(57)【要約】  本発明は、可溶性ＦＧＦデコイポリペプチドと、アグリカン結合タンパク質などの異種ポリペプチドに連結するＦＧＦデコイポリペプチドを含んでなる融合ポリペプチドとを特徴とする。可溶性ＦＧＦデコイポリペプチドおよび融合ポリペプチドのどちらも、軟骨形成不全症などの骨格障害を予防または治療するために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列の少なくともアミノ酸残基１〜３１０または１〜３２３を含んでなるが、配列番号１のアミノ酸配列の少なくともアミノ酸残基６５５〜６９４を除外するアミノ酸配列、または配列番号１の少なくともアミノ酸１〜３１０または１〜３２３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、前記アミノ酸配列の変異体、または
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列の少なくともアミノ酸残基１〜３５７を含んでなるが、配列番号２のアミノ酸配列の少なくともアミノ酸残基７０３〜７４１を除外するアミノ酸配列、または配列番号２の少なくともアミノ酸１〜３５７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、前記アミノ酸配列の変異体
を含んでなる可溶性線維芽細胞増殖因子受容体３（ｓＦＧＦＲ３）ポリペプチドであって、ここで、前記ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドが少なくとも３１１アミノ酸長を有し、（ｉ）または（ｉｉ）の前記変異体がＦＧＦに特異的に結合する、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列の少なくともアミノ酸残基１〜３１０を含んでなり、異種ポリペプチドをさらに含んでなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、前記異種ポリペプチドとして、アグリカン結合タンパク質またはその断片を含んでなる、ｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドである、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列の少なくともアミノ酸残基１〜３１０を含んでなるが、配列番号１のアミノ酸配列の少なくともアミノ酸残基６５５〜６９４を除外するアミノ酸配列、または配列番号１の少なくともアミノ酸１〜３１０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、前記アミノ酸配列の変異体；または
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列の少なくともアミノ酸残基１〜３５７を含んでなるが、配列番号２のアミノ酸配列の少なくともアミノ酸残基７０３〜７４１を除外するアミノ酸配列、または配列番号２の少なくともアミノ酸１〜３５７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、前記アミノ酸配列の変異体
を含んでなり、ここで、（ｉ）または（ｉｉ）の前記変異体がＦＧＦに特異的に結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記アグリカン結合タンパク質またはその断片が、
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列の少なくともアミノ酸残基１５８〜２５２、配列番号３のアミノ酸配列のアミノ酸残基２５９〜３４９、または配列番号３のアミノ酸配列のアミノ酸残基１５８〜３４９を含んでなるアミノ酸配列を含んでなる、ＨＰＬＮ１断片、または配列番号３の少なくともアミノ酸残基１５８〜２５２または２５９〜２４９に対して少なくとも８０％の配列同一性を含んでなる配列同一性を含んでなり、アグリカンに特異的に結合する、前記アミノ酸配列の変異体；
（ｂ）ＨＰＬＮ１、または、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、アグリカンに特異的に結合する、その変異体；
（ｃ）アグリカンに特異的な抗体、抗体誘導体または抗体模倣物；または
（ｄ）フィビュリン−１、ボレリアアグリカン結合タンパク質、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質／トロンボスポンジン５（ＣＯＭＰ／ＴＳＰ５）、またはそのアグリカン結合断片
からなる群から選択される、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３１０を含んでなるが、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸残基３２４〜６９４を除外するアミノ酸配列、または配列番号１の少なくともアミノ酸１〜３１０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、前記アミノ酸の変異体；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３５７を含んでなるが、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基３７１〜７４１を除外するアミノ酸配列；または配列番号２の少なくともアミノ酸１〜３５７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、前記アミノ酸配列の変異体；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３１０を含んでなるが、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸残基４４１〜６９４を除外するアミノ酸配列、または配列番号１の少なくともアミノ酸１〜３１０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、前記アミノ酸の変異体；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３５７を含んでなるが、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基４８８〜７４１を除外するアミノ酸配列、または配列番号２の少なくともアミノ酸１〜３５７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、前記アミノ酸の変異体；
（ｅ）配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３１０を含んでなるが、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸残基５４９〜６９４を除外するアミノ酸配列、または配列番号１の少なくともアミノ酸１〜３１０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、前記アミノ酸の変異体；または
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３５７を含んでなるが、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基５９６〜７４１を除外するアミノ酸配列、または配列番号２の少なくともアミノ酸１〜３５７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、前記アミノ酸の変異体
を含んでなり、（ａ）〜（ｆ）の前記変異体がＦＧＦに特異的に結合する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ＦＧＦが、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ１）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞増殖因子９（ＦＧＦ９）、または線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ１８）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記ｓＦＧＦＲ３融合タンパク質が、配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドが、
（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３２５を含んでなるアミノ酸配列、または
（ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３３８を含んでなるアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列の変異体
を含んでなり、ここで、（ｉ）または（ｉｉ）の前記変異体が、配列番号３３の少なくともアミノ酸１〜３２５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸を含んでなる、ベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載の核酸または請求項１１に記載のベクターを含んでなる、細胞。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１０に記載の核酸、請求項１１に記載のベクター、または請求項１２に記載の細胞を含んでなる、組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、それを必要とする対象に、約０．０００２ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日の前記ポリペプチドを提供するように処方される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、前記それを必要とする対象に、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜約７ｍｇ／ｋｇ／日の前記ポリペプチドを提供するように処方される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
薬学的に許容できる担体をさらに含んでなる、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が皮下、局所、経口、鼻腔内、眼内、静脈内、または筋肉内投与のために処方される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が、皮下投与のために処方される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
薬剤として使用を目的とする、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記それを必要とする対象において、骨格成長遅延障害の予防または治療における使用を目的とする、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記それを必要とする対象がヒトである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記骨格成長遅延障害が、ＦＧＦＲ３関連骨格疾患である、請求項２０または２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記骨格成長遅延障害が、軟骨形成不全症、致死性骨異形成Ｉ型（ＴＤＩ）、致死性骨異形成ＩＩ型（ＴＤＩＩ）、発達遅延および黒色表皮腫（ＳＡＤＤＡＮ）を伴う重症軟骨形成不全症、低軟骨形成症、および頭蓋骨早期癒合症候群からなる群から選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記骨格成長遅延障害が、軟骨形成不全症である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記頭蓋骨早期癒合症候群が、ミュンケ症候群、クルーゾン症候群、アペール症候群、ジャクソン・ワイス症候群、パイフェル症候群、およびクルーゾン外骨格症候群からなる群から選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
それを必要とする対象の体重および／または頭蓋骨サイズを測定するステップを含んでなる骨格成長遅延障害の治療をモニターする方法であって、前記それを必要とする対象の体重および／または頭蓋骨サイズが、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の組成物の投与に応答して測定される、方法。
【請求項２７】
前記それを必要とする対象がヒトである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記アグリカン結合タンパク質が、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）アグリカン結合タンパク質である、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）アグリカン結合タンパク質が、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）グリコサミノグリカン結合タンパク質（Ｂｇｐ）およびボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）高温要求性Ａ（ＢｂＨｔｒＡ）からなる群から選択される、請求項２８に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記異種ポリペプチドが、Ｆｃ領域であり、またはそれを含んでなる、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記変異体が、配列番号１または配列番号２の前記アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記変異体が、配列番号３の前記のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有する、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記変異体が、配列番号３３の前記のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有する、請求項８または９に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが、生物学的に活性であって骨成長を改善する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可溶性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）デコイポリペプチドと、ＦＧＦデコイポリペプチドおよびアグリカン結合タンパク質を含む融合ポリペプチドとを特徴とする。本発明はまた、軟骨形成不全症などの骨格成長遅延障害を予防または治療する方法も特徴とする。
【背景技術】
【０００２】
線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）は、ファミリーのメンバー間でアミノ酸配列の高い保存がある、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦＲ）ファミリーのメンバーである。ＦＧＦＲファミリーのメンバーは、リガンド結合親和性および組織分布の双方によって識別される。完全長ＦＧＦＲポリペプチドは、細胞外ドメイン、単一疎水性膜貫通ドメイン、および細胞質チロシンキナーゼドメインを含有する。ＦＧＦＲポリペプチド細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）と相互作用して、下流シグナル伝達を媒介する。このシグナル伝達が、究極的に細胞分化に影響を及ぼす。特に、ＦＧＦＲ３タンパク質は、成長板で軟骨細胞増殖を阻害して骨伸長を制限することによって、骨の発達において役割を果たす。
【０００３】
ＦＧＦＲ３における機能獲得型点変異は、軟骨形成不全症、発達遅延および黒色表皮腫を伴う重症軟骨形成不全症（ＳＡＤＤＡＮ）、低軟骨形成症、致死性骨異形成、および頭蓋骨早期癒合症などの数種類のヒト骨格成長遅滞障害を引き起こすことが知られている。軟骨形成不全症は短肢小人症の最も一般的な形態であり、四肢の不釣合な短さと相対的大頭症によって特徴付けられる。軟骨形成不全症のおよそ９７％は、ＦＧＦＲ３遺伝子の３８０位でグリシン残基がアルギニン残基で置換されている、ＦＧＦＲ３をコードする遺伝子における単一点変異によって引き起こされる。リガンド結合に続いて、変異は受容体／リガンド複合体の排除を低下させ、細胞内シグナル伝達の延長がもたらされる。このＦＧＦＲ３シグナル伝達の延長は、軟骨成長板の増殖および分化を阻害して、結果的に軟骨内骨成長を損なう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
軟骨形成不全症などの成長障害を治療するために、機能不全ＦＧＦＲ３を標的とする改善された治療薬に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、改善されたｓＦＧＦＲ３デコイポリペプチドと、該物質を使用した治療法とを特徴とする。
【０００６】
第１の態様では、本発明は、タンパク質を含む可溶性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）デコイポリペプチドを特徴とし、前記タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列の少なくともアミノ酸残基１〜３１０または１〜３２３を含むアミノ酸配列、またはアミノ酸配列の変異体を含み、変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）の配列同一性を有して、共有結合異種ポリペプチドの存在または不在下で、ＦＧＦ（例えば、（ＦＧＦ１）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞増殖因子９（ＦＧＦ９）、または線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ１８））と特異的に結合する。異種ポリペプチドが存在する場合、それは、一般に、前述のＦＧＦ結合部分を含む融合タンパク質として存在する。
【０００７】
例えば、ｓＦＧＦデコイポリペプチドは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列の少なくともアミノ酸残基１〜３１０を含むが、配列番号１のアミノ酸配列の少なくともアミノ酸残基６５５〜６９４を含まないアミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列の変異体、または（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列の少なくともアミノ酸残基１〜３５７を含むが、配列番号２のアミノ酸配列の少なくともアミノ酸残基７０３〜７４１を含まないアミノ酸残基、または配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列の変異体を含む。さらに、（ｉ）または（ｉｉ）の変異体は、ＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ９、またはＦＧＦ１８）に特異的に結合する。第１の態様の融合タンパク質ｓＦＧＦデコイポリペプチドは、アグリカン結合ドメインを含む融合タンパク質である配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するアミノ酸配列もまた含み得る。
【０００８】
第１の本発明の態様の融合タンパク質ｓＦＧＦデコイポリペプチドに関して、異種ポリペプチドは、アグリカン結合タンパク質またはその断片であり得る。例えば、アグリカン結合タンパク質またはその断片は、
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列の少なくともアミノ酸残基１５８〜２５２、アミノ酸残基２５９〜３４９、またはアミノ酸残基１５８〜３４９を含む、アミノ酸配列を含むＨＰＬＮ１断片、または配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有する配列同一性を含み、アグリカンに特異的に結合する、アミノ酸配列の変異体；
（ｂ）ＨＰＬＮ１、ｂ）または配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含んでアグリカンに特異的に結合する、その変異体；
（ｃ）アグリカンに特異的な抗体、抗体誘導体または抗体模倣物；または
（ｄ）フィビュリン−１、ボレリアアグリカン−結合タンパク質（例えば、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）グリコサミノグリカン−結合タンパク質（Ｂｇｐ）およびボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）高温要求性Ａ（ＢｂＨｔｒＡ））、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質／トロンボスポンジン５（ＣＯＭＰ／ＴＳＰ５）、またはそのアグリカン結合断片からなる群から選択され得る。
【０００９】
代案としては、異種ポリペプチドは、Ｆｃ領域を含む。
【００１０】
第２の態様では、本発明は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列の少なくともアミノ酸残基１〜３１０または〜３２３を含み、デコイポリペプチドが、少なくとも３１１アミノ酸長を有するが、配列番号１のアミノ酸配列の少なくともアミノ酸残基６５５〜６９４を含まないアミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列の変異体または（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列の少なくともアミノ酸残基１〜３５７を含むが、配列番号２のアミノ酸配列の少なくともアミノ酸残基７０３〜７４１を含まないアミノ酸残基、または配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列変異体を含む、可溶性線維芽細胞増殖因子（ｓＦＧＦ）デコイポリペプチドを特徴とする。特に、（ｉ）または（ｉｉ）の変異体は、ＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ９、またはＦＧＦ１８）に特異的に結合する。
【００１１】
本発明の第１または第２の態様のどちらでも、融合ポリペプチドまたはｓＦＧＦデコイポリペプチドは、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３１０を含むが、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸残基３２４〜６９４を含まない、アミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列の変異体、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３５７を含むが、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基３７１〜７４１を含まない、アミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列の変異体、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３１０を含むが、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸残基４４１〜６９４を含まない、アミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列の変異体、
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３５７を含むが、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基４８８〜７４１を含まない、アミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列の変異体、
（ｅ）配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３１０を含むが、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸残基５４９〜６９４を含まない、アミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列の変異体、または
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３５７を含むが、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基５９６〜７４１を含まない、アミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む、アミノ酸配列を含むアミノ酸配列の変異体を含み得る。
【００１２】
さらに、（ａ）〜（ｆ）の変異体は、ＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ９、またはＦＧＦ１８）に特異的に結合する。
【００１３】
さらに、ｓＦＧＦデコイポリペプチドは、（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３２５を含むアミノ酸配列、または（ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３３８を含むアミノ酸配列、または配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む、（ｉ）または（ｉｉ）のアミノ酸配列の変異体を含み得る。
【００１４】
第２の本発明の態様の別の実施形態では、ｓＦＧＦデコイポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１〜３１０を含み、また少なくとも３１１アミノ酸長を有する。
【００１５】
第３の態様では、本発明は、第１の態様の融合タンパク質をコードする核酸、または第２の態様のｓＦＧＦデコイポリペプチドを特徴とする。
【００１６】
第４の態様では、本発明は、第３の態様の核酸を含んでなるベクター（例えば、ウイルスまたはその他の本明細書に記載されるベクター）を特徴とする。
【００１７】
第５の態様では、本発明は、第１の態様の融合タンパク質を含んでなる細胞（本明細書に記載される細胞など）、第２の態様のｓＦＧＦデコイポリペプチド、第３の態様の核酸、または第４の態様のベクターを特徴とする。
【００１８】
第６の態様では、本発明は、薬剤として使用するための、特に、それを必要とする対象（例えば、ヒト）における、軟骨形成不全症のような骨格成長遅延障害の予防または治療における使用のための第１の態様の融合タンパク質、第２の態様のｓＦＧＦデコイポリペプチ、第３の態様の核酸、第４の態様のベクターまたは第５の態様の細胞を特徴とする。例えば、骨格成長遅延障害は、ＦＧＦＲ３関連骨格疾患である。骨格成長遅延障害は、軟骨形成不全症、致死性骨異形成Ｉ型（ＴＤＩ）、致死性骨異形成ＩＩ型（ＴＤＩＩ）、発達遅延および黒色表皮腫（ＳＡＤＤＡＮ）を伴う重症軟骨形成不全症、低軟骨形成症、および頭蓋骨早期癒合症候群からなる群から選択され得る。特に、骨格成長遅延障害は、軟骨形成不全症である。さらに、頭蓋骨早期癒合症候群は、ミュンケ症候群、クルーゾン症候群、アペール症候群、ジャクソン・ワイス症候群、パイフェル症候群、およびクルーゾン外骨格症候群からなる群から選択される。
【００１９】
本発明はまた、それを必要とする対象（例えば、ヒト）に、約０．０００２ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日の融合ポリペプチドまたはｓＦＧＦデコイポリペプチドを提供するように処方された、第１の態様の融合ポリペプチドまたは第２の態様のｓＦＧＦデコイポリペプチドを特徴とする。特に、融合ポリペプチドまたはｓＦＧＦデコイポリペプチドは、それを必要とする対象（例えば、ヒト）に、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜約７ｍｇ／ｋｇ／日の融合ポリペプチドまたはｓＦＧＦデコイポリペプチドを提供するように処方される。
【００２０】
第７の態様では、本発明は、それを必要とする対象（例えば、ヒト）の体重および／または頭蓋骨サイズの測定をはじめとする、骨格成長遅延障害の治療をモニターする方法を特徴とする。特に、それを必要とする対象（例えば、ヒト）の体重および／または頭蓋骨サイズが、それを必要とする対象（例えば、ヒト）に対する、第１の態様の融合タンパク質、第２の態様のｓＦＧＦデコイポリペプチド、第３の態様の核酸、第４の態様のベクター、または第５の態様の細胞の投与に応答して測定される。
【００２１】
本発明はまた、骨格成長遅延障害の予防または治療において使用するための、第１の態様の融合タンパク質、第２の態様のｓＦＧＦデコイポリペプチド、第３の態様の核酸、第４の態様のベクターまたは第５の態様の細胞と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を特徴とする。医薬組成物は、皮下、局所、経口、鼻腔内、眼内、静脈内、または筋肉内投与のために処方され得る。特に、医薬組成物は、皮下投与のために処方される。
【００２２】
定義
