(57)【要約】  本発明は、乾燥抽出物の重量に対して、没食子酸当量として表される、少なくとも３０重量％のポリフェノール類を含んでなる、トケイソウ種子、特にチャボトケイソウまたはクダモノトケイソウの種子、のポリフェノール抽出物に関する。本発明はまた、この種の抽出物を調製するための方法、それを含有する組成物、およびその化粧料的、皮膚科学的または治療的使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トケイソウ、特にチャボトケイソウまたはクダモノトケイソウ、の種子のポリフェノール抽出物であって、その乾燥抽出物の重量に対して、没食子酸当量として表される少なくとも３０重量％のポリフェノール類と、その乾燥抽出物の重量に対して少なくとも１０重量％の有機酸とを含んでなる、抽出物。
【請求項２】
乾燥抽出物の重量に対して、没食子酸当量として表される少なくとも３５重量％のポリフェノール類、有利には少なくとも４０重量％のポリフェノール類を含んでなる、請求項１に記載の抽出物。
【請求項３】
乾燥抽出物中のポリフェノール類の重量に対して、没食子酸当量として表される前記ポリフェノール類の少なくとも５０重量％がカテキン誘導体である、請求項１または２に記載の抽出物。
【請求項４】
前記有機酸が酢酸、リンゴ酸、クエン酸またはそれらの混合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項５】
水、グリセロール類、グリコール類、およびそれらの混合物から選択される溶媒でのトケイソウ種子の固体／液体抽出によって得られることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項６】
二成分混合物である水／グリセロール、水／グリコール、およびそれらの混合物、有利には水中３０％〜９０％のグリセロールおよび／またはグリコールの割合の混合物、から選択される溶媒でのトケイソウ種子の固体／液体抽出によって得られることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の、トケイソウ種子のポリフェノール抽出物を調製するための方法であって、水、グリセロール類、グリコール類、およびそれらの混合物から選択される溶媒での固体／液体抽出の少なくとも１つの工程を含んでなる、方法。
【請求項８】
以下の連続的工程：
ａ）前記種子を破砕する工程；
ｂ）所望により、好ましくはプレスすることによって、エタノール抽出によってまたは超臨界ＣＯ２抽出によって、前記種子を脱脂する工程；
ｃ）粉砕され、所望によりさらに脱脂された前記種子を、水、グリセロール類、グリコール類、およびそれらの混合物から選択される溶媒で固体／液体抽出する工程；
ｄ）デカンテーションおよび／または遠心分離および／または連続濾過によって固相と液相とを分離する工程；および
ｅ）所望により、工程ｄ）で得られた抽出物を乾燥させる工程
を含んでなることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記固体／液体抽出溶媒が、二成分混合物である水／グリセロール、水／グリコール、およびそれらの混合物、有利には、水中、４０％〜９０％、好ましくは５０％〜９０％、より好ましくは６０％〜８０％、特に７０％、のグリセロールおよび／またはグリコールの割合の混合物、から選択されることを特徴とする、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
有効成分として、請求項１〜６のいずれか一項に記載のトケイソウ種子のポリフェノール抽出物または請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる抽出物と、有利には好適な賦形剤と、を含んでなる、組成物。
【請求項１１】
組成物の総重量に対して、０．００１〜１０重量％、有利には、０．０１〜５重量％の、トケイソウ種子の前記ポリフェノール抽出物を含んでなり、ここで、前記抽出物の重量は乾燥抽出物の重量として表される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
・皮膚および／または粘膜および／または皮膚付属器の障害または病状、有利には、皮膚および／または粘膜および／または皮膚付属器の炎症反応、酸化反応、汚染に関係していてもよいラジカル攻撃に関連する障害、バリアまたはホメオスタシス、老化、特に加齢性および／または光線性の老化、の障害、ならびに／または
・血管障害、ならびに／または
・損傷を受けた脂肪組織：
の予防および／または治療における使用のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抽出物または請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる抽出物または請求項１０もしくは１１に記載の組成物。
【請求項１３】
それらの状態および／または外観を改善するための、皮膚および／または皮膚付属器および／または粘膜の化粧的ケアのための方法であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抽出物または請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる抽出物または請求項１０もしくは１１に記載の化粧用組成物を適用することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トケイソウ、チャボトケイソウ(Passiflora incarnata)またはクダモノトケイソウ(Passiflora edulis）、好ましくはクダモノトケイソウの種子の、特に、ポリフェノールを豊富に含む、抽出物およびそのような抽出物を調製するための方法に関する。本発明はさらに、そのような組成物またはそのような抽出物の化粧料的、皮膚科学的または治療的使用に関する。最後に、本発明は、そのような組成物またはそのような抽出物を適用することにある、皮膚、皮膚付属器または粘膜の化粧的ケアのための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トケイソウ
約５００種のトケイソウ（トケイソウ属）が存在する。これらの種は熱帯、温帯、熱帯の地域、特に、南北アメリカ大陸にしばしば分布しているが、アジア、オーストラリアおよび熱帯アフリカではまれである。
【０００３】
植物学
植物は、低木またはつる性植物の形態である。葉は、互生で、時には単葉、浅裂または掌状である。花は、直径９ｃｍに達することがあり、両性または単性の整正花である。花は、白色と紫色で、キリストの棘の冠に似た糸状の付属物で装飾された薄い花弁を有する。４〜５ｃｍの長さの果物は卵形で、多くの場合、黄色〜橙色である。
【０００４】
最も広く分布している種は、特に、チャボトケイソウおよびクダモノトケイソウである。
【０００５】
植物化学的側面
チャボトケイソウ：主成分はフラボノイドであり、葉に多量に存在する。葉は、特に、高いイソビテキシン含量を含む。葉は高イソビテキシン含量を含み、特に、チャボトケイソウの葉には、少量の単純なインドールアルカロイド（ハルマン、ハルミンなど）、ラフィノース、スクロース、フルクトースおよびグルコースなどの糖類、精油、ならびにこの植物に起因する鎮静性および抗痙攣性の作用に関与する分子として記載されているマルトールも含まれている。
【０００６】
クダモノトケイソウ：特異的な化合物であるパッシフロリン（シクロプロパントリテルペングリコシド）は、乾燥葉のメタノール抽出物から同定されている(E. Bombardelli et al., 1975)。
【０００７】
クダモノトケイソウの葉は、特に、チャボトケイソウ種には見出されないフラボノイドであるイソオリエンチンを含む。これらには、チャボトケイソウ種と同じ微量の精油およびアルカロイドも含まれている。
【０００８】
果実の果肉は、フラボノイド（スカフトシド、イソスカフトシド、イソオリエンチン、オリエンチン、イソビテキシン）、ルテオリン誘導体(M.L. Zeraik, J.H. Yariwake − 2010)、およびアスコルビン酸（約６０ｍｇ／１００ｇ）を含有する。
【０００９】
果肉には、グリコシル化されたシアノゲン誘導体：プルナシン、サンブニグリンおよびアミグダリン、および最近同定された２つのマンデロニトリル−β−ルチノシドも含まれている(D. Chassagne and J. Crouzet, 1998; D.S. Seigler, 2002)。
【００１０】
毒性学
シアノゲン成分は、主に、様々なトケイソウ品種の地上部に含まれる。
【００１１】
種子の特性
種子は、クダモノトケイソウ果実の６〜１２％を構成し、以下を含有する：
・血管弛緩作用および抗酸化作用を有する物質である、ピセアタンノール（レスベラトロールと類似の構造）およびその二量体であるスキルプシンＢを含むポリフェノール類(S. Sano; K. Sugiyama; T. Ito, 2011。
・フィトステロール（０．２％、カンペステロール、スチグマステロール、シトステロール、アベナステロールを含む）；６０％〜７３％リノール酸（オメガ６）、１４％〜２０％オレイン酸および４６５ｐｐｍトコフェロールを含有する油（溶媒抽出後の収率１８％）(G. Piobom, N. Barou et al., 2006; R. de V.V. Lopes et al.)。
