(57)【要約】本発明は、HER2/Neu (ERBB2)発現がん細胞を処置するための組成物および方法に関する。いくつかの態様において、本発明は、標的細胞上のERBB2369〜377エピトープに高い親和性を有し、かつそれに特異的に結合する単離されたT細胞受容体(TCR)を含む。他の態様は、ERBB2特異的TCRを発現するように改変されたT細胞またはT細胞集団を含む。さらなる態様は、ERBB2発現がん細胞を処置するためにERBB2特異的TCR遺伝子移入を使用する方法を含む。養子療法のための改変されたT細胞を含む方法および薬学的組成物も含まれる。2018506287.tif 000011
2018506287.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO: 2または6を含むT細胞受容体(TCR)α鎖およびSEQ ID NO: 4または7を含むTCRβ鎖からなる群より選択される少なくとも1つのTCR鎖を含むチロシン-タンパク質キナーゼHER2/Neu (ERBB2)特異的TCRである、標的細胞上の表面抗原に対する親和性を有する精製されたTCR。
【請求項２】
SEQ ID NO: 9である369〜377番目のアミノ酸を含むERBB2受容体タンパク質のエピトープ(ERBB2369〜377)に結合する、請求項1記載の精製されたTCR。
【請求項３】
標的細胞がHLA-A2+である、請求項1記載の精製されたTCR。
【請求項４】
少なくとも1つのジスルフィド結合を含む、請求項1記載の精製されたTCR。
【請求項５】
TCRα鎖およびβ鎖がペプチドリンカーによってつながれている、請求項1記載の精製されたTCR。
【請求項６】
T細胞受容体(TCR)が、SEQ ID NO: 1を含むTCRα鎖をコードする核酸、SEQ ID NO: 3を含むTCRβ鎖をコードする核酸ならびにSEQ ID NO: 5を含む連結されたTCRα鎖およびβ鎖をコードする核酸からなる群より選択される少なくとも1つの核酸配列によってコードされるチロシン-タンパク質キナーゼHER2/Neu (ERBB2)特異的TCRである、標的細胞上の表面抗原に対する親和性を有するTCRをコードする精製された核酸配列。
【請求項７】
TCR鎖のうちの少なくとも1つのヌクレオチド配列がコドン最適化されている、請求項6記載の精製された核酸。
【請求項８】
請求項6記載の核酸のうちの少なくとも1つに相補的なヌクレオチド配列を含む、精製された核酸。
【請求項９】
請求項6記載の核酸のうちの少なくとも1つとストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、精製された核酸。
【請求項１０】
請求項6記載の核酸のうちの少なくとも1つを含む組み換え発現ベクター。
【請求項１１】
請求項10記載の組み換え発現ベクターを含む、改変された哺乳動物細胞。
【請求項１２】
末梢血単核細胞、臍帯血細胞、初代T細胞、およびT細胞株細胞からなる群より選択される、請求項11記載の改変された哺乳動物細胞。
【請求項１３】
腫瘍浸潤リンパ球(TIL)である、請求項11記載の改変された哺乳動物細胞。
【請求項１４】
請求項13記載の細胞を含む細胞の集団。
【請求項１５】
請求項1記載の精製されたT細胞受容体(TCR)、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項１６】
その必要のある哺乳動物においてがんを処置する方法であって、該哺乳動物においてがんを処置するのに有効な量で、請求項1記載の精製されたT細胞受容体(TCR)を哺乳動物に投与する段階を含む、方法。
【請求項１７】
がんが、乳房、卵巣、胃、腎臓、結腸、膀胱、唾液腺、子宮内膜、膵臓または肺のがんである、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物がヒトである、請求項16記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は米国特許法第119条(e)の下、2015年2月16日付で出願された米国特許仮出願第62/116,864号の優先権を有しており、この出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府資金による研究または開発に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所によって助成された助成金番号CA152540、CA083638およびCA009140-37の下での政府の支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ERBB2 (Her-2/neu)がん原遺伝子は、乳がん、卵巣がんおよび胃がんを含む多様な悪性腫瘍のイニシエーションおよび進行に関与する上皮性チロシンキナーゼ受容体の群の一員をコードする(Engel and Kaklamani, Drugs 67, 1329-1341, 2007（非特許文献1）; Wong et al., Gynecol Obstet Invest 40, 209-212, 1995（非特許文献2）)。ERBB2遺伝子の増幅および過剰発現は、制御不能な細胞増殖および生存、コロニー形成の増加(Bartsch et al., BioDrugs 21, 69-77, 2007（非特許文献3）)ならびにDNA修復の障害(Pietras et al., Oncogene 9, 1829-1838, 1994（非特許文献4）)をもたらす。現在までに、ERBB2を発現する乳房腫瘍および卵巣腫瘍に向けられたいくつかの異なる免疫療法アプローチが開発されている。モノクローナル抗体トラスツズマブのような、抗ERBB2抗体に基づく免疫療法は、ERBB2過剰発現を有する乳がん患者を処置するために用いられうるが、しかしこのアプローチは、卵巣がん患者において有効とされていない(Bookman et al., official journal of the Am. Soc. Clin. Onc. 21, 283-290, 2003（非特許文献5）)。さらに、がんワクチンは、特異的な抗腫瘍免疫を誘導するために用いられているが、それらは弱いT細胞応答しか生じず、客観的な腫瘍退行を誘導しなかった(Knutson et al., J Clin Oncol 23, 7536-7545, 2002（非特許文献6）; Peoples et al., J Clin Oncol 23, 7536-7545, 2005（非特許文献7）)。
【０００４】
