(57)【要約】本開示は、普遍的Ｆｃグリコフォームをさらに含む抗体またはその結合性断片を含む、組成物および使用方法に関する。本開示は、がん、炎症性障害および感染性疾患を含む多くの疾患に対する治療用抗体の有効性を増強するために所望の結合／エフェクター活性に合わせて選択された普遍的Ｆｃグリコフォームを提供する。選択および／または指向された最適化された普遍的Ｆｃグリコフォームは、増強された治療有効性のためのモノクローナル抗体（好ましくは、治療用モノクローナル抗体）の設計および／または作製のために適用されおよび／または組み込まれうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１に結合し、モノクローナル抗体における結合／エフェクター活性を増強するためのＦｃグリコフォームを含む、単離モノクローナル抗体またはその結合性断片であって、前記抗体は、式：
Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２
【化４】
2018509390.tif 000015
を有するグリコフォームを含む、単離モノクローナル抗体またはその結合性断片。
【請求項２】
前記抗体がＩｇＧ１であり、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１への結合が特異的結合である、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項３】
配列番号１４７または配列番号１３７を有するＶＨおよび配列番号１４８または配列番号１３８を有するＶＬを含む、請求項２に記載の単離抗体。
【請求項４】
（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）配列番号１５２（ＧＦＳＬＴＳＹＧ）から選択されるＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号１５３（ＩＷＧＥＧＳＴ）から選択されるＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号１５４（ＡＭＴＧＴＡＹ）から選択されるＨ−ＣＤＲ３
からそれぞれ選択されるＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、およびＨ−ＣＤＲ３を含み；
（ｉｖ）〜（ｖｉ）：
（ｉｖ）配列番号１４９（ＳＳＶＳＹ）から選択されるＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号１５０（ＤＴＳ）から選択されるＬ−ＣＤＲ２；および
（ｖｉ）配列番号１５１（ＨＱＷＳＳＳＰＨＴ）から選択されるＬ−ＣＤＲ３
からそれぞれ選択されるＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を含む、請求項３に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項５】
（ｉ）〜（ｉｖ）：
（ｉ）配列番号１５９（ＱＶＱＬＫＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳ）から選択されるＨ−ＦＲ１；
（ｉｉ）配列番号１６０（ＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶ）から選択されるＨ−ＦＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号１６１（ＮＹＨＳＶＬＩＳＲＬＴＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＬＮＳＬＱＴＤＤＴＡＴＹＹＣ）から選択されるＨ−ＦＲ３；
（ｉｖ）配列番号１６２（ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）から選択されるＨ−ＦＲ４；
からそれぞれ選択されるＨ−ＦＲ１、Ｈ−ＦＲ２、Ｈ−ＦＲ３、およびＨＦＲ４をさらに含み、
（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）：
（ｖ）配列番号１５５（ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳ）から選択されるＬ−ＦＲ１；
（ｖｉ）配列番号１５６（ＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹ）から選択されるＬ−ＦＲ２；
（ｖｉｉ）配列番号１５７（ＫＬＳＳＧＶＰＧＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣ）から選択されるＬ−ＦＲ３；
（ｖｉｉｉ）配列番号１５８（ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ）から選択されるＬ−ＦＲ４
からそれぞれ選択されるＬ−ＦＲ１、Ｌ−ＦＲ２、Ｌ−ＦＲ３およびＬ−ＦＲ４をさらに含む、請求項４に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
【請求項６】
ヒト抗体である、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
ヒト化抗体である、請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
配列番号２０２、配列番号２１２または配列番号２２２を有するＶＨおよび配列番号２０３、配列番号２１３または配列番号２２３を有するＶＬを含む、請求項２に記載の単離抗体。
【請求項９】
（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）配列番号２０７、配列番号２１７、配列番号２２７から選択されるＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号２０８；配列番号２１８、配列番号２２８から選択されるＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号２０９、配列番号２１９、配列番号２２９から選択されるＨ−ＣＤＲ３
からそれぞれ選択されるＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、およびＨ−ＣＤＲ３を含み、
（ｉｖ）〜（ｖｉ）：
（ｉｖ）配列番号２０４；配列番号２１４および配列番号２２４から選択されるＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号２０５；配列番号２１５および配列番号２２５から選択されるＬ−ＣＤＲ２；
（ｖｉ）配列番号２０６、配列番号２１６および配列番号２２６から選択されるＬ−ＣＤＲ３
からそれぞれ選択されるＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を含む、請求項８に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１０】
ヒト抗体である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
ヒト化抗体である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗原結合性断片が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、または単鎖Ｆｖ断片である、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項１３】
請求項６、７、１０、または１１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその結合性断片と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１４】
過剰増殖疾患に対する処置において有用な、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
がんの処置を必要とする対象においてがんを処置する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１３に記載の医薬組成物を投与するステップを含み、これにより、投与された抗体が、前記対象においてＡＤＣＣ活性を増強する、方法。
【請求項１６】
前記がんが、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆管がん、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、骨がん、皮膚がん、子宮頸がん、卵巣がん、および前立腺がんからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、少なくとも１種の他の化学療法剤と組み合わせた医薬製剤を任意選択で投与するステップを含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
（ａ）モノクローナル抗体を、α−フコシダーゼおよび少なくとも１種のエンドグリコシダーゼと接触させるステップと；
（ｂ）単一のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する脱フコシル化抗体を作り出すステップと；
（ｃ）普遍的グリカンを抗体のＦｃ領域のＧｌｃＮＡｃに付加して、前記グリコフォームを有する均質な抗体を形成するステップと
を含む、請求項１３に記載の均質な抗体の集団を作製するための方法。
【請求項１９】
前記抗体が、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４からなる群より選択される抗原のうちの１つまたは複数に特異的に結合する抗体またはその結合性断片を含む、請求項１に記載の抗体またはその結合性断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、がん、炎症性障害および感染性疾患を含む多くの疾患に指向される抗体の治療有効性を増強するために所望の結合／エフェクター活性に合わせて選択された普遍的Ｆｃグリコフォームに関する。特に、選択および／または指向された最適化された普遍的Ｆｃグリコフォームは、増強された治療有効性のためのモノクローナル抗体の設計および／または作製のために作り出されおよび／または組み込まれうる。
【背景技術】
【０００２】
抗体ベースの治療は、炎症性障害、がん、感染性疾患および充実臓器移植片拒絶を含む多くの疾患に対する証明済みの有効性の記録を有している。現在、４０超の治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、米国、欧州および他の数か国において、臨床使用のために承認されている。それらのほとんどは、がんおよび免疫疾患の治療のためのものである。抗腫瘍活性を有する治療用抗体の例は、抗ＣＤ２０抗体、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、および抗ＰＤ−１抗体を含む。
【０００３】
承認された生物製剤の大部分は、所望のグリコシル化パターンを有するタンパク質を送達し、これにより、低減された免疫原性ならびにより高いｉｎ  ｖｉｖｏ有効性および安定性を確実にするため、哺乳動物細胞培養系において産生される。ＣＨＯ細胞またはＮＳ０細胞などの非ヒト哺乳動物発現系は、複雑なヒト型グリカンを付加するために必要な機構を有する。しかし、これらの系において産生されたグリカンは、ヒトにおいて産生されたグリカンとは異なりうる。それらのグリコシル化機構は、タンパク質フォールディングを改変させ、免疫原性を誘導し、薬物の循環寿命を低減させうる所望されない炭水化物決定基を付加する場合が多い。
【０００４】
さらに、哺乳動物細胞培養物は、全てが同じ特性を有するわけではないグリコシル化パターンの不均一な混合物を送達する。治療用タンパク質の安全性、有効性および血清半減期などの特性は、これらのグリコシル化パターンによって影響されうる。哺乳動物細胞培養系は、全てが同じ特性を有するわけではないグリコシル化パターンの不均一な混合物を送達する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Ｆｃグリコシル化は、治療用モノクローナル抗体の分野における重要な主題である。Ｆｃグリコシル化は、Ｆｃ受容体結合および補体活性化などのＦｃエフェクター機能を顕著に修飾しえ、したがって、治療用抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ安全性および有効性プロファイルに影響しうる。抗体内のＦｃグリコシル化の多様性は、Ｆｃエフェクター機能の多様性に対応する。したがって、Ｆｃグリカンにおけるこの異質性は、Ｆｃ受容体へのＩｇＧ分子の結合に影響を与え、これにより、抗体エフェクター機能に影響を与える場合、機能的帰結を有しており、患者において所望されない効果を誘発しえ、したがって、それらには安全性の懸念があると思われる。
【０００６】
炎症性障害、がんおよび感染性疾患を含む多くの疾患に対する改善されたモノクローナル抗体治療が必要とされている。Ｆｃにおける一部の特定のグリコフォームは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能の改善と共に所望の生物学的機能を付与しうる。したがって、これは、最適化されたＦｃグリコフォームを有する治療用抗体を作り出すために有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本開示は、がん、炎症性障害および感染性疾患を含む多くの疾患に対する治療用抗体の有効性を増強するために所望の結合／エフェクター活性に合わせて選択された普遍的Ｆｃグリコフォームを提供する。選択および／または指向された最適化された普遍的Ｆｃグリコフォームは、増強された治療有効性のためのモノクローナル抗体（好ましくは、治療用モノクローナル抗体）の設計および／または作製のために適用されおよび／または組み込まれうる。
【０００８】
一態様では、本開示は、モノクローナル抗体における結合／エフェクター活性を増強するためのＦｃグリコフォームを提供し、前記抗体は、式：
【０００９】
Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２
【００１０】
【化１】
2018509390.tif 000002
を有するグリコフォームを含む。
【００１１】
一部の実施形態では、本開示は、図１のグリコフォームと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供した。一態様では、本開示は、感染性、過剰増殖疾患および／または状態を処置する方法であって、それを必要とする対象に、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を有するグリコフォームを含む医薬組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００１２】
一部の実施形態では、抗体は、以下の配列を含むマウスＭＣ４１抗体、キメラＭＣ４１抗体、ヒト化ＭＣ４１抗体、および／またはヒトＭＣ４１抗体である：
【００１３】
表１−１．抗ＳＳＥＡ−４マウス、ＭＣ４１のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列。
【表１−１】
2018509390.tif 000003
【００１４】
表１−２．  第２のヒト化モノクローナル抗体、ｈＭＣ４１のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列。
【表１−２】
2018509390.tif 000004
【００１５】
表１−３．  第３のヒト化モノクローナル抗体、ｈＭＣ４１のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列。
【表１−３】
2018509390.tif 000005
【００１６】
一態様では、本開示は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１に結合し、モノクローナル抗体における結合／エフェクター活性を増強するためのＦｃグリコフォームを含む、単離モノクローナル抗体またはその結合性断片であって、前記抗体は、式：
Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２
【化２】
2018509390.tif 000006
を有するグリコフォームを含む、単離モノクローナル抗体またはその結合性断片を提供する。
【００１７】
一実施形態では、前記抗体がＩｇＧ１であり、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１への結合が特異的結合である。
【００１８】
一実施形態では、前記抗体が配列番号１４７または配列番号１３７を有するＶＨおよび配列番号１４８または配列番号１３８を有するＶＬを含む。
【００１９】
一実施形態では、前記単離抗体またはその抗原結合性断片が、
（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）配列番号１５２（ＧＦＳＬＴＳＹＧ）から選択されるＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号１５３（ＩＷＧＥＧＳＴ）から選択されるＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号１５４（ＡＭＴＧＴＡＹ）から選択されるＨ−ＣＤＲ３
からそれぞれ選択されるＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、およびＨ−ＣＤＲ３を含み；
（ｉｖ）〜（ｖｉ）：
（ｉｖ）配列番号１４９（ＳＳＶＳＹ）から選択されるＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号１５０（ＤＴＳ）から選択されるＬ−ＣＤＲ２；および
（ｖｉ）配列番号１５１（ＨＱＷＳＳＳＰＨＴ）から選択されるＬ−ＣＤＲ３
からそれぞれ選択されるＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を含む。
【００２０】
一実施形態では、前記単離抗体または抗原結合性断片が、
（ｉ）〜（ｉｖ）：
（ｉ）配列番号１５９（ＱＶＱＬＫＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳ）から選択されるＨ−ＦＲ１；
（ｉｉ）配列番号１６０（ＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶ）から選択されるＨ−ＦＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号１６１（ＮＹＨＳＶＬＩＳＲＬＴＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＬＮＳＬＱＴＤＤＴＡＴＹＹＣ）から選択されるＨ−ＦＲ３；
（ｉｖ）配列番号１６２（ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）から選択されるＨ−ＦＲ４；
からそれぞれ選択されるＨ−ＦＲ１、Ｈ−ＦＲ２、Ｈ−ＦＲ３、およびＨＦＲ４をさらに含み、
（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）：
（ｖ）配列番号１５５（ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳ）から選択されるＬ−ＦＲ１；
（ｖｉ）配列番号１５６（ＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹ）から選択されるＬ−ＦＲ２；
（ｖｉｉ）配列番号１５７（ＫＬＳＳＧＶＰＧＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣ）から選択されるＬ−ＦＲ３；
（ｖｉｉｉ）配列番号１５８（ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ）から選択されるＬ−ＦＲ４
からそれぞれ選択されるＬ−ＦＲ１、Ｌ−ＦＲ２、Ｌ−ＦＲ３およびＬ−ＦＲ４をさらに含む。
【００２１】
一実施形態では、前記抗体がヒト抗体である。
【００２２】
一実施形態では、前記抗体がヒト化抗体である。
【００２３】
一実施形態では、前記抗体が配列番号２００、配列番号２１０または配列番号１３７を有するＶＨおよび配列番号２０１、配列番号２１１または配列番号２２１を有するＶＬを含む。
【００２４】
一実施形態では、前記単離抗体またはその抗原結合性断片が、
（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）配列番号２０７、配列番号２１７、配列番号２２７から選択されるＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号２０８；配列番号２１８、配列番号２２８から選択されるＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号２０９、配列番号２１９、配列番号２２９から選択されるＨ−ＣＤＲ３
からそれぞれ選択されるＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、およびＨ−ＣＤＲ３を含み、
（ｉｖ）〜（ｖｉ）：
（ｉｖ）配列番号２０４；配列番号２１４および配列番号２２４から選択されるＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号２０５；配列番号２１５および配列番号２２５から選択されるＬ−ＣＤＲ２；
（ｖｉ）配列番号２０６、配列番号２１６および配列番号２２６から選択されるＬ−ＣＤＲ３
からそれぞれ選択されるＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を含む。
【００２５】
一実施形態では、ヒト抗体である、請求項９に記載の抗体。
【００２６】
一実施形態では、ヒト化抗体である、請求項９に記載の抗体。
【００２７】
一実施形態では、前記抗原結合性断片が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、または単鎖Ｆｖ断片である。
【００２８】
一態様では、本開示は、請求項６、７、１０、または１１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその結合性断片と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
【００２９】
一実施形態では、医薬組成物は過剰増殖疾患に対する処置において有用である。
【００３０】
一態様では、本開示は、がんの処置を必要とする対象においてがんを処置する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１３に記載の医薬組成物を投与するステップを含み、これにより、投与された抗体が、前記対象においてＡＤＣＣ活性を増強する、方法を提供する。
【００３１】
一実施形態では、がんの処置のための方法は、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆管がん、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、骨がん、皮膚がん、子宮頸がん、卵巣がん、および前立腺がんからなる群より選択される。
【００３２】
一実施形態では、前記方法が、少なくとも１種の他の化学療法剤と組み合わせた医薬製剤を任意選択で投与するステップを含む。別の態様では、本開示は、（ａ）モノクローナル抗体を、α−フコシダーゼおよび少なくとも１種のエンドグリコシダーゼと接触させるステップと；
（ｂ）単一のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する脱フコシル化抗体を作り出すステップと；
（ｃ）普遍的グリカンを抗体のＦｃ領域のＧｌｃＮＡｃに付加して、前記グリコフォームを有する均質な抗体を形成するステップと
を含む、均質な抗体の集団を作製するための方法を提供する。
【００３３】
一実施形態では、前記抗体またはその結合性断片は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４からなる群より選択される抗原のうちの１つまたは複数に特異的に結合する抗体またはその結合性断片を含む。
【００３４】
本開示の他の一態様は、ＭＣ４８の修飾に基づくヒト化糖抗体（ｇｌｙｃｏａｎｔｉｂｏｄｙ）を提供する。原型ならびにそれらのアミノ酸および核酸の構造／配列は、以下に提供される：
【００３５】
表１７−０．マウスモノクローナル抗体ＭＣ４８のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列。
【表１７−０】
2018509390.tif 000007
【００３６】
表１７−１ヒト化モノクローナル抗体ＭＣ４８（第１）のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列
【表１７−１】
2018509390.tif 000008
【００３７】
表１７−２．  ヒト化モノクローナル抗体ＭＣ４８（第２）のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列。
【表１７−２】
2018509390.tif 000009
【００３８】
表１７−３．  ヒト化モノクローナル抗体ＭＣ４８（第３）のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列。
【表１７−３】
2018509390.tif 000010
【００３９】
表１７−４．  ヒト化モノクローナル抗体ＭＣ４８（第４）のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列
【表１７−４】
2018509390.tif 000011
【００４０】
ＳＳＥＡ４に特異的な抗体およびその断片
【００４１】
本開示の一態様は、ＳＳＥＡ−４に結合する新たな抗体およびその断片を特徴とする。抗ＳＳＥＡ−４抗体は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−４六糖）およびＮｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１（ＳＳＥＡ−４六糖の断片）に結合する。一部の例では、抗体は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１に結合することが可能である。一部の例では、抗体は、Ｎｅｕ５Ｇｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−４六糖の類似体）に結合することが可能である。
【００４２】
一部の実施形態では、方法は、ＡＤＣＣを増強する。
【００４３】
一実施形態では、医薬組成物は、アルファ−２，６連結でシアル酸で終結する普遍的二分岐（ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）ｎ−グリカンを有する抗体またはその結合性断片を含む。
【００４４】
別の態様では、本発明は、対象におけるがんを処置および／またはその危険性を低減させるための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の本明細書で記載される組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００４５】
処置は、腫瘍サイズの低減、悪性細胞の消失、転移の防止、再発の防止、播種性がんの軽減もしくは殺滅、生存の延長、および／または腫瘍のがんへの進行までの時間の延長を結果としてもたらす。
【００４６】
一部の実施形態では、本明細書で記載される組成物は、注射剤として製剤化される。一部の実施形態では、組成物は皮下投与される。
【００４７】
本発明のある特定の実施形態の詳細については、本明細書に示す。本発明の他の特徴、目的および利点は、詳細な説明、図面、実施例、および特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、治療用抗体の最適化された普遍的Ｆｃグリカンの構造を示す図である。
【００４９】
【図２】図２は、その治療活性の改善のためにＦｃ領域に最適化された普遍的グリカンを有する均質な抗体の調製のための一般的戦略を示す図である。
【００５０】
【図３】図３は、抗インフルエンザウイルス抗体の増強された抗ウイルス性抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の結果を示す図である。
【００５１】
【図４】図４は、リツキシマブと比較した抗ＣＤ２０  ＧＡｂの例示的な増強されたＡＤＣＣ活性を列挙する表を示す図である。
【００５２】
【図５】図５は、６種の抗ＣＤ２０  ＧＡｂを示す図である。
【００５３】
【図６Ａ】図６Ａは、表の上部を示す図であり、図６Ｂは表の下部を示す図である。表は、抗ＣＤ２０  ＧＡｂおよびリツキシマブの例示的なＦｃγＲＩＩＩＡ結合を列挙する。ＦｃγＲＩＩＩＡ結合は、当技術分野で公知のアッセイを使用して測定されうる。例示的なアッセイは、実施例に記載されている。Ｆｃ受容体結合は、抗ＣＤ２０  ＧＡｂ対リツキシマブの相対比として決定されうる。例示的な実施形態におけるＦｃ受容体結合は、少なくとも１．２倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍もしくは２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍またはそれ超、増大する。
【図６Ｂ】図６Ａは、表の上部を示す図であり、図６Ｂは表の下部を示す図である。表は、抗ＣＤ２０  ＧＡｂおよびリツキシマブの例示的なＦｃγＲＩＩＩＡ結合を列挙する。ＦｃγＲＩＩＩＡ結合は、当技術分野で公知のアッセイを使用して測定されうる。例示的なアッセイは、実施例に記載されている。Ｆｃ受容体結合は、抗ＣＤ２０  ＧＡｂ対リツキシマブの相対比として決定されうる。例示的な実施形態におけるＦｃ受容体結合は、少なくとも１．２倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍もしくは２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍またはそれ超、増大する。
【００５４】
【図７】図７は、ＣＤ２０を有する異なる細胞との、異なる均質な抗体の結合活性を示す図である。図７は、Ｒａｍｏｓ細胞に対する、Ｒｉｔｕｘａｎ−ＳＣＴ（Ｇａｂ１０１）およびＲｉｔｕｘａｎモノ−ＧｌｃＮＡｃのＣＤＣ効果を示す。
【００５５】
【図８】図８は、ＣＤ２０を有する異なる細胞との、異なる均質な抗体の結合活性を示す図である。図８は、Ｒａｊｉ細胞に対する、Ｒｉｔｕｘａｎ−ＳＣＴ（Ｇａｂ１０１）およびＲｉｔｕｘａｎモノ−ＧｌｃＮＡｃのＣＤＣ効果を示す。
【００５６】
【図９】図９は、ＣＤ２０を有する異なる細胞との、異なる均質な抗体の結合活性を示す図である。図９は、ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞に対する、Ｒｉｔｕｘａｎ−ＳＣＴ（Ｇａｂ１０１）およびＲｉｔｕｘａｎモノ−ＧｌｃＮＡｃのＣＤＣ効果を示す。
【００５７】
【図１０】図１０は、ＦＡＣＳで解析した、ヒトＳＵ−ＤＨＬ−４  Ｂ細胞の枯渇を示す図である。細胞を、異なる濃度の、抗ＣＤ２０  ＧａｂであるＲｉｔｕｘａｎ−ＳＣＴ、Ｒｉｔｕｘａｎ−ＧｌｃＮＡｃおよびリツキシマブと共に、１５％自家血漿の非存在下または存在下で培養した。洗浄の後で、細胞を、抗ＣＤ２−ＰＥおよび抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣで染色した。Ｂ細胞枯渇を、ＣＤ１９＋ＣＤ２−Ｂ細胞（図１３）に基づいて、ＦＡＣＳで解析した。
【００５８】
【図１１】図１１は、ＦＡＣＳで解析した、ヒトＲａｍｏｓ  Ｂ細胞の枯渇を示す図である。細胞を、異なる濃度の、抗ＣＤ２０  ＧａｂであるＲｉｔｕｘａｎ−ＳＣＴ、Ｒｉｔｕｘａｎ−ＧｌｃＮＡｃおよびリツキシマブと共に、１５％自家血漿の非存在下または存在下で培養した。洗浄の後で、細胞を、抗ＣＤ２−ＰＥおよび抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣで染色した。Ｂ細胞枯渇を、ＣＤ１９＋ＣＤ２−Ｂ細胞（図１３）に基づいて、ＦＡＣＳで解析した。
【００５９】
【図１２】図１２は、ＦＡＣＳで解析した、ヒトＲａｊｉ  Ｂ細胞の枯渇を示す図である。細胞を、異なる濃度の、抗ＣＤ２０  ＧａｂであるＲｉｔｕｘａｎ−ＳＣＴ、Ｒｉｔｕｘａｎ−ＧｌｃＮＡｃおよびリツキシマブと共に、１５％自家血漿の非存在下または存在下で培養した。洗浄の後で、細胞を、抗ＣＤ２−ＰＥおよび抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣで染色した。Ｂ細胞枯渇を、ＣＤ１９＋ＣＤ２−Ｂ細胞（図１３）に基づいて、ＦＡＣＳで解析した。
【００６０】
【図１３】図１３は、異なる均質な抗体によるヒトＢ細胞の枯渇を示す図である。
【００６１】
【図１４】図１４は、トラスツズマブと比較した抗ＨＥＲ２  ＧＡｂの例示的な増強されたＡＤＣＣ活性を列挙する表を示す図である。
【００６２】
【図１５】図１５は、抗ＨＥＲ２  ＧＡｂおよびリツキシマブの例示的なＦｃγＲＩＩＩＡ結合を列挙する表を示す図である。
【００６３】
【図１６Ａ】図１６は、ヒト化ＭＣ４１ファージクローンの結合活性を決定するための、ＳＳＥＡ−４をコーティングする固体ベースのＥＬＩＳＡを示す図である。
【００６４】
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ヒト化ＭＣ４１ファージクローンの結合活性を決定するための、ＢＳＡをコーティングする固体ベースのＥＬＩＳＡを示す図である。
【００６５】
【図１７Ａ】図１７Ａは、無傷のヒト化ＭＣ４１  ＩｇＧによる結合活性を評価するため、第１、第２、第３のヒト化ＭＣ４１、およびキメラＭＣ４１（ｃｈＭＣ４１）の無傷のＩｇＧが構築されることを示す図である。ＥＬＩＳＡ結果は、第２および第３のヒト化ＭＣ４１が、用量依存的パターンで、ＳＳＥＡ−４と反応しうるが（図１７Ａ）、ＢＳＡとは反応しない（図１７Ｂ）ことを示しており、同じ結果がｃｈＭＣ４１について観察された。
【００６６】
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、無傷のヒト化ＭＣ４１  ＩｇＧによる結合活性を評価するため、第１、第２、第３のヒト化ＭＣ４１、およびキメラＭＣ４１（ｃｈＭＣ４１）の無傷のＩｇＧが構築されることを示す図である。ＥＬＩＳＡ結果は、第２および第３のヒト化ＭＣ４１が、用量依存的パターンで、ＳＳＥＡ−４と反応しうるが（図１７Ａ）、ＢＳＡとは反応しない（図１７Ｂ）ことを示しており、同じ結果がｃｈＭＣ４１について観察された。
【００６７】
【図１８Ａ】図１８Ａは、図１８Ｂの棒グラフについての説明文を示す図である。ｃｈＭＣ４１およびｈＭＣ４１の結合特異性を決定するため、グリカンアレイを実施する。結果を図１８Ｂに示す。キメラＭＣ４１およびヒト化ＭＣ４１は、市販のＳＳＥＡ４抗体（ＭＣ８１３）よりも特異的な結合を示している。これらは、ＳＳＥＡ４またはグリコリル修飾ＳＳＥＡ４のみを認識した。
【図１８Ｂ】図１８Ａは、図１８Ｂの棒グラフについての説明文を示す図である。ｃｈＭＣ４１およびｈＭＣ４１の結合特異性を決定するため、グリカンアレイを実施する。結果を図１８Ｂに示す。キメラＭＣ４１およびヒト化ＭＣ４１は、市販のＳＳＥＡ４抗体（ＭＣ８１３）よりも特異的な結合を示している。これらは、ＳＳＥＡ４またはグリコリル修飾ＳＳＥＡ４のみを認識した。
【００６８】
【図１９Ａ】図１９Ａは、図１９Ｂの棒グラフについての説明文を示す図である。ｃｈＭＣ４１およびｈＭＣ４１の結合特異性を決定するため、グリカンアレイを実施する。結果を図１９Ｂに示す。キメラＭＣ４１およびヒト化ＭＣ４１は、市販のＳＳＥＡ４抗体（ＭＣ８１３）よりも特異的な結合を示している。これらは、ＳＳＥＡ４またはグリコリル修飾ＳＳＥＡ４のみを認識した。
【図１９Ｂ】図１９Ａは、図１９Ｂの棒グラフについての説明文を示す図である。ｃｈＭＣ４１およびｈＭＣ４１の結合特異性を決定するため、グリカンアレイを実施する。結果を図１９Ｂに示す。キメラＭＣ４１およびヒト化ＭＣ４１は、市販のＳＳＥＡ４抗体（ＭＣ８１３）よりも特異的な結合を示している。これらは、ＳＳＥＡ４またはグリコリル修飾ＳＳＥＡ４のみを認識した。
【００６９】
【図２０Ａ】図２０Ａは、ｃｈＭＣ４１およびｈＭＣ４１のエフェクター機能を精査するため、ＡＤＣＣアッセイおよびＣＤＣアッセイを実施したことを示す図である。ＨＰＡＣ膵臓がん細胞系を使用して、ｃｈＭＣ４１、ｈＭＣ４１、陽性対照ＭＣ８１３または陰性対照ＮＨＩｇＧおよびＮＭＩｇＧのＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性を評価した。
【００７０】
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、ｃｈＭＣ４１およびｈＭＣ４１のエフェクター機能を精査するため、ＡＤＣＣアッセイおよびＣＤＣアッセイを実施したことを示す図である。ＨＰＡＣ膵臓がん細胞系を使用して、ｃｈＭＣ４１、ｈＭＣ４１、陽性対照ＭＣ８１３または陰性対照ＮＨＩｇＧおよびＮＭＩｇＧのＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性を評価した。
【００７１】
【図２１Ａ】図２１Ａおよび図２１Ｂは、ｃｈＭＣ４１およびｈＭＣ４１のエフェクター機能を精査するため、ＡＤＣＣアッセイおよびＣＤＣアッセイを実施したことを示す図である。ＨＰＡＣ膵臓がん細胞系を使用して、ｃｈＭＣ４１、ｈＭＣ４１、陽性対照ＭＣ８１３または陰性対照ＮＨＩｇＧおよびＮＭＩｇＧのＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性を評価した。図２１Ａは、ＡＤＣＣを介したがん細胞殺滅活性を示す。図２１Ｂは、ＣＤＣを介したがん細胞殺滅活性を示す。
【図２１Ｂ】図２１Ａおよび図２１Ｂは、ｃｈＭＣ４１およびｈＭＣ４１のエフェクター機能を精査するため、ＡＤＣＣアッセイおよびＣＤＣアッセイを実施したことを示す図である。ＨＰＡＣ膵臓がん細胞系を使用して、ｃｈＭＣ４１、ｈＭＣ４１、陽性対照ＭＣ８１３または陰性対照ＮＨＩｇＧおよびＮＭＩｇＧのＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性を評価した。図２１Ａは、ＡＤＣＣを介したがん細胞殺滅活性を示す。図２１Ｂは、ＣＤＣを介したがん細胞殺滅活性を示す。
【００７２】
【図２２Ａ】図２２Ａは、ＳＳＥＡ−４に結合する抗体を同定するため、本発明者らが、本発明者らによる以前の報告（Ｌｕら、２０１１年）で記載した通りに確立された、２×１０１０のメンバーを含有するファージディスプレイヒトナイーブｓｃＦｖライブラリーを使用したことを示す図である。まず、このライブラリーから、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ結合性ファージを取り除き、次いで、ＳＳＥＡ−４−ＰＥＧコンジュゲートＤｙｎａｂｅａｄｓにより、ＳＳＥＡ−４結合性ファージを選択した。バイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）時において、本発明者らは、ＰＢＳおよび０．０１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ０．０１）の２つの緩衝液系を使用した。５ラウンドにわたるアフィニティー選択の後、第５のラウンドのファージの回収は、ＰＢＳ系およびＰＢＳＴ０．０１系において、第１のラウンドのものと比較して、それぞれ約５５倍〜８０倍増大した。
【００７３】
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、ＳＳＥＡ−４に結合する抗体を同定するため、本発明者らが、本発明者らによる以前の報告（Ｌｕら、２０１１年）で記載した通りに確立された、２×１０１０のメンバーを含有するファージディスプレイヒトナイーブｓｃＦｖライブラリーを使用したことを示す図である。まず、このライブラリーから、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ結合性ファージを取り除き、次いで、ＳＳＥＡ−４−ＰＥＧコンジュゲートＤｙｎａｂｅａｄｓにより、ＳＳＥＡ−４結合性ファージを選択した。バイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）時において、本発明者らは、ＰＢＳおよび０．０１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ０．０１）の２つの緩衝液系を使用した。５ラウンドにわたるアフィニティー選択の後、第５のラウンドのファージの回収は、ＰＢＳ系およびＰＢＳＴ０．０１系において、第１のラウンドのものと比較して、それぞれ約５５倍〜８０倍増大した。
【００７４】
【図２３Ａ】図２３Ａは、ファージクローンをランダムに選択し、ＥＬＩＳＡにより、ＳＳＥＡ−４結合について調べたことを示す図である。
【００７５】
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、ファージクローンをランダムに選択し、ＥＬＩＳＡにより、ＳＳＥＡ−４結合について調べたことを示す図である。
【００７６】
【図２３Ｃ】図２３Ｃは、ファージクローンをランダムに選択し、ＥＬＩＳＡにより、ＳＳＥＡ−４結合について調べたことを示す図である。
【００７７】
【図２３Ｄ】図２３Ｄは、ファージクローンをランダムに選択し、ＥＬＩＳＡにより、ＳＳＥＡ−４結合について調べたことを示す図である。
【００７８】
【図２４】図２４は、２つのファージクローンの特異性および結合アフィニティーを検討するため、本発明者らが、ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡ、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ−ＢＳＡおよびＳＳＥＡ−３−ＢＳＡを含む、グロボ系列グリカンに対する同じファージ力価を使用して、比較ＥＬＩＳＡを実施したことを示す図である。
【００７９】
【図２５Ａ】図２５Ａは、ＳＳＥＡ−４に対する完全ヒト抗体（ｈＡｂ）を確立するため、本発明者らが、ｐ２−７８  ｓｃＦｖのＶＨコード配列およびＶＬコード配列を、それぞれ、ヒトＩｇＧ１骨格に分子操作したことを示す図である。抗ＳＳＥＡ−４  ｐ２−７８  ｈＡｂは、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現系を使用して作製し、次いで、プロテインＧセファロースカラムを通して精製した。本発明者らは、クーマシーブルー染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、抗体の純度について検討した。
【００８０】
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、ｐ２−７８  ｈＡｂの、グロボ系列グリカンに対する結合活性について精査するためのＥＬＩＳＡを示す図である。
【００８１】
【図２６Ａ】図２６Ａは、市販のＩｇＭ抗体であるＭＣ６３１の陽性対照を示す図である。ｐ２−７８  ｈＡｂの特異性をさらに確認するための、２０３の異なるグリカンを含有するグリカンアレイ。
【００８２】
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、ｐ２−７８  ｈＡｂによって認識されるグリカンを示す図である。
【００８３】
【図２６Ｃ】図２６Ｃは、ｐ２−７８  ｈＡｂの特異性をさらに確認するための、２０３の異なるグリカンを含有するグリカンアレイを示す図である。
【００８４】
【図２７Ａ】図２７Ａは、ＭＣ４８およびＭＣ４１のＶＨ可変領域およびＶＬ可変領域の、ＮＣＢＩ  ＩｇＢＬＡＳＴデータベースまたはＩＭＧＴデータベースを用いたアラインメント後、本発明者らが、第１、第２、第３および第４のヒト化ＭＣ４８配列ならびに第１、第２および第３のヒト化ＭＣ４１配列を作り出したことを示す図である。次に、本発明者らは、これらのヒト化ＭＣ４８配列およびヒト化ＭＣ４１配列に従い、ファージディスプレイｓｃＦｖフォーマットを構築し、作り出した。ヒト化ＭＣ４８ファージクローンおよびヒト化ＭＣ４１ファージクローンの結合活性を決定するため、本発明者らは、ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡをコーティングする固体ベースのＥＬＩＳＡを実行した。本発明者らは、第３および第４のヒト化ＭＣ４８  ｓｃＦｖファージ、ならびに第２および第３のヒト化ＭＣ４１  ｓｃＦｖファージが、ＳＳＥＡ−４を、用量依存的に認識しうるのに対し、第１および第２のヒト化ＭＣ４８  ｓｃＦｖならびに第１のＭＣ４１  ｓｃＦｖは、ＳＳＥＡ−４に対する結合活性を喪失したことを見出した。データは、第４のヒト化ＭＣ４８  ｓｃＦｖファージクローン、および第３のヒト化ＭＣ４１  ｓｃＦｖファージクローンの結合アフィニティーが、マウスｍＡｂであるＭＣ４８またはＭＣ４１と比較して維持されたことを示した。
【００８５】
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、ＭＣ４８およびＭＣ４１のＶＨ可変領域およびＶＬ可変領域の、ＮＣＢＩ  ＩｇＢＬＡＳＴデータベースまたはＩＭＧＴデータベースを用いたアラインメント後、本発明者らが、第１、第２、第３および第４のヒト化ＭＣ４８配列ならびに第１、第２および第３のヒト化ＭＣ４１配列を作り出したことを示す図である。次に、本発明者らは、これらのヒト化ＭＣ４８配列およびヒト化ＭＣ４１配列に従い、ファージディスプレイｓｃＦｖフォーマットを構築し、作り出した。ヒト化ＭＣ４８ファージクローンおよびヒト化ＭＣ４１ファージクローンの結合活性を決定するため、本発明者らは、ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡをコーティングする固体ベースのＥＬＩＳＡを実行した。本発明者らは、第３および第４のヒト化ＭＣ４８  ｓｃＦｖファージ、ならびに第２および第３のヒト化ＭＣ４１  ｓｃＦｖファージが、ＳＳＥＡ−４を、用量依存的に認識しうるのに対し、第１および第２のヒト化ＭＣ４８  ｓｃＦｖならびに第１のＭＣ４１  ｓｃＦｖは、ＳＳＥＡ−４に対する結合活性を喪失したことを見出した。データは、第４のヒト化ＭＣ４８  ｓｃＦｖファージクローン、および第３のヒト化ＭＣ４１  ｓｃＦｖファージクローンの結合アフィニティーが、マウスｍＡｂであるＭＣ４８またはＭＣ４１と比較して維持されたことを示した。
【００８６】
【図２８Ａ】図２８Ａは、ＭＣ４８およびＭＣ４１のＶＨ可変領域およびＶＬ可変領域の、ＮＣＢＩ  ＩｇＢＬＡＳＴデータベースまたはＩＭＧＴデータベースを用いたアラインメント後、本発明者らが、第１、第２、第３および第４のヒト化ＭＣ４８配列ならびに第１、第２および第３のヒト化ＭＣ４１配列を作り出したことを示す図である。次に、本発明者らは、これらのヒト化ＭＣ４８配列およびヒト化ＭＣ４１配列に従い、ファージディスプレイｓｃＦｖフォーマットを構築し、作り出した。ヒト化ＭＣ４８ファージクローンおよびヒト化ＭＣ４１ファージクローンの結合活性を決定するため、本発明者らは、ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡをコーティングする固体ベースのＥＬＩＳＡを実行した。本発明者らは、第３および第４のヒト化ＭＣ４８  ｓｃＦｖファージ、ならびに第２および第３のヒト化ＭＣ４１  ｓｃＦｖファージが、ＳＳＥＡ−４を、用量依存的に認識しうるのに対し、第１および第２のヒト化ＭＣ４８  ｓｃＦｖならびに第１のＭＣ４１  ｓｃＦｖは、ＳＳＥＡ−４に対する結合活性を喪失したことを見出した。データは、第４のヒト化ＭＣ４８  ｓｃＦｖファージクローン、および第３のヒト化ＭＣ４１  ｓｃＦｖファージクローンの結合アフィニティーが、マウスｍＡｂであるＭＣ４８またはＭＣ４１と比較して維持されたことを示した。
【００８７】
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、ＭＣ４８およびＭＣ４１のＶＨ可変領域およびＶＬ可変領域の、ＮＣＢＩ  ＩｇＢＬＡＳＴデータベースまたはＩＭＧＴデータベースを用いたアラインメント後、本発明者らが、第１、第２、第３および第４のヒト化ＭＣ４８配列ならびに第１、第２および第３のヒト化ＭＣ４１配列を作り出したことを示す図である。次に、本発明者らは、これらのヒト化ＭＣ４８配列およびヒト化ＭＣ４１配列に従い、ファージディスプレイｓｃＦｖフォーマットを構築し、作り出した。ヒト化ＭＣ４８ファージクローンおよびヒト化ＭＣ４１ファージクローンの結合活性を決定するため、本発明者らは、ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡをコーティングする固体ベースのＥＬＩＳＡを実行した。本発明者らは、第３および第４のヒト化ＭＣ４８  ｓｃＦｖファージ、ならびに第２および第３のヒト化ＭＣ４１  ｓｃＦｖファージが、ＳＳＥＡ−４を、用量依存的に認識しうるのに対し、第１および第２のヒト化ＭＣ４８  ｓｃＦｖならびに第１のＭＣ４１  ｓｃＦｖは、ＳＳＥＡ−４に対する結合活性を喪失したことを見出した。データは、第４のヒト化ＭＣ４８  ｓｃＦｖファージクローン、および第３のヒト化ＭＣ４１  ｓｃＦｖファージクローンの結合アフィニティーが、マウスｍＡｂであるＭＣ４８またはＭＣ４１と比較して維持されたことを示した。
【００８８】
【図２９Ａ】図２９Ａおよび図２９Ｂは、ＭＣ４８およびＭＣ４１のＶＨ可変領域およびＶＬ可変領域の、ＮＣＢＩ  ＩｇＢＬＡＳＴデータベースまたはＩＭＧＴデータベースを用いたアラインメント後、本発明者らが、第１、第２、第３および第４のヒト化ＭＣ４８配列ならびに第１、第２および第３のヒト化ＭＣ４１配列を作り出したことを示す図である。次に、本発明者らは、これらのヒト化ＭＣ４８配列およびヒト化ＭＣ４１配列に従い、ファージディスプレイｓｃＦｖフォーマットを構築し、作り出した。ヒト化ＭＣ４８ファージクローンおよびヒト化ＭＣ４１ファージクローンの結合活性を決定するため、本発明者らは、ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡをコーティングする固体ベースのＥＬＩＳＡを実行した。本発明者らは、第３および第４のヒト化ＭＣ４８  ｓｃＦｖファージ、ならびに第２および第３のヒト化ＭＣ４１  ｓｃＦｖファージが、ＳＳＥＡ−４を、用量依存的に認識しうるのに対し、第１および第２のヒト化ＭＣ４８  ｓｃＦｖならびに第１のＭＣ４１  ｓｃＦｖは、ＳＳＥＡ−４に対する結合活性を喪失したことを見出した。データは、第４のヒト化ＭＣ４８  ｓｃＦｖファージクローン、および第３のヒト化ＭＣ４１  ｓｃＦｖファージクローンの結合アフィニティーが、マウスｍＡｂであるＭＣ４８またはＭＣ４１と比較して維持されたことを示した。
【００８９】
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、ＭＣ４８およびＭＣ４１のＶＨ可変領域およびＶＬ可変領域の、ＮＣＢＩ  ＩｇＢＬＡＳＴデータベースまたはＩＭＧＴデータベースを用いたアラインメント後、本発明者らが、第１、第２、第３および第４のヒト化ＭＣ４８配列ならびに第１、第２および第３のヒト化ＭＣ４１配列を作り出したことを示す図である。次に、本発明者らは、これらのヒト化ＭＣ４８配列およびヒト化ＭＣ４１配列に従い、ファージディスプレイｓｃＦｖフォーマットを構築し、作り出した。ヒト化ＭＣ４８ファージクローンおよびヒト化ＭＣ４１ファージクローンの結合活性を決定するため、本発明者らは、ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡをコーティングする固体ベースのＥＬＩＳＡを実行した。本発明者らは、第３および第４のヒト化ＭＣ４８  ｓｃＦｖファージ、ならびに第２および第３のヒト化ＭＣ４１  ｓｃＦｖファージが、ＳＳＥＡ−４を、用量依存的に認識しうるのに対し、第１および第２のヒト化ＭＣ４８  ｓｃＦｖならびに第１のＭＣ４１  ｓｃＦｖは、ＳＳＥＡ−４に対する結合活性を喪失したことを見出した。データは、第４のヒト化ＭＣ４８  ｓｃＦｖファージクローン、および第３のヒト化ＭＣ４１  ｓｃＦｖファージクローンの結合アフィニティーが、マウスｍＡｂであるＭＣ４８またはＭＣ４１と比較して維持されたことを示した。
【００９０】
【図３０Ａ】図３０Ａおよび３０Ｂは、無傷のヒト化ＭＣ４１  ＩｇＧによる結合活性を評価するため、本発明者らが、第１、第２、第３のヒト化ＭＣ４１およびキメラＭＣ４１（ｃｈＭＣ４１）の無傷のＩｇＧを構築したことを示す図である。ＥＬＩＳＡ結果は、第２および第３のヒト化ＭＣ４１が、用量依存的パターンで、ＳＳＥＡ−４と反応しうるが（図３０Ａ）、ＢＳＡとは反応しない（図３０Ｂ）ことを示しており、同じ結果がｃｈＭＣ４１について観察された。
【図３０Ｂ】図３０Ａおよび３０Ｂは、無傷のヒト化ＭＣ４１  ＩｇＧによる結合活性を評価するため、本発明者らが、第１、第２、第３のヒト化ＭＣ４１およびキメラＭＣ４１（ｃｈＭＣ４１）の無傷のＩｇＧを構築したことを示す図である。ＥＬＩＳＡ結果は、第２および第３のヒト化ＭＣ４１が、用量依存的パターンで、ＳＳＥＡ−４と反応しうるが（図３０Ａ）、ＢＳＡとは反応しない（図３０Ｂ）ことを示しており、同じ結果がｃｈＭＣ４１について観察された。
【００９１】
【図３１Ａ】図３１Ａおよび図３１Ｂは、ｃｈＭＣ４１およびｈＭＣ４１の結合特異性を決定するために、グリカンアレイを実施したことを示す図である。キメラＭＣ４１およびヒト化ＭＣ４１は、市販のＳＳＥＡ４抗体（ＭＣ８１３）よりも特異的な結合を示した。これらは、ＳＳＥＡ４またはグリコリル修飾ＳＳＥＡ４のみを認識した。図３１Ａは、認識されたグリカンを示し、図３１Ｂは、アレイ結果を示す。
【図３１Ｂ】図３１Ａおよび図３１Ｂは、ｃｈＭＣ４１およびｈＭＣ４１の結合特異性を決定するために、グリカンアレイを実施したことを示す図である。キメラＭＣ４１およびヒト化ＭＣ４１は、市販のＳＳＥＡ４抗体（ＭＣ８１３）よりも特異的な結合を示した。これらは、ＳＳＥＡ４またはグリコリル修飾ＳＳＥＡ４のみを認識した。図３１Ａは、認識されたグリカンを示し、図３１Ｂは、アレイ結果を示す。
【００９２】
【図３２Ａ】図３２Ａおよび図３２Ｂは、ｃｈＭＣ４１およびｈＭＣ４１の結合特異性を決定するために、グリカンアレイを実施したことを示す図である。キメラＭＣ４１およびヒト化ＭＣ４１は、市販のＳＳＥＡ４抗体（ＭＣ８１３）よりも特異的な結合を示した。これらは、ＳＳＥＡ４またはグリコリル修飾ＳＳＥＡ４のみを認識した。図３２Ａは、認識されたグリカンを示し、図３２Ｂは、アレイ結果を示す。
【図３２Ｂ】図３２Ａおよび図３２Ｂは、ｃｈＭＣ４１およびｈＭＣ４１の結合特異性を決定するために、グリカンアレイを実施したことを示す図である。キメラＭＣ４１およびヒト化ＭＣ４１は、市販のＳＳＥＡ４抗体（ＭＣ８１３）よりも特異的な結合を示した。これらは、ＳＳＥＡ４またはグリコリル修飾ＳＳＥＡ４のみを認識した。図３２Ａは、認識されたグリカンを示し、図３２Ｂは、アレイ結果を示す。
【００９３】
【図３３Ａ】図３３Ａおよび図３３Ｂは、ｈＭＣ４８、ｃｈＭＣ４１およびｈＭＣ４１のエフェクター機能を精査するため、ＡＤＣＣアッセイおよびＣＤＣアッセイを実施したことを示す図である。ＨＰＡＣ膵臓がん細胞系、ＢｘＰＣ３膵臓がん細胞系およびＰＬ４５膵臓がん細胞系を使用して、ｈＭＣ４８またはＮＨＩｇＧについて、１０μｇ／ｍｌの濃度でＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性を評価した。
【図３３Ｂ】図３３Ａおよび図３３Ｂは、ｈＭＣ４８、ｃｈＭＣ４１およびｈＭＣ４１のエフェクター機能を精査するため、ＡＤＣＣアッセイおよびＣＤＣアッセイを実施したことを示す図である。ＨＰＡＣ膵臓がん細胞系、ＢｘＰＣ３膵臓がん細胞系およびＰＬ４５膵臓がん細胞系を使用して、ｈＭＣ４８またはＮＨＩｇＧについて、１０μｇ／ｍｌの濃度でＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性を評価した。
【００９４】
【図３４Ａ】図３４Ａは、ＨＰＡＣ細胞をｃｈＭＣ４１、ｈＭＣ４１、陽性対照ＭＣ８１３または陰性対照ＮＨＩｇＧで処理したことを示す図である。
【００９５】
【図３４Ｂ】図３４Ｂは、ＨＰＡＣ細胞をｃｈＭＣ４１、ｈＭＣ４１、陽性対照ＭＣ８１３または陰性対照ＮＨＩｇＧで処理したことを示す図である。
【００９６】
【図３５Ａ】図３５Ａおよび図３５Ｂは、データが、ｈＭＣ４１およびｃｈＭＣ４１のエフェクター機能がｈＭＣ４８よりも優れていることを示したことを示す図である。興味深いことに、ヒト化ＭＣ４１は、その元の活性を維持するだけでなく、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを介した、ＭＣ８１３よりも強いがん細胞殺滅活性もまた示した。
【図３５Ｂ】図３５Ａおよび図３５Ｂは、データが、ｈＭＣ４１およびｃｈＭＣ４１のエフェクター機能がｈＭＣ４８よりも優れていることを示したことを示す図である。興味深いことに、ヒト化ＭＣ４１は、その元の活性を維持するだけでなく、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを介した、ＭＣ８１３よりも強いがん細胞殺滅活性もまた示した。
【００９７】
【図３６】図３６は、ｈＭＣ４１およびｈＭＣ４８のＳＳＥＡ−４への結合能を、ＥＬＩＳＡによって検討したことを示す図である。結果は、ＳＳＥＡ−４へのｈＭＣ４１の結合が、ｈＭＣ４８よりもかなり良かったことを示した。ヒト化ＭＣ４１は、ｈＭＣ４８と比較して、より高い結合最大およびより小さいＫｄ（ｈＭＣ４１およびｈＭＣ４８について、それぞれ０．２μｇ／ｍｌおよび４．６μｇ／ｍｌ）値を有する。
【発明を実施するための形態】
【００９８】
化学的定義
【００９９】
定義
特定の官能基および化学用語の定義を以下により詳細に説明する。化学元素は、ｔｈｅ  Ｐｅｒｉｏｄｉｃ  Ｔａｂｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，  ＣＡＳ  ｖｅｒｓｉｏｎ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ、７５版、内表紙に従って識別され、特定の官能基は一般に、その中に記載されているように定義される。さらに、有機化学の一般的原理、ならびに特定の機能性部分および反応性は、Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｏｒｒｅｌｌ、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ、Ｓａｕｓａｌｉｔｏ、１９９９年；ＳｍｉｔｈおよびＭａｒｃｈ、Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１年；Ｌａｒｏｃｋ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９年；ならびにＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ、Ｓｏｍｅ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、３版、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、１９８７年に記載されている。さらに、例示的なグリカンおよび抗体方法論は、Ｗｏｎｇら、ＵＳ２０１００１３６０４２、ＵＳ２００９０３１７８３７、およびＵＳ２０１４００５１１２７に記載されており、それらの各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１００】
本明細書に記載の化合物は、１つまたは複数の不斉中心を含むことができ、したがって、様々な異性体、例えば、鏡像異性体および／またはジアステレオマーで存在し得る。例えば、本明細書に記載の化合物は、個々の鏡像異性体、ジアステレオマー、もしくは幾何異性体の形態であり得、またはラセミ混合物および１種または複数の立体異性体に富む混合物を含めた、立体異性体の混合物の形態であり得る。異性体は、キラル高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ならびにキラル塩の形成および結晶化を含めた当業者に公知の方法によって混合物から単離することができ、または好適な異性体を不斉合成によって調製することができる。例えば、Ｊａｃｑｕｅｓら、Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，  Ｒａｃｅｍａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８１年）；Ｗｉｌｅｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、３３巻：２７２５頁（１９７７年）；Ｅｌｉｅｌ，Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、ＮＹ、１９６２年）；およびＷｉｌｅｎ，Ｔａｂｌｅｓ  ｏｆ  Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、２６８頁（Ｅ．Ｌ．  Ｅｌｉｅｌ編、Ｕｎｉｖ．  ｏｆ  Ｎｏｔｒｅ  Ｄａｍｅ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｏｔｒｅ  Ｄａｍｅ、ＩＮ、１９７２年）を参照。本発明は、他の異性体を実質的に含まない個々の異性体としての本明細書に記載の化合物、および代わりに、様々な異性体の混合物としての化合物をさらに包含する。
【０１０１】
値の範囲が列挙されている場合、これは、その範囲内の各値およびサブ範囲を包含するように意図されている。例えば、「Ｃ１〜６」は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ１〜６、Ｃ１〜５、Ｃ１〜４、Ｃ１〜３、Ｃ１〜２、Ｃ２〜６、Ｃ２〜５、Ｃ２〜４、Ｃ２〜３、Ｃ３〜６、Ｃ３〜５、Ｃ３〜４、Ｃ４〜６、Ｃ４〜５、およびＣ５〜６を包含するように意図されている。
【０１０２】
本発明の実施では、そうでないことが指し示されない限りにおいて、当該分野の技量の範囲内にある、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技法を使用する。このような技法については、文献中で十分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，１９８５）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；論文、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕら、ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｂｙ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  ｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）を参照のこと。
【０１０３】
本明細書で使用される「グリカン」という用語は、多糖またはオリゴ糖を指す。本明細書では、グリカンはまた、糖タンパク質、糖脂質、糖ペプチド、糖プロテオーム、ペプチドグリカン、リポ多糖、またはプロテオグリカンなど、複合糖質の炭水化物部分を指すのにも使用される。グリカンは通例、単糖間のＯ−グリコシド連結だけからなる。例えば、セルロースとは、β−１，４連結Ｄ−グルコースから構成されるグリカン（または、より具体的には、グルカン）であり、キチンとは、β−１，４連結Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンから構成されるグリカンである。グリカンは、単糖残基のホモポリマーの場合も、ヘテロポリマーの場合もあり、直鎖状の場合も、分枝状の場合もある。グリカンは、糖タンパク質内およびプロテオグリカン内の場合と同様に、タンパク質に付着して見出される場合もある。グリカンは一般に、細胞の外部表面上で見出される。真核生物では、Ｏ連結型グリカンおよびＮ連結型グリカンが非常に一般的であるが、原核生物でも、それほど一般的ではないが、見出されうる。Ｎ連結型グリカンは、シークオン（ｓｅｑｕｏｎ）内のアスパラギンのＲ基窒素（Ｎ）に付着して見出される。シークオンとは、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ配列またはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ配列［配列中、Ｘは、プロリン（ｐｒａｌｉｎｅ）を除く任意のアミノ酸である］である。
【０１０４】
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、抗体またはＴ細胞受容体の抗原結合性部位に接触する、抗原分子の部分と定義される。
【０１０５】
本明細書で使用される「フローサイトメトリー」または「ＦＡＣＳ」という用語は、光学的検出デバイスおよび電子的検出デバイスを介した、流体の流れ中に懸濁された粒子または細胞の物理的特性および化学的特性を検討するための技法を意味する。
【０１０６】
天然に存在しないまたは「単離」抗体は、その天然環境の構成要素から同定および分離ならびに／または回収された抗体である。その天然環境の夾雑構成要素は、抗体の研究的使用、診断的使用、または治療的使用に干渉する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質を含みうる。一実施形態では、抗体を（１）例えば、ローリー法により決定される通り、抗体の９５重量％超まで精製し、一部の実施形態では、９９重量％超まで精製するか（２）例えば、スピニングカップ型シークェネーターを使用することにより、Ｎ末端のアミノ酸配列もしくは内部アミノ酸配列のうちの少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで精製するか、または（３）例えば、クーマシーブルーもしくは銀染色を使用して、還元条件下もしくは非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、均質性まで精製する。抗体の天然環境の少なくとも１つの構成要素が存在しないので、単離抗体は、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕの抗体を含む。しかし、通常、単離抗体は、少なくとも１つの精製ステップにより調製する。
【０１０７】
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、重鎖のＣＨ１ドメインのカルボキシ末端において、抗体のヒンジ領域に由来する１つまたは複数のシステインを含むいくつかの残基の付加により、Ｆａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基が、遊離チオール基を保有するＦａｂ’のための、本明細書における呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元は、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として作製された。また、抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。
【０１０８】
任意の脊椎動物種に由来する抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、２つの顕著に異なる種類のうちの１つに割り当てることができる。
【０１０９】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）は、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元構成は周知であり、一般に、例えば、Ａｂｂａｓら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４版（２０００年）において記載されている。抗体は、抗体の、１つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合的会合または非共有結合的会合により形成される、より大型の融合分子の一部でありうる。
【０１１０】
「抗体断片」は、無傷抗体の一部分だけを含み、この場合、部分は、無傷抗体内に存在する場合にその部分と通常関連する機能のうちの少なくとも１つであり、多ければ、これらの大半または全てを保持する。一実施形態では、抗体断片は、無傷抗体の抗原結合性部位を含み、これにより、抗原に結合する能力を保持する。別の実施形態では、抗体断片、例えば、Ｆｃ領域を含む抗体断片は、ＦｃＲｎへの結合、抗体半減期のモジュレーション、ＡＤＣＣ機能、および補体への結合など、無傷抗体内に存在する場合にＦｃ領域と通常関連する生物学的機能のうちの少なくとも１つを保持する。一実施形態では、抗体断片は、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が無傷抗体と実質的に同様の一価抗体である。例えば、このような抗体断片は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける安定性を断片に付与することが可能なＦｃ配列に連結された抗原結合性アームを含みうる。
【０１１１】
本発明の特定のアミノ酸配列に関する同一性または相同性は、いずれの保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、必要な場合、最大のパーセント相同性を達成するために、配列をアラインメントしギャップを導入した後の、候補配列中の、特定の残基と同一であるアミノ酸残基の百分率として本明細書で定義される。特定の配列中への、Ｎ末端、Ｃ末端または内部での伸長、欠失または挿入のいずれも、相同性に影響すると解釈すべきではない。本発明で求められる全ての配列アラインメントは、このような最大相同性アラインメントである。一般に、本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび断片と目的の核酸配列との核酸配列相同性は、少なくとも８０％＞であり、より典型的には、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および／または１００％の増大する相同性であることが好ましい。２つのアミノ酸配列は、それらの配列間に部分的または完全な同一性がある場合、相同である。
【０１１２】
「グロボ系列関連障害」という用語は、典型的には、経路の異常な機能もしくは提示により特徴付けられる、またはその経路の異常な機能もしくは提示に寄与される障害を指す、またはこれについて記載する。このような障害の例は、がんを含む過剰増殖疾患を含むがこれらに限定されない。
【０１１３】
本明細書で使用される「処置」とは、処置される個体または細胞の自然経過を改変しようとする試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の経過中に実施することができる。処置の望ましい効果は、疾患の発症または再発の防止、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的帰結の減殺、炎症および／または組織／器官損傷の防止または低減、疾患の進行速度の低減、疾患状態の回復または軽減、および寛解または予後の改善を含む。一部の実施形態では、本発明の抗体を使用して、疾患または障害の発症を遅延させる。
【０１１４】
本発明の実施では、そうでないことが指し示されない限りにおいて、当該分野の技量の範囲内にある、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技法を使用する。このような技法については、文献中で十分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，１９８５）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；論文、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕら、ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｂｙ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  ｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）を参照のこと。
【０１１５】
