(57)【要約】  本文書は、核酸の単純化され、高感度な、且つ正確な定量を可能にする方法および組成物に関する。一部の方法は、複数のサンプルから標的化された複数のリボ核酸の高度な並列測定を可能にする。さらなる方法は、核酸分子の複雑な混合物から低存在量の核酸変異体の高感度測定を可能にする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆転写の間に各サンプル内で標的化されるＲＮＡ分子のパネルにサンプル特異的カウンティングタグを配分する段階と；
異なるサンプルからのＲＮＡをコピーするために、一貫した比率で相補的ＤＮＡに対してモジュール式オリゴヌクレオチド合成を使用する段階と；
すべてのサンプルから標識ｃＤＮＡをプールし、精製する段階と；
競合的なエンドポイントＰＣＲにより各ｃＤＮＡ標的を別々に増幅させる段階と；
を含むＲＮＡ定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
財政支援研究と関連した陳述
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により授与された、ＴＲ０００１４０およびＴＲ０００１４２の下での政府支援によってなされた。政府は、発明に特定の権利を有する。
【０００２】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１５年２月１３日に出願された仮出願番号６２／１１６，３０２および２０１５年３月２０日に出願された仮出願番号６２／１３５，９２３の利益を主張する。
【０００３】
技術分野
本発明は、溶液中の核酸の同定および定量に関する。
【背景技術】
【０００４】
生体医学研究および臨床医学において多くの適用が核酸の正確な検出および定量に依存する。一部の適用は、遺伝子活性または遺伝子発現に関する情報を提供するために、リボ核酸（「ＲＮＡ」）水準の測定に依存する。他の適用は、点突然変異、挿入、欠失、転位（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）、多型またはコピー数多型のようなゲノム異常の存在を示す変異体デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）またはＲＮＡ配列の測定に依存する。技術的および実用的観点の両方から、色々な課題が核酸の測定に存在する。多くの場合、測定は、大多数のサンプルから行わなければならない。さらに、もし核酸分子の複雑な混合物を含有する制限されたサンプルに、目的とする特定の核酸配列のコピー体が非常に少数で存在すると、低存在量の（ｌｏｗ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ）変異体を確実に確認し、定量することが困難になり得る。
【０００５】
多様な臨床的および研究標本内の遺伝子発現の分析は、細胞生理学に対する本発明者らの理解を裏付け、疾患に対する本発明者らの取り組みに影響を及ぼす。複雑な生物学的システム内の見識ある有意義な遺伝子発現パターンは、通常、二次元：交差多重リボ核酸および交差多重サンプルの統計学的比較を含む。第１ＲＮＡ次元の高度並列型分析に対して発達した技術が存在する一方で、処理効率は、第２サンプル次元で制限されたままである。ＲＮＡ発現のゲノムワイド図が転写体シークエンシング（「ＲＮＡ−Ｓｅｑ」）または微細配列のような技法を使用して得られる。しかし、これらの接近法が各サンプルの別途の多段階プロセッシングを含むため、大規模サンプルの複合化を容易にするためにデザインされていない。ひいては、ＲＮＡ−Ｓｅｑの費用削減がその広範囲な使用を助長する一方で、配列深さ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｐｔｈ）とサンプル当たりの費用とのトレード−オフ（ｔｒａｄｅ−ｏｆｆ）が残っていて、それは、希少な転写物の測定感度を制限することがある。
【０００６】
さらに大きいサンプルセットにわたる標的化されたＲＮＡの評価が、示差的に発現したＲＮＡの部分集合がグローバルプロファイリング方法により確認された後、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（「ｑＲＴ−ＰＣＲ」）を使用して行われる。ｑＲＴ−ＰＣＲの精度、感度および広域力動範囲が、そのような転写物の確認および追加の試験のための選択方法にする。しかし、蛍光のリアルタイムモニタリングが別途の反応体積に対して行われる必要があるため、大多数のサンプルに多重遺伝子ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを適用することは、費用がかかり、手間がかかる。たとえ処理量が自動化または微小流体を通じて改善され得るとしても、別途の指数関数的増幅がサンプル間変動性の傾向が依然として残っている。
【０００７】
また、核酸分子の複雑な混合物から低存在量の変異体核酸配列を検出し、定量することが困難になり得る。希少な変異配列の検出のための高分析感度を達成することは、提供されたサンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡの量が制限される状況では、特に困難になり得る。そのような方法の適用は、癌にかかった個体の血液中の腫瘍由来のＤＮＡまたはＲＮＡ分子の少量を検出することである。ＤＮＡおよびＲＮＡの断片化された分子は、さまざまな種類の悪性腫瘍を有する患者の癌細胞が死ぬことによって血流中に放出されると知られている。そのような循環腫瘍由来の核酸は、非侵襲性癌のバイオマーカーとして優れた展望を示す。血流において、腫瘍由来の核酸は、腫瘍特異的突然変異の存在を基準として正常な背景ＤＮＡまたはＲＮＡと区別され得る。しかし、そのような突然変異核酸のコピー体は、通常、比較的豊富な正常（野生型分子）分子の背後で少量で存在する。しばしば、突然変異腫瘍由来のコピー体は、血漿のトータルＤＮＡまたはＲＮＡを１％未満含み、時には、存在量が０．０１％以下と低くてもよい。したがって、非常に高い分析感度を有するアッセイが、そのような低存在量のＤＮＡまたはＲＮＡの検出に関与する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、広域パネルのマイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」）、メッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）および他の部類のＲＮＡを同時におよび高度の並列方式で多くのサンプルから定量することを可能にする方法および組成物に関する。これらの方法は、従来のデジタルプロファイリング接近法よりずっと少ない配列深さを使用する。一実施態様では、定量タグが逆転写中に配分され、競合増幅およびディープシークエンシング前に、先行サンプルプーリングが許容される。このような接近法は、大規模の遺伝子発現研究をさらに実用的な範囲内でもたらすためにデザインされる。
【０００９】
また、本発明は、核酸分子の複雑な混合物から低存在量の変異体核酸配列の定量を可能にする方法および組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、開示されたＲＮＡプロファイリング方法を概略的に示す。
【図２】図２は、開示されたＲＮＡプロファイリング方法を使用して複合化されたＲＮＡ定量の正確度を支持するデータを提供する。
【図３】図３は、ヒト組織および基準サンプルからのＲＮＡを使用する方法の定量性を検証するためのデータを示す。
【図４】図４は、ヒト血液においての放射線誘発遺伝子発現変化の高処理測定の結果を示す。
【図５】図５は、色々なｍｉＲＮＡプロファイリングプラットホームを比較するためのデータを提供する。
【図６】図６は、ヒト組織のｍｉＲＮＡの絶対定量の結果を示す。
【図７】図７は、校正用ポリメラーゼの３’から５’エキソヌクレアーゼ活性による末端ブロッキング基の消化に抵抗するためにデザインされたＲＮＡｓｅＨ２活性化可能なプライマーを概略的に示す。
【図８】図８は、系統追跡されたＰＣＲの概略的な説明を提供する。
【図９】図９は、系統追跡されたＰＣＲ実験の結果を示す。
【図１０】図１０は、ビーズ特有のバーコードを含有する熱剥離性プライマーがマイクロビーズ上でどのように生成され得るかを示す一例を示す。
【図１１】図１１は、熱変性により放出され得る一時的に固定されたオリゴヌクレオチドの製造方法を示す。
【図１２】図１２は、同じ反応体積で共増幅されるＰＣＲ生成物に区画固有タグを添加するためのプライマーとして機能できる、クローンタグ付きオリゴヌクレオチドをマイクロコンパートメント内に伝達するためのイン−ソリューション方法を示す。
【図１３】図１３は、異なる標的がＰＣＲ増幅のためにどのように液滴またはマイクロウェル内に無作為に区画化され得るかを示す一例を示す。
【図１４】図１４は、単一反応区画（例えば、マイクロウェルまたは液滴）の内容物の実例を示す。
【図１５】図１５ＡおよびＢは、バーコード化プライマーを担持する単一マイクロビーズを含有するマイクロコンパートメント内で実行される系統追跡ＰＣＲの二つの例示的シナリオを示す。
【図１６】図１６ＡおよびＢは、バーコード化プライマーを担持する単一マイクロビーズを含有するマイクロコンパートメント内で実行される系統追跡ＰＣＲの 二つの 追加の実例シナリオを示す。
【図１７】図１７は、二つ（またはそれ以上）の異なるバーコード化プライマーが所定の区画にある場合、マイクロコンパートメント内で系統追跡ＰＣＲの分析がどのように行われるかを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、広域パネルのマイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」）、メッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）および他の部類のＲＮＡを同時におよび高度の並列方式で多くのサンプルから定量することを可能にする方法および組成物に関する。これらの方法は、従来のデジタルプロファイリング接近法よりずっと少ない配列深さを使用する。一実施態様では、定量タグを逆転写反応中に配分され、競合競合増幅およびディープシークエンシング前に、先行サンプルプーリングを可能にする。このような接近法は、大規模の遺伝子発現研究をさらに実用的な範囲内でもたらすためにデザインされる。
【００１２】
また、本発明は、次世代シークエンシングおよび医学診断に関連した組成物および方法に関する。その方法は、核酸変異体、特に低存在量で利用可能なものまたは豊富な野生型配列により不明瞭にされたものを確認し、定量する段階を含む。また、本発明は、複数のサンプルのうち複数の配列からの特定の配列を確認し定量することに関連した方法に関する。また、本発明は、ポリメラーゼ誤取込（ｍｉｓｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）エラー、シーケンサーシーケンサーエラーおよびサンプル誤分類エラーから純粋な核酸変異体を検出し区別することに関する。一実施態様では、方法は、サンプル内の標的化された核酸へのバーコードおよび分子系統タグ（ＭＬＴ）の早期付着を含む。また、方法は、ＤＮＡ配列を標的化するために高度に特異的な混成化時に遮断されないので、ＭＬＴの配分を可能にする一方で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）中に疑似（ｓｐｕｒｉｏｕｓ）増幅生成物を最小化する３’−遮断されたプライマーのネストされたペア（ｎｅｓｔｅｄ  ｐａｉｒ）の使用を含む。方法は、反応の後期サイクルでＭＬＴ含有プライマーの関与を回避するために、ＰＣＲの最初の数サイクル後にアニーリング温度を上昇させることを含む。また、方法は、配列冗長性を達成するために、クローン性重複ペアエンドシークエンシングを含む。また、方法は、分子系統のトラッキングを可能にするために、多数の小さい反応区画（例えば、オイル中の水性液滴または微小流体装置内の微細な反応体積）にＰＣＲ増幅を分けることを含む。追加の方法は、ＤＮＡ二重螺旋の両鎖で突然変異確認することによって、分析感度を向上させるために、微細な反応体積内に二本鎖ＤＮＡ断片の両鎖を増幅およびタグ付けを含む。また、方法は、反応体積内に核酸内容物の区画固有のタグ付けを容易にするために、多数の小さい反応体積（例えば、マイクロコンパートメント）にクローンタグ付きオリゴヌクレオチドの多重コピー体の導入を含む。一実施態様では、そのようなクローンタグ付きオリゴヌクレオチドは、マイクロビーズまたは区画壁のような表面に付着させることなく区画に導入され得る。
【００１３】
一実施態様では一実施態様では、方法は、複合化されたＰＣＲにおいて低存在量の鋳型核酸をタグ付けし、増幅させることによって、核酸変異体を測定することを含む。低存在量の鋳型核酸は、母胎循環中の胎児ＤＮＡ、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、循環腫瘍ＲＮＡ、エキソソーム−由来ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ウイルスＤＮＡ、移植された器官からのＤＮＡまたは細菌ＤＮＡであり得る。多重ＰＣＲは、突然変異を起こしやすいゲノム領域に対する遺伝子特異的プライマーを含むことができる。一実施態様では、突然変異を起こしやすい領域は、癌と関連して変更する遺伝子内にあり得る。
【００１４】
一実施態様では、プライマーは、バーコードおよび／または分子系統タグ（ＭＬＴ）を含む。一実施態様では、ＭＬＴは、２〜１０個のヌクレオチドであり得る。他の実施では、ＭＬＴは、６、７または８個のヌクレオチドであり得る。一実施態様では、バーコードは、鋳型核酸の起源のサンプルを確認できる。一実施態様では、プライマー伸長反応は、標的化された初期バーコーディングを使用する。標的化された初期バーコーディングでは、異なる核酸領域に特異的な複数の異なるプライマーは、全部同じバーコードを有する。同じバーコードは、特定のサンプルから核酸を確認する。一実施態様では、標的化された初期バーコーディングに対して使用されたプライマーは、特有なバーコード含有オリゴヌクレオチドセグメントを遺伝子特異的プライマーセグメントの均一な混合物とモジュール方式で組み合わせることによって生成される。
【００１５】
一実施態様では、開示された分析法は、臨床目的に使用され得る。一実施態様では、血液内の核酸変異体は、処理前と後に確認および測定され得る。癌の一実例で、核酸変異体（例えば、癌関連突然変異）は、治療（例えば、化学療法、放射線療法、手術、生物学的治療法、それらの組合せ）前に確認および／または測定され得る。次に、治療後に、同じ核酸変異体が確認されるか、測定され得る。治療後に、核酸変異体の量的変化は、治療法が成功的であることを示すことができる。
【００１６】
用語「分子系統タグ」（「ＭＬＴ」）の説明
用語「分子系統タグ」（「ＭＬＴ」）は、合成オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）内に含有された一連の配列を示すために使用され、鋳型核酸分子のコピー体に対して多様な配列タグを配分するために使用される。ＭＬＴの配分は、コピーされた（または増幅された）ＤＮＡ配列の系統がＰＣＲの最初の数サイクル中に鋳型核酸分子から形成された初期のコピー体を追跡することを可能にする。分子系統タグは、縮重および／またはあらかじめ定められたＤＮＡ配列を含有できるが、多様なタグ集団が色々な縮重位置を組み込むことによって、最も簡単に行われる。分子系統タグは、２〜１４個の縮重塩基位置を有するようにデザインされるが、好ましくは、６〜８個の塩基位置を有する。塩基は、連続的である必要はなく、一定の配列によって分離され得る。オリゴヌクレオチド分子集団で生成され得る可能なＭＬＴの数は、一般的に、ＭＬＴ配列の長さおよび各縮重位置においての可能な塩基の数によって決定される。例えば、もしＭＬＴが８塩基の長さであり、各位置でＡ、Ｃ、ＧまたはＴを有する可能性がほぼ同一である場合、可能な配列の数は、４＾８＝６５，５３６個である。ＭＬＴは、それぞれのコピーされた鋳型分子に対する完全に特有な配列タグの配分を保証するために、十分な多様性を有する必要はないが、任意の所定のＭＬＴ配列を特定の分子に配分する可能性は低くなければならない。可能なＭＬＴ配列の数が多いほど、所定の鋳型分子に配分される任意の特定の配列の可能性が低くなる。多くの鋳型分子がコピーされ、タグ付けされるとき、同じＭＬＴ配列が一つ以上の鋳型分子に配分され得る。ＭＬＴ配列は、初期コピーから増幅、プロセッシングおよびシークエンシングまでの分子系統を追跡するために使用される。それらは、純粋な突然変異鋳型分子に由来する配列からのポリメラーゼ誤取込またはシーケンサーシーケンサーエラーから発生する配列を区別するために使用され得る。また、ＭＬＴは、増幅されたＰＣＲ生成物が一本のＤＮＡ鎖または二つ以上のＤＮＡ鎖からコピーされるとき（例えば、鋳型核酸断片の単一コピー体が小さい反応区画内で増幅されるとき）、確認のために使用され得る。また、ＭＬＴは、増幅プール中にバーコードのクロスオーバーの結果として誤ったバーコード配分を有する配列を区別するために使用され得る。
【００１７】
用語「分子系統タグ付け」は、核酸鋳型分子に対して分子系統タグを配分する過程を示す。ＭＬＴは、プライマー内に組み込むことができ、鋳型に対するプライマーの特異的な伸長により標的化された鋳型核酸断片から形成されたコピー体に付着され得る。
【００１８】
方法
高処理量ＲＮＡ定量：
ｑＲＴ−ＰＣＲの定量の長所を保有する一方で、シーケンシングベースの読み出しを使用することによって得られるプールサンプルに関連した単一反応の単純性、スケーラビリティおよび均一性に影響を及ぼすＲＮＡ定量戦略が記述される。図１は、開示されたＲＮＡプロファイリング方法を概略的に示す。実例は、９６個のサンプルからの９６個のｍｉＲＮＡの測定を描写する。図１（Ａ）は、モジュールＲＴプライマーミックスが二段階で合成されることを示す：標的特異的配列を含有する９６個の部分的に合成された３’プライマーセグメントがプールされた後、サンプルマーカーとして使用される９６個の５’タグセグメントの添加のために再分布される。結果的に、生成された９６個のプライマーミックスは、それぞれ異なるタグを有する。合成の第２段階が各カラムで３’セグメントの同じ均一混合物で始めるため、最終プライマーミックスは全部、類似な比率の標的特異的配列を共有する。図１（Ｂ）は、各サンプルが標的ＲＮＡ存在量に比例してｃＤＮＡに対してサンプル特異的計量タグを配分するために、まず、サンプル特異的モジュールプライマーミックスを使用して多重逆転写（ＲＴ）されることを示す。すべてのサンプルからのタグ付きｃＤＮＡは、単一体積に組み合わせられ、プライマー伸張配列に相補的であるビオチン標識オリゴヌクレオチドを使用して溶液中のハイブリッドキャプチャにより精製される。多数のサンプルからのタグを有するプールｃＤＮＡは、次に、プラトー相（ｐｌａｔｅａｕ  ｐｈａｓｅ）とされる各標的の競合的な単一構成のＰＣＲで共同増幅される。ディープシークエンシングされたアンプリコンからのタグ／標的組合せのカウンティングは、すべてのサンプルにわたるＲＮＡの相対的存在量（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を示す。
【００１９】
特定の実施態様で、方法は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）または他のＲＮＡ部類を定量できる。方法は、別途のエンドポイントＰＣＲが低および高存在量（ｌｏｗ−  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ａｂｕｎｄａｎｃｅ）のＲＮＡ種の総コピー体を略平等にするため、他の標的化されたまたは全体転写体のシークエンシング方法より塩基当たり平均配列深さが非常に少ないことを必要とする。したがって、希少な転写物は、豊富なサンプルをオーバーサンプリングする必要なしに、適切にサンプリングされ、広い動力範囲を得る一方で、配列の経済性を最大化できる。下記の表１から分かるように、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔパーソナルベンチ−トップシーケンサーの最低出力モード（１百万より少ない読み込み）が９６個のサンプルからの９６個のＲＮＡを迅速で且つ低価で定量するために使用され得、９，２１６個の個別的なｑＲＴ−ＰＣＲ分析と同等なデータを提供する。さらに多数のサンプルセットの分析は、ひいては、反応チューブの数がＲＮＡの数および評価されるサンプルの数の合計−生成物ではない−として増加されるので、ｑＲＴ−ＰＥＣと比較してこの接近法の単純性を強調する。
