(57)【要約】【課題】治療免疫細胞の有効性を改良するための方法に関する。【解決手段】本発明は、除去または中和のためのタンパク質または分子を標的化する標的結合分子と組み合わせて、癌細胞リガンドへの結合時に免疫応答を活性化する受容体（例えば、キメラ抗原受容体−ＣＡＲ）を使用して、改良された抗癌免疫細胞を作製する方法に関する。本発明はまた、改良された治療有効性を有する操作された免疫細胞、及びそれらの使用にも関する。【選択図】図１
2018507685.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫活性化受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、局在化ドメインに連結した標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、を含む、操作された免疫細胞。
【請求項２】
前記操作された免疫細胞が、操作されたＴ細胞、操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、操作されたＮＫ／Ｔ細胞、操作された単球、操作されたマクロファージ、または操作された樹状細胞である、請求項１に記載の操作された免疫細胞。
【請求項３】
前記受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１に記載の操作された免疫細胞。
【請求項４】
前記ＣＡＲが、抗ＣＤ１９−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲである、請求項１に記載の操作された免疫細胞。
【請求項５】
前記標的結合分子が、抗体である、請求項１に記載の操作された免疫細胞。
【請求項６】
前記抗体が、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項５に記載の操作された免疫細胞。
【請求項７】
前記抗体が、ＣＤ３／Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体中の因子、サイトカイン、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子、または免疫応答を下方制御する受容体に結合する、請求項５に記載の操作された免疫細胞。
【請求項８】
ＣＤ３／ＴＣＲ複合体中の前記因子が、ＣＤ３ε、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、またはＣＤ３ζである、請求項７に記載の操作された免疫細胞。
【請求項９】
前記ＨＬＡクラスＩ分子が、β２−ミクログロブリン、α１−ミクログロブリン、α２−ミクログロブリン、またはα３−ミクログロブリンである、請求項７に記載の操作された免疫細胞。
【請求項１０】
免疫応答を下方制御する前記受容体が、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有３（Ｔｉｍ３）、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、またはタンパク質チロシンホスファターゼから選択される、請求項７に記載の操作された免疫細胞。
【請求項１１】
前記サイトカインが、インターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２７、ＩＬ−３５、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、またはトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βである、請求項７に記載の操作された免疫細胞。
【請求項１２】
前記標的結合分子が、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ５２、またはＣＤ１２７に結合する、請求項１に記載の操作された免疫細胞。
【請求項１３】
前記局在化ドメインが、小胞体（ＥＲ）またはゴルジ保持配列；プロテオソーム局在化配列；ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、またはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメイン配列を含む、請求項７に記載の操作された免疫細胞。
【請求項１４】
前記ＥＲまたはゴルジ保持配列が、アミノ酸配列ＫＤＥＬ（配列番号４）、ＫＫＸＸ（配列番号９）、ＫＸＤ／Ｅ（配列番号１０）、またはＹＱＲＬ（配列番号１１）を含み、式中、Ｘが、任意のアミノ酸である、請求項１３に記載の操作された免疫細胞。
【請求項１５】
前記プロテアソーム局在化配列が、ＰＥＳＴモチーフを含む、請求項１３に記載の操作された免疫細胞。
【請求項１６】
前記免疫活性化受容体が、天然に存在しない分子である、請求項１に記載の操作された免疫細胞。
【請求項１７】
局在化ドメインに連結した前記標的結合分子が、天然に存在しない分子である、請求項１に記載の操作された免疫細胞。
【請求項１８】
癌を治療するための、請求項１に記載の操作された免疫細胞の使用であって、治療量の前記操作された免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、使用。
【請求項１９】
前記操作された免疫細胞が、静脈内注入、動脈内注入、腫瘍への直接注射及び／または手術後の腫瘍母地の灌流、人工スキャフォールドにおける腫瘍部位での移植、髄腔内投与、ならびに眼内投与によって前記対象に投与される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記癌が、固形腫瘍または血液学的悪性腫瘍である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
請求項１に記載の操作された免疫細胞を生成するための方法であって、
免疫細胞に、免疫活性化受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、局在化ドメインに連結した標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを導入し、それによって操作された免疫細胞を生成することを含む、方法。
【請求項２２】
前記操作された免疫細胞が、生体外で生成される、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[背景技術]
免疫細胞は、強力かつ特異的な「生きた薬剤」であり得る。免疫細胞は、正常な組織を温存しながら腫瘍細胞を標的化する潜在性を有し、いくつかの臨床的観察は、それらが主要な抗癌活性を有し得ることを示している。したがって、同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受ける患者において、Ｔ細胞媒介移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）（Ｗｅｉｄｅｎ，ＰＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９７９；３００（１９）：１０６８−１０７３；Ａｐｐｅｌｂａｕｍ，ＦＲ  Ｎａｔｕｒｅ，２００１；４１１（６８３５）：３８５−３８９；Ｐｏｒｔｅｒ，ＤＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９４；３３０（２）：１００−１０６；Ｋｏｌｂ，ＨＪ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．１９９５；８６（５）：２０４１−２０５０；Ｓｌａｖｉｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９６；８７（６）：２１９５−２２０４）、及びドナーナチュラルキラー（ＮＫ）細胞アロ反応性（Ｒｕｇｇｅｒｉ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００２；２９５（５５６２）：２０９７−２１００；Ｇｉｅｂｅｌ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０２（３）：８１４−８１９；Ｃｏｏｌｅｙ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１０；１１６（１４）：２４１１−２４１９）は、白血病再発と逆関係にある。ＨＳＣＴの文脈に加えて、抑制性シグナルからＴ細胞を放出する（Ｓｈａｒｍａ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２０１１；１１（１１）：８０５−８１２．；Ｐａｒｄｏｌｌ  ＤＭ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１２；１２（４）：２５２−２６４）、またはそれらを腫瘍細胞に架橋する（Ｔｏｐｐ  ＭＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０１１；２９（１８）：２４９３−２４９８）抗体の投与は、固形腫瘍または白血病のいずれかを有する患者において主要な臨床的応答を生成した。最後に、遺伝子改変自家Ｔリンパ球の注入は、治療抵抗性白血病及びリンパ腫を有する患者において完全かつ持続的な寛解を誘導した（Ｍａｕｄｅ  ＳＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１４；３７１（１６）：１５０７−１５１７）。
【０００２】
それにも関わらず、その適用性を広げ、その有効性を改良することによって、免疫細胞治療法を改善することに対する著しい必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、例えば、癌治療のための改良された治療有効性を有する、操作された免疫細胞に関する。特定の実施形態において、本発明は、免疫活性化受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、局在化ドメインに連結した標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、操作された免疫細胞を提供する。
【０００４】
他の実施形態において、本発明は、癌を治療するための、免疫活性化受容体をコードする遺伝子と、局在化ドメインに連結した標的結合分子をコードする遺伝子とを含む、操作された免疫細胞の使用であって、治療量の操作された免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、使用を提供する。
【０００５】
様々な実施形態において、本発明はまた、操作された免疫細胞を生成するための方法であって、免疫細胞に、免疫活性化受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、局在化ドメインに連結した標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを導入し、それによって操作された免疫細胞を生成することを含む、方法も提供する。
【０００６】
いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、宿主における移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の低減、宿主による拒絶の低減もしくは除去、宿主における生存の延長、宿主における腫瘍による抑制の低減、宿主における自己死滅の低減、宿主における炎症カスケードの低減、または宿主における天然／人工受容体媒介（例えば、ＣＡＲ媒介）シグナル形質導入の持続のうちの１つ以上の結果として、改良された治療有効性を持つ。
【０００７】
前述のことは、添付の図面（異なる見方を通して、同様の参照文字が同一の部分を指す）に説明されるように、本発明の例示的な実施形態についての以下のより具体的な説明から明らかとなるだろう。図面は必ずしも縮尺には従っておらず、代わりに、本発明の実施形態を説明することに重点が置かれる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明において用いられる計画の概略図である。図１Ａは、癌細胞のＣＡＲ媒介殺傷の全体的機構である。図１Ｂは、異なる形式の区画配向ｓｃＦｖ（局在化ドメインに連結した標的結合分子の一例）によるＣＡＲの組み合わせ発現、及び可能性のある標的の例を示す。ＣＡＲは、免疫細胞能力を改良することができる他の受容体によって置換されてもよい。
【図２】ｓｃＦｖを特定の細胞区画に局在化するドメインとともに、ｓｃＦｖを含有する構築物の概略図である。略称：β２Ｍ、β−２ミクログロブリン；ＳＰ、シグナルペプチド；ＶＬ、可変軽鎖；ＶＨ、可変重鎖；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＨＡ、ヒトインフルエンザヘマグルチニン。図面に列挙されない追加の構築物としては、膜結合型（ｍｂ）ｍｙｃ  ＥＥＫＫＭＰ、ｍｂ  ｍｙｃ  ＫＫＴＮ、ｍｂ  ｍｙｃ  ＹＱＲＬ、ｍｂ  ＴＧＮ３８細胞質ドメイン、ｍｂ  ｍｙｃ  ＲＮＩＫＣＤ、リンカー（２０−アミノ酸）ｍｂ  ＥＥＫＫＭＰ、及びＣＤ８膜貫通ドメイン中にシグナリングペプチドを有さず、かつ様々な数のアミノ酸を有する構築物のバリアントが挙げられる。１０−アミノ酸リンカーのヌクレオチド配列は、ＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＡ（配列番号６１）であり、アミノ酸配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６２）である。２０−アミノ酸リンカーのヌクレオチド配列は、ＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＡＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＴ（配列番号６３）であり、アミノ酸配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）である。様々な局在化ドメインが、「局在化ドメイン」という表題の下に示され、示されるように、いくつかの例におけるリンカーを描写する。構築物「ｍｙｃ  ＫＤＥＬ」及び「ＰＥＳＴ  ＫＤＥＬ」は、単一構築物における２つ以上の局在化ドメインの使用を示す。