本明細書で使用される「グリカン」という用語は、多糖またはオリゴ糖を指す。本明細書では、グリカンはまた、糖タンパク質、糖脂質、糖ペプチド、糖プロテオーム、ペプチドグリカン、リポ多糖、またはプロテオグリカンなど、複合糖質の炭水化物部分を指すのにも使用される。グリカンは通例、単糖間のＯ−グリコシド連結だけからなる。例えば、セルロースとは、β−１，４連結Ｄ−グルコースから構成されるグリカン（または、より具体的には、グルカン）であり、キチンとは、β−１，４連結Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンから構成されるグリカンである。グリカンは、単糖残基のホモポリマーの場合も、ヘテロポリマーの場合もあり、直鎖状の場合も、分枝状の場合もある。グリカンは、糖タンパク質内およびプロテオグリカン内の場合と同様に、タンパク質に付着して見出される場合もある。グリカンは一般に、細胞の外部表面上で見出される。真核生物では、Ｏ連結型グリカンおよびＮ連結型グリカンが非常に一般的であるが、原核生物でも、それほど一般的ではないが、見出されうる。Ｎ連結型グリカンは、シークオン内のアスパラギンのＲ基窒素（Ｎ）に付着して見出される。シークオンとは、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ配列またはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ配列［配列中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である］である。
【０１１６】
本明細書で使用される「抗原」という用語は、免疫応答を誘発することが可能な任意の物質と定義される。
【０１１７】
本明細書で使用される「免疫原性」という用語は、免疫原、抗原、またはワクチンが、免疫応答を刺激する能力を指す。
【０１１８】
本明細書で使用される「ＣＤ１ｄ」という用語は、多様なヒト抗原提示細胞の表面上で発現する、糖タンパク質のＣＤ１（表面抗原分類（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）１）ファミリーのメンバーを指す。ＣＤ１ｄを提示した脂質抗原は、ナチュラルキラーＴ細胞を活性化させる。ＣＤ１ｄは、糖脂質抗原が結合する、深い抗原結合溝を有する。樹状細胞上で発現するＣＤ１ｄ分子は、Ｃ３４など、アルファＧａｌＣｅｒ類似体を含む糖脂質に結合し、これらを提示しうる。
【０１１９】
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、抗体またはＴ細胞受容体の抗原結合性部位に接触する、抗原分子の部分と定義される。
【０１２０】
本明細書で使用される「ワクチン」という用語は、全病原生物（死滅させるかまたは弱毒化した）、またはこのような生物の構成要素であって、生物が引き起こす疾患に対する免疫を付与するのに使用される、タンパク質、ペプチド、または多糖などの構成要素からなる抗原を含有する調製物を指す。ワクチン調製物は、天然、合成、または組換えＤＮＡ技術により導出される場合がある。
【０１２１】
本明細書で使用される「抗原特異的」という用語は、特定の抗原または抗原の断片を供給する結果として、特異的細胞増殖がもたらされるような細胞集団の特性を指す。
【０１２２】
本明細書で使用される「特異的に結合すること」という用語は、結合対（例えば、抗体および抗原）の間の相互作用を指す。多様な場合において、特異的に結合することは、約１０〜６モル／リットル、約１０〜７モル／リットル、もしくは約１０〜８モル／リットル、またはそれ未満のアフィニティー定数により具体化することができる。
【０１２３】
「単離」抗体とは、その天然環境の構成要素から同定および分離ならびに／または回収された抗体である。その天然環境の夾雑構成要素は、抗体の研究的使用、診断的使用、または治療的使用に干渉する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質を含みうる。一実施形態では、抗体を（１）例えば、ローリー法により決定される通り、抗体の９５重量％超まで精製し、一部の実施形態では、９９重量％超まで精製するか（２）例えば、スピニングカップ型シークェネーターを使用することにより、Ｎ末端のアミノ酸配列もしくは内部アミノ酸配列のうちの少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで精製するか、または（３）例えば、クーマシーブルーもしくは銀染色を使用して、還元条件下もしくは非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、均質性まで精製する。抗体の天然環境の少なくとも１つの構成要素が存在しないので、単離抗体は、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕの抗体を含む。しかし、通常、単離抗体は、少なくとも１つの精製ステップにより調製する。
【０１２４】
本明細書で使用される「実質的に同様」、「実質的に同じ」、「同等」、または「実質的に同等」という語句は、当業者が、その値（例えば、Ｋｄ値、抗ウイルス効果など）により測定される生物学的特徴の文脈内では、２つの値の間の差違を、生物学的有意性および／または統計学的有意性がほとんどないかまたはないと考えるような、２つの数値（例えば、一方は、分子と関連し、他方は、基準／比較分子と関連する）の間の、十分に高度の類似性を描示する。前記２つの値の間の差違は、例えば、基準／比較分子についての値の関数として、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、および／または約１０％未満である。
【０１２５】
本明細書で使用される「実質的に低減された」または「実質的に異なる」という語句は、当業者が、その値（例えば、Ｋｄ値）により測定される生物学的特徴の文脈内では、２つの値の間の差違を、統計学的有意性があると考えるような、２つの数値（一般に、一方は、分子と関連し、他方は、基準／比較分子と関連する）の間の、十分に高度の差違を描示する。前記２つの値の間の差違は、例えば、基準／比較分子についての値の関数として、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、および／または約５０％超である。
【０１２６】
「結合アフィニティー」とは一般に、分子（例えば、抗体）の単一の結合性部位と、その結合パートナー（例えば、抗原）との非共有結合的相互作用の総合計の強さを指す。そうでないことが指し示されない限りにおいて、本明細書で使用される「結合アフィニティー」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体および抗原）の間の１：１の相互作用を反映する、固有の結合アフィニティーを指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対するアフィニティーは一般に、解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。アフィニティーは、本明細書で記載される方法を含む、当技術分野で公知の一般的な方法により測定することができる。低アフィニティー抗体は一般に、抗原への結合が緩徐であり、たやすく解離する傾向があるのに対し、高アフィニティー抗体は一般に、抗原への結合が迅速であり、結合を長く維持する傾向がある。当技術分野では、結合アフィニティーを測定する様々な方法が公知であり、これらのうちのいずれかを、本発明の目的で使用することができる。具体的な例示的実施形態について、以下で記載する。
【０１２７】
一実施形態では、本発明に従う「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、以下に記載される通りに、目的の抗体およびその抗原のＦａｂバージョンにより実施される、放射性標識型抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定する。Ｆａｂの、抗原に対する、溶液中の結合アフィニティーは、Ｆａｂを、未標識抗原の滴定系列の存在下、最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原で平衡化し、次いで、結合した抗原を、抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートで捕捉する（Ｃｈｅｎら（１９９９年）、Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２９３巻：８６５〜８８１頁）ことにより測定する。アッセイのための条件を確立するには、マイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ）を、一晩、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中に５μｇ／ｍｌの捕捉用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）でコーティングし、その後、ＰＢＳ中に２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンで、室温（約２３℃）で２〜５時間ブロックする。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ；型番２６９６２０）内では、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］−抗原を、目的のＦａｂの系列希釈液と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａら（１９９７年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５７巻：４５９３〜４５９９頁における、抗ＶＥＧＦ抗体であるＦａｂ−１２の評価と符合する）。次いで、目的のＦａｂを、一晩インキュベートするが、インキュベーションを長時間（例えば、６５時間）持続させて、平衡への到達を確実にすることができる。その後、室温におけるインキュベーション（例えば、１時間）のために、混合物を、捕捉用プレートに移す。次いで、溶液を除去し、プレートを、８回、ＰＢＳ中に０．１％のＴｗｅｅｎ−２０で洗浄する。プレートを乾燥させたら、１５０μｌ／ウェルのシンチレーション剤（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０；Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、プレートを、Ｔｏｐｃｏｕｎｔガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）上で、１０分間カウントする。最大結合の２０％未満またはそれと等しい結合をもたらす各Ｆａｂ濃度を、競合的結合アッセイにおける使用のために選択する。別の実施形態によれば、ＫｄまたはＫｄ値は、約１０応答単位（ＲＵ）において固定化した抗原ＣＭ５チップをもちいて、２５℃でＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用する、表面プラズモン共鳴アッセイを使用することにより測定する。略述すると、供給元の指示書に従い、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５；ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化させる。５μｌ／分の流量での注射の前に、抗原を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で、５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈して、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリングタンパク質を達成する。抗原を注射した後、１Ｍのエタノールアミンを注射して、未反応基を遮断する。各実験では、１つのスポットを、タンパク質を固定化させずに活性化させ、エタノールアミンで遮断して、基準の減算のために使用した。動態の測定のために、Ｆａｂの２倍の系列希���液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を伴うＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中、２５℃、約２５μｌ／分の流量で注射する。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純な一対一のラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．２）を使用して、会合センサーグラムと解離センサーグラムとを同時に当てはめることにより計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。例えば、Ｃｈｅｎ，  Ｙ．ら（１９９９年）、Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２９３巻：８６５〜８８１頁を参照されたい。オン速度が、上記の表面プラズモン共鳴アッセイによる１０６Ｍ−１秒−１を超える場合、オン速度は、ストップフロー装備型分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、または撹拌式キュベットを伴う８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定される、漸増濃度の抗原の存在下、２５℃で、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中に２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の、蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍのバンドパス）の増大または減少を測定する、蛍光クエンチング技法を使用することにより決定することができる。
【０１２８】
また、本発明に従う「オン速度」または「会合速度（ｒａｔｅ  ｏｆ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）」または「会合速度（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）」または「ｋｏｎ」も、約１０応答単位（ＲＵ）において固定化した抗原ＣＭ５チップをもちいて、２５℃でＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用する、上で記載した表面プラズモン共鳴法により決定することができる。略述すると、供給元の指示書に従い、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５；ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化させる。５μｌ／分の流量での注射の前に、抗原を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で、５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈して、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリングタンパク質を達成する。抗原を注射した後、１Ｍのエタノールアミンを注射して、未反応基を遮断する。動態の測定のために、Ｆａｂの２倍の系列希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を伴うＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中、２５℃、約２５μｌ／分の流量で注射する。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純な一対一のラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．２）を使用して、会合センサーグラムと解離センサーグラムとを同時に当てはめることにより計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算した。例えば、Ｃｈｅｎ，  Ｙ．ら（１９９９年）Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２９３巻：８６５〜８８１頁を参照されたい。しかし、オン速度が、上記の表面プラズモン共鳴アッセイによる１０６Ｍ−１秒−１を超える場合、オン速度は、ストップフロー装備型分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、または撹拌式キュベットを伴う８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定される、漸増濃度の抗原の存在下、２５℃で、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中に２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の、蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍのバンドパス）の増大または減少を測定する、蛍光クエンチング技法を使用することにより決定することができる。
【０１２９】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指すことを意図する。１つの種類のベクターは、さらなるＤＮＡセグメントをライゲーションしうる、環状の二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別の種類のベクターは、ファージベクターである。別の種類のベクターは、さらなるＤＮＡセグメントを、ウイルスゲノムにライゲーションしうる、ウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内の自律複製が可能である（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、これにより、宿主ゲノムと共に複製されうる。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動的に連結される遺伝子の発現を誘導することが可能である。本明細書では、このようなベクターを、「組換え発現ベクター」（または、単に、「組換えベクター」）と称する。一般に、組換えＤＮＡ技法において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドは、最も一般に使用されるベクターの形態であるので、本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」とを、互換的に使用する場合がある。
【０１３０】
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、任意の長さのヌクレオチドポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは修飾塩基、および／またはそれらの類似体、あるいはＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼ、または合成反応によりポリマーに組み込まれうる任意の基質、がある。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含みうる。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーのアセンブリーの前または後で施すことができる。ヌクレオチドの配列は、ヌクレオチド以外の構成要素により中断されうる。ポリヌクレオチドは、標識とのコンジュゲーションによるなど、合成の後でさらに修飾することができる。他の種類の修飾は、例えば、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つまたは複数の、類似体による置換、例えば、非荷電連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄａｔｅ）、カルバメートなど）を伴うもの、および荷電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を伴うもの、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リシンなど）などのペンダント部分を含有するもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を伴うもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾連結（例えば、アルファアノマー核酸など）を伴うものなどのヌクレオチド間修飾のほか、ポリヌクレオチドの非修飾形態を含む。さらに、通常糖内に存在するヒドロキシル基のうちのいずれかを、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基により置きかえる、標準的な保護基により保護する、またはさらなるヌクレオチドへのさらなる連結を調製するように活性化させることができ、あるいは固体支持体または半固体支持体にコンジュゲートさせることができる。５’末端および３’末端のＯＨは、リン酸化する、またはアミンもしくは１〜２０個の炭素原子による有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシルはまた、標準的な保護基に誘導体化することもできる。ポリヌクレオチドはまた、例えば、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−アリルリボース、２’−フルオロリボース、または２’−アジドリボース、炭素環式の糖類似体、α−アノマー糖、アラビノース、キシロース、またはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、アクリル類似体、およびメチルリボシドなどの塩基性ヌクレオシド類似体を含む、当技術分野で一般に公知の、リボース糖またはデオキシリボース糖の類似の形態も含有しうる。１つまたは複数のホスホジエステル連結を、代替的な連結基で置きかえることができる。これらの代替的な連結基は、ホスフェートを、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＨ２（「ホルムアセタール」）［式中���各ＲまたはＲ’は、独立に、Ｈであるか、または、任意選択で、エーテル（−Ｏ−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはアラルジルを含有する、置換もしくは非置換アルキル（１〜２０個のＣ）である］で置きかえた実施形態を含むがこれらに限定されない。ポリヌクレオチド内の全ての連結は、同一である必要がない。前出の記載は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書で言及される全てのポリヌクレオチドに当てはまる。
【０１３１】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」とは一般に短く、一般に一本鎖であり、一般に、約２００ヌクレオチド未満の長さであるが必ずしもそうではない、一般に合成のポリヌクレオチドを指す。「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は、相互に除外的ではない。ポリヌクレオチドについての上記の記載は、オリゴヌクレオチドにも同等かつ十分に適用可能である。
【０１３２】
「抗体」（Ａｂ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体が、特異的抗原に対する結合特異性を呈示するのに対し、免疫グロブリンは、抗体および抗原特異性を一般に欠く他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系により産生されるレベルは低く、骨髄腫により産生されるレベルは高い。
【０１３３】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、最も広い意味で、互換的に使用され、モノクローナル抗体（例えば、全長または無傷のモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、一価抗体、多価抗体、多特異性抗体（それらが、所望の生物学的活性を呈示する限りにおいて、例えば、二特異性抗体）を含み、また、ある特定の抗体断片（本明細書でより詳細に記載される）も含みうる。抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、および／またはアフィニティー成熟抗体でありうる。
【０１３４】
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。これらのドメインは一般に、抗体の最も可変的な部分であり、抗原結合性部位を含有する。
【０１３５】
「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分は、抗体間で配列が大幅に異なり、各特定の抗体の、その特定の抗原に対する結合および特異性において使用されるという事実を指す。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に、均等に配分されているわけではない。可変性は、軽鎖可変ドメイン内および重鎖可変ドメイン内の両方で相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる、３つのセグメント内に濃縮されている。可変ドメインのうちの、より高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれている。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、大部分、ベータシート構造を接続し、場合によって、ベータシート構造の一部を形成するループを形成する、３つのＣＤＲにより接続されたベータシート構成を採用する、４つのＦＲ領域を含む。各鎖内のＣＤＲは、ＦＲ領域により、一体に近接して保持され、他の鎖に由来するＣＤＲと共に、抗体の抗原結合性部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年）を参照されたい）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合には直接関わらないが、抗体の、抗体依存性細胞傷害への関与など、多様なエフェクター機能を呈示する。
【０１３６】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる、各々が、単一の抗原結合性部位と、その名称がたやすく結晶化するその能力を反映する残りの「Ｆｃ」断片とを伴う、２つの同一の抗原結合性断片を生じさせる。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、抗原を架橋することがやはり可能な、Ｆ（ａｂ’）２断片をもたらす。
【０１３７】
「Ｆｖ」とは、完全な抗原認識部位および抗原結合性部位を含有する、最小の抗体断片である。２つの鎖によるＦｖ分子種では、この領域は、緊密な非共有結合的会合下にある、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。単鎖によるＦｖ分子種では、１つの重鎖可変ドメインと、１つの軽鎖可変ドメインとは、軽鎖と、重鎖とが、２つの鎖によるＦｖ分子種におけるものと類似の「二量体」構造内で会合しうるように、可撓性のペプチドリンカーにより共有結合的に連結されうる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上で、抗原結合性部位を規定するのは、この構成においてである。併せて、６つのＣＤＲは、抗原結合特異性を、抗体に付与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲだけを含むＦｖの半分）でもなお、結合性部位全体より小さなアフィニティーではあるが、抗原を認識し、抗原に結合する能力を有する。
【０１３８】
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、重鎖のＣＨ１ドメインのカルボキシ末端において、抗体のヒンジ領域に由来する１つまたは複数のシステインを含むいくつかの残基の付加により、Ｆａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基が、遊離チオール基を保有するＦａｂ’のための、本明細書における呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元は、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として作製された。また、抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。
【０１３９】
任意の脊椎動物種に由来する抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、２つの顕著に異なる種類のうちの１つに割り当てることができる。
【０１４０】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）は、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元構成は周知であり、一般に、例えば、Ａｂｂａｓら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４版（２０００年）において記載されている。抗体は、抗体の、１つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合的会合または非共有結合的会合により形成される、より大型の融合分子の一部でありうる。
【０１４１】
本明細書では、「全長抗体」、「無傷抗体」、および「全抗体」という用語は、互換的に使用されて、下記で規定される抗体断片ではなく、その実質的な無傷形態にある抗体を指す。用語は特に、Ｆｃ領域を含有する重鎖を伴う抗体を指す。
【０１４２】
「抗体断片」は、無傷抗体の一部分だけを含み、この場合、部分は、無傷抗体内に存在する場合にその部分と通常関連する機能のうちの少なくとも１つであり、多ければ、これらの大半または全てを保持する。一実施形態では、抗体断片は、無傷抗体の抗原結合性部位を含み、これにより、抗原に結合する能力を保持する。別の実施形態では、抗体断片、例えば、Ｆｃ領域を含む抗体断片は、ＦｃＲｎへの結合、抗体半減期のモジュレーション、ＡＤＣＣ機能、および補体への結合など、無傷抗体内に存在する場合にＦｃ領域と通常関連する生物学的機能のうちの少なくとも１つを保持する。一実施形態では、抗体断片は、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が無傷抗体と実質的に同様の一価抗体である。例えば、このような抗体断片は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける安定性を断片に付与することが可能なＦｃ配列に連結された抗原結合性アームを含みうる。
【０１４３】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体集団から得られた抗体を指す、例えば、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる、または均質なグリコフォームプロファイルのみを含みうる（集団中の糖抗体上に、単一のグリカンまたは単一のグリカンプロファイルのみを有する）可能な天然に存在する変異を除き、同一である。Ｆｃ−２９７位における、２，３−シアリルおよび２，６−シアリルならびに脱フコシル化複合二分岐グリカンを使用することによってエフェクター機能を増強するための均質な抗体組成物の例は、ＵＳ１２／９５９，３５１に記載されている。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、個別の抗体の混合物ではない抗体の性格を指し示す。このようなモノクローナル抗体は、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、この場合、標的結合性ポリペプチド配列は、単一の標的結合性ポリペプチド配列の、複数のポリペプチド配列からの選択を含む工程により得られたものであることが典型的である。例えば、選択工程は、固有のクローンの、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンからの選択でありうる。選択された標的結合性配列は、例えば、標的に対するアフィニティーを改善し、標的結合性配列をヒト化し、細胞培養物中のその産生を改善し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるその免疫原性を低減し、多特異性抗体を創出するなどするように、さらに改変させることができ、改変させた標的結合性配列を含む抗体もまた、本発明のモノクローナル抗体であることを理解されたい。異なる決定基（エピトープ）に指向される異なる抗体を含むことが典型的なポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に指向される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は典型的に、他の免疫グロブリンが夾雑していないという点でも有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られるものとしての抗体の性格を指し示すものであり、任意の特定の方法による抗体の作製を必要とするとはみなされないものとする。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば、以下が挙げられる、種々の技術によって作製され得る；ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）；Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、リコンビナントＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｓｉｄｈｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２���０４）；Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；およびＬｅｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）を参照のこと）、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座、またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部または全部を有する動物においてヒトまたはヒト様抗体を生成するための技術（例えば、ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；ＷＯ９１／１０７４１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号；Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）、およびＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと。
【０１４４】
本明細書のモノクローナル抗体は具体的に、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一または相同である一方で、鎖の残りの部分は、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体のほか、それらが、所望の生物学的活性を呈示する限りにおいて、このような抗体の断片（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８１巻：６８５１〜６８５５頁（１９８４年））も含む。
【０１４５】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域に由来する残基を、所望の特異性、アフィニティー、および／または能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長動物など、非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域に由来する残基で置きかえた、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によって、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基を、対応する非ヒト残基で置きかえる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体内またはドナー抗体内で見出されない残基を含みうる。これらの修飾は、抗体の性能をさらに精緻化するように施す。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループのうちの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲのうちの全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのうちの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた、任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部分も含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，  Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。また、以下の総説記事およびその中の参考文献を参照のこと：Ｖａｓｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５−１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５−１０３８（１９９５）；Ｈｕｒｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８−４３３（１９９４）。
【０１４６】
本明細書で使用される「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」という用語は、配列が超可変的であり、かつ／または構造的に規定されたループを形成する、抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は、６つの超可変領域：ＶＨ内の３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびＶＬ内の３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。多くの超可変領域の描写が本明細書において使用され、包含される。Ｋａｂａｔによる相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づき、最も一般に使用されている（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年））。これとは別に、Ｃｈｏｔｈｉａは、構造ループの位置に言及する（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１〜９１７頁（１９８７年））。ＡｂＭによる超可変領域は、ＫａｂａｔによるＣＤＲと、Ｃｈｏｔｈｉａによる構造ループとの折衷を表し、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ製のＡｂＭ抗体モデル作製ソフトウェアで使用されている。「ｃｏｎｔａｃｔ」超可変領域は、利用可能な複合体結晶構造の解析に基づく。これらの超可変領域の各々に由来する残基を、下記に記述する。
【０１４７】
ループ  Ｋａｂａｔ  ＡｂＭ  Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃｏｎｔａｃｔ
【０１４８】
Ｌ１  Ｌ２４−Ｌ３４  Ｌ２４−Ｌ３４  Ｌ２６−Ｌ３２  Ｌ３０−Ｌ３６
【０１４９】
Ｌ２  Ｌ５０−Ｌ５６  Ｌ５０−Ｌ５６  Ｌ５０−Ｌ５２  Ｌ４６−Ｌ５５
【０１５０】
Ｌ３  Ｌ８９−Ｌ９７  Ｌ８９−Ｌ９７  Ｌ９１−Ｌ９６  Ｌ８９−Ｌ９６
【０１５１】
Ｈ１  Ｈ３１−Ｈ３５Ｂ  Ｈ２６−Ｈ３５Ｂ  Ｈ２６−Ｈ３２  Ｈ３０−Ｈ３５Ｂ
【０１５２】
（Ｋａｂａｔ番号付け）
【０１５３】
Ｈ１  Ｈ３１−Ｈ３５  Ｈ２６−Ｈ３５  Ｈ２６−Ｈ３２  Ｈ３０−Ｈ３５  
【０１５４】
（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け）
【０１５５】
Ｈ２  Ｈ５０−Ｈ６５  Ｈ５０−Ｈ５８  Ｈ５３−Ｈ５５  Ｈ４７−Ｈ５８
【０１５６】
Ｈ３  Ｈ９５−Ｈ１０２  Ｈ９５−Ｈ１０２  Ｈ９６−Ｈ１０１  Ｈ９３−Ｈ１０１
【０１５７】
超可変領域は、以下の通り：ＶＬ内の２４〜３６または２４〜３４（Ｌ１）、４６〜５６または５０〜５６または４９〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７または８９〜９６（Ｌ３）、ならびにＶＨ内の２６〜３５（Ｈ１）、５０〜６５または４９〜６５（Ｈ２）、および９３〜１０２、９４〜１０２、または９５〜１０２（Ｈ３）の「拡張超可変領域」を含みうる。可変ドメイン残基は、Ｋａｂａｔら、前出に従い、これらの定義の各々について番号付けされる。
【０１５８】
「フレームワーク」残基または「ＦＲ」残基とは、本明細書で規定される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【０１５９】
「Ｋａｂａｔによる可変ドメイン残基の番号付け」または「Ｋａｂａｔによるアミノ酸位置の番号付け」という用語、およびこれらの変化形は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年）で集成された抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインについて使用されている番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用すると、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＨＶＲの短縮またはこれらへの挿入に対応する、より少ないアミノ酸またはさらなるアミノ酸を含有する場合がある。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後における単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従う残基５２ａ）と、重鎖ＦＲの残基８２の後における残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔに従う残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含みうる。Ｋａｂａｔによる残基の番号付けは、所与の抗体について、抗体の配列相同性領域における、「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付け配列とのアラインメントにより決定することができる。
【０１６０】
「単鎖Ｆｖ」抗体断片または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、この場合、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓｃＦｖが、抗原への結合に所望の構造を形成することが可能である。ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６９〜３１５頁（１９９４年）を参照されたい。
【０１６１】
「ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）」という用語は、２つの抗原結合性部位を伴う小型の抗体断片であって、同じポリペプチド鎖内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む断片（ＶＨ−ＶＬ）を指す。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能とするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは、別の鎖の相補性ドメインと対合し、２つの抗原結合性部位を創出するように強いられる。ダイアボディーについては、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻：６４４４〜６４４８頁（１９９３年）においてより十全に記載されている。
【０１６２】
「ヒト抗体」とは、ヒトにより産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有し、かつ／または本明細書で開示される、ヒト抗体を作製するための技法のうちのいずれかを使用して作製された抗体である。ヒト抗体についてのこの定義は具体的に、非ヒト抗原結合性残基を含むヒト化抗体を除外する。
【０１６３】
「アフィニティー成熟」抗体とは、その１つまたは複数のＨＶＲ内の１つまたは複数の改変であって、これらの改変を保有しない親抗体と比較して、抗体の抗原に対するアフィニティーの改善を結果としてもたらす改変を伴う抗体である。一実施形態では、アフィニティー成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル濃度、またはさらにはピコモル濃度のアフィニティーを有する。アフィニティー成熟抗体は、当技術分野で公知の手順により作製される。Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）は、ＶＨドメインシャフリングおよびＶＬドメインシャフリングによるアフィニティー成熟について記載している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム変異は、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒら、Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９（１９９５）；およびＨａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６（１９９２）によって記載されている。
【０１６４】
「遮断」抗体または「アンタゴニスト」抗体とは、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害または低減する抗体である。ある特定の遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的または完全に阻害する。
【０１６５】
本明細書で使用される「アゴニスト抗体」とは、目的のポリペプチドの機能的活性のうちの少なくとも１つを模倣する抗体である。
【０１６６】
「障害」とは、本発明の抗体による処置から利益を得る任意の状態である。これは、哺乳動物に、問題の障害への素因を与える病理学的状態を含む、慢性障害および急性障害または慢性疾患および急性疾患を含む。本明細書で処置される障害の非限定的な例は、がんを含む。
【０１６７】
「細胞増殖性障害」および「増殖性障害」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖と関連する障害を指す。一実施形態では、細胞増殖性障害は、がんである。
【０１６８】
本明細書で使用される「腫瘍」とは、悪性であれ、良性であれ、全ての新生物性細胞成長および増殖を指し、全ての前がん性細胞および前がん性組織ならびにがん性細胞およびがん性組織を指す。本明細書で言及される通り、「がん」、「がん性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」、および「腫瘍」という用語は、相互に除外的ではない。
【０１６９】
「がん」および「がん性」という用語は、典型的には、未調節の細胞成長／増殖によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指すか、またはこれについて記載する。がんの例は、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、および白血病を含むがこれらに限定されない。このようながんのより具体的な例は、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、肺扁平上皮癌、腹膜がん、肝細胞がん、消化器がん、膵臓がん、神経膠芽腫、子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝癌、白血病、および他のリンパ増殖性障害、ならびに多様な種類の頭頸部がんを含む。
【０１７０】
本明細書で使用される「処置」とは、処置される個体または細胞の自然経過を改変しようとする試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の経過中に実施することができる。処置の望ましい効果は、疾患の発症または再発の防止、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的帰結の減殺、炎症および／または組織／器官損傷の防止または低減、疾患の進行速度の低減、疾患状態の回復または軽減、および寛解または予後の改善を含む。一部の実施形態では、本発明の抗体を使用して、疾患または障害の発症を遅延させる。
【０１７１】
「個体」または「対象」は、脊椎動物である。ある特定の実施形態では、脊椎動物は、哺乳動物である。哺乳動物は、農場動物（ウシなど）、競技動物、ペット（ネコ、イヌ、およびウマなど）、霊長動物、マウス、およびラットを含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、脊椎動物は、ヒトである。
【０１７２】
処置を目的とする「哺乳動物」とは、ヒト、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなど、飼育動物および農場動物、ならびに動物園の動物、競技動物、またはペット動物を含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。ある特定の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
【０１７３】
「有効量」とは、所望の治療的結果または予防的結果を達成するための、投与量において、かつ必要な時間にわたる、有効な量を指す。
【０１７４】
本発明の物質／分子の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する物質／分子の能力などの因子に従い変化しうる。治療有効量はまた、物質／分子の任意の毒性効果または有害効果を、治療的に有益な効果が凌駕するときの量でもある。「予防有効量」とは、所望の予防的結果を達成するための、投与量において、かつ必要な時間にわたる、有効な量を指す。予防用量は、対象において、疾患の発症の前またはその早期に使用されるので、予防有効量は、治療有効量未満となることが典型的であろうが、必ずしもそうではない。
【０１７５】
本明細書で使用される「細胞傷害剤」という用語は、細胞の機能を阻害もしくは防止し、かつ／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。用語は、放射性同位元素（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、およびＬｕの放射性同位元素）、化学療法剤（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロランブシル、ダウノルビシン、または他の挿入剤、核酸分解酵素などの酵素およびその断片、抗生剤、ならびに細菌由来、真菌由来、植物由来、または動物由来の低分子毒素または酵素的に活性な毒素などの毒素であって、それらの断片および／または改変体を含む毒素、ならびに下記で開示される多様な抗腫瘍剤または抗がん剤を含むことを意図する。他の細胞傷害剤については、下記に記載する。殺腫瘍剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
【０１７６】
「化学療法剤」とは、がんの処置において有用な化学化合物である。化学療法剤の例は、チオテパおよびシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）であるＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、およびトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含めたエチレンイミンおよびメチルメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；アセトゲニン（とりわけ、ブラタシンおよびブラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ））；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン（ｌａｐａｃｈｏｎｅ）；ラパコール（ｌａｐａｃｈｏｌ）；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体であるトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレチン（ｓｃｏｐｏｌｅｃｔｉｎ）、および９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン合成類似体、カルゼレシン合成類似体、およびビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体である、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンジスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；クロランブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｍａｐｈａｚｉｎｅ）、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビキン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどの窒素マスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）などのニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）；エンジイン抗生剤（例えば、カリケアマイシン、とりわけ、カリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔｌ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．、３３巻：１８３〜１８６頁（１９９４年）を参照されたい）；ジネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）Ａを含むジネミシン；エスペラミシン；ならびにネオカルチノスタチン発色団、および関連の色素タンパク質である、エンジイン抗生剤（ａｎｔｉｏｂｉｏｔｉｃ）発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシンであるＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生剤；メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）；フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキセート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジクオン；エフロルニチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシンおよびアンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ）などのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；シゾフラン（ｓｉｚｏｆｕｒａｎ）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（とりわけ、Ｔ−２毒素、ベルカリンＡ（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ  Ａ）、ロリジンＡ（ｒｏｒｉｄｉｎ  Ａ）、およびアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセルであるＴＡＸＯＬ（��録商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、パクリタキセルのＣｒｅｍｏｐｈｏｒ非含有アルブミン操作ナノ粒子製剤であるＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌｌ．）、およびドセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）であるＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｖｉｎ）；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤であるＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体；ならびにシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンによる組み合わせ療法の略号であるＣＨＯＰ、ならびにオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））を５−ＦＵおよびロイコボリンと組み合わせた処置レジメンの略号であるＦＯＬＦＯＸなど、上記のうちの２つまたはそれ超の組み合わせを含む。
【０１７７】
医薬製剤
【０１７８】
医薬組成物は、投与製剤と適合性の様式で、治療有効量、保護的量および治療的量で、投与される。投与が必要な有効成分の正確な量は、実施者の判断に依存する。しかし、適切な投与量範囲は、当業者により容易に決定可能である。初回投与および追加免疫用量に適したレジメンもまた可変的であるが、その後の投与が後に続く初回投与を含みうる。ワクチンの投与量もまた、投与経路に依存しえ、宿主サイズにしたがって変動する。
【０１７９】
当技術分野では、動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、またはウマ）においてモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体ならびにこれらの断片を作製する方法が周知である。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。「抗体」という用語は、無傷の免疫グロブリン分子のほか、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖抗体）、およびｄＡｂ（ドメイン抗体；Ｗａｒｄら（１９８９年）、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、５４４頁）など、これらの断片を含む。
【０１８０】
本明細書で開示される組成物は、本開示を読んだ当業者に同定可能な、さらなる活性剤、担体、ビヒクル、賦形剤、または補助剤と併せて、医薬組成物中に含むことができる。
【０１８１】
医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含むことが好ましい。このような医薬組成物中で、本明細書で開示される組成物は、「活性剤」とも称する「活性化合物」を形成する。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という表現は、医薬品の投与と適合性の、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。また、補助的な活性化合物も、組成物に組み込むことができる。医薬組成物は、その意図された投与経路と適合性となるように製剤化する。投与経路の例は、非経口投与、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口（例えば、吸入）投与、経皮（局所）投与、経粘膜投与、および直腸投与を含む。非経口適用、皮内適用、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の構成要素：注射用水、食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの滅菌希釈液；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；アセテート、シトレート、またはホスフェートなどの緩衝剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなど、張度を調整するための薬剤を含みうる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口調製物は、アンプル内、使い捨て型のシリンジ内、またはガラス製もしくはプラスチック製の複数用量バイアル内に封入することができる。
【０１８２】
臨床適用
【０１８３】
本発明は、対象における増殖性疾患、例えば、がん（例えば、肺がん、大腸がん、膵臓がん、胆管がん、または子宮内膜がん）、良性新生物、または血管新生の処置のために有用な選択され指向された最適化された糖抗体を提供する。
【０１８４】
本明細書で記載される組成物は、がんの処置および診断の両方においても使用されうる。当技術分野では、ヒトおよび／または動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、またはウマ）においてモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体ならびにこれらの断片を作製する方法が周知である。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。「抗体」という用語は、無傷の免疫グロブリン分子のほか、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖抗体）、およびｄＡｂ（ドメイン抗体；Ｗａｒｄら（１９８９年）、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、５４４頁）など、これらの断片を含む。
【０１８５】
これらの組成物は、当技術分野で周知の緩衝剤を含む、薬学的に許容される賦形剤などの適切な担体もさらに含みうる。
【０１８６】
天然に存在しない抗体および／または単離抗体ならびにポリヌクレオチドもまた提供される。ある特定の実施形態では、単離抗体およびポリヌクレオチドは、実質的に純粋である。
【０１８７】
抗体の抗原結合性ドメインは、約１１０アミノ酸の２つの可変（Ｖ）領域であって、１つずつが軽（ＶＬ）鎖および重（ＶＨ）鎖に由来し、いずれもが、３つの超可変ループまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）を提示する、Ｖ領域から形成される。Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２巻：４３３〜４５５頁（１９９４年）において記載される通り、可変ドメインは、ＶＨとＶＬとが、短い可撓性ペプチドを介して共有結合的に連結された、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、またはそれらの各々が、定常ドメインに融合し、非共有結合的に相互作用する、Ｆａｂ断片として、ファージ上に機能的にディスプレイされ得る。本明細書で使用される、ｓｃＦｖをコードするファージクローンおよびＦａｂをコードするファージクローンを、まとめて、「Ｆｖファージクローン」または「Ｆｖクローン」と称する。
【０１８８】
ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングし、ファージライブラリー内でランダムに組み換えることができ、次いで、これを、Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２巻：４３３〜４５５頁（１９９４年）において記載されている通り、抗原結合性クローンについて検索することができる。免疫化供給源に由来するライブラリーは、ハイブリドーマの構築を必要とせずに、免疫原に対する高アフィニティー抗体を提供する。代替的に、ナイーブレパートリーをクローニングして、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ、１２巻：７２５〜７３４頁（１９９３年）により記載される通り、免疫化を伴わずに、広範にわたる、非自己抗原に対するヒト抗体と、また自己抗原に対するヒト抗体とによる、単一の供給源を提供することもできる。最後に、ナイーブライブラリーはまた、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２７巻：３８１〜３８８頁（１９９２年）により記載されている通り、幹細胞に由来する、再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードするランダムな配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して、、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける再配列を達成することにより、合成で作製することもできる。
【０１８９】
糸状ファージを、マイナーコートタンパク質ｐＩＩＩへの融合により抗体断片をディスプレイするのに使用する。抗体断片は、例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年）により記載されている通り、ＶＨドメインとＶＬドメインとが、同じポリペプチド鎖上で、可撓性のポリペプチドスペーサーにより接続される、単鎖Ｆｖ断片として、または、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９巻：４１３３〜４１３７頁（１９９１年）において記載されている通り、一方の鎖が、ｐＩＩＩに融合し、他方の鎖が、細菌宿主細胞ペリプラズムに分泌され、ここで、Ｆａｂ−コートタンパク質構造のアセンブリーが、野生型コートタンパク質の一部を取り換えることにより、ファージ表面上にディスプレイされる、Ｆａｂ断片としてディスプレイすることができる。
【０１９０】
抗体可変遺伝子セグメント（ＶＨセグメントおよびＶＬセグメントを含む）をコードする核酸を、目的の細胞から回収し、増幅した。再配列されたＶＨ遺伝子ライブラリーおよびＶＬ遺伝子ライブラリーの場合、所望のＤＮＡは、Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８６巻：３８３３〜３８３７頁（１９８９年）において記載される通り、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡを、リンパ球から単離した後で、再配列されたＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子の５’末端および３’末端にマッチするプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を施し、これにより、発現のための、多様なＶ遺伝子レパートリーを作製することにより得ることができる。Ｖ遺伝子は、Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９年）およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻：５４４〜５４６頁（１９８９年）において記載されている通り、成熟Ｖドメインをコードするエクソンの５’末端におけるバックプライマーと、Ｊセグメントに基づくフォワードプライマーとにより、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡから増幅することができる。しかし、ｃＤＮＡから増幅するためには、バックプライマーはまた、Ｊｏｎｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、９巻：８８〜８９頁（１９９１年）において記載されている通り、リーダーエクソン、およびＳａｓｔｒｙら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８６巻：５７２８〜５７３２頁（１９８９年）において記載されている通り、定常領域内のフォワードプライマーに基づく場合がある。相補性を最大化するため、Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９年）、またはＳａｓｔｒｙら（１９８９年）において記載されている通り、プライマー内に縮重を組み込むことができる。ある特定の実施形態では、例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年）による方法において記載されている通り、またはＯｒｕｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２１巻：４４９１〜４４９８頁（１９９３年）による方法において記載されている通り、免疫細胞の核酸試料中に存在する、全ての利用可能なＶＨ配置およびＶＬ配置を増幅するために、各Ｖ遺伝子ファミリーにターゲティングされたＰＣＲプライマーを使用することにより、ライブラリーの多様性を最大化する。増幅されたＤＮＡを、発現ベクターにクローニングするために、Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９年）において記載されている通り、まれな制限部位を、ＰＣＲプライマー内に、一方の端部におけるタグとして、または、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）において記載されている通り、タグ付けされたプライマーを伴う、さらなるＰＣＲ増幅により導入することができる。
【０１９１】
合成により再配列されたＶ遺伝子のレパートリーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、Ｖ遺伝子セグメントから導出することができる。ヒトＶＨ遺伝子セグメントの大半は、クローニングおよびシークェンシングされ（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２７巻：７７６〜７９８頁（１９９２年）において報告されている）、マッピングされており（Ｍａｔｓｕｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．、３巻：８８〜９４頁（１９９３年）において報告されている）；ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２７巻：３８１〜３８８頁（１９９２年）において記載されている通り、これらのクローニングされたセグメント（Ｈ１ループおよびＨ２ループの全ての主要なコンフォメーションを含む）を使用して、多様な配列および長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマーにより、多様なＶＨ遺伝子レパートリーを作り出すことができる。また、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：４４５７〜４４６１頁（１９９２年）において記載される通り、単一の長さの長いＨ３ループに焦点を当てた、全ての配列多様性を伴うＶＨレパートリーを作製することもできる。ヒトＶκセグメントおよびＶλセグメントは、クローニングおよびシークェンシングされており（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３巻：１４５６〜１４６１頁（１９９３年）において報告されている）、合成軽鎖レパートリーを作製するのに使用することができる。ＶＨおよびＶＬのフォールド（ｆｏｌｄ）の範囲、ならびにＬ３およびＨ３の長さに基づく、合成によるＶ遺伝子レパートリーは、大幅な構造的多様性を有する抗体をコードする。Ｖ遺伝子をコードするＤＮＡの増幅の後、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２７巻：３８１〜３８８頁（１９９２年）による方法に従い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、生殖細胞系列のＶ遺伝子セグメントを再配列することができる。
【０１９２】
