(57)【要約】  本発明は特に、DNAとRNAを正確かつロバストに無酵素かつ無増幅で検出すること（例えば一塩基多型（SNP）、挿入、欠失の検出）を一塩基の分解能で可能にするポリマー鎖、プローブ、組成物、方法、キットに関する。この組成物、方法、キットはさらに、DNAおよび／またはRNAとタンパク質標的の同時検出を提供する。
2018526009.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（1）第1の標的結合領域と、
（2）第1の相補的領域と、
（3）配列特異的領域
を少なくとも含む第1のポリマー鎖と、
（1）第2の標的結合領域と、
（2）第2の相補的領域
を少なくとも含む第2のポリマー鎖
を含むポリマー鎖ペアであって、
前記第1の標的結合領域の標的と前記第2の標的結合領域の標的は同じ核酸分子内にあり、前記第1の標的結合領域の標的は前記第2の標的結合領域の標的と重複しておらず；そして
前記第1の相補的領域は前記第2の相補的領域と相補的である、ポリマー鎖ペア。
【請求項２】
前記第1のポリマー鎖が、前記第1の標的結合領域と前記第1の相補的領域の間にスペーサを含むか、前記第2のポリマー鎖が、前記第2の標的結合領域と前記第2の相補的領域の間にスペーサを含む、請求項1に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項３】
前記第1の標的結合領域、前記第1の相補的領域、前記配列特異的領域のうちの少なくとも1つが一本鎖核酸である、請求項1に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項４】
前記一本鎖核酸がDNAまたはRNAである、請求項3に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項５】
前記第1のポリマー鎖が一本鎖核酸分子である、請求項3に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項６】
前記第2の標的結合領域と前記第2の相補的領域のうちの少なくとも1つが一本鎖核酸である、請求項1に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項７】
前記一本鎖核酸がDNAまたはRNAである、請求項6に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項８】
前記第2のポリマー鎖が一本鎖核酸分子である、請求項6に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項９】
前記スペーサがポリマー鎖である、請求項2に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項１０】
前記ポリマー鎖がポリエチレングリコールを含む、請求項9に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項１１】
前記ポリマー鎖がオリゴヌクレオチドを含む、請求項9に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項１２】
前記第1のポリマー鎖が、前記第1の標的結合領域と前記第1の相補的領域の間にスペーサを含み、かつ、前記第2のポリマー鎖が、前記第2の標的結合領域と前記第2の相補的領域の間にスペーサを含む、請求項2に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項１３】
前記スペーサがポリマー鎖である、請求項12に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項１４】
前記ポリマー鎖がポリエチレングリコールを含む、請求項13に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項１５】
前記ポリマー鎖がオリゴヌクレオチドを含む、請求項13に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項１６】
前記核酸分子がDNA分子またはRNA分子である、請求項1に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項１７】
前記RNA分子が、メッセンジャーRNA（スプライス前のmRNAまたはスプライス後のmRNA）、非コード化RNA（ncRNA）、リボソームRNA（rRNA）、マイクロRNA（miRNA）、ウイルスRNA、細菌RNA、合成RNAのいずれかである、請求項16に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項１８】
前記DNA分子が、真核生物ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、葉緑体DNA、細菌ゲノムDNA、古細菌ゲノムDNA、ウイルスDNA、バクテリオファージDNA、プラスミドDNA、c DNA、合成DNAのいずれかである、請求項16に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項１９】
前記核酸分子が、対応する野生型核酸分子と比べて少なくとも1つの変異を含む、請求項1に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項２０】
前記少なくとも1つの変異が、一塩基多型（SNP）、挿入、欠失、遺伝子融合からなるグループから選択される、請求項19に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項２１】
前記第1の標的結合領域の標的と前記第2の標的結合領域の標的が1個以上のヌクレオチドによって分離されている、請求項1に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項２２】
前記第1の標的結合領域の標的と前記第2の標的結合領域の標的が2個以上のヌクレオチドによって分離されている、請求項21に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項２３】
前記第1の標的結合領域の標的と前記第2の標的結合領域の標的が4個以上のヌクレオチドによって分離されている、請求項22に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項２４】
前記第1の標的結合領域の標的と前記第2の標的結合領域の標的が6個以上のヌクレオチドによって分離されている、請求項23に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項２５】
前記第1の標的結合領域の標的と前記第2の標的結合領域の標的が10個以上のヌクレオチドによって分離されている、請求項24に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項２６】
前記第1の標的結合領域の標的と前記第2の標的結合領域の標的が1個のヌクレオチドによって分離されている、請求項21に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項２７】
前記第1の標的結合領域の標的と前記第2の標的結合領域の標的が前記核酸分子内で連続している、請求項1に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項２８】
前記第1の標的結合領域の標的と前記第2の標的結合領域の標的が、対応する野生型核酸分子と比べて少なくとも1つの変異を含む、請求項1に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項２９】
前記少なくとも1つの変異が、一塩基多型（SNP）、挿入、欠失、遺伝子融合からなるグループから選択される、請求項28に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項３０】
前記第1の標的結合領域の標的と前記第2の標的結合領域の標的が、それぞれ、対応する野生型核酸分子と比べて少なくとも1つの変異を含む、請求項28に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項３１】
前記少なくとも1つの変異が、一塩基多型（SNP）、挿入、欠失、遺伝子融合からなるグループから選択される、請求項30に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項３２】
前記第1の標的結合領域と前記第2の標的結合領域が、それぞれ、長さ約5個〜約35個のヌクレオチドである、請求項1に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項３３】
前記第1の標的結合領域と前記第2の標的結合領域が、それぞれ、長さ約10個〜約30個のヌクレオチドである、請求項32に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項３４】
前記第1の標的結合領域の長さと前記第2の標的結合領域の長さの合計が約55個以下のヌクレオチドである、請求項33に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項３５】
前記第1の標的結合領域の融点測定値または融点予想値が約5℃と約35℃の間であり、かつ前記第2の標的結合領域の融点測定値または融点予想値が約5℃と約35℃の間である、請求項1に記載の部分的二本鎖核酸プローブ。
【請求項３６】
前記第1の標的結合領域の融点測定値または融点予想値と、前記第2の標的結合領域の融点測定値または融点予想値が、約30℃以下異なる、請求項1に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項３７】
前記第1の標的結合領域の融点測定値または融点予想値と、前記第2の標的結合領域の融点測定値または融点予想値が、約20℃以下異なる、請求項36に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項３８】
前記第1の相補的領域と前記第2の相補的領域が、820 mMのNa+イオンかつ250 nMのポリマー鎖という濃度にほぼ等しい溶液条件下で、約60℃〜約90℃の範囲の融点測定値または融点予想値を持つ、請求項1に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項３９】
前記第1の相補的領域と前記第2の相補的領域が、それぞれ、長さ約12個〜約60個のヌクレオチドである、請求項1に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項４０】
前記配列特異的領域が、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができる、請求項1に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項４１】
前記配列特異的領域が一本鎖核酸骨格に共有結合し、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができる、請求項1に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項４２】
前記少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドがRNAまたはDNAである、請求項40または41に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項４３】
前記少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの標識モノマーを含む、請求項42に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項４４】
前記少なくとも1つの標識モノマーが、蛍光色素、量子ドット、染料、酵素、ナノ粒子、化学発光マーカー、ビオチン、直接または間接に検出可能な別のモノマーからなるグループから選択される、請求項43に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項４５】
第1の標識付着位置にある少なくとも1つの標識モノマーが、少なくとも第2の標識付着位置にある少なくとも1つの標識モノマーから、スペクトル的または空間的に識別可能である、請求項43に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項４６】
前記一本鎖核酸骨格が少なくとも1つのアフィニティ部分に付着する、請求項41に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項４７】
前記配列特異的領域が少なくとも1つのアフィニティ部分に付着する、請求項1に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項４８】
前記配列特異的領域がレポータプローブの一部に結合することができ、そのレポータプローブは、
その配列特異的領域と相補的な結合部分と、
線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含む一本鎖核酸骨格
を少なくとも含んでいて、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができる、請求項1に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項４９】
前記少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドがRNAまたはDNAである、請求項48に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項５０】
少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドが少なくとも1つの標識モノマーを含む、請求項48に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項５１】
前記少なくとも1つの標識モノマーが、蛍光色素、量子ドット、染料、酵素、ナノ粒子、化学発光マーカー、ビオチン、直接または間接に検出可能な別のモノマーからなるグループから選択される、請求項50に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項５２】
第1の標識付着位置にある少なくとも1つの標識モノマーが、少なくとも第2の標識付着位置にある少なくとも1つの標識モノマーから、スペクトル的または空間的に識別可能である、請求項50に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項５３】
前記レポータプローブがアフィニティ部分をさらに含む、請求項48に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項５４】
前記配列特異的領域と相補的な結合部分が長さ約20個〜約50個のヌクレオチドである、請求項48に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項５５】
前記配列特異的領域と相補的な結合部分が長さ約35個のヌクレオチドである、請求項54に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項５６】
前記配列特異的領域が、蛍光色素、量子ドット、染料、酵素、ナノ粒子、質量タグ、化学発光マーカー、ビオチン、直接または間接に検出可能な別のモノマーからなるグループから選択された少なくとも1つの標識モノマーを含む、請求項1に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項５７】
前記少なくとも1つの標識モノマーが、前記配列特異的領域内のヌクレオチドに共有結合している、請求項56に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項５８】
前記少なくとも1つの標識モノマーが、前記配列特異的領域の一部にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドに共有結合している、請求項56に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項５９】
前記第1のポリマー鎖が、前記第1の相補的領域と前記配列特異的領域の間に開裂可能なリンカーをさらに含む、請求項1に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項６０】
前記開裂可能なリンカーが光によって開裂可能である、請求項59に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項６１】
前記開裂可能なリンカーが化学的に開裂可能である、請求項59に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項６２】
前記開裂可能なリンカーが酵素によって開裂可能である、請求項59に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項６３】
前記第1の相補的領域と前記第2の相補的領域がハイブリダイズし、前記第1のポリマー鎖と前記第2のポリマー鎖が、部分的二本鎖核酸プローブを形成する、請求項1〜62のいずれか1項に記載のポリマー鎖ペア。
【請求項６４】
請求項63に記載の部分的二本鎖核酸プローブ。
【請求項６５】
前記第1の標的と前記第2の標的からの融点測定値または融点予想値が約40℃と約60℃の間である、請求項64に記載の部分的二本鎖核酸プローブ。
【請求項６６】
前記第1の標的と前記第2の標的からの融点測定値または融点予想値が約44℃と約58℃の間である、請求項65に記載の部分的二本鎖核酸プローブ。
【請求項６７】
前記第1の標的と前記第2の標的からの融点測定値または融点予想値が約47℃と約57℃の間である、請求項66に記載の部分的二本鎖核酸プローブ。
【請求項６８】
前記第1の標的からの融点測定値または融点予想値が約5℃と約35℃の間であり、かつ前記第2の標的からの融点測定値または融点予想値が約5℃と約35℃の間である、請求項64に記載の部分的二本鎖核酸プローブ。
【請求項６９】
第1のポリマー鎖ペアが第1の核酸分子に結合することができ、少なくとも第2のポリマー鎖ペアが少なくとも第2の核酸分子に結合することができ、
前記第1の核酸分子は前記少なくとも第2の核酸分子と異なっている、請求項1〜62のいずれか1項に記載のポリマー鎖ペアを複数含む組成物。
【請求項７０】
（a）請求項1〜62のいずれか1項に記載のポリマー鎖ペアと、
（b）少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域か、少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、
前記核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域
を少なくとも含む捕獲ポリマー鎖
を含んでいて、
前記第1の標的結合領域の標的、前記第2の標的結合領域の標的、前記第3の標的結合領域の標的が重複しておらず、同じ核酸分子内にある、ポリマー鎖トリオ。
【請求項７１】
第1のポリマー鎖トリオが第1の核酸分子に結合することができ、少なくとも第2のポリマー鎖トリオが少なくとも第2の核酸分子に結合することができ、
前記第1の核酸分子は前記少なくとも第2の核酸分子と異なっている、請求項70のポリマー鎖トリオを複数含む組成物。
【請求項７２】
請求項64に記載の部分的二本鎖核酸プローブを複数含む組成物。
【請求項７３】
複数の捕獲ポリマー鎖をさらに含んでいて、
第1の捕獲ポリマー鎖は、
少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域か、少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、
第1の核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域
を少なくとも含み；
少なくとも第2の捕獲ポリマー鎖は、
少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域か、少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、
少なくとも第2の核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域
を含む、請求項72に記載の組成物。
【請求項７４】
サンプル中の核酸分子を検出する方法であって、
（1）サンプルを請求項1〜62のいずれか1項に記載のポリマー鎖ペアと接触させ（ただし、
（a）前記配列特異的領域は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標的付着位置を含んでいて、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって前記核酸分子が同定され；または
（b）前記配列特異的領域は、一本鎖核酸骨格に共有結合し、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって前記核酸分子が同定され；または
（c）前記配列特異的領域は、レポータプローブに結合しているか、結合することができ、そのレポータプローブは、その配列特異的領域と相補的な結合部分と、一本鎖核酸骨格を少なくとも含み、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって前記核酸分子が同定され；または
（d）前記配列特異的領域は、1つ以上の標識モノマーを含み、その1つ以上の標識モノマーによって前記核酸分子が同定され；
前記少なくとも1つの標識モノマーと前記1つ以上の標識モノマーは、蛍光色素、量子ドット、染料、酵素、ナノ粒子、質量タグ、化学発光マーカー、ビオチン、直接または間接に検出可能な他のモノマーからなるグループから選択される）；
（2）標識されたモノマーの前記線形な組み合わせ、または前記1つ以上の標識モノマーを検出し、そのことによってサンプル中の核酸分子を検出することを含む方法。
【請求項７５】
前記サンプルを、
少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域か、少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、
前記核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域
を少なくとも含む捕獲ポリマー鎖（ただし、前記第1の標的結合領域の標的、前記第2の標的結合領域の標的、前記第3の標的結合領域の標的は重複しておらず、同じ核酸分子内にある）と接触させることをさらに含む、請求項74に記載の方法。
【請求項７６】
サンプル中の複数の核酸分子を検出する方法であって、
（1）サンプルを請求項1〜62のいずれか1項に記載の第1のポリマー鎖ペアおよび少なくとも第2のポリマー鎖ペアと接触させ（ただし、
（a）それぞれの配列特異的領域は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標的付着位置を含んでいて、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって第1の核酸分子または少なくとも第2の核酸分子が同定され；または
（b）それぞれの配列特異的領域は、一本鎖核酸骨格に共有結合し、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって前記第1の核酸分子または前記少なくとも第2の核酸分子が同定され；または
（c）前記配列特異的領域は、レポータプローブに結合しているか、結合することができ、そのレポータプローブは、その配列特異的領域と相補的な結合部分と、一本鎖核酸骨格を少なくとも含み、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって前記第1の核酸分子または前記少なくとも第2の核酸分子が同定され；または
（d）前記配列特異的領域は、1つ以上の標識モノマーを含み、その1つ以上の標識モノマーによって前記第1の核酸分子または前記少なくとも第2の核酸分子が同定され；
前記少なくとも1つの標識モノマーと前記1つ以上の標識モノマーは、蛍光色素、量子ドット、染料、酵素、ナノ粒子、質量タグ、化学発光マーカー、ビオチン、直接または間接に検出可能な他のモノマーからなるグループから選択される）；
（2）前記第1のポリマー鎖ペアと前記少なくとも第2のポリマー鎖ペアについて、標識されたモノマーの前記線形な組み合わせ、または前記1つ以上の標識モノマーを検出し、そのことによってサンプル中の前記第1の核酸分子または前記少なくとも第2の核酸分子を検出することを含む方法。
【請求項７７】
前記サンプルを複数の捕獲ポリマー鎖と接触させることをさらに含んでいて、
第1の捕獲ポリマー鎖が、
少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域か、少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、
第1の核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域
を少なくとも含み；
少なくとも第2の捕獲ポリマー鎖が、
少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域か、少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、
少なくとも第2の核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域
を少なくとも含む、請求項76に記載の方法。
【請求項７８】
サンプル中の核酸分子を検出する方法であって、
（1）サンプルを請求項64に記載の部分的二本鎖核酸プローブと接触させ（ただし、
（a）前記配列特異的領域は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標的付着位置を含んでいて、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって前記核酸分子が同定され；または
（b）前記配列特異的領域は、一本鎖核酸骨格に共有結合し、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって前記核酸分子が同定され；または
（c）前記配列特異的領域は、レポータプローブに結合しているか、結合することができ、そのレポータプローブは、その配列特異的領域と相補的な結合部分と、一本鎖核酸骨格を少なくとも含み、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって前記核酸分子が同定され；または
（d）前記配列特異的領域は、1つ以上の標識モノマーを含み、その1つ以上の標識モノマーによって前記核酸分子が同定され；
前記少なくとも1つの標識モノマーと前記1つ以上の標識モノマーは、蛍光色素、量子ドット、染料、酵素、ナノ粒子、質量タグ、化学発光マーカー、ビオチン、直接または間接に検出可能な他のモノマーからなるグループから選択される）；
（2）標識されたモノマーの前記線形な組み合わせ、または前記1つ以上の標識モノマーを検出し、そのことによってサンプル中の核酸分子を検出することを含む方法。
【請求項７９】
前記サンプルを、
少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域か、少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、
前記核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域
を少なくとも含む捕獲ポリマー鎖（ただし、前記第1の標的結合領域の標的、前記第2の標的結合領域の標的、前記第3の標的結合領域の標的は重複しておらず、同じ核酸分子内にある）と接触させることをさらに含む、請求項78に記載の方法。
【請求項８０】
サンプル中の複数の核酸分子を検出する方法であって、
（1）サンプルを請求項64に記載の第1の部分的二本鎖核酸プローブおよび少なくとも第2の部分的二本鎖核酸プローブと接触させ（ただし、
（a）それぞれの配列特異的領域は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標的付着位置を含んでいて、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって第1の核酸分子または少なくとも第2の核酸分子が同定され；または
