(57)【要約】本開示は、ゲノム操作の分野のものであり、具体的には、造血細胞のゲノムの標的化改変である。本発明は、遺伝子治療及びゲノム操作で使用するための組成物及び方法を記載する。具体的には、記載の方法及び組成物は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子、例えば、１つ以上のさらなる遺伝子の調節因子として作用する遺伝子を不活性化させる（例えば、その発現を完全または部分的に消失させる）ことに関する。特に、本発明は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子におけるエンハンサー機能を阻害し、特定の細胞系譜におけるその活性を減弱またはノックアウトさせる方法及び組成物を記載する。さらに、本発明は、エンハンサー配列がＢＣＬ１１Ａ遺伝子内に位置していないＢＣＬ１１Ａエンハンサー機能を阻害する方法及び組成物を提供する。【選択図】図１
2018516556.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆ１からＦ４、Ｆ１からＦ５またはＦ１からＦ６で表される４つ、５つまたは６つのフィンガーを含み、各フィンガーが標的サブサイトを認識する認識ヘリックス領域を含むジンクフィンガータンパク質であって、前記タンパク質は、
（ｉ）以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質：
Ｆ１：ＳＴＧＮＬＴＮ（配列番号７）、
Ｆ２：ＴＳＧＳＬＴＲ（配列番号５）、
Ｆ３：ＤＱＳＮＬＲＡ（配列番号２）、及び
Ｆ４：ＡＱＣＣＬＦＨ（配列番号６）、または
（ｉｉ）以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質：
Ｆ１：ＤＱＳＮＬＲＡ（配列番号２）、
Ｆ２：ＲＰＹＴＬＲＬ（配列番号３）、
Ｆ３：ＳＲＧＡＬＫＴ（配列番号８）、
Ｆ４：ＴＳＧＳＬＴＲ（配列番号５）、
Ｆ５：ＤＱＳＮＬＲＡ（配列番号２）、及び
Ｆ６：ＡＱＣＣＬＦＨ（配列番号６）、
（ｉｉｉ）以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質：
Ｆ１：ＤＱＳＮＬＲＡ（配列番号２）、
Ｆ２：ＲＮＦＳＬＴＭ（配列番号９）、
Ｆ３：ＳＮＧＮＬＲＮ（配列番号１０）またはＳＴＧＮＬＴＮ（配列番号７）またはＳＳＹＮＬＡＮ（配列番号１１）、
Ｆ４：ＴＳＧＳＬＴＲ（配列番号５）、
Ｆ５：ＤＱＳＮＬＲＡ（配列番号２）、及び
Ｆ６：ＡＱＣＣＬＦＨ（配列番号６）、または
（ｉｖ）以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質：
Ｆ１：ＲＳＤＨＬＴＱ（配列番号１３）、
Ｆ２：ＱＳＧＨＬＡＲ（配列番号１４）、
Ｆ３：ＱＫＧＴＬＧＥ（配列番号１５）、
Ｆ４：ＲＨＲＤＬＳＲ（配列番号１８）、及び
Ｆ５：ＲＲＤＮＬＨＳ（配列番号１７）、または
（ｖ）以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質：
Ｆ１：ＲＮＤＨＲＴＴ（配列番号１９）、
Ｆ２：ＱＫＡＨＬＩＲ（配列番号２０）、
Ｆ３：ＱＫＧＴＬＧＥ（配列番号１５）、
Ｆ４：ＲＧＲＤＬＳＲ（配列番号２１）またはＬＫＲＴＬＫＲ（配列番号２５）、及び
Ｆ５：ＲＲＤＮＬＨＳ（配列番号１７）、または
（ｖｉ）以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質：
Ｆ１：ＲＳＤＨＬＴＱ（配列番号１３）、
Ｆ２：ＱＲＡＨＬＴＲ（配列番号２２）、
Ｆ３：ＱＫＧＴＬＧＥ（配列番号１５）またはＱＳＧＴＲＮＨ（配列番号２４）、
Ｆ４：ＨＲＮＴＬＶＲ（配列番号２３）、及び
Ｆ５：ＲＲＤＮＬＨＳ（配列番号１７）、または
（ｖｉｉ）以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質：
Ｆ１：ＲＳＤＨＬＴＱ（配列番号１３）、
Ｆ２：ＱＫＡＨＬＩＲ（配列番号２０）、
Ｆ３：ＱＫＧＴＬＧＥ（配列番号１５）またはＱＳＧＴＲＮＨ（配列番号２４）、
Ｆ４：ＲＧＲＤＬＳＲ（配列番号２１）、及び
Ｆ５：ＲＲＤＮＬＨＳ（配列番号１７）、または
（ｖｉｉｉ）以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質：
Ｆ１：ＲＳＤＨＬＴＱ（配列番号１３）、
Ｆ２：ＱＳＧＨＬＡＲ（配列番号１４）、
Ｆ３：ＱＳＧＴＲＮＨ（配列番号２４）、
Ｆ４：ＱＳＳＤＬＳＲ（配列番号１６）、及び
Ｆ５：ＲＲＤＮＬＨＳ（配列番号１７）
からなる群から選択される、前記ジンクフィンガータンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のジンクフィンガータンパク質及び機能性ドメインを含む、融合タンパク質。
【請求項３】
前記機能性ドメインは、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、または、切断ドメインである、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のジンクフィンガータンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項２もしくは請求項３に記載の融合タンパク質または請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
【請求項６】
前記細胞は、幹細胞または前駆細胞である、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
前記細胞はヒト細胞である、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
前記細胞のゲノムは融合タンパク質により改変される、請求項５〜７のいずれかに記載の細胞。
【請求項９】
前記ゲノム改変は、挿入、欠失及びその組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記ゲノム改変は、ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列の＋５８領域内にある、請求項８または９に記載の細胞。
【請求項１１】
請求項５〜１０のいずれかに記載の細胞から作製される、細胞または細胞株。
【請求項１２】
請求項５〜１１のいずれかに記載の細胞または細胞株に由来する、部分的または完全に分化した細胞。
【請求項１３】
前記細胞は、ゲノム改変を行わない細胞と比較した場合にガンマ及び／またはベータグロビンの発現増加を示す、請求項５〜１２のいずれかに記載の細胞。
【請求項１４】
請求項２もしくは請求項３に記載の融合タンパク質、請求項４に記載のポリヌクレオチド、または請求項５〜１３のいずれかに記載の細胞を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
細胞の内在性ＢＣＬ１１ａエンハンサー配列を改変する方法であって、前記内在性ＢＣＬ１１ａエンハンサー配列が改変されるように、請求項２もしくは請求項３に記載の融合タンパク質または請求項４に記載のポリヌクレオチドを、前記細胞に投与することを含む、前記方法。
【請求項１６】
前記細胞に外来配列を導入し、前記内在性ＢＣＬ１１ａエンハンサー配列に前記外来配列が挿入されるようにすることをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記改変は欠失を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
対象においてグロビン生成を増加させる方法であって、
前記対象に請求項５〜１３のいずれかに記載の細胞を投与することを含む、前記方法。
【請求項１９】
前記対象はヒトであり、前記細胞はヒト幹細胞またはヒト前駆細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞を骨髄移植で投与し、前記細胞は前記対象内で生着し、分化し、かつ成熟する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象は異常ヘモグロビン症に罹患している、請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記異常ヘモグロビン症はベータサラセミアまたは鎌状赤血球症である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
内在性ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列内にゲノム改変を含む遺伝子改変細胞を作製する方法であって、
ａ）細胞と、請求項２または請求項３に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを接触させ、ここで、前記融合タンパク質は切断ドメインを含み、
ｂ）前記ポリヌクレオチドから前記融合タンパク質の発現が導かれる条件に前記細胞を供し、かつ
ｃ）遺伝子改変細胞を作製するために十分な発現融合タンパク質を用いて前記内在性ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列を改変する、各工程を含む、前記方法。
【請求項２４】
前記細胞を少なくとも１つのサイトカインで刺激することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質、請求項４に記載のポリヌクレオチド及び／または請求項５〜１３のいずれかに記載の細胞を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／１６０，３９６号、及び２０１６年３月４日に出願された米国仮特許出願第６２／３０３，５９５号の利益を主張するものであり、それらの開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、ゲノム操作分野のものであり、特に造血細胞のゲノムの標的改変をするものである。
【背景技術】
【０００３】
ゲノム配列決定への取組みによりヒトゲノムには２０，０００〜２５，０００個の遺伝子が含まれているが、転写制御因子は２０００個より少ないことが明らかになっており、このことを考えると、遺伝子発現の時間的、発生的及び組織特異的な各種発現のすべてにおいて遺伝子発現を制御するために多数の因子が相互に作用しているはずであることが明白になる。遺伝子の発現は、基本転写制御因子と特異的転写制御因子とが極めて複雑に混ざりあって制御されており、発現は、シス作用性ＤＮＡエレメントによっても制御され得る。これらのＤＮＡエレメントは、ＤＮＡの局所エレメント、例えばコアプロモーター及びその関連転写因子結合部位、ならびに遠位エレメント、例えばエンハンサー、サイレンサー、インスレーター及び遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）の両エレメントを含む（Ｍａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ７：２９−５０を参照のこと）。
【０００４】
エンハンサーエレメントは、ＳＶ４０ウイルスゲノムにおいて最初に同定され、その後、ヒト免疫グロブリン重鎖座位において見出された。現在では、エンハンサーが多くの遺伝子の発現において調節的役割を果たしていることが知られており、主に遺伝子発現の時間的及び空間的パターンを支配すると考えられる。また、エンハンサーは、遺伝子のコアプロモーターからの距離に依存せず、かつ、プロモーターに対するいかなる特定配列方向にも依存しない様態で機能することも見出されている。エンハンサーは、コアプロモーター領域の数百キロベース上流または下流に位置し得、イントロン配列内に位置するか、または遺伝子の３’末端を越えて位置し得る。
【０００５】
これまで標的ゲノムＤＮＡを切断するさまざまな方法及び組成物が記載されている。このような標的化切断事象を使用して、例えば、標的変異原性誘導、細胞ＤＮＡ配列の標的欠失の誘導、及び所定の染色体座における標的組換えの促進が可能である。例えば、参照によりその開示内容全体が組み込まれる、米国特許第９，２５５，２５０号；第９，２００，２６６号；第９，０４５，７６３号；第９，００５，９７３号；第９，１５０，８４７号；第８，９５６，８２８号；第８，９４５，８６８号；第８，７０３，４８９号；第８，５８６，５２６号；第６，５３４，２６１号；第６，５９９，６９２号；第６，５０３，７１７号；第６，６８９，５５８号；第７，０６７，３１７号；第７，２６２，０５４号；第７，８８８，１２１号；第７，９７２，８５４号；第７，９１４，７９６号；第７，９５１，９２５号；第８，１１０，３７９号；第８，４０９，８６１号；米国特許公開第２００３０２３２４１０号；第２００５０２０８４８９号；第２００５００２６１５７号；第２００５００６４４７４号；第２００６００６３２３１号；第２００８０１５９９９６号；第２０１０００２１８２６４号；第２０１２００１７２９０号；第２０１１０２６５１９８号；第２０１３０１３７１０４号；第２０１３０１２２５９１号；第２０１３０１７７９８３号；第２０１３０１９６３７３号；第２０１５００５６７０５号及び第２０１５０３３５７０８号を参照のこと。
【０００６】
これらの方法では、しばしば、誤りが生じるプロセス、例えば非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）による切断修復または修復鋳型を用いた修復（相同組換え型修復、すなわちＨＤＲ）によって関心対象の遺伝子ノックアウトまたは配列が挿入され得るように（標的を狙った組込み）、人工的切断系を使用して標的ＤＮＡ配列内に二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックを誘導する方法が用いられる。この方法は、ゲノム配列の部位特異的変更をドナーオリゴヌクレオチドの使用を介して導入するためにも使用でき、これには、ゲノム領域の特定の欠失もしくは特定の点変異または局所改変の導入が含まれる（遺伝子修正としても知られる）。切断は、人工ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）などの特定ヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、または特定の切断を先導する人工ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ  ＲＮＡ（「一本鎖ガイドＲＮＡ」）を用いるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用を介して生じ得る。さらに、アルゴノートシステムに基づいた標的化ヌクレアーゼが開発されつつあり（例えば、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のものは「ＴｔＡｇｏ」として知られており、Ｓｗａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ５０７（７４９１）：２５８−２６１を参照のこと）、これも、ゲノム編集及び遺伝子治療において使用される可能性があり得る。
【０００７】
赤血球（Ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ：ＲＢＣ）または赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）は、血液の主要細胞成分である。事実、ＲＢＣはヒトの細胞の４分の１を占める。ヒトでは、成熟ＲＢＣは細胞核及び他の多くの細胞小器官を欠いており、ヘモグロビンという、組織に酸素を運搬し、組織から二酸化炭素を運び出して肺へ戻り二酸化炭素を除去させる働きをする金属タンパク質で満たされている。このタンパク質はＲＢＣの乾燥重量の約９７％を構成し、血液の酸素運搬能を約７０倍増加させる。ヘモグロビンは、２本のアルファ（α）様グロビン鎖及び２本のベータ（β）様グロビン鎖及び４つのヘム基を含むヘテロ四量体である。成人では、α２β２四量体はヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）または成人型ヘモグロビンと呼ばれる。典型的に、アルファグロビン鎖及びベータグロビン鎖は約１：１の比で合成され、この比がヘモグロビン及びＲＢＣの安定化という点で重要であると考えられる。発生過程の胎児では、母体の血流を介して酸素が胎児の全身に送達されるよう、酸素に対する結合親和性がヘモグロビンＡよりも高くなっている胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）という異なる形態のヘモグロビンが生成される。胎児グロビンをコードする遺伝子は２つあり、これらは配列が非常に類似しており、ＨＰＧ１（Ｇガンマとも呼ばれる）及びＨＰＧ２（Ａガンマ）と呼ばれる。胎児ヘモグロビンタンパク質もまた、２本のαグロビン鎖を含んでいるが、成人型βグロビン鎖の代わりに２本の胎児ガンマ（γ）グロビン鎖を有している（すなわち、胎児ヘモグロビンはα２γ２となる）。妊娠約３０週目に、胎児におけるガンマグロビン合成は低下し始める一方、ベータグロビンの生成が増加する。生後約１０か月までに、新生児のヘモグロビンはほぼすべてα２β２となるが、一部のＨｂＦは成人期まで持続する（総ヘモグロビンの約１〜３％）。ガンマグロビンからベータグロビンへの生成切り替え制御は極めて複雑であり、主に、ガンマグロビン転写の下方制御と同時にベータグロビン転写の上方制御が行われている。
【０００８】
ヘモグロビン鎖をコードする配列における遺伝子異常は、鎌状赤血球貧血症及びサラセミアなどのヘモグロビン異常症として知られる多数の疾患の原因となり得る。ヘモグロビン異常症の患者の大部分では、ガンマグロビンをコードする遺伝子がそのまま存在しているが、発現は、上記のように分娩期に生じる正常な遺伝子抑制のため比較的低い。
【０００９】
米国人の５０００人に１人が鎌状赤血球症（ＳＣＤ）に罹患していると推定され、大半はサハラ砂漠以南のアフリカ系の人々である。鎌状赤血球変異のヘテロ接合体の保因者にとってはマラリア防御に関して利益となるようであることから、この形質が長い年月の間に積極的に選択されてきた可能性があり、そのため、サハラ砂漠以南のアフリカでは人口の３分の１が鎌状赤血球形質を有していると推定される。鎌状赤血球症は、６番目のアミノ酸がグルタミン酸からバリンに置換された（ＤＮＡレベルでＧＡＧがＧＴＧになる）結果βグロビン遺伝子が変異することにより生じ、それによって生成されたヘモグロビンは「ヘモグロビンＳ」または「ＨｂＳ」と呼ばれる。低酸素条件下では、酸素非結合型のＨｂＳの立体構造変化により、ＥヘリックスとＦヘリックスの間のタンパク質上の疎水性パッチが露出される。ヘモグロビンのベータ鎖の６位にある疎水性残基のバリンは疎水性パッチと会合できるので、ＨｂＳ分子の凝集を引き起こし繊維状の沈降物を形成させる。これらの凝集体がＲＢＣの異常、すなわち「鎌状化」を引き起こし、細胞の柔軟性が失われる。鎌状のＲＢＣは、もはや形を変形させて毛細血管床に入り込むことができなくなり、鎌状赤血球患者に血管閉塞クリーゼを引き起こし得る。さらに、鎌状ＲＢＣは正常ＲＢＣよりも脆弱なうえ、溶血しやすく、最終的に患者は貧血になる。
【００１０】
鎌状赤血球患者の治療と管理は、急性エピソード発症中の抗生物質治療、疼痛管理及び輸血による治療を生涯にわたって行う。１つの方法としてヒドロキシ尿素の使用があり、ガンマグロビンの産生を増加させることにより部分的にその効果を発揮する。しかし、慢性的なヒドロキシ尿素療法の長期的副作用は未だ不明であり、治療により望ましくない副作用がある上、有効性は患者によってばらつきがある。鎌状赤血球治療の有効性が増しているにもかかわらず、患者の寿命は未だ５０歳半ばから後半にしか届かず、それに関連する疾患罹病率が患者の生活の質に与える影響は深刻である。
【００１１】
サラセミアもまた、ヘモグロビンに関連する疾患であり、典型的には、グロビン鎖の発現低下を伴う。この疾患は、遺伝子の調節領域の変異によって、またはグロビンをコードする配列の変異から起こり得、機能性グロビンタンパク質の発現低下またはレベル低下をもたらす。アルファサラセミアは主に西アフリカ系及び南アジア系の人々に関連しており、マラリア抵抗性をもたらす可能性がある。ベータサラセミアは主に地中海系の人々、典型的にギリシャからトルコ及びイタリアの沿岸地域の人々に関連している。サラセミアマイナーでは、βグロビンアレルのうち１遺伝子のみが変異を有している。個体は小球性貧血に罹患し、通常、平均赤血球容積が正常値より低いことにより検出される（＜８０ｆＬ）。サラセミアマイナーに罹患した対象のアレルはβ＋／βまたはβ０／βである（ここで、「β＋」は、いくらかの量のβ鎖を形成させるアレルを指し、「β」は、野生型βグロビンアレルを指し、「β０」は、欠失のいくつかの形態を含むβグロビン変異を指す）。中間型サラセミアの罹患者は通常の生活を営むことができる場合が多いが、特に病気の時または妊娠中はときおり輸血を要する場合があり、罹患者の貧血の重症度により異なる。これらの患者のアレルはβ＋／β＋またはβｏ／β＋であり得る。サラセミアメジャーはアレルの両方にサラセミア変異がある場合に生じる。これは重度の小球性低色素性貧血である。未治療の場合、貧血、脾腫及び重度の骨変形を引き起こす。進行して２０歳前に死亡する。治療は、定期輸血；脾腫の場合は脾摘出術、及び輸血が原因の鉄過剰のキレート化で構成される。重度サラセミア罹患者の治療には、適切なドナーの同定が可能であれば骨髄移植も用いられているが、この手順には相当なリスクがあり得る。
【００１２】
ＳＣＤ及びベータサラセミアの両方の治療に提案されている１つの方法は、ガンマグロビンの発現を増加させて、ＨｂＦで異常な成人型ヘモグロビンを機能的に置き換えることである。上述のように、ヒドロキシ尿素を用いるＳＣＤ患者の治療は、ガンマグロビンの発現増加に効果があることから部分的に成功であると考えられている。ガンマグロビン再活性化作用に影響を与えることが発見された最初の化合物群は細胞障害性薬物であった。薬理学的に操作してガンマグロビンをデノボ合成させる能力が最初に示されたのは、実験動物における５−アザシチジンの使用においてであった（ＤｅＳｉｍｏｎｅ（１９８２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ７９（１４）：４４２８−３１）。その後の研究により、５−アザシチジンのβ−サラセミア患者及び鎌状赤血球症患者におけるＨｂＦ増加能が確認された（Ｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３０７：１４６９−１４７５、及びＬｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｂｌｏｏｄ６２：３７０−３８０）。さらに、短鎖脂肪酸（例えば、酪酸及び誘導体）はＨｂＦを増加させることが実験系で示されている（Ｃｏｎｓｔａｎｔｏｕｌａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｂｌｏｏｄ７２（６）：１９６１−１９６７）。また、ヒト集団の一部に「遺伝性高胎児ヘモグロビン血症」（ＨＰＦＨ）として知られる病態を有する集団があり、高量のＨｂＦが成人期まで持続している（ＨＰＦＨのヘテロ接合体では１０〜４０％（Ｔｈｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ１８（Ｒ２）：Ｒ２１６−Ｒ２２３を参照のこと）。これはまれな病態であるが、関連するベータグロビン異常が何ら見られない場合は、個体のヘモグロビンの１００％がＨｂＦの場合であっても有意な臨床症状を伴うことはない。ベータサラセミアに罹患している個体が同時にＨＰＦＨに罹患している場合、ＨｂＦの発現により疾患の重症度が軽減され得る。さらに、鎌状赤血球症の自然経過の重症度は患者ごとに有意に異なり得、このばらつきを突き詰めると、一部には、疾患がより軽度な一部の個体では、より高レベルのＨｂＦが発現しているという事実が原因であり得る。
【００１３】
ＨｂＦ発現を高める１つの方法では、産物がガンマグロビンの発現調節において役割を果たす遺伝子の同定が行われる。そのような遺伝子の１つにＢＣＬ１１Ａがあり、最初はリンパ球発生において役割を果たすことから同定された。ＢＣＬ１１Ａは、ガンマグロビン発現の発生段階特異的な調節に関与すると考えられているジンクフィンガータンパク質をコードする。ＢＣＬ１１Ａは成人赤血球前駆細胞に発現し、その発現が下方制御されるとガンマグロビンの発現が増加する。さらに、ＢＣＬ１１Ａ  ｍＲＮＡのスプライシングは発生段階的に調節されると考えられる。胚細胞では、ＢＣＬ１１Ａ−Ｓ及びＢＣＬ１１Ａ−ＸＳとして知られるＢＣＬ１１Ａ  ｍＲＮＡのより短い変異型が主に発現するのに対し、成人細胞では、より長いＢＣＬ１１Ａ−Ｌ及びＢＣＬ１１Ａ−ＸＬのｍＲＮＡ変異型が主として発現すると考えられる。Ｓａｎｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２２  ｐ．１８３９を参照のこと。ＢＣＬ１１Ａタンパク質は、ベータグロビン遺伝子座と相互作用してそのコンホメーションを改変することにより異なる発生段階で発現すると考えられる。ＢＣＬ１１Ａ遺伝子を標的とする抑制性ＲＮＡの使用が提案されているが（例えば、米国特許公開第２０１１０１８２８６７号を参照のこと）、この技術にはいくつかの潜在的欠点がある。すなわち、完全なノックダウンが達成されない可能性があること、そのようなＲＮＡの送達が問題を生じる可能性があること、及びそうしたＲＮＡは必ず継続的に存在することから、生涯にわたり複数の治療が必要になるのである。
ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列を標的にすることによりＨｂＦを増加させる機構が提供される。例えば、米国特許公開第２０１５０１３２２６９号を参照のこと。ゲノムワイド関連解析により、ＨｂＦ高レベルに関連する、ＢＣＬ１１Ａでの一組の遺伝子変異型が同定されている。これらの変異型は、系譜が限定された段階特異的なエンハンサー領域として機能するＢＣＬ１１Ａの非コード領域に見られるＳＮＰの集まりである。さらなる研究により、このＢＣＬ１１Ａエンハンサーは、ＢＣＬ１１Ａが発現するために赤血球細胞においては必要とされるが、Ｂ細胞での発現には必要とされないことが明らかになった（Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ３４３：２５３−２５７を参照のこと）。エンハンサー領域はＢＣＬ１１Ａ遺伝子のイントロン２内で見出され、イントロン２内に３つのＤＮＡｓｅＩ高感受性領域（調節能に関連する、クロマチンの状態を示すことが多い）が同定された。これらの３領域は、ＢＣＬ１１Ａの転写開始部位からのキロベース単位の距離に従って「＋６２」、「＋５８」及び「＋５５」として同定された。これらのエンハンサー領域は、約３５０（＋５５）、５５０（＋５８）、及び３５０（＋６２）のヌクレオチド長である（Ｂａｕｅｒ２０１３、同書）。
したがって、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子発現を改変して、例えば鎌状赤血球症及びベータサラセミアなどのヘモグロビン異常症を治療するためのさらなる方法及び組成物が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第９，２５５，２５０号
【特許文献２】米国特許第９，２００，２６６号
【特許文献３】米国特許第９，０４５，７６３号
【特許文献４】米国特許第９，００５，９７３号
【特許文献５】米国特許第９，１５０，８４７号
【特許文献６】米国特許第８，９５６，８２８号
【特許文献７】米国特許第８，９４５，８６８号
【特許文献８】米国特許第８，７０３，４８９号
【特許文献９】米国特許第８，５８６，５２６号
【特許文献１０】米国特許第６，５３４，２６１号
【特許文献１１】米国特許第６，５９９，６９２号
【特許文献１２】米国特許第６，５０３，７１７号
【特許文献１３】米国特許第６，６８９，５５８号
【特許文献１４】米国特許第７，０６７，３１７号