抗体断片のレパートリーは、ＶＨ遺伝子レパートリーと、ＶＬ遺伝子レパートリーとを、いくつかの方式で一体に組み合わせることにより構築することができる。各レパートリーは、異なるベクター内で創出することができ、ベクターは、例えば、Ｈｏｇｒｅｆｅら、Ｇｅｎｅ、１２８巻：１１９〜１２６頁（１９９３年）において記載されている通り、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるコンビナトリアル感染、例えば、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２１巻：２２６５〜２２６６頁（１９９３年）において記載されているｌｏｘＰ系により組み換えることができる。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける組換え手法では、Ｆａｂ断片の２本鎖としての性質を利用して、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換効率により付与される、ライブラリーサイズに対する制限を克服する。ナイーブＶＨレパートリーと、ナイーブＶＬレパートリーとは、一方はファージミドへ、他方はファージベクターに、個別にクローニングする。次いで、各細胞が、異なる組み合わせを含有し、ライブラリーサイズが、存在する細胞の数（クローン約１０１２個）だけにより制限されるように、２つのライブラリーを、ファージミド含有細菌へのファージ感染により組み合わせる。ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子が、単一のレプリコンに組み換えられ、ファージビリオンに共パッケージングされるように、いずれのベクターも、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける組換えシグナルを含有する。これらの巨大ライブラリーは、アフィニティーの良好な（約１０−８ＭのＫｄ−１）多数の多様な抗体をもたらす。
【０１９３】
代替的に、レパートリーは、例えば、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８８巻：７９７８〜７９８２頁（１９９１年）において記載されている通り、同じベクターに逐次的にクローニングする、または、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）において記載されている通り、ＰＣＲにより一体にアセンブルし、次いで、クローニングすることができる。また、ＰＣＲアセンブリーも、ＶＨ  ＤＮＡおよびＶＬ  ＤＮＡを、可撓性のペプチドスペーサーをコードするＤＮＡと接合して、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）レパートリーを形成するのに使用することができる。さらに別の技法では、Ｅｍｂｌｅｔｏｎら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０巻：３８３１〜３８３７頁（１９９２年）において記載されている通り、「インセルＰＣＲアセンブリー」を使用して、ＶＨ遺伝子とＶＬ遺伝子とを、リンパ球内で、ＰＣＲにより組み合わせ、次いで、連結された遺伝子のレパートリーをクローニングする。
【０１９４】
ライブラリーのスクリーニングは、当技術分野で公知の任意の技法により達成することができる。標的は、吸着プレートのウェルをコーティングし、吸着プレートに固定された宿主細胞上で発現させるのに使用することも、細胞分取で使用することも、ストレプトアビジンコーティングビーズによる捕捉のために、ビオチンにコンジュゲートさせることも、ファージディスプレイライブラリーをパニングするための当技術分野で公知の、他の任意の方法において使用することもできる。
【０１９５】
固相に結合したファージは、洗浄し、次いで、例えば、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８８巻：７９７８〜７９８２頁（１９９１年）において記載されている通り、酸により、または、例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年）において記載されている通り、アルカリにより、または、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）による抗原競合法と類似の手順における、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／ＧＬＯＢＯ  Ｈ抗原の競合により溶出させる。ファージは、単一のラウンドの選択で２０〜１，０００倍に富化することができる。さらに、富化されたファージは、細菌培養物中で成長させ、さらなるラウンドの選択にかけることができる。
【０１９６】
選択の効率は、洗浄時における解離動態、および単一のファージ上の複数の抗体断片が、抗原と同時に係合しうるのかどうかを含む多くの因子に依存する。解離動態が速く（かつ、結合アフィニティーが弱い）抗体は、短い洗浄、多価ファージディスプレイ、および固相内の抗原の高いコーティング密度を使用することにより保持することができる。高密度は、多価相互作用を介してファージを安定化させるだけでなく、解離したファージの再結合に好適でもある。解離動態が遅く（かつ、結合アフィニティーが良好な）抗体の選択は、Ｂａｓｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、８巻：３０９〜３１４頁（１９９０年）およびＷＯ９２／０９６９０において記載されている通り、長い洗浄および一価ファージディスプレイ、ならびにＭａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）において記載されている通り、抗原の低コーティング密度を使用することにより促進することができる。
【０１９７】
しかし、選択された抗体のランダム変異（例えば、上で記載したアフィニティー成熟技法の一部において実施される）は、大半が抗原に結合し、少数はより高いアフィニティーを有する多くの変異体をもたらす可能性が高い。ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／ＧＬＯＢＯ  Ｈを制限すると、まれに、高アフィニティーのファージも競合に耐えない可能性がある。全てのより高いアフィニティーの変異体を保持するため、ファージは、過剰なビオチン化ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／ＧＬＯＢＯ  Ｈと共にインキュベートすることもできるが、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／ＧＬＯＢＯ  Ｈの標的モル濃度アフィニティー定数より低いモル濃度のビオチン化ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／ＧＬＯＢＯ  Ｈと共にインキュベートすることもできる。次いで、高アフィニティー結合性ファージは、ストレプトアビジンコーティング常磁性ビーズにより捕捉することができる。このような「平衡捕捉」により、抗体を、それらの結合アフィニティーに従い、低アフィニティーの極過剰なファージから、アフィニティーの高さがわずか２倍の変異体クローンの単離を可能とする感度で選択することが可能となる。また、固相に結合したファージの洗浄で使用される条件も、解離動態に基づき弁別するように操作することができる。
【０１９８】
本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、ハイブリドーマまたはファージＤＮＡ鋳型から、重鎖および軽鎖の目的のコード領域を特異的に増幅するようにデザインされたオリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより）、たやすく単離およびシークェンシングされる。単離されたら、ＤＮＡを、発現ベクター内に入れ、次いで、これを、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または別途免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞内の所望のモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体コードＤＮＡの、細菌内の組換え発現についての総説論文は、Ｓｋｅｒｒａら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５巻：２５６頁（１９９３年）およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖｓ、１３０巻：１５１頁（１９９２年）を含む。
【０１９９】
本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域をコードする公知のＤＮＡ配列（例えば、適切なＤＮＡ配列は、Ｋａｂａｔら、前出から得ることができる）と組み合わせて、全長重鎖および／もしくは全長軽鎖または部分長重鎖および／もしくは部分長軽鎖をコードするクローンを形成することができる。ＩｇＧ定常領域、ＩｇＭ定常領域、ＩｇＡ定常領域、ＩｇＤ定常領域、およびＩｇＥ定常領域を含む、任意のアイソタイプの定常領域を、この目的のために使用することができ、このような定常領域を、任意のヒト種または動物種から取得し得ることを理解されたい。１つの動物（ヒトなど）種の可変ドメインＤＮＡから導出され、次いで、「ハイブリッド」の全長重鎖および／または全長軽鎖のためのコード配列を形成するように、別の動物種の定常領域ＤＮＡに融合させたＦｖクローンは、本明細書で使用される「キメラ」抗体および「ハイブリッド」抗体の定義に含まれる。一実施形態では、ヒト可変ＤＮＡから導出されたＦｖクローンを、ヒト定常領域ＤＮＡに融合させて、全てのヒト全長重鎖および／もしくはヒト全長軽鎖またはヒト部分長重鎖および／もしくはヒト部分長軽鎖のコード配列を形成する。
【０２００】
ナイーブライブラリーにより産生される抗体（天然または合成）は、中程度のアフィニティー（約１０６〜１０７Ｍ−１のＫｄ−１）のものでありうるが、また、Ｗｉｎｔｅｒら（１９９４年）、前出において記載されている通り、アフィニティー成熟も、二次ライブラリーを構築し、ここから再選択することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで模倣することができる。例えば、エラープローンポリメラーゼ（Ｌｅｕｎｇら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、１巻：１１〜１５頁（１９８９年）において報告されている）を、Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２６巻：８８９〜８９６頁（１９９２年）による方法、またはＧｒａｍら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：３５７６〜３５８０頁（１９９２年）による方法で使用することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ランダムに、変異を導入することができる。加えて、アフィニティー成熟は、例えば、目的のＣＤＲにわたり、ランダムな配列を保有するプライマーを伴うＰＣＲを、選択された個々のＦｖクローン内で使用して、１つまたは複数のＣＤＲをランダムに変異させ、より高いアフィニティーのクローンについてスクリーニングすることにより実施することもできる。ＷＯ９６０７７５４（１９９６年３月１４日公開）は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域内で変異誘発を誘導して、軽鎖遺伝子のライブラリーを創出するための方法について記載した。別の有効な手法は、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）において記載されている通り、非免疫化ドナーから得られた天然に存在するＶドメイン改変体のレパートリーを伴うファージディスプレイにより選択されたＶＨドメインまたはＶＬドメインを組み換え、数回のラウンドにわたる鎖リシャフリングにより、より高いアフィニティーについてスクリーニングすることである。この技法は、アフィニティーが１０−９Ｍの範囲の抗体および抗体断片の作製を可能とする。
【０２０１】
抗体のアフィニティーを生成し評価する他の方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）；米国特許第４，８１６，５６７号；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６；Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７；Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）；Ｅｎｇｅｌｓら、Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，２８：７１６−７３４（１９８９）；Ａｂｒａｈｍｓｅｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：３９０１（１９８５）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４４（１９７６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）において記載されている。
【０２０２】
一般的な方法
【０２０３】
抗体の作製は、ハイブリドーマ技法、および結合剤分子についてのファージディスプレイライブラリーのスクリーニングなど、本明細書で記載される方法を含む当技術分野における日常的な技術を使用して達成することができる。当技術分野では、これらの方法が十分に確立されている。
【０２０４】
略述すると、本発明の抗体は、コンビナトリアルライブラリーを使用して、１つまたは複数の所望の活性を伴う合成抗体クローンについてスクリーニングすることにより作製することができる。原則として、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質に融合させた、抗体可変領域の多様な断片（Ｆｖ）をディスプレイするファージを含有するファージライブラリーをスクリーニングすることにより選択する。このようなファージライブラリーを、所望の抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによりパニングする。所望の抗原に結合することが可能なＦｖ断片を発現させるクローンを、抗原に吸着させ、これにより、ライブラリー内の非結合性クローンから分離する。次いで、結合性クローンを抗原から溶出させ、さらなる抗原吸着／溶出サイクルにより、さらに富化することができる。本発明の抗体のうちのいずれかは、適切な抗原スクリーニング手順をデザインして、目的のファージクローンについて選択した後で、目的のファージクローンに由来するＦｖ配列と、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ第９１−３２４２号、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．（１９９１年）、１〜３巻において記載されている、適切な定常領域（Ｆｃ）配列とを使用して、全長抗体クローンを構築することにより得ることができる。
【０２０５】
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得ることができる、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる、考えられる天然に存在する変異を除き同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、個別の抗体の混合物ではないものとしての抗体の性格を指し示す。
【０２０６】
本発明のモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁（１９７５年）により初めて記載されたハイブリドーマ法を含む当技術分野で公知の様々な方法を使用して作製することもでき、代替的に、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号）により作製することもできる。
【０２０７】
ベクター、宿主細胞、および組換え法
【０２０８】
本発明の抗体を組換えにより作製するには、本発明の抗体をコードする核酸を単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために、複製可能なベクターに挿入する。抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、たやすく単離およびシークェンシングされる。多くのベクターが、利用可能である。ベクターの選択は、使用される宿主細胞に部分的に依存する。宿主細胞は、原核生物由来の細胞または真核生物（一般に、哺乳動物）由来の細胞のいずれかを含むがこれらに限定されない。ＩｇＧ定常領域、ＩｇＭ定常領域、ＩｇＡ定常領域、ＩｇＤ定常領域、およびＩｇＥ定常領域を含む、任意のアイソタイプの定常領域を、この目的のために使用することができ、このような定常領域を、任意のヒト種または動物種から取得し得ることを理解されたい。
【０２０９】
原核宿主細胞を使用する抗体の作製
【０２１０】
ベクターの構築
【０２１１】
本発明の抗体のポリペプチド構成要素をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組換え技法を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単離およびシークェンシングすることができる。代替的に、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成器またはＰＣＲ技法を使用して合成することもできる。得られたら、ポリペプチドをコードする配列を、原核宿主内で異種ポリヌクレオチドを複製し、発現させることが可能な組換えベクターに挿入する。利用可能であり、当技術分野で公知の多くのベクターは、本発明の目的で使用することができる。適切なベクターの選択は、ベクターに挿入される核酸のサイズ、およびベクターで形質転換される特定の宿主細胞に主に依存する。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、またはこれらの両方）、およびそれが存在する特定の宿主細胞に対するその適合性に応じて、多様な構成要素を含有する。ベクターの構成要素は一般に、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合性部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸インサート、および転写終結配列を含むがこれらに限定されない。
【０２１２】
一般に、宿主細胞に適合性の種に由来するレプリコンおよび制御配列を含有するプラスミドベクターは、これらの宿主と関連させて使用する。ベクターは通常、複製部位のほか、形質転換された細胞内の表現型による選択を提供することが可能なマーキング配列も保有する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、Ｅ．ｃｏｌｉ種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２を使用して形質転換することが典型的である。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン（Ａｍｐ）耐性およびテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性をコードする遺伝子を含有し、これにより、形質転換された細胞を同定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体、または他の微生物性プラスミドもしくはバクテリオファージはまた、微生物が内因性タンパク質を発現させるために使用しうるプロモーターも含有しうるか、またはこれを含有するように修飾することができる。特定の抗体を発現させるために使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例については、Ｃａｒｔｅｒら、米国特許第５，６４８，２３７号において詳細に記載されている。
【０２１３】
加えて、宿主微生物に適合性のレプリコンおよび制御配列を含有するファージベクターも、形質転換ベクターとして、これらの宿主と関連させて使用することができる。例えば、λＧＥＭ（商標）１１などのバクテリオファージを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２など、易感染性の宿主細胞を形質転換するのに使用しうる組換えベクターの作製において活用することができる。
【０２１４】
本発明の発現ベクターは、ポリペプチド構成要素の各々をコードする、２つまたはこれを超えるプロモーター−シストロン対を含みうる。プロモーターとは、シストロンに対して上流（５’）に位置する非翻訳の調節配列であって、その発現をモジュレートする。原核生物プロモーターは、誘導的プロモーターと構成的プロモーターとの２つのクラスに分けられることが典型的である。誘導的プロモーターとは、培養条件の変化、例えば、栄養物質の存在もしくは非存在、または温度の変化に応答して、シストロンの高レベルの転写をその制御下で開始するプロモーターである。
【０２１５】
様々な潜在的宿主細胞により認識される多数のプロモーターが周知である。選択されたプロモーターは、制限酵素消化を介して、供給源ＤＮＡから取り出し、単離されたプロモーター配列を、本発明のベクターに挿入することにより、軽鎖または重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作動可能に連結することができる。天然のプロモーター配列および多くの異種プロモーターの両方を使用して、標的遺伝子の増幅、および／または発現を誘導することができる。一部の実施形態では、異種プロモーターは一般に、天然の標的ポリペプチドのプロモーターと比較して、発現させる標的遺伝子の転写の増大および収量の上昇を可能とするので活用される。
【０２１６】
原核宿主を伴う使用に適するプロモーターは、ＰｈｏＡプロモーター、β−ガラクタマーゼプロモーター系およびラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにｔａｃプロモーターまたはｔｒｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターを含む。しかし、細菌内で機能的な他のプロモーター（他の公知の細菌プロモーターまたはファージプロモーターなど）も同様に適する。それらのヌクレオチド配列は公表されており、これにより、当業者が、リンカーまたはアダプターを使用して、それらを、標的軽鎖および標的重鎖をコードするシストロンに、作動可能にライゲーションして、必要とされる任意の制限部位を供給することが可能となる（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら（１９８０年）、Ｃｅｌｌ、２０巻：２６９頁）。
【０２１７】
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、発現させたポリペプチドの、膜を横切るトランスロケーションを誘導する、分泌シグナル配列構成要素を含む。一般に、シグナル配列は、ベクターの構成要素の場合もあり、ベクターに挿入された標的ポリペプチドＤＮＡの一部の場合もある。本発明の目的で選択されたシグナル配列は、宿主細胞により認識およびプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）シグナル配列であるものとする。異種ポリペプチドにとって天然のシグナル配列を認識およびプロセシングしない原核宿主細胞のためには、シグナル配列を、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、およびＭＢＰからなる群より選択される、原核生物シグナル配列で置換する。本発明の一実施形態では、発現系のシストロンの両方で使用されるシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列またはその改変体である。
【０２１８】
別の態様では、本発明に従う免疫グロブリンの産生は、宿主細胞の細胞質内で生じることが可能であり、したがって、各シストロン内の分泌シグナル配列の存在を必要としない。この点で、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、細胞質内で機能的免疫グロブリンを形成するように、発現され、フォールドされ、アセンブルされる。ある特定の宿主株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｔｒｘＢ株）は、ジスルフィド結合形成に好適な細胞質条件をもたらし、これにより、発現したタンパク質サブユニットの適正なフォールディングおよびアセンブリーを可能とする（ＰｒｏｂａおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｇｅｎｅ、１５９巻：２０３頁（１９９５年））。
【０２１９】
本発明の抗体はまた、分泌され、適正にアセンブルされた、本発明の抗体の収量を最大化するために、発現するポリペプチド構成要素の定量的な比をモジュレートしうる発現系を使用することによって作製することもできる。このようなモジュレーションは、ポリペプチド構成要素について、翻訳強度を同時にモジュレートすることにより、少なくとも一部達成する。
【０２２０】
翻訳強度をモジュレートするための１つの技法は、Ｓｉｍｍｏｎｓら、米国特許第５，８４０，５２３号において開示されている。この技法では、シストロン内の翻訳開始領域（ＴＩＲ）の改変体を活用する。所与のＴＩＲについて、翻訳強度がある範囲にある、一連のアミノ酸配列改変体または核酸配列改変体を創出し、これにより、特異的な鎖の所望の発現レベルについて、この因子を調整するための簡便な手段をもたらすことができる。ＴＩＲ改変体は、アミノ酸配列を改変させうるコドン変化を結果としてもたらす、従来の変異誘発技法により作り出すことができる。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列の変化は、サイレントである。ＴＩＲ内の改変は、例えば、シグナル配列の改変と共に、シャイン−ダルガーノ配列の数または間隔の改変を含みうる。変異体のシグナル配列を作り出すための１つの方法は、シグナル配列のアミノ酸配列を変化させない（すなわち、変化がサイレントである）コード配列の起始部における「コドンバンク」の作製である。これは、各コドンの第３のヌクレオチド位置を変化させることにより達成することができ；加えて、ロイシン、セリン、およびアルギニンなど、一部のアミノ酸が、第１の位置および第２の位置を複数有し、これにより、バンクの作製に複雑性を付加しうる。変異誘発のこの方法については、Ｙａｎｓｕｒａら（１９９２年）、ＭＥＴＨＯＤＳ：  Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、４巻：１５１〜１５８頁において詳細に記載されている。
【０２２１】
一実施形態では、その中の各シストロンのＴＩＲ強度がある範囲にあるベクターのセットを作り出す。この限定的なセットにより、各鎖の発現レベルについての比較のほか、多様なＴＩＲ強度の組み合わせの下における、所望の抗体産物の収量についての比較ももたらされる。ＴＩＲ強度は、Ｓｉｍｍｏｎｓら、米国特許第５，８４０，５２３号において詳細に記載されている通り、レポーター遺伝子の発現レベルを定量化することにより決定することができる。翻訳強度の比較に基づき、所望の個々のＴＩＲが、本発明の発現ベクター構築物内で組み合わされるように選択される。
【０２２２】
本発明の抗体を発現させるのに適する原核宿主細胞は、古細菌およびグラム陰性菌またはグラム陽性菌などの真正細菌を含む。有用な細菌の例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）種、Ｂａｃｉｌｌｉ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）種、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉａ、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ、またはＰａｒａｃｏｃｃｕｓを含む。一実施形態では、グラム陰性細胞を使用する。一実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、本発明のための宿主として使用する。Ｅ．ｃｏｌｉ株の例は、Ｗ３１１０株（Ｂａｃｈｍａｎｎ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２巻（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．：  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９８７年）、１１９０〜１２１９頁；ＡＴＣＣ寄託番号：２７，３２５）、および、遺伝子型Ｗ３１１０  ΔｆｈｕＡ  （ΔｔｏｎＡ）  ｐｔｒ３  ｌａｃ  Ｉｑ  ｌａｃＬ８  ΔｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ）  ｄｅｇＰ４１  ｋａｎＲ（米国特許第５，６３９，６３５号）を有する３３Ｄ３株を含むその派生株を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ  ２９４（ＡＴＣＣ：３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  λ１７７６（ＡＴＣＣ：３１，５３７）およびＥ．ｃｏｌｉ  ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ：３１，６０８）など、他の株およびそれらの派生株もまた、適する。これらの例は、限定的なものではなく、例示的なものである。当技術分野では、規定された遺伝子型を有する上述の細菌のうちのいずれかの派生株を構築するための方法が公知であり、例えば、Ｂａｓｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、８巻：３０９〜３１４頁（１９９０年）において記載されている。細菌の細胞内のレプリコンの複製能力を考慮して、適切な細菌を選択することが、一般に必要である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種は、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、またはｐＫＮ４１０など、周知のプラスミドを使用して、レプリコンを供給する場合に、宿主として使用するのに適しうる。典型的には、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌するべきあり、望ましくは、さらなるプロテアーゼ阻害剤を細胞培養物中に組み込みうる。
【０２２３】
抗体の作製
【０２２４】
宿主細胞を、上で記載した発現ベクターで形質転換し、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように改変された、従来の栄養培地中で培養する。
【０２２５】
形質転換とは、ＤＮＡが、染色体外エレメントとして、または染色体への組込み体により複製可能となるように、ＤＮＡを、原核宿主に導入することを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換は、このような細胞に適切な標準的技法を使用してなされる。細胞壁による実質的な障壁を含有する細菌細胞には、塩化カルシウムを使用するカルシウム処理を一般に使用する。形質転換のための別の方法では、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを使用する。さらに別の技法では、電気穿孔が使用される。
【０２２６】
本発明のポリペプチドを作製するのに使用される原核細胞は、当技術分野で公知であり、選択された宿主細胞の培養に適する培地中で成長させる。適切な培地の例は、必要な栄養補充物質を加えたルリアブロス（ＬＢ）を含む。一部の実施形態では、培地はまた、発現ベクターを含有する原核細胞の増殖を選択的に可能とするように、発現ベクターの構築に基づき選び出される、選択用薬剤も含有する。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を発現させる細胞を成長させるために、アンピシリンを、培地に添加する。
【０２２７】
炭素供給源、窒素供給源、および無機ホスフェート供給源のほかに、また、任意の必要な補充物質も、適切な濃度で、単独、または複合窒素供給源など、別の補充物質または培地との混合物として、含むことができる。任意選択で、培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトール、およびジチオトレイトールからなる群より選択される、１つまたは複数の還元剤を含有しうる。
【０２２８】
原核宿主細胞は、適切な温度で培養する。Ｅ．ｃｏｌｉを成長させるには、例えば、成長は、約２０℃〜約３９℃、約２５℃〜約３７℃、および約３０℃を含むがこれらに限定されない温度範囲で行う。培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて、約５〜約９の範囲の任意のｐＨでありうる。Ｅ．ｃｏｌｉでは、ｐＨは、約６．８〜約７．４、または約７．０でありうる。
【０２２９】
誘導的プロモーターを、本発明の発現ベクター内で使用する場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に適する条件下で誘導する。本発明の一態様では、ＰｈｏＡプロモーターを、ポリペプチドの転写を制御するために使用する。したがって、形質転換された宿主細胞は、誘導のためのホスフェート制限培地中で培養する。一実施形態では、ホスフェート制限培地は、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２年）、２６３巻：１３３〜１４７頁を参照されたい）。当技術分野で公知の通り、使用されるベクター構築物に従い、他の様々な誘導剤を使用することができる。
【０２３０】
一実施形態では、発現した本発明のポリペプチドは、宿主細胞のペリプラズムに分泌され、ここから回収される。タンパク質の回収は、一般に、浸透圧ショック、超音波処理、または溶解などの手段による微生物の破壊を伴うことが典型的である。細胞を破壊したら、細胞残渣または全細胞は、遠心分離または濾過により除去することができる。タンパク質は、例えば、アフィニティー樹脂クロマトグラフィーにより、さらに精製することができる。代替的に、タンパク質を、培養培地に輸送し、その中で単離することもできる。細胞は、培養物から除去し、産生されたタンパク質のさらなる精製のために、培養上清を、濾過および濃縮することができる。発現させたポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびウェスタンブロットアッセイなど、一般に公知の方法を使用して、さらに単離および同定することができる。
【０２３１】
本発明の一態様では、抗体の作製を、発酵工程により大量に行う。組換えタンパク質の作製のためには、多様な大スケールの流加発酵手順が利用可能である。大スケールの発酵容量は、少なくとも１０００リットル、例えば、約１，０００〜１００，０００リットルである。これらの発酵槽では、撹拌用インペラーを使用して、酸素および栄養物質、とりわけ、グルコース（一般的な炭素／エネルギー供給源）を分配する。小スケールの発酵とは一般に、容積が約１００リットルを超えず、約１リットル〜約１００リットルの範囲にありうる発酵槽内の発酵を指す。
【０２３２】
発酵工程では、タンパク質発現の誘導は、細胞を、適切な条件下で、所望の密度、例えば、ＯＤ５５０で約１８０〜２２０（この段階では、細胞は、早期定常相にある）まで成長させた後で、開始することが典型的である。当技術分野で公知であり、上で記載した通り、使用されるベクター構築物に従い、様々な誘導剤を使用することができる。細胞は、誘導前に、より短い期間で成長させることができる。細胞は通例、約１２〜５０時間誘導するが、より長い誘導時間も、より短い誘導時間も、使用することができる。
【０２３３】
本発明のポリペプチドの作製収量および作製品質を改善するために、多様な発酵条件を改変することができる。例えば、分泌される抗体ポリペプチドの適正なアセンブリーおよびフォールディングを改善するために、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、および／またはＤｓｂＧ）、またはＦｋｐＡ（シャペロン活性を伴う、ペプチジルプロリルｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−イソメラーゼ）など、シャペロンタンパク質を過剰発現させる、さらなるベクターを使用して、宿主原核細胞を共形質転換することができる。シャペロンタンパク質は、適正なフォールディングおよび細菌宿主細胞内で産生される異種タンパク質の溶解度を促進することが裏付けられている。Ｃｈｅｎら、（１９９９）  Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  ２７４：１９６０１−１９６０５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第６，０８３，７１５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第６，０２７，８８８号；Ｂｏｔｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００−１７１０５；Ｒａｍｍ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１０６−１７１１３；Ａｒｉｅら、（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９９−２１０。
【０２３４】
発現させた異種タンパク質（とりわけ、タンパク質分解に対して感受性の異種タンパク質）のタンパク質分解を最小化するため、タンパク質分解酵素について欠損する、ある特定の宿主株を、本発明のために使用することができる。例えば、宿主細胞株は、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｍｉ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｖ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＶＩ、およびこれらの組み合わせなど、公知の細菌プロテアーゼをコードする遺伝子内に、遺伝子変異を施すように改変することができる。一部のＥ．ｃｏｌｉプロテアーゼ欠損株が利用可能であり、例えば、Ｊｏｌｙら（１９９８年）、前出；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第５，２６４，３６５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第５，５０８，１９２号；Ｈａｒａら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、２巻：６３〜７２頁（１９９６年）において記載されている。
【０２３５】
一実施形態では、タンパク質分解酵素について欠損し、１つまたは複数のシャペロンタンパク質を過剰発現させるプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株を、本発明の発現系内の宿主細胞として使用する。
【０２３６】
抗体の精製
【０２３７】
一実施形態では、本明細書で作製される抗体タンパク質をさらに精製して、さらなるアッセイのための、実質的に均質な調製物を得、使用する。当技術分野で公知の、標準的なタンパク質精製法を使用することができる。以下の手順：免疫アフィニティーカラム上またはイオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のまたはＤＥＡＥなどカチオン交換樹脂上のクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、および例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を使用するゲル濾過は、適切な精製手順を例示するものである。
【０２３８】
一態様では、固相上に固定化されたプロテインＡを、本発明の抗体産物の免疫アフィニティー精製のために使用する。プロテインＡとは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅａｓに由来する、４１ｋＤの細胞壁タンパク質であって、抗体のＦｃ領域に、高アフィニティーで結合する（Ｌｉｎｄｍａｒｋら（１９８３年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．、６２巻：１〜１３頁）。プロテインＡを固定化する固相は、ガラス表面もしくはシリカ表面を含むカラム、またはＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）カラムもしくはケイ酸カラムでありうる。一部の適用では、カラムを、グリセロールなどの試薬でコーティングすると、夾雑物の非特異的付着を防止する可能性が高い。
【０２３９】
精製の第１のステップとして、上で記載した細胞培養物に由来する調製物を、プロテインＡを固定化した固相に適用して、目的の抗体の、プロテインＡへの特異的結合を可能とすることができる。次いで、固相を洗浄すると、固相に非特異的に結合した夾雑物が除去される。最後に、目的の抗体を、固相から、溶出により回収する。
【０２４０】
真核宿主細胞を使用する抗体の作製
【０２４１】
ベクターの構成要素は一般に、以下：シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列のうちの１つまたは複数を含むがこれらに限定されない。
【０２４２】
（ｉ）シグナル配列構成要素
【０２４３】
真核宿主細胞における使用のためのベクターはまた、シグナル配列、または、目的の成熟タンパク質もしくは成熟ポリペプチドのＮ末端において特異的切断部位を有する、他のポリペプチドも含有しうる。選択される異種シグナル配列は一般に、宿主細胞により認識およびプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）異種シグナル配列である。哺乳動物細胞の発現では、哺乳動物シグナル配列のほか、ウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルも利用可能である。
【０２４４】
このような前駆体領域のＤＮＡを、リーディングフレーム内で、抗体をコードするＤＮＡにライゲーションする。
【０２４５】
（ｉｉ）複製起点
【０２４６】
一般に、複製起点構成要素は、哺乳動物の発現ベクターに必要とされない。例えば、ＳＶ４０起点は、初期プロモーターを含有するというだけで使用されうることが典型的である。
【０２４７】
（ｉｉｉ）選択遺伝子構成要素
【０２４８】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択用マーカーとも称する、選択遺伝子を含有しうる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生剤または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）該当する場合、栄養要求性欠損を補完する、または（ｃ）複合培地から得られない必須の栄養物質を供給する、タンパク質をコードする。
【０２４９】
選択スキームの１つの例では、宿主細胞の成長を止める薬物を活用する。異種遺伝子による形質転換に成功した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、これにより、選択レジメンを生き残る。このような優性選択の例では、薬物である、ネオマイシン、ミコフェノール酸、およびハイグロマイシンを使用する。
【０２５０】
哺乳動物細胞に適する選択用マーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩおよびＩＩ（例えば、霊長動物メタロチオネイン遺伝子）、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなど、抗体核酸を取り込む能力のある細胞の同定を可能とする選択用マーカーである。
【０２５１】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞はまず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストである、メトトレキセート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中で、形質転換体の全てを培養することにより同定することができる。野生型ＤＨＦＲを使用する場合に適切な宿主細胞は、例えば、ＤＨＦＲ活性を欠損させたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系（例えば；ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−９０９６）を含む。
【０２５２】
代替的に、抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質、およびアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）など、別の選択用マーカーをコードするＤＮＡ配列で形質転換または共形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、アミノグリコシド抗生剤、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８など、選択用マーカーのための選択用薬剤を含有する培地中の細胞成長により選択することができる。米国特許第４，９６５，１９９号を参照されたい。
【０２５３】
（ｉｖ）プロモーター構成要素
【０２５４】
発現ベクターおよびクローニングベクターは通例、宿主生物により認識され、目的のポリペプチド（例えば、抗体）をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含有する。真核生物のプロモーター配列は、公知である。事実上全ての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置する、ＡＴに富む領域を有する。多くの遺伝子の転写の始点から７０〜８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域［配列中、Ｎは、任意のヌクレオチドでありうる］である。大半の真核生物遺伝子の３’末端は、ポリＡテールの、コード配列の３’末端への付加のシグナルでありうる、ＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列の全ては、真核生物発現ベクターに挿入するのに適する。
【０２５５】
哺乳動物宿主細胞内のベクターからの抗体ポリペプチドの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られたプロモーター、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーターに由来するプロモーター、または熱ショックプロモーターに由来するプロモーターにより制御することができるが、このようなプロモーターが、宿主細胞系に適合性があることを条件とする。
【０２５６】
ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点もまた含有する、ＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として簡便に得られる。ウシパピローマウイルスをベクターとして使用して、哺乳動物宿主内でＤＮＡを発現させるための系は、米国特許第４，４１９，４４６号において開示されている。この系の改変については、米国特許第４，６０１，９７８号において記載されている。また、単純ヘルペスウイルスに由来するチミジンキナーゼプロモーターの制御下、マウス細胞内の、ヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現についての、Ｒｅｙｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２９７巻：５９８〜６０１頁（１９８２年）も参照されたい。代替的に、ラウス肉腫ウイルスの長い末端リピートも、プロモーターとして使用することができる。
【０２５７】
（ｖ）エンハンサーエレメント構成要素
【０２５８】
高等真核生物による、本発明の抗体ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列を、ベクターに挿入することにより増大させうることが多い。今や、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）に由来する、多くのエンハンサー配列が、公知である。しかし、真核細胞ウイルスに由来するエンハンサーを使用することが典型的である。例は、複製起点の後期側（１００〜２７０ｂｐ）にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。真核生物プロモーターの活性化のための増強エレメントについては、また、Ｙａｎｉｖ、Ｎａｔｕｒｅ、２９７巻：１７〜１８頁（１９８２年）も参照されたい。エンハンサーは、ベクターに、抗体ポリペプチドコード配列の５’または３’の位置にスプライスされる場合もあるが、一般に、プロモーターの５’の部位に位置する。
【０２５９】
（ｖｉ）転写終結構成要素
【０２６０】
真核宿主細胞内で使用される発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有することが典型的である。このような配列は一般に、真核生物ＤＮＡもしくは真核生物ｃＤＮＡ、またはウイルスＤＮＡもしくはウイルスｃＤＮＡの５’非翻訳領域、場合によって、３’非翻訳領域から得られる。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化断片として転写される、ヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結構成要素は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６およびその中で開示されている発現ベクターを参照されたい。
【０２６１】
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択および形質転換
【０２６２】
本明細書のベクター内でＤＮＡをクローニングするかまたは発現させるのに適する宿主細胞は、脊椎動物宿主細胞を含む本明細書で記載される高等真核細胞を含む。培養物（組織培養物）中の脊椎動物細胞の繁殖は、日常的な手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞系（ＣＯＳ−７；ＡＴＣＣ：ＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児腎臓細胞系（２９３細胞または懸濁培養で成長させるためにサブクローニングされた２９３細胞；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．、３６巻：５９頁（１９７７年））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／ＤＨＦＲ−（ＣＨＯ；Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７７巻：４２１６頁（１９８０年））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４；Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．、２３巻：２４３〜２５１頁（１９８０年））；サル腎臓細胞（ＣＶ１；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６；ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ；ＡＴＣＣ：ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、３８３巻：４４〜６８頁（１９８２年））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒトヘパトーマ細胞系（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０２６３】
宿主細胞は、抗体の作製のための、上で記載した発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように改変された、従来の栄養培地中で培養する。
【０２６４】
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
【０２６５】
本発明の抗体を作製するのに使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養することができる。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞の培養に適する。加えて、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．、５８巻：４４頁（１９７９年）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０２巻：２５５頁（１９８０年）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；もしくは同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国特許再交付第３０，９８５号において記載されている培地のうちのいずれかを、宿主細胞のための培養培地として使用することもできる。これらの培地のうちのいずれかには、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびホスフェートなど）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生剤（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬など）、微量元素（通例マイクロモル濃度範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、ならびにグルコースもしくは同等のエネルギー供給源を補充することができる。また、他の任意の必要な補充物質も、当業者に公知の適切な濃度で含むことができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に対して既に使用された培養条件であり、当業者に明らかである。
【０２６６】
（ｉｘ）抗体の精製
【０２６７】
組換え技法を使用する場合、抗体は、細胞内で産生させること、または培地に直接分泌させることができる。抗体を細胞内で産生させる場合、最初のステップとして、宿主細胞または溶解させた断片のいずれかである粒子状残渣は一般に、例えば、遠心分離または限外濾過により除去する。抗体を培地に分泌させる場合、このような発現系に由来する上清は一般に、まず、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ限外濾過ユニットまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を前出のステップのうちのいずれかに含み、タンパク質分解を阻害することができ、偶発性の夾雑物の成長を防止するために抗生剤が含まれ得る。
【０２６８】
細胞から調製される抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーは一般に、許容可能な精製技法である。プロテインＡなどのアフィニティー試薬の、アフィニティーリガンドとしての適性は、抗体内に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用して、ヒトγ１重鎖、ヒトγ２重鎖、またはヒトγ４重鎖に基づく抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．、６２巻：１〜１３頁（１９８３年））。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプおよびヒトγ３のために推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、５巻：１５６７〜１５７５頁（１９８６年））。アフィニティーリガンドを付着させるマトリックスは大部分、アガロースであることが多いが、他のマトリックスも利用可能である。ＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなど、力学的に安定的なマトリックスは、アガロースに対して達成しうる流量より大きな流量およびアガロースに対して達成しうる加工時間より短い加工時間を可能とする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合は、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．  Ｔ．  Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が精製のために有用である。また、イオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリン上のクロマトグラフィー、アニオン交換樹脂上またはカチオン交換樹脂上（ポリアスパラギン酸カラムなど）のＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿など、タンパク質精製のための他の技法も、回収される抗体に応じて利用可能である。
【０２６９】
任意の予備的精製ステップの後、目的の抗体と夾雑物とを含む混合物を、必要に応じて、例えば、ｐＨを約２．５〜４．５の間とする溶出緩衝液を使用し、一般に低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で実施される、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにより、さらなる精製ステップにかけることができる。
【０２７０】
当技術分野では、一般に、研究、検査、および臨床使用における使用のための抗体を調製するための技法および方法論が十分に確立されており、上記とも符合し、かつ／または目的の特定の抗体に適切であると当業者にみなされていることに留意されたい。
【０２７１】
活性アッセイ
【０２７２】
本発明の抗体は、それらの物理的特性／化学的特性および生物学的機能について、当技術分野で公知の多様なアッセイにより特徴付けることができる。
【０２７３】
精製された抗体は、Ｎ末端シークェンシング、アミノ酸解析、非変性サイズ除外高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析、イオン交換クロマトグラフィー、およびパパイン消化を含むがこれらに限定されない、一連のアッセイによりさらに特徴付けることができる。
【０２７４】
必要な場合は、抗体を、それらの生物学的活性について解析する。一部の実施形態では、本発明の抗体を、それらの抗原結合活性について調べる。当技術分野で公知であり、本明細書で使用しうる抗原結合性アッセイは、限定せずに述べると、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、およびプロテインＡイムノアッセイなどの技法を使用する、任意の直接的結合アッセイまたは競合的結合アッセイを含む。
【０２７５】
一実施形態では、本発明は、全てではないが一部のエフェクター機能を有する改変された抗体を想定しており、このことが、この抗体を、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が重要であるがある特定のエフェクター機能（例えば、補体およびＡＤＣＣ）が不要または有害である多くの適用に望ましい候補にしている。ある特定の実施形態では、抗体のＦｃ活性は、所望の特性だけが維持されることを確実にするために測定される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害アッセイおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害アッセイが、ＣＤＣ活性および／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認するために実施されうる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（したがって、ＡＤＣＣ活性をおそらくは欠く）がＦｃＲｎ結合能を保持することを確実にするために実施されうる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９巻：４５７〜９２頁（１９９１年）の４６４頁の表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの例は、米国特許第５，５００，３６２号または米国特許第５，８２１，３３７号に記載されている。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代替的に、または加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、ＰＮＡＳ  （ＵＳＡ）  ９５巻：６５２〜６５６頁（１９９８年）に開示されたものなどの動物モデルにおいて評価されうる。Ｃ１ｑ結合アッセイもまた、抗体がＣ１ｑに結合できず、したがってＣＤＣ活性を欠くことを確認するために実行されうる。補体活性化を評価するために、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２巻：１６３頁（１９９６年）に記載されるようなＣＤＣアッセイが実施されうる。ＦｃＲｎ結合およびｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス／半減期の決定もまた、当技術分野で公知の方法を使用して実施されうる。
【０２７６】
抗体断片
【０２７７】
本発明は、抗体断片を包含する。ある特定の状況では、全抗体ではなく、抗体断片を使用することが有利である。より小サイズの断片は、急速なクリアランスを可能とし、充実性腫瘍への接近の改善をもたらしうる。
【０２７８】
抗体断片を産生するための多様な技法が開発されている。従来、これらの断片は、無傷抗体のタンパク質分解性消化を介して導出した（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４巻：１０７〜１１７頁（１９９２年）；およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻：８１頁（１９８５年）を参照されたい）。しかし、今やこれらの断片は、組換え宿主細胞に直接産生させることができる。Ｆａｂ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、およびＳｃＦｖ抗体断片は全て、Ｅ．ｃｏｌｉ内で発現し、Ｅ．ｃｏｌｉから分泌され、このため、これらの断片の大量の作製が容易に可能となりうる。抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリーから単離することができる。代替的に、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収し、化学的にカップリングさせて、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することもできる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：１６３〜１６７頁（１９９２年））。別の手法に従い、Ｆ（ａｂ’）２断片を、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長したＦａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片については、米国特許第５，８６９，０４６号において記載されている。当業者には、抗体断片を作製するための他の技法も明らかであろう。他の実施形態では、選択した抗体は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および同第５，５８７，４５８号を参照されたい。ＦｖおよびｓＦｖは、定常領域を欠く無傷の結合部位を伴う唯一の分子種であり、このため、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける使用時に非特異的結合を低減するのに適する。ｓＦｖ融合タンパク質を構築して、ｓＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにおけるエフェクタータンパク質の融合をもたらすことができる。Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編、前出を参照されたい。例えば、抗体断片はまた、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載の通り、「直鎖状抗体」でもありうる。このような直鎖状抗体断片は、一特異性であっても二特異性であってもよい。
【０２７９】
ヒト化抗体
【０２８０】
本明細書で記載される抗体のうちのいずれも、全長抗体またはその抗原結合性断片の場合がある。一部の例では、抗原結合性断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、または単鎖Ｆｖ断片である。一部の例では、抗原結合性断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、または単鎖Ｆｖ断片である。一部の例では、単離抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、または単鎖抗体である。
【０２８１】
本明細書で記載される抗体のうちのいずれも、以下：
【０２８２】
ａ）組換え抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体断片、二特異性抗体、一特異性抗体、一価抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、または抗体の誘導体であること；ｂ）ヒト抗体、マウス抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、抗原結合性断片、または抗体の誘導体であること；ｃ）単鎖抗体断片、マルチボディー（ｍｕｌｔｉｂｏｄｙ）、Ｆａｂ断片、ならびに／またはＩｇＧアイソタイプ、ＩｇＭアイソタイプ、ＩｇＡアイソタイプ、ＩｇＥアイソタイプ、ＩｇＤアイソタイプ、および／もしくはこれらのサブクラスの免疫グロブリンであること；ｄ）以下の特徴：（ｉ）がん細胞のＡＤＣＣおよび／もしくはＣＤＣを媒介すること；（ｉｉ）がん細胞のアポトーシスを誘導および／もしくは促進すること；（ｉｉｉ）がん細胞の標的細胞の増殖を阻害すること；（ｉｖ）がん細胞の食作用を誘導および／もしくは促進すること；ならびに／または（ｖ）細胞傷害剤の放出を誘導および／もしくは促進することのうちの１つまたは複数を有すること；ｅ）腫瘍特異的炭水化物抗原である、腫瘍関連炭水化物抗原に特異的に結合すること；ｆ）非がん細胞上、非腫瘍細胞上、良性がん細胞上、および／または良性腫瘍細胞上で発現する抗原に結合しないこと；ならびに／またはｇ）がん幹細胞上および通常のがん細胞上で発現する腫瘍関連炭水化物抗原に特異的に結合すること
のうちの１つまたは複数の特徴を有する。
【０２８３】
抗体の、それらのそれぞれの抗原への結合は、特異的であることが好ましい。「特異的」という用語は、結合対の一方のメンバーが、その特異的結合パートナー以外の分子への著明な結合を示さず、例えば、本明細書で指定される分子以外の他の任意の分子との交差反応性が、約３０％未満、好ましくは、２０％、１０％、または１％である状況を指すのに一般に使用される。
【０２８４】
抗体は、その標的エピトープに、高アフィニティー（低ＫＤ値）で結合するのに適し、ＫＤは、ナノモル濃度単位の範囲またはこれより低値の範囲であることが好ましい。アフィニティーは、例えば、表面プラズモン共鳴など、当技術分野で公知の方法により測定することができる。
【０２８５】
例示的な抗体調製物
【０２８６】
本明細書で記載されるＧｌｏｂｏ  ＨエピトープおよびＳＳＥＡ−４エピトープに結合することが可能な例示的な抗体は、当技術分野で公知の任意の方法により作製することができる。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【０２８７】
宿主動物の免疫化およびハイブリドーマ技術
【０２８８】
抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体および抗ＳＳＥＡ−４抗体に対する例示的なポリクローナル抗体は、従来の任意の方法により、血清中の所望の抗体の増大について検討される免疫化哺乳動物から、血液を回収し、血清を血液から分離することにより調製することができる。ポリクローナル抗体は、ポリクローナル抗体を含有する血清を含み、同様に、ポリクローナル抗体を含有する画分は、血清から単離することができる。
【０２８９】
ポリクローナル抗体は一般に、宿主動物（例えば、ウサギ、マウス、ウマ、またはヤギ）において、関連抗原およびアジュバントの、複数回の皮下（ｓｃ）注射または腹腔内（ｉｐ）注射により惹起する。二官能性薬剤または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２などを使用して、関連抗原を、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、スカシガイヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシン阻害剤にコンジュゲートさせることは、有用でありうる。
【０２９０】
任意の哺乳動物は、所望の抗体を作製するための抗原で免疫化することができる。一般に、Ｒｏｄｅｎｔｉａ、Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ、またはＰｒｉｍａｔｅｓの動物を使用することができる。Ｒｏｄｅｎｔｉａの動物は、例えば、マウス、ラット、およびハムスターを含む。Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａの動物は、例えば、ウサギを含む。Ｐｒｉｍａｔｅｓの動物は、例えば、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、アカゲザル、ヒヒ、およびチンパンジーなど、Ｃａｔａｒｒｈｉｎｉ目のサル（旧世界ザル）を含む。
【０２９１】
当技術分野では、動物を抗原で免疫化するための方法が公知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射は、哺乳動物の免疫化のための標準的な方法である。より具体的には、抗原は、適量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水などで希釈し、懸濁させることができる。所望の場合、抗原懸濁液は、フロイント完全アジュバントなど、適量の標準的なアジュバントと混合し、エマルジョンにして、次いで、哺乳動物に投与することができる。動物は、１ｍｇまたは１μｇのペプチドまたはコンジュゲート（それぞれ、ウサギ用またはマウス用）を、３容量のフロイント不完全アジュバントと組み合わせることにより、抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対して免疫化する。
【０２９２】
動物には、力価がプラトーとなるまで、適量のフロイント不完全アジュバントと混合された抗原を、４〜２１日ごとに数回投与することにより追加免疫することができる。動物には、フロイント完全アジュバント中に元の量の５分の１〜１０分の１のペプチドまたはコンジュゲートを、複数の部位における皮下注射により追加免疫する。７〜１４日後、動物から採血し、血清を、抗体力価についてアッセイする。適切な担体はまた、免疫化のためにも使用することができる。上記の免疫化の後で、血清を、標準的な方法により、所望の抗体の量の増大について検討する。好ましくは、動物には、同じ抗原のコンジュゲートを追加免疫するが、異なるタンパク質へ、かつ／または異なる架橋試薬を介してコンジュゲートさせる。コンジュゲートはまた、組換え細胞培養物中で、タンパク質融合体としても作製することができる。また、ミョウバンなどの凝集剤も、免疫応答を増強するのに使用すると適切である。
【０２９３】