（b）それぞれの配列特異的領域は、一本鎖核酸骨格に共有結合し、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって前記第1の核酸分子または前記少なくとも第2の核酸分子が同定され；または
（c）前記配列特異的領域は、レポータプローブに結合しているか、結合することができ、そのレポータプローブは、その配列特異的領域と相補的な結合部分と、一本鎖核酸骨格を少なくとも含み、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって前記第1の核酸分子または前記少なくとも第2の核酸分子が同定され；または
（d）前記配列特異的領域は、1つ以上の標識モノマーを含み、その1つ以上の標識モノマーによって前記第1の核酸分子または前記少なくとも第2の核酸分子が同定され；
前記少なくとも1つの標識モノマーと前記1つ以上の標識モノマーは、蛍光色素、量子ドット、染料、酵素、ナノ粒子、質量タグ、化学発光マーカー、ビオチン、直接または間接に検出可能な他のモノマーからなるグループから選択される）；
（2）前記第1の部分的二本鎖核酸プローブと前記少なくとも第2の部分的二本鎖核酸プローブについて、標識されたモノマーの前記線形な組み合わせ、または前記1つ以上の標識モノマーを検出し、そのことによってサンプル中の前記第1の核酸分子または前記少なくとも第2の核酸分子を検出することを含む方法。
【請求項８１】
前記サンプルを複数の捕獲ポリマー鎖と接触させることをさらに含んでいて、
第1の捕獲ポリマー鎖が、
少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域か、少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、
第1の核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域
を少なくとも含み；
少なくとも第2の捕獲ポリマー鎖が、
少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域か、少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、
少なくとも第2の核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域
を少なくとも含む、請求項80に記載の方法。
【請求項８２】
サンプル中の核酸分子を検出する方法であって、
（1）サンプルを請求項70に記載のポリマー鎖トリオと接触させ（ただし、
（a）前記配列特異的領域は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標的付着位置を含んでいて、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって前記核酸分子が同定され；または
（b）前記配列特異的領域は、一本鎖核酸骨格に共有結合し、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって前記核酸分子が同定され；または
（c）前記配列特異的領域は、レポータプローブに結合しているか、結合することができ、そのレポータプローブは、その配列特異的領域と相補的な結合部分と、一本鎖核酸骨格を少なくとも含み、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって前記核酸分子が同定され；または
（d）前記配列特異的領域は、1つ以上の標識モノマーを含み、その1つ以上の標識モノマーによって前記核酸分子が同定され；
前記少なくとも1つの標識モノマーと前記1つ以上の標識モノマーは、蛍光色素、量子ドット、染料、酵素、ナノ粒子、質量タグ、化学発光マーカー、ビオチン、直接または間接に検出可能な他のモノマーからなるグループから選択される）；
（2）標識されたモノマーの前記線形な組み合わせ、または前記1つ以上の標識モノマーを検出し、そのことによってサンプル中の核酸分子を検出することを含む方法。
【請求項８３】
サンプル中の複数の核酸分子を検出する方法であって、
（1）サンプルを請求項70に記載の第1のポリマー鎖トリオおよび少なくとも第2のポリマー鎖トリオと接触させ（ただし、
（a）それぞれの配列特異的領域は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標的付着位置を含んでいて、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって第1の核酸分子または少なくとも第2の核酸分子が同定され；または
（b）それぞれの配列特異的領域は、一本鎖核酸骨格に共有結合し、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって前記第1の核酸分子または前記少なくとも第2の核酸分子が同定され；または
（c）前記配列特異的領域は、レポータプローブに結合しているか、結合することができ、そのレポータプローブは、その配列特異的領域と相補的な結合部分と、一本鎖核酸骨格を少なくとも含み、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって前記第1の核酸分子または前記少なくとも第2の核酸分子が同定され；または
（d）前記配列特異的領域は、1つ以上の標識モノマーを含み、その1つ以上の標識モノマーによって前記第1の核酸分子または前記少なくとも第2の核酸分子が同定され；
前記少なくとも1つの標識モノマーと前記1つ以上の標識モノマーは、蛍光色素、量子ドット、染料、酵素、ナノ粒子、質量タグ、化学発光マーカー、ビオチン、直接または間接に検出可能な他のモノマーからなるグループから選択される）；
（2）前記第1のポリマー鎖トリオと前記少なくとも第2のポリマー鎖トリオについて、標識されたモノマーの前記線形な組み合わせ、または前記1つ以上の標識モノマーを検出し、そのことによってサンプル中の第1の核酸分子または前記少なくとも第2の核酸分子を検出することを含む方法。
【請求項８４】
第1の標的結合領域と、
第2の標的結合領域と、
その第1の標的結合領域とその第2の標的結合領域の間にあるスペーサと、
配列特異的領域
を少なくとも含んでいて、
前記第1の標的結合領域の標的と前記第2の標的結合領域の標的が同じ核酸分子内にあり、その第1の標的結合領域の標的は、その第2の標的結合領域の標的と重複していない、多価ポリマー鎖。
【請求項８５】
前記第1の標的結合領域、前記第2の標的結合領域、前記配列特異的領域のうちの少なくとも1つが一本鎖核酸である、請求項84に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項８６】
前記一本鎖核酸がDNAまたはRNAである、請求項85に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項８７】
一本鎖核酸分子である、請求項85に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項８８】
前記一本鎖核酸がDNAまたはRNAである、請求項87に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項８９】
前記スペーサがポリマー鎖である、請求項84に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項９０】
前記ポリマー鎖がポリエチレングリコールを含む、請求項89に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項９１】
前記ポリマー鎖がオリゴヌクレオチドを含む、請求項89に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項９２】
前記核酸分子がDNA分子またはRNA分子である、請求項84に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項９３】
前記RNA分子が、メッセンジャーRNA（スプライス前のmRNAまたはスプライス後のmRNA）、非コード化RNA（ncRNA）、リボソームRNA（rRNA）、マイクロRNA（miRNA）、ウイルスRNA、細菌RNA、合成RNAのいずれかである、請求項92に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項９４】
前記DNA分子が、真核生物ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、葉緑体DNA、細菌ゲノムDNA、古細菌ゲノムDNA、ウイルスDNA、バクテリオファージDNA、プラスミドDNA、c DNA、合成DNAのいずれかである、請求項92に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項９５】
前記核酸分子が、対応する野生型核酸分子と比べて少なくとも1つの変異を含む、請求項84に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項９６】
前記少なくとも1つの変異が、一塩基多型（SNP）、挿入、欠失、遺伝子融合からなるグループから選択される、請求項95に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項９７】
前記第1の標的結合領域の標的と前記第2の標的結合領域の標的が1個以上のヌクレオチドによって分離されている、請求項84に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項９８】
前記第1の標的結合領域の標的と前記第2の標的結合領域の標的が2個以上のヌクレオチドによって分離されている、請求項97に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項９９】
前記第1の標的結合領域の標的と前記第2の標的結合領域の標的が4個以上のヌクレオチドによって分離されている、請求項98に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１００】
前記第1の標的結合領域の標的と前記第2の標的結合領域の標的が6個以上のヌクレオチドによって分離されている、請求項99に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１０１】
前記第1の標的結合領域の標的と前記第2の標的結合領域の標的が10個以上のヌクレオチドによって分離されている、請求項100に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１０２】
前記第1の標的結合領域の標的と前記第2の標的結合領域の標的が1個のヌクレオチドによって分離されている、請求項84に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１０３】
前記第1の標的結合領域の標的と前記第2の標的結合領域の標的が前記核酸分子内で連続している、請求項84に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１０４】
前記第1の標的結合領域の標的と前記第2の標的結合領域の標的が、対応する野生型核酸分子と比べて少なくとも1つの変異を含む、請求項84に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１０５】
前記少なくとも1つの変異が、一塩基多型（SNP）、挿入、欠失、遺伝子融合からなるグループから選択される、請求項104に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１０６】
前記第1の標的結合領域の標的と前記第2の標的結合領域の標的が、それぞれ、対応する野生型核酸分子と比べて少なくとも1つの変異を含む、請求項84に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１０７】
前記少なくとも1つの変異が、一塩基多型（SNP）、挿入、欠失、遺伝子融合からなるグループから選択される、請求項106に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１０８】
前記第1の標的結合領域の標的と前記第2の標的結合領域の標的が、それぞれ、長さ約5個〜約35個のヌクレオチドである、請求項84に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１０９】
前記第1の標的結合領域の標的と前記第2の標的結合領域の標的が、それぞれ、長さ約10個〜約30個のヌクレオチドである、請求項108に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１１０】
前記第1の標的結合領域の長さと前記第2の標的結合領域の長さの合計が約55個以下のヌクレオチドである、請求項109に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１１１】
前記第1の標的結合領域の融点測定値または融点予想値が約5℃と約35℃の間であり、かつ前記第2の標的結合領域の融点測定値または融点予想値が約5℃と約35℃の間である、請求項84に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１１２】
前記第1の標的結合領域の融点測定値または融点予想値と、前記第2の標的結合領域の融点測定値または融点予想値が、約30℃以下異なる、請求項84に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１１３】
前記第1の標的結合領域の融点測定値または融点予想値と、前記第2の標的結合領域の融点測定値または融点予想値が、約20℃以下異なる、請求項112に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１１４】
前記配列特異的領域が、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができる、請求項84に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１１５】
前記配列特異的領域が一本鎖核酸骨格に共有結合し、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができる、請求項84に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１１６】
前記少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドがRNAまたはDNAである、請求項114または115に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１１７】
前記少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドが少なくとも1つの標識モノマーを含む、請求項116に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１１８】
前記少なくとも1つの標識モノマーが、蛍光色素、量子ドット、染料、酵素、ナノ粒子、化学発光マーカー、ビオチン、直接または間接に検出可能な別のモノマーからなるグループから選択される、請求項117に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１１９】
第1の標識付着位置にある少なくとも1つの標識モノマーが、少なくとも第2の標識付着位置にある少なくとも1つの標識モノマーから、スペクトル的または空間的に識別可能である、請求項117に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１２０】
前記一本鎖核酸骨格が少なくとも1つのアフィニティ部分に付着する、請求項115に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１２１】
前記配列特異的領域が少なくとも1つのアフィニティ部分に付着する、請求項84に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１２２】
前記配列特異的領域がレポータプローブの一部に結合することができ、そのレポータプローブは、
その配列特異的領域と相補的な結合部分と、
線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含む一本鎖核酸骨格
を少なくとも含んでいて、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができる、請求項84に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１２３】
前記少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドがRNAまたはDNAである、請求項122に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１２４】
前記少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドが少なくとも1つの標識モノマーを含む、請求項122に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１２５】
前記少なくとも1つの標識モノマーが、蛍光色素、量子ドット、染料、酵素、ナノ粒子、化学発光マーカー、ビオチン、直接または間接に検出可能な別のモノマーからなるグループから選択される、請求項124に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１２６】
第1の標識付着位置にある少なくとも1つの標識モノマーが、少なくとも第2の標識付着位置にある少なくとも1つの標識モノマーから、スペクトル的または空間的に識別可能である、請求項124に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１２７】
前記レポータプローブがアフィニティ部分をさらに含む、請求項122に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１２８】
前記配列特異的領域と相補的な結合部分が長さ約20個〜約50個のヌクレオチドである、請求項122に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１２９】
前記配列特異的領域と相補的な結合部分が長さ約35個のヌクレオチドである、請求項123に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１３０】
前記配列特異的領域が、蛍光色素、量子ドット、染料、酵素、ナノ粒子、質量タグ、化学発光マーカー、ビオチン、直接または間接に検出可能な別のモノマーからなるグループから選択された少なくとも1つの標識モノマーを含む、請求項84に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１３１】
前記少なくとも1つの標識モノマーが、前記配列特異的領域内のヌクレオチドに共有結合している、請求項130に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１３２】
前記少なくとも1つの標識モノマーが、前記配列特異的領域の一部にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドに共有結合している、請求項130に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１３３】
前記第1のポリマー鎖が、前記第1の相補的領域または前記第2の相補的領域と前記配列特異的領域の間に、またはその配列特異的領域の中に開裂可能なリンカーをさらに含む、請求項84に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１３４】
前記開裂可能なリンカーが光によって開裂可能である、請求項133に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１３５】
前記開裂可能なリンカーが化学的に開裂可能である、請求項133に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１３６】
前記開裂可能なリンカーが酵素によって開裂可能である、請求項133に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１３７】
前記第1の標的と前記第2の標的の和からの融点測定値または融点予想値が、約25℃と約60℃の間である、請求項84に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１３８】
前記第1の標的と前記第2の標的の和からの融点測定値または融点予想値が、約44℃と約58℃の間である、請求項137に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１３９】
前記第1の標的と前記第2の標的の合計から融点測定値または融点予想値が、約47℃と約57℃の間である、請求項138に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１４０】
前記第1の標的からの融点測定値または融点予想値が約5℃と約35℃の間であり、かつ前記第2の標的からの融点測定値または融点予想値が約5℃と約35℃の間である、請求項84に記載の多価ポリマー鎖。
【請求項１４１】
請求項84〜140のいずれか1項に記載の多価ポリマー鎖を複数含んでいて、
第1の多価ポリマー鎖が第1の核酸分子に結合することができ、少なくとも第2の多価ポリマー鎖が少なくとも第2の核酸分子に結合することができ、
前記第1の核酸分子が前記少なくとも第2の核酸分子と異なっている、組成物。
【請求項１４２】
（a）請求項84〜140のいずれか1項に記載の多価ポリマー鎖と、
（b）少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域か、少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、
前記核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域
を少なくとも含む捕獲ポリマー鎖
を含む多価ポリマー鎖デュオ。
【請求項１４３】
請求項142に記載の多価ポリマー鎖デュオを複数含む組成物であって、
第1の多価ポリマー鎖デュオが第1の核酸分子に結合することができ、少なくとも第2の多価ポリマー鎖デュオが少なくとも第2の核酸分子に結合することができ、
前記第1の核酸分子が前記少なくとも第2の核酸分子と異なっている、組成物。
【請求項１４４】
サンプル中の核酸分子を検出する方法であって、
（1）サンプルを請求項84〜140のいずれか1項に記載の多価ポリマー鎖と接触させ（ただし、
（a）前記配列特異的領域は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標的付着位置を含んでいて、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって前記核酸分子が同定され；または
（b）前記配列特異的領域は、一本鎖核酸骨格に共有結合し、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって前記核酸分子が同定され；または
（c）前記配列特異的領域は、レポータプローブに結合しているか、結合することができ、そのレポータプローブは、その配列特異的領域と相補的な結合部分と、一本鎖核酸骨格を少なくとも含み、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって前記核酸分子が同定され；または
（d）前記配列特異的領域は、1つ以上の標識モノマーを含み、その1つ以上の標識モノマーによって前記核酸分子が同定され；
前記少なくとも1つの標識モノマーと前記1つ以上の標識モノマーは、蛍光色素、量子ドット、染料、酵素、ナノ粒子、質量タグ、化学発光マーカー、ビオチン、直接または間接に検出可能な他のモノマーからなるグループから選択される）；
（2）標識されたモノマーの前記線形な組み合わせ、または前記1つ以上の標識モノマーを検出し、そのことによってサンプル中の核酸分子を検出することを含む方法。
【請求項１４５】
前記サンプルを、
少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域か、少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、
前記核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域
を少なくとも含む捕獲ポリマー鎖と接触させることをさらに含んでいて、
前記第1の標的結合領域の標的、前記第2の標的結合領域の標的、前記第3の標的結合領域の標的は重複しておらず、同じ核酸分子内にある、請求項144に記載の方法。
【請求項１４６】
サンプル中の複数の核酸分子を検出する方法であって、
（1）サンプルを請求項84〜140のいずれか1項に記載の第1の多価ポリマー鎖および少なくとも第2の多価ポリマー鎖と接触させ（ただし、
（a）それぞれの配列特異的領域は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標的付着位置を含んでいて、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって第1の核酸分子または少なくとも第2の核酸分子が同定され；または
（b）それぞれの配列特異的領域は、一本鎖核酸骨格に共有結合し、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって前記第1の核酸分子または前記少なくとも第2の核酸分子が同定され；または
（c）前記配列特異的領域は、レポータプローブに結合しているか、結合することができ、そのレポータプローブは、その配列特異的領域と相補的な結合部分と、一本鎖核酸骨格を少なくとも含み、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって前記第1の核酸分子または前記少なくとも第2の核酸分子が同定され；または
（d）前記配列特異的領域は、1つ以上の標識モノマーを含み、その1つ以上の標識モノマーによって前記第1の核酸分子または前記少なくとも第2の核酸分子が同定され；
前記少なくとも1つの標識モノマーと前記1つ以上の標識モノマーは、蛍光色素、量子ドット、染料、酵素、ナノ粒子、質量タグ、化学発光マーカー、ビオチン、直接または間接に検出可能な他のモノマーからなるグループから選択される）；
（2）前記第1の多価ポリマー鎖および前記少なくとも第2の多価ポリマー鎖について、標識されたモノマーの前記線形な組み合わせ、または前記1つ以上の標識モノマーを検出し、そのことによってサンプル中の第1の核酸分子または前記少なくとも第2の核酸分子を検出することを含む方法。
【請求項１４７】
前記サンプルを複数の捕獲ポリマー鎖と接触させることをさらに含んでいて、
第1の捕獲ポリマー鎖が、
少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域か、少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、
第1の核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域
を少なくとも含み；
少なくとも第2の捕獲ポリマー鎖が、
少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域か、少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、
少なくとも第2の核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域
を少なくとも含む、請求項146に記載の方法。
【請求項１４８】
サンプル中の核酸分子を検出する方法であって、
（1）サンプルを請求項142に記載の多価ポリマー鎖デュオと接触させ（ただし、
（a）前記配列特異的領域は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標的付着位置を含んでいて、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって前記核酸分子が同定され；または
（b）前記配列特異的領域は、一本鎖核酸骨格に共有結合し、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって前記核酸分子が同定され；または
（c）前記配列特異的領域は、レポータプローブに結合しているか、結合することができ、そのレポータプローブは、その配列特異的領域と相補的な結合部分と、一本鎖核酸骨格を少なくとも含み、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって前記核酸分子が同定され；または