【図３Ａ−３Ｂ】図３Ａ〜図３Ｃは、ＣＤ３εのｓｃＦｖ標的化による、Ｔ細胞中のＣＤ３／ＴＣＲの下方制御を示す。図３Ａは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のみを含有するレトロウイルスベクター（「偽」）、またはＧＦＰプラス示される異なる構築物を含有するベクターのいずれかで形質導入した、ジャーカット細胞中の表面ＣＤ３εの発現を示す。形質導入の１週間後、アロフィコシアニン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に共役した抗ＣＤ３抗体を使用して、細胞膜上のＣＤ３εの発現を偽形質導入した細胞の発現と比較した。全ての比較は、ＧＦＰ陽性細胞のゲーティング後に実行した。図３Ｂは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）で増殖させた末梢血Ｔリンパ球で実行した、類似する実験を描写する。染色は、形質導入の１週間後に実行した。
【図３Ｃ】図３Ｃは、示される構築物での形質導入後の、ジャーカット細胞中の膜ＣＤ３εの下方制御を説明するフローサイトメトリープロットを示す。各プロットの右上の象限上の破線付きの四角形は、ＧＦＰ＋ＣＤ３＋細胞を囲む。
【図４】抗ＣＤ３ε  ｓｃＦｖ−ＫＤＥＬもしくは−ＰＥＳＴ、または−ｍｂ  ＥＥＫＫＭＰでの形質導入時の、ジャーカットＴ細胞中の細胞膜上でのＣＤ３ε及びＴＣＲαβの下方制御を示す。膜マーカ発現は、アロフィコシアニン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に共役した抗ＣＤ３抗体、またはフィコエリトリン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に共役した抗ＴＣＲαβを使用した形質導入の１週間後に測定した。「対照」と標識される線は、偽形質導入した細胞の標識を表す。垂直破線は、アイソタイプ適合非反応性抗体で得られた染色の上限を表す。
【図５】抗ｓｃＦｖ及びＣＡＲが同時に発現され得ることを示す。フローサイトメトリードットプロットは、抗ＣＤ３アロフィコシアニン抗体、及びヤギ抗マウスＦａｂ２ビオチンプラス（ＣＡＲを検出するため）フィコエリトリンに共役したストレプトアビジンでの、ジャーカット細胞（上列）または末梢血リンパ球（下列）の染色を表す。細胞を、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ−ｍｙｃ  ＫＤＥＬ構築物、抗ＣＤ１９−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ構築物、または両方で形質導入した。ＧＦＰ陽性細胞のゲーティング後、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ−ｍｙｃ  ＫＤＥＬで形質導入したものはＣＤ３を下方制御し（左列、左下の象限）、抗ＣＤ１９−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ構築物で形質導入したものはＣＡＲを発現した（中列、右上の象限）。両方の構築物で形質導入した細胞のうちのかなりの割合が、ＣＤ３陰性かつＣＡＲ陽性であった（右列、左上の象限）。
【図６】抗ＣＤ１９ＣＡＲが、ＣＤ３／ＴＣＲ下方制御に関わらず、Ｔ細胞活性化及び脱顆粒を引き起こすことを説明する。ジャーカット細胞を、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ−ｍｙｃ  ＫＤＥＬ構築物、抗ＣＤ１９−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ構築物、または両方で形質導入した。Ｔ細胞活性化及び脱顆粒を、偽形質導入した細胞のＴ細胞活性化及び脱顆粒と比較した。細胞を、単独で、または１：１の比率のＣＤ１９＋白血病細胞株ＯＰ−１とともに共培養した。１８時間後、ＣＤ６９及びＣＤ２５の発現を、特定の抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより）を使用するフローサイトメトリーによって試験し、６時間後、ＣＤ１０７ａの発現を試験した（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの抗体）。ＯＰ−１細胞の存在下で、ＣＡＲ発現細胞中のＣＤ６９及びＣＤ２５発現は、細胞がまた抗ＣＤ３ｓｃＦｖ−ＫＤＥＬでも形質導入されるかどうかに関わらず生じ、活性化は、偽もしくは抗ＣＤ３ｓｃＦｖ−ｍｙｃ  ＫＤＥＬ形質導入した細胞中、またはＯＰ−１細胞の不在下では生じなかった。ＣＡＲ刺激はＣＤ１０７発現を改良し、これはＣＤ３／ＴＣＲ下方制御によって影響されなかった。
【図７】Ｔ細胞中で発現される抗ＣＤ１９ＣＡＲが、ＣＤ３／ＴＣＲ下方制御に関わらず、Ｔ細胞増殖を引き起こすことを示す。末梢血Ｔリンパ球を、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ−ｍｙｃ  ＫＤＥＬ構築物及び抗ＣＤ１９−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ構築物の両方で形質導入した。形質導入したＴリンパ球を、Ｓｔｒｅｃｋ（Ｏｍａｈａ，ＮＥ）で処理したＯＰ−１細胞とともに共培養して、示される時間、それらの増殖を抑制した。抗ＣＤ１９ＣＡＲを発現するＣＤ３陽性及びＣＤ３陰性Ｔリンパ球の増殖を、偽形質導入したＴ細胞の増殖と比較した。各記号は、２つの平行培養物の平均細胞数を示す。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ発現に関わらず、同様に良好に増殖した。
【図８】ＧＦＰのみを含有するレトロウイルスベクター（「偽」）、またはＧＦＰプラス抗ＣＤ７ｓｃＦｖ−ｍｙｃ  ＫＤＥＬ構築物を含有するベクターのいずれかで形質導入した、末梢血Ｔリンパ球の膜上のＣＤ７の発現を示す。形質導入の１週間後、フィコエリトリン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に共役した抗ＣＤ７抗体を使用して、細胞膜上のＣＤ７の発現を偽形質導入した細胞の発現と比較した。各プロットの右上の象限上の破線付きの四角形は、ＧＦＰ＋ＣＤ７＋細胞を囲む。
【図９】β２−ミクログロブリンのｓｃＦｖ標的化による、Ｔ細胞中のＨＬＡクラスＩの下方制御を描写する。ジャーカットＴ細胞を、抗β２Ｍ  ｓｃＦｖ−ｍｙｃ  ＫＤＥＬで形質導入した。形質導入の１週間後、フィコエリトリン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に共役した抗ＨＬＡ−ＡＢＣ抗体を使用して、細胞膜上のＨＬＡ−ＡＢＣの発現を、偽形質導入した細胞の発現と比較した。アイソタイプ適合対照抗体での染色もまた示す。ＧＦＰ陽性細胞のゲーティング後に分析を実行した。
【図１０】ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／ＤＬ３のｓｃＦｖ標的化による、ヒトＮＫ細胞中のキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／ＤＬ３の下方制御を描写する。生体外で増殖させ、ＫＩＲ２ＤＬ１発現について選択したＮＫ細胞を、抗ＫＩＲ２ＤＬ１−ＫＩＲ２ＤＬ２／ＤＬ３ｓｃＦｖ−リンカー（２０）ＡＥＫＤＥＬまたは−ＥＥＫＫＭＰで形質導入した。形質導入の８日後、アロフィコシアニン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に共役した抗ＫＩＲ２ＤＬ１抗体、またはフィコエリトリン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に共役した抗ＫＩＲ２ＤＬ２／ＤＬ３抗体を使用して、細胞膜上の対応するＫＩＲの発現を偽形質導入した細胞の発現と比較した。アイソタイプ適合対照抗体での染色もまた示す。ＧＦＰ陽性細胞のゲーティング後に分析を実行した。
【図１１】ｓｃＦｖ標的化による、ヒトＮＫ細胞中のＮＫＧ２Ａの下方制御を描写する。生体外で増殖させたＮＫ細胞を、抗ＮＫＧ２Ａ  ｓｃＦｖ−ＥＥＫＫＭＰで形質導入した。形質導入の８日後、フィコエリトリン（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）に共役したＮＫＧ２Ａ抗体を使用して、細胞膜上のＮＫＧ２Ａの発現を偽形質導入した細胞の発現と比較した。アイソタイプ適合対照抗体での染色もまた示す。ＧＦＰ陽性細胞のゲーティング後に分析を実行した。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の例示的な実施形態についての説明が続く。
【００１０】
近年、免疫細胞を制御する分子経路についての知識の獲得に、それらを生体外で操作する能力（それらの増殖及び遺伝子操作を含む）の顕著な発展が匹敵してきている。現在、時宜を得た様式で、高度に複雑化した臨床等級の免疫細胞生成物を確実に調製することが可能である。生体外細胞操作によって免疫細胞の抗癌活性をいかに配向し、拡大し得るかについての主要な例は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の開発である（Ｅｓｈｈａｒ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ．１９９３；９０（２）：７２０−７２４）。
【００１１】
ＣＡＲは、以前に説明されている人工多分子タンパク質である（Ｇｅｉｇｅｒ  ＴＬ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；１６２（１０）：５９３１−５９３９；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ＲＪ，ｅｔ  ａｌ．，ＮａｔＭｅｄ．２００３；９（３）：２７９−２８６；Ｃｏｏｐｅｒ  ＬＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０１（４）：１６３７−１６４４）。ＣＡＲは、特定の標的に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを含む。例えば、米国特許第８，３９９，６４５号（その全体が本明細書に参照によって組み込まれる）に説明されるように、細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインは、そのようなドメインの任意の所望される供給源に由来し得る。簡潔には、ＣＡＲは、ある標的に特異的に結合する抗体の単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）を含有するように設計され得る。ｓｃＦｖは、膜貫通ドメイン及びヒンジドメインを介して、ＣＤ３ζなどのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）関連シグナリング分子に連結され得る。同族抗原へのｓｃＦｖのライゲーションは、シグナル形質導入を引き起こす。したがって、ＣＡＲは、細胞傷害性Ｔリンパ球を癌細胞に向かって瞬時に再配向し、腫瘍細胞の溶解を誘発することができる（Ｅｓｈｈａｒ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ．１９９３；９０（２）：７２０−７２４；Ｇｅｉｇｅｒ  ＴＬ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；１６２（１０）：５９３１−５９３９；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ＲＪ，ｅｔ  ａｌ．，ＮａｔＭｅｄ．２００３；９（３）：２７９−２８６；Ｃｏｏｐｅｒ  ＬＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０１（４）：１６３７−１６４４；Ｉｍａｉ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２００４；１８：６７６−６８４）。ＣＤ３ζシグナリング単独では、Ｔ細胞を持続的に活性化するには十分ではないため（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ＲＨ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；２１：３０５−３３４；Ｚａｎｇ  Ｘ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｓｏｎ  ＪＰ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７；１３（１８Ｐｔ１）：５２７１−５２７９）、シグナル形質導入を後押しするために、ＣＤ２８及び４−１ＢＢ（またはＣＤ１３７）などの同時刺激分子がＣＡＲ構築物に組み込まれている。この二重シグナリング設計（「第２世代ＣＡＲ」）は、Ｔ細胞から効果的な抗腫瘍活性を引き出すのに有用である。（Ｉｍａｉ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２００４；１８：６７６−６８４；Ｃａｍｐａｎａ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．２０１４；２０（２）：１３４−１４０）。
