(57)【要約】本発明は、ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内で中または低メチル化レベルを有する対象における癌の治療のための方法を提供する。関連キット及び製品も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における癌を治療する方法であって、前記対象に有効量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与することを含み、治療が、前記対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低レベルのメチル化を有する前記対象に基づく、前記方法。
【請求項２】
対象における癌を治療する方法であって、但し、前記対象が、前記対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低レベルのメチル化を有することが見出されていることを条件とし、前記治療が、有効量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項３】
癌を治療する方法であって、
（ａ）癌を有する対象であって、前記対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低レベルのメチル化を有する、対象を選択することと、
（ｂ）ステップａ）で選択された前記対象に有効量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与することと、を含む、前記方法。
【請求項４】
癌を有する対象が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いた治療に応答する可能性が高いかどうかを予測する方法であって、前記対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、メチル化レベルを測定することを含み、前記試料中の前記ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１における、または前記ＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位における、中または低レベルのメチル化が、前記対象が前記治療に応答する可能性が高いことを示す、前記方法。
【請求項５】
対象における癌を治療する方法であって、
（ａ）前記対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、メチル化レベルを測定することと、
（ｂ）有効量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、前記ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において、または前記ＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低レベルのメチル化を有することが判定されている前記対象に投与し、それにより、前記対象における癌を治療することと、を含む、前記方法。
【請求項６】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体治療に応答する可能性が高い癌を有する対象を特定する方法であって、
（ａ）前記対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、メチル化を評価することと、
（ｂ）前記試料中の前記ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／または前記ＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低レベルのメチル化を有する前記対象を特定することと、を含む、前記方法。
【請求項７】
有効量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を前記対象に投与することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記対象が、前記ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において、または前記ＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低レベルのメチル化を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記対象が、前記ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において、及び前記ＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低レベルのメチル化を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記メチル化レベルが、バイサルファイト配列決定により判定される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
中レベルのメチル化が、約２０％〜約４０％のメチル化である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
低レベルのメチル化が、約２０％未満のメチル化である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記メチル化レベルが、バイサルファイト次世代配列決定により判定される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
中レベルのメチル化が、約５％〜約６０％のメチル化である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
低レベルのメチル化が、約５％未満のメチル化である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記メチル化レベルが、メチル化チップアレイを使用して判定される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
中レベルのメチル化が、約０．２〜０．３のベータ値である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
低レベルのメチル化が、約０．２未満のベータ値である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象からの前記試料が、免疫細胞浸潤の根拠を示す、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
免疫細胞浸潤の根拠が、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ｑＰＣＲ、ｑＲＴ−ＰＣＲ、トランスクリプトームプロファイリング、マイクロアレイ分析、または次世代配列決定により検出されるＣＤ８＋リンパ球により示される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記癌が、肺癌、乳癌、膀胱癌、または黒色腫である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記癌が肺癌であり、前記肺癌が、非小細胞肺癌、肺扁平上皮癌腫、または肺腺癌腫である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を阻害する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、ＰＤ−Ｌ１のＢ７−１への結合を阻害する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、ＰＤ−Ｌ１の、ＰＤ−１及びＢ７−１の両方への結合を阻害する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）２断片からなる群から選択される抗体断片である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＤＸ−１１０５、ＭＥＤＩ４７３６、及びＭＳＢ００１０７１８Ｃからなる群から選択される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、配列番号１５のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１６のＨＶＲ−Ｈ２配列、及び配列番号３のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む重鎖と、配列番号１７のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号１８のＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１９のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖とを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
一緒にパッケージ化された、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物と、前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体または薬学的組成物が、前記対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低レベルのメチル化を有する癌を有する対象の治療に適応することを表示するラベルとを含む、製品。
【請求項３３】
試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、メチル化レベルを測定するための試薬を含む、キット。
【請求項３４】
前記ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／または前記ＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低メチル化レベルを有するとして前記対象を分類するための使用説明書をさらに含む、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体と、前記対象が、前記ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／または前記ＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低メチル化レベルを有する場合、前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体を前記対象に投与するための使用説明書とをさらに含む、請求項３３または請求項３４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年５月２９日出願の米国仮出願第６２／１６８，６６８号の優先権の利益を主張するものであり、この仮出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：コンピュータ可読形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１４６３９２０２７０４０ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ、記録日：２０１６年５月２７日、サイズ：１９ＫＢ）。
【０００３】
本発明は、患者からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域の上流領域及び／またはＰＤ−Ｌ１のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位においてメチル化レベルを判定することにより、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いた治療のために癌患者を層別化する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ＰＤ−Ｌ１は、多くの癌で過剰発現され、多くの場合、予後不良に関連している（Ｏｋａｚａｋｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｉｍｍｕｎ．２００７  １９（７）：８１３）（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＲＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６，６６（７）：３３８１）。興味深いことに、腫瘍浸潤Ｔリンパ球の大半は、正常組織中のＴリンパ球及び末梢血Ｔリンパ球とは対照的に、ＰＤ−１を主に発現し、腫瘍反応性Ｔ細胞でのＰＤ−１の上方制御が抗腫瘍免疫応答障害に寄与し得ることを示す（Ｂｌｏｏｄ  ２００９  １１４（８）：１５３７）。これは、Ｔ細胞活性化の減衰及び免疫監視の回避をもたらす、ＰＤ−１発現Ｔ細胞と相互作用するＰＤ−Ｌ１発現腫瘍細胞により媒介されるＰＤ−Ｌ１シグナル伝達の利用に起因し得る（Ｓｈａｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  ２００２）（Ｋｅｉｒ  ＭＥ  ｅｔ  ａｌ．，２００８  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：６７７）。したがって、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用の阻害が、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性の腫瘍死滅を増強し得る。
【０００５】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び悪性腫瘍を治療する上でのそれらの使用が記載されている（例えば、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７，３９−４６ｌ、Ｈｅｒｂｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ５１５，５６３−５６７を参照されたい）。ある特定の患者は、免疫チェックポイント阻害剤に対する一次耐性を有する（例えば、Ｔａｕｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．４，１２７、Ｓｚｎｏｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９，１０２１−３４、及びＧａｊｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２８６−９２を参照されたい）。したがって、抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法に対する癌患者の応答性を予測する必要性が未だにある。
【０００６】
本明細書で開示される全ての参考文献、公報、及び特許出願は、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００７】
ある特定の実施形態において、本発明は、対象に有効量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与することを含む、対象における癌を治療するか、または癌の進行を遅延させる方法を提供し、ここで、治療（または、進行の遅延）は、対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低レベルのメチル化を有する対象に基づく。
【０００８】
ある特定の実施形態において、本発明は、対象における癌を治療するか、または癌の進行を遅延させる方法を提供するが、但し、対象が、対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低レベルのメチル化を有することが見出されていることを条件とし、本方法は、有効量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を対象に投与することを含む。
【０００９】
ある特定の実施形態において、本発明は、（ａ）癌を有する対象であって、該対象が、対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低レベルのメチル化を有する、対象を選択することと、（ｂ）このように選択された対象に有効量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与することとを含む、癌を治療するか、または癌の進行を遅延させる方法を提供する。
【００１０】
ある特定の実施形態において、本発明は、対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、メチル化レベルを測定することを含む、癌を有する対象が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いた治療に応答する可能性が高いかどうかを予測する方法を提供し、ここで、試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１における、またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位における中または低レベルのメチル化は、治療に応答する可能性が高い対象を示す。
【００１１】
ある特定の実施形態において、（ａ）対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、メチル化レベルを測定することと、（ｂ）有効量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において、またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低レベルのメチル化を有することが判定されている対象に投与することとを含む、対象における癌を治療する方法が提供される。
【００１２】
ある特定の実施形態において、本発明は、（ａ）対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、メチル化を評価することと、（ｂ）試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低レベルのメチル化を有する対象を特定することとを含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体治療に応答する可能性が高い癌を有する対象を特定する方法を提供する。
【００１３】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用されるような）いくつかの実施形態において、本方法は、有効量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を対象に投与することをさらに含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用されるような）いくつかの実施形態において、対象は、ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において、及びＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低レベルのメチル化を有する。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用されるような）いくつかの実施形態において、メチル化レベルは、バイサルファイト次世代配列決定により判定される。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用されるような）いくつかの実施形態において、メチル化レベルは、バイサルファイト次世代配列決定により判定される。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用されるような）いくつかの実施形態において、メチル化レベルは、メチル化チップアレイを使用して判定される。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用されるような）いくつかの実施形態において、対象からの試料は、免疫細胞浸潤の根拠を示す。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用されるような）いくつかの実施形態において、免疫細胞浸潤の根拠は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ｑＰＣＲ、ｑＲＴ−ＰＣＲ、トランスクリプトームプロファイリング、マイクロアレイ分析、または次世代配列決定により検出されるＣＤ８＋リンパ球により示される。
【００１４】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用されるような）いくつかの実施形態において、バイサルファイト配列決定により判定される場合、約２０％〜約４０％のメチル化の中レベルのメチル化。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用されるような）いくつかの実施形態において、バイサルファイト配列決定により判定される場合の低レベルのメチル化は、約２０％未満のメチル化である。
【００１５】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用されるような）いくつかの実施形態において、バイサルファイト次世代配列決定により判定される場合、約５％〜約６０％のメチル化の中レベルのメチル化。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用されるような）いくつかの実施形態において、バイサルファイト次世代配列決定により判定される場合の低レベルのメチル化は、約５％未満のメチル化である。
【００１６】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用されるような）いくつかの実施形態において、メチル化チップアレイにより判定される場合の中レベルのメチル化は、約０．２〜約０．３のベータ値である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用されるような）いくつかの実施形態において、メチル化チップアレイにより判定される場合の低レベルのメチル化は、約０．２未満のベータ値である。
【００１７】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用されるような）いくつかの実施形態において、癌は、肺癌、乳癌、膀胱癌、または黒色腫である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用されるような）いくつかの実施形態において、癌は、肺癌であり、肺癌は、非小細胞肺癌、肺扁平上皮癌腫、または肺腺癌腫である。
【００１８】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用されるような）いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を阻害する。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用されるような）いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１のＢ７−１への結合を阻害する。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用されるような）いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１の、ＰＤ−１及びＢ７−１の両方への結合を阻害する。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用されるような）いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、モノクローナル抗体である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用されるような）いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）２断片からなる群から選択される抗体断片である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用されるような）いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用されるような）いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＤＸ−１１０５、及びＭＥＤＩ４７３６からなる群から選択される。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用されるような）いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号１５のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１６のＨＶＲ−Ｈ２配列、及び配列番号３のＨＶＲ−Ｈ３配列を含む重鎖と、配列番号１７のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号１８のＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１９のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖とを含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用されるような）いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本発明は、一緒にパッケージ化された、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物と、抗ＰＤ−Ｌ１抗体または薬学的組成物が、対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低レベルのメチル化を有する癌を有する対象の治療に適応することを表示するラベルとを含む、製品を提供する。
【００２０】
いくつかの実施形態において、本発明は、対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、メチル化レベルを測定するための試薬と、ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低メチル化レベルを有するとして対象を分類するための使用説明書とを含むキットを提供する。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用されるような）いくつかの実施形態において、キットまたは製品は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と、対象が、ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低メチル化レベルを有する場合、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を対象に投与するための使用説明書とをさらに含む。
【００２１】
本明細書に記載される様々な実施形態の特性のうちの１つ、いくつか、または全てを組み合わせて、本発明の他の実施形態を形成することができることを理解されたい。本発明のこれら及び他の態様は、当業者に明らかであろう。本発明のこれら及び他の実施形態は、以下の発明を実施するための形態によりさらに記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】９１個の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株に関するＰＤ−Ｌ１発現レベル及びＰＤ−Ｌ１プロモーターのメチル化ヒートマップを示す。
【図１Ａ】９１個の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株に関するＰＤ−Ｌ１発現レベル及びＰＤ−Ｌ１プロモーターのメチル化ヒートマップを示す。
【図１Ｂ】９１個の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株に関するＰＤ−Ｌ１発現レベル及びＰＤ−Ｌ１プロモーターのメチル化ヒートマップを示す。
【図１Ｃ】９１個の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株に関するＰＤ−Ｌ１発現レベル及びＰＤ−Ｌ１プロモーターのメチル化ヒートマップを示す。
【図１Ｄ】９１個の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株に関するＰＤ−Ｌ１発現レベル及びＰＤ−Ｌ１プロモーターのメチル化ヒートマップを示す。
【図１Ｅ】９１個の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株に関するＰＤ−Ｌ１発現レベル及びＰＤ−Ｌ１プロモーターのメチル化ヒートマップを示す。
【図２Ａ】Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓからの肺腺癌腫腫瘍の集合における、ＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡ発現とＰＤ−Ｌ１プロモーターメチル化との相関性の分析の結果を示す。
【図２Ｂ】Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓからの肺扁平上皮癌腫腫瘍の集合における、ＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡ発現とＰＤ−Ｌ１プロモーターメチル化との相関性の分析の結果を示す。
【図２Ｃ】Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓからの乳癌腫瘍の集合における、ＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡ発現とＰＤ−Ｌ１プロモーターメチル化との相関性の分析の結果を示す。
【図２Ｄ】Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓからの皮膚癌腫腫瘍の集合における、ＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡ発現とＰＤ−Ｌ１プロモーターメチル化との相関性の分析の結果を示す。
【図３】５つの肺癌細胞株（すなわち、Ｈ６６１、ＬＸＦＬ５２９、Ａ４２７、Ｈ２０７３、Ｈ３２２Ｔ、及びＨ１９９３）におけるＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡの発現に対する、５アザ−ｄＣ、ＴＳＡ、ＩＦＮｇ、または５アザ−ｄＣ＋ＴＳＡ＋ＩＦＮｇ処理の効果を評価するために行われた実験の結果を示す。
【図４Ａ】４つの異なる肺癌細胞株（Ａ４２７、Ｈ２９２、Ｈ３２２Ｔ、及びＨ３５８）における、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現及びＲＮＡ発現に対するＩＦＮｇ処理の効果を評価するために行われた実験の結果を示す。
【図４Ｂ】Ａ４２７、Ｈ２９２、Ｈ３２２Ｔ、及びＨ３５８細胞株内のＩＦＮｇ／ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路に対する３０分のＩＦＮｇ処理及び２４時間のＩＦＮｇ処理の効果を判定するために行われた実験の結果を示す。
【図４Ｃ】Ａ４２７及びＨ３５８における、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、及びＰＤ−Ｌ１発現に対するＩＦＮｇ処理、ならびに／またはＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３ノックダウンの効果を判定するために行われた実験の結果を示す。
【図５Ａ】末梢血単核細胞サブセットに対して想定されるＣｐＧメチル化部位のマップ上への、バイサルファイト配列決定データの重ね合わせを示す。
【図５Ａ−１】末梢血単核細胞サブセットに対して想定されるＣｐＧメチル化部位のマップ上への、バイサルファイト配列決定データ。
【図５Ａ−２】末梢血単核細胞サブセットに対して想定されるＣｐＧメチル化部位のマップ上への、バイサルファイト配列決定データ。
【図５Ａ−３】末梢血単核細胞サブセットに対して想定されるＣｐＧメチル化部位のマップ上への、バイサルファイト配列決定データ。
【図５Ｂ】ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内の高、中、または低メチル化レベルを有する、不死化正常肺細胞株、及びＮＳＣＬＣ肺癌細胞株に対して想定されるＣｐＧメチル化部位のマップ上への、バイサルファイト配列決定データの重ね合わせを示す。
【図５Ｂ−１】ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内の高、中、または低メチル化レベルを有する、不死化正常肺細胞株、及びＮＳＣＬＣ肺癌細胞株に対して想定されるＣｐＧメチル化部位のマップ上への、バイサルファイト配列決定データ。
【図５Ｂ−２】ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内の高、中、または低メチル化レベルを有する、不死化正常肺細胞株、及びＮＳＣＬＣ肺癌細胞株に対して想定されるＣｐＧメチル化部位のマップ上への、バイサルファイト配列決定データ。
【図５Ｂ−３】ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内の高、中、または低メチル化レベルを有する、不死化正常肺細胞株、及びＮＳＣＬＣ肺癌細胞株に対して想定されるＣｐＧメチル化部位のマップ上への、バイサルファイト配列決定データ。
【図６Ａ】Ｘ軸上の平滑化ＣｐＧ１及びＣｐＧ５メチル化（Ｍ値）を、Ｙ軸上のＰＤ−Ｌ１発現（ＲＮＡ配列、Ｌｏｇ２カウント）と直接比較するＮＳＣＬＣ細胞株のＣａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＣＧＰ）から作製された点図表プロットを示す。
【図６Ｂ】図６ＡのＮＳＣＬＣ細胞株が分類分けされた３つのメチル化レベルグループ（すなわち、「低」、「中」、及び「高」）の統計的適切性を判定するために行われたＡＮＯＶＡ分析の結果を示す。
【図６Ｃ】図６ＡのＮＳＣＬＣ細胞株内のＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡ発現に対する５アザ−ｄＣ処理の効果の統計的適切性を判定するために行われたＡＮＯＶＡ分析の結果を示す。
【図６Ｄ】連結型ＮＳＣＬＣ細胞株Ｈ１９９３及びＨ２０７３における、ＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡ発現に対する５アザ−ｄＣ処理の効果を判定するために行われた実験の結果を示す。
【図７Ａ】ＮＳＣＬＣ細胞株内のＴ細胞浸潤と、ＣｐＧ５（ｍｕｔ７）におけるメチル化と、ＰＤ−Ｌ１タンパク質レベルとの間の関係の統計的適切性を判定するために行われたＡＮＯＶＡ分析の結果を示す。
【図７Ｂ】ＮＳＣＬＣ細胞株内のＴ細胞浸潤と、ＣｐＧ５（ｍｕｔ７）におけるメチル化と、ＰＤ−Ｌ１転写レベルとの間の関係の統計的適切性を判定するために行われたＡＮＯＶＡ分析の結果を示す。
【図８】ＩｇＶ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｉｅｗｅｒ（Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で表示された．ｂｅｄファイルを提供する。ｂｅｄファイルは、ＳＴＡＴ１及び／またはＳＴＡＴ３が、Ａ４２７及びＨ３５８細胞株内のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域に結合するかどうかを判定するために行われたＣｈＩＰ配列実験の結果を提供する。
【図８Ａ】ＩｇＶ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｉｅｗｅｒ（Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で表示された．ｂｅｄファイルを提供する。ｂｅｄファイルは、ＳＴＡＴ１及び／またはＳＴＡＴ３が、Ａ４２７及びＨ３５８細胞株内のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域に結合するかどうかを判定するために行われたＣｈＩＰ配列実験の結果を提供する。
【図８Ｂ】ＩｇＶ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｉｅｗｅｒ（Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で表示された．ｂｅｄファイルを提供する。ｂｅｄファイルは、ＳＴＡＴ１及び／またはＳＴＡＴ３が、Ａ４２７及びＨ３５８細胞株内のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域に結合するかどうかを判定するために行われたＣｈＩＰ配列実験の結果を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
Ｉ．一般的技法
本明細書において記載されるか、または参照される技法及び手順は、当業者により概して十分に理解され、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，（２００３））、ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ），ｅｄ．，１９８７）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ  Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３−８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ａｎｄ  Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８−１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．��ｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）、及びＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）に記載される広く利用されている方法論などの、従来の方法論などを使用して一般的に用いられる。
【００２４】
ＩＩ．定義
本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、臨床的病変の経過中に治療されている個体または細胞の自然経過を改変するように設計された臨床的介入を指す。治療の望ましい効果には、疾患進行速度の減速、疾患状態の回復または緩和、及び寛解または予後の改善が含まれる。例えば、個体は、癌性細胞の増殖の低減（もしくは破壊）、疾患に起因する症状の減少、疾患に罹患している者の生活の質の向上、疾患の治療に必要な他の薬剤の用量の減少、及び／または個体の生存期間の延長を含むが、これらに限定されない、癌に関連する１つ以上の症状が軽減または排除された場合、「治療」が成功する。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「ｂａｓｅｄ  ｕｐｏｎ（に基づく）」は、（１）本明細書に記載されるような患者の特徴を評価すること、判定すること、または測定すること（及び好ましくは、治療を受けるのに好適な患者を選択すること、及び（２）本明細書に記載されるような治療（複数可）を行うこと、を含む。
【００２６】
治療目的のための「対象」、「患者」、または「個体」は、ヒト、飼育動物及び家畜、ならびに動物園、競技用、または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「疾患の進行を遅延させる」は、疾患（癌など）の発症を延期し、妨害し、減速し、遅らせ、安定させ、かつ／または延ばすことを意味する。この遅延は、治療されている病歴及び／または個体に応じて異なる期間であり得る。当業者に明らかであるように、十分または著しい遅延は、個体が疾患を発症しないという点で、予防を事実上包含し得る。例えば、転移の発症などの末期癌を遅延させることができる。
【００２８】
「有効量」とは、特定の障害の測定可能な改善または予防をもたらすために必要な少なくとも最小の量である。本明細書における有効量は、患者の疾患状態、年齢、性別、及び体重、ならびに個体における所望の応答を誘発する抗体の能力などの要因に応じて異なり得る。有効量は、治療上有益な効果が治療の任意の毒性効果または有害効果を上回るものでもある。予防的使用の場合、有益なまたは所望の結果には、疾患の生化学的、組織学的、及び／または挙動的症状、その合併症、ならびに疾患の発症中に現れる中間病理学的表現型を含む、疾患のリスクの排除もしくは低減、疾患の重症度の軽減、または疾患の発生の遅延などの結果が含まれる。治療的使用の場合、有益なまたは所望の結果には、疾患に起因する１つ以上の症状の減少、疾患に罹患している者の生活の質の向上、疾患の治療に必要な他の薬剤の用量の減少、別の薬剤の効果の増強（例えば、標的による）、疾患の進行の遅延、及び／または生存期間の延長などの臨床結果が含まれる。癌または腫瘍の場合、有効量の薬物は、癌細胞の数を低減させ、腫瘍サイズを低減させ、癌細胞の末梢器官への浸潤を阻害し（すなわち、ある程度遅らせるか、または望ましくは停止し）、腫瘍転移を阻害し（すなわち、ある程度遅らせるか、または望ましくは停止し）、腫瘍成長をある程度阻害し、かつ／または障害に関連する症状のうちの１つ以上をある程度軽減する効果を有し得る。有効量は、１回以上の投与で投与され得る。本発明の目的に関しては、薬物、化合物、または薬学的組成物の有効量は、予防的または治療的治療を直接または間接的に達成するのに十分な量である。臨床分野において理解されるように、薬物、化合物、または薬学的組成物の有効量は、別の薬物、化合物、または薬学的組成物と併せて達成されても、されなくてもよい。したがって、「有効量」は、１つ以上の療法剤を投与するという点で考慮され得、単剤は、１つ以上の他の薬剤と併せて、望ましい結果が達成され得るか、または達成される場合、有効量で与えられると見なされ得る。
【００２９】
