(57)【要約】  前立腺癌を予測するための全血ベースｍＲＮＡバイオマーカー及びそれを検出するための方法が提供される。本開示のｍＲＮＡマーカー及び方法により、前立腺癌患者の識別／診断、高リスクの前立腺癌患者の識別／高リスクの前立腺癌の予測、及び前立腺癌患者の治療が可能である。また、本開示の全血ベースｍＲＮＡバイオマーカーを含む遺伝子チップも提供される。
2018507702.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者からの全血サンプル中における前立腺癌特異的ｍＲＮＡバイオマーカーを検出するための方法であって、
前記全血サンプルからＲＮＡを単離することと、
前記単離したＲＮＡからｃＤＮＡを合成することと、
ＫＬＫ３、ＡＣＡＤＬ、ＧＲＨＬ２、ＨＯＸＢ１３、ＨＳＤ３Ｂ１、ＴＭＰ．ＥＲＧ、ＡＲＶ３．７、ＡＲＶ５６７、ＦＯＬＨ１、ＫＬＫ２、ＨＳＤ３Ｂ２、ＡＧＲ２、ＡＺＧＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＫＣＮＮ２、ＧＰＸ８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＴＭＥＦＦ２、ＳＰＩＮＫ１、ＳＦＲＰ４、ＮＲＯＢ１、ＦＡＭ１３Ｃ、ＨＮＦ１Ａ、ＣＤＨ１２、ＰＧＲ、ＰＩＴＸ２、ＭＹＢＰＣ１、ＦＯＸＡ１、ＳＲＤ５Ａ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＮＰＹ、ＵＧＴ２Ｂ１７、ＣＬＵＬ１、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＦＬＮＣ、ＧＰＲ３９、ＲＥＬＮ、ＴＨＢＳ２、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ３Ａ５、ＢＲＳ３．ＳＮＡＩ２、ＣＤＨ１２、ＮＫＸ３．１、ＬＧＲ５、ＴＲＰＭ８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、及びこれらの任意の組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルを測定することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記合成工程の後で、前記ｃＤＮＡは事前増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
事前増幅工程は、１４サイクル行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅工程は、ｑＲＴ−ＰＣＲによって行われる、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記全血サンプルは、採血チューブ内に収集される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前立腺癌患者を識別するための方法であって、
前記患者の全血サンプルからｃＤＮＡを得ることと、
ＣＯＬ１Ａ１のプライマー対及びプローブを含む遺伝子チップに、前記ｃＤＮＡを接触させることと、
ＣＯＬ１Ａ１の発現レベルを測定することと、
ＣＯＬ１Ａ１の前記発現レベルとＣＯＬ１Ａ１の対照レベルとを比較することと、を含み、前記対照レベルと比較したときの前記全血サンプル中のＣＯＬ１Ａ１の前記発現レベルの増加が、前立腺癌を示す、方法。
【請求項７】
前記遺伝子チップは、ＫＬＫ３、ＡＣＡＤＬ、ＧＲＨＬ２、ＨＯＸＢ１３、ＨＳＤ３Ｂ１、ＴＭＰ．ＥＲＧ、ＡＲＶ３．７、ＡＲＶ５６７、ＦＯＬＨ１、ＫＬＫ２、ＨＳＤ３Ｂ２、ＡＧＲ２、ＡＺＧＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＫＣＮＮ２、ＧＰＸ８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＴＭＥＦＦ２、ＳＰＩＮＫ１、ＳＦＲＰ４、ＮＲＯＢ１、ＦＡＭ１３Ｃ、ＨＮＦ１Ａ、ＣＤＨ１２、ＰＧＲ、ＰＩＴＸ２、ＭＹＢＰＣ１、ＦＯＸＡ１、ＳＲＤ５Ａ２、ＮＰＹ、ＵＧＴ２Ｂ１７、ＣＬＵＬ１、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＦＬＮＣ、ＧＰＲ３９、ＲＥＬＮ、ＴＨＢＳ２、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ３Ａ５、ＢＲＳ３．ＳＮＡＩ２、ＣＤＨ１２、ＮＫＸ３．１、ＬＧＲ５、ＴＲＰＭ８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、及びこれらの任意の組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーのプライマー対及びプローブを更に含んでおり、
前記方法は、更に、
前記少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルを測定することと、
前記少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの前記発現レベルと、前記少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの対照レベルとを比較することと、を含み、前記対照レベルと比較したときの前記少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの前記発現レベルの増加が、前立腺癌を示す、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記合成工程の後で、前記ｃＤＮＡは事前増幅される、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
事前増幅工程は、１４サイクル行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅工程は、ｑＲＴ−ＰＣＲによって行われる、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記全血サンプルは、ＰＡＸ  ｇｅｎｅ  ＲＮＡチューブ内に収集される、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーの前記発現レベルを、リアルタイムＰＣＲによって確認することを更に含む、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前立腺癌に対するリスクファクターを指定することを更に含み、ＫＬＫ３、ＰＧＲ、ＫＣＮＮ２、ＭＹＢＰＣ１、ＨＯＸＢ１３、又はこれらの任意の組み合わせの発現レベルの増加が、高リスクの前立腺癌を示す、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
高リスクの前立腺癌患者を識別するための方法であって、
前記患者の全血サンプルからｃＤＮＡを得ることと、
高リスクの前立腺癌を示す少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーであって、ＫＬＫ３、ＰＧＲ、ＫＣＮＮ２、ＭＹＢＰＣ１、ＨＯＸＢ１３、又はこれらの任意の組み合わせを含む少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーのプライマー対及びプローブを含む遺伝子チップに、前記ｃＤＮＡを接触させることと、
前記少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルを測定することと、
前記少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーの前記発現レベルと、前記少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーの対照レベルとを比較することとを含み、前記対照レベルと比較したときの前記少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーの前記発現レベルの増加が、高リスクの前立腺癌を示す、方法。
【請求項１５】
前立腺癌患者を治療するための方法であって、
前記患者の全血サンプルからｃＤＮＡを得ることと、
ＣＯＬ１Ａ１のプライマー対及びプローブを含む遺伝子チップに、前記ｃＤＮＡを接触させることと、
ＣＯＬ１Ａ１の発現レベルを測定することと、
ＣＯＬ１Ａ１の前記発現レベルとＣＯＬ１Ａ１の対照レベルとを比較することと、
ＣＯＬ１Ａ１の前記対照レベルと比較してＣＯＬ１Ａ１の前記発現レベルが増加している場合、前記患者を治療することと、を含む、方法。
【請求項１６】
前記遺伝子チップは、ＫＬＫ３、ＡＣＡＤＬ、ＧＲＨＬ２、ＨＯＸＢ１３、ＨＳＤ３Ｂ１、ＴＭＰ．ＥＲＧ、ＡＲＶ３．７、ＡＲＶ５６７、ＦＯＬＨ１、ＫＬＫ２、ＨＳＤ３Ｂ２、ＡＧＲ２、ＡＺＧＰ１Ｐ１、ＳＴＥＡＰ２、ＫＣＮＮ２、ＧＰＸ８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＴＭＥＦＦ２、ＳＰＩＮＫ１、ＳＦＲＰ４、ＮＲＯＢ１、ＦＡＭ１３Ｃ、ＨＮＦ１Ａ、ＣＤＨ１２、ＰＧＲ、ＰＩＴＸ２、ＭＹＢＰＣ１、ＦＯＸＡ１、ＳＲＤ５Ａ２、ＮＰＹ、ＵＧＴ２Ｂ１７、ＣＬＵＬ１、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＦＬＮＣ、ＧＰＲ３９、ＲＥＬＮ、ＴＨＢＳ２、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ３Ａ５、ＢＲＳ３．ＳＮＡＩ２、ＣＤＨ１２、ＮＫＸ３．１、ＬＧＲ５、ＴＲＰＭ８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、及びこれらの任意の組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーのプライマー対及びプローブを更に含んでおり、
前記方法は、更に、
前記少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルを測定することと、
前記少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの前記発現レベルと、前記少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの対照レベルとを比較することと、
前記少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの前記対照と比較して、前記少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの前記発現レベルが増加している場合、前記患者を治療することと、を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
患者からの全血サンプル中においてＡＲＶ７（ＡＲＶ３．７）を検出するための方法であって、
前記全血サンプルからＲＮＡを単離することと、
前記単離したＲＮＡからｃＤＮＡを合成することと、
ＡＲＶ３．７の発現レベルを測定することと、を含む、方法。
【請求項１８】
前記合成工程の後で、前記ｃＤＮＡは事前増幅される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記事前増幅工程は、２〜１４サイクル行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記全血サンプルは、採血チューブ内に収集される、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記測定工程は、配列番号２の順方向プライマー及び配列番号３の逆方向プライマーを含む遺伝子チップを用いて行われる、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記遺伝子チップは、配列番号１のプローブを更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記患者の前記全血サンプルからのＡＲＶ７（ＡＲＶ３．７）の前記発現レベルと、ＡＲＶ７（ＡＲＶ３．７）の発現の対照レベルとを比較することを更に含む、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ＡＲＶ７（ＡＲＶ３．７）の前記対照レベルは、前立腺癌に罹患していない個体からの全血サンプルにおけるＡＲＶ７（ＡＲＶ３．７）の発現レベルである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記患者の前記全血サンプルからのＡＲＶ７（ＡＲＶ３．７）の前記発現レベルが、ＡＲＶ７（ＡＲＶ３．７）の発現の前記対照レベルと比較して、増加しているか減少しているかを判定することを更に含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２６】
