(57)【要約】  本明細書では、インターロイキン受容体鎖、ＪＡＫ結合モチーフ、シグナル伝達転写活性化因子（ＳＴＡＴ）５関連モチーフ、および／または外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフを含んでなるＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる細胞内セグメントを含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ならびに前記ＣＡＲを含んでなる細胞および５つの組成物およびそれらの使用が開示される。
2018509893.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）所定の抗原に結合し得る細胞外ドメインと、ｉｉ）膜貫通ドメインと、ｉｉｉ）ａ）インターロイキン受容体鎖の細胞質ドメインおよび／または細胞質共刺激ドメインから選択される１以上の細胞内シグナル伝達ドメインと、ｂ）外因性シグナル伝達転写活性化因子（ＳＴＡＴ）３関連モチーフを含んでなるＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインとを含んでなる細胞内セグメントとを含んでなり、前記細胞内セグメントが内因性または外因性ＪＡＫ結合モチーフおよびＳＴＡＴ５関連モチーフを含んでなる、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項２】
前記外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフが、ＹＸＸＱ（配列番号１３）である、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項３】
前記外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフが、ＹＲＨＱ（配列番号２２）である、請求項１または２に記載のＣＡＲ。
【請求項４】
前記外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフが、ＣＡＲのＣ末端から１００アミノ酸残基内に導入される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項５】
前記１以上の細胞内シグナル伝達ドメインが、インターロイキン受容体鎖の細胞質ドメインであるかまたはそれを含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項６】
前記インターロイキン受容体鎖の細胞質ドメインが、ＪＡＫ結合モチーフおよびＳＴＡＴ５関連モチーフを含んでなる前記細胞質ドメインの末端切断フラグメントである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項７】
前記ＳＴＡＴ５関連モチーフが、ＹＸＸＬ（配列番号４１）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項８】
前記１以上の細胞内シグナル伝達ドメインが、細胞質共刺激ドメインであるかまたはそれを含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項９】
前記細胞質共刺激ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ１３４またはＣＤ１３７の細胞質ドメインである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項１０】
ｉ）所定の抗原に結合し得る細胞外ドメインと、ｉｉ）膜貫通ドメインと、ｉｉｉ）インターロイキン受容体鎖の細胞質ドメインおよび場合により少なくとも１つの補足的細胞質ドメインを含む１以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる細胞内セグメントとを含んでなるＣＡＲ。
【請求項１１】
前記インターロイキン受容体鎖の細胞質ドメインが、チロシンキナーゼ関連モチーフおよびＳＴＡＴ関連モチーフを含んでなる前記細胞質ドメインの末端切断フラグメントである、請求項１０に記載のＣＡＲ。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの補足的細胞質ドメインが、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ２８の細胞質共刺激ドメインである、請求項１０または１１に記載のＣＡＲ。
【請求項１３】
前記インターロイキン受容体鎖が、インターロイキン２受容体（ＩＬ−２Ｒ）β鎖およびインターロイキン２１受容体（ＩＬ−２１Ｒ）α鎖からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項１４】
前記細胞外ドメインが、所定の抗原に結合し得る抗体の抗原結合領域である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項１５】
前記抗体の抗原結合領域が、前記抗体の一本鎖可変フラグメントである、請求項１４に記載のＣＡＲ。
【請求項１６】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８膜貫通ドメインおよびＣＤ８膜貫通ドメインからなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸。
【請求項１８】
前記核酸がＣＡＲをコードし、さらにＮ末端にシグナルペプチドをコードする、請求項１７に記載の核酸。
【請求項１９】
請求項１７または１８に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項２０】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＣＡＲを発現し、および／または請求項１７もしくは１８の核酸または請求項１９のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された細胞。
【請求項２１】
請求項１〜２０いずれか一項に記載のＣＡＲ、核酸、ベクターまたは細胞と場合により薬学上許容可能な賦形剤とを含んでなる組成物。
【請求項２２】
請求項１７もしくは１８に記載の核酸または請求項１９に記載のベクターで細胞を形質導入する、請求項２０に記載の細胞の作製方法。
【請求項２３】
ａ）哺乳動物から免疫細胞を単離すること（場合により、前記免疫細胞はＴ細胞である）；
ｂ）単離された免疫細胞（場合により、Ｔ細胞）を、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする核酸でトランスフェクトまたは形質導入すること；および
ｃ）場合により、トランスフェクションまたは形質導入後にＣＡＲ発現細胞（場合により、ＣＡＲ発現Ｔ細胞）を単離し、および／または拡大培養すること
を含んでなる、請求項２２に記載の細胞の作製方法。
【請求項２４】
疾患を治療もしくは予防するための、および／または対象において所定の抗原を発現する細胞の数を減らすための、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞または組成物の使用。
【請求項２５】
対象において疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に有効量の請求項２０または２１に記載の細胞または組成物を投与することを含んでなる、方法。
【請求項２６】
哺乳動物において抗腫瘍免疫を提供するための、請求項２４または２５に記載の使用または方法。
【請求項２７】
対象において所定の抗原を発現する細胞の数を減らす方法であって、それを必要とする対象に有効量の請求項２０に記載の細胞または所定の抗原と特異的に結合する前記細胞を含んでなる組成物を投与することを含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２０１５年２月１２日に出願された、引用することにより本明細書の一部とされる米国仮出願第６２／１１５，５２７号の優先権に基づき米国特許法１１９条の利益を主張する特許協力条約出願である。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、改良されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、特に、インターロイキン受容体鎖の細胞質ドメイン、および／または細胞質共刺激ドメインを含んでなる細胞内セグメント（前記細胞内セグメントは、ＪＡＫ結合モチーフおよびシグナル伝達転写活性化因子（ＳＴＡＴ）５関連モチーフを含んでなる）、および／または外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフを含んでなるＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなるＣＡＲに関する。また、前記ＣＡＲをコードする核酸、前記ＣＡＲを発現する細胞、ならびにそれらの作製および使用の方法も提供される。
【背景技術】
【０００３】
腫瘍を治療するための１つの治療戦略は、対象とする抗原を標的とするＴ細胞を作製するために特定の抗原と結合し得るＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をＴ細胞に導入することを含み得る。この戦略に基づき、例えば、ＷＴ１、ＭＡＲＴ１、ｇｐ１００、ＣＥＡ、ＣＤ１９およびｍＨＡＧ  ＨＡ−２抗原などの多くの腫瘍抗原を標的とするＴＣＲ遺伝子を用いた養子免疫遺伝子療法が試みられてきた。
【０００４】
もう１つの遺伝子改変Ｔ細胞療法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の使用を含む。ＣＡＲは、単一の融合分子に抗原特異性とＴ細胞活性化特性を併せ持つ。ＣＡＲは、  腫瘍細胞の表面抗原に対する特異性と生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）でＴ細胞の増殖を活性化させる能力を持つ。この療法は、腫瘍表面抗原を標的とする治療抗体よりも強く、より長く持続する抗腫瘍効果を持ち得、従って、その臨床効果もまた大きいものであり得る。
【０００５】
ＣＡＲの代表的な構造は、腫瘍細胞の表面抗原を認識する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と、膜貫通ドメインと、Ｔ細胞を活性化するＴＣＲ複合体の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ζとを含んでなる。このような構成を有するＣＡＲは、第一世代ＣＡＲと呼ばれる。一本鎖可変フラグメント部分をコードする核酸配列は、例えば、標的腫瘍抗原などの標的抗原を認識するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマから単離することができる。ＣＡＲはＴ細胞などの細胞中で生産および発現される。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、腫瘍細胞上の主要組織適合性抗原クラスＩの発現とは独立に腫瘍細胞の表面抗原を直接認識すると同時にＴ細胞を活性化し、それにより、ＣＡＲ発現Ｔ細胞は腫瘍細胞を効率的に死滅させることができる。
【０００６】
第一世代ＣＡＲのＴ細胞活性化能の増強を試みるために、第一世代ＣＡＲに、Ｔ細胞の共刺激分子であるＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインが連結された第二世代ＣＡＲが開発された。さらなる改良型として、第二世代ＣＡＲに、ＣＤ１３７由来細胞内シグナル伝達ドメイン（４−１ＢＢ）またはＣＤ１３４由来細胞内シグナル伝達ドメイン（ＯＸ４０）（両方とも腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーメンバーである）が直列に連結された第三世代ＣＡＲも開発された。従って、様々な腫瘍抗原を標的とする多くのＣＡＲ分子が報告されている（例えば、Sadelain et al 2009参照）。しかしながら、現在報告されている第二世代および第三世代ＣＡＲに共刺激細胞内シグナル伝達ドメインとして使用されているシグナル伝達タンパク質は限定されている。どのＴ細胞シグナル伝達タンパク質に由来する細胞内シグナル伝達ドメインも、ＣＡＲに連結された場合、総てが標的腫瘍細胞を傷害し、および／または死滅させるよう十分にＴ細胞を刺激できるわけではないことが知られている。従って、ＣＡＲに連結した際に有効となるシグナル伝達タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインを見出すことが望ましい。
【発明の概要】
【０００７】
本開示の１つの側面は、標的抗原と特異的に結合し、かつ、標的抗原を発現する標的細胞に対する細胞傷害活性を付与するＣＡＲである。
【０００８】
さらなる側面は、対象とする標的抗原を発現する細胞を標的化するために使用可能な、ＣＡＲを発現する細胞である。
【０００９】
１つの側面は、ｉ）所定の抗原に結合し得る細胞外ドメインと、ｉｉ）膜貫通ドメインと、ｉｉｉ）ａ）インターロイキン受容体鎖の細胞質ドメインおよび／または細胞質共刺激ドメインから選択される１以上の細胞内シグナル伝達ドメインと、ｂ）外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフを含んでなるＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインとを含んでなる細胞内セグメントとを含んでなり、前記細胞内セグメントが内因性または外因性ＪＡＫ結合モチーフおよびＳＴＡＴ５関連モチーフを含んでなるＣＡＲを提供する。
【００１０】
１つの実施形態では、外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフは、ＹＸＸＱ（配列番号１３）である。
【００１１】
ある実施形態では、外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフは、ＹＲＨＱ（配列番号２２）である。
【００１２】
ある実施形態では、外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフは、ＣＡＲのＣ末端から１００アミノ酸残基内にある。
【００１３】
１つの実施形態では、外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフは、ＣＤ３ζのアミノ酸１５６〜１５８に取って代わっている。
【００１４】
ある実施形態では、１以上の細胞内シグナル伝達ドメインは、インターロイキン受容体鎖の細胞質ドメインであるか、またはそれを含んでなる。
【００１５】
別の実施形態では、インターロイキン受容体鎖の細胞質ドメインは、ＪＡＫ結合モチーフおよびＳＴＡＴ５関連モチーフを少なくとも含んでなる末端切断（truncated）フラグメントである。
【００１６】
ある実施形態では、１以上の細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞質共刺激ドメインであるか、またはそれを含んでなる。
【００１７】
別の実施形態では、細胞質共刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ１３４またはＣＤ１３７の細胞質ドメインである。
【００１８】
別の側面は、ｉ）所定の抗原に結合し得る細胞外ドメインと、ｉｉ）膜貫通ドメインと、ｉｉｉ）インターロイキン受容体鎖の細胞質ドメインを含む１以上の細胞内シグナル伝達ドメインと場合により少なくとも１つの補足的細胞質ドメインとを含んでなる細胞内セグメントとを含んでなるＣＡＲである。
【００１９】
ある実施形態では、インターロイキン受容体鎖の細胞質ドメインは、チロシンキナーゼ関連モチーフおよびＳＴＡＴ関連モチーフを含んでなる末端切断フラグメントである。
【００２０】
ある実施形態では、少なくとも１つの補足的細胞質ドメインは、ｉ）ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメイン（場合により、前記ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインは、外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフを含んでなる）、および／またはｉｉ）ＣＤ２８の細胞質共刺激ドメインである。
【００２１】
ある実施形態では、インターロイキン受容体鎖は、インターロイキン２受容体（ＩＬ−２Ｒ）β鎖およびインターロイキン２１受容体（ＩＬ−２１Ｒ）α鎖からなる群から選択される。
【００２２】
さらに別の実施形態では、細胞外ドメインは、所定の抗原に結合し得る抗体の抗原結合領域であり、および／またはそれを含んでなる。
【００２３】
別の実施形態では、抗体の抗原結合領域は、前記抗体の一本鎖可変フラグメントであるか、またはそれを含んでなる。
【００２４】
別の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインおよびＣＤ８膜貫通ドメインからなる群から選択される。
【００２５】
別の実施形態では、ＣＡＲは、さらに場合によりＮ末端にシグナルペプチドを含んでなる。
【００２６】
別の側面は、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸を含む。
【００２７】
ある実施形態では、核酸は、シグナルペプチド（場合により、前記シグナルペプチドはＣＡＲのＮ末端にある）にコンジュゲートされたＣＡＲをコードする。
【００２８】
さらなる側面は、本明細書に記載の核酸を含んでなるベクターを含む。
【００２９】
よりさらなる側面は、本明細書に記載のＣＡＲを発現し、および／または本明細書に記載の核酸もしくはベクターでトランスフェクトまたは形質導入された細胞を含む。
【００３０】
よりさらなる側面は、本明細書に記載のＣＡＲ核酸またはベクター、場合により、本明細書に記載のＣＡＲを含んでなるミクロソーム製剤を含んでなる組成物を含む。
【００３１】
ある実施形態では、組成物は、希釈剤または薬学上許容可能な賦形剤を含んでなる。
【００３２】
本開示によれば、キメラ抗原受容体、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸、前記キメラ抗原受容体を発現する細胞、および以上のいずれかを含んでなる組成物が提供される。ある実施形態では、上記の１以上が腫瘍抗原などの抗原を標的とする養子免疫遺伝子療法の分野で、および／またはスクリーニングもしくはその他のインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）アッセイで使用され得る。本開示のキメラ抗原受容体を細胞に導入し、例えば、その細胞においてキメラ抗原受容体の発現量の増強または上昇を得ることができる。このような細胞は、標的抗原を発現する細胞に対して細胞傷害活性を発揮し得る。
【００３３】
一側面において、
ａ）哺乳動物から免疫細胞を単離すること（場合により、前記免疫細胞はＴ細胞である）；
ｂ）単離された免疫細胞（場合により、Ｔ細胞）を、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸でトランスフェクトまたは形質導入すること；および
ｃ）場合により、トランスフェクションまたは形質導入後にＣＡＲ発現細胞（場合により、ＣＡＲ発現Ｔ細胞）を単離し、および／または拡大培養すること