【００２０】
[表１]
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【００２１】
一実施態様では、方法は、先行サンプル並列化を可能にし、シークエンシングの直前に、サンプルを組み合わせる接近法より優れた色々な利点をもたらす。作業の流れは、非常に単純化され、微小流体装置または自動化を必要としない。すべてのＲＴ後の段階においてのプールプロセッシングは、サンプルにわたって定量的可変性を減少させると予想される。各標的のＰＣＲを完了することによって、配列深さは、大部分豊富な転写物により消費されるのではなく、すべての標的にわたって均一に分布する。したがって、配列深さに関連したサンプル当たりの費用は、最小化される一方で、アンプル深さは、低存在量の転写物のうちサンプル内での差異を正確に定量するために保存される。
【００２２】
方法は、初期サンプルプーリングを利用し、非常に少ない配列深さを使用し、短いｍｉＲＮＡを標的化するため、従来の標的シークエンシング接近法と異なっている。また、それは、ｑＲＴ−ＰＣＲまたは大部分の混成化に基づく接近法より配列変異体（特にさらに長いｍＲＮＡ標的）の識別に一層適している。方法は、次世代シークエンサが他の微小流体または直接分子カウンティング技術により使用された特殊化された多くの機器より制度的な核施設でさらに通常的に入手可能であるため、大部分の研究所にて広範囲にアクセス可能でなければならない。また、方法は、異なるシークエンシングプラットホームにも容易に適用可能であり、多様な機能的ＲＮＡ部類を分析するために拡大され得、最小限の計算インフラおよび専門知識を使用する。
【００２３】
低存在量の核酸変異体の定量：
核酸配列変異体を確認し定量する方法および組成物が開示される。ＤＮＡまたはＲＮＡの複合混合物から低存在量の配列変異体を確認し定量する方法が開示される。方法は、多様な類型の癌にかかった患者の循環系で発見され得る少量の腫瘍由来ＤＮＡを測定できる。
【００２４】
希少な変異型ＤＮＡ配列の評価は、多くの生物学および医学分野において重要である。少量の胎児ＤＮＡが妊婦の循環系で発見され得る。一実施は、胎児の疾患関連遺伝的特徴または性別を評価するために使用され得る希少な胎児ＤＮＡを分析することを含む。受容体により拒否反応を示す器官は、少量のＤＮＡを血液に放出させることができ、このドナー由来のＤＮＡは、ドナーと受容体間の遺伝的差異を基に区別され得る。一実施は、臓器拒否反応および治療の有効性に関する情報を提供するために、ドナー由来のＤＮＡを測定することを含む。他の実施で、核酸は、患者サンプルの感染病原体（例えば、バクテリア、ウイルス、真菌、寄生虫など）から検出され得る。病原体由来核酸の変異に関する遺伝情報は、感染の特徴をよりよく特定し、治療決定に役立つ。例えば、患者に感染するバクテリアゲノム中の抗生物質耐性遺伝子の検出は、抗生物質治療を指示することができる。
【００２５】
低存在量の突然変異の検出および測定は、腫瘍学分野において多くの場合、重要な用途にに適用される。腫瘍は、体細胞性突然変異を取得すると知られているが、それらの一部は、癌細胞の制御されない増殖を促進する。そのような突然変異の確認および定量は、腫瘍学分野において核心的な診断目標になった。同伴診断は、癌の突然変異の原因を特定し、次に、その特定の突然変異に対する効果的な治療法を施すに際して、重要手段になった。ひいては、一部の腫瘍は、標的化された治療法に対する耐性を付与する新しい突然変異を取得する。したがって、腫瘍の突然変異状態の正確な測定は、所定の患者に対する特定治療法の適切性を決定する上で重要な要因であり得る。しかし、腫瘍特異的体細胞性突然変異を検出することは、特に生検または切除標本から得られた腫瘍組織が大きい背景においての間質細胞で少数の腫瘍細胞を有する場合、難しい。腫瘍由来の突然変異型ＤＮＡは、血液、痰、尿、便、胸水または他の生物学的サンプルにおいてごく微量に存在するときに測定することがさらに困難であり得る。
【００２６】
腫瘍由来のＤＮＡは、多様な類型の悪性腫瘍がある患者の死んでいく癌細胞から血流中に放出される。循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の検出は、限定するものではないが、悪性腫瘍の存在の検出、予後の通知、治療効能の評価、腫瘍突然変異等級の変化追跡および疾患再発または進行に対するモニタリングなどを含む色々な用途を有する。特有の体細胞性突然変異が血漿で正常背景ＤＮＡと腫瘍由来のＤＮＡとを区別するために使用されるため、そのような循環腫瘍由来のＤＮＡは、従来の血清蛋白質マーカーの臨床用途を補完できる臨床用途を有する高度に特異的な癌生体マーカーの新しい部類を示す。一実施態様では、方法は、腫瘍特異的、体細胞性突然変異の存在に対してｃｔＤＮＡをスクリーニングすることを含む。そのような実施で、偽陽性結果は、健康な個体の血漿ＤＮＡの癌関連突然変異を発見する可能性が非常に少ないため、非常に珍しい。開示された方法は、高い分析感度および特異性で癌細胞から血流中に入る希少な突然変異型ＤＮＡ分子を測定する方法を含む。非常に高い検出感度を達成することは、初期（およびさらに硬化しやすい）段階で小さい腫瘍の検出するためには特に重要である。
【００２７】
体細胞性突然変異が多様な癌関連遺伝子内で多数の可能な位置で発生し得るため、ｃｔＤＮＡを分析するための臨床的に有用な試験は、多くの遺伝子で同時に、好ましくは、多くのサンプルから同時に突然変異を評価できる必要がある。複数のサンプルから複数の突然変異を起こしやすい領域の分析は、大量並列シークエンシング技術を使用して得られる大量の配列データのさらに効果的な使用を可能にする。一実施態様では、所定のサンプルから発生する分子をバーコードまたはインデックスとしても知られているサンプル特異的ＤＮＡ配列タグで標識することは、一つ以上のサンプルの同時分析を容易にする。異なるサンプル由来の分子を標識するために、区別されるバーコード配列を使用することによって、分子を組み合わせ、混合物に対して大量並列シークエンシングを行うことが可能である。結果的な配列は、次にどの配列がどんなサンプルに由来したかを測定するために、バーコード同一性を基準として分類され得る。誤分類の機会を最小化するために、バーコードは、任意の所定のバーコードが最低二つの位置で異なる塩基を有することによって、セットのすべての他のバーコードと確実に区別され得るようにデザインされる。
【００２８】
大量並列シークエンシングのためにサンプルを製造するために現在使用される大部分のプロトコルで、バーコードは、色々な段階のサンプルプロセッシング（例えば、精製、増幅、エンドリペアなど）後に付着される。バーコードは、バーコーディングされたシークエンシングアダプタの結紮により、または、関心ある核酸のコピー体を形成するために使用されるプライマー内へのバーコードの統合により付着され得る。二つの接近法は、いずれも、通常、バーコードが付着され得る前に、各サンプル由来の核酸に対して別々に行われる色々なプロセッシング工程を使用する。バーコードが付着された後にのみ、サンプルが混合され得る。
【００２９】
一実施態様では、バーコードは、サンプルプロセッシングの非常に初期の段階で標的化された分子に配分される。標的化された初期バーコード付着は、多数のサンプルのシークエンシングがバッチで行うこと可能にするだけでなく、多くのプロセッシング段階が組合せわられた反応体積で行われることを可能にする。ひとまずバーコードがサンプル特異的な方式で核酸分子に付着されると、分子を混合することができ、それ以降の全ての段階が単一チューブで行うことができる。もし大多数のサンプルが分析されると、標的化された初期バーコーディングは、作業の流れを大きく単純化することができる。すべての分子が単一チューブで同じ条件の下に処理され得るため、分子は、均一な実験条件を経験し、サンプル間の変化も最小化される。一実施態様では、異なるサンプルからの核酸のタグ付けは、一定の割合で達成され得、次に、サンプルにわたって核酸濃度の定量的比較を可能にするために使用される。したがって、初期バーコーディングは、多くのサンプルにわたって、変異体だけでなく、多様な標的化された核酸の総量を定量するために使用され得る。
【００３０】
一実施態様では、サンプル特異的バーコードおよび一定比率の遺伝子特異的セグメントの組合せを含有するプライマーの明確に定義された混合物が製造される。そのようなプライマーは、標的化された初期バーコーディングおよびその後のバッチ式サンプルプロセッシングに使用され得る。これらのプライマーは、また、異なるサンプルでＤＮＡまたはＲＮＡの定量に使用され得る。一実施態様では、そのようなプライマーは、単純化されたおよび均一な方式で多数のサンプルから多数の突然変異を起こしやすいゲノム標的領域の並列プロセッシングおよび分析を許容する。
【００３１】
現在の開示された方法は、突然変異型ＤＮＡの有無を単純に測定するのではなく、それを正確に定量する方法を含む。一実施態様では、突然変異型ＤＮＡの量は、腫瘍量および予後に関する情報を提供する。現在の開示された方法は、 アポトーシス性死滅を進行する細胞からの放出時の分解によるものだけでなく、血液由来のヌクレアーゼによる分解により高度に断片化されるＤＮＡを分析できる。体細胞性突然変異が多様な癌関連遺伝子内で多数の可能な位置で発生し得るため、一実施は、所定のサンプルから 同時に多くの遺伝子の突然変異を評価できる。現在の開示された方法は、どんな突然変異が患者の腫瘍に存在するかを事前に知らなくてもｃｔＤＮＡの突然変異を発見できる。一実施は、腫瘍特異的体細胞性突然変異を発達させやすいゲノムＤＮＡの多重領域を評価することによって、多くの異なるタイプの癌に対してスクリーニングすることができる。一実施は、サンプル間の変化を最小化するために、同じ反応チューブ内で一緒に組合せわられた複数のサンプルを含む。
【００３２】
たとえ現在開示された方法が癌を有する患者の血漿または血清で正常（野生型）無細胞ＤＮＡをベースに少量の突然変異循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の測定に最適化されたが、方法は、多様な供給源からの核酸変異体の分析のために、より広範囲に適用され得ることが認知される。そのような供給源の実例としては、限定するものではないが、リンパ節、腫瘍辺縁、胸水、尿、便、血清、骨髄、末梢白血球、口腔粘膜検体採取（ｃｈｅｅｋ  ｓｗａｂ）、循環腫瘍細胞、脳脊髄液、腹水、羊水、嚢胞液、冷凍腫瘍標本、およびホルマリン固定されているおよびパラフィン包理されている腫瘍標本を含む。
【００３３】
方法
高処理量ＲＮＡ定量：
単純化されたおよび正確なＲＮＡ測定のための先行サンプル並列化：
一実施態様では、高処理量ＲＮＡ定量方法は、次の基本的な段階を通じて行われることができる。
【００３４】
一実施態様では、作業の流れの早期並列化を可能にするために、サンプル特異的カウンティンタグ（バーコード）が逆転写（ＲＴ）中に各サンプル内で標的化されるＲＮＡ分子のパネルに配分される。一実施態様では、遺伝子特異的プライマーは、逆転写のために関心あるＲＮＡを標的化するのに使用される。一実施態様では、関心あるＲＮＡは、マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）または任意の他のＲＮＡ類型であり得る。一実施態様では、遺伝子特異的プライマーは、サンプル特異的バーコードで標識される。一実施態様では、サンプル特異的バーコードは、逆転写中に相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に配分される。一実施態様では、ｃＤＮＡに配分された所定のサンプル特異的タグの量は、サンプル中の該当するＲＮＡの存在量に比例する。一実施態様では、逆転写に対して使用されたプライマーの遺伝子特異的ハイブリダイゼーション領域は、６ヌクレオチドほど短くてもよく、４０ヌクレオチドほど長くてもよい。特定の実施で、遺伝子特異的混成化配列は、短いマイクロＲＮＡ標的を逆転写するために使用されるとき、６ヌクレオチド長である。一実施態様では、６−塩基対ＲＮＡ／ＤＮＡ相互作用の特異性および安定性を増大させるために、マイクロＲＮＡに結合しないプライマー塩基は、共通プライマー配列に相補的であるビオチン化オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって、マスキングされ得る。特定の実施態様では、遺伝子特異的混成化配列は、さらに長いメッセンジャーＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡ標的を逆転写するために使用されるとき、１５〜２５ヌクレオチド長である。一実施態様では、多重遺伝子特異的プライマーが多重ＲＮＡ配列の標的化された逆転写（ＲＴ）を行うために同じ反応体積で使用され得る。一実施態様では、所定のサンプルからのＲＮＡを逆転写させるために使用されたすべてのプライマーは、同じサンプル特異的バーコード（タグ）を含有する。一実施態様では、複数のサンプルは、別々の反応体積で同時に逆転写され得る。一実施態様では、逆転写が完了するとき、すべてのサンプルからのすべてのタグ付きｃＤＮＡコピー体は、単一体積で組み合わせられ、精製され得る。一実施態様では、プールｃＤＮＡは、表面に固定されたストレプトアビジンまたはその類似体を使用してビオチン捕捉により精製され得る。
【００３５】
一実施態様では、異なるサンプル由来のＲＮＡが一定の割合で相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に対してコピーされることを保証するために、モジュールオリゴヌクレオチド合成スキームが使用される。一実施態様では、ｊサンプルから逆転写中に、ｉＲＮＡの複合化標的標識を可能にするために、サンプル特異的タグに結合された標的特異的配列のｉｘｊ組合せを有するＲＴプライマーを生成する必要があった。一実施態様では、定量の一貫性を保証するために、同じ比率のすべての標的特異的配列を有する特有にタグ付きプライマーミックスを使用して異なるサンプルを逆転写させることが重要であった。個別的に形成されたプライマーを単に数千個混合することは、非実用的であり、不正確な比率を生成するため、２段階モジュール式オリゴヌクレオチド合成戦略が使用された。一実施態様では、オリゴヌクレオチド合成は、色々な異なる標的特異的プライマー配列を形成した後、停止することができる。一実施態様では、合成器が停止することができ、部分的に合成されたオリゴヌクレオチドを含有した粒子が混合され、色々な新しい合成カラムに分配され得る。一実施態様では、特有のサンプル特異的タグおよびユニバーサルＰＣＲプライマー結合部位を含む各カラムに配列を加えることにより合成を再開することができる。一実施態様では、色々なプライマーミックスが生成されるが、それぞれ５’セグメントに特有なサンプル特異的タグおよび３’セグメントに色々な標的特異的プライマー配列の均一な組成を有する。
【００３６】
一実施態様では、すべてのサンプル由来のタグ付きｃＤＮＡがプールされ、精製される。一実施態様では、ｃＤＮＡプールが、別途の、シングルプレックス、エンドポイントＰＣＲ（安定期に対して取られる）によって各標的の増幅のために別々の反応体積に分配される。所定のｃＤＮＡ種に関連したすべてのサンプル特異的タグが単一体積で競合競合的に増幅されるため、ＲＮＡ存在量をコード化するタグ比が保存される。一実施態様では、ＰＣＲプライマーの５’末端でシークエンシングアダプタの統合は、結果的に生成されるアンプリコンがプールされ、ゲル精製され、追加のライブラリー製造段階なしに大量並列シークエンシングに対する鋳型として直接使用されることを可能にする。
【００３７】
一実施態様では、多様なサンプル中のＲＮＡの相対量は、ＰＣＲ生成物の大量並列シークエンシングにより得られた各ｃＤＮＡ配列に関連したサンプル特異的タグを計数することによって推論され得る。
【００３８】
モジュール式プライマーミックスの効用および組成：
ＲＮＡプロファイリング方法に対して、標的化された核酸分子（特に、ＲＮＡ鋳型からコピーされたｃＤＮＡ）にサンプル特異的タグを配分するために、モジュール式プライマーミックスが使用された。しかし、そのようなモジュール式プライマーミックスは、広範囲な用途を有することができる。それらは、より一般的には、標的化された核酸分子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）の分布または頻度を確認、範疇化、分類、区分、カウンティングまたは測定することを補助できるタグを配分するために使用され得る。モジュール式プライマーミックスは、３’セグメントに多数の異なる標的特異的配列を有し、５’セグメント特有のタグ配列を有するプライマーの混合物である。しばしば、いくつかのモジュール式プライマーミックスは、それぞれのプライマーミックスが別個のタグを有し、すべてのミックスが標的特異的配列の同一組成を有するようにセットとして形成される。標的およびタグの数が大きくなるとき、プライマーを個別的に合成し、次に、それらを混合することが実用的でないことがある。
【００３９】
モジュール式プライマーミックス中に統合されるタグ（また、バーコードまたは標識とも言及される）は、任意的な配列で構成され得るが、通常、確実に区別され得る所定の配列を含む。例えば、ＲＮＡプロファイリング方法において、各タグは、少なくとも二つのヌクレオチド位置がセットのすべての他のタグと異なるようにデザインされ、シークエンシングエラーはタグの誤分類をめったに誘導しない。タグは、塩基の単一の、連続的ストレッチ内に含まれる必要はない。特定の実施では、タグ配列を含むヌクレオチド位置は、モジュール式プライマーミックスの５’セグメントの非連続領域にわたって分布することができる。タグは、また、無作為または縮重位置を含有する（縮重位置は、例えば四個のヌクレオチドＡ、Ｔ、ＣおよびＧがオリゴヌクレオチド合成中に同等な可能性で統合される所である）。しかし、モジュール式プライマーミックス内のタグは、事前規定された（縮重でない）配列を有する少なくとも一部の位置を含有しなければならない。
【００４０】
モジュール式プライマーミックス内で、タグは、サンプル特異的である必要はない。例えば、タグは、サンプル、分子、位置または区画に配分され得る。また、タグは、サンプルセット、分子セット、位置セットまたは区画セットに配分され得る。用途によって、タグの配分は、無作為であるか（例えば、任意のタグが任意のサンプル、分子、位置または区画に無作為に配分される）、または事前規定されたものであってもよい（例えば、当業者は、特定のサンプル、分子、位置または区画に特定のタグを配分するように決定できる）。タグの特有な配分必ずしも必要なものではない。一部の用途に対して、各サンプル、分子、位置または区画には、特有のタグを配分しなければならない。一部の他の用途に対して所定のタグが一つ以上のサンプル、分子、位置または区画に配分されることを可能にする。
【００４１】
一部の用途で、一つ以上のモジュール式プライマーミックスが標的または標的セットを標識するために使用され得る。例えば、モジュール式プライマーミックスは、ＰＣＲ増幅反応の順方向および逆方向プライマーセットの両方として使用され、標的に対する二つの別個のタグの配分を許容できる。標識の大きい多様性は、タグ付き順方向および逆方向プライマーミックスの多様な組合せを使用することによって達成され得る。
【００４２】
複合混合物から低存在量の突然変異型ＤＮＡの定量
鋳型ＤＮＡの分離：
多様な臨床または実験標本からＤＮＡまたはＲＮＡの精製または分離方法が開示される。多くのキットおよび試薬が核酸精製を容易にするために市販されている。分析しようとするサンプルの類型によって、適切な核酸分離技法が選択され得る。後続の酵素反応段階（例えば、重合反応）を抑制する物質は、除去されるか、精製されたＤＮＡまたはＲＮＡサンプルで非抑制性濃度に減少しなければならない。核酸の収率は、可能な限り、最大化されなければならない。精製中にＤＮＡが消失されることは、消失されたＤＮＡが希少な変異型ＤＮＡを含むこともできるため、不利である。血漿からＤＮＡを分離するとき、約１ｎｇ〜１００ｎｇの無細胞ＤＮＡは、１ｍＬの血漿から精製され得、それは、約３５０〜３５，０００ゲノムコピー体に該当する。ＤＮＡ収率は、特に癌のような進行中の疾患過程を有する患者にたいして劇的に変化できる。
【００４３】
一実施態様では、ＤＮＡは、また、限定するものではないが、次を含む他のサンプル類型から分析され得る：胸水、尿、便、血清、骨髄、末梢白血球、循環腫瘍細胞、脳脊髄液、腹水、羊水、嚢胞液、リンパ節、冷凍腫瘍標本、およびホルマリン固定されているおよびパラフィン包理されている腫瘍標本。