【００１２】
４−１ＢＢ及びＣＤ３ζの両方を含有する特定のＣＡＲ、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、米国特許第８，３９９，６４５号に説明されている。抗ＣＤ１９−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲを発現する自家Ｔ細胞の注入は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）（Ｐｏｒｔｅｒ  ＤＬ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ；２０１１：Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１１；３６５（８）：７２５−７３３、Ｋａｌｏｓ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ．２０１１；３（９５）：９５ｒａ７３）、及び急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）（Ｇｒｕｐｐ  ＳＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１３；３６８（１６）：１５０９−１５１８；Ｍａｕｄｅ  ＳＬ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１４；３７１（１６）：１５０７−１５１７）を有する患者において劇的な臨床的応答をもたらした。これらの研究、及び異なるシグナリングモジュールを担持するＣＡＲによる研究（Ｔｉｌｌ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９（１７）：３９４０−３９５０；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ＪＮ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９（１２）：２７０９−２７２０；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ＲＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１１；１１８（１８）：４８１７−４８２８；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ＲＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１３；５（１７７）：１７７ｒａ１３８）は、この技術の臨床的潜在性について、及び一般的な免疫治療についての有力な実証を提供する。
【００１３】
本明細書に説明される方法は、天然または人工受容体（例えば、ＣＡＲ）によって再配向される、免疫細胞中の特定のタンパク質の迅速な除去または非活性化を可能にし、したがって、操作された細胞の用途潜在性を広げ、その機能を著しく改善する。本方法は、除去または中和される標的（例えば、タンパク質）に結合する標的結合分子とともに、免疫活性化受容体、例えば、ＣＡＲ（特定の標的に結合する細胞外ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを含む）を含有する単一構築物または複数構築物に一部依存し、標的結合分子は、用途によってそれを特定の細胞区画（ゴルジもしくは小胞体など）、プロテアソーム、または細胞膜へと配向するドメイン（すなわち、局在化ドメイン）に連結される。単純化のため、局在化ドメイン（ＬＤ）に連結した標的結合分子は、本明細書において「ＬＤ連結標的結合分子」と呼ばれることもある。
【００１４】
本明細書の教示から明らかとなるように、本発明の方法には、様々な免疫活性化受容体が好適であり得る。つまり、癌細胞上に発現されるリガンド（例えば、ペプチドまたは抗原）への結合（ライゲーション）時に免疫応答を活性化することができる分子を含む、任意の受容体を、本方法に従って使用することができる。例えば、上述のように、免疫活性化受容体はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であってもよく、ＣＡＲを設計し、操作するための方法は当該技術分野において既知である（Ｇｅｉｇｅｒ  ＴＬ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９９；１６２（１０）：５９３１−５９３９；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ＲＪ，ｅｔ  ａｌ．，ＮａｔＭｅｄ．２００３；９（３）：２７９−２８６；Ｃｏｏｐｅｒ  ＬＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０１（４）：１６３７−１６４４を参照されたい）。更に、抗体結合能力を有する受容体を使用してもよく（例えば、ＣＤ１６−４−１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ受容体−Ｋｕｄｏ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１４；７４（１）：９３−１０３）、これはＣＡＲに類似しているが、ｓｃＦｖが抗体結合分子（例えば、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２）で置換されたものである。更に、腫瘍細胞ＨＬＡの文脈において、腫瘍細胞上に発現されるペプチドに結合するＴ細胞受容体アルファ鎖及びベータ鎖を含むＴ細胞受容体もまた、本方法に従って使用することができる。更に、癌細胞上に発現されるリガンドに結合することによって免疫応答を活性化する分子を担持する、他の受容体（例えば、腫瘍細胞上に発現されるＮＫＧ２Ｄリガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０−ＣＤ３ゼータ受容体）もまた、使用することができる（例えば、Ｃｈａｎｇ  ＹＨ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１３；７３（６）：１７７７−１７８６を参照されたい）。本明細書で使用される場合、全てのそのような好適な受容体はまとめて「免疫活性化受容体」または「癌細胞リガンドへの結合時に免疫応答を活性化する受容体」と呼ばれる。したがって、癌細胞リガンドによって活性化された分子を有する免疫活性化受容体は、本方法に従って、ＬＤ連結標的結合分子とともに発現され得る。
【００１５】
本方法は、人工受容体によって再配向される免疫細胞の注入に基づく免疫治療の潜在的用途を、著しく拡大する。説明される方法は実用的であり、臨床等級の細胞プロセシングに容易に組み込むことができる。例えば、ＣＡＲ及びＬＤ連結標的結合分子（例えば、ｓｃＦｖ−ｍｙｃ  ＫＤＥＬ（またはＰＥＳＴもしくは膜貫通）を含有する単一のバイシストロニック構築物は、例えば、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）または２Ａペプチド−コード領域部位を、ＣＡＲ及びＬＤ連結標的結合分子をコードする２つのｃＤＮＡの間に挿入することによって、調製することができる。２つ以上の標的を削除するためのトリシストロニック送達系の設計もまた、実行可能であるだろう。あるいは、（同時または連続での）２つの遺伝子の別個の形質導入が実行されてもよい。癌細胞治療法の文脈において、ＣＡＲは、抗体結合シグナリング受容体（Ｋｕｄｏ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１４；７４（１）：９３−１０３）、特定のＨＬＡ−ペプチドの組み合わせに対して配向されるＴ細胞受容体、または癌細胞との接触によって活性化される任意の受容体（Ｃｈａｎｇ  ＹＨ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１３；７３（６）：１７７７−１７８６）によって置換されてもよい。同時の抗ＣＤ１９−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲ及び抗ＣＤ３ε  ｓｃＦｖ−ＫＤＥＬによる、本明細書に説明される研究の結果は、ＣＡＲのシグナリング能力が損なわれなかったことを実証する。
【００１６】
本明細書において試験される両方の抗ＣＤ３ε  ｓｃＦｖ−ＫＤＥＬ（及び−ＰＥＳＴ）は、ＣＤ３及びＴＣＲ発現を安定して下方制御する。残留するＣＤ３＋Ｔ細胞はＣＤ３ビーズを使用して除去することができ、このアプローチは臨床等級の形式においても利用可能なものである。ＣＡＲシグナリングに応答するＣＤ３／ＴＣＲ陰性細胞を作製する能力は、重要な進歩を表す。ＣＡＲ  Ｔ細胞による臨床研究は一般に、自家Ｔ細胞を使用して実行されている。したがって、細胞生成物の品質は患者によって異なり、応答は不均一である。同種Ｔ細胞の注入は、レシピエントの組織抗原による内在性ＴＣＲの刺激を原因とする許容しがたく高い潜在性に致命的なＧｖＨＤのリスクを有するため、現在不可能である。内在性ＴＣＲの欠如はＧｖＨＤ能力を除去するため、ＣＤ３／ＴＣＲの下方制御は同種Ｔ細胞を注入する可能性を開く。同種生成物は、最適な細胞組成物（例えば、高度に細胞傷害性のＴ細胞に富むもの、制御Ｔ細胞が枯渇したものなど）によって調製し、注入される細胞が高いＣＡＲ発現及び機能的効力を有するように選択することができる。更に、完全に標準化された生成物は凍結保存され、患者の免疫細胞の状態、及び除去療法または広範囲の採血を受ける彼／彼女の適応度に関わらず、使用のために利用可能であり得る。ＴＣＲ発現の除去は、ヌクレアーゼなどの遺伝子編集ツールを使用して対処されている（Ｔｏｒｉｋａｉ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２０１２；１１９（２４）：５６９７−５７０５）。これは効果的なアプローチであるものの、それは延長培養による数回の細胞選択及び増殖を必要とするため、臨床設定において実装するのは困難である。本明細書に説明される方法は、多くの実用的な利点を有する。
【００１７】
更に、ＬＤ連結標的結合分子（例えば、ｓｃＦｖ−ｍｙｃ  ＫＤＥＬ、ｓｃＦｖ−ＥＥＫＫＭＰ、またはｓｃＦｖ−ＰＥＳＴ、ここで、ｓｃＦｖは、特定のタンパク質／分子を標的化する）を本発明に従って使用して、ＨＬＡクラスＩ分子を削除し、同種細胞の拒絶の可能性を低減することができる。同種Ｔ細胞の注入はＣＡＲ  Ｔ細胞治療法の将来的な目標である一方で、同種ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の注入は、癌を有する患者を治療するために既に使用されている。ＮＫ細胞に基づく治療法の成功を決定する重要な因子は、ＮＫ細胞が、腫瘍細胞切除を生成する可能性のある効果器：標的比率を達成するのに十分な数で残留しなければならないことである（Ｍｉｌｌｅｒ  ＪＳ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｅｄｕｃ  Ｐｒｏｇｒａｍ．２０１３；２０１３：２４７−２５３）。しかしながら、同種細胞が注入される時、それらの残留性は限定されている。患者に与えられる免疫抑制化学療法は注入されたＮＫ細胞の一過的な生着を可能にするが、これらは注入の２〜４週間以内に拒絶される（Ｍｉｌｌｅｒ  ＪＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２００５；１０５：３０５１−３０５７；Ｒｕｂｎｉｔｚ  ＪＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１０；２８（６）：９５５−９５９）。臓器移植に反して、免疫抑制薬剤はＮＫ細胞機能も抑制するため、継続的な免疫抑制は選択肢ではない。拒絶は主に、レシピエントのＣＤ８＋Ｔリンパ球によるＨＬＡクラスＩ分子の認識によって媒介されるため、注入されたＮＫ細胞（またはＴ細胞）からＨＬＡクラスＩ分子を除去すると、拒絶率が減少または抑止され、同種細胞の生存、及びそれ故に抗腫瘍能力が延長されるだろう。
【００１８】
更に、ＬＤ連結標的結合分子を本発明に従って使用して、抑制性受容体を標的化することができる。具体的には、抗ＰＤ１または抗ＣＴＬＡ−４などの抑制性シグナルからＴ細胞を放出する抗体の投与が、劇的な臨床的応答を生成した（Ｓｈａｒｍａ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１１；１１（１１）：８０５−８１２、Ｐａｒｄｏｌｌ  ＤＭ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１２；１２（４）：２５２−２６４）。ＣＡＲ−Ｔ細胞、特に固形腫瘍に対して配向されるものが、類似する機構によって抑制され得る。したがって、ＰＤ１、ＣＴＬＡ−４、Ｔｉｍ３、または他の抑制性受容体に対する標的結合分子（例えば、ｓｃＦｖまたはリガンド）の発現は、（例えば、ＫＤＥＬ（配列番号４）、ＥＥＫＫＭＰ（配列番号６４）、またはＰＥＳＴモチーフＳＨＧＦＰＰＥＶＥＥＱＤＤＧＴＬＰＭＳＣＡＱＥＳＧＭＤＲＨＰＡＡＣＡＳＡＲＩＮＶ（配列番号７）に連結される場合）これらの分子の発現を防止し、または（膜貫通ドメインに連結される場合）受容体のそれらのリガンドへの結合を防止し、ＣＡＲ媒介シグナル形質導入を持続するだろう。ＮＫ細胞において、抑制性受容体の例としては、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）及びＮＫＧ２Ａが挙げられる（Ｖｉｖｉｅｒ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１１；３３１（６０１３）：４４−４９）。
【００１９】