患者からの全血サンプル中において前立腺癌特異的ｍＲＮＡ転写物を検出するための遺伝子チップであって、ＫＬＫ３、ＡＣＡＤＬ、ＧＲＨＬ２、ＨＯＸＢ１３、ＨＳＤ３Ｂ１、ＴＭＰ．ＥＲＧ、ＡＲＶ３．７、ＡＲＶ５６７、ＦＯＬＨ１、ＫＬＫ２、ＨＳＤ３Ｂ２、ＡＧＲ２、ＡＺＧＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＫＣＮＮ２、ＧＰＸ８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＴＭＥＦＦ２、ＳＰＩＮＫ１、ＳＦＲＰ４、ＮＲＯＢ１、ＦＡＭ１３Ｃ、ＨＮＦ１Ａ、ＣＤＨ１２、ＰＧＲ、ＰＩＴＸ２、ＭＹＢＰＣ１、ＦＯＸＡ１、ＳＲＤ５Ａ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＮＰＹ、ＵＧＴ２Ｂ１７、ＣＬＵＬ１、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＦＬＮＣ、ＧＰＲ３９、ＲＥＬＮ、ＴＨＢＳ２、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ３Ａ５、ＢＲＳ３．ＳＮＡＩ２、ＣＤＨ１２、ＮＫＸ３．１、ＬＧＲ５、ＴＲＰＭ８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、及びこれらの任意の組み合わせから成る群から選択されるｍＲＮＡバイオマーカーを増幅及び検出するように構成されたプライマー対及びプローブを含む、遺伝子チップ。
【請求項２７】
高リスクの前立腺癌患者を識別するための方法であって、
前記患者の全血サンプルからｃＤＮＡを得ることと、
高リスクの前立腺癌を示す８個のｍＲＮＡバイオマーカーであって、ＫＬＫ３、ＰＧＲ、ＫＣＮＮ２、ＭＹＢＰＣ１、ＨＯＸＢ１３、ＣＯＬ１Ａ１、ＧＰＸ８、ＦＡＭ１３Ｃ、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＫＬＫ２、ＴＭＥＦＦ２、ＮＲＯＢ１、ＰＩＴＸ２、ＡＣＡＤＬ、ＳＦＲＰ４、ＡＧＲ２、ＨＮＦ１Ａ、ＧＲＨＬ２、又はこれらの任意の組み合わせから成る群から選択される前記少なくとも８個のｍＲＮＡバイオマーカーのプライマー対及びプローブのセットを含む遺伝子チップに、前記ｃＤＮＡを接触させることと、
全てのｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルを測定することと、
前記少なくとも８個のｍＲＮＡバイオマーカーの前記発現レベルと、前記少なくとも８個のｍＲＮＡバイオマーカーの対照レベルとを比較することと、を含み、前記少なくとも８個のｍＲＮＡバイオマーカーの前記対照レベルと比較したときの前記少なくとも８個のｍＲＮＡバイオマーカーの前記発現レベルの増加が、高リスクの前立腺癌を示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
前立腺癌を予測するための全血ベースｍＲＮＡバイオマーカー及びそれを検出するための方法が、本明細書において提供される。詳細には、本開示のｍＲＮＡマーカー及び方法は、患者からの全血サンプル中における前立腺癌特異的ｍＲＮＡバイオマーカーの検出と、前立腺癌患者の識別と、高リスクの前立腺癌患者の識別と、前立腺癌患者の治療と、を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は、米国の男性にとって２番目に最も多い癌である。前立腺癌はまた、全人種及びヒスパニック系人口の男性の癌による死亡の主要原因の１つである。２０１０年には、米国において１９６，０３８人の男性が前立腺癌であると診断され、米国において２８，５６０人の男性が前立腺癌により死亡した。（Ｕ．Ｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ．Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ：１９９９〜２０１０  Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  Ｗｅｂ−ｂａｓｅｄ  Ｒｅｐｏｒｔ．Ａｔｌａｎｔａ（ＧＡ）：Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；２０１３．）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
前立腺癌の管理における主要な課題の１つとして、進行性形態の病気を止めるために十分な治療を受けるべき患者と、緩慢性形態への過剰処置を避けるべき患者とを区別するためのテストが無いことがある。前立腺癌の分子多様性と、患者から腫瘍組織を得ることの難しさとにより、前立腺癌の個別管理が困難になっている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書では、患者からの全血サンプル中における前立腺癌特異的ｍＲＮＡバイオマーカーを検出するための方法が開示される。この方法は、全血サンプルからＲＮＡを単離することと、単離されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成することと、ＫＬＫ３、ＡＣＡＤＬ、ＧＲＨＬ２、ＨＯＸＢ１３、ＨＳＤ３Ｂ１、ＴＭＰ．ＥＲＧ、ＡＲｖ７（ＡＲＶ３．７）、ＡＲＶ５６７、ＦＯＬＨ１、ＫＬＫ２、ＨＳＤ３Ｂ２、ＡＧＲ２、ＡＺＧＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＫＣＮＮ２、ＧＰＸ８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＴＭＥＦＦ２、ＳＰＩＮＫ１、ＳＦＲＰ４、ＮＲＯＢ１、ＦＡＭ１３Ｃ、ＨＮＦ１Ａ、ＣＤＨ１２、ＰＧＲ、ＰＩＴＸ２、ＭＹＢＰＣ１、ＦＯＸＡ１、ＳＲＤ５Ａ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＮＰＹ、ＵＧＴ２Ｂ１７、ＣＬＵＬ１、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＦＬＮＣ、ＧＰＲ３９、ＲＥＬＮ、ＴＨＢＳ２、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ３Ａ５、ＢＲＳ３．ＳＮＡＩ２、ＣＤＨ１２、ＮＫＸ３．１、ＬＧＲ５、ＴＲＰＭ８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、及び／又はこれらの任意の組み合わせである、或いは、これらから実質的に成る群から選択される、少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルを測定することと、を含む、から成る、及び／又はから実質的に成る。
【０００５】
また、患者からの全血サンプル中におけるＡＲｖ７（ＡＲＶ３．７）を検出するための方法も開示されている。この方法は、全血サンプルからＲＮＡを単離することと、単離されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成することと、ＡＲｖ７（ＡＲＶ３．７）の発現レベルを測定することと、を含む、から成る、及び／又はから実質的に成る。
【０００６】
また、前立腺癌患者を識別するための方法であって、患者の全血サンプルからｃＤＮＡを得ることと、ＣＯＬ１Ａ１のプライマー対及びプローブを含む遺伝子チップに、このｃＤＮＡを接触させることと、ＣＯＬ１Ａ１の発現レベルを測定することと、ＣＯＬ１Ａ１の発現レベルとＣＯＬ１Ａ１の対照レベルとを比較することと、を含む、から成り、及び／又はから実質的に成り、対照レベルと比較したときの全血サンプル中のＣＯＬ１Ａ１の発現レベルの増加が、前立腺癌を示す、方法も開示されている。
【０００７】
高リスクの前立腺癌患者を識別するための方法も提供される。この方法は、患者の全血サンプルからｃＤＮＡを得ることと、高リスクの前立腺癌を示す少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーであって、ＫＬＫ３、ＰＧＲ、ＫＣＮＮ２、ＭＹＢＰＣ１、ＨＯＸＢ１３、ＣＯＬ１Ａ１、ＧＰＸ８、ＦＡＭ１３Ｃ、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＫＬＫ２、ＴＭＥＦＦ２、ＮＲＯＢ１、ＰＩＴＸ２、ＡＣＡＤＬ、ＳＦＲＰ４、ＡＧＲ２、ＨＮＦ１Ａ、ＧＲＨＬ２、及び／又はこれらの任意の組み合わせから成る群から選択される要素、を含む、から成る、及び／又はから実質的に成る、少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーのプライマー対及びプローブを含む遺伝子チップに、このｃＤＮＡを接触させることと、少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルを測定することと、少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルと、少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーの対照レベルとを比較することと、を含む、から成り、及び／又はから実質的に成り、対照レベルと比較したときの少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルの増加が、高リスクの前立腺癌を示す。更に、ｍＲＮＡバイオマーカーは、複数のｍＲＮＡバイオマーカーを含むバイオマーカーパネルと組み合わされる場合がある。所定数、例えば、３、４、５、６、７、８、又は９個以上が検出された場合、対象は、バイオマーカー陽性と呼ばれる。バイオマーカー陽性ステータスは、高リスクの前立腺癌を示す。
【０００８】
更に、前立腺癌患者を治療するための方法であって、患者の全血サンプルからｃＤＮＡを得ることと、ＣＯＬ１Ａ１のプライマー対及びプローブを含む遺伝子チップに、このｃＤＮＡを接触させることと、ＣＯＬ１Ａ１の発現レベルを測定することと、ＣＯＬ１Ａ１の発現レベルとＣＯＬ１Ａ１の対照レベルとを比較することと、ＣＯＬ１Ａ１の対照レベルと比較してＣＯＬ１Ａ１の発現レベルが増加している場合、患者に対して前立腺癌の治療を行うことと、を含む、から成る、及び／又はから実質的に成る方法が開示されている。この例は限定を意図したものではなく、例えば、本明細書に記載のｍＲＮＡバイオマーカーの発現又はバイオマーカー陽性ステータスは、治療を行う患者を選択するためにも使用される場合がある。
【０００９】
また、患者からの全血サンプル中において前立腺癌特異的ｍＲＮＡ転写物を検出するための遺伝子チップであって、ＫＬＫ３、ＡＣＡＤＬ、ＧＲＨＬ２、ＨＯＸＢ１３、ＨＳＤ３Ｂ１、ＴＭＰ．ＥＲＧ、ＡＲＶ３．７、ＡＲＶ５６７、ＦＯＬＨ１、ＫＬＫ２、ＨＳＤ３Ｂ２、ＡＧＲ２、ＡＺＧＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＫＣＮＮ２、ＧＰＸ８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＴＭＥＦＦ２、ＳＰＩＮＫ１、ＳＦＲＰ４、ＮＲＯＢ１、ＦＡＭ１３Ｃ、ＨＮＦ１Ａ、ＣＤＨ１２、ＰＧＲ、ＰＩＴＸ２、ＭＹＢＰＣ１、ＦＯＸＡ１、ＳＲＤ５Ａ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＮＰＹ、ＵＧＴ２Ｂ１７、ＣＬＵＬ１、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＦＬＮＣ、ＧＰＲ３９、ＲＥＬＮ、ＴＨＢＳ２、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ３Ａ５、ＢＲＳ３．ＳＮＡＩ２、ＣＤＨ１２、ＮＫＸ３．１、ＬＧＲ５、ＴＲＰＭ８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、及び／又はこれらの任意の組み合わせから成る群から選択される要素を増幅及び検出するように構成されたプライマー対及びプローブを含む、から成る、及び／又はから実質的に成る遺伝子チップも提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