を含んでなる、本明細書に開示されるＣＡＲを発現する細胞の作製方法が提供される。
【００３４】
別の側面は、例えば、所定の抗原を発現する細胞の数を減らす、疾患を治療する、疾患を予防する、および／または抗腫瘍免疫を提供するための、本明細書に記載のＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞または組成物の使用である。
【００３５】
別の側面は、対象において所定の抗原を発現する細胞の数を減らす方法であって、それを必要とする対象に有効量の本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞を投与することを含んでなり、前記ＣＡＲは所定の抗原と特異的に結合する、方法を含む。
【００３６】
別の側面は、哺乳動物において疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする哺乳動物に有効量の、本明細書に記載のＣＡＲを発現する細胞または本明細書に記載の組成物を投与することを含んでなる方法である。
【００３７】
さらなる側面は、哺乳動物において抗腫瘍免疫を提供する方法であって、それを必要とする哺乳動物に有効量の、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞または本明細書に記載の組成物を投与することを含んでなる方法である。
【００３８】
本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。しかしながら、この詳細な説明から当業者には本開示の趣旨および範囲内で種々の変更および改変が自明となるので、本開示の好ましい実施形態を示す詳細な説明および具体例は説明のためだけに与えられているものと理解されるべきである。
以下、本開示の実施形態を図面に関して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物の概略図である。
【図２】図２は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ構築物による初代Ｔ細胞の形質導入効率を示すフローサイトメトリー分析の一連のプロットである。
【図３】図３は、種々の構築物の抗ＣＤ１９−ＣＡＲ表面発現を示す一連のグラフである。
【図４】図４は、２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）抗ＣＤ１９  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５のリン酸化を示す一連のグラフである。
【図５】図５は、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路活性のグラフ比較である。
【図６】図６は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ構築物Ｔ細胞形質導入および拡大培養のプロトコールを示す模式図である。
【図７】図７は、形質導入後のＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の拡大増殖を示す一連のグラフである。
【図８】図８は、Ｋ５６２−ＣＤ１９細胞によるＣＤ１９特異的刺激の後のＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の拡大増殖を示す一連のグラフである。
【図９】図９は、Ｋ５６２細胞（対照）との共培養後のＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の拡大増殖を示す一連のグラフである。
【図１０】図１０は、Ｋ５６２−ＣＤ１９細胞による抗原特異的再刺激後のＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の拡大増殖を示す一連のグラフである。
【図１１】図１１は、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の細胞分裂速度を示す一連のグラフである。
【図１２】図１２は、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の生存率を示すグラフである。
【図１３】図１３は、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の表面表現型ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋発現レベルを示すフローサイトメトリー分析の一連のプロットである。
【図１４】図１４は、幹細胞様メモリーＴ細胞のマーカー表現型（ＣＤ４５ＲＡ＋  ＣＤ６２Ｌ＋  ＣＤ９５＋）を有するＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の頻度を示す一連のグラフである。
【図１５】図１５は、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞におけるＣＤ６２Ｌ発現を比較する一連のグラフである。
【図１６】図１６は、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞によるＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌を示す一連のグラフである。
【図１７】図１７は、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞によるインビトロ標的細胞溶解を示すグラフである。
【図１８】図１８は、免疫不全マウスへの、ＥＧＦＰ−ルシフェラーゼを発現するＣＤ１９陽性急性リンパ芽球性白血病細胞株ＮＡＬＭ−６の注射とその後のＣＡＲ形質導入Ｔ細胞注射のプロトコールを示す模式図である。
【図１９】図１９は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の注入後の示された時点のルシフェラーゼ活性の一連の生物発光イメージングである。
【図２０】図２０は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞で処置したマウスの全生存率のカプランマイヤー曲線を示すグラフである（各ｎ＝５）。
【図２１】図２１は、実施例に使用したＣＡＲとしてのＮＦＭＣ６３−２８Ｚ、ＮＦＭＣ６３−２８−ｄ２ＲｂＺ、ＮＦＭＣ６３−２８−２１ＲａＺまたはＮＦＭＣ６３−２８Ｚ−２１Ｒａの構造を示す。
【図２２】図２２は、図２１のＣＡＲで形質導入されたＳＴＡＴリン酸化細胞を示す。
【発明の具体的説明】
【００４０】
本明細書で使用する場合、「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、所定の抗原に結合し得る細胞外ドメインと、前記細胞外ドメインが由来するポリペプチドとは異なるシグナル伝達タンパク質に由来する１以上の細胞質ドメインを含んでなる細胞内セグメントと、膜貫通ドメインとを含んでなる融合タンパク質を意味する。「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、「キメラ受容体」、「Ｔ−ボディー」、または「キメラ免疫受容体（ＣＩＲ）」と呼ばれることもある。「所定の抗原に結合し得る細胞外ドメイン」という句は、前記所定の抗原と特異的に結合し得る任意のタンパク質性分子またはその一部を意味する。「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、細胞内での生物学的プロセスの活性化または阻害、例えば、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞などの免疫細胞の活性化を引き起こすシグナルを伝達する働きをすることが知られる任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドドメインを意味する。例としては、ＩＬＲ鎖、ＣＤ２８および／またはＣＤ３ζが挙げられる。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「ＳＴＡＴ３」または「シグナル伝達転写活性化因子３」は、ＳＴＡＴタンパク質ファミリーに属す転写因子を意味する。ＳＴＡＴ３はまた、「急性期応答因子」、「ＡＰＲＦ」、「ＡＰＲＦ転写因子」、「ＤＮＡ結合タンパク質ＡＰＲＦ」、「ＦＬＪ２０８８２」、「仮想タンパク質ＭＧＣ１６０６３」、「ＩＬ−６応答因子」、「ＬＩＦ（白血病阻害因子）応答因子」または「ＳＴＡＴ３＿ＨＵＭＡＮ」とも呼ばれる。ＳＴＡＴ３タンパク質は、細胞増殖および分裂、細胞移動ならびに細胞アポトーシスに関与する遺伝子の調節に関与している。免疫系では、ＳＴＡＴ３は、Ｔ細胞およびＢ細胞などの免疫系細胞の成熟に関するシグナル伝達因子である。Ｓｉｅｇｅｌらは、ＳＴＡＴ３がヒトＴ細胞記憶の生成と維持に役割を果たすことを示している(Siegel et al. 2011)。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「シグナル伝達転写活性化因子３関連モチーフ」または「ＳＴＡＴ３関連モチーフ」は、ＳＴＡＴ３と結合（例えば、より長いポリペプチド／タンパク質の文脈で）するアミノ酸配列ＹＸＸＱ（配列番号１３）（またはその文脈に従って前記アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド）を意味する。ＳＴＡＴ３関連モチーフは、シグナル伝達タンパク質、例えば、ＩＬ−６およびＩＬ−１０内に存在する。ＳＴＡＴ３関連モチーフはまた、ＳＴＡＴ３関連モチーフを内因的に含まないシグナル伝達ドメインに導入することもできる（すなわち、外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフ）。用語「外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフ」は、ドメイン、例えば、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン、に組換えにより導入されるが、前記ドメインに天然には存在しない、または前記ドメイン内の導入場所には存在しないＳＴＡＴ３関連モチーフを意味する。例えば、ＹＸＸＱ（配列番号１３）外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフは、ＣＤ３ζに導入することができる。外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフは、例えば、ＹＲＨＱ（配列番号２２）であり得る。当業者は、外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフが当技術分野で理解されている種々の技術を用いてＣＤ３ζに導入できることを認識するであろう。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「シグナル伝達転写活性化因子５関連モチーフ」または「ＳＴＡＴ５関連モチーフ」は、ＳＴＡＴ５と結合するチロシン残基を含んでなるアミノ酸配列（またはその文脈に従って前記アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド）を意味する。例えば、ＩＬ−２Ｒ  β鎖のＳＴＡＴ５関連モチーフは、チロシン残基−５１０（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００８６９．１のアミノ酸番号５３６、例えば、配列番号１１の２７１であるチロシン残基５１０）を含んでなる。例えば、ＳＴＡＴ５関連モチーフは、アミノ酸残基ＹＸＸＬ（配列番号４１）を含んでなる。例えば、ＳＴＡＴ５関連モチーフは、アミノ酸残基ＹＬＳＬ（配列番号４３）を含んでなる。
【００４４】
用語「外因性関連モチーフ」は、ドメイン、例えば、インターロイキン受容体鎖の細胞質ドメイン、細胞質共刺激ドメインまたはＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインなどの細胞内シグナル伝達ドメイン、に組換えにより導入されるが、前記ドメインに天然には存在しない、または前記ドメイン内の導入場所には存在しない任意の関連モチーフを意味する。例えば、外因性ＪＡＫ結合モチーフは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、インターロイキン受容体鎖の細胞質ドメイン、に挿入することができる。
【００４５】
本明細書で使用する「ＪＡＫ結合モチーフ」は、チロシンキナーゼＪＡＫ会合を可能とするＢＯＸ−１モチーフ、例えばＪＡＫ１、を意味する。ＪＡＫ結合モチーフは、例えば、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００８６９．１のアミノ酸番号２７８〜２８６（配列番号１１のアミノ酸１３〜２１）であり得る。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「ドメイン」は、例えば、他の領域とは独立に特定の構造に折り畳まれ、および／または特定の機能を有する、ポリペプチドの一領域を意味する。ドメインは、例えば、分子の細胞質部分またはその一部であり得る。本明細書で使用する場合、分子の「細胞質ドメイン」は、全長細胞質ドメイン、または活性化された際に細胞内シグナルを伝達するその一部を意味する。
【００４７】
用語「変異体」は、１または数個から複数のアミノ酸の置換、欠失または付加を含んでなる分子を意味し、その変異体が元の配列と同じ機能を実質的に保持する限り、特に保存的置換分子を含む。例えば、ＩＬ受容体変異体は、ＪＡＫ結合モチーフおよびＳＴＡＴ関連モチーフの外側に置換、欠失または付加を含んでいてもよい。例えば、ＩＬ受容体鎖変異体は、ＪＡＫ結合モチーフおよびＳＴＡＴ関連モチーフの外側の領域に５０個まで、４０個まで、３０個まで、２０個までまたは１０個までのアミノ酸欠失および／または保存的置換を含んでいてもよい。同様に、他の分子の変異体も、本明細書で特定された領域の外側の領域に５０個まで、４０個まで、３０個まで、２０個までまたは１０個までのアミノ酸欠失および／または保存的置換を含んでいてもよい。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「細胞内セグメントが内因性または外因性ＪＡＫ結合モチーフおよびＳＴＡＴ５関連モチーフを含んでなる」という句は、その細胞内セグメントが１以上の細胞質ドメインを含んでなる場合を意味し、ＪＡＫ結合モチーフとＳＴＡＴ５関連モチーフは同じ細胞質ドメインにあってもよいし、または別の細胞質ドメインにあってもよい。
【００４９】
用語「補足的細胞質ドメイン」は、インターロイキン受容体（ＩＬＲ）鎖の細胞質ドメインを含んでなるＣＡＲの文脈で本明細書で使用される場合、ＩＬＲ鎖には含まれないシグナル伝達タンパク質の細胞質ドメインである。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「腫瘍抗原」は、その発現が細胞の悪性変化に関連して認識されるようになる、抗原性を有する生体分子を意味する。本開示の腫瘍抗原には、腫瘍特異的抗原（腫瘍細胞のみに存在し、他の正常細胞には見られない抗原）、および腫瘍関連抗原（他の器官および組織もしくは異種および同種異系の正常細胞にも存在する抗原、または発生および／もしくは分化の際に発現される抗原）が含まれる。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「インターロイキン（ＩＬ）受容体」は、インターロイキンに対するサイトカイン受容体を意味する。ＩＬ受容体には、１型および２型サイトカイン受容体の２つの主要なファミリーが存在する。１型インターロイキン受容体には、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−３受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−５受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−９受容体、ＩＬ−１１受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１５受容体、ＩＬ−２１受容体、ＩＬ−２３受容体およびＩＬ−２７受容体が含まれる。２型ＩＬ受容体には、ＩＬ−１０受容体、ＩＬ−２０受容体、ＩＬ−２２受容体およびＩＬ−２８受容体が含まれる。ＩＬ受容体は、複数のポリペプチド鎖から構成される。本明細書では、例えば、ＩＬ−２受容体β鎖は、ＩＬ２ＲｂまたはＩＬ−２Ｒｂと略記される場合がある。
【００５２】
用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、およびマウス−ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体ならびにネズミ、ウシ、ウサギ、ラット、ヤギ、ヒト抗体および他の生物由来抗体を含むものとする。抗体は組換え源に由来してもよく、および／またはトランスジェニック動物で生産されてもよい。抗体はまた合成であってもよい。用語「抗体フラグメント」は、本明細書で使用する場合、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ヘテロ二量体、ミニボディ、ダイアボディ、およびその多量体、多重特異性抗体フラグメントおよびドメイン抗体を含むものとする。抗体は従来の技術を用いて断片化することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは抗体をペプシンで処理することにより作製できる。得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントにジスルフィド結合を還元する処理をしてＦａｂ’フラグメントを生成することができる。パパイン消化は、Ｆａｂフラグメントの形成をもたらし得る。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメントおよびその他のフラグメントも組換え技術により合成することができる。
【００５３】
抗体の作製方法は当技術分野で公知である。ヒトモノクローナル抗体および／またはその結合フラグメントを生産するためには、抗体生産細胞（リンパ球）を、癌を有するヒトから採取し、標準的な体細胞融合手順によって骨髄腫細胞と融合させ、このようにしてこれらの細胞を不死化し、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。このような技術は当技術分野で周知である（例えば、Kohler and Milstein (Nature256:495-497 (1975)により最初に開発されたハイブリドーマ技術）ならびにヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al., Immunol. Today 4:72 (1983))、ヒトモノクローナル抗体を生産するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Cole et al., Methods Enzymol, 121:140-67 (1986))、およびコンビナトリアル抗体ライブラリーのスクリーニング(Huse et al., Science 246:1275 (1989))などの他の技術。ハイブリドーマ細胞を癌細胞と特異的に反応性のある抗体の生産に関して免疫化学的にスクリーニングすることができ、モノクローナル抗体を単離することができる。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）」は、抗原への結合能を保持する抗体由来の一本鎖ポリペプチドを意味する。ｓｃＦｖの例には、組換えＤＮＡ技術により形成され、免疫グロブリン重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）フラグメントのＦｖ領域がスペーサー配列を介して連結されている抗体ポリペプチドが含まれる。ｓｃＦｖを調製するための様々な方法が知られており、米国特許第４６９４７７８号、Science, vol. 242, pp. 423-442 (1988)、Nature, vol. 334, p. 54454 (1989)、およびScience, vol. 242, pp. 1038-1041 (1988)に記載されている方法が含まれる。
