(57)【要約】  生細胞構築物を作製する方法が：（ａ）上面及び底面を有する非細胞性支持体を提供するステップと、（ｂ）生きた未分化細胞を非細胞性支持体と接触させるステップと、次いで、（ｃ）胃腸上皮細胞単層を前記上面上で増殖させるステップとによって実施される。いくつかの実施形態において、単層中の生細胞は：（ｉ）未分化細胞（例えば、幹細胞又は前駆細胞）；及び（ｉｉ）任意選択で、しかし、いくつかの実施形態において好ましくは、分化細胞（例えば、腸細胞、パネート細胞、腸内分泌細胞、房飾細胞、微小細胞、上皮内リンパ球及び／又は杯細胞）を含む。このような方法によって生成される構築物及びそれを（例えば、ハイスループットスクリーニングにおいて）用いる方法も記載されている。
2018506971.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）上面及び底面を有する非細胞性支持体を提供するステップと、
（ｂ）生きた未分化細胞を前記非細胞性支持体と接触させるステップと、次いで、
（ｃ）胃腸上皮細胞単層を前記上面上で増殖させるステップと
を含む、生細胞構築物を作製する方法。
【請求項２】
前記単層内の前記生細胞が：
（ｉ）未分化細胞（例えば、幹細胞又は前駆細胞）；及び
（ｉｉ）任意選択で、しかし、いくつかの実施形態において好ましくは、（例えば、１：１０，０００、２：１０，０００又は１０：１０，０００から、１０，０００：１、１０：０００：２又は１０，０００：１０までの比の）前記未分化細胞と組み合わせた分化細胞（例えば、腸細胞、パネート細胞、腸内分泌細胞、房飾細胞、微小細胞、上皮内リンパ球及び／又は杯細胞）
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記胃腸上皮細胞が、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類及び昆虫の細胞からなる群から選択される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記胃腸上皮細胞がヒト胃腸上皮細胞である請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記胃腸上皮細胞が癌細胞又は腫瘍細胞ではない請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記胃腸上皮細胞が、結腸、小腸、胃、食道、舌、上咽頭、中咽頭、下咽頭及び膵臓の上皮細胞からなる群から選択される請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
（ｄ）生細胞の前記単層を維持する培養培地を、生細胞の前記単層（例えば、この培養培地は前記支持体内又は上にある。）と接触させるステップをさらに含む請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記培養培地が、短鎖脂肪酸（例えば、酪酸、酢酸、プロピオン酸、バルプロ酸など）を含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（ｉ）前記培養培地が、１０ミリモル以下の単糖類並びに二糖類を含み；及び
（ｉｉ）前記培養培地が、少なくとも２ミリモルの前記短鎖脂肪酸（例えば、最大２０、５０又は１００ミリモルの前記短鎖脂肪酸）を含む
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記支持体が多孔質支持体を含む請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記支持体が、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、エラスチン、フィブロネクチン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラチン硫酸、ヒアルロン酸、エンゲルブレス−ホルム−スウォームマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン状タンパク質混合物（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）、ＭａｘＧｅｌ（商標）など）及びこれらの組み合わせを含み；且つ／又は前記支持体が、天然又は合成高分子（任意選択で、上述の化合物により表面改質された、例えば、キトサン、アガロース、アルギン酸、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリレートポリマー、ポリエチレングリコール、合成ペプチドなど）から生成されるヒドロゲルを含む請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記支持体底面が、多孔質担体（例えば、（ポリテトラフルオロエチレン［ＰＴＦＥ］、ポリエステル、ポリカーボネート、セルロースなどから形成されてもよい）多孔質膜、（ナイロン、生分解性ポリマー、金属などから形成されてもよい）メッシュ、無機グリッド、ヒドロゲル又はこれらの組み合わせ上にある請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記上面が、その中に形成された複数のウェルを有し；前記ウェルのそれぞれが、上部開口、側壁及び床を有し；前記胃腸上皮細胞単層が、前記ウェル側壁及び床の上に延び、前記ウェル上部開口が開いたままであり、前記ウェル内が細胞で覆われた開いた内腔（又は「陰窩」）を形成する請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）上面及び底面を有する非細胞性支持体；
（ｂ）前記上面に形成された生きた胃腸上皮細胞の単層
を含む生細胞構築物。
【請求項１５】
前記単層内の前記生細胞が：
（ｉ）未分化細胞（例えば、幹細胞又は前駆細胞）；及び
（ｉｉ）任意選択で、しかし、いくつかの実施形態において好ましくは、（例えば、１：１０，０００、２：１０，０００又は１０：１０，０００から、１０，０００：１、１０：０００：２又は１０，０００：１０までの比の）前記未分化細胞と組み合わせた分化細胞（例えば、腸細胞、パネート細胞、腸内分泌細胞、房飾細胞、微小細胞、上皮内リンパ球及び／又は杯細胞）
を含む請求項１４に記載の構築物。
【請求項１６】
前記胃腸上皮細胞が、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類及び昆虫の細胞からなる群から選択される請求項１４又は１５に記載の構築物。
【請求項１７】
前記胃腸上皮細胞がヒト胃腸上皮細胞である請求項１４から１６のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項１８】
前記胃腸上皮細胞が悪性（癌又は腫瘍）細胞ではない請求項１４から１７のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項１９】
前記胃腸上皮細胞が、結腸、小腸、胃、食道、舌、上咽頭、中咽頭、下咽頭及び膵臓の上皮細胞からなる群から選択される請求項１４から１８のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項２０】
（ｃ）生細胞の前記単層を維持する、生細胞の前記単層と接触している培養培地（例えば、この培養培地は前記支持体内又は上にある。）をさらに含む請求項１４から１９のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項２１】
前記培養培地が、短鎖脂肪酸（例えば、酪酸、酢酸、プロピオン酸、バルプロ酸など）を含む請求項２０に記載の構築物。
【請求項２２】
（ｉ）前記培養培地が、１０ミリモル以下の単糖類並びに二糖類を含み；及び
（ｉｉ）前記培養培地が、少なくとも２ミリモルの前記短鎖脂肪酸（例えば、最大２０、５０又は１００ミリモルの前記短鎖脂肪酸）を含む
請求項２１に記載の構築物。
【請求項２３】
前記支持体が、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、エラスチン、フィブロネクチン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、エンゲルブレス−ホルム−スウォームマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン状タンパク質混合物（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）、ＭａｘＧｅｌ（商標）など）及びこれらの組み合わせを含み；且つ／又は前記支持体が、天然又は合成高分子（任意選択で、上述の化合物により表面改質された、例えば、キトサン、アガロース、アルギン酸、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリレートポリマー、ポリエチレングリコール、合成ペプチドなど）から生成されるヒドロゲルを含む請求項１４から２２のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項２４】
前記支持体が多孔質である請求項１４から２３のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項２５】
前記支持体底面が、多孔質担体（例えば、（ポリテトラフルオロエチレン［ＰＴＦＥ］、ポリエステル、ポリカーボネート、セルロースなどから形成されてもよい）多孔質膜、（ナイロン、生分解性ポリマー、金属などから形成されてもよい）メッシュ、無機グリッド、ヒドロゲル又はこれらの組み合わせ上にある請求項１４から２４のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項２６】
前記上面が、その中に形成された複数のウェルを有し、前記ウェルのそれぞれが、上部開口、側壁及び床を有し；
前記胃腸上皮細胞単層が、前記ウェル側壁及び床の上に延び、前記ウェル上部開口が覆われないままであり、前記ウェル内に開いた細胞内腔（又は「陰窩」）を形成する請求項１４から２５のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項２７】
前記ウェルが、深さ１００、２００又は３００ミクロンから、深さ８００又は１０００ミクロン以上までであり、且つ／又は前記ウェルが、幅１０又は５０ミクロンから、幅１００又は２００ミクロン以上までであり；且つ／又は少なくとも１０、５０又は１００個の前記ウェルが前記上面に形成される請求項２６に記載の構築物。
【請求項２８】
前記単層内の前記生細胞が、分化細胞及び未分化細胞（例えば、幹細胞又は前駆細胞）の両方を組み合わせで含み；
前記分化細胞及び前記未分化細胞が、ある勾配で（例えば、前記勾配の一端で分化細胞の濃度がより高く；前記勾配の他端で未分化細胞の濃度がより高い。）前記単層内に位置し；
前記ウェル側壁に合わせて、又は沿って向けた前記勾配
請求項２６又は２７に記載の構築物。
【請求項２９】
（ａ）請求項１４から２８のいずれか一項に記載の構築物を提供するステップと；
（ｂ）第１の培養培地を前記上面と接触させるステップと；及び
（ｃ）第２の培養培地を前記底面と接触させるステップと
を含み、一方の前記培養培地が、増殖幹細胞及び前駆細胞の前記分化を誘導し、且つ他方の前記培養培地が、未分化細胞の増殖を誘導する、生細胞構築物を維持する方法。
【請求項３０】
（ａ）請求項１２から２４のいずれか一項に記載の構築物、又は請求項２５に記載の方法に従って維持される構築物を提供するステップと、
（ｂ）試験化合物又は微生物を前記構築物と接触させるステップと；次いで、
（ｃ）前記構築物の細胞上の前記微生物の毒性作用、生理作用又は発癌作用を（例えば、前記接触後の前記構築物を、前記化合物又は微生物を接触させていない同様の構築物と比較することによって、且つ／又は前記接触ステップ後の前記構築物を、前記接触ステップ前の前記構築物と比較することによって）検出するステップと
を含む、試験化合物又は微生物を毒性作用、生理作用又は発癌作用についてスクリーニングする方法。
【請求項３１】
前記試験化合物又は微生物が、芳香族有機化合物、脂肪族有機化合物並びに混合芳香族及び脂肪族有機化合物からなる群から選択される請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記試験化合物又は微生物が、グラム陰性菌、グラム陽性菌、酵母及びカビからなる群から選択される請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、胃腸上皮組織構築物を生成する方法に関する。
【０００２】
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所から受けた助成金番号ＲＯ１  ＥＹ）２４５５６の下で政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【０００３】
関連出願の説明
