(57)【要約】  本発明は治療的有効量のＣＹＰ１７Ａ阻害剤および有効量の５−α−レダクターゼ阻害剤を対象に投与することを含む、対象における前立腺癌などのステロイド依存性疾患を治療する方法を提供する。【選択図】無し【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的有効量のＣＹＰ１７Ａ阻害剤および有効量の５−α−レダクターゼ阻害剤を患者に投与することを含む、それを必要とする患者におけるステロイド依存性疾患を治療する方法。
【請求項２】
前記ステロイド依存性疾患がステロイド依存性癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記癌が前立腺癌である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記前立腺癌が去勢抵抗性前立腺癌である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＹＰ１７Ａ阻害剤がアビラテロン、アビラテロン代謝産物であるＤ４Ａおよびガレテロン（ｇａｌｅｔｅｒｏｎｅ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＹＰ１７Ａ阻害剤がアビラテロンおよびアビラテロン代謝産物であるＤ４Ａからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
患者由来の生物学的試料における一種または複数種のＣＹＰ１７Ａ阻害剤の代謝産物のレベルを確定することによって治療を修正することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＹＰ１７Ａ阻害剤がアビラテロンであり、前記ＣＹＰ１７Ａ阻害剤の代謝産物がＤ４Ａ、３β−ヒドロキシ−５β−アビラテロン、３−ケトン−５α−アビラテロン、３−ケトン−５β−アビラテロン、３α−ヒドロキシ−５α−アビラテロン、３α−ヒドロキシ−５β−アビラテロンと３β−ヒドロキシ−５α−アビラテロンからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記５−α−レダクターゼ阻害剤がデュタステリド、フィナステリド、ラピスタリド、トルステリミド、ベクスロステリド、イズステリドとエプリテリチドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣＹＰ１７Ａ阻害剤と前記５−α−レダクターゼ阻害剤が薬学的に許容される担体とともに投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記５−α−レダクターゼ阻害剤および／または一つ以上の前記ＣＹＰ１７Ａ阻害剤が経口投与される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府の資金援助）
本発明はアメリカ国立癌研究所からの助成番号Ｒ０１ＣＡ１６８８９９、Ｒ０１ＣＡ１７２３８２とＲ０１ＣＡ１９０２８９および米陸軍医療研究・軍需品司令部からの助成番号ＰＣ１２１３８２での政府支援でなされた。よって、政府は本発明に対してある権利を有する。
（関連出願の相互引用）
本出願は２０１５年３月６日に出願された米国仮特許出願第６２／１２９，２１５号および２０１５年８月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／２０７，５９４号に優先権を主張し、両者とも参照として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
転移性前立腺癌は一般的には、最初に医学的または外科的去勢に応答し，続いて最終的に去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）として抵抗性が生じ、それは腫瘍の代謝能力により駆動されて主にデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）／ＤＨＥＡサルフェートに由来する強力なアンドロゲンを再構成、それによりアンドロゲン受体（ＡＲ）を刺激する。（Ｃｈａｎｇら，Ｃｅｌｌ，１５４，１０７４−１０８４（２０１３））。
アビラテロン（Ａｂｉｒａｔｅｒｏｎｅ、Ａｂｉと略称され、アビラテロンアセテートとして経口投与される）は、ステロイド薬物であり、ドセタキセル化学療法による治療後においても１７α−ヒドロキシラーゼ／１７，２０−リアーゼ（ＣＹＰ１７Ａ１）を阻害し、アンドロゲン合成を阻止し且つ生存期間を延長させることができる（ｄｅＢｏｎｏら，ＴＨｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３６４，１９９５−２００５（２０１１））。しかしながら、患者はアビラテロン治療への耐性も生じ得る。従って、去勢抵抗性前立腺癌などのステロイド依存性疾患を治療する方法を依然として必要とする。
【発明の概要】
【０００３】
前立腺癌および乳癌のようなステロイド依存性疾患は、前駆体ステロイドを活性化ステロイドに変換することを必要とする。前立腺癌は、最初に性腺由来テストステロン欠乏療法に応答するが、最終的に去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）となって、それは腫瘍により駆動されて前駆体ステロイド（例えばデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）とデヒドロエピアンドロステロンサルフェート）をテストステロンおよび／またはジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）に変換する。ステロイドＣＹＰ１７Ａ阻害剤であるアビラテロンは、主にアンドロゲンの合成に必要なＣＹＰ１７Ａ酵素を抑制することによってこのプロセスをブロックする。アビラテロンは、患者において以前に記載されていない代謝産物であるＤ４Ａに変換され、当該Ｄ４Ａがアンドロゲン経路に沿った複数の段階をブロックすることにより作用するより強力な薬物であること、本発明者から示された。したがって、アビラテロンによる臨床反応は、ある程度でＤ４Ａへの変換に依存している可能性がある。しかしながら、Ｄ４Ａは患者においてさらに代謝され、ステロイド５−α−レダクターゼによって５α−アビラテロンに変換される。Ｄ４Ａの強力な抗腫瘍効果とは対照的に、５α−アビラテロンはアンドロゲン受容体を刺激し、腫瘍成長を促進すると考えられている。しかしながら、Ｄ４Ａの５−アビラテロンへの変換は、５−α−レダクターゼ阻害剤によって薬理学的にブロックされ得る。
本発明者らは、アビラテロンなどのＣＹＰ１７Ａ阻害剤および有効量の５−α−レダクターゼ阻害剤を治療的有効量で患者に投与することを含む、それを必要とする患者におけるステロイド依存性疾患の治療方法を発見し、開発した。いくつかの実施形態では、該ステロイド依存性疾患は、前立腺癌または去勢抵抗性前立腺癌などのステロイド依存性癌である。またいくつかの実施形態では、該方法は、被験者由来の生物学的試料中の一つまたは複数のＣＹＰ１７Ａ阻害剤の代謝産物のレベルを確定することから得られた情報を使用することによって治療を改変するステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
本発明は、以下の図を参照することにより、更に容易に理解され得て，ここにおいて：
図１ａ−１ｅは、マウスおよび患者の両方において起こり、３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３βＨＳＤ）を必要とするＡｂｉからＤ４Ａへの変換の構造的結果を示す化学構造およびグラフを提供する。ａ、ＡｂｉからＤ４Ａへの変換の機構図。＊：３βＨＳＤの基質および生成物における二重結合およびＣ３位。ｂ、インビボでのＡｂｉからＤ４Ａへの変換。アビラテロンアセテートを５匹のマウスに腹腔内投与した。注射の２時間後および４時間後に血液を採取した。血清中のＡｂｉおよびＤ４Ａ濃度を質量分析法によって定量し、アビラテロン＋Ｄ４Ａの合計の百分率として表した。ｃ、Ｄ４Ａはアビラテロンアセテートで治療した全てのＣＲＰＣ患者（ｎ＝１２）で検出可能である。ｄ、アビラテロンアセテートで治療した患者の血清からのＤ４Ａおよびアビラテロンの、典型的な質量分析による追跡。ｅ、３βＨＳＤ１はＡｂｉをＤ４Ａに変換できる。３βＨＳＤ１を過剰発現するＬＡＰＣ４細胞を、１０μＭのアビラテロン（または［３Ｈ］−ＤＨＥＡ）で２４時間処理した。Ｄ４Ａ（アビラテロン＋Ｄ４Ａの百分率として）、［３Ｈ］−ＤＨＥＡおよび［３Ｈ］−ＤＨＥＡ代謝産物（標識代謝産物）をＨＰＬＣで分離した。結果は、生物学的な繰り返しの平均値（ｎ＝３）±標準偏差（ｓ．ｄ．）として示される。実験は少なくとも３回繰り返す。
図２ａ−２ｅは、Ｄ４Ａがアンドロゲン経路における３βＨＳＤ、ＣＹＰ１７Ａ、および５αレダクターゼの酵素活性を阻害することを示す反応スキームおよびグラフを提供する。ａ、ＣＲＰＣにおいて、アドレナリンからＤＨＴおよびＡＲ刺激へのステロイド生成経路の概略図。ｂ、Ｄ４ＡはＬＮＣａＰ中の３βＨＳＤ１活性を阻害する。細胞を０．１、１または１０μＭのＤ４ＡとＡｂｉを含む［３Ｈ］−ＤＨＥＡで９および２４時間処理した。ＤＨＥＡおよびＡＤをＨＰＬＣによって定量した。矢印は０．１μＭのＤ４Ａおよび１μＭのＡｂｉ治療群のＡＤ百分率を表す。ｃ、プレグネノロン代謝およびＤ４Ａがヒト３βＨＳＤ１および３βＨＳＤ２活性を阻害するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ図。Ｄ４Ａは３βＨＳＤ１に対する競合−非競合混在性阻害および３βＨＳＤ２活性に対する非競合阻害を示す。ｄ、Ｄ４ＡによるＣＹＰ１７Ａ１阻害はＡｂｉに匹敵する。ＣＹＰ１７Ａ１を安定に発現する２９３細胞を、０．１、１または１０ｎＭのＤ４ＡまたはＡｂｉを用いて［３Ｈ］−プレグネノロンとともに３および６時間処理した。ＨＰＬＣによってプレグネノロンおよびＤＨＥＡを分離し、定量した。ｅ、Ａｂｉまたはエンザルタミドではなく、Ｄ４Ａは５α−レダクターゼ活性を阻害する。ＬＡＰＣ４細胞を［３Ｈ］−ＡＤおよび示された薬物濃度で処置した。ＨＰＬＣによってステロイドを定量的に測定する。矢印は、１０μＭのＤ４Ａおよび１００μＭのＡｂｉ処置群の５α還元アンドロゲンの百分率を示す。全ての実験はいずれも  生物学的な繰り返し（ｎ＝３）で行い、独立して３回繰り返した。すべての結果は平均値±標準偏差（ｓ．ｄ）として示されている。
図３ａ−３ｇは、Ｄ４ＡがＡＲに結合し、クロマチンにおけるＡＲ占有率、ＡＲ応答性遺伝子の発現および細胞増殖を阻害することを示すグラフであり、ａおよびｂ：Ｄ４Ａは突然変異型ＡＲおよび野生型ＡＲに強く結合する。突然変異型ＡＲ（ＬＮＣａＰ）または野生型ＡＲ（ＬＡＰＣ４）について、０．１ｎＭ  ［３Ｈ］−Ｒ１８８１と競合するためにＤ４Ａ、Ａｂｉおよびエンザルタミド（Ｅｎｚ）（０．００１−１０μＭ）を用いた。細胞内放射能をタンパク質濃度に正規化した、ｃ：Ｄ４ＡはＥｎｚの用量依存性的にクロマチンにおけるＡＲ占有を阻害する。ＬＮＣａＰ細胞を示された濃度のＤＨＴ、Ｄ４ＡおよびＥｎｚで３時間処理した。ＰＳＡ、ＴＭＰＲＳＳ２およびＦＫＢＰ５のＡＲ染色体占有をＣｈｌＰで検出した。ＡＲ  ＣｈｌＰを各遺伝子用未処理対照に基づいて正規化する。ｄ、Ｄ４ＡはＰＳＡ、ＦＫＢＰ５およびＴＭＰＲＳＳ２の発現を阻害する。ＬＮＣａＰ細胞を、ＡｂｉまたはＤ４Ａ（１μＭ）を含む（または含まない）ＤＨＴ（０．５ｎＭ）、ＤＨＥＡ（４０ｎＭ）またはＲ１８８１（０．１ｎＭ）で２４時間処理した。ｑＰＣＲによって遺伝子発現を検出し、ＲＰＬＰＯに正規化する。ｅおよびｆにおいて、Ｄ４ＡのＤＨＴ誘導ＰＳＡ発現に対する阻害は、ＬＮＣａＰおよびＬＡＰＣ４におけるＥｎｚによる阻害に匹敵する。ｇ、Ｄ４ＡはＬＮＣａＰにおけるＤＨＴ（０．５ｎＭ）誘発細胞増殖を阻害する。処置の２，４および６日後にＤＮＡ含量を測定することにより、示された時点で細胞を定量した。ａ、ｂおよびｇにおける実験は、生物学的な繰り返しで行った。Ｃ−Ｆを技術的な繰り返しで行った。すべての実験を３回独立して繰り返した。全ての結果は平均値（パネルｇについては，ｎ＝５；他のすべての実験については、ｎ＝３）±ｓ．ｄ．として示されている。
図４ａ−４ｅは、Ｄ４Ａが異種移植片のステロイド生成および成長を阻害することを示すグラフであり、ａおよびｂにおいて、Ｄ４ＡがＬＮＣａＰおよびＶＣａＰ異種移植におけるステロイド生成を阻害する。異種移植片をＮＳＧマウスの皮下に増殖させた。１０００ｍｍ３に到達した異種移植片を細かく切り、［３Ｈ］−ＤＨＥＡ  ＋  ＡｂｉまたはＤ４Ａ（０．１、１および１０μＭ）で処理した。ＨＰＬＣにより  ＤＨＥＡおよびＡＤを分離し、定量した。実験は生物学的な繰り返し（ｎ＝３異種移植片組織）で行い、結果は平均値±ｓ．ｄ．で示される。矢印は、０．１μＭのＤ４Ａおよび１μＭのＡｂｉ処置群についてのＡＤ百分率を示し、ｃ、Ｄ４Ａは、Ａｂｉと比べてより強力でＶＣａＰ異種移植の進行をブロックする。ビヒクル（Ｃｔｒｌ；  ｎ＝９匹のマウス）、アビラテロンアセテート（ＡＡ；  ｎ＝１０）およびＤ４Ａ（ｎ＝１０）を用いた処置群については、異種移植進行の時間（腫瘍体積の増加＞  ２０％）が示されている。３つの治療群は全て、互いに有意差がある：Ｃｔｒｌ対ＡＡ、Ｐ＝０．０２；  Ｃｔｒｌ対Ｄ４Ａ、Ｐ  ＜０．００１；  ＡＡ対Ｄ４Ａ、Ｐ＝０．０１。ｄ、Ｃ４−２異種移植進行を阻止することについて、Ｄ４Ａ（ｎ＝１０）は、ＡＡ（ｎ＝１０）およびＥｎｚ（ｎ＝１１）よりも強力である：Ｃｔｒｌ  対  Ｄ４Ａ、Ｐ  ＜０．００１；  ＡＡ対Ｄ４Ａ、Ｐ＝０．０１；  Ｅｎｚ対Ｄ４Ａ、Ｐ＝０．０２。ｅ、Ｄ４Ａ活性およびアンドロゲン経路におけるＩＣ５０とＡｂｉとＥｎｚとの比較の概略図。
【０００５】
図５ａ−５ｃは、アビラテロンアセテートで処置した患者における５α‐および５β−還元のＡｂｉ代謝産物の産出を示す化学的スキームおよびグラフを提供する。（Ａ）ステロイド生成酵素によるアビラテロン代謝。前述したアンドロゲン代謝の経路では、ＤＨＥＡは３βＨＳＤによって△４−アンドロステンジオン（ＡＤ）に変換され、ＡＤは５α−アンドロスタンジオン（５αジオン）に５α−還元され、順にアンドロステロンに３−ケト還元される。以下に、アビラテロンのＤ４Ａへの構造的に類似した変換は、５−Ｃ（矢印）でＤ４Ａの５α‐および５β−還元を可能にし、６つのさらなるＡｂｉ代謝産物を生じる。点線の矢印は、３α−異性体と３β−異性体との間の直接的な変換が不確実であると示す。（Ｂ）ＬＡＰＣ４前立腺癌細胞株におけるＡｂｉ代謝産物の相互変換。細胞をＡｂｉまたは示された代謝産物（０．１μＭ）で４８時間処理し、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により示された代謝産物の各々を、三回繰り返して検出した。エラーバーはＳＤを表す。（Ｃ）アビラテロンアセテートで処置した前立腺癌患者１２人の血清中のＡｂｉ代謝産物。代謝産物をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。
図６ａ−６ｄは、インビトロ時間経過および５α還元Ａｂｉ代謝産物のインビボ形成を示すグラフを提供する。（Ａ）Ｄ４Ａから５α還元Ａｂｉ代謝産物への変換、（Ｂ）５α−アビラテロンから３α−ヒドロキシ−５α−アビラテロンへの３−ケトン還元。（Ｃ）ＬＮＣａＰとＬＡＰＣ４前立腺癌細胞株において３α−ヒドロキシ−５α−アビラテロンから５α−アビラテロンへの３α−ヒドロキシ−酸化が検出可能である。１０μＭの規定化合物で細胞を処理し、代謝産物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分離し、ＵＶ分光法によって定量した。（Ｄ）マウスにおけるインビボＡｂｉ代謝。Ａｂｉ（ｎ＝５匹のマウス）またはＤ４Ａ（ｎ＝５匹のマウス）で処理すると、６種の５α‐還元代謝産物がすべて検出可能である。３種の５α‐還元Ａｂｉ代謝産物（各化合物についてｎ＝４匹のマウス）のいずれかで処理すると、二種の他の５α−還元代謝産物が検出され、相互変換が実証される。Ａ−Ｃにおける実験の各々を、３回繰り返して、各実験は少なくとも３回繰り返し、エラーバーはＳＤを表す。
【０００６】
図７ａ−７ｅは、５α−還元Ａｂｉ代謝産物の形成に関与する酵素を示すグラフを提供する。（Ａ）３βＨＳＤ１はアビラテロンからＤ４Ａへの変換と５α−アビラテロンおよび３α−ヒドロキシ−５α−アビラテロンのの下流蓄積を触媒する。Ａｂｉでの処理の前に示された量の３βＨＳＤ１またはベクター対照をコードする発現構築物で  ＬＡＰＣ４細胞を一過的にトランスフェクトした。（Ｂ）ステロイド−５α−レダクターゼ１（ＳＲＤ５Ａ１）またはステロイド−５α−レダクターゼ２（ＳＲＤ５Ａ２）によりＤ４Ａから５α−アビラテロンの変換を促進する。示された量のＳＲＤ５Ａ１またはＳＲＤ５Ａ２、または空のベクタープラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、細胞をＤ４Ａとともに規定のインキュベーション時間でインキュベートした。（Ｃ）ＳＲＤ５Ａ１サイレンシングはＤ４Ａの５α還元をブロックする。非サイレンシングコントロールまたはＳＲＤ５Ａ１を標的とするｓＨＲＮＡを安定に発現するＬＡＰＣ４細胞を、Ｄ４Ａおよび代謝産物で規定時間で処理した。（Ｄ）薬理学的ＳＲＤ５Ａ阻害は、Ｄ４Ａの５α−還元をブロックする。ＬＡＰＣ４細胞をＤ４ＡおよびＳＲＤ５Ａ阻害剤であるデュタステリドまたはＬＹ１９１７０４で処置した。並行対照実験は［３Ｈ］−ＡＤの５α−還元を阻害したことが示された。（Ｅ）ＡＫＲ１Ｃ２は５α−アビラテロンを３α−ヒドロキシ−５α−アビラテロンへ変換することを促進する。２９３Ｔ細胞をＡＫＲ１Ｃ２または空のベクターでトランスフェクトし、５α−Ａｂｉで示された時間、処理した。すべての実験において、代謝産物をＨＰＬＣで分離し、ＵＶ分光法（Ａｂｉ代謝産物）またはβ−ＲＡＭ（［３Ｈ］−アンドロゲン）で定量した。エラーバーは、すべての実験においてＳＤを表す。全ての実験は少なくとも３回行った。