（d）前記配列特異的領域は、1つ以上の標識モノマーを含み、その1つ以上の標識モノマーによって前記核酸分子が同定され；
前記少なくとも1つの標識モノマーと前記1つ以上の標識モノマーは、蛍光色素、量子ドット、染料、酵素、ナノ粒子、質量タグ、化学発光マーカー、ビオチン、直接または間接に検出可能な他のモノマーからなるグループから選択される）；
（2）標識されたモノマーの前記線形な組み合わせ、または前記1つ以上の標識モノマーを検出し、そのことによってサンプル中の核酸分子を検出することを含む方法。
【請求項１４９】
サンプル中の複数の核酸分子を検出する方法であって、
（1）サンプルを請求項142に記載の第1の多価ポリマー鎖デュオおよび少なくとも第2の多価ポリマー鎖デュオと接触させ（ただし、
（a）それぞれの配列特異的領域は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標的付着位置を含んでいて、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって第1の核酸分子または少なくとも第2の核酸分子が同定され；または
（b）それぞれの配列特異的領域は、一本鎖核酸骨格に共有結合し、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって前記第1の核酸分子または前記少なくとも第2の核酸分子が同定され；または
（c）前記配列特異的領域は、レポータプローブに結合しているか、結合することができ、そのレポータプローブは、その配列特異的領域と相補的な結合部分と、一本鎖核酸骨格を少なくとも含み、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって前記第1の核酸分子または前記少なくとも第2の核酸分子が同定され；または
（d）前記配列特異的領域は、1つ以上の標識モノマーを含み、その1つ以上の標識モノマーによって前記第1の核酸分子または前記少なくとも第2の核酸分子が同定され；
前記少なくとも1つの標識モノマーと前記1つ以上の標識モノマーは、蛍光色素、量子ドット、染料、酵素、ナノ粒子、質量タグ、化学発光マーカー、ビオチン、直接または間接に検出可能な他のモノマーからなるグループから選択される）；
（2）前記第1の多価ポリマー鎖デュオと前記少なくとも第2の多価ポリマー鎖デュオについて、標識されたモノマーの前記線形な組み合わせ、または前記1つ以上の標識モノマーを検出し、そのことによってサンプル中の第1の核酸分子または前記少なくとも第2の核酸分子を検出することを含む方法。
【請求項１５０】
請求項69、71、72、73、141、143のいずれか1項に記載の組成物と、使用指示とを含むキット。
【請求項１５１】
タンパク質標的を検出することのできる少なくとも1つのプローブをさらに含む、請求項150に記載のキット。
【請求項１５２】
タンパク質標的を検出することのできる少なくとも1つのプローブをさらに含む、請求項69、71〜73、141、143のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１５３】
タンパク質標的を検出することのできる少なくとも1つのプローブにサンプルを接触させることをさらに含む、請求項74〜83、143〜149のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５４】
NanoString Technologies（登録商標）社の少なくとも別の1つのnCounter（登録商標）プローブをさらに含む、請求項69、71〜73、141、143のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１５５】
前記サンプルをNanoString Technologies（登録商標）社の少なくとも別の1つのnCounter（登録商標）プローブと接触させることをさらに含む、請求項74〜83、143〜149のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願の相互参照
本出願は、2015年9月3日に出願されたアメリカ合衆国仮出願第62/213,812号と、2016年2月8日に出願されたアメリカ合衆国仮出願第62/292,690号の優先権を主張する。上記出願のそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００２】
核酸の検出では、安定性の大きなプローブと特異性の大きなプローブの間のトレードオフが存在し、例えばより長いプローブは融点が高くて非常に安定だが、特異性を欠いているため、一塩基置換を検出することができない。DNAとRNAを正確かつロバストに無酵素かつ無増幅で検出することを一塩基の分解能で可能にするプローブ、組成物、方法、キットが必要とされている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、DNAとRNAを正確かつロバストに無酵素かつ無増幅で検出すること（例えば一塩基多型（SNP）、挿入、欠失の検出）を一塩基の分解能で可能にするポリマー鎖、プローブ、組成物、方法、キットに関する。
【０００４】
本発明の第1の側面は、（1）第1の標的結合領域、（2）第1の相補的領域、（3）配列特異的領域を少なくとも含む第1のポリマー鎖と、（1）第2の標的結合領域、（2）第2の相補的領域を少なくとも含む第2のポリマー鎖を含むポリマー鎖ペアに関する。第1の標的結合領域の標的と第2の標的結合領域の標的は同じ核酸分子内にあり、第1の標的結合領域の標的は第2の標的結合領域の標的と重複していない。第1の相補的領域は、第2の相補的領域と相補的である。
【０００５】
本発明の第2の側面は、サンプル中の核酸分子を検出する方法であって、サンプルを第1の側面のポリマー鎖ペアと接触させる工程を含む方法に関する。この側面は、標識されたモノマーの線形な組み合わせを検出する工程、または1つ以上の標識モノマーを検出する工程を含んでいて、そのことによってサンプル中の核酸分子を検出する。
【０００６】
サンプル中の核酸の検出に向けられた本発明の各側面において、それぞれの第1のポリマー鎖は配列特異的領域を持ち、（a）その配列特異的領域は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標的付着位置を含んでいて、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（b）その配列特異的領域は、一本鎖核酸骨格に共有結合し、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（c）その配列特異的領域は、レポータプローブに結合しているか、結合することができ、そのレポータプローブは、その配列特異的領域と相補的な結合部分と、一本鎖核酸骨格を少なくとも含み、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（d）その配列特異的領域は、1つ以上の標識モノマーを含み、その1つ以上の標識モノマーによって核酸分子が同定される。前記少なくとも1つの標識モノマーは、ビオチン、化学発光マーカー、染料、酵素、蛍光色素、ナノ粒子、量子ドット、直接または間接に検出可能な他のモノマーからなるグループから選択される。
【０００７】
本発明の第3の側面は、第1の側面のポリマー鎖ペアを複数含む組成物に関する。この側面では、第1のポリマー鎖ペアは第1の核酸分子に結合することができ、少なくとも第2のポリマー鎖ペアは少なくとも第2の核酸分子に結合することができる。その第1の核酸分子は、その少なくとも第2の核酸分子と異なっている。
【０００８】
本発明の第4の側面は、サンプル中の複数の核酸分子を検出する方法であって、サンプルを第1の側面の複数のポリマー鎖ペアと接触させる工程、またはサンプルを第3の側面の組成物と接触させる工程を含む方法に関する。この側面は、（1）第1のポリマー鎖ペアについて、標識されたモノマーの線形な組み合わせを検出するか、第1のポリマー鎖ペアについて、1つ以上の標識モノマーを検出し、（2）少なくとも第2のポリマー鎖ペアについて、標識されたモノマーの線形な組み合わせを検出するか、少なくとも第2のポリマー鎖ペアについて、1つ以上の標識モノマーを検出する工程を含んでいて、そのことによってサンプル中の第1の核酸分子と少なくとも第2の核酸分子を検出する。
【０００９】
本発明の第5の側面は、第1の側面のポリマー鎖ペアと、捕獲ポリマー鎖とを含むポリマー鎖トリオに関する。捕獲ポリマー鎖は、（1）少なくとも1つのアフィニティ部分を有する領域か、少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、（2）核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域を少なくとも含んでいる。第1の標的結合領域の標的、第2の標的結合領域の標的、第3の標的結合領域の標的は重複しておらず、同じ核酸分子内にある。
【００１０】
本発明の第6の側面は、サンプル中の核酸分子を検出する方法であって、サンプルを第5の側面のポリマー鎖トリオと接触させる工程を含む方法に関する。この側面は、ポリマー鎖トリオについて、標識されたモノマーの線形な組み合わせを検出する工程、またはポリマー鎖トリオについて、1つ以上の標識モノマーを検出する工程を含んでいて、そのことによってサンプル中の核酸分子を検出する。
【００１１】
本発明の第7の側面は、第5の側面のポリマー鎖トリオを複数含む組成物に関する。この側面では、第1のポリマー鎖トリオは第1の核酸分子に結合することができ、少なくとも第2のポリマー鎖トリオは少なくとも第2の核酸分子に結合することができる。第1の核酸分子は、その少なくとも第2の核酸分子と異なっている。
【００１２】
本発明の第8の側面は、サンプル中の複数の核酸分子を検出する方法であって、サンプルを第5の側面の複数のポリマー鎖トリオと接触させる工程、またはサンプルを第7の側面の組成物と接触させる工程を含む方法に関する。この側面は、（1）第1のポリマー鎖トリオについて、標識されたモノマーの線形な組み合わせを検出するか、第1のポリマー鎖トリオについて、1つ以上の標識モノマーを検出し、（2）少なくとも第2のポリマー鎖トリオについて、標識されたモノマーの線形な組み合わせを検出するか、少なくとも第2のポリマー鎖トリオについて、1つ以上の標識モノマーを検出する工程を含んでいて、そのことによってサンプル中の第1の核酸分子と少なくとも第2の核酸分子を検出する。
【００１３】
本発明の第9の側面は、第1の側面のポリマー鎖ペアの第1の相補的領域と第2の相補的領域がハイブリダイズするときに得られる部分的二本鎖核酸プローブに関する。ハイブリダイズするとき、第1のポリマー鎖と第2のポリマー鎖は、第1の側面のポリマー鎖ペアの各特徴を有する部分的二本鎖核酸プローブを形成する。
【００１４】
本発明の第10の側面は、サンプル中の核酸分子を検出する方法であって、サンプルを第9の側面の部分的二本鎖核酸プローブと接触させる工程を含む方法に関する。この側面は、部分的二本鎖核酸プローブについて、標識されたモノマーの線形な組み合わせを検出するか、部分的二本鎖核酸プローブについて、1つ以上の標識モノマーを検出する工程を含んでいて、そのことによってサンプル中の核酸分子を検出する。
【００１５】
本発明の第11の側面は、第9の側面の部分的二本鎖核酸プローブを複数含む組成物に関する。この側面では、第1の部分的二本鎖核酸プローブは第1の核酸分子に結合することができ、少なくとも第2の部分的二本鎖核酸プローブは少なくとも第2の核酸分子に結合することができる。第1の核酸分子は、その少なくとも第2の核酸分子と異なっている。
【００１６】
本発明の第12の側面は、サンプル中の複数の核酸分子を検出する方法であって、サンプルを第9の側面の複数の部分的二本鎖核酸プローブと接触させる工程、またはサンプルを第11の側面の組成物と接触させる工程を含む方法に関する。この側面は、（1）第1の部分的二本鎖核酸プローブについて、標識されたモノマーの線形な組み合わせを検出するか、第1の部分的二本鎖核酸プローブについて、1つ以上の標識モノマーを検出し、（2）少なくとも第2の部分的二本鎖核酸プローブについて、標識されたモノマーの線形な組み合わせを検出するか、少なくとも第2の部分的二本鎖核酸プローブについて、1つ以上の標識モノマーを検出する工程を含んでいて、そのことによってサンプル中の第1の核酸分子と少なくとも第2の核酸分子を検出する。
【００１７】
本発明の第13の側面は、第9の側面の複数の部分的二本鎖核酸プローブと、複数の捕獲ポリマー鎖とを含む組成物に関する。第1の捕獲ポリマー鎖は、（1）少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域、または少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、（2）核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域を少なくとも含んでいる。それぞれの少なくとも第2の捕獲ポリマー鎖は、（1）少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域、または少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、（2）少なくとも第2の核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域を少なくとも含んでいる。第1の標的結合領域、第2の標的結合領域、第3の標的結合領域それぞれの標的は重複しておらず、同じ核酸分子内にある。第1の核酸分子は、前記少なくとも第2の核酸分子と異なっている。
【００１８】
本発明の第14の側面は、（1）第1の標的結合領域と、（2）第2の標的結合領域と、（3）その第1の標的結合領域とその第2の標的結合領域の間にあるスペーサと、（4）配列特異的領域を少なくとも含む多価ポリマー鎖に関する。第1の標的結合領域の標的と第2の標的結合領域の標的は同じ核酸分子内にあり、第1の標的結合領域の標的は、第2の標的結合領域の標的と重複していない。スペーサとして、ポリマー鎖、例えばオリゴヌクレオチドやポリエチレングリコールが可能である。
【００１９】
本発明の第15の側面は、サンプル中の核酸分子を検出する方法であって、サンプルを第14の側面の多価ポリマー鎖と接触させる工程を含む方法に関する。この側面は、標識されたモノマーの線形な組み合わせを検出する工程、または1つ以上の標識モノマーを検出する工程を含んでいて、そのことによってサンプル中の核酸分子を検出する。
【００２０】
本発明の第16の側面は、第14の側面の多価ポリマー鎖を複数含む組成物に関する。この側面では、第1の多価ポリマー鎖は第1の核酸分子に結合することができ、少なくとも第2の多価ポリマー鎖は少なくとも第2の核酸分子に結合することができる。第1の核酸分子は、その少なくとも第2の核酸分子と異なっている。
【００２１】
本発明の第17の側面は、サンプル中の複数の核酸分子を検出する方法であって、サンプルを第14の側面の複数の多価ポリマー鎖と接触させる工程、またはサンプルを第16の側面の組成物と接触させる工程を含む方法に関する。この側面は、（1）第1の多価ポリマー鎖について、標識されたモノマーの線形な組み合わせを検出するか、第1の多価ポリマー鎖について、1つ以上の標識モノマーを検出し、（2）少なくとも第2の多価ポリマー鎖について、標識されたモノマーの線形な組み合わせを検出するか、少なくとも第2の多価ポリマー鎖について、1つ以上の標識モノマーを検出する工程を含んでいて、そのことによってサンプル中の第1の核酸分子と少なくとも第2の核酸分子を検出する。
【００２２】
本発明の第18の側面は、第14の側面の多価ポリマー鎖と、捕獲ポリマー鎖とを含む多価ポリマー鎖デュオに関する。捕獲ポリマー鎖は、（1）少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域、または少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、（2）核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域を少なくとも含んでいる。第1、第2、第3の標的結合領域の標的は重複しておらず、同じ核酸分子内にある。
【００２３】
本発明の第19の側面は、サンプル中の核酸分子を検出する方法であって、サンプルを第18の側面の多価ポリマー鎖デュオと接触させる工程を含む方法に関する。この側面は、多価ポリマー鎖デュオについて、標識されたモノマーの線形な組み合わせを検出する工程、または多価ポリマー鎖デュオについて、1つ以上の標識モノマーを検出する工程を含んでいて、そのことによってサンプル中の核酸分子を検出する。
【００２４】
本発明の第20の側面は、第18の側面の多価ポリマー鎖デュオを複数含む組成物に関する。この側面では、第1の多価ポリマー鎖デュオは第1の核酸分子に結合することができ、少なくとも第2の多価ポリマー鎖デュオは少なくとも第2の核酸分子に結合することができる。第1の核酸分子は、その少なくとも第2の核酸分子と異なっている。
【００２５】
本発明の第21の側面は、サンプル中の複数の核酸分子を検出する方法であって、サンプルを第18の側面の複数の多価ポリマー鎖デュオと接触させる工程、またはサンプルを第20の側面の組成物と接触させる工程を含む方法に関する。この側面は、（1）第1の多価ポリマー鎖デュオについて、標識されたモノマーの線形な組み合わせを検出するか、第1の多価ポリマー鎖デュオについて、1つ以上の標識モノマーを検出し、（2）少なくとも第2の多価ポリマー鎖デュオについて、標識されたモノマーの線形な組み合わせを検出するか、少なくとも第2の多価ポリマー鎖デュオについて、1つ以上の標識モノマーを検出する工程を含んでいて、そのことによってサンプル中の第1の核酸分子と少なくとも第2の核酸分子を検出する。
【００２６】
本明細書に記載したどの組成物も、タンパク質標的を検出することのできる少なくとも1つのプローブをさらに含むことができる。
【００２７】
本明細書に記載したどの方法も、サンプルを、タンパク質標的を検出することのできる少なくとも1つのプローブと接触させることをさらに含むことができる。
【００２８】
本発明の第22の側面は、第3の側面、第7の側面、第11の側面、第13の側面、第16の側面、第20の側面いずれかの組成物と、使用指示とを含むキットに関する。上記側面いずれかの方法を実施するのに必要な他の要素をキットに含めることができる。このキットは、タンパク質標的を検出することのできる少なくとも1つのプローブをさらに含むことができる。
【００２９】
本発明の各側面において、標識されたオリゴヌクレオチドは、1つ以上の検出可能な標識モノマーで標識することができる。標識は、オリゴヌクレオチドの末端、またはオリゴヌクレオチド内のある一点、またはその組み合わせに位置させることができる。オリゴヌクレオチドは、アミン修飾を有するヌクレオチドを含むことができ、そうすることで、検出可能な標識をそのヌクレオチドにカップリングさせることが可能になる。本発明の標識されたオリゴヌクレオチドは、多彩な標識モノマー（例えば蛍光色素、量子ドット、染料、酵素、ナノ粒子、化学発光マーカー、ビオチン、直接（例えば発光によって）または間接（例えば蛍光標識した抗体の結合によって）に検出可能な本分野で知られている他のモノマー）のうちの任意のもので標識することができる。本発明で使用できる標識の好ましい例は、蛍光体である。いくつかの蛍光体を、ヌクレオチドを標識するための標識モノマーとして用いることができ、その非限定的な例には、GFP関連タンパク質、シアニン染料、フルオレセイン、ローダミン、ALEXA Fluor（商標）、Texas Red、FAM、JOE、TAMRA、ROXが含まれる。スペクトル全体にわたるいくつかの異なる蛍光体が知られており、生産がさらに続けられている。
【００３０】
本発明の各側面において、1つの標的付着位置に、少なくとも1つの標識されたオリゴヌクレオチドをハイブリダイズ（非共有結合）させることができる。その代わりに、1つの位置に、検出可能な標識が欠けた少なくとも1つのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせてもよい。それぞれの位置には、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個〜100個、またはそれ以上の個数の標識された（または標識されていない）オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることができる。それぞれの位置にハイブリダイズする標識されたオリゴヌクレオチドの数は、その位置の長さと、そのオリゴヌクレオチドのサイズに依存する。1つの位置は、長さが約12個〜約1500個のヌクレオチドにすることができる。標識された（または標識されていない）オリゴヌクレオチドの長さは、ヌクレオチドが約12個から約1500個までの長さの変動がある。実施態様では、標識された（または標識されていない）オリゴヌクレオチドの長さは、ヌクレオチドが約800個から約1300個までの長さの変動がある。別の実施態様では、標識された（または標識されていない）オリゴヌクレオチドの長さは、デオキシリボヌクレオチドが約20個から約55個までの変動がある。このようなヌクレオチドは、約65℃と約85℃の間、例えば約80℃の融点／ハイブリダイゼーション温度を持つように設計される。例えば長さが約1100個のヌクレオチドからなる位置は、それぞれが約45個〜約25個の長さのデオキシリボヌクレオチドからなる約25個〜約45個のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。実施態様では、それぞれの位置は、約33個の長さのデオキシリボヌクレオチドからなる約34個の標識されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。その標識されたオリゴヌクレオチドは、一本鎖DNAであることが好ましい。
【００３１】
本発明の各側面において、（1つの位置が標識されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることを通じて）各位置に付着する標識は、前の位置または後の位置の標識から空間分離とスペクトル分解をすることができる。空間分離とスペクトル分解が可能な順序づけられた一連のプローブ用標識を、本明細書ではバーコードまたは標識コードと呼ぶ。バーコードまたは標識コードにより、特定のプローブが結合した標的核酸または標的タンパク質を同定することができる。
【００３２】
「1つ以上」、「少なくとも1つ」などの表現は、非限定的な例として、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000またはそれ以上と、これらの間の任意の数を含むと理解される。したがって「少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチド」は、例えば2個のオリゴヌクレオチド、6個のオリゴヌクレオチド、10個のオリゴヌクレオチドを含んでいる可能性がある。
【００３３】
逆に、「以下」という用語は、記載されている値とそれよりも小さな各値を含む。例えば「100個以下のヌクレオチド」には、100個、99個、98個、97個、96個、95個、94個、93個、92個、91個、90個、89個、88個、87個、86個、85個、84個、83個、82個、81個、80個、79個、78個、77個、76個、75個、74個、73個、72個、71個、70個、69個、68個、67個、66個、65個、64個、63個、62個、61個、60個、59個、58個、57個、56個、55個、54個、53個、52個、51個、50個、49、48個、47個、46個、45個、44個、43個、42個、41個、40個、39個、38個、37個、36個、35個、34個、33個、32個、31個、30個、29個、28個、27個、26個、25個、24個、23個、22個、21個、20個、19個、18個、17個、16個、15個、14個、13個、12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個、1個、0個のヌクレオチドが含まれる。
【００３４】
「複数」、「少なくとも2つ」、「2つ以上」、「少なくとも第2の」などの表現は、非限定的な例として、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000またはそれ以上と、これらの間の任意の数を含むと理解される。したがって「少なくとも第2のポリマー鎖ペア」は、非限定的な例として、2個のポリマー鎖ペア、10個のポリマー鎖ペア、100個のポリマー鎖ペア、1000個のポリマー鎖ペアを含む。同様に、「少なくとも第2の核酸分子」は、非限定的な例として、2個の核酸分子、20個の核酸分子、40個の核酸分子、60個の核酸分子を含む。また、「少なくとも第2の捕獲ポリマー鎖」は、非限定的な例として、2本の捕獲ポリマー鎖、500本の捕獲ポリマー鎖、1000本の捕獲ポリマー鎖、5000本の捕獲ポリマー鎖を含む。さらに、「少なくとも2つの標識付着位置」は、非限定的な例として、2個の標識付着位置、4個の標識付着位置、6個の標識付着位置、8個の標識付着位置を含む。
【００３５】
実施態様では、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、200個、300個、400個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個またはそれ以上の個数の核酸と、これらの間の任意の数が検出される。800個以上の異なる核酸を検出することができる。実施態様では、検出は、各核酸の量を定量することを含んでいる。
【００３６】
本明細書に開示されているプローブと方法により、5 ngという少量の新鮮なゲノムDNA（gDNA）、またはホルマリン固定パラフィン埋包（FFPE）ゲノムDNA（gDNA）から、アレルの頻度が約5％の体細胞バリアントの検出が可能になる。
【００３７】
US2003/0013091、US2007/0166708、US2010/0015607、US2010/0261026、US2010/0262374、US2010/0112710、US2010/0047924、US2014/0371088、US2014/0017688、US2011/0086774に記載されているNanoString Technologies（登録商標）社からのnCounter（登録商標）プローブ、システム、方法が、標的タンパク質および／または標的核酸を同定するための好ましい手段である。NanoString Technologies（登録商標）社からのnCounter（登録商標）プローブ、システム、方法により、複数（800以上）の異なる標的タンパク質および／または標的核酸の同時多重同定が可能になる。上記特許出願公開のそれぞれは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれている。NanoString Technologies（登録商標）社からの上記のnCounter（登録商標）プローブ、システム、方法は、本明細書に記載した任意の側面または実施態様と組み合わせることができる。
【００３８】
nCounter（登録商標）カートリッジ（例えばその単一のレーン）を用い、上記のnCounter（登録商標）プローブ、システム、方法と本明細書に記載した側面または実施態様の組み合わせから、複数の異なる標的タンパク質および／または標的核酸の同時多重同定を実現することができる。
【００３９】
本明細書に記載した側面または実施態様のどれも、本明細書に開示した他の任意の側面または実施態様と組み合わせることができる。
【００４０】
詳細な説明をこれまで開示してきたが、以下の説明は、本開示を説明することが目的であり、本開示の範囲を制限することは意図していない。その範囲は、添付の請求項の範囲によって規定される。他の側面、利点、変更は、下記の請求項の範囲内である。
【００４１】
本明細書で言及した特許と学術文献は、当業者が利用できる知識を明確にしている。本明細書で引用したアメリカ合衆国特許、公開されたアメリカ合衆国特許出願、公開されていないアメリカ合衆国特許出願はすべて、参照により本明細書に組み込まれている。本明細書で引用した外国の公開された特許と特許出願は、参照により本明細書に組み込まれている。本明細書で引用した他の公開された参考文献、文書、原稿、学術文献はすべて、参照により本明細書に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
本特許または本出願のファイルは、少なくとも1枚のカラー図面を含んでいる。カラー図面を伴う本特許または本出願公開のコピーは、請求して必要な費用を支払えば特許商標庁から提供される。
【００４３】