・糖類およびタンパク質。
【００１２】
先行技術
食品用途
果実は先史時代から摂取されていたと思われる。１６世紀のペルーでは、優れたトケイソウはすでに治療薬と考えられており、数多くのトケイソウ品種が一般的な治療行為に多くの国でいまだに使用されている
【００１３】
医療用途
トケイソウ（多くの場合、地上部、時に、果実）は、多くの場合、世界中で、抗不安薬、鎮静薬、利尿薬または鎮痛薬として使用されている(“Passiflora: review update. K. Dhawan, S. Dhawan, A. Sharma, 2004”)。マルトールおよび特定のマルトール誘導体はこの鎮静効果に関与している。
【００１４】
この作用は、チャボトケイソウ種でより一定し、より顕著である。
【００１５】
チャボトケイソウ抽出物は、モルヒネ依存を一変させることが可能である。
【００１６】
クダモノトケイソウ果皮メタノール抽出物の抗低血圧効果および繊維が豊富な脱脂種子抽出物のコレステロール低下効果もまた示されている。
【００１７】
腫瘍浸潤、転移および脈管形成に関与するマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ２およびＭＭＰ９）の阻害を介する果実浸出液の抗腫瘍効果もまた示されている(S.S. Patel, 2009)。
【００１８】
皮膚−化粧料用途
ブラジルでは、クサトケイソウ（Ｐ．ｆｏｅｔｉｄａ）の葉は、特に、イソオリエンチンの存在により、炎症性皮膚障害を治療するために局所的に使用されている。モーリシャスおよびロドリゲスでは、ミスミトケイソウ（Ｐ．ｓｕｂｅｒｏｓａ）の葉の浸出液もまた、皮膚状態を治療するために入浴に使用されている。
【発明の開示】
【００１９】
本出願者は、トケイソウ、特にチャボトケイソウまたはクダモノトケイソウ、有利にはクダモノトケイソウ、の種子の抽出物が、これまでに開示されていない化粧料的特性、薬学的特性および皮膚科学的特性を有することを見出した。具体的には、そのようなトケイソウ種子抽出物がそれらの特定の特性に関してそのまま使用されるのはこれが初めてである。
【００２０】
従って、本発明は、トケイソウの種子、特にチャボトケイソウまたはクダモノトケイソウ、より詳細には、クダモノトケイソウ、の種子のポリフェノール抽出物であって、その乾燥抽出物の重量に対して、没食子酸当量として表される少なくとも３０重量％のポリフェノール類を含んでなる抽出物に関する。この含量は、液体抽出物１ｍｌあたり少なくとも３ｍｇのポリフェノール類に相当する。
【００２１】
ポリフェノール含量は、その乾燥抽出物の重量に対して、没食子酸当量として表される。これらのパーセンテージは、フォーリン・チオカルトアッセイによって得られる。
【００２２】
フォーリン・チオカルトアッセイでは、総てのフェノール化合物がフォーリン・チオカルト試薬（市販品）によって酸化される。この試薬は、リンタングステン酸（Ｈ３ＰＷ１２Ｏ４０）およびリンモリブデン酸（Ｈ３ＰＭｏ１２Ｏ４０）の混合物を含んでなり、これがフェノール性物質の酸化中に還元され、タングステン（Ｗ８Ｏ２３）およびモリブデン（Ｍｏ８Ｏ２３）の青色酸化物の混合物となる。得られた青色は約７５０〜７６０ｎｍに最大吸収を有する。これは、酸化されたフェノール化合物の量に比例する。この方法に使用される基準フェノールは没食子酸である(例えば、Singleton et al., Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic−phosphotungstic acid reagents参照）。従って、このアッセイによって得られた結果は、「乾燥抽出物の総重量に対して、没食子酸当量として表される重量％ポリフェノール類」として表される。
【００２３】
従って、ポリフェノール含量は当業者にとって容易に測定可能なパラメーターである。
【００２４】
本発明の抽出物は、有利には、前記乾燥抽出物の総重量に対して、没食子酸当量として表される少なくとも３５重量％のポリフェノール類、すなわち、液体抽出物１ｍｌあたり少なくとも３．５ｍｇのポリフェノール類を含んでなる。
【００２５】
本発明の抽出物は、より有利には、前記乾燥抽出物の総重量に対して、没食子酸当量として表される少なくとも４０重量％のポリフェノール類、すなわち、液体抽出物１ｍｌあたり少なくとも４ｍｇのポリフェノール類を含んでなる。
【００２６】
本発明の抽出物中に存在するポリフェノール類の大部分はカテキン誘導体である。
【００２７】
本発明の意味の範囲内での用語「カテキン誘導体」とは、カテコールとしても知られるカテキンファミリーのフラボノイドを指す。カテキン誘導体は、より詳細には、以下の一般式（Ｉ）の化合物である：
【化１】
2018538332.tif 000002
［式中:
−−−−−は、ＲまたはＳ配置の一重結合であり；
Ｒ１は、ＯＨまたは以下の式（ＩＩ）のガロイル基であり：
【化２】
2018538332.tif 000003
Ｒ２はＨまたはＯＨである］。
【００２８】
カテキン誘導体は、より詳細には、以下からなる群から選択される一般式（Ｉ）の化合物である：
【００２９】
【表１】
2018538332.tif 000004
【００３０】
本発明の抽出物は、有利には、乾燥抽出物の重量に対して、没食子酸当量として表される少なくとも２０重量％、特に少なくとも２４重量％、のカテキン誘導体を含んでなる。従って、本発明の抽出物では、乾燥抽出物中のポリフェノール類の重量に対して、没食子酸当量として表される前記ポリフェノール類の少なくとも５０重量％、特に少なくとも６０重量％、がカテキン誘導体である。
【００３１】
有利には、本発明の抽出物は、乾燥抽出物の重量に対して、少なくとも１０重量％の有機酸、特に、酢酸、リンゴ酸、クエン酸またはそれらの混合物、をさらに含んでなる。
【００３２】
特に有利には、本発明の抽出物は、乾燥抽出物の重量に対して、没食子酸当量として表される少なくとも３０重量％のポリフェノール類と、乾燥抽出物の重量に対して、少なくとも１０重量％の有機酸、特に、酢酸、リンゴ酸、クエン酸またはそれらの混合物、とを含んでなる。
【００３３】
この態様によれば、本発明の抽出物は有機酸が豊富であるという利点を有し、この利点により、高い抗酸化活性、抗キレート活性および／または水和活性が付与される。
【００３４】
本発明の抽出物は、有利には、水、グリセロール類、グリコール類、およびそれらの混合物、から選択される溶媒でのトケイソウ種子の固体／液体抽出によって得られる。
【００３５】
溶媒は、より詳細には、有利には水中、３０％〜９０％、特に４０％〜９０％、好ましくは５０％〜９０％、より好ましくは６０％〜８０％、特に７０％、のグリセロールおよび／またはグリコールの割合の、二成分混合物である水／グリセロール、水／グリコール、およびそれらの混合物、から選択される。
【００３６】
好ましくは、使用される溶媒は、二成分混合物である水／グリセロールまたは水／プロパンジオール、特に水／プロパンジオール、より詳細には水／１，３−プロパンジオール、から選択される。
【００３７】
具体的には、本発明の抽出物は、有利には、得られた乾燥抽出物に対して重量で：
・約４０％のポリフェノール類；
・約１０％の糖類；
・約１１％の果実酸；および
・約５％のタンパク質
を含有する。
【００３８】
具体的には、本発明の抽出物は、イソオリエンチン、オリエンチン、ビテキシンまたはイソビテキシンを含まない。
【００３９】
本発明はまた、乾燥抽出物の重量に対して、没食子酸当量として表される少なくとも３０重量％のポリフェノール類を含んでなる、トケイソウ、特にチャボトケイソウまたはクダモノトケイソウ、有利にはクダモノトケイソウ、の種子のポリフェノール抽出物を調製するための方法であって、水、グリセロール類、グリコール類、およびそれらの混合物から選択される溶媒での固体／液体抽出の少なくとも１つの工程を含んでなる方法に関する。
【００４０】
有利には、本発明のトケイソウ種子ポリフェノール抽出物を調製するための前記方法は、以下の連続的工程：
ａ）前記種子を破砕する工程；
ｂ）所望により、好ましくは、プレス、エタノール抽出またはＣＯ２抽出によって、前記種子を脱脂する工程；
ｃ）粉砕され、所望によりさらに脱脂された前記種子を、水、グリセロール類、グリコール類、およびそれらの混合物から選択される溶媒で固体／液体抽出する工程；
ｄ）デカンテーションおよび／または遠心分離および／または連続濾過によって固相と液相とを分離する工程；および
ｅ）所望により、工程ｄ）で得られた抽出物を乾燥させる工程
を含んでなる。
【００４１】
前記種子を破砕する工程ａ）は、当業者に公知の方法によって、特にナイフミル、ハンマーミルなどを使用して行うことができる。
【００４２】
工程ｃ）では、固体／液体抽出工程は、好ましくは２０℃〜９０℃、特に３０℃〜８０℃、より詳細には４５℃〜７５℃、典型的には７０℃、の温度で行われる。
【００４３】
抽出は、３０分〜４時間、特に１時間〜３時間、有利には約２時間、行われる。
【００４４】