過去２０〜３０年間にわたり、ヒトｉｎ  ｖｉｖｏにおける治療適用のためのキメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体を調製する、多数の方法が開発されている。最もよく使用され、実績のある方法は、ハイブリドーマ法を使用してマウスｍＡｂを調製し、次いで、ＶＨドメインおよびＶＬドメインのフレームワーク領域、ならびにｍＡｂの定常ドメインを、ヒトＶＨドメインおよびＶＬドメインの、最も相同なヒトフレームワーク領域、ならびに望ましいヒトγ免疫グロブリンのアイソタイプおよびサブクラスの定常領域に転換することにより、ｍＡｂをヒト化することである。臨床で使用されるＸｏｌａｉｒなど、多くのｍＡｂは、ヒトγ１アイソタイプおよびヒトγ１サブクラスならびにヒトκアイソタイプおよびヒトκサブクラスのヒト化ｍＡｂであり、この方法を使用して調製される。
【０２９４】
一部の実施形態では、抗体は、従来のハイブリドーマ技術により作製することができる（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁（１９７５年））。ハイブリドーマ法では、マウス、または、ハムスターもしくはウサギなど、他の適切な宿主動物を、本明細書の上で記載した通りに免疫化して、免疫化のために使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、またはこれらを産生することが可能なリンパ球を誘発する。代替的に、リンパ球は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫化することもできる。
【０２９５】
モノクローナル抗体を調製するために、免疫細胞を、抗原で免疫化された哺乳動物から回収し、上で記載した、血清中に高レベルの所望の抗体について点検し、細胞融合にかける。細胞融合のために使用される免疫細胞は、脾臓から得ることが好ましい。上記の免疫担当細胞と融合させる、他の好ましい親細胞は、例えば、哺乳動物の骨髄腫細胞、より好ましくは、融合細胞を薬物により選択するための獲得特性を有する骨髄腫細胞を含む。
【０２９６】
好ましい骨髄腫細胞は、融合が効率的であり、選択された抗体産生細胞による安定的で高レベルの抗体の産生を支援し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感受性の骨髄腫細胞である。これらの中で、好ましい骨髄腫細胞系は、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１マウス腫瘍およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．  ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２細胞に由来するものなどのマウス骨髄腫細胞系である。また、ヒト骨髄腫細胞系およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系も、ヒトモノクローナル抗体の作製について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３巻：３００１頁（１９８４年）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７年））。
【０２９７】
上記の免疫担当細胞および骨髄腫細胞は、公知の方法、例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎらによる方法（Ｇａｌｆｒｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、７３巻：３〜４６頁、１９８１年）に従い融合させることができる。ハイブリドーマ細胞を形成するように、ポリエチレングリコールなど、適切な融合剤を使用して、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させる（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６年））。細胞融合により結果として得られるハイブリドーマは、それらを、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含有する培地）など、標準的な選択培地中で培養することにより選択することができる。細胞の培養は、典型的にはＨＡＴ培地中で数日間〜数週間持続させ、その時間は、所望のハイブリドーマ（非融合細胞）を除き、他の全ての細胞を死滅させるのに十分である。次いで、標準的な限界希釈を実施して、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングおよびクローニングする。
【０２９８】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、好ましくは非融合親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つまたは複数の物質を含有する、適切な培養培地中に播種し、成長させる。例えば、親骨髄腫細胞が、酵素である、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的にはＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を防止する物質である、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含む。
【０２９９】
ハイブリドーマ細胞が成長する培養培地を、抗原に指向されるモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイにより決定する。酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および／または免疫蛍光における吸光度の測定を使用して、本発明の抗体の抗原結合活性を測定することができる。ＥＬＩＳＡでは、本発明の抗体を、プレート上に固定化し、本発明のタンパク質をプレートに適用し、次いで、抗体産生細胞の培養上清または精製抗体など、所望の抗体を含有する試料を適用する。次いで、一次抗体を認識し、アルカリホスファターゼなどの酵素で標識された二次抗体を適用し、プレートをインキュベートする。次に、洗浄の後で、ｐ−ニトロフェニルホスフェートなどの酵素基質を、プレートに添加し、吸光度を測定して、試料の抗原結合活性を評価する。この方法では、Ｃ末端断片またはＮ末端断片など、タンパク質の断片を使用することができる。ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、本発明に従う抗体の活性を評価することができる。モノクローナル抗体の結合アフィニティーは、例えば、Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７巻：２２０頁（１９８０年）のスキャッチャード解析により決定することができる。
【０３００】
上で記載した方法を含む従来の方法のうちのいずれかを適用して、本明細書で記載されるエピトープに結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、さらなる特徴付けのために同定および選択することができる。
【０３０１】
所望の特異性、アフィニティー、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後で、クローンを、限界希釈手順によりサブクローニングし、標準的な方法により成長させる（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６年））。この目的に適する培養培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭ培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなど、従来の免疫グロブリン精製手順により、培養培地、腹水、または血清から適切に分離される。
【０３０２】
加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍（ａｓｃｉｔｅｓ  ｔｕｍｏｒ）として、ｉｎ  ｖｉｖｏで成長させることもできる。例えば、得られるハイブリドーマは、その後、マウスの腹腔に移植することができ、腹水を採取する。
【０３０３】
得られるモノクローナル抗体は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、プロテインＡカラムもしくはプロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、または本発明のタンパク質をカップリングさせたアフィニティーカラムにより精製することができる。本発明の抗体は、本発明のタンパク質を精製および検出するためだけでなく、また、本発明のタンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストのための候補としても使用することができる。加えて、この抗体は、本発明のタンパク質と関連する疾患のための、抗体処置へも適用することができる。
【０３０４】
組換え技術
【０３０５】
このようにして得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子操作技法を使用して、組換えにより調製することもできる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  Ｃ．  Ａ．  Ｋ．およびＬａｒｒｉｃｋ  Ｊ．  Ｗ．、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  ＬＴＤ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ刊、１９９０年を参照されたい）。抗体をコードするＤＮＡを、抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫化リンパ球などの免疫細胞からクローニングし、適切なベクターに挿入し、宿主細胞に導入して、組換え抗体を調製することができる。本発明はまた、上で記載したように調製した組換え抗体も提供する。
【０３０６】
得られた抗体を、ヒト体内に投与する場合（抗体処置）、免疫原性を低減するために、ヒト抗体またはヒト化抗体が好ましい。例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物は、タンパク質、タンパク質発現細胞、またはそれらの溶解物から選択される抗原で免疫化することができる。次いで、抗体産生細胞を動物から回収し、骨髄腫細胞と融合させて、タンパク質に対するヒト抗体を調製しうるハイブリドーマを得る。代替的に、抗体を産生する免疫化リンパ球などの免疫細胞は、がん遺伝子により不死化し、モノクローナル抗体を調製するために使用することができる。
【０３０７】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、たやすく単離およびシークェンシングすることができる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源としての役割を果たす。単離されたら、ＤＮＡを、発現ベクターに入れ、次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または別途免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞内のモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体をコードするＤＮＡの、細菌内の組換え発現についての総説論文は、Ｓｋｅｒｒａら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５巻：２５６〜２６２頁（１９９３年）およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．、１３０巻：１５１〜１８８頁（１９９２年）を含む。
【０３０８】
上で記載したハイブリドーマ細胞により産生される抗体をコードするＤＮＡを、日常的な技術を介して遺伝子改変して、遺伝子操作された抗体を作製することができる。ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、および二特異性抗体などの遺伝子操作された抗体は、例えば、従来の組換え技術を介して作製することができる。次いで、例えば、ヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインのコード配列で、相同なマウス配列を置換すること（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、８１巻：６８５１頁）により、または、免疫グロブリンのコード配列へ、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または一部を共有結合的に接合することにより修飾することができる。このようにして、標的抗原への結合特異性を有する、「キメラ」抗体または「ハイブリッド」抗体などの遺伝子操作された抗体を調製することができる。
【０３０９】
当技術分野では、「キメラ抗体」の作製のために開発された技法が周知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８１巻、６８５１頁；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（１９８４年）、Ｎａｔｕｒｅ、３１２巻、６０４頁；およびＴａｋｅｄａら（１９８４年）、Ｎａｔｕｒｅ、３１４巻：４５２頁を参照されたい。
【０３１０】
このような非免疫グロブリンポリペプチドで、抗体の定常ドメインを置換するか、または抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインを置換して、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位とを含む、キメラ二価抗体を創出することが典型的である。
【０３１１】
キメラ抗体またはハイブリッド抗体はまた、架橋剤を伴う方法を含む、合成タンパク質化学において公知の方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製することもできる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することにより構築することができる。この目的に適する試薬の例は、イミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｔｅ）およびメチル−４−メルカプトブチルイミデートを含む。
【０３１２】
当技術分野では、非ヒト抗体をヒト化するための方法が周知である。一般に、ヒト化抗体には、非ヒト供給源に由来する１つまたは複数のアミノ酸残基が導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と称することが多く、これは、「移入」可変ドメインから採取されることが典型的である。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らによる方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２７頁（１９８８年）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁（１９８８年））に従い、齧歯動物ＣＤＲまたは齧歯動物ＣＤＲ配列で、ヒト抗体の対応する配列を置換することにより、本質的に実施することができる。したがって、このような「ヒト化」抗体とは、実質的に無傷に満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種に由来する対応する配列で置換されているキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際は、ヒト化抗体は、一部のＣＤＲ残基と、おそらく、一部のＦＲ残基とが、齧歯動物抗体内の類似の部位に由来する残基で置換されているヒト抗体であることが典型的である。
【０３１３】
ヒト化抗体を作製するのに使用される、軽鎖ヒト可変ドメインおよび重鎖ヒト可変ドメインのいずれの選択も、抗原性を低減するのに非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法に従い、齧歯動物抗体の可変ドメイン配列を、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに照らしてスクリーニングする。次いで、齧歯動物の配列に最も近接するヒト配列を、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受容する（Ｓｉｍｓら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２２９６頁（１９９３年）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１頁（１９８７年））。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定の亜群についての、全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体のために使用することができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：４２８５頁（１９９２年）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．  Ｉｍｍｎｏｌ．、１５１巻：２６２３頁（１９９３年））。
【０３１４】
抗原に対する高アフィニティーおよび他の好適な生物学的特性を保持するように抗体をヒト化することは、さらに重要である。この目標を達成するために、好ましい方法に従い、ヒト化抗体を、親配列およびヒト化配列についての三次元モデルを使用する、親配列および多様な概念上のヒト化産物についての解析工程により調製する。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者は、これに精通している。選択された候補免疫グロブリン配列についての、あり得る三次元コンフォメーション構造を例示および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示について検討することにより、候補免疫グロブリン配列の機能において推定される残基の役割についての解析、すなわち、候補免疫グロブリンが、その抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基についての解析が可能となる。このようにして、標的抗原に対するアフィニティーの増大など、所望の抗体特徴を達成するように、ＦＲ残基は、レシピエント配列および移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原への結合に対する影響に、直接、かつ、極めて実質的に関与する。
【０３１５】
今や、代替的に、免疫化されると、内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することもできる。例えば、キメラおよび生殖細胞系列の変異体マウスにおける、抗体重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性の欠失の結果として、内因性抗体産生の完全な阻害がもたらされることが記載されている。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子アレイを、このような生殖細胞系列変異体マウスに導入する結果として、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生がもたらされる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻：２５５１頁（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻：２５５〜２５８頁（１９９３年）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．、７巻：３３頁（１９９３年）を参照されたい。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーから導出することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２７巻：３８１頁（１９９１年）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年））。
【０３１６】
また、本明細書で記載される抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体および抗ＳＳＥＡ−４抗体（重鎖、軽鎖、またはこれらの両方を含む）をコードする核酸、核酸のうちの１つまたは複数を含む発現ベクターなどのベクター、およびベクターのうちの１つまたは複数を含む宿主細胞のうちのいずれも、本開示の範囲内にある。一部の例では、ベクターは、本明細書で記載される抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。一部の例では、ベクターは、本明細書で記載される抗ＳＳＥＡ−４抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。他の例では、ベクターは、それらの発現が、単一のプロモーターまたは２つの別個のプロモーターにより制御される場合がある、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方をコードするヌクレオチド配列を含む。本明細書ではまた、例えば、このセクションで記載される組換え技術を介して、本明細書で記載される抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体および抗ＳＳＥＡ−４抗体のうちのいずれかを作製するための方法も提供される。
【０３１７】
抗体を調製するための他の技術
【０３１８】
他の実施形態では、完全ヒト抗体は、特異的なヒト免疫グロブリンタンパク質を発現させるように操作された市販のマウスを使用することにより得ることができる。また、より所望される免疫応答（例えば、完全ヒト抗体）またはより頑健な免疫応答をもたらすようにデザインされたトランスジェニック動物も、ヒト化抗体またはヒト抗体の作製のために使用することができる。このような技術の例は、Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ．）製のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）、ならびにＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）製のＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ  Ｍｏｕｓｅ（商標）である。別の代替法では、抗体は、ファージディスプレイ技術による組換えにより作製することができる。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号；同第５，５８０，７１７号；同第５，７３３，７４３号；および同第６，２６５，１５０号；ならびにＷｉｎｔｅｒら（１９９４年）、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２巻：４３３〜４５５頁を参照されたい。代替的に、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０年）、Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻：５５２〜５５３頁）を使用して、ヒト抗体および抗体断片を、非免疫化ドナーに由来する免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて産生することもできる。
【０３１９】
無傷抗体（全長抗体）の抗原結合性断片は、日常的な方法を介して調製することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体分子のペプシン消化により作製することができ、Ｆａｂ断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより作り出すことができる。
【０３２０】
代替的に、本明細書で記載される抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体および抗ＳＳＥＡ−４抗体は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻：５５２〜５５４頁（１９９０年）；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）；およびＭａｒｋｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年）において記載されている技法を使用して作り出された抗体ファージライブラリー（例えば、単鎖抗体ファージライブラリー）から単離することができる。後続の刊行物は、鎖シャフリングによる高アフィニティー（ｎＭ範囲）のヒト抗体の作製（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年））、ならびに非常に大規模なファージライブラリーを構築するための戦略としての、コンビナトリアル感染およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．、２１巻：２２６５〜２２６６頁（１９９３年））について記載している。こうして、これらの技法は、モノクローナル抗体を単離するための、従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技法に対する実行可能な代替法である。
【０３２１】
本明細書で記載される通りに得られた抗体は、均質となるまで精製することができる。例えば、抗体の分離および精製は、一般のタンパク質のために使用される分離法および精製法に従い実施することができる。例えば、抗体は、アフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動、およびその他（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年）であるがこれらに限定されないものを、適切に選択し、組み合わせて使用することにより、分離および単離することができる。上記の通りに得られた抗体の濃度は、吸光度の測定、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などにより決定することができる。アフィニティークロマトグラフィーを除く例示的なクロマトグラフィーは、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなど（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ、Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．  Ｍａｒｓｈａｋら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年）を含む。クロマトグラフィー手順は、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィーにより実行することができる。
【０３２２】
抗体は、当技術分野で周知の方法を使用して特徴付けることができる。例えば、１つの方法は、抗原が結合するエピトープを同定すること、または「エピトープマッピング」である。当技術分野では、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９９９年の１１章において記載されている、抗体−抗原複合体の結晶構造の分解、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および合成ペプチドベースのアッセイを含む、タンパク質上のエピトープの位置をマッピングし特徴付けるための多く方法が公知である。さらなる例では、エピトープマッピングを使用して、抗体が結合する配列を決定することができる。エピトープは、直鎖状エピトープ、すなわち、アミノ酸の単一の連なりの中に含有される直鎖状エピトープ、または単一の連なり（一次構造の直鎖状配列）の中に必ずしも含有されない可能性があるアミノ酸の三次元的相互作用により形成される、コンフォメーショナルエピトープの場合がある。長さを変化させるペプチド（例えば、少なくとも４〜６アミノ酸の長さ）を単離または合成し（例えば、組換えにより）、抗体を伴う結合アッセイのために使用することができる。別の例では、抗体が結合するエピトープは、標的抗原配列に由来する重複ペプチドを使用し、抗体による結合を決定することにより、体系的スクリーニングで決定することができる。遺伝子断片発現アッセイに従い、標的抗原をコードするオープンリーディングフレームを、ランダムに、または特異的遺伝子構築により断片化し、発現した抗原の断片の、被験抗体との反応性を決定する。例えば、ＰＣＲにより遺伝子断片を作製し、次いで、放射性アミノ酸の存在下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、タンパク質に転写および翻訳させることができる。次いで、抗体の、放射性標識された抗原断片への結合を、免疫沈降およびゲル電気泳動により決定する。ある特定のエピトープはまた、ファージ粒子の表面上でディスプレイされるランダムなペプチド配列の大規模ライブラリー（ファージライブラリー）を使用することにより同定することもできる。代替的に、重複ペプチド断片の規定されたライブラリーは、単純な結合アッセイにおいて、試験抗体への結合について調べることができる。
【０３２３】
さらなる例では、抗原結合性ドメインに対する変異誘発、ドメインスワッピング実験、およびアラニン走査変異誘発を実施して、エピトープの結合に要請され、十分であり、かつ／または必要な残基を同定することができる。例えば、ドメインスワッピング実験は、候補抗体に対する結合エピトープ内の多様な残基が、近縁であるが抗原的に顕著に異なるタンパク質（ニュートロフィンタンパク質ファミリーの別のメンバーなど）に由来する配列で置きかえられた（スワッピングされた）、標的抗原の変異体を使用して実施することができる。抗体の、変異体の標的タンパク質への結合を評価することにより、特定の抗原断片の、抗体の結合に対する重要性を評価することができる。
【０３２４】
代替的に、競合アッセイは、抗体（例えば、本明細書で記載されるＭＣ４５抗体）が、他の抗体と同じエピトープに結合するのかどうかを決定するように、同じ抗原に結合することが公知の他の抗体を使用して実施することができる。競合アッセイは、当業者に周知である。
【０３２５】
例示的で適切な一般的抗体作製法のさらなる態様
【０３２６】
当技術分野では、動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、またはウマ）においてモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体ならびにこれらの断片を作製する方法が周知である。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。「抗体」という用語は、無傷の免疫グロブリン分子のほか、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖抗体）、およびｄＡｂ（ドメイン抗体；Ｗａｒｄら（１９８９年）、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、５４４頁）など、これらの断片を含む。
【０３２７】
本明細書で開示される組成物は、本開示を読んだ当業者に同定可能な、さらなる活性剤、担体、ビヒクル、賦形剤、または補助剤と併せて、医薬組成物中に含むことができる。
【０３２８】
医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含むことが好ましい。このような医薬組成物中で、本明細書で開示される組成物は、「活性剤」とも称する「活性化合物」を形成する。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という表現は、医薬品の投与と適合性の、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。また、補助的な活性化合物も、組成物に組み込むことができる。医薬組成物は、その意図された投与経路と適合性となるように製剤化する。投与経路の例は、非経口投与、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口（例えば、吸入）投与、経皮（局所）投与、経粘膜投与、および直腸投与を含む。非経口適用、皮内適用、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の構成要素：注射用水、食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの滅菌希釈液；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；アセテート、シトレート、またはホスフェートなどの緩衝剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなど、張度を調整するための薬剤を含みうる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口調製物は、アンプル内、使い捨て型のシリンジ内、またはガラス製もしくはプラスチック製の複数用量バイアル内に封入することができる。
【０３２９】
少なくとも１つの抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体、または抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体をコードする配列を含む、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物が提供される。ある特定の実施形態では、組成物は、医薬組成物でありうる。本明細書で使用される、組成物は、１つもしくは複数のＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈに結合する１つもしくは複数の抗体、および／または１つもしくは複数のＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈに結合する１つもしくは複数の抗体をコードする配列を含む、１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、当技術分野で周知の緩衝剤を含む、薬学的に許容される賦形剤などの適切な担体もさらに含みうる。
【０３３０】
単離抗体ならびにポリヌクレオチドもまた提供される。ある特定の実施形態では、単離抗体およびポリヌクレオチドは、実質的に純粋である。
【０３３１】
一実施形態では、抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体は、モノクローナル抗体である。別の実施形態では、抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体の断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、およびＦ（ａｂ’）２断片）が提供される。これらの抗体断片は、酵素的消化など、従来の手段により創出することもでき、組換え技法により作り出すこともできる。このような抗体断片は、キメラ抗体断片、ヒト化抗体断片、またはヒト抗体断片の場合がある。これらの断片は、下記に示される診断目的および治療目的に有用である。
【０３３２】
当技術分野では、目的の抗体を得られうる、ファージディスプレイライブラリーを作り出すための様々な方法が公知である。目的の抗体を作り出す１つの方法は、Ｌｅｅら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．（２００４年）、３４０巻（５号）：１０７３〜９３頁において記載されている、ファージ抗体ライブラリーの使用を介する。
【０３３３】
本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体は、コンビナトリアルライブラリーを使用して、１つまたは複数の所望の活性を伴う合成抗体クローンについてスクリーニングすることにより作製することができる。原則として、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質に融合させた、抗体可変領域の多様な断片（Ｆｖ）をディスプレイするファージを含有するファージライブラリーをスクリーニングすることにより選択する。このようなファージライブラリーを、所望の抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによりパニングする。所望の抗原に結合することが可能なＦｖ断片を発現させるクローンを、抗原に吸着させ、これにより、ライブラリー内の非結合性クローンから分離する。次いで、結合性クローンを抗原から溶出させ、さらなる抗原吸着／溶出サイクルにより、さらに富化することができる。本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体のいずれも、適切な抗原スクリーニング手順をデザインして、目的のファージクローンについて選択した後で、目的のファージクローンに由来するＦｖ配列と、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ第９１−３２４２号、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．（１９９１年）、１〜３巻において記載されている、適切な定常領域（Ｆｃ）配列とを使用して、全長抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体クローンを構築することにより得ることができる。
【０３３４】
抗体の抗原結合性ドメインは、約１１０アミノ酸の２つの可変（Ｖ）領域であって、１つずつが軽（ＶＬ）鎖および重（ＶＨ）鎖に由来し、いずれもが、３つの超可変ループまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）を提示する、Ｖ領域から形成される。Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２巻：４３３〜４５５頁（１９９４年）において記載される通り、可変ドメインは、ＶＨとＶＬとが、短い可撓性ペプチドを介して共有結合的に連結された、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、またはそれらの各々が、定常ドメインに融合し、非共有結合的に相互作用する、Ｆａｂ断片として、ファージ上に機能的にディスプレイされ得る。本明細書で使用される、ｓｃＦｖをコードするファージクローンおよびＦａｂをコードするファージクローンを、まとめて、「Ｆｖファージクローン」または「Ｆｖクローン」と称する。
【０３３５】
ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングし、ファージライブラリー内でランダムに組み換えることができ、次いで、これを、Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２巻：４３３〜４５５頁（１９９４年）において記載されている通り、抗原結合性クローンについて検索することができる。免疫化供給源に由来するライブラリーは、ハイブリドーマの構築を必要とせずに、免疫原に対する高アフィニティー抗体を提供する。代替的に、ナイーブレパートリーをクローニングして、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ、１２巻：７２５〜７３４頁（１９９３年）により記載される通り、免疫化を伴わずに、広範にわたる、非自己抗原に対するヒト抗体と、また自己抗原に対するヒト抗体とによる、単一の供給源を提供することもできる。最後に、ナイーブライブラリーはまた、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２７巻：３８１〜３８８頁（１９９２年）により記載されている通り、幹細胞に由来する、再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードするランダムな配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して、、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける再配列を達成することにより、合成で作製することもできる。
【０３３６】
糸状ファージを、マイナーコートタンパク質ｐＩＩＩへの融合により抗体断片をディスプレイするのに使用する。抗体断片は、例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年）により記載されている通り、ＶＨドメインとＶＬドメインとが、同じポリペプチド鎖上で、可撓性のポリペプチドスペーサーにより接続される、単鎖Ｆｖ断片として、または、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９巻：４１３３〜４１３７頁（１９９１年）において記載されている通り、一方の鎖が、ｐＩＩＩに融合し、他方の鎖が、細菌宿主細胞ペリプラズムに分泌され、ここで、Ｆａｂ−コートタンパク質構造のアセンブリーが、野生型コートタンパク質の一部を取り換えることにより、ファージ表面上にディスプレイされる、Ｆａｂ断片としてディスプレイすることができる。
【０３３７】
一般に、抗体遺伝子断片をコードする核酸は、ヒトまたは動物から採取された免疫細胞から得られる。抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈクローンに好適なバイアスのかかったライブラリーが所望される場合、対象を、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈで免疫化して、抗体応答を発生させ、脾臓細胞および／もしくは循環Ｂ細胞、または他の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、ライブラリー構築のために回収する。一実施形態では、抗ヒトＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈクローンに好適なバイアスのかかったヒト抗体遺伝子断片ライブラリーは、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈによる免疫化から、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈに対するヒト抗体を産生するＢ細胞がもたらされるように、機能的なヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを保有する（かつ、機能的な内因性抗体産生系を欠く）トランスジェニックマウスにおいて、抗ヒトＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体応答を発生させることにより得る。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスの作製については、下記に記載する。
【０３３８】
抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ反応性細胞集団についてのさらなる富化は、例えば、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈアフィニティークロマトグラフィーによる細胞の分離、または蛍光色素標識されたＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈへの細胞の吸着に続く、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）による、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ特異的抗体を発現させるＢ細胞を単離するのに適するスクリーニング手順を使用することにより得ることができる。
【０３３９】
代替的に、非免疫化ドナーに由来する、脾臓細胞および／もしくはＢ細胞、または他のＰＢＬの使用から、可能な抗体レパートリーの、より良好な表示がもたらされ、また、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈが抗原性でない任意の動物（ヒトまたは非ヒト）種を使用する、抗体ライブラリーの構築も可能となる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抗体遺伝子の構築を組み込むライブラリーのためには、幹細胞を対象から採取して、再配列されていない抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を得る。目的の免疫細胞は、ヒト種、マウス種、ラット種、ウサギ目種、オオカミ科（ｌｕｐｒｉｎｅ）種、イヌ種、ネコ種、ブタ種、ウシ種、ウマ種、およびトリ種など、様々な動物種から得ることができる。
【０３４０】
抗体可変遺伝子セグメント（ＶＨセグメントおよびＶＬセグメントを含む）をコードする核酸を、目的の細胞から回収し、増幅した。再配列されたＶＨ遺伝子ライブラリーおよびＶＬ遺伝子ライブラリーの場合、所望のＤＮＡは、Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８６巻：３８３３〜３８３７頁（１９８９年）において記載される通り、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡを、リンパ球から単離した後で、再配列されたＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子の５’末端および３’末端にマッチするプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を施し、これにより、発現のための、多様なＶ遺伝子レパートリーを作製することにより得ることができる。Ｖ遺伝子は、Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９年）およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻：５４４〜５４６頁（１９８９年）において記載されている通り、成熟Ｖドメインをコードするエクソンの５’末端におけるバックプライマーと、Ｊセグメントに基づくフォワードプライマーとにより、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡから増幅することができる。しかし、ｃＤＮＡから増幅するためには、バックプライマーはまた、Ｊｏｎｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、９巻：８８〜８９頁（１９９１年）において記載されている通り、リーダーエクソン、およびＳａｓｔｒｙら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８６巻：５７２８〜５７３２頁（１９８９年）において記載されている通り、定常領域内のフォワードプライマーに基づく場合がある。相補性を最大化するため、Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９年）、またはＳａｓｔｒｙら（１９８９年）において記載されている通り、プライマー内に縮重を組み込むことができる。ある特定の実施形態では、例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年）による方法において記載されている通り、またはＯｒｕｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２１巻：４４９１〜４４９８頁（１９９３年）による方法において記載されている通り、免疫細胞の核酸試料中に存在する、全ての利用可能なＶＨ配置およびＶＬ配置を増幅するために、各Ｖ遺伝子ファミリーにターゲティングされたＰＣＲプライマーを使用することにより、ライブラリーの多様性を最大化する。増幅されたＤＮＡを、発現ベクターにクローニングするために、Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９年）において記載されている通り、まれな制限部位を、ＰＣＲプライマー内に、一方の端部におけるタグとして、または、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）において記載されている通り、タグ付けされたプライマーを伴う、さらなるＰＣＲ増幅により導入することができる。
【０３４１】
合成により再配列されたＶ遺伝子のレパートリーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、Ｖ遺伝子セグメントから導出することができる。ヒトＶＨ遺伝子セグメントの大半は、クローニングおよびシークェンシングされ（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２７巻：７７６〜７９８頁（１９９２年）において報告されている）、マッピングされており（Ｍａｔｓｕｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．、３巻：８８〜９４頁（１９９３年）において報告されている）；ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２７巻：３８１〜３８８頁（１９９２年）において記載されている通り、これらのクローニングされたセグメント（Ｈ１ループおよびＨ２ループの全ての主要なコンフォメーションを含む）を使用して、多様な配列および長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマーにより、多様なＶＨ遺伝子レパートリーを作り出すことができる。また、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：４４５７〜４４６１頁（１９９２年）において記載される通り、単一の長さの長いＨ３ループに焦点を当てた、全ての配列多様性を伴うＶＨレパートリーを作製することもできる。ヒトＶκセグメントおよびＶλセグメントは、クローニングおよびシークェンシングされており（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３巻：１４５６〜１４６１頁（１９９３年）において報告されている）、合成軽鎖レパートリーを作製するのに使用することができる。ＶＨおよびＶＬのフォールド（ｆｏｌｄ）の範囲、ならびにＬ３およびＨ３の長さに基づく、合成によるＶ遺伝子レパートリーは、大幅な構造的多様性を有する抗体をコードする。Ｖ遺伝子をコードするＤＮＡの増幅の後、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２７巻：３８１〜３８８頁（１９９２年）による方法に従い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、生殖細胞系列のＶ遺伝子セグメントを再配列することができる。
【０３４２】
抗体断片のレパートリーは、ＶＨ遺伝子レパートリーと、ＶＬ遺伝子レパートリーとを、いくつかの方式で一体に組み合わせることにより構築することができる。各レパートリーは、異なるベクター内で創出することができ、ベクターは、例えば、Ｈｏｇｒｅｆｅら、Ｇｅｎｅ、１２８巻：１１９〜１２６頁（１９９３年）において記載されている通り、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるコンビナトリアル感染、例えば、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２１巻：２２６５〜２２６６頁（１９９３年）において記載されているｌｏｘＰ系により組み換えることができる。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける組換え手法では、Ｆａｂ断片の２本鎖としての性質を利用して、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換効率により付与される、ライブラリーサイズに対する制限を克服する。ナイーブＶＨレパートリーと、ナイーブＶＬレパートリーとは、一方はファージミドへ、他方はファージベクターに、個別にクローニングする。次いで、各細胞が、異なる組み合わせを含有し、ライブラリーサイズが、存在する細胞の数（クローン約１０１２個）だけにより制限されるように、２つのライブラリーを、ファージミド含有細菌へのファージ感染により組み合わせる。ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子が、単一のレプリコンに組み換えられ、ファージビリオンに共パッケージングされるように、いずれのベクターも、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける組換えシグナルを含有する。これらの巨大ライブラリーは、アフィニティーの良好な（約１０−８ＭのＫｄ−１）多数の多様な抗体をもたらす。
【０３４３】
代替的に、レパートリーは、例えば、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８８巻：７９７８〜７９８２頁（１９９１年）において記載されている通り、同じベクターに逐次的にクローニングする、または、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）において記載されている通り、ＰＣＲにより一体にアセンブルし、次いで、クローニングすることができる。また、ＰＣＲアセンブリーも、ＶＨ  ＤＮＡおよびＶＬ  ＤＮＡを、可撓性のペプチドスペーサーをコードするＤＮＡと接合して、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）レパートリーを形成するのに使用することができる。さらに別の技法では、Ｅｍｂｌｅｔｏｎら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０巻：３８３１〜３８３７頁（１９９２年）において記載されている通り、「インセルＰＣＲアセンブリー」を使用して、ＶＨ遺伝子とＶＬ遺伝子とを、リンパ球内で、ＰＣＲにより組み合わせ、次いで、連結された遺伝子のレパートリーをクローニングする。
【０３４４】
ライブラリーのスクリーニングは、当技術分野で公知の任意の技法により達成することができる。例えば、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ標的は、吸着プレートのウェルをコーティングし、吸着プレートに固定された宿主細胞上で発現させるのに使用することも、細胞分取で使用することも、ストレプトアビジンコーティングビーズによる捕捉のために、ビオチンにコンジュゲートさせることも、ファージディスプレイライブラリーをパニングするための当技術分野で公知の、他の任意の方法において使用することもできる。
【０３４５】
ファージライブラリー試料は、ファージ粒子のうちの少なくとも一部分と吸着剤との結合に適する条件下で、固定化されたＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈと接触させる。通常、ｐＨ、イオン強度、温度などを含む条件は、生理学的条件を模倣するように選択する。固相に結合したファージは、洗浄し、次いで、例えば、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８８巻：７９７８〜７９８２頁（１９９１年）において記載されている通り、酸により、または、例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年）において記載されている通り、アルカリにより、または、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）による抗原競合法と類似の手順における、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗原の競合により溶出させる。ファージは、単一のラウンドの選択で約２０〜約１，０００倍に富化することができる。さらに、富化されたファージは、細菌培養物中で成長させ、さらなるラウンドの選択にかけることができる。
【０３４６】
選択の効率は、洗浄時における解離動態、および単一のファージ上の複数の抗体断片が、抗原と同時に係合しうるのかどうかを含む多くの因子に依存する。解離動態が速く（かつ、結合アフィニティーが弱い）抗体は、短い洗浄、多価ファージディスプレイ、および固相内の抗原の高いコーティング密度を使用することにより保持することができる。高密度は、多価相互作用を介してファージを安定化させるだけでなく、解離したファージの再結合に好適でもある。解離動態が遅く（かつ、結合アフィニティーが良好な）抗体の選択は、Ｂａｓｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、８巻：３０９〜３１４頁（１９９０年）およびＷＯ９２／０９６９０において記載されている通り、長い洗浄および一価ファージディスプレイ、ならびにＭａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）において記載されている通り、抗原の低コーティング密度を使用することにより促進することができる。
【０３４７】
ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈに対するアフィニティーがわずかに異なる場合でもなお、アフィニティーの異なるファージ抗体の間で選択することは可能である。しかし、選択された抗体のランダム変異（例えば、上で記載したアフィニティー成熟技法の一部において実施される）は、大半が抗原に結合し、少数はより高いアフィニティーを有する多くの変異体をもたらす可能性が高い。ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈを制限すると、まれに、高アフィニティーのファージも競合に耐えない可能性がある。全てのより高いアフィニティーの変異体を保持するため、ファージは、過剰なビオチン化ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈと共にインキュベートすることもできるが、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈの標的モル濃度アフィニティー定数より低いモル濃度のビオチン化ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈと共にインキュベートすることもできる。次いで、高アフィニティー結合性ファージは、ストレプトアビジンコーティング常磁性ビーズにより捕捉することができる。このような「平衡捕捉」により、抗体を、それらの結合アフィニティーに従い、低アフィニティーの極過剰なファージから、アフィニティーの高さがわずか２倍の変異体クローンの単離を可能とする感度で選択することが可能となる。また、固相に結合したファージの洗浄で使用される条件も、解離動態に基づき弁別するように操作することができる。
【０３４８】
抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈクローンは、活性が選択されたクローンでありうる。一実施形態では、本発明は、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈリガンドと、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈとの結合は遮断するが、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈリガンドと、第２のタンパク質との結合は遮断しない、抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体を提供する。このような抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体に対応するＦｖクローンは、（１）抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈクローンを、上記のセクションＢ（Ｉ）（２）で記載した通りファージライブラリーから単離し、任意選択で、単離されたファージクローン集団を、適切な細菌宿主内で成長させることにより増幅し；（２）それぞれ遮断活性および非遮断活性が所望される、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈおよび第２のタンパク質を選択し；（３）抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈファージクローンを、固定化されたＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈに吸着させ；（４）過剰な第２のタンパク質を使用して、第２のタンパク質の結合決定基と重複するかまたは共有される、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ結合性決定基を認識する、任意の所望されないクローンを溶出させ；（５）ステップ（４）の後で吸着を維持したクローンを溶出させることにより選択することができる。任意選択で、本明細書で記載される選択手順を、１回または複数回繰り返すことにより、所望の遮断／非遮断特性を伴うクローンをさらに富化することもできる。
【０３４９】
本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、ハイブリドーマまたはファージＤＮＡ鋳型から、重鎖および軽鎖の目的のコード領域を特異的に増幅するようにデザインされたオリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより）、たやすく単離およびシークェンシングされる。単離されたら、ＤＮＡを、発現ベクター内に入れ、次いで、これを、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または別途免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞内の所望のモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体コードＤＮＡの、細菌内の組換え発現についての総説論文は、Ｓｋｅｒｒａら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５巻：２５６頁（１９９３年）およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖｓ、１３０巻：１５１頁（１９９２年）を含む。
【０３５０】
本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域をコードする公知のＤＮＡ配列（例えば、適切なＤＮＡ配列は、Ｋａｂａｔら、前出から得ることができる）と組み合わせて、全長重鎖および／もしくは全長軽鎖または部分長重鎖および／もしくは部分長軽鎖をコードするクローンを形成することができる。ＩｇＧ定常領域、ＩｇＭ定常領域、ＩｇＡ定常領域、ＩｇＤ定常領域、およびＩｇＥ定常領域を含む、任意のアイソタイプの定常領域を、この目的のために使用することができ、このような定常領域を、任意のヒト種または動物種から取得し得ることを理解されたい。１つの動物（ヒトなど）種の可変ドメインＤＮＡから導出され、次いで、「ハイブリッド」の全長重鎖および／または全長軽鎖のためのコード配列を形成するように、別の動物種の定常領域ＤＮＡに融合させたＦｖクローンは、本明細書で使用される「キメラ」抗体および「ハイブリッド」抗体の定義に含まれる。一実施形態では、ヒト可変ＤＮＡから導出されたＦｖクローンを、ヒト定常領域ＤＮＡに融合させて、全てのヒト全長重鎖および／もしくはヒト全長軽鎖またはヒト部分長重鎖および／もしくはヒト部分長軽鎖のコード配列を形成する。
【０３５１】
ナイーブライブラリーにより産生される抗体（天然または合成）は、中程度のアフィニティー（約１０６〜１０７Ｍ−１のＫｄ−１）のものでありうるが、また、Ｗｉｎｔｅｒら（１９９４年）、前出において記載されている通り、アフィニティー成熟も、二次ライブラリーを構築し、ここから再選択することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで模倣することができる。例えば、エラープローンポリメラーゼ（Ｌｅｕｎｇら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、１巻：１１〜１５頁（１９８９年）において報告されている）を、Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２６巻：８８９〜８９６頁（１９９２年）による方法、またはＧｒａｍら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：３５７６〜３５８０頁（１９９２年）による方法で使用することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ランダムに、変異を導入することができる。加えて、アフィニティー成熟は、例えば、目的のＣＤＲにわたり、ランダムな配列を保有するプライマーを伴うＰＣＲを、選択された個々のＦｖクローン内で使用して、１つまたは複数のＣＤＲをランダムに変異させ、より高いアフィニティーのクローンについてスクリーニングすることにより実施することもできる。ＷＯ９６０７７５４（１９９６年３月１４日公開）は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域内で変異誘発を誘導して、軽鎖遺伝子のライブラリーを創出するための方法について記載した。別の有効な手法は、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）において記載されている通り、非免疫化ドナーから得られた天然に存在するＶドメイン改変体のレパートリーを伴うファージディスプレイにより選択されたＶＨドメインまたはＶＬドメインを組み換え、数回のラウンドにわたる鎖リシャフリングにより、より高いアフィニティーについてスクリーニングすることである。この技法は、アフィニティーが１０−９Ｍの範囲の抗体および抗体断片の作製を可能とする。
【０３５２】
抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体を作り出す他の方法
【０３５３】
抗体のアフィニティーを生成し評価する他の方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）；米国特許第４，８１６，５６７号；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６；Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７；Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）；Ｅｎｇｅｌｓら、Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，２８：７１６−７３４（１９８９）；Ａｂｒａｈｍｓｅｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：３９０１（１９８５）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４４（１９７６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）において記載されている。
【０３５４】
一般的な方法
【０３５５】
したがって、本開示の一態様は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ＳＳＥＡ３、およびＳＳＥＡ−４を三重ターゲティングする単離抗体を特徴とする。三重ターゲティング抗体は、Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（Ｇｌｏｂｏ  Ｈ六糖）およびＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−３五糖）およびＮｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−４六糖）に特異的に結合する。一例では、三重ターゲティング抗体は、ｍＡｂ  ６５１である。
【０３５６】
本開示の別の態様は、Ｇｌｏｂｏ  ＨおよびＳＳＥＡ３を二重ターゲティングする単離抗体を特徴とする。二重ターゲティング抗体は、Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（Ｇｌｏｂｏ  Ｈ六糖）およびＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−３五糖）に特異的に結合する。一例では、二重ターゲティング抗体は、ｍＡｂ  ２７３である。
【０３５７】
さらに別の態様では、本開示は、ＳＳＥＡ−４に特異的な単離抗体を特徴とする。抗ＳＳＥＡ−４抗体は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−４六糖）に結合する。一部の例では、抗体は、Ｎｅｕ５Ｇｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−４六糖の類似体）に結合することが可能である。抗体は、マウスＩｇＧ３（例えば、ｍＡｂ  ＭＣ−８３１−７０）ではなく、抗体は、マウスＩｇＭ（例えば、抗ＲＭ１）ではないことが好ましい。抗体の例は、ｍＡｂ  ４５およびｍＡｂ  ４８を含むがこれらに限定されない。
【０３５８】
本開示の別の態様は、ＳＳＥＡ−４およびその断片に特異的な単離抗体を特徴とする。抗ＳＳＥＡ−４抗体は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−４六糖）およびＮｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１（ＳＳＥＡ−４六糖の断片）に結合する。一部の例では、抗体は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１に結合することが可能である。一部の例では、抗体は、Ｎｅｕ５Ｇｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−４六糖の類似体）に結合することが可能である。一例では、抗体は、ｍＡｂ  ４６である。
【０３５９】
Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４を三重ターゲティングする抗体、Ｇｌｏｂｏ  ＨおよびＳＳＥＡ−３を二重ターゲティングする抗体、ならびに抗ＳＳＥＡ−４抗体を開発し、本明細書でこれらを開示した。本開示による抗体は、治療剤中でも、診断においても、研究用ツールとしても使用することができる。
【０３６０】
したがって、本開示の一態様は、Ｆｃ上に単一の均一なＮ−グリカンを含むモノクローナル抗体の均質な集団の組成物に関し、構造は、エフェクター細胞機能の有効性を増強するために最適化されたＮ−グリカン構造である。
【０３６１】
好ましい実施形態では、Ｎ−グリカンは、Ｆｃ領域のＡｓｎ−２９７に付着される。
【０３６２】
好ましい実施形態では、Ｎ−グリカンは、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の構造からなる。
【０３６３】
本明細書で記載される糖抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されうる。糖抗体は、Ｆｃ糖鎖工学によって作り出されうる。ある特定の実施形態では、糖抗体は、哺乳動物細胞培養によって得られたモノクローナル抗体から酵素的または化学酵素的に操作される。
【０３６４】
一部の実施形態では、本明細書で記載される糖抗体のＦｃ領域は、対応するモノクローナル抗体中の野生型Ｆｃ領域と比較して、ＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合アフィニティーの増大を呈示する。
【０３６５】
一部の実施形態では、本明細書で記載される糖抗体は、野生型免疫グロブリンと比較して、増強された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を呈示する。
【０３６６】
一部の実施形態では、糖抗体は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、およびヒトＩｇＧ４からなる群より選択される。モノクローナル抗体は、ヒト化、ヒトまたはキメラでありうる。
【０３６７】
本明細書で記載される糖抗体は、がん、自己免疫障害、炎症性障害または感染性疾患と関連する抗原に結合しうる。例示的ながん関連抗原は、例えば、Ｇｌｏｂｏ−Ｈ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４を含みうる。
