(57)【要約】対象の気道に酵素を送達するための方法及び組成物。幾つかの態様において、プラスミノーゲン活性化因子などの酵素の噴霧組成物が提供される。さらなる態様において、プラスミノーゲン活性化因子などの酵素を含むペルフルオロカーボン組成物が提供される。組成物は、幾つかの態様において、肺感染症、または吸入煙誘発急性肺損傷（ＩＳＡＬＩ）などの急性肺損傷の治療ために使用することができる。第１の実施形態において、Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドの医薬として許容される製剤が提供される。例えば、幾つかの態様において、当該Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドは、呼吸器系への送達のために製剤される。したがって、幾つかの態様において、生物学的に活性なＣａｖ−１足場ドメインポリペプチドの噴霧溶液が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的に活性なカベオリン−１（Ｃａｖ−１）足場ドメインポリペプチドの噴霧溶液を含む組成物。
【請求項２】
前記Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドが、ＦＴＴＦＴＶＴ（配列番号１）、ＤＧＩＷＫＡＳＦＴＴＦＴＶＴＫＹＷＦＹＲ（配列番号２）、または、ＮＹＨＹＬＥＳＳＭＴＡＬＹＴＬＧＨ（配列番号３）のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドが、２０アミノ酸以下の長さであり、かつ、ＦＴＴＦＴＶＴ（配列番号１）の配列を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドが、１０アミノ酸以下の長さであり、かつ、ＦＴＴＦＴＶＴ（配列番号１）の配列を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドが、ＦＴＴＦＴＶＴ（配列番号１）の配列からなる、または、それから本質的になる、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記噴霧溶液が、振動メッシュ噴霧器を使用して生成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記振動メッシュ噴霧器が、アクティブ型振動メッシュ噴霧器である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記振動メッシュ噴霧器が、パッシブ型振動メッシュ噴霧器である、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記振動メッシュ噴霧器が、Ａｅｒｏｎｅｂ（登録商標）プロフェッショナルネブライザーシステム、または、ＥＺ  Ｂｒｅａｔｈｅ  Ａｔｏｍｉｚｅｒである、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記噴霧溶液が、ジェット噴霧器、または、超音波噴霧器を使用して生成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記溶液が、水溶液である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記溶液が、生理学的に許容される塩を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記溶液が、ｐＨ緩衝剤を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記溶液が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記溶液が、本質的にｐＨ緩衝剤を含まない、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記溶液が、滅菌生理食塩水である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、滅菌生理食塩水、及び、前記生物学的に活性なＣａｖ−１足場ドメインポリペプチドから本質的になる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記噴霧溶液が、生物学的に活性な酵素をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記酵素が、プラスミノーゲン活性化酵素である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記プラスミノーゲン活性化酵素が、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、または、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ｕＰＡが、一本鎖ｕＰＡ（ｓｃｕＰＡ）である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記噴霧溶液が、約２．５μｍ〜２０μｍの平均粒径を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記噴霧溶液が、約２．５μｍ〜８μｍの平均粒径を有する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記噴霧溶液が、約３．０μｍ〜６μｍの平均粒径を有する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
肺の線維化病態を治療または予防する治療に使用するための組成物であって、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組成物を含む、組成物。
【請求項２６】
対象の急性肺損傷、肺感染症、または、肺疾患を治療または予防する方法であって、有効量の生物学的に活性なＣａｖ−１足場ドメインポリペプチドを前記対象に投与することを含み、前記ポリペプチドの噴霧溶液が、前記対象の気道に投与される、方法。
【請求項２７】
前記対象が、急性肺損傷または感染症を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記対象が、化学物質誘発肺損傷を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象が、鋳型気管支炎、喘息、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、または、吸入煙誘発急性肺損傷（ＩＳＡＬＩ）を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記肺疾患が、肺の線維化病態である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記肺疾患が、間質性肺疾患である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記肺疾患が、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、または、肺の瘢痕化である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記投与が、前記Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドを含む溶液を噴霧することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記噴霧が、超音波またはジェット噴霧器を使用して、前記Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドを含む前記溶液を噴霧することを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記噴霧が、超音波またはジェット噴霧器の使用を含まずに、前記Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドを含む前記溶液を噴霧する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記噴霧が、振動メッシュ噴霧器を使用して、前記Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドを含む前記溶液を噴霧することを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記振動メッシュ噴霧器が、アクティブ型振動メッシュ噴霧器である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記振動メッシュ噴霧器が、パッシブ型振動メッシュ噴霧器である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記振動メッシュ噴霧器が、Ａｅｒｏｎｅｂ（登録商標）プロフェッショナルネブライザーシステム、または、ＥＺ  Ｂｒｅａｔｈｅ  Ａｔｏｍｉｚｅｒである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記噴霧が、
（ｉ）Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドを含む凍結乾燥ポリペプチド組成物を得ることと、
（ｉｉ）前記凍結乾燥酵素組成物を水溶液中で再構成してポリペプチド溶液を提供することと、
（ｉｉｉ）前記ポリペプチド溶液を噴霧することと、を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の噴霧溶液を投与することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項４２】
生物学的に活性なプラスミノーゲン活性化酵素を前記対象に投与することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項４３】
前記プラスミノーゲン活性化酵素が、噴霧溶液で前記対象の気道に投与される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記プラスミノーゲン活性化酵素が、ｔＰＡまたはｕＰＡである、請求項２に記載の方法。
【請求項４５】
前記プラスミノーゲン活性化酵素が、ｓｃｕＰＡである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
対象の気道に投与するための生物学的に活性なＣａｖ−１足場ドメインポリペプチドを調製する方法であって、前記Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドを含む溶液を噴霧して噴霧溶液を提供することを含む、方法。
【請求項４７】
