(57)【要約】  活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）ｎという配列を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数であるペプチドコンジュゲートを開示する。サンプル中の変性コラーゲンの検出方法であって、開示されているペプチドコンジュゲートのいずれか１つを含む組成物をサンプルに接触させることであって、活性剤が治療剤を含むことと、ペプチドコンジュゲートの変性コラーゲンへの結合の有無を検出することであって、結合の存在によって、サンプルに変性コラーゲンが存在することが示されることとを含む方法も開示する。コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷の治療方法であって、コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷を持つ対象に、開示されているペプチドコンジュゲートのいずれか１つを投与することを含む方法も開示する。【選択図】図１
2018508492.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記ａ〜ｃを含むペプチドコンジュゲートであって、
ａ．活性剤、
ｂ．スペーサー部分、及び
ｃ．下記ｉ〜ｉｉｉを含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、
ｉ．第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、
ｉｉ．リンカー、及び
ｉｉｉ．分岐点
前記第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）nという配列を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹがいずれかのアミノ酸であり、ｎが３〜１２のいずれかの数である、前記ペプチドコンジュゲート。
【請求項２】
前記第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが同一である、請求項１に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３】
前記第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが異なっている、請求項１に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項４】
Ｘが、プロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項５】
Ｙが、修飾プロリン、リシンまたはアルギニンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項６】
前記修飾プロリンが、ヒドロキシプロリンまたはフルオロプロリンである、請求項５に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項７】
グリシンがアザグリシンとして修飾されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項８】
前記リンカーが、前記コラーゲンハイブリダイゼーションペプチドと前記分岐点との間にある、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項９】
少なくとも２つのリンカーがある、請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１０】
前記リンカーと前記分岐点が、前記第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのＣ末端にある、請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１１】
前記リンカーと前記分岐点が、前記第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのＮ末端にある、請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１２】
前記リンカーが、１つ以上のグリシン残基、アミノヘキサン酸またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１３】
前記分岐点が、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのそれぞれに結合したリンカーを介して、前記第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドを連結する分子である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１４】
前記分岐点が、前記第１のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドに結合しているリンカーと、第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドに結合しているリンカーとに結合している、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１５】
前記分岐点がリシン残基である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１６】
ｎが６である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１７】
前記二量体ペプチドが、
2018508492.tif 000009
という式を含む、請求項１に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１８】
前記二量体ペプチドが、
2018508492.tif 000010
という式を含む、請求項１に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１９】
前記二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、固体支持体に結合している、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２０】
前記固体支持体が、前記分岐点と前記固体支持体との間に存在する結合点を介して結合している、請求項１９に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２１】
前記結合点が、いずれかのアミノ酸残基である、請求項２０に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２２】
前記結合点がグリシン残基である、請求項２１に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２３】
前記固体支持体が、樹脂、ポリマービーズ、アガロースビーズ、ナノチューブ、ナノ粒子、金でコートした表面またはいずれかのポリマー表面である、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２４】
前記活性剤が、検出可能な部分または治療剤である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２５】
前記検出可能な部分が、蛍光色素、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、近赤外色素または高電子密度試薬である、請求項２４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２６】
前記活性剤が、前記コラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのうちの少なくとも１つの前記Ｎ末端または前記Ｃ末端部分に結合している、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２７】
前記スペーサー部分が、前記活性剤と前記第１または第２のコラーゲンハイブリダイゼーションとの間にある、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２８】
前記スペーサー部分がアミノヘキサン酸を含む、請求項２７に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２９】
前記治療剤が、コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷を治療することが知られている治療剤である、請求項２４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３０】
サンプル中の変性コラーゲンの検出方法であって、
ａ．請求項１〜２９のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲートを含む組成物をサンプルに接触させることであって、前記活性剤が治療剤を含むことと、
ｂ．前記ペプチドコンジュゲートの変性コラーゲンへの結合の有無を検出することであって、結合の存在によって、前記サンプル中に変性コラーゲンが存在することが示されることと、
を含む前記方法。
【請求項３１】
コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷の治療方法であって、コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷を持つ対象に、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲートを投与することを含む前記方法。
【請求項３２】
下記ａ〜ｃを含むキットであって、
ａ．活性剤、
ｂ．スペーサー部分、及び
ｃ．下記ｉ〜ｉｉｉを含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、
ｉ．第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、
ｉｉ．リンカー、及び
ｉｉｉ．分岐点、
前記第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）nという配列を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数である前記キット。
【請求項３３】
下記ａ〜ｄを含むキットであって、
ａ）活性剤、
ｂ）第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、
ｃ）リンカー、及び
ｄ）分岐部分、
前記第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）nという配列を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数である前記キット。
【請求項３４】
下記ａ〜ｃを含むペプチドコンジュゲートであって、
ａ）活性剤、
ｂ）スペーサー部分、及び
ｃ）下記ｉ〜ｉｉｉを含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、
ｉ．第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、
ｉｉ．リンカー、及び
ｉｉｉ．分岐点
前記第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのうちの少なくとも１つが、（Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３）ｎ１−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−（Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９）ｎ２という配列を含み、
この配列中、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９が、グリシン、プロリン、修飾プロリンまたはアザグリシンであり、
Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８またはＸａａ９のうちの少なくとも１つが、アザグリシンである前記ペプチドコンジュゲート。
【請求項３５】
Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8またはＸａａ9のうちの１以下が、アザグリシンである、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３６】
Ｘａａ1、Ｘａａ2及びＸａａ3が、同じアミノ酸ではない、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３７】
Ｘａａ4、Ｘａａ5及びＸａａ6が、同じアミノ酸ではない、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３８】
Ｘａａ7、Ｘａａ8及びＸａａ9が、同じアミノ酸ではない、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３９】
Ｘａａ1、Ｘａａ2及びＸａａ3のうちの少なくとも２つが、同じアミノ酸ではない、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項４０】
Ｘａａ4、Ｘａａ5及びＸａａ1のうちの少なくとも２つが、同じアミノ酸ではない、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項４１】
Ｘａａ7、Ｘａａ8及びＸａａ9のうちの少なくとも２つが、同じアミノ酸ではない、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項４２】
前記ペプチドが、
ａ．（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）3−ａｚＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）3、
ｂ．（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）3−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−ａｚＧｌｙ−（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）3または
ｃ．（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）3−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−ａｚＧｌｙ−（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）3
という配列を含む、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項４３】
ｎ1が、１〜２０の整数である、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項４４】
ｎ2が、１〜２０の整数である、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項４５】
前記活性剤が、検出可能な部分または治療剤である、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項４６】
前記検出可能な部分が、蛍光色素、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、近赤外色素または高電子密度試薬である、請求項４５に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項４７】
前記検出可能な部分が、前記ペプチドのＮ末端部分に結合している、請求項４５に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項４８】
前記スペーサー部分が、前記活性剤と前記ペプチドとの間に位置する、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項４９】
前記スペーサー部分が、アミノヘキサン酸を含む、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項５０】
ナノ粒子をさらに含む、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項５１】
前記治療剤が、コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷を治療することが知られている治療剤である、請求項４５に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項５２】
前記治療剤が、がん治療薬、関節炎治療薬または骨粗しょう症薬である、請求項５１に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項５３】
前記ペプチドの、分解されたコラーゲンに対する親和性が、従来のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドよりも高い、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項５４】
前記ペプチドが、天然コラーゲンと結合しない、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項５５】
請求項３４〜５４に記載のペプチドコンジュゲートのうちの１つ以上を含む組成物。
【請求項５６】
製薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
請求項１〜２９に記載のペプチドコンジュゲートのうちの１つ以上を含む組成物。
【請求項５８】
製薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５９】
請求項１〜２９に記載のペプチドコンジュゲートのうちの１つ以上を含むナノ粒子。
【請求項６０】
請求項３４〜５４に記載のペプチドコンジュゲートのうちの１つ以上を含むナノ粒子。
【請求項６１】
コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷を治療する治療剤のスクリーニング方法であって、
ａ．前記ペプチドコンジュゲートの変性コラーゲンへの結合の有無を検出することであって、結合の存在によって、前記サンプルに変性コラーゲンが存在することが示されることと、
ｂ．変性コラーゲンを有するサンプルに、請求項１〜２９及び３４〜５４に記載のペプチドコンジュゲートのうちのいずれか１つを含む組成物を投与することと、
ｃ．前記ペプチドコンジュゲートの変性コラーゲンへの結合の有無を検出することであって、結合の存在によって、前記サンプルに変性コラーゲンが存在することが示されることと、
を含み、
前記ペプチドコンジュゲートの投与後に検出された、前記サンプル中の損傷または変性コラーゲンの量が、前記ペプチドコンジュゲートの投与前に検出された量よりも減少したことによって、治療剤が、コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷を治療できることが示される前記方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