【特許文献１５】米国特許第７，２６２，０５４号
【特許文献１６】米国特許第７，８８８，１２１号
【特許文献１７】米国特許第７，９７２，８５４号
【特許文献１８】米国特許第７，９１４，７９６号
【特許文献１９】米国特許第７，９５１，９２５号
【特許文献２０】米国特許第８，１１０，３７９号
【特許文献２１】米国特許第８，４０９，８６１号
【特許文献２２】米国特許公開第２００３０２３２４１０号
【特許文献２３】米国特許公開第２００５０２０８４８９号
【特許文献２４】米国特許公開第２００５００２６１５７号
【特許文献２５】米国特許公開第２００５００６４４７４号
【特許文献２６】米国特許公開第２００６００６３２３１号
【特許文献２７】米国特許公開第２００８０１５９９９６号
【特許文献２８】米国特許公開第２０１０００２１８２６４号
【特許文献２９】米国特許公開第２０１２００１７２９０号
【特許文献３０】米国特許公開第２０１１０２６５１９８号
【特許文献３１】米国特許公開第２０１３０１３７１０４号
【特許文献３２】米国特許公開第２０１３０１２２５９１号
【特許文献３３】米国特許公開第２０１３０１７７９８３号
【特許文献３４】米国特許公開第２０１３０１９６３７３号
【特許文献３５】米国特許公開第２０１５００５６７０５号
【特許文献３６】米国特許公開第２０１５０３３５７０８号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｍａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ７：２９−５０
【非特許文献２】Ｓｗａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ５０７（７４９１）：２５８−２６１
【非特許文献３】ＤｅＳｉｍｏｎｅ（１９８２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ７９（１４）：４４２８−３１
【非特許文献４】Ｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３０７：１４６９−１４７５
【非特許文献５】Ｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｂｌｏｏｄ６２：３７０−３８０
【非特許文献６】Ｃｏｎｓｔａｎｔｏｕｌａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｂｌｏｏｄ７２（６）：１９６１−１９６７
【非特許文献７】Ｔｈｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ１８（Ｒ２）：Ｒ２１６−Ｒ２２３
【非特許文献８】Ｓａｎｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２２  ｐ．１８３９
【非特許文献９】Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ３４３：２５３−２５７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、遺伝子治療及びゲノム操作で使用するための組成物及び方法を記載する。具体的には、記載の方法及び組成物は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子、例えば、１つ以上のさらなる遺伝子の調節因子として作用する遺伝子を不活性化させる（例えば、その発現を完全または部分的に消失させる）ことに関する。特に、本発明は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子におけるエンハンサー機能を阻害し、特定の細胞系譜におけるその活性を減弱またはノックアウトさせる方法及び組成物を記載する。さらに、本発明は、エンハンサー配列がＢＣＬ１１Ａ遺伝子内に位置していないＢＣＬ１１Ａエンハンサー機能を阻害する方法及び組成物を提供する。こうした状況においてＢＣＬ１１Ａ遺伝子が下方制御される結果、ガンマグロビンの発現増加がもたらされる。
【００１７】
いくつかの態様では、本発明は、４つ、５つまたは６つのフィンガーを含むジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）を含む天然には生じないジンクフィンガータンパク質を含み、各フィンガーは、標的サブサイトを認識する、表１に一列で示した順序の配列を含む認識ヘリックス領域を含む。ある実施形態では、ＺＦＰは、５１４４６、５１４６３、５１４８４、５１８５６、５１８５７または５１８６２（配列番号１で示される標的部位に結合する）及び５１５３６、５１９４９、５１９９０、５１９９３、５１９７９、５１９８２、５２０１５、５２０３２（配列番号１２で示される標的部位に結合する）として表されるタンパク質に対する、表１に示す認識ヘリックスを含む。したがって、ある実施形態では、以下の認識ヘリックス領域を含むジンクフィンガータンパク質を提供する。
（ｉ）Ｆ１：ＳＴＧＮＬＴＮ（配列番号７）、
Ｆ２：ＴＳＧＳＬＴＲ（配列番号５）、
Ｆ３：ＤＱＳＮＬＲＡ（配列番号２）、及び
Ｆ４：ＡＱＣＣＬＦＨ（配列番号６）、または
（ｉｉ）Ｆ１：ＤＱＳＮＬＲＡ（配列番号２）、
Ｆ２：ＲＰＹＴＬＲＬ（配列番号３）、
Ｆ３：ＳＲＧＡＬＫＴ（配列番号８）、
Ｆ４：ＴＳＧＳＬＴＲ（配列番号５）、
Ｆ５：ＤＱＳＮＬＲＡ（配列番号２）、及び
Ｆ６：ＡＱＣＣＬＦＨ（配列番号６）、
（ｉｉｉ）Ｆ１：ＤＱＳＮＬＲＡ（配列番号２）、
Ｆ２：ＲＮＦＳＬＴＭ（配列番号９）、
Ｆ３：ＳＮＧＮＬＲＮ（配列番号１０）もしくはＳＴＧＮＬＴＮ（配列番号７）もしくはＳＳＹＮＬＡＮ（配列番号１１）、
Ｆ４：ＴＳＧＳＬＴＲ（配列番号５）、
Ｆ５：ＤＱＳＮＬＲＡ（配列番号２）、及び
Ｆ６：ＡＱＣＣＬＦＨ（配列番号６）、または
（ｉｖ）Ｆ１：ＲＳＤＨＬＴＱ（配列番号１３）、
Ｆ２：ＱＳＧＨＬＡＲ（配列番号１４）、
Ｆ３：ＱＫＧＴＬＧＥ（配列番号１５）、
Ｆ４：ＲＨＲＤＬＳＲ（配列番号１８）、及び
Ｆ５：ＲＲＤＮＬＨＳ（配列番号１７）、または
（ｖ）Ｆ１：ＲＮＤＨＲＴＴ（配列番号１９）、
Ｆ２：ＱＫＡＨＬＩＲ（配列番号２０）、
Ｆ３：ＱＫＧＴＬＧＥ（配列番号１５）、
Ｆ４：ＲＧＲＤＬＳＲ（配列番号２１）もしくはＬＫＲＴＬＫＲ（配列番号２５）、及び
Ｆ５：ＲＲＤＮＬＨＳ（配列番号１７）、または
（ｖｉ）Ｆ１：ＲＳＤＨＬＴＱ（配列番号１３）、
Ｆ２：ＱＲＡＨＬＴＲ（配列番号２２）、
Ｆ３：ＱＫＧＴＬＧＥ（配列番号１５）もしくはＱＳＧＴＲＮＨ（配列番号２４）、
Ｆ４：ＨＲＮＴＬＶＲ（配列番号２３）、及び
Ｆ５：ＲＲＤＮＬＨＳ（配列番号１７）、または
（ｖｉｉ）Ｆ１：ＲＳＤＨＬＴＱ（配列番号１３）、
Ｆ２：ＱＫＡＨＬＩＲ（配列番号２０）、
Ｆ３：ＱＫＧＴＬＧＥ（配列番号１５）もしくはＱＳＧＴＲＮＨ（配列番号２４）、
Ｆ４：ＲＧＲＤＬＳＲ（配列番号２１）、及び
Ｆ５：ＲＲＤＮＬＨＳ（配列番号１７）、または
（ｖｉｉｉ）Ｆ１：Ｆ１：ＲＳＤＨＬＴＱ（配列番号１３）、
Ｆ２：ＱＳＧＨＬＡＲ（配列番号１４）、
Ｆ３：ＱＳＧＴＲＮＨ（配列番号２４）、
Ｆ４：ＱＳＳＤＬＳＲ（配列番号１６）、及び
Ｆ５：ＲＲＤＮＬＨＳ（配列番号１７）。
【００１８】
ある実施形態では、本明細書に記載するジンクフィンガータンパク質を機能性ドメイン（例えば、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、切断ドメイン（ジンクフィンガーヌクレアーゼ形成のため）など）と融合させる。ジンクフィンガーヌクレアーゼを二量体化する対に使用して、ＺＦＮが標的とするその対の一方もしくは両方の部位またはその近傍で切断してよく、例えば表１の「左のパートナー」（例えば、５１４４６、５１４６３、５１４８４、５１８５６、５１８５７、または５１８６２）は、表１の「右のパートナー」（例えば、５１５３６、５１９４９、５１９９０、５１９９３、５１９７９、５１９８２、５２０１５、または５２０３２）と二量体を形成してＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列を切断することができる。
【００１９】
別の態様では、本発明は、ゲノム操作を目的として、少なくとも１つのヌクレアーゼ（例えば、ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列に結合するヌクレアーゼ）をヒトの幹細胞または前駆細胞（ＨＳＣ／ＰＣ）に送達することを含む。ある実施形態では、ヌクレアーゼは、４つ、５つまたは６つのフィンガーを含むジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）を含み、各フィンガーは、標的サブサイトを認識する、表１に一列で示した順序の配列を含む認識ヘリックス領域を含む。本明細書に記載するヌクレアーゼ（複数可）は、リンカー、例えば、配列番号２６〜２９及び米国特許公開第２０１５０１３２２６９号に示されるようなリンカーを（例えば、ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインの間に）さらに含んでよい。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼをペプチドとして送達し、他の実施形態ではヌクレアーゼを、少なくとも１つのヌクレアーゼをコードする核酸として送達する。いくつかの実施形態では、２つ以上のヌクレアーゼを使用する。いくつかの好ましい実施形態では、ヌクレアーゼをコードする核酸はｍＲＮＡであり、ある場合にはｍＲＮＡが保護されている。いくつかの態様では、ｍＲＮＡを化学的に修飾してよい（例えば、Ｋｏｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２９（２）：１５４−１５７を参照のこと）。他の態様では、ｍＲＮＡはＡＲＣＡキャップを含んでよい（米国特許第７，０７４，５９６号及び第８，１５３，７７３号を参照のこと）。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは非修飾ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドとの混合物を含んでよい（米国特許公開第２０１２／０１９５９３６号を参照のこと）。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼをコードする核酸（複数可）を、電気穿孔法によりＨＳＣ／ＰＣに送達する。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、転写因子の結合部位またはその近傍で切断する。いくつかの態様では、転写因子はＧＡＴＡ−１である。
【００２１】
他の態様では、本発明は、例えば細胞の野生型配列と比較した場合に、内在性ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列が本明細書に記載のヌクレアーゼ（例えば、表１に示す）によって遺伝子改変を受けている細胞または細胞株を含む。本明細書に記載する、ヌクレアーゼにより改変された細胞または細胞株は、構造及び／または機能において野生型細胞及び他の改変（ヌクレアーゼ介在性）細胞のいずれとも区別できる。遺伝子が改変された細胞または細胞株は、ヘテロ接合体の改変であってもホモ接合体の改変であってもよい。改変には、挿入（例えば、導入遺伝子挿入）、欠失及び／またはその組み合わせが含まれてよい。いくつかの好ましい実施形態では、挿入、欠失及び／またはその組み合わせの結果、転写因子結合部位が破壊される。ある実施形態では、改変は、ヌクレアーゼ（複数可）が結合及び／または切断する部位（複数可）もしくはその近傍であり、例えば、切断部位（複数可）から上流または下流へ１〜３００塩基対以内（すなわち、その範囲のあらゆる塩基対数）、より好ましくは、表１に示す結合及び／または切断の部位（複数可）の片側の１〜１００塩基対以内（すなわち、その範囲のあらゆる塩基対数）、よりさらに好ましくは、結合及び／または切断の部位（複数可）の片側の１〜５０塩基対以内（すなわち、その範囲のあらゆる塩基対数）である。改変には、切断部位及び／または１つ以上の結合部位における１つ以上のヌクレオチドに対する改変が含まれてもよい。ある実施形態では、ヌクレアーゼ標的部位（複数可）のうち１つまたは複数部位は改変されない。他の実施形態では、ヌクレアーゼ（複数可）の標的となる部位のうち少なくとも１つ（複数可）を改変する。ある実施形態では、改変はＢＣＬ１１Ａエンハンサーの「＋５８」領域またはその近傍であり、例えば、配列番号１及び配列番号１２のいずれかで示されるヌクレアーゼ結合部位またはその近傍である。いかなる細胞または細胞株であっても本明細書に記載のようにヌクレアーゼによって改変してよく、例えば、幹細胞（ＣＤ３４＋  造血幹細胞のような造血幹細胞）または赤血球（ＲＢＣ）前駆細胞であってよい。また、本明細書に記載のようにヌクレアーゼによる改変後に得られる細胞または細胞株、例えば、ヌクレアーゼの改変を受けた細胞または細胞株に由来する細胞または細胞株についても記載する。本明細書に記載のような改変幹細胞に由来する部分的または完全に分化した細胞も提供する（例えば、ＲＢＣまたはＲＢＣ前駆細胞）。ヌクレアーゼの改変を受けた細胞に由来する細胞は、インビトロ（培養）で増殖（及び／または分化）させてもよいし、また例えば、ヌクレアーゼの改変を受けた幹細胞のエキソビボ投与の後に、生きている対象内で分化させてもよい。本明細書に開示する遺伝子改変細胞または細胞株は、ガンマグロビンの発現増加を示し得る。本明細書に記載する遺伝子改変細胞を含む医薬組成物などの組成物もまた提供される。
【００２２】
他の態様では、本発明は、ドナー核酸を標的細胞に送達して、細胞内にドナー核酸が組み込まれている遺伝子改変細胞を得ることを含む。ドナーは、表１のヌクレアーゼ（複数可）をコードする核酸より前、後、または同時に送達されてよい。ドナー核酸は、細胞のゲノム、例えば、内在性遺伝子座に組み込まれるべき外来配列（導入遺伝子）を含んでよい。いくつかの実施形態では、ドナーは、標的切断部位と相同性のある領域が隣接している完全長遺伝子またはその断片を含んでよい。いくつかの実施形態では、ドナーは相同領域を欠き、相同性非依存的機構（すなわちＮＨＥＪ）を介して標的遺伝子座に組み込まれる。ドナーは任意の核酸配列を含んでよく、例えば、ヌクレアーゼで誘導された二本鎖切断を相同組換えで修復するための基質として核酸を使用した場合に、ドナー指定による欠失を、内在性染色体座（例えば、ＢＣＬ１１Ａエンハンサー領域）に生じさせるか、または（もしくは、さらに）、新規なアレル形態（例えば、転写因子結合部位を排除する点変異）の内在性遺伝子座を作製させる核酸を含んでよい。いくつかの態様では、ドナー核酸は、組込みにより遺伝子修正事象、または標的欠失がもたらされるオリゴヌクレオチドである。
【００２３】
他の態様では、ヌクレアーゼ及び／またはドナーは（複数可）、ウイルスを用いた遺伝子導入法及び／またはウイルスを用いない遺伝子導入法によって送達される。好ましい実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を介して細胞にドナーを送達する。ある場合には、ＡＡＶは、カプシドの血清型と比較して異なる血清型のＬＴＲを含む。
【００２４】
いくつかの態様では、表１に示す１つ以上のヌクレアーゼを使用して、エンハンサーのＤＮＡｓｅＩ高感受性領域内にある領域（例えば、ＢＣＬ１１Ａエンハンサーの＋５８領域）を含めた欠失を作製する。これらの欠失は、約１ヌクレオチドから約５５１ヌクレオチドを含み得る。したがって、欠失は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０，１００，１５０、２００，２５０，３００、３５０，４００，４５０、５００、５５０のヌクレオチド、またはその間のあらゆる数のヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上の転写因子に対する結合領域を含む。いくつかの好ましい実施形態では、欠失は、ＧＡＴＡ−１結合部位、または他の因子と組み合わされているＧＡＴＡ−１に対する結合部位を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、表１のＤＮＡ結合ドメインを機能性ドメインと融合させる。いくつかの態様には、ＤＮＡ結合ドメインと遺伝子発現を調節できるドメインとの融合が含まれる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、モジュレーターが遺伝子発現を抑制する遺伝子発現調節ドメインと融合させた、表１のＤＮＡ結合領域を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ＨＳＣ／ＰＣ細胞と、本発明のヌクレアーゼ及び／またはＤＮＡ結合タンパク質（すなわち、表１に示すＺＦＰ）とを接触させる。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ及び／またはＤＮＡ結合タンパク質を核酸として送達し、他の実施形態ではそれらをタンパク質として送達する。いくつかの実施形態では、核酸は、ヌクレアーゼ及び／またはＤＮＡ結合タンパク質をコードするｍＲＮＡであり、さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは保護されてよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは化学的に修飾されてよく、ｍＲＮＡはＡＲＣＡキャップを含んでよく、かつ／またはｍＲＮＡは非修飾ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドの混合物を含んでよい。これらの細胞に由来する細胞または細胞株もまた提供され、部分的または完全に分化した細胞が含まれる。
【００２７】
いくつかの態様では、対象からのＨＳＣ／ＰＣ採取、または採取した骨髄の精製を行った後、ＨＳＣ／ＰＣと、本発明のヌクレアーゼ及び／またはＤＮＡ結合タンパク質とをエキソビボで接触させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するヌクレアーゼによりＢＣＬ１１Ａエンハンサー領域内に改変が生じ、それにより例えば、構造的及び／または機能的に野生型及び／もしくは他の改変型（例えば、ヌクレアーゼの改変を受けた）細胞とは異なる遺伝子改変細胞が得られる。さらなる実施形態では、ＢＣＬ１１Ａエンハンサー領域の改変を含有しているＨＳＣ／ＰＣを再び対象体内に導入する。ある場合には、ＢＣＬ１１Ａエンハンサー領域の改変を含有しているＨＳＣ／ＰＣを増殖させてから導入を行う。他の態様では、遺伝子改変ＨＳＣ／ＰＣを骨髄移植で対象に与え、その場合、ＨＳＣ／ＰＣは生体内で生着し、分化し、成熟する。いくつかの実施形態では、ＨＳＣ／ＰＣは、Ｇ−ＣＳＦ及び／またはプレリキサフォルで誘導した動員後に対象から単離され、また他の実施形態では、ヒト骨髄またはヒト臍帯からそれらの細胞を単離する。いくつかの態様では、対象に軽度の骨髄破壊的手技で処置を施してから、改変ＨＳＣ／ＰＣを含む移植片を導入し、また他の態様では、強力な骨髄破壊的前処置レジメンで対象を治療する。いくつかの実施形態では、本発明の方法及び組成物を使用して異常ヘモグロビン症の治療または予防を行う。いくつかの態様では、異常ヘモグロビン症はベータサラセミアであり、また他の態様では、異常ヘモグロビン症は鎌状赤血球症である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ＨＳＣ／ＰＣをさらにドナー分子と接触させる。いくつかの実施形態では、ドナー分子をウイルスベクターによって送達する。ドナー分子は、プロモーターの有無にかかわらず、機能性ポリペプチドをコードする配列（例えば、ｃＤＮＡまたはその断片）を１つ以上含んでよい。不活性化にドナー分子を使用する場合はさらなる配列（コード配列または非コード配列）が含まれてよく、２Ａペプチド、ＳＡ部位、ＩＲＥＳなどをコードする配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
一態様では、本発明の方法及び組成物は、ＨＳＣ／ＰＣをインビボで接触させる方法を含む。ヌクレアーゼ及び／またはＤＮＡ結合タンパク質を、当技術分野で公知の方法によりインサイチュでＨＳＣ／ＰＣに送達する。いくつかの実施形態では、本発明のヌクレアーゼ及び／またはＤＮＡ結合タンパク質は、必要性のある対象に投与されるウイルス粒子を含み、また他の実施形態では、ヌクレアーゼ及び／またはＤＮＡ結合タンパク質は、ナノ粒子（例えば、リポソーム）を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子及び／またはナノ粒子を、ＨＳＣ／ＰＣが存在している臓器（例えば、骨髄）に送達する。
【００３０】
別の態様では、ドナー核酸を、相同性非依存的機構を介して細胞のゲノムに組み込む方法を本明細書に記載する。方法は、ドナー核酸がＤＳＢ部位で組み込まれるように、細胞のゲノムに二本鎖切断（ＤＳＢ）を作製し、本明細書に記載のヌクレアーゼを使用してドナー分子を切断することを含む。ある実施形態では、非相同性依存的方法（例えば、ＮＨＥＪ）を介してドナー核酸を組込む。上記のように、インビボでの切断時、ＤＳＢの位置で標的を定めて細胞のゲノムにドナー配列が組み込まれ得る。ドナー配列は、ＤＳＢ作製に用いられるヌクレアーゼの１つ以上が標的とする同じ標的部位を１つ以上含むことができる。したがって、ドナー配列は、組込みが所望されている内在性遺伝子の切断に使用されるヌクレアーゼと同一のヌクレアーゼの１つ以上によって切断されてよい。ある実施形態では、ドナー配列には、ＤＳＢ誘導に使用されるヌクレアーゼとは異なるヌクレアーゼの標的部位が含まれる。標的細胞のゲノムのＤＳＢは、どのような機構で作製してもよい。ある実施形態では、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）と、関心対象領域内の配列に結合するよう人工的に操作された、ジンクフィンガー結合ドメインを含む融合タンパク質と、切断ドメインまたは切断ハーフドメインとによってＤＳＢを作製する。
【００３１】
一態様では、ドナーは、関心対象遺伝子への結合及び／または関心対象遺伝子の発現調節を行う、関心対象の調節タンパク質（例えば、ＺＦＰ  ＴＦ、ＴＡＬＥ  ＴＦまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＴＦ）をコードしてよい。一実施形態では、調節タンパク質は、ＤＮＡ配列に結合して他の調節因子の結合を妨げる。別の実施形態では、調節タンパク質の結合により、標的ＤＮＡの発現を調節（すなわち、誘導または抑制）してよい。
【００３２】
いくつかの実施形態では、トランスジェニックＨＳＣ／ＰＣ細胞及び／または動物には、ヒト遺伝子をコードする導入遺伝子が含まれる。ある場合には、トランスジェニック動物は、外来導入遺伝子と対応する内在性遺伝子座にノックアウトを含み、これにより、ヒトタンパク質を単体で研究できるインビボ系を作製することができる。そのようなトランスジェニックモデルは、関心対象のヒトタンパク質と相互作用するかまたはそれを改変する、低分子または生体高分子または他の実体を同定するためのスクリーニング用に使用され得る。いくつかの態様では、導入遺伝子を、幹細胞（例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞など）または本明細書に記載する任意の方法により得られる動物胚の選択遺伝子座（例えば、セーフハーバー座位）に組み込み、その後、生きた動物が出生するようその胚を移植する。その後、動物を性成熟まで飼育し、少なくとも出生児の一部が編集された内在性遺伝子配列または組込み導入遺伝子を含む出生児を得る。
【００３３】
別の態様では、細胞における遺伝子発現（例えば、ＢＣＬ１１Ａ及び／またはグロビン遺伝子）を改変する方法を本明細書で提供し、かかる方法は、本明細書に記載（表１に記載）する１つ以上のヌクレアーゼを、該１つ以上のタンパク質が発現し、その遺伝子の発現が改変されるような条件下で上記の細胞内に導入することを含む。ある実施形態では、グロビン遺伝子（例えば、ガンマグロビンまたはベータグロビン）の発現を改変する（例えば、増加させる）。本明細書に記載するいずれの方法も、ドナー配列（例えば、外来プロモーターまたは内在性プロモーターの制御下の導入遺伝子またはその断片）を細胞のゲノムに組み込むこと、例えば、ドナーをＢＣＬ１１Ａ遺伝子のヌクレアーゼ切断部位またはその近傍に組み込むことをさらに含んでよい。ウイルスベクターをオリゴヌクレオチドとして、かつ／またはプラスミド上で用いて細胞にドナー配列を導入する。遺伝子発現が改変された細胞は、例えば、赤血球（ＲＢＣ）前駆細胞及び／または造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）であってよい。
【００３４】
他の実施形態では、内在性ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列内にゲノム改変（ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列のヌクレオチド配列に対する改変）を含む遺伝子改変細胞を作製する方法を本明細書で提供し、かかる方法は、ａ）各々が、表１に一列で示される順序の認識ヘリックス領域を含むジンクフィンガードメインを４つ、５つ、または６つ含んでいるジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）と細胞とを接触させ；ｂ）該細胞を、前記ポリヌクレオチドからジンクフィンガータンパク質発現が導かれる条件に供し；かつｃ）遺伝子改変細胞の作製に十分な発現ジンクフィンガータンパク質を用いて内在性ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列を改変する各工程を含む。ある実施形態では、少なくとも１つのサイトカインで細胞を刺激する（例えば、工程（ａ）の前）。ポリヌクレオチドは、任意の好適な方法を使用して細胞と接触させてよく、これにはトランスフェクションを介した方法、非ウイルスベクターを使用する方法、ウイルスベクターを使用する方法、化学的手段による方法または電場による方法（例えば、電気穿孔法）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
本明細書に記載するゲノム改変のうち１つまたは組み合わせを含む細胞もまた提供され、これには、本明細書に記載の方法で作製された細胞に由来する細胞が含まれる。
【００３６】
また、グロビン遺伝子の発現増加を必要とする患者を治療する方法も提供され、かかる方法は、本明細書に記載するような製剤（遺伝子改変細胞、タンパク質及び／またはポリヌクレオチド）を患者のグロビン遺伝子発現を増加させるのに十分な量で患者に投与することを含む。ある実施形態では、患者は、サラセミアまたは鎌状赤血球症に罹患していることが既知であるか、それに罹患している疑いがあるか、またはその発症リスクがある。
【００３７】
本発明の核酸、タンパク質及び／または遺伝子改変細胞を含むキットもまた提供される。キットは、ヌクレアーゼをコードする核酸（例えば、好適な発現ベクターに含有されている遺伝子をコードする、ＲＮＡ分子またはＺＦＮ、ＴＡＬＥＮもしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）、またはヌクレアーゼタンパク質の一定分量、ドナー分子、好適な幹細胞性修飾因子、細胞、緩衝剤、及び／または説明書（例えば、本発明の方法実施について）等を含んでよい。本発明には、限定されることなく、ヌクレアーゼによって作製したゲノム改変（例えば、表１に一列で示されている）を少なくとも１つ含む遺伝子改変細胞（例えば、造血（ＣＤ３４＋）幹細胞またはＲＢＣ前駆細胞のような幹細胞）が含まれ、ここで、ゲノム改変は内在性ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列内にあり、さらに、ゲノム改変は、挿入、欠失及びその組み合わせからなる群から選択され、かつ配列番号１及び配列番号１２のいずれかまたはその近傍における改変を含む。ある実施形態では、細胞は、本明細書に記載する幹細胞に由来する遺伝子改変を行った分化細胞である（例えば、造血幹細胞またはＲＢＣ前駆細胞に由来するＲＢＣ）。
