(57)【要約】本明細書においては、以下の段階を含む、ヒトETV2遺伝子を発現するキメラ非ヒト動物を産生するための方法が記載される：(a) 非ヒトETV2遺伝子の両方のコピーが、該非ヒト動物において機能的ETV2タンパク質の産生を妨害する変異を有する、ETV2ヌル非ヒト動物細胞を生成する段階；(b) (a) のETV2ヌル非ヒト動物細胞由来の核を、除核された非ヒト卵母細胞へ融合させること、および該卵母細胞を活性化させてETV2ヌル非ヒト胚盤胞を形成するように分裂させることを含む体細胞核移植により、ETV2ヌル非ヒト胚盤胞を創出する段階；(c) ヒト幹細胞を (b) のETV2ヌル非ヒト胚盤胞に導入する段階；ならびに(d) (c) の胚盤胞を偽妊娠中の代理母非ヒト動物に移植して、ヒトETV2を発現するキメラ非ヒト動物を生成する段階。2018506984.tif 000017
2018506984.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト動物細胞または胚盤胞が機能的ETV2タンパク質を欠くように、ゲノムが、ETV2遺伝子の両方のアリルに変異を有する、該非ヒト動物細胞または胚盤胞。
【請求項２】
変異がETV2遺伝子の欠失である、請求項1に記載の非ヒト動物細胞または胚盤胞。
【請求項３】
ブタ、ウシ、ウマまたはヤギである、請求項1または2に記載の非ヒト動物細胞または胚盤胞。
【請求項４】
キメラ非ヒト動物または胚盤胞であって、ヒトETV2を発現し、かつ該非ヒト動物ETV2の発現を欠く、該キメラ非ヒト動物または胚盤胞。
【請求項５】
非ヒト動物が、白血球、赤血球、血小板またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるヒト血液細胞を生じる、請求項4に記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項６】
ヒト内皮を生じる、請求項4に記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項７】
非ヒト動物がブタ、ウシ、ウマまたはヤギである、請求項4〜6のいずれか一項に記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項８】
以下の段階を含む、ヒトETV2遺伝子を発現するキメラ非ヒト動物を産生するための方法：
(a) ETV2ヌル非ヒト動物細胞を生成する段階であって、非ヒトETV2遺伝子の両方のコピーが、該非ヒト動物において機能的ETV2タンパク質の産生を妨害する変異を有する、段階；
(b) (a) のETV2ヌル非ヒト動物細胞由来の核を、除核された非ヒト卵母細胞へ融合させること、および該卵母細胞を活性化させてETV2ヌル非ヒト胚盤胞を形成するように分裂させることを含む体細胞核移植により、ETV2ヌル非ヒト胚盤胞を創出する段階；
(c) ヒト幹細胞を (b) のETV2ヌル非ヒト胚盤胞に導入する段階；ならびに
(d) (c) の胚盤胞を偽妊娠中の代理母非ヒト動物に移植して、ヒトETV2を発現するキメラ非ヒト動物を生成する段階。
【請求項９】
以下の段階を含む、ヒトのおよび／またはヒト化された血液細胞または血管を非ヒト動物において産生する方法：
(a) ETV2ヌル非ヒト動物細胞を生成する段階であって、非ヒトETV2遺伝子の両方のアリルが、機能的ETV2タンパク質の産生を妨害する変異を有する、段階；
(b) (a) のETV2ヌル非ヒト動物細胞由来の核を、除核された非ヒト卵母細胞へ融合させること、および該卵母細胞を活性化させてETV2ヌル非ヒト胚盤胞を形成するように分裂させることを含む体細胞核移植により、ETV2ヌル非ヒト胚盤胞または桑実胚を創出する段階；
(c) ヒトドナー幹細胞を (b) のETV2ヌル非ヒト胚盤胞に導入する段階；ならびに
(d) ヒトのおよび／またはヒト化された血液細胞または血管を生じる非ヒト動物を生成するように、(c) の胚盤胞または桑実胚を偽妊娠中の代理母非ヒト動物に移植する段階。
【請求項１０】
非ヒト動物がブタ、ウシ、ウマまたはヤギである、請求項8または9に記載の方法。
【請求項１１】
ヒトドナー幹細胞が組織特異的幹細胞、多能性幹細胞、多分化能成体幹細胞、人工多能性幹細胞、またはさい帯血幹細胞 (UCBSC) である、請求項8または9に記載の方法。
【請求項１２】
幹細胞を提供するドナーが、産生されたヒト化組織または器官のレシピエントである、請求項9に記載の方法。
【請求項１３】
ヒト人工多能性細胞が繊維芽細胞から形成されたものである、請求項9に記載の方法。
【請求項１４】
請求項8または9に記載の方法によって産生された非ヒト動物。
【請求項１５】
請求項8または9に記載の方法により生成された2体の非ヒト動物の交配から産生された子孫非ヒト動物であって、該子孫非ヒト動物がヒトETV2を発現し、該子孫非ヒトのゲノムが該非ヒト動物ETV2遺伝子のホモ接合性欠失を有する、子孫非ヒト動物。
【請求項１６】
非ヒト動物がブタ、ウシ、ウマまたはヤギである、請求項15に記載の子孫非ヒト動物。
【請求項１７】
前記血液細胞が、ヒト人工多能性幹細胞またはヒトさい帯血幹細胞に由来する白血球、赤血球、および／または血小板である、請求項9に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、2015年3月3日付の米国仮特許出願第62/127,330号の優先権の恩典を主張し、この優先権の恩典は本明細書により主張され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表
本文書は、配列表電子テキストファイルを参照により本明細書に組み入れ、これは、EFS-Webを介して電子フォーマットで提出される。「1552048.txt」という名の本テキストファイルは12,288バイトであり、2016年3月1日に作成された。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
血液は人体の主要な器官であり、細胞と血漿から構成される。細胞性の部分は赤血球、白血球、および血小板を含む。血漿の構成成分は、水と、とりわけタンパク質、糖または電解質などの溶解した化合物とからなる。
【０００４】
血液の形成は原腸陥入の間に開始される。最初の造血系列は卵黄嚢の血島に現れる。造血前駆細胞の分化は遺伝的プログラムにより制御される。この遺伝的プログラムの鍵となる因子はEts variant gene 2 (Etv2) という遺伝子であることが最近示された (Stem cells. 2012 August; 30(8): 1611-1623. doi:10.1002/stem. 1131（非特許文献1）)。マウスにおけるEtv2遺伝子の消失は卵黄嚢における造血系列および内皮系列の喪失をもたらした。Etv2変異型におけるEtv2遺伝子の強制過剰発現は造血系列および内皮系列を回復させた (Genesis 2013 Jul:51(7):471-480. Doi: 10.1002/dvg.22396（非特許文献2）)。
【０００５】
血液疾患は赤血球の産生に (すなわち貧血症)、白血球の増殖に (すなわち白血病)、または血小板の凝固に (すなわち凝血障害)、影響し得る。献血された血液がこれらの多様な疾患の治療に用いられる。赤血球は、鎌状赤血球貧血症、地中海貧血症、再生不良性貧血症、白血病または癌に伴う慢性の貧血症の患者の治療に用いられる。血小板は外科手術を受けている患者の出血の管理に用いられる。現在のところ、ヒトの血液の唯一の供給源はヒトドナーである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Stem cells. 2012 August; 30(8): 1611-1623. doi:10.1002/stem. 1131
【非特許文献２】Genesis 2013 Jul:51(7):471-480. Doi: 10.1002/dvg.22396
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ブタにおけるEtv2遺伝子の欠失が造血内皮の (hematoendothelial) 発生の初期段階において造血系列および内皮系列の消失を引き起こすという、新規の発見に基づいている。本発明は、ブタEtv2遺伝子を欠損した (かつしたがってブタの血管系および血液を欠損した) ブタ胚盤胞を生成する。本発明は、Etv2遺伝子陽性の、iPS細胞などのヒト幹細胞を、(Etv2を欠損した) 変異型ブタ胚盤胞に注入することにより、iPS細胞などのヒト幹細胞由来の、ヒトのまたはヒト化された血液および血管系を産生するブタを生成する。毎年、300,000人を超えるアメリカ人が冠状動脈バイパス移植を受けており、このような遺伝子工学的に操作された心臓血管の利用から利益を得るだろう。