コラーゲンは、哺乳動物において最も多いタンパク質であり、体内で発現される全タンパク質の約３分の１を占め、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の主要成分である。コラーゲン不足は、遺伝病、関節炎、骨粗しょう症、癌性腫瘍及びさらには筋骨格組織の損傷を含む多くの病態と関係があることが示されている。発生及び正常組織の維持中に、コラーゲンリモデリングが行われるが、上記のような多くの病態において、過剰なリモデリング活性が見られる。コラーゲンリモデリングの最中には、天然コラーゲンの三重らせんが変性し、タンパク質分解酵素によって、または一本鎖コラーゲンを周囲のＥＣＭに暴露する機械的ストレスによって分解される。
【０００２】
分解されたコラーゲンを検出する組成物及び方法と、分解されたコラーゲンに活性剤を導く方法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）ｎという配列（配列番号１〜１０）を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数であるペプチドコンジュゲートを開示する。いくつかのケースでは、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドは、同一であることができる。いくつかのケースでは、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドは、異なっている。
【０００４】
活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）ｎという配列（配列番号１〜１０）を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数であり、Ｘが、プロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であることができるペプチドコンジュゲートを開示する。いくつかのケースでは、Ｙは、修飾プロリン、リシンまたはアルギニンであることができる。例えば、修飾プロリンは、ヒドロキシプロリンまたはフルオロプロリンであることができる。いくつかのケースでは、グリシンは、アザグリシンとして修飾できる。いくつかのケースでは、多数のアザグリシンが存在できる。
【０００５】
活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）ｎという配列（配列番号１〜１０）を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数であり、そのリンカーが、コラーゲンハイブリダイゼーションペプチドと分岐点との間にあることができるペプチドコンジュゲートを開示する。いくつかのケースでは、少なくとも２つのリンカーが存在することができる。いくつかのケースでは、リンカーと分岐点は、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのＣ末端にあることができる。いくつかのケースでは、リンカーと分岐点は、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのＮ末端にあることができる。
【０００６】
活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）ｎという配列（配列番号１〜１０）を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数であり、その分岐点が、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのそれぞれに結合したリンカーを介して、第１のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドと第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを連結する分子であることができるペプチドコンジュゲートを開示する。いくつかのケースでは、第１のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドに結合できるリンカーと、第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドに結合できるリンカーに、分岐点が結合している。
【０００７】
活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）ｎという配列（配列番号１〜１０）を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数であり、その二量体ペプチドが、［（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）6−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ］2−Ｌｙｓ、（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）6−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−（Ｈｙｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）6または
2018508492.tif 000003
ュゲートを開示する。いくつかのケースでは、二量体ペプチドは、［（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）9−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ］2−Ｌｙｓ、（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）9−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−（Ｈｙｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）9または
2018508492.tif 000004
【０００８】
活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）ｎという配列（配列番号１〜１０）を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数であり、その活性剤が、検出可能な部分または治療剤であるペプチドコンジュゲートを開示する。いくつかのケースでは、活性剤は、コラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのうちの少なくとも１つのＮ末端またはＣ末端部分に結合できる。いくつかのケースでは、スペーサー部分は、活性剤と、第１または第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとの間にあることができる。いくつかのケースでは、活性剤は、コラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのうちの少なくとも１つのＮ末端、Ｃ末端またはこれらの両方の部分に結合できる。いくつかのケースでは、スペーサー部分は、活性剤と、第１または第２のコラーゲンハイブリダイゼーションとの間にあることができる。
【０００９】
サンプル中の変性コラーゲンの検出方法であって、開示されているペプチドコンジュゲートのいずれか１つを含む組成物をサンプルに接触させることであって、活性剤が治療剤を含むことと、そのペプチドコンジュゲートの変性コラーゲンへの結合の有無を検出することであって、結合の存在によって、サンプルに変性コラーゲンが存在することが示されることとを含む方法を開示する。
【００１０】
コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷の治療方法であって、コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷を持つ対象に、開示されているペプチドコンジュゲートのいずれか１つを投与することを含む方法を開示する。
【００１１】
活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むキットであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）ｎという配列（配列番号１〜１０）を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数であるキットを開示する。
【００１２】
活性剤と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドと、リンカーと、分岐部分とを含むキットであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）ｎという配列（配列番号１〜１０）を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数であるキットを開示する。
【００１３】
活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのうちの少なくとも１つが、（Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3）ｎ1−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−（Ｘａａ7−Ｘａａ8−Ｘａａ9）ｎ2という配列（配列番号１２〜５０）を含み、この配列中、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9が、グリシン、プロリン、修飾プロリンまたはアザグリシンであり、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8またはＸａａ9の少なくとも１つが、アザグリシンであるペプチドコンジュゲートを開示する。いくつかのケースでは、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8またはＸａａ9の１以下が、アザグリシンである。いくつかのケースでは、Ｘａａ1、Ｘａａ2及びＸａａ3は、同じアミノ酸ではない。いくつかのケースでは、Ｘａａ4、Ｘａａ5及びＸａａ6は、同じアミノ酸ではない。いくつかのケースでは、Ｘａａ7、Ｘａａ8及びＸａａ9は、同じアミノ酸ではない。いくつかのケースでは、Ｘａａ1、Ｘａａ2及びＸａａ3の少なくとも２つは、同じアミノ酸ではない。いくつかのケースでは、Ｘａａ4、Ｘａａ5及びＸａａ6の少なくとも２つは、同じアミノ酸ではない。いくつかのケースでは、Ｘａａ7、Ｘａａ8及びＸａａ9の少なくとも２つは、同じアミノ酸ではない。
【００１４】
開示されているペプチドコンジュゲートの１つ以上を含む組成物を開示する。
【００１５】
開示されているペプチドコンジュゲートの１つ以上を含むナノ粒子を開示する。
【００１６】
開示されている方法と組成物の追加の利点は、部分的には、下記の説明に示されており、部分的には、説明から分かり、または開示されている方法と組成物を実施することによって、知ることができる。開示されている方法と組成物の利点は、添付の請求項で特に指摘されている要素と組み合わせによって実現及び達成される。上記の大まかな説明と、下記の詳細な説明はいずれも、例示と説明のためのものに過ぎず、特許請求されている本発明を限定するものではないことを理解すべきである。
【００１７】
添付の図面は、本明細書で援用されるとともに、本明細書の一部を構成し、開示されている方法と組成物のいくつかの実施形態を例示し、本明細書とともに、開示されている方法と組成物の原理を説明する役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】提案する二量体ＣＨＰの構造を示している。Ｘは、Ｎ末端の官能化を示している。官能化されない場合には、ＸはＨである。
【図２】ジ−ＣＨＰ−６（３７．５μＭ）、ＣＨＰ−９（６０μＭ）及びＣＨＰ−６（７５μＭ）のアセンブルのＣＤデータ（２２５ｎｍで２時間にわたりモニタリングしたもの）を示している。変換は、９６時間、４℃でインキュベート後に１００％と仮定し、１０℃におけるＣＤ楕円率によって、最高三量体濃度を測定した。サンプルをサンプルキュベットで８０℃まで１０分予熱してから、１０℃に一定に保持したサンプルホルダーに直接移した。サンプルの測定をすぐに始めた。解析の初期時点は、これらの条件で、ブランク（１×ＰＢＳ）が熱的に平衡化する時間を測定することによって判断した。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、コンジュゲートしたＣＦフルオロフォア（４９２ｅｘ、５３３ｅｍ）の蛍光によってモニタリングした場合の、ＣＨＰのゼラチンフィルムに対する親和性を示している。（Ａ）ワークアップなしで、３７℃で一晩インキュベート後、架橋ゼラチンに結合したＣＨＰの蛍光である。（Ｂ）予熱なしで、３７℃で一晩インキュベートしてから、１×ＰＢＳによって３７℃で（２０時間）洗浄した後、架橋ゼラチンに残ったＣＨＰの蛍光である。
【図４】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ及び図４Ｄは、ＣＨＰ９、９ｄ、６及び６ｄのアセンブルのＣＤデータを示している。いずれのペプチドでも、変換は、９６時間、４℃でインキュベート後に１００％と仮定し、１０℃におけるＣＤ楕円率によって、最高三量体濃度を測定した。サンプルをサンプルキュベットで８０℃まで１０分予熱してから、１０℃に一定に保持したサンプルホルダーに直接移した。サンプルの測定をすぐに始めた。解析の初期時点は、これらの条件で、ブランク（１×ＰＢＳ）が熱的に平衡化する時間を測定することによって判断した。いずれのペプチドでも、この時点をゼロ点として設定した。温度による、ＣＤの大きな急上昇により、初期の急上昇が解明不能になるからである。（Ａ）ＣＨＰ９（６０μＭ、３０μＭ及び１５μＭ）のアセンブルの速度を２時間にわたり、２２５ｎｍでモニタリングした。（Ｂ）ＣＨＰ９ｄ（３０μＭ、１５μＭ及び７．５μＭ、パネルＡの同じＣＨＰ鎖濃度に相当）のアセンブルの速度を２時間にわたり、２２５ｎｍでモニタリングした。（Ｃ）ＣＨＰ６（１５０μＭ及び７５μＭ）のアセンブルの速度を２時間にわたり、２２５ｎｍでモニタリングした。（Ｄ）ＣＨＰ６ｄ（７５μＭ、３７．５μＭ及び１５μＭ、パネルＣと同じＣＨＰ鎖濃度に相当する濃度と、さらに低い濃度）のアセンブルの速度を２時間にわたり、２２５ｎｍでモニタリングした。
【図５】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ及び図５Ｄは、完全にアセンブルされたＣＨＰの熱変性と、その後、初期温度まで冷却したものを示している。サンプルは、１℃／分で、その初期温度から９０℃の終温度まで加熱した。続いて、サンプルを１℃／分で、初期温度まで冷却した。（Ａ）ＣＨＰ  ＣＦ−６ｄ（１５０μＭ）の熱変性と部分的なリアセンブルを２２５ｎｍでモニタリングした。サンプルは、４℃から９０℃まで測定した。（Ｂ）ＣＨＰ  ＣＦ−６（７５μＭ、１５０μＭの鎖濃度に相当）の熱変性と部分的なリアセンブルを２２５ｎｍでモニタリングした。サンプルは、４℃から９０℃まで測定した。（Ｃ）ＣＨＰ  ＣＦ−９（１５０μＭ）の熱変性と部分的なリアセンブルを２２５ｎｍで測定した。サンプルは、１０℃から９０℃まで測定した。（Ｄ）ＣＨＰ  ＣＦ−９ｄ（７５μＭ、１５０μＭの鎖濃度に相当）の熱変性と部分的なリアセンブルを２２５ｎｍで測定した。サンプルは、１０℃から９０℃まで測定した。
【図６】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ及び図６Ｄは、コンジュゲートしたＣＦフルオロフォア（４９２ｅｘ、５３３ｅｍ）の蛍光によってモニタリングした場合の、ＣＨＰのゼラチンフィルムに対する親和性を示している。（Ａ）２５℃において１７時間後（合計１０回の洗浄）に、架橋ゼラチンフィルムに残っていたペプチドの割合である。値は、４℃で６回洗浄後（ＣＨＰ９ｒ、６ｒ及び５ｒを９５％超除去後）、ウェルに残っていた蛍光に対して標準化されている。洗浄はすべて、１×ＰＢＳ中で行った。（Ｂ）ＣＨＰ（１５μＭ）を１０％ブタゼラチンに予め混合し、８０℃まで（１０分）予熱してから、９６ウェルプレートに加えた。余分なＣＨＰ−ゼラチン混合物を除去してから、このプレミックスを４℃で２時間インキュベートした。ウェルを４℃で５回洗浄した（ＣＨＰ  ９ｒ、６ｒ及び５ｒを９５％超除去した）。続いて、ウェルを２５℃で２時間洗浄し（合計６回洗浄）、ウェルに残っているＣＨＰをモニタリングした。（Ｃ）予熱なしで、３７℃で一晩、インキュベートしてから、１×ＰＢＳによって３７℃で（２０時間）洗浄した後、架橋ゼラチンに残っていたＣＨＰの蛍光である。（Ｄ）３７℃で一晩、インキュベートしてから（８０℃で予熱、１０分）、１×ＰＢＳによって３７℃で（２０時間）洗浄した後、架橋ゼラチンに残っていたＣＨＰの蛍光である。
【図７】図７Ａ及び図７Ｂは、固定化したＣＨＰによって捕捉されたブタゼラチンのＳＰＲデータを示している。ニュートラアビジンをコートしたＮＬＣセンサーチップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に、ＣＨＰｂ−９、ｂ−９ｄ、ｂ−６及びｂ−６ｄを約４０％の最大担持量で固定化してから、ビオチンで完全にブロックした。会合期中にゼラチンをセンサー表面に塗布してから、解離期中に、ブランクで溶出した。９８１秒間、会合が行われた後、１８００秒間、解離が行われた。値を１００％ビオチンレーンに対して標準化し、各ウェルにおいて固定化したペプチドの質量に調節した。（Ａ）予熱し（８０℃、１０分）、クエンチした（０℃、３０秒）ゼラチン（２５μｇ／ｍＬ）をセンサーに３７℃の周囲温度で塗布した。（Ｂ）予熱し（８０℃、１０分）、クエンチした（０℃、３０秒）ゼラチン（２５μｇ／ｍＬ）をセンサーに１５℃の周囲温度で塗布した。
【図８】コラーゲンハイブリダイゼーションペプチドと変性コラーゲン分子との相互作用を示す概略図である。
【図９】単一状態またはフォールド状態にある単量体と二量体の概略図を示している。
【図１０】コラーゲンハイブリダイゼーションペプチドの単量体及び二量体の合成の概略である。
【図１１】図１１Ａ及び図１１Ｂは、ＣＤにおける２２５ｎｍの平均残基楕円率（ＭＲＥ）の一次導関数を示している。パネルＡは、ＧＰＯ９単量体及び二量体の融点を示している。パネルＢは、ＧＰＯ６単量体及び二量体の融点を示している。同じペプチドの単量体形状と二量体形状の間に、融点の有意な変化は見られない。
【図１２】図１２Ａ及び図１２Ｂは、２２５ｎｍでモニタリングしたＣＭＰの１０℃におけるＣＤリフォールディングを示している。ＣＭＰを８０℃まで５分加熱してからＣＤにかけ、最初の２分のモニタリングデータを除去して、熱転移を排除した。シグナルは、完全にフォールディングされたペプチドのシグナルに対して標準化した。パネルＡには、ＧＰＯ９二量体のリフォールディング速度が、単量体ＧＰＯ９と比べて約２倍上昇したことが示されている。パネルＢには、ＧＰＯ６単量体と二量体との劇的なリフォールディング速度差が示されている。
【図１３】様々な単量体及び二量体ＣＭＰの融点と初期リフォールディング速度の概要を示す表である。*初期速度は、３０μＭの鎖濃度（二量体では１５μＭのペプチド）で得たものである。
【図１４】繰り返し洗浄した後に、薄いゼラチンフィルムに残っていた初期蛍光ＣＦ−ＣＭＰの割合を示している。蛍光は、４８９ｎｍの励起波長、５３０ｎｍの発光波長、５１５ｎｍのカットオフでモニタリングした。ペプチドをフィルム上に５０μＭで撒き、一晩ゼラチンに結合させた。ランダムな三重らせん未形成のＣＭＰ（Ｇ９Ｏ９Ｐ９）がウェルから完全に除去されるまで、４℃の初期洗浄を繰り返した。続いて、２５℃で洗浄を継続した。曲線は、上から下に向かって、ＧＰＯ９単量体、ＧＰＯ９二量体、ＧＰＯ６単量体、ＧＰＯ６二量体、Ｇ９Ｐ９Ｏ９である。
