(57)【要約】標的配列のアンプリコン構築物を生成するための方法が開示され、この方法は、標的配列；汎用性配列を含み、その５’末端に、またはそれに向かって、標的配列の３’末端のうちの１つの配列またはそれに隣接する配列の逆相補体とハイブリダイズすることが可能な標的特異的配列をさらに含むオリゴヌクレオチドプローブ；その３’末端に、オリゴヌクレオチドプローブの汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含む汎用性プライマーを提供すること、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行することを含む。
2018507706.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的配列のアンプリコン構築物を生成するための方法であって、
標的配列；
汎用性配列を含み、その５’末端に、またはそれに向かって、前記標的配列の３’末端のうちの１つの配列またはそれに隣接する配列の逆相補体とハイブリダイズすることが可能な標的特異的配列をさらに含むオリゴヌクレオチドプローブ；
その３’末端に、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含む汎用性プライマー
を提供すること、および
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行すること
を含む方法。
【請求項２】
前記標的配列がＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的配列がｃＤＮＡ標的配列を含み、前記ｃＤＮＡ標的配列が前記ｃＤＮＡ標的配列に対応するＲＮＡ配列に対して逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実行することによってｉｎ  ｓｉｔｕで形成される、請求項１または２のいずれかに一項に記載の方法。
【請求項４】
複数の異なる標的配列に対して多重ＰＣＲが実行される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドプローブが一本鎖ＤＮＡ配列である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドプローブの前記標的特異的配列が、前記標的配列の３’末端のうちの１つまたはそれに隣接する配列と同一である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列が、前記汎用性プライマー上に位置する配列に十分に相補的である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列が、前記オリゴヌクレオチドプローブの３’末端に位置する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドプローブが１つまたは複数の追加の配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つまたは複数の追加の配列が前記汎用性配列の５’および前記標的特異的配列の３’に配置される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つまたは複数の追加の配列が機能性配列である、請求項９または１０のいずれかに一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つまたは複数の機能性配列が、下流オリゴヌクレオチド結合部位、制限酵素認識部位および反応識別配列から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドプローブの３’末端が、ポリメラーゼ伸長をブロックすることが可能なブロック基を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ブロック基がジデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄｄＮＴＰ）またはスペーサーＣ３である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドプローブが２０から５０個のヌクレオチドを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記汎用性プライマーが一本鎖ＤＮＡ配列である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記汎用性プライマーの３’末端が、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列に相補的である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記汎用性プライマーがその５’末端またはその５’末端部分に１つまたは複数の機能性配列および／または基を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つまたは複数の機能性配列が、下流オリゴヌクレオチド結合部位、制限酵素認識部位および反応識別配列から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つまたは複数の基が、蛍光性標識および結合性基から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記汎用性プライマーが５０から１００個のヌクレオチドを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブの対が提供され、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブは、前記標的配列の３’末端の配列のうちの１つの配列または前記標的配列の３’末端のうちの１つの配列に隣接する配列に特異的である標的特異的配列を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブは、前記標的配列の他の３’末端の配列または前記標的配列の他の３’末端に隣接する配列に特異的である標的特異的配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブが異なる汎用性配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
第１および第２の汎用性プライマーの対が提供され、前記第１の汎用性プライマーは、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含み、前記第２の汎用性プライマーは、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含む、請求項２２または２３のいずれかに一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１および第２の汎用性プライマーが異なる機能性配列および／または基を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
複数の異なる標的配列を多重ＰＣＲによって増幅するために、複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブまたはプローブ対および汎用性プライマーまたはプライマー対が提供される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチドプローブが前記汎用性プライマーの濃度と比較してより低い濃度で提供される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記汎用性プライマーの濃度対前記オリゴヌクレオチドプローブの濃度の比が１０：１を超える、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記汎用性プライマーの濃度対前記オリゴヌクレオチドプローブの濃度の比が１２：１から２７５：１である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記汎用性プライマーの濃度対前記オリゴヌクレオチドプローブの濃度の比が１６：１から２５６：１である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的配列の前記アンプリコン構築物がさらに配列決定される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
標的配列からアンプリコン構築物を生成するのに使用するための標的特異的プライマーを調製するための方法であって、
汎用性配列を含み、その５’末端に、またはそれに向かって、前記標的配列の３’末端のうちの１つにおける配列の逆相補体または前記標的配列の３’末端うちの１つに隣接する配列の逆相補体とハイブリダイズすることが可能な標的特異的配列をさらに含むオリゴヌクレオチドプローブ；
その３’末端に、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含む汎用性プライマー
を提供すること、および
ポリメラーゼ連鎖反応を実行すること
を含む方法。
【請求項３３】