【０００８】
ETV2ノックアウトブタまたはその他の動物、例えば雌ウシもしくはヤギを、臨床応用のために、個別化されたヒトの／ヒト化された血液および血管系の産生のための宿主として開発することが、本明細書に記載される。血液を生成する前駆細胞は、血管の内側の裏打ちである内皮をも生成する。内皮の非存在下では血管系は存在せず、発生中の胚は生存できない。心臓血管系および造血系疾病の治療のためのヒトの／ヒト化された組織の新規の供給源として役立つことに加えて、ヒト化されたブタは、ヒト系列の再生および／または薬剤に対する応答を研究するための大型動物モデルとしても役立つであろう。Etv2は旧来の心臓血管系および造血内皮系の転写因子およびシグナルカスケードの標的として発見され、Etv2が造血内皮系列の運命決定および分化を制御することが実証された。加えて、Etv2変異型マウス胚は生存不可能であり内皮／血管系列および造血系列を欠くことが指摘された。ETV2変異型ブタ胚は造血系列および内皮系列を欠くことが、遺伝子編集テクノロジーを用いてさらに確立された。これらの結果に基づくと、Etv2は、発生中の造血内皮系列の主要制御因子である。本明細書においては、ヒト化された遺伝子改変代理母動物の遺伝子工学的操作が記載される。
【０００９】
一つの態様は非ヒト動物細胞または胚盤胞が機能的ETV2タンパク質を欠くように、ゲノムが、ETV2遺伝子の両方のアリルに変異を有する、該非ヒト動物細胞または胚盤胞を提供する。一つの態様において、変異はETV2遺伝子の欠失である。別の態様において、非ヒト動物細胞または胚盤胞はブタ、ウシ、ウマ、またはヤギである。
【００１０】
一つの態様は、キメラ非ヒト動物または胚盤胞であって、ヒトETV2を発現しかつ該非ヒト動物ETV2の発現を欠く、該キメラ非ヒト動物または胚盤胞を提供する。一つの態様において、非ヒト動物は、白血球、赤血球、血小板またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるヒト血液細胞を生じる。別の態様において、キメラ非ヒト動物はヒト内皮を生じる。一つの態様において、非ヒト動物はブタ、ウシ、ウマ、またはヤギである。
【００１１】
一つの態様は、以下の段階を含む、ヒトETV2遺伝子を発現するキメラ非ヒト動物を産生するための方法を提供する：
(a) ETV2ヌル非ヒト動物細胞を生成する段階であって、非ヒトETV2遺伝子の両方のコピーが、該非ヒト動物において機能的ETV2タンパク質の産生を (単独でまたは他の遺伝子と共に) 妨害する変異を有する、段階；
(b) (a) のETV2ヌル非ヒト動物細胞由来の核を、除核された非ヒト卵母細胞へ融合させること、および該卵母細胞を活性化させてETV2ヌル非ヒト胚盤胞を形成するように分裂させることを含む体細胞核移植により、ETV2ヌル非ヒト胚盤胞を創出する段階；
(c) ヒト幹細胞を (b) のETV2ヌル非ヒト胚盤胞に導入する段階；ならびに
(d) (c) の胚盤胞を偽妊娠中の代理母非ヒト動物に移植して、ヒトETV2を発現するキメラ非ヒト動物を生成する段階。
【００１２】
別の態様は、以下の段階を含む、ヒトのおよび／またはヒト化された血液細胞または血管を非ヒト動物において産生する方法を提供する：
(a) ETV2ヌル非ヒト動物細胞を生成する段階であって、非ヒトETV2遺伝子の両方のアリルが、機能的ETV2タンパク質の産生を妨害する変異を有する、段階；
(b) (a) のETV2ヌル非ヒト動物細胞由来の核を、除核された非ヒト卵母細胞へ融合させること、および該卵母細胞を活性化させてETV2ヌル非ヒト胚盤胞を形成するように分裂させることを含む体細胞核移植により、ETV2ヌル非ヒト胚盤胞または桑実胚を創出する段階；
(c) ヒトドナー幹細胞を (b) のETV2ヌル非ヒト胚盤胞に導入する段階；ならびに
(d) ヒトのおよび／またはヒト化された血液細胞または血管を生じる非ヒト動物を生成するように、(c) の胚盤胞または桑実胚を偽妊娠中の代理母非ヒト動物に移植する段階。一つの態様において、血液細胞は、ヒト人工多能性幹細胞またはヒトさい帯血幹細胞に由来する白血球、赤血球、および／または血小板である。
【００１３】
一つの態様において、非ヒト動物はブタ、ウシ、ウマまたはヤギである。別の態様において、ヒトドナー幹細胞は組織特異的幹細胞、多能性幹細胞、多分化能成体幹細胞、人工多能性幹細胞、またはさい帯血幹細胞 (UCBSC) である。一つの態様において、幹細胞を提供するドナーは、産生されたヒト化された組織または器官のレシピエントである。別の態様において、ヒト人工多能性細胞は繊維芽細胞から形成される。
【００１４】
一つの態様は、本明細書に記載された方法により産生された非ヒト動物を提供する。別の態様は、本明細書に記載された方法により生成された2体の非ヒト動物の交配から産生された子孫非ヒト動物であって、該子孫非ヒト動物がヒトETV2を発現し、該子孫非ヒト動物のゲノムが該非ヒト動物ETV2遺伝子のホモ接合性欠失を有する、子孫非ヒト動物を提供する。一つの態様において、非ヒト動物はブタ、ウシ、ウマまたはヤギである。
【００１５】
一つの態様は、遺伝子ノックアウトブタ細胞または胚盤胞であって、該ブタ細胞または胚盤胞が機能的ETV2タンパク質を欠くように、ゲノムが、ETV2遺伝子の欠失を含み、該ブタ細胞または胚盤胞がその欠失についてホモ接合性である、遺伝子ノックアウトブタ細胞または胚盤胞を提供する。一つの態様において、野生型ブタ (イノシシ (Sus scrofa)) ETV2 (ets variant 2) の配列はENSSSCG00000002906において提供される。別の態様において、イノシシets variant 2 (ETV2) mRNAおよびタンパク質の推定配列は以下に提供される。
2018506984.tif 000003
2018506984.tif 000004
【００１６】
一つの態様は、(Etv2を欠損した) ETV2変異型ブタを提供する。別の態様において、キメラETV2変異型ブタは、白血球、赤血球、血小板またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるヒトのまたはヒト化された血液細胞ならびにヒトのまたはヒト化された内皮を生じる。
【００１７】
一つの態様は、以下の段階を含む、ETV2変異型ブタを産生するための方法を提供する：
(a) ETV2ヌルブタ細胞を生成する段階；
(b) (a) のETV2ヌルブタ細胞由来の核を、除核されたブタ卵母細胞へ融合させること、および該卵母細胞を活性化させてETV2ヌルブタ胚盤胞を形成するように分裂させることを含む体細胞核移植 (SCNT) により、ETV2ヌルブタ胚盤胞を創出する段階；
(c) ヒト幹細胞をETV2ヌルブタ胚盤胞に導入する段階。
【００１８】
別の態様は、以下の段階を含む、ヒトのまたはヒト化された血液細胞およびヒトのまたはヒト化された内皮を、ブタにおいて産生する方法を提供する：
(a) ETV2ヌルブタ細胞を生成する段階；
(b) (a) のETV2ヌルブタ細胞由来の核を、除核されたブタ卵母細胞へ融合させること、および該卵母細胞を活性化させてETV2ヌルブタ胚盤胞を形成するように分裂させることを含む体細胞核移植 (SCNT) により、ETV2ヌルブタ胚盤胞を創出する段階；
(c) ヒト幹細胞を (b) のETV2ヌルブタ胚盤胞 (胞胚腔) に導入する段階；ならびに、
(d) ヒトの／ヒト化された血液細胞およびヒトの／ヒト化された内皮を有するブタ (ヒト幹細胞が遺伝子編集された胚盤胞に加えられている) を生成するように、(c) の胚盤胞を偽妊娠中の／代理母ブタに移植する段階。一つの態様において、血液細胞および内皮は、ヒトiPS細胞またはヒトさい帯血幹細胞に由来する、白血球、赤血球、血小板および／または内皮である。
【００１９】
各レシピエントの免疫複合体に対して個別化されたヒトのまたはヒト化された組織および器官を作ることは有用であろう。本明細書に開示されているように、大型動物を宿主として用い、標的器官の成長および／または分化に関与する遺伝子をノックアウトまたは弱めるようにそのゲノムを編集して、該器官の成長および発生のための失われた遺伝情報を補完するように胚盤胞または接合子のステージで該動物にドナー幹細胞を植え付けることにより、それを行うことができる。結果として、補完された組織 (ヒトの/ヒト化された器官) がドナーの遺伝子型および表現型に適合するキメラ動物が得られる。そのような器官は一世代で作られ得、かつ幹細胞は患者自身の身体から採られるか、または生成され得る。本明細書に開示されているように、単一細胞内の複数の遺伝子を同時に編集すること (例えば、参照により本明細書に組み入れられるWO2015/168125を参照) により、これが可能である。複数の遺伝子が、脊椎動物細胞または胚における標的指向させたヌクレアーゼおよび相同組み換え修復 (HDR) テンプレートを利用した編集の標的となり得る。