本出願は、２０１５年１月３０日に出願された米国特許仮出願第６２／１１０，１４７号の利益を主張するものであり、その開示内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
体内のほとんどの臓器は、複数の細胞型から構成される上皮層を持つ。例えば、哺乳動物の腸は、下にある間充織に陥入して管状腺（例えば、小腸内では「リーベルキューンの陰窩」と呼ばれる。）を形成する上皮細胞の単層で覆われている。腸上皮の増殖区画は、幹細胞及び移行−増殖細胞が存在するこれらの陰窩の基底に位置する。これらの細胞は、ほとんどの非増殖細胞が位置する内腔面の腸上皮細胞の急速な再生（マウスで〜５日１）を促進する。２この細胞組織の極性は、基底−内腔軸にわたる可溶性因子（例えば、Ｗｎｔ、ＢＭＰ、Ｎｏｔｃｈ、酪酸）の勾配、並びに支持細胞（例えば、陰窩周囲の線維芽細胞）及びそれらの分泌された細胞外基質との生物物理的相互作用を含む、生化学的及び生物物理学的なインビボの微小環境のバランスによって維持されると考えられる。３−５
【０００５】
インビトロでの生きた陰窩の培養は１９７０年代から試みられてきたが、インビトロで長期増殖性の腸上皮を生成することは極めて困難であることが判明している。６，７これは、インビトロで再現することが不可能であった、腸上皮幹細胞のニッチを構成するインビボの微小環境の複雑さの結果であると考えられる。生きた無傷の陰窩は、二価の陽イオンのキレート化と機械的攪拌によって、動物又はヒトの腸の標本から放出させることができる。８−１０或いは、大腸を含む腸由来の幹細胞は、蛍光活性化細胞選別、磁気活性化細胞選別又は他の細胞分離ツールによって上皮からの放出後に単離することができる。ディッシュ内の陰窩の標準的な２Ｄ培養は、細胞の単層の短期間の増殖をもたらす。１１コラーゲンゲルのみ（すなわち、支持細胞の支持細胞層なし）に陰窩又は幹細胞を包埋することによって３Ｄ培養を実施しても、陰窩の生存は改善しない。９これらの培養方法で陰窩細胞の増殖能が失われることは、インビトロでの腸幹細胞の喪失を示唆している。この状況は、２００９年にハンス・クレバーズ（Ｈａｎｓ  Ｃｌｅｖｅｒｓ）と同僚らが可溶性増殖因子（Ｗｎｔ−３Ａ、Ｒ−スポンジン、ノギン及び上皮増殖因子［ＥＧＦ］）を培養環境に含めることによって３Ｄオルガノイドの培養に成功したときに是正された。このブレークスルーにより、小腸及び大腸由来のオルガノイド及び幹細胞の長期培養が可能になった。１２−１６増殖因子を添加した３Ｄ細胞外基質（ＥＣＭ）内に単離された陰窩又は単離された幹細胞を包埋すると、幹細胞の生存が支持され、上皮オルガノイドへの３Ｄ増殖性の拡大が促進されることがここで示された。１７これらのオルガノイドは、自己再生幹細胞並びに陰窩中に存在する全ての分化細胞型：杯細胞（分泌性粘液）、吸収性の腸細胞（水及び電解質を吸収する。）及び腸内分泌細胞（分泌ホルモン）を含む。この３Ｄオルガノイド技術は、オルガノイドの長期の増殖性の拡大を支持するのに有効であるが、陰窩のインビボの生化学的及び生物物理学的微小環境を正確に模倣するものではない。別の制限は、上皮細胞内の分子輸送の調査を困難にし、無傷の臓器で生じるような上皮の露出した表面を再現しない、オルガノイドの閉じた球状構造である。
【０００６】
生物学者らは、腸上皮組織の単層を生成することを目指して、従来の２Ｄ培養法を再検討することによって３Ｄオルガノイドモデルの制限を克服しようと試みた。オールブリトン（Ａｌｌｂｒｉｔｔｏｎ）グループは、陰窩を３Ｄ細胞外基質に包埋せずに、固体ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）の表面で陰窩を培養した。１８可溶性増殖因子（Ｗｎｔ−３Ａ、Ｒ−スポンジン、ノギン及びＥＧＦ）が供給されたが、陰窩の２Ｄ培養は、細胞の短寿命の非増殖単層のみを生成した。スタッペンベック（Ｓｔａｐｐｅｎｂｅｃｋ）グループは３Ｄ腸オルガノイドを分離し、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートの多孔質膜上で分離した細胞を２Ｄ培養して連続単層を生成した。１９，２０しかし、単層中の細胞は、完全に分化した非再生細胞から構成されていた。その結果、単層を用いた機能的アッセイは、分化した細胞がプレーティングの３日以内に死んだ為、培養の設定直後にのみ実施することができた。これらの結果は、固体表面において（多孔性膜の表面でさえも）、陰窩の従来の２Ｄ培養における幹細胞活性の喪失を示した。これらの単層には幹細胞がなかった為、自己再生していなかった。従って、可溶性増殖因子のみを含む生化学的微小環境は、腸上皮において幹細胞活性を維持するのに十分ではない。生物物理学的微小環境（例えば、細胞付着の為の表面）は、幹細胞の持続性及び増殖を維持する為に、生化学的微小環境と同等に重要である。
【０００７】
固有層は、インビボでの腸幹細胞の生物物理的微小環境であり、幹細胞がその上に存在する疎性結合組織の薄い層である。固有層は透過性であり、上皮への因子及び栄養の輸送を可能にする。さらに、固有層は、細胞外基質のラミニン及びコラーゲンＩＶが豊富である。固体表面（ポリスチレン、ポリジメチルシロキサンから構成されるものなど、又はポリエステル、ポリカーボネートなどから構成されるＴｒａｎｓｗｅｌｌ多孔質膜）は、透過性、剛性及びＥＣＭ成分の存在に関して固有層を完全に模倣していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、背景技術の課題を解決するためのものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
固有層の模倣における上で述べた問題を克服する為に、生体模倣足場を水溶性ＥＣＭタンパク質から作製し、幹細胞の生存能を維持するのに適した生物物理学的微小環境を作り出した。
【００１０】
本発明の第１の態様は：（ａ）上面及び底面を有する非細胞性支持体（例えば、多孔質支持体）を提供するステップと、（ｂ）生きた未分化（例えば、幹細胞及び／又は前駆細胞）細胞を多孔質非細胞性支持体と接触させるステップと、次いで、（ｃ）胃腸上皮細胞単層を上面上で増殖させるステップとを含む、生細胞構築物を作製する方法である。単層中の生細胞は、好ましくは、未分化細胞を含み、いくつかの実施形態において、分化細胞及び未分化細胞の両方を組み合わせで含む。単層は、以下でさらに議論するように、好ましくは長寿命の単層である。
【００１１】
本発明の第２の態様は：（ａ）上面及び底面を有する非細胞性支持体（例えば、多孔質支持体）（ｂ）前記上面に形成された生きた胃腸上皮細胞の単層を含む生細胞構築物である。単層中の生細胞は、未分化細胞（例えば、幹細胞又は前駆細胞）と、任意選択で、しかし、いくつかの実施形態において好ましくは、未分化細胞と組み合わせた分化細胞（例えば、腸細胞、杯細胞）とを含む。
【００１２】
本発明の第３の態様は：（ａ）上述の構築物を提供するステップと；（ｂ）第１の培養培地を構築物上面と接触させるステップと；及び（ｃ）（第１の培養培地とは異なる）第２の培養培地を構築物底面と接触させるステップとを含む、生細胞構築物を維持する方法である。一方の培養培地が、増殖幹細胞及び前駆細胞の分化を誘導し、且つ他方の培養培地が、未分化細胞の増殖を誘導する。
【００１３】
本発明は、本明細書の図面及び以下に記載の明細書において、より詳細に説明される。ウェル、陰窩又は内腔に関する実施形態の実質的な議論が行われるが、本発明の他の実施形態は、このようなウェル、陰窩又は内腔を必要としないことに留意されたい。また、本発明は、胃腸上皮細胞が支持体に付着している実施形態に関してかなり詳細に説明されているが、胃腸上皮細胞を支持体から分離して、これらの細胞懸濁液を他の用途又は目的（例えば、療法、移植、薬剤スクリーニング、継代／増殖、凍結保存など）の為に提供できることにも留意されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】人工的に作り出した生体模倣の２Ｄ及び３Ｄ足場上での腸上皮幹細胞の培養の概略図である。（Ａ）２Ｄ足場。上皮幹細胞を２Ｄ足場上にプレーティングして、幹細胞の連続単層を形成する。示したのは、２つの特殊化した細胞型：杯細胞及び腸細胞に分化した細胞である。（Ｂ）３Ｄ足場。上皮幹細胞を、マイクロウェル構造を持つ３Ｄ足場上で培養する。３Ｄ組織を生成し、可溶性増殖因子の勾配下で分極させる。
【図２】コラーゲンヒドロゲル足場表面上での陰窩の２Ｄ培養を示す図である。細胞は７日目の表面で増殖性であり、連続した層を形成した。スケールバー＝５００μｍ。
【図３】ＥＮＲ−ＷＢ下で７日間培養した２Ｄ単層の幹細胞マーカー（Ｌｇｒ５）、幹／前駆細胞マーカー（Ｓｏｘ９）、成熟上皮細胞マーカー（Ａｌｐｉ、Ｃｈｇａ、ｍｕｃ２）の相対的メッセンジャーＲＮＡ発現を示す図である。新たに単離した結腸陰窩を対照として用いた。データは、新鮮な陰窩及び２Ｄ単層の２つのサンプルの平均である。
【図４】２Ｄ単層の継代及び２Ｄ単層と３Ｄオルガノイドとの間の切替を示す図である。（Ａ）２Ｄ→２Ｄ継代。（Ｂ）２Ｄ→３Ｄ継代。（Ｃ）３Ｄ→２Ｄ継代  スケールバー＝５００μｍ。
【図５】２Ｄ単層の特殊化した細胞への分化を示す図である。（Ａ）培養培地からＷｎｔ−３Ａを除去することによる腸細胞分化。腸細胞の存在をＡｌｐ染色により確認した。（Ｂ）Ｗｎｔ−３Ａ及びＮｏｔｃｈ阻害剤を培養培地に添加することによる杯細胞分化。杯細胞の存在をＭｕｃ２染色により確認した。幹／前駆細胞の喪失をＳｏｘ９染色により確認した。スケールバー＝５０μｍ。
【図６】３Ｄコラーゲン足場上で生成した３Ｄマッシュルーム型結腸上皮組織を示す図である。（Ａ）ソフトリソグラフィー成形プロセスによる多孔質膜上でのコラーゲン足場の作製の概略図である。（Ｂ）デバイスの写真。コラーゲンマイクロウェルアレイは、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサート内の透明な多孔質ＰＴＦＥ膜上に成形されている。（Ｃ）コラーゲン足場のＢＦ画像。（Ｄ）足場のＳＥＭ画像。（Ｅ）（Ｄ）中の赤い四角の近接像はサブミクロンコラーゲン線維を示す。（Ｆ−Ｇ）３Ｄ足場上での結腸幹細胞の培養。（Ｆ）０日目。（Ｇ）５日目。（Ｈ−Ｊ）３Ｄ足場上の結腸上皮組織のＳＥＭ像。（Ｋ−Ｌ）足場切片の顕微鏡像。（Ｋ）明視野像。（Ｌ）蛍光像。青＝Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２核染色。緑＝Ｓｏｘ９ＥＧＦＰ。スケールバー＝５０μｍ。
【図７】２Ｄ結腸上皮単層のインビボ様増殖能、形態及び機能を示す図である。（Ａ）１３７ｍｍ２の面積を持つ連続２Ｄ単層が、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサート内で５日目に生成された。上のパネル、０日目。下のパネル、５日目。白い点線はインサートの外周を示す。（Ｂ）２Ｄ単層のＳＥＭ像。矢印は分泌細胞を示す。（Ｃ）２Ｄ単層細胞における基礎ＥＲＯＤ活性及び誘導能。２Ｄ単層をＥＮＲ−ＷＢ下で５日間培養した。５日目に、細胞を酵素誘導剤（βＮＦ、ＢａＰ及びＴＣＤＤ）で２０時間処理した。ＣＹＰ１Ａ１酵素活性を、エトキシレゾルフィンＯ−デエチラーゼ（ＥＲＯＤ）アッセイを用いて測定した。ｎ＝３。
【図８】ＥＮＲ−ＷＢ下、Ｍａｔｒｉｇｅｌ／コラーゲン足場上で、様々な混合比で５日間培養した結腸上皮細胞を示す図である。上のパネルは明視野像である。下のパネルはＤｓＲｅｄ蛍光像である。スケールバー＝１ｍｍ。
【図９】２Ｄ単層の特殊化した細胞への分化を示す図である。（Ａ）４つの異なる条件：ＥＮＲ−ＷＢ、ＥＮＲ、ＥＮＲ−Ｂ及びＥＮＲ−ＩＧ下での２Ｄ単層培養のムチン２（Ｍｕｃ２）及び炭酸脱水酵素ＩＩ（ＣＡＩＩ）の発現レベルの定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析。相対遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子としての１８ＳリボソームＲＮＡに関して計算される。（Ｂ）−（Ｃ）ＥＮＲ−ＷＢ、ＥＮＲ−Ｂ及びＥＮＲ−ＩＧ下で培養した２Ｄ単層のＳＥＭ像（上のパネル２，０００倍、下のパネル１５，０００倍）。
【図１０】ヒト小腸及び結腸の２Ｄ単層モデルの生成を示す図である。（Ａ）概略図。増殖細胞を灰色で示し、分化細胞を白色で示す。（Ｂ）ヒト小腸陰窩の３Ｄオルガノイド培養。（Ｃ）小腸オルガノイドの２Ｄ単層への変換。（Ｄ）ヒト結腸上皮細胞の３Ｄオルガノイド培養。（Ｅ）培養５日目にオルガノイドから生成した２Ｄ単層。スケールバー＝１００μｍ。
【図１１】初代結腸上皮に対する食物化合物及び天然物の影響を示す図である。（Ａ）細胞（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２陽性）が占めるコラーゲンＤａｉｓｚｅｉｎ（ｄａｉｄｚｅｎのアグリコン）表面積の百分率並びに規格化したＥＤＵ、アルカリホスファターゼ及びムチン２陽性の面積を化合物番号に対してプロットした。ＥＤＵ、アルカリホスファターゼ及びＭｕｃ２の面積を全細胞面積に対して規格化した。アルファベットの見出しは、表１に記載のカテゴリーを指す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施形態を示す添付図面を参照して、本発明をさらに詳しく説明する。しかし、本発明は、多くの異なる形態で具体化することができ、本明細書に記載の実施形態に限定されるものと解釈されるべきではない。むしろこれらの実施形態は、本開示が十分且つ完全であり、本発明の範囲を当業者に十分に伝えるように記載される。
