(57)【要約】本開示の実施形態は、免疫療法に有効なＮＫＴ細胞を作出するための方法及び組成物を含み、ならびに免疫療法を必要とする個体に有効量のＮＫＴ細胞を提供するための方法及び組成物も含む。具体的な実施形態では、ＮＫＴ細胞はＣＤ６２Ｌ＋であり、１以上の共刺激作用因子に曝露されてＣＤ６２Ｌの発現を維持している。場合によっては、ＮＫＴ細胞はキメラ抗原受容体を組み込むように操作されてもよい。【選択図】図３Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫療法で使用するためのナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を調製する方法であって、ＣＤ６２Ｌ陽性ＮＫＴ細胞についてＮＫＴ細胞の集団を濃縮する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ＣＤ６２Ｌ陽性ＮＫＴ細胞が、Ｔ細胞受容体の刺激と共刺激受容体及び／またはサイトカインの同時刺激とによって活性化される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
治療を必要とする個体に治療上有効な量の前記細胞を送達する工程をさらに含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、１以上のキメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体、１以上のサイトカイン、１以上のサイトカイン受容体、１以上のキメラサイトカイン受容体、またはそれらの組み合わせを発現するように操作される請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
免疫療法を用いて病状について個体を治療する方法であって、
（ａ）ＣＤ６２Ｌ陽性ＮＫＴ細胞についてＮＫＴ細胞の集団を濃縮するまたはＣＤ６２Ｌ陽性ＮＫＴ細胞について濃縮されているＮＫＴ細胞の集団を得る工程と、
（ｂ）治療上有効な量の前記ＣＤ６２Ｌ陽性ＮＫＴ細胞を前記個体に提供する工程とを含む、前記方法。
【請求項６】
免疫療法を用いて病状について個体を治療する方法であって、
ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞とＣＤ６２Ｌ−ＮＫＴ細胞の集団混合物を１以上の共刺激作用因子に曝露して同時刺激されたＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞について濃縮し、ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞を作出することによって前記集団混合物からＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞を増殖させる工程と、
前記個体に治療上有効な量の前記同時刺激されたＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞を提供する工程とを含む、前記方法。
【請求項７】
刺激作用因子及び共刺激作用因子が
（ａ）１以上のサイトカイン、
（ｂ）Ｔ細胞受容体に対するアゴニスト抗体またはリガンド（たとえば、ＯＫＴ３ｍＡｂ、６Ｂ１１ｍＡｂ、または結合したアルファ−ガラクトシルセラミドのようなアゴニスト糖脂質を伴った組換えヒトＣＤ１ｄ）及び共刺激受容体を標的とする１以上のアゴニスト抗体を含む基材、または
（ｃ）ＣＤ１ｄの発現を含み、且つ１以上の共刺激受容体の１以上のリガンドの発現を含む抗原提示細胞を含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＤ１ｄの発現が結合したアゴニスト糖脂質を伴う請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記糖脂質がアルファ−ガラクトシルセラミドである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記サイトカインが、ＩＬ−２１、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＴＮＦアルファ及びそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項７、８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記基材がビーズ、プレートまたはゲルである請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗原提示細胞に１以上のポリヌクレオチドが形質導入され、１以上の共刺激受容体の１以上のリガンドを発現する請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記共刺激受容体がＣＤ２８、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、またはそれらの組み合わせである請求項７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記共刺激受容体の前記リガンドが、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＩＣＯＳリガンド、ＣＤ１５４、ＣＤ３０Ｌ、またはそれらの組み合わせである請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＮＫＴ細胞が遺伝子操作を含む請求項７〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記遺伝子操作が前記細胞に癌細胞ターゲティング活性を提供する請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記癌細胞ターゲティング活性が癌細胞上の抗原のターゲティングを含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記遺伝子操作がＴ細胞受容体を含む請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記遺伝子操作がキメラ抗原受容体を含む請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
１以上の共刺激作用因子に前記集団を曝露した後、前記ＮＫＴ細胞が遺伝子操作される請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
１以上の共刺激作用因子に前記集団を曝露した後１、２、３、４、５、６日以上以内に、前記ＮＫＴ細胞が遺伝子操作される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
免疫療法のためのＮＫＴ細胞を作出する方法であって、ＮＫＴ細胞の集団を同時刺激して前記ＮＫＴ細胞の少なくとも一部でＣＤ６２Ｌの発現を維持する工程を含む、前記方法。
【請求項２３】
さらに、それを必要とする個体に有効な量の前記ＮＫＴ細胞を提供する工程を含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
免疫療法のためのＮＫＴ細胞を作出する方法であって、ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞の集団を目的があって濃縮するまたは保持するように設計された１以上の共刺激作用因子にＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞の事前に選別された集団またはＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞とＣＤ６２Ｌ−ＮＫＴ細胞との混合集団を曝露する工程を含む、前記方法。
【請求項２５】
さらに、前記混合集団を得る工程を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記混合集団が、前記濃縮された集団が送達されるであろう個体に由来する請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記混合集団が、前記濃縮された集団が送達されるであろう前記個体とは異なる個体に由来する請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記混合集団が寄託物に由来する請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記混合集団が商業的に得られる請求項２４または２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、双方ともその出願が全体として参照によって本明細書に組み入れられる２０１５年４月２３日に出願された米国仮特許出願番号６２／１５１，６９０及び２０１６年３月１７に出願された米国仮特許出願番号６２／３０９，５２５に対して優先権を主張する。
【０００２】
連邦が支援した研究または開発に関する声明
本発明は国立衛生研究所によって授与されたＲＯ１ＣＡ１１６５４８及びＰ５０ＣＡ１２６７５２のもとで政府の支援によって行われた。政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本開示の実施形態は、細胞生物学、分子生物学、免疫学、及び少なくとも癌医学を含む医学の少なくとも分野を包含する。
【背景技術】
【０００４】
Ｉ型のＮＫＴ細胞（ＮＫＴ）は、インバリアントＴＣＲα鎖Ｖα２４−Ｊα１８を発現し、単形性のＨＬＡクラスＩ様分子ＣＤ１ｄによって提示される自己または微生物に由来する糖脂質に反応する自然リンパ球の進化上保存されたサブセットである（Ｐｏｒｃｅｌｌｉら．（１９９３）；Ｌａｎｔｚ及びＢｅｎｄｅｌａｃ，１９９４；Ｂｅｎｄｅｌａｃら，１９９５；Ｋｉｍら，２０１５）。腫瘍免疫及び免疫療法にとってのＮＫＴの潜在的な重要性は、マウスにおける癌の複数のモデル及び癌患者の初期の臨床試験において実証されている（ＭｃＥｗｅｎ−Ｓｍｉｔｈら，２０１５；Ｄｈｏｄａｐｋａｒ，２００９；Ｅｘｌｅｙ及びＮａｋａｙａｍａ，２０１１；Ｍｏｔｏｈａｓｈｉら，２０１１；Ｙａｍａｓａｋｉ，２０１１；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら，２０１５）。Ｔ細胞とは対照的にＮＫＴは効果的に腫瘍部位に動き、ＣＤ１ｄ＋腫瘍細胞の直接殺傷、腫瘍支援性のマクロファージの阻害、またはＮＫ細胞のトランス活性化を介して抗腫瘍応答に介在することができる（Ｍｅｔｅｌｉｔｓａ，２０１１）。幾つかの研究は、腫瘍浸潤性または循環性のＮＫＴの数と多様な腫瘍型の患者における改善された疾患転帰との間での強い明らかな関連を示している（Ｄｈｏｄａｐｋａｒ，２００９；Ｍｅｔｅｌｉｔｓａら，２００４；Ｔａｃｈｉｂａｎａら，２００５；Ｍｏｌｌｉｎｇら，２００７；Ｃａｒｉａｎｉら，２０１２；Ｃａｒｉａｎｉら，２０１２）。逆に、腫瘍の進行には、ＮＫＴ細胞の数もしくは機能的な活性の低下（１６）、または悪性腫瘍細胞でのＣＤ１ｄの発現の下方調節が伴うことが多い（Ｄｈｏｄａｐｋａｒら，２００３）。これらの腫瘍逃避メカニズムに対抗するために、初代ヒトＮＫＴを生体外で臨床規模まで増殖させ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のトランスジェニック発現を介し、腫瘍細胞に対してその細胞傷害性を向け直す方法が開発された（Ｈｅｃｚｅｙら，２０１４）。ＣＡＲ  Ｔ細胞臨床試験で報告された所見（Ｋａｌｏｓ及びＪｕｎｅ，２０１３；Ｄｏｔｔｉら，２０１４）に類似して、異種腫瘍モデルにおける抗腫瘍有効性とＣＡＲ  ＮＫＴ細胞の産物の生体内での存続性との間に強い相関がある（Ｈｅｃｚｅｙら，２０１４）。しかしながら、ヒトＮＫＴの生体外での増殖及びそれに続く生体内での存続性を支配するメカニズムは大部分未知のままであり、ＮＫＴ細胞に基づく癌免疫療法の合理的な設計を妨げている。
【０００５】
最近の世界的な転写のプロファイリング試験は、ＮＫＴは、Ｔ細胞及びＮＫ細胞と特性を共有するが、リンパ球のはっきり異なる集団であることを実証した（Ｃｏｈｅｎら，２０１３）。マウスでは、最近の概説にて要約されているように（Ｋｉｍら，２０１５；Ｃｏｎｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ及びＢｅｎｄｅｌａｃ，２０１３）、ＮＫＴの発生プログラム及び機能的な分化が最近の１０年間でかなり広範に特徴付けられている。マウスのＮＫＴの幾つかの重要な特徴もヒトの対応部分で確認されている。マウス及びヒトの双方にて、ＮＫＴはＣＤ４＋ＣＤ８＋（二重陽性、ＤＰ）胸腺細胞の段階でＴ細胞から分岐する。胸腺上皮細胞によって正の選択をされるＴ細胞とは異なって、ＮＫＴはＣＤ１ｄを発現するＤＰ胸腺細胞によって選択される（Ｇａｐｉｎら，２００１）。正の選択の直後での前骨髄性白血病亜鉛フィンガー転写因子（ＰＬＺＦ）の発現によってＮＫＴの胸腺内での増殖及びエフェクター／メモリー様の分化が可能になる（Ｓａｖａｇｅら，２００８）。末梢ＮＫＴは寿命の長いリンパ球であり、その胸腺後の維持はＩＬ−１５が介在する緩慢な恒常的増殖に大部分依存する（Ｍａｔｓｕｄａら，２００２；Ｂａｅｖら，２００４）。ヒト末梢血では、ＮＫＴはＣＤ４の発現：ＣＤ４＋及びＣＤ４−（ほとんどＣＤ８／ＣＤ４二重陰性、ＤＮ）に基づいて２つの主要な機能的サブセットに分けられる（Ｌｅｅら，２００２）。ＣＤ４＋サブセットは新生児ＮＫＴで高度に濃縮され、成人ではＣＤ４−サブセットに比べて恒常的な分裂をほとんど受けない（Ｂａｅｖら，２００４）ということは、ＣＤ４＋ＮＫＴは特定の条件下では養子導入した治療用ＮＫＴの長期存続性に寄与し得ることを示唆している。しかしながら、たとえば、αガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ）による抗原刺激に応答したヒトＮＫＴの生体外での増殖は類似の数のＣＤ４＋及びＤＮのＮＫＴを生じる（２８）。ＮＫＴはまたＣＤ１６１及び次いでＣＤ５６の発現の獲得によってＮＫ様の系列分化も示す。Ｔ細胞におけると同様に、ＣＤ５６の発現は最終分化及び増殖能の喪失に関連する（Ｌｏｚａら，２００２）。
【０００６】
ナイーブからセントラルメモリーへ、それからエフェクターメモリーへ、それから最終エフェクター細胞までの十分に確立された発生階層を有する末梢Ｔ細胞（Ｓａｌｌｕｓｔｏら，２００４）とは対照的に、ＮＫＴはナイーブ状態のない「活性化された／メモリー」の表現型を持つ細胞として広く記載されている（Ｄ’Ａｎｄｒｅａら，２０００；Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ及びＧａｐｉｎ，２００２）。臍帯血では、ＮＫＴの大半はＣＤ４＋であり、即効型エフェクター機能のないＣＤ６２Ｌ及びＣＣＲ７と共にＣＤ４５ＲＯを同時発現するので、セントラルメモリーＣＤ４Ｔ細胞に類似する（Ｂａｅｖら，２００４；Ｄ’Ａｎｄｒｅａら，２０００；Ｅｇｅｒら，２００６）。成人の末梢血では、ＮＫＴはＣＤ４＋及びＣＤ４−のサブセットに均等に分けられる（個体間の有意な変異性があるにもかかわらず）。成人ＮＫＴは、メモリーのマーカーを変化して発現し、サイトカイン産生や細胞傷害性のような即効型エフェクター機能を有するので「メモリー」状態と「エフェクター」状態の間での明瞭な境界を欠いている（Ｂａｅｖら，２００４；Ｅｇｅｒら，２００６）。高齢者でさえ成人ＮＫＴの大半はＣＤ２８を発現し（ＤｅｌａＲｏｓａら，２００２）、最終分化したＴエフェクター細胞からそれらを区別している（Ｏｋａｄａら，２００８）。
【０００７】
最近の報告は、ＣＤ６２Ｌ＋セントラルメモリーＴ細胞は幹細胞の特性及び細胞療法製品にて優れた治療活性を有することを明らかにしている（Ｇｒａｅｆら，２０１４；Ｗａｎｇら，２０１２；Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒら，２０１５）。ＮＫＴにおけるＣＤ６２Ｌの発現の機能的な意義は未知のままである。本開示では、ＣＤ６２Ｌ＋サブセットはＮＫＴ細胞の生体外での増殖及び生体内での存続性に必要とされる。重要なことに、ＣＤ１９に特異的なＣＡＲ（ＣＡＲ．ＣＤ１９）を発現するように操作した場合、ＮＳＧマウスにおけるＢ細胞リンパ腫モデルではＣＤ６２Ｌ−ではなくＣＤ６２Ｌ＋のＣＡＲ．ＣＤ１９ＮＫＴが持続する腫瘍退行を生じた。ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴは特定の共刺激リガンドが提供されると生体外増殖の間、維持され得る。この知識によって、たとえば、癌患者にて優れた治療活性を持つＮＫＴ及びＣＡＲ−ＮＫＴを生成するのに使用することができる共刺激性の人工の抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を操作することができる。
【発明の概要】
【０００８】
本開示の方法及び組成物はそれを必要とする個体のための免疫療法に関する。一部の実施形態では、個体は、破壊のために、たとえば、癌のような特定の抗原保有細胞を標的とする治療法を必要とする。本開示は一般に、臨床的に有用な量と有効性のＮＫＴ細胞を生成する方法の改善に基づく免疫療法のためのＮＫＴ細胞の使用を提供する。
【０００９】
本開示の実施形態は、優れた生体内の存続性及び抗腫瘍活性を有するＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞を提供する。本開示の実施形態は、ＮＫＴ細胞を治療応用で使用することができるようにＮＫＴ細胞の効果的な増殖を可能にする。本開示のＮＫＴはＣＤ６２Ｌの発現に関連する向上した生存及び増殖を有する。ＣＤ６２Ｌの発現はＮＫＴ細胞に存在し、ＮＫＴ細胞の同時刺激のゆえに細胞にて維持される。本開示の実施形態は、ＣＤ６２Ｌの発現を維持するための方法によるＮＫＴ細胞の同時刺激を含む。ＮＫＴ細胞は、たとえば、１以上のサイトカイン（少なくともＩＬ−２１を含む）、共刺激受容体に結合する１以上のアゴニスト抗体、及び／またはＣＤ１ｄと、たとえば、１以上の共刺激受容体のリガンドを発現する人工の抗原提示細胞への曝露の際のような、１以上の方法を用いた同時刺激に曝露される。従って、具体的な実施形態では、効果的な癌免疫療法のためにＣＤ６２Ｌが濃縮されたＮＫＴの生成のための人工の抗原提示細胞を利用することができる。
【００１０】
一実施形態では、ＣＤ６２Ｌ陽性ＮＫＴ細胞のためにＮＫＴ細胞の集団を濃縮する工程を含む免疫療法での使用のためのナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を調製する方法がある。具体的な実施形態では、ＣＤ６２Ｌ陽性ＮＫＴ細胞は、Ｔ細胞受容体の刺激及び共刺激受容体及び／またはサイトカインによる同時刺激によって活性化される。場合によっては、方法はさらに、治療を必要とする個体に治療上有効な量の細胞を送達する工程を含む。特定の態様では、細胞は、１以上のキメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体、１以上のサイトカイン、１以上のサイトカイン受容体、１以上のキメラサイトカイン受容体、またはそれらの組み合わせを発現するように操作される。
【００１１】
特定の実施形態では、（ａ）ＣＤ６２Ｌ陽性ＮＫＴ細胞のためにＮＫＴ細胞の集団を濃縮するまたはＣＤ６２Ｌ陽性ＮＫＴ細胞について濃縮されているＮＫＴ細胞の集団を得る工程と、（ｂ）治療上有効な量のＣＤ６２Ｌ陽性ＮＫＴ細胞を個体に提供する工程とを含む、免疫療法を用いて病状について個体を治療する方法がある。
【００１２】
