(57)【要約】  本開示は新規株の微生物を含むそれらの単離微生物、微生物共同体、およびそれらを含む農業用組成物に関する。さらに、本開示は標的植物種に有益な特質を付与するための方法における前記の微生物、微生物共同体、およびそれらを含む農業用組成物の利用方法を教示する。特定の態様では本開示は農学的に重要な作物種において植物の望ましい形質を増大させる方法を提供する。
2018507708.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１８１として寄託されたアシドボラクス・ソリ（Acidovorax soli）、
（ｂ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１８２として寄託されたアシドボラクス・ソリ、
（ｃ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１８３として寄託されたアルスロバクター・クプレシ（Arthrobacter cupressi）、
（ｄ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１８４として寄託されたアルスロバクター・クプレシ、
（ｅ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１８５として寄託されたボセア・エネアエ（Bosea eneae）、
（ｆ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１８６として寄託されたボセア・ロビニアエ（Bosea robiniae）、
（ｇ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１８７として寄託されたボセア・チオオキシダンス（Bosea thiooxidans）、
（ｈ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１８８として寄託されたキチノファーガ・テラエ（Chitinophaga terrae）、
（ｉ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１８９として寄託されたキチノファーガ・テラエ、
（ｊ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１９０として寄託されたデルフチア・ラクストリス（Delftia lacustris）、
（ｋ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１９１として寄託されたデルフチア・ラクストリス、
（ｌ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１９２として寄託されたデュガネラ・ラディシス（Duganella radicis）、
（ｍ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１９３として寄託されたデュガネラ・ビオラセイニグリア（Duganella violaceinigria）、
（ｎ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１９４として寄託されたディアドバクター・ソリ（Dyadobacter soli）、
（ｏ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１９５として寄託されたディアドバクター・ソリ、
（ｐ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１９６として寄託されたフラボバクテリウム・グラセイ（Flavobacterium glacei）、
（ｑ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１９７として寄託されたハーバスピリラム・クロロフェノリカム（Herbaspirillum chloroフェノールicum）、
（ｒ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１９８として寄託されたマッシリア・アルビディフラバ（Massilia albidiflava）、
（ｓ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１９９として寄託されたマッシリア・ニアステンシス（Massilia niastensis）、
（ｔ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２０１として寄託されたノボスフィンゴビウム・リンダニクラスティカム（Novosphingobium lindaniclasticum）、
（ｕ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２００として寄託されたノボスフィンゴビウム・リンダニクラスティカム、
（ｖ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２０２として寄託されたノボスフィンゴビウム・レシノボルム（Novosphingobium resinovorum）、
（ｗ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２０３として寄託されたノボスフィンゴビウム・レシノボルム、
（ｘ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２０４として寄託されたパエニバチルス・グリカニリティカス（Paenibacillus glycanilyticus）、
（ｙ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２０５として寄託されたペドバクター・ソリ（Pedobacter soli）、
（ｚ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２０６として寄託されたペドバクター・テラエ（Pedobacter terrae）、
（ａａ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２０７として寄託されたシュードモナス・ジンジュエンシス（Pseudomonas jinjuensis）、
（ｂｂ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２０８として寄託されたラムリバクター・ヘンチレンシス（Ramlibacter henchirensis）、
（ｃｃ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２０９として寄託されたラムリバクター・ヘンチレンシス、
（ｄｄ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２１０として寄託されたリゾビウム・リゾリザエ（Rhizobium rhizoryzae）、
（ｅｅ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２１１として寄託されたリゾビウム・リゾリザエ、
（ｆｆ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２１２として寄託されたリゾビウム属の種、
（ｇｇ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２１３として寄託されたエンシフェル・アダエレンス（Ensifer adhaerens）、
（ｈｈ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２１４として寄託されたスフィンゴピキシス・アラスケンシス（Sphingopyxis alaskensis）、
（ｉｉ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２１５として寄託されたスフィンゴピキシス・アラスケンシス、
（ｊｊ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２１６として寄託されたバリオボラックス・ギンセンギソリ（Variovorax ginsengisoli）、
（ｋｋ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２１７として寄託されたバリオボラックス・ギンセンギソリ、
（ｌｌ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１７４として寄託されたアクロモバクター・プルモニス（Achromobacter pulmonis）、
（ｍｍ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１７２として寄託されたクリセオバクテリウム・デケオンゲンス（Chryseobacterium daecheongense）、
（ｎｎ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１６６として寄託されたデュガネラ・ラディシス、
（ｏｏ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１７５として寄託されたエキシグオバクテリウム・アウランティアクム（Exiguobacterium aurantiacum）、
（ｐｐ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１６７として寄託されたエキシグオバクテリウム・シビリカム（Exiguobacterium sibiricum）、
（ｑｑ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１７１として寄託されたコサコニア・ラディシンシタンス（Kosakonia radicincitans）、
（ｒｒ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１７０として寄託されたミクロバクテリウム・オレイボランス（Microbacterium oleivorans）、
（ｓｓ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１６８として寄託されたノボスフィンゴビウム・セディミニコラ（Novosphingobium sediminicola）、
（ｔｔ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１７６として寄託されたペドバクター・テラエ、
（ｕｕ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１６５として寄託されたラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、
（ｖｖ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１７３として寄託されたアグロバクテリウム・ファブルム（Agrobacterium fabrum）、
（ｗｗ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１６９として寄託されたエンシフェル・アダエレンス、
（ｘｘ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２２４として寄託されたパントエア・バガンス（Pantoea vagans）、
（ｙｙ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２２５として寄託されたシュードモナス・オリジハビタンス（Pseudomonas oryzihabitans）、
（ｚｚ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２２６として寄託されたステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、
（ａａａ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２２９として寄託されたラーネラ・アクアティリス、
（ｂｂｂ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２２８として寄託されたラーネラ・アクアティリス、
（ｃｃｃ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２２７として寄託されたロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、
（ｄｄｄ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２３６として寄託されたハーバスピリラム・クロロフェノリカム、
（ｅｅｅ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２３０として寄託されたバチルス・ナイアシニ（Bacillus niacini）、
（ｆｆｆ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２３１として寄託されたポラロモナス・ギンセンギソリ（Polaromonas ginsengisoli）、
（ｇｇｇ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２３４として寄託されたポラロモナス・ギンセンギソリ、
（ｈｈｈ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２３２として寄託されたデュガネラ・ビオラセイニグラ（Duganella violaceinigra）、
（ｉｉｉ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２３３として寄託されたデュガネラ・ビオラセイニグラ、および
（ｊｊｊ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２３５として寄託されたマッシリア・ニアステンシス（Masilia niastensis）
からなる群より選択される単離細菌株。
【請求項２】
請求項１に記載の単離細菌株と実質的に類似の形態的特徴および生理的特徴を有する単離細菌株。
【請求項３】
請求項１に記載の単離細菌株と実質的に類似の遺伝的特徴を有する単離細菌株。
【請求項４】
請求項１に記載の単離細菌株の実質的に純粋な培養物。
【請求項５】
請求項１に記載の単離細菌株の子孫。
【請求項６】
請求項１に記載の単離細菌株の突然変異体。
【請求項７】
請求項１に記載の単離細菌株または前記単離細菌株の突然変異体の無細胞性または不活化調製物。
【請求項８】
請求項１に記載の単離細菌株または前記単離細菌株の突然変異体により生産される代謝物質。
【請求項９】
請求項１に記載の単離細菌株、および
農業上許容可能な担体
を含む農業用組成物。
【請求項１０】
前記単離細菌株がグラム当たり１×１０３〜１×１０１２細菌細胞の割合で前記組成物中に存在する、請求項９に記載の農業用組成物。
【請求項１１】
前記農業用組成物が種子被膜剤として製剤される、請求項９に記載の農業用組成物。
【請求項１２】
少なくとも１つの有益な形質を植物種に付与する方法であって、
（ａ）前記植物、または前記植物が植え付けられている培地に請求項１に記載の単離細菌株を適用すること
を含む前記方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの有益な形質を植物種に付与する方法であって、
（ａ）前記植物、または前記植物が植え付けられている培地に請求項９に記載の農業用組成物を適用すること
を含む前記方法。
【請求項１４】
ステノトロホモナス・マルトフィリア、ロドコッカス・エリスロポリス、パントエア・バガンス、シュードモナス・オリジハビタンス、ラーネラ・アクアティリス、リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）、デュガネラ・ラディシス、エキシグオバクテリウム・シビリカム、ノボスフィンゴバクテリウム・セディミニコラ（Novosphingobacterium sediminicola）、エンシフェル・アダエレンス、ミクロバクテリウム・オレイボランス（Micorbacterium oleivorans）、およびそれらの混合物からなる群より選択される少なくとも２種類の微生物を含む微生物共同体。
【請求項１５】
請求項１４に記載の微生物共同体と実質的に類似の形態的特徴および生理的特徴を有する微生物共同体。
【請求項１６】
請求項１４に記載の微生物共同体と実質的に類似の遺伝的特徴を有する微生物共同体。
【請求項１７】
請求項１４に記載の微生物共同体の実質的に純粋な培養物。
【請求項１８】
請求項１４に記載の微生物共同体に関して列挙されたいずれかの微生物の後代。
【請求項１９】
請求項１４に記載の微生物共同体に関して列挙されたいずれかの微生物の突然変異体。
【請求項２０】
請求項１４に記載の微生物共同体または請求項１４に記載の微生物共同体に関して列挙されたいずれかの微生物の突然変異体の無細胞性または不活化調製物。
【請求項２１】
請求項１４に記載の微生物共同体または請求項１４に記載の微生物共同体に関して列挙されたいずれかの微生物の突然変異体によって生産される代謝物質。
【請求項２２】
請求項１４に記載の微生物共同体、および
農業上許容可能な担体
を含む農業用  組成物。
【請求項２３】
前記微生物共同体がグラム当たり１×１０３〜１×１０１２細菌細胞の割合で前記組成物中に存在する、請求項２２に記載の農業用組成物。
【請求項２４】
前記農業用組成物が種子被膜剤として製剤される、請求項２２に記載の農業用組成物。
【請求項２５】
少なくとも１つの有益な形質を植物種に付与する方法であって、
（ａ）前記植物、または前記植物が植え付けられている培地に請求項１４に記載の微生物共同体を適用すること
を含む前記方法。
【請求項２６】
少なくとも１つの有益な形質を植物種に付与する方法であって、
（ａ）前記植物、または前記植物が植え付けられている培地に請求項２２に記載の農業用組成物を適用すること
を含む前記方法。
【請求項２７】
（ａ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２２６として寄託されたステノトロホモナス・マルトフィリア、
（ｂ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２２７として寄託されたロドコッカス・エリスロポリス、
（ｃ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２２４として寄託されたパントエア・バガンス、
（ｄ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２２５として寄託されたシュードモナス・オリジハビタンス、
（ｅ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２２９として寄託されたラーネラ・アクアティリス、
（ｆ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２２８として寄託されたラーネラ・アクアティリス、
（ｇ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１６５として寄託されたラーネラ・アクアティリス、
（ｈ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１６６として寄託されたデュガネラ・ラディシス、
（ｉ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１６７として寄託されたエキシグオバクテリウム・シビリカム、
（ｊ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１６８として寄託されたノボスフィンゴバクテリウム・セディミニコラ、
（ｋ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１６９として寄託されたエンシフェル・アダエレンス、
（ｌ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１７０として寄託されたミクロバクテリウム・オレイボランス（Micorbacterium oleivorans）、
およびそれらの混合物
からなる群より選択される少なくとも２種類の微生物を含む微生物共同体。
【請求項２８】
ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２２６として寄託されたステノトロホモナス・マルトフィリア、ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２２７として寄託されたロドコッカス・エリスロポリス、ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２２４として寄託されたパントエア・バガンス、およびＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２２５として寄託されたシュードモナス・オリジハビタンスを含む請求項２７に記載の微生物共同体。
【請求項２９】
ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２２９として寄託されたラーネラ・アクアティリス、およびリゾビウム・エトリを含む請求項２７に記載の微生物共同体。
【請求項３０】
ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２２６として寄託されたステノトロホモナス・マルトフィリア、ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２２７として寄託されたロドコッカス・エリスロポリス、ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２２４として寄託されたパントエア・バガンス、ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２２５として寄託されたシュードモナス・オリジハビタンス、およびＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２２８として寄託されたラーネラ・アクアティリスを含む請求項２７に記載の微生物共同体。
【請求項３１】
ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１６６として寄託されたデュガネラ・ラディシス、ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１６７として寄託されたエキシグオバクテリウム・シビリカム、ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１６８として寄託されたノボスフィンゴバクテリウム・セディミニコラ、ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１６９として寄託されたエンシフェル・アダエレンス、およびＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１７０として寄託されたミクロバクテリウム・オレイボランス（Micorbacterium oleivorans）を含む請求項２７に記載の微生物共同体。
【請求項３２】
ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２２７として寄託されたロドコッカス・エリスロポリス、ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２２５として寄託されたシュードモナス・オリジハビタンス、およびＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２２８として寄託されたラーネラ・アクアティリスを含む請求項２７に記載の微生物共同体。
【請求項３３】
請求項２７に記載の微生物共同体と実質的に類似の形態的特徴および生理的特徴を有する微生物共同体。
【請求項３４】
請求項２７に記載の微生物共同体と実質的に類似の遺伝的特徴を有する微生物共同体。
【請求項３５】
請求項２７に記載の微生物共同体の実質的に純粋な培養物。
【請求項３６】
請求項２７に記載の微生物共同体に関して列挙されたいずれかの微生物の後代。
【請求項３７】
請求項２７に記載の微生物共同体に関して列挙されたいずれかの微生物の突然変異体。
【請求項３８】
請求項２７に記載の微生物共同体または請求項２７に記載の微生物共同体に関して列挙されたいずれかの微生物の突然変異体の無細胞性または不活化調製物。
【請求項３９】
請求項２７に記載の微生物共同体または請求項２７に記載の微生物共同体に関して列挙されたいずれかの微生物の突然変異体によって生産される代謝物質。
【請求項４０】
請求項２７に記載の微生物共同体、および
農業上許容可能な担体
を含む農業用組成物。
【請求項４１】
前記微生物共同体がグラム当たり１×１０３〜１×１０１２細菌細胞の割合で前記組成物中に存在する、請求項４０に記載の農業用組成物。
【請求項４２】
前記農業用組成物が種子被膜剤として製剤される、請求項４０に記載の農業用組成物。
【請求項４３】
少なくとも１つの有益な形質を植物種に付与する方法であって、
（ａ）前記植物、または前記植物が植え付けられている培地に請求項２７に記載の微生物共同体を適用すること
を含む前記方法。
【請求項４４】
少なくとも１つの有益な形質を植物種に付与する方法であって、
（ａ）前記植物、または前記植物が植え付けられている培地に請求項４０に記載の農業用組成物を適用すること
を含む前記方法。
【請求項４５】
少なくとも１つの有益な形質を植物種に付与する方法であって、前記植物、または前記植物が植え付けられている培地に少なくとも１種類の単離細菌種を適用することを含み、
前記少なくとも１種類の単離細菌種がアシドボラクス・ソリ、アグロバクテリウム・ファブルム、アルスロバクター・クプレシ、ボセア・エネアエ、ボセア・ミナティトラネンシス（Bosea minatitlanensis）、ボセア・ロビナエ（Bosea robinae）、カウロバクター・ヘンリシイ（Caulobacter henricii）、キチノファーガ・アルベンシコーラ（Chitinophaga arvensicola）、キチノファーガ・テラエ、デルフチア・ラクストリス、デュガネラ・ラディセス（Duganella radices）、デュガネラ・ビオラセイニグラ、ディアドバクター・ソリ、フラボバクテリウム・グラシエイ（Flavobacterium glaciei）、フラテウリア属の種、ハーバスピリラム・クロロフェノリカム、ジャンチノバクテリウム属の種、ルテイバクター・イェオジュエンシス（Luteibacter yeojuensis）、マッシリア・アルビディフラバ、マッシリア・ニアステンシス、ミクロバクテリウム属の種、ノボスフィンゴビウム・リンダニクラスティカム、ノボスフィンゴビウム・レシノボルム、ノボスフィンゴビウム・ローザ（Novosphingobium rosa）、パエニバチルス・アミロリティカス（Paenibacillus amylolyticus）、パエニバチルス・コンドロイティヌス（Paenibacillus chondroitinus）、パエニバチルス・グリカニリティカス、ペドバクター・リゾファエラエ（Pedobacter rhizophaerae）、ペドバクター・テラエ、ポラロモナス・ギンセンギソリ、シュードモナス・ジンジュエンシス、ラムリバクター・ヘンチレンシス、リゾビウム・リゾリザエ、ロドフェラックス・フェリレデューセンス（Rhodoferax ferrireducens）、エンシフェル・アダエレンス、スフィンゴビウム・クイスクイリアルム（Sphingobium quisquiliarum）、スフィンゴピキシス・アラスケンシス、ステノトロホモナス・テラエ（Stenotrophomonas terrae）、バリオボラックス・ギンセンギソリ、およびそれらの混合物からなる群より選択される、
前記方法。
【請求項４６】
前記少なくとも１種類の単離細菌種が、
（ａ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１８１として寄託されたアシドボラクス・ソリ、
（ｂ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１８２として寄託されたアシドボラクス・ソリ、
（ｃ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１７３として寄託されたアグロバクテリウム・ファブルム、
（ｄ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１８３として寄託されたアルスロバクター・クプレシ、
（ｅ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１８４として寄託されたアルスロバクター・クプレシ、
（ｆ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１８５として寄託されたボセア・エネアエ、
（ｇ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１８６として寄託されたボセア・ロビナエ、
（ｈ）キチノファーガ・テラエＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１８８として寄託された、
（ｉ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１９０として寄託されたデルフチア・ラクストリス、
（ｊ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１９１として寄託されたデルフチア・ラクストリス、
（ｋ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１９２として寄託されたデュガネラ・ラディシス、
（ｌ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１６６として寄託されたデュガネラ・ラディシス  （、
（ｍ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１９３として寄託されたデュガネラ・ビオラセイニグラ、
（ｎ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２３２として寄託されたデュガネラ・ビオラセイニグラ、
（ｏ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２３３として寄託されたデュガネラ・ビオラセイニグラ、
（ｐ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１９３として寄託されたディアドバクター・ソリ、
（ｑ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１９４として寄託されたディアドバクター・ソリ、
（ｒ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１９６として寄託されたフラボバクテリウム・グラシエイ、
（ｓ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１９７として寄託されたハーバスピリラム・クロロフェノリカム、
（ｔ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２３６として寄託されたハーバスピリラム・クロロフェノリカム、
（ｕ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１９８として寄託されたマッシリア・アルビディフラバ（Masilia albidiflava）、
（ｖ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１９９として寄託されたマッシリア・ニアステンシス（Masilia niastensis）、
（ｗ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２３５として寄託されたマッシリア・ニアステンシス（Masilia niastensis）、
（ｘ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２００として寄託されたノボスフィンゴビウム・リンダニクラスティカム、
（ｙ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２０１として寄託されたノボスフィンゴビウム・リンダニクラスティカム、
（ｚ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２０２として寄託されたノボスフィンゴビウム・レシノボルム、
（ａａ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２０３として寄託されたノボスフィンゴビウム・レシノボルム、
（ｂｂ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２０４として寄託されたパエニバチルス・グリカニリティカス、
（ｃｃ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２０５として寄託されたペドバクター・ソリ、
（ｄｄ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２０６として寄託されたペドバクター・テラエ、
（ｅｅ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１７６として寄託されたペドバクター・テラエ、
（ｆｆ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２３１として寄託されたポラロモナス・ギンセンギソリ、
（ｇｇ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２３４として寄託されたポラロモナス・ギンセンギソリ、
（ｈｈ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２０７として寄託されたシュードモナス・ジンジュエンシス、
（ｉｉ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２０８として寄託されたラムリバクター・ヘンチレンシス、
（ｊｊ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２１０として寄託されたリゾビウム・リゾリザエ、
（ｋｋ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２１１として寄託されたリゾビウム・リゾリザエ、
（ｌｌ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２１３として寄託されたエンシフェル・アダエレンス、
（ｍｍ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１６９として寄託されたエンシフェル・アダエレンス、
（ｎｎ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２１４として寄託されたスフィンゴピキシス・アラスケンシス、
（ｏｏ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２１５として寄託されたスフィンゴピキシス・アラスケンシス、
（ｐｐ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２１６として寄託されたバリオボラックス・ギンセンギソリ、および
（ｑｑ）ＮＲＲＬ寄託物番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２１７として寄託されたバリオボラックス・ギンセンギソリ
からなる群より選択される株である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
表１〜３より選択される単離細菌株。
【請求項４８】
請求項４７に記載の単離細菌株と実質的に類似の形態的特徴および生理的特徴を有する単離細菌株。
【請求項４９】
請求項４７に記載の単離細菌株と実質的に類似の遺伝的特徴を有する単離細菌株。
【請求項５０】
請求項４７に記載の単離細菌株の実質的に純粋な培養物。
【請求項５１】
請求項４７に記載の単離細菌株の子孫。
【請求項５２】
請求項４７に記載の単離細菌株の突然変異体。
【請求項５３】
請求項４７に記載の単離細菌株または前記単離細菌株の突然変異体の無細胞性または不活化調製物。
【請求項５４】
請求項４７に記載の単離細菌株または前記単離細菌株の突然変異体によって生産される代謝物質。
【請求項５５】
請求項４７に記載の単離細菌株、および
農業上許容可能な担体
を含む農業用組成物。
【請求項５６】
前記単離細菌株がグラム当たり１×１０３〜１×１０１２細菌細胞の割合で前記組成物中に存在する、請求項５５に記載の農業用組成物。
【請求項５７】
前記農業用組成物が種子被膜剤として製剤される、請求項５５に記載の農業用組成物。
【請求項５８】
少なくとも１つの有益な形質を植物種に付与する方法であって、
（ａ）前記植物、または前記植物が植え付けられている培地に請求項４７に記載の単離細菌株を適用すること
を含む前記方法。
【請求項５９】
少なくとも１つの有益な形質を植物種に付与する方法であって、
（ａ）前記植物、または前記植物が植え付けられている培地に請求項５５に記載の農業用組成物を適用すること
を含む前記方法。
【請求項６０】
表１〜３より選択される少なくとも２種類の微生物を含む微生物共同体。
【請求項６１】
表１に記載されるものから選択される少なくとも２種類の微生物を含む微生物共同体。