【００５５】
用語「ＣＤ３ζ」は、本明細書で使用する場合、総ての哺乳動物種、好ましくは、ヒトの分化抗原群３（ＣＤ３）Ｔ細胞共受容体を意味する。哺乳動物では、ＣＤ３は、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ３δ鎖および２本のＣＤ３ε鎖を含んでなる。ＣＤ３ζ鎖（例えば、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿９３２１７０．１）は、本開示のＣＡＲを操作するために使用可能な細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、配列番号７）を含んでなる。
【００５６】
用語「２８−ｚ」は、本明細書で使用する場合、ＦＭＣ６３由来一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）とＣＤ２８膜貫通ドメインおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインを連結することにより作製されたＣＡＲ構築物を意味する。
【００５７】
用語「２８−ＢＢ−ｚ」は、本明細書で使用する場合、ＦＭＣ６３由来一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）とＣＤ２８膜貫通ドメインを、さらには４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを連結することにより作製されたＣＡＲ構築物を意味する。
【００５８】
用語「２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）」は、本明細書で使用する場合、ＦＭＣ６３由来一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）とＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＪＡＫシグナル伝達に関与するＢＯＸ  １モチーフ（例えば、ＪＡＫ結合モチーフを含んでなる）と５１０番にＳＴＡＴ５会合のためのチロシン残基とを含んでなるＩＬ−２Ｒβ細胞質ドメイン、およびさらにＳＴＡＴ３会合に関与する外因性ＹＸＸＱ（配列番号１３）モチーフを含んでなるＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを連結することにより作製されたＣＡＲ構築物を意味する。
【００５９】
用語「核酸配列」は、本明細書で使用する場合、天然の塩基、糖および糖間（主鎖）結合からなるヌクレオシドまたはヌクレオチドモノマーの配列を意味する。この用語にはまた、非天然モノマーまたはその一部を含んでなる修飾または置換配列も含まれる。本出願の核酸配列はデオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）またはリボ核酸配列（ＲＮＡ）であり得、アデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシルを含む天然塩基が含まれる。これらの配列はまた、修飾塩基も含有し得る。このような修飾塩基の例には、アザおよびデアザアデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシル；ならびにキサンチンおよびヒポキサンチンが含まれる。
【００６０】
用語「単離された核酸」は、本明細書で使用する場合、組換えＤＮＡ技術により生産される場合には細胞材料もしくは培養培地を、または化学合成される場合には化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸を意味する。単離された核酸はまた、その核酸が由来する、核酸に天然に隣接している配列（すなわち、その核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）も実質的に含まない。用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むものとし、二本鎖または一本鎖のいずれでもよく、センスまたはアンチセンス鎖に相当する。さらに、用語「核酸」は、相補的核酸配列、例えば、ｃＤＮＡを含む。
【００６１】
用語「単離されたポリペプチド」は、「単離されたタンパク質」とも呼ばれ、組換えＤＮＡ技術により生産される場合には細胞材料もしくは培養培地を、または化学合成される場合には化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないポリペプチドを意味する。
【００６２】
用語「アミノ酸」は、天然アミノ酸ならびに修飾アミノ酸の総てを含む。
【００６３】
「保存的アミノ酸バリエーション」は、本明細書で使用する場合、そのタンパク質の所望の特性を損なうことなくあるアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されているものである。
【００６４】
用語「対象」は、本明細書で使用する場合、ヒトを含む動物界の総てのメンバーを意味する。
【００６５】
本明細書で使用する場合、当技術分野で十分に理解されているように、「治療」は、臨床結果を含む、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。有益なまたは所望の臨床結果は、限定されるものではないが、検出可能であるか不能であるかは問わず、１以上の症状または病態の緩和または改善、疾患の程度の軽減、疾患の状態の安定化（すなわち、無増悪）、疾患の拡散の防止、疾患の進行の遅延または緩徐化、疾患状態の改善または軽減、および寛解（部分的または完全）を含み得る。「治療」はまた、治療を受けなかった場合の予想生存期間に比べて生存期間を延長することも意味し得る。疾患または障害を「軽減する」とは、障害を治療しない場合に比べて、障害もしくは疾患状態の程度および／もしくは望ましくない臨床発現が軽くなること、ならびに／または進行の経過が緩徐化または長くなることを意味する。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「癌を治療または予防する」という句は、癌細胞の複製を阻害すること、抗腫瘍免疫を提供すること、癌の拡散（転移）を阻害すること、腫瘍増殖を阻害すること、癌細胞の数もしくは腫瘍増殖を減らすこと、または癌関連症状を改善することを意味する。
【００６７】
用語「投与する」は、本明細書で使用する場合、所定の抗原を発現する細胞の拡散を減らし、および／または阻害するために治療上有効な量の、例えば、ＣＡＲ発現細胞または本出願の組成物を患者に投与することを意味する。
【００６８】
本開示の範囲を理解する上で、「を含んでなる」という用語およびその派生語は、本明細書で使用する場合、記載されている特徴、要素、成分、群、整数、および／または工程の存在を明示するが、記載されていない特徴、要素、成分、群、整数、および／または工程の存在を排除しないオープンエンドの用語であるものとする。以上のことは、「含む」、「有する」という用語およびそれらの派生語などの類似の意味を有する語にも当てはまる。最後に、「実質的に」、「約」および「およそ」などの程度の用語は、本明細書で使用する場合、最終的な結果を有意に変化させないような、被修飾語の合理的偏差量を意味する。これらの程度の用語は、この偏差が、それが修飾する語の意味を否定しない限り、被修飾語の少なくとも±５％の偏差を含むと解釈されるべきである。
【００６９】
本明細書でおよび添付の特許請求の範囲使用される場合、単数形「１つの(a)」、「１つの(an)」および「その(the)」は、内容がそうではないことが明示されない限り、複数の指示語を含む。また、用語「または」は、内容がそうではないことが明示されない限り、一般に、「および／または」を含むその意味の範囲内で使用されることにも留意されたい。
【００７０】
特定の節に記載される定義および実施形態は、当業者に理解されるように、それらが好適であると記載される本明細書の他の実施形態にも当てはまることが意図される。
【００７１】
本明細書において終点による数値範囲の列挙は、その範囲内に包含される総ての数字および分数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４、および５を含む）。また、総ての数およびその分数も用語「約」で修飾されるであろうことも理解されるべきである。
【００７２】
さらに、特定の節に記載される定義および実施形態は、当業者に理解されるように、それらが好適であると記載される本明細書の他の実施形態にも当てはまることが意図される。例えば、以下の下りでは、本発明の種々の側面がより詳しく定義される。このように定義される各側面は、そうではないことが明示されない限り、他のいずれの１または複数の側面と組み合わせてもよい。特に、好ましいまたは有利であるとして示されるいずれの特徴も、好ましいまたは有利であるとして示される他のいずれの１または複数の特徴と組み合わせてもよい。
【００７３】
（１）本開示ＣＡＲ
本明細書では、ｉ）所定の抗原に結合し得る細胞外ドメイン、ｉｉ）膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞質共刺激ドメインおよび／またはインターロイキン受容体鎖の細胞質ドメインから選択される１以上の細胞内シグナル伝達ドメインと外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフを含んでなるＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインとを含んでなる細胞内セグメント（ここで、前記細胞内セグメントは、内因性のまたは外因性ＪＡＫ結合モチーフおよびＳＴＡＴ５関連モチーフを含んでなる）を含んでなるＣＡＲが開示される。ある実施形態では、これらのドメインは、場合により、Ｎ末端から始まって以上の順序で、直接的または間接的に融合される。ある実施形態では、細胞内セグメント内のこれらのドメインは、逆の順序で融合される。
【００７４】
また、本明細書では、ｉ）所定の抗原に結合し得る細胞外ドメイン、ｉｉ）膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）ＩＬ受容体鎖の細胞質ドメインおよび場合により少なくとも１つの補足的細胞質ドメインを含む１以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる細胞内セグメント、を含んでなるＣＡＲも開示される。ある実施形態では、これらのドメインは、場合により、Ｎ末端から始まって以上の順序で、直接的または間接的に融合される。１つの実施形態では、細胞内セグメント内のこれらのドメインは、逆の順序で融合される。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ＩＬ受容体鎖は、膜貫通ドメインの近位にあり、および／またはＣＡＲ細胞内セグメントのＮ末端に近いか、またはＮ末端を形成する。他の実施形態では、ＩＬ受容体鎖は、ＣＡＲ内の細胞内セグメントのＣ末端に近いか、またはＣ末端を形成する。いくつかの実施形態では、ＩＬ受容体鎖は、ＣＡＲ内の、外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフＹＸＸＱ（配列番号１３）を含んでなるＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインの上流またはＮ末端側にある。
【００７６】
ＣＡＲ細胞内セグメントがＩＬ受容体鎖のシグナル伝達ドメインのみを含んでなる実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、内因性ＴＣＲを介してＭＨＣ複合体内に存在する所定の抗原によって、および／または内因性ＣＤ２８を介してＣＤ８０／８６分子によって、例えば、Ｂ細胞によって活性化され得る。
【００７７】
また、本開示のＣＡＲを発現する細胞も提供される。このような細胞は、例えば、高い増殖速度および／または高い生存率を持ち得、高い量のサイトカインを生産し、および／またはＣＡＲを発現しない親細胞に比べて、ＣＡＲが結合する所定の／予め選択された抗原をその表面に有する細胞に対して高い細胞傷害活性を持ち得る。例えば、実施例に示されるように、２８−ＩＬ２ＲＢｚ（ＹＸＸＱ）ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、高い細胞分裂、増殖および生存率を有し、治療として前記細胞を受容しているマウスにおいて、抗腫瘍効果を提供し、かつ、全生存率を改善する。
【００７８】
（ａ）細胞外ドメイン
本開示のＣＡＲに関して使用される「所定の抗原に結合し得る細胞外ドメイン」は、標的抗原と結合し得るタンパク質性分子またはその一部を含んでなるドメインであり、例えば、抗体の抗原結合ドメインおよび受容体のリガンド結合ドメインが含まれる。このドメインは、細胞表面に存在する抗原に結合して相互作用し、それにより、ＣＡＲを発現する細胞に対する特異性を付与する。例えば、本開示のＣＡＲに関して使用される細胞外ドメインは、抗体（例えば、Ｈ鎖およびＬ鎖）の可変領域、一本鎖およびその結合フラグメントもしくはＴＣＲ（ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ）を含んでなり、および／またはそれに由来し、あるいはＣＤ４エクトドメイン、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ１１Ｃ、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ４９Ａ、ＣＤ４９Ｂ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９Ｅ、ＣＤ４９Ｆ、ＣＤ６１、ＣＤ４１、および／またはＣＤ５１に由来する。これらのタンパク質の全領域を使用してもよい。他方、抗原またはリガンドに結合し得るドメイン、例えば、抗体Ｆａｂフラグメント、抗体可変領域［Ｈ鎖のＶ領域（ＶＨ）およびＬ鎖（ＶＬ）のＶ領域］または受容体の細胞外リガンド結合ドメインを使用することができる。特に、ある実施形態では、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を使用することができる。例えば、ＣＤ４エクトドメインは、ＨＩＶ感染細胞を認識することができる。
【００７９】
本開示のＣＡＲの細胞外ドメインは、１つのみの抗原もしくはリガンドに結合してもよく、または２以上の抗原もしくはリガンドに結合してもよい。加えて、本開示は、１つの細胞外ドメインを含んでなるＣＡＲと２以上の細胞外ドメインを含んでなるＣＡＲの両方を含む。
【００８０】
本開示のＣＡＲの細胞外ドメインは、標的抗原を認識する抗体、場合により、細胞表面抗原もしくは可溶性抗原、または抗原と相互作用する分子から選択され得る。抗原の例としては、ウイルス抗原、細菌（特に、感染性細菌）抗原、寄生虫抗原、特定の病態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカー（例えば、腫瘍抗原）、および免疫細胞の表面分子が含まれる。
【００８１】
本開示は、一側面において、レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−ＬＰ）、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、およびエコーウイルス）、風疹ウイルス、コロナウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科［例えば、１型および２型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘−帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、およびヘルペスウイルス］、ポックスウイルス科（例えば、痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、およびポックスウイルス）、またはＣ型肝炎ウイルスに由来する抗原と結合し得るＣＡＲを提供する。
【００８２】
本開示は、別の側面において、ブドウ球菌属(Staphylococci)、連鎖球菌属(Streptococcus)、大腸菌(Escherichia coli)、シュードモナス(Pseudomonas)、またはサルモネラ菌属(Salmonella)の菌株に由来する抗原と結合し得るＣＡＲを提供する。特に、本開示は、感染性細菌、例えば、ピロリ菌(Helicobacter pyloris)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophilia)、マイコバクテリア種の菌株（例えば、結核菌(M. tuberculosis)、鳥結核菌(M. avium)、Ｍ．イントラセルラーレ(M. intracellulare)、Ｍ．カンサシー(M. kansaii)、またはＭ．ゴルドネ(M. gordonea)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitides)、リステリア菌(Listeria monocytogenes)、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)、Ａ群連鎖球菌属、Ｂ群連鎖球菌属（ストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、または破傷風菌(Clostridium tetani)に由来する抗原と結合し得るＣＡＲを提供する。
【００８３】
本開示は、別の側面において、５Ｔ４、α  ５β１−インテグリン、７０７−ＡＰ、ＡＦＰ、ＡＲＴ−４、Ｂ７Ｈ４、ＢＡＧＥ、β−カテニン／ｍ、Ｂｃｒ−ａｂｌ、ＭＮ／Ｃ  ＩＸ抗体、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、ＣＴ、Ｃｙｐ−Ｂ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥｐＣａｍ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ−２／ｎｅｗ、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７０Ｉ、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ｉＣＥ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−５、ＫＩＡＡ０２０５、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＡＲＴ−２／Ｓｋｉ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ＮＡ８８−Ａ、ＰＡＰ、プロテイナーゼ−３、ｐ１９０  ｍｉｎｏｒ  ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｐｍｌ／ＲＡＲα、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１またはＳＡＲＴ−３、サバイビン、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＧＦβ、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、ＶＥＧＦ、ＷＴ１、ＮＹ−Ｅｓｏ−１またはＮＹ−Ｅｓｏ−Ｂなどの腫瘍抗原と結合し得るＣＡＲを提供する。本開示はまた、細胞表面接着分子、自己免疫疾患に見られる炎症性細胞の表面分子、または自己免疫を生じるＴＣＲと結合し得るＣＡＲも提供する。