実施形態では、ＣＤ６２＋ＮＫＴ細胞とＣＤ６２−ＮＫＴ細胞の集団混合物を１以上の共刺激作用因子に曝露して同時刺激されたＣＤ６２＋ＮＫＴ細胞について濃縮し、ＣＤ６２＋ＮＫＴ細胞を作出することによってその集団混合物からＣＤ６２＋ＮＫＴ細胞を増殖させる工程と、治療上有効な量の同時刺激されたＣＤ６２＋ＮＫＴ細胞を個体に提供する工程とを含む、免疫療法を用いて病状について個体を治療する方法がある。具体的な実施形態では、刺激作用因子及び共刺激作用因子は、（ａ）１以上のサイトカイン；（ｂ）Ｔ細胞受容体のためのアゴニスト抗体またはリガンド（たとえば、ＯＫＴ３ｍＡｂ、６Ｂ１１ｍＡｂまたは結合したアルファ−ガラクトシルセラミドのようなアゴニスト糖脂質を伴った組換えヒトＣＤ１ｄ）及び共刺激受容体を標的とする１以上のアゴニスト抗体を含む基材；または（ｃ）ＣＤ１ｄの発現を含み、且つ１以上の共刺激受容体の１以上のリガンドの発現を含む抗原提示細胞を含む。特定の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−２１、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＴＮＦアルファ及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。基材はビーズ、プレートまたはゲルであってもよい。具体的な実施形態では、抗原提示細胞は、１以上のポリヌクレオチドで形質導入されて１以上の共刺激受容体の１以上のリガンドを発現する。共刺激受容体は、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、またはそれらの組み合わせであってもよい。共刺激受容体のリガンドは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＩＣＯＳリガンド、ＣＤ１５４、ＣＤ３０Ｌ、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００１３】
特定の実施形態では、本開示によって包含されるＮＫＴ細胞は、遺伝子操作を含む。具体的な態様では、遺伝子操作は細胞に、癌細胞における抗原のターゲティングのような癌細胞ターゲティング活性を提供する。遺伝子操作はＴ細胞受容体及び／またはキメラ抗原受容体を含んでもよい。場合によっては、ＮＫＴ細胞は、集団を１以上の共刺激作用因子に曝露させた後に遺伝子操作される。ＮＫＴ細胞は、１以上の共刺激作用因子への集団の曝露の後、１、２、３、４、５、６日以上以内に遺伝子操作されてもよい。
【００１４】
特定の実施形態では、ＮＫＴ細胞の集団を同時刺激してＮＫＴ細胞の少なくとも一部でＣＤ６２Ｌの発現を維持する工程を含む、免疫療法のためのＮＫＴ細胞を作出する方法がある。場合によっては、方法はさらに、それを必要とする個体に治療上有効な量のＮＫＴ細胞を提供する工程を含む。
【００１５】
一実施形態では、意図的にＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞を濃縮するまたは保持するように設計された１以上の共刺激作用因子にＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞の予備選別した集団またはＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞とＣＤ６２Ｌ−ＮＫＴ細胞の混合集団を曝露する工程を含む、免疫療法のためのＮＫＴ細胞を作出する方法がある。場合によっては、方法はさらに、混合集団を得る工程を含む。具体的な実施形態では、混合集団は濃縮された集団が送達されるであろう個体に由来する。特定の態様では、混合集団は濃縮された集団が送達されるであろう個体とは異なる個体に由来する。混合集団は寄託物に由来してもよいし、または商業的に入手してもよい。
【００１６】
一実施形態では、ＣＤ１ｄを発現し、且つ１以上の共刺激受容体の１以上のリガンドを発現している非天然の細胞を含む物質の組成物がある。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】（１Ａ〜１Ｄ）初代ＮＫＴの試験管内での抗原刺激後の培養におけるＣＤ６２Ｌ＋サブセットの蓄積を示す図である。（１Ａ）新たに単離したＰＢＭＣ（０日目）に由来する及びαＧａｌＣｅｒで刺激し、培養にて試験管内で増殖させた後１２日目の初代ＮＫＴにてＦＡＣＳによってＣＤ６２Ｌの発現を調べた。（１Ｂ）個々のドナー（ｎ＝１０）に由来する一次刺激（１Ａにおけるような）の後、示した間隔でのＮＫＴにおけるＣＤ６２Ｌ発現の動態。（１Ｃ）ＮＫＴ細胞表面上のＰＤ−１、ＴＩＭ−３及びＬＡＧ−３の発現を０日目と１２日目にＦＡＣＳによって測定した。４人のドナーのうち１人の代表的な図（上のパネル）またはドナーすべてのＭＦＩの平均値±ＳＤ（下のパネル）。（１Ｄ）一次刺激後１２日目にて、ＮＫＴをＣＤ６２Ｌ＋とＣＤ６２Ｌ−のサブセットに磁気で選別し、その後、ヒト免疫学パネルｖ２及びｎＣｏｕｎｔｅｒ解析システムを用いてＲＮＡを単離し、遺伝子発現を解析した。ヒートマップは、０．０２未満のｐ値で遺伝子のｌｏｇ２倍の変化（ＣＤ６２＋／ＣＤ６２Ｌ−）及び２を超える平均倍数変化を示している。データは６人のＮＫＴ細胞のドナーから生成した（１２対の試料）。
【図１Ｂ】同上。
【図１Ｃ−１】同上。
【図１Ｃ−２】同上。
【図１Ｃ−３】同上。
【図１Ｄ】同上。
【００１８】
【図２Ａ】（２Ａ〜２Ｅ）ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌ−のＮＫＴの機能的な性状分析を示す図である。（２Ａ）ルシフェラーゼを形質導入したＣＤ１ｄ＋ＤＡＯＹ細胞をＰＢＳ（対照）またはαＧａｌＣｅｒで一晩パルスし、その後、磁気で選別したＣＤ６２Ｌ＋またはＣＤ６２Ｌ−のＮＫＴと共に共培養した。ルシフェラーゼ強度をプレートリーダーで測定することによって４時間後、細胞傷害性を分析した。左の図はＮＫＴサブセット間で細胞傷害性に差異のない３人のドナーの代表である。右の図はＮＫＴサブセット間で細胞傷害性に有意な差異がある３人のドナーの代表である。（２Ｂ）３人のドナーに由来するＮＫＴによる３回の独立した実験におけるルミネックスアッセイによってαＧａｌＣｅｒで刺激したＣＤ６２Ｌ＋またはＣＤ６２Ｌ−のＮＫＴの２４時間上清にてＩＦＮγ及びＩＬ−４の濃度を測定した。（２Ｃ）ＣＦＳＥで標識したＮＫＴを選別後のＦＡＣＳによって確認されたようにＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌ−のサブセットに磁気で選別し（上のパネル）、αＧａｌＣｅｒでパルスした放射線照射のＡＰＣによって刺激した。刺激の３日後、ＣＦＳＥ陽性事象に対してゲートをかけた後、ＦＡＣＳによってＮＫＴにてアネキシンＶ及び７−ＡＡＤについての染色を解析した。結果は調べた５人のドナーの代表に由来する（真ん中のパネル）。対応する棒グラフ（下のパネル）は３日目におけるアネキシンＶ＋ＮＫＴの百分率の平均値±ＳＤを示す（Ｎ＝５）。（２Ｄ）ＣＦＳＥ希釈によって測定されたように、刺激後６日目にて細胞増殖を評価した。結果は調べた５人のドナーの代表に由来し（上のパネル）、５人のドナーすべてのＣＦＳＥのＭＦＩの平均値±ＳＤである（下のパネル）。（２Ｅ）ＮＫＴ細胞の刺激後、示した時間間隔で総細胞計数を行った。示されるのは代表的ドナーの生細胞の平均値±ＳＤ（上のパネル）または刺激後６日目で調べた５人のドナーそれぞれの倍数変化である。***Ｐ＜０．００１、対応するｔ検定。
【図２Ｂ】同上。
【図２Ｃ−１】同上。
【図２Ｃ−２】同上。
【図２Ｄ−１】同上。
【図２Ｄ−２】同上。
【図２Ｅ】同上。
【００１９】
【図３Ａ】（３Ａ〜３Ｄ）ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴは優れた生体内の存続性及び抗腫瘍活性を有することを示す図である。（３Ａ）ルシフェラーゼを形質導入したＮＫＴをＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌ−のサブセットに選別し、ＮＳＧマウスに注射した。生物発光画像法によってＮＫＴ細胞の生体内存続性をモニターした。（３Ｂ）ＣＤ６２Ｌ＋またはＣＤ６２Ｌ−のＮＫＴの注射後示した日数での生物発光の光子計数の平均値±ＳＤ（Ｐ＝０．００８、対応のあるｔ検定）。（３Ｃ）各マウスに２×１０５個のルシフェラーゼを形質導入したＤａｕｄｉリンパ腫細胞のｉ．ｖ．注射（０日目）、その後、ＩＬ−２（１０００Ｕ／マウス）または対照としてＰＢＳを伴った１０７個のＣＡＲ．ＣＤ１９を形質導入したＮＫＴのｉ．ｖ．注射（４日目）を与えた。週に１回、生物発光画像法を用いて腫瘍の増殖をモニターした。（３Ｄ）Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法によって生存確率を解析した（群当たり１０匹のマウス）。次いで対数ランク検定を用いて生存における差異を比較した。
【図３Ｂ】同上。
【図３Ｃ】同上。
【図３Ｄ】同上。
【００２０】
【図４Ａ】（４Ａ〜４Ｄ）同時刺激はＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴを維持し、枯渇を阻むことを示す図である。（４Ａ）ＮＫＴをＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌ−のサブセットに選別し、αＧａｌＣｅｒで刺激し、刺激の前及び３日後にＦＡＣＳによって４−１ＢＢ及びＯＸ４０の発現について調べた。示したのは４人のドナーの代表に由来する図である。（４Ｂ）示したアゴニストｍＡｂで被覆したプレートにてＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴを刺激した。示したのは、０日目と比較した刺激後７日目のＮＫＴ細胞の絶対数における倍数変化の平均値±ＳＤ（Ｎ＝４）である。Ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡ。（４Ｃ）ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴをＢと同様に刺激し、７日目にアイソタイプ対照（灰色）に対比したＣＤ６２Ｌの発現（黒色）について解析した。示したのは、代表的なオーバーレイヒストグラム（上のパネル）及びＣＤ６２Ｌ＋細胞の百分率の平均値±ＳＤ、Ｎ＝４である。（４Ｄ）ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴをＢと同様に刺激し、１２日目にアイソタイプ対照（灰色）に対比したＰＤ−１の発現（黒色）について解析した。示したのは、代表的なオーバーレイヒストグラム（上のパネル）及びＰＤ−１＋細胞の百分率の平均値±ＳＤである。**または***Ｐ＜０．０１または０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡ。
【図４Ｂ】同上。
【図４Ｃ−１】同上。
【図４Ｃ−２】同上。
【図４Ｃ−３】同上。
【図４Ｄ−１】同上。
【図４Ｄ−２】同上。
【図４Ｄ−３】同上。
【００２１】
【図５Ａ】（５Ａ〜５Ｅ）新たに単離した、及び試験管内で増殖させたＮＫＴの表現型解析を示す図である。（５Ａ）新たに単離した臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣ）における初代ＮＫＴ（ＣＤ３＋Ｖα２４−Ｊα１８＋のサブセットにゲートをかけた）にてＦＡＣＳによってＣＤ４及びＣＤ６２Ｌの発現を調べた。図は５人のＣＢＭＣドナーの代表に由来する。（５Ｂ）αＧａｌＣｅｒによる刺激及び試験管内での増殖の前（０日目）及び１２日後にＡのようにゲートをかけた後、初代ＮＫＴにてＣＤ４及びＣＤ６２Ｌの発現を調べた。図は１０人のＰＢＭＣドナーの代表に由来する。（５Ｃ）αＧａｌＣｅｒによる刺激及び試験管内での増殖の前（０日目）及び１２日後にＡのようにゲートをかけた後、初代ＮＫＴにおけるＣＤ６２Ｌの発現との関係でのＣＣＲ７、ＣＤ２７及びＣＤ２８の発現。図は６人のＰＢＭＣドナーの代表に由来する。（５Ｄ）αＧａｌＣｅｒによる刺激及び試験管内での増殖の１２日後におけるＣＤ６２Ｌの発現との関係でのＣＤ１６１、ＣＤ５６及びＩＬ７Ｒαの発現。図は３人のＰＢＭＣドナーの代表に由来する。（５Ｅ）αＧａｌＣｅｒによる刺激及び試験管内での増殖の後１２日目にて細胞内フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ６２Ｌの発現との関係でのＰＬＺＦ、ＬＥＦ１及びＧＡＴＡ３の発現ならびにＬＥＦ１及びＧＡＴＡ３の同時発現を解析した。図は４人のＰＢＭＣドナーの代表に由来する。
【図５Ｂ】同上。
【図５Ｃ】同上。
【図５Ｄ】同上。
【図５Ｅ−１】同上。
【図５Ｅ−２】同上。
【００２２】
【図６Ａ−１】（６Ａ〜６Ｂ）ａＧａｌＣｅｒでパルスし、放射線照射したＰＢＭＣに対比してＣＤ３／ＣＤ２８アゴニストｍＡｂによって増殖させた後のＮＫＴ細胞の純度及び絶対数の比較を示す図である。ＮＫＴは４人のＰＢＭＣから単離した。その半分はａＧａｌＣｅｒでパルスし、放射線照射した自己ＰＢＭＣを用いて刺激し、別の半分はＣＤ３／ＣＤ２８ｍＡｂを被覆したプレートで刺激した。双方の場合、細胞は隔日でＩＬ−２（２００Ｕ／ｍｌ）を加えた培養で増殖させた。１２日目に培養物を解析した。（６Ａ）ＮＫＴ細胞の純度はＣＤ３及びｉＴＣＲαを発現している細胞の百分率としてフローサイトメトリーによって決定した。（６Ｂ）ＮＫＴ細胞の絶対細胞計数は３つ組にてトリパンブルー排除アッセイを用いて実施した。*Ｐ＜０．０５、データは対応のあるｔ検定を用いてＬｏｇ（２）変換の後解析した。
【図６Ａ−２】同上。
【図６Ｂ】同上。
【００２３】
【図７Ａ】（７Ａ〜７Ｂ）ＣＡＲ．ＣＤ１９で形質導入したＮＫＴ細胞を示す図である。（７Ａ）ＣＡＲ．ＣＤ１９構築物の模式図。（７Ｂ）ＮＫＴを自己ＰＢＭＣ（４０Ｇｙで照射した）で再刺激した。再刺激後３日目に、２４穴の非組織培養プレートをレトロネクチンで被覆し、洗浄の後、ＣＡＲ．ＣＤ１９を含有する１ｍｌのレトロウイルス上清で植菌した。次いでウイルス上清を取り除き、完全培地と２００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２のウェルにＮＫＴを加えた。次いでＮＫＴをＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌ−のサブセットに磁気で選別し、形質導入後１２日目のＦＡＣＳによる２Ｄ３ｍＡｂ染色によってＣＡＲ．ＣＤ１９の表面発現を解析した。示したのは、３回の独立した実験の代表に由来するＦＡＣＳの図である。
【図７Ｂ】同上。
【００２４】
【図８Ａ】（８Ａ〜８Ｂ）静止状態の及び活性化されたＮＫＴ上での共刺激受容体の発現を示す図である。（８Ａ）静止状態のＮＫＴ（一次刺激の１２日後）及びαＧａｌＣｅｒによる再刺激の３日後のＮＫＴにおけるＣＤ４に関連したＯＸ４０及び４−１ＢＢの発現のＦＡＣＳ解析。図は６人のＰＢＭＣドナーの代表に由来する。（８Ｂ）αＧａｌＣｅｒによるＮＫＴ細胞の再刺激３日後でのＣＤ４に関連したＯＸ４０及び４−１ＢＢの発現について、磁気で選別したＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌ−のＮＫＴを解析した。図は４人のＰＢＭＣドナーの代表に由来する。
【図８Ｂ】同上。
【００２５】
【図９】低濃度及び高濃度のプレートに結合したＯＫＴ３ｍＡｂを用いたＮＫＴ細胞の増殖の比較を示す図である。試験管内で増殖させ、休止しているＮＫＴを、２０ｎｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３であるＯＫＴ３ｍＡＢで単独にて、または５００ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８であるＣＤ２８．２ｍＡｂと共に刺激した。細胞は、隔日でＩＬ−２（２００Ｕ／ｍｌ）を加えた培養で増殖させた。１２日目に３つ組でトリパンブルー排除アッセイを用いてＮＫＴ細胞の絶対細胞計数を実施し、０日目での投入数に分けた。データはＭ±ＳＤ、Ｎ＝４である。**Ｐ＝０．０１、対応のあるｔ検定。
【００２６】
【図１０−１】ＩＬ−２１は初代増殖の間にＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞の頻度を増やすことを示す図である。
【図１０−２】同上。
【図１０−３】同上。
【００２７】
【図１１−１】ＩＬ−２１は二次増殖の間にＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞の頻度を増やすことを実証する図である。
【図１１−２】同上。
【図１１−３】同上。
【００２８】
【図１２−１】例としてＲａｍｏｓ細胞上でのＣＤ１ｄ及び共刺激分子の発現を示す図である。
【図１２−２】同上。
【００２９】
【図１３−１】Ｒａｍｏｓ細胞は高レベルのＣＤ６２Ｌの発現を伴う初代ＮＫＴを増殖させることができることを示す図である。
【図１３−２】同上。
【図１３−３】同上。
【００３０】
【図１４】Ｒａｍｏｓ細胞は、ＣＤ６２Ｌの発現の有意な保持を伴った二次刺激の際ＮＫＴを増殖させることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本出願は２０１５年４月２３日に出願された６２／１５１，６９０を参照によって本明細書に組み入れる。
【００３２】
本明細書で使用されるとき、「ａ」または「ａｎ」は１以上を意味してもよい。クレームにて本明細書で使用されるとき、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」と併せて使用される場合、単語「ａ」または「ａｎ」は１または１超を意味してもよい。本明細書で使用されるとき、「別の」は少なくとも第２以上を意味してもよい。具体的な実施形態では、本発明の態様は、たとえば、本発明の１以上の配列から「本質的に成って」もよくまたは「成って」もよい。本発明の一部の実施形態は、本発明の１以上の要素、方法工程及び／または方法から成ってもよく、または本質的に成ってもよい。本明細書に記載されている任意の方法または組成物は、本明細書に記載されている他の方法または組成物に関連して実施され得ることが熟考される。本出願の範囲は、本明細書に記載されている過程、機械、製造、物質の組成、手段、方法及び工程の特定の実施形態に限定されるとは意図されない。
【００３３】
Ｉ．一般的な実施形態
本開示は、ＮＫＴ細胞が十分なレベルまで増殖し、生体内にて十分なレベルで持続して治療効果を達成することができるので免疫療法での使用に好適なＮＫＴ細胞を提供する。本開示のＮＫＴ細胞は、少なくともある程度それらが高い治療適用性を有するようにするＣＤ６２Ｌを発現し、その発現を維持するように操作される。ＮＫＴ細胞におけるＣＤ６２Ｌの発現のそのような維持は、１以上の共刺激作用因子への曝露の際を含む同時刺激の際に少なくともある程度生じる。
【００３４】
ＩＩ．ＮＫＴ細胞及びその同時刺激
特定の実施形態では、ＮＫＴ細胞は、細胞がＣＤ６２Ｌの発現を維持できるようにする１以上の共刺激作用因子への曝露に続いて向上した試験官内の増殖及び生体内での存続性を有するので、ＮＫＴ細胞は治療応用で有用である。１以上の共刺激作用因子は任意の種類のものでもよいが、具体的な実施形態では、それらは、１以上のサイトカイン；（ｂ）共刺激受容体を標的とする１以上のアゴニスト抗体を含む基材（たとえば、ビーズ、プレート等）；及び／または（ｃ）ＣＤ１ｄの発現を含み、且つ１以上の共刺激受容体の１以上のリガンドの発現を含む抗原提示細胞のような細胞を含む。ＮＫＴ細胞がサイトカインに曝露される場合では、サイトカインは好適な種類のものであってもよいが、具体的な場合では、サイトカインはＩＬ−２１、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＮＦアルファまたはそれらの組み合わせである。具体的な実施形態では、ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞はＩＬ−２の存在下での培養の際、ＩＬ−２１を発現し、ＩＬ−２１はＣＤ６２Ｌの発現を保持する。