要約、並びに以下の発明を実施するための形態は、添付の図面と併せて読むことで、更に理解される。本開示の方法及び遺伝子チップを説明するために、図面に、本方法及び遺伝子チップの例示的な実施形態を示す。しかし、本方法及び遺伝子チップは、ここに開示されている特定の実施形態に限定されない。以下の図面において、
【図１】ＣＯＬ１Ａ１の例示的なＲＯＣ曲線であり、マーカー発現レベルの全てにおいて、感度と特異度との間のトレードオフを示している。点は、感度及び特異度が最大化される最適なカットポイントを示す。
【図２】バイオマーカー又はバイオマーカーパネルに対する例示的なカプラン・マイヤー曲線であり、Ｘ軸が表す特定の時間までに、病気の再発又は病気による死亡などの出来事を経験しなかった対象の割合を示している。バイオマーカー陽性の対象は赤のラインで示され、バイオマーカー陰性の対象は黒のラインでそれぞれ示されている。バイオマーカー陽性の対象は、バイオマーカー陰性の対象よりも早くそのような出来事を経験する傾向が顕著に高い。すなわち、バイオマーカー陽性の対象は、予後が不良である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本開示の方法及び遺伝子チップは、本開示の一部を形成する添付図面に関してなされる以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解することができる。本開示の方法及び遺伝子チップは、本明細書に記載及び／又は図示された特定の方法及び遺伝子チップに限定されないことが理解される。また、本明細書で使用される用語は、具体的な実施形態を例によって説明するためだけのものであり、請求項に記載の方法及び遺伝子チップを制限することを意図しないことが理解される。
【００１２】
特別な記述が無い限り、動作に関する可能なメカニズム又は形態、或いは改善の理由についての説明は、説明のみを意図したものである。本開示の方法は、提案されている動作に関するメカニズム又は形態、或いは改善の理由の是非によって制限されない。
【００１３】
特定の数値に関する言及は、文脈上他に明記されない限り、少なくともその特定の値を含むものとする。値の範囲が表されている場合、別の実施形態において、ある特定の値から、及び／又は他の特定の値までが含まれる。更に、範囲で記述される値に関する言及は、その範囲内のあらゆる値を含む。範囲はいずれも包括的であり、組み合わせが可能である。
【００１４】
値が、先行詞「約」を用いて近似値として表現される場合、その特定の値は、別の実施形態を形成することが理解される。
【００１５】
また、明確さのために本明細書では別々の実施形態の文脈で説明される、本開示の方法及び遺伝子チップの特定の複数の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることも理解される。逆に、簡潔さのために単一の実施形態の文脈で説明される、本開示の方法及び遺伝子チップの種々の特徴が、別々に若しくは任意のサブコンビネーションとして提供される場合もある。
【００１６】
本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は複数を含むものとする。
【００１７】
本明細書で使用するとき、「患者」という用語は、その全血サンプルが、本開示の方法によって分析可能なあらゆる哺乳類を指す。したがって、本開示の方法は、ヒト及びヒト以外の対象に適用可能である。ただし、ヒトに対して使用するのが最も好ましい。いくつかの実施形態では、患者のサンプルは、ヒトのサンプルである。他の実施形態では、患者のサンプルは、ヒト以外のサンプルである。「患者」及び「対象」は、本明細書において、交換可能に使用できる。
【００１８】
本明細書で使用するとき、「遺伝子チップにｃＤＮＡを接触させる」という表現は、遺伝子の発現を評価するために、患者の全血サンプルから得たｃＤＮＡを、遺伝子チップによって培養する又は遺伝子チップに加える手順のことを指す。
【００１９】
「発現レベルの増加」という表現は、ｍＲＮＡバイオマーカーが存在することと、対照サンプルと比較してｍＲＮＡバイオマーカーのレベルが上昇していることと、の両方を含む。例えば、本開示のｍＲＮＡバイオマーカーの１つ又は複数が、対照サンプルに含まれていない場合がある。そのようなｍＲＮＡバイオマーカーの場合は、「発現レベルの増加」という表現は、患者の全血サンプル中にｍＲＮＡバイオマーカーが存在していることを指す。逆に、本開示のｍＲＮＡバイオマーカーの１つ又は複数が、対照サンプルにある程度のレベルで存在する場合がある。そのようなｍＲＮＡバイオマーカーの場合は、「発現レベルの増加」という表現は、対照サンプルと比較して、患者の全血サンプル中のｍＲＮＡバイオマーカーのレベルが上昇していることを指す。
【００２０】
本明細書で使用するとき、「対照サンプル」とは、前立腺癌に罹患しておらず、かつ、過去に罹患したことのない個体又はそのような個体集団からの全血サンプルを指す。したがって、「〜の対照レベル」とは、前立腺癌に罹患しておらず、かつ、過去に罹患したことのない個体又はそのような個体集団からの全血サンプル中における、本開示の１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを指す。
【００２１】
本明細書で使用するとき、「プライマー対」とは、目的のｍＲＮＡバイオマーカーのｃＤＮＡを増幅するための順方向プライマー及び逆方向プライマーを指す。
【００２２】
前立腺癌特異的ｍＲＮＡバイオマーカーの検出
本明細書では、患者からの全血サンプル中における前立腺癌特異的ｍＲＮＡバイオマーカーを検出するための方法が開示される。この方法は、全血サンプルからＲＮＡを単離することと、単離したＲＮＡからｃＤＮＡを合成することと、任意選択的にｃＤＮＡを事前増幅（ｐｒｅａｍｐｌｉｆｙ）することと、ＫＬＫ３、ＡＣＡＤＬ、ＧＲＨＬ２、ＨＯＸＢ１３、ＨＳＤ３Ｂ１、ＴＭＰ．ＥＲＧ、ＡＲＶ７（ＡＲＶ３．７）（ＡＲＶ７としても知られている）、ＡＲＶ５６７、ＦＯＬＨ１、ＫＬＫ２、ＨＳＤ３Ｂ２、ＡＧＲ２、ＡＺＧＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＫＣＮＮ２、ＧＰＸ８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＴＭＥＦＦ２、ＳＰＩＮＫ１、ＳＦＲＰ４、ＮＲＯＢ１、ＦＡＭ１３Ｃ、ＨＮＦ１Ａ、ＣＤＨ１２、ＰＧＲ、ＰＩＴＸ２、ＭＹＢＰＣ１、ＦＯＸＡ１、ＳＲＤ５Ａ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＮＰＹ、ＵＧＴ２Ｂ１７、ＣＬＵＬ１、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＦＬＮＣ、ＧＰＲ３９、ＲＥＬＮ、ＴＨＢＳ２、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ３Ａ５、ＢＲＳ３．ＳＮＡＩ２、ＣＤＨ１２、ＮＫＸ３．１、ＬＧＲ５、ＴＲＰＭ８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、又はこれらの任意の組み合わせである少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルを測定することと、を含む。
【００２３】
本開示の方法により、全血サンプル中における前立腺癌特異的ｍＲＮＡバイオマーカーを検出することができる。これらのマーカーの検出は、前立腺癌患者の識別／診断、高リスクの前立腺癌患者の識別／高リスクの前立腺癌の予測、及び前立腺癌患者の治療に使用することができる。
【００２４】
本明細書で使用するとき、「前立腺癌特異的ｍＲＮＡバイオマーカー」とは、全血サンプルから前立腺癌を検出するために使用することができる、単一のｍＲＮＡバイオマーカー又はｍＲＮＡバイオマーカーの群（すなわち、２つ以上の関連するバイオマーカー）を指す。例示的なｍＲＮＡバイオマーカーが表１にリストされており、ＫＬＫ３、ＡＣＡＤＬ、ＧＲＨＬ２、ＨＯＸＢ１３、ＨＳＤ３Ｂ１、ＴＭＰ．ＥＲＧ、ＡＲＶ３．７、ＦＯＬＨ１、ＫＬＫ２、ＨＳＤ３Ｂ２、ＡＧＲ２、ＡＺＧＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＫＣＮＮ２、ＧＰＸ８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＴＭＥＦＦ２、ＳＰＩＮＫ１、ＳＦＲＰ４、ＮＲＯＢ１、ＦＡＭ１３Ｃ、ＨＮＦ１Ａ、ＣＤＨ１２、ＰＧＲ、ＰＩＴＸ２、ＭＹＢＰＣ１、ＦＯＸＡ１、ＳＲＤ５Ａ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＮＰＹ、ＵＧＴ２Ｂ１７、ＣＬＵＬ１、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＦＬＮＣ、ＧＰＲ３９、ＲＥＬＮ、ＴＨＢＳ２、ＣＹＰ１７Ａ１、ＢＲＳ３．ＳＮＡＩ２、ＣＤＨ１２、ＮＫＸ３．１、ＬＧＲ５、ＴＲＰＭ８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、及びＣＹＰ３Ａ５が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
好適なｍＲＮＡバイオマーカーは、アンドロゲン制御群、アビラテロン抵抗群、神経内分泌バイパス群、又はその他のバイパスパスウェイに、機能的に分類することができる。このように、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーは、アンドロゲン制御群、アビラテロン抵抗群、神経内分泌バイパス群、その他のバイパスパスウェイ、又はこれらの任意の組み合わせのメンバーであり得る。
【００２７】
全血の発現プロファイリングには、腫瘍組織の発現プロファイリングに対して、いくつかの実用上の利点がある。サンプル採取時の侵襲性が最小限である性質、サンプリング手順の標準化が比較的容易であること、そして、長い期間繰り返しサンプルを得られること（腫瘍組織は、標準的治療の一部として採取されることがないため）である。全血サンプルは、当該技術分野で既知の多くの技術（例えば、静脈穿刺が挙げられるが、これに限定されない）によって、患者から得ることができる。全血サンプルは、採血チューブ内に収集することができる。いくつかの実施形態では、採血チューブは、ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）ブランドのｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブであり得る。
【００２８】
全血サンプルからＲＮＡを単離するための技術は、当該技術分野において既知である。好適な市販のキットには、例えば、ＱＩＡＧＥＮのＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｋｉｔが挙げられる。この手順が、実施例のセクションにて説明される。
【００２９】
単離したＲＮＡからｃＤＮＡを合成するための技術は、当該技術分野において既知であり、ＲＮＡの逆転写が挙げられるが、これに限定されない。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、合成工程の後で事前増幅され得る。事前増幅工程は、任意の好適なサイクル数行われ得る。サイクル数は、初発のｃＤＮＡの量及び／又は増幅工程の実行に必要なｃＤＮＡの量によって決まる部分がある。好適な事前増幅のサイクル数としては、１〜２０サイクルが含まれるが、これらに限定されない。したがって、事前増幅工程は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０サイクルのうち任意のサイクル数行うことができる。いくつかの態様では、事前増幅工程は、２サイクル行うことができる。他の態様では、事前増幅工程は、１４サイクル行うことができる。更に他の態様では、事前増幅工程は、２０サイクルより多く行うことができる。
【００３１】