【００８４】
（ｂ）細胞内セグメント
本開示によるＣＡＲの細胞内セグメントは、１以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなり得、同じ分子内に存在する細胞外ドメインがそのコグネイト抗原／リガンドと結合（相互作用）する際に細胞にシグナルを伝達し得る、タンパク質性分子である。
【００８５】
ある側面において、ＣＡＲ細胞内セグメントは、外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフを含んでなるＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる。加えて、ＣＡＲ細胞内セグメントは、ＩＬ受容体鎖の細胞質ドメインおよび／または細胞質共刺激ドメインから選択される１以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなり、前記細胞内セグメントは、内因性または外因性ＪＡＫ結合モチーフおよびＳＴＡＴ５関連モチーフを含んでなる。
【００８６】
一次細胞質シグナル伝達配列は、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。例えば、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞質シグナルを提供する。一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）[Nature, vol. 338, pp. 383-384 (1989)]として知られるシグナル伝達モチーフを含んでいてもよい。他方、阻害的に働く一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）[J Immunol., vol. 162, No. 2, pp. 897-902 (1999)]として知られるシグナル伝達モチーフを含んでいてもよい。本開示では、ＩＴＡＭおよび／またはＩＴＩＭを有する細胞内シグナル伝達ドメインを使用することができる。
【００８７】
使用可能なＩＴＡＭを有する細胞内シグナル伝達ドメインの例は、例えば、ＣＤ３ζの代わりに、またはＣＤ３ζと置き換えて、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するＩＴＡＭを有する細胞内シグナル伝達ドメインを含む。具体的には、１以上のＩＴＡＭを含んでなる細胞内ドメインの例には、ＣＤ３ζ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿９３２１７０．１）のアミノ酸番号５２〜１６４（配列番号７）、ＦｃεＲＩγ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００４０９７．１）のアミノ酸番号４５〜８６、ＦｃεＲＩβ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００１３０．１）のアミノ酸番号２０１〜２４４、ＣＤ３γ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００００６４．１）のアミノ酸番号１３９〜１８２、ＣＤ３δ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００７２３．１）のアミノ酸番号１２８〜１７１、ＣＤ３ε（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００７２４．１）のアミノ酸番号１５３〜２０７、ＣＤ５（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０５５０２２．２）のアミノ酸番号４０２〜４９５、ＣＤ２２（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７６２．２）のアミノ酸番号７０７〜８４７、ＣＤ７９ａ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７７４．１）のアミノ酸番号１６６〜２２６、ＣＤ７９ｂ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００６１７．１）のアミノ酸番号１８２〜２２９、およびＣＤ６６ｄ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１８０６．２）のアミノ酸番号１７７〜２５２の配列を有するペプチド、ならびにこれらのペプチドと同じ機能を有するそれらの変異体が含まれる。本明細書に記載のＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤまたはＧｅｎＢａｎｋのアミノ酸配列情報に基づくアミノ酸番号は、各タンパク質の前駆体（シグナルペプチド配列などを含んでなる）の全長に基づいて符番されている。
【００８８】
ＣＤ３ζが以上のものに置き換わっている実施形態では、外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフは、ＣＤ３ζ置換部に導入される。
【００８９】
ＳＴＡＴ３転写因子シグナル伝達は、ヒトＴ細胞記憶の生成と維持に重要な役割を果たす(Siegel et al. 2011)。ＳＴＡＴ３シグナル伝達はまた、Ｔ細胞において、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）抗腫瘍効果を増強する可能性もある(Blood. 2010 and J Exp Med. 2005)。
【００９０】
ある実施形態では、外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフは、ＹＸＸＱ（配列番号１３）である。示されたように、ＣＤ３ζシグナル伝達ペプチドの細胞内シグナル伝達ドメイン内に含まれる外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフＹＸＸＱ（配列番号１３）は、ＳＴＡＴ３結合能がある。ある実施形態では、ＣＤ３ζの細胞内ドメインは、配列番号７の配列である。
【００９１】
ある実施形態では、ＳＴＡＴ３関連モチーフＹＸＸＱ（配列番号１３）において「Ｘ」で表されるアミノ酸残基は、ＳＴＡＴ３結合を保持するいずれの修飾天然アミノ酸も含む、任意の天然アミノ酸であり得る。１つの実施形態では、アミノ酸Ｘは、ロイシン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、リシン、プロリン、メチオニン、バリン、グルタミン、トレオニン、アスパラギン酸から独立に選択される。例えば、アミノ酸Ｘはアルギニンである。例えば、アミノ酸Ｘはヒスチジンである。
【００９２】
ある実施形態では、チロシン残基に隣接する２つのアミノ酸残基は、アルギニン−ヒスチジンである。さらに別の実施形態では、外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフは、ＹＲＨＱ（配列番号２２）である。
【００９３】
外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフＹＸＸＱ（配列番号１３）はＣＤ３ζの細胞内ドメインのどの部分に導入されてもよいが、ある実施形態では、ＹＸＸＱ関連モチーフはＣ末端領域付近に挿入される。特定の理論に縛られることを望むものではないが、多くの内因性ＹＸＸＱモチーフは、Ｃ末端から１００ａａ付近またはそれ以内に配置されると考えられる。また、Ｃ末端領域付近にあるＹＸＸＱモチーフは、ＧＰ１３０およびＬＩＦＲ研究でより近位にある方が機能性が高いことが示されている(Schmitz J et al. J Immunol. 2000;164:848-54; Tomida M et al. Blood. 1999;93:1934-41)。
【００９４】
ある実施形態では、外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフＹＸＸＱ（配列番号１３）は、ＣＡＲのＣ末端から２００アミノ酸残基内にあるＣＤ３ζの細胞内ドメインの任意の部分に導入される。例えば、ＳＴＡＴ３関連モチーフは、ＣＡＲのＣ末端から２００アミノ酸残基内、１５０アミノ酸残基内、１００アミノ酸残基内、９０アミノ酸残基内、８０アミノ酸残基内、７０アミノ酸残基内、６０アミノ酸残基内、５０アミノ酸残基内、４０アミノ酸残基内、３０アミノ酸残基内、２０アミノ酸残基内または１０アミノ酸残基内に導入される。
【００９５】
本明細書で述べられるように、ＣＤ３ζの細胞内ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含んでなる。１つの実施形態では、外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフは、ＩＴＡＭ以外の場所に導入される。
【００９６】
ＩＴＡＭは、機能的に冗長であるが、それらはシグナル伝達応答の強度に関して相加作用を有する。例えば、ＣＤ３ζの細胞内ドメインは、細胞内シグナル伝達のための３つのＩＴＡＭを含んでなる。よって、１つの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲのＣＤ３ζ細胞内ドメイン内のＩＴＡＭモチーフは維持される。
【００９７】
ある実施形態では、外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフを含んでなるＣＤ３ζ細胞内ドメインは、少なくとも１つのＩＴＡＭモチーフを含んでなる。１つの実施形態では、外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフを含んでなるＣＤ３ζ細胞内ドメインは、２つのＩＴＡＭモチーフを含んでなる。さらなる実施形態では、外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフを含んでなるＣＤ３ζ細胞内ドメインは、３つのＩＴＡＭモチーフを含んでなる。
【００９８】
当業者は、Ｄ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインにＳＴＡＴ３関連モチーフを導入するためにいくつかの方法が使用可能であることを認識するであろう。例えば、図１に示されるように、外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフは、１０４〜１０６位のアミノ酸残基Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔを残基１０４番のチロシンとそのチロシン残基に１０５番および１０６番で隣接する任意の他の２個のアミノ酸残基で置換し、それにより、ＹＸＸＱ（配列番号１３）関連モチーフを形成することにより導入することができる。ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基１０４−１０５−１０６は、  全長ＣＤ３ζ（例えば、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿９３２１７０．１）のアミノ酸残基１５６−１５７−１５８に相当する。ＣＤ３ζ細胞内ドメインの残基１０４〜１０７にＹＸＸＱモチーフを含んでなる２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）の配列が配列番号２４に示される。ＣＤ３ζ細胞内ドメイン（ＣＤ３ζ細胞内ドメインは、配列番号２５の残基４７５〜５８６で示される）の残基１０４〜１０７にＹＲＨＱ（配列番号２２）モチーフを含んでなる２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＲＨＱ）の配列。
【００９９】
例えば、ＳＴＡＴ３モチーフは、例えば、ギブソンアセンブリ法を用い、部位特異的変異誘発によって導入することができる。以下のプライマーがギブソンアセンブリに使用できる：フォワード、ＡＣＧＣＣＴＡＴＣＧＣＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣ（配列番号２６）；およびリバース、ＣＴＧＡＴＧＧＣＧＡＴＡＧＧＣＧＴＣＧＴＡＧＧＴＧＴ（配列番号２７）。使用可能な他の方法には、例えば、ＰＣＲに基づく技術、例えば、ポリメラーゼ不完全プライマー伸長(polymerase incomplete primer extension)（ＰＩＰＥ）クローニング、配列および連結非依存的クローニング（ＳＬＩＣ）およびオーバーラップエクステンションクローニング（ＯＥＣ）(Klock et al., 2008; Li et al., 2007; Bryskin et al., 2010; Unger et al., 2010)が含まれる。
【０１００】
記載のように、ある実施形態におけるＣＡＲは、ＩＬＲ鎖および細胞質共刺激ドメインの細胞質ドメインから選択される１以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる細胞内セグメントを含んでなる。
【０１０１】
本開示に使用されるＩＬ受容体鎖の細胞質ドメインは、ＩＬ受容体の任意の鎖から選択することができ、例えば、ＩＬ−２受容体β鎖（ＮＣＢＩ  ＲＥＦＳＥＱ：ＮＰ＿０００８６９．１）（配列番号１１、ＩＬ−２１受容体α鎖（ＮＣＢＩ  ＲＥＦＳＥＱ：ＮＰ＿０６８５７０．１；配列番号６）のアミノ酸番号２５６〜５３８）のアミノ酸番号２６６〜５５１、共通ＩＬ−２受容体γ鎖（ＮＣＢＩ  ＲＥＦＳＥＱ：ＮＰ＿０００１９７．１）のアミノ酸番号２８４〜３６９、ＩＬ−７Ｒα（ＮＣＢＩ  ＲＥＦＳＥＱ：ＮＰ＿００２１７６．２）のアミノ酸番号２６５〜４５９、ＩＬ−９Ｒα（ＮＣＢＩ  ＲＥＦＳＥＱ：ＮＰ＿００２１７７．２）のアミノ酸番号２９２〜５２１またはＩＬ−４Ｒα（ＮＣＢＩ  ＲＥＦＳＥＱ：ＮＰ＿０００４０９．１）のアミノ酸番号２５７〜８２５を含んでなる細胞質ドメインが使用可能である。ＩＬ受容体鎖の細胞質ドメインの全領域が使用可能である（例えば、本明細書に示される配列）。
【０１０２】
あるいは、ＩＬ受容体鎖の前記細胞質ドメインの末端切断フラグメントも使用可能である。例えば、末端切断フラグメントは、ＩＬＲ細胞質ドメインの２５０までのアミノ酸を含んでなるか、または５０〜２００アミノ酸もしくは８０〜１５０アミノ酸である。
【０１０３】
ある実施形態では、ＩＬ受容体鎖の細胞質ドメイン、場合により、ＩＬ受容体鎖の前記細胞質ドメインの末端切断フラグメントは、少なくともＳＴＡＴ関連モチーフ、場合により、ＳＴＡＴ５関連モチーフ、とＪＡＫ結合モチーフ（ｂｏｘ−１モチーフとしても知られる）とを含んでなる。ある実施形態では、ＩＬ受容体鎖の細胞質ドメインまたはその末端切断フラグメントは、ＳＴＡＴ５関連モチーフとＪＡＫ結合モチーフとを含んでなる。
【０１０４】
ある実施形態では、ＩＬ受容体鎖の細胞質ドメインおよび／または末端切断フラグメントには、同じ機能を有する変異体、例えば、ＳＴＡＴシグナル伝達、場合により、ＳＴＡＴ５シグナル伝達および／またはＪＡＫシグナル伝達を誘導する変異体が含まれる。
【０１０５】
本開示の１つの側面では、ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）β鎖の細胞質ドメインが使用可能である。本開示で使用可能なＩＬ−２Ｒ  β鎖の細胞質ドメインの例には、ＩＬ−２Ｒ  β鎖（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００８６９．１、配列番号１１）のアミノ酸番号２６６〜５５１が含まれる。本開示の１つの側面では、ＩＬ−２Ｒ  β鎖の細胞質ドメインの末端切断フラグメントが使用可能である。この末端切断フラグメントは、ｉ）チロシンキナーゼＪＡＫ１との会合を可能とする、ＢＯＸ−１モチーフとも呼ばれる、ＪＡＫ結合モチーフ（例えば、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００８６９．１のアミノ酸番号２７８〜２８６）、およびｉｉ）ＳＴＡＴ関連モチーフ、場合により、ＳＴＡＴ５またはＳＴＡＴ３関連モチーフを含んでいてもよい。ＩＬ受容体鎖の他の部分は、例えば、保存的アミノ酸バリエーションによって変更可能である。
【０１０６】
ある実施形態では、細胞内セグメントは、外因性ＪＡＫ結合モチーフ、またはＪＡＫ結合モチーフを含んでなるシグナル伝達分子を含んでいてもよい。例えば、ＪＡＫ結合モチーフは、ＩＬ２Ｒγ（ＩＬ２ＲＧ）、エリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）、トロンボポエチン受容体（ＴｐｏＲ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体（ＧＭ−ＣＳＦＲ）、および成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）に由来する。
【０１０７】
ＩＬ−２Ｒ  β鎖は、ＳＴＡＴ５会合に使用される３つの機能的ＳＴＡＴ５結合モチーフ、ＹＦＦＦ（配列番号２８）、ＹＣＴＦ（配列番号２９）およびＹＬＳＬ（配列番号４３）を含んでなる。これらのチロシン残基の変異は、ＩＬ−２Ｒ  β鎖のＩＬ−２反応性を無効にし得る(Friedmann et al., 1996)。エリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）は、ＳＴＡＴ５の活性化を媒介する２つのチロシン残基、すなわち、Ｙ３４３とＹ４０１を含んでなり、両方ともＹＸＸＬモチーフ（配列番号４１）を有することが記載されている(Klingmuller et al., 1996)。従って、ＹＸＸＬ（配列番号４１）は、ＳＴＡＴ５の動員に好ましいモチーフであり得る。例えば、ＩＬ−２Ｒ  β鎖  ＳＴＡＴ５結合モチーフで示されているように、他のアミノ酸残基も機能的である。１つの実施形態では、ＳＴＡＴ５関連モチーフは、ＩＬ−２Ｒ  β鎖  ＳＴＡＴ５関連モチーフであり、チロシン残基−５１０（チロシン残基５１０は、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００８６９．１のアミノ酸番号５３６である）を含んでなる。
【０１０８】
ある実施形態では、ＳＴＡＴ５関連モチーフは、ＩＬ２Ｒγ、ＥｐｏＲ、ＴｐｏＲ、ＧＭ−ＣＳＦＲおよびＧＨＲに由来し得る。
【０１０９】
ある実施形態では、ＩＬ−２Ｒ  β鎖のＳＴＡＴ５関連モチーフは、アミノ酸残基ＹＸＸＬ（配列番号４１）を含んでなる。ある実施形態では、ＳＴＡＴ５関連モチーフにおいて「Ｘ」で表されるアミノ酸残基は、ＳＴＡＴ５結合を保持する任意の修飾天然アミノ酸を含む、任意の天然アミノ酸であり得る。
【０１１０】