【請求項６２】
表２に記載されるものから選択される少なくとも２種類の微生物を含む微生物共同体。
【請求項６３】
表３に記載されるものから選択される少なくとも２種類の微生物を含む微生物共同体。
【請求項６４】
表４に記載される共同体より選択される微生物共同体。
【請求項６５】
表５に記載される共同体より選択される微生物共同体。
【請求項６６】
表６に記載される共同体より選択される微生物共同体。
【請求項６７】
表７に記載される共同体より選択される微生物共同体。
【請求項６８】
表８に記載される共同体より選択される微生物共同体。
【請求項６９】
表９に記載される共同体より選択される微生物共同体。
【請求項７０】
表１０に記載される共同体より選択される微生物共同体。
【請求項７１】
微生物種子被膜剤で強化された植物種子であって、
（ａ）植物種子、および
（ｂ）前記植物種子に塗布された種子被膜剤
を含み、前記種子被膜剤が表１〜３に記載される少なくとも１種類の微生物を含む、前記植物種子。
【請求項７２】
前記種子被膜剤が表４〜１０に記載される微生物の共同体を含む、請求項７１に記載の微生物種子被膜剤で強化された植物種子。
【請求項７３】
前記微生物種子被膜剤が種子当たり１×１０５〜１×１０９細菌細胞の濃度で表１〜３に記載される少なくとも１種類の微生物を含む、請求項７１に記載の微生物種子被膜剤で強化された植物種子。
【請求項７４】
農業に使用される表１〜３より選択される微生物。
【請求項７５】
少なくとも１種類の植物と表１〜３より選択される少なくとも１種類の微生物を含む植物と微生物の人造混合物。
【請求項７６】
植物種の望ましい表現型形質を増大または助長する方法であって、
（ａ）前記植物、または前記植物が植え付けられている培地に表１〜３より選択される細菌を適用すること
を含む前記方法。
【請求項７７】
前記細菌で植物種子を被覆すること、前記細菌で植物の一部分を被覆すること、植物の一部分に前記細菌を噴霧すること、植物または種子を植え付ける畝間に前記細菌を噴霧すること、植物の一部分、または植物が植え付けられる領域に前記細菌を潅注すること、植物の一部分、または植物が植え付けられる領域に前記細菌を拡散させること、植物の一部分、または植物が植え付けられる領域に前記細菌を散布すること、およびそれらの組合せにより前記適用が行われる、請求項７６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、あらゆる目的のためにそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される２０１５年２月９日に出願された米国仮特許出願番号第６２／１１３７９２号、および２０１５年５月２２日に出願された米国仮特許出願番号第６２／１６５６２０号、および２０１６年１月１９日に出願された米国仮特許出願番号第６２／２８０５０３号の優先権の利益を請求するＰＣＴ国際特許出願である。
【０００２】
技術分野
本開示は特に農業に用途を有する単離済みで、且つ、生物学的に純粋な微生物に関する。本開示の微生物を単離済み、且つ、生物学的に純粋な状態で利用することができ、そればかりか本開示の微生物は農業上許容可能な組成物に製剤される。さらに、本開示は本開示の微生物のうちの少なくとも２種類のメンバーを含む農業上有益な微生物共同体、ならびに農業用途における前記共同体の利用方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
国際連合世界食糧計画によると世界には９億人近くの栄養不良の人々が存在する。栄養不良の流行は発展途上国において特に顕著であり、そこでは６人に１人の子供が標準体重未満である。利用可能な食物の量が少ないことは多くの社会経済的要因の結果であると考えることができる。しかしながら、究極的な原因が何であれ、２０５０年までに９０億人に達すると予期されている増加する世界人口を養うために利用可能な食物が不足しているという事実は変わらない。国際連合は２０５０年の予測される世界人口を養うためには農業生産高が７０〜１００％増加することが必要であると推定している。
【０００４】
農業の効率性の生産性が世界の増加する人口の扶養に重要であることがこれらの衝撃的な世界人口と栄養不良人口により強調される。以前には決して見られなかった作物収量を達成することになった近代的条播作物農業により達成された技術的進歩は印象的である。しかしながら、遺伝子改変作物および新規殺虫性化合物および除草性化合物などの技術革新によって達成された進歩にもかかわらず、指数関数的に増加する世界人口の要求を満たすためには作物の生産高の改善が必要である。
【０００５】
科学者は世界の農業上の「収量ギャップ」（最良の観測収量と他の別の場所での結果との間の差）を狭めることができれば世界中の作物生産高が４５〜７０％増加するだろうと予測している。すなわち、世界中の地域に関係なく、農家全員がそれぞれの領域で予期される到達可能な最高の収量を達成することができれば世界の食料生産の不足の大部分に対処することができるだろう。しかしながら、不均一な世界の土地状況にまたがってより高い収量をどのように達成するかという問題を解決することは難しい。
【０００６】
収量ギャップは不充分な水、標準以下の農業行為、不充分な肥料、ならびに除草剤および抗病虫害剤が利用可能でないことにより説明可能であることが多い。しかしながら、水、肥料、除草剤、および抗病虫害剤の世界中での使用を大いに増加させることは世界の大半にとって経済的に実行不可能であるばかりではなく、環境的に悪い結果を有することになる。
【０００７】
したがって、先進国の大半で利用されている現在の高投入式農業システムを単に大規模化することにより農業生産高の期待に応えることは単に実現不可能である。
【０００８】
したがって、作物の生産高を増やし、所望の植物種に有益な形質を付与する改良された方法の緊急の必要性が本技術分野において存在する。
【発明の概要】
【０００９】
本開示は、どのように作物の生産高を改善し、それにより世界的な収量ギャップを狭めるかというこの重要な問題を扱い、それと共に植物種に他の有益な形質を付与する方法を提供する。
【００１０】
作物の生産高の増加および収量の増加に対する本開示が提供する解決法は水消費量の増加または系への合成化学物質投入量の増加に依存していないため、その解決法は地球資源にとって有害ではない。どちらかというと、本開示は望ましい植物に収量の増加を含む有益な特質を付与するために微生物を利用する。
【００１１】
したがって、本開示は、農家が重要な作物の収量を増加させることを可能にし、合成除草剤および合成抗病虫害剤の利用増加に依存していない環境的に持続可能な解決法を提供する。
【００１２】
複数の実施形態では本開示は１つ以上の望ましい植物の特質を助長する微生物および微生物共同体を利用する効率的で広範囲に利用可能な農業用プラットホームを規定する。
【００１３】
幾つかの実施形態では一種類の微生物が利用される。幾つかの態様ではその一種類の微生物が単離および精製される。幾つかの態様ではその一種類の微生物は分類学上の一つの種の細菌である。幾つかの態様ではその一種類の微生物は分類学上の一つの種の細菌の特定可能な株である。幾つかの態様ではその一種類の微生物は分類学上の一つの種の細菌の新規の新しく発見された株である。
【００１４】
幾つかの実施形態では表１の一種類の微生物が利用される。他の実施形態では表２の一種類の微生物が利用される。さらに他の実施形態では表３の一種類の微生物が利用される。
【００１５】
幾つかの実施形態ではボセア属の微生物が利用される。
【００１６】
幾つかの態様では、分類学的に特定可能な種であるにしても、または分類学的に特定可能な株であるにしても、その一種類の微生物は異なる種または株の１種類以上の他の微生物と混合される。ある特定の態様では２種類以上の微生物の混合物が共同体または合同体を形成する。共同体および合同体という用語は互換的に利用される。
【００１７】
ある特定の態様では本開示は、望ましい表現型植物形質または遺伝子型植物形質の発生および発現の助長に役立つ高機能性微生物共同体の開発を規定する。幾つかの実施形態では本開示の共同体は、個々の微生物が単独で生きているときには自然界で見られない機能特性を有する。すなわち、さまざまな実施形態において特定の微生物種を混合して共同体にすることにより、一つずつを見るとその合同体のどの１つの特定メンバーも所有していない機能特性を有する微生物混合物が生じる。
【００１８】
幾つかの実施形態では前記微生物共同体が有するこの機能特性は、１つ以上の有益な特質、例えば、成長の亢進、収量の増加、窒素利用効率の上昇、ストレス耐性の上昇、乾燥耐性の上昇、光合成速度の上昇、水利用効率の向上、病原体耐性の上昇、必ずしも植物の収量に影響しないが、むしろ植物の機能性に関係する植物構造の修飾等を植物種に付与する能力である。
【００１９】
幾つかの実施形態ではそれらの個々の微生物は自然界で存在するときにはこれらの有益な特質を植物に付与する能力を有していない。むしろ、幾つかの実施形態では人工的にこれらの微生物を混合して共同体にすることによって自然界には存在しない特性および機能特質を有する機能性組成物が開発される。
【００２０】
しかしながら、他の実施形態では本開示は、所望の植物種に有益な特質を付与することが可能であり、混合して共同体にすることを必要としない単離済み、且つ、生物学的に純粋な個々の微生物を規定する。
【００２１】
複数の実施形態では前記微生物共同体は表１の個々の微生物のあらゆる組合せであり得る。他の実施形態では前記微生物共同体は表２の個々の微生物のあらゆる組合せであり得る。さらに他の実施形態では前記微生物共同体は表３の個々の微生物のあらゆる組合せであり得る。さらに他の実施形態では前記微生物共同体は表１〜３のうちのいずれかの表の個々の微生物のあらゆる組合せであり得る。ある特定の実施形態では前記微生物共同体は２種類の微生物、または３種類の微生物、または４種類の微生物、または５種類の微生物、または６種類の微生物、または７種類の微生物、または８種類の微生物、または９種類の微生物、または１０種類の微生物、または１０種類より多くの種類の微生物を含む。
【００２２】
本開示の別の目的は単離された微生物および微生物共同体の植物成長促進剤としての使用に関する。他の態様ではそれらの単離された微生物および微生物共同体は成長調節剤として機能し、それらは、例えば、正常な老化を乱してバイオマスの増加を引き起こすことができる。
【００２３】
本開示のさらに別の目的は単離された微生物および微生物共同体の土壌健全性向上剤および植物健全性向上剤としての使用に関する。
【００２４】
本開示の別の目的は多次元的な活動を同じように行うことができる微生物合同体をデザインすることである。ある特定の態様ではその合同体を構成する微生物は相乗的に作用する。複数の態様ではある特定の植物の特性に対してその微生物合同体が有する効果は、その合同体のいずれか１つの特定の微生物メンバーが単独で利用された場合に観察される効果よりも大きい。すなわち、幾つかの態様ではその合同体のいずれかの特定メンバーが単独で利用された場合に見られる効果と比べると、その合同体は効果の合計よりも大きい効果を所望の植物の特性に対して示す。
【００２５】
幾つかの態様では前記共同体は、例えば、将来のミクロビオーム開発のための軌道を設定する初期入植者または創立者集団として活動することにより他の植物微生物間相互作用を確立することになる。
【００２６】
複数の実施形態では本開示は微生物単離物の相乗的組合せ（または混合物）を対象とする。
【００２７】
幾つかの態様では本明細書において教示される共同体は穀物、果実および花の収量の改善、植物の複数の部分の成長の改善、耐病性の改善、極めて厳しい気候での生存性の改善、および植物の他の望ましい表現型特性の改善をはじめとする広範囲の農業用途を提供する。どんな有害な副作用も環境にもたらすことなく植物へのこれらの利益を得ることができることが重要である。
【００２８】
幾つかの態様では本開示の個々の微生物または同微生物を含む共同体を組み合わせて農業上許容可能な組成物にすることができる。
【００２９】
幾つかの実施形態では本開示の農業用組成物には、限定されないが、湿潤剤、相溶化剤、消泡剤、洗浄剤、金属イオン封鎖剤、ドリフト低減剤、中和剤、緩衝剤、腐食防止剤、染料、着臭剤、展着剤、浸透助剤、固着剤、結合剤、分散剤、増粘剤、安定化剤、乳化剤、凝固点降下剤、抗菌剤、肥料、抗病虫害剤、除草剤、不活性担体、重合体等が含まれる。
【００３０】
本開示の１つの実施形態では前記微生物（単離された一種類の種、または株、または共同体を含む）は種子被膜剤または種子への他の適用物の形で提供される。複数の実施形態ではその種子被膜剤は裸で未処理の種子に塗布され得る。他の実施形態ではその種子被膜剤はその前に処理された種子に対する種子保護膜として塗布され得る。
【００３１】
幾つかの実施形態では塗布された微生物が内部寄生する場合があり、その結果、処理された生育中の植物およびその後代の子孫にそれらの微生物が存在することになる。他の実施形態ではそれらの微生物は種子処理剤との共処理として同時に塗布される場合がある。
【００３２】
本開示の１つの実施形態では前記微生物は顆粒、プラグ、または植物培地に投入される土壌潅注の形で提供される。他の実施形態では前記微生物は葉面噴霧組成物または葉面液体組成物など、葉面処理の形で提供される。葉面噴霧処理または葉面液体処理は生育中の植物または培地、例えば土壌に対して行われてよい。
【００３３】
複数の実施形態では本開示の農業用組成物は、何よりも、（１）液剤、（２）水和剤、（３）粉剤、（４）可溶粉剤、（５）濃縮乳剤または濃縮懸濁剤、（６）種子粉衣、（７）錠剤、（８）水分散性顆粒剤、（９）水溶性顆粒剤（持続放出性または急速放出性）、（１０）マイクロカプセル化顆粒剤または懸濁剤、および（１１）潅水用成分として製剤され得る。ある特定の態様ではそれらの組成物は従来の噴霧処理の前に水性媒体中に希釈されてよい。本開示の組成物は土壌、植物、種子、根圏、リゾシース（rhizosheath）、または前記微生物組成物を適用することが有益である他の領域に適用され得る。
【００３４】
本開示のさらに別の目的は高コロニー形成単位（ＣＦＵ）の細菌集団または細菌共同体を提供するように製剤されている前記農業用組成物に関する。幾つかの態様ではそれらの農業用組成物は適切な有効期間を規定するアジュバントを有する。複数の実施形態では本教示の農業用組成物のＣＦＵ濃度は前記微生物が自然界で存在するとき、すなわち前記微生物が本開示の方法の外側で存在するときの濃度よりも高い。別の実施形態ではその農業用組成物は担体１グラム当たり１０３〜１０１２ＣＦＵの濃度または担体１グラム当たり１０５〜１０９ＣＦＵの濃度で前記微生物細胞を含む。一つの態様では前記微生物細胞は１０５〜１０９ＣＦＵの濃度で種子被膜として種子に直接的に塗布される。他の態様では前記微生物細胞は１０５〜１０９ＣＦＵの濃度で種子保護膜として別の種子被膜の上に塗布される。他の態様では前記微生物細胞は１０５〜１０９ＣＦＵの濃度で別の種子処理剤との共処理として適用される。
【００３５】
複数の態様では本開示は植物の生育を促進する農業用微生物製剤を対象とする。複数の態様では本開示は農業用生物接種剤として製剤される本教示の単離微生物および同微生物を含む共同体を規定する。本教示の生物接種剤は植物、種子、または土壌に適用され得る。単離された微生物を含む生物接種剤の製剤の適切な例を参照により本明細書に援用される米国特許第７０９７８３０号明細書に見ることができる。
【００３６】
本開示の多微生物製剤は窒素含有肥料の必要性を低下させることができ、ミネラル分を可溶化することができ、病原体から植物を保護することができ、且つ、リン酸塩などの価値のある栄養分を植物にとって利用可能であるようにすることができ、それにより化学抗病虫害剤および化学肥料を使用する必要性が低下し、その必要性が除外される。
【００３７】
幾つかの実施形態では単離済みで、且つ、生物学的に純粋な本開示の微生物は所望の植物種に１つ以上の有益な特質または形質を付与する方法において利用され得る。
【００３８】
幾つかの実施形態では単離済みで、且つ、生物学的に純粋な本開示の微生物を含む農業上許容可能な組成物は所望の植物種に１つ以上の有益な特質または形質を付与する方法において利用され得る。
【００３９】
幾つかの実施形態では本開示の共同体は所望の植物種に１つ以上の有益な特質または形質を付与する方法において利用され得る。
【００４０】
幾つかの実施形態では本開示の共同体を含む農業上許容可能な組成物は所望の植物種に１つ以上の有益な特質または形質を付与する方法において利用され得る。
【００４１】
幾つかの態様では単離済みで、且つ、生物学的に純粋な本開示の微生物、および／または本開示の共同体は高速微生物選別プロセス（「ＡＭＳ」プロセス）から得られる。本開示の幾つかの態様で利用されるＡＭＳプロセスは例えば（１）国際公開第２０１２１２５０５０（Ａ１）号パンフレットとして２０１２年９月２０日に公開された国際出願ＰＣＴ／ＮＺ２０１２／００００４１号明細書、および（２）国際公開第２０１４０４６５５３（Ａ１）号パンフレットとして２０１４年３月２７日に公開された国際出願ＰＣＴ／ＮＺ２０１３／０００１７１号明細書において説明されており、これらのＰＣＴ出願のそれぞれの全体が全ての目的のために参照により本明細書に援用される。ＡＭＳプロセスは本開示において、例えば、図１〜４において説明されている。
【００４２】
しかしながら、他の実施形態では本開示の微生物は高速微生物選別プロセスから得られない。幾つかの態様では本開示の複数の実施形態において利用される微生物はデータベース内に存在する微生物のメンバーの中から選択される。特定の態様では本開示の複数の実施形態において利用される微生物は前記微生物の特定の特徴に基づいてデータベース内に存在する微生物から選択される。
【００４３】
本開示は、通常は植物の要素または植物の部分に見られない量でその植物の要素またはその植物の部分に単離された微生物または微生物共同体を被覆することにより前記植物の要素または前記植物の部分を効果的に増強することができると規定している。
【００４４】
本明細書に記載される幾つかの実施形態は、種子の表面にその種子にとって異種性である少なくとも１種類の単離微生物を含む精製微生物集団から構成される製剤を接触させることを含む、農業用種子組成物、すなわち種子被膜剤を調製するための方法である。その他の実施形態は、植物の表面にその植物にとって異種性である少なくとも１種類の単離微生物を含む精製微生物集団から構成される製剤を接触させることを含む農業用植物組成物の調製を必然的に伴う。
【００４５】
幾つかの態様では本開示の単離微生物、微生物共同体、および／または農業用組成物の種子または植物への適用により農学的に重要な形質が調節される。農学的に重要な形質は、例えば、耐病性、乾燥耐性、耐熱性、耐寒性、耐塩性、金属耐性、除草剤耐性、耐化学性、改善された水使用効率、改善された窒素利用、改善された窒素ストレスに対する耐性、改善された窒素固定、病虫害耐性、植食者耐性、病原体耐性、増加した収量、限定的な水条件下での増加した収量、健康状態の増進、生長力の改善、成長の改善、光合成能力の改善、栄養状態の増進、変化したタンパク質含量、変化した油含量、増加したバイオマス、増加したシュート長、増加した根長、改善された根構造、増加した種子重量、より短い種子発芽までの時間、変化した種子炭水化物組成、変化した種子油組成、さや数、老化の遅延化、緑色のままでいること、および変化した種子タンパク質組成であり得る。幾つかの態様では少なくとも２つ、３つ、４つ、またはそれより多くの農学的に重要な形質が調節される。幾つかの態様ではその調節は前述の農学的形質のうちの１つに対する正の効果である。
【００４６】
幾つかの態様では本開示の単離微生物、共同体、および／または農業用組成物は、基準植物と比べて変化した油含量、変化したタンパク質含量、変化した種子炭水化物組成、変化した種子油組成、変化した種子タンパク質組成、耐化学性、耐寒性、老化の遅延化、耐病性、乾燥耐性、穂重、成長の改善、健康状態の増進、耐熱性、除草剤耐性、植食者耐性、改善された窒素固定、改善された窒素利用、改善された根構造、改善された水使用効率、増加したバイオマス、減少したバイオマス、増加した根長、減少した根長、増加した種子重量、増加したシュート長、減少したシュート長、増加した収量、限定的な水条件下での増加した収量、穀粒質量、穀粒水分含量、金属耐性、穂数、穂当たりの穀粒数、さや数、栄養状態の増進、病原体耐性、病虫害耐性、光合成能力の改善、耐塩性、緑色のままでいること、生長力の改善、成熟した種子の増加した乾燥重量、成熟した種子の増加した新鮮重量、植物当たりの増加した成熟種子数、増加したクロロフィル含量、植物当たりの増加したさや数、植物当たりの増加したさや長、植物当たりの減少した、萎れた葉の数、植物当たりの減少した、ひどく萎れた葉の数、および植物当たりの増加した、萎れていない葉の数、代謝物質のレベルの検出可能な変化、転写物のレベルの検出可能な変化、およびプロテオームの検出可能な変化など、植物の特徴を調節または変更するために植物に適用され得る。
【００４７】
幾つかの実施形態では本明細書において教示される農業用製剤は農業適合性担体、粘着剤、微生物安定化剤、殺真菌剤、殺菌剤、除草剤、殺線虫剤、殺虫剤、植物成長調節剤、殺鼠剤、および栄養物からなる群より選択される少なくとも１つのメンバーを含む。
【００４８】
本明細書に記載される方法は少なくとも１００ＣＦＵもしくは芽胞、少なくとも３００ＣＦＵもしくは芽胞、少なくとも１，０００ＣＦＵもしくは芽胞、少なくとも３，０００ＣＦＵもしくは芽胞、少なくとも１０，０００ＣＦＵもしくは芽胞、少なくとも３０，０００ＣＦＵもしくは芽胞、少なくとも１００，０００ＣＦＵもしくは芽胞、少なくとも３００，０００ＣＦＵもしくは芽胞、少なくとも１，０００，０００ＣＦＵもしくは芽胞、またはそれより多くの本明細書において教示される微生物と種子または植物を接触させることを含み得る。
【００４９】
本明細書に記載される方法の幾つかの実施形態では本開示の単離微生物は農作植物の標的組織内、および／または標的組織上で検出可能であるために有効な量で製剤中に存在する。例えば、その微生物は植物の標的組織内、および／または標的組織上に少なくとも１００ＣＦＵもしくは芽胞、少なくとも３００ＣＦＵもしくは芽胞、少なくとも１，０００ＣＦＵもしくは芽胞、少なくとも３，０００ＣＦＵもしくは芽胞、少なくとも１０，０００ＣＦＵもしくは芽胞、少なくとも３０，０００ＣＦＵもしくは芽胞、少なくとも１００，０００ＣＦＵもしくは芽胞、少なくとも３００，０００ＣＦＵもしくは芽胞、少なくとも１，０００，０００ＣＦＵもしくは芽胞、またはそれより多くの量で検出される。あるいは、または加えて、本開示の微生物は、本開示の製剤が適用されなかった基準農作植物と比べるとその製剤が適用された植物のバイオマスおよび／または収量を少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、またはそれより多く増加させるために有効な量で製剤中に存在してよい。あるいは、または加えて、本開示の微生物は、本開示の製剤が適用されなかった基準農作植物と比べるとその製剤が適用された植物の目的の農学的形質を少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、またはそれより多く検出できるほどに調節するために有効な量で製剤中に存在してよい。
【００５０】
幾つかの実施形態では本明細書において教示される農業用組成物は常温保存可能である。幾つかの態様では本明細書において教示される微生物は凍結乾燥されている。ボトル、ジャー、アンプル、パッケージ、ベッセル、バッグ、ボックス、ビン、封筒、紙箱、コンテナ、サイロ、運送用コンテナ、トラックの荷台、およびケースからなる群より選択される物体の中に封じ込められている複数の単離微生物も本明細書に記載される。
【００５１】
幾つかの態様では選択された植物種を開示された微生物、すなわち操作的分類単位（ＯＴＵ）、株、または前述のもののうちのいずれかを含む組成物と組み合わせることにより作物の収量が改善され、それらの作物の産物の生産が改善される。したがって、１つの態様では本開示は、第１植物の種子およびその第１植物の種子の表面上に被覆されている微生物の調製物からなる人造混合物であって、その微生物が未被覆の基準種子の表面上に存在するよりも高いレベルで前記種子の表面に存在するような前記人造混合物を提供する。別の態様では本開示は、第１植物の一部分およびその第１植物のその部分の表面上に被覆されている微生物の調製物からなる人造混合物であって、その微生物が未被覆の基準植物の部分の表面上に存在するよりも高いレベルで前記第１植物のその部分の表面に存在するような前記人造混合物を提供する。前述の方法を単独で、または植物育種技術および植物遺伝子導入技術と並行して用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本明細書において指向性微生物選別とも呼ばれる高速微生物選別（ＡＭＳ）の開示された方法を模式的に表している一般化プロセスを示す図である。微生物合同体の文脈でそのプロセスを見るとき、その模式図は微生物合同体の指向性進化の過程を表している。そのプロセスは本開示の有益な微生物を得た１つの方法である。
【図２】本開示の有益な微生物を得た実施形態の一般化プロセスフローチャートを示す図である。
【図３】本開示の有益な微生物を得た実施形態の図解および付随するフローチャートを示す図である。
【図４】本開示の有益な微生物を得た実施形態の図解および付随するフローチャートを示す図である。
【図５】個々の微生物株（ＢＣＩ）の植菌後７日の時点におけるコムギの平均総バイオマスを新鮮重量のグラム数で表したグラフを示す図である。
【図６】個々の微生物株での処理後４日の時点におけるトウモロコシの平均シュート長をミリメートル単位で表したグラフを示す図である。トウモロコシの種子に個々の微生物株（ＢＤＮＺ番号）を植菌し、発芽検査の対象とした。種子に植菌し、それらの種子を湿らせたペーパータオル上に配置し、そしてそれらのペーパータオルを巻いた。巻いたペーパータオルを２５℃の密封したプラスチックバッグの中でインキュベートした。それぞれ３０粒ずつ二組の種子について個々の株を検査した。シュートの長さを植菌後日数（ＤＰＩ）４日の時点で測定した。標準誤差を表すバーが示されている。発芽率が検査した全ての株で良好である一方で、水対照と比較して植菌後日数（ＤＰＩ）４日の時点でシュート長の相対的増加をインビボで引き起こした株もあったことが結果より示されている。
【図７】個々の微生物株での処理後４日の時点におけるトウモロコシの平均根長をミリメートル単位で表したグラフを示す図である。トウモロコシの種子に個々の微生物株（ＢＤＮＺ番号）を植菌し、発芽検査の対象とした。種子に植菌し、それらの種子を湿らせたペーパータオル上に配置し、そしてそれらのペーパータオルを巻いた。巻いたペーパータオルを２５℃の密封したプラスチックバッグの中でインキュベートした。それぞれ３０粒ずつ二組の種子について個々の株を検査した。根の長さを植菌後日数（ＤＰＩ）４日の時点で測定した。標準誤差を表すバーが示されている。発芽率が検査した全ての株で良好である一方で、水対照と比較して植菌後日数（ＤＰＩ）４日の時点で根長の相対的増加をインビボで引き起こした株もあったことが結果より示されている。
【図８】個々の微生物株での処理後４日の時点におけるコムギの平均シュート長をミリメートル単位で表したグラフを示す図である。コムギの種子に個々の微生物株（ＢＤＮＺ番号）を植菌し、発芽検査の対象とした。種子に植菌し、それらの種子を湿らせたペーパータオル上に配置し、そしてそれらのペーパータオルを巻いた。巻いたペーパータオルを２５℃の密封したプラスチックバッグの中でインキュベートした。それぞれ３０粒ずつ二組の種子について個々の株を検査した。シュートの長さを処理後４日の時点で測定した。発芽率は検査した全ての株で良好であり（＞９０％）、且つ、水対照と比較して植菌後日数（ＤＰＩ）４日の時点でシュート長の相対的増加をインビトロで引き起こした株もあったことが結果より示されている。
【図９】個々の微生物株での処理後４日の時点におけるコムギの平均根長をミリメートル単位で表したグラフを示す図である。コムギの種子に個々の微生物株（ＢＤＮＺ番号）を植菌し、発芽検査の対象とした。種子に植菌し、それらの種子を湿らせたペーパータオル上に配置し、そしてそれらのペーパータオルを巻いた。巻いたペーパータオルを２５℃の密封したプラスチックバッグの中でインキュベートした。それぞれ３０粒ずつ二組の種子について個々の株を検査した。根の長さを処理後４日の時点で測定した。発芽率は検査した全ての株で良好であり（＞９０％）、且つ、水対照と比較して植菌後日数（ＤＰＩ）４日の時点で根長の相対的増加をインビトロで引き起こした株もあったことが結果より示されている。
【図１０】個々の微生物株での処理後４日の時点におけるトマトの平均シュート長をミリメートル単位で表したグラフを示す図である。Ｔｏｍａｔｏの種子に個々の微生物株（ＢＤＮＺ番号）を植菌し、発芽検査の対象とした。種子に植菌し、それらの種子を湿らせたペーパータオル上に配置し、そしてそれらのペーパータオルを巻いた。巻いたペーパータオルを２５℃の密封したプラスチックバッグの中でインキュベートした。それぞれ５０粒ずつ二組の種子について個々の株を検査した。シュートの長さを処理後４日の時点で測定した。水対照種子の平均シュート長を「Ｈ２Ｏ」と表示されている一番右のバーに見ることができる。発芽率は検査した全ての株で良好であり、且つ、水対照と比較して植菌後日数（ＤＰＩ）４日の時点でシュート長の相対的増加をインビトロで引き起こした株もあったことが結果より示されている。
【図１１】個々の微生物株での処理後４日の時点におけるトマトの平均根長をミリメートル単位で表したグラフを示す図である。トマトの種子に個々の微生物株（ＢＤＮＺ番号）を植菌し、発芽検査の対象とした。種子に植菌し、それらの種子を湿らせたペーパータオル上に配置し、そしてそれらのペーパータオルを巻いた。巻いたペーパータオルを２５℃の密封したプラスチックバッグの中でインキュベートした。それぞれ５０粒ずつ二組の種子について個々の株を検査した。根の長さを処理後４日の時点で測定した。水対照種子の平均根長を「Ｈ２Ｏ」と表示されている一番右のバーに見ることができる。発芽率は検査した全ての株で良好であり、且つ、水対照と比較して植菌後日数（ＤＰＩ）４日の時点で根長の相対的増加をインビトロで引き起こした株もあったことが結果より示されている。［受託番号］  特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
【００５３】
本願において説明される微生物はアメリカ合衆国、６１６０４、イリノイ州、ピオリア、ノースユニバーシティー・ストリート１８１５番地に位置する国際寄託当局である農業研究局特許培養物コレクション（ＮＲＲＬ）に寄託された。
【００５４】
寄託は特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項の下で行われた。
【００５５】
米国特許法施行規則第１．８０１〜１．８０９条および米国特許審査便覧第２４０２〜２４１１．０５条に示される基準に従い、且つ、それらの基準を満たすように寄託を行った。
【００５６】
前述のブダペスト条約による寄託物のＮＲＲＬ受託番号、寄託日の日付、および説明が表１〜３に提示される。
【表１−１】
2018507708.tif 000003
【表１−２】
2018507708.tif 000004
【表１−３】
2018507708.tif 000005
【表２】
2018507708.tif 000006
【表３−１】
2018507708.tif 000007
【表３−２】
2018507708.tif 000008
【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
2018507708.tif 000014
【発明を実施するための形態】
【００５７】
定義
以下の用語は当業者によって充分に理解されると考えられるが、本開示の内容の説明を容易にするために以下の定義を記載する。
【００５８】
「一つの（ａ）」または「一つの（ａｎ）」という用語はその実体の１つ以上を指し、すなわち、複数の指示物を指すことができる。したがって、「一つの（ａ）」または「一つの（ａｎ）」、「１つ以上の」および「少なくとも１つの」という用語は本明細書において互換的に使用される。加えて、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」によって「一つの要素」に言及することは、ただ一つのその要素が存在すると文脈から明確に求められない限り、一つより多くのその要素が存在する可能性を除外しない。
【００５９】
本明細書において使用される場合、「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」または「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」という用語は広い意味で理解されるべきである。これらの用語は互換的に使用され、それらの用語には２つの原核生物ドメインである細菌と古細菌、ならびに真核生物である真菌と原生生物が含まれるがこれらに限定されない。幾つかの実施形態では本開示は表１〜３の「微生物」、または本開示中に存在する他の様々な表の「微生物」を参照する。この特徴づけはそれらの表の特定された分類学上の細菌の属に関連するだけでなく、前記表の特定された分類学上の細菌の種、ならびに様々な新規の、および新たに特定された細菌株にも関連し得る。
【００６０】
「微生物共同体」または「微生物合同体」という用語は個々の微生物種、または種の株からなる微生物群落の一部分を指し、それは共通の機能を実行すると説明される場合があり得、または認識可能なパラメーターもしくは植物表現型形質に関係する、またはそのようなものを引き起こす、またはそのようなものと相関すると説明される場合があり得る。その群落は２種類以上の種の微生物または一つの種の２種類以上の株の微生物を含んでよい。幾つかの例ではそれらの微生物はその群落内で共生的に共存する。 
【００６１】
「微生物群落」という用語は２種類以上の種または株を含む微生物群を意味する。微生物共同体と異なり微生物群落には共通の機能を実行する必要性が無く、または認識可能なパラメーターもしくは植物表現型形質に関係する、またはそのようなものを引き起こす、またはそのようなものと相関する必要性が無い。
【００６２】
「高速微生物選別」または「ＡＭＳ」という用語は「指向性微生物選別」または「ＤＭＳ」という用語と互換的に使用され、本開示の幾つかの実施形態において本請求の微生物種または前記種の共同体を得るために利用される反復選別法を指す。
【００６３】
本明細書において使用される場合、「単離する」、「単離された」、「単離微生物」、およびそのような用語は、１種類以上の微生物が特定の環境においてそれが付着している物質（例えば土壌、水、植物組織）のうちの少なくとも１つから分離されていることを意味するものとする。
【００６４】
したがって、「単離微生物」はその自然状態の環境では存在せず、むしろ本明細書に記載される様々な技術を介してその微生物はその自然背景から取り出され、非自然的な存在状態に配置される。したがって、その単離株は、例えば、生物学的に純粋な培養物として、または農業用担体に付着している芽胞（またはその株の他の形態）として存在し得る。
【００６５】
本開示のある特定の態様では単離微生物は単離済みで、且つ、生物学的に純粋な培養物として存在する。特定の微生物の単離済みで、且つ、生物学的に純粋な培養物は、他の生物が前記培養物に（科学的理由で）実質的に含まれておらず、その問題の個々の微生物のみが前記培養物に含まれていることを表していることが当業者によって理解される。その培養物は様々な濃度の前記微生物を含むことができる。本開示は、単離済みで、且つ、生物学的に純粋な微生物は多くの場合で「あまり純粋ではない、または純粋ではない物質と必然的に異なる」ことを指摘する。例えば、（精製プロスタグランジンについて検討している）In re Bergstrom, 427 F.2d 1394, (CCPA 1970)を参照されたい。（精製微生物について検討している）In re Bergy, 596 F.2d 952 (CCPA 1979)も参照されたい。196 F. 496 (2d Cir. 1912)で一部は支持され、一部は差し戻しになった(Learned Handが精製アドレナリンについて検討している)Parke-Davis & Co. v. H.K. Mulford & Co., 189 F. 95 (S.D.N.Y. 1911)も参照されたい。これらの判例の各々は参照により本明細書に援用される。さらに、幾つかの態様では本開示は、単離済みで、且つ、生物学的に純粋な微生物培養物内で見出されなくてはならない濃度または純度限界のある特定の定量的測定法を規定する。ある特定の実施形態ではこれらの純度値の存在は本開示の微生物を自然状態で存在するそれらの微生物と区別する追加の属性である。例えば、参照により本明細書に援用する（微生物により生産されるビタミンＢ１２の純度限界について検討している）Merck & Co. v. Olin Mathieson Chemical Corp., 253 F.2d 156 (4th Cir. 1958)を参照されたい。
【００６６】
本明細書において使用される場合、「個々の単離物」は、１種類以上の他の微生物からの分離の後に単一の属、種、または株の微生物を圧倒的に含む組成物または培養物を意味すると理解されるべきである。その語句はその微生物が単離または精製されている程度を表すと理解されるべきではない。しかしながら、「個々の単離物」は実質的に一種類のみの属、種、または株の微生物を含むことができる。
【００６７】
本明細書において使用される「培地」という用語は、植物の生育を支援するために適切であるあらゆる媒体である。例として、その媒体は、限定されないが、土、鉢植え用培養土、バーク、バーミキュライト、水耕栽培用溶液単体および固形植物支持系に投入された水耕栽培用溶液、および組織培養ゲルを含む天然媒体または人工媒体であり得る。それらの媒体は単独で、または１つ以上の他の媒体と組み合わせて使用してよいことが理解されるべきである。外因性栄養素や根および葉のための物理的支持系を加えて、または加えずにその媒体を使用してもよい。
【００６８】