少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルを測定することは、ｃＤＮＡを増幅することと、ＫＬＫ３、ＡＣＡＤＬ、ＧＲＨＬ２、ＨＯＸＢ１３、ＨＳＤ３Ｂ１、ＴＭＰ．ＥＲＧ、ＡＲＶ３．７、ＡＲＶ５６７、ＦＯＬＨ１、ＫＬＫ２、ＨＳＤ３Ｂ２、ＡＧＲ２、ＡＺＧＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＫＣＮＮ２、ＧＰＸ８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＴＭＥＦＦ２、ＳＰＩＮＫ１、ＳＦＲＰ４、ＮＲＯＢ１、ＦＡＭ１３Ｃ、ＨＮＦ１Ａ、ＣＤＨ１２、ＰＧＲ、ＰＩＴＸ２、ＭＹＢＰＣ１、ＦＯＸＡ１、ＳＲＤ５Ａ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＮＰＹ、ＵＧＴ２Ｂ１７、ＣＬＵＬ１、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＦＬＮＣ、ＧＰＲ３９、ＲＥＬＮ、ＴＨＢＳ２、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ３Ａ５、ＢＲＳ３．ＳＮＡＩ２、ＣＤＨ１２、ＮＫＸ３．１、ＬＧＲ５、ＴＲＰＭ８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、又はこれらの任意の組み合わせのプライマー対及びプローブを含む遺伝子チップを用いて、増幅したｃＤＮＡを検出することと、を含む。いくつかの態様では、遺伝子チップは、分析対象の各ｍＲＮＡバイオマーカーに対してプライマー対及び１つのプローブを含み得る。他の態様では、遺伝子チップは、分析対象の各ｍＲＮＡバイオマーカーに対して１つより多いプライマー対及び１つより多いプローブを含み得る。
【００３２】
理論に束縛されることを意図しないが、遺伝子チップに添加された事前増幅されたｃＤＮＡは、目的のｍＲＮＡバイオマーカー内の領域に特異的なプライマー対に結合されて、増幅される。ｃＤＮＡが増幅されると、増幅されたｃＤＮＡは、目的のｍＲＮＡバイオマーカー内の領域に特異的なプローブに結合される。増幅されたｃＤＮＡへのプローブの結合により、増幅工程が起こったときに増幅されたｃＤＮＡの検出が可能となる。このように、本開示の方法により、増幅プロセス中の早い段階で少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルを検出することができ、その結果、感度及び精度が向上する。
【００３３】
測定工程は、事前増幅されたｃＤＮＡに対しても、増幅されていないｃＤＮＡに対しても行うことができる。ｃＤＮＡの増幅は、例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲによって行うことができる。好適な試薬及び条件は、当該技術分野の当業者に知られている。ｑＲＴ−ＰＣＲは、多くの好適なプラットフォーム上で行うことができる。いくつかの態様では、例えば、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（商標）を用いてｑＲＴ−ＰＣＲを行うことができる。したがって、いくつかの実施形態では、測定工程は、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（商標）のプラットフォーム上における、上述のように少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーを含むＦｌｕｉｄｉｇｍ（商標）のＧｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｈｉｐを用いたｑＲＴ−ＰＣＲによって、ｃＤＮＡを増幅することを含み得る。
【００３４】
また、患者からの全血サンプル中においてＡＲＶ７（ＡＲＶ３．７）を検出するための方法も開示されている。本開示の方法は、全血サンプルからＲＮＡを単離することと、単離されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成することと、ＡＲＶ３．７の発現レベルを測定することと、を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、合成工程の後で事前増幅され得る。好適な事前増幅のサイクル数としては、１〜２０サイクルが含まれるが、これらに限定されない。したがって、事前増幅工程は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０サイクル行うことができる。いくつかの態様では、事前増幅工程は、２サイクル行うことができる。
【００３６】
全血サンプルは、ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブなどの採血チューブ内に収集することができる。
【００３７】
測定工程は、ＡＲＶ３．７のプライマー及びプローブを含む、本開示の遺伝子チップのうちのいずれか１つを用いて行うことができる。いくつかの実施形態では、測定工程は、配列番号２の順方向プライマー及び配列番号３の逆方向プライマーを含む遺伝子チップを用いて行うことができる。いくつかの態様では、遺伝子チップは、配列番号１のプライマーを更に含む場合がある。
【００３８】
ＡＲＶ７（ＡＲＶ３．７）の発現を検出するための方法は、患者の全血サンプルからのＡＲＶ７（ＡＲＶ３．７）の発現レベルと、ＡＲＶ７（ＡＲＶ３．７）の発現の対照レベルとを比較することを更に含む場合がある。ＡＲＶ７（ＡＲＶ３．７）の発現の好適な対照レベルとしては、例えば、前立腺癌に罹患していない個体からの全血サンプルにおけるＡＲＶ７（ＡＲＶ３．７）の対照レベルが挙げられる。比較工程を使用して、患者の全血サンプルからのＡＲＶ７（ＡＲＶ３．７）の発現レベルが、ＡＲＶ７（ＡＲＶ３．７）の発現の対照レベルと比較して、増加しているか減少しているかを判定することができる。
【００３９】
前立腺癌患者を識別するための方法
また、本明細書では、前立腺癌患者を識別するための方法も開示されている。本開示の方法は、患者の全血サンプルからｃＤＮＡを得ることと、ＣＯＬ１Ａ１のプライマー対及びプローブを含む遺伝子チップに、このｃＤＮＡを接触させることと、ＣＯＬ１Ａ１の発現レベルを測定することと、ＣＯＬ１Ａ１の発現レベルとＣＯＬ１Ａ１の対照レベルとを比較することと、を含む、から成り、及び／又はから実質的に成り、対照レベルと比較したときの全血サンプル中のＣＯＬ１Ａ１の発現レベルの増加が、前立腺癌を示す、方法も開示されている。
【００４０】
全血サンプルからＲＮＡを単離して、単離したＲＮＡからｃＤＮＡを合成することによって、ｃＤＮＡを全血サンプルから得ることができる。ＲＮＡの単離及びｃＤＮＡの合成を行うための好適な技術には、上記で開示された技術と、更に、実施例のセクションで開示される技術と、が含まれる。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、合成工程の後で事前増幅され得る。事前増幅工程は、任意の好適なサイクル数行うことができる。例えば、１〜２０サイクル行うことができるが、これらに限定されない。したがって、事前増幅工程は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０サイクル行うことができる。いくつかの態様では、事前増幅工程は、１４サイクル行うことができる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、遺伝子チップは、ＫＬＫ３、ＡＣＡＤＬ、ＧＲＨＬ２、ＨＯＸＢ１３、ＨＳＤ３Ｂ１、ＴＭＰ．ＥＲＧ、ＡＲＶ３．７、ＡＲＶ５６７、ＦＯＬＨ１、ＫＬＫ２、ＨＳＤ３Ｂ２、ＡＧＲ２、ＡＺＧＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＫＣＮＮ２、ＧＰＸ８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＴＭＥＦＦ２、ＳＰＩＮＫ１、ＳＦＲＰ４、ＮＲＯＢ１、ＦＡＭ１３Ｃ、ＨＮＦ１Ａ、ＣＤＨ１２、ＰＧＲ、ＰＩＴＸ２、ＭＹＢＰＣ１、ＦＯＸＡ１、ＳＲＤ５Ａ２、ＮＰＹ、ＵＧＴ２Ｂ１７、ＣＬＵＬ１、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＦＬＮＣ、ＧＰＲ３９、ＲＥＬＮ、ＴＨＢＳ２、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ３Ａ５、ＢＲＳ３．ＳＮＡＩ２、ＣＤＨ１２、ＮＫＸ３．１、ＬＧＲ５、ＴＲＰＭ８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、又はこれらの任意の組み合わせである少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーのプライマー対及びプローブを更に含む。遺伝子チップが、少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーのプライマー対及びプローブを含む実施形態では、本方法は、少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルを測定することと、少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルと少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの対照レベルとを比較することと、を更に含み、対照レベルと比較したときの少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルの増加が、前立腺癌を示す。
【００４２】
いくつかの態様では、遺伝子チップは、分析対象の各ｍＲＮＡバイオマーカーに対して１つのプライマー対及び１つのプローブを含み得る。他の態様では、遺伝子チップは、分析対象の各ｍＲＮＡバイオマーカーに対して１つより多いプライマー対及び１つより多いプローブを含み得る。
【００４３】
遺伝子チップが、少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーのプライマー対及びプローブを更に含む実施形態では、本方法は、ＣＯＬ１Ａ１及び少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルを測定することと、ＣＯＬ１Ａ１及び少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルと、ＣＯＬ１Ａ１及び少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの対照レベルとを比較することと、を更に含む。例えば、そして、制限することを意図せずに、いくつかの実施形態では、本方法は、ＣＯＬ１Ａ１のプライマー対及びプローブと、ＭＹＢＰＣ１のプライマー対及びプローブとを含む遺伝子チップにｃＤＮＡを接触させることと、ＣＯＬ１Ａ１及びＭＹＢＰＣ１の発現レベルを測定することと、ＣＯＬ１Ａ１及びＭＹＢＰＣ１の発現レベルとＣＯＬ１Ａ１及びＭＹＢＰＣ１の対照レベルとを比較することと、を含む場合があり、対照レベルと比較したときの全血サンプル中のＣＯＬ１Ａ１及びＭＹＢＰＣ１の発現レベルの増加が、前立腺癌を示す。
【００４４】
ＣＯＬ１Ａ１単独の、或いはＣＯＬ１Ａ１と少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーとの組み合わせの発現レベルを測定することは、ＣＯＬ１Ａ１のプライマー対を単独で用いて、或いはＣＯＬ１Ａ１のプライマー対と少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーのプライマーとを組み合わせて用いて、ｃＤＮＡを増幅することと、ＣＯＬ１Ａ１のプローブを単独で用いて、或いはＣＯＬ１Ａ１のプローブと少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーのプローブとを組み合わせて用いて、増幅されたｃＤＮＡを検出することと、を含む。測定工程は、事前増幅されたｃＤＮＡに対しても、増幅されていないｃＤＮＡに対しても行うことができる。ｃＤＮＡの増幅は、例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲによって行うことができる。好適な試薬及び条件は、当該技術分野の当業者に知られている。ｑＲＴ−ＰＣＲは、多くの好適なプラットフォーム上で行うことができる。いくつかの態様では、例えば、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（商標）を用いてｑＲＴ−ＰＣＲを行うことができる。したがって、いくつかの実施形態では、測定工程は、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（商標）のプラットフォーム上における、ＣＯＬ１Ａ１のプライマー単独を又はＣＯＬ１Ａ１のプライマーと上述のような少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーのプライマーとの組み合わせを含むＦｌｕｉｄｉｇｍ（商標）のＧｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｈｉｐを用いたｑＲＴ−ＰＣＲによって、ｃＤＮＡを増幅することを含み得る。