有利には、工程ｃ）で使用される抽出溶媒は、有利には水中、３０％〜９０％、特に４０％〜９０％、好ましくは５０％〜９０％、より好ましくは６０％〜８０％、特に７０％、のグリセロールおよび／またはグリコールの割合の、二成分混合物である水／グリセロール、水／グリコール、およびそれらの混合物から選択される。具体的には、抽出溶媒は、二成分混合物である水／グリセロールまたは水／プロパンジオール、特に水／プロパンジオール、より詳細には水／１，３−プロパンジオール、から選択される。
【００４５】
前記方法の有利な変形では、工程ｃ）の前に、トケイソウ種子を脱脂する。分散させる前に、粉砕した種子を、特にエタノール中で脱脂することができる。脂質の除去によって、抽出および濾過の工程の効果をより良好にすることが可能になる。同様に、かつ、好ましくは、これらの種子の固形油かす、すなわち、溶媒による油の予備抽出から得られた残渣を、例えば、超臨界ＣＯ２技術を用いて、好ましくは機械プレスによって、使用することが可能である。
【００４６】
固相と液相を分離する工程ｄ）は、完全な清澄および微生物学的清浄が達成されるまで、当業者に公知の方法によって、特に、デカンテーション、遠心分離および／または連続濾過、によって行われる。
【００４７】
有利には、本発明のポリフェノール抽出物は、当業者に公知の方法による、乾燥工程ｅ）により安定化することができる。
【００４８】
例えば、乾燥工程は、例えば、マルトデキストリンまたはアラビアガム繊維（Ｆｉｂｒｅｇｕｍ（登録商標）、ＣＮＩ）タイプの添加剤の存在下で行うことができる。添加剤含量は、典型的には、前記抽出物の液体形態で得られた乾燥物質のパーセンテージに対して０％〜８０％の添加剤で変化する。
【００４９】
前記抽出物は、好ましくは凍結乾燥によって乾燥させ、最終粉末を得る。最終粉末は、有利には、前記抽出物の乾燥物質３０〜７０重量％を含んでなり、１００％の残りは凍結乾燥添加剤である。より有利には、最終粉末は、前記抽出物から得られる乾燥物質５０％および凍結乾燥添加剤５０％を含んでなる。
【００５０】
あるいは、本発明の出発原料は、特にプレスすることによって脱脂した、脱脂トケイソウ種子の固形油かすであり得る。これに関連してかつ限定されない例として、本発明のポリフェノール抽出物は、以下の方法によって得ることができる：
ａ’）プレスすることによって脱脂したトケイソウ種子の固形油かすの溶液を、水中１０％乾燥物質の濃度で調製する工程；
ｂ’）７０℃の温度で２時間撹拌しながら固体／液体抽出する工程；
ｃ’）連続濾過により精製する工程；および
ｄ’）除菌濾過過する工程。
【００５１】
本発明の方法によって得られる抽出物は、前の段落に記載のとおり、有利には、乾燥抽出物の重量に対して、没食子酸当量として表される少なくとも３５重量％、より有利には少なくとも４０重量％、のポリフェノール類を含んでなる。
【００５２】
有利には、本発明の方法によって得られる抽出物はまた、乾燥抽出物の重量に対して、少なくとも１０重量％の有機酸、特に、酢酸、リンゴ酸、クエン酸またはそれらの混合物、を含んでなる。
【００５３】
有利には、本発明の方法によって得られる抽出物は、乾燥抽出物の重量に対して、没食子酸当量として表される少なくとも２０重量％、特に少なくとも２４重量％、のカテキン誘導体を含んでなる。従って、本発明の方法によって得られる抽出物では、乾燥抽出物中のポリフェノール類の重量に対して、没食子酸当量として表される少なくとも５０重量％、特に少なくとも６０重量％、のポリフェノール類はカテキン誘導体である。
【００５４】
従って、本発明はまた、トケイソウの種子、特に上述の方法によって得ることができるチャボトケイソウまたはクダモノトケイソウの種子、有利にはクダモノトケイソウの種子、の抽出物に関する。そのような抽出物は、本発明の抽出物に関して上で定義した仕様を満たす。
【００５５】
以下の説明において、表現「本発明の抽出物」とは、上で定義した抽出物そのものまたは上で記載した本発明の方法によって得ることができる抽出物を指す。
【００５６】
本発明はさらに、有効成分として、トケイソウ種子のポリフェノールを豊富に含む本発明の抽出物と、必要に応じて、好適な賦形剤とを含んでなる組成物に関する。本発明の抽出物は、上の段落で定義した通り、前記抽出物そのものに関し、さらに本発明の方法によって得ることができる抽出物に関するものである。
【００５７】
本発明の組成物は、有利には、その組成物の総重量に対して、０．００１〜１０重量％、有利には０．０１〜５重量％、の、本発明のトケイソウ種子の前記ポリフェノール抽出物を含んでなり、その抽出物の重量は乾燥抽出物として表される。
【００５８】
この組成物は、有利には化粧用、医薬用または皮膚科用である。前記組成物は、好ましくは外部局所経路を介して投与されるように処方される。
【００５９】
本発明の組成物は、１種以上の他の有効成分をさらに含んでなり得る。
【００６０】
本発明の組成物は、局所投与に好適な様々な調製物として処方することができる。
【００６１】
具体的には、局所組成物は、特に、クリーム、エマルション、ミルク、軟膏、ローション、油、水性または水−アルコール性もしくはグリコール性の溶液、粉末、パッチ、スプレー、シャンプー、ワニスまたは任意の他の外用製品であり得る。
【００６２】
本発明の組成物は、その（化粧料的、皮膚科学的または薬学的）性質に応じて、少なくとも１種の化粧料上、薬学上または皮膚科学上許容される賦形剤をさらに含み得る。特に、本発明の組成物は、界面活性剤、増粘剤、防腐剤、香料、染料、ケミカルまたはミネラルフィルター、水和剤、温泉水などから選択される、当業者に公知の少なくとも１種の化粧料上、薬学上または皮膚科学上許容される助剤をさらに含み得る。当業者は、それらの一般的な知識に基づいて、本発明の組成物の処方物を適合させることができる。
【００６３】
本発明の組成物の最適な投与様式、投薬スケジュールおよび投与形は、例えば、患者または動物の年齢または体重、一般的健康状態、処置に対する耐性および肌質、ならびに観察される副作用などの、患者または動物に適合した薬学的、皮膚科学的または化粧料的処置の確立において一般的に考慮される基準に従って、決定することができる。
【００６４】
本発明はまた、皮膚および／または粘膜および／または皮膚付属器の状態または疾患、有利には、皮膚および／または粘膜および／または皮膚付属器の、炎症反応、酸化反応、汚染に関係していてもよいラジカル攻撃に関連する障害、バリアまたはホメオスタシス、老化、特に加齢性および／または光線性の老化、の障害の予防および／または治療における使用のための本発明の抽出物または本発明の組成物に関する。
【００６５】
本発明はまた、血管障害および／または損傷を受けた脂肪組織の予防および／または治療における使用のための本発明の抽出物または本発明の組成物に関する。
【００６６】
本発明はまた、皮膚および／または粘膜および／または皮膚付属器の障害または病状、有利には、皮膚および／または粘膜および／または皮膚付属器の、炎症反応、酸化反応、汚染に関係していてもよいラジカル攻撃に関連する障害、バリアまたはホメオスタシス、老化、特に加齢性および／または光線性の老化、の障害の予防および／または治療のための化粧用、医薬用または皮膚科用組成物の製造における、本発明のトケイソウ種子抽出物または本発明の組成物の使用に関する。
【００６７】
本発明はまた、血管障害および／または損傷を受けた脂肪組織の予防および／または治療のための化粧用、医薬用または皮膚科用組成物の製造における、本発明のトケイソウ種子抽出物または本発明の組成物の使用に関する。
【００６８】
本発明はさらに、皮膚および／または粘膜および／または皮膚付属器の障害または病状、有利には、皮膚および／または粘膜および／または皮膚付属器の、炎症反応、酸化反応、汚染に関係していてもよいラジカル攻撃に関連する障害、バリアまたはホメオスタシス、老化、特に加齢性および／または光線性の老化、の障害を予防および／または治療するための方法であって、それを必要とする対象への、本発明のトケイソウ種子抽出物または本発明の組成物の有効量の投与、特に局所投与、を含んでなる方法に関する。
【００６９】
本発明はさらに、血管障害および／または損傷を受けた脂肪組織を予防および／または治療するための方法であって、それを必要とする対象への、本発明のトケイソウ種子抽出物または本発明の組成物の有効量の投与、特に局所投与、を含んでなる方法に関する。
【００７０】
具体的には、本発明の組成物または抽出物は、未成熟、正常または成熟／加齢に関わらず、皮膚、皮膚付属器（髪および爪）および／または粘膜（歯茎、歯周組織、生殖器粘膜）の、炎症反応、酸化反応、汚染、紫外線放射、タバコなどの環境ストレスに関係しているラジカル攻撃に関連する障害、バリアまたはホメオスタシス、老化、特に加齢性および／または光線性の老化、の障害の予防および／または治療を目的とする。
【００７１】
特に、本発明の組成物または抽出物は、紫外線放射および／または重金属などの汚染物質への曝露によって引き起こされる炎症反応および／またはラジカル反応に関連するか、または内因性反応に関連し、その結果、促進老化、バリアの障害、血管障害、しみなどを生じる障害の予防および／または治療を目的とする。
【００７２】
特に、本発明の組成物または抽出物は、皮膚老化、特に加齢性および／または光線性の老化に対抗することを目的とする。
【００７３】
具体的には、本発明の抽出物は、汚染防止の化粧用剤として使用されることを目的とする。
【００７４】