【００３５】
ＮＫＴ細胞が、共刺激受容体を免疫的に認識するアゴニスト抗体（少なくとも場合によっては、モノクローナルである）である１以上の共刺激作用因子に曝露される場合、受容体は共刺激受容体であってもよい。しかしながら、具体的な実施形態では、受容体は、たとえば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１、ＩＣＡＭ１、またはＨＶＥＭである。細胞の集団、たとえば、ＮＫＴ細胞の集団が抗体に十分に曝露されるようにする基材に抗体を付着させてもよい。抗体は商業的に入手してもよく、贈与として得てもよく、または当該技術で標準の手段によって製造されてもよい。
【００３６】
ＮＫＴ細胞が、治療上有効な量の、抗原提示細胞活性を有する細胞、たとえば、人工的な抗原提示細胞（たとえば、抗原提示細胞活性を持つ非天然の細胞）に曝露される場合、細胞は１以上のポリヌクレオチドで形質導入されて１以上の共刺激受容体の１以上のリガンドを発現してもよい。細胞はそれが１以上の共刺激受容体の１以上のリガンドを発現する限り、任意の種類のものであってもよいが、少なくとも場合によっては、細胞はＣＤ１ｄも発現する。細胞は特定の実施形態では、抗原提示細胞である。具体的な場合、ＣＤ１ｄを発現し、及び／または１以上の共刺激受容体の１以上のリガンドを発現する細胞は天然に存在し、本明細書に包含される方法で使用されてもよい。他の場合では、天然にＣＤ１ｄを発現せず、及び／または１以上の共刺激受容体の１以上のリガンドを天然に発現しない細胞は形質導入されて各成分を発現し、本明細書に包含される方法で使用される。共刺激受容体のリガンドは任意の種類のものであってもよいが、具体的な実施形態では、リガンドはＣＤ８０、ＣＤ８６、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＴＩＭ４、ＬＩＧＨＴ、等である。抗原提示細胞活性を有する細胞が１以上のポリヌクレオチドで形質導入される場合、ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター（たとえば、プラスミド）を含むベクターに含まれてもよい。ウイルスベクターにはレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター等が挙げられる。ベクターは抗原提示細胞活性を有する細胞での発現のための好適な調節要素を含むであろう。場合によっては、抗原提示細胞活性を有する細胞に形質導入されるポリヌクレオチドは、たとえば、２つの共刺激受容体リガンドをコードするような２以上のコーディング領域をコードする。そのような場合、別々のコーディング領域が同じ調節要素によって調節されてもよいし、調節されなくてもよい。
【００３７】
ＮＫＴ細胞におけるＣＤ６２Ｌの発現がＮＫＴ細胞の同時刺激のゆえに持続されている実施形態では、所望のＮＫＴ細胞を調製する工程に一般的な順序があってもよいし、またはなくてもよい。特定の実施形態では、ＮＫＴ細胞は選別（たとえば、磁気ビーズまたはＦＡＣＳの選別）によって適当な供給源（たとえば、血液（末梢血、臍帯血等を含む））から得られ、細胞の混合された集団で存在する。これに続いて、ＮＫＴ細胞は、Ｔ細胞受容体に対するアゴニスト抗体もしくはリガンド（たとえば、ＯＫＴ３ｍＡｂ、６Ｂ１１ｍＡｂまたはアルファ−ガラクトシルセラミドのような結合したアゴニスト糖脂質を伴った組換えヒトＣＤ１ｄ）を含有する基材、またはＣＤ１ｄ及びアルファ−ガラクトシルセラミドのような結合したアゴニスト糖脂質を発現している抗原提示細胞を用いてＴＣＲの刺激を介して活性化される。ＴＣＲで活性化されたＮＫＴ細胞を同時刺激に曝露して同時刺激の非存在下で生じるよりも高いレベルのＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞を集団から作出してもよい。一部の実施形態では、それを必要とする個体への送達に先立って、且つ１以上の共刺激作用因子への曝露に続いて、ＮＫＴ細胞は、組換え手段によって操作されて１以上の特徴を組み込む、たとえば、ＮＫＴ細胞を治療用にする１以上の治療剤または治療実体を発現する。特定の実施形態では、細胞は遺伝子操作されて、抗原保有細胞を標的とする能力を細胞に提供する。具体的な実施形態では、操作は、１以上のキメラ抗原受容体及び／またはＴ細胞受容体のいずれか、または対象とする特定の抗原を標的とするそれらを発現するようにＮＫＴ細胞に形質導入することである。具体的な実施形態では、抗原は腫瘍抗原である。
【００３８】
個体における病状の治療に利用されるＮＫＴ細胞は、それが投与される個体を起源としてもよいし、それらは別の個体を起源としてもよいし、またはそれらは細胞寄託から得られてもよい。ＮＫＴ細胞は具体的な実施形態では、１型のＮＫＴ細胞である。
【００３９】
ＮＫＴ細胞は個体への送達に先立って選別されてもよいし、または選別されなくてもよい。具体的な実施形態では、ＣＤ６２Ｌ陽性ＮＫＴ細胞はＣＤ６２Ｌ陰性ＮＫＴ細胞から選別されないが、代わりの実施形態では、それらは選別されてもよい。たとえば、それらがＣＤ２Ｌを発現しているかどうかに基づいて細胞が選別されない場合、細胞が物理的分離によって選別されなければ、それらはＣＤ６２Ｌ発現の維持を生じる細胞の同時刺激を用いて濃縮することができる。
【００４０】
ほとんどの場合、特定の表現型に基づいて細胞は選別されないが、細胞を選別する一部の場合では、たとえば、細胞を特異的に結合することができる１以上の基材への曝露の際に所望の細胞を回収することによって、所望の細胞の濃縮を可能にする方法によってそれらをそのようにしてもよい。たとえば、基材（たとえば、ビーズ、粒子、プレート、ゲルマトリクス等）上の抗体を用いた所望の細胞の分離を利用してもよく、その際、抗体は細胞を直接または間接的に結合してもよい。具体的な実施形態では、磁気分離が採用されてもよい。
【００４１】
ＩＩＩ．ＮＫＴ細胞の遺伝子操作
特定の実施形態では、それを必要とする個体への送達に先立ってＮＫＴ細胞は遺伝子操作される。ＮＫＴ細胞は普通、ＴＣＲ刺激及び同時刺激の後に操作され；特定の実施形態では、遺伝子操作は刺激後１、２、３、４、５日以上以内に発生する（且つこれは、使用される形質導入の種類に左右されてもよく；たとえば、レトロウイルスベクターではそれは２日以内である）。
【００４２】
ＮＫＴ細胞の遺伝子操作はヒトの手によって発生することができ、特定の実施形態では、遺伝子操作は、細胞が１以上の癌細胞、たとえば、特定の抗原を発現している癌細胞を特異的に標的とすることができるようにする。具体的な実施形態では、操作はＮＫＴ細胞に特定の癌細胞のための特定の非天然の受容体を提供する。受容体は任意の種類のものであってもよいが、具体的な実施形態では、受容体は、たとえば、Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体である。場合によっては、キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＣＳＰＧ４、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、メソテリン等のためのものである。
【００４３】
腫瘍ＤＮＡの配列決定によって明らかにされた変異していない腫瘍関連抗原（たとえば、サバイビン、ＭＹＣＮ、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＭＡＧＥ、ＰＲＡＭＥ、ＷＴ１、等）または患者に特異的な変異した腫瘍抗原に由来するＭＨＣ／ペプチド複合体に対するＴ細胞受容体。
【００４４】
場合によっては、ＮＫＴ細胞はＣＡＲを発現するように操作される。腫瘍に向けられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させるためのＮＫＴ細胞の遺伝子操作は、タンパク質／抗原の処理及び提示における異常によるものである腫瘍免疫逃避機構を迂回する抗腫瘍エフェクター細胞を生じることができる。さらに、トランスジェニック受容体はタンパク質由来ではない腫瘍関連抗原に向けることができる。本開示の特定の実施形態では、少なくともＣＡＲを含むように操作されているＮＫＴ細胞がある。具体的な態様では、特定のＮＫＴ細胞は２以上のＣＡＲの発現を含む。
【００４５】
本開示は、ＣＡＲと呼ばれる（キメラＴ細胞受容体またはキメラ免疫受容体とも呼ばれてもよい）人工的なＴ細胞受容体を発現しているＮＫＴ細胞を含む。本開示の実施形態では、それは癌抗原に特異的である。ＣＡＲは一般に細胞外ドメインと膜貫通ドメインと細胞内ドメインとを含んでもよい。それは、具体的な実施形態では、第１世代、第２世代または第３世代であってもよい。
【００４６】
特定の場合では、ＮＫＴ細胞は、キメラであり、非天然であり、ヒトの手によって少なくともある程度操作され、対象とする特定の癌抗原に向けられるＣＡＲを含む。特定の場合では、操作されたＣＡＲは１、２、３、４以上の成分を有し、一部の実施形態では、１以上の成分が癌抗原を含む癌細胞へのＮＫＴ細胞のターゲティングまたは結合を促す。具体的な実施形態では、ＣＡＲは、癌抗原に対する抗体、細胞質シグナル伝達ドメインの一部または全部、及び／または１以上の共刺激分子、たとえば、共刺激分子の細胞内ドメインの一部または全部を含む。具体的な実施形態では、抗体は単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。特定の態様では、抗体は、たとえば、対象とする抗原を発現している癌細胞の細胞表面における癌抗原に向けられる。特定の実施形態では、たとえば、Ｔ細胞受容体ζ鎖に由来するもののような細胞質シグナル伝達ドメインは、キメラ受容体の標的抗原との結合に続いてＮＫＴ細胞の増殖及びエフェクター機能のための刺激シグナルを生じるために、キメラ受容体の少なくとも一部として採用される。例には、たとえば、ＣＤ２７、Ｃｄ２８、４−１ＢＢ及びＯＸ４０のような共刺激分子に由来する細胞内ドメインまたはたとえば、ＩＬ７及びＩＬ１５のようなサイトカイン受容体のシグナル伝達成分が挙げられることになるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、共刺激分子を採用して抗原結合の後ＣＡＲによって生じるＮＫＴ細胞の活性化、増殖、及び細胞傷害性を高める。具体的な実施形態では、共刺激分子はＣＤ２８、ＯＸ４０、及び４−１ＢＢである。
【００４７】
一般に、ＣＡＲの細胞外ドメインは、シグナルペプチドと、抗原認識ドメインと、抗原認識ドメインを膜貫通ドメインに連結するスペーサーとを包含する。抗原認識ドメインは一般に特定の癌抗原に特異的な単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含むであろう。しかしながら、同一細胞に２以上のＣＡＲがある場合、第２のＣＡＲは別の特定の抗原に特異的なｓｃＦｖを含んでもよい。癌抗原の例には、たとえば、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、黒色腫の優先的に発現される抗原（ＰＲＡＭＥ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ−軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦｒｖＩＩＩ、癌胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＨＥＲ２、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体ａ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、ルイスＹ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣ１、葉酸受容体−ａ、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、またはＣＤ４４ｖ６のいずれか１つが挙げられる。
【００４８】
細胞外ドメインのためのヒンジ領域の例には、免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域、ＩｇＧ１に由来するヒンジ領域、及びＣＤ３の一部が挙げられる。場合によっては、膜貫通領域はＣＤ２８であるけれども、それは任意の種類のものであってもよい。
【００４９】
一般に、本開示のＣＡＲの細胞内ドメインは、抗原認識後の細胞及び受容体のクラスターにおけるシグナル伝達に利用される。最も一般に使用される細胞内ドメイン成分は、３つのＩＴＡＭを含有し、且つ抗原が結合した後、Ｔ細胞に活性化シグナルを伝達するＣＤ３ゼータである。一部の実施形態では、ＣＤ２８、４−１ＢＢ及び／またはＯＸ４０との組み合わせでのＣＤ３ゼータのような追加の共刺激性のシグナル伝達が利用される。
【００５０】
ＩＶ．細胞全般
本開示の細胞は、１以上の共刺激作用因子によって同時刺激されているＣＤ６２Ｌ陽性ＮＫＴ細胞と同様にそれ自体抗原提示細胞である特定の共刺激作用因子（抗原提示細胞活性を有する非天然の細胞と呼ばれてもよい）の双方を含む。一部の実施形態では、ＣＤ１ｄを発現している非天然の細胞であり、且つ１以上の共刺激受容体の１以上のリガンドを発現している人工的な抗原提示細胞である、物質の組成物がある。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、用語「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」は相互交換可能に使用されてもよい。これらの用語はすべて、任意の及び全てのその後の世代であるその子孫も含む。故意のまたは故意ではない突然変異のために子孫すべてが同一であるわけではない可能性があることが理解される。異種の核酸配列を発現している文脈では、「宿主細胞」は、原核細胞または真核細胞を指すことができ、それには、ベクターを複製することができる及び／またはベクターによってコードされる異種遺伝子を発現させることができる形質転換可能な生物が挙げられる。宿主細胞はベクターのためのレシピエントとして使用することができ、使用されている。宿主細胞は、「形質移入」されてもよくまたは「形質転換」されてもよく、それはそれによって外来性の核酸が宿主細胞に形質移入されてもよく、または導入されてもよい過程を指す。形質転換された細胞は初代の対象細胞及び子孫を含む。本明細書で使用されるとき、用語「操作された」及び「組換えの」細胞または宿主細胞は、外来性の核酸配列、たとえば、ベクターがその中に導入されている細胞を指すように意図される。従って、組換え細胞は組換えで導入された核酸を含有していない天然に存在する細胞から区別できる。
【００５２】
特定の実施形態では、ＲＮＡまたはタンパク性の配列は同一宿主細胞にて他の選択されたＲＮＡまたはタンパク性と同時発現させてもよいことが熟考される。同時発現は、宿主細胞に２以上の異なる組換えベクターで同時形質移入することによって達成されてもよい。或いは、ＲＮＡについて複数の異なるコーディング領域を含むように単一の組換えベクターを構築してもよく、次いで単一ベクターで形質移入された宿主細胞にてそれを発現させてもよい。
【００５３】
一部のベクターは、原核細胞及び真核細胞の双方でそれが複製され及び／または発現されるようにする制御配列を採用してもよい。当業者はさらに、上述の宿主細胞のすべてをインキュベートしてそれらを維持し、ベクターの複製を可能にする条件を理解することになる。理解され、知られるのはまた、ベクターの大規模生産と同様にベクターによってコードされる核酸及びその同族のポリペプチド、タンパク質またはペプチドの製造を可能にする技法及び条件である。
【００５４】
ベクターまたはベクターに組み込むＤＮＡの組換え操作における操作のために原核細胞が採用されてもよいけれども、本開示で使用される細胞は、哺乳類を含む真核細胞である。細胞は特にヒトであるが、対象とする動物、特に各動物での使用のための、たとえば、ウマ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、イヌ、ネコ等のような家畜に関連することができる。
【００５５】
細胞は、たとえば、細胞を受け取っている個体との関係で、自己細胞、同系細胞、同種細胞、及びさらに場合によっては、異種細胞であることができる。細胞は、主要組織適合性複合体）「ＭＨＣ」）の特性を変えることによって、β２−ミクログロブリンを不活化して機能的なクラスＩのＭＨＣ分子の形成を妨げることによって、クラスＩＩ分子の不活化、１以上のＭＨＣ分子の発現を提供すること、細胞傷害活性に関連する遺伝子の発現を高めるまたは阻害することによって細胞傷害性能を高めるまたは不活化すること等によって操作されてもよい。
【００５６】
ＣＡＲをコードする発現ベクターを１以上のＤＮＡ分子または構築物として細胞に導入することができ、その際、構築物を含有する宿主細胞の選択を可能にする少なくとも１つのマーカーがあってもよい。構築物は従来の方法で調製することができ、その際、遺伝子及び調節領域は単離されてもよく、適宜、制限または配列決定、または他の手段によってライゲーションされてもよく、適当なクローニング宿主にクローニングされてもよく、解析されてもよい。特に、ＰＣＲを用いて、機能単位の全部または一部を含む個々の断片を単離してもよく、その際、適宜、「プライマー修復」、ライゲーション、試験管内変異誘発を用いて１以上の突然変異が導入されてもよい。いったん完成され、適当な配列を有することが実証された構築物は次いで従来の手段によってＣＴＬに導入されてもよい。細胞への感染または形質導入のために、構築物は、レトロウイルスベクターを含むアデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）または単純性ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）等のような複製しない不完全ウイルスゲノムに組み込まれてもよいし、パッケージされてもよい。構築物には所望であれば形質移入のためのウイルス配列が含まれてもよい。或いは、構築物は、融合、エレクトロポレーション、遺伝子銃、形質移入、リポフェクチン等によって導入されてもよい。宿主細胞は、構築物の導入の前に培養にて増殖させ、増やしてもよく、その後、構築物の導入及び構築物の組込みのための適当な処理が行われる。次いで細胞を増やし、構築物に存在するマーカーによってスクリーニングする。上手く使用されてもよい種々のマーカーにはｈｐｒｔ、ネオマイシン耐性、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシン耐性等が挙げられる。
【００５７】
多くの状況で、人は操作された細胞を殺傷できることを望んでもよく、その際、人は治療を終了することを望み、その存在後の細胞の非存在が対象であるまたは他の事象である研究では細胞は腫瘍性になる。この目的で、人は、人が制御された条件下で操作された細胞を殺傷することができる特定の遺伝子産物の発現を提供することができる。カスパーゼ９のような自殺遺伝子産物はそのような産物の例である。
【００５８】
実例として、癌患者または癌に感受性の患者または癌を有することが疑われる患者は以下のように治療されてもよい。本明細書に記載されているような操作された細胞が患者に投与され、長期間保持されてもよい。個体は細胞の１回以上の投与を受けてもよい。細胞は操作され、それを必要とする個体に提供されることになる。
【００５９】
Ｖ．ポリヌクレオチド