【００３８】
ヌクレアーゼは、少なくとも１つのジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（例えば、表１に示すような）及び／または少なくとも１つのＴＡＬＥＮを含んでよく、ヌクレアーゼ（複数可）は、ヌクレアーゼ（複数可）をコードするタンパク質形態で、かつ／またはポリヌクレオチドとして細胞に導入されてよい。ある実施形態では、ゲノム改変は、導入遺伝子をコードするドナーポリヌクレオチドの組込みを含む挿入を含む。また、本明細書に記載する遺伝子改変細胞の１つ以上を含む医薬組成物も提供される。
【００３９】
また、認識ヘリックス領域を含むジンクフィンガードメインを４つ、５つまたは６つ含むジンクフィンガータンパク質を含んだＤＮＡ結合タンパク質も提供され、ここで、ジンクフィンガータンパク質は、表１に一列で示される順序の認識ヘリックス領域を含む。また、表１に示す標的部位の塩基対部分（例えば、少なくとも４つ、５つ、６つまたはそれ以上）を含む配列に結合する複数の繰返しを含むＴＡＬＥタンパク質も提供される。本明細書に記載するジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥタンパク質と、野生型または人工的に操作した切断ドメインもしくは切断ハーフドメインとを含む融合タンパク質もまた、本明細書に記載するタンパク質（ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ）をコードするポリヌクレオチドとして提供される。本明細書に記載する１つ以上のポリヌクレオチド及び／またはタンパク質を含む細胞（例えば、造血（ＣＤ３４＋）幹細胞のような単離幹細胞）もまた提供される。本明細書に記載するタンパク質、ポリヌクレオチド及び／または細胞を１つ以上含むキットもまた提供される。
【００４０】
細胞（例えば、ＲＢＣ前駆細胞及び／または造血幹細胞）におけるグロビン遺伝子発現を改変する方法もまた記載され、かかる方法は、細胞内に、本明細書に記載する１つ以上のヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、１つ以上のタンパク質が発現し、かつグロビン遺伝子の発現（例えば、ガンマ及び／またはベータグロビン）が改変される（例えば、増加させる）ような条件下で導入することを含む。ある実施形態では、方法はさらに、例えば、ウイルスベクターをオリゴヌクレオチドとして使用するかまたはプラスミド上で使用して、細胞のゲノムにドナー配列を組み込むことを含む。ドナー配列は、内在性または外来性のプロモーターの制御下の導入遺伝子を含んでよい。
【００４１】
また、内在性ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列（例えば、表１に示す標的部位）内にゲノム改変を含む遺伝子改変細胞を作製する方法も提供され、かかる方法は、（ａ）各々が表１に一列で示される順序の認識ヘリックス領域を含んでいるジンクフィンガードメインを４つ、５つ、または６つ含むジンクフィンガーヌクレアーゼを含む融合タンパク質コードするポリヌクレオチドと細胞とを接触させ；（ｂ）該細胞を、ポリヌクレオチドから融合タンパク質の発現が導かれる条件に供し；かつ（ｃ）遺伝子改変細胞の作製に十分な発現融合タンパク質を用いて内在性ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列を改変する各工程を含む。ある実施形態では、方法はさらに、少なくとも１つのサイトカインで細胞を刺激することを含む。ポリヌクレオチド（複数可）は、例えば、ウイルスを用いない送達システム、ウイルスを用いた送達システム、及び／または送達ビヒクルを使用して、細胞内部に送達されてよく、それには細胞を電場に供することを含んでよい。
【００４２】
グロビン遺伝子の発現増加を必要とする患者（例えば、患者は、サラセミア（例えば、β−サラセミア）または鎌状赤血球症などのグロビン異常症に罹患していることが既知である、罹患の疑いがある、または発症リスクがある）を治療する方法もまた提供され、かかる方法は、本明細書に記載する医薬組成物（例えば、タンパク質、ポリヌクレオチド及び／または細胞）を、患者のグロビン遺伝子発現を増加させるのに十分な量で患者に投与することを含む。
【００４３】
これら及び他の態様は、開示全体に照らすと当業者に容易に明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図中に示されているＢＣＬ１１ａ特異的ＺＦＮ対で編集したＣＤ３４＋細胞に由来する赤血球中のヒトガンマグロビン発現（ＨＢＧ）とヒトベータグロビン発現（ＨＢＢ）との相対比を示すグラフである。
【図２Ａ】末梢血（ＰＢ）から単離されたＣＤ３４＋細胞における２対のＢＣＬ１１ａ特異的ＺＦＮの活性を示すグラフである。ＢＴＸ電気穿孔装置を使用して細胞にトランスフェクションを行った。各条件ごとの検出された％インデル（検出可能なＮＨＥＪ活性の測定）を、図２Ａ（ｍＲＮＡインプット範囲：０．５〜４μｇ）及び図２Ｂ（ｍＲＮＡインプット範囲：２．０〜８．０μｇ）の各グラフの下に示す。
【図２Ｂ】末梢血（ＰＢ）から単離されたＣＤ３４＋細胞における２対のＢＣＬ１１ａ特異的ＺＦＮの活性を示すグラフである。ＢＴＸ電気穿孔装置を使用して細胞にトランスフェクションを行った。各条件ごとの検出された％インデル（検出可能なＮＨＥＪ活性の測定）を、図２Ａ（ｍＲＮＡインプット範囲：０．５〜４μｇ）及び図２Ｂ（ｍＲＮＡインプット範囲：２．０〜８．０μｇ）の各グラフの下に示す。
【図３】ヒトガンマグロビン（ＨＢＧ）の発現を、図２Ｂに示す編集されたＰＢ  ＣＤ３４＋細胞の赤血球分化後のＨＢＧとヒトベータグロビン（ＨＢＢ）の相対比として示すグラフである。各種ＺＦＮが同一ｍＲＮＡ分子上でコードされるが、分離は２ａ自己切断ペプチド配列によって行われる単一ｍＲＮＡ種（「２ａ」として識別）と、それぞれのｍＲＮＡがＺＦＮ対の一方をコードする２種類のｍＲＮＡを使用した場合（ｓｅｐａｒａｔｅ（別個）の「ｓｅｐ」として識別）とを比較する。
【図４Ａ】骨髄（ＢＭ）からから単離されたＣＤ３４＋細胞における２対のＢＣＬ１１ａ特異的ＺＦＮの活性を示すグラフである。ＢＴＸ電気穿孔装置を使用して細胞にトランスフェクションを行った。各条件ごとの検出された％インデル（検出可能なＮＨＥＪ活性の測定）を、図４Ａ（ｍＲＮＡインプット範囲：２．０〜８．０μｇ）のグラフの下に示す。
【図４Ｂ】骨髄（ＢＭ）からから単離されたＣＤ３４＋細胞における２対のＢＣＬ１１ａ特異的ＺＦＮの活性を示すグラフである。ＢＴＸ電気穿孔装置を使用して細胞にトランスフェクションを行った。ＺＦＮそれぞれをコードする複数配列を分離する２ａ自己切断ペプチド配列を有する単一ｍＲＮＡ種として複数ＺＦＮを供給する場合、または２つのＺＦＮを別々のｍＲＮＡ上に供給する場合の１対のＺＦＮの活性を示す。
【図５Ａ】電気穿孔装置Ｍａｘｃｙｔｅを使用した、ＰＢ由来ＣＤ３４＋細胞におけるＺＦＮ対の活性を示す。各条件ごとの検出された％インデル（検出可能なＮＨＥＪ活性の測定）を図５Ａ及び図５Ｂのグラフの下に示す。２つのＺＦＮ対間の比較を示す。
【図５Ｂ】電気穿孔装置Ｍａｘｃｙｔｅを使用した、ＰＢ由来ＣＤ３４＋細胞におけるＺＦＮ対の活性を示す。各条件ごとの検出された％インデル（検出可能なＮＨＥＪ活性の測定）を図５Ａ及び図５Ｂのグラフの下に示す。ＺＦＮそれぞれをコードする複数配列を分離する２ａ自己切断ペプチド配列を有する単一ｍＲＮＡ種として複数ＺＦＮを供給する場合、または２つのＺＦＮを別々のｍＲＮＡ上に供給する場合の各ＺＦＮ対の活性を示す。
【図６】骨髄由来ＣＤ３４＋細胞における対Ａ（ＳＢＳ５１４４６／５１５３６）及び対Ｂ（ＳＢＳ５１８５７／５１９４９）の大規模活性を示すグラフである。ＺＦＮ対をコードするｍＲＮＡは、ＺＦＮ対の一方それぞれをコードする各種配列を２ａ自己切断配列によって分離する単一ｍＲＮＡとして、またはそれぞれのＺＦＮをコードする別々のｍＲＮＡとして供給した。活性は、検出された％インデルで示されている。
【図７】図６に示す大規模遺伝子編集後、分化１４日目に検出されたＨＢＧ及びＨＢＢの発現の相対量を示すグラフである。前述のように、両ＺＦＮをコードする単一ｍＲＮＡとして、または別々のｍＲＮＡとして試料を試験した。分化第０日目に検出されたインデル量は、図下部の枠外に示されており、インデル活性はＨＧＢ発現量に追従することを示している。
【図８】上記のように単一ｍＲＮＡとして、または別々のｍＲＮＡとして対Ｂで処理した骨髄由来ＣＤ３４＋細胞の大規模編集において検出されたインデルの割合を示すグラフである。
【図９Ａ】上記のように単一ｍＲＮＡとして、または別々のｍＲＮＡとして対Ｂで処理した骨髄由来ＣＤ３４＋細胞の大規模編集において検出されたインデルの割合を示すグラフである。
【図９Ｂ】上記のように単一ｍＲＮＡとして、または別々のｍＲＮＡとして対Ｂで処理した骨髄由来ＣＤ３４＋細胞の大規模編集において検出されたインデルの割合を示すグラフである。
【図１０Ａ】対Ａ（図１０Ａ）及び対Ｂ（図１０Ｂ）のオフターゲットの解析結果を示す表である。
【図１０Ｂ】対Ａ（図１０Ａ）及び対Ｂ（図１０Ｂ）のオフターゲットの解析結果を示す表である。
【図１１Ａ】ＳＢ  ＺＦＮ  ｍＲＮＡで処置した患者細胞及び野生型（ｗｔ）細胞を用いた実験１（図１１Ａ）及び実験２（図１１Ｂ）におけるインビトロでの分化をリアルタイムＲＴ  ｑＰＣＲで解析したものを示すグラフである。グラフは、ガンマグロビンｍＲＮＡとアルファグロビンｍＲＮＡとの相対比を示す。
【図１１Ｂ】ＳＢ  ＺＦＮ  ｍＲＮＡで処置した患者細胞及び野生型（ｗｔ）細胞を用いた実験１（図１１Ａ）及び実験２（図１１Ｂ）におけるインビトロでの分化をリアルタイムＲＴ  ｑＰＣＲで解析したものを示すグラフである。グラフは、ガンマグロビンｍＲＮＡとアルファグロビンｍＲＮＡとの相対比を示す。
【図１２Ａ】実験１（図１２Ａ）及び実験２（図１２Ｂ）におけるガンマグロビンとアルファグロビンの比を示すグラフである。ガンマグロビン値については、Ａガンマ及びＧガンマのピーク値及び、適用可能な場合は、ＡガンマＴピーク値を加算した。
【図１２Ｂ】実験１（図１２Ａ）及び実験２（図１２Ｂ）におけるガンマグロビンとアルファグロビンの比を示すグラフである。ガンマグロビン値については、Ａガンマ及びＧガンマのピーク値及び、適用可能な場合は、ＡガンマＴピーク値を加算した。
【図１３】ガンマ／ベータ様タンパク質比、解析コロニーの個々におけるアレルの状態にしたがってグラフにしたものを示す。データを遺伝子型クラスによって選別した（非改変アレルは「＋」、編集アレルは「−」；野生型は「＋／＋」；単一アレル改変は「＋／−」；及び両アレル改変は「−／−」とした）。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本明細書は、ＢＣＬ１１Ａ及び／またはガンマグロビンの発現を調節するためのゲノム操作、ならびにヘモグロビン異常症の治療及び／または予防を行うための組成物及び方法を開示する。特に、表１に一列で示されている認識ヘリックス領域を有するＺＦＰを含むヌクレアーゼは、ＨＳＣ／ＰＣで効率的に達成され、その後の赤血球新生時に相対的なガンマグロビン発現に変化をもたらす。こうしたＢＣＬ１１Ａ及びガンマグロビン発現の調節は、ベータグロビンの発現が不十分であるか、またはベータグロビンの変異型の発現があるヘモグロビン異常症（例えば、ベータサラセミア、鎌状赤血球症）の治療に特に有用である。本発明の方法及び組成物を用いると、赤血球前駆細胞でのガンマグロビン発現を改変することによって、異常ベータグロビンが原因で生じる合併症及び疾患関連後遺症を克服することができる。
【００４６】
概要
本明細書に開示する方法、ならびに組成物の調製と使用の実施には、特に明記しない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造と解析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ及び当技術分野の技能の範囲内である関連分野の従来技術が採用される。これらの技術は文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９及びＴｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７及び定期更新版；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９８；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９９；及びＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照のこと。
【００４７】
定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、及び「オリゴヌクレオチド」という用語は同じ意味で使用され、直鎖または環状のコンホメーションをした一本鎖もしくは二本鎖形態にある、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す。本開示の目的の場合、これらの用語は、ポリマーの長さについて限定するものと解釈されるべきではない。これらの用語は、天然型ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基部分、糖部分及び／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）が改変されているヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は塩基対合の特異性が同じであり、すなわち、Ａの類似体はＴと塩基対合することになる。
【００４８】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、同じ意味で使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、アミノ酸ポリマーにも適用され、その場合は、１つ以上のアミノ酸が、対応する天然に生じるアミノ酸の化学的類似体または改変による誘導体である。
【００４９】
「結合」とは、配列特異的な、非共有結合による高分子間（例えば、タンパク質と核酸の間）の相互作用を指す。全体としての相互作用が配列特異的である限り、結合相互作用のすべての構成要素が配列特異的（例えば、ＤＮＡ骨格のリン酸残基との接触）である必要はない。そのような相互作用は一般に１０−６Ｍ−１以下の解離定数（Ｋｄ）によって特徴づけられる。「親和性」とは結合強度を指し、高結合親和性と低いＫｄとは相関する。
【００５０】
「結合タンパク質」は、別の分子に結合することのできるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）及び／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合は自身に結合することができ（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成）、かつ／または、異なる１つまたは複数のタンパク質の１つ以上の分子に結合することができる。結合タンパク質は、１種以上の結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質には、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性及びタンパク質結合活性がある。
【００５１】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、亜鉛イオンの配位を介してその構造が安定化されている、結合ドメイン内のアミノ酸配列領域であるジンクフィンガーの１つ以上を介してＤＮＡに配列特異的に結合するタンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしばジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略称される。
【００５２】
「ＤＮＡ結合領域ＴＡＬＥ」または「ＴＡＬＥ」は、ＴＡＬＥという繰返しドメイン／ユニットを１つ以上含むポリペプチドである。繰返しドメインは、ＴＡＬＥがその対応する標的ＤＮＡ配列に結合する際に関与している。単一の「繰返しユニット」（「繰返し」ともいう）は、典型的に３３〜３５アミノ酸長であり、天然に生じるＴＡＬＥタンパク質内部では、他のＴＡＬＥ繰返し配列との配列相同性を少なくとも一部に示す。
【００５３】
ジンクフィンガー及びＴＡＬＥの各結合ドメインを「人工的に操作」して所定のヌクレオチド配列に結合させることができ、例えば、天然に生じるジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の人工的な操作（１つ以上のアミノ酸の改変）を介して可能である。したがって、人工的に操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は天然には生じないタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を人工的に操作する方法の非限定的な例は設計及び選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が主に合理的基準から得られる天然には生じないタンパク質である。設計の合理的基準には、置換規則の適用、ならびに既存のＺＦＰ及び／またはＴＡＬＥの設計と結合に関するデータが保存されているデータベース内の情報を処理するコンピュータアルゴリズムが含まれる。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号；第６，４５３，２４２号；第６，５３４，２６１号及び第８，５８５，５２６号を参照のこと。また、ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６及びＷＯ０３／０１６４９６も参照のこと。
【００５４】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、主に経験的方法、例えば、ファージ提示、相互作用トラップまたはハイブリッド選択を行った結果作製される自然界では見られないタンパク質である。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，２００，７５９号；第８，５８６，５２６号；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０  ＷＯ０１／８８１９７，ＷＯ０２／０９９０８４を参照のこと。
【００５５】
「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与すると考えられている、原核生物のアルゴノートタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する。例えば、Ｓｗａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ（同書）、Ｇ．Ｓｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１，６５２を参照のこと）。「ＴｔＡｇｏシステム」は、例えば、ガイドＤＮＡなど、ＴｔＡｇｏ酵素による切断に必要な全構成要素である。
【００５６】
「組換え」は、２つのポリヌクレオチド間で遺伝情報の交換が行われる過程を指し、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同組換えによるドナーの捕捉を含むが、これに限定されるものではない。本開示の目的の場合、「相同組換え（ＨＲ）」とは、そのような情報交換の特殊な形態を指し、例えば、相同組換え型修復機構を介した細胞の二本鎖切断の修復中に生じる交換をいう。この過程は、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「ドナー」分子を鋳型に使用して「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を受けた分子）を修復し、またドナーから標的へと遺伝情報の導入がもたらされることから「非交差型遺伝子変換（ｎｏｎ−ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）」または「ショートトラクト遺伝子変換（ｓｈｏｒｔ  ｔｒａｃｔ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）」としてさまざまな名称で知られる。いかなる特定の理論にも束縛されることは望まないが、そのような導入には、破壊された標的とドナーの間で形成されるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、及び／またはドナーを使用して、標的の一部となるであろう遺伝情報及び／または関連過程を再合成する「合成依存的鎖アニーリング」を使用することができる。このような特殊ＨＲの結果、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部またはすべてが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるような標的分子の配列改変が生じることが多い。
【００５７】
開示の方法では、本明細書に記載する１つ以上の標的化ヌクレアーゼにより、所定部位における標的配列（例えば、細胞クロマチン）に二本鎖切断（ＤＳＢ）が作製される。ＤＳＢは、相同組換え型修復または非相同組換え型修復機構による欠失及び／または挿入を生じさせてよい。欠失には塩基対がいくつ含まれてもよい。同様に、挿入には、例えば、任意選択で切断領域のヌクレオチド配列に対して相同性のある、「ドナー」ポリヌクレオチドの組込みを含む塩基対がいくつ含まれてもよい。ドナー配列は物理的に組み込んでよく、または別法として、ドナーポリヌクレオチドを、相同組換えを介した切断修復用の鋳型に使用して、ドナーのヌクレオチド配列のすべてまたは一部を細胞クロマチンに導入する。したがって、細胞クロマチンの第１の配列は、改変が可能であり、ある実施形態では、ドナーポリヌクレオチドに存在する配列に変換可能である。したがって、「置換する」または「置換」という用語の使用は、１つのヌクレオチド配列を別のヌクレオチド配列で置換することを表すものと理解することができ（すなわち、情報の意味での配列の置換）、必ずしもあるポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドで物理的または化学的に置換される必要はない。
【００５８】
本明細書に記載するいずれの方法においても、細胞内のさらなる標的部位のさらなる二本鎖切断に、ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥＮのさらなる対を使用することができる。
【００５９】
本明細書に記載するいずれの方法も、関心対象遺伝子（複数可）の発現を破壊するドナー配列を標的を狙って組み込むことにより、大きさを問わないドナーの挿入、及び／または細胞内の１つ以上の標的配列の部分的もしくは完全な不活性化を行うために使用することができる。部分的または完全に不活性化された遺伝子を有する細胞株もまた提供される。
【００６０】
本明細書に記載するいずれの方法においても、外来ヌクレオチド配列（「ドナー配列」または「導入遺伝子」）は、関心対象領域のゲノム配列に対して相同であるが同一ではない配列を含有することができ、それにより、相同組換えが促進され関心対象領域に非同一配列が挿入される。したがって、ある実施形態では、関心対象領域内の配列に相同なドナー配列部分は、置換されたゲノム配列に対し約８０〜９９％（またはその範囲のあらゆる整数）の配列同一性を示す。他の実施形態では、ドナー配列とゲノム配列の相同性は、例えば、ドナー配列とゲノム配列の１００連続塩基対に対し１ヌクレオチドのみが異なる場合の９９％よりも高い。特定の場合では、ドナー配列の非相同部分は、関心対象領域に新たな配列が導入されるよう、その関心対象領域に存在しない配列を含有することができる。これらの場合、非相同配列は一般に、関心対象領域内の配列に相同または同一な、５０〜１，０００塩基対（またはその範囲の任意の整数値）または１，０００より大きい任意の数の塩基対からなる配列に隣接している。他の実施形態では、ドナー配列は第１の配列に対して非相同であり、非相同組換え機構によってゲノムに挿入される。
【００６１】
「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破断を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素による加水分解または化学的加水分解などを含むが、これに限定されるものではない多様な方法によって開始させることができる。一本鎖切断及び二本鎖切断のいずれも可能であるが、二本鎖切断は、２つの別個の一本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断により平滑末端または突出末端（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｅｎｄ）のいずれかが生成され得る。ある実施形態では、標的とする二本鎖ＤＮＡに対し融合ポリペプチドを使用する。
【００６２】
「切断ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なるポリペプチド）と共に、切断活性（好ましくは二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。「第１の切断ハーフドメイン及び第２の切断ハーフドメイン」；「＋の切断ハーフドメイン及び−の切断ハーフドメイン」及び「右の切断ハーフドメイン及び左の切断ハーフドメイン」という用語は同じ意味で使用され、二量体化する切断ハーフドメインの対を指す。
【００６３】
「人工的切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の人工的切断ハーフドメイン）と偏性ヘテロ二量体（ｏｂｌｉｇａｔｅ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）を形成するよう改変されている切断ハーフドメインである。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００５／００６４４７４号、第２００７０２１８５２８号、第２００８０１３１９６２号及び第２０１１０２０１０５５号も参照のこと。
【００６４】
用語「配列」とは任意の長さのヌクレオチド配列を指し、これはＤＮＡまたはＲＮＡであり得、直鎖、環状または分岐であり得、一本鎖でも二本鎖でもあり得る。用語「ドナー配列」とは、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、どの長さでも可能であり、例えば、２〜１００，０００，０００ヌクレオチド長（またはその範囲もしくはそれより上の任意の整数値）、好ましくは約１００〜１００，０００ヌクレオチド長（またはその範囲のあらゆる整数）、より好ましくは約２０００〜２０，０００ヌクレオチド長（すなわち、その範囲のあらゆる値）、さらにより好ましくは約５〜１５ｋｂ（すなわち、その範囲のあらゆる値）であり得る。