本発明の方法はまた、ＣＡＲ配向Ｔ細胞治療法を受け入れられる、より多数の標的の標的化も可能にする。ＣＡＲ配向治療法の主な制限のうちの１つは、腫瘍細胞によって発現される特定の抗原の不足である。白血病及びリンパ腫などの血液学的悪性腫瘍の場合、非造血細胞中で発現されない分子は潜在性な標的ではあり得るが、それらはＴ細胞及び／またはＮＫ細胞上でも発現されるため、ＣＡＲ標的としては使用することができない。免疫細胞上でのそのようなＣＡＲの発現は、「殺同胞」機構による免疫細胞自体の消滅をもたらし、それらの抗癌能力を無効にする可能性があるだろう。標的分子が、機能的な有害作用なく免疫細胞から除去され得る場合、対応する特異性を有するＣＡＲが発現され得る。これは、血液学的悪性腫瘍を標的化する多くの新しい機会を開く。可能性のある標的の例としては、多発性骨髄腫において発現されるＣＤ３８、Ｔ細胞白血病及びリンパ腫において発現されるＣＤ７、急性白血病において発現されるＴｉｍ−３、ホジキン病において発現されるＣＤ３０、全ての血液学的悪性腫瘍において発現されるＣＤ４５及びＣＤ５２が挙げられる。これらの分子はまた、かなりの割合のＴ細胞及びＮＫ細胞中でも発現される。
【００２０】
更に、活性化された免疫細胞によるサイトカインの分泌が、サイトカイン放出症候群及びマクロファージ活性化症候群を引き起こし、免疫細胞治療法の深刻な有害作用を呈することが示されている（Ｌｅｅ  ＤＷ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１４；１２４（２）：１８８−１９５）。したがって、ＬＤ連結標的結合分子を本発明に従って使用して、そのような炎症カスケードに寄与し得る、ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２７、ＩＬ−３５、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、及びトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βなどのサイトカインを遮断することができる。
【００２１】
したがって、一実施形態において、本発明は、免疫活性化受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、局在化ドメインに連結した標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、操作された免疫細胞に関する。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「操作された」免疫細胞は、天然に存在する免疫細胞と比較して遺伝子改変されている免疫細胞を含む。例えば、本方法に従って生成された操作されたＴ細胞は、それが由来するＴ細胞中に天然には存在しないヌクレオチド配列を含む核酸を保有する。いくつかの実施形態において、本発明の操作された免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、及び局在化ドメインに連結した標的結合分子（ＬＤ連結標的結合分子）を含む。特定の一実施形態において、本発明の操作された免疫細胞は、抗ＣＤ１９−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲ、及び局在化ドメインに連結した抗ＣＤ３ｓｃＦｖを含む。
【００２３】
特定の実施形態において、操作された免疫細胞は、操作されたＴ細胞、操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、操作されたＮＫ／Ｔ細胞、操作された単球、操作されたマクロファージ、または操作された樹状細胞である。
【００２４】
特定の実施形態において、本明細書で使用される場合、「免疫活性化受容体」は、癌細胞リガンドへの結合時に免疫応答を活性化する受容体を指す。いくつかの実施形態において、免疫活性化受容体は、癌細胞上に発現されるリガンド（例えば、ペプチドまたは抗原）への結合（ライゲーション）時に免疫応答を活性化することができる分子を含む。一実施形態において、免疫活性化受容体はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり、ＣＡＲを設計し、操作するための方法は当該技術分野において既知である。他の実施形態において、免疫活性化受容体は抗体結合受容体であり、これはＣＡＲに類似しているが、ｓｃＦｖが抗体結合分子（例えば、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２）で置換されたものである（例えば、ＣＤ１６−４−１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ受容体−Ｋｕｄｏ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１４；７４（１）：９３−１０３）。様々な実施形態において、腫瘍細胞ＨＬＡの文脈において、腫瘍細胞上に発現されるペプチドに結合するＴ細胞受容体アルファ鎖及びベータ鎖を含むＴ細胞受容体もまた、本方法に従って使用することができる。特定の実施形態において、癌細胞上に発現されるリガンドに結合することによって免疫応答を活性化する分子を担持する、他の受容体（例えば、腫瘍細胞上に発現されるＮＫＧ２Ｄリガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０−ＣＤ３ゼータ受容体）もまた、使用することができる（例えば、Ｃｈａｎｇ  ＹＨ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１３；７３（６）：１７７７−１７８６を参照されたい）。癌細胞上に発現されるリガンド（例えば、ペプチドまたは抗原）への結合（ライゲーション）時に免疫応答を活性化することができる全てのそのような好適な受容体はまとめて「免疫活性化受容体」と呼ばれる。当業者によって認識されるように、免疫活性化受容体は、抗体または抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）を含有する必要はなく、むしろ、標的分子に結合する免疫活性化受容体の部分は、例えば、受容体−リガンド対中の受容体または受容体−リガンド対中のリガンドに由来し得る。
【００２５】
特定の態様において、免疫活性化受容体は、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ３８、ＣＳ−１、ＴＩＭ３、ＣＤ１２３、メソセリン、葉酸受容体、ＨＥＲ２−ｎｅｕ、上皮増殖因子受容体、及び上皮増殖因子受容体を含むが、これらに限定されない、腫瘍細胞の表面上に発現される分子に結合する。いくつかの実施形態において、免疫活性化受容体は、ＣＡＲ（例えば、抗ＣＤ１９−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲ）である。特定の実施形態において、免疫活性化受容体は、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ３８、ＣＳ−１、ＴＩＭ３、ＣＤ１２３、メソセリン、葉酸受容体、ＨＥＲ２−ｎｅｕ、上皮増殖因子受容体、及び上皮増殖因子受容体を含むが、これらに限定されない、腫瘍細胞の表面上に発現される分子に結合する、抗体またはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。腫瘍細胞の表面上に発現されるそのような分子に対する抗体は、当該技術分野において既知かつ入手可能である。一例として、ＣＤ３及びＣＤ７に対する抗体は、当該技術分野において商業的に入手可能かつ既知である。本明細書に例証されるように、そのような抗体及びそれらに由来する抗体の断片（例えば、ｓｃＦｖ）を本発明において使用することができる。更に、標的タンパク質に対する抗体及び抗体断片を生成する方法は、当該技術分野において周知かつ通例である。
【００２６】
本発明に従う免疫活性化受容体（例えば、ＣＡＲ）の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６（例えば、ＣＤ１６ＡまたはＣＤ１６Ｂ）、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２（例えば、ＣＤ３２ＡまたはＣＤ３２Ｂ）、ＣＤ６４（例えば、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４Ｂ、またはＣＤ６４Ｃ）、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、及びＦＧＦＲ２Ｂを含むが、これらに限定されない、１回貫通膜タンパク質に由来してもよい。いくつかの例において、膜タンパク質はＣＤ８αではない。膜貫通ドメインはまた、天然に存在しない疎水性タンパク質セグメントであってもよい。
【００２７】
免疫活性化受容体（例えば、ＣＡＲ）のヒンジドメインは、ＣＤ８αなどのタンパク質またはＩｇＧに由来し得る。ヒンジドメインは、ＣＤ８αの膜貫通ドメインもしくはヒンジドメインの断片、または様々な長さの親水性残基からなるポリペプチドなどの天然に存在しないペプチド、または（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号８）ポリペプチド（ｎは、例えば、３〜１２（これらを含む）の整数である）であってもよい。
【００２８】
免疫活性化受容体（例えば、ＣＡＲ）のシグナリングドメインは、ＣＤ３ζ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、または免疫細胞中の活性化シグナルを送達することが既知である他の分子に由来し得る。受容体の少なくとも１つの同時刺激シグナリングドメインが、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７としても知られる）、ＣＤ２８、ＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアント、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１、またはＣＤ２などの同時刺激分子であってもよい。そのような分子は、当該技術分野において容易に入手可能かつ既知である。
【００２９】
当業者によって認識されるように、免疫活性化受容体の構成要素は、所望される結果を生成するため、本明細書に説明されるようにいくつかの機能的組み合わせを含むように操作され得る。特定のＣＡＲ抗ＣＤ１９−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζを一例として使用すると、本明細書に説明されるように、分子に結合する抗体（例えば、またはその抗原結合断片（ｓｃＦｖなど））は、異なる分子に結合する抗体（例えば、抗ＣＤ１９の代わりに抗ＣＤ２０、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ１２３など）で置換されてもよい。他の実施形態において、同時刺激分子（この具体例においては４−１ＢＢ）はまた、異なる同時刺激分子（例えば、ＣＤ２８）によって異なってもよい。いくつかの実施形態において、刺激分子（この具体例においてはＣＤ３ζ）は、別の既知の刺激分子で置換されてもよい。様々な実施形態において、所望される場合、受容体の膜貫通ドメインもまた異なってもよい。そのような免疫活性化受容体の設計、生成、及び機能性の試験は、当業者によって容易に決定され得る。同様に、そのような免疫活性化受容体をコードする核酸の設計、細胞への送達、及び発現は、当該技術分野において容易に既知かつ入手可能である。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、複数のヌクレオチドモノマー（例えば、リボヌクレオチドモノマーまたはデオキシリボヌクレオチドモノマー）を含むポリマーを指す。「核酸」は、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子を含む。核酸分子は、天然に存在するもの、組み換え型のもの、または合成のものであってもよい。更に、核酸分子は、一本鎖、二本鎖、または三本鎖であってもよい。いくつかの実施形態において、核酸分子は改変されてもよい。二本鎖ポリマーの場合、「核酸」は、分子のいずれかまたは両方の鎖を指し得る。
【００３１】
核酸に関連して、「ヌクレオチド配列」という用語は、リン結合（例えば、リン酸ジエステル結合、アルキル及びアリール−ホスホネート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホトリエステル結合）ならびに／または非リン結合（例えば、ペプチド結合及び／もしくはスルファメート結合）などの共有結合によって接合される、一連の近接ヌクレオチドを指す。特定の実施形態において、例えば、局在化ドメインに連結した標的結合分子をコードするヌクレオチド配列は、異種配列（例えば、異なる種または細胞型を起源とする遺伝子）である。
【００３２】
「ヌクレオチド」及び「ヌクレオチドモノマー」という用語は、天然に存在するリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドモノマー、ならびに天然に存在しないそれらの誘導体及び類似体を指す。したがって、ヌクレオチドは、例えば、天然に存在する塩基（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、またはデオキシシチジン）を含むヌクレオチド、及び当該技術分において既知である改変された塩基を含むヌクレオチドを含み得る。
【００３３】
当業者によって認識されるように、いくつかの態様において、核酸は、プラスミド配列を更に含む。プラスミド配列は、例えば、プロモータ配列、選択マーカ配列、及び遺伝子座標的化配列からなる群から選択される１つ以上の配列を含み得る。