前記Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドが、ＦＴＴＦＴＶＴ（配列番号１）、ＤＧＩＷＫＡＳＦＴＴＦＴＶＴＫＹＷＦＹＲ（配列番号２）、または、ＮＹＨＹＬＥＳＳＭＴＡＬＹＴＬＧＨ（配列番号３）のアミノ酸配列を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドが、２０アミノ酸以下の長さであり、かつ、ＦＴＴＦＴＶＴ（配列番号１）の配列を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドが、１０アミノ酸以下の長さであり、かつ、ＦＴＴＦＴＶＴ（配列番号１）の配列を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドが、ＦＴＴＦＴＶＴ（配列番号１）の配列からなる、または、それから本質的になる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記溶液の噴霧が、振動メッシュ噴霧器を使用することによる、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記振動メッシュ噴霧器が、アクティブ型振動メッシュ噴霧器である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記振動メッシュ噴霧器が、パッシブ型振動メッシュ噴霧器である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記振動メッシュ噴霧器が、Ａｅｒｏｎｅｂ（登録商標）プロフェッショナルネブライザーシステム、または、ＥＺ  Ｂｒｅａｔｈｅ  Ａｔｏｍｉｚｅｒである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記溶液の前記噴霧が、超音波またはジェット噴霧器を使用することを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５６】
前記溶液の前記噴霧が、超音波またはジェット噴霧器の使用を含まない、請求項４６に記載の方法。
【請求項５７】
前記溶液が、水溶液である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５８】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載のａ組成物を生成する方法としてさらに定義される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５９】
噴霧が、
（ｉ）Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドを含む凍結乾燥ポリペプチド組成物を得ることと、
（ｉｉ）前記凍結乾燥酵素組成物を水溶液中で再構成してポリペプチド溶液を提供することと、
（ｉｉｉ）前記ポリペプチド溶液を噴霧することと、を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項６０】
請求項４６〜５９のいずれか一項に記載の方法によって生成された噴霧ポリペプチド溶液。
【請求項６１】
前記噴霧溶液を、それを必要とする対象の気道に投与することをさらに含む、請求項４６〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
凍結乾燥防止剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６３】
前記凍結乾燥防止剤が、マンニトールである、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
前記マンニトールが、前記Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドに対して１００：１〜５：１ｗ／ｗの割合で存在する、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６５】
生物学的に活性なカベオリン−１（Ｃａｖ−１）足場ドメインポリペプチド、及び、少なくとも第１の凍結乾燥防止剤を含む凍結乾燥組成物であって、水溶液に暴露されたときに、前記Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドが可溶性を保つ、凍結乾燥組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１５年２月２７日に出願された米国仮出願第６２／１２６，０３９号の優先権を主張し、その全内容は、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【０００２】
配列表の援用
「ＵＴＦＢＰ１０４９ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」の名称で特定された（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）において認められた）１ＫＢのファイルに含まれており、かつ、２０１６年２月２６日に作成された配列表は、本明細書と共に電子出願に供されており、かつ、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
発明の背景
【０００３】
１．発明の技術分野
本発明は、一般的には、分子生物学、薬物送達、及び、薬物の分野に関する。より詳細には、本発明は、呼吸器系への送達などによる、対象に治療用ポリペプチド組成物を送達するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
２．関連技術の説明
肺損傷の間に、ｐ５３発現が増大して、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）を誘発する一方で、肺上皮細胞（ＬＥＣ）のアポトーシスを招くウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）及びその受容体（ｕＰＡＲ）の発現を阻害する。この傷害のメカニズムには、ｕＰＡ、ｕＰＡＲ、カベオリン−１（「Ｃａｖ−１」）、及び、β１−インテグリンの間での細胞表面シグナル伝達相互作用が関係している（Ｓｈｅｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。これらの相互作用を調節する組成物は、傷害を受けた、または、損傷した肺上皮細胞のアポトーシスを阻害する方法、及び、急性肺損傷、及び、それに続いて生じる肺線維症を治療する方法において使用することができる。したがって、肺損傷を予防または治療するために使用することができるポリペプチド、特に、そのようなポリペプチドの治療的送達のための製剤及び方法が待望されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の実施形態において、Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドの医薬として許容される製剤が提供される。例えば、幾つかの態様において、当該Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドは、呼吸器系への送達のために製剤される。したがって、幾つかの態様において、生物学的に活性なＣａｖ−１足場ドメインポリペプチドの噴霧溶液が提供される。好ましい態様において、当該Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドは、ＦＴＴＦＴＶＴのアミノ酸配列（「ＣＳＰ−７」、配列番号１）、または、配列番号１に対して１個、２個、または、３個のアミノ酸の欠失、置換、または、挿入を行った配列を含む。さらに別の態様において、ＤＧＩＷＫＡＳＦＴＴＦＴＶＴＫＹＷＦＹＲ（配列番号２）の配列、または、配列番号２に対して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または、８個のアミノ酸の欠失、置換、または、挿入を行った配列を含む、Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドが提供される。ある態様において、当該実施形態のＣａｖ−１足場ドメインポリペプチドは、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、または、７アミノ酸以下の長さである。特定の態様において、当該Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドは、ＦＴＴＦＴＶＴ（配列番号１）の配列からなる、あるいは、それから本質的になる。
【０００６】
さらなる実施形態において、ＮＹＨＹＬＥＳＳＭＴＡＬＹＴＬＧＨ（配列番号３）の配列、または、配列番号３に対して１個、２個、３個、４個、または、５個のアミノ酸の欠失、置換、または、挿入を行った配列を含む医薬として許容される製剤ポリペプチドが提供される。幾つかの態様において、医薬として許容される製剤は、呼吸器系への送達のために製剤される。したがって、幾つかの態様において、ＮＹＨＹＬＥＳＳＭＴＡＬＹＴＬＧＨ（配列番号３）の配列、または、配列番号３に対して１個、２個、３個、４個、または、５個のアミノ酸の欠失、置換、または、挿入を行った配列を含む、生物学的に活性なポリペプチドの噴霧溶液が提供される。ある態様において、当該ポリペプチドは、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、または、７アミノ酸以下の長さである。
【０００７】
当該実施形態の薬学的に許容される製剤として、塩、緩衝剤、防腐剤、増粘剤、安定剤、及び、界面活性剤などがあるが、これらに限定されない。特定の態様において、当該製剤は、水性製剤である。ある事例では、当該製剤は、凍結乾燥され、場合によっては、投与前に溶液に可溶化することができる。特定の態様において、当該実施形態の医薬製剤は、カチオン性、アニオン性、両性イオン性、または、非イオン性の界面活性剤界面活性剤を本質的に含まない。好ましい態様において、当該実施形態の医薬製剤は、濾過、及び／または、滅菌される。特定の態様において、医薬製剤は、滅菌生理食塩水、または、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液を含む。他の態様において、当該溶液は、本質的にｐＨ緩衝剤を含まない。さらなる態様において、医薬製剤は、安定剤を含む。例えば、当該安定剤は、グリシン及びリジンなどのアミノ酸、炭水化物または凍結乾燥防止剤（例えば、デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、または、マンニトール）を含むことができる。特定の態様において、医薬製剤は、本質的に、滅菌生理食塩水、及び、生物学的に活性なポリペプチド（例えば、Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチド）からなる。当該実施形態の医薬製剤のための付加成分を、以下に詳述する。幾つかの態様において、当該実施形態の噴霧組成物は、凍結乾燥防止剤（例えば、デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、または、マンニトール）を含み、それらは、当該Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドに対して、１００：１〜５：１、１００：１〜１０：１、６０：１〜１０：１、５０：１〜２０：１、または、４０：１〜２０：１の重量／重量（ｗ／ｗ）の比率で存在する。例えば、当該組成物は、当該Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドに対して、４０：１〜２０：１ｗ／ｗ（例えば、約３０：１）の比率でマンニトールを含むことができる。
【０００８】
