(57)【要約】本開示は、前立腺がんのげっ歯類モデルを提供する。本明細書で開示されるげっ歯類は、マウスプロバシン遺伝子の５’及び３’調節領域の制御下で発がん性タンパク質（例えば、ＳＶ４０腫瘍抗原）の前立腺特異的発現をもたらす導入遺伝子を含む。当該げっ歯類は、ヒト前立腺がんの発生に似ている進行型の前立腺腫瘍を発生する。自らのゲノム内に導入遺伝子を含むげっ歯類であって、前記導入遺伝子が、（ａ）マウスプロバシン遺伝子の５’調節領域、（ｂ）発がん性タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸、及び、（ｃ）前記マウスプロバシン遺伝子の３’調節領域、を含み、前記５’調節領域、前記核酸、及び前記３’調節領域が互いに作用可能に連結している、げっ歯類。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
自らのゲノム内に導入遺伝子を含むげっ歯類であって、前記導入遺伝子が、
（ａ）マウスプロバシン遺伝子の５’調節領域、
（ｂ）発がん性タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸、及び、
（ｃ）前記マウスプロバシン遺伝子の３’調節領域、を含み、
前記５’調節領域、前記核酸、及び前記３’調節領域が互いに作用可能に連結している、
げっ歯類。
【請求項２】
前記５’調節領域が、前記マウスプロバシン遺伝子の転写開始部位の少なくとも５ｋｂ上流の核酸配列を含む、請求項１に記載のげっ歯類
【請求項３】
前記５’調節領域が、前記マウスプロバシン遺伝子の転写開始部位の少なくとも１０ｋｂ上流の核酸配列を含む、請求項１に記載のげっ歯類。
【請求項４】
前記５’調節領域が、前記マウスプロバシン遺伝子の転写開始部位の少なくとも２５ｋｂ上流の核酸配列を含む、請求項１に記載のげっ歯類。
【請求項５】
前記５’調節領域が、前記マウスプロバシン遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、請求項１に記載のげっ歯類。
【請求項６】
前記５’調節領域が配列番号６に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のげっ歯類。
【請求項７】
前記３’調節領域が、前記マウスプロバシン遺伝子の転写終結部位の少なくとも５ｋｂ下流の核酸配列を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載のげっ歯類。
【請求項８】
前記３’調節領域が、前記マウスプロバシン遺伝子の転写終結部位の少なくとも２５ｋｂ下流の核酸配列を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載のげっ歯類。
【請求項９】
前記３’調節領域が、前記マウスプロバシン遺伝子の転写終結部位の少なくとも５０ｋｂ下流の核酸配列を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載のげっ歯類。
【請求項１０】
前記３’調節領域が、前記マウスプロバシン遺伝子の３’非翻訳領域を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載のげっ歯類。
【請求項１１】
前記３’調節領域が配列番号７に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載のげっ歯類。
【請求項１２】
前記発がん性タンパク質がＳＶ４０腫瘍抗原またはＭｙｃを含む、請求項１から１１のいずれか１項に記載のげっ歯類。
【請求項１３】
前記ＳＶ４０腫瘍抗原が、ＳＶ４０ラージＴ抗原またはその機能的に活性な断片を含む、請求項１２に記載のげっ歯類。
【請求項１４】
前記ＳＶ４０腫瘍抗原が、ＳＶ４０スモールｔ抗原またはその機能的に活性な断片を含む、請求項１２に記載のげっ歯類。
【請求項１５】
前記第１のヌクレオチド配列が、ＳＶ４０ラージＴ抗原またはその機能的に活性な断片と、さらにＳＶ４０スモールｔ抗原またはその機能的に活性な断片との両方をコードする、請求項１から１１のいずれか１項に記載のげっ歯類。
【請求項１６】
前記第１のヌクレオチド配列が配列番号１に記載の配列を含む、請求項１から１１のいずれか１項に記載のげっ歯類。
【請求項１７】
前記核酸が、レポーターをコードする第２のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１から１６のいずれか１項に記載のげっ歯類。
【請求項１８】
前記レポーターがルシフェラーゼである、請求項１７に記載のげっ歯類。
【請求項１９】
前記第１のヌクレオチド配列が、２Ａペプチドをコードする第３のヌクレオチド配列を介してインフレームで前記第２のヌクレオチドに連結している、請求項１７または１８に記載のげっ歯類。
【請求項２０】
前記２Ａペプチドが、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＦ２Ａペプチド、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＥ２Ａペプチド、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＰ２Ａペプチド、及び配列番号１３のアミノ酸配列を含むＴ２Ａペプチドからなる群から選択される、請求項１９に記載のげっ歯類。
【請求項２１】
前記２Ａペプチドが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＴ２Ａペプチドである、請求項１９に記載のげっ歯類。
【請求項２２】
前記核酸が、前記げっ歯類細胞中で活性なプロモーターに作用可能に連結している選択マーカーをコードする第４のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１から２１のいずれか１項に記載のげっ歯類。
【請求項２３】
前記導入遺伝子が、前記ゲノム内の異所的な遺伝子座で統合される、請求項１から２２のいずれか１項に記載のげっ歯類。
【請求項２４】
少なくとも１〜１０個の前記導入遺伝子のコピーが、前記異所的な遺伝子座で直列に統合される、請求項２３に記載のげっ歯類。
【請求項２５】
前記げっ歯類がマウスまたはラットである、請求項１から２４のいずれか１項に記載のげっ歯類。
【請求項２６】
前記げっ歯類がマウスである、請求項１から２４に記載のげっ歯類。
【請求項２７】
前記マウスが、Ｃ５７ＢＬ／６系統、１２９系統、またはこれらの交雑系からなる群から選択される系統のものである、請求項２６に記載のげっ歯類。
【請求項２８】
前記マウスがＦ１Ｈ４系統のものである、請求項２７に記載のげっ歯類。
【請求項２９】
前記発がん性タンパク質が前立腺において特異的に発現される、請求項１から２８のいずれか１項に記載のげっ歯類。
【請求項３０】
前記発がん性タンパク質が、前立腺の背側葉、前葉、または背側葉及び前葉において発現される、請求項２９に記載のげっ歯類。
【請求項３１】
前記げっ歯類が、以下からなる群から選択される少なくとも１種の表現型により特徴づけられる、請求項１から３０のいずれか１項に記載のげっ歯類：（ｉ）前記げっ歯類が、少なくとも生後約２ヵ月以降に、前立腺組織中に前立腺上皮内新生物（ＰＩＮ）を呈し始める；（ｉｉ）前記げっ歯類が、前立腺の背側葉、または背側葉及び前葉においてＰＩＮを呈する；（ｉｉｉ）前記げっ歯類が、実質的に前立腺の背側葉、前葉、または背側葉及び前葉の両方においてＰＩＮを呈し、実質的に前立腺の腹葉においてＰＩＮを呈しない；（ｉｖ）前記げっ歯類が、少なくとも生後約６ヵ月以降に、腺がんを呈し始める；（ｖ）前記げっ歯類が、前立腺の背側葉、前葉、または背側葉及び前葉の両方において腺がんを呈する；（ｖｉ）前記げっ歯類が、実質的に前立腺の背側葉、前葉、または背側葉及び前葉の両方において腺がんを呈し、実質的に前立腺の腹葉においてＰＩＮを呈しない。
【請求項３２】
前記げっ歯類が、生後約４〜６ヵ月でＰＩＮを呈し始める、請求項３１に記載のげっ歯類。
【請求項３３】
前記げっ歯類が、生後約７〜９ヵ月で腺がんを呈し始める、請求項３１に記載のげっ歯類。
【請求項３４】
前記腺がんが神経内分泌がんではない、請求項３１または３３に記載のげっ歯類。
【請求項３５】
前立腺において腺がんを呈し、前記腺がんが神経内分泌がんではない、請求項１に記載のげっ歯類。
【請求項３６】
前記げっ歯類が、生後約４〜６ヵ月で前立腺の背側葉及び／または前葉においてＰＩＮを呈し始め、生後約７〜９ヵ月で前立腺の背側葉及び／または前葉において腺がんを呈し始める、請求項３１に記載のげっ歯類。
【請求項３７】
請求項１から３６のいずれか１項に記載のげっ歯類の、単離された細胞または組織。
【請求項３８】
ゲノム内に導入遺伝子を含むげっ歯類胚幹（ＥＳ）細胞であって、前記導入遺伝子が、
（ａ）マウスプロバシン遺伝子の５’調節領域、
（ｂ）発がん性タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸、及び、
（ｃ）マウスプロバシン遺伝子の３’調節領域、を含み、
前記５’調節領域、前記核酸、及び前記３’調節領域が互いに作用可能に連結している、
げっ歯類。
【請求項３９】
マウスＥＳ細胞またはラットＥＳ細胞である、請求項３８に記載のげっ歯類ＥＳ細胞。
【請求項４０】
前記発がん性タンパク質がＳＶ４０腫瘍抗原またはＭｙｃを含む、請求項３８に記載のげっ歯類ＥＳ細胞。
【請求項４１】
前立腺がんのげっ歯類モデルを作製する方法であって、
（ａ）げっ歯類ＥＳ細胞に導入遺伝子を導入するステップであって、
（ｉ）マウスプロバシン遺伝子の５’調節領域、
（ｉｉ）発がん性タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸、及び、
（ｉｉｉ）マウスプロバシン遺伝子の３’調節領域、を含み、
前記５’調節領域、前記核酸、及び前記３’調節領域が作用可能に連結している、導入するステップと、
（ｂ）ゲノム内に導入遺伝子を含む修飾げっ歯類ＥＳ細胞を選択するステップと、
（ｃ）前記修飾げっ歯類ＥＳ細胞を、前記げっ歯類の桑実期以前の宿主胚に導入するステップと、
（ｄ）前記宿主胚を代理母に移植するステップと、
（ｅ）前記前立腺がんのげっ歯類モデルを得るステップと、を含む、方法。
【請求項４２】
前記導入遺伝子が異所的な遺伝子座に統合される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記げっ歯類がマウスまたはラットである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記発がん性タンパク質がＳＶ４０腫瘍抗原またはＭｙｃを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記発がん性タンパク質が、前記げっ歯類の前立腺において特異的に発現される、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年９月２日に出願された米国仮出願第６２／２１３，３８９号の優先権の利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、前立腺がんのげっ歯類モデルに関する。本明細書で開示されるげっ歯類は、マウスプロバシン遺伝子の５’及び３’調節領域に作用可能に連結したＳＶ４０腫瘍抗原コード配列を含む導入遺伝子を含む。本明細書で開示されるげっ歯類は、この導入遺伝子の前立腺特異的発現を示し、ヒト前立腺がんの発生に似ている進行性形態の前立腺腫瘍を発生する。
【０００３】
配列表の参照による組み込み
２０１６年８月２４日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介し米国特許商標庁に提出された、32350_10161US01_SequenceListing.txtという名称の４４０ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表が、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