【図１５】二量体ＣＨＰと単量体ＣＨＰのリフォールディングを比較したものを示している。
【図１６】二量体ＣＨＰと単量体ＣＨＰを比較した、ＳＰＲ会合及び解離曲線を示している。
【図１７】非予熱ペプチドを用いたゼラチン保持性アッセイにおける初期結合と、残った蛍光を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
開示されている方法と組成物は、特定の実施形態の下記の詳細な説明と、本明細書に含まれている実施例と、図面と、図面の上記及び下記の説明を参照することによって、さらに容易に理解することができる。
【００２０】
開示されている方法と組成物は、別段の定めのない限り、具体的な合成方法、具体的な解析技法または特定の試薬に限定されず、したがって、様々であってよいことを理解すべきである。また、本明細書で用いられている用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定することは意図されていないことを理解すべきである。
【００２１】
開示されている方法と組成物用に使用できるか、開示されている方法と組成物と併せて使用できるか、開示されている方法と組成物の調製に使用できるか、または開示されている方法と組成物の生成物である材料、組成物及び成分を開示する。これらの材料及びその他の材料は、本明細書に開示されており、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示されているときには、これらの化合物のそれぞれの様々な個別及び集合的な組み合わせと置換の具体的な言及が明示的に開示されていなくても、それぞれが具体的に想定され、本明細書に説明されていることが分かる。例えば、ペプチドコンジュゲートが開示及び論議されているとともに、そのペプチドコンジュゲートを含む多くの分子に対して行うことのできる多くの修正が論議されている場合には、具体的に反対の記載がない限り、考えられるペプチドコンジュゲート及び修正形態のあらゆる組み合わせと置換が、具体的に想定される。すなわち、分子Ａ、Ｂ及びＣという部類とともに、分子Ｄ、Ｅ及びＦという部類が開示されているとともに、Ａ−Ｄという分子の組み合わせの例が開示されている場合、それぞれが個別に挙げられていなくても、それぞれは、個別かつ集合的に想定される。したがって、この例では、Ａ、Ｂ及びＣ、Ｄ、Ｅ及びＦ、ならびにＡ−Ｄという組み合わせの例の開示から、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ及びＣ−Ｆという組み合わせのそれぞれを具体的に想定し、開示されているものとみなすべきである。同様に、これらのいずれのサブセットまたは組み合わせも、具体的に想定及び開示される。したがって、例えば、Ａ、Ｂ及びＣ、Ｄ、Ｅ及びＦ、ならびにＡ−Ｄという組み合わせの例の開示から、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ及びＣ−Ｅのサブグループを具体的に想定し、開示されているものとみなすべきである。この概念は、開示されている組成物の作製及び使用方法における工程を含め（これらに限らない）、本願のすべての態様に適用される。すなわち、行うことのできる様々な追加の工程がある場合には、開示されている方法のいずれかの具体的な実施形態または実施形態の組み合わせとともに、これらの追加の工程のそれぞれを行うことができることと、このような組み合わせのそれぞれを具体的に想定し、開示されているものとみなすべきであることが分かる。
【００２２】
Ａ．定義
記載されている特定の手法、プロトコール及び試薬は変更できるので、開示されている方法と組成物は、記載されている特定の手法、プロトコール及び試薬に限定されないことが分かる。本明細書で用いられている用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するようには意図されておらず、本発明は、添付の請求項のみによって限定されることになることも分かる。
【００２３】
本明細書及び添付の請求項で使用する場合、文脈によって明らかに別段に示されない限り、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形には、複数の言及が含まれることに留意しなければならない。すなわち、例えば、「ペプチドコンジュゲート」という場合には、複数のそのようなペプチドコンジュゲートが含まれ、「そのペプチドコンジュゲート」という場合は、「１つ以上のペプチドコンジュゲート」と、当業者に知られているその等価物に言及することになるなどである。
【００２４】
「任意の」または「任意に応じて」とは、その後に記載の事柄、環境または材料が、発生または存在してもしなくてもよいことと、その記載に、その事柄、環境または材料が発生または存在する場合と、その事柄、環境または材料が発生または存在しない場合とが含まれることを意味する。
【００２５】
「治療する」という用語は、特定の疾患、障害及び／または状態の１つ以上の症状または特徴の部分的または完全な緩和、改善、軽減、発症の遅延、進行の抑制、重症度の低下及び／または発症の低下を指す。例えば、コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷を「治療する」とは、損傷／変性コラーゲンの量の低減または排除を指すことができる。治療は、疾患、障害及び／もしくは状態の徴候を示していない対象、ならびに／または疾患、障害及び／または状態の初期の徴候しか示していない対象に対して、その疾患、障害及び／または状態に関係する病状を発症するリスクを軽減する目的で行うこともできる。
【００２６】
「対象」という用語は、投与の標的、例えば動物を指す。すなわち、開示されている方法の対象は、哺乳動物のような脊椎動物であることができる。例えば、対象は、ヒトであることができる。この用語は、特定の年齢または性別を示さない。対象は、「個体」または「患者」と同義的に用いることができる。
【００２７】
範囲は、本明細書では、「約」を付した特定の１つの値から、及び／または「約」を付した別の特定の値までのものとして表すことがある。このような範囲で表されるときには、文脈によって具体的に別段に示されない限り、その１つの特定の値から、及び／またはもう一方の特定の値までの範囲も具体的に想定し、開示されているものとみなす。同様に、値が、その前に付された「約」という語を用いることによって近似値として表されるときには、文脈によって具体的に別段に示されない限り、その特定の値によって、開示されているものとみなすべき別の具体的に想定される実施形態が形成されることが分かるであろう。文脈によって具体的に別段に示されない限り、それぞれの範囲の端点は、他方の端点と関連して、かつ他方の端点とは独立に有意であることがさらに分かるであろう。そして、文脈によって具体的に別段に示されない限り、すべての個別の値と、明示的に開示されている範囲に含まれる値の小範囲も具体的に想定し、開示されているものとみなすべきであることを理解すべきである。上記は、特定のケースにおいて、これらの実施形態の一部またはすべてが明示的に開示されているかにかかわらず、適用される。
【００２８】
別段の定めのない限り、本明細書で用いられているすべての技術的及び科学的用語は、開示されている方法と組成物が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本発明の方法と組成物の実施または試験においては、本明細書に記載されているものと類似または同等のいずれかの方法と材料を用いることができるが、特に有用な方法、装置及び材料が記載されている。本明細書で引用されている文献と、それらの文献が引用されている材料は、参照により、本明細書に具体的に援用される。本明細書中のいかなるものも、本発明が、先行発明によるそのような開示に先行する権利を与えられないことを認めるものとして解釈すべきではない。いずれの参照も、先行技術を構成することを認めるものではない。参考文献の論議には、その執筆者の主張内容が示されており、出願人は、引用されている文書の正確性と妥当性に異議を申し立てる権利を留保する。本明細書では、多くの文献を参照しているが、このような参照により、これらの文書のいずれかが、当該技術分野における技術常識の一部を形成することを認めるものではないことは明らかに分かるであろう。
【００２９】
本明細書の説明と請求項を通じて、「含む」という語と、その語の変形表現（「含んでいる」など）は、「〜が挙げられるが、これらに限らない」を意味し、例えば、他の添加剤、成分、整数または工程を排除するようには意図されていない。具体的には、１つ以上の工程または操作を含むものとして示されている方法においては、各工程が、列挙されているものを含むことが具体的に想定され（ただし、その工程が、「からなる」などの限定的な用語を含む場合は除く）、各工程から、例えば、その工程に列挙されていない他の添加剤、成分、整数または工程を排除するようには意図されていないことを意味する。
【００３０】
当業者であれば、単なる日常的な実験を用いて、本明細書に具体的に記載されている方法と組成物の具体的な実施形態の多くの均等物を認識するか、または解明できるであろう。このような均等物は、下記の請求項の範囲に含まれるように意図されている。
【００３１】
Ｂ．ペプチドコンジュゲート
活性剤と、スペーサー部分と、二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートを開示する。
【００３２】
活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）ｎという配列（配列番号１〜１０）を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数であるペプチドコンジュゲートを開示する。
【００３３】
いくつかのケースでは、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドは、同一である。いくつかのケースでは、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドは、異なっている。いくつかのケースでは、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドは、配列が異なっているか、または、同じ配列を有することができるが、リピート数（すなわちｎ）が異なるという意味で異なっていることができる。
【００３４】
活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）ｎという配列（配列番号１〜１０）を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数であり、Ｘが、プロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるペプチドコンジュゲートを開示する。
【００３５】
活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）ｎという配列（配列番号１〜１０）を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数であり、Ｙが、修飾プロリン、リシンまたはアルギニンであるペプチドコンジュゲートを開示する。いくつかのケースでは、Ｘは、プロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、Ｙは、修飾プロリン、リシンまたはアルギニンである。修飾プロリンは、ヒドロキシプロリンまたはフルオロプロリンであることができる。
【００３６】
活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）ｎという配列（配列番号１〜１０）を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数であり、グリシンをアザグリシンとして修飾できるペプチドコンジュゲートを開示する。いくつかのケースでは、１つのグリシンのみをアザグリシンとして修飾する。いくつかのケースでは、少なくとも２つのグリシンをアザグリシンとして修飾する。いくつかの態様では、ＸまたはＹがアザグリシンであることができる。
【００３７】
活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）ｎという配列（配列番号１〜１０）を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数であり、リンカーが、コラーゲンハイブリダイゼーションペプチドと分岐点との間にあるペプチドコンジュゲートを開示する。いくつかのケースでは、少なくとも２つのリンカーがある。いくつかのケースでは、リンカーと分岐点は、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのＣ末端にある。いくつかのケースでは、リンカーと分岐点は、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのＮ末端にある。いくつかのケースでは、リンカーは、アミノ酸系または化学的なものであることができるが、これらに限らない。例えば、リンカーは、１つ以上のグリシン残基、アミノヘキサン酸またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることができる。ペプチドが、Ｎ末端で結合するか、Ｃ末端で結合するかによって、リンカーは様々であることができる。例えば、Ｎ末端で結合する際には、システインが２つのリンカーを用いることができ、Ｃ末端で結合する際には、二酸などの鋳型分子に対する反応性末端リンカーを用いることができる。
【００３８】
活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）ｎという配列（配列番号１〜１０）を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数であり、分岐点が、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのそれぞれに結合したリンカーを介して、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドを連結する分子であるペプチドコンジュゲートを開示する。分岐点は、アミノ酸系または化学化合物であることができる。例えば、いくつかのケースでは、分岐点は、リシン残基であることができる。いくつかのケースでは、分岐点は、第１のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドに結合しているリンカーと、第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドに結合しているリンカーに結合できる。分岐点は、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドに結合するリンカーに結合するので、分岐点は、リンカーが位置するペプチドのいずれかの末端に存在する。すなわち、分岐点は、コラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかにあることができる。
【００３９】
活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）ｎという配列（配列番号１〜１０）を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数であり、ｎが、６または９であることができるペプチドコンジュゲートを開示する。活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）ｎという配列（配列番号１〜１０）を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数であり、二量体ペプチドを、［（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）6−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ］2−Ｌｙｓ、（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）6−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−（Ｈｙｐ−  Ｐｒｏ  −Ｇｌｙ）6または
【００４０】
2018508492.tif 000005
【００４１】
（配列番号１１）という式によって表すことができるペプチドコンジュゲートを開示する。いくつかのケースでは、二量体ペプチドは、［（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）9−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ］2−Ｌｙｓ、（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）9−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−（Ｈｙｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）9または
【００４２】
2018508492.tif 000006
【００４３】
（配列番号５１）という式を含む。
【００４４】
活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）ｎという配列（配列番号１〜１０）を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数であり、二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、固体支持体に結合できるペプチドコンジュゲートを開示する。いくつかのケースでは、固体支持体は、分岐点と固体支持体との間に存在する結合点を介して結合できる。いくつかのケースでは、この結合点は、いずれかのアミノ酸残基であることができる。いくつかのケースでは、分岐点は、固体支持体の結合点としても機能する。例えば、結合点は、グリシン残基であることができる。いくつかのケースでは、固体支持体は、樹脂、ポリマービーズ、アガロースビーズ、ナノチューブ、ナノ粒子、金でコートした表面、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、金、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキサイド、ガラス、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、官能化シラン、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン及びポリアミノ酸またはいずれかのポリマー表面であることができるが、これらに限らない。固体支持体は、薄いフィルムまたは膜、ビーズ、瓶、皿、繊維、光ファイバー、織繊維、チップ、コンパクトディスク、成形ポリマー、金属、粒子及び微粒子を含むいずれかの有用な形態をしていることができる。チップは、長方形または正方形の小さい材料片である。
【００４５】
