(57)【要約】  本発明は、皮膚でのコラーゲンターンオーバーを改善する効力を有する物質を特定するための方法に関する。また本発明は、皮膚のリモデリングを強化するための、コラーゲン分解活性物質およびコラーゲン合成促進活性物質の組み合わせを含む組成物に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン促進活性物質の活性を高める効力を有する物質を特定する方法であって、以下のステップ：
(a) 試験物質の存在下または非存在下でヒト皮膚線維芽細胞（HDF）をインキュベートするステップ；
(b) 続いて、試験物質を除去し、かつ、HDFによるコラーゲン放出を刺激するのに十分な時間にわたって、コラーゲン促進活性物質の存在下で該HDFをインキュベートするステップ；および
(c) 試験物質およびコラーゲン促進活性物質を用いて処理したHDFにより放出されたコラーゲンの量を測定し、かつ、その量を、試験物質の非存在下でコラーゲン促進活性物質を用いて処理したHDFにより放出されたコラーゲンの量と比較するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
ステップ(a)において、試験物質の存在下で約48時間にわたってHDFをインキュベートし、ステップ(b)において、コラーゲン促進活性物質の存在下で約72時間にわたってHDFをインキュベートする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ステップ(c)において放出されたコラーゲンの測定は、1型プロコラーゲンCペプチド酵素結合免疫吸着アッセイ（PIP EIA）を用いて行なわれる、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
コラーゲン合成促進活性物質が、TGFβ1、Solペプチド、テリハボク（Calophyllum Inophyllum）（タマヌ油（Tamanu Original Oil）として入手可能）、パルミトイルジペプチド-5ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニン/パルミトイルジペプチド-5ジアミノヒドロキシ酪酸（Syn(登録商標)Tacks 801045）、ミモサ・テヌイフローラ（Mimosa tenuiflora）（テペスコヒューテ（Tepescohuite）スプレー乾燥抽出物として入手可能）、ダイズポリペプチド、イワベンケイ（Rhodiola Rosea）、ダイズ抽出物（フィトマトリックスK100（Phytomatrix K100）として入手可能）、パルミトイルトリペプチド-1/パルミトイルトリペプチド-7、藻類抽出物/加水分解イネタンパク質、スナジグミ（Hippophae Rhamnoides）（シーバックソーン抽出物として入手可能）、ヨーロッパブドウ（ネオビキシル（Neovixyl）として入手可能）、オプンチア・ツナ（Opuntia Tuna）（ウチワサボテン（prickly pear cactus））、乳清タンパク質（NXP75として入手可能）、酵母ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha（H. polymorpha））の抽出物、パルミトイルペンタペプチド-4（マトリキシル500（Matrixyl 500）として入手可能）、酵母多糖（メタバイオティクスTMマイクロリフト（MetabioticsTM Microlift）として入手可能）、ラミナリア・ディギタータ（Laminaria Digitata）（マイトスティームDI（Mitostime DI）として入手可能）、加水分解コラーゲン、藻類抽出物（ラナブルー・パラベンフリーとして入手可能）、ガラクトアラビナン（TRIspire Enhanceとして入手可能）、ラウリドン（Laurydone）、テルミナリア・フェルディナンディアナ（Terminalia Ferdinandiana）（カカドゥプラム抽出物（グリセリン））、リン酸アスコルビルアミノプロピル、アルテミア（Artemia）、グアバ（Psidium Guajava）（グアバ抽出物）、トウモロコシ（Zea mays）、クリスマム・マリチマム（Crithmum Maritimum）、エリンギウム・マリチマム（Eryngium Maritimum）、クレアチン（クレアピュア（Creapure(登録商標)）として入手可能）、セキセツソウ（Centella asiatica）、ペルセア・グラティッシマ（Persea Gratissima）（アボカド果実抽出物、アボカディンTMHU25（AvocadinTM HU25）として入手可能）、コガネバナ（Scutellaria Baicalensis）（バイカリンMM（Baicalin MM）として入手可能）、パルミトイルヘキサペプチド-12、アスコルビン酸テトラヘキシルデシル（BV-OSCとして入手可能）、シュードアルテロモナス属発酵物（アンタルクティシン（Antarcticine(登録商標)）として入手可能）、アセチルヘキサペプチド-8（アルギレリン（Argireline(登録商標)）溶液として入手可能）、アスコルビルグルコシド、リン酸アスコルビルマグネシウム、パルミチン酸アスコルビル、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
コラーゲン合成促進活性物質の活性を高める効力を有する物質を特定する方法であって、以下のステップ：
(a) ヒト皮膚線維芽細胞（HDF）によるコラーゲン放出を刺激するのに十分な時間にわたって、コラーゲン合成促進活性物質の存在下またはコラーゲン合成促進活性物質と試験物質との組み合わせの存在下で、HDFをインキュベートするステップ；および
(b) 試験物質とコラーゲン合成促進活性物質の両方を用いて処理されたHDFにより放出されたコラーゲンの量を測定し、かつ、その量を、試験物質を用いる処理の非存在下でコラーゲン合成促進活性物質を用いて処理したHDFにより放出されたコラーゲンの量と比較するステップ
を含む、上記方法。
【請求項６】
コラーゲン合成促進活性物質が、TGFβ1、Solペプチド、テリハボク（Calophyllum Inophyllum）（タマヌ油（Tamanu Original Oil）として入手可能）、パルミトイルジペプチド-5ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニン/パルミトイルジペプチド-5ジアミノヒドロキシ酪酸（Syn(登録商標)Tacks 801045）、ミモサ・テヌイフローラ（Mimosa tenuiflora）（テペスコヒューテ（Tepescohuite）スプレー乾燥抽出物として入手可能）、ダイズポリペプチド、イワベンケイ（Rhodiola Rosea）、ダイズ抽出物（フィトマトリックスK100（Phytomatrix K100）として入手可能）、パルミトイルトリペプチド-1/パルミトイルトリペプチド-7、藻類抽出物/加水分解イネタンパク質、スナジグミ（Hippophae Rhamnoides）（シーバックソーン抽出物として入手可能）、ヨーロッパブドウ（ネオビキシル（Neovixyl）として入手可能）、オプンチア・ツナ（Opuntia Tuna）（ウチワサボテン（prickly pear cactus））、乳清タンパク質（NXP75として入手可能）、酵母ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha（H. polymorpha））の抽出物、パルミトイルペンタペプチド-4（マトリキシル500（Matrixyl 500）として入手可能）、酵母多糖（メタバイオティクスTMマイクロリフト（MetabioticsTM Microlift）として入手可能）、ラミナリア・ディギタータ（Laminaria Digitata）（マイトスティームDI（Mitostime DI）として入手可能）、加水分解コラーゲン、藻類抽出物（ラナブルー・パラベンフリーとして入手可能）、ガラクトアラビナン（TRIspire Enhanceとして入手可能）、ラウリドン（Laurydone）、テルミナリア・フェルディナンディアナ（Terminalia Ferdinandiana）（カカドゥプラム抽出物（グリセリン））、リン酸アスコルビルアミノプロピル、アルテミア（Artemia）、グアバ（Psidium Guajava）（グアバ抽出物）、トウモロコシ（Zea mays）、クリスマム・マリチマム（Crithmum Maritimum）、エリンギウム・マリチマム（Eryngium Maritimum）、クレアチン（クレアピュア（Creapure(登録商標)）として入手可能）、セキセツソウ（Centella asiatica）、ペルセア・グラティッシマ（Persea Gratissima）（アボカド果実抽出物、アボカディンTMHU25（AvocadinTM HU25）として入手可能）、コガネバナ（Scutellaria Baicalensis）（バイカリンMM（Baicalin MM）として入手可能）、パルミトイルヘキサペプチド-12、アスコルビン酸テトラヘキシルデシル（BV-OSCとして入手可能）、シュードアルテロモナス属発酵物（アンタルクティシン（Antarcticine(登録商標)）として入手可能）、アセチルヘキサペプチド-8（アルギレリン（Argireline(登録商標)）溶液として入手可能）、アスコルビルグルコシド、リン酸アスコルビルマグネシウム、パルミチン酸アスコルビル、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
皮膚でのコラーゲンターンオーバーを強化する方法であって、以下のステップ：
(a) 皮膚の結合組織中でコラーゲンを分解する効力を有する第1の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含む第1の組成物を、コラーゲンターンオーバーの強化を必要とする皮膚に塗布し；かつ、結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン貪食を刺激するのに十分な時間にわたって、第1の組成物を皮膚と接触したままにするステップ；
