(57)【要約】  抗原結合タンパク質の水性製剤を生成する方法または抗原結合タンパク質の再酸化を増大させる方法が開示されている。本方法は、（ａ）抗原結合タンパク質分子の再酸化を増大させ、ステップ（ａ）の前に観察された還元された抗原結合タンパク質分子のパーセンテージと比較して、還元された抗原結合タンパク質分子のパーセンテージの低下を達成するのに十分な条件下において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液を荷電デプスフィルターと接触させることと、（ｂ）任意に、還元された抗原結合タンパク質分子の量または相対量を測定することとを含む。再酸化された抗原結合タンパク質を含む製剤も記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原結合タンパク質の水性製剤を生成する方法であって、
（ａ）ステップ（ａ）の前に観察された還元された抗原結合タンパク質分子のパーセンテージと比較して、還元された抗原結合タンパク質分子のパーセンテージの少なくとも２０％の低下を達成するのに十分な条件下において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液を荷電デプスフィルターと接触させることと、
（ｂ）任意に、還元された抗原結合タンパク質分子の量または相対量を測定することと
を含む、前記方法。
【請求項２】
抗原結合タンパク質の再酸化を増大させる方法であって、
（ａ）抗原結合タンパク質分子の再酸化を増大させるのに十分な条件下において、前記抗原結合タンパク質分子を含む水溶液を荷電デプスフィルターと接触させることであって、任意に前記接触させるステップの後に前記抗原結合タンパク質分子の前記再酸化が少なくとも２倍増加される、前記接触させることと、
（ｂ）任意に、還元された抗原結合タンパク質分子の量または相対量を測定することと
を含む、前記方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）において前記荷電デプスフィルターと接触させた後の還元された抗原結合タンパク質分子の総量は、抗原結合タンパク質分子の総量よりも１０％以下少ない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ａ）に続いて抗原結合タンパク質分子の前記溶液をプロテインＡクロマトグラフィーに供する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）の前に、抗原結合タンパク質分子の前記溶液をプロテインＡクロマトグラフィーに供する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
抗原結合タンパク質分子の前記溶液中の１つ以上のウイルスを不活化するステップをさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記抗原結合タンパク質分子中の還元されたジスルフィド結合の量は、荷電深層ろ過前と比較して、荷電深層ろ過後に少なくとも３分の１低減される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記還元された抗原結合タンパク質分子のパーセンテージは、ステップ（ａ）の後に少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、または少なくとも４時間低下し続ける、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記接触させることは、室温で行われる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記接触させることは、摂氏２度から８度の温度で行われる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
抗原結合タンパク質分子の前記溶液に空気または酸素を通気するステップをさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
抗原結合タンパク質分子の前記溶液をナトリウム、カルシウム、マグネシウム、水銀、モリブデン、クロム、カドミウム、アルミニウム、カリウム、コバルト、鉄、マンガン、チタン、亜鉛、ニッケル、銅、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される陽イオンと接触させることをさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
抗原結合タンパク質分子の前記溶液は、複数の荷電デプスフィルターと接触させられる、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記荷電デプスフィルターは、珪藻土層を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記荷電デプスフィルターは、セルロース層及び無機層をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記無機層は、ポリアミン樹脂を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記荷電デプスフィルターは、正荷電イオンを含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記荷電デプスフィルターは、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、水銀、クロム、カドミウム、アルミニウム、カリウム、鉛、ヒ素、コバルト、鉄、マンガン、チタン、亜鉛、ニッケル、銅、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される金属を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記接触させることは、２５０Ｌ／ｍ２から８５０Ｌ／ｍ２の間のスループットで行われる、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ抗体である、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体は、カッパ軽鎖を有するＩｇＧ１抗体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体は、ラムダ軽鎖を有するＩｇＧ１抗体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗原結合タンパク質は、ＲＡＮＫＬ、腫瘍壊死因子アルファ、上皮増殖因子受容体、ＣＤ２０、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、スクレロスチン、及び血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａから成る群から選択される抗原と結合する、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記抗原結合タンパク質は、アブシキシマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブベドチン、カナキヌマブ、セツキシマブ、セルトリズマブペゴル、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、イピリムマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、ナタリズマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、ベドリズマブ、及び前述のいずれかのバイオ後続品から成る群から選択される、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記抗原結合タンパク質は、配列番号１〜８から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む抗原結合領域を含む、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
還元された抗原結合タンパク質分子の量は、ドデシル硫酸ナトリウムを用いた非還元キャピラリー電気泳動を使用して測定される、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
陽イオン交換クロマトグラフィーのステップをさらに含む、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
（１）任意にその後に荷電深層ろ過が続く、プロテインＡクロマトグラフィーステップと、（２）任意にその後に荷電深層ろ過が続く、ウイルス不活化ステップと、（３）任意にその後に荷電深層ろ過が続く、陽イオン交換クロマトグラフィーステップとを含み、任意に（４）任意にその後に荷電深層ろ過が続く、塩不耐性相互作用クロマトグラフィーステップと、（５）任意にその後に荷電深層ろ過が続く、ウイルスろ過ステップと、（５）任意にその後に荷電深層ろ過が続く、限外ろ過及び／またはダイアフィルトレーションのうちの１つ以上をさらに含む、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
荷電デプスフィルターとの接触後、ろ液は、少なくとも約４時間インキュベートされる、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
還元された抗原結合タンパク質分子の量または相対量は、ドデシル硫酸ナトリウムを用いた非還元キャピラリー電気泳動（ｎｒＣＥ−ＳＤＳ）を使用して求められる、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
抗原結合タンパク質の水性製剤を生成する方法であって、接触させるステップの前に観察された還元された抗原結合タンパク質分子のパーセンテージと比較して、還元された抗原結合タンパク質分子のパーセンテージの少なくとも２０％の低下を達成するのに十分な条件下において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液を荷電デプスフィルターと接触させることを含み、前記少なくとも２０％の低下は、ドデシル硫酸ナトリウムを用いた非還元キャピラリー電気泳動（ｎｒＣＥ−ＳＤＳ）を使用して求められる、前記方法。
【請求項３３】
抗原結合タンパク質の再酸化を増大させる方法であって、接触させるステップの後に抗原結合タンパク質分子の再酸化の少なくとも２倍の増加を達成するのに十分な条件下において、前記抗原結合タンパク質分子を含む水溶液を荷電デプスフィルターと接触させることを含み、前記少なくとも２倍の増加は、ドデシル硫酸ナトリウムを用いた非還元キャピラリー電気泳動（ｎｒＣＥ−ＳＤＳ）を使用して求められる、前記方法。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれかに記載の方法を使用して調製される再酸化される抗原結合タンパク質を含む水性製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
２０１６年８月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／２０４，８３１号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）による利益をここで主張し、その開示を参照によって本明細書に組み込む。
【０００２】
配列表
本出願は、本開示の別個の部分として、コンピュータ可読形式の配列表（４９８４１Ａ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、１１，９６２バイト、２０１６年８月１２日作成）を含み、その全体が参照により組み込まれる。
【０００３】
発明の分野
本開示は、再酸化された抗原結合タンパク質を含む水性製剤を生成する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
抗体などの治療効果のある抗原結合タンパク質が世界中の何百万の患者を処置するために現在使用されている。抗原結合タンパク質分子は、一般に哺乳動物細胞培養系において作製され、標準的な一続きのろ過及びクロマトグラフィー工程を使用して回収される（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ．２（５）：４８０−４９９（２０１０）を参照）。抗原結合タンパク質分子の構造及び安定性は、それぞれの抗原結合タンパク質分子にある２つの重鎖同士及び重鎖と軽鎖を結合するジスルフィド結合に大きく依存するが、作製及び精製プロセスにおいて、１つ以上のジスルフィド結合が遊離チオール基に還元される場合がある。鎖間のジスルフィド結合の還元は、抗原結合タンパク質分子の構造的完全性を脆弱にし、抗原結合タンパク質フラグメント（例えば、軽鎖、重鎖、及びそれらの組み合わせ）及び／または抗原結合タンパク質凝集体に至る可能性があり、それが、抗原結合タンパク質の生物学的機能、ひいては、その治療効果を損なう。還元分子が精製プロセス中にその他の力（例えば、イオン結合、疎水結合、水素結合、及びファンデルワールス）により完全なままであっても、それらが、保管の間または臨床的使用において断片化する場合もある。したがって、部分的に還元された抗原結合タンパク質分子を再酸化して、安定で効果的な医薬製剤を生成する方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ．２（５）：４８０−４９９（２０１０）
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、（Ｆｃ領域を含む抗原結合タンパク質、抗体、もしくはペプチボディなどの）抗原結合タンパク質の水性製剤を生成する方法またはそのような抗原結合タンパク質の再酸化を増大させる方法及びこれらの方法により調製される再酸化された抗原結合タンパク質を含む製剤を対象とする。一態様において、本開示は、（Ｆｃ領域を含む抗原結合タンパク質、抗体、またはペプチボディなどの）抗原結合タンパク質の水性製剤を生成する方法であって、（ａ）ステップ（ａ）の前に観察された還元された抗原結合タンパク質分子のパーセンテージと比較して、還元された抗原結合タンパク質分子のパーセンテージの少なくとも２０％の低下、任意に３０％または４０％の低下を達成するのに十分な条件下において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液を荷電デプスフィルターと接触させることと、（ｂ）任意に、還元された抗原結合タンパク質分子の（総量などの）量または相対量を測定することとを含む、方法を提供する。別の態様において、本開示は、（Ｆｃ領域を含む抗原結合タンパク質、抗体、またはペプチボディなどの）抗原結合タンパク質の再酸化を増大させる方法であって、（ａ）抗原結合タンパク質分子の再酸化を増大させるのに十分な条件下において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液を荷電デプスフィルターと接触させることと、（ｂ）任意に、還元された抗原結合タンパク質分子の（総量などの）量または相対量を測定することとを含む、方法を提供する。一態様において、還元された抗原結合タンパク質分子の（総量などの）量または相対量は、ドデシル硫酸ナトリウムを用いた非還元キャピラリー電気泳動（ｎｒＣＥ−ＳＤＳ）を使用して測定される。上記の態様のいずれかにおいて、ステップ（ａ）において荷電デプスフィルターと接触させた後の還元された抗原結合タンパク質分子の総量は、抗原結合タンパク質分子の総量のうちの１０％以下であり、及び／またはステップ（ａ）の前と比較して少なくとも３分の１低減される。
【０００７】
いくつかの態様において、本明細書に記載されている方法のステップ（ａ）に続いて及び／またはそれに先行して、抗原結合タンパク質分子の水溶液をプロテインＡクロマトグラフィーに供する。任意に、本開示による方法は、抗原結合タンパク質分子の水溶液中の１つ以上のウイルスを不活化するステップ及び／または抗原結合タンパク質分子の水溶液を陽イオン交換クロマトグラフィーに供すること及び／または抗原結合タンパク質分子の水溶液に空気または酸素を通気することをさらに含む。任意に、方法は、チオレドキシンまたはチオレドキシン様タンパク質の阻害物質を抗原結合タンパク質分子の水溶液に添加することをさらに含む（例えば、米国特許出願公報第２００９００５３７８６号を参照）。