１つの実施形態ではその培地は土、砂、泥、粘土、腐植土、表土、石、または水などの天然媒体である。別の実施形態ではその培地は人工物である。そのような人工培地は天然媒体の状態を模倣するように構成されていてよいが、これは必須ではない。人工培地は砂、鉱物、ガラス、石、水、金属、塩、栄養物、水をはじめとする物質のうちの１つの物質、または１より多くのあらゆる数の物質、およびそれらの物質の組合せから作製され得る。１つの実施形態ではその培地は無菌である。別の実施形態ではその培地は無菌ではない。
【００６９】
追加の化合物または成分、例えば、特定のグループの微生物の植物との、および微生物相互との相互作用および／またはそのグループの微生物の選別を支援し得る成分によって前記培地を修正してよく、またはそのような成分によって前記培地を強化してよい。例えば、抗生物質（ペニシリンなど）または滅菌剤（例えば、四級アンモニウム塩および酸化剤）が存在してよく、且つ／または物理的条件（塩分、植物栄養物（例えば有機鉱物および無機鉱物（リン、窒素含有塩、アンモニア、カリウム、ならびにコバルトおよびマグネシウムのような微量栄養物など）、ｐＨ、および／または温度）を修正してよい。
【００７０】
本明細書において使用される場合、「植物」という用語には植物の全体またはあらゆる部分またはその派生物、例えば植物細胞、植物プロトプラスト、植物を再生することができる植物細胞組織培養物、植物カルス、胚、花粉、胚珠、果実、花、葉、種子、根、根端などが含まれる。
【００７１】
本明細書において使用される場合、「栽培品種」という用語は園芸技術または農学技術によって作製され、自然集団の中では通常見られない植物の変種、株、または品種を指す。
【００７２】
本明細書において使用される場合、「双子葉類」、「双子葉植物」および「双子葉類の」という用語は２枚の子葉を含む胚を有する顕花植物を指す。本明細書において使用される場合、「単子葉類」、「単子葉植物」および「単子葉類の」という用語は１枚のみの子葉を含む胚を有する顕花植物を指す。これらのグループの間には当然他の公知の差があり、当業者はそれらの差を容易に認識する。
【００７３】
本明細書において使用される場合、「改善された」は植物のある特徴の対照植物と比較した、または問題となっている特徴に付随する公知の平均的な量と比較した改善を包含すると広く理解されるべきである。例えば、本開示の有益な微生物または共同体の適用に付随する「改善された」植物バイオマスは、本明細書において教示される微生物によって処理された植物のバイオマスを処理されていない対照植物のバイオマスに対して比較することにより実証され得る。あるいは、当業者に知られている科学または農業の刊行物の中で示されているような所与の植物によって通常達成される平均的バイオマスに対して本明細書において教示される微生物によって処理された植物のバイオマスを比較することが可能である。本開示では「改善された」はデータが統計学的に有意（すなわちｐ＜０．０５）であることを必ずしも要求しない。むしろ１つの値（例えば平均処理値）が別の値（例えば平均対照値）と異なっていることを示す数量化量可能なあらゆる差が「改善された」レベルまで上昇し得る。
【００７４】
本明細書において使用される場合、「阻害および抑制すること」およびそのような用語が、幾つかの実施形態においては求められてよいことではあるが、完全な阻害または抑制を要求すると解釈されてはならない。
【００７５】
本明細書において使用される場合、「遺伝子型」という用語は個々の細胞、細胞培養物、組織、生物（例えば植物）、または生物群の遺伝的構成を指す。
【００７６】
本明細書において使用される場合、「アレル」という用語はある遺伝子の１種類以上の代替的形態のうちのいずれかを意味し、それらのアレルの全てが少なくとも１つの形質または特徴に関連する。二倍体細胞では所与の遺伝子の２つのアレルが一対の相同染色体上の対応する座位を占める。複数の実施形態において本開示はＱＴＬ、すなわち１種類以上の遺伝子または調節配列を含み得るゲノム領域に関するので、幾つかの例では「アレル」の代わりに「ハプロタイプ」（すなわちある染色体断片のアレル）を参照するほうがより正確である。しかしながら、それらの例では「アレル」という用語は「ハプロタイプ」という用語を含むと理解されるべきである。アレルが類似の表現型を発現するとき、それらのアレルは同一であると考えられる。配列の差はあり得るが、配列の差が表現型に影響しない限りそれらの配列の差は重要ではない。
【００７７】
本明細書において使用される場合、「座位（ｌｏｃｕｓ）」（複数形で座位（ｌｏｃｉ））という用語は例えば遺伝子または遺伝マーカーが見られる染色体上の特定の場所または特定の複数の場所または部位を意味する。
【００７８】
本明細書において使用される場合、「遺伝的に連鎖した」という用語は、交雑によって２種類以上の形質を分離することが困難であるほど育種中に高率で共遺伝するそれらの２種類以上の形質を指す。
【００７９】
本明細書において使用される「組換え」または「組換え事象」は染色体交差または独立組み合せを指す。「組換え体」という用語は組換え事象の結果として生じる新しい遺伝的構成を有する植物を指す。
【００８０】
本明細書において使用される場合、「分子マーカー」または「遺伝マーカー」という用語は核酸配列の特徴の差を可視化するための方法において使用される指標を指す。そのような指標の例は特定の遺伝的位置および染色体上の位置を規定する制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカー、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、挿入突然変異、マイクロサテライトマーカー（ＳＳＲ）、配列特徴的増幅領域（ＳＣＡＲ）、切断増幅多型配列（ＣＡＰＳ）マーカー、またはアイソザイムマーカー、または本明細書に記載されるマーカーの組合せである。あるアレルの近傍にある分子マーカーのマッピングは分子生物学技術の当業者によって実施され得る技法である。
【００８１】
本明細書において使用される場合、「形質」という用語は特徴または表現型を指す。例えば、本開示の幾つかの実施形態の背景では作物の収量はある植物によって生産される市場性のあるバイオマス（例えば、果実、繊維、穀粒）の量に関する。望ましい形質には、限定されないが、水使用効率、栄養物使用効率、生産高、機械式収穫の可能性、果実の成熟度、貯蔵期間、病虫害耐性／耐病性、早期植物成熟、ストレス耐性等を含む植物の他の特徴が含まれてもよい。形質は優性遺伝または劣性遺伝されてもよく、または部分的もしくは不完全に優性遺伝されてもよい。形質は単遺伝子性（すなわち単一の座位によって決定される）または多遺伝子性（すなわち１つより多くの座位によって決定される）であってよく、または環境と１種類以上の遺伝子の相互作用から生じてもよい。
【００８２】
優性形質はヘテロ接合状態またはホモ接合状態のときに完全に表現型を発現することになり、劣性形質はホモ接合性状態で存在するときにのみ、その劣性形質を発現する。
【００８３】
本開示の背景では１種類以上の植物遺伝子および１種類以上の微生物遺伝子の相互作用から形質が生じてもよい。
【００８４】
本明細書において使用される場合、「ホモ接合性」という用語は、２つの同一のアレルが特定の座位に存在していて、それらが二倍体生物の細胞中の対応する対の相同染色体上に個別に配置されているときに存在する遺伝的状態を意味する。逆に、本明細書において使用される場合、「ヘテロ接合性」という用語は、２つの異なるアレルが特定の座位に存在していて、それらが二倍体生物の細胞の対応する対の相同染色体上に個別に配置されている時に存在する遺伝的状態を意味する。
【００８５】
本明細書において使用される場合、「表現型」という用語は、個体の遺伝的構成（すなわち、遺伝子型）と環境との間の相互作用から生じる個々の細胞、細胞培養物、生物（例えば植物）、または生物群の観察可能な特徴を指す。
【００８６】
本明細書において使用される場合、核酸配列またはタンパク質配列について述べるときの「キメラ」または「組換え」という用語は少なくとも２つの異種性ポリヌクレオチド、または２つの異種性ポリペプチドを結合して単一の巨大分子になっている核酸配列またはタンパク質配列を指し、または少なくとも１つの天然核酸配列もしくはタンパク質配列の１つ以上の要素を再構成している核酸配列またはタンパク質配列を指す。例えば、「組換え」という用語は２つの他の場合であれば分離されている配列断片の、例えば、化学合成による人工的連合体、または遺伝子操作技術による単離核酸断片の操作による人工的連合体を指すことができる。
【００８７】
本明細書において使用される場合、「合成ヌクレオチド配列」または「合成ポリヌクレオチド配列」は自然界に生じることが知られていないヌクレオチド配列、または天然物ではないヌクレオチド配列である。一般的にそのような合成ヌクレオチド配列は他のあらゆる天然ヌクレオチド配列と比較すると少なくとも１か所のヌクレオチドの差を含むことになる。
【００８８】
本明細書において使用される場合、「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのどちらか、またはそれらの類似体のあらゆる長さの多量体型のヌクレオチドを指す。この用語はその分子の一次構造を指し、したがって二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡを含む。その用語にはメチル化および／またはキャップ化核酸、修飾塩基含有核酸、骨格改変含有核酸などのような修飾核酸も含まれる。「核酸」および「ヌクレオチド配列」という用語は互換的に使用される。
【００８９】
本明細書において使用される場合、「遺伝子」という用語は生物学的機能と関連するＤＮＡのあらゆる断片を指す。したがって、遺伝子にはコード配列および／またはコード配列の発現に必要な調節配列が含まれるがこれらに限定されない。遺伝子には、例えば、他のタンパク質の認識配列を形成する非発現ＤＮＡ断片も含まれ得る。目的の起源からのクローニングまたは公知の配列情報もしくは予想配列情報からの合成をはじめとして様々な起源から遺伝子を得ることができ、遺伝子には所望のパラメーターを有するようにデザインされた配列が含まれてもよい。
【００９０】
本明細書において使用される場合、「相同な」または「相同体」または「オルソログ」という用語は当技術分野において知られており、共通の祖先またはファミリーメンバーを有し、且つ、配列同一性の程度に基づいて決定される関連配列を指す。「相同性」、「相同な」、「実質的に類似の」および「実質的に対応する」という用語は本明細書において互換的に使用される。それらの用語は１つ以上のヌクレオチド塩基の変化によって遺伝子発現を媒介する能力またはある特定の表現型を発生させる能力が影響されていない核酸断片を指す。これらの用語は、最初の未修飾断片と比較して、生じた核酸断片の機能特質を実質的に変化さることがない１つ以上のヌクレオチドの欠失または挿入などの本開示の核酸断片の改変も指す。しがたって、当業者が理解するように、本開示は特定の例となる配列以外の配列も包含することが理解される。これらの用語は１種類の種、亜種、変種、栽培品種または株に見られる遺伝子と別の種、亜種、変種、栽培品種または株の対応する遺伝子または同等の遺伝子との間の関係を説明する。本開示の目的のためには相同配列が比較される。「相同配列」または「相同体」または「オルソログ」は機能的に関連していると考えらえる、信じられる、または知られている。機能的関係は、限定されないが、（ａ）配列同一性の程度および／または（ｂ）同一または類似の生物学的機能を含む多数の面のうちのいずれか１つに関して示され得る。（ａ）と（ｂ）の両方が示されることが好ましい。Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubelら編、1987年) Supplement 30, section 7.718, Table 7.71において検討されているプログラムのような当技術分野において容易に利用可能なソフトウェアプログラムを使用して相同性を決定することができる。幾つかのアラインメントプログラムはMacVector（Oxford Molecular社、オックスフォード、英国）、ALIGN Plus（Scientific and Educational Software社、ペンシルバニア州）および AlignX （Vector NTI、Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）である。別のアラインメントプログラムはS
equencher（Gene Codes社、アナーバー、ミシガン州）であり、初期パラメーターを使用する。
【００９１】
本明細書において使用される場合、「ヌクレオチド変化」という用語は当技術分野においてよく理解されているように、例えば、ヌクレオチドの置換、欠失、および／または挿入を指す。例えば、突然変異にはサイレントな置換、付加、または欠失を生成してコードされるタンパク質の特性もしくは活性、またはそのタンパク質が作製される様式を変えることがない変化が含まれる。
【００９２】
本明細書において使用される場合、「タンパク質の改変」という用語は当技術分野においてよく理解されているように、例えば、アミノ酸置換、アミノ酸修飾、欠失、および／または挿入を指す。
【００９３】
本明細書において使用される場合、ある核酸またはポリペプチドの「少なくとも一部」または「断片」という用語はそのような配列に特徴的な最小限のサイズを有する部分、またはその部分よりも幾らかでも大きい全長分子の断片であって最大でその全長分子を含むそれ以下の断片を意味する。本開示のポリヌクレオチドの断片は遺伝的調節性エレメントの生物学的活性部分をコードしてよい。遺伝的調節性エレメントを含む本開示のポリヌクレオチドのうちの１つの一部を単離し、本明細書に記載されるように活性を評価することによりその遺伝的調節性エレメントの生物学的活性部分を調製することができる。同様に、ポリペプチドの一部は４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸などであってよく、最大で全長ポリペプチドまでになる。使用されるその部分の長さは特定の用途によって左右される。ハイブリダイゼーションプローブとして有用な核酸部分は１２ヌクレオチドほどの長さでよい。幾つかの実施形態ではそれは２０ヌクレオチドである。エピトープとして有用なポリペプチド部分は４アミノ酸ほどの長さでよい。全長ポリペプチドの機能を実行するポリペプチド部分は４アミノ酸よりも長くなることが一般的である。
【００９４】
変異体ポリヌクレオチドはＤＮＡシャッフリングなどの突然変異形成法および組換え誘導法に由来する配列も包含する。そのようなＤＮＡシャッフリングのための戦略が当技術分野において知られている。例えば、Stemmer (1994) PNAS 91:10747-10751、Stemmer (1994) Nature 370:389-391、Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438、Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347、Zhang et al. (1997) PNAS 94:4504-4509、Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291、ならびに米国特許第５６０５７９３号明細書および第５８３７４５８号明細書を参照されたい。本明細書において開示されるポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のため、あらゆる目的の植物から抽出されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡより対応するＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲ反応において使用されるようにオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。ＰＣＲプライマーの設計方法およびＰＣＲクローニング方法が当技術分野において一般的に知られており、それらの方法はSambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual（第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、プレーンビュー、ニューヨーク州）の中に開示されている。Innisら編、(1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications （Academic Press、ニューヨーク）、Innis および Gelfand編、(1995) PCR Strategies （Academic Press、ニューヨーク）、ならびにInnis および Gelfand編、(1999) PCR Methods Manual （Academic Press、ニューヨーク）も参照されたい。ＰＣＲの公知の方法には対になったプライマーを使用する方法、ネステッドプライマーを使用する方法、一方だけが特異的なプライマーを使用する方法、縮重プライマーを使用する方法、遺伝子特異的プライマーを使用する方法、ベクター特異的プライマーを使用する方法、部分的ミスマッチプライマーを使用する方法などが含まれるがこれらに限定されない。
【００９５】
本明細書において使用される「プライマー」という用語は、プライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に置かれると、すなわち、ヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼなどの重合用の薬剤および適切な温度とｐＨの存在下に置かれるとＤＮＡポリメラーゼが取り付くことを可能にし、それによってＤＮＡ合成の開始点として役立つ増幅標的にアニーリングすることが可能であるオリゴヌクレオチドを指す。（増幅）プライマーは増幅の効率を最大にするために一本鎖であることが好ましい。そのプライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドであることが好ましい。そのプライマーは重合用の薬剤の存在下で伸長産物の合成を開始するために充分に長い必要がある。それらのプライマーの正確な長さは温度およびプライマーの組成（Ａ／Ｔ対Ｇ／Ｃ含量）をはじめとする多くの因子に左右される。双方向性プライマー対は、ＰＣＲ増幅におけるプライマーのようにＤＮＡ増幅の技術分野で共通して使用されるような１本のフォワードプライマーと１本のリバースプライマーからなる。
【００９６】
「ストリンジェンシー」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語はハイブリッドの安定性に影響するハイブリダイゼーション条件、例えば、温度、塩濃度、ｐＨ、ホルムアミド濃度などを指す。これらの条件はプライマーまたはプローブのその標的核酸配列に対する特異的結合を最大化し、且つ、非特異的結合を最小化するように経験的に最適化される。使用されるそれらの用語にはプローブまたはプライマーが他の配列に対するときよりも高い検出の程度で（例えば、バックグラウンドに対して少なくとも２倍を超える）その標的配列にハイブリダイズするときの条件への言及が含まれる。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、様々な状況下で異なる。大きな配列ほど高い温度で特異的にハイブリダイズする。ストリンジェントな条件は規定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択されることが一般的である。そのＴｍは相補性標的配列の５０％が完全一致するプローブまたはプライマーにハイブリダイズするときの（規定のイオン強度およびｐＨの下での）温度である。ストリンジェントな条件は、典型的には、ｐＨ７．０〜８．３で塩濃度が約１．０Ｍ未満のＮａ＋イオン、典型的には約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋イオンの濃度（または他の塩）であり、且つ、温度が短いプローブまたはプライマー（例えば１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、（例えば５０ヌクレオチドを超える）長いプローブまたはプライマーについては少なくとも約６０℃である条件になる。ストリンジェントな条件はホルムアミドなどの脱安定化剤の添加によって達成されてもよい。例となる低ストリンジェント条件または「ストリンジェンシーが低下した条件」には３７℃における３０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳからなる緩衝溶液を用いるハイブリダイゼーションと４０℃における２×ＳＳＣの中での洗浄が含まれる。例となる高ストリンジェンシー条件には３７℃における５０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳの中でのハイブリダイゼーションと６０℃における０．１×ＳＳＣの中での洗浄が含まれる。ハイブリダイゼーション法は当技術分野においてよく知られており、例えばAusubel et al., 1998および Sambrook et al., 2001によって説明されている。幾つかの実施形態ではストリンジェントな条件は４５℃における１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、０．５〜２０％、例えば０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％のドデシル硫酸ナトリウムを含む０．２５ＭのＮａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．２）の中でのハイブリダイゼーションとそれに続く５５℃〜６５℃における０．１％（重量／体積）のドデシル硫酸ナトリウムを含む５×ＳＳＣの中での洗浄である。
【００９７】
本明細書において使用される場合、「プロモーター」はコード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。そのプロモーター配列は近位上流エレメントとより遠位にある上流エレメントからなり、後者のエレメントはエンハンサーと呼ばれることが多い。よって、「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、それはそのプロモーターの固有のエレメントであってよく、またはプロモーターのレベルまたは組織特異性を強化するために挿入される異種性エレメントであってもよい。プロモーターはそれらの全体が天然遺伝子に由来してよく、または自然界で見られる様々なプロモーターに由来する様々なエレメントから構成されてよく、または合成ＤＮＡ断片を含んでもよい。異なるプロモーターが異なる組織または細胞種において、または異なる発生ステージにおいて、または異なる環境条件に応答して遺伝子発現を誘導し得ることが当業者によって理解される。調節配列の正確な境界が完全に規定されていない事例がほとんどであるので幾らか変化しているＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を持つ場合があることがさらに理解される。
【００９８】
本明細書において使用される場合、「植物プロモーター」は、その起源が植物細胞であるにしても、そうでないにしても、植物細胞において転写を開始することが可能であるプロモーターであり、例えばアグロバクテリウムプロモーターは植物細胞内で機能することがよく知られている。したがって、植物プロモーターには植物、植物ウイルスならびにアグロバクテリウム属細菌およびブラディリゾビウム属細菌のような細菌から得られたプロモーターＤＮＡが含まれる。植物プロモーターは構成的プロモーターまたは非構成的プロモーターであり得る。
【００９９】
本明細書において使用される場合、「構成的プロモーター」は大半の条件下および／または大半の発生ステージ中に活性を有するプロモーターである。植物生物工学において使用される発現ベクター、例えば遺伝子導入細胞または遺伝子導入植物の選択に使用されるタンパク質の高レベルの生産、簡単な検出と定量を可能にするレポータータンパク質または採点可能マーカーの高レベルの発現、調節性転写系の一部である転写因子の高レベルの生産、植物において遍在性活性を必要とする化合物の生産、および植物発生の全てのステージにおいて必要とされる化合物の生産において使用される発現ベクター中に構成的プロモーターを使用することには幾つかの利点がある。非限定的な例となる構成的プロモーターにはＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、ｏｐｉｎｅプロモーター、ユビキチンプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーターなどが含まれる。
【０１００】
本明細書において使用される場合、「非構成的プロモーター」はある特定の条件下で、ある特定の種類の細胞において、および／またはある特定の発生ステージ中に活性を有するプロモーターである。例えば、組織特異的プロモーター、組織嗜好性プロモーター、細胞種特異的プロモーター、細胞種嗜好性プロモーター、誘導可能プロモーター、および発生制御下のプロモーターが非構成的プロモーターである。発生制御下のプロモーターの例には茎、葉、根、または種子などのある特定の組織において転写を優先的に開始するプロモーターが含まれる。
【０１０１】
本明細書において使用される場合、「誘導可能」プロモーターまたは「抑制可能」プロモーターは化学因子制御下または環境因子制御下にあるプロモーターである。誘導可能プロモーターによって転写を実行し得る環境条件の例には嫌気性条件、またはある特定の化学物質、または光の存在が含まれる。
【０１０２】
本明細書において使用される場合、「組織特異的」プロモーターはある特定の組織においてのみ転写を開始するプロモーターである。遺伝子の構成的発現と異なり、組織特異的発現は幾つかの相互に作用する遺伝子制御の結果である。したがって、当技術分野では特定の組織における導入遺伝子の効率的で信頼性のある発現を達成するために相同な植物種または近縁の植物種に由来するプロモーターを使用することが好ましいときがある。このことが、科学文献と特許文献の両方において見られる特定の植物および組織から単離された組織特異的プロモーターが大量にある主な理由の１つである。
【０１０３】
本明細書において使用される場合、「機能可能であるように結合した」という用語は、一方の核酸配列の機能が他方の核酸配列によって制御されるような単一の核酸断片上でのそれらの核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターがコード配列の発現を制御することが可能である（すなわち、そのコード配列がそのプロモーターの転写制御下にある）とき、そのプロモーターはそのコード配列と機能可能であるように結合している。コード配列はセンス方向またはアンチセンス方向で調節配列と機能可能であるように結合することができる。別の例では本開示の相補性ＲＮＡ領域は標的ｍＲＮＡの５’側、または標的ｍＲＮＡの３’側、または標的ｍＲＮＡ内に直接的または間接的に機能可能であるように結合することができ、または第一相補性領域は標的ｍＲＮＡに対して５’側であり、その相補領域は標的ｍＲＮＡに対して３’側である。
【０１０４】
本明細書において使用される場合、「組換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」、「キメラコンストラクト」、「コンストラクト」、および「組換えＤＮＡコンストラクト」という語句は本明細書において互換的に使用される。組換えコンストラクトは核酸断片、例えば、自然界では一緒に見られない調節配列とコード配列の人工的な組合せを含む。例えば、キメラコンストラクトは異なる起源に由来する調節配列とコード配列、または同じ起源に由来するが自然界で見られるものとは異なる様に配置されている調節配列とコード配列を含んでよい。そのようなコンストラクトは単独で使用されてもよく、ベクターと併せて使用されてもよい。ベクターを使用する場合、ベクターの選択は当業者によく知られているように宿主細胞を形質転換するために使用される方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。当業者は宿主細胞の形質転換、本開示の単離核酸断片のいずれかを含む宿主細胞の選択と増殖に成功するためにベクター上に存在していなくてはならない遺伝要素をよく理解している。当業者は、異なる独立した形質転換事象によって異なる発現レベルと発現パターンが生じることになり（Jones et al., (1985) EMBO J. 4:2411-2418; De Almeida et al., (1989) Mol. Gen. Genetics 218:78-86）、したがって所望の発現レベルと発現パターンを示す株を得るために複数の事象をスクリーニングしなくてはならないことも理解する。そのようなスクリーニングは何よりもＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のイムノブロッティング分析、または表現型分析によって達成され得る。ベクターは、自律的に複製するか、または宿主細胞の染色体に統合し得るプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体などであり得る。ベクターは、自律的に複製していない裸ＲＮＡポリヌクレオチド、裸ＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内でＤＮＡとＲＮＡの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリリシン複合体化ＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチド複合体化ＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソーム複合体化ＤＮＡなどでもあり得る。本明細書において使用される場合、「発現」という用語は機能性最終産物、例えばｍＲＮＡまたはタンパク質（前駆体または成熟体）の生産を指す。
【０１０５】
幾つかの実施形態では前記細胞または生物は少なくとも１つの異種性形質を有する。本明細書において使用される場合、「異種性形質」という用語は形質転換された宿主細胞または遺伝子導入生物に外来性ＤＮＡ断片、異種性ポリヌクレオチド、または異種性核酸により与えられた表現型を指す。植物における脂肪酸組成の改変、植物のアミノ酸含量の変更、植物の病原体防御機構の変更、経済的に重要な形質（例えば、穀粒収量、糧秣収量等）についての植物の収量の増加などを含むがこれらに限定されない表現型の様々な変化が本開示の関心事である。これらの結果は本開示の方法および組成物を使用して植物において異種性産物を発現させることにより、または内在性産物の発現を上昇させることにより達成され得る。
【０１０６】
「人造混合物」は植物と本開示の微生物の混合物を含み得る。その混合は、例えば、農作植物などの植物の種子の表面、または宿主植物組織（根、茎、葉等）を本開示の微生物で被覆することにより達成され得る。さらに、「人造混合物」は様々な株または種の微生物の混合物を含み得る。人造混合物はその混合物を自然界で生じるあらゆる混合物から区別する少なくとも１種類の変数を有する。その変数は、特に、自然には生じない種子上または植物組織上での微生物濃度、または自然には生じない微生物と植物の組合せ、または自然には生じない微生物同士または株同士の組合せであってよい。これらの例の各々において、その人造混合物は人為性を示し、且つ、その混合物の個々の要素が単離状態であると考えられるときには存在しない構造的特性および／または機能的特性を有する。
【０１０７】
幾つかの実施形態ではある微生物が種子または植物にとって「内在性」であり得る。本明細書において使用される場合、ある微生物が起源とする植物または種子からその微生物が得られている場合にその微生物はその植物標本にとって「内在性」であると考えられる。すなわち、前記微生物が自然界で前記植物に付着して見られる場合、前記微生物はその植物標本にとって「内在性」であると考えられる。植物に内在性微生物を適用する複数の実施形態では、その内在性微生物は自然界でその植物に見られるレベルとは異なる量で適用される。したがって、所与の植物にとって内在性である微生物が自然には生じないレベルでその植物上に存在する場合、前記微生物はなお前記植物と人造混合物を形成し得る。
【０１０８】
幾つかの実施形態ではある微生物が種子または植物にとって「外来性」（「異種性」とも呼ばれる）であり得る。本明細書において使用される場合、ある微生物が起源とする植物または種子からその微生物が得られていない場合にその微生物はその植物標本にとって「外来性」であると考えられる。すなわち、前記微生物が自然界で前記植物に付着して見られない場合、前記微生物はその植物標本にとって「外来性」であると考えられる。例えば、あるトウモロコシ植物の葉組織に通常付着している微生物は前記微生物を自然界では有していない別のトウモロコシ植物の葉組織にとって外来性であると考えられる。別の例ではあるトウモロコシ植物に通常付着している微生物は前記微生物を自然界では有していないコムギ植物にとって外来性であると考えられる。
【０１０９】
所与の植物組織に微生物を「外因的に付着させる」こともできる。これは自然界ではその微生物が見られない植物組織にその微生物を配置することを意味する。例えば、所与の微生物が自然界では所与の植物の根だけに発生する場合、植物の地上組織にその微生物を外因的に適用することができ、それによって前記植物組織にその微生物を「外因的に付着させる」ことになる。したがって、自然界ではある微生物を存在させていない、または自然界ではある微生物を適用されている数では存在させていない植物にその微生物を適用するとき、その微生物は外因的に付着させられたと見なされる。
【０１１０】
本明細書における前記組成物および方法によって宿主植物に改善された「農学的形質」または「農学的に重要な形質」が提供されてよく、それらには、限定されないが、次のもの、すなわち前記種子処理製剤を使用せずに種子から生育された同質遺伝子系統植物と比べて変化した油含量、変化したタンパク質含量、変化した種子炭水化物組成、変化した種子油組成、および変化した種子タンパク質組成、耐化学性、耐寒性、老化の遅延化、耐病性、乾燥耐性、穂重、成長の改善、健康状態の増進、耐熱性、除草剤耐性、植食者耐性、改善された窒素固定、改善された窒素利用、改善された根構造、改善された水使用効率、増加したバイオマス、増加した根長、増加した種子重量、増加したシュート長、増加した収量、限定的な水条件下での増加した収量、穀粒質量、穀粒水分含量、金属耐性、穂数、穂当たりの穀粒数、さや数、栄養状態の増進、病原体耐性、病虫害耐性、光合成能力の改善、耐塩性、緑色のままでいること、生長力の改善、成熟した種子の増加した乾燥重量、成熟した種子の増加した新鮮重量、植物当たりの増加した成熟種子数、増加したクロロフィル含量、植物当たりの増加したさや数、植物当たりの増加したさや長、植物当たりの減少した、萎れた葉の数、植物当たりの減少した、ひどく萎れた葉の数、および植物当たりの増加した、萎れていない葉の数、代謝物質のレベルの検出可能な変化、転写物のレベルの検出可能な変化、およびプロテオームの検出可能な変化が含まれ得る。
所与の植物種に有益な形質を付与する本開示の微生物および共同体による能力
【０１１１】
本開示は望ましい植物種、例えば目的の農学的種に有益な特質（または有益な形質）を付与するために微生物を利用する。本開示では「有益な特質」または「有益な形質」という用語は互換的に使用され、それは本明細書に記載される微生物または微生物共同体の適用によって望ましい植物表現型または目的の遺伝的特質が調節されることを表す。前述のように、幾つかの態様では所与の微生物によって生産される代謝物質が究極的には有益な形質の調節または所与の植物への有益な形質の付与の原因となっていることが非常にあり得る。
【０１１２】
本開示の微生物の適用によって調節され得る非常に多くの有益な形質が存在する。例えば、それらの微生物は１つ以上の有益な特質、例えば、成長の亢進、収量の増加、窒素利用効率の上昇、ストレス耐性の上昇、乾燥耐性の上昇、光合成速度の上昇、水利用効率の向上、病原体耐性の上昇、必ずしも植物の収量に影響しないが、むしろ植物の機能性に関係する植物構造の修飾、植物に目的の代謝物質の生産を増加させること等を植物種に付与する能力を有し得る。
【０１１３】
複数の態様では本明細書において教示される微生物は穀物、果実および花の収量の改善、植物の複数の部分の成長の改善、耐病性の改善、極めて厳しい気候での生存性の改善、および植物の他の望ましい表現型特性の改善を含む広範囲の農業用途を提供する。
【０１１４】
幾つかの態様では本開示の単離微生物、共同体、および／または農業用組成物は、基準植物と比べて変化した油含量、変化したタンパク質含量、変化した種子炭水化物組成、変化した種子油組成、変化した種子タンパク質組成、耐化学性、耐寒性、老化の遅延化、耐病性、乾燥耐性、穂重、成長の改善、健康状態の増進、耐熱性、除草剤耐性、植食者耐性、改善された窒素固定、改善された窒素利用、改善された根構造、改善された水使用効率、増加したバイオマス、増加した根長、増加した種子重量、増加したシュート長、増加した収量、限定的な水条件下での増加した収量、穀粒質量、穀粒水分含量、金属耐性、穂数、穂当たりの穀粒数、さや数、栄養状態の増進、病原体耐性、病虫害耐性、光合成能力の改善、耐塩性、緑色のままでいること、生長力の改善、成熟した種子の増加した乾燥重量、成熟した種子の増加した新鮮重量、植物当たりの増加した成熟種子数、増加したクロロフィル含量、植物当たりの増加したさや数、植物当たりの増加したさや長、植物当たりの減少した、萎れた葉の数、植物当たりの減少した、ひどく萎れた葉の数、および植物当たりの増加した、萎れていない葉の数、代謝物質のレベルの検出可能な変化、転写物のレベルの検出可能な変化、およびプロテオームの検出可能な変化など、植物の特徴を調節または変更するために植物に適用され得る。
【０１１５】
幾つかの態様では本開示の単離微生物、共同体、および／または農業用組成物は特定の植物の特徴を負の方向で調節するために植物に適用され得る。例えば、幾つかの態様では本開示の微生物は目的の表現型形質を減少させることができるが、これはこの機能性が幾つかの適用例で望ましい場合があり得るからである。例えば、本開示の微生物は根の成長を減少させる能力、または根の長さを減少させる能力を有してよい。または、それらの微生物はシュートの成長を減少させる能力、または植物が成長するスピードを低下させる能力を有してよいが、これは植物形質のこれらの調節がある特定の用途において望ましい可能性があるからである。