【０００７】
図８Ａ−８Ｉは５α−還元のアビラテロン代謝産物がアンドロゲン途径と腫瘍進行に対する影響を示すグラフを提供する。（Ａ）アビラテロンとＤ４Ａに起因する強力なＣＹＰ１７Ａ１阻害活性は、５α−Ａｂｉおよび３α−ＯＨ−５α−Ａｂｉへの変換により弱められる。ＣＹＰ１７Ａ１を過剰発現する２９３細胞を［３Ｈ］−プレグネノロンで処理し、示された薬物の存在下でＤＨＥＡへの変換を評価した。（Ｂ）Ｄ４Ａの５α還元は、３βＨＳＤ阻害活性の喪失を引き起こす。ＬＮＣａＰ細胞を［３Ｈ］−ＤＨＥＡおよび示された薬物で４８時間処理し、ＡＤへの代謝流量を評価した。（Ｃ）５α−Ａｂｉおよび３α−ＯＨ−５α−Ａｂｉは、Ｄ４Ａに起因するＳＲＤ５Ａ阻害活性を失う。ＬＡＰＣ４細胞を［３Ｈ］−ＡＤおよび示された薬物で処理し、５α−ジオンへのフラックスを２４時間のインキュベーション後に評価した。（Ｄ）５α−ＡｂｉおよびＤ４Ａは、ＡＲと同程度に結合する。ＬＮＣａＰおよびＬＡＰＣ４はそれぞれ、突然変異性ＡＲおよび野生型ＡＲを発現し、［３Ｈ］−Ｒ１８８１および示された化合物とともに３０分間インキュベートした。細胞内放射能をタンパク質濃度に正規化した。（Ｅ）および（Ｆ）において５α−Ａｂｉは、ＬＡＰＣ４およびＬＮＣａＰにおけるアンドロゲン応答性遺伝子発現を刺激する。遅延し、より適度なＰＳＡ発現を３α−ＯＨ−５α−Ａｂｉで刺激する。（Ｇ）ＬＡＰＣ４における５α−ＡｂｉによるＰＳＡ発現の用量依存的刺激。（Ｈ）対照（ｎ＝９匹のマウス）と比較して、３α−ＯＨ−５α−アビラテロン（ｎ＝９匹のマウス）ではなく、５α−アビラテロン（ｎ＝１０匹のマウス）による処置は、精巣摘除マウスにおけるＶＣａＰ  ＣＲＰＣ異種移植の成長を速める。示された化合物での治療は、ＣＲＰＣ腫瘍が１００ｍｍ３に達したときに開始し、且つ無増悪生存は、２回の連続した測定で＞  ３０％の増殖があった時間として評価した。処置群間の差の有意性を対数ランク検定で評価した。＊＊  ５α−ＡｂｉとＣｔｒｌの差については、Ｐ  ＜０．０１。（Ｉ）５β−還元Ａｂｉ代謝産物はＰＳＡ発現を刺激しない。発現は、Ｅ−ＧおよびＩにおいて、ＲＰＬＰＯおよびビヒクル発現に基づいて正規化される。エラーバーは、Ａ−ＧおよびＩにおけるＳＤを表す．Ａ−ＧおよびＩにおけるすべての実験は、少なくとも３回行われた。
【０００８】
図９ａ‐９ｅは、ＡｂｉおよびＤ４Ａへの長期間の曝露がＳＲＤ５Ａ発現および酵素活性の増加およびＤ４Ａから５α還元したＡｂｉ代謝産物への転換の増加をもたらすことを示すスキーム、画像およびグラフを提供する。（Ａ）実験スキーマ。ＶＣａＰ細胞をＤＨＥＡ（１００ｎＭ）単独で、または示した濃度のＡｂｉまたはＤ４Ａとともに６ヶ月間連続して培養した。ＬＮＣａＰ細胞を同様の条件下（それぞれＬＮ１、ＬＮ３およびＬＮ５＝ＶＣａＰ１、ＶＣａＰ３およびＶＣａＰ５処理）で処理した。ＡｂｉまたはＤ４Ａによる処理は、ＶＣａＰ（Ｂ）およびＬＮＣａＰ（Ｃ）におけるＳＲＤ５Ａ酵素活性の増加およびＤ４Ａの５α−Ａｂｉ代謝産物への変換の増加を誘導する。細胞を［３Ｈ］−ＡＤ、［３Ｈ］−Ｔ、またはＤ４Ａで２４時間または４８時間処理し、５α還元代謝産物への変換をＨＰＬＣで評価した。ＳＲＤ５Ａ１タンパク質発現は、ＶＣａＰ（Ｄ）およびＬＮＣａＰ（Ｅ）におけるＡｂｉおよびＤ４Ａ処理により増加する。（Ｃ）および（Ｄ）は、３回繰り返して、ＳＤはエラーバーを表す。全ての実験は少なくとも３回行った。
図１０Ａ−図１０ＦはＳＲＤ５Ａ阻害が血清Ｄ４Ａを有意に増加させ、且つアビラテロンアセテートで治療された患者の血清における全ての三種の５α−アビラテロン代謝産物を特異的かつ有意に枯渇させることを示すグラフおよび表を提供する。（Ａ）臨床試験スキーマ。アビラテロンアセテート＋プレドニゾン（開始サイクル３）での治療の二ヶ月後に、１ヶ月および４ヶ月（開始サイクル４および７）のデュタステリドによる治療の追加後に、Ａｂｉ代謝産物を測定するための血液を採取した。血清中の（Ｂ）Ａｂｉ、（Ｃ）Ｄ４Ａ、（Ｄ）全ての三種の５α還元Ａｂｉ代謝産物、および（Ｅ）全ての三種の５β−還元のアビラテロン代謝産物における血清濃度。（Ｆ）臨床試験の３つの時点のそれぞれにおける平均ＡｂｉおよびＡｂｉ代謝産物濃度を示す表の要約。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明者らは、治療的有効量のＣＹＰ１７Ａ阻害剤および有効量の５−α−レダクターゼ阻害剤を投与することにより、患者における前立腺癌などのステロイド依存性疾患を治療することができることを実証した。
定義
本明細書に記載される単語は実施例を説明するためのものに過ぎず、本発明を全体として限定するものとして解釈されるべきではない。単数形「一」、「一つ」および「該」は、本発明の説明および添付の特許請求の範囲において使用される場合、それらを取り巻く文脈によって禁忌を示さない限り、複数形を含む。
本明細書で使用される「治療」、「処理」および「処置」などは、前立腺癌などのステロイド依存性疾患に罹患している患者に利益をもたらす任意の行為を指し、少なくとも１つの症状の緩和または抑制、疾患の進行の遅延などが挙げられる。
本明細書で使用される予防とは、前立腺癌のようなステロイド依存性疾患に罹患する危険性のある患者に対し、障害の軽減または疾患の発症の回避または万が一発病した場合の一つまたは複数の症状の減少を含む利益を提供する任意の作用を意味する。被験体は、家族歴の結果として危険にさらされている可能性がある。
本明細書で使用される「薬学的に許容される」とは、疾患の重篤度および治療の必要性に照らして、化合物または組成物が、過度に有害な副作用なしに、本明細書に記載の方法に係る患者への投与に適していることを意味する。
用語「治療的有効」は、代替的な療法に典型的に関連する有害な副作用を回避しつつ、疾患重篤度を低下させるという目標を達成する各薬剤の量を限定することを意図する。治療的有効量は、１回以上の用量で投与することができる。一方、有効用量は、酵素阻害などの特定の効果を提供するのに十分な量であるが、治療的に有効であってもなくてもよい。
【００１０】
本明細書で使用される「診断」という用語は、患者における疾患の性質を確定すること、ならびに疾患または疾患のエピソードの重篤度および可能性のある結果および／または回復の見込み（予後）のを確定することを包含し得る。「診断」は、治療の初期選択、治療の修正（例えば、用量および／または投薬計画の調整）などを含む、合理的治療のコンテキストでの診断も含むことができる。
本発明は、異性体（例えば、ジアステレオマーおよびエナンチオマーを含む）、互変異性体、塩、溶媒和物、多形体、プロドラッグなどを含む、それらの薬学的に許容される形態のいずれかの本明細書に記載の活性剤（ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）を包含する。特に、化合物が光学活性である場合、本発明は、具体的には、化合物の各々のエナンチオマーおよび該エナンチオマーのラセミ混合物を含む。「化合物」という用語は、明示的に記載されているか否かにかかわらず（時には「塩」が明示されているが）、そのような形態のいずれかまたはすべてを含むことを理解すべきである。
ステロイド依存性疾患の治療
一態様では、本発明は、治療的有効量のＣＹＰ１７Ａ阻害剤および有効量の５−α−レダクターゼ阻害剤を患者に投与することを含む、それを必要とする患者におけるステロイド依存性疾患を治療する方法を提供する。
予防的および／または治療的処置を提供するために、ＣＹＰ１７Ａ阻害剤および５−α−レダクターゼ阻害剤（すなわち、活性剤）の併用投与を使用することができる。本発明の活性薬剤は、例えば、ステロイド依存性疾患の罹患に先立って、予防的に被験体に投与することができる。予防的（すなわち、防止的）投与は、患者におけるステロイド依存性疾患がその後に発生する可能性を減少させるか、またはその後に起こるステロイド依存性疾患の重篤度を低下させるのに有効である。ステロイド依存性疾患の家族歴を有する患者のような、ステロイド依存性疾患を発症する危険性が高い患者に、予防的治療を施すことができる。
【００１１】
あるいは、活性剤は、既にステロイド依存性疾患に罹患している患者に治療的に投与することができる。ステロイド依存性疾患を有すると診断された患者は、治療を必要とする患者である。癌治療を必要とする患者は、望ましくない急速な細胞増殖を特徴とする障害を有すると診断された患者であり得る。このような障害には、癌および前癌状態が含まれるが、これらに限定されない。治療的投与の一実施形態において、化合物の投与は、ステロイド依存性疾患を消滅するのに有効である；別の実施形態では、活性剤の投与は、ステロイド依存性疾患の重篤度を低下させるか、または罹患した患者の寿命を延ばすのに有効である。被験体は、好ましくは、飼いならされた家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ）またはペット（例えば、イヌ、ネコ）などの哺乳類である。より好ましくは、被験体はヒトである。
ステロイド依存性疾患
本発明は、ステロイド依存性疾患の診断、治療および指導のための方法を提供する。ステロイド依存性疾患は、本明細書中で使用される場合、その持続にとってステロイドホルモンの存在が必要である疾患を指す。特に、ステロイド依存性疾患とは、酵素ＣＹＰ１７Ａ１が、疾患が依存するステロイドの量を調節する役割を果たす疾患を指す。ステロイド依存性疾患の例としては、喘息、高血圧、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎）、腎炎症候群、子宮内膜症、副腎機能障害、乳癌および前立腺癌が挙げられる。本明細書で使用される場合、ステロイド依存性疾患は、ステロイド依存性疾患であると通常は特徴づけられるが、ステロイド非依存性を有するかまたは進展する疾患を包含する。
いくつかの実施形態において、ステロイド依存性疾患は癌である。ステロイド依存性癌の例には、膀胱癌、乳癌、子宮内膜癌、膵臓癌および前立腺癌が含まれる。ステロイド依存性である可能性があるさらなるタイプの癌の同定が進行中である。いくつかの実施形態では、癌が依存するステロイドは性ステロイドである。性ステロイド（生殖腺ステロイドとも呼ばれる）は、アンドロゲンまたはエストロゲン受容体と相互作用するステロイドホルモンである。性ステロイドには、タンパク同化ステロイド、アンドロステンジオン、デヒドロエピアンドロステロン、ジヒドロテストステロン、およびテストステロンなどのアンドロゲン；エストラジオール、エストリオール、エストロンなどのエストロゲン；プロゲストゲンであるプロゲステロンが挙げられる。
本明細書で使用する「腫瘍」または「癌」という用語は、被験体の異常な細胞の異常な急速な増殖を特徴とする状態を指す。異常な細胞は、しばしば、固形腫瘍を形成し得る形質転換細胞である「腫瘍性細胞」と呼ばれる。「腫瘍」という用語は、悪性または良性を問わず、過剰または異常な細胞分裂および前癌性および癌性細胞に起因する、異常な集団または細胞の集団（例えば、２つ以上の細胞）を指す。悪性腫瘍は、制御されない細胞増殖に加えて、周囲の組織に侵入して転移する可能性があるという点で、良性の増殖または腫瘍とは区別される。
いくつかの実施形態では、癌は前立腺癌である。本明細書で使用される前立腺癌は、オスの生殖器系の前立腺において癌が発生する疾患を指す。前立腺癌は、正常な精液を分泌する前立腺細胞が癌細胞に突然変異したときに始まる腺癌として分類される。前立腺癌の初期段階では、癌細胞の小さな塊が、他の正常な前立腺に限定されたままであり、前立腺癌上皮内癌または前立腺上皮内新生組織形成（ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ、ＰＩＮ）状態として知られ、前立腺癌の前癌病変である。時間の経過とともに、これらの癌細胞は増殖して周囲の前立腺組織（基質）に広がり始め、腫瘍を形成する。前立腺癌が前立腺に由来し且つ残っている可能性があるが、前立腺腫瘍細胞は、血流およびリンパ系を移動する能力を発達させ、したがって、他の器官または組織に見られる。前立腺癌は、骨、リンパ節、直腸、および膀胱に最も一般的に転移する。本明細書中で使用される場合、前立腺癌の治療または予防は、他の器官または組織に見られる転移前立腺癌の治療も指す。
【００１２】
ほとんどのステロイド依存性癌は、１〜３年後に難治になり、治療されても増殖を再開する。したがって、いくつかの実施形態では、前立腺癌は、ホルモン耐性前立腺癌またはアンドロゲン非依存性前立腺癌としても知られている去勢抵抗性前立腺癌である。去勢抵抗性前立腺癌を有する患者は、もはや化学療法または外科的手段による利用可能なアンドロゲン／テストステロン／ＤＨＴの減少である去勢治療に対して、非応答性になっている。しかしながら、これらの癌は、アンドロゲン受容体活性化のためのホルモン依存性を依然として示す。
前立腺癌または他のステロイド依存性疾患の存在は、当業者に公知の様々な技術を用いて確認することができる。前立腺癌の存在を確認する好ましい方法は、生検を行うことである。前立腺癌生検では、典型的には、前立腺由来の組織試料は、特別な中空コア針を挿入して除去する生検銃を使用して、直腸を介して取得するものである。続いて、組織試料を顕微鏡下で検査して、癌細胞が存在するか否かを判定し、発見された癌の顕微鏡的特徴またはグリーソンスコアを評価する。ヒト被験体が前立腺癌を有するか否かを確定するための追加の手順には、直腸指診、膀胱鏡検査、経直腸的超音波断層法、超音波および磁気共鳴映像法が含まれるが、これらに限定されない。
【００１３】
癌治療の場合、ステロイド依存性疾患の治療方法は、癌を消滅するステップをさらに含むことができる。癌の除去は、凍結アブレーション、熱アブレーション、放射線療法、化学療法、高周波アブレーション、エレクトロポレーション、アルコールアブレーション、高密度焦点式超音波、光力学療法、モノクローナル抗体の投与、および抗毒素の投与からなる群から選択される方法を用いて達成することができる。
活性剤
本発明は、ＣＹＰ１７Ａ阻害剤および５−α−レダクターゼ阻害剤との併用治療を用いてステロイド依存性疾患を治療する。ステロイド依存性疾患を有する被験体は、ステロイド代謝の変化を介してＣＹＰ１７Ａ阻害剤による治療に対する耐性を発達させることができる。アビラテロンは被験体において、以前に記載されていない代謝産物であるＤ４Ａに変換され、当該Ｄ４Ａがアンドロゲン経路に沿った複数の段階をブロックすることにより作用するより強力な薬物であること、本発明者から示された。したがって、アビラテロンによる臨床反応は、ある程度でＤ４Ａへの変換に依存している可能性がある。しかしながら、Ｄ４Ａは患者でさらに代謝され、ステロイド５−α−レダクターゼによって５−α−アビラテロンに変換される。Ｄ４Ａの強力な抗腫瘍効果とは対照的に、５−α−アビラテロンは、腫瘍増殖を促進すると予想されるアンドロゲン受容体を刺激するようである。しかし、Ｄ４Ａの５−α−アビラテロンへの変換は、５−α−レダクターゼ阻害剤によって薬理学的にブロックされ得る。
【００１４】
５‐α‐レダクターゼ阻害剤は、ステロイド依存性疾患の治療に使用されるＣＹＰ１７Ａ阻害剤に対する耐性を克服するその能力からその有効性の有意な部分を導くので、ＣＹＰ１７Ａ阻害剤および５−α−レダクターゼ阻害剤は、５−αレダクターゼ阻害剤がＣＹＰ１７Ａ阻害剤の有効性を増加させるために十分に密接に投与される。これは、本明細書では、時間的に近接して投与されると言及することができる。時間的に近接するという構成は、個体の代謝や、投与されるＣＹＰ１７Ａ阻害剤および５−α−レダクターゼ阻害剤の用量によって変化し得る。いくつかの実施形態では、時間的に近接することは、他の薬剤の投与の１時間以内、６時間以内、１２時間以内、または２４時間以内であってもよい。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ１７Ａ阻害剤および５−α−レダクターゼ阻害剤は同時に投与される。しかしながら、他の実施形態では、５−α−レダクターゼ阻害剤は、ＣＹＰ１７Ａ阻害剤投与の前後のいずれかに、またはＣＹＰ１７Ａ阻害剤投与の直前またはＣＹＰ１７Ａ阻害剤投与後の時間に近接して、時間的に近接して投与することができる。
ＣＹＰ１７Ａおよび５−α−レダクターゼ阻害剤は、ペアとして、または補助的療法のように、他の薬物もしくは栄養素と組み合わせて投与することができる。本願に係る化合物の用途および、一つまたは複数の他の医薬品の用途を定義する際の用語「補助療法」または「併用療法」は、薬物の有益な効果をもたらす投薬計画において、各薬剤の投与を逐次的に包含することが意図され、規定割合のこれらの活性剤を有する単一の製剤設計、または各薬剤における複数の別個の製剤設計のような、ほぼ同時の形態でこれらの薬剤を共投与することを包含することも意図される。
【００１５】
多くのＣＹＰ１７Ａ阻害剤が公知であり、この方法での使用に適している。ステロイド１７−α−モノオキシゲナーゼ、または１７α−ヒドロキシラーゼ／１７，２０リアーゼ／１７，２０デソラーゼとしても知られているシトクロムＰ４５０  １７Ａ（ＣＹＰ１７Ａ）は、ヒトにおいてＣＹＰ１７Ａ１遺伝子によってコードされる酵素である。これは１７α−ヒドロキシラーゼ活性および１７，２０−リアーゼ活性の両方を有し、プロゲスチン、ミネラロコルチコイド、グルココルチコイド、アンドロゲンおよびエストロゲンを産生するステロイド生成経路の重要な酵素である。ＣＹＰ１７Ａ阻害剤の例には、アビラテロン、アビラテロン代謝産物であるＤ４Ａ、ガレテロン、オルテロネル、ＶＴ−４６４、およびＣＦＧ９２０が含まれる（Ｇｏｍｅｚら、Ｓｔｅｒｏｉｄｓ、９５，８０−８７（２０１５））。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ１７Ａ阻害剤は、アビラテロン、アビラテロン代謝産物であるＤ４Ａおよびガレテロンからなる群から選択されるステロイド化合物であり、さらなる実施形態では、ＣＹＰ１７Ａ阻害剤は、アビラテロンおよびアビラテロン代謝産物であるＤ４Ａからなる群から選択される。