(b) コラーゲン合成を促進する効力を有する第2の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含む第2の組成物を皮膚に塗布し；かつ皮膚の結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン放出を促進するのに十分な時間にわたって、第2の組成物を皮膚と接触したままにするステップ
を含み、このとき、ステップ(a)および(b)はいずれかの順序で連続的に行われ；かつ、第1の組成物と第2の組成物の両方が皮膚に塗布されるときに、第1の活性物質は第2の活性物質の活性を改善する、上記方法。
【請求項８】
第2の活性物質が、TGFβ1、Solペプチド、テリハボク（Calophyllum Inophyllum）（タマヌ油（Tamanu Original Oil）として入手可能）、パルミトイルジペプチド-5ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニン/パルミトイルジペプチド-5ジアミノヒドロキシ酪酸（Syn(登録商標)Tacks 801045として入手可能）、ミモサ・テヌイフローラ（Mimosa tenuiflora）（テペスコヒューテ（Tepescohuite）スプレー乾燥抽出物として入手可能）、ダイズポリペプチド、イワベンケイ（Rhodiola Rosea）、ダイズ抽出物（フィトマトリックスK100（Phytomatrix K100）として入手可能）、パルミトイルトリペプチド-1/パルミトイルトリペプチド-7、藻類抽出物/加水分解イネタンパク質、スナジグミ（Hippophae Rhamnoides）（シーバックソーン抽出物として入手可能）、ヨーロッパブドウ（ネオビキシル（Neovixyl）として入手可能）、オプンチア・ツナ（Opuntia Tuna）（ウチワサボテン（prickly pear cactus））、乳清タンパク質（NXP75として入手可能）、酵母ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha（H. polymorpha））の抽出物、パルミトイルペンタペプチド-4（マトリキシル500（Matrixyl 500）として入手可能）、酵母多糖（メタバイオティクスTMマイクロリフト（MetabioticsTM Microlift）として入手可能）、ラミナリア・ディギタータ（Laminaria Digitata）（マイトスティームDI（Mitostime DI）として入手可能）、加水分解コラーゲン、藻類抽出物（ラナブルー・パラベンフリーとして入手可能）、ガラクトアラビナン（TRIspire Enhanceとして入手可能）、ラウリドン（Laurydone）、テルミナリア・フェルディナンディアナ（Terminalia Ferdinandiana）（カカドゥプラム抽出物（グリセリン））、リン酸アスコルビルアミノプロピル、アルテミア（Artemia）、グアバ（Psidium Guajava）（グアバ抽出物）、トウモロコシ（Zea mays）、クリスマム・マリチマム（Crithmum Maritimum）、エリンギウム・マリチマム（Eryngium Maritimum）、クレアチン（クレアピュア（Creapure(登録商標)）として入手可能）、セキセツソウ（Centella asiatica）、ペルセア・グラティッシマ（Persea Gratissima）（アボカド果実抽出物、アボカディンTMHU25（AvocadinTM HU25）として入手可能）、コガネバナ（Scutellaria Baicalensis）（バイカリンMM（Baicalin MM）として入手可能）、パルミトイルヘキサペプチド-12、アスコルビン酸テトラヘキシルデシル（BV-OSCとして入手可能）、シュードアルテロモナス属発酵物（アンタルクティシン（Antarcticine(登録商標)）として入手可能）、アセチルヘキサペプチド-8（アルギレリン（Argireline(登録商標)）溶液として入手可能）、アスコルビルグルコシド、リン酸アスコルビルマグネシウム、パルミチン酸アスコルビル、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
第1の活性物質が、ネオビキシル（Neovixyl）、テオブロマ（Theobroma）、NXP75、Taisohリキッド、ピチア属/レスベラトロール発酵物（Pichia/resveratrol ferment）、ワイルドブッシュプラム抽出物、アマチャリキッドB（Amacha liquid B）、ビフィズス菌抽出物、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
コラーゲンターンオーバーの強化を必要とする皮膚が、硬化して整列しているコラーゲンの存在を特徴とする、請求項7に記載の方法。
【請求項１１】
コラーゲンターンオーバーの強化を必要とする皮膚が、眼窩周囲領域の皮膚である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
皮膚でのコラーゲンターンオーバーを強化する方法であって、以下のステップ：
(a) 皮膚の結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン貪食を刺激することによりコラーゲンを分解する効力を有する第1の活性物質および結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン合成を促進する効力を有する第2の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含む組成物を、コラーゲンターンオーバーの強化を必要とする皮膚に塗布するステップであって、このとき、該組成物が皮膚に塗布されるときに、第1の活性物質が第2の活性物質の効力を改善する、上記ステップ；および
(b) 皮膚でのコラーゲンターンオーバーを強化するのに十分な時間にわたって、該組成物を皮膚と接触したままにするステップ
を含む、上記方法。
【請求項１３】
皮膚トリートメントキットであって、
皮膚の結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン貪食を刺激することによりコラーゲンを分解する効力を有する第1の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含有する第1の組成物；
皮膚の結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン合成を促進する効力を有する第2の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含有する第2の組成物であって、第1の組成物および第2の組成物の両方が皮膚に塗布されるときに、第1の活性物質が第2の活性物質の効力を改善する、上記第2の組成物；および
第1の組成物を用いる処置の非存在下で第2の組成物を用いる処置により達成可能なコラーゲン放出の程度を超えるコラーゲン放出の程度を達成するための、いずれかの順序での、連続的な第1の組成物および第2の組成物の使用に関する消費者に対する使用説明書
を含む、上記皮膚トリートメントキット。
【請求項１４】
第2の活性物質が、ネオビキシル（Neovixyl）、テオブロマ（Theobroma）、NXP75、Taisohリキッド、ピチア属/レスベラトロール発酵物（Pichia/resveratrol ferment）、ワイルドブッシュプラム抽出物、アマチャリキッドB（Amacha liquid B）、ビフィズス菌抽出物、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、第2の組成物が、TGFβ1、Solペプチド、テリハボク（Calophyllum Inophyllum）（タマヌ油（Tamanu Original Oil）として入手可能）、パルミトイルジペプチド-5ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニン/パルミトイルジペプチド-5ジアミノヒドロキシ酪酸（Syn(登録商標)Tacks 801045）、ミモサ・テヌイフローラ（Mimosa tenuiflora）（テペスコヒューテ（Tepescohuite）スプレー乾燥抽出物として入手可能）、ダイズポリペプチド、イワベンケイ（Rhodiola Rosea）、ダイズ抽出物（フィトマトリックスK100（Phytomatrix K100）として入手可能）、パルミトイルトリペプチド-1/パルミトイルトリペプチド-7、藻類抽出物/加水分解イネタンパク質、スナジグミ（Hippophae Rhamnoides）（シーバックソーン抽出物として入手可能）、ヨーロッパブドウ（ネオビキシル（Neovixyl）として入手可能）、オプンチア・ツナ（Opuntia Tuna）（ウチワサボテン（prickly pear cactus））、乳清タンパク質（NXP75として入手可能）、酵母ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha（H. polymorpha））の抽出物、パルミトイルペンタペプチド-4（マトリキシル500（Matrixyl 500）として入手可能）、酵母多糖（メタバイオティクスTMマイクロリフト（MetabioticsTM Microlift）として入手可能）、ラミナリア・ディギタータ（Laminaria Digitata）（マイトスティームDI（Mitostime DI）として入手可能）、加水分解コラーゲン、藻類抽出物（ラナブルー・パラベンフリーとして入手可能）、ガラクトアラビナン（TRIspire Enhanceとして入手可能）、ラウリドン（Laurydone）、テルミナリア・フェルディナンディアナ（Terminalia Ferdinandiana）（カカドゥプラム抽出物（グリセリン））、リン酸アスコルビルアミノプロピル、アルテミア（Artemia）、グアバ（Psidium Guajava）（グアバ抽出物）、トウモロコシ（Zea mays）、クリスマム・マリチマム（Crithmum Maritimum）、エリンギウム・マリチマム（Eryngium Maritimum）、クレアチン（クレアピュア（Creapure(登録商標)）として入手可能）、セキセツソウ（Centella asiatica）、ペルセア・グラティッシマ（Persea Gratissima）（アボカド果実抽出物、アボカディンTMHU25（AvocadinTM HU25）として入手可能）、コガネバナ（Scutellaria Baicalensis）（バイカリンMM（Baicalin MM）として入手可能）、パルミトイルヘキサペプチド-12、アスコルビン酸テトラヘキシルデシル（BV-OSCとして入手可能）、シュードアルテロモナス属発酵物（アンタルクティシン（Antarcticine(登録商標)）として入手可能）、アセチルヘキサペプチド-8（アルギレリン（Argireline(登録商標)）溶液として入手可能）、アスコルビルグルコシド、リン酸アスコルビルマグネシウム、パルミチン酸アスコルビル、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される活性物質を含む、請求項13に記載の皮膚トリートメントキット。