【０００８】
一態様において、（Ｆｃ領域を含む抗原結合タンパク質、抗体、またはペプチボディなどの）抗原結合タンパク質の水性製剤を生成する方法は、接触させるステップの前に観察された還元された抗原結合タンパク質分子のパーセンテージと比較して、還元された抗原結合タンパク質分子のパーセンテージの少なくとも２０％の低下を達成するのに十分な条件下において抗原結合タンパク質分子を含む水溶液を荷電デプスフィルターと接触させることを含み、少なくとも２０％の低下は、ドデシル硫酸ナトリウムを用いた非還元キャピラリー電気泳動（ｎｒＣＥ−ＳＤＳ）を使用して求められる。別の態様において、（Ｆｃ領域を含む抗原結合タンパク質、抗体、またはペプチボディなどの）抗原結合タンパク質の再酸化を増大させる方法は、接触させるステップの後に抗原結合タンパク質分子の再酸化の少なくとも２倍の増加を達成するのに十分な条件下において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液を荷電デプスフィルターと接触させることを含み、少なくとも２倍の増加は、ドデシル硫酸ナトリウムを用いた非還元キャピラリー電気泳動（ｎｒＣＥ−ＳＤＳ）を使用して求められる。
【０００９】
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、（１）任意にその後に荷電深層ろ過が続く、プロテインＡクロマトグラフィーステップと、（２）任意にその後に荷電深層ろ過が続く、ウイルス不活化ステップと、（３）任意にその後に荷電深層ろ過が続く、陽イオン交換クロマトグラフィーステップとを含み、任意に（４）任意にその後に荷電深層ろ過が続く、任意に塩不耐性相互作用クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及び混合方式クロマトグラフィーから選択されるクロマトグラフィーステップと、（５）任意にその後に荷電深層ろ過が続く、ウイルスろ過ステップと、（５）任意にその後に荷電深層ろ過が続く、限外ろ過及び／またはダイアフィルトレーションのうちの１つ以上をさらに含む。任意に、本明細書に記載されている方法のいずれかにおいて、荷電デプスフィルターとの接触後、ろ液は、例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、２４時間以上インキュベートされる。
【００１０】
一態様において、荷電デプスフィルターは、珪藻土層を含む。任意に、荷電デプスフィルターは、セルロース層及び／または無機層をさらに含み、例えば、無機層は、ポリアミン樹脂を含む。別の態様において、荷電デプスフィルターは、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、水銀、クロム、アルミニウム、カリウム、鉛、ヒ素、カドミウム、コバルト、鉄、マンガン、チタン、亜鉛、ニッケル、銅、またはそれらの組み合わせのいずれか１つなどの陽イオンを含む。別の態様において、荷電デプスフィルターは、陽イオンの以下の組み合わせのうちの１つを含む：１）銅及びコバルト、２）銅及びカドミウム、３）コバルト及びカドミウム、または４）銅、コバルト、及びカドミウム。いくつかの実施形態において、陽イオンは、＋２またはさらに高い酸化状態（＋３もしくは＋４など）の金属である。いくつかの態様において、本方法は、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液を１、２、３、４、５つ以上の荷電デプスフィルター（複数可）と接触させることを含む。
【００１１】
一態様において、水溶液は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体などのＩｇＧ抗体である抗原結合タンパク質分子を含む。例えば、いくつかの態様において、抗体は、カッパ軽鎖を有するＩｇＧ１抗体またはラムダ軽鎖を有するＩｇＧ１抗体である。
【００１２】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＥＧＦレセプター、ＬＦＡ−１、Ｍｏｌ、ｐ１５０、ｐ９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、アルファｖ／ベータ３インテグリン、血管内皮増殖因子、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、ミュラー管抑制因子、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質、エリスロポエチン、ＮＧＦ−ベータ、血小板由来増殖因子、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、上皮増殖因子、ＴＧＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、ＴＧＦ−ベータ４、ＴＧＦ−ベータ５、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ、インスリン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、インスリン様成長因子結合タンパク質、第ＶＩＩＩ因子、組織因子、フォン・ヴィレブランド因子、プロテインＣ、アルファ−１−アンチトリプシン、プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ボンバジン、トロンビン、トロンボポエチン、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、アルブミン、ＩｇＥ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター、レプチンレセプター、骨由来神経栄養因子、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、ＮＴ−６、リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、プロリラキシン、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、ＩＬ−１からＩＬ−１０、ＡＩＤＳエンベロープウイルス抗原、カルシトニン、グルカゴン、心房性ナトリウム利尿因子、肺サーファクタント、腫瘍壊死因子−アルファ、腫瘍壊死因子−ベータ、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、Ｄｎａｓｅ、インヒビン、アクチビン、プロテインＡ、プロテインＤ、骨形成タンパク質、スーパーオキシドジスムターゼ、崩壊促進因子、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される抗原と結合する。
【００１３】
別の態様において、本水性製剤は、アブシキシマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブベドチン、カナキヌマブ、セツキシマブ、セルトリズマブペゴル、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、イピリムマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、ナタリズマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、ベドリズマブ、及び前述のいずれかのバイオ後続品から成る群から選択される抗体を含む。一実施形態において、水性製剤は、リツキシマブまたはリツキシマブの１、２、３、４、５、もしくは６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体を含み、例えば、この抗体は、（ａ）リツキシマブの３つのすべての軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖、（ｂ）リツキシマブの３つのすべての重鎖ＣＤＲを含む重鎖、または（ｃ）両方を含む場合がある。別の実施形態において、本水性製剤は、インフリキシマブまたはインフリキシマブの１、２、３、４、５、もしくは６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体を含み、例えば、この抗体は、（ａ）インフリキシマブの３つのすべての軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖、（ｂ）インフリキシマブの３つのすべての重鎖ＣＤＲを含む重鎖、または（ｃ）両方を含む場合がある。一実施形態において、本水性製剤は、オファツムマブまたはオファツムマブの１、２、３、４、５、もしくは６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体を含み、例えば、この抗体は、（ａ）オファツムマブの３つのすべての軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖、（ｂ）オファツムマブの３つのすべての重鎖ＣＤＲを含む重鎖、または（ｃ）両方を含む場合がある。
【００１４】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載されている方法のいずれかを使用して調製された再酸化された（Ｆｃ領域を含む抗原結合タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗体フラグメントまたはペプチボディなどの）抗原結合タンパク質分子を含む製剤を提供する。
【００１５】
前述の概要は、本発明のすべての態様を定義することを意図しておらず、本開示の他の特徴及び利点は図面を含む以下の詳細な説明から明らかになるであろう。本開示は、統合された文書として関連することが意図され、当然のことながら、特徴の組み合わせが本開示の同じ文、段落、またはセクションにおいて一緒に見られない場合であっても、本明細書に記載される特徴のすべての組み合わせが企図される。さらに、本開示は、付加的な態様として、特に上記の変形よりも多少なりとも範囲が狭い本発明のすべての実施形態を含む。「ａ」または「ａｎ」とともに記載または請求される本開示の態様に関して、当然のことながら、これらの用語は、文脈が明白により限定された意味を必要としない限り「１つ以上」を意味する。セット内の１つ以上として記載される要素に関して、当然のことながら、セット内のすべての組み合わせが企図される。本開示の態様が特徴「を含むこと」と記載される場合、実施形態は、特徴「から成ること」または特徴「から本質的に成ること」も企図される。本開示の付加的な特徴及び変形は、本出願の全体から当業者には明白であろうし、すべてのそのような特徴は本開示の態様として意図される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ｎｒＣＥ−ＳＤＳを使用して測定した回収された細胞培養液（ＨＣＣＦ）中、及びプロテインＡプール中の部分的な抗体還元のレベルをプレピーク化学種のパーセンテージとして示す。
【図２】（ａ）荷電デプスフィルターを通過する前のプロテインＡプール中、及び（ｂ）荷電デプスフィルターを通過した後のろ過ウイルス不活化プール中の部分的な抗体還元のレベルをプレピーク化学種のパーセンテージとして示す。
【図３Ａ】ろ過後最大８日間の室温または２℃から８℃における荷電深層ろ過されたプロテインＡプール中の部分的な抗体還元のレベルをプレピーク化学種のパーセンテージとして示す。
【図３Ｂ】ろ過後最大８日間の室温または２℃から８℃における荷電深層ろ過していないプロテインＡプール中の部分的な抗体還元のレベルをプレピーク化学種のパーセンテージとして示す。
【図４Ａ】荷電深層ろ過に供されたか、またはろ過されず、続いてプロテインＡクロマトグラフィーに供されたＨＣＣＦ中の部分的な抗体還元のレベルをプレピーク化学種のパーセンテージとして示す。
【図４Ｂ】ろ過後最大２４時間の荷電深層ろ過に供されたか、またはろ過されず、続いてプロテインＡクロマトグラフィーに供されたＨＣＣＦ中の部分的な抗体還元のレベルをプレピーク化学種のパーセンテージとして示す。
【図５Ａ】深層ろ過ろ液と比較した充填材料としてのプロテインＡプール中の部分的な抗体還元のレベルをプレピーク化学種のパーセンテージとして示す。
【図５Ｂ】ろ過後最大２４時間の（ａ）ろ過前（ｎＶＩＰ／充填材料）、（ｂ）滅菌メンブレンろ過後及び（ｃ）荷電深層ろ過後の中和されたウイルス不活化プール中の部分的な抗体還元のレベルをプレピーク化学種のパーセンテージとして示す。
【図６】ろ過後最大５０時間の荷電深層ろ過されていないプロテインＡプール、荷電深層ろ過されたＦＶＩＰプール、空気で酸素供給したｎＶＩＰプール及び空気を与えないｎＶＩＰプール中の部分的な抗体還元のレベルをプレピーク化学種のパーセンテージとして示す。
【図７Ａ】ろ過後最大２４時間の２５０Ｌ／ｍ２（模擬実験）及び３５０Ｌ／ｍ２から８５０Ｌ／ｍ２（実験）のスループットでの荷電深層ろ過後の部分的な抗体還元のレベルをプレピーク化学種のパーセンテージとして示す。
【図７Ｂ】ろ過後最大２４時間の１５０Ｌ／ｍ２から４５０Ｌ／ｍ２のスループットでの荷電深層ろ過後の部分的な抗体還元のレベルをプレピーク化学種のパーセンテージとして示す。
【図８Ａ】荷電深層ろ過を用いない陽イオン交換クロマトグラフィー前（ｎＶＩＰ）及び後（ＣＥＸ  ＰＬ）の部分的な抗体還元のレベルをプレピーク化学種のパーセンテージとして（プレピーク）及び高分子量の化学種（ＨＭＷ）を示す。
【図８Ｂ】荷電深層ろ過のみの後（ＦＶＩＰ）または荷電深層ろ過に続く陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ  ＰＬ）の処理直後（ｔ＝０）の部分的な抗体還元のレベルをプレピーク化学種のパーセンテージとして（プレピーク）及び高分子量の化学種（ＨＭＷ）を示す。
【図８Ｃ】荷電深層ろ過のみの後（ＦＶＩＰ）または荷電深層ろ過に続く陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ  ＰＬ）の処理の４時間後（ｔ＝４）の部分的な抗体還元のレベルをプレピーク化学種のパーセンテージとして（プレピーク）及び高分子量の化学種（ＨＭＷ）を示す。
【図９Ａ】Ｈ２ＳＯ４を荷電デプスフィルターに通して２時間再循環させることによって得た０．５×から４×のＨ２ＳＯ４洗浄液を添加したｎＶＩＰ試料中、または未添加のｎＶＩＰ中の部分的な抗体還元のレベルをプレピーク化学種のパーセンテージとして示す。
【図９Ｂ】ＮａＯＡｃを荷電デプスフィルターに通して２時間再循環させることによって得た０．５×から４×アセタート（ＮａＯＡｃ）洗浄液を添加したｎＶＩＰ試料中、または未添加のｎＶＩＰ中の部分的な抗体還元のレベルをプレピーク化学種のパーセンテージとして示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、少なくとも部分的に荷電デプスフィルター由来の材料が非荷電デプスフィルター対照よりも少なくとも３倍抗原結合分子の再酸化を促進するという驚くべき発見に基づくものである。再酸化を促進するための荷電深層ろ過の使用は、ＩｇＧ１抗体などの還元されやすい抗原結合分子に特に望ましい。
【００１８】
本開示は、（Ｆｃ領域を含む抗原結合タンパク質、抗体、もしくはペプチボディなどの）抗原結合タンパク質の水性製剤を生成する方法、または抗原結合タンパク質の再酸化を増大させる方法であって、還元された抗原結合タンパク質分子のパーセンテージを低下させるのに十分な条件下において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液を荷電デプスフィルターと接触させることを含む、方法を提供する。本開示はまた、本明細書に記載されている方法を使用して調製される再酸化された（Ｆｃ領域を含む抗原結合タンパク質、抗体、またはペプチボディなどの）抗原結合タンパク質を含む製剤を提供する。本開示による荷電デプスフィルターを含む方法は、水溶液中の部分的に還元された抗原結合タンパク質分子の量を低減するための空気の通気、冷却、及び滅菌メンブレンろ過などのその他の方法よりも効果的であり、それにより、抗原結合タンパク質生成プロセス及び得られる医薬製剤をする断片化及び凝集の問題を改善する。
【００１９】