【０３６８】
他の態様では、本明細書で開示される抗体は、グリカンの改変体および誘導体を検出できる。例えば、グリカンの還元性末端は、遊離である、または天然（例えば、ＳＳＥＡ４糖脂質）もしくは非天然（例えば、グリカンアレイを作製するため、または診断目的のためのコンジュゲーションのためのリンカー）であるテールに連結される。これらの誘導体は全て、抗体によって認識されうる。
【０３６９】
したがって、ある特定の診断実施形態およびアレイ実施形態では、本発明の抗体は、本明細書で記載されるグリカンだけでなく、その酸化型改変体もまた検出できる。本発明の抗体は、前記酸化型改変体へのコンジュゲーション産物もまた検出できる。
【０３７０】
ある特定の態様では、本開示は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１、およびその酸化型改変体、ならびに前記酸化型改変体へのコンジュゲーション産物、およびその酸化型改変体、ならびに前記酸化型改変体へのコンジュゲーション産物に特異的に結合する単離ヒト化モノクローナル糖抗体を提供する；前記酸化型改変体は、グリカンの第一級アルコールの、カルボニルへの転換産物であり、コンジュゲーション産物は、カルボニルの、第一級アミンまたは第二級アミン部分を有するイミンへの転換産物である。
【０３７１】
例えば、第一級アルコールを含むグリカンは、当業者に公知の方法によって、酸化型改変体に転換されうる。非限定的な例として、ガラクトース上の第一級アルコールは、グリカンを、酸化剤、例えば、過ヨウ素酸ナトリウム（ｍ−過ヨウ素酸ナトリウム）、または過ヨウ素酸の別の塩（例えば、カリウム、アンモニウム、マンガン、リチウム）と接触させることによって、アルデヒドに転換されうる。グリカン中の糖部分の１つまたは複数が、酸化されうる。酸化剤の濃度は、水または適切な緩衝液中、１マイクロモル濃度、５マイクロモル濃度、１０マイクロモル濃度、２５マイクロモル濃度、５０マイクロモル濃度、１００マイクロモル濃度、２００マイクロモル濃度、５００マイクロモル濃度、７５０マイクロモル濃度、１ミリモル濃度、５ミリモル濃度、１０ミリモル濃度、２５ミリモル濃度、５０ミリモル濃度、１００ミリモル濃度、または５００ミリモル濃度でありうる。温度は、摂氏５〜４５度、好ましくは摂氏１５〜４０度、より好ましくは摂氏３５〜４０度でありうる。反応時間は、１０秒間〜２０分間、好ましくは３０秒間〜１０分間でありうる。適切な緩衝液は、食塩水、ホスフェート、ＣＨＥＳ、ＭＥＳ、ボレート、アセテート、カーボネート、ホルメート、シトレート、オキサレートを含む、または排除しうる。穏やかに酸性の緩衝液を使用することが好ましい。トリスまたはグリシンまたは遊離糖は、反応において競合するので、これらを含まない緩衝液を使用することが好ましい。転換は、当業者に公知の方法による透析または遠心透析（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｄｉａｌｙｓｉｓ）によって精製されうる。
【０３７２】
コンジュゲーション産物は、当業者に公知の方法によって、参照により本明細書に組み込まれるＧ．  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第３版、ＩＳＢＮ：  ９７８−０−１２−３８２２３９−０、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２０１３年に記載されるように、酸化型産物と、適切なアミン、ヒドラジン、ヒドラジド、またはオキソ−アミンとの反応から形成されうる。非限定的な例として、第一級アミンは、グリカン内のガラクトースの過ヨウ素酸酸化された第一級アルコールから形成された単一のアルデヒド官能基を有するグリカンと反応しうる。正味の産物はイミンである。イミンは、当業者に公知の方法、例えば、シアノ水素化ホウ素還元によってアルコールへと任意選択でさらに還元されて、加水分解に対してより安定なコンジュゲーション産物を形成しうる。一部の態様では、アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、またはオキソ−アミンは、コンジュゲーション産物のさらなる修飾のために、アレイ、レポーター分子、またはビオチンにさらに共有結合的に連結されうる。一部の態様では、レポーター分子は、蛍光分子でありうる。一部の態様では、レポーター分子は、放射性標識された分子でありうる。一部の態様では、レポーター分子は、固有のスペクトル特徴（例えば、ＩＲスペクトル、ラマンスペクトル、またはＮＭＲスペクトル）を有する分子でありうる。一部の態様では、アレイは、固体表面、化学修飾された表面、ポリマーコーティングされた表面、ビーズ、ゲル、粒子、またはナノ粒子でありうる。一部の態様では、ナノ粒子は、蛍光性であり得るか、または光ルミネセンスを呈示しうる。一部の態様では、コンジュゲーション産物は、カルボニルの、第一級アミンまたは第二級アミン部分を有するイミンへの転換産物でありうる。
【０３７３】
一般に、本発明は、アフィニティー成熟させたＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体を提供する。これらの抗体は、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈに対するアフィニティーおよび特異性を増大させている。このアフィニティーおよび感受性の増大により、本発明の分子を、（ａ）本発明の分子の感受性の増大、および／または（ｂ）本発明の分子の、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈへの緊密な結合により利益を得る適用および方法のために使用することが可能となる。
【０３７４】
一態様では、ＳＳＥＡ４／ＳＳＥＡ３／ＧｌｏｂｏＨは、がん細胞およびがん幹細胞に特異的に発現される３種のグリカンである。これら３種の糖脂質の合成のための重要な酵素であるベータ−３−ＧａｌＴ５のノックダウンは、がん細胞のアポトーシスを引き起こすが、正常細胞のアポトーシスは引き起こさない。抗体、特に、ＳＳＥＡ４に優先的もしくは特異的な糖抗体、および／またはＳＳＥＡ３／ＳＳＥＡ４／ＧｌｏｂｏＨに同時に対する抗体は、有効ながん治療剤である。別の態様では、３種のグリカンＳＳＥＡ４／ＳＳＥＡ３／ＧｌｏｂｏＨ、特にＳＳＥＡ３は、がん幹細胞マーカーとして有用である。
【０３７５】
一態様では、ＳＳＥＡ４および／または組み合わせでのＳＳＥＡ４／ＳＳＥＡ３／ＧｌｏｂｏＨは、例えば、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆管がん、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、骨がん（骨肉腫）、皮膚がん、子宮頸がん、卵巣がん、および前立腺がんを含む異なるがんの処置のための治療標的として有用である。
【０３７６】
一実施形態では、これらの例示的ながん型の細胞表面上で発現されるＳＳＥＡ４に対するヒト治療用抗体またはヒト化治療用抗体が提供される。
【０３７７】
別の実施形態では、これらの例示的ながん型の細胞表面上で同時に発現されるＳＳＥＡ３／ＳＳＥＡ４／Ｇｌｏｂｏ−Ｈに対するヒト治療用抗体またはヒト化治療用抗体が提供される。
【０３７８】
さらに、本開示は、グロボ系列スフィンゴ糖脂質合成をモジュレートするために有用な抗体および／または結合性断片の産生を誘発しうるＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ関連エピトープ（天然および修飾型）をターゲティングする免疫原性コンジュゲート組成物も対象とする。さらに、本開示は、過剰増殖疾患および／または過剰増殖状態の処置または検出のために本明細書で記載される組成物を使用する方法も対象とする。
【０３７９】
一実施形態では、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体は、１つまたは複数のＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ活性の部分的または全面的な遮断が所望される、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ媒介性障害の処置に有用である。一実施形態では、本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体を使用して、がんを処置する。
【０３８０】
本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体は、質量分析も遺伝子操作も必要とせずに、イムノアッセイ、例えば、サンドイッチアッセイ、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、または免疫顕微鏡法における、高感度で特異的なエピトープの検出を可能とする。これにより、これらの経路の正常な機能の観察および解明のいずれにおいても、ならびに経路の機能が異常な場合の検出にも、著明な利点がもたらされる。
【０３８１】
本発明のＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体はまた、疾患の発生および発症機序における役割を決定するのにも使用することができる。例えば、上で記載した通り、本発明のＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体を使用して、１つまたは複数の疾患状態と相関しうるＴＡＣＡが通常一過性で発現するのかどうかを決定することができる。
【０３８２】
本発明のＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体を使用して、さらに、本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体が特異的でない、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈの正常な活性には干渉せずに、１つまたは複数のＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈの調節が異常であるか、または機能が異常である疾患を処置することができる。
【０３８３】
別の態様では、本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体は、多様な細胞型内および組織内のがん状態を検出するための試薬としても有用性を見出す。
【０３８４】
さらに別の態様では、本抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体は、活性遮断パターンが、本発明の対象の抗体の活性遮断パターンと類似する、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈアンタゴニストを開発するのに有用である。例えば、本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体を使用して、同じＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈへの結合特徴、および／またはＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ経路の遮断能を有する他の抗体を決定および同定することができる。
【０３８５】
さらなる例として、本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体を使用して、直鎖状エピトープおよびコンフォメーショナルエピトープを含む、本明細書で例示される抗体と実質的に同じ、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈの抗原決定基に結合する、他の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体を同定することができる。
【０３８６】
本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体を、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈが関与する生理学的経路に基づくアッセイで使用して、１つまたは複数の結合パートナーの、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈへの結合を遮断するのに、抗体と同様の薬理学的効果を呈示する、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈの低分子アンタゴニストについてスクリーニングすることができる。
【０３８７】
抗体の作製は、ハイブリドーマ技法、および結合剤分子についてのファージディスプレイライブラリーのスクリーニングなど、本明細書で記載される方法を含む当技術分野における日常的な技術を使用して達成することができる。当技術分野では、これらの方法が十分に確立されている。
【０３８８】
略述すると、本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体は、コンビナトリアルライブラリーを使用して、１つまたは複数の所望の活性を伴う合成抗体クローンについてスクリーニングすることにより作製することができる。原則として、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質に融合させた、抗体可変領域の多様な断片（Ｆｖ）をディスプレイするファージを含有するファージライブラリーをスクリーニングすることにより選択する。このようなファージライブラリーを、所望の抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによりパニングする。所望の抗原に結合することが可能なＦｖ断片を発現させるクローンを、抗原に吸着させ、これにより、ライブラリー内の非結合性クローンから分離する。次いで、結合性クローンを抗原から溶出させ、さらなる抗原吸着／溶出サイクルにより、さらに富化することができる。本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体のうちのいずれかは、適切な抗原スクリーニング手順をデザインして、目的のファージクローンについて選択した後で、目的のファージクローンに由来するＦｖ配列と、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ第９１−３２４２号、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．（１９９１年）、１〜３巻において記載されている、適切な定常領域（Ｆｃ）配列とを使用して、全長抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体クローンを構築することにより得ることができる。
【０３８９】
一実施形態では、本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体は、モノクローナル抗体である。本発明の範囲内にはまた、本明細書で提供される抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体の、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、およびＦ（ａｂ’）２断片、ならびにこれらの変化形などの抗体断片も包含される。これらの抗体断片は、酵素的消化など、従来の手段により創出することもでき、組換え技法により作り出すこともできる。このような抗体断片は、キメラ抗体断片、ヒト抗体断片、またはヒト化抗体断片でありうる。これらの断片は、本明細書で示される実験目的、診断目的、および治療目的に有用である。
【０３９０】
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得ることができる、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる、考えられる天然に存在する変異を除き同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、個別の抗体の混合物ではないものとしての抗体の性格を指し示す。
【０３９１】
本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁（１９７５年）により初めて記載されたハイブリドーマ法を含む当技術分野で公知の様々な方法を使用して作製することもでき、代替的に、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号）により作製することもできる。
【０３９２】
ベクター、宿主細胞、および組換え法
【０３９３】
本発明の抗体を組換えにより作製するには、本発明の抗体をコードする核酸を単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために、複製可能なベクターに挿入する。抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、たやすく単離およびシークェンシングされる。多くのベクターが、利用可能である。ベクターの選択は、使用される宿主細胞に部分的に依存する。宿主細胞は、原核生物由来の細胞または真核生物（一般に、哺乳動物）由来の細胞のいずれかを含むがこれらに限定されない。ＩｇＧ定常領域、ＩｇＭ定常領域、ＩｇＡ定常領域、ＩｇＤ定常領域、およびＩｇＥ定常領域を含む、任意のアイソタイプの定常領域を、この目的のために使用することができ、このような定常領域を、任意のヒト種または動物種から取得し得ることを理解されたい。
【０３９４】
原核宿主細胞を使用する抗体の作製
【０３９５】
ベクターの構築
【０３９６】
本発明の抗体のポリペプチド構成要素をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組換え技法を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単離およびシークェンシングすることができる。代替的に、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成器またはＰＣＲ技法を使用して合成することもできる。得られたら、ポリペプチドをコードする配列を、原核宿主内で異種ポリヌクレオチドを複製し、発現させることが可能な組換えベクターに挿入する。利用可能であり、当技術分野で公知の多くのベクターは、本発明の目的で使用することができる。適切なベクターの選択は、ベクターに挿入される核酸のサイズ、およびベクターで形質転換される特定の宿主細胞に主に依存する。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、またはこれらの両方）、およびそれが存在する特定の宿主細胞に対するその適合性に応じて、多様な構成要素を含有する。ベクターの構成要素は一般に、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合性部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸インサート、および転写終結配列を含むがこれらに限定されない。
【０３９７】
一般に、宿主細胞に適合性の種に由来するレプリコンおよび制御配列を含有するプラスミドベクターは、これらの宿主と関連させて使用する。ベクターは通常、複製部位のほか、形質転換された細胞内の表現型による選択を提供することが可能なマーキング配列も保有する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、Ｅ．ｃｏｌｉ種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２を使用して形質転換することが典型的である。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン（Ａｍｐ）耐性およびテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性をコードする遺伝子を含有し、これにより、形質転換された細胞を同定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体、または他の微生物性プラスミドもしくはバクテリオファージはまた、微生物が内因性タンパク質を発現させるために使用しうるプロモーターも含有しうるか、またはこれを含有するように修飾することができる。特定の抗体を発現させるために使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例については、Ｃａｒｔｅｒら、米国特許第５，６４８，２３７号において詳細に記載されている。
【０３９８】
加えて、宿主微生物に適合性のレプリコンおよび制御配列を含有するファージベクターも、形質転換ベクターとして、これらの宿主と関連させて使用することができる。例えば、λＧＥＭ（商標）１１などのバクテリオファージを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２など、易感染性の宿主細胞を形質転換するのに使用しうる組換えベクターの作製において活用することができる。
【０３９９】
本発明の発現ベクターは、ポリペプチド構成要素の各々をコードする、２つまたはこれを超えるプロモーター−シストロン対を含みうる。プロモーターとは、シストロンに対して上流（５’）に位置する非翻訳の調節配列であって、その発現をモジュレートする。原核生物プロモーターは、誘導的プロモーターと構成的プロモーターとの２つのクラスに分けられることが典型的である。誘導的プロモーターとは、培養条件の変化、例えば、栄養物質の存在もしくは非存在、または温度の変化に応答して、シストロンの高レベルの転写をその制御下で開始するプロモーターである。
【０４００】
様々な潜在的宿主細胞により認識される多数のプロモーターが周知である。選択されたプロモーターは、制限酵素消化を介して、供給源ＤＮＡから取り出し、単離されたプロモーター配列を、本発明のベクターに挿入することにより、軽鎖または重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作動可能に連結することができる。天然のプロモーター配列および多くの異種プロモーターの両方を使用して、標的遺伝子の増幅、および／または発現を誘導することができる。一部の実施形態では、異種プロモーターは一般に、天然の標的ポリペプチドのプロモーターと比較して、発現させる標的遺伝子の転写の増大および収量の上昇を可能とするので活用される。
【０４０１】
原核宿主を伴う使用に適するプロモーターは、ＰｈｏＡプロモーター、β−ガラクタマーゼプロモーター系およびラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにｔａｃプロモーターまたはｔｒｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターを含む。しかし、細菌内で機能的な他のプロモーター（他の公知の細菌プロモーターまたはファージプロモーターなど）も同様に適する。それらのヌクレオチド配列は公表されており、これにより、当業者が、リンカーまたはアダプターを使用して、それらを、標的軽鎖および標的重鎖をコードするシストロンに、作動可能にライゲーションして、必要とされる任意の制限部位を供給することが可能となる（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら（１９８０年）、Ｃｅｌｌ、２０巻：２６９頁）。
【０４０２】
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、発現させたポリペプチドの、膜を横切るトランスロケーションを誘導する、分泌シグナル配列構成要素を含む。一般に、シグナル配列は、ベクターの構成要素の場合もあり、ベクターに挿入された標的ポリペプチドＤＮＡの一部の場合もある。本発明の目的で選択されたシグナル配列は、宿主細胞により認識およびプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）シグナル配列であるものとする。異種ポリペプチドにとって天然のシグナル配列を認識およびプロセシングしない原核宿主細胞のためには、シグナル配列を、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、およびＭＢＰからなる群より選択される、原核生物シグナル配列で置換する。本発明の一実施形態では、発現系のシストロンの両方で使用されるシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列またはその改変体である。
【０４０３】
別の態様では、本発明に従う免疫グロブリンの産生は、宿主細胞の細胞質内で生じることが可能であり、したがって、各シストロン内の分泌シグナル配列の存在を必要としない。この点で、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、細胞質内で機能的免疫グロブリンを形成するように、発現され、フォールドされ、アセンブルされる。ある特定の宿主株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｔｒｘＢ株）は、ジスルフィド結合形成に好適な細胞質条件をもたらし、これにより、発現したタンパク質サブユニットの適正なフォールディングおよびアセンブリーを可能とする（ＰｒｏｂａおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｇｅｎｅ、１５９巻：２０３頁（１９９５年））。
【０４０４】
本発明の抗体はまた、分泌され、適正にアセンブルされた、本発明の抗体の収量を最大化するために、発現するポリペプチド構成要素の定量的な比をモジュレートしうる発現系を使用することによって作製することもできる。このようなモジュレーションは、ポリペプチド構成要素について、翻訳強度を同時にモジュレートすることにより、少なくとも一部達成する。
【０４０５】
翻訳強度をモジュレートするための１つの技法は、Ｓｉｍｍｏｎｓら、米国特許第５，８４０，５２３号において開示されている。この技法では、シストロン内の翻訳開始領域（ＴＩＲ）の改変体を活用する。所与のＴＩＲについて、翻訳強度がある範囲にある、一連のアミノ酸配列改変体または核酸配列改変体を創出し、これにより、特異的な鎖の所望の発現レベルについて、この因子を調整するための簡便な手段をもたらすことができる。ＴＩＲ改変体は、アミノ酸配列を改変させうるコドン変化を結果としてもたらす、従来の変異誘発技法により作り出すことができる。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列の変化は、サイレントである。ＴＩＲ内の改変は、例えば、シグナル配列の改変と共に、シャイン−ダルガーノ配列の数または間隔の改変を含みうる。変異体のシグナル配列を作り出すための１つの方法は、シグナル配列のアミノ酸配列を変化させない（すなわち、変化がサイレントである）コード配列の起始部における「コドンバンク」の作製である。これは、各コドンの第３のヌクレオチド位置を変化させることにより達成することができ；加えて、ロイシン、セリン、およびアルギニンなど、一部のアミノ酸が、第１の位置および第２の位置を複数有し、これにより、バンクの作製に複雑性を付加しうる。変異誘発のこの方法については、Ｙａｎｓｕｒａら（１９９２年）、ＭＥＴＨＯＤＳ：  Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、４巻：１５１〜１５８頁において詳細に記載されている。
【０４０６】
一実施形態では、その中の各シストロンのＴＩＲ強度がある範囲にあるベクターのセットを作り出す。この限定的なセットにより、各鎖の発現レベルについての比較のほか、多様なＴＩＲ強度の組み合わせの下における、所望の抗体産物の収量についての比較ももたらされる。ＴＩＲ強度は、Ｓｉｍｍｏｎｓら、米国特許第５，８４０，５２３号において詳細に記載されている通り、レポーター遺伝子の発現レベルを定量化することにより決定することができる。翻訳強度の比較に基づき、所望の個々のＴＩＲが、本発明の発現ベクター構築物内で組み合わされるように選択される。
【０４０７】
本発明の抗体を発現させるのに適する原核宿主細胞は、古細菌およびグラム陰性菌またはグラム陽性菌などの真正細菌を含む。有用な細菌の例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）種、Ｂａｃｉｌｌｉ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）種、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉａ、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ、またはＰａｒａｃｏｃｃｕｓを含む。一実施形態では、グラム陰性細胞を使用する。一実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、本発明のための宿主として使用する。Ｅ．ｃｏｌｉ株の例は、Ｗ３１１０株（Ｂａｃｈｍａｎｎ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２巻（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．：  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９８７年）、１１９０〜１２１９頁；ＡＴＣＣ寄託番号：２７，３２５）、および、遺伝子型Ｗ３１１０  ΔｆｈｕＡ  （ΔｔｏｎＡ）  ｐｔｒ３  ｌａｃ  Ｉｑ  ｌａｃＬ８  ΔｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ）  ｄｅｇＰ４１  ｋａｎＲ（米国特許第５，６３９，６３５号）を有する３３Ｄ３株を含むその派生株を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ  ２９４（ＡＴＣＣ：３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  λ１７７６（ＡＴＣＣ：３１，５３７）およびＥ．ｃｏｌｉ  ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ：３１，６０８）など、他の株およびそれらの派生株もまた、適する。これらの例は、限定的なものではなく、例示的なものである。当技術分野では、規定された遺伝子型を有する上述の細菌のうちのいずれかの派生株を構築するための方法が公知であり、例えば、Ｂａｓｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、８巻：３０９〜３１４頁（１９９０年）において記載されている。細菌の細胞内のレプリコンの複製能力を考慮して、適切な細菌を選択することが、一般に必要である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種は、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、またはｐＫＮ４１０など、周知のプラスミドを使用して、レプリコンを供給する場合に、宿主として使用するのに適しうる。典型的には、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌するべきあり、望ましくは、さらなるプロテアーゼ阻害剤を細胞培養物中に組み込みうる。
【０４０８】
抗体の作製
【０４０９】
宿主細胞を、上で記載した発現ベクターで形質転換し、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように改変された、従来の栄養培地中で培養する。
【０４１０】
形質転換とは、ＤＮＡが、染色体外エレメントとして、または染色体への組込み体により複製可能となるように、ＤＮＡを、原核宿主に導入することを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換は、このような細胞に適切な標準的技法を使用してなされる。細胞壁による実質的な障壁を含有する細菌細胞には、塩化カルシウムを使用するカルシウム処理を一般に使用する。形質転換のための別の方法では、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを使用する。さらに別の技法では、電気穿孔が使用される。
【０４１１】
本発明のポリペプチドを作製するのに使用される原核細胞は、当技術分野で公知であり、選択された宿主細胞の培養に適する培地中で成長させる。適切な培地の例は、必要な栄養補充物質を加えたルリアブロス（ＬＢ）を含む。一部の実施形態では、培地はまた、発現ベクターを含有する原核細胞の増殖を選択的に可能とするように、発現ベクターの構築に基づき選び出される、選択用薬剤も含有する。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を発現させる細胞を成長させるために、アンピシリンを、培地に添加する。
【０４１２】
炭素供給源、窒素供給源、および無機ホスフェート供給源のほかに、また、任意の必要な補充物質も、適切な濃度で、単独、または複合窒素供給源など、別の補充物質または培地との混合物として、含むことができる。任意選択で、培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトール、およびジチオトレイトールからなる群より選択される、１つまたは複数の還元剤を含有しうる。
【０４１３】
原核宿主細胞は、適切な温度で培養する。Ｅ．ｃｏｌｉを成長させるには、例えば、成長は、約２０℃〜約３９℃、約２５℃〜約３７℃、および約３０℃を含むがこれらに限定されない温度範囲で行う。培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて、約５〜約９の範囲の任意のｐＨでありうる。Ｅ．ｃｏｌｉでは、ｐＨは、約６．８〜約７．４、または約７．０でありうる。
【０４１４】
誘導的プロモーターを、本発明の発現ベクター内で使用する場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に適する条件下で誘導する。本発明の一態様では、ＰｈｏＡプロモーターを、ポリペプチドの転写を制御するために使用する。したがって、形質転換された宿主細胞は、誘導のためのホスフェート制限培地中で培養する。一実施形態では、ホスフェート制限培地は、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２年）、２６３巻：１３３〜１４７頁を参照されたい）。当技術分野で公知の通り、使用されるベクター構築物に従い、他の様々な誘導剤を使用することができる。
【０４１５】
一実施形態では、発現した本発明のポリペプチドは、宿主細胞のペリプラズムに分泌され、ここから回収される。タンパク質の回収は、一般に、浸透圧ショック、超音波処理、または溶解などの手段による微生物の破壊を伴うことが典型的である。細胞を破壊したら、細胞残渣または全細胞は、遠心分離または濾過により除去することができる。タンパク質は、例えば、アフィニティー樹脂クロマトグラフィーにより、さらに精製することができる。代替的に、タンパク質を、培養培地に輸送し、その中で単離することもできる。細胞は、培養物から除去し、産生されたタンパク質のさらなる精製のために、培養上清を、濾過および濃縮することができる。発現させたポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびウェスタンブロットアッセイなど、一般に公知の方法を使用して、さらに単離および同定することができる。
【０４１６】
本発明の一態様では、抗体の作製を、発酵工程により大量に行う。組換えタンパク質の作製のためには、多様な大スケールの流加発酵手順が利用可能である。大スケールの発酵容量は、少なくとも１０００リットル、例えば、約１，０００〜１００，０００リットルである。これらの発酵槽では、撹拌用インペラーを使用して、酸素および栄養物質、とりわけ、グルコース（一般的な炭素／エネルギー供給源）を分配する。小スケールの発酵とは一般に、容積が約１００リットルを超えず、約１リットル〜約１００リットルの範囲にありうる発酵槽内の発酵を指す。
【０４１７】
発酵工程では、タンパク質発現の誘導は、細胞を、適切な条件下で、所望の密度、例えば、ＯＤ５５０で約１８０〜２２０（この段階では、細胞は、早期定常相にある）まで成長させた後で、開始することが典型的である。当技術分野で公知であり、上で記載した通り、使用されるベクター構築物に従い、様々な誘導剤を使用することができる。細胞は、誘導前に、より短い期間で成長させることができる。細胞は通例、約１２〜５０時間誘導するが、より長い誘導時間も、より短い誘導時間も、使用することができる。
【０４１８】
本発明のポリペプチドの作製収量および作製品質を改善するために、多様な発酵条件を改変することができる。例えば、分泌される抗体ポリペプチドの適正なアセンブリーおよびフォールディングを改善するために、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、および／またはＤｓｂＧ）、またはＦｋｐＡ（シャペロン活性を伴う、ペプチジルプロリルｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−イソメラーゼ）など、シャペロンタンパク質を過剰発現させる、さらなるベクターを使用して、宿主原核細胞を共形質転換することができる。シャペロンタンパク質は、適正なフォールディングおよび細菌宿主細胞内で産生される異種タンパク質の溶解度を促進することが裏付けられている。Ｃｈｅｎら、（１９９９）  Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  ２７４：１９６０１−１９６０５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第６，０８３，７１５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第６，０２７，８８８号；Ｂｏｔｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００−１７１０５；Ｒａｍｍ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１０６−１７１１３；Ａｒｉｅら、（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９９−２１０。
【０４１９】
発現させた異種タンパク質（とりわけ、タンパク質分解に対して感受性の異種タンパク質）のタンパク質分解を最小化するため、タンパク質分解酵素について欠損する、ある特定の宿主株を、本発明のために使用することができる。例えば、宿主細胞株は、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｍｉ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｖ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＶＩ、およびこれらの組み合わせなど、公知の細菌プロテアーゼをコードする遺伝子内に、遺伝子変異を施すように改変することができる。一部のＥ．ｃｏｌｉプロテアーゼ欠損株が利用可能であり、例えば、Ｊｏｌｙら（１９９８年）、前出；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第５，２６４，３６５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第５，５０８，１９２号；Ｈａｒａら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、２巻：６３〜７２頁（１９９６年）において記載されている。
【０４２０】
一実施形態では、タンパク質分解酵素について欠損し、１つまたは複数のシャペロンタンパク質を過剰発現させるプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株を、本発明の発現系内の宿主細胞として使用する。
【０４２１】
抗体の精製
【０４２２】
一実施形態では、本明細書で作製される抗体タンパク質をさらに精製して、さらなるアッセイのための、実質的に均質な調製物を得、使用する。当技術分野で公知の、標準的なタンパク質精製法を使用することができる。以下の手順：免疫アフィニティーカラム上またはイオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のまたはＤＥＡＥなどカチオン交換樹脂上のクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、および例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を使用するゲル濾過は、適切な精製手順を例示するものである。
【０４２３】
一態様では、固相上に固定化されたプロテインＡを、本発明の抗体産物の免疫アフィニティー精製のために使用する。プロテインＡとは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅａｓに由来する、４１ｋＤの細胞壁タンパク質であって、抗体のＦｃ領域に、高アフィニティーで結合する（Ｌｉｎｄｍａｒｋら（１９８３年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．、６２巻：１〜１３頁）。プロテインＡを固定化する固相は、ガラス表面もしくはシリカ表面を含むカラム、またはＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）カラムもしくはケイ酸カラムでありうる。一部の適用では、カラムを、グリセロールなどの試薬でコーティングすると、夾雑物の非特異的付着を防止する可能性が高い。
【０４２４】
精製の第１のステップとして、上で記載した細胞培養物に由来する調製物を、プロテインＡを固定化した固相に適用して、目的の抗体の、プロテインＡへの特異的結合を可能とすることができる。次いで、固相を洗浄すると、固相に非特異的に結合した夾雑物が除去される。最後に、目的の抗体を、固相から、溶出により回収する。
【０４２５】
真核宿主細胞を使用する抗体の作製
【０４２６】
ベクターの構成要素は一般に、以下：シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列のうちの１つまたは複数を含むがこれらに限定されない。
【０４２７】
（ｉ）シグナル配列構成要素
【０４２８】
真核宿主細胞における使用のためのベクターはまた、シグナル配列、または、目的の成熟タンパク質もしくは成熟ポリペプチドのＮ末端において特異的切断部位を有する、他のポリペプチドも含有しうる。選択される異種シグナル配列は一般に、宿主細胞により認識およびプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）異種シグナル配列である。哺乳動物細胞の発現では、哺乳動物シグナル配列のほか、ウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルも利用可能である。
【０４２９】
このような前駆体領域のＤＮＡを、リーディングフレーム内で、抗体をコードするＤＮＡにライゲーションする。
【０４３０】
（ｉｉ）複製起点
【０４３１】
一般に、複製起点構成要素は、哺乳動物の発現ベクターに必要とされない。例えば、ＳＶ４０起点は、初期プロモーターを含有するというだけで使用されうることが典型的である。
【０４３２】
（ｉｉｉ）選択遺伝子構成要素
【０４３３】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択用マーカーとも称する、選択遺伝子を含有しうる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生剤または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）該当する場合、栄養要求性欠損を補完する、または（ｃ）複合培地から得られない必須の栄養物質を供給する、タンパク質をコードする。
【０４３４】
選択スキームの１つの例では、宿主細胞の成長を止める薬物を活用する。異種遺伝子による形質転換に成功した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、これにより、選択レジメンを生き残る。このような優性選択の例では、薬物である、ネオマイシン、ミコフェノール酸、およびハイグロマイシンを使用する。
【０４３５】
哺乳動物細胞に適する選択用マーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩおよびＩＩ（例えば、霊長動物メタロチオネイン遺伝子）、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなど、抗体核酸を取り込む能力のある細胞の同定を可能とする選択用マーカーである。
【０４３６】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞はまず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストである、メトトレキセート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中で、形質転換体の全てを培養することにより同定することができる。野生型ＤＨＦＲを使用する場合に適切な宿主細胞は、例えば、ＤＨＦＲ活性を欠損させたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系（例えば；ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−９０９６）を含む。
【０４３７】
代替的に、抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質、およびアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）など、別の選択用マーカーをコードするＤＮＡ配列で形質転換または共形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、アミノグリコシド抗生剤、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８など、選択用マーカーのための選択用薬剤を含有する培地中の細胞成長により選択することができる。米国特許第４，９６５，１９９号を参照されたい。
【０４３８】
（ｉｖ）プロモーター構成要素
【０４３９】
発現ベクターおよびクローニングベクターは通例、宿主生物により認識され、目的のポリペプチド（例えば、抗体）をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含有する。真核生物のプロモーター配列は、公知である。事実上全ての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置する、ＡＴに富む領域を有する。多くの遺伝子の転写の始点から７０〜８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域［配列中、Ｎは、任意のヌクレオチドでありうる］である。大半の真核生物遺伝子の３’末端は、ポリＡテールの、コード配列の３’末端への付加のシグナルでありうる、ＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列の全ては、真核生物発現ベクターに挿入するのに適する。
【０４４０】
哺乳動物宿主細胞内のベクターからの抗体ポリペプチドの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られたプロモーター、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーターに由来するプロモーター、または熱ショックプロモーターに由来するプロモーターにより制御することができるが、このようなプロモーターが、宿主細胞系に適合性があることを条件とする。
【０４４１】
ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点もまた含有する、ＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として簡便に得られる。ウシパピローマウイルスをベクターとして使用して、哺乳動物宿主内でＤＮＡを発現させるための系は、米国特許第４，４１９，４４６号において開示されている。この系の改変については、米国特許第４，６０１，９７８号において記載されている。また、単純ヘルペスウイルスに由来するチミジンキナーゼプロモーターの制御下、マウス細胞内の、ヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現についての、Ｒｅｙｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２９７巻：５９８〜６０１頁（１９８２年）も参照されたい。代替的に、ラウス肉腫ウイルスの長い末端リピートも、プロモーターとして使用することができる。
【０４４２】
（ｖ）エンハンサーエレメント構成要素
【０４４３】
高等真核生物による、本発明の抗体ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列を、ベクターに挿入することにより増大させうることが多い。今や、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）に由来する、多くのエンハンサー配列が、公知である。しかし、真核細胞ウイルスに由来するエンハンサーを使用することが典型的である。例は、複製起点の後期側（１００〜２７０ｂｐ）にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。真核生物プロモーターの活性化のための増強エレメントについては、また、Ｙａｎｉｖ、Ｎａｔｕｒｅ、２９７巻：１７〜１８頁（１９８２年）も参照されたい。エンハンサーは、ベクターに、抗体ポリペプチドコード配列の５’または３’の位置にスプライスされる場合もあるが、一般に、プロモーターの５’の部位に位置する。
【０４４４】
（ｖｉ）転写終結構成要素
【０４４５】
真核宿主細胞内で使用される発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有することが典型的である。このような配列は一般に、真核生物ＤＮＡもしくは真核生物ｃＤＮＡ、またはウイルスＤＮＡもしくはウイルスｃＤＮＡの５’非翻訳領域、場合によって、３’非翻訳領域から得られる。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化断片として転写される、ヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結構成要素は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６およびその中で開示されている発現ベクターを参照されたい。
【０４４６】
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択および形質転換
【０４４７】
本明細書のベクター内でＤＮＡをクローニングするかまたは発現させるのに適する宿主細胞は、脊椎動物宿主細胞を含む本明細書で記載される高等真核細胞を含む。培養物（組織培養物）中の脊椎動物細胞の繁殖は、日常的な手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞系（ＣＯＳ−７；ＡＴＣＣ：ＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児腎臓細胞系（２９３細胞または懸濁培養で成長させるためにサブクローニングされた２９３細胞；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．、３６巻：５９頁（１９７７年））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／ＤＨＦＲ−（ＣＨＯ；Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７７巻：４２１６頁（１９８０年））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４；Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．、２３巻：２４３〜２５１頁（１９８０年））；サル腎臓細胞（ＣＶ１；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６；ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ；ＡＴＣＣ：ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、３８３巻：４４〜６８頁（１９８２年））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒトヘパトーマ細胞系（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０４４８】
宿主細胞は、抗体の作製のための、上で記載した発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように改変された、従来の栄養培地中で培養する。
【０４４９】
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
【０４５０】
本発明の抗体を作製するのに使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養することができる。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞の培養に適する。加えて、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．、５８巻：４４頁（１９７９年）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０２巻：２５５頁（１９８０年）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；もしくは同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国特許再交付第３０，９８５号において記載されている培地のうちのいずれかを、宿主細胞のための培養培地として使用することもできる。これらの培地のうちのいずれかには、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびホスフェートなど）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生剤（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬など）、微量元素（通例マイクロモル濃度範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、ならびにグルコースもしくは同等のエネルギー供給源を補充することができる。また、他の任意の必要な補充物質も、当業者に公知の適切な濃度で含むことができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に対して既に使用された培養条件であり、当業者に明らかである。
【０４５１】
（ｉｘ）抗体の精製
【０４５２】
組換え技法を使用する場合、抗体は、細胞内で産生させること、または培地に直接分泌させることができる。抗体を細胞内で産生させる場合、最初のステップとして、宿主細胞または溶解させた断片のいずれかである粒子状残渣は一般に、例えば、遠心分離または限外濾過により除去する。抗体を培地に分泌させる場合、このような発現系に由来する上清は一般に、まず、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ限外濾過ユニットまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を前出のステップのうちのいずれかに含み、タンパク質分解を阻害することができ、偶発性の夾雑物の成長を防止するために抗生剤が含まれ得る。
【０４５３】
細胞から調製される抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーは一般に、許容可能な精製技法である。プロテインＡなどのアフィニティー試薬の、アフィニティーリガンドとしての適性は、抗体内に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用して、ヒトγ１重鎖、ヒトγ２重鎖、またはヒトγ４重鎖に基づく抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．、６２巻：１〜１３頁（１９８３年））。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプおよびヒトγ３のために推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、５巻：１５６７〜１５７５頁（１９８６年））。アフィニティーリガンドを付着させるマトリックスは大部分、アガロースであることが多いが、他のマトリックスも利用可能である。ＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなど、力学的に安定的なマトリックスは、アガロースに対して達成しうる流量より大きな流量およびアガロースに対して達成しうる加工時間より短い加工時間を可能とする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合は、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．  Ｔ．  Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が精製のために有用である。また、イオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリン上のクロマトグラフィー、アニオン交換樹脂上またはカチオン交換樹脂上（ポリアスパラギン酸カラムなど）のＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿など、タンパク質精製のための他の技法も、回収される抗体に応じて利用可能である。
【０４５４】
任意の予備的精製ステップの後、目的の抗体と夾雑物とを含む混合物を、必要に応じて、例えば、ｐＨを約２．５〜４．５の間とする溶出緩衝液を使用し、一般に低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で実施される、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにより、さらなる精製ステップにかけることができる。
【０４５５】
当技術分野では、一般に、研究、検査、および臨床使用における使用のための抗体を調製するための技法および方法論が十分に確立されており、上記とも符合し、かつ／または目的の特定の抗体に適切であると当業者にみなされていることに留意されたい。
【０４５６】
活性アッセイ
【０４５７】
本発明の抗体は、それらの物理的特性／化学的特性および生物学的機能について、当技術分野で公知の多様なアッセイにより特徴付けることができる。
【０４５８】
精製された抗体は、Ｎ末端シークェンシング、アミノ酸解析、非変性サイズ除外高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析、イオン交換クロマトグラフィー、およびパパイン消化を含むがこれらに限定されない、一連のアッセイによりさらに特徴付けることができる。
【０４５９】
必要な場合は、抗体を、それらの生物学的活性について解析する。一部の実施形態では、本発明の抗体を、それらの抗原結合活性について調べる。当技術分野で公知であり、本明細書で使用しうる抗原結合性アッセイは、限定せずに述べると、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、ナノ粒子イムノアッセイ、アプタマーイムノアッセイおよびプロテインＡイムノアッセイなどの技法を使用する、任意の直接的結合アッセイまたは競合的結合アッセイを含む。
【０４６０】
抗体断片
【０４６１】
本発明は、抗体断片を包含する。ある特定の状況では、全抗体ではなく、抗体断片を使用することが有利である。より小サイズの断片は、急速なクリアランスを可能とし、充実性腫瘍への接近の改善をもたらしうる。
【０４６２】
抗体断片を産生するための多様な技法が開発されている。従来、これらの断片は、無傷抗体のタンパク質分解性消化を介して導出した（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４巻：１０７〜１１７頁（１９９２年）；およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻：８１頁（１９８５年）を参照されたい）。しかし、今やこれらの断片は、組換え宿主細胞に直接産生させることができる。Ｆａｂ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、およびＳｃＦｖ抗体断片は全て、Ｅ．ｃｏｌｉ内で発現し、Ｅ．ｃｏｌｉから分泌され、このため、これらの断片の大量の作製が容易に可能となりうる。抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリーから単離することができる。代替的に、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収し、化学的にカップリングさせて、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することもできる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：１６３〜１６７頁（１９９２年））。別の手法に従い、Ｆ（ａｂ’）２断片を、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長したＦａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片については、米国特許第５，８６９，０４６号において記載されている。当業者には、抗体断片を作製するための他の技法も明らかであろう。他の実施形態では、選択した抗体は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および同第５，５８７，４５８号を参照されたい。ＦｖおよびｓＦｖは、定常領域を欠く無傷の結合部位を伴う唯一の分子種であり、このため、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける使用時に非特異的結合を低減するのに適する。ｓＦｖ融合タンパク質を構築して、ｓＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにおけるエフェクタータンパク質の融合をもたらすことができる。Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編、前出を参照されたい。例えば、抗体断片はまた、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載の通り、「直鎖状抗体」でもありうる。このような直鎖状抗体断片は、一特異性であっても二特異性であってもよい。
【０４６３】
ヒト化抗体
【０４６４】
本発明は、ヒト化抗体を包含する。当技術分野では、非ヒト抗体をヒト化するための多様な方法が公知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒト供給源から導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有しうる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と称することが多く、これは、「移入」可変ドメインから採取されることが典型的である。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らによる方法（Ｊｏｎｅｓら（１９８６年）、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８年）、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２７頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁）に従い、超可変領域配列で、ヒト抗体の対応する配列を置換することにより、本質的に実施することができる。したがって、このような「ヒト化」抗体とは、実質的に無傷に満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種に由来する対応する配列で置換されているキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際は、ヒト化抗体は、一部の超可変領域残基と、おそらく、一部のＦＲ残基とが、齧歯動物抗体内の類似の部位に由来する残基で置換されているヒト抗体であることが典型的である。
【０４６５】
ヒト化抗体を作製するのに使用される、軽鎖ヒト可変ドメインおよび重鎖ヒト可変ドメインのいずれの選択も、抗原性を低減するのに重要でありうる。いわゆる「ベストフィット」法に従い、齧歯動物抗体の可変ドメイン配列を、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに照らしてスクリーニングする。次いで、齧歯動物の配列に最も近接するヒト配列を、ヒト化抗体のためのヒトフレームワークとして受容する（Ｓｉｍｓら（１９９３年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２２９６頁；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１頁）。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定の亜群についての、全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体のために使用することができる（Ｃａｒｔｅｒら（１９９２年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：４２８５頁；Ｐｒｅｓｔａら（１９９３年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２６２３頁）。
【０４６６】
抗原に対する高アフィニティーおよび他の好適な生物学的特性を保持するように抗体をヒト化することがさらに一般に望ましい。この目標を達成するために、１つの方法に従い、ヒト化抗体を、親配列およびヒト化配列についての三次元モデルを使用する、親配列および多様な概念上のヒト化産物についての解析工程により調製する。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者は、これに精通している。選択された候補免疫グロブリン配列についての、あり得る三次元コンフォメーション構造を例示および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示について検討することにより、候補免疫グロブリン配列の機能において推定される残基の役割についての解析、すなわち、候補免疫グロブリンが、その抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基についての解析が可能となる。このようにして、標的抗原に対するアフィニティーの増大など、所望の抗体特徴を達成するように、ＦＲ残基は、レシピエント配列および移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、超可変領域の残基は、抗原への結合に対する影響に、直接、かつ、極めて実質的に関与する。
【０４６７】
ヒト抗体
【０４６８】
本発明のヒト抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローンの可変ドメイン配列を、上で記載した、公知のヒト定常ドメイン配列と組み合わせることにより構築することができる。代替的に、本発明のヒトモノクローナル抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体は、ハイブリドーマ法により作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の作製のための、ヒト骨髄腫細胞系およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系については、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３巻：３００１頁（１９８４年）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７年）；およびＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻：８６頁（１９９１年）により記載されている。
【０４６９】
今や、免疫化されると、内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することができる。例えば、キメラおよび生殖細胞系列の変異体マウスにおける、抗体重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性の欠失の結果として、内因性抗体産生の完全な阻害がもたらされることが記載されている。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子アレイを、このような生殖細胞系列変異体マウスに導入する結果として、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生がもたらされる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻：２５５１頁（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻：２５５頁（１９９３年）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７巻：３３頁（１９９３年）を参照されたい。
【０４７０】
遺伝子シャフリングはまた、ヒト抗体を、非ヒト抗体、例えば、齧歯動物抗体から導出するのにも使用することができ、この場合、ヒト抗体は、非ヒト出発抗体と同様のアフィニティーおよび特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法に従い、上で記載したファージディスプレイ技法により得られる、非ヒト抗体断片の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のいずれかを、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置きかえ、非ヒト鎖／ヒト鎖のｓｃＦｖキメラまたはＦａｂキメラの集団を創出する。抗原による選択の結果として、非ヒト鎖／ヒト鎖のキメラｓｃＦｖまたはキメラＦａｂが単離され、ここで、ヒト鎖は、初代ファージディスプレイクローン内で、対応する非ヒト鎖を除去したときに破壊された抗原結合性部位を回復する、すなわち、エピトープにより、ヒト鎖パートナーの選択が支配される（刷り込まれる）。残存する非ヒト鎖を置きかえるために工程を繰り返すと、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に公開された、ＰＣＴ  ＷＯ９３／０６２１３を参照されたい）。従来の、非ヒト抗体の、ＣＤＲグラフティングによるヒト化と異なり、この技法は、非ヒト由来のＦＲ残基もＣＤＲ残基も有さない、完全ヒト抗体をもたらす。
【０４７１】
二特異性抗体
【０４７２】
二特異性抗体とは、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、二特異性抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である。ある特定の実施形態では、結合特異性のうちの一方は、特異的リシン連結を含む、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈに対するものであり、他方は、他の任意の抗原に対するものである。ある特定の実施形態では、二特異性抗体は、２つの異なるリシン連結を有する、２つの異なるＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈに結合しうる。二特異性抗体は、全長抗体として、または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二特異性抗体）として調製することができる。