【００４５】
全血サンプルは、ＰＡＸ  ｇｅｎｅ  ＲＮＡチューブ（これに限定されない）などの採血チューブ内に収集することができる。
【００４６】
前立腺癌患者を識別するための方法は、少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルを、リアルタイムＰＣＲによって確認することを更に含む場合がある。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本方法は、前立腺癌に対するリスクファクターを指定することを更に含む場合があり、ＫＬＫ３、ＰＧＲ、ＫＣＮＮ２、ＭＹＢＰＣ１、ＨＯＸＢ１３、又はこれらの任意の組み合わせの発現レベルの増加が、高リスクの前立腺癌を示す。
【００４８】
高リスクの前立腺癌患者を識別するための方法
高リスクの前立腺癌患者を識別するための方法も開示される。本方法は、患者の全血サンプルからｃＤＮＡを得ることと、高リスクの前立腺癌を示すｍＲＮＡバイオマーカーのプライマー対と、このｍＲＮＡバイオマーカーのパネルであって、ＫＬＫ３、ＰＧＲ、ＫＣＮＮ２、ＭＹＢＰＣ１、ＨＯＸＢ１３、ＣＯＬ１Ａ１、ＧＰＸ８、ＦＡＭ１３Ｃ、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＫＬＫ２、ＴＭＥＦＦ２、ＮＲＯＢ１、ＰＩＴＸ２、ＡＣＡＤＬ、ＳＦＲＰ４、ＡＧＲ２、ＨＮＦ１Ａ、ＧＲＨＬ２、又はこれらの任意の組み合わせを含むパネルと、を含む遺伝子チップに、ｃＤＮＡを接触させることと、少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルを測定することと、少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルと、少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーの対照レベルとを比較することと、を含む、から成り、及び／又はから実質的に成り、対照レベルと比較したときの少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルの増加が、高リスクの前立腺癌を示す。
【００４９】
本開示の方法により、全血サンプルからの、ＫＬＫ３、ＰＧＲ、ＫＣＮＮ２、ＭＹＢＰＣ１、ＨＯＸＢ１３、ＣＯＬ１Ａ１、ＧＰＸ８、ＦＡＭ１３Ｃ、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＫＬＫ２、ＴＭＥＦＦ２、ＮＲＯＢ１、ＰＩＴＸ２、ＡＣＡＤＬ、ＳＦＲＰ４、ＡＧＲ２、ＨＮＦ１Ａ、ＧＲＨＬ２、又はこれらの任意の組み合わせの検出に基づいて、高リスクの前立腺癌を予測することができる。
【００５０】
全血サンプルからＲＮＡを単離して、単離したＲＮＡからｃＤＮＡを合成することによって、ｃＤＮＡを全血サンプルから得ることができる。ＲＮＡの単離及びｃＤＮＡの合成を行うための好適な技術には、上記で開示された技術と、更に、実施例のセクションで開示される技術と、が含まれる。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、合成工程の後で事前増幅され得る。事前増幅工程は、任意の好適なサイクル数行われ得る。サイクル数は、開始ｃＤＮＡの量及び／又は増幅工程の実行に必要なｃＤＮＡの量によって決まる部分がある。好適な事前増幅のサイクル数としては、１〜２０サイクルが含まれるが、これらに限定されない。したがって、事前増幅工程は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０サイクル行うことができる。いくつかの態様では、事前増幅工程は、２サイクル行うことができる。他の態様では、事前増幅工程は、１４サイクル行うことができる。更に他の態様では、事前増幅工程は、２０サイクルより多く行うことができる。
【００５１】
ＫＬＫ３、ＰＧＲ、ＫＣＮＮ２、ＭＹＢＰＣ１、ＨＯＸＢ１３、ＣＯＬ１Ａ１、ＧＰＸ８、ＦＡＭ１３Ｃ、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＫＬＫ２、ＴＭＥＦＦ２、ＮＲＯＢ１、ＰＩＴＸ２、ＡＣＡＤＬ、ＳＦＲＰ４、ＡＧＲ２、ＨＮＦ１Ａ、ＧＲＨＬ２、又はこれらの任意の組み合わせの発現レベルを測定することは、ＫＬＫ３、ＰＧＲ、ＫＣＮＮ２、ＭＹＢＰＣ１、ＨＯＸＢ１３、ＣＯＬ１Ａ１、ＧＰＸ８、ＦＡＭ１３Ｃ、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＫＬＫ２、ＴＭＥＦＦ２、ＮＲＯＢ１、ＰＩＴＸ２、ＡＣＡＤＬ、ＳＦＲＰ４、ＡＧＲ２、ＨＮＦ１Ａ、ＧＲＨＬ２、又はこれらの任意の組み合わせのプライマー対を用いて、ｃＤＮＡを増幅させることと、ＫＬＫ３、ＰＧＲ、ＫＣＮＮ２、ＭＹＢＰＣ１、ＨＯＸＢ１３、ＣＯＬ１Ａ１、ＧＰＸ８、ＦＡＭ１３Ｃ、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＫＬＫ２、ＴＭＥＦＦ２、ＮＲＯＢ１、ＰＩＴＸ２、ＡＣＡＤＬ、ＳＦＲＰ４、ＡＧＲ２、ＨＮＦ１Ａ、ＧＲＨＬ２、又はこれらの任意の組み合わせのプローブを用いて、増幅したｃＤＮＡを検出することと、を含む。測定工程は、事前増幅されたｃＤＮＡに対しても、増幅されていないｃＤＮＡに対しても行うことができる。ｃＤＮＡの増幅は、例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲによって行うことができる。好適な試薬及び条件は、当該技術分野の当業者に知られている。ｑＲＴ−ＰＣＲは、多くの好適なプラットフォーム上で行うことができる。いくつかの態様では、例えば、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（商標）を用いてｑＲＴ−ＰＣＲを行うことができる。したがって、いくつかの実施形態では、測定工程は、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（商標）のプラットフォーム上における、上述のようにＫＬＫ３、ＰＧＲ、ＫＣＮＮ２、ＭＹＢＰＣ１、ＨＯＸＢ１３、ＣＯＬ１Ａ１、ＧＰＸ８、ＦＡＭ１３Ｃ、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＫＬＫ２、ＴＭＥＦＦ２、ＮＲＯＢ１、ＰＩＴＸ２、ＡＣＡＤＬ、ＳＦＲＰ４、ＡＧＲ２、ＨＮＦ１Ａ、ＧＲＨＬ２、又はこれらの任意の組み合わせのプライマーを含むＦｌｕｉｄｉｇｍ（商標）のＧｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｈｉｐを用いたｑＲＴ−ＰＣＲによって、ｃＤＮＡを増幅することを含む場合がある。
【００５２】
いくつかの態様では、遺伝子チップは、分析対象の各ｍＲＮＡバイオマーカーに対して１つのプライマー対及び１つのプローブを含み得る。他の態様では、遺伝子チップは、分析対象の各ｍＲＮＡバイオマーカーに対して１つより多いプライマー対及び１つより多いプローブを含み得る。
【００５３】
全血サンプルは、ＰＡＸ  ｇｅｎｅ  ＲＮＡチューブ（これに限定されない）などの採血チューブ内に収集することができる。
【００５４】
高リスクの前立腺癌患者を識別するための方法は、少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルを、リアルタイムＰＣＲによって確認することを更に含む場合がある。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本方法は、１つより多いｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルをリアルタイムＰＣＲによって測定することと、閾値数より多い数のマーカーの陽性発現を検出することと、を伴う場合がある。これらの実施形態では、閾値数より多い数のマーカーが陽性発現を示す患者が、バイオマーカー陽性と考えられる。バイオマーカー陽性ステータスは、高リスクの病気の可能性の高さに関連している。
【００５６】
前立腺癌患者を治療するための方法
本明細書では、前立腺癌患者を治療するための方法であって、患者の全血サンプルからｃＤＮＡを得ることと、ＣＯＬ１Ａ１のプライマー対及びプローブを含む遺伝子チップに、このｃＤＮＡを接触させることと、ＣＯＬ１Ａ１の発現レベルを測定することと、ＣＯＬ１Ａ１の発現レベルとＣＯＬ１Ａ１の対照レベルとを比較することと、ＣＯＬ１Ａ１の対照レベルと比較してＣＯＬ１Ａ１の発現レベルが増加している場合、患者を治療することとを含む方法が開示される。
【００５７】
いくつかの実施形態では、遺伝子チップは、ＫＬＫ３、ＡＣＡＤＬ、ＧＲＨＬ２、ＨＯＸＢ１３、ＨＳＤ３Ｂ１、ＴＭＰ．ＥＲＧ、ＡＲＶ３．７、ＡＲＶ５６７、ＦＯＬＨ１、ＫＬＫ２、ＨＳＤ３Ｂ２、ＡＧＲ２、ＡＺＧＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＫＣＮＮ２、ＧＰＸ８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＴＭＥＦＦ２、ＳＰＩＮＫ１、ＳＦＲＰ４、ＮＲＯＢ１、ＦＡＭ１３Ｃ、ＨＮＦ１Ａ、ＣＤＨ１２、ＰＧＲ、ＰＩＴＸ２、ＭＹＢＰＣ１、ＦＯＸＡ１、ＳＲＤ５Ａ２、ＮＰＹ、ＵＧＴ２Ｂ１７、ＣＬＵＬ１、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＦＬＮＣ、ＧＰＲ３９、ＲＥＬＮ、ＴＨＢＳ２、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ３Ａ５、ＢＲＳ３．ＳＮＡＩ２、ＣＤＨ１２、ＮＫＸ３．１、ＬＧＲ５、ＴＲＰＭ８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、又はこれらの任意の組み合わせである少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーのプライマー対及びプローブを更に含む。遺伝子チップが、少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーのプライマー対及びプローブを含む実施形態では、本方法は、少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルを測定することと、少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルと少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの対照レベルとを比較することと、少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルが少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの対照よりも増加している場合、患者を治療することと、を更に含む。
【００５８】
他の実施形態では、遺伝子チップは、複数のｍＲＮＡバイオマーカーのプライマー対及びプローブを更に含む。
【００５９】
いくつかの態様では、遺伝子チップは、分析対象の各ｍＲＮＡバイオマーカーに対して１つのプライマー対及び１つのプローブを含み得る。他の態様では、遺伝子チップは、分析対象の各ｍＲＮＡバイオマーカーに対して１つより多いプライマー対及び１つより多いプローブを含み得る。
【００６０】