T細胞受容体は、抗原の提示に応答してT細胞の活性化に関与する膜タンパク質の複合体である。TCRの刺激は、抗原ペプチドをT細胞に提示し、TCR複合体に結合して一連の細胞内シグナル伝達カスケードを誘導する抗原提示細胞上の主要組織適合複合体分子(MHC)によって誘発される。TCRは、一般に、リガンド認識に関与するTCRヘテロ二量体を形成する6つの異なる膜結合鎖から構成される。TCRは、構造的には類似しているが、明確な解剖学的位置および機能を有するα/βおよびγ/δ形態で存在する。1つの態様において、TCRは、TCRα鎖およびβ鎖を含み、例えばTCRをコードする核酸は、TCRα鎖およびTCRβ鎖をコードする核酸を含む。別の態様において、α鎖もしくはβ鎖またはその両方は、少なくとも1つのN-脱グリコシル化を含む。各鎖は、2つの細胞外ドメイン、可変ドメインおよび定常ドメインから構成される。1つの態様において、TCRは、少なくとも1つのネズミ定常領域を含む。定常ドメインは細胞膜の近位にあり、続いて膜貫通ドメインおよび短い細胞質の尾部がある。1つの態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインである。可変ドメインは、TCRが結合特異性を有する特定の抗原およびMHC分子の決定に寄与する。次に、固有の抗原-MHC複合体に対するT細胞の特異性は、T細胞によって発現される特定のTCRに存在する。定常ドメインおよび可変ドメインの各々は、鎖内ジスルフィド結合を含みうる。1つの態様において、TCRは少なくとも1つのジスルフィド結合を含む。可変ドメインには、抗体の相補性決定領域(CDR)に類似した高度に多型性のループが含まれる。TCR配列の多様性は、連結変数(V)、多様性(D)、結合(J)および定常遺伝子の体細胞再編成を介して生成される。機能的α鎖およびγ鎖ポリペプチドは、再編成されたV-J-C領域により形成されるが、β鎖およびδ鎖は、V-D-J-C領域からなる。細胞外定常ドメインは、膜近位領域および免疫グロブリン領域を含む。
【０００５】
ウイルス感染症、ウイルス関連悪性腫瘍、およびがんの養子細胞療法のための所与の抗原特異性の多数のT細胞を生成するための信頼できる方法として、過去10年間にTCR遺伝子移入が開発されている(Engels and Uckert, Mol Aspects Med 28, 115-142, 2007（非特許文献8）)。TCR遺伝子治療の臨床的実現可能性は、一般的に発現している黒色腫抗原であるMART1に特異的なTCRを用い黒色腫において最初に実証された(Morgan et al., Science 314, 126-129, 2006（非特許文献9）)。15人の患者において用いられたMART1 TCR形質導入CD8+ T細胞の養子移入は、移植された集団の持続的生着および2人の患者における有意な腫瘍退行をもたらし、養子T細胞移入の概念実証を示した(Morgan et al., Science 314, 126-129, 2006（非特許文献9）)。黒色腫において機能的結合活性および臨床的有効性の改善を付与したさらに高親和性のMART-1特異的TCRが後に同定されたが、正常なメラニン細胞の付随的破壊に起因する白斑、ブドウ膜炎および難聴の発生率が高くなった(Johnson et al., Immunol 177, 6548-6559 , 2006（非特許文献10）; Johnson et al., J Blood 114, 535-546, 2009（非特許文献11）)。
【０００６】
ERBB2指向性のTCR遺伝子治療は、一般的な上皮がんに対して有意な有望性を保持していると思われる。しかし、がん患者から直接的に結合力の高い(highly avid) ERBB2特異的TCRを単離することは困難であり、臨床的に試験されていない。ERBB2特異的T細胞を生成する有望な戦略の1つは、免疫学的ERBB2自己寛容を克服し、既存のT細胞免疫をプライミングしうる強力な免疫レジメンによるERBB2+腫瘍担持患者のワクチン接種に依る。ERBB2+乳房腫瘍を有するHLA-A2+患者へのERBB2由来HLAクラスIおよびIIペプチドを用いてパルスした自己成熟樹状細胞(DC)ワクチンの投与は、ERBB2特異的T細胞を効率的にプライミングし、その頻度を増加させ、いくらかの患者において腫瘍退行をもたらすことがERBB2/DCワクチンの研究において示された(Czerniecki et al., Cancer Res 67, 1842-1852, 2007（非特許文献12）)。さまざまな免疫原性ERBB2ペプチドに特異的な細胞傷害性Tリンパ球(CTL)が記述されているが、それらは不十分な機能的結合活性および腫瘍反応性の両方を示すことが多い。
【０００７】
それゆえ、T細胞に基づく養子免疫療法を最適化することが、ならびに内因性抗原を発現する腫瘍細胞に対して高い機能的結合活性および腫瘍反応性を示すERBB2エピトープに高度に特異的な強力なCD8+ T細胞を作出することが当技術分野において必要とされている。本発明はこの必要性に対処する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Engel and Kaklamani, Drugs 67, 1329-1341, 2007
【非特許文献２】Wong et al., Gynecol Obstet Invest 40, 209-212, 1995
【非特許文献３】Bartsch et al., BioDrugs 21, 69-77, 2007
【非特許文献４】Pietras et al., Oncogene 9, 1829-1838, 1994
【非特許文献５】Bookman et al., official journal of the Am. Soc. Clin. Onc. 21, 283-290, 2003
【非特許文献６】Knutson et al., J Clin Oncol 23, 7536-7545, 2002
【非特許文献７】Peoples et al., J Clin Oncol 23, 7536-7545, 2005
【非特許文献８】Engels and Uckert, Mol Aspects Med 28, 115-142, 2007
【非特許文献９】Morgan et al., Science 314, 126-129, 2006
【非特許文献１０】Johnson et al., Immunol 177, 6548-6559 , 2006
【非特許文献１１】Johnson et al., J Blood 114, 535-546, 2009
【非特許文献１２】Czerniecki et al., Cancer Res 67, 1842-1852, 2007
【発明の概要】
【０００９】
本明細書において記述されるように、本発明は、HER2/Neu (ERBB2)発現がんを処置するための組成物および方法に関する。
【００１０】