本発明を以下に詳述する前に、本発明は、本明細書に記載した特定の方法論、プロトコール、および試薬に限定されず、これらは変化してもよいものと理解される。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを描写するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことも理解される。特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００２３】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、”Ａ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ  ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）”，Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｗ，Ｎａｇｅｌ，Ｂ．ａｎｄ  Ｋｏｅｌｂｌ，Ｈ．ｅｄｓ．（１９９５），Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，ＣＨ−４０１０  Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に記載されるように定義される。
【００２４】
以下で、本発明の構成要素について説明する。これらの構成要素は、特定の実施形態と共に列挙されるが、追加的な実施形態を作成するために、任意の様式かつ任意の数で組み合わせられてもよいものと理解すべきである。様々に記載される実施例および好ましい実施形態は、本発明を明示的に記載される実施形態のみに限定するものと解釈されるべきではない。この説明は、明示的に記載される実施形態を任意の数の開示されるおよび／または好ましい構成要素と組み合わせる、実施形態を支持して包含するものと理解すべきである。さらに、本出願に記載される全ての構成要素の任意の順列および組み合わせは、文脈上明らかに別の意味を示唆しない限り、本出願の記載によって開示されると見なされるべきである。
【００２５】
本明細書全体および続く特許請求の範囲を通じて、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「を含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、および「を含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「を含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」などのバリエーションは、記述される整数またはステップまたは整数群またはステップ群の包含を暗示するが、任意のその他の整数またはステップまたは整数群またはステップ群を排除しないものと理解される。本明細書および添付の特許請求範囲の用法では、内容上例外が明記されていない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、指示対象の複数形を含む。
【００２６】
「アグリカン」という用語は、本明細書の用法では、ヒトにおいてＡＣＡＮ遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。これは、軟骨特異的プロテオグリカンコアタンパク質（ＣＳＰＣＰ）およびコンドロイチン硫酸プロテオグリカン１としてもまた知られている。遺伝子は、レクチカン（コンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｔｏｉｔｉｎ）硫酸プロテオグリカン）ファミリーのメンバーである。コードされるタンパク質は、軟骨組織中の細胞外マトリックスの不可欠な部分であり、それは、軟骨中の圧縮に耐える。このタンパク質は２３１６アミノ酸長であり、選択的スプライシングのために複数のイソ型で発現され得る。アミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベース（ＲｅｆＳｅｑ受入番号ＮＰ＿００１１２６）から得られ得る。
【００２７】
「アグリカン結合タンパク質」は、例えば、アグリカンの球状ドメイン（Ｇ１、Ｇ２、またはＧ３）と相互作用する任意のタンパク質またはその断片などの、アグリカンに特異的に結合する結合タンパク質またはその断片である。例示的アグリカン結合タンパク質としては、抗体、フィビュリン−１、ボレリアアグリカン結合タンパク質（例えば、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）グリコサミノグリカン結合タンパク質（Ｂｇｐ）およびボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）高温要求性Ａ（ＢｂＨｔｒＡ））、および軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質／トロンボスポンジン５（ＣＯＭＰ／ＴＳＰ５）が挙げられる。例えば、アグリカン結合タンパク質としては、ヒトヒアルロナンおよびプロテオグリカンリンクタンパク質１（ＨＰＬＮ１）またはその断片が挙げられる。特に、ＨＰＬＮ１断片は、軟骨リンクドメイン１（ＬＫ１；配列番号３のアミノ酸１５８〜２５２）、軟骨リンクドメイン２（ＬＫ２；配列番号３のアミノ酸２５９〜３４９）、またはＬＫ１およびＬＫ２ドメインの双方（配列番号３のアミノ酸１５８〜３４９）を含み得る。好ましくは、ＨＰＬＮ１断片は、配列番号３の少なくとも残基５３〜１４０以外、および／または配列番号３のアミノ酸１〜１４０または１〜１５７以外のアミノ酸配列を有する。例えば、ＨＰＬＮ１またはその断片（例えば、配列番号３のアミノ酸１５８〜３４９（ＬＫ１−ＬＫ２ドメイン））などのアグリカン結合タンパク質は、例えば、ｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチド中で、配列番号１のアミノ酸１〜３２３を含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド断片などのＦＧＦＲ３ポリペプチド断片に融合されてもよい。
【００２８】
本明細書の用法では「結合タンパク質」という用語は、別の分子に特異的に結合するタンパク質を指す。この用語は、結合機能が保持されている限り、ポリペプチドの断片を含むものと理解される。このような結合タンパク質は、単一結合ドメインタンパク質ならびに多重結合ドメインタンパク質を含み得る。多重結合ドメインタンパク質は、ポリペプチドの一次構造に沿って２つ以上の離散した（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）非連続領域を含み、一緒になって全体的結合活性に寄与するタンパク質を含む。それぞれの結合活性は、３つの非連続的相補性決定領域に由来することから、多重結合ドメインタンパク質の特定例は、重鎖および軽鎖抗体鎖を含む。結合タンパク質は、単量体または多量体種であり得る。ヘテロマーの結合タンパク質は、一緒になって特定のリガンドに対して結合活性を示す、少なくとも２つの異なるサブユニットから構成される、多量体結合タンパク質の特定の例である。多量体結合タンパク質に言及する場合、用語は、ポリペプチドの組み立てと、組み立てられた複合体の結合機能とが保持される限り、サブユニットの断片を含むものと理解される。ヘテロマーの結合タンパク質は、例えば、抗体と、Ｆａｂおよび（Ｆａｂ’）２部分などのその断片とを含む。
【００２９】
「親ポリペプチドの生物学的活性」という用語は、細胞の内部または外部の親ポリペプチドの任意の活性を指す。例えば、アグリカン結合タンパク質に関して、それはアグリカンに特異的に結合する能力である。ＦＧＦデコイポリペプチドに関しては、この用語は、（ｉ）ＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ２）に特異的に結合する能力；（ｉｉ）ＦＧＦ細胞内シグナル伝達を低下させる能力（例えば、ＦＧＦとの結合によるＦＧＦＲ３受容体活性化に続くＥｒｋリン酸化）；および／または（ｉｉｉ）生体内で骨成長を回復させる能力（例えば、Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスにおいて）を指す。
【００３０】
当業者は、親ポリペプチドの断片または変異体が、生物学的に活性であるかどうかを容易に判定し得る。ＦＧＦＲ３受容体の機能的活性化は、既知の方法ならびに本明細書に記載される方法に従って、当業者によって容易に評価され得ることに留意されたい。確かに、活性化ＦＧＦＲ３受容体は、細胞質ドメインに向かって位置するチロシン残基上、すなわち、Ｔｙｒ６４８およびＴｙｒ６４７上でリン酸化されるので、ＦＧＦＲ３受容体上の機能的活性化は、例えば、そのリン酸化を測定することによって評価されてもよい。例えば、ＦＧＦＲ３受容体のリガンド誘導性リン酸化の分析は、Ｌｅ  Ｃｏｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，８：２１６４−２１７３，２０１０）に記載されるようにして実施され得る。代案としては、細胞における受容体リン酸化は、この修飾を特異的に認識する抗体を使用した、免疫細胞化学、免疫組織化学および／またはフローサイトメトリーによって容易に検出され得る。例えば、Ｔｙｒ６４８およびＴｙｒ６４７残基上のＦＧＦＲ３のリン酸化は、リン酸化Ｔｙｒ６４８およびＴｙｒ６４７−ＦＧＦＲ３に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用した、免疫細胞化学、免疫組織化学および／またはフローサイトメトリーによって検出され得る。さらに、ＦＧＦＲ３はそのリガンドと結合すると、ＥＲＫおよびｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路およびＳＴＡＴ経路を活性化することによって、シグナル伝達を媒介する。したがって、ＦＧＦＲ３受容体の活性化はまた、Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌａｎｃｅｔ，３７０：１６２−１７２，２００７）によって記載されるように、これらの特定の経路の活性化を判定することによっても評価され得る。
【００３１】
「細胞培養」という用語は、天然環境外の管理条件下で、細胞培地の中または上において細胞を増殖させる工程を指す。「細胞培地」という用語は、例えば、特に動物細胞のような多細胞真核生物に由来する細胞などの細胞、特に上で定義されるような細胞の生存または増殖を支持する液体またはゲルを意味する。このような培地は、このような細胞の生存または増殖を支持するのに必要な全ての栄養素を含んでなる。細胞培地組成物は、乾燥粉末組成物、液体組成物または固体（例えば、ゲルまたは寒天）組成物であり得る。適切な細胞培養および培養技術は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１９８８；１１（２）：９３−８を参照されたい。
【００３２】
「コドン最適化」という用語は、本明細書の用法では、核酸中のコドンの改変、特にＤＮＡによってコードされるポリペプチドを改変することなく、宿主生物の典型的なコドン使用頻度を反映することを指す。宿主細胞または宿主生物は、好ましくはヒトである。コドン最適化は、ＪＡＶＡ  Ｃｏｄｏｎ  Ａｄａｐｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌ（ｗｗｗ．ｊｃａｔ．ｄｅ）またはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｔｏｏｌ（ｗｗｗ．ｅｕ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ＣｏｄｏｎＯｐｔ）などのオンラインツールを使用して、核酸配列およびそれに対してコドンが最適化される宿主生物を単に入力することによって、過度の負担なしに当業者によって実施され得る。種々の生物のコドン使用頻度は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ（現時点で３５，７９９種の異なる生物）などのオンラインデータベースにおいて入手可能である。
【００３３】
任意選択的に、第３の態様の核酸は、コドン最適化されてもよい。第１の態様の融合タンパク質をコードする核酸に関しては、核酸の一部のみ、特に、検出可能なマーカー、ＦＧＦデコイポリペプチド、ペプチドリンカーおよび／またはアグリカン結合タンパク質をコードする部分の１つまたは複数が、コドン最適化されてもよい。第１の態様のＦＧＦデコイポリペプチドタンパク質をコードする核酸に関しては、核酸の一部のみ、特に検出可能なマーカーおよび／またはＦＧＦデコイポリペプチドをコードする部分の１つまたは複数が、コドン最適化されてもよい。好ましくは、核酸は、ＧＣ含有量を減少させることによって遺伝子操作を容易にするためにおよび／または宿主細胞における発現のために、コドン最適化される。
【００３４】
「シンク」または「トラップ」としても知られている、「デコイ」または「デコイ受容体」という用語は、リガンドに結合するが、作動薬をシグナル伝達受容体複合体にシグナル伝達または提示することが構造的にできない受容体を指す。デコイは、リガンドの分子トラップの役割を果たし、それによってリガンドがその機能的受容体に結合するのを妨げる。デコイは、好ましくは可溶性である。デコイは、本明細書に記載されるようなｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはその断片であり得る。
【００３５】
「検出可能な標識」、「マーカー」または「タグ」という用語は、本明細書の用法では、別の物質または物質の複合体、特に第１の態様の融合タンパク質または第２の態様の可溶性ＦＧＦデコイポリペプチドの存在を示すことができる、任意の種類の物質を指す。検出可能な標識は、検出される物質に連結または導入される物質であり得る。好ましいのは、精製、定量および／または生体内検出ができるようにするのに適する、検出可能な標識である。適切な標識の例としては、フルオロフォア、発色団、放射性標識、金属コロイド、酵素、または化学発光または生物発光分子が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明の文脈では、適切なタグは、好ましくはそのペプチド配列が組換えタンパク質の中または上に遺伝的にグラフトされるタンパク質タグである。タンパク質タグは、例えば、アフィニティタグ、可溶化タグ、クロマトグラフィータグ、エピトープタグ、または蛍光タグを包含してもよい。アフィニティタグは、タンパク質が、アフィニティ技術を使用してそれらの粗製生物学的起源から精製され得るように、タンパク質に付加される。これらとしては、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が挙げられる。ポリ（Ｈｉｓ）タグは、金属マトリックスと結合する、広く使用されるタンパク質タグである。可溶化タグは、特にシャペロン欠損種で発現される組換えタンパク質のために、タンパク質の適切な折り畳みを助け、それらが沈殿しないようにするために使用される。これらとしては、チオレドキシン（ＴＲＸ）およびポリ（ＮＡＮＰ）が挙げられる。いくつかの親和性タグは、ＭＢＰおよびＧＳＴのように可溶化剤としての二重の役割を果たす。クロマトグラフィータグを使用して、タンパク質のクロマトグラフィー特性を変化させ、特定の分離技術の全域で異なる分解能を与える。しばしば、これらは、ＦＬＡＧタグのようなポリアニオン系アミノ酸からなる。エピトープタグは短いペプチド配列であり、それらは高親和性抗体が、多くの異なる生物種において信頼性をもって産生され得ることから選択される。これらは通常ウイルス遺伝子に由来して、それがその高い免疫反応性を説明する。エピトープタグとしては、Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグ、およびＨＡタグが挙げられる。これらのタグは、ウエスタンブロット法、免疫蛍光、および免疫沈降法実験に特に有用であるが、抗体精製においても用途がある。蛍光タグは、タンパク質に視覚的読み取りを与えるために使用される。ＧＦＰおよびその変異体（例えば、異なる蛍光スペクトルを有する変異ＧＦＰ）およびＲＦＰおよびその変異体（例えば、異なる蛍光スペクトルを有する変異ＲＦＰ）が、最も一般的に使用される蛍光タグである。ＧＦＰ／ＲＦＰのより高度な用途としては、それを折り畳みレポーター（折り畳まれた場合は蛍光、そうでない場合は無色）として使用することが挙げられる。フルオロフォアのさらなる例としては、フルオレセイン、ローダミン、およびスルホインドシアニン色素Ｃｙ５が挙げられる。
【００３６】
検出可能な標識の好ましい例としては、ＡｖｉＴａｇ（酵素ＢｉｒＡによるビオチン化、およびストレプトアビジによる単離を可能にするペプチドン（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ、配列番号１１））、カルモジュリンタグ（タンパク質カルモジュリンによって結合されたペプチド（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ、配列番号１２））、ポリグルタミン酸タグ（Ｍｏｎｏ−Ｑなどのアニオン交換樹脂に効率的に結合するペプチド（ＥＥＥＥＥＥ、配列番号１３））、Ｅタグ（抗体によって認識されるペプチド（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ、配列番号１４））、ＦＬＡＧタグ（抗体によって認識されるペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号１５））、ＨＡタグ（抗体によって認識されるペプチド（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ、配列番号１６））、Ｈｉｓタグ（ニッケルまたはコバルトキレートによって結合された５−１０個のヒスチジン（ＨＨＨＨＨＨ、配列番号１７））、Ｍｙｃタグ（抗体によって認識される短いペプチド（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ、配列番号１８））、Ｓタグ（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ、配列番号１９）、ＳＢＰタグ（ストレプトアビジンと結合するペプチド（ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ、配列番号２０））、Ｓｏｆｔａｇ１（哺乳類発現用（ＳＬＡＥＬＬＮＡＧＬＧＧＳ、配列番号２１））、Ｓｏｆｔａｇ３（原核生物発現用（ＴＱＤＰＳＲＶＧ、配列番号２２））、Ｓｔｒｅｐタグ（ストレプトアビジンまたはｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ（ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ）と称される修飾ストレプトアビジンと結合するペプチド（ＳｔｒｅｐタグＩＩ：ＷＳＨＰＱＦＥＫ、配列番号２３））、ＴＣタグ（ＦｌＡｓＨおよびＲｅＡｓＨ二ヒ素化合物によって認識されるテトラシステインタグ（ＣＣＰＧＣＣ、配列番号２４））、Ｖ５タグ（抗体によって認識されるペプチド（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ、配列番号２５））、ＶＳＶタグ（抗体によって認識されるペプチド（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ、配列番号２６））、Ｘｐｒｅｓｓタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ、配列番号２７）、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ（ピリンＣタンパク質に共有結合するペプチド（ＴＤＫＤＭＴＩＴＦＴＮＫＫＤＡＥ、配列番号２８））、ＳｐｙＴａｇ（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質に共有結合するペプチド（ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ、配列番号２９））、ＢＣＣＰ（Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃａｒｂｏｘｙｌ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＢｉｒＡによってビオチン化されてストレプトアビジンによる認識を可能にするタンパク質ドメイン）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグ（固定化グルタチオンと結合するタンパク質）、緑色蛍光タンパク質タグ（自然に蛍光性であり、ナノボディによって結合され得るタンパク質）、マルトース結合タンパク質タグ（アミロースアガロースと結合するタンパク質）、Ｎｕｓタグ、チオレドキシンタグ、Ｆｃタグ（免疫グロブリンＦｃドメインに由来する）、Ｔｙタグ、障害促進アミノ酸（Ｐ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｑ、Ｇ）を含有する設計された不定形タグ（Ｍｉｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ：Ｔａｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｔａｉｌｓ．Ｉｎｔｒｉｎ���ｉｃａｌｌｙ  Ｄｉｓｏｒｄ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １，ｅ２６７９０  １−５（２０１３）を参照されたい）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３７】
検出可能な標識は、切断可能な配列を介して融合タンパク質に連結し得る。好ましくは、配列は、プロテアーゼによって認識可能であり切断可能である。プロテアーゼは、好ましくはエンテロキナーゼである。特に、切断可能な配列の最初の（すなわち、Ｎ末端）残基がプロリンでないことが好ましい。切断可能な配列の長さは、好ましくは２〜２０、３〜１５または４〜１０アミノ酸である。例示的な切断可能な配列は、ＬＶＤＱＩＰＡ（配列番号３０）である。好ましくは、検出可能な標識は、第１の態様の融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端にあり、より好ましくはＮ末端にある。例えば、ＦＬＡＧタグ（例えば、配列番号１５）などの検出可能な標識は、ｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドのＮ末端にあってもよい（例えば、配列番号４のアミノ酸残基１〜８を参照されたい）。代案としては、ＦＬＡＧタグ（例えば、配列番号１５）などの検出可能な標識は、ｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドのＣ末端にあってもよい。さらに、ＦＬＡＧタグ（例えば、配列番号１５）などの検出可能な標識は、例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ２（配列番号１のアミノ酸１〜５４８）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ３（配列番号１のアミノ酸１〜４４０）、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（配列番号１のアミノ酸１〜３２３）などのｓＦＧＦＲ３ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端にあってもよい。
【００３８】
「真核細胞」という用語は、特に、酵母または動物細胞である。酵母細胞は、最も広い意味では、酵母生物の任意の細胞、例えば、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）マルシアヌス変種（ｖａｒ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クルイベロミセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、カンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、およびカンジダ・バーサチルス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、ピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）（Ｐｉｃｈｉａｓｔｉｐｉｄｉｓ）やピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（Ｐｉａｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）やピキア・ソルビトフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｏｒｂｉｔｏｐｈｉｌａ）などのピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、デバロミセス属（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、サッカロミコプシス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｃｏｐｓｉｓ）、サッカロミコデス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ウィッケルハミア属（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ）、デバリオミセス属（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）（Ｄｅｂａｙｏｍｙｃｅｓ）、ハンセニアスポラ属（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、クロエケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、ジゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属、クライシア属（Ｋｕｒａｉｓｈｉａ）、コマガタエラ属（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）、メチニコビア属（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、ウィリオプシス属（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）、ナカザワエア属（Ｎａｋａｚａｗａｅａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、ブレラ属（Ｂｕｌｌｅｒａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ウィリオプシス属（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）（Ｗｉｌｌｏｐｓｉｓ）またはスポロボロミセス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）に由来する細胞であり得る。しかし、好ましくは、酵母細胞はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）細胞、特にサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞である。
【００３９】
動物細胞は、霊長類、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ハムスター、ウシ、昆虫（例えば、Ｓｆ９またはＳｆ２１）など、好ましくはヒトの細胞であってもよい。また、それは、懸濁または付着細胞であってもよい。懸濁細胞は、例えば、付着条件で可能な密度よりも高い密度に増殖するなど、懸濁液中で（すなわち、表面に付着することなく）自然に生存してもよい細胞、または懸濁培養中で生存ができるように改変された細胞である。接着細胞は、付着性を増大させて増殖および分化に必要なその他のシグナルを提供するための細胞外マトリックス要素（コラーゲンおよびラミニンなど）で被覆されてもよい、組織培養プラスチックまたはマイクロキャリアなどの表面を必要とする細胞である。一実施形態では、接着細胞は単層細胞である。例えば、細胞は、ハイブリドーマ細胞、初代上皮細胞、内皮細胞、角化細胞、単球／マクロファージ、リンパ球、造血幹細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、および肝実質細胞からなる群から選択される。より具体的には、それは、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯＤＧ４４細胞、ＣＨＯＤＰ−１２細胞、ＣＨＯＤＨＦＲ−細胞、ＣＨＯ−ＧＳ細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＨＥＫ−２９３胎生期腎細胞、ＨｅＬａ子宮頸上皮細胞、ＰＥＲ−Ｃ６網膜細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＨＤＭＥＣ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＨＬ−６０細胞、ＨＭＥＣ−１細胞、ＨＵＶＥＣ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ジャーカット細胞、ＭＲＣ５細胞、Ｋ５６２細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＳ０細胞Ｓｐ２０細胞、ＣＯＳ細胞、およびＶＥＲＯ細胞からなる群から選択されてもよい。
【００４０】
「細胞外ドメイン」または「ＥＣＤ」という用語は、膜貫通ドメインを越えて細胞外空間内に伸びる、ポリペプチド（例えば、ＦＧＦＲ３ポリペプチド）の部分を指す。上に記載されたように、ＥＣＤは、ＩｇＧ１ドメイン（ａａ５７〜１１０）、ＩｇＧ２ドメイン（ａａ１６１〜２４５）、およびＩｇＧ３ドメイン（ａａ２６８〜３５７）を含む。ＦＧＦＲ３のＥＣＤは全てのＥＣＤ（ＦＧＦＲ３のａａ５７〜１１０）を含んでもよく、または完全長ＦＧＦＲ３  ＥＣＤに存在する１つまたは複数のアミノ酸が欠損している、ＦＧＦＲ３  ＥＣＤなどのＥＣＤの断片を含んでもよい。ＥＣＤは、ＦＧＦＲの１つまたは複数のＦＧＦへの結合を媒介する。例えば、可溶性ＦＧＦＲ（例えば、ｓＦＧＦＲ３）は、ＦＧＦＲポリペプチドのＥＣＤの少なくとも一部を含む。ＦＧＦＲ３ポリペプチドの例示的ＥＣＤとしては、例えば、配列番号１の少なくともアミノ酸１〜３００、１〜３１０、１〜３２０、１〜３３０、１〜３４０、１〜３５０、１〜３６０、または１〜３６５が挙げられる。
【００４１】