表１〜３の単離微生物
【０１１６】
複数の態様では本開示は表１〜３に提示されている特定済みの微生物種の新しい株を含む単離微生物を提供する。
【０１１７】
他の態様では本開示は表１〜３において特定済みの種および株の単離全微生物培養物を提供する。これらの培養物は様々な濃度で微生物を含んでよい。
【０１１８】
複数の態様では本開示は表１〜３から選択される微生物の農業における利用を規定する。
【０１１９】
幾つかの実施形態では本開示はアゾトバクター属、アゾスピリルム属、バチラス属、ボセア属、カウロバクター属、デュガネラ属、フラボバクテリウム属、ハーバスピリラム属、ルテイバクター属、マッシリア属、ムシラギニバクター属、パントエオ（Pantoeo）属、パエニバチラス属、ポラロモナス属、シュードデュガネラ属、シュードモナス属、ラーネラ属、ラムリバクター属、リゾビウム属、ロドコッカス属、ロドフェラックス属、スフィンゴビウム属、およびステノトロホモナス属に属する単離微生物種を提供する。
【０１２０】
幾つかの実施形態では植物種に１つ以上の有益な特質を付与するためにボセア属の微生物が農業に利用される。
【０１２１】
幾つかの実施形態では本開示はアゾトバクター・クロオコッカム（Azotobacter chroococcum）、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）(最近、パントエア・バガンス（Pantoea vagans）に割り当てを直された）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・オリジハビタンス（Pseudomonas oryzihabitans）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、およびステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）からなる群より選択される単離微生物種を提供する。
【０１２２】
幾つかの実施形態では本開示はアゾトバクター・クロオコッカム、パントエア・アグロメランス（最近、パントエア・バガンスに割り当てを直された）、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・オリジハビタンス、シュードモナス・プチダ、ラーネラ・アクアティリス、リゾビウム・エトリ、ロドコッカス・エリスロポリス、およびステノトロホモナス・マルトフィリアからなる群より選択される種の新規単離微生物株を提供する。これらの前述の種の特定の新しい株を表１〜３に見ることができる。
【０１２３】
さらに、本開示は表１〜３において特定済みの微生物の特徴と実質的に類似の特徴を有する微生物に関する。
【０１２４】
本開示において特定される単離微生物種および前記種の新しい株は標的植物種に有益な特質または形質を付与することができる。
【０１２５】
例えば、表１〜３に記載される単離微生物または前記微生物の共同体は植物の健康および生長力を改善することができる。その改善された植物の健康および生長力は、例えば、前記微生物適用が植物の表現型または遺伝子型形質に対して有する効果を測定することにより定量的に測定され得る。
表１〜３の微生物共同体
【０１２６】
複数の態様では本開示は表１において特定済みの微生物の中から選択される少なくともいずれか２種類の微生物の組合せを含む微生物共同体を提供する。
【０１２７】
他の態様では本開示は表２において特定済みの微生物の中から選択される少なくともいずれか２種類の微生物の組合せを含む微生物共同体を提供する。
【０１２８】
さらに他の態様では本開示は表３において特定済みの微生物の中から選択される少なくともいずれか２種類の微生物の組合せを含む微生物共同体を提供する。
【０１２９】
また、本開示は表１〜３において特定済みの微生物の中から選択される少なくともいずれか２種類の微生物の組合せを含む微生物共同体を提供する。
【０１３０】
ある特定の実施形態では本開示の共同体は２種類の微生物、または３種類の微生物、または４種類の微生物、または５種類の微生物、または６種類の微生物、または７種類の微生物、または８種類の微生物、または９種類の微生物、または１０種類以上の微生物を含む。その共同体の前記微生物は異なる微生物種、またはある微生物種の異なる株である。
【０１３１】
幾つかの実施形態では本開示はアゾトバクター属、アゾスピリルム属、バチラス属、ボセア属、カウロバクター属、デュガネラ属、フラボバクテリウム属、ハーバスピリラム属、ルテイバクター属、マッシリア属、ムシラギニバクター、パントエア属、パエニバチラス属、ポラロモナス属、シュードデュガネラ属、シュードモナス属、ラーネラ属、ラムリバクター属、リゾビウム属、ロドコッカス属、ロドフェラックス属、スフィンゴビウム属、およびステノトロホモナス属に属する少なくとも２種類の単離微生物種を含む共同体を提供する。
【０１３２】
幾つかの実施形態では本開示はアゾトバクター・クロオコッカム、パントエア・アグロメランス（最近、パントエア・バガンスに割り当てを直された）、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・オリジハビタンス、シュードモナス・プチダ、ラーネラ・アクアティリス、リゾビウム・エトリ、ロドコッカス・エリスロポリス、およびステノトロホモナス・マルトフィリアからなる群より選択される少なくとも２種類の単離微生物種を含む共同体を提供する。
【０１３３】
幾つかの実施形態では本開示はアゾトバクター・クロオコッカム、パントエア・アグロメランス（最近、パントエア・バガンスに割り当てを直された）、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・オリジハビタンス、シュードモナス・プチダ、ラーネラ・アクアティリス、リゾビウム・エトリ、ロドコッカス・エリスロポリス、およびステノトロホモナス・マルトフィリアからなる群より選択される種の少なくとも２つの新規単離微生物株を含む共同体を提供する。これらの前述の種の特定の新しい株を表１〜３に見ることができる。
【０１３４】
特定の態様では本開示は表４〜１０においてグループ分けされている種を含む微生物共同体を提供する。表４〜１０について、ＡからＩの文字は以下のように規定される本開示の微生物の非限定的な選択を表している。
【０１３５】
Ａ＝表１において特定済みのアゾトバクター・クロオコッカ（Azotobacter chroococcu）および付随する新規株、
【０１３６】
Ｂ＝表１において特定済みのパントエア・アグロメランス（最近、パントエア・バガンスに割り当てを直された）および付随する新規株、
【０１３７】
Ｃ＝表１において特定済みのシュードモナス・フルオレッセンスおよび付随する新規株、
【０１３８】
Ｄ＝表１において特定済みのシュードモナス・オリジハビタンスおよび付随する新規株、
【０１３９】
Ｅ＝表１において特定済みのシュードモナス・プチダおよび付随する新規株、
【０１４０】
Ｆ＝表１において特定済みのラーネラ・アクアティリスおよび付随する新規株、
【０１４１】
Ｇ＝表１において特定済みのリゾビウム・エトリおよび付随する新規株、
【０１４２】
Ｈ＝表１において特定済みのロドコッカス・エリスロポリスおよび付随する新規株、および
【０１４３】
Ｉ＝表１において特定済みのステノトロホモナス・マルトフィリアおよび付随する新規株。
【表４】
2018507708.tif 000015
【表５】
2018507708.tif 000016
【表６】
2018507708.tif 000017
【表７】
2018507708.tif 000018
【表８】
2018507708.tif 000019
【表９】
2018507708.tif 000020
【表１０】
2018507708.tif 000021
【０１４４】
幾つかの実施形態では前記微生物共同体は表４〜１０のあらゆるメンバー群から選択され得る。
単離微生物‐原試料
【０１４５】
色々な場所の中でもニュージーランドおよびアメリカ合衆国内の様々な場所で本開示の微生物を得た。
単離微生物‐微生物培養技術
【０１４６】
表１〜３の微生物は、それらの微生物の表現型を特徴解析し、次にそれを利用して分類学的に認識される種にその微生物を特定するために標準的な顕微鏡技術を利用して特定された。
【０１４７】
本開示の微生物の単離、特定、および培養は標準的な微生物学的技術を使用して達成され得る。そのような技術の例をそれぞれ参照により援用するGerhardt, P.（編）Methods for General and Molecular Microbiology. American Society for Microbiology, ワシントンＤ．Ｃ．（１９９４年）および Lennette, E. H.（編）Manual of Clinical Microbiology, 第３版. American Society for Microbiology, ワシントンＤ．Ｃ．（１９８０年）の中に見出すことができる。
【０１４８】
上で本明細書に記載された表現型形質（例えば、グラム陽性／陰性、好気的／嫌気的に芽胞を形成することが可能であるか、細胞の形態、炭素源代謝、酸／塩基生産、酵素分泌、代謝分泌等）を特徴とするシングルコロニーを得るため、および汚染混入した培養物に対して作業する可能性を低くするために固形培地（例えば、栄養物寒天プレート）上に標本を画線することにより単離を達成することができる。
【０１４９】
例えば、本開示の単離細菌について、生物学的試料の継代培養を繰り返し、各継代培養の後に固形培地へ画線して個々のコロニーを得ることにより生物学的に純粋な単離物を得ることができる。凍結乾燥細菌の調製方法、融解方法、および培養方法は一般的に知られており、例えば、C. A. Reddy, T. J. Beveridge, J. A. Breznak, G. A. Marzluf, T. M. Schmidt, and L. R. Snyder編、American Society for Microbiology, ワシントンＤ．Ｃ．、1033頁内のGherna, R. L. and C. A. Reddy. 2007. Culture Preservation, p 1019-1033.が参照により本明細書に援用される。したがって、グリセロールを含む溶液中に−７０℃で長期保存されている凍結乾燥された液体製剤および培養物を本発明の製剤の提供に関して使用することが企図されている。
【０１５０】
好気性条件下の液体培地中で本開示の細菌を増殖させることができる。本開示の細菌株を増殖させるための培地は炭素源、窒素源、および無機塩、ならびにビタミン、アミノ酸、核酸などのような特別に必要とされる物質を含む。それらの細菌株の増殖に使用され得る適切な炭素源の例にはデンプン、ペプトン、イーストエクストラクト、アミノ酸、グルコース、アラビノース、マンノース、グルコサミン、マルトースなどのような糖、酢酸、フマル酸、アジピン酸、プロピオン酸、クエン酸、グルコン酸、リンゴ酸、ピルビン酸、マロン酸などのような有機酸の塩、エタノールおよびグリセロールなどのようなアルコール、大豆油、米糠油、オリーブ油、コーン油、ゴマ油のような油脂が含まれるがこれらに限定されない。添加されるその炭素源の量は炭素源の種類に応じて変化し、１リットルの培地当たり１グラムから１００グラムの間であるのが典型的である。主要な炭素源としてグルコース、デンプン、および／またはペプトンが０．１〜５％（重量／体積）の濃度でその培地に含まれていることが好ましい。本発明の細菌株の増殖に使用され得る適切な窒素源の例にはアミノ酸、イーストエクストラクト、トリプトン、ビーフエクストラクト、ペプトン、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニアまたはそれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。窒素源の量は窒素源の種類に応じて変化し、１リットルの培地当たり０．１グラムから３０グラムの間であるのが典型的である。それらの無機塩、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸第二鉄、硫酸第一鉄、塩化第二鉄、塩化第一鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムを単独で、または組み合わせて使用することができる。無機酸の量はその無機塩の種類に応じて変化し、１リットルの培地当たり０．００１グラムから１０グラムの間であることが典型的である。特別に必要とされる物質の例にはビタミン、核酸、イーストエクストラクト、ペプトン、ミートエクストラクト、モルトエクストラクト、乾燥酵母およびそれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。それらの細菌株の増殖を可能にする温度、基本的には２０℃と４６℃の間の温度で培養を行うことができる。幾つかの態様では温度の範囲は３０℃〜３７℃である。最適の増殖のため、幾つかの実施形態では前記培地はｐＨ７．０〜７．４に調節され得る。前記細菌株を培養するためにミシガン州デトロイトのDifco社より入手可能なNutrient BrothまたはNutrient Agarのような市販の培地を使用してもよいことが理解される。培養時間は使用する培地の種類と主要炭素源としての糖の濃度に応じて変化し得ることが理解される。
【０１５１】
複数の態様では培養は２４〜９６時間の間にわたって続く。この様にして得ら得た細菌細胞は当技術分野においてよく知られている方法を使用して単離される。例には膜濾過および遠心分離が含まれるがこれらに限定されない。水酸化ナトリウムなどを使用してｐＨを調節してよく、水分含量が４％以下に等しくなるまで凍結乾燥機を使用してその培養物を乾燥してよい。上で本明細書に記載された各株を増殖させることにより微生物共培養物を得ることができる。適合可能な培養条件を用いることができるときにはそれらの微生物株を一緒に培養してよいことが理解される。
単離微生物‐微生物株
【０１５２】
利用可能なすべての表現型データおよび遺伝子型データをコンセンサス分類に組み込んでいる多相性分類学（Vandamme et al. 1996. Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics. Microbiol Rev 1996, 60:407-438）に基づいて微生物を属に分類することができる。種を限定するための１つの許容される遺伝子型方法は全体的なゲノム関連性に基づいており、それによると標準的な条件下で５℃以下のΔＴｍ（相同性ハイブリッドと異種性ハイブリッドとの間の融点の差）でＤＮＡ−ＤＮＡ間ハイブリダイゼーションを用いて約７０％以上の関連性を有する株が同じ種のメンバーであると考えられる。したがって、前述の７０％の閾値よりも高い割合を有する集団は同じ種の変種であると考えられ得る。
【０１５３】
種間の区別をつけるために１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を使用することが多く、それではある１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列が所定の％配列同一性に満たない基準配列との配列同一性を有する場合にそれらの配列が得られた２種類の生物は異なる種の生物であると言われる。
【０１５４】
したがって、複数の微生物が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列にわたる配列同一性を有する場合にそれらの微生物は同じ種の微生物であると考えることが可能である。複数の態様ではある微生物が少なくとも９５％の同一性を有していればそれだけでその微生物は同じ種であると考えられ得る。
【０１５５】
さらに、一つの種の微生物株を、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列にわたる配列同一性を有する微生物株として定義することが可能である。基準配列に対して２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列を比較してもよい。複数の態様ではある微生物が少なくとも９５％の同一性を有していればそれだけでその微生物は同じ株であると考えられ得る。複数の実施形態では「実質的に類似の遺伝的特徴」は少なくとも９５％の同一性を有する微生物を意味する。
【０１５６】
培養不可能な微生物を表現型が決定されていない状態で確定的な種に割り当てることは不可能である場合が多く、それらの微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列が既知の種との同一性原理に適う場合にそれらの微生物をある属の中の候補（ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ）に指定することができる。
【０１５７】
１つのアプローチは配列空間における近縁種の多数の株の分布を観察し、他のクラスターからよく分離している株クラスターを特定することである。このアプローチは複数のコア（ハウスキーピング）遺伝子の連結配列を使用してクラスター化パターンを評価することにより開発されており、多座位配列分析（ＭＬＳＡ）または多座位配列系統樹分析と呼ばれている。現在の分類学の方法により非常に近縁の種に割れ当てられた多数の株の間でのクラスター化パターンを調査するため、ある属の中の少数の株の間での関係、またはより広範囲の分類群内での関係を調べるため、および具体的な分類学上の問題に対処するためにＭＬＳＡがうまく用いられている。より一般的には、細菌種が存在するか尋ねるため、すなわち、大集団の類似株がよく分離したクラスターに常に分類されるか観察するため、または幾つかの事例ではクラスターへの明確な分離が観察されない遺伝的連続性が存在するか観察するためにその方法を使用することができる。
【０１５８】
より正確に属の決定を行うため、形態学的特徴、生化学的特徴、および生理学的特徴などの表現型形質の決定を行って基準属原型と比較する。コロニーの形態には色、形、着色、粘りの生成等が含まれ得る。細胞の特徴は形、サイズ、グラム反応、細胞外物質、内生胞子の存在、鞭毛の存在と場所、運動性、および封入体について説明される。生化学的特徴および生理学的特徴は様々な範囲の温度、ｐＨ、塩分および大気条件でのその生物の増殖、異なる単一の炭素源が存在するときの増殖、および異なる単一の窒素源が存在するときの増殖を説明する。当業者は本開示の属を規定する表現型形質を合理的に特定することになる。例えば、リゾビウム属の種を特定するために特定の寒天（例えばＹＭＡ）上でのコロニー、色、形態、および風合いが用いられた。
【０１５９】
１つの実施形態では本明細書において教示される微生物は１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を利用して特定された。１６Ｓ  ｒＲＮＡは細菌の特定に有用な種／株特異的なシグネチャ配列を提供することができる超可変領域を含むことが当技術分野において知られている。本開示ではそれらの微生物の多くが部分的な（５００〜１２００ｂｐの）１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列シグネチャを介して特定された。複数の態様では各株が寒天プレートから選別された純粋なコロニー単離物を表す。存在する生物の多様性を表すために寒天培地上でのコロニーのあらゆる決定的な形態学的特徴に基づいて選別を行った。複数の実施形態では使用した培地はＲ２Ａ、ＰＤＡ、窒素非含有半固形培地、またはＭＲＳ寒天であった。「ピックされた」単離物の各々のコロニーについての説明を２４時間の培養後に行い、我々のデータベースに入力した。それらの単離物の各々について配列データを後で得た。
【０１６０】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を使用する系統樹分析を用いて共通の属に属する「実質的に類似の」種を限定し、且つ、所与の分類学上の種の「実質的に類似の」株も限定した。さらに、我々は、植物に有利に行動する可能性がある株と株の間の重要ではない差と重要な差の両方を強調するために利用され得る単離物の生理学的特質および／または生化学的特質を記録した。
農業用組成物
【０１６１】
幾つかの実施形態では本開示の微生物は農業用組成物に混合される。幾つかの実施形態では本開示の農業用組成物には、限定されないが、湿潤剤、相溶化剤（「相溶化薬」とも呼ばれる）、消泡剤、洗浄剤、金属イオン封鎖剤、ドリフト低減剤、中和剤および緩衝剤、腐食防止剤、染料、着臭剤、展着剤（「拡展剤」とも呼ばれる）、浸透助剤（「浸透剤」とも呼ばれる）、固着剤（「粘着剤」または「結合剤」とも呼ばれる）、分散剤、増粘剤（「濃厚剤」とも呼ばれる）、安定化剤、乳化剤、凝固点降下剤、抗菌剤などが含まれる。
【０１６２】
幾つかの実施形態では本開示の農業用組成物は固体である。固形組成物が使用される場合、１種類以上の担体材料を活性単離微生物または共同体と共に含むことが望ましい場合がある。幾つかの実施形態では本開示は、限定されないが、シリカ、シリカゲル、ケイ酸塩、タルク、カオリン、アッタクレイ、石灰岩、チョーク、黄土、粘土、ドロマイト、珪藻土、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、合成土壌様材料などの鉱物土、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、チオ尿素および尿素などの肥料、シリアルミール、ツリーバークミール、ウッドミールおよびナッツシェルミールなどの植物起源の製品、セルロースパウダー、アタパルジャイト、モンモリロナイト、マイカ、バーミキュライト、合成シリカおよび合成ケイ酸カルシウム、またはこれらの組成物をはじめとする担体の使用を教示する。
【０１６３】
幾つかの実施形態では本開示の農業用組成物は液体である。したがって、幾つかの実施形態では本開示は本明細書において開示される農業用組成物がモノエタノールアミン塩、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、硫酸水素アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、シュウ酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、チオ硫酸アンモニウム、二リン酸水素アンモニウム、一リン酸二水素アンモニウム、リン酸水素ナトリウムアンモニウム、チオシアン酸アンモニウム、スルファミン酸アンモニウムまたはカルバミン酸アンモニウムなどの化合物または塩を含み得ることを教示する。
【０１６４】
幾つかの実施形態では本開示は農業用組成物がポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、部分加水分解ポリ酢酸ビニル、カルボキシメチルセルロース、デンプン、ビニルピロリドン／酢酸ビニル共重合体およびポリ酢酸ビニル、またはこれらの組成物などの結合剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、タルクまたはポリエチレングリコール、またはこれらの組成物などの滑沢剤、シリコーン乳液、長鎖アルコール、リン酸エステル、アセチレンジオール、脂肪酸または有機フッ素化合物などの消泡剤、およびエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）の塩、トリニトリロトリ酢酸の塩、またはポリリン酸の塩、またはこれらの組成物などの錯化剤を含み得ることを教示する。
【０１６５】
幾つかの実施形態では前記農業用組成物は表面活性剤を含む。幾つかの実施形態ではそれらの表面活性剤は液体農業用組成物に添加される。他の実施形態ではそれらの表面活性剤は固形製剤、特に適用前に担体によって希釈されるように設計されている固形製剤に添加される。したがって、幾つかの実施形態では前記農業用組成物は界面活性剤を含む。界面活性剤は標的に対する前記微生物の生物学的性能を改善するために単体で使用されることがあり、または他の添加物、例えば、スプレータンクミックスへのアジュバントとしての鉱物油または植物油と共に使用されることがある。生物学的機能強化のために使用される界面活性剤の種類は前記微生物の性質と作用機序に概ね依存する。それらの表面活性剤は陰イオン性、陽イオン性、または非イオン性の性質であり得、乳化剤として、湿潤化剤として、懸濁化剤として、または他の目的のために用いられ得る。幾つかの実施形態ではそれらの界面活性剤はアルキルエトキシレート、直鎖状脂肪族アルコールエトキシレート、および脂肪族アミンエトキシレートなどの非イオン性界面活性剤である。製剤技術分野において従来的に使用されおり、且つ、本製剤において使用されてもよい界面活性剤がMcCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual, MC Publishing社、リッジウッド、ニュージャージー州、１９９８年およびEncyclopedia of Surfactants, Ｉ〜ＩＩＩ巻、Chemical Publishing社、ニューヨーク、1980〜81年に記載されている。幾つかの実施形態では本開示は、芳香族スルホン酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、またはアンモニウム塩、例えば、リグノスルホン酸、フェノールスルホン酸、ナフタレンスルホン酸およびジブチルナフタレンスルホン酸、ならびにアリールスルホン酸の脂肪酸、アルキルエーテル、ラウリルエーテル、脂肪族アルコール硫酸エステルおよび脂肪族アルコールグリコールエーテル硫酸エステルのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、またはアンモニウム塩、ホルムアルデヒドとのスルホン酸化ナフタレンの縮合物およびその誘導体、フェノールおよびホルムアルデヒドとナフタレンまたはナフタレンスルホン酸の縮合物、ホルムアルデヒドとフェノールまたはフェノールスルホン酸の縮合物、ホルムアルデヒドおよび亜硫酸ナトリウムとフェノールの縮合物、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、エトキシル化イソオクチルフェノール、エトキシル化オクチルフェニルエーテル、またはエトキシル化ノニルフェノール、トリブチルフェニルポリグリコールエーテル、アルキルアリールポリエーテルアルコール、イソトリデシルアルコール、エトキシル化ひまし油、エトキシル化トリアリールフェノール、リン酸含有トリアリールフェノールエトキシレートの塩、ラウリルアルコールポリグリコールエーテルアセテート、ソルビトールエステル、リグニンサルファイト廃液またはメチルセルロース、またはこれらの組成物をはじめとする界面活性剤の使用を教示する。
【０１６６】
幾つかの実施形態では本開示は、ラウリル硫酸ジエタノールアンモニウムなどのアルキル硫酸の塩、ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウムなどのアルキルアリールスルホン酸塩、ノニルフェノールＣ１８エトキシレートなどのアルキレンオキシド付加アルキルフェノール産物、トリデシルアルコールＣ１６エトキシレートなどのアルキレンオキシド付加アルコール産物、ステアリン酸ナトリウムなどの石鹸、ジブチルナフタレンスルホン酸ナトリウムなどのアルキルナフタレンスルホン酸塩、ジ（２−エチルヘキシル）スルホコハク酸ナトリウムなどのジアルキルスルホコハク酸エステル塩、ソルビトールオレエートなどのソルビトールエステル、ラウリルトリメチルアンモニウムクロリドなどの四級アミン、ポリエチレングリコールステアレートなどの脂肪酸のポリエチレングリコールエステル、エチレンオキシドとプロピレンオキシドのブロック共重合体、モノアルキルリン酸エステルとジアルキルリン酸エステルの塩、大豆油、菜種油／キャノーラ油、オリーブ油、ひまし油、ヒマワリ種子油、ココナッツ油、コーン油、綿実油、亜麻仁油、パーム油、ピーナッツ油、ヒマワリ油、ゴマ油、桐油などのような植物油、および上記の植物油のエステル、特にメチルエステルをはじめとする他の適切な表面活性剤を教示する。
【０１６７】
幾つかの実施形態では前記農業用組成物は湿潤化剤を含む。湿潤化剤は液体に添加されるとその液体とその液体が広がっている表面との間の界面張力を低下させることによりその液体の拡散力または浸透力を増大させる物質である。湿潤化剤は農薬製剤における２つの主要な機能、すなわち、可溶性液剤濃縮液または懸濁濃縮液を作製するために加工および製造時に水中での粉剤の湿潤速度を上昇させること、およびスプレータンクまたは他の容器の中で製品を水と混合している間の水和剤の湿潤時間を減少させ、水分散性顆粒剤への水の浸透を改善することのために使用される。幾つかの実施形態では水和剤、懸濁濃縮液、および水分散性顆粒製剤をはじめとする本開示の農業用組成物において使用される湿潤化剤の例はラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、アルキルフェノールエトキシレート、および脂肪族アルコールエトキシレートである。
【０１６８】
幾つかの実施形態では本開示の農業用組成物は分散剤を含む。分散剤は、粒子の表面に吸着し、且つ、それらの粒子の分散状態の保護に役立ち、且つ、それらの粒子が再凝集することを防ぐ物質である。幾つかの実施形態では分散剤は製造時に分散および懸濁を促進するために、およびスプレータンク中でそれらの粒子が水に再分散することを確実にするために本開示の農業用組成物に添加される。幾つかの実施形態では分散剤は水和剤、懸濁濃縮液、および水分散性顆粒剤に使用される。分散剤として使用される界面活性剤は粒子表面上に強力に吸着する能力を有し、且つ、粒子の再凝集に対する帯電障壁または立体障壁を提供する。幾つかの実施形態では最も一般的に使用される界面活性剤は陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、またはそれらの２種類の混合物である。
【０１６９】
水和剤製剤の幾つかの実施形態では最も一般的な分散剤はリグノスルホン酸ナトリウム類である。幾つかの実施形態では懸濁濃縮液はナフタレンスルホン酸ナトリウムホルムアルデヒド縮合物などの高分子電解質を使用して非常に良好な吸着と安定化を提供する。幾つかの実施形態ではトリスチリルフェノールエトキシレートリン酸エステルも使用される。幾つかの実施形態ではアルキルアリールエチレンオキシド縮合物およびＥＯ−ＰＯブロック共重合体などが懸濁濃縮液の分散剤として陰イオン性界面活性剤と組み合わせられることがある。
【０１７０】
幾つかの実施形態では本開示の農業用組成物は高分子界面活性剤を含む。幾つかの実施形態ではそれらの高分子界面活性剤は非常に長い疎水性「骨格」と界面活性剤の「櫛」の「歯」を形成する多数のエチレンオキシド鎖を有する。幾つかの実施形態ではこれらの高分子量重合体は疎水性骨格が多数の固着点を粒子表面上に対して有しているので非常に良好な長期安定性を懸濁濃縮液に付与することができる。幾つかの実施形態では本開示の農業用組成物において使用される分散剤の例はリグノスルホン酸ナトリウム類、ナフタレンスルホン酸ナトリウムホルムアルデヒド縮合物、トリスチリルフェノールエトキシレートリン酸エステル、脂肪族アルコールエトキシレート、アルキルエトキシレート、ＥＯ−ＰＯブロック共重合体、およびグラフト共重合体である。
【０１７１】
幾つかの実施形態では本開示の農業用組成物は乳化剤を含む。乳化剤は一方の液相の液滴の別の液相中での懸濁液を安定化する物質である。乳化剤が無い場合はそれらの２種類の液体は２つの非混和性液相に分離することになる。幾つかの実施形態では最も一般的に使用される乳化剤混合物には１２以上のエチレンオキシド単位を有するアルキルフェノールまたは脂肪族アルコール、およびドデシルベンゼンスルホン酸の油溶性カルシウム塩が含まれる。８から１８までの範囲の親水性親油性バランス（「ＨＬＢ」）値によって良好な安定性の乳液が通常提供されることになる。幾つかの実施形態では少量のＥＯ−ＰＯブロック共重合体界面活性剤の添加により乳液安定性を改善することができることがある。
【０１７２】
幾つかの実施形態では本開示の農業用組成物は可溶化剤を含む。可溶化剤は臨界ミセル濃度より上の濃度でミセルを水中に形成する界面活性剤である。その後、それらのミセルは水不溶性物質をそのミセルの疎水性部分の内側に溶解または可溶化することができる。可溶化に通常使用される界面活性剤の種類は非イオン性界面活性剤、すなわちソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノオレエートエトキシレート、およびメチルオレエートエステルである。
【０１７３】
幾つかの実施形態では本開示の農業用組成物は有機溶媒を含む。有機溶媒は主に乳化可能濃縮物の製剤、ＵＬＶ製剤、およびそれらよりも低い程度ではあるが顆粒製剤に使用される。時には溶媒混合物が使用される。幾つかの実施形態では本開示はケロシンまたは精製パラフィンなどの脂肪族パラフィン油を含む溶媒の使用を教示する。他の実施形態では本開示はキシレンおよびＣ９芳香族溶媒とＣ１０芳香族溶媒の高分子量画分などの芳香族溶媒の使用を教示する。幾つかの実施形態では抗病虫害剤が水に乳化されるときにその製剤の結晶化を防ぐための共溶媒として塩素化炭化水素が有用である。溶解力を増加させるための共溶媒としてアルコールが使用されることがある。
【０１７４】
幾つかの実施形態では前記農業用組成物はゲル化剤を含む。濃厚剤またはゲル化剤は主に懸濁濃縮液、乳液、およびサスポエマルジョンの製剤において使用され、その液体のレオロジーまたは流動特質を改変し、且つ、分散粒子または分散液滴の分離および沈降を防止する。増粘剤、ゲル化剤、および沈降防止剤は大まかに２つのカテゴリー、すなわち水不溶性微粒子と水溶性重合体に分類される。粘土およびシリカを使用して懸濁濃縮液製剤を作製することが可能である。幾つかの実施形態では前記農業用組成物は、限定されないが、モンモリロナイト、例えばベントナイト、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、およびアタパルジャイトをはじめとする１種類以上の濃厚剤を含む。幾つかの実施形態では本開示は増粘剤としての多糖類の使用を教示する。最も一般的に使用される多糖類の種類は種子および海藻の天然抽出物またはセルロースの合成誘導体である。幾つかの実施形態はキサンタンを利用し、幾つかの実施形態はセルロースを利用する。幾つかの実施形態では本開示は、限定されないが、グアーガム、ローカストビーンガム、カラギーナン、アルギン酸塩、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＳＣＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）をはじめとする増粘剤の使用を教示する。幾つかの実施形態では本開示は改変デンプン、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、およびポリエチレンオキシドなどの他のタイプの沈降防止剤の使用を教示する。別の良好な沈降防止剤はキサンタンガムである。
【０１７５】
幾つかの実施形態では生産中の混合操作、またはスプレータンクによる散布中の混合操作の間に界面張力を低下させる界面活性剤が存在することによって水性の製剤が泡立つことがあり得る。したがって、幾つかの実施形態では泡立つ傾向を低下させるために生産ステージの間、またはボトル／スプレータンクに充填する前のどちらかに消泡剤を添加することが多い。一般的には２種類の消泡剤、すなわちシリコーン消泡剤と非シリコーン消泡剤が存在する。シリコーンは通常ジメチルポリシロキサンの水性乳液であり、一方で非シリコーン消泡剤はオクタノールおよびノナノールなどの水不溶性油、またはシリカである。両方の場合で消泡剤の機能は空気水間接触面から界面活性剤を移動させることである。
【０１７６】
幾つかの実施形態では前記農業用組成物は保存剤を含む。
【０１７７】
さらに、本開示の方法に従って開発された個々の微生物、または微生物共同体、または微生物群落を農業空間において利用可能な公知の活性薬剤、例えば抗病虫害剤、除草剤、殺菌剤、殺真菌剤、殺虫剤、殺ウイルス剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、ダニ駆除剤、植物成長調節剤、殺鼠剤、防藻剤、生物的防除剤、または有益な薬剤と組み合わせることができる。さらに、本開示の方法に従って開発されたそれらの微生物、微生物共同体、または微生物群落を公知の肥料と組み合わせることができる。そのような組合せは相乗的特質を示すことがあり得る。さらにまた、本開示の方法に従って開発された個々の微生物、または微生物共同体、または微生物群落を不活性成分と組み合わせることができる。また、幾つかの態様では本開示の微生物は生体活性薬剤と組み合わせられる。
本開示の微生物および共同体によって生産される代謝物質
【０１７８】
幾つかの事例では本開示の微生物は１種類以上の化合物を生産してよく、且つ／または１種類以上の活性を有してよく、例えば、次の活性、すなわち、代謝物質の生産、オーキシンなどの植物ホルモンの生産、アセトインの生産、抗菌性化合物の生産、シデロフォアの生産、セルラーゼの生産、ペクチナーゼの生産、キチナーゼの生産、キシラナーゼの生産、窒素固定、またはリン鉱石可溶化のうちの１つ以上を有してよい。
【０１７９】
例えば、本開示の微生物はオーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、エチレン、ブラシノステロイド、およびアブシジン酸からなる群より選択される植物ホルモンを生産してよい。
【０１８０】
したがって、本開示の微生物によって「生産される代謝物質」は前記微生物によって生産されるあらゆる分子（小分子、ビタミン、ミネラル、タンパク質、核酸、脂質、脂肪、炭水化物等）を表現するものとする。本開示の微生物が有益な形質を所与の植物種に付与する正確な作用機序は知られていないことが多い。幾つかの例ではその微生物はその植物にとって有益である代謝物質を生産しているという仮説が立てられている。したがって、幾つかの態様では微生物の無細胞性調製物または不活化調製物がある植物にとって有益であるが、それはその調製物が前記微生物によって生産されたものであり、且つ、ある植物にとって有益である代謝物質を含む限り、その所与の植物種に有益な形質を付与するためにその微生物が生きている必要はないからである。