前記オリゴヌクレオチドプローブが一本鎖ＤＮＡ配列である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記オリゴヌクレオチドプローブの前記標的特異的配列が、前記標的配列の３’末端の配列またはそれに隣接する配列と同一である、請求項３２または３３のいずれかに一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列が、前記汎用性プライマー上に位置する配列に十分に相補的である、請求項３２〜３４のいずれかに一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列が、前記オリゴヌクレオチドプローブの３’末端に位置する、請求項３２〜３５のいずれかに一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記オリゴヌクレオチドプローブが１つまたは複数の追加の配列を含む、請求項３２〜３６のいずれかに一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記１つまたは複数の追加の配列が前記汎用性配列の５’および前記標的特異的配列の３’に配置される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記１つまたは複数の追加の配列が機能性配列である、請求項３７または３８のいずれかに一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記１つまたは複数の機能性配列が、下流オリゴヌクレオチド結合部位、制限酵素認識部位および反応識別配列から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記オリゴヌクレオチドプローブの３’末端が、ポリメラーゼ伸長をブロックすることが可能なブロック基を含む、請求項３２〜４０のいずれかに一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ブロック基がジデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄｄＮＴＰ）またはスペーサーＣ３である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記オリゴヌクレオチドプローブが２０から５０個のヌクレオチドを含む、請求項３２〜４２のいずれかに一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記汎用性プライマーが一本鎖ＤＮＡ配列である、請求項３２〜４３のいずれかに一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記汎用性プライマーの３’末端が、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列に相補的である、請求項３２〜４４のいずれかに一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記汎用性プライマーがその５’末端またはその５’末端部分に１つまたは複数の機能性配列および／または基を含む、請求項３２〜４５のいずれかに一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記１つまたは複数の機能性配列が、下流オリゴヌクレオチド結合部位、制限酵素認識部位および反応識別配列から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記１つまたは複数の機能性基が、蛍光性標識および結合性基から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記汎用性プライマーが５０から１００個のヌクレオチドを含む、請求項３２〜４８のいずれかに一項に記載の方法。
【請求項５０】
第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブの対が提供され、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブは、前記標的配列の３’末端のうちの１つの配列または前記標的配列の３’末端のうちの１つの配列に隣接する配列に特異的である標的特異的配列を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブは、前記標的配列の他の３’末端の配列または前記標的配列の他の３’末端に隣接する配列に特異的である標的特異的配列を含む、請求項３２〜４９のいずれかに一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブが異なる汎用性配列を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
第１および第２の汎用性プライマーの対が提供され、前記第１の汎用性プライマーは、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含み、前記第２の汎用性プライマーは、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含む、請求項５０または５１のいずれかに一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記第１および第２の汎用性プライマーが異なる機能性配列および／または基を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記オリゴヌクレオチドプローブが前記汎用性プライマーの濃度と比較してより低い濃度で提供される、請求項３２〜５３のいずれかに一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記汎用性プライマーの濃度対前記オリゴヌクレオチドプローブの濃度の比が１０：１を超える、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記汎用性プライマーの濃度対前記オリゴヌクレオチドプローブの濃度の比が１２：１から２７５：１である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記汎用性プライマーの濃度対前記オリゴヌクレオチドプローブの濃度の比が１６：１から２５６：１である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ＰＣＲによってＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ標的配列を増幅するために前記標的特異的プライマーが使用される、請求項３２〜５７のいずれかに一項に記載の方法。
【請求項５９】
ＲＮＡ標的配列からｃＤＮＡアンプリコン構築物を生成するための方法であって、
標的特異的プライマー；
ＲＮＡ標的配列
を提供すること、および
逆転写を実行すること
を含み、前記標的特異的プライマーは請求項３２〜５８のいずれかに一項に記載の方法によって調製される方法。
【請求項６０】
前記標的特異的プライマーがｉｎ  ｓｉｔｕで調製される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ｃＤＮＡアンプリコン構築物がＰＣＲによってさらに増幅される、請求項５９または６０のいずれかに一項に記載の方法。
【請求項６２】
標的特異的プライマーを調製するのに使用するためのオリゴヌクレオチドプローブであって、汎用性配列を含み、その５’末端に、またはそれに向かって、標的配列の３’末端のうち１つの配列の逆相補体または前記標的配列の３’末端のうちの１つに隣接する配列の逆相補体とハイブリダイズすることが可能な標的特異的配列をさらに含むオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６３】
一本鎖ＤＮＡ配列である、請求項６２に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６４】
前記オリゴヌクレオチドプローブの前記標的特異的配列が、前記標的配列の３’末端のうちの１つの配列またはそれに隣接する配列と同一である、請求項６２または６３のいずれかに一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６５】
前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列が、前記汎用性プライマー上に位置する配列に十分に相補的である、請求項６２〜６４のいずれかに一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６６】
前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列が、前記オリゴヌクレオチドプローブの３’末端に位置する、請求項６２〜６５のいずれかに一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６７】
１つまたは複数の追加の配列を含む、請求項６２〜６６のいずれかに一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６８】
前記１つまたは複数の追加の配列が前記汎用性配列の５’および前記標的特異的配列の３’に配置される、請求項６７に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６９】
前記１つまたは複数の追加の配列が機能性配列である、請求項６７または６８のいずれかに一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項７０】
前記１つまたは複数の機能性配列が、下流オリゴヌクレオチド結合部位、制限酵素認識部位および反応識別配列から選択される、請求項６９に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項７１】