本発明の文脈で、「ＦＧＦＲ３関連骨格疾患」という用語は、ＦＧＦＲ３の異常な活性化増大によって、特にＦＧＦＲ３受容体の機能獲得型変異体の発現によって引き起こされる、骨格疾患を意味することが意図される。本明細書の用法では、「機能獲得型ＦＧＦＲ３受容体変異体」、「ＦＧＦＲ３の機能獲得型変異体」または「延長された活性を示す変異体ＦＧＦＲ３」という用語は同義的に使用されて、前記受容体の変異体が、ＦＧＦリガンドの存在下において、対応する野生型受容体の生物学的活性よりも高い生物学的活性を示す（すなわち、下流シグナル伝達を始動させる）ことを指す。ＦＧＦＲ３関連骨格疾患は、好ましくはＦＧＦＲ３関連骨格異形成症およびＦＧＦＲ３関連頭蓋骨早期癒合症である。本発明によるＦＧＦＲ３関連骨格異形成症は、遺伝性または散発性疾患に相当してもよい。ＦＧＦＲ３関連骨格異形成症としては、致死性骨異形成症Ｉ型、致死性骨異形成症ＩＩ型、低軟骨形成症、軟骨形成不全症およびＳＡＤＤＡＮ（発達遅延および黒色表皮腫を伴う重症軟骨形成不全症）、黒色表皮腫（ａｃｎｔｈｏｓｉｓ  ｎｉｇｒｉｃａｎｓ）を伴うクルーゾン症候群、ミュンケ症候群、およびＣＡＴＳＨＬ（屈指症、高身長、側弯症、および難聴）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００４２】
例えば、ＦＧＦＲ３関連骨格異形成症は、ＦＧＦＲ３受容体のＧ３８０Ｒ機能獲得型変異体の発現によって引き起こされる、軟骨形成不全症である。代案としては、ＦＧＦＲ３関連骨格異形成症は、ＦＧＦＲ３受容体のＧ３７５Ｃ、Ｇ３４６Ｅ、またはＳ２７９Ｃの発現によって引き起こされる、軟骨形成不全症である。将来同定されるであろうＦＧＦＲ３受容体の別の変異体によって引き起こされる軟骨形成不全症もまた包含されることに、さらに留意されたい。ＦＧＦＲ３関連骨格異形成症はまた、ＦＧＦＲ３受容体のＮ５４０Ｋ、Ｋ６５０Ｎ、Ｋ６５０Ｑ、Ｓ８４Ｌ、Ｒ２００Ｃ、Ｎ２６２Ｈ、Ｇ２６８Ｃ、Ｙ２７８Ｃ、Ｖ３８１Ｅ機能獲得型変異体の発現によって引き起こされる、低軟骨形成症であり得る。ＦＧＦＲ３関連骨格異形成症はさらに、Ｒ２４８Ｃ、Ｓ２４８Ｃ、Ｇ３７０Ｃ、Ｓ３７１Ｃ；Ｙ３７３Ｃ、Ｘ８０７Ｒ、Ｘ８０７Ｃ、Ｘ８０７Ｇ、Ｘ８０７Ｓ、Ｘ８０７Ｗ、およびＫ６５０Ｍ  ＦＧＦＲ３受容体からなる群から選択される、ＦＧＦＲ３受容体の機能獲得型変異体の発現によって引き起こされる致死性骨異形成症Ｉ型であり得て、またはＦＧＦＲ３受容体のＫ６５０Ｅ機能獲得型変異体の発現によって引き起こされる致死性骨異形成症ＩＩ型であり得る。さらに、ＦＧＦＲ３関連骨格異形成症は、ＦＧＦＲ３受容体のＫ６５０Ｍ機能獲得型変異体の発現によって引き起こされる、発達遅延および黒色表皮腫を伴う重症軟骨形成不全症であり得る。
【００４３】
「線維芽細胞増殖因子」または「ＦＧＦ」という用語は、ヒトにおいては構造的に関連したシグナル伝達分子を含んでなる、ＦＧＦファミリーのメンバーを指す。この用語は、好ましくは全て線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）に結合する、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、およびＦＧＦ１８のいずれかを指す。より好ましくは、それはＦＧＦＲ３に結合することが示されている、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ９および／またはＦＧＦ１８を少なくとも指す。したがって、本明細書に記載される全ての態様および実施形態で言及されるＦＧＦは、好ましくはＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ９および／またはＦＧＦ１８である。それでもなお、その他のＦＧＦもまた、ＦＧＦＲ３に結合してもよく、したがって本発明によるＦＧＦという用語の範囲内にあることを念頭に置かなければならない。
【００４４】
好ましいＦＧＦ１は、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するヒトＦＧＦ１である。好ましいＦＧＦ２は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するヒトＦＧＦ２である。好ましいＦＧＦ９は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するヒトＦＧＦ９である。好ましいＦＧＦ１８は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するヒトＦＧＦ１８である。
【００４５】
「線維芽細胞増殖因子受容体３」、「ＦＧＦＲ３」または「ＦＧＦＲ３受容体」という用語は、本明細書の用法では、あらゆる天然の機能的にシグナル伝達するＦＧＦＲ３ポリペプチドを指す。特に、ＦＧＦＲ３は、１つまたは複数のＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ９および／またはＦＧＦ１８）と特異的に結合するポリペプチドを指す。染色体４の遠位短腕上に位置するヒトＦＧＦＲ３遺伝子は、１９エクソンを含有する、８０６アミノ酸タンパク質前駆体（線維芽細胞増殖因子受容体３イソ型１前駆体）をコードする。ＦＧＦＲ（例えば、ＦＧＦＲ３）は、増殖因子のＦＧＦファミリーのリガンドの結合によって活性化される、細胞膜に広がるチロシンキナーゼである。ＦＧＦＲ３およびその他のＦＧＦＲは、膜貫通ドメインの３つの細胞外免疫グロブリン様ドメインと、２つの細胞内チロシンキナーゼドメインとからなる。ＦＧＦＲ３は、ＦＧＦＲ３の可溶性断片をはじめとする、ＦＧＦＲ３ポリペプチドの全てまたはその断片および／または任意の変異、ならびに多形体およびスプライス変異体を含み得る。アルギニン残基による３８０位のグリシン残基の置換（すなわち、Ｇ３８０Ｒ）などのＦＧＦＲ３遺伝子の変異は、頭蓋骨早期癒合症および複数のタイプの骨格異形成症を引き起こす。選択的スプライシングが起こり、エクソン９でなく代替の８を利用するものをはじめとする追加的な変異体が記載されているが、それらの完全長の性質は判定されていない。ＦＧＦＲ３受容体は、細胞外ドメイン（アミノ酸残基１〜３６６）、膜貫通ドメイン（アミノ酸残基３６７〜３９９）、および細胞内ドメイン（アミノ酸残基４００〜８０６）を含んでなる。細胞外ドメインは、ＩｇＧ１ドメイン（アミノ酸残基５７〜１１０）、ＩｇＧ２ドメイン（アミノ酸残基１６１〜２４５）、およびＩｇＧ３ドメイン（アミノ酸残基２６８〜３５７）を含んでなる。細胞内ドメインは、２つのチロシンキナーゼドメイン（アミノ酸残基４５９〜７９２）を含んでなる。天然のヒトＦＧＦＲ３遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００１４２．４に示されるヌクレオチド配列を有し、天然のヒトＦＧＦＲ３タンパク質は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿０００１３３に示されるアミノ酸配列を有して、本明細書で配列番号６によって表わされる。
【００４６】
「断片」という用語は、好ましくは、標準核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上を含有する、ポリペプチドまたは核酸分子の部分を意味する。断片は、参照ポリペプチド（例えば、ＦＧＦＲ３）の全長まで、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、５００、６００、７００個以上のアミノ酸残基を含有してもよい。
【００４７】
例えば、ＦＧＦＲ３ポリペプチド断片は、例えば、配列番号１の少なくともアミノ酸１〜３００、１〜３１０、１〜３２０、１〜３３０、１〜３４０、１〜３５０、１〜３６０、１〜３７０、１〜３８０、１〜３９０、１〜４００、１〜４１０、１〜４２０、１〜４３０、１〜４４０、１〜４４０、１〜４５０、１〜４６０、１〜４７０、１〜４８０、１〜４９０、１〜５００、１〜５１０、１〜５２０、１〜５３０、１〜５４０、１〜５５０、１〜５６０、１〜５７０、１〜５８０、１〜５９０、１〜６００、１〜６１０、１〜６２０、１〜６３０、１〜６４０、１〜６５０、１〜６６０、１〜６７０、または１〜６８０などの配列番号１の断片に対する、少なくとも５０％（例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有する、任意のポリペプチドを含んでもよい。例えば、ＦＧＦＲ３ポリペプチド断片は、例えば、配列番号１の少なくともアミノ酸１〜３００、１〜３１０、１〜３２０、１〜３３０、１〜３４０、１〜３５０、１〜３６０、１〜３７０、１〜３８０、１〜３９０、１〜４００、１〜４１０、１〜４２０、１〜４３０、１〜４４０、１〜４４０、１〜４５０、１〜４６０、１〜４７０、１〜４８０、１〜４９０、１〜５００、１〜５１０、１〜５２０、１〜５３０、１〜５４０、１〜５５０、１〜５６０、１〜５７０、１〜５８０、１〜５９０、１〜６００、１〜６１０、１〜６２０、１〜６３０、１〜６４０、１〜６５０、１〜６６０、１〜６７０、または１〜６８０などの配列番号１の断片に対する、少なくとも５０％の配列同一性を有する、任意のポリペプチドを含んでもよい。例えば、ＦＧＦＲ３ポリペプチド断片は、例えば、配列番号１の少なくともアミノ酸１〜３００、１〜３１０、１〜３２０、１〜３３０、１〜３４０、１〜３５０、１〜３６０、１〜３７０、１〜３８０、１〜３９０、１〜４００、１〜４１０、１〜４２０、１〜４３０、１〜４４０、１〜４４０、１〜４５０、１〜４６０、１〜４７０、１〜４８０、１〜４９０、１〜５００、１〜５１０、１〜５２０、１〜５３０、１〜５４０、１〜５５０、１〜５６０、１〜５７０、１〜５８０、１〜５９０、１〜６００、１〜６１０、１〜６２０、１〜６３０、１〜６４０、１〜６５０、１〜６６０、１〜６７０、または１〜６８０などの配列番号１の断片に対する、少なくとも５５％の配列同一性を有する、任意のポリペプチドを含んでもよい。例えば、ＦＧＦＲ３ポリペプチド断片は、例えば、配列番号１の少なくともアミノ酸１〜３００、１〜３１０、１〜３２０、１〜３３０、１〜３４０、１〜３５０、１〜３６０、１〜３７０、１〜３８０、１〜３９０、１〜４００、１〜４１０、１〜４２０、１〜４３０、１〜４４０、１〜４４０、１〜４５０、１〜４６０、１〜４７０、１〜４８０、１〜４９０、１〜５００、１〜５１０、１〜５２０、１〜５３０、１〜５４０、１〜５５０、１〜５６０、１〜５７０、１〜５８０、１〜５９０、１〜６００、１〜６１０、１〜６２０、１〜６３０、１〜６４０、１〜６５０、１〜６６０、１〜６７０、または１〜６８０などの配列番号１の断片に対する、少なくとも６０％の配列同一性を有する、任意のポリペプチドを含んでもよい。例えば、ＦＧＦＲ３ポリペプチド断片は、例えば、配列番号１の少なくともアミノ酸１〜３００、１〜３１０、１〜３２０、１〜３３０、１〜３４０、１〜３５０、１〜３６０、１〜３７０、１〜３８０、１〜３９０、１〜４００、１〜４１０、１〜４２０、１〜４３０、１〜４４０、１〜４４０、１〜４５０、１〜４６０、１〜４７０、１〜４８０、１〜４９０、１〜５００、１〜５１０、１〜５２０、１〜５３０、１〜５４０、１〜５５０、１〜５６０、１〜５７０、１〜５８０、１〜５９０、１〜６００、１〜６１０、１〜６２０、１〜６３０、１〜６４０、１〜６５０、１〜６６０、１〜６７０、または１〜６８０などの配列番号１の断片に対する、少なくとも６５％の配列同一性を有する、任意のポリペプチドを含んでもよい。例えば、ＦＧＦＲ３ポリペプチド断片は、例えば、配列番号１の少なくともアミノ酸１〜３００、１〜３１０、１〜３２０、１〜３３０、１〜３４０、１〜３５０、１〜３６０、１〜３７０、１〜３８０、１〜３９０、１〜４００、１〜４１０、１〜４２０、１〜４３０、１〜４４０、１〜４４０、１〜４５０、１〜４６０、１〜４７０、１〜４８０、１〜４９０、１〜５００、１〜５１０、１〜５２０、１〜５３０、１〜５４０、１〜５５０、１〜５６０、１〜５７０、１〜５８０、１〜５９０、１〜６００、１〜６１０、１〜６２０、１〜６３０、１〜６４０、１〜６５０、１〜６６０、１〜６７０、または１〜６８０などの配列番号１の断片に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有する、任意のポリペプチドを含んでもよい。例えば、ＦＧＦＲ３ポリペプチド断片は、例えば、配列番号１の少なくともアミノ酸１〜３００、１〜３１０、１〜３２０、１〜３３０、１〜３４０、１〜３５０、１〜３６０、１〜３７０、１〜３８０、１〜３９０、１〜４００、１〜４１０、１〜４２０、１〜４３０、１〜４４０、１〜４４０、１〜４５０、１〜４６０、１〜４７０、１〜４８０、１〜４９０、１〜５００、１〜５１０、１〜５２０、１〜５３０、１〜５４０、１〜５５０、１〜５６０、１〜５７０、１〜５８０、１〜５９０、１〜６００、１〜６１０、１〜６２０、１〜６３０、１〜６４０、１〜６５０、１〜６６０、１〜６７０、または１〜６８０などの配列番号１の断片に対する、少なくとも７５％の配列同一性を有する、任意のポリペプチドを含んでもよい。例えば、ＦＧＦＲ３ポリペプチド断片は、例えば、配列番号１の少なくともアミノ酸１〜３００、１〜３１０、１〜３２０、１〜３３０、１〜３４０、１〜３５０、１〜３６０、１〜３７０、１〜３８０、１〜３９０、１〜４００、１〜４１０、１〜４２０、１〜４３０、１〜４４０、１〜４４０、１〜４５０、１〜４６０、１〜４７０、１〜４８０、１〜４９０、１〜５００、１〜５１０、１〜５２０、１〜５３０、１〜５４０、１〜５５０、１〜５６０、１〜５７０、１〜５８０、１〜５９０、１〜６００、１〜６１０、１〜６２０、１〜６３０、１〜６４０、１〜６５０、１〜６６０、１〜６７０、または１〜６８０などの配列番号１の断片に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、任意のポリペプチドを含んでもよい。例えば、ＦＧＦＲ３ポリペプチド断片は、例えば、配列番号１の少なくともアミノ酸１〜３００、１〜３１０、１〜３２０、１〜３３０、１〜３４０、１〜３５０、１〜３６０、１〜３７０、１〜３８０、１〜３９０、１〜４００、１〜４１０、１〜４２０、１〜４３０、１〜４４０、１〜４４０、１〜４５０、１〜４６０、１〜４７０、１〜４８０、１〜４９０、１〜５００、１〜５１０、１〜５２０、１〜５３０、１〜５４０、１〜５５０、１〜５６０、１〜５７０、１〜５８０、１〜５９０、１〜６００、１〜６１０、１〜６２０、１〜６３０、１〜６４０、１〜６５０、１〜６６０、１〜６７０、または１〜６８０などの配列番号１の断片に対する、少なくとも８５％の配列同一性を有する、任意のポリペプチドを含んでもよい。例えば、ＦＧＦＲ３ポリペプチド断片は、例えば、配列番号１の少なくともアミノ酸１〜３００、１〜３１０、１〜３２０、１〜３３０、１〜３４０、１〜３５０、１〜３６０、１〜３７０、１〜３８０、１〜３９０、１〜４００、１〜４１０、１〜４２０、１〜４３０、１〜４４０、１〜４４０、１〜４５０、１〜４６０、１〜４７０、１〜４８０、１〜４９０、１〜５００、１〜５１０、１〜５２０、１〜５３０、１〜５４０、１〜５５０、１〜５６０、１〜５７０、１〜５８０、１〜５９０、１〜６００、１〜６１０、１〜６２０、１〜６３０、１〜６４０、１〜６５０、１〜６６０、１〜６７０、または１〜６８０などの配列番号１の断片に対する、少なくとも９０％の配列同一性を有する、任意のポリペプチドを含んでもよい。例えば、ＦＧＦＲ３ポリペプチド断片は、例えば、配列番号１の少なくともアミノ酸１〜３００、１〜３１０、１〜３２０、１〜３３０、１〜３４０、１〜３５０、１〜３６０、１〜３７０、１〜３８０、１〜３９０、１〜４００、１〜４１０、１〜４２０、１〜４３０、１〜４４０、１〜４４０、１〜４５０、１〜４６０、１〜４７０、１〜４８０、１〜４９０、１〜５００、１〜５１０、１〜５２０、１〜５３０、１〜５４０、１〜５５０、１〜５６０、１〜５７０、１〜５８０、１〜５９０、１〜６００、１〜６１０、１〜６２０、１〜６３０、１〜６４０、１〜６５０、１〜６６０、１〜６７０、または１〜６８０などの配列番号１の断片に対する、少なくとも９５％の配列同一性を有する、任意のポリペプチドを含んでもよい。例えば、ＦＧＦＲ３ポリペプチド断片は、例えば、配列番号１のアミノ酸１〜３２３（ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４）、配列番号１のアミノ酸１〜４４０（ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ３）、または配列番号１のアミノ酸１〜５４８（ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ２）を含み得る。一実施形態では、配列番号１のアミノ酸１〜６９４（ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１）からなるｓＦＧＦＲ３ポリペプチド断片は、本発明の範囲内で可溶性ＦＧＦＲ３ポリペプチドとして除外される。
【００４８】
タンパク質に関する「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」という用語は、異なるタンパク質に由来する好ましくは機能ドメインである、２つ以上のポリペプチドを含んでなる。２つ以上のポリペプチドは、ペプチド結合によって直接または間接的に連結する。融合タンパク質は、２つ以上の核酸配列を連結することによって生成される。これは、組換え的に、そしてまた核酸合成を通じて、実施され得る。この融合コンストラクトの翻訳は、２つ以上のポリペプチドに由来する機能特性がある、単一タンパク質をもたらす。
【００４９】
本明細書の用法では、「特発性骨格成長遅延障害」という用語は、その原因が不明であり、例えば、組換えヒトＧＨ（ｒｈＧＨ）などの外因性成長ホルモン（ＧＨ）による治療がそれに対して効果がない、骨格疾患を指す。
【００５０】
「モニターする」という用語は、本明細書の用法では、典型的に、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、１年間、２年間、３年間、５年間、１０年間、１５年間、または任意のその他の期間である治療処置の間、または特定期間中に診断された、骨格成長遅延障害の付随症状に言及する。「付随症状」という用語は、治療の過程において、骨格成長遅延障害の状態、特に状態の変化が、対象の体重および／または頭蓋長および／または幅に基づいて検出されてもよく、特に（ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ）、例えば、１ヶ月または１年当たり１、２、３、４回以上、またはおよそ１、２、３、４、５、６、７、８、１２または１６週間毎などの任意の種類の定期的な時間区分におけるその変化に基づいて判定されてもよいことを意味する。対象の体重および／または頭蓋骨サイズ、またはその変化はまた、例えば、各治療または薬物／療法投与の前および／または後などの治療の特定の事象時に判定され得る。
【００５１】
「核酸」または「核酸分子」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基または双方の一本鎖または二本鎖オリゴマーまたはポリマーとして理解されるものとする。典型的に、核酸は、個々のヌクレオチドモノマー間のリン酸ジエステル結合を通じて形成される。本発明の文脈では、核酸という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含むが、これに限定されるものではない。核酸の一本鎖の描写はまた、相補鎖の配列を（少なくとも部分的に）画定する。核酸は、一本鎖または二本鎖であってもよく、二本鎖および一本鎖双方の配列の部分を含んでもよい。核酸は、生物学的、生化学的または化学的合成方法、または当該分野で公知の方法のいずれかによって得られてもよい。本明細書の用法では、「核酸」という用語は、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語を含んでなる。本発明の文脈では、核酸という用語は、特にｃＤＮＡ、組換えＤＮＡ、およびｍＲＮＡを含んでなる。核酸はまた、人工的核酸であり得る。人工的核酸としては、ポリアミドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノおよびロックド核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）およびトレオース核酸（ＴＮＡ）が挙げられる。これらのそれぞれは、分子骨格の変化によって、天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡと区別される。
【００５２】
「ペプチドリンカー」、「リンカー」または「スプライサー」は、本発明の文脈では、１〜１００個のアミノ酸のペプチド鎖を指す。好ましい実施形態では、本発明によるペプチドリンカーは、少なくとも１，２，３，４，５，６，７，８，９または１０アミノ酸の最小長を有する。さらに好ましい実施形態では、本発明によるペプチドリンカーは、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、または２０アミノ酸の最大長を有する。好ましい範囲は、５〜２５および１０〜２０アミノ酸長である。ペプチドリンカーは、可撓性ペプチドリンカーであり、すなわち、共に連結する２つの融合タンパク質構成要素間に、可撓性を提供することが好ましい。このような可撓性は、アミノ酸が小型であり、アミノ酸鎖の回転または屈曲を妨げる嵩高い側鎖を有さない場合に、一般に増大する。したがって、好ましくは本発明のペプチドリンカーは、特にグリシン（ｇｌｙｃｉｎｓ）、アラニン、セリン、スレオニン、ロイシン、およびイソロイシンのアミノ酸含有量の増加を有する。好ましくは、ペプチドリンカーの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％７０％、８０、９０％以上のアミノ酸が、小型アミノ酸である。
【００５３】
例えば、リンカーのアミノ酸は、グリシンおよびセリンから選択され、すなわち、前記リンカーは、ポリグリシンまたはポリグリシン／セリンリンカーであり、「ポリ」は、リンカー中の少なくとも５０％、６０％７０％、８０、９０％または１００％にさえ至るグリシンおよび／またはセリン残基の比率を意味する。特に好ましい実施形態では、本発明によるペプチドリンカーの上記の好ましい最小および最大長が、組み合わされてもよい。さらに好ましい実施形態では、本発明のペプチドリンカーは非免疫原性であり；特に好ましい実施形態では、ペプチドリンカーはヒトにおいて非免疫原性である。例えば、本明細書に記載されるｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチド（例えば、配列番号４のアミノ酸残基１〜８含有または非含有の配列番号４または配列番号３３）は、アミノ酸配列ＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳなどのグリシンおよびセリンリンカーを含み得る。
【００５４】
「薬学的に」または「薬学的に許容可能な」とは、必要に応じて、哺乳類、特にヒトに投与された場合に、有害なアレルギー性またはその他の有害反応を生じない、分子実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体または賦形剤とは、任意のタイプの無毒の固体、半固体または液体の増量剤、希釈剤、封入材料または製剤助剤を指す。医薬組成物の形態、投与経路、用量、およびレジメンは、治療する病状、疾患の重症度、対象の年齢、体重、および性別などに必然的に左右される。本発明の医薬組成物は、局所、経口、鼻腔内、眼内、静脈内、筋肉内または皮下投与などのために処方され得る。
【００５５】
「ポリペプチド」という用語は、本明細書の用法では、長さまたは翻訳後修飾にかかわりなく、アミノ酸の任意のペプチド結合鎖を指す。本発明で使用可能なポリペプチドは、化学修飾によってさらに修飾され得る。これは、化学的に修飾されたポリペプチドが、天然アミノ酸以外のその他の化学基を含んでなることを意味する。このようなその他の化学基の例としては、制限なしに、グリコシル化アミノ酸およびリン酸化アミノ酸が挙げられる。ポリペプチドの化学修飾は、親ポリペプチドと比較して、例えば、安定性の向上、生物学的半減期の増大、または水溶性の増大の１つ以上の有利な特性を提供してもよい。本発明のポリペプチドに適用できる化学修飾としては、制限なしに、ＰＥＧ化、非グリコシル化ポリペプチドのグリコシル化、またはポリペプチド中に存在するグリコシル化パターンの修飾が挙げられる。さらに例示的な修飾としては、例えば、異常アミノ酸様Ｎｌｅ、ＮｖａまたはＯｒｎによるアミノ酸の置換などの修飾および／または異常アミノ酸によるアミノ酸の置換；例えば、Ｎ末端アシル化（好ましくはアセチル化）または脱アミノ化（ｄｅｓａｍｉｎａｔｉｏｎ）、またはＣ末端カルボキシル基のアミドまたはアルコール基への修飾などのペプチドのＮ末端および／またはＣ末端の修飾；２つのアミノ酸間のアミド結合における修飾：２つのアミノ酸を連結するアミド結合の窒素原子またはα炭素における、アシル化（好ましくはアセチル化）またはアルキル化（好ましくはメチル化）；２つのアミノ酸を連結するアミド結合のα炭素におけるアシル化（好ましくはアセチル化）またはアルキル化（好ましくはメチル化）などの、２つのアミノ酸を連結するアミド結合のα炭素における修飾；例えば、１つまたは複数の天然アミノ酸（Ｌ鏡像異性体）の対応するＤ鏡像異性体による置換などのキラリティー変化；アミノ酸鎖の反転（Ｃ末端からＮ末端への）と共に、１つまたは複数の天然に存在するアミノ酸（Ｌ鏡像異性体）が対応するＤ鏡像異性体で置換される、逆反転；１つまたは複数のα炭素が窒素原子で置換された、アザペプチド；および／または１つまたは複数のアミノ酸のアミノ基が、α炭素ではなくβ炭素に結合するβペプチドが挙げられる。
【００５６】
本明細書の用法では、疾患または障害の「予防（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」または「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」とは、このような疾患または障害が対象において発生するのを予防することを意味する。
【００５７】
「原核細胞」という用語は、本明細書の用法では、クローニングまたはタンパク質発現などの組換えＤＮＡ技術における応用に適した任意の種類の細菌生物を指し、グラム陰性およびグラム陽性微生物の双方を含む。適切な細菌は、例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、カウロバクター属（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）（シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ））、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）またはストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）から選択されてもよい。
【００５８】
「骨格成長遅延障害」という用語は、本明細書の用法では、骨の変形および／または奇形によって特徴付けられる骨格疾患を指す。これらの疾患としては、成長板（骨端軟骨）破断によって引き起こされる骨格成長遅滞障害、特発性骨格成長遅滞障害、およびＦＧＦＲ３関連骨格疾患が挙げられるが、これに限定されない。例えば、骨格成長遅延障害は、軟骨形成不全症、ホモ接合型軟骨形成不全症、ヘテロ接合軟骨形成不全症、軟骨無形成症、先端骨形成不全症、遠位中間肢節短縮型異形成、アテロオステオジェネシス、屈曲肢異形成症、点状軟骨異形成症、肢根型点状軟骨異形成症、鎖骨頭蓋骨異骨症、先天性大腿骨短縮症、頭蓋骨早期癒合症（例えば、ミュンケ症候群、クルーゾン症候群、アペール症候群、ジャクソン・ワイス症候群、パイフェル症候群、またはクルーゾン外骨格症候群）、指症、短指症、屈指症、多指症、合指症、捻曲性骨異形成症、小人症、分節異常異形成症、内軟骨腫症、線維性軟骨発生症、線維性異形成、遺伝性多発性外骨腫症、低軟骨形成症、低ホスファターゼ症、低リン血症性くる病、ヤッフェ・リヒテンシュタイン症候群、クニースト異形成症、クニースト症候群、ランガー型中間肢異形成症、マルファン症候群、マッキューン・オルブライト症候群、小肢症、骨幹端異形成症、ヤンセン型骨幹端異形成症、変容性骨（ｍｅｔａｔｒｏｐｈｉｃ）異形成症、モルキオ症候群、ニーバーゲルト型中間肢異形成症、神経線維腫症（例えば、１型、例えば、骨症状発現を伴うまたは骨症状発現を伴わない；２型；シュワン細胞腫症；または本明細書に記載されるいずれか）、骨関節炎、骨軟骨異形成症、骨形成不全症、周産期致死性型骨形成不全症、大理石骨病、骨斑紋症、末梢異骨症、ラインハルト症候群、ロバーツ症候群、ロビノウ症候群、短肋骨多指症候群、低身長、先天性脊椎骨端発育不全、脊椎骨端骨幹端異形成症、または致死性骨異形成症などの骨格異形成症を含んでもよい。したがって、本発明は、例えば、軟骨形成不全症などの骨格成長遅延障害の症状の治療または予防を提供する。
【００５９】
「可溶性」という用語は、本明細書の用法では、タンパク質またはポリペプチド、特に受容体が細胞膜に直接結合しないこと、したがって可溶性タンパク質またはポリペプチドがあらゆる膜固着機能を欠くように、全てのまたはかなりの膜貫通（すなわち、親油性）ドメインの不在または機能阻害によって特徴付けられることを示唆する。細胞質ドメインはまた、不在であってもよい。この点において、ＦＧＦＲ３の膜貫通ドメインは、配列番号６に記載の野生型配列のアミノ酸３６７〜３９９から伸長して、ＦＧＦＲ３の細胞質ドメインは、配列番号６に記載の野生型配列のアミノ酸４００〜８０６から伸長する。ＦＧＦＲ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、配列番号６に記載の野生型ＦＧＦＲ３配列のアミノ酸１〜３６６またはその断片から伸長する。
【００６０】