表現「汚染防止の化粧用剤」とは、オゾンおよび有機燃焼残渣などの有毒ガスによって生じる障害または病状を予防、軽減および／または排除するために皮膚およびケラチン物質を保護する薬剤を指す。具体的には、汚染防止の化粧用剤は、抗酸化活性および抗ラジカル活性を有する。ここでの汚染は、特に大気汚染（オゾンなど）、屋外汚染物質（例えば、二酸化窒素、一酸化炭素、二酸化硫黄、アンモニア、多環式芳香族炭化水素などの揮発性有機化合物（例えば、ベンゾ−α−ピレン））、屋内汚染物質（例えば、揮発性有機化合物、塗料残渣、生物学的汚染物質、タバコの煙、調理煙、建設資材、家庭清掃または木材処理製品）、である。
【００７５】
上述の皮膚障害または病状は、より詳細には、血管障害、アトピー性皮膚炎、湿疹、刺激性皮膚炎、過敏性皮膚、反応性皮膚、しみのある皮膚、皮膚紅斑、加齢または光加齢皮膚、日光過敏性皮膚、日焼けおよびあらゆる種類の光線による炎症である。
【００７６】
本発明はまた、それらの状態および／または外観を改善するための、皮膚および／または皮膚付属器および／または粘膜の化粧的ケアのための方法であって、有利には、外部局所経路を介して、本発明の組成物または抽出物を適用することにある方法に関する。
【００７７】
本発明は、その老化を予防するための、皮膚の化粧的ケアのための方法であって、本発明の組成物または抽出物を皮膚に適用することにある方法に関する。
【００７８】
本発明はまた、汚染の影響から生物を保護するための化粧料的処置方法であって、本発明の抽出物または組成物を、特に化粧料上有効な量で、皮膚および皮膚付属器に適用することにある方法に関する。
【００７９】
以下の実施例により本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】本発明の抽出物によるＮｒｆ２活性化のパーセンテージを示す。
【図２】ＢａＰで処理した皮膚外植片におけるクローディン−４免疫染色を示す（プロトコール１）
【図３】ＢａＰ＋ニコチンで処理した皮膚外植片におけるフィラグリン免疫染色を示す（プロトコール２）
【図４】ＢａＰ＋ニコチンで処理した皮膚外植片におけるロリクリン免疫染色を示す（プロトコール２）
【図５】ＢａＰ＋ニコチンで処理した皮膚外植片におけるコラーゲン−Ｉ免疫染色を示す（プロトコール２）
【図６】ＢａＰで処理した皮膚外植片におけるエラスチン免疫染色を示す（プロトコール１）
【図７】ＢａＰで処理した皮膚外植片におけるフィブロネクチン免疫染色を示す（プロトコール１）
【図８】処置した正常ヒトケラチノサイトの電気泳動後のコメットアッセイの外観を示す。図８Ａは陰性対照サンプルに対応し、図８ＢはＵＶ対照サンプルに対応し、図８Ｃは０．００１％の本発明の抽出物に対応する。
【図９】調査した被験者におけるＴ０およびＴ２８時点での重金属含量の変化を示す。
【図１０】プラセボを受けた被験者または活性薬剤を受けた被験者におけるＴ０およびＴ２８時点での、ＭＤＡ（図１０Ａ）、カタラーゼおよびＳＯＤ（図１０Ｂ）の含量をＵ／タンパク質１ｍｇとして表した変化を示す。
【図１１】プラセボを受けた被験者または活性薬剤を受けた被験者におけるＴ０およびＴ２８時点でのカルボニル化タンパク質含量の変化を示す。図１１Ａは、棒グラフであり、図１１Ｂは、カルボニル化タンパク質の蛍光染色を行った細胞層の写真を示す。定量は、その後、画像解析によって行われる。
【実施例】
【００８１】
実施例１：本発明の抽出物
ポリフェノール抽出物は、以下の方法に従って得られる：
ａ）プレスすることによって脱脂し、破砕したクダモノトケイソウ種子の固形油かす（１０％乾燥物質）の溶液を、７０：３０（ｗ／ｗ）１，３−プロパンジオール／水混合物で調製する工程；
ｂ）７０℃で２時間撹拌しながら抽出する工程；
ｃ）粗濾過により残留植物を除去する工程；および
ｄ）さらなる除菌濾過過を含む濾過によって得られた抽出物を精製する工程。
【００８２】
このようにして得られた液体ポリフェノール抽出物は、以下の特徴（乾燥抽出物の％）を有する：
・乾燥抽出物（乾燥室）：０．９％（ｍ／ｍ）
・総ポリフェノール含量（分光光度法による−没食子酸当量単位）：４３％
・カテキン誘導体含量（ＨＰＬＣによる−没食子酸当量単位）：２２．３％
・リンゴ酸含量（酵素キットによる）：５．４％
・クエン酸含量（酵素キットによる）：３．７％
・タンパク質含量（ケルダールによる×６．２５）：４．５％
【００８３】
実施例２：本発明の抽出物
ポリフェノール抽出物は、以下の方法に従って得られる：
ａ）脱脂せずに破砕したクダモノトケイソウ種子１３．３％の溶液を、７０：３０  １，３−プロパンジオール／水混合物で調製する工程；
ｂ）７０℃で２時間撹拌しながら抽出する工程；
ｃ）粗濾過により残留植物を除去する工程；および
ｄ）さらなる除菌濾過過を含む濾過によって得られた抽出物を精製する工程。
【００８４】
このようにして得られた液体ポリフェノール抽出物は、以下の特徴（乾燥抽出物の％）を有する：
・乾燥抽出物（乾燥室）：１．０７％（ｍ／ｍ）
・総ポリフェノール含量（分光光度法による−没食子酸当量）：４０％
・タンパク質含量（ケルダール×６．２５）：５．７％
【００８５】
実施例３：本発明の抽出物の生物学的活性
１．生物学的可能性
本発明の抽出物の生物学的可能性を、正常ヒト繊維芽細胞（ＮＨＦ）およびメラニン化再構成ヒト表皮において、遺伝子発現調節試験を用いて調べた。
【００８６】
従って、表皮（バリア、色素沈着、炎症など）および真皮（瘢痕化、弾力性、堅さなど）の様々な生理学的経路に関与する４６個の遺伝子の発現をＰＣＲアレイによって研究した。
【００８７】
材料および方法：
正常ヒト繊維芽細胞（ＮＨＦ）およびメラニン化再構築表皮を、ＮＨＦに対して０．００２％および０．０５％（ｗ／ｖ）または再構築表皮に対して０．００２％および０．００５％（ｗ／ｖ）の、実施例１で得た本発明の抽出物の存在下で、かつＮＨＦに関しては２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−β１の存在下または再構築表皮（試験の検証のための対照）に関しては１ｎＭビタミンＤ３の存在下で２４時間インキュベートした。
【００８８】
処理の終わりに、ＲＮＡを抽出し、表皮および真皮の重要な機能を標的とするＴａｑＭａｎアレイを用いてｑＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現を解析した。
【００８９】
結果および結論：
結果を下の表２および３に示し、特に、本発明の抽出物は、特定のマーカーの遺伝子発現を変化させるが、以下の活性において特に重要であることを示している：
・真皮細胞外マトリックスのホメオスタシスおよび構造（↓ＭＭＰ３）；および
・表皮真皮接合部（↑ＬＡＭＣ２）。
【００９０】
より詳細には、本発明の抽出物のポリフェノール類は、抗酸化防御およびホルミシス現象に関与する遺伝子発現の調節を可能にした（↑ＨＭＯＸ１、ＦＴＬおよびＧ６ＰＤ）。
【００９１】
これは、本発明の抽出物が抗酸化活性、抗ラジカル活性および老化防止活性を有することを示している。
【００９２】
【表２】
2018538332.tif 000005
【００９３】
【表３】
2018538332.tif 000006
【００９４】
２．ホルメシスおよび細胞解毒の誘導に関する活性
ホルメシス分子（またはホルメチン）は、二相性効果、すなわち、低用量での有益な効果と高用量での逆の効果とを有する物質である（例えば、酸化促進剤または酸化防止剤）。ホルメチンはまた、生物に対する軽度ストレスの影響を再現するが、代わりに、細胞が今後の攻撃から身を守ることを可能にし、それによって、様々な加齢性疾患（癌）または身体現象（皮膚老化、治癒不良など）または有害な環境影響（紫外線放射、汚染など）から生物を保護することを可能にする分子であるとも記載されている。
【００９５】
以下の解析は、本発明の抽出物のホルメシスおよび細胞解毒の誘導に関する活性の研究を可能にした。
【００９６】
Ａ−転写因子Ｎｒｆ２の転座の活性化：
本発明の抽出物の効果を、ホルメシス応答および生物の特定の解毒経路に関与するカスケードの前駆体であるＮｒｆ２の転座の活性化に関して評価した。
【００９７】
材料および方法
Ｎｒｆ２およびルシフェラーゼ（レポーター遺伝子）の活性化のための特異的プラスミドである抗酸化剤応答エレメント（ＡＲＥ）プラスミドＮＱＯ１を含有するＡＲＥ−ルシフェラーゼ−トランスフェクトＨａＣａＴケラチノサイトを、実施例１で得た本発明の抽出物を０．０１％〜０．０００５％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で用いて、および陽性参照である２０μＭ  ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノンを用いて３７℃で６時間処理した。
【００９８】
処理の終わりに、細胞単層を溶解し、ルシフェラーゼ活性を、ＰＲＯＭＥＧＡ製の「ルシフェラーゼアッセイキット」を用いてアッセイし、各溶解物のタンパク質含量を、ブラッドフォード法（ＢｉｏＲａｄ）を用いてアッセイする。
【００９９】
結果および結論
得られた結果を表４および図１に示す。これらの結果は、本発明の抽出物が核内のＮｒｆ２活性の増加を誘導し、従って、核膜を介したＮｒｆ２の転座を誘導したことを示しており、この転写因子の活性化が示される。
【０１００】
これは、本発明の抽出物が抗酸化活性、抗ラジカル活性および老化防止活性を有することを示している。