本発明の1つの局面は、標的細胞上の表面抗原に対する親和性を有する精製されたT細胞受容体(TCR)を含む。本発明のTCRは、SEQ ID NO: 2または6を含むTCRα鎖およびSEQ ID NO: 4または7を含むTCRβ鎖からなる群より選択される少なくとも1つのTCR鎖を含むチロシン-タンパク質キナーゼHER2/Neu (ERBB2)特異的TCRである。
【００１１】
本発明の別の局面は、標的細胞上の表面抗原に対する親和性を有するT細胞受容体(TCR)をコードする精製された核酸配列を含む。本発明のTCRは、SEQ ID NO: 1を含むTCRα鎖をコードする核酸、SEQ ID NO: 3を含むTCRβ鎖をコードする核酸ならびにSEQ ID NO: 5を含む連結されたTCRα鎖およびβ鎖をコードする核酸からなる群より選択される少なくとも1つの核酸配列によってコードされるチロシン-タンパク質キナーゼHER2/Neu (ERBB2)特異的TCRである。
【００１２】
本発明の別の局面は、標的細胞上の表面抗原に対する親和性を有するT細胞受容体(TCR)をコードする上記の精製された核酸配列の核酸のうちの少なくとも1つに相補的なヌクレオチド配列を含む精製された核酸を含む。
【００１３】
本発明の別の局面は、標的細胞上の表面抗原に対する親和性を有するT細胞受容体(TCR)をコードする上記の精製された核酸配列の核酸のうちの少なくとも1つとストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む精製された核酸を含む。
【００１４】
本発明のさらなる局面は、標的細胞上の表面抗原に対する親和性を有するT細胞受容体(TCR)をコードする上記の精製された核酸配列の核酸のうちの少なくとも1つを含む組み換え発現ベクターを含む。
【００１５】
本発明のさらなる局面は、上記の組み換え発現ベクターを含む改変された哺乳動物細胞を含む。
【００１６】
本発明の別の局面は、上記の改変された哺乳動物細胞を含む細胞の集団を含み、かつここで細胞が腫瘍浸潤リンパ球(TIL)である。
【００１７】
本発明のさらなる局面は、上記の精製されたT細胞受容体(TCR)、および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を含む。
【００１８】
さらに別の局面において、本発明は、その必要のある哺乳動物においてがんを処置する方法を含む。本発明の方法は、該哺乳動物においてがんを処置するのに有効な量で、上記の精製されたT細胞受容体(TCR)を哺乳動物に投与する段階を含む。
【００１９】
本明細書において描写される本発明の上記の局面またはいずれかの他の局面のさまざまな態様において、精製されたTCRは、SEQ ID NO: 9である、369〜377番目のアミノ酸を含むERBB2受容体タンパク質のエピトープ(ERBB2369〜377)に結合する。ある特定の態様において、本発明の標的細胞はHLA-A2+である。ある特定の態様において、本発明のTCRは少なくとも1つのジスルフィド結合を含む。他の態様において、TCRα鎖およびβ鎖はペプチドリンカーによってつながれている。他の態様において、TCR鎖のうちの少なくとも1つのヌクレオチド配列はコドン最適化されている。他の態様において、本発明の改変された哺乳動物細胞は、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、初代T細胞、およびT細胞株細胞からなる群より選択される。さらに他の態様において、本発明の改変された哺乳動物細胞は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)である。さらなる態様において、本発明の方法によって処置されるがんは、乳房、卵巣、胃、腎臓、結腸、膀胱、唾液腺、子宮内膜、膵臓または肺のがんである。さらなる態様において、哺乳動物はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
本発明の好ましい態様の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより一層理解されるであろう。本発明を例示する目的のために、図面には現在好ましい実施態様が示されている。しかしながら、本発明は、図面に示された実施態様の正確な構成および手段に限定されないことを理解すべきである。
【図１】ERBB2をパルスしたDC1がERBB2指向性T細胞の頻度を増加させることを示す一連のグラフである。ERBB2をパルスしたDC1ワクチン投与後の非浸潤性乳管がん(DCIS)を有する患者からCD8+ T細胞を精製し、ERBB2369〜377ペプチドパルス自己樹状細胞と7日間共培養した。1週間後、CD8+ T細胞を収集し、ERBB2369〜377またはMART126〜35に結合した標識四量体を用いてフローサイトメトリーにより分析した。MART1 T細胞は、陰性対照エフェクタ細胞として役立った。CD8およびERBB2についての陽性細胞の割合をドットプロットで示す。
【図２】図2A〜2Dは、ERBB2369〜377特異的T細胞がペプチドをパルスしたT2細胞を強く認識し、HLA-A2拘束ERBB2発現腫瘍細胞を示差的に認識することを示す一連のヒストグラムおよびグラフである。図2A: ペプチドをパルスした標的に応答したERBB2369〜377特異的T細胞のIFN-γ産生。HLA-A2拘束ERBB2369〜377またはMART126〜35ペプチドを負荷したT2細胞とERBB2またはMART1特異的T細胞を18時間共培養した。図2B: ERBB2369〜377特異的T細胞は、関連するペプチドに対して高い結合活性を示す。一定範囲の滴定濃度のERBB2369〜377ペプチドを用いてパルスしたT2細胞とともに18時間、ERBB2369〜377特異的T細胞をインキュベートした。MART1 T細胞は陰性対照エフェクタT細胞としての機能を果たし、MART126〜35を用いてパルスしたT2は陰性対照標的T細胞としての機能を果たした。図2C: ERBB2またはMART1特異的T細胞を単独で培養し(刺激なし)またはヒトHLA-A2拘束ERBB2+樹立がん細胞株で終夜刺激した。SKOV-3 (HLA-A2- ERBB2+)およびCEM (HLA-A2- ERBB2-)は、陰性対照腫瘍標的としての機能を果たした。図2D: HLA-A2拘束ERBB2発現腫瘍細胞株の抗原プロセッシング機構(APM)発現。ヒトTAP1、TAP2、TAPASINおよびTAP2のmRNAレベルを、リアルタイムPCRによって定量した。mRNAレベルは、APM陰性T2細胞株に対する増加倍率として表される。β-アクチンを内因性遺伝子対照として用いた。結果は、三つ組のウェルの平均±SDを描く。全てのアッセイ法について、ELISAによって無細胞上清からIFN-γを定量し、二つ組のウェルの平均濃度(pg/ml)±SEMとして報告した。