【００６５】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造体である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストン及びヒストン以外の染色体のタンパク質などのタンパク質を含む。真核細胞のクロマチンの大部分はヌクレオソームという形態で存在し、そこでは、ヌクレオソームコアは、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４それぞれのヒストンを２つずつ含む八量体と会合した、約１５０塩基対のＤＮＡを含み、ヌクレオソームコア同士の間にリンカーＤＮＡ（長さは生物により異なる）が伸びている。ヒストンＨ１分子は一般にリンカーＤＮＡと会合している。本開示の目的の場合、用語「クロマチン」は、原核生物及び真核生物両方の、あらゆる種類の細胞の核タンパク質が包含されるものとする。細胞クロマチンには、染色体クロマチンもエピソームクロマチンも含まれる。
【００６６】
「染色体」は、細胞ゲノムの全部または一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムはその核型によって特徴づけられることが多く、この核型にはその細胞のゲノムを含む染色体すべてが集められている。細胞のゲノムは１つ以上の染色体を含み得る。
【００６７】
「エピソーム」は、複製する核酸、核タンパク質複合体、または細胞の染色体の核型には含まれていない核酸を含む他の構造体である。エピソームの例には、プラスミド及び特定のウイルスゲノムが含まれる。
【００６８】
「接近可能領域」は、核酸内に存在する標的部位に、その標的部位を認識する外来分子が結合できる、細胞クロマチン内の部位である。いかなる特定の理論にも束縛されることは望まないが、接近可能領域は、ヌクレオソーム構造にパッケージされない領域であると考えられる。接近可能領域の特徴的な構造はしばしば、化学的プローブ及び酵素を用いたプローブ、例えば、ヌクレアーゼに対するその感受性により検出され得る。
【００６９】
「標的部位」または「標的配列」は、結合に十分な条件が存在する場合に、結合分子が結合することになる核酸の一部を定義する核酸配列である。
【００７０】
「外来」分子は、通常は細胞に存在しないが、遺伝学的、生化学的または他の１つ以上の方法によって細胞に導入され得る分子である。「通常は細胞に存在していること」は、その細胞の特定の発生段階及び環境条件について決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生過程にしか存在しない分子は、成人筋細胞に対しては外来分子である。同様に、熱ショックで誘導された分子は、熱ショックを受けていない細胞に対しては外来分子である。外来分子は、例えば、機能不全を起こしている内在性分子の機能するタイプまたは正常に機能している内在性分子の機能不全を起こしているタイプを含むことができる。
【００７１】
外来分子は、特に、低分子、例えばコンビナトリアルケミストリー過程によって作製されたもの、または高分子、例えばタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、もしくは上記分子の改変による任意の誘導体、または上記分子を１つ以上含む任意の複合体であり得る。核酸にはＤＮＡ及びＲＮＡが含まれ、一本鎖または二本鎖であり得、直鎖、分岐または環状であり得、かつ、任意の長さであり得る。核酸には、二重鎖を形成できるもの、ならびに三重鎖形成核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号及び第５，４２２，２５１号を参照のこと。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース及びヘリカーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７２】
外来分子は、内在性分子と同じ種類の分子、例えば、外来性のタンパク質または核酸であり得る。例えば、外来核酸は、細胞に導入された感染性のウイルスゲノム、プラスミドもしくはエピソーム、または通常は細胞に存在しない染色体を含み得る。細胞に外来分子を導入する方法は当業者に公知であり、脂質介在性導入法（すなわち、中性脂質及びカチオン性脂質などのリポソーム）、電気穿孔法、直接注入、細胞融合、粒子撃込み、リン酸カルシウム共沈降法、ＤＥＡＥ−デキストランによる誘導型導入法及びウイルスベクターによる導入法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。外来分子はまた、内在性分子と同じ種類であるが、細胞が由来している種とは異なる種に由来する分子でもあり得る。例えば、ヒト核酸配列を、元々はマウスまたはハムスターに由来する細胞株に導入してよい。外来分子を植物細胞に導入する方法は当業者に公知であり、プロトプラスト形質転換、シリコンカーバイド（例えば、ウイスカー（商標））、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる形質転換、脂質介在性導入法（すなわち、中性脂質及びカチオン性脂質などのリポソーム）、電気穿孔法、直接注入、細胞融合、粒子撃込み（例えば、「遺伝子銃」を使用）、リン酸カルシウム共沈降法、ＤＥＡＥ−デキストランによる誘導型導入法及びウイルスベクターによる導入法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７３】
これに対し、「内在性」分子は、特定の環境条件下の特定の発生段階において特定の細胞に通常存在する分子である。例えば、内在性核酸は、染色体、またはミトコンドリア、葉緑体もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に生じるエピソーム核酸を含み得る。さらなる内在性分子としては、タンパク質、例えば、転写因子及び酵素を挙げることができる。
【００７４】
本明細書で使用する場合、用語「外来核酸の産物」には、ポリヌクレオチド及びポリペプチドのいずれの産物も含まれ、例えば、転写産物（ＲＮＡなどのポリヌクレオチド）及び翻訳産物（各種ポリペプチド）が含まれる。
【００７５】
「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が結合している、好ましくは共有結合している分子である。サブユニット分子は、化学的に同じ種類の分子であっても、または化学的に異なる種類の分子であってもよい。第１の種類の融合分子の例には、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインと、１つ以上の活性化ドメインとの融合体）及び融合核酸（例えば、前掲の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。第２の種類の融合分子の例には、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの融合体、及びマイナーグルーブバインダーと核酸との融合体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７６】
融合タンパク質の細胞内発現は、細胞への融合タンパク質の送達によって、または、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達によってもたらされ得、ここで、ポリヌクレオチドが転写され、その転写が翻訳されて融合タンパク質が作製される。トランススプライシング、ポリペプチド切断及びポリペプチドライゲーションもタンパク質の細胞内発現に使用され得る。細胞にポリヌクレオチド及びポリペプチドを送達する方法は本開示の他の箇所に記載されている。
【００７７】
本開示の目的の場合、「遺伝子」には、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（下記を参照のこと）、ならびに遺伝子産物の生成を調節するすべてのＤＮＡ領域が含まれ、そのような調節配列がコード配列及び／または転写された配列に隣接するか否かは問わない。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、転写終結因子、リボソーム結合部位及び配列内リボソーム侵入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製起点、マトリックス結合部位ならびに遺伝子座制御領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【００７８】
「遺伝子発現」とは、遺伝子に含まれている情報を、遺伝子産物に変換することを指す。遺伝子産物は、直接の遺伝子転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたは他の任意の種類のＲＮＡ）または、ｍＲＮＡの翻訳により生成されたタンパク質であり得る。また遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、及び編集などのプロセスによって改変されたＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボース化、ミリストイル化、及びグリコシル化によって改変されたタンパク質も含まれる。
【００７９】
遺伝子発現の「調節」は遺伝子の活性変化を指す。発現の調節には、遺伝子活性化及び遺伝子抑制が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。ゲノム編集（例えば、切断、改変、不活性化、ランダム変異）を使用して発現を調節することができる。遺伝子の不活性化とは、本明細書に記載するＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含まない細胞と比べた場合の遺伝子発現の任意の低下を指す。したがって、遺伝子の不活性化は部分的であっても完全であってもよい。
【００８０】
「保護された」ｍＲＮＡとは、ｍＲＮＡの安定性または翻訳が増加されるように、ある程度改変されているｍＲＮＡである。保護の例には、シチジン残基及びウリジン残基の２５％を上限に、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）及び５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を用いて置換することが含まれる。得られるｍＲＮＡは、対応する非修飾型よりも低い免疫原性及び高い安定性を示す。（Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（（２０１２），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．１１，ｐａｇｅｓ  １８３３−１８４４を参照のこと）。他の変更としては、いわゆるＡＲＣＡキャップと呼ばれる付加が挙げられ、これにより、インビトロで作製されたｍＲＮＡの翻訳可能性が高まる（米国特許ＵＳ７０７４５９６を参照のこと）。
【００８１】
「関心対象領域」とは、例えば、遺伝子、または遺伝子内部にあるかもしくは遺伝子に隣接している非コード配列といった、外来分子との結合が望ましい、細胞クロマチンの任意の領域である。結合は、標的ＤＮＡ切断及び／または標的組換えが目的であり得る。関心対象領域は、染色体内、エピソーム内、細胞小器官のゲノム（例えば、ミトコンドリアのゲノム、葉緑体のゲノム）内、または例えば感染ウイルスゲノム内に存在し得る。関心対象領域は、遺伝子のコード領域の内部、または例えば、リーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンといった転写された非コード領域の内部、またはコード領域の上流または下流の転写されていない領域の内部であり得る。関心対象領域は、単一ヌクレオチド対ほどの小さな領域もしくは最高２，０００ヌクレオチド対の長さ、または任意の整数値のヌクレオチド対であり得る。
【００８２】
「真核生物の」細胞には、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞及びヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８３】
「機能的連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）」及び「機能的に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」（または「機能的に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」）という用語は、２つ以上の構成要素（配列要素など）の並置に関して同じ意味で使用され、その場合、これらの構成要素は、いずれの構成要素も正常に機能し、かつ、それらの構成要素のうち少なくとも１つが、他の構成要素のうち少なくとも１つに対する機能発揮を誘導させることができるように並置される。例を挙げると、プロモーターなどの転写調節配列が、１つ以上の転写調節因子の有無に応答してコード配列の転写レベルを制御する場合、その転写調節配列は該コード配列に機能的に連結されている。転写調節配列は一般にコード配列とシスで機能的に連結されているが、必ずしもコード配列と直接隣り合っていなくてよい。例えば、エンハンサーは、コード配列に機能的に連結された転写調節配列であるが、両者は隣接していない。
【００８４】
融合ポリペプチドに関して、用語「機能的に連結された」とは、構成要素の各々が、そのように連結されていない場合に考えられる機能と同じ機能を、他の構成要素と連結された状態で果たすことを意味し得る。例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓのＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとを融合させた融合ポリペプチドの場合、その融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓというＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位及び／またはその結合部位と結合することができ、また活性化ドメインが遺伝子発現を上方制御することができる場合、該ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓのＤＮＡ結合ドメインとその活性化ドメインは機能的に連結されている。ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓのＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとを融合させた融合ポリペプチドの場合、その融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓというＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位及び／またはその結合部位と結合することができ、また切断ドメインが標的部位近傍のＤＮＡを切断することができる場合、該ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓのＤＮＡ結合ドメインと該切断ドメインとは機能的に連結されている。
【００８５】
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」とは、その配列が完全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、完全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一の機能を保持しているタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応する天然の分子より多いか、少ないか、または同じ数の残基を有することができ、かつ／または１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドの置換を含有することができる。核酸の機能（例えば、コードする機能、別の核酸とのハイブリダイズ能）を測定する方法は当技術分野で周知である。同様に、タンパク質の機能を測定する方法は周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合アッセイ、電気泳動移動度シフト解析、または免疫沈降法によって決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によって評価することができる。上記Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．を参照のこと。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、共免疫沈降法、ツーハイブリッド法または相補性（遺伝子相補性及び生化学的相補性の両方）によって決定することができる。
【００８６】
「ベクター」は、標的細胞に遺伝子配列を導入することができる。典型的に、「ベクター構築体」、「発現ベクター」、及び「遺伝子導入ベクター」とは、関心対象遺伝子の発現を導くことができ、標的細胞に遺伝子配列を導入することができる任意の核酸構築体を意味する。したがって、この用語には、クローニング、及び発現ビヒクル、ならびに組み込みベクターが含まれる。
【００８７】
「対象」及び「患者」という用語は同じ意味で使用され、ヒト患者及びヒト以外の霊長類といった哺乳類、ならびにウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、及び他の動物といった実験動物を指す。したがって、本明細書で使用する「対象」または「患者」という用語は、本発明の幹細胞が投与され得る任意の哺乳類の患者または対象を意味する。本発明での対象には、１種以上の化学的毒素、例えば神経毒素などに曝露された対象が含まれる。
【００８８】
「幹細胞性」とは、任意の細胞が幹細胞様に作用する相対的能力、すなわち、全能性、多能性、もしくは寡能性の程度、及び幅広い、または限定されない自己複製といった、個々の幹細胞どれもが有し得る能力を指す。
【００８９】
ヌクレアーゼ
本明細書は、導入遺伝子が標的を定めてゲノムに組み込まれるよう、導入遺伝子と、細胞ゲノムを切断するヌクレアーゼとを担持するドナー分子をインビボで切断するのに有用な組成物、特にヌクレアーゼについて記載する。ある実施形態では、ヌクレアーゼの１つ以上は天然に生じるものである。他の実施形態では、ヌクレアーゼの１つ以上は、天然には生じない、すなわち、ＤＮＡ結合ドメイン及び／または切断ドメイン内で人工的に操作されている。例えば、天然に生じるヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインを、選択標的部位に結合するよう改変してよい（例えば、対応する結合部位とは異なる部位に結合するよう人工的に操作されたメガヌクレアーゼ）。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、異種のＤＮＡ結合ドメイン及び切断ドメインを含む（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬエフェクタードメインのＤＮＡ結合タンパク質；メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインと、異種の切断ドメイン）。
【００９０】
Ａ．ＤＮＡ結合ドメイン
ある実施形態では、細胞ゲノムのインビボでの切断及び／または標的化切断に使用される１つ以上のヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、天然には生じないジンクフィンガータンパク質であり、選択標的部位に結合するよう人工的に操作されたジンクフィンガータンパク質である。例えば、いずれも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７；Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６；米国特許第６，４５３，２４２号；第６，５３４，２６１号；第６，５９９，６９２号；第６，５０３，７１７号；第６，６８９，５５８号；第７，０３０，２１５号；第６，７９４，１３６号；第７，０６７，３１７号；第７，２６２，０５４号；第７，０７０，９３４号；第７，３６１，６３５号；第７，２５３，２７３号；及び米国特許公開第２００５／００６４４７４号；２００７／０２１８５２８号；２００５／０２６７０６１号を参照のこと。
【００９１】
人工的に操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に生じるジンクフィンガータンパク質と比較して、新規な結合特異性を有し得る。人工的操作方法には、合理的設計及び各種の選択が挙げられるが、これらに限定されるものではない。合理的設計には、例えば、３ヌクレオチド（または４ヌクレオチド）の配列及び個々のジンクフィンガーのアミノ酸配列を含むデータベースの使用が挙げられ、これにおいて、３ヌクレオチド配列または４ヌクレオチド配列の各々は、特定の３ヌクレオチド配列または４ヌクレオチド配列と結合する、ジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列に関連している。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、共有米国特許第６，４５３，２４２号及び第６，５３４，２６１号を参照のこと。
【００９２】
ファージ提示及びツーハイブリッド系を含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，４１０，２４８号；第６，１４０，４６６号；第６，２００，７５９号；及び第６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７及びＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強作用は、例えば、共有ＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。
【００９３】
さらに、これら及び他の参考文献に開示されているように、ジンクフィンガードメイン及び／またはマルチフィンガー型ジンクフィンガータンパク質を、例えば、５アミノ酸長以上のリンカーなど、任意の好適リンカー配列を使用して共に連結してよい。６アミノ酸長以上の例示的リンカー配列については米国特許第６，４７９，６２６号；第６，９０３，１８５号；及び第７，１５３，９４９号も参照のこと。本明細書に記載するタンパク質には、そのタンパク質の個々のジンクフィンガー間の好適なリンカーのあらゆる組み合わせも含まれてよい。
【００９４】
標的部位の選択；融合タンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）を設計及び構築するためのＺＦＰ及び方法は当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，０８１号；第５，７８９，５３８号；第６，４５３，２４２号；第６，５３４，２６１号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０９９０８４；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６及びＷＯ０３／０１６４９６に詳述されている。
【００９５】
ほぼどのようなリンカー（スペーサー）でも、ＤＮＡ結合ドメインの１つ以上の構成要素（例えば、ジンクフィンガー）の間、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインの間、及び／またはＤＮＡ結合ドメインと機能性ドメイン（例えば、ヌクレアーゼ）の間に使用してよい。好適リンカー配列の非限定的な例には、米国特許第８，７７２，４５３号；第７，８８８，１２１号；第６，４７９，６２６号；第６，９０３，１８５号；及び第７，１５３，９４９号；ならびに米国公開第２００９０３０５４１９号；第２０１５００６４７８９号及び第２０１５０１３２２６９号が挙げられる。したがって、本明細書に記載するタンパク質には、個々のＤＮＡ結合性構成要素間及び／またはＤＮＡ結合ドメインと本明細書に記載する組成物の機能性ドメインとの間の好適なリンカーのあらゆる組み合わせが含まれ得る。
【００９６】
Ｂ．切断ドメイン
好適な任意の切断ドメインを、本明細書に記載するＤＮＡ結合ドメインに機能的に連結して、ヌクレアーゼを形成することができる。切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメイン、例えばジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及びヌクレアーゼ由来の切断ドメインにとって異種であってよい。異種切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、２００２−２００３  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；及びＢｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照のこと。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵ＤＮａｓｅＩ；ミクロコッカスヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Ｌｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照のこと）。これらの酵素の１つ以上（またはその機能的断片）を切断ドメイン及び切断ハーフドメインの供給源として使用できる。
【００９７】
同様に、切断ハーフドメインは、上記のように、切断活性に二量体化が必要な任意のヌクレアーゼまたはその部分に由来し得る。一般に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合は、切断に２つの融合タンパク質が必要である。別法として、２つの切断ハーフドメインを含む単一タンパク質を使用できる。かかる２つの切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得うるか、または各切断ハーフドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得る。さらに、２つの融合タンパク質にとっての標的部位は、かかる２つの融合タンパク質と、各自それぞれの標的部位との結合が、例えば二量体化によって、切断ハーフドメインに機能的切断ドメインを形成させる、互いに対する空間的配向で切断ハーフドメインを設置するように、互いに対して配置されるのが好ましい。したがって、ある実施形態では、標的部位の近端は、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチドによって分離される。しかし、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対を２つの標的部位の間に介在させることができる（例えば、２〜５０ヌクレオチド対またはそれ以上）。一般に、切断の部位は標的部位と標的部位の間にある。