例示的ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドとしては、配列番号１の少なくともアミノ酸１〜３００、１〜３１０、１〜３２０、１〜３３０、１〜３４０、１〜３５０、１〜３６０、１〜３７０、１〜３８０、１〜３９０、１〜４００、１〜４１０、１〜４２０、１〜４３０、１〜４４０、１〜４４０、１〜４５０、１〜４６０、１〜４７０、１〜４８０、１〜４９０、１〜５００、１〜５１０、１〜５２０、１〜５３０、１〜５４０、１〜５５０、１〜５６０、１〜５７０、１〜５８０、１〜５９０、１〜６００、１〜６１０、１〜６２０、１〜６３０、１〜６４０、１〜６５０、１〜６６０、１〜６７０、１〜６８０、または１〜６９０が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、これらのｓＦＧＦＲ３ポリペプチド断片のいずれかに対する、少なくとも５０％（例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有する、任意のポリペプチドを含み得る。例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１（配列番号１）の断片を含み得る。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１（配列番号１）は、配列番号６のアミノ酸３１１〜４２２の欠失を特徴とする。特に、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、例えば、配列番号１のアミノ酸１〜３２３（ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４）、配列番号１のアミノ酸１〜４４０（ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ３）、または配列番号１のアミノ酸１〜５４８（ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ２）を含んでもよい。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドはまた、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドのＮ末端（例えば、配列番号１のアミノ酸残基１〜５６）の欠失を含んでもよい。
【００６１】
「可溶性ＦＧＦＲ３ポリペプチド」または「ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド」という用語は、本明細書の用法では、膜貫通（すなわち、親油性）ドメインの全てまたはかなりの部分の不在または機能阻害によって特徴付けられ、またＦＧＦＲ３ポリペプチドを細胞膜に固着させるいかなるポリペプチド部分も含有しない、ＦＧＦＲ３ポリペプチドを指す。したがってｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、ＦＧＦＲ３ポリペプチドの非膜結合形態である。特に、ＦＧＦＲ３の膜貫通ドメインは、野生型ＦＧＦＲ３配列（配列番号６）のアミノ酸残基３６７〜３９９から伸長する。したがってｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、野生型ＦＧＦＲ３ポリペプチド配列（配列番号６）のアミノ酸残基３６７〜３９９の欠失を含む。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、野生型ＦＧＦＲ３ポリペプチド配列の細胞質ドメイン（配列番号６のアミノ酸残基４００〜８０６）の欠失をさらに含み得る。さらに、ｓＦＧＦＲ３は、野生型ＦＧＦＲ３ポリペプチド配列の細胞外ドメイン（配列番号６のアミノ酸残基１〜３６６）の欠失を含み得る。
【００６２】
「特異的に結合するという」用語は、本明細書の用法では、タンパク質の不均一集団における、特に、生物、好ましくは人体などの細胞における、本明細書で定義される結合パートナー（例えば、ＦＧＦまたはアグリカン）の存在に決定力がある結合反応を指す。したがって、特定のリガンドは、その定義される結合パートナーと結合し、生物、好ましくはヒトの生物に存在する、より好ましくは細胞外液（例えば間質液および血漿）中、または細胞外マトリックス、特に軟骨の中または上に存在する、その他の分子に相当量で結合しない。一般に、標的分子に「特異的に結合する」リガンドは、好ましくは室温で（例えば、２０℃〜２５℃）、その標的分子に対して、約１０−５未満（例えば、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、および１０−１２以下）の平衡解離定数ＫＤを有する。平衡解離定数を測定する方法は、当該技術分野で周知である。好ましい方法は、ＢｉａＣｏｒｅ（登録商標）システムを使用する。特に、別のタンパク質特異的に結合する（アグリカン結合タンパク質またはＦＧＦＲ３などの）タンパク質の断片および／または変異体に関して、特異的に結合するとは、それが、その由来するタンパク質（すなわち、それぞれ、アグリカン結合タンパク質またはＦＧＦＲ３）の結合活性の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％を有すること意味する。適切な結合アッセイについては、実施例１（ＦＧＦ／アグリカン結合）および実施例４を参照されたい。その他のタンパク質またはその断片または変異体は、それ相応に試験され得る。
【００６３】
「対象」または「患者」という用語は、本明細書の用法では、齧歯類、ネコ、イヌ、ウマ、または霊長類などのヒトまたは非ヒト哺乳類を意味する。好ましくは、対象はヒトであり、より好ましくは小児である（すなわち、本発明に関して、特に身長がなおも伸びているヒトである）。成長板の軟骨基質は、新生児または小児において成人におけるよりも密度がより低いことに留意されたい。したがって、理論による拘束は望まないが、本発明のポリペプチドは、新生児または小児において、前記軟骨基質により良く浸透することが期待され得る。一実施形態では、対象は、本明細書に記載されるような骨格成長遅延障害、特にＦＧＦＲ３関連骨格疾患に罹患していると診断されている。
【００６４】
疾患または障害の「治療（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本明細書の用法では、（ａ）障害の重症度を低下させる；（ｂ）治療される障害に特徴的な症状の発生を制限または予防する；（ｃ）治療される障害に特徴的な症状の悪化を阻止する；（ｄ）障害を以前に有した個人における障害の再発を制限または予防する；および（ｅ）以前に障害に症候性であった個体における症状の再発を制限または予防する、の１つまたは複数を達成することを意味する。
【００６５】
上記は、好ましくは出生時に顕著な低身長、長い体躯、および短縮四肢；４２〜５６インチの成人身長；大きな頭および突出した前頭部；顔の一部は未発達であり得る；出生時には脚はまっすぐに見えるが、小児が歩き始めると、彼または彼女は外反膝または内反膝の変形を発症する；手および足は大きく見えるが、手指および足指は短く太い；肘における腕の矯正は限定的なこともあるが、通常は、患者がいかなる特定の活動を行うのも妨げない；小児は、腰背部の過度な湾曲とあひる歩行パターンを発症することもある；例えば、歯の過密状態などに起因する歯科疾患；体重管理困難；神経性および呼吸性困難；および／または腰背部および／または脊椎における疲労、疼痛、および無感覚をはじめとする軟骨形成不全症の１つまたは複数の症状に適用される。
【００６６】
「変異体」という用語は、ポリペプチドに関して、アミノ酸配列の１つまたは複数の変化によって、それが由来するポリペプチドと比較して異なる、ポリペプチドと理解されるものとする。タンパク質変異体がそれに由来するポリペプチドは、親ポリペプチドとしても知られている。典型的に、変異体は人工的に、好ましくは遺伝子技術的手段によって構築される。典型的に、親ポリペプチドは、野生型タンパク質または野生型タンパク質ドメインである。本発明において使用可能な変異体はまた、親ポリペプチドの相同体、オルソログ、またはパラログに由来してもよい。アミノ酸配列の変化は、アミノ酸交換、挿入、欠失、Ｎ末端切断、またはＣ末端切断、またはこれらの変化の任意の組合せであってもよく、これらは１つまたは複数の部位で起こってもよい。好ましい実施形態では、本発明で使用可能な変異体は、最大２００（最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００）のアミノ酸配列の変化（すなわち、交換、挿入、欠失、Ｎ末端切断、および／またはＣ末端切断）の総数を示す。アミノ酸交換は、保存的および／または非保存的であってもよい。好ましい実施形態では、本発明で使用可能な変異体は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００のアミノ酸交換、好ましくは保存的アミノ酸変化によって、それが由来するタンパク質またはドメインと異なる。代案としてはまたはそれに加えて、「変異体」は、本明細書の用法では、それが由来する親ポリペプチドに対する、ある程度の配列同一性によって特徴付けられ得る。より正確には、タンパク質変異体は、本発明の文脈で、その親ポリペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を示す。好ましくは、タンパク質変異体の配列同一性は、２０、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００以上のアミノ酸の一続きにわたって、より好ましくは参照ポリペプチド（親ポリペプチド）の全長にわたる。「少なくとも８０％の配列同一性」という用語は、明細書全体を通じて、ポリペプチド配列の比較に関して使用される。この表現は、好ましくは各参照ポリペプチドに対する、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を指す。好ましくは、当該ポリペプチドと参照ポリペプチドは、上で特定される一続きにわたって、示される配列同一性を示す。
【００６７】
本発明のポリペプチド「変異体」の配列同一性は、本発明のｓＦＧＦデコイポリペプチドのアミノ酸配列（例えば、配列番号１のアミノ酸１〜３１０）の同定された範囲にわたって、または同定されたｓＦＧＦデコイポリペプチドの全アミノ酸配列（例えば、配列番号１の全てのアミノ酸）を参照して判定され得る。本発明の変異体ポリペプチドの配列同一性百分率を判定する場合、配列アライメントは、あらゆる特定の除外されたアミノ酸残基（例えば、配列番号６のアミノ酸３６７〜３９９または配列番号１のアミノ酸３２４〜６９４）を省略してもよい。例えば、配列番号１のアミノ酸１〜３１０に対して少なくとも８０％の配列同一性を示す本発明のｓＦＧＦデコイポリペプチドの変異体ポリペプチドについて、比較のための配列アラインメントは、アミノ酸１〜３１０のみにわたって起こってもよく、または完全長ｓＦＧＦデコイポリペプチド内の２つ以上の同定された範囲のアミノ酸配列を考慮してもよい。
【００６８】
「変異体」という用語は、核酸に関して、ヌクレオチド配列における１つまたは複数の変化によって、それが由来する核酸と比較して、異なるポリヌクレオチドと理解される。変異体がそれに由来する核酸は、親核酸としてもまた知られている。典型的に、変異体は人工的に、好ましくは遺伝子技術的手段によって構築される。典型的に、親核酸は、野生型核酸またはその一部である。本発明において使用可能な変異体はまた、親核酸の相同体、オルソログ、またはパラログに由来してもよい。ヌクレオチド配列の変化は、交換、挿入、欠失、５’切断または３’切断、またはこれらの変化の任意の組み合わせであってもよく、それらは１つまたは複数の部位で起こってもよい。好ましい実施形態では、本発明で使用可能な変異体は、ヌクレオチド配列において最大６００（最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００または６００）の変化の総数を示す。ヌクレオチド交換は、ポリペプチド変異体に関して、上に示したような非保存的および／または好ましくは保存的アミノ酸交換を引き起こしてもよい。代案としてはまたはそれに加えて、「変異体」は、本明細書の用法では、それが由来する親核酸に対する、ある程度の配列同一性によって特徴付けられ得る。より正確には、核酸変異体は、本発明の文脈では、その親核酸に対して少なくとも８０％の配列同一性を示す。好ましくは、核酸変異体の配列同一性は、２０、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００以上のアミノ酸の一続きにわたって、より好ましくは参照核酸（親核酸）の全長にわたる。「少なくとも８０％の配列同一性」という用語は、明細書全体を通じて、核酸配列の比較に関してもまた使用される。この用語は、好ましくは各参照核酸または各参照核酸に対する、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を指す。好ましくは、当該核酸および参照核酸は、上で特定された一続きにわたる配列同一性を示す。
【００６９】
本明細書の用法では、「ベクター」という用語は、タンパク質またはポリヌクレオチドまたはその混合物を指し、それは、細胞に導入されることができ、またはその中に含まれる核酸を細胞に導入できる。本発明の文脈では、第３の態様の核酸は、ベクター導入時に細胞内で発現されることが好ましい。適切なベクターは、当該技術分野で公知であり、例えば、プラスミド、コスミド、人工染色体（例えば、細菌、酵母またはヒト）、バクテリオファージ、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイル、アデノ随伴ウイルスまたはバキュロウイルス）、またはナノ操作物質（例えば、オルモシル）が含まれる。必要なベクター技術は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｌｏｄｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ；６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｕｎｅ  １５，２００７；ｏｒ  Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２０１２  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１Ａ−１Ｃ】（Ａ）野生型ヒト線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）（約８７ｋＤａ）、（Ｂ）野生型ヒトヒアルロナンおよびプロテオグリカンリンクタンパク質１（ＨＰＬＮ１）（約４０ｋＤａ）、および（Ｃ）発明者によって以前開発された可溶性ＦＧＦＲ３（ｓＦＧＦＲ３、約７２ｋＤａ）のタンパク質構造およびドメインの一連の概略図を示す（ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５０８００；配列番号１を参照されたい）。ｓＦＧＦＲ３は、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドのＮ末端にあるＦＬＡＧタグと共に示される。
【図２Ａ−２Ｄ】例示的ＦＧＦデコイポリペプチド断片（ｓＦＧＦＲ３欠失変異体）（Ａ）ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１（約７０ｋＤａ）、（Ｂ）ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ２（約６２ｋＤａ）、（Ｃ）ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ３（約４９ｋＤａ）、および（Ｄ）ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（約３７ｋＤａ）の構造を示す一連の概略図である。それぞれの例示的ｓＦＧＦＲ３断片（ｓＦＧＦＲ３欠失変異体）は、ｓＦＧＦＲ３断片のＮ末端にある任意選択のＦＬＡＧタグと共に示される。
【図３Ａ−３Ｄ】ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４およびＨＰＬＮ１を含有する、例示的融合タンパク質またはその断片の構造を示す一連の概略図である：（Ａ）ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＨＰＬＮ１（約７９ｋＤａ）、（Ｂ）ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２（約６２ｋＤａ；配列番号４のアミノ酸残基１〜８含有または非含有の配列番号４または配列番号３３）、（Ｃ）ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１（約５０ｋＤａ）、および（Ｄ）ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ２（約５０ｋＤａ）。それぞれの例示的ｓＦＧＦＲ３融合タンパク質が、ｓＦＧＦＲ３融合タンパク質のＮ末端にある任意選択のＦＬＡＧタグと共に示される。
【図４Ａ−４Ｂ】欠失（Ｄｅｌ）変異体を使用したＦＧＦ結合、およびＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３全長タンパク質との比較を示すグラフである。（Ａ）様々な組換えタンパク質が、一定量のヒトＦＧＦ２と共に培養された。（Ｂ）Ｄｅｌ４変異体を使用して、ヒトＦＧＦ９の固定が確認された。
【図５Ａ−５Ｂ】ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４処置に続く頭蓋骨長（Ａ）および体重（Ｂ）を使用した、成長速度の評価を示すグラフである。
【図６Ａ−６Ｄ】２．５ｍｇ／ｋｇ（例えば、２．５ｍｇ／ｋｇ／週、３週間にわたる週２回）の用量で投与された、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４処置の体内評価を示すグラフである。処置効果は、体重（Ａ）、体長（Ｂ）、尾長（Ｃ）の測定、および頭蓋長（Ｌ）／頭蓋幅（Ｗ）比（Ｄ）によって評価された。
【図７Ａ−７Ｂ】ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２を使用した、ＦＧＦ（Ａ）およびアグリカン（Ｂ）結合を示すグラフである。
【図８Ａ−８Ｂ】ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２の処置効果の生体内評価を示すグラフである。Ａ．成長速度は、処置期間中の体重測定によって評価された。Ｂ．処置群または対照群における、ＷＴおよび遺伝子組換えＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの骨格パラメーター。
【図９】ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドおよびｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドにおける、シグナルペプチド（例えば、ＭＧＡＰＡＣＡＬＡＬＣＶＡＶＡＩＶＡＧＡＳＳ）の役割を示すウエスタンブロットの画像である。Ｎ末端位置のＦＬＡＧタグを有するｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１（配列番号１）と、それに続くシグナルペプチド配列（レーンＢ１）、Ｎ末端位置のＦＬＡＧタグがあるｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２（配列番号４）と、それに続くシグナルペプチド配列（レーンＢ１４）、Ｎ末端位置のＦＬＡＧタグがあるｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４と、それに続くシグナルペプチド配列（レーンＢ２７）、Ｃ末端位置のＦＬＡＧタグがあるｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１（配列番号１）（レーンＢ８）、Ｃ末端位置のＦＬＡＧタグがあるｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２（配列番号４）（レーンＢ２１）、およびＣ末端位置のＦＬＡＧタグがあるｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（レーンＢ３４）を検出するために、抗ＦＬＡＧモノクローナルＭ２抗体が使用された。
【図１０Ａ−１０Ｂ】出生後５日目（図１０Ａ）および２２日目（図１０Ｂ）に、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１（配列番号１）およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２（配列番号４）で処置されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの大腿骨成長板における、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３の免疫組織化学染色を示す顕微鏡写真である。
【図１１Ａ−１１Ｈ】ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２（図１１Ａ−１１Ｂ）による５日間の処置または無処置（図１１Ｃ−１１Ｈ）後における、野生型マウスおよびＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスのＸ線写真である。
【図１２】ヒトＦＧＦ２（１００ｐｇ／ｍｌ）の存在または不在下で、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１（配列番号１）を２４時間攻撃投与した後のＡＴＤＣ５軟骨細胞におけるリン酸化ＥＲＫを示すグラフである。結果は、ｈＦＧＦ２のみがある条件の百分率として表される。模擬上清が、対照として使用された。
【図１３Ａ−１３Ｃ】細胞増殖に対する異なるｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１画分の効果を示す、画像およびグラフである。示されるのは、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１のサイズ排除クロマトグラム（図１３Ａ）；ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１の抗ＦＬＡＧモノクローナルＭ２抗体を使用したウエスタンブロット（図１３Ｂ）；およびＦＧＦと、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１の異なる画分との存在下における、ＡＴＤＣ５軟骨細胞の増殖（図１３Ｃ）である。
【図１４Ａ−１４Ｃ】軟骨細胞増殖に対する異なるｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２画分の効果を示す、画像およびグラフである。示されるのは、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２のサイズ排除クロマトグラム（図１４Ａ）；ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１の抗ＦＬＡＧモノクローナルＭ２抗体を使用したウエスタンブロット（図１４Ｂ）；およびＦＧＦと、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１の異なる画分との存在下における、ＡＴＤＣ５軟骨細胞の増殖（図１４Ｃ）である。
【図１５Ａ−１５Ｅ】投与の１時間、３時間、６時間、または２４時間後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、１２５Ｉ−ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１の脳組織および血漿濃度および安定性を示すグラフである。
【図１６Ａ−１６Ｅ】投与の１時間、３時間、６時間、または２４時間後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２の脳組織および血漿濃度および安定性を示すグラフである。１２５Ｉ−ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１および１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２の血漿濃度の比較もまた示される（図１６Ｅ）。
【図１７Ａ−１７Ｂ】１２５Ｉ−ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１および１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２血漿濃度のノンコンパートメント解析（ＮＣＡ）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
本発明者らは、それを必要とする対象（例えば、ヒト、特に乳児または小児）において軟骨形成不全症などの骨格成長遅滞障害を治療または予防するのに使用されてもよい、可溶性ＦＧＦＲ３線維芽細胞増殖因子受容体３（ｓＦＧＦＲ３）のポリペプチド変異体を発見した。本発明は、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）断片を含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド変異体を提供する。特に、本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、例えば、配列番号６のアミノ酸３１１〜４２２の欠失を特徴として、以下の例示的なＤｅｌ変異体を提供するｓＦＧＦＲ３欠失（Ｄｅｌ）変異体を含む。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ２（配列番号１のアミノ酸１〜５４８）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ３（配列番号１のアミノ酸１〜４４０）、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（配列番号１のアミノ酸１〜３２３）。本発明はまた、例えば、ヒトヒアルロナンおよびプロテオグリカンリンクタンパク質１（ＨＰＬＮ１）を含む、アグリカン結合タンパク質（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２（配列番号４のアミノ酸残基１〜８含有または非含有の配列番号４、または配列番号４のアミノ酸残基１〜８含有または非含有の配列番号４または配列番号３３）またはその断片）などの異種ポリペプチドに融合された、配列番号１のアミノ酸１〜３２３を含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド断片などのｓＦＧＦＲ３ポリペプチド断片を含む、融合ポリペプチドを特徴とする。それを必要とする対象（例えば、ヒト、特に乳児または小児）において、骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨形成不全症）を治療または予防するために、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるようなＤｅｌ変異体）および融合ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２（配列番号４のアミノ酸残基１〜８含有または非含有の配列番号４））を投与する方法もまた記載される。
【００７２】
本発明者らは、ｓＦＧＦＲ３のより小型の機能部分が、より大型の可溶性ＦＧＦＲ３断片および完全長ＦＧＦＲ３ポリペプチドと比較して、遊離ＦＧＦの固定に続く二量体化の能力を保ちながら、同様の作用機序を示すことを判定した。より短い細胞内部ドメインがあるいくつかのＦＧＦＲ３ポリペプチド変異体が、設計された。全ての変異体は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１（配列番号１）と同様の親和性でヒトＦＧＦ２と結合した。最も短いＦＧＦＲ３変異体であるｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（配列番号１のアミノ酸１〜３２３）の使用でさえ、治療効果を示し、それは遺伝子組換えＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの骨成長を回復させた。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４がこの疾患のマウスモデルに投与された際にも、軟骨形成不全症治療における治療効果が観察され、したがって成長障害の治療における、そして融合タンパク質などの追加的なコンストラクションの設計における、このＦＧＦＲ３断片の使用が実証される。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４コンストラクトはまた、成長速度の指標として体重および頭蓋長のモニタリングの使用を検証するためにも使用された。さらに、本発明は、ｓＦＧＦＲ３のより小型の機能性部分と、ヒトヒアルロナンおよびプロテオグリカンリンクタンパク質１（ＨＰＬＮ１）とを含んでなる、融合タンパク質を提供する。これらの融合タンパク質は、ＦＧＦならびにアグリカンと結合して、以前のｓＦＧＦＲ３デコイと比較して、改善された治療効果を示す。
【００７３】
線維芽細胞増殖因子受容体３
本開示は、特定の線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）ポリペプチドに、あるいはＦＧＦＲ３をコードする核酸に限定されない。ＦＧＦＲ３ポリペプチドは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、またはＦＧＦ１８）への結合を媒介する線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）ファミリーのメンバーを包含して、骨の発達および維持における役割を有する。特に、ＦＧＦＲ３ポリペプチドは、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ９および／またはＦＧＦ１８と結合し得る。
【００７４】
ＦＧＦＲ３ポリペプチドは、既知のＦＧＦＲ３ポリペプチドのいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはその断片を含み得る。ＦＧＦＲ３ポリペプチドは、ＦＧＦＲ３のＩｇ３ドメインの選択的スプライシングによって生じるＦＧＦＲ３などの天然の（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｉｎｇ）イソ型を含み得て、その中では、Ｉｇ３のＣ末端半分が、２つの別々のエクソンである、エクソン８（イソ型１；ＦＧＦＲ３  ＩＩＩｂ）およびエクソン９（イソ型３；ＦＧＦＲ３  ＩＩＩｃ）によってコードされる。特に、ＦＧＦＲ３ポリペプチドは、エクソン９（受入番号ＮＰ＿０００１３３）によってコードされるＣ末端Ｉｇ３半分がある、ＦＧＦＲ３  ＩＩＩｃ型ＥＣＤを含み得て、それは、ＦＧＦＲ３転写変異体１（受入番号ＮＭ＿０００１４２．４）に対応する。ＦＧＦＲ３ポリペプチドは、エクソン８（受入番号ＮＰ＿００１１５６６８５）によってコードされるＣ末端半分がある、ＦＧＦＲ３  ＩＩＩｂ型ＥＣＤもまた含み得て、それは、ＦＧＦＲ３転写変異体３（受入番号ＮＭ＿００１１６３２１３）に対応する
【００７５】