【００３４】
本明細書で使用される場合、局在化ドメインに連結した標的結合分子をコードする遺伝子は、「ＬＤ連結標的結合分子」と呼ばれることもある。
【００３５】
特定の実施形態において、標的結合分子は、抗体またはその抗原結合断片である。本明細書で使用される場合、「抗体」は、改変もしくは操作されているか、またはヒト抗体である、インタクトな抗体または抗原結合断片を含む、インタクトな抗体または抗体の抗原結合断片を意味する。改変または操作されている抗体の例は、キメラ抗体、ヒト化抗体、多重パラトピック抗体（例えば、二重パラトピック抗体）、及び多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、ミニボディ、及びダイアボディが挙げられる。
【００３６】
「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖、及びＣＨ１、及び１つの重鎖の可変領域を含む。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することはできない。
【００３７】
「Ｆｃ」領域は、ある抗体のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む２つの重鎖断片を含有する。２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合によって、及びＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって、ともに保持される。
【００３８】
「Ｆａｂ′断片」は、２つのＦａｂ′断片の２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成されて、Ｆ（ａｂ′）２分子を形成し得るように、１つの軽鎖、ならびにＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン及びＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の領域またも含有する１つの重鎖の一部分を含有する。
【００３９】
「Ｆ（ａｂ′）２断片」は、２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成されるように、２つの軽鎖、ならびにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の定常領域の一部分を含有する２つの重鎖を含有する。したがって、Ｆ（ａｂ′）２断片は、２つの重鎖の間のジスルフィド結合によってともに保持される、２つのＦａｂ′断片で構成される。
【００４０】
「Ｆｖ領域」は、重鎖及び軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域は欠如する。
【００４１】
特定の一実施形態において、標的結合分子は、単鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ抗体」）である。ｓｃＦｖは、ある抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片を指し、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、ｓｃＦｖが抗原結合に所望される構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを更に含む。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  Ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。ＰＣＴ公開第ＷＯ８８／０１６４９号、ならびに米国特許第４，９４６，７７８号及び同第５，２６０，２０３号もまた参照されたい。一例として、本明細書に開示されるｓｃＦｖのＶＨドメインとＶＬドメインとの間のリンカーは、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４３）を含む。当業者によって認識されるように、様々な好適なリンカーが、当該技術分野において提供されるように、及び本明細書に開示されるように、最適な機能のために設計され、試験され得る。
【００４２】
ＬＤ連結標的結合分子の部分であるｓｃＦｖは、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または類似する抗体結合シグナリング受容体の文脈において生じるｓｃＦｖと必ずしも同一ではない。いくつかの実施形態において、ＬＤ連結標的結合分子の部分であるｓｃＦｖは、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または類似する抗体結合シグナリング受容体の文脈において生じるｓｃＦｖと同一である。
【００４３】
いくつかの実施形態において、標的結合分子（例えば、ＬＤ連結標的結合分子の文脈におけるｓｃＦｖ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号１４、１５、１８、１９、２２、２３、２６、２７、３０、３１、３４、３５、３８、または３９のうちのいずれか１つ以上に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する１つ以上の配列を含む。
【００４４】
「配列同一性」という用語は、デフォルトギャップ重量を使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列される時、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列が、少なくとも、例えば、７０％の配列同一性、または少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも８５％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％以上の配列同一性を共有することを意味する。配列比較について、典型的には１つの配列が基準配列（例えば、親配列）としての役割を果たし、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する時には、試験配列及び基準配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。その後、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づいて、基準配列に対する試験配列（複数可）の配列同一性パーセントを計算する。
【００４５】
比較のための配列の最適な整列は、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査（一般に、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい）によって、実行することができる。配列同一性パーセント及び配列類似性の決定に好適であるアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）に説明されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通して公的に入手可能（国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）のＮＣＢＩインターネットサーバを通して公的にアクセス可能）である。典型的には、デフォルトプログラムパラメータを使用して、配列比較を実行することができるが、カスタム化パラメータもまた使用されてもよい。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８９：１０９１５（１９８９）を参照されたい）をデフォルトとして使用する。
【００４６】
特定の実施形態において、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は、それぞれ配列番号１２及び１３、それぞれ配列番号１６及び１７、それぞれ配列番号２０及び２１、それぞれ配列番号２４及び２５、それぞれ配列番号２８及び２９、それぞれ配列番号３２及び３３、またはそれぞれ配列番号３６及び３７に規定されるアミノ酸配列を有するＶＨ及びＶＬを含む。いくつかの実施形態において、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は、それぞれ配列番号１２及び１３、それぞれ配列番号１６及び１７、それぞれ配列番号２０及び２１、それぞれ配列番号２４及び２５、それぞれ配列番号２８及び２９、それぞれ配列番号３２及び３３、またはそれぞれ配列番号３６及び３７に規定されるＶＨ及びＶＬ配列に対して、それぞれが少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有する配列を有するＶＨ及びＶＬを含む。
【００４７】
「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片である。断片は、同一のポリペプチド鎖中で軽鎖可変領域（ＶＬ）に接続した重鎖可変領域（ＶＨ）（ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）を含む。同一鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは、別の鎖の相補ドメインとの対合、及び２つの抗原結合部位の作製を強制される。ダイアボディは、例えば、特許文書ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、及びＨｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８に説明される。
【００４８】
特定の実施形態において、抗体は、トリアボディまたはテトラボディである。トリアボディ及びテトラボディを設計し、生成する方法は、当該技術分野において既知である。例えば、Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２４８（１−２）：４７−６６，２００１を参照されたい。
【００４９】
「ドメイン抗体断片」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含有する、免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片である。いくつかの例において、２つ以上のＶＨ領域がペプチドリンカーで共有結合されて、二価のドメイン抗体断片が作製される。二価のドメイン抗体断片の２つのＶＨ領域は、同一の抗原を標的化しても、異なる抗原を標的化してもよい。
【００５０】
いくつかの実施形態において、抗体は、改変または操作される。改変または操作された抗体の例としては、キメラ抗体、多重パラトピック抗体（例えば、二重パラトピック抗体）、及び多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）が挙げられる。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「多重パラトピック抗体」は、少なくとも２つの単一ドメイン抗体を含む抗体を意味し、そのうち、少なくとも一方の単一ドメイン抗体が、抗原上の第１の抗原決定基に対して配向され、少なくとも１つの他方の単一ドメイン抗体が、同一の抗原上の第２の抗原決定基に対して配向される。したがって、例えば、「二重パラトピック」抗体は、抗原上の第１の抗原決定基に対して配向される少なくとも１つの単一ドメイン抗体、及び同一の抗原上の第２の抗原決定基に対して配向される少なくとも１つの更なる単一ドメイン抗体を含む。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの単一ドメイン抗体を含む抗体を意味し、そのうち、少なくとも一方の単一ドメイン抗体が、第１の抗原に対して配向され、少なくとも１つの他方の単一ドメイン抗体が、（第１の抗原とは異なる）第２の抗原に対して配向される。したがって、例えば、「二重特異性」抗体は、第１の抗原に対して配向される少なくとも１つの単一ドメイン抗体、及び例えば、第１の抗原とは異なる第２の抗原に対して配向される少なくとも１つの更なる単一ドメイン抗体を含む抗体である。
【００５３】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗体は、モノクローナル抗体、例えば、マウスモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体を生成する方法は、当該技術分野において既知である。例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。
【００５４】
様々な実施形態において、ＬＤ連結標的結合分子の文脈における標的結合分子は、標的分子に結合する受容体またはリガンドである。例えば、その標的結合分子は、ＰＤ−１に結合するリガンド（例えば、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２）であってもよい。したがって、当業者によって認識されるように、標的結合分子は、抗体であっても、標的分子に結合するリガンド／受容体であってもよい。
【００５５】