【００２０】
一つの態様は、以下の段階を含む、非ヒト宿主動物においてヒト化された組織を産生するための方法を提供する：(i) 宿主の細胞または胚における、所望の組織または器官の成長および／または発生に関与する一つまたは複数の遺伝子を遺伝的に編集する段階；(ii) ヒト化された組織または器官を産生するように (細胞 (例えば幹細胞) による補完の利用を通じてキメラ動物を産生するように)、ドナーからの幹細胞の有効量を細胞、胚、接合子または胚盤胞 (例えば、ヒト−ブタ胚盤胞) に注入することにより宿主の失われた遺伝情報を補完して、キメラ動物を創出する段階。
【００２１】
一つの態様において、幹細胞はヒト人工多能性幹細胞 (iPS細胞) またはヒトさい帯血幹細胞である。一つの態様において、ヒトiPS細胞は線維芽細胞または任意の成熟細胞すなわち体細胞 (例えばヒト細胞) から形成された。一つの態様において、ETV2ヌルブタ細胞はTALENSを用いた遺伝子編集を用いて創出された (遺伝子: ETV2 ENSSSCG00000002906)。
【００２２】
キメラブタを産生する方法および本発明のキメラブタから組織を産生する方法が、さらに記載される。一つの態様は、本明細書に記載された方法から生成された2頭のブタの交配から産生された子孫ブタであって、該子孫ブタがヒトETV2を発現し、該子孫ブタのゲノムがブタETV2遺伝子のホモ接合性欠失を含む、子孫ブタを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】Etv2は造血系列および内皮系列の主要制御因子である。Etv2変異型および野生型の同腹子の胚をE8.5に回収し、切片を作り、ヘマトキシリン-エオシン染色およびエンドムチン抗体 (α-エンドムチン) を用いた免疫組織化学により解析した。このステージで、野生型胚においては一次心臓血管 (primary heart vein) (PHV)、背側大動脈 (DA)、および心内膜 (End) が形成されるが、Etv2変異型マウスはこれらの構造を欠いている。抗エンドムチン染色は、血管 (矢頭) および心内膜 (矢印) を明らかにしているが、これらは変異型の胚には存在しない。
【図１Ｂ】Etv2は造血系列および内皮系列の主要制御因子である。E8.5のEtv2野生型 (Wt)、ヘテロ接合性 (Het)、および変異型の胚からの卵黄嚢細胞を用いたメチルセルロースコロニー形成アッセイ。Etv2について野生型およびヘテロ接合性の動物が類似のコロニー形成活性を有する一方、Etv2変異型の卵黄嚢細胞は有さないことに注意されたい。
【図１Ｃ】Etv2は造血系列および内皮系列の主要制御因子である。安定にトランスフェクトされたES細胞系統を、ドキシサイクリン (Dox) 誘導性の様式でEtv2を発現するように遺伝子工学的に操作した。ES細胞を4日間分化させ、Doxの添加によりEtv2を誘導させた。5日間の誘導後のフローサイトメトリー解析は、Etv2が誘導されると造血系列 (CD45+) および内皮系列 (PECAM+またはTie2+) の両方が有意に増加することを実証した。
【図１Ｄ】Etv2は造血系列および内皮系列の主要制御因子である。Etv2誘導三日目から六日目までのEBのコロニー形成活性。Etv2が誘導されると造血活性が増加したことに注意されたい。白いバー：誘導なし、黒いバー：Dox誘導。
【図２】中胚葉系列の運命決定におけるEtv2の提唱される役割。
【図３−１】Flk1ではなくEtv2が、Etv2変異型ESC/EBの内皮系および造血系の表現型をレスキューできる。Etv2およびFlk1はFlk1-/-のESC/EBの内皮系分化をレスキューできるが (A)、Etv2-/-のESC/EBの内皮系分化をレスキューできるのはEtv2だけである (B) ことを実証するFACS解析の定量化。造血系マーカーにより同様の結果が得られた (データ不掲載)。
【図３−２】Flk1ではなくEtv2が、Etv2変異型ESC/EBの内皮系および造血系の表現型をレスキューできる。系列ならびにEtv2およびFlk1に対するレスキュー研究の概要がパネルに提示される (C)。
【図３−３】Flk1ではなくEtv2が、Etv2変異型ESC/EBの内皮系および造血系の表現型をレスキューできる。Gata2は物理的に相互作用し、かつEtv2活性を増幅する。(D) Etv2-Gata2コンストラクトの模式図。Etv2およびGata2は2Aペプチド配列を介して連結され、均等に発現する。融合コンストラクトは、Etv2およびGata2の2つのタンパク質へと、リボソームスキッピング機構によって翻訳された。(E〜F) Etv2およびGata2のEBにおける共発現が造血系列および内皮系列の分化の増強をもたらす。EBを、EB三日目から四日目までドキシサイクリン処理するか (+Dox)、または未処理のままにし (-Dox)、六日目にFACS解析のために採取した。造血系列はc-Kit＋/CD41＋細胞集団として同定され (E)、かつ内皮系列はFlk1＋/CD31＋と表される (F)。
【図３−４】Flk1ではなくEtv2が、Etv2変異型ESC/EBの内皮系および造血系の表現型をレスキューできる。パネルGは、内皮系列および造血系列における、Etv2の上流の制御因子および下流の標的を強調する。
【図４Ａ】TALENによるETV2のノックアウト。遺伝子編集を検出するために3段 (three-tired) PCRアッセイが利用された。プライマーa-dからの増幅は欠失アリルが存在することを指し示した。ヘテロ接合性およびホモ接合性クローンを区別するために、プライマーa-bおよびc-dを用いて野生型アリルを増幅した。a-dからの産物が存在しかつa-b、c-dからの産物が両方共存在しない場合のみ、クローンは欠失アリルについてホモ接合性であると考えられる。
【図４Ｂ】TALENによるETV2のノックアウト。これらの基準に適合するクローンを緑色の四角で囲んだ。
【図５】図5A〜H。ブタETV2の喪失はマウスEtv2変異型の表現型を再現した。E18.0の野生型ブタ胚 (A) および同一の発生ステージのETV2ノックアウト胚 (B)。挿入図は、尿膜の拡大図を示す。変異型における、血管網形成を欠いた異常な全体的形態に注意されたい (挿入図)。(C〜H) AおよびBにそれぞれ示された胚の尿膜 (C、D)、心臓の高さ (E、F)、および体幹の高さ (G、H) を通る断面を、内皮系マーカーTie2；心臓系列マーカーGata4；および核の対比染色である4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) により染色した。野生型尿膜はTie2陽性の内皮系の裏打ちにより高度に血管形成しており、かつ血液を含む (C、矢印) のに対し、変異型はこれらの集団を欠いていた (D)。野生型胚においては心内膜、主静脈 (CV)、および背側大動脈 (DA) は明瞭に見える (E、G)。対照的に、ETV2ヌル胚はこれらの構造を完全に欠いていたが、Gata4 (緑色) により標識された心臓前駆体および腸は存在していた (それぞれFおよびH)。スケールバー：1000μm (A、B)、200μm (A、Bにおける挿入図)、100μm (C〜H)。
【図６】図6A〜H。Etv2変異型マウス胚の野生型ES細胞による補完。Etv2-/+マウスとEtv2dFl/+マウスとの交配から得られた胚盤胞に10〜15個のEYFP標識野生型ES細胞を注入した。E10.5に胚を採取し、遺伝子型を決定した。A、B：野生型ES細胞の子孫の分布を示す全載落射蛍光像。C〜H：それぞれAおよびBに示された胚の心臓 (心室) を通る断面。パネルはEYFP (C、D)、エンドムチン (E、F) 免疫組織化学、および重ね合わせ像 (G、H) を示す。スケールバー：1000μm (A、B)、および100μm (C〜H)。
【図７】図7A〜C。Etv2変異型および野生型のES細胞の共分化。7AC5、EYFPで標識され他の点では野生型であるES細胞およびEtv2変異型ES細胞 (Etv2-/-) を、別々に分化させるか (上二段)、または、混合して懸滴法により共分化させた (下段)。細胞を四日目に分離させ、細胞表面マーカーについて解析した。EYFP陰性Etv2変異型細胞は内皮系列および造血系列に寄与せず、これにより野生型ES細胞からの傍分泌の影響は最小限であることで指し示されることに注意されたい。