ある実施形態では、ＳＴＡＴ５関連モチーフは、チロシン残基５１０と、チロシン残基５１０のＣ末端側に隣接する４残基、すなわち、ＹＬＳＬＱ（配列番号１２）を含んでなる。
【０１１１】
ＳＴＡＴ５関連モチーフは、細胞質ドメイン内に内在し得る。例えば、ＩＬ−２Ｒβ鎖の細胞質ドメインは、ＳＴＡＴ５関連モチーフを含んでなる。ＳＴＡＴ５関連モチーフはまた、このモチーフを天然には発現しない細胞質ドメインに導入することもできる。例えば、ＳＴＡＴ５会合は、例えば、本明細書に記載のものを含む既知の方法を用い、アミノ酸残基の置換または挿入により導入することができる。
【０１１２】
他のＳＴＡＴ３関連モチーフも知られており、例えば、ＩＬ２１ＲのＹＬＲＱ（配列番号３０）；ＩＬ６ＳＴのＹＲＨＱ（配列番号２２）、ＹＦＫＱ（配列番号３１）、ＹＬＰＱ（配列番号３２）およびＹＭＰＱ（配列番号３３）；ＧＣＳＦＲのＹＶＬＱ（配列番号３４）；ＬＩＦＲのＹＱＰＱ（配列番号３５）、ＹＫＰＱ（配列番号３６）およびＹＲＰＱ（配列番号３７）；ＦＧＦＲ１のＹＴＨＱ（配列番号３８）；ＩＬ１０ＲＡのＹＬＲＱ（配列番号３０）およびＹＬＫＱ（配列番号３９）；ならびにＥＧＦＲのＹＨＮＱ（配列番号４０）が含まれる(Shao et al., 2004)。
【０１１３】
ある実施形態では、細胞内セグメントは、複数のＳＴＡＴ３関連モチーフおよび／または複数のＳＴＡＴ５関連モチーフを含む、ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５関連モチーフを含んでなる。
【０１１４】
ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５関連モチーフは、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインのいずれに配置または導入することもできる。
【０１１５】
同様に、細胞内セグメントは、細胞内シグナル伝達ドメインのいずれに配置または導入することもできる１以上のＪＡＫ結合モチーフを含んでなる。
【０１１６】
ＢＯＸ−１モチーフはまた、配列番号５のアミノ酸１３〜２１としても示され、チロシン残基−５１０はまた、配列番号５のアミノ酸番号７９としても示される（およびこのチロシン残基に隣接するモチーフはアミノ酸８０〜８３である）。ある実施形態では、インターロイキン受容体細胞質ドメインフラグメントは、配列番号５のアミノ酸２２〜７８を含んでなる。ＩＬ−２Ｒ  β鎖の細胞質ドメインの末端切断フラグメント（配列番号５）の例には、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００８６９．１のアミノ酸番号２６６〜３３７および５３０〜５５１の配列を有するペプチドが含まれる。
【０１１７】
本開示の１つの側面では、ＩＬ−２１受容体（ＩＬ−２１Ｒ）α鎖の細胞質ドメインが使用可能である。本開示で使用されるＩＬ−２１Ｒ  α鎖の細胞質ドメインの例には、ＩＬ−２１Ｒ  α鎖のアミノ酸番号２５６〜５３８（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０６８５７０．１、配列番号６）を含んでなる細胞内シグナル伝達ドメインが含まれる。本開示の１つの側面で、ＩＬ−２１Ｒ  α鎖の細胞質ドメインの末端切断フラグメントが使用可能である。末端切断フラグメントには、チロシンキナーゼＪＡＫ１との会合に必要なｂｏｘ−１モチーフ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０６８５７０．１のアミノ酸番号２６６〜２７４）が含まれ、また、ＳＴＡＴ関連モチーフが含まれる。ある実施形態では、ＳＴＡＴ関連モチーフは、チロシン残基−５００（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００８６９．１のアミノ酸番号５１９）およびＳＴＡＴ１／３会合に必要とされるチロシン残基５００、すなわち、ＹＬＲＱ（配列番号３０）のＣ末端側に隣接する３残基を含んでなる。
【０１１８】
細胞内シグナル伝達ドメインの他の例には、ＴＣＲ複合体および／または共刺激分子に由来する細胞質領域、およびそれらの配列と同じ機能を有する任意の変異体が含まれる。他の例には、引用することにより本明細書の一部とされるSadelain et al 2009の表２に挙げられている細胞質シグナル伝達ドメインが含まれる。
【０１１９】
天然Ｔ細胞の活性化は、２つの異なる種類の細胞内シグナル伝達ドメイン、すなわち、ＴＣＲ複合体を介して抗原依存的一次活性化（例えばＣＤ３ζにより提供される、例えば、一次細胞質シグナル）を誘導するためのドメインおよび二次または共刺激シグナル（二次細胞質シグナル）を提供するために抗原非依存的に作用するドメインにより伝達される。
【０１２０】
１つの側面において、本開示のＣＡＲ細胞内セグメントは、外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフおよび場合により、二次細胞質シグナル伝達配列を含んでなるＣＤ３ζ細胞内細胞質シグナル伝達ドメインを含んでなる。
【０１２１】
本明細書で使用する場合、用語「二次細胞質シグナル伝達」および「共刺激」は互換的に使用される。
【０１２２】
本開示で使用可能な二次または共刺激細胞質シグナル伝達ドメインを含んでなる細胞内ドメインの例には、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＩＣＯＳ、およびＣＤ１５４、例えば、シグナル伝達モチーフを含んでなるその末端切断フラグメント、に由来する配列が含まれる。その具体例には、ＣＤ２（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７５８．２）のアミノ酸番号２３６〜３５１、ＣＤ４（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００６０７．１）のアミノ酸番号４２１〜４５８、ＣＤ５（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０５５０２２．２）のアミノ酸番号４０２〜４９５、ＣＤ８α（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７５９．３）のアミノ酸番号２０７〜２３５、ＣＤ８β（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３５６６４．１）のアミノ酸番号１９６〜２１０、ＣＤ２８（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００６１３０．１）のアミノ酸番号１８０〜２２０（配列番号８）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１５５２．２）のアミノ酸番号２１４〜２５５、ＣＤ１３４（ＯＸ４０、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００３３１８．１）のアミノ酸番号２４１〜２７７、およびＩＣＯＳ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０３６２２４．１）のアミノ酸番号１６６〜１９９の配列を有するペプチド、およびこれらのペプチドが有するものと同じ機能を有するそれらの変異体が含まれる。
【０１２３】
１つの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲ細胞内セグメントは、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ１３４およびＣＤ１３７から選択される細胞質共刺激ドメインをさらに含んでなる。
【０１２４】
好ましい開示は、１つの側面において、外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフを含んでなるＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインに加えて、１以上の、例えば、２または３の細胞内シグナル伝達ドメインを有する細胞内セグメントを含んでなるＣＡＲを含む。
【０１２５】
本開示はまた、直列された２以上の同じ細胞内シグナル伝達ドメインを有する細胞内セグメントを含んでなるＣＡＲを含む。１つの側面において、本開示は、ＩＬ受容体の細胞質ドメインがＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインのＮ末端側にあるＣＡＲ、すなわち、ＩＬ受容体の細胞質ドメインとＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインが、Ｎ末端側からこの順序で連結されたものを含んでなるＣＡＲを提供する。本開示はまた、上述のＣＡＲにＣＤ２８（例えば、ＣＤ２８の細胞質共刺激ドメイン）の細胞内ドメインをさらに付加することにより得られるＣＡＲ、すなわち、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインと、ＩＬ受容体の細胞質ドメインと、外因性ＳＴＡＴ３モチーフを含んでなるＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインとが、Ｎ末端側からこの順序で連結されたものを含んでなるＣＡＲも含む。
【０１２６】
ある実施形態では、ＣＡＲは、外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフと、インターロイキン受容体鎖の細胞質ドメインおよび細胞質共刺激ドメインから選択される細胞内シグナル伝達ドメインとを含んでなる、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる細胞内セグメントを含んでなり、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインの少なくとも１つは、内因性のまたは外因性ＪＡＫ結合モチーフおよびＳＴＡＴ５関連モチーフを含んでなる。
【０１２７】
１つの実施形態では、ＣＡＲは、外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフを有するＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインと、内因性または外因性ＪＡＫ結合モチーフおよびＳＴＡＴ５関連モチーフを含んでなるＩＬ受容体鎖フラグメントの細胞質ドメインと、ＣＤ２８の細胞質共刺激ドメインとを含んでなる。
【０１２８】
本開示のＣＡＲでは、オリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーが、細胞内セグメントのドメイン間に、そこでドメインを連結するように、および／またはそれらを他のドメインと連結するように挿入できる。例えば、２〜１０アミノ酸長を有するリンカーが使用できる。特に、グリシン−セリン連続配列を有するリンカーが使用できる。例えば、リンカーＩＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４２）を、ＣＤ２８細胞質ドメインと部分的細胞質ＩＬ−２受容体βドメインの間に挿入することができる。例えば、リンカーＫＬＧＧＳＧＰ（配列番号１９）を、部分的細胞質ＩＬ−２受容βドメインとおよびＣＤ３ζ鎖の細胞内ドメインの間に挿入することができる。
【０１２９】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、例えば配列番号２４に示されるように、シグナルペプチドと、ＦＭＣ６３一本鎖可変フラグメント細胞外ドメインと、ＣＤ２８膜貫通と、ＣＤ２８細胞質ドメインと、ＪＡＫ結合モチーフおよび内因性ＳＴＡＴ５関連モチーフを含んでなる部分的細胞質ＩＬ−２受容体βドメインと、外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフを含んでなるＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインとが、Ｎ末端側からこの順序で連結されたものを含んでなる。
【０１３０】
別の側面では、ｉ）所定の抗原に結合し得る細胞外ドメイン、ｉｉ）膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）インターロイキン受容体鎖の細胞質ドメインおよび場合により補足的細胞質ドメインを含む１以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる細胞内セグメント、を含んでなるＣＡＲが提供される。
【０１３１】
ＩＬ受容体鎖の細胞質ドメインは、本明細書に記載のＩＬ受容体のいずれの鎖から選択されてもよい。ＩＬ受容体鎖の細胞質ドメインの全領域が使用可能である。あるいは、ＩＬ受容体鎖の前記細胞質ドメインの末端切断フラグメントもまた使用可能である。全長およびその末端切断フラグメントの例は本明細書に示される。
【０１３２】
ある実施形態では、末端切断フラグメントは、本明細書に記載の、少なくとも１つのチロシンキナーゼ関連モチーフ（ｂｏｘ−１モチーフとしても知られる）およびＳＴＡＴ（シグナル伝達転写活性化因子）関連モチーフを含んでいてもよい。例えば、末端切断フラグメントは、ＩＬＲ細胞質ドメインの２５０までのアミノ酸を含んでなるか、または５０〜２００アミノ酸もしくは８０〜１５０アミノ酸である。
【０１３３】
本明細書に記載されるように、ＩＬ−２Ｒ  β鎖のＳＴＡＴ関連モチーフは、チロシン残基−５１０（チロシン残基５１０は、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００８６９．１のアミノ酸番号５３６である）を含んでなる。ある実施形態では、ＳＴＡＴ関連モチーフは、チロシン残基５１０と、チロシン残基５１０のＣ末端側に隣接する４残基、すなわち、ＹＬＳＬＱ（配列番号１２）を含んでなる。
【０１３４】
他のＳＴＡＴ関連モチーフも知られており、例えば、Kisseleva et al 2002の表２に示されているように、ＩＬ−６のＹＸＸＱ（配列番号１３）、場合により、ＹＸＰＱ、ＩＬ−１０のＹＸＸＱ（配列番号１３）、ＩＬ−１２のＹＬＰＳＮＩＤ（配列番号１４）、ＩＬ−２のＹＬＳＬＱ（配列番号１２）、ＹＣＴＦＰ（配列番号１５）、ＹＦＦＦＨ（配列番号１６）、ＩＬ−７のＹＶＴＭＳ（配列番号１７）、ＩＬ−９のＹＬＰＱＥ（配列番号１８）、ならびにＩＬ−４のＹＫＡＦＳ（配列番号２０）およびＹＫＰＦＱ（配列番号２１）が含まれる。いずれのＳＴＡＴシグナル伝達ドメインも使用可能であり、および／またはＩＬＲ鎖に導入できる。
【０１３５】
ある実施形態では、ＩＬ受容体の細胞質ドメインに加えて、ＣＡＲ細胞内セグメントは、ＩＬ受容体内に存在するもの以外の少なくとも１つの補足的シグナル伝達ドメインを含んでなる。細胞内シグナル伝達ドメインの例には、ＴＣＲ複合体由来の細胞質領域および／または共刺激分子、およびそのような配列と同じ機能を有する任意の変異体が含まれる。他の例としては、引用することにより本明細書の一部とされるSadelain et al 2009の表２に挙げられている細胞質シグナル伝達ドメインが含まれる。
【０１３６】
ある実施形態では、ＣＡＲ細胞内セグメントは、細胞内シグナル伝達ドメインとして本明細書に記載されている一次細胞質シグナル伝達配列および／または二次（例えば、共刺激）細胞質シグナル伝達配列を含んでなる。
【０１３７】
ある実施形態では、細胞内セグメントは、本明細書に記載のＩＴＡＭおよび／またはＩＴＩＭを有する細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる。
【０１３８】
本開示は、ＩＬ受容体の細胞質ドメインに加えて、１以上、例えば、２または３の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる細胞内セグメントを含んでなるＣＡＲを含む。例えば、ＣＡＲは、ＩＬ受容体の細胞質ドメインおよびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる。例えば、ＣＡＲは、ＩＬ受容体の細胞質ドメイン、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８の細胞質共刺激ドメインを含んでなる。
【０１３９】
本開示はまた、直列された２以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる細胞内セグメントを含んでなるＣＡＲを含む。例えば、ＣＡＲは、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインのＮ末端側にＩＬ受容体の細胞質ドメインを含んでなり、すなわち、それは、ＩＬ受容体の細胞質ドメインとＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインが、Ｎ末端側からこの順序で連結されたものを含んでなる。
【０１４０】
本開示はまた、上述のＣＡＲに導入されたＣＤ２８の細胞内ドメインをさらに含んでなるＣＡＲ、すなわち、ＣＤ２８の細胞質共刺激ドメインと、ＩＬ受容体の細胞質ドメインと、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインが、場合によりＮ末端側からこの順序で連結されたものを含んでなるＣＡＲも含む。例えば、ＣＡＲ細胞内セグメントは、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインのＣ末端側にＩＬ受容体の細胞質ドメインを含んでなり、すなわち、それは、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインとＩＬ受容体の細胞質ドメインは、Ｎ末端側からこの順序で連結されたものを含んでなる。
【０１４１】
よって、ある実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる細胞内セグメント、１以上の細胞質共刺激ドメインを含んでなり、ここで、前記細胞内セグメントは、ＪＡＫ結合モチーフ、ＳＴＡＴ５および／またはＳＴＡＴ３関連モチーフを含んでなる。
【０１４２】
（ｃ）膜貫通ドメインおよびスペーサードメイン
本開示のＣＡＲは、膜貫通ドメインを含んでなる。膜貫通ドメインは、天然ポリペプチドに由来してもよく、または人工的に設計されてもよい。天然ポリペプチド由来の膜貫通ドメインは、膜結合または膜貫通タンパク質から得ることができる。例えば、Ｔ細胞受容体αまたはβ鎖、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、またはＧＩＴＲの膜貫通ドメインが使用可能である。人工的に設計された膜貫通ドメインは、主として、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含んでなるポリペプチドである。例えば、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが合成膜貫通ドメインの各末端に見られ得る。場合により、短鎖オリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、例えば、２〜１０アミノ酸長のリンカーを、本明細書に記載の膜貫通ドメインと細胞内セグメントの間に配置することができる。特に、グリシン−セリン連続配列を有するリンカー配列が使用可能である。
【０１４３】
例えば、ＣＤ２８（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００６１３０．１）のアミノ酸番号１５３〜１７９（配列番号９）の配列を有する膜貫通ドメインが膜貫通ドメインとして使用できる。
【０１４４】