ＦＧＦＲ３ポリペプチドは、上に記載されたＦＧＦＲ３アミノ酸配列だけでなく、これらのＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、配列番号６）に対する、少なくとも５０％（例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）のアミノ酸配列同一性を有する任意のポリペプチド、またはこれらのＦＧＦＲ３アミノ酸配列のアミノ酸断片（例えば、ＦＧＦＲ３アミノ酸配列（例えば、配列番号６）の少なくとも５０、１００、１５０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０以上のアミノ酸残基）もまた含んでもよい。上で論じた例示的ＦＧＦＲ３ポリペプチドに加えて、本開示は、例えば、ヒトなどの患者において、骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨形成不全症）治療するための同一または類似ＦＧＦ結合親和性を含んでなる、任意のＦＧＦＲ３ポリペプチドもまた提供する。
【００７６】
可溶性ＦＧＦＲ３
本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、本明細書に記載されるＦＧＦＲ３のいずれかの可溶性（例えば、非膜結合）形態を含む。本開示は、特定のｓＦＧＦＲ３に限定されず、１つまたは複数のＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ１（配列番号７）、ＦＧＦ２（配列番号８）、ＦＧＦ９（配列番号９）、および／またはＦＧＦ１８（配列番号１０））に結合する任意のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを含んでもよく、したがって、例えば、軟骨形成不全症などの骨格成長遅滞障害を治療するための１つまたは複数のＦＧＦのデコイ受容体として使用されてもよい。本発明は、それを必要とする対象において、例えば、軟骨形成不全症などの本明細書に記載される病状を治療するために使用されてもよい、配列番号５などの本明細書に記載されるｓＦＧＦＲ３ポリペプチドをコードする核酸をさらに含む。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、例えば、ＩｇＧ３ドメインのＣ末端半分をコードするエクソン８および９と、膜貫通ドメインを含むエクソン１０とが欠けている、ＦＧＦＲ３イソ型２の断片（すなわちｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１；配列番号１および受入番号ＮＰ＿０７５２５４）であり得て、ＦＧＦＲ３転写変異体２（受入番号ＮＭ＿０２２９６５）に対応する。ｓＦＧＦＲ３を含む組成物は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１４／１１１７４４号パンフレットおよび国際公開第２０１４／１１１４６７号パンフレットにさらに記載される。
【００７７】
例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、ＦＧＦＲ３イソ型２のアミノ酸配列の断片（例えば、配列番号１の少なくともアミノ酸１〜３００、１〜３１０、１〜３２０、１〜３３０、１〜３４０、１〜３５０、１〜３６０、１〜３７０、１〜３８０、１〜３９０、１〜４００、１〜４１０、１〜４２０、１〜４３０、１〜４４０、１〜４４０、１〜４５０、１〜４６０、１〜４７０、１〜４８０、１〜４９０、１〜５００、１〜５１０、１〜５２０、１〜５３０、１〜５４０、１〜５５０、１〜５６０、１〜５７０、１〜５８０、１〜５９０、１〜６００、１〜６１０、１〜６２０、１〜６３０、１〜６４０、１〜６５０、１〜６６０、１〜６７０、１〜６８０、または１〜６９０）を含み得る。特に、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１〜３２３（ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４）、配列番号１のアミノ酸１〜４４０（ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ３）、または配列番号１のアミノ酸１〜５４８（ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ２）を含んでもよいが、これに限定されるものではない。
【００７８】
ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドおよびその断片は、Ｎ末端シグナルペプチド配列もまた含み得る。Ｎ末端シグナルペプチドは、それが合成された場合は、合成タンパク質上に存在するが、典型的に、細胞からのポリペプチド搬出に際して、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドから切断される。本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドおよびｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドは、それらの分泌形態（すなわち、Ｎ末端シグナルを欠く）および非分泌形態（すなわち、Ｎ末端シグナルを有する）の双方を含む。当業者は、異なるｓＦＧＦＲ３ポリペプチドにおいてＮ末端シグナルペプチドの位置が変動し、ポリペプチドのＮ末端上の例えば、最初の５、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、３０以上のアミノ酸残基を含んでもよいことを理解するであろう。例えば、例示的シグナルペプチドは、配列番号１のアミノ酸１〜２２を含み得るが、これに限定されるものではない。さらに、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ２、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ３、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（それぞれ、配列番号１のアミノ酸１〜５４８、配列番号１のアミノ酸１〜４４０、配列番号１のアミノ酸１〜３２３に相当する）などのｓＦＧＦＲ３ポリペプチドおよび融合ポリペプチド、またはＦＧＦＲ３融合ポリペプチド（例えば、配列番号４のアミノ酸１〜８含有または非含有の配列番号４または配列番号３３）は、例えば、配列番号１の少なくともアミノ酸１〜５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または５６などのＮ末端アミノ酸の欠失を含み得る。当業者は、例えば、Ｂｅｎｄｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（４）：７８３−７９５，２００４）に記載されて、ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／においてウェブで利用できるものなどの適切なコンピュータアルゴリズムによって、シグナル配列切断部位の位置を予測し得る。
【００７９】
ｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチド
本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、異種ポリペプチド（例えば、アグリカン結合タンパク質）からの機能ドメインに任意選択的に融合されて、本明細書に記載のｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドが提供され得る。いくつかのｓＦＧＦＲ３ポリペプチドにおいては、セリンまたはグリシンに富む配列（例えば、ポリグリシンまたはポリグリシン／セリンリンカー）などの可撓性のリンカーが、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドと融合ポリペプチド（例えば、アグリカン結合タンパク質）の間に含まれてもよい。さらなる例示的な融合タンパク質およびリンカーについては、下に記載される。
【００８０】
例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１の断片などの上記のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸１〜３２３（ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４）、配列番号１のアミノ酸１〜４４０（ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ３）、または配列番号１のアミノ酸１〜５４８（ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ２）は、例えば、アグリカン結合タンパク質を含む融合ポリペプチド、または対象（例えば、ヒト）に投与された場合に軟骨を標的とする任意のポリペプチドであり得る。特に、例えば、アグリカンの球状ドメイン（Ｇ１、Ｇ２、またはＧ３）と相互作用する任意のタンパク質などのアグリカン（ａｇｇｒｅｇａｎ）と結合するタンパク質の任意の機能部分が、ｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドに含まれ得る。
【００８１】
本明細書に記載されるｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドを製造するのに使用され得る例示的アグリカン結合タンパク質としては、抗体、フィビュリン−１、ボレリアアグリカン結合タンパク質（例えば、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）グリコサミノグリカン結合タンパク質（Ｂｇｐ）およびボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）高温要求性Ａ（ＢｂＨｔｒＡ））、および軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質／トロンボスポンジン５（ＣＯＭＰ／ＴＳＰ５）が挙げられる。例えば、アグリカン結合タンパク質としては、ヒトヒアルロナンおよびプロテオグリカンリンクタンパク質１（ＨＰＬＮ１）またはその断片が挙げられる。特に、ＨＰＬＮ１断片は、軟骨リンクドメイン１（ＬＫ１；配列番号３のアミノ酸１５８〜２５２）、軟骨リンクドメイン２（ＬＫ２；配列番号３のアミノ酸２５９〜３４９）、またはＬＫ１およびＬＫ２ドメインの双方（配列番号３のアミノ酸１５８〜３４９）を含み得る。追加的なｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドは、ＨＰＬＮ１ポリペプチド（例えば、配列番号３）に対する、少なくとも５０％（例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）のアミノ酸配列同一性を有し、またはそのアミノ酸断片（例えば、ＨＰＬＮ１アミノ酸配列（すなわち、配列番号３）の全長の少なくとも５０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０以上のアミノ酸残基）を有する、任意のポリペプチドを含んでもよい。例えば、ＦＧＦＲ３融合ポリペプチドのアグリカン結合タンパク質またはその断片は、配列番号１のアミノ酸１〜３２３（ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４）などのｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはその断片との組み合わせで、例えば、ＬＫ１およびＬＫ２ドメインの双方（配列番号３のアミノ酸１５８〜３４９）を含み得る。
【００８２】
さらに、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ２、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ３、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４）は、例えば、Ｎ末端またはＣ末端ドメインに、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合ポリペプチドであり得る。免疫グロブリン分子は、当該技術分野で周知の構造を有する。それは、鎖間ジスルフィド結合によって連結する、２本の軽鎖（それぞれ約２３ｋＤ）および２本の重鎖（それぞれ約５０〜７０ｋＤ）を含む。免疫グロブリンは、（例えば、パパイン切断によって）タンパク分解性に、Ｆａｂ（軽鎖と、重鎖のＶＨおよびＣＨ１ドメインとを含有する）およびＦｃ（隣接配列と共に、重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有する）に容易に切断される。本明細書に記載されるような有用なＦｃ断片としては、任意の哺乳類（例えば、ヒト）に由来する、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ、およびそれらの様々なサブクラス（例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、ＩｇＧ−４、ＩｇＡ−１、ＩｇＡ−２）をはじめとする、任意の免疫グロブリン分子のＦｃ断片が挙げられる。例えば、Ｆｃ断片はヒトＩｇＧ−１である。本発明のＦｃ断片は、例えば、重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインと、ヒンジ領域の任意の部分とを含んでもよい。Ｆｃ領域は、任意選択的に、当業者に知られている任意の適切な１つまたは複数のアミノ酸残基で、グリコシル化されてもよい。本明細書に記載されるようなＦｃ断片は、本明細書に記載されるＦｃ断片のいずれかと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０以上の付加、欠失、または置換を有してもよい。
【００８３】
本明細書に記載されるｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドは、ＳＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはその断片と異種ポリペプチドまたはその断片（例えば、アグリカン結合タンパク質またはその断片またはＦｃ領域）との間のペプチドリンカー領域を含んでもよい。リンカー領域は、ｓＡＬＰを生物学的に活性のままにする、例えば、立体障害性でない、任意の配列および長さであり得る。例示的なリンカーの長さは、例えば、１〜５、６〜１０、１１〜１５、１６〜２０、２１〜２５、２６〜３０、３１〜３５、３６〜４０、４１〜４５、４６〜５０、５１〜５５、５６〜６０、６１〜６５、６６〜７０、７１〜７５、７６〜８０、８１〜８５、８６〜９０、９１〜９５、９６〜１００、１０１〜１１０、１１１〜１２０、１２１〜１３０、１３１〜１４０、１４１〜１５０、１５１〜１６０、１６１〜１７０、１７１〜１８０、１８１〜１９０、または１９１〜２００アミノ酸残基などの１〜２００アミノ酸残基である。例えば、リンカーは、例えば、顕著な固定された二次または三次構造のない領域などの可撓性部分を含むか、またはそれからなる。好ましい範囲は、５〜２５および１０〜２０アミノ酸長である。このような可撓性は、アミノ酸が小型であり、アミノ酸鎖の回転または屈曲を妨げる嵩高い側鎖を有さない場合に、一般に増大する。したがって、好ましくは本発明のペプチドリンカーは、特にグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、ロイシン、およびイソロイシンのアミノ酸含有量の増加を有する。
【００８４】
例示的可撓性リンカーは、グリシンに富むリンカーであり、例えば、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％にさえ至るグリシン残基を含有する。リンカーは、例えば、セリンに富むリンカーもまた含有してもよく、例えば、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％にさえ至るセリン残基を含有する。場合によっては、リンカーのアミノ酸配列は、グリシンおよびセリン残基のみからなる。例えば、ｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチド（例えば、配列番号４のアミノ酸残基１〜８含有または非含有の配列番号４または配列番号３３）は、アミノ酸配列ＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳなどのグリシンおよびセリンリンカーを含み得る。リンカーは、任意の適切な１つまたは複数のアミノ酸残基で、任意選択的にグリコシル化されてもよい。さらに、本明細書に記載されるリンカーは、共有結合または非共有結合する、任意のその他の配列または部分を含んでもよい。リンカーはまた、不在であってもよく、その中では、ＦＧＦＲ３ポリペプチドと異種ポリペプチド（例えば、アグリカン結合タンパク質またはその断片またはＦｃ領域）とが、介在残基なしで直接共に融合する。
【００８５】
追加的なアミノ酸残基は、ＦＧＦＲ３融合ポリペプチドを製造するのに使用されるクローニングストラテジーに従って、ＦＧＦＲ３融合ポリペプチドに導入され得る。例えば、さらなるアミノ酸残基は、ポリペプチドを可溶性形態に維持するために、ＦＧＦＲ３膜貫通ドメインの一部を提供しない。さらに、任意のこのような追加的なアミノ酸残基は、本発明のＦＧＦＲ３ポリペプチドまたは融合ポリペプチドに組み込まれた場合、宿主細胞のエンドプロテアーゼのための切断部位を提供しない。設計された配列が、宿主細胞のエンドプロテアーゼによって切断される可能性は、例えば、Ｉｋｅｚａｗａ（Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２５：４０９−４１７，２００２）によって記載されるように予測され得る。
【００８６】
本発明のＦＧＦＲ３ポリペプチドおよび融合ポリペプチドは、二量体または四量体に会合されてもよい。さらに、本発明のポリペプチドまたは融合ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたは融合ポリペプチド）は、グリコシル化またはＰＥＧ化されてもよい。
【００８７】
ｓＦＧＦＲ３核酸およびポリペプチドの製造
本発明のｓＦＧＦＲ３およびｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドをコードする核酸は、当該分野で公知の任意の方法によって製造され得る。典型的に、所望の融合ポリペプチドをコードする核酸が分子クローニング法を使用して生成され、一般に、プラスミドまたはウイルスなどのベクター内に入れられる。ベクターを使用して、融合ポリペプチドの発現に適した宿主細胞に核酸が形質転換される。典型的な方法は、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）で開示される。多数の細胞型が適切な宿主細胞として使用され得るが、適切な翻訳後修飾を与えることができることから、哺乳類細胞が好ましい。本発明の宿主細胞としては、例えば、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ−７細胞、または任意のその他の適切な宿主細胞が挙げられる。例えば、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。代案としては、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞であり得る。
【００８８】
治療法
本明細書で提供されるのは、軟骨形成不全症を有する患者（例えば、軟骨形成不全症を有するヒト）などの患者において、骨格成長遅延障害を治療するための方法である。特に、患者は、骨格成長遅延障害（例えば、軟骨形成不全症）の１つまたは複数の症状を呈してもよく、または有する可能性がある。方法は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ２、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ３、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（それぞれ、配列番号１のアミノ酸１〜５４８、配列番号１のアミノ酸１〜４４０、配列番号１のアミノ酸１〜３２３に対応する）などのｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、またはＦＧＦＲ３融合ポリペプチド（例えば、配列番号４のアミノ酸残基１〜８含有または非含有の配列番号４または配列番号３３）を患者（例えば、ヒト）に投与することを伴う。例えば、患者は、例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはＦＧＦＲ３融合ポリペプチドの投与前に、本明細書に記載されるもの（例えば、軟骨形成不全症）などの骨格成長遅延障害の兆候または症状を呈する。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ２、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ３、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（例えば、それぞれ、配列番号１のアミノ酸１〜５４８、配列番号１のアミノ酸１〜４４０、および配列番号１のアミノ酸１〜３２３）などの本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、または本発明のｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチド（例えば、配列番号４のアミノ酸残基１〜８含有または非含有の配列番号４または配列番号３３）による治療は、患者（例えば、ヒト）が、本明細書に記載されるもの（例えば、軟骨形成不全症）などの骨格発達遅延障害と診断された後に、または患者が、本明細書に記載されるもの（例えば、軟骨形成不全症）などの骨格成長遅延障害の兆候または症状を呈した後に行われてもよい。特に、患者はｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２によって治療される。
【００８９】
ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ２、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ３、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（例えば、それぞれ、配列番号１のアミノ酸１〜５４８、配列番号１のアミノ酸１〜４４０、および配列番号１のアミノ酸１〜３２３）などのｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、またはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチド（例えば、配列番号４のアミノ酸残基１〜８含有または非含有の配列番号４または配列番号３３）による治療は、例えば、軟骨形成不全症などの骨格成長遅延障害の症状の改善をもたらし得る。方法を使用して、例えば、軟骨形成不全症などの骨格成長遅延障害の症状の重症度の逆転または低下があるように、例えば、軟骨形成不全症などの骨格成長遅延障害に伴う症状が治療され得る。
【００９０】
骨格成長遅延障害
骨格成長遅滞障害は、本明細書に記載されるようなｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドを投与することによって、治療または予防され得る。特に、方法は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ２、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ３、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（例えば、それぞれ、配列番号１のアミノ酸１〜５４８、配列番号１のアミノ酸１〜４４０、配列番号１のアミノ酸１〜３２３）などのｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、またはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２（配列番号４のアミノ酸残基１〜８含有または非含有の配列番号４または配列番号３３））を患者（例えば、ヒト）に投与することを伴う。本明細書に記載されるｓＦＧＦＲ３ポリペプチドおよびｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドで治療され得る骨格成長遅延障害は、骨の変形および／または奇形によって特徴付けられ、ＦＧＦＲ３関連骨格疾患が挙げられるが、これに限定されるものではない。特に、患者はｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２によって治療される。
【００９１】
本明細書に記載されるようなｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２など）の投与は、軟骨形成不全症、軟骨無形成症、先端骨形成不全症、遠位中間肢節短縮型異形成症、アテロオステオジェネシス、屈曲肢異形成症、点状軟骨異形成症、肢根型点状軟骨異形成症、鎖骨頭蓋骨異骨症、先天性大腿骨短縮症、クルーゾン症候群、アペール症候群、ジャクソン・ワイス症候群、パイフェル症候群、クルーゾン外骨格症候群、指症、短指症、屈指症、多指症、合指症、捻曲性骨異形成症、小人症、分節異常異形成症、内軟骨腫症、線維性軟骨発生症、線維性異形成、遺伝性多発性外骨腫症、低ホスファターゼ症、低リン血症性くる病、ヤッフェ・リヒテンシュタイン症候群、クニースト異形成症、クニースト症候群、ランガー型中間肢異形成症、マルファン症候群、マッキューン・オルブライト症候群、小肢症、骨幹端異形成症、ヤンセン型骨幹端異形成症、変容性骨（ｍｅｔａｔｒｏｐｈｉｃ）異形成症、モルキオ症候群、ニーバーゲルト型中間肢異形成症、神経線維腫症（１型（例えば、骨症状発現を伴うまたは骨症状発現を伴わない）、２型、またはシュワン細胞腫症など）、骨関節炎、骨軟骨異形成症、骨形成不全症、周産期致死性型骨形成不全症、大理石骨病、骨斑紋症、末梢異骨症、ラインハルト症候群、ロバーツ症候群、ロビノウ症候群、短肋骨多指症候群、低身長、先天性脊椎骨端発育不全、または脊椎骨端骨幹端異形成症をはじめとするが、これに限定されるものではない骨格成長遅延障害を治療し得る。例えば、本明細書に記載されるｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドの投与は、前述の障害のいずれかと関連する症状を消散させおよび／または予防してもよい。
【００９２】
本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドおよびｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドは、ＦＧＦＲ３関連骨格疾患（例えば、軟骨形成不全症）などの骨格成長遅延障害と関連する症状を治療するために使用され得る。例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドで治療されてもよい、骨格成長遅延障害の症状の非限定的な例としては、短縮四肢および体躯、内反膝、あひる歩行、頭蓋奇形（例えば、大きな頭部）、クローバー形頭蓋、頭蓋骨早期癒合症（例えば、頭蓋骨の早期癒合）、ウォルム骨（例えば、頭蓋骨間の異常な糸状の接続）、手足の異常（例えば、多指症または余剰指）、「ヒッチハイカー」母指および異常な指爪および足爪、および胸部異常（例えば、梨形胸部または狭い胸郭）が挙げられる。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドおよびｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドの投与によって治療され得る追加的な症状としては、例えば、先天性白内障、近視、口蓋裂、または聴覚消失などの眼、口、および耳の異常などの骨格成長遅延障害を有する患者における非骨格異常；水頭症、孔脳症、水頭性無脳症、または脳梁の無形成などの脳奇形；心房中隔欠損、動脈管開存症、または大血管転位症などの心臓欠陥；発達遅延；または精神遅滞もまた挙げられる。したがって、本明細書に記載されるようなｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドの投与は、骨格成長遅延障害の１つまたは複数の症状の改善をもたらしてもよい。
【００９３】
（例えば、機能獲得型ＦＧＦＲ３変異の結果としてのＦＧＦＲ３の過剰活性化によって引き起こされるかそれと関連する）ＦＧＦＲ３関連骨格疾患である任意の骨格成長遅延障害は、本明細書に記載のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドを患者（例えば、ヒト）に投与することによって治療され得る。例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドは、骨格形成異常およびＦＧＦＲ３関連頭蓋骨癒合症などのＦＧＦＲ３関連疾患を治療するために投与され得る。ＦＧＦＲ３関連骨格疾患としては、軟骨形成不全症、致死性骨異形成症Ｉ型（ＴＤＩ）、致死性骨異形成症ＩＩ型（ＴＤＩＩ）、発達遅延および黒色表皮腫を伴う重症軟骨形成不全症（ＳＡＤＤＡＮ）、低軟骨形成症、および頭蓋骨早期癒合症（例えば、ミュンケ症候群および黒色表皮腫を伴うクルーゾン症候群）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００９４】
軟骨形成不全症、低軟骨形成症、ＳＡＤＤＡＮ、ＴＤＩ、およびＴＤＩＩなどの異なるＦＧＦＲ３関連骨格障害と関連するＦＧＦＲ３遺伝子の変異がある患者（例えば、ヒト患者）は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ２、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ３、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４などのｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、またはｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４とアグリカン結合タンパク質の断片とを含む融合ポリペプチドなどのｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２（配列番号４のアミノ酸残基１〜８含有または非含有の配列番号４または配列番号３３））によって治療され得る。