【００１６】
同様の番号は、全体を通して同様の要素を指す。図面において、特定の線の太さ、層、構成要素、要素又は特徴は、見やすいように誇張されている場合がある。使用される場合、破線は、別段の指定がない限り、任意選択の特徴又は操作を示す。
【００１７】
本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態のみを記述する為のものであり、本発明を限定する為のものではない。本明細書において用いられるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈により特に明確に示されていない限り、複数形も含むことを意図している。さらに、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」又は「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、本明細書で用いられるときは、記載された特徴、整数、ステップ、操作、要素成分及び／又はこれらのグループ又は組み合わせの存在を特定するが、１つ又は複数の他の特徴、整数、ステップ、操作、要素、構成要素及び／又はこれらのグループ又は組み合わせの存在又は追加を除外するものではないことが理解されるであろう。
【００１８】
本明細書において用いられるとき、「及び／又は」という用語は、関連する列挙された項目のいずれか及び全ての可能な組み合わせ或いは１つ又は複数を含み、代替（「又は」）において解釈されるときは組み合わせの欠如も含む。
【００１９】
他に定義されていない限り、本明細書において用いられる（技術用語及び科学用語を含む）全ての用語は、本発明が属する技術分野の当業者には通常理解される意味と同じ意味を有する。さらに、一般に使用される辞書において定義された用語などの用語は、本明細書において明示的にそのように定義されていない限り、明細書及び特許請求の範囲の文脈において、それらの意味と一致する意味を有すると解釈すべきであり、理想的な意味又は過度に形式的な意味で解釈すべきではないことが理解されるであろう。周知の機能又は構造は、簡潔さ、及び／又は明確さの為に詳細に記載されないことがある。
【００２０】
ある要素が別の要素の「上に」ある、別の要素に「取り付けられる」、「接続される」、「結合される」、「接触している」などと表されるとき、この要素は、直接、他の要素の上にある、他の要素に取り付けられる、接続される、他の要素と結合される、且つ／又は接触していることができ、或いは間に挟まれた要素が存在することもできることが理解されるであろう。一方、ある要素が、例えば、別の要素の「直接上に」ある、別の要素に「直接取り付けられる」、「直接接続される」、別の要素と「直接結合される」又は「直接接触している」と表されるとき、間に挟まれた要素は存在しない。別の特徴と「隣接して」配置された構造又は特徴への言及は、隣接する特徴に重なるか、又はその下にある部分を有することができることも当業者なら理解するであろう。
【００２１】
「最上部（ｔｏｐ）」、「最下部（ｂｏｔｔｏｍ）」、「下（ｕｎｄｅｒ）」、「下方（ｂｅｌｏｗ）」、「下部（ｌｏｗｅｒ）」、「上方（ｏｖｅｒ）」、「上部（ｕｐｐｅｒ）」などのような空間的相対語は、本明細書において、図面に示す、ある要素又は特徴と、別の（１つ又は複数の）要素又は（１つ又は複数の）特徴との関係を記述する説明を容易にする為に用いられる。空間的相対語は、図面に描かれている向きに加えて、使用中又は操作中のデバイスの様々な向きを包含するものであることが理解されるであろう。例えば、図中のデバイスが反転される場合、他の要素又は特徴の「下」又は「真下（ｂｅｎｅａｔｈ）」と記載された要素は、他の要素又は特徴の「上方」を向くであろう。従って、例示的な用語「下」は、上方及び下の両方の向きを包含し得る。デバイスは違う向きでもよく（９０度回転又は他の向き）、本明細書において用いられる空間的相対記述語は、それに応じて解釈されてもよい。
【００２２】
様々な要素、構成要素、領域、層及び／又はセクションを説明する為に、第１の、第２の、などの用語が本明細書において用いられることがあるが、これらの要素、構成要素、領域、層及び／又はセクションは、これらの用語によって制限されるべきではないことが理解されるであろう。むしろ、これらの用語は、ある要素、構成要素、領域、層及び／又はセクションを、別の要素、構成要素、領域、層及び／又はセクションと区別する為に用いられているだけである。従って、本明細書において議論されている第１の要素、構成要素、領域、層又はセクションは、本発明の教示から逸脱することなく、第２の要素、構成要素、領域、層、又はセクションと呼ぶこともできる。操作（又はステップ）の順序は、特に具体的に記載のない限り、請求項又は図面に提示されている順番に限定されない。
【００２３】
１．胃腸上皮細胞。
本発明を実施する為に使用される未分化細胞及び／又は胃腸上皮細胞などの細胞は、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類及び昆虫を含む任意の起源の種のものでもよい。いくつかの実施形態において、細胞は哺乳類細胞であり、その例には、ヒト、サル、類人猿、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ及びブタの胃腸上皮細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、細胞は、好ましくは一次組織に由来し、癌細胞又は腫瘍細胞ではない。結腸、小腸、胃、食道、舌、鼻咽頭、中咽頭、下咽頭及び膵臓の上皮細胞を含む任意のタイプの胃腸上皮細胞を使用してもよい。
【００２４】
胃腸上皮細胞は、本発明が実施されている特定の段階又は時間に応じて、未分化細胞（例えば、幹細胞又は前駆細胞）、分化細胞（例えば、腸細胞、パネート細胞、腸内分泌細胞、房飾細胞、微小細胞、上皮内リンパ球及び／又は杯細胞）又はこれらの組み合わせでもよい。
【００２５】
未分化胃腸上皮細胞（又は胃腸上皮幹細胞）を含む胃腸上皮細胞は既知であり、既知の技術又はその変形に従って収集又は提供されてもよいことは、当業者には明らかであろう。例えば、Ｔ．エン及びＮ．ライト（T. Yen and N. Wright）著，「胃腸管幹細胞ニッチ（The gastrointestinal tract stem cell niche）」，ステム  セル  レビューズ（Stem Cell Rev.），２巻３号，２００６年，ｐ．２０３−２１２；Ｓ．ウマル（S. Umar）著，「腸幹細胞（Intestinal Stem Cells）」，カレント  ガストロエンテロロジー  レポーツ（Curr.Gastroenterol Rep.），１２巻５号，２０１０年１０月，ｐ．３４０−３４８；Ｐ．ユング等（P. Jung et al.）著，「ヒト結腸幹細胞の単離及びインビトロでの拡大（Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells）」，ネイチャー  メディスン（Nature Medicine），１７巻，２０１１年，ｐ．１２２５−１２２７；Ｊ．ミルズ及びＲ．シブダサニ（J. Mills and R. Shivdasani）著，「胃上皮幹細胞（Gastric epithelial stem cells）」，ガストロエンテロロジー（Gastroenterology），１４０巻２号，２０１１年２月，ｐ．４１２−４２４；Ａ．デウォード，Ｊ．クラマー及びＥ．ラガッセ（A. DeWard, J. Cramer, and E. Lagasse）著，「マウス食道における細胞の不均一性は非静止上皮幹細胞集団の存在を意味する（Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population）」，セル  レポーツ（Cell.Rep.），９巻２号，２０１４年１０月２３日，ｐ．７０１−７１１；Ａ．グラチュ等（A. Gracz et al.）著，「活性及び条件的幹細胞の特徴を有するＣＤ２４及びＣＤ４４標識ヒト腸上皮細胞集団（CD24 and CD44 Mark Human Intestinal Epithelial Cell Populations with Characteristics of Active and Facultative Stem Cells）」，ステム  セルズ（Stem Cells），３１巻９号，２０１３年，ｐ．２０２４−３０；Ｆ．ワン等（F. Wang et al.）著，「表面マーカーの組み合わせ及びコロニー形成アッセイに基づく腸幹細胞の単離及びキャラクタリゼーション（Isolation and Characterization of Intestinal Stem Cells Based on Surface Marker Combinations and Colony-Formation Assay）」，ガストロエンテロロジー（Gastroenterology），１４５巻２号，２０１３年，ｐ．３８３−９５を参照されたい。
【００２６】
２．生細胞構築物及び作製方法。
上で述べたように、本発明は、生細胞構築物及びその作製方法を提供する。通常、本方法は：
（ａ）上面及び底面を有する非細胞性支持体を提供するステップと、
（ｂ）生きた未分化細胞（例えば、幹細胞及び／又は前駆細胞）を（典型的にはその上面上の）非細胞性支持体と接触させるステップと、次いで、
（ｃ）胃腸上皮細胞単層を（典型的にはその上面上の）支持体上で増殖させるステップとによって実施される。
【００２７】
未分化細胞は、間葉系幹細胞、造血幹細胞、人工多能性幹細胞、胃腸上皮から得られる、又はそれに由来する幹細胞などを含むが、これらには限定されない任意の適したタイプのものでもよい。
【００２８】
単層中の生細胞は、好ましくは、分化細胞（例えば、腸細胞、パネート細胞、腸内分泌細胞、房飾細胞、微小細胞、上皮内リンパ球及び／又は杯細胞）及び未分化細胞（例えば、幹細胞又は前駆細胞）の両方を、（例えば、１：１０，０００、２：１０，０００又は１０：１０，０００から、１０，０００：１、１０：０００：２又は１０，０００：１０までの比の）組み合わせで含む。典型的には、本方法は：
（ｄ）生細胞の単層を維持する培養培地を、生細胞の単層（例えば、培養培地は支持体内又は上にある。）と接触させるステップをさらに含む。任意選択で、しかし、いくつかの実施形態において好ましくは、培養培地は、短鎖脂肪酸（例えば、酪酸、酢酸、プロピオン酸、バルプロ酸など）を生理的濃度（例えば、結腸に対して０．１〜５ｍＭの範囲内）で含む。培養培地はまた、以下でさらに議論するように、典型的な栄養素、増殖因子及びシグナル伝達因子などを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態において：（ｉ）培養培地は、１０ミリモル以下の単糖類並びに二糖類を（合計、組み合わせで）含み；同時に、（ｉｉ）培養培地は、少なくとも２ミリモルの前記短鎖脂肪酸（例えば、合計、組み合わせで、最大２０、５０又は１００ミリモルの短鎖脂肪酸）を含む。
【００３０】
有利には、単層は、長時間：すなわち、少なくとも２日、４日又は６日、最長２週又は４週、或いは２カ月又は４カ月以上の時間、維持及び増殖させてもよい。
【００３１】
本発明において使用される支持体（細胞外基質又は「ＥＣＭ」と呼ばれることもある。）は、以下の実施例及び以下の議論において説明される）。支持体は、有機、無機又はこれらの複合材であってもよい。いくつかの実施形態において、支持体は、コラーゲンなどの有機高分子を、典型的には以下で述べる他の原料との組み合わせで含む。多くの実施形態において、支持体は多孔質である。以下でも述べるように、支持体が、多孔質担体（例えば、多孔質膜、メッシュ、無機グリッド、ヒドロゲル又はこれらの組み合わせ）上に提供又は取り付けられて、そこに構造的な支持を与えてもよい。支持体は、（例えば、マクロ解剖学的構造を模倣する為の）複合材をそこに含む、平坦な、管状の、湾曲した、球形の、楕円面などを含む任意の適した形状又は構成であってもよい。
【００３２】
内腔又は陰窩の形成を容易にする為のウェルを有する支持体。いくつかの実施形態において、支持体上面は、その中に形成された複数のウェルを有する。上部開口、側壁及び床を有する（典型的には、支持体を完全に貫通しない）ウェルのそれぞれ。これらの実施形態において、胃腸上皮細胞単層はウェル内に−すなわち、ウェル側壁及び（通常は）床の上に延び、ウェル上部開口は開いたままであり、ウェル内が細胞で覆われた開いた内腔（又は「陰窩」）を形成する。
【００３３】
通常、ウェルは、深さ１００、２００又は３００ミクロンから、深さ８００又は１０００ミクロン以上までであり、且つ／又はウェルは、幅１０又は５０ミクロンから、幅１００又は２００ミクロン以上までであり；且つ／又は少なくとも１０、５０又は１００個のウェルが上面に形成される。任意の適した数のウェルが上面上に形成されてもよいが、いくつかの実施形態では、少なくとも１０個又は１００個のウェルが形成され、構築物の特定の使用に応じて、最大１，０００個又は１０，０００個以上のウェルが形成される。