以下の定義は、当業者の本開示の理解を助けるのに有用であろう。本明細書において別に定義されていない限り、本開示に使用される科学及び技術用語は、当業者が一般的に解釈する意味を有するものとする。値の範囲が提供される場合、当然のことながら、文脈が明らかに別のことを規定していない限り、下限の単位の１／１０までのその範囲の上限値と下限値の間にある値のそれぞれ、ならびにその他の任意の指定された値またはその指定された範囲の間にある値が本発明の範囲内に包含される。これらのより狭い範囲の上限値及び下限値は、独立してより狭い範囲に含まれる場合もあり、指定された範囲内の任意の特に除外された限界値に依存する。抗体に関して記載される任意及びすべての実施形態はまた、Ｆｃ領域を含む抗原結合タンパク質（例えば、ペプチボディ）などの抗原結合タンパク質に対して使用することができる。反対に、抗原結合タンパク質に関して記載される任意及びすべての実施形態はまた、それぞれ及びすべての場合に、本明細書で定義される抗体に特に当てはまる。
【００２０】
「抗原結合タンパク質」という用語は、抗原結合領域または抗原結合部分であって、それが結合する別の分子（抗原）に対して高い親和性を有する抗原結合領域または抗原結合部分を含むタンパク質またはポリペプチドを指す。抗原結合タンパク質は、抗体、ペプチボディ、抗体フラグメント、抗体誘導体、抗体類似体、融合タンパク質（一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）及び二本鎖（二価）ｓｃＦｖを含む）、及びキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を含む抗原レセプターを包含する。
【００２１】
「抗体」という用語は、生化学及びバイオ工学分野におけるその通常の意味に従って本明細書中で使用される。本明細書中で使用される場合の用語の意味の範囲内の抗体の中でも、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、内在性遺伝子を活性化することを含むプロセスによって及び細胞培養において作製された抗体及びトランスジェニック植物及び動物において作製されたものなどの外来性発現コンストラクトの発現を含むプロセスによって作製されたものを含む組み換えＤＮＡ技術によって作製された抗体（本明細書中でときには組み換え抗体とも言及される）を含む生物学的供給源から単離されたもの、ならびにペプチド合成及び半合成などの化学合成を含む方法によって作製された抗体である。別のことが明確に記載されている場合を除き、とりわけキメラ抗体、ヒト化抗体、及び多価（例えば、二重特異性）抗体も本明細書中で使用される場合のこの用語の範囲内にある。原型のＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合によって結合された２つの同一の軽鎖・重鎖二量体から構成される四量体糖タンパク質である。２種類の脊椎動物の軽鎖、カッパ及びラムダがある。それぞれの軽鎖は、定常領域及び可変領域から構成される。カッパ及びラムダ軽鎖は、それらの定常領域配列によって区別される。５種類の脊椎動物の重鎖：アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューがある。それぞれの重鎖は、可変領域及び定常領域から構成され、それらは、一般に３つのドメインを含む。５つの重鎖の種類は、脊椎動物抗体の５つのクラス（アイソタイプ）：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭを定義する。例えば、４つのヒトＩｇＧサブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ならびに２つのＩｇＡサブクラス、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２がある。いくつかの実施形態において、抗体は、完全長抗体である。これらのすべて及び上で具体的に記載されていないその他のものも、本明細書中で使用される場合の用語「抗体（複数可）」の意味に含まれる。
【００２２】
「荷電デプスフィルター」または「デプスフィルター」という用語は、基材のチャネル内の物理的な捕捉及び／または例えば、基材の電荷による動電学的吸着に基づいて溶液をろ過する多孔質基材（例えば、２ｍｍから５ｍｍの厚さの基材）を含むフィルターを指す。さまざまな正荷電イオン、好ましくは、金属イオンがそのようなフィルターに使用するのに適している。荷電デプスフィルターは、例えば、Ｃｕｎｏ，  Ｉｎｃ．（例えば、ＺＥＴＡ  ＰＬＵＳ  Ｓシリーズ、ＺＥＴＡ  ＰＬＵＳ  ＳＰシリーズ、ＺＥＴＡ  ＰＬＵＳ  ＬＰシリーズ、ＺＥＴＡ  ＰＬＵＳ  ＣＰシリーズ、ＺＥＴＡ  ＰＬＵＳ  ＬＰ  ＢＣシリーズ）、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（例えば、Ｄ０ＨＣ、Ｃ０ＨＣ、Ｆ０ＨＣ、Ａ１ＨＣ、Ｂ１ＨＣ、Ｘ０ＨＣ）、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ、及びＰａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（例えば、ＳＥＩＴＺ  Ｐシリーズ、ＳＥＩＴＺ  Ｋシリーズ、ＳＵＰＲＡＤＵＲシリーズ、ＳＴＡＸシリーズ、ＳＵＰＲＡＣＡＰシリーズ、ＳＵＰＲＡＰＡＫシリーズ、ＳＵＰＲＡＤＩＳＣシリーズ）から市販されている。
【００２３】
「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、一般に約９から１２アミノ酸長の抗原結合タンパク質の軽鎖または重鎖の高頻度可変領域を指し、これが、抗原結合タンパク質に結合特異性を与える。
【００２４】
一態様において、本開示は、（Ｆｃ領域を含む抗原結合タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗体フラグメント、またはペプチボディなどの）抗原結合タンパク質の水性製剤を生成する方法であって、（ａ）ステップ（ａ）の前に観察された還元された抗原結合タンパク質分子のパーセンテージと比較して、還元された抗原結合タンパク質分子のパーセンテージの少なくとも２０％の低下を達成するのに十分な条件下において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液を荷電デプスフィルターと接触させることと、（ｂ）任意に、還元された抗原結合タンパク質分子の（総量などの）量または相対量を測定することとを含む、方法を提供する。別の態様において、本開示は、（Ｆｃ領域を含む抗原結合タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗体フラグメントまたはペプチボディなどの）抗原結合タンパク質の再酸化を増大させる方法であって、（ａ）抗原結合タンパク質分子の再酸化を増大させるのに十分な条件下において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液を荷電デプスフィルターと接触させることと、（ｂ）任意に、還元された抗原結合タンパク質分子の量または相対量を測定することとを含む方法を提供する。（Ｆｃ領域を含む抗原結合タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗体フラグメントまたはペプチボディなどの）抗原結合タンパク質分子の再酸化は、ステップ（ａ）の前に観察された還元された抗原結合タンパク質分子の（総量などの）量または相対量（例えば、パーセンテージ）と比較した、還元された抗原結合タンパク質分子の（総量などの）量または相対量（例えば、パーセンテージ）の減少によって立証され得る。
【００２５】
還元された抗原結合タンパク質分子の減少は、例えば、荷電デプスフィルターとの接触の前後の水溶液中の抗原結合タンパク質フラグメントの量を定量して、鎖間のジスルフィド結合切断の程度を評価することによって判断することができる。サイズバリアントを特定し、試料中の部分的に還元された抗原結合タンパク質分子の量を定量する一方法は、ｎｒＣＥ−ＳＤＳを使用して、抗原結合タンパク質フラグメントに対応するプレピーク化学種のパーセンテージを求めることを含む（例えば、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．２９（１２）：２５５０−６（２００８）を参照）。一般に、非還元バッファーが試料に添加される。高温でのインキュベーション後、試料がシリカキャピラリーに注入される。キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ−ＳＤＳ）ゲル及び有効な電圧を使用して分離が実施され、例えば、ＵＶ吸光度２２０ｎｍで検出が実施される。抗原結合タンパク質の水性製剤の純度を測定するためのその他の方法、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、タンパク質凝集体と単量体を区別するが、試料中の部分的に還元された抗原結合タンパク質分子と再酸化された抗原結合タンパク質分子を識別しないため、本開示の方法に使用するのには十分でない。
【００２６】
一態様において、（Ｆｃ領域を含む抗原結合タンパク質、抗体、またはペプチボディなどの）抗原結合タンパク質の水性製剤を生成する方法は、接触させるステップの前に観察された還元された抗原結合タンパク質分子のパーセンテージと比較して、還元された抗原結合タンパク質分子のパーセンテージの少なくとも２０％の低下を達成するのに十分な条件下において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液を荷電デプスフィルターと接触させることを含み、少なくとも２０％の低下は、ｎｒＣＥ−ＳＤＳを使用して求められる。別の態様において、（Ｆｃ領域を含む抗原結合タンパク質、抗体、またはペプチボディなどの）抗原結合タンパク質の再酸化を増大させる方法は、接触させるステップの後に抗原結合タンパク質分子の再酸化の少なくとも２倍の増加を達成するのに十分な条件下において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液を荷電デプスフィルターと接触させることを含み、少なくとも２倍の増加は、ｎｒＣＥ−ＳＤＳを使用して求められる。
【００２７】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液中の還元された（Ｆｃ領域を含む抗原結合タンパク質、抗体、もしくはペプチボディなどの）抗原結合タンパク質分子または還元されたジスルフィド結合のパーセンテージは、水溶液を本開示による荷電デプスフィルターと接触させた後、接触させるステップの前に観察された還元された抗原結合タンパク質分子または還元されたジスルフィド結合のパーセンテージと比較して少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％以上低減される。一態様において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液を荷電デプスフィルターと接触させた後の還元された抗原結合タンパク質分子の総量は、溶液中の抗原結合タンパク質分子の総量のうちの１０％未満、例えば、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満である。別の尺度として、ジスルフィド結合を含む水溶液中の還元された抗原結合タンパク質分子または還元されたジスルフィド結合のパーセンテージは、水溶液が開示されている荷電デプスフィルターと接触させられた後に、接触させるステップの前と比較して少なくとも約１．５分の１、例えば、少なくとも約１．５分の１、少なくとも約２分の１、少なくとも約２．５分の１、少なくとも約３分の１、少なくとも約４分の１、少なくとも約５分の１以下低下する。
【００２８】
いくつかの態様において、本開示による荷電デプスフィルターは、少なくとも１つの珪藻土層及び／または正荷電イオン、好ましくは金属イオンを含む。いくつかの例となる態様において、珪藻土層は、高いパーセンテージ（例えば、約９０％）のシリカを含む、及び／または有機物質を除去するために焼成される。任意に、荷電デプスフィルターは、セルロース層及び／または無機層をさらに含む。任意の態様において、無機層は、湿潤強度をもたらす樹脂粘結剤、例えば、ポリアミドアミン・エピクロロヒドリン（ＰＡＡＥ）などのポリアミン樹脂を任意に含む。いくつかの実施形態において、電荷デプスフィルターは、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、水銀、クロム、カドミウム、アルミニウム、カリウム、鉛、ヒ素、コバルト、鉄、マンガン、チタン、亜鉛、ニッケル、銅、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つの金属イオンを含む。別の態様において、荷電デプスフィルターは、金属の以下の組み合わせのうちの１つを含む：１）銅及びコバルト、２）銅及びカドミウム、３）コバルト及びカドミウム、または４）銅、コバルト、及びカドミウム。いくつかの実施形態において、金属（または金属の組み合わせの１つ以上もしくはすべての金属）は、＋２またはさらに高い酸化状態（＋３もしくは＋４など）を有する。本開示の方法に使用するのに適した荷電デプスフィルターとしては、ＭＩＬＬＩＳＴＡＫ＋  Ａ１ＨＣ及びＸ０ＨＣフィルター（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビレリカ、マサチューセッツ州）、ならびにＺＥＴＡ  ＰＬＵＳ（例えば、ＺＥＴＡ  ＰＬＵＳ  ３０ＳＰ）フィルター（Ｃｕｎｏ，  Ｉｎｃ．、メリデン、コネチカット州）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。荷電デプスフィルター上の１つ以上の金属（銅など）は、再酸化を促進することができる。いくつかの態様において、本開示による荷電デプスフィルターは、１つ以上の以下の媒体を含む：ＨＣ、ＣＥ、ＤＥ、ＩＭ、ＣＲ、ＺＡ、ＳＰ、ＨＰ、ＺＣ、ＥＬＩＳ、ＬＡ、ＬＰ、ＥＫＳ−Ｐ、ＥＫＭ−Ｐ、ＳＵＰＲＡ  ＥＫ  １  Ｐ、ＫＳ  ５０  Ｐ、ＳＵＰＲＡ  ８０  Ｐ、Ｋ  １００  Ｐ、Ｋ  ２５０  Ｐ、Ｋ  ７００  Ｐ、及びＫ  ９００  Ｐ。
【００２９】
荷電深層ろ過に関するプロトコルは、当該技術分野において知られており、市販の荷電デプスフィルターの製造業者からも入手可能である。いくつかの態様において、荷電デプスフィルターは、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液を充填する前に脱イオン水及び平衡化バッファーで洗い流される。任意に、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液は、約１０Ｌ／ｍ２から約１０００Ｌ／ｍ２の間、例えば、約３５０Ｌ／ｍ２から約８５０Ｌ／ｍ２の間、約２５０Ｌ／ｍ２から約４５０Ｌ／ｍ２の間、約１５０Ｌ／ｍ２から約４５０Ｌ／ｍ２の間、約５０Ｌ／ｍ２から約８００Ｌ／ｍ２の間、または約１５０Ｌ／ｍ２、約２００Ｌ／ｍ２、約２５０Ｌ／ｍ２、約３００Ｌ／ｍ２、約３５０Ｌ／ｍ２、約４００Ｌ／ｍ２、約４５０Ｌ／ｍ２、約５００Ｌ／ｍ２、約５５０Ｌ／ｍ２、約６００Ｌ／ｍ２、約６５０Ｌ／ｍ２、約７００Ｌ／ｍ２、約７５０Ｌ／ｍ２、約８００Ｌ／ｍ２、約８５０Ｌ／ｍ２、もしくは約９００Ｌ／ｍ２のスループットを達成するよう荷電デプスフィルターシステムに充填される。いくつかの態様において、荷電デプスフィルターシステムに水溶液を通す流量は、任意に約５０ｐｓｉ以下、例えば、約５０ｐｓｉ、約５０ｐｓｉ未満、約４０ｐｓｉ未満、約３０ｐｓｉ未満、約２０ｐｓｉ未満、または約１０ｐｓｉ未満の圧力において、約５００Ｌ／ｍ２／時未満、例えば、約４００Ｌ／ｍ２／時未満、約３００Ｌ／ｍ２／時未満、約２００Ｌ／ｍ２／時未満、約１００Ｌ／ｍ２／時未満、または約５０Ｌ／ｍ２／時未満である。一態様において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液の総量は、約５時間以下、例えば、約５時間、約４．５時間、約４時間、約３．５時間、約３時間、約２．５時間、約２時間、約１．５時間、約１時間、約３０分間以下にわたって荷電デプスフィルターシステムを通してろ過される。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液の総量は、約１から２時間、または約１．５から２時間などの約１から約３時間の間の時間にわたって荷電デプスフィルターシステムを通してろ過される。