したがって、幾つかの実施形態において、当該実施形態のポリペプチドを含む噴霧組成物が提供される。幾つかの態様において、噴霧溶液は、振動メッシュ噴霧器を用いて生成される。振動メッシュ噴霧器は、アクティブ型、または、パッシブ型振動メッシュ噴霧器とすることができる。幾つかの態様において、振動メッシュ噴霧器は、Ａｅｒｏｎｅｂ（登録商標）プロフェッショナルネブライザーシステム、または、ＥＺ  Ｂｒｅａｔｈｅ  Ａｔｏｍｉｚｅｒとすることができる。さらなる態様において、当該噴霧溶液は、ジェット噴霧器、または、超音波噴霧器を使用して生成される。幾つかの態様において、実施形態の噴霧溶液は、約２．５μｍ〜１００μｍ、２．５μｍ〜５０μｍ、２．５μｍ〜２０μｍ、２．５μｍ〜８μｍ、または、３．０μｍ〜６μｍの間の平均粒径を有することができる。
【０００９】
幾つかの態様において、そのような噴霧溶液などの当該実施形態の医薬製剤は、生物学的に活性な酵素をさらに含む。当該酵素は、プラスミノーゲン活性化酵素とすることができる。当該プラスミノーゲン活性化酵素は、幾つかのさらなる態様において、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、または、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）とすることができる。当該ｕＰＡは、一本鎖ｕＰＡ（ｓｃｕＰＡ）とすることができる。
【００１０】
さらなる実施形態において、肺の疾患、傷害または感染（例えば、肺の線維化病態）を治療または予防する治療に使用するための組成物が提供され、当該組成物は、医薬として許容される担体において、実施形態のポリペプチドを含む。特定の実施形態において、当該組成物は、噴霧組成物であり、そのような組成物は、気道への送達のために製剤化される。
【００１１】
さらに別の実施形態において、生物学的に活性なカベオリン−１（Ｃａｖ−１）足場ドメインポリペプチド、及び、少なくとも第１の凍結乾燥防止剤を含む凍結乾燥組成物が提供され、当該Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドは、水溶液に暴露されたときに可溶性を保つ。幾つかの態様において、当該実施形態の凍結乾燥組成物は、凍結乾燥防止剤（例えば、デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、または、マンニトール）を含み、それらは、当該Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドに対して、１００：１〜５：１、１００：１〜１０：１、６０：１〜１０：１、５０：１〜２０：１、または、４０：１〜２０：１の重量／重量（ｗ／ｗ）の比率で存在する。例えば、当該組成物は、当該Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドに対して、４０：１〜２０：１ｗ／ｗ（例えば、約３０：１）の比率でマンニトールを含むことができる。
【００１２】
さらに別の実施形態において、対象における肺の疾患、傷害または感染（例えば、肺の線維化病態）を治療または予防する方法であって、当該対象に対して、医薬として許容可能な担体に担持された有効量の当該実施形態のポリペプチドを投与する方法が提供される。例えば、ある方法は、噴霧溶液で提供されるポリペプチドなどの生物学的に活性なＣａｖ−１足場ドメインポリペプチドを、当該対象の気道に投与することもできる。幾つかの態様において、当該対象は、急性肺損傷または感染症、または、化学物質誘発肺損傷を有する。特定の態様において、当該対象は、鋳型気管支炎、喘息、慢性閉塞性気道／肺（ＣＯＰＤ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、吸入煙誘発急性肺損傷（ＩＳＡＬＩ）、気管支拡張症、吸入毒素誘発性気道疾患（例えば、塩素誘発性気道疾患）、マスタードガスへの曝露、特定の物質（例えば、シリカ粉塵）への暴露、閉塞性細気管支炎、特発性器質化肺炎、コラーゲン血管性肺疾患（例えば、狼瘡、強皮症、または、混合性結合組織疾患）、間質性肺疾患（例えば、特発性肺線維症、または、サルコイドーシス）、薬物誘発性肺疾患、及び、加速性肺線維症（例えば、ＡＲＤＳを含む急性肺損傷後に生じるもの）を有する。
【００１３】
幾つかの態様において、当該実施形態の医薬製剤を投与する方法は、ポリペプチド（例えば、Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチド）を含む溶液を噴霧することを含む。この噴霧は、当該Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドを含む溶液を噴霧するために超音波またはジェット噴霧器を使用することを、含んでいてもよく、あるいは、含まなくてもよい。他の態様において、この噴霧は、振動メッシュ噴霧器を用いて、当該Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドを含む溶液を噴霧することを含む。当該振動メッシュ噴霧器は、アクティブ型またはパッシブ型振動メッシュ噴霧器とすることができる。幾つかの態様において、当該振動メッシュ噴霧器は、Ａｅｒｏｎｅｂ（登録商標）プロフェッショナルネブライザーシステム、または、ＥＺ  Ｂｒｅａｔｈｅ  Ａｔｏｍｉｚｅｒとすることができる。
【００１４】
さらに別の態様において、当該実施形態の医薬製剤の噴霧は、凍結乾燥された（例えば、Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドを含む）ポリペプチド組成物を得て、凍結乾燥酵素組成物を水溶液中で再構成してポリペプチド溶液を提供して、そして、当該ポリペプチド溶液を噴霧することを含む。幾つかの態様において、噴霧溶液は、上記した実施形態及び態様に従って投与される。さらなる態様において、生物学的に活性なプラスミノーゲン活性化酵素が、当該対象に対してさらに投与される。当該プラスミノーゲン活性化酵素は、当該対象の気道に噴霧した溶液で投与することができる。当該プラスミノーゲン活性化酵素は、ｔＰＡまたはｕＰＡとすることができる。特定の態様において、当該ｕＰＡは、一本鎖ｕＰＡ（ｓｃｕＰＡ）とすることができる。
【００１５】
さらに別の実施形態において、生物学的に活性なＣａｖ−１足場ドメインポリペプチドなどのポリペプチドを調製する方法であって、対象の気道に投与するために、当該ポリペプチドを含む溶液を噴霧して、噴霧溶液を提供することを含む、方法が提供される。
【００１６】
本明細書で使用した、特定の成分に関して「本質的に含まない」とは、特定の成分のいずれもが、意図的に組成物に配合されていない、及び／または、夾雑物または微量としてのみ存在することを意味する。したがって、意図しない組成物の汚染に起因する特定成分の総量は、０．０５％よりもかなり低い。最も好ましくは、特定の成分の量が、標準的な分析方法で検出することができない組成物である。
【００１７】
用語「投与する」とは、経口的、局所的、静脈内、皮下、経皮性、経皮的、筋内、非経口的関節内、細動脈内、皮内、脳室内、頭蓋内、腹腔内、病巣内、鼻腔内、直腸内、膣内、吸入によって、または、埋め込み式貯留部を介して投与することを指す。用語「非経口」は、皮下、静脈内、筋内、関節内、滑膜内、胸骨内、クモ膜下腔内、肝内、病巣内、及び、頭蓋内注射、または、注入技術を含む。幾つかの実施形態において、当該投与は、噴霧された組成物の吸入である。
【００１８】
用語「気道」とは、本明細書では、上気道、呼吸気道、及び、肺を含む気道のあらゆる箇所を指す。当該上気道は、鼻及び鼻の通路、口、及び、喉を含む。呼吸気道は、喉頭、気管、気管支、及び、細気管支を含む。肺は、呼吸細気管支、肺胞管、肺胞嚢、及び、肺胞を含む。
【００１９】
用語「吸入煙誘発急性肺損傷」及び「ＩＳＡＬＩ」とは、本明細書において互換可能に使用されており、かつ、煙吸入によって引き起こされる急性肺損傷（ＡＬＩ）の形態のことを指す。ＡＬＩは、「軽度ＡＲＤＳ」とも称されている。ＡＬＩとは、対象において、次に示す、１）胸部Ｘ線での両側性肺浸潤、２）右心臓カテーテル法により臨床的に測定した場合に、１８ｍｍＨｇ（２．４ｋＰａ）未満の肺毛細血管毛楔入圧、及び、３）３００ｍｍＨｇ（４０ｋＰａ）未満のＰａＯ２／ＦｉＯ２、の１つ以上の状態が認められるものと定義することができる。幾つかの実施形態において、ＩＳＡＬＩの治療は、次に示す、酸素減少、気道閉塞（重度気道閉塞を含む）、線維性気道内沈着または破片、及び、肺胞フィブリン沈着の１つ以上の病態の治療を含む。
【００２０】
用語「噴霧する」、「噴霧した」、及び、他の文法的変形は、本明細書において、液体を小さなエアロゾル小滴へ変換するプロセスのことを指す。幾つかの実施形態において、当該エアロゾル液滴は、約２〜１０μｍの平均直径を有する。幾つかの実施形態において、当該エアロゾル液滴は、約２〜４μｍの平均直径を有する。
【００２１】
本明細書では、「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上のことを意味するものである。特許請求の範囲では、単語「含む」と併せて使用される場合、単語「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上のことを意味するものである。
【００２２】
特許請求の範囲での用語「または」の使用は、本明細書の開示では、代替物と「及び／または」とだけを指すとの定義を支持しているが、代替物のみを指すとの断りが明示されていない限り、または、代替物が相互に排他的でない限りは、「及び／または」を意味するために使用される。本明細書で使用した「別の」は、少なくとも第２またはそれ以上のものを意味するものである。
【００２３】
本願を通じて、用語「約」とは、数値が、装置についての誤差の固有の変動、当該数値を決定するために使用される方法、または、試験対象の間に存在する変動を含むことを示すために使用される。
【００２４】
本発明の他の目的、特徴、及び、利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、本発明の要旨及び範囲を超えない範囲内での様々な変更及び修正は、詳細な説明から当業者には自明である。
【００２５】
以下の図面は、本明細書の一部を形成するものであり、かつ、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本明細書に記載の特定の実施形態の詳細な説明と１つ以上のこれらの図面とを組み合わせて参照することによって、本発明の理解をさらに深めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＣＳＰ分散噴霧手順の概略図である。
【図２】例１に記載の様々な調製法に従って、噴霧した後に組成物のＣＳＰ−７含量を測定した。
【図３】加工及び噴霧後のＣＳＰ−７マー及び残存ペプチドの百分率で表される化学的アッセイデータ。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
Ｉ．本発明
本明細書では、Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドなどの生物学的に活性なポリペプチドの医薬製剤が提供される。例えば、幾つかの態様において、当該Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドは、呼吸器系への送達のために製剤される。ポリペプチドは、水溶液中での製剤化及び振動メッシュ噴霧器などの噴霧器を用いた酵素溶液を噴霧して、対象の気道に投与するために調製することができる。本明細書に詳述されている本研究の驚くべき知見は、Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドなどのポリペプチドの噴霧により、ポリペプチドのかなりの部分が維持された噴霧組成物が得られることである。また、気道を介して、Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドなどの噴霧ポリペプチドの治療有効量を当該対象に投与することによって、肺損傷及び肺疾患を治療する方法が、本明細書において提供される。