【図３Ａ】レトロウイルスにより形質導入されたSupT1細胞上のERBB2 TCRの発現を示す一連のグラフである。図3A: SupT1細胞のレトロウイルス形質導入によるTCRα/β対のスクリーニング。8つの異なるTCRの組み合わせをコードするレトロウイルスを、SupT1細胞の形質導入によるERBB2369〜377特異性についてスクリーニングした。遺伝的に改変されたSupT1細胞のHLA-A2/ERBB2369〜377四量体染色を形質導入から5日後に行い、フローサイトメトリーによって分析した。ERBB2特異的ポリクローナルCD8+ T細胞からα鎖およびβ鎖が単離された異なるTCRを各々が有する、2つの代表的なSupT1集団を示す。非形質導入(NV)細胞およびMART1 SupT1細胞は、HLA-A2/ERBB2369〜377四量体結合の陰性対照としての機能を果たした。
【図３Ｂ】レトロウイルスにより形質導入されたCD8+ T細胞上のERBB2 TCRの発現を示す一連のグラフである。図3B: 初代TCR形質導入CD8+ T細胞のHLA-A2/ERBB2369〜377四量体染色。ERBB2 TCR7またはMART1 TCRのいずれかで形質導入されたCD8+ T細胞および非形質導入CD8+ T細胞(NV)を、示されたHLA-A2/ペプチド四量体で染色した。数字は四量体+細胞の割合を表す。
【図４】図4A〜4Cは、ERBB2369〜377特異的T細胞が、インビトロでERBB2ペプチド負荷標的およびERBB2発現がん細胞株に応答して強力なIFN-γ産生を示すことを実証する一連のヒストグラムおよびグラフである。図4A: HLA-A2拘束ERBB2369〜377またはMART126〜35を負荷したT2細胞とERBB2またはMART1 TCR形質導入T細胞を18時間共培養した。図4B: ERBB2またはMART1 TCR形質導入T細胞を単独で培養し(刺激なし)またはヒトHLA-A2拘束ERBB2+樹立がん細胞株で終夜刺激した。SKOV-3 (HLA-A2- ERBB2+)およびCEM (HLA-A2- ERBB2-)は、陰性対照腫瘍標的としての機能を果たした。図4C: ERBB2369〜377特異的TCRおよび対照MART1 TCRで形質導入されたCD8+ T細胞を形質導入から11日後に、一定範囲の滴定濃度のERBB2369〜377ペプチドを用いてパルスしたT2細胞とともに18時間インキュベートした。MART126〜35ペプチドを用いてパルスしたT2は陰性対照標的T細胞としての機能を果たした。全てのアッセイ法について、ELISAによって無細胞上清からIFN-γを定量し、二つ組のウェルの平均濃度(pg/ml)±SEMとして報告した。
【図５】図5A〜5Cは、ERBB2369〜377特異的TCR7を発現するT細胞がインビボで腫瘍成長を遅延させることを立証する一連のグラフおよびイラストである。ERBB2369〜377特異的TCR7を発現するT細胞は、インビボで腫瘍成長を遅延させる。レトロウイルスにより形質導入されたERBB2 TCR7 CD8+ T細胞および乳がん細胞株MDA231を、0日目にNSGマウスの脇腹に同時に皮下注射した。MDA231と同時注射されたMART1特異的F5 TCR形質導入T細胞を対照として用いた。図5A: 腫瘍成長は、キャリパー測定によって経時的に判定された。結果は、全ての群についてn=5で平均腫瘍体積(mm3 ± SEM)として表される。p<0.05の統計的有意性は、＊p=0.0495、＊＊p=0.0075、＊＊＊p= 0.0029として報告されている。35日後、腫瘍を切除し、撮影し(図5B)、腫瘍重量を測定した(図5C)。TCR, T細胞受容体; NSG, NOD/SCID/γ鎖-/-。
【図６】分極DC1細胞が成熟樹状細胞の特徴を示すことを実証する一連のグラフである。末梢血単球は、4日間GM-CSFおよびIL-4の存在下、完全培地中で培養すると未成熟樹状細胞(iDC)に分化した。成熟樹状細胞(mDC)は、IFN-γおよびLPSでのiDCの刺激によって得られた。mDCを収集し、特異的抗体を用いたフローサイトメトリー分析によりCD80、CD86、CD83およびCD40のその発現についてアッセイした。mDCは、高レベルのCD80、CD83、CD86およびCD40発現を示した。
【図７】ERBB2発現がん細胞がERBB2特異的T細胞の活性化表現型を刺激することを示すグラフである。ERBB2特異的T細胞は、ERBB2特異的刺激に応答してCD69初期活性化抗原を発現する。ERBB2特異的T細胞を、標的細胞なし(なし)でまたは示されたERBB2陰性もしくは陽性樹立腫瘍細胞標的とともに24時間培養した。インキュベーション時間の後、T細胞をCD8、ERBB2四量体およびCD69について染色し、フローサイトメトリーによって分析した。次に蛍光活性化流動選別(FACS)を用いてCD8+ ERBB2四量体+ CD69+ T細胞を選別した。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
詳細な説明
定義
他に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記述された方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料を本発明の試験の実践において用いることができるが、好ましい材料および方法が本明細書において記述される。本発明を記述および主張するうえで、以下の専門用語が用いられる。
【００２２】
本明細書において用いられる専門用語は、特定の態様のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【００２３】
「1つの(a)」および「1つの(an)」という冠詞は本明細書において、その冠詞の文法的目的語の1つまたは2つ以上(すなわち、少なくとも1つ)をいうように用いられる。例として、「1つの(an)要素」は、1つの要素または2つ以上の要素を意味する。
【００２４】
量、時間的持続時間などのような測定可能な値をいう場合に本明細書において用いられる「約」は、規定値から±20%または±10%、より好ましくは±5%、さらにより好ましくは±1%、なおより好ましくは±0.1%のバラツキを包含するよう意図されるが、これはそのようなバラツキが、開示された方法を実施するのに適切なためである。
【００２５】
本明細書において用いられる「活性化」は、検出可能な細胞増殖を誘導するのに十分に刺激されたT細胞の状態をいう。活性化はまた、誘発されたサイトカイン産生および検出可能なエフェクタ機能に関連しうる。「活性化T細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂を受けているT細胞をいう。