本明細書で使用される場合、ＬＤ連結標的結合分子の文脈における「連結した」は、１つ以上の局在化ドメインをコードする１つ以上の遺伝子に隣接する枠内に直接ある（例えば、リンカーを有さない）標的結合分子をコードする遺伝子を指す。あるいは、標的結合分子をコードする遺伝子は、本明細書に説明されるように、リンカー配列を通して、１つ以上の局在化ドメインをコードする１つ以上の遺伝子に接続されてもよい。当該技術分野において既知である様々な好適なリンカーを使用して、標的結合分子を局在化ドメインに繋留することができる。例えば、様々な長さの親水性残基からなるポリペプチドなどの天然に存在しないペプチド、または（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号８）ポリペプチド（ｎは、例えば、３〜１２（これらを含む）の整数である）を、本発明に従って使用してもよい。特定の実施形態において、リンカーは、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６２）を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）を含む。様々な実施形態において、約５〜約１００（これらを含む）のアミノ酸長を有するペプチドリンカーを、本発明において使用することができる。特定の実施形態において、約２０〜約４０（これらを含む）のアミノ酸長を有するペプチドリンカーを、本発明において使用することができる。いくつかの実施形態において、少なくとも５のアミノ酸長、少なくとも１０のアミノ酸長、少なくとも１５のアミノ酸長、少なくとも２０のアミノ酸長、少なくとも２５のアミノ酸長、少なくとも３０のアミノ酸長、少なくとも３５のアミノ酸長、または少なくとも４０のアミノ酸を有するペプチドリンカーを、本発明において使用することができる。当業者によって認識されるように、そのようなリンカー配列及びそのようなリンカー配列のバリアントは、当該技術分野において既知である。リンカー配列を組み込む構築物を設計する方法、及び機能性を評価する方法は、当業者にとって容易に入手可能である。
【００５６】
特定の実施形態において、ＬＤ連結標的結合分子は、免疫細胞の表面上に発現される標的に結合する。いくつかの実施形態において、ＬＤ連結標的結合分子は、標的分子の活性または機能を抑制する。一例として、本明細書に開示されるように、ＬＤ連結標的結合分子は、例えば、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ４５、ｈＢ２ＭＧ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／ＤＬ３、またはＮＫＧ２Ａに結合し、それによってそのような分子の細胞表面発現を下方制御するように設計されてもよい。そのような分子の下方制御は、例えば、分解及び／または内在化のための分子の局在化／標的化を通して達成することができる。他の実施形態において、ＬＤ連結標的結合分子は、標的を非活性にする（例えば、標的は、もはやその同族リガンドもしくは受容体に相互作用及び／または結合することができない）。
【００５７】
いくつかの実施形態において、本発明の操作された免疫細胞は、改良された治療有効性を有する。本明細書で使用される場合、「改良された治療有効性」は、宿主における移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の低減、宿主による拒絶の低減もしくは除去、宿主における生存の延長、宿主における腫瘍による抑制の低減、宿主における自己死滅の低減、宿主における炎症カスケードの低減、または宿主におけるＣＡＲ媒介シグナル形質導入の持続のうちの１つ以上を指す。
【００５８】
本発明の特定の実施形態において、ＬＤ連結標的結合分子の文脈における標的結合分子は、ＣＤ３／Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体中の分子、サイトカイン、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子、または免疫応答を下方制御する受容体に結合する。
【００５９】
特定の実施形態において、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体中の分子は、ＣＤ３ε、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、またはＣＤ３ζであり得る。特定の一実施形態において、分子はＣＤ３εである。
【００６０】
別の実施形態において、ＨＬＡクラスＩ分子は、ベータ−２ミクログロブリン、α１−ミクログロブリン、α２−ミクログロブリン、またはα３−ミクログロブリンである。
【００６１】
他の実施形態において、免疫応答を下方制御する受容体は、例えば、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、Ｔｉｍ３、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ−例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１（ＣＤ１５８ａとしても知られる）、ＫＩＲ２ＤＬ２／ＤＬ３（ＣＤ１５８ｂとしても知られる））、ＣＤ９４またはＮＫＧ２Ａ（ＣＤ１５９ａとしても知られる）、タンパク質チロシンホスファターゼ（Ｓｒｃ相同性領域２ドメイン含有ホスファターゼ（ＳＨＰ）−１及びＳＨＰ−２など）から選択される。したがって、そのような受容体は、本明細書に説明されるように、部分ＬＤ連結標的結合分子によって標的化することができる。
【００６２】
様々な実施形態において、部分ＬＤ連結標的結合分子によって標的化され得るサイトカインの例としては、例えば、インターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２７、ＩＬ−３５、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、またはトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βが挙げられる。
【００６３】
更なる一態様において、ＬＤ連結標的結合分子は、例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ５２、またはＣＤ１２７から選択される分子に結合する。
【００６４】
任意の標的タンパク質に対する抗体及びそれらの抗体断片を生成する方法は、当該技術分野において周知かつ通例である。更に、本明細書に例証されるように、様々な標的（例えば、ＣＤ３及びＣＤ７）に対する商業的に入手可能な抗体を使用して、本明細書に例証されるように、ＬＤ連結標的結合分子を作製することができる。本明細書に例証されるように、当該技術分野において既知である抗体及びそれらに由来する抗体の断（例えば、ｓｃＦｖ）を本発明において使用することができる。
【００６５】
他の態様において、ＬＤ連結標的結合分子の局在化ドメインは、小胞体（ＥＲ）保持配列ＫＤＥＬ（配列番号４）、またはＫＫＸＸ（配列番号９）、ＫＸＤ／Ｅ（配列番号１０）（式中、Ｘは、任意のアミノ酸であり得る−Ｇａｏ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ１９：５０８−５１５，２０１４を参照されたい）、及びＹＱＲＬ（配列番号１１）（Ｚｈａｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ４６：５５−６０，１９９８を参照されたい）などの他のＥＲもしくはゴルジ保持配列；例えば、「ＰＥＳＴ」モチーフ−ＳＨＧＦＰＰＥＶＥＥＱＤＤＧＴＬＰＭＳＣＡＱＥＳＧＭＤＲＨＰＡＡＣＡＳＡＲＩＮＶ（配列番号７）を含むプロテオソーム標的化配列；ならびに／あるいはＣＤ８α膜貫通ドメイン、または本明細書に説明される別の１回膜貫通タンパク質の膜貫通（例えば、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６（ＣＤ１６ＡもしくはＣＤ１６Ｂなど）、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２（ＣＤ３２ＡもしくはＣＤ３２Ｂなど）、ＣＤ６４（ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４Ｂ、もしくはＣＤ６４Ｃなど）、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、またはＦＧＦＲ２Ｂ）などの細胞膜に標的結合分子を標的化する配列を含む。本明細書に例証される具体的な局在化ドメイン（配列）の例を、図２に示す。様々な他の局在化配列が、当該技術分野において既知かつ入手可能である。
【００６６】
図２に示されるように、本発明のＬＤ連結標的結合分子は、１つ以上の局在化ドメインを含んでもよい。例えば、ＬＤ連結標的結合分子は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０のともに連結した局在化ドメインを有してもよい。所与のＬＤ連結標的結合分子において、２つ以上の局在化ドメインが使用される場合、各局在化ドメインは、任意の介在リンカーありまたはなしで連結され得る。一例として、図２に示されるように、単一のＬＤ連結標的結合分子において、局在化ドメインＣＤ８ＴＭ、ＰＥＳＴモチーフ、及びＥＥＫＫＭＰを使用することができる。この特定の構築物は、いかなる介在リンカーも有さない局在化ドメインを示す一方で、局在化ドメインのうちのいくつかまたは全ての間に、様々な介在リンカーが組み込まれてもよい。他の例が、図２に示される。
【００６７】
当業者によって認識されるように、免疫活性化受容体及び／またはＬＤ連結標的結合分子は、本明細書に開示される標的、及び本明細書に開示される標的のバリアントに結合するように設計されてもよい。一例として、免疫活性化受容体及び／またはＬＤ連結標的結合分子は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体中の分子、またはその天然に存在するバリアント分子に結合するように設計されてもよい。そのような天然に存在するバリアントは、その分子の野生型形態と同一の機能を有し得る。他の実施形態において、バリアントは、その分子の野生型形態と比較して変化した機能を有し得る（例えば、疾患状態を与える）。
【００６８】
当業者によって認識されるように、図２に示されるＬＤ連結標的結合分子構築物の様々な構成要素は、その組み合わせが機能的ＬＤ連結標的結合分子を生成する限り、（例えば、異なるリンカー、異なる局在化配列、異なるｓｃＦｖなどを含有するように）異なる組み合わせで置換されてもよい。特定の構築物の機能性を評価する方法は、本明細書に開示される当業者の領域内である。
【００６９】
更なる態様において、本発明は、癌を治療するための、免疫活性化受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、局在化ドメインに連結した標的結合分子（例えば、ｓｃＦｖ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、操作された免疫細胞の使用であって、治療量の操作された免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、使用に関する。
【００７０】
別の態様において、本発明は、癌を治療するための、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、局在化ドメインに連結した単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、操作された免疫細胞の使用であって、治療量の操作された免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、使用に関する。
【００７１】
他の態様において、本発明は、自己免疫障害を治療するための、免疫活性化受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、局在化ドメインに連結した標的結合分子（例えば、ｓｃＦｖ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、操作された免疫細胞の使用であって、治療量の操作された免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、使用に関する。
【００７２】
他の態様において、本発明はまた、感染性疾患を治療するための、免疫活性化受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、局在化ドメインに連結した標的結合分子（例えば、ｓｃＦｖ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、操作された免疫細胞の使用であって、治療量の操作された免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、使用にも関する。
【００７３】
様々な実施形態において、免疫活性化受容体は、ＣＡＲ（例えば、抗ＣＤ１９−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲ）である。
【００７４】
他の実施形態において、局在化ドメインに連結した単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、図２に示されるいずれか１つ以上の構築物から選択される。
【００７５】
いくつかの態様において、操作された免疫細胞は、対象への注入によって投与される。免疫細胞（例えば、同種または自家免疫細胞）を注入する方法は、当該技術分野において既知である。疾患の症状を寛解させるために、十分な数の細胞がレシピエントに投与される。典型的には、１０７〜１０１０個の細胞の薬用量、例えば、１０９個の細胞の薬用量が、単回設定で注入される。注入は、単回の１０９個の細胞の用量として投与されるか、またはいくつかの１０９個の細胞の薬用量に分割される。注入頻度は、３〜３０日に１回、または所望もしくは指示される場合、それよりも長い間隔ですらあり得る。注入量は一般に、一対象当たり少なくとも１回の注入、及び許容される場合好ましくは少なくとも３回の注入、または疾患症状が寛解されるまでである。細胞は、５０〜２５０ｍｌ／時の速度で静脈内注入され得る。他の好適な投与様式としては、動脈内注入、腫瘍への直接注射及び／または手術後の腫瘍母地の灌流、人工スキャフォールドにおける腫瘍部位での移植、髄腔内投与、ならびに眼内投与が挙げられる。本発明をそのような送達様式に適合させる方法は、当業者にとって容易に入手可能である。