【００２８】
ＩＩ．生物学的に活性なポリペプチド
当該実施形態での特定の態様は、肺の感染症、傷害、または、疾患を、治療及び予防するために使用することができる生物学的に活性なポリペプチドに関する。特に、当該実施形態に従って使用するためのポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、または、配列番号３と、少なくとも約８０％、８５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または、９９％同一である。特定の態様において、当該実施形態のポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、または、配列番号３の配列に対して１個、２個、３個、または、それ以上のアミノ酸の置換、欠失、または、挿入を含むことができる。さらに、幾つかの態様では、当該ポリペプチドは、長さが、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、または、７個以下のアミノ酸である。さらなる態様において、当該実施形態のポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、または、配列番号３の配列の１度、２度、３度、または、それ以上の反復を含む。
【００２９】
用語「同一性」または「相同性」とは、配列を整列させて、ギャップを導入した後における、対比される対応する配列の残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基の百分率を意味するものであり、必要に応じて、配列全体の最大同一性百分率を実現し、かつ、配列同一性の一部としてのあらゆる保存的置換も考慮しないものと解釈される。Ｎ末端またはＣ末端の伸長も挿入も、同一性または相同性を低下させるものと解釈されない。アライメントのための方法及びコンピュータプログラムは、当該技術分野において周知である。配列同一性は、配列分析ソフトウェアを用いて測定することができる。
【００３０】
用語「ポリペプチド」とは、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、または、ペプチド模倣体の化合物を指すものであって、その最も広い意味で使用される。当該サブユニットは、ペプチド結合によって連結することができる。別の実施形態において、当該サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどによって連結することができる。本明細書では、用語「アミノ酸」は、グリシン、及び、ＤまたはＬ光学異性体、ならびに、アミノ酸類似体、及び、ペプチド模倣体を含み、天然及び／または非天然または合成アミノ酸のいずれかを指す。３つ以上のアミノ酸のペプチドは、ペプチド鎖が短い場合、一般的には、オリゴペプチドと称されている。当該ペプチド鎖が長い場合、当該ペプチドは、一般的には、ポリペプチドまたはタンパク質と称されている。
【００３１】
ポリヌクレオチド、または、ポリヌクレオチド領域（または、ポリペプチド、または、ポリペプチド領域）は、別の配列に対して特定の百分率（例えば、８０％、８５％、９０％、または、９５％）の「配列同一性」または「相同性」を示し、それら２つの配列を比較すると、その塩基（または、アミノ酸）の百分率は同じである。このアラインメント及び百分率相同性または配列同一性は、当該技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０，ｓｅｃｔｉｏｎ  ７．７．１８，Ｔａｂｌｅ  ７．７．１．に記載のソフトウェアプログラムを用いて決定することができる。好ましくは、アラインメントのためにデフォルトパラメーターが使用される。好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターを用いるＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰであり、以下のデフォルトパラメーター、遺伝コード＝標準、フィルタ＝なし、鎖＝両方、カットオフ値＝６０、期待値＝１０、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、説明＝５０配列、並べ替え＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ、データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを使用する。
【００３２】
幾つかの態様において、アミノ酸置換は、類似の親水性を有するアミノ酸に対する置換である１つ以上の位置でポリペプチドに対して行うことができる。タンパク質に対する相互作用的な生物学的機能を付与する際のハイドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当該技術分野で一般的に理解されている（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。アミノ酸の相対的な疎水性の特徴は、得られたタンパク質の二次構造に寄与し、タンパク質の他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を決定することが認められている。したがって、このような保存的置換は、ポリペプチドにおいて行うことができ、それらの活性にわずかな影響しか及ぼさないようである。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、以下の親水性値、アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸塩（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（０．５）、ヒスチジン−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）が、アミノ酸残基に割り当てられている。これらの数値は目安として使用することができ、したがって、親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のアミノ酸の置換が特に好ましく、±０．５以内の置換が特に好ましい。したがって、本明細書に記載のあらゆるポリペプチドは、類似の親水性値を有する、相違するが同種のアミノ酸のアミノ酸置換によって修飾することができる。＋／−１．０または±０．５ポイント以内の親水性を有するアミノ酸は相同であると考えられる。
【００３３】
コンジュゲート
本発明の組成物及び方法は、ポリエチレングリコールなどの異種ペプチドセグメントまたはポリマーとコンジュゲートすることができるＣａｖ−１足場ドメインポリペプチドなどの生物学的に活性なポリペプチドを含む。さらなる態様において、加工されたポリペプチドはＰＥＧに連結されて、酵素の流体力学的半径を増大させ、それによって、血清の持続性を増加させることができる。特定の態様において、開示されたポリペプチドは、腫瘍細胞上の外部受容体または結合部位に特異的かつ安定に結合する能力を有するリガンドなどのあらゆる標的薬剤にコンジュゲートすることができる（米国特許公開公報第２００９／０３０４６６６号）。
【００３４】
Ａ．融合タンパク質
本発明の特定の実施形態は、融合タンパク質に関する。これらの分子は、Ｎ−またはＣ−末端で異種ドメインに連結された実施形態のポリペプチドを有することができる。例えば、融合体は、異種宿主においてタンパク質の組換え発現を可能にするために、他の種に由来するリーダー配列を使用してもよい。別の有用な融合には、融合タンパク質の精製を容易にするために、血清アルブミン親和性タグまたは６個のヒスチジン残基などのタンパク質アフィニティタグ、または、抗体エピトープ、好ましくは、切断可能なエピトープなどの免疫学的に活性なドメインを付加することを含む。親和性タグとして、ポリヒスチジン、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などがあるが、これらに限定されない。
【００３５】
特定の実施形態において、当該実施形態のポリペプチドは、ＸＴＥＮポリペプチド（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、アルブミン、または、アルブミン結合ペプチドなどのインビボ半減期を増加させるペプチドに連結することができる。
【００３６】
融合タンパク質を生成する方法は、当業者に周知である。そのようなタンパク質は、例えば、完全融合タンパク質のデノボ合成によって、または、異種ドメインをコードするＤＮＡ配列の付着と、それに続く無傷融合タンパク質の発現によって産生することができる。
【００３７】
親タンパク質の機能的活性を回復する融合タンパク質の産生は、タンデムに連結されたポリペプチドの間でスプライシングされたペプチドリンカーをコードする架橋ＤＮＡセグメントで遺伝子を連結することによって促進することができる。当該リンカーは、得られる融合タンパク質の適切な折り畳みを可能にするのに十分な長さである。
【００３８】
Ｂ．リンカー
特定の実施形態において、当該実施形態のポリペプチドは、二官能性架橋試薬を使用して化学的にコンジュゲートするか、あるいは、タンパク質レベルでペプチドリンカーと融合することができる。
【００３９】
二官能性架橋試薬は、親和性マトリックスの調製、多様な構造の修飾及び安定化、リガンド及び受容体結合部位の同定、及び、構造研究を含む、様々な目的に広く使用されている。適切なペプチドリンカーを使用して、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーなどの当該実施形態のポリペプチドを連結することもできる。
【００４０】
２つの同一の官能基を有するホモ二官能性試薬は、同一及び異なる巨大分子の間または巨大分子のサブユニットの間の架橋を誘導し、そして、ポリペプチドリガンドをそれらの特異的結合部位に連結するのに非常に効率的であることを証明した。ヘテロ二官能性試薬は、２つの異なる官能基を含む。２つの異なる官能基の異なる反応性を利用することによって、選択的かつ逐次的に架橋を制御することができる。当該二官能性架橋試薬は、それらの官能基、例えば、アミノ−、スルフヒドリル−、グアニジン−、インドール−、カルボキシル−特異的な基の特異性に従って分割することができる。これらのうち、遊離アミノ基に関する試薬は、市場での入手可能性、合成の容易さ、及び、それらを適用することができる穏やかな反応条件が故にとりわけ普及している。
【００４１】
ヘテロ二官能性架橋試薬の大部分は、第一アミン反応性基及びチオール反応性基を含有する。別の例では、ヘテロ二官能性架橋試薬及び当該架橋試薬を使用する方法が記載されている（とりわけ、米国特許第５，８８９，１５５号は、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する）。当該架橋試薬は、求核性ヒドラジド残基を求電子性マレイミド残基と結合させ、一例では、アルデヒドと遊離チオールとのカップリングを可能にする。当該架橋試薬は、様々な官能基を架橋するように修飾することができる。