【図１】図1は、ポリマー鎖、ポリマー鎖ペア、部分的二本鎖核酸プローブの例を示している。図1Aは、第1の標的結合領域（赤色）と第2の標的結合領域（緑色）を含む第1のポリマー鎖を有するポリマー鎖ペアを示している。図1Bは、標識部分（緑色の丸）を含む第1のポリマー鎖と、アフィニティ部分（星印）を含む第2のポリマー鎖を有するポリマー鎖ペアを示している。図1Cは、1つのポリマー鎖ペアを示しており、ここでは、第1のポリマー鎖が、線形な組み合わせで共有結合した複数（図では6個）の標的付着位置を含む一本鎖核酸骨格に共有結合していて、それぞれの標識付着位置に、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドが結合するか；あるいは配列特異的領域が、線形な組み合わせで共有結合した複数の標的付着位置を含んでいて、それぞれの標識付着位置に、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドが結合する。図1D〜図1Gは、複数のポリマー鎖ペアを示しており、ここでは、それぞれの第1の相補的領域が第2の相補的領域にハイブリダイズし、そのことによって部分的二本鎖核酸プローブを生み出している。図1Fは、1つのポリマー鎖ペア／部分的二本鎖核酸プローブを示しており、ここでは、複数の標的付着位置の1つに、標識モノマーが欠けた相補的一本鎖オリゴヌクレオチド（白丸で示す）が結合する。図1Gは、レポータプローブに結合した配列特異的領域を有する1つのポリマー鎖ペア／部分的二本鎖核酸プローブを示しており、そのレポータプローブは、複数（図では5つ）の標識付着位置を含んでいて、そのそれぞれに、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドが結合する。色つきのそれぞれの丸は、それぞれの標識付着位置または配列特異的領域に付着する複数の標識モノマーの全体を表わしている。図1と本開示の別の場所に示した色は、非限定的な例である。他の色の標識や、本分野で知られている他の検出可能な標識を本発明のプローブで用いることができる。
【図２】図2は、図1に示したのと同様のポリマー鎖ペア／部分的二本鎖核酸プローブを示しており、そのそれぞれが核酸分子に結合している。図2Bには、その核酸分子に結合した捕獲ポリマー鎖が示されている。この捕獲ポリマー鎖は、アフィニティ部分（星印）を含んでいる。
【図３】図3は、ポリマー鎖、ポリマー鎖ペア、部分的二本鎖核酸プローブの例を示しており、そのそれぞれが、少なくとも1つのスペーサ（青色の波線で示す）を含んでいる。図3Aは、1つのポリマー鎖ペアを示しており、ここでは、それぞれのポリマー鎖がスペーサを有する。図3Bは、1つのポリマー鎖ペアを示しており、ここでは第1のポリマー鎖がスペーサを有する。図3Cは、1つのポリマー鎖ペアを示しており、ここでは第2のポリマー鎖がスペーサを有する。図3Eは、1つのポリマー鎖ペア／部分的二本鎖核酸プローブを示しており、ここでは第1のポリマー鎖がアフィニティ部分（星印）を含んでいる。図3Fは、1つのポリマー鎖ペア／部分的二本鎖核酸プローブを示しており、ここでは複数の標的付着位置の1つに、標識モノマーが欠けた相補的一本鎖オリゴヌクレオチド（白丸で示す）が結合する。
【図４】図4は、図3示したのと同様のポリマー鎖ペア／部分的二本鎖核酸プローブを示しており、そのそれぞれが核酸分子に結合している。図4Cには、その核酸分子に結合した捕獲ポリマー鎖が示されている。この捕獲ポリマー鎖のほうには、少なくとも1つのアフィニティ部分（星印）を含む一本鎖核酸が結合している。
【図５】図5は、本発明のポリマー鎖、ポリマー鎖ペア、部分的二本鎖核酸プローブを用いて核酸分子を検出するいくつかの工程を示している。図5Aは、核酸分子への第1のポリマー鎖の結合を示している。その第1のポリマー鎖はスペーサを含んでいる。図5Bは、その後の工程を示しており、ここでは、第2のポリマー鎖が核酸分子に結合し終わっていて、第1の相補的領域が第2の相補的領域にハイブリダイズする。図5Bの工程をこの方法の第1の工程にして、第1のポリマー鎖と第2のポリマー鎖を同時に核酸分子に供給してもよいことに注意されたい。あるいは第1のポリマー鎖と第2のポリマー鎖を、そのそれぞれの相補的領域を通じて最初にハイブリダイズさせ（そのことによって部分的二本鎖核酸プローブを生成させ）、その後にプローブを核酸分子に供給してもよい。図5Cは、図5Bの二本鎖核酸プローブの配列特異的領域にレポータプローブが結合した状態を示しており、そのレポータプローブは、複数（図では4つ）の標識付着位置を含んでいて、それぞれの標識付着位置に、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドが結合する。図5Cに示した複合体の各要素を核酸に別々に、または同時に供給できることに注意されたい。
【図６】図6は、本発明のポリマー鎖、ポリマー鎖ペア、部分的二本鎖核酸プローブを用いて核酸分子を検出する別の工程を示している。図6Aは、核酸分子に結合した二本鎖核酸プローブと捕獲ポリマー鎖を示している。図6Bは、図6Aの二本鎖核酸プローブの配列特異的領域がレポータプローブに結合した状態を示しており、そのレポータプローブは、複数（図では6つ）の標識付着位置を含んでいて、それぞれの標識付着位置に、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドが結合する。核酸分子には捕獲ポリマー鎖も結合しており、その捕獲ポリマー鎖のほうには、少なくとも1つのアフィニティ部分（星印）を含む一本鎖核酸が結合している。
【図７】図7は、本発明のポリマー鎖、ポリマー鎖ペア、部分的二本鎖核酸プローブを用いて核酸分子を検出する別の一連の工程を示している。図7Aは、核酸分子への捕獲ポリマー鎖の最初の結合を示している。その後、図7Cにおいて、第2のポリマー鎖が核酸分子に結合する。
【図８】図8は、ポリマー鎖、ポリマー鎖ペア、部分的二本鎖核酸プローブの例を示しており、ここではそれぞれの第1のポリマー鎖が、開裂可能なリンカー（紫色の三角形で示す）を含んでいる。図8Cでは、レポータプローブがアフィニティ部分（星印）を含んでおり、図8Dでは、配列特異的領域の一部がアフィニティ部分を含んでいる。
【図９】図9は、核酸分子に結合した部分的二本鎖核酸プローブを示しており、ここでは第1のポリマー鎖が、開裂可能なリンカー（紫色の三角形で示す）を含んでいる。開裂可能なリンカーを開裂させるのに十分な力を加える（赤い稲妻型の線）。図9Bは、レポータプローブに結合している配列特異的領域の一部分が部分的二本鎖核酸プローブから放出される。すると放出されたレポータプローブを検出することができる。この例では、放出された配列特異的領域のその部分がアフィニティ部分を含んでいて、それをその後の工程で捕獲することができる。
【図１０】図10は、多価ポリマー鎖の例を示している。図10Aは、第1の標的結合領域（緑色）と、第2の標的結合領域（赤色）と、第1の標的結合領域と第2の標的結合領域の間のスペーサと、配列特異的領域（第2の標的結合領域の左側）を含む多価ポリマー鎖を示している。図10Bは、標識部分（赤色の丸）を含む多価ポリマー鎖を示している。図10Cは、線形な組み合わせで共有結合した複数（図では6つ）の標識付着位置を含む一本鎖核酸骨格に共有結合した多価ポリマー鎖を示しており、そのうちの5つの標識付着位置には、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチド（色つきの丸）が結合し、1つの標識付着位置には、標識モノマーが欠けた相補的一本鎖オリゴヌクレオチド（白丸で示す）が結合する。あるいは配列特異的領域は、線形な組み合わせで共有結合した複数の標識付着位置を含んでいて、それぞれの標識付着位置に、少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドが結合する。図10Dは、レポータプローブに結合した配列特異的領域を有する多価ポリマー鎖を示しており、そのレポータプローブは複数（図では6つ）の標識付着位置を含んでいて、それぞれの標識付着位置に、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドが結合する。色つきのそれぞれの丸は、それぞれの標識付着位置または配列特異的領域に付着する複数の標識モノマーの全体を表わす。
【図１１】図11は、図10と同様の多価ポリマー鎖を示しており、そのそれぞれが核酸分子に結合している。図11Bは、核酸分子に結合した捕獲ポリマー鎖を示している。その捕獲ポリマー鎖は、アフィニティ部分（星印）を含んでいる。
【図１２】図12は、多価ポリマー鎖の例を示しており、そのそれぞれは、1つのスペーサ（青色の波線で示す）を含んでいる。図12Bは、アフィニティ部分（星印）を含む多価ポリマー鎖を示している。図12Eは、1つの多価ポリマー鎖を示しており、ここでは、（レポータプローブの）複数の標識付着位置のうちの1つに、標識モノマーが欠けた相補的一本鎖オリゴヌクレオチド（白丸で示す）が結合する。
【図１３】図13は、図12と同様の多価ポリマー鎖を示しており、そのそれぞれが核酸分子に結合している。図13Cは、核酸分子に結合した多価ポリマー鎖と捕獲ポリマー鎖を示している。捕獲ポリマー鎖のほうには、少なくとも1つのアフィニティ部分（星印）を含む一本鎖核酸が結合している。
【図１４】図14は、多価ポリマー鎖と捕獲ポリマー鎖を用いて核酸分子を検出する工程の例を示している。
【図１５】図15は、開裂可能なリンカー（紫色の三角形で示す）を含む多価ポリマー鎖の例を示している。図15D〜図15Fの多価ポリマー鎖は、それぞれが1つのスペーサ（青色の波線で示す）を含んでいるのに対し、図15A〜図15Cの多価ポリマー鎖はスペーサを欠いている。
【図１６】図16は、1価プローブと、本発明のポリマー鎖ペア／部分的二本鎖プローブ／多価ポリマー鎖に関する融点の分布を表わすグラフを示している。
【図１７】図17は、サンプル中の1つ以上の核酸を検出するために本発明の方法で使用できる工程の概略である。
【図１８】図18は、ポリマー鎖ペア／部分的二本鎖プローブをNanoString Technologies（登録商標）社からの既存のDV2レポータプローブとともに用いたBRAF V600E SNP検出実験（実施例1）で使用されるポリマー鎖ペア／部分的二本鎖プローブ（図18A）を示している。図18Bは、図18Aの3つのプローブが結合する核酸配列を示している。図18Cは、実施例1で得られた結果の一部を示している。
【図１９】図19は、BRAF V600E SNP検出実験（実施例1）で得られた追加の結果を示している。
【図２０】図20は、BRAF V600E SNP検出実験（実施例1）で得られた追加の結果を示している。
【図２１】図21は、BRAF V600E SNP検出実験（実施例1）で得られた追加の結果を示している。
【図２２】図22は、BRAF V600E SNP検出実験（実施例1）で得られた追加の結果を示している。
【図２３】図23は、BRAF V600E SNP検出実験（実施例1）で得られた結果に基づく、2アーム式高性能プローブのためのプローブ設計の傾向を示している。
【図２４】図24は、ポリマー鎖ペア／部分的二本鎖プローブをNanoString Technologies（登録商標）社からの既存のDV2レポータプローブとともに用いたEGFR T790M SNP検出実験（実施例1）で得られた結果を提示している。
【図２５】図25は、4つの実験から得られた結果に基づく、2アーム式高性能プローブのためのプローブ設計の傾向を示している。実施例1により詳しく記載する。
【図２６】図26は、1つの核酸分子に結合した図1〜図3と同様のポリマー鎖ペア／二本鎖核酸プローブと、その核酸分子に結合しした捕獲ポリマー鎖を示している。捕獲ポリマー鎖のほうには、少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸が結合している。このポリマー鎖ペア／二本鎖核酸プローブによって検出可能なSNPが示されている。
【図２７】図27は、KRASエキソン2のコドン12と13の一塩基バリアント（SNV）の参照配列を示している。この参照配列とSNV遺伝子座に特異的なプローブを調製して試験した。
【図２８Ａ】図28A〜図28Dは、実施例2に記載したKRASエキソン2ホットスポット実験で用いるプローブを示している。KRASのエキソン2ホットスポット周辺の鋳型配列が上部に沿って示されている。マッチング参照プローブと10個のSNV変異体プローブが、青と赤で強調した2つの標的結合領域とともに示されている。すべての実験で共通のプローブB（図26の赤色）を使用した。図28Aは配列全体を示しており、図28B〜図28Dは、それぞれ、図28Aの配列の1/3を示している。
【図２８Ｂ】図28Aの説明に同じ。
【図２８Ｃ】図28Aの説明に同じ。
【図２８Ｄ】図28Aの説明に同じ。
【図２９】図29は、実施例2に記載したKRASのエキソン2ホットスポット実験からの結果を示している。各遺伝子座の位置での特異度は、標的と正確に一致するプローブのカウント数の割合を、すべてのKRASエキソン2プローブに関するディジタルカウント数に対する割合として求めることによって明らかになる。
【図３０】図30は、EGFRのエキソン19と、その既知のいくつかの欠失バリアントを示している。
【図３１Ａ】図31 A〜図31Dは、実施例3のEGFRエキソン19欠失実験で用いるプローブである。EGFRエキソン19欠失周辺の鋳型配列が上部に沿って示されている。マッチング参照プローブと3個の変異体プローブが、青と赤で強調した2つの標的結合領域とともに示されている。欠失領域は、プローブ配列にピンク色で強調したギャップとして示してある。すべての実験で共通のプローブBオリゴ（図26の赤色）を使用した。図31 Aは配列全体を示しており、図31B〜図31Dは、それぞれ、図31Aの配列の1/3を示している。
【図３１Ｂ】図31Aの説明に同じ。
【図３１Ｃ】図31Aの説明に同じ。
【図３１Ｄ】図31Aの説明に同じ。
【図３２】図32は、実施例3のEGFRエキソン19欠失実験からの結果を示している。それぞれの欠失配列の特異度は、標的と正確に一致するプローブのディジタルカウント数の割合を、EGFRエキソン19プローブのカウント数に対する割合として求めることによって明らかになる。
【図３３Ａ】図33 A〜図33Dは、実施例4の多重SNV実験で用いるプローブである。7つのSNV遺伝子座それぞれの周辺の鋳型配列が上部に沿って示されている。マッチング野生型プローブとSNV変異体プローブが、青と赤で強調した2つの標的結合領域とともに示されている。各遺伝子座のためのプローブBオリゴを黄色で強調してある。図33 Aは配列全体を示しており、図33B〜図33Dは、それぞれ、図33Aの配列の1/3を示している。
【図３３Ｂ】図33Aの説明に同じ。
【図３３Ｃ】図33Aの説明に同じ。
【図３３Ｄ】図33Aの説明に同じ。
【図３４】図34は、実施例4の多重SNV実験からの結果を示している。SKMEL 2、SKMEL 5、SKMEL 28という3つの細胞系のDNAサンプルの遺伝子型を7つのSNV変異について求めた。遺伝子とCOSMICのIDをプロット中に示してある。野生型（WT）配列および変異（Mut）配列と一致するプローブについて、バックグラウンドに対する信号の比をプロットしてある。
【図３５】図35は、実施例4の多重SNV実験によって求めた遺伝子型を、他の方法によって求めた遺伝子型と比較して示している。qPCRの結果は、同じ細胞系から取得したサンプルでTaqMan（登録商標）アッセイを利用して求めた。NGSとWGSの結果は、文献から取得する。
【図３６】図36は、実施例5の3D生物学実験からの結果を示している。この実験では、DNA SNV、RNA遺伝子発現、タンパク質を同時に検出する。3つの細胞系にBRAF阻害薬であるベムラフェニブを投与した。これら3つの細胞系は、BRAF V600E 変異に関して野生型であるSW 48と、その変異に関して異種接合であるRPMI 7591と、二重変異体であるSKMEL 28であった。ベムラフェニブは、BRAF V600E 変異を含む細胞を特異的に標的とする。すべてのデータを3回繰り返して取得した。各細胞系の遺伝子型は、SNV DNAアッセイを利用して求めた。薬を用いた処理に起因する遺伝子発現（上）とタンパク質発現（下）の変化は、BRAF V600E遺伝子型に依存する。
【図３７】図37は、タンパク質の検出に用いる3種類のプローブを示している。上部の配置では、プローブが、タンパク質結合ドメインに付着した核酸を含んでいる。この配置では、開裂可能なモチーフ（例えば開裂可能なリンカー、図示せず）を核酸とタンパク質結合ドメインの間に、または核酸そのものの中に含めることができる。中央の配置では、タンパク質結合ドメインが核酸に付着し、プローブが核酸にハイブリダイズしている。（標的結合ドメインと、タンパク質結合ドメイン（緑色で示す）に付着した核酸を含む）このプローブには、（図38に示してあるように）標的結合ドメインがタンパク質標的に結合する前、または標的結合ドメインがタンパク質標的に結合した後に、プローブが結合することができる。開裂可能なモチーフを、骨格と、タンパク質結合ドメインに付着した核酸の一方または両方に含めることができる。下部の配置では、タンパク質結合ドメインが核酸に付着し、中間オリゴヌクレオチド（赤色で示す）が、プローブと、タンパク質結合ドメインに付着した核酸の両方にハイブリダイズしている。
【図３８】図38は、図37の中央と下部のプローブを示している。上部の2つの図は、タンパク質に結合する前とタンパク質に結合した後のプローブを示している。次の図は、開裂可能なモチーフが開裂した後のプローブを示している。この図では、開裂可能なモチーフは、核酸と標的結合ドメインの間にある。核酸が放出されると、その核酸を信号オリゴヌクレオチドと見なすことができる。下部の図では、その信号オリゴヌクレオチド（プローブから放出された核酸）にレポータプローブが結合する。
【図３９】図39は、図37に示した中央の配置のプローブからの信号オリゴヌクレオチドの放出と、図38のプローブを示している。プローブ（またはレポータプローブ）内の開裂可能なモチーフの位置が、放出される信号オリゴヌクレオチドにどのような材料が含まれるかに影響を及ぼす。
【図４０】図40は、実施例6に記載したKRASエキソン2変異ホットスポット実験からの結果を示している。各ハイブリダイゼーション反応における全カウント数は参照カウント数によって大半が占められ、予想されるバリアントのカウント数は5％である。
【図４１】図41は、実施例7に記載したEGFRエキソン19挿入-欠失ホットスポット実験からの結果を示している。各ハイブリダイゼーション反応における全カウント数は参照カウント数によって大半が占められ、バリアント鋳型に関して予想されるバリアントのカウント数は5％である。
【図４２】図42は、実施例8に記載したホットスポット実験での多重SNV検出実験からの結果を示している。2つのFFPE由来ゲノムDNA（gDNA）サンプルの同体積混合物から、1〜10％の割合で存在する10通りの変異を持つサンプルが得られ、それをSNVアッセイで調べる。
【図４３】図43は、実施例8に記載したホットスポット実験での多重SNV検出実験からのバリアントプローブのカウント数の比較を示している。
【図４４】図44は、実施例8に記載したホットスポット実験での多重SNV検出実験からのp値の比較を示している。参照サンプルをバリアントサンプルと比較してカウント数に有意差があるというのは、バリアントサンプルに変異アレルが存在することを示している。
【図４５】図45は、実施例9に記載したSNVと遺伝子融合転写産物の同時検出に関する実験作業フローの全体を示している。
【図４６】図46は、SNVパネルによって調べたSNVのリストと、それらSNVの特徴と、実施例9に記載したSNVと融合を同時に検出する実験で用いたプライマーを示している。
【図４７】図47は、実施例9に記載したデータを得るための、SNV変異アレル特異的プローブのカウント数の比較を示している。この比較から、COSM532含有FFPE gDNAサンプルから検出されたKRAS COSM532変異のカウント数は、参照gDNAと比べて約100倍多いことがわかる。
【図４８】図48は、実施例9に記載したデータを得るための、SNV参照アレル特異的プローブのカウント数の比較を示している。この比較から、参照gDNAサンプルからの参照アレルの検出とCOSM532含有FFPE gDNAサンプルからの参照アレルの検出に有意差がないことがわかる。
【図４９】図49は、実施例9に記載したようにしてSNVを同時に調べる間に得られた肺融合遺伝子アッセイのカウント数を示している。このデータは、対照サンプル中にEML4-ALK融合体だけが存在することの証拠を示している。
【図５０】図50は、実施例9に記載したようにしてSNVを同時に調べる間に得られた肺融合遺伝子アッセイのカウント数を示している。このデータは、対照サンプル中にCCDC6-RET融合体だけが存在することの証拠を示している。
【図５１】図51は、実施例9に記載したようにしてSNVを同時に調べる間に得られた肺融合遺伝子アッセイのカウント数を示している。このデータは、対照サンプル中にSLC34A2-ROS1融合体だけが存在することの証拠を示している。
【図５２】図52は、実施例9に記載したようにしてSNVを同時に調べる間に得られた肺融合遺伝子アッセイのカウント数を示している。このデータは、SNVと融合転写産物の同時検出アッセイの間に用いるRNA供給源の違いによってSNVアッセイプローブのカウント数に有意な差は生じないことを示している。
【００４４】
発明の詳細な説明
本発明は、一部が、DNAとRNAを正確かつロバストに無酵素かつ無増幅で検出すること（例えば一塩基多型（SNP）、挿入、欠失の検出）を一塩基の分解能で可能にするポリマー鎖、プローブ、組成物、方法、キットに基づいている。
【００４５】
本発明をさまざまな「検出」技術（例えば蛍光、発色、質量分析）と組み合わせて特定のハイブリダイゼーション事象を同定および／または定量することができる。例として、本明細書に開示したポリマー鎖と部分的二本鎖核酸プローブは、多彩な読み出しレポータ（例えば蛍光（単一分子、微粒子による多分子、DNA折り紙、ローリングサークル増幅、分岐DNA）、化学発光、発色、質量タグ（質量分析用）、酵素）とともに用いることができる。したがって、標準的な核酸ハイブリダイゼーション法を改変して本発明のプローブを利用できるようにすることができる。さらに、本明細書に開示したポリマー鎖と部分的二本鎖核酸プローブは、NanoString Technologies（登録商標）社からの蛍光光学的バーコードシステム（例えばnCounter（登録商標）システム）に適合しているため、そのシステムで用いることができる。したがってnCounter（登録商標）システムの作業フローの変更は最少になる。それと組み合わせることで、本明細書に開示したポリマー鎖と部分的二本鎖核酸プローブは、一塩基の分解能を持つ多重核酸検出とディジタル定量を提供する（例えば1つの一塩基多型（SNP）、1つの挿入、1つの欠失の検出）。これらのことは、現在利用できる技術の顕著な改善である。
【００４６】
核酸を検出するためのプローブの設計は、安定性と特異性の間のトレードオフである。より長いプローブ（例えば35塩基対）は、高い融点（Tm）と比較的狭いTm分布を持つ。このプローブは強くて完全な結合を提供するが、特異性はより小さいため、一般に、1個のミスマッチ、または2個以上のミスマッチを検出することはできない。それに対してより短いプローブ（例えば10塩基対）は、低いTmと非常に広いTm分布を有する。このプローブは結合の強さが小さいが、非常に特異的であるため、一塩基の識別が可能である。本発明は、2つの短い核酸結合領域を有するプローブを開示することによってこの問題を解決する。それら2つの短い核酸結合領域が合わさって安定性と特異性を提供するため、一塩基置換を検出することができる。図16は、本発明のこれら利点を示している。
【００４７】
図16に示されているように、約10塩基対の標的結合ドメインを有する短いプローブは、低くて広く分布した融点を持ち、約35塩基対の標的結合ドメインを有する長いプローブは、高くて分布が狭い融点を持つ。それとは対照的に、本発明により、低くて分布が狭い融点を持つ2つの短い核酸結合領域（例えば8塩基対＋9塩基対；9塩基対＋11塩基対；10塩基対＋13塩基対）を有するプローブが提供される。
【００４８】
本発明では、比較的短い核酸結合領域は、大きな特異性の維持を助けることで一塩基の識別を可能にするのに対し、タンデム配置の2つの核酸結合領域は、両方の核酸結合領域からの配列が標的配列と完全に一致しているとき、ハイブリダイズしたアームの融点を上昇させる。どちらかの核酸結合領域にミスマッチが1つあると、核酸結合領域が比較的短いことと、結合領域が1つだけだと安定なハイブリダイゼーションを維持するには短すぎることが原因で、安定なハイブリダイゼーションが妨げられる。両方の核酸結合領域が完全に一致してハイブリダイズするときだけ、安定かつ特異的なハイブリダイゼーションを維持することができ、そのハイブリダイゼーションをその後さまざまな手段で検出することができる。
【００４９】
核酸を検出するためのプローブを設計するとき、本発明のプローブは、安定で高感度の結合と一塩基置換に対する感度の間で以前は必要とされたトレードオフを解消する。
【００５０】
本発明の特異的プローブは、一塩基置換を99％超の精度で検出することができる。実施例1を参照されたい。
【００５１】
本発明の第1の側面は、（1）第1の標的結合領域と（2）第1の相補的領域と（3）配列特異的領域を少なくとも含む第1のポリマー鎖と、（1）第2の標的結合領域と（2）第2の相補的領域を少なくとも含む第2のポリマー鎖を含むポリマー鎖ペアに関する。第1の標的結合領域の標的と第2の標的結合領域の標的は同じ核酸分子内にあり、第1の標的結合領域の標的は第2の標的結合領域の標的と重複していない。第1の相補的領域は第2の相補的領域と相補的である。
【００５２】
この第1の側面のポリマー鎖ペアの例が、図1A〜図1C、図3A〜図3C、図8A、図8B、図8D、図8Eに示されている。
【００５３】
第1の側面の実施態様では、第1のポリマー鎖は、（例えば第1の標的結合領域と第1の相補的領域の間に）スペーサを含むことができる、および／または第2のポリマー鎖は、（例えば第2の標的結合領域と第2の相補的領域の間に）スペーサを含むことができる。スペーサとして、ポリマー鎖（例えばオリゴヌクレオチドやポリエチレングリコール）が可能である。「折り畳みジョイント」間のスペーサは、応力点の負荷を軽減して安定化させる。スペーサは、領域間のジョイント、またはある領域内のジョイントにかかる「曲げ」歪みを緩和するために含めることができる。
【００５４】
第1の側面の実施態様では、第1の標的結合領域、第1の相補的領域、配列特異的領域のうちの少なくとも1つが一本鎖核酸（例えばDNAまたはRNA）である。第1のポリマー鎖の全体を一本鎖核酸分子にすることができる。第2の標的結合領域と第2の相補的領域の少なくとも一方は一本鎖核酸（例えばDNAまたはRNA）である。第2のポリマー鎖の全体を一本鎖核酸分子にすることができる。
【００５５】
第1の標的結合領域と第2の標的結合領域が1つの核酸分子（すなわち同じ核酸分子）に結合することができる。核酸分子としてDNAが可能であり、例えば、真核生物ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、葉緑体DNA、細菌ゲノムDNA、古細菌ゲノムDNA、ウイルスDNA、バクテリオファージDNA、プラスミドDNA、cDNA、合成（すなわち非天然の）DNAがある。核酸分子としてRNAが可能であり、例えば、メッセンジャーRNA（スプライス前のmRNAまたはスプライス後のmRNA）、非コード化RNA（ncRNA）、リボソームRNA（rRNA）、マイクロRNA（miRNA）、ウイルスRNA、細菌RNA、合成（すなわち非天然の）RNAがある。核酸分子は、対応する野生型核酸分子と比べて少なくとも1つの変異（例えば一塩基多型（SNP）、挿入、欠失、遺伝子融合）を含むことができる。その少なくとも1つの変異は、第1の標的結合領域の標的および／または第2の標的結合領域の標的の中に存在していてもよいし、その代わりに、またはそれに加えて、変異がそれら2つの標的の外に存在していてもよい。変異が2つ以上の一塩基変化に対応する場合には、その変異に対応する1つ以上の塩基が第1の標的結合領域の標的の中に存在することができ、その変異に対応する塩基の1つ以上が第2の標的結合領域の標的の中に存在することができる。
【００５６】
第1の標的結合領域の標的と第2の標的結合領域の標的は、1個以上のヌクレオチド（例えば約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、30個、40個、50個、100個、1000個またはそれ以上の個数と、これらの間の任意の個数）によって分離することができる。2本のポリマー鎖が（それぞれの相補的領域を通じて）互いにハイブリダイズして核酸内の各標的に結合できる限り、2つの標的を隔てる分離距離に上限は存在しない。部分的には、スペーサの一方または両方の長さが2つの標的を隔てる分離距離を決めるため、一方または両方のスペーサが長くなるほど2つの標的はより離れるが、核酸内の各標的に安定に結合することと、2本のポリマー鎖が安定にハイブリダイズすることは相変わらず可能である。あるいは第1の標的結合領域の標的と第2の標的結合領域の標的は連続していてもよい（すなわちヌクレオチドによって分離されない）。
【００５７】