【０１８１】
１つの実施形態では本開示の微生物はオーキシン（例えば、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ））を生産してよい。オーキシンの生産をアッセイすることができる。本明細書に記載される微生物の多くが培養されて増殖すると植物ホルモンオーキシンであるインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）を生産することが可能であり得る。オーキシンは根の成長の程度を含む植物の生理の変更に重要な役割を果たす。
【０１８２】
したがって、一実施形態では本開示の微生物は所与の植物種の表面上または組織内に配置されている集団として存在する。それらの微生物は、それらの微生物または本開示の無細胞性もしくは不活性調製物で処理されていない基準植物と比較するとその植物上またはその植物内に見られる代謝物質の量の検出可能な増加を引き起こすのに有効な量で代謝物質を生産してよい。前記微生物集団によって生産される代謝物質はその植物種にとって有益であり得る。
植物成長調節因子およびバイオスティミュラント
【０１８３】
幾つかの実施形態では本開示の農業用組成物は本教示の微生物と組み合わせて使用される植物成長調節剤および／またはバイオスティミュラントを含む。
【０１８４】
幾つかの実施形態では本開示の方法に従って開発された個々の微生物、または微生物共同体、または微生物群落をオーキシン、ジベレリン、サイトカイニン、エチレン発生体、成長阻害剤、および成長抑制剤などの農業空間における公知の植物成長調節剤と組み合わせることができる。
【０１８５】
例えば、幾つかの実施形態では本開示は、何よりも次の活性成分、すなわちアンシミドール、ブトラリン、アルコール、クロロメコードクロリド（chloromequat chloride）、サイトカイニン、ダミノジド、エテポホン（ethepohon）、フルルプルミドール、ジベレリン酸、ジベレリン混合物、インドール−３−酪酸（ＩＢＡ）、マレイン酸ヒドラジド、メフルイジド、メピコートクロリド、メピコートペンタボレート、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、１−ナフタレンアセテミド（1-napthaleneacetemide）、（ＮＡＤ）、ｎ−デカノール、プラクロブトラゾール（placlobutrazol）、プロヘキサジオンカルシウム、トリネキサパックエチル、ウニコナゾール、サリチル酸、アブシジン酸、エチレン、ブラシノステロイド、ジャスモン酸類、ポリアミン、一酸化窒素、ストリゴラクトン、またはカリキンをはじめとする活性成分のうちの１つ以上を含む農業用組成物を教示する。
【０１８６】
幾つかの実施形態では本開示の方法に従って開発された個々の微生物、または微生物共同体、または微生物群落を何よりもQUICKROOTS（登録商標）、VAULT（登録商標）、RHIZO-STICK（登録商標）、NODULATOR（登録商標）、DORMAL（登録商標）、SABREX（登録商標）などの農業空間において知られる種子接種剤と組み合わせることができる。幾つかの実施形態ではブラディリゾビウム属接種剤が本明細書で開示されるいかなる単一の微生物または微生物共同体と組み合わせて利用される。特定の態様では前述の接種剤のうちの１つ、例えばQUICKROOTS（登録商標）またはブラディリゾビウム属を本明細書において教示される微生物または微生物共同体と組み合わせると相乗的効果が観察される。
【０１８７】
幾つかの実施形態では本開示の農業用組成物は植物成長調節剤を含み、その植物成長調節剤は銅、マンガン、および亜鉛と共にカイネチン、ジベレリン酸、およびインドール酪酸を含む。
【０１８８】
幾つかの態様では銅、マンガン、および亜鉛と共に本開示の微生物（例えば表１〜３のいずれかの微生物またはそれらの組合せ）およびカイネチン、ジベレリン酸、およびインドール酪酸と含む前記農業用組成物は相乗的に一緒に作用する能力を示す。
【０１８９】
幾つかの実施形態では本開示は、限定されないが、Abide（登録商標）、A-Rest（登録商標）、Butralin（登録商標）、Fair（登録商標）、Royaltac M（登録商標）、Sucker-Plucker（登録商標）、Off-Shoot（登録商標）、Contact-85（登録商標）、Citadel（登録商標）、Cycocel（登録商標）、E-Pro（登録商標）、Conklin（登録商標）、Culbac（登録商標）、Cytoplex（登録商標）、Early Harvest（登録商標）、Foli-Zyme（登録商標）、Goldengro（登録商標）、Happygro（登録商標）、Incite（登録商標）、Megagro（登録商標）、Ascend（登録商標）、Radiate（登録商標）、Stimulate（登録商標）、Suppress（登録商標）、Validate（登録商標）、X-Cyte（登録商標）、B-Nine（登録商標）、Compress（登録商標）、Dazide（登録商標）、Boll Buster（登録商標）、BollD（登録商標）、Cerone（登録商標）、Cotton Quik（登録商標）、Ethrel（登録商標）、Finish（登録商標）、Flash（登録商標）、Florel（登録商標）、Mature（登録商標）、MFX（登録商標）、Prep（登録商標）、Proxy（登録商標）、Quali-Pro（登録商標）、SA-50（登録商標）、Setup（登録商標）、Super Boll（登録商標）、Whiteout（登録商標）、Cutless（登録商標）、Legacy（登録商標）、Mastiff（登録商標）、Topflor（登録商標）、Ascend（登録商標）、Cytoplex（登録商標）、Ascend（登録商標）、Early Harvest（登録商標）、Falgro（登録商標）、Florgib（登録商標）、Foli-Zyme（登録商標）、GA3（登録商標）、GibGro（登録商標）、Green Sol（登録商標）、Incite（登録商標）、N-Large（登録商標）、PGR IV（登録商標）、Pro-Gibb（登録商標）、Release（登録商標）、Rouse（登録商標）、Ryzup（登録商標）、Stimulate（登録商標）、BVB（登録商標）、Chrysal（登録商標）、Fascination（登録商標）、Procone（登録商標）、Fair（登録商標）、Rite-Hite（登録商標）、Royal（登録商標）、Sucker Stuff（登録商標）、Embark（登録商標）、Sta-Lo（登録商標）、Pix（登録商標）、Pentia（登録商標）、DipN Grow（登録商標）、Goldengro（登録商標）、Hi-Yield（登録商標）、Rootone（登録商標）、Antac（登録商標）、FST-7（登録商標）、Royaltac（登録商標）、Bonzi（登録商標）、Cambistat（登録商標）、Cutdown（登録商標）、Downsize（登録商標）、Florazol（登録商標）、Paclo（登録商標）、Paczol（登録商標）、Piccolo（登録商標）、Profile（登録商標）、Shortstop（登録商標）、Trimmit（登録商標）、Turf Enhancer（登録商標）、Apogee（登録商標）、Armor Tech（登録商標）、Goldwing（登録商標）、Governor（登録商標）、Groom（登録商標）、Legacy（登録商標）、Primeraone（登録商標）、Primo（登録商標）、Provair（登録商標）、Solace（登録商標）、T-Nex（登録商標）、T-Pac（登録商標）、Concise（登録商標）、およびSumagic（登録商標）をはじめとする１種類以上の市販の植物成長調節剤を含む農業用組成物を教示する。
【０１９０】
幾つかの実施形態では本発明は植物成長調節因子の生産または中断に影響する植物ホルモンまたは化学物質などの植物成長調節剤および／または植物成長刺激剤と本開示の微生物または微生物共同体の相乗的使用を教示する。
【０１９１】
幾つかの実施形態では本発明は植物ホルモンにオーキシン（例えば、インドール酢酸、ＩＡＡ）、ジベレリン、サイトカイニン（例えば、カイネチン）、アブシジン酸、エチレン（およびＡＣＣシンターゼにより制御され、且つ、ＡＣＣデアミナーゼにより中断されるその生産）が含まれ得ることを教示する。
【０１９２】
幾つかの実施形態では本発明は、本明細書において開示される微生物および微生物共同体と相乗的に作用し得るフミン酸、フルボ酸、アミノ酸、ポリフェノールおよびタンパク質加水分解物などの追加の植物成長促進化学薬品を教示する。
【０１９３】
幾つかの実施形態では本開示は、本明細書の表１〜３に開示されるいかなる単一の微生物または微生物混合物を含む、本開示の方法に従って開発された個々の微生物、または微生物共同体、または微生物群落をAscend（登録商標）または他の類似の植物成長調節剤と組み合わせることができることを教示する。Ascend（登録商標）はカイネチンとして０．０９０％のサイトカイニン、０．０３０％のジベレリン酸、０．０４５％のインドール酪酸、および９９．８３５％の他の成分を含むものとして説明される。
【０１９４】
したがって、幾つかの実施形態では本開示はAscend（登録商標）と組み合わせて本教示の微生物をあらゆる作物に適用することを規定する。さらに、本開示はあらゆる方法または散布量を利用してAscend（登録商標）と組み合わせて本教示の微生物をあらゆる作物に適用することを規定する。
【０１９５】
幾つかの実施形態では本開示はバイオスティミュラントを含む農業用組成物を教示する。
【０１９６】
本明細書において使用される場合、「バイオスティミュラント」という用語は土または他の植物培地に存在し得る微生物の成長を刺激するように作用するあらゆる物質を指す。
【０１９７】
その土または培地の中の微生物のレベルが植物の健康と直接的に相関する。微生物は生物分解性炭素源を餌とするので、植物の健康はその土の中の有機物の量とも相関する。植物を育て、且つ、生育させるために肥料によって栄養物が提供されるが、幾つかの実施形態では微生物を育て、且つ、増殖させるためにバイオスティミュラントによって生物分解性炭素、例えば、糖蜜、炭水化物、例えば、糖類が提供される。別途明確に指定されない限り、バイオスティミュラントは微生物の活性または植物の成長と発生を促進することが可能な単一の成分、または幾つかの異なる成分の組合せを含んでよく、その促進は独立して作用するか、または組み合わさって作用するそれらの成分のうちの１つ以上の効果に起因する。
【０１９８】
幾つかの実施形態ではバイオスティミュラントは非栄養性植物成長応答を発生させる化合物である。幾つかの実施形態ではバイオスティミュラントの多くの重要な利益がホルモン活性に影響するそれらの能力に基づいている。植物のホルモン（植物ホルモン）は正常な植物発生ならびに環境に対する応答を調節する化学メッセンジャーである。根およびシュートの成長、ならびに他の成長応答が植物ホルモンによって調節される。幾つかの実施形態ではバイオスティミュラント中の化合物によって植物のホルモン状態を変更することができ、且つ、その植物の成長および健康に対して大きな影響を及ぼすことができる。したがって、幾つかの実施形態では本開示はバイオスティミュラントの共通成分としてシーケルプ、フミン酸、フルボ酸、およびビタミンＢ類を教示する。幾つかの実施形態では本開示のバイオスティミュラントは抗酸化活性を強化し、それによって植物の防御系が向上される。幾つかの実施形態ではビタミンＣ、ビタミンＥ、およびグリシンなどのアミノ酸がバイオスティミュラントに含まれる抗酸化剤である。
【０１９９】
他の実施形態ではバイオスティミュラントは土または他の植物培地に存在する微生物の成長を刺激するように作用してよい。特定の有機種子抽出物（例えば、ダイズ）を含むある特定のバイオスティミュラントを微生物接種剤と併用したときにその微生物接種剤に含まれる微生物の増殖をそれらのバイオスティミュラントによって刺激することができたことが先行研究により示されている。したがって、幾つかの実施形態では本開示は微生物接種剤と共に使用されると固有の微生物と接種剤微生物の両方の集団を増強することが可能である１種類以上のバイオスティミュラントを教示する。バイオスティミュラントの幾つかの普及している使用法の総説についてはCalvo et al., 2014, Plant Soil 383:3-41を参照されたい。
【０２００】
幾つかの実施形態では本開示は、本明細書の表１〜３に開示されるいかなる単一の微生物または微生物混合物を含む、本開示の方法に従って開発された個々の微生物、または微生物共同体、または微生物群落をあらゆる植物バイオスティミュラントと組み合わせることができることを教示する。
【０２０１】
幾つかの実施形態では本開示は、限定されないが、何よりもVitazyme（登録商標）、Diehard（商標）Biorush（登録商標）、Diehard（商標）Biorush（登録商標）Fe、Diehard（商標）Soluble Kelp、Diehard（商標）Humate SP、Phocon（登録商標）、Foliar Plus（商標）、Plant Plus（商標）、Accomplish LM（登録商標）、Titan（登録商標）、Soil Builder（商標）、Nutri Life, Soil Solution（商標）、Seed Coat（商標）、PercPlus（商標）、Plant Power、CropKarb（登録商標）、Thrust（商標）、Fast2Grow（登録商標）、Baccarat（登録商標）、および Potente（登録商標）をはじめとする１種類以上の市販のバイオスティミュラントを含む農業用組成物を教示する。
【０２０２】
幾つかの実施形態では本開示は、本明細書の表１〜３に開示されるいかなる単一の微生物または微生物混合物を含む、本開示の方法に従って開発された個々の微生物、または微生物共同体、または微生物群落をProGibb（登録商標）または他の類似の植物成長調節剤と組み合わせることができることを教示する。ProGibb（登録商標）は４．０％のジベレリン酸と９６．００％の他の成分を含むものとして説明される。
【０２０３】
幾つかの実施形態では本開示は、本明細書の表１〜３に開示されるいかなる単一の微生物または微生物混合物を含む、本開示の方法に従って開発された個々の微生物、または微生物共同体、または微生物群落をRelease（登録商標）または他の類似の植物成長調節剤と組み合わせることができることを教示する。Release（登録商標）は１０．０％のジベレリン酸と９０．００％の他の成分を含むものとして説明される。
【０２０４】
幾つかの実施形態では本開示は、本明細書の表１〜３に開示されるいかなる単一の微生物または微生物混合物を含む、本開示の方法に従って開発された個々の微生物、または微生物共同体、または微生物群落をRyzUp SmartGrass（登録商標）または他の類似の植物成長調節剤と組み合わせることができることを教示する。RyzUp SmartGrass（登録商標）は４０．０％のジベレリンＡ３と６０．００％の他の成分を含むものとして説明される。
【０２０５】
幾つかの実施形態では本開示は、本明細書の表１〜３に開示されるいかなる単一の微生物または微生物混合物を含む、本開示の方法に従って開発された個々の微生物、または微生物共同体、または微生物群落をX-CYTE（商標）または他の類似の植物成長調節剤と組み合わせることができることを教示する。X-CYTE（商標）は０．０４％のカイネチンとしてのサイトカイニンと９９．９６％の他の成分を含むものとして説明される。
【０２０６】
幾つかの実施形態では本開示は、本明細書の表１〜３に開示されるいかなる単一の微生物または微生物混合物を含む、本開示の方法に従って開発された個々の微生物、または微生物共同体、または微生物群落をN-Large（商標）または他の類似の植物成長調節剤と組み合わせることができることを教示する。N-Large（商標）は４．０％のジベレリンＡ３と９６．００％の他の成分を含むものとして説明される。
【０２０７】
幾つかの実施形態では本開示の方法に従って特定された微生物または微生物共同体が活性化学薬品と組み合わせられると植物の目的の表現型形質に対する相加的効果が見られる。他の実施形態では本開示の方法に従って特定された微生物または微生物共同体が活性化学薬品と組み合わせられると植物の目的の表現型形質に対する相乗的効果が見られる。
【０２０８】
幾つかの実施形態では本開示の方法に従って特定された微生物または微生物共同体が肥料と組み合わせられると植物の目的の表現型形質に対する相加的効果が見られる。他の実施形態では本開示の方法に従って特定された微生物または微生物共同体が肥料と組み合わせられると植物の目的の表現型形質に対する相乗的効果が見られる。
【０２０９】
幾つかの実施形態では本開示の方法に従って特定された微生物または微生物共同体が植物成長調節剤と組み合わせられると植物の目的の表現型形質に対する相加的効果が見られる。幾つかの実施形態では本開示の方法に従って特定された微生物または微生物共同体が植物成長調節剤と組み合わせられると相乗的効果が見られる。幾つかの態様ではAscend（登録商標）と本開示の微生物が組み合わされ、目的の１つ以上の表現型形質について相乗的効果が観察される。
【０２１０】
幾つかの実施形態では本開示の方法に従って特定された微生物または微生物共同体がバイオスティミュラントと組み合わせられると植物の目的の表現型形質に対する相加的効果が見られる。幾つかの実施形態では本開示の方法に従って特定された微生物または微生物共同体がバイオスティミュラントと組み合わせられると相乗的効果が見られる。
【０２１１】
本教示の方法によって得られる相乗的効果はColbyの式（すなわち（Ｅ）＝Ｘ＋Ｙ−（Ｘ×Ｙ／１００））によって数量化され得る。参照により全体を本明細書に援用するColby, R. S., “Calculating Synergistic and Antagonistic Responses of Herbicide Combinations,” 1967 Weeds, vol. 15, pp. 20-22を参照されたい。したがって、ある成分がその存在によって所望の効果を合算した量よりも大きな量まで増大させることが「相乗的」という言葉に意図されている。
【０２１２】
本開示の単離微生物および共同体は農業上の活性化合物の有効性を相乗的に向上させることができ、農業上の補助化合物の有効性も相乗的に向上させることができる。
【０２１３】
他の実施形態では本開示の方法に従って特定された微生物または微生物共同体が肥料と組み合わせられると相乗的効果が見られる。
【０２１４】
さらに、ある特定の実施形態では本開示は微生物共同体を規定するために相乗的相互作用を利用する。すなわち、ある特定の態様では本開示相乗的に作用するある特定の単離微生物種を一緒に混合して植物に有益な形質を付与する、または有益な植物形質の増大と相関する共同体にする。
【０２１５】
公知の活性農業用化合物の活性を改善するため、本開示に従って開発された農業用組成物をある特定の補助剤と共に製剤することができる。これにはその活性化合物の効力を維持しながらその製剤中の活性成分の量を減少させることができ、したがってコストを可能な限り低く抑えることができ、且つ、あらゆる公的規制に従うことができるという利点がある。個々の事例において、ある特定の補助剤を添加しない特定の活性成分による処理によって成功が不充分である場合にその特定の補助剤を本開示の微生物単離物および共同体と共に添加することにより実際に植物の処理に成功することができるので、その活性化合物の作用範囲を広げることも可能であり得る。また、個々の事例において環境条件が好ましいものではないときに適切な製剤によってその活性化合物の性能を高めることができる。
【０２１６】
農業用組成物に使用され得るそのような補助剤はアジュバントであり得る。アジュバントは表面活性化合物または塩様化合物の形態を取ることが多い。アジュバントそれらの作用機序に応じて改変剤、活性化剤、肥料、ｐＨ緩衝剤などに大まかに分類され得る。改変剤は製剤の湿潤特質、粘着特質、および拡散特質に影響を与える。活性化剤は植物のろう質の上皮を分解し、活性成分の上皮への浸透を（数分にわたる）短期と（数時間にわたる）長期の両方で改善する。硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムまたは尿素などの肥料は活性成分の吸収および溶解性を改善し、そして活性成分の対抗的挙動を減少させ得る。ｐＨ緩衝剤は製剤を至適ｐＨにするために従来通り使用される。
【０２１７】
本開示の農業用組成物のそれ以外の実施形態については、参照によりここに援用するKluwer Academic Publishers社に版権があるD. A. Knowles編、 “Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations” １９９８年を参照されたい。
種子処理
【０２１８】
幾つかの実施形態では本開示は、種子を播種する前、または種子を植える前にそれらの種子を本開示の微生物または農業用組成物のうちの１つ以上の組合せで処理することにより植物の所望の形質、例えば植物の生育、植物の健康、および／または病害虫に対する植物の耐性を増強させることができるという発見にも関する。
【０２１９】
したがって、幾つかの実施形態では本開示は前記微生物または微生物共同体のうちの１つ以上の種子処理剤としての使用を教示する。その種子処理剤は未処理で「裸」の種子に直接的に塗布される種子被膜剤であり得る。しかしながら、その種子処理剤は１種類以上の以前の種子被膜剤または種子処理剤で既に被覆されている種子に塗布される種子保護膜であり得る。その以前の種子処理剤は化学的または生物学的な１種類以上の活性化合物と１種類以上の不活性成分を含んでよい。
【０２２０】
「種子処理」という用語は種子が土に植えられる前、またはその間にその種子にある物質を塗布することを一般的に指す。本開示の微生物および本開示の他の農業用組成物での種子処理は、種子が発芽し、実生が現れる少し前にそれらの種子を植える場所に処理を行うことの利点を有する。
【０２２１】
他の実施形態では本開示は、種子処理剤の使用によって植物の処理に成功するために必要とされる微生物または農業用組成物の量が最小限になり、且つ、土への散布または出現した実生への散布などの散布技術と比較して作業者が前記微生物および組成物と接触する量がさらに限定されることも教示する。
【０２２２】
また、幾つかの実施形態では本開示は、本明細書において開示される微生物が植物の一生のうちの初期ステージ（例えば、実生の出現後の最初の３０日間）の増強にとって重要であることを教示する。したがって、幾つかの実施形態では種子処理剤としての本開示の微生物および／または組成物の送達によりその活性にとって重要な時間に前記微生物が作用部位に配置される。
【０２２３】
幾つかの実施形態では本開示の微生物組成物は種子処理剤として製剤される。幾つかの実施形態では種子処理製品を正確に、安全に、および効率的に種子に塗布するために特異的に設計および製造されている処理剤散布装置を使用することを介して従来の混合方法、散布方法、またはそれらの方法の組合せを用いて１層以上の本明細書において開示される微生物および／または農業用組成物でそれらの種子を実質的に均一に被覆することができると考えている。そのような装置はロータリーコーター、ドラムコーター、流動床技術、噴流床、ロータリーミスト、またはそれらの組合せなどの様々な種類の被覆技術を使用している。本開示の種子処理剤のような液体種子処理剤をスピニング「アトマイザー」ディスクまたはスプレーノズルのどちらかを介して散布することができ、その種子処理剤がスプレーパターンを通って移動するときにその種子処理剤が種子に均一に分配される。複数の態様ではその後でさらに処理剤を分配し、且つ、乾燥させるために追加の期間にわたって種子を混合する、または種子を転がす。
【０２２４】
発芽と実生の出現の均一性を高めるために前記微生物組成物で被覆する前に種子を発芽処理しても発芽処理しなくてもよい。代替的実施形態において乾燥粉末製剤を計量して動き回る種子の上に振りかけ、乾燥粉末製剤が完全に分配されるまで混合させることができる。
【０２２５】
幾つかの実施形態では前記種子は本開示による微生物学的組成物で被覆された少なくとも一部の表面領域を有する。幾つかの実施形態では前記微生物組成物を含む種子被膜が裸の種子に直接的に塗布される。幾つかの実施形態では前記微生物組成物を含む種子保護膜が既に上に塗布された種子被膜を有する種子に塗布される。幾つかの態様では前記種子は例えばクロチアニジンおよび／またはバチルス・フィルムス（Bacillus firmus）Ｉ−１５８２を含む種子被膜を有してよく、その種子被膜の上に本組成物が種子保護膜として塗布されることになる。幾つかの態様では本教示の微生物組成物はPONCHO（商標）VOTiVO（商標）で既に処理されている種子に種子保護膜として塗布される。幾つかの態様では前記種子は例えばメタラキシルおよび／またはクロチアニジンおよび／またはバチルス・フィルムスＩ−１５８２を含む種子被膜を有してよく、その種子被膜の上に本組成物が種子保護膜として塗布されることになる。幾つかの態様では本教示の微生物組成物はACCELERON（商標）で既に処理されている種子に種子保護膜として塗布される。
【０２２６】
幾つかの実施形態では微生物処理された種子は種子当たり約１０３から約１０１２まで、約１０３から約１０１１まで、約１０３から約１０１０まで、約１０３から約１０９まで、約１０３から約１０８まで、約１０３から約１０７まで、約１０３から約１０６まで、約１０３から約１０５、または約１０３から約１０４までの微生物芽胞濃度、または微生物細胞濃度を有する。
【０２２７】
幾つかの実施形態では微生物処理された種子は種子当たり約１０４から約１０１２まで、約１０４から約１０１１まで、約１０４から約１０１０まで、約１０４から約１０９まで、約１０４から約１０８まで、約１０４から約１０７まで、約１０４から約１０６、または約１０４から約１０５までの微生物芽胞濃度、または微生物細胞濃度を有する。
【０２２８】
幾つかの実施形態では微生物処理された種子は種子当たり約１０５から約１０１２まで、約１０５から約１０１１まで、約１０５から約１０１０まで、約１０５から約１０９まで、約１０５から約１０８まで、約１０５から約１０７、または約１０５から約１０６までの微生物芽胞濃度、または微生物細胞濃度を有する。
【０２２９】
幾つかの実施形態では微生物処理された種子は種子当たり約１０５から約１０９までの微生物芽胞濃度、または微生物細胞濃度を有する。
【０２３０】
幾つかの実施形態では微生物処理された種子は種子当たり少なくとも約１×１０３、または約１×１０４、または約１×１０５、または約１×１０６、または約１×１０７、または約１×１０８、または約１×１０９の微生物芽胞濃度、または微生物細胞濃度を有する。
【０２３１】
幾つかの実施形態では種子に塗布される微生物および／または農業用組成物のうちの１種類以上の量が最終製剤、ならびに利用する植物または種子のサイズまたは種類に左右される。幾つかの実施形態ではそれらの微生物のうちの１種類以上が製剤全体の約２％（重量／重量）から約８０％（重量／重量）の割合で存在する。幾つかの実施形態ではそれらの組成物に使用される前記微生物のうちの１種類以上が重量比で製剤全体の約５％（重量／重量）から約６５％（重量／重量）、または１０％（重量／重量）から約６０％（重量／重量）である。
【０２３２】
幾つかの実施形態ではそれらの種子は種子当たりさらに多くの芽胞または微生物細胞、例えば種子当たり約１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６または１０１７などの数の芽胞または細胞を有してもよい。
【０２３３】
幾つかの実施形態では本開示の種子被膜の厚さは最大で１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、１２０μｍ、１３０μｍ、１４０μｍ、１５０μｍ、１６０μｍ、１７０μｍ、１８０μｍ、１９０μｍ、２００μｍ、２１０μｍ、２２０μｍ、２３０μｍ、２４０μｍ、２５０μｍ、２６０μｍ、２７０μｍ、２８０μｍ、２９０μｍ、３００μｍ、３１０μｍ、３２０μｍ、３３０μｍ、３４０μｍ、３５０μｍ、３６０μｍ、３７０μｍ、３８０μｍ、３９０μｍ、４００μｍ、４１０μｍ、４２０μｍ、４３０μｍ、４４０μｍ、４５０μｍ、４６０μｍ、４７０μｍ、４８０μｍ、４９０μｍ、５００μｍ、５１０μｍ、５２０μｍ、５３０μｍ、５４０μｍ、５５０μｍ、５６０μｍ、５７０μｍ、５８０μｍ、５９０μｍ、６００μｍ、６１０μｍ、６２０μｍ、６３０μｍ、６４０μｍ、６５０μｍ、６６０μｍ、６７０μｍ、６８０μｍ、６９０μｍ、７００μｍ、７１０μｍ、７２０μｍ、７３０μｍ、７４０μｍ、７５０μｍ、７６０μｍ、７７０μｍ、７８０μｍ、７９０μｍ、８００μｍ、８１０μｍ、８２０μｍ、８３０μｍ、８４０μｍ、８５０μｍ、８６０μｍ、８７０μｍ、８８０μｍ、８９０μｍ、９００μｍ、９１０μｍ、９２０μｍ、９３０μｍ、９４０μｍ、９５０μｍ、９６０μｍ、９７０μｍ、９８０μｍ、９９０μｍ、１０００μｍ、１０１０μｍ、１０２０μｍ、１０３０μｍ、１０４０μｍ、１０５０μｍ、１０６０μｍ、１０７０μｍ、１０８０μｍ、１０９０μｍ、１１００μｍ、１１１０μｍ、１１２０μｍ、１１３０μｍ、１１４０μｍ、１１５０μｍ、１１６０μｍ、１１７０μｍ、１１８０μｍ、１１９０μｍ、１２００μｍ、１２１０μｍ、１２２０μｍ、１２３０μｍ、１２４０μｍ、１２５０μｍ、１２６０μｍ、１２７０μｍ、１２８０μｍ、１２９０μｍ、１３００μｍ、１３１０μｍ、１３２０μｍ、１３３０μｍ、１３４０μｍ、１３５０μｍ、１３６０μｍ、１３７０μｍ、１３８０μｍ、１３９０μｍ、１４００μｍ、１４１０μｍ、１４２０μｍ、１４３０μｍ、１４４０μｍ、１４５０μｍ、１４６０μｍ、１４７０μｍ、１４８０μｍ、１４９０μｍ、１５００μｍ、１５１０μｍ、１５２０μｍ、１５３０μｍ、１５４０μｍ、１５５０μｍ、１５６０μｍ、１５７０μｍ、１５８０μｍ、１５９０μｍ、１６００μｍ、１６１０μｍ、１６２０μｍ、１６３０μｍ、１６４０μｍ、１６５０μｍ、１６６０μｍ、１６７０μｍ、１６８０μｍ、１６９０μｍ、１７００μｍ、１７１０μｍ、１７２０μｍ、１７３０μｍ、１７４０μｍ、１７５０μｍ、１７６０μｍ、１７７０μｍ、１７８０μｍ、１７９０μｍ、１８００μｍ、１８１０μｍ、１８２０μｍ、１８３０μｍ、１８４０μｍ、１８５０μｍ、１８６０μｍ、１８７０μｍ、１８８０μｍ、１８９０μｍ、１９００μｍ、１９１０μｍ、１９２０μｍ、１９３０μｍ、１９４０μｍ、１９５０μｍ、１９６０μｍ、１９７０μｍ、１９８０μｍ、１９９０μｍ、２０００μｍ、２０１０μｍ、２０２０μｍ、２０３０μｍ、２０４０μｍ、２０５０μｍ、２０６０μｍ、２０７０μｍ、２０８０μｍ、２０９０μｍ、２１００μｍ、２１１０μｍ、２１２０μｍ、２１３０μｍ、２１４０μｍ、２１５０μｍ、２１６０μｍ、２１７０μｍ、２���８０μｍ、２１９０μｍ、２２００μｍ、２２１０μｍ、２２２０μｍ、２２３０μｍ、２２４０μｍ、２２５０μｍ、２２６０μｍ、２２７０μｍ、２２８０μｍ、２２９０μｍ、２３００μｍ、２３１０μｍ、２３２０μｍ、２３３０μｍ、２３４０μｍ、２３５０μｍ、２３６０μｍ、２３７０μｍ、２３８０μｍ、２３９０μｍ、２４００μｍ、２４１０μｍ、２４２０μｍ、２４３０μｍ、２４４０μｍ、２４５０μｍ、２４６０μｍ、２４７０μｍ、２４８０μｍ、２４９０μｍ、２５００μｍ、２５１０μｍ、２５２０μｍ、２５３０μｍ、２５４０μｍ、２５５０μｍ、２５６０μｍ、２５７０μｍ、２５８０μｍ、２５９０μｍ、２６００μｍ、２６１０μｍ、２６２０μｍ、２６３０μｍ、２６４０μｍ、２６５０μｍ、２６６０μｍ、２６７０μｍ、２６８０μｍ、２６９０μｍ、２７００μｍ、２７１０μｍ、２７２０μｍ、２７３０μｍ、２７４０μｍ、２７５０μｍ、２７６０μｍ、２７７０μｍ、２７８０μｍ、２７９０μｍ、２８００μｍ、２８１０μｍ、２８２０μｍ、２８３０μｍ、２８４０μｍ、２８５０μｍ、２８６０μｍ、２８７０μｍ、２８８０μｍ、２８９０μｍ、２９００μｍ、２９１０μｍ、２９２０μｍ、２９３０μｍ、２９４０μｍ、２９５０μｍ、２９６０μｍ、２９７０μｍ、２９８０μｍ、２９９０μｍ、または３０００μｍであり得る。
【０２３４】
幾つかの実施形態では本開示の種子被膜の厚さは０．５ｍｍ、１ｍｍ、１．５ｍｍ、２ｍｍ、２．５ｍｍ、３ｍｍ、３．５ｍｍ、４ｍｍ、４．５ｍｍ、または５ｍｍであり得る。
【０２３５】
幾つかの実施形態では本開示の種子被膜の重量は未被覆種子の少なくとも０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、２０％、２０．５％、２１％、２１．５％、２２％、２２．５％、２３％、２３．５％、２４％、２４．５％、２５％、２５．５％、２６％、２６．５％、２７％、２７．５％、２８％、２８．５％、２９％、２９．５％、３０％、３０．５％、３１％、３１．５％、３２％、３２．５％、３３％、３３．５％、３４％、３４．５％、３５％、３５．５％、３６％、３６．５％、３７％、３７．５％、３８％、３８．５％、３９％、３９．５％、４０％、４０．５％、４１％、４１．５％、４２％、４２．５％、４３％、４３．５％、４４％、４４．５％、４５％、４５．５％、４６％、４６．５％、４７％、４７．５％、４８％、４８．５％、４９％、４９．５％、または５０％であり得る。
【０２３６】
幾つかの実施形態では前記微生物芽胞および／または微生物細胞を自由に種子に被覆することができ、または種子に被覆する前にそれらを液体組成物または固形組成物中に製剤することができる。例えば、前記微生物を含む固形組成物は、固形担体に芽胞懸濁液または細胞懸濁液が染み込むまでその芽胞懸濁液とその固形担体を混合することにより調製され得る。次にこの混合物を乾燥して所望の粒子を得ることができる。
【０２３７】
幾つかの他の実施形態では本開示の固形微生物組成物または液体微生物組成物に機能性薬剤、例えば活性炭素、栄養物（肥料）、および発芽率と製品の品質を改善することができる他の薬剤、またはそれらの組合せがさらに含まれることが企図されている。
【０２３８】
当技術分野において知られている種子被膜方法および種子被膜組成物は、本開示の実施形態うちの１つをつけ加えることによりそれらを改変するときに特に有用であり得る。そのような被覆方法およびそのような被覆方法を適用するための被覆装置が例えばそれぞれ参照により本明細書に援用する米国特許第５９１６０２９号明細書、第５９１８４１３号明細書、第５５５４４４５号明細書、第５３８９３９９号明細書、第４７５９９４５号明細書、第４４６５０１７号明細書、および米国特許出願公開第１３／２６０３１０号明細書において開示されている。
【０２３９】
種子被膜組成物が例えばそれぞれ参照により本明細書に援用する米国特許第５９３９３５６号明細書、第５８７６７３９号明細書、第５８４９３２０号明細書、第５７９１０８４号明細書、第５６６１１０３号明細書、第５５８０５４４号明細書、第５３２８９４２号明細書、第４７３５０１５号明細書、第４６３４５８７号明細書、第４３７２０８０号明細書、第４３３９４５６号明細書、および第４２４５４３２号明細書において開示されている。
【０２４０】
幾つかの実施形態では本発明の組成物を含む種子処理製剤に様々な添加物を加えることができる。結合剤を添加することができ、それらの結合剤には被覆される種子に対して植物有害効果を有しない天然物または合成物であり得る接着性高分子から構成される結合剤が含まれる。その結合剤はポリ酢酸ビニル、ポリ酢酸ビニル共重合体、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）共重合体、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルコール共重合体；エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースをはじめとするセルロース；ポリビニルピロリドン；デンプン、改変デンプン、デキストリン、マルトデキストリン、アルギン酸塩およびキトサンをはじめとする多糖類；脂肪、油；ゼラチンおよびゼインをはじめとするタンパク質；アラビアガム、シェラック、塩化ビニリデンおよび塩化ビニリデン共重合体、リグノスルホン酸カルシウム、アクリル共重合体、ポリビニルアクリレート、ポリエチレンオキシド、アクリルアミド重合体および共重合体、ポリヒドロキシエチルアクリレート、メチルアクリルアミド単量体、およびポリクロロプレンから選択され得る。
【０２４１】
ニトロソ発色団、ニトロ発色団、モノアゾ、ビスアゾおよびポリアゾを含むアゾ発色団として分類される有機発色団；アクリジン、アントラキノン、アジン、ジフェニルメタン、インダミン、インドフェノール、メチン、オキサジン、フタロシアニン、チアジン、チアゾール、トリアリールメタン、キサンテンを含む様々な着色料のうちのいずれかが使用され得る。加えることができる他の添加物には鉄、マンガン、ホウ素、銅、コバルト、モリブデンおよび亜鉛の塩のような微量栄養素が含まれる。
【０２４２】
種子表面上に前記処理剤を保持するために重合体または他の防塵剤を適用することができる。
【０２４３】
幾つかの特異的実施形態では前記被覆剤は前記微生物細胞または芽胞に加えて被着剤層をさらに含み得る。その被着剤は無毒、生物分解性、および接着性である必要がある。そのような材料の例にはポリ酢酸ビニル、ポリ酢酸ビニル共重合体、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルコール共重合体；メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、およびヒドロキシメチルプロピルセルロースなどのセルロース；デキストリン、アルギン酸塩、糖類、糖蜜、ポリビニルピロリドン、多糖類、タンパク質、脂肪、油、アラビアガム、ゼラチン、シロップ、およびデンプンが含まれるがこれらに限定されない。例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第７２１３３６７号明細書中にさらに多くの例を見ることができる。
【０２４４】