【００４４】
系統追跡ＰＣＲ
一実施態様では、標的化された鋳型ＤＮＡ分子が遺伝子特異的プライマーを使用して「分子系統タグ」（ＭＬＴ）で標識されることを可能にし、これらのタグ付きコピー体が次にユニバーサルプライマーを使用して追加にコピーされる（増幅される）ことを可能にする方法が提供される。一実施態様では、このような反応は、試薬の伝達なしに単一反応体積で行われ、それは、過程の単純性という顕著な長所を提供する。図８に示されているように、ＭＬＴ配列を含有する色々な遺伝子特異的プライマーが、関心ある複数の標的化されたゲノム領域（例えば、癌の体細胞性突然変異を起こしやすい領域）を同時にコピーし標識するために使用される。遺伝子特異的プライマーは、ユニバーサルプライマーの溶融温度より低い溶融温度（標的遺伝子配列に対する混成化のために）を有する。標的化された鋳型ＤＮＡ断片のコピーおよびＭＬＴ配列の配分は、ＰＣＲの最初の数（２〜４）サイクルの間にさらに低いアニーリング温度を使用することによって促進される。後続のＰＣＲサイクルで、アニーリング温度は、ＭＬＴ含有遺伝子特異的プライマーの反応への追加の関与を阻止するために上昇される。順方向の遺伝子特異的プライマーの５’部分は、順方向のユニバーサルプライマー配列の３’部分と同一の共通配列を含有する。逆方向の遺伝子特異的プライマーの５’部分は、ユニバーサル逆方向プライマー配列の３’部分と同一の第２（異なる）共通配列を含有する。
【００４５】
ユニバーサルプライマー配列は、遺伝子特異的プライマーより高い溶融温度を有するようにデザインされる。一実施態様では、ユニバーサルプライマーは、混成化安定性を増加させるために、一部の位置でヌクレオチド類似体、例えば架橋型人工核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ，ＬＮＡ）残基で変形され得る。あるいは、ユニバーサルプライマーは、溶融温度を増加させるために、単に、さらに長い配列および／またはさらに大きいＧ／Ｃ含量を有することができる。ＰＣＲの後期サイクル（最初の２〜４サイクル後）の間に、熱サイクリングのアニーリング温度は、ユニバーサルプライマーが効果的に混成化できる水準に上昇し得るが、遺伝子特異的プライマーは、そうできない。したがって、最初の数ＰＣＲサイクルに生成されたＭＬＴ標識されたコピー体は、増幅され始め、アンプリコン配列の大部分を含まなければならない。
【００４６】
一実施態様では、遺伝子特異的プライマーは、相対的に低い濃度（それぞれ〜１０から〜５０ｎＭ）でＰＣＲカクテルに存在することができるが、バーコーディングされたユニバーサルプライマーは、さらに高い濃度（それぞれ〜２００から〜５００ｎＭ）で存在する。一実施態様では、バーコードおよびアダプタ配列を欠く短いユニバーサルプライマーは、また、相対的に高い濃度（それぞれ〜１００ｎＭから〜５００ｎＭ）でカクテルに添加され得る。低濃度の遺伝子特異的プライマーの混成化および延長のための十分な時間を許容するために、さらに長いアニーリング時間が最初の数ＰＣＲサイクルに使用され得、この際、選択的にアニーリング温度にゆっくり冷却される。後続のＰＣＲサイクルの間に、ユニバーサルプライマーのさらに高い濃度のために、さらに速いアニーリング時間が使用され得る。
【００４７】
標的外混成化および遺伝子特異的プライマーの延長の最小化は、この方法の成功に重要である。同じ反応カクテル内においてのユニバーサルプライマーの存在のため、遺伝子特異的プライマーの相互間の混成化および延長（すなわちプライマー二量体の形成）を最小化することが特に重要である。遺伝子特異的プライマーのうち極めて少量の二量体の形成でも、反応には致命的であることがあるが、そのような二量体がユニバーサルプライマーにより指数関数的にコピーされ、増幅され得るためである。もし二量体の増幅が反応より優位に立つと、標的化された遺伝子領域は、十分に増幅されなくてもよい。遺伝子特異的プライマーの標的外混成化および延長を最小化するために、一実施態様では、遮断された遺伝子特異的プライマーが使用される。そのようなプライマーの３’末端は、ＰＣＲポリメラーゼにより延長され得ない一つ以上の残基で遮断される。遮断基は、ポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性により消化されてはならないことがまた重要である。この目的のために、一実施態様では、二つのヌクレオチドがプライマーの末端で逆方向に付着される（これにより、最後から2番目の結合は、３’−３’である）。図７に示されているように、単一ＲＮＡ残基がＤＮＡオリゴヌクレオチドに導入され、遮断基がプライマーの標的特異的混成化時に熱安定性ＲＮＡｓｅＨ２酵素により切断され得る。遮断基が切断されるとき、プライマーは、それの目的の標的に対して延長することができる。一部の疑似混成化および延長が相変らず発生し得る一方で、そのような手段は、反応に及ぼす影響を最小化できる。
【００４８】
図７は、校正用ポリメラーゼの３’から５’エキソヌクレアーゼ活性による末端遮断基の消化に抵抗するようにデザインされたＲＮＡｓｅＨ２活性化可能プライマーを概略的に示す。遮断基は、プライマーの非特異的延長を防止するために、特にプライマー二量体の形成を回避するために、プライマーの３’末端に添加される。プライマーがそれの標的ＤＮＡ配列に特異的に混成化されるとき、熱安定性ＲＮＡｓｅＨ２酵素は、単一ＲＮＡヌクレオチドでプライマーを切断し、次にポリメラーゼにより延長することができる３’ヒドロキシル末端末端を生成する。「Ｄ」で表示された位置は、標的配列に相補的であるＤＮＡヌクレオチドを示す。「ｒ」で表示された位置は、標的配列に相補的であるＲＮＡヌクレオチドを示す。「ＸＸ」により表示された遮断基は、逆方向に付着された二つのヌクレオチドを示す（最後から２番目の結合は、３’−３結合であり、末端「Ｘ」は、フリー５’ヒドロキシルを有する）。ＸＸ位置は、５’−ＣＥ（ベータ−シアノエチル）ホスホラミダイトを使用して合成される。ｄＡ−５’ホスホラミダイトが使用されたが、当業者は、また、ｄＣ−５’、ｄＴ−５’またはｄＧ−５’を使用できる。ポリメラーゼは、５’末端から延長せず、または校正用（ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、そのような末端を消化しない。この実例で、プライマーの５’領域は、縮重分子系統タグおよびユニバーサルプライマー配列を有するものと描写されるが、これらの特徴は、選択的であり、且つサンプル特異的バーコードのような他の特徴も含まれることができる。
【００４９】
図８は、系統追跡ＰＣＲの概略的な説明を提供する。系統追跡されたＰＣＲの目標は、分子系統タグ（ＭＬＴ）をＰＣＲの最初の数サイクルの間に鋳型分子に配分し、次にこれらタグ付きコピー体を後続のＰＣＲサイクルの間に（追加のＭＬＴの統合を最小化しつつ）、ユニバーサルプライマーを使用して増幅させることである。このような戦略は、ポリメラーゼ誤取込エラーおよびシーケンサーエラーから純粋な鋳型由来の突然変異を区別するために使用され得る。また、戦略は、二本鎖ＤＮＡ鋳型の両鎖が液滴またはマイクロウェルのような小さい反応体積内でタグ付けされ、増幅されたことを確認するために使用され得る。系統追跡されたＰＣＲは、試薬を伝達するか、添加することなく、連続的な熱サイクリングプログラムを使用して単一反応体積でまたは多重微細反応体積で行われることができる。方法は、低溶融温度（例えば６０℃）を有する遺伝子特異的プライマー、およびさらに高い溶融温度（例えば７２℃）を有するユニバーサルプライマーを使用する。遺伝子特異的プライマーは、５’領域にユニバーサルプライマー配列だけでなく、ＭＬＴ配列を含有する。ＰＣＲの少なくとも最初の２（しかし、最初の４ほどまで）サイクルは、低いＴｍ（例えば、６０℃）で行われ、ＭＬＴ含有遺伝子特異的プライマーの混成化および延長を可能にする。後続するＰＣＲの〜３０サイクルに対して、ユニバーサルプライマーの優先的な使用を促進し、追加のＭＬＴの統合を最小化するために、さらに高いＴｍ（例えば、７２℃）が使用される。ユニバーサルプライマーによる疑似生成物の増幅を回避するために、遺伝子特異的プライマーからプライマー二量体の形成を最小化することが緊要である。したがって、プライマー特異性を増大させるためのスキーム、例えばＲＮＡｓｅＨ２活性化可能な遺伝子特異的プライマーが使用されなければならない。また、ユニバーサルプライマーがＲＮＡｓｅＨ２活性化可能であってもよいが、選択的である。ここで、ユニバーサルプライマーは、サンプル特異的バーコードを含有することが示されるが、プライマーのこの部分は、省略されるか、または他の特徴が意図的用途に応じて統合され得る。Ｔｍ＝溶融温度。ＭＬＴ＝分子系統タグ。
【００５０】
図９は、系統追跡されたＰＣＲ実験の結果を示す。図９（Ａ）は、単一チューブの系統追跡されたＰＣＲ実験からの増幅生成物が２％アガロースゲル上で予想されたサイズで移動するバンドを生成することを示す。図９（Ｂ）は、系統追跡されたＰＣＲ増幅生成物から生成された次世代シークエンシングデータの分析が棒グラフでＭＬＴコピー体の予想された分布パターンを示すことを示す。分析されたサンプルは、健康な支援者の血漿由来の〜６０００ゲノム当量の二本鎖野生型ＤＮＡのにスパイクされた既知のＫＲＡＳＧ１２Ｃ突然変異を含有する〜２０ゲノム当量の二本鎖ＤＮＡで構成された。Ｘ軸は、所定のＭＬＴ配列ペアが発見されたＫＲＡＳＧ１２Ｃ突然変異の読み込みの数を示す。Ｙ軸は、所定の数の読み込みコピー体を有する特有のＭＬＴ配列ペア（異なるタグ）の数を示す。略２０個の二本鎖突然変異型ＤＮＡコピー体が反応に添加されたので、〜４０の異なるＭＬＴ配列ペアが、観察されたように、複数の読み込みカウントを有するものと予想された。
【００５１】
また、一実施態様では、ユニバーサルプライマーの特異性は、ＲＮＡｓｅＨ２−切断可能な遮断基をプライマー内に組み込むことによって増大することができる。また、一実施態様では、ユニバーサルプライマーは、サンプル特異的バーコードで標識され得、異なるサンプルに対する異なるバーコード化プライマーの使用が、ＰＣＲ生成物がプールされ、バッチ式で次世代シークエンシングが行われることを許容する。配列データは、次にバーコード同一性をベースにサンプル特異的ビン（ｂｉｎｓ）に分類され得る。また、一実施態様では、ユニバーサルプライマーは、アダプタ配列を含有でき、それは、選択された次世代シークエンシング（ＮＧＳ）プラットホーム上でのシークエンシングを容易にする。一実施態様では、長い（サンプル特異的バーコードおよびアダプタ配列を含有する）および短い（バーコードおよびアダプタを欠く）ユニバーサルプライマーの混合物が使用され得る。短いプライマーがさらに速い混成化速度（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を有するため、それらは、ＰＣＲの初期サイクル中の増幅効率を増大させることができる。
【００５２】
特定の実施で、ＤＮＡ生成物は、大量並列シークエンシングが行われる前に、所望サイズの生成物を選択し、使用しないプライマーを除去するためにゲル精製される。特定の実施で、限定するものではないが、ビオチンタグ付き相補性オリゴヌクレオチドを使用するハイブリッド捕捉、高性能液体クロマトグラフィー、毛細管電気泳動、シリカ膜分割、または磁性固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズへの結合を含んで他の精製接近法が使用され得る。
【００５３】
一実施態様では、次世代シーケンサーが、タグされ、増幅され、精製されたＰＣＲ生成物から大多数の配列を得るために使用される。そのようなシーケンサーにより生成されたクローン配列（各配列は、単一核酸分子から発生する）は、ウルトラディープシークエンシングとして知られている接近法を使用して変異体分子を確認し定量するために使用され得る。原則的に、多数の配列が各標的部位および各サンプル毎に得られるため、希少な変異体が検出され、測定され得る。しかし、シーケンサーのエラーが純粋な変異体として誤判断され得るため、シーケンサーのエラー速度は、検出感度を制限できる。シーケンサーエラーの寄与を最小化するために、一実施は、クローン重複ペアエンド配列を使用する。各クローン集団からのＤＮＡの反対鎖を別々にシークエンシングすることによって、且つ、配列の重複領域を比較することによって、シーケンサーエラーから発生する変異体の大多数が除去され得る。一実施態様では、配列重複領域は、突然変異を起こしやすい区域にあるようにデザインされる。一実施態様では、重複領域で完全に一致する読み込みペアだけが追加の分析のために保有される。そのような分析のために、クローンペアエンド読み込みを生成するシーケンサーが有用である。特定の実施で、他の大量並列シークエンシングプラットホームが、また、活用され得る。
【００５４】
一実施態様では、ＰＣＲ増幅、プロセッシングまたはシークエンシング中に導入されたエラーは、変異体配列と関連した分子系統タグ（ＭＬＴ）の分布を分析することによって、純粋な鋳型由来の突然変異配列と区別され得る。もし所定の標的サンプルビン（ｂｉｎ）に対する獲得されたＮＧＳ読み込みの数が、そのサンプル内の標的化された鋳型ＤＮＡコピー体の数倍さらに大きい場合、本来配分されたＭＬＴが多重コピー体で存在すると予想され得る。したがって、もし突然変異鋳型ＤＮＡ断片がＰＣＲの早期サイクルの間にＭＬＴ配列で標識された場合、配列データは、そのＭＬＴ配列および突然変異を有する多重読み込みを含有すると予想され得る。逆に、ＰＣＲエラーまたはシーケンサーエラーから発生する変異体は、同じＭＬＴ配列を有するさらに少ない数の読み込みを含有すると予想され得る（通常、各ＭＬＴ配列は、１回のみ発生し得る）。また、一実施態様では、ＭＬＴは、プール増幅の間にクロスオーバー事象により不正確なサンプル特異的バーコードを有する配列を区別するに使用され得る。
【００５５】
ＤＮＡ二重螺旋の両鎖上で一致する突然変異を確認するための区画化されたＰＣＲおよび引き続くＮＧＳ
たとえ前記記述された系統追跡ＰＣＲ方法が大部分のＰＣＲエラーとシーケンサーエラーから純粋な鋳型由来の突然変異を区別できるが、ＰＣＲの最初の数サイクルの間に発生する誤取込を確認することは難しい。そのような初期誤取込エラーから発生する変異体配列は、純粋な鋳型由来の突然変異に対して予想された多重ＭＬＴコピー体と同様に、相対的に高い数のＭＬＴコピー体と関連付けることができる。このような制限を改善するために、鋳型由来の突然変異を確認するための代替戦略は、所定の二本鎖の鋳型ＤＮＡ断片の両鎖で同じ突然変異が存在することを確認することである。ＰＣＲからまたは鋳型ＤＮＡの塩基損傷から発生するエラーが同じ鋳型断片の両鎖のコピー体に対する相補性変更を生成する可能性は、殆どないものと見られる。
【００５６】
一実施態様では、区画化、タグ付け、増幅およびシークエンシング戦略が、突然変異が二本鎖鋳型ＤＮＡ断片の両鎖に存在することを証明するために使用される。一実施態様では、ＰＣＲ反応カクテルは、前記系統追跡されたＰＣＲに対して使用されたもの（ユニバーサルプライマーおよびＭＬＴ配列を含有するＲＮＡｓｅＨ２−活性化可能な遺伝子特異的プライマーの混合物を含有する）と類似している。しかし、決定的な違いは、長いユニバーサルバーコードプライマー（順方向または逆方向）のうち一つがカクテルから省かれ、区画固有バーコードを含有するプライマーがその代わりに使用され得ることである。一実施態様では、ＰＣＲ反応カクテル（鋳型ＤＮＡ断片を含む）は、多くの微小流体区画に分けられ、任意の所定の区画が特定の標的化された鋳型ＤＮＡ断片の一つ以上のコピー体を含有する可能性が、非常に低い。図１３に示されたように、区画は、多数の増幅可能な標的化された断片（異なる標的）を有することができるが、同じ標的の一つ以上のコピー体を有することはめったにない。例えば、もし所定の標的のコピー体が１０個の区画のうち略一つにのみ発見されると、同じ区画でその標的の二つのコピー体を発見する可能性は、〜１／１００になり得る。すべての区画は、ユニバーサルプライマーおよび 遺伝子特異的プライマーの全パネルを含有しているため、区画内のすべての増幅可能な標的がタグ付けされ、コピーされ、増幅される。一実施態様では、すべての区画は、同時に同じ熱サイクリングプロトコル（系統追跡されたＰＣＲに対して使用されたものと類似している）が行われる。
【００５７】
図１３は、異なる標的がＰＣＲ増幅のためにどのように液滴またはマイクロウェル内に無作為に区画化されるかの実例を示す。各文字は、標的化された鋳型ＤＮＡ断片を示し、それぞれの文字発生は、その標的の単一コピー体を示す。増幅反応の区画化は、所定の増幅可能な、標的化された鋳型ＤＮＡ断片の通常０または一つ（および時には二つ以上）のコピー体が区画内に存在するように行われる。しかし、多重ゲノム領域が同時に標的化されるため、色々な異なる標的化されたＤＮＡ断片（通常、それぞれの単一コピー体の、時には一つ以上のコピー体）が区画内に存在することができる。
【００５８】
図１４は、単一反応区画（例えば、マイクロウェルまたは液滴）の内容の実例を示す。図示されたものは、ＭＬＴ含有の遺伝子特異的プライマー、ユニバーサルプライマー、標的化された鋳型ＤＮＡ断片（および他の非標的化されたＤＮＡ断片）、およびビーズ特有のバーコードを有するビーズ担持熱放出性プライマーである。これに加えて、反応区画は、反応緩衝液、ｄＮＴＰ、ＲＮＡｓｅＨ２酵素およびポリメラーゼ（例えば、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ）を含有する。すべての区画は、遺伝子特異的プライマーの全体パネルを含有する。各遺伝子特異的プライマーは、ＭＬＴ配列を含有し、また、ユニバーサルプライマー配列の一部を有する。各遺伝子特異的プライマーは、５〜５０ｎＭのような相対的に低い濃度で存在する。ユニバーサルプライマーは、高濃度（例えば、２００〜５００ｎＭ）で存在する。ビーズから放出されたバーコード化プライマーは、区画で相対的に低い濃度（〜５〜５０ｎＭ）を有するものと予想される。二本鎖ＤＮＡ鋳型断片は、最も強固なエラー抑制を許容するが、一本鎖鋳型がまた使用され得る。任意の所定のマイクロビーズは、同じビーズ特有のバーコードを有するプライマーの多重コピー体を担持する。区画内のビーズ分布がほぼ無作為であるため、多くの区画が一つ以上のマイクロビーズを含有し、少数の区画が何も含有しない（ポアソン統計によって測定される）。この実例で、ビオチン標識増幅生成物は、次にストレプトアビジンコーティングされたビーズを使用して捕捉され、分離される。
【００５９】
図１５ＡおよびＢは、バーコード化プライマーを運搬する単一マイクロビーズを含有するマイクロコンパートメント内で行われる系統追跡ＰＣＲの二つの実例のシナリオを示す。パネルＡは、二重螺旋の両鎖に純粋な突然変異を含有する二本鎖標的化されたＤＮＡ断片のタグ付けおよび増幅を示す（二重螺旋の二本鎖は、完全に相補的である）。この場合、同じビーズ特有のバーコードがすべての増幅生成物に配分される。二つの別個のＭＬＴペア（すなわちＡ−Ｂ、およびＣ−Ｄ）を含有する多重読み込みの突然変異の存在は、突然変異が鋳型ＤＮＡの両鎖に存在したことを示す。パネルＢは、野生型二本鎖ＤＮＡ断片の類似なタグ付けＡＣ増幅を示す。この場合、増幅生成物は、少数のポリメラーゼエラーを含有するが、配列がビーズ特有のバーコードによりグループ化されるとき、一貫した突然変異は見られない。異なる文字で標識されたＭＬＴおよびバーコード（例えば、ＭＬＴＧまたはバーコードＷ）は、異なるヌクレオチド配列タグを示す。単純化のために、各タグまたはバーコードは、単一文字のアルファベットにより確認されるが、実際には、各タグは、通常、６〜１０個の塩基のストレッチで構成される。
【００６０】
図１６ＡおよびＢは、バーコード化プライマーを担持する単一マイクロビーズを含有するマイクロコンパートメント内で系統追跡されたＰＣＲが行われる二つの追加実例のシナリオを示す。パネルＡは、二つのＤＮＡ鋳型鎖のうち一つをコピーするとき、ポリメラーゼ誤取込エラーがＰＣＲの第１サイクルの間に発生した野生型二本鎖ＤＮＡ断片のタグ付けおよび増幅を示す。これは、ＰＣＲの第１サイクルの間に発生したとしても、エラーがどのように区別され得るかに対する極端な実例として示される。この場合、増幅生成物は、純粋な突然変異が鋳型ＤＮＡ二重螺旋の両鎖からコピーされたとすれば、予想し得るように、二つのＭＬＴペア全部（すなわちＩ−ＪおよびＫ−Ｌ）でなく、二ＭＬＴペアのうち一つ（すなわちＩ−Ｊ）にのみ関連したエラーを示す。パネルＢは、ポリメラーゼ誤取込エラーがＰＣＲの第１サイクルの間に発生した野生型一本鎖ＤＮＡ断片のタグ付けおよび増幅を示す。この場合、たとえエラーがその区画内で増幅されたコピー体の集団全体で発見され得るが（バーコードＺでタグ付けされる）、コピー体はすべて、全部鋳型ＤＮＡ二重螺旋の両鎖からコピーされた純粋な突然変異に対して予想し得るように、二つ（またはそれ以上）のＭＬＴペアでない、単一ＭＬＴペア（すなわちＭ−Ｎ）を有する。