【図８】図8A〜C。野生型ラットES細胞はEtv2変異型マウスES細胞が内皮となる能力をレスキューする。野生型マウスES細胞 (A)、Etv2変異型マウスES細胞 (B)、または1:1の比率のEtv2変異型マウスES細胞および野生型ラットES細胞 (C) が、EB形成によって、分化を誘導された。野生型マウスES細胞は、血管様構造を裏打ちするCD31+細胞を生成し (A)、これが変異型EBでは見られない (B) ことに注意されたい。野生型ラットES細胞との共分化はCD31+集団を回復した (C)。
【図９】図9A〜B。ヒト-ブタキメラ胚盤胞。(A) hUCBSCをICM内に有する胚盤胞。胚盤胞が孵化を開始しつつあることに注意されたい。(B) DiI標識hiPSCをICM内に有する胚盤胞。隣接するDiI標識hiPSCを有する孵化した胚盤胞に注意されたい。ZP：透明帯；ICM：内部細胞塊。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
本明細書には、ブタなどのETV2 (または他の遺伝子のノックアウトと組み合わせたETV2) ノックアウト動物の、臨床および前臨床応用に向けた、個別化されたヒトの/ヒト化された血液および血管系の産生のための宿主としての開発が記載される。心臓血管系および造血系の疾病の治療に向けたヒトの/ヒト化された組織の新規の供給源として役立つ事に加えて、ブタなどのヒト化された動物は、ヒト系列の再生、または薬剤に対する応答の研究のための大型動物モデルとしても役立つであろう。
【００２５】
血液および心臓血管系の疾病はどちらもよく見られ、命に関わる (1〜3)。これらの疾病は慢性、衰弱性および致死性であり、かつこれらは新規の治療法を必要とする。血液および心臓血管系の発生プログラムは多数の重なり合う特徴を有し、どちらも側板中胚葉から派生したものであり、どちらも転写因子、シグナルカスケード、および細胞外における指示の交差ネットワークによって、同時制御される。最近の研究は、共通する前駆娘細胞が造血内皮系列を生み出すことを示唆している。Etv2/Etsrp71/ER71は、Mesp1、Flk1/Creb、およびNkx2-5を包含している旧来の心臓血管系および造血内皮系の転写因子およびシグナルカスケードの標的である。Etv2は造血内皮系列の運命決定および分化を制御することが実証されている (4〜17)。加えて、Etv2変異型のマウス胚は生育不能であり、かつ、中胚葉 (造血および内皮) 系列の発生を混乱させた (9、10)。本明細書に記載されたデータは、ETV2変異型のブタ胚もまた生育不能でありかつ造血系列および内皮系列を欠くことを立証する。この結果に基づけば、Etv2は発生中における造血内皮系列の主要制御因子である。本明細書にはETV2ノックアウトブタの、臨床応用のための個別化されたヒト血液および血管系の産生のための宿主としての開発が記載される。このヒト化された大型動物モデルは、再生医療のための重要なリソースであると考えられ、かつ、個別化されたヒト化されたブタの器官生成のプラットホームとして役立つであろう。この戦略は、慢性の心臓血管系および造血系疾病ならびに移植のための新しい治療法の開発に対し重大な影響力を持つ可能性がある。心臓血管系および造血系疾病の治療のためのヒト組織の新規の供給源として役立つことに加えて、ヒト化されたブタは、ヒト系列の再生または薬剤に対する応答の研究のための大型動物モデルとしても役立つであろう。
【００２６】
定義：
本発明の記載および請求においては、下記に定める定義の通りの以下の用語法が用いられる。別に定義されない限り、本明細書に用いられるすべての技術的および科学的用語は本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同等のいかなる方法および材料も、本発明の実施または試験において用いられ得る。遊離基、置換基、および範囲について下記に列挙される特定かつ所望の値は単なる例示であり、それらは遊離基および置換基についての他の所定の値または所定の範囲内の他の値を除外しない。
【００２７】
本明細書に用いられる冠詞「一つの」および「ある」とは一つまたは複数の、すなわち少なくとも一つの、該冠詞の文法上の目的語を意味する。例示するなら「ある要素」は一つの要素または複数の要素を意味する。
【００２８】
本明細書に用いられる用語「約」は、およそ、〜の領域内、概略的に、または、〜近辺を意味する。用語「約」が数値の範囲と共に用いられる時、これは、その範囲を、定められた数値の上下に境界を広げるように修正する。一般的に、本明細書において、用語「約」は数値を、記載された値の上下に20%の分散で修正するように用いられる。
【００２９】
用語「単離された」は、一つもしくは複数の因子も、細胞も、または、インビボにおいて一つもしくは複数の因子もしくは細胞に付随する一つもしくは複数の細胞構成成分も伴っていない、該一つまたは複数の因子または細胞を意味する。
【００３０】
「細胞」とは、ヒトを包含する哺乳動物などの脊椎動物の細胞を包含し、または「対象」とは、ヒトを包含する哺乳動物などの脊椎動物である。哺乳動物はヒト、農業用動物、スポーツ用動物、および伴侶動物を包含するが、それらに限定されない。用語「動物」に包含されるのは、イヌ、ネコ、魚、スナネズミ、モルモット、ハムスター、ウマ、ウサギ、ブタ、マウス、サル (例えば、類人猿、ゴリラ、チンパンジー、またはオランウータン)、ラット、ヒツジ、ヤギ、雌ウシ、および鳥が包含される。
【００３１】
用語「ブタ (pig)」および「ブタ (swine)」および「ブタ (porcine)」は交換可能に用いられ、かつ、性別、大きさ、または品種に関わらず、同一のタイプの動物を意味する包括的な用語である。
【００３２】
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ (TALEN) は、TALエフェクターDNA結合ドメインをDNA開裂ドメインに融合させることで生成された人工制限酵素である。これらの試薬は、インサイチューでのゲノム編集のための効率的で、プログラム可能で、かつ特異的なDNA開裂を可能にする。転写活性化因子様エフェクター (TALE) は、配列特異的にDNAに結合するタンパク質である。このようなTALEをヌクレアーゼ (例えば、FokIエンドヌクレアーゼ) に融合させることで、高度に特異的なDNA「ハサミ」が作られる (これらの分子は、任意のDNA配列に結合するように遺伝子工学的に操作され得る)。本明細書において用いられるTALENという用語は広義であり、かつもう一つのTALENの補助なしに二本鎖DNAを開裂し得る単量体TALENを包含する。TALENという用語は、DNAを同一の部位で開裂するよう協働するように遺伝子工学的に操作された一対のTALENのうち一方または両方のメンバーを意味するようにも用いられる。協働するTALENは、DNAの掌性を基準として、左TALENおよび右TALENと呼ばれ得る。
【００３３】
TALEN遺伝子が構築されたらプラスミドに挿入され、次にそのプラスミドは標的細胞をトランスフェクトするために用いられ、ここで、その遺伝子産物が発現し、核に入り、ゲノムにアクセスする。TALENは、二本鎖切断 (DSB) を誘導すること、および任意で、積荷／予め選択された遺伝子を挿入することによってゲノムを編集するのに使われ得、細胞は修復機構によってそれに応答する。この様式で、ゲノム中の、例えば疾病を引き起こす変異を訂正することに用いられ得る。
【００３４】
遺伝子編集を含む遺伝子操作は、当業者に利用可能な任意の方法によって、例えば標的化エンドヌクレアーゼ、および相同組み換え修復 (HDR)、TALEN、CRISPR (例えばCAS9/CRISPR)、リコンビナーゼ融合分子、合成ブタ人工染色体、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー、またはrAAVに基づく遺伝子編集システムの使用によって、(例えば、所望の標的遺伝子をノックアウトするために) 行われ得る。さらに、ノックアウト目的のために、遺伝子の不活性化のために (干渉RNA (shRNA、siRNA、dsRNA、RISC、miRNA) など)、または遺伝子を発現するために、様々な核酸が細胞に導入され得る。
【００３５】