第1の標的結合領域と第2の標的結合領域の長さは、それぞれ、長さが約5個と約35個の間のヌクレオチドである（例えば10個〜30個のヌクレオチド）。例として、それぞれの標的結合領域は、長さを約5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個のヌクレオチドにすることができる。第1の標的結合領域の長さと第2の標的結合領域の長さは、合わせてヌクレオチド約55個以下である（すなわち10個以上のヌクレオチドかつ60個未満のヌクレオチドであり、あらゆる和がこれらの間の個数になる）。
【００５８】
第1の標的結合領域の融点測定値または融点予想値と、第2の標的結合領域の融点測定値または融点予想値は、約5℃と約35℃の間である（例えば約5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、 22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃）。第1の標的結合領域の融点測定値または融点予想値と、第2の標的結合領域の融点測定値または融点予想値は、約30℃以下異なっている（例えば30℃、29℃、28℃、27℃、26℃、25℃、24℃、23℃、22℃、21℃、20℃、19℃、18℃、17℃、16℃、15℃、14℃、13℃、12℃、11℃、10℃、9℃、8℃、7℃、6℃、5℃、4℃、3℃、2℃、1℃、0℃）。第1の標的結合領域と第2の標的結合領域は、ほぼ同じ融点測定値または融点予想値を持つことができる。第1の標的結合領域と第2の標的結合領域の和からの融点測定値または融点予想値は、約25℃と約60℃の間である（例えば約25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃）。
【００５９】
第1の相補的領域および／または第2の相補的領域は、それぞれ、長さを約12個〜約60個のヌクレオチドにすることができる（例えば約12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、 42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個）。
【００６０】
第1の側面の実施態様では、第1のポリマー鎖の配列特異的領域は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含むことができる。それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチド（例えばDNAまたはRNA）に結合することができる。少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの標識モノマー（例えばビオチン、化学発光マーカー、染料、酵素、蛍光色素、ナノ粒子、量子ドット、直接または間接に検出可能な他のモノマー）を含んでいる。第1の標識付着位置にある少なくとも1つの標識モノマーは、少なくとも第2の標識付着位置にある少なくとも1つの標識モノマーから、スペクトル的または空間的に識別できる。一本鎖オリゴヌクレオチドは、標識モノマーを欠いていてもよい。配列特異的領域は、少なくとも1つのアフィニティ部分（例えばアビジン、ビオチン、ストレプトアビジン、固体基板に直接または間接に捕獲することのできる別の部分）に付着させることができる。
【００６１】
第1の側面の実施態様では、第1のポリマー鎖の配列特異的領域は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含む一本鎖核酸骨格に共有結合される。それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチド（例えばDNAまたはRNA）を結合することができる。少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの標識モノマー（例えばビオチン、化学発光マーカー、染料、酵素、蛍光色素、ナノ粒子、量子ドット、直接または間接に検出可能な他のモノマー）を含んでいる。第1の標識付着位置にある少なくとも1つの標識モノマーは、少なくとも第2の標識付着位置にある少なくとも1つの標識モノマーから、スペクトル的または空間的に識別できる。一本鎖オリゴヌクレオチドは、標識モノマーを欠いていてもよい。配列特異的領域および／または一本鎖核酸骨格は、少なくとも1つのアフィニティ部分（例えばアビジン、ビオチン、ストレプトアビジン、固体基板に直接または間接に捕獲することのできる別の部分）に付着させることができる。
【００６２】
第1の側面の実施態様では、配列特異的領域は、レポータプローブの一部に結合することができる。レポータプローブは、配列特異的領域と相補的な結合部分と、一本鎖核酸骨格を少なくとも含んでいる。骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含んでいる。それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチド（例えばDNAまたはRNA）に結合することができる。少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの標識モノマー（例えばビオチン、化学発光マーカー、染料、酵素、蛍光色素、ナノ粒子、量子ドット、直接または間接に検出可能な他のモノマー）を含んでいる。第1の標識付着位置にある少なくとも1つの標識モノマーは、少なくとも第2の標識付着位置にある少なくとも1つの標識モノマーから、スペクトル的または空間的に識別できる。一本鎖オリゴヌクレオチドは、標識モノマーを欠いていてもよい。レポータプローブは、少なくとも1つのアフィニティ部分（例えばアビジン、ビオチン、ストレプトアビジン、固体基板に直接または間接に捕獲することのできる別の部分）に付着させることができる。レポータプローブで配列特異的領域と相補的な結合部分は、長さが約20個〜約50個のヌクレオチドである（約20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、 42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個）。
【００６３】
第1の側面の実施態様では、第1のポリマー鎖の配列特異的領域は、少なくとも1つの標識モノマー（例えばビオチン、化学発光マーカー、染料、酵素、蛍光色素、ナノ粒子、量子ドット、直接または間接に検出可能な他のモノマー）を含むことができる。その少なくとも1つの標識モノマーは、配列特異的領域内のヌクレオチドに共有結合させること、または配列特異的領域の一部にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドに共有結合させることができる。配列特異的領域は、少なくとも1つのアフィニティ部分（例えばアビジン、ビオチン、ストレプトアビジン、固体基板に直接または間接に捕獲することのできる別の部分）に付着させることができる。
【００６４】
第1の側面の実施態様では、第2のポリマー鎖を少なくとも1つのアフィニティ部分（例えばアビジン、ビオチン、ストレプトアビジン、固体基板に直接または間接に捕獲することのできる別の部分）に付着させることができる。
【００６５】
第1の側面の実施態様では、第1のポリマー鎖はさらに、開裂可能なリンカーを第1の相補的領域と配列特異的領域の間に含んでいる。あるいは開裂可能なリンカーは、配列特異的領域の中にある。開裂可能なリンカーとして、光で開裂可能なもの、および／または化学的に開裂可能なもの、および／または酵素で開裂可能なものが可能である。光で開裂可能なリンカーは、適切なコヒーレントな光源（例えばレーザー、UV光源）または適切なコヒーレントでない光源（例えばアークランプ、発光ダイオード（LED））によって提供される光によって開裂させることができる。
【００６６】
本発明の第2の側面は、サンプル中の核酸分子を検出する方法であって、サンプルを第1の側面および／または第1の側面の任意の実施態様のポリマー鎖ペアと接触させる工程を含む方法に関する。この側面では、第1のポリマー鎖は配列特異的領域を持ち、（a）その配列特異的領域は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標的付着位置を含んでいて、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（b）その配列特異的領域は、一本鎖核酸骨格に共有結合し、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（c）その配列特異的領域は、レポータプローブに結合しているか、結合することができ、そのレポータプローブは、その配列特異的領域と相補的な結合部分と、一本鎖核酸骨格を少なくとも含み、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（d）その配列特異的領域は、1つ以上の標識モノマーを含み、その1つ以上の標識モノマーによって核酸分子が同定される。その1つ以上の標識モノマーは、ビオチン、化学発光マーカー、染料、酵素、蛍光色素、ナノ粒子、量子ドット、直接または間接に検出可能な他のモノマーからなるグループから選択される。この側面は、標識されたモノマーの上記線形な組み合わせ、または上記1つ以上の標識モノマーを検出する工程を含んでいて、そのことによってサンプル中の核酸分子を検出する。
【００６７】
核酸分子を検出するための第2の側面による方法の例が、図2A、図2C、図4A、図4B、図5に示されている。
【００６８】
第2の側面の実施態様は、サンプルを捕獲ポリマー鎖と接触させることをさらに含んでいる。捕獲ポリマー鎖は、（1）少なくとも1つのアフィニティ部分を有する領域、または少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、（2）核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域を少なくとも含んでいる。第1、第2、第3の標的結合領域の標的は重複しておらず、同じ核酸分子内にある。捕獲ポリマー鎖は、参照によって本明細書に組み込まれている文献に記載されている捕獲プローブと同義語である。
【００６９】
本発明の第3の側面は、第1の側面および／または第1の側面の任意の実施態様のポリマー鎖ペアを複数含む組成物に関する。この側面では、第1のポリマー鎖ペアが第1の核酸分子に結合することができ、少なくとも第2のポリマー鎖ペアが少なくとも第2の核酸分子に結合することができる。その第1の核酸分子は、その少なくとも第2の核酸分子と異なっている。
【００７０】
本発明の第4の側面は、サンプル中の複数の核酸分子を検出する方法であって、サンプルを第1の側面および／または第1の側面の任意の実施態様の複数のポリマー鎖ペアと接触させる工程、またはサンプルを第3の側面および／または第3の側面の任意の実施態様の組成物と接触させる工程を含む方法に関する。この側面では、それぞれの第1のポリマー鎖は配列特異的領域を持ち、（a）その配列特異的領域は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標的付着位置を含んでいて、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（b）その配列特異的領域は、一本鎖核酸骨格に共有結合し、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（c）その配列特異的領域は、レポータプローブに結合しているか、結合することができ、そのレポータプローブは、その配列特異的領域と相補的な結合部分と、一本鎖核酸骨格を少なくとも含み、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（d）その配列特異的領域は、1つ以上の標識モノマーを含み、その1つ以上の標識モノマーによって核酸分子が同定される。その1つ以上の標識モノマーは、ビオチン、化学発光マーカー、染料、酵素、蛍光色素、ナノ粒子、量子ドット、直接または間接に検出可能な他のモノマーからなるグループから選択される。この側面は、第1のポリマー鎖ペアと少なくとも第2のポリマー鎖ペアについて、標識されたモノマーの線形な組み合わせまたは上記1つ以上の標識モノマーを検出し、そのことによってサンプル中の第1の核酸分子と少なくとも第2の核酸分子核酸分子を検出する工程を含んでいる。
【００７１】
第4の側面の実施態様は、サンプルを複数の第3のポリマー鎖と接触させることをさらに含んでいる。第1の捕獲ポリマー鎖は、少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域、または少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、第1の核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域を少なくとも含んでいる。それぞれの少なくとも第2の捕獲ポリマー鎖は、少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域、または少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、少なくとも第2の核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域を少なくとも含んでいる。第1、第2、第3の標的結合領域それぞれの標的は重複しておらず、同じ核酸分子内にある。第1の核酸分子は、上記少なくとも第2の核酸分子と異なっている。捕獲ポリマー鎖は、参照によって本明細書に組み込まれている文献に記載されている捕獲プローブと同義語である。
【００７２】
本発明の第5の側面は、第1の側面および／または第1の側面の任意の実施態様のポリマー鎖ペアと、捕獲ポリマー鎖とを含むポリマー鎖トリオに関する。捕獲ポリマー鎖は、（1）少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域、または少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、（2）核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域を少なくとも含んでいる。第1、第2、第3の標的結合領域の標的は重複しておらず、同じ核酸分子内にある。捕獲ポリマー鎖は、参照によって本明細書に組み込まれている文献に記載されている捕獲プローブと同義語である。
【００７３】
本発明の第6の側面は、サンプル中の核酸分子を検出する方法であって、サンプルを第5の側面および／または第5の側面の任意の実施態様のポリマー鎖トリオと接触させる工程を含む方法に関する。この側面では、第1のポリマー鎖は配列特異的領域を持ち、（a）その配列特異的領域は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標的付着位置を含んでいて、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（b）その配列特異的領域は、一本鎖核酸骨格に共有結合し、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（c）その配列特異的領域は、レポータプローブに結合しているか、結合することができ、そのレポータプローブは、その配列特異的領域と相補的な結合部分と、一本鎖核酸骨格を少なくとも含み、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（d）その配列特異的領域は、1つ以上の標識モノマーを含み、その1つ以上の標識モノマーによって核酸分子が同定される。その1つ以上の標識モノマーは、ビオチン、化学発光マーカー、染料、酵素、蛍光色素、ナノ粒子、量子ドット、直接または間接に検出可能な他のモノマーからなるグループから選択される。この側面は、ポリマー鎖トリオ上の標識されたモノマーの線形な組み合わせまたは上記1つ以上の標識モノマーを検出し、そのことによってサンプル中の核酸分子を検出する工程を含んでいる。
【００７４】
核酸を検出するための第6の側面の方法の例が、図2B、図4C、図6A、図6B、図7、図9に示されている。
【００７５】
本発明の第7の側面は、第5の側面および／または第5の側面の任意の実施態様のポリマー鎖トリオを複数含む組成物に関する。この側面では、第1のポリマー鎖トリオが第1の核酸分子に結合することができ、少なくとも第2のポリマー鎖トリオが少なくとも第2の核酸分子に結合することができる。第1の核酸分子は、その少なくとも第2の核酸分子と異なっている。
【００７６】
本発明の第8の側面は、サンプル中の複数の核酸分子を検出する方法であって、サンプルを第5の側面および／または第5の側面の任意の実施態様の複数のポリマー鎖トリオと接触させる工程、またはサンプルを第7の側面および／または第7の側面の任意の実施態様の組成物と接触させる工程を含む方法に関する。この側面では、第1のポリマー鎖は配列特異的領域を持ち、（a）その配列特異的領域は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標的付着位置を含んでいて、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（b）その配列特異的領域は、一本鎖核酸骨格に共有結合し、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（c）その配列特異的領域は、レポータプローブに結合しているか、結合することができ、そのレポータプローブは、その配列特異的領域と相補的な結合部分と、一本鎖核酸骨格を少なくとも含み、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（d）その配列特異的領域は、1つ以上の標識モノマーを含み、その1つ以上の標識モノマーによって核酸分子が同定される。その1つ以上の標識モノマーは、ビオチン、化学発光マーカー、染料、酵素、蛍光色素、ナノ粒子、量子ドット、直接または間接に検出可能な他のモノマーからなるグループから選択される。この側面は、第1のポリマー鎖トリオと少なくとも第2のポリマー鎖トリオについて、標識されたモノマーの線形な組み合わせまたは上記1つ以上の標識モノマーを検出し、そのことによってサンプル中の第1の核酸分子と少なくとも第2の核酸分子を検出する工程を含んでいる。
【００７７】
本発明の第9の側面は、第1の側面および／または第1の側面の任意の実施態様のポリマー鎖ペアの第1の相補的領域と第2の相補的領域がハイブリダイズするときに得られる部分的二本鎖核酸プローブに関する。第1のポリマー鎖と第2のポリマー鎖は、ハイブリダイズすると、第1の側面および／または第1の側面の任意の実施態様のポリマー鎖ペアの各特徴を有する部分的二本鎖核酸プローブを形成する。それに加え、この側面の部分的二本鎖核酸プローブは、第1の標的と第2の標的からの融点測定値または融点予想値が約40℃と約60℃の間である（例えば約40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃）。
【００７８】
第9の側面の部分的二本鎖核酸プローブの例が、図1D〜図1G、図3D〜図3G、図8C、図8Fに示されている。
【００７９】
本発明の第10の側面は、サンプル中の核酸分子を検出する方法であって、サンプルを第9の側面の部分的二本鎖核酸プローブと接触させる工程を含む方法に関する。この側面では、第1のポリマー鎖は配列特異的領域を持ち、（a）その配列特異的領域は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標的付着位置を含んでいて、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（b）その配列特異的領域は、一本鎖核酸骨格に共有結合し、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（c）その配列特異的領域は、レポータプローブに結合しているか、結合することができ、そのレポータプローブは、その配列特異的領域と相補的な結合部分と、一本鎖核酸骨格を少なくとも含み、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（d）その配列特異的領域は、1つ以上の標識モノマーを含み、その1つ以上の標識モノマーによって核酸分子が同定される。その1つ以上の標識モノマーは、ビオチン、化学発光マーカー、染料、酵素、蛍光色素、ナノ粒子、量子ドット、直接または間接に検出可能な他のモノマーからなるグループから選択される。この側面は、前記標識されたモノマーの線形な組み合わせまたは上記1つ以上の標識モノマーを検出し、そのことによってサンプル中の核酸分子を検出する工程を含んでいる。
【００８０】
核酸を検出するための第10の側面の方法の例が、図2A〜図2C、図4A、図4B、図5に示されている。
【００８１】
第10の側面の実施態様は、サンプルを捕獲ポリマー鎖と接触させることをさらに含んでいる。捕獲ポリマー鎖は、（1）少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域、または少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、（2）核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域を少なくとも含んでいる。第1、第2、第3の標的結合領域の標的は重複しておらず、同じ核酸分子内にある。捕獲ポリマー鎖は、参照によって本明細書に組み込まれている文献に記載されている捕獲プローブと同義語である。
【００８２】
本発明の第11の側面は、第9の側面および／または第9の側面の任意の実施態様の部分的二本鎖核酸プローブを複数含む組成物に関する。この側面では、第1の部分的二本鎖核酸プローブが第1の核酸分子に結合することができ、少なくとも第2の部分的二本鎖核酸プローブが少なくとも第2の核酸分子に結合することができる。第1の核酸分子は、その少なくとも第2の核酸分子と異なっている。
【００８３】
本発明の第12の側面は、サンプル中の複数の核酸分子を検出する方法であって、サンプルを第9の側面および／または第9の側面の任意の実施態様の複数の部分的二本鎖核酸プローブと接触させる工程、またはサンプルを第11の側面および／または第11の側面の任意の実施態様の組成物と接触させる工程を含む方法に関する。この側面では、それぞれの第1のポリマー鎖は配列特異的領域を持ち、（a）その配列特異的領域は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標的付着位置を含んでいて、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（b）その配列特異的領域は、一本鎖核酸骨格に共有結合し、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（c）その配列特異的領域は、レポータプローブに結合しているか、結合することができ、そのレポータプローブは、その配列特異的領域と相補的な結合部分と、一本鎖核酸骨格を少なくとも含み、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（d）その配列特異的領域は、1つ以上の標識モノマーを含み、その1つ以上の標識モノマーによって核酸分子が同定される。その1つ以上の標識モノマーは、ビオチン、化学発光マーカー、染料、酵素、蛍光色素、ナノ粒子、量子ドット、直接または間接に検出可能な他のモノマーからなるグループから選択される。この側面は、第1の部分的二本鎖核酸プローブと少なくとも第2の部分的二本鎖核酸プローブについて、標識されたモノマーの線形な組み合わせ、または上記1つ以上の標識モノマーを検出し、そのことによってサンプル中の第1の核酸分子と少なくとも第2の核酸分子を検出する工程を含んでいる。
【００８４】
第12の側面は、サンプルを複数の第3のポリマー鎖と接触させることをさらに含んでいる。第1の捕獲ポリマー鎖は、少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域、または少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、第1の核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域を少なくとも含んでいる。それぞれの少なくとも第2の捕獲ポリマー鎖は、少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域、または少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、少なくとも第2の核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域を少なくとも含んでいる。第1、第2、第3の標的結合領域それぞれの標的は重複しておらず、同じ核酸分子内にある。捕獲ポリマー鎖は、参照によって本明細書に組み込まれている文献に記載されている捕獲プローブと同義語である。
【００８５】
本発明の第13の側面は、第9の側面および／または第9の側面の任意の実施態様の複数の部分的二本鎖核酸プローブと、複数の捕獲ポリマー鎖を含む組成物に関する。第1の捕獲ポリマー鎖は、少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域、または少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、第1の核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域を少なくとも含んでいる。それぞれの少なくとも第2の捕獲ポリマー鎖は、少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域、または少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、少なくとも第2の核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域を少なくとも含んでいる。第1、第2、第3の標的結合領域それぞれの標的は重複しておらず、同じ核酸分子内にある。第1の核酸分子は、上記少なくとも第2の核酸分子と異なっている。捕獲ポリマー鎖は、参照によって本明細書に組み込まれている文献に記載されている捕獲プローブと同義語である。
【００８６】
本発明の第14の側面は、（a）第1の標的結合領域と、（2）第2の標的結合領域と、（3）その第1の標的結合領域とその第2の標的結合領域の間にあるスペーサと、（4）配列特異的領域を少なくとも含む多価ポリマー鎖に関する。第1の標的結合領域の標的と第2の標的結合領域の標的は同じ核酸分子内にあり、第1の標的結合領域の標的は第2の標的結合領域の標的と重複していない。スペーサとして、ポリマー鎖、例えばオリゴヌクレオチドやポリエチレングリコールが可能である。「折り畳みジョイント」間のスペーサは、応力点の負荷を軽減して安定化させる。スペーサは、領域間のジョイント、またはある領域内のジョイントにかかる「曲げ」歪みを緩和するために含めることができる。
【００８７】
第14の側面の多価ポリマー鎖の例が、図10、図12、図15に示されている。
【００８８】
第14の側面の実施態様では、第1の標的結合領域、第2の標的結合領域、配列特異的領域のうちの少なくとも1つが一本鎖核酸（例えばDNAまたはRNA）である。多価ポリマー鎖全体を一本鎖核酸分子にすることができる。
【００８９】
第1の標的結合領域と第2の標的結合領域は1つの核酸分子（すなわち同じ核酸分子）に結合することができる。核酸分子としてDNAが可能であり、例えば、真核生物ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、葉緑体DNA、細菌ゲノムDNA、古細菌ゲノムDNA、ウイルスDNA、バクテリオファージDNA、プラスミドDNA、cDNA、合成（すなわち非天然の）DNAがある。核酸分子としてRNAが可能であり、例えば、メッセンジャーRNA（スプライス前のmRNAまたはスプライス後のmRNA）、非コード化RNA（ncRNA）、リボソームRNA（rRNA）、マイクロRNA（miRNA）、ウイルスRNA、細菌RNA、合成（すなわち非天然の）RNAがある。核酸分子は、対応する野生型核酸分子と比べて少なくとも1つの変異（例えば一塩基多型（SNP）、挿入、欠失、遺伝子融合）を含むことができる。その少なくとも1つの変異は、第1の標的結合領域の標的および／または第2の標的結合領域の中に存在していてもよいし、その代わりに、またはそれに加えて、変異がそれら2つの標的の外に存在していてもよい。
【００９０】
第1の標的結合領域の標的と第2の標的結合領域の標的は、1個以上のヌクレオチド（例えば約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、30個、40個、50個、100個、1000個またはそれ以上の個数と、これらの間の任意の個数）によって分離することができる。2つの標的結合領域が核酸内の各標的に結合できる限り、2つの標的を隔てる分離距離に上限は存在しない。部分的には、スペーサの長さが2つの標的を隔てる分離距離を決めるため、スペーサが長くなるほど2つの標的はより離れるが、核酸内の各標的に安定に結合することは相変わらず可能である。第1の標的結合領域の標的と第2の標的結合領域の標的は連続していてもよい（すなわちヌクレオチドによって分離されない）。