被着剤、分散剤、界面活性剤、および栄養素および緩衝成分などの様々な添加剤を前記種子処理製剤に含めることもできる。他の従来の種子処理添加物にはコーティング剤、湿潤化剤、緩衝剤、および多糖類が含まれるがこれらに限定されない。水、固形物、または乾燥粉末などの前記種子処理製剤に少なくとも１種類の農業上許容可能な担体を添加することができる。それらの乾燥粉末は炭酸カルシウム、石膏、バーミキュライト、タルク、腐植土、活性炭、および様々なリン化合物などの様々な材料に由来し得る。
【０２４５】
幾つかの実施形態では前記種子被膜組成物は、種子上への塗布を容易にするために前記活性成分と混合される有機成分または無機成分であり、天然成分または合成成分である少なくとも１種類の充填剤を含み得る。複数の態様ではその充填剤は粘土、天然または合成のケイ酸塩、シリカ、樹脂、ワックス、固形肥料（例えばアンモニウム塩）；カオリン、粘土、タルク、ライム、水晶、アタパルジャイト、モンモリロナイト、ベントナイトまたは珪藻土などの天然土壌鉱物、またはシリカ、アルミナ、もしくはケイ酸塩、特にケイ酸アルミニウムもしくはケイ酸マグネシウムなどの合成ミネラルのような不活性固形物である。
【０２４６】
幾つかの実施形態では前記種子処理製剤は次の成分、すなわち、地下においてのみ作用する化合物を含む他の抗病虫害剤；キャプタン、チラム、メタラキシル、フルジオキソニル、オキサジキシルおよびそれらの材料の各々の異性体などのような殺真菌剤；グリフォセート、カルバメート類、チオカルバメート類、アセトアミド類、トリアジン類、ジニトロアニリン類、グリセロールエーテル類、ウラシル類、フェノキシ類、尿素類、および安息香酸類から選択される化合物をはじめとする除草剤；ベンズオキサジン、ベンズヒドリル誘導体、Ｎ，Ｎ−ジアリルジクロロアセトアミド、様々なジハロアシル化合物、オキサゾリジニル化合物およびチアゾリジニル化合物、エタノン、ナフタル酸無水物化合物、およびオキシム誘導体などの除草剤解毒剤；化学肥料、生物肥料、ならびにリゾビウム属、バチルス属、シュードモナス属、セラチア属、トリコデルマ属、グロムス属、グリオクラディウム属および菌根菌に由来する他の天然または組換え体の細菌および真菌などの生物的防除剤のうちの１つ以上をさらに含んでよい。種子上の別々の層にこれらの成分を添加してよく、あるいは本開示の種子被膜組成物の一部としてこれらの成分を添加してよい。
【０２４７】
幾つかの実施形態では本開示において種子を処理するために使用される前記製剤は懸濁液、乳液、水性媒体（例えば、水）中の粒子泥状物、水和剤、水和顆粒剤（乾燥フロアブル剤）、および乾燥顆粒剤の形態であり得る。懸濁液または泥状物として製剤される場合、その製剤中の活性成分の濃度は約０．５重量％から約９９重量％（重量／重量）または５〜４０％であり得、そうでなければ当業者により製剤される通りであり得る。
【０２４８】
上で述べたように、他の従来の非活性成分または不活性成分を前記製剤に組み込むことができる。そのような不活性成分には従来の固着剤、例えば種子処理剤中に使用される分散剤／固着剤混合剤として作用するメチルセルロースなどの分散剤、ポリビニルアルコール、レシチン、高分子分散剤（例えば、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニル）、濃厚剤（例えば、粒子懸濁液の粘度を改善し、且つ、沈降を軽減するための粘度濃厚剤）、乳液安定化剤、界面活性剤、凍結防止化合物（例えば尿素）、染料、着色料などが含まれるがこれらに限定されない。本開示において有用なその他の不活性成分を、参照により本明細書に援用する McCutcheon’s, vol. 1, “Emulsifiers and Detergents,” MC Publishing Company、グレンロック、ニュージャージー州、米国、１９９６年に見ることができる。
【０２４９】
本開示の種子被膜剤製剤は、限定されないが、容器（例えばボトルまたはバッグ）内での混合、機械式散布、タンブリング、噴霧、および浸漬をはじめとする様々な方法により種子に塗布され得る。本開示に従う微生物組成物と種子を接触させるために様々な活性材料または不活性材料を使用することができる。
【０２５０】
幾つかの実施形態では種子の処理に使用される前記微生物または農業用組成物の量は種子の種類および活性成分の種類に応じて変化するが、その処理は種子と農業上有効量の本発明の組成物との接触を含む。
【０２５１】
上で考察したように、有効量は有益な結果または所望の結果に影響を与えるのに充分である本発明の組成物のその量を意味する。有効量は１回以上の投与で投与され得る。
【０２５２】
幾つかの実施形態では前記被覆層に加えて前記種子は次の成分、すなわち、殺真菌剤および除草剤を含む他の抗病虫害剤、除草剤解毒剤、肥料および／または生物的防除剤のうちの１つ以上で処理されてよい。これらの成分を別の層として添加してよく、あるいは前記被覆層に添加してよい。
【０２５３】
幾つかの実施形態では本開示の種子被膜剤製剤は流動床技術、ローラーミル法、輪転静電気式種子処理機、およびドラムコーターなどの様々な技術および機械を使用して種子に塗布され得る。噴流床などの他の方法も有用であり得る。被覆前にそれらの種子をプレサイジング処理してよい。被覆後にそれらの種子を乾燥し、その後にサイジング処理のためにサイジング機に送ることが典型的である。そのような技法は当技術分野において知られている。
【０２５４】
幾つかの実施形態では微生物処理された種子を上塗り塗膜で包んで前記被覆剤を保護してもよい。そのような上塗りは当技術分野において知られおり、流動床技術およびドラム式フィルムコーティング技術を用いて塗布され得る。
【０２５５】
本開示の他の実施形態では固形マトリックスプライミングの使用により本開示に従う組成物を種子に導入することができる。例えば、ある量の本発明の組成物を固形マトリックス材と混合することができ、次に前記組成物を種子に導入させるための時間にわたってその種子をその固形マトリックス材と接触させることができる。その後、所望によりその種子をその固形マトリックス材から分離し、且つ、保存または使用することができ、または固形マトリックス材と種子の混合物を保存するか、またはそのまま植え付けることができる。本開示において有用である固形マトリックス材にはポリアクリルアミド、デンプン、粘土、シリカ、アルミナ、土、砂、ポリウレア、ポリアクリレート、または本発明の組成物をある時間の間に吸収または吸着し、且つ、その組成物を種子の中または種子の上に放出することが可能である他のあらゆる材料が含まれる。本発明の組成物および固形マトリックス材が相互に適合することを確かめることが有用である。例えば、固形マトリックス材はその固形マトリックス材が例えば数分間、数時間、または数日にわたって正当な速度で前記組成物を放出することができるように選択されるべきである。
微生物
【０２５６】
本明細書において使用される場合、「微生物」という用語は広義で理解されるべきである。微生物という用語には原核生物の２つのドメインである細菌と古細菌、ならびに真核生物である真菌と原生生物が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５７】
例として、前記微生物にはプロテオバクテリア門（シュードモナス属、エンテロバクター属、ステノトロホモナス属、バークホルデリア属、リゾビウム属、ハーバスピリラム属、パントエア属、セラチア属、ラーネラ属、アゾスピリラム属、アゾリゾビウム属、デュガネラ属、デルフチア属、ブラディリゾビウム属、シノリゾビウム属およびハロモナス属など）、フィルミクテス門（バチルス属、パエニバチラス属、ラクトバチラス属、マイコプラズマ属、およびアセトバクテリウム属など）、アクチノバクテリア門（ストレプトマイセス属、ロドコッカス属、ミクロバクテリウム属、およびカートバクテリウム属など）、および真菌の子嚢菌門（トリコデルマ属、アンペロマイセス属、コニオチリウム属、ペコエオマイセス（Paecoelomyces）属、ペニシリウム属、クラドスポリウム属、ヒポクレア属、ビューベリア属、メタリジウム属、バーティシリウム属、コルディセプス属、ピキア属、およびカンジダ属など）、担子菌門（コプリヌス属、コルティシウム属、およびアガリクス属など）および卵菌門（ピチウム属、ムコール属、およびモルティエレラ属など）が含まれ得る。
【０２５８】
特定の実施形態では前記微生物は内生菌または着生菌、または植物根圏もしくはリゾシースに居住する微生物である。すなわち、前記微生物は植物の根に付着している土壌物質に、または植物の根に直接隣接している領域に存在することが見られることがある。１つの実施形態では前記微生物は種子担持内生菌である。
【０２５９】
内生菌は病原生物が宿主植物に感染することを防止することにより宿主植物に利益をもたらすことがある。内生菌が広範囲に植物組織に感染することにより、その領域の内生菌が病原性物を打ち負かし、且つ、病原生物が定着することを防ぐ「バリア効果」が生じる。内生菌が病原生物をはじめとする競合者の成長を阻害する化学物質を生産する場合もある。
【０２６０】
ある特定の実施形態では前記微生物は培養不可能である。これはその微生物が培養可能であることが知られていない、または当業者に知られている方法を用いてその微生物を培養することが困難であることを意味すると理解されるべきである。
【０２６１】
本開示の微生物はあらゆる起源から収集または取得されてよく、またはあらゆる起源から収集された物質の中に含有されていてよく、且つ／またはそのような物質に付着していてよい。
【０２６２】
一実施形態では陸上環境の土壌、植物、真菌、動物（無脊椎動物を含む）ならびに堆積物、水および湖と川の生物相をはじめとする他の生物相を含むあらゆる全般的な陸上環境から、海洋環境の生物相および堆積物（例えば海水、海洋泥、海洋植物、海洋無脊椎動物（例えば海綿）、海洋脊椎動物（例えば魚））を含む海洋環境から、陸上および海洋岩石圏（表土および石、例えば破砕した地下の石、砂および粘土）から、氷雪圏およびその融解水から、大気圏（例えば、濾過された空気中の塵、雲および雨滴）から、市街環境、産業環境および他の人造環境（例えば、コンクリート、道路脇の側溝、屋根、道路表面上の蓄積された有機物および鉱物）から前記微生物が取得される。
【０２６３】
別の実施形態では前記微生物は適切な微生物の選別に好都合である可能性がある起源から収集される。例として、その起源は、他の植物が生育するのに望ましい特定の環境、またはテロワールと関連していると考えられる特定の環境であってよい。別の例ではその起源は１つ以上の望ましい形質を有する植物、例えば特定の環境中で自然に生育する植物、または目的のある特定の条件下で自然に生育する植物であってよい。例として、ある特定の植物は砂地または塩分が高い砂で、または極端な温度で、または水がほとんど無い状態で自然に生育する場合があり、またはある特定の植物はその環境中に存在するある特定の害虫または病気に対して耐性である場合がある。特にそのような条件が例えば特定の地理的位置において利用可能な唯一の条件である場合にそのような条件下で栽培されることが商業作物にとって望ましい場合がある。その他の例として、そのような環境下で栽培される商業作物から、またはより具体的にはあらゆる特定の環境において栽培される作物の中で目的の形質を最もよく示す個々の作物、例えば塩分が限られている土において栽培される作物の中で最も早く育つ植物、または苛酷な虫害または疫病の流行に曝された作物の中で最も損傷が少ない植物、または繊維含量、油含量などを含む所望の量のある特定の代謝物質および他の化合物を有する植物、または望ましい色、味、もしくは臭いを示す植物から前記微生物が収集され得る。前記微生物は、真菌および他の動物および植物の生物相、土壌、水、堆積物、およびこれまでに言及された環境の他の要素をはじめとする目的の植物から、または目的の環境中に生じるあらゆる物質から収集されてよい。ある特定の実施形態では前記微生物は異なる環境から分離された個々の単離物である。
【０２６４】
１つの実施形態では本開示の方法において使用する微生物または微生物混合物は個々の微生物種または微生物株の既存のコレクションからある植物に対するそれらのあり得る利益または予想される利益についての幾らかの知識に基づいて選別されてよい。例えば、その微生物は窒素固定を改善すること、土壌有機物からリン酸を遊離させること、無機形態のリン酸塩（例えばリン鉱石）からリン酸を遊離させること、根微小環境において「炭素固定」すること、植物の根圏に存在することにより周囲の土壌からの栄養物の吸収に関してその植物を補助し、次にさらにすぐに利用できるようにこれらの栄養物をその植物に提供すること、植物根にある根粒の数を増やし、それにより植物当たりの共生窒素固定細菌（例えばリゾビウム属の種）の数およびその植物により固定される窒素の量を増加させること、植物が病原微生物の侵入および拡散に抵抗することを助けるＩＳＲ（全身誘導抵抗性）またはＳＡＲ（全身獲得誘導性）などの植物防御応答を誘起すること、拮抗現象により、または栄養物もしくは空間などの資源の競合的利用により植物の生育または健康にとって有害な微生物と競合すること、植物の１か所以上の部分の色を変えること、または植物の化学プロファイル、植物の臭い、味、もしくは１つ以上の他の特質を変えることが予測され得る。
【０２６５】
１つの実施形態ではある植物に対するあり得る利益または予想される利益についての知識を提供しない個々の微生物種または微生物株の既存のコレクションから微生物または微生物混合物が選別される。例えば、植物組織から単離された植物の生育または健康を改善する能力についてのどのような知識も無い未同定の微生物のコレクション、または医薬品の開発につながる可能性がある化合物を生産する可能性について調べるために収集された微生物のコレクション。
【０２６６】
１つの実施形態では前記微生物が自然界で存在する原試料（例えば、土、石、水、空気、塵、植物または他の生物）からそれらの微生物が獲得される。それらの微生物は本開示の方法における使用目的を考慮してあらゆる適切な形態で提供され得る。しかしながら、ただの例であるが、前記微生物は水性懸濁液、ゲル、ホモジネート、顆粒、粉末、泥状物、生きている生物、または所望の物質として提供され得る。
【０２６７】
本開示の微生物は実質的に純粋な培養物または混合培養物の状態で単離され得る。それらの微生物は濃縮されてよく、希釈されてよく、またはそれらの微生物が原試料中で見られる自然の濃度で提供されてよい。例えば、塩類堆積物に由来する微生物はその堆積物を真水に懸濁し、その堆積物を底に沈降させることにより本開示における使用のために単離され得る。適切な時間の沈降の後にデカンテーションにより前記微生物の大部分を含むその水を取り出し、そのまま植物培地に投入するか、またはフィルタリングもしくは遠心分離により濃縮し、適切な濃度に希釈し、そして前記塩の大部分を除去して植物培地に投入してよい。その他の例として、植物に対する損傷の可能性を最小限にするために無機化された起源または有毒な起源に由来する微生物を同様に処理して植物の培養材料への投入用に前記微生物を回収してよい。
【０２６８】
別の実施形態では前記微生物はそれらの微生物が自然界で存在する原試料から単離されていない粗精製形態で使用される。例えば、前記微生物はそれらが存在する原試料と組み合わせて、例えば、土壌、または植物の根、種子もしくは葉として提供される。この実施形態ではその原試料は微生物のうちの１つ以上の種を含んでよい。
【０２６９】
幾つかの実施形態では微生物の混合集団が本開示の方法において使用される。
【０２７０】
前記微生物が原試料（例えば、前記微生物が自然界で存在する物質）から単離される本開示の実施形態では当業者に容易に理解される多数の標準的な技術のうちのいずれか１つの技術またはそれらの技術の組合せが用いられ得る。しかしながら、例として、これらの技術は一般的には単一の微生物の固形物培養物または液体培養物を実質的に純粋な形態で得ることができる処理を用い、通常は固形微生物培地表面上での物理的分離による処理または液体微生物培地中への容量希釈単離による処理を用いる。これらの処理は、適切な固形ゲル培地上に乾燥物質、液体懸濁液、泥状物またはホモジネートが薄層状に広げられるその物質からの単離、または滅菌培地中に行われ、且つ、液体培地または固形培地中に接種されるその物質の段階希釈を含み得る。
【０２７１】
必須ではないが、１つの実施形態では前記微生物を含む物質は、その物質の中で全ての微生物を増殖させるため、または前記微生物集団の一部分を選別するためにその物質の中で微生物向けの栄養を高めるか（例えば、熱曝露に対して耐性である微生物（例えば、枯草菌）を選別するために試料を低温殺菌することにより）、またはその試料を低濃度の有機溶媒または滅菌剤（例えば、家庭用漂白剤）に曝露して芽胞形成微生物または溶媒耐性微生物の生存度を高めることにより単離処理前に前処理されてよい。その後、上のようにその強化物質または選択的生存用に処理された物質から微生物を単離することができる。
【０２７２】
本開示の一実施形態では内生微生物または着生微生物が植物材料から単離される。当技術分野において知られているあらゆる数の標準的な技術を使用してよく、前記微生物は例えば根、茎および葉、および植物生殖組織を含む植物のあらゆる適切な組織から単離され得る。例として、植物からの単離のための従来の方法には目的の植物材料（例えば根または茎、葉）の無菌的切除、適切な溶液（例えば２％次亜塩素酸ナトリウム）での表面滅菌、その後の微生物培養のための栄養培地への植物材料の配置が含まれることが典型的である（例えば、 Strobel G and Daisy B (2003) Microbiology and Molecular Biology Reviews 67 (4): 491-502、Zinniel DK et al. (2002) Applied and Environmental Microbiology 68 (5): 2198-2208を参照されたい）。
【０２７３】
本開示の１つの実施形態では前記微生物は根組織から単離される。植物材料から微生物を単離するためのその他の方法をこれより詳細に説明する。
【０２７４】
１つの実施形態では（前記方法の前または前記方法のあらゆる段階で）前記微生物集団を選択圧に曝露する。例えば、前記微生物を（好ましくは無菌の）植物培地に添加する前に低温殺菌に曝すことにより、所望の形質について選別された植物に悪条件下で、商業用保管場所で、または被覆剤として種子に塗布される場合には悪環境下でより容易に生存することができる芽胞形成微生物が付着するという確率が高まる可能性がある。
【０２７５】
本明細書においてこれまでに述べたある特定の実施形態では粗精製形態で前記微生物を使用してよく、植物または媒体から前記微生物を単離する必要が無い。例えば、選択された植物にとって有益であると特定された前記微生物を含む植物材料または培地を得て次回の前記方法のための微生物の粗精製物起源として、または前記方法の終局における微生物の粗精製物起源として使用してよい。例えば、植物材料全体を取得し、所望によりマルチングまたは破砕などの処理をしてよい。あるいは、選択された植物の個々の組織または部分（葉、茎、根、および種子など）を植物から分離し、所望によりマルチングまたは破砕などの処理をしてよい。ある特定の実施形態では第２セットの１種類以上の微生物が付着している植物の１か所以上の部分が１つ以上の選択された植物から取り除かれてよく、その方法が連続して反復して行われる場合はその部分が植物育種方法のいずれかの段階で使用される１つ以上の植物に接ぎ木されてよい。
本開示の微生物、同微生物を含む共同体および組成物の適用から利益を得ることができる植物
【０２７６】
コケおよび地衣類および藻類を含むあらゆる数の多種多様な植物が本開示の方法において使用され得る。複数の実施形態ではそれらの植物は経済的、社会的、または環境的な価値を有する。例えば、それらの植物には食用作物、繊維作物、油料作物として使用される植物、林業において使用される植物、パルプ製紙工業において使用される植物、バイオ燃料生産用供給原料として使用される植物、および観賞植物として使用される植物が含まれ得る。
【０２７７】
他の実施形態ではそれらの植物は雑草のように経済的、社会的、または環境的に望ましくない植物であり得る。次のものは本開示の方法を適用してよい植物の種類の非限定的な例の一覧である。
食用作物：
【０２７８】
穀草類、例えばトウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、モロコシ、キビ、エンバク、ライムギ、ライコムギ、およびソバ；
【０２７９】
葉菜類、例えばキャベツ、ブロッコリー、チンゲンサイ、ルッコラなどのアブラナ科植物；ホウレンソウ、クレソン、およびレタスなどのサラダ用野菜；
【０２８０】
花果菜類、例えばアボガド、スイートコーン、アーティチョーク；ウリ科植物、例えばセイヨウカボチャ、キュウリ、メロン、ズッキーニ、カボチャ；ナス科野菜／果実、例えばトマト、ナス、およびトウガラシ；
【０２８１】
結莢菜類、例えばラッカセイ、ピーナッツ、サヤエンドウ、ダイズ、インゲン、レンティル、ヒヨコマメ、オクラ；
【０２８２】
鱗茎菜類、例えばアスパラガス、セロリ；ネギ属作物、例えばニンニク、タマネギ、およびリーク；
【０２８３】
塊根菜類、例えばニンジン、ビート、タケノコ、キャッサバ、ヤム、ショウガ、キクイモ、パースニップ、ダイコン、ジャガイモ、サツマイモ、タロ、カブ、およびワサビ；
【０２８４】
テンサイ（Beta vulgaris）、サトウキビ（Saccharum officinarum）をはじめとする糖料作物；
【０２８５】
ノンアルコール飲料および刺激物質、例えばコーヒー、紅茶、ハーブティー、および緑茶、ココア、マリファナ、およびタバコの生産のために栽培される作物；
【０２８６】
漿果類（例えばキウイフルーツ、ブドウ、スグリ、グースベリー、グアバ、フェイジョア、ザクロ）、かんきつ類（例えばオレンジ、レモン、ライム、グレープフルーツ）、偽果類（例えばバナナ、クランベリー、ブルーベリー）、集合果類（ブラックベリー、ラズベリー、ボイセンベリー）、複合果類（例えばパイナップル、イチジク）、核果類（例えばアンズ、モモ、サクランボ、プラム）、ナシ状果類（例えばリンゴ、ナシ）などの果菜類およびイチゴ、ヒマワリ種子のような他の果菜類；
【０２８７】
料理用および薬用ハーブ類、例えばローズマリー、バジル、ローレル、コリアンダー、ミント、ディル、オトギリソウ、ジギタリス、アロエベラ、ローズヒップ、およびアサ；
【０２８８】
スパイス、例えばブラックペッパー、クミン、シナモン、ナツメグ、ジンジャー、クローブ、サフラン、カルダモン、メース、パプリカ、マサラ、スターアニスを生産する作物；
【０２８９】
ナッツ類、例えばアーモンドおよびクルミ、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ココナッツ、クリ、マカダミアナッツ、ピスタチオ；ピーナッツ、ペカンナッツの生産のために栽培される作物；
【０２９０】
ビール、ワインおよび他のアルコール飲料の生産のために栽培される作物、例えばブドウおよびホップ；
【０２９１】
油料作物、例えばダイズ、ピーナッツ、綿、オリーブ、ヒマワリ、ゴマ、ルピナス属の種およびアブラナ科作物（例えばキャノーラ／アブラナ）、および、食用菌類、例えばマッシュルーム、シイタケおよびヒラタケ；
牧畜農業に使用される植物：
【０２９２】
マメ科植物：シャジクソウ属の種、ウマゴヤシ属の種、およびミヤコグサ属の種；シロツメクサ（T.repens）、アカツメクサ（T. pratense）、コーカサスクローバー（T. ambigum）、サブタレニアンクローバー（T.subterraneum）、アルファルファ／ルーサン（Medicago sativum）、一年生ウマゴヤシ；タルウマゴヤシ；コメツブウマゴヤシ；イガマメ（Onobrychis viciifolia）、ミヤコグサ（Lotus corniculatus）、ネビキミヤコグサ（Lotus pedunculatus）；
【０２９３】
サヤエンドウ（Pisum sativum）、インゲン（Phaseolus vulgaris）、ソラマメ（Vicia faba）、リョクトウ（Vigna radiata）、ササゲ（Vigna unguiculata）、ヒヨコマメ（Cicer arietum）、ルピナス（ルピナス属の種）を含む豆類；トウモロコシ/コーン (Zea mays）、モロコシ（モロコシ属の種）、キビ（Panicum miliaceum、P. sumatrense）、イネ（Oryza sativa indica、Oryza sativa japonica）、コムギ（Triticum sativa）、オオムギ（Hordeum vulgare）、ライムギ（Secale cereale）、ライコムギ（Triticum × Secale）、エンバク（Avena sativa）を含む穀草類；
【０２９４】
飼料用およびアメニティー用草類：ドクムギ属の種；ウシノケグサ属の種；ヌカボ属の種、ホソムギ（Lolium perenne）、ネズミホソムギ（Lolium hybridum）、ネズミムギ（Lolium multiflorum）、オニウシノケグサ（Festuca arundinacea）、ヒロハノウシノケグサ（Festuca pratensis）、オオウシノケグサ（Festuca rubra）、ウシノケグサ（Festuca ovina）、フェストロリウム（Lolium × Festucaの雑種）、カモガヤ（Dactylis glomerata）、ナガハグサ（Poa pratensis）、ヌマイチゴツナギ（Poa palustris）、タチイチゴツナギ（Poa nemoralis）、オオスズメノカタビラ（Poa trivialis）、コイチゴツナギ（Poa compresa）、スズメノチャヒキ属の種；クサヨシ属（アワガエリ属の種）、オオカニツリ（Arrhenatherum elatius）、コムギダマシ属の種、セイヨウチャヒキ（Avena strigosa）、アワ（Setaria italic）などの寒地型牧草；
【０２９５】
クサヨシ属の種、ビロードキビ属の種、スズメガヤ属の種、キビ属の種、アメリカスズメノヒエ（Paspalum notatum）、ヤマカモジグサ属の種などの暖地型牧草、ならびにスイッチグラス（Panicum virgatum）およびススキ属の種などのバイオ燃料生産に使用される牧草；
繊維作物：
【０２９６】
綿、麻、ジュート、ココナッツ、サイザル麻、アマ（アマ属の種）、マオラン（マオラン属の種）；針葉樹および広葉樹の種などの紙および工業木質繊維用に収穫される植林および人工林の種；
植林業において使用される高木と低木の種およびバイオ燃料作物：
【０２９７】
マツ（マツ属の種）、ベイマツ（トガサワラ属の種）、トウヒ（トウヒ属種）、イトスギ（イトスギ属の種）、ワットル（アカシア属の種）、ハンノキ（ハンノキ属の種）、オークの種（コナラ属の種）、セコイア（セコイアデンドロン属の種）、ヤナギ（ヤナギ属の種）、カバノキ（カバノキ属の種）、スギ（ヒマラヤスギ属の種）、トネリコ（トネリコ属の種）、カラマツ（カラマツ属の種）、ユーカリ属の種、タケ（タケ連の種）およびポプラ（ヤマナラシ属の種）；
抽出処理、生物学的処理、物理的処理、または生化学的処理によるエネルギー、バイオ燃料、または工業製品への変換のために栽培される植物：
【０２９８】
アブラヤシ、ジャトロファ、ダイズ、綿、リンシードなどの油料植物；パラゴムノキ（Hevea brasiliensis）および パナマゴムノキ（Castilla elastica）などのラテックス生産植物；糖料作物（例えばビート、サトウキビ）、デンプン生産作物（例えばＣ３穀物およびＣ４穀物および塊茎作物）、林木（例えばマツ、ユーカリ）などのセルロース系作物ならびにタケ、スイッチグラス、ススキなどの穀物科およびイネ科の植物を含む、バイオ燃料生産用の直接的または間接的な供給原料、すなわちバイオ燃料、工業溶媒、または化学製品、例えばエタノールまたはブタノール、プロパンジダイヤル、または他の燃料または工業材料の生産中の化学的転換、物理的（例えば、熱または触媒による）転換、または生化学的（例えば、酵素前処理による）転換、または生物学的（例えば、微生物発酵による）転換の後の供給原料として使用される植物；バイオ炭の生産と共に、またはバイオ炭の生産を含まずに、ガス化および／または微生物または触媒によるそのガスのバイオ燃料または溶媒もしくはプラスチックなどの他の工業原料への転換を介してエネルギー生産、バイオ燃料生産、または工業化学品生産に使用される作物（例えば、針葉樹の林木、ユーカリ属の林木、熱帯樹の林木、または広葉樹の林木、タケ、スイッチグラス、ススキ、サトウキビなどの穀物科およびイネ科の作物、または麻またはポプラ、ヤナギなどの軟木のようなバイオマス作物、およびバイオ炭の生産に使用されるバイオマス作物；
医薬品産業、農業機能性食品産業、および機能性化粧品産業に有用な天然産物を生産する作物：
【０２９９】
医薬品前駆体もしくは医薬品化合物または機能性食品および機能性化粧品用の化合物および材料を生産する作物、例えば、スターアニス（シキミ酸）、イタドリ（レスベラトロール）、キウイフルーツ（可溶性繊維、タンパク質分解酵素）；
審美的特質または環境的特質のために栽培される花卉園芸植物、観賞植物、および施設用植物：
【０３００】
バラ、チューリップ、キクなどの花；
【０３０１】
ツゲ属、ヘーベ属、バラ属、ツツジ属、キヅタ属などの観賞用低木；
【０３０２】
スズカケノキ属、チョイシャ属、エスカロニア属、トウダイグサ属、スゲ属などのアメニティー植物；
【０３０３】
ミズゴケなどのコケ；
バイオレメディエーション用に栽培される植物：
【０３０４】
ヒマワリ属、アブラナ属、ヤナギ属、ヤマナラシ属、ユーカリ属。
雑種およびＧＭ植物の改良
【０３０５】
ある特定の態様では本開示の微生物を雑種植物に散布して前記雑種植物の有益な形質を増大させる。他の態様では本開示の微生物を遺伝子改変植物に散布して前記ＧＭ植物の有益な形質を増大させる。本明細書において教示される微生物を雑種植物およびＧＭ植物に散布し、そうしてこれらの植物のエリートジェネティクスおよびトレイトテクノロジーを最大限に活用することができる。
【０３０６】
種子、実生、切り枝、栄養繁殖体、または成長可能な他のあらゆる植物材料もしくは植物組織の形で植物を提供してよいことが理解されるべきである。１つの実施形態ではその種子は表面汚染混入微生物を除去するために次亜塩素酸ナトリウムまたは塩化水銀などの物質で表面殺菌されてよい。１つの実施形態ではその栄養繁殖体は、例えば組織培養における無菌小植物として、植物培地に配置される前に無菌培養で増殖される。
適用方法
【０３０７】
当技術分野において知られているあらゆる適切な技術を用いて前記微生物が植物、実生、切り枝、栄養繁殖体など、および／または前記植物を含む培地に適用され得る。
【０３０８】
しかしながら、例として、単離微生物、同微生物を含む共同体または組成物を噴霧または散布により植物、実生、切り枝、栄養繁殖体などに適用してよい。
【０３０９】
別の実施形態では前記単離微生物、同微生物を含む共同体または組成物を播種前の植物種子に直接的に適用してよい。
【０３１０】
別の実施形態では前記単離微生物、同微生物を含む共同体または組成物を種子被膜剤として植物種子に直接的に適用してよい。
【０３１１】
本開示の１つの実施形態では前記単離微生物、同微生物を含む共同体または組成物は顆粒、またはプラグ、または植物培地に投入される土壌潅注の形で提供される。
【０３１２】
他の実施形態では前記単離微生物、同微生物を含む共同体または組成物は葉面噴霧組成物または葉面液体組成物などの葉面散布の形で提供される。葉面噴霧処理または葉面液体処理は生育中の植物または培地、例えば土壌に対して行われてよい。
【０３１３】
別の実施形態では前記単離微生物、同微生物を含む共同体または組成物は顆粒剤として製剤されてよく、種子の植え付け中に一緒に適用されてよい。または、その粒剤は植え付けの後に適用されてよい。または、その顆粒剤は植え付けの前に適用されてよい。
【０３１４】
幾つかの実施形態では前記単離微生物、同微生物を含む共同体または組成物は作物の成長、収量、および品質を改善するために局所適用および／または潅注適用として植物または培地に投与される。その局所適用は乾燥ミックスまたは乾燥粉末または散布組成物の利用を介したものであり得、または液体ベースの製剤であり得る。
【０３１５】
複数の実施形態では前記単離微生物、同微生物を含む共同体または組成物は、何よりも、（１）液剤、（２）水和剤、（３）粉剤、（４）可溶粉剤、（５）濃縮乳剤または濃縮懸濁剤、（６）種子粉衣または種子被覆剤、（７）錠剤、（８）水分散性顆粒剤、（９）水溶性顆粒剤（持続放出性または急速放出性）、（１０）マイクロカプセル化顆粒剤または懸濁剤、および（１１）潅水用成分として製剤され得る。ある特定の態様では前記組成物は従来の噴霧処理の前に水性媒体中に希釈されてよい。本開示の組成物は土壌、植物、種子、根圏、リゾシース、または前記微生物組成物を適用することが有益である他の領域に適用され得る。さらになお、内生微生物を導入するための手段としてバリスティック法を利用することができる。
【０３１６】
複数の態様では前記組成物は植物の葉に散布される。前記組成物は乳液または懸濁濃縮液、溶液、または葉面噴霧の形で植物の葉に散布されてよい。前記組成物の適用は実験室、栽培用チャンバー、温室、または野外で行われてよい。
【０３１７】
別の実施形態では微生物は、根または茎を切り、液体微生物懸濁液、またはゲル、または粉末を噴霧、浸漬、あるいは塗布することにより前記微生物にその植物表面を曝露することでその植物に植菌されてよい。
【０３１８】
別の実施形態では前記微生物は葉または根の組織に直接的に注入されてよく、あるいは葉または根の切断片、またはその他には切り出された胚もしくは幼根もしくは子葉鞘に直接的に植菌されてよい。その後、その他の微生物を含む培地にこれらの植菌された植物を曝露してよい。しかしながら、これは必須ではない。
【０３１９】
他の実施形態では特に前記微生物が培養不可能である場合に接ぎ木、外植片の挿入、吸引、電気穿孔、創傷、断根、気孔開口の誘導、または微生物が植物細胞もしくは細胞間空間に侵入する機会を提供するあらゆる物理的、化学的、もしくは生物学的処理のうちのいずれか１つ、またはそれらの組合せによって前記微生物が植物に移されてよい。当業者は使用可能な多数の代替的技術を容易に理解し得る。
【０３２０】
１つの実施形態では前記微生物は根、茎、葉および／または植物生殖部分などの植物の部分に浸透し（内部寄生することになる）、且つ／または根、茎、葉および／または植物生殖部分の表面上で増殖し（着生することになる）、且つ／または植物根圏内で増殖する。１つの実施形態では前記微生物はその植物と共生関係を形成する。
【実施例】
【０３２１】
Ｉ．農業上重要な作物における収量の増加
本開示のある特定の実施形態では本方法は所与の作物の収量を増加させることを目的とする。
【０３２２】
本開示の単離微生物、同微生物を含む共同体および組成物の利用に基づく本明細書において提供される本方法は、重要な農業作物の収量を増加させる能力を有する。さらに肥料を加えずにこれらの収量の増加を実現することができる。
実施例１：単離微生物および微生物共同体を用いるホソムギバイオマスの増加
Ａ．単離微生物を用いる種子処理
【０３２３】
本実施例では表１〜３の単離微生物を種子被膜剤としてホソムギ（Lolium perenne）の種子に塗布する。種子被膜剤としてその単離微生物を塗布してすぐにそのホソムギを標準的な方法で植え付け、栽培する。
【０３２４】
種子被膜剤として前記単離微生物が塗布されなかった対照区のホソムギ種子も植え付ける。
【０３２５】
前記種子被膜剤で処理された種子から栽培されたホソムギ植物は対照ホソムギ植物よりも大量のバイオマスを示すことが予期される。
【０３２６】
それらの処理植物に由来するバイオマスは約１〜１０％より多く、１０〜２０％より多く、２０〜３０％より多く、３０〜４０％より多く、４０〜５０％より多く、５０〜６０％より多く、６０〜７０％より多く、７０〜８０％より多く、８０〜９０％より多く、またはそれ以上により多いことがあり得る。
【０３２７】
それらの処理植物に由来するバイオマスは対照に対して１エーカー当たり約１ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約２ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約３ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約４ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約５ブッシェルの増加、またはそれより多い増加と同じであり得る。
【０３２８】
幾つかの態様ではそのバイオマスの増加は統計学的に有意である。他の態様ではそのバイオマスの増加は統計学的に有意ではないが、それでも数量化可能である。
Ｂ．微生物共同体を用いる種子処理
【０３２９】
本実施例では表１〜３の少なくとも２種類の微生物を含む微生物合同体を種子被膜剤としてホソムギ（Lolium perenne）の種子に塗布する。種子被膜剤としてその微生物合同体を塗布してすぐにそのホソムギを標準的な方法で植え付け、栽培する。
【０３３０】
種子被膜剤として前記微生物合同体が塗布されなかった対照区のホソムギ種子も植え付ける。
【０３３１】
前記種子被膜剤で処理された種子から栽培されたホソムギ植物は対照ホソムギ植物よりも大量のバイオマスを示すことが予期される。
【０３３２】
それらの処理植物に由来するバイオマスは約１〜１０％より多く、１０〜２０％より多く、２０〜３０％より多く、３０〜４０％より多く、４０〜５０％より多く、５０〜６０％より多く、６０〜７０％より多く、７０〜８０％より多く、８０〜９０％より多く、またはそれ以上により多いことがあり得る。
【０３３３】
それらの処理植物に由来するバイオマスは対照に対して１エーカー当たり約１ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約２ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約３ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約４ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約５ブッシェルの増加、またはそれより多い増加と同じであり得る。
【０３３４】
幾つかの態様ではそのバイオマスの増加は統計学的に有意である。他の態様ではそのバイオマスの増加は統計学的に有意ではないが、それでも数量化可能である。
Ｃ．単離微生物を含む農業用組成物を用いる処理
【０３３５】
本実施例では表１〜３の単離微生物を農業用組成物として適用し、種蒔きの時にホソムギ種子に投与する。