【００７６】
特定の態様において、治療される癌は、固形腫瘍または血液学的悪性腫瘍である。血液学的悪性腫瘍の例としては、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、脊髄形成異常症、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫が挙げられる。固形腫瘍の例としては、肺癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、肝細胞癌腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、脳腫瘍が挙げられる。
【００７７】
別の実施形態において、本発明は、本発明の操作された免疫細胞を生成するための方法であって、免疫細胞に、免疫活性化受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、局在化ドメインに連結した標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを導入し、それによって操作された免疫細胞を生成することを含む、方法に関する。
【００７８】
特定の実施形態において、ヌクレオチド配列を含む核酸は、生体外で免疫細胞に導入される。他の実施形態において、ヌクレオチド配列を含む核酸は、生体内で免疫細胞に導入される。
【００７９】
いくつかの実施形態において、「免疫細胞」は、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ／Ｔ細胞、単球、マクロファージ、または樹状細胞を含む。
【００８０】
導入されるヌクレオチド配列を含む核酸は、本明細書に説明される免疫活性化受容体と、局在化ドメインに連結した標的結合分子（例えば、ｓｃＦｖ）とを含有する単一バイシストロニック構築物であってもよい。本明細書に説明されるように、単一バイシストロニック構築物は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）または２Ａペプチドコード領域部位を、本明細書に説明される免疫活性化受容体（例えば、ＣＡＲ）及び標的結合分子（例えば、ｓｃＦｖ）をコードする２つのｃＤＮＡの間に挿入することによって、調製することができる。２つ以上の標的を削除するためのトリシストロニック送達系の設計もまた、実行可能であるだろう。あるいは、個々の構築物（例えば、ＣＡＲ及びＬＤ連結標的結合分子）の（同時または連続での）別個の形質導入が実行されてもよい。外来性核酸を導入する方法は、本明細書に例証され、当該技術分野において周知である。
【００８１】
本明細書で使用される場合、それに反して明確に示されない限り、「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」という不定冠詞は、「少なくとも１つの」を意味することが理解されるべきである。
【実施例】
【００８２】
例証
方法
【００８３】
マウス抗ヒトＣＤ３ハイブリドーマからの、ｓｃＦｖのクローニング
【００８４】
抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体を分泌するＰＬＵ４ハイブリドーマ細胞（ＩｇＧ２ａアイソタイプ、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹ）を、ＩＭＤＭプラスＧｌｕｔａＭＡＸ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で、２０％のウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）及び抗生物質とともに培養した。ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して全ＲＮＡを抽出し、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）及びオリゴチミジン１５プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）によってｃＤＮＡを合成した。ＩｇＧ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ  Ｍｏｕｓｅ  ＢｉｏＧｅｎｏｍｉｃｓ（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｓａｌｅｍ，ＭＡ）を使用して、重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域を増幅させ、ＰＣＲ生成物を配列決定用ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中へとクローニングした。重複伸長ＰＣＲによるスプライシングを使用して、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４をコードする可動性リンカー配列によって、ＶＨ及びＶＬ遺伝子をｓｃＦｖへと組み立てた。健康なドナーのヒト活性化Ｔ細胞由来するｃＤＮＡを使用するＰＣＲによって、ＣＤ８αのシグナルペプチドドメインをサブクローニングし、ＶＬ断片の５’末端に接続した。センスプライマー：５’−ＡＴＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＧＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣ−３’（配列番号２）及び逆方向プライマー：５’−ＣＡＧＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＧＡＡＡＴＡＡＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＧＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＧ−３’（配列番号３）を使用するＰＣＲによって、Ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ、配列番号１）をＶＨのＣ終端に添加した。Ｍｙｃタグの後、センスプライマー：５’−ＡＴＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＧＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣ−３’（配列番号５）及び逆方向プライマー：５’−ＴＡＴＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＡＣＴＣＧＴＣＣＴＴＣＡＧＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＧＡＡＡＴＡＡＧ−３’（配列番号６）によって、ＫＤＥＬ（配列番号４）コード配列もまた作製した。ＣＤ８シグナルペプチド、ヒトＣＤ３に対するｓｃＦｖ、Ｍｙｃタグ、及びＫＤＥＬ（配列番号４）配列からなる合成された遺伝子を、ＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターのＥｃｏＲＩ部位及びＸｈｏＩ部位へとサブクローニングした。図２に列挙されるように、ｍｙｃ−ＫＤＥＬが他の配列によって置換される構築物もまた、作製した。
【００８５】
マウスオルニチン脱炭酸酵素のアミノ酸４２２〜４６１に対応する「ＰＥＳＴ」の配列−ＳＨＧＦＰＰＥＶＥＥＱＤＤＧＴＬＰＭＳＣＡＱＥＳＧＭＤＲＨＰＡＡＣＡＳＡＲＩＮＶ（配列番号７）モチーフを、ＧｅｎＢａｎｋ（受入番号ＮＭ＿０１３６１４．２）から得た。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によってコドン最適化及び遺伝子合成を行い、ＰＣＲによってＶＨの３’末端へとサブクローニングした。構築物を、ＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターのＥｃｏＲＩ部位及びＸｈｏＩ部位へとサブクローニングした。
【００８６】
ヒトＣＤ７に対するｓｃＦｖのクローニング
【００８７】
マウスＴＨ６９（抗ＣＤ７）抗体に由来する配列ｓｃＦｖを、文献（Ｐｅｉｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ２００２（６２）：２８４８−２８５５）から得た。コドン最適化後、ＣＤ８シグナルペプチド、ヒトＣＤ７に対するｓｃＦｖ、Ｍｙｃタグ、及びＫＤＥＬ（配列番号４）配列からなる合成された遺伝子を、ＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターのＥｃｏＲＩ部位及びＸｈｏＩ部位へとサブクローニングした。図２に列挙されるように、ｍｙｃ−ＫＤＥＬが他の配列によって置換される構築物もまた、作製した。
【００８８】
ヒトベータ−２ミクログロブリン（ｈＢ２ＭＧ）に対するｓｃＦｖのクローニング
【００８９】
マウスＢＢＭ．１（抗ｈＢ２ＭＧ）ＩｇＧ２ｂ抗体に由来する配列ｓｃＦｖを、文献（Ｇｒｏｖｅｎｄｅｒ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．２００４；６５（１）：３１０−３２２）から得た。コドン最適化後、ＣＤ８シグナルペプチド、ヒトＢ２ＭＧに対するｓｃＦｖ、Ｍｙｃタグ、及びＫＤＥＬ（配列番号４）配列からなる合成された遺伝子を、ＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターのＥｃｏＲＩ部位及びＸｈｏＩ部位へとサブクローニングした。
【００９０】
ヒトＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／ＤＬ３に対するｓｃＦｖのクローニング
【００９１】
ヒトモノクローナル抗体Ｉ−７Ｆ９（抗ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、及びＫＩＲ２ＤＬ３）のアミノ酸配列は、Ｍｏｒｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．らによる公開国際特許出願第ＷＯ２００６００３１７９Ａ２号に由来した。コドン最適化後、可変軽（ＶＬ）領域及び可変重（ＶＨ）領域をリンカー配列で接続することによって、ｓｃＦｖの配列を設計した。ＣＤ８シグナルペプチド、ヒトＫＩＲに対するｓｃＦｖ（ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、及びＫＩＲ２ＤＬ３）、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン、ならびにＫＫＭＰ配列からなる合成された遺伝子を、ＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターのＥｃｏＲＩ部位及びＸｈｏＩ部位へとサブクローニングした。図２に列挙されるように、ＫＫＭＰが他の配列によって置換される構築物もまた、作製した。
【００９２】
ヒトＮＫＧ２Ａに対するｓｃＦｖのクローニング
【００９３】
マウス抗体Ｚ１９９（抗ＮＫＧ２Ａ）の配列は、Ｓｐｅｅらによる公開特許（ＥＰ２２４７６１９Ａ１）に由来した。コドン最適化後、可変軽（ＶＬ）領域及び可変重（ＶＨ）領域をリンカー配列で接続することによって、ｓｃＦｖの配列を設計した。ＣＤ８シグナルペプチド、ヒトＮＫＧ２Ａに対するｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通、ならびにＫＫＭＰ配列からなる合成された遺伝子を、ＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターのＥｃｏＲＩ部位及びＸｈｏＩ部位へとサブクローニングした。図２に列挙されるように、ＫＫＭＰが他の配列によって置換される構築物もまた、作製した。本明細書で作製されるｓｃＦｖｓの配列情報を、表１に示す。図２に描写される様々な構成要素の配列情報を、表２に示す。
【００９４】
抗ＣＤ１９−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲ
【００９５】
このＣＡＲを、以前に説明されるように作製した（Ｉｍａｉ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２００４；１８：６７６−６８４、Ｉｍａｉ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００５；１０６：３７６−３８３）。
【００９６】
表１．ｓｃＦｖ配列情報
【表１−１】
2018507685.tif 000003
【表１−２】
2018507685.tif 000004
【表１−３】
2018507685.tif 000005
【表１−４】
2018507685.tif 000006
【表１−５】
2018507685.tif 000007
【表１−６】
2018507685.tif 000008
【表１−７】
2018507685.tif 000009
【００９７】
表２．図２に描写される構成要素の配列情報
【表２−１】
2018507685.tif 000010
【表２−２】
2018507685.tif 000011
【表２−３】
2018507685.tif 000012
【表２−４】
2018507685.tif 000013
【表２−５】
2018507685.tif 000014