「細胞増殖性障害」及び「増殖性障害」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖に関連する障害を指す。一実施形態において、細胞増殖性障害は、癌である。一実施形態において、細胞増殖性障害は、腫瘍である。
【００３０】
「腫瘍」は、本明細書で使用される場合、悪性か良性かを問わず、全ての腫瘍性細胞の成長及び増殖、ならびに全ての前がん性及びがん性細胞及び組織を指す。「癌」、「癌性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」、及び「腫瘍」という用語は、本明細書で言及される場合、相互排他的ではない。
【００３１】
「癌」及び「癌性」という用語は、制御されていない細胞成長を典型的に特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか、または説明する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病またはリンパ系悪性腫瘍、扁平上皮癌（例えば、上皮性扁平上皮癌）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）または胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）（消化管癌及び消化管間質癌など）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路性の癌、肝細胞癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、子宮内膜癌または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）または腎臓癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、多発性骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度／びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非開裂細胞性ＮＨＬ、巨大病変性ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、及びヴァルデンストレームマクログロブリン血症など）、慢性骨髄芽球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞性白血病、慢性骨髄芽球性白血病、及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症に関連する異常血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、メイグス症候群、脳癌、ならびに頭頸部癌、軟部組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌腫、及び中皮腫、膠芽腫、神経芽細胞腫、ならびに関連する転移が含まれるが、これらに限定されない。癌の他の例には、乳癌（乳癌腫など）、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌腫、及び肺の扁平上皮癌腫など）、及び皮膚癌（黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫、結節型黒色腫、及び皮膚癌腫など）（それらの癌の転移型を含む）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
「試料」は、本明細書で使用される場合、例えば、物理的、生化学的、化学的、及び／または生理的特徴に基づいて特性化及び／または特定される、細胞実体及び／または他の分子実体を含有する、目的の対象から得られるか、またはそれに由来する、組成物を指す。例えば、「疾患試料」という用語、及びその変化形は、特性化される細胞実体及び／または分子実体を含有することが予想されるか、または含有することが知られている、目的の対象から得られる任意の試料を指す。試料は、核酸（ポリヌクレオチド、例えばゲノムＤＮＡ及び／または転写など）及び／またはポリペプチドが単離され得る対象からの癌細胞及び／または腫瘍細胞を含有する生物学的組織または流体の生物学的試料（エクスビボ生物学的試料など）であり得る。かかる試料は典型的には、ヒト対象からのものであるが、他の対象（本明細書の他の場所に記載されるような哺乳動物として分類されるかかる任意の動物）から単離される組織を含む。試料には、生体組織及び解剖試料などの組織の切片、組織学的目的のために採取された凍結切片も含まれ得る。試料には、対象から採取したての試料、またはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料などの保存組織試料が含まれ得る。試料には、患者組織に由来する外植片、ならびに初代及び／または形質転換細胞培養物も含まれる。
【００３３】
「組織または細胞試料」は、対象または患者の組織から得られる同様の細胞の集合を意味する。組織または細胞試料の供給源は、採取したての、凍結された、及び／または保存された、臓器もしくは組織試料、または生体組織もしくは吸引液；血液または任意の血液組成成分；脳脊髄液、羊膜液、腹腔液、または組織液などの体液；対象の妊娠期間または発育における任意の時期の細胞からの固形組織であり得る。組織試料は、初代もしくは培養細胞、または細胞株でもあり得る。任意に、組織または細胞試料は、疾患組織／臓器から得られる。組織試料は、防腐剤、抗凝固剤、緩衝液、固定剤、栄養素、抗生物質などの、自然界の組織とは自然には混合されない化合物を含有し得る。
【００３４】
「細胞傷害性剤」という用語は、本明細書で使用される場合、（例えば、細胞死を引き起こすか、増殖を阻害するか、またはさもなければ細胞機能を妨害する）細胞に有害である任意の薬剤を指す。細胞傷害性剤には、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、成長阻害剤、酵素及びそれらの断片、例えば、核酸分解酵素、ならびに毒素、例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の小分子毒素または酵素的に活性な毒素（それらの断片及び／または変異体を含む）が含まれるが、これらに限定されない。例示的な細胞傷害性剤は、抗微小管薬、白金配位錯体、アルキル化剤、抗生物質剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、代謝拮抗薬、トポイソメラーゼＩ阻害剤、ホルモン及びホルモン類似体、シグナル伝達経路阻害剤、非受容体チロシンキナーゼ血管新生阻害剤、免疫療法剤、アポトーシス促進剤、ＬＤＨ−Ａ阻害剤、脂肪酸生合成阻害剤、細胞周期シグナル伝達阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ならびに癌代謝阻害剤から選択され得る。一実施形態において、細胞傷害性剤は、タキサンである。一実施形態において、タキサンは、パクリタキセルまたはドセタキセルである。一実施形態において、細胞傷害性剤は、白金剤である。一実施形態において、細胞傷害性剤は、ＥＧＦＲのアンタゴニストである。一実施形態において、ＥＧＦＲのアンタゴニストは、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミン（例えば、エルロチニブ）である。一実施形態において、細胞傷害性剤は、ＲＡＦ阻害剤である。一実施形態において、ＲＡＦ阻害剤は、ＢＲＡＦ及び／またはＣＲＡＦ阻害剤である。一実施形態において、ＲＡＦ阻害剤は、ベムラフェニブである。一実施形態において、細胞傷害性剤は、ＰＩ３Ｋ阻害剤である。
【００３５】
「化学療法剤」は、癌の治療において有用な化合物を指す。化学療法剤の例には、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍ．）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．）、ジスルフィラム、没食子酸エピガロカテキン、サリノスポラミドＡ、カーフィルゾミブ、１７−ＡＡＧ（ゲルダナマイシン）、ラディシコール、乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨ−Ａ）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、スニチブ（ｓｕｎｉｔｉｂ）（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ／Ｓｕｇｅｎ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フィナスネート（ｆｉｎａｓｕｎａｔｅ）（ＶＡＴＡＬＡＮＩＢ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ）、５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）、ロイコボリン、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＧＳＫ５７２０１６、Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ）、ロナファミブ（Ｌｏｎａｆａｍｉｂ）（ＳＣＨ  ６６３３６）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標）、Ｂａｙｅｒ  Ｌａｂｓ）、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＡＧ１４７８、アルキル化剤、例えばチオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド；アルキルスルホネート、例えばブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；エチレンイミン及びメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホルアミド、及びトリメチロメラミンを含む）；アセトゲニン（特に、ブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（トポテカン及びイリノテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ−１０６５（そのアゾゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；副腎皮質ステロイド（プレドニゾン及びプレドニゾロンを含む）；酢酸シプロテロン；５α−還元酵素フィナステリド及びデュタステリドを含む）；ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット、バルプロ酸、モセチノスタットドラスタチン；アルデスロイキン、タルクデュオカルマイシン（合成類似体ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エロイテロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチイン；スポンジスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロマファジン（ｃｈｌｏｍａｐｈａｚｉｎｅ）、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド���酸塩（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ  ｏｘｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンω１Ｉ（Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１９９４  ３３：１８３−１８６）；ダイネマイシン（ダイネマイシンＡを含む）；ビスホスホネート、例えばクロドロネート；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カミノマイシン（ｃａｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン、クロモマイシニス（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）（ドキソルビシン）、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えばメトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補液（ｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、例えばフロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビスアントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジ��オン；エルホミチン（ｅｌｆｏｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシノイド、例えばマイタンシン及びアンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダムノール（ｍｏｐｉｄａｍｎｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド（２−ｅｔｈｙｌｈｙｄｒａｚｉｄｅ）；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン（ｓｉｚｏｆｕｒａｎ）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（パクリタキセル、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（クレモホール不含）、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌ．）、及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）（ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）；Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）；クロランムブシル（ｃｈｌｏｒａｎｍｂｕｃｉｌ）；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）（ゲムシタビン）；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金系剤、エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；カペシタビン；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）（ビノレルビン）；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチノイン酸；ならびに上述のもののいずれかの薬学的に許容される塩、酸、及び誘導体が含まれる。
【００３６】
この定義には、（ｉ）抗エストロゲン剤及び選択的エストロゲン受容体調節剤（ＳＥＲＭ）などの、腫瘍に対してホルモン作用を制御または阻害するように作用する抗ホルモン剤（例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）、クエン酸タモキシフェン）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン（ｉｏｄｏｘｙｆｅｎｅ）、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）（クエン酸トレミファイン（ｔｏｒｅｍｉｆｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ）を含む）、（ｉｉ）副腎におけるエストロゲン産生を制御するアロマターゼ酵素を阻害する、アロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）（酢酸メゲストロール）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）（エキセメスタン、Ｐｆｉｚｅｒ）、フォルメスタニー（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）（ボロゾール）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）など、（ｉｉｉ）抗アンドロゲン剤、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；ブセレリン、トリプテレリン（ｔｒｉｐｔｅｒｅｌｉｎ）、酢酸メドロキシプロゲステロン、ジエチルスチルベストロール、プレマリン、フルオキシメステロン、全てのトランスレチオニン酸（ｔｒａｎｓｒｅｔｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、フェンレチニド、ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）、（ｉｖ）タンパク質キナーゼ阻害剤、（ｖ）脂質キナーゼ阻害剤、（ｖｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｌｆ、及びＨ−Ｒａｓ；（ｖｉｉ）リボザイム、例えば、ＶＥＧＦ発現阻害剤（例えば、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標））及びＨＥＲ２発現阻害剤、（ｖｉｉｉ）ワクチン、例えば、遺伝子療法用ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）、ｒＩＬ−２；トポイソメラーゼ１阻害剤、例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ、ならびに（ｉｘ）上述のもののいずれかの薬学的に許容される塩、酸、及び誘導体も含まれる。
【００３７】
化学療法剤には、抗体、例えば、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）、Ｉｍｃｌｏｎｅ）、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ）、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）、ペルツズマブ（ＯＭＮＩＴＡＲＧ（登録商標）、２Ｃ４、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ、Ｃｏｒｉｘｉａ）、及び抗体−薬物コンジュゲート、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）も含まれる。本発明の化合物との併用で薬剤として治療可能性を有するさらなるヒト化モノクローナル抗体には、アポリズマブ、アセリズマブ（ａｓｅｌｉｚｕｍａｂ）、アトリズマブ、バピネオズマブ、ビバツズマブメルタンシン（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ  ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、カンツズマブメルタンシン、セデリズマブ（ｃｅｄｅｌｉｚｕｍａｂ）、セトリズマブペゴール、シドフシツズマブ（ｃｉｄｆｕｓｉｔｕｚｕｍａｂ）、シドツズマブ（ｃｉｄｔｕｚｕｍａｂ）、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、エルリズマブ（ｅｒｌｉｚｕｍａｂ）、フェルビズマブ（ｆｅｌｖｉｚｕｍａｂ）、フォントリズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、ラベツズマブ、リンツズマブ、マツズマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、モトビズマブ（ｍｏｔｏｖｉｚｕｍａｂ）、ナタリズマブ、ニモツズマブ（ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）、ノロビズマブ（ｎｏｌｏｖｉｚｕｍａｂ）、ヌマビズマブ（ｎｕｍａｖｉｚｕｍａｂ）、オクレリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パスコリズマブ（ｐａｓｃｏｌｉｚｕｍａｂ）、ペクフシツズマブ（ｐｅｃｆｕｓｉｔｕｚｕｍａｂ）、ペクツズマブ（ｐｅｃｔｕｚｕｍａｂ）、パキセリズマブ、ラリビズマブ（ｒａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）、ラニビズマブ、レスリビズマブ（ｒｅｓｌｉｖｉｚｕｍａｂ）、レスリズマブ、レシビズマブ（ｒｅｓｙｖｉｚｕｍａｂ）、ロベリズマブ（ｒｏｖｅｌｉｚｕｍａｂ）、ルプリズマブ（ｒｕｐｌｉｚｕｍａｂ）、シブロツズマブ（ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、シプリズマブ、ソンツズマブ（ｓｏｎｔｕｚｕｍａｂ）、タカツズマブテトラキセタン（ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ  ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、タドシズマブ（ｔａｄｏｃｉｚｕｍａｂ）、タリズマブ、テフィバズマブ（ｔｅｆｉｂａｚｕｍａｂ）、トシリズマブ、トラリズマブ（ｔｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、ツコツズマブセルモロイキン（ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ  ｃｅｌｍｏｌｅｕｋｉｎ）、ツクシツズマブ（ｔｕｃｕｓｉｔｕｚｕｍａｂ）、ウマビズマブ（ｕｍａｖｉｚｕｍａｂ）、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、ビジリズマブ、及びインターロイキン−１２  ｐ４０タンパク質を認識するように遺伝子修飾された排他的にヒト配列の組換え全長ＩｇＧ１λ抗体である、抗インターロイキン−１２（ＡＢＴ−８７４／Ｊ６９５、Ｗｙｅｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が含���れる。
【００３８】
「成長阻害剤」は、本明細書で使用されるとき、インビトロまたはインビボのいずれかで細胞の成長を阻害する化合物または組成物を指す。一実施形態において、成長阻害剤は、抗体が結合する抗原を発現する細胞の増殖を予防または低減する成長阻害抗体である。別の実施形態において、成長阻害剤は、Ｓ期の細胞の割合を著しく低減させるものであり得る。成長阻害剤の例には、Ｇ１停止及びＭ期停止を誘導する薬剤などの、細胞周期進行（Ｓ期以外の場所で）を遮断する薬剤が含まれる。従来のＭ期遮断薬には、ビンカ（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン、及び、例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンなどのトポイソメラーゼＩＩ阻害剤が含まれる。Ｇ１を停止する薬剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、及びａｒａ−ＣなどのＤＮＡアルキル化剤は、Ｓ期停止にも波及する。さらなる情報は、ＭｕｒａｋａｍｉらによるＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ａｎｄ  Ｉｓｒａｅｌ，ｅｄｓ．，Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、第１章、表題「Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ」（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５）、例えば、ｐ．１３で見ることができる。タキサン（パクリタキセル及びドセタキセル）は、両方ともイチイに由来する抗癌薬である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ）は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体由来の微小管の構築を促進し、脱重合を阻止することにより微小管を安定させ、結果的に、細胞内での有糸分裂を阻害する。
【００３９】
本明細書における「抗体」という用語は、最も広義に使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷抗体から形成された多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を具体的に包含するが、これは、それらが所望の生物活性を呈する場合に限る。
【００４０】
「抗ＰＤ−Ｌ１抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ＰＤ−Ｌ１と、その結合パートナー、例えば、ＰＤ−１、Ｂ７−１のうちのいずれか１つ以上との相互作用に起因するシグナル伝達を減少、遮断、阻害、抑止、または妨害するアンタゴニスト抗体を指す。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１のその結合パートナーへの結合を阻害する抗体である。具体的な態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１の、ＰＤ−１及び／またはＢ７−１への結合を阻害する。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体には、ＰＤ−Ｌ１とその結合パートナー、例えば、ＰＤ−１、Ｂ７−１のうちの１つ以上との相互作用に起因するシグナル伝達を減少、遮断、阻害、抑止、または妨害するその抗原結合断片が含まれる。一実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１を通したＴリンパ球媒介性シグナル伝達上で発現された細胞表面タンパク質によりまたはそれを介して媒介される陰性共刺激シグナルを低減し、機能障害Ｔ細胞の機能障害性をより低くする（例えば、抗原認識へのエフェクター応答を増強する）。一実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書に記載されるＹＷ２４３．５５．Ｓ７０である。別の実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書に記載されるＭＤＸ−１１０５である。別の実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書に記載されるＭＰＤＬ３２８０Ａである。別の実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書に記載されるＭＥＤＩ４７３６である。
【００４１】
「遮断」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物活性を阻害または低減するものである。いくつかの実施形態において、遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的にまたは完全に阻害する。本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−１によるシグナル伝達を遮断する。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、「ｂｉｎｄｓ（結合する）」、「ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ（に特異的に結合する）」、または「ｉｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ（に特異である）」という用語は、生物学的分子を含む分子の異種分子集団の存在下で標的の存在を決定する、標的と抗体との間の結合などの測定可能かつ再現可能な相互作用を指す。例えば、標的（エピトープであり得る）に結合するか、またはそれに特異的に結合する抗体は、この標的に、他の標的に結合するよりも高い親和性で、結合力で、より容易に、かつ／またはより長期間結合する抗体である。一実施形態において、抗体が無関係の標的に結合する程度は、例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）により測定される場合、抗体の標的への結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態において、標的に特異的に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態において、抗体は、異なる種由来のタンパク質間で保存されるタンパク質上のエピトープに特異的に結合する。別の実施形態において、特異的結合は、排他的結合を含み得るが、それを必要としない。
【００４３】
「抗体断片」は、無傷抗体の一部分を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
【００４４】
「全長抗体」、「無傷抗体」、及び「全抗体」という用語は、以下に定義される抗体断片ではない、その実質的に無傷の形態の抗体を指すために本明細書で互換的に使用される。これらの用語は特に、Ｆｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。
【００４５】
「単離された」抗体は、その自然環境の構成成分から特定及び分離され、かつ／または回収されたものである。その自然環境の汚染物質成分は、抗体の試験的、診断的、または治療的使用を妨害するであろうで材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が含まれ得る。いくつかの実施形態において、抗体は、（１）例えば、ローリー法により決定される場合、９５重量％超、いくつかの実施形態において、９９重量％超まで、（２）例えば、スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度まで、または（３）例えば、クマシーブルーもしくはシルバー染色を使用して、還元もしくは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質になるまで精製される。単離抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの構成成分が存在しないため、組換え細胞内でインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常、単離抗体は、少なくとも１つの精製ステップにより調製されるであろう。
【００４６】
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖が１つのジスルフィド共有結合により重鎖に連結している一方で、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重及び軽鎖は、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、いくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖は、一方の端（ＶＬ）に可変ドメインを有し、その他方の端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられている。
【００４７】
「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分の配列が抗体間で大きく異なり、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性において使用されるという事実を指す。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均等に分布していない。これは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの両方において、超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、主にβシート構成を採用し、３つの超可変領域により連結され、βシート構造に連結し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する４つのＦＲを含む。各鎖内の超可変領域は、ＦＲにより近接近して一緒に保持され、他の鎖の超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与していないが、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）における抗体の関与などの様々なエフェクター機能を呈する。
【００４８】
抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位を有する、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、及び「Ｆｃ」断片を産生し、その名前は、容易に結晶化するその能力を反映している。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原に架橋することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。
【００４９】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、密接な非共有結合性会合にある１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この構成において、各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を画定する。集合的に、６つの超可変領域は、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一可変ドメイン（または抗原に特異的な超可変領域を３つのみ含むＦｖの半分）でさえも、抗原を認識してそれに結合する能力を有するが、全結合部位よりも親和性が低い。
【００５０】
Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加の分だけＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が少なくとも１つの遊離チオール基を持つＦａｂ’の本明細書における表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
【００５１】
任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なる種類のうちの１つに割り当てられ得る。
【００５２】
抗体は、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てられ得る。無傷抗体には５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２にさらに分別され得る。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元構成が周知されており、例えば、Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄ．（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｃｏ．，２０００）に概して記載される。抗体は、抗体と１つ以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有会合または非共有会合により形成された、より大きな融合分子の一部であり得る。
【００５３】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチドに存在している。いくつかの実施形態において、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これは、ｓｃＦｖが抗原結合に所望の構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖの概説に関しては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
【００５４】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小抗体断片を指し、これらの断片は、同じポリペプチド鎖内の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合させられ、２つの抗原結合部位が作製される。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）により完全に記載される。
【００５５】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団に含まれる個々の抗体は、同一であり、かつ／または同じエピトープに結合するが、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る想定される変異体は除外され、かかる変異体は、概して、少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンにより汚染されていないという点で有利である。「モノクローナル」という修飾語句は、実質的に同種の抗体集団から得られているような抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、まずＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により記載されるハイブリドーマ法により作製され得るか、または組換えＤＮＡ法により作製され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）、及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技法を使用してファージ抗体ライブラリから単離もされ得る。
【００５６】
本明細書におけるモノクローナル抗体は、重及び／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または同種である一方で、鎖（複数可）の残りが、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または同種である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにかかる抗体の断片を特異的に含むが、これは、それらが所望の生物活性を呈する場合に限る（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書における目的のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザル、またはカニクイザルなどの旧世界ザル）に由来する可変ドメイン抗原結合配列、及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が含まれる（米国特許第５，６９３，７８０号）。
【００５７】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（供与体抗体）の超可変領域由来の残基により置き換えられるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの事例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも供与体抗体にも見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに洗練するために行われる。概して、ヒト化抗体は、上述のＦＲ置換（複数可）を除いて、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、かつＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。ヒト化抗体は任意に、免疫グロブリンの定常領域、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分も含むであろう。さらなる詳細に関しては、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【００５８】
「ヒト抗体」は、ヒトにより産生され、かつ／または本明細書で開示されるヒト抗体を作製するための技法のうちのいずれかを使用して作製されている抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的に除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む当技術分野で既知の様々な技法を使用して産生され得る。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）。Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）、Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）に記載される方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である。ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５：３６８−７４（２００１）も参照されたい。ヒト抗体は、抗原攻撃に応答してかかる抗体を産生するように修飾されているが、その内因性遺伝子座が無効化されているトランスジェニック動物、例えば、免疫化異種マウスに抗原を投与することにより調製され得る（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関しては、米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号を参照されたい）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されるヒト抗体に関しては、例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０３：３５５７−３５６２（２００６）も参照されたい。
【００５９】