【０４７３】
当技術分野では、二特異性抗体を作製するための方法が公知である。従来、二特異性抗体の組換えによる作製は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づき、この場合、２つの重鎖は、異なる特異性を有する（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ、３０５巻：５３７頁（１９８３年））。免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖とのランダムな取合せのために、これらのハイブリドーマ（クァドローマ）は、そのうちの１つだけが正確な二特異性構造を有する、１０の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生する。通例、アフィニティークロマトグラフィーステップによりなされる、正確な分子の精製は、いくぶん煩瑣であり、産物の収量も低い。同様の手順は、１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１０巻：３６５５頁（１９９１年）において開示されている。
【０４７４】
異なる実施形態に従い、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を伴う抗体の可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させる。融合は、例えば、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域のうちの少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。ある特定の実施形態では、軽鎖の結合に必要な部位を含有する、第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）は、融合体のうちの少なくとも１つの中に存在する。免疫グロブリン重鎖融合体と、所望の場合、免疫グロブリン軽鎖とをコードするＤＮＡを、別個の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物に共トランスフェクトする。構築において使用される、等しくない比の３つのポリペプチド鎖から、最適の収量を得る実施形態では、これにより、３つのポリペプチド断片の相互の比率を調整するのに大きな柔軟性がもたらされる。しかし、少なくとも２つの、等しい比のポリペプチド鎖を発現させる結果として、高収量がもたらされる場合、または比が特段の重要性を有さない場合は、ポリペプチド鎖の２つまたは３つ全てのコード配列を、１つの発現ベクター内に挿入することが可能である。
【０４７５】
この手法の一実施形態では、二特異性抗体は、一方のアームにおける、第１の結合特異性を伴う、ハイブリッドの免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにおける、ハイブリッドの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性をもたらす）とから構成される。免疫グロブリン軽鎖が、二特異性分子の半分だけに存在することにより、容易な分離の方途がもたらされるので、この非対称性構造により、所望の二特異性化合物の、望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの分離が容易となることが見出された。この手法は、ＷＯ９４／０４６９０において開示されている。二特異性抗体を作り出すことのさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１巻：２１０頁（１９８６年）を参照されたい。
【０４７６】
別の手法に従い、抗体分子対の間の界面を操作して、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の百分率を最大化することができる。界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面に由来する、１つまたは複数の小型のアミノ酸側鎖を、より大型の側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置きかえる。大型のアミノ酸側鎖を、より小型の側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置きかえることにより、大型の側鎖と相補的な、同一または同様なサイズの「空隙」を、第２の抗体分子の界面上に創出する。これにより、ホモ二量体など、他の望ましくない最終生成物に対する、ヘテロ二量体の収量を増大させるための機構がもたらされる。
【０４７７】
二特異性抗体は、架橋抗体または「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲート内の抗体のうちの一方をアビジンへ、他方をビオチンにカップリングさせることができる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を、望ましくない細胞にターゲティングするため（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のため（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／００３７３、およびＥＰ０３０８９）に提起されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋法を使用して作製することができる。当技術分野では、適切な架橋剤が周知であり、多数の架橋技法と共に、米国特許第４，６７６，９８０号において開示されている。
【０４７８】
また、二特異性抗体を、抗体断片から作り出すための技法も、文献に記載されている。例えば、二特異性抗体は、化学連結を使用して調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻：８１頁（１９８５年）は、無傷抗体を、タンパク質分解により切断して、Ｆ（ａｂ’）２断片を作り出す手順について記載している。これらの断片を、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、近接のジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィドの形成を防止する。次いで、作り出されたＦａｂ’断片を、チオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に転換する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうちの一方を、メルカプトエチルアミンによる還元によって、Ｆａｂ’−チオールに再転換し、等モル量である他方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二特異性抗体を形成する。作製された二特異性抗体は、酵素を選択的に固定化するための薬剤として使用することができる。
【０４７９】
近年の進展は、二特異性抗体を形成するように、化学的にカップリングさせうる、Ｆａｂ’−ＳＨ断片の、Ｅ．ｃｏｌｉからの直接的回収を容易としている。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１７５巻：２１７〜２２５頁（１９９２年）は、完全ヒト化二特異性抗体であるＦ（ａｂ’）２分子の作製について記載している。各Ｆａｂ’断片を、Ｅ．ｃｏｌｉから個別に分泌させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、指向性化学的カップリングにかけて、二特異性抗体を形成する。このようにして形成された二特異性抗体は、ＨＥＲ２受容体を過剰発現する細胞、および正常ヒトＴ細胞に結合すること、ならびにヒト細胞傷害性リンパ球の、ヒト乳房腫瘍標的に対する溶解活性を誘発することが可能であった。
【０４８０】
また、二特異性抗体断片を、組換え細胞培養物から直接、作製および単離するための多様な技法も記載されている。例えば、二特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して作製されている（Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８巻（５号）：１５４７〜１５５３頁（１９９２年））。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質に由来するロイシンジッパーペプチドを、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に、遺伝子融合により連結した。抗体のホモ二量体を、ヒンジ領域において還元して、単量体を形成し、次いで、これを再度酸化して、抗体のヘテロ二量体を形成した。この方法はまた、抗体のホモ二量体を作製するためにも活用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻：６４４４〜６４４８頁（１９９３年）により記載されている「ダイアボディー」技術は、二特異性抗体断片を作製するための代替的な機構を提供している。断片は、同じ鎖上の２つのドメインの間の対合を可能とするには短すぎるリンカーにより、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、１つの断片のＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別の断片の相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインと対合することを強いられ、これにより、２つの抗原結合性部位を形成する。また、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用により、二特異性抗体断片を作製するための別の戦略も、報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２巻：５３６８頁（１９９４年）を参照されたい。
【０４８１】
二価を超える抗体が想定されている。例えば、三特異性抗体を調製することができる（Ｔｕｔｔら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻：６０頁（１９９１年））。
【０４８２】
多価抗体
【０４８３】
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現させる細胞により、二価抗体より速く内部化（および／または異化）されうる。本発明の抗体は、３つまたはこれを超える抗原結合性部位を伴う多価抗体（ＩｇＭクラス以外の抗体である）（例えば、四価抗体）の可能性があり、これは、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により、たやすく作製することができる。多価抗体は、二量体化ドメインおよび３つまたはこれを超える抗原結合性部位を含みうる。二量体化ドメインは、例えば、Ｆｃ領域またはヒンジ領域を含む（またはこれらからなる）。この状況では、抗体は、Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域に対してアミノ末端側にある、３つまたはこれを超える抗原結合性部位とを含む。一実施形態では、多価抗体は、例えば、３つ〜約８つ、または４つの抗原結合性部位を含む（またはこれらからなる）。多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（例えば、２つのポリペプチド鎖）を含み、ここで、ポリペプチド鎖は、２つまたはこれを超える可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃ［配列中、ＶＤ１は、第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の可変ドメインであり、Ｆｃは、Ｆｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１およびＸ２は、アミノ酸またはポリペプチドを表し、ｎは、０または１である］を含みうる。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＨ−ＣＨ１−可撓性リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖；またはＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を含みうる。本明細書の多価抗体は、少なくとも２つ（例えば、４つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含みうる。本明細書の多価抗体は、例えば、約２つ〜約８つの軽鎖可変ドメインポリペプチドを含みうる。本明細書で想定される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、任意選択で、ＣＬドメインをさらに含む。
【０４８４】
抗体改変体
一部の実施形態では、本明細書で記載される抗体のアミノ酸配列修飾が想定される。例えば、アミノ酸配列修飾は、抗体の結合アフィニティーおよび／または他の生物学的特性を改善するのに望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列改変体は、適切なヌクレオチド変化を抗体核酸に導入することにより、またはペプチド合成により調製する。このような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／または抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入、および／または抗体のアミノ酸配列内の残基の置換を含む。最終構築物が、所望の特徴を保有するという条件で、欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせを作製して、最終的な構築物に到達することができる。アミノ酸改変は、配列を作製するときに、対象抗体のアミノ酸配列内に導入することができる。
【０４８５】
変異誘発に好ましい位置である、抗体のある特定の残基または領域の同定に有用な方法は、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ  （１９８９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：１０８１〜１０８５頁により記載されている通り、「アラニン走査変異誘発」と呼ばれる。本明細書では、標的残基の残基または基を同定し（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＧｌｕなどの荷電残基）、アミノ酸の抗原との相互作用に影響を及ぼすように、中性アミノ酸または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）で置きかえる。次いで、置換の部位において、または置換の部位に代えて、さらなる改変体または他の改変体を導入することにより、置換に対する機能的な感受性を実証するアミノ酸位置を精緻化する。したがって、アミノ酸配列の変化形を導入するための部位は、あらかじめ決定するが、変異自体の性質は、あらかじめ決定する必要がない。例えば、所与の部位における変異の性能を解析するには、アラニン走査またはランダム変異誘発を、標的コドンまたは標的領域において施し、発現させた免疫グロブリンを、所望の活性についてスクリーニングする。
【０４８６】
アミノ酸配列の挿入は、長さが１残基〜１００またはこれを超える残基を含有するポリペプチドの範囲の、アミノ末端融合体および／またはカルボキシル末端融合体のほか、単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を伴う抗体、または細胞傷害性ポリペプチドに融合させた抗体を含む。抗体分子の他の挿入改変体は、抗体のＮ末端またはＣ末端の、酵素への融合体（例えば、ＡＤＥＰＴの場合）、または抗体の血清中半減期を延長するポリペプチドへの融合体を含む。
【０４８７】
別の種類の改変体は、アミノ酸置換改変体である。これらの改変体は、抗体分子内の少なくとも１つのアミノ酸残基を、異なる残基で置きかえている。置換変異誘発のために、最も大きな関心の対象となる部位は、超可変領域を含むが、また、ＦＲの改変も想定される。保存的置換を、「好ましい置換」の表題の下に、表Ａに示す。このような置換が、生物学的活性の変化を結果としてもたらす場合は、表Ａで「例示的置換」と名指されるか、またはアミノ酸クラスに言及して、下記でさらに記載される、より実質的な変化を導入し、産物をスクリーニングすることができる。
【０４８８】
表Ａ
【０４８９】
元の例示的な好ましい
【０４９０】
残基置換
【０４９１】
Ａｌａ  （Ａ）  Ｖａｌ；  Ｌｅｕ；  Ｉｌｅ  Ｖａｌ
【０４９２】
Ａｒｇ  （Ｒ）  Ｌｙｓ；  Ｇｌｎ；  Ａｓｎ  Ｌｙｓ
【０４９３】
Ａｓｎ  （Ｎ）  Ｇｌｎ；  Ｈｉｓ；  Ａｓｐ，  Ｌｙｓ；  Ａｒｇ  Ｇｌｎ
【０４９４】
Ａｓｐ  （Ｄ）  Ｇｌｕ；  Ａｓｎ  Ｇｌｕ
【０４９５】
Ｃｙｓ  （Ｃ）  Ｓｅｒ；  Ａｌａ  Ｓｅｒ
【０４９６】
Ｇｌｎ  （Ｑ）  Ａｓｎ；  Ｇｌｕ  Ａｓｎ
【０４９７】
Ｇｌｕ  （Ｅ）  Ａｓｐ；  Ｇｌｎ  Ａｓｐ
【０４９８】
Ｇｌｙ  （Ｇ）  Ａｌａ  Ａｌａ
【０４９９】
Ｈｉｓ  （Ｈ）  Ａｓｎ；  Ｇｌｎ；  Ｌｙｓ；  Ａｒｇ  Ａｒｇ
【０５００】
Ｉｌｅ  （Ｉ）  Ｌｅｕ；  Ｖａｌ；  Ｍｅｔ；  Ａｌａ；  Ｌｅｕ
【０５０１】
Ｐｈｅ；  ノルロイシン
【０５０２】
Ｌｅｕ  （Ｌ）  ノルロイシン；  Ｉｌｅ；  Ｖａｌ；  Ｉｌｅ
【０５０３】
Ｍｅｔ；  Ａｌａ；  Ｐｈｅ
【０５０４】
Ｌｙｓ  （Ｋ）  Ａｒｇ；  Ｇｌｎ；  Ａｓｎ  Ａｒｇ
【０５０５】
Ｍｅｔ  （Ｍ）  Ｌｅｕ；  Ｐｈｅ；  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ
【０５０６】
Ｐｈｅ  （Ｆ）  Ｔｒｐ；  Ｌｅｕ；  Ｖａｌ；  Ｉｌｅ；  Ａｌａ；  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ
【０５０７】
Ｐｒｏ  （Ｐ）  Ａｌａ  Ａｌａ
【０５０８】
Ｓｅｒ  （Ｓ）  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ
【０５０９】
Ｔｈｒ  （Ｔ）  Ｖａｌ；  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ
【０５１０】
Ｔｒｐ  （Ｗ）  Ｔｙｒ；  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ
【０５１１】
Ｔｙｒ  （Ｙ）  Ｔｒｐ；  Ｐｈｅ；  Ｔｈｒ；  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ
【０５１２】
Ｖａｌ  （Ｖ）  Ｉｌｅ；  Ｌｅｕ；  Ｍｅｔ；  Ｐｈｅ；  Ｌｅｕ
【０５１３】
Ａｌａ；  ノルロイシン
【０５１４】
抗体の生物学的特性の実質的な修飾は、（ａ）例えば、シートコンフォメーションもしくはヘリックスコンフォメーションとしての置換エリア内のポリペプチド骨格の構造；（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性；または（ｃ）側鎖のかさを維持することに対するそれらの効果が著明に異なる置換を選択することにより達成する。アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性（Ａ．  Ｌ．  Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２版、７３〜７５頁、Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７５年））：
【０５１５】
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
【０５１６】
（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｏ）
【０５１７】
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
【０５１８】
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）
に従い群分けすることができる。
【０５１９】
代替的に、天然に存在する残基は、一般的な側鎖特性に基づく群：
【０５２０】
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
【０５２１】
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
【０５２２】
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
【０５２３】
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
【０５２４】
（５）鎖の配向性に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
【０５２５】
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
に分けることができる。
【０５２６】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを、別のクラスのメンバーと交換することを伴う。また、このような置換残基を、保存的置換部位へ、または残りの（非保存的な）部位に導入することもできる。
【０５２７】
１つの種類の置換改変体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つまたは複数の超可変領域残基の置換を伴う。一般に、さらなる開発のために選択される、結果として得られる改変体では、生物学的特性は、それらが作り出された親抗体と比べて修飾されている（例えば、改善されている）。このような置換改変体を作り出すための簡便な方途は、ファージディスプレイを使用するアフィニティー成熟を伴う。略述すると、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７カ所の部位）を変異させて、各部位における全ての可能なアミノ酸置換を作り出す。このようにして作り出された抗体は、糸状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージングされたファージコートタンパク質（例えば、Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩ産物）のうちの少なくとも一部との融合体としてディスプレイされる。次いで、ファージディスプレイされた改変体を、本明細書で開示される通り、それらの生物学的活性（例えば、結合アフィニティー）についてスクリーニングする。修飾のための候補超可変領域部位を同定するために、走査変異誘発（例えば、アラニン走査）を実施して、抗原への結合に著明に寄与する超可変領域残基を同定することができる。代替的に、または加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を解析して、抗体と抗原との接触点を同定することも有益でありうる。このような接触残基および隣接残基は、本明細書で詳述される技法を含む、当技術分野で公知の技法に従う置換のための候補である。このような改変体を作り出したら、改変体のパネルを、本明細書で記載される技法を含む、当技術分野で公知の技法を使用するスクリーニングにかけ、１つまたは複数の関連アッセイにおいて優れた特性を伴う抗体を、さらなる開発のために選択することができる。
【０５２８】
抗体のアミノ酸配列改変体をコードする核酸分子は、当技術分野で公知の様々な方法により調製する。これらの方法は、天然供給源（天然に存在するアミノ酸配列改変体の場合）からの単離、またはオリゴヌクレオチド媒介型（または部位指向）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、および抗体の、以前に調製された改変体もしくは非バージョンに対する、カセット型変異誘発による調製を含むがこれらに限定されない。
【０５２９】
１つまたは複数のアミノ酸修飾を、本発明の抗体のＦｃ領域内に導入し、これにより、Ｆｃ領域改変体を作り出すことが望ましい場合がある。Ｆｃ領域改変体は、ヒンジシステインのアミノ酸位置を含む、１つまたは複数のアミノ酸位置におけるアミノ酸修飾（例えば、置換）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃ領域）を含みうる。
【０５３０】
イムノコンジュゲート
【０５３１】
別の態様では、本発明は、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌由来、真菌由来、植物由来、もしくは動物由来の酵素的に活性な毒素、またはこれらの断片）、または放射性同位元素（すなわち、放射性コンジュゲート）などの細胞傷害剤にコンジュゲートさせた抗体を含む、イムノコンジュゲートまたは抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。
【０５３２】
細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤、すなわち、がんの処置において、腫瘍細胞を死滅させるかまたは阻害する薬物を局所送達するために、抗体−薬物コンジュゲートを使用すること（ＳｙｒｉｇｏｓおよびＥｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９年）、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９巻：６０５〜６１４頁；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−ＤｕｖａｚおよびＳｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７年）、Ａｄｖ．  Ｄｒｇ  Ｄｅｌ．  Ｒｅｖ．、２６巻：１５１〜１７２頁；米国特許第４，９７５，２７８号）により、薬物部分の、腫瘍へのターゲティング送達、および腫瘍細胞内の蓄積が可能となり、この場合、これらの薬剤（ｄｒｕｇ  ａｇｅｎｔ）をコンジュゲートさせずに全身投与すれば、許容不可能なレベルの毒性が、消失が求められる腫瘍細胞のほか、正常細胞にも結果としてもたらされうる（Ｂａｌｄｗｉｎら（１９８６年）、Ｌａｎｃｅｔ（１９８６年３月１５日）：６０３〜０５頁；Ｔｈｏｒｐｅ（１９８５年）、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ‘８４：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａ．  Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５〜５０６頁）。こうして、毒性を最小としながら、有効性を最大とすることが探索される。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれも、これらの戦略において有用であると報告されている（Ｒｏｗｌａｎｄら（１９８６年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２１巻：１８３〜８７頁）。これらの方法で使用される薬物は、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキセート、およびビンデシンを含む（Ｒｏｗｌａｎｄら（１９８６年）、前出）。抗体−毒素コンジュゲート内で使用される毒素は、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシンなどの低分子毒素（Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００年）、Ｊｏｕｒ．  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．、９２巻（１９号）：１５７３〜１５８１頁；Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００年）、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１０巻：１０２５〜１０２８頁；Ｍａｎｄｌｅｒら（２００２年）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、１３巻：７８６〜７９１頁）、メイタンシノイド（ＥＰ１３９１２１３；Ｌｉｕら（１９９６年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９３巻：８６１８〜８６２３頁）、およびカリケアマイシン（Ｌｏｄｅら（１９９８年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５８巻：２９２８頁；Ｈｉｎｍａｎら（１９９３年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５３巻：３３３６〜３３４２頁）を含む。毒素は、それらの細胞傷害効果および細胞増殖抑制効果を、チューブリンへの結合、ＤＮＡへの結合、またはトポイソメラーゼの阻害を含む機構により及ぼしうる。一部の細胞傷害薬は、大型の抗体またはタンパク質受容体のリガンドにコンジュゲートさせると、不活性であるか活性がより低い傾向がある。
【０５３３】
抗体の誘導体
【０５３４】
本発明の抗体は、当技術分野で公知であり、たやすく利用可能な、さらなる非タンパク質性部分を含有するように、さらに修飾することができる。一実施形態では、抗体の誘導体化に適する部分は、水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、およびこれらの混合物を含むがこれらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中のその安定性のために、製造において有利でありうる。ポリマーは、任意の分子量であることが可能であり、分枝状であっても非分枝状であってもよい。抗体に付着させるポリマーの数は変更し得、１つを超えるポリマーを付着させる場合、ポリマーは、同じ、または、異なる分子の場合がある。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／または種類は、改善される抗体の特定の特性または機能、抗体の誘導体が規定された条件下の治療で使用されるのかどうかなどを含むがこれらに限定されない検討項目に基づき決定することができる。
【０５３５】
別の実施形態では、放射線への曝露により選択的に加熱されうる、抗体と非タンパク質性部分とのコンジュゲートが提供される。一実施形態では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、１０２巻：１１６００〜１１６０５頁（２００５年））。放射線は、任意の波長のものであることが可能であり、通常の細胞には有害でないが、非タンパク質性部分を、抗体−非タンパク質性部分に近位の細胞が死滅する温度まで加熱する波長を含むがこれらに限定されない。
【０５３６】
医薬製剤
【０５３７】
本発明の抗体を含む治療用製剤は、所望の程度の純度を有する抗体を、任意選択の、生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６版、Ｏｓｏｌ，  Ａ．編（１９８０年））と、水溶液、凍結乾燥製剤、または他の乾燥製剤の形態で混合することにより、保管用に調製する。許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤は、使用される投与量および濃度で、レシピエントに対して非毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、および、グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【０５３８】
本明細書の製剤はまた、処置される特定の適応症に対する必要に応じて、１つを超える活性化合物であって、互いに対して有害な影響を及ぼし合わない相補的活性を伴う活性化合物を含むがこれらに限定されない活性化合物も含有しうる。このような分子は、意図される目的に有効な量で組み合わせの中に適切に存在する。
【０５３９】
有効成分はまた、例えば、コアセルベーション技法により、または界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）内、またはマクロエマルジョン中の、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル内またはゼラチンマイクロカプセル内およびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル内に捕らえることもできる。このような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６版、Ｏｓｏｌ，  Ａ．編（１９８０年）において開示されている。
【０５４０】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける投与のために使用される製剤は、滅菌製剤でなければならない。これは、滅菌濾過膜を介する濾過によりたやすく達成される。
【０５４１】
持続放出調製物を調製することができる。適切な持続放出調製物の例は、本発明の免疫グロブリンを含有する固体の疎水性ポリマーによる半透性マトリックスを含み、このマトリックスは、成型品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態にある。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーと、酢酸ロイプロリドとから構成される注射用マイクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーが、１００日間超にわたり分子の放出を可能とするのに対し、ある特定のヒドロゲルは、タンパク質を放出する期間が短い。封入された免疫グロブリンは、長時間体内にとどまる場合、３７℃の水分に曝露される結果として、変性または凝集し、生物学的活性の喪失および可能な免疫原性の変化を結果としてもたらす場合がある。関与する機構に応じた、安定化のための妥当な戦略を案出することができる。例えば、凝集機構は、チオ−ジスルフィド交換を介する、分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることがわかっていれば、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含量を制御し、適切な添加剤を使用し、特異的なポリマーマトリックス組成物を開発することにより達成することができる。
【０５４２】
使用
【０５４３】
本発明の抗体は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける治療法において使用することができる。本発明の抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける特異的抗原活性を、部分的または完全に遮断するアンタゴニストとして使用することができる。さらに、本発明の抗体の少なくとも一部は、他の種に由来する抗原活性を中和しうる。したがって、本発明の抗体を使用して、例えば、抗原を含有する細胞培養物中、ヒト対象、または、本発明の抗体が交差反応する抗原を有する他の哺乳動物対象（例えば、チンパンジー、ヒヒ、マーモセット、カニクイザル、およびアカゲザル、ブタ、またはマウス）における特異的抗原活性を阻害することができる。一実施形態では、本発明の抗体は、抗原活性を阻害するように、抗体を抗原と接触させることにより、抗原活性を阻害するために使用することができる。一実施形態では、抗原は、ヒトタンパク質分子である。
【０５４４】
一実施形態では、本発明の抗体は、抗原活性が有害である障害を患う対象において、抗原を阻害するための方法であって、対象における抗原活性を阻害するように、対象に、本発明の抗体を投与するステップを含む方法において使用することができる。一実施形態では、抗原は、ヒトタンパク質分子であり、対象は、ヒト対象である。代替的に、対象は、本発明の抗体が結合する抗原を発現させる哺乳動物でありうる。なおさらに、対象は、抗原を導入した（例えば、抗原の投与により、または抗原導入遺伝子の発現により）哺乳動物でありうる。本発明の抗体は、ヒト対象に、治療目的で投与することができる。さらに、本発明の抗体は、抗体が交差反応する抗原を発現させる非ヒト哺乳動物（例えば、霊長動物、ブタ、またはマウス）に、獣医学的目的で、またはヒト疾患の動物モデルとして、投与することもできる。後者に関して、このような動物モデルは、本発明の抗体の治療有効性の評価（例えば、投与量および投与の時間経過についての検査）に有用でありうる。本発明の抗体を使用して、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  ＨおよびＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ化タンパク質（ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の異常な発現および／または活性と関連する疾患、障害、または状態であって、がん、筋障害、ユビキチン経路関連の遺伝子障害、免疫／炎症性障害、神経障害、および他のユビキチン経路関連障害を含むがこれらに限定されない疾患、障害、または状態を処置するか、阻害するか、進行を遅延させるか、再発を防止する／遅延させるか、回復させるか、または防止することができる。
【０５４５】
一態様では、本発明の遮断抗体は、ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈに特異的である。
【０５４６】
ある特定の実施形態では細胞傷害剤とコンジュゲートさせた本発明の抗体を含むイムノコンジュゲートを、患者に投与する。一部の実施形態では、イムノコンジュゲート、および／またはそれが結合する抗原は、それらの細胞表面上にＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈと関連する１つまたは複数のタンパク質を発現させる細胞により内部化され、結果として、それが会合する標的細胞の殺滅におけるイムノコンジュゲートの治療有効性の増大をもたらす。一実施形態では、細胞傷害剤は、標的細胞内の核酸をターゲティングするか、またはこれに干渉する。このような細胞傷害剤の例は、本明細書で言及される化学療法剤（メイタンシノイドまたはカリケアマイシンなど）、放射性同位元素、またはリボヌクレアーゼもしくはＤＮＡエンドヌクレアーゼのうちのいずれかを含む。
【０５４７】
本発明の抗体は、治療において、単独で、または他の組成物と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体は、別の抗体および／またはアジュバント／治療剤（例えば、ステロイド）と共に共投与することができる。例えば、本発明の抗体は、処置スキームにおいて、例えば、がん、筋障害、ユビキチン経路関連の遺伝子障害、免疫／炎症性障害、神経障害、および他のユビキチン経路関連障害を含む、本明細書で記載される疾患のうちのいずれかの処置において、抗炎症剤および／または消毒薬と組み合わせることができる。上で言及された、このような組み合わせ療法は、組み合わせ投与（２つまたはこれを超える薬剤が、同じ製剤中または個別の製剤中に含まれる場合）と、個別投与とを含み、個別投与の場合、本発明の抗体の投与は、１つまたは複数の補助療法の投与の前、および／またはこれらの後で施すことができる。
【０５４８】
本発明の抗体（および補助療法剤）は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、および鼻腔内、ならびに、局所的処置に所望の場合、病変内投与を含む任意の適切な手段により投与することができる。非経口注入は、筋内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または皮下投与を含む。加えて、抗体は、特に、抗体の用量を減じるパルス注入により投与するのに適する。投薬は、任意の適切な経路によって、例えば、投与が短期であるのか、長期であるのかに部分的に応じて、静脈内または皮下注射などの注射を介することが可能である。
【０５４９】
抗体の調製および投与では、本発明の抗体の結合標的の位置を考慮する場合がある。結合標的が、細胞内分子である場合、本発明のある特定の実施形態は、結合標的が位置する細胞に導入される抗体またはその抗原結合性断片を提供する。一実施形態では、本発明の抗体は、細胞内でイントラボディー（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）として発現させることができる。本明細書で使用される「イントラボディー」という用語は、Ｍａｒａｓｃｏ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、４巻：１１〜１５頁（１９９７年）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３４巻：１６３〜１７０頁（２００４年）；米国特許第６，００４，９４０号および同第６，３２９，１７３号；米国特許出願公開第２００３／０１０４４０２号；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２００３／０７７９４５号において記載されている通り、細胞内で発現し、標的分子に選択的に結合することが可能な、抗体またはその抗原結合性部分を指す。イントラボディーの細胞内発現は、所望の抗体またはその抗原結合性部分をコードする核酸（その抗体または抗原結合性断片をコードする遺伝子と通常関連する、野生型のリーダー配列および分泌シグナルを欠く）を、標的細胞に導入することによりなされる。核酸を細胞に導入する、任意の標準的な方法であって、微量注射、遺伝子銃注射、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム、および、目的の核酸を保有するレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびワクシニアベクターによるトランスフェクションを含むがこれらに限定されない方法を使用することができる。ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈへの細胞内結合、および１つまたは複数のＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ媒介性細胞内経路のモジュレーションが可能な、１つまたは複数のイントラボディーを発現させるように、本発明の抗ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４／Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体の全部または一部分をコードする、１つまたは複数の核酸を、標的細胞に送達することができる。
【０５５０】
別の実施形態では、内部化抗体が提供される。抗体は、抗体の細胞への送達を増強するある特定の特徴を保有する場合もあり、このような特徴を保有するように修飾される場合もある。当技術分野では、これを達成するための技法が公知である。例えば、抗体のカチオン化は、その細胞への取込みを容易とすることが公知である（例えば、米国特許第６，７０３，０１９号を参照されたい）。また、リポフェクションまたはリポソームも、抗体を細胞に送達するのに使用することができる。抗体断片を使用する場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害性断片が一般に有利である。例えば、抗体の可変領域配列に基づき、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するペプチド分子をデザインすることができる。このようなペプチドは、化学合成する、かつ／または組換えＤＮＡ技術により作製することができる。例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻：７８８９〜７８９３頁（１９９３年）を参照されたい。
【０５５１】
モジュレーターポリペプチドの、標的細胞への侵入は、当技術分野で公知の方法により増強することができる。例えば、ＨＩＶ  ＴａｔまたはＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメインタンパク質に由来する配列など、ある特定の配列は、異種タンパク質の、細胞膜を横切る効率的な取込みを誘導することが可能である。例えば、Ｃｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（１９９９年）、９６巻：４３２５〜４３２９頁を参照されたい。
【０５５２】
結合標的が脳内に位置する場合、本発明のある特定の実施形態は、血液脳関門を越える抗体またはその抗原結合性断片を提供する。ある特定の神経変性疾患は、抗体または抗原結合性断片が、脳にたやすく導入されうるような、血液脳関門の透過性の増大と関連する。血液脳関門が無傷のままである場合は、物理的方法、脂質ベースの方法、ならびに受容体およびチャネルベースの方法を含むがこれらに限定されない、血液脳関門を横切って分子を輸送するための、当技術分野で公知のいくつかの手法が存在する。
【０５５３】
抗体または抗原結合性断片を、血液脳関門を横切って輸送する、物理的方法は、血液脳関門を全体として迂回する方法、または血液脳関門内に開口部を創出する方法を含むがこれらに限定されない。迂回法は、脳への直接的注射（例えば、Ｐａｐａｎａｓｔａｓｓｉｏｕら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、９巻：３９８〜４０６頁（２００２年）を参照されたい）、間質内注入／対流増強型送達（例えば、Ｂｏｂｏら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９１巻：２０７６〜２０８０頁（１９９４年）を参照されたい）、および送達デバイスの脳内への植込み（例えば、Ｇｉｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、９巻：５８９〜５９５頁（２００３年）；およびＧｌｉａｄｅｌ  Ｗａｆｅｒｓ（商標）、Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌを参照されたい）を含むがこれらに限定されない。関門内に開口部を創出する方法は、超音波（例えば、米国特許公開第２００２／００３８０８６号を参照されたい）、浸透圧（例えば、高張性マンニトールの投与による（Ｎｅｕｗｅｌｔ，  Ｅ．  Ａ．、Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ  Ｂａｒｒｉｅｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ、１および２巻、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）））、例えば、ブラジキニンまたは透過剤Ａ−７による透過処理（例えば、米国特許第５，１１２，５９６号、同第５，２６８，１６４号、同第５，５０６，２０６号、および同第５，６８６，４１６号を参照されたい）、および血液脳関門を夾叉するニューロンの、抗体または抗原結合性断片をコードする遺伝子を含有するベクターによるトランスフェクション（例えば、米国特許公開第２００３／００８３２９９号を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。
【０５５４】
抗体または抗原結合性断片を、血液脳関門を横切って輸送する、脂質ベースの方法は、抗体または抗原結合性断片を、血液脳関門の血管内皮上の受容体に結合する抗体または抗原結合性断片にカップリングさせたリポソーム内に封入する方法（例えば、米国特許出願公開第２００２００２５３１３号を参照されたい）、および抗体または抗原結合性断片を、低密度リポタンパク質粒子（例えば、米国特許出願公開第２００４０２０４３５４号を参照されたい）またはアポリポタンパク質Ｅ（例えば、米国特許出願公開第２００４０１３１６９２号を参照されたい）でコーティングする方法を含むがこれらに限定されない。
【０５５５】
抗体または抗原結合性断片を、血液脳関門を横切って輸送する、受容体およびチャネルベースの方法は、グルココルチコイド遮断剤を使用して、血液脳関門の透過性を増大させる方法（例えば、米国特許出願公開第２００２／００６５２５９号、同第２００３／０１６２６９５号、および同第２００５／０１２４５３３号を参照されたい）；カリウムチャネルを活性化させる方法（例えば、米国特許出願公開第２００５／００８９４７３号を参照されたい）、ＡＢＣ薬物輸送体を阻害する方法（例えば、米国特許出願公開第２００３／００７３７１３号を参照されたい）；抗体をトランスフェリンでコーティングし、１つまたは複数のトランスフェリン受容体の活性をモジュレートする方法（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１２９１８６号を参照されたい）、および抗体をカチオン化する方法（例えば、米国特許第５，００４，６９７号を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。
【０５５６】
本発明の抗体組成物は、「医薬品の製造および品質管理に関する基準（ｇｏｏｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）」に準拠する方式で、製剤化、投薬および投与される。この文脈で検討される因子は、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与法、投与のスケジュール指定、および医療従事者に公知の他の因子を含む。抗体は、問題の障害を防止または処置するのに現在使用されている、１つまたは複数の薬剤と共に製剤化する必要はないが、任意選択で、これらと共に製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する本発明の抗体の量、障害または処置の種類、および上で論じた他の因子に依存する。これらは、一般に、本明細書で記載される通り同じ投与量および投与経路で、または本明細書で記載される投与量の約１〜９９％で、または経験的／臨床的に適切であると決定される任意の投与量および任意の経路で使用される。
【０５５７】
疾患を防止または処置するために、本発明の抗体の適切な投与量（単独で、または、化学療法剤など、他の薬剤と組み合わせて使用する場合）は、処置される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度および経過、抗体が予防目的で投与されるのか、治療目的で投与されるのか、以前の治療、患者の臨床歴および抗体への応答、ならびに主治医の判断に依存する。抗体は、患者に一度に、または一連の処置にわたり投与するのに適する。疾患の種類および重症度に応じて、抗体約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）が、例えば、１回または複数回の個別投与によるのであれ、連続注入によるのであれ、患者に投与するための初期の候補投与量でありうる。典型的な毎日の１回分の投与量は、上で言及した因子に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはこれを超える範囲でありうる。数日間またはこれを超えて長期にわたる繰返し投与では、状態に応じて、処置は一般に、疾患症状の所望される抑制が生じるまで持続される。１つの例示的な抗体の投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇのうちの１つまたは複数の用量（またはこれらの任意の組み合わせ）を、患者に投与することができる。このような用量は、間欠的に、例えば、毎週または３週間ごとに（例えば、患者が抗体の、約２〜約２０用量、または例えば、約６用量を受けるように）投与することができる。初期の高負荷用量に続き、１回または複数回の低用量を投与することができる。例示的な投薬レジメンは、初期負荷用量約４ｍｇ／ｋｇに続いて、毎週の維持用量約２ｍｇ／ｋｇの抗体を投与することを含む。しかし、他の投与レジメンも、有用でありうる。この治療の進捗状況は、従来の技法およびアッセイにより、容易にモニタリングされる。
【０５５８】
製品
【０５５９】
本発明の別の態様では、上で記載した障害の処置、防止、および／または診断に有用な材料を含有する製品が提供される。製品は、容器、および容器上における標識もしくはパッケージ添付文書、または容器と関連する標識もしくはパッケージ添付文書を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどを含む。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。容器は、それ自体で、または別の組成物と組み合わされると、状態を処置、防止、および／または診断するのに有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを含みうる（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針で穿刺可能な止栓を有するバイアルの場合がある）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の抗体である。標識またはパッケージ添付文書は、組成物が、選択した状態を処置するために使用されることを指し示す。さらに、製品は、（ａ）組成物がその中に含有された第１の容器であって、組成物が本発明の抗体を含む、容器と；（ｂ）組成物がその中に含有された第２の容器であって、組成物がさらなる細胞傷害性またはこれ以外の治療剤を含む、容器とを含みうる。本発明のこの実施形態における製品は、組成物を使用して、特定の状態を処置しうることを指し示す、パッケージ添付文書もさらに含みうる。代替的に、または加えて、製品は、静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液など、薬学的に許容される緩衝液を含む第２の（または第３の）容器もさらに含みうる。製品は、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業上のおよび使用者の観点から望ましい他の材料もさらに含む。
【０５６０】
医薬組成物および製剤
【０５６１】
本明細書で記載される抗体を調製した後で、「凍結乾燥前の製剤（ｐｒｅ−ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」を作製することができる。製剤を調製するための抗体は、本質的に純粋であることが好ましく、本質的に均質であることが所望される（すなわち、夾雑タンパク質などを含まない）。「本質的に純粋な」タンパク質とは、組成物の総重量に基づき、少なくとも約９０重量％のタンパク質、好ましくは、少なくとも約９５重量％を含む組成物を意味する。「本質的に均質な」タンパク質とは、組成物の総重量に基づき、少なくとも約９９重量％のタンパク質を含む組成物を意味する。ある特定の実施形態では、タンパク質は、抗体である。
【０５６２】
凍結乾燥前の製剤中の抗体の量は、所望の用量容量、投与方式などを考慮に入れて決定する。選択したタンパク質が、無傷抗体（全長抗体）である場合、約２ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、約５ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬであり、最も好ましくは、約２０〜３０ｍｇ／ｍＬが、例示的な出発タンパク質濃度である。タンパク質は一般に、溶液中に存在する。例えば、タンパク質は、ｐＨ緩衝溶液中に、ｐＨ約４〜８で、好ましくは、約５〜７で存在しうる。例示的な緩衝剤は、ヒスチジン、ホスフェート、トリス、シトレート、スクシネート、および他の有機酸を含む。緩衝剤濃度は、例えば、緩衝剤および製剤（例えば、再構成製剤）の所望の等張性に応じて、約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、または約３ｍＭ〜約１５ｍＭでありうる。下記で裏付けられる通り、ヒスチジンは、凍結乾燥保護特性を有しうるので、好ましい緩衝剤は、ヒスチジンである。スクシネートは、別の有用な緩衝剤であることが示された。
【０５６３】
凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を、凍結乾燥前の製剤に添加する。好ましい実施形態では、凍結乾燥保護剤は、スクロースまたはトレハロースなどの非還元糖である。凍結乾燥前の製剤中の凍結乾燥保護剤の量は一般に、再構成すると、結果として得られる製剤が等張性となるような量である。しかしまた、高張性の再構成製剤も、適切でありうる。加えて、凍結乾燥保護剤の量は、凍結乾燥時に、許容不可能な量のタンパク質の分解／凝集が生じるほどに少なすぎてはならない。凍結乾燥保護剤が、糖（スクロースまたはトレハロースなど）であり、タンパク質が、抗体である場合、例示的な、凍結乾燥前の製剤中の凍結乾燥保護剤濃度は、約１０ｍＭ〜約４００ｍＭ、好ましくは、約３０ｍＭ〜約３００ｍＭ、最も好ましくは、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭである。
【０５６４】
タンパク質と凍結乾燥保護剤との比は、タンパク質と凍結乾燥保護剤との各組み合わせについて選択する。タンパク質濃度が高い等張性の再構成製剤を作り出すための、選択したタンパク質としての抗体、および凍結乾燥保護剤としての糖（例えば、スクロースまたはトレハロース）の場合、凍結乾燥保護剤と抗体とのモル比は、１モルの抗体に対して約１００〜約１５００モルの凍結乾燥保護剤、好ましくは、１モルの抗体に対して約２００〜約１０００モルの凍結乾燥保護剤、例えば、１モルの抗体に対して約２００〜約６００モルの凍結乾燥保護剤でありうる。
【０５６５】
本発明の好ましい実施形態では、凍結乾燥前の製剤に、界面活性剤を添加することが望ましいことが見出されている。代替的に、または加えて、界面活性剤は、凍結乾燥製剤および／または再構成製剤に添加することもできる。例示的な界面活性剤は、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０または８０）；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）；Ｔｒｉｔｏｎ；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｌａｕｒｅｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）；オクチルグリコシドナトリウム；ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、リノレイルスルホベタイン、またはステアリルスルホベタイン；ラウリルサルコシン、ミリスチルサルコシン、リノレイルサルコシン、またはステアリルサルコシン；リノレイルベタイン、ミリスチルベタイン、またはセチルベタイン；ラウロアミドプロピルベタイン、コカミドプロピルベタイン、リノレアミドプロピルベタイン、ミリストアミドプロピルベタイン、パルミドプロピル（ｐａｌｎｉｄｐｒｏｐｙｌ）ベタイン、またはイソステアラミドプロピルベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）；ミリストアミドプロピルジメチルアミン、パルミドプロピルジメチルアミン、またはイソステアラミドプロピルジメチルアミン；ココイルメチルタウリンナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌ  ｃｏｃｏｙｌ  ｔａｕｒａｔｅ）またはオレオイルメチルタウリン二ナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌ  ｏｌｅｙｌ−ｔａｕｒａｔｅ）；ならびにＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）シリーズ（Ｍｏｎａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｐａｔｅｒｓｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリプロピレングリコール（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌ  ｇｌｙｃｏｌ）、およびエチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＰＦ６８など）などの非イオン性界面活性剤を含む。添加される界面活性剤の量は、界面活性剤により、再構成されるタンパク質の凝集を低減し、再構成後における粒子状物質の形成を最小化するような量である。例えば、界面活性剤は、凍結乾燥前の製剤中に、約０．００１〜０．５％の量で、好ましくは、約０．００５〜０．０５％で存在しうる。
【０５６６】
本発明のある特定の実施形態では、凍結乾燥保護剤（スクロースまたはトレハロースなど）と、増量剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）との混合物を、凍結乾燥前の製剤の調製物中で使用する。増量剤により、その中に過剰なポケットなどを伴わずに、均一な凍結乾燥ケーキの作製を可能とすることができる。
【０５６７】
それらが、製剤の所望の特徴に有害な影響を及ぼさないという条件で、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６版、Ｏｓｏｌ，  Ａ．編（１９８０年）において記載されているものなど、他の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤を、凍結乾燥前の製剤（および／または凍結乾燥製剤および／または再構成製剤）中に含むことができる。許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤は、使用される投与量および濃度で、レシピエントに対して非毒性であり、さらなる緩衝化剤；防腐剤；共溶媒；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ポリエステルなどの生体分解性ポリマー；ならびに／またはナトリウムなどの塩形成対イオンを含む。
【０５６８】
本明細書で記載される医薬組成物および製剤は、安定的であることが好ましい。「安定的な」製剤／組成物とは、その中の抗体が、保管時に、その物理的および化学的な安定性および完全性を本質的に保持する製剤／組成物である。当技術分野では、タンパク質の安定性を測定するための多様な解析技法が利用可能であり、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２４７〜３０１頁、Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．刊（１９９１年）；およびＪｏｎｅｓ，  Ａ．、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．、１０巻：２９〜９０頁（１９９３年）において総説されている。安定性は、選択された温度で、選択された期間にわたり測定することができる。
【０５６９】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける投与のために使用される製剤は、滅菌製剤でなければならない。これは、凍結乾燥および再構成の前に、または凍結乾燥および再構成の後で、滅菌濾過膜を介する濾過によりたやすく達成される。代替的に、混合物全体の無菌性は、タンパク質を除く成分を、例えば、約１２０℃で約３０分間、オートクレーブにかけることにより達成することができる。
【０５７０】
タンパク質、凍結乾燥保護剤、および他の任意選択の構成要素を一体に混合した後で、製剤を凍結乾燥させる。Ｈｕｌｌ５０（登録商標）（Ｈｕｌｌ、ＵＳＡ）フリーズドライヤーまたはＧＴ２０（登録商標）（Ｌｅｙｂｏｌｄ−Ｈｅｒａｅｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）フリーズドライヤーなど、多くの異なるフリーズドライヤーが、この目的で利用可能である。フリーズドライは、製剤を凍結させ、その後、一次乾燥に適する温度で、凍結させた内容物から、氷を昇華させることにより達成する。この条件下で、生成物温度は、製剤の共融点または崩壊温度を下回る。一次乾燥のための保管温度は、約５０〜２５０ｍＴｏｒｒの範囲であることが典型的である適切な圧力で、約−３０〜２５℃の範囲となる（一次乾燥時に、生成物が凍ったままである条件で）ことが典型的である。主に、製剤、サイズ、および試料を保持する容器の種類（例えば、ガラスバイアル）、ならびに液体の容量により、乾燥に要請される時間が指示され、これは、数時間〜数日間（例えば、４０〜６０時間）の範囲でありうる。二次乾燥段階は、容器の種類およびサイズ、ならびに使用されるタンパク質の種類に主に依存して、約０℃〜４０℃で実行することができる。しかし、本明細書では、二次乾燥ステップは、必要でない場合もあることが見出された。例えば、凍結乾燥のうちの全水除去期を通した保管温度は、約１５〜３０℃（例えば、約２０℃）でありうる。二次乾燥に要請される時間および圧力は、例えば、温度および他のパラメータに依存して、適切な凍結乾燥ケーキを生成する時間および圧力である。二次乾燥時間は、生成物中に所望される残りの水分レベルにより指示され、少なくとも約５時間（例えば、１０〜１５時間）を要することが典型的である。圧力は、一次乾燥ステップ中に使用される圧力と同じでありうる。フリーズドライ条件は、製剤およびバイアルサイズに応じて変化しうる。
【０５７１】
場合によって、移出ステップを回避するために、タンパク質製剤は、タンパク質の再構成が実行される容器内で凍結乾燥させることが望ましい場合がある。この場合の容器は、例えば、３、５、１０、２０、５０、または１００ｃｃのバイアルでありうる。一般的な提案として、凍結乾燥は、その水分含量が約５％未満、好ましくは、約３％未満である凍結乾燥製剤を結果としてもたらす。
【０５７２】
所望の段階において（代表的に、タンパク質を患者に投与するとき）、再構成製剤中のタンパク質濃度が、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、例えば、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約４００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは、約８０ｍｇ／ｍＬ〜約３００ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは、約９０ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬとなるように、凍結乾燥製剤を、希釈剤で再構成し得る。再構成製剤中のこのような高タンパク質濃度は、再構成製剤の皮下送達を意図する場合に特に有用であると考えられる。しかし、静脈内投与など、他の投与経路では、再構成製剤中のより低濃度のタンパク質が所望でありうる（例えば、再構成製剤中に約５〜５０ｍｇ／ｍＬまたは約１０〜４０ｍｇ／ｍＬのタンパク質）。ある特定の実施形態では、再構成製剤中のタンパク質濃度は、凍結乾燥前の製剤中の濃度より著明に高濃度である。例えば、再構成製剤中のタンパク質濃度は、凍結乾燥前の製剤の濃度の約２〜４０倍（ｔｉｍｅ）、好ましくは、３〜１０倍（ｔｉｍｅ）、最も好ましくは、３〜６倍（ｔｉｍｅ）（例えば、少なくとも３倍（ｆｏｌｄ）または少なくとも４倍（ｆｏｌｄ））でありうる。
【０５７３】
再構成は一般に、完全な湿潤化（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）を確実にするように、約２５℃の温度で行うが、所望に応じて、他の温度も使用することができる。再構成に要請される時間は、例えば、希釈剤の種類、賦形剤およびタンパク質の量に依存する。例示的な希釈剤は、滅菌水、静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝食塩水）、滅菌生理食塩溶液、リンゲル液、またはデキストロース溶液を含む。希釈剤は、任意選択で、防腐剤を含有する。例示的な防腐剤については、上で記載しており、ベンジルアルコールまたはフェノールアルコールなど、芳香族アルコールが好ましい防腐剤である。使用される防腐剤の量は、異なる防腐剤濃度を、タンパク質に対する適合性について評価し、防腐剤の有効性試験を行うことにより決定する。例えば、防腐剤が、芳香族アルコール（ベンジルアルコールなど）である場合、防腐剤は、約０．１〜２．０％、好ましくは、約０．５〜１．５％であるが、最も好ましくは、約１．０〜１．２％の量で存在しうる。好ましくは、再構成製剤は、バイアル１つ当たり、６０００個未満の粒子を有し、これらは、＞１０μｍのサイズである。
【０５７４】
治療適用
【０５７５】
本明細書では、このような処置を必要とする対象に、本明細書で記載される１つまたは複数の抗体を含む、治療有効量の組成物を投与するステップを含む治療法について記載する。
【０５７６】
ある特定の実施形態では、処置される対象は、哺乳動物である。ある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、またはヤギなどの家畜化された動物である。ある特定の実施形態では、対象は、イヌまたはネコなどのコンパニオン動物である。ある特定の実施形態では、対象は、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、またはヤギなどの家畜動物である。ある特定の実施形態では、対象は、動物園の動物である。別の実施形態では、対象は、齧歯動物、イヌ、または非ヒト霊長動物などの研究用動物である。ある特定の実施形態では、対象は、トランスジェニックマウスまたはトランスジェニックブタなどの非ヒトトランスジェニック動物である。
【０５７７】
一部の実施形態では、処置を必要とする対象（例えば、ヒト患者）は、がんを伴うか、がんを有することが疑われるか、またはがんの危険性があると診断される。がんの例は、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆管がん、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、子宮頚がん、卵巣がん、および前立腺がんを含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、がんは、脳がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、または膵臓がんである。一部の好ましい実施形態では、がんは、脳がんまたは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）がんである。
【０５７８】
好ましい実施形態では、抗体は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４を発現させるがん細胞をターゲティングすることが可能である。一部の実施形態では、抗体は、がん細胞上のＧｌｏｂｏ  ＨおよびＳＳＥＡをターゲティングすることが可能である。一部の実施形態では、抗体は、がんにおけるＳＳＥＡをターゲティングすることが可能である。
【０５７９】
したがって、抗体は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４に対する三重ターゲティング抗体である。一部の実施形態では、抗体は、Ｇｌｏｂｏ  ＨおよびＳＳＥＡ−３に対する二重ターゲティング抗体と、抗ＳＳＥＡ−４抗体との混合物である。一部の実施形態では、抗体は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４に対する三重ターゲティング抗体と、抗ＳＳＥＡ−４抗体との混合物である。一部の実施形態では、抗体は、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体と、抗ＳＳＥＡ−３抗体と、抗ＳＳＥＡ−４抗体との混合物である。一部の実施形態では、抗体は、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体と、抗ＳＳＥＡ−４抗体との混合物である。一部の実施形態では、抗体は、抗ＳＳＥＡ−４抗体である。
【０５８０】
処置は、腫瘍サイズの低減、悪性細胞の消失、転移の防止、再発の防止、播種性がんの軽減もしくは殺滅、生存の延長、および／または腫瘍のがんへの進行までの時間の延長を結果としてもたらす。
【０５８１】
一部の実施形態では、処置は、さらなる治療を、前記対象に、抗体の前記投与の前、前記投与の間、または前記投与の後に投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、さらなる治療は、化学療法剤による処置である。一部の実施形態では、さらなる治療は、放射線療法である。
【０５８２】