【００１６】
幅広い種類の５−α−レダクターゼ阻害剤が公知であり、本方法における使用に適している。これらの薬剤は、種々の内因性ステロイドの代謝変換に関与する酵素である５α−レダクターゼを阻害する。５α−レダクターゼは、３−オキソ−５α−ステロイド４−デヒドロゲナーゼとも呼ばれ、ステロイド代謝に関与する酵素である。５αレダクターゼのアイソザイム（１、２、および３）が３つあり、それらは年齢とともに組織で様々に変化する。５α−レダクターゼ阻害は、アンドロゲン関連障害において、主要にアンドロゲン性ホルモンであるテストステロンのより強力なジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）への変換を防止するために用いられることが最もよく知られている。いくつかの実施形態では、５−α−レダクターゼ阻害剤は、デュタステリド、フィナステリド、ラピスタリド、トルステリミド、ベクスロステリド、イズステリド、およびエプリテラチドからなる群から選択される。
候補薬剤は、動物モデルにおいて試験することができる。動物モデルは、治療中の前立腺癌などのステロイド依存性疾患に適したものでなければならない。例えば、動物モデルは癌の研究のためのものであり得る。動物モデル（例えば、マウス）における様々な癌の研究は、ヒト癌の研究のために一般的に受け入れられているプラクティスである。例えば、ヒト腫瘍細胞が動物に注入されたヌードマウスモデルは、広範囲の癌の研究に有用な一般的なモデルとして一般に受け入れられている（例えば、Ｐｏｌｉｎら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ、１５：９９−１０８（１９９７））。一般的に、候補薬剤で処置した対照動物と処置を受けなかった対照同腹仔との間で結果を比較する。トランスジェニック動物モデルも利用可能であり、ヒト疾患のモデルとして一般に受け入れられている（例えば、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：３４３９−３４４３（１９９５））。候補薬剤を、例えば、癌転移、癌細胞運動、癌細胞侵襲性、またはそれらの組み合わせを含む、癌に関連する一つまたは複数の症状を減少させるかどうかを確定するために、これらの動物モデルに投与することができる。
１つ以上のＣＹＰ１７Ａ阻害剤の代謝産物のレベルを確定することによる治療の修正
本方法の別の実施形態は、被験体由来の生物学的試料中の一つ以上のＣＹＰ１７Ａ阻害剤の代謝産物のレベルを確定することによって治療を修正するステップを含む。ＣＹＰ１７Ａ阻害剤の代謝産物のレベルは、５−α−レダクターゼ阻害剤による治療が修正されるべきかどうかを評価するために用いることができる。換言すれば、ＣＹＰ１７Ａ阻害剤の代謝産物は、治療の有効性を監視するためのバイオマーカーとして使用される。治療修正には、例えば、投与される５−α−レダクターゼ阻害剤の変更、投薬計画の変更、または投与される５−α−レダクターゼまたはＣＹＰ１７Ａ阻害剤の用量の変更が含まれる。代謝産物は、典型的にはステロイド代謝産物である。例えば、アビラテロンが投与される場合、ＣＹＰ１７Ａ阻害剤の代謝産物は、Ｄ４Ａ、３β−ヒドロキシ−５β−アビラテロン、３−ケトン−５α−アビラテロン、３−ケトン−５β−アビラテロン、３α−ヒドロキシ−５α−アビラテロン、３α−ヒドロキシ−５β−アビラテロンと３β−ヒドロキシ−５α−アビラテロンからなる群から選択されるステロイド代謝産物を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、この方法は、治療前に被験体から採取された生物学的試料中の一つ以上のＣＹＰ１７Ａ阻害剤の代謝産物のレベルを確定し、続いて治療期間または治療後に被験体から採取された対応の生物学的試料におけるＣＹＰ１７Ａ阻害剤の代謝産物のレベルを確定することを含む。あるいは、この方法は、治療前または治療後に被験体から採取された生物学的試料中の一つ以上のＣＹＰ１７Ａ阻害剤の代謝産物のレベルを確定し、それらを所定の値と比較することを含んでもよい。ステロイド依存性疾患を治療するためのステロイド合成の阻害が維持されていることを示すポジティブな指標となることがあるが、ＣＹＰ１７Ａ阻害剤の代謝産物形成のレベルの増加は、治療が修正されるべきであるという兆候である。
生物学的試料としては、尿および血液関連試料（例えば、全血、血清、血漿、および他の血液由来試料）、尿、脳脊髄液、気管支肺胞洗浄液などの体液が挙げられるがそれに限定されない。生物学的試料の別の例は、組織試料である。被験体から採取された生体試料中のＣＹＰ１７Ａ阻害剤の代謝産物のレベルは、定量的または定性的に、通常は定量的に評価することができる。ＣＹＰ１７Ａ阻害剤の代謝産物のレベルは、インビボまたはインビトロのいずれかで確定することができる。
生物学的試料は新鮮であっても保存されていてもよい（例えば、血液バンクに保存された血液または血液成分）。１時間、１日、１週間、１ヶ月間、または１ヶ月以上保存するなど、試料をさまざまな時間、保存できます。生物学的試料は、本発明のアッセイのために明示的に得られた体液または本発明のアッセイのためにサブサンプリングすることができる別の目的のために得られた体液であってもよい。
被験体におけるＣＹＰ１７Ａ阻害剤の代謝産物のレベルは、ステロイドおよびその断片を同定することができる検出器を含む機械である分析装置を用いて測定することができる。分析装置は、質量分析計、紫外線分光計、核磁気共鳴分光計などの分光装置であってもよい。分光計は、生物学的試料（例えば、体液）のような媒体中の規定物質の濃度または量を評価するために分光技術を使用する装置である。ＣＹＰ１７Ａ阻害剤の代謝産物のレベルを測定するために使用される分析装置は、ポータブル装置または固定装置のいずれでもよい。分析装置は、ＣＹＰ１７Ａ阻害剤の代謝産物を検出するために使用される装置を含めることに加えて、分析前の分析物の精製（すなわち、物理的分離）を提供する追加の装置を含むこともできる。例えば、検体検出器が質量分析計である場合、ＣＹＰ１７Ａ阻害剤の代謝産物を質量分析による検出前に精製するための高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）またはガスクロマトグラフ（ＧＣ）を含むことができ、またはゲル電気泳動を用いてタンパク質を精製することが好ましい。
【００１８】
本明細書に示されるように、質量分析に基づく方法を使用して、生物学的試料中のＣＹＰ１７Ａ阻害剤の代謝産物のレベルを評価することができる。質量分析計は、イオン化源（例えば、エレクトロスプレーイオン化）、その質量電荷比（ｍ／ｚ）比に従ってイオン化源に形成されたイオンを分離する分析器、および荷電イオンを検出する検出器を含む。タンデム質量分析では、２つ以上の分析装置が含まれる。そのような方法は、当技術分野で標準的であり、例えば、オンラインエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）およびタンデム質量分析を有するＨＰＬＣを含む。
いくつかの実施形態では、被験体から得られた生物学的試料中のＣＹＰ１７Ａ阻害剤の代謝産物のレベルを、所定の値と比較する。一実施形態では、所定の値は、ＣＹＰ１７Ａ阻害剤を投与されている被験体のプールから得られた同等のサンプル中のＣＹＰ１７Ａ阻害剤の代謝産物のレベルに基づく。これらの対照被験体はまた、５−α−レダクターゼ阻害剤を受けていてもよく、または５−α−レダクターゼ阻害剤を受けていなくてもよい。
当業者に公知の任意の適切な方法によって比較を行うことができる。例えば、分析装置を操作する個人によって、または分析装置によって提供されるデータにアクセスする他の個人によって、数学的または定性的な比較を実行することができる。あるいは、ＣＹＰ１７Ａ阻害剤の代謝産物のレベルを確定し、比較するステップは、（例えば、電子データプロセッサーによって）電子的に行うことができる。
薬物投与および処方
本発明はまた、活性成分としてのＣＹＰ１７Ａ阻害剤および５−α−レダクターゼ阻害剤、および活性成分と組み合わる、薬学的に許容される液体または固体のベクターを含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物はステロイド依存性疾患の治療に適している前述のいずれかの化合物を含む。
該化合物は、薬学的に許容される塩として投与することができる。薬学的に許容される塩とは、化合物の比較的非毒性の無機酸および有機酸の付加塩を指す。これらの塩は、化合物の最終的な単離および精製の間にｉｎ  ｓｉｔｕで調製することができ、または化合物の性質に依存して、式Ｉの精製化合物を適切な対イオンと別々に反応させ、そのように形成された塩を単離することによって調製することもできる。代表的な対イオンには、塩化物、臭化物、硝酸塩、アンモニウム塩、硫酸塩、トシレート、リン酸塩、酒石酸塩、エチレンジアミン塩およびマレイン酸塩などが含まれる。例えば、Ｈａｙｎｅｓら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ，９４，２１１１−２１２０（２００５）を参照。例えば、アビラテロンの好ましい塩形態は酢酸アビラテロンである。
前記医薬組成物は、当業者に知られている様々な希釈剤または賦形剤を含む、被験体に送達するための１つまたは複数の様々な生理学的に許容される担体および１つまたは複数の活性成分を含む。例えば、腸管外の場合、等張性生理食塩水が好ましい。局所投与の場合、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの担体を含むクリーム、またはペプチドの活性をブロックまたは阻害しない局所クリームに通常見られる他の薬剤を使用することができる。他の適切な担体には、エチルアルコール、リン酸緩衝化生理食塩水、および他の平衡塩類溶液が含まれるが、これらに限定されない。
【００１９】
該製剤は、便宜上、単位投薬形態で提供することができ、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製することができる。好ましくは、このような方法は、活性薬剤を１つ以上の付属成分を構成する担体と結合させるというステップを含む。一般的に、製剤は、液体担体、細かく分割された固体担体、またはその両方と活性薬剤を均一かつ密接に接触させ、続いて必要に応じて生成物を所望の製剤に成形することによって調製される。本発明の方法は、所望の効果を生じるのに有効な量で、本発明の組成物を被験体、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに投与することを含む。ＣＹＰ１７Ａ阻害剤および５−α−レダクターゼ阻害剤は、単回投与または複数回投与として投与することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性および動物モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ活性を比較することにより、活性薬剤の有用な用量を確定することができる。マウスおよび他の動物における有効な投薬量をヒトに外挿する方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第４，９３８，９４９号を参照されたい。
本発明の薬剤は、好ましくは、医薬組成物中に調合され、続いて、本発明の方法に従って、ヒト患者などの被験体に、選択された投与経路に適合した様々な形態で投与される。製剤には、経口、吸入、直腸、膣、局所、経鼻、点眼、または腸管外（皮下、筋肉内、腹腔内および静脈内投与）に適したものが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＹＰ１７Ａ阻害剤および／または５−α−還元酵素阻害剤を経口投与する。経口投与に適した本発明の製剤は、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、ロゼンジ剤、ウエハーまたはカシェ剤のような別個の単位として提供することができ、それぞれ活性化合物含有の粉末または顆粒、リポソーム、シロップ、エリキシル、エマルジョンまたはドラフトのような水性液体または非水性液体中の溶液または懸濁液とする。そのような組成物および調製物は、典型的には、少なくとも約０．１ｗｔ％の活性剤を含有する。式Ｉで表れる化合物（すなわち、活性薬剤）の量は、その用量レベルが被験体において所望の結果を生じるのに有効であるような量である。
【００２０】
吸入製剤には、吸入器からの投与用に設計された製剤が含まれる。吸入または吹き入れのための組成物は、薬学的に許容される水性または有機溶媒、またはそれらの混合物における溶液および懸濁液、エアロゾルならびに粉末を含む。好ましくは、組成物は、局所的または全身的効果のために、経口または鼻の呼吸経路によって投与される。好ましくは、薬学的に許容される溶媒中の組成物を、不活性ガスによって霧状にすることができる。好ましくは、溶液、懸濁液または粉末組成物を、適切な方式で製剤を送達するデバイスから、経口的または経鼻的に投与することができる。経鼻スプレー製剤には、活性剤と保存剤および等張剤の精製水溶液が含まれる。好ましくは、そのような製剤を、鼻粘膜に適合するｐＨおよび等張性状態に調整する。
直腸または膣投与のための製剤は、カカオバター、または硬化脂肪または硬化脂肪カルボン酸などの適切な担体を用いて坐薬として製造することができる。眼科用製剤は、ｐＨおよび等張性因子を好ましくは眼に適合するように調整することを除いて、鼻スプレーと同様の方法によって調製される。局所用製剤には、鉱油、石油、ポリヒドロキシアルコール、または局所医薬製剤用他の基剤などの一つまたは複数の媒体に溶解または懸濁された活性剤が含まれる。
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などはまた、以下の一つまたは複数の成分を含むことができる：トラガントゴム、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；スクロース、フルクトース、ラクトースまたはアスパルテームなどの甘味剤；天然または人工香味料。単位剤形がカプセル剤である場合、それは植物油またはポリエチレングリコールのような液体担体をさらに含んでもよい。様々な他の物質がコーティングとして存在してもよく、または他の方式で固体単位剤形の物理的形態を改変してもよい。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤は、ゼラチン、ワックス、シェラック、砂糖などでコーティングすることができる。シロップ剤またはエリキシル剤は、一つまたは複数の甘味剤、メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどの保存剤、糖の結晶化を遅延させる薬剤、多価アルコールのような他の成分の溶解性を高めるグリセロールまたはソルビトールなどの薬剤、、染料および香味剤を含んでもよい。任意の単位投薬形態の調製に使用される材料は、使用量でほぼ無毒である。活性薬剤は、徐放性調製物およびデバイスに組み込むことができる。
化合物の調製
本発明の化合物は、特に本明細書に含まれる説明に照らして、化学分野において周知の方法と同様の方法を含む合成経路によって合成することができる。出発材料は、一般的に、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）のような商業的供給源から入手可能であるか、または当業者に周知の方法を用いて容易に調製される（例えば、Ｌｏｕｉｓ．ＦｉｅｓｅｒおよびＭａｒｙ  Ｆｉｅｓｅｒ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ｖ．１−１９，Ｗｉｌｅｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９６７−１９９９ｅｄ．）；Ａｌａｎ  Ｒ．Ｋａｔｒｉｔｓｋｙ，Ｏｔｔｏ  Ｍｅｔｈ−Ｃｏｈｎ，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｗ．Ｒｅｅｓ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ｖ．１−６，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，（１９９５）；Ｂａｒｒｙ  Ｍ．ＴｒｏｓｔおよびＩａｎ  Ｆｌｅｍｉｎｇ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｖ．１−８，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，（１９９１）；またはＢｅｉｌｓｔｅｉｎｓ  ｈａｎｄｂｕｃｈ  ｄｅｒ  ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ  Ｃｈｅｍｉｅ，４，Ａｕｆｌ．Ｅｄ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，付録を含む（Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎのオンラインデータベースからも入手可能））。
当業者であれば、本発明の化合物を合成するために様々な合成経路を使用できることを理解するできる。特定の出発物質および試薬は反応スキームに説明され、以下で議論されるが、種々の誘導体および／または反応条件を提供するために他の出発物質および試薬を容易に置換することができる。さらに、以下に記載の方法によって調製される化合物の多くは、当業者に周知の従来の方法を用いて本開示に照らしてさらに修飾することができる。