ヒト疾患の動物モデルは、疾患の根底にある病理学的機序を理解するための、そして有効な治療法を開発するための重要なツールである。前立腺がんは、米国において今年だけでも約３０，０００人の男性の命を奪い、新たに２００，０００人超の男性が当該疾患と診断される見込みとなっている。当技術分野では前立腺がんのマウスモデルが説明されているが、それぞれのモデルには制約がある。例えば、ラットプロバシンプロモーターの制御下でＳＶ４０腫瘍抗原を発現するトランスジェニックマウスは、急速な疾患進行を示したが、典型的には生後６〜１２週で前立腺上皮内新生物を呈し、生後１８〜２２週で浸潤性がんを呈した。このような結果は、ヒトにおける特徴的にゆっくりとしたがんの発生とは異なる。さらに、マウスモデルの一部では、腹葉において導入遺伝子の顕著な発現が検出されたが、腹葉は、ヒト前立腺がんが典型的に生じる周辺帯に類似しない部分である。加えて、マウスモデルの一部における神経内分泌がんの蔓延も、これらのモデルと神経内分泌がんを有する患者の小規模な亜集団との関連性を制約するものである。
【０００５】
そのため、ヒト前立腺がんの病理学的特徴を忠実に再現する、改良された前立腺がんの動物モデルが必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、新規の前立腺がんのげっ歯類モデルを提供する。本明細書で開示されるげっ歯類は、マウスプロバシン遺伝子の５’及び３’調節領域を利用して、ＳＶ４０腫瘍抗原またはＭｙｃなどの発がん性タンパク質の前立腺特異的発現に向ける。当該げっ歯類は、ヒト前立腺がんの発生及び進行を再現する進行型の前立腺腫瘍を発生する。
【０００７】
一態様では、本開示は、ゲノム内に導入遺伝子を含むげっ歯類であって、導入遺伝子が、５’から３’にかけて、マウスプロバシン遺伝子の５’調節領域、ＳＶ４０腫瘍抗原またはＭｙｃなどの発がん性タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸、及びマウスプロバシン遺伝子の３’調節領域を含む、げっ歯類を提供する。５’調節領域、ＳＶ４０腫瘍抗原などの発がん性タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸、及び３’調節領域は、互いに作用可能に連結して、げっ歯類におけるＳＶ４０腫瘍抗原またはＭｙｃなどの発がん性タンパク質の前立腺特異的発現に影響を及ぼす。
【０００８】
一部の実施形態では、導入遺伝子内の５’調節領域は、マウスプロバシン遺伝子の転写開始部位の上流にあるマウスプロバシン遺伝子座からのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、導入遺伝子内の５’調節領域は、マウスプロバシン遺伝子の転写開始部位のすぐ上流にあるマウスプロバシン遺伝子座からのヌクレオチド配列を含む。あるいくつかの実施形態では、導入遺伝子内の５’調節領域は、マウスプロバシン遺伝子の転写開始部位の少なくとも５ｋｂ、１０ｋｂ、または２５ｋｂ上流（例えば、すぐ上流）にある配列を含む。一部の実施形態では、５’調節領域は、マウスプロバシン遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。特定の実施形態では、５’調節領域は、配列番号６に記載のヌクレオチド配列を含む。
【０００９】
一部の実施形態では、導入遺伝子内の３’調節領域は、マウスプロバシン遺伝子の転写終結部位の下流にあるマウスプロバシン遺伝子座からのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、導入遺伝子内の３’調節領域は、マウスプロバシン遺伝子の転写終結部位のすぐ下流にあるマウスプロバシン遺伝子座からのヌクレオチド配列を含む。あるいくつかの実施形態では、３’調節領域は、マウスプロバシン遺伝子の転写終結部位の少なくとも５ｋｂ、２５ｋｂ、または５０ｋｂ下流（例えば、すぐ下流）にある配列を含む。一部の実施形態では、３’調節領域は、マウスプロバシン遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。特定の実施形態では、３’調節領域は、配列番号７に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
一部の実施形態では、導入遺伝子内のＳＶ４０腫瘍抗原をコードする核酸配列は、ＳＶ４０ラージＴ抗原またはその機能的に活性な断片をコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子内のＳＶ４０腫瘍抗原をコードする核酸配列は、ＳＶ４０スモールｔ抗原またはその機能的に活性な断片をコードする。他の実施形態では、ＳＶ４０腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列は、ＳＶ４０ラージＴ抗原またはその機能的に活性な断片をコードし、さらにＳＶ４０スモールｔ抗原またはその機能的に活性な断片もコードする。特定の実施形態では、ＳＶ４０腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に記載の配列を含む。
【００１１】
一部の実施形態では、導入遺伝子はレポーター遺伝子をさらに含む。特定の実施形態では、当該レポーターはルシフェラーゼである。詳細な実施形態では、当該レポーター遺伝子は、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００１２】
当該レポーター遺伝子は、発がん性タンパク質（例えば、ＳＶ４０腫瘍抗原またはＭｙｃ）コード配列に対し、当該レポーター遺伝子が発がん性タンパク質（例えば、ＳＶ４０腫瘍抗原またはＭｙｃ）の発現を反映するように、作用可能に連結している。一部の実施形態では、導入遺伝子内の発がん性タンパク質（例えば、ＳＶ４０腫瘍抗原）コード配列は、２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列を介してインフレームでレポーター遺伝子に連結している。特定の実施形態では、当該２Ａペプチドは、Ｆ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、及びＴ２Ａペプチドからなる群から選択される。詳細な実施形態では、当該２Ａペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＴ２Ａペプチドである。
【００１３】
一部の実施形態では、当該導入遺伝子は、追加のエレメント、例えば、当該導入遺伝子を有するげっ歯類細胞の選択及び同定を可能にする、選択可能なマーカー遺伝子またはカセットを含むことができる。
【００１４】
一部の実施形態では、当該導入遺伝子は、げっ歯類遺伝子の異所的な遺伝子座に統合される。あるいくつかの実施形態では、当該導入遺伝子の少なくとも１〜１０のコピー（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のコピー）がゲノム内の１つ以上の異所的な遺伝子座で統合される。特定の実施形態では、当該導入遺伝子の複数のコピー（２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のコピー）は、ゲノム内の１つの異所的な遺伝子座で直列に統合される。詳細な実施形態では、当該導入遺伝子の５コピーは、ゲノム内の１つの異所的な遺伝子座で直列に統合される。他の実施形態では、当該導入遺伝子は、標的遺伝子座、例えば内在性プロバシン遺伝子座に統合される。
【００１５】
一実施形態では、げっ歯類はマウスである。一部の実施形態では、本明細書で提供されるげっ歯類は、マウスまたはラットである。一部の実施形態では、当該げっ歯類は、Ｃ５７ＢＬ系統、１２９系統、またはこれらの交雑種から選択される系統のマウスである。特定の実施形態では、当該げっ歯類は、Ｃ５７ＢＬ／６及び１２９の交雑種であるＦ１Ｈ４系統のマウスである。
【００１６】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるげっ歯類は、本明細書に記載のヒト前立腺がんの発現及び病理学的特徴、例えば、レポーター（例えば、ルシフェラーゼ）及び発がん性タンパク質（例えば、ＳＶ４０  Ｔ抗原またはＭｙｃ）をコードする導入遺伝子が発現される部分、前立腺上皮内新生物（ＰＩＮ）の発生にかかる時間期間、ＰＩＮが発生する前立腺内の部分、前立腺腺がんの発生にかかる時間期間、腺がんが発生する前立腺内の部分、及び発生した腺がんが神経内分泌がんではないという特徴、を含めた発現及び病理学的特徴のいずれかの組み合わせを示す。特定の実施形態では、当該げっ歯類は、生後約４〜６ヵ月で前立腺組織中に前立腺上皮内新生物を呈し始める。一部の実施形態では、当該げっ歯類は、生後約７〜９ヵ月で腺がんを呈し始める。あるいくつかの実施形態では、当該げっ歯類において発生する腺がんは、神経内分泌がんではない。
【００１７】
別の態様では、本開示は、本明細書で提供されるげっ歯類から単離された細胞または組織を提供する。細胞が単離され得るげっ歯類組織としては、例えば、胸腺、膵臓、胃腸、肝臓、肺、膀胱、及び前立腺を挙げることができる。
【００１８】
なお別の態様では、本開示は、ゲノム内に導入遺伝子を含むげっ歯類胚幹（ＥＳ）細胞であって、当該導入遺伝子が、５’から３’にかけて、マウスプロバシン遺伝子の５’調節領域、ＳＶ４０腫瘍抗原またはＭｙｃなどの発がん性タンパク質をコードする核酸、及びマウスプロバシン遺伝子の３’調節領域を含み、当該５’調節領域、ＳＶ４０腫瘍抗原またはＭｙｃなどの発がん性タンパク質をコードする当該核酸、及び当該３’調節領域が、互いに作用可能に連結している、げっ歯類胚幹（ＥＳ）細胞を提供する。一部の実施形態では、当該げっ歯類ＥＳ細胞は、マウスＥＳ細胞またはラットＥＳ細胞である。
【００１９】
さらなる態様では、本開示は前立腺がんのげっ歯類モデルを作製する方法であって、げっ歯類ＥＳ細胞のゲノム内に、５’から３’にかけて、マウスプロバシン遺伝子の５’調節領域、ＳＶ４０腫瘍抗原またはＭｙｃなどの発がん性タンパク質をコードする核酸、及びマウスプロバシン遺伝子の３’調節領域を含む導入遺伝子を導入するステップであって、当該５’調節領域、ＳＶ４０腫瘍抗原またはＭｙｃなどの発がん性タンパク質をコードする当該核酸、及び当該３’調節領域が、互いに作用可能に連結している、導入するステップと、ゲノム内に当該導入遺伝子を含む修飾げっ歯類ＥＳ細胞を選択するステップと、当該修飾げっ歯類ＥＳ細胞を、桑実期以前の当該げっ歯類の宿主胚に導入するステップと、当該宿主胚を代理母に移植するステップと、前立腺がんのげっ歯類モデルを得るステップと、を含む方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
本出願のファイルには、カラーで制作された図面が少なくとも１点含まれている。カラー図面を含む本特許のコピーは、要請時及び必要料金の支払時に特許商標庁から提供されることになる。
【図１】図１は、前立腺がんのマウスモデルの作製に使用される導入遺伝子及びその構成成分の例を示す図である。導入遺伝子は、５’から３’にかけて、マウスプロバシン遺伝子から約５１ｋｂの５’調節領域、ＳＶ４０腫瘍抗原をコードする核酸配列、Ｔ２Ａペプチドをコードする核酸配列、ルシフェラーゼレポーターをコードする核酸配列、ネオマイシン選択カセット、及びマウスプロバシン遺伝子から約１０７ｋｂの３’調節領域を含む。