【００３０】
一態様において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液は、荷電デプスフィルターに室温、すなわち、約２０℃から約２６℃、例えば、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、または約２６℃で接触させられる。別の態様において、接触させるステップは、約１℃または２℃から約８℃の間、例えば、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、または約８℃の温度で行われる。
【００３１】
いくつかの実施形態において、荷電デプスフィルターまたは荷電デプスフィルター由来の材料（珪藻土層など）は、本明細書に記載されている任意の方法を使用して抗原結合タンパク質を再酸化する能力に関して試験される。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、荷電デプスフィルターまたは荷電デプスフィルター由来の材料（珪藻土層など）とともにインキュベートされ、その後、還元された抗原結合タンパク質の量を測定するためにさまざまな時点（１または２時間の間に３０分毎）において抗原結合タンパク質の試料が採取される。いくつかの実施形態において、荷電デプスフィルター由来の材料（珪藻土層など）がカラムに入れられ、抗原結合タンパク質がカラムに充填され、カラムを押し通される。カラムから回収された試料に関する還元された抗原結合タンパク質の量が測定される。
【００３２】
いくつかの態様において、本開示による方法は、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液をプロテインＡクロマトグラフィーに供することをさらに含む。プロテインＡクロマトグラフィーに関する手法は、当該技術分野において知られており、このプロセスは、免疫グロブリンのＦｃ及び／またはＦａｂ領域に対するプロテインＡの親和性に基づいて、Ｆｃ領域を有する抗原結合タンパク質分子を含む溶液から宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、及びウイルスなどの夾雑物を除去するために慣行的に使用されている。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質をプロテインＡ樹脂に結合させるために中性または塩基性のローディングバッファー（ｐＨ７から８など）が使用される。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質をプロテインＡ樹脂から溶出するために、３から５の間のｐＨ、例えば、３から４、または４から５などの低いｐＨが使用される。一実施形態において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液は、荷電デプスフィルターと接触させられる前に、プロテインＡクロマトグラフィーに供される。いくつかの実施形態において、プロテインＡクロマトグラフィーの後、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液は、荷電デプスフィルターと接触させられる前に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２４時間以上インキュベートされる。いくつかの実施形態において、プロテインＡクロマトグラフィーの後、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液は、荷電デプスフィルターと接触させられる前に、２から１０時間の間（２から２４時間の間、４から２０時間の間、または４から１０時間の間など）インキュベートされる。別の実施形態において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液は、最初に荷電デプスフィルターと接触させられた後、それからプロテインＡクロマトグラフィーに供される。いくつかの実施形態において、深層ろ過の後、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液は、プロテインＡクロマトグラフィーに供される前に、再酸化を促進するために少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２４、３２、４８時間以上インキュベートされる。いくつかの実施形態において、深層ろ過後、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液は、プロテインＡクロマトグラフィーに供される前に２から３２時間の間（１２から２４時間の間、２４から４８時間の間、または２４から３２時間の間など）インキュベートされる。
【００３３】
本開示の方法は、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液中に存在する１つ以上のウイルスを不活化するステップをさらに含む。一実施形態において、本方法は、溶液を荷電デプスフィルターと接触させる前に、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液中の１つ以上のウイルスを不活化することを含む。別の実施形態において、方法は、溶液を荷電デプスフィルターと接触させた後に、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液中の１つ以上のウイルスを不活化することを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質分子を含むウイルス不活化水溶液は、再酸化を促進するために、荷電深層ろ過後に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２４、３２、４８時間以上インキュベートされる。ウイルスを不活化するための方法は、当該技術分野において知られており、一般に抗原結合タンパク質分子を含む水溶液のｐＨを、例えば、３．０から４．０の間のｐＨに、約１時間などの長時間低下させることを含む。いくつかの実施形態において、本開示による方法は、荷電デプスフィルターと接触させられる前に、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液をプロテインＡクロマトグラフィー及びウイルス不活化ステップに供すること、例えば、プロテインＡクロマトグラフィーに続くウイルス不活化を含む。別の実施形態において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液は、荷電デプスフィルターと接触させられた後に、プロテインＡクロマトグラフィー及びウイルス不活化ステップ、例えば、プロテインＡクロマトグラフィーに続くウイルス不活化に供される。さらに別の実施形態において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液は、プロテインＡクロマトグラフィーに供された後に荷電デプスフィルターと接触させられ、それにウイルス不活化が続く。一実施形態において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液は、プロテインＡクロマトグラフィーに供され、それにウイルス不活化が続き、その後、荷電デプスフィルターと接触させられた後に、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４時間以上のインキュベーション保持時間が続く。
【００３４】
さらに別の態様において、本開示の方法は、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液を陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーに供することをさらに含む。ＣＥＸクロマトグラフィーに関する手法は、当該技術分野において知られており、このプロセスは、負に荷電したＣＥＸ樹脂に対する抗体の親和性に基づいて、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ１及びＩｇＧ２抗体などの抗体を分離するために慣行的に使用されている。一実施形態において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液は、荷電デプスフィルターと接触させられる前にＣＥＸクロマトグラフィーに供される。別の実施形態において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液は、荷電デプスフィルターと最初に接触させられ、その後、ＣＥＸクロマトグラフィーに供される。さらに別の実施形態において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液は、ＣＥＸクロマトグラフィーに供される前に、プロテインＡクロマトグラフィー及びウイルス不活化ステップに供された後、荷電デプスフィルターと接触させられ、荷電深層ろ過に続く少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４時間以上のインキュベーション保持時間を任意に伴う。別の実施形態において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液は、荷電デプスフィルターと接触させられる前にプロテインＡクロマトグラフィーに供され、その後にＣＥＸクロマトグラフィーが続く。
【００３５】
一態様において、本開示による方法は、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液を１つの荷電デプスフィルターと接触させることを含む。別の態様において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液は、複数の荷電デプスフィルター、例えば、２、３、４つ以上の荷電デプスフィルターと、例えば、順次または同時に接触させられるか、あるいは遠心分離、精密ろ過、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、プロテインＡクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、及び／またはウイルス不活化／ろ過などの他のプロセスステップによって分離される。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液（例えば、ＨＣＣＦ）は、任意に荷電デプスフィルターと接触させられ、その後、任意に荷電深層ろ過ステップが続く、プロテインＡクロマトグラフィーステップに供され、その後、任意に荷電深層ろ過ステップが続く、ウイルス不活化ステップに供され、その後、任意に荷電深層ろ過ステップが続く、陽イオン交換クロマトグラフィーステップに供され、その後、任意に荷電深層ろ過ステップが続く、第１級アミン配位子を用いた塩不耐性相互作用クロマトグラフィー（ＳＴＩＣ  ＰＡ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、及び混合方式クロマトグラフィー（ＭＭＣ）から任意に選択される別のクロマトグラフィーステップに供され、その後、任意に荷電深層ろ過ステップが続く、ウイルスろ過ステップに供され、その後、任意に荷電深層ろ過ステップが続く、限外ろ過／ダイアフィルトレーションステップに供される。さらに任意に、任意の荷電深層ろ過ステップに続く少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４時間以上のインキュベーション保持時間がある。
【００３６】
本明細書に記載されている任意の方法の一態様において、抗原結合タンパク質分子の水溶液が荷電デプスフィルターと接触させられた後、抗原結合タンパク質分子の再酸化を増大させることの効果は長時間継続する。いくつかの態様において、還元された抗原結合タンパク質分子のパーセンテージは、荷電深層ろ過後、少なくとも１時間、例えば、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間以上低下し続け、例えば、約４から約２４時間後に最終的に還元された抗原結合タンパク質分子が最低限の定常状態の量に達する。いくつかの態様において、水溶液中の還元された抗原結合タンパク質分子のパーセンテージは、約２℃から室温の間の温度で低下し続ける。対照的に、抗原結合タンパク質分子の水溶液中の部分的に還元された抗原結合タンパク質分子の量は、その溶液が荷電デプスフィルターと接触させられない場合、増加し続ける（実施例を参照のこと）。
【００３７】
一態様において、抗原結合タンパク質分子の水溶液は、珪藻土を含む組成物とさらに接触させられる。任意に、組成物は、酸洗浄された珪藻土を含む、及び／または約９０％の二酸化ケイ素を含む。珪藻土を含む組成物の例としては、Ｃｅｌｉｔｅ  ５４５  Ｆｉｌｔｅｒ  Ａｉｄ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ピッツバーグ、ペンシルベニア州）及びＨＹＦＬＯ  ＳＵＰＥＲＣＥＬ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
一態様において、抗原結合タンパク質分子の水溶液は、溶液中の陽イオン、例えば、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、水銀、モリブデン、クロム、カドミウム、アルミニウム、カリウム、コバルト、鉄、マンガン、チタン、亜鉛、ニッケル、銅、またはそれらの組み合わせなどの金属イオンとさらに接触させられる。一態様において、抗原結合タンパク質分子の水溶液は、金属の以下の組み合わせのうちの１つとさらに接触させられる：１）銅及びコバルト、２）銅及びカドミウム、３）コバルト及びカドミウム、または４）銅、コバルト、及びカドミウム。いくつかの実施形態において、金属（または金属の組み合わせの１つ以上もしくはすべての金属）は、＋２またはさらに高い酸化状態（＋３もしくは＋４など）を有する。一態様において、陽イオン、例えば、溶解した金属イオンは、水溶液を荷電デプスフィルターと接触させるステップの前またはその間に抗原結合タンパク質分子を含む水溶液に添加される。例えば、銅がＨＣＣＦに任意に添加される。任意に、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液は、すなわち、水溶液を荷電デプスフィルターと接触させる前、間、及び／または後に空気または酸素が通気される。また、任意に、バイオリアクター中の溶存酸素レベルが高められ、ＨＣＣＦ容器は、ＨＣＣＦの回収前に酸素飽和バッファーで事前に満たされ、及び／またはバイオリアクター及び／またはＨＣＣＦ容器の通気が増加される。
【００３９】
一態様において、（Ｆｃ領域を含む抗原結合タンパク質、融合タンパク質、抗体、もしくはペプチボディなどの）抗原結合タンパク質の水性製剤を生成する方法またはそのような抗原結合タンパク質の再酸化を増大させる方法は、（ａ）ステップ（ａ）の前に観察された還元された抗原結合タンパク質分子のパーセンテージと比較して、還元された抗原結合タンパク質分子のパーセンテージの少なくとも２０％の低下、任意に３０％または４０％の低下を達成するのに十分な条件下において、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液を荷電デプスフィルター由来の少なくとも１つの抽出可能物と接触させることと、（ｂ）任意に、還元された抗原結合タンパク質分子の（総量などの）量または相対量を測定することとを含む。荷電デプスフィルター由来の抽出可能物は、例えば、本明細書に記載されている陽イオンまたは荷電デプスフィルターに存在するその他の構成成分である場合がある。任意に、抽出可能物は、荷電デプスフィルターを酸性溶液、例えば、Ｈ２ＳＯ４と接触させることによって荷電デプスフィルターから取り除かれる。一態様において、抗原結合タンパク質分子の水溶液は、荷電デプスフィルターと接触させられるかわりに、荷電デプスフィルター由来の少なくとも１つの抽出可能物と接触させられる。別の態様において、抗原結合タンパク質分子の水溶液は、荷電デプスフィルターとの接触に加えて荷電デプスフィルター由来の少なくとも１つの抽出可能物と接触させられる。
【００４０】