【００２６】
本明細書において用いられる「親和性」という用語は、受容体との配位結合を形成するリガンド(例えば、分子、タンパク質、ホルモン、神経伝達物質または薬物)の能力をいう。リガンドと受容体との結合親和性は、リガンドとその受容体結合部位との間の引力の相互作用力に依存する。高親和性リガンド結合はリガンドとその受容体との間のより大きい分子間力に起因し、その一方で低親和性リガンド結合はリガンドとその受容体との間の分子間力がより小さい。高親和性結合は、低親和性結合の場合よりもその受容体結合部位でリガンドの滞留時間が長いことを伴う。結合親和性は、解離定数(Kd)によって定量的に定義することができ、Kdが低いほど、リガンドとその受容体との間の結合親和性は高くなる。
【００２７】
本明細書において用いられる「抗体」という用語は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子をいう。抗体は、天然供給源または組み換え供給源に由来する無傷の免疫グロブリンであってもよく、無傷の免疫グロブリンの免疫反応性部分であってもよい。抗体は、典型的には、免疫グロブリン分子の四量体である。本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、FabおよびF(ab)2、ならびに一本鎖抗体(scFv)およびヒト化抗体を含む、種々の形態で存在しうる(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。
【００２８】
「抗体断片」という用語は、無傷の抗体の部分をいい、無傷の抗体の抗原決定可変領域をいう。抗体断片の例としては、Fab、Fab'、F(ab')2およびFv断片、直鎖状抗体、scFv抗体、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００２９】
本明細書において用いられる「抗体重鎖」は、天然に存在する立体配座にある全抗体分子中に存在する2つのタイプのポリペプチド鎖のうち大きい方をいう。
【００３０】
本明細書において用いられる「抗体軽鎖」は、天然に存在する立体配座にある全抗体分子中に存在する2つのタイプのポリペプチド鎖のうち小さい方をいう。αおよびβ軽鎖は、2つの主要な抗体軽鎖アイソタイプをいう。
【００３１】
本明細書において用いられる用語「合成抗体」とは、例えば、本明細書において記述されるバクテリオファージによって発現される抗体のような、組み換えDNA技術を用いて作製される抗体を意味する。この用語はまた、抗体をコードしかつ抗体タンパク質またはその抗体を規定するアミノ酸配列を発現するDNA分子の合成によって作製された抗体であって、そのDNA配列またはアミノ酸配列が、DNA配列またはアミノ酸配列の利用可能かつ当技術分野において周知である合成技術を用いて得られた抗体も意味するとみなされるべきである。
【００３２】
本明細書において用いられる「抗原」または「Ag」という用語は、免疫応答を誘発する分子と定義される。この免疫応答には、抗体産生、または特異的免疫適格細胞の活性化のいずれかまたは両方が含まれうる。当業者は、事実上、全てのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原として働きうることを理解するであろう。さらに、抗原は、組み換えDNAまたはゲノムDNAに由来することができる。当業者は、免疫応答を惹起するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のDNAが、それゆえ、本明細書においてその用語が用いられる通りの「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の完全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要はないことを理解するであろう。本発明が、2つ以上の遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を含むが、これに限定されないこと、およびこれらのヌクレオチド配列が、所望の免疫応答を誘発するために様々な組み合わせで配置されることは容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原が生体サンプルから作製され得る、合成され得る、または生体サンプルに由来し得ることは容易に明らかである。そのような生体サンプルは、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または生体液を含むことができるが、これらに限定されることはない。
【００３３】
本明細書において用いられる「抗腫瘍効果」という用語は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞の数の減少、転移の数の減少、平均余命の増加、またはがん性病状に付随する様々な生理的症状の改善によって明らかになりうる生物学的効果をいう。「抗腫瘍効果」は、腫瘍のそもそもの発生の予防における、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によっても明らかになりうる。
【００３４】
本明細書において用いられる場合、「自己」という用語は、後にその個体に再び導入される、同じ個体に由来する任意の材料をいうよう意図される。
【００３５】
本明細書において用いられる「がん」という用語は、異常細胞の急速かつ制御不能な増殖によって特徴付けられる疾患と定義される。がん細胞は局所的に広がることもあれば、または血流およびリンパ系を通じて身体の他の部分に広がることもある。様々ながんの例としては、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がんなどが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００３６】
本明細書において用いられる「コドン最適化」という用語は、1つの種のヌクレオチドのDNA配列を別の種のヌクレオチドのDNA配列に変換/置換することによって、関心対象の遺伝子の翻訳効率を増加させることにより生物におけるタンパク質発現を改善かつ最大化することを目的とした技法をいうように意図される。コドン最適化は、野生型DNA配列および稀有なコドンを、タンパク質を変化させることなく、より高度に発現される種配列および頻繁に出現するコドンにより置き換えることを含む。
【００３７】