【００９８】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在し、配列特異的なＤＮＡへの結合（認識部位において）、及び結合部位またはその近傍におけるＤＮＡの切断をすることができる。特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除かれた部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインと切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素であるＦｏｋＩは、一方の鎖上にあるその認識部位から９ヌクレオチドの場所、もう一方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドの場所におけるＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；第５，４３６，１５０号及び第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：４２７５−４２７９；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：２７６４−２７６８；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：８８３−８８７；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照のこと。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素に由来する切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）及び１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを含み、人工的に操作されていても操作されていなくてもよい。
【００９９】
切断ドメインが結合ドメインから分離可能なＩＩＳ型制限酵素の例はＦｏｋＩである。この特定の酵素は二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１０，５７０−１０，５７５。したがって、本開示の目的の場合、開示の融合タンパク質で使用するＦｏｋＩ酵素の部分は切断ハーフドメインとみなす。したがって、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合体を使用する、細胞配列の標的化二本鎖切断及び／または標的化置換では、各々がＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質を使用して、触媒的に活性な切断ドメインを再構成することができる。別法として、ジンクフィンガー結合ドメインと２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインとを含有している単一ポリペプチド分子を使用することもできる。ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合体を使用する標的化切断及び標的化配列改変のためのパラメータは、本開示の他の箇所に記載されている。
【０１００】
切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持しているか、または、多量体化（例えば、二量体化）して機能的切断ドメインを形成する能力を保持しているタンパク質の任意の部分であり得る。
【０１０１】
例示的なＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，８８８，１２１号に記載されている。さらなる制限酵素もまた、分離可能な結合ドメインと切断ドメインを含有し、これらは本開示により意図されている。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０を参照のこと。
【０１０２】
ある実施形態では、切断ドメインは、ホモ二量体化を最小限に抑えるかまたは防ぐ、１つ以上の人工的切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン変異体ともいう）を含み、記載は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９１４，７９６号；第８，０３４，５９８号及び第８，６２３，６１８号を参照のこと。ＦｏｋＩの４４６位、４４７位、４７９位、４８３位、４８４位、４８６位、４８７位、４９０位、４９１位、４９６位、４９８位、４９９位、５００位、５３１位、５３４位、５３７位、及び５３８位のアミノ酸残基はいずれも、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体化に影響を与える標的である。
【０１０３】
偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示的な人工的切断ハーフドメインには、第１の切断ハーフドメインがＦｏｋＩのアミノ酸残基４９０位及び５３８位における変異を含み、第２の切断ハーフドメインがアミノ酸残基４８６位及び４９９位における変異を含む対が含まれる。
【０１０４】
したがって、一実施形態では、４９０位における変異はＧｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し、５３８位における変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し、４８６位における変異はＧｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）に置換し、４９９位における変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換する。具体的には、本明細書に記載する人工的切断ハーフドメインは、一方の切断ハーフドメインの４９０位（Ｅ→Ｋ）及び５３８（Ｉ→Ｋ）を変異させて「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」として表される人工的切断ハーフドメインを作製し、かつ別の切断ハーフドメインの４８６位（Ｑ→Ｅ）及び４９９（Ｉ→Ｌ）を変異させて「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」として表される人工的切断ハーフドメインを作製することによって調製した。本明細書に記載する人工的切断ハーフドメインは、異常な切断を最小限に抑えるかまたは消失させる偏性ヘテロ二量体変異体である。例えば、あらゆる目的のためにその開示内容は全体が参照により組み込まれる米国特許公開第２００８／０１３１９６２号を参照のこと。ある実施形態では、人工的切断ハーフドメインは、４８６位、４９９位及び４９６位（野生型ＦｏｋＩに対する番号付け）における変異、例えば、４８６位における野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基に置換する変異、４９９位における野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基に置換する変異、及び４９６位における野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基（それぞれ「ＥＬＤ」及び「ＥＬＥ」ドメインともいう）に置換する変異を含む。他の実施形態では、人工的切断ハーフドメインは、４９０位、５３８位及び５３７位（野生型ＦｏｋＩに対する番号付け）における変異、例えば、４９０位における野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に置換する変異、５３８位における野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に置換する変異、及び５３７位における野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基（それぞれ「ＫＫＫ」及び「ＫＫＲ」ドメインともいう）に置換する変異を含む。他の実施形態では、人工的切断ハーフドメインは、４９０位及び５３７位（野生型ＦｏｋＩに対する番号付け）における変異、例えば、４９０位における野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に置換する変異、５３７位における野生型のＨｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基（それぞれ「ＫＩＫ」及び「ＫＩＲ」ドメインともいう）に置換する変異を含む。例えば、米国特許第７，９１４，７９６号；第８，０３４，５９８号及び第８，６２３，６１８号を参照のこと。他の実施形態では、人工的切断ハーフドメインは、「Ｓｈａｒｋｅｙ」及び／または「Ｓｈａｒｋｅｙ’」変異を含む（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ，（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４００（１）：９６−１０７を参照のこと）。
【０１０５】
本明細書に記載する人工的切断ハーフドメインは、任意の好適な方法を使用して、例えば、米国特許公開第７，８８８，１２１号；第７，９１４，７９６号；第８，０３４，５９８号及び第８，６２３，６１８号に記載されるように、野生型の切断ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的変異誘発によって調製することができる。
【０１０６】
別法として、いわゆる「開裂酵素（ｓｐｌｉｔ−ｅｎｚｙｍｅ）」技術を使用して、核酸標的部位においてインビボでヌクレアーゼを構築してよい（例えば、米国特許公開第２００９００６８１６４号を参照のこと）。そのような開裂酵素の構成要素は、別々の発現構築体のいずれに発現させてもよく、または、個々の構成要素を、例えば自己切断２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列によって分離した、１つのオープンリーディングフレーム内に連結させることができる。構成要素は、個別のジンクフィンガー結合ドメインであっても、またはメガヌクレアーゼの核酸結合ドメインであってもよい。
【０１０７】
ヌクレアーゼは、例えば、ＷＯ２００９／０４２１６３及び２００９００６８１６４に記載のように、酵母を用いた染色体系において、活性についての使用前スクリーニングを行うことができる。ヌクレアーゼの発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあってよく、例として、ラフィノース及び／またはガラクトースの存在下で活性化（抑制解除）され、グルコース存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターがある。
【０１０８】
本明細書に記載するヌクレアーゼ（複数可）は、標的部位に１つ以上の二本鎖及び／または一本鎖の切開を作製し得る。ある実施形態では、ヌクレアーゼは、触媒的に不活性な切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩ及び／またはＣａｓタンパク質）を含む。例えば、米国特許第９，２００，２６６号；第８，７０３，４８９号及びＧｕｉｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２（６）：５７７−５８２を参照のこと。触媒的に不活性な切断ドメインは、触媒的に活性なドメインと組み合わされてニッカーゼとして作用して一本鎖切開を作製しよい。したがって、２つのニッカーゼを併用して特定領域に二本鎖切開を作製することができる。さらなるニッカーゼもまた、当技術分野で公知であり、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４４（２）：ｅ１１．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｖ８７８．Ｅｐｕｂ２０１５Ｏｃｔ１９に記載がある。
【０１０９】
標的部位
上記で詳述されるように、ＤＮＡドメインを人工的に操作して、どのような選択配列にも結合させることができる。人工的に操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然に生じるＤＮＡ結合ドメインと比べて新規な結合特異性を有し得る。ある実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列内の配列に結合し、例えば、標的部位（典型的に、塩基対は９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１またはそれ以上）はＢＣＬ１１Ａのエキソン２とエキソン３の間にあり、これには、表１に示すＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列のＤＮＡｓｅＩ高感受性部位内の配列（例えば、＋５８）に結合するＤＮＡ結合ドメインが含まれる。人工的操作方法には合理的設計及び各種の選択が挙げられるが、これらに限定されるものではない。合理的設計には、例えば、３ヌクレオチド（または４ヌクレオチド）の配列及び個々のジンクフィンガーのアミノ酸配列を含むデータベースの使用が挙げられ、これにおいて、３ヌクレオチド配列または４ヌクレオチド配列の各々は、特定の３ヌクレオチド配列または４ヌクレオチド配列と結合する、ジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列に関連している。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、共有米国特許第６，４５３，２４２号及び第６，５３４，２６１号を参照のこと。ＴＡＬエフェクタードメインの合理的設計も実施され得る。例えば、米国公開第２０１１０３０１０７３号を参照のこと。
【０１１０】
ファージ提示及びツーハイブリッド系を含む、ＤＮＡ結合ドメインに適用可能な例示的選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，４１０，２４８号；第６，１４０，４６６号；第６，２００，７５９号；及び第６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７及びＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強作用は、例えば、共有ＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。
【０１１１】
標的部位の選択；融合タンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）を設計及び構築するためのヌクレアーゼ及び方法は当業者に公知であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５００６４４７４号及び第２００６０１８８９８７号に詳述されている。
【０１１２】
さらに、これら及び他の参考文献に開示されているように、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、マルチフィンガー型ジンクフィンガータンパク質）及び／またはＤＮＡ結合ドメイン（複数可）と機能性ドメイン（複数可）との融合体を、例えば、５アミノ酸以上のリンカーなど、任意の好適リンカー配列を使用して共に連結してよい。米国特許第８，７７２，４５３号；第７，８８８，１２１号（例えば、「ＺＣ」リンカー）；第６，４７９，６２６号；第６，９０３，１８５号；及び第７，１５３，９４９号；米国公開第２００９０３０５４１９号）及び第２０１５００６４７８９号。本明細書に記載するタンパク質には、そのタンパク質の個々のＤＮＡ結合ドメイン間の好適なリンカーのあらゆる組み合わせが含まれてよい。米国特許第８，５８６，５２６号も参照のこと。
【０１１３】
ドナー
ある実施形態では、本開示は、本明細書に記載するＢＣＬ１１Ａエンハンサー領域結合分子を使用して外来配列を細胞のゲノムに組み込む、ヌクレアーゼ介在性の標的化組込みに関する。上記のように、外来配列（「ドナー配列」または「ドナー」または「導入遺伝子」とも呼ばれる）の挿入は、例えば、特定領域の欠損及び／または変異遺伝子の修正または野生型遺伝子の発現増加のために行う。ドナー配列が、典型的に、それが配置されるゲノム配列と同一ではないことは容易に明らかとなるであろう。ドナー配列に、相同性のある２つの領域が隣接する非相同配列を含有させて、関心対象の位置において効率的なＨＤＲを行わせることができ、または、非相同組換え型修復機構を介してドナー配列を組み込むことができる。さらに、ドナー配列は、細胞クロマチン内の関心対象領域に相同ではない配列を含有するベクター分子を含むことができる。ドナー分子は、細胞クロマチンに対して相同性のあるいくつかの不連続領域を含有することができ、例えば、ここに記載のヌクレアーゼの１つによって誘導されたＤＢＳの修復用基質として使用した場合に、Ｂｃｌ１１ａエンハンサー領域（またはその断片）の欠損をもたらす。さらに、関心対象領域に通常存在しない配列を標的化挿入する場合、上記配列をドナー核酸分子に存在させ、関心対象領域内の配列に対して相同性のある領域を隣接させることができる。
【０１１４】
挿入用ポリヌクレオチドは、「外来」ポリヌクレオチド、「ドナー」ポリヌクレオチドもしくは分子または「導入遺伝子」とも言うことができる。ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖及び／または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであり得、直鎖形態または環状形態で細胞に導入され得る。例えば、米国特許公開第２０１０００４７８０５号及び第２０１１０２０７２２１号を参照のこと。ドナー配列（複数可）は、ＤＮＡ  ＭＣ内に含有されることが好ましく、環状形態または直鎖形態で細胞に導入してよい。直鎖形態で導入する場合、当業者に公知の方法によってドナー配列の両端を（例えば、エキソヌクレアーゼによる分解から）保護することができる。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基を直鎖型分子の３’末端に付加し、かつ／または自己相補的オリゴヌクレオチドを一端または両端に連結する。例えば、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：４９５９−４９６３；Ｎｅｈｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７２：８８６−８８９を参照のこと。分解から外来ポリヌクレオチドを保護するさらなる方法には、末端アミノ基（複数可）の付加及び、例えば、ホスホロチオエート残基、ホスホルアミダート残基、及びＯ−メチルリボース残基またはデオキシリボース残基のような改変型ヌクレオチド間結合の使用が挙げられるが、これらに限定されるものではない。二本鎖形態で導入する場合、ドナーには、１つ以上のヌクレアーゼ標的部位、例えば、細胞のゲノムに組み込まれるべき導入遺伝子に隣接するヌクレアーゼ標的部位が含まれてよい。例えば、米国特許公開第２０１３０３２６６４５号を参照のこと。
【０１１５】
ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーター及び抗生物質耐性をコードする遺伝子などのさらなる配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。さらに、ドナーポリヌクレオチドは、裸の核酸として、核酸とリポソームまたはポロキサマーなどの薬剤との複合体として導入することができ、またはウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス及びインテグラーゼ欠損型レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達することができる。
【０１１６】
ある実施形態では、二本鎖ドナーには、長さが１ｋｂより大きい配列（例えば、コード配列。導入遺伝子ともいう）、例えば、２〜２００ｋｂ、２〜１０ｋｂ（またはその範囲のあらゆる値）の配列（例えば、コード配列。導入遺伝子ともいう）が含まれる。二本鎖ドナーには、例えば少なくとも１つのヌクレアーゼ標的部位も含まれる。ある実施形態では、ドナーには、例えば、ＺＦＮ対またはＴＡＬＥＮ対のための少なくとも２つの標的部位が含まれる。典型的に、ヌクレアーゼの標的部位は、導入遺伝子切断について、導入遺伝子配列の外側、例えば、導入遺伝子配列にとって５’及び／または３’にある。ヌクレアーゼ切断部位（複数可）は任意のヌクレアーゼ（複数可）の切断部位であってよい。ある実施形態では、二本鎖ドナーに含有されるヌクレアーゼ標的部位（複数可）は、内在性標的の切断に使用されるヌクレアーゼと同じヌクレアーゼ（複数可）が標的とする部位であり、その中に、相同性非依存的方法を介して切断されたドナーが組み込まれる。
【０１１７】
ドナーは一般に、その発現が組込み部位において内在性プロモーター、すなわち、中にドナーが挿入される内在性遺伝子の発現を誘導するプロモーターによって誘導されるように挿入される（例えば、グロビン、ＡＡＶＳ１など）。しかしながら、ドナーが、プロモーター及び／またはエンハンサー、例えば構成的プロモーターまたは誘導性もしくは組織特異的プロモーターを含んでよいことは明らかであろう。
【０１１８】
ドナー分子は、内在性遺伝子の全部、一部が発現するかまたは全く発現しないように内在性遺伝子に挿入されてよい。他の実施形態では、導入遺伝子（例えば、グロビンコード配列を持つかまたは持たないもの）を任意の内在性遺伝子座、例えばセーフハーバー座位に組み込む。例えば、米国特許公開第２００８０２９９５８０号；第２００８０１５９９９６号及び第２０１０００２１８２６４号を参照のこと。
【０１１９】
さらに、発現には必要ではないが、外来配列には、転写調節配列または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム侵入部位、２Ａペプチドをコードする配列及び／またはポリアデニル化シグナルが含まれてもよい。
【０１２０】
本明細書に記載するドナー配列上に担持される導入遺伝子は、ＰＣＲなど当技術分野で公知の標準的技術を使用してプラスミド、細胞または他の供給源から単離されてよい。使用するドナーは、環状超らせん型、環状弛緩型、直鎖等を含む、トポロジーの種類の変更を含むことができる。別法として、標準的なオリゴヌクレオチド合成技術を使用して、それらを化学的に合成してよい。さらに、ドナーをメチル化してもメチル化を欠失させてもよい。ドナーは、細菌または酵母の人工染色体の形態（ＢＡＣまたはＹＡＣ）であってよい。
【０１２１】
本明細書に記載する二本鎖ドナーポリヌクレオチドには天然には生じない１つ以上の塩基及び／または骨格が含まれてよい。特に、本明細書に記載する方法を使用してメチル化されたシトシンを有するドナー分子の挿入を実行し、関心対象領域の転写静止状態を達成してよい。
【０１２２】
外来（ドナー）ポリヌクレオチドは、任意の関心対象配列（外来配列）を含んでよい。例示的な外来配列には、任意のポリペプチドコード配列（例えば、ｃＤＮＡ）、プロモーター配列、エンハンサー配列、エピトープタグ、標識遺伝子、切断酵素認識部位及び各種の発現構築体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。標識遺伝子には、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を誘導するタンパク質をコードする配列、有色タンパク質または蛍光タンパク質または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）及び増強された細胞増殖及び／または遺伝子増幅を誘導するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）をコードする配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。エピトープタグには、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列のコピーが１つ以上含まれる。
【０１２３】
好ましい実施形態では、外来配列（導入遺伝子）は、細胞での発現が所望される任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、これには、抗体、抗原、酵素、受容体（細胞表面または核の）、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーターポリペプチド、増殖因子、及び上記の任意のものの機能的断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。コード配列は、例えばｃＤＮＡであってよい。
【０１２４】
例えば、外来配列は、遺伝性疾患を有する対象において欠損しているかまたは機能していないポリペプチドをコードする配列を含んでよく、そのような疾患には、以下の任意の遺伝性疾患を含むが、それらに限定されるものではない：軟骨無形成症、色盲、酸性マルターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＯＭＩＭ  Ｎｏ．１０２７００）、副腎脳白質ジストロフィー症、アイカルディ症候群、アルファ１アンチトリプシン欠損症、アルファ−サラセミア、アンドロゲン不感性症候群、アペール症候群、不整脈源性右室異形成、毛細血管拡張性運動失調症、バース症候群、ベータサラセミア、青色ゴム乳首様母斑症候群、カナバン病、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、ネコ鳴き症候群、嚢胞性線維症、ダーカム病、外胚葉異形成症、ファンコニ貧血、進行性骨化性線維異形成症、脆弱Ｘ症候群、ガラクトース血症、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス（例えばＧＭ１）、血色素症、ベータグロビンの６番目のコドンにおけるヘモグロビンＣ変異（ＨｂＣ）、血友病、ハンチントン病、ハーラー症候群、低ホスファターゼ症、クラインフェルター症候群、クラッベ病、ランガー・ギデオン症候群、白血球接着欠乏症（ＬＡＤ、ＯＭＩＭ  Ｎｏ．１１６９２０）、異染性白質ジストロフィー、ＱＴ延長症候群、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、ネイル・パテラ症候群、腎性尿崩症、神経線維腫症、ニーマン・ピック病、骨形成不全症、ポルフィリン症、プラダー・ウィリー症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、サンフィリッポ症候群、重度複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、シュワッハマン症候群、鎌状赤血球症（鎌状赤血球貧血症）、スミス・マゲニス症候群、スティックラー症候群、テイ・サックス病、血小板減少‐橈骨欠損（ＴＡＲ）症候群、トリーチャー・コリンズ症候群、トリソミー、結節性硬化症、ターナー症候群、尿素サイクル異常症、フォンヒッペル・リンダウ病、ワールデンブルグ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウィスコット・アルドリッチ症候群、Ｘ連鎖リンパ増殖症候群、（ＸＬＰ、ＯＭＩＭ  Ｎｏ．３０８２４０）。
【０１２５】
標的化組込みによって治療され得るさらなる例示的な疾患には、後天性免疫不全症、リソソーム蓄積症（例えば、ゴーシェ病、ＧＭ１、ファブリー病及びテイ・サックス病）、ムコ多糖症（例えば、ハンター病、ハーラー病）、ヘモグロビン異常症（例えば、鎌状赤血球症、ＨｂＣ、α−サラセミア、β−サラセミア）及び血友病が挙げられる。
【０１２６】
ある実施形態では、外来配列は、標的化組込みが行われた細胞の選択を可能にする標識遺伝子（上記）、及びさらなる機能性をコードする連結配列を含むことができる。標識遺伝子の非限定的な例には、ＧＦＰ、薬物選択マーカー（複数可）等が挙げられる。
【０１２７】
挿入可能なさらなる遺伝子配列には、例えば、変異配列を置換する野生型遺伝子を含んでよい。例えば、野生型の第ＩＸ因子遺伝子配列を、該遺伝子の内在性コピーが変異している幹細胞のゲノムに挿入してよい。野生型コピーは、内在性遺伝子座に挿入してもよいし、または、別の方法でセーフハーバー座位を標的にさせてもよい。
【０１２８】