いくつかの実施形態において、本開示による抗原結合タンパク質は、天然に存在する抗体に生じる且つそれを構成するアミノ酸配列、及び／または本開示に従って抗原結合タンパク質を作製するために一般的に利用されるいくつかの手法を示すべく、ハイブリドーマ技術によって、（例えば、相同もしくは非相同組み換えによる）内在性遺伝子の活性化によって、内在性転写制御領域の支配下における外来性遺伝子の発現によって、外来性発現コンストラクトの発現によって、半合成によって及び新規の合成によって作製されたアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖ポリペプチドを含む。
【００４１】
これらの抗原結合タンパク質の中には、天然に存在する、類似しているがそれとは異なる、半分新規のアミノ酸配列及び／または新規の配列を有するかどうかにかかわらず、とりわけ、抗原結合タンパク質構造が還元可能なジスルフィド結合を含む限り、全体がもしくは一部が新規のアミノ酸配列を有するもの、天然に存在する抗体のアミノ酸配列と一部は一致するが他は異なるアミノ酸配列を有するもの、天然に存在する対応物もしくはそれと関連する配列とほぼ同じアミノ酸配列を有するが、１つ以上の翻訳後修飾が対応物と異なるもの、ならびに第２の異なる抗原結合タンパク質ポリペプチドから成る、もしくはそれ由来のもしくはそれに関連する可能性があり、任意のその他のポリペプチドもしくはタンパク質から成る、もしくはそれ由来の可能性がある１つ以上のポリペプチド領域と融合した任意の前述のもの（一部もしくは全体）の一部に含まれるものが含まれる。そのようなポリペプチドは、一般に本明細書中では融合ポリペプチド及び／または融合タンパク質と呼ぶ。例えば、本開示による抗原結合タンパク質は、天然に存在するか、または市販されている抗原結合タンパク質の１つ以上のＣＤＲ領域及び／またはそれ由来のＣＤＲ領域及び／またはＣＤＲ関連領域を含むタンパク質である。
【００４２】
一部の例において、抗原結合タンパク質とは、本明細書中で使用される場合、抗体のＦｃ領域と融合した１つ以上の抗原特異的なペプチド（例えば、２つまたは３つのペプチドが連続した）を含む「ペプチボディ」を含む。例えば、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，ＭＡｂｓ．４（５）：５８６−９１（２０１２）、２０１４年１月２３日に公開された米国特許出願公開第２０１４／００２４１１１号を参照のこと。
【００４３】
さらに、本開示による抗原結合タンパク質の中には、前述のものすべてによる修飾タンパク質がある。そのような修飾タンパク質の中に、非共有結合、共有結合、または共有結合及び非共有結合の両方によって化学的に修飾されたタンパク質が含まれる。細胞の修飾系によって行われる場合もある翻訳後修飾あるいは酵素的及び／または化学的方法によってエクスビボにおいて組み込まれる、またはその他の方法で組み込まれる修飾の１つ以上をさらに含む前述のもののすべても含まれる。
【００４４】
本開示の前述のもの及び他の態様による抗原結合タンパク質に関して、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｌ．Ｃｌｅｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｓ．Ｃｒａｉｋ，ｅｄｓ．Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９６）、特にその中のＫｅｌｌｅｙ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｆ．，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，ｐｐ．３９９−４３４及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｐ．＆  Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｅ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００５，１１２６−１１３６を参照のこと。それらのそれぞれは、その全体、特に抗原結合タンパク質の構造及び操作、特に本開示によるバイオ医薬品抗体及び抗体関連医薬品タンパク質に関する部分が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４５】
一態様において、抗原結合タンパク質は、特に還元に感受性の高いクラスに属する。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ラムダ軽鎖を有する。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１λ、ＩｇＧ１κ、ＩｇＧ２λ、及びＩｇＧ２κから成る群から選択される。
【００４６】
前述のものすべてに関して、ヒトに投与されたときに著しく有害な免疫応答を引き起こさないヒト及びヒト化抗体などのヒト、ヒト化、及びその他の抗原結合タンパク質が特に好ましい。非ヒト、例えば、飼い慣らされた哺乳動物に投与されたときに著しく有害な免疫応答を同様に引き起こさない前述のものすべてによる抗原結合タンパク質も好ましい。
【００４７】
いくつかの実施形態において、抗体は、１つ以上のＣＤタンパク質、ＨＥＲレセプターファミリータンパク質、細胞接着分子、成長因子、神経成長因子、線維芽細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子、骨誘導因子、インスリン及びインスリン関連タンパク質、凝固及び凝固関連タンパク質、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、その他の血液及び血清タンパク質血液型抗原、レセプター、レセプター関連タンパク質、成長ホルモンレセプター、Ｔ細胞受容体、神経栄養因子、ニューロトロフィン、リラキシン、インターフェロン、インターロイキン、ウイルス抗原、リポタンパク質、インテグリン、リウマチ因子、免疫毒素、表面膜タンパク質、輸送タンパク質、ホーミングレセプター、アドレシン、調節タンパク質、及びイムノアドヘシンに特異的に結合するタンパク質から成る群から選択される。
【００４８】
例えば、いくつかの態様において、本開示による抗原結合タンパク質は、単独でまたは任意の組み合わせで以下の１つ以上と結合する：（ｉ）ＣＤタンパク質、以下に限定されないが、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３４、（ｉｉ）ＨＥＲレセプターファミリータンパク質、例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、及びＥＧＦレセプター、（ｉｉｉ）細胞接着分子、例えば、ＬＦＡ−１、Ｍｏｌ、ｐ１５０，９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、及びアルファｖ／ベータ３インテグリン、（ｉｖ）成長因子、以下に限定されないが、例えば、血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、ミュラー管抑制因子、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、神経成長因子、例えば、ＮＧＦ−ベータ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子、例えば、ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、例えば、とりわけ、ＴＧＦ−アルファ及びＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、ＴＧＦ−ベータ４、もしくはＴＧＦ−ベータ５を含むＴＧＦ−ベータ、インスリン様成長因子−Ｉ及び−ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、及び骨誘導因子、（ｖ）インスリン及びインスリン関連タンパク質、以下に限定されないが、例えば、インスリン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、及びインスリン様成長因子結合タンパク質、（凝固及び凝固関連タンパク質、例えば、とりわけ、第ＶＩＩＩ因子、組織因子、フォン・ヴィレブランド因子、プロテインＣ、アルファ−１−アンチトリプシン、プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼ及び組織プラスミノーゲン活性化因子（「ｔ−ＰＡ」）、ボンバジン、トロンビン、及びトロンボポエチン、（ｖｉｉ）コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、とりわけ、以下のＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ、（ｖｉｉｉ）その他の血液及び血清タンパク質、以下に限定されないが、例えば、アルブミン、ＩｇＥ、及び血液型抗原、（ｉｘ）レセプター及びレセプター関連タンパク質、例えば、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター、レプチン（ＯＢ）レセプター、成長ホルモンレセプター、及びＴ細胞受容体、（ｘ）神経栄養因子、以下に限定されないが、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及びニューロトロフィン−３、−４、−５、または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、もしくはＮＴ−６）、（ｘｉ）リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、及びプロリラキシン、（ｘｉｉ）インターフェロン、例えば、インターフェロン−アルファ、−ベータ、及び−ガンマ、（ｘｉｉｉ）インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１からＩＬ−１０、（ｘｉｖ）ウイルス抗原、以下に限定されないが、例えば、ＡＩＤＳエンベロープウイルス抗原、（ｘｖ）リポタンパク質、カルシトニン、グルカゴン、心房性ナトリウム利尿因子、肺サーファクタント、腫瘍壊死因子−アルファ及び−ベータ、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ（活性化制御、正常Ｔ細胞発現及び分泌）、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、Ｄｎａｓｅ、インヒビン、及びアクチビン、（ｘｖｉ）インテグリン、プロテインＡもしくはＤ、リウマチ因子、免疫毒素、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、スーパーオキシドジスムターゼ、表面膜タンパク質、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＡＩＤＳエンベロープ、輸送タンパク質、ホーミングレセプター、アドレシン、調節タンパク質、イムノアドヘシン、抗原結合タンパク質、ならびに（ｘｖｉｉ）前述のもののいずれかの生物学的に活性なフラグメントまたはバリアント。
【００４９】
前述のものすべてに関して、有効な治療薬であるもの、特に標的、特に上で挙げたものの中の標的（それ由来の標的、それに関連する標的、及びその改変物を含む）と結合することによって治療効果を発揮するものが特に好ましい。
【００５０】
任意に、抗原結合タンパク質は、ＯＰＧＬ、ミオスタチン、ＩＬ−４レセプター、ＩＬ１−Ｒ１、Ａｎｇ２、ＮＧＦ、ＣＤ２２、ＩＧＦ−１レセプター、Ｂ７ＲＰ−１、ＩＦＮガンマ、ＴＡＬＬ−１、幹細胞因子、Ｆｌｔ−３、ＩＬ−１７またはＩＬ−１７レセプターのいずれかと結合する抗原結合タンパク質から成る群から選択される。
【００５１】
例えば、いくつかの態様において、本開示による抗体またはペプチボディは、以下のとおり特徴づけることができる：（ｉ）ＯＰＧＬ特異抗体及びペプチボディ（ＲＡＮＫＬ特異抗体、ペプチボディとも言及される）、例えば、完全ヒト化及びヒトＯＰＧＬ特異抗体、特に、完全ヒト化モノクローナル抗体、以下に限定されないが、例えば、ＯＰＧＬ特異抗体に関してその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ０３／００２７１３号に記載されている抗体、特にその公報に記載されている配列を有するもの、特に、以下に限定されないが、その公報中で９Ｈ７、１８Ｂ２、２Ｄ８、２Ｅ１１、１６Ｅ１、及び２２Ｂ３の名称であるもの、例えば、公報の図２に記載されているとおりの配列番号２の軽鎖及び／またはＷＯ０３／００２７１３のその中の図４に記載されているとおりの配列番号４の重鎖のいずれかを有するＯＰＧＬ特異抗体、そのそれぞれが前述の公報に開示されているとおりに完全にその全体が参照により本明細書に個別に及び具体的に組み込まれる、（ｉｉ）ミオスタチン結合作用物質またはペプチボディ、例えば、ミオスタチン特異的ペプチボディ、その全体、特にミオスタチン特異的ペプチボディに関する部分が参照により本明細書に組み込まれる特に米国特許出願公開第２００４／０１８１０３３号に記載されているもの、以下に限定されないが、例えば、ＴＮ８−１９−１からＴＮ８−１９−４０、ＴＮ８−１９  ｃｏｎ１及びＴＮ８−１９  ｃｏｎ２を含むｍＴＮ８−１９ファミリーのペプチボディ、ｍＬ２ファミリーのペプチボディ、配列番号３８４〜４０９のｍＬ１５ファミリー、ｍＬ１７ファミリー、ｍＬ２０ファミリー、ｍＬ２１ファミリー、ｍＬ２４ファミリー、そのそれぞれが前述の公報に開示されているとおりに完全にその全体が参照により本明細書に個別に及び具体的に組み込まれる、（ｉｉｉ）ＩＬ−４レセプター特異抗体、特にＩＬ−４及び／またはＩＬ−１３のレセプターとの結合に関係する活性を阻害するもの、例えば、参照によってその全体、特にＩＬ−４レセプター特異抗体に関する部分が本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３７４２号の国際公開第ＷＯ２００５／０４７３３１号に記載されているもの、特にその中に記載されているような抗体、特に以下に限定されないが公報中でＬ１Ｈ１、Ｌ１Ｈ２、Ｌ１Ｈ３、Ｌ１Ｈ４、Ｌ１Ｈ５、Ｌ１Ｈ６、Ｌ１Ｈ７、Ｌ１Ｈ８、Ｌ１Ｈ９、Ｌ１Ｈ１０、Ｌ１Ｈ１１、Ｌ２Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ２Ｈ３、Ｌ２Ｈ４、Ｌ２Ｈ５、Ｌ２Ｈ６、Ｌ２Ｈ７、Ｌ２Ｈ８、Ｌ２Ｈ９、Ｌ２Ｈ１０、Ｌ２Ｈ１１、Ｌ２Ｈ１２、Ｌ２１３、Ｌ２Ｈ１４、Ｌ３Ｈ１、Ｌ４Ｈ１、Ｌ５Ｈ１、Ｌ６Ｈ１と呼ばれているもの、そのそれぞれが前述の公報に開示されているとおりに完全にその全体が参照により本明細書に個別に及び具体的に組み込まれる、（ｉｖ）インターロイキン１−レセプター１（「ＩＬ１−Ｒ１」）特異抗体、ペプチボディ、以下に限定されないが、例えば、参照によってその全体、特にＩＬ１−Ｒ１特異的結合タンパク質、モノクローナル抗体に関する部分を本明細書に組み込んだものとする米国特許出願公報第ＵＳ２００４／０９７７１２Ａ１号に記載されているもの、とりわけ、以下に限定されな��が、公報中で１５ＣＡ、２６Ｆ５、２７Ｆ２、２４Ｅ１２、及び１０Ｈ７と呼ばれるもの、そのそれぞれは、上記の米国特許出願公報に開示されているとおりに完全にその全体が参照により本明細書に個別に及び具体的に組み込まれる、（ｖ）Ａｎｇ２特異抗体及びペプチボディ、以下に限定されないが、例えば、それぞれが参照によってその全体、特にＡｎｇ２特異抗体及びペプチボディに関する部分が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ０３／０５７１３４号及び米国特許出願公開第ＵＳ２００３／０２２９０２３号に記載されているもの、とりわけそれに記載されている配列のもの及び以下に限定されないが、例えば、Ｌ１（Ｎ）、Ｌ１（Ｎ）ＷＴ、Ｌ１（Ｎ）１Ｋ  ＷＴ、２ｘＬ１（Ｎ）、２ｘＬ１（Ｎ）ＷＴ、Ｃｏｎ４（Ｎ）、Ｃｏｎ４（Ｎ）１Ｋ  ＷＴ、２ｘＣｏｎ４（Ｎ）１Ｋ、Ｌ１（Ｃ）、Ｌ１（Ｃ）１Ｋ、２ｘＬ１（Ｃ）、Ｃｏｎ４（Ｃ）、Ｃｏｎ４（Ｃ）１Ｋ、２ｘＣｏｎ４（Ｃ）１Ｋ、Ｃｏｎ４−Ｌ１（Ｎ）、Ｃｏｎ４−Ｌ１（Ｃ）、ＴＮ−１２−９（Ｎ）、Ｃ１７（Ｎ）、ＴＮ８−８（Ｎ）、ＴＮ８−１４（Ｎ）、Ｃｏｎ  １（Ｎ）、さらに例えば、それに関して参照によってその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２００３／０３０８３３号に記載されているものなどの抗Ａｎｇ２抗体及び製剤、特に公報中で記載されているそれらの各種変形としてＡｂ５２６、Ａｂ５２８、Ａｂ５３１、Ａｂ５３３、Ａｂ５３５、Ａｂ５３６、Ａｂ５３７、Ａｂ５４０、Ａｂ５４３、Ａｂ５４４、Ａｂ５４５、Ａｂ５４６、Ａ５５１、Ａｂ５５３、Ａｂ５５５、Ａｂ５５８、Ａｂ５５９、Ａｂ５６５、ＡｂＦ１ＡｂＦＤ、ＡｂＦＥ、ＡｂＦＪ、ＡｂＦＫ、ＡｂＧ１Ｄ４、ＡｂＧＣ１Ｅ８、ＡｂＨ１Ｃ１２、ＡｂｌＡ１、ＡｂｌＦ、ＡｂｌＫＡｂｌＰ、及びＡｂｌＰ、そのそれぞれが前述の公報に開示されているとおりに完全にその全体が参照により本明細書に個別に及び具体的に組み込まれる、（ｖｉ）ＮＧＦ特異抗体、特に、以下に限定されないが、例えば、参照によってその全体、特にＮＧＦ−特異抗体に関して本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第ＵＳ２００５／００７４８２１号に記載されているもの、特に、以下に限定されないが、例えば、その中で４Ｄ４、４Ｇ６、６Ｈ９、７Ｈ２、１４Ｄ１０及び１４Ｄ１１と呼ばれているＮＧＦ−特異抗体、そのそれぞれが前述の公報に開示されているとおりに完全にその全体が参照により本明細書に個別に及び具体的に組み込まれる、（ｖｉｉ）ＣＤ２２特異抗体、例えば、参照によってＣＤ２２特異抗体、特にヒトＣＤ２２特異抗体に関してその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，７８９，５５４号に記載されているもの、以下に限定されないが、例えば、ヒト化及び完全ヒト抗体、以下に限定されないが、例えば、ヒト化及び完全ヒトモノクローナル抗体、特に以下に限定されないが、例えば、ヒトＣＤ２２特異的ＩｇＧ抗体、例えば、ヒト・マウスモノクローナルｈＬＬ２カッパ鎖とジスルフィド結合したヒト・マウスモノクローナルｈＬＬ２ガンマ鎖の二量体、以下に限定される、例えば、エプラツズマブ、ＣＡＳ登録番号５０１４２３−２３−０のヒトＣＤ２２特異的完全ヒト化抗体、（ｖｉｉｉ）ＩＧＦ−１レセプタ��特異抗体、例えば、参照によってＩＧＦ−１レセプター特異抗体に関してその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４６４９３号に記載されているもの、以下に限定されないが、例えば、その中でＬ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３、Ｌ１４Ｈ１４、Ｌ１５Ｈ１５、Ｌ１６Ｈ１６、Ｌ１７Ｈ１７、Ｌ１８Ｈ１８、Ｌ１９Ｈ１９、Ｌ２０Ｈ２０、Ｌ２１Ｈ２１、Ｌ２２Ｈ２２、Ｌ２３Ｈ２３、Ｌ２４Ｈ２４、Ｌ２５Ｈ２５、Ｌ２６Ｈ２６、Ｌ２７Ｈ２７、Ｌ２８Ｈ２８、Ｌ２９Ｈ２９、Ｌ３０Ｈ３０、Ｌ３１Ｈ３１、Ｌ３２Ｈ３２、Ｌ３３Ｈ３３、Ｌ３４Ｈ３４、Ｌ３５Ｈ３５、Ｌ３６Ｈ３６、Ｌ３７Ｈ３７、Ｌ３８Ｈ３８、Ｌ３９Ｈ３９、Ｌ４０Ｈ４０、Ｌ４１Ｈ４１、Ｌ４２Ｈ４２、Ｌ４３Ｈ４３、Ｌ４４Ｈ４４、Ｌ４５Ｈ４５、Ｌ４６Ｈ４６、Ｌ４７Ｈ４７、Ｌ４８Ｈ４８、Ｌ４９Ｈ４９、Ｌ５０Ｈ５０、Ｌ５１Ｈ５１、及びＬ５２Ｈ５２と呼ばれるＩＧＦ−１特異抗体、そのそれぞれが参照によりその全体が前述の国際出願に開示されているとおりに完全に本明細書に個別に及び具体的に組み込まれる、（ｉｘ）Ｂ−７関連タンパク質１（「Ｂ７ＲＰ−１」）特異抗体、（Ｂ７ＲＰ−１は、文献中でＢ７Ｈ２、ＩＣＯＳＬ、Ｂ７ｈ、及びＣＤ２７５とも言及される）特にＢ７ＲＰ特異完全ヒトモノクローナルＩｇＧ２抗体、特にＢ７ＲＰ−１の第１の免疫グロブリン様ドメインにあるエピトープと結合する完全ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体、とりわけ、特に、Ｂ７ＲＰ−１と、活性化Ｔ細胞にあるその本来のレセプター、ＩＣＯＳとの相互作用を阻害するもの、とりわけ、前述の事項のすべてにおいて、参照によってそのような抗体に関してその全体が本明細書に組み込まれる２００５年７月１８日に出願された米国特許仮出願第６０／７００，２６５号に開示されているもの、以下に限定されないが、例えば、その中で以下のとおりに呼ばれている抗体：１６Ｈ、５Ｄ、２Ｈ、４３Ｈ、４１Ｈ、及び１５Ｈ、そのそれぞれは前述の米国特許仮出願に開示されているとおりにその全体が完全に参照により本明細書に個別に及び具体的に組み込まれる、（ｘ）ＩＬ−１５特異抗体またはペプチボディ、例えば、ヒト化モノクローナル抗体、特に米国特許出願公開第ＵＳ２００３／０１３８４２１号、同第ＵＳ２００３／０２３５８６号、同第ＵＳ２００４／００７１７０２号に開示されているものなどの抗体、これらの文献のそれぞれがＩＬ−１５特異抗体及びペプチボディに関して参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、特に、例えば、以下に限定されないが、例えば、１４６Ｂ７などのＨｕＭａｘ  ＩＬ−１５抗体、（ｘｉ）ＩＦＮガンマ特異抗体、とりわけヒトＩＦＮガンマ特異抗体、特に完全ヒト抗ＩＦＮガンマ抗体、例えば、ＩＦＮガンマ特異抗体に関して参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第ＵＳ２００５／０００４３５３号に記載されているもの、特に、例えば、その中で１１１８、１１１８＊、１１１９、１１２１、及び１１２１＊と呼ばれる抗体、そのそれぞれが前述の米国公報に開示されているとおりに参照によりその全体が完全に本明細書に個別に及び具体的に組み込まれる、（ｘｉｉ）ＴＡＬＬ−１特異抗体及びその他のＴＡＬＬ特異的結合タンパク質、例えば、ＴＡＬＬ−１結合タンパク質に関して参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３／０１９５１５６号に記載されているもの、特に表４及び５Ｂの分子、そのそれぞれが前述の米国公報に開示されているとおりに参照によりその全体が完全に本明細書に個別に及び具体的に組み込まれる、（ｘｉｉｉ）ＣＤ２０特異抗体、例えば、ＣＤ２０特異抗体、特にヒトＣＤ２０特異抗体に関して参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，７３６，１３７号及び同第５，８４３，４３９号に記載されているもの、以下に限定されないが、例えば、ヒト化及び完全ヒト抗体、以下に限定されないが、例えば、ヒト化及び完全ヒトモノクローナル抗体、特に、以下に限定されないが、例えば、ヒトＣＤ２０特異的ＩｇＧ抗体、以下に限定される、例えば、キメラマウス／ヒトＣＤ２０特異抗体リツキシマブ、ＣＡＳ登録番号１７４７２２−３１−７、及びオファツムマブ、ＣＡＳ登録番号６７９８１８−５９−８、（ｘｉｖ）カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）特異抗体、（ｘｖ）血小板特異（例えば、血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＰＡＣ−１）特異）抗体、（ｘｖｉ）スクレロスチン特異抗体、ならびに（ｘｖｉｉ）二重特異性抗体、例えば、二重特異性Ｔ細胞誘導体（ＢｉＴＥ）、例えば、前述のタンパク質標的のいずれかに対して親和性を有する二重特異性抗体。
【００５２】
いくつかの態様において、抗体またはペプチボディは、以下の１つ以上と特異的に結合するタンパク質から成る群から選択される：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＥＧＦレセプター、ＬＦＡ−１、Ｍｏｌ、ｐ１５０，９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、アルファｖ／ベータ３インテグリン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、ミュラー管抑制因子、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＮＧＦ−ベータ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、ＴＧＦ−ベータ４、ＴＧＦ−ベータ５、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、インスリン様成長因子結合タンパク質、例えば、とりわけ、第ＶＩＩＩ因子、組織因子、フォン・ヴィレブランド因子、プロテインＣ、アルファ−１−アンチトリプシン、プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼ及び組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、ボンバジン、トロンビン、及びトロンボポエチン、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、アルブミン、ＩｇＥ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター、レプチン（ＯＢ）レセプター、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、ＮＴ−６）、リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、プロリラキシン、インターフェロン−アルファ、−ベータ、及び−ガンマ、ＩＬ−１からＩＬ−１０、ＡＩＤＳエンベロープウイルス抗原、カルシトニン、グルカゴン、心房性ナトリウム利尿因子、肺サーファクタント、腫瘍壊死因子−アルファ及び−ベータ、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、Ｄｎａｓｅ、インヒビン、及びアクチビン、プロテインＡもしくはＤ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、スーパーオキシドジスムターゼ、ならびに崩壊促進因子（ＤＡＦ）。
【００５３】
いくつかの態様において、抗体は、アブシキシマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブベドチン、カナキヌマブ、セツキシマブ、セルトリズマブペゴル、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、イピリムマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、ナタリズマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、ベドリズマブ、及び前述のいずれかのバイオ後続品から成る群から選択される。一態様において、抗体は、リツキシマブ（例えば、米国特許第５，８４３，４３９号を参照）であるか、または配列番号１と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、もしくは少なくとも９９％同一の重鎖可変領域、及び配列番号２と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、もしくは少なくとも９９％同一の軽鎖可変領域を含むか、または１、２、３、４、５、もしくは６つのリツキシマブのＣＤＲ（配列番号３〜８）を含む。別の態様において、抗体は、インフリキシマブ（例えば、米国特許第６，２８４，４７１号を参照）であるか、または配列番号９と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、もしくは少なくとも９９％同一の重鎖可変領域、及び配列番号１０と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、もしくは少なくとも９９％同一の軽鎖可変領域を含む。別の態様において、抗体は、オファツムマブ（例えば、米国特許第８，５２９，９０２号を参照）であるか、または配列番号１１と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、もしくは少なくとも９９％同一の重鎖可変領域、及び配列番号１２と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、もしくは少なくとも９９％同一の軽鎖可変領域を含む。
【００５４】
本発明による抗原結合タンパク質は、前述のもののすべてを包含し、その重鎖ＣＤＲのすべて、及び／またはその軽鎖ＣＤＲのすべてを保持するバリアントをさらに含み、上記のとおりの抗原結合タンパク質の参照アミノ酸配列、特に、ＧｅｎＢａｎｋもしくはその他の参照タンパク質の参照配列などの医薬品結合タンパク質とアミノ酸配列が７０％以上、著しくは８０％以上、さらに著しくは９０％以上、さらに一層著しくは９５％以上、詳細には９７％以上、より詳細には９８％以上、さらに一層詳細には９９％以上同一である領域を含む。この関連で同一性は、さまざまな周知で容易に入手可能なアミノ酸配列解析ソフトウェアを使用して求めることができる。好ましいソフトウェアとしては、配列をサーチし、アライメントする課題に対する十分な解決法と考えられるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを実装するものが挙げられる。特に速度が重要な考慮事項である場合には、その他のアルゴリズムも利用してよい。この関連で使用することができるＤＮＡ、ＲＮＡ、及びポリペプチドのアライメントならびに相同性マッチングのための一般に利用されるプログラムとしては、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＰＲＯＳＲＣＨ、ＢＬＡＺＥ、及びＭＰＳＲＣＨが挙げられ、後者は、ＭａｓＰａｒによって製造された大規模並列処理用プロセッサにおける実行のためのＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムの実装である。
【００５５】
この関連で特に好ましいバリアントは、上記の参照抗原結合タンパク質の５０％から１５０％の活性を有し、この関連で特に極めて好適な実施形態は、参照抗原結合タンパク質の６０％から１２５％の活性を有し、さらに一層極めて好適な実施形態は、参照抗原結合タンパク質の７５％から１１０％の活性を有し、さらにより極めて好適な実施形態は、参照の８５％から１２５％の活性を有し、さらにより極めて好適な実施形態は、参照の９０％から１１０％の活性を有する。
【００５６】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載されている方法のいずれかを使用して調製される再酸化された抗原結合タンパク質分子を含む製剤を提供する。医薬品抗原結合タンパク質製剤の製剤に従来利用される多くの試薬及び方法が、本開示のさまざまな態様及び好適な実施形態による製剤に使用されてもよい。それによると、関係する技術分野において周知で定型化した医薬品を製剤化及び使用するための多くの方法及び成分は、それに関連する本開示のさまざまな態様及び好適な実施形態による製剤の設計、生成及び使用に使用することができる。そのような方法及び成分は、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ，２１ｓｔ  Ｅｄ．、Ｂｅｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  Ｐａ．（２００５）、ＡＮＳＥＬ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，８ｔｈ  Ｅｄ．，Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．（２００５）、及びＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｓｖｅｎ  Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ａｎｄ  Ｌａｒｓ  Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｉｔｏｒｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（２０００）に記載されており、それらのそれぞれはその全体、特にそれと関連する本発明のさまざまな態様及び好適な実施形態による再酸化された抗原結合タンパク質分子を含む製剤に使用することができる従来の成分及び方法に関する部分が本明細書に組み込まれる。
【００５７】