【図２】図２は、Ｌｕｃｉ−ＴＲＡＭＰ  ＥＳクローンＡ−Ｃ１０（５ｘ）の同定及びＥＳクローン由来マウスにおける導入遺伝子の前立腺特異的発現を示す図である。遺伝子導入ｍＲＮＡを、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて、Ｔ抗原及びルシフェラーゼ導入遺伝子に対し設計したアッセイで評価した。生後８週のマウスからの組織を採取し、直ちにＲＮＡＬａｔｅｒ試薬に浸した。全ＲＮＡをＲｅｇｅｎｅｒｏｎ  ＤＮＡ  Ｃｏｒｅにより抽出し、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社の指示に軽微な変更を行ったものに従ってｑＰＣＲを実施した。野生型（交雑種非トランスジェニック対照マウス）、Ａ−Ｂ１（導入遺伝子の発現が低い／ないマウス）、Ａ−Ｂ８（中程度、ただし異所性発現のマウス）、Ａ−Ｃ１０（前立腺背側葉（ＤＬＰ）及び前立腺前葉（ＡＰ）及び精嚢（ＳＶ）のみに発現される約５コピーの導入遺伝子を有するＬｕｃｉ−ＴＲＡＭＰマウス）。グラフ内でバーにより表される組織の順序は、左から右へ、ＤＬＰ、ＡＰ  ＆  ＳＶ、膀胱、肝臓、肺、腎臓、心臓、胸腺、及び唾液腺である。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｃは、Ｌｕｃｉ−ＴＲＡＭＰマウスの一生を通じたいくつかの月齢における縦断的インビボ生物発光イメージングを示す図である。図３Ａにおいて、Ｆ１Ｈ４野生型対照マウスは、加齢に伴ういかなる生物発光も示さなかったが、ｌｕｃｉ−ＴＲＡＭＰマウスは、加齢に伴い腹部に生物発光の増加を示した。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｃは、Ｌｕｃｉ−ＴＲＡＭＰマウスの一生を通じたいくつかの月齢における縦断的インビボ生物発光イメージングを示す図である。図３Ｂは、この腹部生物発光の代表例（マウスＩＤ番号１２５５７４３）であり、生後１１ヵ月におけるルシフェラーゼ遺伝子の双方向の泌尿生殖器発現が非常に明らかである。野生型Ｆ１Ｈ４対照は生物発光を示さなかったが、第２の対照マウス（Ｒ２６−Ｌ−Ｌｕｃ２）は、ルシフェラーゼ遺伝子をユビキタスなＲＯＳＡ２６  （Ｒ２６）プロモーターから発現させたため、全臓器及び全月齢で生物発光を示した。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃは、Ｌｕｃｉ−ＴＲＡＭＰマウスの一生を通じたいくつかの月齢における縦断的インビボ生物発光イメージングを示す図である。図３Ｃは、肺、ならびに場合によっては肝臓及び骨髄（ＢＭ）、におけるルシフェラーゼ遺伝子の検出を示している。指示組織を用いてｑＰＣＲアッセイ（図２で記載したものと同じ）を実施し、結果から、Ｌｕｃｉ−ＴＲＡＭＰ肺で検出され、いずれの対照系統の肺と比較しても顕著であるＴ抗原導入遺伝子シグナルの存在が示された。Ｌｕｃｉ−ＴＲＡＭＰ  ＢＭ及び肝臓からのシグナルは、当該肺より低かったが、対照組織と比較したときに統計的に有意であった。ルシフェラーゼｑＰＣＲの結果は、Ｌｕｃｉ−ＴＲＡＭＰ肺から、Ｆ１Ｈ４肺と比較して統計的に有意なシグナルが示された。ＢＭ及び肝臓のシグナルは野生型の組織よりも高かったが、統計的な有意性には至らなかった。Ｒ２６−Ｌ−Ｌｕｃ２マウスからの結果はＬｕｃｉ−ＴＲＡＭＰマウスからのシグナルをしのぐものであり、グラフからは除いた。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｂは、Ｌｕｃｉ−ＴＲＡＭＰマウス及び野生型マウスの背側外側葉のパラフィン切片における代表的なヘマトキシリン／エオシン染色画像である。図４Ａは、Ｌｕｃｉ−ＴＲＡＭＰマウスの前立腺背側葉からの前立腺上皮内新生物（ＰＩＮグレードは各サブパネルのラベルに収載されている）を示している。生後８ヵ月までに、過形成が腺がんに進行したが、ただし基底辺縁部はインタクトであった。生後１１ヵ月までに、ますます前立腺の間質が間質細胞で浸潤された（おそらくは免疫性質のもの）。これとは対照的に、野生型Ｆ１Ｈ４前立腺は、生後１１〜１６ヵ月でいくらか年齢に関連した過形成を示したが、Ｌｕｃｉ−ＴＲＡＭＰ前立腺のポイントには達しなかった。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｂは、Ｌｕｃｉ−ＴＲＡＭＰマウス及び野生型マウスの背側外側葉のパラフィン切片における代表的なヘマトキシリン／エオシン染色画像である。図４Ｂは、Ｌｕｃｉ−Ｔｒａｍｐ前葉における高悪性度ＰＩＮから腺がんへの同様な進行を、野生型対照マウスにおける同様な正常な前立腺上皮と比較して示している。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｂは、Ｌｕｃｉ−ＴＲＡＭＰマウスにおいて発生した前立腺腫瘍が上皮腫瘍であり、神経内分泌腫瘍ではないことを実証している。図５Ａは、抗Ｅ−カドヘリン抗体を用いた前立腺組織サンプルの免疫染色を示している。黒褐色の沈着は、抗体が、管腔上皮細胞が発現するタンパク質に対し特異的に反応していた場所を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｂは、Ｌｕｃｉ−ＴＲＡＭＰマウスにおいて発生した前立腺腫瘍が上皮腫瘍であり、神経内分泌腫瘍ではないことを実証している。図５Ｂは、抗−Ｅ−シナプトフィジン抗体を用いた前立腺組織サンプルの免疫染色を示している。膵臓内の褐色の反応産生物は、本来神経内分泌系である島細胞を示している。これとは対照的に、Ｆ１Ｈ４野生型前立腺及びＬｕｃｉ−ＴＲＡＭＰ前立腺については、いずれの葉（ＤＬＰまたはＡＰ）も特に反応産生物を示さなかった。標準的手順に従って免疫組織化学プロトコールを実施し、パラフィン切片を切り、脱パラフィンし、指示抗体と反応させた。ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合した２次抗体を、１次抗体の宿主に対し、特定の相互作用を増幅するために使用した。免疫複合体を視覚化するためにＤＡＢ（図５Ｂ）を使用した。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
配列番号１〜１７  を以下に概括する。配列は、本開示の最後に記載する。
１  ＳＶ−４０  Ｔ抗原コード配列（ラージＴ及びスモールｔ抗原をコードする）
２  Ｔ２Ａコード配列
３  ルシフェラーゼコード配列
４  ＳＶ−４０後期ポリ（Ａ）配列
５  ネオマイシン選択カセット
６  ５１ｋｂのマウスプロバシン遺伝子の５’調節領域配列
７  １０７ｋｂのマウスプロバシン遺伝子の３’調節領域配列
８  ＳＶ４０ラージＴ抗原のアミノ酸配列(GenBank:AAB59924.1)
９  ＳＶ４０スモールｔ抗原のアミノ酸配列(GenBank:AAB59925.1)
１０  ペプチドＦ２Ａのアミノ酸配列
１１  ペプチドＥ２Ａのアミノ酸配列
１２  ペプチドＰ２Ａのアミノ酸配列
１３  ペプチドＴ２Ａのアミノ酸配列
１４  ＬＸＣＸＥモチーフ
１５  ＳＶ４０タグ−Ｔ２Ａ−ルシフェラーゼ導入遺伝子の完全なヌクレオチド配列
１６  マウスプロバシン遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含めた５’配列
１７  マウスプロバシン遺伝子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含めた３’配列
【００２２】
（詳細な説明）
本開示は、新規の前立腺がんのげっ歯類モデルを提供する。本明細書で開示されるげっ歯類は、マウスプロバシン遺伝子の５’及び３’調節領域に作用可能に連結した、がん遺伝子または発がん性タンパク質（ＳＶ４０腫瘍抗原またはＭｙｃなど）をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含有する。当該げっ歯類は、この導入遺伝子の前立腺特異的発現を示し、ヒト前立腺がんの発生に似た進行性形態の前立腺腫瘍を発生する。
【００２３】
ラットプロバシンプロモーターが駆動するＳＶ４０腫瘍抗原の発現に基づいた前立腺がんのトランスジェニックマウスモデルは、当技術分野で説明されている。しかし、これらのトランスジェニックマウスモデルには複数の制約がある。例えば、トランスジェニックマウスは、概して疾患進行が急速であり、典型的には生後６〜１２週で前立腺上皮内新生物（ＰＩＮ）を呈し、生後１８〜２２週で浸潤性がんを呈する。この結果は、ヒトにおける特徴的にゆっくりとしたがんの発生とは異なる。さらに、マウスモデルの一部において、腹葉に導入遺伝子の顕著な発現が検出されたが、この部分は、ヒト前立腺がんが典型的に生じる周辺帯に類似していない。加えて、マウスモデルの一部における神経内分泌がんの蔓延も、これらのモデルと神経内分泌がんを有する患者の小規模な亜集団との関連性を制約するものである。
【００２４】
本明細書で開示されるげっ歯類は、ヒト前立腺がんにおいて生じる病理学的現象を、既存のマウスモデルよりも良好に再現する。例えば、本明細書で提供されるげっ歯類では、当該導入遺伝子の優勢な発現が前立腺の背側葉に検出されるが、背側葉は、ヒト前立腺腺がんが典型的に生じるヒト前立腺周辺帯に類似する部分である。さらに、本明細書で提供されるげっ歯類は、進行型の前立腺腫瘍を発生するが、これは、当技術分野で報告されているトランスジェニックマウスよりも疾患進行の速度がはるかに遅く、かつ寿命が長いヒト前立腺腫瘍における、過形成から高悪性度前立腺上皮内新生物（すなわちＨＧＰＩＮ）、浸潤性腺がんに至るまでの様々な段階に似ている。加えて、本明細書で開示されるげっ歯類において発生する腺がんは、本質的に神経内分泌系ではない。
【００２５】
いかなる特定の理論にも拘泥する意図はないが、ＳＶ４０腫瘍抗原を発現させるために当該導入遺伝子に含まれるマウスプロバシン遺伝子の５’調節領域及び／または３’調節領域は、本開示のげっ歯類モデルについて観察された利点に関する重要な因子であり得ると考えられる。
【００２６】
導入遺伝子
「導入遺伝子」という用語には、受容生物の染色体または染色体外ＤＮＡへの導入のために遺伝子的に操作された核酸分子が含まれる。また、「導入遺伝子」には、生物の染色体または染色体外ＤＮＡに統合された外因性核酸も含まれる。
【００２７】
本明細書で開示される、トランスジェニックげっ歯類の生成を目的とした導入遺伝子は、５’から３’にかけて、マウスプロバシン遺伝子の５’調節領域、ＳＶ４０腫瘍抗原をコードする核酸配列、及びマウスプロバシン遺伝子の３’調節領域を含み、これらは互いに作用可能に連結して、げっ歯類におけるＳＶ４０腫瘍抗原の前立腺特異的発現に影響を及ぼす。
【００２８】
一部の実施形態では、当該導入遺伝子は、中でもレポーター遺伝子及び選択可能なマーカー遺伝子などの、追加的なエレメントを含む。
【００２９】
「作用可能に連結」という用語には、機能的関係にある核酸エレメントの連結が含まれる。核酸配列は、他の核酸配列との機能的関係に置かれた場合に「作用可能に連結」している。例えば、プロモーターもしくはエンハンサー、またはプロモーターもしくはエンハンサーを含有する５’調節領域は、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作用可能に連結している。本開示の文脈において、マウスプロバシン遺伝子の５’調節領域及びマウスプロバシン遺伝子の３’調節領域は、ＳＶ４０腫瘍抗原をコードする核酸配列に作用可能に連結して、ＳＶ４０腫瘍抗原をコードする核酸配列による転写の開始及び終結に影響を及ぼす。
【００３０】
本明細書で開示される導入遺伝子は、公知の方法を用いて作製することができる。例えば、導入遺伝子は、細菌相同組み換え及びＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）の技術を用いて組み立てることができる（例えば、Ｕ．Ｓ．  ６，５８６，２５１及びValenzuelaら、High-throughput engineering of the mouse genome coupledwith high-resolution expression analysis, 2003, Nature Biotech.21(6):652-659を参照）。本明細書で提供される導入遺伝子の一例は、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００３１】
前立腺がんのげっ歯類モデルの生成における使用に好適な様々な導入遺伝子のエレメントを、以下でさらに詳細に説明する。
