生される異常な抗自己抗体の存在によって特徴付けられる疾患である。疾患Ｂリンパ球の生検を得、イディオタイプの配列を、微小不均一性の評価を含め、選択的配列増幅とこの後の分子配列分析を通じて決定する。疾患Ｂリンパ球により産生される異常な抗自己抗体に対して親和性を有する１つのドメインと（例えば、エフェクター細胞においてみられるような）Ｆｃ受容体に対する親和性を有する第２ドメインとを有する抗イディオタイプ治療抗体を開発するために、イディオタイプ遺伝子をコードするアンプリコンを使用する。治療抗体は、対象に投与されると、異常な抗自己抗体を産生するＢリンパ球のクローン系統を攻撃及び殺滅する免疫細胞を誘導し、それにより関節炎の発生又は進行を予防する。本開示の方法及び組成物の標的選択性（例えば、選択的にがん細胞を標的とする能力）の増加は、現行の処置（例えば、リツキシマブ）に対してより安全でより毒性が少ない代替的処置を提供する。
【０２５４】
［実施例３］  ハイブリドーマ技術を使用するモノクローナル抗体の産生
ハイブリドーマは、本開示の構築物（例えば、抗体）を作製するために使用され得る。ハイブリドーマは、生きている患者由来の腫瘍細胞又はそれから作製された膜抽出物を用いてマウスを免疫することによって生成される。マウスに、免疫原量の細胞又は抽出物を腹腔内接種し、次いで同様の量の免疫原でブーストする。脾臓を免疫化マウスから回収し、体細胞ハイブリダイゼーション技術を使用して、脾細胞及びマウス腫瘍パートナーからハイブリドーマを調製する。腫瘍細胞及び脾細胞を、ｆｕｓｏｇｅｎポリエチレングリコールを使用して融合する。融合細胞を融合培地から分離し、ＨＡＴ選択成長培地で成長させ、ハイブリダイズされていない親細胞を排除する。ハイブリドーマを拡張させ、上清を、固相酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、抗原として免疫作用剤（腫瘍細胞又はそれから作製される膜抽出物）を使用して、抗腫瘍活性についてアッセイする。簡潔に述べると、４０μｌの０．１ｍｇ／ｍｌの腫瘍由来細胞膜タンパク質を、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）マイクロタイターウェル内に４℃で１２時間置く。抽出物を吸引し、ウェルを、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。続けて、ウェルを、４５μｌの１：１０希釈のハイブリドーマ上清を用いてインキュベートする。希釈剤は、２５ｍＭのバッファー、１０％のウシ血清及び０．１％のアジ化ナトリウムを含む培地である。室温で３０分後、ウェルを洗浄し、続けて１：２００希釈のペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧと３７℃で４５分間インキュベートする。インキュベーション後、ウェルをＰＢＳで洗浄し、２００μｌの２，２−アジノ−ジ（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸）の０．１Ｍクエン酸ナトリウム中バッファーｐＨ４．２と室温で３０分間反応させる。腫瘍由来細胞膜抽出物に対して０．７Ｏ．Ｄ．を超える反応を示すウェルに対応するハイブリドーマをｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長させる。モノクローナル抗体を、硫酸アンモニウム沈殿、クロマトグラフィー及び／又は限外ろ過を使用して、これらのハイブリドーマの培養培地から単離する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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