【００４２】
さらに、当該実施形態のポリペプチドを組み合わせるために、抗体−抗原相互作用、アビジンビオチン結合、アミド結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ホスホエステル結合、ホスホアミド結合、無水物結合、ジスルフィド結合、イオン性及び疎水性相互作用、二重特異性抗体、及び、抗体断片、または、これらの組み合わせなどの、当業者に公知のあらゆる他の連結／カップリング剤、及び／または、メカニズムを使用することができる。
【００４３】
血液中で適切な安定性を有する架橋剤が使用されることが好ましい。多くのタイプのジスルフィド結合含有リンカーが知られており、これらは、標的化剤及び治療剤／予防剤を複合化するために首尾よく使用することができる。立体障害のあるジスルフィド結合を含むリンカーは、インビボでより大きな安定性を与えることができる。したがって、これらのリンカーは、一群の連結剤である。
【００４４】
障害を有する架橋剤に加えて、非障害リンカーも本明細書に従って使用することができる。保護されたジスルフィドを含むか、または、生成しないと考えられる他の有用な架橋剤として、ＳＡＴＡ、ＳＰＤＰ、及び、２−イミノチオランがある（Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｐｅ、１９８７）。そのような架橋剤の使用は、当該技術分野において周知である。別の実施形態は、可撓性リンカーの使用を含む。
【００４５】
化学的にコンジュゲートされると、当該ペプチドは、一般的には、コンジュゲートを、非結合剤及び他の汚染物質から分離するために精製される。当該ペプチドを臨床的に有用にするのに十分な程度の純度のコンジュゲートを提供する際に使用するために、多くの精製技術が利用可能である。
【００４６】
ゲル濾過、ゲル浸透、または、高速液体クロマトグラフィーのようなサイズ分離に基づく精製方法は、一般的に、最も使用されるであろう。ブルー−セファロース分離のような他のクロマトグラフィー技術を使用することもできる。封入体から融合タンパク質を精製するための従来の方法、例えば、Ｎ−ラウロイル−サルコシンナトリウム（ＳＬＳ）のような温和な界面活性剤を使用することも有用である。
【００４７】
Ｃ．ポリエチレングリコール化
ある態様において、当該実施形態の方法及び組成物は、開示されたポリペプチドのポリエチレングリコール化に関する。ポリエチレングリコール化は、ポリ（エチレングリコール）ポリマー鎖を他の分子、通常は、薬物または治療用タンパク質に共有結合させるプロセスである。ポリエチレングリコール化は、ＰＥＧの反応性誘導体を標的巨大分子とインキュベートすることによって通常は実現される。薬物または治療用タンパク質へのＰＥＧの共有結合は、当該薬剤を宿主の免疫系から「マスクする」（免疫原性及び抗原性を低下させる）ことができ、あるいは、当該薬剤の流体力学的サイズ（溶液中のサイズ）を増大させることができ、腎クリアランスを低下させることによって、その循環時間を延ばす。また、ポリエチレングリコール化によって、疎水性の薬物及びタンパク質を水溶性にすることもできる。
【００４８】
ポリエチレングリコール化の第１のステップは、一方または両方の末端でのＰＥＧポリマーの適切な官能化である。同じ反応性部分を有する各末端で活性化されるＰＥＧは、「ホモ二官能性」として知られており、存在する官能基が異なる場合、ＰＥＧ誘導体は「ヘテロ二官能性」または「ヘテロ官能性」と称されている。ＰＥＧポリマーの化学的に活性な、または、活性化された誘導体は、ＰＥＧを所望の分子に結合させるために調製される。
【００４９】
ＰＥＧ誘導体の適切な官能基の選択は、ＰＥＧにカップリングされる分子に関して利用可能な反応基のタイプに基づく。タンパク質の場合、典型的な反応性アミノ酸として、リシン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、及び、チロシンなどがある。Ｎ末端アミノ基及びＣ末端カルボン酸も使用することができる。
【００５０】
第１世代のＰＥＧ誘導体を形成するために使用される技術は、一般的には、当該ＰＥＧポリマーを、ヒドロキシル基、典型的には、無水物、酸塩化物、クロロギ酸エステル類、及び、炭酸塩類に対して反応性を示す基と反応させる。第２世代のポリエチレングリコール化の化学作用によって、アルデヒド、エステル、アミドなどのさらに効率的な官能基がコンジュゲーションのために利用可能となっている。
【００５１】
ポリエチレングリコール化の用途がますます進歩し、かつ、洗練されてきたので、コンジュケーションのためのヘテロ二官能性ＰＥＧの必要性が高まっている。これらのヘテロ二官能性ＰＥＧは、親水性、可撓性、及び、生体適合性のスペーサーが必要となる２つの要素を連結する上で非常に有用である。ヘテロ二官能性ＰＥＧの好ましい末端基は、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、アミン、カルボン酸、及び、ＮＨＳエステルである。
【００５２】
最も一般的な修飾剤またはリンカーは、メトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）分子である。それらの活性は、アルコール末端にタンパク質修飾基を付加することに依存している。幾つかの事例では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧジオール）が前駆体分子として使用される。その後、ジオールは、ヘテロまたはホモ二量体のＰＥＧ結合分子を作製するために、両端で修飾される。
【００５３】
タンパク質は、一般的には、非プロトン化チオール類（システイニル残基）またはアミノ基などの求核部位でポリエチレングリコール化される。システイニル特異的修飾試薬の例として、ＰＥＧマレイミド、ＰＥＧヨードアセテート、ＰＥＧチオール、及び、ＰＥＧビニルスルホンなどがある。４種はすべて、温和な条件下で、かつ、中性から僅かにアルカリ性のｐＨで、システイニル特異的であるが、各々には幾つかの欠点がある。マレイミドで形成されるチオエーテルは、アルカリ性条件下では幾分不安定であるので、このリンカーを有する製剤を選択することには幾つかの制限がある。ヨードＰＥＧ類で形成されたカルバモチオエート結合は、より安定であるが、遊離ヨウ素は、幾つかの条件下でチロシン残基を修飾することができる。ＰＥＧチオール類は、タンパク質チオールとジスルフィド結合を形成するが、この結合も、アルカリ条件下では不安定である。ＰＥＧ−ビニルスルホン反応性は、マレイミド及びヨードＰＥＧと比較して比較的緩慢であるが、形成されるチオエーテル結合は非常に安定である。その緩慢な反応速度は、ＰＥＧ−ビニルスルホン反応を制御しやすくすることもできる。
【００５４】
これらの残基は、通常ジスルフィド結合の形態であるか、あるいは、生物学的活性のために必要とされるので、天然システイン残基における部位特異的ポリエチレングリコール化は滅多に行われない。一方、部位特異的突然変異誘発を用いて、チオール特異的リンカーのシステインポリエチレングリコール化部位を組み込むことができる。システイン突然変異は、ポリエチレングリコール化試薬に利用可能であり、ポリエチレングリコール化をした後に依然として生物学的に活性であるように設計されなければならない。
【００５５】
アミン特異的修飾剤として、ＰＥＧ  ＮＨＳエステル、ＰＥＧトレシル酸塩、ＰＥＧアルデヒド、ＰＥＧイソチオシアネート、及び、他の幾つかのものがある。すべてが温和な条件下で反応し、アミノ基に対して非常に特異的である。当該ＰＥＧ  ＮＨＳエステルは、おそらくは反応性の薬剤の１つであろうが、その高い反応性は、ポリエチレングリコール化反応を大規模に制御することを難しくしている。ＰＥＧアルデヒドは、アミノ基とイミンを形成し、次いで、シアノ水素化ホウ素ナトリウムで第２級アミンへと還元される。水素化ホウ素ナトリウムとは異なり、シアノ水素化ホウ素ナトリウムは、ジスルフィド結合を還元しない。しかし、この化学物質は非常に毒性が強く、また、揮発性が顕著となる低いｐＨでは慎重に取り扱わなければならない。
【００５６】
ほとんどのタンパク質では、複数のリジン残基が故に、部位特異的なポリエチレングリコール化は困難である。幸いなことに、これらの試薬は、非プロトン化アミノ基と反応するので、より低いｐＨで反応を行うことによって、ポリエチレングリコール化を低ｐＫアミノ基にも作用させることが可能である。一般的には、α−アミノ基のｐＫは、リジン残基のイプシロン−アミノ基より１〜２ｐＨ単位だけ低い。ｐＨ７以下で当該分子をポリエチレングリコール化することにより、Ｎ末端に対する高い選択性を実現することができる。しかし、これは、当該タンパク質のＮ末端部分が生物学的活性に必要でない場合にのみ実現可能である。それでもなお、ポリエチレングリコール化による薬物動態上の利点は、インビトロ生物活性の有意な損失を上回っており、ポリエチレングリコール化の化学作用にかかわらず、さらに大きなインビボ生物活性を有する生成物を得るに至る。
【００５７】
ポリエチレングリコール化の手順を開発する際に考慮すべき幾つかのパラメーターがある。幸いなことに、通常は、４つまたは５つの主要パラメーターがある。ポリエチレングリコール化条件を最適化するための「実験の設計」手法は、非常に有用である。チオール特異的ポリエチレングリコール化反応については、考慮するパラメーターとして、タンパク質の濃度、ＰＥＧ対タンパク質比（モル基準）、温度、ｐＨ、反応時間、幾つかの事例では、酸素の排除などがある。（酸素は、タンパク質による分子間ジスルフィド形成に寄与することができ、ポリエチレングリコール化生成物の収率を低下させる。）特に、Ｎ末端アミノ基を標的とする場合、ｐＨがさらに重要であることを除いて、アミン特異的修飾を行う場合と同じ要素（酸素を除く）を考慮する。
【００５８】
アミン及びチオール特異的修飾の双方について、これらの反応条件は、タンパク質の安定性に影響する。このことは、温度、タンパク質濃度、及び、ｐＨを制限しかねない。加えて、ＰＥＧリンカーの反応性は、ポリエチレングリコール化反応を開始する前に把握されていなければならない。例えば、ポリエチレングリコール化剤が、わずか７０％の活性しかない場合には、使用されるＰＥＧの量は、活性ＰＥＧ分子のみが、タンパク質対ＰＥＧ反応の化学量論において計数されるように徹底すべきである。
【００５９】
ＩＩＩ．医薬組成物
Ｃａｖ−１足場ドメインポリペプチドなどの実施形態のポリペプチドを、細胞アポトーシスを阻害するため、及び、肺組織への損傷を治療及び予防するために、全身または局所投与することが企図されている。これらは、静脈内、クモ膜下腔内、及び／または、腹腔内に投与することができる。好ましい態様において、当該ポリペプチドは、噴霧製剤の投与など、気道に局所的に送達される。それらは、単独で、または、抗線維性化合物と組み合わせて投与することができる。
【００６０】
本発明は、治療用製剤の特定の性質によって制限されることは意図していない。例えば、このような組成物は、生理学的に許容される液体、ゲル、または、固体の担体、希釈剤、及び、賦形剤とともに製剤に提供することができる。これらの治療用調製物は、家畜での獣医学的使用、及び、他の治療剤と同様の方法でのヒトにおける臨床的使用のために、哺乳動物に投与することができる。一般的には、治療効果を得るに必要な投薬量は、使用のタイプ及び投与様式、ならびに、個々の対象の特定の必要条件に応じて変化する。
【００６１】