【０３３６】
例えば、農家がホソムギ種子を畑に散布するときと同時に前記種子に前記農業用組成物を塗布することが予期される。これは、例えば、それらのホソムギ種子を含んでおり、且つ、同ホソムギ種子を散布するように構成されているホッパーまたはスプレッダーに前記農業用組成物を投入することにより達成され得る。
【０３３７】
前記農業用組成物が投与されていない対照区のホソムギ種子も植え付ける。
【０３３８】
前記農業用組成物で処理された種子から栽培されたホソムギ植物は対照ホソムギ植物よりも大量のバイオマスを示すことが予期される。
【０３３９】
それらの処理植物に由来するバイオマスは約１〜１０％より多く、１０〜２０％より多く、２０〜３０％より多く、３０〜４０％より多く、４０〜５０％より多く、５０〜６０％より多く、６０〜７０％より多く、７０〜８０％より多く、８０〜９０％より多く、またはそれ以上により多いことがあり得る。
【０３４０】
それらの処理植物に由来するバイオマスは対照に対して１エーカー当たり約１ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約２ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約３ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約４ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約５ブッシェルの増加、またはそれより多い増加と同じであり得る。
【０３４１】
幾つかの態様ではそのバイオマスの増加は統計学的に有意である。他の態様ではそのバイオマスの増加は統計学的に有意ではないが、それでも数量化可能である。
Ｄ．微生物共同体を含む農業用組成物を用いる処理
【０３４２】
本実施例では表１〜３の少なくとも２種類の微生物を含む微生物合同体を農業用組成物として適用し、種蒔きの時にホソムギ種子に投与する。
【０３４３】
例えば、農家がホソムギ種子を畑に散布するときと同時に前記種子に前記農業用組成物を塗布することが予期される。これは、例えば、それらのホソムギ種子を含んでおり、且つ、同ホソムギ種子を散布するように構成されているホッパーまたはスプレッダーに前記農業用組成物を投入することにより達成され得る。
【０３４４】
前記農業用組成物が投与されていない対照区のホソムギ種子も植え付ける。
【０３４５】
前記農業用組成物で処理された種子から栽培されたホソムギ植物は対照ホソムギ植物よりも大量のバイオマスを示すことが予期される。
【０３４６】
それらの処理植物に由来するバイオマスは約１〜１０％より多く、１０〜２０％より多く、２０〜３０％より多く、３０〜４０％より多く、４０〜５０％より多く、５０〜６０％より多く、６０〜７０％より多く、７０〜８０％より多く、８０〜９０％より多く、またはそれ以上により多いことがあり得る。
【０３４７】
それらの処理植物に由来するバイオマスは対照に対して１エーカー当たり約１ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約２ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約３ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約４ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約５ブッシェルの増加、またはそれより多い増加と同じであり得る。
【０３４８】
幾つかの態様ではそのバイオマスの増加は統計学的に有意である。他の態様ではそのバイオマスの増加は統計学的に有意ではないが、それでも数量化可能である。
実施例２：単離微生物および微生物共同体を用いるトウモロコシバイオマスの増加
A.単離微生物を用いる種子処理
【０３４９】
本実施例では表１〜３の単離微生物を種子被膜剤としてトウモロコシ（Zea mays）の種子に塗布する。種子被膜剤としてその単離微生物を塗布してすぐにそのトウモロコシを標準的な方法で植え付け、栽培する。
【０３５０】
種子被膜剤として前記単離微生物が塗布されなかった対照区のトウモロコシ種子も植え付ける。
【０３５１】
前記種子被膜剤で処理された種子から栽培されたトウモロコシ植物は対照トウモロコシ植物よりも大量のバイオマスを示すことが予期される。
【０３５２】
それらの処理植物に由来するバイオマスは約１〜１０％より多く、１０〜２０％より多く、２０〜３０％より多く、３０〜４０％より多く、４０〜５０％より多く、５０〜６０％より多く、６０〜７０％より多く、７０〜８０％より多く、８０〜９０％より多く、またはそれ以上により多いことがあり得る。
【０３５３】
それらの処理植物に由来するバイオマスは対照に対して１エーカー当たり約１ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約２ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約３ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約４ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約５ブッシェルの増加、またはそれより多い増加と同じであり得る。
【０３５４】
幾つかの態様ではそのバイオマスの増加は統計学的に有意である。他の態様ではそのバイオマスの増加は統計学的に有意ではないが、それでも数量化可能である。
Ｂ．微生物共同体を用いる種子処理
【０３５５】
本実施例では表１〜３の少なくとも２種類の微生物を含む微生物合同体を種子被膜剤としてトウモロコシ（Zea mays）の種子に塗布する。種子被膜剤としてその微生物合同体を塗布してすぐにそのトウモロコシを標準的な方法で植え付け、栽培する。
【０３５６】
種子被膜剤として前記微生物合同体が塗布されなかった対照区のトウモロコシ種子も植え付ける。
【０３５７】
前記種子被膜剤で処理された種子から栽培されたトウモロコシ植物は対照トウモロコシ植物よりも大量のバイオマスを示すことが予期される。
【０３５８】
それらの処理植物に由来するバイオマスは約１〜１０％より多く、１０〜２０％より多く、２０〜３０％より多く、３０〜４０％より多く、４０〜５０％より多く、５０〜６０％より多く、６０〜７０％より多く、７０〜８０％より多く、８０〜９０％より多く、またはそれ以上により多いことがあり得る。
【０３５９】
それらの処理植物に由来するバイオマスは対照に対して１エーカー当たり約１ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約２ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約３ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約４ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約５ブッシェルの増加、またはそれより多い増加と同じであり得る。
【０３６０】
幾つかの態様ではそのバイオマスの増加は統計学的に有意である。他の態様ではそのバイオマスの増加は統計学的に有意ではないが、それでも数量化可能である。
Ｃ．単離微生物を含む農業用組成物を用いる処理
【０３６１】
本実施例では表１〜３の単離微生物を農業用組成物として適用し、種蒔きの時にトウモロコシ種子に投与する。
【０３６２】
例えば、農家がトウモロコシ種子を畑に植え付けるときと同時に前記種子に前記農業用組成物を塗布することが予期される。これは、例えば、それらのトウモロコシ種子を含んでおり、且つ、同トウモロコシ種子を列に並べて植え付けるように構成されている標準的な１６条植え付け機上のホッパーまたはバルクタンクに前記農業用組成物を投入することにより達成され得る。あるいは、前記農業用組成物をその植え付け機上の分離したバルクタンクに入れ、トウモロコシ種子を植え付けるとすぐにそれらの列にその農業用組成物を噴霧することができる。
【０３６３】
前記農業用組成物が投与されていない対照区のトウモロコシ種子も植え付ける。
【０３６４】
前記農業用組成物で処理された種子から栽培されたトウモロコシ植物は対照トウモロコシ植物よりも大量のバイオマスを示すことが予期される。
【０３６５】
それらの処理植物に由来するバイオマスは約１〜１０％より多く、１０〜２０％より多く、２０〜３０％より多く、３０〜４０％より多く、４０〜５０％より多く、５０〜６０％より多く、６０〜７０％より多く、７０〜８０％より多く、８０〜９０％より多く、またはそれ以上により多いことがあり得る。
【０３６６】
それらの処理植物に由来するバイオマスは対照に対して１エーカー当たり約１ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約２ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約３ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約４ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約５ブッシェルの増加、またはそれより多い増加と同じであり得る。
【０３６７】
幾つかの態様ではそのバイオマスの増加は統計学的に有意である。他の態様ではそのバイオマスの増加は統計学的に有意ではないが、それでも数量化可能である。
Ｄ．微生物共同体を含む農業用組成物を用いる処理
【０３６８】
本実施例では表１〜３の少なくとも２種類の微生物を含む微生物合同体を農業用組成物として適用し、種蒔きの時にトウモロコシ種子に投与する。
【０３６９】
例えば、農家がトウモロコシ種子を畑に植え付けるときと同時に前記種子に前記農業用組成物を塗布することが予期される。これは、例えば、それらのトウモロコシ種子を含んでおり、且つ、同トウモロコシ種子を列に並べて植え付けるように構成されている標準的な１６条植え付け機上のホッパーまたはバルクタンクに前記農業用組成物を投入することにより達成され得る。あるいは、前記農業用組成物をその植え付け機上の分離したバルクタンクに入れ、トウモロコシ種子を植え付けるとすぐにそれらの列にその農業用組成物を噴霧することができる。
【０３７０】
前記農業用組成物が投与されていない対照区のトウモロコシ種子も植え付ける。
【０３７１】
前記農業用組成物で処理された種子から栽培されたトウモロコシ植物は対照トウモロコシ植物よりも大量のバイオマスを示すことが予期される。
【０３７２】
それらの処理植物に由来するバイオマスは約１〜１０％より多く、１０〜２０％より多く、２０〜３０％より多く、３０〜４０％より多く、４０〜５０％より多く、５０〜６０％より多く、６０〜７０％より多く、７０〜８０％より多く、８０〜９０％より多く、またはそれ以上により多いことがあり得る。
【０３７３】
それらの処理植物に由来するバイオマスは対照に対して１エーカー当たり約１ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約２ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約３ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約４ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約５ブッシェルの増加、またはそれより多い増加と同じであり得る。
【０３７４】
幾つかの態様ではそのバイオマスの増加は統計学的に有意である。他の態様ではそのバイオマスの増加は統計学的に有意ではないが、それでも数量化可能である。
実施例３：単離微生物および微生物共同体を用いるダイズバイオマスの増加
Ａ．単離微生物を用いる種子処理
【０３７５】
本実施例では表１〜３の単離微生物を種子被膜剤としてダイズ（Glycine max）の種子に塗布する。種子被膜剤としてその単離微生物を塗布してすぐにそのダイズを標準的な方法で植え付け、栽培する。
【０３７６】
種子被膜剤として前記単離微生物が塗布されなかった対照区のダイズ種子も植え付ける。
【０３７７】
前記種子被膜剤で処理された種子から栽培されたダイズ植物は対照ダイズ植物よりも大量のバイオマスを示すことが予期される。
【０３７８】
それらの処理植物に由来するバイオマスは約１〜１０％より多く、１０〜２０％より多く、２０〜３０％より多く、３０〜４０％より多く、４０〜５０％より多く、５０〜６０％より多く、６０〜７０％より多く、７０〜８０％より多く、８０〜９０％より多く、またはそれ以上により多いことがあり得る。
【０３７９】
それらの処理植物に由来するバイオマスは対照に対して１エーカー当たり約１ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約２ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約３ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約４ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約５ブッシェルの増加、またはそれより多い増加と同じであり得る。
【０３８０】
幾つかの態様ではそのバイオマスの増加は統計学的に有意である。他の態様ではそのバイオマスの増加は統計学的に有意ではないが、それでも数量化可能である。
Ｂ．微生物共同体を用いる種子処理
【０３８１】
本実施例では表１〜３の少なくとも２種類の微生物を含む微生物合同体を種子被膜剤としてダイズ（Glycine max）の種子に塗布する。種子被膜剤としてその微生物合同体を塗布してすぐにそのダイズを標準的な方法で植え付け、栽培する。
【０３８２】
種子被膜剤として前記微生物合同体が塗布されなかった対照区のダイズ種子も植え付ける。
【０３８３】
前記種子被膜剤で処理された種子から栽培されたダイズ植物は対照ダイズ植物よりも大量のバイオマスを示すことが予期される。
【０３８４】
それらの処理植物に由来するバイオマスは約１〜１０％より多く、１０〜２０％より多く、２０〜３０％より多く、３０〜４０％より多く、４０〜５０％より多く、５０〜６０％より多く、６０〜７０％より多く、７０〜８０％より多く、８０〜９０％より多く、またはそれ以上により多いことがあり得る。
【０３８５】
それらの処理植物に由来するバイオマスは対照に対して１エーカー当たり約１ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約２ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約３ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約４ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約５ブッシェルの増加、またはそれより多い増加と同じであり得る。
【０３８６】
幾つかの態様ではそのバイオマスの増加は統計学的に有意である。他の態様ではそのバイオマスの増加は統計学的に有意ではないが、それでも数量化可能である。
Ｃ．単離微生物を含む農業用組成物を用いる処理
【０３８７】
本実施例では表１〜３の単離微生物を農業用組成物として適用し、種蒔きの時にダイズ種子に投与する。
【０３８８】
例えば、農家がダイズ種子を畑に植え付けるときと同時に前記種子に前記農業用組成物を塗布することが予期される。これは、例えば、それらのダイズ種子を含んでおり、且つ、同ダイズ種子を列に並べて植え付けるように構成されている標準的な１６条植え付け機上のホッパーまたはバルクタンクに前記農業用組成物を投入することにより達成され得る。あるいは、前記農業用組成物をその植え付け機上の分離したバルクタンクに入れ、ダイズ種子を植え付けるとすぐにそれらの列にその農業用組成物を噴霧することができる。
【０３８９】
前記農業用組成物が投与されていない対照区のダイズ種子も植え付ける。
【０３９０】
前記農業用組成物で処理された種子から栽培されたダイズ植物は対照ダイズ植物よりも大量のバイオマスを示すことが予期される。
【０３９１】
それらの処理植物に由来するバイオマスは約１〜１０％より多く、１０〜２０％より多く、２０〜３０％より多く、３０〜４０％より多く、４０〜５０％より多く、５０〜６０％より多く、６０〜７０％より多く、７０〜８０％より多く、８０〜９０％より多く、またはそれ以上により多いことがあり得る。
【０３９２】
それらの処理植物に由来するバイオマスは対照に対して１エーカー当たり約１ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約２ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約３ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約４ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約５ブッシェルの増加、またはそれより多い増加と同じであり得る。
【０３９３】
幾つかの態様ではそのバイオマスの増加は統計学的に有意である。他の態様ではそのバイオマスの増加は統計学的に有意ではないが、それでも数量化可能である。
Ｄ．微生物共同体を含む農業用組成物を用いる処理
【０３９４】
本実施例では表１〜３の少なくとも２種類の微生物を含む微生物合同体を農業用組成物として適用し、種蒔きの時にダイズ種子に投与する。
【０３９５】
例えば、農家がダイズ種子を畑に植え付けるときと同時に前記種子に前記農業用組成物を塗布することが予期される。これは、例えば、それらのダイズ種子を含んでおり、且つ、同ダイズ種子を列に並べて植え付けるように構成されている標準的な１６条植え付け機上のホッパーまたはバルクタンクに前記農業用組成物を投入することにより達成され得る。あるいは、前記農業用組成物をその植え付け機上の分離したバルクタンクに入れ、ダイズ種子を植え付けるとすぐにそれらの列にその農業用組成物を噴霧することができる。
【０３９６】
前記農業用組成物が投与されていない対照区のダイズ種子も植え付ける。
【０３９７】
前記農業用組成物で処理された種子から栽培されたダイズ植物は対照ダイズ植物よりも大量のバイオマスを示すことが予期される。
【０３９８】
それらの処理植物に由来するバイオマスは約１〜１０％より多く、１０〜２０％より多く、２０〜３０％より多く、３０〜４０％より多く、４０〜５０％より多く、５０〜６０％より多く、６０〜７０％より多く、７０〜８０％より多く、８０〜９０％より多く、またはそれ以上により多いことがあり得る。
【０３９９】
それらの処理植物に由来するバイオマスは対照に対して１エーカー当たり約１ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約２ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約３ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約４ブッシェルの増加、または１エーカー当たり約５ブッシェルの増加、またはそれより多い増加と同じであり得る。
【０４００】
幾つかの態様ではそのバイオマスの増加は統計学的に有意である。他の態様ではそのバイオマスの増加は統計学的に有意ではないが、それでも数量化可能である。
実施例４：単離微生物を用いるコムギ実生バイオマスの改変
Ａ．単離微生物を用いる種子処理
【０４０１】
本実施例ではコムギ種子に個々の微生物株（ＢＣＩ）を植え付け、発芽させた（図５）。
【０４０２】
それらの種子に植菌し、それらの種子を湿らせたペーパータオル上に配置し、そしてそれらのタオルを巻いた。その後、巻いたペーパータオルを湿らせたタオルで覆われたプラスチック製のビンの中で２５℃に保温した。図５の中に見られる各株を各複製検査当たり２０種子ずつ三組で検査した。
【０４０３】
総バイオマスを処理後７日の時点で測定した。植菌されていない「水」対照処理を行い、同時に測定を行った。図５のＸ軸と平行であり、且つ、Ｙ軸のてっぺんの近くで複数の棒線を二分している実線は植菌されていない対照種子を表す。植菌された株の中には未処理対照と比較して植菌後日数（ＤＰＩ）７日の時点でバイオマスの相対的な増加をインビトロで示した株もあった。
【０４０４】
表１１は上で説明されたように植菌されたコムギにおける水のみで処理された対照（Ｈ２Ｏ）および未処置（Ｕｎｔ）対照と比べたバイオマスの増加の分析を提示している。種のすぐ右にある２つの列は水のみでの処理対照と未処理対照に対する増加率（％ＩＯＣ）を示している。バイオマスの増加と減少の両方が表１１のデータの中に示されている。栄養物および水が渇水または地域的条件により限定されることがある場合に小さな植物ほど耕地でこれらの資源を保存する可能性を示しており、したがって減少は収量に関連するという仮説が立てられる。
【０４０５】
それらの結果は、約１９株が水のみの対照および未処理対照と比較して植菌後日数（ＤＰＩ）７日の時点でコムギの総バイオマスの相対的な増加をインビトロで引き起こしたことを示した。８株は両方の対照に対して５％を超える増加を示し、一方で１９株は水対照に対してバイオマスの５％を超える減少を示した。
【表１１−１】
2018507708.tif 000022
【表１１−２】
2018507708.tif 000023
実施例５：単離微生物を用いるトウモロコシ、コムギ、およびトマトの根およびシュートの長さの増加
Ａ．単離微生物を用いる種子処理
【０４０６】
本実施例ではトウモロコシ、コムギ、およびトマトの種子に個々の微生物株（ＢＤＮＺ株）を植え付け、発芽させた。
【０４０７】
それらの種子に植菌し、それらの種子を湿らせたペーパータオル上に配置し、そしてそれらのタオルを巻いた。その後、巻いたペーパータオルを密封したプラスチックバッグの中で２５℃に保温した。表１２に見られる各株を発芽検査においてコムギおよびトウモロコシについては各複製検査当たり３０種子ずつ、およびトマトについては各複製検査当たり５０種子ずつ二組で検査した。
【０４０８】
処理後４日の時点で根の長さとシュートの長さ（ＲＬおよびＳＬ）を測定した。水による種子の対照処理と本開示の微生物接種剤が無い種子の対照処理。植菌された株の中には未処理対照と比較して植菌後日数（ＤＰＩ）４日の時点で根および／またはシュートの長さの相対的な増加を示したものもあった。
【０４０９】
トウモロコシ種子に塗布された各株を３０種子ずつ二組で検査した。発芽率が検査した全ての株で良好である一方で、水対照と比較して植菌後日数（ＤＰＩ）４日の時点で根および／またはシュートの長さの相対的な増加をインビトロで引き起こした株もあった（図６および図７を参照されたい）。
【０４１０】
コムギ種子に塗布された各株を３０種子ずつ二組で検査した。処理後４日の時点で根とシュートの長さを測定した。発芽率が検査した全ての株で良好であり（＞９０％）、且つ、水対照と比較して植菌後日数（ＤＰＩ）４日の時点で根および／またはシュートの長さの相対的な増加をインビトロで引き起こした株もあったことが結果より示される（図８および図９を参照されたい）。
【０４１１】
トマト種子に塗布された各株を５０種子ずつ二組で検査した。植菌後日数（ＤＰＩ）４日の時点で根とシュートの長さを測定した。発芽率が検査した全ての株で良好であり、且つ、水対照と比較して植菌後日数（ＤＰＩ）４日の時点で根および／またはシュートの長さの相対的な増加をインビトロで引き起こした株もあったことが結果より示される（図１０および図１１を参照されたい）。
【０４１２】
表１２は水のみで処理された対照（Ｈ２Ｏ）と比べた上で説明されたような植菌後の根とシュートの長さの増加（ｍｍ単位）の分析を提示している。種のすぐ右にある列は水のみでの処理対照に対する増加率（％ＩＯＣ）を示している。増加と減少の両方がデータの中に示されている。栄養物および水が渇水または地域的条件により限定されることがある場合に小さな植物ほど耕地でこれらの資源を保存する可能性を示しており、したがって減少は収量に関連するという仮説が立てられる。
【０４１３】
優良な植物から単離された多数の株が植菌後日数（ＤＰＩ）４日の時点で水対照に対する根および／またはシュートの長さの有意な増加（ｐ＜０．１、フィッシャーのＬＳＤ）を引き起こしたことがそれらの結果より示された。優良な植物から単離された２０株により水対照に対するトウモロコシの根の長さの有意な増加が引き起こされ、１９株によりトウモロコシのシュートの長さの有意な増加が引き起こされた。４株により対照に対するコムギの根とシュートの長さの有意な増加が引き起こされた。４株により対照に対するトマトの根とシュートの長さの有意な増加が引き起こされた。
【表１２】
2018507708.tif 000024
【０４１４】
植物の早期発生に対する前記微生物処理の効果を評価するために表１２において根とシュートの長さを評価した。バイオマスの増加と減少の両方が次のような可能性を反映すると指摘されている。すなわち、減少は収量に関連するという仮説が立てられており、例えば、栄養物および水が渇水または地域的条件により限定されることがある場合に小さな植物ほど耕地でこれらを保存する可能性を示す。検査した全ての株のうちの４０株ほどにより水対照と比較して植菌後日数（ＤＰＩ）４日の時点で根の長さの相対的な増加がインビトロで引き起こされ、且つ、３５株により水対照と比較してシュートの長さの相対的な増加がインビトロで引き起こされたことが結果より示される。４種類のトマト株、３種類のコムギ株および１７種類のトウモロコシ株によりシュートの長さと根の長さの両方の有意な増加（ｐ＜０．１、最小二乗差）が引き起こされた。
ＩＩ．農業上重要な作物における乾燥耐性および水使用効率の向上
【０４１５】
本開示のある特定の実施形態では本方法は所与の作物の乾燥耐性および水使用効率を向上させることを目的とする。
【０４１６】
本開示の単離微生物、同微生物を含む共同体および組成物の利用に基づく本明細書において提供される本方法は、重要な農業作物の乾燥耐性および水使用効率を向上させる能力を有する。これによってより持続的な農業システムが可能になり、且つ、重要な作物の栽培に適切である世界中の領域が増加する。
実施例１：単離微生物および微生物共同体を用いるホソムギの乾燥耐性と水使用効率の向上
Ａ．単離微生物を用いる種子処理
【０４１７】
本実施例では表１〜３の単離微生物を種子被膜剤としてホソムギ（Lolium perenne）の種子に塗布する。種子被膜剤としてその単離微生物を塗布してすぐにそのホソムギを標準的な方法で植え付け、栽培する。
【０４１８】
種子被膜剤として前記単離微生物が塗布されなかった対照区のホソムギ種子も植え付ける。
【０４１９】
前記種子被膜剤で処理された種子から栽培されたホソムギ植物は、対照ホソムギ植物と比較すると乾燥条件に耐える数量化可能、且つ、優れた能力を示し、且つ／または優れた水使用効率を示すことが予期される。
【０４２０】
乾燥耐性および／または水使用効率は当技術分野のあらゆる数の標準的な検査、例えば、葉の水分貯留の検査、膨圧喪失点の検査、光合成速度の検査、乾燥ストレスについての葉色と他の表現型指標の検査、収量性の検査、および様々な根の形態学的パターンと成長パターンの検査に基づき得る。
Ｂ．微生物共同体を用いる種子処理
【０４２１】
本実施例では表１〜３の少なくとも２種類の微生物を含む微生物合同体を種子被膜剤としてホソムギ（Lolium perenne）の種子に塗布する。種子被膜剤としてその微生物合同体を塗布してすぐにそのホソムギを標準的な方法で植え付け、栽培する。
【０４２２】
種子被膜剤として前記微生物合同体が塗布されなかった対照区のホソムギ種子も植え付ける。
【０４２３】
前記種子被膜剤で処理された種子から栽培されたホソムギ植物は、対照ホソムギ植物と比較すると乾燥条件に耐える数量化可能、且つ、優れた能力を示し、且つ／または優れた水使用効率を示すことが予期される。
【０４２４】
乾燥耐性および／または水使用効率は当技術分野のあらゆる数の標準的な検査、例えば、葉の水分貯留の検査、膨圧喪失点の検査、光合成速度の検査、乾燥ストレスについての葉色と他の表現型指標の検査、収量性の検査、および様々な根の形態学的パターンと成長パターンの検査に基づき得る。
Ｃ．単離微生物を含む農業用組成物を用いる処理
【０４２５】
本実施例では表１〜３の単離微生物を農業用組成物として適用し、種蒔きの時にホソムギ種子に投与する。
【０４２６】
例えば、農家がホソムギ種子を畑に散布するときと同時に前記種子に前記農業用組成物を塗布することが予期される。これは、例えば、それらのホソムギ種子を含んでおり、且つ、同ホソムギ種子を散布するように構成されているホッパーまたはスプレッダーに前記農業用組成物を投入することにより達成され得る。
【０４２７】
前記農業用組成物が投与されていない対照区のホソムギ種子も植え付ける。
【０４２８】
前記農業用組成物で処理された種子から栽培されたホソムギ植物は、対照ホソムギ植物と比較すると乾燥条件に耐える数量化可能、且つ、優れた能力を示し、且つ／または優れた水使用効率を示すことが予期される。
【０４２９】
乾燥耐性および／または水使用効率は当技術分野のあらゆる数の標準的な検査、例えば、葉の水分貯留の検査、膨圧喪失点の検査、光合成速度の検査、乾燥ストレスについての葉色と他の表現型指標の検査、収量性の検査、および様々な根の形態学的パターンと成長パターンの検査に基づき得る。
Ｄ．微生物共同体を含む農業用組成物を用いる処理
【０４３０】
本実施例では表１〜３の少なくとも２種類の微生物を含む微生物合同体を農業用組成物として適用し、種蒔きの時にホソムギ種子に投与する。
【０４３１】
例えば、農家がホソムギ種子を畑に散布するときと同時に前記種子に前記農業用組成物を塗布することが予期される。これは、例えば、それらのホソムギ種子を含んでおり、且つ、同ホソムギ種子を散布するように構成されているホッパーまたはスプレッダーに前記農業用組成物を投入することにより達成され得る。
【０４３２】
前記農業用組成物が投与されていない対照区のホソムギ種子も植え付ける。
【０４３３】
前記農業用組成物で処理された種子から栽培されたホソムギ植物は、対照ホソムギ植物と比較すると乾燥条件に耐える数量化可能、且つ、優れた能力を示し、且つ／または優れた水使用効率を示すことが予期される。
【０４３４】
乾燥耐性および／または水使用効率は当技術分野のあらゆる数の標準的な検査、例えば、葉の水分貯留の検査、膨圧喪失点の検査、光合成速度の検査、乾燥ストレスについての葉色と他の表現型指標の検査、収量性の検査、および様々な根の形態学的パターンと成長パターンの検査に基づき得る。
実施例２：単離微生物および微生物共同体を用いるトウモロコシの乾燥耐性と水使用効率の向上
Ａ．単離微生物を用いる種子処理
【０４３５】
本実施例では表１〜３の単離微生物を種子被膜剤としてトウモロコシ（Zea mays）の種子に塗布する。種子被膜剤としてその単離微生物を塗布してすぐにそのトウモロコシを標準的な方法で植え付け、栽培する。
【０４３６】
種子被膜剤として前記単離微生物が塗布されなかった対照区のトウモロコシ種子も植え付ける。
【０４３７】
前記種子被膜剤で処理された種子から栽培されたトウモロコシ植物は、対照トウモロコシ植物と比較すると乾燥条件に耐える数量化可能、且つ、優れた能力を示し、且つ／または優れた水使用効率を示すことが予期される。
【０４３８】
乾燥耐性および／または水使用効率は当技術分野のあらゆる数の標準的な検査、例えば、葉の水分貯留の検査、膨圧喪失点の検査、光合成速度の検査、乾燥ストレスについての葉色と他の表現型指標の検査、収量性の検査、および様々な根の形態学的パターンと成長パターンの検査に基づき得る。
Ｂ．微生物共同体を用いる種子処理
【０４３９】
本実施例では表１〜３の少なくとも２種類の微生物を含む微生物合同体を種子被膜剤としてトウモロコシ（Zea mays）の種子に塗布する。種子被膜剤としてその微生物合同体を塗布してすぐにそのトウモロコシを標準的な方法で植え付け、栽培する。
【０４４０】
種子被膜剤として前記微生物合同体が塗布されなかった対照区のトウモロコシ種子も植え付ける。
【０４４１】
前記種子被膜剤で処理された種子から栽培されたトウモロコシ植物は、対照トウモロコシ植物と比較すると乾燥条件に耐える数量化可能、且つ、優れた能力を示し、且つ／または優れた水使用効率を示すことが予期される。
【０４４２】
乾燥耐性および／または水使用効率は当技術分野のあらゆる数の標準的な検査、例えば、葉の水分貯留の検査、膨圧喪失点の検査、光合成速度の検査、乾燥ストレスについての葉色と他の表現型指標の検査、収量性の検査、および様々な根の形態学的パターンと成長パターンの検査に基づき得る。
Ｃ．単離微生物を含む農業用組成物を用いる処理
【０４４３】
本実施例では表１〜３の単離微生物を農業用組成物として適用し、種蒔きの時にトウモロコシ種子に投与する。
【０４４４】
例えば、農家がトウモロコシ種子を畑に植え付けるときと同時に前記種子に前記農業用組成物を塗布することが予期される。これは、例えば、それらのトウモロコシ種子を含んでおり、且つ、同トウモロコシ種子を列に並べて植え付けるように構成されている標準的な１６条植え付け機上のホッパーまたはバルクタンクに前記農業用組成物を投入することにより達成され得る。あるいは、前記農業用組成物をその植え付け機上の分離したバルクタンクに入れ、トウモロコシ種子を植え付けるとすぐにそれらの列にその農業用組成物を噴霧することができる。
【０４４５】
前記農業用組成物が投与されていない対照区のトウモロコシ種子も植え付ける。
【０４４６】
前記農業用組成物で処理された種子から栽培されたトウモロコシ植物は、対照トウモロコシ植物と比較すると乾燥条件に耐える数量化可能、且つ、優れた能力を示し、且つ／または優れた水使用効率を示すことが予期される。
【０４４７】
乾燥耐性および／または水使用効率は当技術分野のあらゆる数の標準的な検査、例えば、葉の水分貯留の検査、膨圧喪失点の検査、光合成速度の検査、乾燥ストレスについての葉色と他の表現型指標の検査、収量性の検査、および様々な根の形態学的パターンと成長パターンの検査に基づき得る。
Ｄ．微生物共同体を含む農業用組成物を用いる処理
【０４４８】
本実施例では表１〜３の少なくとも２種類の微生物を含む微生物合同体を農業用組成物として適用し、種蒔きの時にトウモロコシ種子に投与する。
【０４４９】
例えば、農家がトウモロコシ種子を畑に植え付けるときと同時に前記種子に前記農業用組成物を塗布することが予期される。これは、例えば、それらのトウモロコシ種子を含んでおり、且つ、同トウモロコシ種子を列に並べて植え付けるように構成されている標準的な１６条植え付け機上のホッパーまたはバルクタンクに前記農業用組成物を投入することにより達成され得る。あるいは、前記農業用組成物をその植え付け機上の分離したバルクタンクに入れ、トウモロコシ種子を植え付けるとすぐにそれらの列にその農業用組成物を噴霧することができる。
【０４５０】
前記農業用組成物が投与されていない対照区のトウモロコシ種子も植え付ける。
【０４５１】
前記農業用組成物で処理された種子から栽培されたトウモロコシ植物は、対照トウモロコシ植物と比較すると乾燥条件に耐える数量化可能、且つ、優れた能力を示し、且つ／または優れた水使用効率を示すことが予期される。
【０４５２】
乾燥耐性および／または水使用効率は当技術分野のあらゆる数の標準的な検査、例えば、葉の水分貯留の検査、膨圧喪失点の検査、光合成速度の検査、乾燥ストレスについての葉色と他の表現型指標の検査、収量性の検査、および様々な根の形態学的パターンと成長パターンの検査に基づき得る。
実施例３：単離微生物および微生物共同体を用いるダイズの乾燥耐性と水使用効率の向上
Ａ．単離微生物を用いる種子処理
【０４５３】
本実施例では表１〜３の単離微生物を種子被膜剤としてダイズ（Glycine max）の種子に塗布する。種子被膜剤としてその単離微生物を塗布してすぐにそのダイズを標準的な方法で植え付け、栽培する。
【０４５４】
種子被膜剤として前記単離微生物が塗布されなかった対照区のダイズ種子も植え付ける。
【０４５５】
前記種子被膜剤で処理された種子から栽培されたダイズ植物は、対照ダイズ植物と比較すると乾燥条件に耐える数量化可能、且つ、優れた能力を示し、且つ／または優れた水使用効率を示すことが予期される。
【０４５６】
乾燥耐性および／または水使用効率は当技術分野のあらゆる数の標準的な検査、例えば、葉の水分貯留の検査、膨圧喪失点の検査、光合成速度の検査、乾燥ストレスについての葉色と他の表現型指標の検査、収量性の検査、および様々な根の形態学的パターンと成長パターンの検査に基づき得る。
B.微生物共同体を用いる種子処理
【０４５７】
本実施例では表１〜３の少なくとも２種類の微生物を含む微生物合同体を種子被膜剤としてダイズ（Glycine max）の種子に塗布する。種子被膜剤としてその微生物合同体を塗布してすぐにそのダイズを標準的な方法で植え付け、栽培する。
【０４５８】
種子被膜剤として前記微生物合同体が塗布されなかった対照区のダイズ種子も植え付ける。
【０４５９】
前記種子被膜剤で処理された種子から栽培されたダイズ植物は、対照ダイズ植物と比較すると乾燥条件に耐える数量化可能、且つ、優れた能力を示し、且つ／または優れた水使用効率を示すことが予期される。
【０４６０】
乾燥耐性および／または水使用効率は当技術分野のあらゆる数の標準的な検査、例えば、葉の水分貯留の検査、膨圧喪失点の検査、光合成速度の検査、乾燥ストレスについての葉色と他の表現型指標の検査、収量性の検査、および様々な根の形態学的パターンと成長パターンの検査に基づき得る。
Ｃ．単離微生物を含む農業用組成物を用いる処理
【０４６１】
本実施例では表１〜３の単離微生物を農業用組成物として適用し、種蒔きの時にダイズ種子に投与する。
【０４６２】
例えば、農家がダイズ種子を畑に植え付けるときと同時に前記種子に前記農業用組成物を塗布することが予期される。これは、例えば、それらのダイズ種子を含んでおり、且つ、同ダイズ種子を列に並べて植え付けるように構成されている標準的な１６条植え付け機上のホッパーまたはバルクタンクに前記農業用組成物を投入することにより達成され得る。あるいは、前記農業用組成物をその植え付け機上の分離したバルクタンクに入れ、ダイズ種子を植え付けるとすぐにそれらの列にその農業用組成物を噴霧することができる。
【０４６３】
前記農業用組成物が投与されていない対照区のダイズ種子も植え付ける。
【０４６４】