【０１０１】
【表４】
2018538332.tif 000007
【０１０２】
Ｂ−ホルメシスおよび細胞解毒の主要なマーカーの遺伝子発現。
本発明の抽出物の効果を、ホルメシス経路および細胞解毒に関与する様々なマーカーの遺伝子発現に関して研究した。
【０１０３】
材料および方法：
正常ヒト繊維芽細胞を、０．００５％および０．００２％（ｗ／ｖ）の、実施例１で得た本発明の抽出物を用いて３７℃で６時間、２４時間および４８時間処理した。
【０１０４】
処理の終わりに、ホルメシスのマーカー（ＨＭＯＸ１、ＦＴＬ、Ｇ６ＰＤおよびＮｒｆ２）および細胞解毒に関与するマーカー（ＳＯＤ１およびカタラーゼ）の遺伝子発現を定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより解析し、ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ（ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対して正規化した。
【０１０５】
結果を、一元ＡＮＯＶＡに続いてダネット検定により統計解析した（ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭバージョン５．０２ソフトウェア、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、カリフォルニア州、ＵＳＡ）。
【０１０６】
結果：
得られた結果を表５に示す。これらの結果は、本発明の抽出物が、６時間および２４時間でＨＭＯＸ１の遺伝子発現を有意に刺激し、３つの時間でＦＴＬの遺伝子発現を有意に刺激し、６時間および２４時間でＧ６ＰＤの遺伝子発現を有意に刺激し、２４時間でＳＯＤ１の遺伝子発現を有意に刺激し、２４時間および４８時間でＮｒｆ２の遺伝子発現を有意に刺激し、２４時間でカタラーゼの遺伝子発現を有意に刺激したことを示している。
【０１０７】
これは、本発明の抽出物が抗酸化活性、抗ラジカル活性および老化防止活性を有することを示している。
【０１０８】
【表５】
2018538332.tif 000008
【０１０９】
Ｃ−ヘムオキシゲナーゼの産生：
本発明の抽出物を、ヘムオキシゲナーゼのタンパク質発現に関して解析した。
【０１１０】
材料および方法：
正常ヒト繊維芽細胞を、０．００２％および０．００５％（ｗ／ｖ）の、実施例１で得た本発明の抽出物を用いて、および５μＭおよび１０μＭクルクミン（参照ホルメチン）を用いて２４時間処理した。
【０１１１】
処理の終わりに、細胞内ヘムオキシゲナーゼ１（またはＨＭＯＸ１またはＨＯ１）を、ＥＬＩＳＡ技術を用いて定量した。対象となるマーカーの量に比例する染色を、光学濃度（ＯＤ）を４５０ｎｍで読み取ることによって測定し、得られた値は、ＢＣアッセイ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）を用いたタンパク質アッセイによって得られた細胞の量に関連していた。
【０１１２】
結果を、一元ＡＮＯＶＡに続いてダネット検定により統計解析した（ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭバージョン５．０２ソフトウェア、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、カリフォルニア州、ＵＳＡ）。
【０１１３】
結果：
得られた結果を表６に示す。これらの結果は、本発明の抽出物がクルクミンと同じ強度でヘムオキシゲナーゼ１の産生を誘導することを示している。この結果により、この同じマーカーの遺伝子発現の研究中に本発明者らが観察した本発明の抽出物の作用が確認される。
【０１１４】
これは、本発明の抽出物が抗酸化活性、抗ラジカル活性および老化防止活性を有することを示している。
【０１１５】
【表６】
2018538332.tif 000009
【０１１６】
Ｄ−Ｎｒｆ２  ｓｉＲＮＡ条件下でのヘムオキシゲナーゼの産生：
本発明の抽出物によるヘムオキシゲナーゼ活性化経路が実際にＮｒｆ２の活性化を通るかどうかを検証するために、ヘムオキシゲナーゼの産生を誘導する可能性を、Ｎｒｆ２発現が遮断される系（低分子干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）において確認した。
【０１１７】
材料および方法：
正常ヒト繊維芽細胞を、Ｎｒｆ２  ｓｉＲＮＡおよびスクランブルｓｉＲＮＡ（作用しない対照ｓｉＲＮＡ）を用いて２４時間前処理し、その後、各前条件で、０．００５％（ｗ／ｖ）の、実施例１で得た本発明の抽出物を用いて２４時間前処理した。
【０１１８】
処理の終わりに、細胞内ヘムオキシゲナーゼ１（またはＨＭＯＸ１）を、ＥＬＩＳＡ技術を用いて定量した。対象となるマーカーの量に比例する染色を、光学濃度（ＯＤ）を４５０ｎｍで読み取ることによって測定した。
【０１１９】
結果を、一元ＡＮＯＶＡに続いてテューキー検定により統計解析した（ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭバージョン５．０２ソフトウェア、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、カリフォルニア州、ＵＳＡ）。
【０１２０】
結果：
得られた結果を表７に示す。これらの結果は、Ｎｒｆ２経路が部分的に遮断される場合（Ｎｒｆ２  ｓｉＲＮＡ）に、本発明の抽出物によって誘導されるＨＭＯＸ１産生の刺激が実質的に減少する（−６２％、ｐ＜０．００１）ことを示している。
【０１２１】
従って、ヘムオキシゲナーゼの産生に対する本発明の抽出物の活性は実際にＮｒｆ２経路を通る。
【０１２２】
これは、本発明の抽出物が抗酸化活性、抗ラジカル活性および老化防止活性を有することを示している。
【０１２３】
【表７】
2018538332.tif 000010
【０１２４】
Ｅ−活性酸素種（ＲＯＳ）の産生に対する効果：
活性酸素種のＨ２Ｏ２誘導に関する本発明の抽出物の抗酸化能力を研究した。
【０１２５】
材料および方法:
Ｈ２ＤＣＦ−ＤＡプローブの取り込み（６０分間のインキュベーション）の前に、正常ヒトケラチノサイトを、０．００２％、０．００５％および０．０１％（ｗ／ｖ）の、実施例１で得た本発明の抽出物の存在下、または５００μＭビタミンＣおよび１０μＭクエルセチン（参照酸化防止剤）の存在下で２４時間インキュベートした。
【０１２６】
次いで、ケラチノサイトを１００μＭ過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）で２０分間刺激し、活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を蛍光の測定によって評価した。
【０１２７】
結果を、一元ＡＮＯＶＡに続いてテューキー検定により統計解析した（ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭバージョン５．０２ソフトウェア、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、カリフォルニア州、ＵＳＡ）。
【０１２８】
結果：
得られた結果を表８に示す。これらの結果は、本発明の抽出物が、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）がもたらす酸化ストレスに応答したケラチノサイトによるＲＯＳの産生を有意に阻害したことを示している。この抗酸化活性のレベルは２つの対照酸化防止剤（ビタミンＣおよびクエルセチン）のレベルと同等である。
【０１２９】
これは、本発明の抽出物が抗酸化活性、抗ラジカル活性および老化防止活性を有することを示している。
【０１３０】
【表８】
2018538332.tif 000011
【０１３１】
３．汚染の有害な影響からの保護
上記の結果は、本発明の抽出物が、転写因子Ｎｒｆ２の転座の活性化を介してヘムオキシゲナーゼ１の産生を刺激することを示した。その結果、本発明の抽出物は、Ｈ２Ｏ２ストレスによってもたらされるＲＯＳ生成の減少を介して、抗酸化細胞保護を可能にした。
【０１３２】
本発明の抽出物は皮膚防御の刺激を可能にするため、本発明者らは、様々な環境ストレス、この場合では、汚染に関してそれらの保護効果を評価した。
【０１３３】
Ａ−酸化ストレスに対する効果：
材料および方法：
Ｈ２ＤＣＦ−ＤＡプローブの取り込み（４５分間のインキュベーション）の前に、正常ヒトケラチノサイトを、０．００２％（ｗ／ｖ）の、実施例１で得た本発明の抽出物、５００μＭビタミンＣおよび１０μＭクエルセチン（参照酸化防止剤）を用いて、１０μＭクルクミン（参照ホルメチン）または１０μＭレスベラトロールを用いて２４時間処理した。
【０１３４】
次いで、ケラチノサイトを９μｇ／ｍｌベンゾ−α−ピレン（ＢａＰ）で２０分間刺激した。
【０１３５】
ＲＯＳ産生を蛍光の測定によって評価した。
【０１３６】
結果の有意性はスチューデントのｔ検定によって検証した。
【０１３７】
結果および結論：
得られた結果を表９に示す。これらの結果は、０．００２％の本発明の抽出物が６μｇ／ｍｌおよび９μｇ／ｍｌ  ＢａＰによってもたらされる酸化ストレスに応答したケラチノサイトによるＲＯＳ産生を阻害したことを示している。