本明細書において用いられる場合、「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響または変化を与えないアミノ酸改変をいうよう意図される。そのような保存的改変には、アミノ酸置換、付加および欠失が含まれる。改変は、部位特異的突然変異誘発およびPCR媒介突然変異誘発のような、当技術分野において公知の標準的な技法によって、本発明の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分枝側鎖を有するアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。したがって、抗体のCDR領域内の1つまたは複数のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基で置き換えることができ、この変化した抗体は、本明細書において記述される機能的アッセイ法を用い抗原結合能について試験することができる。
【００３８】
「疾患」は、動物が恒常性を維持できず、疾患が改善されなければその動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態である。対照的に、動物における「障害」は、その動物が恒常性を維持できるが、その動物の健康状態が障害のない場合よりも好ましくない健康状態である。未処置のまま放置されても、障害が必ずしも動物の健康状態のさらなる低下を引き起こすとは限らない。
【００３９】
「有効量」または「治療的有効量」は、本明細書において互換的に用いられ、特定の生物学的結果を達成するのに有効な、または治療的もしくは予防的利益をもたらす、本明細書において記述される化合物、製剤、材料もしくは組成物の量をいう。そのような結果には、当技術分野において適当な任意の手段によって判定されるような抗腫瘍活性が含まれうるが、これに限定されることはない。
【００４０】
「エレクトロポレーション」という用語は、膜貫通電場パルスを用いて、細胞膜内の微視的経路(細孔)を誘導することをいう; その存在により、プラスミド、オリゴヌクレオチド(例えばDNA、RNA)、siRNA、薬物、イオン、および水のような生体分子が、細胞膜の一方の側から他方の側へと通過することが可能になる。
【００４１】
「コードする」とは、定義されたヌクレオチド(すなわち、rRNA、tRNAおよびmRNA)配列または定義されたアミノ酸配列のいずれかを有する、生物学的過程において他の重合体および高分子の合成のための鋳型として働く、遺伝子、cDNAまたはmRNAのような、ポリヌクレオチドにおける特定のヌクレオチド配列の固有の特性ならびにそれに起因する生物学的特性をいう。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳によって細胞または他の生体系においてタンパク質が産生される場合、タンパク質をコードする。mRNA配列と同一であり通常は配列表に示されるヌクレオチド配列であるコード鎖も、遺伝子またはcDNAの転写のための鋳型として用いられる非コード鎖もともに、タンパク質、またはその遺伝子もしくはcDNAの他の産物をコードするということができる。
【００４２】
本明細書において用いられる場合、「内因性」とは、生物、細胞、組織もしくは系の内部に由来するか、またはそれらの内部で産生される、任意の材料をいう。
【００４３】
本明細書において用いられる場合、「外因性」という用語は、生物、細胞、組織もしくは系の外部から導入されるか、またはそれらの外部で産生される、任意の材料をいう。
【００４４】
本明細書において用いられる「増大する」という用語は、T細胞の数の増加のように、数が増加することをいう。1つの態様において、エクスビボで増大したT細胞は、培養物中に当初存在している数と比べて数が増加する。別の態様において、エクスビボで増大したT細胞は、培養物中の他の細胞型と比べて数が増加する。本明細書において用いられる「エクスビボ」という用語は、生物(例えば、ヒト)から取り出され、生物の外側で(例えば、培養皿、試験管、またはバイオリアクタ中で)増殖された細胞をいう。
【００４５】
本明細書において用いられる「発現」という用語は、そのプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および/または翻訳と定義される。
【００４６】
「発現ベクター」または「組み換え発現ベクター」とは、発現されるヌクレオチド配列に機能的に連結された発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含むベクターをいう。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用性エレメントを含む; 発現のための他のエレメントは宿主細胞によって、またはインビトロ発現系において供給されうる。発現ベクターには、組み換えポリヌクレオチドを組み入れたコスミド、プラスミド(例えば、裸のもの、またはリポソーム中に含まれるもの)ならびにウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)のような、当技術分野において公知の全てのものが含まれる。
【００４７】
本明細書において用いられる「相同」とは、2つの重合体分子間、例えば、2つのDNA分子もしくは2つのRNA分子のような、2つの核酸分子間、または2つのポリペプチド分子間のサブユニット配列同一性をいう。これら2つの分子の両方におけるあるサブユニット位置が同じ単量体サブユニットで占められる場合; 例えば、2つのDNA分子の各々におけるある位置がアデニンによって占められているなら、それらはその位置で相同である。2つの配列間の相同性は、一致しているまたは相同である位置の数の一次関数である; 例えば、2つの配列における位置の半分(例えば、長さが10サブユニットの重合体における5つの位置)が相同であるなら、2つの配列は50%相同であり; 位置の90% (例えば、10中9)が一致しているまたは相同であるなら、2つの配列は90%相同である。
【００４８】
「完全ヒト」とは、分子全体がヒト由来であるか、または抗体のヒト形態と同一のアミノ酸配列からなる、抗体のような、免疫グロブリンをいう。
【００４９】
「ハイブリダイズする」とは、種々のストリンジェントな条件の下で、相補的なポリヌクレオチド配列(例えば、本明細書において記述される遺伝子)またはその部分の間で対合して二本鎖分子を形成することを意味する(例えば、Wahl and Berger, Methods Enzymol. 152:399, 1987; Kimmel, Methods Enzymol. 152:507, 1987を参照のこと)。高度にストリンジェントな条件の下で、ヌクレオチド配列は、中または低ストリンジェントな条件の下で観察されるハイブリダイゼーションの程度よりも検出可能に大きい量で標的配列とハイブリダイズする。高ストリンジェンシー条件には、正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、または散在しているほんのわずかだけの不一致を含有するポリヌクレオチドを、ハイブリダイズするヌクレオチド配列に一致するほんのわずかだけの短い領域(例えば、3〜10塩基)を有するランダムな配列から区別する条件が含まれる。高ストリンジェンシーの条件では、一方のポリヌクレオチドの全ての(または大部分の)塩基が他方の相補的塩基と対合することを要するが、低ストリンジェンシーの条件ではいくつかの塩基の不一致を許容する。