本開示はまた、本明細書で定義されているような抗原特異的なＣＡＲをコードする核酸配列を含む組成物及び該核酸配列を抱えている細胞も包含する。核酸配列は特定の態様では組換え核酸配列であり、合成であってもよい。それはＰＮＡ（ペプチド核酸）と同様にＤＮＡ、ＲＮＡを含んでもよく、それはそれらのハイブリッドであってもよい。
【００６０】
さらに、核酸分子が、たとえば、チオエステル結合及び／またはヌクレオチド類似体を含有してもよいことがさらなる目的で想定される。操作は、細胞にてエンドヌクレアーゼ及び／またはエキソヌクレアーゼに対する核酸分子の安定化に有用であってもよい。核酸分子は、細胞にて前記核酸分子の転写を可能にするキメラ遺伝子を含む適当なベクターによって転写されてもよい。この点で、そのようなポリヌクレオチドは「遺伝子ターゲティング」または「遺伝子治療」のアプローチに使用することができることも理解されるべきである。別の実施形態では、核酸分子は標識される。核酸の検出のための方法は当該技術で周知であり、たとえば、サザンブロット及びノーザンブロット、ＰＣＲまたはプライマー伸長である。この実施形態は、遺伝子療法のアプローチの間での上述の核酸分子の上手く行った導入を検証するためのスクリーニング方法で有用であってもよい。
【００６１】
核酸分子は前述の核酸分子のいずれかを単独でまたは組み合わせで含む、組換えで作出されたキメラ核酸分子であってもよい。具体的な態様では、核酸分子はベクターの一部である。
【００６２】
従って、本開示はまた、本開示に記載されている核酸分子を含むベクターを含む組成物にも関する。
【００６３】
多数の好適なベクターが分子生物学の当業者に既知であり、その選択は所望の機能に左右され、それらにはプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、及び遺伝子操作で従来使用されている他のベクターが挙げられる。当業者に周知の方法を用いて種々のプラスミド及びベクターを構築することができる。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら．（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），（１９９４）に記載されている技法を参照のこと。或いは、本開示のポリヌクレオチド及びベクターは標的細胞への送達のためにリポソームに再構成することができる。クローニングベクターを用いてＤＮＡの個々の配列を単離してもよい。特定のポリペプチドの発現が求められる発現ベクターに関連する配列を移すことができる。典型的なクローニングベクターには、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２及びｐＧＢＴ９が挙げられる。典型的な発現ベクターには、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＥＳＰ−１、ｐＯＰ１３ＣＡＴが挙げられる。
【００６４】
具体的な実施形態では、本明細書で定義されている抗原特異的なＣＡＲをコードする核酸配列に操作可能に連結された調節配列である核酸配列を含むベクターがある。そのような調節配列（制御要素）は熟練者には既知であり、それらにはプロモータ、スプライスカセット、翻訳開始コドン、ベクターに挿入物を導入するための翻訳及び挿入の部位が挙げられてもよい。具体的な実施形態では、核酸は真核細胞または原核細胞での発現を可能にする前記発現制御配列に操作可能に連結される。
【００６５】
ベクターは、本明細書で定義されているような抗原特異的なＣＡＲをコードする核酸分子を含む発現ベクターであることが想定される。具体的な態様では、ベクターは、たとえば、レンチウイルスベクターのようなウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、たとえば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）またはＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含めて市販されている。
【００６６】
用語「調節配列」はそれらがライゲーションされるコーディング配列の発現を達成するのに必要であるＤＮＡ配列を指す。そのような制御配列の性質は宿主生物に応じて異なる。原核生物では、制御配列には一般にプロモータ、リボソーム結合部位及びターミネータが挙げられる。真核生物では、一般に制御配列にはプロモータ、ターミネータ、及び一部の例では、エンハンサ、トランスアクチベータまたは転写因子が挙げられる。用語「制御配列」は、最小でも、その存在が発現に必要である成分すべてを含むように意図され、追加の有利な成分も含んでもよい。
【００６７】
用語「操作可能に連結される」は、そのように記載されている成分が意図される方法でそれらが機能するのを可能にする関係にある並置を指す。コーディング配列に「操作可能に連結される」制御配列は、制御配列に適合する条件下でコーディング配列の発現が達成されるような方法でライゲーションされる。制御配列がプロモータである場合、二本鎖核酸が好ましくは使用されることは当業者にとって明白である。
【００６８】
従って、引用されているベクターは特定の実施形態では、発現ベクターである。「発現ベクター」は選択された宿主を形質転換するのに使用することができ、選択された宿主にてコーディング配列の発現を提供する構築物である。発現ベクターは、たとえば、クローニングベクター、バイナリベクターまたは組込みベクターであることができる。発現は、核酸分子の好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。原核細胞及び／または真核細胞にて発現を保証する調節要素は当業者に周知である。真核細胞の場合、それらは通常、転写の開始を保証するプロモータならびに任意で、転写の終結及び転写物の安定化を保証するポリＡシグナルを含む。原核宿主細胞にて発現を可能にする考えられる調節要素は、たとえば、大腸菌ではＰＬ、ｌａｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモータを含み、真核宿主細胞にて発現を可能にする調節要素の例は、酵母におけるＡＯＸ１もしくはＧＡＬ１プロモータ、または哺乳類及び他の動物の細胞におけるＣＭＶ−、ＳＶ４０−、ＲＳＶ−プロモータ（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶ−エンハンサ、ＳＶ４０−エンハンサ、またはグロビンイントロンである。
【００６９】
たとえば、調節要素のような転写の開始に関与する側にある要素はまた、ポリヌクレオチドの下流のたとえば、ＳＶ４０−ポリ−Ａ部位またはｔｋ−ポリ−Ａ部位のような転写終結シグナルも含んでもよい。さらに、使用される発現系に応じて、ポリヌクレオチドを細胞性の区画に向けることができる、またはそれを培地に分泌することができるリーダー配列を引用されている核酸配列のコーディング配列に加えてもよく、それは当該技術で周知である。リーダー配列は、翻訳開始及び終結の配列を伴う適当な相で作られ、好ましくはリーダー配列は細胞周辺腔または細胞外の培地への翻訳されたタンパク質またはその一部の分泌を指図することができる。任意で、異種配列は、所望の特徴、たとえば、発現された組換え産物の安定化または簡略化された精製を付与するＮ末端特定ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる。：上記を参照のこと。この文脈では、たとえば、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ  ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＦ−Ｎｅｏ、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ及びｐＥＦ−ＡＤＡ、（Ｒａｕｍら．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（２００１），５０（３）、１４１−１５０）またはｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）のような好適な発現ベクターが当該技術で知られている。
【００７０】
一部の実施形態では、発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換するまたはそれに形質移入することができるベクターにおける真核プロモータ系であるが、原核宿主の制御配列も使用されてもよい。ベクターが適当な宿主にいったん組み込まれると、ヌクレオチド配列の高レベルの発現に好適な条件下で宿主が維持され、所望のように、本開示のポリペプチドの回収及び精製が続いてもよい。特定の実施形態では、１以上のコード可能な配列が低酸素環境に応答性である発現制御配列によって調節される。
【００７１】
追加の調節要素には転写エンハンサと同様に翻訳エンハンサが挙げられてもよい。有利なことに、本開示の上述のベクターは選択可能な及び／またはスコア化できるマーカーを含む。形質転換された細胞の選択に有用な選択可能なマーカー遺伝子は当業者に周知であり、たとえば、メソトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｒｅｉｓｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｉｆｅ−Ｓｃｉ．Ａｄｖ．）１３（１９９４），１４３−１４９）、アミノグリコシドであるネオマイシン、カナマイシン及びパロマイシンに対する耐性を付与するｎｐｔ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ，ＥＭＢＯ  Ｊ．２（１９８３），９８７−９９５）ならびにハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｍａｒｓｈ，Ｇｅｎｅ，３２（１９８４），４８１−４８５）についての選択の基礎として代謝拮抗物質耐性を含む。追加の選択可能な遺伝子、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用するようにするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用するようにするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５（１９８８），８０４７）；細胞がマンノースを利用するようにするマンノース−６−リン酸イソメラーゼ（ＷＯ９４／２０６２７）及びオルニチン脱炭酸酵素阻害剤である２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を付与するＯＤＣ（オルニチン脱炭酸酵素）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ，１９８７，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｅｄ）またはブラスチシジンＳに対する耐性を付与するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓに由来するデアミナーゼ（Ｔａｍｕｒａ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９（１９９５），２３３６−２３３８）が記載されている。
【００７２】
有用なスコア化できるマーカーも当業者に既知であり、市販されている。有利なことに、前記マーカーは、ルシフェラーゼ（Ｇｉａｃｏｍｉｎ，Ｐｌ．Ｓｃｉ．１１６（１９９６），５９−７２；Ｓｃｉｋａｎｔｈａ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１７８（１９９６），１２１）、緑色蛍光タンパク質（Ｇｅｒｄｅｓ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３８９（１９９６），４４−４７）またはβ−グルクロニダーゼ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，ＥＭＢＯ  Ｊ．６（１９８７），３９０１−３９０７）をコードする遺伝子である。この実施形態は引用されているベクターを含有する細胞、組織及び生物の簡単な且つ迅速なスクリーニングに特に有用である。
【００７３】
上述のように、引用されている核酸分子は細胞にて単独でまたはベクターの一部として使用されて細胞にてコードされたポリペプチドを発現することができる。特異的なＣＡＲ構築物のいずれか１つをコードするＤＮＡ配列を含有する核酸分子またはベクターは次に対象とするポリペプチドを産生する細胞に導入される。引用されている核酸分子及びベクターは、細胞への直接導入のために、またはリポソームもしくはウイルスベクター（たとえば、アデノウイルス、レトロウイルス）を介した導入のために設計されてもよい。
【００７４】
上記によれば、本開示は、本明細書で定義されている抗原特異的なＣＡＲのポリペプチド配列をコードする核酸分子を含む遺伝子操作において従来使用されているベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージを動かす方法に関する。好ましくは、前記ベクターは発現ベクター及び／または遺伝子導入またはターゲティングベクターである。たとえば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピローマウイルスのようなウイルスに由来する発現ベクターを引用されているポリヌクレオチドまたはベクターの標的化された細胞集団への送達に使用してもよい。当業者に周知である方法を用いて組換えベクターを構築することができる；たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら．（ｌｏｃ  ｃｉｔ），Ａｕｓｕｂｅｌ（１９８９，ｌｏｃ  ｃｉｔ．）または他の標準の教科書に記載されている技法を参照のこと。或いは、引用されている核酸分子及びベクターは標的細胞への送達のためにリポソームに再構成することができる。本開示の核酸分子を含有するベクターを周知の方法によって宿主細胞に移すことができるが、それは細胞宿主の種類に応じて異なる。たとえば、塩化カルシウム形質移入が原核細胞には一般的に利用されるのに対して他の細胞宿主にはリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが使用されてもよい；Ｓｍｂｒｏｏｋ、上記を参照のこと。
【００７５】
ＸＩＩ．医薬組成物
本開示によれば、用語「医薬組成物」は個体に投与するための組成物を指す。本開示の特定の態様では、医薬組成物は複数のＮＫＴ細胞を含む。好まれる実施形態では、医薬組成物は、非経口、経皮、腔内、動脈内、クモ膜下もしくは静脈内の投与、または癌への直接注入のための組成物を含む。前記医薬組成物は点滴または注射を介して個体に投与されることが特に想定される。好適な組成物の投与は、様々な方法によって、たとえば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、局所または皮内の投与によって達成されてもよい。
【００７６】
本開示の医薬組成物はさらに薬学上許容できるキャリアを含む。好適な医薬キャリアの例は当該技術で周知であり、それには、リン酸緩衝化生理食塩水溶液、水、油／水エマルションのようなエマルション、種々の種類の湿潤剤、無菌溶液等が挙げられる。そのようなキャリアを含む組成物は周知の従来の方法によって製剤化することができる。これらの医薬組成物を好適な用量で対象に投与することができる。
【００７７】
投与計画は主治医及び臨床因子によって決定されるであろう。医療技術で周知のように、１人の患者に対する投与量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、全身状態、及び現在投与されている他の薬剤を含む多数の因子に左右される。定期評価によって進行をモニターすることができる。ＣＡＲで操作されたＮＫＴが静脈内点滴を介して投与されてもよい。用量は１×１０７／ｍ２〜２×１０８／ｍ２の範囲であることができ、具体的な態様では、１０９個までの細胞を利用してもよい。
【００７８】
本開示の組成物は局所でまたは全身性に投与されてもよい。投与は一般に非経口、たとえば、静脈内であろう；ＤＮＡはまた、たとえば、内部もしくは外部の標的部位への遺伝子銃送達によって、または動脈内の部位へのカテーテルによって直接標的部位に投与されてもよい。好まれる実施形態では、医薬組成物は皮下に投与され、一層さらに好まれる実施形態では、静脈内に投与される。非経口投与のための製剤には無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液及びエマルションが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、たとえば、オリーブ油のような植物油、及びたとえば、オレイン酸エチルのような注射用の有機エステルである。水性キャリアには、生理食塩水及び緩衝液媒体を含む水、アルコール性／水性溶液、エマルションまたは懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーのデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルには、流体及び栄養物の補充液、電解質補充液（たとえば、リンガーのデキストロースに基づくもの）等が挙げられる。たとえば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性気体等のような保存剤及び他の添加剤も存在してもよい。加えて、本開示の医薬組成物は、タンパク性のキャリア等、たとえば、好ましくはヒト起源の血清アルブミンまたは免疫グロブリンを含んでもよい。本開示の医薬組成物は、ＣＡＲ構築物またはそれをコードする核酸分子またはベクター（本開示に記載されているような）に加えて、医薬組成物の用途に応じてさらに生物学的に活性のある作用因子を含んでもよいことが想定される。
【００７９】
ＸＩＩ．ＮＫＴ細胞の治療上の使用
実例として、癌患者または癌に感受性の患者または癌を有することが疑われる患者は本明細書に記載されているように治療されてもよい。本明細書に記載されているように操作されたＮＫＴ細胞を個体に投与し、長期間保持してもよい。個体は１回以上の細胞の投与を受けてもよい。一部の実施形態では、遺伝子操作された細胞を被包して免疫認識を阻害し、腫瘍の部位に配置する。
【００８０】
種々の実施形態では、腫瘍性疾患のような癌性疾患の予防、治療または改善に発現構築物、それを含むベクター、宿主細胞及び／または医薬組成物を使用する。特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、たとえば、固形腫瘍を有する癌を含む癌を予防する、改善する及び／または治療することにおいて特に有用であってもよい。
【００８１】
本明細書で使用されるとき、「治療」または「治療すること」には、疾患または病的状態の症状または病状に対して有益なまたは望ましい効果が含まれ、治療される疾患または状態、たとえば、癌の１以上の測定可能なマーカーにおける最低限の低下でさえ含まれてもよい。治療には任意で、疾患もしくは状態の症状の軽減もしくは改善、または疾患もしくは状態の進行の遅延が関与することができる。「治療」は疾患または状態、またはその関連する症状の完全な撲滅または治癒を必ずしも示さない。
【００８２】