【００２１】
本発明を以下の実施例によって説明する。特定の例、材料、量および手順は、本明細書に記載された本発明の範囲および精神に従って広く解釈されるべきであることを理解されたい。
実施例
実施例１：アビラテロンからＤ４Ａへの変換は、前立腺癌に対する抗腫瘍活性を駆動する：
前立腺癌の去勢に対する耐性の発達理由について、腫瘍が、前駆ステロイドを５α−ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）に変換し、アンドロゲン受容体（ＡＲ）によるシグナル伝達および去勢耐性前立腺癌（ＣＲＰＣ）の発達を促進する代謝能力を獲得するからである（  Ｃｈａｎｇら、Ｃｅｌｌ，１５４：１０７４−１０８４（２０１３））。副腎前駆体ステロイドからのＤＨＴ合成、またはおそらくコレステロールからの新規合成によるＤＨＴ合成は、３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３βＨＳＤ）、ステロイド−５α−レダクターゼ（ＳＲＤ５Ａ）および１７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１７βＨＳＤ）アイソザイムによる酵素反応を一般に必要とする（Ｋｎｕｄｓｅｎ  ＫＥ，ＰｅｎｎｉｎｇＴＭ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ，２１：３１５−３２４（２０１０）））。ステロイド性１７α−ヒドロキシラーゼ／１７，２０−リアーゼ（ＣＹＰ１７Ａ１）阻害剤であるアビラテロンは、この合成プロセスをブロックし、生存期間を延長する（Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，  ３６８（２）：１３８−４８，（２０１２））。本発明者らは、アビラテロンが酵素によって複数のステロイド生成酵素をブロックし、アンドロゲン受容体（ＡＲ）に拮抗するより活性なΔ４−アビラテロン（Ｄ４Ａ）に変換されると仮定し、アビラテロンの臨床活性についてのさらなる説明を提供する。ここでは、マウスおよび前立腺癌患者において、アビラテロンがＤ４Ａに変換されることを示す。Ｄ４Ａは、ＤＨＴ合成に必要なＣＹＰ１７Ａ１，３βＨＳＤおよびＳＲＤ５Ａを阻害する。さらに、Ｄ４Ａによる競合的ＡＲ拮抗作用は強力なアンタゴニストであるエンザルタミド（ｅｎｚａｌｕｔａｍｉｄｅ）に匹敵する。Ｄ４Ａはまた、異種移植片腫瘍に対してアビラテロンよりも強力な抗腫瘍活性を有する。本発明者らの知見は、アビラテロンの生存延長のためのさらなる説明としてより活性な薬剤への変換を示唆している。本発明者らは、Ｄ４Ａによる直接治療は、アビラテロン治療よりも臨床的に有効であると提案する。
【００２２】
アンドロゲン合成に必要とされる酵素であるＣＹＰ１７Ａ１をブロックするアビラテロン（Ａｂｉ）および強力かつ効果的にＡＲを競合的にブロックするエンザルタミドによって与えられる臨床的利益および全生存期間の利点から、ＣＲＰＣにおけるアンドロゲン代謝とＡＲの中心的役割および重要な要件が実証される（Ｂｅｅｒら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３７１（５）：４２４−３３（２０１４））。Ａｂｉ（バイオアベイラビリティのためにそのアセテート形態で投与される）はステロイド性化合物であり、したがってステロイド代謝酵素による変換の可能性がある。本発明者らは、天然ステロイド基質デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）およびΔ５−アンドロステンジオール（Ａ５ジオール）にも存在するＡｂｉのΔ５，３β−ヒドロキシル構造を仮定し、３βＨＳＤアイソザイムによるそのΔ４，３ケトンコンジナー（Δ４−アビラテロンまたはＤ４Ａ）への変換に感受性になって、それによりステロイドのＡ環とＢ環がテストステロンと同じになったことで、ＡＲおよびＤＨＤ合成に必要なＳＲＤ５Ａを含むステロイド生成酵素との阻害相互作用を可能にする（図１ａ）。末梢組織におけるそのような変換は、Ｄ４Ａがアンドロゲン経路へのその効果を増強するために複数の標的と関与することを可能にし、Ａｂｉ療法の臨床的効力の代替的説明、したがって直接的治療がより有効である可能性を提供する。
本発明者らは、アビラテロンアセテートを投与したマウスの血清（図１ｂ）ならびにアビラテロンアセテートで処置しているＣＲＰＣ患者の血清（図１ｃ、Ｉｄ）においてＤ４Ａが検出可能であることを見出した。通常３βＨＳＤ活性が低いＬＡＰＣ４前立腺癌細胞株では、３βＨＳＤが過剰発現している場合のみ、ＡｂｉのＤ４Ａへの変換が検出可能である（図１ｅ）。頑強な内在性３βＨＳＤ酵素活性を有するマウス副腎（マウス前立腺ではない）のような他の組織も、ＡｂｉをＤ４Ａに変換する。これらの結果は、Ｄ４ＡがＡｂｉの主要代謝産物であり、変換のために３βＨＳＤを必要とし、Ａｂｉに間接的に起因する腫瘍に影響を与える可能性があることを示唆している。
【００２３】
Ｄ４Ａは、ＣＹＰ１７Ａ１，３βＨＳＤ、ＳＲＤ５ＡおよびＡＲとの直接相互作用（図２Ａ）を含む、アンドロゲン経路の複数の段階に影響を及ぼし得る。増強されたＡｂｉ薬剤の曝露は３βＨＳＤをブロックするかもしれないが、通常の投与はおそらくそうではない（Ｌｉら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１８：３５７１−３５７９（２０１２））。一方、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；図２Ｂ）によって示すように、Ｄ４Ａは、ＬＮＣａＰおよびＶＣａＰ細胞における３βＨＳＤによる［３Ｈ］−ＤＨＥＡのΔ４−アンドロステンジオン（ＡＤ）への変換を阻害する点でＡｂｉよりも約１０倍強力である。Ｄ４Ａは、混合阻害カイネティクスで、ヒトアイソザイムである（３βＨＳＤ１および３βＨＳＤ２）の両方を阻害する（図２Ｃ）。ＣＹＰ１７Ａ１阻害は、Ａｂｉによる作用の主要な直接的メカニズムである（Ｆｅｒｒａｌｄｅｓｃｈｉら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９：３３５３−３３５９（２０１３））。改質ステロイドアゾールのコンフォメーション研究は、Ｄ４ＡのＡ環構造がＣＹＰ１７Ａ１への結合を著しく乱さないことを示唆している（Ｇａｒｒｉｄｏら、Ｊ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，１４３：１−１０（２０１４））。Ｄ４ＡおよびＡｂｉは同様に、ＣＹＰ１７Ａ１による［３Ｈ］−プレグネノロンのＤＨＥＡへの変換を阻止する。ＨＰＬＣによって示すように、３時間のインキュベーション後に、ＣＹＰ１７Ａ１を発現するインタクトな２９３細胞においてビヒクル、１ｎＭ  Ｄ４Ａおよび１ｎＭ  ＡｂｉによるＤＨＥＡの変換率はそれぞれ７０．１％、４．２％および２．６％である（図２Ｄ）。Ｄ４ＡのΔ４，３‐ケト構造は、ＴおよびＡＤのような生理学的ＳＲＤ５Ａ基質と同一である（図１Ａ）（Ｃｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，１０８：１３７２８−１３７３３（２０１１））。内在的に発現されたＳＲＤ５Ａに対するＤ４Ａの効果を確定するために、強力なＳＲＤ５Ａ酵素活性を示すＬＡＰＣ４細胞をＤ４Ａ、Ａｂｉまたはエンザルタミドで処理し、［３Ｈ］−ＡＤ（ＳＲＤ５Ａ１の好ましい天然基質）の存在下で培養した。Ｄ４Ａ（１０μＭ）は、ＡＤから５α−アンドロスタンジオンおよび他の５α−還元アンドロゲンへの変換をほぼ完全にブロックする一方、Ａｂｉおよびエンザルタミドは１００μＭの濃度でも検出可能な効果を示さない（図２ｅ）。
Ａｂｉは、特にリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）における突然変異の存在下で、ＡＲに対する適度な親和性を有することが報告されている（Ｒｉｃｈａｒｄｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，７２：２１７６−２１８２（２０１２））。３βＨＳＤによるＡｂｉのＤ４Ａへの変換は、ＴとＤＨＴの両方と共有される３−ケト構造を提供し、ＡＲに対する最も高い親和性を有するステロイド（図１ａ）を提供する。ＡｂｉからＤ４Ａの３−ケト構造への変換がＡＲに対する薬物親和性にどのように影響を及ぼすかを確定するために、我々は競合アッセイを行った。突然変異体（ＬＮＣａＰで発現され、ＩＣ５０＝５．３ｎＭ）および野生型（ＬＡＰＣ４で発現され、ＩＣ５０＝７．９ｎＭ）ＡＲに対するＤ４Ａの親和性は、Ａｂｉのものよりも大きく（それぞれＩＣ５０＝４１８および＞５００ｎＭ）、エンザルタミドに匹敵し（それぞれＩＣ５０＝２４および２３ｎＭ、図３Ａ−３Ｂ）またはわずかに大きく、且つビカルタミドよりも明らかに大きく、ビカルタミドはエンザルタミド導入前の最も強力な競合性非ステロイド性ＡＲ拮抗剤である。ＡＲ  ＬＢＤに対するＤ４Ａの親和性は、Ａｂｉよりも優れた一方、エンザルタミドよりも幾分低く、クロマチン上のＰＳＡ、ＴＭＰＲＳＳ２、およびＦＫＢＰ５調節エレメントに対するＤＨＴ誘発クロマチンにおけるＡＲ占有率への阻害に変換する（図３Ｃ）。ＡＲ親和性とＤ４Ａおよびエンザルタミドのクロマチン占有率への影響との間の不一致は、いくつかのＡＲアンタゴニストについて以前に報告されたように、不活性複合体における結合ＡＲ拮抗作用およびクロマチン結合と一致する（Ｈｏｄｇｓｏｎら，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ。２８０：６５１１−６５１９（２００５）。
【００２４】
我々は次に、アンドロゲン応答性遺伝子発現に対するＤ４Ａの効果の累積結果を調べた。Ａｂｉと比較して、Ｄ４Ａは、ＬＮＣＡＰ、ＬＡＰＣ４およびＣ４−２細胞株においてＤＨＴ、ＤＨＥＡおよびＲ１８８１によって誘導されるＰＳＡ、ＴＭＰＲＳＳ２およびＦＫＢＰ５の発現を明らかに良好に抑制する（図３Ｄ）。Ｄ４ＡはＡＲ標的遺伝子発現を用量依存的に阻害する。ＤＨＴ誘発内在性ＰＳＡ発現に対するＤ４Ａとエンザルタミドとの比較は、Ｄ４Ａが変異ＡＲおよび野生型ＡＲに対してエンザルタミドと同等であることを示している（図３Ｅ−図３Ｆ）。アンドロゲン応答性遺伝子発現の下流で、Ｄ４ＡおよびエンザルタミドのＤＨＴ刺激による細胞増殖に対する効果は同等であり（図３Ｇ）、両方ともＡｂｉよりも強力である。
組織培養にて観察されたＤ４Ａのステロイド合成に対す阻害作用が腫瘍においても生じるか否かを確定するために、強力な３βＨＳＤ酵素活性を有する２つの前立腺癌異種移植モデルにおける効果を評価した。効果的に酵素活性を増加させるミスセンス含有３βＨＳＤ１をコードする変異遺伝子を有するＶＣａＰおよびＬＮＣａＰ細胞の皮下マウス異種移植腫瘍を雄ＮＳＧマウスで増殖させた。新鮮な腫瘍を収穫し、細かく刻み、［３Ｈ］−ＤＨＥＡ＋ＡｂｉまたはＤ４Ａ（０．１−１０μＭ）とともにインキュベートした。３βＨＳＤによるＤＨＥＡからＡＤへの変換をブロックすることについて、図２に示す効果と同様に、Ｄ４Ａは、ＬＮＣａＰ（図４ａ）およびＶＣａＰ異種移植（図４Ｂ）において、Ａｂｉよりも１０倍強力である。例えば、ＬＮＣａＰおよびＶＣａＰ異種移植片の両方では、０．１μＭのＤ４Ａは、４８時間でのＡＤ蓄積をブロックするための１μＭのＡｂｉに相当する。ステロイド合成の阻害およびＡＲの直接遮断に対するＤ４Ａの併用効果が、Ａｂｉと比較して増強された抗腫瘍活性をもたらすかどうかを試験するために、ＶＣａＰ異種移植片を、ＤＨＥＡペレットで（ヒト副腎生理の模倣、図４Ｃ）睾丸を切除したマウスの皮下に移植してそれを成長させる。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を作成し、対数ランクで治療群を検定し比較することによって、Ｄ４Ａ、アビラテロンアセテートまたはビヒクルでの処置開始から腫瘍進行（腫瘍体積増加＞２０％）までの時間を評価した。進行はアビラテロンアセテート群と比較してＤ４Ａ群で有意に遅延した（Ｐ＝０．０１１）。我々はまた、Ｃ４−２細胞株モデルと同じ方法を用いて異種移植の成長を比較した。Ｄ４Ａ治療は、アビラテロンアセテートおよびエンザルタミドと比較して、無増悪生存期間を増加させた（図４Ｄ）。異種移植研究の終わりにＤ４Ａ処置マウスから採取した血清では、アビラテロンアセテートで処置した患者において最も高く上昇し、高血圧および高カリウム血症を引き起こす（Ａｔｔａｒｄら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，２６：４５６３−４５７１（２００８））ミネラルコルチコイドであるデオキシコルチコステロンの検出可能な増加はなかった。図４Ｅは、アンドロゲン経路における複数のサイトとＤ４Ａ、Ａｂｉおよびエンザルタミドの相対的効力を示し、患者における３βＨＳＤによるＡｂ４のＤ４Ａへの変換が、ＡＲシグナル伝達および前立腺癌の進行を阻害している。
【００２５】
次世代のホルモン療法であるＡｂｉとｅｎｚａｌｕｔａｍｉｄｅはそれぞれ１つの主要な標的（それぞれＣＹＰ１７Ａ１とＡＲ）を持っています。これらの薬物は、アンドロゲン合成およびＡＲ刺激が両方ともＣＲＰＣの発達および進行を促進するために必要不可欠な成分であることを臨床的に立証している。経口投与後、アビラテロンアセテートは加水分解され、それによりＣＹＰ１７Ａ１をブロックすることによって主要な活性剤であると考えられるＡｂｉに変換される。Ａｂｉの主要な認識された代謝産物は、肝におけるＣＹＰ３Ａ４およびＳＵＬＴ２Ａ１プロセシングから生じ、ＡｂｉおよびＡｂｉ硫酸のＮ−オキシドをそれぞれ形成する。これらの修飾のいずれも、ステロイド骨格のΔ５，３β−ヒドロキシル構造に影響しない。対照的に、Ｄ４Ａへの変換は、ＣＹＰ１７Ａ１阻害を保持しながら、ステロイド構造をＡＲ、ＳＲＤ５Ａおよび３βＨＳＤにより好適なステロイド構造に改変し、これらのすべての段階でアンドロゲンシグナル伝達を遮断する。患者におけるＡｂｉのＤ４Ａへの変換およびアンドロゲン経路の個々の成分への影響の臨床的意義は、約１μＭのＣｍａｘおよび広い患者間変動性を示す薬物動態試験の観点から見る必要がある。さらに、本発明者らの知見は、Ａｂ４と直接比較した場合、Ｄ４ＡもＣＲＰＣに対してはるかに強力な抗腫瘍活性を有することを示唆している。
ＣＲＰＣ患者をＤ４Ａで直接治療する潜在的な臨床的有用性は、完全に解明されていないＡｂｉに対する耐性の根本的なメカニズムおよびＡｂｉからの利益が枯渇した臨床状況に依存する。ある証拠は、持続性ＡＲシグナリングが少なくともＡｂｉ耐性症例のサブセットを特徴付けることを示唆している。例えば、ＣＲＰＣにおけるＡＲコピー数の増加は、Ａｂｉに対する臨床応答の欠如と関連し（Ｃａｒｒｅｉｒａら，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．６：２５４ｒａ１２５（２０１４）），、ＡＲタンパク質発現の増加は、取得されたＡｂｉへの臨床的耐性が発達する時に現るようである。Ａｂｉは強力なＣＹＰ１７Ａ１阻害剤であるが、患者の尿中ステロイド代謝産物の研究は、アンドロゲン合成阻害が不完全であることを示し、耐性機構としての持続性ステロイド生成の可能性を高める。（Ａｔｔａｒｄら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．９７：５０７−５１６（２０１２））。臨床的に、ＣＹＰ１７Ａ１阻害と強力なＡＲアンタゴニストの組み合わせは、ＣＲＰＣ患者においてより強力なアンドロゲンシグナル伝達阻害を与えるようである。（Ｅｆｓｔａｔｈｉｏｕら，ＡＳＣＯ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，３２：５０００（２０１４））
【００２６】
アビラテロンアセテートで処置した患者におけるＤ４Ａの循環濃度は、かなり変化するようである。肝臓Ａｂｉ代謝産物とは対照的に、末梢組織におけるＡｂｉのＤ４Ａへの変換によって、血清中の存在よりも末梢組織（ＣＲＰＣなど）の方が高いＤ４Ａ濃度をもたらす可能性がある。したがって、ＣＲＰＣにおけるアンドロゲンシグナル伝達に対するＤ４Ａの効果、特にＤＨＴ合成における遠位段階およびＡＲアンタゴニストとしての活性は、血清濃度のみに基づいて過小評価され得る。それにもかかわらず、末梢組織におけるＤ４ＡレベルおよびＡｂｉの臨床活性に対するＤ４Ａの正確な寄与は未だ確定されていない。
最後に、本発明者らの結果は、ステロイドと非ステロイド性ＣＹＰ１７Ａ１阻害剤との間に以前に評価されていなかったクラス効果が存在する可能性を高める。アビラテロンアセテートとは対照的に、非ステロイド性ＣＹＰ１７Ａ１阻害剤であるＴＡＫ−７００は、転移性ＣＲＰＣの生存期間を延長できなかった。（Ｆｉｚａｚｉら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，３３（７）：７２３−３１（２０１５））。下流の活性化ステロイド代謝産物が存在しないことがこれらの所見に寄与している可能性がある。この問題は、他のステロイド性および非ステロイド性のＣＹＰ１７Ａ１阻害剤がさらなる臨床研究を受けているため考慮すべきである。
結論として、本発明者らは、アビラテロンアセテートで処置したＣＲＰＣ患者に存在し、親薬物よりも強力な抗腫瘍活性を有する新規なＡｂｉ代謝産物を同定した。Ｄ４Ａへの変換は、Ａｂｉの使用で観察された臨床的活動の一部を担う可能性がある。我々は、Ｄ４Ａによる治療がＡｂｉよりも大きな臨床的利益をもたらす可能性があることを示唆している。
方法
細胞株
【００２７】