【００９５】
例えば、ＦＧＦＲ３遺伝子のＧ３８０Ｒ、Ｇ３７５Ｃ、Ｇ３４６ＥまたはＳ２７９Ｃ変異に起因する軟骨形成不全症を治療するために、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドが投与され得る。以下の例示的ＦＧＦＲ３関連骨格障害を治療するために、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドおよびｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドの投与が使用されてもよい：ＦＧＦＲ３遺伝子のＧ３７５Ｃ、Ｇ３４６ＥまたはＳ２７９Ｃ変異に起因する低軟骨形成症；ＦＧＦＲ３遺伝子のＲ２４８Ｃ、Ｓ２４８Ｃ、Ｇ３７０Ｃ、Ｓ３７１Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｘ８０７Ｒ、Ｘ８０７Ｃ、Ｘ８０７Ｇ、Ｘ８０７Ｓ、Ｘ８０７Ｗ、およびＫ６５０Ｍ変異に起因するＴＤＩ；ＦＧＦＲ３遺伝子のＫ６５０Ｅ変異に起因するＴＤＩＩ；およびＦＧＦＲ３遺伝子のＫ６５０Ｍ変異に起因するＳＡＤＤＡＮ。したがって、本明細書に開示されるｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドで治療される患者は、例えば、ＦＧＦＲ３遺伝子に変異を有してもよい。
【００９６】
（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ２、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ３、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４などのｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、またはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２））による治療などの治療の前または後に、前述のＦＧＦＲ３遺伝子の変異のいずれか（例えば、ＦＧＦＲ３遺伝子のＧ３８０Ｒ変異）が、患者（例えば、軟骨形成不全症、低軟骨形成症、ＳＡＤＤＡＮ、ＴＤＩ、およびＴＤＩＩがあるヒト）からのサンプルにおいて、検出され得る。さらに、患者両親および／または胎児サンプル（例えば、母親血液から得られる胎児核酸、胎盤サンプル、または胎児サンプル）が、当該技術分野で公知の方法によって、変異について検査されてもよい。
【００９７】
軟骨形成不全症
軟骨形成不全症は、ヒトにおける小人症の最も一般的な原因であり、本明細書に記載されるようなｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドを投与することによって、治療または予防され得る。特に、軟骨形成不全症は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ２、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ３、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（例えば、それぞれ、配列番号１のアミノ酸１〜５４８、配列番号１のアミノ酸１〜４４０、配列番号１のアミノ酸１〜３２３）などのＦＧＦＲ３ポリペプチド、またはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２（配列番号４のアミノ酸残基１〜８含有または非含有の配列番号４または配列番号３３））を患者（例えば、ヒト）に投与することによって治療されてもよい。本明細書に記載されるようなｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドの投与は、成長遅延、頭蓋変形、歯科矯正欠陥、（例えば、中枢性無呼吸または痙攣からの死亡リスクを伴う）頸髄圧迫、脊髄狭窄症（例えば、下肢および腰痛）、水頭症（例えば、脳シャント手術を要する）、慢性耳炎による難聴、心血管疾患、神経学的疾患、呼吸困難、疲労、疼痛、腰背部および／または脊椎（ｓｐｉｎ）無感覚、および肥満をはじめとするが、これに限定されるものではない、症状の改善をもたらしてもよい。
【００９８】
本明細書に記載されるｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドを使用して治療される患者としては、例えば、軟骨形成不全症がある、乳児、小児、および成人が挙げられる。乳児は、しばしば出生時に軟骨形成不全症と診断され、したがって、本明細書に記載されるようなｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはｓＦＧＦＲ３融合タンパク質による治療は、例えば、出生直後、または出生前（子宮内）など患者の生涯においてできるだけ早く開始されてもよい。
【００９９】
患者（例えば、ヒト）における軟骨形成不全症状は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ２、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ３、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（例えば、それぞれ、配列番号１のアミノ酸１〜５４８、配列番号１のアミノ酸１〜４４０および配列番号１のアミノ酸１〜３２３）などのｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、またはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２（配列番号４のアミノ酸残基１〜８含有または非含有の配列番号４または配列番号３３））で患者が治療される前または後にモニターされてもよい。例えば、軟骨形成不全症の症状が治療の前にモニターされて、方法の実施に先立つ軟骨形成不全症の重症度および患者の状態が評価されてもよい。本発明の方法は、患者における軟骨形成不全症の診断と、本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドによる治療の過程において、例えば、１ヶ月または１年に１、２、３、４回以上、またはおよそ１、２、３、４、５、６、７、８、１２または１６週間毎などの一定期間にわたってモニターされた変化に基づいて、患者の体重、頭蓋骨長および／または頭蓋幅の変化などの軟骨形成不全症の症状の変化について患者をモニターすることを含んでもよい。患者の体重および／または頭蓋骨サイズまたはその変化はまた、例えば本明細書に記載のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドの投与前および／または投与後などの治療の特定の事象時に判定され得る。例えば、体重および／または頭蓋骨サイズは、本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドの投与に応答して測定される。
【０１００】
体重は、好ましくは標準化された様式で、例えば同じ衣服で（特にヒトの場合）または衣服なしで、または１日の特定の時間に、好ましくは絶食状態で（例えば、朝食前、または少なくとも１、２、３、４、５時間以上の絶食後）に行われる。
【０１０１】
頭蓋骨サイズは、好ましくは長さ、高さ、幅および／または外周で表される。測定は、既知のまたは自己考案された標準化された方法で行い得る。ヒト対象では、頭蓋外周の測定が好ましい。これは、通常、例えば、前頭部周囲の最も突出した部分から頭部の後ろの最も広い部分までなどの頭部のできるだけ広い外周（しかし耳の周辺または眉毛とその下の顔面領域でない）に巻き付けられた、テープなどの可撓性で非伸縮性の材料を用いて行われる。ヒト対象のための別の好ましい測定は、例えば、顎の下側から頭部の最上点までの頭蓋骨の高さを判定し得る。齧歯類対象では、頭蓋骨の長さ（例えば、鼻骨の先端から後頭骨の後ろまで）の測定が好ましい。代案としては、頭蓋骨の幅（例えば、頭頂骨の最も広い点）、または蓋骨の高さ（例えば、下顎角突起の最下点から前頭間骨まで）もまた好ましい。好ましくは、任意の測定は、例えば、少なくとも３回など２回以上行われて、長さ、高さ、幅および／または外周として、最大値が取られた（ｕｓ  ｔａｋｅｎ）。
【０１０２】
医薬組成物および製剤
本発明の組成物（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ２、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ３、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（例えば、それぞれ、配列番号１のアミノ酸１〜５４８、配列番号１のアミノ酸１〜４４０、配列番号１のアミノ酸１〜３２３）などのｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、またはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２（配列番号４のアミノ酸残基１〜８含有または非含有の配列番号４または配列番号３３）を含む）は、当該分野で公知の多様な方法によって投与され得る。当業者には理解されるように、投与の経路および／または様式は、所望の結果次第で変動する。投与経路は、環境および治療の目的などの多様な要因に左右され得る。特に、本明細書に記載されるｓＦＧＦＲ３ポリペプチドおよびｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２）は、例えば、皮下（例えば、皮下注射によって）、静脈内、経口、経鼻、筋肉内、舌下、クモ膜下腔内に、または皮内などの当該分野で公知の任意の経路によって投与され得る。一例として、本発明の医薬組成物は、液体、溶液、懸濁液、丸薬、カプセル、錠剤、ジェルキャップ、粉末、ゲル、軟膏、クリーム、噴霧剤、ミスト、噴霧蒸気、エアロゾル、またはフィトソームの形態であり得る。
【０１０３】
投与量
任意の量の医薬組成物（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ２、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ３、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（例えば、それぞれ、配列番号１のアミノ酸１〜５４８、配列番号１のアミノ酸１〜４４０、および配列番号１のアミノ酸１〜３２３）などのｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、またはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２（配列番号４のアミノ酸残基１〜８含有または非含有の配列番号４または配列番号３３））が、骨格成長遅延障害がある患者（例えば、軟骨形成不全症がある患者）などの患者に投与され得る。投与量は、投与様式および患者の年齢をはじめとする、多数の要因に左右される。典型的には、単回用量に含まれる組成物（例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドを含む）の量は、顕著な毒性を誘発することなく、本明細書に記載されるような病状（例えば、軟骨形成不全症）を治療するのに効果的な量である。
【０１０４】
例えば、本明細書に記載される、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ２、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ３、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（例えば、それぞれ、配列番号１のアミノ酸１〜５４８、配列番号１のアミノ酸１〜４４０、配列番号１のアミノ酸１〜３２３）などのｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、またはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２（配列番号４のアミノ酸１〜８含有または非含有の配列番号４または配列番号３３））は、例えば、０．０００２ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．００２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、または０．２ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ）の範囲の個々の用量で、患者（例えば、軟骨形成不全症がある患者）に投与され得る。特に、本明細書に記載されるｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドは、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜７ｍｇ／ｋｇの個々の用量で投与され得る。これらの用量は、１日、１週間、１ヶ月、または１年間当たり、１回または複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回以上）投与され得る。
【０１０５】
例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ２、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ３、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（例えば、それぞれ、配列番号１のアミノ酸１〜５４８、配列番号１のアミノ酸１〜４４０、配列番号１のアミノ酸１〜３２３）などのｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはその断片（ｏｆ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ）、またはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２（配列番号４のアミノ酸１〜８含有または非含有の配列番号４または配列番号３３））の例示的用量としては、例えば、０．０００２、０．０００５、０．００１０、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、３、２．５、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０ｍｇ／ｋｇが挙げられる。本明細書に列挙される全ての用量または範囲について、「約」という用語は、列挙される値または範囲終点の±１０％で、これらの用量を修正するために使用されてもよい。特に、本開示によるｓＦＧＦＲ３組成物は、約０．０００２ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０２ｍｇ／ｋｇ／日〜約１５ｍｇ／ｋｇ／日、または約０．２ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日（例えば、０．７５ｍｇ／ｋｇ／日）の範囲の用量で患者に投与され得る。例えば、ｓＦＧＦＲ３組成物は、例えば、約０．００１４ｍｇ／ｋｇ／週〜約１４０ｍｇ／ｋｇ／週、例えば、約０．１４ｍｇ／ｋｇ／週〜約１０５ｍｇ／ｋｇ／週、または、例えば、約１．４ｍｇ／ｋｇ／週〜約７０ｍｇ／ｋｇ／週（例えば、５ｍｇ／ｋｇ／週）の範囲の週間用量で患者に投与され得る。投与量は、疾患の程度（例えば、軟骨形成不全症）および患者（例えば、軟骨形成不全症がある患者）からの異なるパラメーターなどの従来の要因に従って、臨床医によって適応される。
【０１０６】
ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ２、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ３、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（例えば、それぞれ、配列番号１のアミノ酸１〜５４８、配列番号１のアミノ酸１〜４４０、配列番号１のアミノ酸１〜３２３）などのｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、またはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２（配列番号４のアミノ酸１〜８含有または非含有の配列番号４または配列番号３３））を含む組成物の用量は、単回または複数回の投与レジメンのどちらかで提供されてもよい。用量は、例えば、毎時間、２時間毎、毎日、隔日、週２回、週３回、週４回、週５回、週６回、毎週、隔週、毎月、隔月、または毎年投与され得る。代案としては、用量は、例えば、１日当たり、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、または１２回与され得る。特に、投与レジメンは、週２回である。例えば、本明細書に記載されるｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドは、２．５ｍｇ／ｋｇの用量で週２回投与され得る。投与レジメン持続期間は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０日間、週間、または月間であり得て、または患者の残りの寿命にさえ至る。投与の量、頻度、および期間は、疾患の程度および患者からの異なるパラメーターなどの従来の要因に従って、臨床医によって適応される。
【０１０７】
担体／ビヒクル
ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、それぞれ、配列番号１のアミノ酸１〜５４８、配列番号１のアミノ酸１〜４４０、または配列番号１のアミノ酸１〜３２３）、またはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチド（ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２（配列番号４のアミノ酸１〜８含有または非含有の配列番号４または配列番号３３））を含有する製剤は、薬学的に許容可能な滅菌水性または非水性溶媒、懸濁液またはエマルションと組み合わせて患者に提供されてもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、魚油、および注射用有機エステルである。水性担体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース溶液、塩化ナトリウム添加デキストロース溶液、ラクトース含有リンゲル溶液、または不揮発性油固定油を含む、生理食塩水および緩衝化医療用非経口ビヒクルを含む、水、水−アルコール溶液、乳濁液または懸濁液が挙げられる。
【０１０８】
静脈内ビヒクルは、リンゲルデキストロースに基づくものなどの液体および栄養補充液、電解質補充液を含んでもよい。例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；および酢酸塩，プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩などの薬学的に許容可能な塩が、その中に含まれ得る。さらに、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助剤が、このようなビヒクル中に存在してもよい。薬学的に許容可能な担体の徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）で利用可能である。
【０１０９】
好ましくは、医薬組成物は、注射できる製剤に対して薬学的に許容可能なビヒクルを含有する。これらは特に、等張性滅菌生理食塩水（リン酸一ナトリウムまたはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムなどまたはこのような塩の混合物）、または状況次第で、滅菌水または生理食塩水の添加に際して、注射液の構成（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）ができるようにする、乾燥、特に凍結乾燥組成物であってもよい。投与に使用される用量は、様々なパラメーターの関数として、特に使用される投与様式、関連病理、または代案としては所望の治療持続期間の関数として、適合させ得る。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低いレベルで化合物の用量を開始して、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増大させることは、十分に当業者の技術の範囲内である。しかし、製品の１日投与量は、１日当たり成人１人当たり０．０１〜１．０００ｍｇの広い範囲にわたって変化させてもよい。好ましくは、組成物は、治療される対象への投与量の症候に基づく調節のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０および５００ｍｇの活性成分を含有する。薬剤は、典型的に、約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇ、好ましくは約１ｍｇ〜約１００ｍｇの活性成分を含有する。薬物の有効量は、通常、１日当たり０．０００２ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、特に約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜７ｍｇ／ｋｇ体重の用量レベルで提供される。医薬組成物を調製するために、本発明によるポリペプチドの有効量が、薬学的に許容可能な担体または水性媒体に溶解または分散されてもよい。
【０１１０】
注射用途に適する医薬品形態としては、滅菌水溶液または分散体；ゴマ油、落花生油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および滅菌注射液または２０分散体の即時処方のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、形態は無菌でなくてはならず、容易な注射針通過性が存在する程度に流動性でなくてはならない。それは、製造および貯蔵の条件下で安定していなくてはならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなくてはならない。遊離塩基または薬理学的に許容可能な塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散体はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、それらの混合物中、および油中でも調製され得る。通常の貯蔵および使用条件下では、これらの調製物は微生物の増殖を防ぐための保存料を含有する。
【０１１１】
本発明によるポリペプチドおよび核酸は、中性または塩形態の組成物に処方され得る。薬学的に許容可能な塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基によって形成される）が含まれ、例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸によって形成される。遊離カルボキシル基によって形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導され得る。担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および野菜油を含有する溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散体の場合は必要な粒度の維持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性が維持され得る。微生物の作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの様々な抗菌剤および抗真菌剤によってもたらされ得る。多くの場合、例えば糖類または塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることが、好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を組成物中で使用することによってもたらされ得る。
【０１１２】
必要に応じて、必要量の活性化合物が、上に列挙されたその他の成分のいくつかと共に適切な溶媒中に組み込まれ、それに続く濾過滅菌によって滅菌注射液が調製される。一般に、分散体は、様々な滅菌活性成分を、基本的分散媒体および上に列挙されたものからの必要なその他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、活性成分と、あらかじめ滅菌濾過された溶液からの任意の追加的な所望の成分との粉末をもたらす、真空乾燥および凍結乾燥技術である。直接注射のための、より濃縮された、または高度に濃縮された溶液の調製もまた検討され、そこでは、溶媒としてのＤＭＳＯの使用が極めて迅速な浸透をもたらして、高濃度活性剤が小さな腫瘍領域に送達されることが想定される。処方されると、溶液は、投与剤形と適合する様式で、治療的に有効な量で投与される。製剤は、上に記載された注射液の種類などの様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどもまた使用され得る。水溶液中での非経口投与のために、例えば、溶液が適切に緩衝化されて、液体希釈剤が最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされてもよい。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与に特に適する。これに関連して、用いられ得る滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に公知であろう。例えば、１回投与量が１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解されて、１０００ｍｌの皮下注射液に添加されるか、または提案された点滴部位に注入され得る。投与量のいくらかの変動は、治療される対象の病状次第で必然的に起こるであろう。いずれにせよ、投与を担当する者が、対象にとって適切な用量を判定するであろう。
【０１１３】
遺伝子治療
ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ２、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ３、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（例えば、それぞれ、配列番号１のアミノ酸１〜５４８、配列番号１のアミノ酸１〜４４０、配列番号１のアミノ酸１〜３２３）などのｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、またはｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２（例えば、配列番号４のアミノ酸残基１〜８含有または非含有の配列番号４または配列番号３３）などのｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドは、遺伝子治療を通じても送達され得て、そこでは、タンパク質をコードする外因性核酸が目的の組織に送達されて、生体内で発現される。遺伝子治療方法は、例えば、そのそれぞれが参照により本明細書に援用される、Ｖｅｒｍｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：２３９−２４２，１９９７），Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７：Ｓ６７−Ｓ６８，２００９），ａｎｄ  Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．２６：１３５−１４２，２０１１）で考察される。ウイルスベクター系および非ウイルスベクター系の双方が、使用され得る。ベクターは、例えば、プラスミド、人工染色体（例えば、細菌、哺乳類、または酵母人工染色体）、複製起点が提供されるウイルスまたはファージベクター、および任意選択的に、ウイルスポリペプチドをコードする核酸の発現のためのプロモーター、および任意選択的に、プロモーターのレギュレーターであってもよい。例えば、細菌プラスミドの場合は、ベクターは、アンピシリンまたはカナマイシン耐性遺伝子などの１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子を含有してもよく、または真菌ベクターの場合は、耐性遺伝子を含有してもよい。ベクターは、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはウイルスポリペプチドの製造のために生体外で使用されてもよく、または例えば、ベクターによってコードされるウイルスポリペプチドの製造のために、哺乳類宿主細胞などの宿主細胞を形質移入または形質転換するために使用されてもよい。ベクターはまた、例えば、ワクチン接種または遺伝子治療の方法において、生体内で使用されるように適合されてもよい。
【０１１４】
適切なウイルスベクターの例としては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルスをはじめとするヘルペスウイルス、α−ウイルス、カナリアポックスなどのポックスウイルス、およびワクシニアウイルスベースのシステムが挙げられる。これらのウイルスを使用した遺伝子導入技術は、当該分野で公知である。例えば、レトロウイルスベクターを使用して、本発明の核酸が宿主ゲノムに安定に組み込まれてもよい。対照的に、複製欠損アデノウイルスベクターはエピソーム性のままであり、したがって一過性発現を可能にする。例えば、サブユニットワクチンまたはイムノアッセイで使用するために、本発明の核酸によってコードされる一定量のウイルスポリペプチドを製造するために、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルスベクター）、ヒト細胞、酵母または細菌中で発現を駆動できるベクターが用いられてもよい。追加的な例では、複製欠損サルデノウイルスベクターが、生存ベクターとして使用されてもよい。これらのウイルスはＥ１欠失を含有し、Ｅ１遺伝子で形質転換された細胞株上で増殖させ得る。これらのベクターは、コードされたウイルスポリペプチドが発現されてもよいように、本発明の核酸を挿入するように操作され得る。