【００３４】
ウェルは、正方形、長方形、円形又は楕円形の輪郭又はこれらの他の複合形を含む任意の適した形状を有してもよく；垂直又は傾斜した側壁又はこれらの組み合わせを有してもよく；平坦な床又は丸みを帯びた床或いはこれらの組み合わせを有してもよい；など。
【００３５】
上述のような構築物を用いて、幹細胞（及び／又は分化細胞、或いは分化した幹細胞のタイプ）の勾配が単層内で形成されてもよい。これは：（ａ）上述の構築物を提供するステップと；（ｂ）第１の培養培地を構築物上面と接触させるステップと；及び（ｃ）（第１の培養培地とは異なる）第２の培養培地を構築物底面と接触させるステップとによって実現することができる。（例えば、以下でさらに議論するように、適切なシグナル伝達因子を含むことによって）一方の培養培地が、増殖幹細胞及び前駆細胞の分化を誘導し、且つ他方の培養培地が、未分化細胞の増殖を誘導する。勾配は、以下でさらに議論するように、典型的にはウェル壁に合わせて向くか、又は並ぶ（例えば、分化細胞に対する幹細胞の比は、ウェルの最上部よりも最下部でより大きいか、又はその逆である）。
【００３６】
その他の担持材料。コラーゲンに加えて、他のタイプのＥＣＭを用いて生体模倣足場を構築することができる。これらには、ゼラチン、ラミニン、エラスチン、フィブロネクチン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラチン硫酸、ヒアルロン酸、エンゲルブレス−ホルム−スウォーム（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ）マウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン状タンパク質混合物（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）、ＭａｘＧｅｌ（商標）など）及び上述のＥＣＭの混合物（例えば、コラーゲン／Ｍａｔｒｉｇｅｌ混合物）が含まれるが、これらに限定されない。天然高分子及び合成高分子からのヒドロゲルもまた、この足場を構築し、続いてＥＣＭ分子を用いて足場を表面加工する為に使用することができる。天然高分子及び合成高分子の例には、キトサン、アガロース、アルギン酸、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリレートポリマー、ポリエチレングリコール、合成ペプチドなどが含まれる。
【００３７】
上で述べたように、支持体は、無機材料、又は有機及び無機材料の複合材であってもよい。支持体に適した無機材料の例には、ガラス、ヒドロキシアパタイト、４５Ｓ５  ＢｉｏｇｌａｓｓなどのＢｉｏｇｌａｓｓ、リン酸カルシウム、ケイ素、酸化ケイ素、酸化チタン、金、酸化アルミニウムなどが含まれるが、これらに限定されない。本質的に多孔質でない場合、これらの材料を、焼結、エッチング、浸出、リソグラフィーなどを含むが、これに限定されない様々な方法によって多孔質にすることができる。例えば、リソグラフィー／エッチングによって、ケイ素と金の多孔質メッシュを作製することができる。
【００３８】
支持体又は足場は、ＥＣＭ成分の透過性、剛性及び存在に関して、生物物理学的微小環境（固有層）を模倣又は実質的に模倣することができる。足場は、５１〜１００重量％の水及び０〜４９重量％の高分子を含む高分子ヒドロゲルから作製することができる。高分子には、天然高分子（例えば、コラーゲン、ゼラチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ラミニン、キトサン、アガロースなど）及び合成高分子（ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールなど）が含まれる。足場は、その表面にＥＣＭタンパク質の層を有するように調整された非ヒドロゲル材料から作製することができる。足場は多孔質又は透過性にして、栄養素、因子、代謝産物及び他の分子が通過できるようにすることができる。この透過性により、このような足場上で増殖した組織に、組織の平面と直交する勾配をかけることができる。勾配は、組織の表面に平行に、すなわち組織表面を横切って形成することもできる。３Ｄ足場を横切る垂直な勾配は、足場を横切る増殖因子の勾配をかけることによって、同じ足場上の幹細胞及び分化細胞の両方を維持する。足場を生分解性にして、再生医療用途の為の移植を可能にすることができる。足場を固体表面に付着させることも、自立させることもできる。足場は、細胞材料（細胞、組織、血液、微生物叢）又は非細胞材料（薬剤、ポリマービーズ、磁性粒子など）と混合することができる。培地への酪酸ナトリウムの添加は、足場上の結腸上皮細胞の培養を強化。幹細胞が自己再生の源を提供するので、組織は長寿命である。３Ｄ足場は、微細構造（例えば、マイクロウェル、マイクロポスト、チャネル、ストライプ及び他の微細構造）を含む。本方法は結腸上皮を越えて、他の健康な胃腸（ＧＩ）上皮組織（小腸、胃、食道、舌、膵臓などを含む。）及び幹細胞を持つ非ＧＩ組織（肝臓、脳、毛包、腎臓、網膜上皮など）並びに患部組織まで拡大することができる。
【００３９】
インビトロで陰窩を形成したり、陰窩に影響を与えたり、その機能を変えたりする為に使用することができるその他の因子、化学物質及び薬剤。因子（Ｗｎｔ、ＢＭＰ［骨形態形成タンパク質］及びＮｏｔｃｈ）のシグナル伝達における勾配は、細胞の位置及び増殖を制御することによって陰窩の極性に関与すると考えられている。上述のＷｎｔ−３Ａタンパク質の勾配に加えて、他の因子、小分子及び薬剤を使用して細胞シグナル伝達経路を制御し、組織の分極を誘導することができる。因子、小分子及び薬剤には、Ｗｎｔ、ＢＭＰ、ＧＲＥＭ１、２、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の活性化剤及び阻害剤が含まれる。例は、ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗｎｔ活性化剤）、ＩＷＰ（Ｗｎｔ阻害剤）、Ｙ−２７６３２（Ｎｏｔｃｈ阻害剤）、ノギン（ＢＭＰ阻害剤）、Ｊａｇｇｅｄ  １（Ｎｏｔｃｈ活性化剤）、Ｇｒｅｍｌｉｎ（ＢＭＰアンタゴニスト）、サイトカイン、食物化合物（繊維、酪酸、他の脂肪酸、代謝産物）などである。他の脂肪酸には、繊維の微生物発酵によって生成される短鎖脂肪酸であるプロピオン酸及び酢酸が含まれ、別の代謝産物には、分岐鎖脂肪酸、胆汁酸及び微生物由来の二次胆汁酸、尿素、アミン、アンモニア、乳酸、フェノール、インドール、硫黄、二酸化炭素、水素、硫化水素及びメタンが含まれる。代謝産物には、複合糖質（可溶性繊維）、豆及び難消化性デンプンからのものが含まれ、微生物叢から産生することができる。他の化学物質には、抗利尿ホルモン、緩下剤、菌体内毒素、ホルモン（例えば、ＶＩＰ）及び内因性物質（例えば、胆汁酸）、アルドステロン、ソマトスタチン、α２−アドレナリン作動薬（例えば、クロニジン）、アセチルコリン、一酸化窒素、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）などが含まれる。
【００４０】
生体模倣足場の真下に他の膜を使用することができる。生体模倣足場は、上述の支持体上に作製することができる。支持体には、多孔質膜（ポリテトラフルオロエチレン［ＰＴＦＥ］、ポリエステル、ポリカーボネート及びセルロース）、メッシュ（ナイロン、生分解性ポリマー、金属）、無機グリット材料、ヒドロゲルなどが含まれる。
【００４１】
他の足場を使用して、２Ｄ単層中の腸上皮細胞の長期増殖活性及び生存能を支持することができる。足場は、透過性、剛性、及びＥＣＭ成分の存在に関して、生物物理学的微小環境（固有層）を模倣することができる。足場は、５１〜１００重量％の水及び０〜４９重量％の高分子を含む高分子ヒドロゲルから作製することができる。高分子には、天然高分子（例えば、コラーゲン、ゼラチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ラミニン、キトサン、アガロースなど）及び合成高分子（ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールなど）が含まれる。足場は、その表面にＥＣＭタンパク質の層を有するように調整された非ヒドロゲル材料から作製することができる。足場は、多くの場合、多孔質又は透過性であり、栄養素、因子、代謝産物及び他の分子を通過させる。足場を生分解性にして、体内への移植を可能にすることができる。足場を固体表面に付着させることも、自立させることもできる。足場は、細胞材料（免疫細胞又は他の細胞型、組織、血液）又は非細胞性材料（薬剤、ポリマービーズ、磁性粒子など）と混合することができる。酪酸ナトリウムなどの短鎖（例えば、Ｃ１〜Ｃ４又はＣ６）脂肪酸を培地に添加すると、足場上の結腸上皮細胞の培養が強化される。３Ｄ足場は、足場を横切る増殖因子の勾配をかけることによって、同じ足場上の幹細胞及び分化細胞の両方を維持することができる。幹細胞が自己再生の源を提供するので、組織は長寿命である。３Ｄ足場は、微細構造（例えば、マイクロウェル、マイクロポスト、チャネル、ストライプ及び他の微細構造）を含む。本方法は結腸上皮を越えて、他の健康な胃腸（ＧＩ）上皮組織（小腸、胃、食道、舌などを含む。）及び幹細胞を持つ非ＧＩ組織（肝臓、脳、毛包、腎臓、網膜上皮など）並びに患部組織まで拡大することができる。
【００４２】
３．有用性。
ほとんどの上皮組織の現在のインビトロモデルは、依然として腫瘍由来の不死化細胞株の使用に依存している。例えば、結腸癌に由来するＣａｃｏ−２細胞は、腸管上皮を模倣する為に広く使用されている。２６−２８これらの腫瘍細胞株は連続単層を形成することができるが、その癌表現型は正常組織の生理又はインビボで見られる微小構造をよく反映していない。この問題は、インビトロ組織モデルの主な課題の１つを示しており、これは、生体内臓器系をより代表する系を形成する為に、正常組織に由来する初代細胞を使用することである。２９３Ｄオルガノイド培養系は、初代細胞由来の細胞を連続培養するこの必要性を克服したが、球状オルガノイドの閉じた構造によって制限されたままであり、従来の組織培養系に典型的な標準的な開いた表面ではなく、ゼラチン層内で培養する必要がある（例えば、これは、Ｃａｌｖｉｎ  Ｋｕｏの気液界面培養と比べてもよい。これらは、平坦な表面で増殖し、分極した上皮及び露出した内腔表面を有する全ての層（すなわち、上皮及び間充織）上に含まれる。違いはやはり、これらが長寿命ではなく、増殖と分化がランダムであり、ある程度制御されないということである）。この表面は、平面状又は回旋状であってもよいが、閉じた構造であるオルガノイドとは異なり、開いた構造を有することを特徴とする。開いた構造を特徴とする培養系を発明することにより、この研究は、自動化されたハイスループット培養及び解析プラットフォームにおいて利用される従来の組織培養法及び現在のロボット工学に適合する初代細胞から構成される上皮組織の培養を行うオルガノイド系の限界を克服した。開いた構造及び透過性基質は、上皮表面と平行及び直交する両方の可溶性因子の勾配下で細胞の培養を可能にする。開いた構造は、閉じた系では不可能な上皮の関門機能、吸収及び分泌のアッセイを可能にする。初代上皮と、覆っている細菌及びマイクロバイオームの他の成分との相互作用も今や可能である。これらの生体外組織は、とりわけマウス、ブタ及びヒトを含む様々な種から作製することができる。トランスジェニック動物、遺伝子組換えヒト幹細胞（例えば、ＴＡＬＥＮ又はＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ）、人工多能性幹細胞、並びに特定の疾患を有する動物体及び人体に由来する幹細胞から開発されるモデル系は、これらの組織を作製する為に使用することができる材料の他の非限定的な例である。健康な源及び病気の源から、並びに異なる遺伝的背景の細胞からこれらの組織を作製できる能力は、薬剤のスクリーニング、疾患メカニズムの研究及び基礎生物学の研究にとって重要になる。生体模倣足場上又は内部で共培養された種々の他の細胞型（例えば、免疫細胞、線維芽細胞、及び特定の生体内上皮組織と共存することが明らかになった他のもの）の添加は、細胞−細胞相互作用並びに薬剤及び代謝産物の組織に対する影響を理解するのに役立つ。本発明者らは、一次組織を用いて生体模倣足場上に生成された上皮組織が、上皮組織の研究の為の現在の細胞モデルより優れていると断定する。いくつかの例が続くが、このリストは全てを含んだものではない。
１）生理学的研究（腸上皮細胞を横切る分子輸送、誘導された酵素機能、細菌との相互作用）の為のインビトロモデル
２）薬剤、生物製剤、毒素、変異誘発物質、食物化合物、病原体、ウイルス、微生物などのスクリーニング検査
３）制御された条件（酸素圧、薬剤暴露、食物化合物、代謝産物など）下での微生物叢のスクリーニング検査
４）トランスレーショナルな動物モデル又はヒト由来の幹細胞及び初代細胞を用いた疾患モデル