遺伝子チップが、少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーのプライマー対及びプローブを更に含む実施形態では、前立腺癌患者を治療するための方法は、ＣＯＬ１Ａ１及び少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルを測定することと、ＣＯＬ１Ａ１及び少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルとＣＯＬ１Ａ１及び少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの対照レベルとを比較することと、ＣＯＬ１Ａ１及び少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルが、ＣＯＬ１Ａ１及び少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの対照レベルより増加している場合、患者を治療することと、を含む。例えば、そして、制限することを意図せずに、いくつかの実施形態では、本方法は、ＣＯＬ１Ａ１のプライマー対及びプローブと、ＭＹＢＰＣ１のプライマー対及びプローブとを含む遺伝子チップにｃＤＮＡを接触させることと、ＣＯＬ１Ａ１及びＭＹＢＰＣ１の発現レベルを測定することと、ＣＯＬ１Ａ１及びＭＹＢＰＣ１の発現レベルとＣＯＬ１Ａ１及びＭＹＢＰＣ１の対照レベルとを比較することと、ＣＯＬ１Ａ１及びＭＹＢＰＣ１の対照レベルと比較してＣＯＬ１Ａ１及びＭＹＢＰＣ１の発現レベルが増加している場合、患者を治療することとを含み得る。
【００６１】
遺伝子チップが、複数のｍＲＮＡバイオマーカーのプライマー対及びプローブを更に含む実施形態では、前立腺癌患者を治療するための方法は、複数のｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルを測定することと、ｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルと各ｍＲＮＡバイオマーカーの発現の対照レベルとを比較することと、閾値数より多い数のｍＲＮＡバイオマーカーが、対照レベルより高い発現レベルで検出された場合、患者を治療することと、を含む。
【００６２】
全血サンプルからＲＮＡを単離して、単離したＲＮＡからｃＤＮＡを合成することによって、ｃＤＮＡを全血サンプルから得ることができる。ＲＮＡの単離及びｃＤＮＡの合成を行うための好適な技術には、上記で開示された技術と、更に、実施例のセクションで開示される技術と、が含まれる。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、合成工程の後で事前増幅され得る。事前増幅工程は、任意の好適なサイクル数行われ得る。サイクル数は、開始ｃＤＮＡの量及び／又は増幅工程の実行に必要なｃＤＮＡの量によって決まる部分がある。好適な事前増幅のサイクル数としては、１〜２０サイクルが含まれるが、これらに限定されない。したがって、事前増幅工程は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０サイクル行うことができる。いくつかの態様では、事前増幅工程は、２サイクル行うことができる。他の態様では、事前増幅工程は、１４サイクル行うことができる。更に他の態様では、事前増幅工程は、２０サイクルより多く行うことができる。
【００６３】
ＣＯＬ１Ａ１単独の、或いはＣＯＬ１Ａ１と少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーとの組み合わせの発現レベルを測定することは、ＣＯＬ１Ａ１のプライマー対を単独で用いて、或いはＣＯＬ１Ａ１のプライマー対と少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーのプライマー対との組み合わせを用いて、ｃＤＮＡを増幅することと、ＣＯＬ１Ａ１のプローブを単独で用いて、或いはＣＯＬ１Ａ１単独のプローブと少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーのプローブとの組み合わせを用いて、増幅されたｃＤＮＡを検出することと、を含む。測定工程は、事前増幅されたｃＤＮＡに対しても、増幅されていないｃＤＮＡに対しても行うことができる。ｃＤＮＡの増幅は、例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲによって行うことができる。好適な試薬及び条件は、当該技術分野の当業者に知られている。ｑＲＴ−ＰＣＲは、多くの好適なプラットフォーム上で行うことができる。いくつかの態様では、例えば、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（商標）を用いてｑＲＴ−ＰＣＲを行うことができる。したがって、いくつかの実施形態では、測定工程は、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（商標）のプラットフォーム上における、ＣＯＬ１Ａ１のプライマー単独を又はＣＯＬ１Ａ１のプライマーと上述のような少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーのプライマーとの組み合わせを含むＦｌｕｉｄｉｇｍ（商標）のＧｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｈｉｐを用いたｑＲＴ−ＰＣＲによって、ｃＤＮＡを増幅することを含み得る。
【００６４】
全血サンプルは、ＰＡＸ  ｇｅｎｅ  ＲＮＡチューブ（これに限定されない）などの採血チューブ内に収集することができる。
【００６５】
前立腺癌患者を治療するための方法は、少なくとも１つのｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルを、リアルタイムＰＣＲによって確認することを更に含む場合がある。
【００６６】
ＣＯＬ１Ａ１又はＣＯＬ１Ａ１及び少なくとも１つの追加のｍＲＮＡバイオマーカーの発現レベルが増加している患者を治療するための好適な化合物としては、以下の化合物が含まれる（ただし、これらに限定されない）。
【００６７】
【化１】
2018507702.tif 000004
【００６８】
遺伝子チップ
本明細書では、患者からの全血サンプル中における前立腺癌特異的ｍＲＮＡ転写物を検出するための遺伝子チップが開示される。いくつかの実施形態では、遺伝子チップは、ＫＬＫ３、ＡＣＡＤＬ、ＧＲＨＬ２、ＨＯＸＢ１３、ＨＳＤ３Ｂ１、ＴＭＰ．ＥＲＧ、ＡＲＶ３．７、ＡＲＶ５６７、ＦＯＬＨ１、ＫＬＫ２、ＨＳＤ３Ｂ２、ＡＧＲ２、ＡＺＧＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＫＣＮＮ２、ＧＰＸ８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＴＭＥＦＦ２、ＳＰＩＮＫ１、ＳＦＲＰ４、ＮＲＯＢ１、ＦＡＭ１３Ｃ、ＨＮＦ１Ａ、ＣＤＨ１２、ＰＧＲ、ＰＩＴＸ２、ＭＹＢＰＣ１、ＦＯＸＡ１、ＳＲＤ５Ａ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＮＰＹ、ＵＧＴ２Ｂ１７、ＣＬＵＬ１、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＦＬＮＣ、ＧＰＲ３９、ＲＥＬＮ、ＴＨＢＳ２、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ３Ａ５、ＢＲＳ３．ＳＮＡＩ２、ＣＤＨ１２、ＮＫＸ３．１、ＬＧＲ５、ＴＲＰＭ８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、又はこれらの任意の組み合わせを増幅及び検出するように構成されたプライマー対及びプローブを含む場合がある。
【００６９】
いくつかの実施形態では、遺伝子チップは、ＫＬＫ３、ＡＣＡＤＬ、ＧＲＨＬ２、ＨＯＸＢ１３、ＨＳＤ３Ｂ１、ＴＭＰ．ＥＲＧ、ＡＲＶ３．７、ＡＲＶ５６７、ＦＯＬＨ１、ＫＬＫ２、ＨＳＤ３Ｂ２、ＡＧＲ２、ＡＺＧＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＫＣＮＮ２、ＧＰＸ８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＴＭＥＦＦ２、ＳＰＩＮＫ１、ＳＦＲＰ４、ＮＲＯＢ１、ＦＡＭ１３Ｃ、ＨＮＦ１Ａ、ＣＤＨ１２、ＰＧＲ、ＰＩＴＸ２、ＭＹＢＰＣ１、ＦＯＸＡ１、ＳＲＤ５Ａ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＮＰＹ、ＵＧＴ２Ｂ１７、ＣＬＵＬ１、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＦＬＮＣ、ＧＰＲ３９、ＲＥＬＮ、ＴＨＢＳ２、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ３Ａ５、ＢＲＳ３．ＳＮＡＩ２、ＣＤＨ１２、ＮＫＸ３．１、ＬＧＲ５、ＴＲＰＭ８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、又はこれらの任意の組み合わせを増幅及び検出するように構成された複数のプライマー対及び複数のプローブを含む場合がある。例えば、そして、制限することを意図せずに、いくつかの態様では、遺伝子チップは、分析対象の各ｍＲＮＡバイオマーカーに対して１つのプライマー対及び１つのプローブを含み得る。他の態様では、遺伝子チップは、分析対象の各ｍＲＮＡバイオマーカーに対して１つより多いプライマー対及び１つより多いプローブを含み得る。
【００７０】
好適なプローブとしては、表２にリストされたものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
【表２】
2018507702.tif 000005
ＴａｑＭａｎ（登録商標）レポーター＝ＦＡＭ
【００７２】
ＴＭＰに好適なプライマー及びプローブ：ＥＧＲ及びＡＲＶ７（ＡＲＶ３．７）としては、表３にリストされたものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
【表３】
2018507702.tif 000006
全てのアッセイで、ＦＡＭ  ＴａｑＭａｎレポーターを使用した。
【００７４】
コントロール遺伝子アッセイで、内在性コントロールを使用した。
【実施例】
【００７５】
方法
ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡマニュアル抽出手順
ＲＮＡは、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ  ＧｍｂＨ、２００９年３月）に記載されているように（後で簡潔に述べる）、ＱＩＡＧＥＮのＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｋｉｔを用いて抽出された。
【００７６】
ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブを、スイングアウトローターを用いて、３０００〜５０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清をデカント又はピペッティングにより取り除いた。４ｍＬのＲＮａｓｅフリー水をペレットに加えて、新しい二次的なＢＤ  Ｈｅｍｏｇａｒｄキャップを用いてチューブを閉じた。ペレットが完全に溶解するまでチューブをボルテックスし、３０００〜５０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を全て取り除いて廃棄した。
【００７７】
３５０μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＢＲ１を加えて、ペレットが完全に溶解するまでボルテックスした。１．５ｍＬのマイクロ遠心チューブにサンプルをピペットで入れた。３００μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＢＲ２及び４０μＬのプロテイナーゼＫを加えた。このサンプルを、ボルテックスにより５秒間混和し、シェーカーインキュベーターを用いて５５℃、４００〜１４００ｒｐｍで１０分間インキュベートした。
【００７８】