ＬＮＣａＰおよびＶＣａＰ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０中で維持した。ＬＡＰＣ４細胞は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｓａｗｙｅｒｓ博士（Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）から親切に提供され、１０％ＦＢＳ含有のＩｓｃｏｖｅ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  培地で増殖させた。Ｃ４−２細胞は、Ｌｅｌａｎｄ  Ｃｈｕｎｇ博士（Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）から親切に提供され、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０で維持された。ＬＮＣａＰおよびＶＣａＰを用いて行ったすべての実験は、ポリ−ＤＬ−オルニチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）でコーティングしたプレートで行った。プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＣＹＰ１７（カリフォルニア大学サンフランシスコ校のＷａｌｔｅｒ  Ｍｉｌｌｅｒ博士の寛大な贈り物）でのトランスフェクションおよびＧ４１８による選択によって、ヒトＣＹＰ１７Ａ１を安定的に発現する２９３細胞株を産出した。細胞株は、ＤＤＣ  Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ、ＯＨ）によって認証され、プライマーでマイナスマイコプラズマがないと判定された。
化学薬品
アビラテロンアセテートはＭｅｄｋｏｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃｈａｐｅｌ  ｈｉｌｌ、ＮＣ）から購入された。ＡｂｉおよびＤ４Ａは、前述のように合成された。（参照：Ｌｉら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１８：３５７１−３５７９（２０１２）。エンザルタミドはＭｅｄｉｖａｔｉｏｎ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）から得られた。
ステロイド代謝
細胞株の代謝：３７℃で、細胞を２０万個細胞／ウェルで１２ウェルプレートに播種し、約２４時間インキュベートし、続いて放射性（［３Ｈ］標識）および非放射性アンドロゲンの混合物（最終濃度、１００ｎＭ；約１，０００，０００ｃｐｍ／ウェル；  ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）とともにインキュベートした。示された時間に培地のアリコートを集めた。収集した培地を１０００単位のβ−グルクロニダーゼ（Ｈｅｌｉｘ  ｐｏｍａｔｉａ；  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で６５℃にて２時間処理し、８６０μｌのエチルアセテート／イソオクタン（１：１）で抽出し、窒素ガス下で濃縮した。異種移植代謝：１０７個のＬＮＣａＰまたはＶＣａＰ細胞を、５ｍｇの９０日間徐放性ＤＨＥＡペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ）を移植した外科的に睾丸切除したＮＳＧマウスに、Ｍａｔｒｉｇｅｌで皮下注射した。異種移植片は、１０００ｍｍ３に達した時点で収穫し、細かく切り、放射能（［３Ｈ］標識）と非放射性アンドロゲンの混合物またはＡｂｉとともに１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで１０００ｍｍ３までに３７℃で培養した。各異種移植片を、少なくとも３回の独立した実験において３回繰り返して分析した。示された時間に培地のアリコートを集めた。収集した培地を６５℃で２時間１０００単位のβ−グルクロニダーゼで処理し、８６０μｌのエチルアセテート／イソオクタン（１：１）で抽出し、窒素ガス下で濃縮した。
【００２８】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を、Ｗａｔｅｒｓ  ７１７  Ｐｌｕｓ  ＨＰＬＣまたはＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＨＰＬＣで行った。乾燥サンプルを５０％メタノール中で再構成し、ＨＰＬＣに注入した。ステロイドおよび薬物代謝産物を、３０℃のメタノール／水勾配を使用して、Ｋｉｎｅｔｅｘ  １００×２．１ｍｍ、２．６μｍ粒子径のＣ１８逆相カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）で分離した。Ｌｉｑｕｉｓｃｉｎｔシンチレーションカクテル（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）を使用して、２５４ｎｍに設定した二波長紫外可視検出器またはβ−ＲＡＭモデル３インライン放射能検出器（ＩＮ／ＵＳ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ。）を使用してカラム流出液を分析した。あるいは、乾燥した試料をプラスチック裏地のシリカゲルプレートに塗布し、クロロホルム：酢酸エチル（３：１）の移動相を用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分離した後、プレートをホスホイメージャースクリーンに曝し、Ｓｔｏｒｍ  ｍｏｄｅｌ  ８６０  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）で定量した。すべてのＨＰＬＣおよびＴＬＣ研究は３回繰り返し実施し、独立した実験で少なくとも３回繰り返した。結果は平均値±ＳＤとして示される。
遺伝子発現
細胞をフェノールレッドフリーおよび血清フリー培地で少なくとも４８時間飢餓状態にし、示された薬物および／またはアンドロゲンで処置した。ＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡミニプレップキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてＲＮＡを抽出した。ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて逆転写反応で１μｇのＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ｑＰＣＲは、三回繰り返し行い、前述したＰＳＡ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＦＫＢＰ５、およびＲＰＬＰＯのプライマー（Ｃｈａｎｇら，Ｃｅｌｌ，１５４：１０７４−１０８４（２０１３））、９６ウェルプレート中でＲＯＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を有するｉＴａｑ  Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘを利用したＡＢＩ  ７５００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｍａｃｈｉｎｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、最終反応容積２０μｌで行った。試料値をＲＰＬＰＯおよびビヒクル処理の細胞に正規化することにより、各ｍＲＮＡの正確な定量を実現する。
ＣｈＩＰ実験
【００２９】
ＬＮＣａＰ細胞を少なくとも４８時間血清飢餓状態にし、示された薬物およびＤＨＴで３時間処置した。前述した抗ＡＲ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−８１６）を用いてＣｈＩＰアッセイを行った。Ｌｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０８：３１１６−３１２３（２０１１）。全ての沈殿したＤＮＡ試料をｑＰＣＲにより定量し、入力されたＤＮＡに正規化した。すべてのＣｈＩＰ実験は少なくとも３回実施された。ＣｈＩＰ実験に使用されるプライマーは、前述の実験からのものである。Ｅｖａｕｌら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１５１：３５１４−３５２０（２０１０）。
マウス異種移植物研究
６から８週齢の雄性ＮＳＧマウスは、クリーブランドクリニック生物資源ユニット施設から得た。すべてのマウス研究は、クリーブランドクリニック機関動物管理および使用委員会によって承認されたプロトコールのもとで行われた。サンプル数は、ＣＲＰＣの異種移植モデルにおけるステロイド生成阻害の以前の研究に基づいて確定した。Ｃｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０８：１３７２８−１３７３３（２０１１）。進行の基準は、臨床進行に類似する基準に基づいて確定された。マウスを外科的に睾丸に摘出し、ヒトの副腎生理の状況においてＣＲＰＣを模倣するために５ｍｇの９０日間徐放性ＤＨＥＡペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を移植した。２日後、１０７個のＶＣａＰまたはＣ４−２細胞をマトリゲルにて皮下注射した。腫瘍が３００ｍｍ３（長さ×幅×高さ×０．５２）に達したら、ビヒクル（ＶＣａＰおよびＣ４−２についてはそれぞれ９匹または１０匹のマウス）、アビラテロンアセテート（二つの細胞株についてｎ＝１０のマウス）、Ｄ４Ａ（両細胞株についてｎ＝１０マウス）またエンザルタミド（Ｃ４−２についてはｎ＝１１）処置群にマウスを無作為に割り当てた（厳密には無作為化しなかった）。５ｍＬ／ｋｇの腹腔内注射によりアビラテロンアセテートおよびＤ４Ａ（５％ベンジルアルコールおよび９５％ベニバナ油溶液０．１ｍＬ中、０．５ｍｍｏｌ／ｋｇ／日）を１５日間まで毎日投与した。対照群には、５％ベンジルアルコールおよび９５％ベニバナ油溶液０．１ｍＬを毎日腹腔内注射により投与した。エンザルタミド群のマウスには、毎日食餌中のエンザルタミド（１０ｍｇ／ｋｇ／日）を給餌した（Ｔｒａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ。３２４：７８７−７９０（２００９））。治療は研究者に盲目的ではなかった。腫瘍体積を毎日測定し、腫瘍体積の２０％増加する時間を確定した。処置１５日目または腫瘍の大きさがベースラインの２倍である場合にマウスを屠殺した。治療群間の差の有意性は、ＳｉｇｍａＳｔａｔ  ３．５でのログランク検定を用いたＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析によって評価した。
酵素アッセイ
【００３０】
３βＨＳＤの阻害剤としてのＤ４Ａを試験するために、以前に記載されたように酵素アッセイを実施した。（Ｌｉら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１８：３５７１−３５７９（２０１２））。簡潔に述べると、インキュベーションでは、組換えヒト３βＨＳＤ１または３βＨＳＤ２（酵母ミクロソーム内、それぞれのインキュベーションは４５または２．５μｇタンパク質）、［３Ｈ］−プレグネノロン（１００，０００ｃｐｍ、１−２０μｍｏｌ／Ｌ）およびＤ４Ａ  ５−２０μｍｏｌ／Ｌ）またはエタノールビヒクルを０．５ｍＬのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中に加入した。３７℃で１〜３分間プレインキュベートした後、ＮＡＤ＋（１ｍｍｏｌ／Ｌ）を加え、３７℃で２０分間インキュベートした。１ｍＬのエチルアセテート／イソオクタン（１：１）の添加により反応を停止させ、続いてステロイドを有機相に抽出し、乾燥させた。乾燥した抽出物中のステロイドをＨＰＬＣで分析し、インラインシンチレーション計数によって定量した
ＡＲ競合アッセイ
細胞を無血清培地で４８時間培養し、続いて、［３Ｈ］−Ｒ１８８１および示された濃度のＤ４Ａ、Ａｂｉ、エンザルタミド、Ｒ１８８１またはビカルタミドで３０分間処理した。細胞を１ＸＰＢＳで４回および０．９％ＮａＣｌ溶液で２回洗浄した後、ＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＳ６０００１Ｃ液体シンチレーションカウンターで細胞内放射能を測定し、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で検出したタンパク質濃度に正規化した。
細胞増殖アッセイ
【００３１】
ＬＮＣａＰ細胞（１０万／ｍＬ）は、９６ウェルプレートに播種し、１０％活性炭処理済みＦＢＳ含有且つフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ−１６４０培地でアンドロゲンおよび／または薬物とともに培養した。培地は１日おきに交換された。２日、４日または６日後、細胞を回収し、処理後に溶解させた。Ｈｏｅｃｈｓｔ染色およびＷａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）によって検出されたＤＮＡ含量に基づいて増殖を確定した。有意差を判定するために両側スチューデントのｔ検定を用いた。
質量分析
患者の血清採取および薬物抽出。アビラテロンアセテートによる治療を受けているＣＲＰＣ患者１２例は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ承認プロトコル（Ｃａｓｅ  ７８１３）の下で同意された。Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  Ｐｌｕｓ血清採血管（＃ＢＤ３６７８１４、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）を用いて血液を採取した。Ａｂｉ酢酸塩を１日１０００ｍｇ投与した後、２時間から１４時間の間に血液を採取した。血液を凝固させ、管を２５００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。血清アリコットを処理するまで−８０℃で凍結させた。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて患者の血清２００μＬから薬物代謝産物および内部標準（ｄ４−ｃｏｒｔｉｓｏｌ、ＣＤＮ同位体Ｐｏｉｎｔｅ−Ｃｌａｉｒｅ、Ｑｕｅｂｅｃ  Ｃａｎａｄａ）を抽出し、窒素ガスで置換し、メタノール中でで再構成した後、質量分析を行った。
マウス血清収集、誘導体化および抽出。マウス異種移植研究の完了時に、ステロイド分析のためにマウス血清を収集した。２０μｌの血清および内部標準β−デオキシコルチコステロンをヒドロキシルアミン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で誘導体化した。ステロイドをメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で抽出し、窒素ガスの気流下で蒸発させ、メタノール／水（５０：５０）で再構成した後、質量分析を行った。
安定同位体で希釈の液体クロマトグラフィー質量分析
【００３２】
マウス血清分析。機器の制御および定量用のソフトウェアとして、Ａｒｉａ  ＭＸ  ２．１およびＴｒａｃｅｆｉｎｄｅｒ  ３．２．３６８．２２を備えたＴｈｅｒｍｏ  ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｉｖａ−Ｐｒｅｌｕｄｅ  ＳＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で試料を分析した。移動相として、ＬＣＭＳ等級のメタノールおよび水（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）の２５−１００％メタノールの勾配を用いて、Ａｃｃｕｃｏｒｅ  ５０×３ｍｍ、２．６μｍＣ１８カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）  、流速０．６ｍｌ／分であった。陽イオンモードでの電気スプレーイオン化にて、ステロイドをイオン化した。多重反応モニタリングを使用してデオキシコルチコステロン（ｍ／ｚ：３６１．２／１２４．１）およびｄ８−デオキシコルチコステロン（ｍ／ｚ：３６９．４／１２８．１）（ＲＩのＳｔｅｒａｌｏｉｄｓ  Ｎｅｗｐｏｒｔ、ＲＩ）のオキシムの質量変換を追跡する。安定同位体希釈分析を用いて濃度を確定した。
患者血清分析。Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄの承認を受けたプロトコールに基づく同意を得てから、前立腺癌患者から血液を採取した。ＤＧＵ−２０Ａ３Ｒ脱気装置、２台のＬＣ−３０ＡＤポンプ、ＳＩＬ−３０ＡＣオートサンプラー、ＣＴＯ−１０ＡカラムオーブンおよびＣＢＭ−２０Ａシステムコントローラを備えた超高速液体クロマトグラフィーステーション（島津、京都、日本）をＱＴＲＡＰ  ５５００質量分析計（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）と組み合わせて使用して試料を分析した。移動相は、ＬＣ−ＭＳ等級（フィッシャー）メタノール：アセトニトリル：水（４４：３６：２０）からなっていた。薬物代謝産物の分離は、０．２ｍｌ／分の流速で、Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ｐｌｕｓ  １５０×２．１ｍｍ、３．５μｍＣ１８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いて達成された。薬物代謝産物を、陽イオンモードでのエレクトロスプレーイオン化を用いてイオン化した。Ｄ４Ａ（ｍ／ｚ：３４８．２／１５６．３）、アビラテロン（ｍ／ｚ：３５０．３／１５６．１）、およびｄ４−コルチゾール（ｍ／ｚ：３６７．１／１２１．１）の質量変換を追跡するために多重反応モニタリングを用いた。既知の濃度の各代謝産物をスパイクしたヒト血清を用いて標準曲線を作成し、患者サンプル中の未知濃度の確定を可能にした。