【表２−６】
2018507685.tif 000015
【００９８】
遺伝子形質導入、細胞増殖、フローサイトメトリー分析、及び機能研究
【００９９】
これらを、以前に説明されるように実行した（Ｋｕｄｏ，Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１４；７４（１）：９３−１０３）。
【０１００】
結果
【０１０１】
ｓｃＦｖ構築物の作製
【０１０２】
この技術の概略を、図１に説明する。我々が作製した抑制構築物の概略図を、図２に示す。ｓｃＦｖ部分は、抗体生成ハイブリドーマ細胞株の、または対応する公開された配列の、可変軽（ＶＬ）及び可変重（ＶＨ）免疫グロブリン鎖領域をコードするｃＤＮＡのクローニングに由来し得る。ＶＬ及びＶＨは、完全ｓｃＦｖを作製するための標準的技術に従って、短ペプチド配列（「リンカー」）によって連結される。発現されるために、ｓｃＦｖはＮ終端でシグナルペプチドに連結され、予備実験において確認されるように、シグナルペプチドはｓｃＦｖが発現されるために必要とされる。ｓｃＦｖプラスシグナルペプチドを含有するタンパク質は一般に、細胞環境へと放出される。例えば、予備実験（示さず）において、ジャーカットＴ細胞中に発現される抗ＣＤ３ε  ｓｃＦｖプラスシグナルペプチドが、細胞の培養上清中に検出された。ｓｃＦｖを特定の区画に配向し、その分泌を防止することによって、他の細胞に対する可能性のある作用が防止される。それを小胞体（ＥＲ）に配向するために、ＫＤＥＬ（配列番号４）モチーフ（ＥＲ中にタンパク質を保持）を利用した（Ｓｔｒｅｂｅ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９；３４１（１−２）：３０−４０）。標的化されるタンパク質の分解を促進するために、我々は、それをプロテアソーム標的化ＰＥＳＴモチーフに連結させた（Ｊｏｓｈｉ，Ｓ．Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ．  ２０１２；４（６）：６８６−６９３）。ｓｃＦｖはまた、それを、膜貫通ドメイン及びＣＤ８αのヒンジまたは別の膜貫通タンパク質に連結することによって、細胞膜に配向されてもよい。
【０１０３】
抗ＣＤ１９−ＢＢ−ζＣＡＲを発現するＴリンパ球中のＴ細胞受容体の下方制御
【０１０４】
提案された計画が、ＣＡＲを発現し、１つ以上のマーカを欠如する免疫細胞の作製に適用され得るかどうかを決定するために、抗ＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞中でＴ細胞受容体（ＴＣＲ）発現を下方制御した。
【０１０５】
細胞膜上に発現されるために、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体は、その全ての構成要素（ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ）の組み立てを必要とする。１つの構成要素の欠如は、ＣＤ３／ＴＣＲ発現、及びしたがって抗原認識を防止する。予備研究において、抗ＣＤ３εハイブリドーマ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹから購入）のｓｃＦｖをクローニングし、ＫＤＥＬ（配列番号４）、ＰＥＳＴ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、または図２に示される他のものを含有する構築物を作製した。
【０１０６】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含有するマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）レトロウイルスベクターを使用して、ＣＤ３／ＴＣＲ＋ジャーカット細胞株中で、本明細書に開示される構築物を形質導入した。形質導入後のＧＦＰ＋細胞のパーセンテージは、全ての実験において９０％超であった。図３Ａは、フローサイトメトリーによって測定される、ＧＦＰ＋細胞間の抗ＣＤ３ε抗体での染色の結果を示す。ＣＤ３εの抗体染色は、列挙される構築物で形質導入した細胞中、様々な程度まで減少した。ヒト末梢血Ｔリンパ球によって、類似するＣＤ３εの下方制御を得た（図３Ｂ）。図３Ｃは、ＧＦＰのみを含有するベクターで形質導入した細胞と比較した、異なる遺伝子構築物での形質導入後の、ＧＦＰ陽性ジャーカット細胞中のＣＤ３ε発現の説明的なフローサイトメトリードットプロットを示す。ＣＤ３の下方制御は、ジャーカット細胞の増殖、または試験された全ての他の細胞マーカ（ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ２５、ＣＤ６９を含む）の発現には影響を与えなかった。ＣＤ３発現の抑制は、３ヶ月超残留した。ＣＤ３陰性細胞の更なる濃縮は、抗ＣＤ３磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）でのＣＤ３＋Ｔ細胞枯渇によって達成することができる。
【０１０７】
ジャーカット細胞またはヒト末梢血Ｔリンパ球の抗ＴＣＲαβ抗体での染色は、ＣＤ３ε発現の下方制御が、ＴＣＲαβ発現の下方制御と関連していることを示した（図４）。
【０１０８】
次に、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ−ｍｙｃ  ＫＤＥＬが抗ＣＤ１９−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲと同時に発現され得るかどうかを決定した。図５に示されるように、これは、抗ＣＤ１９ＣＡＲを発現する一方でＣＤ３発現を欠如するＴ細胞をもたらした。これらの細胞上では、ＴＣＲもまた不在であった（図示せず）。
【０１０９】
ＣＡＲが、下方制御されたＣＤ３／ＴＣＲを有するジャーカット細胞中でシグナリングすることができるかどうかを評価するために、活性化マーカＣＤ６９及びＣＤ２５の発現を試験し、ＣＤ１９＋白血病細胞株ＯＰ−１とともに共培養したジャーカット細胞中でのＣＤ１０７ａ発現によって、溶解性顆粒のエキソサイトーシスを測定した。図６に示されるように、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ−ｍｙｃ  ＫＤＥＬ構築物によるＣＤ３／ＴＣＲの下方制御は、抗ＣＤ１９−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲがジャーカット細胞を活性化する能力を減少させなかった。ＣＡＲシグナリングに対するＣＤ３／ＴＣＲ削除の影響を更に探索するために、ＣＡＲを発現するＣＤ３陰性Ｔリンパ球が、そのライゲーションによって刺激され得るかどうかを決定した。図７に示されるように、抗ＣＤ１９ＣＡＲを発現するＴリンパ球をＣＤ１９＋白血病細胞とともに共培養すると、ＣＤ３が下方制御されたか否かに関わらず、Ｔ細胞増殖がもたらされ、これは、ＣＤ３／ＴＣＲ下方制御がＣＡＲ増殖刺激を減少させなかったことを示した。
【０１１０】
したがって、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ−ｍｙｃ  ＫＤＥＬ構築物を使用して、ＣＡＲによって駆動されるＴ細胞活性化、脱顆粒、及び増殖に影響を与えることなく、ＣＡＲ−Ｔ細胞中でＣＤ３／ＴＣＲを効果的に下方制御され得る。
【０１１１】
ＣＤ７の下方制御
【０１１２】
ＣＤ３／ＴＣＲ発現の調節に成功した計画を、他の表面分子に適用することができるかどうかを決定した。この目的のため、ＣＤ７発現を調節した。ｓｃＦｖ配列は、Ｐｅｉｐｐら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ２００２（６２）：２８４８−２８５５）によって公開されるものに由来し、これを、図２に説明されるＣＤ８シグナルペプチド及びｍｙｃ−ＫＤＥＬ配列に連結した。ＭＳＣＶレトロウイルスベクターを使用して、フィコエリトリン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に共役した抗ＣＤ７抗体によって検出される、ＣＤ７の高発現を有する末梢血リンパ球中で、抗ＣＤ７−ｍｙｃ  ＫＤＥＬ構築物を形質導入した。図８に示されるように、この構築物で形質導入したＴリンパ球中のＣＤ７は、実質的に抑止された。
【０１１３】
ＨＬＡ−クラスＩの下方制御
【０１１４】
その後、この計画を適用して、別の表面分子ＨＬＡクラスＩを下方制御した。
【０１１５】
ＨＬＡクラスＩは、多形α鎖、及びβ２−ミクログロブリンと呼ばれる非多形鎖からなる。後者のサブユニットのノックダウンは、ＨＬＡ（マウスにおいてはＭＨＣ）クラスＩ発現の抑止をもたらす（Ｋｏｌｌｅｒ，ＢＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９０；２４８（４９６０）：１２２７−１２３０）。β２−ミクログロブリンと反応するｓｃＦｖを使用して、免疫細胞中のＨＬＡクラスＩの発現を抑制した。
【０１１６】
ｓｃＦｖ配列は、Ｇｒｏｖｅｎｄｅｒら（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．２００４；６５（１）：３１０−３２２）によって公開されるものに由来し、これを、図２に説明されるＣＤ８シグナルペプチド及びｍｙｃ  ＫＤＥＬ配列に連結した。ＭＳＣＶレトロウイルスベクターを使用して、フィコエリトリン（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に共役した抗ＨＬＡ−ＡＢＣ抗体によって検出される、ＨＬＡクラスＩの高発現を有するジャーカット細胞中で、抗β２Ｍ−ｍｙｃ  ＫＤＥＬ構築物を形質導入した。図９に示されるように、この構築物で形質導入したジャーカット細胞は、ＨＬＡ−ＡＢＣ発現の実質的な下方制御を有した。細胞は、それらの形態及び増殖能力を維持した。
【０１１７】
ＮＫ細胞中の抑制性受容体の下方制御
【０１１８】
上に説明される計画が、他の免疫細胞中で発現される表面分子にもまた適用されるかどうかを決定するために、抑制性受容体ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／ＤＬ３、及びＮＫＧ２Ａの機能の下方制御をＮＫ細胞中で試験した。
【０１１９】
ＫＩＲ受容体を下方制御するために、ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／ＤＬ３と反応するｓｃＦｖを使用して、ＮＫ細胞中でのそれらの発現を抑制した。ｓｃＦｖ配列は、Ｍｏｒｅｔｔａら（特許ＷＯ２００６／００３１７９Ａ２）によって公開されるものに由来し、これを、図２に説明されるＣＤ８シグナルペプチド及びＥＲ保持配列に連結した。ＭＳＣＶレトロウイルスベクターを使用して、ヒト末梢血から増殖させ、ＫＩＲ２ＤＬ１発現について選択したＮＫ細胞中で、この構築物を形質導入した。これらの細胞は、アロフィコシアニン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に共役した抗ＫＩＲ２ＤＬ１抗体によって検出される、高いＫＩＲ２ＤＬ１発現、及びフィコエリトリン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に共役した抗ＫＩＲ２ＤＬ２／ＤＬ３抗体によって検出される、高いＫＩＲ２ＤＬ２／ＤＬ３発現もまた有した。図１０は、標的化されるＫＩＲの実質的な下方制御とともに、ｓｃＦｖ−リンカー（２０）ＡＥＫＥＤＬ及びｓｃＦｖ−ＥＥＫＫＭＰによって得られた結果を示す。
【０１２０】
ＮＫＧ２Ａを下方制御するために、ＮＫＧ２Ａと反応するｓｃＦｖを使用して、ＮＫ細胞中でのその発現を抑制した。Ｓｐｅｅらによる公開欧州特許出願第ＥＰ２２４７６１９Ａ１号に由来したｓｃＦｖ配列を、図２に説明されるＣＤ８シグナルペプチド及びＥＲ保持配列に連結した。ＭＳＣＶレトロウイルスベクターを使用して、フィコエリトリン（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）に共役した抗ＮＫＧ２Ａ抗体によって検出される、高いＮＫＧ２Ａ発現を有するヒト末梢血から増殖させたＮＫ細胞中で、この構築物を形質導入した。図１１は、ｓｃＦｖ−ＥＥＫＫＭＰによって得られたＮＫＧ２Ａの実質的な下方制御を示す。
【０１２１】
本明細書に引用される全ての特許、公開出願、及び参考文献の教示は、それらの全体が参照によって組み込まれる。
【０１２２】
本発明が、その例示的な実施形態を参照しながら具体的に示され、説明されている一方で、その中に、添付の特許請求の範囲によって網羅される本発明の範囲を逸脱することなく、形態及び詳細における様々な変更がなされ得ることが当業者によって理解されるだろう。
【図１】
2018507685.tif 000016
【図２】
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【図３Ａ−３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2018507685.tif 000022
【図７】
2018507685.tif 000023
【図８】
2018507685.tif 000024
【図９】
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【図１０】
2018507685.tif 000026
【図１１】
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【配列表】
2018507685000001.app
【国際調査報告】
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2018507685.tif 000029
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