【００３２】
マウスプロバシン遺伝子の５’及び３’調節領域
プロバシンは、元々はラットから単離された前立腺特異的遺伝子である。ラットプロバシンのプロモーター（ｒＰＢ）遺伝子は、トランスジェニックマウスにおいて異種遺伝子を前立腺に対し特異的に標的化できることが示されている（Greenbergら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3439-3443, 1995;Kasperら、Lab. Invest. 78 (3): i-xv, 1998; Hillら、Cancer Res.65(22): 10243-10254, 2005)。これらの研究では、利用されるプロモーター領域が、ラットプロバシン遺伝子の５’領域からの比較的短いセグメントに限定されている（Greenbergら (1995)では454bp断片(-426+28)、Kasper ら (1998)では11.5kb断片、及びHill ら (2005)では458bp断片(-458))。
【００３３】
本開示によれば、マウスプロバシン遺伝子からの５’調節領域及び３’調節領域は、ＳＶ４０腫瘍抗原の前立腺特異的発現に向けるための導入遺伝子に含まれる。
【００３４】
「前立腺特異的発現」とは、前立腺における発現が非前立腺の組織及び臓器における発現より実質的に高い、または非前立腺の組織及び臓器における発現が前立腺における発現と比較してわずかであることを意味する。「実質的に高い」とは、前立腺における発現が、他の組織及び臓器における発現よりも、少なくとも５０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％高いことを意味する。「わずか（ｉｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）」とは、このような他の組織の各々における発現が、前立腺における発現の２０％、１０％、５％、または１％以下であることを意味する。
【００３５】
本明細書における導入遺伝子で使用するための５’及び３’調節領域は、マウスプロバシン遺伝子の５’上流領域及び３’下流領域に見いだされる調節エレメントを含み、ＳＶ４０腫瘍抗原コード配列などの異種遺伝子の前立腺特異的発現を付与するのに十分である。
【００３６】
「調節エレメント」という用語には転写調節配列が含まれ、これには５’転写調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、及びサプレッサーエレメント）及び３’転写調節配列（例えば、転写終結配列）が含まれる。また、「調節エレメント」という用語には、転写の効率や転写の安定性、さらに翻訳の開始にも影響を及ぼし得る、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）及び３’ＵＴＲにおける調節配列も含まれる。
【００３７】
本開示によれば、導入遺伝子内のＳＶ４０腫瘍抗原コード配列に隣接する５’調節配列は、マウスプロバシン遺伝子の翻訳開始点（すなわち、開始コドンＡＴＧ）の上流にあるマウスプロバシン遺伝子座からのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、導入遺伝子内のＳＶ４０腫瘍抗原コード配列に隣接する５’調節配列は、マウスプロバシン遺伝子の転写開始点（すなわち、転写開始部位）のすぐ上流にあるマウスプロバシン遺伝子座からのヌクレオチド配列を含む。「転写開始点のすぐ上流」というフレーズは、配列（例えば、５’調節配列）がマウスプロバシン遺伝子の転写開始部位の上流かつ３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、２、または１ｂｐ以内であることを意味する。一部の実施形態では、導入遺伝子内のＳＶ４０腫瘍抗原コード配列に隣接する５’調節配列は、マウスプロバシン遺伝子の転写開始点の約１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、または１０ｋｂ上流（例えば、すぐ上流）にある配列を含む。他の実施形態では、ＳＶ４０腫瘍抗原コード配列に隣接する５’配列は、マウスプロバシン遺伝子の転写開始点の少なくとも１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ、１７ｋｂ、１８ｋｂ、１９ｋｂ、または２０ｋｂ上流（例えば、すぐ上流）にある配列を含む。さらに他の実施形態では、ＳＶ４０腫瘍抗原コード配列に隣接する５’調節配列は、マウスプロバシン遺伝子の転写開始点の少なくとも１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、または５０ｋｂ上流（例えば、すぐ上流）にある配列を含む。特定の実施形態では、ＳＶ４０腫瘍抗原コード配列に隣接する５’配列は、マウスプロバシン遺伝子の転写開始点の少なくとも約４５ｋｂ、４６ｋｂ、４７ｋｂ、４８ｋｂ、４９ｋｂ、または５０ｋｂ上流（例えば、すぐ上流）にある配列を含む。
【００３８】
一部の実施形態では、導入遺伝子内のＳＶ４０腫瘍抗原コード配列に隣接する５’調節配列は、マウスプロバシン遺伝子の５’ＵＴＲ配列も含む。あるいくつかの実施形態では、ＳＶ４０腫瘍抗原コード配列に隣接する５’配列は、マウスプロバシン遺伝子の５’ＵＴＲ配列全体を含む。特定の実施形態では、ＳＶ４０腫瘍抗原コード配列に隣接する５’調節配列内に含まれるマウスプロバシン遺伝子の５’ＵＴＲ配列は、配列番号１６のヌクレオチド３２９〜４６９または４２７〜４６９に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００３９】
特定の実施形態では、導入遺伝子内のＳＶ４０腫瘍抗原コード配列に隣接する５’調節配列は、配列番号６に記載のポリヌクレオチド配列、それと実質的に同一な配列、またはその断片を含む。
【００４０】
２つの配列を比較する文脈における「実質的に同一な」とは、対象配列が、参照配列に対し少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、またはそれ以上の配列同一性を有することを意味する。
【００４１】
あるいくつかの実施形態では、導入遺伝子内のＳＶ４０腫瘍抗原コード配列に隣接する５’調節配列は、配列番号６に記載のポリヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、ＳＶ４０腫瘍抗原コード配列に隣接する５’調節配列は、少なくとも１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、または５０ｋｂの長さの配列番号６の断片、好ましくは配列番号６の３’末端から測定した長さが上述のいずれかである断片を含む。
【００４２】
本開示によれば、導入遺伝子内のＳＶ４０腫瘍抗原コード配列に隣接する３’調節配列は、マウスプロバシン遺伝子の翻訳終結部位の下流にあるマウスプロバシン遺伝子座からのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、導入遺伝子内のＳＶ４０腫瘍抗原コード配列に隣接する３’調節配列は、マウスプロバシン遺伝子の転写終結部位のすぐ下流にあるマウスプロバシン遺伝子座からのヌクレオチド配列を含む。「転写終結部位のすぐ下流」というフレーズは、配列（例えば、３’調節配列）がマウスプロバシン遺伝子の転写終結部位の下流かつ３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、２、または１ｂｐ以内であることを意味する。
【００４３】
一部の実施形態では、導入遺伝子内のＳＶ４０腫瘍抗原コード配列に隣接する３’調節配列は、マウスプロバシン遺伝子の転写終結点の少なくとも５００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、または１０ｋｂ下流（例えば、すぐ下流）にある配列を含む。特定の実施形態では、ＳＶ４０腫瘍抗原コード配列に隣接する３’配列は、マウスプロバシン遺伝子の転写終結点の少なくとも１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、または１００ｋｂ下流（例えば、すぐ下流）にある配列を含む。他の実施形態では、ＳＶ４０腫瘍抗原コード配列に隣接する３’配列は、マウスプロバシン遺伝子の転写終結点の約１００ｋｂ、１０１ｋｂ、１０２ｋｂ、１０３ｋｂ、１０４ｋｂ、１０５ｋｂ、１０６ｋｂ、または１０７ｋｂ下流（例えば、すぐ下流）にある配列を含む。
【００４４】
一部の実施形態では、ＳＶ４０腫瘍抗原コード配列に隣接する３’配列は、マウスプロバシン遺伝子の３’ＵＴＲ配列も含む。あるいくつかの実施形態では、ＳＶ４０腫瘍抗原コード配列に隣接する３’配列は、マウスプロバシン遺伝子の３’ＵＴＲ配列全体及びイントロンを含む。特定の実施形態では、マウスプロバシン遺伝子の３’ＵＴＲ及びイントロン配列を含む３’配列は、配列番号１７のヌクレオチド４〜３９８２に記載されている。
【００４５】
特定の実施形態では、ＳＶ４０腫瘍抗原コード配列に隣接する３’配列は、配列番号７に記載のポリヌクレオチド配列、それと実質的に同一な配列、またはその断片を含む。
【００４６】
あるいくつかの実施形態では、ＳＶ４０腫瘍抗原コード配列に隣接する３’配列は、配列番号７に記載のポリヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、ＳＶ４０腫瘍抗原コード配列に隣接する３’配列は、少なくとも２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、または１０５ｋｂの長さの配列番号７の断片、好ましくは配列番号７の５’末端から測定した長さが上述のいずれかである断片を含む。
【００４７】
ＳＶ４０腫瘍抗原
多くの実施形態では、がん遺伝子または発がん性タンパク質をコードする核酸が本開示で使用される。一部の実施形態では、当該がん遺伝子はＭｙｃである(Grabowskaら、Cancer Metastasis Rev. 2014 September ; 33(0):377-397)。他の実施形態では、発がん性タンパク質はＳＶ４０腫瘍抗原である。
【００４８】
シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ゲノムは、５２４３ｂｐからなり（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０２４００．１を参照）、初期コード領域、後期コード領域、及び調節領域の３つの領域に分類される(Ahujaら、Oncogene 24: 7729-7745 (2005))。初期コード領域は、増殖性感染の初期に発現される３種のタンパク質：ラージＴ抗原、スモールｔ抗原、及び１７Ｋ  Ｔ抗原をコードする(Ahujaら(2005)(上記参照))。ラージＴ抗原及びスモールｔ抗原は、共通のプレｍＲＮＡ転写物からの選択的スプライシングを通じて生成された２つのｍＲＮＡから産生される(vanSantenら、Nucleic Acid Res. 14 (24): 9911-9926 (1986))。ＳＶ４０ラージＴ抗原によるｐ５３及び網膜芽腫（Ｒｂ）ファミリーの腫瘍サプレッサーの阻害、ならびにＳＶ４０スモールｔ抗原によるｐｐ２Ａホスファターゼへの作用は、ＳＶ４０誘導形質転換にとって重要であることが確証されている(Ahujaら (2005)(上記参照))。トランスジェニックマウスにおける、切断型ラージＴ抗原を含めたＳＶ４０腫瘍抗原の発現は、過形成及びがんの発生をもたらす(Ahujaら (2005)（上記参照）； Hillら、Cancer Res 65: 10243-54, 2005)。
【００４９】