実施例２：アビラテロンの代謝をリダイレクトして、前立腺癌治療を生化学的に微調整する
【００３３】
アビラテロンは、患者においてＤ４Ａに代謝され、Ｄ４Ａは、さらに大きな抗腫瘍活性および、テストステロンなどの内因性ステロイド性な５α−レダクターゼ基質と構造類似性を有する。ここでは、Ｄ４Ａが少なくとも３つの５α−還元型および３つの５β−還元型代謝産物に変換されることを示す。前立腺癌の患者では、アビラテロンを摂取している患者では、初期の５β−還元代謝産物である３−ケト−５α−ａｂｉがＤ４Ａよりも豊富であり、前立腺癌の進行を促進するアンドロゲン受容体（ＡＲ）アゴニストである。アビラテロン単独、続いてアビラテロン＋デュタステリド（５α−レダクターゼ阻害剤）の臨床試験では、３−ケト−５α−ａｂｉおよび下流代謝産物が枯渇し、Ｄ４Ａ濃度は上昇し、代謝産物を促進する腫瘍の生成を効果的にブロックし、Ｄ４Ａ累積を許容する。さらに、デュタステリドは、臨床的に検出可能な３つの５β−還元代謝産物を枯渇させず、薬理的５α−レダクターゼ阻害がアビラテロン代謝に及ぼす特異的な生化学的効果を実証する。私たちの知見は、治療法を最適化するために、以前は評価されておらず、生化学的に特異的なアビラテロン代謝を臨床的に微調整する方法を示唆している。
結果
【００３４】
Ｄ４ＡのΔ４，３−ケト構造は、３−ケト−５α−Ａｂｉ（５α−Ａｂｉ）への５α還元または３−ケト−５β−ａｂｉ（５β−Ａｂｉ）への不可逆反応である５β−還元に対して潜在的に感受性になる（図５Ａ）。これらの代謝産物の３−ケト還元は、それらを３α−ＯＨおよび３β−ＨＯ同族体に可逆的に変換し、Ｄ４Ａの下流に計６つの新規代謝産物を生成する（図５Ａ）。ＬＡＰＣ４前立腺癌細胞株において、ＡｂｉおよびＤ４Ａから３つの５α還元代謝産物すべてへの変換、３つの５α還元代謝産物間の相互変換、および３つの５β還元代謝産物間の相互変換が、質量分析によって検出可能である（図５Ｂ）。結果は、前立腺癌のＶＣａＰ細胞株モデルの治療と同様である。さらに、アビラテロンアセテートで処置しているＣＲＰＣを有する１２人の患者の血清において、６つの代謝産物のすべてが臨床的に検出可能である（図５Ｃ）。
【００３５】
ステロイド５α還元は、ステロイドの平面構造を保存し、生物学的に活性なアンドロゲンの調節（すなわち、テストステロンのＤＨＴおよび△４−アンドロステンジオン［ＡＤ］から５α−アンドロスタンジオン［５α−ジオン］への変換）において重要な役割を果たす。（Ｃｈａｎｇら，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．，１０８，１３７２８−１３７３３（２０１１））。一方、ステロイド５β−還元は、一般にステロイドホルモンを不活性化し、クリアランスを容易にする９０°の屈曲を導入することによって、平面コンフォメーションを破壊する。従って我々は、その後の研究においてＤ４Ａの５α還元の経路および代謝産物を焦点とした。ヒト前立腺癌細胞株であるＬＮＣａＰおよびＬＡＰＣ４とＶＣａＰ異種移植片において、Ｄ４Ａとの直接インキュベーションは、５α−Ａｂｉおよび３α−ＯＨ−５α−Ａｂｉへの変換をもたらし（図６Ａ）、５α−Ａｂｉによる処理は３α−ＯＨ−５α−Ａｂｉへの変換をもたらす（図６Ｂ）。特にＬＡＰＣ４では、この反応の可逆性は、３α−ＯＨ−５α−Ａｂｉ処理に対する５α−Ａｂｉ検出によって実証される（図６Ｃ）。しかしながら、３α−ＯＨ−５α−Ａｂｉへの還元が好ましい指向性であると思われる。同様に、インビボで、逆反応もまた検出可能であるが、５α−Ａｂｉは３α−ＯＨ−５α−Ａｂｉに優先的に変換される（図６Ｄ）。３β−ＯＨ−５α−Ａｂｉも酸化されて５α−Ａｂｉとなり、３α−ＯＨ−５α−Ａｂｉに変換される。ステロイド５α還元の不可逆的性質を反映し、Ａｂｉ、Ｄ４Ａ、または５β−還元代謝産物は、５α−還元Ａｂｉ代謝産物のいずれかでの処置後には検出されない。これらのデータは、Ｄ４Ａが５α−Ａｂｉに５α還元され、３−（αおよびβ）−ＯＨ異性体の両方に３−ケト還元される反応、およびそれらの逆反応が前立腺癌細胞およびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で起こるというモデルが裏付けられた。
５α−Ａｂｉおよび３α−ＯＨ−５α−Ａｂｉの合成は、３βＨＳＤによるＡｂｉのＤ４Ａへの上流の変換によって促進される（図７Ａ）。内因性ステロイド−５α−レダクターゼ（ＳＲＤ５Ａ）発現のない細胞では、Ｄ４Ａの５α−Ａｂｉへの変換は、ＳＲＤ５Ａ１またはＳＲＤ５Ａ２のいずれかの発現によって可能になる（図７Ｂ）。ＳＲＤ５Ａ１を主に発現するＬＡＰＣ４細胞において、ＳＲＤ５Ａ１に対する遺伝的サイレンシング（図７Ｃ）または、ＳＲＤ５Ａ１阻害剤ＬＹ１９１７０４  （Ｈｉｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．，  ９０，  ５２７７−５２８１（１９９３）を用いる薬理学的遮断、または臨床的に達成可能な濃度の二重アイソザイム阻害剤のデュタステリド（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．，  ８９，  ２１７９−２１８４  （２００４）は、Ｄ４Ａの５α−Ａｂｉおよび３α−ＯＨ−５α−Ａｂｉへの変換を阻害する。（図７Ｄ）。アルド−ケトレダクターゼアイソザイムＡＫＲ１Ｃ２は、３−ケトステロイド、ＤＨＴを５α−アンドロスタン−３α、１７β−ジオールに変換する主要な３−ケトレダクターゼであると考えられている。Ｒｉｚｎｅｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４４、２９２２−２９３２（２００３）。我々は、ＡＫＲ１Ｃ２発現が３α−ＯＨ−５α−Ａｂｉへの５α−Ａｂｉの還元も可能にすることを見出した（図７Ｅ）。
【００３６】
次に、我々はアンドロゲン経路上の５α−Ａｂｉ代謝産物の活性を確定しようとした。［３Ｈ］−プレグネノロンのＤＨＥＡへの変換、［３Ｈ］−ＤＨＥＡのＡＤへの変換、以及［３Ｈ］−ＡＤの５α−ジオンへの変換によって評価されるように、Ｄ４Ａの５α−Ａｂｉおよび３α−ＯＨ−５α−Ａｂｉへの還元は、ＣＹＰ１７Ａ１（図８Ａ）、３βＨＳＤ（図８Ｂ）およびＳＲＤ５Ａ阻害活性（図８Ｃ）の減弱または損失を伴う。プレグネノロンをＤＨＥＡに、［３Ｈ］−ＤＨＥＡをＡＤに、そして［３Ｈ］−ＡＤを５α−ジオンにそれぞれ変換する。Ｄ４Ａおよび５α−Ａｂｉ代謝産物に対する３βＨＳＤの効果またはその欠如は、内因性Δ４，３−ケトステロイドが３βＨＳＤを阻害し、５α還元が阻害活性の喪失につながるという他の観察と一致する。（Ｂｙｒｎｅら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．，６２，４１３−４１８（１９８６））。
５α−Ａｂｉの親和性は、ＬＮＣａＰのＴ８７７Ａ変異型ＡＲおよびＬＡＰＣ４の野生型ＡＲに対するＤ４Ａの親和性に匹敵するが、３α−ＯＨ−５α−ＡｂｉおよびＡｂｉの親和性は低い（図８Ｄ）。ＡＲへの５α−Ａｂｉ結合の結果を評価するために、アンドロゲン応答性遺伝子の発現を評価した。５α−Ａｂｉによる治療は、ＬＡＰＣ４およびＬＮＣａＰにおけるアンドロゲン応答性遺伝子の発現をもたらす（図８Ｅ、ＦおよびＧ）。３α−ＯＨ−５α−Ａｂｉによる処理は、低い誘導レベルである。ＰＳＡの誘導に対する３α−ヒドロキシ−５α−アビラテロンの遅延および適度な効果は、ＬＮＣａＰと比較してＬＡＰＣ４においてより顕著に生じると思われる、ＡＲに対する低い結合親和性および３α−ヒドロキシ−５α−アビラテロンから５α−Ａｂｉへの適度な変換と一致する。（図６Ｃ）。腫瘍成長に対する５α−ＡｂｉによるＡＲ刺激の効果を試験するために、ＣＲＰＣ異種移植片を５α−Ａｂｉおよび３α−ＯＨ−５α−Ａｂｉで処置した。５α−Ａｂｉは無増悪生存期間を有意に短縮したが（Ｐ＜０．０１）、３α−ＯＨ−５α−Ａｂｉは対照とする異種移植と比較して検出可能な効果がなかった（図８Ｈ）。我々はまた、アンドロゲン応答性遺伝子発現に対する効果について３つの５β還元Ａｂｉ代謝産物をすべて試験し、ステロイド平面構造の変動が代謝産物活性の欠失を伴うことを確認した（図８Ｉ）。
【００３７】
我々は、Ａｂｉ処置の条件下で、前立腺癌細胞が、ＳＲＤ５ＡアップレギュレーションによってＤ４Ａ→５α−Ａｂｉの変換を促進する能力を発達させる可能性があると仮定した。ＶＣａＰおよびＬＮＣａＰ細胞をＤＨＥＡとともにＤ４ＡまたはＡｂｉで６ヶ月間培養し、ヒト副腎アンドロゲン環境を模倣した（図９Ａ）。［３Ｈ］−ＡＤ→５α還元アンドロゲン、［３Ｈ］−Ｔ→ＤＨＴ、およびＤ４Ａ→５α還元Ａｂｉの変換によって評価されるように、Ｄ４ＡおよびＡｂｉで長期培養・増殖した細胞は、ＳＲＤ５Ａ酵素活性の増加を示した（図９Ｂ〜Ｃ）。増加したＳＲＤ５Ａ酵素活性は、ＳＲＤ５Ａ１  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現の有意的な増加を伴った（図９Ｄ〜Ｅ）。総合すると、これらの結果は、おそらく、Ｄ４Ａに関連する抗腫瘍活性を枯渇させ、および／または増加した５−Ａｂｉ濃度のＡＲアゴニスト活性を増加させるために選択的成長の利点があることを示唆している。
【００３８】
次に、Ａｂｉ酢酸塩での治療の患者では、５α−Ａｂｉ：Ｄ４Ａの約２．５：１の増加率が特異であり、かつデュタステリドによる二重ＳＲＤ５Ａアイソザイム阻害によって臨床的に可逆的であると、本発明者から仮定した。２カ月（２サイクル）のアビアセテート（１日１０００ｍｇ）とプレドニゾン（１日５ｍｇ）の第２相臨床試験（ＮＣＴ０１３９３７３０）、それに続くサイクル３の開始時のデュタステリドの添加（３．５ｍｇ  １日１回；図  １０Ａ）は、転移性ＣＲＰＣを有する男性において進行する。アビアセテート単独（サイクル３の最初）およびデュタステリドの添加（サイクル４、７の最初）血液を採取した１６人の患者を分析に含めた。驚くべきことに、デュタステリドの添加後、５α−Ａｂｉの平均濃度が８９％低下した（サイクル３：２５．８ｎＭ対サイクル４：２．９ｎＭ；図１０Ｄ）。患者におけるＤ４Ａの５α−還元をブロックすることに対するデュタステリドの効果をさらに裏づけ、ＳＲＤ５Ａの下流の他の２つの５α還元代謝産物も同様の低下を示した（３α−ＯＨ−５α−Ａｂｉでは９２％減少し、３β−ＯＨ−５α−Ａｂｌでは７３％減少）。薬理学的ＳＲＤ５Ａ阻害は、Ｄ４Ａの平均血清濃度をほぼ２倍にした（サイクル３：９．９ｎＭ対サイクル４：１８．２ｎＭ；図１０Ｃ）。予想外に、この差は統計的有意性には達しなかったが（Ｐ＝０．０５１）、デュタステリドの添加はＡｂｉの平均濃度もほぼ倍増した（サイクル３：１９１．２ｎＭ対サイクル４：３７２．４ｎＭ；図１０Ｂ）。ベースラインでのＡｂｉ単独からの変化はわずかに減少したが、添加後の第２の時点中の第７サイクルでのデュタステリド、Ａｂｉ、Ｄ４Ａおよび５α−Ａｂｉ代謝産物の濃度はサイクル４と同様であった（図１０Ｆ）。最後に、デュタステリドの添加後の５α−Ａｂｉ代謝産物の実質的な低下とは対照的に、３つの５β−還元Ａｂｉ代謝産物のいずれも減少しておらず、５α−Ａｂｉ代謝に対するＳＲＤ５Ａ阻害の非常に特異的な生化学的効果を支持した  （図１０Ｅ）。それとともに、５α−Ａｂｉ：Ｄ４Ａの増加値は薬理学的、特異的、臨床的にデュタステリドで可逆的である。
討論
ＡｂｉはＣＲＰＣに対する臨床的に強力な治療法であるが、最終的に耐性が生じる。残存する尿中のアンドロゲン代謝産物（Ａｔｔａｒｄら．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．，  ９７，  ５０７−５１６  （２０１２）と、高い残留血清濃度のＤＨＥＡ硫酸塩と、ヒト副腎から産生される主要なアンドロゲンとがＡｂｉ治療の患者に存続することによって証明されるように、ＡｂｉによるＣＹＰ１７Ａ１阻害は臨床的に不完全である。包括的なゲノム研究は、ＡＲシグナル伝達を維持する分子異常がＣＲＰＣの発達に関与することを示しており  （Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  １６１，  １２１５−１２２８  （２０１５））  、Ａｂｉで治療した患者における循環腫瘍ＤＮＡおよび循環腫瘍細胞シグナリングの他の臨床研究は、維持されたＡＲ軸シグナル伝達がＡｂｉ耐性を駆動することを示唆している（Ｃａｒｒｅｉｒａら，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．，６，２５４ｒａｌ２５（２１０４））。要するに、これらの研究は、持続性ＡＲシグナリングの逆転が少なくともＡｂｉ耐性疾患患者のサブセットにおいて治療上の利益を有するべきであることを示唆している。
持続性ＡＲシグナリングの一部は、維持されたステロイド生成によって提供される内因性アンドロゲン（テストステロンおよび／またはＤＨＴ）の持続的な供給によって生じる。前臨床モデルは実際にＡｂｉ抵抗性がステロイド生成酵素のアップレギュレーションによって推進され得ることを示唆している（Ｍｏｓｔａｇｈｅｌら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１７（１８）：５９１３−２５（２０１１））。私たちの発見は、強力な内在性アンドロゲンを提供するとともに、ステロイド生成酵素がＡｂｉ代謝を調節することによって二重の目的を果たし得ることを実証し、具体的にはＤ４Ａに関連する抗腫瘍活性の喪失を、ＳＲＤ５Ａ酵素活性の増加を伴ってそれを５α−    Ａｂｉに変換することによって促進し、これは代わりに腫瘍促進性ＡＲアゴニスト活性を有する。本発明者らの知見と一致するように、ＳＲＤ５Ａは、Ａｂｉ耐性の別  のモデルにおいて、最も向上制御されたステロイド合成酵素転写物の１つとして他者に注目されている。
Ａｂｉの広範なステロイド生成代謝に関する我々の所見からみれば、内因性ステロイドとＡｂｉとに対するステロイド生成酵素の相乗効果を考慮すべきである。例えば、増加したＳＲＤ５Ａ酵素活性は、ＤＨＴ合成を増加させ、Ｄ４Ａを５α−Ａｂｉに変換することによって、腫瘍成長に対して一致した好都合な効果を有するはずである。一方、３βＨＳＤ活性の増加は、ＴおよびＤＨＴの合成に必要であるが（腫瘍にとって有益である）、ＡｂｉのＤ４Ａへの変換を増加させる（腫瘍に有害である）ので、不一致効果を有すると予想される。それについて、おそらく内在性基質（例えば，  ＤＨＥＡ，  △５−ａｎｄｒｏｓｔｅｎｅｄｉｏｌ  ａｎｄ  ｐｒｅｇｎｅｎｏｌｏｎｅ）がＤ４Ａよりも好ましいので、腫瘍内３βＨＳＤ活性の増加が有益な正味効果を生じる可能性がある。内因性５α−還元アンドロゲンおよび５α−Ａｂｉの両方に関連する第３の酵素反応は、３−ケトステロイドへの３α−ＯＨ酸化である。ＡＲを刺激しない（３α−ＯＨ）５α−アンドロスタンジオールの（３−ケト）ＤＨＴへの酸化または「逆変換」は、ＡＲシグナル伝達を刺激することができる。（Ｂｉｓｗａｓ，Ｍ．Ｇ．およびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７２，１５９５９−１５９６６（１９９７））。ＤＨＴ合成の増加に加えて、３α−ＯＨ−５α−Ａｂｉの５α−Ａｂｉへの変換もＡＲに対する親和性を増加させ（図８Ｄ）、アンドロゲン応答性遺伝子発現（図８Ｅ〜Ｇ）および腫瘍増殖図８Ｈ）を刺激するので、アンドロゲンおよびＡｂｉ代謝に対するこの反応の正味の効果が一致して刺激的であると期待される。３α−ＯＨ−５α−Ａｂｉの５α−Ａｂｉへの変換がＬＡＰＣ４モデルにおいてより大きくなるという我々の知見（図６Ｃ）は、ＬＡＰＣ４モデルにおいてもＤＨＴに対する５α−アンドロスタンジオールの優先的な酸化という以前の知見と一致する。（Ｍｏｈｌｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７１，１４８６−１４９６（２０１１））。ＬＡＰＣ４では観察されたが、ＬＮＣａＰでは観察されなかった（図８Ｅ−Ｇ）３α−ＯＨ−５α−ＡｂｉによるＰＳＡ発現の好適に遅延した刺激も、５α−Ａｂｉへの酸化に依存する間接的効果と一致する。
【００３９】
これらの考察にもかかわらず、血清中に見出されるＡｂｉ代謝産物の大部分は、腫瘍代謝とは独立して形成され、肝酵素の活性から生じる。前立腺癌細胞株はＤ４Ａを容易に５α還元させることが判明したが、前立腺癌に依存する５β還元は観察されなかった。ステロイド５α−および５β−ダクターゼ反応はいずれも肝臓で起こることが知られている。それにもかかわらず、我々の臨床研究では、デュタステリドをアビラテロンアセテートでの処理に添加すると、Ｄ４Ａ  ５α還元の即時産物である５α−Ａｂｉの循環濃度が約９０％低下し、他の５α−Ａｂｉ代謝産物も同様に減少した。Ｄ４Ａ濃度は、デュタステリドの添加後に付随して上昇し、Ｄ４Ａ代謝に対するデュタステリドの特定の薬理学的効果を支持した。数値的には、Ａｂｉ濃度の上昇もあり、これは一般的に受け入れられている統計的有意性のレベルに達しなかったが（Ｐ＝０．０５１）、少なくとも患者のサブセットにおいてＳＲＤ５ＡによるＡｂｉクリアランスの重要なメカニズムを提供する可能性を高める。
デュタステリドの効果は、サイクル３の開始時と比較してサイクル７の開始時にわずかに減少するようであった。これは、より長い治療期間の未だ確定されていない代謝効果によるものである可能性がある。