活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）ｎという配列（配列番号１〜１０）を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数であり、活性剤が、検出可能な部分または治療剤であることができるペプチドコンジュゲートを開示する。いくつかのケースでは、活性剤は、コラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのうちの少なくとも１つのＮ末端またはＣ末端部分に結合できる。いくつかのケースでは、活性剤は、コラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのうちの１つのみに結合できる。いくつかのケースでは、活性剤は、両方のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドに結合できる。いくつかのケースでは、活性剤は、コラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのうちの１つまたは両方のＮ末端とＣ末端の両方に存在できる。
【００４６】
いくつかのケースでは、検出可能な部分は、蛍光色素、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、近赤外色素または高電子密度試薬であることができる。すなわち、検出可能な部分は、蛍光部分、放射性部分、電子部分及び間接的な部分（ビオチンまたはジゴキシゲニンなど）であることができるが、これらに限らない。間接的な部分を用いるときには、その間接的な部分と結合する二次結合剤を用いて、結合したコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドの存在を検出できる。これらの二次結合剤は、間接的な部分に結合する抗体、ハプテンまたはその他の結合パートナー（例えばアビジン）を含むことができる。
【００４７】
いくつかのケースでは、治療剤は、コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷を治療することが知られている治療剤であることができる。例えば、治療剤は、いずれかの好適な医薬またはその他の治療剤であることができるが、これらに限らず、骨形成促進剤、抗菌剤、抗炎症剤、ポリペプチド（組み換えタンパク質、サイトカインまたは抗体など）、小分子化学物質またはこれらのいずれかの組み合わせが挙げられるが、これらに限らない。いくつかのケースでは、治療剤は、がん治療薬、関節炎治療薬または骨粗しょう症薬であることができる。治療剤は、骨の成長を促進し、炎症を軽減し、コラーゲンの安定を促すのが可能であることができる。治療剤としては、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、Ｇ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、抗スクレロスチン抗体、成長ホルモン、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β、ＫＧＦ、ＦＧＦ−１０、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−βレセプター、ＣＴ、ＧＨ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、セリプロロール、アクチビン及び結合組織増殖因子を挙げることができるが、これらに限らない。いくつかのケースでは、治療剤は、Ａｖａｓｔｉｎ、Ｅｙｌｅａ、Ｈｕｍｉｒａ、ＲｅｏＰｒｏ、Ｃａｍｐａｔｈ、トシリズマブ、Ｉｌａｒｉｓ、Ｒｅｍｏｖａｂ、Ｃｉｍｚｉａ、Ｅｒｂｉｔｕｘ、Ｚｅｎａｐａｘ、Ｐｒｏｌｉａ、Ｒａｐｔｉｖａ、Ｒｅｘｏｍｕｎ、Ａｂｅｇｒｉｎ、ＨｕＺＡＦ、Ｓｉｍｐｏｎｉ、Ｉｇｏｖｏｍａｂ、ＩＭＡＢ３６２、Ｉｍｃｉｒｏｍａｂ、Ｒｅｍｉｃａｄｅ、Ｙｅｒｖｏｙ、Ｔｙｓａｂｒｉ、Ｔｈｅｒａｃｉｍ、ＯｖａＲｅｘ、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ、Ｔｈｅｒａｇｙｎ、Ｏｍｎｉｔａｒｇ、Ｃｙｒａｍｚａ、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ、Ａｎｔｏｖａ、Ａｃｔｅｍｒａ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ｅｋｔｏｍａｂ、Ｓｔｅｌａｒａ、ＨｕｍａＳＰＥＣＴ、ＨｕＭａｘ−ＥＧＦｒ、ＨｕＭａｘ−ＣＤ４など（これらに限らない）の抗体であることができる。治療剤は、腫瘍、関節炎、骨粗しょう症、ＭＭＰインヒビター、カテプシンインヒビター、インターロイキンインヒビター、ＴＲＡＩＬインヒビター、ＶＥＧＦインヒビターまたはＣＤ結合剤を標的にすることができる。
【００４８】
いくつかのケースでは、コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷は、軟骨／骨損傷、腱／靱帯損傷、角膜損傷、ならびにコラーゲンリモデリング活性が高い疾患（がん、関節炎、骨粗しょう症、線維症及び不安定プラークなど）であることができるが、これらに限らない。
【００４９】
活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）ｎという配列（配列番号１〜１０）を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数であり、スペーサー部分が、活性剤と、第１または第２のコラーゲンハイブリダイゼーションとの間にあることができるペプチドコンジュゲートを開示する。いくつかのケースでは、スペーサー部分は、アミノヘキサン酸を含むことができる。いくつかのケースでは、スペーサー部分は、１つ以上のグリシンまたはＰＥＧであることができる。
【００５０】
活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのうちの少なくとも１つが、（Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3）ｎ1−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−（Ｘａａ7−Ｘａａ8−Ｘａａ9）ｎ2という配列（配列番号１２〜５０）を含み、この配列中、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9が、グリシン、プロリン、修飾プロリンまたはアザグリシンであり、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8またはＸａａ9のうちの少なくとも１つが、アザグリシンであるペプチドコンジュゲートも開示する。いくつかのケースでは、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8またはＸａａ9のうちの１以下は、アザグリシンであることができる。いくつかのケースでは、Ｘａａ1、Ｘａａ2及びＸａａ3は、同じアミノ酸ではない。いくつかのケースでは、Ｘａａ4、Ｘａａ5及びＸａａ6は、同じアミノ酸ではない。いくつかのケースでは、Ｘａａ7、Ｘａａ8及びＸａａ9は、同じアミノ酸ではない。いくつかのケースでは、Ｘａａ1、Ｘａａ2及びＸａａ3のうちの少なくとも２つは、同じアミノ酸ではない。いくつかのケースでは、Ｘａａ4、Ｘａａ5及びＸａａ6のうちの少なくとも２つは、同じアミノ酸ではない。いくつかのケースでは、Ｘａａ7、Ｘａａ8及びＸａａ9のうちの少なくとも２つは、同じアミノ酸ではない。
【００５１】
活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのうちの少なくとも１つが、（Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3）ｎ1−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−（Ｘａａ7−Ｘａａ8−Ｘａａ9）ｎ2という配列（配列番号１２〜５０）を含み、この配列中、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9が、グリシン、プロリン、修飾プロリンまたはアザグリシンであり、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8またはＸａａ9のうちの少なくとも１つが、アザグリシンであり、上記のペプチドが、（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）3−ａｚＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）3（配列番号５２）、（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）3−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−ａｚＧｌｙ−（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）3（配列番号５３）または（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）3−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−ａｚＧｌｙ−（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）3という配列（配列番号５４）を含むペプチドコンジュゲートを開示する。
【００５２】
活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのうちの少なくとも１つが、（Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3）ｎ1−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−（Ｘａａ7−Ｘａａ8−Ｘａａ9）ｎ2（配列番号１２〜５０）という配列を含み、この配列中、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9が、グリシン、プロリン、修飾プロリンまたはアザグリシンであり、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8またはＸａａ9のうちの少なくとも１つが、アザグリシンであり、ｎ1が、１〜２０の整数であることができるペプチドコンジュゲートを開示する。いくつかのケースでは、ｎ2は、１〜２０の整数であることができる。
【００５３】
活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのうちの少なくとも１つが、（Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3）ｎ1−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−（Ｘａａ7−Ｘａａ8−Ｘａａ9）ｎ2（配列番号１２〜５０）という配列を含み、この配列中、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9が、グリシン、プロリン、修飾プロリンまたはアザグリシンであり、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8またはＸａａ9のうちの少なくとも１つが、アザグリシンであり、活性剤が、検出可能な部分または治療剤であることができるペプチドコンジュゲートを開示する。いくつかのケースでは、検出可能な部分は、蛍光色素、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、近赤外色素または高電子密度試薬であることができる。すなわち、検出可能な部分は、蛍光部分、放射性部分、電子部分及び間接的な部分（ビオチンまたはジゴキシゲニンなど）であることができるが、これらに限らない。間接的な部分を用いるときには、その間接的な部分と結合する二次結合剤を用いて、結合したコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドの存在を検出できる。これらの二次結合剤は、その間接的な部分に結合する抗体、ハプテンまたはその他の結合パートナー（例えばアビジン）を含むことができる。いくつかのケースでは、検出可能な部分は、上記のペプチドのＮ末端、Ｃ末端またはこれらの両方の部分に結合できる。いくつかのケースでは、治療剤は、コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷を治療することが知られている治療剤であることができる。例えば、治療剤は、いずれかの好適な医薬またはその他の治療剤であることができるが、これらに限らず、骨形成促進剤、抗菌剤、抗炎症剤、ポリペプチド（組み換えタンパク質、サイトカインもしくは抗体など）、小分子化学物質またはこれらのいずれかの組み合わせが挙げられるが、これらに限らない。いくつかのケースでは、治療剤は、がん治療薬、関節炎治療薬または骨粗しょう症薬であることができる。治療剤は、骨の成長を促進し、炎症を軽減し、コラーゲンの安定を促すのが可能であることができる。治療剤の例としては、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、Ｇ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、抗スクレロスチン抗体、成長ホルモン、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β、ＫＧＦ、ＦＧＦ−１０、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−βレセプター、ＣＴ、ＧＨ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、セリプロロール、アクチビン及び結合組織増殖因子を挙げることができるが、これらに限らない。いくつかのケースでは、治療剤は、Ａｖａｓｔｉｎ、Ｅｙｌｅａ、Ｈｕｍｉｒａ、ＲｅｏＰｒｏ、Ｃａｍｐａｔｈ、トシリズマブ、Ｉｌａｒｉｓ、Ｒｅｍｏｖａｂ、Ｃｉｍｚｉａ、Ｅｒｂｉｔｕｘ、Ｚｅｎａｐａｘ、Ｐｒｏｌｉａ、Ｒａｐｔｉｖａ、Ｒｅｘｏｍｕｎ、Ａｂｅｇｒｉｎ、ＨｕＺＡＦ、Ｓｉｍｐｏｎｉ、Ｉｇｏｖｏｍ��ｂ、ＩＭＡＢ３６２、Ｉｍｃｉｒｏｍａｂ、Ｒｅｍｉｃａｄｅ、Ｙｅｒｖｏｙ、Ｔｙｓａｂｒｉ、Ｔｈｅｒａｃｉｍ、ＯｖａＲｅｘ、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ、Ｔｈｅｒａｇｙｎ、Ｏｍｎｉｔａｒｇ、Ｃｙｒａｍｚａ、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ、Ａｎｔｏｖａ、Ａｃｔｅｍｒａ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ｅｋｔｏｍａｂ、Ｓｔｅｌａｒａ、ＨｕｍａＳＰＥＣＴ、ＨｕＭａｘ−ＥＧＦｒ、ＨｕＭａｘ−ＣＤ４など（これらに限らない）の抗体であることができる。治療剤は、腫瘍、関節炎、骨粗しょう症、ＭＭＰインヒビター、カテプシンインヒビター、インターロイキンインヒビター、ＴＲＡＩＬインヒビター、ＶＥＧＦインヒビターまたはＣＤ結合剤を標的にすることができる。
【００５４】
いくつかのケースでは、コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷は、軟骨／骨損傷、腱／靱帯損傷、角膜損傷、ならびにコラーゲンリモデリング活性が高い疾患（がん、関節炎、骨粗しょう症、線維症及び不安定プラークなど）であることができるが、これらに限らない。
【００５５】
活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートであって、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのうちの少なくとも１つが、（Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3）ｎ1−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−（Ｘａａ7−Ｘａａ8−Ｘａａ9）ｎ2という配列（配列番号１２〜５０）を含み、この配列中、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9が、グリシン、プロリン、修飾プロリンまたはアザグリシンであり、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8またはＸａａ9のうちの少なくとも１つが、アザグリシンであり、スペーサー部分が、活性剤と上記のペプチドとの間に位置するペプチドコンジュゲートを開示する。いくつかのケースでは、スペーサー部分は、アミノヘキサン酸を含むことができる。いくつかのケースでは、スペーサー部分は、１つ以上のグリシンまたはＰＥＧであることができる。
【００５６】
活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのうちの少なくとも１つが、（Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3）ｎ1−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−（Ｘａａ7−Ｘａａ8−Ｘａａ9）ｎ2という配列（配列番号１２〜５０）を含み、その配列中、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9が、グリシン、プロリン、修飾プロリンまたはアザグリシンであり、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8またはＸａａ9のうちの少なくとも１つが、アザグリシンであり、上記のペプチドの、分解されたコラーゲンに対する親和性が、従来のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドよりも高いペプチドコンジュゲートを開示する。いくつかのケースでは、上記のペプチドは、天然コラーゲンと結合しない。
【００５７】
Ｃ．組成物
開示されているペプチドコンジュゲートのうちの１つ以上を含む組成物を開示する。いくつかのケースでは、開示する組成物は、製薬学的に許容可能な担体をさらに含む。例えば、１つ以上のペプチドコンジュゲートを含む組成物であって、そのペプチドコンジュゲートが、活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含み、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）ｎという配列（配列番号１〜１０）を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数である組成物を開示する。１つ以上のペプチドコンジュゲートを含む組成物であって、そのペプチドコンジュゲートが、活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含み、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのうちの少なくとも１つが、（Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3）ｎ1−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−（Ｘａａ7−Ｘａａ8−Ｘａａ9）ｎ2という配列（配列番号１２〜５０）を含み、この配列中、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9が、グリシン、プロリン、修飾プロリンまたはアザグリシンであり、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8またはＸａａ9のうちの少なくとも１つが、アザグリシンである組成物も開示する。