５）薬剤、食物化合物などの包括的な用量−反応プロファイルを含むスクリーニングの為の薬理学的及び薬物動態学的モデル
６）代謝を研究する為のインビトロモデル
７）関門機能を維持する為の上皮組織の創傷治癒の為のインビトロモデル
８）細菌−上皮相互作用を研究する為のインビトロモデル
９）損傷した上皮を修復する為の移植の為の組織工学
１０）特定の遺伝的背景及び個々の患者に対して実施された調査による個別化医療
１１）水及び電解質（ナトリウム、塩化物、プロトン、重炭酸塩、カリウム）の吸収、並びに未吸収の栄養素の再利用などのアッセイの性能
１２）粘液の流れ、移動及び産生並びに嚢胞性線維症のようにこれに起因する疾患の影響
１３）止痢剤のアッセイ
１４）ｓ、アヘン剤、及び便秘の為の治療、例えば、緩下剤
１５）シン−、プレ−及びプロバイオティック剤のアッセイ。
１６）放射線不透過性及びシンチグラフィーマーカーのアッセイ及びこれらの上皮に対する影響
１７）免疫細胞及びその産物（抗体及びサイトカイン）の上皮に対する影響
１８）可溶性及び不溶性繊維のアッセイ及びその上皮に対する影響
１９）任意のタイプの損傷に応じた上皮に対する応答及び上皮の修復の理解
２０）偽膜形成につながる細菌、例えば、クロストリジウム・ディフィシルの調査
２１）発癌性化合物のスクリーニング
２２）生物兵器化合物のスクリーニング
２３）ＮＳＡＩＤ治療の副作用としてのＧＩ出血を予防する為の研究。
２４）上皮の完全性及び疾患（例えば、炎症性腸疾患、腸疾患、癌など）に対する免疫系の役割に関する研究。
２５）放射性及び化学療法剤並びにオフターゲット効果を改善する薬剤のアッセイ。
２６）生体外組織の拡大。
【００４３】
上述の用途は主に、平面状のインビトロ組織構築物によって可能になる研究に関連するが、構築物は、体内の損傷組織又は患部組織の修復の為の新しい組織を作製する手段として想定することができる。例えば、２Ｄ単層は、以下のように再生医療の為に使用することもできる：幹細胞は、消化管上皮損傷（例えば、炎症性腸疾患由来）を有する患者の生検から得ることもできる。幹細胞を足場上で拡大させて、多くの増殖細胞を産生することもできる。細胞を培養容器から分離し、同じ患者に戻して、損傷した上皮組織を修復することができる。
【００４４】
４．スクリーニング法。
従って、上で述べたように、いくつかの実施形態において、本発明は：（ａ）上述の構築物を提供するステップと；（ｂ）試験化合物又は微生物を前記構築物と接触させるステップと；次いで、（ｃ）前記構築物の細胞上の前記微生物の毒性作用、生理作用又は発癌作用を（例えば、前記接触後の構築物を、前記化合物又は微生物を接触させていない同様の構築物と比較することによって、且つ／又は前記接触ステップ後の構築物を、前記接触ステップ前の前記構築物と比較することによって）検出するステップとを含む、試験化合物又は微生物を毒性作用、生理作用又は発癌作用についてスクリーニングする方法を提供する。
【００４５】
いくつかの実施形態において、試験化合物又は微生物は、芳香族有機化合物、脂肪族有機化合物並びに混合芳香族及び脂肪族有機化合物からなる群から選択される。例えば、いくつかの実施形態において、スクリーニングの為の化合物は、天然物、プレバイオティクス、プロバイオティクス、食料品、発癌物質、薬剤、薬剤代謝産物、細菌代謝産物及び毒素、刺激物、土壌化合物、摂取可能な毒素などである化合物である。
【００４６】
いくつかの実施形態において、試験化合物又は微生物は、グラム陰性菌、グラム陽性菌、酵母及びカビからなる群から選択される。例えば、いくつかの実施形態において、微生物は、哺乳類（特にヒト）種の通常の、又は健康な腸管内菌叢（又は「マイクロバイオーム」）に見られるタイプの細菌である。例えば、米国特許出願公開第２０１４００９３４７８号明細書を参照されたい。いくつかの実施形態において、微生物は、クロストリジウム、コレラ、サルモネラ、赤痢菌、寄生虫（サナダムシ、蟯虫、鉤虫、ｅｙｃ）、アメーバ（ジアルジアなど）などの感染性生物である。従って、いくつかの実施形態において、微生物は、良性及び感染性の腸内細菌及び病原体の両方を含む腸内細菌又は病原体である。
【００４７】
適した検出方法には、免疫組織化学、ＤＮＡのＰＣＲ、ｍＲＮＡ発現、ＲＮＡ配列決定、経上皮電気抵抗、輸送アッセイ（イオン、化合物、タンパク質など）、分泌アッセイ、電子顕微鏡、フローサイトメトリー、上清又はリザーバーの質量分析、それらのＥＬＩＳＡ及び放射化学アッセイ、それらの蛍光ベースのセンサ、並びに上皮細胞への微生物付着が含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
本発明を、以下の非限定的な例において、より詳細に説明する。結腸単層の特定の例が示されているが、他の胃腸上皮細胞からの単層、特に小腸、腸、胃、食道、舌、上咽頭、中咽頭、下咽頭及び膵臓の上皮細胞なども、以下で説明する同様の方法で、又は当業者には明らかであろうこのような技術の変形によって形成できることを理解されたい。
【００４９】
［実施例１］
２ｄ及び３ｄ足場上の両方における長期の結腸上皮単層の実証
本発明の実証として、２つのタイプの足場（２Ｄ及び３Ｄ足場）をコラーゲンから作製し、幹細胞を含む初代結腸陰窩組織から得た細胞の長期培養が支持されることを示した（図１）。単離された陰窩又は幹細胞を平面状の２Ｄ足場の表面で培養することによって、２Ｄ結腸上皮単層を作製した（図１Ａ）。この条件下で、生化学的微小環境は、可溶性増殖因子（Ｗｎｔ−３Ａ、Ｒ−スポンジン、ノギン及びＥＧＦ）によって与えられたが、生物物理学的微小環境は、透過性、剛性及びＥＣＭ成分に関して固有層を模倣するコラーゲン足場によって与えられた。単層は増殖性幹細胞を含んでいた。培地中の増殖因子を変化させることにより、単層を、杯細胞及び腸細胞などの特殊化した細胞に任意に選択的に分化させることができた（図１Ａ）。
【００５０】
陰窩のインビボでの生物物理学的／生化学的微小環境をより綿密に再現する為に、マイクロウェルのアレイ及び分極構造（すなわち、別個の増殖性及び非増殖性のゾーン又は幹細胞及び分化細胞区画）を有する結腸上皮の生成を導く勾配、並びに２Ｄ足場よりも生体内結腸上皮によく似た形状を持つ３Ｄ足場を用いた（図１Ｂ）。しかし、下にある足場への他の形状、例えば、小腸の絨毛及び陰窩、舌の乳頭及び味蕾、胃腺及び胃小窩の形状を有するものも可能である。陰窩又はその表面で精製された幹細胞に由来する細胞の連続培養によって、開いた内腔の陰窩を３Ｄ足場上に生成した。組織は、結腸陰窩の全体的にマッシュルーム型の形状を再現した。さらに、足場を横切る可溶性増殖因子の勾配をかけることによって、組織が、別個の増殖性及び非増殖性のゾーンに分極して、インビボで存在するものを模倣することが示された（図１Ｂ）。従って、インビボの陰窩の全ての特徴：（１）内腔及び基底側、（２）開いた内腔、（３）基底側の幹細胞及び増殖細胞区画、並びに（４）基底側から、分化細胞を形成する内腔に向かって遊走する増殖性細胞を模倣したインビトロの陰窩が作製された。全体の表面は、平面状又は非平面状にすることも可能である。
【００５１】
結果
生体模倣足場上での陰窩の２Ｄ培養は、増殖性で長寿命の２Ｄ単層を産生した。１ｍＬの中和したコラーゲン前駆体を６ウェルプレートの１つのウェルに添加することによって、コラーゲン（ラット尾部、Ｉ型、２ｍｇ／ｍＬ）から生体模倣の平面状の足場を作製し、３７℃で３０分間重合させた。足場は、９９．８重量％の水及び０．２重量％のコラーゲンタンパク質を含んでいたので、固有層の疎性結合組織を模倣していた。細胞がＤｓＲｅｄ蛍光タンパク質を発現するＣＡＧ−ＤｓＲｅｄマウスモデルを用いて、蛍光顕微鏡により結腸上皮細胞の増殖をモニターした。足場上での陰窩の２Ｄ培養を、標準的な２Ｄ細胞培養と同様の方法で実施した（図２）。結腸陰窩を足場上にプレーティングし、Ｗｎｔ−３Ａ、Ｒ−スポンジン、ノギン及びＥＧＦを含む培地で培養した。酪酸ナトリウム（０．５ｍＭ）を培地に加えた。酪酸は、食物繊維の嫌気性細菌発酵によって結腸内で局所的に産生される食物因子である。酪酸は、結腸細胞の主要なエネルギー源として働く短鎖脂肪酸であり、以前の研究は、エネルギーの為の酪酸がないと、結腸細胞がオートファジーを起こすことを示している。２１エネルギー源であることに加えて、酪酸ナトリウムは、ＨＤＡＣ阻害剤２２及びＮｏｔｃｈ活性化剤などの他の役割を果たすことが示されている。２３これらの実験に使用された培養培地は、ＥＮＲ−ＷＢ（Ｅ−ＥＧＦ、Ｎ−ノギン、Ｒ−スポンジン、Ｗ−Ｗｎｔ−３Ａ、Ｂ−ブチレート）と呼ばれる。
【００５２】
単離した陰窩を足場の上に載せた。この足場では、その細胞が数時間以内に足場表面に付着した。２４時間までに、足場表面に置かれた陰窩は、２Ｄの密に充填された単層中に細胞の小さなパッチを形成した（図３）。細胞のパッチは、７日目に細胞のほぼ連続した単層が形成されるまで広がり続けた。細胞分化の兆候である細胞アポトーシスは、この比較的早い時点では観察されなかった。この結果は、下記のデータに示されるように、コラーゲン足場が、幹細胞に必要な生物物理学的シグナルを与えて、その増殖能を維持することを実証した。また、この結果は、ＥＣＭゲル内の細胞／陰窩の封入が、幹細胞活性を維持する為に必要でないことも示した。単層は、試験した最長の時間の少なくとも２０日間は長寿命であった。
【００５３】
幹／前駆細胞は２Ｄ単層を足場上に作り上げる。コラーゲン足場上の２Ｄ単層は、分化細胞のみからなるのではなく、幹／前駆細胞及び分化細胞の混合物から構成される。この記述は、以下の実験的証拠によって裏付けられている。
【００５４】
（１）単層中の細胞を、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により分析した。ＲＴ−ＰＣＲの結果（図３）は、新たに単離された陰窩と比較して、幹細胞マーカー遺伝子Ｌｇｒ５の発現が２Ｄ単層について大幅に上昇したことを示した。分化マーカー遺伝子Ｍｕｃ２及びＣｈｇａは、新鮮な陰窩で見られたものと比較して下方制御された。Ｓｏｘ９の幹／前駆マーカー遺伝子は、新鮮な陰窩で見られたものと違いがなかった。腸細胞マーカー遺伝子Ａｌｐｉは大幅に上方制御されたが、単層はアルカリホスファターゼ（ａｌｐ）比色染色で陰性であった（図５Ａ）。これらの結果に基づいて、単層は、幹細胞、前駆細胞及び分化細胞から構成されていた可能性がある。
【００５５】
（２）単層は、増殖能力を失うことなく、２Ｄフォーマットで複数回継代することができた（現在までに６継代まで試験されている）（図４Ａ）。コラゲナーゼ（ＶＩ型、５００Ｕ／ｍＬ、１０分）で足場を溶解することにより、２Ｄ単層をコラーゲン足場から分離した。ピペット操作で細胞層を小断片に解離させた。細胞断片をコラーゲン足場上に再びプレーティングし、ＥＮＲ−ＷＢ条件下で培養した。細胞断片は新しい足場に付着し、再び増殖単層に成長した。この結果は、増殖細胞のみが単層を再現する能力を保持する為、単層が増殖細胞と分化細胞（腸細胞、杯細胞）の両方から作製されることを実証している。上で述べたように、小腸細胞などの他の細胞、及び他の分化細胞（例えば、パネート細胞、腸内分泌細胞、房飾細胞、微小細胞、上皮内リンパ球など、並びに腸細胞及び杯細胞）を用いて同様の結果を得ることができることを当業者なら理解するであろう。
【００５６】
（３）２Ｄ単層を３Ｄオルガノイドに変換することができる。３Ｄオルガノイドモデルは、結腸幹細胞の増殖を維持する為に十分に確立されている。単層が幹細胞を保有していることを証明する為に、本発明者らは、２Ｄ単層をコラーゲン足場から分離し、ピペット操作を繰り返して、これを小断片に解離させた。細胞断片を、３Ｄ培養の為にＭａｔｒｉｇｅｌに包埋した（図４Ｂ）。細胞断片は、２日目、３Ｄオルガノイドに成長し、６日目、大きなオルガノイドに広がり続けた。さらに、そのように調製した３Ｄオルガノイド内の細胞は、機械的なピペット操作を繰り返してＭａｔｒｉｇｅｌからオルガノイドを放出し、オルガノイドをコラーゲン足場上にプレーティングすることによって２Ｄ単層として成長するように切り替えて戻すこともできる（図４Ｃ）。オルガノイドは、１日目に足場上に広がり、６日目に２Ｄ単層を形成した（図４Ｃ）。これらの結果は、２Ｄ単層及び３Ｄオルガノイドが相互変換可能であり、両方のフォーマットが増殖性幹／前駆細胞並びに分化細胞を持つことを実証している。
【００５７】
（４）免疫蛍光染色は、２Ｄ単層細胞が、Ｓｏｘ９に対する抗体を用いる染色において陽性であることを示す（図５）。Ｓｏｘ９に対する抗体は、幹／前駆細胞を染色するが、分化細胞は染色しないことが既知である。さらに、単層は、分化細胞染色マーカー（図５）、すなわちアルカリホスファターゼ（ａｌｐ）、比色染色（腸細胞）及びＭｕｃ２（杯細胞）について染色されたとき、強い蛍光を示さない。
【００５８】
（５）２Ｄ単層は、成熟腸細胞及び杯細胞に選択的且つ完全に分化することができる（詳細は次のセクションを参照）。
【００５９】
上述の結果は、ＥＮＲ−ＷＢ条件下で培養されたコラーゲン足場上の２Ｄ単層が、幹／前駆細胞を持ち、従って、自己再生することを証明している。これは、２Ｄ単層の増殖を促進する幹／前駆細胞である。
【００６０】