本開示のＣＡＲでは、スペーサードメインを、細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間、または細胞内セグメントと膜貫通ドメインの間に配置することができる。スペーサードメインは、膜貫通ドメインを細胞外ドメインと、および／または膜貫通ドメインを細胞内セグメントと連結する働きをするいずれのオリゴペプチドまたはポリペプチドも意味する。スペーサードメインは、３００個までのアミノ酸、例えば、約１０〜１００個のアミノ酸、または約２５〜５０個のアミノ酸を含んでなる。
【０１４５】
スペーサードメインは、好ましくは、ＣＡＲと抗原の結合を促進し、かつ、細胞へのシグナル伝達を増強する配列を有する。結合を促進することが期待されるアミノ酸の例には、システイン、荷電アミノ酸、ならびに潜在的グリコシル化部位内のセリンおよびトレオニンが含まれ、これらのアミノ酸は、スペーサードメインを構成するアミノ酸として使用することができる。
【０１４６】
ある実施形態では、スペーサードメインは、ＣＤ８α（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７５９．３）のアミノ酸番号１１８〜１７８、すなわち、ＣＤ８αのヒンジ領域、ＣＤ８β（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３５６６４．１）のアミノ酸番号１３５〜１９５、ＣＤ４（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００６０７．１）のアミノ酸番号３１５〜３９６、ＣＤ２８（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００６１３０．１）のアミノ酸番号１１４〜１５２（配列番号１０）、またはそれらの一部を含んでなるか、またはからなるポリペプチドである。さらに、スペーサードメインは人工的合成された配列であってもよい。
【０１４７】
本開示のＣＡＲは、ポリマー、特に、二量体を形成するように設計することができる。例えば、例えばジスルフィド結合を介してＣＡＲを重合（二量体化）するために、システインがスペーサードメインおよび／または膜貫通ドメインに挿入される。
【０１４８】
さらに、本開示のＣＡＲでは、シグナルペプチド配列をＮ末端に連結することができる。シグナルペプチド配列は、多くの分泌タンパク質および膜タンパク質のＮ末端に存在し、１５〜３０アミノ酸長を有する。本明細書に記載の細胞内ドメインを有するタンパク質分子の多くは膜タンパク質であり、シグナルペプチド配列を有する。このような分泌タンパク質および膜タンパク質に由来するシグナルペプチドは、本開示のＣＡＲのシグナルペプチドとして使用可能である。いずれのシグナルペプチドも使用可能である。例えば、シグナルペプチドは、オンコスタチンＭシグナルペプチドであり得る。シグナルペプチドは、ヒト由来であってよく、また、非ヒト、例えば、昆虫細胞またはウイルス由来であってもよい。ある実施形態では、シグナルペプチドは、ヒトシグナルペプチドである。
【０１４９】
（２）ＣＡＲをコードする核酸
本開示は、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸を提供する。ＣＡＲをコードする核酸は、示されたＣＡＲのアミノ酸配列から常法により容易に作製することができる。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、各ドメインのアミノ酸配列に関する上述のＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤまたはＧｅｎＢａｎｋ受託番号から取得することができ、標準的な分子生物学的および／または化学的手順を用いて本開示の核酸を作製することができる。例えば、ヌクレオチド配列に基づいて核酸を合成することができ、ｃＤＮＡライブラリーからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて得られたＤＮＡフラグメントを組み合わせることによって本開示の核酸を作製することができる。
【０１５０】
本開示の核酸は、好適なプロモーターの制御下で発現されるように別の核酸に連結することができる。プロモーターの例には、遺伝子または作動可能に連結された構築物の発現を構成的に促進するプロモーター、薬物などの（例えば、テトラサイクリンまたはドキソルビシン）の作用により遺伝子または作動可能に連結された構築物の発現を誘導するプロモーターが含まれる。本開示の核酸はまた、核酸の効率的な転写を得るために、プロモーターまたは転写開始部位と協働する他の調節エレメント、例えば、エンハンサー配列またはターミネーター配列を含んでなる核酸と連結することもできる。本開示の核酸に加え、核酸の発現を確認するためのマーカーとなり得る遺伝子（例えば、薬剤耐性遺伝子、リポーター酵素をコードする遺伝子、または蛍光タンパク質をコードする遺伝子）を組み込んでもよい。
【０１５１】
ある実施形態では、核酸は、特定の宿主での発現のためにコドンが最適化された核酸である。
【０１５２】
本開示は、有効成分としての本開示の核酸を、薬学上許容可能な賦形剤とともに含んでなる組成物を提供する。好適な薬学上許容可能な賦形剤は当業者に周知である。薬学上許容可能な賦形剤の例には、リン酸緩衝生理食塩水（例えば、０．０１Ｍリン酸塩、０．１３８Ｍ  ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、または硫酸塩などの無機酸塩を含有する水溶液、生理食塩水、グリコールまたはエタノールの溶液、および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩または安息香酸塩などの有機酸の塩が含まれる。湿潤剤または乳化剤、およびｐＨ緩衝剤などのアジュバントも使用可能である。薬学上許容可能な賦形剤としては、Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)（引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されている賦形剤が適切に使用することができる。本開示の組成物は、非経口投与、例えば、注射または注入に好適な既知の形態に処方することができる。さらに、本開示の組成物は、沈殿防止剤、保存剤、安定剤および／または分散剤などの製剤添加剤、ならびに保存中の有効性を延長するための保存剤を含んでなってもよい。本組成物は、使用前に適当な無菌液体で再構成するための乾燥形態であってもよい。微粒子を介する投与のためには、顕微鏡的サイズの金粒子などの粒子をＤＮＡでコーティングすることができる。
【０１５３】
本開示の核酸がｅｘ  ｖｉｖｏで細胞に導入される場合、本開示の核酸は、細胞への核酸の移動を促進する物質、例えば、上述の賦形剤に加えて、リポソームまたは陽イオン脂質など、核酸を導入するための試薬と組み合わせてもよい。あるいは、後述のように、本開示の核酸を運ぶベクターも有用である。特に、好適なベクターにより運ばれる本開示の核酸を含有する、生体への投与に好適な形態の組成物がインビボ遺伝子療法に好適である。
【０１５４】
本開示の核酸を有効成分として含んでなる組成物は、その核酸によりコードされているＣＡＲが結合する抗原によって、例えば、癌［血液癌（白血病）、固形腫瘍など］、炎症性疾患／自己免疫疾患（喘息、湿疹）、肝炎、および原因がインフルエンザおよびＨＩＶなどのウイルス、細菌、または真菌である感染性疾患、例えば、結核、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、または深在性真菌症などの疾患の治療のために投与することができる。本開示の核酸を有効成分として含んでなる組成物は、皮内、筋肉内、皮下、腹膜内、鼻腔内、動脈内、静脈内、腫瘍内、または輸入リンパ管に、非経口投与により、例えば、注射または注入により投与することができ、またはそれらの投与のために適宜処方することができるが、投与経路は特に限定されない。
【０１５５】
（３）ＣＡＲを発現する細胞を生産するための方法
本開示のＣＡＲを発現する細胞を生産するための方法は、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸を細胞に導入する工程を含む。この工程は、ｅｘ  ｖｉｖｏで行われる。例えば、細胞を、本開示のＣＡＲを発現する細胞を生産するようにｅｘ  ｖｉｖｏにて本開示の核酸を運ぶウイルスベクターまたは非ウイルスベクターで形質転換することができる。
【０１５６】
本開示の方法では、哺乳動物由来の細胞、例えば、ヒト細胞、またはサル、マウス、ラット、ブタ、ウマ、またはイヌなどの非ヒト哺乳動物由来の細胞を使用することができる。
【０１５７】
１つの実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【０１５８】
本開示の方法で使用される細胞は特に限定されず、いずれの細胞も使用可能である。例えば、体液、組織もしくは器官、例えば、血液（末梢血、臍帯血など）もしくは骨髄から採取、単離、もしくは精製された細胞、または上述の細胞を分化させる、もしくは多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製するために初期化することにより得られた細胞が使用可能である（例えば、Themeli et al 2013参照）。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、免疫細胞［例えば、Ｔ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞、マクロファージ、単球、ＮＫ細胞または造血細胞（好中球、好塩基球）を含む］、臍帯血単核細胞、線維芽細胞、脂肪細胞前駆体、肝細胞、皮膚ケラチノサイト、間葉幹細胞、脂肪幹細胞、種々の癌細胞株、または神経幹細胞が使用可能である。例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞、Ｔ細胞の前駆細胞（造血幹細胞、リンパ球前駆細胞など）またはそれらを含有する細胞集団が使用可能である。Ｔ細胞の例には、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、および腫瘍浸潤リンパ球が含まれる。Ｔ細胞およびＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団には、ＰＢＭＣが含まれる。上述の細胞は、生体から採取してもよく、生体から採取した細胞の拡大培養により得てもよく、または細胞株として樹立してもよい。生産されたＣＡＲ発現細胞または生産されたＣＡＲ発現細胞から分化させた細胞の生体への移植が望まれる場合は、その生体自体またはその同種の生体から採取した細胞に核酸を導入することができる。
【０１５９】
本開示のＣＡＲをコードする核酸はベクターに導入することができ、そのベクターを細胞に導入することができる。例えば、レトロウイルスベクター（オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、および偽型ベクターを含む）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターまたはセンダイウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）ベクター、およびＨＳＶベクターなどのウイルスベクターが使用可能である。例えば、感染細胞内で自己複製しないように複製能を欠くウイルスベクターが使用可能である。
【０１６０】
加えて、非ウイルスベクターもまた、本開示において、ＷＯ９６／１００３８、ＷＯ９７／１８１８５、ＷＯ９７／２５３２９、ＷＯ９７／３０１７０およびＷＯ９７／３１９３４（引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されているように、リポソームまたは陽イオン脂質などの縮合剤と組み合わせて使用することができる。本開示の核酸はまた、リン酸カルシウム形質導入、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、または粒子衝撃により細胞に導入することもできる。
【０１６１】
例えば、レトロウイルスベクターが使用される場合、本開示の方法は、ＬＴＲ配列に基づき好適なパッケージング細胞とベクターによりプロセシングされるパッケージングシグナル配列を選択すること、およびパッケージング細胞を用いてレトロウイルス粒子を作製することによって行うことができる。パッケージング細胞の例には、ＰＧ１３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０７８）、ＧＰ＋Ｅ−８６およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２（米国特許第５，２７８，０５６号）、およびＰｓｉ−Ｃｒｉｐ[Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 85, pp. 6460-6464 (1988)]が含まれる。レトロウイルス粒子はまた、２９３細胞または高トランスフェクション効率を有する２９３Ｔ細胞を用いて作製することもできる。レトロウイルスおよびレトロウイルスベクターのパッケージングに使用可能なパッケージング細胞に基づいて生産された多くの種類のウイルスベクターが、多くの会社から広く市販されている。
【０１６２】
１つの側面は、本明細書に記載の核酸またはベクターで細胞をトランスフェクトまたは形質導入することを含んでなる、本明細書に開示される細胞の作製方法である。
【０１６３】
別の側面は、
ａ）哺乳動物から免疫細胞を単離すること；
ｂ）単離された免疫細胞、場合により、単離されたＴ細胞を、本明細書に開示されるＣＡＲをコードする核酸でトランスフェクトまたは形質導入すること；および
ｃ）場合により、ＣＡＲ発現細胞、場合により、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を単離し、および／または拡大培養すること
を含んでなる、本明細書に開示される細胞の作製方法である。
【０１６４】
１つの実施形態では、単離される免疫細胞は、単離されるＴ細胞である。
【０１６５】
ある実施形態では、単離される細胞はＣＤ３＋であり、場合により、形質導入またはトランスフェクション前に、場合により、可溶型または膜結合型の抗ＣＤ３抗体、例えば、ＯＫＴ３またはｍＯＫＴ３、および／またはＡＰＣで刺激される。１つの実施形態では、ＡＰＣは人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）である。別の実施形態では、ＡＰＣは、膜型の抗ＣＤ３モノクローナル抗体を発現する。
【０１６６】
１つの実施形態では、トランスフェクションまたは形質導入工程が繰り返される。例えば、トランスフェクションまたは形質導入工程は、２回、または３回、または４回、または例えば、十分な発現レベルが達成されるまで行うことができる。例えば、トランスフェクションまたは形質導入工程は、５回行うことができる。
【０１６７】
１つの実施形態では、細胞は、連続２日以上トランスフェクトまたは形質導入する。例えば、細胞は、連続２日、連続３日、または連続４日トランスフェクトまたは形質導入する。
【０１６８】
１つの実施形態では、ＣＡＲ形質導入細胞を、所定の抗原を発現する照射細胞で刺激する。例えば、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を照射細胞で、エフェクター：標的比１００：１、７５：１、５０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：５０または１：１００で刺激する。
【０１６９】
（４）ＣＡＲを発現する細胞およびその使用
本開示のＣＡＲを発現する細胞は、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸が本明細書に記載の生産方法によって導入および発現された細胞である。
【０１７０】
本開示の細胞は、ＣＡＲを介して特定の抗原と結合し、それにより、シグナルが細胞に伝達され、結果として細胞が活性化される。ＣＡＲを発現する細胞の活性化は、宿主細胞の種類およびＣＡＲの細胞内ドメインによって異なり、指標として、例えば、サイトカインの放出、細胞増殖速度の向上、または細胞表面分子の変化などに基づいて確認することができる。例えば、活性化細胞からの細胞傷害性サイトカイン（腫瘍壊死因子、リンホトキシンなどの）放出は、抗原を発現する標的細胞の破壊を引き起こす。加えて、サイトカインの放出または細胞表面分子の変化は、他の免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、およびマクロファージを刺激する。
【０１７１】
２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）  ＣＡＲにより操作されたＴ細胞は、第一世代（２８−ｚ）および第二世代（２８−ＢＢ−ｚ）ＣＡＲＳを含んでなるＴ細胞に比べて、より速い細胞分裂速度およびアポトーシスの低減を通してより優れた増殖を示すことが実証される（図１２参照）。加えて、２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）ＣＡＲにより操作されたＴ細胞はまた、反復抗原刺激の後に幹細胞様記憶表現型を維持する（図１４）。
【０１７２】
よって、ＣＡＲを発現する細胞は、疾患のための治療薬として使用できる。実施例４ならびに図１８〜２０に示されるように、白血病細胞を注射し、かつ、２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）抗ＣＤ１９  ＣＡＲで処置したマウスは、非処置マウスおよび前世代ＣＡＲで処置したマウスに比べて腫瘍活性の低下ならびに全生存率の増大を示した。
【０１７３】
１つの側面では、疾患を治療するための本明細書に記載のＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞または組成物の使用が提供される。
【０１７４】
別の側面は、哺乳動物において疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする哺乳動物に有効量の本明細書開示に開示される細胞または組成物を投与することを含んでなる方法である。
【０１７５】
さらなる側面は、哺乳動物において抗腫瘍免疫を提供する方法であって、それを必要とする哺乳動物に有効量の本明細書開示に開示される細胞または組成物を投与することを含んでなる方法である。
【０１７６】
治療薬は、有効成分として、ＣＡＲを発現する細胞を含んでなり、好適な賦形剤をさらに含んでいてもよい。賦形剤の例には、有効成分として本開示の核酸を含んでなる組成物のための上述の薬学上許容可能な賦形剤、種々の細胞培養培地、および等張性塩化ナトリウムを含む。
【０１７７】
ＣＡＲを発現する細胞が投与される疾患は、その疾患がその細胞に感受性を示す限り特に限定されない。１つの実施形態では、疾患は癌である。
【０１７８】
例えば、癌は、血液癌または固形腫瘍である。例えば、血液癌は、白血病、リンパ腫または骨髄腫である。例えば、固形腫瘍は、乳癌、卵巣癌、膠芽腫、骨肉腫、または髄芽細胞腫である。
【０１７９】
ある実施形態では、疾患は、炎症性疾患／自己免疫疾患（喘息、湿疹）、肝炎、およびその原因がインフルエンザおよびＨＩＶなどのウイルス、細菌、または真菌である感染性疾患、例えば、結核、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、および深在性真菌症である。
【０１８０】