【００５８】
例えば、本明細書に記載されている組成物は、製薬学的に許容可能な担体を含むことができる。「製薬学的に許容可能な」とは、当業者には周知なように、有効成分のいずれの分解も最小限にするとともに、対象におけるいずれの副作用も最小限にするように選択することになる材料または担体を意味する。担体の例としては、ジミリストイルホスファチジル（ＤＭＰＣ）、リン酸緩衝化生理食塩水または多胞状リポソームが挙げられる。例えば、ＰＧ：ＰＣ：コレステロール：ペプチドまたはＰＣ：ペプチドを本発明における担体として使用できる。その他の好適な製薬学的に許容可能な担体とそれらの配合物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ  ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５に記載されている。典型的には、適量の製薬学的に許容可能な塩をその配合物中で用いて、その配合物を等張化する。製薬学的に許容可能な担体のその他の例としては、生理的食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液が挙げられるが、これらに限らない。その溶液のｐＨは、約５〜約８または約７〜約７．５であることができる。さらに、担体としては、上記の組成物を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスであって、成形物、例えば、フィルム、ステント（血管形成術の際に血管に埋め込まれる）、リポソームまたは微粒子の形状をしているマトリックスのような徐放性調製物が挙げられる。例えば、投与経路と、投与する組成物の濃度によっては、特定の担体の方が好ましいこともあることは当業者には明らかであろう。最も典型的な担体は、滅菌水、生理的食塩水及び生理的ｐＨの緩衝化液のような溶液を含め、薬物をヒトに投与する際の標準的な担体であろう。
【００５９】
本発明のポリペプチド、ペプチドまたはコンジュゲートの意図されている活性が損なわなければ、医薬組成物は、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝液、保存剤なども含むことができる。医薬組成物は、（本発明の組成物に加えて）、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬などのような１つ以上の有効成分も含んでよい。
【００６０】
Ｄ．ナノ粒子
開示されているペプチドコンジュゲートのうちの１つ以上を含むナノ粒子を開示する。すなわち、１つ以上のペプチドコンジュゲートを含むナノ粒子であって、その１つ以上のペプチドコンジュゲートが、活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含み、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）ｎという配列（配列番号１〜１０）を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数であるナノ粒子を開示する。
【００６１】
１つ以上のペプチドコンジュゲートを含むナノ粒子であって、その１つ以上のペプチドコンジュゲートが、活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含み、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのうちの少なくとも１つが、（Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3）ｎ1−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−（Ｘａａ7−Ｘａａ8−Ｘａａ9）ｎ2という配列（配列番号１２〜５０）を含み、この配列中、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9が、グリシン、プロリン、修飾プロリンまたはアザグリシンであり、Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8またはＸａａ9のうちの少なくとも１つが、アザグリシンであるナノ粒子も開示する。
【００６２】
ナノ粒子とは概して、５００ｎｍ〜０．５ｎｍ未満の範囲の粒子を指す。いくつかのケースでは、ナノ粒子の直径は、５０〜５００ｎｍであることができる。いくつかのケースでは、ナノ粒子の直径は、５０〜３００ｎｍであることができる。ポリマー粒子の細胞インターナリゼーションは、そのサイズに大きく依存し、ナノ粒子のポリマー粒子は、ミクロ粒子のポリマー粒子よりもはるかに高い効率で、細胞にインターナリゼーションされる。例えば、直径１００ｎｍのナノ粒子は、直径１μＭの微粒子と比べて、約２．５倍多く、培養Ｃａｃｏ−２細胞に取り込まれることがＤｅｓａｉらによって示されている（Ｄｅｓａｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１４：１５６８−７３（１９９７））。ナノ粒子の方が、インビボにおいて、組織の深くまで拡散することもできる。
【００６３】
ポリマーは、ナノ粒子のコアを形成することができ、いずれかの生分解性または非生分解性の合成または天然ポリマーであることができる。いくつかのケースでは、ポリマーは、生分解性ポリマーである。ナノ粒子は、送達ビヒクルとして理想的な材料である。ナノ粒子は、生物的バリヤーを通る効率が良く、モノマー比またはポリマーのサイズなどの因子（例えば、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）とポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）コポリマーの比）を変えることによって、数日から数カ月の範囲の期間にわたって、内包化した遺伝的改変体を徐放させるのに使用できるからである。
【００６４】
好ましい生分解性ポリマーの例としては、ポリ（ヒドロキシ酸）（乳酸とグリコール酸のポリマー及びコポリマーなど）、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリエステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）、ならびにポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）のように、加水分解によって分解する合成ポリマーが挙げられる。
【００６５】
天然ポリマーとしては、アルギネート及びその他の多糖と、コラーゲンと、アルブミン及びその他の親水性タンパク質と、ゼイン及びその他のプロラミンと、疎水性タンパク質と、これらのコポリマー及び混合物を挙げることができる。概して、これらの材料は、インビボにおいて、酵素加水分解または水への暴露によるか、表面またはバルクの浸食によるかのいずれかで分解する。
【００６６】
いくつかのケースでは、非生分解性ポリマー、特に疎水性ポリマーを用いることができる。非生分解性ポリマーの例としては、エチレンビニルアセテートと、ポリ（メタ）アクリル酸と、無水マレイン酸と他の不飽和重合性ポリマーとのコポリマーと、ポリ（ブタジエン無水マレイン酸）と、ポリアミドと、これらのコポリマー及び混合物と、デキストランと、セルロースと、これらの誘導体が挙げられる。
【００６７】
その他の好適な生分解性及び非生分解性ポリマーとしては、ポリ酸無水物、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアルキレンオキサイド（ポリエチレングリコールなど）、ポリアルキレンテレフタレート（ポリ（エチレンテレフタレート）など）、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルアセテート）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリハロゲン化ビニル、ポリビニルピロリドン、アクリル酸エステルのポリマー、メタクリル酸エステルのポリマー、ポリシロキサン、ポリウレタン、及びこれらのコポリマー、変性セルロース、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシエチルセルロース、セルローストリアセテート、セルロースサルフェートナトリウム塩、ならびにポリアクリレート（ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）など）が挙げられるが、これらに限らない。これらの材料は、物理的混合物（ブレンド）またはコポリマーとして、単独で用いることができる。
【００６８】
ポリマーは、親水性または疎水性である生物接着性ポリマーであってよい。親水性ポリマーとしては、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）（ＮＯＶＥＯＮ（商標）製の高分子量の架橋アクリル酸系ポリマー）、ポリカルボフィル、セルロースエステル及びデキストランが挙げられる。
【００６９】
ポリマーマトリックスまたは製剤上のコーティング内に、放出速度制御ポリマーを含めることができる。使用してよい速度制御ポリマーの例は、粘度が５ｃｐｓ、５０ｃｐｓ、１００ｃｐｓもしくは４０００ｃｐｓのいずれかであるヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、または異なる粘度のブレンド、エチルセルロース、メチルメタクリレート（ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＳ１００、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＬ１００、ＥＵＤＲＡＧＩＴ  ＮＥ  ３０Ｄ（Ｒｏｈｍ  Ａｍｅｒｉｃａから供給されている）である。胃溶性ポリマー（ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｅ１００など）または腸溶性ポリマー（ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ１００−５５Ｄ、Ｌ１００及びＳ１００など）を速度制御ポリマーとブレンドして、ｐＨ依存性の放出動態を実現させてよい。アルギネート、ポリエチレンオキサイド、カルボキシメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロースのような他の親水性ポリマーを速度制御ポリマーとして用いてもよい。
【００７０】
Ｅ．スクリーニング及び検出方法
サンプル中の変性コラーゲンの検出方法であって、開示されているペプチドコンジュゲートのいずれか１つを含む組成物をサンプルに接触させることであって、その活性剤が治療剤を含むことと、ペプチドコンジュゲートの変性コラーゲンへの結合の有無を検出することであって、結合の存在によって、サンプルに変性コラーゲンが存在することが示されることとを含む方法を開示する。例えば、サンプル中の変性コラーゲンの検出方法であって、活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートを含む組成物であって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）ｎという配列（配列番号１〜１０）を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数である組成物を接触させることであって、その活性剤が治療剤を含むことと、ペプチドコンジュゲートの変性コラーゲンへの結合の有無を検出することであって、結合の存在によって、サンプルに変性コラーゲンが存在することが示されることとを含む方法を開示する。いくつかのケースでは、結合が存在しないことにより、サンプルに変性コラーゲンが存在しないことが示される。
【００７１】
いくつかのケースでは、結合の存在は、イムノアッセイ、蛍光アッセイまたは酵素ベースのアッセイを用いて判断することができる。したがって、いくつかのケースでは、検出可能な部分は、蛍光色素、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、近赤外色素または高電子密度試薬であることができるが、これらに限らない。すなわち、検出可能な部分は、蛍光部分、放射性部分、電子部分及び間接的な部分（ビオチンまたはジゴキシゲニンなど）であることができるが、これらに限らない。間接的な部分を用いるときには、その間接的な部分と結合する二次結合剤を用いて、結合したコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドの存在を検出できる。これらの二次結合剤は、その間接的な部分に結合する抗体、ハプテンまたはその他の結合パートナー（例えばアビジン）を含むことができる。
【００７２】
コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷を治療する治療剤のスクリーニング方法も開示する。いくつかのケースでは、コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷は、軟骨／骨損傷、腱／靱帯損傷、角膜損傷、ならびにコラーゲンリモデリング活性が高い疾患（がん、関節炎、骨粗しょう症、線維症及び不安定プラークなど）であることができるが、これらに限らない。このスクリーニング方法は、サンプル中の損傷または変性コラーゲンを検出することと、治療剤をサンプルに投与してから、再度、損傷または変性コラーゲンの存在を検出することとを含む。損傷または変性コラーゲンの存在量が減少していたら、その治療剤は、コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷に有効な治療である。損傷または変性コラーゲンの存在量が変わらないかまたは増加している場合には、その治療剤は、コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷に有効な治療ではない。
【００７３】
コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷を治療する治療剤のスクリーニング方法であって、ペプチドコンジュゲートの変性コラーゲンへの結合の有無を検出することであって、結合の存在によって、サンプルに変性コラーゲンが存在することが示されることと、変性コラーゲンを有するサンプルに、開示されているペプチドコンジュゲートのいずれか１つを含む組成物を投与することと、そのペプチドコンジュゲートの変性コラーゲンへの結合の有無を検出することであって、結合の存在によって、サンプルに変性コラーゲンが存在することが示されることとを含み、ペプチドコンジュゲートの投与後に検出された、サンプル中の損傷または変性コラーゲンの量が、ペプチドコンジュゲートの投与前に検出された量よりも減少したことによって、治療剤が、コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷を治療できることが示される方法を開示する。いくつかのケースでは、ペプチドコンジュゲートの変性コラーゲンへの結合の有無を検出することは、開示されているペプチドコンジュゲートのいずれか１つを含む組成物をサンプルに接触させることを含み、イムノアッセイ、蛍光アッセイまたは酵素ベースのアッセイを用いて、結合の存在を判断できる。
【００７４】
コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷を治療する治療剤のスクリーニング方法であって、ペプチドコンジュゲートの変性コラーゲンへの結合の有無を検出することであって、結合の存在によって、サンプルに変性コラーゲンが存在することが示されることと、変性コラーゲンを有するサンプルに、活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むペプチドコンジュゲートを含む組成物であって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）ｎという配列（配列番号１〜１０）を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数である組成物を投与することと、ペプチドコンジュゲートの変性コラーゲンへの結合の有無を検出することであって、結合の存在によって、サンプルに変性コラーゲンが存在することが示されることとを含み、ペプチドコンジュゲートの投与後に検出された、サンプル中の損傷または変性コラーゲンの量が、ペプチドコンジュゲートの投与前に検出された量よりも減少することによって、治療剤が、コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷を治療できることが示される方法を開示する。
【００７５】
Ｆ．治療方法
コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷の治療方法であって、コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷を持つ対象に、開示されているペプチドコンジュゲートのいずれかを投与することを含む方法を開示する。いくつかのケースでは、コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷は、軟骨／骨損傷、腱／靱帯損傷、角膜損傷、ならびにコラーゲンリモデリング活性が高い疾患（がん、関節炎、骨粗しょう症、線維症及び不安定プラークなど）であることができるが、これらに限らない。
【００７６】
コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷の治療方法であって、ペプチドコンジュゲートの変性または損傷コラーゲンへの結合の有無を検出することであって、結合の存在によって、サンプルに変性コラーゲンが存在することが示されることと、変性コラーゲンを有するサンプルに、開示されているペプチドコンジュゲートのいずれか１つを含む組成物を投与することとを含む方法を開示する。いくつかのケースでは、ペプチドコンジュゲートの変性コラーゲンへの結合の有無を検出することが、開示されているペプチドコンジュゲートのいずれか１つを含む組成物をサンプルに接触させることと、ペプチドコンジュゲートの、サンプル中の損傷または変性コラーゲンへの結合を検出することとを含む。いくつかのケースでは、結合の存在は、イムノアッセイ、蛍光アッセイまたは酵素ベースのアッセイを用いて判断できる。
【００７７】
コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷の治療方法であって、開示されているペプチドコンジュゲートのいずれか１つを含む組成物をサンプルに投与することと、ペプチドコンジュゲートの変性または損傷コラーゲンへの結合の有無を検出することであって、結合の存在によって、サンプルに変性コラーゲンが存在することが示されることと、開示されているペプチドコンジュゲートのいずれか１つを含む組成物によって、変性または損傷コラーゲンを有するサンプルを治療することとを含む方法を開示する。いくつかのケースでは、開示されているペプチドコンジュゲートのいずれか１つを含む組成物によって、変性または損傷コラーゲンを有するサンプルを治療することには、検出工程の前に投与するペプチドコンジュゲートとは異なる第２のペプチドコンジュゲートの投与が必要となる。いくつかのケースでは、１つのペプチドコンジュゲートのみの投与が必要となる。例えば、検出前に投与するペプチドコンジュゲートは、検出可能な部分と治療剤の両方を含むことができる。いくつかのケースでは、ペプチドコンジュゲートの損傷または変性コラーゲンへの結合によって、治療剤の活性化と治療効果の提供を誘発できる。いくつかのケースでは、ペプチドコンジュゲートの損傷または変性コラーゲンへの結合を検出した後に、治療剤を刺激または活性化する誘発剤をサンプルに投与することができる。