本明細書で使用されるとき、「予防する」及びたとえば、「予防された」、「予防すること」等のような類似の単語は、疾患または状態、たとえば、癌の発生または再発の可能性を予防する、抑制するまたは低減するアプローチを示す。それはまた、疾患または状態の発症または再発を遅延させること、または疾患または状態の症状の発生または再発を遅延させることも指す。本明細書で使用されるとき、「予防」及び類似の単語は、疾患または状態の発症または再発に先立って疾患または状態の強度、影響、症状及び／または負荷を減らすことも含む。
【００８３】
特定の実施形態では、本開示は、単独でまたは別の治療法との併用で、少なくとも一部の態様では、薬学上許容できるキャリアまたは賦形剤と一緒に投与することができる発現構築物、核酸分子及び／またはベクターを抱えている細胞をある程度熟考する。特定の実施形態では、細胞の投与に先立って、前記核酸分子またはベクターを細胞のゲノムに安定して組み込ませてもよい。具体的な実施形態では、特定の細胞または組織に特異的であり、前記細胞にて持続するウイルスベクターが使用されてもよい。好適な医薬キャリア及び賦形剤は当該技術で周知である。本開示に従って調製された組成物は上記で特定された疾患の予防または治療または遅延に使用することができる。
【００８４】
さらに、本開示は、それを必要とする対象に、本明細書で熟考されるような及び／または本明細書で熟考されるような工程によって製造されるような抗原認識部分の分子及び化学療法耐性分子、それをコードする核酸配列、それをコードするベクターを抱えている有効量の細胞を投与する工程を含む、癌性（腫瘍性を含む）疾患の予防、治療または改善の方法に関する。
【００８５】
例となる操作された免疫細胞の組成物の投与についての考えられる適応は、乳腺、前立腺、肺及び結腸の癌または上皮性の癌／癌腫、たとえば、ＭＭ、乳癌、結腸癌、前立腺癌、頭頚部の癌、皮膚癌、泌尿／生殖路の癌、たとえば、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌及び腎臓癌、肺癌、胃癌、小腸の癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、胆管の癌、食道癌、唾液腺の癌及び甲状腺の癌、神経芽細胞腫、髄芽細胞腫、膠芽細胞腫、造血系悪性腫瘍等を含む腫瘍性疾患を含む癌性疾患である。細胞の組成物の投与についての例となる適応は、たとえば、特定の抗原を発現している悪性腫瘍を含む癌性疾患である。加えて、それには、他の腫瘍抗原を異常に発現している悪性腫瘍が含まれ、それらも標的とされてもよい。本開示の組成物の投与は、たとえば、最小限の残存疾患、初期の癌、進行癌、及び／または転移癌及び／または難治性癌を含むあらゆるステージ及び種類の癌に有用である。
【００８６】
本開示はさらに、免疫細胞を介して作用する他の化合物、たとえば、二重特異性抗体構築物、標的化された毒素または他の化合物との同時投与プロトコールを包含する。本発明の化合物の同時投与のための臨床投薬計画は、他の成分の投与と同時の、その前の及び／またはその後の同時投与を包含してもよい。特定の併用療法には、化学療法、放射線、手術、ホルモン療法、または他の種類の免疫療法が挙げられる。
【００８７】
実施形態は、本明細書に記載されているような１以上のＮＫＴ細胞、本明細書に記載されているような核酸配列、本明細書に記載されているようなベクター、及び／または本明細書に記載されているような宿主を含むキットに関する。本開示のキットは上記の本明細書に記載されているような医薬組成物を単独で、または薬物療法もしくは介入を必要とする個体に投与されるさらなる薬物との併用で含むことも熟考される。
【００８８】
構築物で操作されているＮＫＴ細胞は次いで選択的条件下で培養にて増殖させ、構築物を有するとして選択されている細胞を次いで増やし、たとえば、宿主細胞における構築物の存在を判定するためのポリメラーゼ鎖反応を用いて解析してもよい。操作された宿主細胞がいったん特定されると、次いでそれらは、計画されたように、たとえば、培養で増やすようにまたは宿主生物に導入されるように使用されてもよい。
【００８９】
細胞の性質に応じて、多種多様な方法で細胞を宿主生物、たとえば、哺乳類に導入してもよい。代わりの実施形態では、細胞が癌に進行するまたは癌に進行するように操作されるが、具体的な実施形態では、細胞は腫瘍の部位に導入されてもよい。採用される細胞の数は、多数の状況、導入の目的、細胞の寿命、使用されるプロトコール、たとえば、投与の数、増殖する細胞の能力、組換え構築物の安定性等に左右されるであろう。細胞は分散物として適用されてもよく、一般に対象とする部位にまたはその近傍に注入される。細胞は生理的に許容できる培地に入れてもよい。
【００９０】
ＤＮＡの導入はあらゆる場合で組込みを生じる必要はない。一部の状況では、導入されたＤＮＡの一時的な維持が十分であってもよい。このように、人は短期の効果を有してもよく、その際、細胞は宿主に導入されてもよく、次いで所定の時間の後、たとえば、細胞が特定の部位にホーミングすることができた後、刺激されてもよい。
【００９１】
細胞は所望のように投与されてもよい。所望の応答に応じて、投与の方法、細胞の寿命、存在する細胞の数、種々のプロトコールが採用されてもよい。投与の数は少なくともある程度上記に記載されている因子に左右されるであろう。
【００９２】
系は、多数の変数、たとえば、リガンドに対する細胞性の応答、発現の効率、及び適宜、分泌のレベル、発現産物の活性、時間及び状況によって変化してもよい患者の特定のニーズ、細胞の喪失の結果としての細胞性の活性の喪失の速度、または個々の細胞の発現活性、等に依存することが十分に理解されるべきである。従って、各個々の患者については、全体としての集団に投与することができる普遍的な細胞があったとしても、各患者は個体にとって適正な投与量についてモニターされることになることが予想され、患者をモニターするそのような実践は当該技術で日常的である。
【００９３】
ＶＩ．本開示のキット
本明細書に記載されている組成物のいずれかがキットに含まれてもよい。非限定例では、細胞または細胞を操作する試薬がキットに含まれてもよい。特定の実施形態では、ＮＫＴ細胞またはＮＫＴ細胞を含む細胞の集団がキットに含まれてもよい。そのようなキットは細胞の操作用の１以上の試薬を有してもよいし、または有さなくてもよい。そのような試薬には、たとえば、小分子、タンパク質、核酸、抗体、緩衝液、プライマー、ヌクレオチド、塩及び／またはそれらの組み合わせが挙げられる。１以上のサイトカインをコードするヌクレオチドまたはサイトカイン自体がキットに含まれてもよい。サイトカインまたはアゴニストモノクローナル抗体を含む抗体のようなタンパク質がキットに含まれてもよい。抗体を含む基材または裸の基材自体がキットに含まれてもよく、一部の実施形態では、抗体保有の基材を生成する試薬がキットに含まれる。基材はビーズまたはプレートを含む任意の種類のものであってもよい。抗原提示細胞活性を含む細胞またはそれを生成する試薬がキットに含まれてもよい。それを生成する試薬を含む、キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体をコードするヌクレオチドがキットに含まれてもよい。
【００９４】
特定の態様では、キットは本開示の細胞療法及び別の癌療法を含む。場合によっては、細胞療法の実施形態に加えて、キットはまた、たとえば、化学療法、ホルモン療法、及び免疫療法のような第２の癌療法も含む。キットは個体のために特定の癌に対して誂えられてもよく、個体のための各第２の癌療法を含んでもよい。
【００９５】
キットは、本発明の好適に等分された組成物を含んでもよい。キットの成分は水性媒体または凍結乾燥された形態にて包装されてもよい。キットの容器手段には一般に、その中に成分が入れられてもよい、好ましくはその中で成分が好適に等分される、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ビン、注射器または他の容器手段が挙げられるであろう。キットに１を超える成分がある場合、キットはまた一般に、追加の成分が別々に入れられてもよい第２の、第３の、または他の追加の容器も含有してもよい。しかしながら、成分の種々の組み合わせが１つのバイアルに含まれてもよい。本発明のキットはまた通常、商業販売のために厳重な管理下で組成物を含有するための手段及び他の試薬容器も含むであろう。そのような容器には、その中で所望のバイアルが保持される射出成形または吹き込み成形の容器が挙げられてもよい。
【００９６】
キットの成分が１及び／または１以上の溶液にて提供される場合、液体は水溶液であり、無菌の水溶液が特に好まれる。その場合、容器手段はそれ自体、それから製剤が身体の感染領域に適用されてもよい、動物に注射されてもよい、及び／または、キットの他の成分に適用されてもよい、及び／またはそれと混合されてもよい注射器、ピペット及び／または装置のようなその他であってもよい。しかしながら、キットの成分は乾燥粉末として提供されてもよい。試薬及び／または成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は好適な溶媒の添加によって再構成することができる。溶媒はまた、別の容器手段で提供されてもよいが想定される。
【実施例】
【００９７】
以下の実施例を含んで本発明の好まれる実施形態を実証する。後に続く実施例で開示されている技法は、本発明の実践で上手く機能することが本発明者らによって発見された技法を表すので、その実践のための好ましい様式を構成すると見なすことができることが当業者によって十分に理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本発明の観点から、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、開示されている具体的な実施形態にて多数の変更を行うことができ、それでもやはり、同様のまたは類似の結果を得ることができることを十分に理解すべきである。
実施例１
生体内の存続性に関与するＮＫＴ細胞サブセットの特定及び治療活性及び培養でのこのサブセットの増殖に必要とされる条件を定義すること
【００９８】
インバリアントナチュラルキラー細胞（ＮＫＴ）の養子導入は、癌、自己免疫疾患及び他の疾患の免疫療法のための有望な治療法として開発されている。ＮＫＴ細胞の頻度はヒト末梢血では低いので、そのような治療法は、その長寿と機能を保存しながら初代ＮＫＴの生体外での大量の増殖を要する。しかしながら、生体内または生体外いずれかでのＮＫＴの維持に関与する細胞性及び分子のメカニズムは大部分未知のままである。ここで、初代ヒトＮＫＴの試験管内での抗原で誘導した増殖が、そのサブセットの当初の頻度にかかわらず、調べた５人すべてにおいてＣＤ６２Ｌ陽性のサブセットの進行性の蓄積に関連することが明らかにされている。ＮＫＴのＣＤ６２Ｌ陽性及びＣＤ６２Ｌ陰性のサブセットへの磁気選別に続いて、ＴＣＲの刺激に応答してＣＤ６２Ｌ陽性細胞のみが生き残り、増殖したのに対してＣＤ６２Ｌ陰性細胞の約９０％は３日以内にアポトーシスを受けた。さらに、ＮＳＧマウスへの養子導入の後、ＣＤ６２Ｌ陽性ＮＫＴはＣＤ６２Ｌ陰性のものよりも５倍長く持続した。重要なことに、ＣＤ６２Ｌ陽性ＮＫＴは、異種リンパ腫モデルにてはるかに高い治療活性及びマウスの有意に長い生存を有した。ＣＤ６２Ｌ陽性細胞を増殖させることは、それらがＴＣＲ単独で、または共刺激受容体と共に活性化されるとそれぞれ、ＣＤ６２Ｌの発現を下方調節した、または維持した。特に、ＣＤ３、ＣＤ２８及び／または４−１ＢＢに対するアゴニストｍＡｂの特定の組み合わせは、その増殖の最大速度及びその後の生体内での存続性に関連する試験管内で刺激されたＮＫＴにおける安定なＣＤ６２Ｌの発現を可能にする。従って、結果は、細胞療法への応用のためのその有効な生体外増殖に活用することができるヒトＮＫＴにおける以前予想されなかった機能的な階層を明らかにしている。
【００９９】
従って、本明細書で特定されているのは、高い増殖能及び優れた治療活性を持つヒトＮＫＴ細胞のマーカーとしてのＣＤ６２Ｌである。高い治療活性を持つＮＫＴ細胞産物の生成に有用である生体外での増殖の間にＮＫＴ上でのＣＤ６２Ｌの下方調節を防ぐ試験管内での刺激条件が実証された。
実施例２
ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞は優れた生体内での存続性及び抗腫瘍活性を有する
【０１００】
ＣＤ６２Ｌ＋細胞は、初代ＮＫＴの抗原刺激の際に培養にて蓄積する。成人末梢血におけるヒトＮＫＴの表現型を臍帯血におけるそれと比較した以前の研究は、新生児におけるはるかに高い比率のＣＤ４＋及びＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴを認めた（Ｂａｅｖら，２００４；Ｄ’Ａｎｄｒｅａら，２０００；Ｅｇｅｒら，２００６））（図５Ａ）。臍帯血におけるＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴの優勢は、ＣＤ４または／及びＣＤ６２Ｌの発現が、優れた発生能を有し、治療応用のためのＮＫＴの生体外での増殖を支え得るＮＫＴのサブセットを指し示すことを示唆している。この実施形態を調べるために、末梢血から単離した直後及びαＧａｌＣｅｒによる刺激後の培養における様々な時間間隔で初代ＮＫＴにて免疫表現型検査を行ったが、それは、ＣＤ３／ＣＤ２８の刺激に基づくＴ細胞増殖のプロトコールの使用に比べて高い頻度と絶対数のＮＫＴを一貫して生じた（図６）。新たに単離されたＮＫＴにおけるＣＤ６２Ｌの発現の顕著な個体間変動にもかかわらず、新たに単離されたＮＫＴにおける３３．６３％±２７．６２％から培養１２日目における６９．９２％±１０．５７％までのＮＫＴのＣＤ６２Ｌ＋分画の著しい蓄積があった（Ｐ＜０．００１、図１Ａ、１Ｂ）。ＣＤ６２Ｌは培養の前後の双方でＣＤ４＋ＮＫＴ上でさらに頻繁に発現されていたが、ＣＤ６２Ｌ＋細胞の蓄積はＣＤ４＋ＮＫＴの優先的な増殖によっては説明できなかった。実際、１２日間の培養の終了時、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋及びＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４＋ＮＫＴの頻度はそれぞれ３．９±１．８、１．９±０．７及び３．８±１．９倍増えた。これらの結果に一致して、０日目に比べて１２日目ではＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４−のサブセットの濃縮があった（図５Ｂ）。ＮＫＴのさらなる多重パラメータの性状分析は、ＣＤ６２Ｌは培養前ＣＣＲ７と同時発現されることが多いが、ＣＣＲ７の発現は培養中次第に失われることを示した（図５Ｃ）。培養前、ほぼすべてのＮＫＴがＣＤ２７及びＣＤ２８の双方を発現していた。ＣＤ６２Ｌの状況にかかわらず、ＣＤ２７は培養の１２日目までにＮＫＴのほぼ半分で下方調節された一方で、ＣＤ２８の発現はそのままだった（図５Ｃ）。
【０１０１】
ＣＤ６２Ｌ−細胞は高レベルのＣＤ１６１及びＣＤ５６（ＮＫ様の分化）を発現したが、低レベルのＩＬ−７Ｒαを発現した（図５Ｄ）。新たに単離されたＮＫＴはＣＤ６２Ｌ＋またはＣＤ６２Ｌ−のサブセットのいずれかで枯渇マーカー（ＰＤ−１、ＬＡＧ−３または６ＴＩＭ−３）を稀にしか発現しなかった一方で、ＮＫＴ細胞培養の１２日目ではＣＤ６２Ｌ−サブセットはＰＤ−１及びＴＩＭ３を優先的に発現していた（Ｐ＝０．００４３、０．０１８４、図５Ｃ）。さらに、１２日目に選別したＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌ−ＮＫＴの免疫関連遺伝子の発現解析（ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）プラットフォーム）は、ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴにおけるＴ細胞の生存／メモリーに関連する遺伝子（たとえば、ＬＥＦ１、Ｓ  １ＰＲ１、ＩＬ−７Ｒα、ＩＬ２１Ｒ）及びＣＤ６２Ｌ−ＮＫＴにおける枯渇／最終分化に関連する遺伝子（ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＤ２４４、ＣＤ１６１、ＣＤ５６、図１Ｄ）のｍＲＮＡの上方調節を明らかにした。転写因子であるリンパ球エンハンサ因子１（ＬＥＦ１）はＣＤ６２Ｌ−ＮＫＴに比べてＣＤ６２Ｌ＋にて過剰発現された最上位の免疫関連遺伝子だった、細胞内フローサイトメトリー解析は、ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴが均一にＬＥＦ１を発現したのに対してＣＤ６２Ｌ−細胞の主要分画はＬＥＦ１陰性だったことを明らかにした。ＬＥＦ１は最近、ＧＡＴＡ３遺伝子発現の転写活性化を部分的に介してマウスＮＫＴ細胞の前駆細胞の増殖に介在することが示された（Ｃａｒｒら、２０１５）ので、ＬＥＦ１及びＣＤ６２Ｌのレベルに関連してヒトＮＫＴにてＧＡＴＡ３タンパク質のレベルを解析した。ＧＡＴＡ３の発現はヒトＮＫＴにてＬＥＦ１及びＣＤ６２Ｌの発現に強く相関した（図５Ｅ）。興味深いことに、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌ−ＮＫＴはＮＫＴ細胞の機能的分化の転写主要調節因子であるＰＬＺＦを同じレベルで発現した（Ｃｏｈｅｎら、２０１３）。従って、ＣＤ６２Ｌ＋サブセットは初代ＮＫＴの抗原刺激の際に培養にて優勢に蓄積し、ＣＤ６２Ｌ発現の喪失は、ＮＫ様の最終分化、枯渇、及び増殖性転写調節因子の下方調節に関連する。
【０１０２】
ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴは数的増殖が可能であるＴｈ−０−様細胞である。次に、ＮＫＴを初代培養からＣＤ６２Ｌ＋とＣＤ６２Ｌ−のサブセットに磁気で選別し、その機能的特性を調べた。図２Ａは、標的細胞をαＧａｌＣｅｒでパルスした場合、ＣＤ１ｄ＋ＤＡＯＹ髄芽細胞腫に対して、双方のサブセットは同等に細胞傷害性であった（６人のドナーのうち３人）、またはＣＤ６２Ｌ−ＮＫＴの方がＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴよりも細胞傷害性であった（６人のドナーのうち３人）ことを明らかにしている。αＧａｌＣｅｒで刺激したＮＫＴにおけるサイトカイン産生の解析は、ＣＤ６２Ｌ−サブセットに比べてＣＤ６２Ｌ＋によるはるかに高いレベルのＩＦＮγ及びＩＬ−４双方の産生を明らかにした（Ｐ＜０．００１、図２Ｂ）。ＣＤ６２Ｌ＋細胞はＴｈ−０−様の極性化を示す（ＩＦＮγとＩＬ−４の均衡のとれた産生、末梢血ＮＫＴの全集団の典型である）のに対して、ＣＤ６２Ｌ−細胞の極性化プロファイルは各サイトカインの低い絶対量のために明瞭には決定することができなかった。ｎＣｏｕｎｔｅｒ解析によって判定されたようにＣＤ６２Ｌ−サブセットにおけるＩＬ−２３ＲｍＲＮＡ発現の強い上方調節（図１Ｄ、潜在的なＴｈ１７の極性化）にもかかわらず、ＦＡＣＳによるＮＫＴの細胞表面におけるＩＬ−２３Ｒタンパク質の発現もＥＬＩＳＡによるＴＣＲ刺激の際のＩＬ−１７の産生も検出されなかった。
【０１０３】