【請求項１５】
第1の活性物質が、ネオビキシル（Neovixyl）、テオブロマ（Theobroma）、NXP75、Taisohリキッド、ピチア属/レスベラトロール発酵物（Pichia/resveratrol ferment）、ワイルドブッシュプラム抽出物、アマチャリキッドB（Amacha liquid B）、ビフィズス菌抽出物、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項13に記載の皮膚トリートメントキット。
【請求項１６】
皮膚トリートメント製品であって、皮膚の結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン貪食を刺激することによりコラーゲンを分解する効力を有する第1の活性物質および結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン合成を促進する効力を有する第2の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含む組成物を含み、このとき、第1の活性物質および第2の活性物質は、該組成物が皮膚に塗布されるときに、第1の活性物質が第2の活性物質の効力を改善するのに有効な量で該組成物中に存在する、上記皮膚トリートメント製品。
【請求項１７】
皮膚でのコラーゲンターンオーバーを強化するための処置レジメンを通してヒト皮膚を美容上改善するための方法であって、以下のステップ：
皮膚の結合組織中でコラーゲンを分解する効力を有する第1の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含有する第1の組成物を提供するステップであって、該第1の組成物が結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン貪食を刺激するために機能する、上記ステップ；
皮膚の結合組織中でコラーゲン合成を促進する効力を有する第2の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含有する第2の組成物を提供するステップであって、該第2の組成物は結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン放出を促進するために機能する、上記ステップ；
第1の組成物を用いる処置の非存在下で第2の組成物を用いた処置により達成可能なコラーゲンターンオーバーのレベルを超える皮膚でのコラーゲンターンオーバーのレベルを達成するために、連続的な第1の組成物および第2の組成物の使用に対して消費者に指示するステップ；
第1の組成物を皮膚に塗布するステップ；および
第2の組成物を皮膚に塗布するステップ
を含み、このとき、第1の組成物および第2の組成物はいずれかの順序で皮膚に塗布することができ；かつ、第1の組成物および第2の組成物の両方が皮膚に塗布されるときに、第1の活性物質が第2の活性物質の効力を改善する、上記方法。
【請求項１８】
第1の活性物質が、ネオビキシル（Neovixyl）、テオブロマ（Theobroma）、NXP75、Taisohリキッド、ピチア属/レスベラトロール発酵物（Pichia/resveratrol ferment）、ワイルドブッシュプラム抽出物、アマチャリキッドB（Amacha liquid B）、ビフィズス菌抽出物、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
第2の活性物質が、TGFβ1、Solペプチド、テリハボク（Calophyllum Inophyllum）（タマヌ油（Tamanu Original Oil）として入手可能）、パルミトイルジペプチド-5ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニン/パルミトイルジペプチド-5ジアミノヒドロキシ酪酸（Syn(登録商標)Tacks 801045として入手可能）、ミモサ・テヌイフローラ（Mimosa tenuiflora）（テペスコヒューテ（Tepescohuite）スプレー乾燥抽出物として入手可能）、ダイズポリペプチド、イワベンケイ（Rhodiola Rosea）、ダイズ抽出物（フィトマトリックスK100（Phytomatrix K100）として入手可能）、パルミトイルトリペプチド-1/パルミトイルトリペプチド-7、藻類抽出物/加水分解イネタンパク質、スナジグミ（Hippophae Rhamnoides）（シーバックソーン抽出物として入手可能）、ヨーロッパブドウ（ネオビキシル（Neovixyl）として入手可能）、オプンチア・ツナ（Opuntia Tuna）（ウチワサボテン（prickly pear cactus））、乳清タンパク質（NXP75として入手可能）、酵母ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha（H. polymorpha））の抽出物、パルミトイルペンタペプチド-4（マトリキシル500（Matrixyl 500）として入手可能）、酵母多糖（メタバイオティクスTMマイクロリフト（MetabioticsTM Microlift）として入手可能）、ラミナリア・ディギタータ（Laminaria Digitata）（マイトスティームDI（Mitostime DI）として入手可能）、加水分解コラーゲン、藻類抽出物（ラナブルー・パラベンフリーとして入手可能）、ガラクトアラビナン（TRIspire Enhanceとして入手可能）、ラウリドン（Laurydone）、テルミナリア・フェルディナンディアナ（Terminalia Ferdinandiana）（カカドゥプラム抽出物（グリセリン））、リン酸アスコルビルアミノプロピル、アルテミア（Artemia）、グアバ（Psidium Guajava）（グアバ抽出物）、トウモロコシ（Zea mays）、クリスマム・マリチマム（Crithmum Maritimum）、エリンギウム・マリチマム（Eryngium Maritimum）、クレアチン（クレアピュア（Creapure(登録商標)）として入手可能）、セキセツソウ（Centella asiatica）、ペルセア・グラティッシマ（Persea Gratissima）（アボカド果実抽出物、アボカディンTMHU25（AvocadinTM HU25）として入手可能）、コガネバナ（Scutellaria Baicalensis）（バイカリンMM（Baicalin MM）として入手可能）、パルミトイルヘキサペプチド-12、アスコルビン酸テトラヘキシルデシル（BV-OSCとして入手可能）、シュードアルテロモナス属発酵物（アンタルクティシン（Antarcticine(登録商標)）として入手可能）、アセチルヘキサペプチド-8（アルギレリン（Argireline(登録商標)）溶液として入手可能）、アスコルビルグルコシド、リン酸アスコルビルマグネシウム、パルミチン酸アスコルビル、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】
皮膚でのコラーゲンターンオーバーを強化するための処置を通してヒト皮膚を美容上改善するための方法であって、以下のステップ：
(a) 皮膚の結合組織中のコラーゲンを分解する効力を有する第1の活性物質および結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン合成を促進する効力を有する第2の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含む組成物を提供するステップであって、該組成物が皮膚に塗布されるときに、第1の活性物質が第2の活性物質の効力を改善する、上記ステップ；および
(b) 皮膚に組成物を塗布し、かつ、第1の活性物質が結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン貪食を刺激し、および第2の活性物質が結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン放出を促進するのに十分な時間にわたって、組成物を皮膚に接触したままにするステップ
を含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚のアンチエージングの分野に関連する。より具体的には、本発明は、老化した皮膚でのしわ（line）および小じわ（wrinkle）、より詳細には、処置が難しい皮膚の領域のしわおよび小じわを予防または除去するための新規組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
老化（aging）および光老化（photoaging）は、特に、最後には顔の皮膚の細かいしわ、小じわ、およびたるみの出現に至る、皮膚の構造的変化に関連する。皮膚でのしわおよび小じわの形成は、老化の自然な過程である。それにもかかわらず、皮膚でのしわおよび小じわの存在は、若さを失ったことを常に思い出させるものである。これらの望ましくない老化の徴候の消失に対する消費者の要望は、より若々しい外観のための、アンチエージング製品および皮膚を若返らせる方法の世界的ビジネスへとつながってきた。