いくつかのＨＶＲ描写が本明細書で使用され、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づき、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは、その代わりに、構造的ループの位置に言及する（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＡｂＭ  ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ  ＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａ構造的ループとの間の妥協案を示し、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。これらＨＶＲの各々の残基は、以下に記載される。
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【００６０】
ＨＶＲは、以下の「伸長ＨＶＲ」を含み得る：ＶＬにおいて、２４−３６または２４−３４（Ｌ１）、４６−５６または５０−５６（Ｌ２）、及び８９−９７または８９−９６（Ｌ３）、ならびにＶＨにおいて、２６−３５（Ｈ１）、５０−６５もしくは４９−６５（Ｈ２）、及び９３−１０２、９４−１０２、または９５−１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、これらの定義の各々に関しては、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）に従って番号付けされる。
【００６１】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書に定義されるような超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００６２】
「ネイキッド抗体」は、細胞傷害性部分などの異種分子または放射標識に複合されない（本明細書に定義される）抗体である。
【００６３】
「ａｂｏｕｔ（約）」という用語は、本明細書で使用される場合、当業者に容易に知られているそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（かつ説明する）。例えば、「約Ｘ」を言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。
【００６４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ（１つの）」、「ｏｒ（または）」、及び「ｔｈｅ（その）」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。本明細書に記載される本発明の態様及び変形は、態様及び変形「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ（からなる）」及び／または「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（から本質的になる）」を含むことが理解される。
【００６５】
本発明を詳細に記載する前に、本発明が特定の組成物または生物学的系に限定されず、言うまでもなく多様であり得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語が特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図されていないことも理解されたい。
【００６６】
ＩＩＩ．方法
いくつかの実施形態において、対象に有効量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与することを含む、対象における癌を治療するか、または癌の進行を遅延させる方法が提供され、ここで、治療は、対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低レベルのメチル化を有する対象に基づく。
【００６７】
いくつかの実施形態において、対象における癌を治療するか、または癌の進行を遅延させる方法が提供されるが、但し、対象が、対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低レベルのメチル化を有することが見出されていることを条件とし、本方法は、有効量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を対象に投与することを含む。
【００６８】
いくつかの実施形態において、（ａ）癌を有する対象であって、該対象が、対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低レベルのメチル化を有する、対象を選択することと、（ｂ）このように選択された対象（ステップ（ａ）で選択された）に有効量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与することとを含む、癌を治療するか、または癌の進行を遅延させる方法が提供される。
【００６９】
いくつかの実施形態において、対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、メチル化レベルを測定することを含む、癌を有する対象が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いた治療に応答する可能性が高いかどうかを予測する方法が提供され、ここで、試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１における、またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位における、中または低レベルのメチル化が、対象が治療に応答する可能性が高いことを示す。
【００７０】
いくつかの実施形態において、（ａ）対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、メチル化レベルを測定することと、（ｂ）有効量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において、またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低レベルのメチル化を有することが判定されている対象に投与することとを含む、対象における癌を治療する方法が提供される。
【００７１】
いくつかの実施形態において、（ａ）対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、メチル化レベルを測定することと、（ｂ）有効量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、ステップ（ａ）で測定された場合、ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において、またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低レベルのメチル化を有することが判定されている対象に投与することとを含む、対象における癌を治療する方法が提供される。
【００７２】
いくつかの実施形態において、対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、メチル化レベルを測定することと、対象が、ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において、またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低レベルのメチル化を有する場合、有効量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を対象に投与することとを含む、対象における癌を治療する方法が提供される。
【００７３】
いくつかの実施形態において、（ａ）対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、メチル化レベルを評価するかまたは測定することと、（ｂ）対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において、またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低レベルのメチル化を有する対象を特定することとを含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体治療に応答する可能性が高い癌を有する対象を特定する方法が提供される。いくつかの実施形態において、本方法は、有効量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を対象に投与することをさらに含む。
【００７４】
ある特定の実施形態において、本明細書で提供される方法は、ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において、及びＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、メチル化レベルを評価することを含む。
【００７５】
ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１のゲノム配位（本明細書でＭｕｔ２とも称される）は、ｈｇ１９  ｃｈｒ９：５４４９８８７−５４４９８９１である。ＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位のゲノム配位（本明細書でＣｐＧ５またはＭｕｔ７とも称される）は、ｈｇ１９  ｃｈｒ９：５４５０９３４−５４５１０７２である。これらの配位の配列は、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）などの公開オンラインゲノムデータベースで得ることができる。
【００７６】
ＣｐＧ１の核酸配列は、ＧＣＴＣＧ（配列番号２２）である。
【００７７】
ＣｐＧ５の核酸配列は、ＣＡＣＧＧＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＴ  ＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＴＧＡＣＴＴＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＴＣＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＴＣＴＡＡＧＴＡＡＧ  ＴＣＴＣＴＴＣＣＴＧＣＧＣＴＡＡＧＣＡＧＧＴＣＣＡＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＡＣＧＧＡＡＴＴＴＡＴＴＴＧＣＴＣＴＧＴＣＣＡＴＴ（配列番号２３）である。
【００７８】
ｈｇ１９  ｃｈｒ９：５４４９８８７−５４５１０７２の配列は、以下に提供される（ＣｐＧ１及びＣｐＧ５は、下線部分である）。
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【００７９】
メチル化レベルを判定する方法
ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１における及び／またはＰＤ−Ｌ１のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位におけるメチル化度は、多様な方法を使用して測定され得る。ある特定の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１における、またはＰＤ−Ｌ１のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位におけるメチル化度は、バイサルファイトＤＮＡ配列決定により判定される。バイサルファイトを用いたＤＮＡの処理は、シトシン（「Ｃ」）残基をウラシル（「Ｕ」）に変換するが、５−メチルシトシン残基には影響を及ぼさない。したがって、バイサルファイト処理は、個体のシトシン残基のメチル化状態に応じるＤＮＡ配列に特異的な変化を導入し、それにより、ＤＮＡのセグメントのメチル化状態についての単一−ヌクレオチド分解情報を得る。この情報を回復するために、様々な分析が変化配列において行われ得る。次いで、いくつかの実施形態において、目的のバイサルファイト修飾配列（ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位など）は、２セットのストランド特異的プライマーを有するＰＣＲにより増幅されて、各ストランドの１つずつからなる１対の断片を得、ここで、チミン及び５−メチルシトシン残基のみがシトシンとして増幅される場合、全てのウラシル及びチミン残基が増幅される。ＰＣＲ産生物は、直接配列決定され得るか、またはクローン化及び配列決定されて、単一のＤＮＡ分子のメチル化マップを提供し得る（例えば、Ｆｒｏｍｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：１８２７−１８３１，１９９２を参照されたい）。
【００８０】
いくつかの実施形態において、バイサルファイト配列決定により判定される場合の低レベルのメチル化は、ＣｐＧ１における約２０％未満のメチル化である（１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または約１％未満の値間の任意の範囲を含む、これらのメチル化のうちのいずれか１つなど）。いくつかの実施形態において、バイサルファイト配列決定により判定される場合の低レベルのメチル化は、ＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位における約２０％％未満のメチル化である（１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または約１％未満の値間の任意の範囲を含む、これらのメチル化のうちのいずれか１つなど）。いくつかの実施形態において、バイサルファイト配列決定により判定される場合の低レベルのメチル化は、ＣｐＧ１における約２０％未満のメチル化（１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または約１％未満の値間の任意の範囲を含む、これらのメチル化のうちのいずれか１つなど）、及びＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位における約２０％未満のメチル化である（１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または約１％未満の値間の任意の範囲を含む、これらのメチル化のうちのいずれか１つなど）。
【００８１】
いくつかの実施形態において、バイサルファイト配列決定により判定される場合の中レベルのメチル化は、ＣｐＧ１における約２０％〜約４０％のメチル化である（２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、または４０％の値間の任意の範囲を含む、これらのうちのいずれか１つなど）。いくつかの実施形態において、バイサルファイト配列決定により判定される場合の中レベルのメチル化は、ＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位における約２０％〜約４０％のメチル化である（２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、または４０％の値間の任意の範囲を含む、これらのうちのいずれか１つなど）。いくつかの実施形態において、バイサルファイト配列決定により判定される場合の中レベルのメチル化は、ＣｐＧ１における約２０％〜約４０％のメチル化（２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、または４０％の値間の任意の範囲を含む、これらのうちのいずれか１つなど）、及びＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位における約２０％〜約４０％のメチル化である（２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、または４０％の値間の任意の範囲を含む、これらのうちのいずれか１つなど）。
【００８２】
いくつかの実施形態において、バイサルファイト配列決定により判定される高レベルのメチル化は、ＣｐＧ１における約４０％超〜約１００％のメチル化である（４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の値間の任意の範囲を含む、これらのメチル化のうちのいずれか１つなど）。いくつかの実施形態において、バイサルファイト配列決定により判定される高レベルのメチル化は、ＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位における約４０％超〜約１００％のメチル化である（４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の値間の任意の範囲を含む、これらのメチル化のうちのいずれか１つなど）いくつかの実施形態において、バイサルファイト配列決定により判定される高レベルのメチル化は、ＣｐＧ１における約４０％超〜約１００％のメチル化（４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の値間の任意の範囲を含む、これらのメチル化のうちのいずれか１つなど）、及びＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位における約４０％超〜約１００％のメチル化である（４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の値間の任意の範囲を含む、これらのメチル化のうちのいずれか１つなど）。
【００８３】
ある特定の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１における及び／またはＰＤ−Ｌ１のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位におけるメチル化度は、バイサルファイト次世代配列決定（ＢＳ−ＮＧＳ）により判定され、ここで、バイサルファイトで処理されるＤＮＡは、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）ＨＩ  ＳＥＱ（商標）配列決定系などの高処理次世代配列決定系を使用して分析される。バイサルファイト次世代配列決定に関する追加の詳細に関しては、例えば、Ｆａｒｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１５．０２．００１、Ｔｉｅｄｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１４．１０．０１３、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．１６９０１１．１１３、Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＰＬＯＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．  ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｇｅｎ．１００４７９２を参照されたい。
【００８４】
いくつかの実施形態において、バイサルファイト次世代配列決定により判定される場合の低レベルのメチル化は、ＣｐＧ１における約５％未満のメチル化である（約４％、約３％、約２％、約１％、または約１％未満のメチル化など、これらの値間の任意の範囲を含む）。いくつかの実施形態において、バイサルファイト次世代配列決定により判定される場合の低レベルのメチル化は、ＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位における約５％未満のメチル化である（約４％、約３％、約２％、約１％、または約１％未満のメチル化など、これらの値間の任意の範囲を含む）。いくつかの実施形態において、バイサルファイト次世代配列決定により判定される場合の低レベルのメチル化は、ＣｐＧ１における約５％未満のメチル化（約４％、約３％、約２％、約１％、または約１％未満のメチル化など、これらの値間の任意の範囲を含む）、及びＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位における約５％未満のメチル化である（約４％、約３％、約２％、約１％、または約１％未満のメチル化など、これらの値間の任意の範囲を含む）。
【００８５】
いくつかの実施形態において、バイサルファイト次世代配列決定により判定される場合の中レベルのメチル化は、ＣｐＧ１における約５％〜約６０％のメチル化である（５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または約６０％未満のメチル化の値間の任意の範囲を含む、これらのうちのいずれか１つなど）。いくつかの実施形態において、バイサルファイト次世代配列決定により判定される場合の中レベルのメチル化は、ＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位における約５％〜約６０％のメチル化である（５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または約６０％未満のメチル化の値間の任意の範囲を含む、これらのうちのいずれか１つなど）。いくつかの実施形態において、バイサルファイト次世代配列決定により判定される場合の中レベルのメチル化は、ＣｐＧ１における約５％〜約６０％のメチル化（約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、または約６０％未満のメチル化など、これらの値間の任意の範囲を含む）、及びＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位における約５％〜約６０％のメチル化である（５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または約６０％未満のメチル化の値間の任意の範囲を含む、これらのうちのいずれか１つなど）。
【００８６】
いくつかの実施形態において、バイサルファイト次世代配列決定により判定される高レベルのメチル化は、ＣｐＧ１における約６０％〜約１００％のメチル化である（６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、約９９％超、または約１００％のメチル化の値間の任意の範囲を含む、これらのうちのいずれか１つなど）。いくつかの実施形態において、バイサルファイト次世代配列決定により判定される高レベルのメチル化は、ＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位における約６０％〜約１００％のメチル化である（６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、約９９％超、または約１００％のメチル化の値間の任意の範囲を含む、これらのうちのいずれか１つなど）。いくつかの実施形態において、バイサルファイト次世代配列決定により判定される高レベルのメチル化は、ＣｐＧ１における約６０％〜約１００％のメチル化（かかる約６０％、約６０％超、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、約９９％超、または約１００％のメチル化の値間の任意の範囲を含む）、及びＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位における約６０％〜約１００％のメチル化である（６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、約９９％超、または約１００％のメチル化の値間の任意の範囲を含む、これらのうちのいずれか１つなど）。
【００８７】
ある特定の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１における及び／またはＰＤ−Ｌ１のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位におけるメチル化度は、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）のＩＮＦＩＮＩＵＭ（登録商標）ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ＢｅａｄＣｈｉｐアレイなどのメチル化チップアレイを使用して判定される。簡潔に言うと、バイサルファイトを用いた処理後に、ゲノムＤＮＡは、全ゲノム増幅され（ＷＧＡ）、酵素的に断片化され、精製され、ヒトメチル化４５０ＢｅａｄＣｈｉｐｓに付加され、これは、９９％のＲｅｆＳｅｑ遺伝子を包含する４８５，５１２個のプローブを含有する。プローブは、ショア領域及びｍｉＲＮＡプロモーター、ならびに非ＣｐＧ部位の３０９１個のプローブにおいて、追加の包含を以って１９，７５５個の特有のＣｐＧアイランドを査定する。交雑の間、バイサルファイトで処理されたＷＧＡ−ＤＮＡ分子は、個別のビーズの種類に連結する遺伝子座特異的ＦＮＡオリゴマーにアニールする。２つのビーズの種類は、各ＣｐＧ遺伝子座に対応し、すなわち、一方はメチル化（「Ｃ」）に、及び他方は非メチル化（「Ｔ」）状態に対応する。対立遺伝子特異的プライマーのアニール後に、ＤＮＰ及びビオチンで標識化されたｄｄＮＴＰを使用する単一塩基伸長法が続く。同じＣｐＧ遺伝子座に対する両方のビーズの種類は、ＣｐＧ遺伝子座内の査定された「Ｃ」の前に塩基により判定された同じ種類に標識化されたヌクレオチドを組み込み、したがって、同色のチャンネル内で検出されるであろう。伸長後、アレイは、蛍光染色、かつスキャンされ、非メチル化及びメチル化のビーズの種類により産生されるシグナルの強度が測定される。各試料中の各遺伝子座に関して、ＤＮＡメチル化値を記録するためにソフトウェアが使用され、「ベータ値」として記載される。ＤＮＡメチル化ベータ値は、０〜１の継続可変値であり、これは、メチル化ビーズの種類の強度の、組み合わされた遺伝子座の強度に対する比を示す。ＩＮＦＩＮＩＵＭ（登録商標）ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ＢｅａｄＣｈｉｐアレイ及びアッセイプラットフォームのさらなる詳述は、例えば、Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７２，３−８、Ｓａｎｄｏｖａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６，６９２−７０２、ｄｅ  Ｒｕｉｊｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌａｂｉｎｖｅｓｔ．２０１５．５３、Ｌｅｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６，３７−４９に記載され、他の場所にも記載される。
【００８８】
いくつかの実施形態において、メチル化チップアレイ（ＩＮＦＩＮＩＵＭ（登録商標）ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ＢｅａｄＣｈｉｐアレイなど）を使用して判定される場合の低レベルのメチル化は、ＣｐＧ１に関して約０〜約０．２未満のベータ値である（０、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、及び０．１９の値間の任意の範囲を含む、これらのうちのいずれか１つなど）。いくつかの実施形態において、メチル化チップアレイ（ＩＮＦＩＮＩＵＭ（登録商標）ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ＢｅａｄＣｈｉｐアレイなど）を使用して判定される場合の低レベルのメチル化は、ＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位に関して約０〜約０．２未満のベータ値である（０、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、及び０．１９の値間の任意の範囲を含む、これらのうちのいずれか１つなど）。いくつかの実施形態において、メチル化チップアレイ（ＩＮＦＩＮＩＵＭ（登録商標）ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ＢｅａｄＣｈｉｐアレイなど）を使用して判定される場合の低レベルのメチル化は、ＣｐＧ１に関して約０〜約０．２未満ほどのベータ値（０、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、及び０．１９の値間の任意の範囲を含む、これらのうちのいずれか１つなど）、及びＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位に関して約０〜約０．２未満のベータ値である（０、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、及び０．１９の値間の任意の範囲を含む、これらのうちのいずれか１つなど）。
【００８９】
いくつかの実施形態において、メチル化チップアレイ（ＩＮＦＩＮＩＵＭ（登録商標）ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ＢｅａｄＣｈｉｐアレイなど）を使用して判定される場合の中レベルのメチル化は、ＣｐＧ１に関して約０．２〜約０．３のベータ値である（０．２、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、または０．２９の値間の任意の範囲を含む、これらのうちのいずれか１つなど）。いくつかの実施形態において、メチル化チップアレイ（ＩＮＦＩＮＩＵＭ（登録商標）ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ＢｅａｄＣｈｉｐアレイなど）を使用して判定される場合の中レベルのメチル化は、ＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位に関して約０．２〜約０．３のベータ値である（０．２、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、または０．２９の値間の任意の範囲を含む、これらのうちのいずれか１つなど）。いくつかの実施形態において、メチル化チップアレイ（ＩＮＦＩＮＩＵＭ（登録商標）ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ＢｅａｄＣｈｉｐアレイなど）を使用して判定される場合の中レベルのメチル化は、ＣｐＧ１に関して約０．２〜約０．３のベータ値（０．２、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、または０．２９の値間の任意の範囲を含む、これらのうちのいずれか１つなど）、及びＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位に関して約０．２〜約０．３のベータ値である（０．２、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、または０．２９の値間の任意の範囲を含む、これらのうちのいずれか１つなど）。
【００９０】
いくつかの実施形態において、メチル化チップアレイ（ＩＮＦＩＮＩＵＭ（登録商標）ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ＢｅａｄＣｈｉｐアレイなど）を使用して判定される場合の高レベルのメチル化は、ＣｐＧ１に関して約０．３超〜約１．０のベータ値である（０．３超、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、または１．０の値間の任意の範囲を含む、これらのうちのいずれか１つなど）。いくつかの実施形態において、メチル化チップアレイ（ＩＮＦＩＮＩＵＭ（登録商標）ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ＢｅａｄＣｈｉｐアレイなど）を使用して判定される場合の高レベルのメチル化は、ＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位に関して約０．３超〜約１．０のベータ値である（０．３超、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、または１．０の値間の任意の範囲を含む、これらのうちのいずれか１つなど）。いくつかの実施形態において、メチル化チップアレイ（ＩＮＦＩＮＩＵＭ（登録商標）ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ＢｅａｄＣｈｉｐアレイなど）を使用して判定される場合の高レベルのメチル化は、ＣｐＧ１に関して約０．３超〜約１．０のベータ値（０．３超、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、または１．０の値間の任意の範囲を含む、これらのうちのいずれか１つなど）、及びＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位に関して約０．３超〜約１．０のベータ値である（０．３超、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、または１．０の値間の任意の範囲を含む、これらのうちのいずれか１つなど）。
【００９１】
いくつかの実施形態において、対象からの試料は、核酸（ポリヌクレオチド、例えばゲノムＤＮＡ及び／または転写など）及び／またはポリペプチドが単離され得る対象からの癌細胞及び／または腫瘍細胞を含有する生物学的組織または流体の生物学的試料（エクスビボ生物学的試料など）である。いくつかの実施形態において、試料は、組織学目的のために採取されたものなどの組織の凍結切片を含む。いくつかの実施形態において、試料は、生体組織から採取される。いくつかの実施形態において、試料は、解剖から採取される。いくつかの実施形態において、試料は、凍結組織試料である。いくつかの実施形態において、試料は、対象から得られた採取したての試料である。いくつかの実施形態において、試料は、保存組織試料である。いくつかの実施形態において、試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料である。いくつかの実施形態において、試料は、対象からの組織に由来する外植片、または初代及び／もしくは形質転換細胞培養物である。
【００９２】
本明細書に記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、対象からの癌細胞を含有する試料は、免疫細胞浸潤の根拠をさらに示す。ある特定の実施形態において、対象からの癌細胞を含有する試料中のＣＤ１６＋、ＣＤ４＋、ＣＤ３＋、ＣＤ５６＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ６８＋、ＣＤ２０＋、ＣＤ１６３＋、またはＣＤ８＋リンパ球のうちのいずれか１つ以上の存在は、免疫細胞浸潤を示し、ある特定の実施形態において、対象からの癌細胞を含有する試料中のＣＤ８＋リンパ球の存在は、免疫細胞浸潤を示す。ある特定の実施形態において、対象からの癌細胞を含有する試料中のＣＤ１６＋、ＣＤ４＋、ＣＤ３＋、ＣＤ５６＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ６８＋、ＣＤ２０＋、ＣＤ１６３＋、またはＣＤ８＋リンパ球のうちの１つ以上の存在が、当業者により周知されており、広く使用される免疫組織化学的（ＩＨＣ）アッセイを使用して検出される。かかる方法には、例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、及びフローサイトメトリーが含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、対象からの癌細胞を含有する試料中のＣＤ１６＋、ＣＤ４＋、ＣＤ３＋、ＣＤ５６＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ６８＋、ＣＤ２０＋、ＣＤ１６３＋、またはＣＤ８＋リンパ球のうちの１つ以上の存在は、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ｑＲＴ−ＰＣＲ、トランスクリプトームプロファイリング（ＲＮＡ配列など）、マイクロアレイ分析、次世代配列決定などが含まれるが、これらに限定されない遺伝子発現分析技法を使用して検出される。かかるサービスは、例えば、ＦＬＵＩＤＩＧＭ（登録商標）、ＮＡＮＯＳＴＲＩＮＧ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（登録商標）などにより提供される。
【００９３】
ある特定の実施形態において、対象からの癌細胞を含有する試料は、ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中レベルのメチル化を有し、免疫細胞浸潤の根拠を有さない場合、対象は抗ＰＤ−Ｌ１抗体で治療されない。ある特定の実施形態において、対象からの癌細胞を含有する試料は、ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中レベルのメチル化を有し、免疫細胞浸潤の根拠を有する場合、対象は抗ＰＤ−Ｌ１抗体で治療される。
【００９４】
癌
本明細書に記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、癌は、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、またはリンパ系悪性腫瘍である。本明細書に記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、癌は、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、またはリンパ系悪性腫瘍である。いくつかの実施形態において、癌は、扁平上皮癌（例えば、上皮性扁平上皮癌）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）または胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）（消化管癌及び消化管間質癌など）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路性の癌、肝細胞癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、子宮内膜癌または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）または腎臓癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、多発性骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度／びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非開裂細胞性ＮＨＬ、巨大病変性ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、及びヴァルデンストレームマクログロブリン血症など）、慢性骨髄芽球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞性白血病、慢性骨髄芽球性白血病、及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症に関連する異常血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、メイグス症候群、脳癌、ならびに頭頸部癌、軟部組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌腫、及び中皮腫、膠芽腫、神経芽細胞腫、ならびに関連する転移である。
【００９５】
ある特定の実施形態において、本発明の方法による治療を受け入れられる癌には、乳癌、肺癌、及び皮膚癌（それらの癌の転移型を含む）が含まれる。ある特定の実施形態において、乳癌は、乳癌腫である。いくつかの実施形態において、肺癌は、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌腫、または肺の扁平上皮癌腫である。ある特定の実施形態において、皮膚癌は、黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫、結節型黒色腫、皮膚癌腫、または膀胱癌である。
【００９６】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体
ＰＤ−Ｌ１（「プログラム死−リガンド１」としても既知である、ＰＤＣＤ１Ｌ１、ＰＤＣＤ１ＬＧ１、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ、及びＣＤ２７４）は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び骨髄系細胞上で見られる受容体であるＰＤ−１に結合する４０ｋＤａ種１の膜貫通型タンパク質である。ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との係合は、ＩＬ−２産生及びＴ細胞増殖のＴＣＲ媒介性活性化を阻害するシグナルを送達する。ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１経路は、主要な機序として結び付き、それにより、腫瘍が免疫系による排除を回避する（Ｌｉｐｓｏｎ  ＥＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ２０１３；１（１）：５４−６３）。理論に束縛されるわけではないが、抗ＰＤ−Ｌ１抗体によるＰＤ−Ｌ１の阻害は、Ｔ細胞の活性化を可能にし得、したがって、それらが癌細胞及び腫瘍細胞を効果的に検出し、攻撃する能力を復元する。
【００９７】
本明細書で提供される方法のいずれか１つのある特定の実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（または、その抗原結合断片）は、ＰＤ−Ｌ１のその結合パートナーへの結合を阻害する。具体的な態様において、ＰＤ−Ｌ１結合パートナーは、ＰＤ−１及び／またはＢ７−１である。ある特定の実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（または、その抗原結合断片）は、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＤＸ−１１０５、ＭＥＤＩ４７３６、及びＭＳＢ００１０７１８Ｃからなる群から選択される。ＢＭＳ−９３６５５９としても既知であるＭＤＸ−１１０５は、ＷＯ２００７／００５８７４に記載される抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（配列番号２０及び２１にそれぞれ示される重及び軽鎖可変領域配列）は、ＷＯ２０１０／０７７６３４  Ａ１に記載される抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。ＭＥＤＩ４７３６は、ＷＯ２０１１／０６６３８９及びＵＳ２０１３／０３４５５９に記載される抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【００９８】