【００９１】
第1の標的結合領域と第2の標的結合領域の長さは、それぞれ、長さが約5個と約35個の間のヌクレオチドである（例えば10個〜30個のヌクレオチド）。例として、それぞれの標的結合領域は、長さを約5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個のヌクレオチドにすることができる。第1の標的結合領域の長さと第2の標的結合領域の長さは、合わせてヌクレオチド約55個以下である（すなわち10個以上のヌクレオチドかつ60個未満のヌクレオチドであり、あらゆる和がこれらの間の個数になる）。
【００９２】
第1の標的結合領域の融点測定値または融点予想値と、第2の標的結合領域の融点測定値または融点予想値は、約5℃と約35℃の間である（例えば約5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、 22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃）。第1の標的結合領域の融点測定値または融点予想値と、第2の標的結合領域の融点測定値または融点予想値は、約30℃以下異なっている（例えば30℃、29℃、28℃、27℃、26℃、25℃、24℃、23℃、22℃、21℃、20℃、19℃、18℃、17℃、16℃、15℃、14℃、13℃、12℃、11℃、10℃、9℃、8℃、7℃、6℃、5℃、4℃、3℃、2℃、1℃）。第1の標的結合領域と第2の標的結合領域は、ほぼ同じ融点測定値または融点予想値を持つことができる。第1の標的結合領域と第2の標的結合領域の和からの融点測定値または融点予想値は、約25℃と約60℃の間である（例えば約25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃）。
【００９３】
第14の側面の実施態様では、多価ポリマー鎖の配列特異的領域は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含むことができる。それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチド（例えばDNAまたはRNA）に結合することができる。少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの標識モノマー（例えばビオチン、化学発光マーカー、染料、酵素、蛍光色素、ナノ粒子、量子ドット、直接または間接に検出可能な他のモノマー）を含んでいる。第1の標識付着位置にある少なくとも1つの標識モノマーは、少なくとも第2の標識付着位置にある少なくとも1つの標識モノマーから、スペクトル的または空間的に識別できる。一本鎖オリゴヌクレオチドは、標識モノマーを欠いていてもよい。多価ポリマー鎖は、少なくとも1つのアフィニティ部分（例えばアビジン、ビオチン、ストレプトアビジン、固体基板に直接または間接に捕獲することのできる別の部分）に付着させることができる。
【００９４】
第14の側面の実施態様では、多価ポリマー鎖の配列特異的領域は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含む一本鎖核酸骨格に共有結合する。それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチド（例えばDNAまたはRNA）に結合することができる。少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの標識モノマー（例えばビオチン、化学発光マーカー、染料、酵素、蛍光色素、ナノ粒子、量子ドット、直接または間接に検出可能な他のモノマー）を含んでいる。第1の標識付着位置にある少なくとも1つの標識モノマーは、少なくとも第2の標識付着位置にある少なくとも1つの標識モノマーから、スペクトル的または空間的に識別できる。一本鎖オリゴヌクレオチドは、標識モノマーを欠いていてもよい。配列特異的領域および／または一本鎖核酸骨格は、少なくとも1つのアフィニティ部分（例えばアビジン、ビオチン、ストレプトアビジン、固体基板に直接または間接に捕獲することのできる別の部分）に付着させることができる。
【００９５】
第14の側面の実施態様では、配列特異的領域は、レポータプローブの一部に結合させることができる。レポータプローブは、配列特異的領域と相補的な結合部分と、一本鎖核酸骨格を少なくとも含んでいる。骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含んでいる。それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチド（例えばDNAまたはRNA）に結合することができる。少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの標識モノマー（例えばビオチン、化学発光マーカー、染料、酵素、蛍光色素、ナノ粒子、量子ドット、直接または間接に検出可能な他のモノマー）を含んでいる。第1の標識付着位置にある少なくとも1つの標識モノマーは、少なくとも第2の標識付着位置にある少なくとも1つの標識モノマーから、スペクトル的または空間的に識別できる。一本鎖オリゴヌクレオチドは、標識モノマーを欠いていてもよい。レポータプローブは、少なくとも1つのアフィニティ部分（例えばアビジン、ビオチン、ストレプトアビジン、固体基板に直接または間接に捕獲することのできる別の部分）に付着させることができる。レポータプローブで配列特異的領域と相補的な結合部分は、長さが約20個〜約50個のヌクレオチドである（約20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、 42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個）。
【００９６】
第14の側面の実施態様では、多価ポリマー鎖の配列特異的領域は、少なくとも1つの標識モノマー（例えばビオチン、化学発光マーカー、染料、酵素、蛍光色素、ナノ粒子、量子ドット、直接または間接に検出可能な他のモノマー）を含むことができる。その少なくとも1つの標識モノマーは、配列特異的領域内のヌクレオチドに共有結合させること、または配列特異的領域の一部にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドに共有結合させることができる。配列特異的領域は、少なくとも1つのアフィニティ部分（例えばアビジン、ビオチン、ストレプトアビジン、固体基板に直接または間接に捕獲することのできる別の部分）に付着させることができる。
【００９７】
第14の側面の実施態様では、多価ポリマー鎖は、第2の標的結合領域と配列特異的領域の間に開裂可能なリンカーをさらに含んでいる。あるいは開裂可能なリンカーは、配列特異的領域の中にある。開裂可能なリンカーとして、光で開裂可能なもの、および／または化学的に開裂可能なもの、および／または酵素で開裂可能なものが可能である。光で開裂可能なリンカーは、適切なコヒーレントな光源（例えばレーザー、UV光源）または適切なコヒーレントでない光源（例えばアークランプ、発光ダイオード（LED））によって提供される光によって開裂させることができる。
【００９８】
本発明の第15の側面は、サンプル中の核酸分子を検出する方法であって、サンプルを第14の側面および／または第14の側面の任意の実施態様の多価ポリマー鎖と接触させる工程を含む方法に関する。この側面では、多価ポリマー鎖は配列特異的領域を持ち、（a）その配列特異的領域は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標的付着位置を含んでいて、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（b）その配列特異的領域は、一本鎖核酸骨格に共有結合し、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（c）その配列特異的領域は、レポータプローブに結合しているか、結合することができ、そのレポータプローブは、その配列特異的領域と相補的な結合部分と、一本鎖核酸骨格を少なくとも含み、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（d）その配列特異的領域は、1つ以上の標識モノマーを含み、その1つ以上の標識モノマーによって核酸分子が同定される。その1つ以上の標識モノマーは、ビオチン、化学発光マーカー、染料、酵素、蛍光色素、ナノ粒子、量子ドット、直接または間接に検出可能な他のモノマーからなるグループから選択される。この側面は、標識されたモノマーの線形な組み合わせまたは上記1つ以上の標識モノマーを検出し、そのことによってサンプル中の核酸分子を検出する工程を含んでいる。
【００９９】
核酸を検出するための第15の側面の方法の例が、図11A、図11C、図13A、図13Bに示されている。
【０１００】
第15の側面の実施態様は、サンプルを捕獲ポリマー鎖と接触させることをさらに含んでいる。捕獲ポリマー鎖は、（1）少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域、または少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、（2）核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域を少なくとも含んでいる。第1、第2、第3の標的結合領域の標的は重複しておらず、同じ核酸分子内にある。捕獲ポリマー鎖は、参照によって本明細書に組み込まれている文献に記載されている捕獲プローブと同義語である。
【０１０１】
本発明の第16の側面は、第14の側面および／または第14の側面の任意の実施態様の多価ポリマー鎖を複数含む組成物に関する。この側面では、第1の多価ポリマー鎖が第1の核酸分子に結合することができ、少なくとも第2の多価ポリマー鎖が少なくとも第2の核酸分子に結合することができる。第1の核酸分子は、その少なくとも第2の核酸分子と異なっている。
【０１０２】
本発明の第17の側面は、サンプル中の複数の核酸分子を検出する方法であって、サンプルを第14の側面および／または第14の側面の任意の実施態様の複数の多価ポリマー鎖と接触させる工程、またはサンプルを第16の側面および／または第16の側面の任意の実施態様の組成物と接触させる工程を含む方法に関する。この側面では、それぞれの多価ポリマー鎖は配列特異的領域を持ち、（a）その配列特異的領域は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標的付着位置を含んでいて、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（b）その配列特異的領域は、一本鎖核酸骨格に共有結合し、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（c）その配列特異的領域は、レポータプローブに結合しているか、結合することができ、そのレポータプローブは、その配列特異的領域と相補的な結合部分と、一本鎖核酸骨格を少なくとも含み、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（d）その配列特異的領域は、1つ以上の標識モノマーを含み、その1つ以上の標識モノマーによって核酸分子が同定される。その1つ以上の標識モノマーは、ビオチン、化学発光マーカー、染料、酵素、蛍光色素、ナノ粒子、量子ドット、直接または間接に検出可能な他のモノマーからなるグループから選択される。この側面は、第1の多価ポリマー鎖と少なくとも第2の多価ポリマー鎖について、標識されたモノマーの線形な組み合わせまたは上記1つ以上の標識モノマーを検出し、そのことによってサンプル中の第1の核酸分子と少なくとも第2の核酸分子を検出する工程を含んでいる。
【０１０３】
第17の側面の実施態様は、サンプルを複数の捕獲ポリマー鎖と接触させることをさらに含んでいる。第1の捕獲ポリマー鎖は、少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域、または少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、第1の核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域を少なくとも含んでいる。それぞれの少なくとも第2の捕獲ポリマー鎖は、少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域、または少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、少なくとも第2の核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域を少なくとも含んでいる。第1、第2、第3の標的結合領域それぞれの標的は重複しておらず、同じ核酸分子内にある。第1の核酸分子は、上記少なくとも第2の核酸分子と異なっている。捕獲ポリマー鎖は、参照によって本明細書に組み込まれている文献に記載されている捕獲プローブと同義語である。
【０１０４】
本発明の第18の側面は、第14の側面および／または第14の側面の任意の実施態様の多価ポリマー鎖と、捕獲ポリマー鎖を含む多価ポリマー鎖デュオに関する。捕獲ポリマー鎖は、（1）少なくとも1つのアフィニティ部分を含む領域、または少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と、（2）核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域を少なくとも含んでいる。第1、第2、第3の標的結合領域の標的は重複しておらず、同じ核酸分子内にある。捕獲ポリマー鎖は、参照によって本明細書に組み込まれている文献に記載されている捕獲プローブと同義語である。
【０１０５】
本発明の第19の側面は、サンプル中の核酸分子を検出する方法であって、サンプルを第18の側面および／または第18の側面の任意の実施態様の多価ポリマー鎖デュオと接触させる工程を含む方法に関する。この側面では、多価ポリマー鎖は配列特異的領域を持ち、（a）その配列特異的領域は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標的付着位置を含んでいて、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（b）その配列特異的領域は、一本鎖核酸骨格に共有結合し、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（c）その配列特異的領域は、レポータプローブに結合しているか、結合することができ、そのレポータプローブは、その配列特異的領域と相補的な結合部分と、一本鎖核酸骨格を少なくとも含み、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（d）その配列特異的領域は、1つ以上の標識モノマーを含み、その1つ以上の標識モノマーによって核酸分子が同定される。その1つ以上の標識モノマーは、ビオチン、化学発光マーカー、染料、酵素、蛍光色素、ナノ粒子、量子ドット、直接または間接に検出可能な他のモノマーからなるグループから選択される。この側面は、ポリマー鎖デュオについて、標識されたモノマーの線形な組み合わせ、または上記1つ以上の標識モノマーを検出し、そのことによってサンプル中の核酸分子を検出する工程を含んでいる。
【０１０６】
核酸を検出するための第19の側面の方法の例が、図11B、図13C、図14に示されている。
【０１０７】
本発明の第20の側面は、第18の側面および／または第18の側面の任意の実施態様の多価ポリマー鎖デュオを複数含む組成物に関する。この側面では、第1の多価ポリマー鎖デュオが第1の核酸分子に結合することができ、少なくとも第2の多価ポリマー鎖デュオが少なくとも第2の核酸分子に結合することができる。第1の核酸分子は、その少なくとも第2の核酸分子と異なっている。
【０１０８】
本発明の第21の側面は、サンプル中の複数の核酸分子を検出する方法であって、サンプルを第18の側面および／または第18の側面の任意の実施態様の複数の多価ポリマー鎖デュオと接触させる工程、またはサンプルを第20の側面および／または第20の側面の任意の実施態様の組成物と接触させる工程を含む方法に関する。この側面では、それぞれの多価ポリマー鎖は配列特異的領域を持ち、（a）その配列特異的領域は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標的付着位置を含んでいて、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（b）その配列特異的領域は、一本鎖核酸骨格に共有結合し、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（c）その配列特異的領域は、レポータプローブに結合しているか、結合することができ、そのレポータプローブは、その配列特異的領域と相補的な結合部分と、一本鎖核酸骨格を少なくとも含み、その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含み、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子が同定される；または（d）その配列特異的領域は、1つ以上の標識モノマーを含み、その1つ以上の標識モノマーによって核酸分子が同定される。その1つ以上の標識モノマーは、ビオチン、化学発光マーカー、染料、酵素、蛍光色素、ナノ粒子、量子ドット、直接または間接に検出可能な他のモノマーからなるグループから選択される。この側面は、ポリマー鎖デュオと第2のポリマー鎖デュオについて、標識されたモノマーの線形な組み合わせ、または上記1つ以上の標識モノマーを検出し、そのことによってサンプル中の第1の核酸分子と少なくとも第2の核酸分子を検出する工程を含んでいる。
【０１０９】
本発明の第22の側面は、第3の側面および／または第3の側面の任意の実施態様、第7の側面および／または第7の側面の任意の実施態様、第11の側面および／または第11の側面の任意の実施態様、第13の側面および／または第13の側面の任意の実施態様、第16の側面および／または第16の側面の任意の実施態様、第20の側面および／または第20の側面の任意の実施態様いずれかの組成物と、使用指示を含むキットに関する。このキットは、タンパク質標的を検出することのできる少なくとも1つのプローブをさらに含むことができる。
【０１１０】
本明細書に記載したどの組成物も、タンパク質標的を検出することのできる少なくとも1つのプローブをさらに含むことができる。
【０１１１】
本明細書に記載したどの方法も、サンプルを、タンパク質標的を検出することのできる少なくとも1つのプローブと接触させることをさらに含むことができる。
【０１１２】
本発明の各側面において、標識されたオリゴヌクレオチドは、1つ以上の検出可能な標識モノマーで標識された状態が可能である。標識は、オリゴヌクレオチドの末端、またはオリゴヌクレオチド内のある一点、またはその組み合わせに位置させることができる。オリゴヌクレオチドは、アミン修飾を有するヌクレオチドを含むことができ、そうすることで、検出可能な標識をそのヌクレオチドにカップリングさせることが可能になる。本発明の標識されたオリゴヌクレオチドは、多彩な標識モノマー（例えば蛍光色素、量子ドット、染料、酵素、ナノ粒子、化学発光マーカー、ビオチン、直接（例えば発光によって）または間接（例えば蛍光標識した抗体の結合によって）に検出することができる本分野で知られている他のモノマー）のうちの任意のもので標識された状態が可能である。本発明で使用できる標識の好ましい例は、蛍光体である。いくつかの蛍光体を、ヌクレオチドを標識するための標識モノマーとして用いることができ、その非限定的な例には、GFP関連タンパク質、シアニン染料、フルオレセイン、ローダミン、ALEXA Fluor（登録商標）、Texas Red、FAM、JOE、TAMRA、ROXが含まれる。スペクトル全体にわたるいくつかの異なる蛍光体が知られており、生産がさらに続けられている。
【０１１３】
本発明の各側面において、付着位置の数は、1〜100の範囲またはそれ以上である。実施態様では、位置の数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10から15、20、30、40、50、100の範囲、またはこれらの間の任意の範囲である。実際には、このような技術は完全に当業者の能力範囲であるため、核酸を検出するための位置の数には制限がない。同時に検出可能な（「多重化された」）核酸分子の数は、標識付着位置の数に依存する。例として、2つの標識付着位置が存在し、それぞれの位置に関して2つの可能な色つき標識モノマーがあるときには、4つの核酸分子を検出することができる。3つの標識付着位置が存在し、それぞれの位置に関して2つの可能な色つき標識モノマーがあるときには、8つの核酸分子を検出することができる。3つの標識付着位置が存在し、それぞれの位置に関して3つの可能な色つき標識モノマーがあるときには、27個の核酸分子を検出することができる。
【０１１４】
本発明の各側面において、1つの標識付着位置を少なくとも1つの標識されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズ（非共有結合）させることができる。あるいは1つの位置を検出可能な標識が欠けた少なくとも1つのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることができる。各位置は、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21〜100個、またはそれ以上の個数の標識された（または標識されていない）オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることができる。各位置にハイブリダイズした標識されたオリゴヌクレオチドの数は、位置の長さとオリゴヌクレオチドのサイズに依存する。1つの位置は、長さが約300個〜約1500個のヌクレオチドにすることが可能である。標識された（または標識されていない）オリゴヌクレオチドの長さは、約20個〜約1500個のヌクレオチドの範囲である。実施態様では、標識された（または標識されていない）オリゴヌクレオチドの長さは、約800個〜約1300個のヌクレオチドの範囲である。別の実施態様では、標識された（または標識されていない）オリゴヌクレオチドの長さは、約20個〜約55個のデオキシリボヌクレオチドの範囲である。このようなヌクレオチドは、融点／ハイブリダイゼーション温度が約65℃と約85℃の間、例えば約80℃となるように設計される。例えば長さが約1100個のヌクレオチドからなる位置は、それぞれが約45個〜約25個の長さのデオキシリボヌクレオチドからなる約25個〜約45個のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。実施態様では、それぞれの位置は、約33個の長さのデオキシリボヌクレオチドからなる約34個の標識されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。その標識されたオリゴヌクレオチドは一本鎖DNAであることが好ましい。
【０１１５】
本発明の各側面において、（1つの位置が標識されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることを通じて）各位置に付着する標識は、前の位置または後の位置の標識から空間分離とスペクトル分解をすることができる。空間分離とスペクトル分解が可能な順序づけられた一連のプローブ用標識を、本明細書ではバーコードまたは標識コードと呼ぶ。バーコードまたは標識コードにより、特定のプローブが結合した標的核酸または標的タンパク質を同定することができる。
【０１１６】
「1つ以上」、「少なくとも1つ」などの表現は、非限定的な例として、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000またはそれ以上と、これらの間の任意の数を含むと理解される。したがって「少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチド」は、例えば2個のオリゴヌクレオチド、6個のオリゴヌクレオチド、10個のオリゴヌクレオチドを含んでいる可能性がある。
【０１１７】
「複数」、「少なくとも2つ」、「2つ以上」、「少なくとも第2の」などの表現は、非限定的な例として、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000またはそれ以上と、これらの間の任意の数を含むと理解される。したがって「少なくとも第2のポリマー鎖ペア」は、非限定的な例として、2個のポリマー鎖ペア、10個のポリマー鎖ペア、100個のポリマー鎖ペア、1000個のポリマー鎖ペアを含む。同様に、「少なくとも第2の核酸分子」は、非限定的な例として、2個の核酸分子、20個の核酸分子、40個の核酸分子、60個の核酸分子を含む。また、「少なくとも第2の捕獲ポリマー鎖」は、非限定的な例として、2本の捕獲ポリマー鎖、500本の捕獲ポリマー鎖、1000本の捕獲ポリマー鎖、5000本の捕獲ポリマー鎖を含む。さらに、「少なくとも2つの標識付着位置」は、非限定的な例として、2個の標識付着位置、4個の標識付着位置、6個の標識付着位置、8個の標識付着位置を含む。
【０１１８】
ポリマー鎖またはプローブは、化学的に合成すること、またはプローブをコードする核酸をクローニングして入れたベクターを用いて生物に産生させることができる。
【０１１９】
本明細書に記載した任意のポリマー鎖またはプローブを本発明の方法とキットで用いることができる。
【０１２０】
本分野で周知のように、所与の核酸に関し、融点（Tm）測定値または融点予想値は、溶液条件（例えば1価陽イオン（例えばNa+）の濃度、2価陽イオン（例えばMg2+）の濃度、遊離したヌクレオチド（例えばdNTP）の濃度）に依存する。また、ポリマー鎖と標的核酸分子の濃度も重要である。一般に、本明細書に記載したように、Tmは、核酸化学の分野で実践されていることが知られているアルゴリズムを用いて「予想」される。しかし測定と予想の間にはある程度の誤差が常に存在する可能性がある。それは、典型的には±2℃〜±3℃である。最も一般的には、本明細書に記載したTmは、Tmを予想するための標準溶液濃度のもとでの値であり、濃度の例は、15 mMのNa+、0 mMのMg2+、0 mMのdNTPs、100 pMのポリマー鎖と、820 mMのNa+、0 mMのMg2+、0 mMのdNTPs、250 nMのポリマー鎖である。ポリマー鎖および／またはその中の領域の長さが融点測定値または融点予想値に影響を与えることも周知である。したがって融点は、ポリマー鎖の領域（例えば標的結合領域および／または相補的領域）の長さを変えることによって制御できる。
【０１２１】
本発明のどのポリマー鎖またはプローブも、アフィニティ部分を含むことができる。適切なアフィニティ部分の非限定的な例を下に示す。たいていのアフィニティ部分は二重の目的に役立つ可能性があることを理解すべきである。すなわち、ポリマー鎖および／または部分的二本鎖プローブおよび／またはレポータプローブを固定化するためのアンカーとしてと、（完全に組み立てられているか、一部だけが組み立てられているかに関係なく）それらを精製するための部分としての両方の目的である。
【０１２２】
いくつかの実施態様では、アフィニティ部分はタンパク質モノマーである。タンパク質モノマーの非限定的な例には、免疫グロブリン定常領域(『Current Protocols in Molecular Biology』、第2巻、Ausubel他編、Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience社、1996年の中のPetty、Metal-chelate affinity chromatographyを参照のこと）、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST；Smith、1993年、Methods Mol. Cell. Bio. 第4巻：220〜229ページ）、大腸菌マルトーゼ結合タンパク質（Guan他、 1987年、Gene第67巻：21〜30ページ）、さまざまなセルロース結合ドメイン（アメリカ合衆国特許第5,496,934号；第5,202,247号；第5,137,819号；Tomme他、1994年、Protein Eng. 第7巻：117〜123ページ）が含まれる。他のアフィニティ部分は特異的結合パートナーによって認識されるため、固体支持体に固定化することのできるその結合パートナーへのアフィニティ結合による単離と固定化が容易である。例えばアフィニティ部分としてエピトープが可能であり、結合パートナーとして抗体が可能である。そのようなエピトープの非限定的な例には、FLAGエピトープ、アミノ酸408〜439の位置のmycエピトープ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（HA）エピトープ、ジゴキシゲニン（「DIG」）が含まれる。別の実施態様では、アフィニティ部分は、別のタンパク質またはアミノ酸（例えばアビジン／ストレプトアビジンとビオチン）によって認識されるタンパク質またはアミノ酸配列である。