溶解物を、２ｍＬの処理チューブ（processing tube）に配置されたＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）Ｓｈｒｅｄｄｅｒ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ（紫色）に、ピペットで直接入れ、最高速度（ただし、２０，０００×ｇを超えない）で３分間遠心分離した。フロースルー画分の上清の全てを、新しい１．５ｍＬのマイクロ遠心チューブに、処理チューブ内のペレットを乱さないように慎重に移した。３５０μＬのエタノール（９６〜１００％）を加え、ボルテックスにより混和し、短時間遠心分離にかけて、チューブの蓋の内側から水滴を除去した。
【００７９】
７００μＬのサンプルを、２ｍＬの処理チューブに配置されたＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ（赤）に、ピペットで入れ、８０００〜２０，０００×ｇで１分間遠心分離した。スピンカラムを、新しい２ｍＬの処理チューブに配置した。残ったサンプルを、ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎに、ピペットで入れ、８０００〜２０，０００×ｇで１分間遠心分離した。スピンカラムを、新しい２ｍＬの処理チューブ内に配置し、フロースルーを含有する古い処理チューブを廃棄した。
【００８０】
３５０μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＢＲ３を、ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎに、ピペットで入れ、８０００〜２０，０００×ｇで１分間遠心分離した。スピンカラムを、新しい２ｍＬの処理チューブに配置し、フロースルーを含有する古い処理チューブを廃棄した。
【００８１】
７０μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＲＤＤが入った１．５ｍＬのマイクロ遠心チューブに、１０μＬのＤＮａｓｅ  Ｉストック溶液を加えて、軽く混和した。ＤＮａｓｅ  Ｉインキュベーションミックス（８０μＬ）を、ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎメンブレン上に、ピペットによって直接添加し、机上（２０〜３０℃）に１５分間載置した。３５０μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＢＲ３を、ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎに、ピペットで入れ、８０００〜２０，０００×ｇで１分間遠心分離にかけた。スピンカラムを、新しい２ｍＬの処理チューブ内に配置し、フロースルー画分を含有する古い処理チューブを廃棄した。
【００８２】
更に、５００μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＢＲ４を、ＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎに加え、８０００〜２０，０００×ｇで３分間遠心分離にかけた。フロースルーを含有するチューブを廃棄して、ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡスピンカラムを、新しい２ｍＬの処理チューブに配置して、８０００〜２０，０００×ｇで１分間遠心分離した。
【００８３】
フロースルーを含有するチューブを廃棄した。ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎを、１．５ｍＬのマイクロ遠心チューブ内に配置し、４０μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＢＲ５を、ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎメンブレン上に、ピペットによって直接添加した。カラムを８０００〜２０，０００×ｇで１分間遠心分離して、ＲＮＡを溶出した。この工程を、４０μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＢＲ５及び同じマイクロ遠心チューブを用いて繰り返した。
【００８４】
シェーカーインキュベーター中で、溶出物を、６５℃で５分間振とうさせずにインキュベートした。インキュベーション後、チューブを氷上ですぐに冷やした。ＲＮＡサンプルをすぐに使用しない場合は、−２０℃又は−７０℃で保存した。
【００８５】
ｃＤＮＡの合成
２ｘ逆転写マスターミックスの調製：適切な回数の反応が行われるように、表４に示すようにマスターミックス（２ｘ）を氷上で調製した（反応数＋１０％、２０μＬ反応あたり）。注：１０μＬのサンプルＲＮＡをマスターミックスに加えて、最終反応量を２０μＬとした。
【００８６】
【表４】
2018507702.tif 000007
【００８７】
マスターミックスを数回（５〜１０回）ボルテックスにより混和し、その後、短時間遠心分離した（１５００×ｇ、５〜１０秒間）。反応混合物を、９６ウェルプレートの適切な各ウェルに１０μＬずつ加えた。
【００８８】
マスターミックスへのＲＮＡサンプルの添加：１０μＬの各ＲＮＡサンプルを、９６ウェルプレートの適切なウェル（水のネガティブコントロールを含む）に加えて、最終反応量を２０μＬとした。３回上下にピペッティングすることにより、溶液を緩やかに混合した。９６ウェル反応プレートをプレートシールで密閉して、短時間遠心分離した（１５００×ｇ、６０秒間）。
【００８９】
ＡＢＩ９７００の設定：ＡＢＩ９７００を下記のように設定した。
ステップ１：２５℃で１０分間
ステップ２：３７℃で１２０分間
ステップ３：８５℃で５秒間
ステップ４：４℃で最終ホールド
反応量は、２０μＬに設定した。
【００９０】
ｃＤＮＡの事前増幅
事前増幅及びリアルタイムＰＣＲのためのプライマープローブアッセイミックスの調製：１００μＬの２０Ｘプライマー−プローブ混合物を、リアルタイムＰＣＲ用に調製した。
【００９１】
０．２Ｘ事前増幅アッセイプールの調製：０．２Ｘ事前増幅アッセイプールを、表５に示すように調製した。注：下記の量は、４００μＬの０．２Ｘ事前増幅アッセイプールを調製するためのものである。この量は、テストを行うサンプルの数／Ｔａｑｍａｎアッセイの数に応じて調製することができる。
【００９２】
【表５】
2018507702.tif 000008
【００９３】
サンプル及び２ｘマスターミックスの調製：合成されたｃＤＮＡ反応プレート及び０．２Ｘアッセイミックスプールを、氷上に載置した。２Ｘ事前増幅マスターミックスを、表６に示すように調製した。
【００９４】
【表６】
2018507702.tif 000009
【００９５】
１１．２５μＬのマスターミックスを、９６ウェル反応プレートの適切なウェルにアリコートした。３．７５μＬの各ｃＤＮＡサンプル（ポジティブコントロール及びネガティブコントロールの両方を含む）を、マスターミックス反応プレート内の適切なウェルに移して、３回上下にピペッティングすることによって混合し、短時間遠心分離した。
【００９６】
ＡＢＩ９７００の設定：ＡＢＩ９７００を下記のように設定した。
ステップ１：９５℃で１０分間
ステップ２：９５℃で１５秒間
ステップ３：６０℃で４分間
ステップ４：ステップ２〜３を１４サイクルに設定
ステップ５：４℃で最終ホールド
反応量を、１５μＬに設定した。
【００９７】
事前増幅物の希釈：事前増幅の完了後、事前増幅反応プレートを短時間遠心分離した（１５００×ｇで６０秒間）。ＩＤＴＥを、各反応ウェルに１３５μＬずつ加えて（１：１０希釈）、３回上下にピペッティングすることによってよく混合し、短時間遠心分離した（１５００×ｇで５〜１０秒間）。事前増幅物を、その後更に使用するまでの間、−２０℃で保存した。
【００９８】
Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（商標）９６．９６リアルタイムＰＣＲ
１０Ｘアッセイの調製：１０Ｘアッセイのアリコートを、表７に示す量で調製した。この量は、複数回の実行に合わせて増量することができる。
【００９９】
【表７】
2018507702.tif 000010
【０１００】
サンプルプレミックス及びサンプルの調製：表８中の成分を組み合わせて、サンプルプレミックス及び最終サンプル混合物を作製した。この量は、複数回の実行に合わせて増量することができる。
【０１０１】
【表８】
2018507702.tif 000011
１．５ｍＬのチューブ（チップを完全に満たすのに十分な量）内で、ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ＭｉｘとＧＥサンプル充填試薬とを組み合わせた。その後、このサンプルプレミックスを、各サンプルに３．３μＬずつアリコートすることができる。
【０１０２】
チップの充填：プライム（１３６ｘ）スクリプトが完了すると、プライムされたチップを、ＩＦＣコントローラーＨＸから取り出した。５μＬの各アッセイ及び各サンプルを、チップ上の対応するインレットに、ピペットで入れた。チップを、ＩＦＣコントローラーＨＸへと戻した。ＩＦＣコントローラーＨＸソフトウェアを用いて、ロードミックス（１３６ｘ）スクリプトを実行して、サンプル及びアッセイをチップに充填した。ロードミックス（１３６ｘ）スクリプトが完了すると、充填されたチップをＩＦＣコントローラーから取り出した。
【０１０３】
データ収集ソフトウェアの使用：チップをＢｉｏＭａｒｋにロードして、遺伝子発現アッセイ用の説明書／ラン９６．９６用プロトコル（run 96.96 specific protocols）に従った。
【０１０４】
分析：データ分析には、自動検知器を選択した。ＣＴ＜３５及び４つの複写物のうち１つにおいても存在するサンプルは、増幅に関して陽性と考えた。
【０１０５】
ＡＲ軸−リキッドバイオプシーアッセイの開発手順
プライマーの検証：カスタムデザイン及び再検証Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイを、ＡＢＩにオーダーした（表２及び３に、マーカー及び対応する遺伝子番号の詳細がリストされている）。４つの前立腺癌細胞株（ＶＣａＰ、ＬＮＣａＰ、２２ＲＶ１、及びＰＣ−３）（これらの遺伝子の大部分を表す）のパネルを、アッセイ及びプライマーの検証に用いた。
【０１０６】
ＦＦＰＥＴ（ｆｏｒｍａｌｉｎ  ｆｉｘｅｄ  ｐａｒａｆｆｉｎ  ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ；ホルマリン固定パラフィン包埋組織）由来ＲＮＡの検証：これらのマーカーが真に進行性の腫瘍を示すかどうかをテストするために、これらのアッセイを、４０個のＦＦＰＥ前立腺癌及び隣接する正常組織由来のＲＮＡサンプルのセットにおいてテストした。ＦＦＰＥＴブロック由来のＲＮＡを、ＱｉａｇｅｎのＡｌｌ  Ｐｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  ＦＦＰＥＴ  Ｋｉｔを用いて抽出した。ＲＮＡ濃度を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒで確認した。１２μＬの量中の総ＲＮＡ３５０〜５００ｎｇを、ＱｉａｇｅｎのＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ（商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ及びｐｒｏｔｏｃｏｌを用いて、逆転写した。ｃＤＮＡの約１／３の事前増幅を、ＴａｑＭａｎ  ＰｒｅＡｍｐ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ／ｐｒｏｔｏｃｏｌを用いて、４８個のマーカーを含む２５μＬの反応量中で、１４サイクル行った。事前増幅されたｃＤＮＡを、１ｘ  ＴＥバッファーで１：２０の比率に希釈した。希釈された事前増幅物を、９６．９６Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎチップに充填して、ユーザーガイドに従ってＢｉｏｍａｒｋで実行した。ＡＣＴＢ及びＧＡＰＤＨを内在性コントロールとして用いた。サンプルに対して、４通りのテストを行った（上述のように、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡ−ＲＮＡ  ＦＦＰＥＴ  Ｋｉｔを用いたＲＮＡ抽出）。
【０１０７】
ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）血液にスパイクした細胞株：全血細胞（ＷＢＣ）のバックグラウンドにおけるマーカーの発現が異なるかどうかをテストするために、ＶＣａＰ細胞株を、健常ドナーからのＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）（Ｑｕｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）血液サンプルに、段階的希釈（１０、５０、１００、及び５００細胞）でスパイクした。ＱｉａｇｅｎのＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ（前述）を用いて、総ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ濃度を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ｓｙｓｔｅｍで測定した。１０μＬのＲＮＡから、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ／ｐｒｏｔｏｃｏｌを用いて、ｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡの約１／３の事前増幅を、ＴａｑＭａｎ  ＰｒｅＡｍｐ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、４８個の遺伝子マーカーを含む１５μＬの反応量中で、１４サイクル行った。事前増幅されたｃＤＮＡを、１ｘ  ＴＥバッファーで１：１０の比率に更に希釈した。ＦｌｕｉｄｉｇｍのＢｉｏＭａｒｋユーザーガイドに従って、希釈された事前増幅物を、９６．９６Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎチップに充填して、Ｂｉｏｍａｒｋで実行した。各サンプル及びマーカーのテストは重複して行った。その結果、各遺伝子／サンプルに対して４つの値が得られた。ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、及びＲＰＬ１９を内因性コントロールとして使用し、ＢＳＴ１及びＰＴＰＲＣをＷＢＣコントロールとして使用した。
【０１０８】
前立腺癌患者からのＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）由来ＲＮＡに対するテスト：約１７０個のマーカーを、１４３人の前立腺癌患者及び２０人の健常な男性対象由来のＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡサンプル中でテストした（Ｃａｐｉｔａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｕｒｅｌｉｎｅ、及びＣｏｎｖｅｒｓａｎｔ  Ｂｉｏから取り寄せた癌サンプル）。進行性と緩慢性又は健常ドナーとで検出が異なっていたマーカーを最終的に残した。
【０１０９】
ＶｉｉＡ  ７（商標）機器でのＲＴ−ＰＣＲアッセイにより、ＢｉｏＭａｒｋの結果を確認：Ｂｉｏｍａｒｋ（商標）（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｏ、ＣＡ）プラットフォームで検出されることが分かったマーカーに対して、ＶｉｉＡ７（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によるテストを更に行い、これらの結果を検証／確認した。ＶｉｉＡ７によって順次検証されるマーカーの全てを最終的に残して、リキッドバイオプシーパネルを作成した。
【０１１０】
Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（登録商標）ＢｉｏＭａｒｋ（商標）ＨＤシステム：このハイスループットリアルタイムＰＣＲアッセイを、９６個のサンプル中の９６個の検体を同時に検出可能であり、１回の実行で９，２１６個のデータポイントを作成可能なＦｌｕｉｄｉｇｍ（登録商標）ＢｉｏＭａｒｋ（商標）ＨＤシステムを用いて行った。ＢｉｏＭａｒｋ（商標）ＨＤプラットフォームは、わずか７ｎＬの反応を必要とするサンプル及びアッセイの微小流体分布を用いており、完了までの時間が３時間未満である。
【０１１１】
手順：ＦＦＰＥＴ由来のＲＮＡ及びＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡサンプルを、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて逆転写して、その後、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＴａｑＭａｎ  Ｐｒｅ−Ａｍｐ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを用いて、ｃＤＮＡの事前増幅を１０／１４サイクル行った。事前増幅されたｃＤＮＡを希釈して、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＶｉｉＡ  ７（商標）又はＦｌｕｉｄｉｇｍ（登録商標）の遺伝子発現用Ｂｉｏｍａｒｋ（商標）プラットフォームでテストした。
【０１１２】
前立腺癌患者からの全血から特異的に検出されたｍＲＮＡマーカーの検出
前立腺癌患者及び健常コントロールから採取した全血からのｍＲＮＡマーカー発現レベルから成るデータを使用して、アッセイパラメーターを導き出した。アッセイの独立した検証を可能とするため、データを、トレーニングセットとバリデーションセットに７０％：３０％の比率で分割した。閾値Ｃｔの値を、トレーニングデータの受信者操作特性（ＲＯＣ）分析に基づいて導き出した。また、アッセイの診断性を、感度、特異度、及びＲＯＣ曲線下の面積（area under the ROC curve；ＡＵＣ）を用いて評価した。アッセイを、この検証データにより、独立して評価した。このとき、トレーニングデータから得た閾値を使用して、どの患者が前立腺癌に罹患しているかを予測した。また、アッセイを、感度及び特異度で評価した。表９に、各マーカーに対して決定された閾値Ｃｔの値をリストする。図１に、代表的なマーカーの個別のＲＯＣ曲線を示す。
【０１１３】
【表９】
2018507702.tif 000012
マーカーは、遺伝子記号で表わされている。カットポイントは、各マーカーの検出の閾値Ｃｔの値を示す。感度（Sens）は、そのマーカーが、前立腺癌患者で検出される可能性と同等である。特異性は、そのマーカーが、前立腺癌に罹患していない患者で検出されない可能性と同等である。ＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＣ）は、そのマーカーが、前立腺癌患者で検出されるレベルが、健常コントロールよりも高い可能性である。
【０１１４】
全血からのｍＲＮＡマーカーの検出に基づいた、高リスク前立腺癌の予測
選択されたマーカーの予後能力を、前立腺癌患者及び健常コントロールから採取した全血におけるｍＲＮＡマーカーの発現レベルから成るデータセットにおいて評価した。トレーニングデータにおいて前立腺癌と正常な健常コントロールとを区別するために、閾値を、上述のＲＯＣ分析を用いて導き出した。臨床リスクファクターとの関連性を、フィッシャー直接確率法を用いて評価した。臨床リスクファクターと顕著な関連性を有する選択されたマーカーを、表１０〜１２にリストする。
【０１１５】
【表１０】
2018507702.tif 000013
前立腺癌と正常な健常コントロールとの区別を最適に検出するために導き出された閾値を用いて、マーカーの発現を２つに分けた。診断からのグリソンスコアを用いて、患者を、低（グリソン≦６）リスクサブセットと高（グリソン≧８）リスクサブセットとの２つに分けた。表に、各マーカーが発現した／発現しなかった腫瘍の総数（Ｎ）と、グリソン低リスク群及びグリソン高リスク群におけるマーカー検出を表にまとめたものと、を示す。顕著な関連性については、フィッシャー直接確率法（ｐ値）を用いて判定した。
【０１１６】
【表１１】
2018507702.tif 000014
前立腺癌と正常な健常コントロールとの区別を最適に検出するために導き出された閾値を用いて、マーカーの発現を２つに分けた。患者を、低（ＰＳＡ＜２０ｎｇ／ｍＬ）リスクサブセットと高（ＰＳＡ≧２０ｎｇ／ｍＬ）リスクサブセットとの２つに分けた。表に、各マーカーが発現した／発現しなかった腫瘍の総数（Ｎ）と、ＰＳＡ低リスク群及びＰＳＡ高リスク群におけるマーカー検出を表にまとめたものと、を示す。顕著な関連性については、フィッシャー直接確率法（ｐ値）を用いて判定した。
【０１１７】
【表１２】
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前立腺癌と正常な健常コントロールとの区別を最適に検出するために導き出された閾値を用いて、マーカーの発現を２つに分けた。表に、各マーカーが発現した／発現しなかった腫瘍の総数（Ｎ）と、転移性再発した／発現しなかった腫瘍におけるマーカー検出を表にまとめたものと、を示す。顕著な関連性については、フィッシャー直接確率法（ｐ値）を用いて判定した。
【０１１８】
高リスクの前立腺癌を示す多変量バイオマーカーパネルの識別
複数のｍＲＮＡバイオマーカーを含むバイオマーカーパネルの識別を、前立腺癌患者及び健常コントロールから採取した全血におけるｍＲＮＡマーカーの発現レベルから成るデータセットにおいて行った。１６個の遺伝子（ＡＣＡＤＬ、ＡＧＲ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＦＡＭ１３Ｃ、ＧＰＸ８、ＧＲＨＬ２、ＨＮＦ１Ａ、ＨＯＸＢ１３、ＫＬＫ２、ＫＬＫ３、ＭＹＢＰＣ１、ＮＲ０Ｂ１、ＰＩＴＸ２、ＳＦＲＰ４、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＴＭＥＦＦ２）が、前立腺癌サンプルにおいて、健常有志よりも顕著に高い発現を示すことが識別された。これらの１６個の遺伝子を、後述するように、多変量バイオマーカーパネルに組み込んだ。閾値を、上述のようにＲＯＣ分析を用いて導き出した。閾値は、９０％の特異度で前立腺癌患者を識別するように、すなわち、９０％以上の健常有志が、健常有志として正しく識別されるように選択した。機械学習プロセスを用いて、患者が高リスクとみなされるべき検出陽性バイオマーカーの数を定義した。過剰適応を防止するために、データを、上述のように、トレーニングセットとバリデーションセットとに分割した。トレーニングセットを用いて、最適な数の陽性マーカーを含む分類ルールを定義する。具体的には、トレーニングデータから１００個のサンプルをランダムに選択することにより、ブーストラップサンプルを作成した。分類ルールは、予測されるバイオマーカーのステータスと、生化学的再発までの時間との相関を評価することにより、作成した。この相関は、バイオマーカー陽性状態の対象が、バイオマーカー陰性状態の対象よりも早く生化学的再発を経験する可能性を測定する、Ｃ統計量（concordance index）を用いて測定された。分類ルールの最適な数の特徴として、８個のマーカーが識別された。すなわち、８個より多い数のマーカーが陽性の対象が、バイオマーカー陽性であると判断され、生化学的再発までの時間がより短いと予測される。この分類ルールと生化学的再発までの時間との関連性を、ｃｏｘ回帰分析を用いたサンプルの独立バリデーションセットを用いて検証した。多変量バイオマーカーパネルにより、バイオマーカー陰性の母集団と比較して、生化学的再発までの時間が著しく短い対象のサブセットが識別された（ＨＲ＝７．９４、ｐ値＝０．０２４）。
【０１１９】
当業者であれば、本発明の好ましい実施形態に対して、多数の変更及び修正を加えることができ、そのような変更及び修正が、本発明の精神を逸脱しない範囲内で行うことができることを理解するであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨及び範囲に含まれる、そのような等価的な変形の全てを網羅することが意図されている。
【０１２０】
本明細書に引用又は記載されている各特許、特許出願、及び刊行物の開示は、その全文において本明細書に参考として組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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