【００６１】
図１７は、所定の区画で二つ（またはそれ以上）のビーズ上に二つ（またはそれ以上）の異なるバーコード化プライマーがあった場合、分析がどのように行われるかを示す。ビーズは、Ｐｏｉｓｓｏｎ分布によって異なる区画内に分布すると予想され、この際、一部の区画は、ビーズを含有せず、一部の区画は、単一ビーズを含有し、一部の区画は、二つ以上を含有する。ビーズを含有しない区画の数を減少させるために、当業者は、区画当たり二つまたは三つのビーズの中間値を達成することを目標とすることができる。あるいは、 単一区画内に単一ビーズを分配するために、Ｐｏｉｓｓｏｎ統計を克服するための方法が存在するが、これらの接近法は、複雑な微小流体操作またはプライマーの規定された反応チャンバー内への事前提供を含む。一つ以上のバーコード化プライマーセットが存在する区画は、配列データの後続的なコンピュータ分析中に確認され得る。所定のＭＬＴペアが一つ以上の区画に由来する配列で発見された可能性が非常に低いため、そのようなペアに関連したすべての区画固有バーコードは、単一区画から誘導されたものと推論され得る。
【００６２】
一実施態様では、分子系統タグ（ＭＬＴ）は、遺伝子特異的プライマーを通じて鋳型分子に配分され、次にこれらのタグ付きコピー体は、系統追跡されたＰＣＲに対して記述されたように、ユニバーサルプライマーにより増幅される。区画内で、もし一般的に所定の標的化された二本鎖鋳型ＤＮＡ断片のコピー体が一つ以上存在しなければ、ＭＬＴは、二つの異なる鎖のコピー体から発生する増幅された配列を確認するために使用され得る（図１５に示される）。一実施態様では、一つまたは少数の区画固有タグを含有するプライマーが所定の反応区画内で生成されたアンプリコンを確認するために使用され得る。したがって、そのようなタグ付け計画を使用して、同じ変異体配列が同じ区画内でＤＮＡの二つの異なる鎖からコピーされたことを確認することが可能である。
【００６３】
ＰＣＲカクテルは、多様な方法で微小流体区画内に分けられることができる。一実施態様では、区画は、１０ピコリットルほど小さく、１０ナノリットルほど大きくてもよい。特定の実施で、区画は、〜０．１から１ナノリットルの体積である。理想的には、所定の実験に対して区画の体積は、均一でなければならない。区画の数は、鋳型ＤＮＡ分子の用途および予想された濃度によって数千〜数百万の範囲であり得る。一実施態様では、ＰＣＲ区画は、微小流体液滴発生装置を使用してオイル中のＰＣＲカクテルの液滴として製造され得る。ミネラルオイルがこの目的のために使用され、またはフッ素化油が使用され得る。界面活性剤がＰＣＲの前または途中に、液滴を安定化させ、液滴の結合を防止するために使用され得る。一実施態様では、オイル中のＰＣＲカクテルのエマルジョンが、また、混合物を激しく撹拌することによって簡単に生成できる（しかし、この接近法は、不均一なサイズの液滴を生成する短所を有する）。他の実施で、ＰＣＲカクテルは、微小流体装置でマイクロウェルに区画化され得る。一実施態様では、数千のナノリットルサイズのウェルを有するパターン化ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含有するスライドが使用され得る。一実施態様では、反応体積がオイルまたは空気により分離される、狭い蛇行チャネルを含有する微小流体装置が使用され得る。一実施態様では、ＰＣＲカクテルがチャネル内に導入された後、チャネルが同時に閉じられる数千個の微細バルブにより別途の反応チャンバーに分けられることができる同様の微小流体装置が使用され得る。ＰＣＲは、マイクロコンパートメントを同時に熱サイクリングすることによって行われることができる。
【００６４】
一実施態様では、区画固有タグ（またはバーコード）を含有するクローンプライマーは、マイクロビーズを通じて区画に導入され得る。それぞれ均一にタグ付きプライマーの多くのコピー体を担持する多数のマイクロビーズを製造することが可能であるが、非常に多様なタグが、異なるビーズに存在する。所定のビーズが表面でタグ付きプライマーのクローン集団を担持するが（全部同じタグを有する）、異なるビーズが異なるタグを有するプライマーを担持する。一実施態様では、マイクロビーズは、ＰＣＲカクテルと混合され得、カクテルで区画化され得る。一実施態様では、ビーズの濃度は、平均２または３個のビーズが各区画に伝達されるように調整され得る（少数の区画はビーズを有しない）。ビーズの区画内への分布は、Ｐｏｉｓｓｏｎ統計に従うと予想される。一実施態様では、プライマーは、ビーズ表面から加熱により（ビーズに付着された相補性ＤＮＡ鎖からプライマーを溶融させることによって）区画化された溶液中に放出され得る。他の実施で、プライマーは、光切断によりビーズ表面から区画化された溶液中に放出され得る（光切断可能なホスホラミダイトがオリゴヌクレオチドをビーズ表面に連結させるために使用され得る）。他の実施で、プライマーをビーズに付着されたままにし、混成化および重合反応は、ビーズ表面で行われることができる。一実施態様では、超常磁性ビーズ（交差結合されたポリスチレンでコーティングされ、表面は、アミンまたはヒドロキシル基で活性化される）が使用され得る。他の実施で、限定するものではないが、アガロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレンまたはポリメチルメタクリレートを含む物質で構成されたビーズが使用され得る。一実施態様では、ビーズは、ビオチン標識オリゴヌクレオチドに結合するために、ストレプトアビジンでコーティングされ得る。特定の実施で、ビーズは、０．５マイクロメーターから１００マイクロメーターのサイズであり得る。特定の実施で、ビーズは、１マイクロメーターから５マイクロメーターのサイズである。特定の実施で、所定の実験で使用されたビーズは、相対的に均一なサイズで各ビーズ上に相対的に均一な数のプライマーコピー体を担持する。
【００６５】
図１０は、ビーズ特有のバーコードを含有する熱放出性プライマーがどのようにマイクロビーズ上で製造され得るかの実例を示す。まず、オリゴヌクレオチドが自動オリゴヌクレオチド合成器でマイクロビーズの表面で標準ホスホラミダイト化学を使用して合成され得る。マイクロビーズ表面は、例えばアミンまたはヒドロキシル基で官能化され得、それは、ホスホラミダイト単量体と共有結合を形成する。追加のホスホラミダイト単量体が以後に順次に標準合成プロトコルを使用して添加され得る。ビーズ結合されたオリゴヌクレオチドの所望の方向によって、標準または５’−ベータ−シアノエチルホスホラミダイト単量体のいずれかが使用され得る。オリゴヌクレオチドとビーズ表面の間に若干の距離を導入させるために、一つまたは多数のスペーサーホスホラミダイトがビーズ表面に添加された後、ヌクレオチド単量体が添加され得る。方法項で記述されたように、スプリットおよびプール合成がビーズ特有のバーコードをオリゴヌクレオチドに組み込むために使用され得る。もしマイクロビーズが小さすぎて自動オリゴヌクレオチド合成器のカラムに使用されたフリットにより保有されない場合、当業者は、磁石により所定の位置に保有された超常磁性マイクロビーズを使用できる。共通プライミング配列（および選択的なビオチン基）を含有する第２オリゴヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼを使用してビーズ結合されたオリゴヌクレオチドをコピーすることができる。このようにして、延長したプライマーは、ユニバーサルプライマー配列だけでなく、ビーズ特有のバーコード配列を含有する。ビーズが液滴またはマイクロウェルのようなさらに小さい反応体積に区画化された後、ビーズ特有のバーコードを含有する延長したプライマーが熱変性によりビーズから放出され得る（例えば、ＰＣＲの途中に）。他のプライマー放出方式、例えば光切断および化学的脱カップル化がまた使用され得る。
【００６６】
図１１は、熱変性により放出され得る一時的に固定化されたオリゴヌクレオチドを製造するための代替方法を示す。切断可能な基（例えば光切断可能なリンカー）を含有するオリゴヌクレオチドは、表面（例えば、マイクロビーズ）で直接合成されるか、または表面、粒子または分子に共有結合またはビオチン親和性捕捉を通じて合成後に結合され得る。規定されたバーコード配列または縮重タグ配列（例えば、ＭＬＴ）のセットがオリゴヌクレオチドに統合され得る。タグは、また、スプリットおよびプール合成を通じて合成され、所定のビーズ（または粒子）上に同じタグの多数のコピー体を有する非常に多様なタグが製造され得る。オリゴヌクレオチドは、自己相補性の領域を有するようにデザインされ、切断されたオリゴヌクレオチドが塩基対相互作用（混成化）を通じて付着されたまま維持される。オリゴヌクレオチドは、熱変性により後に溶液中に放出され得る。オリゴヌクレオチドは、下流の用途によって５’から３’に、または３’から５’に合成され得る。
【００６７】
一実施態様では、多様なセットのクローンタグ付きプライマー（１ビーズ、１タグ）を担持するビーズ集団がスプリットおよびプールオリゴヌクレオチド合成接近法を使用して合成され得る。共通プライマー配列が自動オリゴヌクレオチド合成器で標準ホスホラミダイト化学を使用して合成され得る。プライマーは、適切なホスホラミダイトを使用して５’から３’、または３’から５’方向に合成され得る。一実施態様では、ホスホラミダイトは、それの表面がアミンまたはヒドロキシル基で変形されたビーズを使用することによって、ビーズに共有結合され得る。一実施態様では、永久磁石または電気磁石が自動オリゴヌクレオチド合成器で合成カラム内に磁性マイクロビーズを保有するために使用され得る（ビーズがフリットにより保有されるには、あまりに小さい可能性があるからである）。一実施態様では、スプリットおよびプール合成接近法がビーズ上にクローンの多様なタグを生成するために使用される。プライマーの共通領域が形成された後、合成器がタグ配列が始まる所で停止する。一実施態様では、ビーズがプールされた後、４個の異なる新しいカラムに分けられ、異なるホスホラミダイト（ｄＡ、ｄＴ、ｄＣまたはｄＧ）が４個のカラムに添加される（カラム当たり一つのホスホラミダイト）。他の実施で、４以上または未満のカラムおよび４つのホスホラミダイトが使用され得る（所定の位置で可能な残基の数を増加または減少させるためである）。タグ領域内で各カップリングサイクル後に、ビーズは、プールされ、次のサイクルのために新しいカラムに再分布される。この方法で、所定のビーズにカップリングされたオリゴヌクレオチドは、所定のサイクルで同じ塩基を受けるが、所定の位置に添加されたその塩基は、無作為に選択される。一実施態様では、ビーズ特有のタグ配列は、１〜１５塩基の長さであり得る。特定の実施で、ビーズ特有のタグ配列は、８〜１２塩基長さであり得る。一実施態様では、相補性プライマーがビーズ結合されたオリゴヌクレオチドに混成化され得、ポリメラーゼを使用して延長し、図１０に概略的に示されたように、タグ配列および追加のプライマー配列がコピーされる。延長したプライマーは、ビーズ特有のバーコードを有する熱放出性プライマーとして作用する。一実施態様では、この熱放出性バーコード化プライマーは、区画内でＰＣＲ増幅された標的上に混成化し、延長させるために使用され得る（熱放出性プライマーの３’末末端は、標的化されたアンプリコンとの混成化を容易にするために、ユニバーサルプライマー配列の一部を含有する）。
【００６８】
他の実施で、区画固有タグを含有するプライマーは、区画内に事前分布され得る。例えば、もしＰＣＲカクテルが微小流体装置のマイクロウェルに分けられると、区画固有タグを含有するプライマーが各マイクロウェルに添加された後、ＰＣＲカクテルが添加され得る。一実施態様では、プライマーは、マイクロウェルの表面または壁に化学的にカップリングされるか、またはビオチン−ストレプトアビジン相互作用を通じてカップリングされ得る。一実施態様では、プライマーは、加熱により（前記記述されたように固定された相補性オリゴヌクレオチドの溶融により）、光切断により、または他の手段によりマイクロウェルから放出され得る。一実施態様では、プライマーは、壁の表面に付着されたまま、維持され得、重合化は、表面で行われることができる。
【００６９】
一実施態様では、タグ付き増幅生成物は、多数の小さい反応体積の内容物を組み合わせることによって、ＰＣＲ後にプールされる。一実施態様では、これは、オイル中の水性液滴を結合させる試薬（例えば、クロロホルム）を添加することによって行われることができる。一実施態様では、反応体積は、微小流体装置上のマイクロウェルからの反応生成物を採取することによって組み合わせられることができる。一実施態様では、プールされ、増幅されたＤＮＡ生成物は、ゲル精製され、 所望のサイズの生成物が選択され、大量並列シークエンシングが行われる前に、使用されないプライマーが除去される。特定の実施で、精製するための他の接近法として、例えば限定するものではないが、ビオチンタグ付き相補性オリゴヌクレオチドを使用するハイブリッド捕獲、高性能液体クロマトグラフィー、毛細管電気泳動、シリカ膜分割、または磁性の可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズへの結合が使用され得る。
【００７０】
一実施態様では、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）がタグ付けされ、増幅され、精製されたＰＣＲ生成物から大多数の配列を得るために使用される。一実施態様では、（前記記述されたような）クローン重複ペアエンドシークエンシング接近法が使用され、シーケンサー誘導されたエラーを含有する読み込みが除外することができる。一実施態様では、配列データは、標的化された二本鎖鋳型ＤＮＡ断片の両鎖をコピーすることから得られる純粋な突然変異を確認するために分析される。そのような純粋な突然変異を確認するために使用された戦略は、図１５〜図１７を参照して理解され得る。次の論理が使用される：
【００７１】
１．一実施態様では、ＭＬＴパターンは、マイクロコンパートメント内の増幅されたＰＣＲ生成物が一つの鋳型鎖または二つの鋳型鎖をコピーすることから得られたか否かを測定するために使用され得る。一実施態様では、もし単一ＭＬＴ配列ペアが所定の区画から増幅された配列で見られると、増幅された配列は、その区画内で増幅されたＤＮＡの一本鎖に由来したと推論され得る。一実施態様では、もし二つ（またはそれ以上）のＭＬＴ配列ペアが所定の区画から増幅された配列に見られると、増幅された配列は、その区画内で増幅された 二つ（またはそれ以上）の ＤＮＡの鎖から得られたと推論され得る。
【００７２】
２．一実施態様では、ＰＣＲ増幅された配列は、区画固有バーコードの分析をベースに所定の区画から得られたものと確認され得る。一実施態様では、区画に配分された単一バーコードがあり得る。他の実施で、区画に配分された一つ以上のバーコードがあり得る。もし一つ以上のバーコードがあると、バーコードの組合せは、同じ区画に由来したものであって、ＰＣＲ生成物を確認するために使用され得る。
【００７３】
３．一実施態様では、突然変異は、もし（ａ）所定の区画から得られた増幅された配列の大部分が突然変異を含有し、（ｂ）観察されたＭＬＴパターンが増幅された配列が一つ以上の鋳型鎖から得られたことを確認すると、真正な鋳型由来の突然変異であると見なされる。区画が一つ以上のＤＮＡ断片を含有する可能性が殆どないため、一つ以上の鋳型鎖から誘導された配列は、二重螺旋ＤＮＡ断片の相補鎖から誘導されたものとほぼ確実に推論され得る。
【００７４】
異なる区画にクローンタグ付きオリゴヌクレオチドを伝達する方法：
異なる区画にクローンタグ付きプライマーを伝達するためにビーズを使用することは、色々な短所を有する。このようなビーズ集団の合成は、特にスプリットおよびプール工程が使用されるため、複雑であり得る。また、ビーズの区画内への無作為分布を保証することが難しいことがあるが、それはビーズが沈降するか、凝集し、Ｐｏｉｓｓｏｎ統計に従わない分布に至るためである。より無作為なビーズ分布を達成するために、ビーズスラリーが連続的に撹拌される必要があり得、または区画化が迅速に行われ、ビーズの沈降を最小化できる。
【００７５】
クローンタグ付きプライマーをマイクロコンパートメントに事前分配することは、過程の複雑性という短所を有する。プライマーは、異なるタグで別々に合成されなければならず、異なるタグ付きプライマーのコピー体が、異なるマイクロウェルに分配されなければならない。これは、特殊なロボット装置の使用を含む。タグ付きプライマーを数百または数千個のマイクロウェルに分布させることは、実現可能になり得るが、さらに多くの（例えば、数百万）の区画に対してこれを達成することは難しい。
【００７６】
クローンタグ付きオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドを表面（例えば、ビーズまたはマイクロウェル壁）に付着させることを必要とせずにマイクロコン区画に伝達する方法および組成物が開示される。溶液中のオリゴヌクレオチドの使用は、タグの区画内へのさらに均一な分布を保証し、実施するに非常に簡単であるため、有益である。計画は、図１２に概略的に示される。
【００７７】
図１２は、クローンタグ付きオリゴヌクレオチドをマイクロコンパートメント内に伝達するイン−ソリューション方法を示すが、オリゴヌクレオチドは、同じ反応体積で共同増幅されるＰＣＲ生成物に区画固有タグを添加するためのプライマーとして機能することができる。縮重タグ配列を含有する鋳型オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲカクテルに添加され、ＰＣＲカクテルが区画化されるとき、少数の個別的な鋳型オリゴヌクレオチド分子（例えば平均２〜３分子）が各区画に分配され得る。鋳型オリゴヌクレオチドを増幅させることができるプライマーが、また、反応カクテルに含まれる。したがって、ＰＣＲが行われるとき、各区画内の少数の鋳型オリゴヌクレオチドが少数のクローン区画固有タグを含有する多数のコピー体を生成するために増幅される。これらのクローンタグ付きオリゴヌクレオチドは、同一反応体積内で共同増幅された他のＰＣＲ生成物に区画固有タグを配分するためのプライマーとして使用され得る（例えば、多重ゲノム領域の系統追跡ＰＣＲを通じて）。
【００７８】
一実施態様では、均一なタグ付きオリゴヌクレオチド配列の多くのコピー体が、該タグ付きＤＮＡ配列の単一分子を区画内に導入させた後、それを区画内で短いプライマーを使用して（ＰＣＲを通じて）コピーし、増幅させることによって、区画で製造され得る。鋳型として単一タグ付きＤＮＡ分子を開始することによって、区画内で増幅されたコピー体は、クローン的であり、且つ、鋳型分子として同じタグを内部に有する。一実施態様では、タグ付き鋳型ＤＮＡは、二本鎖であり得る。他の実施で、鋳型ＤＮＡは、上部または下部相補鎖のいずれか一つで構成される、一本鎖であり得る。一実施態様では、鋳型分子の集団内のタグ（またはバーコード）配列は、オリゴヌクレオチド合成中に縮重位置を組み込むことによって（例えば、多重「Ｎ」位置を組み込むことによって、Ｎは、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＡ塩基を略同一にカップリングさせる可能性を示す）、生成され得る。一実施態様では、事前規定されたバーコードが、また、鋳型分子に統合され得る。一実施態様では、一つ以上の異なるタグ付き分子が区画内で鋳型として使用され得、この場合、区画内で増幅されたオリゴヌクレオチドが一つ以上のタグ配列を含有する。特定の実施で、タグ付き鋳型分子を含有しない区画の数を最小化するために、平均二つまたは三つの異なるタグ付き鋳型分子が区画に導入され得る（Ｐｏｉｓｓｏｎ統計に従って分布する）。一実施態様では、その結果として 区画内で 得られた増幅されたクローンタグ付きオリゴヌクレオチドコピー体が区画内で他のＤＮＡ配列に混成化し、それをコピーすることによって、プライマーとして機能することができる。一実施態様では、そのようなプライマーは、区画内で増幅生成物に区画固有タグを配分させるために使用され得る。もし一つ以上の区画固有タグ（バーコード）を含有するプライマーが区画内に存在すると、タグの組合せは、所定の区画から得られるものであって、増幅生成物を確認するのに使用され得る。一実施態様では、区画内でタグ付き鋳型分子を増幅させるために、順方向および逆方向の短いプライマーの不均一な濃度が使用され得る。一実施態様では、順方向プライマーは、逆方向プライマーより２倍〜２０倍さらに濃縮され得る（またはその反対）。不均一な濃度のプライマーの使用は、「非対称ＰＣＲ」を生じさせ、一つの増幅された鎖のその補体よりさらに多いコピー体が生成される。一実施態様では、そのような非対称増幅は、増幅されたクローンタグ付きオリゴヌクレオチドの区画の他のＤＮＡ配列との混成化を促進できる（これにより、増幅されたオリゴヌクレオチドがタグ付きプライマーとして作用することが可能になる）。図１２は、このような接近法を示す。