【０１１５】
プロモーターおよびその他の発現調節シグナルは、それに対して発現が設計される宿主細胞と適合するように選択されてもよい。例えば、哺乳類のプロモーターとしては、カドミウムなどの重金属に応答して誘導され得るメタロチオネインプロモーターと、β−アクチンプロモーターとが挙げられる。ＳＶ４０大型Ｔ抗原プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期（１Ｅ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルスプロモーター、またはＨＰＶプロモーター、特にＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）などのウイルスプロモーターが使用されてもよい。全てのこれらのプロモーター、ならびに追加的なプロモーターは、当技術分野において十分に記載されている。
【０１１６】
本明細書に記載される核酸分子は、非ウイルスベースのシステムを用いて投与されてもよい。例えば、これらの投与システムとしては、微小球カプセル化、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ナノ粒子、およびリポソームベースのシステムが挙げられる。非ウイルスベースのシステムとしてはまた、「裸の」ポリヌクレオチドの送達を容易にする技術も挙げられる（電気穿孔、「遺伝子銃」送達、およびポリヌクレオチド導入のために使用される様々なその他の技術など）。
【０１１７】
導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞中で安定してまたは一過性に維持され得る。安定した維持は、典型的に、導入されたポリヌクレオチドが、宿主細胞と適合する複製起点を含有すること、または染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）または核もしくはミトコンドリア染色体などの宿主細胞のレプリコンに組み込まれることのどちらかを必要とする。
【０１１８】
本発明は、以下の実施例によって説明されるが、これらは単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１１９】
実施例１：デコイ設計および試験手順
異なるタンパク質変異体の構造および配列。
ＦＧＦＲ３、ＨＰＬＮ１、および可溶性ＦＧＦＲ３（ｓＦＧＦＲ３）の異なるドメインの概略図が図１に示される（ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５０８００を参照されたい）。実施例のＦＧＦＲ３欠失変異体は図２に示され、実施例の融合タンパク質は図３に示される。
【０１２０】
配列番号１は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５０８００のｓＦＧＦＲ３のアミノ酸配列を提供し、配列番号２は、同じｓＦＧＦＲ３のアミノ酸配列であるが、完全なＩｇ様Ｃ２型ドメイン３を有するアミノ酸配列を提供し、配列番号３は、ＨＰＬＮ１のアミノ酸配列、配列番号４は、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２のアミノ酸配列を提供し（図３Ｂ参照）、配列番号５は、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２の核酸配列を提供し（図３Ｂ参照）そして配列番号６は、野生型ヒトＦＧＦＲ３を提供する。
【０１２１】
クローニングおよびタンパク質生産システム。
Ｄｅｌプラスミドは、ｓＦＧＦＲ３−ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３プラスミドの部位特異的変異誘発によって得られた。ＬＫ１−ＬＫ２のｃＤＮＡ配列は、元のタンパク質配列をコードしながら、ヒト（Ｈｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓ）について最適化された（ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒプロセス、ＧｅｎｅＡｒｔ）。合成された断片は、ＰｍｌＩおよびＫｐｎＩクローニング部位を使用して、ｓＦＧＦＲ３−ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３（Ｇａｒｃｉａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，５，２０３ｒａ１２４（２０１３））にサブクローニングされた。プラスミドＤＮＡが、形質転換された細菌から精製されて、ＵＶ分光法によって濃度が判定された。最終コンストラクトは、配列決定によって確認された。
【０１２２】
組換えタンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞において、ＣａＣｌ２形質移入試薬を使用した一過性形質移入によって製造された。各形質移入は、２ｍＭのグルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および抗生物質（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が添加されたフェノールレッド無添加１００ｍｌ  ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の８０％コンフルエントなＨＥＫ２９３を用いて、細胞工場（Ｈｉｇｈ  ｆｌａｓｋ  Ｔ６００、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）において実施された。ＣａＣｌ２  （６９０μｌ）およびｐＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３変異体（２４０μｇ）は、７，２ｍｌ  ＨＢＳ中の６．２７ｍｌ  Ｈ２Ｏに再懸濁されて室温で３０分間培養され、次に細胞上で３７℃で５％ＣＯ２で１６時間培養された。次に培地が、フェノールレッドなしの１２０ｍｌ補充ＤＭＥＭで交換された。７２時間後、生産培地は０．２２μｍフィルターを使用して濾過され、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  ６０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で濃縮された。次にアフィニティーカラム（ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、製造会社の使用説明書示に従って、組換えタンパク質が精製された。タンパク質の量は、特異的ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって、製造会社の使用説明書に従って測定された。
【０１２３】
ＦＧＦ結合。
固定量のヒトＦＧＦ２またはヒトＦＧＦ９（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）が、ＰＢＳ  １％ＢＳＡ中の各組換えタンパク質（０〜２５０ｎｇ／ｍｌ）の漸増用量と共に、３７℃で２時間培養された。特定の市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、残りの未結合ＦＧＦが定量化された。対応するＥＬＩＳＡキットの感度に基づいて、ＦＧＦ２およびＦＧＦ９に対して、それぞれ１０００ｐｇ／ｍｌまたは１２００ｐｇ／ｍｌが使用された。
【０１２４】
アグリカン結合。
ＥＬＩＳＡプレートは、１０μｇ／ｍＬのＡｇｇｒｅｃａｎ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃１２２０−ＰＧ−０２５）によってウェル当たりの最終容量５０μｌでコーティングされて、室温で一晩培養された。プレートは、ウェル当たり３００μｌのＰＢＳ  １％ＢＳＡで、室温で１時間にわたりブロックされた。異なる量のタンパク質（０〜１００μｌ）が、室温で１時間培養された。Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ＥＬＩＳＡキット（＃ＤＹＣ７６６Ｅ）からのＦＧＦＲ３に対する特異的検出抗体を使用して、製造業者の推奨に従って、アグリカンに固定された組換えタンパク質が検出された。
【０１２５】
マウスにおける有効性試験および成長速度の評価。
Ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．８５−２３，ｒｅｖｉｓｅｄ  １９８５；ｈｔｔｐ：／／ｇｒａｎｔｓ１．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｒａｎｔｓ／ｏｌａｗ／ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ／ｐｈｓｐｏｌ．ｈｔｍ）およびＥｕｒｏｐｅａｎ  ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌｓ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｐｕｒｐｏｓｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｅｃ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ／ｃｈｅｍｉｃａｌｓ／ｌａｂ＿ａｎｉｍａｌｓ／ｌｅｇｉｓｌａｔｉｏｎ＿ｅｎ．ｈｔｍ）に常に従った。全ての手順は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｅｔｈｉｃ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓによって承認された（承認番号ＮＣＥ−２０１２−５２）。
【０１２６】
実験は、変異体ＦＧＦＲ３の発現がＣｏｌ２ａ１プロモーター／エンハンサーによって駆動される、トランスジェニックＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋動物上で実施された（Ｎａｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５，４９７７−４９８８，１９９８）。マウスは１２時間の明／暗サイクルに曝露され、標準的な実験用食物と水に自由にアクセスできた。遺伝子型は、ＦＧＦＲ３導入遺伝子の３６０ｂｐを増幅するプライマー５’−ＡＧＧＴＧＧＣＣＴＴＴＧＡＣＡＣＣＴＡＣＣＡＧＧ−３’（配列番号３１）および５’−ＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＴＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＴＧＧ−３’（配列番号３２）を使用して、ゲノムＤＮＡのＰＣＲによって確認された（Ｎａｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，前出）。
【０１２７】
各組換えタンパク質のいくつかの用量が、試験された。３日目に、１同腹仔の全ての新生仔マウスに同一投与量が与られた。対照同腹仔には、５０％グリセロール（ビヒクル）を含有する１０μｌのＰＢＳが投与された。その後、皮下注射が、３週間にわたって週２回、代案としては（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ）背中の左側および右側に実施された。マウスは、運動および排尿の変化に特に注意を払って毎日観察された。育種は、理論的には、半分は野性型および半分はヘテロ接合Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの同腹仔が生じるように設定された。表現型浸透の変動に起因する偏りを回避するために、同じブリーダーからの少なくとも２同腹仔（１処置群および１対照群）に対して実験が実施された。オスとメスの間に統計的な差異は観察されず；したがって、それらは全ての分析のために１つのグループと見なされた（Ｇａｒｃｉａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５，２０３ｒａ１２４，２０１３）。
【０１２８】
２２日目に、全ての動物は、ペントバルビタールの致死注射によって殺処分された。性別が判定された。全ての引き続く測定および分析は、実験的バイアスを回避するために、マウスの遺伝子型を知ることなく実施された。研究終了時に遺伝子型同定が実施されて、データと特定遺伝子型との対応関係が明らかにされた。軟骨形成不全症は、重要な表現型変動性を有する疾患であるため、全ての動物を研究に含めて研究能力を向上させた。２２日目以前に死亡した動物は、早期死亡に対する治療の影響の研究に使用され、２２日目まで到達した動物は、全ての分析に使用された。全ての実験およびデータ測定は、常に盲検法で実施された。
【０１２９】
２２日目の殺処分後、体重が測定された。血液（５００μｌ）が心臓穿刺によって採取され、２５μｌが２５μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡと混合された。サンプルは、遠心分離せずに血液計算のために分析された（Ｈｅｍａｖｅｔ  ９５０ＦＳ，Ｍａｓｃｏｔ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ）。屍体の皮膚を注意深く剥ぎ、電子デジタルキャリパー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して骨格測定（体長および尾長）を得た。全体長は、鼻から最後の尾椎の末端まで測定され；尾は最初の尾椎から始まって測定された。臓器を採取して秤量し、標準パラフィン包埋技術を使用したさらなる組織学的分析のために、１０％ホルマリン中に保存した。臓器は、色または質感の変容、結節の存在などの巨視的異常について観察された。
【０１３０】
ＰＫ／ＰＤ解析。
ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３およびＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２のＰＫ／ＰＤパラメーターを判定するために、８週齢のＷＴマウスに、それぞれ５０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇのタンパク質の静脈内または皮下ボーラスが投与された。ヘパリンカテーテル（ｎ＝４）を使用した後眼窩穿刺によって、１５分、１時間、３時間、８時間、２４時間、および４８時間後に採血した。ＦＬＡＧ標識タンパク質濃度は、抗ＦＬＡＧＥＬＩＳＡ（Ｓｉｇｍａ）によって測定された。
【０１３１】
統計解析。
統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０ソフトウェアを用いて実施された。使用される統計的検定を決定するために、必要な仮定が確認された。正規性および等分散を確認するために、ダゴスティーノ・パーソン（Ａｇｏｓｔｉｎｏ  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ）オムニバス正規性検定（α＝０．０５）およびブラウン・フォーサイス検定（ｐ＜０．０５）が、それぞれ実施された。全ての骨格測定データセット（体重、体長、尾長、頭蓋の長さ、幅、長さ／幅）は、正規性および等分散要件を満たしたので、２つの独立したグループの比較のための両側スチューデントのｔ検定が、異なる統計分析において使用された。処置群と対照群の間の死亡率データの比較は、ダン検定と共にクラスカル・ワリス検定（ｐ＜０．０５）を使用して実施された。血液計算の比較は、ダネットの多重比較検定（９５％ＣＩ）と共に一方向ＡＮＯＶＡを使用して実施された。臓器重量相関分析では、データセットが正規分布に従うか否かにかかわらず、それぞれパーソンまたはスピアマン検定が使用され、多重比較検定（α０．０５）が使用された。相関を比較するために、フィッシャーのｒ−ｚ変換が実施された。ヒトＦＧＦおよびマウスＦＧＦに結合するデコイの比較は、直線回帰によって実施された。
【０１３２】
実施例２：欠失変異体の生体外試験
概要：全ての４つのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ２、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ３、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４変異体は、ｓＦＧＦＲ３完全長コンストラクトと同様の親和性で、ヒトＦＧＦ２と結合する。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４は、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３と同一の親和性でＦＧＦ９と結合する。
【０１３３】
全ての４つの変異体は、ヒトＦＧＦ２と結合するそれらの能力について生体外で試験された。ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３分子の作用機序を検証するために使用されたプロトコールと同様に；異なる量のＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌが、一定量のＦＧＦ２と共に培養された。全ての変異体は、最初のＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３タンパク質と同様の親和性で、用量依存様式でヒトＦＧＦ２と結合する（図４Ａ）。線形回帰分析は、５つの勾配間に統計的な差異を示さなかった（Ｐ＝０，５４７８）。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４はまた、用量依存様式でヒトＦＧＦ９にも結合できた（図４Ｂ）。
【０１３４】
実施例３：Ｄｅｌ４欠失変異体の生体外試験
概要：Ｄｅｌ４は遺伝子組換えＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの骨成長を回復させるのに効果的である。
【０１３５】
ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４をその治療有効性について評価するために、２．５ｍｇ／ｋｇのタンパク質が、３日齢の動物に３週間にわたり週２回投与された。対照群には、ビヒクルが投与された。実験は、盲検化されて実施された。合計１０８匹の動物が含まれた。
【０１３６】
３日齢の新生仔マウスへの３週間の注射レジメンに続いて、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４の生物学的効果が評価された。１同腹仔からの全てのオスおよびメス新生仔マウスは、２．５ｍｇ／ｋｇＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（ｎ＝７４）または対照群ではビヒクル（ｎ＝５２）によって、３週間にわたり週２回の処置を受けた。最初の観察は、治療による死亡率の有意な低下であり、処置群の４０％の死亡率と比較して、ビヒクル処置Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの死亡率は６３％であった。
【０１３７】
成長速度は、成長する動物の頭蓋骨長および体重をモニターすることによって、３週間の治療中に評価された。結果は、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４処置による成長速度の改善を示す（図５Ａおよび５Ｂ）。双方のタイプの測定（体重および頭蓋長）は、成長速度を評価して治療応答をモニターするのにもまた、有用であることが立証された。
【０１３８】
２２日目に、生存する全ての動物が殺処分され、それらの成長が、体重、体長、および尾長の測定値として評価された。ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４処置は、全体的な骨格成長に対して、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３処置と同様の範囲の好ましい効果を有した（図６Ａ〜６Ｄ）。Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスは、ＷＴ同腹仔よりも平均して２０％軽かったが、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４で処置された場合には、体重が増加した（図６Ａ）。ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４処置された遺伝子組換えマウスは、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３処置されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスおよびビヒクル処置されたＷＴ対照と有意差がない、体格（体長および尾長）を有し（尾長分析ではＰ＝０．１７４３、体長分析ではＰ＝０，３３７７、スチューデントのｔ検定）、軟骨形成不全症がある遺伝子組換えマウスにおいて骨成長を回復させるのに、ｓＦＧＦＲ３の細胞外ドメインで十分であることが示唆された。
【０１３９】
実施例４：標的化デコイの生体外試験
概要：ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２は、ＦＧＦ２およびアグリカンと効果的に結合する。
【０１４０】
生体内試験開始に先だって、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２は、ＦＧＦ２およびアグリカンと結合するその能力について評価された。このために、異なる量の組換えタンパク質が、一定量のＦＧＦ２と共に培養された。本発明者らの結果は、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２が、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３と同一親和性でヒトＦＧＦ２に結合することを示す（図７Ａ）。
【０１４１】
アグリカン結合を確認するために、異なる量の組換えタンパク質が、固定量のアグリカンと共に培養された。図７Ｂに見られるように、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２は、用量依存様式でアグリカンと結合する。ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３およびＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４は陰性対照として使用され、アグリカンと結合できない（データ未掲載）。これらの結果は、ｓＦＧＦＲ３の細胞外部分およびＨＰＬＮ１タンパク質の部分を含有する融合タンパク質が、ＦＧＦと、軟骨特異的成分であるアグリカンとの双方に結合し得ることを確認する。
【０１４２】
実施例５：標的化デコイの生体内試験
概要：ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２は、Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの骨成長を回復させるのに効果的である。
【０１４３】
最初の完全長タンパク質と融合タンパク質との間の薬物動態パラメーターの比較は、静脈内または皮下経路のいずれかによるタンパク質のボーラスの注射によって実施された。結果は、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２タンパク質が、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３と同一範囲内の血液半減期がある同様のＰＫパラメーターを有したことを示す（表１を参照されたい）。しかし、融合タンパク質は軟骨を標的とし、したがってこの組織に保持されるので、血液を使用して測定された半減期が、循環し続けるＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３と比較してはるかに低いと予測されることを念頭に置かねばならない。実際に、驚くべきことに、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２がＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３よりも安定していることを示す、計算された不安定性指標（ＩＩ）（ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２では安定と分類される３７．４１、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３ではス安定と分類される４４．０４）を考慮し、そして血中で判定された同様の半減期を考慮すると、身体からのＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２の実際の排出時間が、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３よりも有意に長いことが想定されなくてはならず、これは有効投与量および／または投与頻度を低下できるようしてもよいので、非常に有利である。
【０１４４】
ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２の治療的可能性は、３日齢から開始して、０．３ｍｇ／ｋｇのタンパク質を３週間にわたり週２回皮下注射することによって評価された。対照群にはビヒクルが投与され、実験は盲検化された。合計１０２匹の動物が含まれた。
【０１４５】
ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２処置は、対照群の６３％から治療群の３７．５％への遺伝子組換え動物の死亡率の有意な低下をもたらした。図８Ａに見られるように、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２処置によって、成長速度が有意に改善された。２２日目の殺処分に続いて、成長が、体重、体長、および尾長の測定値として評価された。０．３ｍｇ／ｋｇの用量で、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２処置は、遺伝子組換えＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスとそれらのＷＴ同腹仔の全体的な骨格成長に、好ましい効果を有した（図８Ｂ）。
【０１４６】
殺処分の時点で、肝臓、肺、心臓、脾臓、および腎臓において、可能な副作用が評価された。ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２またはビヒクルの慢性皮下注射を投与された１０２匹の動物のいずれも、巨視的異常を呈さなかった。全ての群において、臓器重量の変化は全身重量の変化と相関しており（表２）、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２処置が、臓器増殖に直接影響を与えないことが示唆される。この研究では、全ての動物で血球数は正常であった（表３）。
【０１４７】
【表１】
2018508185.tif 000002
【０１４８】
【表２】
2018508185.tif 000003
【０１４９】
【表３】
2018508185.tif 000004
【０１５０】
結論。
この研究は、ｓＦＧＦＲ３およびＨＰＬＮ１の部分を含有する融合タンパク質が、軟骨形成不全症のマウスモデルにおいて、軟骨内骨成長を回復させるのに使用され得ることを示す。
【０１５１】
本発明者らは、最初に、ｓＦＧＦＲ３の細胞外部分と細胞内ドメインの非常に短い部分とを含むデコイ変異体が、効果的なＦＧＦ結合を引き起こしてＧ３８０Ｒ変異を保有するマウスにおいて骨成長を回復させる生体内効力を生じさせるのに、十分であることを検証した。
【０１５２】
融合タンパク質は、軟骨を特異的に標的とするように設計され、したがって標的組織の曝露を増大させ、可能な有効用量を減少できるようにする。生体内分布研究は、身体を通した同様の拡散がある軟骨捕捉を示唆する（ＰＫ／ＰＤ解析）。ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２処置は、遺伝子組換えマウスモデルにおける骨成長を回復させるのに効果的である。ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３と同様に、明らかな毒性はＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２処置と関連がなく、このタンパク質が軟骨形成不全症と関連障害の治療薬として使用され得ることが示唆された。
【０１５３】
本発明者らはまた、成長速度を評価するための体重および頭蓋骨長および／または幅のモニタリングの使用を検証した。どちらのアプローチも同様の結果を与える一方で、新生仔の頭蓋測定が適切に実施されなかった場合、望まれない副作用が生ることもあるので、速度の指標として体重を使用する方が技術的に簡単である。
【０１５４】
結論として、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２は、軟骨形成不全症および関連障害のための実行可能な治療選択肢であることが実証された。
【０１５５】
実施例６：ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドおよび融合ポリペプチドのデコイ設計および精製