ＳＶ４０ラージＴ抗原は７０８アミノ酸からなり、スモールｔ抗原は１７４アミノ酸からなる。ラージＴ抗原及びスモールｔ抗原は共に、タンパク質のＮ末端領域に位置するＪドメインを共有する。ラージＴ抗原は、Ｒｂタンパク質結合モチーフ（ＬＸＣＸＥ、配列番号１４）及び核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含めた複数の追加的ドメインを有する。スモールｔ抗原は、Ｊドメインに後続するｐｐ２Ａ結合ドメインを有する。Ahujaら (2005) (上記参照)を参照されたい。
【００５０】
「ＳＶ４０腫瘍抗原」という用語には、全長（すなわち、野生型）ＳＶ４０ラージＴ抗原もしくはその機能的に活性な断片、全長（すなわち、野生型）のＳＶ４０スモールｔ抗原もしくはその機能的に活性な断片、またはこれらの組み合わせが含まれる。言い換えれば、導入遺伝子内のＳＶ４０腫瘍抗原をコードする核酸配列は、全長ＳＶ４０ラージＴ抗原もしくはその機能的に活性な断片（スモールｔ抗原なし）、全長ＳＶ４０スモールｔ抗原もしくはその機能的に活性な断片（ラージＴ抗原なし）、またはこれらの組み合わせ（例えば、核酸配列がＳＶ４０ラージＴ抗原及びＳＶ４０スモールｔ抗原の両方をコードする）をコードすることができる。
【００５１】
「機能的に活性な断片」という用語は、全長（野生型）Ｔ抗原に関連付けられた１つ以上の機能（例えば、形質転換誘導、または腫瘍形成の開始、促進、もしくは持続に関連付けられた全長Ｔ抗原の機能、ｐ５３またはＲｂの活性阻害におけるラージＴ抗原の機能、あるいはｐｐ２Ａに対する結合及び作用におけるスモールｔ抗原の機能）を有するＴ抗原の断片を指す。Ｔ抗原の機能的に活性な断片の一例に、Hill ら (2005)（上記参照）で説明されている切断型ラージＴ抗原があるが、これは、野生型ラージＴ抗原（スモールｔ抗原なし）のうちのＮ末端のわずか１２１アミノ酸を含み、「Ｔ１２１」とも称される。Ｔ１２１変異体抗原は、Ｊドメイン及びｐＲｂ結合ドメインを含み、ｐＲｂファミリータンパク質を不活性化しマウスにおいてＰＩＮ及び腺がんを産生するのに十分であることが見いだされている(Hillら (2005)(上記参照))。
【００５２】
野生型ＳＶ４０  Ｔ抗原の腫瘍形成を開始、促進、または持続する機能も維持する他の変異体ＳＶ４０  Ｔ抗原が説明されている。例えば、Ｋａｓｐｅｒ  ら (Lab Invest. 78 (3): i-xv, 1998)により説明されるＳＶ４０遺伝子欠失変異体は、ラージＴ抗原のみを発現しスモールｔ抗原を発現せず、マウスにおいてＰＩＮ及び腺がんを誘導することも見いだされた。
【００５３】
一部の実施形態によれば、導入遺伝子内のＳＶ４０腫瘍抗原をコードする核酸配列は、全長ＳＶ４０ラージＴ抗原またはその機能的に活性な断片をコードし、スモールｔ抗原をコードしない。あるいくつかの実施形態では、ラージＴ抗原は、配列番号８のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一な配列を含む。特定の実施形態では、ＳＶ４０腫瘍抗原をコードする核酸配列は、配列番号８のアミノ酸配列を含むラージＴ抗原をコードする。別の特定の実施形態では、ＳＶ４０腫瘍抗原をコードする核酸配列は、配列番号８の最初の１２１アミノ酸を含む切断型ラージＴ抗原をコードする。
【００５４】
一部の実施形態では、導入遺伝子内のＳＶ４０腫瘍抗原をコードする核酸配列は、全長ＳＶ４０スモールｔ抗原またはその機能的に活性な断片をコードし、ラージＴ抗原をコードしない。あるいくつかの実施形態では、スモールｔ抗原は、配列番号９のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一な配列を含む。特定の実施形態では、ＳＶ４０腫瘍抗原をコードする核酸配列は、配列番号９のアミノ酸配列を有するスモールｔ抗原をコードする。
【００５５】
さらに他の実施形態では、導入遺伝子内のＳＶ４０腫瘍抗原をコードする核酸配列は、全長ＳＶ４０ラージＴ抗原またはその機能的に活性な断片と、全長ＳＶ４０スモールｔ抗原またはその機能的に活性な断片との両方をコードする。あるいくつかの実施形態では、ＳＶ４０腫瘍抗原をコードする核酸配列は、全長ＳＶ４０ラージＴ抗原及び全長ＳＶ４０スモールｔ抗原の両方をコードする。特定の実施形態では、ＳＶ４０腫瘍抗原をコードする核酸は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一なヌクレオチド配列を含む。
【００５６】
レポーター
一部の実施形態では、本明細書で開示される導入遺伝子は、検出可能なシグナルを提供するかまたはそれを生成可能なレポータータンパク質（すなわち、「レポーター」）をコードする、レポーター遺伝子も含む。本開示における使用に好適なレポーターとしては、β−ガラクトシダーゼ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、またはこれらの組み合わせが挙げられる。
【００５７】
あるいくつかの実施形態では、当該レポーターはルシフェラーゼである。「ルシフェラーゼ」という用語には、基質、ルシフェリンの酸化反応を触媒する酸化酵素のクラスが含まれ、生物発光は、この酸化反応の結果として放出される。本明細書での使用に好適なルシフェラーゼとしては、ホタル種Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ由来のホタルルシフェラーゼ、他の生物由来のルシフェラーゼ、及びこれらの機能的誘導体（例えば、遺伝子工学の手法により作成される機能的誘導体）が挙げられる。野生型（または天然存在）の「機能的誘導体」ルシフェラーゼには、１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、付加、欠失、または置換）を有することにより野生型ルシフェラーゼとは異なる、そして野生型ルシフェラーゼの酵素活性を実質的に保持するタンパク質が含まれる。「野生型ルシフェラーゼの酵素活性を実質的に保持する」というフレーズには、機能的誘導体及び野生型の酵素活性を比較した際の、両方向における３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５、２％、または１％以下の相違が含まれる。一部の実施形態では、野生型ルシフェラーゼの機能的誘導体は、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、当該レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼをコードし、かつ配列番号３に記載のヌクレオチド配列、または配列番号３と実質的に同一なヌクレオチド配列を含む。
【００５８】
ＳＶ４０腫瘍抗原コード配列とレポーター遺伝子との間の連結
レポーター遺伝子配列は、ＳＶ４０腫瘍抗原をコードする核酸配列と作用可能に連結して、レポーターの発現がＳＶ４０腫瘍抗原の発現を反映しかつ同時発生するように、導入遺伝子内に配置される。ＳＶ４０腫瘍抗原コード配列とレポーター核酸との間の作用可能な連結は、当技術分野で公知のいくつかの方法で、例えばマルチシストロニックな（ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）発現戦略を使用することで、達成することができる。マルチシストロニック発現ベクターは、同じｍＲＮＡから（すなわち、同じプロモーターから産生された転写物から）２つ以上の別々のタンパク質を同時に発現する。タンパク質のマルチシストロニック発現に好適な戦略としては、２Ａペプチドの使用及び内部リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）の使用が挙げられる。
【００５９】
一部の実施形態では、ＳＶ４０腫瘍抗原コード配列及びレポーター遺伝子は、２Ａペプチドをコードする核酸配列を介して、互いに連結している。当該ＳＶ４０腫瘍抗原コード配列は、２Ａペプチドコード配列のＮ末端に配置することができ、当該レポーター遺伝子は、２Ａペプチドコード配列のＣ末端に配置する。代替方法として、当該ＳＶ４０腫瘍抗原コード配列は、２Ａペプチドコード配列のＣ末端に配置することができ、当該レポーター遺伝子は、２Ａペプチドコード配列のＮ末端に配置する。
【００６０】
２Ａペプチドは小さな「自己切断」ペプチドであり、概して長さが１８〜２２アミノ酸である。リボソームが２ＡペプチドのＣ末端におけるグリシル−プロリルペプチド結合の合成をスキップし、２Ａペプチドとそのすぐ下流のペプチドとの切断につながることが実証されている(Kimら、PLoS One 2011; 6(4): e18556)。結果として、「切断された」下流ペプチドはそのＮ末端にプロリンを有する。２Ａ介在の切断は、全真核細胞における普遍的な現象である。２Ａペプチドは、ピコルナウイルス、昆虫ウイルス、及びＣ型ロタウイルスから同定され(Szymczakら、"Developmentof 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors"Expert Opin Biol Ther 5: 627-638 (2005))、本開示における使用に好適である。あるいくつかの実施形態では、ＳＶ４０腫瘍抗原及びレポータータンパク質の連結に使用する２Ａペプチドは、ＦＭＤＶ  ２Ａ（「Ｆ２Ａ」）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（「Ｅ２Ａ」）、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（「Ｐ２Ａ」）、またはＴｈｏｓｅａａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（「Ｔ２Ａ」）から選択される２Ａペプチドである。詳細な実施形態では、これらの２Ａペプチドは、以下の配列を有する。
F2A  VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 10)
E2A  QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 11)
P2A  ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 12)
T2A  EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 13)
【００６１】
一部の実施形態では、Ｔ２Ａペプチドは、ＳＶ４０腫瘍抗原とレポータータンパク質との間の連結を提供するために使用される。一実施形態では、本明細書で使用されるＴ２Ａペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、当該Ｔ２Ａペプチドは、配列番号２のヌクレオチド配列によりコードされる。
【００６２】
他の実施形態では、ＳＶ４０腫瘍抗原コード配列及びレポーター核酸配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を介して互いに連結している。ＩＲＥＳは、当技術分野で十分に立証されたヌクレオチド配列であり、ｍＲＮＡの途中での翻訳開始を可能にし、それにより単一のｍＲＮＡ分子から２つ以上のタンパク質産物の翻訳をもたらす。
【００６３】
導入遺伝子内の他のエレメント
一部の実施形態では、本明細書で提供される導入遺伝子は、選択マーカーをコードする核酸配列も含む。このような選択マーカーとしては、以下に限定するものではないが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）、またはこれらの組み合わせが挙げられる。
【００６４】
当該選択マーカー核酸は発現カセットに含まれてもよく、この選択マーカーをコードする核酸配列は、所望の細胞内で活性の１つ以上のプロモーター、例えば一方がげっ歯類ＥＳ細胞などのげっ歯類細胞内で活性であり、他方が細菌細胞内で活性である２つのプロモーター、と作用可能に連結している。
【００６５】