【００７９】
クローンタグ付きオリゴヌクレオチド配列の多くのコピー体を反応区画に導入させるためのこの方法は、多くの潜在的用途を有する。一実施態様では、この方法は、前記記述されたように、低存在量の突然変異型ＤＮＡ分子の測定を補助するために使用され得る。他の実施で、この方法は、単一細胞ゲノムデータを生成するために、異なる区画で単一細胞から増幅されたＤＮＡ生成物をタグするために使用され得る。他の実施で、方法は、単一細胞の高処理量ＲＮＡプロファイリングを容易にするために、異なる区画においての単一細胞からの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のコピー体を標識するために使用され得る。他の実施で、方法は、ゲノム配列アセンブリを容易にするために、区画内でさらに大きい染色体断片に由来する多重アンプリコンに同じタグを配分するために使用され得る。
【００８０】
他の実施で、区画固有ＤＮＡタグ付け方法は、高度に複合化された単一細胞プロテオミクスを容易にするために使用され得る。この接近法で、異なる蛋白質を標的とする抗体は、両側に共通プライマー結合配列が隣接する抗体特異的バーコード配列を含有するオリゴヌクレオチドで標識され得る。抗体の複合化されたパネルは、無傷細胞の表面上の、または固定型且つ透過性細胞内部の蛋白質に結合され得る。パネルの各抗体は、異なる抗体特異的タグを含有するオリゴヌクレオチドで標識される。余分の抗体が洗浄された後、細胞は、 、各区画が一つ以上の細胞を含有する可能性がないように区画化される（例えばオイル中の水性液滴に、または微小流体装置のマイクロウェルに）。区画内の共通ＰＣＲプライマーは、共通プライマー結合配列を通じてすべての抗体−結合バーコーディングされたオリゴヌクレオチドを同時に増幅させるに使用され得る。区画内の増幅されたタグの相対存在量は、細胞内でそれの蛋白質標的に結合された対応抗体の相対存在量を反映する。次いで区画固有バーコードは、異なる単一細胞で蛋白質の定量を可能にするために導入され得る。非常に多様な抗体特異的タグが生成され得るため、異なる抗体に対する複合化の容量は、事実上無限である。
【００８１】
より一般的に、記述された方法は、区画内で核酸分子が区画固有タグで標識される必要がある任意の用途に対して使用され得る。
【００８２】
実施例
本技術は、次の実施例を参照することによりさらによく理解され得る。
これらの実施例は、具体的な実施を示すことが意図される。
【００８３】
実施例１
この実施例は、高処理量ＲＮＡ定量方法の適用を記述する。方法は、下流サンプルプロセッシングおよび分析を簡素化し、費用を減少させるために、多重ＲＮＡ−含有サンプルの先行並列化を可能にする。
【００８４】
材料および方法
ＲＴプライマーミックスのモジュール合成：
プライマーの混合物を生成するために、２段階モジュール式オリゴヌクレオチド合成戦略を使用し、この際、各混合物は、５’セグメントに別個のサンプル特異的バーコードおよび３’セグメントに均一な割合の多重標的特異的配列を有する（図１ａ）。まず、色々な標的特異的３’セグメントを別途のオリゴヌクレオチド合成カラムで形成した。合成を標準ホスホラミダイト化学を使用して３’から５’方向に４０ナノモルポリスチレン支持カラム（Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｓｔｏｎ，ＰＡ）でＤｒ．Ｏｌｉｇｏ１９２自動合成器を使用して行った。合成を３’セグメントのオリゴマー化が完了した後に中断し、部分的に合成されたオリゴヌクレオチドが依然としてジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基で保護された状態でポリスチレン支持体に残した。
【００８５】
アルゴンガスをカラムを通じて吹き込んで、ポリスチレン支持体を乾燥させた後、カラムを切断し、ポリスチレン粉末を通常のガラスバイアルに注入した。粒子をポリスチレンを中性に浮揚させるために、 ２：１〜３：１のジクロロメタン：アセトニトリル混合物に懸濁させ滴定しておいた。スラリーを一定に撹拌し、均一な混合を保証する一方で、ピペットを使用して等量の体積のスラリーを新しい合成カラム（下部フリットが所定の位置にある）に分配した。次に、カラムをアセトニトリルでフラッシングし、すべてのポリスチレン粒子が底に沈むようにした。アセトニトリルを重力により完全に流した後、上部フリットを所定の位置に配置し、粉末をカラムに固定した。各サンプル特異的バーコードに対して一つのカラムを形成した。
【００８６】
新しいカラムを、合成を継続するために自動合成器に再び載置した。下記の表６に示されたように、異なるバーコード配列を、プライマーミックスの５’セグメントに組み込むための各カラムに配分した。バーコードは、８個のヌクレオチド長さになるようにデザインし、各バーコードは、 セット内の他のすべてのバーコードと 最低２つの位置で異なる（シーケンサーエラーによって引き起こされる誤分類の可能性を最小化するためである）。また、ユニバーサルＰＣＲプライマー結合配列を各オリゴヌクレオチド混合物の５’セグメントに添加した。合成器をポリスチレン支持体上に既に存在する部分的に合成されたオリゴヌクレオチドを解明するために、３’末端に追加の「仮想塩基」が存在するようにプログラミングした。
【００８７】
[表６]
2018509178.tif 000004
2018509178.tif 000005
2018509178.tif 000006
【００８８】
モジュール式合成の第２段階が完了した後、オリゴヌクレオチド混合物を、ＤＭＴ基をのこしたままポリスチレン支持体から切断した。各混合物に迅速な脱保護を行い、引き続いて、別のＧｌｅｎ−Ｐａｋ  ＤＮＡ逆相カートリッジ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）で精製した。カートリッジは、完了したオリゴヌクレオチドの５’末末端に選択的に疎水性ＤＭＴ基を保有し、全長生成物を豊富にした。ＤＭＴ基を精製完了時に除去した。次に、精製されたオリゴヌクレオチド混合物を乾燥させ、１０ｍＭトリス（ｐＨ  ６．０）に再懸濁し、１０ｘ作業ストックを形成した。ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡモジュール式プライマーセグメントの配列を下記の表３、表５および表８に列挙する。
【００８９】
[表３]
2018509178.tif 000007
2018509178.tif 000008
2018509178.tif 000009
【００９０】
[表５]
2018509178.tif 000010
2018509178.tif 000011
【００９１】
[表８]
2018509178.tif 000012
2018509178.tif 000013
【００９２】
合成ＲＮＡサンプルの製造：
下記の表２に示されたように、９０個のマイクロＲＮＡおよび６個の対照ＲＮＡ配列で構成されたＲＮＡオリゴヌクレオチドをＹａｌｅ  Ｋｅｃｋオリゴヌクレオチド合成コア設備で４０ｎＭｏｌｅ規模で合成して精製し、この際、２’−脱保護された。Ｔｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  Ｅｖｏ  ２００ロボットリキッドハンドラーを、事前規定された量の各ＲＮＡを９６ウェルプレートのウェルに分配するようにプログラミングし、ヒートマップ（ｈｅａｔ  ｍａｐ）上のバラの画像が製造されるようにデザインされたパターンで４〜０．０８ｎＭ範囲の最終濃度を達成した。ＲＮＡをＲＮＡｓｅフリーの水に１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ  ７．６）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、および３００ｎｇ／ｍＬのキャリア  ＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を含有している緩衝液に溶かした。合成ＲＮＡ溶液をＲＴに必要になる時まで−８０℃で保管した。
【００９３】
[表２]
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【００９４】
組織および細胞株ＲＮＡサンプル：
第１選択型ヒト全ＲＮＡ調査パネル（Ａｍｂｉｏｎ）を２０個の正常ヒト組織由来のトータルＲＮＡの供給源として使用した。ＭＡＱＣリファレンスサンプルは、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅユニバーサルヒトリファレンスＲＮＡ（１０個のヒト細胞株からのトータルＲＮＡで構成される）、およびＡｍｂｉｏｎ第１選択型ヒト脳リファレンスＲＮＡで構成された。
【００９５】
放射線照射された血液サンプルからのＲＮＡ：
エール大学の人体調査委員会（Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認下に１８人の健康な支援者からの書面同意を得た後、末梢血をクエン酸ナトリウムを含有するチューブに収集した。血液を２ｍＬの部分標本に分け、採血した後、１時間以内に分当たり１．７９Ｇｙの容量速度で０、０．１、０．５、２、４または８ＧｙのＸ放射線を照射した。次に、血液を１０％ウシ胎仔血清を含有する等容量のＲＰＭＩ１６４０培地を添加した後、２４時間３７℃でインキュベーションした。末梢血単核細胞をフィコール勾配遠心分離を使用して分離し、全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してこれら細胞から製造した。
【００９６】
ｍｉＲＮＡサンプルのプロセッシング：
方法の第１段階で、多重ＲＮＡ標的を各サンプルに対して単一チューブで逆転写させた。所定のサンプルに対して使用されたＲＴプライマーミックスは、表３に示されたように、５’セグメントにサンプル特異的タグ、および３’セグメントに一貫した割合の多重標的特異的プライマー配列を有する。プライマーを短いｍｉＲＮＡ（および対照標準ＲＮＡ）標的の３’末末端で６個のヌクレオチドと混成化するようにデザインした。５’−ビオチン標識オリゴヌクレオチドを隣接する相補的共通プライマー配列にアニーリングし、積層（ｓｔａｃｋｉｎｇ）塩基を延長させることによって、短いＲＮＡ／プライマー異種二重螺旋を安定化させた。
【００９７】
各逆転写カクテルは、ＲＮＡｓｅフリーの水に５μＭのタグ付きプライマーミックス（〜５０ｎＭの各標的特異的プライマー）、７．５μＭのビオチン標識オリゴヌクレオチド、１ｘＲＴ緩衝液、３ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、５ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、３０ｎｇ／μＬの担体ＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）、鋳型ＲＮＡ、および５ユニット／μＬのＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で構成された。各ＲＴを１０μＬの最終体積で行った。鋳型ＲＮＡ、ＤＴＴおよび逆転写酵素を添加する前に、カクテルを９５℃で２分間加熱した後、室温に冷却させることによって、ビオチン標識オリゴヌクレオチドをプライマーミックスにアニーリングした。最後の組み立てられたＲＴカクテルに対して１６℃で２分、４２℃で１分、および５０℃で１秒の４０サイクルを行った。反応を、６５℃で２０分間加熱し、ＥＤＴＡを１０  ｍＭの最終濃度で添加することによって停止させた。次に、すべての別途のＲＴ反応の生成物を単一体積で組み合わせた。
【００９８】
プールｃＤＮＡを、高容量のストレプトアビジンがコーティングされたアガロース樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（１０μＬのＲＴ反応当たり添加された５μＬｋ樹脂スラリー）を使用して相補的ビオチン標識されたオリゴヌクレオチドの捕捉により精製した。室温で少なくとも２時間チューブを徐々にくるくる回転させることによって、樹脂粒子を溶液中に懸濁された状態を維持させて、ビオチン結合を促進した。次に、粒子を１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．６および５０ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液で洗浄した。ｃＤＮＡを９５℃で２分間の熱変性させることにより樹脂結合オリゴから新しい体積の同一緩衝液（樹脂スラリーの体積の２倍）に放出された。延長されていないＲＴプライマーを除去するために、下記の表４に示されたように、プライマー延長配列（各１００ｎＭ）に相補的なビオチン標識オリゴヌクレオチドの混合物を使用して第２ラウンドの選択的アニーリング、捕捉、洗浄および溶出を行った。
【００９９】
[表４]
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【０１００】
精製されたｃＤＮＡプールを各ｃＤＮＡ標的のシングルプレックスエンドポイントＰＣＲのために９６個の別途のチューブに分配した。所定の標的に関連したすべてのサンプル特異的タグが単一反応体積で競合競合増幅を進行したため、タグ比率が維持された。各ＰＣＲに使用されたプライマーペアは、図１ｂ（表４）に示されたように、ユニバーサル順方向プライマーと区別される標的特異的逆方向プライマーで構成された。シークエンシングアダプタをプライマーの５’末末端に統合させて、ＯＣＲ生成物の直接的なシークエンシングを可能にした。各ＰＣＲカクテルは、１０μＬ体積の１ｘＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  ＰＣＲ緩衝液Ｉ（ｄＮＴＰｓおよびＭｇＣｌ2を含む）、１００ｎＭのユニバーサル順方向プライマー、１００ｎＭの標的特異的逆方向プライマー、２μＬのプールｃＤＮＡ鋳型および０．２μＬのＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で構成された。ミネラルオイルを添加し、蒸発を最小限に抑えた。熱サイクリング媒介変数は、２分間９４℃、３０秒間６０℃、２０秒間７２℃、次いで２０秒間９４℃、３０秒間６５℃  および２０秒間７２℃の４０サイクルであった。最終延長段階を７２℃で２分間行い、引き続き、４℃に冷却させた後、ＥＤＴＡ（最終１０ｍＭ）を添加し、ポリメラーゼ活性を停止させた。
【０１０１】
すべてのＰＣＲ体積を組み合わせて、２０μＬの部分標本のプール反応生成物を２％低融点アガロースゲルで精製した。ＤＮＡを切除したゲルスライスからＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。濃度をＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して推定し、Ｉｏｎ  ＴｏｒｒｅｎｔエマルジョンＰＣＲに対して推奨された水準に調整した。
【０１０２】
ｍＲＮＡサンプルのプロセッシング：
ｍＲＮＡサンプルのプロセッシングのための全体計画は、ｍｉＲＮＡサンプルに対して前記記述されたものと同一であり、ただいくつかの顕著な変形があった。ｍＲＮＡがｍｉＲＮＡよりはるかに大きかったため、プライマーを、約１００ヌクレオチド標的領域を増幅するようにデザインすることができた。したがって、さらに長い遺伝子特異的ＲＴプライマーを使用した（表５および表８）。これは、延長した塩基積層を通じて安定性を増大させるために、相補的ビオチン化オリゴヌクレオチドを必要とすることなく、熱安定性ポリメラーゼを使用して高温でＲＴが行われることを可能にした。各ＲＴ反応は、ＲＮＡｓｅフリーの水にタグ付きプライマーミックス（各〜５０ｎＭの標的特異的プライマー）、１ｘ第１鎖の緩衝液、５００μＭの各ｄＮＴＰ、５ｍＭのＤＴＴ、鋳型ＲＮＡ、および１０ユニット／μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔIII逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で構成された１０μＬ体積で行った。プライマーを室温で組み合わせた後、５５℃で１時間インキュベーションするときに添加された緩衝液、ＤＴＴおよびポリメラーゼなしに、５分間 ６５℃に加熱することによって、ＲＮＡ標的にアニーリングした。反応物を、７５℃で２０分間、９５℃で１分間加熱し、ＥＤＴＡ（最終１０ｍＭ）を添加することによって、ポリメラーゼを不活性化させた後にプールした。
【０１０３】
ＲＴ中のビオチン標識オリゴヌクレオチドの不在は、プライマー延長された配列に相補的であるビオチン化オリゴヌクレオチドを使用する単一段階でｃＤＮＡの捕捉を可能にした（表７および表９）。プールされ、精製されたｃＤＮＡ鋳型を表７および表９で列挙したプライマーを使用する各標的のシングルプレックスエンドポイントＰＣＲのために別途のチューブに分配した。熱サイクリング媒介変数は、前記ｍｉＲＮＡに対して記述したものと同一であるが、第１サイクルに対して６０℃の代わりに６３℃のアニーリング温度を使用した。
【０１０４】
[表７]
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【０１０５】
[表９]
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【０１０６】
次世代シークエンシング：
鋳型をＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシークエンシングのために自動Ｉｏｎ  ＯｎｅＴｏｕｃｈシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して製造した。ゲル精製されたアンプリコンを機器にローディングする前に、製造業者により推奨された濃度に希釈した。自動エマルジョンＰＣＲは、イオンスフィア粒子（ＩＳＰ）に対して大量並列クローン増幅を可能にした。ポリクローナルＩＳＰを最小化するために、鋳型希釈を１０％〜３０％鋳型−ポジティブＩＳＰをなすように調整した。ワンタッチエンリッチメントシステムを使用して鋳型−ポジティブＩＳＰを分離し、それをシークエンシングのために半導体チップ上にローディングした。所望の配列深さに応じて、３１４低容量チップまたは３１８高容量チップのうち一つを使用した。シークエンシングをＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２００ｂｐ試薬キットを使用して行った。
【０１０７】
配列のビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）およびカウンティング：
各標的／バーコードビンに属する読み込み数を測定するために、ＴｏｒｒｅｎｔＳｕｉｔｅソフトウェア（バージョン４．０）の一部のとして提供されたＴｏｒｒｅｎｔ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＴＭＡＰ）を使用した。所定のデータセットの分析のために３ファイルのアップロードが必要であった：ユーザ規定されたバーコードおよびアダプタ配列を含有するテキストファイル、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡ基準配列を列挙するＦＡＳＴＡフォーマットファイル、および標的領域を規定するＢＥＤファイル。読み取りを標的基準配列と整列させた後、包含範囲分析プラグ−インモジュールを作動させ、その結果のバーコード／アンプリコン包含範囲マトリックスをダウンロードした。このマトリックスは、各ビンに対する読み込みカウントを含有し、マイクロソフトエクセルで開かれ、さらに操作され得た。
【０１０８】
配列データのダウンサンプリングがＴｏｒｒｅｎｔＳｕｉｔｅソフトウェアでは可能ではなかったため、図２ｅに対する読み込みの規定された下位セットからビニングされたカウントを得るために、代替案を使用した。この目的のために、マイクロソフトエクセルで「ｃｏｕｎｔｉｆｓ」機能を探索した。ＴＭＡＰ分析と比較したこの接近法との重要な違いは、完全な配列マッチのみがカウントされたということであった。したがって、シーケンサーのエラーによる不完全一致の可能性を最小限に抑えるために、約１０〜１２ヌクレオチドの短い基準配列を使用した。基準配列は、疑似ＰＣＲ生成物（例えば、プライマー二量体）の計数を回避するために、任意の単一プライマーに含まれた配列を超えて延長させるために選択した。各基準配列が単に単一標的にのみ一致することを保証するために、さらに注意した。