デュタステリドに構造的に関連するＳＲＤ５Ａ阻害剤であるフィナステリドは、５β−レダクターゼに結合して阻害することが報告されている（Ｄｒｕｒｙら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２８４，１９７８６−１９７９０（２００９））。５β還元Ａｂｉ代謝産物に何らかの影響がないことは、Ｄ４Ａの５α還元に対するデュタステリドの顕著な特異性を実証する。５β−還元代謝産物の存在および維持はさらに、薬理学的５α−レダクターゼ阻害による代謝の「逃避」メカニズムを示唆し、Ｄ４Ａ、おそらくはＡｂｉ濃度が５β−レダクターゼ阻害によってさらに上昇し、さらなる治療的増強をもたらす可能性が高まる。
我々の研究は、Ａｂｉで治療した患者におけるＤ４Ａ代謝に対するＳＲＤ５Ａ阻害の明確で特異的な生化学的効果を実証し、Ａｂｉ治療の利点を強化すると期待される。ＳＲＤ５Ａ阻害によるＡｂｉ代謝の微調整の臨床的利点は、無作為化試験においてさらなる研究が必要である。
実験ステップ
【００４０】
細胞株、薬物および構築物。ＬＮＣａＰ、２９３ＴとＶＣａＰ細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入され，且つ１０％ＦＢＳ（Ｇｅｍｉｎｉ生物製品）を有するＲＰＭＩ−１６４０（ＬＮＣａＰ）またはＤＭＥＭ（２９３ＴおよびＶＣａＰ）で維持される。ＬＡＰＣ４細胞株はＣｈａｒｌｅｓ  Ｓａｗｙｅｒｓ博士（Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）により親切に提供され，且つ１０％ＦＢＳ含有のＩｓｃｏｖｅ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  培地で増殖する。前述のようにＳＲＤ５Ａ１ノックダウンを有する安定的なＬＡＰＣ４細胞株を構築する（Ｃｈａｎｇら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，１０８，１３７２８−１３７３３（２０１１））。プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｃｌ７（Ｗａｌｔｅｒ  Ｍｉｌｌｅｒ博士の寛大な贈り物，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ）を使用してヒトＣＹＰ１７Ａ１を発現する２９３という安定的な細胞株を確立する（Ｐａｐａｒｉ−Ｚａｒｅｅｉら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４７，１５９１−１５９７（２００６））。細胞株はＤＤＣ  Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＯＨ）により同定され，且つプライマーでマイコプラズマフリーであると判定された。デュタステリドはＭｅｄｋｏｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃｈａｐｅｌ  ｈｉｌｌ，ＮＣ）から購入される。エンザルタミドはＭｅｄｉｖａｔｉｏｎ（ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）から得られる。ＡＫＲ１Ｃ２発現プラスミドはＴｒｅｖｏｒ  Ｐｅｎｎｉｎｇ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ）の寛大な贈り物である。
【００４１】
細胞株代謝：２０万個／ｍｌで細胞を接種し，且つ１２ウェルプレートで約２４時間インキュベートし，続いて規定される薬物または［３Ｈ］標記（約１，０００，０００ｃｐｍ／ウェル；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）と非放射性アンドロゲンの混合物（最終濃度，１００ｎＭ）とともに３７℃でインキュベートした。收集した培地をβ−グルクロニダーゼ（Ｈｅｌｉｘ  ｐｏｍａｔｉａ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理し，酢酸エチル：イソオクタン（１：１）で抽出し，且つ窒素下で前述の方法で濃縮する（Ｌｉら，５２３，３４７−３５１（２０１５））。
【００４２】
異種移植代謝：Ｍａｔｒｉｇｅｌを含む１０７個のＶＣａＰ細胞を、５ｍｇ、９０日の持続放出ＤＨＥＡペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）を担体として、睾丸摘出したＮＳＧマウスに皮下注射した。１０００ｍｍ３の異種移植片を採取し、細かく切り、示された薬物とともに、３７℃で１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養した。示された時間に培地のアリコートを集めた。回収したＨＰＬＣ用の培地を、細胞株由来の培地と同じプロトコールを用いて処理した。
ＨＰＬＣ
Ｗａｔｅｒｓ  ７１７  ＰＬＵＳ  ＨＰＬＣまたはＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＨＰＬＣを使用してＨＰＬＣ分析を行う。干燥した試料を５０％メタノールで再配合し，且つ３０℃でメタノール／水勾配を用いてＫｉｎｅｔｅｘ  １００×２．１ｍｍ、２．６μｍ粒径のＣ１８反相カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）で分離する。Ｌｉｑｕｉｓｃｉｎｔシンチレーションカクテル（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）を用いて，２５４ｎｍ  ＵＶ−可視検出器またはβ−ＲＡＭモデル３インライン放射能検出器（ＩＮ／ＵＳ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用してカラム流出液を分析する。全てのＨＰＬＣ研究はいずれも三回繰り返して実施し，独立実験で至少３回繰り返す。結果は平均値±標準偏差値（ＳＤ）として示されている。
遺伝子発現およびイムノブロッティング
示された薬物および／またはアンドロゲンによる処置の前に、フェノールレッドおよび血清フリー培地で少なくとも４８時間、細胞を飢餓状態にした。ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成は、それぞれＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡミニプレップキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて行った。以上記載のように、ＲＯＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を有するｉＴａｑ  Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＳｕｐｅｒｍｉｘおよびＴＭＰＲＳＳ２、ＰＳＡおよびＲＰＬＰＯのプライマーを用いて、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析をＡＢＩ  ７５００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で３回実施した。（Ｃｈａｎｇら，Ｃｅｌｌ１５４，１０４７−１０８４（２０１３））。各ｍＲＮＡの正確な定量は、サンプル値をＲＰＬＰＯおよびビヒクル処理細胞に対して正規化することによって達成された。ウサギ抗ＳＲＤ５Ａ１（Ａｂｎｏｖａ）抗体およびマウス抗β−アクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）抗体のイムノブロットでは、５０μｇの細胞溶解物を使用した。
マウス異種移植研究
６‐８週齢のオスＮＳＧマウスはクリーブランドクリニック生物資源ユニット施設（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｕｎｉｔ  ｆａｃｉｌｉｔｙ）から得られる。すべてのマウス研究は、クリーブランドクリニック機関動物管理および使用委員会によって承認されたプロトコールのもとで行われた。１０７個のＶＣａＰ細胞をマトリゲルにて皮下注射した。腫瘍が１００ｍｍ３（長さ×幅×高さ×０．５２）に達したら、マウスを外科的に睾丸摘出し、ビヒクル（ｎ＝９）、５α−Ａｂｉ（ｎ＝１０）または３α−ＯＨ−５α−Ａｂｉ（ｎ＝９）処置群に任意に割り当てた。毎日マウスに、０．１５ｍＬの５α−Ａｂｉおよび３α−ＯＨ−５α−Ａｂｉを２０日間まで腹腔内注射した（５％ベンジルアルコールおよび９５％ベニバナ油溶液中に溶解し、それぞれ０．１５ｍｍｏｌ／ｋｇ／ｄおよび０．０７５ｍｍｏｌ／ｋｇ／ｄ）。対照群には、５％ベンジルアルコールおよび９５％ベニバナ油溶液０．１５ｍＬを毎日腹腔内注射によって投与した。腫瘍容積を一日おきに測定し、腫瘍容積の３０％増加する時間を確定した（２つの連続的な増加）。マウスを処置２０日目に犠牲にした。治療群間の差の有意性を、ＳｉｇｍａＳｔａｔ  ３．５での対数ランク検定を用いたカプラン−マイヤー生存分析によって評価した。
ＡＲ競合試験
細胞をフェノールレッドフリーおよび血清フリー培地で少なくとも４８時間飢餓状態にし、続いて［３Ｈ］−Ｒ１８８１および示された濃度の薬物で３０分間処理した。細胞をＰＢＳで完全に洗浄し、続いてＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＳ６０００１Ｃ液体シンチレーションカウンターで細胞内放射能を測定し、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で検出した細胞内放射能をタンパク質濃度に正規化した。
患者の血清採取と薬物抽出
Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  ＣｌｉｎｉｃのＡｂｉ  ａｃｅｔａｔｅで治療を受けているＣＲＰＣ患者１２人は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ承認プロトコル（ケース  ７８１３）の下で同意した。Ａｂｉ酢酸塩の１日用量１０００ｍｇを投与した後、１〜１６時間の間にＶａｃｕｔａｉｎｅｒ  Ｐｌｕｓ血清採血管（＃ＢＤ３６７８１４、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）を用いて血液を採取し、凝固させた。管を２５００ＲＰＭまたは１４３０×ｇで１０分間遠心分離した。血清アリコットを処理するまで−８０℃で凍結させた。ＤｕｔａｓｔｅｒｉｄｅのＡｂｉ代謝への影響を研究するために、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの第ＩＩ相臨床試験（ＮＣＴ０１３９３７３０）で治療された患者から血清試料を採取した。各患者は、アビラテロンアセテート（１日１，０００ｍｇ）＋プレドニゾン（５ｍｇ  １日）を２サイクル（８週間）投与した後、デュタステリド（１日３．５ｍｇ）による追加治療を開始した。Ａｂｉ単独で、およびデュタステリドの添加後に（サイクル３，４および７の開始）、試料を採取した。この臨床試験でこの施設で治療された１７人の患者は、３つの時点すべてから血液を入手できた。１人の患者は検出限界以下のＡｂｉ濃度を有し、後に副作用のために治療を止めると確定したため、分析には含まれなかった。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて１００μＬ患者血清から薬物代謝産物と内部標準物質（ｄ４−アビラテロン，Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ，ＯｎｔａｒｉｏＣａｎａｄａ）を抽出し，窒素ガスの流れの下で蒸発させ、メタノール／水（５０：５０）中で再構成した後、質量分析を行う。既知の濃度の各代謝産物をスパイクしたヒト血清を用いて標準曲線を作成し、患者サンプル中の未知濃度の確定を可能にした。
マウス血清抽出
内部標準物質（ｄ４−アビラテロン）を含有する５００μｌメタノールで２０μｌマウス血清を沈殿させ，続いて上清を質量分析器を供する。未知の代謝産物濃度を正確に測定するために、既知の代謝産物濃度をスパイクしたマウス血清で標準曲線を作成する。
細胞株の培地抽出
異なる時点で集めた２００μｌの培地をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で抽出し、窒素ガスの気流下で蒸発させ、メタノール：水（５０：５０）で再構成した後、質量分析を行った。
質量分析
ＤＧＵ−２０Ａ３Ｒ脱気装置、２つのＬＣ−３０ＡＤポンプ、ＳＩＬ−３０ＡＣオートサンプラー、ＣＴＯ−１０ＡカラムオーブンおよびＣＢＭ（登録商標）、システムコントローラ−２０Ａを有する超高速液体クロマトグラフィーステーション（島津製薬、京都、日本）をＱＴＲＡＰ  ５５００質量分析計（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）とともに使用して試料を分析する。薬物代謝産物を、陽イオンモードでのエレクトロスプレーイオン化を用いてイオン化した。Ａｂｉ、ＩＳおよび代謝産物の質量転移を追跡するために、複数の反応モニタリングを使用した（表１）。代謝産物の構造および質量遷移の類似性に起因して、それらをクロマトグラフィーで分離することが必要であった。薬物代謝産物の分離は、０．２ｍｌ／分の流速でＬＣ−ＭＳ等級（フィッシャー）メタノール：アセトニトリル：水：ギ酸（３９：２６：３４：１）からなる移動相およびＣ１８分析カラムを用いて達成された。Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ｐｌｕｓ  １５０×２．１ｍｍ、３．５μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ）。
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実施例３：アビラテロン代謝産物の合成
化学合成
以下のアビラテロン（Ａｂｉ）代謝産物の合成が既に開発された：Ｄ４Ａ、５α−アビラテロン，３α−ヒドロキシ−５α−アビラテロン、３β−ヒドロキシ−５α−アビラテロン、５β−アビラテロン、３α−ヒドロキシ−５β−アビラテロンと３β−ヒドロキシ−５β−アビラテロン。３β−ヒドロキシ−５α−アビラテロンの合成は３β−ヒドロキシ−５α−アンドロスタン−１７−オンから開始し、ヒドロキシをアセテートとして保護し、１６，１７−エノールトリフラートを形成し、Ｓｕｚｕｋｉカップリング反応では３−ジエチルピリジルボランで処理する（スキーム１の収率約８５％）。水酸化カリウム中で加溶媒分解することによりアセチルを除去し、３β−ヒドロキシ−５α−Ａｂｉを得、この化合物をクロム酸で酸化して５α−Ａｂｉを得た（収率約９０％）。Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ反応によりＣ−３で立体化学を反転させることにより、３α−ヒドロキシ−５α−Ａｂｉを３β−ヒドロキシ−５α−Ａｂｉから調製した。このアプローチの論理的根拠は、出発材料の３β−ヒドロキシ−５α−アンドロスタン−１７−オンが３α−ヒドロキシ−５α−アンドロスタン−１７−オンよりもずっと安価であり、且つ３つの化合物を全て産出することであって、従って、開発された合成方法は非常に経済的である。対応する５β類似体は、エチオコラノン（３α−ヒドロキシ−５β−アンドロスタン−１７−オン）から出発して同じ戦略で合成されたが、Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ反応の収率は、３β−ヒドロキシ−５β−Ａｂｉの合成（スキーム２）の方が低かった。Ｄ４Ａの合成は、Ｏｐｐｅｎａｕｅｒ酸化を用いて３β−ヒドロキシ−△５−ＡｂｉをＤ４Ａに変換することを除いて、カップリング反応およびＯｐｐｅｎａｕｅｒ反応（スキーム３）の両方について全体的に改善された収率で、以前と同じ手順を使用してＤＨＥＡから開始した。
【化１】
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スキーマ１：５α−アビラテロン，３α−ヒドロキシ−５α−アビラテロン，３β−ヒドロキシ−５α−アビラテロン
Ｃ−３アセチル保護形成のための一般的手順
ピリジンに溶解した出発物質に無水酢酸を加え、反応物を室温で６〜７時間撹拌した。完了時に、反応物を激しく撹拌しながら氷冷水に注いで１時間で放置した。形成された白色沈殿物を濾過し、過剰の水で洗浄し、真空下で一晩乾燥させた。
３β−アセトキシ−５α−アンドロスタ−１６−エン−１７−イル−トリフルオロメタンスルホネート（２）
【００４３】
−７８℃のテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中の化合物１（１．６３ｇ、４．９ｍｍｏｌ）の溶液をカリウムビス（トリメチルシリル）アミド（ＫＨＭＤＳ、０．５Ｍ、９．８ｍＬ、４．９ｍｍｏｌ）で処理し、−７８℃で１時間撹拌した。Ｎ−フェニル−ビス（トリフルロメタンスルホンアミド）（２．０９ｇ、５．８８ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を−７８℃で２時間撹拌し、続いて室温までゆっくりと加温し、飽和ＮＨ４Ｃｌでクエンチした。生成物を酢酸エチルで抽出し、有機相を水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。化合物２をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン〜１０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、収率は８５％である。
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３β−アセトキシ−１７−（３−ピリジル）−５α−アンドロスタ−１６−エン  （３）
【００４４】