前記オリゴヌクレオチドプローブの３’末端が、ポリメラーゼ伸長をブロックすることが可能なブロック基を含む、請求項６２〜７０のいずれかに一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項７２】
前記ブロック基がジデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄｄＮＴＰ）またはスペーサーＣ３である、請求項７１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項７３】
２０から５０個のヌクレオチドを含む、請求項６２〜７２のいずれかに一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ＤＮＡまたは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）標的配列のアンプリコン構築物を生成するための新規方法に関する。本発明の方法は、配列決定目的のためにＤＮＡまたはｃＤＮＡ標的配列を調製することに特に適している。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲは、ＤＮＡ鋳型から標的配列を選択的に増幅し、以下の３つのステップから本質的になる：ＤＮＡ鋳型の変性；標的配列または標的配列に隣接する配列へのプライマーのハイブリダイゼーション；およびＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長。伝統的に、ＰＣＲの生成物（本明細書ではアンプリコンと呼ぶ）は、それらの分子量によってＤＮＡ配列を識別する方法であるゲル電気泳動によって分析される。しかし、大規模並行配列決定（次世代配列決定またはＮＧＳとしても知られる）などの多くの現代の適用は、ＰＣＲアンプリコンが、しばしばそれらの末端の機能性配列の形で特異的改変を取り込むことを必要とする。
【０００３】
機能性配列を取り込んでいるアンプリコンを生成するためのいくつかの方法が存在するが、全て、増加費用、プロセシングの複雑性、交差汚染の可能性、キャリーオーバーまたはこれらの組合せなどの欠点を有する。例えば、従来の一段階ＰＣＲ方法は、プライマーの５’末端に機能性配列を追加し、次に通常の方法でＰＣＲを実行して、機能性配列をアンプリコンのいずれかの末端に加えることを含む。しかし、この方法は、特に多数の異なる機能性配列が必要とされるときに厄介で高価である。さらに、この方法は、複雑な組合せにも自動化されたプロセシングにも適さない。
【０００４】
従来の二段階ＰＣＲ方法は、より複雑な構築物を生成するために一般的に使用される。従来の二段階ＰＣＲ方法では、「汎用性配列（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」をアンプリコンのいずれかの末端に加えるために、前記のような一次ＰＣＲステップを実行する。一次ＰＣＲステップで使用されるプライマーは、標的配列に隣接するＤＮＡ配列に相補的である３’遺伝子特異的配列、および５’汎用性配列を含む。次に、一次ＰＣＲで生成されるアンプリコンを鋳型として使用して、二次ＰＣＲステップを実行する。二次ＰＣＲステップで使用されるプライマーは、それらの３’末端が、一次ＰＣＲからのアンプリコンの５’末端の汎用性配列に相補的であり、それにハイブリダイズするように設計される。二次ＰＣＲステップで使用されるプライマーは、５’テールの適当なアレイによって、アンプリコンに必要な機能性配列を追加する。この方法は、プライマーの比較的小さいセットを使用して、機能性配列のより複雑な組合せがＰＣＲアンプリコンに追加されることを可能にする。
【０００５】
従来の二段階ＰＣＲ方法は多段階を必要とし、したがって、特に自動化された液体処理が利用できず、多数の試料を分析する必要がある場合には厄介なことがある。さらに、一次および二次ＰＣＲステップは別々に実行され、一次ＰＣＲステップの生成物は二次ＰＣＲステップで鋳型として使用される。これは、開放チューブおよび／またはチューブの移動を必要とする。したがって、交差汚染またはキャリーオーバーの実際のリスクがある。ＰＣＲは指数関数的増幅を含むので、特にその過程がＮＧＳのような高感受性の分析のための調製ステップとして使用されるときは、低いレベルの汚染さえも、検出するのが困難である非常に重大な影響を及ぼし得る。
【０００６】
さらに、二次ＰＣＲステップは「汎用性プライマー」の使用を含むが、このように呼ばれるのは、一次ＰＣＲステップで使用されるプライマーの汎用性配列に相補的な配列をそれらが全て含むからである。このように、いかなる汎用性プライマーも適当な汎用性配列を含有する任意の標的とハイブリダイズすることができる。この柔軟性は、誤ったアンプリコンが増幅され、続いて調べられてしまうリスクの増加をもたらす。
【０００７】
二段階ＰＣＲ方法は、ＷＯ２００７／１３０９６７、ＷＯ０３／０９７７９４、ＷＯ２０１２／０５４９３３およびＷＯ０２／１４５３４に開示される。
【０００８】
一次および二次ＰＣＲステップを単一の反応に合わせることによって従来の二段階ＰＣＲ方法を単純化することが試みられた。相対的な一次および二次プライマー濃度ならびに／またはＰＣＲ反応条件を最適化することによって、低複雑性構築物のために限られた成功が達成された。しかし、最適化は時間がかかり、この方法は、ＮＧＳのために必要とされるものなどの複雑なアンプリコン構築物を強力に生成することができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００７／１３０９６７号
【特許文献２】国際公開第０３／０９７７９４号
【特許文献３】国際公開第２０１２／０５４９３３号
【特許文献４】国際公開第０２／１４５３４号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、アンプリコン構築物、特に複雑なアンプリコン構築物を生成するための、改善された方法を提供する。上記の従来の二段階ＰＣＲ方法とは対照的に、有利なことには、本発明の方法は、単一の閉鎖的チューブのＰＣＲで実行することができる。さらに、本発明の方法は、使用するのが安く、簡単であり、標的特異性を増加させ、多重化の能力を有し、不正な標的を増幅するかまたは誤った機能性配列を付け加える可能性を有意に低減する。
【００１１】
本発明は、標的配列のアンプリコン構築物を生成するための方法であって、
標的配列；
汎用性配列を含み、その５’末端に、またはそれに向かって、標的配列の３’末端のうちの１つの配列またはそれに隣接する配列の逆相補体とハイブリダイズすることが可能な標的特異的配列をさらに含むオリゴヌクレオチドプローブ；
その３’末端に、オリゴヌクレオチドプローブの汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含む汎用性プライマー
を提供すること、および
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行すること
を含む方法を提供する。
【００１２】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して標的配列のアンプリコン構築物を生成するための方法を提供する。好ましい実施形態では、本発明の方法を使用して生成されるアンプリコン構築物は、一方または両方の末端に、増幅された標的配列に隣接する、１つまたは複数の機能性配列および／または基をそれらが取り込むことで、タグ付けされる。これらの機能性配列および／または基は、標的配列をさらに調べるために下流の過程で活用することができる物理的および／または化学的特性をアンプリコン構築物に付与する。本発明の方法は、配列決定、例えば次世代配列決定（ＮＧＳ）に適する機能性配列を取り込んでいるアンプリコン構築物を生成するのに特に適している。しかし、本発明の方法は、法医学ならびに遺伝性または感染性の疾患の検出および診断を含むがこれらに限定されない他の調査目的に適する任意の所望の機能性配列を含むアンプリコン構築物を生成するために使用できることが認識されるべきである。
【００１３】
上で考察したように、本発明の方法は、標的配列を提供すること、およびＰＣＲによって標的配列を増幅することを含む。ＰＣＲの任意の形態を本発明の方法で用いることができる。例えば、ＤＮＡを増幅するために使用されるＰＣＲの伝統的な形態、発現されたＤＮＡを増幅するために使用されるＰＣＲ技術である逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびＤＮＡの増幅を定量的に測定するために使用されるＰＣＲ技術であるリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、全て本発明の方法で用いることができるＰＣＲの形態である。同様に、任意のＰＣＲ熱サイクル操作条件を本発明の方法で用いることができる。
【００１４】
標的配列でＰＣＲを実行するために追加の試薬が必要とされ、しかもそれらの試薬は用いたＰＣＲ技術のタイプによって変動することを認めるべきである。例えば、ＰＣＲを実行するために、本発明の方法は、熱安定ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）および全４つのデオキシリボヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を提供する。同様に、ＲＴ−ＰＣＲを実行するために、酵素逆転写酵素が提供される。しかし、さらに詳細に下で考察されるように、本発明の方法は標的特異的プライマーを提供しない。むしろ、標的特異的プライマーは、本発明の方法によってｉｎ  ｓｉｔｕで生成される。