このような組成物は、典型的には、注射可能な液体溶液または懸濁液として調製される。適切な希釈剤及び賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールなど、及び、それらの組み合わせである。さらに、必要に応じて、当該組成物は、少量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、安定化剤、または、ｐＨ緩衝剤を含有してもよい。
【００６２】
臨床用途が企図される場合、意図される用途に適切な形態で、タンパク質、抗体、及び、薬物を含む医薬組成物を調製することが必要である。一般的には、医薬組成物は、医薬として許容される担体に溶解または分散された、当該実施形態の１つ以上の有効量のポリペプチドまたは付加薬剤を含むことができる。「医薬として、または、薬理学的に許容される」という表現は、動物、例えば、ヒトに適切に投与された場合に、好ましくない、アレルギー性の、または、他の有害な反応を生じない分子及び組成物のことを指す。本明細書に開示された方法によって単離された当該実施形態の少なくとも１つのポリペプチド、または、追加の活性成分を含有する医薬組成物の調製は、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用するＲｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，１９９０によって例証されているように、本明細書の開示を参照すれば、当業者に周知の事項である。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与にあって、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓでの要求事項である、調製物が、無菌性、発熱原性、一般的安全性、及び、純度の基準を満たさなければならないことが理解される。
【００６３】
本明細書では、「医薬として許容される担体」として、あらゆる、及び、すべての溶剤、分散媒、被覆剤、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩類、防腐剤、薬物、薬物安定剤、ゲル剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、染料、これらの類似物質、及び、これらの組み合わせなど、当業者に周知のものがある（例えば、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用するＲｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，１９９０を参照されたい）。従来の担体が活性成分と不適合である場合を除いて、当該医薬組成物におけるその使用が企図される。
【００６４】
本発明の特定の実施形態は、固体、液体、または、エアロゾルの形態で投与されるべきかどうか、ならびに、注射のような投与経路のために滅菌する必要があるかどうかに応じて、異なるタイプの担体を含むことができる。当該組成物は、静脈内に、皮内に、経皮で、髄腔内に、動脈内に、腹腔内に、鼻腔内に、膣内に、直腸内に、筋肉内に、皮下に、経粘膜で、経口で、局所的に、局部的に、吸入（例えば、噴霧製剤の吸入）で、注射で、点滴で、連続注入で、直接に、カテーテルを介して、洗浄を介して、脂質組成物（例えば、リポソーム）で標的細胞を局所的に灌流して、または、当業者に周知であろう他の方法によって、または、上記した方法の組み合わせ（例えば、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用するＲｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，１９９０を参照されたい）によって、投与することができる。
【００６５】
修飾されたポリペプチドは、遊離塩基、中性または塩の形態の組成物で製剤することができる。医薬として許容される塩として、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、または、例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸、または、酢酸、シュウ酸、酒石酸、または、マンデル酸のような有機酸で形成されたものがある。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または、水酸化第二鉄のような無機塩基、または、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、または、プロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。製剤されると、溶液は、投薬製剤に適合する方法で、かつ、治療有効量で投与される。当該製剤は、注射溶液などの非経口投与用に製剤されたもの、または、肺への送達のためのエアロゾル、あるいは、薬剤放出カプセルなど消化管投与のために製剤されたものなど、様々な剤形で容易に投与される。
【００６６】
さらに、本発明の特定の態様によれば、投与に適した組成物は、不活性希釈剤を含む、または、含まない医薬として許容される担体に提供することができる。当該担体は、同化可能であり、かつ、液体、半固体、すなわち、ペースト、または、固体担体を含むべきである。あらゆる従来の媒体、薬剤、希釈剤、または、担体が、レシピエント、または、そこに含まれる組成物の治療有効性に有害である場合を除いて、当該方法の実施において使用する投与可能な組成物への使用が適切である。担体または希釈剤の例として、脂肪、油、水、生理食塩水、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、充填剤など、または、それらの組み合わせがある。また、この組成物は、１種以上の成分の酸化を遅らせるための様々な抗酸化剤を含むことができる。さらに、様々な抗菌剤及び抗真菌剤などの防腐剤によって、微生物の作用の防止をもたらすことができ、防腐剤としては、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、または、それらの組み合わせがあるが、それらに限定されない。
【００６７】
本発明の特定の態様によれば、当該組成物は、好都合でかつ実用的な方法、すなわち、溶液、懸濁液、乳化、混合、封入、吸収などによって担体と組み合わせられる。そのような手順は、当業者が日常的に行っている。
【００６８】
本発明の特定の実施形態において、当該組成物は、半固体または固体の担体と完全に混和または混合される。この混合は、あらゆる好都合な方法、例えば、粉砕で実施することができる。治療活性の喪失、すなわち、胃内での変性から組成物を保護するために、安定化剤を混合プロセスにおいて添加することもできる。当該組成物に使用する安定剤の例として、緩衝液、グリシン及びリジンなどのアミノ酸、デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトールなどの炭水化物または凍結乾燥防止剤などがある。
【００６９】
さらなる実施形態において、本発明は、当該実施形態のポリペプチド、１つ以上の脂質、及び、水性溶媒を含む医薬的な脂質ビヒクル組成物の使用に関する。本明細書では、用語「脂質」とは、水に特徴的に不溶性であり、かつ、有機溶媒で抽出可能な広範囲のあらゆる物質を含むものと定義される。この広範な種類の化合物は、当業者に周知であり、本明細書では「脂質」という用語が使用されるので、特定の構造に限定されない。その例として、長鎖脂肪族炭化水素及びそれらの誘導体を含む化合物がある。脂質は、天然物または合成物（すなわち、人間による設計物または生成物）とすることができる。しかしながら、脂質は、通常、生物学的物質である。生物学的脂質は、当該技術分野において周知であり、そして、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、スルファチド、エーテル及びエステル結合脂肪酸を有する脂質、重合性脂質、及び、これらの組み合わせなどがある。当然のことながら、脂質として当業者に理解される本明細書に具体的に記載されたもの以外の化合物も、当該組成物及び当該方法に包含される。
【００７０】
当業者であれば、脂質媒体に組成物を分散させるために利用可能な技術範囲について精通しているであろう。例えば、当該実施形態のポリペプチドは、脂質を含む溶液に分散させ、脂質で溶解し、脂質で乳化し、脂質と混合し、脂質と結合させ、脂質と共有結合させ、脂質に懸濁させて含有させ、ミセルまたはリポソームに含有されているか、または、それらで複合体化されるか、あるいは、当業者に公知のあらゆる手段で脂質または脂質構造と会合される。当該分散液は、リポソームの形成をもたらすことがあるかもしれず、あるいは、もたらさないかもしれない。
【００７１】
動物患者に投与される組成物の実際の投与量は、体重、病態の重篤度、治療をする疾患のタイプ、過去または現在の治療的介入、患者の特発性疾患、及び、投与の経路などの物理的及び生理学的因子によって決定される。投与量及び投与の経路によって、好ましい投与量及び／または有効量の投与の回数は、対象の応答に応じて変えることができる。いずれの場合にも、投与を担当する医師は、組成物の活性成分の濃度、及び、個々の対象での適切な用量を決定するであろう。
【００７２】
特定の実施形態において、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含むことができる。他の実施形態において、活性化合物は、単位重量の約２％〜約７５％、または、例えば、約２５％〜約６０％、及び、そこで導くことのできるあらゆる範囲を含むことができる。当然に、治療的に有用な各組成物での活性化合物の量は、化合物の所定のあらゆる単位用量において適切な投与量が得られるように、調製することができる。そのような医薬製剤を調製する当業者は、溶解性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与の経路、製品保存期間、ならびに、他の薬理学的考察のような要因を考慮するであろうし、そうなると、様々な投与量及び治療計画が望ましくなってくる。
【００７３】
他の例において、用量としては、約１μｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重、約１０μｇ／ｋｇ／体重、約５０μｇ／ｋｇ／体重、約１００μｇ／ｋｇ／体重、約２００μｇ／ｋｇ／体重、約３５０μｇ／ｋｇ／体重、約５００μｇ／ｋｇ／体重、約１ｍｇ／ｋｇ／体重、約５ｍｇ／ｋｇ／体重、約１０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約２００ｍｇ／ｋｇ／体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５００ｍｇ／ｋｇ／体重、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重まで、または、それ以上の投与量、及び、そこで導くことのできる範囲などがあるが、これらに限定されない。本明細書で列挙した数値から導くことのできる範囲の例として、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ／体重など、上掲の数値に基づいた範囲で投与することができるが、これらに限定されない。
【００７４】