この関連で有用な可能性のあるさらなる方法及び成分が、とりわけ、米国特許第６，１７１，５８６号、ＷＯ２００５／０４４８５４、米国特許第６，２８８，０３０号、米国特許第６，２６７，９５８号、ＷＯ２００４／０５５１６４、米国特許第４，５９７，９６６号、ＵＳ２００３／０１３８４１７、米国特許第６，２５２，０５５号、米国特許第５，６０８，０３８号、米国特許第６，８７５，４３２号、ＵＳ２００４／０１９７３２４、ＷＯ０２／０９６４５７、米国特許第５，９４５，０９８号、米国特許第５，２３７，０５４号、米国特許第６，４８５，９３２号、米国特許第６，８２１，５１５号、米国特許第５，７９２，８３８号、米国特許第５，６５４，４０３号、米国特許第５，９０８，８２６号、ＥＰ０  ８０４  １６３、及びＷＯ２００５／０６３２９１に開示されており、これらの文献のそれぞれは参照によってその全体、特に本開示による薬学的に許容される抗原結合タンパク質製剤に関する部分が本明細書に組み込まれる。
【００５８】
成分及び特定のタイプの製剤のさまざまな特定の態様を説明のために下でさらに記載する。したがって、提供する説明は、本開示のさまざまな態様及び実施形態による再酸化された抗原結合タンパク質を含む水性製剤に可能な方法及び組成物の網羅的なものではなく、決して排他的なものでもない。
【００５９】
ほぼ、本開示の数々の態様及び実施形態による再酸化された抗原結合タンパク質を含む製剤は、決して以下に限定されないが賦形剤及びその他の医薬品を含む付加的な成分を含むことになる。本開示のさまざまな態様及び実施形態による製剤は、とりわけ、以下に記載される賦形剤、例えば、以下に限定されないが、製剤及び／または抗原結合タンパク質の重量オスモル濃度、モル浸透圧濃度、粘度、透明度、色、張性、におい、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着または浸透を調整、維持あるいは保護するための成分などを含んでもよい。製剤は、当然、とりわけ、例えば、製剤化される個々の抗原結合タンパク質、製剤に含まれることになるその他の医薬品などのその他の活性薬剤、意図される投与経路、利用される投与方法、投与量、投与頻度、及び送達方式に依存することになる。
【００６０】
本発明のさまざまな態様におけるある特定の好適な実施形態による製剤は、再酸化された抗原結合タンパク質及び担体を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質の濃度は、ｍｇ／ｍＬ単位でおよそ１０から４００の間、または１０から３００の間、または１０から２５０の間、または１０から２００の間、または１０から１５０の間、または１０から１００の間、または１０から７０の間、または１０から５０の間である。本開示のさまざまな態様におけるある特定の好適な実施形態による製剤は、再酸化された抗原結合タンパク質及び担体を含み、薬学的に許容される塩、浸透圧平衡剤（張性調整薬剤）、抗酸化剤、抗生剤、抗真菌剤、増量剤、凍結乾燥保護物質、消泡剤、キレート剤、保存料、着色料、鎮静剤、または付加的な医薬品の１つ以上をさらに含む組成物を提供する。
【００６１】
いくつかの実施形態において、担体は、タンパク質がその中に分散させられてもよい粉末などの固体である。この関連で好適な実施形態において、担体は、液体、特に所望の緩衝能をもたらす濃度で特に自己緩衝性タンパク質が極めて溶解できる液体である。液体担体は、有機的でも、または非有機的でもよい。好ましくは、それらは、水性であり、最も好ましくはそれはほとんどが純水であるか、または完全に純水から構成される。いくつかの実施形態において、担体は、薬学的に許容されるバッファー、例えば、アセタート、スクシナート、シトラート、ヒスチジン（イミダゾール）、ホスファート、トリス、またはそれらの組み合わせを含む。担体はまた、とりわけ以下のテキストに記載されているものなどの生物学的バッファーを含む生物学的バッファーである：緩衝剤及びバッファーに関してその全体が参照によって本明細書に組み込まれるＴＥＩＴＺ  ＴＥＸＴＢＯＯＫ  ＯＦ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｂｕｒｔｉｓ  ａｎｄ  Ａｓｈｗｏｏｄ，ｅｄｓ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．（１９９９）、特に表５０−１３から５０−１６中、その全体、とりわけ、表１−３、１−４、及び１−５及びそれに関連する文に関して参照によって本明細書に組み込まれるＴＨＥ  ＴＯＯＬＳ  ＯＦ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｔｅｒｒａｎｃｅ  Ｇ．Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７７）、特に１章、１〜３５ページ、ならびに参照によってその全体が本明細書に組み込まれるＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）、特に１６０〜１６４ページ、とりわけその中の表６．４及び６．５及びそれに関連する文、１２章、３節、３２４〜３３３ページ、とりわけ、その中の表１２−４及び１２−５及びそれに関連する文及び付属書類Ｃ：Ｂｕｆｆｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙのすべて。いくつかの実施形態において、製剤は、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００８０３１１０７８号に記載されているとおり自己緩衝性である。
【００６２】
本開示のさまざまな態様におけるある特定の好適な実施形態による製剤は、低張、等張、または高張、好ましくはほぼ等張であり、糖、とりわけ好ましくはソルビトール、マンニトール、スクロース、グルコース、ラクトース、トレハロース、プロピレングリコール、またはグリセロールの任意の１つ以上を含む１つ以上のポリオールを含んでもよい溶液として再酸化された抗原結合タンパク質及び担体を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示による製剤は、１つ以上の薬学的に許容される界面活性剤、好ましくは１つ以上のポリソルベート２０、ポリソルベート８０、その他のソルビタンの脂肪酸エステル、ポリエトキシレート、またはポロクサマー１８８をさらに含む。付加的な賦形剤が、粘度の調節などの製剤の物理的、化学的、もしくは生物学的特性の調節などの多種多様な目的のために本開示による製剤に、ならびにあるいは有効性を向上させるため、及びまたは、例えば、製造、出荷、保管、使用前調製、投与の間、及びその後に生じるストレスによる分解及び劣化に対してそのような製剤及びプロセスを安定させるために本発明のプロセスに使用されてもよい。
【００６３】
いくつかの実施形態において、本開示による製剤は、例えば、製剤のイオン強度及び／または等張性及び／または粘度を調節するため及び／または再酸化された抗原結合タンパク質の溶解度及び／または物理的安定性を向上させるために１つ以上の塩を含む。任意に、塩濃度は、１５０ｍＭ未満、例えば、１２５ｍＭ未満、１００ｍＭ未満、７５ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、または２５ｍＭ未満である。いくつかの実施形態において、本開示による製剤は、例えば、増量剤、安定剤、及び／または酸化防止剤として１つ以上のアミノ酸、例えば、リジン、プロリン、セリン、アラニン、グリシン、アルギニン、メチオニン、またはそれらの組み合わせを含む。
【００６４】
いくつかの実施形態において、本開示による製剤は、１つ以上の酸化防止剤、例えば、１つ以上の還元剤、酸素／フリーラジカルスカベンジャー、またはＥＤＴＡ及びグルタチオンを含むが、それらに限定されないキレート剤を含む。いくつかの実施形態において、ＥＤＴＡの量は、０．５から１５ｍＭの間、例えば、１から１０ｍＭ、２から８ｍＭ、３から７、ｍＭ、３から４ｍＭ、４から５ｍＭ、または５から６ｍＭである。いくつかの実施形態において、ＥＤＴＡの濃度は５ｍＭである。いくつかの実施形態において、ＥＤＴＡは、チオレドキシンまたはチオレドキシン様タンパク質を阻害する。いくつかの実施形態において、本開示による製剤は、＋２またはさらに高い酸化状態（＋３または＋４など）を有する金属、例えば、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２、Ｃａ＋２、Ｚｎ＋２、Ｃｕ＋２、Ｃｄ＋２、Ｃｏ＋２、Ｓｒ＋２、もしくはＡｌ＋３を含むが、それらに限定されない１つまたは金属イオンを含む。いくつかの実施形態において、金属の濃度は、１から９００ｐｐｍの間、例えば、１０から８００ｐｐｍ、１００から７００ｐｐｍ、１０から１００ｐｐｍ、１００から２００ｐｐｍ、２００から３００ｐｐｍ、３００から４００ｐｐｍ、４００から５００ｐｐｍ、５００から６００ｐｐｍ、または６００から７００ｐｐｍである。
【００６５】
任意に、本開示による製剤は、微生物の増殖を阻害し、無菌性を維持するための保存料を含む。適した保存料の例としては、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、ブチルアルコール、パラベン、レゾルシノール、カテコール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、第４級アンモニウム塩、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
この関連で有用なタンパク質安定化及び製剤材料及び方法に関するさまざまな解説が入手可能であり、例えば、Ａｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｏｌｖｅｎｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，”Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．８（３）：２８５−９１（１９９１）、Ｋｅｎｄｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，”ｉｎ：ＲＡＴＩＯＮＡＬ  ＤＥＳＩＧＮ  ＯＦ  ＳＴＡＢＬＥ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ：ＴＨＥＯＲＹ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｎｎｉｎｇ，ｅｄｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１３：６１−８４（２００２）、及びＲａｎｄｏｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１５９−７５（２００２）、これらのそれぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６７】
さまざまな実施形態において、本開示による製剤は、対象に治療薬を投与する分野の当業者に周知のさまざまな適した経路によって投与することができる。さまざまな実施形態におけるそのような経路としては、経口的に、眼に、粘膜に、局所的に、直腸に、吸入スプレーなどによって肺に、及び皮膚上に組成物を投与することが挙げられるが、これらに限定されるものではない。以下の非経口投与経路も本発明のさまざまな実施形態に有用である：静脈内、動脈内、心臓内、脊髄内、くも膜下腔内、骨内、関節腔内、滑液嚢内、皮内（ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ、ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）、皮下、腹腔内、及び／または筋肉内注射による投与。いくつかの実施形態において、静脈内、動脈内、皮内（ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ、ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）、皮下及び／または筋肉内注射が使用される。いくつかの実施形態において、皮下及び／または筋肉内注射が使用される。
【００６８】
本開示は、以下の実施例を参照することによってさらに容易に理解されるであろう。実施例は、説明のために提供するものであり、限定する意図はない。
【実施例】
【００６９】
本発明は、以下の説明のための非限定例によりさらに説明される。
【実施例１】
【００７０】
抗体作製中の抗体分子の還元
バイオリアクターにおいて増殖させられた宿主細胞からの組み換え抗体分子の作製及び精製は、一部の抗体分子の部分的な還元をもたらし、それにより分子の治療効果を低下させる可能性がある。還元された抗体分子を再酸化しようと曝気ステップが加えられても、抗体分子の部分的な還元は、バイオリアクターで始まり、作製及び精製プロセス全体を通して継続する可能性がある。以下の実施例は、作製及び精製プロセスの過程にわたる抗体分子の還元ならびに抗体分子の再酸化の増大及び水溶液中の還元された抗体分子のパーセンテージの低下に対する１つ以上の深層ろ過ステップの効果を調査する。
【００７１】
組み換え抗体分子を含む細胞培養液を回収し、クロスフロー精密ろ過を使用して清澄化した。回収した細胞培養液（ＨＣＣＦ）に空気を通気し、及び／または冷却し、任意に１以上の凍結／解凍サイクルに供した。プロテインＡクロマトグラフィーを樹脂製造業者の説明書に従って行い、プロテインＡプールを形成した。ＨＣＣＦ及びプロテインＡプール中の部分的に還元された抗体分子の量をｎｒＣＥ−ＳＤＳを使用して分析して、部分的に還元された抗体分子に対応するプレピーク化学種のパーセンテージを求めた。ＨＣＣＦ中に部分的に還元された抗体は存在したが、還元された抗体のパーセンテージは、ＨＣＣＦと比較してプロテインＡプールにおいて著しく高かった。
【００７２】
特定の例では、配列番号１の重鎖可変領域及び配列番号２の軽鎖可変領域を有するカッパ軽鎖を有する抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１抗体（抗体Ａ）を産生する宿主細胞を、バイオリアクターで最大１５日間培養した。抗体を含む細胞培養液を回収し、クロスフロー精密ろ過を使用して清澄化した。その後、回収した細胞培養液（ＨＣＣＦ）に空気を通気し、及び／または冷却し、８０±１５％溶存酸素及び／または２℃から８℃の温度に維持した。通気／冷却したＨＣＣＦを室温にした後、製造業者の説明書に従ってＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ及びＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲＥ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ピッツバーグ、ペンシルベニア州）を使用したプロテインＡクロマトグラフィーに供して、プロテインＡプールを形成した。ＨＣＣＦ及びプロテインＡプール中の部分的に還元された抗体分子の量をｎｒＣＥ−ＳＤＳを使用して分析して、部分的に還元された抗体分子に対応するプレピーク化学種のパーセンテージを求めた（図１）。抗体分子の還元は、バイオリアクターで始まっていた。細胞培養液に空気を通気し、冷却した後、部分的に還元された抗体のパーセンテージが低下したにもかかわらず、回収後にジスルフィド結合の還元が続いており、プレピーク化学種のパーセンテージは、回収した細胞培養液と比較してプロテインＡプールで著しく高かった。したがって、制御された酸素及び温度条件、すなわち、回収した細胞培養液の空気の通気及び冷却では、抗体分子の部分的な還元を妨げるのに十分ではなく、十分に再酸化を増大させなかった。
【実施例２】
【００７３】
荷電深層ろ過後の部分的に還元された抗体分子の増大された再酸化