【００１５】
上で考察したように、本発明の方法は、標的配列を提供すること、およびＰＣＲによって標的配列を増幅することを含む。標的配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ配列であってよい。本発明の方法がｃＤＮＡ標的配列を提供することであるならば、ｃＤＮＡ標的配列は、本発明の方法で使用する前に調製することができる。ｃＤＮＡ標的配列は、酵素逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを公知の方法で使用してその対応するＲＮＡ配列から調製することができる。あるいは、ｃＤＮＡ配列はｉｎ  ｓｉｔｕでその対応するＲＮＡ配列から調製することができ、その場合には、本発明の方法は対応するＲＮＡ配列を提供し、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）が好ましくは実行される。
【００１６】
ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ標的配列は、任意の生物体のゲノムの任意の部分に由来し得る。例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ標的配列は、ヒトゲノムまたは他の動物ゲノム、植物ゲノム、真菌ゲノム、細菌ゲノム、ウイルスゲノムおよび／または任意の他のＤＮＡ分子に由来し得る。ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ配列は、ＤＮＡベクター、例えばプラスミドまたはウイルスの構成部分として提供することができることを認めるべきである。ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ標的配列は、異なるＤＮＡ、ｃＤＮＡもしくはＲＮＡ標的配列の試料として、または単離形態で提供することができることも認めるべきである。さらに、１つの特異的ＤＮＡ、ｃＤＮＡもしくはＲＮＡ標的配列またはいくつかの異なるＤＮＡ、ｃＤＮＡもしくはＲＮＡ標的配列を一度に増幅するために、本発明の方法を使用することができることを認めるべきである。
【００１７】
複数の異なるＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／またはＲＮＡ標的配列のアンプリコン構築物を同時に生成するために、本発明の方法を使用することができることを認めるべきである。そのような状況で、ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／またはＲＮＡ標的配列で多重ＰＣＲを実行することができる。
【００１８】
上で考察したように、本発明の方法は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ標的配列を提供すること、およびＰＣＲを実行することを含む。したがって、本明細書において本発明に関する「標的配列」への一般的言及は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ標的配列を含むものとする。さらに、本明細書において本発明に関する「ＰＣＲ」への一般的言及は、特記しない限り全てのタイプのＰＣＲおよび操作条件を含むものとする。
【００１９】
本発明の方法は、標的配列、オリゴヌクレオチドプローブ、汎用性プライマーを提供すること、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行することを含む。さらに詳細に下で考察されるように、本発明の方法は、標的配列のアンプリコン構築物、より好ましくは標的配列のタグ付きのアンプリコン構築物を、１回のＰＣＲまたは一段階反応で生成するために使用することができる。１回のＰＣＲは一連のサイクルを一般的に含み、各サイクルは一連の規定の熱インキュベーションからなることを認めるべきである。
【００２０】
本発明の方法は、標的特異的プライマーのｉｎ  ｓｉｔｕ生成に依存する。反応の開始に向かって、汎用性プライマーがオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズし、伸長してｉｎ  ｓｉｔｕで標的特異的プライマーを生成する。標的特異的プライマーは、汎用性プライマーに存在する機能性配列のおかげで任意の必要な機能性配列を含有することができる（さらに詳細に下で考察される）。オリゴヌクレオチドプローブはこの反応で枯渇せず、したがって、触媒として作用し、ＰＣＲの間の以降のラウンドの熱サイクリングで他の汎用性プライマーとハイブリダイズして、より多くの標的特異的なプライマーを形成することができる。標的配列は、一旦形成された標的特異的プライマーによって増幅され、ｉｎ  ｓｉｔｕで生成された標的特異的プライマーに含まれる配列に対応する配列が隣接したアンプリコン構築物を生ずる。この方法は、複雑なアンプリコン構築物が１回のＰＣＲで形成されることを可能にするという点で有利である。
【００２１】
本発明の方法は、ＰＣＲの間に相互作用して標的特異的プライマーを形成する、汎用性プライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブを提供することを含む。オリゴヌクレオチドプローブは、任意の核酸配列または核酸配列の組合せであってよい。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは一本鎖ＤＮＡ配列である。他の実施形態は、他のタイプの核酸、例えばＲＮＡまたは連結核酸（ＬＮＡ（商標））を完全にまたは一部含むオリゴヌクレオチドプローブを使用することができる。
【００２２】
オリゴヌクレオチドプローブは、標的配列の３’末端のうちの１つに相補的な配列または標的配列の３’末端に隣接する配列に相補的な配列をその３’末端に含まないので、標的特異的プライマーでない。結果として、このプローブは標的配列とハイブリダイズすることができない。
【００２３】
上で考察したように、オリゴヌクレオチドプローブは、その５’末端に、またはそれに向かって、標的配列の３’末端のうちの１つの配列またはそれに隣接する配列の逆相補体とハイブリダイズすることが可能な標的特異的配列を含む。オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に向かって配置される配列は、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端部分の中に配置されると解釈するべきである。
【００２４】
標的特異的配列は、標的配列の３’末端の配列または標的配列の３’末端のうちの１つに隣接する配列と同一の配列であってよい。あるいは、標的特異的配列は、結果として生じる標的特異的プライマーが標的特異的配列または標的特異的配列に隣接する配列とハイブリダイズすることができるように、標的配列の３’末端の配列または標的配列の３’末端のうちの１つに隣接する配列と実質的に同一である配列であってよい。
【００２５】
オリゴヌクレオチドプローブは、汎用性プライマーへのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを可能にする汎用性配列をさらに含む。それが汎用性プライマー上に位置する配列とハイブリダイズすることができるようにそれが汎用性プライマー上に位置する配列に十分に相補的である限り、汎用性配列は任意の配列であってよい。
【００２６】
汎用性配列は、その５’末端から離れて、オリゴヌクレオチドプローブの上のどこにでも位置することができる。特に、汎用性配列は、５’末端から、３’末端までの間の、３’末端を含めて、オリゴヌクレオチドプローブの任意の位置に位置することができる。好ましい実施形態では、汎用性配列は、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端に位置する。
【００２７】
オリゴヌクレオチドプローブは、１つまたは複数の追加の配列を含むことができる。それらの追加の配列が汎用性配列の一部もしくは全体を形成するか、または汎用性配列の５’および標的特異的配列の３’に配置されるならば、それらの追加の配列の逆相補体は、結果として生じるｉｎ  ｓｉｔｕで生成された標的特異的プライマーに存在することになる。追加の配列が存在する場合は、それらの配列の１つまたは複数は、結果として生じる標的特異的プライマーに化学的および／または物理的特性を付与することが可能な機能性配列であってよい。任意の機能性配列を用いることができる。適する機能性配列には、これらに限定されないが、下流オリゴヌクレオチド結合部位、制限酵素認識部位および反応識別配列が含まれる。
【００２８】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端は、ポリメラーゼ伸長をブロックすることが可能なブロック基を含む。このように、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端は、ＰＣＲの間にポリメラーゼによって伸長させることができない。オリゴヌクレオチドの３’末端をブロックするのに適する任意のブロック基を用いることができる。適するブロック基には、これらに限定されないが、ジデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄｄＮＴＰ）およびスペーサーＣ３が含まれる。これらの基は当技術分野で公知であり、市販されている。ブロック基の存在が機能性にとって有利または必須であるかを立証するために実験が実行され、そうではないことが分かっている。しかし、ブロック基は、プローブの伸長から生じる望ましくない結果、例えば交差ハイブリダイゼーションおよび／または干渉を阻止することができる。これらの実験の結果は、実施例でさらに詳細に考察される。したがって、ブロック基を用い、それによってオリゴヌクレオチドプローブの構造を単純化し、オリゴヌクレオチドプローブの伸長のいかなる望ましくない結果も回避することが好ましい。オリゴヌクレオチドプローブの伸長は、それが汎用性プライマーの３’末端に相補的でないようにオリゴヌクレオチドプローブを設計することによって阻止することもできる。