前記農業用組成物で処理された種子から栽培されたダイズ植物は、対照ダイズ植物と比較すると乾燥条件に耐える数量化可能、且つ、優れた能力を示し、且つ／または優れた水使用効率を示すことが予期される。
【０４６５】
乾燥耐性および／または水使用効率は当技術分野のあらゆる数の標準的な検査、例えば、葉の水分貯留の検査、膨圧喪失点の検査、光合成速度の検査、乾燥ストレスについての葉色と他の表現型指標の検査、収量性の検査、および様々な根の形態学的パターンと成長パターンの検査に基づき得る。
Ｄ．微生物共同体を含む農業用組成物を用いる処理
【０４６６】
本実施例では表１〜３の少なくとも２種類の微生物を含む微生物合同体を農業用組成物として適用し、種蒔きの時にダイズ種子に投与する。
【０４６７】
例えば、農家がダイズ種子を畑に植え付けるときと同時に前記種子に前記農業用組成物を塗布することが予期される。これは、例えば、それらのダイズ種子を含んでおり、且つ、同ダイズ種子を列に並べて植え付けるように構成されている標準的な１６条植え付け機上のホッパーまたはバルクタンクに前記農業用組成物を投入することにより達成され得る。あるいは、前記農業用組成物をその植え付け機上の分離したバルクタンクに入れ、ダイズ種子を植え付けるとすぐにそれらの列にその農業用組成物を噴霧することができる。
【０４６８】
前記農業用組成物が投与されていない対照区のダイズ種子も植え付ける。
【０４６９】
前記農業用組成物で処理された種子から栽培されたダイズ植物は、対照ダイズ植物と比較すると乾燥条件に耐える数量化可能、且つ、優れた能力を示し、且つ／または優れた水使用効率を示すことが予期される。
【０４７０】
乾燥耐性および／または水使用効率は当技術分野のあらゆる数の標準的な検査、例えば、葉の水分貯留の検査、膨圧喪失点の検査、光合成速度の検査、乾燥ストレスについての葉色と他の表現型指標の検査、収量性の検査、および様々な根の形態学的パターンと成長パターンの検査に基づき得る。
ＩＩＩ．農業上重要な作物における窒素使用効率の向上
【０４７１】
本開示のある特定の実施形態では本方法は所与の農業システムに投入される必要がある窒素の量を減らし、それでいて所与の作物について同等以上の収量を達成することを目的とする。
【０４７２】
本開示の単離微生物、同微生物を含む共同体および組成物の利用に基づく本明細書において提供される本方法は、窒素が空気、土壌、および水路に浸出するために農家が毎年失う窒素肥料の量を減少させる能力を有する。これによって、今日の農業上の期待に応える収量成果を今まで通り生みだすことができるより持続的な農業システムが可能になる。
実施例１：単離微生物および微生物共同体を用いるホソムギのＮＵＥの向上
Ａ．単離微生物を用いる種子処理
【０４７３】
本実施例では表１〜３の単離微生物を種子被膜剤としてホソムギ（Lolium perenne）の種子に塗布する。種子被膜剤としてその単離微生物を塗布してすぐにそのホソムギを標準的な方法で植え付け、栽培する。
【０４７４】
種子被膜剤として前記単離微生物が塗布されなかった対照区のホソムギ種子も植え付ける。
【０４７５】
前記種子被膜剤で処理された種子から栽培されたホソムギ植物は、対照ホソムギ植物と比較すると窒素を利用する数量化可能、且つ、優れた能力を示すことが予期される。
【０４７６】
窒素使用効率は、同化経路における主要窒素代謝プールサイズのうちのいずれかの測定可能な変化（例えば、次のもの、すなわち、硝酸、亜硝酸、アンモニア、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、ロイシン、トレオニン、メチオニン、グリシン、トリプトファン、チロシン、植物の一部分の総タンパク質含量、植物の一部分の総窒素含量、および／またはクロロフィル含量のうちの１つ以上の測定可能な変化）を記録することにより、または処理された植物が対照植物と比較して低い窒素施肥レベルで同等以上のバイオマスまたは収穫可能な収量を提供することが示される場合、または処理された植物が対照植物と比較して同じ窒素施肥レベルで増加したバイオマスまたは収穫可能な収量を提供することが示される場合に数量化され得る。
Ｂ．微生物共同体を用いる種子処理
【０４７７】
本実施例では表１〜３の少なくとも２種類の微生物を含む微生物合同体を種子被膜剤としてホソムギ（Lolium perenne）の種子に塗布する。種子被膜剤としてその微生物合同体を塗布してすぐにそのホソムギを標準的な方法で植え付け、栽培する。
【０４７８】
種子被膜剤として前記微生物合同体が塗布されなかった対照区のホソムギ種子も植え付ける。
【０４７９】
前記種子被膜剤で処理された種子から栽培されたホソムギ植物は、対照ホソムギ植物と比較すると窒素を利用する数量化可能、且つ、優れた能力を示すことが予期される。
【０４８０】
窒素使用効率は、同化経路における主要窒素代謝プールサイズのうちのいずれかの測定可能な変化（例えば、次のもの、すなわち、硝酸、亜硝酸、アンモニア、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、ロイシン、トレオニン、メチオニン、グリシン、トリプトファン、チロシン、植物の一部分の総タンパク質含量、植物の一部分の総窒素含量、および／またはクロロフィル含量のうちの１つ以上の測定可能な変化）を記録することにより、または処理された植物が対照植物と比較して低い窒素施肥レベルで同等以上のバイオマスまたは収穫可能な収量を提供することが示される場合、または処理された植物が対照植物と比較して同じ窒素施肥レベルで増加したバイオマスまたは収穫可能な収量を提供することが示される場合に数量化され得る。
Ｃ．単離微生物を含む農業用組成物を用いる処理
【０４８１】
本実施例では表１〜３の単離微生物を農業用組成物として適用し、種蒔きの時にホソムギ種子に投与する。
【０４８２】
例えば、農家がホソムギ種子を畑に散布するときと同時に前記種子に前記農業用組成物を塗布することが予期される。これは、例えば、それらのホソムギ種子を含んでおり、且つ、同ホソムギ種子を散布するように構成されているホッパーまたはスプレッダーに前記農業用組成物を投入することにより達成され得る。
【０４８３】
前記農業用組成物が投与されていない対照区のホソムギ種子も植え付ける。
【０４８４】
前記農業用組成物で処理された種子から栽培されたホソムギ植物は、対照ホソムギ植物と比較すると窒素を利用する数量化可能、且つ、優れた能力を示すことが予期される。
【０４８５】
窒素使用効率は、同化経路における主要窒素代謝プールサイズのうちのいずれかの測定可能な変化（例えば、次のもの、すなわち、硝酸、亜硝酸、アンモニア、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、ロイシン、トレオニン、メチオニン、グリシン、トリプトファン、チロシン、植物の一部分の総タンパク質含量、植物の一部分の総窒素含量、および／またはクロロフィル含量のうちの１つ以上の測定可能な変化）を記録することにより、または処理された植物が対照植物と比較して低い窒素施肥レベルで同等以上のバイオマスまたは収穫可能な収量を提供することが示される場合、または処理された植物が対照植物と比較して同じ窒素施肥レベルで増加したバイオマスまたは収穫可能な収量を提供することが示される場合に数量化され得る。
Ｄ．微生物共同体を含む農業用組成物を用いる処理
【０４８６】
本実施例では表１〜３の少なくとも２種類の微生物を含む微生物合同体を農業用組成物として適用し、種蒔きの時にホソムギ種子に投与する。
【０４８７】
例えば、農家がホソムギ種子を畑に散布するときと同時に前記種子に前記農業用組成物を塗布することが予期される。これは、例えば、それらのホソムギ種子を含んでおり、且つ、同ホソムギ種子を散布するように構成されているホッパーまたはスプレッダーに前記農業用組成物を投入することにより達成され得る。
【０４８８】
前記農業用組成物が投与されていない対照区のホソムギ種子も植え付ける。
【０４８９】
前記農業用組成物で処理された種子から栽培されたホソムギ植物は、対照ホソムギ植物と比較すると窒素を利用する数量化可能、且つ、優れた能力を示すことが予期される。
【０４９０】
窒素使用効率は、同化経路における主要窒素代謝プールサイズのうちのいずれかの測定可能な変化（例えば、次のもの、すなわち、硝酸、亜硝酸、アンモニア、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、ロイシン、トレオニン、メチオニン、グリシン、トリプトファン、チロシン、植物の一部分の総タンパク質含量、植物の一部分の総窒素含量、および／またはクロロフィル含量のうちの１つ以上の測定可能な変化）を記録することにより、または処理された植物が対照植物と比較して低い窒素施肥レベルで同等以上のバイオマスまたは収穫可能な収量を提供することが示される場合、または処理された植物が対照植物と比較して同じ窒素施肥レベルで増加したバイオマスまたは収穫可能な収量を提供することが示される場合に数量化され得る。
実施例２：単離微生物および微生物共同体を用いるトウモロコシのＮＵＥの向上
A.単離微生物を用いる種子処理
【０４９１】
本実施例では表１〜３の単離微生物を種子被膜剤としてトウモロコシ（Zea mays）の種子に塗布する。種子被膜剤としてその単離微生物を塗布してすぐにそのトウモロコシを標準的な方法で植え付け、栽培する。
【０４９２】
種子被膜剤として前記単離微生物が塗布されなかった対照区のトウモロコシ種子も植え付ける。
【０４９３】
前記種子被膜剤で処理された種子から栽培されたトウモロコシ植物は、対照トウモロコシ植物と比較すると窒素を利用する数量化可能、且つ、優れた能力を示すことが予期される。
【０４９４】
窒素使用効率は、同化経路における主要窒素代謝プールサイズのうちのいずれかの測定可能な変化（例えば、次のもの、すなわち、硝酸、亜硝酸、アンモニア、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、ロイシン、トレオニン、メチオニン、グリシン、トリプトファン、チロシン、植物の一部分の総タンパク質含量、植物の一部分の総窒素含量、および／またはクロロフィル含量のうちの１つ以上の測定可能な変化）を記録することにより、または処理された植物が対照植物と比較して低い窒素施肥レベルで同等以上のバイオマスまたは収穫可能な収量を提供することが示される場合、または処理された植物が対照植物と比較して同じ窒素施肥レベルで増加したバイオマスまたは収穫可能な収量を提供することが示される場合に数量化され得る。
Ｂ．微生物共同体を用いる種子処理
【０４９５】
本実施例では表１〜３の少なくとも２種類の微生物を含む微生物合同体を種子被膜剤としてトウモロコシ（Zea mays）の種子に塗布する。種子被膜剤としてその微生物合同体を塗布してすぐにそのトウモロコシを標準的な方法で植え付け、栽培する。
【０４９６】
種子被膜剤として前記微生物合同体が塗布されなかった対照区のトウモロコシ種子も植え付ける。
【０４９７】
前記種子被膜剤で処理された種子から栽培されたトウモロコシ植物は、対照トウモロコシ植物と比較すると窒素を利用する数量化可能、且つ、優れた能力を示すことが予期される。
【０４９８】
窒素使用効率は、同化経路における主要窒素代謝プールサイズのうちのいずれかの測定可能な変化（例えば、次のもの、すなわち、硝酸、亜硝酸、アンモニア、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、ロイシン、トレオニン、メチオニン、グリシン、トリプトファン、チロシン、植物の一部分の総タンパク質含量、植物の一部分の総窒素含量、および／またはクロロフィル含量のうちの１つ以上の測定可能な変化）を記録することにより、または処理された植物が対照植物と比較して低い窒素施肥レベルで同等以上のバイオマスまたは収穫可能な収量を提供することが示される場合、または処理された植物が対照植物と比較して同じ窒素施肥レベルで増加したバイオマスまたは収穫可能な収量を提供することが示される場合に数量化され得る。
Ｃ．単離微生物を含む農業用組成物を用いる処理
【０４９９】
本実施例では表１〜３の単離微生物を農業用組成物として適用し、種蒔きの時にトウモロコシ種子に投与する。
【０５００】
例えば、農家がトウモロコシ種子を畑に植え付けるときと同時に前記種子に前記農業用組成物を塗布することが予期される。これは、例えば、それらのトウモロコシ種子を含んでおり、且つ、同トウモロコシ種子を列に並べて植え付けるように構成されている標準的な１６条植え付け機上のホッパーまたはバルクタンクに前記農業用組成物を投入することにより達成され得る。あるいは、前記農業用組成物をその植え付け機上の分離したバルクタンクに入れ、トウモロコシ種子を植え付けるとすぐにそれらの列にその農業用組成物を噴霧することができる。
【０５０１】
前記農業用組成物が投与されていない対照区のトウモロコシ種子も植え付ける。
【０５０２】
前記農業用組成物で処理された種子から栽培されたトウモロコシ植物は、対照トウモロコシ植物と比較すると窒素を利用する数量化可能、且つ、優れた能力を示すことが予期される。
【０５０３】
窒素使用効率は、同化経路における主要窒素代謝プールサイズのうちのいずれかの測定可能な変化（例えば、次のもの、すなわち、硝酸、亜硝酸、アンモニア、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、ロイシン、トレオニン、メチオニン、グリシン、トリプトファン、チロシン、植物の一部分の総タンパク質含量、植物の一部分の総窒素含量、および／またはクロロフィル含量のうちの１つ以上の測定可能な変化）を記録することにより、または処理された植物が対照植物と比較して低い窒素施肥レベルで同等以上のバイオマスまたは収穫可能な収量を提供することが示される場合、または処理された植物が対照植物と比較して同じ窒素施肥レベルで増加したバイオマスまたは収穫可能な収量を提供することが示される場合に数量化され得る。
Ｄ．微生物共同体を含む農業用組成物を用いる処理
【０５０４】
本実施例では表１〜３の少なくとも２種類の微生物を含む微生物合同体を農業用組成物として適用し、種蒔きの時にトウモロコシ種子に投与する。
【０５０５】
例えば、農家がトウモロコシ種子を畑に植え付けるときと同時に前記種子に前記農業用組成物を塗布することが予期される。これは、例えば、それらのトウモロコシ種子を含んでおり、且つ、同トウモロコシ種子を列に並べて植え付けるように構成されている標準的な１６条植え付け機上のホッパーまたはバルクタンクに前記農業用組成物を投入することにより達成され得る。あるいは、前記農業用組成物をその植え付け機上の分離したバルクタンクに入れ、トウモロコシ種子を植え付けるとすぐにそれらの列にその農業用組成物を噴霧することができる。
【０５０６】
前記農業用組成物が投与されていない対照区のトウモロコシ種子も植え付ける。
【０５０７】
前記農業用組成物で処理された種子から栽培されたトウモロコシ植物は、対照トウモロコシ植物と比較すると窒素を利用する数量化可能、且つ、優れた能力を示すことが予期される。
【０５０８】
窒素使用効率は、同化経路における主要窒素代謝プールサイズのうちのいずれかの測定可能な変化（例えば、次のもの、すなわち、硝酸、亜硝酸、アンモニア、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、ロイシン、トレオニン、メチオニン、グリシン、トリプトファン、チロシン、植物の一部分の総タンパク質含量、植物の一部分の総窒素含量、および／またはクロロフィル含量のうちの１つ以上の測定可能な変化）を記録することにより、または処理された植物が対照植物と比較して低い窒素施肥レベルで同等以上のバイオマスまたは収穫可能な収量を提供することが示される場合、または処理された植物が対照植物と比較して同じ窒素施肥レベルで増加したバイオマスまたは収穫可能な収量を提供することが示される場合に数量化され得る。
実施例３：単離微生物および微生物共同体を用いるダイズのＮＵＥの向上
Ａ．単離微生物を用いる種子処理
【０５０９】
本実施例では表１〜３の単離微生物を種子被膜剤としてダイズ（Glycine max）の種子に塗布する。種子被膜剤としてその単離微生物を塗布してすぐにそのダイズを標準的な方法で植え付け、栽培する。
【０５１０】
種子被膜剤として前記単離微生物が塗布されなかった対照区のダイズ種子も植え付ける。
【０５１１】
前記種子被膜剤で処理された種子から栽培されたダイズ植物は、対照ダイズ植物と比較すると窒素を利用する数量化可能、且つ、優れた能力を示すことが予期される。
【０５１２】
窒素使用効率は、同化経路における主要窒素代謝プールサイズのうちのいずれかの測定可能な変化（例えば、次のもの、すなわち、硝酸、亜硝酸、アンモニア、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、ロイシン、トレオニン、メチオニン、グリシン、トリプトファン、チロシン、植物の一部分の総タンパク質含量、植物の一部分の総窒素含量、および／またはクロロフィル含量のうちの１つ以上の測定可能な変化）を記録することにより、または処理された植物が対照植物と比較して低い窒素施肥レベルで同等以上のバイオマスまたは収穫可能な収量を提供することが示される場合、または処理された植物が対照植物と比較して同じ窒素施肥レベルで増加したバイオマスまたは収穫可能な収量を提供することが示される場合に数量化され得る。
Ｂ．微生物共同体を用いる種子処理
【０５１３】
本実施例では表１〜３の少なくとも２種類の微生物を含む微生物合同体を種子被膜剤としてダイズ（Glycine max）の種子に塗布する。種子被膜剤としてその微生物合同体を塗布してすぐにそのダイズを標準的な方法で植え付け、栽培する。
【０５１４】
種子被膜剤として前記微生物合同体が塗布されなかった対照区のダイズ種子も植え付ける。
【０５１５】
前記種子被膜剤で処理された種子から栽培されたダイズ植物は、対照ダイズ植物と比較すると窒素を利用する数量化可能、且つ、優れた能力を示すことが予期される。
【０５１６】
窒素使用効率は、同化経路における主要窒素代謝プールサイズのうちのいずれかの測定可能な変化（例えば、次のもの、すなわち、硝酸、亜硝酸、アンモニア、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、ロイシン、トレオニン、メチオニン、グリシン、トリプトファン、チロシン、植物の一部分の総タンパク質含量、植物の一部分の総窒素含量、および／またはクロロフィル含量のうちの１つ以上の測定可能な変化）を記録することにより、または処理された植物が対照植物と比較して低い窒素施肥レベルで同等以上のバイオマスまたは収穫可能な収量を提供することが示される場合、または処理された植物が対照植物と比較して同じ窒素施肥レベルで増加したバイオマスまたは収穫可能な収量を提供することが示される場合に数量化され得る。
Ｃ．単離微生物を含む農業用組成物を用いる処理
【０５１７】
本実施例では表１〜３の単離微生物を農業用組成物として適用し、種蒔きの時にダイズ種子に投与する。
【０５１８】
例えば、農家がダイズ種子を畑に植え付けるときと同時に前記種子に前記農業用組成物を塗布することが予期される。これは、例えば、それらのダイズ種子を含んでおり、且つ、同ダイズ種子を列に並べて植え付けるように構成されている標準的な１６条植え付け機上のホッパーまたはバルクタンクに前記農業用組成物を投入することにより達成され得る。あるいは、前記農業用組成物をその植え付け機上の分離したバルクタンクに入れ、ダイズ種子を植え付けるとすぐにそれらの列にその農業用組成物を噴霧することができる。
【０５１９】
前記農業用組成物が投与されていない対照区のダイズ種子も植え付ける。
【０５２０】
前記農業用組成物で処理された種子から栽培されたダイズ植物は、対照ダイズ植物と比較すると窒素を利用する数量化可能、且つ、優れた能力を示すことが予期される。
【０５２１】
窒素使用効率は、同化経路における主要窒素代謝プールサイズのうちのいずれかの測定可能な変化（例えば、次のもの、すなわち、硝酸、亜硝酸、アンモニア、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、ロイシン、トレオニン、メチオニン、グリシン、トリプトファン、チロシン、植物の一部分の総タンパク質含量、植物の一部分の総窒素含量、および／またはクロロフィル含量のうちの１つ以上の測定可能な変化）を記録することにより、または処理された植物が対照植物と比較して低い窒素施肥レベルで同等以上のバイオマスまたは収穫可能な収量を提供することが示される場合、または処理された植物が対照植物と比較して同じ窒素施肥レベルで増加したバイオマスまたは収穫可能な収量を提供することが示される場合に数量化され得る。
Ｄ．微生物共同体を含む農業用組成物を用いる処理
【０５２２】
本実施例では表１〜３の少なくとも２種類の微生物を含む微生物合同体を農業用組成物として適用し、種蒔きの時にダイズ種子に投与する。
【０５２３】
例えば、農家がダイズ種子を畑に植え付けるときと同時に前記種子に前記農業用組成物を塗布することが予期される。これは、例えば、それらのダイズ種子を含んでおり、且つ、同ダイズ種子を列に並べて植え付けるように構成されている標準的な１６条植え付け機上のホッパーまたはバルクタンクに前記農業用組成物を投入することにより達成され得る。あるいは、前記農業用組成物をその植え付け機上の分離したバルクタンクに入れ、ダイズ種子を植え付けるとすぐにそれらの列にその農業用組成物を噴霧することができる。
【０５２４】
前記農業用組成物が投与されていない対照区のダイズ種子も植え付ける。
【０５２５】
前記農業用組成物で処理された種子から栽培されたダイズ植物は、対照ダイズ植物と比較すると窒素を利用する数量化可能、且つ、優れた能力を示すことが予期される。
【０５２６】
窒素使用効率は、同化経路における主要窒素代謝プールサイズのうちのいずれかの測定可能な変化（例えば、次のもの、すなわち、硝酸、亜硝酸、アンモニア、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、ロイシン、トレオニン、メチオニン、グリシン、トリプトファン、チロシン、植物の一部分の総タンパク質含量、植物の一部分の総窒素含量、および／またはクロロフィル含量のうちの１つ以上の測定可能な変化）を記録することにより、または処理された植物が対照植物と比較して低い窒素施肥レベルで同等以上のバイオマスまたは収穫可能な収量を提供することが示される場合、または処理された植物が対照植物と比較して同じ窒素施肥レベルで増加したバイオマスまたは収穫可能な収量を提供することが示される場合に数量化され得る。
ＩＶ．農業上重要な作物における代謝物質発現の増加
【０５２７】
本開示のある特定の実施形態では本方法は所与の作物の目的の代謝物質の生産を増加させることを目的とする。
【０５２８】
本開示の単離微生物、同微生物を含む共同体および組成物の利用に基づく本明細書において提供される本方法は、所与の作物の目的の代謝物質の生産を増加させる能力を有する。
実施例１：単離微生物および微生物共同体を用いるバジルにおける糖含量の増加
Ａ．単離微生物を用いる種子処理
【０５２９】
本実施例では表１〜３の単離微生物を種子被膜剤としてバジル（Ocium basilicum）の種子に塗布する。種子被膜剤としてその単離微生物を塗布してすぐにそのバジルを標準的な方法で植え付け、栽培する。
【０５３０】
種子被膜剤として前記単離微生物が塗布されなかった対照区のバジル種子も植え付ける。
【０５３１】
前記種子被膜剤で処理された種子から栽培されたバジル植物は、対照バジル植物と比較すると水溶性炭化水素含量の数量化可能な増加を示すことが予期される。
Ｂ．微生物共同体を用いる種子処理
【０５３２】
本実施例では表１〜３の少なくとも２種類の微生物を含む微生物合同体を種子被膜剤としてバジル（Ocium basilicum）の種子に塗布する。種子被膜剤としてその微生物合同体を塗布してすぐにそのバジルを標準的な方法で植え付け、栽培する。
【０５３３】
種子被膜剤として前記微生物合同体が塗布されなかった対照区のバジル種子も植え付ける。
【０５３４】
前記種子被膜剤で処理された種子から栽培されたバジル植物は、対照バジル植物と比較すると水溶性炭化水素含量の数量化可能な増加を示すことが予期される。
Ｖ．微生物混合物およびAscend（登録商標）を用いて達成可能な相乗的効果
Ａ．Ascend（登録商標）と組み合わせた単離微生物を用いる種子処理
【０５３５】
本実施例では表１〜３の単離微生物をAscend（登録商標）と混合し、種子被膜剤として植物の種子に塗布する。種子被膜剤としてその単離微生物／Ascend（登録商標）混合物を塗布してすぐにその植物を標準的な方法で植え付け、栽培する。
【０５３６】
種子被膜剤として前記単離微生物／Ascend（登録商標）混合物が塗布されなかった対照区の植物種子も植え付ける。
【０５３７】
前記種子被膜剤で処理された種子から栽培された植物は、対照植物と比較すると目的の表現型形質の数量化可能な増加を示すことが予期される。目的のその表現型形質について相乗効果が観察され得ることが予期される。
Ｂ．Ascend（登録商標）と組み合わせた微生物共同体を用いる種子処理
【０５３８】
本実施例では表１〜３の少なくとも２種類の微生物を含む微生物合同体をAscend（登録商標）と混合し、その後で種子被膜剤として植物の種子に塗布する。種子被膜剤としてその微生物合同体／Ascend（登録商標）混合物を塗布してすぐにその植物を標準的な方法で植え付け、栽培する。
【０５３９】
種子被膜剤として前記微生物合同体／Ascend（登録商標）混合物が塗布されなかった対照区の植物種子も植え付ける。
【０５４０】
前記種子被膜剤で処理された種子から栽培された植物は、対照植物と比較すると目的の表現型形質の数量化可能な増加を示すことが予期される。目的のその表現型形質について相乗効果が観察され得ることが予期される。
ＶＩ．微生物共同体
【０５４１】
前記実施例で利用された微生物共同体が非限定的な例として表１３に提示されているが、前記微生物共同体は表１〜３に提示されているいずれか１種類以上の微生物を含んでよいことが理解される。
【表１３−１】
2018507708.tif 000025
【表１３−２】
2018507708.tif 000026
【表１３−３】
2018507708.tif 000027
【表１３−４】
2018507708.tif 000028
ＶＩＩ．植物表現型に対する微生物共同体の効果
実施例１：米国での試験において微生物共同体に曝露された植物の表現型の評価
【０５４２】
表１４において開示されている植物を制御環境下において１６７ｍｌの根域で典型的には土壌基材の中で栽培した。全ての種に対する全ての実験についてチャンバーの光周期を１６時間に設定した。実験中に植物の高さが増すので光強度は１８０μｍｏｌ  ＰＡＲ  ｍ−２・ｓ−１から約  μｍｏｌ  ＰＡＲ  ｍ−２・ｓ−１の範囲であった。
【０５４３】
トウモロコシ、ダイズ、およびモロコシの実験について気温は明期の間に２８℃であるのが典型的であり、暗期の間に２３℃まで低下した。コムギの実験について気温は明期の間に２４℃であるのが典型的であり、暗期の間に２０℃まで低下した。
【０５４４】
初期栄養成長期の間に、典型的にはＶ３発生ステージの前に表現型を評価した。
【０５４５】
葉のクロロフィル含量の指標を提示する測定器（CCM-200, Opti Sciences社、ハドソン、ニューハンプシャー州、米国）を使用して最も若い完全に広がった葉の途中で葉のクロロフィル含量を非破壊的に測定した。
【０５４６】
８０℃に設定された乾燥オーブンの中で一定の重量になるまで植物を乾燥させた後で植物全体、シュートおよび根の乾燥重量を測定した。各実験において測定される各表現型について少なくとも１０複製植物を測定した。
【０５４７】
微生物共同体を植菌された種子から栽培された植物との比較のために各実験において植菌されていない種子の対照処理を行った。
【表１４】
2018507708.tif 000029
【０５４８】
表１４において提示されているデータは同じ実験の対照実験と比べて特定の合同体が目的の表現型を変化させた倍率（効力）を説明している。評価された表現型は全植物乾燥重量（植物）、シュート乾燥重量（シュート）、根乾燥重量（根）、葉クロロフィル含量（クロロフィル）、および葉温（Ｔｌｅａｆ）であった。
【０５４９】
提示されているデータは対照に対して特定の合同体が検査された回数（評価）にわたって平均化されている。異なる回数の評価で異なる表現型が測定された共同体について、評価回数と表現型を一致させるためにデータポイントの隣に星印を置いた。特定の作物種（作物）について評価を分析し、提示している。
【０５５０】
提示されているデータは６０％を超える評価件数で目的の表現型を増大させた共同体（ヒットレート＞５９）、および６０％を超える評価件数で目的の表現型を減少させた共同体（ヒットレート＜４１）を特定している。目的の選択された表現型の減少が収量に関連するという可能性が目的の表現型の増大と減少の両方により示されていると記録された。葉のクロロフィルの減少を介した葉群光合成の改善、およびシュートバイオマスの減少を介した乾燥耐性の改善が２つの例を構成する。
実施例２：ニュージーランドでの試験において微生物共同体に曝露された植物の表現型の評価
【０５５１】
２５℃で４８〜７２時間にわたってＲ２Ａ上で保温される塗抹プレートとして培養された単離物から接種剤を調製した。滅菌蒸留水（ＳＤＷ）と混ぜ合わせることでコロニーを回収し、それを次に滅菌容器に移した。回収された細胞の段階希釈物を播種し、２５℃で２４時間にわたって培養して各懸濁液のコロニー形成単位（ＣＦＵ）数を推定した。約１×１０５ｃｆｕ／微生物／種子になり、且つ、液体懸濁液中での吸収または５％植物ガム質および植物油を用いる過剰処理により種子が植菌されるように個々の単離物または単離物の混合物（共同体）を用いて希釈物を調製した。
【０５５２】
表１５の植物に対応する種子を処理の２４〜４８時間以内に農業用土、鉢植え用媒体または不活性成長培地に植えた。制御環境内または温室内のどちらかで植物を小さい鉢（２８ｍＬから２００ｍＬ）の中で栽培した。全ての種に対する全ての実験についてチャンバーの光周期を１６時間に設定した。気温は２２〜２４℃の間に維持されることが典型的であった。
【０５５３】
特に指定の無い限り、週に２〜３回全ての植物に水道水を給水した。栽培条件は目的の形質に応じて変化し、それには次のような施肥、給水法および塩類ストレスの操作が含まれた。
低Ｎ‐窒素肥料を加えていない土、鉢植え用媒体、または不活性成長培地に種子を植える
中Ｎ‐１３５ｋｇ／ｈａの割合で散布される窒素に等しくなるように市販の窒素肥料を添加した土または成長培地に種子を植える
不溶性Ｐ‐鉢植え用媒体または不活性生育基質に種子を植え、唯一のリン酸肥料としてリン酸三カルシウムを含む四分の一の強度のPikovskayaの液体培地を給水する
寒冷ストレス‐土、鉢植え用媒体、または不活性成長培地に種子を植え、１週間にわたって１０℃で保温した後に植物生育室に移す
塩類ストレス‐土、鉢植え用媒体、または不活性成長培地に種子を植え、１００〜２００ｍｇ／Ｌの間のＮａＣｌを含む溶液を給水する
【０５５４】
各実験について未処理の（微生物を塗布されていない）対照を調製した。培養環境中で植物をトレイ上でランダム化した。１０と３０の間の数の複製植物を各実験の各処理のために調製した。初期栄養成長期の間に、典型的にはＶ３発生ステージの前と播種後の３週間と６週間の間に表現型を評価した。葉を切り取り、重量を量った。根を洗い、吸い取り紙で吸い取って乾燥し、そして重量を量った。結果より未処理対照に対する処理の成績が示される。
【表１５−１】
2018507708.tif 000030
【表１５−２】
2018507708.tif 000031
【表１５−３】
2018507708.tif 000032
【表１５−４】
2018507708.tif 000033
【０５５５】
表１５において提示されているデータは同じ実験の対照実験と比べて微生物種または微生物株により目的の表現型が変化し得る効力を説明している。評価された表現型はストレスが無い状態と有る状態のどちらか（アッセイ）で生育した植物のシュート新鮮重量および根新鮮重量であった。各微生物種について全体の効力スコアはその種のある株が独立した評価でシュートと根の両方の新鮮重量を増加させた倍率を示している。各種についてそれぞれの独立したアッセイの詳細が提示されており、株ＩＤ（株）およびそのアッセイが行われた作物腫（作物）が提示されている。それぞれの独立したアッセイについてシュートおよび根の新鮮重量の対照に対する増加率が提示されている。
【０５５６】
実施例３：米国での実地試験において微生物共同体に曝露されたトウモロコシの収量効果の評価
【０５５７】
表１６において提示されているデータはアメリカ合衆国の中西部の８か所において検査した６種類の共同体の対照と比べた最終的収量の変化をまとめている。アメリカ合衆国のカリフォルニア州において実施された２回の乾燥試験の最終的収量データも提示されている。データは１エーカー当たりのブッシェル数の特定の等級で収量効果が観察された試験数の割合として表されている。全ての実地試験は標準的な農耕法に従って行われた。
【表１６】
2018507708.tif 000034
実施例４：ニュージーランドでの実地試験において微生物共同体に曝露されたトウモロコシの収量効果の評価
【０５５８】
表１７において提示されているデータは選択された共同体についてのニュージーランドでの実地試験の結果をまとめている。提示されているデータは特定の共同体が対照と比べて検査されている試験の回数とその共同体処理が対照処理と比べて最終的な収量を増加させた試験の回数を説明している。全ての実地試験は標準的な農耕法に従って行われた。
【表１７】
2018507708.tif 000035
実施例５：ＡＲＳ培養物コレクション（ＮＲＲＬ）に寄託された微生物
【０５５９】
１つの実験上の実施形態において、本発明者らは本開示の適用において次の微生物種を利用した。表１８は米国農務省ＡＲＳ培養物コレクション（ＮＲＲＬ）に寄託された本開示の微生物種を詳細に説明している。
【表１８−１】
2018507708.tif 000036
【表１８−２】
2018507708.tif 000037
【表１８−３】
2018507708.tif 000038
【表１８−４】
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【表１８−５】
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実施例６：ＡＲＳ培養物コレクション（ＮＲＲＬ）に寄託された新規微生物種
【０５６０】
１つの実験上の実施形態において、本発明者らは本開示の適用において次の微生物種を利用した。
【表１９−１】
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【表１９−２】
2018507708.tif 000042
実施例７：農業にとって新規の寄託微生物種
【０５６１】
１つの実験上の実施形態において、本発明者らは本開示の適用において次の微生物種を利用した。表２０はそれぞれの受託番号でＮＲＲＬ寄託機関、ＡＴＣＣ寄託機関、および／またはＤＳＭＺ寄託機関に寄託された本開示の微生物を示している。
【表２０−１】
2018507708.tif 000043
【表２０−２】
2018507708.tif 000044
実施例８：微生物共同体の実施形態
【０５６２】
１つの実験上の実施形態において、本発明者らは本開示の適用において次の微生物共同体を利用した。表２１は本開示の微生物共同体Ｄ１、Ａ１、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ１２、およびＡ１５を示している。それらの共同体名の各々の下にそれらの共同体の各々に存在する微生物を特定する特異的な株番号がある。
【表２１】
2018507708.tif 000045
実施例９：微生物株および微生物種の実施形態
【０５６３】
１つの実験上の実施形態において、本発明者らは本開示の適用において次の微生物種および／または微生物株を利用した。表２２は、農業とっては新規であり、且つ、本開示の制御環境スクリーニング実験において正の結果を示した実験的研究において利用された特定の微生物種と微生物株を示している。
【表２２】
2018507708.tif 000046
参照による援用
【０５６４】
本明細書において引用されている全ての参照文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願は全ての目的のために全体が参照により援用される。
【０５６５】
しかしながら、本明細書において引用されているあらゆる参照文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願への言及は、それらが正当な先行技術を構成する、または世界中のどこかの国の共通一般知識の一部を形成すると認めた、またはいかなる形でもそれを示唆したと理解されず、且つ、そのように理解されるべきではない。
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【図１】
2018507708.tif 000047
【図２】
2018507708.tif 000048
【図３】
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【図４】
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【図５】
2018507708.tif 000051
【図６】
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【図７】
2018507708.tif 000053
【図８】
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【図９】
2018507708.tif 000055
【図１０】
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【図１１】
2018507708.tif 000057
【国際調査報告】
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2018507708.tif 000059
2018507708.tif 000060
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