試験管内増殖の間でのＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴの蓄積が抗原刺激に応答したその優先的な生き残りまたは増殖のせいかどうかを調べるために、選別した細胞をαＧａｌＣｅｒでパルスした抗原提示細胞によって刺激した後、その細胞死及び増殖の比率を測定した。刺激後３日目で、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌ−のそれぞれ３１％±２１％及び７４％±７．５％がアポトーシスを受けた（図２Ｃ）。６日目にＣＦＳＥ希釈によって測定されたようにＣＤ６２Ｌ−サブセットに対比してＣＤ６２Ｌ＋サブセットでははるかに大きな比率の増殖があった（図２Ｄ）。さらに、ＣＤ６２Ｌ−群で生き残り、増殖した細胞の大半がＣＤ６２Ｌを発現したということは、これらの細胞が元々のＣＤ６２Ｌ−分画におけるＣＤ６２Ｌ＋細胞の小さなサブセットの子孫だったことを示唆している。これらの結果に一致して、選別したＣＤ６２Ｌ＋とＣＤ６２Ｌ−のＮＫＴのＩＬ−２単独と共にまたはＴＣＲ刺激を伴った６日間の培養後に生成されたＮＫＴの数には著しい差異があった。実際、図２Ｅ（上のパネル）はＣＤ６２Ｌ＋細胞がＩＬ−２単独で、またはＴＣＲ刺激を伴ってそれぞれ２．５倍及び８倍の数的増殖を受けたことを示している。対照的にＣＤ６２Ｌ−ＮＫＴはいずれの条件でも増殖できなかった。抗原刺激に応答したＮＫＴ細胞の増殖の程度はドナーごとに異なるけれども、調べた５人のドナーすべてにおいてＣＤ６２Ｌ−サブセットはＮＫＴ細胞の増殖にほとんどまたは全く寄与しなかった（図２Ｅ、下のパネル）。従って、ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴは抗原刺激に応答して生き残り、増殖し、且つ培養におけるＮＫＴ細胞の数的増殖に関与する。
【０１０４】
ＣＤ６２Ｌ＋サブセットはＮＫＴの生体内での存続性及び治療活性に関与する。養子導入されたＮＫＴの生体内での存続性におけるＣＤ６２Ｌ＋サブセットの役割を判定するために、ホタルルシフェラーゼをＮＫＴに形質導入し、それらをＣＤ６２Ｌ＋とＣＤ６２Ｌ−のサブセットに磁気で選別した。次いで本発明者らは選別した細胞をＮＳＧマウスに養子導入した。縦生物発光画像法によって、ＣＤ６２Ｌ−細胞からのシグナルが２日まで検出できるのに対してＣＤ６２Ｌ＋細胞は１０日目まで検出可能なままであることが実証された（Ｐ＜０．００１、図３Ａ、Ｂ）。次に、リンパ腫のためのＣＡＲ再指向免疫療法のモデルにてＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌ−のＮＫＴ細胞サブセットの生体内治療能を比較した。４−１ＢＢの共刺激性細胞内ドメインを含有するＣＤ１９に特異的なＣＡＲ（ＣＡＲ．ＣＤ１９、図７）をＮＫＴに形質導入し、その後ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌ−のサブセットに選別した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒγ（ヌル）（ＮＳＧ）マウスにルシフェラーゼを形質導入したＣＤ１９＋Ｄａｕｄｉリンパ腫細胞をｉ．ｖ．注射し、４日後、ＣＤ６２Ｌ＋またはＣＤ６２Ｌ−のＣＡＲ．ＣＤ１９ＮＫＴ細胞を受け取る２群にマウスを分けた。ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌ−のＣＡＲ．ＣＤ１９ＮＫＴは双方とも未処理の対照に比べて処理された動物の生存を延長した（Ｐ＜０．００１）。重要なことに、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＡＲ．ＮＫＴだけが生存する９匹の処理された動物のうち７匹で持続した腫瘍の退行を誘導し、そのうち５匹は少なくとも３ヵ月間腫瘍がなかった。対照的に、ＣＤ６２Ｌ−ＣＡＲ．ＮＫＴで処理した１０匹のマウスはすべて腫瘍の進行に屈服した（Ｐ＜０．００１、図３Ｃ、Ｄ）。従って、ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴはＣＤ６２Ｌ−ＮＫＴに比べて延長した生体の存続性及び優れた治療能を有する。
【０１０５】
同時刺激はＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴを維持し、枯渇を防ぐ。同時刺激はＮＫＴの活性化、生き残り及び増殖にて役割を担うという証拠が増えている（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｅｕｖｅｌら、２０１１）。休止しているＮＫＴはＣＤ２８を発現している（図５Ｃ）一方で、それらは４−１ＢＢ及びＯＸ４０のような後期共刺激受容体をほとんどまたは全く発現していない（図８Ａ）。しかしながら、αＧａｌＣｅｒでパルスした自己ＰＢＭＣによるＮＫＴの刺激は、ＮＫＴすべてにおける４−１ＢＢの、及びＣＤ４＋ＮＫＴにおけるＯＸ４０の迅速な誘導を生じた（図８Ａ）。ＴＣＲ刺激の最初の２４〜４８時間以内にＣＤ６２Ｌは一時的に下方調節される（データは示さず）ので、刺激に先立って選別したＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌ−のＮＫＴにて４−１ＢＢ及びＯＸ４０の発現の動態を解析した。ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌ−のＮＫＴの７１．１３％±１８．６６％及び５１．９８％±１８．８３％が刺激後７２時間以内にＯＸ４０を上方調節する（Ｐ＝０．００７２、図４Ａ）ことが見いだされた。同様に、刺激されたＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴはＣＤ６２Ｌ−ＮＫＴに比べて高レベルの４−１ＢＢを発現した（Ｐ＝０．０１１、図４Ａ）。ＯＸ４０はＣＤ６２Ｌ＋またはＣＤ６２Ｌ−ＮＫＴのいずれかのＣＤ４＋サブセットで優先的に上方調節され他に対して、４−１ＢＢはＮＫＴすべてで上方調節された（図８Ｂ）。
【０１０６】
次に、同時刺激が試験管内で増殖させたＮＫＴの枯渇に対抗し得るのかどうかを検討した。抗ＣＤ３アゴニストｍＡｂであるＯＫＴ３を単独で、またはＣＤ２８、４−１ＢＢもしくはその双方との組み合わせで被覆したプレート上でＣＤ６２Ｌ＋を選別したＮＫＴを刺激した。本発明者らがアゴニスト活性を持つ抗ＯＸ４０ｍＡｂを入手できなかったので、これらの設定ではＯＸ４０は調べなかった。先ず、抗ＣＤ２８、抗４−１ＢＢまたはその双方による同時刺激は、２０ｎｇ／ｍｌでの抗ＣＤ３単独での刺激に比べて７日以内での培養にて生成されたＮＫＴの数を増やした（Ｐ＜０．００１、図４Ｂ）。同時刺激の非存在下では、２０ｎｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌまでのＯＫＴ３の濃度の上昇は生成されるＮＫＴの数に影響を与えなかった一方で、同時刺激は、それを低濃度のＯＫＴ３と組み合わせた場合のみＮＫＴ細胞の数の上昇に有効だった（図９）。重要なことに、ＯＫＴ３単独による刺激後７日目でＮＫＴの半分未満がＣＤ６２Ｌについて陽性だった。抗ＣＤ２８、抗４−１ＢＢまたは抗４−１ＢＢｍＡｂを伴った抗ＣＤ２８の添加はそれぞれＮＫＴの５８％±７．１％（Ｐ＝０．０２６）、７３％±９．２％（Ｐ＝０．００３６）、及び７３％±６．１％（Ｐ＝０．０００２）にてＣＤ６２Ｌ発現の保持を生じた（図４Ｃ）。ＣＤ６２Ｌ発現の保持と協調して、共刺激性のシグナルを提供されたＮＫＴは有意に少ないＰＤ−１を発現した（Ｐ＜０．０５、図４Ｄ）。従って、抗原刺激の間での共刺激受容体の結合は増殖しているＮＫＴにおけるＣＤ６２Ｌの発現を支え、その枯渇を妨げる。
【０１０７】
本開示の特定の実施形態の意義
【０１０８】
ヒトＮＫＴ−細胞生物学の知識における決定的なギャップは有効なＮＫＴ細胞に基づく癌免疫療法の開発を減速してきた。有効なＮＫＴ細胞に基づく細胞療法及び遺伝子療法への応用にとって必須の要件である、ＮＫＴ細胞の生体外での数的な増殖及びその後の生体内での存続性は末梢血ＮＫＴのＣＤ６２Ｌ＋のサブセットに依存する。反復するＴＣＲ刺激に応答してＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴのみが生き残り、増殖する一方で、ＣＤ６２Ｌ−細胞は早期の枯渇及び細胞死を経験する。ＮＫＴの連続的な刺激はＣＤ６２Ｌ発現の喪失に関連するが、ＴＣＲ刺激の間での共刺激受容体の活性化はこの過程に対抗することができる。具体的には、本発明者らは、ＣＤ８６、４−１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌ分子の独特の組み合わせ、ならびにＣＤ６２Ｌの発現を最大限保護して高度に効率的な臨床規模のＮＫＴ細胞の増殖を可能にするａＡＰＣ表面上での同時発現のレベルを実験的に決定した。特定の実施形態では、本開示によって包含されるようなａＡＰＣを用いて生成されたＣＡＲ−ＮＫＴは、長期の生体内存続性、ならびにリンパ腫及び神経芽細胞腫（癌の種類の例）の生体内モデルに対する優れた治療活性を示す。
【０１０９】
ＣＤ６２Ｌ＋サブセットは生体外での抗原刺激の際のＮＫＴの数的増殖に関与する。以下の知見が上記の結論を支持する：（ｉ）初代ＮＫＴ細胞の刺激の後、ＣＤ６２Ｌ＋細胞の分画が劇的に増加する、（ｉｉ）選別されたＣＤ６２Ｌ−細胞の大半がアポトーシスを受けるのに対して選別されたＣＤ６２Ｌ＋細胞は同一の刺激に応答して増殖する；（ｉｉｉ）ＣＤ６２Ｌ−ＮＫＴは、新たに単離されたＰＢＭＣにて最終分化の兆候（ＣＤ１６１及びＣＤ５６の発現）を示し、且つＰＤ−１及びＴＩＭ−３の発現の顕著な上方調節及びサイトカインを産生する能力の低下によって証拠付けられるように、試験管内での刺激の際、枯渇の表現型を迅速に獲得する。類似の特徴がＴ細胞の治療用産物で観察される場合、それらは癌患者に養子導入された後の存続性または客観的な応答のその後の欠如に関連する（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉら，２００５；Ｋｌｅｂａｎｏｆｆら，２００５）。
【０１１０】
増殖しているＮＫＴは最終的にはＣＤ６２Ｌの発現を下方調節し、試験管内での培養の間に枯渇の表現型を獲得する。この所見は、ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴの頻度が臍帯血に比べて成人末梢血で低いので、ヒト末梢血ＮＫＴの個体発生を反映していると思われる（Ｅｇｅｒら，２００６；Ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔら，２０００）。報告の１つでは、臍帯血ＮＫＴはＣＤ６２Ｌを発現しないことが見いだされた（Ｄ’Ａｎｄｒｅａら，２０００）。その報告とその他の間での及び現在の結果による矛盾の理由は、特定の実施形態では、技術的である。Ｍ．Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓらは末梢血における高レベルのＣＤ６２Ｌを伴ったＣＤ１ｄ拘束性のＴ細胞の非常に稀なナイーブ様の集団を特定した（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓら、２０１１）。しかしながら、これらの細胞は、従来のＮＫＴに比べてインバリアントＶα２４鎖を発現しておらず、低レベルのＰＬＺＦ発現を有する。本試験のＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌ−のＮＫＴは双方とも同等に高レベルのＰＬＺＦを発現していた。
【０１１１】
ＣＤ６２Ｌは末梢のＮＫＴ細胞及びＴ細胞の長期維持に関与する細胞の共通するマーカーを表してもよい。Ｐ．Ｇｒａｅｆらは、ＣＤ６２Ｌ＋セントラルメモリーＴ細胞は幹細胞の特性を持つこと；それらはエフェクター／メモリー及びエフェクターＴ細胞を生じる一方でそれ自体増殖できることを明らかにした（Ｇｒａｅｆら、２０１４）。ごく最近公開された研究では、Ｄ．Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒらは、ナイーブ及びセントラルメモリーのサブセットから生成されたヒトＣＡＲ．ＣＤ１９を発現しているＣＤ８またはＣＤ４Ｔ細胞はエフェクターメモリーのサブセットから生成されたものに比べてＲａｊｉリンパ腫異種移植片に対してさらに有効であることを実証した（Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒら、２０１５）。著者らはまた、最も強力なＣＤ４＋とＣＤ８＋ＣＡＲを発現しているサブセットを組み合わせることが生体内で相乗的な抗腫瘍活性を生じることも見いだした。ＮＫＴの活性化は、マウスモデル及びヒトの臨床試験にてＮＫ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞のトランス活性化をもたらすことが示されている（Ｄｈｏｄａｐｋａｒら，２００９；Ｖｉｖｉｅｒら，２０１２）ので、ＣＡＲ  ＮＫＴのＣＡＲを発現しているリンパ球の他の定義されたサブセットとの組み合わせは有用な治療戦略であってもよい。
【０１１２】
ＬＥＦ１及びＩＬ−７ＲαはＣＤ６２Ｌ−ＮＫＴに比べてＣＤ６２Ｌ＋で最も過剰発現した免疫関連遺伝子だった。最近の報告では、Ｃａｒｒらは、ＣＤ１２７の直接的な転写活性化及びｃ−ｍｙｃ遺伝子の発現を介したその胸腺の発生のステージ２の間にマウスのＶα１４インバリアント（ｉＮＫＴ）細胞の増殖におけるＬＥＦ１の独特の機能を明らかにした（Ｃａｒｒら、２０１５）。ヒトＮＫＴにおけるＬＥＦ１とＧＡＴＡ３の調和した発現の所見に一致して、これらの研究者らはまた、ＬＥＦ１が転写因子ＧＡＴＡ３を上方調節し、それは、ｉＮＫＴ２細胞におけるＩＬ−４の産生と同様にｉＮＫＴ１細胞におけるＩＬ−４とＩＮＦγの二重産生に必要とされる。後者の細胞は、ＣＤ６２Ｌ＋細胞が優先的にＧＡＴＡ３を発現し、高レベルの双方のサイトカインを産生することが見いだされたヒト末梢血ＮＫＴに密接に類似する。マウスのＮＫＴによるＣａｒｒらの研究及びヒトＮＫＴによる結果を受け入れて、具体的な実施形態では、ＬＥＦ１はＮＫＴ細胞の発生の早期段階で決定的な役割を担い、その数及び機能を制御する。ヒトＮＫＴのＣＤ６２Ｌ＋サブセットにおける高レベルのＬＥＦ１の発現及びＣＤ６２Ｌ−サブセットにおけるその喪失は、保存された増殖能を持つあまり分化していないＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴと、増殖し、サイトカインを産生する能力を損なった最終分化したＣＤ６２Ｌ−ＮＫＴ細胞に向いたＴｈ−０−様サイトカインのプロファイルに由来する直線的な進行のモデルに一致する。
【０１１３】
同時刺激はマウスのモデルにおけるＮＫＴの発生、活性化、及び機能的応答にて決定的な役割を担うという証拠が増えている（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｅｕｖｅｌら，２０１１；Ｕｌｄｒｉｃｈら，２００５）。しかしながら、ヒトＮＫＴにおける共刺激受容体の発現に関することはほとんど知られていない。本開示では、本発明者らは、ヒトＴ細胞にて顕著な生存促進性の特性を有する共刺激受容体のセット：ＣＤ２８、４−１ＢＢ及びＯＸ４０に着目した（Ａｃｕｔｏら，２００３；Ｋｒｏｃｚｅｋら，２００４；Ｒｅｄｍｏｎｄら，２００９）。先ず、新たに単離したヒトＮＫＴがＣＤ２８を発現し（３４）、それらがＣＤ２７を同時発現することを示し、それによって、保存された機能的潜在力を持つメモリーＴ細胞の分化の相当する段階に類似する（Ｏｋａｄａら、２００８）ことを確認した。本開示は、ヒトＮＫＴにて４−１ＢＢ及びＯＸ４０のベースライン及び刺激後の動態を特徴付ける最初のものである。双方の受容体は新たに単離されたＮＫＴでは検出できないが、ＴＣＲの刺激に続いて誘導される。Ｔ細胞と同様に（Ｃｒｏｆｔら、２０１０）、ヒトＮＫＴはＣＤ４＋サブセットにてＯＸ４０を優先的に上方調節した。ＮＫＴの大半は４−１ＢＢも上方調節したが、それはＴ細胞のＣＤ８＋サブセットで優先的に上方調節される（Ｌｙｎｃｈ、２００８）。重要なことに、個々の共刺激受容体の同時刺激はＣＤ６２Ｌ発現の喪失を阻害し、ＮＫＴを枯渇から救済することができた。ＣＤ２８及び４−１ＢＢが同時に活性化されると、ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴの維持に対して相加効果があった。
実施例３
方法及び材料の実施例
【０１１４】
細胞株及び培養条件
Ｄａｕｄｉ、Ｒａｊｉ、ＤＡＯＹ、Ｒａｍｏｓ及び２９３Ｔの細胞はＡＴＣＣから購入した。Ｄａｕｄｉ、Ｒａｊｉ、及びＲａｍｏｓの細胞はＲＰＭＩで培養したのに対してＤＡＯＹ及び２９３Ｔの細胞はＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で維持した。双方の種類の培地は１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ−１（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）によって補完した。
【０１１５】
ＮＫＴ細胞の単離、形質導入、増殖及び選別
臍帯血のＮＫＴ細胞を分析するために、ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ癌センター及びＢａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅの施設内倫理委員会によって認可されたプロトコールに従って、ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ癌センター臍帯血バンクから得た廃棄される臍帯血単位を使用した。健常ドナー（少なくとも１８歳）のＰＢＭＣは、Ｇｕｌｆ  Ｃｏａｓｔ地域血液センターから購入したバフィーコートから勾配遠心分離によって単離した。ＮＫＴは抗ｉＮＫＴマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によって精製した。陰性ＰＢＭＣ分画を放射線照射（４０Ｇｙ）して、等分した。１００ｎｇ／ｍＬのαＧａｌＣｅｒ（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｉｒｉｎ）でパルスした自己ＰＢＭＣのアリコートによってＮＫＴを刺激した。組換えＩＬ−２（２００Ｕ／ｍｌ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ）を隔日で完全ＲＰＭＩ（ＨｙＣｌｏｎｅ  ＲＰＭＩ１６４０，１０％の熱非働化ウシ胎児血清及び２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ）に添加した。ＮＫＴを１０日間増殖させ、次いで自己ＰＢＭＣ（４０Ｇｙで照射した）または指示した場合ＡＰＣとしてのＲａｍｏｓ細胞（１００Ｇｙで照射した）によって再刺激した。再刺激の３日後、２４穴の非組織培養プレートをレトロネクチン（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）で被覆し、洗浄後、ＣＡＲ．ＣＤ１９を含有する１ｍｌのレトロウイルス上清によって植菌し、４６００Ｇで６０分間遠心した。次いで、ウイルス上清を取り除き、刺激したＮＫＴを完全培地及び２００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２でのウェルに加えた。４８時間後、細胞をプレートから取り出し、洗浄し、１０６個／ｍｌの濃度で２００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を伴った完全ＲＰＭＩに再浮遊させ、連続した増殖のためにプレートに播いた。トリパンブルー（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）計数によってＮＫＴ細胞の数を決定した。指示された場合、ＮＫＴまたはＣＡＲ−ＮＫＴをＣＤ６２Ｌ−ＰＥｍＡｂ（ＧＲＥＧ−５６，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と抗ＰＥマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によって標識し、その後、製造元の指示書に従ってＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌ−のサブセットに磁気で選別した。選別した細胞の表現型をＦＡＣＳによって決定した。