【００２９】
オリゴヌクレオチドプローブの長さは、汎用性配列、標的特異的配列および存在する任意の追加の配列の長さによって決定される。好ましくは、汎用性配列および標的特異的配列の長さは、それぞれ汎用性プライマーおよび標的配列とのハイブリダイゼーションに十分な特異性を付与するために必要とされる、最小の長さである。追加の長さは、望ましくない交差ハイブリダイゼーション二次構造および／または干渉をもたらし得る。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、最高１００ヌクレオチド、より好ましくは最高５０ヌクレオチド、なおより好ましくは２０から５０ヌクレオチド、さらになおより好ましくは３０から４０ヌクレオチドを含む。
【００３０】
上で考察したように、本発明の方法では、１つのオリゴヌクレオチドプローブが提供される。しかし、２つまたはそれを超えるプローブが提供されてもよく、これらは標的配列の同じ３’末端または標的配列の３’末端の１つに隣接する同じ配列に特異的であることを認めるべきである。あるいは、２つまたはそれを超えるプローブは、標的配列の異なる３’末端、または標的配列の異なる３’末端に隣接する配列に特異的であってよい。
【００３１】
好ましい一実施形態では、本発明の方法は、第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブの対を提供する。この実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブは、標的配列の３’末端の配列のうちの１つまたは標的配列の３’末端のうちの１つに隣接する配列に特異的である標的特異的配列を含み、第２のオリゴヌクレオチドプローブは、標的配列の他の３’末端の配列または標的配列の他の３’末端に隣接する配列に特異的である標的特異的配列を含む。このように、第１および第２の標的特異的プライマーの対はｉｎ  ｓｉｔｕで生成され、これらは、標的配列の両末端に機能性配列を追加することが可能である。
【００３２】
方法が第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブの対を提供する実施形態では、第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブは、同じまたは異なる汎用性配列を含むことができる。好ましくは、結果として生じるアンプリコンの各末端に機能性配列を独立して付け加えるために、第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブの対は異なる汎用性配列を含む。同様に、第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブは、同じまたは異なる追加のおよび／または機能性配列を含むことができる。好ましくは、任意の１つの標的配列から形成することができる異なるアンプリコン構築物の可能な数を増加させるために、第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブは、異なる追加の配列を含む。
【００３３】
上で考察したように、本発明の方法は、汎用性プライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブを提供すること、ならびにＰＣＲを実行して、標的配列を増幅することが可能な標的特異的プライマーを作製することを含む。汎用性プライマーはオリゴヌクレオチドプローブの汎用性配列とハイブリダイズし、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端を鋳型として使用してＰＣＲの間にＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、標的特異的プライマーを形成する。標的特異的プライマーは、適するプライミング特異性を可能にするように標的配列の３’末端のうちの１つまたは標的配列の３’末端に隣接する配列に十分に相補的な３’配列を含むので、標的特異的である。
【００３４】
汎用性プライマーは、一本鎖の核酸配列である。任意の核酸配列または核酸配列の組合せを用いることができる。好ましい実施形態では、汎用性プライマーは、一本鎖ＤＮＡ配列である。他の実施形態は、他のタイプの核酸、例えばＲＮＡまたは連結核酸（ＬＮＡ（商標））を完全にまたは一部含む汎用性プライマーを使用することができる。
【００３５】
汎用性プライマーは、その３’末端に、オリゴヌクレオチドプローブの汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含む。これを達成するために、汎用性プライマーの３’末端は、オリゴヌクレオチドプローブの汎用性配列に相補的であるか、またはハイブリダイゼーションを可能にするためにオリゴヌクレオチドプローブの汎用性配列に十分に相補的である。ＰＣＲの間、汎用性プライマーはオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズし、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端を鋳型として使用して伸長される。結果として生じるｉｎ  ｓｉｔｕで生成された標的特異的プライマーの３’末端は、標的配列の３’末端配列のうちの１つまたは標的配列の３’末端のうちの１つに隣接する配列とハイブリダイズすること、および、さらなるＰＣＲのラウンドでポリメラーゼによって伸長されることが可能である。
【００３６】
好ましい実施形態では、汎用性プライマーは、その５’末端にまたはそれに向かって位置する、１つまたは複数の機能性配列および／または基をさらに含む。上で考察したように、汎用性プライマーの５’末端に向かって配置される機能性配列および／または基は、汎用性プライマーの５’末端部分の中に配置されると解釈するべきである。機能性配列および／または基は、結果として生じる標的特異的プライマーおよびアンプリコン構築物に化学的および／または物理的特性を付与する。任意の機能性配列および／または基を使用することができ、これらは、結果として生じるアンプリコンの以降の使用目的によって変動する。そのような機能性配列の使用は、当該技術分野で公知である。
【００３７】
例えば、タグ付けされたアンプリコンがＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ（登録商標）装置で配列決定されるならば、汎用性プライマーは試料特異的指標配列を好ましくは含む。このタイプの配列は、アンプリコンがどの試料に由来したか識別するために、配列決定分析の間に一般的に使用される。汎用性プライマーは、アンプリコンを配列フローセルとハイブリダイズさせ、配列決定の前にアンプリコンの初期（クローン）増幅を実行するために使用されるアダプター配列を好ましくはさらに含む。さらに、本用途のために、オリゴヌクレオチドプローブの汎用性配列は、装置上の対の末端配の列決定読み取りのために使用される配列決定プライマーに好ましくは相補的である。
【００３８】
他のタイプの機能性配列には、これらに限定されないが、酵素認識配列、試料識別のための配列および下流分析適用で使用するためのオリゴヌクレオチド結合性配列が含まれる。汎用性プライマーの上の機能性基には、これらに限定されないが、蛍光性標識および結合性基、例えばビオチンが含まれる。
【００３９】
汎用性プライマーの長さは、汎用性配列および存在する任意の追加の配列の長さによって決定される。好ましい実施形態では、汎用性プライマーは、最高２００ヌクレオチド、より好ましくは最高１５０ヌクレオチド、なおより好ましくは５０から１００ヌクレオチド、さらになおより好ましくは７０から１００ヌクレオチドを含む。
【００４０】
本発明の方法は、共通のオリゴヌクレオチドプローブまたは異なるオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることが可能である、２つまたはそれを超える汎用性プライマーを提供することを含むことができる。好ましい実施形態では、第１および第２の汎用性プライマーの対が提供され；各々は、それぞれ第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブの汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含む。本発明の方法が第１および第２の汎用性プライマーの対を提供する実施形態では、結果として生じるアンプリコンの各末端に機能性配列および／または基を独立して付け加え、任意の１つの標的配列から形成することができるアンプリコン構築物の可能な数を増加させるために、第１および第２の汎用性プライマーは、異なる機能性配列および／もしくは基ならびに／またはこれらの組合せを好ましくは含む。
【００４１】
本発明の方法の他の実施形態では、複数の異なる標的配列を単一の多重反応で増幅するために、複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブまたはプローブ対および汎用性プライマーまたはプライマー対が提供される。
【００４２】