本明細書で提供される方法に有用な抗ＰＤ−Ｌ１抗体（または、その抗原結合断片）の例、及びそれらを作製するための方法は、ＰＣＴ特許出願ＷＯ２０１０／０７７６３４  Ａ１及びＵＳ８，２１７，１４９に記載され、これらは、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００９９】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（または、その抗原結合断片）は、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との間、及び／またはＰＤ−Ｌ１とＢ７−１との間の結合を阻害することができる。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）２断片からなる群から選択される抗体断片である。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ヒト抗体である。
【０１００】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１０１】
一実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域ポリペプチドを含有し、
2018526323.tif 000004
さらに、Ｘ１はＤまたはＧであり、Ｘ２はＳまたはＬであり、Ｘ３はＴまたはＳである。
【０１０２】
１つの具体的な態様において、Ｘ１はＤであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＴである。別の態様において、ポリペプチドは、次の式に従うＨＶＲ間に並置された可変領域重鎖フレームワーク配列をさらに含む：（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）。さらに別の態様において、フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。さらなる態様において、フレームワーク配列は、ＶＨ下位群ＩＩＩコンセンサスフレームワークである。なおもさらなる態様において、フレームワーク配列のうちの少なくとも１つは、以下のものである。
2018526323.tif 000005
【０１０３】
なおもさらなる態様において、重鎖ポリペプチドは、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む可変領域軽鎖とさらに組み合わされ、
2018526323.tif 000006
さらに、Ｘ４はＤまたはＶであり、Ｘ５はＶまたはＩであり、Ｘ６はＳまたはＮであり、Ｘ７はＡまたはＦであり、Ｘ８はＶまたはＬであり、Ｘ９はＦまたはＴであり、Ｘ１０はＹまたはＡであり、Ｘ１１はＹ、Ｇ、Ｆ、またはＳであり、Ｘ１２はＬ、Ｙ、Ｆ、またはＷであり、Ｘ１３はＹ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｆ、またはＩであり、Ｘ１４はＨ、Ｖ、Ｐ、Ｔ、またはＩであり、Ｘ１５はＡ、Ｗ、Ｒ、Ｐ、またはＴである。
【０１０４】
なおもさらなる態様において、Ｘ４はＤであり、Ｘ５はＶであり、Ｘ６はＳであり、Ｘ７はＡであり、Ｘ８はＶであり、Ｘ９はＦであり、Ｘ１０はＹであり、Ｘ１１はＹであり、Ｘ１２はＬであり、Ｘ１３はＹであり、Ｘ１４はＨであり、Ｘ１５はＡである。なおもさらなる態様において、軽鎖は、次の式に従うＨＶＲ間に並置された可変領域軽鎖フレームワーク配列をさらに含む：（ＬＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）。なおもさらなる態様において、フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。なおもさらなる態様において、フレームワーク配列は、ＶＬカッパＩコンセンサスフレームワークである。なおもさらなる態様において、フレームワーク配列のうちの少なくとも１つは、以下のものである。
2018526323.tif 000007
【０１０５】
別の実施形態において、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む単離された抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗原結合断片が提供され、
【０１０６】
重鎖は含み、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３、さらに、
2018526323.tif 000008
【０１０７】
軽鎖は含み、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３、さらに、
2018526323.tif 000009
さらに、Ｘ１はＤまたはＧであり、Ｘ２はＳまたはＬであり、Ｘ３はＴまたはＳであり、Ｘ４はＤまたはＶであり、Ｘ５はＶまたはＩであり、Ｘ６はＳまたはＮであり、Ｘ７はＡまたはＦであり、Ｘ８はＶまたはＬであり、Ｘ９はＦまたはＴであり、Ｘ１０はＹまたはＡであり、Ｘ１１はＹ、Ｇ、Ｆ、またはＳであり、Ｘ１２はＬ、Ｙ、Ｆ、またはＷであり、Ｘ１３はＹ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｆ、またはＩであり、Ｘ１４はＨ、Ｖ、Ｐ、Ｔ、またはＩであり、Ｘ１５はＡ、Ｗ、Ｒ、Ｐ、またはＴである。
【０１０８】
具体的な態様において、Ｘ１はＤであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＴである。別の態様において、Ｘ４はＤであり、Ｘ５はＶであり、Ｘ６はＳであり、Ｘ７はＡであり、Ｘ８はＶであり、Ｘ９はＦであり、Ｘ１０はＹであり、Ｘ１１はＹであり、Ｘ１２はＬであり、Ｘ１３はＹであり、Ｘ１４はＨであり、Ｘ１５はＡである。さらに別の態様において、Ｘ１はＤであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＤであり、Ｘ５はＶであり、Ｘ６はＳであり、Ｘ７はＡであり、Ｘ８はＶであり、Ｘ９はＦであり、Ｘ１０はＹであり、Ｘ１１はＹであり、Ｘ１２はＬであり、Ｘ１３はＹであり、Ｘ１４はＨであり、Ｘ１５はＡである。
【０１０９】
さらなる態様において、重鎖可変領域は、（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）のようなＨＶＲ間に並置された１つ以上のフレームワーク配列を含み、軽鎖可変領域は、（ＬＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）のようなＨＶＲ間に並置された１つ以上のフレームワーク配列を含む。なおもさらなる態様において、フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。なおもさらなる態様において、重鎖フレームワーク配列は、Ｋａｂａｔ下位群Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩ配列に由来する。なおもさらなる態様において、重鎖フレームワーク配列は、ＶＨ下位群ＩＩＩコンセンサスフレームワークである。なおもさらなる態様において、重鎖フレームワーク配列のうちの１つ以上は、以下のものである。
2018526323.tif 000010
【０１１０】
なおもさらなる態様において、軽鎖フレームワーク配列は、ＫａｂａｔカッパＩ、ＩＩ、ＩＩ、またはＩＶ下位群配列に由来する。なおもさらなる態様において、軽鎖フレームワーク配列は、ＶＬカッパＩコンセンサスフレームワークである。なおもさらなる態様において、軽鎖フレームワーク配列のうちの１つ以上は、以下のものである。
2018526323.tif 000011
【０１１１】
なおもさらに具体的な態様において、抗体は、ヒトまたはマウス定常領域をさらに含む。なおもさらなる態様において、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される。なおもさらに具体的な態様において、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１である。なおもさらなる態様において、マウス定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３からなる群から選択される。なおもさらなる態様において、ＩｇＧ２Ａの場合、マウス定常領域。なおもさらに具体的な態様において、抗体は、低減したかまたは最小のエフェクター機能を有する。なおもさらに具体的な態様において、最小のエフェクター機能は、「エフェクターなしＦｃ突然変異」またはアグリコシル化に起因する。なおもさらなる実施形態において、エフェクターなしＦｃ突然変異は、定常領域内のＮ２９７ＡまたはＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ置換である。
【０１１２】
さらに別の実施形態において、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体が提供され、
【０１１３】
重鎖はさらに含み、ＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨ（配列番号１５）、ＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１６）、及びＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号３）に対して、それぞれ、少なくとも８５％の配列同一性を有するＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３配列、または
【０１１４】
軽鎖は、ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１７）、ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号１８）、及びＱＱＹＬＹＨＰＡＴ（配列番号１９）に対して、それぞれ、少なくとも８５％の配列同一性を有するＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３配列をさらに含む。
【０１１５】
具体的な態様において、配列同一性は、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。別の態様において、重鎖可変領域は、（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）のようなＨＶＲ間に並置された１つ以上のフレームワーク配列を含み、軽鎖可変領域は、（ＬＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）のようなＨＶＲ間に並置された１つ以上のフレームワーク配列を含む。さらに別の態様において、フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。なおもさらなる態様において、重鎖フレームワーク配列は、Ｋａｂａｔ下位群Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩ配列に由来する。なおもさらなる態様において、重鎖フレームワーク配列は、ＶＨ下位群ＩＩＩコンセンサスフレームワークである。なおもさらなる態様において、重鎖フレームワーク配列のうちの１つ以上は、以下のものである。
2018526323.tif 000012
【０１１６】
なおもさらなる態様において、軽鎖フレームワーク配列は、ＫａｂａｔカッパＩ、ＩＩ、ＩＩ、またはＩＶ下位群配列に由来する。なおもさらなる態様において、軽鎖フレームワーク配列は、ＶＬカッパＩコンセンサスフレームワークである。なおもさらなる態様において、軽鎖フレームワーク配列のうちの１つ以上は、以下のものである。
2018526323.tif 000013
【０１１７】
なおもさらに具体的な態様において、抗体は、ヒトまたはマウス定常領域をさらに含む。なおもさらなる態様において、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される。なおもさらに具体的な態様において、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１である。なおもさらなる態様において、マウス定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３からなる群から選択される。なおもさらなる態様において、ＩｇＧ２Ａの場合、マウス定常領域。なおもさらに具体的な態様において、抗体は、低減したかまたは最小のエフェクター機能を有する。なおもさらに具体的な態様において、最小のエフェクター機能は、「エフェクターなしＦｃ突然変異」またはアグリコシル化に起因する。なおもさらなる実施形態において、エフェクターなしＦｃ突然変異は、定常領域内のＮ２９７ＡまたはＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ置換である。
【０１１８】
なおもさらなる実施形態において、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む単離抗ＰＤ−Ｌ１抗体が提供され、
（ａ）重鎖配列は、重鎖配列：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳ  ＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号２０）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するか、または
（ｂ）軽鎖配列は、軽鎖配列：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号２１）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【０１１９】
具体的な態様において、配列同一性は、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。別の態様において、重鎖可変領域は、（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）のようなＨＶＲ間に並置された１つ以上のフレームワーク配列を含み、軽鎖可変領域は、（ＬＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）のようなＨＶＲ間に並置された１つ以上のフレームワーク配列を含む。さらに別の態様において、フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。さらなる態様において、重鎖フレームワーク配列は、Ｋａｂａｔ下位群Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩ配列に由来する。なおもさらなる態様において、重鎖フレームワーク配列は、ＶＨ下位群ＩＩＩコンセンサスフレームワークである。なおもさらなる態様において、重鎖フレームワーク配列のうちの１つ以上は、以下のものである。
2018526323.tif 000014
【０１２０】
なおもさらなる態様において、軽鎖フレームワーク配列は、ＫａｂａｔカッパＩ、ＩＩ、ＩＩ、またはＩＶ下位群配列に由来する。なおもさらなる態様において、軽鎖フレームワーク配列は、ＶＬカッパＩコンセンサスフレームワークである。なおもさらなる態様において、軽鎖フレームワーク配列のうちの１つ以上は、以下のものである。
2018526323.tif 000015
【０１２１】
なおもさらに具体的な態様において、抗体は、ヒトまたはマウス定常領域をさらに含む。なおもさらなる態様において、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される。なおもさらに具体的な態様において、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１である。なおもさらなる態様において、マウス定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３からなる群から選択される。なおもさらなる態様において、ＩｇＧ２Ａの場合、マウス定常領域。なおもさらに具体的な態様において、抗体は、低減したかまたは最小のエフェクター機能を有する。なおもさらに具体的な態様において、最小のエフェクター機能は、原核細胞内での産生に起因する。なおもさらに具体的な態様において、最小のエフェクター機能は、「エフェクターなしＦｃ突然変異」またはアグリコシル化に起因する。なおもさらなる実施形態において、エフェクターなしＦｃ突然変異は、定常領域内のＮ２９７ＡまたはＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ置換である。
【０１２２】
別のさらなる実施形態において、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む単離抗ＰＤ−Ｌ１抗体が提供され、
（ａ）重鎖配列は、重鎖配列：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２４）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するか、または
（ｂ）軽鎖配列は、軽鎖配列：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号２１）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【０１２３】
なおもさらなる実施形態において、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む単離抗ＰＤＬ１抗体が提供され、
（ａ）重鎖配列は、重鎖配列：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩ  ＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫ（配列番号２８）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するか、または
（ｂ）軽鎖配列は、軽鎖配列：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦ  ＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号２９）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【０１２４】
具体的な態様において、配列同一性は、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。別の態様において、重鎖可変領域は、（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）のようなＨＶＲ間に並置された１つ以上のフレームワーク配列を含み、軽鎖可変領域は、（ＬＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）のようなＨＶＲ間に並置された１つ以上のフレームワーク配列を含む。さらに別の態様において、フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。さらなる態様において、重鎖フレームワーク配列は、Ｋａｂａｔ下位群Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩ配列に由来する。なおもさらなる態様において、重鎖フレームワーク配列は、ＶＨ下位群ＩＩＩコンセンサスフレームワークである。なおもさらなる態様において、重鎖フレームワーク配列のうちの１つ以上は、以下のものである。
2018526323.tif 000016
【０１２５】
なおもさらなる態様において、軽鎖フレームワーク配列は、ＫａｂａｔカッパＩ、ＩＩ、ＩＩ、またはＩＶ下位群配列に由来する。なおもさらなる態様において、軽鎖フレームワーク配列は、ＶＬカッパＩコンセンサスフレームワークである。なおもさらなる態様において、軽鎖フレームワーク配列のうちの１つ以上は、以下のものである。
2018526323.tif 000017
【０１２６】
なおもさらに具体的な態様において、抗体は、ヒトまたはマウス定常領域をさらに含む。なおもさらなる態様において、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される。なおもさらに具体的な態様において、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１である。なおもさらなる態様において、マウス定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３からなる群から選択される。なおもさらなる態様において、ＩｇＧ２Ａの場合、マウス定常領域。なおもさらに具体的な態様において、抗体は、低減したかまたは最小のエフェクター機能を有する。なおもさらに具体的な態様において、最小のエフェクター機能は、原核細胞内での産生に起因する。なおもさらに具体的な態様において、最小のエフェクター機能は、「エフェクターなしＦｃ突然変異」またはアグリコシル化に起因する。なおもさらなる実施形態において、エフェクターなしＦｃ突然変異は、定常領域内のＮ２９７ＡまたはＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ置換である。
【０１２７】
さらに別の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＣＡＳ登録番号：１４２２１８５−０６−５）である。なおもさらなる実施形態において、配列番号２４の重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／または配列番号２５の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む単離抗ＰＤ−１抗体が提供される。なおもさらなる実施形態において、重鎖及び／または軽鎖配列を含む単離抗ＰＤＬ−１抗体が提供され、
（ａ）重鎖配列は、重鎖配列：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号２６）に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するか、または
【０１２８】
（ｂ）軽鎖配列は、軽鎖配列：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２７）に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の軽鎖または重鎖可変領域配列をコードする単離核酸が提供され、
（ａ）重鎖はさらに含み、ＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨ（配列番号１５）、ＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１６）、及びＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号３）に対して、それぞれ、少なくとも８５％の配列同一性を有するＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３配列、ならびに
（ｂ）軽鎖は、ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１７）、ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号１８）、及びＱＱＹＬＹＨＰＡＴ（配列番号１９）に対して、それぞれ、少なくとも８５％の配列同一性を有するＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３配列をさらに含む。
【０１３０】
具体的な態様において、配列同一性は、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。態様において、重鎖可変領域は、（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）のようなＨＶＲ間に並置された１つ以上のフレームワーク配列を含み、軽鎖可変領域は、（ＬＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）のようなＨＶＲ間に並置された１つ以上のフレームワーク配列を含む。さらに別の態様において、フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。さらなる態様において、重鎖フレームワーク配列は、Ｋａｂａｔ下位群Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩ配列に由来する。なおもさらなる態様において、重鎖フレームワーク配列は、ＶＨ下位群ＩＩＩコンセンサスフレームワークである。なおもさらなる態様において、重鎖フレームワーク配列のうちの１つ以上は、以下のものである。
2018526323.tif 000018
【０１３１】
なおもさらなる態様において、軽鎖フレームワーク配列は、ＫａｂａｔカッパＩ、ＩＩ、ＩＩ、またはＩＶ下位群配列に由来する。なおもさらなる態様において、軽鎖フレームワーク配列は、ＶＬカッパＩコンセンサスフレームワークである。なおもさらなる態様において、軽鎖フレームワーク配列のうちの１つ以上は、以下のものである。
2018526323.tif 000019
【０１３２】
なおもさらに具体的な態様において、本明細書に記載される抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ヒトまたはマウス定常領域をさらに含む。なおもさらなる態様において、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される。なおもさらに具体的な態様において、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１である。なおもさらなる態様において、マウス定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３からなる群から選択される。なおもさらなる態様において、ＩｇＧ２Ａの場合、マウス定常領域。なおもさらに具体的な態様において、抗体は、低減したかまたは最小のエフェクター機能を有する。なおもさらに具体的な態様において、最小のエフェクター機能は、原核細胞内での産生に起因する。なおもさらに具体的な態様において、最小のエフェクター機能は、「エフェクターなしＦｃ突然変異」またはアグリコシル化に起因する。なおもさらなる態様において、エフェクターなしＦｃ突然変異は、定常領域内のＮ２９７ＡまたはＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ置換である。
【０１３３】
なおもさらなる態様において、本明細書に記載される抗体のいずれかをコードする核酸が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、核酸は、本明細書に記載される抗ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれかをコードする核酸の発現に好適なベクターをさらに含む。なおもさらに具体的な態様において、ベクターは、核酸の発現に好適な宿主細胞をさらに含む。なおもさらに具体的な態様において、宿主細胞は、真核細胞または原核細胞である。なおもさらに具体的な態様において、真核細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞である。
【０１３４】
抗体またはその抗原結合断片は、例えば、かかる抗体または断片を産生するのに好適な条件下で、発現に好適な形態にある前述の抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗原結合断片のうちのいずれかをコードする核酸を含有する宿主細胞を培養することと、抗体または断片を回復することと、を含む方法により、当技術分野で既知の方法を使用して作製され得る。
【０１３５】
ＩＶ．抗体の調製
本明細書で提供される方法、キット、及び製品は、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体を使用するか、または組み込む。かかる抗体を生成及び産生するための例示的な技法は、以下に記載される。
【０１３６】
抗原調製
ＰＤ−Ｌ１（細胞外ドメインなど）の可溶形態、または任意に他の分子に複合されるそれらの断片は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を生成するための及び／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を選別するための免疫原として使用され得る。あるいは、ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞が、免疫原として、または選別するために使用され得る。かかる細胞は、天然源（例えば、癌細胞株）に由来し得るか、または膜貫通分子を発現するように組換え技法により形質転換されている細胞であり得る。抗ＰＤ−Ｌ１抗体を調製及び／または選別するのに有用なＰＤ−Ｌ１の他の形態が、当業者には明らかであろう。
【０１３７】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は好ましくは、関連抗原及びアジュバントの複数の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注入により、動物において生じる。二機能性または誘導化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介した複合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタールアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲ１は異なるアルキル基である）を使用して、関連抗原を、免疫する種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシン阻害剤と複合することが有用であり得る。
【０１３８】
動物は、例えば、１００μｇまたは５μｇのタンパク質またはコンジュゲート（それぞれ、ウサギまたはマウスの場合）を、３体積のフロイントの完全なアジュバントと組み合わせ、複数の部位で溶液を皮内注入することにより、抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対して免疫される。１ヶ月後、動物は、複数の部位での皮下注入により完全フロイントアジュバント中のペプチドまたはコンジュゲートの元の量の１／５〜１／１０で追加免疫される。７〜１４日後、動物から採血し、血清を抗体力価に関してアッセイする。動物は、力価がプラトーに到達するまで追加免疫される。いくつかの実施形態において、動物は、同じ抗原のコンジュゲートで追加免疫されるが、異なるタンパク質に複合され、かつ／または異なる架橋試薬により複合される。コンジュゲートは、タンパク質融合物として組換え細胞培養物でも作製され得る。さらに、ミョウバンなどの凝集剤が、免疫応答を増強するために好適に使用される。
【０１３９】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、実質的に同種の抗体の集団から得られ、すなわち、その集団に含まれる個々の抗体は、同一であり、かつ／または同じエピトープに結合するが、モノクローナル抗体の産生中に生じる想定される変異体は除外され、かかる変異体は、概して、少量で存在する。したがって「モノクローナル」という修飾語は、個別のまたはポリクローナル抗体の混合物ではないような抗体の特徴を示す。
【０１４０】
例えば、モノクローナル抗体は、まずＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により記載されるハイブリドーマ法を使用して作製され得るか、または組換えＤＮＡ法により作製され得る（米国特許第４，８１６，５６７号）。
【０１４１】
ハイブリドーマ法において、マウス、またはハムスターなどの他の適切な宿主動物が、本明細書に記載されるように免疫化されて、免疫化のために使用されるタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を産生するか、または産生することができるリンパ球が誘発される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化され得る。次いで、リンパ球は、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を使用して骨髄腫細胞で融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【０１４２】
このように調製されたハイブリドーマ細胞は、播種され、非融合の親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を好ましくは含有する好適な培養培地で成長する。例えば、親骨髄腫細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻止する。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生を支援し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性を示すものである。いくつかの実施形態において、とりわけ、骨髄腫細胞株は、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞に由来するものなどのマウス骨髄腫株である。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０１４４】
ハイブリドーマ細胞が成長する培養培地は、抗原に対して指向されたモノクローナル抗体の産生に関してアッセイされる。いくつかの実施形態において、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によるか、または放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素連結免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイにより判定される。
【０１４５】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャチャード分析により判定され得る。
【０１４６】
所望の特異性、親和性、及び／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後、クローンは、限界希釈手順によりサブクローン化され、標準の方法により成長され得る（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的に好適な培養培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍としてインビボで成長し得る。
【０１４７】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順により、培養培地、腹水、または血清から好適に分離される。
【０１４８】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離及び配列決定される。いくつかの実施形態において、ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの供給源としての機能を果たす。単離されると、ＤＮＡは発現ベクター内に配置され得、これは次いで、宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などにトランスフェクトされて、組換え宿主細胞内のモノクローナル抗体の合成体が得られる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現に関する概説論文には、Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６−２６２（１９９３）、及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．，１３０：１５１−１８８（１９９２）が含まれる。
【０１４９】
ライブラリ由来抗体
抗体または抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載される技法を使用して生成された抗体ファージライブラリから単離され得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）、及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）は、それぞれ、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記載する。続報は、鎖シャッフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））、ならびに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてのコンビナトリアル感染及びインビボ組換えを記載する（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３））。したがって、これらの技法は、モノクローナル抗体を単離するための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技法の実行可能な代替案である。
【０１５０】
ＤＮＡは、例えば、同種マウス配列の代わりにヒト重及び軽鎖定常ドメインのコード配列の代わりに置換することによるか（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てもしくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することにより修飾され得る。
【０１５１】
典型的には、かかる非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインの代わりに置換されるか、またはそれらが、抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換されて、抗原に対して特異性を有する１つの抗原結合部位、及び異なる抗原に対して特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作製する。
【０１５２】
本発明の抗体は、所望の活性（複数可）を有する抗体に関してコンビナトリアルライブラリを選別することにより単離され得る。例えば、実施例３に記載される方法などの、ファージディスプレイライブラリを生成し、かつ所望の結合特徴を有する抗体に関してかかるライブラリを選別するための多様な方法が当技術分野で知られている。追加の方法が、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）で概説されており、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）、Ｍａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）、Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）、及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）にさらに記載される。
【０１５３】
ある特定のファージディスプレイ方法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により別個にクローン化され、ファージライブラリ内で無作為に組換えられ、次いで、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されるような抗原結合ファージに関して選別され得る。ファージは典型的には、抗体断片を一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片またはＦａｂ断片のいずれかとして表示する。免疫化源由来のライブラリは、ハイブリドーマの構築を必要とすることなく、免疫原に高親和性抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１２：７２５−７３４（１９９３）に記載されるように、ナイーブレパートリーがクローン化（例えば、ヒトから）されて、いずれの免疫化もなしに広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対する抗体の単一源を提供し得る。最後に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）により記載されるように、ナイーブライブラリはまた、幹細胞由来の配列されていないＶ−遺伝子セグメントをクローン化することにより、及びランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用することにより合成作製されて、高可変ＣＤＲ３領域をコードし、かつ再配列されたインビトロを達成し得る。ヒト抗体ファージライブラリを記載する特許公報には、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、及び米国特許公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７/０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、及び同第２００９／０００２３６０号が含まれる。
【０１５４】
ヒト抗体ライブラリから単離された抗体または抗体断片は、本明細書においてヒト抗体またはヒト抗体断片と見なされる。
【０１５５】
キメラ及びヒト化抗体