生体模倣足場上の２Ｄ単層は、短寿命の特殊化した細胞に分化することができる。インビボの結腸上皮は、幹／前駆細胞だけでなく、特殊化した分化細胞：腸細胞、杯細胞及び腸内分泌細胞からも構成される。幹／前駆細胞の機能は、短寿命の特殊化した細胞の自己再生の為の源を提供することである。特殊化した細胞の機能は、吸収（腸細胞）、粘液分泌（杯細胞）及びホルモン産生（腸内分泌細胞）に及ぶ。結腸上皮の生理のインビトロ機能研究の為の特殊化した細胞を生成することが非常に望ましい。
【００６１】
３Ｄオルガノイドと同様、２４２Ｄ単層中の幹／前駆細胞は、Ｗｎｔ及びＮｏｔｃｈシグナル伝達の両方の活性化によって維持されると考えられる。ＥＮＲ−ＷＢ条件下では、Ｗｎｔ−３Ａ及びＲ−スポンジン（Ｗｎｔシグナル伝達エンハンサー）がＷｎｔシグナル伝達活性化剤として作用する一方、０．５ｍＭ酪酸ナトリウムが、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の活性化剤として作用する可能性がある。２３腸細胞系列への分化を誘導する為、本発明者らはまず、ＥＮＲ−ＷＢ下、コラーゲン足場上で２Ｄ単層を４日間培養し、次いで、細胞を腸細胞分化培地で４日間処理した。腸細胞分化培地ＥＮＲ−ＢはＷｎｔ−３Ａを含まない。処理前後の２Ｄ単層を、明視野像化、Ｓｏｘ９／ＤＡＰＩ染色及びアルカリホスファターゼ（Ａｌｐ）染色によって検査した（図５Ａ）。処理後、細胞は、明確な細胞境界（明視野像）を有する円柱上皮細胞になった。細胞はＳｏｘ９発現を失ったが、Ａｌｐ染色を得た。これらの結果は、２Ｄ単層の細胞が腸細胞に分化したことを示している。
【００６２】
Ｗｎｔ及びＮｏｔｃｈシグナル伝達の両方の不活性化は、３Ｄオルガノイド培養モデルにおける杯細胞系列への分化を可能にした。２４これを２Ｄ培養モデルで試験する為に、本発明者らはまず、ＥＮＲ−ＷＢ下、コラーゲン足場上で２Ｄ単層を４日間培養し、次いで、細胞を杯分化培地で４日間処理した。杯分化培地はＷｎｔ−３Ａ又は酪酸を含まないが、Ｗｎｔ阻害剤（２μＭ  ＩＷＰ−２）及びＮｏｔｃｈ阻害剤（１０μＭ  ＬＹ−４１１５７５）を含む。処理前後の２Ｄ単層を、明視野像化、Ｓｏｘ９／ＤＡＰＩ染色及びＭｕｃ２染色によって検査した（図５Ｂ）。処理後に分泌顆粒が現れた（明視野像）。細胞はＳｏｘ９発現を失ったが、Ｍｕｃ２染色を得た。これらの結果は、２Ｄ単層細胞が杯細胞に分化したことを示す。
【００６３】
インビボで起こることと同様に、２Ｄ単層中の分化細胞（腸細胞及び杯細胞）は、数日以内に短寿命で死滅する。分化培地で処理した後、およそ３日目に２Ｄ単層中の細胞が死滅し始め、６日目に全ての細胞が死滅して表面から分離した。従って、これらの分化細胞の機能的アッセイを可能にする短いウィンドウ（２〜３日）のみが存在する。
【００６４】
再生上皮細胞単層を用いて、３Ｄコラーゲン足場上に３Ｄ上皮組織構築物を生成する。図５に示す平面状の足場上の２Ｄ単層は、ＥＮＲ−ＷＢ条件下で幹／前駆細胞を持つ細胞層として維持することができるか、又は分化培地に曝されたときに完全に分化するように誘導することができる（腸細胞、杯細胞）。図１Ｂに示す深いマイクロウェル構造を持つ３Ｄ足場など、非平面状の足場が使用される場合、幹／前駆細胞及び分化細胞（腸細胞、杯細胞）の両方が存在するが、Ｗｎｔ−３Ａの可溶性増殖因子の勾配が、マイクロウェルの基底付近で、この増殖因子の濃度がより高く、ウェルの最上部及びアレイの上面付近で濃度がより低いとき、同じ足場上の別個の区画内に存在する。幹／前駆細胞は、Ｗｎｔ−３Ａの存在によりマイクロウェルの基底に位置し、マイクロウェルの開口部の細胞は、源から離れたＷｎｔ−３Ａタンパク質の不在により腸細胞に分化する。３Ｄ足場及びＷｎｔ−３Ａの勾配は、陰窩のインビボでの生物物理学的／生化学的微小環境を正確に再現する。生成された３Ｄ結腸上皮組織は、分極構造（すなわち、別個の増殖性及び非増殖性のゾーン）、及び開いた内腔、及び構造を陰窩として識別するマッシュルーム型の形状を有する。
【００６５】
図６Ａに概略を示したプロセスを用いて、３Ｄコラーゲン足場を透明な多孔質膜上に作製した。透明な多孔質膜（親水性ＰＴＦＥ、孔径０．４μｍ）は、プラスチック製Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートの一部であった。１ｍＬのコラーゲン溶液（０．０２Ｍ酢酸中１０ｍｇ／ｍＬ）を、０．３２５ｍＬの中和緩衝液（１０倍ＰＢＳ  １部、０．２Ｍ水酸化ナトリウム１部及び７．５重量％重炭酸ナトリウム０．０８部の混合物）で中和し、氷上に置いた。０．２５ｍＬのコラーゲン混合物をＴｒａｎｓｗｅｌｌインサート内の多孔質膜上に加えた。マイクロポストのアレイ（ポスト直径＝６０μｍ、高さ＝２４０μｍ、中心間のギャップ＝１００μｍ）を持つＰＤＭＳの型を１重量％ウシ血清アルブミンでコーティングし、水ですすぎ、コラーゲン上に直接置いた。インサートを４℃の冷蔵庫に２時間入れ、次いで、３７℃に移し、１時間インキュベートしてコラーゲンを重合させた。次いで、ＰＤＭＳの型を、固化したコラーゲンからゆっくりと分離した。マイクロウェルのアレイ（ウェル直径＝６０μｍ、高さ＝２４０μｍ、中心間のギャップ＝１００μｍ）を多孔質膜の最上部のコラーゲン足場上に作製した。コラーゲン足場の安定性を向上させる為に、０．０３Ｍ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ、ｐＨ５）緩衝液中の０．２Ｍ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及び０．０５Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により、足場を室温で４時間架橋した。次いで、足場を水ですすぎ、７５％エタノールで滅菌し、最後にＰＢＳ緩衝液ですすいだ。
【００６６】
図６Ｂは、３Ｄコラーゲン足場を含むＴｒａｎｓｗｅｌｌインサートの写真を示す。中央の正方形部分（６ｍｍ×６ｍｍ）には、３，６００個のマイクロウェルが含まれていた。インサートは、１２ウェルプレートのウェルに入れる。多孔質膜及びコラーゲン足場のクリアランスは、明視野及び蛍光顕微鏡の両方による足場の画像化を可能にする。足場の明視野像を図６Ｃに示す。図６Ｄ及び図６Ｅの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像は、臨界点乾燥によって調製されたコラーゲン足場の高度に多孔質の構造を示す。足場は、サブミクロンコラーゲン線維と混ざり合っている（図６Ｅ）。
【００６７】
結腸上皮細胞の断片を３Ｄ足場上にプレーティングした。断片は足場のマイクロウェルに着床した（図６Ｆ）。培養５日目に、細胞は、足場に沿って連続的な組織層を形成した（図６Ｇ）。特に、組織の内腔は開いており、ＳＥＭ像（図６Ｈから図６Ｊ）によって明らかにされるように、インビトロで多くの陰窩の特徴を有する構造を作り出した。
【００６８】
細胞をＥＮＲ−ＷＢ条件下で４日間培養し、その後のＷｎｔ−３Ａの３日間の勾配により、組織を分極させた。本発明者らは、Ｓｏｘ９ＥＧＦＰマウスモデル由来の結腸幹細胞を使用した。ＥＧＦＰはＳｏｘ９プロモーター下で発現され、Ｓｏｘ９発現は腸の幹細胞及び前駆細胞に限定されている（ただし分化した結腸上皮に限定されない。）為、２５ＥＧＦＰを増殖細胞の能力の指標として使用した。Ｗｎｔ−３Ａの勾配を設定する為に、０．５ｍＬのＥＮＲ−Ｂ培地を上部区画に加え、１．５ｍＬのＥＮＲ−ＷＢ培地を下部区画に加えた。媒体を毎日変えた。培養の最後に、組織をグルタルアルデヒドで固定し、核Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２色素で染色し、凍結切片とした。組織は３Ｄであり、ＳＥＭ像と一致する開いた内腔及びマッシュルーム形状を含んでいた（図６Ｋ）。特に、ＥＧＦＰ発現は、内腔側ではなく、組織の基底面に位置していることが判明し、構造の分極、並びに別個の幹細胞及び分化細胞区画を有する真の陰窩の形成を示している（図６Ｌ）。細胞増殖（ＥＧＦＰ＋）は基底側の高いＷｎｔ−３Ａ濃度によって維持され、一方、分化（ＥＧＦＰ−）はＷｎｔ−３Ａ濃度が低い内腔側で生じた。これらは、マイクロウェル足場上に陰窩を持つインビトロ組織の形成を実証している。組織は、インビボでの陰窩の形状、構造及び分極のいずれも実証した。生体模倣足場は、合成陰窩の基底への幹細胞の強制的な局在化を可能にし、続いて、マイトジェン／モルフォゲンの内因性放出からの自然勾配形成を可能にする。生物学的に重要な支持細胞の共培養はエクスビボで拡大され、生体模倣足場上に層を成し、作り出した腸／結腸組織層を生成することができる。
【００６９】
［実施例２］
２ｄ単層は、インビボ様増殖能、形態及び機能を持つ
インビボでは、腸上皮は、哺乳類の体内で最も急速に増殖する組織の１つである。これと一貫して、コラーゲン足場上で培養した結腸上皮細胞のインビトロ２Ｄ単層は高増殖性であった。この増殖能を実証する為に、２Ｄ単層の断片を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサート内のコラーゲン足場上にプレーティングした（図７Ａ、上のパネル）。インサートの外周を白い点線で示す）。５日目までに、細胞は、１３７ｍｍ２の表面積を有するインサートの表面全体を占める連続２Ｄ単層を生成した（図７Ｂ、下のパネル）。この結果は、２Ｄ単層培養技術がインビトロで結腸上皮組織の大断片を生成することができることを実証しており、これは、３Ｄオルガノイド培養技術で達成することは不可能である。
【００７０】
インビトロ組織がインビボ様形態を持つか調べる為に、５日目のコラーゲン足場上で培養した２Ｄ単層を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で検査した。２Ｄ単層中の細胞は、インビボで見られる腸上皮の特徴である、丸石様の形態及び配置（図７Ｂ、上のパネル）を示した。大部分の細胞は、その頂端面に微絨毛を有していた（図７Ｂ、下のパネル）。杯細胞はまた、２Ｄ単層（図７Ｂ中、矢印で示す。）にも存在し、これは頂端面に小胞を有して粘液を放出した。ＳＥＭ像は、インビトロ組織が、（この非限定的な例において）インビボ様の形態を持つことを示す。
【００７１】
腸は、多くの重要な機能（吸収、分泌など）を有する重要な臓器である。１つの機能は、摂取した生体異物の生体内変換／解毒の主要な初期の源を提供するチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素活性による代謝である（カミンスキー，Ｌ．Ｓ．等（Kaminsky, L. S. et al.）著，クリティカル  レビューズ  イン  トキシコロジー（Critical Reviews in Toxicology），２１巻，１９９２年，ｐ．４０７−４２２）。ＣＹＰのうち、ＣＹＰ１Ａ１は、エストラジオールの２−ＯＨ−エストラジオールへの分解において生理学的役割を果たす（ペイン，Ｍ．Ｆ等（Paine, M. F. et al.）著，ドラッグ  メタボリズム  アンド  ディスポジション（Drug Metabolism and Disposition），２７巻，１９９９年，ｐ．３６０−３６４）。インビボで、ラット腸内のＣＹＰ１Ａ１は、ラットに多環式芳香族炭化水素（ＰＡＨ）を与えることによって誘導することができる（マルティニョーニ，Ｍ．等（Martignoni, M. et al.）著，ケミコ−バイオロジカル  インタラクションズ（Chemico-Biological Interactions），１５１巻，２００４年，ｐ．１−１１）。インビトロ２Ｄ単層が、このタイプのインビボ様機能を持つか調べる為に、２Ｄ単層を３つのタイプのＰＡＨ（培地中、１０００倍希釈、トルエンを溶媒として使用）で２０時間処理した：１０μＭ  β−ナフトフラボン（βＮＦ）、１μＭベンゾ［ａ］ピレン（ＢａＰ）、０．１μＭ  ２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（ＴＣＤＤ）。ＣＹＰ１Ａ１酵素活性は、エトキシレゾルフィンＯ−デエチラーゼ（ＥＲＯＤ）アッセイを用いて測定した（ジョーンズ，Ｓ．Ｐ．等（Jones, S. P. et al.）著，エコトキシコロジー（Ecotoxicology），２３巻，２０１４年，ｐ．８０２−８０８）。ＣＹＰ１Ａ１酵素活性は、３つのＰＡＨ全てによって効果的に実証された（図１Ｃ）。ＴＣＤＤは最も強力なＣＹＰ１Ａ１誘導物質であり、ＣＹＰ１Ａ１活性は、トルエン溶媒で処理した細胞と比較して４０倍増加した。この結果は、２Ｄ単層がインビボ様機能：ＣＹＰ１Ａ１活性を誘導する能力を持つことを実証している。
【００７２】
［実施例３］
足場の組成及び特性が結腸上皮の形態を決定する
本発明者らは、結腸上皮細胞が、コラーゲンゲルの表面に増殖細胞の２Ｄ単層を形成することを示した。生体模倣足場を構築する為に使用できる他のタイプのＥＣＭを探索する為に、本発明者らは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（タンパク質濃度８．７ｍｇ／ｍＬ）及びコラーゲン（２ｍｇ／ｍＬ）を様々な体積比で混合し、得られたヒドロゲルを３７℃で１時間重合させた。結腸上皮細胞を足場上にプレーティングし、ＥＮＲ−ＷＢ（定義については下記参照。）下で５日間培養した。細胞は異なる形態を形成した（図８）。Ｍａｔｒｉｇｅｌ組成が２５％未満のとき、細胞が広がって２Ｄ単層を形成し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ組成が５０％を超えるとき、細胞は３Ｄスフェロイドを形成した。本発明者らの結果は、細胞の封入を必要とせずに、Ｍａｔｒｉｇｅｌの上面上に３Ｄオルガノイドを形成することができることを初めて示す。１つの利点は、全てのオルガノイドが、その後の顕微鏡分析において同じ結像面上に位置することである。