オリゴヌクレオチドプローブおよび汎用性プライマーは、適する濃度比で用いられる。適する濃度比は、ルーチンの実験によって容易に決定することができる。汎用性プライマーの濃度と比較してより低い濃度でオリゴヌクレオチドプローブを提供することが好ましいことが分かっている。
【００４３】
好ましくは、汎用性プライマーの濃度対オリゴヌクレオチドプローブの濃度の比は、２：１を超え、より好ましくは５：１を超え、なおより好ましくは１０：１を超える。好ましい一実施形態では、汎用性プライマーの濃度対オリゴヌクレオチドプローブの濃度の比は、最高４０００：１、より好ましくは最高２０００：１、なおより好ましくは最高１０００：１、なおより好ましくは最高５００：１であってよい。
【００４４】
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブに対する汎用性プライマーの相対濃度は、１０：１から３００：１、なおより好ましくは１２：１から２７５：１、さらになおより好ましくは１５：１から２６５：１である。オリゴヌクレオチドプローブに対する汎用性プライマーの特に好ましい相対濃度は、１６：１から２５６：１である。
【００４５】
上で考察したように、本発明の方法は、１回のＰＣＲで標的配列のアンプリコン構築物を生成するために使用することができる。したがって、同時反応からのＰＣＲ交差汚染のリスクがない。しかし、本発明の方法は、２つの別々のＰＣＲステップで標的配列のアンプリコン構築物を生成するために使用することもできることを認めるべきである。第１のＰＣＲステップでは、標的特異的プライマーは、オリゴヌクレオチドプローブおよび汎用性プライマーから調製される。第２のＰＣＲステップでは、標的配列は、第１のＰＣＲステップによって生成される標的特異的プライマーによって増幅される。
【００４６】
したがって、さらなる態様では、本発明は、標的配列からアンプリコン構築物を生成するのに使用するための標的特異的プライマーを調製するための方法であって、
汎用性配列を含み、その５’末端に、またはそれに向かって、標的配列の３’末端のうちの１つの配列の逆相補体または標的配列の３’末端のうちの１つに隣接する配列の逆相補体とハイブリダイズすることが可能な標的特異的配列をさらに含むオリゴヌクレオチドプローブ；
その３’末端に、オリゴヌクレオチドプローブの汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含む汎用性プライマー
を提供すること、および
ポリメラーゼ連鎖反応を実行すること
を含む方法を提供する。
【００４７】
オリゴヌクレオチドプローブおよび汎用性プライマー、ならびに標的特異的プライマーを形成するためにＰＣＲの間にそれらが相互作用する条件は、本発明の第１の態様に関して上で詳細に考察されている。一旦本発明のさらなる態様の方法によって形成されると、標的特異的プライマーは、好ましくは１つまたは複数の機能性配列が隣接したその標的配列のアンプリコン構築物を生成するために、以降のおよび別個のＰＣＲで標的配列を増幅するために使用することができる。上記のように、標的配列はＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡ標的配列であってよく、任意の生物体のゲノムの任意の部分に由来し得る。
【００４８】
上記のように、本発明のこのさらなる態様の方法は、標的配列に、一方または両方の末端において機能性配列を隣接させることが可能な第１および第２の標的特異的プライマーの対を調製するために使用することができることを認めるべきである。第１および第２の標的特異的プライマーの対を調製するために、第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブの対ならびに第１および第２の汎用性プライマーの対が提供される。
【００４９】
本発明のこのさらなる態様の方法は、異なる標的配列または異なる標的配列に隣接する配列とハイブリダイズすることが可能な、複数の標的特異的プライマーを調製するために使用することができることも認めるべきである。このように、本発明のさらなる態様の方法は、多重ＰＣＲで使用するための一群の標的特異的プライマーを調製するために用いることができる。
【００５０】
上で考察したように、本発明の方法は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ標的配列のアンプリコン構築物を生成するために用いることができる。ｃＤＮＡ標的配列のアンプリコン構築物を生成するためにこの方法が使用される場合は、ｃＤＮＡ配列は前もってその対応するＲＮＡ配列から調製することができる。あるいは、ｃＤＮＡ配列は、ｉｎ  ｓｉｔｕで形成することができる。その場合は、ＲＮＡ配列が提供され、ＲＴ−ＰＣＲが実行される。一旦逆転写によって形成されると、ｃＤＮＡはＰＣＲの間に標的特異的プライマーとハイブリダイズし、それによって増幅される。標的特異的プライマーも、ＰＣＲによってｉｎ  ｓｉｔｕで形成される。
【００５１】
しかし、本発明の方法はＲＮＡ標的配列から直接的にｃＤＮＡアンプリコン構築物を生成するために使用することもでき、このｃＤＮＡアンプリコン構築物は一方または両方の末端に１つまたは複数の機能性配列または基を含み、それらは必要に応じて次に分析またはプロセシングすることができることを認めるべきである。
【００５２】
したがって、なおさらなる態様では、本発明は、ＲＮＡ標的配列からｃＤＮＡアンプリコン構築物を生成するための方法であって、
標的特異的プライマー；
ＲＮＡ標的配列
を提供すること、および
逆転写を実行すること
を含む方法を提供し、標的特異的プライマーは本明細書で上に記載される方法によって調製される。
【００５３】
標的特異的プライマーならびにそれをオリゴヌクレオチドプローブおよび汎用性プライマーからどのように形成できるかは、本発明の第１の態様に関して上で詳細に記載されている。上記のように、標的特異的プライマーは、本発明のこのなおさらなる態様の方法での使用の前に、前もってＰＣＲによって調製することができる。あるいは、標的特異的プライマーは、ｉｎ  ｓｉｔｕで調製することができる。標的特異的プライマーがｉｎ  ｓｉｔｕで調製されるならば、本発明のこのなおさらなる態様の方法は、オリゴヌクレオチドプローブおよび汎用性プライマーをさらに提供し、ＰＣＲは本発明の第１の態様に関して上で考察される通りに実行される。一旦標的特異的プライマーがＰＣＲによって形成されると、逆転写反応をＲＮＡ標的配列に対して実行することができる。実際には、ＰＣＲ反応および逆転写反応は、並行して起こることができる。
【００５４】
本発明の方法で提供されるＲＮＡ標的配列は、ヒトゲノムまたは他の動物ゲノム、植物ゲノム、真菌ゲノム、細菌ゲノム、ウイルスゲノムおよび／または任意の他のＲＮＡ分子を含む任意の生物体のゲノムの任意の部分に由来してよい。上記のように、ＲＮＡ標的配列は、異なるＲＮＡ標的配列の試料として、または単離形態で提供することができることを認めるべきである。さらに、本発明の方法は、１つの特異的ＲＮＡ標的配列またはいくつかの異なるＲＮＡ標的配列を一度に増幅するために使用することができることを認めるべきである。
【００５５】
上記のように、本発明のこのなおさらなる態様の方法は、ＲＮＡ標的配列に対して逆転写を実行することを必要とする。したがって、酵素逆転写酵素などの逆転写反応のために必要な追加の試薬が必要であることを認めるべきである。
【００５６】
使用時、標的特異的プライマーはＲＮＡ標的配列に結合し、逆転写反応の間、逆転写酵素によって伸長される。結果として生じるｃＤＮＡは、ＰＣＲによってさらに増幅することができる。
【００５７】
さらになおさらなる態様では、本発明はＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ標的特異的プライマーを調製するのに使用するためのオリゴヌクレオチドプローブを提供し、このオリゴヌクレオチドプローブは汎用性配列を含み、その５’末端に、またはそれに向かって、ＤＮＡ、ｃＤＮＡもしくはＲＮＡ標的配列の３’末端のうちの１つの配列の逆相補体またはＤＮＡ、ｃＤＮＡもしくはＲＮＡ標的配列の３’末端のうちの１つに隣接する配列の逆相補体とハイブリダイズすることが可能な標的特異的配列をさらに含む。
【００５８】
標的特異的配列および汎用性配列を含むオリゴヌクレオチドプローブの構成部分は、本発明の第１の態様に関して上で詳細に考察されている。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、用いられた標的配列、第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブならびに第１および第２の汎用性プライマーを示す。
【図２】図２は、反応シーケンスの第１の反応を例示する。
【図３】図３は、結果として生じる第１および第２の標的特異的プライマー４０および４２を示す。
【図４ａ】図４ａは、本発明の方法により異なるＤＮＡ標的配列から得られたＤＮＡ断片でのゲル電気泳動の結果を示す。
【図４ｂ】図４ｂは、本発明の方法により異なるＤＮＡ標的配列から得られたＤＮＡ断片でのゲル電気泳動の結果を示す。
【図４ｃ】図４ｃは、本発明の方法により異なるＤＮＡ標的配列から得られたＤＮＡ断片でのゲル電気泳動の結果を示す。
【図４ｄ】図４ｄは、本発明の方法により異なるＤＮＡ標的配列から得られたＤＮＡ断片でのゲル電気泳動の結果を示す。
【図５】図５は、本発明の方法により異なるＤＮＡ標的配列から得られたＤＮＡ断片でのゲル電気泳動の結果を示す。
【図６】図６は、本発明の方法により異なるＤＮＡ標的配列から得られたＤＮＡ断片でのゲル電気泳動の結果を示す。
【図７】図７は、本発明の方法により異なるＤＮＡ標的配列から得られたＤＮＡ断片でのゲル電気泳動の結果を示す。