化合物２（２ｇ、４．３０ｍｍｏｌ）、ジエチル−３−ピリジルボラン（７５８．５ｍｇ、５．４８ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（２０ｍＬ）中のビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）クロライド（３０ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）の懸濁物を  炭酸ナトリウム水溶液（２Ｍ、７．５ｍＬ）に添加した。混合物をＮ２下で１８時間還流した。反応液を減圧濃縮し、残渣を酢酸エチルで抽出した。有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。化合物３をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン〜５０％酢酸エチル／ヘキサン）により精製し、収率：９０％。
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１７−（３−ピリジル）−５α−アンドロスタ−１６−エン−３β−オール（３β−ヒドロキシ−５α−アビラテロン）（４）
【００４５】
化合物３（８００ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）をメタノール（１０ｍＬ）に室温で溶解した。１０％ＫＯＨ−メタノール溶液（７ｍＬ）を加え、混合物を１．５時間撹拌し、続いて減圧下で濃縮した。ジクロロメタン（４０ｍＬ）および水（４０ｍＬ）を加え、混合物を１時間撹拌した。有機相を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。化合物４をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン〜５０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、収率８５％、ＨＰＬＣ純度９９．３％。
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１７−（３−ピリジル）−５α−アンドロスタ−１６−エン−３−オン（５α−アビラテロン）（５）
【００４６】
アセトン（２５ｍＬ）中の化合物４（２７０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）の溶液に、１０％（ｗ／ｖ）クロム酸（４．５ｍＬ）を０℃で滴下した。混合物を室温で３時間撹拌し、重炭酸ナトリウム溶液をｐＨ＝７まで加えた。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機相を水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。化合物５をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン〜４０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、収率：８５％，ＨＰＬＣ純度９９．４％。
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ＨＲＭＳによってｍ／ｚが［Ｍ＋Ｈ］＝３５０．２４８９と測定され，ｍ／ｚ＝３５０．２４７８と予測される。
１７−（３−ピリジル）−５α−アンドロスタ−１６−エン−３α−（４−フェノキシ）ベンゾエート（６）
【００４７】
化合物４（１３２ｍｇ、０．３７５ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１０８ｍｇ、０．４１２ｍｍｏｌ）および４−フェノキシ安息香酸（８１ｍｇ、０．３７５ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解し、０℃に１５分間冷却した  後に、ジイソプロピルアゾジカルボキシレートをゆっくりと添加し、添加するうちに黄色を消失させる。混合物を２．５時間撹拌し、揮発性成分を減圧下で除去した。化合物６をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出液として、２０％酢酸エチル／ヘキサン）により残渣から精製し、収率：８５％。
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１７−（３−ピリジル）−５α−アンドロスタ−１６−エン−３α−オール（３α−ヒドロキシ−５α−アビラテロン）（７）
【００４８】
化合物６（４０ｍｇ、０．１０２ｍｍｏｌ）をメタノール（４ｍＬ）に室温で溶解した。１０％ＫＯＨ−メタノール溶液（２．０ｍＬ）を加え、混合物を８０℃で２〜３時間撹拌し、続いて減圧下で濃縮した。ジクロロメタン（２５ｍＬ）および水（２５ｍＬ）を加え、混合物を１時間撹拌した。有機相を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。化合物７をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン〜５０％酢酸エチル／ヘキサン）により精製して、収率８５％。
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【化２】
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スキーマ２：５β−アビラテロン、３α−ヒドロキシ−５β−アビラテロンと３β−ヒドロキシ−５β−アビラテロンの合成
３α−アセトキシ−５β−アンドロスタ−１６−エン−１７−イル−トリフルオロメタンスルホネート（９）
−７８℃のテトラヒドロフラン（６ｍＬ）中の化合物８（５００ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）の溶液をカリウムビス（トリメチルシリル）アミド（ＫＨＭＤＳ、０．７Ｍ、２．４ｍＬ、１．５０ｍｍｏｌ）に−７８℃１時間処理した。Ｎ−フェニル−ビス（トリフルロメタンスルホンアミド）（６２６ｍｇ、１．８１ｍｍｏｌ）を加え、反応物を−７８℃で２時間撹拌し、次に室温までゆっくりと加温し、飽和ＮＨ４Ｃｌでクエンチした。生成物を酢酸エチルで抽出し、有機相を水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。化合物９をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン〜１０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、収率：８５％。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：  ４．７０（ｓ，１Ｈ），２．０２（ｓ，３Ｈ），０．９４（ｓ，３Ｈ），０．９３（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ。
３α−アセトキシ−１７−（３−ピリジル）−５β−アンドロスタ−１６−エン（１０）
【００４９】
化合物９（６９８ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）、ジエチル−３−ピリジルボラン（２６５ｍｇ、１．８０ｍｍｏｌ）  ＴＨＦ（１５ｍＬ）中のビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）クロリド（１１．０ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を炭酸ナトリウム水溶液（２Ｍ、５ｍＬ）に添加した。混合物をＮ２下で１８時間還流した。反応液を減圧濃縮し、残渣を酢酸エチルで抽出した。有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。化合物１０をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン〜５０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、収率：９０％。
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１７−（３−ピリジル）−５β−アンドロスタ−１６−エン−３α−オール（３α−ヒドロキシ−５β−アビラテロン）（１１）
【００５０】
化合物１０（１５０ｍｇ、０．３８３ｍｍｏｌ）をメタノール（５ｍＬ）に室温で溶解した。１０％ＫＯＨ−メタノール溶液（２．０ｍＬ）を加え、混合物を１．５時間撹拌し、続いて減圧下で濃縮した。ジクロロメタン（２５ｍＬ）および水（２５ｍＬ）を加え、混合物を１時間撹拌した。有機相を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。化合物１１をフロリジルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン〜５０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、収率：３５％。
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１７−（３−ピリジル）−５β−アンドロスタ−１６−エン−３−オン（５β−アビラテロン）（１２）
アセトン（４ｍＬ）中の化合物１１（５０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）の溶液に、１０％（ｗ／ｖ）クロム酸（１．０ｍＬ）を０℃で滴下した。混合物を室温で３時間撹拌し、重炭酸ナトリウム溶液をｐＨ＝７まで加えた。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機相を水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。化合物１２をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン〜４０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、収率：８５％，ＨＰＬＣ純度９９．４％。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．６（ｓ，１Ｈ），８．４（ｄ，Ｊ＝４．８，１Ｈ），７．６（ｄ，Ｊ＝７．６，１Ｈ），７．２（ｄｄ，Ｊ１＝４．８ＨｚおよびＪ２＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），５．９（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），２．４−１．２（ｍ，２０Ｈ），１．１（ｓ，３Ｈ），１．０（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ。
１７−（３−ピリジル）−５β−アンドロスタ−１６−エン−３β−（４−フェノキシ）ベンゾエート（１３）
【００５１】
化合物１１（１３２ｍｇ、０．３７５ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１０８ｍｇ、０．４１２ｍｍｏｌ）および４−フェノキシ安息香酸（８１ｍｇ、０．３７５ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解し、０℃で１５分間冷却し、ジイソプロピルアゾジカルボキシレートを徐々に加え、添加するうちに黄色を消失させた。混合物を２．５時間撹拌し、揮発性成分を減圧下で除去した。化合物１３を、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出液として、２０％酢酸エチル／ヘキサン）により残渣から精製し、収率３５％。
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１７−（３−ピリジル−５β−アンドロスタ−１６−エン−３β−オール（３β−ヒドロキシ−５β−アビラテロン）（１４）
【００５２】
化合物１３（４０ｍｇ、０．１０２ｍｍｏｌ）をメタノール（４ｍＬ）に室温で溶解した。１０％ＫＯＨ−メタノール溶液（２．０ｍＬ）を加え、混合物を８０℃で２〜３時間撹拌し、続いて減圧下で濃縮した。ジクロロメタン（２５ｍＬ）および水（２５ｍＬ）を加え、混合物を１時間撹拌した。有機相を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。化合物１４をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン〜５０％酢酸エチル／ヘキサン）により精製して、収率８５％。
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【化３】
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スキーマ３：Ｄ４Ａの合成
３β−アセトキシ−５α−アンドロスタ−１６−エン−１７−イル−トリフルオロメタンスルホネート（１７）
【００５３】
テトラヒドロフラン中の化合物１６（４．０ｇ、１２．１０ｍｍｏｌ）の溶液を−７８℃でカリウムヘキサメチルジシラザン（ＫＨＭＤＳ、０．５  Ｍ、２４．０ｍＬ、１２．１０ｍｍｏｌ）を加え、−７８℃で１時間撹拌した．Ｎ−フェニル−ビス（トリフルロメタンスルホンイミド）（５．１８ｇ、１４．５２ｍｍｏｌ）を加え、反応物を−７８℃で２時間撹拌し、次に室温にゆっくりと加温し、飽和ＮＨ４Ｃｌでクエンチした。減圧濃縮後、残留物を酢酸エチルで抽出し、有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。化合物１７をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し，収率：８５％。
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３β−アセトキシ−１７−（３−ピリジル）−５α−アンドロスタ−１６−エン（１８）
【００５４】
化合物１７（３．６ｇ、７．７８ｍｍｏｌ）、ジエチル−３−ピリジルボラン（１．３７ｇ、９．３４ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（３５ｍＬ）中のビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）クロライド（５４ｍｇ、０．０７７ｍｍｏｌ）  の懸濁液を炭酸ナトリウム水溶液（２Ｍ、１０ｍＬ）に加えた。混合物をＮ２下で１８時間還流した。反応液を減圧濃縮し、残渣を酢酸エチルで抽出した。有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。化合物１８をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン〜５０％酢酸エチル／ヘキサン）により精製して、収率：９０％。
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１７−（３−ピリジル）−５α−アンドロスタ−１６−エン−３β−オール（１９）
【００５５】
化合物１８（２．４ｇ、３．６ｍｍｏｌ）をメタノール（３０ｍＬ）に室温で溶解した。１０％ＫＯＨ−メタノール溶液（２１ｍＬ）を加え、混合物を１．５時間撹拌し、続いて減圧下で濃縮した。ジクロロメタン（８０ｍＬ）および水（８０ｍＬ）を加え、混合物を１時間撹拌した。有機相を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。化合物１９をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン〜５０％酢酸エチル／ヘキサン）により精製し、収率：８５％、ＨＰＬＣ純度９９．３％。
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１７−（３−ピリジル）アンドロスタ−４，１６−ジエン−３−オン（２０）
【００５６】
トルエン（１００ｍＬ）を、ディーン・スターク装置を用いて３５ｍＬが留去されるまで加熱還流した。室温に冷却された残りのトルエン（６５ｍＬ）に化合物１９（２．２ｇ、６．２９ｍｍｏｌ）、２−ブタノン（２０ｍＬ）およびアルミニウムイソプロポキシド（３．２ｇ、１５．７４ｍｍｏｌ）を添加した。反応物をさらに１６時間還流し、続いて溶媒を減圧下で除去した。生成物を酢酸エチルで抽出し、有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。化合物２０をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン〜５０％酢酸エチル／ヘキサン）により精製し，収率：８５％，ＨＰＬＣ純度９９．２％。
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【００５７】
すべての特許、特許出願、および刊行物、および本明細書に引用された電子的に入手可能な材料の完全な開示は、参考として援用される。前述の詳細な説明および実施例は、理解を明確にするためのものに過ぎない。そこから不必要な制限が理解されるべきではない。特に、化合物が有効である可能性のある機構を説明する理論が提示されてもよいが、本発明者は本明細書に記載の理論に拘束されない。本発明は、図示され説明された正確な詳細に限定されず、当業者に自明である変形が特許請求の範囲によって定義される本発明の保護範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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