本明細書の教示に従った、そのような発現カセットの構築では、分子生物学術分野において周知である方法を利用する（例えば、ＡｕｓｕｂｅｌまたはＭａｎｉａｔｉｓを参照のこと）。トランスジェニック動物を作製する発現カセットを使用する前に、発現カセットを好適な細胞株（例えば、初代細胞、形質転換細胞、または不死化細胞株）に導入することによって、選択した制御因子と会合したストレス誘導物質に対する発現カセットの反応性を試験することができる。
【０１２９】
さらに、発現には必要ではないが、外来配列は、転写調節配列または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム侵入部位、２Ａペプチドをコードする配列及び／またはポリアデニル化シグナルであってもよい。さらに、関心対象遺伝子の制御因子をレポーター遺伝子に機能的に連結してキメラ遺伝子（例えば、レポーター発現カセット）を作製することができる。
【０１３０】
非コード核酸配列の標的化挿入も達成され得る。アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする配列も標的化挿入に使用され得る。
【０１３１】
さらなる実施形態では、ドナー核酸は、さらなるヌクレアーゼ設計の具体的な標的部位である非コード配列を含んでよい。その後、さらなるヌクレアーゼを細胞に発現させて、関心対象の別のドナー分子の挿入によって本来のドナー分子が切断され改変されるようにしてよい。この方法では、ドナー分子の反復組込みが発生し、関心対象の特定の遺伝子座またはセーフハーバー座位における形質スタッキングを可能にし得る。
【０１３２】
送達
本明細書に記載するヌクレアーゼ（表１）、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド及び本明細書に記載するタンパク質及び／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の好適な手段によってインビボまたはエキソビボで任意の細胞型に送達され得る。
【０１３３】
好適な細胞には、真核生物（例えば、動物）及び原核生物の細胞及び／もしくは細胞株が挙げられる。そのような細胞から作製される、そのような細胞または細胞株の非限定的な例には、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、及びｐｅｒＣ６細胞ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）などの昆虫細胞、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの真菌細胞が挙げられる。ある実施形態では、細胞株はＣＨＯ、ＭＤＣＫまたはＨＥＫ２９３の細胞株である。好適な細胞には、あくまでも例示であるが、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞及び間葉系幹細胞などの幹細胞も含まれる。
【０１３４】
本明細書に記載するヌクレアーゼを送達する方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号；第６，５０３，７１７号；第６，５３４，２６１号；第６，５９９，６９２号；第６，６０７，８８２号；第６，６８９，５５８号；第６，８２４，９７８号；第６，９３３，１１３号；第６，９７９，５３９号；第７，０１３，２１９号；及び第７，１６３，８２４号に記載されており、これらすべての開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれるものとする。
【０１３５】
本明細書に記載するヌクレアーゼ及び／またはドナー構築体は、本明細書に記載する、ＺＦＮ（複数可）の１つ以上をコードする配列を含有しているベクターを使用して送達してもよい。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクター等を含むが、これらに限定されない任意のベクター系を使用してよい。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，５３４，２６１号；第６，６０７，８８２号；第６，８２４，９７８号；第６，９３３，１１３号；第６，９７９，５３９号；第７，０１３，２１９号；及び第７，１６３，８２４号も参照のこと。さらに、これらのベクターのいずれも、治療に必要とされる配列の１つ以上を含んでよいことは明らかであろう。したがって、１つ以上のヌクレアーゼ及びドナー構築体を細胞に導入する場合、ヌクレアーゼ及び／またはドナーポリヌクレオチドは、同じベクター上に担持されても、または異なるベクター上（ＤＮＡ  ＭＣ（複数可））に担持されてもよい。複数のベクターを使用する場合、各ベクターは、１つまたは複数のヌクレアーゼ及び／またはドナー構築体をコードする配列を含んでよい。従来のウイルスによる遺伝子導入法及びウイルスを用いない遺伝子導入法を使用して、ヌクレアーゼ及び／またはドナー構築体をコードする核酸を細胞（例えば、哺乳類細胞）及び標的組織に導入することができる。ウイルスを用いないベクターによる送達システムには、ＤＮＡまたはＲＮＡプラスミド、ＤＮＡ  ＭＣ、裸の核酸、及びリポソームもしくはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体を形成した核酸が挙げられる。好適な非ウイルスベクターにはｎａｎｏｔａｘｉｓベクターが含まれ、ＩｎＣｅｌｌＡｒｔ（フランス）から市販されているベクターが挙げられる。ウイルスベクターによる送達システムには、ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが挙げられ、細胞に送達された後はエピソームゲノムまたは組込みゲノムを有する。人工的に操作されたＤＮＡ結合タンパク質及びこれらの結合タンパク質を含む融合タンパク質のインビボ送達の概説については、例えば、Ｒｅｂａｒ（２００４）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ１３（７）：８２９−８３９；Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１２）：１４４４−１４５４ならびに遺伝子送達全般の参考文献、例えばＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ＆Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ１１：２１１−２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ＆Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ１１：１６２−１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ１１：１６７−１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ８：３５−３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ＆Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌ���ｅｔｉｎ５１（１）：３１−４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｄｏｅｒｆｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｈｍ（ｅｄｓ．）（１９９５）；及びＹｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ１：１３−２６（１９９４）を参照のこと。
【０１３６】
ウイルスを用いない核酸の送達方法には、電気穿孔法、リポフェクション法、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸複合体、裸のＤＮＡ、人工ウイルス粒子、及び薬剤で増強させたＤＮＡの取込みが挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用する音響穿孔法も核酸の送達に使用することができる。
【０１３７】
さらなる例示的な核酸送達システムには、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ドイツ、ケルン市）、Ｍａｘｃｙｔｅ、Ｉｎｃ．（メリーランド州ロックビル）、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（マサチューセッツ州ホリストン）及びＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．（例えばＵＳ６００８３３６を参照のこと）から提供されているものが挙げられる。リポフェクション法は例えば、米国特許第５，０４９，３８６号；第４，９４６，７８７号；及び第４，８９７，３５５号）に記載されており、リポフェクション試薬が販売されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクション法に好適なカチオン性脂質及び中性脂質には、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４のものが挙げられる。
【０１３８】
免疫脂質（ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｉｄ）複合体のような標的化リポソームなどの脂質：核酸複合体の調製は当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：４０４−４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ２：７１０−７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号、第４，２１７，３４４号、第４，２３５，８７１号、第４，２６１，９７５号、第４，４８５，０５４号、第４，５０１，７２８号、第４，７７４，０８５号、第４，８３７，０２８号、及び第４，９４６，７８７号を参照のこと）。
【０１３９】
さらなる送達方法には、送達すべき核酸のＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）内パッケージングを使用することが含まれる。これらのＥＤＶは、抗体の１本の腕は標的組織に対する特異性を有し、もう１本の腕はＥＤＶに対する特異性を有する二重特異性抗体を使用して標的組織に特異的に送達される。抗体はＥＤＶを標的細胞表面まで運び、その後、ＥＤＶがエンドサイトーシスによって細胞内へ運ばれる。一旦細胞内に入った後、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２７（７）：６４３を参照のこと）。
【０１４０】
人工的に操作されたＺＦＰ、ＴＡＬＥ及び／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをコードする核酸を送達するための、ウイルスを用いたＲＮＡまたはＤＮＡ系の使用では、ウイルスに体内の特定の細胞を標的とさせ、ウイルスのペイロードを細胞核に輸送させる高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、直接患者に投与することも（インビボ）、またはウイスルベクターを使用して細胞をインビトロで処理し、その改変細胞を患者に投与することもできる（エキソビボ）。ＺＦＰ送達にウイルスを用いる従来の系には、遺伝子導入用のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニア及び単純ヘルペスウイルスの各ベクターが挙げられるが、これに限定されるものではない。宿主ゲノムへの組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルスによる遺伝子導入法で可能であり、挿入された導入遺伝子の長期発現がもたらされることが多い。さらに、高い形質導入効率が多くの異なる細胞型及び標的組織において観察されている。
【０１４１】
外来エンベロープタンパク質の組込みによってレトロウイルスの親和性を改変し、標的細胞となり得る標的集団を拡大させることができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入するかまたは感染させ、典型的には高いウイルス力価を与えるレトロウイルスベクターである。レトロウイルスによる遺伝子導入系の選択は、標的組織に応じて決まる。レトロウイルスベクターは、シス作用性の長い末端反復配列で構成され、最高６〜１０ｋｂの外来配列パッケージング能力を有する。最小シス作用性ＬＴＲは、ベクターの複製及びパッケージングに十分であり、その後、これらを使用して、標的細胞に治療用遺伝子を組み込み、導入遺伝子の永久的発現を得る。広く使用されるレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びその組み合わせに基づいたものが含まれる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００）を参照のこと。
【０１４２】
一過性発現が好ましい適用では、アデノウイルスを用いた系を使用できる。アデノウイルスを用いたベクターは、多くの細胞型で非常に高い効率で形質導入することができ、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターでは、高力価及び高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純なシステムで大量に作製可能である。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターも、例えば、核酸及びペプチドのインビトロでの作製、ならびにインビボ及びエキソビボでの遺伝子治療手技用に、標的核酸を用いて形質導入するために使用される（例えば、Ｗｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１６０：３８−４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号；第ＷＯ９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ５：７９３−８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照のこと。組換え型ＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ８１：６４６６−６４７０（１９８４）；及びＳａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）など多数の刊行物に記載されている。
【０１４３】
現在、ウイルスベクターによる少なくとも６種の方法が臨床試験における遺伝子導入に利用可能であり、それらは、形質導入因子を生成するようヘルパー細胞株に挿入された遺伝子による欠陥ベクターの補完を行う方法を利用する。
【０１４４】
ｐＬＡＳＮ及びＭＦＧ−Ｓは、臨床試験で使用されているレトロウイルスベクター例である（Ｄｕｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ８５：３０４８−３０５（１９９５）；Ｋｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７−１０２（１９９５）；Ｍａｌｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ９４：２２  １２１３３−１２１３８（１９９７））。遺伝子治療試験で最初に使用された治療用ベクターはＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮであった。（Ｂｌａｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：４７５−４８０（１９９５））。ＭＦＧ−Ｓをパッケージングしたベクターで５０％以上の形質導入効率が観察されている。（Ｅｌｌｅｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０（１９９７）；Ｄｒａｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：１１１−２（１９９７）。
【０１４５】
組換え型アデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠陥を有する非病原性のパルボウイルスである２型アデノ随伴ウイルスを用いる、有望な代替的遺伝子送達システムである。すべてのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接する、ＡＡＶの逆向きの１４５ｂｐ末端反復のみを保持するプラスミドに由来している。形質導入された細胞のゲノムに組込むことによる効率的な遺伝子導入及び安定な導入遺伝子送達は、このベクターシステムの主要な特徴である。（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ３５１：９１１７  １７０２−３（１９９８），Ｋｅａｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７４８−５５（１９９６））。ＡＡＶの他の血清型であるＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９及びＡＡＶｒｈ．１０及び任意の新規なＡＡＶ血清型も、本発明に従って使用可能である。
【０１４６】
複製欠損組換え型アデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で作製され、多数の異なる細胞型を容易に感染させることができる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、人工的に操作されるように、導入遺伝子がＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、及び／またはＥ３遺伝子を置き換え；その後、複製欠陥ベクターを、欠失しているトランス性の遺伝子機能を供給するヒト２９３細胞で増殖させる。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓及び筋肉に見られる非分裂の分化細胞など、複数種の組織の形質導入がインビボで可能である。従来のＡｄベクターは担持能が大きい。臨床試験においてＡｄベクターを使用した一例では、筋肉注射による抗腫瘍免疫化のポリヌクレオチド治療を行った（Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。臨床試験で遺伝子導入にアデノウイルスベクターを使用したさらなる例には、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ２４：１  ５−１０（１９９６）；Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７  １０８３−１０８９（１９９８）；Ｗｅｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２０５−１８（１９９５）；Ａｌｖａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５９７−６１３（１９９７）；Ｔｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３（１９９８）；Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−１０８９（１９９８）が挙げられる。
【０１４７】
パッケージング細胞を使用して、宿主細胞を感染させることができるウイルス粒子を形成する。そのような細胞には、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、及びレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは、通常、ウイルス粒子に核酸ベクターをパッケージングする産生細胞株によって作製される。ベクターは、典型的に、パッケージング及びその後の宿主への組込みに必要なウイルスの最小配列を含有し（適用可能な場合）、他のウイルス配列は発現させるべきタンパク質をコードする発現カセットにより置換される。欠損しているウイルスの機能は、パッケージング細胞株によりトランス性で供給される。例えば、遺伝子治療に使用されるＡＡＶベクターは典型的に、宿主ゲノムへのパッケージング及び組込みに必要なＡＡＶゲノム由来の末端逆位反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐ及びｃａｐをコードするがＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞株にパッケージングされる。また、細胞株は、ヘルパーとしてのアデノウイルスで感染させられる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製及びヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列欠失のため大量にはパッケージングされない。例えば、ＡＡＶよりもアデノウイルスの方が感受性が高い熱処理によってアデノウイルスによる汚染を減らすことができる。
【０１４８】
多くの遺伝子治療の適用では、遺伝子治療ベクターが特定の組織種に高度に特異的に送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターを改変して、ウイルスの外面に、ウイルス外被タンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させて、所与の細胞型に対する特異性を有するようにすることができる。リガンドは、関心対象の細胞型に存在することが知られている受容体に対して親和性を有するよう選択される。例えば、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：９７４７−９７５１（１９９５）には、モロニーマウス白血病ウイルスを改変して、ｇｐ７０と融合させたヒトのヘレグリンを発現させることができ、その組換え型ウイルスが、ヒト上皮成長因子受容体を発現している特定のヒト乳癌細胞を感染させることが報告されている。この原理は、他のウイルス−標的細胞対まで拡大させることができ、その場合、標的細胞は受容体を発現し、ウイルスは、細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する。例えば、繊維状ファージを人工的に操作して、選択されるほとんどすべての細胞受容体に対して特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示させることができる。上記は主にウイルスベクターに適用されるが、同原則はウイルス以外のベクターにも適用できる。そのようなベクターを人工的に操作して、特定の標的細胞による取り込みを促進する特定の取込み配列を含有させることができる。
【０１４９】
遺伝子治療ベクターは、以下に記載のように、個々の患者への投与、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入）または局所投与によってインビボで送達することができる。別法として、ベクターを、個々の患者から外植した細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺、組織生検）または万能ドナー造血幹細胞などの細胞にエキソビボで送達し、その後、通常は、ベクターが組み込まれた細胞について選別を行ってから、当該細胞を患者に再移植することができる。
【０１５０】
また、ヌクレアーゼ及び／またはドナー構築体を含有しているベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）も、インビボで細胞の形質導入を行う生物に直接投与可能である。別法として、裸のＤＮＡを投与することができる。投与は、血液または組織細胞との最終的接触に分子を導入するために通常使用される経路のいずれによっても行われ、それらとして、注射、注入、局所投与及び電気穿孔法を含むが、これに限定されるものではない。そのような核酸を投与する好適な方法は利用可能であり、また当業者に周知であるが、特定の組成物の投与に１つ以上の経路を使用でき、特定の経路によって、別の経路よりも速やかで有効な反応が得られ得ることが多い。
【０１５１】
本明細書に記載するポリヌクレオチド（例えば、ヌクレアーゼをコードし、かつ／または二本鎖のドナー）の導入に好適なベクターには、非組込み型レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）が含まれる。例えば、Ｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１１３８２−１１３８８；Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１；Ｚｕｆｆｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０；Ｆｏｌｌｅｎｚｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ２５：２１７−２２２；米国特許公開第２００９／０１１７６１７号を参照のこと。
【０１５２】
薬理学的に許容される担体は、投与する個々の組成物、ならびにその組成物の投与に使用される具体的な方法によってある程度決定される。したがって、実に多種多様な好適な医薬組成物製剤が利用可能であり、以下に記載するとおりである（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，１９８９を参照のこと）。
【０１５３】
ヌクレアーゼをコードする配列及びドナー構築体は、同一または異なる系を使用して送達可能なことは明らかとなるであろう。例えば、ヌクレアーゼ及びドナーは、同一のＤＮＡ  ＭＣによって運搬され得る。別法として、ドナーポリヌクレオチドをＭＣによって、また１つ以上のヌクレアーゼを標準的なプラスミドまたはＡＡＶベクターによって運搬させることができる。さらに、異なるベクターを、同一または異なる経路で投与することができる（筋肉注射、尾静脈注射、他の静脈注射、腹腔内投与及び／または筋肉注射）。ベクターは、同時または任意の順序で送達することができる。
【０１５４】
したがって、本開示には、治療用タンパク質をコードする導入遺伝子の挿入に反応しやすい疾患及び病態のインビボまたはエキソビボでの治療が含まれる。組成物は、ヒト患者に対し、血清中または標的器官もしくは細胞において治療用ポリペプチドの所望濃度を得るのに有効な量で投与される。投与は、所望の標的細胞にポリヌクレオチドが送達される任意の手段によって可能である。例えば、インビボ及びエキソビボのいずれの方法も意図される。門脈への静脈内注射は好ましい投与方法である。他のインビボ投与方法には、例えば、肝臓または胆管の葉内への直接注射及び肝臓に対して遠位の静脈内注射、例えば、総肝動脈を介した注射、肝実質への直接注射、総肝動脈を介した注射、及び／または胆樹を通す逆行性注入が挙げられる。エキソビボでの投与方法には、切除した肝細胞または肝臓の他の細胞をインビトロで形質導入し、その後、形質導入され、切除した肝細胞を、ヒト患者の門脈管構造、肝実質または胆樹内へ注入して戻す方法が挙げられ、例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６：３３５−３４１を参照のこと。
【０１５５】