【実施例】
【００６０】
本発明の実施形態は、今から以下の実施例を通して例示目的のためにだけ記載される。
【００６１】
（実施例１）
本発明の方法は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ（登録商標）装置での配列決定のためにＤＮＡ標的配列のタグ付きのアンプリコン構築物を生成するために実行された。このアッセイのための標的配列は、ヒトＭＵＴＹＨ遺伝子（ｒｅｆＳｅｑ  ＮＭ＿００１１２８４２５）のエクソン７の一部である。このアッセイは、ＭＵＴＹＨ関連のポリポーシス（ＭＡＰ）を引き起こすことが知られている特異的突然変異（ＭＵＴＹＨ：ｃ．５３６Ａ＞Ｇ、ｐ．Ｔｙｒ１７９Ｃｙｓ）を分析するために使用される。
【００６２】
第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブの対は、第１および第２の汎用性プライマーの対と一緒に標的配列に対して設計された。用いられた標的配列、第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブならびに第１および第２の汎用性プライマーは、図１に示す。
【００６３】
図１に関しては、ＤＮＡ配列は一般的に２で表される。示すように、ＤＮＡ配列は二本鎖であり、センス鎖４および相補的アンチセンス鎖６を含む。センスおよびアンチセンス鎖４および６は、互いに反対の方向に向かう。ＤＮＡ配列２は、本発明の方法による増幅のための標的配列８をさらに含む。配列１０および１２は、それぞれセンス鎖４およびアンチセンス鎖６の３’末端で標的配列に隣接する。
【００６４】
第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ１４および１６で一般的に表される。示すように、第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブ１４および１６は一本鎖ＤＮＡ配列であり、各々、標的配列２の３’末端のうちの１つの逆相補体または標的配列２の３’末端のうちの１つに隣接する配列とハイブリダイズすることが可能な標的特異的配列を含む。特に、第１のオリゴヌクレオチドプローブ１４は、標的配列２のアンチセンス鎖６の配列１２と同一である配列１８を含む。同様に、第２のオリゴヌクレオチドプローブ１６は、標的配列２のセンス鎖４の配列１０と同一である配列２０を含む。オリゴヌクレオチドプローブ配列１８および２０は、太字で強調される。
【００６５】
さらに詳細に下で考察されるように、第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブ１４および１６は、それぞれ第１および第２の汎用性プライマー２８および３０とのハイブリダイゼーションを促進するために、汎用性配列２２および２４をさらに含む。汎用性配列２２および２４には、下線を引く。
【００６６】
第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブ１４、１６は、ＰＣＲの間のポリメラーゼ伸長をブロックするためにそれらの３’末端にブロック基２６をさらに含む。
【００６７】
示すように、第１の汎用性プライマー２８および第２の汎用性プライマー３０は、一本鎖ＤＮＡ配列である。第１の汎用性プライマー２８は、その３’末端に、第１のオリゴヌクレオチドプローブ１４の汎用性配列２２に相補的な配列３２を含む。同様に、第２の汎用性プライマー３０は、その３’末端に、第２のオリゴヌクレオチドプローブ１６の汎用性配列２４に相補的な配列３４を含む。配列３２および３４には、下線を引く。
【００６８】
第１および第２の汎用性プライマー２８および３０は、それらの５’末端にそれぞれ機能性配列３６および３８を各々含む。機能性配列３６および３８は変更可能であり、結果として生じるタグ付きのアンプリコンが改変および／または分析される方法に適するように変更することができる。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ（登録商標）装置での配列決定のために、標的配列のアンプリコンは、両末端において異なる機能性配列の組合せと隣接していなければならない。それらの配列は、ＭｉＳｅｑ（登録商標）などのＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定装置での使用のためにＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）によって設計された異なる配列のライブラリーから選択することができる。特に、配列決定アダプターＰ５は、８つの試料特異的指標配列（Ａ５０１〜Ａ５０７）のうちの１つと合わせて使用することができる。さらに、配列決定アダプターＰ７は、１２個の試料特異的指標配列（Ａ７０１〜Ａ７１２）のうちの１つと合わせて使用することができる。配列決定アダプターはフローセルハイブリダイゼーションおよびブリッジ増幅のために使用され、配列決定読み取りがどの試料に由来したかについて識別するために試料特異的指標配列が使用される。
【００６９】
実施例１では、機能性配列３６は、Ｐ５配列決定アダプターを試料特異的指標配列Ａ５０１と合わせて含む。さらに、機能性配列３８は、Ｐ７配列決定アダプターを試料特異的指標配列Ａ７０１と合わせて含む。
【００７０】
第１および第２の汎用性プライマー２８および３０は、それらの５’末端に向かってそれぞれ機能性配列５０および５２をさらに含む。機能性配列５０および５２も変更可能であり、結果として生じるタグ付きのアンプリコンが改変および／または分析される方法に適するように変更することができる。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ（登録商標）装置での配列決定のために、標的配列のアンプリコンは、両末端で配列決定プライマー結合部位Ｓ１およびＳ２と隣接していなければならない。配列決定プライマー結合部位は、配列決定の間、異なる配列決定読み取りのためにプライマーをハイブリダイズするために使用される。
【００７１】
実施例１では、機能性配列５０は配列決定プライマー結合部位Ｓ１を含み、機能性配列５２は配列決定プライマー結合部位Ｓ２を含む。
【００７２】
上で考察したように、本発明の方法は、単一のＰＣＲ反応シーケンスで標的配列のタグ付きアンプリコン構築物を生成することが可能である。反応シーケンスは、２つの反応からなる；第１は、第１および第２の標的特異的プライマーを生成するための、第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブ１４および１６と第１および第２の汎用性プライマー２８および３０の間の反応であり、第２の反応は、標的配列のタグ付きアンプリコン構築物を生成するための、第１および第２の標的特異的プライマーと標的配列または標的配列に直接隣接している配列の間の反応である。一旦第１の反応からの生成物が形成されると、それらは第２の反応の構成成分としての使用に直ちに利用可能である。結果として、第１および第２の反応が同時に起こる。単一の反応シーケンスの第１および第２の反応は、それぞれ図２および３に例示される。
【００７３】
ヒトＭＵＴＹＨ遺伝子のエクソン７（ｒｅｆＳｅｑ  ＮＭ＿００１１２８４２５）を増幅するために、Ｑ５（登録商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、製品コード：Ｍ０４９４Ｌ）および２ｎｇ／μｌの最終濃度のゲノムＤＮＡを使用して本発明の方法を実行した。反応は、以下の熱サイクルで行った：
ステップ１：９８℃で３０秒間
ステップ２：以下を４０サイクル：
９８℃で１０秒間
６０℃で２０秒間
７２℃で２０秒間
ステップ３：７２℃で５分間
図２は、反応シーケンスの第１の反応を例示する。簡潔に示すために、第１および第２の汎用性プライマー２８および３０の機能性配列３６および３８は、文字「Ｎ」で置き換えた。
【００７４】
示すように、第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブ１４および１６の汎用性配列２２および２４は、それぞれ第１および第２の汎用性プライマー２８および３０の配列３２および３４とハイブリダイズする。ＰＣＲの間、汎用性プライマー２８および３０は、配列１８および２０を鋳型として使用してＤＮＡポリメラーゼによって示す方向に伸長される。
【００７５】
結果として生じる第１および第２の標的特異的プライマー４０および４２を、図３に示す。標的特異的プライマー４０および４２は、ＤＮＡ配列２の３’配列１２および１０に相補的な３’配列４４および４６をそれぞれ含む。したがって、第１および第２の標的特異的プライマー４０および４２は、ＤＮＡ配列２の配列１２および１０とそれぞれハイブリダイズすることが可能である。ＰＣＲの間、第１および第２の標的特異的プライマー４０および４２は、標的配列８を鋳型として使用してＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。このように、標的配列は増幅され、結果として生じるアンプリコン構築物は、非標的特異的プライマー２８および３０を起源とする配列によって両末端にタグが付けられる。
【００７６】
結果として生じるタグ付きのアンプリコン構築物は、４８で一般的に表される。簡潔に示すために、全体のアンプリコン配列は示されない。示されない配列は、点線によって表す。
【００７７】
正しい標的配列が増幅されたことを確認するために、アンプリコン構築物４８をＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ（登録商標）システムで配列決定した。アンプリコン構築物４８は、正しい標的配列に対応した。