【０００３】
小じわは、年齢、紫外（UV）光への曝露、喫煙、および繰り返される表情などの要因の組み合わせにより引き起こされる。天然の油分の産生の減少は、皮膚を乾燥させ、小じわが多い見た目にする。皮膚が水分を失うと、それによる乾燥はしわおよび小じわをもたらし得る。比較的若い皮膚にふっくらとした見た目を与える皮膚の深層にある脂肪は減少し始めて、目立つしわおよび深いひだを伴う、緩んでたるんだ皮膚を生じさせる。UV光への曝露は、皮膚の深部の真皮中で表皮の直下に位置する、コラーゲン線維およびエラスチン線維からなる皮膚の結合組織の破壊を促進することにより、自然の老化プロセスを速める。支持になる結合組織がなくなると、皮膚は強度および柔軟性を失う。結果として、時期尚早に皮膚がたるんで、小じわが寄り始める。喫煙もまた、皮膚の正常な老化プロセスを加速させて、小じわの一因となる場合がある。微笑むこと、笑うこと、および目を細めることによる反復される筋肉の動作は、皮膚にしわを形成させる場合がある。絶え間ない体重の変動は、継続的に皮膚を伸ばし、これにより小じわがよりでき易くなる。顔面筋を使うたびに、皮膚表面の直下に溝が形成される。さらに、皮膚が老化するにつれて、柔軟性が失われ、それにより元の位置に跳ね返って戻るのが難しくなる。この弾力性の減少の結果として、次には、これらの溝が、深い小じわの形で顔面の永続的な造作となる。
【０００４】
皮膚のしわおよび小じわの形成を予防し、遅延させ、停止させ、かつ/または元に戻すための処置は、レチノイドおよび抗酸化剤などの種々の活性物質を含有する化粧用クリームから、皮膚剥離術（dermabrasion）、微小皮膚剥離術（microdermabrasion）、レーザー、化学的ピーリング、A型ボツリヌス毒素（ボトックス）、軟組織フィラー、美容整形（しわ取り）、および特定のエネルギーの光線（例えば、近赤外光）を発するデバイスの使用などのリサーフェシング処置に及ぶ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
処方箋がいらない市販のしわ取りクリームの効力は、部分的には、活性成分（1種または複数）に依存する。しかしながら、これらのクリームは処方薬クリームよりも低い濃度の活性成分を含有するので、宣伝文句および効力（もしあるとすれば）は限られたものであり、かつ通常は長続きしない。リサーフェシング処置および美容整形は、発赤、圧痛および疼痛をはじめとする副作用を伴う場合がある。最小限の副作用を示す、効果のあるアンチエージング製品および方法に対する必要性が未だ存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第1の態様の一実施形態では、コラーゲン促進活性物質の活性を高める効力を有する物質を特定する方法が提供され、該方法は、以下のステップ：
(a) 試験物質の存在下または非存在下でヒト皮膚線維芽細胞（HDF）をインキュベートするステップ；
(b) 続いて、試験物質を除去し、かつ、HDFによるコラーゲン放出を刺激するのに十分な時間にわたって、コラーゲン促進活性物質の存在下で該HDFをインキュベートするステップ；および
(c) 試験物質およびコラーゲン促進活性物質を用いて処理したHDFにより放出されたコラーゲンの量を測定し、かつ、その量を、試験物質の非存在下でコラーゲン促進活性物質を用いて処理したHDFにより放出されたコラーゲンの量と比較するステップ
を含む。
【０００７】
本発明のこの態様のさらなる実施形態では、コラーゲン合成促進活性物質の活性を高める効力を有する物質を特定する方法は、以下のステップ：
(a) ヒト皮膚線維芽細胞（HDF）によるコラーゲン放出を刺激するのに十分な時間にわたって、コラーゲン合成促進活性物質の存在下またはコラーゲン合成促進活性物質と試験物質との組み合わせの存在下で、HDFをインキュベートするステップ；および
(b) 試験物質とコラーゲン合成促進活性物質の両方を用いて処理されたHDFにより放出されたコラーゲンの量を測定し、かつ、その量を、試験物質を用いる処理の非存在下でコラーゲン合成促進活性物質を用いて処理したHDFにより放出されたコラーゲンの量と比較するステップ
を含む。
【０００８】
本発明の第2の態様の第1の実施形態では、皮膚でのコラーゲンターンオーバーを強化する方法が提供され、該方法は、以下のステップ：
(a) 皮膚の結合組織中でコラーゲンを分解する効力を有する第1の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含む第1の組成物を、コラーゲンターンオーバーの強化を必要とする皮膚に塗布し；かつ、結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン貪食を刺激するのに十分な時間にわたって、第1の組成物を皮膚と接触したままにするステップ；
(b) コラーゲン合成を促進する効力を有する第2の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含む第2の組成物を皮膚に塗布し；かつ皮膚の結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン放出を促進するのに十分な時間にわたって、第2の組成物を皮膚と接触したままにするステップ
を含み、このとき、ステップ(a)および(b)はいずれかの順序で連続的に行われ；かつ、第1の組成物と第2の組成物の両方が皮膚に塗布されるときに、第1の活性物質は第2の活性物質の活性を改善する。
【０００９】
本発明のこの態様の第2の実施形態は、皮膚でのコラーゲンターンオーバーを強化する方法を提供し、該方法は、以下のステップ：
(a) 皮膚の結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン貪食を刺激することによりコラーゲンを分解する効力を有する第1の活性物質および結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン合成を促進する効力を有する第2の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含む組成物を、コラーゲンターンオーバーの強化を必要とする皮膚に塗布するステップであって、このとき、該組成物が皮膚に塗布されるときに、第1の活性物質が第2の活性物質の効力を改善する、上記ステップ；および
(b) 皮膚でのコラーゲンターンオーバーを強化するのに十分な時間にわたって、該組成物を皮膚と接触したままにするステップ
を含む。
【００１０】
本発明の第3の態様は、皮膚でのコラーゲンターンオーバーを強化するための処置レジメンを通してヒト皮膚を美容上改善するための方法に関連し、該方法は、以下のステップ：
皮膚の結合組織中でコラーゲンを分解する効力を有する第1の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含有する第1の組成物を提供するステップであって、該第1の組成物が結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン貪食を刺激するために機能する、上記ステップ；
皮膚の結合組織中でコラーゲン合成を促進する効力を有する第2の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含有する第2の組成物を提供するステップであって、該第2の組成物は結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン放出を促進するために機能する、上記ステップ；
第1の組成物を用いる処置の非存在下で第2の組成物を用いた処置により達成可能なコラーゲンターンオーバーのレベルを超える皮膚でのコラーゲンターンオーバーのレベルを達成するために、連続的様式での第1の組成物および第2の組成物の使用に対して消費者に指示するステップ；
第1の組成物を皮膚に塗布するステップ；および
第2の組成物を皮膚に塗布するステップ
を含み、このとき、第1の組成物および第2の組成物はいずれかの順序で皮膚に塗布することができ；かつ、第1の組成物および第2の組成物の両方が皮膚に塗布されるときに、第1の活性物質が第2の活性物質の効力を改善する。
【００１１】
本発明の第3の態様のさらなる実施形態では、皮膚でのコラーゲンターンオーバーを強化するための処置を通してヒト皮膚を美容上改善するための方法が提供され、該方法は、以下のステップ：
(a) 皮膚の結合組織中のコラーゲンを分解する効力を有する第1の活性物質および結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン合成を促進する効力を有する第2の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含む組成物を提供するステップであって、該組成物が皮膚に塗布されるときに、第1の活性物質が第2の活性物質の効力を改善する、上記ステップ；および
(b) 皮膚に組成物を塗布し、かつ、第1の活性物質が結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン貪食を刺激し、および第2の活性物質が結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン放出を促進するのに十分な時間にわたって、組成物を皮膚に接触したままにするステップ
を含む。
【００１２】
本発明の第4の態様は、皮膚トリートメント製品を提供し、該製品は、皮膚の結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン貪食を刺激することによりコラーゲンを分解する効力を有する第1の活性物質および結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン合成を促進する効力を有する第2の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含む組成物を含み、このとき、第1の活性物質および第2の活性物質は、該組成物が皮膚に塗布されるときに、第1の活性物質が第2の活性物質の効力を改善するのに有効な量で該組成物中に存在する。