【００７３】
Ｍａｔｒｉｇｅｌは非常に軟らかく、原子間力顕微鏡法によって測定されるその弾性率は４５０Ｐａという低さである（スーフィ，Ｓ．Ｓ．等（Soofi, S. S. et al.）著，ジャーナル  オブ  ストラクチュラル  バイオロジー（Journal of Structural Biology），１６７巻，２００９年，ｐ．２１６−２１９）。コラーゲンゲルは、Ｍａｔｒｉｇｅｌよりもはるかに硬く、濃度２ｍｇ／ｍＬで２００ｋＰａの線形弾性率を有する（カミングズ，Ｃ．Ｌ．等（Cummings, C. L. et al.）著，バイオマテリアルズ（Biomaterials），２５巻，２００４年，ｐ．３６９９−３７０６）。２小腸粘膜下層の弾性率（粘膜及び平滑筋層の機械的除去による小腸由来の無細胞のコラーゲン）は約１３２〜５４９ｋＰａである（ローダー，Ｒ．等（Roeder, R. et al.）著，ジャーナル  オブ  バイオメディカル  マテリアルズ  リサーチ（J. Biomed Mater Res.），４７巻，１９９９年，ｐ．６５−７０）。従って、コラーゲンは、上皮が存在する粘膜下層のこの生物物理学的特性を模倣する点で、Ｍａｔｒｉｇｅｌよりも優れている。本発明者らの結果は、生物物理学的特性（例えば、剛性）が、結腸上皮の形態を決定する際に役割を果たすことを示唆し、足場の生物物理学的特性を微調整することが必要であることを示している。
【００７４】
［実施例４］
生体模倣足場上の２Ｄ単層が多能性であり、特殊化した細胞に選択的に分化することができるという別の証拠
インビボの結腸上皮は、幹／前駆細胞だけでなく、特殊化した分化細胞（腸細胞、杯細胞、腸内分泌細胞）からも構成される。幹／前駆細胞の機能は、短寿命の特殊化した細胞の再生の為の源を提供することである。特殊化した細胞の機能は、吸収（腸細胞）、粘液分泌（杯細胞）及びホルモン産生（腸内分泌細胞）に及ぶ。従って、インビボ条件の模倣として結腸上皮のインビトロ機能研究の為の特殊化した細胞を生成することが非常に望ましい。
【００７５】
２Ｄ単層中の幹／前駆細胞を、Ｗｎｔ及びＮｏｔｃｈシグナル伝達の両方の活性化によって維持した。本発明者らは、Ｗｎｔ−３Ａタンパク質及びＲ−スポンジン（Ｗｎｔシグナル伝達エンハンサー）を使用してＷｎｔシグナル伝達を活性化し、０．５ｍＭ酪酸ナトリウムを使用してＮｏｔｃｈシグナル伝達を活性化した。増殖性幹／前駆細胞を２Ｄ単層中で維持する為に使用される培地をＥＮＲ−ＷＢ（Ｅ：上皮増殖因子、Ｎ：ノギン、Ｒ：Ｒ−スポンジン：Ｗ：Ｗｎｔ−３Ａ、Ｂ：酪酸）と表す。ＥＮＲ−ＷＢ下の２Ｄ単層を走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）により検査した（図９Ｂ）。２Ｄ単層中の細胞は、インビボで見られる腸上皮の特徴である、丸石様の形態及び配置を示した。一部の細胞は滑らかな表面を持ち、他の細胞は、その頂端面に低密度の微絨毛を有していた。
【００７６】
腸細胞系列への分化を誘導する為、本発明者らはまず、ＥＮＲ−ＷＢ下、コラーゲン足場上で２Ｄ単層を４日間培養し、次いで、細胞をＥＮＲ−Ｂ分化培地（Ｗｎｔ−３Ａタンパク質の除去）で３日間処理した。２Ｄ単層をＳＥＭにより検査した。細胞は、吸収性の腸細胞の特徴である、高密度の微絨毛をその頂端面に有していた（図９Ｃ）。遺伝子解析（図９Ａ）は、ＥＮＲ−ＷＢ条件と比較して、ＥＮＲ−Ｂ条件において腸細胞遺伝子（ＣＡＩＩ）が上方制御（１６倍）されていることを示す。ＳＥＭ像及び遺伝子発現解析はいずれも、２Ｄ単層細胞が、ＥＮＲ−Ｂ下で腸細胞に首尾よく分化したことを示す。
【００７７】
杯細胞系列への分化を誘導する為、本発明者らはまず、ＥＮＲ−ＷＢ下、コラーゲン足場上で２Ｄ単層を４日間培養し、次いで、細胞をＥＮＲ−ＩＧ分化培地（Ｉ：ＩＷＰ−２、Ｇ：γセクレターゼ阻害剤ＬＹ−４１１５７５）で３日間処理した。ＩＷＰ−２はＷｎｔシグナル伝達を阻害し、ＬＹ−４１１５７５はＮｏｔｃｈシグナル伝達を阻害した。２Ｄ単層をＳＥＭにより検査した。細胞は、粘液分泌杯細胞の特徴である、粘液を放出する小胞をその頂端面に有していた（図９Ｄ）。遺伝子解析（図９Ａ）は、ＥＮＲ−ＷＢ条件と比較して、ＥＮＲ−ＩＧ条件において杯細胞遺伝子（Ｍｕｃ２）が大きく上方制御（６８倍）されていることを示す。ＳＥＭ像及び遺伝子発現解析はいずれも、２Ｄ単層細胞が、ＥＮＲ−ＩＧ条件下で杯細胞に首尾よく分化したことを示す。
【００７８】
ＳＥＭ像に基づいて、本発明者らは、推定に基づき、ＥＮＲ−ＷＢ条件（図９Ｂ）下での滑らかな微絨毛又は低密度の微絨毛を有する細胞は幹／前駆細胞であると結論付けた。これらの細胞は、腸細胞（ＥＮＲ−Ｂ）又は杯細胞（ＥＮＲ−ＩＧ）のいずれかに選択的に分化することができるので多能性である。
【００７９】
［実施例５］
ヒト小腸及び結腸上皮細胞は、２Ｄ単層として培養することができる
本発明者らは、マウスからヒト小腸及び大腸へ２Ｄ単層培養技術を拡張した。そうする為に、陰窩をまずヒト腸から単離し、３Ｄオルガノイドモデルにおいて培養して、幹細胞、前駆細胞及び分化細胞を含む細胞を増殖した（図１０）。次いで、オルガノイドをＭａｔｒｉｇｅｌから回収し、コラーゲンヒドロゲル足場（１ｍｇ／ｍＬ、ラット尾部コラーゲン、Ｉ型）の表面にプレーティングした。３Ｄオルガノイドは足場上で平坦化され、露出した内腔表面を持つ増殖性の広がる２Ｄ単層を生成した。ヒト細胞培養培地は、先進のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｗｎｔ−３Ａ馴化培地、Ｒ−スポンジン−２馴化培地及びノギン馴化培地の体積比３：１：１：１の混合物から配合、調製し、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、Ｎ−アセチルシステイン（１．２５ｍＭ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（１×）、Ｂ２７（１×）、Ｙ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤（１０μＭ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、Ａ８３−０１（５００ｎｇ／ｍＬ）、プロスタグランジンＥ２（１０ｎＭ）、ニコチンアミド（１０ｍＭ）、ガストリン（１０ｎＭ）、ＳＢ２０２１９０（３μＭ）、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）及びゲンタマイシン（５μｇ／ｍＬ）を追加した。Ｗｎｔ−３Ａの活性は、ＴＣＦ／ＬＥＦルシフェラーゼレポーター安定ＨＥＫ２９３細胞株（Ｓｉｇｎｏｓｉｓ、＃ＳＬ−００１５）により、３０ｎｇ／ｍＬと決定され、組換えＷｎｔ−３ａタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃１３２４−ＷＮ）を用いて校正した。
【００８０】
ヒト小腸については、生検組織を胃バイパス手術から得た。約１，０００個の陰窩を１ｍＬの培地に懸濁させた。懸濁液を５００ｇ、４℃で５分間遠心分離した。ペレットを１００μＬのＭａｔｒｉｇｅｌに懸濁させ、１５μＬの陰窩／Ｍａｔｒｉｇｅｌ懸濁液を２４ウェルプレートの各ウェルにプレーティングし、３７℃で１０分間インキュベートしてＭａｔｒｉｇｅｌを硬化させた。１ｍＬの培養培地を各ウェルに加えた。３Ｄオルガノイドが陰窩から成長するのが観察された（図４Ｂ）。オルガノイドをＭａｔｒｉｇｅｌから回収してコラーゲンヒドロゲル上にプレーティングし、これを平坦にして、増殖性の広がる２Ｄ単層を生成した（図４Ｃ）。
【００８１】
同様の結果がヒト結腸上皮細胞についても得られた。ヒト上行結腸は、ドナー（女性、６３歳）から得た。結腸上皮細胞をまず３Ｄオルガノイドとして培養し（図４Ｄ）、次いで２Ｄ単層に変換した（図４Ｅ）。上記のデータは、ヒト腸上皮細胞が生体模倣足場上に広がって、開いた内腔表面を有する２Ｄ単層を形成することができることを実証している。
【００８２】
［実施例６］
初代腸上皮を用いた食物代謝産物及び天然物のハイスループットスクリーニング
膨大な数の食物及び代謝産物化合物を、腸内の増殖、分化及び他の細胞挙動に対するそれらの影響についてスクリーニングする方策はますます重要になってきている。しかし、正常な健康な結腸細胞に対するこれらの化合物の作用を忠実に再現することができる技術が欠如している為、大きな課題が存在する。スクリーニングツールとしてのインビトロの平面状の腸組織プラットフォームの可能性を実証する為に、（表１に列挙した）７７種の化合物を、初代腸上皮細胞の増殖分化を変化させる能力についてスクリーニングした。これらの属性は、繰り返される化学的、物理的、免疫性及び感染性の傷害に直面している腸の関門機能及び修復の中心である。さらに、制御された増殖及び最終分化は、発癌状態を回避する為の鍵である。細胞死を伴わずに腸細胞増殖を最小限に抑え、細胞増殖を増強し、又は分化した系列に細胞を導く代謝産物又は天然物は、健康維持の為、及び療法として非常に重要である。これらの化合物は、初代腸細胞に対する多様な、又は未知の影響を有する、脂肪酸、胆汁酸、フラベノイド、植物エストロゲン、フェノール、テルペノイド、ナイトレートなどを含む幅広い化学的クラスとなった。７５，０００個の細胞を、ＥＮＲ−Ｗ（しかし、１０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ−３Ａを含む。）を含むコラーゲンヒドロゲル上で２４時間培養し、細胞を表面に付着させ、続いて、食物／天然化合物と共に４８時間インキュベートした。次いで、４つの属性：核（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２）、Ｓ期又は増殖性細胞（ＥＤＵ）、腸細胞表現型（高アルカリホスファターゼ）及び杯細胞マーカー（Ｍｕｃ２）について、細胞を順次分析した（図１１）。いくつかの化合物は、核及びＳ期細胞の数が対照細胞（ＥＮＲ−Ｗで培養した。）の数よりも有意に少なかった（ｐ＜０．０１）ので、増殖抑制性であった。これらは脂肪酸、ナイトレート、テルペノイド及びクルクミノイドの多くを含み、これらは全て分化を促進するか、又は細胞毒性を示すことが既知である。特に、キャベツ及び芽キャベツの苦味の原因であるグルコシノレート（＃６８、＃６９、＃７０）は、高濃度で消費されると有毒であり、これは部分的に、それらが腸細胞に直接作用することが原因である可能性がある。スタウロスポリン（＃３２）は、核の数を有意に増加させたが、対照のそれと比較してＳ期細胞を減少させ、初期増殖とその後のアポトーシスを示唆している。いくつかの化合物は、細胞数を大きくは減少させなかったが、増殖を抑制し、癌のリスクを減少させることができる可能性のある特徴。これらは、没食子酸（＃２８）、エラグ酸（＃２９）及びプニカラギン（＃３１）などのアッセイしたフェノールのほとんど、並びにバルプロ酸（＃６）及びβ−カロテン（＃５８）などの化合物も含んでいたが、それらは全て、文献において細胞分化を誘導すると認識されている。イチョウ葉に見られるイソラムネチン（＃２１）は、Ｓ期の細胞数を増加させたが、これは、毒素に直面している腸の損傷を緩和するこの天然物の能力の１つの源である可能性がある。驚いたことに、調味料、香料及び化粧品に使用されるユーカリプトール（＃４２）も細胞増殖を最小限に抑え、腸細胞系列に向けて細胞を押し、アルカリホスファターゼ発��を増加させた（ｐ＝０．０１）。細胞数を減少させずに腸細胞系列に向けて細胞を導いた他の化合物は、ザクロに見られる抗酸化物質であるプニカラギン（＃３１；ｐ＝０．０２）及び香料産業において使用される核内受容体リガンドであるフィトール（＃５１；ｐ＝０．００２）であった。腸細胞形成を促進する分子は、腸の関門及び／又は吸収機能を強化することによってそれらの有益な効果のいくつかを発揮する可能性があり、従って、さらに調査する価値がある可能性がある。単一化合物であるマタイレシノール（＃７７）は、Ｍｕｃ２又はムチン発現を有意に増加させた（ｐ＜０．０１）。マタイレシノールは、Ｃａｃｏ−２細胞においてＣＯＸ−２由来のプロスタグランジンＥ２を増加させ、プロスタグランジンＥ２は、結腸内で杯細胞形成を誘導して粘液分泌を増加させることが特徴とされている。初代結腸上皮のスクリーニングは、マタイレジノールを粘液産生の増加と直接結びつけ、これはプロスタグランジンＥ経路を介している可能性がある。
【００８３】
表１。食物化合物及び天然物並びに調査の為のそれらの作業濃度のリスト。
【表１】
2018506971.tif 000003
【表２】
2018506971.tif 000004
【００８４】
参考文献