体細胞核移植 (SCNT) は体細胞および卵細胞から生育可能な胚を創出するための試験室技術である。体細胞核移植の方法は二つの異なる細胞を必要とする。一つ目は卵子 (卵／卵母細胞) として知られる雌性配偶子である。二つ目は、人体の細胞を意味する体細胞である。皮膚細胞、脂肪細胞、および肝細胞はその一部の例にすぎない。ドナー卵細胞の核は、「脱プログラム状態」のまま、取り出されて廃棄される。体細胞の核もまた取り出されるが、保持され、除核された体細胞が破棄される。残っているのは、細胞なしの体細胞核および除核された卵細胞である。次いで、体細胞核を「空の」卵子の中へ注入することにより、これらを融合させる。卵に挿入された後、体細胞核はその宿主卵細胞により再プログラムされる。今や体細胞核を含んでいる卵子は、衝撃により刺激され、分裂を開始する。今や卵は生育可能であり、片方だけの親からのすべての必要な遺伝情報を含んだ成体を産生することが可能である。続いて正常に発生が起こり、多くの体細胞分裂の後、この単一の細胞は、元の生物体と同一のゲノムを有する胚盤胞 (細胞約100個を有する初期胚) (すなわちクローン) を形成する。治療的クローニングにおける使用に関しては、次にこのクローン胚を破壊することによって幹細胞を得ることができ、あるいは、生殖クローニングの場合は、クローン胚はさらなる発生のために宿主母 (偽妊娠中の/代理母) に移植され、出産に至る。
【００３６】
「キメラ」とは、遺伝的に異なる細胞から構成される単一の生物体を意味する。
【００３７】
「ヒト化された」とは、非ヒト動物から採取され、そのタンパク質配列および遺伝的相補物が該非ヒト宿主よりもヒトのものに類似している、器官または組織を意味する。
【００３８】
「器官」とは、共通の機能のために働く構造単位に加わった組織の集合体を意味する。本明細書において用いられる「組織」とは、特有の機能を一緒に行う同一起源の類似した細胞の集合体を意味する。
【００３９】
ヌル欠損生物は、同一遺伝子に対する2つのアリルの変異型または喪失を有する。変異型の／喪失したアリルはどちらも完全な機能欠損または「ヌル」アリルであり、したがってホモ接合性ヌルとヌル欠損は同義である。
【００４０】
遺伝子ノックアウト (略語：KO) は、生物体の両方のアリルが作動しなくされている (生物体の「ノックアウト」)、遺伝学的技法である。ノックアウト、不活性化された、および破壊されたという用語は本明細書において交換可能に用いられ、遺伝子発現産物が除去されるかまたは大幅に減少するように標的部位が変更されていることを意味する。ノックアウト生物体、または単にノックアウトとしても知られる。この用語はまた、遺伝子を「ノックアウトする」というように、そのような生物体を創出する方法をも意味する。この技術は本質的に遺伝子ノックインの逆である。
【００４１】
遺伝子という用語は広義であり、発現されて機能的産物を作る染色体DNAを意味する。遺伝子はアリルを有する。遺伝子編集は単一アリル性または両アリル性であり得る。
【００４２】
用語「含む」、「含んでいる」および同様のものは米国特許法においてそれらに帰せられた意味を有し得、かつ「包含する」、「包含している」および同様のものを意味し得る。本明細書において用いる場合、「包含している」または「包含する」または同様のものは、限定なしに包含していることを意味する。
【００４３】
器官移植の要請を満たすには外因性器官の産生が必要である
現在、進行した末期の器官不全に対する唯一の決定的な治療法は移植である。移植の制限因子はドナー器官の入手可能性である。何十万もの患者がこのような治療法の恩恵を受けられるはずであるが、合併する疾病のために、適合する移植候補とならない。したがって、死体または生体のドナー器官が著しく不足している。その上、器官移植は終生の免疫抑制を必要とし、これもまた有害な副作用を有する。本明細書においてはブタにおけるヒト化された組織の生成が記載され、これは移植のための器官の無制限な供給源として役立ち、かつ心臓血管系および造血系の疾病の治療のためのパラダイムシフトとなるプラットホームを提供すると考えられる。
【００４４】
異種間移植に強い関心が集まっている。例えば、ラットの膵臓が、胚盤胞補完の方法によりマウスにおいて産生された (27)。これらの研究において、膵臓発生の主要制御遺伝子であるPdx1に関して変異型である胚盤胞に、野生型 (Wt) ラットからの多能性幹細胞 (rPSC) が注入された (27)。rPSCが注入された胚盤胞の代理母雌性マウス親への移植は、ラット細胞で構成された機能的な膵臓を持つマウスキメラを生み出した。これらの研究は、胚が標的器官を完全に欠くように鍵となる発生制御因子を欠損した胚盤胞を生成することの重要性を強調した。次いで、これらの変異型宿主は、健常ドナー幹細胞を配置してドナー由来の器官を生成するための発生上の「ニッチ」を提供する。胚盤胞補完戦略はまた、げっ歯類において腎臓、胸腺および肝臓などの器官を、および最近ではブタにおいて膵臓も産生した (28〜31)。 
【００４５】
遺伝子編集プラットホームまたは当業者に利用可能な任意の方法を利用することで、多様な発生遺伝子を変異させて、器官欠損動物たとえばブタを生成することができ、この際、外因性器官の生成のために胚盤胞補完が実施され得る。
【００４６】
Etv2 (ENSSSCG00000002906) は内皮系列および造血系列の主要制御遺伝子である
いくつかの理由から、内皮系および造血系を欠損したブタ胚を生成するためにEtv2遺伝子座を変異させた。第一に、本発明者らはマウスにおいてEtv2が内皮系および造血系の発生の主要制御遺伝子であることを実証した (7〜9)。遺伝的な系列追跡戦略を用いて、Etv2発現細胞が内皮系列および造血系列を生み出すことが実証された (9、10)。第二に、包括的遺伝子欠失戦略がとられ、Etv2変異型のマウス胚は、内皮系列および造血系列を欠くので生育不能であることが実証された (図1A、B) (8)。トランスクリプトーム解析を用いて、Etv2非存在下では、Tie2が顕著に調節不全であることが特定された (7、8)。さらには、トランスジェニック技術および分子生物学的技法 (転写アッセイ、EMSA、ChIP、および変異誘発) を用いて、Spi1、Tie2およびLmo2がEtv2の直接の下流の標的であることが確認された (7、8、11)。第三に、分化中のES/EBの系におけるEtv2の強制過剰発現が内皮系列および造血系列の集団を有意に増加させ、これにより、Etv2が、両方の系列を誘導する分子カスケードを決定する能力を有する単一の因子であることが実証された (図1C、D) (8)。
【００４７】
第四に、中胚葉系列の運命決定におけるEtv2の機能的な役割が明らかにされ、かつEtv2の上流の分子的経路がその下流の標的と共に明らかにされた。野生型 (Wt) およびEtv2変異型のマウスのマイクロアレイ解析により、Etv2変異型において心臓特異的な転写物が過剰であったことが明らかにされ、これにより、Etv2が心臓系列の分化を抑制することが示唆された (9)。この発見の裏付けとして、Etv2の過剰発現は、ES/EB細胞における心臓の分化を抑制したが内皮系および造血系プログラムは誘導した。これらの研究から、Etv2の役割は中胚葉系列の運命決定において、心臓の分化の阻害因子として、ならびに内皮系および造血系の分化に必要十分な因子と定義された (図2) (9)。
【００４８】
Etv2が関与する分子的経路に関して鍵となるいくつかの発見が図2に要約されている。第一に、Flk1およびEtv2の遺伝学的順位が決定された (12)。どちらも造血系列および内皮系列を生成できないFlk1変異型およびEtv2変異型のES細胞を用いて、これらの表現型がEtv2またはFlk1の過剰発現によってレスキューされ得るかを試験した。結果は、Flk1変異型ESC/EBが内皮系および造血系となる能力はEtv2およびFlk1のいずれによってもレスキューされたが、Etv2変異型の表現型はEtv2のみによりレスキューされ、Flk1によってはレスキューされなかったことを実証した。この発見は、(1) Etv2は遺伝学的にFlk1の下流であり、かつ (2) Etv2の下方制御がFlk1変異型の表現型の原因となることを指し示す。したがって、内皮系の前駆体におけるFlk1→Etv2という順位が確立された。第二に、Gata2がEtv2の機能の補因子として同定された (図3D〜F) (11)。ES細胞において1:1の化学量論でGata2およびEtv2が過剰発現することで、Etv2単独に比べて造血系および内皮系の分化が共に増強されることが実証された。Gata2自体は分化を増強せず、このことは、これがEtv2の機能の増幅器としてはたらいていることを示唆する。第三に、最近のマウスおよびゼブラフィッシュにおける研究において、Etv2が内皮系列および造血系列の運命決定をさらに支配する系列に限定的なマイクロRNAを制御することが実証されている (データ不掲載)。要約すると、Etv2と相互作用して造血系列および内皮系列の分化を促進する補因子とともに、上流および下流の因子が明らかにされた (図3G)。
【００４９】