【０１２３】
実施態様では、ポリマー鎖、および／または部分的二本鎖プローブ、および／またはレポータプローブは、アビジン-ビオチン結合ペアを介して基板に固定化することができる。いくつかの実施態様では、ポリマー鎖、および／または部分的二本鎖プローブ、および／またはレポータプローブがビオチン部分を含んでいて、基板がアビジンを含んでいる。アビジンを含む有用な基板は市販されており、その中には、TB0200（Accelr8）、SAD6、SAD20、SAD100、SAD500、SAD2000（Xantec社）、SuperAvidin（Array-It（登録商標）社）、ストレプトアビジンスライド（カタログ番号MPC 000、Xenopore社）、STREPTAVIDINnslide（カタログ番号439003、Greiner Bio-one社）が含まれる。しかし、当業者に知られている任意のアビジン含有基板を用いることができる。
【０１２４】
基板は、アフィニティ部分を含むポリマー鎖、および／または部分的二本鎖プローブ、および／またはレポータプローブの選択的固定化を妨げない限り、任意の形を取ることができる。例えば基板は、円板、スラブ、ストリップ、ビーズ、サブミクロン粒子、被覆された磁性ビーズ、ゲルパッド、微量滴定ウエル、スライド、膜、フリットの形や、当業者に知られている他の形を持つことができる。基板は、場合によっては、その基板の上またはその基板の中を液体が流れるのを助けるハウジング（例えばクロマトグラフィカラム、スピンカラム、シリンジバレル（注射筒）、ピペット、ピペットチップ、96ウエルまたは384ウエルのプレート、マイクロチャネル（微小流路）、キャピラリ）の中に配置される。
【０１２５】
本発明により、任意のサンプル（例えば生物サンプル）中に存在する1つ以上の核酸を検出するためのポリマー鎖、プローブ、方法、組成物、キットが提供される。当業者であればわかるように、サンプルは、任意の数のものを含むことができ、その非限定的な例には、実質的にあらゆる生物（哺乳動物のサンプルが好ましく、ヒトサンプルが特に好ましい）の細胞（初代細胞と培養した細胞系の両方、体外培養物から解離した細胞が含まれる）、細胞ライセートまたは細胞抽出物（その非限定的な例に、タンパク質抽出物、RNA抽出物、精製したmRNAが含まれる）、組織（培養した組織または体外培養した組織が含まれる）、組織抽出物（その非限定的な例に、タンパク質抽出物、RNA抽出物、精製したmRNAが含まれる）；体液（その非限定的な例に、血液、尿、血清、リンパ球、胆汁、脳脊髄液、間質液、房水または硝子体液、初乳、痰、羊水、唾液、肛門分泌物、膣分泌物、汗、精液、濾出液、滲出液（例えば膿瘍や、他のあらゆる感染部位または炎症部位から得られた流体）が含まれる）、関節（例えば正常な関節、または関節リウマチ、変形性関節症、痛風、敗血症性関節炎などの疾患に冒されている関節）から得られた流体；環境サンプル（その非限定的な例に、大気サンプル、農業サンプル、水サンプル、土壌サンプルが含まれる）；生物兵器剤サンプル；研究サンプル（細胞外流体、細胞培養物からの細胞外上清、細菌内の封入体、細胞コンパートメント、細胞ペリプラズム、ミトコンドリアコンパートメントが含まれる）が含まれる。
【０１２６】
サンプルは、実質的にあらゆる生物（例えば植物界、菌界、動物界の体細胞生物が含まれる）から得ることができる。サンプルは、動物（例えば哺乳動物）から得ることが好ましい。ヒトサンプルが特に好ましい。
【０１２７】
生物サンプルは、生物試料から間接的に由来したものでもよい。例えば標的核酸が細胞転写産物（例えばmRNA）である場合には、本発明の生物サンプルとして、mRNAの逆転写によって産生されたcDNAを含むサンプルが可能である。別の一例では、本発明の生物サンプルは、生物試料を分画（例えばサイズ分画または膜分画）にすることによって作製される。
【０１２８】
サンプルとして、核酸インサイチュハイブリダイゼーション法または免疫組織化学法に適合するように調製されて、ガラススライドまたは適切な固体支持体の上に固定化された細胞（生きた細胞または固定された細胞）または組織切片（生きた組織切片または固定された組織切片、例えばホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）切片）が可能である。組織サンプルは、包埋し、一連の切片にし、顕微鏡スライドに固定化することができる。細胞または組織切片の表面へのアクセスが確保されており、そのことによって流体交換が可能になる。これは、流体室試薬交換システム（例えばGrace（登録商標）Bio-Labs社、ベンド、オレゴン州）を用いることによって実現できる。一連の組織切片は、互いに約5μm〜15μm離すことができる。ブロッキング工程は、ポリマー鎖、プローブ、組成物を適用する前、および／または適用した後に実施することができる。
【０１２９】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載したポリマー鎖、プローブ、組成物、方法、キットを病気の診断に使用する。本明細書では、診断する、または病気の診断という用語は、その病気を予測または診断すること、その病気へのかかりやすさを判断すること、その病気の治療をモニタすること、その病気の治療反応、その病気の予後、その病気の進行、その病気の特定の治療法に対する反応を診断することを含んでいる。例えば組織サンプルを本明細書に記載したポリマー鎖、部分的二本鎖核酸プローブ、方法、キットのいずれかで調べ、（非疾患状態と比べて）サンプル中の疾患または悪性細胞のタイプのマーカーの存在および／または量を明らかにし、そうすることで疾患またはがんの診断またはステージ判断をすることができる。組織サンプルとして、腫瘍生検標本またはその一部、すなわち臨床上重要な組織サンプルが可能である。例えば腫瘍は、乳がんからのものが可能である。サンプルとして、切除したリンパ節が可能である。組織サンプルとして、腫瘍細胞を含んでいる可能性のある（例えば固形腫瘍または液体腫瘍からの）リキッドバイオプシー、または腫瘍細胞から放出された核酸、または腫瘍細胞から放出されたタンパク質が可能である。
【０１３０】
本発明の組成物とキットは、ポリマー鎖と、部分的二本鎖核酸プローブと、他の試薬（例えば緩衝液や、本分野でサンプル中のタンパク質および／または核酸の結合を容易にすることが知られている他の試薬、すなわちハイブリダイゼーション反応を実施するための他の試薬）を含むことができる。
【０１３１】
キットは、このキットの諸要素を使用するための指示も含むことになろう。その非限定的な例には、標識されたオリゴヌクレオチドをポリマー鎖またはレポータプローブにハイブリダイズさせるのに必要な情報、またはレポータプローブをポリマー鎖または部分的二本鎖核酸プローブに結合させるのに必要な情報、またはポリマー鎖または部分的二本鎖核酸プローブをサンプル中の核酸分子に結合させるのに必要な情報、または第1のポリマー鎖と第2のポリマー鎖をハイブリダイズさせて部分的二本鎖核酸プローブを形成するのに必要な情報が含まれる。
【０１３２】
キットは、ポリマー鎖または部分的二本鎖核酸プローブ、および／またはこのキットとともにに含まれるレポータプローブの結合と、場合によっては検出に適した表面を含む装置をさらに含むことができる。その表面には、本分野で知られている任意の手段で結合させることができる。
【０１３３】
キットは、生物サンプルから核酸を抽出するための組成物をさらに含むことができる。
【０１３４】
キットは、ハイブリダイゼーション試薬、精製試薬、固定化試薬、イメージング試薬からなるグループから選択された試薬をさらに含むことができる。
【０１３５】
標識されたモノマーおよび／またはレポータプローブを含むポリマー鎖は、市販のカートリッジ、ソフトウエア、システム（例えばnCounter（登録商標）カートリッジを用いたnCounter（登録商標）システム）を用いて検出し、定量することができる。
【０１３６】
nCounter（登録商標）分析システムの基礎は、調べる各核酸分子に割り当てた固有コードである（国際特許出願PCT/US2008/059959と、Geiss他、Nature Biotechnology、2008年、第26巻(3)：317〜325ページ；そのそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。このコードは、順序づけられた一連の色つき蛍光スポットからなり、それらスポットが、調べる各核酸分子のための固有バーコードを生み出す。
【０１３７】
一般に、本明細書に記載した方法では、NanoString Technologies（登録商標）社からのDV2試薬を使用することができる。DV2試薬を用いると、第1のポリマー鎖および／または部分的二本鎖核酸プローブが一本鎖核酸骨格に共有結合する。その骨格は、線形な組み合わせで共有結合した少なくとも2つの標識付着位置を含んでおり、それぞれの標識付着位置は、少なくとも1つの標識モノマーを含む少なくとも1つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することができ、標識されたモノマーの線形な組み合わせによって核酸分子を同定する。それに加え、捕獲ポリマー鎖または捕獲プローブを用いる場合には、それは、（1）少なくとも1つのアフィニティ部分を含む一本鎖核酸に結合することのできる領域と（2）核酸分子に結合することのできる第3の標的結合領域を少なくとも含んでいる。
【０１３８】
NanoString Technologies（登録商標）社からのDV2試薬を使用する本明細書に記載した方法は、少なくとも以下の工程を含んでいる。すなわち、（1）設計の信頼性／耐久性を最大にする一群の設計規則に従い、核酸の一部（例えば一塩基多型（SNP）、挿入、欠失、遺伝子融合が位置する場所）をカバーするポリマー鎖／プローブを設計する工程と；（2）DV2試薬の必要な全成分を適切な濃度で核酸分子とともに混合し、ハイブリダイゼーションのための規定の温度と時間でインキュベートする工程と；（3）必要な精製を実施して過剰なポリマー鎖／プローブを除去し、ポリマー鎖および／またはレポータプローブを捕獲した後、蛍光検出と分析を実施する工程である。これら工程のそれぞれは、NanoString Technologies（登録商標）社による公開特許文献により詳しく記載されている。例えばUS2014/0371088を参照のこと。
【０１３９】
一般に、NanoString Technologies（登録商標）社からのDV2システムは、作製と利用のための、タグに基づく多重化可能なレポータシステムと方法に関係している。タグに基づくナノレポータシステムにより、アッセイを柔軟に設計することが経済的かつ迅速に可能になる。というのもアッセイの遺伝子特異的要素は、レポータプローブおよび捕獲試薬から分離されているため、安価で広く入手できるDNAオリゴヌクレオチドによって実現できるからである。アッセイの遺伝子特異的オリゴヌクレオチド部（すなわち標的結合領域を含むポリマー鎖）を置き換えるだけで、レポータプローブの単一のセットを異なる実験において無限に多様な遺伝子の読み出しに用いることができる。タグに基づかないレポータシステムでは、レポータプローブと捕獲試薬（例えば、標識付着領域＋付着した標識と、アフィニティ部分）が標的結合領域に（直接または間接に）共有結合する。これらは、変更するには複雑でコストがかかる。
【０１４０】
US2003/0013091、US2007/0166708、US2010/0015607、US2010/0261026、US2010/0262374、US2010/0112710、US2010/0047924、US2014/0371088、US2014/0017688、US2011/0086774に記載されているように、NanoString Technologies（登録商標）社からのnCounter（登録商標）プローブ、システム、方法が、標的タンパク質および／または標的核酸を同定するための好ましい手段である。NanoString Technologies（登録商標）社からのnCounter（登録商標）プローブ、システム、方法により、複数（800以上）の明確に異なる標的タンパク質および／または標的核酸の同時多重同定が可能になる。上記の特許出願公開のそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている。NanoString Technologies（登録商標）社からの上記のnCounter（登録商標）プローブ、システム、方法は、本明細書に記載した任意の側面または実施態様と組み合わせることができる。
【０１４１】
単一のnCounter（登録商標）カートリッジ（例えばその単一のレーン）を用いて、上記のnCounter（登録商標）プローブ、システム、方法と、本明細書に記載した側面または実施態様の組み合わせから、複数の明確に異なる標的タンパク質および／または標的核酸の同時多重同定を実施することが可能である。
【０１４２】
サンプル中に複数ある核酸分子それぞれの相対量は、単一の多重化ハイブリダイゼーション反応で測定することができる。サンプルを、複数のポリマー鎖、多価ポリマー鎖、部分的二本鎖核酸プローブ、組成物などと組み合わせると、ハイブリダイゼーションが起こる。標識モノマーは、完全に自動化されたイメージングとデータ回収装置（Digital Analyzer、NanoString Technologies（登録商標）社）を用いて検出され、そのことによって各核酸分子の量が定量される。各サンプルについて、結合面積の約10 mm2を表わす約600の視野（FOV）が画像（1376×1024画素）にされる。典型的なイメージング密度は、多重化の程度、サンプル入力の量、全核酸分子の量に応じ、視野1つにつき約100〜1200個のレポータプローブである。データは、核酸分子1個あたりのカウント数をサンプルごとにリストにした簡単なスプレッドシート形式で出力される。
【０１４３】
本発明の標識モノマーは、特定の信号を検出することのできる本分野で利用可能な任意の手段で検出することができる。標識モノマーが蛍光を出す場合には、適切な励起源を考慮することが好ましい。可能な励起源の非限定的な例には、ランプ、キセノンランプ、レーザー、発光ダイオードや、これらをいくつか組み合わせたものが含まれる。適切な励起源を適切な光学的検出システム（例えば倒立蛍光顕微鏡、落射蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡）と組み合わせて使用する。ポリマー鎖またはレポータプローブ上のスポット列を調べるため、十分な空間分解能での検出が可能な顕微鏡を用いることが好ましい。
【０１４４】
本明細書に開示した一塩基バリエーション（SNV）プローブと方法により、5 ngの新鮮なゲノムDNA（gDNA）またはホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）ゲノムDNA（gDNA）から、アレル頻度が約5％の体細胞バリアントの検出が可能になる。
【０１４５】
本明細書と添付の請求項で用いる単数形「1つの」と「その」には、文脈が明らかに異なることを示している場合を除き、複数形が含まれる。
【０１４６】
特に断わらない限り、または文脈から明らかな場合を除き、本明細書では、「または」という用語は包括的であり、「または」と「および」の両方をカバーすると理解される。
【０１４７】
特に断わらない限り、または文脈から明らかである場合を除き、本明細書では、「約」という用語は、本分野における通常の許容範囲内であると理解され、例えば平均値の2標準偏差内である。約は、記載されている値の10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内、1％以内、0.5％以内、0.1％以内、0.05％以内、0.01％以内と理解することができる。異なることが文脈から明らかな場合を除き、本明細書に与えられているすべての数値が「約」という用語によって変化する。
【０１４８】
特に断わらない限り、本明細書で用いるあらゆる科学技術用語は、本発明が関係する当業者が一般に理解するのと同じ意味を持つ。本明細書に記載したのと同様の、または同等の他のポリマー鎖、プローブ、組成物、方法、キットを用いて本発明を実施できるが、本明細書には好ましい材料と方法が記載されている。本明細書で用いる用語は特定の実施態様を記述することを目的としており、制限することは意図していないことを理解されたい。
【実施例】
【０１４９】
実施例1：ポリマー鎖ペア／部分的二本鎖プローブをNanoString Technologies（登録商標）社からの既存のDV2レポータプローブとともに用いたSNP検出実験
【０１５０】
BRAF遺伝子のV600E一塩基多型（SNP）を検出する実験を実施した。
【０１５１】
図18Aは、この実施例で用いる3つの部分的二本鎖プローブを示している。第1のプローブは野生型標的を検出するためのものであり、2つのプローブ（m1とm2）は、標的の2つの変異体バージョンを検出するためのものである。この実験では、NanoString Technologies（登録商標）社のDV2システムを使用した。プローブは、長さが10個のヌクレオチドの標的結合領域と長さが8個のヌクレオチドの標的結合領域を含んでいて（「10＋8」）、m1変異とm2変異は、8個のヌクレオチドからなる標的結合領域によって検出された。
【０１５２】
3つのプローブのための（BRAFエキソン15に対応する）合成標的を図18Bに示す。この実験では、第1の標的結合領域の標的と第2の標的結合領域の標的が連続している。
【０１５３】
ハイブリダイゼーションを室温で実施した。NanoString Technologies社の25視野（FOV）を持つnCounter（登録商標）ディジタル分析装置でのイメージング前に精製工程は実施しなかった。
【０１５４】
99％の精度で一塩基が識別されるという素晴らしい結果が、10＋8プローブで観察された。図18Cを参照されたい。
【０１５５】
標的結合領域が別の長さであるプローブ（すなわち11＋36、12＋36、13＋36、14＋16、14＋17、14＋28、14＋30、14＋36、15＋15、15＋18、15＋22、15＋25、15＋26、15＋27、15＋28、15＋29、16＋18、16＋22、16＋23、16＋24、16＋25、16＋26、16＋27、18＋22、18＋25、19＋19、19＋20、19＋21、20＋20、20＋21）を調べた。特に、これらプローブのうちの11個で野生型アレルの検出が99.5％超の特異度であった（図19、左図の紫色のバンドを参照のこと）。また、これらプローブのうちの2個で変異アレルの検出が99.8％超の特異度であった（図19、右図の紫色のバンドを参照のこと）。
【０１５６】
それに加え、本発明のプローブは非常に高感度であり、合成核酸中の野生型標的を約10 fMまで検出できること（図20参照）と、約75 ngのゲノムDNAサンプル中の野生型標的を検出できること（図21参照）が示された。
【０１５７】
本発明のプローブは、野生型ゲノムDNAと混合しておいた合成変異体標的核酸を検出できることが示された。ここでは、プローブは、300 ngの全ゲノムDNAサンプル中に約5％の合成変異体標的核酸を含む溶液を検出することができた（バックグラウンドのレベルは陰性対照の測定を通じて求めた）。（図22参照）
【０１５８】
これらのデータ（特に図19に示したデータ）は、標的結合領域の長さを調節することで特異度を改善できることを示している。理論に囚われないならば、第1の標的結合領域と第2の標的結合領域の間の融点の差と、第1の標的結合領域と第2の標的結合領域の融点の和を関連させることに基づいて「高性能」プローブを予想することができる。この実施例の選択されたデータに関して図23からわかるのは、Tmを15 mMのNa+と100 pMのプローブという濃度条件で計算するとき、高性能プローブが20℃未満（例えば約0℃と約10℃の間）のTmの差を持つことと、Tmの和が約40℃と約60℃の間（例えば約47℃と約52℃の間）であることである。「SNR」は信号対雑音比を表わす。
【０１５９】
EGFR遺伝子のT790M SNPを検出する実験も実施した。
【０１６０】
さまざまな長さの標的結合領域（すなわち8＋23、8＋25、9＋23、9＋25、10＋22、11＋14、11＋17、11＋19、12＋14、12＋15、13＋14、14＋14、14＋15、15＋13、15＋14）を有する多彩なプローブを調べた。1つのプローブでの野生型アレルの検出に関する優れた結果（99.8％超の特異度）と、別の1つのプローブでの変異アレルの検出に関する99.8％超の特異度（図24の紫色のバンド参照）。
【０１６１】
高性能の2アーム式プローブに向かうというプローブ設計の傾向が、4つの実験から得られた結果に基づいて確認された。図25は、プローブの設計に関して出現する規則を示しており、この規則は、RAF V600E SNP実験とEGFR T790M SNP実験に基づくとともに、KRAS G12とEGFR L858に関する他の2つのSNP検出実験に基づいている（データは示さない）。
【０１６２】
図25に示したように、高性能のプローブはTmの差が20℃未満であり、Tmの和が約47℃と約52℃の間である。
【０１６３】
直前の例は、本発明をいかにして実施するかの完全な開示と説明を当業者に提示するために示したものであり、発明者が発明と見なす範囲を制限することは意図していない。使用する数値（例えば量と濃度）が正確になるよう努力してきたが、いくらかの実験誤差と偏差を考慮する必要がある。特に断わらない限り、温度は摂氏で表わし、圧力は大気圧またはその近傍である。
【０１６４】
実施例2：ポリマー鎖ペア／部分的二本鎖プローブをNanoString Technologies（登録商標）社からの既存のDV2レポータプローブとともに用いた、ホットスポット領域でのSNP検出実験
【０１６５】
KRASエキソン2ホットスポットにおける一塩基多型（SNP）を検出する実験を実施した。
【０１６６】
図26は、この実施例で用いたのと同様の部分的二本鎖プローブの模式図を示している。この実験では、NanoString Technologies（登録商標）社のDV2システムを使用した。この実施例でも、本明細書に開示したどの実施例でも、図26に示したプローブを図1〜図15に示した任意のプローブ、プローブペア、組成物で置き換えうることに注意されたい。図26では、標的配列上の1個のヌクレオチド（灰色）を、「プローブA」と名づけた2アーム式アダプタプローブ（青色）を用いて既存のNanoStringレポータオリゴ（緑色）で検出することができる。このアダプタプローブは、ステム配列を介して互いにハイブリダイズした2つのオリゴからなる。これらの実験では、両方のオリゴが標的配列上の隣接領域にハイブリダイズする。それに加え、一方のオリゴがNanoStringレポータオリゴにハイブリダイズする。プローブのステム部と各オリゴのハイブリダイズ領域の間にPEGリンカーが存在していてもよい。ここでは、一塩基ミスマッチがプローブのハイブリダイゼーションを破壊することになるという理由で、一塩基特異性が2アーム式プローブによって実現された。標的配列は、アダプタ「プローブB」（赤色）と捕獲プローブ（オレンジ色）を含む既存のNanoString技術によって表面に捕獲された。
【０１６７】
図27に示した参照配列とSNV遺伝子座（いくつかの既知の一塩基変異体が含まれているコドン12と13を含むKRASエキソン2）に対して特異的なプローブを調べた。それぞれのプローブは、長さが13個〜24個のヌクレオチドからなる2つの標的結合領域を含んでおり、SNV変異はそれら2つの領域の短い方に存在する。各プローブの配列と位置を図28A〜図28Dに示す（図28Aは配列全体を、図28B〜図28Dは、図28Aの配列の1/3を示している）。まとめると、プローブプールは、KRASエキソン2に特異的な11個のプローブと、KRASエキソン2に非特異的な23個のプローブ（バックグラウンドプローブ）を含んでいた。
【０１６８】
合成標的を用いてプローブプールに含まれる各プローブの特異度を調べた。参照配列を含む11個のKRAS標的バリアントと10個のSNV変異体のそれぞれについてプローブプールを別々に調べた。バックグラウンド標的が各反応物に含まれていた。
【０１６９】
NanoString Technologies（登録商標）社の既存のプロトコルと試薬を用いてハイブリダイゼーション反応を実施し、NanoString Technologies（登録商標）社のnCounter（登録商標）分析システムを用いて分析した。ハイブリダイゼーション反応物には、25 pMのNanoString DV2 レポータ、100 pMずつのプローブB、20 pMずつのプローブA、50 ngのサケ精子DNA、360万コピーの合成標的が5×SSPE塩の中に含まれていた。反応物を65℃で少なくとも16時間ハイブリダイズさせた後、NanoString Technologies（登録商標）社のnCounter（登録商標）分析システムに移した。
【０１７０】
プローブプールに含まれる各プローブに関するディジタルカウント数から、プローブの特異度が各SNV遺伝子座について96％超であることが明らかになった。特異度は、目的とする標的に向かう所与のプローブに関するカウント数を、全KRAS標的に関するカウント数と比較した割合によって求めた。図29参照。
【０１７１】
これらの実験は、標準チミン（T）塩基を含む鋳型と、ウラシル（U）で置換された各チミンヌクレオチドを有する鋳型を用いて実施した。両方の多彩な鋳型が同じ結果を生んだ。
【０１７２】
実施例3：ポリマー鎖ペア／部分的二本鎖プローブをNanoString Technologies（登録商標）社からの既存のDV2レポータプローブとともに用いた欠失検出実験
【０１７３】
EGFRエキソン19における欠失を検出する実験を実施した。
【０１７４】
この実験では、NanoString Technologies（登録商標）社のDV2システムを図26に示した2アーム式プローブのアーキテクチャとともに用いた。この実施例でも、本明細書に開示したどの実施例でも、図26に示したプローブを図1〜図15に示した任意のプローブ、プローブペア、組成物で置き換えうることに注意されたい。図30に示した参照配列と3つの欠失含有標的に対して特異的なプローブを調べた。各プローブは、長さが18個〜21個のヌクレオチドからなる2つの標的結合領域を含んでいた。各プローブの配列と位置を図31A〜図31Dに示す（図31Aは配列全体を、図31B〜図31Dは、図31Aの配列の1/3を示している）。まとめると、プローブプールは、EGFRエキソン19に特異的な4個のプローブと、EGFRエキソン19に非特異的な11個のプローブ（バックグラウンドプローブ）を含んでいた。
【０１７５】
合成標的を用いてプローブプールに含まれる各プローブの特異度を調べた。参照配列と3個の欠失変異体配列を含む4個のEGFR標的バリアントのそれぞれについて別々にプローブプールを調べた。バックグラウンド標的が各反応物に含まれていた。
【０１７６】
NanoString Technologies（登録商標）社の既存のプロトコルと試薬を用いてハイブリダイゼーション反応を実施し、NanoString Technologies（登録商標）社のnCounter（登録商標）分析システムを用いて分析した。ハイブリダイゼーション反応物には、25 pMのNanoString DV2 レポータ、100 pMずつのプローブB、20 pMずつのプローブA、50 ngのサケ精子DNA、360万コピーの合成標的が5×SSPE塩の中に含まれていた。反応物を65℃で少なくとも16時間ハイブリダイズさせた後、NanoString Technologies（登録商標）社のnCounter（登録商標）分析システムに移した。
【０１７７】
プローブプールに含まれる各プローブに関するディジタルカウント数から、プローブの特異度が各SNV遺伝子座について96％超であることが明らかになった。特異度は、目的とする標的に向かう所与のプローブに関するカウント数を、全EGFR標的に関するカウント数と比較した割合によって求めた。図32参照。
【０１７８】
実施例4：ポリマー鎖ペア／部分的二本鎖プローブをNanoString Technologies（登録商標）社からの既存のDV2レポータプローブとともに用いた多重SNV検出実験
【０１７９】
1つの反応で多重SNV変異を検出する実験を実施した。
【０１８０】
この実験では、NanoString Technologies（登録商標）社のDV2システムを図26に示した2アーム式プローブのアーキテクチャとともに用いた。この実施例でも、本明細書に開示したどの実施例でも、図26に示したプローブを図1〜図15に示した任意のプローブ、プローブペア、組成物で置き換えうることに注意されたい。参照配列と、7つの異なる遺伝子座にあるSNV配列に対して特異的なプローブを調べた。各プローブは、長さが18個〜21個のヌクレオチドからなる2つの標的結合領域を含んでいた。各プローブの配列と位置を図33A〜図33Dに示す（図33Aは配列全体を、図33B〜図33Dは、図33Aの配列の1/3を示している）。まとめると、プローブプールは、14個の2アーム式プローブと、内在性対照として機能したRNAsePのための1個の単一アームプローブを含んでいた。