上述の疾患の治療のために低減または除去されることが望まれる細胞によってプロセシングされる抗原、すなわち、腫瘍抗原、ウイルス抗原、または細菌抗原などと結合する本開示のＣＡＲを発現する細胞が、これらの疾患の治療のために投与される。
【０１８１】
よって、１つの側面は、対象において所定の抗原を発現する細胞の数を減らす方法であって、それを必要とする対象に有効量の本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞を投与することを含んでなる方法を含み、ここで、ＣＡＲは所定の抗原と特異的に結合する。
【０１８２】
本開示の細胞はまた、再発性白血病の寛解などを目的とした、骨髄移植または放射線暴露、ドナーリンパ球輸血後の感染性疾患の予防のために使用できる。
【０１８３】
ＣＡＲ発現細胞を有効成分として含んでなる治療薬は、皮内、筋肉内、皮下、腹膜内、鼻腔内、動脈内、静脈内、腫瘍内、または輸入リンパ管に、非経口投与により、例えば、注射または注入により投与することができるが、投与経路は限定されない。
【０１８４】
１つの実施形態では、対象は、癌を有することが疑われるか、または癌を有する。１つの実施形態では、対象は、炎症性疾患を有することが疑われるか、または炎症性疾患を有する。
【０１８５】
さらに、特定の節に記載される定義および実施形態は、当業者に理解されるように、それらが好適であると記載される本明細書の他の実施形態にも当てはまることが意図される。例えば、以下の下りでは、本発明の種々の側面がより詳しく定義される。このように定義される各側面は、そうではないことが明示されない限り、他のいずれの１または複数の側面と組み合わせてもよい。特に、好ましいまたは有利であるとして示されるいずれの特徴も、好ましいまたは有利であるとして示される他のいずれの１または複数の特徴と組み合わせてもよい。
【０１８６】
上記の開示は本出願を全般的に説明する。より完全な理解は、以下の具体例を参照することにより得ることができる。これらの例は単に例示のために記載され、本出願の範囲を限定するものではない。状況が好都合であることを示唆または呈示すれば、形態の変化および等価物の置換も企図される。本明細書では特定の用語が使用されているが、このような用語は記述の意味を意図し、限定を目的とするものではない。
【実施例】
【０１８７】
以下の限定されない例で本開示を説明する。
【０１８８】
実施例１
抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物
図１に示されるように、ＦＭＣ６３由来一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）(Nicholson et al., 1997)が、ＣＤ２８およびＣＤ３ζ鎖（２８−ｚ、第二世代）、ＣＤ２８、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζ鎖（２８−ＢＢ−ｚ、第３世代）、またはＣＤ２８、内部欠失を伴うＩＬ−２受容体β鎖の細胞質ドメイン、およびＳＴＡＴ３結合のために外因性ＹＸＸＱモチーフ（配列番号１３）が導入されたＣＤ３ζ鎖（２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ））に連結された。ＹＸＸＱ（配列番号１３）モチーフは、１５６〜１５８番においてＣＤ３ζ鎖によりコードされているＬｅｕ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ残基をＴｙｒ−Ａｒｇ−Ｈｉｓに置換することによって作製した。ＦＭＣ６３は、ＣＤ１９クラスターに属すＩｇＧ２ａマウスモノクローナル抗体である。オンコスタチンＭをシグナルペプチドとして使用した。部位特異的変異誘発にはギブソンアセンブリ法を用いた。以下のプライマーを使用した：ＡＣＧＣＣＴＡＴＣＧＣＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣ（配列番号２６）、およびＣＴＧＡＴＧＧＣＧＡＴＡＧＧＣＧＴＣＧＴＡＧＧＴＧＴ（配列番号２７）。
【０１８９】
抗ＣＤ１９  ＣＡＲ構築物による一次Ｔ細胞の形質導入効率
抗ＣＤ１９  ＣＡＲ構築物による初代Ｔ細胞の形質導入効率を決定するために、末梢血ＣＤ３＋  Ｔ細胞を、膜性型の抗ＣＤ３  ｍＡｂ（クローンＯＫＴ３）、ＣＤ８０、およびＣＤ８３（ｍＯＫＴ３／ａＡＰＣ）(Butler et al.,2012)を発現する人工抗原提示細胞で刺激し、その後、レトロウイルスを用いて個々のＣＡＲ構築物で形質導入した。形質導入は連続３日繰り返した。ｍＯＫＴ３／ａＡＰＣでの初回刺激から７日後に、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞をビオチン標識プロテインＬ、次いで、ストレプトアビジン−ＡＰＣで染色した。染色されたＴ細胞を図２に示されるようにフローサイトメトリーにより分析した。種々のＣＡＲ構築物で形質導入したＴ細胞で形質導入効率は同等であった。独立した４回の実験の代表的データを示す。
【０１９０】
抗ＣＤ１９−ＣＡＲ表面発現
抗ＣＤ１９−ＣＡＲ表面発現を、初代Ｔ細胞で発現されたＣＡＲ構築物の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定することにより比較した（ｎ＝４）（図３）。ＣＡＲ表面発現は、２８−ＢＢ−ｚおよび２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）  ＣＡＲ  Ｔ細胞では、２８−ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞に比べてやや低かった。統計的有意性は対応のあるｔ検定を用いて表した。エラーバーは標準偏差を示す。
【０１９１】
２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５のリン酸化
２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞をサイトカイン不含培地で１日間休止させ、Ｋ５６２−ＣＤ１９細胞で、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比２：１にて刺激した。リン酸化されたＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を固定／透過処理し、特異的ｍＡｂで染色し、図４に示されるように細胞内フローサイトメトリー分析により分析した。２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）ＣＡＲで操作されたＴ細胞は、ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５両方のリン酸化に段階的な増加を示した。３回の実験の代表的データを示す。
【０１９２】
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路活性の比較
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を図４と同じ条件下、Ｋ５６２細胞またはＣＤ１９を安定発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２−ＣＤ１９）で刺激し、リン酸化されたＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５の発現を刺激後１８時間に測定した。相対的平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、Ｋ５６２細胞と共培養した２８−ｚ  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の平均ＭＦＩ値（ｎ＝４）で除することにより計算した。図５に示されるように、２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）ＣＡＲ＋  Ｔ細胞は、Ｋ５６２−ＣＤ１９細胞と共培養した場合に、ＳＴＡＴ３（Ｐ＜０．０１）およびＳＴＡＴ５（Ｐ＜０．０５；対応のあるｔ検定）の有意に高いリン酸化を示し、ＣＡＲがＣＤ１９特異的ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路の活性化を誘導したことを示す。
【０１９３】
実施例２
抗ＣＤ１９  ＣＡＲ構築物Ｔ細胞の形質導入および拡大培養のプロトコール
末梢ＣＤ３＋  Ｔ細胞をｍＯＫＴ３／ａＡＰＣで刺激し、レトロウイルスにより個々のＣＤ１９  ＣＡＲで連続３日形質導入した。ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を、ＩＬ−２  １００ＩＵ／ｍＬおよびＩＬ−１５  １０ｎｇ／ｍＬの存在下、照射済みのＫ５６２−ＣＤ１９細胞またはＫ５６２細胞でＥ：Ｔ比２：１にて、示されている場合に週に１回刺激した（図６参照）。Ｅ：Ｔ比および形質導入期間の変動が想定され得る。例えば、ｍＯＫＴ３／ａＡＰＣで刺激したＣＤ３＋  Ｔ細胞は、Ｅ：Ｔ比１０：１で連続３日形質導入することができる。
【０１９４】
形質導入後のＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の拡大培養
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の増殖倍率を図７に示す（ｎ＝４）。総てのＣＡＲ形質導入Ｔ細胞において２週間で１００倍を超えるＣＤ８＋  Ｔ細胞の拡大増殖が得られた。２８−ＢＢ−ｚ  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、形質導入後に、２８−ｚ  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞に比べて有意に優れた増殖を示し（対応のあるｔ検定によりＰ＜０．０５）、一方、２８−ｚ  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞と２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の間に差は無かった。
【０１９５】
Ｋ５６２−ＣＤ１９細胞によるＣＤ１９特異的刺激後のＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の拡大培養
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を、照射済みのＫ５６２−ＣＤ１９細胞を用いて、ＣＤ１９特異的方法で刺激した。２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）ＣＡＲで形質導入したＴ細胞は、サイトカインの補充にかかわらずＣＤ４＋  Ｔ細胞とＣＤ８＋  Ｔ細胞の両方でより優れた増殖を示した。ＣＡＲ＋  Ｔ細胞の増殖倍率を図８に示す（ｎ＝４；統計的有意性は対応のあるｔ検定で評価した）。
【０１９６】
Ｋ５６２細胞との共培養後のＣＡＲ＋  Ｔ細胞の拡大培養
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を照射済みＫ５６２細胞（対照）で刺激した。ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の増殖倍率を図９に示す（ｎ＝４）。従前に示されるように、２８−ＢＢ−ｚで形質導入されたＴ細胞は、２８−ｚ  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞に比べて抗原非依存的増殖を促進した(Milone et al., 2009)（ＣＤ８＋  Ｔ細胞に対して対応のあるｔ検定によりＰ＜０．０５）。対照的に、２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）ＣＡＲ＋  Ｔ細胞は、抗原特異的ＣＤ１９刺激の不在下で２８−ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を超える増殖利益を付与しなかった。
【０１９７】
Ｋ５６２−ＣＤ１９細胞による抗原特異的再刺激後のＣＡＲ＋  Ｔ細胞の拡大培養
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を、図１０に示されるように、毎週、照射済みＫ５６２−ＣＤ１９細胞で２回刺激した。ＣＡＲ＋  Ｔ細胞の増殖倍率を示す（ｎ＝４）。２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）  ＣＡＲで操作されたＴ細胞は、他のＣＡＲ形質導入Ｔ細胞に比べて増殖の向上を示した（ＣＤ８＋  Ｔ細胞に対してＰ＜０．０５；対応のあるｔ検定）。
【０１９８】
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞における細胞分裂速度
ＣＡＲで操作されたＴ細胞を、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、Ｋ５６２−ＣＤ１９細胞で２：１比にて刺激した。刺激３日後の、２８−ｚ  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞に対するＣＡＲ形質導入ＣＤ４＋またはＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＣＦＳＥの平均ＭＦＩを図１１に示す（ｎ＝４）。各ドナーにおいて２８−ｚ  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞におけるＣＦＳＥの強度を１とした。エラーバーは標準偏差を示す。統計的有意性は対応のあるｔ検定で評価した。２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）ＣＡＲで形質導入したＴ細胞は、有意に増強された細胞分裂を示した。
【０１９９】
実施例３
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の生存率
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞をＫ５６２−ＣＤ１９細胞で２：１比にて刺激した。死細胞の頻度を刺激３日後にフローサイトメトリーにより評価した（ｎ＝４）（図１２）。エラーバーは標準偏差を表す。２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）ＣＡＲ構築物で形質導入したＴ細胞は、抗原刺激時にアポトーシスの減少を示した。差の有意性は対応のあるｔ検定により評価した。図１１および１２に示されるデータは、ＣＤ１９刺激時の２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）ＣＡＲ＋  Ｔ細胞の増殖の優位性が細胞分裂の増加とアポトーシスの減少の両方から生じたことを示す。
【０２００】
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の表面表現型
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞をＫ５６２−ＣＤ１９で２：１比にて刺激した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞上の表面ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌを特異的ｍＡｂで染色し、刺激７日後にフローサイトメトリー分析を行った（図１３）。４回の独立した実験の代表的データを示す。２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）ＣＡＲで形質導入したＴ細胞は、２８−ｚまたは２８−ＢＢ−ｚ  ＣＡＲ＋  Ｔ細胞に比べてＣＤ４５ＲＡ＋  ＣＤ６２Ｌ＋  Ｔ細胞サブセットを維持していた。
【０２０１】
幹細胞様メモリーＴ細胞のマーカー表現型（ＣＤ４５ＲＡ＋  ＣＤ６２Ｌ＋  ＣＤ９５＋）を有するＣＡＲ  Ｔ細胞の頻度
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞をＫ５６２−ＣＤ１９で２：１比にて刺激した。ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＤ９５表面発現を刺激７日後に分析した（ｎ＝４）（図１４）。２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋  ＣＤ６２Ｌ＋  ＣＤ９５＋幹細胞様メモリーＴ細胞サブセットの有意に高い頻度を有した。統計的有意性は対応のあるｔ検定で評価した。
【０２０２】
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞におけるＣＤ６２Ｌ発現の比較
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞におけるＣＤ６２Ｌ発現を図１３および１４に関して記載したように分析した。ＣＡＲ形質導入ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＣＤ６２Ｌ発現の相対的ＭＦＩは、各ＭＦＩを２８−ｚ  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の平均ＭＦＩ値（ｎ＝４）で除することにより計算した。２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、他のＣＡＲ＋  Ｔ細胞に比べて有意に高いＣＤ６２Ｌ発現レベルを示した（対応のあるｔ検定によりＰ＜０．０５）。
【０２０３】
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞によるＩＬ−２分泌
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞をＫ５６２−ＣＤ１９で１：１比にて刺激した。刺激１週間後、Ｔ細胞をｍＯＫＴ３／ａＡＰＣで再刺激し、サイトカイン分泌は、特異的ｍＡｂによる染色の後に細胞内フローサイトメトリーで測定した。２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）ＣＡＲ＋  Ｔ細胞は、２８−ｚおよび２８−ＢＢ−ｚ  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞に比べてより多いＩＬ−２を分泌した。有意性は対応のあるｔ検定により評価した。これらの結果は図１５に示されるデータと一致し；２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）ＣＡＲ＋  Ｔ細胞は、他のＣＡＲ  Ｔ細胞に比べて、ＣＤ４５ＲＡ＋  ＣＤ６２Ｌ＋  ＣＤ９５＋幹細胞様メモリーＴ細胞サブセットを優先的に維持した。
【０２０４】
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞によるインビトロ標的細胞溶解
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した照射済み標的細胞（Ｋ５６２−ＣＤ１９およびＣＤ１９＋  Ｎａｌｍ−６細胞）とともにＥ：Ｔ比３：１にて６時間共培養した。培養中に残存したＣＦＳＥ陽性生細胞のパーセンテージをフローサイトメトリー分析により決定した（ｎ＝３）。親Ｋ５６２細胞を対照として使用した。エラーバーは標準偏差を表す。統計的有意性は反復測定ＡＮＯＶＡで評価した。２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋細胞に対して、他のＣＡＲ形質導入Ｔ細胞と同等の溶解活性を示した。