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体が、例えば、米国特許第４，８１６，５６７、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））に記載される。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または非ヒト霊長類、例えば、サルに由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。さらなる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変化した「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【０１５６】
ある特定の実施形態において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減する一方で、親非ヒト抗体の特異性及び親和性は保持するようにヒト化される。概して、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（または、それらの部分）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（または、それらの部分）がヒト抗体配列に由来する１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部も含むであろう。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体におけるいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を復元または改善するように、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
【０１５７】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野で記載されている。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、非ヒトである源からそれに導入される１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は本質的に、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者らの方法に従い（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））、超可変領域配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに置換することにより行われ得る。したがって、かかる「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的により少ない部分が、非ヒト種由来の対応する配列により置換されているキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７）。実際に、ヒト化抗体は典型的には、いくつかの超可変領域残基、かつ場合によってはいくつかのＦＲ残基が、齧歯類抗体中の類似部位からの残基により置換されているヒト抗体である。
【０１５８】
ヒト化抗体を作製するのに使用されるヒト可変ドメインの選択は、軽ドメイン及び重ドメインの両方とも、抗原性を低減するのに非常に重要である。いわゆる「最適合」方法によると、齧歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変−ドメイン配列の全ライブラリに対して選別される。次いで、齧歯類のものに最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として受け入れられる（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。別の方法は、軽または重鎖可変領域の特定の下位群の全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークが、いくつかの異なるヒト化抗体のために使用され得る（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））。
【０１５９】
抗体が、抗原に対する高親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持してヒト化されることがさらに重要である。この目標を達成するために、本方法のいくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用した、親配列及び様々な概念上のヒト化産生物の分析プロセスにより調製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に、利用可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定される三次元立体配座構造を例示及び表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらのディスプレイの精査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性の高い役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響する残基の分析を可能にする。このように、標的抗原（複数可）に対する増加した親和性などの所望の抗体特徴が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わされ得る。概して、超可変領域残基は、抗原結合への影響に直接的に、かつ最も実質的に関与している。
【０１６０】
上記のＣＤＲ配列は概して、ヒト軽鎖カッパ下位群Ｉ（ＶＬ６Ｉ）の実質的にヒトコンセンサスなＦＲ残基、及びヒト重鎖下位群ＩＩＩ（ＶＨＩＩＩ）の実質的にヒトコンセンサスなＦＲ残基などの、ヒト可変軽及びヒト可変重フレームワーク配列内に存在する。ＷＯ２００４／０５６３１２（Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）も参照されたい。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、可変重領域は、ヒトＩｇＧ鎖定常領域に結合し得、ここで、天然配列及び変異体定常領域を含む領域は、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３であり得る。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、本明細書における抗体は、アミノ酸置換が、重鎖残基のＥＵ番号付けを使用した２９８、３３３、及び３３４位、好ましくはＳ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、及びＫ３３４Ａにあるものなどの、ＡＤＣＣ活性を改善するＦｃ領域内に少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含み得る。米国特許第６，７３７，０５６Ｂ１号、Ｐｒｅｓｔａも参照されたい。これらの抗体のうちのいずれかは、ＦｃＲｎ結合または血清半減期、例えば、Ｎ４３４Ｗなどの重鎖位置４３４での置換を改善するＦｃ領域内に少なくとも１つの置換を含み得る。米国特許第６，７３７，０５６Ｂ１号、Ｐｒｅｓｔａも参照されたい。これらの抗体のうちのいずれかは、例えば、少なくとも３２６位、好ましくはＫ３２６ＡまたはＫ３２６Ｗでの置換を含む、ＣＤＣ活性を増加させるＦｃ領域内に少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含み得る。米国特許第６，５２８，６２４Ｂ１（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．）号も参照されたい。
【０１６３】
ヒト抗体
ヒト化の代替物として、ヒト抗体が生成され得る。例えば、免疫化すると内因性免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の完全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが現在では可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合欠失が、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。かかる生殖系突然変異マウス内にヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子アレイを移動させると、抗原攻撃に際してヒト抗体の産生をもたらす。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）、ならびに米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５８９，３６９号、及び同第５，５４５，８０７号を参照されたい。
【０１６４】
あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０））は、未免疫供与体の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ヒト抗体及び抗体断片をインビトロで産生するために使用され得る。この技法によると、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３またはｆｄなどの糸状バクテリオファージの主要または非主要なコートタンパク質遺伝子にインフレームでクローン化され、ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片として表示される。糸状粒子はファージゲノムの一本ストランドＤＮＡコピーを含有することに因り、抗体の機能的特性に基づく選択は、結果として、それらの特性を呈する抗体をコードする遺伝子の選択にもなる。したがって、ファージは、Ｂ細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージディスプレイは、多様な形式で行われ得、それらの概説に関しては、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。Ｖ−遺伝子セグメントのいくつかの源は、ファージディスプレイのために使用され得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫化マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリから、抗オキサゾロン抗体の多種多様なアレイを単離した。未免疫のヒト供与体由来のＶ遺伝子のレパートリーは、構築され得、多種多様な抗原（自己抗原を含む）に対する抗体は、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）により記載される技法に本質的に従って単離され得る。米国特許第５，５６５，３３２号及び同第５，５７３，９０５号も参照されたい。
【０１６５】
また、ヒト抗体は、インビトロ活性化Ｂ細胞により生成され得る（米国特許第５，５６７，６１０号及び同第５，２２９，２７５号を参照されたい）。
【０１６６】
抗体断片
抗体断片を産生するための様々な技法が開発されている。従来、これらの断片は、無傷抗体のタンパク質分解消化により得られていた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）、及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。しかし、これらの断片は、現在、組換え宿主細胞により直接産生され得る。例えば、抗体断片は、上記で考察される抗体ファージライブラリから単離され得る。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され、化学的にカップリングして、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成し得る（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。別の手法によると、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。抗体断片を産生するための他の技法が、当業者に明らかであろう。他の実施形態において、最適な抗体は、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５、米国特許第５，５７１，８９４号、及び米国特許第５，５８７，４５８号を参照されたい。抗体断片は、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるような「線状抗体」でもあり得る。かかる線状抗体断片は、単一特異性または二重特異性であり得る。
【０１６７】
多重特異性抗体
多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有し、これらのエピトープは、通常、異なる抗原由来である。かかる分子が通常２つの異なるエピトープ（すなわち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）のみに結合する一方で、三重特異性抗体などの追加の特異性を有する抗体は、本明細書で使用されるとき、この表現により包含される。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製され得る（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）。
【０１６８】
二重特異性抗体を作製するための方法は、当技術分野で知られている。全長二重特異性抗体の従来の産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づき、これらの２つの鎖は、異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重及び軽鎖のランダム分類に因り、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の混合物を産生する可能性があり、これらのうちの１つのみが正しい二重特異性構造を有する。通常は親和性クロマトグラフィーステップにより行われる正しい分子の精製は、やや煩雑であり、生成物収率は低い。同様の手順が、ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）で開示される。
【０１６９】
当技術分野で既知の二重特異性抗体を作製するための１つの手法は、「ノブイントゥホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」または「プロチェバランスイントゥキャビティ（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ−ｉｎｔｏ−ｃａｖｉｔｙ）」手法である（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）。この手法において、２つの免疫グロブリンポリペプチド（例えば、重鎖ポリペプチド）は各々、界面を含む。一方の免疫グロブリンポリペプチドの界面は、他方の免疫グロブリンポリペプチドの対応する界面と相互作用し、それにより、２つの免疫グロブリンポリペプチドが会合を可能にする。これらの界面は、一方の免疫グロブリンポリペプチドの界面に位置する「ノブ」または「プロチェバランス」（これらの用語は、本明細書で互換的に使用され得る）は、他方の免疫グロブリンポリペプチドの界面に位置する「ホール」または「キャビティ」（これらの用語は、本明細書で同義に使用され得る）に対応するように操作され得る。いくつかの実施形態において、ホールは、ノブと同一または同様のサイズのものであり、２つの界面が相互作用するときに、一方の界面のノブが他方の界面の対応するホール内に位置付け可能になるように好適に位置付けられる。理論に束縛されることを望むものではないが、これは、ヘテロ多量体を安定させ、かつ他の種、例えば、ホモ多量体よりもヘテロ多量体の形成を好むと考えられる。いくつかの実施形態において、この手法は、２つの異なる免疫グロブリンポリペプチドのヘテロ多量体化を促進し、異なるエピトープに対する結合特異性を有する２つの免疫グロブリンポリペプチドを含む二重特異性抗体を作製するために使用され得る。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、ノブは、小さいアミノ酸側鎖をより大きい側鎖で置き換えることにより構築され得る。いくつかの実施形態において、ホールは、大きいアミノ酸側鎖をより小さい側鎖で置き換えることにより構築され得る。ノブまたはホールは、元の界面内に存在し得るか、または合成的に導入され得る。例えば、ノブまたはホールは、界面をコードする核酸配列を改変させて、少なくとも１つの「元の」アミノ酸残基を少なくとも１つの「移入」アミノ酸残基で置き換えることにより合成的に導入され得る。核酸配列を改変するための方法には、当技術分野で周知の標準の分子生物学技法が含まれ得る。様々なアミノ酸残基の側鎖体積は、以下の表に示される。いくつかの実施形態において、元の残基は、小さい側鎖体積（例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、トレオニン、またはバリン）を有し、ノブを形成するための移入残基は、自然発生するアミノ酸であり、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンを含み得る。いくつかの実施形態において、元の残基は、大きい側鎖体積（例えば、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン）を有し、ホールを形成するための移入残基は、自然発生するアミノ酸であり、アラニン、セリン、トレオニン、及びバリンを含み得る。
2018526323.tif 000020
ａアミノ酸の分子量は、水の分子量を差し引いたものである。Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，４３ｒｄｅｄ．Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９６１の値。
ｂＡ．ＡＺａｍｙａｔｎｉｎ，Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：１０７−１２３，１９７２の値。
ｃＣ．Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：１−１４，１９７５の値。利用可能な表面範囲は、この参考文献の図６〜２０に定義されている。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、ノブまたはホールを形成するための元の残基は、ヘテロ多量体の三次元構造に基づいて特定される。当技術分野で既知の三次元構造を得るための技法には、Ｘ線結晶学及びＮＭＲが含まれ得る。いくつかの実施形態において、界面は、免疫グロブリン定常ドメインのＣＨ３ドメインである。これらの実施形態において、ヒトＩｇＧ１のＣＨ３／ＣＨ３界面は、４つの逆平行βストランド上に位置する各ドメイン上に１６個の残基を伴う。理論に束縛されることを望むものではないが、突然変異残基は好ましくは、ノブがパートナーＣＨ３ドメイン内の補償ホールよりむしろ周囲の溶媒により収容され得る危険性を最小限に抑えるように、２つの中央逆平行βストランド上に位置する。いくつかの実施形態において、２つの免疫グロブリンポリペプチド内の対応するノブ及びホールを形成する突然変異は、以下の表に提供される１つ以上の対に対応する。
2018526323.tif 000021
【０１７２】
突然変異は、元の残基、続いて、Ｋａｂａｔ番号付けシステムを使用した位置、その後、移入残基により表示されている（全ての残基は、一文字のアミノ酸コードで示されている）。複数の突然変異は、コロンで区切られている。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、免疫グロブリンポリペプチドは、上の表２に列挙される１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、表２の左側の欄に列挙される１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＨ３ドメインを含む第１の免疫グロブリンポリペプチドと、表２の右側の欄に列挙される１つ以上の対応するアミノ酸置換を含むＣＨ３ドメインを含む第２の免疫グロブリンポリペプチドとを含む。
【０１７４】
上記で考察されるようにＤＮＡを突然変異させた後、１つ以上の対応するノブ形成突然変異またはホール形成突然変異を有する修飾された免疫グロブリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で既知の標準の組換え技法及び細胞系を使用して発現及び精製され得る。例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、同第５，８０７，７０６号、同第５，８２１，３３３号、同第７，６４２，２２８号、同第７，６９５，９３６号、同第８，２１６，８０５号、米国公開第２０１３／００８９５５３号、及びＳｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１：７５３−７５８，２０１３を参照されたい。修飾された免疫グロブリンポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核宿主細胞、またはＣＨＯ細胞などの真核宿主細胞を使用して産生され得る。対応するノブ及びホールを持つ免疫グロブリンポリペプチドは、共培養物中で、宿主細胞で発現され、ヘテロ多量体として一緒に精製され得るか、または単一培養物中で発現され、別個に精製され、インビトロで構築され得る。いくつかの実施形態において、細菌宿主細胞の２つの菌株（一方はノブを有する免疫グロブリンポリペプチドを発現し、他方はホールを有する免疫グロブリンポリペプチドを発現する）は、当技術分野で既知の標準の細菌培養技法を使用して共培養される。いくつかの実施形態において、２つの菌株は、例えば、培養物中で等しい発現レベルを達成するように、特定の比率で混合され得る。いくつかの実施形態において、２つの菌株は、５０：５０、６０：４０、または７０：３０の比率で混合され得る。ポリペプチドが発現した後、細胞が一緒に溶解され得、タンパク質が抽出され得る。ホモ多量体種対ヘテロ多量体種の存在量の測定を可能にする当技術分野で既知の標準の技法には、サイズ排除クロマトグラフィーが含まれ得る。いくつかの実施形態において、各修飾された免疫グロブリンポリペプチドは、標準の組換え技法を使用して別個に発現され、それらはインビトロで一緒に構築され得る。構築は、例えば、各修飾された免疫グロブリンポリペプチドを精製し、それらを等しい質量で一緒に混合及びインキュベートし、ジスルフィドを還元し（例えば、ジチオスレイトールで処理することにより）、濃縮し、かつポリペプチドを再酸化することにより達成され得る。形成された二重特異性抗体は、カチオン交換クロマトグラフィーを含む標準の技法を使用して精製され得、サイズ排除クロマトグラフィーを含む標準の技法を使用して測定され得る。これらの方法のより詳細な説明に関しては、Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１：７５３−８，２０１３を参照されたい。いくつかの実施形態において、修飾された免疫グロブリンポリペプチドは、ＣＨＯ細胞で別個に発現され、上述の方法を使用してインビトロで構築され得る。
【０１７５】
異なる手法によると、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原の組み合わせ部位）が、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。融合は好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。融合のうちの少なくとも１つに存在する、軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが典型的である。免疫グロブリン重鎖融合物、所望の場合、免疫グロブリン軽鎖融合物をコードするＤＮＡは、別個の発現ベクターに挿入され、好適な宿主生物に共トランスフェクトされる。これは、構築時に使用される不均等な比率の３つのポリペプチド鎖が最適収率を提供するとき、実施形態において、３つのポリペプチド断片の相互割合を調整する上で優れた柔軟性を提供する。しかし、等しい比率での少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高収率をもたらすとき、またはそれらの比率が特に重要でないとき、２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１７６】
この手法の一実施形態において、二重特異性抗体は、一方のアームにある第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにあるハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）とからなる。二重特異性分子の半分のみでの免疫グロブリン軽鎖の存在が容易な分離方法を提供するため、この非対称構造が、望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることが見出された。この手法は、ＷＯ９４／０４６９０で開示されている。二重特異性抗体の生成のさらなる詳細に関しては、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
【０１７７】
ＷＯ９６／２７０１１に記載される別の手法によると、１対の抗体分子間の界面は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大にするように操作され得る。１つの界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の界面由来の１つ以上の小さいアミノ酸側鎖は、より大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えられる。大きい側鎖（複数可）と同一または同様のサイズの補償「キャビティ」は、大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置き換えることにより第２の抗体分子の界面上に作製される。これは、ホモ二量体などの他の望ましくない最終産物よりもヘテロ二量体の収率を増加させるための機構を提供する。
【０１７８】
二重特異性抗体は、架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の１つはアビジンにカップリングし、他のものはビオチンにカップリングし得る。かかる抗体は、例えば、免疫系細胞の標的を望ましくない細胞に絞るため（米国特許第４，６７６，９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療のために提唱されている（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、及びＥＰ０３０８９）。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋方法を使用して作製され得る。好適な架橋剤が、当技術分野で周知されており、いくつかの架橋技法と併せて米国特許第４，６７６，９８０号で開示される。
【０１７９】
抗体断片から二重特異性抗体を生成するための技法も文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学連結を使用して調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）は、無傷抗体がタンパク質分解的に切断されて、Ｆ（ａｂ’）２断片を生成する手順を記載する。これらの断片は、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元されて、隣接するジチオールを安定させ、分子間ジスルフィド形成を阻止する。次いで、生成されたＦａｂ’断片は、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうちの１つが、メルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’−チオールに再変換され、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて、二重特異性抗体が形成される。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用され得る。
【０１８０】
近年の進歩により、化学的にカップリングされて二重特異性抗体を形成し得るＦａｂ’−ＳＨ断片をＥ．ｃｏｌｉから直接回収することが容易になった。Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記載する。各Ｆａｂ’断片は、Ｅ．ｃｏｌｉから別個に分泌され、インビトロでの指向性化学的カップリングにかけられて、二重特異性抗体が形成された。
【０１８１】
組換え細胞培養物から直接的に二重特異性抗体断片を作製及び単離するための様々な技法も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドが、遺伝子融合により２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結した。抗体ホモ二量体がヒンジ領域で還元されてモノマーが形成され、次いで、再酸化されて、抗体ヘテロ二量体が形成された。この方法は、抗体ホモ二量体の産生のためにも利用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）により記載される「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替機序を提供している。断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、１つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは、別の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと対合させられ、それにより、２つの抗原結合部位が形成される。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用により二重特異性抗体断片を作製するための別の方策も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。
【０１８２】
二重特異性抗体断片を作製するための別の技法は、「二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー」またはＢｉＴＥ（登録商標）手法である（例えば、ＷＯ２００４／１０６３８１、ＷＯ２００５／０６１５４７、ＷＯ２００７／０４２２６１、及びＷＯ２００８／１１９５６７を参照されたい）。この手法は、単一のポリペプチド上に配列された２つの抗体可変ドメインを利用する。例えば、単一のポリペプチド鎖は、可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを各々有する２つの一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片を含み、これらのドメインは、２つのドメイン間の分子内会合を可能にする十分な長さのポリペプチドリンカーにより分離される。この単一のポリペプチドは、２つのｓｃＦｖ断片間のポリペプチドスペーサー配列をさらに含む。各ｓｃＦｖは、異なるエピトープを認識し、２つの異なる細胞の種類の細胞が、各ｓｃＦｖがその同族のエピトープと係合するときに近接近するかまたは係留されるように、これらのエピトープは、異なる細胞の種類に対して特異的であり得る。この手法の１つの特定の実施形態は、免疫細胞により発現される細胞表面抗原を認識するｓｃＦｖ、例えば、Ｔ細胞上のＣＤ３ポリペプチドを含み、これは、悪性または腫瘍細胞などの標的細胞により発現される細胞表面抗原を認識する別のｓｃＦｖに連結する。
【０１８３】
それが単一のポリペプチドであるため、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、当技術分野で既知の任意の原核または真核細胞発現系、例えば、ＣＨＯ細胞株を使用して発現され得る。しかし、具体的な精製技法（例えば、ＥＰ１６９１８３３を参照されたい）が、モノマー二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを、モノマーの意図される活性以外の生物活性を有し得る他の多量体種から分離するために必要であり得る。１つの例示的な精製スキームにおいて、分泌ポリペプチドを含有する溶液はまず、金属親和性クロマトグラフィーにかけられ、ポリペプチドは、イミダゾール濃度の勾配を用いて溶出される。この溶出物は、アニオン交換クロマトグラフィーを使用してさらに精製され、ポリペプチドは、塩化ナトリウム濃度の勾配を用いて使用して溶出される。最後に、この溶出物は、サイズ排除クロマトグラフィーにかけられ、多量体種からモノマーが分離される。
【０１８４】
Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）により記載される「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替機序を提供している。断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、１つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは、別の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと対合させられ、それにより、２つの抗原結合部位が形成される。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用により二重特異性抗体断片を作製するための別の方策も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。
【０１８５】
二価を超える抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体が調製され得る。Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１８６】
複合、あるいは修飾された抗体
本明細書における方法で使用される抗体または製品に含まれる抗体は、細胞傷害性剤に任意に複合される。例えば、抗体は、ＷＯ２００４／０３２８２８に記載されるような薬物に複合され得る。
【０１８７】
かかる抗体細胞傷害性剤コンジュゲートの生成において有用な化学療法剤が上述されている。
【０１８８】
抗体と、カリケアマイシン、メイタンシン（米国特許第５，２０８，０２０号）、トリコテン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｎｅ）、及びＣＣ１０６５などの１つ以上の小分子毒素とのコンジュゲートも、本明細書で企図される。本発明の一実施形態において、抗体は、１つ以上のメイタンシン分子（例えば、抗体１分子あたり約１〜約１０のメイタンシン分子）に複合される。メイタンシンは、例えば、Ｍａｙ−ＳＳ−Ｍｅに変換され得、これは、Ｍａｙ−ＳＨ３に還元され、修飾された抗体と反応して（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２））マイタンシノイド抗体コンジュゲートが生成され得る。
【０１８９】
あるいは、抗体は、１つ以上のカリケアマイシン分子に複合される。抗生物質のカリケアマイシン族は、ピコモル以下の濃度で二本ストランドＤＮＡの切断を産生することができる。γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ、及びθＩ１が含まれるが、これらに限定されないカリケアマイシンの構造的類似体が使用され得る（Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６−３３４２（１９９３）、及びＬｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８（１９９８））。
【０１９０】
使用され得る酵素的に活性な毒素及びそれらの断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンが含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日に公開されたＷＯ９３／２１２３２を参照されたい。
【０１９１】
本発明は、核酸分解活性（例えば、リボヌクレアーゼ、またはＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅ）を有する化合物と複合された抗体をさらに企図する。
【０１９２】
多様な放射性同位体は、放射性複合抗体の産生のために利用可能である。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、及びＬｕの放射性同位体が含まれる。
【０１９３】
抗体と細胞傷害性剤とのコンジュゲートは、Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）、サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジサクシニミジルなど）、アルデヒド（グルタレルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ）など）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トリエン（ｔｏｌｙｅｎｅ）２，６−ジイソシアネートなど）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの多様な二機能性タンパク質カップリング剤を使用して作製され得る。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製され得る。炭素−１４−標識化１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体に複合するための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞内で細胞傷害性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィドリンカー（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２））が使用され得る。
【０１９４】
あるいは、抗体及び細胞傷害性剤を含む融合タンパク質は、例えば、組換え技法またはペプチド合成により作製され得る。
【０１９５】
さらに別の実施形態において、抗体は、抗体受容体コンジュゲートが患者に投与される腫瘍事前標的化において利用するために「受容体」（かかるストレプトアビジン）に複合され得、続いて、非結合コンジュゲートが、除去剤を使用して血液循環から除去され、次いで、細胞傷害性剤（例えば、放射性ヌクレオチド）に複合される「リガンド」（例えば、アビジン）が投与される。
【０１９６】
本発明の抗体は、前駆薬物（例えば、ペプチジル化学療法剤、ＷＯ８１／０１１４５を参照されたい）を活性抗癌薬物に変換する前駆薬物活性化酵素とも複合され得る。例えば、ＷＯ８８／０７３７８及び米国特許第４，９７５，２７８号を参照されたい。
【０１９７】
かかるコンジュゲートの酵素構成成分には、前駆薬物において、それをより活性な細胞傷害性形態に変換するような方法で作用することができる任意の酵素が含まれる。
【０１９８】
本発明の方法で有用である酵素には、リン酸塩含有前駆薬物を遊離薬物に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ；硫酸塩含有前駆薬物を遊離薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；無毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬物、５−フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有前駆薬物を遊離薬物に変換するのに有用なセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、及びカテプシン（例えば、カテプシンＢ及びＬ）などのプロテアーゼ；Ｄ−アミノ酸置換基を含有する前駆薬物を変換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化前駆薬物を遊離薬物に変換するのに有用なβ−ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼなどの炭水化物切断酵素、β−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なβ−ラクタマーゼ、ならびにアミン窒素において、フェノキシアセチル基またはフェニルアセチル基でそれぞれ誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼなどのペニシリンアミダーゼが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、「アブザイム」としても当技術分野で既知の酵素活性を有する抗体が、本発明の前駆薬物を遊離活性薬物に変換するために使用され得る（例えば、Ｍａｓｓｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：４５７−４５８（１９８７）を参照されたい）。抗体アブザイムコンジュゲートは、本明細書に記載されるように、アブザイムを腫瘍細胞集団に送達するために調製され得る。
【０１９９】
本発明の酵素は、上記で考察されるヘテロ二機能性架橋試薬の使用などの、当技術分野で周知の技法により抗体に共有結合され得る。あるいは、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結する本発明の抗体の抗原結合領域を少なくとも含む融合タンパク質は、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技法を使用して構築され得る（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４−６０８（１９８４）を参照されたい）。
【０２００】
抗体の他の変形が本明細書で企図される。例えば、抗体は、多様な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールのコポリマーのうちの１つに連結し得る。いくつかの実施形態において、Ｆａｂ’などの抗体断片は、１つ以上のＰＥＧ分子に連結する。