【００５０】
ストリンジェントな塩濃度は、通常、約750 mM NaClおよび75 mMクエン酸三ナトリウムより低く、好ましくは約500 mM NaClおよび50 mMクエン酸三ナトリウムより低く、より好ましくは約250 mM NaClおよび25 mMクエン酸三ナトリウムより低い。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミド、の非存在下で達成することができる一方で、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約35%のホルムアミド、より好ましくは少なくとも約50%のホルムアミドの存在下で達成することができる。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約30℃、より好ましくは少なくとも約37℃、最も好ましくは少なくとも約42℃の温度を含む。さらなるパラメータ、例えば、ハイブリダイゼーション時間、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)などの界面活性剤の濃度、およびキャリアDNAの添加または除外など、を変化させることは、当業者に周知である。ストリンジェンシーのさまざまなレベルは、必要に応じてこれらの種々の条件を組み合わせることにより達成される。好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、750 mM NaCl、75 mMクエン酸三ナトリウム、および1% SDS中において30℃で行われる。より好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、500 mM NaCl、50 mMクエン酸三ナトリウム、1% SDS、35%ホルムアミド、および100 μg/ml変性サケ精子DNA (ssDNA)中において37℃で行われる。より好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、250 mM NaCl、25 mMクエン酸三ナトリウム、1% SDS、50%ホルムアミド、および200 μg/ml ssDNA中において42℃で行われる。これらの条件への有用な変更は、当業者には容易に明らかであろう。
【００５１】
ほとんどの応用事例では、ハイブリダイゼーションに続く洗浄段階もまた、ストリンジェンシーについて変わるであろう。洗浄のストリンジェンシー条件は、塩濃度により、および温度により定義することができる。洗浄のストリンジェンシーは、塩濃度を減少させることによって、または温度を上昇させることによって高めることができる。例えば、洗浄段階のストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約30 mM NaClおよび3 mMクエン酸三ナトリウムより低く、より好ましくは約15 mM NaClおよび1.5 mMクエン酸三ナトリウムより低い。洗浄段階のストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約25℃、より好ましくは少なくとも約42℃、さらに好ましくは少なくとも約68℃の温度を含む。好ましい態様において、洗浄段階は、30 mM NaCl、3 mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中において25℃で行われる。より好ましい態様において、洗浄段階は、15 mM NaCl、1.5 mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中において42℃で行われる。より好ましい態様において、洗浄段階は、15 mM NaCl、1.5 mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中において68℃で行われる。
【００５２】
これらの条件のさらなる変更は、当業者には容易に明らかであろう。ハイブリダイゼーション技法は当業者に周知であり、例えば、Benton and Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記述されている。
【００５３】
本明細書において用いられる「同一性」とは、2つのポリペプチド分子間のような、2つの重合体分子間の、特に2つのアミノ酸分子間のサブユニット配列同一性をいう。2つのアミノ酸配列が同じ位置に同じ残基を有する場合; 例えば、2つのポリペプチド分子の各々における位置がアルギニンによって占められているなら、それらはその位置で同一である。2つのアミノ酸配列がアライメントにおいて同じ位置に同じ残基を有する程度または同一性は、百分率として表現されることが多い。2つのアミノ酸配列間の同一性は、一致しているまたは同一である位置の数の一次関数である; 例えば、2つの配列における位置の半分(例えば、10アミノ酸長の重合体における5つの位置)が同一であるなら、2つの配列は50%同一であり; 位置の90% (例えば、10中9)が一致しているまたは同一であるなら、2つのアミノ酸配列は90%同一である。
【００５４】
本明細書において用いられる「免疫グロブリン」または「Ig」という用語は、抗体として機能するタンパク質のクラスと定義される。B細胞によって発現される抗体は、BCR (B細胞受容体)または抗原受容体といわれることもある。このタンパク質のクラスに含まれる5つの成員は、IgA、IgG、IgM、IgDおよびIgEである。IgAは、唾液、涙液、母乳、消化管分泌物、ならびに気道および泌尿生殖路の粘液分泌物のような、身体分泌物中に存在する主要な抗体である。IgGは、最も一般的な循環血中抗体である。IgMは、ほとんどの対象で一次免疫応答において産生される主要な免疫グロブリンである。これは凝集反応、補体固定および他の抗体応答において最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌およびウイルスに対する防御において重要である。IgDは抗体機能が判明していない免疫グロブリンであるが、抗原受容体として働いている可能性がある。IgEは、アレルゲンに対する曝露時に肥満細胞および好塩基球からのメディエータの放出を引き起こすことによって即時型過敏症を媒介する免疫グロブリンである。