【０１０９】
ビニングされた配列カウントの正常化および標準化：
図２ａおよび図２ｂのローズの画像を示すヒートマップを生成するために、二つの複製実験からの計数を９，２１６個のデータビンのそれぞれに対して平均化した。次いで、カウントを分配された合成ＲＮＡの公知の総量に対して列と行にわたって正常化した。まず、所定の列のカウントをその列に分配されたＲＮＡの総量に対するカウントの和の比で乗算した。二番目に、所定の行のその結果の値をその行に分配されたＲＮＡの総量に対する値の和の比率で乗算した。最後に、これら正常化された値の二進対数を計算し、ヒートマップに図表化した。
【０１１０】
ヒト組織および血液サンプルからのｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡ測定の正常化および標準化（図３ａ、図３ｂ、図５）を下記の説明の通り行った。まず、複製値を各データビンに対して平均化した。二番目に、各標的に対する異なるシングルプレックスＰＣＲによって生成された総カウントを同等にするために、所定の列にわたる値は、その列の値の合計を１０００にするために共通因子で乗算した。三番目に、データのフローリング（ｆｌｏｏｒｉｎｇ）をすべてのビンに対して０．０１づつ足すことによって（それによって０値を除去する）達成した。これは、３５より大きいＣｑ値を３５に変換させるｑＲＴ−ＰＣＲ実験の通常の方法と類似していた。四番目に、ｍｉＲＮＡ水準を正常化するために、所定のサンプルのすべてのｍｉＲＮＡＤＰ対する平均発現値を正常化因子として使用した。放射線照射された血液サンプルからのｍＲＮＡを二つのハウスキーピング遺伝子、ＡＣＴＢおよびＧＡＰＤＨの平均発現値に対して正常化した。五番目に、ログ10（倍数−変化）値をすべてのデータビンに対して計算した。六番目に、平均センタリングを各値から列平均を差し引くことによって行った。最後に、各値を列にわたり標準偏差で割ることによって各値を自動縮尺した。
【０１１１】
正常なヒト組織のｍｉＲＮＡの絶対量を測定するために（図６）、各合成ｍｉＲＮＡの約１５，０００の複製物を含有する定量参照標準サンプルを逆転写させ、５０ｎｇの組織由来の全ＲＮＡサンプルと競合競合的に増幅させた。すべてのサンプルを3回の技術的複製で分析した。読み込みカウントを複製物に対して平均化した。所定の組織サンプルの標的に対する平均カウントを対照サンプルの同一標的に対する平均カウントで割った。次いで、その結果値に１５，０００を乗算してその組織サンプルの５０ｎｇのトータルＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ複製物の数の推定値を算出した。ログ10−変換値をヒートマップに図表化した。
【０１１２】
ヒートマップの図表化：
すべてのヒートマップをクラスタリングすることなく、ＴｒｅｅＶｉｅｗソフトウェア（ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｒａｎａ．ｌｂｌ．ｇｏｖ／ＥｉｓｅｎＳｏｆｔｗａｒｅ．ｈｔｍからダウンロード）を使用して作成した。公開されたｑＲＴ−ＰＣＲ研究からの生（Ｒａｗ）Ｃｑ値をｍｉＲＮＡボディーマップウェブサイト（ｗｗｗ．ｍｉｒｎａｂｏｄｙｍａｐ．ｏｒｇ）から得た。その値を３５でフローリングし、前記において概略記述したのと同じ正常化および標準化段階を第４段階から開始して行った。公開されたおよび測定されたデータの標準化された値を別途のヒートマップに同じ色相スケールおよびコントラストパラメータを使用して図表化した。スプリットピクセルマップを、ひとつのマップ上の各ピクセルの半分を消した後、それを二つ目のマップにＡｄｏｂｅイラストレーターおよびフォトショップ（登録商標）を使用してオーバーレイしておくことによって生成した。
【０１１３】
ＭＡＱＣサンプルのｍＲＮＡの分析：
ｍＲＮＡ分析に対する標的遺伝子を、通常的にＭＡＱＣデータセットで報告された三個のすべての定量（非微細配列）プラットホームにわたって試験された４８個の遺伝子の中から選択した。これら４８個の遺伝子の中から、発現が３個のプラットホームにわたって一貫した水準(having a low coefficient of variance) で測定された３０個を選択した。標的化された遺伝子は、表５に列挙されている。
【０１１４】
４回繰り返した実験からのビニングされた配列カウントを４個のＭＡＱＣサンプル（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）のそれぞれに対して平均化した。所定の遺伝子に対する平均カウントをその遺伝子に対する値の和を作るために、共通因子で乗算し、１０００にした。フローリングは適用しなかった。ただし、３０個のみの標的を分析したため、サンプルにわたる全般的な平均発現水準に対する標準化は推奨され得なかった。したがって、所定のサンプルに対する発現値をそのサンプルに対するＰＯＬＲ２およびＡＣＴＢ参照遺伝子の平均測定に対して正常化した。
【０１１５】
正常化した発現値を使用してヒトのユニバーサルリファレンスＲＮＡ（サンプルＡ）とヒト以外のリファレンスＲＮＡ（サンプルＢ）間の３０遺伝子すべてに対する倍数−変化を計算した。相対的な正確度をサンプルＣおよびＤの測定に基づいて、メインテキストで記述された通りに計算した。
【０１１６】
結果
合成ＲＮＡ混合物を使用した正確度評価：
開示されたＲＮＡプロファイリング方法の性能を、まず公知量の合成ｍｉＲＮＡの混合物に対して試した。９０種類のヒトｍｉＲＮＡの代表的なパネルをｍｉＲＢａｓｅ登記所から選択したが、優先的に、先に発見され、より良く規定された生物学的機能を有するものを選択した。さらに６つのＲＮＡを対照標準として含ませた：３個のヒトの小核／核であるＲＮＡ断片、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ｍｉＲＮＡおよび自然で発見されていない２個の任意の配列（表２）。これら合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドをそれぞれロボットリキッドハンドラーを使用して９６個の別個のチューブに、３００ｎｇ／ｍＬポリ−Ａ担体ＲＮＡをベースに４〜０．０８ｎＭの範囲の最終濃度になるように異なる量で分配した。ＲＮＡを方法の容量および正確度の複合化を簡単に目視で評価するために、デザインされたパターンで分布させた；定量し、ヒートマップに図表化した時、ＲＮＡ混合物は、ローズ（ｒｏｓｅ）の映像を再現する。
【０１１７】
ｊサンプルからの逆転写中にｉＲＮＡの複合化された標的化された標識化を可能にするために、サンプル特異的タグに付着した標的特異的配列のｉ×ｊ組み合わせを有するＲＴプライマーを生成する必要があった。さらに、定量一貫性を保証するために、同じ比率のすべての標的特異的配列を有する特有の標的化されたプライマーミックスを使用して異なるサンプルを逆転写させることが重要であった。個別的に形成された数千個のプライマーを単純に混合することが非実用的で且つ不正確な比率を算出するため、２段階モジュールオリゴヌクレオチド合成戦略を考案した（図１ａ）。合成を、それぞれが３’末末端で異なる標的特異的プライマー配列を含有する、９６個の部分的なオリゴヌクレオチドを形成した後に停止した。部分的に合成されたオリゴヌクレオチドを含有するすべてのポリスチレン粒子を完全に混合し、９６個の新しいカラムに分配した。その後、合成を再開し、特有なサンプル特異的タグおよびユニバーサルＰＣＲプライマー結合部位を含んだ配列を各カラムに添加した。最後に、オリゴヌクレオチドを、全長生成物を豊富にするためにソリッド支持体から切断し、脱保護させ、カートリッジ精製した。この接近法で９６個のプライマーミックスが生成されたが（表３）、それぞれ５’セグメントに特有のサンプル特異的タグおよび３’セグメントに９６個の標的特異的プライマー配列の均一な組成を有した。一度形成された後、プライマーセットを数百もの反応に使用することができた。
【０１１８】
開示されたＲＮＡプロファイリング方法の第１段階において、９６個の標的化されたＲＮＡがすべて各サンプルに対して単一ウェルで同時に逆転写された（図１ｂ）。ＲＴプライマーをそれぞれの短いｍｉＲＮＡ標的の３’末末端で６個のヌクレオチドに混成化するようにデザインした。標的特異的プライマー配列の比率がすべての反応において類似していると見なされるので、タグ付きｃＤＮＡ複製物の比率は、それぞれのサンプルでＲＮＡの存在量を忠実に反映しなければならない。ＲＮＡ／ＤＮＡ相互作用の特異性および安定性を増大させるために、ＲＮＡに結合しないプライマーの塩基を共通プライマー配列に相補的であるビオチン化オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによってマスキングした；これは、また、塩基スタッキングの領域を延長させると予想される。ＲＴが完了した時、９６個のすべてのサンプルからのタグ付きｃＤＮＡを単一チューブにプールし、ストレプトアビジンアガロース樹脂を使用して混成化されたビオチン化オリゴヌクレオチドのプルダウン（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ）によって精製した。ｃＤＮＡの熱溶出後に、第２ラウンドの選択的混成化および捕捉をプライマー延長した配列に相補的であるビオチン化オリゴヌクレオチドを使用して行った（表４）。
【０１１９】
次に、ｃＤＮＡプールを別途のエンドポイントＰＣＲによる各標的の増幅のために（安定期として採択する）９６ウェルプレートのウェルに分配した。重要なことに、所定のｃＤＮＡ種と関連したすべてのタグが単一体積で競合的に増幅したので、ＲＮＡ豊富をコーディングするタグ比率が保存された。ＰＣＲプライマー（表４）の５’末端でシークエンシングアダプタの統合は、結果として生成されたアンプリコンがプールされ、ゲル精製され、追加のライブラリーの製造段階なしに大量並列シークエンシングに対する鋳型として直接使用されることを可能にした。
【０１２０】
９６個すべての反応からプールされたアンプリコンを、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭで低容量３１４または高容量３１８チップのうちいずれか一つを使用してシークエンシングし、それぞれ作動当たり平均０．４２Ｍまたは３．４８Ｍの濾過された読み込みを生成した（表１）。読み込みをそれらの標的およびタグ配列を基準としてビニングした。Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＴＭＡＰ包含範囲分析モジュールを使用して、９，２１６個のすべてのビンに対する読み込みカウントの表を作成した。各チップの大きさについて、二つの複製実験の平均カウントを使用して各値の正常化およびログ変換後にヒートマップを作成した（方法にて詳細に説明した）。
【０１２１】
その結果の図表は、意図されたローズの画像（図２、ａおよびｂ）を再現し、大多数のサンプルにわたって複雑な合成ＲＮＡ混合物の正確かつ高度の並列定量を確認した。ピクセルシェードの微妙な差の一貫したレンダリングは、ＲＮＡ量において相対的に小さい変化を区別する分析能力を証明した。低容量チップで生成された画像は、低光量で撮った写純粋なように、より不鮮明に見えるが、依然としてノイズ以上の強力な定量信号を示した。サンプルに添加された合成ＲＮＡの量とそれの測定水準の間の一致度を評価するために、各ＲＮＡに対する平均に対する公知および測定された値の倍数変化に対する比較を行った（図２、ｃおよびｄ）。回帰分析の結果、３１８チップデータに対して０．８２および０．８８、３１４チップデータに対して０．８９および０．８４の傾きおよびＲ2をそれぞれ得た。次いで、測定の正確度に及ぼす配列深さの効果を知るために、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数を、使用された読み込みの総数を異ならせながら公知および測定値の間で計算した（図２ｅ）。この分析は、単に概略５００，０００の総読み込み（標的／サンプルビン当たり、単に約５４読み込みの平均に該当する）以上で正確度のわずかな改善しか示さなかった。
【０１２２】
図２は、開示されたＲＮＡプロファイリング方法を使用した複合化されたＲＮＡ定量の正確度を支持するデータを提供する。パネルＡは、９６サンプル内で特殊な比率で混合された９６個の合成ｍｉＲＮＡと対照ＲＮＡの測定に基づくローズの９，２１６ピクセル映像を示したヒートマップを示す。二つの複製実験の平均値が表わされるが、それぞれ高容量３１８チップを使用してシークエンシングされた。正常化は、方法で記述された。ＲＮＡは、表２に列挙されたものと同じ順序であった。パネルＢは、低容量３１４チップを使用した二つの複製物から作成された類似のヒートマップを示す。パネルＣおよびＤは、３１８（パネルＣ）または３１４チップ（パネルＤ）を使用してサンプルに添加された合成ＲＮＡの量とその測定水準の間の一致性を示す。倍数変化は、各ＲＮＡに対する平均と相対的である。パネルＥは、公知および測定されたＲＮＡ水準の間のＰｅａｒｓｏｎ相関係数によって定義された、定量正確度に及ぼす配列深さの効果を示す。
【０１２３】
ヒト組織のｍｉＲＮＡの多重分析：
人工ＲＮＡサンプルを越えて移動し、分析の性能を次に２０個の正常ヒト組織から得られたｍｉＲＮＡに対して試した。これらのサンプルを、開示されたＲＮＡプロファイリング方法を使用して行った測定が妥当であり得る、独立的に公開されたｑＲＴ−ＰＣＲデータの活用度を基準に選択した。入力は、各サンプルからの５０ｎｇのトータルＲＮＡからなり、結果としての読み込みカウントに対して前述されたように、全般的な平均正常化、平均−センタリングおよび自動縮尺を行った。結果を、開示されたＲＮＡプロファイリング方法を使用して行われる測定が対角線上のスプリットピクセルの二つの半分で公開された値と比較された変形したヒートマップを使用して示す（図３ａ）。データセット間の一致度は、赤色および緑色半分の組み合わせを有するピクセルの欠乏で証明される。Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数の分析は、所定の組織に対して開示されたＲＮＡプロファイリング方法対ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されたＲＮＡ水準の間に良好な一致があることを示す（図３ｂ）。また、相関は、関連した組織（例えば、結腸および小腸または卵巣および精巣）の間でも観察された。他のプラットホームからのデータに対する比較は、図５に示す。測定は、試験された多様なプラットホームにわたって良好な一貫性を示した。ペア方式の相関係数の類似の範囲が開示されたＲＮＡプロファイリング方法を４個の直角プラットホームと比較した時に発見され、そのような直角プラットホームを互いに比較した時に発見されたのと同じであった（図５）。また、公知の、等モル量のすべての合成ｍｉＲＮＡを定量参照標準として含有するサンプルを共増幅させることによって、相対濃度よりは絶対濃度を測定することが可能であった（図６）。このような分析に基づいて、分析が少なくとも４〜５桁の濃度範囲に亘ってｍｉＲＮＡを測定することが可能であると示された。
【０１２４】
図３は、ヒト組織および参照サンプルからのＲＮＡで方法の定量性を証明するためのデータを図示する。パネルＡは、公開されたｑＲＴ−ＰＣＲ測定に対して２０個の正常ヒト組織からの３個の技術的複製物として測定された９０ｍｉＲＮＡの水準を比較するピクセルが分けられたヒートマップを示す。二つのデータセットのすべて標準化された。パネルＢは、同じ組織からの（対角線の）または異なる組織間の（対角線の外）開示されたＲＮＡプロファイリング方法対ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されたｍｉＲＮＡ水準の相関係数のヒートマップを示す。色相図式および組織の順序は、ａと同じである。パネルＣは、開示されたＲＮＡプロファイリング方法（４回繰返しで）対３個の他のプラットホームによって測定されるところ、ＭＡＱＣ参照サンプルでのｍＲＮＡ水準の倍数−差のペア方式相関を示す。すべてのプラットホームに対して３０ｍＲＮＡを試した。線形回帰フィットが図示される。ＵＨＲ＝ユニバーサルヒトリファレンスＲＮＡ；ＨＢＲ＝ヒト脳リファレンスＲＮＡ。パネルＤは、サンプルＡおよびＢ12の測定に基づいて予測された水準と比較したＭＡＱＣサンプルＣおよびＤのｍＲＮＡの測定された水準の間の％差として規定された、相対的な正確度のボックス図表を示す（同じ３０遺伝子に対するものである）。予測された水準は、Ｃ’＝０．７５Ａ＋０．２５ＢおよびＤ’＝０．２５Ａ＋０．７５Ｂと計算された。水平線＝中間；ボックス＝四分位数範囲；ウィスカー＝１０番目〜９０番目の百分位数；点＝特異値。
【０１２５】
図５は、複数のｍｉＲＮＡプロファイリングプラットホームを比較するためのデータを提供する。パネルＡは、開示されたＲＮＡプロファイリング方法を含み、５つの直角プラットホームを使用して正常な脳および肝から得られるトータルＲＮＡで測定されたｍｉＲＮＡ水準を示す。他の４個のプラットホームからのデータは、独立した研究所によって報告された。異なるプラットホームによって測定された脳対肝でのｍｉＲＮＡ水準間のｌｏｇ2（倍数差）に対する値をヒートマップに示す。分析は、すべての分析パネルに共通するｍｉＲＮＡに制限されていた。ｍｉＲＮＡは、それの水準が所定のプラットホームに対して二つのサンプルのすべてにおいて検出限界を下回っている場合、排除させた。報告された値は、３個の技術的複製物の平均である。パネルＢは、開示されたＲＮＡプロファイリング方法対４個の直角プラットホームによって測定されたところ、脳と肝間のｍｉＲＮＡ水準の倍数差の双方式相関を示す。パネルＣは、すべてのプラットホームの組み合わせに対する双方式Ｒ2値を示す。外部データセットをＴａｑｍａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲ8に対してｍｉｒｎａｂｏｄｙｍａｐ．ｏｒｇから、およびＩｌｌｕｍｉｎａ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ（ＧＳＥ４９８１６），Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ配列（ＧＳＥ４９６６１）およびＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（ＧＳＥ４９６００）に対するＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓからダウンロードした。Ｄ．Ｍ．＝開示されたＲＮＡプロファイリング方法。
【０１２６】
図６は、ヒト組織においてｍｉＲＮＡの絶対定量を図示する。それぞれのｍｉＲＮＡ種の約１５，０００個の合成複製物を含有する共増幅された定量参照標準サンプルに対して正常化することによって、絶対ｍｉＲＮＡ濃度を推定することができた。トータルＲＮＡ入力は、組織サンプル当たり５０ｎｇであった。各値を平均３回の複製ＲＴ反応から得て、シングルプレックスＰＣＲに対してプールした。Ｈｓａ−ｍｉｒ−３８１は、増幅が不十分であったため、分析から除外させた。陰影スケールは、ｍＲＮＡの存在量を示し、挿入された棒グラフは、これらの値の頻度分布を同じ規模で示す。
【０１２７】
参照標準でｍＲＮＡの測定：