投与されるべきヌクレアーゼ（複数可）及びドナーの有効量は、その患者ごとに、関心対象の治療用ポリペプチドによって異なる。したがって、有効量は、組成物を投与する医師により最良に決定され、適切な用量は、当技術分野の当業者により容易に決定され得る。組込み及び発現に十分な時間をかけた後（例えば、典型的に４〜１５日）、治療用ポリペプチドの血清中または他の組織でのレベルの分析、投与前の初期レベルとの比較によって、投与量が低すぎる、適正範囲内である、または高すぎるということが決定される。初回投与及び後続投与についての好適な計画もさまざまであるが、計画は、初回投与を行い、その後必要に応じて後続投与することが典型的である。後続投与は、連日から１年に１回、数年おきに至るまで、さまざまな間隔で投与してよい。当技術分野の当業者には、送達ベクターが免疫抑制を受けることにより形質導入が阻害または遮断されることを回避するため、適切な免疫抑制法が推奨され得、例えば、Ｖｉｌｑｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，６：１３９１−１４０１を参照されたい。
【０１５６】
エキソビボ投与及びインビボ投与のための製剤には、液体懸濁液または乳化液が挙げられる。有効成分はしばしば、薬理学的に許容され、有効成分と適合性のある添加物と混合される。好適な添加物には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びその組み合わせが含まれる。さらに、組成物は、少量の助剤、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤または医薬組成物の有効性を高める他の試薬を含有してよい。
【０１５７】
細胞
本明細書には、本明細書に記載するヌクレアーゼ（表１）によって内在性ＢＣＬ１１Ａエンハンサー配列が改変される細胞及び／または細胞株も記載される。改変は、例えば、細胞の野生型配列と比較した場合のものであってよい。細胞または細胞株は、改変には、ヘテロ接合体またはホモ接合体であってよい。ＢＣＬ１１Ａ配列に対する改変は、挿入、欠失及び／またはその組み合わせを含んでよい。
【０１５８】
改変は、好ましくは、ヌクレアーゼ（複数可）が結合及び／または切断する部位（複数可）またはその近傍、例えば、切断部位（複数可）の上流または下流の１〜３００（すなわち、その範囲のあらゆる値）塩基対内、より好ましくは、結合及び／または切断の部位（複数可）の片側から１〜１００塩基対内（すなわち、その範囲のあらゆる値）、よりさらに好ましくは、結合及び／または切断の部位（複数可）の両側の１〜５０塩基対内（すなわち、その範囲のあらゆる値）である。ある実施形態では、改変は、ＢＣＬ１１Ａエンハンサーの「＋５８」領域またはその近傍、例えば、表１の第１列のいずれかに示されるヌクレアーゼ結合部位またはその近傍である。
【０１５９】
例えば幹細胞、例えば胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞及び間葉系幹細胞など、どの細胞または細胞株でも改変してよい。本明細書に記載する細胞の他の非限定的例には、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋など）、樹状細胞、Ｂ細胞が挙げられる。部分的または完全な分化細胞など、幹細胞の子の細胞もまた提供される（例えば、ＲＢＣまたはＲＢＣ前駆細胞）。改変ＢＣＬ１１Ａ配列が含まれる他の細胞株の非限定的な例には、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、及びｐｅｒＣ６細胞、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）などの昆虫細胞、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの真菌細胞が挙げられる。
【０１６０】
本明細書に記載する細胞は、障害を、例えば、エキソビボでの治療によって、治療及び／または予防するのに有用である。ヌクレアーゼの改変を受けた細胞は、増殖させて、その後、標準的技術を使用して患者に再導入することができる。例えば、Ｔｅｂａｓ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ３７０（１０）：９０１を参照のこと。幹細胞の場合、対象への注入後、これらの前駆細胞から機能性導入遺伝子を発現する細胞へのインビボでの分化が起こる。本明細書に記載する細胞を含む医薬組成物もまた提供される。さらに、患者への投与に先立ち、細胞を凍結保存してよい。
【０１６１】
本明細書に開示する改変された細胞または細胞株のいずれもガンマグロビンの発現増加を示し得る。本明細書に記載する遺伝子改変細胞を含む医薬組成物などの組成物もまた提供される
【０１６２】
適用
本明細書に開示する方法及び組成物は、タンパク質の発現を改変すること、または鎌状赤血球症またはサラセミアなどの遺伝性疾患で発現されるタンパク質をコードする異常な遺伝子配列を修正することを目的とする。したがって、方法及び組成物により、そのような遺伝性疾患の治療及び／または予防が提供される。ゲノム編集（例えば、幹細胞）を使用して、異常遺伝子の修正、野生型遺伝子の挿入、または内在性遺伝子の発現の変更が可能である。非限定的な例として、野生型遺伝子、例えば、少なくとも１つのグロビン（例えば、α及び／またはβグロビン）をコードする遺伝子を細胞に挿入して（例えば、本明細書に記載する１つ以上のヌクレアーゼを使用して内在性ＢＣＬ１１ａエンハンサー配列に挿入）、細胞で欠損及び／または欠落しているグロビンタンパク質を提供し、これによりグロビン発現不良が原因の遺伝性疾患、例えば、異常ヘモグロビン症を治療する。あるいは、またはさらに、適切なドナー投与の有無にかかわらず、ゲノム編集により、不良な内在性遺伝子の修正、例えば、α−ヘモグロビンまたはβ−ヘモグロビンにおける点変異の修正を行って遺伝子の発現を修復すること、及び／または遺伝性疾患、例えば、鎌状赤血球症を治療すること、及び／または任意の直接もしくは間接的なグロビン調節遺伝子のノックアウトもしくは改変（過剰発現または抑制）（例えば、γグロビン調節遺伝子ＢＣＬ１１ＡまたはＢＣＬ１１Ａ調節因子ＫＬＦ１の不活性化）を行うことができる。具体的には、本発明の方法及び組成物は、ヘモグロビン異常症の治療または予防に使用される。
【０１６３】
本発明のヌクレアーゼは、ＢＣＬ１１Ａの発現に必要なことが知られているＢＣＬ１１Ａエンハンサー領域を標的とし、したがって、ガンマグロビン発現が下方制御される。このエンハンサー領域の改変により、赤血球におけるガンマグロビン発現の増加がもたらされ得るため、鎌状赤血球症またはベータサラセミアの治療または予防に有用となり得る。
【０１６４】
以下の実施例は、ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む、本開示の例示的な実施形態に関する。これは、あくまでも例示を目的とし、また、他のヌクレアーゼ、例えば、ＴｔＡｇｏ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、人工的に操作されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）、ならびに／または天然に生じるかもしくは人工的に操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）のＤＮＡ結合ドメインと、異種の切断ドメインとの融合体、ならびに／またはメガヌクレアーゼとＴＡＬＥタンパク質との融合体を使用できることは認識されよう。
【実施例】
【０１６５】
実施例１：ジンクフィンガーヌクレアーゼの構築
ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に対してＺＦＮを構築し、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：７７８−７８５に記載のようにＣＥＬ１アッセイで試験した。エンハンサー領域の＋５８領域に対して特異的なＺＦＮを記載のように作製した。ヌクレアーゼを下記表１に示す：
表１：ＢＣＬ１１Ａエンハンサー領域の＋５８に特異的なＺＦＮ対
【表１−１】
2018516556.tif 000003
【表１−２】
2018516556.tif 000004
【表１−３】
2018516556.tif 000005
【表１−４】
2018516556.tif 000006
【表１−５】
2018516556.tif 000007
【表１−６】
2018516556.tif 000008
【表１−７】
2018516556.tif 000009
＊５１４４６と５１４６３はリンカー配列が異なる
【０１６６】
全ＺＦＮを機能性（切断活性）について試験したところ、活性であることがわかった。
【０１６７】
実施例２：ヒトＫ５６２細胞におけるＺＦＮの活性
簡単に言うと、ヒトＫ５６２細胞を、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩで培養し、２００，０００細胞を、左及び右のＺＦＮパートナーをコードするそれぞれのプラスミドＤＮＡを最適下限濃度の２５ｎｇ用いてＡｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）により製造者の指示書にしたがいトランスフェクションした（表２ａ）。さらに、左のＺＦＮ２５ｎｇ及び右のＺＦＮ５ｎｇを用いて実験を実施した（表２ｂ）。Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：８０８−８１６及びＧｕｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．６４９：２４７−５６）に記載のＣｅｌ−Ｉアッセイ（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用してトランスフェクション後２日目または３日目のＺＦＮ誘導性の標的遺伝子改変を検出した。このアッセイでは、標的部位のＰＣＲ増幅の後、配列決定によって挿入及び／または欠失（「インデル」）の定量を行った。Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム（「ｍｉＳＥＱ」）によるディープシークエンシングを製造者の指示書にしたがって使用し、編集効率ならびに編集で作製されたアレルの性質を測定した。結果は下記表２に示され、数字は観察されたパーセントＮＨＥＪ活性を指す：
表２ａ：Ｋ５６２細胞におけるマトリックスのスクリーニング（各ＺＦＮ２５ｎｇ）
【表２−ａ】
2018516556.tif 000010
表２ｂ：Ｋ５６２細胞におけるマトリックスのスクリーニング（左のＺＦＮ２５ｎｇ、右のＺＦＮ５ｎｇ）
【表２−ｂ】
2018516556.tif 000011
【０１６８】
ＤＮＡ結合領域とヌクレアーゼドメイン間に４つの異なるリンカーを使用してＺＦＮも構築した（米国特許公開第２０１５００６４７８９号を参照のこと）。被験リンカー配列は下記に示され、配列の「ＨＴＫＩＨ」部分はＤＮＡ結合領域のカルボキシ末端であり、「ＥＬＥＥＫ」部分はヌクレアーゼドメインのアミノ末端である。下線部分は２つのドメイン間のリンカー配列である。
【０１６９】
リンカー配列
【化１】
2018516556.tif 000012
【０１７０】
これらの実験では、左側パートナー上のＬ７ｃ５またはＬ７ａリンカーと組み合わせて右側パートナー上のＬ０またはＬ８ｃ４リンカーを試験した。ＺＦＮの組み合わせを、Ｋ５６２細胞における切断活性について試験し、その結果（パーセントＮＨＥＪ活性）を下記表３に示す。
表３：各種ドメインリンカーとＺＦＮ活性
【表３−１】
2018516556.tif 000013
【表３−２】
2018516556.tif 000014
【０１７１】
実施例３：ＣＤ３４＋細胞におけるＺＦＮの活性
本明細書に記載するＺＦＮもまたヒトＣＤ３４＋細胞で試験した。ＣＤ３４＋形質導入では、ＢＴＸ  ＥＣＭ８３０装置で２ｍｍギャップのキュベットを使用した。組織培養未処理プレート内で、１ｘＣＣ１１０（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含むｘ−ｖｉｖｏ１０培地（Ｌｏｎｚａ）でヒトＣＤ３４＋細胞を増殖させた。細胞を計数し、室温で１０分間１２００ｒｐｍで遠心分離を行って採取した。細胞を室温のＰＢＳで１〜２回洗浄した。各トランスフェクションにつき２００，０００細胞を使用し、それらを１００μＬのＢＴｅｘｐｒｅｓｓ溶液に再懸濁させた。ＣＤ３４＋の実験では、ＤＮＡではなく、ＺＦＮをコードするＲＮＡを使用した。ｍＭｅｓｓａｇｅＭａｃｈｉｎｅ  Ｔ７  Ｕｌｔｒａ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してＲＮＡを作製した。トランスフェクションあたり、各ＺＦＮをコードするＲＮＡを５００ｎｇ加え、混合物をキュベットに移した。移した直後、混合物に２５０Ｖで５ミリ秒の電気穿孔を行った。予め温めた培地をキュベットに加え、培地と細胞を合わせて４８ウェル組織培養未処理プレートに移し、その後３７℃でインキュベートした。
【０１７２】
２日または３日後、続いてＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑを使用して細胞をゲノム分析に供した。編集したアレルのパーセントを定量化するため、標準的Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定アダプター配列を付加するプライマーを使用して、関心対象のゲノム領域をＰＣＲ増幅にかけた。第２の群の１３回のＰＣＲを実施して両末端にバーコード配列及びブリッジアダプター配列を付加した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑでアンプリコン配列決定用の製造者のプロトコルにしたがって配列決定を実施した。ＭｉＳｅｑでペアエンドによる読取りを生成し、それらを標準的なアラインメントソフトウェアを使用してマージしアダプターのトリミングを行う。その後、カスタムスクリプトを使用してバーコード配列対によって試料ごとに読み取りを分離（ｄｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）した。次いで、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを実装して、アンプリコン配列をリファレンス配列へグローバルアラインメントした（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）．Ｊｏｕｒ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏ４８（３）：４４３−５３）。アラインメントのギャップまたは挿入を％ＮＨＥＪ事象として計数し、未処理対照試料の配列と比較して配列特異的な背景発生率を決定した。結果を下記表４に示す。
表４：ＣＤ３４＋細胞におけるＺＦＮ活性
【表４】
2018516556.tif 000015
【０１７３】
代表的な対から選択したセット（各ＺＦＮにつき１μｇ）でｍＲＮＡインプットを増量して使用すると、表５に示すようにさらなる量の切開が観察された。
表５Ａ及び５Ｂ：高濃度ＺＦＮでもたらされる高活性
表５Ａ
【表５−Ａ１】
2018516556.tif 000016
【表５−Ａ２】
2018516556.tif 000017
表５Ｂ
【表５Ｂ】
2018516556.tif 000018
【０１７４】
上記のトランスフェクションは、ほとんどは、ＺＦＮの各種組み合わせの活性を比較できるようにｍＲＮＡインプットが不飽和の条件下で実施された。ｍＲＮＡの飽和インプットまたはその近傍の量で得られる改変の最大量を検討するため、我々は、ＢＴＸ電気穿孔を使用して、２ａ構築体または２つのＺＦＮを組み合わせて１つのｍＲＮＡにしたものを増量させてＣＤ３４＋細胞にトランスフェクションした。結果を下記表６に示す。
表６：ｍＲＮＡインプット増量に伴うＢｃｌ１１ａエンハンサーの改変
【表６】
2018516556.tif 000019
【０１７５】
表６のデータは、試験した全組み合わせについて、ｍＲＮＡインプット増量に伴いＺＦＮ標的領域が非常に多く改変されることを示している。
【０１７６】
異なるリンカーを含むＺＦＮを用いた場合の活性を分析する実験２で行った実験と同様に、リンカーが活性に与える効果もＣＤ３４＋細胞で試験した。上記のように、これらの実験でＺＦＮを送達するためにｍＲＮＡ量をさまざまに変えて（それぞれにつき５００ｎｇ、１０００ｎｇまたは２０００ｎｇ）使用した。
表７は、リンカー同一性がＺＦＮ対の活性に与える効果を示す。
表７：ＣＤ３４＋細胞を用いたリンカー同一性がＺＦＮ活性に与える効果
【表７】
2018516556.tif 000020
【０１７７】
実施例４：編集されたＣＤ３４＋細胞の分化とヘモグロビン発現
相対的ガンマグロビン発現に対する効果を検討するため、ＺＦＮ対の代表的試料をコードするｍＲＮＡを、ＢＴＸ  ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎで製造者の指示書にしたがいＣＤ３４＋細胞（健常ドナーボランティアから入手）に導入した。その後、細胞を赤血球に分化させた。簡単に言うと、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＣＤ３４＋マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を製造者の指示にしたがって使用しＣＤ３４＋細胞を精製した。増殖因子の存在下で、ＢＩＴ９５０００（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＩｓｃｏｖｅ’ｓ  ＭＤＭでＣＤ３４＋細胞を培養した。３ステップ液体培養モデルを使用して細胞を赤血球系列へ分化させた。最初の６日間（第１段階）は、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ３−Ｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）、及びＩＬ−３（２０ｎｇ／ｍｌ）を用いてＣＤ３４＋細胞を増殖させた。次いで、増殖した細胞は、Ｅｐｏ（２Ｕ／ｍｌ）及びＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を用いて、系列決定させ赤血球系列へ向けて分化させた（第２段階）。Ｇｉａｒｒａｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｂｌｏｏｄ１１８（１９）：５０７１−９を参照のこと。
【０１７８】
相対的ガンマグロビン発現を分析するため、ＺＦＮで処理した後の、ガンマグロビン、アルファグロビン及びベータグロビンをコードする各ｍＲＮＡの比を、分化開始後１４日目にＲＴ−ＰＣＲ解析によって測定した。製造者（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から提供されたプロトコルで遺伝子特異的アッセイを使用して、標準のＴａｑｍａｎ（登録商標）解析によって解析を行った。ガンマグロビン（ＨＢＧ）の相対的レベルを、アルファグロビン（ＨＢＡ）またはベータグロビン（ＨＢＢ）の発現レベルで正規化し、その比を、対照細胞のガンマ／アルファ比またはガンマ／ベータ比と比較した。
【０１７９】
データは下記表８に記載され、プラスミドをコードするＧＦＰで処理した細胞に比べ、ＺＦＮで処理した細胞でのガンマグロビン発現の増加が見られたことを示している。
表８：編集されたＣＤ３４＋細胞でのアルファグロビンまたはベータグロビンに対するガンマグロビン発現の変化
【表８】
2018516556.tif 000021
【０１８０】
上記のように飽和ｍＲＮＡ濃度またはその近傍の濃度でトランスフェクションされたＣＤ３４＋細胞をインビトロで赤血球に分化させた後のグロビン発現ＲＴ−ＰＣＲ解析では、ＧＦＰのｍＲＮＡをトランスフェクションした対照試料と比較して、Ｂｃｌ１１ａエンハンサーを標的とする選択ＺＦＮ対すべてによる非常に効率的なガンマグロビン活性化が示されている（図１）。データを下記表９に記載する。
表９：高比率のヒトガンマグロビン発現
【表９】
2018516556.tif 000022
【０１８１】
実施例５：ＢＴＸ電気穿孔装置を使用した別個ｍＲＮＡ及び単一ｍＲＮＡでのＣＤ３４＋細胞におけるＺＦＮ活性
ヒト末梢血から単離された、動員されたヒトＣＤ３４＋細胞及び骨髄から単離されたＣＤ３４＋細胞で２対のＺＦＮの活性を試験した。簡単に言うと、ＣＤ３４＋細胞を以下のとおり健常ドナーから単離した。白血球除去による採取物は、低速遠心分離及び上清除去を行って血小板を除去した。血小板除去後、抗ＣＤ３４磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、ドイツ）で細胞を標識化し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｌｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して陽性選択を行った。選択後、陽性画分（濃縮ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ）を洗浄し、培地（すなわち、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３−リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）１００ｎｇ／ｍｌずつ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及びトロンボポチエン（ＴＰＯ）を添加したＸ−ＶＩＶＯ１０培地）に１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させ、ＶｕｅＬｉｆｅ培養バッグ（Ｓａｉｎｔ−Ｇｏｂａｉｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）に移し３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。骨髄由来ＣＤ３４＋細胞の精製では、ヒドロキシエチルデンプン沈降法で採取物から赤血球（ＲＢＣ）を除去した。ＲＢＣ除去後、抗ＣＤ３４磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、ドイツ）で細胞を標識化し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙを使用して陽性選択を行った。選択後、陽性画分（濃縮ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ）を洗浄し、培地（すなわち、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３−リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）１００ｎｇ／ｍｌずつ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及びトロンボポチエン（ＴＰＯ）を添加したＸ−ＶＩＶＯ１０培地）に１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させ、ＶｕｅＬｉｆｅ培養バッグ（Ｓａｉｎｔ−Ｇｏｂａｉｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）に移し３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０１８２】
使用した対は５１４４６／５１５３６（対Ａ）及びＳＢＳ５１８５７／５１９４９（対Ｂ）であった。細胞に導入されたｍＲＮＡとしてＺＦＮを試験した。トランスフェクションには、ＢＴＸ装置を使用した。簡単に言うと、試料あたり２００，０００細胞をＢＴＸｐｒｅｓｓ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ溶液（ＢＴＸ）に懸濁させ、ＲＮＡと混合した。その後、混合物に２５０ボルトで４ミリ秒間パルスをかけ、コールドショック条件（３０℃で一晩）に供してから、細胞を３７℃で回収した。トランスフェクション後２日または３日目にＺＦＮ活性の分析を行った。２つのＺＦＮコード配列間に２ａ自己切断ペプチド配列を使用した単一ｍＲＮＡ種としてＺＦＮを試験した。そのデータは図２に記載されている。さらに、同一条件を使用して１対のＺＦＮを試験し、その場合、ｍＲＮＡは２つの別々の種として提供され、各ｍＲＮＡが単一ＺＦＮをコードした。下記表１０ａ及び表１０ｂは、単一ｍＲＮＡの場合と、２つのｍＲＮＡの場合の活性結果（％ＮＨＥＪまたはインデル）を示す（記載データはいくつかの実験から得たものである）。
表１０ａ：単一ｍＲＮＡ種と２つのｍＲＮＡ種の比較（％インデル）
【表１０−ａ】
2018516556.tif 000023
表１０ｂ：単一ｍＲＮＡ種と２つのｍＲＮＡ種の比較（％インデル）
【表１０−ｂ】
2018516556.tif 000024
【０１８３】
また、ＴａｑＭａｎ（登録商標）を標準プロトコルにしたがって使用し、ヒトガンマグロビン及びヒトベータグロビンの発現も試験した。その後、結果を、ＨＢＢ（ベータ）に対するＨＢＧ（ガンマ）の比として正規化した。これは図３に示され、ここでも２対のＺＦＮ、すなわち、５１４４６／５１５３６（対Ａ）とＳＢＳ５１８５７／５１９４９（対Ｂ）を比較している。さらに、単一ｍＲＮＡとしてのＺＦＮ対の提供を比較してＨＢＧ及びＨＢＢの発現も測定し、その場合、その対の各ＺＦＮをコードする配列を２ａ自己切断ペプチド配列により分離させ、各ＺＦＮをコードするｍＲＮＡを別々に供給するという条件で行った。データから、これらの条件下では、ＳＢＳ５１８５７／５１９４９のＢ対の方がＢＣＬ１１ａ標的の切断及びＨＢＧ発現の増加発生において、より活性であったことが実証された。
【０１８４】
骨髄由来ＣＤ３４＋細胞でＺＦＮ対を試験したところ、ここでも両対ともに活性であることがわかった（図４ａを参照のこと）。ＳＢＳ５１８５７／５１９４９対に対する活性も試験し、ここで、ＺＦＮは上記のように２ａを有する単一ｍＲＮＡ上で、または２つの別々のｍＲＮＡとして供給された（図４ｂ）。ＳＢＳ５１８５７／５１９４９対は、５１４４６／５１５３６対より高い活性を示した。
【０１８５】
実施例７：特異性分析
不偏捕捉分析
捕捉アッセイは、標的細胞にヌクレアーゼと二重鎖ＤＮＡドナーとを共導入することにより、結果として生じたゲノム切断部位の画分に、ＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復経路を介してドナーが「捕捉」されることの観察に基づいている（Ｏｒｌａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ，（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８（１５）ｅ１５２；Ｇａｂｒｉｅｌ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：８１６−２３．）。この捕捉事象は相同性で誘導されるものではないことに留意されたい（事実、二重鎖ＤＮＡドナーは、ヒトゲノムに対するいかなる相同性も含有していない）。さらに、ＺＦＮをコードするｍＲＮＡは、ＤＮＡ切断内に捕捉されることはできず、二重鎖ＤＮＡドナーのみができることにも留意されたい。一旦二重鎖ゲノムがトラップされると、切断事象の永久タグを表す。ゲノムＤＮＡ単離後、ドナーから隣接ゲノム配列内へのプライマー伸長法で捕捉部位を同定し、その後、アダプターライゲーション、ＰＣＲ、及び得られるドナー−ゲノム結合の配列決定を行ってよい。
【０１８６】
簡単に言うと、ドナー送達、ＺＦＮ発現、及びＤＳＢ部位内へのドナー捕捉を最大にするため、Ｋ５６２細胞株で捕捉分析試験を行った。細胞には、ＺＦＮをコードするｍＲＮＡ及びオリゴヌクレオチド二重鎖ドナーを用いて電気穿孔を行った。別個に、ＢＭ及びＰＢに由来するＣＤ３４＋細胞に上記のようにＺＦＮをコードするｍＲＮＡを用いてＭａｘｃｙｔｅ装置を使用して電気穿孔を行った。使用した二重鎖ドナーオリゴヌクレオチドを下記に示す（配列番号３０及び３１）：