１．Ｎ．バーカー，Ｍ．ファン・デ・ウェテリンク及びＨ．クレバーズ（N.Barker, M. van de Wetering and H.Clevers）著，ジーンズ  アンド  デベロップメント（Genes & Development），２２巻，２００８年，ｐ．１８５６−１８６４。
２．Ｅ．フックス及びＴ．チェン（E.Fuchs and T.Chen）著，エンボ  レポーツ（Embo Reports），１４巻，２０１３年，ｐ．３９−４８。
３．Ｍ．ブリタン及びＮ．Ａ．ライト（M.Brittan and N.A.Wright）著，ガット（Gut），５３巻，２００４年，ｐ．８９９−９１０。
４．Ｃ．コジンスキー，Ｖ．Ｓ．Ｗ．リー，Ａ．Ｓ．Ｙ．チェン，Ｊ．チャン，Ｃ．Ｈｏ，Ｗ．Ｙ．ツイ，Ｔ．Ｌ．チェン，Ｒ．Ｃ．ミフリン，Ｄ．Ｗ．パウエル，Ｓ．Ｔ．ユエン，Ｓ．Ｙ．レオン及びＸ．チェン（C.Kosinski, V.S.W.Li, A.S.Y.Chan, J.Zhang, C.Ho, W.Y.Tsui, T.L.Chan, R.C.Mifflin, D.W.Powell, S.T.Yuen, S.Y.Leung and X.Chen）著，プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシーズ  オブ  ジ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.），１０４巻，２００７年，ｐ．１５４１８−１５４２３。
５．Ｔ．Ｈ．エン及びＮ．Ａ．ライト（T.H.Yen and N.A.Wright）著，ステム  セル  レビューズ（Stem Cell Rev.），２巻，２００６年，ｐ．２０３−２１２。
６．Ｇ．Ｌ．イーストウッド及びＪ．Ｓ．トリアー（G.L.Eastwood and J.S.Trier）著，ガストロエンテロロジー（Gastroenterology），６４巻，１９７３年，ｐ．３７５−３８２。
７．Ｈ．オトラップ，Ｌ．Ａ．バレット，Ｆ．Ｅ．ジャクソン，Ｍ．Ｌ．ジェスダーソン，Ｇ．ストーナー，Ｐ．フェルプス，Ｂ．Ｆ．トランプ及びＣ．Ｃ．ハリス（H.Autrup, L.A.Barrett, F.E.Jackson, M.L.Jesudason, G.Stoner, P.Phelps, B.F.Trump and C.C.Harris）著，ガストロエンテロロジー（Gastroenterology），７４巻，１９７８年，ｐ．１２４８−１２５７。
８．Ｃ．ブース，Ｓ．パテル，Ｇ．Ｒ．ベニヨン及びＣ．Ｓ．ポッテン（C.Booth, S.Patel, G.R.Bennion and C.S.Potten）著，エピセリアル  セル  バイオロジー（Epithelial Cell Biol.），４巻，１９９５年，ｐ．７６−８６。
９．Ｒ．Ｈ．ホワイトヘッド，Ａ．ブラウン及びＰ．Ｓ．バタール（R.H.Whitehead, A.Brown and P.S.Bhathal）著，イン  ビトロ  セルラー  アンド  デベロップメンタル  バイオロジー（In Vitro Cellular & Developmental Biology），２３巻，１９８７年，ｐ．４３６−４４２。
１０．Ｊ．Ｂ．セデリン，Ｔ．ホーン及びＯ．Ｈ．ニールセン（J.B.Seidelin, T.Horn and O.H.Nielsen）著，アメリカン  ジャーナル  オブ  フィジオロジー−ガストロインテスティナル  アンド  リバー  フィジオロジー（Am.J.Physiol.-Gastroint.Liver Physiol.），２８５巻，２００３年，ｐ．Ｇ１１２２−Ｇ１１２８。
１１．Ａ．クアローニ（A.Quaroni）著，ガストロエンテロロジー（Gastroenterology），９６巻，１９８９年，ｐ．５３５−５３６。
１２．Ｔ．サトー，Ｒ．Ｇ．フリース，Ｈ．Ｊ．スニッパート，Ｍ．ファン・デ・ウェテリンク，Ｎ．バーカー，Ｄ．Ｅ．シュタンゲ，Ｊ．Ｈ．ファンＥｓ，Ａ．アボ，Ｐ．クジャラ，Ｐ．Ｊ．ペータース及びＨ．クレバーズ（T.Sato, R.G.Vries, H.J.Snippert, M. van de Wetering, N.Barker, D.E.Stange, J.H. van Es, A.Abo, P.Kujala, P.J.Peters and H.Clevers）著，ネイチャー（Nature），４５９巻，２００９年，ｐ．２６２−Ｕ１４７。
１３．Ｔ．サトー，Ｊ．Ｈ．ファンＥｓ，Ｈ．Ｊ．スニッパート，Ｄ．Ｅ．シュタンゲ，Ｒ．Ｇ．フリース，Ｍ．ファン・デン・ボルン，Ｎ．バーカー，Ｎ．Ｆ．シュロイヤー，Ｍ．ファン・デ・ウェテリンク及びＨ．クレバーズ（T.Sato, J.H. van Es, H.J.Snippert, D.E.Stange, R.G.Vries, M. van den Born, N.Barker, N.F.Shroyer, M. van de Wetering and H.Clevers）著，ネイチャー（Nature），２０１０年。
１４．Ｔ．サトー，Ｄ．Ｅ．シュタンゲ，Ｍ．フェランテ，Ｒ．Ｇ．フリース，Ｊ．Ｈ．ファンＥｓ，Ｓ．ファン・デン・ブリンク，Ｗ．Ｊ．ファン・フート，Ａ．プロンク，Ｊ．ファン・ゴープ，Ｐ．Ｄ．シェルセマ及びＨ．クレバーズ（T.Sato, D.E.Stange, M.Ferrante, R.G.Vries, J.H.Van Es, S.Van den Brink, W.J.Van Houdt, A.Pronk, J.Van Gorp, P.D.Siersema and H.Clevers）著，ガストロエンテロロジー（Gastroenterology），１４１巻，２０１１年，ｐ．１７６２−１７７２。
１５．Ｐ．ユング，Ｔ．サトー，Ａ．メルロス−スアレス，Ｆ．Ｍ．バリガ，Ｍ．イグレシアス，Ｄ．ロセル，Ｈ．アウアー，Ｍ．ガラルド，Ｍ．Ａ．ブラスコ，Ｅ．サンチョ，Ｈ．クレバーズ及びＥ．バトル（P.Jung, T.Sato, A.Merlos-Suarez, F.M.Barriga, M.Iglesias, D.Rossell, H.Auer, M.Gallardo, M.A.Blasco, E.Sancho, H.Clevers and E.Batlle）著，ネイチャー  メディスン（Nature Medicine），１７巻，２０１１年，ｐ．１２２５−１２２７。
１６．Ｓ．Ｒ．ユイ，Ｔ．ナカムラ，Ｔ．サトー，Ｙ．ネモト，Ｔ．ミズタニ，Ｘ．チヨン，Ｓ．イチノセ，Ｔ．ナガイシ，Ｒ．オカモト，Ｋ．ツチヤ，Ｈ．クレバーズ及びＭ．ワタナベ（S.R.Yui, T.Nakamura, T.Sato, Y.Nemoto, T.Mizutani, X.Zheng, S.Ichinose, T.Nagaishi, R.Okamoto, K.Tsuchiya, H.Clevers and M.Watanabe）著，ネイチャー  メディスン（Nature Medicine），１８巻，２０１２年，ｐ．６１８−６２３。
１７．Ｍ．シュテルツナー，Ｍ．ヘルムラート，Ｊ．Ｃ．Ｙ．ダン，Ｓ．Ｊ．ヘニング，Ｃ．Ｗ．ハウチェン，Ｃ．クオ，Ｊ．リンチ，Ｌ．Ｈ．Ｌｉ，Ｓ．Ｔ．マグネス，Ｍ．Ｇ．マーティン，Ｍ．Ｈ．ウォン，Ｊ．ユー及びＮ．Ｉ．Ｈ．Ｉ．Ｓ．Ｃ．Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕ（M.Stelzner, M.Helmrath, J.C.Y.Dunn, S.J.Henning, C.W.Houchen, C.Kuo, J.Lynch, L.H.Li, S.T.Magness, M.G.Martin, M.H.Wong, J.Yu and N.I.H.I.S.C.Consortiu）著，アメリカン  ジャーナル  オブ  フィジオロジー−ガストロインテスティナル  アンド  リバー  フィジオロジー（Am.J.Physiol.-Gastroint.Liver Physiol.），３０２巻，２０１２年，ｐ．Ｇ１３５９−Ｇ１３６３。
１８．Ｙ．Ｌ．ワン，Ａ．Ａ．アフマド，Ｃ．Ｅ．シムズ，Ｓ．Ｔ．マグネス及びＮ．Ｌ．オールブリトン（Y.L.Wang, A.A.Ahmad, C.E.Sims, S.T.Magness and N.L.Allbritton）著，ラボ  チップ（Lab Chip），１４巻，２０１４年，ｐ．１６２２−１６３１。
１９．Ｃ．ムーン，Ｋ．Ｌ．ファンデュッセン，Ｈ．ミヨシ及びＴ．Ｓ．スタッペンベック（C.Moon, K.L.VanDussen, H.Miyoshi and T.S.Stappenbeck）著，ムコサル  イミューノロジー（Mucosal Immunol），７巻，２０１４年，ｐ．８１８−８２８。
２０．Ｋ．Ｌ．ファンデュッセン，Ｊ．Ｍ．マリンショウ，Ｎ．シャイフ，Ｈ．ミヨシ，Ｃ．ムーン，Ｐ．Ｉ．ター，Ｍ．Ａ．チョルバ及びＴ．Ｓ．スタッペンベック（K.L.VanDussen, J.M.Marinshaw, N.Shaikh, H.Miyoshi, C.Moon, P.I.Tarr, M.A.Ciorba and T.S.Stappenbeck）著，ガット（Gut），２０１４年，ｄｏｉ：１０．１１３６／ｇｕｔｊｎｌ−２０１３−３０６６５１
２１．Ｄ．Ｒ．ドノホー，Ｎ．ガルゲ，Ｘ．Ｘ．チャン，Ｗ．サン，Ｔ．Ｍ．オコンネル，Ｍ．Ｋ．バンガー及びＳ．Ｊ．ブルトマン（D.R.Donohoe, N.Garge, X.X.Zhang, W.Sun, T.M.O'Connell, M.K.Bunger and S.J.Bultman）著，セル  メタボリズム（Cell Metabolism），１３巻，２０１１年，ｐ．５１７−５２６。
２２．Ｊ．Ｒ．デービー（J.R.Davie）著，ジャーナル  オブ  ニュートリション（Journal of Nutrition），１３３巻，２００３年，ｐ．２４８５Ｓ−２４９３Ｓ。
２３．Ｍ．Ａ．カヨ，Ａ．Ｋ．カヨ，Ｓ．Ｍ．ジャージュール及びＨ．チェン（M.A.Cayo, A.K.Cayo, S.M.Jarjour and H.Chen）著，（American Journal of Translational Research），１巻，２００９年，ｐ．１７８−１８３。
２４．Ｘ．Ｌ．イン，Ｈ．Ｆ．ファリン，Ｊ．Ｈ．ファンＥｓ，Ｈ．クレバーズ，Ｒ．ランガー及びＪ．Ｍ．カープ（X.L.Yin, H.F.Farin, J.H. van Es, H.Clevers, R.Langer and J.M.Karp）著，ネイチャー  メソッズ（Nature Methods），１１巻，２０１４年，ｐ．１０６−＋。
２５．Ｅ．Ｊ．フォルマイスター，Ａ．Ｌ．シオナス，Ｄ．Ｋ．ローランス，Ｃ．Ｌ．バークリー，Ｇ．Ｈ．リー及びＳ．Ｔ．マグネス（E.J.Formeister, A.L.Sionas, D.K.Lorance, C.L.Barkley, G.H.Lee and S.T.Magness）著，アメリカン  ジャーナル  オブ  フィジオロジー−ガストロインテスティナル  アンド  リバー  フィジオロジー（Am.J.Physiol.-Gastroint.Liver Physiol.），２９６巻，２００９年，ｐ．Ｇ１１０８−Ｇ１１１８。
２６．Ｈ．Ｊ．キム，Ｄ．ハー，Ｇ．ハミルトン及びＤ．Ｅ．イングバー（H.J.Kim, D.Huh, G.Hamilton and D.E.Ingber）著，ラボ  チップ（Lab Chip），１２巻，２０１２年，ｐ．２１６５−２１７４。
２７．Ｑ．ラマダン，Ｈ．Ｊａｆａｒｐｏｏｒｃｈｅｋａｂ，Ｃ．Ｂ．ホワン，Ｐ．シラッチ，Ｓ．カラーラ，Ｇ．コクル，Ｊ．ガーユ，Ｊ．ラムスデン，Ｃ．ルファート，Ｇ．ヴェルジェール及びＭ．Ａ．Ｍ．ジイス（Q.Ramadan, H.Jafarpoorchekab, C.B.Huang, P.Silacci, S.Carrara, G.Koklu, J.Ghaye, J.Ramsden, C.Ruffert, G.Vergeres and M.A.M.Gijs）著，ラボ  チップ（Lab Chip），１３巻，２０１３年，ｐ．１９６−２０３。
２８．Ｊ．Ｈ．スング，Ｊ．Ｊ．ユー，Ｄ．ルオ，Ｍ．Ｌ．シュラー及びＪ．Ｃ．マーチ（J.H.Sung, J.J.Yu, D.Luo, M.L.Shuler and J.C.March）著，ラボ  チップ（Lab Chip），１１巻，２０１１年，ｐ．３８９−３９２。
２９．Ｊ．Ｈ．スング，Ｍ．Ｂ．エシュ，Ｊ．Ｍ．プロット，Ｃ．Ｊ．ロング，Ａ．スミス，Ｊ．Ｊ．ヒックマン及びＭ．Ｌ．シュラー（J.H.Sung, M.B.Esch, J.M.Prot, C.J.Long, A.Smith, J.J.Hickman and M.L.Shuler）著，ラボ  チップ（Lab Chip），１３巻，２０１３年，ｐ．１２０１−１２１２。
【００８５】
以上は本発明の例示であり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。本発明は以下の請求項によって定義され、請求項の均等物もこの請求項の中に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2018506971.tif 000013
【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【国際調査報告】
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