【００７８】
いくつかのケースでは、治療剤は、いずれかの好適な医薬またはその他の治療剤であることができるが、これらに限らず、骨形成促進剤、抗菌剤、抗炎症剤、ポリペプチド（組み換えタンパク質、サイトカインもしくは抗体など）、小分子化学物質またはこれらのいずれかの組み合わせが挙げられるが、これらに限らない。いくつかのケースでは、治療剤は、がん治療薬、関節炎治療薬または骨粗しょう症薬であることができる。治療剤は、骨の成長を促進し、炎症を軽減し、コラーゲンの安定を促すのが可能であることができる。治療剤としては、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、Ｇ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、抗スクレロスチン抗体、成長ホルモン、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β、ＫＧＦ、ＦＧＦ−１０、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−βレセプター、ＣＴ、ＧＨ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、セリプロロール、アクチビン及び結合組織増殖因子を挙げることができるが、これらに限らない。いくつかのケースでは、治療剤は、Ａｖａｓｔｉｎ、Ｅｙｌｅａ、Ｈｕｍｉｒａ、ＲｅｏＰｒｏ、Ｃａｍｐａｔｈ、トシリズマブ、Ｉｌａｒｉｓ、Ｒｅｍｏｖａｂ、Ｃｉｍｚｉａ、Ｅｒｂｉｔｕｘ、Ｚｅｎａｐａｘ、Ｐｒｏｌｉａ、Ｒａｐｔｉｖａ、Ｒｅｘｏｍｕｎ、Ａｂｅｇｒｉｎ、ＨｕＺＡＦ、Ｓｉｍｐｏｎｉ、Ｉｇｏｖｏｍａｂ、ＩＭＡＢ３６２、Ｉｍｃｉｒｏｍａｂ、Ｒｅｍｉｃａｄｅ、Ｙｅｒｖｏｙ、Ｔｙｓａｂｒｉ、Ｔｈｅｒａｃｉｍ、ＯｖａＲｅｘ、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ、Ｔｈｅｒａｇｙｎ、Ｏｍｎｉｔａｒｇ、Ｃｙｒａｍｚａ、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ、Ａｎｔｏｖａ、Ａｃｔｅｍｒａ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ｅｋｔｏｍａｂ、Ｓｔｅｌａｒａ、ＨｕｍａＳＰＥＣＴ、ＨｕＭａｘ−ＥＧＦｒ、ＨｕＭａｘ−ＣＤ４など（これらに限らない）の抗体であることができる。治療剤は、腫瘍、関節炎、骨粗しょう症、ＭＭＰインヒビター、カテプシンインヒビター、インターロイキンインヒビター、ＴＲＡＩＬインヒビター、ＶＥＧＦインヒビターまたはＣＤ結合剤を標的にすることができる。
【００７９】
Ｇ．投与
本明細書に記載されている方法では、ペプチドコンジュゲートまたは組成物の細胞への投与または送達は、様々な機構によることができる。
【００８０】
いくつかのケースでは、開示されているペプチドコンジュゲートと組成物は、局所治療が望ましいのか、または全身治療が望ましいか、かつ治療する領域に応じて、多くの方法で投与できる。
【００８１】
非経口投与の調製剤としては、滅菌水溶液剤または非水溶液剤、懸濁剤及び乳剤が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（オリーブ油など）及び注射用有機エステル（エチルオレエートなど）である。水性担体としては、生理的食塩水及び緩衝化媒体を含め、水、アルコール／水溶液、乳剤または懸濁剤が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲルまたは固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体及び栄養補給液、電解質補給液（リンゲルデキストロースベースのものなど）などが挙げられる。保存剤及びその他の添加剤（例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤及び不活性ガスなど）も存在してよい。
【００８２】
局所投与用製剤としては、軟膏剤、ローション剤、クリーム、ゲル剤、滴剤、座剤、噴霧剤、液剤及び散剤を挙げることができる。従来の医薬担体、水性基剤、粉末基剤または油性基剤、増粘剤などが必要であるかまたは望ましいことがある。
【００８３】
経口投与用組成物としては、散剤もしくは顆粒剤、水もしくは非水性媒体中の懸濁剤もしくは液剤、カプセル剤、サッシェ剤または錠剤が挙げられる。増粘剤、矯味矯臭剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましいこともある。本発明の組成物のいくつかは、無機酸（塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸及びリン酸など）ならびに有機酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸及びフマル酸など）との反応によって、または無機塩基（水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなど）ならびに有機塩基（モノアルキルアミン、ジアルキルアミン、トリアルキルアミン、モノアリールアミン、ジアリールアミン、トリアリールアミン及び置換エタノールアミンなど）との反応によって形成される、製薬学的に許容可能な酸または塩基付加塩として投与することができる。
【００８４】
Ｈ．キット
上記の組成物と材料、及び他の材料は、開示されている方法を行うため、または開示されている方法を行うのを補助するための有用なキットとして、いずれかの好適な組み合わせで併せてパッケージ化することができる。特定のキット内のキット成分が、開示されている方法において併せて使用するように設計及び適合されていれば有用である。例えば、二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドを含むペプチドコンジュゲートを作製するためのキットを開示する。
【００８５】
活性剤と、スペーサー部分と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、リンカー、ならびに分岐点を含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドとを含むキットであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）ｎという配列（配列番号１〜１０）を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数であるキットを開示する。
【００８６】
活性剤と、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドと、リンカーと、分岐部分とを含むキットであって、その第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）ｎという配列（配列番号１〜１０）を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数であるキットも開示する。
【００８７】
開示されているキットは、緩衝液と、試薬と、ペプチドコンジュゲートの作製方法に関する説明とも含むことができる。
【実施例】
【００８８】
Ａ．実施例１
正式にはコラーゲン模倣ペプチド（ＣＭＰ）として知られるコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド（ＣＨＰ、分子量２〜３ｋＤａ）の能力は、三重らせんハイブリダイゼーションを通じて、コラーゲン分解領域に特異的に結合することが示されている。ＣＨＰは、グリシン、プロリン及びヒドロキシプロリン（Ｇ−Ｐ−Ｏ、式中、Ｏはヒドロキシプロリンである）の繰り返しモチーフを含む短いペプチドである。ＣＨＰは、その三重らせん融解温度（Ｔｍ）よりも低い温度では、三重らせんにフォールディングする傾向が高く、そのペプチドが、一本鎖状態（三重らせん状ではない状態）の変性コラーゲンに提示されると、変性コラーゲンＩ、ＩＩ及びＩＶに結合することが示されている。
【００８９】
ＣＨＰは、個々のＣＨＰ鎖の関与を伴う三重らせんハイブリダイゼーションを通じて、コラーゲン鎖に結合する。したがって、三重らせん状のＣＨＰは、変性コラーゲンに結合できず、コラーゲンに適用する前に、個々の鎖に分離する（または融解する）必要がある。コラーゲンとの結合のために一本鎖ＣＨＰを作る最も容易な方法は、そのペプチドをそのＴｍ超に加熱することによるものである。しかしながら、高温のＣＨＰ溶液は、天然の組織を損傷することがあるので、インビボ及びエキソビボのコラーゲン結合実験への適用には適さない。疾患のイメージング及び薬物分子の送達のような実際の生体医学用途への応用のためには、加熱せずに使用できるＣＨＰが強く望まれている。このようなＣＨＰにより、熱感受性または光感受性の活性剤のＣＨＰへのコンジュゲーションも可能になる。
【００９０】
低濃度でもフォールディング動態が速い新しいＣＨＰデザインであれば、インビボにおいて高速かつ容易な薬物送達を可能にできる。一本鎖コラーゲンのフォールディング動態は、濃度依存性が大きいことから、まず、３つの鎖末端を核にしてから、三重らせんにフォールディングされるように増殖することによって、三重らせんのフォールディングが行われることが示されている。Ａｃｋｅｒｍａｎらの研究により、一本鎖コラーゲンの反応次数が２．８であることが示されており、フォールディングの律速工程が、溶液において３本の鎖が遭遇すること（これは、濃度依存性である）であることが示唆されている。低濃度では、ＣＨＰのフォールディングは非常に遅く、体内でペプチドが三重らせんを形成する能力が潜在的に制限される。このことは、治療／診断のために従来のＣＨＰをインビボで送達する際の主な制約の１つとなり得る。
【００９１】
この実施例では、加熱せずに使用できるとともに、単量体ＣＨＰと比べたときに、フォールディング動態が有意に高い二量体ＣＨＰの設計と合成が調査されている。この二量体ＣＨＰは、リシン残基によってＣ末端で結合している２つの従来のＣＨＰを有する。この二量体ＣＨＰは、低濃度でコラーゲン鎖に結合する能力が向上しているはずである。１つの二量体分子のみがコラーゲン鎖と結合すればいいからである。この結果、フォールディングが速くなり得、高い毒性を持つ薬物と結合する可能性が生じるので、インビボで同様の結合を得るには、投与量をかなり低下させる必要が生じ得る。
【００９２】
これまでに報告されているＣＨＰとの比較における、この二量体のリフォールディング速度と、ＣＨＰがリフォールディングを開始する温度が調査されている。結果から、二量体ＣＨＰの方が、速くフォールディングされるのみならず、予熱なしで、変性コラーゲン（ブタゼラチン）に高レベルで結合できることが示されている。
【００９３】
１．構造
二量体ＣＨＰの構造は、４つの別々の成分を含むことができる。第１の成分は、分岐点であり、この分岐点により、二量体分子を作製可能になる。分岐点は、二量体ＣＨＰの２つのアームの結合部を画定する。過去の試験において、分岐点は、リシン分岐で構成されており、このリシン分岐により、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）の最中に、Ｌｙｓ残基上の２つのアミンへのカップリングを通じて、二量体ＣＨＰの両方のアームを同時に成長可能になる。第２の成分は、フレキシブルリンカーである。このリンカーは、コンフォメーション柔軟性のために、二量体ＣＨＰに加えることができ、このリンカーにより、立体的に阻害されずに、三重らせんのフォールディングが可能になる。具体的なリンカーの選択は制限されないが、柔軟性が重要であることがある。過去の試験では、トリプルグリシンリンカーが用いられているが、６−アミノヘキサン酸または短いＰＥＧリンカーも用いることができる。第３の成分は、三重らせん形成領域である。この領域は、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ（式中、ＸとＹは、いずれかのアミノ酸であることができる）の繰り返しセグメントで構成することができ、このセグメントは、三重らせんを形成することが示されている。このセグメントは、３つの位置ごとにＧｌｙを有することができる。いくつかのケースでは、Ｇｌｙは、３つの位置ごとに必要であることがある。Ｘは、一般的にはＰｒｏであるが、Ｇｌｕ、Ａｓｐなどであることもできる。Ｙは、Ｐｒｏ、修飾Ｐｒｏ（Ｈｙｐ、フルオロＰｒｏ）、ＬｙｓまたはＡｒｇであることができる。いずれかの１つのＣＨＰは、様々なタイプのＧｌｙ−Ｘ−Ｙリピートで構成することができる。そして、第４の成分の官能基（または活性剤）は、このペプチドの末端（いずれか１つまたは両方の末端）に結合できる。この官能基は、イメージング部分（例えば、蛍光もしくは放射性プローブ）または治療的分子であることができ、機能性をＣＨＰに付与することができる。
【００９４】
いくつかのケースでは、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの配列には、３つの位置ごとにグリシン残基が存在することができ、存在しなければ、三重らせんが形成されない。しかしながら、いくつかのケースでは、安定した三重らせんの形成が期待されるアザグリシンのケースのように、グリシンに対する多少の修飾は許容できる。他の２つの位置（Ｘ及びＹ）は、実質的にいずれのアミノ酸にも適合できるが、いくつかのアミノ酸は、他のアミノ酸よりも、三重らせんを安定させる。最も一般的には、プロリン（Ｐ）が、Ｘの位置を占め、ヒドロキシプロリン（Ｏ）がＹの位置に入る。いくつかのケースでは、Ｇ−Ｐ−Ｏという配列が、天然のアミノ酸を用いて、最も安定した三重らせんを形成する。しかしながら、Ｙの位置のヒドロキシプロリンに対する修飾は一般的である。非天然アミノ酸の導入により、特に、４−フルオロプロリン及び４−アジドプロリンのようなプロリン誘導体により、三重らせんの安定性を向上できることが多い。Ｙの位置にあるプロリンも、安定な三重らせんを形成するが、形成される構造は、ヒドロキシプロリンから作られる構造ほどは強固ではない。これらは、ＸとＹの位置を占める一般的なアミノ酸であるが、ほぼすべてのアミノ酸を導入でき、それでも、ＸとＹの位置を占めるＰｒｏ及びＨｙｐが十分存在する限りは、三重らせんを得ることができる。１つの例外は、ＰｒｏまたはＨｙｐの導入なしに、荷電残基によって、三重らせんを安定化できることである。このケースでは、ＸとＹの位置は、反対の電荷に帯電される必要がある。Ｘは、ＡｓｐまたはＧｌｕである必要があり、Ｙは、ＬｙｓまたはＡｒｇである必要がある。
【００９５】
２．ペプチドの合成
この調査では、別段の定めのない限り、ペプチドは、標準的な固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を用いて、ＴｅｎｔａＧｅｌ−ＲＡＭという樹脂（充填量１ｍｇ当たり０．１８または０．２ｍｍｏｌ）上で、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸とＨＢＴＵ化学物質を用いて（アミノ酸４当量、ＨＢＴＵ４当量、Ｃｌ−ＨｏＢＴ４当量、ＤＩＥＡ８当量、１時間）合成した。二量体ＣＨＰは、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを分岐点として用いて合成し、両方の遊離アミンから鎖を同時に成長させることによって、二量体ＣＨＰを作製した。
【００９６】
簡潔に述べると、樹脂をＤＭＦ中で４５分膨潤させ、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンで脱保護し（２回、１５分）、ＤＭＦで４回洗浄して、アミノ酸カップリング用の樹脂を調製した。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（４当量）をＨＢＴＵ（４当量）と混合することによって、アミノ酸を樹脂上にカップリングして、Ｃｌ−ＨＯＢｔ（４当量）をＤＭＦに溶解し、樹脂に加えた。続いて、ＤＩＥＡ（６当量）を加え、その反応物を１時間混合した。カップリング後、余分な試薬をＤＭＦで除去してから、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンで、Ｆｍｏｃ保護基を除去し（２回、１５分）、ＤＭＦで４回洗浄した。このカップリング手順を各アミノ酸について繰り返した。
【００９７】
少なくとも２４時間、ＰｙＡＯＰによって活性化されるＣＦを６モル当量用いて、蛍光標識をコンジュゲートした。２時間、ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２０（９５：２．５：２．５）という標準的な切断カクテルを用いて、完全長ペプチドを固体支持体から除去し、セミ分取カラムＶｙｄａｃ  Ｃ１８で、逆相ＨＰＬＣによって、水（０．１％ＴＦＡ）とアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）、１％／分、５ｍｌ／分の流速の線状勾配を用いて、切断したペプチドを精製した。マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）によって、精製したペプチドを解析した。
【００９８】
３．結果及び考察
この二量体ＣＨＰコンストラクトは、図２に示されているように、同等の単量体ＣＨＰよりもかなり速く三重らせんにフォールディングした。比較的高い濃度でも、ジ−ＣＨＰ−６は、ＣＨＰ−６よりも速いリフォールディング速度を示し、ＣＨＰ−６は、１０℃で２時間インキュベート後も、その半最大リフォールディングに達しなかった。しかしながら、同じ鎖濃度において、ジ−ＣＨＰ−６は、２時間で、ほぼ完全にリフォールディングした。この差は、ＣＨＰ−６よりも速くリフォールディングしたＣＨＰ−９と比較した場合も明らかであった。
【００９９】
【表１】
2018508492.tif 000007
【０１００】
二量体ＣＨＰが、架橋ゼラチンフィルムにおいてコラーゲン鎖に結合する能力を評価した。ＣＨＰ溶液（ＰＢＳ中に２０μＭ）を架橋ゼラチンフィルムに直接加えた。加熱実験では、ＣＨＰは、８０℃まで１０分予熱してから加えた。ペプチドは、ゲルと３７℃で一晩、十分に平衡させてから、３７℃で繰り返し洗浄し（４回、ＰＢＳ）、特異的に結合しなかったすべてのペプチドを十分に除去し、体温における結合レベルを割り出した。保持性を測定するために、ペプチドを上記のように結合させてから、３７℃においてＰＢＳで洗浄し（５×１時間、１×１２時間）、ゼラチンフィルム内での保持性を測定した。図３に示されているように、有意な量の二量体ＣＨＰが、加熱なしで、架橋ゼラチンに結合できた。この結合レベルは、同等の長さのＣＨＰで過去に報告されたレベルよりもほぼ４倍高い。加えて、２０時間後では、二量体ＣＨＰの方が、単量体ＣＨＰと比べて、ゼラチンに残ったレベルが高かった。これにより、生理的条件でも、二量体ＣＨＰが、ゼラチン基材への結合を長期間維持する能力が示され、インビボでの利用の可能性が示されている。
【０１０１】
【表２】
2018508492.tif 000008
【０１０２】
単量体ＣＨＰと二量体ＣＨＰの間には、リフォールディング速度に大きな違いがあり、これは、ＧＰＯリピートが少ないほど特に明らかであった（図４）。比較的高い濃度でも、ＧＰＯ−６単量体（６）の方が、ＧＰＯ−６二量体（６ｄ）よりもリフォールディング速度が遅く、１０℃で２時間インキュベート後も、その半最大リフォールディングに達しなかった。しかしながら、同じ鎖濃度で、二量体ＧＰＯ６（６ｄ）は、２時間でほぼ完全にリフォールディングした。この違いは、ＧＰＯ９単量体（９）とＧＰＯ９二量体（９ｄ）を比較した時でも明らかであったが、ＧＰＯ９単量体は、ＧＰＯ６単量体よりもかなり速くリフォールディングする。
【０１０３】