幾つかの態様において、医薬製剤は、１つ以上の界面活性剤を含む。開示された方法に従って使用される界面活性剤として、イオン性及び非イオン性界面活性剤がある。代表的な非イオン性界面活性剤として、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０及びＴＷＥＥＮ−８０（登録商標）界面活性剤（Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪのＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ  Ｉｎｃ．）などのポリソルベート類、ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）界面活性剤（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯのＳｉｇｍａ）、デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム、オクチルグリコシドナトリウム、ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、または、ステアリル−スルホベタイン、ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、または、ステアリル−サルコシン、リノレイル−、ミリスチル−、または、セチル−ベタイン、ラウロアミドプロピル−、コカミドプロピル−、リノレアミドプロピル−、ミリスタミドプロピル−、パルニドプロピル−、または、（例えば、ラウロアミドプロピル）、ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、または、イソステアアミドプロピル−ジメチルアミン、ナトリウムメチルココイル−、または、メチルオレイル−タウリン酸ジナトリウム、ＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）界面活性剤（Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．のＭｏｎａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、ポリエチレングリコール、ポリプロピルグリコール、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）界面活性剤（ＢＡＳＦ、Ｍｔ．Ｏｌｉｖｅ，ＮＪ）などのエチレンとプロピレングリコールのブロックコポリマー、オリゴ（エチレンオキシド）アルキルエーテル類、アルキル（チオ）グルコシド類、アルキルマルトシド類、及び、リン脂質類などがあるが、これらに限定されない。例えば、当該界面活性剤は、約０．０１％〜約０．５％（製剤の他の固体成分の総重量に対する界面活性剤の重量；「ｗ／ｗ」）、約０．０３％〜約０．５％（ｗ／ｗ）、約０．０５％〜約０．５％（ｗ／ｗ）、または、約０．１％〜約０．５％（ｗ／ｗ）の量で存在することができる。しかし、さらなる態様において、当該実施形態の医薬製剤は、本質的に非イオン性界面活性剤を含まないか、あるいは、すべての界面活性剤を本質的に含まない。
【００７５】
本明細書において、さらに提供されるものは、当該実施形態のポリペプチド及びペルフルオロカーボン（ＰＦＣ）を含む組成物である。幾つかの実施形態において、当該組成物でのポリペプチドは、配列番号１〜３のポリペプチドの１つから選択される。さらなる実施形態において、当該組成物でのＰＦＣは、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロ−１，３−ジメチルシクロヘキサン、ＦＣ−７５、ペルフルオロオクタン、及び、ペルフルオロ−オクチルブロミドから選択される。幾つかの態様において、ＰＦＣは、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロ−１，３−ジメチルシクロヘキサン、または、ＦＣ−７５などのシクロアルキル基を有するＰＦＣであるか、または、それを含む。プラスミノーゲン活性化因子及びＰＦＣは、あらゆる比率または濃度とすることが可能である、ことが理解されるべきである。幾つかの実施形態において、当該組成物は、ＰＦＣの約０．００５〜０．０４０ｍｇ／ｍｌの濃度のプラスミノーゲン活性化因子を含む。
【００７６】
さらに、対象における肺損傷または疾患（例えば、吸入煙誘発性急性肺損傷（ＩＳＡＬＩ））を治療する方法であって、当該対象に治療有効量の当該実施形態のポリペプチドとＰＦＣとを含む組成物を投与することを含む方法が提供される。したがって、幾つかの実施形態において、ポリペプチド及びＰＦＣ組成物を投与する方法であって、当該組成物での当該ＰＦＣが、ペルフルオロデカリン及びペルフルオロ−オクチルブロミドから選択される、方法が提供される。
【００７７】
用語「ペルフルオロカーボン」及び「ＰＦＣ」は互換可能に使用されるものであって、本明細書では、主として炭素及びフッ素を含む有機フッ素化合物のことを指す。用語「ペルフルオロカーボン」とは、炭素及びフッ素に加えて、分子を含有する高度にフッ素化された分子を含み、一般的には、フルオロカーボン類と称されていることを意味するものである、ことを理解されたい。ペルフルオロカーボンの例として、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロ−オクチルブロミド、ＦＣ  ７７、ＰＦ  ５０６０、及び、Ｒｉｍａｒ  １０１などがあるが、これらに限定されない。本発明に従って使用されるＰＦＣは、ガス溶解性、密度、及び、表面張力に関して、同様の物理化学的特性を有するが、病巣清掃の間の気道病変の視覚化及び移動性に影響を及ぼす可能性のある放射性不透過性及び動粘性率に関して異なる場合がある。列挙した各ペルフルオロカーボンは、立体異性体、エナンチオマー、及び、ジアステレオマーなどのすべての関連異性体を含む。
【００７８】
ＩＶ．エアロゾル分散及び噴霧装置
当該製剤は、あらゆる適切な装置を用いて噴霧することができ、当該装置としては、ジェット噴霧器、超音波噴霧器、定量噴霧吸入器（ＭＤＩ）、及び、ジェットまたはノズルを介した強制通過による液体のエアロゾル化用装置（例えば、Ｈａｙｗａｒｄ，Ｃａｌｉｆ．のＡｒａｄｉｇｍによるＡＥＲＸ（登録商標）薬剤送達装置）などがあるが、これらに限定されない。本明細書で後述するように、対象に製剤を送達するために、肺送達装置は、人工呼吸器も具備することができ、任意に、マスク、マウスピース、ミスト吸入装置、及び／または、プラットフォームを組み合わせて、使用者が正しく吸入をして、呼吸の適切な時期に薬剤を自動的に送達するように誘導する。本発明の方法に従って使用することができる代表的な噴霧装置として、米国特許第６，３５７，６７１号、同第６，３５４，５１６号、同第６，２４１，１５９号、同第６，０４４，８４１号、同第６，０４１，７７６号、同第６，０１６，９７４号、同第５，８２３，１７９号、同第５，７９７，３８９号、同第５，６６０，１６６号、同第５，３５５，８７２号、同第５，２８４，１３３号、及び、同第５，２７７，１７５号、及び、米国公開特許出願第２００２／００２０４１２号、及び、同第２００２／００２０４０９号に記載されたものがあるが、これらに限定されない。
【００７９】
ジェット噴霧器を使用して、圧縮機または病院の空気ラインからの圧縮ガスは、ジェットとして知られる狭い狭窄部を通過する。これにより、低圧の領域が形成され、貯留部からの液体薬物は、供給管を通じて送給され、空気流によって細分されて液滴になる。最も小さな液滴のみが直接に噴霧され、その大部分は調節板及び器壁に衝突し、そして、貯留部に戻される。結果として、ジェット噴霧を実施するにあたって必要な時間は、幾つかある要素の中でも特に、噴霧される組成物の体積によって変化し、そのような時間は当業者によって容易に調整することができる。
【００８０】
定量噴霧式吸入器（ＭＤＩ）を使用して、噴霧器を用いて一般的に送達されるよりも濃縮された形態で、本発明の組成物を送達することができる。効果を最大限にするためには、ＭＤＩ送達システムは、適切な投与技術を必要としており、当該技術は、吸入によるエアロゾル送達の協調作動、約０．５〜０．７５リットル／秒の緩慢な吸入、吸入容量吸入に近い深呼吸、及び、少なくとも４秒間の呼吸停止を含む。ＭＤＩを使用した肺送達は、比較的に治療期間が短く、かつ、低コストという治療上の恩恵を受ける場合に、好都合かつ好適である。任意に、噴霧を行っている間に、製剤を約２５℃〜約９０℃に加熱して、効果的な液滴形成とその後の送達を促すことができる。例えば、米国特許第５，２９９，５６６号を参照されたい。
【００８１】
当該実施形態の噴霧組成物は、肺の内部に効率的に送達するのに適した大きさの組成物の小滴を含む。事例によっては、界面活性剤製剤は、肺気管支、より好ましくは細気管支、さらにより好ましくは肺胞管、そして、さらにより好ましくは肺胞へと送達される。噴霧液滴は、一般的には、約１５μｍ未満の直径、約１０μｍ未満の直径、約５μｍ未満の直径、または、約２μｍ未満の直径である。ヒト対象の肺胞気管支へ効率的に送達をするために、噴霧組成物は、好ましくは、約１μｍ〜約５μｍの直径を有する液滴を含むことができる。
【００８２】
液滴の大きさは、当該技術分野で周知の技術、例えば、カスケード反応、衝撃、レーザー回折、及び、光学パターンを用いて評価することができる。ＭｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７２：４７９６−８０４、Ｆｕｌｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４３：７２６−８、及び、Ｖｅｃｅｌｌｉｏ  Ｎｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｊ  Ａｅｒｏｓｏｌ  Ｍｅｄ  １４：１０７−１４を参照されたい。
【００８３】
噴霧後のタンパク質の安定性は、サイズ排除クロマトグラフィー、電気泳動技術、ＵＶ分光法及び円二色分光法などの分光技術、及び、（インビトロまたはインビボで測定した）タンパク質活性を含む当該技術分野で公知の技術を用いて、評価することができる。タンパク質安定性のインビトロアッセイを行うために、噴霧組成物を収集し、次いで、濾材で蒸留または吸収させることができる。インビボアッセイを実施するため、または、対象に組成物を肺投与するために、噴霧のための装置は、対象による吸入に適したものとされる。例えば、タンパク質の安定性は、タンパク質の凝集レベルを決定することによって評価することができる。好ましくは、本発明のエアロゾル組成物は、タンパク質の凝集体を実質的に含まない。可溶性凝集物の存在は、ＤＬＳ（ＤｙｎａＰｒｏ−８０１ＴＣ、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、Ｖａ．のＰｒｏｔｅｉｎＳｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）及び／またはＵＶ分光光度法を用いて、定性的に決定することができる。
【００８４】
用語「振動メッシュ噴霧器」とは、本明細書では、微粒子の低速噴霧を生成するために、複数の開口を有する振動メッシュまたはプレート（開口プレート）を使用するという一般原則に基づいて作動するあらゆる噴霧器のことを指す。幾つかの噴霧器は、液体貯留部の上部でメッシュ／膜が振動する１，０００〜７，０００個の孔を有するメッシュ／膜を含むことができる（例えば、本明細書の一部を構成するものとして各々の内容を援用する米国特許公開第２００９／０１３４２３５号とＷａｌｄｒｅｐ及びＤｈａｎｄ  ２００８とを参照されたい）。幾つかの実施形態において、当該振動メッシュ噴霧器は、ＡＥＲＯＮＥＢ（登録商標）プロフェッショナル噴霧器、Ｏｍｒｏｎ  ＭＩＣＲＯＡＩＲ（登録商標）、Ｐａｒｉ  ＥＦＬＯＷ（登録商標）、または、ＥＺ  Ｂｒｅａｔｈｅ  Ａｔｏｍｉｚｅｒである。幾つかの態様において、振動メッシュ噴霧器は、約５０〜２５０ｋＨｚの間、７５〜２００ｋＨｚの間、１００〜１５０ｋＨｚの間、または、約１２０ｋＨｚの振動周波数を有する。これらの装置は、エアロゾルを肺に対して非常に効率的に送達し、そして、これらの装置に残存する液体の量は最小限となり、このことは、プラスミノーゲン活性化因子のような高価で強力な化合物にあっては好都合である。