【０１８１】
Qiagen（登録商標）社からのDNeasy Blood & Tissue Kit を用いて3つの細胞系からDNAを抽出した。TaqMan（商標）Hotstart 2x Mastermixを200 nMの順プライマーオリゴおよび逆プライマーオリゴとともに用い、20 ngのDNAを20μlのPCR反応物の中で増幅した。サーモサイクラーのプログラムは、（1）95℃を30秒間、（2）95℃を15秒間、（3）56℃を30秒間、（4）68℃を30秒間、（5）工程（2）〜（4）の繰り返しを18サイクル、（6）68℃を300秒間である。増幅したDNAは、使用する前に10分間かけて95℃まで加熱して変性させ、次いで氷の上で急冷した。
【０１８２】
3つの細胞系それぞれに由来する増幅したDNAについて別々にプローブプールを調べ、興味の対象である7つの遺伝子座それぞれの遺伝子型を明らかにした。
【０１８３】
NanoString Technologies（登録商標）社の既存のプロトコルと試薬を用いてハイブリダイゼーション反応を実施した。ハイブリダイゼーション反応物には、25 pMのNanoString DV2 レポータ、100 pMずつのプローブB、20 pMずつのプローブA、5μlの増幅したDNAが5×SSPE塩の中に含まれていた。反応物を65℃で少なくとも16時間ハイブリダイズさせた後、NanoString Technologies（登録商標）社のnCounter（登録商標）分析システムに移した。
【０１８４】
これらの実験では、ここに記載したハイブリダイゼーション反応物を、NanoString Technologies nCounter PanCancer Profiles遺伝子発現パネルとProtein Plusを含む別のハイブリダイゼーション反応物と組み合わせた。
【０１８５】
参照（野生型、WT）プローブとSNV（変異体、Mut）プローブのディジタルカウント数を比較し、どのプローブがバックグラウンドよりも大きな信号を示したかによって各遺伝子座の位置の遺伝子型を明らかにした。図34参照。
【０１８６】
このSNVアッセイを利用して各細胞系と各遺伝子座について調べた遺伝子型は、TaqMan（商標）遺伝子型決定アッセイを含む他の方法で明らかにした遺伝子型ならびに公開されているデータと一致していた。図35参照。
【０１８７】
実施例5：3D生物学：同じ装置でのDNA、SNV、RNA遺伝子発現とタンパク質プロファイルの同時検出
【０１８８】
本明細書に記載したSNV検出アッセイにNanoString Technologies（登録商標）アッセイを組み合わせた実験を実施した。
【０１８９】
3つの細胞系からの細胞を、DNAサンプル調製物、RNAサンプル調製物、タンパク質サンプル調製物に分割した。最初のプロセシングの後、RNAとタンパク質を組み合わせて1つのハイブリダイゼーション反応物にした。
【０１９０】
DNAハイブリダイゼーション反応：Qiagen（登録商標）社からのDNeasy Blood & Tissue Kit を用いてDNAを抽出した。抽出したDNAは、実施例3に記載したようにして増幅するか、Covaris装置を用いて剪断して300 bpの断片にした。DNAは、使用する前に10分間かけて95℃まで加熱して変性させ、次いで氷の上で急冷した。NanoString Technologies（登録商標）社のDV2システムを図26に示した2アーム式プローブのアーキテクチャとともに使用した。この実施例でも、本明細書に開示したどの実施例でも、図26に示したプローブを図1〜図15に示した任意のプローブ、プローブペア、組成物で置き換えうることに注意されたい。興味の対象であるSNVの遺伝子型は、実施例3に記載したようにして、野生型配列と変異体配列に対して特異的なプローブを用いて明らかにした。NanoString Technologies（登録商標）社の既存のプロトコルと試薬を用いてハイブリダイゼーション反応を実施した。ハイブリダイゼーション反応物には、25 pMのNanoString DV2 レポータ、100 pMずつのプローブB、20 pMずつのプローブA、5μlの増幅したDNA（または500 ngの増幅していないCovaris剪断DNA）が5×SSPE塩の中に含まれていた。反応物を65℃で少なくとも16時間ハイブリダイズさせた。
【０１９１】
RNA：タンパク質ハイブリダイゼーション反応：同じハイブリダイゼーションにおいてRNAとタンパク質を組み合わせるためのプロトコルは、既存のNanoString Technologies 製品のためのプロトコルに概略が記載されている。RNA は、Qiagen（登録商標）社からのRNeasy Kitを用いて抽出するか、溶解させた細胞から直接採取した。タンパク質プロセシングのため、NanoString Technologiesタンパク質アッセイにおけるように、細胞ライセートをライセート緩衝液（2％SDS、100 mMのトリス pH 6.8、50 mMのDTT）を用いて調製し、タンパク質結合プレートに添加し、興味の対象であるタンパク質に特異的なDNAタグ付き抗体とともにインキュベートした。結合しなかった抗体を洗い流した後、残った抗体をRLT緩衝液の中に懸濁させた。このRLT緩衝液を、標準的なNanoString Technologies（登録商標）nCounter（登録商標）ハイブリダイゼーション反応においてタンパク質標的に対して用いた。NanoString Technologies（登録商標）社の既存のプロトコルと試薬（RNAとタンパク質標的の両方に対して特異的なnCounterレポータを含む）を用いてハイブリダイゼーション反応を実施した。反応物を65℃で少なくとも16時間ハイブリダイズさせた。
【０１９２】
DNAハイブリダイゼーション反応物とRNA：タンパク質ハイブリダイゼーション反応物を組み合わせた直後にNanoString Technologies（登録商標）nCounter（登録商標）分析システムに移した。
【０１９３】
DNA SNVプローブについてのディジタルカウント数を、PNA遺伝子発現プローブおよびタンパク質プローブについてのカウント数と同時に測定した。
【０１９４】
この技術を利用して多次元の情報を同じサンプルから同時に明らかにすることができる。図36参照。タンパク質の検出に役立つプローブの例とその使用法を図37〜図39に示してある。
【０１９５】
実施例6：ポリマー鎖ペア／部分的二本鎖プローブをNanoString Technologies（登録商標）社からの既存のDV2レポータプローブとともに用いた、ホットスポット領域におけるSNV検出実験
【０１９６】
KRASエキソン2ホットスポットにおける一塩基バリアント（SNV）を検出する実験を実施した。
【０１９７】
図26は、この実施例で用いたのと同様の部分的二本鎖プローブの模式図を示している。この実験では、NanoString Technologies（登録商標）社のDV2システムを使用した。この実施例でも、本明細書に開示したどの実施例でも、図26に示したプローブを図1〜図15に示した任意のプローブ、プローブペア、組成物で置き換えうることに注意されたい。参照配列とSNVバリアント配列に対するプローブの特異度を調べた。各プローブは、長さが13個〜23個のヌクレオチドからなる2つの標的結合領域を含んでいた。KRASエキソン2遺伝子座について、1つの参照プローブと、12の異なるバリアント配列に対して特異的な12個のプローブを含むプローブプールを用いてその領域を調べた。これらのプローブは、ゲノムの他の領域に対して特異的な64個の別の参照プローブと136個の別のバリアントプローブを含むプローブプールで用いた。
【０１９８】
デオキシチミンの代わりにデオキシウラシル（dU）を含む合成標的を用いてプローブプール内の各プローブの特異度を調べた。dU含有鋳型は、SNVアッセイの増幅工程で生じたPCR産物を模倣した。別々の反応ウエルにおいて、プローブプールを12個のKRAS標的バリアントそれぞれの360万コピーと参照配列の7200万コピーで調べた。多数の参照配列の文脈では、約5％の感度であった。大半の反応物には1つのバリアント鋳型が存在していたが、1つの反応物には参照サンプルを模倣するバリアント鋳型が存在していなかった。1つの反応物には2つのバリアント鋳型が存在していた。
【０１９９】
NanoString Technologies社の既存のプロトコルと試薬を用いてハイブリダイゼーション反応を実施した。ハイブリダイゼーション反応物には、20 pMのNanoString DV2レポータ、100 pMずつのプローブT、20 pMずつの149個のバリアントSNVプローブS、100 pMずつの64個の参照プローブS、5μlの増幅したDNAが5×SSPE塩の中に含まれていた。それに加え、200 pMのプローブM（減衰オリゴ）を使用して過剰な参照信号を減衰させ、各SNVアッセイが5％の感度になることを保証した。減衰オリゴは、DV2レポータタグの逆相補的体である標準35量体オリゴであり、プローブSハイブリダイゼーション部位をブロックした。反応物を65℃で16時間ハイブリダイズさせた後、nCounter（登録商標）分析システムに移した。
【０２００】
KRASエキソン2プローブ群の中の各プローブに関するディジタルカウント数は、各反応における参照信号に合致し、反応物の中の正確なバリアント鋳型に対して特異的なバリアントプローブからの二次的カウント数とも合致することが明らかになった。全カウント数の分布を計算し、目的とする標的に向かう所与のプローブの特異度の推定値とした。図40参照。
【０２０１】
実施例7：ポリマー鎖ペア／部分的二本鎖プローブをNanoString Technologies（登録商標）社からの既存のDV2レポータプローブとともに用いた欠失検出実験
【０２０２】
EGFRエキソン19の中の挿入-欠失を検出する実験を実施した。
【０２０３】
この実験では、NanoString Technologies（登録商標）社のDV2システムを図26に示した2アーム式プローブのアーキテクチャとともに用いた。この実施例でも、本明細書に開示したどの実施例でも、図26に示したプローブを図1〜図15に示した任意のプローブ、プローブペア、組成物で置き換えうることに注意されたい。各プローブは、長さが17個〜24個のヌクレオチドからなる2つの標的結合領域を含んでいた。まとめると、EGFRエキソン19遺伝子座に関し、1つの参照プローブと、9個のバリアント配列に特異的な9つのバリアントプローブを含むプローブプールを用いてその領域を調べた。これらのプローブは、ゲノムの別の領域に対して特異的な64個の別の参照プローブおよび139個の別のバリアントプローブと組み合わせて用いた。
【０２０４】
デオキシチミンの代わりにデオキシウラシル（dU）を含む合成標的を用いてプローブプールに含まれる各プローブの特異度を調べた。dU含有鋳型は、SNVアッセイの増幅工程で生じたPCR産物を模倣した。別々の反応ウエルにおいて、プローブプールを9個のEGFRエキソン19標的バリアントそれぞれの360万コピーと参照配列の7200万コピーで調べた。これを用いて多数の参照配列の文脈で約5％の感度にした。大半の反応物には1つのバリアント鋳型が存在していたが、参照サンプルを模倣するバリアント鋳型が存在していない反応物が1つ含まれていた。
【０２０５】
NanoString Technologies社の既存のプロトコルと試薬を用いてハイブリダイゼーション反応を実施した。ハイブリダイゼーション反応物には、20 pMのNanoString DV2 レポータ、100 pMずつのプローブT、20 pMずつの149個のバリアントSNVプローブS、100 pMずつの64個の参照プローブS、5μlの増幅したDNAが5×SSPE塩の中に含まれていた。それに加え、200 pMのプローブM（減衰オリゴ）を使用して過剰な参照信号を減衰させ、各SNVアッセイが5％の感度になることを保証した。減衰オリゴは、DV2レポータタグの逆相補体である標準35量体オリゴであり、プローブSハイブリダイゼーション部位をブロックした。反応物を65℃で16時間ハイブリダイズさせた後、nCounter（登録商標）分析システムに移した。
【０２０６】
EGFRエキソン19プローブ群の中の各プローブに関するディジタルカウント数は、各反応における参照信号と矛盾せず、反応物の中の正確なバリアント鋳型に対して特異的なバリアントプローブからの二次的カウント数とも矛盾しないことが明らかになった。全カウント数の分布を計算し、目的とする標的に向かう所与のプローブの特異度の推定値とした。図41参照。
【０２０７】
実施例8：ポリマー鎖ペア／部分的二本鎖プローブをNanoString Technologies（登録商標）社からの既存のDV2レポータプローブとともに用いた、ホットスポットにおける多重SNV検出実験
【０２０８】
1つの反応で多重SNV変異を検出する実験を実施した。
【０２０９】
この実験では、NanoString Technologies（登録商標）社のDV2システムを図26に示した2アーム式プローブのアーキテクチャとともに用いた。この実施例でも、本明細書に開示したどの実施例でも、図26に示したプローブを図1〜図15に示した任意のプローブ、プローブペア、組成物で置き換えうることに注意されたい。参照配列と43個の異なる遺伝子座の位置のSNV配列に対して特異的なプローブを調べた。各プローブは、長さが13個〜27個のヌクレオチドからなる2つの標的結合領域を含んでいた。まとめると、プローブプールは、178個の異なる2アーム式プローブと、対照として機能するさまざまな内在性標準プローブおよび外在性標準プローブを含んでいた。
【０２１０】
精製したゲノムDNA（gDNA）サンプルを、Horizon Discovery社から購入したホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）切片から抽出した。各サンプルを操作して4個または9個のSNVが2％〜17.5％の割合で含まれるようにした。2つの産物（HD200＋HD 301）をまとめてプールすることによってサンプルを作り出した。そのサンプルは、43個の標的をカバーするパネルの中で調べた114個のSNVのうちの10個のSNVを含んでいた。図42に示したように、各変異体は1〜10％のレベルで存在していると考えられる。
【０２１１】
参照サンプルとして、CoriellサンプルNA12878を用いた。このサンプルは、調べたすべての遺伝子座で参照信号だけを示すことがわかった。
【０２１２】
43個のカスタムプライマーペアを用いて5 ngの各DNAを増幅し、興味の対象であるSNV遺伝子座を増幅した。用いたサーモサイクラーのプログラムは、（1）37℃を30分間、（2）50℃を600秒間、（3）95℃を180秒間、（4）95℃を30秒間、（5）56℃を120秒間、（7）68℃を30秒間、（8）工程（4）〜（7）の繰り返しを21サイクル、（9）68℃を300秒間である。増幅したDNAは、使用する前に10分間かけて95℃まで加熱して変性させ、次いで氷の上で急冷した。
【０２１３】
NanoString Technologies社の既存のプロトコルと試薬を用いてハイブリダイゼーション反応を実施した。ハイブリダイゼーション反応物には、25 pMのNanoString DV2 レポータ、100 pMずつのプローブT、20 pMずつの114個のバリアントSNVプローブS、100 pMずつの43個の参照プローブS、5μlの増幅したDNAが5×SSPE塩の中に含まれていた。それに加え、200 pMのプローブM（減衰オリゴ）を使用して過剰な参照信号を減衰させ、多数のサイクルで各SNVに関して感度が少なくとも5％に達することを可能にした。減衰オリゴは、DV2レポータタグの逆相補体である標準35量体オリゴであり、プローブSハイブリダイゼーション部位をブロックした。反応物を65℃で16時間ハイブリダイズさせた後、nCounter（登録商標）分析システムに移した。
【０２１４】
参照プローブと、検出可能なレベルで存在することが予想されるバリアントプローブ（バリアント、変異体）のディジタルカウント数を3回繰り返して比較した。バリアントサンプル中の10個のバリアントプローブは、参照サンプル中の同じプローブのカウント数と比べて有意に大きくなることがわかった。図43参照。p値は、Log2バリアント対参照比を表にしてtスコアを計算することによって得た。予想されるすべてのバリアントプローブで、p値が0.05未満の有意であった。すべての参照プローブで、p値が有意水準0.05よりも大きくなった。図44参照。
【０２１５】
実施例9：ポリマー鎖ペア／部分的二本鎖プローブをNanoString Technologies（登録商標）社からの既存のDV2レポータプローブおよびNanoString Technologies（登録商標）社のnCounter（登録商標）肺遺伝子融合パネルとともに用いた、nCounter（登録商標）システムでのSNVとRNA融合転写産物の同時検出
【０２１６】
SNV変異と、肺がんに関係するRNA遺伝子融合転写産物の存在を同時に検出する実験を、ホルマリン固定パラフィン埋包（FFPE）組織サンプルから抽出した患者由来のゲノムDNAで実施するとともに、同じ組織サンプルから抽出したRNA、またはホルマリン固定パラフィン埋包（FFPE）培養細胞からなる市販の対照サンプルから抽出したRNAで実施した。
【０２１７】
DNAとRNAは、Qiagen（登録商標）社（ドイツ国）からのAllPrep（登録商標）DNA/RNA FFPE Kit（カタログ番号ID：80234）を販売者が推奨するプロトコルに従って用いて単一のFFPE切片群から抽出した。
【０２１８】
FFPE培養細胞は、Horizon Discovery Group PLC社（ケンブリッジ、イギリス国）からの市販品を取得したものであり、ALK-RET-ROS1 Fusion RNA参照基準（カタログID：HD784）として記載されている。この市販サンプルは、厚さ10μmの単一のFFPE切片、すなわち「カール」として提供された。それは、販売者により、操作された細胞系、または融合バックグラウンドからのクローンに由来する細胞系からなるよく特徴づけられた生物関連参照材料であると、より詳しく説明されている。それに加え、それは、EML4-ALK融合体（バリアント1；COSMIC ID: COSF463）、CCDC6-RET融合体（COSMIC ID：COSF1272）、SLC34A2-ROS1融合体（COSMIC ID：COSF1197）に対して陽性であると説明されている。
【０２１９】
患者由来のFFPEサンプル（事例ID：82430からの試料ID：1194863B）は、Asterand Bioscience社（デトロイト、ミシガン州）から取得した。このサンプルは、本実施例で使用する前に販売者が遺伝子型特異的PCRを利用してあらかじめスクリーニングし、KRAS p.G13D SNV（c.38G>A；COSMIC ID：COSM532）に対して陽性であることを確認してあった。この試料は、57歳の非ヒスパニック系白人男性で実施した肺腫瘍葉切除に由来するものであった。腫瘍は、UICCステージT1bN0M0であり、かつ肺腺癌の中分化粘液型（非小細胞肺癌（NSCLC）の一形態）であると記述されていた。この試料はFFPEブロックとして購入し、個々の約10μmの切片をそのブロックから切り出し、1つ以上の切片からDNAとRNAを抽出した。
【０２２０】
実験の作業フロー全体を図45に示してある。この実験では、抽出したゲノムDNA（gDNA）をSNVアッセイの作業フローに従って処理し、抽出から前増幅を経てSNV特異的プローブプールとの16時間のハイブリダイゼーションまでを実施した。それと並行して、抽出した全RNAを、公開されているユーザープロトコルにより、16時間のハイブリダイゼーションを通じてnCounter（登録商標）Vantage（商標）Lung Fusion Panelプローブ（NanoString Technologies（登録商標）社、シアトル、ワシントン州；カタログ番号XT-CSO-LKFU1-12）で処理した。並行した16時間のハイブリダイゼーションの後、2つのハイブリダイゼーション反応物をプールし、混合し、nCounter（登録商標）の単一レーンに装填して、自動化された精製、固定化、イメージングを実施した。それぞれの単一レーン内の陽性プローブの数を、nCounter（登録商標）システムの自動化された顕微鏡イメージングによって数えた。SNVと融合転写産物の検出は、データを数えることに基づいており、カウント数がバックグラウンドのカウント数のレベルを有意に上回っているとき陽性であった。
【０２２１】
具体的には、実施したこの実験では、10μlの反応物の中で、図46に列挙した11個のプライマーペアを用いて5 ngのFFPE抽出DNAを増幅し、興味の対象であるSNV遺伝子座を増幅した。用いたサーモサイクラーのプログラムは、（1）37℃を30分間、（2）50℃を600秒間、（3）95℃を180秒間、（4）95℃を30秒間、（5）56℃を120秒間、（7）68℃を30秒間、（8）工程（4）〜（7）の繰り返しを20サイクル、（9）68℃を300秒間である。増幅したDNAは、使用する前に10分間かけて95℃まで加熱して変性させ、次いで氷の上で急冷した。
【０２２２】
NanoString Technologies社の既存のプロトコルと試薬を用いてハイブリダイゼーション反応を実施した。15μlのSNV検出ハイブリダイゼーション反応物には、25 pMのNanoString Technologies（登録商標）DV2 レポータ、100 pMずつの標準プローブB（すなわちSNVプローブTプール）、20 pMずつの26個のバリアントSNV 2アーム式プローブ（図3H参照）、100 pMずつの11個の参照2アーム式プローブ（2アーム式プローブのプールは、本明細書では、プローブSプールとも呼ぶ）、5μlの増幅したDNAが5×SSPE塩の中に含まれていた。それに加え、200 pMのプローブM（減衰オリゴプール）を使用して過剰な参照信号を減衰させ、多数のサイクルで各SNV変異アレルに関して感度が少なくとも5％に達することを可能にした。減衰オリゴは、DV2レポータタグの逆相補体である標準d35量体オリゴであり、2アーム式プローブをDV2レポータハイブリダイゼーション配列から競合的にブロックした。それぞれの2アーム式プローブは、長さが12個〜25個のヌクレオチドからなる2つの標的結合領域を含んでいた。追加の対照プローブもハイブリダイゼーション反応物に含まれていた。SNV検出反応物を65℃で16時間ハイブリダイズさせた後、プールし、（120 ngのRNA入力を用いた）標準である、やはり65℃で16時間ハイブリダイズさせておいた15μlのRNA／融合体プローブハイブリダイゼーション反応物と混合した。プールして混合した後、このまとめたハイブリダイゼーション反応物をnCounter（登録商標）分析システムに移し、自動化されたプロセシングと計数を実施した。サンプルとアッセイパネルの組み合わせ、すなわちA）参照NA12878ゲノムDNA（gDNA）だけに関するSNVアッセイ、B）FFPEから抽出された患者由来のgDNAに関するSNVアッセイと、同じ患者に由来するFFPEサンプルから抽出されたRNAに関するnCounter（登録商標）Vantage（商標）Lung Fusion Panelアッセイの同時組み合わせ、C）FFPEから抽出された患者由来のgDNAに関するSNVアッセイと、Horizon Discovery ALK-RET-ROS1融合体RNA参照基準FFPEサンプルから抽出されたRNAのSNVアッセイの同時組み合わせを、同じnCounter（登録商標）カートリッジ上で評価した。
【０２２３】
ヒトゲノムDNA参照サンプルとして、サンプルNA12878（Coriell Institute、カムデン、ニュージャージー州）を使用した。このサンプルは、調べたすべての遺伝子座で参照信号だけを示すことが見いだされた。5 ngのこの非FFPE gDNAを上記のようにしてSNVプローブパネルだけで処理した（前増幅PCRを17サイクル）。65℃での16時間にわたるハイブリダイゼーションの後、この対照に関するハイブリダイゼーション反応物を、他のすべての測定を行なったのと同じnCounter（登録商標）カートリッジのレーン1に装填した。
【０２２４】
SNVプローブのカウント数を内部対照に基づいて規格化した後、（2段落上に記載した）実験サンプルBとCからの参照アレルプローブとバリアントアレルプローブのディジタルカウント数を、NA12878参照サンプルから得られた一致したプローブのカウント数と比較した。2つのデータセット（本実施例ではサンプルAとサンプルC）のヒストグラムから、プローブのカウント数が有意に異なっている唯一の例は、図47に示されているように、FFPEサンプル中のKRAS COSM532変異に関するSNVプローブに対応することが明らかになった。それとは対照的に、これら2つのサンプル間で参照アレルに関してプローブのカウント数には有意な差がないことが図48に示されている。これは、FFPE由来のgDNAが、調べたすべての遺伝子座に存在する参照アレルを持つことの証拠であると解釈される。サンプルAとBを比較したとき、定性的に同じ結果が得られた。図52とその上部にある説明は、サンプルBとCから非常によく相関したSNVカウント数が生じたことを示している。
【０２２５】
処理が最少の融合プローブアッセイのカウント数を、（3段落上に記載した）サンプルBとCの組み合わせに関するデータから評価した。ALK遺伝子に由来する転写産物を検出する設計のプローブからのカウント数のヒストグラムを図49に示す。5'ALK転写産物と3'ALK転写産物が不均衡であることの明らかな証拠が融合陽性対照で見られた。すなわち、転写されたALK遺伝子の3'部分が一致するプローブである「ALK_3P-1'」、「ALK_3P_2'」、「ALK_3P_3'」、「ALK_3P_4'」のカウント数は、同じ遺伝子の5'部分が一致するプローブ（ALK_5P-nシリーズ）のカウント数よりも有意に多かった。さらに、特別なEML4_13：ALK_20転写産物が同じサンプルに存在する証拠が存在していた。これらの結果の両方とも、EML4-ALK融合体がこの対照の中に存在するという報告と一致していた。それとは対照的に、患者サンプルの中で5'/3' ALK転写産物が不均衡であるとか、患者サンプルの中に特別なALK融合体が存在するという証拠は、ほとんど存在しない。
【０２２６】
RET遺伝子とNTRK1遺伝子に由来する転写産物を検出する設計のプローブからのカウント数のヒストグラムを図50に示す。5'RET転写産物と3'RET転写産物が不均衡であることの明らかな証拠が融合陽性対照で示され、特別なCCDC6_1:RET_12転写産物が同じサンプルに存在する証拠が存在している。これらの結果の両方とも、CCDC6：RET融合体がこの対照の中に存在するという報告と一致していた。それとは対照的に、患者サンプルの中で5′/3′ RETが不均衡であるとか、患者サンプルの中に特別なRET融合体またはNTRK1融合体が存在するという証拠は、ほとんど存在しない。
【０２２７】
ROS1遺伝子に由来する転写産物を検出する設計のプローブからのカウント数のヒストグラムを図51に示す。5′ROS1転写産物と3′ROS1転写産物が不均衡であることの明らかな証拠が融合陽性対照で示され、1つ以上の特別なSLC34A2_4：ROS1転写産物が同じサンプルに存在するという証拠が存在している。これらの結果の両方とも、SLC34A2：ROS1融合体がこの対照の中に存在するという報告と一致していた。それとは対照的に、患者サンプルの中で5′/3′ ROS1が不均衡であるとか、患者サンプルの中に特別なROS1融合体が存在するという証拠は、ほとんど存在しない。
【０２２８】
患者由来のFFPE RNAの中で融合転写産物の証拠を検出できなかったというのは、（SNV によるKRAS COSM532変異のように）SNVドライバー変異を有する腫瘍が、融合体に由来するドライバー変異（例えばALK、RET、ROS1に関係するドライバー変異）も有することは滅多にないという観察結果と一致している。
【０２２９】
RNA融合-遺伝子転写産物を検出するための同時アッセイは、SNVアッセイのプローブのカウント数に有意な影響を与えなかった。規格化後、nCounter（登録商標）Vantage（商標）Lung Fusion Panelを用いた、患者をマッチさせたFFPE RNAの同時アッセイから得られたSNVプローブのカウント数は、市販のHorizon HD784対照から得られたFFPE RNAで実施した同様のアッセイから得られたSNVプローブのカウント数に非常に近かった。そのことが、図52に示されている。この図では、両方のデータセットにおける最大のカウント数は、変異体KRAS COSM532アレルの存在を検出したSNVプローブ（オレンジ色の丸で示す）に由来する。調べた合計11個の遺伝子座に関する参照アレルSNVプローブは、予想されるように、プローブの信号が次に大きいグループとして現われる（緑色の丸で示す）。最後に、11個の遺伝子座に変異アレルが存在しないことを検出する設計のSNPプローブは、一般に非常に小さなカウント数（通常は100未満）の位置に集まる（図52に青色の丸で示す）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【国際調査報告】
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