【００１３】
本発明の第5の態様は、皮膚トリートメントキットに関連する。該キットは、以下の構成要素：
皮膚の結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン貪食を刺激することによりコラーゲンを分解する効力を有する第1の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含有する第1の組成物；
皮膚の結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン合成を促進する効力を有する第2の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含有する第2の組成物であって、第1の組成物および第2の組成物の両方が皮膚に塗布されるときに、第1の活性物質が第2の活性物質の効力を改善する、上記第2の組成物；および
第1の組成物を用いる処置の非存在下で第2の組成物を用いる処置により達成可能なコラーゲン放出の程度を超えるコラーゲン放出の程度を達成するための、いずれかの順序での、連続的様式での第1の組成物および第2の組成物の使用に関する消費者に対する使用説明書
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】HDFでの形質転換増殖因子β1（TGFβ1）誘導性コラーゲンレベルに対するワイルドブッシュプラム抽出物の作用を示すグラフである。
【図２】HDFでのTGFβ1誘導性コラーゲンレベルに対するピチア属/レスベラトロール発酵物（Pichia/resveratrol ferment）の作用を示すグラフである。
【図３】HDFでのTGFβ1誘導性コラーゲンレベルに対するネオビキシル（Neovixyl）（イネ幹細胞およびブドウ種子抽出物）の作用を示すグラフである。
【図４】HDFでのTGFβ1誘導性コラーゲンレベルに対するアマチャリキッドB（ヒドランゲア・マクロフィラvar.オアマチャ・マキノ（Hydrangea macrohylla var. Oamacha Makino））植物抽出物の作用を示すグラフである。
【図５】HDFでのTGFβ1誘導性コラーゲンレベルに対するテオブロマ（Theobroma）（カカオ種子抽出物）の作用を示すグラフである。
【図６】HDFでのTGFβ1誘導性コラーゲンレベルに対するビフィズス菌抽出物（ラクトバチルス・ビフィダス（Lactobacillus Bifidus））の作用を示すグラフである。
【図７】HDFでのTGFβ1誘導性コラーゲンレベルに対するTaisohリキッド（ジジフス・ジュジュバ（Zizphus jujube）ナツメ抽出物）の作用を示すグラフである。
【図８】HDFでのTGFβ1誘導性コラーゲンレベルに対するNXP75（低温殺菌済み液状乳清由来のタンパク質濃縮物画分）の作用を示すグラフである。
【図９】HDFでのSolペプチド（ジャガイモ（Solanum tuberosum））誘導性コラーゲンレベルに対するNXP75の作用を示すグラフである。
【図１０】コラーゲンコート済ミクロスフェアビーズに対するメチルグリオキサールの作用を示すグラフである。
【図１１】メチルグリオキサールを用いて前処理したコラーゲンコート済ミクロスフェアビーズのHDFによる貪食に対する作用を示すグラフである。
【図１２】NXP75により刺激されたコラーゲン合成に対するネオビキシル（Neovixyl）の作用を示すグラフである。
【図１３】NXP75により刺激されたコラーゲン合成に対するアマチャリキッドBの作用を示すグラフである。
【図１４】マイトスティーム（Mitostime）により誘導されたコラーゲン合成に対するTaisohリキッドの作用を示すグラフである。
【図１５】Solペプチドにより誘導されたコラーゲン合成に対するTaisohリキッドの作用を示すグラフである。
【図１６】酵母ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）抽出物により誘導されたコラーゲン合成に対するTaisohリキッドの作用を示すグラフである。
【図１７】リボキシル（Riboxyl）により誘導されたコラーゲン合成に対するTaisohリキッドの作用を示すグラフである。
【図１８】酵母ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）抽出物により誘導されたコラーゲン合成に対するアマチャリキッドBの作用を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
ヒト皮膚線維芽細胞（HDF）は、別々の細胞層を合体させるための結合組織を生成する。HDFは、細胞外マトリックスを形成するフィブロネクチン、コラーゲン、およびエラスチンをはじめとするタンパク質分子を産生する。コラーゲンの長い繊維状の束（すなわち、筋膜）は、皮膚を身体の筋肉および器官へとつなぎ留める。真皮と表皮との間に細胞外マトリックスをつくり出すことにより、線維芽細胞は、上皮細胞がマトリックスを付着させることを可能にし、これにより、表皮細胞が合わさって皮膚の最上層（すなわち、組織化された扁平上皮細胞）を形成する。
【００１６】
結合組織の主要なタンパク質であるコラーゲンは、皮膚の強度および柔軟性を担う。年をとると、ヒトの身体はコラーゲンを再構築する能力を失う。軟結合組織では、成長および発達ならびにまた病的状態に応答してコラーゲンマトリックスを合成および分解する線維芽細胞により、恒常性が維持される。マトリックスリモデリングのバランスに対する攪乱は、コラーゲンの正味の損失またはコラーゲンの無秩序な異常増殖につながり得る。コラーゲンターンオーバーの2種類の経路が認識されており、細胞内経路と細胞外経路である。細胞外経路は、HDFによりコラーゲン線維に隣接して放出される、プロテイナーゼ、特にメタロプロテイナーゼ（MMP）の活性に依存すると考えられており、細胞内経路はHDFによるコラーゲン線維の貪食を含むと信じられている。貪食の後には、プロテイナーゼによるリソソーム装置中のコラーゲン線維の消化が続く。
【００１７】
しかしながら、我々が年をとれば、加齢に関連する変化は避けられず、コラーゲン恒常性の維持を担う線維芽細胞は存続することができなくなる。このことは、皮膚の眼窩周囲領域で最も頻繁に明らかになる。目の周りの皮膚は、身体中で最も薄く、わずかなコラーゲンおよびエラスチンを含有する。日光ダメージを受けた際には、この皮膚は、顔に小じわができる最初の領域に含まれ、この小じわが「目尻のしわ」（crow’s feet）になる。硬化して整列しているコラーゲン線維を特徴とするこれらの領域は、コラーゲンの合成および分解を調整するコラーゲンターンオーバーの天然の恒常性メカニズムに対して特に抵抗性である。
【００１８】
小じわのない皮膚を曲げて、表情をつくる一時的な折り目を形成させる場合、最も強い張力を受けるのは折り目の基部にある組織であると考えられている。その張力に反応して、線維芽細胞が張力の方向または折り目に対して垂直な方向にコラーゲンを沈着させる。この皮膚が曲げられて折り目が形成される連続する時点のそれぞれで、折り目の基部にある組織は沈着したコラーゲンに起因してわずかに硬化する。これが小じわの基部での張力をわずかに高め、さらに整列したコラーゲンの沈着を引き起こす。時間が経てば、整列したコラーゲンは、これが永続的な小じわを維持する状態にまで、皮膚の応力場で優勢となる。
【００１９】
眼窩周囲領域の目尻のしわが、MMPによるコラーゲン分解の細胞外経路に対して抵抗性である硬化した整列されたコラーゲンの存在を特徴とするので、本発明者らは、結合組織の生理学的リモデリングを、コラーゲン促進剤の使用と組み合わせて、コラーゲン分解の細胞内経路（すなわち、線維芽細胞によるコラーゲンの貪食）を刺激することにより強化することができるか否かを研究した。
【００２０】
本発明者らは、コラーゲン合成の促進剤の作用を強化する新規活性物質を特定するための新たな臨床的リモデリング戦略を開発した。第1の戦略は、2ステップアプローチを用いる。第1ステップでは、コラーゲン貪食刺激活性物質を用いてHDFを処理し、第2ステップでは、コラーゲン促進活性物質を用いてHDFを処理する。
【００２１】
コラーゲン促進活性物質の活性を強化する効力を有する物質を特定する方法は、以下のステップ：
(a) 試験物質の存在下または非存在下でHDFをインキュベートするステップ；
(b) その後に、試験物質を除去し、かつHDFによるコラーゲン放出を刺激するのに十分な時間にわたってコラーゲン促進活性物質の存在下でHDFをインキュベートするステップ；および
(c) 試験物質およびコラーゲン促進活性物質を用いて処理されたHDFにより放出されたコラーゲンの量を測定し、かつ、その量を、試験物質の非存在下でコラーゲン促進活性物質を用いて処理されたHDFにより放出されたコラーゲンの量と比較するステップ
を含む。
【００２２】
好ましくは、ステップ(a)では、試験物質の存在下または非存在下で約48時間にわたってHDFをインキュベートし、ステップ(b)では、HDFによるコラーゲン産生に対するコラーゲン増進剤のin vitro評価のための標準的手順に従って、コラーゲン合成促進活性物質の存在下で約72時間にわたってHDFをインキュベートする。ステップ(c)での放出されたコラーゲンの量の測定は、1型プロコラーゲンCペプチド酵素結合免疫吸着アッセイ（PIP EIA）を用いて行なわれる。
【００２３】
第2の戦略では、コラーゲン合成促進活性物質の活性を強化する効力を有する物質を特定する方法は、以下のステップ：
(a) HDFによるコラーゲン放出を刺激するのに十分な時間にわたって、コラーゲン合成促進活性物質の存在下またはコラーゲン合成促進活性物質と試験物質との組み合わせの存在下で、HDFをインキュベートするステップ；および
(b) 試験物質とコラーゲン合成促進活性物質の両方を用いて処理されたHDFにより放出されたコラーゲンの量を測定し、かつ、その量を、試験物質を用いる処理の非存在下でコラーゲン合成促進活性物質を用いて処理したHDFにより放出されたコラーゲンの量と比較するステップ