抗体Ａを含む抗体水溶液を、上記のとおりプロテインＡクロマトグラフィーに供した後、プロテインＡプールのｐＨを約ｐＨ３．６に１時間低下させ、その後、ｐＨ５に調節することを含むウイルス不活化ステップを実施して、中和されたウイルス不活化プール（ｎＶＩＰ）を形成した。ｎＶＩＰをＭＩＬＬＩＳＴＡＫ＋  Ａ１ＨＣ荷電デプスフィルターシステム（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した荷電深層ろ過に続いて製造業者の説明書に従ってＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＥＸＰＲＥＳＳ  ＳＨＣ親水性フィルターを使用した滅菌ろ過に供して、ろ過ウイルス不活化プール（ＦＶＩＰ）を形成した。ろ過は、圧力制限を監視及び制御するための圧力センサーに接続されたフィルターを備えた通常のフローろ過システム（ＰｅｎｄｏＴＥＣＨ、プリンストン、ニュージャージー州）を使用して実施した。流速及び圧力は、それぞれ≦約２００ＬＭＨ及び≦約５０ｐｓｉに維持した。約５０Ｌ／ｍ２から約８００Ｌ／ｍ２の範囲でろ過する溶液を充填する前に、フィルターを、まず約１００Ｌ／ｍ２で脱イオン化水により洗い流し、≧約５０Ｌ／ｍ２の３０ｍＭアセタートバッファー、ｐＨ５．０による平衡化段階を続けた。最後に、そのフィルターを、約２０Ｌ／ｍ２の平衡化バッファーで洗い流した。プロテインＡプール中及びＦＶＩＰ中の部分的な抗体還元のレベルをｎｒＣＥ−ＳＤＳによって測定したプレピーク化学種のパーセンテージとして求めた（図２）。荷電デプスフィルターとの接触の後に、プロテインＡプール中の部分的に還元された抗体の量は著しく低減され、観察されたプレピーク％が３分の１を超えて低下した。プロテインＡプール生成物塊のすべてが荷電デプスフィルターを使用したろ過後に回収され、このことは、プレピーク化学種％の低下が本開示による荷電デプスフィルターとの接触後の部分的に還元された抗体の再酸化によるものであり、抗体分子は失われていないことを実証した。チオレドキシン及びチオレドキシン還元酵素の存在は、質量分光光度測定を使用して判断した。プロテインＡプール中にチオレドキシン様タンパク質が存在したが、荷電深層ろ液は、チオレドキシン及びチオレドキシン還元酵素を共に含まなかった。
【００７４】
抗体分子の増大された再酸化をさらに評価するために、プロテインＡプールを調製し、上記のとおり荷電デプスフィルターと接触させて、ＦＶＩＰを形成するか、またはさらにはろ過せず、その後、最大８日間、室温または２℃から８℃の間の温度で保持した。ｎｒＣＥ−ＳＤＳによってプレピーク化学種のパーセンテージとして測定したＦＶＩＰ（図３Ａ）中または荷電深層ろ過していないプロテインＡプール（図３Ｂ）中の部分的な抗体還元のレベルを求めた。ＦＶＩＰ中のプレピーク化学種のパーセンテージは、荷電デプスフィルターとの接触後、低下し続け、室温及び２℃から８℃の間の温度の両方で再酸化が増大した。ＦＶＩＰ中の部分的に還元された抗体分子の量はほぼ３分の１に低減され、３日以下のうちに定常状態レベルに達した。対照的に、ろ過していないプロテインＡプール中のプレピーク化学種のパーセンテージは、両温度で時間とともに増加し続け、このことは、抗体分子のさらなる還元を示し、冷却した場合と比較して室温で還元反応速度が速かった。
【００７５】
荷電深層ろ過はまた、プロテインＡクロマトグラフィーに先立って実施された場合に抗体分子の再酸化を増大させる際にも有効であった。ＨＣＣＦを製造業者の説明書に従ってＭＩＬＬＩＳＴＡＫ＋  Ｘ０ＨＣデプスフィルターシステム（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、３５０Ｌ／ｍ２のスループットで荷電深層ろ過に供するか、またはろ過しないかのいずれかの後、プロテインＡクロマトグラフィーに供して、プロテインＡプールを形成した。ｎｒＣＥ−ＳＤＳによってプレピーク化学種のパーセンテージとして測定した荷電深層ろ過したプロテインＡプール中または荷電深層ろ過していないプロテインＡプール中の部分的な抗体還元のレベルを求めた（図４Ａ及び図４Ｂ）。非ろ過対照と比較して、装填材料として荷電深層ろ液を使用したプロテインＡプールで観察されたプレピーク化学種のパーセンテージはおよそ２分の１（５０％）に低下した（図４Ａ）。さらに、部分的に還元された抗体分子のレベルがプロテインＡクロマトグラフィー後も増加し続けた非ろ過対照と比較して、荷電深層ろ液からのプロテインＡプールはより安定で、プレピーク化学種のパーセンテージは比較的一定のままであった（図４Ｂ）。
【００７６】
この結果は、抗体分子を含む水溶液を本開示による荷電デプスフィルターと接触させると抗体分子の再酸化を効果的に増大させて、部分的に還元された抗体分子の量が低減されたことを実証した。
【実施例３】
【００７７】
抗体分子の再酸化に対するろ過方法の比較
実施例２に記載されているとおりにｎＶＩＰを作製し、３５０Ｌ／ｍ２のスループットでＭＩＬＬＩＳＴＡＫ＋  Ａ１ＨＣデプスフィルターシステムを使用した荷電深層ろ過またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＥＸＰＲＥＳＳ  ＳＨＣ親水性フィルターを使用した滅菌メンブレンろ過のいずれかに供した。ｎｒＣＥ−ＳＤＳによって測定したフィルターシステムに充填するｎＶＩＰ中及びろ過後のｎＶＩＰ中の部分的な抗体還元のレベルをプレピーク化学種のパーセンテージとして求めた（図５Ａ及び図５Ｂ）。荷電深層ろ過は、極めて還元された材料であっても再酸化を促進することが示され、装填材料中の４５％から深層ろ過ろ液中の１０％未満にまでのプレピーク化学種のパーセンテージの低下を達成した（図５Ａ）。ｎＶＩＰ中及び滅菌ろ過ろ液中のプレピーク化学種のパーセンテージは同等であり、このことは、ろ過単独のため曝気が抗体分子の再酸化を促進しなかったことを示した。しかしながら、ろ過直後（ｔ＝０）の滅菌ろ過ろ液と比較して、荷電深層ろ過ろ液中で観察されたプレピーク％に２分の１を超える低下があった。さらに、ろ過後最初の４時間の保持にわたって荷電深層ろ過ろ液中のプレピーク化学種のパーセンテージは低下し続け、４時間までに定常状態レベルに達し、これは、ｎＶＩＰ中または滅菌ろ過ろ液中のプレピーク化学種のパーセンテージよりも３分の１を超えて低かった。したがって、ろ過の行為ではなく特に荷電デプスフィルターの使用が部分的に還元された抗体の再酸化を促進した。
【実施例４】
【００７８】
抗体分子の再酸化に対する荷電深層ろ過及び酸素供給の効果
抗体Ａを含む水溶液を、プロテインＡクロマトグラフィーに続いて、最大５０時間の保持ステップに続く（ａ）ＦＶＩＰを形成するためのウイルス不活化ステップ後にＭＩＬＬＩＳＴＡＫ＋  Ａ１ＨＣ荷電デプスフィルターシステムを使用した荷電深層ろ過、（ｂ）ｎＶＩＰを形成するためのウイルス不活化ステップに続く１００％溶存酸素までの空気の通気、または（ｃ）ｎＶＩＰを形成するためのウイルス不活化のみ、または（ｄ）対照として保持ステップのみに供した。プレピーク化学種のパーセンテージとしてｎｒＣＥ−ＳＤＳによって測定したプロテインＡプール、ＦＶＩＰ、空気を用いて酸素供給したｎＶＩＰ及び空気を与えないｎＶＩＰ中の部分的な抗体還元のレベルを比較した（図６）。プロテインＡプール及びｎＶＩＰの間のプレピーク化学種の開始パーセンテージは、ｎＶＩＰが空気で酸素供給されたかどうかにかかわらず同等であった。対照的に、荷電深層ろ過後のＦＶＩＰ中の還元された抗体分子の量は、およそ２倍少なかった。ＦＶＩＰ中のプレピーク化学種のパーセンテージは、保持の間低下し続け、プロテインＡプールまたは酸素供給していないｎＶＩＰよりも３分の１を超えて低く、酸素供給したｎＶＩＰよりも２分の１を超えて低い定常状態レベルに達した。したがって、１００％飽和酸素があっても抗体分子の再酸化に最低限の影響しかなく、部分的に還元された抗体分子の量を低減することに対して荷電深層ろ過よりはるかに有効ではなかった。
【実施例５】
【００７９】
抗体分子の再酸化に対する荷電デプスフィルタースループットの影響
スループット、すなわち、部分的に還元された抗体の再酸化に対してフィルターの１平方メートル当たりの荷電デプスフィルターと接触させられる水溶液の合計量の影響を評価した。抗体Ａを含む水溶液を上記のとおりにＭＩＬＬＩＳＴＡＫ＋  Ａ１ＨＣフィルターを使用して３５０Ｌ／ｍ２から８５０Ｌ／ｍ２のスループットで荷電深層ろ過に供し、ろ過後最大２４時間の部分的な抗体還元のレベルをプレピーク化学種のパーセンテージとしてｎｒＣＥ−ＳＤＳによって測定した（図７Ａ）。スループットを増加させると、ろ過後の最初の数時間の間、抗体分子の再酸化の反応速度が遅くなったが、ろ過後２４時間までに、試験したすべてのスループットがプレピーク化学種の同じ定常状態のパーセンテージを達成し、産業用途に対する本開示の方法の広い適用可能性を実証した。Ｃｕｎｏ  Ｚｅｔａ＋  ＳＰ９０荷電デプスフィルターを使用して１５０Ｌ／ｍ２から４５０Ｌ／ｍ２のスループットで行った同様の実験も、試験したすべてのスループットで増大された再酸化及び部分的な抗体還元のレベルの低下を達成した（図７Ｂ）。
【実施例６】
【００８０】
抗体分子の再酸化に対するＣＥＸクロマトグラフィーの影響
抗体Ａを含む水溶液をプロテインＡクロマトグラフィー、その後、ウイルス不活化ステップに供して、ｎＶＩＰを形成した。ｎＶＩＰを（ａ）ＣＥＸプールを形成するためのＦＲＡＣＴＯＧＥＬ  ＳＯ３樹脂（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した５０ｇ／ＬのＣＥＸクロマトグラフィーのみ、（ｂ）ＦＶＩＰを形成するためのＭＩＬＬＩＳＴＡＫ＋  Ａ１ＨＣデプスフィルターシステムを使用した荷電深層ろ過のみ、または（ｃ）（ａ）及び（ｂ）に記載されているとおりのＦＶＩＰを形成するための荷電深層ろ過に続くＣＥＸプールを形成するためのＣＥＸクロマトグラフィーに供した。ＣＥＸステップは、結合及び溶出方式で高分子量（ＨＭＷ）の化学種を分離するために設計した。部分的な抗体分子は、遊離チオールにより樹脂上で二量体になり、ＨＭＷ化学種として溶出することができる。ｎＶＩＰのＣＥＸクロマトグラフィーの前後（図８Ａ）及び荷電深層ろ過されたＦＶＩＰのＣＥＸクロマトグラフィーの直後（図８Ｂ）ならびに荷電深層ろ過されたＦＶＩＰのＣＥＸクロマトグラフィーの４時間後（図８Ｃ）に部分的な抗体還元のレベルをプレピーク化学種のパーセンテージとしてｎｒＣＥ−ＳＤＳによって測定した。ＨＭＷ化学種のパーセンテージも部分的な抗体分子の基準として求めた。ＣＥＸクロマトグラフィーの前後の荷電深層ろ過されていないｎＶＩＰ中の還元されたプレピーク化学種のパーセンテージは同等であった（図８Ａ）。ＦＶＩＰ中の還元された抗体のレベルは、荷電深層ろ過後のｎＶＩＰ中よりも３分の１を超えて低かった。荷電深層ろ過されたＦＶＩＰ中のプレピーク化学種のパーセンテージは、ＣＥＸクロマトグラフィーの直後に１．５分の１を超えてさらに低下し（図８Ｂ）、ＣＥＸクロマトグラフィーの０及び４時間後で同等であった（図８Ｂ及び８Ｃ）。さらに、荷電深層ろ過されたＦＶＩＰ中のＨＭＷ化学種のパーセンテージは、ＣＥＸクロマトグラフィー後に低下し、このことは部分的な抗体分子の減少を裏付けた。この結果は、荷電深層ろ過後のこの抗体種の再酸化がＣＥＸカラムにおいても続き、定常状態に達したことを示した。
【実施例７】
【００８１】
抗体分子の再酸化に対する荷電デプスフィルター構成成分の影響
荷電デプスフィルターを１００Ｌ／ｍ２の脱イオン化水で洗い流した後に、フィルターを取り除き、結合した金属を除去するために０．１ＭのＨ２ＳＯ４溶液、または対照として１００ｍＭのアセタート溶液、ｐＨ５．０を用いた２時間の再循環段階を続けた。抗体Ａを含む水溶液を、プロテインＡクロマトグラフィーに供し、その後、ウイルス不活化ステップに続く中和ステップを行って、ｎＶＩＰを形成した。２時間の再循環後、アセタート溶液及び硫酸溶液を、１部のｎＶＩＰに対して０．５、１、２及び４部のバッファーのさまざまな体積比でｎＶＩＰ試料に添加した。硫酸溶液は、荷電デプスフィルターから取り除かれた結合した金属及びその他の材料を含んでいた。例えば、硫酸溶液は、約１５００パーツ・パー・ビリオン（ｐｐｂ）のＣｕ２＋を含んでいた一方で、アセタート溶液は、５ｐｐｂ未満のＣｕ２＋に匹敵した。添加の０、２、４及び２４時間後の添加試料中の部分的な抗体還元のレベルをプレピーク化学種のパーセンテージとしてｎｒＣＥ−ＳＤＳによって測定した。予想どおり、未添加のｎＶＩＰは、抗体分子の再酸化を示さなかった。対照的に、硫酸溶液を添加したｎＶＩＰ中のプレピーク化学種のパーセンテージは著しく低かった（図９Ａ）。ｔ＝０において定常状態に達した１×以上の濃度で硫酸溶液を添加したｎＶＩＰ中のプレピーク化学種のパーセンテージは、ｎＶＩＰを荷電デプスフィルターから取り除いた構成成分と接触させると効率的に再酸化を増大させたことを示した。ｎＶＩＰへのアセタート溶液の添加は、抗体分子の再酸化を促進する際に硫酸溶液または抗体のデプスフィルターとの直接接触程、効率的ではなかった（図９Ｂ）。アセタート溶液を添加したｎＶＩＰ中のｔ＝０におけるプレピーク化学種のパーセンテージは、硫酸溶液添加ｎＶＩＰと比較して高く、２４時間の保持後にも依然として定常状態が達成されなかった。この結果は、荷電デプスフィルターから得られる構成成分が部分的に還元された抗体分子の再酸化を効率的に増大させることができることを実証した。
【実施例８】
【００８２】
還元された抗体分子を再酸化するためのプロセス
表１は、再酸化された抗体分子を含む水溶液を調製するためのプロセスＡからＮを示す。
【００８３】
【表１】
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【００８４】
まず、還元された抗原結合タンパク質分子を含む水溶液、例えば、ＨＣＣＦは、細胞培養液に空気を通気せずに得る。プロセスＡでは、例えば、水溶液を荷電深層ろ過ステップに供して、第１のろ液を形成し、第１のろ液をプロテインＡクロマトグラフィーステップに供して、第１の溶出液を形成する。第１の溶出液を荷電深層ろ過ステップに供して、第２のろ液を形成し、第２のろ液を低いｐＨのウイルス不活化ステップに供して、ウイルスが不活化された第２のろ液を形成する。ウイルスが不活化された第２のろ液を荷電深層ろ過ステップに供して、第３のろ液を形成する。第３のろ液を陽イオン交換クロマトグラフィーステップに供して、第２の溶出液を形成した後、荷電深層ろ過ステップに供して、第４のろ液を形成する。第４のろ液を１つ以上の付加的なクロマトグラフィーステップ、例えば、ＳＴＩＣ  ＰＡ、ＨＩＣ、及び／またはＭＭＣに供して、第３（もしくは第４もしくは第５）の溶出液を形成した後、荷電深層ろ過ステップに供して、第５のろ液を形成する。
【００８５】
別の例において、プロセスＢに関して、水溶液をプロテインＡクロマトグラフィーステップに供して、第１の溶出液を形成する。第１の溶出液を荷電深層ろ過ステップに供して、第１のろ液を形成して、第１のろ液を低いｐＨのウイルス不活化ステップに供して、ウイルスが不活化された第１のろ液を形成する。ウイルスが不活化された第１のろ液を荷電深層ろ過ステップに供して、第２のろ液を形成する。第２のろ液を陽イオン交換クロマトグラフィーステップに供して、第２の溶出液を形成した後、荷電深層ろ過ステップに供して、第３のろ液を形成する。第３のろ液を１つ以上の付加的なクロマトグラフィーステップ、例えば、ＳＴＩＣ  ＰＡ、ＨＩＣ、及び／またはＭＭＣに供して、第３（もしくは第４もしくは第５）の溶出液を形成した後、荷電深層ろ過ステップに供して、第４のろ液を形成する。
【００８６】
プロセスＡからＮのいずれかにおいて、プロセスは、再酸化された抗体分子を含む水溶液を実現するために、任意に付加的な後の精製段階、例えば、１つ以上の限外ろ過、ダイアフィルトレーション、及びウイルスろ過ステップをさらに含む。プロセスＡからＮのいずれかにおいて、このプロセスを使用して実現された再酸化された抗体分子を含む水溶液は、プロセスの開始前に観察された還元された抗原結合タンパク質分子のパーセンテージと比較して、還元された抗原結合タンパク質分子のパーセンテージが低い。
【００８７】
前述の実施例は、抗原結合タンパク質分子を含む水溶液の本開示による荷電デプスフィルターとの接触が、部分的に還元された抗原結合タンパク質分子の再酸化を効果的に増大させ、それにより抗体の構造的完全性ならびに関連する生物学的及び治療的機能を取り戻すことを示している。
【００８８】
本明細書中で挙げたすべての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物または特許出願のそれぞれが参照によって組み込まれることを明確に個別に示されたかのように参照によって本明細書に組み込んだものとする。前述の発明を説明及び理解を明確にするための例の目的でいくらか詳細に記載してきたが、本開示の教示に照らして添付の特許請求の趣旨または範囲から逸脱することなくそれらにある特定の変更及び改変を行えることは当業者には容易にわかるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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