本発明の方法は、初期腫瘍を処置および防止し、これにより、より進行した病期への進行を防止し、その結果として、進行がんと関連する罹患率および死亡率の低減をもたらすのに特に有利である。本発明の方法はまた、例えば、原発性腫瘍を除去した後でも遷延する休眠腫瘍である、腫瘍の再発もしくは腫瘍の再成長、または、腫瘍の発生を低減もしくは防止するのにも有利である。
【０５８３】
一部の実施形態では、本明細書で開示される方法は、例えば、がんが、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ＳＳＥＡ−３、および／またはＳＳＥＡ−４の発現の増大により特徴付けられる場合、がんの処置または防止に有用である。一部の実施形態では、がんは、がん幹細胞を含む。一部の実施形態では、がんは、前がん、および／または悪性がん、および／または治療抵抗性がんである。一部の実施形態では、がんは、脳がんである。
【０５８４】
本発明の方法では、がんは、例えば、乳がん、結腸直腸がん、直腸がん、肺がん、腎細胞がん、神経膠腫（例えば、退形成性星状細胞腫、退形成性乏突起星状細胞腫（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ  ｏｌｉｇｏａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、退形成性希突起神経膠腫、多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ））、腎臓がん、前立腺がん、肝臓がん、膵臓がん、軟組織肉腫、カルチノイド癌、頭頸部がん、黒色腫、および卵巣がんなどの充実性腫瘍でありうる。一実施形態では、がんは、脳がんまたはＧＢＭである。本明細書で開示される方法を実施するために、本明細書で記載される少なくとも１つの抗体を含有する、上で記載した有効量の医薬組成物／製剤を、処置を必要とする対象（例えば、ヒト）に、例えば、ボーラスとして、もしくはある期間にわたる連続注入による静脈内投与、筋内経路、腹腔内経路、脳脊髄内経路、皮下経路、関節内経路、滑液包内経路、髄腔内経路、経口経路、吸入経路、または局所経路などの適切な経路を介して、投与することができる。ジェット噴霧器および超音波噴霧器を含む、液体製剤のための市販の噴霧器は、投与に有用である。液体製剤は、直接噴霧することができ、凍結乾燥粉末は、再構成の後で噴霧することができる。代替的に、抗体は、フルオロカーボン製剤および定量吸入器を使用してエアゾール化する、または凍結乾燥および粉砕された粉末として吸入することもできる。
【０５８５】
本明細書で記載される方法により処置される対象は、哺乳動物、より好ましくは、ヒトでありうる。哺乳動物は、農場動物、競技動物、ペット、霊長動物、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、およびラットを含むがこれらに限定されない。処置を必要とするヒト対象は、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆管がん、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、子宮頚がん、卵巣がん、および前立腺がんを含むがこれらに限定されないがんを有するか、これらの危険性があるか、またはこれらを有することが疑われるヒト患者でありうる。がんを有する対象は、日常的な医学的検査により同定することができる。
【０５８６】
本明細書で使用される「有効量」とは、単独で、または１つもしくは複数の他の活性剤と組み合わせて、対象に治療効果を付与するのに要請される各活性剤の量を指す。当業者により認識されている通り、有効量は、処置される特定の状態、状態の重症度、個々の患者のパラメータであって、医療従事者の知見および専門知識の範囲内にある、年齢、身体の状態、サイズ、性別、および体重、処置の持続期間、併用療法（存在する場合）の性格、具体的な投与経路などの因子を含むパラメータに応じて変化する。これらの因子は、当業者に周知であり、日常的な実験だけで対処することができる。個々の構成要素またはそれらの組み合わせの最大用量、すなわち、確かな医学的判断に従う、最も高い安全用量を使用することが一般に好ましい。しかし、当業者は、患者が、医学的理由、心理的理由、または事実上他の任意の理由で、より低い用量または耐容可能な用量を主張することを理解する。
【０５８７】
半減期など、経験的な検討項目は一般に、投与量の決定に寄与する。例えば、ヒト化抗体または完全ヒト抗体など、ヒト免疫系に適合性の抗体を使用し、抗体の半減期を延長し、抗体が宿主の免疫系に攻撃されることを防止することができる。投与頻度は、治療の経過にわたり決定および調整することができ、一般に、がんの処置、および／または抑制、および／または回復、および／または遅延に基づくが必ずしもそうではない。代替的に、本明細書で記載される抗体の持続的連続放出製剤は、適切でありうる。当技術分野では、持続放出を達成するための、多様な製剤およびデバイスが公知である。
【０５８８】
一例では、本明細書で記載される抗体の投与量は、抗体の１回または複数回の投与を施された個体において、経験的に決定することができる。個体には、抗体の投与量を漸増させて施す。抗体の有効性を評価するために、日常的な実施に従い、疾患（例えば、がん）の指標を追跡することができる。
【０５８９】
一般に、本明細書で記載される抗体のうちのいずれかを投与するための、初期候補投与量は、約２ｍｇ／ｋｇでありうる。本開示の目的で、典型的な毎日の投与量は、上で言及した因子に応じて、約０．１μｇ／ｋｇ〜３μｇ／ｋｇ〜３０μｇ／ｋｇ〜３００μｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはこれ超のうちのいずれかの範囲でありうる。数日間またはこれを超えて長期にわたる繰返し投与では、状態に応じて、症状の所望の抑制が生じるまで、またはがんもしくはその症状を緩和するのに十分な治療レベルが達成されるまで、処置を持続する。例示的な投薬レジメンは、約２ｍｇ／ｋｇの初期用量、それに続く約１ｍｇ／ｋｇの抗体の毎週の維持用量、またはそれに続く隔週の約１ｍｇ／ｋｇの維持用量を投与することを含む。しかし、他の投与レジメンも、実施者が達成したいと望む薬物動態的減衰のパターンに応じて有用でありうる。例えば、１週間に１〜４回の投薬が想定される。一部の実施形態では、約３μｇ／ｍｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ（約３μｇ／ｍｇ、約１０μｇ／ｍｇ、約３０μｇ／ｍｇ、約１００μｇ／ｍｇ、約３００μｇ／ｍｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、および約２ｍｇ／ｋｇなど）の範囲の投薬を使用することができる。一部の実施形態では、投薬頻度は、毎週１回、２週間ごと、４週間ごと、５週間ごと、６週間ごと、７週間ごと、８週間ごと、９週間ごと、もしくは１０週間ごと；または毎月１回、２カ月ごと、もしくは３カ月ごと、またはこれより長い間隔である。この治療の進捗状況は、従来の技法およびアッセイにより、容易にモニタリングされる。投薬レジメン（使用される抗体を含む）は、時間をわたり変化しうる。
【０５９０】
本開示の目的で、本明細書で記載される抗体の適切な投与量は、使用される特異的抗体（またはその組成物）、がんの種類および重症度、抗体が予防目的で投与されるのか、治療目的で投与されるのか、以前の治療、患者の臨床歴および抗体への応答、ならびに主治医の判断に依存する。本明細書で記載される抗体の投与は、あらかじめ選択された期間にわたり本質的に持続的な場合もあり、例えば、がんの発症の前に、発症時に、または発症の後における、間隔を置いた一連の用量の場合もある。
【０５９１】
本明細書で使用される「処置すること」という用語は、１つまたは複数の活性剤を含む組成物の、がん、がんの症状、またはがんに対する素因を有する対象への、がん、がんの症状、またはがんに対する素因を治癒させるか、治すか、緩和するか、軽減するか、変化させるか、修復するか、回復するか、改善するか、またはこれに影響を及ぼすことを目的とする適用または投与を指す。
【０５９２】
がんを緩和することは、がんの発症もしくは進行を遅延させること、またはがんの重症度を軽減することを含む。がんを緩和することは必ずしも、治癒結果を必要としない。本明細書で使用される、がんの発症を「遅延させること」とは、がんの進行を延期し、妨害し、遅らせ、妨げ、安定化させ、かつ／または先送りすることを意味する。この遅延は、処置されるがんおよび／または個体の履歴に応じて、時間の長さが変化するものである場合がある。がんの発症を「遅延させる」かもしくは緩和するか、またはがんの発病（ｏｎｓｅｔ）を遅延させる方法とは、方法を使用しない場合と比較して、所与の時間枠内における、がんの１つまたは複数の症状の発症の可能性（危険性）を低減し、かつ／または所与の時間枠内における、症状の程度を軽減する方法である。このような比較は、統計学的に有意な結果をもたらすのに十分な多数の対象を使用する臨床研究に基づくことが典型的である。
【０５９３】
がんの「発症」または「進行」とは、がんの初期症状発現および／またはその後の進行を意味する。がんの発症は、検出可能な場合があり、当技術分野で周知の、標準的な臨床的技法を使用して評価することができる。しかし、発症とはまた、検出不能でありうる進行も指す。本開示の目的で、発症または進行とは、症状の生物学的経過を指す。「発症」は、発生、再発、および発病を含む。本明細書で使用される、がんの「発病」または「発生」は、初期発病および／または再発を含む。
【０５９４】
医薬の技術分野における当業者に公知である、従来の方法を使用して、処置される疾患の種類または疾患の部位に応じて、医薬組成物を対象に投与することができる。この組成物はまた、他の従来の経路を介して投与することもでき、例えば、経口、非経口、吸入スプレーにより、局所、直腸、鼻、口腔、膣、または植込み式レザバーを介して投与することもできる。本明細書で使用される「非経口」という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋内、関節内、動脈内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、病変内、および頭蓋内の注射技法または注入技法を含む。加えて、医薬組成物は、対象に、１カ月、３カ月、もしくは６カ月のデポ注射用の材料および方法、または生体分解性の材料および方法などを使用する、注射用デポ投与経路を介して投与することもできる。
【０５９５】
注射用組成物は、植物油、ジメチルアセトアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｔａｍｉｄｅ）、ジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｆｏｒｍａｍｉｄｅ）、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、およびポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）など、多様な担体を含有しうる。静脈内注射のためには、水溶性抗体を、点滴法により投与することができ、これにより、抗体と生理学的に許容される賦形剤とを含有する医薬製剤を注入する。生理学的に許容される賦形剤は、例えば、５％のデキストロース、０．９％の食塩水、リンゲル液、または他の適切な賦形剤を含みうる。筋内調製物、例えば、抗体の適切な可溶性塩形態の滅菌製剤は、注射用水、０．９％の食塩水、または５％のグルコース溶液などの医薬賦形剤中に溶解され、投与され得る。
【０５９６】
診断適用
【０５９７】
本明細書では、対象におけるがんを診断するための方法であって、（ａ）ＧＭ３、ＧＭ２、ＧＭ１、ＧＤ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＴ１ｂ、Ａ２Ｂ５、ＬｅＸ、ｓＬｅＸ、ＬｅＹ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ＴＦ、Ｔｎ、ｓＴｎ、ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ１３３からなるマーカーのパネルの発現を検出する、１つまたは複数のモノクローナル抗体を含む組成物を、対象から得られた細胞試料または組織試料に適用するステップと；（ｂ）モノクローナル抗体の、細胞試料または組織試料への結合についてアッセイするステップと；（ｃ）結合を、正常対照と比較して、対象におけるがんの存在を決定するステップとを含む方法が記載される。
【０５９８】
検出および診断のためのがんの例は、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆管がん、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、子宮頚がん、卵巣がん、および前立腺がんを含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、がんは、脳がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、または膵臓がんである。
【０５９９】
一部の実施形態では、マーカーは、ＧＭ２、ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ｂ、Ａ２Ｂ５、Ｔｆ、Ｔｎ、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ２４、ＣＤ４４、およびＣＤ９０からなる。一部の実施形態では、組成物は、ＧＭ２、ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ｂ、Ａ２Ｂ５、Ｔｆ、Ｔｎ、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ２４、ＣＤ４４、およびＣＤ９０を検出することが可能な複数のモノクローナル抗体を含む。
【０６００】
一部の実施形態では、抗体は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４を発現させるがん細胞を検出することが可能である。一部の実施形態では、抗体は、がん細胞上のＧｌｏｂｏ  ＨおよびＳＳＥＡを検出することが可能である。一部の実施形態では、抗体は、がんにおけるＳＳＥＡを検出することが可能である。一部の実施形態では、がんは、脳がんまたは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）がんであり、抗体は、抗ＳＳＥＡ−４モノクローナル抗体である。
【０６０１】
Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ＳＳＥＡ−３、および／またはＳＳＥＡ−４に特異的なモノクローナル抗体を、単独で、または組み合わせで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの診断アッセイのために使用して、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４を発現させるがん細胞（例えば、本明細書で指し示される、ＧＢＭ、ある特定の充実性腫瘍細胞、および造血系がん細胞）を検出することができる。例えば、試料（例えば、血液試料または組織生検材料）を、患者から得、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４に対する三重ターゲティング抗体、または抗ＳＳＥＡ−４抗体と組み合わせたＧｌｏｂｏ  Ｈ／ＳＳＥＡ−３二重ターゲティング抗体と接触させ、患者試料中の、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４を発現させるがん細胞の存在を、抗体の結合を検出することにより決定することができる。抗体の結合は、直接（例えば、抗体自体を標識する場合）、または、二次抗体など、第２の検出剤を使用することにより検出することができる。検出可能な標識は、本発明の抗体と、直接的に、または、例えば、キレート剤もしくはリンカーを介して、間接的に会合させることができる。
【０６０２】
一部の実施形態では、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ＳＳＥＡ−３、および／またはＳＳＥＡ−４に特異的なモノクローナル抗体を、がんを有するか、またはがんを有することが疑われる個体に由来する生物学的試料と接触させ、試料中の細胞に結合する抗体を決定し、このとき、抗体の結合が通常より高度または低度であれば、個体ががんを有することが指し示される。一部の実施形態では、生物学的試料は、血液試料または血液画分（例えば、血清、血漿、血小板、赤血球、白血球）である。一部の実施形態では、生物学的試料は、例えば、公知の腫瘍の境界を決定するように、組織試料（生検材料）、例えば、疑わしい腫瘍部位、または罹患していることが公知の組織に由来する。一部の実施形態では、生物学的試料は、炎症部位から得られる。
【０６０３】
生検は、組織、すなわち、非流体細胞型から試料を得るように実施することが典型的である。適用される生検技法は、評価される組織型（例えば、乳房、皮膚、結腸、前立腺、腎、肺、膀胱、リンパ節、肝、骨髄、気道、または肺）に依存する。がんの場合、技法はまた、他の因子の中で、腫瘍のサイズおよび種類（例えば、固体、懸濁物、または血液）にも依存する。生検技法は、例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｋａｓｐｅｒら編、１６版、２００５年、７０章、および第Ｖ部の全体において論じられている。
【０６０４】
試料中の細胞に結合する抗体を検出する任意の方法を、本診断アッセイのために使用することができる。当技術分野では、例えば、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡法、ＥＬＩＳＡなど、抗体の結合を検出する方法が周知である。一部の実施形態では、方法は、決定するステップの前に、生物学的試料を、検出のために調製するステップを含む。例えば、細胞の亜集団（例えば、白血球）を、個体に由来する試料の残余（例えば、他の血液構成要素）から分離することもでき、より容易な検出のために、組織中の細胞を懸濁させることもできる。
【０６０５】
一部の実施形態では、試料中の、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ／ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４を発現させる細胞の百分率を決定し、対照、例えば、がんを有することが公知の個体もしくは個体群に由来する試料（陽性対照）、またはがんを有さないことが公知の個体もしくは個体群に由来する試料（正常対照、非疾患対照、または陰性対照）と比較する。一部の実施形態では、対照は、所与の組織について確立される、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ／ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４発現の標準的な範囲である。Ｇｌｏｂｏ  Ｈ／ＳＳＥＡ−３／ＳＳＥＡ−４を発現させる細胞の百分率が正常より高いかもしくは低いこと、または発現レベルが高いかももしくは低いことから、個体ががんを有することが指し示される。
【０６０６】
一実施形態では、血液試料または組織試料など、生物学的試料中のＧｌｏｂｏ  Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４を検出するキットが提供される。例えば、対象におけるがんの診断を確認するために、生検を実施して、組織学的検査のための組織試料を得ることができる。代替的に、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４の存在を検出するのに、血液試料を得ることもできる。ポリペプチドを検出するためのキットは、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４に特異的に結合する、例えば、本明細書で開示される抗体のうちのいずれかの、１つまたは複数の抗体を含むことが典型的である。さらなる実施形態では、抗体を標識する（例えば、蛍光標識、放射性標識、または酵素標識により）。
【０６０７】
一実施形態では、キットは、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４に特異的に結合する、１つまたは複数の抗体の使用手段を開示する指示材料を含む。指示材料は、電子形態（コンピュータ用ディスケットまたはコンパクトディスクなど）で書かれ得るか、または視覚的（ビデオファイルなど）であり得る。キットはまた、キットがデザインされる特定の適用を容易とするさらなる構成要素も含みうる。したがって、例えば、キットは加えて、標識を検出する手段（酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するフィルターセット、二次抗体などの適切な二次標識など）も含有しうる。キットは加えて、緩衝剤、および特定の方法を実施するために日常的に使用される他の試薬も含みうる。当業者には、このようなキットおよび適切な内容物が周知である。
【０６０８】
当技術分野では、細胞表面マーカーの存在または非存在を決定する方法が周知である。例えば、抗体は、酵素、磁気ビーズ、コロイド状の磁気ビーズ、ハプテン、蛍光色素、金属化合物、放射性化合物、または薬物を含むがこれらに限定されない、他の化合物にコンジュゲートさせることができる。抗体はまた、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、または免疫組織化学アッセイなどであるがこれらに限定されないイムノアッセイにおいても活用することができる。抗体はまた、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）のためにも使用することができる。ＦＡＣＳでは、他のより精緻なレベルの検出の中では、複数の有色チャネル、小角および鈍角の光散乱検出チャネル、ならびにインピーダンスチャネルを使用して、細胞を分離または分取する（米国特許第５，０６１，６２０号を参照されたい）。これらのアッセイでは、本明細書で開示される、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４に結合するモノクローナル抗体のうちのいずれかを、使用することができる。したがって、抗体は、限定せずに述べると、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳ、組織免疫組織化学、ウェスタンブロット、または免疫沈降を含む、従来のイムノアッセイにおいて使用することができる。
【０６０９】
腫瘍を病期分類し、かつ／またはその予後を決定するための方法
【０６１０】
本開示の別の態様は、ヒト患者における腫瘍を病期分類し、かつ／またはその予後を決定するための方法であって、（ａ）ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、およびＧｌｏｂｏ  Ｈからなるマーカーの発現を検出する、１つまたは複数の抗体を含む組成物を、患者から得られた細胞試料または組織試料に適用するステップと；（ｂ）モノクローナル抗体の、細胞試料または組織試料への結合についてアッセイするステップと；（ｃ）被験試料中のマーカーの発現レベルを、基準試料中のレベルと比較するステップと；（ｄ）患者における腫瘍の病期および／または予後を、ステップ（ｃ）で同定された転帰に基づき決定するステップとを含む方法を特徴とする。
【０６１１】
一部の実施形態では、がんは、脳がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、または膵臓がんである。一部の好ましい実施形態では、がんは、脳がんまたはＧＢＭである。
【０６１２】
一部の実施形態では、抗体は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４を発現させるがん細胞を検出することが可能である。一部の実施形態では、抗体は、がん細胞上のＧｌｏｂｏ  ＨおよびＳＳＥＡを検出することが可能である。一部の実施形態では、抗体は、がんにおけるＳＳＥＡを検出することが可能である。一部の実施形態では、がんは、脳がんまたは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）がんであり、抗体は、抗ＳＳＥＡ−４モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、がんが、脳がんまたはＧＢＭである場合、抗体は、抗ＳＳＥＡ−４である。
【０６１３】
一部の実施形態では、提供されたグリカンコンジュゲート、免疫原性組成物は、聴神経腫瘍、腺癌、副腎がん、肛門がん、血管肉腫（ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）（例えば、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、血管肉腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ））、虫垂がん、良性単クローン性高ガンマグロブリン血症、胆道がん（ｂｉｌｉａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ）（例えば、胆管癌）、膀胱がん、乳がん（例えば、乳房の腺癌、乳房の乳頭癌、乳腺がん（ｍａｍｍａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ）、乳房の髄様癌）、脳がん（例えば、髄膜腫；神経膠腫、例えば、星状細胞腫、希突起神経膠腫；髄芽腫）、気管支がん、カルチノイド腫瘍、子宮頸がん（例えば、子宮頸部腺癌）、絨毛癌、脊索腫、頭蓋咽頭腫、結腸直腸がん（例えば、結腸がん、直腸がん、結腸直腸腺癌）、上皮癌、上衣腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）（例えば、カポジ肉腫、多発性特発性出血性肉腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓａｒｃｏｍａ））、子宮内膜がん（例えば、子宮がん、子宮肉腫）、食道がん（例えば、食道の腺癌、バレット腺癌（Ｂａｒｒｅｔｔ’ｓ  ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ））、ユーイング肉腫、眼がん（例えば、眼球内黒色腫、網膜芽細胞腫）、家族性過好酸球増加症、胆嚢がん、胃がん（例えば、胃腺癌）、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮癌、口腔がん（例えば、口腔扁平上皮癌（ＯＳＣＣ）、咽頭（ｔｈｒｏａｔ）がん（例えば、喉頭がん、咽頭（ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ）がん、上咽頭がん、中咽頭がん））、造血性がん（例えば、白血病、例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）（例えば、Ｂ細胞ＡＬＬ、Ｔ細胞ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（例えば、Ｂ細胞ＡＭＬ、Ｔ細胞ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（例えば、Ｂ細胞ＣＭＬ、Ｔ細胞ＣＭＬ）、および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）（例えば、Ｂ細胞ＣＬＬ、Ｔ細胞ＣＬＬ）；リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）（例えば、Ｂ細胞ＨＬ、Ｔ細胞ＨＬ）および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）（例えば、Ｂ細胞ＮＨＬ、例えば、びまん性大細胞型リンパ腫（ＤＬＣＬ）（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ））、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（例えば、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ｎｏｄａｌ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｚｏｎｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ｓｐｌｅｎｉｃ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｚｏｎｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ））、縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｅｄｉａｓｔｉｎａｌ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫（すなわち、「ワルデンシュトレームマクログロブリン血症」）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫および原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫；ならびにＴ細胞ＮＨＬ、例えば、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫��ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）／白血病、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）（例えば、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）（例えば、菌状息肉症（ｍｙｃｏｓｉｓ  ｆｕｎｇｉｏｄｅｓ）、セザリー症候群）、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫（ｅｘｔｒａｎｏｄａｌ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、腸症型Ｔ細胞リンパ腫（ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ  ｔｙｐｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫）；上記１つまたは複数の白血病／リンパ腫の混合；ならびに多発性骨髄腫（ＭＭ））、重鎖病（例えば、アルファ鎖病、ガンマ鎖病、ミュー鎖病）、血管芽細胞腫、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ｔｕｍｏｒ）、免疫球性アミロイドーシス（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｉｃ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ）、腎臓がん（例えば、ウィルムス腫瘍としても知られる腎芽腫、腎細胞癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞がん（ＨＣＣ）、悪性へパトーマ）、肺がん（例えば、気管支原性癌、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺の腺癌）、平滑筋肉腫（ＬＭＳ）、肥満細胞症（例えば、全身性肥満細胞症）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、中皮腫、骨髄増殖性障害（ＭＰＤ）（例えば、真性赤血球増加症（ＰＶ）、本態性血小板増加症（ＥＴ）、骨髄線維症（ＭＦ）としても知られる原発性骨髄線維症（ＡＭＭ）、慢性特発性骨髄線維症、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性好中球性白血病（ＣＮＬ）、好酸球増加症候群（ＨＥＳ））、神経芽細胞腫、神経線維腫（例えば、神経線維腫症（ＮＦ）１型または２型、神経鞘腫症）、神経内分泌がん（例えば、胃腸膵神経内分泌腫瘍（ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｔｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒ）（ＧＥＰ−ＮＥＴ）、カルチノイド腫瘍）、骨肉腫、卵巣がん（例えば、嚢胞腺癌、卵巣胎児性癌、卵巣腺癌）、乳頭腺癌、膵臓がん（例えば、膵臓腺癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｎｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）、島細胞腫瘍）、陰茎がん（例えば、陰茎および陰嚢のパジェット病）、松果体腫、未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＴ）、前立腺がん（例えば、前立腺腺癌）、直腸がん、横紋筋肉腫、唾液腺がん、皮膚がん（例えば、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、角化棘細胞腫（ＫＡ）、黒色腫、基底細胞癌（ＢＣＣ））、小腸がん（例えば、虫垂がん）、軟組織肉腫（例えば、悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）、脂肪肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）、軟骨肉腫、線維肉腫、粘液肉腫）、皮脂腺癌、汗腺癌、滑膜腫、精巣がん（例えば、セミノーマ、精巣胎児性癌）、甲状腺がん（例えば、甲状腺の乳頭癌、甲状腺乳頭癌（ＰＴＣ）、甲状腺髄様がん）、尿道がん、膣がんおよび外陰部がん（例えば、外陰部のパジェット病）を含むがこれらに限定されないがんを処置または診断するのに有用である。ある特定の実施形態では、提供されたグリカンコンジュゲート、免疫原性組成物またはワクチンは、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆管がん、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、骨がん、皮膚がん、子宮頸がん、卵巣がん、および前立腺がんを処置するために有用である。
【０６１４】
本明細書で記載される処置方法を実施するために、本明細書で記載されるグリカン組成物のいずれかの有効量が、上記のように、適切な経路を介して処置を必要とする対象に投与されうる。ヒト対象などの対象は、がんを有するか、がんを有することが疑われるか、またはがんに対して感受性の患者でありうる。一部の実施形態では、グリカンコンジュゲートまたは免疫原性組成物の量は、がんの成長の阻害および／または腫瘍量（ｔｕｍｏｒ  ｍａｓｓ）の低減をもたらす応答を誘発するのに十分である。他の実施形態では、グリカン組成物の量は、標的がんの発病を遅延させるまたはがんを発症する危険性を低減させるのに有効でありうる。有効量を達成するために必要な提供されたグリカン組成物の正確な量は、例えば、対象の種、年齢、および全身状態、副作用または障害の重症度、特定の化合物の正体、投与様式などに依存して、対象ごとに変動する。所望の投与量は、１日３回、１日２回、１日１回、１日おき、３日ごと、毎週、２週間ごと、３週間ごと、または４週間ごとに、送達されうる。ある特定の実施形態では、所望の投与量は、複数回の投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、またはそれを超える回数の投与）を使用して送達されうる。
【０６１５】
ある特定の実施形態では、７０ｋｇの成人への１日に１回または複数回の投与のための、提供されたグリカン組成物の有効量は、単位剤形当たり、約０．０００１ｍｇ〜約３０００ｍｇ、約０．０００１ｍｇ〜約２０００ｍｇ、約０．０００１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約０．００１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇ、または約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇの化合物を含みうる。
【０６１６】
ある特定の実施形態では、提供されたグリカン組成物は、所望の治療効果を得るために、１日に１回または複数回で、１日当たり対象の体重１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇ〜約１００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約５０ｍｇ、好ましくは約０．１ｍｇ〜約４０ｍｇ、好ましくは約０．５ｍｇ〜約３０ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、より好ましくは約１ｍｇ〜約２５ｍｇを送達するのに十分な投与量レベルで、経口または非経口投与されうる。
【０６１７】
本明細書で記載される用量範囲は、成体への提供されたグリカンコンジュゲート、免疫原性組成物またはワクチンの投与のためのガイダンスを提供することを理解されたい。例えば、小児または青年に投与すべき量は、医療従事者または当業者によって決定されえ、成体に投与される量よりも低いまたはそれと同じでありうる。
【０６１８】
提供されたグリカン組成物は、１つまたは複数のさらなる治療的活性剤と組み合わせて投与されうることもまた理解されたい。提供されたグリカンコンジュゲート、免疫原性組成物またはワクチンは、それらのバイオアベイラビリティを改善する、それらの代謝を低減および／もしくは修飾する、それらの排泄を阻害する、ならびに／または体内でのそれらの分布を修飾するさらなる治療的活性剤と組み合わせて投与されうる。使用される治療は、同じ障害に対する所望の効果を達成しうる、および／または異なる効果を達成しうることもまた理解されたい。
【０６１９】
提供されたグリカン組成物は、１つまたは複数のさらなる治療的活性剤と同時発生的に、その前に、またはその後に投与されうる。一般に、各薬剤は、その薬剤について決定された用量でおよび／またはタイムスケジュールで投与される。この組み合わせにおいて活用されるさらなる治療的活性剤は、単一の組成物中で一緒に投与されうる、または異なる組成物中で別々に投与されうることをさらに理解されたい。レジメンにおいて使用する特定の組み合わせは、本発明の化合物と、さらなる治療的活性剤および／または達成すべき所望の治療効果との適合性を考慮に入れる。一般に、組み合わせ中で活用されるさらなる治療的活性剤は、それらが個々に活用されるときのレベルを超えないレベルで活用されると予測される。一部の実施形態では、組み合わせ中で活用されるレベルは、個々に活用されるレベルよりも低い。
【０６２０】
ある特定の実施形態では、提供されたグリカン組成物は、本明細書で記載される１つまたは複数のさらなる医薬品剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ）と組み合わせて投与される。ある特定の実施形態では、さらなる医薬品剤は、抗がん剤である。抗がん剤は、生物療法的抗がん剤（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔ）ならびに化学療法剤を包含する。
【０６２１】
例示的な生物療法的抗がん剤は、インターフェロン、サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子、インターフェロンα、インターフェロンγ）、ワクチン、造血成長因子、モノクローナル血清療法、免疫賦活薬および／または免疫調節剤（例えば、ＩＬ−１、２、４、６、または１２）、免疫細胞増殖因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）および抗体（例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（トラスツズマブ）、Ｔ−ＤＭ１、ＡＶＡＳＴＩＮ（ベバシズマブ）、ＥＲＢＩＴＵＸ（セツキシマブ）、ＶＥＣＴＩＢＩＸ（パニツムマブ）、ＲＩＴＵＸＡＮ（リツキシマブ）、ＢＥＸＸＡＲ（トシツモマブ））を含むがこれらに限定されない。
【０６２２】
例示的な化学療法剤は、抗エストロゲン薬（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、およびメゲストロール）、ＬＨＲＨアゴニスト（例えば、ゴセレリン（ｇｏｓｃｒｃｌｉｎ）およびロイプロリド）、抗アンドロゲン薬（例えば、フルタミドおよびビカルタミド）、光線力学的治療（例えば、ベルテポルフィン（ｖｅｒｔｏｐｏｒｆｉｎ）（ＢＰＤ−ＭＡ）、フタロシアニン、光感受性物質Ｐｃ４、およびデメトキシ−ヒポクレリンＡ（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙ−ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ  Ａ）（２ＢＡ−２−ＤＭＨＡ））、窒素マスタード（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、トロホスファミド、クロランブシル、エストラムスチン、およびメルファラン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ））、アルキルスルホネート（例えば、ブスルファンおよびトレオスルファン）、トリアゼン（例えば、ダカルバジン、テモゾロミド）、白金含有化合物（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビン）、タキソイド（例えば、パクリタキセルまたはパクリタキセル等価物、例えば、ナノ粒子アルブミン結合型パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ）、ドコサヘキサエン酸結合型パクリタキセル（ＤＨＡ−パクリタキセル、Ｔａｘｏｐｒｅｘｉｎ）、ポリグルタミン酸結合型パクリタキセル（ＰＧ−パクリタキセル、パクリタキセルポリグルメクス、ＣＴ−２１０３、ＸＹＯＴＡＸ）、腫瘍活性化プロドラッグ（ＴＡＰ）ＡＮＧ１００５（３分子のパクリタキセルに結合したＡｎｇｉｏｐｅｐ−２）、パクリタキセル−ＥＣ−１（ｅｒｂＢ２認識ペプチドＥＣ−１に結合したパクリタキセル）、およびグルコース−コンジュゲート化パクリタキセル、例えば、２’−パクリタキセルメチル２−グルコピラノシルスクシネート（２’−ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｍｅｔｈｙｌ  ２−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）；ドセタキセル、タキソール）、エピポドフィリン（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎ）（例えば、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド、トポテカン、９−アミノカンプトテシン、カンプトイリノテカン（ｃａｍｐｔｏｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン、クリスナトール（ｃｒｉｓｎａｔｏｌ）、マイトマイシンＣ（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ））、代謝拮抗剤、ＤＨＦＲ阻害剤（例えば、メトトレキセート、ジクロロメトトレキセート、トリメトレキセート、エダトレキセート）、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ阻害剤（例えば、ミコフェノール酸、チアゾフリン、リバビリン、およびＥＩＣＡＲ）、リボヌクレオチド（ｒｉｂｏｎｕｃｌｏｔｉｄｅ）レダクターゼ阻害剤（例えば、ヒドロキシウレアおよびデフェロキサミン）、ウラシル類似体（例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン、ドキシフルリジン、ラルチトレキセド（ｒａｔｉｔｒｅｘｅｄ）、テガフール−ウラシル、カペシタビン）、シトシン類似体（例えば、シタラビン（ａｒａＣ）、シトシンアラビノシド、およびフルダラビン）、プリン類似体（例えば、メルカプトプリンおよびチオグアニン）、ビタミンＤ３類似体（例えば、��Ｂ  １０８９、ＣＢ  １０９３、およびＫＨ  １０６０）、イソプレニル化阻害剤（例えば、ロバスタチン）、ドーパミン作動性神経毒（例えば、１−メチル−４−フェニルピリジニウムイオン）、細胞周期阻害剤（例えば、スタウロスポリン）、アクチノマイシン（例えば、アクチノマイシンＤ、ダクチノマイシン）、ブレオマイシン（例えば、ブレオマイシンＡ２、ブレオマイシンＢ２、ペプロマイシン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、ミトキサントロン）、ＭＤＲ阻害剤（例えば、ベラパミル）、Ｃａ２＋  ＡＴＰａｓｅ阻害剤（例えば、タプシガルジン）、イマチニブ、サリドマイド、レナリドミド、チロシンキナーセ阻害剤（例えば、アキシチニブ（ＡＧ０１３７３６）、ボスチニブ（ＳＫＩ−６０６）、セジラニブ（ＲＥＣＥＮＴＩＮ（商標）、ＡＺＤ２１７１）、ダサチニブ（ＳＰＲＹＣＥＬ（登録商標）、ＢＭＳ−３５４８２５）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）、ＣＧＰ５７１４８Ｂ、ＳＴＩ−５７１）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＴＹＶＥＲＢ（登録商標））、レスタウルチニブ（ＣＥＰ−７０１）、ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）、ニロチニブ（ＴＡＳＩＧＮＡ（登録商標））、セマキサニブ（ｓｅｍａｘａｎｉｂ）（セマキシニブ、ＳＵ５４１６）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）、ＳＵ１１２４８）、トセラニブ（ｔｏｃｅｒａｎｉｂ）（ＰＡＬＬＡＤＩＡ（登録商標））、バンデタニブ（ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標）、ＺＤ６４７４）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７、ＰＴＫ／ＺＫ）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））、ニロチニブ（ＴＡＳＩＧＮＡ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、エベロリムス（ＡＦＩＮＩＴＯＲ（登録商標））、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標））、テムシロリムス（ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標））、ＥＮＭＤ−２０７６、ＰＣＩ−３２７６５、ＡＣ２２０、乳酸ドビチニブ（ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ  ｌａｃｔａｔｅ）（ＴＫＩ２５８、ＣＨＩＲ−２５８）、ＢＩＢＷ  ２９９２（ＴＯＶＯＫ（商標））、ＳＧＸ５２３、ＰＦ−０４２１７９０３、ＰＦ−０２３４１０６６、ＰＦ−２９９８０４、ＢＭＳ−７７７６０７、ＡＢＴ−８６９、ＭＰ４７０、ＢＩＢＦ  １１２０（ＶＡＲＧＡＴＥＦ（登録商標））、ＡＰ２４５３４、ＪＮＪ−２６４８３３２７、ＭＧＣＤ２６５、ＤＣＣ−２０３６、ＢＭＳ−６９０１５４、ＣＥＰ−１１９８１、チボザニブ（ＡＶ−９５１）、ＯＳＩ−９３０、ＭＭ−１２１、ＸＬ−１８４、ＸＬ−６４７、および／またはＸＬ２２８）、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ））、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、エベロリムス（ＲＡＤ−００１）、リダフォロリムス、ＡＰ２３５７３（Ａｒｉａｄ）、ＡＺＤ８０５５（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＢＥＺ２３５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＢＧＴ２２６（Ｎｏｒｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ７６５（Ｓａｎｏｆｉ  Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＰＦ−４６９１５０２（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＧＤＣ０９８０（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）、ＳＦ１１２６（Ｓｅｍａｆｏｅ）およびＯＳＩ−０２７（ＯＳＩ））、オブリメルセン、ゲムシタビン、カルミノマイシン、ロイコボリン、ペメトレキセド、シクロホスファミド、ダカルバジン、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂｉｚｉｎｅ）、プレドニゾロン、デキサメタゾン、カンパテシン（ｃａｍｐａｔｈｅｃｉｎ）、プリカマイシン、アスパラギナーゼ、アミノプテリン、メトプテリン（ｍｅｔｈｏｐｔｅｒｉｎ）、ポルフィロマイシン、メルファラン、ロイロシジン（ｌｅｕｒｏｓｉｄｉｎｅ）、ロイロシン（ｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）、クロランブシル、トラベクテジン、プロカルバジン、ディスコデルモリド、カルミノマイシン、アミノプテリン、およびヘキサメチルメラミンを含むがこれらに限定されない。
【０６２３】
そうでないと定義されない限りにおいて、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で記載される方法および材料と類似または同等な任意の方法および材料が、本発明の実施および検査において使用されうるが、好ましい方法および材料が本明細書に記載される。本明細書中で具体的に言及される全ての刊行物および特許は、本発明に関連して使用されうる刊行物中で報告されている化学物質、細胞系、ベクター、動物、機器、統計解析および方法論を記載および開示することを含む全ての目的のために、参照により組み込まれる。本明細書中で引用される全ての参考文献は、当該分野の技量レベルを示すものと解釈すべきである。先行発明を理由として、本発明がそのような開示に先行する資格がないことの承認として解釈すべきものは、本明細書中には存在しない。
【実施例】
【０６２４】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を裏付けるために含まれる。以下の実施例に開示される技法は、本発明者らが発見した技法が、本発明の実施において良好に機能することを示し、したがって、その実施のための好ましい様式を構成すると解釈されうることを、当業者は理解すべきである。しかし、本開示の観点から、当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなしに、開示された特定の実施形態において多くの変化がなされ、類似または同様の結果がなおも得られうることを理解すべきである。
【０６２５】
（実施例１）
最適化された普遍的Ｆｃグリカンの例示的な構造
【０６２６】
治療用抗体のために最適化された普遍的Ｆｃグリカンのグリカン構造は、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（図１）である。
【０６２７】
【化３】
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【０６２８】
図１．治療用抗体の最適化された普遍的Ｆｃグリカンの構造。
【０６２９】
（実施例２）
Ｆｃ領域に最適化された普遍的グリカンを有する均質な抗体の調製のための例示的な一般的手順。
【０６３０】
本開示は、Ｆｃ領域に最適化された普遍的グリカンを有する均質な抗体の集団を作製するための、例示的な改善された方法であって、（ａ）モノクローナル抗体を、α−フコシダーゼおよび少なくとも１種のエンドグリコシダーゼと接触させ、これにより、単一のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する脱フコシル化抗体を得るステップと、（ｂ）普遍的グリカンを抗体のＦｃ領域のＧｌｃＮＡｃに付加して、図１に示される最適化されたグリカン形態を有する均質な抗体を形成するステップとを含む方法を提供する（図２）。
【０６３１】
図２．その治療活性の改善のためにＦｃ領域に最適化された普遍的グリカンを有する均質な抗体の調製のための一般的戦略を参照のこと。
【０６３２】
エンドグリコシダーゼを使用して、Ｎ−グリカン中のオリゴ糖の可変部分をトリミングする。本明細書で使用するエンドグリコシダーゼの例は、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳ、およびそれらの改変体を含むがこれらに限定されない。
【０６３３】
（実施例３）
モノクローナル抗体媒介性の抗ウイルス性治療剤を増強するための、Ｆｃ領域に普遍的グリカンを有する均質な抗体の調製。
【０６３４】
そのＡＤＣＣ効果を増大させるためにＦｃ領域に普遍的グリカンを有する均質な抗インフルエンザウイルス抗体の調製のための例示的な方法。
【０６３５】
赤血球凝集素（ＨＡ）の保存されたストーク（ｓｔａｌｋ）領域をターゲティングする広く中和性のモノクローナル抗体は、その機能を誘発するように、抗体ＦｃとＦｃ受容体との相互作用によって促進されうる。本明細書で開示される一般的な戦略および方法を使用することによって、最適化された普遍的グリカンを有する均質な抗体の調製のために、抗インフルエンザウイルス抗体ＦＩ６を、その裏付けられたＡＤＣＣ効果に基づいて選択し、（ＨＡ）のストーク領域をターゲティングする他の抗インフルエンザウイルス抗体Ｆ１０を選択した。簡潔に述べると、ＦＩ６抗体およびＦ１０抗体を、文献に報告された方法（ｒｅｆ）によって調製した。自家製の不均一なモノクローナル抗体ＦＩ６またはＦ１０を、出発物質として使用し、エンドグリコシダーゼｅｎｄｏ  Ｓで修飾して、ＧｌｃＮＡｃ−Ｆｕｃの二糖ｍＡｂとＧｌｃＮＡｃの単糖ｍＡｂとの混合物を得た。その後、均質な単糖ｍＡｂを、フコシダーゼの適用によって得たか；または単糖種を、Ｅｎｄｏ  Ｓとフコシダーゼとの組み合わせをワンステップで用いて得た。
【０６３６】
リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０、０．１２５ｍＬ）中のＦＩ６／Ｆ１０（０．２５ｍｇ）を、Ｅｎｄｏ  Ｓ（１２．５μｇ）およびＢｆＦｕｃＨ（０．２５ｍｇ）と共に、３７℃で２２時間インキュベートした。ＬＣ−ＭＳ解析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、重鎖上のＮ−グリカンの完全な切断を示した。反応混合物を、リン酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）であらかじめ平衡化したプロテインＡ−アガロース樹脂（０．１ｍＬ）のカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーに供した。カラムを、リン酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．０、１．０ｍＬ）で洗浄した。結合したＩｇＧを、グリシン−ＨＣｌ（５０ｍＭ、ｐＨ３．０、１．０ｍＬ）で放出させ、溶出画分を、トリス−Ｃｌ緩衝液（１．０Ｍ、ｐＨ８．３）で即座に中和した。Ｆｃ断片を含有する画分を合わせ、遠心濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）によって濃縮して、均質なモノ−ＧｌｃＮＡｃ抗体（０．１９３ｍｇ）を得た。産物をトリプシン処理し、糖ペプチドであるＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを使用して解析して、グリカン操作ＦＩ６／Ｆ１０のグリコシル化パターンを確認した。
【０６３７】
鶏卵卵黄からのシアリルグリカン（ＳＣＴ）の単離は、一部の修飾を伴う、公開された方法に従った。簡潔に述べると、鶏卵卵黄のエタノール抽出を遠心分離し、濾過し、ｅｎｄｏ  Ｍで処理し、反応が完了した後で、ＳＣＴを、ゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、精製されたＳＣＴを凍結乾燥させて、純粋なＳＣＴ産物を白色粉末として得た（８２％）。
【０６３８】
水（６０．０μＬ）中ＳＣＴ（Ｓｉａ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）（３．０ｍｇ）、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）（６．３ｍｇ）およびＥｔ３Ｎ（９．０μＬ）の溶液を、４℃で１時間撹拌した。反応混合物を、０．０５％の水性Ｅｔ３Ｎによって溶出させるＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム上でのゲル濾過クロマトグラフィーに供した。産物（ＳＣＴオキサゾリン）を含有する画分を合わせ、凍結乾燥させて、白色粉末（２．６ｍｇ、収率８７．４％）を得た。
【０６３９】
ＳＣＴオキサゾリンを、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中のグリコシンターゼ（ｇｌｙｃｏｓｙｎｔｈａｓｅ）とモノ−ＧｌｃＮＡｃ  Ｆｉ６またはＦ１０との混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラムと、その後のアニオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑとによって精製して、所望の産物である最適化された均質な抗インフルエンザウイルス抗体ＦＩ６−ＭまたはＦ１０−Ｍを回収した。産物をトリプシン処理し、糖ペプチドであるＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを使用して解析して、ＦＩ６−ＭまたはＦ１０−Ｍのグリコシル化パターンを確認した。
【０６４０】
（実施例４）
【０６４１】
ＦＩ６／Ｆ１０および糖鎖工学ＦＩ６−Ｍ／Ｆ１０−ＭのＡＤＣＣアッセイ。抗インフルエンザウイルス抗体の増強されたＡＤＣＣ結果を裏付けた図３を参照のこと。
【０６４２】
抗ウイルス性抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増強は、グリカン修飾を有する抗インフルエンザモノクローナル抗体ＦＩ６およびＦ１０を用いて裏付けられる。ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、細胞表面上に全長Ｃａｌ／０９  ＨＡを発現するようにプラスミドを一過性にトランスフェクトし、インフルエンザウイルス感染細胞を模倣させた。これらの細胞を、健康なドナーから単離した新たに調製されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と、１：２０または１：５０の感染細胞とＰＢＭＣとの比で混合した。次いで、グリカン修飾ありおよびグリカン修飾なしの、異なる濃度の抗体ＦＩ６およびＦ１０を、混合物中に添加した。５時間後、ＦＩ６およびＦ１０誘導性のＡＤＣＣの結果を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解（ＬＤＨ放出）によってモニタリングした。結果は、グリカン修飾を有する抗体ＦＩ６およびＦ１０によって誘導されたＡＤＣＣが、１．５〜３倍増強されることを示している。
【０６４３】
（実施例５）
ＡＤＣＣアッセイのための例示的な方法および材料
【０６４４】
（実施例）
抗ステムモノクローナル抗体ＦＩ６およびＦ１０
【０６４５】
Ｆ１０抗体発現プラスミドおよびＦＩ６抗体発現プラスミドを、ポリエチレンイミンを使用することによってＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトし、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。７日間のインキュベーション後、上清を遠心分離によって回収し、抗体を、プロテインＡビーズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によって精製した。抗体を、ＰＢＳ緩衝液中でのＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でのゲル濾過クロマトグラフィーによってさらに精製した。
【０６４６】
（実施例６）
【０６４７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ
【０６４８】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ｐＶａｘ−Ｃａｌ／０９赤血球凝集素（ＨＡ）発現プラスミドを４８時間トランスフェクトした。ＨＡ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トリプシン処理し、９６ウェルＵ底プレート中に、５０ｕｌのＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中に１ウェル当たり５，０００細胞で播種した。
【０６４９】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健康なボランティアから得た全血のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ分離によって調製し、ＡＤＣＣアッセイにおいてエフェクター細胞として使用した。簡潔に述べると、全血を、等容量のＨＢＳＳで希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に重ね、４００ｇで４０分間遠心分離した。ＰＢＭＣ細胞を採取し、ＨＢＳＳで２回洗浄し、５０／１のエフェクター対標的比を使用してＨＡ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と混合した。
【０６５０】
ＰＢＭＣとＨＡ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞との混合物を、異なる濃度の抗体ＦＩ６およびＦ１０で処理し、３７℃で５時間インキュベートした。
【０６５１】
５時間のインキュベーション後、ＡＤＣＣを、ｃｙｔｏＴｏｘ９６  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を測定することによってモニタリングした。
【０６５２】
（実施例７）
モノクローナル抗体媒介性の抗がん治療剤を増強するための、Ｆｃ領域に普遍的グリカンを有する均質な抗体の調製
【０６５３】
代表的例：
【０６５４】
市販のＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を、Ｆｃ領域に普遍的グリカンを有する均質な抗インフルエンザウイルス抗体の調製のために以前に記載された同じ方法の後、出発物質として使用した。Ｆｃ領域に最適化された普遍的グリカンＳｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を有する均質なＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を得ることができる。同じ方法を使用して、本発明者らは、異なるグリカンを有する抗体の活性の比較のために、それらのＦｃ領域に異なるグリカン形態を有する異なる均質なＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）抗体およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体もまた調製した。
【０６５５】
均質な抗ＣＤ２０抗体の生物学的特徴
【０６５６】
Ｆｃ上でのグリコシル化は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび循環半減期を含む、多様な免疫グロブリンエフェクター媒介性機能に影響しうる。ＡＤＣＣ増強は、治療用抗体薬物の有効性を改善するための重要な戦略である。これは、より低い薬物コストの利益を目的として、有効な薬物投与量を低下させうる。本明細書で記載される均質な抗ＣＤ２０抗体は、機能的特性によって特徴付けられうる。抗ＣＤ２０  ＧＡｂは、ヒトＣＤ２０発現細胞に対するアポトーシスを含む細胞成長阻害活性を有する。一部の実施形態では、抗ＣＤ２０  ＧＡｂは、その親抗体と比較して、より強力な細胞成長阻害活性を呈示する。
【０６５７】
（実施例８）
【０６５８】
抗ＣＤ２０糖抗体のＡＤＣＣ活性
【０６５９】
本発明に従う均質な抗体のＡＤＣＣ活性は、親抗体のＡＤＣＣ活性と比較して、少なくとも８倍増大した、好ましくは少なくとも１５倍、より好ましくは少なくとも３５倍増大したＡＤＣＣ活性、好ましくは少なくとも５０倍増大したＡＤＣＣ活性、好ましくは少なくとも６０倍増大したＡＤＣＣ活性、最も好ましくは少なくとも８０倍増大したＡＤＣＣ活性である。
【０６６０】
本発明の均質な抗体のＡＤＣＣ溶解活性は、例えば、ＳＫＢＲ５、ＳＫＢＲ３、ＬｏＶｏ、ＭＣＦ７、ＯＶＣＡＲ３および／またはＫａｔｏ  ＩＩＩなどの標的がん細胞系を使用して、親抗体と比較して測定されうる。
【０６６１】
本明細書で記載される多数の抗ＣＤ２０  ＧＡｂ、特にＧＡｂ１０１、およびＧＡｂ１０４は、その親抗体であるリツキシマブと比較して、増強されたＡＤＣＣ活性を呈示した。本発明の均質な抗体は、Ｂ細胞またはＢ細胞によって産生される抗体が関与するＢ細胞媒介性の悪性腫瘍および免疫学的疾患に対する治療剤として、優れた効果を呈示でき、本発明の目的は、治療剤の開発において抗ＣＤ２０  ＧＡｂを使用することである。
【０６６２】
（実施例９）
抗ＣＤ２０糖抗体のＣＤＣ活性
【０６６３】
本明細書で記載される均質な抗体は、驚くべきことに、ＣＤＣに影響を与えることなしに改善されたＡＤＣＣを提供することが可能である。例示的なＣＤＣアッセイは、実施例に記載されている。例示的な実施形態では、糖抗体のＡＤＣＣは増大するが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などの他の免疫グロブリン型エフェクター機能は、類似のままである、または顕著には影響を受けない。
【０６６４】
ＦｃγＲＩＩＩと抗ＣＤ２０糖抗体との結合
【０６６５】
ＦｃγＲＩＩＩＡを、ＨＥＫ−２９３細胞系中にトランスフェクトして、組換えタンパク質を発現させた。分泌されたＦｃγＲＩＩＩＡ組換えタンパク質を精製し、次いで、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中に系列濃度（２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、および１２．５ｎＭ）になるように希釈した。抗ＣＤ２０  ＧＡｂ  １０１、１０２、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０および１１１の各々を、１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中に希釈し、次いで、抗ヒトＦａｂドメイン抗体をあらかじめ固定化したＣＭ５チップに捕捉した。ＦｃγＲＩＩＩＡの系列滴定を、３０ｍｌ／分の流量で注射し、結合させた。単一サイクルの動態データを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して１：１結合モデルに当てはめて、平衡定数（Ｋａ／Ｋｄ）を測定した。結果を表２に示す。
【０６６６】
表２は、抗ＣＤ２０  ＧＡｂおよびリツキシマブの例示的なＦｃγＲＩＩＩＡ結合を列挙する。ＦｃγＲＩＩＩＡ結合は、当技術分野で公知のアッセイを使用して測定されうる。例示的なアッセイは、実施例に記載されている。Ｆｃ受容体結合は、抗ＣＤ２０  ＧＡｂ対リツキシマブの相対比として決定されうる。例示的な実施形態におけるＦｃ受容体結合は、少なくとも１．２倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍もしくは２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍またはそれ超、増大する。
【０６６７】
表２．
【０６６８】
リツキシマブと比較して、結合データは、抗ＣＤ２０  ＧＡｂ、特にＧＡｂ１０１およびＧＡｂ１０４が、標的分子であるＣＤ２０に対するより強い結合アフィニティーを呈示することを示した。
【０６６９】
合わせると、抗ＣＤ２０  ＧＡｂ、特にＧＡｂ１０１、およびＧＡｂ１０４は、リツキシマブと比較して、増強されたＡＤＣＣ活性およびより強いＦｃγＲＩＩＩＡ結合アフィニティーを呈示した。本発明の均質な抗体は、単独で、または好ましくは、２つもしくはそれ超のそのような抗体を含む組成物中でのいずれかで、そして化学療法などの他の処置と任意選択で組み合わせて、優れた臨床応答を提供しうる。ＡＤＣＣ増強抗ＣＤ２０糖抗体は、Ｂ細胞リンパ腫および他の疾患に対する代替的治療剤を提供しうる。それらの増大したエフェクター機能は、それらがより低い濃度でおよびより低い頻度で投薬され、これにより、抗体毒性および／または抗体寛容の発達の可能性を低減させうることを意味するので、本発明の糖抗体は、現在の投与経路および現在の治療レジメンを改変させるために使用されうる。さらに、それらの改善されたエフェクター機能は、組換え宿主系において産生された対応する抗ＣＤ２０モノクローナル抗体による処置に対して以前には耐性または難治性であった臨床適応症を処置するための新たな手法をもたらす。
【０６７０】
（実施例１０）
Ｂリンパ腫細胞への結合
【０６７１】
Ｒｉｔｕｘａｎ−ＳＣＴ（ＧＡｂ１０１）およびＲｉｔｕｘａｎモノ−ＧｌｃＮＡｃの、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｒａｊｉ細胞およびＳＵ−ＤＨＬ−４細胞への結合活性を検討したところ、結果は、これらが共にリツキシマブと類似の結合活性を有することを示した（図４）。
【０６７２】
図４．ＣＤ２０を有する異なる細胞との、異なる均質な抗体の結合活性。
【０６７３】
（実施例１１）
Ｂリンパ腫細胞に対するＣＤＣ
【０６７４】
Ｒｉｔｕｘａｎ−ＳＣＴ（ＧＡｂ１０１）およびＲｉｔｕｘａｎモノ−ＧｌｃＮＡｃの、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｒａｊｉ細胞およびＳＵ−ＤＨＬ−４細胞に対するＣＤＣ効果を調べた。Ｒａｍｏｓ細胞で見られた比較ＣＤＣプロファイル（ＧＡｂ１０１によって増強され、Ｒｉｒｕｘａｎ−ＧｌｃＮＡｃによって低減される）が、他のＢリンパ腫細胞系ＳＵ−ＤＨＬ−４で確認された（図５の右側パネル）。異なる細胞継代を使用して２回目に実施した場合、再現性のある結果が得られた。
【０６７５】
（実施例１１）
【０６７６】
図５．ヒトＢ細胞の枯渇を参照のこと。
【０６７７】
ヒトＢ細胞の枯渇を、ヒト血液から新たに調製したヒトＰＢＭＣ細胞を使用して実施した。マイクロプレート上で培養した、ＲＰＭＩ  １６４０−５％ＦＢＳ中２×１０６個の細胞を、異なる濃度の、抗ＣＤ２０  ＧＡｂであるＲｉｔｕｘａｎ−ＳＣＴ、Ｒｉｔｕｘａｎ−ＧｌｃＮＡｃおよびリツキシマブと共に、３７℃で４時間、１５％自家血漿の非存在下または存在下でインキュベートした。洗浄の後で、細胞を、抗ＣＤ２−ＰＥおよび抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣを用いて氷上で５分間染色した。Ｂ細胞枯渇を、ＣＤ１９＋ＣＤ２−Ｂ細胞に基づいてＦＡＣＳで解析した（図６）。図６．異なる均質な抗体によるヒトＢ細胞の枯渇を参照のこと。
【０６７８】
（実施例１２）
Ｂリンパ腫細胞への結合。
【０６７９】
抗体の結合を、ＣＤ２０＋Ｂリンパ腫細胞系（Ｒａｍｏｓ、Ｒａｊｉ、および）において精査し、フローサイトメトリーで解析した。マイクロプレート上２×１０５／ウェルの、１％ウシ胎仔血清を含有するＰＢＳ中の細胞を、異なる濃度の目的の抗体と共に、氷上で１時間インキュベートする。細胞を洗浄し、ＰＢＳ緩衝液中に再懸濁し、検出用ヤギ抗ｈＩｇＧ−Ｆｃγ−ＰＥと共に氷上で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳでの解析に供する。
【０６８０】
（実施例１３）
ＦｃＲＩＩＩａ発現ＣＨＯ細胞への結合。
【０６８１】
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の誘導と相関することが公知の前駆事象である、ＦｃＲＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６ａ）への抗体の結合を、高アフィニティーＣＤ１６ａ（１５８Ｖａｌ）でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞において精査し、フローサイトメトリーで解析した。マイクロプレート上１×１０５／ウェルの、１％ウシ胎仔血清を含有するＰＢＳ中の細胞を、異なる濃度の目的の抗体と共に、氷上で１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＰＢＳ緩衝液中に再懸濁し、検出用ヤギ抗ｈＩｇＧ−Ｆｃγ−ＰＥと共に氷上で３０分間インキュベートする。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳでの解析に供する。