二量体ＣＨＰは、徐冷中に、その単量体対応物と比べて、かなり容易に三重らせんを形成することもできる。熱変性して、９０℃まで加熱した後、ペプチドに対して、９０〜４℃（１℃／分）の温度低下勾配をかけ、その間、２２５ｎｍにおける楕円率をモニタリングした。これらの冷却勾配中、二量体ＣＨＰは、繰り返し単位の数が同じ単量体よりも、高い温度でリフォールディングを始める。ＧＰＯ６単量体では、報告されているＴｍを約１０℃下回るまで、ＧＰＯ９単量体では、報告されているＴｍを約１５℃下回るまでは、有意なリフォールディングは観察されなかった。しかしながら、試験したすべての二量体ＣＨＰでは、すぐに有意なリフォールディングが観察され、図５に示されているように、冷却勾配の終わりまでには、加熱前の楕円率にほぼ完全に戻った。
【０１０４】
ゼラチンフィルムへの結合：ペプチド溶液（ＰＢＳ中に２０μＭ）を８０℃まで１０分予熱してから、架橋ゼラチンフィルムに直接加えた。ペプチドを４℃で一晩、ゲルと十分に平衡させてから、４°で繰り返し洗浄し（４回、３０分）、特異的に結合しなかったすべてのペプチドを十分に除去した。続いて、ＰＢＳ（５×１時間、１×１２時間）でゼラチンウェルを室温で洗浄し、ゼラチンフィルム内での保持性を測定した。各ケースにおいて、二量体ＣＨＰの保持性は、同等の単量体の保持性よりも高かった。単量体ＧＰＯ５（ＣＦ−５）及びＧＰＯ６（ＣＦ−６）は、ゼラチンフィルムからほぼ完全に洗い出されたことから、この温度においては、これらの化合物のゼラチンに対する親和性が高くないことが示された。これよりもかなり低い融点でも、ＧＰＯ５二量体（ＣＦ−５ｄ）のゼラチンフィルムに対する親和性は、ＣＦ−６よりもかなり高かった。同様に、ＧＰＯ６二量体（ＣＦ−６ｄ）の親和性は、ＧＰＯ９単量体（ＣＦ−９）とＧＰＯ９二量体（ＣＦ−９ｄ）の親和性と同程度であり、図６Ａに示されているように、これらのいずれも、ゼラチンフィルムにおける保持性は同程度であった。これらのペプチドが、三重らせんを形成後または結合前に、ゼラチン内に物理的に単に捕捉される可能性を排除するために、ＣＨＰとゼラチンのプレミックスを作製し、拡散律速結合を排除してから、同様の形でウェルを洗浄することによって、結合親和性を確認した。図６Ｂに示されているように、試験したすべてのペプチドのゼラチンフィルムにおける保持性は、図６Ａと比べるとわずかに高かったことから、予想したとおりに、ＣＨＰが、自己集合よりも、高い割合のゼラチンに結合し得ることが示された。
【０１０５】
ＣＨＰをインビボで用いることの主な制約は、注射前に、三重らせんを完全に解く必要があることである。二量体ＣＨＰは、ゼラチンに対する親和性が向上しているとともに、融点がかなり低くなっているので、二量体ＣＨＰは、事前の予熱なしに、ゼラチンフィルムに対して有意な結合を示せることが考えられる。図６Ｃ、６Ｄに示されているように、前の結合アッセイと同様の形で、いずれかの予熱を行うかまたは行わずに、ペプチドが生理的温度でゼラチンフィルムに結合する能力を判断した。この試験では、ペプチド溶液を室温まで昇温させてから、調製済みの架橋ゼラチンフィルムに加えた（５０μＬ、２０μＭ）。続いて、溶液を３７℃で一晩インキュベートしてから、溶液を除去した。ＰＢＳ（２０時間）でウェルを３７℃で洗浄して、結合を判断した。予熱サンプルを調製し、同じ方法でインキュベートしたが、予熱（８０℃、１０分）してから、架橋ゼラチンウェルに加えた。
【０１０６】
試験した３つのすべての二量体ＣＨＰは、ゼラチンウェルに有意に結合でき、ＧＰＯ９及びＧＰＯ６二量体が、予熱なしで、ＧＰＯ９単量体よりも有意に結合する能力を示した。これは、ＧＰＯ６二量体の比較的低い融点に起因する可能性が高く、このＧＰＯ６二量体は、生理的温度で部分的にほどけて、ゼラチンに結合できるようになる。あるいは、二量体状態で三重らせんを作ることによって、開いたＣＨＰ鎖のままにすることができ、このＣＨＰ鎖は、これらの状況でもゼラチンに結合でき、ＧＰＯ９二量体が予熱なしで結合する能力の真相である可能性がある。予熱なしで有意に結合することが明らかになった単量体はなかった。ＧＰＯ５及びＧＰＯ６単量体は、ゼラチンに対する親和性が、生理的温度においては、有効に結合するほど十分には強くなかったが、これらのＣＨＰを解離するには、３７℃で十分であるので、このケースにおいて結合しているいずれのペプチドも、迅速に溶出される。加えて、３７℃でのインキュベートは、ＧＰＯ９の三重らせんを解くには十分ではないので、ＧＰＯ９単量体は、予熱なしでは、有意には結合できない。
【０１０７】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）：すべての実験のＳＰＲ曲線では、会合期の間、ゼラチンがペプチドに迅速に会合し、解離期の間、ゼラチンが解離しなかったか、ほとんど解離しなかったことが示されている（図７）。１５℃では、解離期の間、シグナル強度は実質的に低下していないことから、ゼラチンが、ペプチドに強固に結合しており、除去されるペプチドがないことが示されている。しかしながら、３７℃では、シグナルのわずかな低下が観察されることから、解離期の間、結合したペプチドのごく一部が溶出されることが示されている。この作用は、試験したすべてのペプチドで観察された。しかしながら、会合期では、大きな違いが観察された。３７℃では、表面上のすべての試験ペプチドに吸着されたゼラチンの量が、１５℃と比べてかなり多かった。加えて、３７℃では、二量体ＧＰＯ６及びＧＰＯ９の両方とも、ゼラチンと結合する能力が、単量体対応物における当量数の鎖の能力よりも高かった。驚くべきことに、単量体ＧＰＯ６及びＧＰＯ９は、ゼラチンと結合する能力があまり異なっていなかったことから、結合速度が、ＣＨＰの結合能力よりも、三重らせんを形成するゼラチンに依存することが示された。１５℃では、ゼラチンは、かなり遅い速度で、表面に吸着された。三重らせんは、低温でしか形成されないので、この結果は、予想外であった。温度が低いほど、三重らせんの形成が促されると予測されたからである。しかしながら、この吸着速度の低下は、この低い温度における表面近くでの拡散速度の低下またはより凝集したゼラチン構造に起因し得る。加えて、１５℃では、ＧＰＯ９二量体は、ゼラチンと結合する高い能力を保持していたが、ＧＰＯ６二量体は、単量体ＣＨＰに匹敵する速度で、ゼラチンと結合できるに過ぎなかった。
【０１０８】
４．考察
二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドは、単量体ＣＨＰよりもはるかに容易にリフォールディングすることが分かった（これは、核形成速度の上昇に起因し得る）。二量体ＣＨＰでは、単量体形態と比べて、結合親和性の向上が見られる（ＧＰＯが高いほど、安定性が高くなる）。現在用いられているＣＨＰよりも、予熱なしでの結合が多い。二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドは、生理的温度において、単量体よりも多くのゼラチンに結合することもできた。
【０１０９】
Ｂ．実施例２
コラーゲンは、細胞外マトリックスの不可欠な成分であり、毎日、高比率のコラーゲンが分解されて、体内でターンオーバーする。しかしながら、過剰なコラーゲンリモデリングによって特徴付けられる多くの病理学的状態が存在する。コラーゲンハイブリダイゼーションペプチド（ＣＨＰ）は、インビトロ及びインビボで変性コラーゲン鎖と選択的にハイブリダイゼーションできるＧＸＹリピートで構成される小さいペプチドであり、従来のアプローチを用いるのが困難であることが多いものである。ＣＨＰの結合は、変性コラーゲン鎖との三重らせんハイブリダイゼーションによって主に駆動されることが分かっている。したがって、ＣＨＰは、体内において、変性コラーゲンの領域に、部分ナノ粒子、イメージング手段またはその他の治療剤を導くものとして使用できる。しかしながら、既存のＣＨＰは、その結合親和性と、遅いフォールディング動態によって制限されており、その結果、高比率のペプチドが、対象領域に結合できる前に、身体によって除去される。
【０１１０】
ＣＨＰの結合動態を向上させる潜在的な方法は、その局所濃度を向上させることである。鋳型ＣＨＰを作製する多くの研究が行われてきたが、それらの鋳型ＣＨＰは、すべて３本の鎖を含むことを必要とするので、変性コラーゲンに結合できない。２本鎖ＣＨＰの作製により、局所鎖濃度が向上する一方、さらには、ペプチドが変性コラーゲンに結合可能となる。加えて、その２本鎖が１つの複合体を形成する必要がないことにより、またはらせん当たりのヒドロキシプロリン含有量の向上により、結合親和性が多価性により向上し得る。
【０１１１】
１．方法
ペプチドの合成：この調査で使用したペプチドは、標準的なＦｍｏｃ手順による固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって調製した。それらのペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって確認した。二重にＦｍｏｃで保護したリシンによって、二量体ＣＨＰ分岐をアセンブルし、その結果、Ｎ末端の伸長中に２つの同一の鎖が得られ、このことは、二量体ＣＨＰの作製に好適である。
【０１１２】
円偏光二色性：すべてのペプチドについて、２２５ｎｍで円偏光二色性（ＣＤ）を測定した。１０〜８０℃で、０．５℃／分の加熱速度で、１℃ごと中断しながら、ペプチドの融解曲線を得た。ペプチド溶液を４℃で少なくとも１２時間インキュベートした後に、リフォールディング実験を行った。濃度は、鎖濃度に対して標準化した。
【０１１３】
蛍光結合：標準的なＳＰＰＳによって、蛍光カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）分子を各ペプチドのＮ末端にコンジュゲートすることによって、ＣＨＰのゼラチンへの結合をモニタリングした。蛍光ペプチドの溶液を８０℃まで５分加熱してから、９６ウェルプレートにおいて、５０μＬを、事前に調製した薄いＥＤＣ架橋ゼラチンフィルムに注入した。ペプチドを一晩、４℃でインキュベートしてから、４℃の１×ＰＢＳ後に、２５℃の１×ＰＢＳというラウンドを繰り返して、洗浄した。
【０１１４】
ＣＭＰの二量体形状は、６個の繰り返し単位と９個の繰り返し単位のいずれも、融点が、そのそれぞれの単量体形状と変わらなかったが、溶液におけるリフォールディング速度が大幅に向上した。この違いは、小さいＣＭＰほど明確であった。
【０１１５】
２．結論
二量体ＧＰＯ６では、その単量体形態と比べて、結合親和性が明らかに向上した。ＣＨＰのゼラチンへの結合親和性は、間接的に測定される。洗浄工程が、主に拡散によって仲介されるからである。結合親和性とフォールディング速度の向上により、単量体ＣＨＰの場合のように、融解または脱保護のようないずれの事前の前処理なしに、二量体ＣＨＰをインビボで直接使用可能になる。これらの二量体ＣＨＰは、ペプチドまたはその他の分子によって官能化しやすく、単量体ＣＨＰよりも強力な、変性コラーゲンに対する標的化手段として使用できる。
【０１１６】
Ｃ．実施例３
ゼラチンのような変性コラーゲン物質に対する結合速度と親和性を向上させるコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド（ＣＨＰ）を開発した。コラーゲンは、細胞外マトリックスの不可欠な成分であり、毎日、高比率のコラーゲンが分解されて、体内でターンオーバーする。しかしながら、過剰なコラーゲンリモデリングによって特徴付けられる多くの病理学的状態が存在する。コラーゲンハイブリダイゼーションペプチド（ＣＨＰ）は、インビトロ及びインビボで変性コラーゲン鎖と特異的にハイブリダイゼーションできるＧＸＹリピートで構成される小さいペプチドである。標準的な方法（抗体、ピクロシリウスレッド）を用いて、天然コラーゲンと変性コラーゲンを区別するのは、非常に困難である。ＣＨＰの結合は、変性コラーゲン鎖のみで生じる三重らせんハイブリダイゼーションによって駆動されることが分かっている。したがって、ＣＨＰは、体内の変性コラーゲンの領域に、ナノ粒子、イメージング手段またはその他の治療剤を導く能力を有する。しかしながら、既存のＣＨＰは、その結合親和性と、遅いフォールディング動態によって制限されており、その結果、高比率のペプチドが、対象領域に結合できる前に、身体によって除去される。
【０１１７】
２つのアームを持つ（二量体の）ＣＨＰであって、三重らせん形成鎖の局所濃度を向上させる役割を果たす一方で、そのＣＨＰがゼラチンに容易に結合できるようになっているＣＨＰを開発した。この局所濃度は、他の三重らせん形成鎖へのフォールディング速度を向上させる。この二量体ＣＨＰは、特に短いＣＨＰ二量体ほど、ゼラチンに対する結合親和性を向上させることも示されている。これらの二量体ＣＨＰは、現在使われているＣＨＰと同じ方法で結合する能力を持つが、親和性を損なうことなく、有意に速い結合速度で結合できる。これらの特徴により、さらに高い比率の標的分子が、所望のコラーゲン基材に良好に結合できるようにできる。
【０１１８】
この新たな化合物は、［（ＧＰＯ）６Ｇ３）２ＫＧというアミノ酸配列を有する二量体ＣＨＰである。このＣＨＰは、２つの同一なＧ−Ｐ−Ｏ（Ｏはヒドロキシプロリンである）鎖が、１つのリシン分岐点を通じて連結しているもので構成されており、両末端で修飾を行って、様々なイメージングまたは治療手段を含めることができる。二量体ＣＨＰは、Ｎ末端とＣ末端の両方の修飾を含む標準的な固相ペプチド合成方法を用いて、樹脂上で完全に合成できる。
【０１１９】
２本の鎖を１つの分子に含めても、融点には有意な影響は及ばず、二量体ＣＨＰの融点（３８℃）は、Ｇ−Ｐ−Ｏリピートの数が同じ単量体ＣＨＰ（ＧＰＯ６、３７℃）とほぼ同一である。この融点は、現在使われているＣＨＰ（ＧＰＯ９）（６８℃で融解転移する）よりもかなり低い。加えて、二量体ＣＨＰは、低い融解温度にもかかわらず、既存の単量体ＣＨＰよりもリフォールディング速度がかなり速い。ＣＤリフォールディング実験では、３７．５μＭの二量体ＣＨＰは、１０分で半分リフォールディングしたが、６０μＭのＧＰＯ９は、２時間後に４０％フォールディングし、７５μＭのＧＰＯ６は、２時間後に２８％フォールディングした（図１５）。そして、ゼラチン保持性の調査では、二量体ＣＨＰは、ゼラチンフィルムに対する親和性が、既存の単量体ＣＨＰと同程度であった。
【０１２０】
二量体ＣＨＰは、既存の単量体ＣＨＰよりも速いフォールディング動態で、変性コラーゲンと有効にハイブリダイゼーションできる。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、ＣＨＰが変性コラーゲンを溶液から捕捉する能力を測定した。ＳＰＲ表面に固定化したビオチン化二量体ＣＨＰは、同じ条件において、同等のＣＨＰと比べて、約２倍の量のゼラチンを捕捉及び保持できた（図１６）。加えて、二量体ＣＨＰの２５℃におけるＫｄは０．６２１μＭであったが、これは、ＥＬＩＳＡ様アッセイにおけるビオチン化ＧＰＯ９（Ｋｄ＝０．５７３μＭ、２５℃）とほぼ同一である。
【０１２１】
架橋ゼラチンフィルムを用いた保持性調査では、蛍光標識二量体ＣＨＰは、現在使われているＣＨＰよりもわずかに、ゼラチン基材に結合したままであることが示された（二量体ＣＨＰの保持性が６６％に対して、ＣＨＰは５８％）。加えて、蛍光標識二量体ＣＨＰのゼラチン基材に対する初期結合性は３５０％高く、２０時間、３７℃で洗浄した後に残ったペプチドは５０％多かった（図１７）。これらのデータによって、二量体ＣＨＰが、速い動態、高い親和性で、顕著なワークアップなしに、変性コラーゲンに結合できるという最初の所見が確認されている。
【０１２２】
二量体ＣＨＰの利点は、使用前の準備がかなり大幅に少なくなった状態で、インビボで使用できる点である。既存のＣＨＰでは、身体への結合のためにＣＨＰをプライムするためのいくつかの調整工程（三重らせんの形成を無効にする融解、立体的制限剤のＵＶによる脱ケージ化など）のうちの少なくとも１つを行う必要がある。二量体ＣＨＰの迅速化されたフォールディング動態と、ゼラチンに対する同程度の結合親和性と、低下したＴｍにより、このような準備工程は不要である。二量体ＣＨＰの融点は、体温に非常に近いので、注射の最中、その物質に存在するいずれのセルフフォールディングも無効にするには、身体の周囲温度で十分であり、二量体ＣＨＰが、体内のコラーゲン変性部位に容易に結合できるようになる。これに対し、同程度の親和性を持つ既存のＣＨＰは、体温よりもかなり高い温度で融解する三重らせんを形成しやすいので、そのＣＨＰが体内のコラーゲンと結合できるようにするには、適用前に、加熱工程が必要となる。
【０１２３】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年１月３０日に提出した米国特許仮出願第６２／１２５，７５６号の優先権を主張するものであり、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【０１２４】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、ＮＩＡＭＳ／ＮＩＨによって付与されたＲ０１−ＡＲ０６０４８４及びＲ２１−ＡＲ０６５１２４、ならびにＤＯＤによって付与されたＷ８１ＸＷＨ−１２−１−０５５５に基づき、米国政府の支援によりなされたものである。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０１２５】
配列表の参照
２０１５年１月２９日に作成したとともに、サイズが７１，１５３バイトである「２１１０１＿０３２５Ｐ１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称のテキストファイルとして、２０１５年１月２９日に提出した配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）（５）に従って、参照により本明細書に援用される。
【０１２６】
参照文献
Ｙｕ，Ｓ．Ｍ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１３，ｖｏｌ．１７（６）：９６８−９７５
Ｂｏｕｄｋｏ，Ｓ．；Ｆｒａｎｋ，Ｓ．；ｅｔ．ａｌ．Ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｒｉｐｌｅ  ｈｅｌｉｘ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｄ  ｔｒｉｍｅｒｉｚｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｉｒｄ  ｔｏ  ｆｉｒｓｔ  ｏｒｄｅｒ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００２，ｖｏｌ．３１７：４５９−４７０
Ｘｕ，Ｙ．；Ｂｈａｔｅ，Ｍ．；ａｎｄ  Ｂｒｏｄｓｋｙ，Ｂ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  Ｓｔｅｐ  ａｎｄ  Ｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｒｉｐｌｅ−Ｈｅｌｉｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，ｖｏｌ．４１：８１４３−８１５１
Ａｃｋｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．；ａｎｄ  Ｂｒｏｄｓｋｙ，Ｂ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９，ｖｏｌ．２７４（１２）：７６６８−７６７３
【図１】
2018508492.tif 000011
【図２】
2018508492.tif 000012
【図３】
2018508492.tif 000013
【図４Ａ−Ｂ】
2018508492.tif 000014
【図４Ｃ−Ｄ】
2018508492.tif 000015
【図５Ａ−Ｂ】
2018508492.tif 000016
【図５Ｃ−Ｄ】
2018508492.tif 000017
【図６Ａ−Ｂ】
2018508492.tif 000018