Etv2変異型の動物は内皮系列および造血系列を完全に欠き、かつヒト幹細胞が集合するためのニッチを提供することがこの研究により予測されるので、これらおよびその他の結果は、Etv2がブタモデルにおける遺伝子編集のための候補であるという論拠を支持する。本明細書に記載の組成物および方法はヒト内皮系細胞に沿って並ぶかまたはそれと共に集合する血管系をもたらし、これにより、移植のための理想的な組織となる。さらには、代理母ブタモデルにおいてヒト血液が産生される。
【００５０】
Etv2がその他の遺伝子と異なる第五の理由は、異種間移植研究から明らかになる。種間の相補およびその後の外因性器官の移植の原理証明研究は成功であったが、これらの器官のために働く血管は宿主由来であったことが指摘された (1、2)。器官拒絶反応、とりわけ異種間移植されたブタ組織の超急性の拒絶反応における血管表面の周知の重要性を考慮すると、これらの発見は重大な懸念を生じさせる (13)。事実、内皮系列のヒト化はほとんどの外因性器官の発生に必要である。Etv2はこの目的に関して理想的な候補である。
【００５１】
ヒト化された大型動物モデルは再生医療のための重要なリソースであり、かつ個別化した器官を作るためのプラットホームとして役立つであろう。この戦略は慢性の心臓血管系疾病および造血系疾病ならびに移植に対する現在の臨床診療のパラダイムを転換させ得る。今日まで、器官の外因性移植は、マウスとラットの間 (27、29)；およびブタとブタの間 (31) で行われており、大型動物モデルにおけるヒト化された器官の発生の成功は報告されたことがない。米国特許仮出願番号第62/247,092号が参照により本明細書に組み入れられる。
【００５２】
以下の実施例はある特に望ましい本発明の態様をさらに例示することを意図しており、本発明の範囲をいかなる形でも制限することを意図したものではない。
【実施例】
【００５３】
材料および方法
繁殖豚/未経産豚：飼育された母性 （maternal） 雌性ブタ (8〜12月齢) が胚移植のレシピエントとして用いられ、承認済みのIACUCプロトコールのもとで、妊娠期間予測および分娩において通常の飼育ブタと同様に飼養および維持される。
【００５４】
発情同期化および受精：朝の給餌に混合した6.8mLのMatrix (アルトレノゲスト2.2mg/mL) を、発情周期の11〜22日目に繁殖豚に与え、発情を同期化する。Matrixの最終日およびその四日後にLutalyse (2cc) をIM投与する。繁殖豚は、Matrix投与終了の六日後から、発情に関して毎日2回検査される。発情期にあると初めて検出された後最大3回、繁殖豚を、選択された種豚由来の精液によって受精させる。繁殖豚は妊娠期間23〜90日目の妊娠状態に関してドップラー超音波または、線形5mHzトランスデューサーを用いた経腹腔的超音波によって検査される。どちらの方式の超音波も侵襲的ではなく、繁殖豚も胎児も害さない。獣医師の要望によりまたは遺伝的解析のために、妊娠中の未経産豚/繁殖豚から採血して任意の疾病が存在していないかを判定してもよい。
【００５５】
胚移植：再構成されたクローン胚を、非同期レシピエントの雌性ブタの子宮に外科手術により移植する。外科手術による胚移植のために、以下の組み合わせで麻酔を誘導する：ケタミン (2mg/kg)、チレタミン/ゾラゼパム (0.25mg/kg)、キシラジン (1mg/kg)、およびアトロピン (0.03mg/kg；全てIowa Veterinary Supplyより)。残りの過程の間、イソフルランまたはセボフルラン (5%導入、1〜4%で持続させて外科手術麻酔レベルを維持) により全身麻酔を維持する。背側横臥位の間に、外科手術のためにレシピエントを無菌で準備し、尾側腹側切開を行い、子宮、卵管、および卵巣を包含する生殖器官を露出させて調べる。典型的には、150〜200個の再構成されたクローン胚が、5.5インチTomCat (登録商標) カテーテル (Iowa Veterinary Supply) を用いて、卵管峡部に配置される。子宮を腹腔内に戻し、レシピエント動物を縫合し、術後回復期におく。妊娠期間の間は、妊娠状態を確認し監視するために、3.5MHz経腹腔的プローブが装着されたAloka500超音波スキャナー (Aloka Co. Ltd, Wallingford, CT) を用いたリアルタイム超音波検査が用いられる。レシピエントの飼育は正常な妊娠器官中の繁殖豚と同様に維持される。子ブタ産生に関しては、レシピエントに自然に子ブタを出産させるか、または、妊娠期間118日目より前の帝王切開により分娩させる。初乳給与および、Nurtinger保育装置を包含する徹底的な新生仔サポートが、必要であれば利用可能である。
【００５６】
ETV2ノックアウトブタ胚は造血系列および内皮系列を欠いている
Etv2を欠く胚はおよそE9.5で致死となり血管系および血液を有さないため、Etv2がマウスにおける血管形成および造血に関与していることが、以前の研究により実証されている (7〜10)。ブタにおけるETV2 (ENSSSCG00000002906) の役割を調べるために、ブタ線維芽細胞内で該遺伝子に隣接する2組のTALENのペアを用いてETV2コード配列全体を除去した (図4)。
1) ETV2欠失戦略
TALEN：
2018506984.tif 000005
2) HDRステッチテンプレート：このテンプレートはTALENが誘導した5'および3’切断を予測可能な領域で融合させる。これは、欠失アリルの回収効率をも増大させた。
HRオリゴ
2018506984.tif 000006
下線小文字=ETV2 3.2切断部位の右側からの相同性のある42nt
太大文字=ETV2 5.2切断部位の左側からの相同性のある42nt 
大文字下線=挿入されたBamHI部位
ETV2 5' NJ F1からETV2 3' NJ R1までの全配列：これは、上記のテンプレートを修復／融合のために用いて欠失アリルが作成された際の予測されるPCR産物である。
2018506984.tif 000007
3) スクリーニングプライマー：
2018506984.tif 000008
【００５７】
完全な遺伝子除去におけるプロセスの効率は15%であった；遺伝子型決定したクローンの79個/528個がETV2遺伝子の欠失についてホモ接合性であった。ホモ接合性ETV2ノックアウトの線維芽細胞クローンを、代理母繁殖豚に移植されるETV2ヌル胚を生成するための核のクローニング (体細胞核移植；SCNT) に用いた。クローニング効率は29%であった。
【００５８】
胚は、E18.0に採取され、解析された (図5)。E18.0に、野生型 (Wt) 胚は尿膜中のよく発達した血管網を伴って血管形成し (図3A)、血液発生の証拠を有した (図5C)。対照的に、ETV2 KO胚は明瞭な発生異常を示した。どちらの胚も24体節期であるにも関わらずETV2 KOではWt胚に比べて成長が遅れ (図5B)、血液および血管系列の両方を欠いていた (図7C〜H)。ETV2 KO胚は、Wt胚においては明瞭に発生している主静脈、背側大動脈、および心内膜を欠いていた (図5E〜H)。
【００５９】
図1および5における結果は類似の表現型を反映するものであり、かつETV2の機能がマウスとブタの間で保存されていることを示唆する。さらに、これらのデータは、複数の細胞タイプにおいてヒト化されるキメラ器官の生育をサポートするためにブタゲノムへの複数の変異を指示できることを、実証する。
【００６０】
ETV2を欠失させる代わりに、産生される全てのタンパク質が非機能性であるフレームシフト変異のような変異を遺伝子に入れることができる。例えば：
1) フレームシフトKOアリル：本実施例においては、エクソン3および未成熟終止コドンにフレームシフトが創出される。
1) TALEN：
2018506984.tif 000009
2) HDRテンプレート：
ssETV2 3.1 HR-KO
2018506984.tif 000010
太小文字下線=ssETV2 3.1切断部位
大文字イタリック=終止コドン
大文字=挿入された塩基
下線=挿入されたHindIII制限部位
ssETV2 3.3 WT配列
2018506984.tif 000011
太大文字下線=ssETV2 3.3切断部位
ssETV2 3.3 HR-KO
2018506984.tif 000012
太小文字下線=ssETV2 3.3切断部位
大文字イタリック=終止コドン
大文字=挿入された塩基
下線=挿入されたHindIII制限部位
3) スクリーニングプライマー：
2018506984.tif 000013
【００６１】
Etv2変異型の胚は野生型マウスES細胞によりレスキューされる