【００８５】
特定の態様において、当該実施形態の噴霧組成物は、振動メッシュ噴霧器を使用して生成される。例えば、当該組成物は、アクティブ型振動メッシュ噴霧器（例えば、Ａｅｒｏｎｅｂ（登録商標）プロフェッショナルネブライザーシステム）を用いて生成することができる。このようなシステムの説明及びその動作は、例えば、本明細書の一部を構成するものとして各々の全内容を援用する米国特許第６，９２１，０２０号、同第６，９２６，２０８号、同第６，９６８，８４０号、同第６，９７８，９４１号、同第７，０４０，５４９号、同第７，０８３，１１２号、同第７，１０４，４６３号、同第７，３６０，５３６号に記載されている。さらに別の態様において、当該実施形態の組成物は、Ｏｍｒｏｎ  ＭＩＣＲＯＡＩＲ（登録商標）またはＥＺ  Ｂｒｅａｔｈｅ  Ａｔｏｍｉｚｅｒのようなパッシブ型メッシュ噴霧器を用いて生成することができる。
【００８６】
Ｖ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために記載されたものである。以下の実施例に開示した技術が、本発明を実施するにあたって本発明者が知見した良好に機能させるための技術を開示するものであって、したがって、その実施のための好ましい態様を構成するものと考えることができることは、当業者であれば理解するであろう。しかし、当業者であれば、本明細書の開示に照らして、本発明の要旨及び範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態に対して多くの変更を行うことができ、また、さらに同様のまたは類似の結果を得ることも認識すべきである。
【００８７】
例１−ペプチド噴霧
材料−Ｔｙｌｅｒに所在するＴｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒからペプチドを得て、−８０℃で保存した。これらのペプチドは、ＣＳＰ、ＣＳＰ−７、または、スクランブルしたものであった。２種類の液体媒体を使用し、両方とも室温で保存した。Ｇｉｂｃｏ、ロット１４１９０−１４４として製造されたダルベッコのリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ）は、ＵＴ−Ａｕｓｔｉｎに所在するＢｉｏｓｔｏｒｅから購入した。ＤＰＢＳの成分を、以下の表１に示す。ＡＰＰ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＬＣ、ＮＤＣ  ６３３２３−１８６−１０、ロット６００８０３９として製造された滅菌標準生理食塩水（ＮＳ）（１０ｍｌバイアルに包装され、かつ、０．９％ｗ／ｖの塩化ナトリウムを含む）は、Ｆｏｒｔｙ  Ａｃｒｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｙから購入した。
【００８８】
【表１】
2018507867.tif 000002
【００８９】
２種類の噴霧器を利用した。Ａｅｒｏｎｅｂ（登録商標）プロフェッショナルネブライザーシステム（アクティブ型振動メッシュ、Ａｅｒｏｇｅｎ、Ｇａｌｗａｙ）とは、複数の患者用の携帯型医療機器であり、医師が処方した吸入薬を噴霧することを目的としており、多目的噴霧器での使用も承認されている。ＥＺ  Ｂｒｅａｔｈｅ  Ａｔｏｍｉｚｅｒ（パッシブ型振動メッシュ、Ｎｅｐｈｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）は、エアゾール形態の液体薬物をヒトが呼吸する空気に噴霧することを意図した装置である。これらの装置は、機械的換気または他の陽圧呼吸補助の有無にかかわらず患者によって使用される。
【００９０】
ＣＳＰ分散液の調製−試験用シンチレーションバイアルを、様々な調製に従って作製した。第１の調製では、４ｍｇのスクランブルペプチドまたはＣＳＰペプチドを秤量し、そして、バイアルに入れ、次いで、８ｍｌのＰＢＳまたはＮＳを加えた。第２の調製では、３ｍｇのスクランブルペプチドまたはＣＳＰ−７ペプチドを秤量し、そして、バイアルに入れ、次いで、６ｍｌのＰＢＳまたはＮＳを加えた。バイアルを磁気撹拌し、そして、３０分間撹拌した。次いで、この分散液をＡｅｒｏｎｅｂ  ＰｒｏまたはＥＺ  Ｂｒｅａｔｈ  Ａｔｏｍｉｚｅｒに入れた。試料を、冷却バイアル内での凝縮によって回収した。毎回０．５ｍｌの試料を採取し、そして、直ちに、−８０℃で保存した（図１を参照されたい）。
【００９１】
回収した試料を、ペプチド含量について分析した（図２を参照されたい）。顕著な量のＣＳＰ７ペプチドは、リン酸緩衝食塩水または標準生理食塩水のいずれかに一旦分散し、そして、２つの振動メッシュ噴霧器で噴霧した後に保持されていることが見出された。したがって、これらの研究は、ＣＳＰ７が吸入のために製剤できることを実証している。
【００９２】
例２−ペプチドの凍結乾燥及び噴霧
製剤の調製−凍結乾燥を用いてＣＳＰ７マーの凍結乾燥ケーキを調製した。５００μｇ／ｍｌのＣＳＰ７マー溶液を、以下のようにして調製した。ペプチド粉末をＤＰＢＳに最小量の水酸化アンモニウム（ｐＨ７〜８）で溶解し、そして、１．５％ｗ／ｖのマンニトールを当該溶液に添加した。この溶液を、０．２μｍのＳＦＣＡ滅菌シリンジフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を用いて滅菌濾過した。濾過の効果も試験した。１ｍｌの濾液を、ホウケイ酸ガラスバイアルに充填し、ＶｉｒＴｉｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｒ（ＶｉｒＴｉｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ．、Ｇａｒｄｉｎｅｒ，ＮＹ）を用いて凍結乾燥した。凍結乾燥サイクルパラメーターは、表２で概説したように設定した。一次乾燥時間は、試料の数によって変化した。
【００９３】
【表２】
2018507867.tif 000003
【００９４】
ＣＳＰ７マーペプチドの噴霧研究−凍結乾燥ペプチドを注射用滅菌水（５００μｇ／ｍｌ）で再構成した。２つの市販のブランドの振動メッシュ噴霧器を使用して噴霧を実証して、それら噴霧器の効率の変動を研究した。Ａｅｒｏｎｅｂ（登録商標）Ｐｒｏ（Ａｅｒｏｇｅｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）またはＥＺ  Ｂｒｅａｔｈｅ（登録商標）アトマイザー（モデルＥＺ−１００、Ｎｅｐｈｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ）を用いて溶液を噴霧した。エアロゾルの雲が観察されなくなった後に、噴霧を停止した。各試料の凝縮液をポリプロピレンチューブに集め、そして、分析を行うまで５℃に保った。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて各試料中のペプチドの量を分析し、そして、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を用いて分解生成物を検出した。
【００９５】
クロマトグラフィー条件−試料を、波長２２０ｎｍのＤｉｏｎｅｘ  ３０００高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ，ＮＪ）を用いて分析した。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｌｕｎａ５μＣ１８（２）１００Å、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）、Ｔｏｒｒａｃｅ，ＣＡ）カラムによって、流速１．０ｍｌ／分で、７マーペプチドを溶出させた。２つの移動相は、相Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸を含む水）及び移動相Ｂ（０．０９％トリフルオロ酢酸を含む、２０：８０の水とアセトニトリルの混合物）であった。２０分かけて、２５〜３５％の移動相ＢからなるＨＰＬＣ勾配を、周囲温度で行った。各試料の２０μｌを当該カラムに注入し、そして、２２０ｎｍの検出波長でクロマトグラムを得た。当該試料の各々について、重複した測定を行った。同じ試料を、ＬＣ／ＭＳで試験し、分解産物も決定した。
【００９６】
処方、滅菌濾過、凍結乾燥、及び、噴霧のｕＰＡ活性への影響−凍結乾燥ペプチドは水に容易に溶解した。図３は、ペプチドの化学的アッセイを示している。処方組成、滅菌濾過、または、噴霧は、ペプチドの回収率に影響を与えなかった。両方の噴霧器で同様の結果が得られた。
＊  ＊  ＊
【００９７】
本明細書に開示され、かつ、特許請求されるすべての方法は、本開示に照らして過度の実験をすることなく再現及び実行することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して記載されているが、当業者であれば、本発明の概念、要旨、及び、範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された当該方法、及び、当該プロセス、または、当該方法のステップの順序に変更を加えることができる、ことは自明である。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連する特定の薬剤を、本明細書に記載の薬剤と置き換えることで、同じまたは類似の結果が達成されることも明らかである。当業者に明らかなそのような類似の置換及び修正はすべて、添付した特許請求の範囲によって定義される本発明の要旨、範囲及び概念の範囲内にあるものとみなされる。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載された発明に対して例示的な手順または他の詳細事項を補足的に提供する限り、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する。
米国特許第５，２９９，５６６号、同第５，８８９，１５５号、同第６，３５７，６７１号、同第６，３５４，５１６号、同第６，２４１，１５９号、同第６，０４４，８４１号、同第６，０４１，７７６号、同第６，０１６，９７４号、同第５，８２３，１７９号、同第５，７９７，３８９号、同第５，６６０，１６６号、同第５，３５５，８７２号、同第５，２８４，１３３号、同第５，２７７，１７５号、同第６，９２１，０２０号、同第６，９２６，２０８号、同第６，９６８，８４０号、同第６，９７８，９４１号、同第７，０４０，５４９号、同第７，０８３，１１２号、同第７，１０４，４６３号、同第８，６９７，８４０号、同第７，３３２，４６９号、及び、同第第７，３６０，５３６号。
米国公開特許出願第２００２／００２０４１２号、同第２００９／０３０４６６６号、同第２００９／０１３４２３５号、及び同第２００２／００２０４０９号。
国際（ＰＣＴ）公開第ＷＯ／２０１４／１４５３８９号。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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