【０２０５】
実施例４
ベクター構築
ＮＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲは、２８−ｚ  ＣＡＲとも呼ばれ、Kochenderfer et al. (J Immunother. 2009 Sep;32(7):689-702)により最初に構築されたＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲのシグナル配列をオンコスタチンＭシグナル配列（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０６５３９１．１、配列番号１のアミノ酸番号１〜２５）で置換することにより作出された抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体である。コドンが最適化されたＮＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲ構築物はＧｅｎｅａｒｔ（登録商標）により合成し、ｐＭＸレトロウイルスベクター(Int J Hematol. 1998, 67:351-9)にクローニングした。ＮＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲのアミノ酸配列は配列番号１に示される。ＮＦＭＣ６３−２８−ｄ２ＲｂＺ  ＣＡＲは、ＮＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲのＣＤ２８ドメインとＣＤ３ζドメインの間に、ｂｏｘ−１モチーフおよび隣接チロシン残基−５１０を含むヒトＩＬ−２受容体β鎖の細胞質ドメインの末端切断フラグメント（例えば、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００８６９．１のアミノ酸番号２６６〜３３７および５３０〜５５１、配列番号５）を有するキメラ抗原受容体である。ＮＦＭＣ６３−２８−ｄ２ＲｂＺ  ＣＡＲのアミノ酸配列を配列番号２に示す。ＮＦＭＣ６３−２８−２１ＲａＺ  ＣＡＲは、ＮＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲのＣＤ２８ドメインとＣＤ３ζドメインの間に、ヒトＩＬ−２１受容体α鎖の全長細胞質ドメイン（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０６８５７０．１のアミノ酸番号２５６〜５３８、配列番号６）を有するキメラ抗原受容体である。ＮＦＭＣ６３−２８−２１ＲａＺ  ＣＡＲのアミノ酸配列を配列番号３に示す。ＮＦＭＣ６３−２８Ｚ−２１Ｒａ  ＣＡＲは、ＮＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲのＮ末端とともにヒトＩＬ−２１受容体α鎖の全長細胞質ドメインを有するキメラ抗原受容体である。ＮＦＭＣ６３−２８Ｚ−２１Ｒａ  ＣＡＲのアミノ酸配列を配列番号４に示す。ＣＡＲの構造を図２１に示す。ＦＭＣ６３−２８−ｄ２ＲｂＺ  ＣＡＲ、ＮＦＭＣ６３−２８−２１ＲａＺ  ＣＡＲおよびＮＦＭＣ６３−２８Ｚ−２１Ｒａ  ＣＡＲをコードする核酸を、各細胞質ドメインをコードするＤＮＡをｐＭＸレトロウイルスベクター中のＮＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲ構築物に挿入することにより構築した。
【０２０６】
エコトロピックレトロウイルスベクターは、ｐｈｏｅｎｉｘ−ｅｃｏ細胞株にＴｒａｎｓＩＴ２９３（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ）を有するＣＡＲ構築物レトロウイルスプラスミドを一時的にトランスフェクトすることにより得、その後、ＰＧ１３細胞株を、形質導入ｐｈｏｅｎｉｘ−ｅｃｏ細胞株から得られたエコトロピックレトロウイルスベクターで形質導入した。ＧａＬＶ偽型レトロウイルスベクターは、形質導入ＰＧ１３細胞株のバルクから得、Ｊｕｒｋａｔ細胞への遺伝子導入のために使用した。
【０２０７】
細胞
ＰＧ１３細胞株およびｐｈｏｅｎｉｘ−ｅｃｏ細胞株を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＤＭＥＭ培地で培養した。
【０２０８】
Ｋ５６２細胞またはヒトＣＤ８０およびＣＤ８３発現構築物で形質導入したＫ５６２細胞をさらにヒトＣＤ１９発現構築物で形質導入し、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ細胞、Clin Cancer Res., 2007, 13:1857-67, Immunol Rev., 2014, 257:191-209)として使用した。Ｋ５６２とＫ５６２由来細胞およびＪｕｒｋａｔとＪｕｒｋａｔ由来細胞を、１０％ＦＣＳおよび５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地で培養した。
【０２０９】
ＣＡＲ構築物移入および細胞選別
細胞を、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ結合ウイルス感染法(J Biochem. 2001 Sep;130(3):331-4)を用いて形質導入した。この方法では、レトロウイルス溶液をＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標、タカラバイオ）コーティングプレートに予め付与し、３２℃、２，０００ｇで２時間遠心分離した後、ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水ですすいだ。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ウイルスを予め付与したプレートに適用した。この遺伝子導入を２回行った。
【０２１０】
ＣＡＲ構築物の遺伝子導入後、細胞をビオチン−プロテインＬ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）および抗ビオチンマイクロビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）で選別した。選別後、導入ＣＡＲ構築物の９５％を超える陽性および同等レベルの平均蛍光強度が確認された。
【０２１１】
ＳＴＡＴのリン酸化
ＣＡＲ形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞およびａＡＰＣを計数し、氷上で混合した。４℃で回転沈降させた後、細胞を３７℃の湯浴でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を１．５％パラホルムアルデヒド中で固定し、１００％メタノールで透過処理を施した。その後、細胞を以下の抗体で染色した；Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ４４／４２  ＭＡＰキナーゼ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、クローンＥ１０）、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ３（ｐＹ７０５）（ＢＤ  Ｐｈｏｓｆｌｏｗ、クローン４／Ｐ−ＳＴＡＴ３）、およびＰｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ５（ｐＹ６９４）（ＢＤ  Ｐｈｏｓｆｌｏｗ、クローン４７／Ｐ−ＳＴＡＴ５）。フローサイトメトリーの取得はＢＤ  ＦａｃｓＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行い、分析はＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を用いて行った。
【０２１２】
結果を図２２に示す。図２の上の図に示されるように、ＮＦＭＣ６３−２８ＺのみがＣＤ３ζシグナル伝達のマーカーであるＭＡＰキナーゼのリン酸化を示し、一方、ＮＦＭＣ６３−２８−ｄ２Ｒ５は、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＡＰキナーゼ陽性画分においてＳＴＡＴ５のリン酸化を示す。また、図２の下の図に示されるように、ＮＦＭＣ６３−２８−２１ＲａＺおよびＮＦＭＣ６３−２８Ｚ−２１Ｒａの両方が、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＡＰキナーゼ陽性画分においてＳＴＡＴ３のリン酸化を示す。これらの結果は、これらのＣＡＲが、抗原刺激時のＭＡＰキナーゼシグナル伝達に加えてそれぞれＩＬ−２およびＩＬ−２１シグナル伝達の主要標的であるＳＴＡＴ５またはＳＴＡＴ３シグナル伝達を活性化し得ることを示す。
【０２１３】
実施例５
マウスにおけるインビボ抗白血病効果
ヒトＣＤ１９＋  ＮＡＬＭＥ  Ｂ白血病細胞を保持する免疫不全ＮＳＧマウス  を２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）抗ＣＤ１９  ＣＡＲまたは前世代ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した。
【０２１４】
図１８に示されるように、ＣＤ３＋  Ｔ細胞をレトロウイルスにより２８−ｚ、２８−ＢＢ−ｚ、または２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）抗ＣＤ１９  ＣＡＲのいずれかで形質導入し、ＣＤ１９形質導入Ｋ５６２細胞で刺激した。免疫不全ＮＳＧマウスに、ＥＧＦＰ−ルシフェラーゼ（ＮＡＬＭ６−ＧＬ）を発現するＣＤ１９陽性急性リンパ芽球性白血病細胞株ＮＡＬＭ−６を静脈内注射し、次いで、その後、腫瘍注射から１４日後にそれらにＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を注射した。
【０２１５】
抗ＣＤ１９  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の注入後、非処置群および２８−ｚ抗ＣＤ１９  ＣＡＲ群では０、７、２８日目の、ならびに２８−ＢＢ−ｚおよび２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）抗ＣＤ１９  ＣＡＲ群では０、７、２８、４２および６３日目のルシフェラーゼ活性のインビボ生物発光イメージングを図１９に示す。２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）抗ＣＤ１９  ＣＡＲで処置したマウスは、他の群に比べてより大きな腫瘍活性低下を示す。
【０２１６】
抗ＣＤ１９  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞で処置したマウス（各ｎ＝５）の全生存率のカプラン−マイヤー曲線は、２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）抗ＣＤ１９  ＣＡＲ処置マウスが、非処置群ならびに前世代２８−ｚおよび２８−ＢＢ−ｚ抗ＣＤ１９  ＣＡＲに比べて良好な全生存率を有したことを示す。
【０２１７】
本出願はその時点で好ましい例であると考えられるものに関して記載されているが、本出願は開示されている例に限定されないと理解されるべきである。これに対して、本出願は添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内に含まれる種々の改変および等価の配置を包含することが意図される。
【０２１８】
総ての刊行物、特許および特許出願は、各個の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個々に引用することによりその全内容が本明細書の一部とされることが示される場合と同程度に、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる。具体的には、例えば、表または他所に示される受託番号および／またはバイオマーカー配列（例えば、タンパク質および／または核酸）を含む、本明細書に示される各受託番号を伴う配列は、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる。
【０２１９】
配列の表
配列番号１：ＮＦＭＣ６３−２８Ｚ
【化１】
2018509893.tif 000003
１−２５：シグナルペプチド
２６−２７０：ＦＭＣ６３  ＳＣＦＶ
２７４−３１２：ＣＤ２８部分的細胞外ドメイン
３１３−３３９：ＣＤ２８膜貫通ドメイン
３４０−３８０：ＣＤ２８細胞質ドメイン
３８１−４９２：ＣＤ３ζの細胞内ドメイン
【０２２０】
配列番号２：ＮＦＭＣ６３−２８−ｄ２ＲｂＺ
【化２】
2018509893.tif 000004
１−２５：シグナルペプチド
２６−２７０：ＦＭＣ６３  ＳＣＦＶ
２７４−３１２：ＣＤ２８部分的細胞外ドメイン
３１３−３３９：ＣＤ２８膜貫通ドメイン
３４０−３８０：ＣＤ２８細胞質ドメイン
３９８−４９１：ＩＬ−２受容体β部分的細胞質ドメイン
４９９−６１０：ＣＤ３ζの細胞内ドメイン
【０２２１】
配列番号３：ＮＦＭＣ６３−２８−２１ＲａＺ
【化３】
2018509893.tif 000005
１−２５：シグナルペプチド
２６−２７０：ＦＭＣ６３  ＳＣＦＶ
２７４−３１２：ＣＤ２８部分的細胞外ドメイン
３１３−３３９：ＣＤ２８膜貫通ドメイン
３４０−３８０：ＣＤ２８細胞質ドメイン
３８１−６６３：ＩＬ−２１受容体α全長細胞質ドメイン
６７１−７８２：ＣＤ３ζの細胞内ドメイン
【０２２２】
配列番号４：ＮＦＭＣ６３−２８Ｚ−２１Ｒａ
【化４】
2018509893.tif 000006
１−２５：シグナルペプチド
２６−２７０：ＦＭＣ６３  ＳＣＦＶ
２７４−３１２：ＣＤ２８部分的細胞外ドメイン
３１３−３３９：ＣＤ２８膜貫通ドメイン
３４０−３８０：ＣＤ２８細胞質ドメイン
３８１−４９２：ＣＤ３ζの細胞内ドメイン
５０８−７９０：ＩＬ−２１受容体α全長細胞質ドメイン
【０２２３】
配列番号５：ＩＬ−２Ｒβ鎖の細胞質ドメインの末端切断フラグメント
【化５】
2018509893.tif 000007
【０２２４】
配列番号６：ヒトＩＬ−２１受容体α鎖の細胞質ドメイン
【化６】
2018509893.tif 000008
１１−１９：ＢＯＸ  １モチーフ
２６４：リン酸化可能チロシン残基
２６５‐２６７−チロシン隣接残基
【０２２５】
配列番号７：ＣＤ３ζの細胞内ドメイン
【化７】
2018509893.tif 000009
【０２２６】
配列番号８：ＣＤ２８の細胞内ドメイン
【化８】
2018509893.tif 000010
【０２２７】
配列番号９：ＣＤ２８の膜貫通ドメイン
【化９】
2018509893.tif 000011
【０２２８】
配列番号１０：ＣＤ２８の部分的細胞外ドメイン
【化１０】
2018509893.tif 000012
【０２２９】
配列番号１１
ＮＰ＿０００８６９．１，２６６−５５１：
【化１１】
2018509893.tif 000013
【０２３０】
配列番号１２−ＹＬＳＬＱ
配列番号１３−ＹＸＸＱ
配列番号１４−ＹＬＰＳＮＩＤ
配列番号１５−ＹＣＴＦＰ
配列番号１６−ＹＦＦＦＨ
配列番号１７−ＹＶＴＭＳ
配列番号１８−ＹＬＰＱＥ
配列番号１９−ＫＬＧＧＳＧＰ
配列番号２０−ＹＫＡＦＳ
配列番号２１−ＹＫＰＦＱ
配列番号２２−ＹＲＨＱ
配列番号２３−ＹＸＰＱ
【０２３１】
配列番号２４：ＣＤ３ζの細胞内ドメインの１０４−１０７番にＳＴＡＴ３関連モチーフを有する２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＸＸＱ）
【化１２】
2018509893.tif 000014
１−２５：シグナルペプチド
２６−２７０：ＦＭＣ６３  ＳＣＦＶ
２７４−３１２：ＣＤ２８部分的細胞外ドメイン
３１３−３３９：ＣＤ２８膜貫通ドメイン
３４０−３８０：ＣＤ２８細胞質ドメイン
３８１−４７４：ＩＬ−２受容体β部分的細胞質ドメイン
４７５−５８６：外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフＹＸＸＱを含んでなるＣＤ３ζの細胞内ドメイン
【０２３２】
配列番号２５：ＣＤ３ζの細胞内ドメインの１０４−１０７番にＳＴＡＴ３関連モチーフＹＲＨＱ（配列番号２２）を有する２８−ＩＬ２ＲＢ−ｚ（ＹＲＨＱ）
【化１３】
2018509893.tif 000015
１−２５：シグナルペプチド
２６−２７０：ＦＭＣ６３  ＳＣＦＶ
２７４−３１２：ＣＤ２８部分的細胞外ドメイン
３１３−３３９：ＣＤ２８膜貫通ドメイン
３４０−３８０：ＣＤ２８細胞質ドメイン
３８１−４７４：ＩＬ−２受容体β部分的細胞質ドメイン
４７５−５８６：外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフＹＲＨＱを含んでなるＣＤ３ζの細胞内ドメイン
【０２３３】
配列番号２６−ＡＣＧＣＣＴＡＴＣＧＣＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣ
配列番号２７−ＣＴＧＡＴＧＧＣＧＡＴＡＧＧＣＧＴＣＧＴＡＧＧＴＧＴ
配列番号２８−ＹＦＦＦ
配列番号２９−ＹＣＴＦ
配列番号３０−ＹＬＲＱ
配列番号３１−ＹＦＫＱ
配列番号３２−ＹＬＰＱ
配列番号３３−ＹＭＰＱ
配列番号３４−ＹＶＬＱ
配列番号３５−ＹＱＰＱ
配列番号３６−ＹＫＰＱ
配列番号３７−ＹＲＰＱ
配列番号３８−ＹＴＨＱ
配列番号３９−ＹＬＫＱ
配列番号４０−ＹＨＮＱ
配列番号４１−ＹＸＸＬ
配列番号４２−ＩＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号４３−ＹＬＳＬ
【０２３４】
参考文献
2018509893.tif 000016
2018509893.tif 000017
【図１】
2018509893.tif 000018
【図２】
2018509893.tif 000019
【図３】
2018509893.tif 000020
【図４】
2018509893.tif 000021
【図５】
2018509893.tif 000022
【図６】
2018509893.tif 000023
【図７】
2018509893.tif 000024
【図８】
2018509893.tif 000025
【図９】
2018509893.tif 000026
【図１０】
2018509893.tif 000027
【図１１】
2018509893.tif 000028
【図１２】
2018509893.tif 000029
【図１３】
2018509893.tif 000030
【図１４】
2018509893.tif 000031
【図１５】
2018509893.tif 000032
【図１６】
2018509893.tif 000033
【図１７】
2018509893.tif 000034
【図１８】
2018509893.tif 000035
【図１９】
2018509893.tif 000036
【図２０】
2018509893.tif 000037
【図２１】
2018509893.tif 000038
【図２２】
2018509893.tif 000039
【配列表】
2018509893000001.app
【国際調査報告】
2018509893.tif 000040
2018509893.tif 000041
2018509893.tif 000042
2018509893.tif 000043
2018509893.tif 000044