ｍＲＮＡを定量するための方法を調整することは難しくなかった。標的長さ制限がないため、ＲＴを高温でさらに長い遺伝子特異的プライマーを使用して行われることができた（表５）。他のマイナーな変形は、方法のセクションで詳細に説明した。検証ベンチマークを提供するために、その発現を一貫した水準で測定した３０個の遺伝子をＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ品質管理（ＭＡＱＣ）コンソーシアムプロジェクトの一環として、３個の異なる定量プラットホームを使用して標的化した。分析を、（Ａ）ＳｔｒａｔａｇｅｎｅユニバーサルヒトＲＮＡ、（Ｂ）Ａｍｂｉｏｎヒト脳ＲＮＡ、および（Ｃ）３：１および（Ｄ）１：３の比率のこれら両サンプルの混合物で構成された４個のＭＡＱＣ参照サンプルから１００ｎｇのトータルＲＮＡを使用して４回繰り返して行った。発現水準をＡＣＴＢおよびＰＯＬＲ２Ａの平均水準に対して正常化した。開示されたＲＮＡプロファイリング方法と三つの定量ＭＡＱＣプラットホームのそれぞれの間の倍数変化測定の相関関係を評価するために、サンプルＡとＢの間の倍数差の双方式回帰分析を行った（図３ｃ）。３０遺伝子の共通セットに対し、開示されたＲＮＡプロファイリング方法対ＴａｑＭａｎに対するそれぞれの傾きおよびＲ2は、１．０２および０．８９であり；対比ＳｔａＲＴ−ＰＣＲに対しては０．９７および０．９１であり、対比ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅに対しては０．９２および０．８８であった。サンプルＣおよびＤは、規定された比率のサンプルＡとＢで構成されるので、分析の相対的な正確度（ＲＡ）は、ＣおよびＤに対する観察された発現水準をＡおよびＢの測定から計算された予測水準と比較することによって評価することができた。遺伝子に対するＲＡ点数は、ΔＣ＝（Ｃ−Ｃ’）／Ｃ’およびΔＤ＝（Ｄ−Ｄ’）／Ｄ’で定義し、ここで、ＣおよびＤは、遺伝子の測定された水準であり、Ｃ’およびＤ’は、予測水準である。３０個のｍＲＮＡのパネルに対するＲＡ点数のボックス図表は、値が略０周辺に分布していることを示す（図３ｄ）。
【０１２８】
放射線被ばくの高処理量評価：
最後に、臨床サンプルに対する開示されたＲＮＡプロファイリング方法の活用度を評価するために、放射線誘発遺伝子発現変化をヒトの血液で測定した。これは、大規模の核の災難後に、全身被爆線量の推定方法として提案されたことがある；しかし、サンプル処理量の最適化は、潜在的に被ばくした数千名の個体の分類を可能にする必要がある。この目的に対して開示されたＲＮＡプロファイリング方法を使用する実現可能性を調べるために、以前に確認された２３個の放射線反応性転写物のパネルの発現変化を定量するための分析法が開発された。この分析を、１８名の個体から生体外放射線照射された血液サンプル（それぞれ６容量水準）の並列分析を行うために使用した。入力は、全血の放射線照射２４時間後に分離された末梢血単核細胞由来の４００ｎｇのトータルＲＮＡでなっていた。予想通り、信号が１８名のすべての個体にわたって平均化された時に発現の容量依存度の増加がパネルのすべての遺伝子に対して観察された（図４、ａおよびｂ）。また、各個体に対する発現パターンは、全体傾向と良好な一貫性を示した（図４ｃ）。
【０１２９】
図４は、ヒトの血液で放射線誘発遺伝子発現変化の高処理量測定の結果を図示する。以前に確認された放射線反応性遺伝子のパネルで発現水準変化を、１８名の個体からの１０８個の血液サンプルの生体外放射線照射２４時間後に測定した。すべてのサンプルを二つの複製ＲＮＡプロファイリング実験で並列に処理および測定した。パネルＡは、ｍｏｃｋ照射されたサンプルに対して、多様な放射線容量で遺伝子発現の平均倍数誘導を示す。エラーバーは、ＳＥＭを示す。パネルＢは１８対象体に対して平均化された異なる容量での標準化された遺伝子発現値のヒートマップを示すが、それらのそれぞれの値は、パネルＣに別途図示される。平均センタリングおよび自動縮尺を各対象体からのサンプルに対して別途に行った。
【０１３０】
実施例２
この実施例は、複雑な核酸混合物内の低存在量の変異体配列の高感度かつ効果的な測定に対して指示された方法およびシステムを記述する。本発明者などは、この実施例で記述された方法を「系統追跡ＰＣＲ」（ＬＴ−ＰＣＲ）と言及する。ＬＴ−ＰＣＲの目標は、分子特異的タグ（分子系統タグまたはＭＬＴと言及される）をＰＣＲの最初の数サイクルの間に鋳型ＤＮＡ分子に配分し、純粋な鋳型由来の突然変異をシーケンサーまたはＰＣＲエラーから区別することを可能にさせることである。この実施例は、癌にかかった患者から得られた血液サンプルからのＤＮＡの分析を記述するが、この方法は、腫瘍組織、細胞、尿などのような他の供給源からのサンプルにも、より一般的に適用され得る。この方法は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ鋳型に適用され得、さらにＲＮＡの逆転写によって生成された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）にも適用され得る。
【０１３１】
材料および方法：
患者血漿サンプルの収集およびプロセッシング
血液をカルシウム−ＥＤＴＡを含有する真空管内への静脈穿刺によって収集した。多様なチューブサイズ、典型的には、３ｍＬ〜１０ｍＬの間のものを使用した。血液を収集時にチューブで数回反転させてＫ2−ＥＤＴＡを均一に混合させた。サンプルを一時的に保管してから、血漿を分離する前に室温（２０〜２５℃）で移した。血漿を分離し血液を収集した後、できるだけ迅速に、好ましくは３または４時間内に冷凍させた。収集チューブを１０００×ｇで１０分間、ゆっくりと加速し減速させる揺動バケットローター付き臨床遠心分離機から遠心分離した（ブレーキオフ）。細胞がチューブの底で邪魔にならないように（増加した背景野生型ＤＮＡ水準を誘導する白血球の吸引を回避するために）注意しながら、血漿を赤血球およびバフィーコートから１ｍＬピペットを使用して除去した。血漿を０．５〜１ｍＬ部分標本で１．５ｍＬのクライオバイアルに分配した。 次に、血漿を追加のプロセッシングに必要となるまで−８０℃で冷凍させた。
【０１３２】
血漿からＤＮＡの抽出および精製
血漿を−８０℃冷凍装置から取り出し、ＤＮＡ抽出を進行する前に室温で１５〜３０分間解凍した。
【０１３３】
血漿からＤＮＡの抽出および精製された血漿を次に６８００×ｇで３分間遠心分離して任意の低温沈殿物を除去した。上清を追加のプロセッシングのために新しいチューブに移した。
【０１３４】
１ｍＬまでの血漿体積からＤＮＡの抽出のために、ＱｉａＡｍｐＭｉｎＥｌｕｔｅウイルス真空キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用した（溶出体積は２０μＬ程度に低い）。５ｍＬまでの血漿の大量の体積に対しては、ＤＮＡ精製のためにＱｉａＡｍｐ循環核酸キットを使用した（溶出体積は２０μＬ程度と低い）。すべてのキットを製造業者の説明書に従って使用し、一般的に最低推奨体積（好ましくは２０μＬ）でＤＮＡを溶出した。１ｍＬの血漿をＱｉａＡｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅウイルス真空キットを使用して処理するために、５マイクログラムの坦体ＲＮＡ（ｃＲＮＡ；Ｑｉａｇｅｎ）を１ｍＬ当たり添加し、Ｑｉａｇｅｎウェブサイトで探した使用者開発プロトコルに従った。
【０１３５】
遮断された３’末端を有するユニバーサルプライマーおよびＭＬＴ−含有遺伝子特異的プライマーの合成：
オリゴヌクレオチドをＰＣＲによる増幅のために、ゲノムＤＮＡの特異的突然変異を起こしやすい領域を標的化するようにデザインした。プライマーを自動ＤＮＡオリゴヌクレオチド合成器（Ｄｒ．Ｏｌｉｇｏ  １９２）で標準ホスホラミダイト化学を使用して３’から５’方向にユニバーサルポリスチレン支持体ＩＩＩ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で２００ナノモル規模で合成した。プライマーのデザインは、図７および図８に概略的に図示される。遺伝子特異的プライマーは、３’−末端に遺伝子特異的配列を有し、それらは、ＭＬＴを含む７つの縮重位置を含有し、ユニバーサルプライマー配列の一部のを含有する。ユニバーサルプライマーは、溶融温度を高めるためにＬＮＡ変形を含有する。プライマー配列は、下記の表１０で列挙する。プライマーをゲル精製するか、カートリッジ精製した。この方法が複数の標的を同時に分析できるかを証明するために、プライマーを癌で頻繁に突然変異した８つのゲノム領域を標的化するようにデザインした：ＫＲＡＳの１領域、ＢＲＡＦの１領域、ＰＰＰ２Ｒ１Ａの１領域、ＰＩＫ３ＣＡの２領域、およびＥＧＦＲの３領域。この実施例において、８個のゲノム領域が標的化されたが、この方法は数十または数百または数千個の標的アンプリコンに容易に拡大することができる。
【０１３６】
[表１０]
2018509178.tif 000025
2018509178.tif 000026
2018509178.tif 000027
【０１３７】
系統追跡されたＰＣＲタグ付けおよび増幅：
変形されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を各ＤＮＡ鋳型サンプルに対して、下記で概略的に説明する条件を使用して単一反応チューブで行った：
【０１３８】
系統追跡されたＰＣＲ設定（２０μＬ反応）：
精製された鋳型ＤＮＡ（共溶出された坦体ＲＮＡ［ｃＲＮＡ］を含有することができる）１０μＬ（またはそれ未満）
５ｘ濃縮されたＰｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ）４μＬ
１６個の遺伝子特異的プライマーのミックス（ストックはそれぞれ２００ｎＭを有する）２μＬ
サンプル特異的バーコードおよびシークエンシングアダプタを有するユニバーサル順方向および逆方向プライマーの混合物（ストックはそれぞれ５μＭを有する）２μＬ
４ｄＮＴＰの混合物（ストックはそれぞれ１０ｍＭ）０．４μＬ
Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ）（２Ｕ／μＬストック）０．２μＬ
ＲＮＡｓｅ  Ｈ２（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（２０ｍＵ／μＬストック）１μＬ
水（２０μＬの最終体積を形成するためである）。
【０１３９】
一部の反応のために、さらに長いユニバーサルプライマーに加えてさらに短いユニバーサルプライマー（バーコードおよびシークエンシングアダプタがない［表１０］）をそれぞれ２００ｎＭの最終濃度で、一緒に添加した。さらに迅速な混成化速度を有するさらに短いユニバーサルプライマーを含むことは、ＭＬＴ標識された複製物のより有効である早期増幅を促進するために意図された。
【０１４０】
温度サイクリング条件：
ａ．３０秒間９８℃
ｂ．１０秒間９８℃
ｃ．７０℃から、１０秒当たり１℃の速度で徐々に６０℃に低下する
ｄ．１分間６０℃
ｅ．３０秒間７２℃
ｆ．工程ｂ〜ｅを２サイクル以上間繰り返す（合計３サイクル）
ｇ．１０秒間９８℃
ｈ．６０秒間７２℃
ｉ．３４回以上のサイクルの間に工程ｇ〜ｈをさらに繰り返す（合計３５サイクル）
ｇ．４℃に維持
【０１４１】
熱サイクリングが終わった時、各反応体積に２μＬの１００ｍＭ  ＥＤＴＡ含有緩衝液を添加し、ポリメラーゼ活性を不活性化させた。次いで、各サンプルからのおおよそ１０μＬの増幅生成物を増幅されたＤＮＡの後続する精製のために単一チューブにプールした。
【０１４２】
次世代シークエンシングのためのＤＮＡの製造：
プールされたＰＣＲ反応生成物をエチジウムブロマイドおよび１ｘＴＢＥ緩衝液を含む２％アガロースゲルで精製した。すべてのＰＣＲ生成物が同様の最終長さのものであったため、プールされた生成物は、ゲルで多少拡散帯として現れた。この拡散帯を新しいメスの刃を使用してゲルから切断し、ゲルが可視帯域の 数ミリメートル上下を切断してさらに早くまたはさらに遅く作動され得、十分に可視化されていない任意の低密度帯までも含むことを保証した。製造業者の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡをゲルスライスから分離した。ＤＮＡを５０μＬの溶出緩衝液、ＥＢに溶出させた。
【０１４３】
次世代シークエンシング
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ流れセル上にローディングするためのサンプルを製造するために、ＤＮＡの濃度をＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して測定し、ＤＮＡをＩｌｌｕｍｉｎａによって推奨された濃度に希釈した。クラスターの形成をＩｌｌｕｍｉｎａのプロトコルにしたがってフローセルで行った。サンプルをフローセルが単一のレーン上にローディングした。シークエンシングをＨｉＳｅｑ  ２０００機器で多重化されたペアエンド方式で行い、この時、各方向の読み込み長さは７５塩基対であった。追加の実験で、シークエンシングをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ機器で行い、各方向に１００、１５０、２００または２５０塩基対のペアエンド読み込み長さが活用された。また、２回のインデックス読み込みを行い、インデックス読み込み長さは標準７サイクルから９サイクルまで増加して、本発明のさらに長いバーコード（インデックス）配列を適切に読み込むことができた。
【０１４４】
実施例３
実施例２と同様に、実施例３は、複雑な核酸混合物内の低存在量の変異体配列の高感度で効果的な測定に対して指示された方法およびシステムを記述する。この実施例は実施例２で記述したように、「系統追跡されたＰＣＲ」（ＬＴ−ＰＣＲ）を統合するが、追加で分析感度を改善するために区画化戦略を使用する。ＰＣＲを多くの小さい反応体積に分けたため、所定の反応体積で特定の標的化されたＤＮＡ断片の一つ以上の複製物を有する可能性が非常に低くなった。変異体配列の増幅された複製物が所定の反応区画内で二本鎖鋳型ＤＮＡ断片の両鎖から発生することを確認することを可能にするように作ったタグ付け戦略を使用した。この実施例は、癌にかかった患者から得られた血液サンプルからのＤＮＡの分析を記述するが、この方法は、腫瘍組織、細胞、尿などのような他の供給源からのサンプルにもより一般的に適用され得る。この方法はまた、一本鎖ＤＮＡ鋳型におよびＲＮＡの逆転写によって生成された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）にも適用され得るが、エラー抑制の強固さに妥協がなければならない。
【０１４５】
材料および方法
患者血漿サンプルの収集およびプロセッシング
血液を実施例２に記述の方法と同じ方法を使用して収集した。
【０１４６】
血漿からのＤＮＡの抽出および精製
ＤＮＡを実施例２記述の方法と同じ方法を使用して患者の血漿サンプルから抽出した。
【０１４７】
遮断された３’末端を有するユニバーサルプライマーおよびＭＬＴ含有遺伝子特異的プライマーの合成
実施例２で合成された同じプライマー（表１０）をこの実施例で使用するものの、長い順方向ユニバーサルプライマー（バーコードおよびシークエンシングアダプタを含有する）は例外とした。プライマーの合成を実施例２記述の方法と同じ方法を使用して行った。
【０１４８】
磁性ビーズ上のビーズ特有のバーコードを含有するオリゴヌクレオチドのスプリットおよびプール合成
磁性のマイクロビーズを使用してバーコーディングされた順方向ユニバーサルプライマーを異なるＰＣＲ微細区画（例えば、液滴またはマイクロウェル）に伝達した。各ビーズを多くのプライマー複製物がすべて同じビーズ特有のバーコード（ＢＳＢＣ）を有するようにデザインした。所望の順方向ユニバーサルプライマー配列の配列は、次のとおりである：
【０１４９】
５’−ビオチン−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ［ＢＳＢＣ］ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣ−３’
【０１５０】
約百万ビーズ特有のバーコードを有する数百万個の磁性のマイクロビーズを生成するために、オリゴヌクレオチド合成をバーコード配列を生成するためのスプリットおよびプール接近法を使用してビーズの表面で直接行った。アミン変形を有する表面活性化された超常磁性２．８μｍビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０  Ａｍｉｎｅ  ［Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］）をオリゴヌクレオチド合成のためのソリッド支持体として使用した。合成の各バッチに対して、５０μＬのビーズスラリーを製造業者によって提供された通りに使用した（約１００×１０6ビーズ）。ビーズは、フリットによって合成カラムに保有されるには小さすぎるため、ドーナツ状のネオジム磁石をカラム周辺に置いて磁性ビーズをカラムの側面の位置に保持させた。スペーサー９ホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）は直接アミン変形されたビーズと反応してアンモニウムヒドロキシド／メチルアミン（ＡＭＡ）で標準脱保護される間に切断されないホスホラミデート結合を生成した。追加のホスホラミダイトは、このスペーサーに結合されて所望のオリゴヌクレオチド鎖が成長された。合成されたオリゴヌクレオチドは、合成が完了した時、ビーズに付着したままであった。次の配列をビーズの表面で合成した：
【０１５１】
５’−スペーサー９−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−スペーサーＣ３−ＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧＴ［ＢＳＢＣ］ＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ−３’
【０１５２】
５’から３’方向にオリゴヌクレオチドを合成するために、５’−ＣＥホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用した。オリゴヌクレオチド配列は、ビーズの表面から追加の空間を導入するために、１０ｄＴの残基を含有する。ビーズ特有のバーコード（ＢＳＢＣ）は、スプリットおよびプール合成を使用して合成された１０個の残基で構成された。これら１０個の位置のそれぞれにおいてホスホラミダイトカップリングのために、合成を停止させ、磁性ビーズをプールした後、４個のカラムに分けた。４個の異なるカラムは、４個の異なるホスホラミダイト（５’−ｄＡ、５’−ｄＴ、５’−ｄＣおよび５’−ｄＧ）を受けた。合成を１０回のカップリングサイクルのそれぞれの間に停止してビーズがプールされ、４個のカラムに同等に再分布されることを許容した。合成が完了した後、ビーズ結合されたオリゴヌクレオチドをＡＭＡで６５℃で１０分間脱保護させた。次いで、ビーズを脱イオン水で洗浄し、次いで１０ｍＭトリスｐＨ７．６緩衝液に懸濁した。
【０１５３】
マイクロビーズの表面で熱放出性相補的バーコード化プライマーを合成するために、次のプライマーをビーズ結合されたオリゴヌクレオチドにアニーリングし、クレノウ断片（Ｅｘｏ−）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して延長させた。
【０１５４】
５’−ビオチン−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣ−３’
【０１５５】
ビーズを０．２ｍＭ  ｄＮＴＰが補充された５０μＬのＮＥＢ緩衝液２（１ｘ濃度）に再懸濁した。プライマー延長反応を製造業者の指示にしたがって行い、クレノウポリメラーゼを添加した後に３７℃で３０分間反応をインキュベーションした。次いで、ビーズを５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭトリスｐＨ７．６を含有する緩衝液で洗浄し、そこで再懸濁した。
【０１５６】
クローンタグ付きプライマーを区画に伝達するためのビーズフリー方法
一部の実験で、ビーズを使用する代わりに、代替接近法を使用して区画内のＰＣＲ生成物に区画固有タグを導入した。ビーズベースの伝達と同様に、目標は、異なる区画に次のプライマー配列を伝達することであった：
【０１５７】
５’−ビオチン−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ［ＣＳＢＣ］ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣ−３’
【０１５８】
所定の区画で、このプライマーの多数の複製物を導入し、この時、クローン複製物は一つまたは少数の区画固有バーコード（ＣＳＢＣ）を含有する。そのようなプライマーを製造するために、非常に希釈された鋳型ＤＮＡをＰＣＲカクテルに添加した後、平均２乃至〜３増幅可能な複製物（分子）が各溝画に（Ｐｏｉｓｓｏｎ分布に沿って）分配されることを許容する濃度で区画化した。鋳型ＤＮＡは、次の配列で構成された：
【０１５９】
Ｄｅｇｅｎ鋳型：
５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣ−３’
次のプライマーをさらにカクテルに添加した：
Ｂｉｏ−ＳｈｏｒｔＦＷＤ：
５’−ビオチン−ＡＡ＋ＴＧ＋ＡＴ＋ＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧａＴＣＴＡＸＸ−３’（１００ｎＭ最終濃度で添加する）