さらに実験を実施して、Ｃ末端位置にＦＬＡＧタグがある、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４）およびｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２）が作製された。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３ＦＴ細胞（ＴｈｅｒｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中のＣａＣｌ２形質移入試薬を使用した一過性形質移入によって、組換えタンパク質が製造された。使用されたプラスミドは、全ての変異体（ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２）で、ｐＢＡｐｏ−ＥＦ１α−ｓＦＧＦＲ３−ＦＬＡＧプラスミドであった。エルレンマイアーフラスコ（２０００ｍｌ）に、２９３ＦＴ細胞が１．８×１０６細胞／ｍｌの濃度で接種された。細胞は、形質移入に先だって室温で５分間遠心分離され、次に最終容積３００ｍｌの培地（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁された。ｓＦＧＦＲ３−ＦＬＡＧ（６００μｇプラスミドＤＮＡ）および１．７３ｍの２Ｍ  ＣａＣｌ２を含む溶液が、１８ｍｌの２×Ｈｅｐｅｓ緩衝食塩水（ＨＢＳ）に再懸濁され、次に室温で３０分間培養された。次に混合物は、エルレンマイアーフラスコに添加され、６００ｍｌの新鮮培地が４時間後に添加された。７２時間後、１）５ミクロンの孔径定格および０．０９５ｍ２のフィルター表面積を有する、プリーツ型ガラス微小繊維デプスフィルターを特徴とする、ＵＬＴＡ  Ｐｒｉｍｅ  ＧＦカプセル、および２）０．６／０．２ミクロンの孔径定格および０．１ｍ２の濾過表面積を有するポリエーテルスルホン前置フィルター付き、プリーツ型ポリエーテルスルホン滅菌等級メンブレン層を特徴とするＵＬＴＡ  Ｐｕｒｅ  ＨＣカプセル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｅｒｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の２つの異なるカプセルの組み合わせがある、Ａｋｔａ（商標）Ｆｌｕｘ  ６十字流濾過システムを使用して上清が精製された。
【０１５６】
次に、ＣａＣｌ２形質移入（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用したＧＰ２−２９３パッケージング細胞株の安定した形質移入によって、安定した細胞株が作製された。Ｄｅｌベクターが、２９３ＦＴ細胞で得られた一過性形質移入結果に基づいて設計され、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２を産生する、安定した細胞株が作製された。特に、プラスミドは、以前に設計されたＮ末端ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３変異体と同一のシグナルペプチド（ＭＧＡＰＡＣＡＬＡＬＣＶＡＶＡＩＶＡＧＡＧＡＳＳ）、Ｃ末端位置のＦＬＡＧタグ、ＣＭＶプロモーターの代わりのＥＦ１αプロモーター、およびｐＢＡｂｅ骨格を含んだ。ｐＶＳＶｇおよびｐＢＡＢＥ−ＥＦ１αＰｕｒｏ  ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１  Ｃｔｅｒ  ＦＬＡＧ、ｐＢＡＢＥ−ＥＦ１α  Ｐｕｒｏ  ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２  Ｃｔｅｒ  ＦＬＡＧ、またはｐＢＡＢＥ−ＥＦ１α  Ｐｕｒｏ  ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４  Ｃｔｅｒ  ＦＬＡＧの同時形質移入は、製造会社の使用説明書に従って実施された。
【０１５７】
次に、組換えｓＦＧＦＲ３ポリペプチドおよび融合ポリペプチドが、十字流濾過システムを使用して精製された。この技術の利点は、凝集なしの混入物の除去であり、精製された組換えｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、ＩＥＸクロマトグラフィーのために最適化された条件下で製造される。十字流濾過は、１０倍濃度で、限外濾過中空繊維カートリッジ（繊維：ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＵＦＰ−７５０Ｃ）を使用して実施され、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１についてはＴｒｉｓ  ２０ｍＭ  ｐＨ７中、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２についてはＴｒｉｓ  ２０ｍＭｐ  Ｈ８．５中の３回の容積交換がそれに続いた。次に、Ｈｉ  Ｐｒｅｐ  Ｑ  ＦＦ  ２０ｍｌカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１についてはｐＨ７で、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２についてはｐＨ８．５で、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）が実施された。吸引および溶出は、５ｍｌ／分の速度で実施された。８ｍｌの体積分画がカラムに添加され、次に非結合ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドがＴｒｉｓ２０ｍＭを含む緩衝液で洗浄され、Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、１Ｍ  ＮａＣｌによる洗浄がそれに続いた。最後に、全ての組換えｓＦＧＦＲ３ポリペプチドおよび融合ポリペプチドについて、１ｍｌ／分の流速の１３ｍｌの上清および２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４の溶出緩衝液を用いて、ＨｉＬｏａｄＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、サイズ排除クロマトグラフィーを実施した。
【０１５８】
実施例７：ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドおよび融合ポリペプチドにおけるシグナル配列の役割
ＰＶＤＦ膜スタックと共に、ＴＢＯＬＴ（商標）４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｐｌｕｓ  Ｇｅｌｓ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＩＢＬＯＴ（登録商標）２Ｇｅｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２のウエスタンブロットが実施された。試料調製および移動は、製造会社の使用説明書を使用して実施された。移動手順は、ｉＢｌｏｔ（登録商標）２  Ｇｅｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＤｅｖｉｃｅのＰ０プログラム（すなわち、２０Ｖで１分間、２３Ｖで４分間、２５Ｖで２分間）であった。３０分間のブロッキング後、抗ＦＬＡＧモノクローナルＭ２抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）とのインキュベーションが１時間実施された。次に標準ＥＣＬ基質（Ｌｉｃｏｒ）を用いた分析のために、Ｃ−ＤｉＧｉｔ化学発光ウェスタンブロットスキャナが使用された。
【０１５９】
ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２のＦＬＡＧタグがＮ末端位置にあり、シグナルペプチド配列がそれに続く場合、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドおよび融合ポリペプチドは、抗ＦＬＡＧモノクローナルＭ２抗体を使用したウェスタンブロットによって検出不能であった（図９；レーンＢ１、Ｂ１４、およびＢ２７）。対照的に、Ｃ末端位置にＦＬＡＧタグがある、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２は、抗ＦＬＡＧモノクローナルＭ２抗体を使用したウエスタンブロットによって検出可能であった（図９；レーンＢ８、Ｂ２１、およびＢ３４を参照されたい）。これらの結果は、ＦＬＡＧタグがＣ末端位置に存在するが、Ｎ末端位置には存在しない場合、シグナル配列（ＭＧＡＰＡＣＡＬＡＬＣＶＡＶＡＩＶＡＧＡＳＳ）が、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２から切断されることを実証し、それが分泌を妨害するようである。
【０１６０】
実施例８：生体内分布
ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１またはｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２による治療は、Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスにおいて、その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．（前出）に記載されるように実施された。マウスは、出生後５日目および２２日目に殺処分された。マウスの成長板におけるｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２の生体内分布、および全ての骨、成長板厚さ、および肥大性軟骨細胞領域に対するｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２の影響を３週間にわたって判定した。ＦＬＡＧタグ化ポリペプチドの存在が、成長板において判定された。これらの結果は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２が成長板内でより迅速に（例えば、５日目に）捕捉されることを実証し、これはＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋Ｆｇｆｒ３マウスのアグリカン欠損に起因してもよい（図１０Ａ）。さらに、２２日目にｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１のより大きな蓄積があった（図１０Ｂ）。また、Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋において、２２日目にｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１のより大きな蓄積があった（図１０Ｂ）。結果は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２が、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１と比較して、５日目に野生型マウスの成長板内でより迅速にトラップされること、そしてｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１と比較して、２２日目に野生型マウスにおいてｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２のより大きな蓄積があることもさらに示された。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２による処置の５日後に、頭蓋測定およびＸ線検査もまた、野生型マウスおよびＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスで実施された（表４；図１１ＡおよびＢ）。頭蓋測定およびＸ線撮影はまた、無処置の野生型マウスおよびＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスでも実施された。（表５および６；図１１Ｃ〜１１Ｈ）。
【０１６１】
【表４】
2018508185.tif 000005
【０１６２】
【表５】
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【０１６３】
【表６】
2018508185.tif 000007
【０１６４】
実施例９：効力アッセイ
効力アッセイを実施して、ＡＴＤＣ５軟骨細胞における、Ｅｒｋ／Ｐ−Ｅｒｋ細胞内シグナル伝達に対するｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１（配列番号１）の効果が判定された。ＡＴＤＣ５細胞は、９６ウェルプレート内に７．５×１０３の密度で播種され、ＤＭＥＭ−Ｆ１２／０．５％ＢＳＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で２４時間培養された。次に細胞は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１（０または２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、ｈＦＧＦ２（１００ｐｇ／ｍｌ）を２４時間攻撃投与された。細胞内シグナル伝達は  ＩＣＷキットＰｈｏｓｐｈｏＰｌｕｓ（登録商標）ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）Ｉｎ−Ｃｅｌｌ  Ｄｕｅｔ（ＩＣＷ  Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）−（細胞シグナル伝達）を用いて評価された。２４時間の培養後、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１（配列番号１）を用いて培養されたＡＴＤＣ５細胞においてＥｒｋリン酸化の低下があり、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１（配列番号１）またはＦＧＦのみを用いて培養されたＡＴＤＣ５細胞と比較して、ＦＧＦが低下した（図１２）。これらの結果は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１（配列番号１）が、ＦＧＦの機能性デコイであることを実証する。したがって、その他のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド変異体、特に、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ２、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ３、またはｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４などの配列番号６のアミノ酸３１１〜４２２の欠失を含むものはＦＧＦの機能性デコイと同様の性質を示すことが期待される。
【０１６５】
実施例１０：細胞増殖
精製されたｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドの異なる画分の細胞増殖に対する効果が、ＡＴＤＣ５軟骨細胞において判定された。サイズ排除クロマトグラフィーと、それに続くウエスタンブロット分析が上述したように実施されて、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１（図１３Ａ〜１３Ｃ）およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２（図１４Ａ〜１４Ｃ）の画分が精製および同定された。ＡＴＤＣ５細胞は、９６ウェルプレート内に５×１０３の密度で播種され、ＤＭＥＭ−Ｆ１２／０．５％ＢＳＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で４８時間培養された。次に細胞は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１またはｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２のどちらかの画分（０または２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、ＦＧＦ２（１００ｐｇ／ｍｌ）で７２時間攻撃投与された。増殖は、蛍光を測定するＣｙ定量増殖アッセイ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で評価された。これらの結果は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１（画分２〜５および６；図１２Ｃ）およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２（画分９〜１２）の異なる画分が、ＡＴＤＣ５軟骨細胞において細胞増殖を有意に増大させたことを実証する。
【０１６６】
実施例１１：行動研究
行動研究が実施されて、Ｃ５７ＢＬ６／ＪマウスにおけるｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２の長期効果が特性決定された。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２は、出生後３日目に始まって、出生後最初の８週間にわたり週２回皮下投与された。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２、または２．５ｍｇ／ｋｇのビヒクルで処置された、３つの異なる群（１群当たり１６匹のオスマウス）があった。行動評価は、出生後第１０週と第１４週の間に行われた。行動、感覚能力、運動能力、心理学的特徴、および認知機能に対する、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２の効果が調べられた。
【０１６７】
これらの研究は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２による処置の長期毒性の兆候を示さなかった。アーウィン試験、活動度測定試験、高架式十字迷路試験、強制水泳試験については、いずれの群でも変化は観察されなかった。臭気識別については、私はｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２で軽微な低下を観察した。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２の投与は、加速ロータロッド試験中の運動協調性の軽微な低下、およびモリス水迷路試験中の運動協調および空間記憶の軽微な改善をもたらし、それらは統計学的に差がなかった。
【０１６８】
実施例１２：ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２は、血液脳関門を通過しない
薬物動態研究を実施して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて血液脳関門を通過するＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２の取り込みが判定された。静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラス注射後、ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２の脳組織摂取が、４つの時点（１時間（ｈ）、３時間（ｈ）、６時間（ｈ）、および２４時間（ｈ））で測定された。ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２は、放射性標識トレーサー（１２５Ｉ−ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１または１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２）として、２．５ｍｇ／ｋｇの未標識ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２と共に注射された。１２５Ｉ−ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１または１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２の注射用量は動物当たり約１０μＣｉであり、これは０．１ｍｇ／ｋｇ未満に相当する。マウスを１時間、３時間、６時間または２４時間目に安楽死させた後、臓器および血漿中の１２５Ｉ−ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１または１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２の濃度が、液体シンチレーション計数によって測定された。
【０１６９】
トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈降性物質（例えば、無処理トレーサー）の画分を測定することによって、血漿および脳サンプル中の代謝について、１２５Ｉ−ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１または１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２濃度が補正された。ＴＣＡ補正の妥当性は、サイズ排除高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）カラムにサンプルを注入することによっても確認された。１２５Ｉ−ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１または１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２の臓器濃度は、動物を殺処分にする直前に放射性標識アルブミン（３Ｈ−ＲＳＡ）を注射することによって、血管内含有量（Ｖ０）について補正された。ＲＳＡの分布の見かけの臓器体積は、Ｖ０に相当する。アルブミンの用量は、微々たるものであった（生理学的濃度の１％程度）。脳以外の全ての臓器について、血管含有量差し引いて血漿中のＴＣＡ沈降性画分を考慮に入れることによって、濃度が計算された。しかし、ＴＣＡ沈殿が実施されなかったので、脳以外のこれらの臓器への分解物質の取り込みについては補正されなかった。
【０１７０】
脳濃度は、以下の式によって計算された：Ｃｂｒａｉｎ（ｃｏｒｒ．）＝［Ｖｄ（ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１）−Ｖ０］×Ｃｐｌａｓｍａ（ｔｅｒｍｉｎａｌ）、式中、Ｖｄ（ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１）は、脳におけるＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１の分布容積（Ｃｂｒａｉｎ／Ｃｐｌａｓｍａとして計算された）であり、Ｖ０は、脳に分布するアルブミンの容積であり、Ｃｐｌａｓｍａ（ｔｅｒｍｉｎａｌ）は、最終試料採取時間におけるＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１の血漿濃度である。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２の計算が完全に同じように実施されて、全ての濃度は、それぞれグラムまたはｍｌ当たりの注射用量（％ＩＤ／ｇまたはＩＤ／ｍＬ）のパーセントとして表され、ｉ．ｖ．ボーラスの用量は１００％に等しい。所望ならば、これらの値に注射用量を乗ずることによって、［ｍｇ／ｇ］または［ｍｇ／ｍＬ］に変換してもよい（ｇ単位の体重／１０００ｇ）×２．５ｍｇ。全ての体重は、２５ｇ〜３０ｇの範囲であった。
【０１７１】
測定された時点（１時間、３時間、６時間、または２４時間）のいずれかで、補正された脳濃度（血管含有量および分解（ＴＣＡ沈降性）に関する補正後）によって示されるように、１２５Ｉ−ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１の検出可能な脳取り込みはなかった（図１５Ａ）。さらに、対応ｔ検定によって判定されるように、測定時点（１時間、３時間、６時間、または２４時間）のいずれでも、ＲＳＡ（＝Ｖ０）のＶｄおよび１２５Ｉ−ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１のＶｄは、有意に異ならなかった（図１５Ｂ）。血漿および脳組織における１２５Ｉ−ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１の安定性を比較するために、１２５Ｉ−ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１血漿濃度が判定された（図１５Ｃ）。全ての測定時点で、１２５Ｉ−ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１のＴＣＡＴＣＡ沈降性画分は、血漿よりも脳組織においてより低く（２４時間の脳サンプルの濃度は検出不能）（図１５Ｄ）、これは低分子量分解生成物のいくらかの取り込みを示差しても良い。ＦＰＬＣ溶出プロファイルは、ＴＣＡデータと一致した（図１５Ｅ）。
【０１７２】
１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２の脳組織取り込みについても、同様の結果が得られた。測定された時点（４時間、３時間、６時間、または２４時間）のいずれかで、補正された脳濃度（血管含有量および分解（ＴＣＡ沈降性）に関する補正後）によって示されるように、１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２の検出可能な脳取り込みはなかった（図１６Ａ）。さらに、対応ｔ検定によって判定されるように、測定時点（４時間、３時間、６時間、または２４時間）のいずれでも、ＲＳＡ（＝Ｖ０）のＶｄおよび１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２のＶｄは、有意に異ならなかった（図１６Ｂ）。全ての測定時点で、１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２のＴＣＡＴＣＡ沈降性画分は、血漿よりも脳組織においてより低く（図１６Ｃ）、これは低分子量分解生成物のいくらかの取り込みを示差しても良い。ＦＰＬＣ溶出プロファイルは、ＴＣＡデータと一致した（図１６Ｄ）。比較してみると、１２５Ｉ−ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１および１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２の血漿濃度は、全ての測定時点で同様であった（図１６Ｅ）。
【０１７３】
Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎを用いた１２５Ｉ−ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１および１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２血漿濃度のノンコンパートメント解析（ＮＣＡ）では、１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２の曲線下面積（ＡＵＣ）は、１２５Ｉ−ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１のＡＵＣよりも０．７１倍低かった（図１７Ａおよび１７Ｂ）。したがって、１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２のクリアランスは、１２５Ｉ−ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１のクリアランスより１．４倍高かった。推定された終末半減期は同様であった（すなわち、１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２については６００分、１２５Ｉ−ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１については５６６分）。初期濃度（Ｃ０）は、１２５Ｉ−ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１または１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２についてほぼ同一であった。１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２の分布容積（ＶｚまたはＶｓｓ）は、１２５Ｉ−ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１のＶｚまたはＶｓｓよりも高く、初期（例えば、分布相）に見られる腎臓および肝臓における１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２のより高い臓器取り込みに一致する。
【０１７４】
結論として、ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１またはｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２のいずれかのマウスの脳組織への測定可能な取り込みは、静脈内ボーラスとして注射された２．５ｍｇ／ｋｇの用量で、本研究で分析された時点のいずれにおいても認められない。これらの結果は、１２５Ｉ−ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１および１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２（トレーサー標識タンパク質）が、脳組織および血漿において未標識のタンパク質に対して同様に挙動するという仮説に基づく。
【図１Ａ−１Ｃ】
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【図２Ａ−２Ｄ】
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【図３Ａ−３Ｄ】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図６Ａ−６Ｄ】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図８Ａ−８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ−１０Ｂ】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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