一部の実施形態では、選択マーカーをコードする核酸配列には部位特異的組み換え標的配列が隣接し、これにより、導入遺伝子が統合された後に部位特異的組み換え標的配列間にある核酸配列（例えば、選択マーカー核酸）の除去が可能になる。選択マーカー核酸または対象のポリヌクレオチドに隣接し得る部位特異的組み換え標的配列としては、以下に限定するものではないが、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、ｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ｒｏｘ、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００６６】
詳細な実施形態では、本明細書で提供される導入遺伝子は、５’から３’にかけて、ｌｏｘＰ（５’）配列、ＴＡＴＡ  ｂｏｘ−ｈＵｂ（ヒトユビキチンプロモーター）、ＥＭ７プロモーター、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼコード配列、ポリＡ配列、及びｌｏｘＰ（３’）配列を含有するネオマイシン選択カセットを含む。特定の実施形態では、当該ネオマイシン選択カセットは、配列番号５に記載のヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一なヌクレオチド配列を含む。一旦当該導入遺伝子を含むＥＳ細胞クローンが選択されると、当該ネオマイシン選択カセットは、例えば電気穿孔を介して、Ｃｒｅレコンビナーゼを導入することにより、切除することができる。代替方法として、当該ネオマイシン選択カセットは、ＥＳクローンから生成した後代を、Ｃｒｅレコンビナーゼを発現する除去（ｄｅｌｅｔｏｒ）げっ歯類系統と交配することにより、除去することができる。
【００６７】
一部の実施形態では、本明細書で提供される導入遺伝子は、ＳＶ４０腫瘍抗原コード配列の３’側に配置され、レポーター核酸が存在する場合にはレポーター核酸の３’側に配置される、ＳＶ４０後期領域ポリＡ配列も含む。特定の実施形態では、当該ＳＶ４０後期領域ポリＡ配列は、配列番号４に記載のヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一なヌクレオチド配列を含む。
【００６８】
前立腺がんのげっ歯類モデル
マウスプロバシン遺伝子の５’及び３’調節領域に作用可能に連結したＳＶ４０腫瘍抗原をコードする導入遺伝子をゲノム内に含有する、げっ歯類が提供される。このようなげっ歯類は、当該導入遺伝子を前立腺において特異的に発現し、ヒト前立腺がんの発生に似ている進行型の前立腺腫瘍を呈する。
【００６９】
当技術分野において、前立腺がんのトランスジェニックマウスモデルが説明されている。例えば、マウス前立腺のトランスジェニック腺がん（ＴＲＡＭＰ）モデルはGreenbergら (1995)(上記参照)、及びGingrich ら (Cancer Res. 56:4096-4102, 1996)により説明されているが、これは前立腺特異的ラットプロバシンミニマルプロモーター（−４２７／＋２８ｂｐ）を利用してＳＶ４０ラージＴ及びスモールｔ抗原の発現を駆動する。導入遺伝子は、ＴＲＡＭＰマウスの前立腺上皮において発現され、前立腺の背葉、側葉、及び前葉よりも腹葉において顕著に高いレベルで発現される(Greenberg ら(1995)の図１)。ＴＲＡＭＰマウスは、生後６〜１２週までに前立腺上皮内新生物（ＰＩＮ）を発生し、これは、生後２０〜２４週までに前立腺の背側葉において低分化で浸潤性の腺がんに進行する(Greenbergら(1995))。ＴＲＡＭＰマウスに形成された腺がんは離れた部位（例えば、リンパ節及び肺）への転移を発生する(Gingrichら(1996)(上記参照))が、骨に転移することは少ない。ＴＲＡＭＰマウスにおいて発生する腺がんの多くが、神経内分泌を起源とするものであり(Chiaverottiら、AmJ Pathol. 172(1): 236-246, 2008)、このタイプのがんは、ヒト前立腺がん患者の１０％に相当するに過ぎない。ＴＲＡＭＰモデルの派生物がHillら(2005)（上記参照により説明されているが、これは２つのアデニン及びウリジンリッチなエレメント（すなわち「ＡＲＥ」）を置き換えた切断型ラットプロバシンプロモーターセグメント（−４５８ｂｐ）を利用して、切断型ＳＶ４０ラージＴ抗原の発現を駆動する。）導入遺伝子は、前立腺の背葉、前葉、及び腹葉において発現される。このようなＴＲＡＭＰ派生マウスは、生後２ヵ月までにＰＩＮを発生し、これは生後４ヵ月までにがんに進行する。前立腺がんのＬＡＤＹトランスジェニックマウスモデルがKasperら(1998)(上記参照)により説明されているが、これは比較的大きい（１１．５ｋｂ）ラットプロバシンプロモーターセグメントを利用して切断型ＳＶ４０ラージＴ抗原を駆動し、前立腺における導入遺伝子発現をもたらす。ＬＡＤＹマウスは、生後５〜１０週までに腺過形成及びＰＩＮを発生し、次に２０週までに高悪性度上皮異形成及び低未分化腺がんを、主に前立腺の背側葉及び前葉において発生する。ＬＡＤＹマウスは、他の臓器への転移を発生することは少ない。これらのトランスジェニックマウスモデルの全てにおいて疾患進行の速度が急速であり、特徴的にゆっくりとしたヒトにおけるがんの発生とは異なる。ＴＲＡＭＰマウスにおける神経内分泌がんの蔓延も、このマウスモデルと神経内分泌がんを有する患者の小規模な亜集団との関連性を制約するものである。
【００７０】
本明細書で提供されるげっ歯類は、当技術分野で説明されているモデルよりも良好にヒト前立腺がんの病理学的特徴を再現する。例えば、当該導入遺伝子の優勢な発現が当該げっ歯類の背側葉で検出されるが、背側葉は、ヒト前立腺腺がんが典型的に生じるヒト前立腺周辺帯に類似する部分である。さらに、本明細書で提供されるげっ歯類は、進行型の前立腺腫瘍を発生するが、これは、当技術分野で報告されているＴＲＡＭＰ及びＬＡＤＹマウスと比較して疾患進行の速度がはるかに遅く、かつ寿命が長いヒト前立腺がんにおける、過形成から高悪性度前立腺上皮内新生物（すなわちＨＧＰＩＮ）、腺がんに至るまでの様々な段階に似ている。加えて、本明細書で開示されるげっ歯類において発生する腺がんは、本質的に神経内分泌系ではない。
【００７１】
一部の実施形態では、当該導入遺伝子は、当該げっ歯類の前立腺の背側葉及び／または前葉において発現される。一部の実施形態では、背側葉及び／または前葉における当該導入遺伝子の発現は、前立腺の腹葉におけるものよりも高い。特定の実施形態では、背側葉、前葉、または背側葉及び前葉を合わせたものにおける当該導入遺伝子の発現は、腹葉における発現よりも実質的に高い（すなわち、少なくとも３０％、４０％、５０％、７５％、１００％またはそれ以上高い）。
【００７２】
本明細書で提供されるげっ歯類は、前立腺上皮内新生物、すなわちＰＩＮを発生する。ＰＩＮは、典型的には、既存の腺腔（ｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｓｐａｃｅ）内における浸潤を伴わない（すなわち、基底膜が破られていない）非定型細胞の増殖によって特徴づけられる。一部の実施形態では、当該げっ歯類は、生後約３〜７ヵ月、または生後約４〜６ヵ月でＰＩＮを呈し始める。あるいくつかの実施形態では、当該げっ歯類は、少なくとも生後約２、３、４、５、または６ヵ月までＰＩＮを呈しない。一部の実施形態では、当該げっ歯類において発生するＰＩＮは、前立腺の背側葉、または背側葉及び前葉にある。特定の実施形態では、当該げっ歯類において発生するＰＩＮは、実質的に前立腺の背側葉及び／または前葉にあり、実質的に前立腺の腹葉にはない。「実質的に」という用語は、ＰＩＮを呈する部分の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上が前立腺の背側葉及び／または前葉にあり、ＰＩＮを呈する部分の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％以下が前立腺の腹葉にあることを意味する。
【００７３】
本明細書で提供されるげっ歯類は、前立腺腺がんを発生する。腺がんは、概して、非定型細胞の浸潤性及び／または破壊的増殖により特徴づけられる。一般的には、この非定型細胞はある程度の腺性分化を有する。一部の実施形態では、当該げっ歯類は、生後約７〜９ヵ月、または生後約８ヵ月で前立腺腺がんを呈し始める。あるいくつかの実施形態では、当該げっ歯類は、少なくとも生後約６、７、８、９、または１０ヵ月まで腺がんを呈しない。一部の実施形態では、当該げっ歯類において発生する腺がんは、前立腺の背側葉、または背側葉及び前葉にある。特定の実施形態では、当該げっ歯類において発生する腺がんは、実質的に前立腺の背側葉及び／または前葉にあり、実質的に前立腺の腹葉にはない。「実質的に」という用語は、腺がんを呈する部分の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上が前立腺の背側葉及び／または前葉にあり、腺がんを呈する前立腺内の部分の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％以下が前立腺の腹葉にあることを意味する。
【００７４】
一部の実施形態では、当該レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子）は、別の臓器で検出される。特定の実施形態では、当該レポーター遺伝子は、膀胱、肝臓、肺、腎臓、心臓、胸腺、唾液腺、骨、またはこれらの組み合わせから選択される臓器で検出される。
【００７５】
一部の実施形態では、当該げっ歯類において発生する腺がんは、神経内分泌がんではない。神経内分泌（ＮＥ）がんは、別個の形態及びマーカー発現パターンに関連付けられる(Chiaverottiら(2008)(上記参照))。例えば、ＮＥがんは、低分化で高浸潤性の病変により特徴づけられ、管構造をゆがめる大きな腫瘤を形成し、正常なまたは過形成の腺を捕捉し、通常は複数の葉を巻き込み、しばしば広い部分の壊死をもたらす。免疫染色アッセイにおいて、ＮＥがんは、典型的にはアンドロゲン受容体（ＡＲ）の染色が陰性であるか、またはＡＲについて弱く分散した細胞質染色を示すが、シナプトフィジン染色は陽性である。これは、シナプトフィジン染色が陰性であり、ＡＲについて強い核染色がある正常及び過形成前立腺上皮とは著しく対照的である。特定の実施形態では、本明細書で提供されるげっ歯類において発生する腺がんはシナプトフィジンを発現しない。すなわち、例えば免疫染色による判定で、シナプトフィジンの染色は陰性であるが、上皮マーカーのＥ−カドヘリンに対しては陽性である。
【００７６】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるげっ歯類は、上述の発現及び病理学的特徴、例えば、導入遺伝子が発現される部分、ＰＩＮの発生にかかる時間期間、ＰＩＮが発生する前立腺内の部分、前立腺腺がんの発生にかかる時間期間、腺がんが発生する前立腺内の部分、及び発生した腺がんが神経内分泌がんではないという特徴を含めた、発現及び病理学的特徴のいずれかの組み合わせを示す。多くの実施形態では、当該げっ歯類は以下の特徴のいずれか１つの組み合わせを示すことができる：  （ｉ）前立腺の背側葉及び／または前葉における導入遺伝子発現；（ｉｉ）少なくとも生後約２、３、４、５、６ヵ月までＰＩＮを呈さず、特定の実施形態では、生後約３〜７ヵ月、または生後約４〜６ヵ月でＰＩＮを呈し始める；（ｉｉｉ）前立腺の背側葉、または背側葉及び前葉においてＰＩＮを呈し、一部の実施形態では、実質的に前立腺の背側葉及び／または前葉においてＰＩＮを呈するが実質的に前立腺の腹葉において呈しない；（ｉｖ）少なくとも生後約６、７、８、９、または１０ヵ月まで腺がんを呈さず、特定の実施形態では、生後約７〜９ヵ月、または生後約８ヵ月で前立腺腺がんを呈し始める；（ｖ）背側葉、または背側葉及び前葉において腺がんを呈し、特定の実施形態では、実質的に前立腺の背側葉及び／または前葉において腺がんを呈するが、実質的に前立腺の腹葉において呈しない。特定の実施形態では、生後約４〜６ヵ月で前立腺組織にＰＩＮを呈し始め、生後約７〜９ヵ月で腺がんを呈し始めるげっ歯類であって、このげっ歯類において発生する腺がんが神経内分泌がんではない、げっ歯類が本明細書で開示される。