を含む。
【００２４】
ステップ(b)での放出されたコラーゲンの量の測定は、PIP EIAアッセイを用いて行なわれる。
【００２５】
本発明はさらに、皮膚でのコラーゲンターンオーバーを強化する方法に関連する。本発明の第1の実施形態では、該方法は、以下のステップ：
(a) 皮膚の結合組織中でコラーゲンを分解する効力を有する第1の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含む第1の組成物を、コラーゲンターンオーバーの強化を必要とする皮膚に塗布し；かつ、結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン貪食を刺激するのに十分な時間にわたって、第1の組成物を皮膚と接触したままにするステップ；
(b) コラーゲン合成を促進する効力を有する第2の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含む第2の組成物を皮膚に塗布し；かつ皮膚の結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン放出を促進するのに十分な時間にわたって、第2の組成物を皮膚と接触したままにするステップ
を含み、このとき、ステップ(a)および(b)はいずれかの順序で連続的に行われ；かつ、第1の組成物と第2の組成物の両方を皮膚が塗布されるときに、第1の活性物質は第2の活性物質の活性を改善する。
【００２６】
本発明のこの態様の第2の実施形態では、皮膚でのコラーゲンターンオーバーを強化する方法は、以下のステップ：
(a) 皮膚の結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン貪食を刺激することによりコラーゲンを分解する効力を有する第1の活性物質および結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン合成を促進する効力を有する第2の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含む組成物を、コラーゲンターンオーバーの強化を必要とする皮膚に塗布するステップであって、このとき、該組成物が皮膚に塗布されるときに、第1の活性物質が第2の活性物質の効力を改善する、上記ステップ；および
(b) 皮膚でのコラーゲンターンオーバーを強化するのに十分な時間にわたって、該組成物を皮膚と接触したままにするステップ
を含む。
【００２７】
本発明はまた、皮膚でのコラーゲンターンオーバーを強化するための処置を通してヒト皮膚を美容上改善するための方法にも関連する。本発明のこの態様の第1の実施形態では、該方法は、以下のステップ：
皮膚の結合組織中でコラーゲンを分解する効力を有する第1の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含有する第1の組成物を提供するステップであって、該第1の組成物が結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン貪食を刺激するために機能する、上記ステップ；
皮膚の結合組織中でコラーゲン合成を促進する効力を有する第2の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含有する第2の組成物を提供するステップであって、該第2の組成物は結合組織中で線維芽細胞によるコラーゲン放出を促進するために機能する、上記ステップ；
第1の組成物を用いる処置の非存在下で第2の組成物を用いた処置により達成可能なコラーゲンターンオーバーのレベルを超える皮膚でのコラーゲンターンオーバーのレベルを達成するために、連続的様式での第1の組成物および第2の組成物の使用に対して消費者に指示するステップ；
第1の組成物を皮膚に塗布するステップ；および
第2の組成物を皮膚に塗布するステップ
を含み、このとき、第1の組成物および第2の組成物はいずれかの順序で皮膚に塗布することができ；かつ、第1の組成物および第2の組成物の両方が皮膚に塗布されるときに、第1の活性物質が第2の活性物質の効力を改善する。
【００２８】
本発明のこの態様の第2の実施形態では、皮膚でのコラーゲンターンオーバーを強化するための処置を通してヒト皮膚を美容上改善するための方法は、以下のステップ：
(a) 皮膚の結合組織中のコラーゲンを分解する効力を有する第1の活性物質および結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン合成を促進する効力を有する第2の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含む組成物を提供するステップであって、該組成物が皮膚に塗布されるときに、第1の活性物質が第2の活性物質の効力を改善する、上記ステップ；および
(b) 皮膚に組成物を塗布し、かつ、第1の活性物質が結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン貪食を刺激し、および第2の活性物質が結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン放出を促進するのに十分な時間にわたって、組成物を皮膚に接触したままにするステップ
を含む。
【００２９】
本発明に係る皮膚トリートメント製品は、皮膚の結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン貪食を刺激することによりコラーゲンを分解する効力を有する第1の活性物質および結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン合成を促進する効力を有する第2の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含む組成物を含み、このとき、該組成物が皮膚に塗布されるときに、第1の活性物質が第2の活性物質の効力を改善するのに有効な量で、該組成物中に第1の活性物質および第2の活性物質が存在する。
【００３０】
本発明に係る皮膚トリートメントキットは、以下の構成要素：
皮膚の結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン貪食を刺激することによりコラーゲンを分解する効力を有する第1の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含有する第1の組成物；
皮膚の結合組織中の線維芽細胞によるコラーゲン合成を促進する効力を有する第2の活性物質および化粧品として許容されるビヒクルを含有する第2の組成物であって、第1の組成物および第2の組成物の両方が皮膚に塗布されるときに、第1の活性物質が第2の活性物質の効力を改善する、上記第2の組成物；および
第1の組成物を用いる処置の非存在下で第2の組成物を用いる処置により達成可能なコラーゲン放出の程度を超えるコラーゲン放出の程度を達成するための、いずれかの順序での連続的な第1の組成物および第2の組成物の使用に関する、消費者に対する使用説明書
を含む。
【００３１】
本発明の製品および方法で有用であるコラーゲン合成を促進する効力を有する物質としては、限定するものではないが、TGFβ1、Solペプチド、テリハボク（Calophyllum Inophyllum）（タマヌ油（Tamanu Original Oil）として入手可能）、パルミトイルジペプチド-5ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニン/パルミトイルジペプチド-5ジアミノヒドロキシ酪酸（Syn(登録商標)Tacks 801045）、乳清タンパク質、ミモサ・テヌイフローラ（Mimosa tenuiflora）（テペスコヒューテ（Tepescohuite）スプレー乾燥抽出物として入手可能）、ダイズポリペプチド、イワベンケイ（Rhodiola Rosea）、ダイズ抽出物（フィトマトリックスK100（Phytomatrix K100）として入手可能）、パルミトイルトリペプチド-1/パルミトイルトリペプチド-7、藻類抽出物/加水分解イネタンパク質、スナジグミ（Hippophae Rhamnoides）（シーバックソーン抽出物として入手可能）、ヨーロッパブドウ（ネオビキシル（Neovixyl）として入手可能）、オプンチア・ツナ（Opuntia Tuna）（ウチワサボテン（prickly pear cactus））、乳清タンパク質（NXP75として入手可能）、酵母ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha（H. polymorpha））の抽出物、パルミトイルペンタペプチド-4（マトリキシル500（Matrixyl 500）として入手可能）、酵母多糖（メタバイオティクスTMマイクロリフト（MetabioticsTM Microlift）として入手可能）、ラミナリア・ディギタータ（Laminaria Digitata）（マイトスティームDI（Mitostime DI）として入手可能）、加水分解コラーゲン、藻類抽出物（ラナブルー・パラベンフリーとして入手可能）、ガラクトアラビナン（TRIspire Enhanceとして入手可能）、ラウリドン（Laurydone）、テルミナリア・フェルディナンディアナ（Terminalia Ferdinandiana）（カカドゥプラム抽出物（グリセリン））、リン酸アスコルビルアミノプロピル、アルテミア（Artemia）、グアバ（Psidium Guajava）（グアバ抽出物）、トウモロコシ（Zea mays）、クリスマム・マリチマム（Crithmum Maritimum）、エリンギウム・マリチマム（Eryngium Maritimum）、クレアチン（クレアピュア（Creapure(登録商標)）として入手可能）、セキセツソウ（Centella asiatica）、ペルセア・グラティッシマ（Persea Gratissima）（アボカド果実抽出物、アボカディンTMHU25（AvocadinTM HU25）として入手可能）、コガネバナ（Scutellaria Baicalensis）（バイカリンMM（Baicalin MM）として入手可能）、パルミトイルヘキサペプチド-12、アスコルビン酸テトラヘキシルデシル（BV-OSCとして入手可能）、シュードアルテロモナス属発酵物（アンタルクティシン（Antarcticine(登録商標)）として入手可能）、アセチルヘキサペプチド-8（アルギレリン（Argireline(登録商標)）溶液として入手可能）、アスコルビルグルコシド、リン酸アスコルビルマグネシウム、およびパルミチン酸アスコルビルが挙げられる。