【０２０１】
本明細書で開示される抗体は、リポソームとしても製剤化され得る。抗体を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）、Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）、米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号、ならびに１９９７年１０月２３日に公開されたＷＯ９７／３８７３１に記載されるような、当技術分野で既知の方法により調製される。循環時間が向上したリポソームが、米国特許第５，０１３，５５６号で開示される。
【０２０２】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法により生成され得る。リポソームは、所定の細孔サイズのフィルターを通して押し出されて、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、ジスルフィド互換反応を介して、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されるようなリポソームに複合され得る。化学療法剤は任意に、リポソーム内に含有される。Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１（１９）１４８４（１９８９）を参照されたい。
【０２０３】
抗体変異体
抗体のアミノ酸配列修飾（複数可）が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化を抗体核酸に導入することにより、またはペプチド合成により調製される。かかる修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／またはそれへの挿入、及び／またはその置換が含まれる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終構築物に到達するためになされるが、但し、最終構築物が所望の特徴を有することを条件とする。アミノ酸変化は、抗体の翻訳後処理も改変し得、例えば、グリコシル化部位の数または位置を変化することができる。
【０２０４】
突然変異生成の好ましい位置である抗体のある特定の残基または領域の特定に有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）により記載されるような「アラニンスキャニング突然変異生成」と呼ばれる。ここで、残基または標的残基群が特定され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電残基）、中性または負に荷電されたアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）により置き換えられて、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を及ぼす。次いで、置換に対する機能的感受性を実証するアミノ酸位置は、さらなるまたは他の変異体を置換部位に、またはそこの代わりに導入することにより洗練される。したがって、アミノ酸配列変異を導入するための部位が予め決定されている一方で、変異自体の性質は予め決定される必要はない。例えば、所与の部位での突然変異の性能を分析するために、ａｌａスキャニングまたはランダム突然変異生成が標的コドンまたは領域で実行され、発現された抗体変異体が所望の活性に関して選別される。
【０２０５】
アミノ酸配列挿入には、長さが１残基から１００以上の残基の範囲を含有するポリペプチドの範囲であるアミノ末端及び／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ−末端メチオニル残基を有する抗体、または細胞傷害性ポリペプチドに融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増加させる酵素またはポリペプチドの抗体のＮ−またはＣ末端への融合が含まれる。
【０２０６】
別の種類の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基により置き換えられた抗体分子内に少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。抗体、抗体の置換突然変異生成のために最も重要な部位には、超可変領域が含まれるが、ＦＲ改変も企図される。保存的置換は、表３内の見出し「好ましい置換」の下に示される。かかる置換が生物活性の変化をもたらす場合、表３内の「例示的な置換」で表示されるより実質的な変化が導入され、産生物が選別され得る。
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【０２０７】
抗体の生物学的特性の実質的な修飾は、置換を選択することにより達成され、これらは、（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えば、シートもしくは螺旋立体配座、（ｂ）標的部位における分子の荷電もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクの維持に対するそれらの影響が著しく異なる。アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性に従って群分けされ得る（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．，ｐｐ．７３−７５，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７５））。
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）
【０２０８】
あるいは、自然発生する残基は、共通の側鎖特性に基づいて群分けされ得る。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
【０２０９】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーと別のクラスのメンバーとの交換を伴う。
【０２１０】
抗体の適切な立体配座の維持に関与しない任意のシステイン残基も概してセリンで置換されて、分子の酸化的安定性が改善され、異常な架橋が阻止され得る。逆に、システイン結合（複数可）は抗体に付加されて、その安定性を改善することができる（特に、抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合）。
【０２１１】
特に好ましい種類の置換変異体は、親抗体の１つ以上の超可変領域残基を置換することに関与する。概して、さらなる開発のために選択されて得られた変異体（複数可）は、それらが生成される親抗体に対して改善された生物学的特性を有するであろう。かかる置換変異体を生成するための簡便な方法は、ファージディスプレイを使用した親和性成熟である。簡潔に言うと、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７つの部位）が突然変異されて、各部位に全ての想定されるアミノ置換が生成される。このように生成された抗体変異体は、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として糸状ファージ粒子からの一価様式で表示される。次いで、ファージディスプレイされた変異体は、本明細書で開示されるようなそれらの生物活性（例えば、結合親和性）に関して選別される。修飾のための候補超可変領域部位を特定するために、アラニンスキャニング突然変異生成が行われ、抗原結合に著しく寄与する超可変領域残基が特定され得る。あるいは、または加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体と抗原との間の接触点を特定することが有益であり得る。かかる接触残基及び隣接残基は、本明細書に詳述される技法に従う置換の候補である。かかる変異体が生成されると、変異体のパネルが本明細書に記載されるように選別され、１つ以上の関連アッセイで優れた特性を有する抗体がさらなる開発のために選択され得る。
【０２１２】
抗体の別の種類のアミノ酸変異体は、抗体の元のグリコシル化パターンを改変する。かかる改変には、抗体に見られる１つ以上の炭水化物部分の欠失、及び／または抗体に存在しない１つ以上のグリコシル化部位の付加が含まれる。
【０２１３】
ポリペプチドのグリコシル化は典型的には、Ｎ連結型またはＯ連結型のいずれかである。Ｎ連結は、炭水化物部分の、アスパラギン残基の側鎖への結合を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分の、アスパラギン側鎖への酵素結合の認識配列である。したがって、ポリペプチド内でのこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作製する。Ｏ連結グリコシル化は、糖類であるＮ−アセイルガラクトサミン（ａｃｅｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用され得る。
【０２１４】
グリコシル化部位の、抗体への付加は、（Ｎ連結グリコシル化部位のための）上述のトリペプチド配列のうちの１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を改変することにより簡便に達成される。改変は、（Ｏ連結グリコシル化部位のための）元の抗体の配列への１つ以上のセリンまたはトレオニン残基の付加、またはそれによる置換によっても行われ得る。
【０２１５】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合した炭水化物は改変され得る。例えば、抗体のＦｃ領域に結合するフコースを欠く成熟炭水化物構造を有する抗体が、米国特許出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８  Ａ１（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）号に記載され、ＣＤ２０抗体組成物に関しては同第ＵＳ２００４／００９３６２１  Ａ１（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）号も参照されたい。抗体のＦｃ領域に結合する炭水化物中で二等分のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する抗体がＷＯ０３／０１１８７８，Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．、及び米国特許第６，６０２，６８４（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）号で参照される。抗体のＦｃ領域に結合するオリゴ糖中で少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体が、ＷＯ９７／３００８７（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）で報告され、それらのＦｃ領域に結合する改変された炭水化物を有する抗体に関してはＷＯ９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）及びＷＯ９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）も参照されたい。
【０２１６】
いくつかの実施形態において、本明細書におけるグリコシル化変異体は、Ｆｃ領域を含み、ここで、炭水化物構造は、フコースを欠くＦｃ領域に結合する。かかる変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有する。任意に、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣをさらに改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／または３３４位（残基のＥｕ番号付け）での置換をそこでさらに含む。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体に関する公報の例には、米国特許出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８  Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ、ＷＯ００／６１７３９Ａ１、ＷＯ０１／２９２４６Ａ１、ＵＳ２００３／０１１５６１４Ａ１、ＵＳ２００２／０１６４３２８Ａ１、ＵＳ２００４／００９３６２１Ａ１、ＵＳ２００４／０１３２１４０Ａ１、ＵＳ２００４／０１１０７０４Ａ１、ＵＳ２００４／０１１０２８２Ａ１、ＵＳ２００４／０１０９８６５Ａ１、ＷＯ０３／０８５１１９Ａ１、ＷＯ０３／０８４５７０Ａ１、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０３５５８６（フコシル化のＲＮＡ阻害（ＲＮＡｉ）を記載する）、Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が含まれる。脱フコシル化抗体を産生する細胞株の例には、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）、米国特許出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８  Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ、及びＷＯ２００４／０５６３１２  Ａ１，Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，特に実施例１１）、及びアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞株が含まれる（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４））。
【０２１７】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野で既知の多様な方法により調製される。これらの方法には、天然源からの単離（自然発生するアミノ酸配列変異体の場合）またはオリゴヌクレオチド媒介性（または、部位指向された）突然変異生成による調製、ＰＣＲ突然変異生成、及び事前に調製された変異体または非変異体版の抗体のカセット突然変異生成が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１８】
例えば、抗体の抗原依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）及び／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を増強するために、エフェクター機能に関して本発明の抗体を修飾することが望ましい場合がある。これは、１つ以上のアミノ酸置換を抗体のＦｃ領域内に導入することにより達成され得る。あるいはまたは加えて、システイン残基（複数可）は、Ｆｃ領域内に導入され得、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にする。このように生成されたホモ二量体抗体は、改善された内部移行能力、ならびに／または増加した補体媒介性細胞殺滅及び抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）、及びＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照されたい。増強された抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体も、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されるようなヘテロ二機能性架橋剤を使用して調製され得る。あるいは、二重Ｆｃ領域を有する抗体が操作され得、それにより、増強された補体溶解及びＡＤＣＣ能力を有し得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０（１９８９）を参照されたい。
【０２１９】
ＷＯ００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）は、ヒトエフェクター細胞の存在下で改善されたＡＤＣＣ機能を有する抗体を記載し、ここで、抗体は、それらのＦｃ領域内にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、改善されたＡＤＣＣを有する抗体は、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／または３３４位での置換を含む。いくつかの実施形態において、改変されたＦｃ領域は、これらの位置の１つ、２つ、３つにおいて置換を含むか、またはそれらからなるヒトＩｇＧ１のＦｃ領域である。
【０２２０】
改変されたＣ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を有する抗体が、ＷＯ９９／５１６４２、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号、米国特許第６，２４２，１９５Ｂ１号、米国特許第６，５２８，６２４Ｂ１号、及び米国特許第６，５３８，１２４（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．）号に記載される。抗体は、それらのＦｃ領域のアミノ酸位置２７０、３２２、３２６、３２７、３２９、３１３、３３３、及び／または３３４のうちの１つ以上でのアミノ酸置換を含む。
【０２２１】
抗体の血清半減期を増加させるために、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されるようなサルベージ受容体結合エピトープが抗体（特に、抗体断片）中に組み込まれ得る。本明細書で使用される場合、用語「サルベージ受容体結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させる原因となる、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す。Ｆｃ領域内に置換及び増加した血清半減期を有する抗体も、ＷＯ００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）に記載される。
【０２２２】
３つ以上（好ましくは４つ）の機能的抗原結合部位を有する操作抗体も、企図される（米国出願第ＵＳ２００２／０００４５８７  Ａ１号、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）。
【０２２３】
本発明の抗体は、当技術分野で既知であり、かつ容易に利用可能である追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾され得る。ある特定の実施形態において、抗体の誘導体化に好適な部分は、水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性に因り、製造時に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量のものであり得、分岐状または非分岐状であり得る。抗体に結合したポリマーの数は異なり得、１つを超えるポリマーが結合している場合、それらは、同じ分子または異なる分子であり得る。概して、誘導体化のために使用されるポリマーの数及び／または種類は、改善された抗体の特定の特性または機能、抗体の誘導体が所定の条件下で療法において使用されるかどうかなどを含むが、これらに限定されない検討事項に基づいて決定され得る。
【０２２４】
ベクター、宿主細胞、及び組換え方法
抗体は、組換え方法を使用しても産生され得る。抗抗原抗体の組換え産生に関して、抗体をコードする核酸が単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクターに挿入される。抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され得、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）配列決定され得る。多くのベクターが利用可能である。ベクター構成成分には概して、以下のシグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。
【０２２５】
シグナル配列構成成分
本発明の抗体は、直接のみならず、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換え的に産生され得、これは好ましくは、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドである。選択される異種シグナル配列は好ましくは、宿主細胞により認識及び処理される（例えば、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものである。天然抗体シグナル配列を認識も処理もしない原核宿主細胞に関して、シグナル配列は、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核シグナル配列により置換される。酵母分泌に関して、天然シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、因子リーダー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓα−因子リーダーを含む）、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー、またはＷＯ９０／１３６４６に記載されるシグナルにより置換され得る。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
【０２２６】
複製起点
発現及びクローニングベクターの両方は、１つ以上の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含有する。概して、クローニングベクターにおいて、この配列は、宿主染色体ＤＮＡとは無関係にベクターの複製を可能にするものであり、これらには、複製起点または自己複製配列が含まれる。かかる配列は、多様な細菌、酵母、及びウイルスに関して周知されている。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点が大半のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド起点が酵母に好適であり、様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）が哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点構成成分は、哺乳動物発現ベクターに必要とされない（ＳＶ４０起点は、初期プロモーターを含有することに因り、典型的に使用され得る。
【０２２７】
選択遺伝子構成成分
発現及びクローニングベクターは、選択遺伝子、別名、選択可能なマーカーを含有し得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンへの耐性を与えるか、（ｂ）栄養要求性欠損を補完するか、または（ｃ）複合培地から入手不可能な必須の栄養素、例えば、ＢａｃｉｌｌｉのためのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子を供給するタンパク質をコードする。
【０２２８】
選択スキームの一例は、宿主細胞の成長を停止する薬物を利用する。異種遺伝子を用いた形質転換に成功した細胞は、薬物耐性を与え、したがって選択レジメンで生き残るタンパク質を産生する。かかる優性選択の例は、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸、及びハイグロマイシンを使用する。
【０２２９】
哺乳動物細胞に好適な選択可能なマーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉ及び−ＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどの抗体コード核酸を取り込むための細胞構成成分の特定を可能にするものである。
【０２３０】
例えば、ＤＨＦＲ遺伝子で形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中で形質転換体を培養することにより特定される。これらの条件下で、ＤＨＦＲ遺伝子は、任意の他の共形質転換された核酸とともに増幅される。内因性ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）が使用され得る。
【０２３１】
あるいは、ＧＳ遺伝子で形質転換された細胞は、ＧＳ阻害剤であるＬ−メチオニンスルホキシミン（Ｍｓｘ）を含有する培養培地中で形質転換体を培養することにより特定される。これらの条件下で、ＧＳ遺伝子は、任意の他の共形質転換された核酸とともに増幅される。ＧＳ選択／増幅系が、上述のＤＨＦＲ選択／増幅系と組み合わせて使用され得る。
【０２３２】
あるいは、目的の抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲ遺伝子、及び例えば、アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などの別の選択可能なマーカーで形質転換または共形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、アミノグリコシド抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８などの選択可能なマーカー用の選択剤を含有する培地中の細胞成長により選択され得る。米国特許第４，９６５，１９９号を参照されたい。
【０２３３】
酵母での使用に好適な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９））。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１で成長する能力を欠く酵母の突然変異菌株のための選択マーカーを提供する。Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）。次いで、酵母宿主細胞ゲノム中でのｔｒｐ１病変の存在は、トリプトファンの不在下での成長による形質転換の検出に有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２が欠損した酵母菌株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を持つ既知のプラスミドにより補完される。
【０２３４】
加えて、１．６μｍの環状プラスミドｐＫＤ１由来のベクターが、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ酵母の形質転換に使用され得る。あるいは、組換え仔牛キモシンの大規模産生のための発現系としてＫ．ｌａｃｔｉｓが報告された。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０）。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの工業用菌株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定した多コピー発現ベクターも開示されている。Ｆｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１）．
【０２３５】
プロモーター構成成分
発現及びクローニングベクターは概して、宿主生物により認識され、かつ抗体をコードする核酸に作動可能に連結するプロモーターを含有する。原核宿主との使用に好適なプロモーターには、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリ性ホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが含まれる。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するためのプロモーターは、抗体をコードするＤＮＡに作動可能に連結するシャイン・ダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含有するであろう。
【０２３６】
真核生物のプロモーター配列が既知である。実質的に全ての真核遺伝子が、転写が始まる部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴに富んだ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであり得るＣＮＣＡＡＴ領域である。大半の真核遺伝子の３’末端は、コード配列の３’末端へのポリＡ尾部の付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列の全てが、真核発現ベクターに好適に挿入される。
【０２３７】
酵母宿主との使用に好適なプロモーター配列の例には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素のプロモーター、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【０２３８】
成長条件により制御された転写のさらなる利点を有する誘導可能なプロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトース及びガラクトース利用の原因となる酵素のプロモーター領域である。酵母発現での使用に好適なベクター及びプロモーターは、ＥＰ７３，６５７にさらに記載される。酵母エンハンサーも酵母プロモーターとともに有利に使用される。
【０２３９】
哺乳動物宿主細胞中のベクターからの抗体転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、または異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから得られるプロモーターにより制御され得るが、但し、かかるプロモーターが宿主細胞系と適合性であることを条件とする。
【０２４０】
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として簡便に得られる。ウシ乳頭腫ウイルスをベクターとして使用して哺乳動物宿主におけるＤＮＡを発現させるための系は、米国特許第４，４１９，４４６号で開示される。この系の変化形は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載される。単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞内のヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現に関しては、Ｒｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８−６０１（１９８２）も参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復がプロモーターとして使用され得る。
【０２４１】
エンハンサー要素構成成分
より高次の真核生物による本発明の抗体をコードするＤＮＡの転写は、多くの場合、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている。しかし、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用されるであろう。例には、複製起点の後半側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後半側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核プロモーターの活性化のための増強要素に関しては、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８（１９８２）も参照されたい。エンハンサーは、抗体コード配列の５’位または３’位でベクターにスプライスされ得るが、好ましくは、プロモーターから５’部位に位置する。
【０２４２】
転写終結構成成分
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞）で使用される発現ベクターは、転写終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有するであろう。かかる配列は一般的に、真核またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’非翻訳領域、時折、３’非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結構成成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６及びそれらで開示される発現ベクターを参照されたい。
【０２４３】
宿主細胞の選択及び形質転換
本明細書におけるベクター内のＤＮＡのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、または高等真核生物の細胞である。この目的に好適な原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性の生物などの真正細菌、例えば、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａなどのＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、及びＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓなどのＢａｃｉｌｌｉ（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６，７１０で開示されるＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ４１Ｐ）、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが含まれる。１つの好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、及びＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）などの他の菌株も好適である。これらの例は、限定するものではなく、例示するものである。
【０２４４】
全長抗体、抗体融合タンパク質、及び抗体断片は、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされないとき、例えば、治療抗体が、単独で腫瘍細胞破壊における効果を示す細胞傷害性剤（例えば、毒素）に複合されるとき、細菌内で産生され得る。全長抗体は、血液循環におけるより優れた半減期を有する。Ｅ．ｃｏｌｉでの産生がより迅速であり、より費用効率が高い。細菌内の抗体断片及びポリペプチドの発現に関して、例えば、米国特許第５，６４８，２３７（ＣＡｒｔｅｒ  ｅｔ．  ａｌ．）号、米国特許第５，７８９，１９９（Ｊｏｌｙ  ｅｔ  ａｌ．）号、米国特許第５，８４０，５２３（Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．）号を参照されたく、これらは、発現及び分泌を最適化するための翻訳開始領域（ＴＩＲ）及びシグナル配列を記載する。Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３），ｐｐ．２４５−２５４も参照されたく、これは、Ｅ．ｃｏｌｉ内の抗体断片の発現を記載する。発現後、抗体は、可溶性画分中のＥ．ｃｏｌｉ細胞ペーストから単離され得、例えば、アイソタイプに応じてタンパク質ＡまたはＧカラムにより精製され得る。最終精製は、例えば、ＣＨＯ細胞で発現された抗体を精製するためのプロセスと同様に行われ得る。
【０２４５】
原核生物に加えて、糸状真菌または酵母などの真核微生物が、抗体コードベクターに好適なクローニングまたは発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または一般的なパン酵母が、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用されているものである。しかし、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ  ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、及びＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓなどのＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３，０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなどのＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ；さらに、糸状真菌、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、ならびにＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ及びＡ．ｎｉｇｅｒなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主などの、いくつかの他の属、種、及び菌株が、一般的に利用可能であり、本明細書において有用である。治療的タンパク質の産生のための酵母及び糸状菌の使用を考察している概説に関しては、例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４）を参照されたい。
【０２４６】
グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的または完全ヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす、ある特定の真菌及び酵母菌株が選択され得る。例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるグリコシル化経路のヒト化を記載している）、及びＧｅｒｎｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）を参照されたい。
【０２４７】
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス菌株及び変異体、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（イモムシ）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉなどの宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞が特定されている。トランスフェクションのための多様なウイルス菌株、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１変異体及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５菌株が公的に利用可能であり、かかるウイルスは、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、本発明による本明細書におけるウイルスとして使用され得る。
【０２４８】
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、ウキクサ（Ｌｅｎｉｎａｃｅａｅ）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、及びタバコの植物細胞培養物も宿主として利用され得る。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物における抗体の産生のためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。
【０２４９】
脊椎動物細胞は、宿主として使用され得、培養物中での脊椎動物細胞の繁殖（組織培養物）は、日常的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ヒト胚腎臓株（２９３細胞または懸濁培養物中での成長のためにサブクローン化された２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））、サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、及びヒト肝臓癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））、ならびにＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体産生に好適なある特定の哺乳動物宿主細胞株の概説に関しては、例えば、Ｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３），ｐｐ．２５５−２６８を参照されたい。
【０２５０】
宿主細胞は、抗体産生のために上述の発現またはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換対の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切なものとして修飾された従来の栄養素培地中で培養される。
【０２５１】
宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために使用される宿主細胞は、多様な培地中で培養され得る。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ修飾イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販される培地は、宿主細胞を培養するのに好適である。加えて、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５号、もしくは同第５，１２２，４６９号、ＷＯ９０／０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、または米国特許再発行第３０，９８５号に記載される培地のいずれも、宿主細胞のための培養培地として使用され得る。これらの培地のいずれにも、必要に応じて、ホルモン及び／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬物など）、微量要素（マイクロモルの範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物と定義される）、ならびにグルコースまたは同等のエネルギー源が補充され得る。任意の他の必要な補充物も、当業者には既知であろう適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともにこれまでに使用されているものであり、当業者には明らかであろう。