ブタにおけるヒト化された組織の生成に関する基礎的前提とは、注入された細胞が変異型宿主における発生学的ニッチに優先的に集合し、失われた細胞タイプを生成することである。原理証明研究として、および、Etv2が理想的な標的遺伝子であるかを評価するために、Etv2変異型のマウス胚盤胞を、EYFP標識野生型マウスES細胞により補完した (図6)。野生型細胞存在下において変異型アリルを正の選択により (positively) 同定するために、二つの別個のEtv2変異型系統の半接合体マウスが飼育された (データ不掲載)。胚をE10.5 (Etv2変異型の胚の致死性を観察した一日後) に回収し、遺伝子型決定して、EYFP陽性細胞および内皮系マーカーであるエンドムチンの分布を調べた。Etv2半接合性およびEtv2変異型の胚の両方において、野生型ES細胞は成功裏に胚に取り込まれた (図6A、B)。EYFP標識野生型細胞は、半接合性動物の全ての胚葉の複数の細胞タイプにランダムに分布した (図6C、E、G) のに対し、Etv2変異型においてはEYFP陽性細胞の大多数は内皮系列、心内膜系列、および造血系列で見られた (図6D、F、H) ことが、免疫組織化学的解析により明らかになった。このデータは、全てのエンドムチン陽性内皮系細胞がEYFPを発現したという見解を支持し、このことは、これらが野生型ES細胞からの派生物であることを示すものである (図6D、F、H)。Etv2変異型の胚はまた、血管内に未発達の血液様形態を伴うEYFP標識Tie2陽性細胞も有し、このことは、造血系列もまたレスキューされたことを示唆する (データ不掲載)。
【００６２】
さらにこの発見を確証するために、EYFP標識された野生型およびEtv2変異型のES細胞を利用し (8)、別々にまたは一緒に分化させて、分化四日目に、造血系列 (CD41、CD45) および内皮系列 (CD31、Tie2) に対する各系統の寄与をFACSを用いて調べた (図8)。野生型7AC5/EYFP細胞は99%EYFP陽性であり、かつ、4.54%が内皮系、0.36%が造血系細胞を生成した (上列)。Etv2変異型の細胞はEYFP陰性であり、かつ、内皮系および造血系細胞を生成しなかった (中列)。共分化した (co-differentiated) EBの解析により、EYFP陰性細胞の内皮系列および造血系列への寄与は、Etv2変異型のES細胞のそれと区別できないこと、ならびに、EYFP陽性細胞は、単独で培養された野生型細胞と類似の効率で内皮系列および造血系列を生成したことが明らかになった(下列)。この結果は、ES/EB共分化系において「レスキューされた」内皮系列および造血系列は野生型ES細胞のみに由来することを、指し示した。これらの結果は、ヒト化された内皮系列および造血系列のための宿主動物を生成するためにブタETV2を標的とすることの論拠を提供する。
【００６３】
ラットの胚性幹細胞はEtv2変異型のマウス胚体における内皮系集団をレスキューする
次いで、Etv2ヌルES/EBの補完が可能かどうかが、二つの異なる種を用いてテストされた。インビトロES/EB補完アッセイが、Etv2変異型のマウスES細胞および野生型ラットES細胞を用いて行われた (図7) (22)。野生型またはEtv2変異型のマウスES細胞は、分化培地中で超低接着プレートにES細胞を播種することによる胚様体 (EB) 形成により、分化を誘導された。12日間の培養後、EBを固定し、切片を作り、かつ内皮系マーカーCD31について染色した (8)。野生型マウスEBにおいては、強いCD31+集団が血管様構造を裏打ちすることが観察されたが (図7A)、Etv2変異型のEBにおいてはCD31+細胞は全く観察されなかった (図7B)。対照的に、Etv2変異型のES細胞および野生型ラットES細胞の共分化培養物は、頑強なCD31発現を伴う細胞のパッチを現し、これにより、CD31+集団がこの共培養法によりレスキューされたことが示される (図7C)。マウス-ラット補完アッセイにおけるこの成功は、さらにブタ-ブタおよびブタ-ヒト補完実験への発展のための概念証明および論拠を提供する。
【００６４】
ヒトさい帯血幹細胞 (hUCBSC) およびhiPSCはブタ単為生殖体 (電気的に活性化されて受精なしに発生する胚) の内部細胞塊 (ICM) に取り込まれる
ヒト-ブタキメラを生成する戦略の実行可能性を評価するために、hUCBSCおよびhiPSCがブタ胚盤胞に取り込まれて胚発生に加わる能力を調べた。ブタ単為生殖胚盤胞が、卵母細胞の電気刺激を用いて生成された (42)。活性化の六日後に9〜12個のDiIまたはEdU (24時間) 標識されたhUCBSCまたはhiPSCが胞胚腔に注入された。胚盤胞を二日間培養下で回復させた後、撮影した。標識されたhUCBSCおよびhiPSCは、90%がブタ胚盤胞からなるICM中で観察された (図9A、B、代表的な像が示されている)。DiI分布とヒト核抗原特異的抗体 (HNA) を用いた免疫組織化学との比較により、HNA抗体は注入されたヒト幹細胞を検出することが明らかになった (図9A、矢印)。増殖中の細胞を検出するために、EdU標識hiPSCを注入された胚盤胞を採取前の1時間にわたりBrdUでさらにパルス標識した。EdUを用いた二重標識により、注入されたヒト幹細胞は注入48時間後も増殖を続けていたことが明らかになる (図9B、矢印)。これらの結果は、ブタ胚盤胞のICMへのヒト幹細胞の組み込み、および、キメラ胚盤胞の、子宮への移植の準備における孵化ステージへの発生進行を実証する。ブタ単為生殖胚へのヒト幹細胞の取り込みを調べるため、キメラ胚盤胞を偽妊娠中の繁殖豚に移植し、E28に胚を解析した。すでに報告されたように (30) 正常発生中の胚が得られ、その一つは、HNA抗体で染色されるヒト細胞塊を含むことが見出された。これらの結果は、ヒト幹細胞集団がICMの発生に適合可能であるかどうかおよび／または寄与するかどうかを調べるための迅速なアッセイを支持および提供するものである。その上、単為生殖胚盤胞の移植は、ヒト幹細胞の、発生中の胚への取り込みおよび分化を調べるためのハイスループットな方法を提供する。この戦略の重大な利点は、ブタ卵母細胞が食糧生産の副産物として豊富に入手可能であること、および、単為生殖胚が大量に規則正しく生成され得ることである。単為生殖胚は８週以後は生存せず、したがって、望ましくないヒト-ブタキメラを意図せずに誕生させる懸念がなくなることに留意すべきである。
【００６５】
文献目録
2018506984.tif 000014
2018506984.tif 000015
2018506984.tif 000016
【００６６】
本発明は、さまざまな特定のかつ好ましい態様および技法を参照して説明されている。しかしながら、数多くの変形および修正が本発明の範囲内で行われ得ることが理解されるべきである。参照された全ての論文、特許、および特許文献は、個々に参照により組み入れられるのと同様に参照により組み入れられることが意図される。
【図１Ａ】
2018506984.tif 000018
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年12月1日(2017.12.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト動物細胞または胚盤胞が機能的ETV2タンパク質を欠くように、ゲノムが、ETV2遺伝子の両方のアリルに変異を有する、該非ヒト動物細胞または胚盤胞。
【請求項２】
変異がETV2遺伝子の欠失である、請求項1に記載の非ヒト動物細胞または胚盤胞。
【請求項３】
ブタ、ウシ、ウマまたはヤギである、請求項1または2に記載の非ヒト動物細胞または胚盤胞。
【請求項４】
キメラ非ヒト動物または胚盤胞であって、ヒトETV2を発現し、かつ該非ヒト動物ETV2の発現を欠く、該キメラ非ヒト動物または胚盤胞。
【請求項５】
非ヒト動物が、白血球、赤血球、血小板またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるヒト血液細胞を生じる、請求項4に記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項６】
ヒト内皮を生じる、請求項4に記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項７】
非ヒト動物がブタ、ウシ、ウマまたはヤギである、請求項4〜6のいずれか一項に記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項８】
以下の段階を含む、ヒトETV2遺伝子を発現するキメラ非ヒト動物を産生するための方法：
(a) ETV2ヌル非ヒト動物細胞を生成する段階であって、非ヒトETV2遺伝子の両方のコピーが、該非ヒト動物において機能的ETV2タンパク質の産生を妨害する変異を有する、段階；