【００３２】
本発明の製品および方法で有用であるコラーゲンを分解する効力を有する物質としては、限定するものではないが、ネオビキシル（Neovixyl）、テオブロマ（Theobroma）、NXP75、Taisohリキッド、ピチア属/レスベラトロール発酵物（Pichia/resveratrol ferment）、ワイルドブッシュプラム抽出物、アマチャリキッドB（Amacha liquid B）、およびビフィズス菌抽出物が挙げられる。
【００３３】
本発明に係る皮膚トリートメント製品は、1種または2種の局所用組成物を含むことができる。コラーゲン促進活性物質およびコラーゲン促進活性物質の効力を改善するコラーゲン分解活性物質の両方を含有する単一製剤の場合、これは、例えば、化粧水、スプリッツァー、ローション、昼用クリームおよび/または夜用クリーム、昼用セラムおよび/または夜用リペアセラム、ムース、ジェル、マスク、メーキャップファンデーションなどの形態を採ることができる。あるいは、コラーゲン促進活性物質を含有するものと、両方の組成物が皮膚に塗布される場合にコラーゲン促進活性物質の効力を改善するコラーゲン分解活性物質を含有するものの2種類の別個の組成物の塗布を含むレジメンを皮膚に施すことができる。2種類の別個の組成物のそれぞれは、例えば、単一製剤に関して上記で言及された形態のうちのいずれかの1種以上として提供することができる。
【００３４】
組成物は、しわおよび/もしくは小じわが形成されているいずれかの皮膚領域、または環境、日中のストレス、日光曝露、もしくは時期尚早な老化の悪影響を受け易く、かつしわおよび/もしくは小じわが形成されることが予測され得るいずれかの皮膚領域に対して塗布することができる。本発明の組成物は、目の周りの眼窩周囲領域の皮膚での目尻のしわなどの、皮膚リモデリングに対して最も抵抗性であるそれらの皮膚領域に対処するために特に適している。
【００３５】
本発明の組成物は、必要に応じて、または予め決められたスケジュールに従って皮膚に塗布することができる。組成物は、いずれかの他のトリートメント製品もしくはファンデーションメーキャップの塗布の前の清浄な皮膚に直接塗布することができ、または他のトリートメント製品もしくはファンデーションメーキャップの上から塗布することができる。それぞれの塗布により皮膚に塗布される組成物の量は、使用者の具体的なニーズに応じて広い範囲で変化し得る。例えば、使用者がはっきりとした小じわを有する場合、使用者は、使用者の皮膚が比較的細かいしわを示す場合よりも高頻度に組成物を塗布することを選択することができる。組成物は、数日から数ヵ月または数年もの期間にわたって、1日に約1回または2回から1週間に1回の範囲の頻度で塗布することができる。別の例では、単一の組成物を、1日に1回または2回、朝および/または夕に、6ヵ月以上の期間にわたって塗布することができる。さらなる例では、2種類の組成物を連続的に塗布する予定である場合、レジメン中で、それらをいずれの順序で用いることもできる。1種類の組成物を、他の組成物が皮膚に塗布された直後に、1日に1回または2回、皮膚に塗布することができる。別の例では、別個の組成物を隔日で1日1回もしくは2回塗布することができ、または別個の組成物を1週間おきに1日1回もしくは2回塗布するなどすることができる。
【００３６】
本発明を、例示の目的のみのために提供される以下の非限定的な実施例によりさらに説明する。
【実施例】
【００３７】
実施例1：コラーゲン貪食の誘導剤を用いた前処理後のHDFでのTGFβ1誘導性コラーゲン合成の測定
手順：
1. 1日目に、HDFを96ウェルプレートに播種した。
2. 2日目に、コンフルエンスに達した後のHDFを、培地（対照）または活性物質（貪食増進剤であることが本発明者らにより以前に見出された試験物質*；データ示さず）を用いて、飢餓条件下で48時間処理した（ステップ1）。
3. 4日目に、活性物質を除去し、細胞を、培地またはコラーゲン誘導剤である培地中の0.25ng/mL TGFβ1を用いて72時間処理した（ステップ2）。
4. 7日目に、培地を回収し、PIP EIAを用いてコラーゲン放出について分析した。PIPの量（プロコラーゲンng/mL培地）を、EIAプレートリーダーを用いて吸光度を測定することにより定量する。PIPの正確なサンプル濃度は、標準曲線に対する比吸光度を比較することにより決定することができる。標準的な3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイを用いて、細胞生存率も評価した。アッセイは、生存細胞中での、水溶性MTT（黄色のテトラゾール）から不溶性の紫色ホルマザンへの変換を含む。続いて、ホルマザンを溶解させ、分光光度計を用いて約500〜600nmの波長での吸光度を測定することにより、濃度を決定する。
【００３８】
*貪食を強化する活性物質の効力を測定するための一般的プロトコール：
HDFによるコラーゲン貪食の分析は、細胞表面に貼りついて包まれる、コラーゲンコート済蛍光ミクロスフェア（F20892 FluoSpheres(登録商標)I型コラーゲン標識ミクロスフェアとしてMolecular Probes社から入手可能な1.0μm黄色-緑色蛍光500/515nmビーズ）を用いて評価した。HDFを、飢餓条件下で48時間、活性物質を用いて処理し、続いて、コラーゲンコート済ミクロスフェア（2×106ビーズ）と共に3時間インキュベートした。次にHDFを洗浄して、緩く結合しているかまたは未結合のミクロスフェアを除去した。蛍光顕微鏡観察を用いて、蛍光ミクロスフェアがHDFによって包み込まれていることを確認した。分光光度計により読み取られた蛍光シグナルを用いて、貪食により取り込まれたコラーゲンを定量的に測定した。未コーティングのスフェアは細胞により保持されなかったので、HDFによる取り込みはコラーゲンコーティングに対して特異的であることが見出された。試験した活性物質のそれぞれが、培地と比較して、コラーゲンコート済ミクロスフェアの貪食を促進することが見出された。
【００３９】
ステップ1で用いた貪食増進活性物質：
1. ワイルドブッシュプラム抽出物
2. メタバイオティクス（Metabiotics）
3. ネオビキシル（Neovixyl）
4. アマチャリキッドB（Amacha liquid B）植物抽出物
5. テオブロマ（Theobroma）
6. ビフィズス菌抽出物
7. Taisohリキッド（Taisoh liquid）
8. NXP-75
【００４０】
結果：
グラフ中に示されるすべての結果に関して、試験物質の非存在下でTGFβ1を用いて産生されたコラーゲンの量と比較して、試験物質およびそれに続くコラーゲン促進剤であるTGFβ1を用いたHDFの連続的処理により生じたコラーゲン産生（プロコラーゲン（Pro-Col）として測定される）での増加割合（％）を確認するために、以下の計算を利用した：
【００４１】
{[[培地中の試験物質を用いた処理（ステップ1）およびその後の培地中のTGFβ1を用いた処理（ステップ2）後に観察されるPro-Colの量]−[培地を用いた処理（ステップ1）およびその後の培地中のTGFβ1を用いた処理（ステップ2）後に観察されるPro-Colの量]]/[[培地中の試験物質を用いた処理（ステップ1）およびその後の培地を用いた処理（ステップ2）後に観察されるPro-Colの量]−[培地を用いた処理（ステップ1）およびその後の培地を用いた処理（ステップ2）後に観察されるPro-Colの量]]×100}−(100)
【００４２】
データに対して用いられた統計解析方法は、ANOVAおよびフィッシャーのLSD事後解析（*＝p＜0.05；**＝p＜0.01）であった。
【００４３】
図1〜図8のそれぞれでは、TGFβ1によって刺激されたコラーゲン合成に対する各貪食増進活性物質の作用を示す。0.25ng/mLで単独で用いられたTGFβ1は、非処理対照と比較してコラーゲン合成を30％増加させたことが見出された。図1では、0.1μg/mLのワイルドブッシュプラム抽出物が、TGFβ1誘導性コラーゲンレベルを187％増加させたことが実証されている。この効果は統計学的に有意ではなかった。1mg/mLで用いられたメタバイオティクス・リフトの効果は、図2に示される通り、TGFβ1誘導性コラーゲンのレベルを51％増加させたことが見出された。この結果は、統計学的に有意である。図3では、10mg/mLで用いられたネオビキシルが、TGFβ1誘導性コラーゲンレベルを78％増加させたことが見出された。この効果もまた、統計学的に有意である。1mg/mLで用いられたアマチャリキッドB植物抽出物は、図4に見られる通り、TGFβ1により誘導されるコラーゲンの量を統計学的に有意に85％増加させたことが実証された。1μg/mLで試験されたテオブロマは、図5に示される通り、TGFβ1誘導性コラーゲンレベルを統計学的に有意に187％増加させたことが見出された。図6に示される結果は、1mg/mLで用いられたビフィズス菌細菌培養液がTGFβ1誘導性コラーゲンレベルを統計学的に有意に376％増加させたことを示す。1μg/mLで試験されたTaisohリキッドは、図7に示される通り、TGFβ1誘導性コラーゲンのレベルを統計学的に有意に5373％増加させたことが見出された。図8に示される結果は、1μg/mLで試験されたNXP75が、TGFβ1誘導性コラーゲンのレベルを統計学的に有意に450％増加させたことを実証する。
【００４４】
図9に示される結果は、1μg/mLで試験されたNXP75が、異なるコラーゲン合成増進剤であるSolペプチドにより誘導されるコラーゲン合成もまた、統計学的に有意に166％増加させたことを実証する。