【０１１６】
レトロウイルス構築物及びレトロウイルスの産生
ＣＡＲ．ＣＤ１９及びＣＡＲ．ＧＤ２の構築物は、以前記載された（Ｈｅｃｚｅｙら，２０１４；Ｐｕｌｅら，２００５）ように作製され、それらは、ＩｇＧ１のヒンジ領域に由来する短いスペーサーを介してＣＤ８αに由来する膜貫通ドメインに接続されたＣＤ１９に特異的な抗体ＦＭＣ−６３またはＧＤ２に特異的な抗体１４Ｇ２ａに由来するｓｃＦｖとその後のζ鎖に融合された４−１ＢＢのシグナル伝達細胞内ドメイン配列を含有した。レトロウイルス上清は、キメラ抗原を含有するプラスミドの組み合わせによる２９３Ｔ細胞の形質移入によって産生されたが、以前記載された（Ｖｅｒａら，２００６）ようにＲＤＦプラスミドはＲＤ１１４のエンベロープをコードし、ＰｅｇＰａｍ３プラスミドはＭｏＭＬＶのｇａｇ−ｐｏｌをコードした。
【０１１７】
増殖及びアポトーシスのアッセイ
ＮＫＴをＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、αＧａｌＣｅｒでパルスしたＰＢＭＣによって、または２０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を単独で、もしくは０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（ＣＤ２８．２）及び／または１．５μｇ／ｍｌの抗４−１ＢＢ（ｈ４１ＢＢ−Ｍ１２７）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）との組み合わせで被覆したプレートによって刺激した。フローサイトメトリーを用いてＣＦＳＥの希釈を測定することによって３日目及び６日目に細胞増殖を調べた。加えて、アネキシン−Ｖ及び７−ＡＡＤ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による染色とその後のフローサイトメトリーによって３日目に早期及び後期段階のアポトーシスを測定した。
【０１１８】
多重サイトカインアッセイ
ＡＰＣまたはアゴニスト抗体被覆のプレート（クローン６Ｂ１１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってＮＫＴを２４時間刺激した。上清を回収し、製造元の指示書に従ってＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイを用いてヒトサイトカイン／ケモカインアッセイキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって解析した。
【０１１９】
フローサイトメトリー
以下に対する以下のｍＡｂ：ＨＬＡ−Ｃ  ＥＭＲ８−５、ＣＤ１ｄ  ＣＤ１ｄ４２、ＣＤ８６  ２３３１、４−１ＢＢＬ  Ｃ６５−４８５、ＯＸ４０Ｌ  ｉｋ−１、ＣＤ３  ＯＫＴ、Ｖα２４−Ｊα１８  ６Ｂ１１、ＣＤ４  ＳＫ３、ＣＤ６２Ｌ  ＤＲＥＧ−５６、ＣＤ１３４  ＡＣＴ３５、ＣＤ１３７  ４Ｂ４−１、ＰＤ−１  ＥＨ１２．１、ＧＡＴＡ３  Ｌ５０−８２３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＬＡＧ−３ポリクローナル、ＴＩＭ−３  ３４４８２３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）、及びウサギ抗ＬＥＦ１  ＥＰ２０３０ＹｍＡｂ（ＡＢＣＡＭ）を用いて免疫表現型検査を行った。ＢＤまたはＲ＆Ｄが提案した蛍光色素及びアイソタイプが一致したＡｂを陰性対照として用いた。ＮＫＴ上でのＣＡＲ．ＣＤ１９の発現は、抗Ｉｄ（クローン１３６．２０．１）ＣＤ１９−ＣＡＲ特異的なｍＡｂ（Ｔｏｒｉｋａｉら、２０１３）及びヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウエアｖ．６．０及びＦｌｏｗＪｏ７．２．５（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を用いたＬＳＲ−ＩＩ５レーザーフローサイトメトリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で解析を行った。
【０１２０】
試験管内での細胞傷害性アッセイ
以前記載された（Ｌｉｕら、２０１３）ように４時間のルシフェラーゼアッセイを用いて親ＮＫＴ及びＣＡＲ．ＣＤ１９  ＮＫＴのＤＡＯＹまたはＲａｊｉ細胞に対する細胞傷害性を評価した。
【０１２１】
遺伝子発現の解析
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを回収した。ｎＣｏｕｎｔｅｒ解析システムを用いたＢＣＭゲノム及びＲＮＡプロファイリングコアにて免疫学パネルｖ．２（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ）を用いて遺伝子発現の解析を行った。ｎＳｏｌｖｅｒ２．０ソフトウエア（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ）を用いてデータを解析した。
【０１２２】
生体内の実験
ＮＳＧマウスのコロニーは元々Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手し、ＢＣＭ動物管理施設で維持されていた。ルシフェラーゼを形質導入したＲａｊｉリンパ腫細胞を２×１０５個ｉ．ｖ．注射することによって腫瘍の増殖を開始させた。３日目に４〜８×１０６個のＣＡＲ−ＮＫＴで処理し、その後、３日ごとにＩＬ−２（１０００Ｕ／マウス）のｉ．ｐ．注射を行った。生物発光画像法（Ｓｍａｌｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｔｅｘａｓ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）によって週に２回腫瘍増殖を評価した。生体内での存続性の実験については、レトロウイルス構築物を用いてＣＡＲ．ＣＤ１９とルシフェラーゼをＮＫＴに同時形質導入し、それを腫瘍のないマウスまたは担腫瘍マウスにｉ．ｖ．注射し、生物発光画像法を用いて週２回モニターした。動物実験はＩＡＣＵＣが認可したプロトコールに従って実施した。
【０１２３】
統計データ
試験管内及び生体内の実験については、本発明者らは、対応のある両側ｔ検定を用いて２群の連続変数を評価し、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定と共に一元配置ＡＮＯＶＡを用いて２を超える群の連続変数を評価した。Ｋａｐｌａｎ／Ｍｅｉｅｒ法及びログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定によって生存を解析して群の対を比較した。ＧｒａｐｈＰａｄ（商標）Ｐｒｉｓｍ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウエア）を用いて統計データを計算した。ｐ値が０．０５未満であれば、差異を有意と見なした。
【０１２４】
試験の認可
ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ癌センター（Ｈ−１６３２０）及びＢａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｈ−２０９１１）における施設内倫理委員会によって認可されたプロトコールに従ってＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ癌センター臍帯血バンクから臍帯血単位を得た。プロトコールＨ−１６３２０に加わるのに先立って参加女性すべてから文書でのインフォームドコンセントを受け取った。臨床使用に好適ではない（普通少ない細胞数のために）臍帯血単位は廃棄したか、またはＢａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅにおけるプロトコールＨ−２０９１１のもとでの研究目的に使用した。動物実験は、Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅの施設内動物管理委員会によって認可されたプロトコールＡＮ−５１９４に従って実施した。
実施例４
ＮＫＴ細胞に対するＩＬ−２１の効果
【０１２５】
この実施例は、細胞をＩＬ−２１に曝露した際、ＩＬ−２１はＮＫＴ細胞に対して有益な効果を有することを実証する。図１０は、初代増殖の間にＩＬ−２１がＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞の頻度を増やすことを示している。３人のドナーからＮＫＴ細胞を単離し、ａＧａｌＣｅｒを負荷したＰＢＭＣとＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）またはＩＬ−２１（１０ｎｇ／ｍｌ）を伴ったＩＬ−２とによって１２日間刺激した。ＮＫＴを回収し、ＣＤ６２Ｌについて染色し、その後ＦＡＣＳ解析を行った。図１１は、二次増殖の間にＩＬ−２１がＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞の頻度を増やすことを明らかにしている。初代増殖（図１０）に続いて３人のドナーに由来するＮＫＴをａＧａｌＣｅｒを負荷したＰＢＭＣとＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）またはＩＬ−２１（１０ｎｇ／ｍｌ）を伴ったＩＬ−２とによって１２日間再刺激した。ＮＫＴを回収し、ＣＤ６２Ｌについて染色し、その後ＦＡＣＳ解析を行った。図１２は、Ｒａｍｏｓ細胞上でのＣＤ１ｄ及び共刺激分子の発現を示している。ＲａｍｏｓＢ細胞リンパ腫細胞はＡＴＣＣから入手し、相当するｍＡｂ及びＩｇＧ対照を用いてＣＤ１ｄ、ＣＤ８６、４−１ＢＢＬ、及びＯＸ４０ＬについてＦＡＣＳによって解析した。Ｒａｍｏｓ細胞は高レベルのＣＤ６２Ｌ発現を伴った初代ＮＫＴを増殖させることができる（図１３）。３人のドナーからＮＫＴを単離し、ＩＬ−２を含有する培地にてａＧａｌＣｅｒを負荷したＲａｍｏｓ細胞（２×１０６個／ウェル）によって１０日間刺激した。ＮＫＴを回収し、数を数え、ＣＤ３、６Ｂ１１及びＣＤ６２Ｌについて染色した。最終的に図１４では、Ｒａｍｏｓ細胞は二次刺激の際、ＣＤ６２Ｌ発現を有意に保持してＮＫＴを増殖させることが示されている。ＰＢＭＣによる初代増殖（図１０のような）に続いて、ＮＫＴ（１×１０−／ウェル）を、ＩＬ−２を含有する培地にてａＧａｌＣｅｒを負荷したＲａｍｏｓ細胞（２×１０６個／ウェル）によって１０日間再刺激した。ＮＫＴを回収し、数を数え、ＣＤ３、６Ｂ１１及びＣＤ６２Ｌについて染色した。
参考文献
【０１２６】
本明細書で言及されている特許及び出版物はすべて本発明が関係する当該技術における当業者のレベルを示す。特許及び出版物はすべて、各個々の出版物が具体的に且つ個々に参照によって組み入れられるように指示されたかのようにと同じ程度にその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【０１２７】
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ｄｅ  ＬＣ，ら．Ｉｎｖａｒｉａｎｔ  ＮＫＴ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｇｉｖｅｎ  ＨＬＡ−ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ＣＤ４＋  ａｎｄ  ＣＤ４−  ｓｕｂｓｅｔ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｓｔａｔｅ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１；１８６（７）：４４９０−４４９９．
ＤｅｌａＲｏｓａ，Ｏら．Ｖａｌｐｈａ２４＋  ＮＫＴ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  ｅｌｄｅｒｌｙ  ｈｕｍａｎｓ．Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．２００２；３７（２−３）：２１３−２１７．
Ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔ，ＨＪら．Ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｃｑｕｉｒｅ  ａ  ｍｅｍｏｒｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｂｅｆｏｒｅ  ｂｉｒｔｈ．Ｂｌｏｏｄ，２０００；９５（７）：２４４０−２４４２．
Ｄｈｏｄａｐｋａｒ，ＭＶら．Ａ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｄｅｆｅｃｔ  ｉｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｓ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｅｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｏ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｙｅｌｏｍａ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００３；１９７（１２）：１６６７−７６．
Ｄｈｏｄａｐｋａｒ，ＭＶ．Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ１ｄ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ：ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．２００９；１４：７９６−８０７．
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Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ，ＪＮら．Ｂ−ｃｅｌｌ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｍｉｓｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ  ａｌｏｎｇ  ｗｉｔｈ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ１９  ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ａｎｔｉｇｅｎ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ，２０１２；１１９（１２）：２７０９−２７２０．
Ｋｒｏｃｚｅｋ，ＲＡ，Ｍａｇｅｓ，ＨＷ，Ｈｕｔｌｏｆｆ，Ａ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｐａｒａｄｉｇｍｓ  ｏｆＴ−ｃｅｌｌ  ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｌｍｍｕｎｏｌ．２００４；１６（３）：３２１−３２７．
Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｍ，Ｇａｐｉｎ，Ｌ．Ｔｈｅ  ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｌｉｆｅｓｔｙｌｅ  ｏｆ  ＮＫＴ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２；２（８）：５５７−５６８．
Ｌａｎｔｚ，０，Ｂｅｎｄｅｌａｃ，Ａ．Ａｎ  ｉｎｖａｒｉａｎｔ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｃｈａｉｎ  ｉｓ  ｕｓｅｄ  ｂｙ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｌａｓｓ  ！−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ４＋  ａｎｄ  ＣＤ４−８−  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９４；１８０（３）：１０９７−１１０６．
Ｌｅｅ，ＰＴ，Ｂｅｎｌａｇｈａ，Ｋ，Ｔｅｙｔｏｎ，Ｌ，Ｂｅｎｄｅｌａｃ，Ａ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｌｉｎｅａｇｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｖ（ａｌｐｈａ）２４  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００２；１９５（５）：６３７−６４１．
Ｌｉｕ，Ｄら．  Ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ  ＣＤ１ｄ  ａｎｄ  ｃａｎ  ｂｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ＮＫＴ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｉｎ．ｌｍｍｕｎｏｌ．２０１３；１４９（１）：５５−６４．
Ｌｏｚａ，ＭＪ，Ｍｅｔｅｌｉｔｓａ，ＬＳ，Ｐｅｒｕｓｓｉａ，Ｂ．ＮＫＴ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＫ−Ｉｉｋｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２；３２（１２）：３４５３−３４６２．
Ｌｙｎｃｈ，ＤＨ．Ｔｈｅ  ｐｒｏｍｉｓｅ  ｏｆ  ４−１ＢＢ  （ＣＤ１３７）−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｉ．Ｒｅｖ．２００８；２２２：２７７−２８６．
Ｍａｔｓｕｄａ，ＪＬら．Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｏｆ  Ｖ  ａｌｐｈａ  １４ｉ  ＮＫＴ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．ｌｍｍｕｎｏｌ．２００２；３（１０）：９６６−９７４．
Ｍａｕｓ，ＭＶら．Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ＡＰＣｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＤ２８  ａｎｄ  ４−１８８．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２；２０（２）：１４３−１４８．
ＭｃＥｗｅｎ−Ｓｍｉｔｈ，ＲＭ，Ｓａｌｉｏ，Ｍ，Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ，Ｖ．Ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｖａｒｉａｎｔ  ＮＫＴ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｉ．Ｒｅｓ．２０１５；３（５）：４２５−４３５．