【０１３８】
よって、本発明の抽出物は、汚染がもたらす酸化ストレスに対して保護効果を発揮する。従って、本発明の抽出物は、抗酸化活性、抗ラジカル活性、汚染防止活性および老化防止活性を有する。
【０１３９】
【表９】
2018538332.tif 000012
【０１４０】
Ｂ−皮膚構造の保護：
汚染の有害な影響から皮膚（真皮および表皮）の完全性を保護する本発明の抽出物の能力を、ヒト皮膚外植片に関して研究した。
【０１４１】
材料および方法：
４５歳の女性からのヒト皮膚外植片を、３％の、実施例１で得た本発明の抽出物を含有する化粧品処方または含有しない化粧品処方（プラセボ）を局所適用することにより２４時間前処理した。
【０１４２】
次に、プロトコール１ではベンゾ−α−ピレン（ＢａＰ、２０μＭ）またはプロトコール２ではＢａｐ＋ニコチン（２０μＭ）の存在下で化粧品処方で再度前記外植片を処理した。
【０１４３】
様々な皮膚構造マーカーの免疫染色を行った。
【０１４４】
結果および結論：
得られた結果を図２〜７に示す。
【０１４５】
ＢａＰ±ニコチンによって引き起こされる汚染を模倣するストレスは、研究した構造マーカーの発現の変化をもたらした。
【０１４６】
これらの条件下で、本発明の抽出物は以下の表皮マーカー：
・クローディン４（密着結合／バリア機能のマーカー）、
・フィラグリン（バリア機能のマーカーおよび天然水和因子の前駆体）、および
・ロリクリン（細胞分化／バリア機能に関与するマーカー）；
および真皮マーカー：
・コラーゲンＩ（皮膚の堅さに関与するマーカー）、
・エラスチン（皮膚弾力性に関与するマーカー）、および
・フィブロネクチン（真皮構造に関与するマーカー）
を保護した。
【０１４７】
これらの結果は、表皮の構造的完全性およびそのバリア機能の真の保護効果、ならびに真皮の正常構造の維持、それに従って、環境汚染からの全体的な皮膚保護効果を示す。
【０１４８】
従って、本発明の抽出物は、抗酸化活性、抗ラジカル活性、汚染防止活性および老化防止活性を有する。
【０１４９】
Ｃ−オゾンストレスに対する解毒活性の評価
オゾンストレスに対する本発明の抽出物の保護能力および解毒能力を再構築表皮に関して評価した。
【０１５０】
材料および方法：
再構築ヒト表皮（ＲＨＥ）を、３％の、実施例１で得た本発明の抽出物を含有する化粧品処方または含有しない化粧品処方（プラセボ）を局所適用することにより２４時間前処理した。
【０１５１】
次に、０．５〜１ｐｐｍのオゾンを用いて表皮をストレスに供した。
【０１５２】
解毒酵素であるカタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ）およびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の酵素活性を、熱量測定（ＳＯＤおよびＧＰＸ）または蛍光（カタラーゼ）ＥＬＩＳＡ法によって定量した。
【０１５３】
脂質過酸化は、ＧＣによって行われるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）アッセイによって評価した。
【０１５４】
ＤＮＡ酸化は、比色法によって行われる８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）アッセイによって評価した。
【０１５５】
結果を、一元ＡＮＯＶＡに続いてテューキー検定により統計解析した（ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭバージョン５．０２ソフトウェア、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、カリフォルニア州、ＵＳＡ）。
【０１５６】
結果および結論:
オゾンストレスによる酵素カタラーゼ、ＳＯＤおよびＧＰＸの過剰活性化；この増加は、オゾンがもたらす酸化ストレスを示す。
【０１５７】
これらの条件下で、本発明の抽出物は、この過剰活性化を有意に阻害した。
【０１５８】
オゾンストレスの不在（基本条件）下では、本発明の抽出物は、解毒酵素の活性の阻害を誘導しない。これにより、それは、実際に、誘導されるストレスに対する保護効果であり、細胞の解毒系の阻害ではないことが確認される
（表１０、１１および１２）。
【０１５９】
オゾンストレスは酸化的損傷を誘導し、８−ＯＨｄＧおよびＭＤＡの増加として表される。
【０１６０】
本発明の抽出物は、８−ＯＨｄＧおよびＭＤＡの産生を有意に阻害することによって、オゾンストレスによってもたらされる酸化的損傷から細胞成分を有意に保護する。
（表１３および１４）。
【０１６１】
【表１０】
2018538332.tif 000013
【０１６２】
【表１１】
2018538332.tif 000014
【０１６３】
【表１２】
2018538332.tif 000015
【０１６４】
【表１３】
2018538332.tif 000016
【０１６５】
【表１４】
2018538332.tif 000017
【０１６６】
４．日光に関連した有害な効果からの保護
紫外（ＵＶ）線および赤外（ＩＲ）線は、様々な深度まで皮膚に浸透し、とりわけ、皮膚の堅さの低下および放出されるフリーラジカルの量の増加の原因となり、それによって、早期の皮膚老化をもたらす。また、このような光線は、黒色腫の形成および皮膚免疫抑制の原因ともなる。
【０１６７】
ＵＶまたはＩＲがもたらすストレスに対する本発明の抽出物の保護効果を研究した。
【０１６８】
Ａ−ＵＶによるＤＮＡ損傷からの保護（コメットアッセイ）：
紫外線放射に関する細胞の核完全性の維持を、コメットアッセイを用いて試験した。
【０１６９】
材料および方法：
正常ヒトケラチノサイトを、０．００１％（ｗ／ｖ）の、実施例１で得た本発明の抽出物を用いて２時間処理した。
【０１７０】
コメットアッセイは、１９８８年に「Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．」によって記載され、１９９１年に「Ｍｅｏ  ｅｔ  ａｌ．」によって記載された方法に従って行われ、真夏の１〜３分の日光暴露に相当する４．５Ｊ／ｃｍ２の光（０．２８Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡ；０．０８Ｊ／ｃｍ２のＵＶＢおよび４．１４Ｊ／ｃｍ２の可視光）を細胞に照射することにある。これに続いて、アガロースゲル電気泳動を用いたＤＮＡ移動が行われる。
【０１７１】
相対値χ２  ＯＴＭは、Ｓｙｓｔａｔソフトウェアを用いて計算され、この値は、コメットの大きさに正比例し、従って、紫外線放射に対する活性薬剤の保護の程度に正比例する。
【０１７２】
結果の有意性は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔソフトウェア（バージョン１１．０、Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、シカゴ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いた分散分析によって検証した。
【０１７３】
結果および結論：
結果を表１５および図８に示す。
【０１７４】
これらの結果は、０．００１％の本発明の抽出物が、ＵＶ照射によるＤＮＡ損傷に関してケラチノサイトを保護したことを示している（５４％保護、ｐ＜０．００１）。
【０１７５】
従って、本発明の抽出物は、抗酸化活性、抗ラジカル活性、汚染防止活性および老化防止活性を有する。
【０１７６】
【表１５】
2018538332.tif 000018
【０１７７】
Ｂ−ＩＲによるＭＭＰ１産生の阻害
太陽のスペクトルの半分以上を占める赤外（ＩＲ）線は、ＭＭＰ１などのプロテアーゼの産生を刺激することによって、皮膚老化に寄与する真皮マトリックスの分解を誘導することができる。
【０１７８】
ＩＲ線の有害な影響から真皮細胞を保護する本発明の抽出物の能力を、ＭＭＰ１産生を評価することにより研究した。
【０１７９】
材料および方法：
正常ヒト繊維芽細胞（ＮＨＦ）を、０．００１％の、実施例１で得た本発明の抽出物、または１０−７Ｍデキサメタゾン（参照抗炎症薬）の存在下で４８時間インキュベートし、続いて、１時間の赤外線照射（０．５７ｋＪ／ｃｍ２）を行った。
【０１８０】
インキュベーション後、上清を集め、放出されたＭＭＰ１をアッセイした（ＥＬＩＳＡキット、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。
【０１８１】
結果の有意性はスチューデントのｔ検定によって検証した。
【０１８２】
結果および結論：
結果を表１６に示す。これらの結果は、０．００１％の本発明の抽出物が正常ヒト繊維芽細胞における赤外線によるＭＭＰ１産生を有意に阻害したことを示している。
【０１８３】
従って、本発明の抽出物は、抗酸化活性、抗ラジカル活性、汚染防止活性および老化防止活性を有する。
【０１８４】
【表１６】
2018538332.tif 000019
【０１８５】
Ｃ−ＵＶがもたらす酸化ストレスからの保護：
ＵＶ照射によってもたらされる活性酸素種（ＲＯＳ）に関する本発明の抽出物の抗酸化能力を研究した。
【０１８６】
材料および方法:
Ｈ２ＤＣＦ−ＤＡプローブの取り込み（１時間のインキュベーション）の前に、正常ヒトケラチノサイトを、０．００１％および０．００５％（ｗ／ｖ）の、実施例１で得た本発明の抽出物の存在下、または５００μＭビタミンＣ（参照酸化防止剤）の存在下で２４時間インキュベートした。
【０１８７】
次いで、ケラチノサイトを２４００Ｊ／ｍ２のＵＶ（２０００Ｊ／ｍ２のＵＶＢおよび４００Ｊ／ｍ２のＵＶＡ）で刺激し、その後、０．００１％および０．００５％（ｗ／ｖ）の、実施例１で得た本発明の抽出物の存在下、または５００μＭビタミンＣの存在下、３７℃で１５分間の培養に戻した。
【０１８８】
活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を蛍光の測定によって評価し、得られた値を、ＭＴＴ細胞生存率アッセイを用いて得られた細胞量に対して正規化した。
【０１８９】
結果を、一元ＡＮＯＶＡに続いてテューキー検定により統計解析した（ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭバージョン５．０２ソフトウェア、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、カリフォルニア州、ＵＳＡ）。
【０１９０】
結果および結論：
本発明の抽出物がＵＶによる（２４００Ｊ／ｍ２）酸化ストレスに応答したケラチノサイトによるＲＯＳ産生を有意に阻害した（表１７）。
【０１９１】
【表１７】
2018538332.tif 000020
【０１９２】
５．化学的ストレスの影響からの保護
ＰＭＡがもたらすＰＧＥ２産生に及ぼす影響：
化学分子ＰＭＡに対する本発明の抽出物の抗炎症保護を、プロスタグランジン２（ＰＧＥ２）の放出の分析によって研究した。
【０１９３】
材料および方法：
正常ヒトケラチノサイトを、０．００２％および０．００５％の、実施例１で得た本発明の抽出物を用いて、および１０−６Ｍインドメタシン（プロスタグランジン経路の抗炎症薬対照）を用いて３７℃で２４時間前処理し、これらの同じ細胞単層上でさらに２４時間使用される０．１μｇ／ｍｌのＰＭＡ（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート）による炎症に関する活性薬剤の保護のレベルを測定できるようにした。
【０１９４】
処理の終わりに、上清を集め、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）のアッセイを行う。ＰＧＥ２の量に比例する染色を、光学濃度（ＯＤ）を４５０ｎｍで読み取ることによって測定した。
【０１９５】
結果の有意性はスチューデントのt検定によって検証した。
【０１９６】
結果：
結果を表１８に示す。これらの結果は、両方の濃度の本発明の抽出物が、０．１μｇ／ｍｌのＰＭＡによる誘導に関するＰＧＥ２放出を有意に減少させたことを示している。
【０１９７】
従って、本発明の抽出物は、抗酸化活性、抗ラジカル活性、汚染防止活性および老化防止活性を有する。
【０１９８】
【表１８】
2018538332.tif 000021
【０１９９】
６．老化の影響からの保護
汚染、日光の有害な影響、化学分子および他の総ての酸化ストレス誘導形態などの環境ストレスの反復作用は、真皮マトリックスの分解をもたらし、それによって、早期の皮膚老化をもたらす。
【０２００】
加齢に伴い過少発現または過剰発現されるタンパク質に関する作用を解析するために、細胞老化モデルにおいて本発明の抽出物を解析した。
【０２０１】
材料および方法：
ケラチノサイトを、所望により、０．００００２５％の、実施例１で得た本発明のＤＭ抽出物の存在下で、老化表現型を誘導する培養培地（「プロエイジ(pro-age)」培地）中で４週間、培養し、週１回トリプシン処理する。
【０２０２】
３週間の培養／継代培養の終わりに、プロテオーム解析を行う。この解析により様々な細胞経路のタンパク質を６つの領域：代謝、アポトーシス、解毒、タンパク質異化およびタンパク質合成に分類した。
【０２０３】
結果および結論：
結果を表１９に示す。老化誘導のこの関連において、本発明の抽出物は、主に細胞の解毒／保護および免疫防御に関与するいくつかのタンパク質の発現を刺激かつ／または保護した：
【０２０４】
細胞解毒および保護：
・ペルオキシレドキシン２（ＰＲＤＸ２）の刺激：細胞内ＲＯＳによって引き起こされる損傷からの細胞保護において役割を果たす抗酸化酵素。
・カルボニルレダクターゼ１（ＣＢＲ１）の刺激：カルボニル化合物（医薬品）を減少させ、脂質過酸化の間の解毒に介入するデヒドロゲナーゼ／レダクターゼ。レダクターゼは、「プロエイジ」条件下で阻害されるが、これらの条件下で本発明の抽出物によって刺激を受ける。
・アルデヒドデヒドロゲナーゼ２（ＡＬＤＨ２）の阻害：アルデヒド／カルボニル分子（医薬品、汚染など）を触媒／解毒する、細胞の保護および分化において役割を果たすミトコンドリア酵素。このタンパク質は、「プロエイジ」条件下で刺激を受けるが、本発明の抽出物によってその発現は基礎的レベルまで回復する。
・脂肪酸結合タンパク質５（ＦＡＢＰ５）の刺激：主に表皮で発現され、脂質ホメオスタシスの調節に関与し、それによって、バリア機能において役割を果たすシャペロンタンパク質。その発現は「プロエイジ」条件下で阻害されるが、パッションフルーツのポリフェノール類によって回復される。
・プロテアソームβ２およびβ６サブユニット（ＰＳＭＢ２およびＰＳＭＢ６）の刺激：プロテアソームは、損傷を受けた／酸化したタンパク質の除去および細胞内タンパク質の置換に関与する。プロテアソームは、とりわけ、損傷を受けたタンパク質をグルタミン（β６）のレベルおよびトリプシン（β２）のレベルで切断するαサブユニットおよびβサブユニットからなる。加齢はプロテアソーム活性を低下させ、これが損傷を受けた／酸化したタンパク質の蓄積につながる；この加齢効果は、「プロエイジ」条件下で見出されるが、これらの条件下で、本発明の抽出物は、これら２つのプロテアソームサブユニットの発現を刺激する。
【０２０５】
免疫防御：
・β−２−ミクログロブリン（Ｂ２ＭＧ）の阻害：免疫応答に関与する小さな表面タンパク質（表皮）。これは、主要組織適合遺伝子複合体の一部であり、疾患状態で過剰発現され、それによって、インターロイキン類、特にインターロイキン６およびインターロイキン８、ならびに免疫抑制性インターロイキンであるインターロイキン１０、が生成される。ここでは、老化を誘導する条件下でその発現は増加する。本発明の抽出物はこの増加を妨げる。
・マンノース結合レクチン１（ＬＭＡＮ１）の阻害：アポトーシス細胞および病原体の食作用を可能にすることによって免疫応答に関与するタンパク質。この遺伝子の欠損は皮膚における細胞残屑の増加を伴う。これは、仮に存在するとしても、基礎的状態では非常に少なく、炎症状態（例えば、ＵＶ）で増加する。「プロエイジ」条件下で、その発現は増加し、本発明の抽出物の作用下で調節される。
【０２０６】
【表１９】
2018538332.tif 000022
【０２０７】
７．結論
これらの様々な試験は、本発明のポリフェノール抽出物の抗炎症効果、抗酸化効果、汚染防止効果、それに従って、老化防止効果を示す。
【０２０８】
実施例４：ＭＤＡ、ＳＯＤ、カタラーゼ（ＣＡＴ）およびカルボニル化タンパク質の量の測定による、プラセボに対するトケイソウポリフェノール活性薬剤のｉｎ  ｖｉｖｏ効力の評価
試験デザイン：
・二重盲検試験。
・無作為化比較試験
【０２０９】
集団：
汚染された環境に住む、総ての肌質の、３０歳〜５０歳の間の、アジア人女性被験者３０名の２グループ（活性薬剤グループ１およびプラセボグループ１）。
【０２１０】
使用法：
製品を、顔の片面に、被験者自身によって、自宅で、１日２回（朝と夕方）、２８日間適用する。
試験プロトコール:
【０２１１】
【表２０】
2018538332.tif 000023
【０２１２】
パネルあたりの平均実年齢：
・パネル全体：３９．９歳（３０歳〜５０歳の間）
投与した組成物:
プラセボ処方
【０２１３】
【表２１】
2018538332.tif 000024
【０２１４】
【表２２】
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【０２１５】
１．Ｔ０およびＴ２８において被験者が受けた汚染の評価
Ｔ０およびＴ２８において、頭皮から１ｃｍの毛髪の房を採取した。各時点における被験者の重金属曝露を決定するために、生化学分析を行った。分析には、１０名の被験者、各パネルから５名が参加した。
【０２１６】
結果（表２１および図９）は、一定量の重金属またはわずかな増加を示している。汚染のばらつきが原因にすぎない有益な効果の仮説を除外して、被験者の汚染への曝露は試験中に減少しなかったと結論付けることができる。
【０２１７】
【表２３】
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【０２１８】
２．Ｔ０およびＴ２８におけるＭＤＡ、ＣＡＴおよびＳＯＤの量の評価
Ｔ０およびＴ２８において、被験者の各頬からスワブを採取した。ＭＤＡ、ＣＡＴおよびＳＯＤの量を決定するために、生化学分析を行った。分析には、３０名の被験者、各パネルから１５名が参加した。
【０２１９】
ＭＤＡ、ＣＡＴおよびＳＯＤの量は、活性薬剤およびプラセボではＴ０およびＴ２８の間で有意に減少し、活性薬剤で有意により大きな減少が起こる（表２２および図１０Ａおよび１０Ｂ）。