【０２５２】
抗体の精製
組換え技法を使用するとき、抗体は、細胞内、細胞膜周辺腔内で産生されてもよいし、または培地に直接分泌されてもよい。抗体が細胞内で産生される場合、第１のステップとして、微粒子残屑（宿主細胞または溶解断片のいずれか）が、例えば、遠心分離または限外濾過により除去される。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）は、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順を記載する。簡潔に言うと、細胞ペーストが、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で、約３０分にわたって融解される。細胞残屑は、遠心分離により除去され得る。抗体が培地に分泌される場合、かかる発現系の上清は概して、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して、まず濃縮される。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するために前述のステップのうちのいずれかに含まれ得、抗生物質は、外来性汚染物質の成長を阻止するために含まれ得る。
【０２５３】
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを使用して精製され得、親和性クロマトグラフィーが典型的に好ましい精製ステップのうちの１つである。親和性リガンドとしてのタンパク質Ａの好適性は、抗体内に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに応じる。タンパク質Ａは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用され得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。タンパク質Ｇは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合する基質は、ほとんどの場合アガロースであるが、他の基質も利用可能である。制御細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定した基質は、アガロースで達成され得るものよりも速い流速、及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。イオン交換カラム上での分画、エタノール沈降、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上でのヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈降などのタンパク質精製のための他の技法も、回収される抗体に応じて利用可能である。
【０２５４】
概して、研究、試験、及び臨床で使用するための抗体を調製するための様々な方法論が当技術分野で十分に確立されており、上述の方法論と一致しており、かつ／または当業者により目的の特定の抗体に適切であると見なされる。
【０２５５】
生物学的に活性な抗体の選択
上述のように産生された抗体は、治療的観点から有益な特性を有する抗体を選択するか、または抗体の生物活性を保持する製剤及び条件を選択するために、１つ以上の「生物活性」アッセイにかけられ得る。抗体は、それが産生される抗原に結合するその能力について試験され得る。例えば、当技術分野で既知の方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなど）が使用され得る。
【０２５６】
例えば、抗ＰＤＬ１抗体の場合、抗体の抗原結合特性は、ＰＤＬ１に結合する能力を検出するアッセイで評価され得る。いくつかの実施形態において、抗体の結合は、例えば、飽和結合、ＥＬＩＳＡ、及び／または競合アッセイ（例えば、ＲＩＡ’ｓ）により判定され得る。抗体は、例えば、治療薬としてのその有効性を評価するために、他の生物活性アッセイにもかけられ得る。かかるアッセイは、当技術分野で既知であり、抗体の標的抗原及び意図される使用に応じる。例えば、抗体によるＰＤ−Ｌ１遮断の生物学的効果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）マウスモデル、及び／または例えば、米国特許第８，２１７，１４９号に記載されるような同系腫瘍モデルにおいて評価され得る。
【０２５７】
目的の抗原上の特定のエピトープに結合する抗体（例えば、例示的な抗ＰＤＬ１抗体の、ＰＤ−Ｌ１への結合を遮断するもの）に関して選別するために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されるものなどの通常の交差遮断アッセイが行われ得る。あるいは、例えば、Ｃｈａｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４（１９９５）に記載されるようなエピトープマッピングが、抗体が目的のエピトープに結合するかどうかを判定するために行われ得る。
【０２５８】
Ｖ．薬学的製剤
本発明に従って使用される抗体の治療製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、所望の純度を有する抗体を、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．）Ｅｄ．（１９８０））と混合することにより、保管用に調製される。許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、これらには、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０２５９】
皮下投与のために適合された凍結乾燥製剤は、米国特許第６，２６７，９５８（Ａｎｄｙａ  ｅｔ  ａｌ．）号に記載される。かかる凍結乾燥製剤は、好適な希釈剤により高タンパク質濃度に再構成されてもよく、この再構成された製剤は、本明細書で治療される哺乳動物に皮下投与され得る。
【０２６０】
抗体（複数可）の結晶化形態も企図される。例えば、ＵＳ２００２／０１３６７１９Ａ１（Ｓｈｅｎｏｙ  ｅｔ  ａｌ．）を参照されたい。
【０２６１】
本明細書における製剤は、治療されている特定の適応症に必要な、１つを超える活性化合物、いくつかの実施形態において、互いに有害な影響を及ぼさない相補的な活性を有するものも含有し得る。例えば、細胞傷害性剤；化学療法剤；免疫抑制剤；サイトカイン；サイトカインアンタゴニストもしくは抗体；成長因子；ホルモン；インテグリン；インテグリンアンタゴニストもしくは抗体（例えば、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈから市販されるエファリズマブ／ＲＡＰＴＩＶＡなどのＬＦＡ−１抗体、またはナタリズマブ／ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標）Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ／Ｅｌａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から入手可能な）などのアルファ４インテグリン抗体）；ＩＦＮ−ベータ−１ａ（ＲＥＢＩＦ（登録商標）及びＡＶＯＮＥＸ（登録商標））もしくはＩＦＮ−ベータ−１ｂ（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（登録商標））などのインターフェロンクラスの薬物；オリゴペプチド、かかる酢酸グラチラマー（ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標））；ミトキサントロン（ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ（登録商標））、メトトレキサート、シクロホスファミド、クロラムブシル、もしくはアザチオプリンなどの細胞傷害性剤；静注用免疫グロブリン（ガンマグロブリン）；リンパ球減損薬物（例えば、ミトキサントロン、シクロホスファミド、Ｃａｍｐａｔｈ、抗ＣＤ４、またはクラドリビン）；非リンパ球減損免疫抑制薬物（例えば、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）またはシクロスポリン）；「スタチン」クラスのコレステロール低下薬物；エストラジオール；テストステロン；ホルモン補充療法；二次ＭＳもしくはＭＳに関する症状（例えば、痙縮、失禁、痛み、疲労）を治療する薬物；ＴＮＦ阻害剤；疾患修飾性抗リウマチ薬物（ＤＭＡＲＤ）；非ステロイド性抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）；コルチコステロイド（例えば、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、デキサメタゾン、またはグルココルチコイド）；レボチロキシン；シクロスポリンＡ；ソマタスタチン（ｓｏｍａｔａｓｔａｔｉｎ）類似体；サイトカインアンタゴニスト；抗代謝剤；免疫抑制剤；インテグリンアンタゴニストもしくは抗体（例えば、エファリズマブなどのＬＦＡ−１抗体またはナタリズマブなどのアルファ４インテグリン抗体）；または別のＢ細胞表面アンタゴニスト／抗体などを、製剤の形態でさらに提供することが望ましい場合もある。かかる他の薬剤の種類及び有効量は、例えば、製剤中に存在する抗体の量、治療されている多発性硬化症の種類、及び患者の臨床的パラメータに応じる。これらは概して、それまでに使用されたのと同じ投与量及び投与経路か、またはそれまでに用いられた投与量の約１〜９９％で使用される。
【０２６２】
活性成分はまた、例えばコアセルベーション技法または界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタチレート）マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロ乳濁液、ナノ粒子、及びナノカプセル）中に、またはマクロ乳濁液中に取り込まれ得る。かかる技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）で開示される。
【０２６３】
徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の好適な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、これらのマトリックスは、成形物品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸塩とのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）などの分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注入可能なミクロスフェア）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【０２６４】
インビボ投与のために使用される製剤は、滅菌されていなければならない。これは、滅菌濾過膜を通す濾過により容易に達成される。
【０２６５】
ＶＩ．投与
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、静脈内、筋肉内、皮下、局所、経口、経皮、腹腔内、眼窩内、移植により、吸入により、髄腔内、脳室内、または鼻腔内投与される。有効量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、疾患の予防または治療のために投与され得る。抗ＰＤ−Ｌ１抗体の適切な投与量は、治療される疾患の種類、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の種類、疾患の重症度及び経過、個体の臨床的条件、個体の臨床歴及び治療への応答、ならびに担当医の裁量に基づいて判定され得る。
【０２６６】
一般的な提案として、ヒトに投与される治療有効量の抗体は、１回以上の投与にかかわらず、患者の体重の約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。いくつかの実施形態において、使用される抗体は、例えば、約０．０１〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約３５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１〜約１ｍｇ／ｋｇであり、毎日投与される。いくつかの実施形態において、抗体は、１５ｍｇ／ｋｇで投与される。しかし、他の投与量レジメンも有用であり得る。一実施形態において、本明細書に記載される抗ＰＤＬ１抗体は、２１日周期の１日目に、約１００ｍｇ、約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１３００ｍｇ、または約１４００ｍｇの用量でヒトに投与される。この用量は、注入などの、単回用量または複数回の用量（例えば、２または３回用量）で投与され得る。併用治療において投与される抗体の用量は、単剤治療と比較して低減され得る。この療法の進展は、従来の技法により容易に監視される。
【０２６７】
いくつかの実施形態において、本方法は、追加の療法をさらに含み得る。追加の療法は、放射線療法、手術（例えば、腫瘍摘出手術及び乳房切除）、化学療法、遺伝子療法、ＤＮＡ療法、ウイルス療法、ＲＮＡ療法、免疫療法、骨髄移植術、ナノ療法、モノクローナル抗体療法、または前述の組み合わせであり得る。追加の療法は、アジュバント療法またはネオアジュバント療法の形態であり得る。いくつかの実施形態において、追加の療法は、小分子酵素阻害剤または抗転移薬の投与である。いくつかの実施形態において、追加の療法は、副作用制限剤（例えば、治療の副作用の発生及び／または重症度を軽減するよう意図された薬剤、例えば、制嘔吐剤など）の投与である。いくつかの実施形態において、追加の療法は、放射線療法である。いくつかの実施形態において、追加の療法は、手術である。いくつかの実施形態において、追加の療法は、放射線療法と手術との組み合わせである。いくつかの実施形態において、追加の療法は、ガンマ照射である。いくつかの実施形態において、追加の療法は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を標的とする療法、ＨＳＰ９０阻害剤、チューブリン阻害剤、アポトーシス阻害剤、及び／または化学予防剤である。追加の療法は、本明細書に記載される化学療法剤のうちの１つ以上であり得る。
【０２６８】
併用療法
ある特定の実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、別の抗癌剤または癌療法と併せて投与される。「Ｉｎ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ（と併せて）」は、別の治療法に加えた１つの治療法の施行を指す。したがって、「と併せて」は、個体への他の治療法の投与前、投与中（例えば、それとともに、またはそれと同時に）、または投与後の１つの治療法の投与を指す。
【０２６９】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、化学療法または化学療法剤と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、放射線療法または放射線療法剤と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、標的療法または標的療法剤と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、免疫療法または免疫療法剤、例えば、モノクローナル抗体と併せて投与され得る。
【０２７０】
理論に束縛されることを望むものではないが、活性化共刺激分子を促進することによるか、または陰性共刺激分子を阻害することによる増強Ｔ細胞刺激が、腫瘍細胞死を促進し得、それにより、癌を治療するか、または癌の進行を遅延させると考えられる。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、活性化共刺激分子に対して指向されるアゴニストと併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、活性化共刺激分子には、ＣＤ４０、ＣＤ２２６、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、またはＣＤ１２７が含まれ得る。いくつかの実施形態において、活性化共刺激分子に対して指向されるアゴニストは、ＣＤ４０、ＣＤ２２６、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、またはＣＤ１２７に結合するアゴニスト抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、阻害性共刺激分子に対して指向されるアンタゴニストと併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、阻害性共刺激分子には、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２としても既知である）、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＩＤＯ、ＴＩＧＩＴ、ＭＩＣＡ／Ｂ、またはアルギナーゼが含まれ得る。いくつかの実施形態において、阻害性共刺激分子に対して指向されるアンタゴニストは、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＩＤＯ、ＴＩＧＩＴ、ＭＩＣＡ／Ｂ、またはアルギナーゼに結合するアンタゴニスト抗体である。
【０２７１】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２としても既知である）に対して指向されるアンタゴニスト、例えば、遮断抗体と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１、またはＹｅｒｖｏｙ（登録商標）としても既知である）と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、トレメリムマブ（チシリムマブまたはＣＰ−６７５、２０６としても既知である）と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６としても既知である）に対して指向されるアンタゴニスト、例えば、遮断抗体と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＧＡ２７１と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＴＧＦベータに対して指向されるアンタゴニスト、例えば、メテリムマブ（ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ）（ＣＡＴ−１９２としても既知である）、フレソリムマブ（ｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂ）（ＧＣ１００８としても既知である）、またはＬＹ２１５７２９９と併せて投与され得る。
【０２７２】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞またはＣＴＬ）の養子移動を含む治療と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、優性陰性ＴＧＦベータ受容体、例えば、優性陰性ＴＧＦベータＩＩ種の受容体を含むＴ細胞の養子移動を含む治療と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＨＥＲＣＲＥＥＭプロトコルを含む治療と併せて投与され得る（例えば、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ  ＮＣＴ００８８９９５４を参照されたい）。
【０２７３】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＣＤ１３７（ＴＮＦＲＳＦ９、４−１ＢＢ、またはＩＬＡとしても既知である）に対して指向されるアゴニスト、例えば、活性化抗体と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ウレルマブ（ｕｒｅｌｕｍａｂ）（ＢＭＳ−６６３５１３としても既知である）と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＣＤ４０に対して指向されるアゴニスト、例えば、活性化抗体と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＣＰ−８７０８９３と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＯＸ４０（ＣＤ１３４としても既知である）に対して指向されるアゴニスト、例えば、活性化抗体と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、抗ＯＸ４０抗体（例えば、ＡｇｏｎＯＸ）と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＣＤ２７に対して指向されるアゴニスト、例えば、活性化抗体と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＣＤＸ−１１２７と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）に対して指向されるアンタゴニストと併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、ＩＤＯアンタゴニストとともにあるのは、１−メチル−Ｄ−トリプトファン（１−Ｄ−ＭＴとしても既知である）である。
【０２７４】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、抗体−薬物コンジュゲートと併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗体−薬物コンジュゲートは、メルタンシン（ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）またはモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を含む。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、抗ＮａＰｉ２ｂ抗体−ＭＭＡＥコンジュゲート（ＤＮＩＢ０６００ＡまたはＲＧ７５９９としても既知である）と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、トラスツズマブエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１、アドトラスツズマブエムタンシン、またはＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈとしても既知である）と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＤＭＵＣ５７５４Ａと併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、エンドセリンＢ受容体（ＥＤＮＢＲ）を標的とする抗体−薬物コンジュゲート、例えば、ＭＭＡＥと複合されたＥＤＮＢＲに対して指向される抗体と併せて投与され得る。
【０２７５】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、血管生成阻害剤と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＶＥＧＦ、例えば、ＶＥＧＦ−Ａに対して指向される抗体と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈとしても既知である）と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アンギオポエチン２（Ａｎｇ２としても既知である）に対して指向される抗体と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＥＤＩ３６１７と併せて投与され得る。
【０２７６】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、抗悪性腫瘍剤と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＣＳＦ−１Ｒ（Ｍ−ＣＳＦＲまたはＣＤ１１５としても既知である）を標的とする薬剤と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、抗ＣＳＦ−１Ｒ（ＩＭＣ−ＣＳ４としても既知である）と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、インターフェロン、例えば、インターフェロンアルファまたはインターフェロンガンマと併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ロフェロン−Ａ（組換えインターフェロンアルファ−２ａとしても既知である）と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＧＭ−ＣＳＦ（組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ｒｈｕ  ＧＭ−ＣＳＦ、サルグラモスチム、またはＬｅｕｋｉｎｅ（登録商標）としても既知である）と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＩＬ−２（アルデスロイキンまたはＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）としても既知である）と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＩＬ−１２と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＣＤ２０を標的とする抗体と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、ＣＤ２０を標的とする抗体は、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１またはＧａｚｙｖａ（登録商標）としても既知である）またはリツキシマブである。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＧＩＴＲを標的とする抗体と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、ＧＩＴＲを標的とする抗体は、ＴＲＸ５１８である。
【０２７７】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、癌ワクチンと併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、癌ワクチンは、ペプチド癌ワクチンであり、いくつかの実施形態において、個別化ペプチドワクチンである。いくつかの実施形態において、ペプチド癌ワクチンは、多価長ペプチド、多ペプチド、ペプチドカクテル、ハイブリッドペプチド、またはペプチドパルス樹状細胞ワクチンである（例えば、Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ，１０４：１４−２１，２０１３を参照されたい）。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アジュバントと併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＴＬＲアゴニスト、例えば、Ｐｏｌｙ−ＩＣＬＣ（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）としても既知である）、ＬＰＳ、ＭＰＬ、またはＣｐＧ  ＯＤＮを含む治療と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファと併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＩＬ−１と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＨＭＧＢ１と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＩＬ−１０アンタゴニストと併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＩＬ−４アンタゴニストと併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＩＬ−１３アンタゴニストと併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＨＶＥＭアンタゴニストと併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＩＣＯＳアゴニストと併せて、例えば、ＩＣＯＳ−Ｌ、またはＩＣＯＳに対して指向されるアゴニスト抗体の投与により投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＣＸ３ＣＬ１を標的とする治療と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＣＸＣＬ９を標的とする治療と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＣＸＣＬ１０を標的とする治療と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＣＣＬ５を標的とする治療と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＬＦＡ−１またはＩＣＡＭ１アゴニストと併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、セレクチンアゴニストと併せて投与され得る。
【０２７８】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、標的療法と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、Ｂ−Ｒａｆの阻害剤と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ベムラフェニブ（Ｚｅｌｂｏｒａｆ（登録商標）としても既知である）と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ダブラフェニブ（Ｔａｆｉｎｌａｒ（登録商標）としても既知である）と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）としても既知である）と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＥＫ１（ＭＡＰ２Ｋ１としても既知である）またはＭＥＫ２（ＭＡＰ２Ｋ２としても既知である）などのＭＥＫの阻害剤と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、コビメチニブ（ＧＤＣ−０９７３またはＸＬ−５１８としても既知である）と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、トラメチニブ（Ｍｅｋｉｎｉｓｔ（登録商標）としても既知である）と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、Ｋ−Ｒａｓの阻害剤と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ｃ−Ｍｅｔの阻害剤と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、オナルツズマブ（ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）（ＭｅｔＭＡｂとしても既知である）と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、Ａｌｋの阻害剤と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＡＦ８０２（ＣＨ５４２４８０２またはアレクチニブとしても既知である）と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の阻害剤と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＢＫＭ１２０と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、イデラリシブ（ＧＳ−１１０１またはＣＡＬ−１０１としても既知である）と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ペリフォシン（ＫＲＸ−０４０１としても既知である）と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、Ａｋｔの阻害剤と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＫ２２０６と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＧＳＫ６９０６９３と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＧＤＣ−０９４１と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ｍＴＯＲの阻害剤と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、シロリムス（ラパマイシンとしても既知である）と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９またはＴｏｒｉｓｅｌ（登録商標）としても既知である）と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、エベロリムス（ＲＡＤ００１としても既知である）と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、リダフォロリムス（ＡＰ−２３５７３、ＭＫ−８６６９、またはデフォロリムスとしても既知である）と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＯＳＩ−０２７と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＡＺＤ８０５５と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＩＮＫ１２８と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＸＬ７６５と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＧＤＣ−０９８０と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＢＥＺ２３５（ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５としても既知である）と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＢＧＴ２２６と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＧＳＫ２１２６４５８と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＦ−０４６９１５０２と併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＦ−０５２１２３８４（ＰＫＩ−５８７としても既知である）と併せて投与され得る。
【０２７９】
ＶＩＩ．キット及び製品
本発明は、本明細書に記載される方法による癌の治療に有用な材料を含有するキット及び製品をさらに提供する。
【０２８０】
いくつかの実施形態において、本発明は、一緒にパッケージ化された、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（または、その抗原結合断片）及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物と、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（または、その抗原結合断片）または薬学的組成物が、対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において、またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低メチル化レベルを有する、癌を有する対象の治療に適応することを表示するラベルとを含む、製造のを提供する。いくつかの実施形態において、本製品は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（または、その抗原結合断片）または薬学的組成物を、対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において、またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低メチル化レベルを有する癌を有する対象に投与するための使用説明書をさらに含む。
【０２８１】
いくつかの実施形態において、本発明は、一緒にパッケージ化された、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（または、その抗原結合断片）及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物と、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（または、その抗原結合断片）または薬学的組成物の投与が、対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において、またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低レベルのメチル化を有する患者に基づくことを表示するラベルとを含む、製造のを提供する。いくつかの実施形態において、本製品は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（または、その抗原結合断片）または薬学的組成物を、対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において、またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低メチル化レベルを有する癌を有する対象に投与するための使用説明書をさらに含む。
【０２８２】
いくつかの実施形態において、本発明は、一緒にパッケージ化された、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（または、その抗原結合断片）及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物と、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（または、その抗原結合断片）または薬学的組成物が選択された患者に投与されることを表示するラベルとを含む、製造のを提供し、ここで、対象は、対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において、またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低レベルのメチル化を有することが見出されている。いくつかの実施形態において、本製品は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（または、その抗原結合断片）または薬学的組成物を、対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において、またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低メチル化レベルを有する癌を有する対象に投与するための使用説明書をさらに含む。
【０２８３】
いくつかの実施形態において、本発明は、対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、メチル化レベルを測定するための試薬と、ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低メチル化レベルを有するとして対象を分類するための使用説明書とを含むキットを提供する。ある特定の実施形態において、キットは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と、対象が、ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において及び／またはＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低メチル化レベルを有する場合、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を対象に投与するための使用説明書とをさらに含む。
【０２８４】
本明細書に記載されるキットまたは製品のいずれかのいくつかの実施形態において、対象は、対象からの癌細胞を含有する試料中のＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１において、及びＰＤ−Ｌ１遺伝子のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位において、中または低レベルのメチル化を有することが見出されている。