(b) (a) のETV2ヌル非ヒト動物細胞由来の核を、除核された非ヒト卵母細胞へ融合させること、および該卵母細胞を活性化させてETV2ヌル非ヒト胚盤胞を形成するように分裂させることを含む体細胞核移植により、ETV2ヌル非ヒト胚盤胞を創出する段階；
(c) ヒト幹細胞を (b) のETV2ヌル非ヒト胚盤胞に導入する段階；ならびに
(d) (c) の胚盤胞を偽妊娠中の代理母非ヒト動物に移植して、ヒトETV2を発現するキメラ非ヒト動物を生成する段階。
【請求項９】
以下の段階を含む、ヒトのおよび／またはヒト化された血液細胞または血管を非ヒト動物において産生する方法：
(a) ETV2ヌル非ヒト動物細胞を生成する段階であって、非ヒトETV2遺伝子の両方のアリルが、機能的ETV2タンパク質の産生を妨害する変異を有する、段階；
(b) (a) のETV2ヌル非ヒト動物細胞由来の核を、除核された非ヒト卵母細胞へ融合させること、および該卵母細胞を活性化させてETV2ヌル非ヒト胚盤胞を形成するように分裂させることを含む体細胞核移植により、ETV2ヌル非ヒト胚盤胞または桑実胚を創出する段階；
(c) ヒトドナー幹細胞を (b) のETV2ヌル非ヒト胚盤胞または桑実胚に導入する段階；ならびに
(d) ヒトのおよび／またはヒト化された血液細胞または血管を生じる非ヒト動物を生成するように、(c) の胚盤胞または桑実胚を偽妊娠中の代理母非ヒト動物に移植する段階。
【請求項１０】
非ヒト動物がブタ、ウシ、ウマまたはヤギである、請求項8または9に記載の方法。
【請求項１１】
ヒトドナー幹細胞が組織特異的幹細胞、多能性幹細胞、多分化能成体幹細胞、人工多能性幹細胞、またはさい帯血幹細胞 (UCBSC) である、請求項8〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
幹細胞を提供するドナーが、産生されたヒト化組織または器官のレシピエントである、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ヒト人工多能性幹細胞が繊維芽細胞から形成されたものである、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
請求項8〜13のいずれか一項に記載の方法によって産生された非ヒト動物。
【請求項１５】
請求項8〜13のいずれか一項に記載の方法により生成された2体の非ヒト動物の交配から産生された子孫非ヒト動物であって、該子孫非ヒト動物がヒトETV2を発現し、該子孫非ヒト動物のゲノムが該非ヒト動物ETV2遺伝子のホモ接合性欠失を有する、子孫非ヒト動物。
【請求項１６】
非ヒト動物がブタ、ウシ、ウマまたはヤギである、請求項15に記載の子孫非ヒト動物。
【請求項１７】
前記血液細胞が、ヒト人工多能性幹細胞またはヒトさい帯血幹細胞に由来する白血球、赤血球、および／または血小板である、請求項9に記載の方法。
【請求項１８】
以下の段階を含むプロセスによって作製されたキメラ血液細胞：
(a) ETV2ヌル非ヒト動物細胞を生成する段階であって、非ヒトETV2遺伝子の両方のアリルが、機能的ETV2タンパク質の産生を妨害する変異を有する、段階；
(b) (a) のETV2ヌル非ヒト動物細胞由来の核を、除核された非ヒト卵母細胞へ融合させること、および該卵母細胞を活性化させてETV2ヌル非ヒト胚盤胞を形成するように分裂させることを含む体細胞核移植により、ETV2ヌル非ヒト胚盤胞または桑実胚を創出する段階；
(c) ヒトドナー幹細胞を (b) のETV2ヌル非ヒト胚盤胞または桑実胚に導入する段階；ならびに
(d) キメラ血液細胞を発現する非ヒト動物を生成するように、(c) の胚盤胞または桑実胚を偽妊娠中の代理母非ヒト動物に移植する段階。
【請求項１９】
ヒトETV2遺伝子を発現し、かつヒトドナー細胞を含む移植された非ヒト胚盤胞または桑実胚に由来する、キメラ血液細胞。
【請求項２０】
非ヒト動物がブタである、請求項18または19に記載のキメラ血液細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
キメラブタを産生する方法および本発明のキメラブタから組織を産生する方法が、さらに記載される。一つの態様は、本明細書に記載された方法から生成された2頭のブタの交配から産生された子孫ブタであって、該子孫ブタがヒトETV2を発現し、該子孫ブタのゲノムがブタETV2遺伝子のホモ接合性欠失を含む、子孫ブタを提供する。
[本発明1001]
非ヒト動物細胞または胚盤胞が機能的ETV2タンパク質を欠くように、ゲノムが、ETV2遺伝子の両方のアリルに変異を有する、該非ヒト動物細胞または胚盤胞。
[本発明1002]
変異がETV2遺伝子の欠失である、本発明1001の非ヒト動物細胞または胚盤胞。
[本発明1003]
ブタ、ウシ、ウマまたはヤギである、本発明1001または1002の非ヒト動物細胞または胚盤胞。
[本発明1004]
キメラ非ヒト動物または胚盤胞であって、ヒトETV2を発現し、かつ該非ヒト動物ETV2の発現を欠く、該キメラ非ヒト動物または胚盤胞。
[本発明1005]
非ヒト動物が、白血球、赤血球、血小板またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるヒト血液細胞を生じる、本発明1004のキメラ非ヒト動物。
[本発明1006]
ヒト内皮を生じる、本発明1004のキメラ非ヒト動物。
[本発明1007]
非ヒト動物がブタ、ウシ、ウマまたはヤギである、本発明1004〜1006のいずれかのキメラ非ヒト動物。
[本発明1008]
以下の段階を含む、ヒトETV2遺伝子を発現するキメラ非ヒト動物を産生するための方法：
(a) ETV2ヌル非ヒト動物細胞を生成する段階であって、非ヒトETV2遺伝子の両方のコピーが、該非ヒト動物において機能的ETV2タンパク質の産生を妨害する変異を有する、段階；
(b) (a) のETV2ヌル非ヒト動物細胞由来の核を、除核された非ヒト卵母細胞へ融合させること、および該卵母細胞を活性化させてETV2ヌル非ヒト胚盤胞を形成するように分裂させることを含む体細胞核移植により、ETV2ヌル非ヒト胚盤胞を創出する段階；
(c) ヒト幹細胞を (b) のETV2ヌル非ヒト胚盤胞に導入する段階；ならびに
(d) (c) の胚盤胞を偽妊娠中の代理母非ヒト動物に移植して、ヒトETV2を発現するキメラ非ヒト動物を生成する段階。
[本発明1009]
以下の段階を含む、ヒトのおよび／またはヒト化された血液細胞または血管を非ヒト動物において産生する方法：
(a) ETV2ヌル非ヒト動物細胞を生成する段階であって、非ヒトETV2遺伝子の両方のアリルが、機能的ETV2タンパク質の産生を妨害する変異を有する、段階；
(b) (a) のETV2ヌル非ヒト動物細胞由来の核を、除核された非ヒト卵母細胞へ融合させること、および該卵母細胞を活性化させてETV2ヌル非ヒト胚盤胞を形成するように分裂させることを含む体細胞核移植により、ETV2ヌル非ヒト胚盤胞または桑実胚を創出する段階；
(c) ヒトドナー幹細胞を (b) のETV2ヌル非ヒト胚盤胞に導入する段階；ならびに
(d) ヒトのおよび／またはヒト化された血液細胞または血管を生じる非ヒト動物を生成するように、(c) の胚盤胞または桑実胚を偽妊娠中の代理母非ヒト動物に移植する段階。
[本発明1010]
非ヒト動物がブタ、ウシ、ウマまたはヤギである、本発明1008または1009の方法。
[本発明1011]
ヒトドナー幹細胞が組織特異的幹細胞、多能性幹細胞、多分化能成体幹細胞、人工多能性幹細胞、またはさい帯血幹細胞 (UCBSC) である、本発明1008または1009の方法。
[本発明1012]
幹細胞を提供するドナーが、産生されたヒト化組織または器官のレシピエントである、本発明1009の方法。
[本発明1013]
ヒト人工多能性細胞が繊維芽細胞から形成されたものである、本発明1009の方法。
[本発明1014]
本発明1008または1009の方法によって産生された非ヒト動物。
[本発明1015]
本発明1008または1009の方法により生成された2体の非ヒト動物の交配から産生された子孫非ヒト動物であって、該子孫非ヒト動物がヒトETV2を発現し、該子孫非ヒトのゲノムが該非ヒト動物ETV2遺伝子のホモ接合性欠失を有する、子孫非ヒト動物。
[本発明1016]
非ヒト動物がブタ、ウシ、ウマまたはヤギである、本発明1015の子孫非ヒト動物。
[本発明1017]
前記血液細胞が、ヒト人工多能性幹細胞またはヒトさい帯血幹細胞に由来する白血球、赤血球、および／または血小板である、本発明1009の方法。
【国際調査報告】
2018506984.tif 000034