【００７７】
本明細書で提供されるげっ歯類は、当技術分野で報告されているＴＲＡＭＰ及びＬＡＤＹマウスと比較して長い生存時間を有するが、この理由はおそらくは、本明細書で提供されるげっ歯類の疾患進行速度が遅く、かつより攻撃的な神経内分泌がんを発生しないことによる。一部の実施形態では、本明細書で提供されるげっ歯類は、少なくとも生後約１６、１８、２０、２２、または２４ヵ月まで生きる。特定の実施形態では、当該げっ歯類は、生後２４ヵ月よりも長く生きる。
【００７８】
本明細書で提供されるげっ歯類には、例えば、マウス、ラット、及びハムスターが含まれる。一部の実施形態では、当該げっ歯類はマウスまたはラットである。特定の実施形態では、当該げっ歯類はマウスである。
【００７９】
一部の実施形態では、当該げっ歯類は、Ｃ５７ＢＬ系統、例えば、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスである。別の実施形態では、当該げっ歯類は、１２９系統、例えば、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９／ＳｖＪａｅ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２からなる群から選択される１２９系統のマウスである（例えば、Festing ら (1999),Mammalian Genome 10:836; Auerbach ら (2000), Biotechniques29(5):1024-1028, 1030, 1032を参照)。一部の実施形態では、当該げっ歯類は、前述の１２９系統及び前述のＣ５７ＢＬ／６系統のミックスのマウスである。あるいくつかの実施形態では、当該マウスは、前述の１２９系統のミックス（すなわち、交雑種）、または前述のＣ５７ＢＬ系統のミックス、またはＣ５７ＢＬ系統及び１２９系統のミックスである。あるいくつかの実施形態では、当該マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６系統及び１２９系統のミックスである。特定の実施形態では、当該マウスはＶＧＦ１系統であり、これは、Ｃ５７ＢＬ／６及び１２９の交雑種であるＦ１Ｈ４系統としても知られる。他の実施形態では、当該マウスは、ＢＡＬＢ系統、例えばＢＡＬＢ／ｃ系統である。一部の実施形態では、当該マウスは、ＢＡＬＢ系統及び前述の別系統のミックスである。
【００８０】
一部の実施形態では、当該げっ歯類はラットである。あるいくつかの実施形態では、当該ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉから選択される。他の実施形態では、当該ラットは、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される２つ以上の系統のミックスである。
【００８１】
トランスジェニックげっ歯類を作製する方法
本明細書で提供されるげっ歯類は、当技術分野で公知の方法を用いて作製することができる。代表的な実施形態では、マウスプロバシン遺伝子の５’及び３’調節領域に作用可能に連結したＳＶ４０腫瘍抗原をコードする導入遺伝子を含有するベクターを、構築することができる。例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ）のクローン及び相同組み換えならびにＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）の技術を利用して、所望の導入遺伝子を保有するＢＡＣベクターを構築することができる（例えば、U.S. 6,586,251及びValenzuelaら(2003), High-throughput engineering ofthe mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, NatureBiotech 21(6):652-659を参照)。
【００８２】
一部の実施形態では、導入遺伝子を保有するＢＡＣベクターは、例えば電気穿孔により、ｒげっ歯類胚幹（ＥＳ）に導入することができる。マウスＥＳ細胞及びラットＥＳ細胞は共に当技術分野で説明されている。例えば、US 7,576,259、US 7,659,442、US 7,294,754、及びUS 2008-0078000 A1(これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる)は、マウスＥＳ細胞及び遺伝子修飾マウスを作製するＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法について記載しており、US2014/0235933 A1及びUS 2014/0310828 A1(これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる)は、ラットＥＳ細胞及び遺伝子修飾ラットを作製する方法について記載している。
【００８３】
ゲノム内で統合された導入遺伝子を有するＥＳ細胞を選択することができる。一部の実施形態では、げっ歯類の標的遺伝子座に統合された導入遺伝子を有するＥＳ細胞が選択される。標的遺伝子座としては、例えば、内在性げっ歯類プロバシン遺伝子座（例えば、相同組み換え介在の統合を介して）が挙げられる。導入遺伝子の標的化された統合を有するＥＳ細胞を生成するために、標的化統合を容易にする標的化ベクターを設計し使用することができる。他の実施形態では、ゲノム内で統合された導入遺伝子を有するＥＳ細胞は、統合が生じる部位に無関係に選択される。言い換えると、導入遺伝子の１つ以上のコピーは、１つ以上の異所的な遺伝子座（すなわち、標的遺伝子座以外の部位）で統合されてもよい。一部の実施形態では、導入遺伝子の少なくとも１〜１０のコピーがＥＳ細胞のゲノム内で統合される。あるいくつかの実施形態では、導入遺伝子の複数のコピー、例えば、導入遺伝子の２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のコピーが、ＥＳ細胞のゲノム内で統合される。当該導入遺伝子の複数のコピーは、ゲノムの１つの遺伝子座に統合されても複数の遺伝子座に統合されてもよい。特定の実施形態では、当該導入遺伝子の複数のコピー（すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のコピー）は、ゲノムの１つの遺伝子座に直列に統合される。次に、ゲノム内で統合された導入遺伝子を有するＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（例えば、US 7,576,259、US 7,659,442、US 7,294,754、及びUS 2008-0078000 A1を参照)、またはUS2014/0235933 A1及びUS 2014/0310828 A1に記載の方法を用いることにより、桑実期以前の胚（例えば、８細胞期胚）への注入に使用する。ドナーＥＳ細胞を含む胚は胚盤胞期までインキュベートし、次に代理母に移植して、完全にドナーＥＳ細胞に由来するＦ０げっ歯類を産生する。当該導入遺伝子を有するげっ歯類の子は、導入遺伝子配列の存在を検出する対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）アッセイ（Valenzuelaら（上記参照））を用いて、尾切片から単離されたＤＮＡを遺伝子型判定することにより同定することができる。）当該導入遺伝子が陽性の子は、当該導入遺伝子の前立腺特異的発現に基づいて（例えば、他の組織及び臓器と比較しての前立腺における発現レベル、及び前立腺の様々なセクション（例えば背葉、側葉、前葉、及び腹葉）における発現レベル）、かつ／または前立腺がんの発生及び信仰に基づいて（例えば、ＰＩＮ及びがんの発症及び進行）、さらにスクリーニングすることができる。
【００８４】
上述のような所望の表現型を示すげっ歯類を生成可能なＥＳクローンは、同定することができる。所望の表現型としては、例えば、実質的に前立腺の背側葉及び前葉における当該導入遺伝子の前立腺特異的発現、及び生後約４〜６ヵ月におけるＰＩＮの発症及び生後約８ヵ月におけるがんの発症があることが挙げられる。このようなＥＳクローンは、培養し保管することができる。一部の実施形態では、ＥＳクローンは、標的遺伝子座（例えば、内在性プロバシン遺伝子座）で統合された当該導入遺伝子の少なくとも１つのコピーを含有する。他の実施形態では、導入遺伝子の少なくとも１〜１０のコピーが、ゲノム内の１つ以上の異所的な部位で統合される。一部の実施形態では、ＥＳクローンは、ゲノム内で統合された導入遺伝子の複数のコピー、例えば、導入遺伝子の２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のコピーを含有する。あるいくつかの実施形態では、導入遺伝子の複数のコピー（２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のコピー）は、ゲノムの複数の遺伝子座に統合される。あるいくつかの別の実施形態では、当該導入遺伝子の複数のコピーは、ゲノムの１つの遺伝子座、例えば１つの異所的な遺伝子座で、直列に統合される。特定の実施形態では、クローンＡ−Ｃ１０（５ｘ）と称される、ゲノムの１つの遺伝子座に直列に統合された導入遺伝子の５つのコピーを有するマウスＥＳクローンが本明細書で提供される。この導入遺伝子は、マウスプロバシン遺伝子の５’及び３’調節領域が隣接するＳＶ４０タグ−Ｔ２Ａ−ルシフェラーゼのコード配列を含む。
【００８５】
他の実施形態では、ＥＳ細胞を使用することなくトランスジェニックげっ歯類が作製され得る。例えば、げっ歯類の非ＥＳ細胞のゲノム（例えば、線維芽細胞または誘導多能性細胞）は、従来の形質転換法（例えば、電子穿孔）に基づいて修飾することができ、このような非ＥＳ細胞の修飾ゲノムは、核移植手法を用いることにより、好適な受容細胞（例えば、卵母細胞）に移行させることができる。次に、修飾細胞（例えば、修飾卵母細胞）を好適な条件下で懐胎（ｇｅｓｔａｔｅｄ）させて胚を形成する。例えば、Hanら "Nuclear Transfer in MouseOocytes and Embryos"", Methodsin Enzymology 476: 171-184 (2010)、及びZhou ら "Generation of FertileCloned Rats by Regulating Oocyte Activation", Science 302: 1179(2003)を参照。
【００８６】
トランスジェニックげっ歯類を使用する方法
本明細書で提供されるげっ歯類は、前立腺がんの識別、診断、ステージ分類の方法論開発を可能にすることに加え、前立腺がん進行の根底にある分子的機序のより良好な理解を可能にする。加えて、このようなげっ歯類は、前立腺がんの予防及び治療のためのスクリーニング及び治療剤の開発で使用することができる。
【００８７】
本明細書は、限定するものとして解釈すべきではない以下の実施例により、さらに例示される。全ての引用参考文献（本出願全体で引用される文献参照、発行特許、及び公表された特許出願を含む）は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【実施例】
【００８８】
実施例１  Ｌｕｃｉ−ＴＲＡＭＰマウスの生成
本実施例は、本明細書でＬｕｃｉ−ＴＲＡＭＰマウスとも称されるトランスジェニックマウスであって、マウスプロバシン遺伝子の５’調節領域及び３’調節領域が隣接するＳＶ４０腫瘍抗原−Ｔ２Ａ−ルシフェラーゼポリペプチドの核酸コード配列を含む導入遺伝子を含有する、トランスジェニックマウスの生成を例示する。
【００８９】