ＳｈｏｒｔＲＥＶ：
５’−ＧＧＡ＋ＡＧＡＧＣＧ＋ＴＣＧ＋ＴＧＴＡＧＧＧＡＡａＧＡＧＴＸＸ−３’（２０ｎＭ最終濃度で添加する）
Ｘ＝ｄＡ−５’−ＣＥホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用した反対方向のｄＡ。
下部の場合の残基はＲＮＡ；上部の場合の残基はＤＮＡである。
Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＣまたはＧを組み込む可能性が同等な縮重位置。
Ａ残基の前方で「＋」は、その位置でＬＮＡヌクレオチドを指す。
【０１６０】
マイクロコンパートメントに対して熱サイクリングを遂行することによって、少数のタグ付き鋳型分子がクローン増幅されて、区画固有タグを含有する所望のプライマーの多くの複製物が生成された。ビオチニル化された短い前方プライマーが短い逆方向プライマーと比較して５’−倍過剰に添加されたため、逆方向鎖の複製物よりもさらに多い前方鎖複製物が（非対称ＰＣＲを通じて）形成された。したがって、前方鎖の過剰複製物は、次に同一区画で共増幅された遺伝子特異的ＰＣＲ生成物に混成化されることによってさらに延長され得る。このような方法で、区画の遺伝子特異的ＰＣＲ生成物は区画固有タグで標識された。この接近法は、図１２で図式化される。
【０１６１】
ＰＣＲカクテル
この実施例で使用されたＰＣＲカクテルは、マイクロビーズが区画固有プライマーを伝達するために使用されたか、またはビーズフリー接近法が使用されたかによって左右される。
【０１６２】
ビーズベース接近法に対して、次のＰＣＲカクテルを使用した：
精製された鋳型ＤＮＡ（共溶出された坦体ＲＮＡ［ｃＲＮＡ］を含有することができる）１０μＬ（またはそれ未満）
５×濃縮されたＰｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ）４μＬ
１６個の遺伝子特異的プライマーの混合物（ストックはそれぞれ２００ｎＭを有する）２μＬ
短いユニバーサル順方向および逆方向プライマー（ストックはそれぞれ１０μＭ）１μＬ
サンプル特異的バーコードおよびシークエンシングアダプタを有する長いユニバーサル逆方向プライマー（１０μＭストック）１μＬ
４  ｄＮＴＰの混合物（ストックはそれぞれ１０ｍＭ）０．４μＬ
Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ）（２Ｕ／μＬストック）０．２μＬ
ＲＮＡｓｅ  Ｈ２（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（２０ｍＵ／μＬストック）１μＬ
水（２０μＬの最終体積を作るためである）
【０１６３】
（プライマー配列は表１０に列挙される）
【０１６４】
タグ付きプライマーを担持するビーズを区画化直前にカクテルに添加し、ビーズが区画に均一に分布することを促進するためによく混合した。ビーズの数を調整し、平均〜２から〜３個のビーズがマイクロコンパートメントに分布され得るようにした。
【０１６５】
ビーズフリー接近法を使用して区画固有タグを含有するクローンプライマーを導入したとき、次のＰＣＲカクテルを使用した：
精製された鋳型ＤＮＡ（共溶出された担体ＲＮＡ［ｃＲＮＡ］を含有できる）８μＬ（またはそれ未満）
５ｘ濃縮されたＰｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ）４μＬ
１６個の遺伝子特異的プライマーの混合物（ストックはそれぞれ２００ｎＭを有する）  ２μＬ
短いユニバーサル順方向（ストック５μＭ）および短いユニバーサル逆方向プライマー（ストックは１０μＭ）の混合物１μＬ
サンプル特異的バーコードおよびシークエンシングアダプタを有する長いユニバーサル逆方向プライマー（１０μＭストック）１μＬ
Ｄｅｇｅｎ鋳型（ストック濃度は下記記述されるもののように調整する）１μＬ
Ｂｉｏ−ＳｈｏｒｔＦＷＤ（１μＭストック）および短いＲＥＶ（０．２μＭストック）の混合物１μＬ
４  ｄＮＴＰの混合物（ストックはそれぞれ１０ｍＭ）０．４μＬ
Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ）（２Ｕ／μＬストック）０．２μＬ
ＲＮＡｓｅ  Ｈ２（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（２０ｍＵ／μＬストック）１μＬ
水（２０μＬの最終体積を作るためである）
【０１６６】
「Ｄｅｇｅｎ鋳型」プライマーのストック溶液の濃度を平均２〜３個の増幅可能な分子がそれぞれの区画に分配されるように調整した。デジタルＰＣＲ実験をこの鋳型の連続希釈を使用して行い、増幅可能な分子の濃度を正確に測定した。
【０１６７】
ＰＣＲの微小流体区画化
二つの異なる接近法をＰＣＲカクテルを熱サイクリングする前に、微細反応体積で区画化するために使用した。一つ目の接近法は、オイル中に水性ＰＣＲカクテル（選択的にマイクロビーズを含有する）の微小流体性液滴を製造するものであった。二つ目の接近法は、微小流体装置のマイクロウェルにＰＣＲカクテル（選択的にマイクロビーズを含有する）を分割するものであった。二つの接近法両方において、それぞれ概略１ナノリットルの概略２０，０００個の異なるの微細な反応体積が２０マイクロリットルのＰＣＲカクテルから生成された。区画の総数および大きさは、分析されるゲノム同等物の数によって将来の実験で調整され得る。この実施例で使用した区画化図式は、ゲノム鋳型ＤＮＡ（〜３０００ゲノム同等物）の約８〜１０ｎｇの推定を基盤とした。
【０１６８】
ＰＣＲカクテルをオイル中の水性液滴に区画化するために、ＢｉｏＲａｄ  ＱＸ１００液滴発生器を製造業者の説明書から一部変形して使用した。一部変形とは、前記ＰＣＲカクテル（マイクロビーズがある、またはない）を製造業者の推奨されたＰＣＲスーパーミックスの代わりに使用したものであった。ＥｖａＧｒｅｅｎに対する液滴生成オイルを使用した。熱サイクリングを０．２ｍＬ薄膜のＰＣＲチューブで行った。
【０１６９】
ＰＣＲカクテルをマイクロウェルに区画化するために、本発明者などは、それぞれ約１ｎＬ体積を保有する２０，０００個のマイクロウェルを生成するために、その上にポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）がパターン化されたカスタム微細加工透明スライドを使用した。ＰＤＭＳ表面をＰＣＲカクテルのマイクロウェルへの均一な分布を促すために表面を親水性にする処理をした。カバースリップをＰＤＭＳパターンを挟むために添加し、それによってマイクロウェルを熱サイクリングのために密封した。
【０１７０】
熱サイクリング
実施例２で使用したプロトコルに類似する熱サイクリングプロトコルを使用し、ただし、最後の２回のサイクルは、区画固有タグを含有するビオチン標識されたプライマーの混成化および延長を促進するためにさらに低いアニーリング温度を有した。
【０１７１】
温度サイクリング条件：
ａ．３０秒間９８℃
ｂ．１０秒間９８℃
ｃ．７０℃から、１０秒当たり１℃の速度で徐々に６０℃に低下する
ｄ．１分間６０℃
ｅ．３０秒間７２℃
ｆ．工程ｂ〜ｅをさらに２サイクルの間に繰り返す（合計３サイクル）
ｇ．１０秒間９８℃
ｈ．６０秒間７２℃
ｉ．３４回以上のサイクルの間に工程ｇ〜ｈを繰り返す（合計３５サイクル）
ｊ．１０秒間９８℃
ｋ．６０秒間６０℃
ｌ．１回以上のサイクルの間にｉ〜ｋを繰り返す（合計２サイクル）
ｍ．４℃維持
【０１７２】
すべての区画からタグ付き生成物の組み合わせ
熱サイクリングを完了した時、区画化された反応体積を組み合わせ、ＥＤＴＡ含有緩衝液を組み合わせられた体積に添加して（〜１０ｍＭの最終濃度）ポリメラーゼ活性を不活性化した。オイル中の液滴を合体するために、クロロホルムを添加し、そのエマルジョンをボルテクサーで攪拌した後、Ｂｉｏ−Ｒａｄ推奨プロトコルに従って高速で遠心分離した。マイクロウェルからのＰＣＲ生成物を組み合わせるために、カバースリップを除去し、マイクロウェルを約２００μＬのＥＤＴＡ含有緩衝液で洗浄した。万一、磁性ビーズがカクテルに添加されていれば、これを磁石を使用して溶液から除去した。
【０１７３】
次世代配列化のためのＤＮＡの製造：
プールされたＰＣＲ反応生成物をエチジウムブロマイドおよび１×ＴＢＥ緩衝液を含んだ２％アガロースゲルで精製した。予想されたサイズ（隣接したレーンで走ったサイズマーカーを基準に）のバンドを新しいメス刃を使用してゲルから切断した。製造業者の説明書に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡをゲルスライスから分離した。ＤＮＡを５０μＬの溶出緩衝液、ＥＢ（Ｑｉａｇｅｎ）に溶出させた。
【０１７４】
一部の実験で、高容量ストレプトアビジンアガロース樹脂スラリー（５μＬ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各反応体積に添加してビオチン標識反応生成物を捕捉した。次いで、ビーズを１０ｍＭトリスｐＨ７．６で洗浄した後、ビオチン化鎖に相補的であるＤＮＡ鎖をビーズ表面から５０μＬの溶出緩衝液ＥＢ（Ｑｉａｇｅｎ）での熱変性により溶出した。
【０１７５】
次世代シークエンシング
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑフローセル上にローディングするためのサンプルを製造するために、ＤＮＡの濃度をＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）を使用して測定し、ＤＮＡをＩｌｌｕｍｉｎａによって推奨された濃度に希釈した。シークエンシングを実施例２で記述した通りに行った。
【０１７６】
配列分析のためのアルゴリズムの概要
コンピュータを利用した分析を両鎖からマッチング突然変異配列を生成した突然変異二本鎖ＤＮＡ断片を確認し定量するために、結果的な配列データに対して行った。この分析に使用された基礎となる論理は、「方法」のセクションで記述される。
【０１７７】
本発明が特定具体例の観点で記述されたが、発明はそのような具体例に制限されるものではない。発明の要旨を逸脱しない変形、変更は技術分野の当業者に自明である。開示された具体例の先行技術は、技術分野の任意の当業者が本開示を製造するか使用することを可能にするために提供されるのは自明である。これら具体例に対する多様な変形は技術分野の当業者に明白であり、本願で定義された一般的な原理は開示の思想または範疇を逸脱することなく他の具体例適用され得る。したがって、本開示は本願に提示された具体例に制限されるものと意図されないが、本願に開示された原理および新規の特徴と一貫した最も広範囲な範疇に従うものであるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年10月11日(2017.10.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖核酸断片のペア鎖から得られた配列の同定方法であって、
複数の二本鎖核酸断片を水溶液に溶解させる段階と；
前記溶液を複数の区画に分配する段階であって、区画は、二つ以上の二本鎖核酸断片を含有する可能性が低く、二本鎖核酸断片の増幅生成物が同じゲノム基準配列に対して配列される段階と；
区画化された二本鎖核酸断片の両鎖をＰＣＲを行うことによってコピーし、増幅させる段階と；
一つ以上の区画固有ＤＮＡ配列タグを増幅されたＤＮＡコピー体に付着させて、二本鎖核酸断片の両鎖のコピー体に同じタグまたはタグのセットが付着される段階と；
増幅され、タグ付着されたＤＮＡコピー体を含有する区画を組み合わせる段階と；
全部または下位セットの増幅され、タグ付きＤＮＡコピー体をシークエンシングする段階と；
二本鎖核酸断片のペア鎖から得られた配列を共通区画固有ＤＮＡ配列タグまたはタグのセットの共有を基準として同定する段階と；
を含む方法。
【請求項２】
前記二本鎖核酸断片のペア鎖から得られた配列の比較は、二本鎖核酸断片の配列を測定するとき、エラーの減少を可能にする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸配列の測定においてエラー減少は、核酸配列の混合物内で低存在量（ｌｏｗ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ）の配列変異体を同定するために使用される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記二本鎖核酸断片は、ＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記二本鎖核酸断片は、ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記二本鎖核酸断片は、ゲノムＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記二本鎖核酸断片は、血液由来のゲノムセルフリーＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記二本鎖核酸断片は、腫瘍組織由来のゲノムＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記二本鎖核酸断片は、ホルマリン固定された、パラフィン挿入された腫瘍組織由来のゲノムＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記二本鎖核酸断片は、合成アダプタ分子が結紮されているゲノムＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記合成アダプタ分子は、次の成分：ＤＮＡ、ＲＮＡ、変形塩基、および自然的に発生する核酸で発見されないオリゴヌクレオチド変形のうち少なくとも一つを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記二本鎖核酸断片の結紮されたアダプタの部分は、増幅前に一つ以上の公知されたミスマッチ塩基対を含有し、増幅されたコピー体の系統が上部または下部鎖に対して追跡されることを可能にする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記二本鎖核酸断片は、両鎖の全体長さに沿って、または両鎖の長さの一部に沿って相補的塩基対を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記水溶液は、オイル中の水性液滴に区画化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記水溶液は、固体分離器、半固体分離器、または固体および半固体分離器を使用してチャンバーに区画化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
増幅生成物が同じゲノム基準配列に対して配列される二つ以上の二本鎖核酸断片を区画が含有する可能性が１０％未満で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
増幅生成物が同じゲノム基準配列に対して配列される二つ以上の二本鎖核酸断片を区画が含有する可能性が１％未満で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
区画化された二本鎖核酸断片は、特異的なゲノム配列を標的化する一つ以上のプライマーペアを使用するＰＣＲにより増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
区画化された二本鎖核酸断片は、結紮されたアダプタ配列を標的化する一つ以上のプライマーペアを使用するＰＣＲにより増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記区画固有タグまたは区画固有タグのセットは、異なる区画内で増幅されるＤＮＡコピー体を区別するために使用され得る、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記区画固有ＤＮＡ配列タグは、プライマー配列内に統合され、前記プライマーを使用するＰＣＲにより増幅されたＤＮＡコピー体に付着される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記区画は、区画当たり平均１０個未満の区画固有タグを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記区画は、区画当たり平均２〜３個の区画固有タグを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記増幅され、タグ付着されたＤＮＡコピー体の下位セットは、ハイブリッド捕捉のような標的豊富化方法により、またはイン−ソリューション捕捉でシークエンシングされるために選択される、 請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
複数の区画内に分配される標的化されたＤＮＡ分子のコピー体に一つ以上の区画固有ＤＮＡ配列タグを付着させる方法であって、
複数の希釈された鋳型オリゴヌクレオチド（ＤＴＯ）分子を含有する水溶液を製造する段階であって、ＤＴＯ分子は、共通配列が両側にある縮重または部分的に縮重タグ配列を含む段階と；
前記溶液を複数の区画に分配する段階と；
ＤＴＯ分子をＤＴＯ分子の共通配列を標的化するプライマーを使用するＰＣＲによりコピーし、増幅させて、区画内に同じタグ配列を有する複数のクローンＤＴＯコピー体をもたらす段階と；
クローン的に増幅されたＤＴＯコピー体を区画内で標的化されたＤＮＡ分子のコピー体に一つ以上の区画固有配列タグを付着させるためのプライマーとして使用する段階と；
を含む方法。
【請求項２６】
前記ＤＴＯ分子の濃度は、区画化の前に調整され、区画が増幅前に区画当たり平均１０個未満のＤＴＯ分子を含有する、 請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＤＴＯ分子の濃度は、区画化の前に調整され、区画が増幅前に区画当たり平均２〜３個のＤＴＯ分子を含有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＤＴＯ増幅の特異性は、遮断要素が全体的にまたは部分的に相補的ＤＮＡ鎖にプライマーが混成化されながら、除去される時まで延長され得ないプライマーを使用することによって増加する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
標的化されたＤＮＡ分子は、区画化の前にＤＴＯ分子と同じ溶液に溶解される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
ＤＴＯ分子を増幅させるために使用されたプライマーは、区画化の前にＤＴＯ分子と同じ溶液に溶解される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
ＤＴＯ分子を増幅させるために使用されたプライマーは、同等でない濃度であり、標的化されたＤＮＡ分子に混成化するために活用され得る一本鎖ＤＴＯコピー体の生成をもたらす、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
複数のサンプルからの標的化されたＲＮＡを並列で定量する方法であって、
複数のＲＮＡサンプルを得る段階と；
モジュール式オリゴヌクレオチド合成戦略を使用してプライマーを合成する段階であって、合成は、複数の異なる標的特異的プライマーが形成された後、停止され、部分的に合成されたプライマーが混合され、複数の別途の体積に分配された後、少なくとも特有のサンプル特異的タグ配列をそれぞれの別途の体積のプライマー混合物に添加するために合成が再開される段階と；
逆転写時に、各サンプルにおいて、モジュール式に合成されたプライマーを使用して、標的化されたＲＮＡからコピーされたサンプル特異的タグを一定の割合で相補的ＤＮＡに付与する段階と；
すべてのサンプルからタグ付き相補的ＤＮＡをプールし、精製する段階と；
エンドポイントＰＣＲによりそれぞれの相補的ＤＮＡ標的を別に増幅させる段階と；
増幅生成物をプールし、シークエンシングする段階と；
異なる標的配列に関連したサンプル特異的タグの数をカウンティングし、すべてのサンプルにわたる標的化されたＲＮＡの相対存在量を測定する段階と；
を含む方法。
【国際調査報告】
2018509178.tif 000045
2018509178.tif 000046