Ｍｅｔｅｌｉｔｓａ，ＬＳら．Ｈｕｍａｎ  ＮＫＴ  ｃｅｌｌｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｂｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ  ＣＤ１ｄ  ｗｉｔｈ  ｂｏｕｎｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｏｒ  ｉｎｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｂｙ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ＩＬ−２  ｔｏ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１６７（６）：３１１４−３１２２．
Ｍｅｔｅｌｉｔｓａ，ＬＳ．Ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ＮＫＴ  ｃｅｌｌｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＣＤ１ｄ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ＣＤ１ｄ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．Ｃｌｉｎ．ｌｍｍｕｎｏｌ．２０１１；１４０（２）：１１９−１２９．
Ｍｅｔｅｌｉｔｓａ，ＬＳら．Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ＣＣＬ２．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００４；１９９（９）：１２１３−１２２１．
Ｍｏｉｌｉｎｇ，ＪＷら．Ｌｏｗ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｉｎｖａｒｉａｎｔ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｐｏｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００７；２５（７）：８６２−８６８．
ＭｏｒｒｉｓＥＳら．ＮＫＴ  ｃｅｌｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｏｔｅｎｔ  Ｇ−  ＣＳＦ  ａｎａｌｏｇｓ．Ｊ．Ｃｉｉｎ．ｌｎｖｅｓｔ．２００５；１１５（１１）：３０９３−３１０３．
Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ，Ｓ，Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｙ，Ｙｏｓｈｉｎｏ，Ｉ，Ｎａｋａｙａｍａ，Ｔ．  Ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｉＮＫＴ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ．ｌｍｍｕｎｏｌ．２０１１；１４０（２）：１６７−１７６．
Ｏｋａｄａ，Ｒ，Ｋｏｎｄｏ，Ｔ，Ｍａｔｓｕｋｉ，Ｆ，  Ｔａｋａｔａ，Ｈ，  Ｔａｋｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｉｎｔ．ｌｍｍｕｎｏｌ．２００８；２０（９）：１１８９−１１９９．
Ｐｅｇｒａｍ，ＨＪ，Ｓｍｉｔｈ，ＥＬ，Ｒａｆｉｑ，Ｓ，Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ，ＲＪ．ＣＡＲ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ：  ｃａｎ  ｓｕｃｃｅｓｓ  ｓｅｅｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ８−ｃｅｌｌ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｂｅ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｔｏ  ｏｔｈｅｒ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ？Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．２０１５；７（５）：５４５−５６１．
Ｐｏｒｃｅｌｌｉ，Ｓ，Ｙｏｃｋｅｙ，ＣＥ，Ｂｒｅｎｎｅｒ，ＭＢ，Ｂａｌｋ，ＳＰ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆＴ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＴＣＲ）  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ＣＤ４−８−  ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒａｌ  Ｖ  ｂｅｔａ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ａｎ  ｉｎｖａｒｉａｎｔ  ＴＣＲ  ａｌｐｈａ  ｃｈａｉｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９３；１７８（１）：  １−１６．
Ｐｉｌｌａｉ，ＡＢ，Ｇｅｏｒｇｅ，Ｔｌ，Ｄｕｔｔ，Ｓ，Ｔｅｏ，Ｐ，Ｓｔｒｏｂｅｒ，Ｓ．  Ｈｏｓｔ  ＮＫＴ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｎ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｐｅｒｍｉｔ  ｇｒａｆｔ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｆｔｅｒ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；１７８（１０）：６２４２−６２５１．
Ｐｏｒｔｅｒ，ＤＬ，Ｌｅｖｉｎｅ，ＢＬ，Ｋａｌｏｓ，Ｍ，Ｂａｇｇ，Ａ，Ｊｕｎｅ，ＣＨ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ．Ｅｎｇｉ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１１；３６５（Ｓ）：７２５−７３３．
Ｐｕｌｅ，ＭＡ，Ｓｔｒａａｔｈｏｆ，ＫＣ，Ｄｏｔｔｉ，Ｇ，Ｈｅｓｌｏｐ，ＨＥ，Ｒｏｏｎｅｙ，ＣＭ，Ｂｒｅｎｎｅｒ，ＭＫ．Ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｈａｔ  ａｕｇｍｅｎｔｓ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｃｌｏｎａｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００５；１２（５）：９３３−９４１．
Ｒａｍｏｓ，ＣＡ，Ｈｅｓｌｏｐ，ＨＥ，Ｂｒｅｎｎｅｒ，ＭＫ．ＣＡＲ−Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．２０１５．
Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＬ，Ｒｕｂｙ，ＣＥ，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，ＡＤ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆＯＸ４０−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；２９（３）：１８７−２０１．
Ｓａｌｌｕｓｔｏ，Ｆ，Ｇｅｇｉｎａｔ，Ｊ，Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ，Ａ．Ｃｅｎｔｒａｌ  ｍｅｍｏｒｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ：  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；２２：７４５−７６３．
Ｓａｖａｇｅ，ＡＫら．Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＰＬＺＦ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＫＴ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅａｇｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００８；２９（３）：３９１−４０３．
Ｓａｖｏｌｄｏ，Ｂら．ＣＤ２Ｓ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．ｌｎｖｅｓｔ．２０１１；１２１（５）：１Ｓ２２−１Ｓ２６．
Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ，Ｄら．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ＣＯＢ  ａｎｄ  ＣＤ４  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｃｏｎｆｅｒ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２０１５．
Ｓｕｈｏｓｋｉ，ＭＭら．  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ａ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ａｒｒａｙ  ｏｆ  ｃｏ−  ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００７；１５（５）：９８１−９８８．
Ｔａｃｈｉｂａｎａ，Ｔら．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒ  Ｖａｌｐｈａ２４−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：  ａ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５；１１（２０）：７３２２−７３２７．
Ｔａｈｉｒ，ＳＭら．Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｖａｒｉａｎｔ  ＮＫ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１６７（７）：４０４６−４０５０．
Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ，Ｈａｒａｄａ，Ｍ，Ｄａｓｈｔｓｏｏｄｏｌ，Ｎ，Ｋｏｊｏ，Ｓ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ＮＫＴ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ＮＫＴ  ｃｅｌｌ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃ．Ｊｐｎ．Ａｃａｄ．Ｓｅｒ．Ｂ．Ｐｈｙｓ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．２０１５；９１（７）：２９２−３０４．
Ｔｈｏｍａｓ，ＡＫ，Ｍａｕｓ，ＭＶ，Ｓｈａｌａｂｙ，ＷＳ，Ｊｕｎｅ，ＣＨ，Ｒｉｌｅｙ，ＪＬ．Ａ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｃｏａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ＣＤ３  ａｎｄ  ＣＤ２８  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｒａｐｉｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ＣＤ４  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｃｌｉｎ．ｌｍｍｕｎｏｌ．２００２；１０５（３）：２５９−２７２．
Ｔｏｒｉｋａｉ，Ｈら．Ｔｏｗａｒｄ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｄｏｎｏｒｓ．Ｂｌｏｏｄ，２０１３；１２２（８）：１３４１−１３４９．
Ｕｌｄｒｉｃｈ，ＡＰら．ＮＫＴ  ｃｅｌｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ：ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，Ｂｉｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｈｙｐｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｔｏ  ｆｕｒｔｈｅｒ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；１７５（５）：３０９２−３１０１．
ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｅｕｖｅｌ，ＭＪ，Ｇａｒｇ，Ｎ，Ｖａｎ，ＫＬ，Ｈａｅｒｙｆａｒ，ＳＭ．ＮＫＴ  ｃｅｌｌ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ：ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｍｉｓｅ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２０１１；１７（２）：６５−７７．
Ｖｅｒａ，Ｊら．Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｋｉｌｌ  ｍａｔｕｒｅ  Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ，２００６；１０８（１２）：３８９０−３８９７．
Ｖｉｖｉｅｒ，Ｅ，Ｕｇｏｌｉｎｉ，Ｓ，Ｂｌａｉｓｅ，Ｄ，Ｃｈａｂａｎｎｏｎ，Ｃ，Ｂｒｏｓｓａｙ，Ｌ．  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  Ｔｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；１２（４）：２３９−２５２．
Ｗａｎｇ，Ｘら．Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｏｆ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  −ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＣＤ１９−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍａｎ  ＣＯＢ＋ｃｅｎｔｒａｌ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ  ａｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｃａｌｅ．Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１２；３５（９）：６８９−７０１．
Ｘｕ，Ｙら．Ｃｌｏｓｅｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔ−ｍｅｍｏｒｙ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＡＲ．ＣＤ１９−Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ａｒｅ  ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  ｂｙ  ＩＬ−７  ａｎｄ  ＩＬ−１５．Ｂｌｏｏｄ，２０１４；１２３（２４）：３７５０−３７５９．
Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｋら．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＫＴ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｆｔｅｒ  ＮＫＴ  ｃｅｌｌ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｌｉｎ．ｌｍｍｕｎｏｌ．２０１１；１３８（３）：２５５−２６５
【図１Ａ】
2018516548.tif 000003
【図１Ｂ】
2018516548.tif 000004
【図１Ｃ−１】
2018516548.tif 000005
【図１Ｃ−２】
2018516548.tif 000006
【図１Ｃ−３】
2018516548.tif 000007
【図１Ｄ】
2018516548.tif 000008
【図２Ａ】
2018516548.tif 000009
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ−１】
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【図２Ｃ−２】
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【図２Ｄ−１】
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【図２Ｄ−２】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ−１】
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【図４Ｃ−２】
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【図４Ｃ−３】
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【図４Ｄ−１】
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【図４Ｄ−２】
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【図４Ｄ−３】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ−１】
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【図５Ｅ−２】
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【図６Ａ−１】
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【図６Ａ−２】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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