【化２】
2018516556.tif 000025
【０１８７】
各鎖の５’末端のＮＮＮＮはランダム一本鎖四量体の突出を指し、下線を引いたＮＮＮＮはランダム二重配列を指し、同一組込み事象間で区別するためのバーコードとして使用した。オリゴとｍＲＮＡの組み合わせそれぞれについて三連試料を調製した。トランスフェクション後７日目及び１４日目にゲノムＤＮＡを単離し（Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ）、１μｇ（３３００００ゲノム／１連）を増幅プロトコル用インプットとして使用した。その後、試料を本質的には記載のとおり処理した（Ｐａｒｕｚｙｎｓｋｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．５：１３７９−１３９５）。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してアンプリコンを精製し、ＰＣＲで増幅させて、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームでのディープシークエンシング用にバーコード及びアダプターを導入した。アンプリコンの各末端のバーコードを検出するため、ＭｉＳｅｑ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でｖ２  ３００サイクルシークエンシングキットをペアエンド１５０ｂｐ読み取り及び８ｂｐデュアルインデックス読み取りで使用し、最終産物の定量、プール及び配列決定を行った。このおかげで、オフターゲット遺伝子座候補１セットが得られ、その後、これらをＢＭまたはＰＢに由来するＣＤ３４細胞で遺伝子型を決定した。対Ａ（ＳＢＳ番号５１４４６／５１５３６）で同定された結果を図１０ａに示し、対Ｂ（ＳＢＳ番号５１８５７／５１９４９）で同定された結果を図１０ｂに示す。データをさらに下記表１１にまとめる。
表１１：骨髄由来ＣＤ３４＋、対Ａ及び対Ｂのオフターゲット分析
【表１１】
2018516556.tif 000026
【０１８８】
ＰＢ由来ＣＤ３４＋細胞で同様の試験を実施し、下記表１２に観察結果をまとめた。
表１２：末梢血由来ＣＤ３４＋、対Ａ及び対Ｂのオフターゲット分析
【表１２】
2018516556.tif 000027
【０１８９】
実施例６：Ｍａｘｃｙｔｅ電気穿孔装置を使用した別個ｍＲＮＡ及び単一ｍＲＮＡでのＣＤ３４＋細胞におけるＺＦＮの活性
次に我々は、Ｍａｘｃｙｔｅ  ＧＴ電気穿孔装置を使用してＣＤ３４＋細胞でＺＦＮ対を用いて、より大規模の実験を行った。上記のように正常ドナー由来の末梢血から単離された、動員されたＣＤ３４＋細胞（ＰＢ）を以下のとおり試験した：細胞（試料あたり３００万）をＲＴ  Ｍａｘｃｙｔｅ  ＥＰ緩衝液に再懸濁させ最終濃度を３０  ｅ６細胞／ｍＬとした。細胞をｍＲＮＡと混合し、製造者指定のプログラムを使用して電気穿孔を行った。細胞を３７℃で２０分間、手短に回復させた後、希釈してコールドショック条件（３０℃で一晩）に供してから細胞を３７℃で回復させた。２〜３日後に活性を分析した。対Ａ及びＢ対の両方を用いて前述のように実験を行い、ここでは、各対を単一ｍＲＮＡ上に導入した（図５Ａ）。ＺＦＮ対Ｂ（ＳＢＳ５１８５７／５１９４９）もまた、単一ｍＲＮＡまたは２つの別個のｍＲＮＡとして上記のように試験した（図５ｂ）。これらの実験では、対Ｂは最も高い活性を示した。
【０１９０】
骨髄由来細胞では、編集の成功には，より多くのｍＲＮＡを必要としたが、高活性が観察された（図６を参照のこと）。細胞を上記のようにＨＢＧ及びＨＢＢの発現について分析し、ＨＢＧ／ＨＢＢ比を第０日のパーセントインデル活性と比較した（図７）。高レベルのＨＢＧ発現と高いインデル活性との間には良好な呼応が見られた。Ｍａｘｃｙｔｅプロトコルを使用してさらなる解析を実施し（図８及び９）、そこでは、各実験でのインデルの頻度は常に同じではなかったが、実施ごとに、相対的活性（例えば、２ａ  ＳＢＳ５１８５７／５１９４９構築体の方が別個ｍＲＮＡよりも高い）が観察されたことがわかった。
【０１９１】
実施例７：マウスにおける編集されたヒトＣＤ３４＋細胞の生着
上記のように、ＣＤ３４＋ヒト細胞を、＋５８エンハンサー特異的ＺＦＮをコードするｍＲＮＡで処理し、その後ＮＳＧマウスに生着させる。ＣＤ３４＋細胞は、健常ヒトボランティアから得る。ある場合には、血液成分分離の前にＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標））またはＧ−ＣＳＦ＋プレリキサフォル（Ｍｏｚｏｂｉｌ（登録商標））を使用して、ＣＤ３４＋動員戦略を実施した。血液成分分離の前に製造者の指示書にしたがってＧ−ＣＳＦを４日間連日投与する。プレリキサフォルを使用した場合は、やはり製造者の指示書にしたがって回収前の最終夜に投与した。標準的方法で血液成分分離を実施する。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＣｌｉｎｉＭＡＣｓシステムを標準的方法かつ製造者の指示書にしたがって使用し、動員されたＰＢＭＣ  ｌｅｕｋｏｐａｋでＣＤ３４＋細胞を濃縮した。
【０１９２】
Ａｍｂｉｏｎ  ｍＭｅｓｓａｇｅ  ｍＭａｃｈｉｎｅ（登録商標）Ｔ７  ｕｌｔｒａキットを製造者の指示のとおり使用して、キャップが付加されポリアデニル化した、ＺＦＮをコードするｍＲＮＡを合成し、その後、Ｍａｘｃｙｔｅ  ＧＴシステムまたは、ＢＴＸ  ＥＣＭ８３０エレクトロポレーターをいずれも製造者の指示書にしたがって使用してＣＤ３４＋細胞の電気穿孔を行った。
【０１９３】
ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウスを使用してＣＤ３４＋移植を行った。移植前日（１６〜２４時間前）、マウスを亜致死線量照射（３００ＲＡＤ）に供する。上記でＺＦＮ処理したＣＤ３４＋細胞を、照射を受けたマウスに尾静脈注射して移植し、ここで、マウス１匹あたり１００万細胞を０．５ｍＬ  ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡに入れて与えた。
【０１９４】
この実験では、４６８０１／４７９２３対をコードするｍＲＮＡを用いてＣＤ３４＋細胞に電気穿孔を行う。２Ａ自己切断ペプチドをコードする配列で区切られた単一オープンリーディングフレームにＺＦＮをコードする遺伝子を共にクローニングする。ＧＦＰを対照として使用した。マウスへの移植後、移植から４週間目、８週間目及び１２週間目に試料を採取し、細胞内のヒト細胞特異的マーキングのレベルを観察する。
【０１９５】
ＺＦＮで編集されたＣＤ３４＋細胞の生着及び分化、ならびに生着レベルは、未編集の対照群と比べると、編集された細胞間では同様であった。
【０１９６】
実施例８：患者由来細胞でのＺＦＮの活性
ＺＦＮの活性をヒト末梢血から単離された、動員されたヒトＣＤ３４＋細胞及び骨髄から単離されたＣＤ３４＋細胞で試験した。５人のβサラセミア対象から得たＨＳＰＣ（Ｐ１１、Ｐ１８、Ｐ０４、Ｐ０８及びＰ１９とする）を動員し、記載のとおり精製した（Ｙａｎｎａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ２０（１）：２３０）。いずれの実験でも、解凍後２日目に、ＢＴＸエレクトロポレーター（マサチューセッツ州ホリストン、電圧＝２５０Ｖ、パルス長＝５ｍｓ）を使用して、１００μＬのＢＴＸ  Ｅｘｐｒｅｓｓ電気穿孔溶液中で２００，０００のＣＤ３４＋細胞に電気穿孔を行った。トランスフェクションでは、４μｇの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするｍＲＮＡ（電気穿孔効率についての対照として、また、電気穿孔自体の非特異的効果及び細胞へのｍＲＮＡ導入の非特異的効果を検査するため）、または４μｇ及び８μｇのＳＢ５１８５７−２ａ−５１９４９  ｍＲＮＡを使用した。
【０１９７】
ＢＴＸエレクトロポレーターを使用した小規模トランスフェクションでは、これらのＳＢ５１８５７／５１９４９  ｍＲＮＡ量は、ＭａｘＣｙｔｅ装置での大規模トランスフェクションで使用した８０〜１２０ｕｇ／ｍｌ濃度と同等の標的遺伝子改変及びγ−グロビン活性化がもたらされた。
【０１９８】
電気穿孔後、３０℃で一過性に一晩培養を実施した。さらに４８時間３７℃にて細胞を培養すると、インビトロでの分化が開始され、一定分量の細胞を回収してＤＮＡ改変の分析を行った。トランスフェクション後、ＣＣ１００サイトカインカクテル（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、カナダ）が添加されたＸ  Ｖｉｖｏ  １０培地（Ｌｏｎｚａ、ウォーカーズビル、ＭＤ）で細胞を培養した。
【０１９９】
電気穿孔後７２時間、インビトロでの分化が開始された時点（したがって、トランスフェクション後ｄ３は分化のｄ０とした）及び赤血球分化の１４日目に、ＭｉＳｅｑディープシークエンシングによりＢＣＬ１１Ａ遺伝子の改変を測定した。結果を表１３に示す。
【０２００】
我々が入手した患者由来ＣＤ３４＋細胞試料は、使用前に２回凍結されており、そのため、これらの一部の試料で、解凍時の生存率及び細胞増殖の低下が示された。解凍後の低生存率は、トランスフェクション後の生存率の大幅な低下及び低い標的遺伝子改変と一致し、特に、トランスフェクションされていない死亡細胞から得たＤＮＡが依然として存在している、初期の時点で観察されている。ＳＢ−ＺＦＮトランスフェクションとは独立したトランスフェクション後の細胞生存率の指標として、表１３は、ＧＦＰ  ｍＲＮＡでトランスフェクションした対照試料中の細胞供給源ごとの細胞生存率を示している。表には、実験１の患者細胞試料Ｐ１８は、生存率がこの実験の他の２試料よりも（７１％及び８０％）はるかに低く（３８％）、また約７０％のアレルが改変された他と同様の改変レベルには及ばなかったことが示されている。同様に、第３日の第２実験では、患者細胞試料Ｐ０８は、健常細胞を人工的及び自然に増殖させた後でも、非常に不良な生存率（２２％）及び非常に低い初期改変レベル及び最適下限の改変レベルを示した。
表１３：ＭｉＳｅｑによるＢＣＬ１１Ａ遺伝子改変分析
【表１３】
2018516556.tif 000028
ＮＤ＝データなし、ＷＴ＝野生型
【０２０１】
これらのデータは、健常ドナー及びβサラセミアを有するサラセミア患者に由来する、Ｇ  ＣＳＦ動員され、精製されたＨＳＰＣへＳＢ  ＺＦＮ  ｍＲＮＡを電気穿孔した後、大半の試料において、臨床試料に予想される範囲内のＢＣＬ１１Ａエンハンサーの破壊が生じたことを示す。試料の一部の低生存率の結果、Ｐ１８及びＰ０８でのエンハンサーの破壊は健常ドナーボランティア由来の細胞よりも低かったため、これら２つの低生存率試料は下記解析から外した。重要なことには、確固たる細胞生存率を示した対象由来試料（例えば、試料Ｐ１１及びＰ０４）は、野生型細胞で見られた遺伝子改変レベルと同等の遺伝子改変レベルも示した。
【０２０２】
βサラセミアを有する対象由来のＣＤ３４＋ＨＳＰＣの赤血球後代から単離されたαグロビンｍＲＮＡ及びγグロビンｍＲＮＡのレベルは、ＳＢ  ＺＦＮ  ｍＲＮＡで処理後にＲＴ  ｑＰＣＲで解析したところ、胎児（γ）グロビンレベルの増加を示した（図１１）。胎児γグロビンｍＲＮＡレベルは、サラセミア細胞ではβグロビンｍＲＮＡの発現が低いかまたはまったくなかったため、αグロビンｍＲＮＡに対して正規化して示されている。
【０２０３】
ＳＢ  ＺＦＮ  ｍＲＮＡで処理した、βサラセミアを有する対象由来のＣＤ３４＋ＨＳＰＣの赤血球後代は、胎児（γ）グロビンｍＲＮＡとαグロビンｍＲＮＡとの比において予想通りの増加を見せ、グロビンｍＲＮＡとアルファグロビンｍＲＮＡとの比は、特に、解凍後の生存率が良好で、結果として野生型細胞に匹敵する標的遺伝子改変レベルを示した患者試料において野生型ドナー細胞と同様の比が示された。
【０２０４】
その後、逆相ＨＰＬＣを使用して、ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーの改変によりタンパク質レベルでの胎児ヘモグロビンの上昇が見られるかどうかを測定した。
【０２０５】
２つの実験についてガンマグロビン（Ａガンマ及びＧガンマのピークの和）／アルファグロビンの比は、胎児グロビンタンパク質の明確な上昇を示し、健常ボランティア及びサラセミア患者由来の赤血球（ＲＢＣ）で、ＢＣＬ１１ＡエンハンサーのＳＢ  ＺＦＮ破壊時に観察された。ただし、サラセミア細胞、特にβ０／β０細胞での未処理のガンマ／アルファ比は、通常、野生型の（ｗｔ）細胞の場合をはるかに超える。βサラセミアメジャー患者に由来する細胞における胎児グロビンと成人グロビンとの比の分析は、非改変細胞におけるαグロビンの四量体化及び沈殿によりＨＰＬＣ分析が可能なプールからαグロビンが除去されてしまうという事実により複雑になる。
【０２０６】
したがって、αグロビンが残留βグロビンと四量体化したこと（β＋サラセミア患者の場合）及びαグロビンがγグロビンと四量体化したこと、またはαグロビンがγグロビンと四量体化したこと（β０／β０細胞の場合）しかアッセイで明らかにできない。したがって、γグロビンタンパク質レベルが上昇する場合、生成的に四量体化したαグロビンタンパク質レベルも上昇し得るので、γ／αグロビンタンパク質比はγグロビンタンパク質レベルの上昇を過小評価させる。野生型細胞で調べるために有用な別の比は、γグロビン／β様タンパク質比であった（後者は、２つのγグロビンタンパク質レベルとδグロビンとβグロビンの和である）。ただし、サラセミア患者細胞、特にβ０／β０細胞では、この比は通常９０％超であった、ＺＦＮ未処理細胞でも、またＺＦＮ処理後のγグロビンタンパク質レベルの実質的な上昇があってもこの比は顕著には上昇しなかった。
【０２０７】
実施例９：ＺＦＮ処理した野生型ＣＤ３４＋細胞における改変アレルの分布と胎児グロビンに対する効果の分析。
また我々は、ＳＢ  ＺＦＮで処理したＣＤ３４＋細胞由来赤血球細胞の評価を、２つの主要項目に関して単一細胞レベルで行った：（１）個々の細胞間のＺＦＮ作用を評価することによるＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー領域のアレルの分布、及び（２）個々のアレル（野生型及び遺伝子改変型）の分布が胎児グロビンレベルに与える効果（γ／βグロビンｍＲＮＡ比で評価）。したがって、ＳＢ  ＺＦＮ  ＨＳＰＣに見られる単一ＣＤ３４＋細胞を選別しインビトロで分化させた。得られる単一細胞に由来するヘモグロビン化細胞コロニーを個別に回収した。各コロニーのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーのＳＢ  ＺＦＮ標的領域において配列決定し、遺伝子座が破壊されているかどうかを決定し、破壊されている場合、作製されている遺伝子座の正確なアレル型を決定した。さらに、同一のコロニーからトータルＲＮＡを単離し、これらの個々のクローンにおけるグロビン発現レベルをリアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ  ｑＰＣＲ）で分析した。
【０２０８】
方法
単一細胞試験では、トランスフェクションしたＳＢ  ＺＦＮ  ＨＳＰＣ細胞を３７℃で解凍し、１０ｍＬのＸ  ＶＩＶＯに室温で加え、４５０×ｇにて５分、室温で遠心にかけた。細胞ペレットを、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、及びＳＣＦ（各１００ｎｇ／ｍＬ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＸ  ＶＩＶＯ培地に１×１０６／ｍＬで再懸濁させた。２４ウェル組織培養未処理プレート内で３７℃、５％ＣＯ２にて加湿インキュベーターで一晩培養し、細胞を採取して遠心にかけ、０．５％ウシ血清アルブミンを添加したリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に２×１０６／ｍＬで再懸濁させた。９６ウェルＵ字底ＴＣ未処理プレートに入れたステップ１の赤血球培地（２００μＬ／ウェル）内に２細胞／ウェルで細胞を入れ、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩＩを使用して選別した。ステップ１の赤血球培地は、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ、５％ヒトＡＢ＋血漿、ヒトホロトランスフェリン３３０μｇ／ｍＬ、ヒトインスリン２０μｇ／ｍＬ、ヘパリン２Ｕ／ｍＬ、組換え型ヒトエリスロポエチン３Ｕ／ｍＬ、ＳＣＦ１００ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ３  ５ｎｇ／ｍＬ、及びヒドロコルチゾン１μＭ／ｍＬを添加した、Ｇｌｕｔａｍａｘ含有イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で構成された。ステップ１赤血球培地で３７℃、５％ＣＯ２で７日間培養後、ウェルあたり１５０μＬの培地を除去し、ステップ２赤血球培地１００μＬと交換した。この培地は、ステップ１培地と同様であるが、ＩＬ３及びヒドロコルチゾンを加えなかった。さらに４日培養後、ウェルあたり１００μＬの培地を除去し、ステップ３培地１００μＬと交換した。この培地は、ステップ２培地と同様であるが、ＳＣＦを含んでいなかった。
【０２０９】
分化後１４日目、ウェルあたり１０μＬの細胞懸濁液をディープシークエンシング用に回収した。さらに、ウェルあたり１００μＬの培地を除去し、１００μＬの新鮮なステップ３培地と交換した。残存細胞をさらに３日培養し、その時、ウェルあたり５０μＬの細胞懸濁液を採取して等容量のＮｕｃＲｅｄ（２滴／１ｍＬのＰＢＳ  ０．５％  ＢＳＡ）で染色し、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅで細胞密度及び脱核率について計数した。残存する細胞を遠心にかけ、ＰＢＳで１回洗浄し、２０μＬの高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）グレードの水に溶解させた。細胞残渣を遠心分離（１０，０００×ｇ、１５分、４℃）によって除去した。準備ができるまで溶血血液を７０℃で保存し、逆相超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）に供してグロビン鎖分析を行った。
【０２１０】
ＤＮＡディープシークエンシングにより遺伝子改変効率を評価した。関心対象領域（ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー領域内にＺＦＮ結合部位を含有）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅させ、改変レベルをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑを用いたペアエンドディープシークエンシングで決定する。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ配列決定プラットフォームと適合性のあるライブラリーを作製するため、２セットの融合プライマーを連続ポリメラーゼ連鎖反応で使用してアダプター、バーコード、及びフローセルバインダー（短いＤＮＡ配列）を標的特異的アンプリコンに結合させた。以下のプライマーをＭｉＳｅｑ  Ａｄａｐｔｏｒ  ＰＣＲに使用する（下線部分は、ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー特異的配列である）：
【化３】
2018516556.tif 000029
個々の単一細胞に由来する赤血球培養物を回収し、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用してｇＤＮＡを抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームでのディープシークエンシングを使用する遺伝子型決定分析に供した。
【０２１１】
逆相ＵＰＬＣによるグロビン鎖分析では、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＥＨ  Ｃ４カラム（３００Ａ、１．７ｍｉｃｒｏｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ）に５μＬの溶血血液を注入した。３８％〜４２．５％アセトニトリル含有水及びトリフルオロ酢酸係数０．１％の１８分の直線勾配を使用し流量０．２ｍＬ／分で室温にて溶出液を得た。溶出液に２２０ｎｍを照射した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ＯｐｅｎＬＡＢソフトウェアを使用して、特定のグロビン鎖それぞれの量を表す、特定グロビン鎖、γ、βまたはαの面積百分率を定量化した。
【０２１２】
結果
この試験では、１２０μｇ／ｍｌまたは８０μｇ／ｍｌのＳＢ  ＺＦＮをＣＤ３４＋細胞にトランスフェクションしてＳＢ  ＺＦＮ  ＨＳＰＣ細胞を作製し、トランスフェクション後３日目に細胞試料を採取して、ディープシークエンシングによりＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー領域の破壊レベルについて分析した。これにより、実験１ではＳＢ  ＺＦＮトランスフェクション試料のＢＣＬ１１Ａアレル約６７％が改変され、実験２では５８％が改変されたことが明らかになった（表１４）。
【０２１３】
そのような単一細胞分析を実施するため、２つの異なる実験（１及び２）のＳＢ  ＺＦＮ  ＨＳＰＣの個々の細胞を選別して９６ウェルプレートに播種し、インビトロで赤血球に分化させ、個々の単一細胞培養物それぞれを、ハイスループットＤＮＡ配列決定ならびにＵＰＬＣによるグロビン発現分析で分析した。
【０２１４】
単一細胞培養物のＭｉＳｅｑ遺伝子型決定結果を表１４にまとめている。ＳＢ  ＺＦＮ処理ＨＳＰＣ細胞のロットごとに、２００〜３００の個々の単一細胞赤血球培養物を分析した。実験１及び実験２それぞれについて、表現型が明らかな全クローン（混合クローンは除外、実験１では２０５クローン及び実験２では２６５クローン）のうち、２８％または３６％は野生型クローン（＋／＋）、１４％または１１％はヘテロ接合体クローン（＋／）、及び５８％または５２％はホモ接合体（／）クローンである。ＳＢ  ＺＦＮ処理細胞由来の単一細胞赤血球培養物の全アレルのうち、実験１及び２それぞれ、６５％または５８％は、ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座で破壊されていた。何らかの改変アレルを持つ単一細胞赤血球培養物すべてのうち、改変細胞クローンの８１％（実験１）または８２％（実験２）はＢＣＬ１１Ａの両アレルが破壊されていた。
表１４：ＳＢ  ＺＦＮでトランスフェクションしたＨＳＰＣ由来の単一細胞赤血球培養物の遺伝子型決定
【表１４−１】
2018516556.tif 000030
【表１４−２】
2018516556.tif 000031
【０２１５】
データは、５８〜６７％の標的化したＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー改変を担持するＳＢ  ＺＦＮ  ＨＳＰＣは、２８〜３６％の野生型細胞、１１〜１４％の単一アレル改変担持細胞、及び５２〜５８％の標的遺伝子座両アレル改変担持細胞で構成されていたことを示す。
【０２１６】
遺伝子型が明らかなクローンのうち、１５２クローン及び１７２クローン（それぞれ実験１及び２）は、ＮｕｃＲｅｄ染色で測定した脱核率で示されるようにインビトロで赤血球細胞に首尾よく分化した。その後、これらの単一細胞赤血球培養物を逆相ＵＰＬＣ分析に供し、グロビン鎖発現レベルを測定した。各コロニーは、その赤血球成熟の程度が異なっており、同じＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子型を持つコロニー内部であっても、γ／βグロビン比のある程度のばらつきは予測された。さらに、ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーの破壊されたアレルの一部は、部分的または完全な機能を保持する場合があり、ＧＡＴＡ１結合部位を保持する結果である可能性が高い（Ｖｉｅｒｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１２（１０）：９２７−３０；Ｃａｎｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ５２７（７５７７）：１９２−７）。
【０２１７】
データ（図１３）からわかるように、その結果は、ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座のコロニーの遺伝子型とそのγ／βグロビン比との間に明らかな相関があることを示した。具体的には、ＢＣＬ１１Ａの両アレル（ホモ接合体）の改変を担持するコロニーでは、実験１及び２の平均正規化γ／β比はそれぞれ３５％及び３９％であり、単一アレル（ヘテロ接合体の）改変コロニーでは、実験１及び２それぞれの平均正規化γ／β比は１９％及び１３％、ならびに野生型コロニーでは実験１及び２はそれぞれ１４％及び１３％であった。ウェルチの補正を用いた両側ｔ検定では、「ホモ接合体−対−野生型」比較のＰ値は、実験１及び２ともに＜０．０００１；「ヘテロ接合体−対−ホモ接合体」比較のＰ値は実験１が＜０．０００１、実験２が０．００２５；及び「ヘテロ接合体−対−野生型」比較のＰ値は実験１及び２ともにそれぞれ０．０２及び０．０００２である。下記グラフ（図１３）では、γ／β及びγ／αグロビン比を、被験コロニーすべてについてプロットし、ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーのアレルクラスの遺伝子型決定を行って選別する。
【０２１８】
本明細書で言及する特許、特許出願及び刊行物はいずれも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２１９】
開示は、明瞭な理解を目的とした説明及び実施例で一部が提供されてはいるが、本開示の範囲の趣旨および範囲から逸脱することなく多様な変更及び修正を行うことが可能であることは当業者には明らかとなろう。したがって、上述の記載内容及び実施例により限定されると解釈されるべきではない。
【図１】
2018516556.tif 000032
【図２Ａ】
2018516556.tif 000033
【図２Ｂ】
2018516556.tif 000034
【図３】
2018516556.tif 000035
【図４Ａ】
2018516556.tif 000036
【図４Ｂ】
2018516556.tif 000037
【図５Ａ】
2018516556.tif 000038
【図５Ｂ】
2018516556.tif 000039
【図６】
2018516556.tif 000040
【図７】
2018516556.tif 000041
【図８】
2018516556.tif 000042
【図９Ａ】
2018516556.tif 000043
【図９Ｂ】
2018516556.tif 000044
【図１０Ａ】
2018516556.tif 000045
【図１０Ｂ】
2018516556.tif 000046
【図１１Ａ】
2018516556.tif 000047
【図１１Ｂ】
2018516556.tif 000048
【図１２Ａ】
2018516556.tif 000049
【図１２Ｂ】
2018516556.tif 000050
【図１３】
2018516556.tif 000051
【配列表】
2018516556000001.app
【国際調査報告】
2018516556.tif 000052
2018516556.tif 000053
2018516556.tif 000054
2018516556.tif 000055