【０２２０】
【表２４】
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【０２２１】
３．Ｔ０およびＴ２８におけるカルボニル化タンパク質の量の評価
Ｔ０およびＴ２８において、被験者の各頬でＤ−Ｓｑｕａｍｅサンプリングを行った。カルボニル化タンパク質の量を決定するために、生化学的染色を行った。分析には、２０名の被験者、各パネルから１０名が参加した。
【０２２２】
カルボニル化タンパク質の量は、活性薬剤およびプラセボではＴ０およびＴ２８の間で有意に減少し、活性薬剤で有意により大きな減少が起こる、（表２３および図１１Ａおよび１１Ｂ）。
【０２２３】
【表２５】
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【０２２４】
４．生化学的測定の概要
結果は、パネル全体に関しても非喫煙者および喫煙者サブパネルに関しても抗ラジカル／解毒効力を示している。
【０２２５】
活性薬剤は、皮膚の自然防御、ＳＯＤおよびＣＡＴに代わるため、解毒プロセスから生じる残渣（ＭＤＡ）の量は少なくなる。
【０２２６】
カルボニル化タンパク質の結果により、この抗ラジカル／解毒作用が確認される。
【０２２７】
５．効力の概要
活性薬剤（３％）は、以下のパラメーターに関して有意な効力を示した：
・頬におけるＭＤＡの量
活性薬剤は、生体頬サンプルから測定したＭＤＡの量に関して以下の効果を誘導した：
・パネル全体（３０名の被験者）では、２３．９％の有意な減少。観察された効果は、プラセボで観察された効果と比較して有意である。
・頬におけるＳＯＤの量
活性薬剤は、生体頬サンプルから測定したＳＯＤの量に関して以下の効果を誘導した：
・パネル全体（３０名の被験者）では、１８．６％の有意な減少。観察された効果は、プラセボで観察された効果と比較して有意である。
・頬におけるＣＡＴの量
活性薬剤は、生体頬サンプルから測定したＣＡＴの量に関して以下の効果を誘導した：
・パネル全体（３０名の被験者）では、１８．９％の有意な減少。観察された効果は、プラセボで観察された効果と比較して有意である。
・頬におけるカルボニル化タンパク質の量
活性薬剤は、生体頬サンプルから測定したカルボニル化タンパク質の量に関して以下の効果を誘導した：
・パネル全体（２０名の被験者）では、５１．５％の有意な減少。観察された効果は、プラセボで観察された効果と比較して有意である。
【０２２８】
→これらの結果の総ては、解毒に関して有意な効果を示している。
【０２２９】
実施例５：局所経路による適用のための組成物
局所経路による適用のためのいくつかの組成物を以下に示す。実施例１または２の、トケイソウ種子のポリフェノール抽出物は、クレンジングウォーター、水中油型エマルション、油中水型エマルション、オイル、ミルク、ローション、シャンプー、発泡製品およびスプレーなどの様々な化粧品に組み込むことができ、その組成を例として以下に示す。
【０２３０】
【表２６】
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【０２３１】
【表２７】
2018538332.tif 000030
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2018538332.tif 000036
【図７】
2018538332.tif 000037
【図８Ａ】
2018538332.tif 000038
【図８Ｂ】
2018538332.tif 000039
【図８Ｃ】
2018538332.tif 000040
【図９】
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【図１０Ａ】
2018538332.tif 000042
【図１０Ｂ】
2018538332.tif 000043
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年8月22日(2018.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トケイソウ、特にチャボトケイソウまたはクダモノトケイソウ、の種子のポリフェノール抽出物であって、その乾燥抽出物の重量に対して、没食子酸当量として表される少なくとも３０重量％のポリフェノール類と、その乾燥抽出物の重量に対して少なくとも１０重量％の有機酸とを含んでなり、前記有機酸が酢酸、リンゴ酸、クエン酸またはそれらの混合物である、抽出物。
【請求項２】
乾燥抽出物の重量に対して、没食子酸当量として表される少なくとも３５重量％のポリフェノール類、有利には少なくとも４０重量％のポリフェノール類を含んでなる、請求項１に記載の抽出物。
【請求項３】
乾燥抽出物中のポリフェノール類の重量に対して、没食子酸当量として表される前記ポリフェノール類の少なくとも５０重量％がカテキン誘導体である、請求項１または２に記載の抽出物。
【請求項４】
水、グリセロール類、グリコール類、およびそれらの混合物から選択される溶媒でのトケイソウ種子の固体／液体抽出によって得られることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項５】
二成分混合物である水／グリセロール、水／グリコール、およびそれらの混合物、有利には水中３０％〜９０％のグリセロールおよび／またはグリコールの割合の混合物、から選択される溶媒でのトケイソウ種子の固体／液体抽出によって得られることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の、トケイソウ種子のポリフェノール抽出物を調製するための方法であって、水、グリセロール類、グリコール類、およびそれらの混合物から選択される溶媒での固体／液体抽出の少なくとも１つの工程を含んでなる、方法。
【請求項７】
以下の連続的工程：
ａ）前記種子を破砕する工程；
ｂ）所望により、好ましくはプレスすることによって、エタノール抽出によってまたは超臨界ＣＯ２抽出によって、前記種子を脱脂する工程；
ｃ）粉砕され、所望によりさらに脱脂された前記種子を、水、グリセロール類、グリコール類、およびそれらの混合物から選択される溶媒で固体／液体抽出する工程；
ｄ）デカンテーションおよび／または遠心分離および／または連続濾過によって固相と液相とを分離する工程；および
ｅ）所望により、工程ｄ）で得られた抽出物を乾燥させる工程
を含んでなることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記固体／液体抽出溶媒が、二成分混合物である水／グリセロール、水／グリコール、およびそれらの混合物、有利には、水中、４０％〜９０％、好ましくは５０％〜９０％、より好ましくは６０％〜８０％、特に７０％、のグリセロールおよび／またはグリコールの割合の混合物、から選択されることを特徴とする、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
有効成分として、請求項１〜５のいずれか一項に記載のトケイソウ種子のポリフェノール抽出物または請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる抽出物と、有利には好適な賦形剤と、を含んでなる組成物。
【請求項１０】
組成物の総重量に対して、０．００１〜１０重量％、有利には、０．０１〜５重量％の、トケイソウ種子の前記ポリフェノール抽出物を含んでなり、ここで、前記抽出物の重量は乾燥抽出物の重量として表される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
・皮膚および／または粘膜および／または皮膚付属器の障害または病状、有利には、皮膚および／または粘膜および／または皮膚付属器の、炎症反応、酸化反応、汚染に関係していてもよいラジカル攻撃に関連する障害、バリアまたはホメオスタシス、老化、特に加齢性および／または光線性の老化、の障害、ならびに／または
・血管障害、ならびに／または
・損傷を受けた脂肪組織：
の予防および／または治療における使用のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抽出物または請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる抽出物または請求項９もしくは１０に記載の組成物。
【請求項１２】
それらの状態および／または外観を改善するための、皮膚および／または皮膚付属器および／または粘膜の化粧的ケアのための方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抽出物または請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる抽出物または請求項９もしくは１０に記載の化粧用組成物を適用することを含む、方法。
【国際調査報告】
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2018538332.tif 000048
2018538332.tif 000049
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