当該導入遺伝子を含有するベクターは、細菌相同組み換え及びＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）の技術を介して構築することができる（例えば、U.S. 6,586,251及びValenzuelaら、High-throughput engineering of the mousegenome coupled with high-resolution expression analysis, 2003, NatureBiotech.21(6):652-659を参照)。簡潔に述べると、マウスプロバシン遺伝子を含有する細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンＲＰ２３−４１７Ｂ１８を利用し、以下のように修飾した。マウス５’−ＵＴＲの７５塩基対（ｂｐｓ）、ＳＶ４０−Ｔ抗原（終止コドンなし）、次にＴ２Ａ配列、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ／ＮｈｅＩ制限部位、ならびに終止コドン及びマウス３’−ＵＴＲの８９ｂｐｓからなる１断片をＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより合成し、伝播のためにＲ６Ｋバックボーンにクローニングした。ルシフェラーゼ２ｃＤＮＡ配列及びそのｐＡを、側面のＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ制限部位を付加するプライマーを用いて、Ｐｒｏｍｅｇａプラスミド（ｐＧＬ４）から増幅した。ＸｈｏＩ及びＮｈｅＩ部位が隣接するネオマイシン耐性カセットをルシフェラーゼ増幅産物と共ライゲーションし（ｃｏ−ｌｉｇａｔｅｄ）合成断片にした。マウスＰｂｓｎ遺伝子（開始ＡＴＧコドンから終止ＴＡＧコドンまで）を置き換えるための細菌相同組み換えを上流（７５ｂｐｓ）及び下流（８９ｂｐｓ）の相同配列により媒介した。組み換えがシームレスであることを確かにするための接合部のシークエンシング及び修飾ＢＡＣの期待サイズを確認するための制限断片の分析を行った後、電子穿孔を行うためにＢａｃベクターを線状化し精製した。
【００９０】
得られた修飾ＢＡＣベクターを図１に図示する。修飾ＢＡＣベクターの構成成分のヌクレオチド配列は、配列番号１〜７に記載されている。
【００９１】
この修飾ＢＡＣベクターを、ＶＧＦ１（Ｆ１Ｈ４としても知られる）Ｃ５７ＢＬ６／１２９Ｆ１一代交雑種胚幹（ＥＳ）細胞に電子穿孔して、ゲノム内で統合されたＳＶ４０−Ｔ２Ａ−ルシフェラーゼ導入遺伝子を有する修飾ＥＳ細胞を作成した。ＳＶ４０−Ｔ２Ａ−ルシフェラーゼ導入遺伝子を含有する修飾ＥＳ細胞を、ジェネテシン（Ｇ４１８）への耐性に基づき選択した。
【００９２】
次に、選択したＥＳ細胞クローンをドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法により、桑実期以前のマウス胚に顕微注入した（例えば、US 7,576,259、US 7,659,442、US 7,294,754、及びUS 2008-0078000 A1を参照)。ドナーＥＳ細胞を含むマウス胚を胚盤胞期までインキュベートし、次に代理母に移植して、完全にドナーＥＳ細胞に由来するＦ０マウスを産生した。当該導入遺伝子を有するマウスは、導入遺伝子配列の存在を検出する対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）アッセイ(Valenzuelaら(上記参照))を用いて、尾切片から単離されたＤＮＡを遺伝子型判定することにより同定した。当該導入遺伝子が陽性の子をさらに、Ｔ抗原及びルシフェラーゼの前立腺特異的発現についてスクリーニングした。
【００９３】
クローンＡ−Ｃ１０（５ｘ）を８週間で前立腺特異的導入遺伝子発現を示すマウスを産生するＥＳクローンとして同定した（図２）。遺伝子導入ｍＲＮＡを、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて、Ｔ抗原及びルシフェラーゼ導入遺伝子に対し設計したアッセイで評価した。生後８週のマウスからの組織を採取し、直ちにＲＮＡＬａｔｅｒ試薬に浸した。全ＲＮＡをＲｅｇｅｎｅｒｏｎ  ＤＮＡ  Ｃｏｒｅにより抽出し、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社の指示を少々変更したものに従ってｑＰＣＲを実施した。野生型（交雑種非トランスジェニック対照マウス）、Ａ−Ｂ１（導入遺伝子の発現が低い／ないマウス）、Ａ−Ｂ８（中程度、ただし異所性発現のマウス）、Ａ−Ｃ１０（前立腺背側葉（ＤＬＰ）及び前立腺前葉（ＡＰ）及び精嚢（ＳＶ）のみに発現される約５コピーの導入遺伝子を有するＬｕｃｉ−ＴＲＡＭＰマウス）。
【００９４】
実施例２  Ｌｕｃｉ−ＴＲＡＭＰコホートの縦断的分析
ＥＳクローンＡ−Ｃ１０（５ｘ）から生成したＬｕｃｉ−ＴＲＡＭＰマウスをＭＡＩＤ  ２３１９と称し、本実施例で説明する実験で使用した。ＭＡＩＤ  ２３６３と称されるマウスは、ゲノム内のＲｏｓａ  ２６遺伝子座に導入遺伝子「Ｒ２６−Ｌ−ｌｕｃ２」（非組織特異的な様式でルシフェラーゼレポーターを発現する）を含有し、野生型Ｆ１Ｈ４マウスを対象として使用した。
【００９５】
３５匹のＭＡＩＤ２３１９マウス（Ｌｕｃｉ−ＴＲＡＭＰ）のコホートを飼育して前立腺腫瘍が発生させ、並行して同じ数のＭＡＩＤ  ２３６３マウス（Ｒ２６−Ｌ−Ｌｕｃ２）及びＦ１Ｈ４マウスを飼育した。各群から５匹のマウスを２、４、６、８、１１、及び１６ヵ月目にそれぞれ取り出し、インビボのルシフェラーゼイメージング、μＣＴスキャン（除脂肪量／体脂肪量／骨量を評価するため）、病理組織分析（開始後４ヵ月）、及び分子フェノタイピング（ＲＮＡ−ｓｅｑ及びｑＰＣＲ）を行った。
【００９６】
縦断的研究のため、各指示時点（以下に挿入）において、全動物にルシフェリンを皮下投与（１５０ｍｇ／ｋｇ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）し、イソフルランにより麻酔をかけ、１２〜１４分後にＬｕｍｉｎａ  ＸＲインビボイメージングシステムでスキャンした。  Ｌｉｖｉｎｇソフトウェアを使用して輪郭外周（ｃｏｎｔｏｕｒ  ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ）でＲＯＩを自動描画し、５％閾値で強度シグナル（全光束）を計算した。
【００９７】
ＢｉｏＳｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社及びＲｅｇｅｎｅｒｏｎ社のインハウス用検索パラメーターを用いてｑＰＣＲプローブを設計した。組織をＴＲＩｚｏｌ中で均質化し、クロロホルムを相分離に使用した。全ＲＮＡを含有する水相を、ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｕａｇｅｎ、カタログ番号２１７００４）を用いて製造業者の使用に従って精製した。ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）ＤＮアーゼ緩衝液及びＴＵＲＢＯ  ＤＮアーゼ試薬（Ａｍｂｉｏｎ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてゲノムＤＮＡを除去した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ（商標）マスターミックス試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１７５５５００）を用いてｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡにした。ＡＢＩ  ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎマスターミックス試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号４３７００７４）でｃＤＮＡを増幅した。任意のｃＤＮＡ入力の差を標準化するための内部制御遺伝子として、βアクチンを使用した。サンプル間の倍数差を算出するための参照サンプルとして、野生型（Ｆ１Ｈ４）の肺を使用した。組織ごと、遺伝子型ごとにＮ＝５のオス。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン３．０）を用いて統計的分析及びグラフによる分析を実施した。スチューデントの独立ｔ検定を用いてデータを分析した。結果はＰ値＜０．０５で統計的に有意と考えられた。エラーバーは、ＳＤを示す。
【００９８】
結果を図３Ａ〜３Ｃに示す。病理組織学分析から明らかにされた前立腺がんの進行を表１に概括した。ｍＰＩＮ及び腺がんの割り当ては、以下のガイドラインに基づいた。
【００９９】
ｍＰＩＮ：既存の腺腔内における非定型細胞の増殖、ただし浸潤を欠く（すなわち、基底膜は破られていない）。ｍＰＩＮは、特定のＧＥＭモデルと互換性のある形態学（非定型）に基づき、上皮過形成から分化している。ｍＰＩＮの進行は年齢に関連付けられ、浸潤性がんに進むことが示されている。グレード分けは、構造的または細胞学的異常の程度に基づき、１〜４の尺度において数字が高いほど異常の程度が高い：
ｍＰＩＮ１（上皮過形成）＝軟質核及び／または細胞質の異型（炎症とは無関係）ならびに単層または２重層に並んだ細胞。
ｍＰＩＮ２＝細胞層が２層以上で、房状の核異型または乳頭状分岐を伴う。
ｍＰＩＮ３＝異型の増加／頻度増加及び管腔を部分的〜完全に満たすさらに広範な乳頭状分岐。
ｍＰＩＮ４＝著明な／頻繁な異型ならびに過増殖の分岐及び腺腔の膨満、ただし明らかな浸潤を欠く。
腺がん：ある程度の腺分化を有する非定型細胞の浸潤性及び／または破壊的増殖。マウスにおいては、間質線維増生及び様々な程度の間質性炎症がより進んだ病変と関連付けられている。
【０１００】
代表的な病理染色の画像を、図４Ａ〜４Ｂに示す。Ｌｕｃｉ−ＴＲＡＭＰマウスからの前立腺腫瘍に対する免疫組織化学分析を図５Ａ〜５Ｂに示す。組織を、新たに調製した４％パラホルムアルデヒド中で終夜固定し、次にパラフィン包埋し、切片を作り、病期分類のためにヘマトキシリン及びエオシンで染色した。  一部の切片を、シナプトフィジン（Ａｂｃａｍ  番号３２１２７）またはＥ−カドヘリン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇクローン６４Ｅ１０）に対する抗体を用いて、それぞれ神経内分泌または上皮の抗原をアッセイした。
【０１０１】
これらの研究により、以下のことが明らかになった。
・  生後４ヵ月から、全てのＬｕｃｉ−ＴＲＡＭＰ前立腺（各年齢集団につき５／５マウス）において解剖顕微鏡下で前立腺腫瘍の発生が認められ（透明な前立腺内の真っ白な点／部分）、対象においては異常が検出されなかった。
・  ４ヵ月及び６ヵ月では、各月齢で分析した３／３のＬｕｃｉ−ＴＲＡＭＰマウスが、背側外側葉及び前葉の両方で非浸潤性前立腺がんを示した。各月齢群で分析した４／４の対照マウスは、いずれの葉でも一切異常を示さなかった。
・  ８ヵ月及び１１ヵ月では、各月齢の３／３のＬｕｃｉ−ＴＲＡＭＰマウスが背側外側葉及び前葉の両方で前立腺腺がんを示した。各月齢群で分析した３／３の対照マウスは、いずれの葉でもほとんど異常を示さなかった。
・  １６ヵ月では、５／５のＬｕｃｉ−ＴＲＡＭＰマウスが前葉に前立腺腺がんを示し、４／４において背側外側葉に前立腺腺がんが検出された。
・  Ｌｕｃｉ−ＴＲＡＭＰマウスの腹葉はわずかな変化を示した（上皮過形成にとどまった）。
・  生後８ヵ月から微小浸潤が観察されたが、生後１６ヵ月までに血管侵入が生じた根拠はなかった。
・  ＩＨＣ分析から、Ｌｕｃｉ−ＴＲＡＭＰ前立腺腫瘍は、上皮マーカーＥ−カドヘリンの染色が陽性であり、神経内分泌マーカーシナプトフィジンの染色が陰性だった。
【０１０２】
【表１−１】
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【表１−２】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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