【００４５】
実施例2：コラーゲン貪食の誘導剤を用いた前処理後のHDFでのNXP75誘導性コラーゲン合成の測定
手順：
1. 1日目に、HDFを96ウェルプレートに播種した。
2. 2日目に、コンフルエンスに達した後のHDFを、培地（対照）または活性物質を用いて、飢餓条件下で48時間処理した（ステップ1）。活性物質は、貪食増進剤であることが本発明者らにより以前に見出された試験物質であった；データは示していない（貪食を強化する活性物質の効力を測定するための一般的プロトコールに関しては、上記の実施例1を参照されたい）。
3. 4日目に、活性物質を除去し、細胞を、培地またはコラーゲン誘導剤である培地中の20μg/mL NXP75を用いて72時間処理した（ステップ2）。
4. 7日目に、培地を回収し、上記の実施例1に記載される通りに、PIP EIAを用いてコラーゲン放出について分析した。
【００４６】
結果：
グラフ中に示されるすべての結果に関して、試験物質の非存在下でNXP75を用いて産生されたコラーゲンの量と比較して、試験物質およびそれに続くコラーゲン促進剤であるNXP75を用いたHDFの連続的処理により生じたコラーゲン産生（プロコラーゲン（Pro-Col）として測定される）での増加割合（％）を確認するために、以下の計算を利用した：
【００４７】
{[[培地中の試験物質を用いた処理（ステップ1）およびその後の培地中のNXP75を用いた処理（ステップ2）後に観察されるPro-Colの量]−[培地を用いた処理（ステップ1）およびその後の培地中のNXP75を用いた処理（ステップ2）後に観察されるPro-Colの量]]/[[培地中の試験物質を用いた処理（ステップ1）およびその後の培地を用いた処理（ステップ2）後に観察されるPro-Colの量]−[培地を用いた処理（ステップ1）およびその後の培地を用いた処理（ステップ2）後に観察されるPro-Colの量]]×100}−(100)
【００４８】
データに対して用いられた統計解析方法は、ANOVAおよびフィッシャーのLSD事後解析（*＝p＜0.05；**＝p＜0.01）であった。
【００４９】
図12および図13のそれぞれでは、NXP75によって刺激されたコラーゲン合成に対する各貪食増進活性物質の作用を示す。図12では、10mg/mLで用いられたネオビキシルが、NXP75誘導性コラーゲン合成を統計学的に有意に55％増加させたことが示される。1mg/mLで用いられた貪食増進剤であるアマチャリキッドBは、NXP75誘導性コラーゲン合成を統計学的に有意に94％増加させたことが観察された。
【００５０】
実施例3：コラーゲン貪食の誘導剤を用いた前処理後のHDFでのNXP75誘導性コラーゲン合成の測定
手順：
1. 1日目に、HDFを96ウェルプレートに播種した。
2. 2日目に、コンフルエンスに達した後のHDFを、培地（対照）または活性物質を用いて、飢餓条件下で48時間処理した（ステップ1）。活性物質は、貪食増進剤であることが本発明者らにより以前に見出された試験物質であった；データは示していない（貪食を強化する活性物質の効力を測定するための一般的プロトコールに関しては、上記の実施例1を参照されたい）。
3. 4日目に、活性物質を除去し、細胞を、培地またはコラーゲン誘導剤である培地中の20μg/mL NXP75を用いて72時間処理した（ステップ2）。
4. 7日目に、培地を回収し、上記の実施例1に記載される通りに、PIP EIAを用いてコラーゲン放出について分析した。
【００５１】
結果：
グラフ中に示されるすべての結果に関して、試験物質の非存在下でNXP75を用いて産生されたコラーゲンの量と比較して、試験物質およびそれに続くコラーゲン促進剤であるNXP75を用いたHDFの連続的処理により生じたコラーゲン産生（プロコラーゲン（Pro-Col）として測定される）での増加割合（％）を確認するために、以下の計算を利用した：
【００５２】
{[[培地中の試験物質を用いた処理（ステップ1）およびその後の培地中のNXP75を用いた処理（ステップ2）後に観察されるPro-Colの量]−[培地を用いた処理（ステップ1）およびその後の培地中のNXP75を用いた処理（ステップ2）後に観察されるPro-Colの量]]/[[培地中の試験物質を用いた処理（ステップ1）およびその後の培地を用いた処理（ステップ2）後に観察されるPro-Colの量]−[培地を用いた処理（ステップ1）およびその後の培地を用いた処理（ステップ2）後に観察されるPro-Colの量]]×100}−(100)
【００５３】
データに対して用いられた統計解析方法は、ANOVAおよびフィッシャーのLSD事後解析（*＝p＜0.05；**＝p＜0.01）であった。
【００５４】
図14〜図18のそれぞれでは、コラーゲン促進活性物質によって刺激されたコラーゲン合成に対する各貪食増進活性物質の作用を示す。図14では、1mg/mLで用いられた貪食増進剤であるTaisohリキッドが、0.1mg/mLで用いられたマイトスティーム（Mitostime）により誘導されるコラーゲン合成を促進したことが見出された。マイトスティーム誘導性コラーゲン合成は、統計学的に有意に141％促進された。1mg/mLで用いられたTaisohリキッドはまた、5μg/mLで用いられたSolペプチドにより誘導されるコラーゲン合成を促進したことも観察された。図15に示される通り、コラーゲン合成は、統計学的に有意に125％促進された。1mg/mLで用いられたTaisohリキッドはさらに、0.4mg/mLで用いられた酵母ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）の抽出物により誘導されるコラーゲン合成を促進したことも示された。図16に示される通り、コラーゲン合成は、統計学的に有意に87％促進された。図17にも示される通り、1mg/mLで用いられたTaisohリキッドは、1mg/mLで用いられたリボキシル（Riboxyl）により誘導されるコラーゲン合成を、統計学的に有意に49％促進する。1mg/mLで用いられた貪食増進剤であるアマチャBリキッドBは、図18で観察される通り、0.4mg/mLで用いられた酵母ハンセヌラ・ポリモルファの抽出物により誘導されるコラーゲン合成を、統計学的に有意に348％増加させたことが観察された。
【００５５】
実施例4：HDFによるコラーゲン貪食に対するコラーゲンの糖化の影響
糖化最終産物（AGE）修飾型コラーゲンは、MMP（すなわち、コラーゲンターンオーバーの細胞外経路）によるものなどのタンパク質分解に対する感受性低下に起因する硬化および弾力性の低下を引き起こす架橋を特徴とする。眼窩周囲領域の目尻のしわなどの皮膚領域は、同様に、MMPによる分解に対して抵抗性である硬化したコラーゲンを特徴とするので、本発明者らは、糖化がHDFによるコラーゲン貪食に影響を及ぼし得るかを調べた。
【００５６】
A. メチルグリオキサールへのコラーゲンコート済ミクロスフェアの曝露
手順：
1. コラーゲンコート済ミクロスフェアを、糖化誘導剤であるメチルグリオキサールと共に一晩インキュベートした。
2. 続いて、ミクロスフェアをアミン反応性蛍光色素（Alexa Fluor 594 NHSエステル）と共にインキュベートし、色素の蛍光を測定した。
【００５７】
メチルグリオキサールとコラーゲンとの間の酸化反応の影響を、コラーゲン上の遊離の未修飾アミン基（メチルグリオキサールによる糖化反応に対する標的）の量を検出することにより測定した。プローブとの低い反応率は、糖化型コラーゲンの存在を示すものである。
【００５８】
図10に示される結果は、コラーゲンの遊離の未修飾アミン官能基に対する蛍光シグナルは、メチルグリオキサールとインキュベートされたコラーゲンコート済ミクロスフェアビーズに対して、より低いことを示し、このことは、メチルグリオキサールへのコラーゲンコート済ミクロスフェアビーズの曝露が、コラーゲンの修飾（すなわち、糖化）を引き起こしたことを確認する。
【００５９】
B. HDFによる糖化型コラーゲン貪食の測定
手順：
1. 1日目に、HDFを24ウェルプレートに播種した。
2. 2日目に、コンフルエンスに達した後のHDFを、飢餓条件下で48時間維持した。
3. 4日目に、HDFを、対照としてのコラーゲンコート済ミクロスフェア（2×106ビーズ）または糖化誘導剤であるメチルグリオキサールを用いて一晩前処理されたコラーゲンコート済ミクロスフェア（2×106ビーズ）と共に、3時間インキュベートした。続いて、PBSを用いてHDFを洗浄して、未結合ビーズおよび緩く結合しているビーズを除去した。
4. Presto Blue試薬を用いて細胞生存率を測定し；上記の実施例1に記載された手順を用いて内在化したビーズの蛍光読み取り値を決定することにより貪食を測定した。
【００６０】
図11に示される結果は、貪食指数（すなわち、生存率シグナルにより除算された貪食蛍光シグナルの比率）として表わされている。結果により、メチルグリオキサールを用いて前処理されたコラーゲンコート済ミクロスフェアビーズは、未修飾コラーゲンを用いてコーティングされたミクロスフェアビーズと実質的に同じ割合でHDFにより取り込まれたことが示される。これらの結果から、本発明者らは、コラーゲンターンオーバーを促進するための本発明の方法を、コラーゲンがMMPによる分解に対して抵抗性である眼窩周囲領域などの処置が難しい皮膚の領域での加齢の徴候を防止または除去するために成功裏に用いることができたことを理論化する。
【００６１】
本発明の数種類の例示的実施形態を上記で説明してきたが、そのような例示的実施形態は、いかなる様式であっても、本発明の広い範囲を限定するものと解釈されるべきではない。記載された実施形態およびその構成要素の種々の改変および等価物が、当業者には明らかであろう。一部の改変および等価物は当業者には容易に認識されるであろうし、他の改変および等価物は慣用の実験法以上のものを必要としない場合がある。したがって、そのような改変および等価物は、本発明の精神および範囲の内に入ることが理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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