【０６８２】
Ｂリンパ腫細胞に対する補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）。抗体によって誘導されるＣＤＣ効果を、ＣＤ２０＋Ｂリンパ腫細胞系（ＲａｍｏｓおよびＳＫＷ６．４）において精査し、フローサイトメトリーで解析した。マイクロプレート上２．０×１０５／ウェルの、ＲＰＭＩ  １６４０培養培地中の細胞を、異なる濃度の目的の抗体と共に、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＲＰＭＩ  １６４０中１０％のヒト血清と共に３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＰＩ試薬を用いて暗中で５分間インキュベートした。ＣＤＣによる細胞死を、ＦＡＣＳで解析した。
【０６８３】
Ｂリンパ腫細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）。糖抗体によって誘導されるＡＤＣＣ効果を、新たに調製されたヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用して、ＣＤ２０含有Ｂリンパ腫細胞系（ＲａｍｏｓおよびＳＫＷ６．４）において精査し、結果をフローサイトメトリーで解析した。ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ中の標的Ｂ細胞を、まず、ＣＦＳＥを用いて３７℃で５分間標識した。洗浄の後で、ＲＰＭＩ  １６４０培地中のＣＦＳＥ標識細胞を、異なる濃度の目的の糖抗体、およびＰＢＭＣエフェクター細胞と共に、マイクロプレート上で３７℃で４時間インキュベートした。標的細胞とエフェクター細胞との比を２５：１に設定した。得られた混合物を、ＰＩ試薬を用いて暗中で５分間染色した。ＡＤＤＣによる細胞死を、ＦＡＣＳで解析した。
【０６８４】
ヒトＢ細胞の枯渇。ヒトＢ細胞の枯渇を、ヒト血液から新たに調製したヒトＰＢＭＣ細胞を使用して実施した。マイクロプレート上で培養した、ＲＰＭＩ  １６４０−５％ＦＢＳ中２×１０６の細胞を、異なる濃度の目的の抗体と共に、３７℃で４時間、１５％自家血漿の非存在下または存在下でインキュベートした。洗浄の後で、細胞を、抗ＣＤ２−ＰＥおよび抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣを用いて氷上で５分間染色した。Ｂ細胞枯渇を、ＣＤ１９＋ＣＤ２−Ｂ細胞に基づいてＦＡＣＳで解析した。
【０６８５】
グリカン操作戦略による、均質なＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の調製。
【０６８６】
異なるグリカン修飾された均質なＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を調製するための方法。
【０６８７】
均質な抗ＨＥＲ２抗体の生物学的特徴
【０６８８】
Ｆｃ上でのグリコシル化は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび循環半減期を含む、多様な免疫グロブリンエフェクター媒介性機能に影響しうる。ＡＤＣＣ増強は、治療用抗体薬物の有効性を改善するための重要な戦略である。これは、より低い薬物コストの利益を目的として、有効な薬物投与量を低下させる可能性を有する。本明細書で記載される均質な抗ＨＥＲ２糖抗体は、機能的特性によって特徴付けられうる。抗ＨＥＲ２  ＧＡｂは、ＨＥＲ２発現細胞に対するアポトーシスを含む細胞成長阻害活性を有する。一部の実施形態では、抗ＨＥＲ２  ＧＡｂは、その親抗体と比較して、より強力な細胞成長阻害活性を呈示する。
【０６８９】
抗ＨＥＲ２糖抗体のＡＤＣＣ活性
【０６９０】
本発明に従う糖抗体のＡＤＣＣ活性は、親抗体のＡＤＣＣ活性と比較して、少なくとも３倍増大した、好ましくは少なくとも９倍、より好ましくは少なくとも１０倍増大したＡＤＣＣ活性、好ましくは少なくとも１２倍増大したＡＤＣＣ活性、好ましくは少なくとも２０倍増大したＡＤＣＣ活性、最も好ましくは少なくとも３０倍増大したＡＤＣＣ活性である。
【０６９１】
本発明の糖抗体のＡＤＣＣ溶解活性は、ＳＫＢＲ５、ＳＫＢＲ３、ＬｏＶｏ、ＭＣＦ７、ＯＶＣＡＲ３および／またはＫａｔｏ  ＩＩＩなどの標的がん細胞系を使用して、親抗体と比較して測定されうる。
【０６９２】
表３は、トラスツズマブと比較した、抗ＨＥＲ２  ＧＡｂの例示的な増強されたＡＤＣＣ活性を列挙する。例示的なアッセイは実施例に記載されている。
【表３】
2018509390.tif 000013
【０６９３】
本明細書で記載される多数の抗ＨＥＲ２  ＧＡｂ、特にＧＡｂ１０１、およびＧＡｂ１０４は、その親抗体であるリツキシマブと比較して、増強されたＡＤＣＣ活性を呈示する。本発明の糖抗体は、ＨＥＲ２陽性疾患に対する治療剤として、優れた効果を呈示しうることが想定され、本発明の目的は、治療剤の開発において抗ＨＥＲ２  ＧＡｂを使用することである。
【０６９４】
抗ＨＥＲ２糖抗体のＣＤＣ活性
【０６９５】
本明細書で記載される糖抗体は、驚くべきことに、ＣＤＣに影響を与えることなしに改善されたＡＤＣＣを提供することが可能である。例示的なＣＤＣアッセイは、実施例に記載されている。例示的な実施形態では、糖抗体のＡＤＣＣは増大するが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などの他の免疫グロブリン型エフェクター機能は、類似のままである、または顕著には影響を受けない。
【０６９６】
ＦｃγＲＩＩＩと抗ＨＥＲ２糖抗体との結合
【０６９７】
表４は、抗ＨＥＲ２  ＧＡｂおよびリツキシマブの例示的なＦｃγＲＩＩＩＡ結合を列挙する。
表４．
【０６９８】
ＦｃγＲＩＩＩＡ結合は、当技術分野で公知のアッセイを使用して測定されうる。例示的なアッセイは、実施例に記載されている。Ｆｃ受容体結合は、抗ＨＥＲ２  ＧＡｂ対トラスツヅマブの相対比として決定されうる。例示的な実施形態におけるＦｃ受容体結合は、少なくとも２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍もしくは２０倍、３０倍、４０倍、５０倍またはそれ超、増大する。
【０６９９】
トラスツヅマブと比較して、結合データは、抗ＨＥＲ２  ＧＡｂ、特にＧＡｂ１０１およびＧＡｂ１０４が、標的分子であるＨＥＲ２に対するより強い結合アフィニティーを呈示することを示した。
【０７００】
合わせると、抗ＨＥＲ２  ＧＡｂ、特にＧＡｂ１０１、およびＧＡｂ１０４は、トラスツヅマブと比較して、増強されたＡＤＣＣ活性およびより強いＦｃγＲＩＩＩＡ結合アフィニティーを呈示する。本発明の糖抗体は、単独で、または好ましくは、２つもしくはそれ超のそのような抗体を含む組成物中でのいずれかで、そして化学療法などの他の処置と任意選択で組み合わせて、優れた臨床応答を提供しうることが企図される。ＡＤＣＣ増強抗ＨＥＲ２糖抗体は、ＨＥＲ２陽性疾患に対する代替的治療剤を提供しうることが企図される。それらの増大したエフェクター機能は、それらがより低い濃度でおよびより低い頻度で投薬され、これにより、抗体毒性および／または抗体寛容の発達の可能性を低減させうることを意味するので、本発明の糖抗体は、現在の投与経路および現在の治療レジメンを改変させるために有利に使用されうる。さらに、それらの改善されたエフェクター機能は、組換え宿主系において産生された対応する抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体による処置に対して以前には耐性または難治性であった臨床適応症を処置するための新たな手法をもたらす。
【０７０１】
モノクローナル抗体媒介性の抗炎症治療剤を増強するための、Ｆｃ領域に普遍的グリカン（ＳＣＴ）を有する均質な抗体の調製。
【０７０２】
ｓｉａａ２，６Ｇａｌ構造を有するＦｃ領域は、抗炎症活性を増大させうる。ここで、本発明者らは、その抗炎症活性を改善するためにＦｃ領域にＳＣＴグリカンを有する均質なＨｕｍｉｒａを調製する。
【０７０３】
抗ＴＮＦαのＮ−グリコシル化の解析のための一般的手順
【０７０４】
本発明者らは、糖ペプチド前駆体に適用された衝突誘導性解離（ＣＩＤ）エネルギーにわたってオリゴ糖由来の断片イオン（オキソニウムイオン）の収量をモニタリングするための質量分析法を開発した。オキソニウムイオン法の多重反応モニタリング（ＭＲＭ）は、今後のバイオシミラー治療剤の日常的な品質管理解析に対する規制上の要件を満たすことができる。
【０７０５】
５ｕｇのアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））（Ａｂｂｖｉｅから購入した）を、２５ｕｌの２Ｍグアニジン−ＨＣｌ中に溶解させ、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を、５ｍＭの最終濃度になるように添加した。１１０℃で１０分間のインキュベーション後、還元されたシステイン残基を、１０ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）中で３７℃で１時間アルキル化した。５ｍＭのＤＴＴを添加して、過剰なＩＡＡをＲＴで１０分間クエンチする。産物を、５０ｍＭの重炭酸アンモニウム中で１５倍希釈し、その後、スピンカラム（１０ｋＤａタンパク質ＭＷカットオフ）で微量遠心分離した。トリプシン消化を、１：２５（ｗ／ｗ）の酵素：タンパク質比を使用して３７℃で４時間実施した。試料を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析のために−２０℃で冷凍した。
【０７０６】
計装
【０７０７】
ｍ／ｚ  ２０４オキソニウムイオン（ＨｅｘＮＡｃ）モニタリングによる糖ペプチド定量化を、Ａｇｌｉｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣシステムと共に４０００  ＱＴｒａｐ三連四重極型質量分析計（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）を使用して実施した。糖ペプチドの微小不均一性の相対的定量化のために、全ての可能なグリカン組成を網羅する前駆イオンｍ／ｚをｉｎ−ｓｉｌｉｃｏで導き出し、単一の定量遷移（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）を、各前駆イオン（Ｑ３  ｍ／ｚ＝２０４）についてモニタリングした。
【０７０８】
ＭＳデータ解析
【０７０９】
獲得した生データを、Ａｎａｌｙｓｔ  １．５（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）で処理した。各遷移の質量クロマトグラムを積分し、ピーク面積によって定量化した。各構成要素の百分率組成を、合わせた全ての構成要素の合計に対して計算した。
【０７１０】
抗ＴＮＦα抗体Ｈｕｍｉｒａ−ＳＣＴの調製
【０７１１】
鶏卵卵黄からのシアリル糖ペプチド（ＳＧＰ）の単離は、公開された方法に従った。簡潔に述べると、鶏卵卵黄のフェノール抽出を遠心分離し、濾過し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅｒａｒｌ  ６５０Ｍ、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−２５およびＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を含むクロマトグラフィーカラムによって精製した。リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０、５ｍＭ）中のシアリル糖ペプチド（ＳＧＰ）（５２ｍｇ）溶液を、Ｅｎｄｏ  Ｍ（５３μｇ）と共に３７℃でインキュベートした。７時間後、反応混合物を、水によって溶出させるＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム上でのゲル濾過クロマトグラフィーに供した。産物を含有する画分を合わせ、凍結乾燥させて、産物（グリカン−１０１）を白色粉末（３０ｍｇ、収率８２％）として得た。
【０７１２】
水中グリカン−１０１（Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）（３０ｍｇ）、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）（６２．７ｍｇ）およびＥｔ３Ｎ（８９μＬ）の溶液を、４℃で１時間撹拌した。反応混合物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム上でのゲル濾過クロマトグラフィーに供し、０．０５％の水性Ｅｔ３Ｎによって溶出させた。産物（ＳＣＴオキサゾリン）を含有する画分を合わせ、凍結乾燥させて、白色粉末を得た。
【０７１３】
ＳＣＴオキサゾリンを、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中のエンドグリコシダーゼとＧＡｂ  Ｈｕｍｉｒａ−ＧｌｃＮＡｃとの混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラムと、その後のアニオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑとによって精製して、所望の産物である抗ＴＮＦα  ＧＡｂ１０１を回収した。産物をトリプシン処理し、糖ペプチドであるＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを使用して解析して、Ｈｕｍｉｒａ−ＳＣＴのグリコシル化パターンを確認した。
【０７１４】
抗ＴＮＦαの結合アフィニティー
【０７１５】
１５８アミノ酸を含有するヒト組換えＴＮＦ−α（ＭＷ＝１７．５ｋＤａ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＰＲＯＳＰＥＣ）中で産生し、精製した。組換えヒトＴＮＦ−αタンパク質を滴定し、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、および３．１２５ｎＭの系列希釈を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で調製した。アダリムマブならびに抗ＴＮＦα  ＧＡｂ  ２００および４０１を、１０μｇ／ｍｌの濃度になるようにＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中に希釈し、次いで、抗ヒトＦｃドメイン抗体をあらかじめ固定化したＣＭ５チップに捕捉した。次いで、分析物としての組換えヒトＴＮＦ−アルファの系列濃度を、３０μｌ／分の流量で注射し、チップ上の捕捉された抗体に結合させた。結合の後で、抗体−分析物複合体を、５０μｌ／分の流量で、再生緩衝液である１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ  ｐＨ１．５によって洗浄した。ＣＭ５チップを、さらなる使用のために、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中で４℃で維持した。単一サイクルの動態データを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して１：１結合モデルに当てはめて、平衡定数（Ｋａ／Ｋｄ）を測定した。
【０７１６】
（実施例１３）
抗ＳＳＥＡ−４モノクローナル抗体の作製
【０７１７】
ＳＳＥＡ−４に特異的なｍＡｂを開発するために、ハイブリドーマ方法論を使用した。６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＳＳＥＡ−４ワクチンにより、３回皮下免疫化した。３回の免疫化は、２週間間隔で施した。各ワクチン接種は、２μｇのＳＳＥＡ−４を含有した。全ての血清は、４，０００×ｇで１０分間の遠心分離により得た。血清学的応答は、グリカンマイクロアレイにより解析した。最終追加免疫は、２μｇのＳＳＥＡ−４により、腹腔内に施し、３日後、免疫化されたマウスに由来する脾臓細胞を、ハイブリドーマを作り出すために使用した。
【０７１８】
所望の抗原結合活性を伴う抗体を分泌するハイブリドーマ細胞は、以下の通りにスクリーニングした。０．１Ｍ、ｐＨ９．６の炭酸緩衝液中に４μｇ／ｍＬのニュートラアビジンと共に、４℃で一晩インキュベートすることにより、マイクロタイタープレートをコーティングした。ウェルを、ｐＨ＝７．３のＰＢＳ中に１％のＢＳＡで、１時間ブロックし、４μｇ／ｍＬのＳＳＥＡ−４−ビオチンと共に、１時間インキュベートした。抗血清は、３７℃で１時間、多様な希釈率でインキュベートした。洗浄の後で、リガンドと結合した抗体を、１：１０，０００のＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体またはＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）により検出し、３７℃で１時間インキュベートした後で、ＴＭＢ基質を伴うインキュベーションを施した。ＯＤは、４５０ｎｍで決定した。陽性クローンを、さらなる特徴付けのために選択した。本研究では、３つの例示的なクローンである、４５、４６、および４８を、ＳＳＥＡ−４に特異的に結合するものとして同定した。マウスモノクローナルのアイソタイプ解析（ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ）には、ＩｓｏＱｕｉｃｋ  Ｓｔｒｉｐｓ  ａｎｄ  Ｋｉｔｓ（Ｓｉｇｍａ；Ｉ９５３５）を使用した。ハイブリドーマ培地を、反応バイアルに添加する。ストリップが直立していることを確実にして、ストリップを、試料に挿入する。試料は、ストリップを伝って上行する。ストリップを５分間発色させてから、最終的な解釈を施す。
【０７１９】
ｍＡｂ  ４５、ｍＡｂ  ４６、およびｍＡｂ  ４８のＶＨ遺伝子セグメントおよびＶＬ遺伝子セグメントを、ＰＣＲにより、抗体を分泌するハイブリドーマクローンから増幅した。このようにして得られた遺伝子セグメントをシークェンシングして、ｍＡｂ  ４５、ｍＡｂ  ４６、およびｍＡｂ  ４８のＶＨ配列およびＶＬ配列を決定し、これらを表３〜５に示す。
【０７２０】
（実施例１４）
キメラ抗体の作製
【０７２１】
ｍＡｂ  ２７３およびｍＡｂ  ６５１のＶＨ遺伝子セグメントおよびＶＬ遺伝子セグメントを、ＰＣＲにより、抗体を分泌するハイブリドーマクローンから増幅した。このようにして得られた遺伝子セグメントをシークェンシングして、ｍＡｂ  ２７３およびｍＡｂ  ６５１のＶＨ配列およびＶＬ配列を決定し、これらを表１および２に示す。重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、図９に示すヒトＩｇＧ１抗体発現ベクターにクローニングした。ＶＨでは、酵素部位ＢｓｉＷＩおよびＡｐａＩを使用し、ＶＬでは、酵素部位ＢｓＰＥＩおよびＮｈｅＩを使用した。ベクターは、２９３Ｆ細胞またはＣＨＯ−Ｓ細胞のいずれかに、一過性にトランスフェクトした。組換えキメラＡｂは、結合アッセイおよび補体依存性腫瘍細胞溶解アッセイのためのさらなる研究のために精製した。
【０７２２】
ｍＡｂ  ４６およびｍＡｂ  ４８のＶＨ遺伝子セグメントおよびＶＬ遺伝子セグメントを、ＰＣＲにより、抗体を分泌するハイブリドーマクローンから増幅した。このようにして得られた遺伝子セグメントをシークェンシングして、ｍＡｂ  ４６およびｍＡｂ  ４８のＶＨ配列およびＶＬ配列を決定し、これらを表５および４に示す。重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、図９に示すヒトＩｇＧ１抗体発現ベクターにクローニングした。ＶＨでは、酵素部位ＢｓｉＷＩおよびＡｐａＩを使用し、ＶＬでは、酵素部位ＢｓＰＥＩおよびＮｈｅＩを使用した。ベクターは、２９３Ｆ細胞またはＣＨＯ−Ｓ細胞のいずれかに、一過性にトランスフェクトした。組換えキメラＡｂは、結合アッセイおよび補体依存性腫瘍細胞溶解アッセイのためのさらなる研究のために精製した。
【０７２３】
（実施例１５）
フローサイトメトリーによるがん細胞への抗体の結合解析
【０７２４】
ｍＡｂ  ２７３および抗ＳＳＥＡ−４（ｍＡｂ  ４５、ｍＡｂ  ４６およびｍＡｂ  ４８）のがん細胞系への結合を検討した。細胞（１×１０５）を、多様な濃度の抗体を含有する１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）中に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、細胞を、６４９標識ヤギ抗マウス抗体（１：１００；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共に氷上で３０分間インキュベートし、その後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒシステム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で解析した。結果を図７Ａ〜Ｄに示す。乳がん細胞ＭＣＦ−７を、ｍＡｂ  ２７３で染色した（図７Ａ）。膵臓がん細胞（ＨＰＡＣおよびＢｘＰＣ３）および乳がん細胞ＭＣＦ−７を、ｍＡｂ  ４５で染色した（図７Ｂ）。膵臓がん細胞（ＨＰＡＣおよびＢｘＰＣ３）および乳がん細胞ＭＣＦ−７を、ｍＡｂ  ４６で染色した（図７Ｃ）。膵臓がん細胞（ＨＰＡＣおよびＢｘＰＣ３）および乳がん細胞ＭＣＦ−７を、ｍＡｂ  ４８で染色した（図７Ｄ）。
【０７２５】
本発明者らはまた、グリカンアレイを、ＭＣ４５、ＭＣ４８、およびＭＣ８１３−７０の、表面上のＳＳＥＡ−４六糖に対する解離定数を決定するのにも使用したが、ＭＣ４５、ＭＣ４８、およびＭＣ８１３についてのＫｄ値を下記に示す。これらの結果は、これらのｍＡｂが、ＳＳＥＡ−４に対して高度に特異的であることを示した。
【表Ａ】
2018509390.tif 000014
【０７２６】
（実施例１６）
例示的なｍＡｂ  ４６およびｍＡｂ  ４８が、ＳＳＥＡ−４を発現させる細胞に対するＣＤＣを媒介する能力について検討した。Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ膵臓腺癌細胞（ＢｘＰＣ３）を、補体の供給源としてのウサギ血清の存在下で検討した。細胞死は、生存度プローブである７−ＡＡＤを添加することにより評価した。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターを使用して、７−ＡＡＤ測定の結果に基づき、比溶解百分率を計算した。抗体は、４０μｇ／ｍＬで約２０％の殺滅活性を示した。図５（Ｃ）において示される通り、ｍＡｂ  ４６およびｍＡｂ  ４８は、ＳＳＥＡ−４を発現させる細胞に対するＣＤＣを媒介することに成功した。
【０７２７】
（実施例１５）
例示的なファージディスプレイのバイオパニング手順
【０７２８】
クローン２．５×１０１０個を含有する、ファージディスプレイされたヒトナイーブｓｃＦｖライブラリー（Ｌｕら、２０１１年）から、ＰＥＧコンジュゲートカルボキシルＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、室温（ＲＴ）で１時間、非特異的結合を減算し（ｓｕｂｔｒａｃｔ）、その後、ＳＳＥＡ−４−ＰＥＧを固定化したＤｙｎａｂｅａｄｓと共に、４℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳまたは０．０１％のＴｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ０．０１）による洗浄の後で、ＳＳＥＡ−４−ＰＥＧ−Ｄｙｎａｂｅａｄｓに結合したファージを、Ｅ−ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞での、３７℃で０．５時間の感染により回収した。感染細胞の一部は、系列希釈して、力価を決定し、他の細胞は、Ｍ１３ＫＯ７ファージによりレスキューし、増幅した。レスキューされたファージ力価を決定した後で、次のラウンドのバイオパニングを実施した。バイオパニングの第４のラウンドおよび第５のラウンドにおいて、ファージクローンをランダムに選択して、ＥＬＩＳＡスクリーニングのために培養した。
【０７２９】
選択されたファージクローンのＥＬＩＳＡスクリーニング
【０７３０】
抗原認識を検出するために、マイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を、それぞれ、０．２μｇ／ｍｌのＳＳＥＡ−４−ＢＳＡ、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ−ＢＳＡ、ＳＳＥＡ−３−ＢＳＡ、およびＢＳＡでコーティングした。選択されたファージクローンを、３％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中に１：２で希釈し、各ウェルに添加した。プレートを、ＲＴで１時間インキュベートし、ＰＢＳＴ０．１で洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートマウス抗Ｍ１３ファージ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共にインキュベートした。プレートを再度洗浄し、ＯＰＤおよびＨ２Ｏ２を添加した。３ＮのＨＣｌによる反応の終結の後で、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ  ６８０；ＢｉｏＲａｄ）を使用して４９０ｎｍを使用して、吸光度を測定した。本発明者らは、ファージミドを、ＥＬＩＳＡ陽性ファージクローンから抽出して、自動シークェンシングにより、ｓｃＦｖコード領域を同定した。
【０７３１】
抗ＳＳＥＡ−４ヒトＩｇＧの構築および発現
【０７３２】
選択されたｓｃＦｖのＶＨ領域を、ＡｇｅＩ部位およびＮｈｅＩ部位により、ヒト免疫グロブリンガンマ１重鎖のシグナルペプチド領域および定常領域を含有する修飾発現ベクターであるｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−Ｇａｍｍａ１にクローニングした。選択されたｓｃＦｖのＶＬ領域を、ＡｇｅＩ部位およびＥｃｏＲＶ部位により、ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖のシグナルペプチド領域および定常領域を含有する修飾発現ベクターであるｐ−Ｋａｐｐａ−ＨｕＧｓにクローニングした。両方のプラスミドを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクトし、血清非含有培地中、３７℃で１週間持続的にインキュベートして、ヒト抗体を作製した。
【０７３３】
抗ＳＳＥＡ−４ヒトＩｇＧの精製
【０７３４】
培養培地を回収し、遠心分離し、孔サイズを０．４５μｍとする膜で濾過した。次いで、抗ＳＳＥＡ−４ヒトＩｇＧを精製するために、上清を、プロテインＧカラムクロマトグラフィー（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけた。溶離液をＰＢＳにより透析した後で、通例通り、クーマシーブルー染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、抗体について検討した。抗体の濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および分光光度計により評価した。
【０７３５】
ＭＣ４８のヒト化
【０７３６】
ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｑ９ＵＬ７３およびＡＹ５７７２９８の２つのヒト遺伝子は、それぞれ、ＭＣ４８  ＶＨおよびＭＣ４８  ＶＬと最も類似するものであった。本発明者らは、Ｑ９ＵＬ７３遺伝子の修飾フレームワーク（ＦＲ）１〜ＦＲ４からなる第１のヒト化ＭＣ４８（ｈＭＣ４８）ＶＨ、および受託ＡＹ５７７２９８由来の４つのＦＲからなる第１のｈＭＣ４８  ＶＬ、ＰＤＢ由来の１ＹＹ８に従うＶＨによる第２のｈＭＣ４８  ＦＲに対し、第１の配列と同じである第２のｈＭＣ４８  ＶＬ、ならびにＱ９ＵＬ７３遺伝子のＦＲ１、２、および４を修飾する第３のｈＭＣ４８  ＶＨ配列、ならびにヒトＡＹ５７７２９８遺伝子へＦＲ２およびＦＲ４を変化させる第３のｈＭＣ４８  ＶＬを含む、３つのＭＣ４８配列をヒト化した。これらのヒト化配列の全ては、ＭＣ４８のＶＨおよびＶＬのうちの、保存されたＣＤＲ１〜ＣＤＲ３であった。
【０７３７】
ヒト化ＭＣ４８改変体の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の構築
【０７３８】
ヒト化ＭＣ４８配列（ＶＨ−ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ−ＶＬ（配列番号１１５））のｓｃＦｖ形態を遺伝子合成し（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、Ｓｆｉ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で切り出した。ゲル抽出の後、消化された産物を、ｐＣＡＮＴＡＢ−５Ｅファージミド（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にクローニングした。
【０７３９】
ヒト化ＭＣ４８（ｈＭＣ４８）ｓｃＦｖファージクローンの作製
【０７４０】
ｈＭＣ４８改変体ファージミドを、ＴＧ１  Ｅ−ｃｏｌｉに形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２％のグルコースを含有する２×ＹＴ培地（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）中に回収し、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（ＮＥＢ）により、３７℃で１時間レスキューした。１，５００×ｇで１０分間の遠心分離の後で、これらのペレットを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２×ＹＴ培地中で、一晩再懸濁させて、ｓｃＦｖファージを作り出した。
【０７４１】
ＥＬＩＳＡによる、ｈＭＣ４８  ｓｃＦｖファージクローンについての結合アッセイ
【０７４２】
ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡを、ＥＬＩＳＡプレート上、０．２μｇ／ｍｌの濃度でコーティングした。洗浄およびブロッキングの後で、系列希釈されたファージを、ＲＴで１．５時間インキュベートした。洗浄の後で、１：１０００に希釈されたＨＲＰコンジュゲート抗Ｍ１３抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ＲＴで１時間添加した。次いで、液体基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を発色させ、３ＮのＨＣｌで停止させた。光学密度は、４５０ｎｍで測定した。
【０７４３】
結果
【０７４４】
ＳＳＥＡ−４に結合するファージディスプレイされたｓｃＦｖの同定
【０７４５】
ＳＳＥＡ−４に結合する抗体を同定するため、本発明者らは、本発明者らによる以前の報告（Ｌｕら、２０１１年）で記載した通りに確立された、２．５×１０１０のメンバーを含有するファージディスプレイされたヒトナイーブｓｃＦｖライブラリーを使用した。まず、このライブラリーから、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ結合性ファージを取り除き、次いで、ＳＳＥＡ−４−ＰＥＧコンジュゲートＤｙｎａｂｅａｄｓにより、ＳＳＥＡ−４結合性ファージについて選択した。バイオパニング時において、本発明者らは、ＰＢＳおよび０．０１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ０．０１）の２つの緩衝液系を使用した。５ラウンドにわたるアフィニティー選択の後、第５のラウンドのファージ回収は、ＰＢＳ系およびＰＢＳＴ０．０１系のそれぞれにおいて、第１のラウンドの約５５倍および約８０倍増大した（図１０）。ファージクローンをランダムに選択し、ＥＬＩＳＡにより、ＳＳＥＡ−４結合について調べた（図１１）。本発明者らは、ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡには特異的に結合するが、ＢＳＡ対照タンパク質には特異的に結合しない７つのクローンを見出した。８つの個々のクローン全てをシークェンシングすることにより、本発明者らは、顕著に異なるヒトＶＨコード領域およびヒトＶＬコード領域を含有する、２つの固有の抗ＳＳＥＡ−４ファージクローン（ｐ１−５２およびｐ２−７８）を同定した（図１６Ａ）。
【０７４６】
２つのファージクローンの特異性および結合アフィニティーを検討するため、本発明者らは、ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡ、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ−ＢＳＡ、およびＳＳＥＡ−３−ＢＳＡを含む、グロボ系列グリカンに対する同じファージ力価を使用して、比較ＥＬＩＳＡを実施した（図１２）。ｐ２−７８ファージクローンは、ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡおよびＳＳＥＡ−３−ＢＳＡに対する強い結合、ならびにＧｌｏｂｏ  Ｈ−ＢＳＡに対するわずかに弱い結合を示した。しかし、本発明者らは、ｐ１−５２ファージクローンの、ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡに対する結合活性は、非常に弱いことを見出した。したがって、本発明者らは、さらなる研究のために、ｐ２−７８クローンに焦点を当てた。
【０７４７】
ＳＳＥＡ−４に対する完全ヒト抗体（ｈＡｂ）を確立するため、本発明者らは、ｐ２−７８  ｓｃＦｖのＶＨコード配列およびＶＬコード配列を、それぞれ、ヒトＩｇＧ１骨格に分子操作した。抗ＳＳＥＡ−４  ｐ２−７８  ｈＡｂは、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現系を使用して作製し、次いで、プロテインＧセファロースカラムを通して精製した。本発明者らは、クーマシーブルー染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、抗体の純度について検討した（図１３Ａ）。結果は、抗体の純度レベルが、９５％を超えることを示す。その後、本発明者らは、ＥＬＩＳＡを実施して、ｐ２−７８  ｈＡｂの、グロボ系列グリカンに対する結合活性について精査した（図１３Ｂ）。本発明者らは、ｐ２−７８  ｈＡｂは、ＳＳＥＡ−４およびＳＳＥＡ−３には結合するが、Ｇｌｏｂｏ  Ｈには結合しないことを見出し、このことからｐ２−７８のヒトＩｇＧバージョンが、ＳＳＥＡ−４の結合エピトープを認識する、その親ｓｃＦｖバージョンの活性を保持することが裏付けられる。
【０７４８】
本発明者らは、２０３の異なるグリカンを含有するグリカンアレイを使用して、ｐ２−７８  ｈＡｂの特異性をさらに確認した。結果は、ｐ２−７８  ｈＡｂが、ＳＳＥＡ４、シアリル−ＳＳＥＡ４、ＳＳＥＡ４Ｇｃ、およびＧｂ５（ＳＳＥＡ３）を認識することを示した（図１４Ｂ）。興味深いことに、ｐ２−７８  ｈＡｂはまた、ＧｌｏｂｏＨも認識し、ＥＬＩＳＡアッセイからの結果と類似した（図１２）。市販のＩｇＭ抗体であるＭＣ６３１を、陽性対照として使用した（図１４Ａ）。
【０７４９】
ヒト化ＭＣ４８  ｍＡｂの開発
【０７５０】
非ヒト化マウスｍＡｂは、臨床状況では、それらの血清中半減期が短く、ヒトエフェクター機能を誘発することができず、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答をもたらすこと（ＬｏＢｕｇｌｉｏら、１９８９年）を含む、ある特定の制限を有しうる。したがって、ｍＡｂは、それらのＣＤＲを、ヒトＩｇ分子のＶＨ  ＦＲおよびＶＬ  ＦＲにグラフティングすることにより、ヒト化することができる（Ｒｏｇｕｓｋａら、１９９４年）。
【０７５１】
ヒト化ＭＣ４８を開発するため、本発明者らは、ハイブリドーマ細胞に由来するＭＣ４８のＶＨ可変領域およびＶＬ可変領域をシークェンシングした（表４）。ＭＣ４８のＶＨ可変領域およびＶＬ可変領域の、ＮＣＢＩ  ＩｇＢＬＡＳＴデータベースを用いたアラインメントの後で、本発明者らは、ＭＣ４８のＦＲを修飾し、第１、第２、第３、および第４のヒト化ＭＣ４８配列を作り出した（表１７、図１７）。次に、本発明者らは、これらのヒト化ＭＣ４８配列に従い、ファージディスプレイされるｓｃＦｖフォーマットを構築し、作り出した。ヒト化ＭＣ４８ファージクローンの結合活性を決定するため、本発明者らは、ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡをコーティングする固体ベースのＥＬＩＳＡを実行した（図１５および１８）。本発明者らは、ヒト化ＭＣ４８  ｓｃＦｖファージが、ＳＳＥＡ−４を、用量依存的に認識しうることを見出した。データは、第４のヒト化ＭＣ４８  ｓｃＦｖファージが、マウスｍＡｂ  ＭＣ４８と比較して、その結合アフィニティーを維持することを示した。
【０７５２】
（実施例１６）
【０７５３】
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ。
【０７５４】
例示的なヒト化ＭＣ  ４８がＳＳＥＡ−４発現細胞のＣＤＣを媒介する能力を検討する。Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓの乳癌細胞または膵臓癌細胞を、一晩の成長のために９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、その後アッセイした。次いで、細胞を、補体の供給源としてのウサギ血清（１：５希釈；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下で、ＲＰＭＩ中に系列希釈した濃度のヒト化ＭＣ  ４８またはヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と共にインキュベートした。細胞死は、生存度プローブである７−ＡＡＤを添加することにより評価する。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターを使用して、７−ＡＡＤ測定の結果に基づき、比溶解百分率を計算する。抗体は、アイソタイプ対照と比較して、１０μｇ／ｍＬで顕著な殺滅活性を示す。示されるように、ヒト化ＭＣ４８−４は、ＳＳＥＡ−４発現細胞のＣＤＣを首尾よく媒介する。
【０７５５】
（実施例１７）
【０７５６】
材料および方法
【０７５７】
ＭＣ４１、第１のｈＭＣ４１、第２のｈＭＣ４１および第３のｈＭＣ４１ファージクローンの例示的な単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の構築
【０７５８】
ＭＣ４１、第１のｈＭＣ４１、第２のｈＭＣ４１および第３のｈＭＣ４１配列のｓｃＦｖ形態（ＶＨ−ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ−ＶＬ）を遺伝子合成し（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、Ｓｆｉ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で切り出した。ゲル抽出の後、消化された産物を、ｐＣＡＮＴＡＢ−５Ｅファージミド（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にクローニングした。ｈＭＣ４１改変体ファージミドを、ＴＧ１  Ｅ−ｃｏｌｉに形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２％のグルコースを含有する２×ＹＴ培地（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）中に回収し、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（ＮＥＢ）により、３７℃で１時間レスキューした。１，５００×ｇで１０分間の遠心分離の後で、これらのペレットを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２×ＹＴ培地中で、一晩再懸濁させて、ｓｃＦｖファージを作り出した。
【０７５９】
有効性の裏付け：ＥＬＩＳＡによる、ＭＣ４１  ｓｃＦｖファージクローンおよびｈＭＣ４１  ｓｃＦｖファージクローンまたはＩｇＧについての結合アッセイ
【０７６０】
ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡを、ＥＬＩＳＡプレート上、０．２μｇ／ｍｌの濃度でコーティングした。洗浄およびブロッキングの後で、系列希釈されたファージまたはＩｇＧを、ＲＴで１．５時間インキュベートした。洗浄の後で、１：１０００に希釈されたＨＲＰコンジュゲート抗Ｍ１３抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、１：２０００に希釈されたＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体またはＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体を、ＲＴで１時間添加した。次いで、液体基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を発色させ、３ＮのＨＣｌで停止させた。光学密度は、４５０ｎｍで測定した。
【０７６１】
有効性の裏付け：ＭＣ４１のヒト化
【０７６２】
２つのヒト遺伝子ＩＧＨＪ４＊０８およびＩＧＫＶ６−２１＊０２は、ＭＣ４１のＶＨおよびＶＬと最も類似するものであった。したがって、本発明者らは、ＭＣ４１のヒト化のために、これら２つの遺伝子からＦＲを選択する。全てのヒト化ＭＣ４１中のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３は保存した。
【０７６３】
有効性の裏付け：抗ＳＳＥＡ−４ヒト化ＩｇＧの構築および発現
【０７６４】
選択されたｓｃＦｖのＶＨ領域を、ＡｇｅＩ部位およびＮｈｅＩ部位により、ヒト免疫グロブリンガンマ１重鎖のシグナルペプチド領域および定常領域を含有する修飾発現ベクターであるｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−Ｇａｍｍａ１にクローニングした。ヒト化ＭＣ４１のＶＬ領域を、ＡｇｅＩ部位およびＥｃｏＲＶ部位により、ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖のシグナルペプチド領域および定常領域を含有する修飾発現ベクターであるｐ−Ｋａｐｐａ−ＨｕＧｓにクローニングした。両方のプラスミドを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクトし、血清非含有培地中、３７℃で１週間持続的にインキュベートして、ヒト化抗体を作製した。
【０７６５】
有効性の裏付け：抗ＳＳＥＡ−４ヒト化ＩｇＧの精製
【０７６６】
培養培地を回収し、遠心分離し、孔サイズを０．４５μｍとする膜で濾過した。次いで、抗ＳＳＥＡ−４ヒト化ＩｇＧを精製するために、上清を、プロテインＧカラムクロマトグラフィー（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけた。溶離液をＰＢＳにより透析した後で、通例通り、クーマシーブルー染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、抗体について検討した。抗体の濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および分光光度計により評価した。
【０７６７】
有効性の裏付け：グリカンアレイによるｃｈＭＣ４１およびｈＭＣ４１の結合特異性
【０７６８】
グリカンアレイスライドを、１％ＢＳＡで４５分間ブロックし、次いで、系列希釈したｃｈＭＣ４１  ＩｇＧまたはｈＭＣ４１  ＩｇＧと共にＲＴでもう４５分間インキュベートした。洗浄の後で、ロバ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ−Ｆ６７４を、第２の抗体として、ＲＴで４０分間使用した。最後に、スライドを洗浄し、乾燥させ、その後波長６７４ｎｍでスキャンした。
【０７６９】
有効性の裏付け：抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ
【０７７０】
ＨＰＡＣ（５×１０３細胞）膵臓がん細胞を、９６ウェルプレート中に播種し、約８０％コンフルエントになるまで培養した。次いで、これらの細胞を、ＰＢＭＣ（エフェクター、Ｅ）と一緒に、抗体ｃｈＭＣ４１、ｈＭＣ４１、ＭＣ８１３、ＮＨＩｇＧまたはＮＭＩｇＧと共に３７℃で１６時間インキュベートした。処理の後で、ＬＤＨ発現レベルを、ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって検出した。反応を、５６０ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長を用いて蛍光によって読み取った（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５）。
【０７７１】
有効性の裏付け：補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ
【０７７２】
ＨＰＡＣ（５×１０３細胞）膵臓がん細胞系を、約８０％コンフルエントになるまで一晩培養し、抗体ｃｈＭＣ４１、ｈＭＣ４１、ＭＣ８１３、ＮＨＩｇＧまたはＮＭＩｇＧ、およびウサギ補体（２０％）（Ｌｏｗ−Ｔｏｘ−Ｍウサギ補体、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を含有する混合物と、３７℃で１６時間反応させた。次いで、細胞生存度を、ＡＤＣＣアッセイの手順と同じ手順に従って、ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定した。
【０７７３】
有効性の裏付け：ヒト化ＭＣ４１  ｍＡｂの開発
【０７７４】
マウスｍＡｂは、それらの短い血清半減期、ヒトエフェクター機能を誘発できないこと、およびヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答の生成を含む、限定的な臨床使用を有する（ＬｏＢｕｇｌｉｏら、１９８９年）。従って、ｍＡｂは、それらのＣＤＲをヒトＩｇ分子のＶＨおよびＶＬのＦＲにグラフティングすることによってヒト化すべきである（Ｒｏｇｕｓｋａら、１９９４年）。
【０７７５】
ＭＣ４１のＶＨ可変領域およびＶＬ可変領域の、ＮＣＢＩ  ＩｇＢＬＡＳＴデータベースまたはＩＭＧＴデータベースを用いたアラインメント後、本発明者らは、第１、第２および第３のヒト化ＭＣ４１配列を作り出した。次に、本発明者らは、これらのヒト化ＭＣ４１配列に従い、ファージディスプレイされるｓｃＦｖフォーマットを構築し、作り出した。ヒト化ＭＣ４１ファージクローンの結合活性を決定するため、本発明者らは、ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡをコーティングする固体ベースのＥＬＩＳＡを実行した（図１）。本発明者らは、第２および第３のヒト化ＭＣ４１  ｓｃＦｖファージが、ＳＳＥＡ−４を、用量依存的に認識しうるのに対し、第１のＭＣ４１  ｓｃＦｖは、ＳＳＥＡ−４に対する結合活性を喪失することを見出した（図１）。無傷のヒト化ＭＣ４１  ＩｇＧによる結合活性を評価するために、本発明者らは、第１、第２、第３のヒト化ＭＣ４１、およびキメラＭＣ４１（ｃｈＭＣ４１）の無傷のＩｇＧを構築した。ＥＬＩＳＡ結果は、第２および第３のヒト化ＭＣ４１が、用量依存的パターンで、ＳＳＥＡ−４と反応しうるが（図２Ａ）、ＢＳＡとは反応しない（図２Ｂ）ことを示しており、同じ結果がｃｈＭＣ４１について観察された。第２および第３のヒト化ＭＣ４１の結合アフィニティーは、マウスＭＣ４１と比較して維持された。本発明者らは、第２のヒト化ＩｇＧをｈＭＣ４１と命名した。ｃｈＭＣ４１およびｈＭＣ４１の結合特異性を決定するために、グリカンアレイを実施した。キメラＭＣ４１およびヒト化ＭＣ４１は、市販のＳＳＥＡ４抗体（ＭＣ８１３）よりも特異的な結合を示した。これらは、ＳＳＥＡ４またはグリコリル修飾ＳＳＥＡ４のみを認識した（図３）。
【０７７６】
有効性の裏付け：ｃｈＭＣ４１およびｈＭＣ４１のＡＤＣＣおよびＣＤＣ。
【０７７７】
ｃｈＭＣ４１およびｈＭＣ４１のエフェクター機能を裏付けるため、ＡＤＣＣアッセイおよびＣＤＣアッセイを実施した。ＨＰＡＣ膵臓がん細胞系を使用して、ｃｈＭＣ４１、ｈＭＣ４１、陽性対照ＭＣ８１３または陰性対照ＮＨＩｇＧおよびＮＭＩｇＧのＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性を評価した（図４および５）。データは、ｈＭＣ４１のエフェクター機能がｃｈＭＣ４１と類似していることを示した。興味深いことに、ヒト化ＭＣ４１は、その元の活性を維持するだけでなく、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを介した、ＭＣ８１３よりも強いがん細胞殺滅活性もまた示した（図５）。
【０７７８】
参考文献
【０７７９】
ＬｏＢｕｇｌｉｏ，  Ａ．Ｆ．，  Ｗｈｅｅｌｅｒ，  Ｒ．Ｈ．，  Ｔｒａｎｇ，  Ｊ．，  Ｈａｙｎｅｓ，  Ａ．，  Ｒｏｇｅｒｓ，  Ｋ．，  Ｈａｒｖｅｙ，  Ｅ．Ｂ．，  Ｓｕｎ，  Ｌ．，  Ｇｈｒａｙｅｂ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｋｈａｚａｅｌｉ，  Ｍ．Ｂ．  （１９８９）．  Ｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｍａｎ：  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８６，  ４２２０−４２２４．
【０７８０】
Ｒｏｇｕｓｋａ，  Ｍ．Ａ．，  Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，  Ｊ．Ｔ．，  Ｋｅｄｄｙ，  Ｃ．Ａ．，  Ｈｅｎｒｙ，  Ａ．Ｈ．，  Ｓｅａｒｌｅ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｌａｍｂｅｒｔ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ，  Ｖ．Ｓ．，  Ｂｌａｔｔｌｅｒ，  Ｗ．Ａ．，  Ｒｅｅｓ，  Ａ．Ｒ．，  ａｎｄ  Ｇｕｉｌｄ，  Ｂ．Ｃ．  （１９９４）．  Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９１，  ９６９−９７３．
【０７８１】
（実施例１８）
【０７８２】
有効性の裏付け：材料および方法
【０７８３】
ファージディスプレイのバイオパニング手順
【０７８４】
クローン２．５×１０１０個を含有する、ファージディスプレイされたヒトナイーブｓｃＦｖライブラリー（Ｌｕら、２０１１年）から、ＰＥＧコンジュゲートカルボキシルＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、室温（ＲＴ）で１時間、非特異的結合を減算し（ｓｕｂｔｒａｃｔ）、その後、ＳＳＥＡ−４−ＰＥＧを固定化したＤｙｎａｂｅａｄｓと共に、４℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳまたは０．０１％のＴｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ０．０１）による洗浄の後で、ＳＳＥＡ−４−ＰＥＧ−Ｄｙｎａｂｅａｄｓに結合したファージを、Ｅ−ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞での、３７℃で０．５時間の感染により回収した。感染細胞の一部は、所定の力価に系列希釈し、他の細胞は、Ｍ１３ＫＯ７ファージによりレスキューし、増幅した。レスキューされたファージ力価を決定した後で、次のラウンドのバイオパニングを実施した。バイオパニングの第４のラウンドおよび第５のラウンドにおいて、ファージクローンをランダムに選択して、ＥＬＩＳＡスクリーニングのために培養した。
【０７８５】
選択されたファージクローンのＥＬＩＳＡスクリーニング
【０７８６】
抗原認識を検出するために、マイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を、それぞれ、０．２μｇ／ｍｌのＳＳＥＡ−４−ＢＳＡ、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ−ＢＳＡ、ＳＳＥＡ−３−ＢＳＡ、およびＢＳＡでコーティングした。選択されたファージクローンを、３％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中に１：２で希釈し、各ウェルに添加した。プレートを、ＲＴで１時間インキュベートし、ＰＢＳＴ０．１で洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートマウス抗Ｍ１３ファージ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共にインキュベートした。プレートを再度洗浄し、ＯＰＤおよびＨ２Ｏ２を添加した。３ＮのＨＣｌによる反応の終結の後で、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ  ６８０；ＢｉｏＲａｄ）を使用して４９０ｎｍを使用して、吸光度を測定した。本発明者らは、ファージミドを、ＥＬＩＳＡ陽性ファージクローンから抽出して、自動シークェンシングにより、ｓｃＦｖコード領域を同定した。
【０７８７】
有効性の裏付け：抗ＳＳＥＡ−４ヒトＩｇＧの構築および発現
【０７８８】
選択されたｓｃＦｖのＶＨ領域を、ＡｇｅＩ部位およびＮｈｅＩ部位により、ヒト免疫グロブリンガンマ１重鎖のシグナルペプチド領域および定常領域を含有する修飾発現ベクターであるｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−Ｇａｍｍａ１にクローニングした。選択されたｓｃＦｖのＶＬ領域を、ＡｇｅＩ部位およびＥｃｏＲＶ部位により、ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖のシグナルペプチド領域および定常領域を含有する修飾発現ベクターであるｐ−Ｋａｐｐａ−ＨｕＧｓにクローニングした。両方のプラスミドを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクトし、血清非含有培地中、３７℃で１週間持続的にインキュベートして、ヒト抗体を作製した。
【０７８９】
有効性の裏付け：抗ＳＳＥＡ−４ヒトＩｇＧの精製
【０７９０】
培養培地を回収し、遠心分離し、孔サイズを０．４５μｍとする膜で濾過した。次いで、抗ＳＳＥＡ−４ヒトＩｇＧを精製するために、上清を、プロテインＧカラムクロマトグラフィー（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけた。溶離液をＰＢＳにより透析した後で、通例通り、クーマシーブルー染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、抗体について検討した。抗体の濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および分光光度計により評価した。
【０７９１】
有効性の裏付け：ＭＣ４８およびＭＣ４１のヒト化
【０７９２】
ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｑ９ＵＬ７３およびＡＹ５７７２９８の２つのヒト遺伝子は、それぞれ、ＭＣ４８  ＶＨおよびＭＣ４８  ＶＬと最も類似するものであった。本発明者らは、Ｑ９ＵＬ７３遺伝子の修飾フレームワーク（ＦＲ）１〜ＦＲ４からなる第１のヒト化ＭＣ４８（ｈＭＣ４８）ＶＨ、および受託ＡＹ５７７２９８由来の４つのＦＲからなる第１のｈＭＣ４８  ＶＬ、ＰＤＢ由来の１ＹＹ８に従うＶＨによる第２のｈＭＣ４８  ＦＲに対し、第１の配列と同じである第２のｈＭＣ４８  ＶＬ、ならびにＱ９ＵＬ７３遺伝子のＦＲ１、２、および４を修飾する第３のｈＭＣ４８  ＶＨ配列、ならびにヒトＡＹ５７７２９８遺伝子へＦＲ２およびＦＲ４のみを変化させる第３のｈＭＣ４８  ＶＬを含む、３つのＭＣ４８配列をヒト化した。これらのヒト化配列の全ては、ＭＣ４８のＶＨおよびＶＬのうちの、保存されたＣＤＲ１〜ＣＤＲ３であった。他の２つのヒト遺伝子ＩＧＨＪ４＊０８およびＩＧＫＶ６−２１＊０２は、ＭＣ４１のＶＨおよびＶＬと最も類似するものであった。したがって、本発明者らは、ＭＣ４１のヒト化のために、これら２つの遺伝子からＦＲを選択する。全てのヒト化ＭＣ４８およびヒト化ＭＣ４１中のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３は保存した。
【０７９３】
有効性の裏付け：ヒト化ＭＣ４８ファージクローンおよびヒト化ＭＣ４１ファージクローンの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の構築
【０７９４】
ヒト化ＭＣ４８（ｈＭＣ４８）およびヒト化ＭＣ４１（ｈＭＣ４１）配列のｓｃＦｖ形態（ＶＨ−ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ−ＶＬ）を遺伝子合成し（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、Ｓｆｉ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で切り出した。ゲル抽出の後、消化された産物を、ｐＣＡＮＴＡＢ−５Ｅファージミド（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にクローニングした。ｈＭＣ４８およびｈＭＣ４１改変体ファージミドを、ＴＧ１  Ｅ−ｃｏｌｉに形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２％のグルコースを含有する２×ＹＴ培地（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）中に回収し、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（ＮＥＢ）により、３７℃で１時間レスキューした。１，５００×ｇで１０分間の遠心分離の後で、これらのペレットを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２×ＹＴ培地中で、一晩再懸濁させて、ｓｃＦｖファージを作り出した。
【０７９５】
有効性の裏付け：ＥＬＩＳＡによる、ｈＭＣ４８  ｓｃＦｖファージクローンおよびｈＭＣ４１  ｓｃＦｖファージクローンまたはＩｇＧについての結合アッセイ
【０７９６】
ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡを、ＥＬＩＳＡプレート上、０．２μｇ／ｍｌの濃度でコーティングした。洗浄およびブロッキングの後で、系列希釈されたファージまたはＩｇＧを、ＲＴで１．５時間インキュベートした。洗浄の後で、１：１０００に希釈されたＨＲＰコンジュゲート抗Ｍ１３抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、１：２０００に希釈されたＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体またはＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体を、ＲＴで１時間添加した。次いで、液体基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を発色させ、３ＮのＨＣｌで停止させた。光学密度は、４５０ｎｍで測定した。
【０７９７】
有効性の裏付け：グリカンアレイによるｐ２−７８  ｈＡｂ、ｃｈＭＣ４１およびｈＭＣ４１の結合特異性
【０７９８】
グリカンアレイスライドを、１％ＢＳＡで４５分間ブロックし、次いで、系列希釈したｐ２−７８  ｈＡｂ、ｃｈＭＣ４１  ＩｇＧまたはｈＭＣ４１  ＩｇＧと共にＲＴでもう４５分間インキュベートした。洗浄の後で、ロバ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ−Ｆ６７４が、ＲＴで４０分間第２の抗体であった。最後に、スライドを洗浄し、乾燥させ、その後波長６７４ｎｍでスキャンした。
【０７９９】
有効性の裏付け：抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ
【０８００】
ＨＰＡＣ、ＢｘＰＣ３またはＰＬ４５（５×１０３細胞）膵臓がん細胞を、９６ウェルプレート中に播種し、約８０％コンフルエントになるまで培養した。次いで、これらの細胞を、ＰＢＭＣ（エフェクター、Ｅ）と一緒に、抗体ｈＭＣ４８、ｈＭＣ４１またはＮＨＩｇＧと共に３７℃で１６時間インキュベートした。処理の後で、ＬＤＨ発現レベルを、ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって検出した。反応を、５６０ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長を用いて蛍光によって読み取った（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５）。
【０８０１】
有効性の裏付け：補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ
【０８０２】
ＨＰＡＣ、ＢｘＰＣ３またはＰＬ４５（５×１０３細胞）膵臓がん細胞系を、約８０％コンフルエントになるまで一晩培養し、抗体ｈＭＣ４８、ｈＭＣ４１またはＮＨＩｇＧ、およびウサギ補体（１０％および２０％）（Ｌｏｗ−Ｔｏｘ−Ｍウサギ補体、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を含有する混合物と、３７℃で１６時間反応させた。次いで、細胞生存度を、ＡＤＣＣアッセイの手順と同じ手順に従って、ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定した。
【０８０３】
有効性の裏付け：
【０８０４】
ＳＳＥＡ−４に結合するファージディスプレイされたｓｃＦｖの同定
【０８０５】
ＳＳＥＡ−４に結合する抗体を同定するため、本発明者らは、本発明者らによる以前の報告（Ｌｕら、２０１１年）で記載した通りに確立された、２×１０１０のメンバーを含有するファージディスプレイされたヒトナイーブｓｃＦｖライブラリーを使用した。まず、このライブラリーを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ結合性ファージによって取り出し、次いで、ＳＳＥＡ−４−ＰＥＧコンジュゲートＤｙｎａｂｅａｄｓにより、ＳＳＥＡ−４結合性ファージを選択した。バイオパニング時において、本発明者らは、ＰＢＳおよび０．０１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ０．０１）の２つの緩衝液系を使用した。５ラウンドにわたるアフィニティー選択の後、第５のラウンドのファージ回収は、ＰＢＳ系およびＰＢＳＴ０．０１系のそれぞれにおいて、第１のラウンドと比較して約５５倍および約８０倍増大した（図１）。ファージクローンをランダムに選択し、ＥＬＩＳＡにより、ＳＳＥＡ−４結合について調べた（図２）。本発明者らは、ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡには特異的に結合するが、ＢＳＡ対照タンパク質には特異的に結合しない７つのクローンを見出した。８つの個々のクローン全てをシークェンシングすることにより、本発明者らは、顕著に異なるヒトＶＨコード領域およびヒトＶＬコード領域を含有する、２つの固有の抗ＳＳＥＡ−４ファージクローン（ｐ１−５２およびｐ２−７８）を同定した（表１）。
【０８０６】
２つのファージクローンの特異性および結合アフィニティーを検討するため、本発明者らは、ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡ、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ−ＢＳＡ、およびＳＳＥＡ−３−ＢＳＡを含む、グロボ系列グリカンに対する同じファージ力価を使用して、比較ＥＬＩＳＡを実施した（図３）。ｐ２−７８ファージクローンは、ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡおよびＳＳＥＡ−３−ＢＳＡに対する強い結合、ならびにＧｌｏｂｏ  Ｈ−ＢＳＡに対するよりわずかな結合を示した。しかし、本発明者らは、ｐ１−５２ファージクローンの、ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡに対する結合活性は、非常に弱いことを見出した。したがって、本発明者らは、さらなる研究のために、ｐ２−７８クローンに焦点を当てた。
【０８０７】
ＳＳＥＡ−４に対する完全ヒト抗体（ｈＡｂ）を確立するため、本発明者らは、ｐ２−７８  ｓｃＦｖのＶＨコード配列およびＶＬコード配列を、それぞれ、ヒトＩｇＧ１骨格に分子操作した。抗ＳＳＥＡ−４  ｐ２−７８  ｈＡｂは、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現系を使用して作製し、次いで、プロテインＧセファロースカラムを通して精製した。本発明者らは、クーマシーブルー染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、抗体の純度について検討した（図４Ａ）。結果は、抗体の純度レベルが、９５％を超えることを示す。その後、本発明者らは、ＥＬＩＳＡを実施して、ｐ２−７８  ｈＡｂの、グロボ系列グリカンに対する結合活性について精査した（図４Ｂ）。本発明者らは、ｐ２−７８  ｈＡｂは、ＳＳＥＡ−４およびＳＳＥＡ−３には結合するが、Ｇｌｏｂｏ  Ｈには結合しないことを見出し、このことからｐ２−７８のヒトＩｇＧバージョンが、ＳＳＥＡ−４の結合エピトープを認識する、その親ｓｃＦｖバージョンの活性を保持することが裏付けられる。
【０８０８】
本発明者らは、２０３の異なるグリカンを含有するグリカンアレイを使用して、ｐ２−７８  ｈＡｂの特異性をさらに確認した。結果は、ｐ２−７８  ｈＡｂが、ＳＳＥＡ４、シアリル−ＳＳＥＡ４、ＳＳＥＡ４Ｇｃ、およびＧｂ５（ＳＳＥＡ３）を認識することを示した（図５Ｂ）。興味深いことに、ｐ２−７８  ｈＡｂはまた、Ｇｌｏｂｏ  Ｈもわずかに認識し、ＥＬＩＳＡアッセイからの結果と類似した（図３）。市販のＩｇＭ抗体であるＭＣ６３１を、陽性対照として使用した（図５Ａ）。
【０８０９】
有効性の裏付け：ヒト化ＭＣ４８およびＭＣ４１  ｍＡｂの開発
【０８１０】
マウスｍＡｂは、それらの短い血清半減期、ヒトエフェクター機能を誘発できないこと、およびヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答の生成を含む、限定的な臨床使用を有する（ＬｏＢｕｇｌｉｏら、１９８９年）。従って、ｍＡｂは、それらのＣＤＲをヒトＩｇ分子のＶＨおよびＶＬのＦＲにグラフティングすることによってヒト化すべきである（Ｒｏｇｕｓｋａら、１９９４年）。
【０８１１】
ＭＣ４８およびＭＣ４１のＶＨ可変領域およびＶＬ可変領域の、ＮＣＢＩ  ＩｇＢＬＡＳＴデータベースまたはＩＭＧＴデータベースを用いたアラインメント後、本発明者らは、第１、第２、第３および第４のヒト化ＭＣ４８配列、ならびに第１、第２および第３のヒト化ＭＣ４１配列を作り出した。次に、本発明者らは、これらのヒト化ＭＣ４８およびＭＣ４１配列に従い、ファージディスプレイされるｓｃＦｖフォーマットを構築し、作り出した。ヒト化ＭＣ４８およびＭＣ４１ファージクローンの結合活性を決定するため、本発明者らは、ＳＳＥＡ−４−ＢＳＡをコーティングする固体ベースのＥＬＩＳＡを実行した（図６、７および８）。本発明者らは、第３および第４のヒト化ＭＣ４８配列、ならびに第２および第３のヒト化ＭＣ４１  ｓｃＦｖファージが、ＳＳＥＡ−４を、用量依存的に認識しうるのに対し、第１および第２のヒト化ＭＣ４８配列、ならびに第１のＭＣ４１  ｓｃＦｖは、ＳＳＥＡ−４に対する結合活性を喪失することを見出した（図６、７および８）。データは、第４のヒト化ＭＣ４８  ｓｃＦｖファージクローン、および第３のヒト化ＭＣ４１  ｓｃＦｖファージクローンの結合アフィニティーが、マウスｍＡｂ  ＭＣ４８またはＭＣ４１と比較して維持されたことを示した。無傷のヒト化ＭＣ４１  ＩｇＧによる結合活性を評価するために、本発明者らは、第１、第２、第３のヒト化ＭＣ４１、およびキメラＭＣ４１（ｃｈＭＣ４１）の無傷のＩｇＧを構築した。ＥＬＩＳＡ結果は、第２および第３のヒト化ＭＣ４１が、用量依存的パターンで、ＳＳＥＡ−４と反応しうるが（図９Ａ）、ＢＳＡとは反応しない（図９Ｂ）ことを示しており、同じ結果がｃｈＭＣ４１について観察された。本発明者らは、第２のヒト化ＩｇＧをｈＭＣ４１と命名した。ｃｈＭＣ４１およびｈＭＣ４１の結合特異性を決定するために、グリカンアレイを実施した。キメラＭＣ４１およびヒト化ＭＣ４１は、市販のＳＳＥＡ４抗体（ＭＣ８１３）よりも特異的な結合を示した。これらは、ＳＳＥＡ４またはグリコリル修飾ＳＳＥＡ４のみを認識した（図１０）。
【０８１２】
有効性の裏付け：ｈＭＣ４８、ｃｈＭＣ４１およびｈＭＣ４１のＡＤＣＣおよびＣＤＣ試験。
【０８１３】
ｈＭＣ４８、ｃｈＭＣ４１およびｈＭＣ４１のエフェクター機能を調査するため、ＡＤＣＣアッセイおよびＣＤＣアッセイを実施した。ＨＰＡＣ、ＢｘＰＣ３およびＰＬ４５膵臓がん細胞系を使用して、１０μｇ／ｍｌの濃度においてｈＭＣ４８またはＮＭＩｇＧのＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性を評価した（図１１）。さらにＨＰＡＣ細胞を、ｃｈＭＣ４１、ｈＭＣ４１、陽性対照ＭＣ８１３または陰性対照ＮＨＩｇＧで処理した（図１２および１３）。データは、ｈＭＣ４１およびｃｈＭＣ４１のエフェクター機能がｈＭＣ４８より優れていることを示した。興味深いことに、ヒト化ＭＣ４１は、その元の活性を維持するだけでなく、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを介した、ＭＣ８１３よりも強いがん細胞殺滅活性もまた示した（図１３）。
【０８１４】
（実施例１９）
【０８１５】
ＭＣ４１対ＭＣ４８の結合
【０８１６】
ｈＭＣ４１およびｈＭＣ４８のＳＳＥＡ−４への結合能を、ＥＬＩＳＡによって検討した。結果は、ＳＳＥＡ−４へのｈＭＣ４１の結合が、ｈＭＣ４８よりもかなり良かったことを示した。ヒト化ＭＣ４１は、ｈＭＣ４８と比較して、より高い結合最大およびより小さいＫｄ（ｈＭＣ４１およびｈＭＣ４８について、それぞれ０．２μｇ／ｍｌおよび４．６μｇ／ｍｌ）値を有する。
【０８１７】
参考文献
【０８１８】
ＬｏＢｕｇｌｉｏ，  Ａ．Ｆ．，  Ｗｈｅｅｌｅｒ，  Ｒ．Ｈ．，  Ｔｒａｎｇ，  Ｊ．，  Ｈａｙｎｅｓ，  Ａ．，  Ｒｏｇｅｒｓ，  Ｋ．，  Ｈａｒｖｅｙ，  Ｅ．Ｂ．，  Ｓｕｎ，  Ｌ．，  Ｇｈｒａｙｅｂ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｋｈａｚａｅｌｉ，  Ｍ．Ｂ．  （１９８９）．  Ｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｍａｎ：  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８６，  ４２２０−４２２４．
【０８１９】
Ｌｕ，  Ｒ．−Ｍ．，  Ｃｈａｎｇ，  Ｙ．−Ｌ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｍ．−Ｓ．，  ａｎｄ  Ｗｕ，  Ｈ．−Ｃ．  （２０１１）．  Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉ−ｃ−Ｍｅｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３２，  ３２６５−３２７４．
【０８２０】
Ｒｏｇｕｓｋａ，  Ｍ．Ａ．，  Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，  Ｊ．Ｔ．，  Ｋｅｄｄｙ，  Ｃ．Ａ．，  Ｈｅｎｒｙ，  Ａ．Ｈ．，  Ｓｅａｒｌｅ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｌａｍｂｅｒｔ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ，  Ｖ．Ｓ．，  Ｂｌａｔｔｌｅｒ，  Ｗ．Ａ．，  Ｒｅｅｓ，  Ａ．Ｒ．，  ａｎｄ  Ｇｕｉｌｄ，  Ｂ．Ｃ．  （１９９４）．  Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９１，  ９６９−９７３．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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