【０２８５】
本明細書に記載されるキットまたは製品のいずれかのいくつかの実施形態において、ラベルは、ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１における、またはＰＤ−Ｌ１のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位におけるメチル化度が、バイサルファイトＤＮＡ配列決定により判定されることを表示し、本明細書に記載されるキットまたは製品のいずれかのいくつかの実施形態において、ラベルは、ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１における、またはＰＤ−Ｌ１のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位におけるメチル化度が、バイサルファイト次世代配列決定により判定されることを表示する。本明細書に記載されるキットまたは製品のいずれかのいくつかの実施形態において、ラベルは、ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内のＣｐＧ１における、またはＰＤ−Ｌ１のイントロン１内の１つ以上のＣｐＧ部位におけるメチル化度が、メチル化チップアレイ（ＩＮＦＩＮＩＵＭ（登録商標）ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ＢｅａｄＣｈｉｐアレイなど）を使用して判定されることを表示する。
【０２８６】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるキットまたは製品は、対象からの癌細胞を含有する試料中の免疫細胞浸潤を検出するための試薬を含む。
【０２８７】
いくつかの実施形態において、試薬には、以下の抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ６８抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１６３抗体、または抗ＣＤ８抗体のうちの１つ以上が含まれる。いくつかの実施形態において、試薬は、抗ＣＤ８抗体である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるキットまたは製品は、対象からの癌細胞を含有する試料中の免疫細胞浸潤を検出するために、免疫組織化学的アッセイ（ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、またはフローサイトメトリーが含まれるが、これらに限定されない）を行うための使用説明書をさらに含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるキットまたは製品は、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ｑＲＴ−ＰＣＲ、トランスクリプトームプロファイリング（ＲＮＡ配列など）、マイクロアレイ分析、世代配列決定などが含まれるが、これらに限定されない遺伝子発現分析アッセイを行うための使用説明書をさらに含む。
【０２８８】
本明細書で提供されるキットまたは製品のいずれかのいくつかの実施形態において、癌は、乳癌、肺癌、または皮膚癌（それらの癌の転移型を含む）である。ある特定の実施形態において、乳癌は、乳癌腫である。いくつかの実施形態において、肺癌は、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌腫、または肺の扁平上皮癌腫である。ある特定の実施形態において、皮膚癌は、黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫、結節型黒色腫、または皮膚癌腫である。
【０２８９】
本キットまたは本製品のいずれかのいくつかの実施形態において、キットまたは製品中に含まれる抗ＰＤ−Ｌ１抗体（または、その抗原結合断片）は、本明細書に記載される抗ＰＤ−Ｌ１アニチ体である。本キットまたは本製品のいずれかのいくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（または、その抗原結合断片）は、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＤＸ−１１０５、及びＭＥＤＩ４７３６からなる群から選択される。本明細書で提供される製品中に含まれ得るか、または本明細書で提供される製品もしくはキット中に含まれ得る他の例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体（または、その抗原結合断片）は、ＷＯ２０１０／０７７６３４、ＷＯ２００７／００５８７４、ＷＯ２０１１／０６６３８９、及びＵＳ２０１３／０３４５５９に記載され、それらの各々は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２９０】
典型的には、本キットまたは本製品は、容器と、容器上のまたは容器に関連するラベルまたは添付文書と、を含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成され得る。容器は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（または、その抗原結合断片）、または癌を治療するのに有効な薬学的組成物を保持または収容し、滅菌アクセスポート（例えば、容器は、皮下注射針により穿刺可能なストッパーを有する静脈用溶液袋またはバイアルであり得る）を有し得る。本組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【０２９１】
ラベルまたは添付文書は、提供されている抗体及び任意の他の薬物の投薬量及び間隔についての具体的な指示により、本組成物が癌に罹患している患者において癌を治療するために使用されることを示す。本製品は、注入用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸塩緩衝塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液などの薬学的に許容される希釈緩衝液を含む第２の容器をさらに含み得る。本製品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
【０２９２】
任意に、本明細書における製品は、治療のための抗体以外の薬剤を含む容器と、患者をかかる薬剤で治療する上での使用説明書とをさらに含み、かかる薬剤は、例えば、化学療法剤（本明細書の他の場所に記載される化学療法剤など）、細胞傷害性剤（本明細書の他の場所に記載される細胞傷害性剤など）などである。
【０２９３】
本発明のさらなる詳細が、以下の非限定的な実施例により例示されている。本明細書における全ての引用の開示内容は、参照することにより本明細書に明確に組み込まれる。
【実施例】
【０２９４】
実施例は、単に本発明の例示となるように意図されており、したがって、決して本発明を限定するものと考えられるべきではなく、また、上記で考察される本発明の態様及び実施形態を記載及び詳述する。先の実施例及び詳細な記載は、限定するものではなく、例示として提供されている。
【０２９５】
実施例１：材料及び方法
以下の実施例２において、以下の材料及び方法を使用した。
【０２９６】
細胞株及び培養条件
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）またはアカデミックソースからＮＳＣＬＣ細胞株を入手し、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び２ｍＭのＬ−グルタミンで補充されたＲＰＭＩ１６４０培地内で培養した。細胞を、ＰＢＳ洗浄、及びＡｃｃｕｔａｓｅ剥離培地（Ｓｉｇｍａ）を用いたインキュベーション後に、分割及び／または実験分析のために剥離した。細胞を、０．１ｍＭのトリコスタチンＡ（「ＴＳＡ」、Ｓｉｇｍａ）及び／または１ｎｇ／ｍＬのインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）で２４時間、及び１ｍＭの５−アザシチジン−ｄＣ（５−アザ−ｄＣ，Ｓｉｇｍａ）で、ｑｄの３日間（すなわち、毎日）またはｑ２ｄの６日間（すなわち、隔日）で処理した。
【０２９７】
腫瘍試料
Ｔｈｅ  ＭＴ  Ｇｒｏｕｐ、Ｃｕｒｅｌｉｎｅ，Ｉｎｃ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、Ｔｒｉｓｔａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  ＬＬＣ、またはＣｌｉｎＰａｔｈ  ＡｄｖｉｓｏｒｓのＩＲＢ承認業者の収集物からＮＳＣＬＣ患者の保存腫瘍標本を入手した。
【０２９８】
ＤＮＡ／ＲＮＡ分析
ＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して同じ溶解液からのＲＮＡ及びＤＮＡ抽出のための細胞を溶解するために、緩衝液ＲＬＴ  Ｐｌｕｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用した。Ａｓｕｒａｇｅｎ，ＩｎｃのＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）でのマイクロアレイ、及びＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したｑＰＣＲにより、ＲＮＡ発現を分析した。Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｕｉｔｅ（Ｐａｒｔｅｋ）、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ（ＴＩＢＣＯ）、ＪＭＰ（ＳＡＳ）、及びＩＰＡ（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ）を使用してデータを分析した。ＩＮＦＩＮＩＵＭ（登録商標）ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でＤＮＡを分析した。ＤＮＡを、Ｚｙｍｏ  ＤＮＡ  Ｇｏｌｄメチル化キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してバイサルファイト修飾し、ＣＤ２７４プロモーター領域を標的とするバイサルファイト特異的配列決定プライマーで増幅した。ＰＣＲ産生物をＴＡサブクローン化し、標準の方法（ＡＢＩ）を使用して配列決定した。ＢＩＱ分析装置ソフトウェア（Ｃ．Ｂｏｃｋ）を使用して、ＡＢＩ配列ファイルを分析した。
【０２９９】
タンパク質分析
タンパク質溶解液を、細胞抽出緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して生成し、ＳｉｇｍａＦＡＳＴプロテアーゼ阻害剤タブレット（Ｓｉｇｍａ）、ならびにホスファターゼ阻害剤カクテル１及び２（Ｓｉｇｍａ）で補充した。溶解液を４℃で１０分間、２０，０００ｘｇで遠心分離し、次いで、ウェスタンブロット（ＷＢ）による分析のために上清を除去した。試料を、ＮｕＰａｇｅ  Ｎｏｖｅｘ  ＬＤＳ及びＳＲＡ緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理し、ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２分子量標準物質（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともにビストリスゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上に投入した。ゲルを、ｉＢｌｏｔシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してニトロセルロース膜に移動させ、次いで、室温で１時間、Ｏｄｙｓｓｅｙ遮断緩衝液（ＬＩ−ＣＯＲ）で遮断した。ゲルを、ヒトＰＤ−Ｌ１（内部）、β−アクチン（Ｓｉｇｍａ）に対する抗体で染色し、ｐ／ｔ  ＳＴＡＴ１、ｐ−ＳＴＡＴ３−Ｙ７０５、ｐ−ＳＴＡＴ３−Ｓ７２７、及びｔ−ＳＴＡＴ３（全てＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を、Ｏｄｙｓｓｅｙ遮断緩衝液＋０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０中で希釈した。初代抗体は、Ｏｄｙｓｓｅｙ遮断緩衝液＋０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０＋０．００１％のＳＤＳ中でＬＩ−ＣＯＲから検出された二次抗体であり、それらをＯｄｙｓｓｅｙ  ＣＬｘシステム（ＬＩ−ＣＯＲ）で分析した。
【０３００】
ＦＡＣＳ分析に関して、細胞を剥離し、次いで、ＦＢＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で２回洗浄した。次いで、細胞を、ＰＥ−複合抗ヒトＰＤ−Ｌ１またはアイソタイプコントロール（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のいずれかで染色し、次いで、洗浄して、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ分析装置（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分析した。
【０３０１】
免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を、Ｈｅｒｂｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ５１５，５６３−５７４に記載されるように行った。
【０３０２】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ、Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）
ＮＳＣＬＣ細胞株は適切な集密度に成長し、処理した細胞を１％のホルムアルデヒドで１５分間固定し、０．１２５Ｍのグリシンで抑制した。溶解緩衝液の付加及びＤｏｕｎｃｅホモジナイザーでの分裂により、クロマチンを単離した。溶解液を超音波処理し、ＤＮＡを３００〜５００ｂｐの平均長さにせん断した。クロマチンの分割量を、ＲＮａｓｅ、プロテイナーゼＫ、及び解架橋のための熱で処理することにより、ゲノムＤＮＡ（Ｉｎｐｕｔ）を調製した。処理後、エタノール沈降を行った。ゲノムＤＮＡのペレットを再懸濁し、得られたＤＮＡをＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計上で定量化した。元のクロマチン体積への外挿は、クロマチンの総収量の定量化を可能にした。
【０３０３】
クロマチンの分割量（３０μｇ）を、タンパク質Ａアガロースビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で事前に清浄した。目的のゲノムＤＮＡ領域を、ＳＴＡＴ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｃａｔ＃ｓｃ−３４５）及びＳＴＡＴ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−４８２）に対して４μｇの抗体を使用して単離した。複合体を洗浄し、ＳＤＳ緩衝液でビーズから溶出し、ＲＮａｓｅ及びプロテイナーゼＫ処理にかけた。６５℃で一晩、インキュベーションにより架橋を戻し、フェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈降によりクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）ＤＮＡを精製した。
【０３０４】
ＣｈＩＰの豊富さの質を、候補ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３コントロール部位に対するプライマーを使用してｑＰＣＲによりアッセイした。ｑＰＣＲの反応を、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して３セット行った。得られたシグナルを、入力ＤＮＡを使用して各プライマー対に対してｑＰＣＲを行うことによりプライマー効率に関して正常化した。
【０３０５】
ＣｈＩＰ配列決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）
Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定ライブラリを、末端研磨、ｄＡ−付加、及びアダプターライゲーションの標準の連続酵素ステップによりＣｈＩＰ及びＩｎｐｕｔ  ＤＮＡから調製した。最終のＰＣＲ増幅ステップ後、得られたＤＮＡライブラリを、ＨｉＳｅｑ２５００またはＮｅｘＳｅｑ５００上で定量し、配列決定した。配列（５０ｎｔのリード、単一末端、または７５ｎｔのリード、単一末端）を、ＢＷＡアルゴリズムを使用してヒトゲノム（ｈｇ１９）に整列させた。整列させた配列を各々、それらの３’末端においてシリコで、２００ｂｐの長さ、すなわち、サイズ選択されたライブラリ内の平均ゲノム断片長さに伸長し、ゲノムに沿って３２‐ｎｔのビンに割り当てた。得られたヒストグラム（ゲノム「シグナルマップ」）をｂｉｇＷｉｇファイル内に保存した。ピーク位置を、ｐ値のカットオフ＝１ｘ１０−７を示すＭＡＣＳアルゴリズム（ｖ１．４．２．）を使用して判定した。シグナルマップ及びピーク位置を、Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ専有分析プログラムへの入力データとして使用し、これは、試料比較、ピークメトリクス、ピーク位置、及び遺伝子アノテーションについての詳細な情報を含むエクセル表を作製する。
【０３０６】
バイサルファイト次世代配列決定（バイサルファイトＮＧＳ、Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）
また、ＣｈＩＰ配列により分析したＮＳＣＬＣ細胞株を、ＰＤ−Ｌ１プロモーターのメチル化状態に関してバイサルファイト次世代配列決定（ＮＧＳ）を介して分析した。標的領域（プラスストランド）に対するＰＣＲプライマーを、ＭｅｔｈＰｒｉｍｅｒソフトウェア（ｗｏｒｌｄ−ｗｉｄｅ−ｗｅｂ．ｕｒｏｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｍｅｔｈｐｒｉｍｅｒ／ｍｅｔｈｐｒｉｍｅｒ．ｃｇｉ）で考案した。バイサルファイト変換ゲノムＤＮＡから標的領域を増幅するために、プライマーを使用した。６つの試料の各々に関して、およそ等量の９つのＰＣＲ産生物を利用し、コンカテマー化し（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｚｅｄ）、１５０〜３００個の塩基対の平均断片長さに超音波処理し、標準物質に加工し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定ライブラリのバーコードをつけた。Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定ライブラリを、ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００で配列決定した。配列決定リードを、ビスマルク整列プログラム（ｖ  ０．７．７）（ｗｏｒｌｄ−ｗｉｄｅ−ｗｅｂ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｂｉｓｍａｒｋ／）を使用して分析した。参照配列としてヒトｃｈｒ６及びｃｈｒ９（ｈｇ１９構築）を使用した。ビスマルク整列レポートを、ファイル「２６７４Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  ｂｉｓｍａｒｋ  ｒｅｐｏｒｔｓ．ｘｌｓｘ」に纏める。５１０万〜７４０万のリードを試料毎に分析した。
【０３０７】
実施例２：ＰＤ−Ｌ１のメチル化及び発現の分析
ＲＮＡ及びＤＮＡを９１個のＮＳＣＬＣ細胞株から抽出し、ＰＤ−Ｌ１発現レベル（ＲＮＡ配列、Ｌｏｇ２カウント）及びプロモーターメチル化（ＩＮＦＩＮＩＵＭ（登録商標）アレイ）に関して試験した。５つのＣｐＧ部位（すなわち、ＣｐＧ１〜ＣｐＧ５）のうちの２つは、ＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡ発現と逆相関である異なるメチル化パターンを示した。図１を参照されたい。図１の最も左にＣｐＧ部位として示される第１のＣｐＧ部位、すなわち、ＣｐＧ１は、ＴＳＳの予測されたＰＤ−Ｌ１プロモーター部位上流で見られた。図１の最も右にＣｐＧ部位として示される第２のＣｐＧ部位、すなわち、ＣｐＧ５は、イントロン１内に位置した。ＣｐＧ１〜５の平均ベータ値の各々のヒートマップを、ＣＤ２７４転写ＮＭ＿０１４１４３内のそれらの位置に対してプロットし、それらに伴う発現ヒートマップを遺伝子座９ｐ２４．１におけるＰＤ−Ｌ１プロモーターマップの右に配置した。図１は、試験した各細胞株に関する、ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域発現及びメチル化ヒートマップを示す。ヒートマップのＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡ発現を高（赤）から低（緑）に分類した。高いＰＤ−Ｌ１発現を有する細胞株が低メチル化（青）であることが見出された。
【０３０８】
Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ  ３．０）の腫瘍データを分析して、ＰＤ−Ｌ１発現（ＲＮＡ配列、Ｌｏｇ２カウント）対ＤＮＡメチル化（ＩＮＦＩＮＩＵＭ（登録商標）アレイ、ＣｐＧ１＆ＣｐＧ５の平均ｍ値）の間の会合においてさらに調査した。４つの収集物の腫瘍には、肺腺癌腫（ＬＵＡＤ）、肺扁平上皮癌腫（ＬＵＳＣ）、乳癌（ＢＲＣＡ）、及び皮膚癌腫（ＳＫＣＭ）が含まれた。ＲＮＡ発現とメチル化との間の逆相関は、これらの患者の腫瘍分析においても見られた：ＬＵＡＤ＝−０．３３、ＬＵＳＣ＝−０．３８、ＢＲＣＡ＝−０．４、及びＳＫＣＭ＝−０．２５。腫瘍試料をさらに下位群に分けて、各腫瘍における免疫浸潤の量によりＰＤ−Ｌ１発現をさらに解析するために、ＣＤ８Ａ発現（ＲＮＡ配列、中央値カットオフ）により色付けした。より高いＣＤ８Ａ発現を有する腫瘍は、より高いＰＤ−Ｌ１発現及びより低いＰＤ−Ｌ１プロモーターメチル化も有する傾向にあった。図２Ａ（肺腺癌腫）、２Ｂ（肺扁平上皮癌腫）、２Ｃ（乳癌）、及び２Ｄ（皮膚癌腫）を参照されたい。
【０３０９】
ＰＤ−Ｌ１発現レベル及びプロモーターメチル化に関して試験したＮＳＣＬＣ細胞株の中から選択した数（図１を参照されたい）を分析して、ＰＤ−Ｌ１プロモーターメチル化とＰＤ−Ｌ１発現インビトロとの間の関係をさらに調査した。さらなる分析のために選択された細胞株を、ＣｐＧ１及びＣｐＧ５における平均メチル化レベルに基づいて選択した。細胞株Ｈ６６１、ＬＸＦＬ５２９、及びＡ４２７を、ＣｐＧ１及びＣｐＧ５において高平均メチル化レベルを有するとして分類し、細胞株Ｈ２０７３及びＨ３２２Ｔを、ＣｐＧ１及びＣｐＧ５において中平均メチル化レベルを有するとして分類し、細胞株Ｈ１９９３を、ＣｐＧ１及びＣｐＧ５において低平均メチル化レベルを有するとして分類した。
【０３１０】
細胞株の各々の細胞を５つの条件のうちの１つに曝露した：（１）処理なし、（２）１ｍＭの５−アザシチジン−ｄＣ（５−アザ−ｄＣ、ＤＮＡ脱メチル化剤）による処理、（３）０．１ｍＭのトリコスタチンＡ（ＴＳＡ、クラスＩ及びクラスＩＩの哺乳動物ヒストン脱アセチル化酵素）による処理、（４）１ｎｇ／ｍＬのインターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）による処理、または（５）５−アザ−ｄＣ、ＴＳＡ、及びＩＦＮｇの組み合わせによる処理。次いで、ｑＲＴ−ＰＣＲによりＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡ発現を測定した。図３に示されるように、ＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡ発現は、３日の５−アザ−ｄＣ処理の後、Ｈ６６１、ＬＸＦＬ５２９、Ａ４２７、及びＨ３２２Ｔにおいて増加した。Ｈ３２２Ｔだけが、ＴＳＡ処理後にＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡ発現の増加を実証した。５−アザ−ｄＣ、ＴＳＡ、及びＩＦＮｇの組み合わせによる処理が、Ｈ１９９３（すなわち、ＣｐＧ１及びＣｐＧ５において低平均メチル化レベルを有する細胞株）以外の全ての株においてＰＤ−Ｌ１発現を結果的に増加させた。Ｈ１９３３は、高レベルのベースラインＰＤ−Ｌ１発現を既に実証した。
【０３１１】
４つの細胞株、すなわち、Ａ４２７（ＣｐＧ１及びＣｐＧ５が高レベルのメチル化を有する）、Ｈ３２２Ｔ（ＣｐＧ１及びＣｐＧ５が中レベルのメチル化を有し、ＰＤ−Ｌ１発現がＩＦＮｇでの処理により誘導可能である、Ｈ２９２（ＣｐＧ１及びＣｐＧ５が低レベルのメチル化を有する）、及びＨ３５８（ＣｐＧ１及びＣｐＧ５が低レベルのメチル化を有する）を実験で使用するために選択して、ＩＦＮｇの存在下及び不在下における、ＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡとタンパク質発現との関係をさらに調査した。ＩＦＮｇを用いて刺激したとき、Ａ４２７、Ｈ３２２Ｔ、Ｈ２９２、及びＨ３５８は、それらの元の基礎発現とは無関係にＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡ誘導の増加を示した。図４Ａを参照されたい。ＩＦＮｇの不在下で低レベルでＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡを発現するＡ４２７及びＨ２９２は、Ａ４２７のＲＮＡレベルが低い（０．０１２  ２−ＤＣｔにおける）ままである一方で、Ｈ２９２が増加したＲＮＡレベル（０．１０２  ２−ＤＣｔにおける）を示す、ＩＦＮｇ刺激への可変応答を示した。ＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡ発現における最も大きな変化がＨ３２２Ｔ株において観察され、０．０１８から１．３５６  ２−ＤＣｔへ増加した。高レベルのベースラインＰＤ−Ｌ１発現、ならびにＣｐＧ１及びＣｐＧ５において低メチル化レベルを既に示したＨ３５８細胞株は、刺激後にそのＲＮＡ発現に対して著しい変化を示さなかった。
【０３１２】
ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現は、ベースライン及びその後のＩＦＮｇ刺激の両方において、このサブセットの細胞株内のＲＮＡ発現と非厳密に相関する。Ａ４２７は依然として、２０の正常化蛍光強度中央値（ｎＭＦＩ）を有するＦＡＣＳによるバックグラウンドを超える発現をほとんど示さなかった。Ｈ３２２Ｔも、低レベルのＰＤ−Ｌ１発現（１０７のｎＭＦＩ）を示した。図４Ａを参照されたい。Ｈ２９２は、１５８０のｎＭＦＩを有する著しくより高いタンパク質発現を示し、Ｈ３５８は、最も高いベースライン発現（４２０４のｎＭＦＩ）を実証した。全ての４つの細胞株は、ＩＦＮｇ処理後に増加した表面ＰＤ−Ｌ１タンパク質レベルを示した。Ａ４２７細胞株において、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現は、低いままであった。Ｈ２９２及びＨ３５８細胞株において、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現は、３〜４倍増加し、Ｈ３２２Ｔにおいて、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現は、ベースラインレベルと比較すると４８倍を超えて増加した。比較的に、ＩＦＮｇ処理後のＡ４２７におけるＰＤ−Ｌ１タンパク質レベルは、Ｈ３２２Ｔで見られる処理前のレベルに増加した。その後のＨ３２２ＴにおけるＩＦＮｇ処理は、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現が高度に誘導可能であることを示した。上記で考察されるように、Ｈ３２２ＴにおけるＰＤ−Ｌ１タンパク質のベースラインレベルは、低かった。対照的に、ＩＦＮｇ処理後のＨ３２２ＴにおけるＰＤ−Ｌ１タンパク質レベルは、ＩＦＮｇ処理後のＨ２９２及びＨ３５８におけるＰＤ−Ｌ１タンパク質レベルと比較可能であった。
【０３１３】
次に、ＩＦＮｇ／ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路が、Ａ４２７、Ｈ３２２Ｔ、Ｈ２９２、及びＨ３５８におけるＰＤ−Ｌ１転写及びタンパク質レベルのＩＦＮｇ媒介性誘導において役割を果たすかどうかを判定するために、ウェスタンブロットを行った。簡潔に言うと、Ａ４２７、Ｈ３２２Ｔ、Ｈ２９２、及びＨ３５８の細胞に対して、（ａ）処理なし、（ｂ）３０分間のＩＦＮｇによる処理、または（ｃ）２４時間のＩＦＮｇによる処理、のいずれかを行った。次いで、細胞をタンパク質溶解液に加工し、ゲル上に流し、ブロットし、以下の抗体を用いて調べた：（１）抗ホスホ−ＳＴＡＴ１、（２）抗トータル−ＳＴＡＴ１、（３）抗ホスホ−ＳＴＡＴ３−Ｙ７０５、（４）抗ホスホ−ＳＴＡＴ３−Ｓ７２７、（５）抗トータル−ＳＴＡＴ３、及び（６）β−アクチン（ローディングコントロール）。全ての４つの細胞株は、ＩＦＮｇ刺激後に力強いｐ−ＳＴＡＴ１活性化を示し、基礎ｐ−ＳＴＡＴ１は、Ｈ３５８だけで観察された。図４Ｂを参照されたい。ＳＴＡＴ３に関する初期の活性化部位である、ｐ−ＳＴＡＴ３−Ｙ７０５は、Ｈ２９２（３０分のＩＦＮｇ処理後）及びＨ３５８において構成的に活性化したが、Ｈ３５８においては、ＩＦＮｇ刺激後の２４時間以内に消滅した。ＳＴＡＴ３は、Ｓ７２７でのｍＴＯＲ及びＭＡＰＫ経路によりさらに活性化した。ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路の活性化は、２４時間以内にＨ３５８細胞を除いて全ての細胞株において観察され、これは、初期時点及び後期時点の両方で、刺激前後におけるｐ−ＳＴＡＴ３−Ｓ７２７活性化を示さなかった。これらの結果は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路（ＳＴＡＴ１経路を含む）が、試験した全ての４つの細胞株において活性であることを示す。
【０３１４】
次に、ｓｉＲＮＡを使用して、Ａ４２７及びＨ３５８におけるＰＤ−Ｌ１プロモーターメチル化とＩＦＮｇ／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路との間の関係を調査した。上述されるように、ＣｐＧ１及びＣｐＧ５は、Ａ４２７において低レベルのメチル化を有し、Ａ４２７は、ベースラインにおいて、及びＩＦＮｇ刺激後に、低いＰＤ−Ｌ１タンパク質発現を示したか、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現を示さなかった。対照的に、ＣｐＧ１及びＣｐＧ５は、Ｈ３５８において低レベルのメチル化を有し、Ｈ３５８は、ＩＦＮｇ刺激後に増加した、ベースラインにおいて高いＰＤ−Ｌ１タンパク質発現を示した。どのＳＴＡＴがメチル化という点でＰＤ−Ｌ１発現にとって最も重大であるかを判定するために、各細胞株の細胞を、（１）ｓｉＲＮＡ無し、（２）スクランブルコントロール、（３）ｓｉＳＴＡＴ１、（４）ｓｉＳＴＡＴ３、（５）ＩＦＮｇ、または（６）ｓｉＳＴＡＴ１、ｓｉＳＴＡＴ３、及びＩＦＮｇとともに投薬した。
【０３１５】
Ａ４２７は、ＩＦＮｇを用いた刺激後の活性化ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３の強力な誘導にかかわらず、処理に関係なくＰＤ−Ｌ１発現を示さなかった。図４Ｃを参照されたい。非メチル化Ｈ３５８細胞は、ＩＦＮｇ刺激でさらに誘導された基礎構成的なＰＤ−Ｌ１発現を示した。ｓｉＳＴＡＴ３は、ＰＤ−Ｌ１基礎発現をさらに低減した。ｓｉＳＴＡＴ１及びｓｉＳＴＡＴ３の両方は、ベースラインに近接したＰＤ−Ｌ１発現をノックダウンした一方で、ＩＦＮｇと両方のｓｉＲＮＡとの組み合わせは、ｓｉＲＮＡ干渉を用いた同時刺激にかかわらず、ＰＤ−Ｌ１発現をほとんど示さなかった。これらの結果は、ＰＤ−Ｌ１プロモーターのメチル化が、ＩＦＮｇ／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ１またはＩＦＮｇ／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３の活性化にかかわらず、ＰＤ−Ｌ１発現を遮断したことを示す。これらの結果は、ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３の両方が、ＩＦＮｇで刺激されたＰＤ−Ｌ１発現のために必要とされ、ＳＴＡＴ３は、ＰＤ−Ｌ１基礎発現にも部分的に必要とされるであろうことも示す。
【０３１６】
次に、バイサルファイト配列決定データを、３つ全てのＰＤ−Ｌ１プロモーターメチル化分類（すなわち、高、中、及び低メチル化レベル）を示す、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サブセット、不死化正常肺細胞株、及びＮＳＣＬＣ肺株に対して想定されるＣｐＧメチル化部位のマップ上に重ね合わせた。図５Ａ及び５Ｂにおいて、Ｍｕｔ２／Ｃｐｇ１及びＭｕｔ７／ＣｐＧ５を赤色で囲んだ。患者の腫瘍において免疫浸潤として見られ得るであろう、様々なＰＢＭＣサブセットにおけるメチル化はほとんど見られないか、全く見られない。図５Ａを参照されたい。正常肺細胞株も、これらの部位においてメチル化を示さなかった。図５Ａ及び５Ｂを参照されたい。高レベルでＰＤ−Ｌ１を発現した細胞株Ｈ３５８及びＨ１９９３は、ＣｐＧ１及び５においてメチル化を示さなかった。図５Ｂを参照されたい。低いが、誘導可能であるベースラインＰＤ−Ｌ１発現を示した細胞株Ｈ３２２Ｔ及びＨ２０７３は、両方のＣｐＧ部位において部分的なメチル化を実証した。図５Ｂを参照されたい。低いベースラインＰＤ−Ｌ１発現を有すると示されたＡ４２７は、ＣｐＧ１及びＣｐＧ５において高レベルのメチル化を呈した。ＰＢＭＣサブセット及び正常肝細胞株内のＣｐＧ１及びＣｐＧ５において、メチル化はほとんど見られないか、全く見られないため、患者の全腫瘍試料中で検出されるＰＤ−Ｌ１プロモーター領域におけるメチル化は、したがって、試料中の腫瘍細胞から優位に発生し、任意の他の細胞サブセットからは発生しないはずである。
【０３１７】
Ｘ軸上の平滑化ＣｐＧ１及びＣｐＧ５のメチル化（Ｍ値）を、Ｙ軸上のＰＤ−Ｌ１発現（ＲＮＡ配列、Ｌｏｇ２カウント）と直接比較する点図表プロットを作製するために、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＣＧＰ）からのＮＳＣＬＣ細胞株を使用した。図６Ａに示されるように、データは、−０．７のＰｅａｒｓｏｎの相関性を有し、高度に逆相関する関係を有する。これらの細胞株内のＰＤ−Ｌ１ベースライン発現は、プロモーターメチル化のレベルにより非常に影響を受ける。次いで、図６Ａにおいて分析されたＣＧＰ細胞株を、３つのメチル化グループに分類分けした：（１）低（すなわち、ＣｐＧ１及びＣｐＧ５の両方において、低メチル化からメチル化無し）、（２）中間（すなわち、ＣｐＧ１またはＣｐＧ５部位のメチル化）、または（３）高（ＣｐＧ１及びＣｐＧ５の両方のメチル化）。これらのグループをＸ軸上にプロットし、ＲＮＡ配列による基礎ＰＤ−Ｌ１発現をＹ上にプロットし、各グループの発現中央値を示した。ＡＮＯＶＡ分析は、ＰＤ−Ｌ１発現に際し、各グループに関して高い統計的適切性を示した。グループ（１）（すなわち、低）は、最も高いＰＤ−Ｌ１発現中央値を有し、グループ（２）（すなわち、中間）及びグループ（３）（すなわち、高）のメチル化グループは、より低いＰＤ−Ｌ１発現中央値を示した。図６Ｂを参照されたい。これらのデータは、基礎ＰＤ−Ｌ１発現が、ＣｐＧ１またはＣｐｇ５のいずれかにおけるプロモーターのメチル化レベルに反比例して制御されるが、メチル化されるＣｐＧ部位の数にも反比例して制御されることを示す。
【０３１８】
次いで、より大きな数の細胞株のデータセット内のＰＤ−Ｌ１発現に対して大域脱メチル化が有するであろう効果の順番で、ＣＰＧ  ＮＳＣＬＣ細胞株パネル内の細胞株を５−アザ−ｄＣにより処理した。ＰＤ−Ｌ１発現が著しく誘導された。グループ（３）（すなわち、高）の細胞株のみが、メチル化が抑制されたＰＤ−Ｌ１発現の著しい誘導を示した。図６Ｃを参照されたい。加えて、このパネル内の２つの細胞株、Ｈ１９９３（低）及びＨ２０７３（中間）は、１人の患者からの２つの別個の試料から生じていることで知られている。Ｈ１９９３は、５−アザ−ｄＣ処理後にＰＤ−Ｌ１発現の著しい変化を示さなかった一方で、Ｈ２０７３は、ＰＤ−Ｌ１プロモーターの脱メチル化後に著しいＰＤ−Ｌ１発現誘導を示した。図６Ｄを参照されたい。これらの結果は、ＣｐＧ１及びＣｐＧ５における非類似のパターンのメチル化を有する異なる細胞株が同じ患者に源を発するため、ＰＤ−Ｌ１のメチル化がＰＤ−Ｌ１発現に影響を及ぼす駆動因子であり得ることを実証する。
【０３１９】
適応免疫は、免疫浸潤が、ＩＦＮｇ及び活性化Ｔ細胞からの他の因子の放出により、腫瘍内のＰＤ−Ｌ１などの免疫チェックポイントタンパク質を活性化及び上方制御し得るプロセスである。上述の実験の結果は、このＰＤ−Ｌ１活性化が、ＣｐＧ１及び／またはＣｐＧ５において高レベルのメチル化を有する細胞株内で遮断されること提示する。活性化Ｔ細胞浸潤（ＣＤ８Ａ遺伝子発現、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）及びＣｐＧ５における腫瘍細胞ＰＤ−Ｌ１プロモーターメチル化（ｍｕｔ７とも称される）を検出するために、ヒトＮＳＣＬＣ腫瘍試料の集合を分析した。図７Ａ及び７Ｂに示されるように、低いＣｐＧ５／ｍｕｔ７メチル化を有する高度に浸潤された腫瘍試料のみが、ＩＨＣ（タンパク質、図７Ａ）及びｑＲＴ−ＰＣＲ（ＲＮＡ、図７Ｂを参照されたい）の両方により高いＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞発現を示した。低浸潤腫瘍もしくは未浸潤腫瘍、または高いＣｐＧ５メチル化を有する腫瘍の全てが、低いＰＤ−Ｌ１タンパク質発現及びＲＮＡ発現を示した。活性化Ｔ細胞の浸潤による腫瘍細胞ＰＤ−Ｌ１の上方制御は、これらのＮＳＣＬＣ患者の腫瘍試料中のＣｐＧ５におけるプロモーターメチル化により依然として遮断される。
【０３２０】
次に、ＣｐＧ１及びＣｐＧ５におけるＣｐＧメチル化が、ＳＴＡＴ１及び／またはＳＴＡＴ３の、ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域（ＣｐＧ１）及びイントロン１（ＣｐＧ５）への結合を物理的に遮断し得るかどうかを判定するために、実験を行った。ＰＤ−Ｌ１プロモーター内のＣｐＧ１に近接近する２つの既知のＳＴＡＴ結合モチーフが存在する。上述のＡ４２７（すなわち、メチル化）及びＨ３５８（すなわち、非メチル化）細胞株は、ほぼ集密まで成長し、次いで、上述のようにコントロール緩衝液またはＩＦＮγのいずれかで刺激された。翌朝、細胞を２つの分割量に分割し、１つ目を、バイサルファイト配列決定で使用して、２つ目を、ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３結合を評価するためにＣｈＩＰ配列で使用した。バイサルファイト配列決定は、両方の細胞株のメチル化状態を確認し、異なる結合パターンが、ＭＡＣＳピークコーリングによる著しいピークの分析により示されるように、２つの細胞株間で観察された。
【０３２１】
ＣｈＩＰ配列実験の結果は、ＩｇＶ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｉｅｗｅｒ（Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で表示されたｂｅｄファイルとして、図８に示される。図８において、上のｂｅｄファイルは、ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域及びイントロン１内で見られるＣｐＧ’ｓの配位を含む。ＣｐＧ１及びＣｐＧ５は、標識化される。第２のｂｅｄファイルは、ＰＤ−Ｌ１プロモーター領域内の既知のＳＴＡＴ結合モチーフの配位を含む。第３のｂｅｄファイルは、Ｈｇ１９配列及びＰＤ−Ｌ１／ＣＤ２７４の遺伝子構造を含む。第４〜第１１のｂｅｄファイル（番号１〜８）は、ＭＡＣＳの著しい結合ファイルであり、ＮＳＣＬＣ細胞株Ａ４２７及びＨ３５８において、ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３を用いた我々のＣｈＩＰ配列実験より下流で生成される。
【０３２２】
メチル化したＡ４２７の細胞株は、ＩＦＮγ刺激がある場合でも、またはない場合でもＳＴＡＴタンパク質のいずれの結合も示さなかった。表４を参照されたい。かかる結果は、Ａ４２７におけるＣｐＧ１、かつ場合によってはＣｐＧ５のメチル化は、ＰＤ−Ｌ１プロモーター内のＣｐＧ１に近接する、ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３の、ＳＴＡＴ結合モチーフへの結合を完全に遮断することを示す。無刺激のＨ３５８は、ＳＴＡＴ１による結合を示さなかったが、ＳＴＡＴ１は、ＩＦＮγ刺激後に、ＰＤ−Ｌ１プロモーターに結合することが示された。表４を参照されたい。Ｈ３５８細胞株は、刺激に関係なくＳＴＡＴ３により結合された。表４を参照されたい。先に示されたように、Ｈ３５８は、非常に高い基礎レベルのＰＤ−Ｌ１ＲＮＡ発現を既に有し、これらの結果は、ＳＴＡＴ３の転写因子が、この細胞株内の高レベルの基礎ＰＤ−Ｌ１発現の駆動体であるかもしれないことを提示する。
2018526323.tif 000023
【０３２３】
前述の実施例は、例示目的のためのみに提供されており、決して、本発明の範囲を限定するようには意図されていない。本明細書に示されて説明される修正に加えて、本発明の様々な修正は、前述の説明から当業者に明らかになり、それらは添付の特許請求の範囲内のものである。
【図１】
2018526323.tif 000024
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ａ−１】
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【図５Ａ−２】
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【図５Ａ−３】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｂ−１】
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【図５Ｂ−２】
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【図５Ｂ−３】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018526323.tif 000056
2018526323.tif 000057