【図６Ｃ−Ｄ】
2018508492.tif 000019
【図７】
2018508492.tif 000020
【図８】
2018508492.tif 000021
【図９】
2018508492.tif 000022
【図１０】
2018508492.tif 000023
【図１１】
2018508492.tif 000024
【図１２】
2018508492.tif 000025
【図１３】
2018508492.tif 000026
【図１４】
2018508492.tif 000027
【図１５】
2018508492.tif 000028
【図１６】
2018508492.tif 000029
【図１７】
2018508492.tif 000030
【配列表】
2018508492000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年10月2日(2017.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記ａ〜ｃを含むペプチドコンジュゲートであって、
ａ．活性剤、
ｂ．スペーサー部分、及び
ｃ．下記ｉ〜ｉｉｉを含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、
ｉ．第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、
ｉｉ．リンカー、及び
ｉｉｉ．分岐点
前記第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）nという配列を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹがいずれかのアミノ酸であり、ｎが３〜１２のいずれかの数である、前記ペプチドコンジュゲート。
【請求項２】
前記第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが同一である、請求項１に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３】
前記第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが異なっている、請求項１に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項４】
Ｘが、プロリン、修飾プロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項５】
Ｙが、修飾プロリン、リシンまたはアルギニンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項６】
前記修飾プロリンが、ヒドロキシプロリンまたはフルオロプロリンである、請求項５に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項７】
グリシンがアザグリシンとして修飾されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項８】
前記リンカーが、前記コラーゲンハイブリダイゼーションペプチドと前記分岐点との間にある、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項９】
少なくとも２つのリンカーがある、請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１０】
前記リンカーと前記分岐点が、前記第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのＣ末端にある、請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１１】
前記リンカーと前記分岐点が、前記第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのＮ末端にある、請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１２】
前記リンカーが、１つ以上のグリシン残基、アミノヘキサン酸またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１３】
前記分岐点が、第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのそれぞれに結合したリンカーを介して、前記第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドを連結する分子である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１４】
前記分岐点が、前記第１のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドに結合しているリンカーと、第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドに結合しているリンカーとに結合している、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１５】
前記分岐点がリシン残基である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１６】
ｎが６である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１７】
前記二量体ペプチドが、
【化１】
2018508492.tif 000031
という式を含む、請求項１に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１８】
前記二量体ペプチドが、
【化２】
2018508492.tif 000032
という式を含む、請求項１に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１９】
前記二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、固体支持体に結合している、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２０】
前記固体支持体が、前記分岐点と前記固体支持体との間に存在する結合点を介して結合している、請求項１９に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２１】
前記結合点が、いずれかのアミノ酸残基である、請求項２０に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２２】
前記結合点がグリシン残基である、請求項２１に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２３】
前記固体支持体が、樹脂、ポリマービーズ、アガロースビーズ、ナノチューブ、ナノ粒子、金でコートした表面またはいずれかのポリマー表面である、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２４】
前記活性剤が、検出可能な部分または治療剤である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２５】
前記検出可能な部分が、蛍光色素、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、近赤外色素または高電子密度試薬である、請求項２４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２６】
前記活性剤が、前記コラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのうちの少なくとも１つの前記Ｎ末端または前記Ｃ末端部分に結合している、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２７】
前記スペーサー部分が、前記活性剤と前記第１または第２のコラーゲンハイブリダイゼーションとの間にある、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２８】
前記スペーサー部分がアミノヘキサン酸を含む、請求項２７に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２９】
前記治療剤が、コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷を治療することが知られている治療剤である、請求項２４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３０】
サンプル中の変性コラーゲンの検出方法であって、
ａ．請求項１〜２９のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲートを含む組成物をサンプルに接触させることであって、前記活性剤が治療剤を含むことと、
ｂ．前記ペプチドコンジュゲートの変性コラーゲンへの結合の有無を検出することであって、結合の存在によって、前記サンプル中に変性コラーゲンが存在することが示されることと、
を含む前記方法。
【請求項３１】
コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷の治療方法であって、コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷を持つ対象に、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲートを投与することを含む前記方法。
【請求項３２】
下記ａ〜ｃを含むキットであって、
ａ．活性剤、
ｂ．スペーサー部分、及び
ｃ．下記ｉ〜ｉｉｉを含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、
ｉ．第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、
ｉｉ．リンカー、及び
ｉｉｉ．分岐点、
前記第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）nという配列を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数である前記キット。
【請求項３３】
下記ａ〜ｄを含むキットであって、
ａ）活性剤、
ｂ）第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、
ｃ）リンカー、及び
ｄ）分岐部分、
前記第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドが、少なくとも（ＧＸＹ）nという配列を含み、この配列中、Ｇがグリシンであり、ＸとＹが、いずれかのアミノ酸であり、ｎが、３〜１２のいずれかの数である前記キット。
【請求項３４】
下記ａ〜ｃを含むペプチドコンジュゲートであって、
ａ）活性剤、
ｂ）スペーサー部分、及び
ｃ）下記ｉ〜ｉｉｉを含む二量体のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、
ｉ．第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチド、
ｉｉ．リンカー、及び
ｉｉｉ．分岐点
前記第１及び第２のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドのうちの少なくとも１つが、（Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３）ｎ１−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−（Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９）ｎ２という配列を含み、
この配列中、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９が、グリシン、プロリン、修飾プロリンまたはアザグリシンであり、
Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８またはＸａａ９のうちの少なくとも１つが、アザグリシンである前記ペプチドコンジュゲート。
【請求項３５】
Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8またはＸａａ9のうちの１以下が、アザグリシンである、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３６】
Ｘａａ1、Ｘａａ2及びＸａａ3が、同じアミノ酸ではない、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３７】
Ｘａａ4、Ｘａａ5及びＸａａ6が、同じアミノ酸ではない、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３８】
Ｘａａ7、Ｘａａ8及びＸａａ9が、同じアミノ酸ではない、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３９】
Ｘａａ1、Ｘａａ2及びＸａａ3のうちの少なくとも２つが、同じアミノ酸ではない、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項４０】
Ｘａａ4、Ｘａａ5及びＸａａ1のうちの少なくとも２つが、同じアミノ酸ではない、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項４１】
Ｘａａ7、Ｘａａ8及びＸａａ9のうちの少なくとも２つが、同じアミノ酸ではない、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項４２】
前記ペプチドが、
ａ．（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）3−ａｚＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）3、
ｂ．（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）3−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−ａｚＧｌｙ−（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）3または
ｃ．（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）3−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−ａｚＧｌｙ−（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）3
という配列を含む、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項４３】
ｎ1が、１〜２０の整数である、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項４４】
ｎ2が、１〜２０の整数である、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項４５】
前記活性剤が、検出可能な部分または治療剤である、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項４６】
前記検出可能な部分が、蛍光色素、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、近赤外色素または高電子密度試薬である、請求項４５に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項４７】
前記検出可能な部分が、前記ペプチドのＮ末端部分に結合している、請求項４５に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項４８】
前記スペーサー部分が、前記活性剤と前記ペプチドとの間に位置する、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項４９】
前記スペーサー部分が、アミノヘキサン酸を含む、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項５０】
ナノ粒子をさらに含む、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項５１】
前記治療剤が、コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷を治療することが知られている治療剤である、請求項４５に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項５２】
前記治療剤が、がん治療薬、関節炎治療薬または骨粗しょう症薬である、請求項５１に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項５３】
前記ペプチドの、分解されたコラーゲンに対する親和性が、従来のコラーゲンハイブリダイゼーションペプチドよりも高い、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項５４】
前記ペプチドが、天然コラーゲンと結合しない、請求項３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項５５】
請求項３４〜５４に記載のペプチドコンジュゲートのうちの１つ以上を含む組成物。
【請求項５６】
製薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
請求項１〜２９に記載のペプチドコンジュゲートのうちの１つ以上を含む組成物。
【請求項５８】
製薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５９】
請求項１〜２９に記載のペプチドコンジュゲートのうちの１つ以上を含むナノ粒子。
【請求項６０】
請求項３４〜５４に記載のペプチドコンジュゲートのうちの１つ以上を含むナノ粒子。
【請求項６１】
コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷を治療する治療剤のスクリーニング方法であって、
ａ．前記ペプチドコンジュゲートの変性コラーゲンへの結合の有無を検出することであって、結合の存在によって、前記サンプルに変性コラーゲンが存在することが示されることと、
ｂ．変性コラーゲンを有するサンプルに、請求項１〜２９及び３４〜５４に記載のペプチドコンジュゲートのうちのいずれか１つを含む組成物を投与することと、
ｃ．前記ペプチドコンジュゲートの変性コラーゲンへの結合の有無を検出することであって、結合の存在によって、前記サンプルに変性コラーゲンが存在することが示されることと、
を含み、
前記ペプチドコンジュゲートの投与後に検出された、前記サンプル中の損傷または変性コラーゲンの量が、前記ペプチドコンジュゲートの投与前に検出された量よりも減少したことによって、治療剤が、コラーゲンの損傷を伴う疾患または損傷を治療できることが示される前記方法。
【国際調査報告】
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2018508492.tif 000034
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