【００７８】
（実施例２）
図４ａ〜４ｄは、本発明の方法により異なるＤＮＡ標的配列から得られたＤＮＡ断片でのゲル電気泳動の結果を示す。
【００７９】
上で考察したように、ＰＣＲの間、汎用性プライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブは相互作用して標的特異的プライマーを形成し、それらは次に標的配列を増幅することが可能である。オリゴヌクレオチドプローブ対標的特異的プライマーの最適な濃度比を判定するために、実験を実行した。
【００８０】
４対の第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブを、ヒトゲノムに由来する４つの異なるＤＮＡ標的配列に対して設計した（本明細書において、標的配列Ｗ、Ｘ、ＴおよびＵと呼ぶ）。第１および第２の汎用性プライマーの単一の対を、４対の第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることが可能なように設計した。
【００８１】
標的配列Ｗ、Ｘ、ＴおよびＵは、以下の通りヒトゲノムからの遺伝子の部分であった：
Ｗ：ＮＲＡＳ遺伝子のエクソン２（ｒｅｆｓｅｑ  ＮＭ＿００２５２４．４）
Ｘ：ＮＲＡＳ遺伝子のエクソン３（ｒｅｆｓｅｑ  ＮＭ＿００２５２４．４）
Ｔ：ＫＲＡＳ遺伝子のエクソン３（ｒｅｆｓｅｑ  ＮＭ＿００４９８５．３）
Ｕ：ＫＲＡＳ遺伝子のエクソン２（ｒｅｆｓｅｑ  ＮＭ＿００４９８５．３）
各標的配列に対して様々な濃度比で、本発明の方法を数回繰り返した。各回、汎用性プライマーの濃度は一定にしておいたが、オリゴヌクレオチドプローブの濃度は減少させた。
【００８２】
Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（登録商標）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、製品コード：Ｍ０４９４Ｌ）および２ｎｇ／μｌの最終濃度のヒトゲノムＤＮＡを使用して本発明の方法を実行した。反応は、以下の熱サイクルで行った：
ステップ１：９８℃で３０秒間
ステップ２：以下を４０サイクル：
９８℃で１０秒間
６０℃で２０秒間
７２℃で２０秒間
ステップ３：７２℃で５分間
各標的配列の反応の各々から生成したアンプリコン構築物は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＤＮＡ  １０００キットを使用して展開した。標的配列が本発明の方法によって首尾よく増幅されたかどうか立証するために、塩基対でのアンプリコンの予想される長さを、ＤＮＡの視認可能なバンドに対して外挿した。オリゴヌクレオチドプローブの濃度が２ｆｍｏｌ／μｌから１１７ａｍｏｌ／μｌの範囲内であり、汎用性プライマーの濃度が３０ｆｍｏｌ／μｌであった場合に、必要とされるアンプリコン構築物のより高い濃度が得られることが判明した。これは、１６：１から２５６：１の汎用性プライマー対オリゴヌクレオチドプローブの最適な濃度比に等しい。汎用性プライマー対オリゴヌクレオチドプローブの最適な濃度比が使用された反応の結果を、図４ａ〜４ｄに示す。
【００８３】
図４ａ〜４ｄに示すように、オリゴヌクレオチドプローブの濃度が２ｆｍｏｌ／μｌから１１７ａｍｏｌ／μｌの範囲内であり、汎用性プライマーの濃度が３０ｆｍｏｌ／μｌであった場合に、標的配列Ｗ、Ｘ、ＴおよびＵのアンプリコン構築物は本発明の方法によって首尾よく形成された。
【００８４】
（実施例３）
図５〜６は、本発明の方法により異なるＤＮＡ標的配列から得られたＤＮＡ断片でのゲル電気泳動の結果を示す。
【００８５】
さらなる２０対の第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブを、さらなる２０個のＤＮＡ標的配列（本明細書で配列ＡからＳおよびＶと呼ぶ）に対して設計した。上記のように、第１および第２の汎用性プライマーの単一の対を、２０対の第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることが可能なように設計した。
【００８６】
実施例２から得られた最適な濃度比内の濃度比（汎用性プライマーの濃度：３０ｆｍｏｌ／μｌおよびオリゴヌクレオチドプローブの濃度：１ｆｍｏｌ／μｌ）を使用して、全２４個の標的配列（実施例２からの配列Ｗ、Ｘ、ＴおよびＵと実施例３からの配列ＡからＳおよびＶ）で本発明の方法を実行した。
【００８７】
全てのオリゴヌクレオチドプローブ対は、それらの３’末端にブロック基を含んだ。
【００８８】
Ｑ５（登録商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、製品コード：Ｍ０４９４Ｌ）および２ｎｇ／μｌの最終濃度のヒトゲノムＤＮＡを使用して本発明の方法を実行した。反応は、以下の熱サイクルで行った：
ステップ１：９８℃で３０秒間
ステップ２：以下を４０サイクル：
９８℃で１０秒間
６０℃で２０秒間
７２℃で２０秒間
ステップ３：７２℃で５分間
上記のように、生成されたアンプリコン構築物は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＤＮＡ１０００キットを使用して展開し、塩基対でのそれらの予想サイズを既知のサイズのＤＮＡの視認可能なバンドに対して外挿した。アンプリコン構築物の各々のおよそのゲノム位置および塩基対での予想サイズは、以下の通りであった：
【００８９】
【表１】
2018507706.tif 000003
【００９０】
示すように、標的配列ＡからＸのアンプリコン構築物は、実施例２から得られた最適な濃度比を使用したとき（汎用性プライマーの濃度：３０ｆｍｏｌ／μｌおよびオリゴヌクレオチドプローブの濃度：１ｆｍｏｌ／μｌ）、本発明の方法によって首尾よく形成された。
【００９１】
（実施例４）
図７は、本発明の方法により異なるＤＮＡ標的配列から得られたＤＮＡ断片のゲル電気泳動の結果を示す。
【００９２】
さらなる４対の第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブを、さらなる４個のＤＮＡ標的配列（本明細書で配列Ｃ−ＮＢ、Ｎ−ＮＢ、Ｗ−ＮＢおよびＸ−ＮＢと呼ぶ）に対して設計した。
Ｃ−ＮＢ：ＪＡＫ２遺伝子のエクソン１４（ｒｅｆｓｅｑ  ＮＭ＿００４９７２．３）
Ｎ−ＮＢ：ＭＵＴＹＨ遺伝子のエクソン７（ｒｅｆｓｅｑ  ＮＭ＿００１１２８４２８）
Ｗ−ＮＢ：ＮＲＡＳ遺伝子のエクソン２（ｒｅｆｓｅｑ  ＮＭ＿００２５２４．４）
Ｘ−ＮＢ：ＮＲＡＳ遺伝子のエクソン３（ｒｅｆｓｅｑ  ＮＭ＿００２５２４．４）
再び、第１および第２の汎用性プライマーの単一の対を、４対の第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることが可能なように設計した。本発明の方法は、実施例２から得られた最適な濃度比（汎用性プライマーの濃度：３０ｆｍｏｌ／μｌおよびオリゴヌクレオチドプローブの濃度：１ｆｍｏｌ／μｌ）を使用して、全４つの標的配列に対して実行した。
【００９３】
それが本発明の方法の性能に影響するかどうかを判定するために、４対のオリゴヌクレオチドプローブをブロック基なしで設計した。
【００９４】
Ｑ５（登録商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、製品コード：Ｍ０４９４Ｌ）および２ｎｇ／μｌの最終濃度のヒトゲノムＤＮＡを使用して本発明の方法を実行した。反応は、以下の熱サイクルで行った：
ステップ１：９８℃で３０秒間
ステップ２：以下を４０サイクル：
９８℃で１０秒間
６０℃で２０秒間
７２℃で２０秒間
ステップ３：７２℃で５分間
上記のように、生成されたアンプリコン構築物は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＤＮＡ１０００キットを使用して展開し、塩基対でのそれらの予想サイズを既知のサイズのＤＮＡの視認可能なバンドに対して外挿した。アンプリコン構築物の各々の塩基対での予想サイズは、以下の通りであった：
【００９５】
【表２】
2018507706.tif 000004
【００９６】
示すように、標的配列Ｃ−ＮＢ、Ｎ−ＮＢ、Ｗ−ＮＢおよびＸ−ＮＢのアンプリコン構築物は、実施例２から得られた最適な濃度比を使用したとき（汎用性プライマーの濃度：３０ｆｍｏｌ／μｌおよびオリゴヌクレオチドプローブの濃度：１ｆｍｏｌ／μｌ）、本発明の方法によって首尾よく形成された。
【００９７】
正しい標的配列が増幅されたことを確認するために、生成された全４つのアンプリコン構築物をＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ（登録商標）システムで配列決定した。アンプリコン構築物のうちの全４つは、正しい標的配列に対応した。したがって、ブロック基の有無は、方法の性能に影響しない。
【図１】
2018507706.tif 000005
【図２】
2018507706.tif 000006
【図３】
2018507706.tif 000007
【図４ａ】
2018507706.tif 000008
【図４ｂ】
2018507706.tif 000009
【図４ｃ】
2018507706.tif 000010
【図４ｄ】
2018507706.tif 000011
【図５】
2018507706.tif 000012
【図６】
2018507706.tif 000013
【図７】
2018507706.tif 000014
【国際調査報告】
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