【００５５】
本明細書において用いられる「免疫応答」という用語は、リンパ球が抗原分子を異物と同定し、抗体の形成を誘導し、および/またはリンパ球を活性化して抗原を除去する場合に起きる抗原に対する細胞応答と定義される。
【００５６】
本明細書において用いられる場合、「説明材料（instructional material）」は、本発明の組成物および方法の有用性を伝えるために使用できる刊行物、記録、略図または他の任意の表現媒体を含む。本発明のキットの説明材料は、例えば、本発明の核酸、ペプチドおよび/もしくは組成物を含む容器に添付されてもよく、または核酸、ペプチドおよび/もしくは組成物を含む容器と一緒に出荷されてもよい。あるいは、説明材料および化合物がレシピエントによって共同的に用いられることを意図して、説明材料は容器とは別に出荷されてもよい。
【００５７】
「単離された」とは、天然の状態から変えられたまたは取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離されて」いないが、その天然状態の共存物質から部分的にまたは完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離されて」いる。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができ、または例えば、宿主細胞のような、非天然環境で存在することができる。
【００５８】
本明細書において用いられる「レンチウイルス」とは、レトロウイルス科(Retroviridae)ファミリーの属をいう。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染できるという点で、レトロウイルスの中でも独特である; それらはかなりの量の遺伝情報を宿主細胞のDNA中に送達することができるため、それらは遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の1つである。HIV、SIVおよびFIVは全て、レンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、インビボで有意なレベルの遺伝子移入を達成するための手段を与える。
【００５９】
本明細書において用いられる用語「改変された」とは、本発明の分子または細胞の変化した状態または構造を意味する。分子は化学的に、構造的に、および機能的になど、多くの方法で改変されうる。細胞は、核酸の導入によって改変されうる。
【００６０】
本明細書において用いられる用語「調節する」とは、処置もしくは化合物の非存在下での対象における応答のレベルと比較して、および/または他の点では同一であるが処置を受けていない対象における応答のレベルと比較して、対象における応答のレベルの検出可能な増加または減少を媒介することを意味する。この用語は対象、好ましくはヒトにおいて、天然のシグナルもしくは応答をかく乱させ、および/またはそれに影響を与え、それにより有益な治療応答を媒介することを包含する。
【００６１】
本発明の文脈において、一般的に存在する核酸塩基に関する以下の略語が用いられる。「A」はアデノシンをいい、「C」はシトシンをいい、「G」はグアノシンをいい、「T」はチミジンをいい、および「U」はウリジンをいう。
【００６２】
特別の定めのない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重型である、かつ同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。RNAまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列という語句はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、型によっては、イントロンを含みうる程度までイントロンを含みうる。
【００６３】
「機能的に連結された」という用語は、調節配列と異種核酸配列との間の、後者の発現を結果的にもたらす、機能的連結をいう。例えば、第1の核酸配列が第2の核酸配列との機能的関係の下で配置されている場合、第1の核酸配列は第2の核酸配列と機能的に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与えるなら、プロモーターはコード配列に機能的に連結されている。一般に、機能的に連結されたDNA配列は連続的であり、2つのタンパク質コード領域をつなぎ合わせることが必要な場合、同じ読み枠の中にある。
【００６４】
「過剰発現された」腫瘍抗原または腫瘍抗原の「過剰発現」という用語は、患者の特定の組織または臓器の内部にある固形腫瘍のような疾患領域からの細胞における腫瘍抗原の発現が、その組織または臓器からの正常細胞における発現のレベルと比べて異常なレベルであることを示すよう意図される。腫瘍抗原の過剰発現によって特徴付けられる固形腫瘍または血液悪性腫瘍を有する患者は、当技術分野において公知の標準的なアッセイ法によって判定することができる。
【００６５】
免疫原性組成物の「非経口」投与には、例えば、皮下(s.c.)、静脈内(i.v.)、筋肉内(i.m.)もしくは胸骨内注射、または輸注法が含まれる。
【００６６】
本明細書において用いられる「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖と定義される。さらに、核酸はヌクレオチドの重合体である。したがって、本明細書において用いられる核酸およびポリヌクレオチドは互換的である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、それらは単量体「ヌクレオチド」に加水分解されうるという一般知識を有する。単量体ヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解されうる。本明細書において用いられる場合、ポリヌクレオチドには、非限定的に、組み換え手段、すなわち通常のクローニング技術およびPCR(商標)などを用いた組み換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングを含む、当技術分野において利用可能な任意の手段により、ならびに合成手段により得られる全ての核酸配列が含まれるが、これらに限定されることはない。
【００６７】
本明細書において用いられる場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は互換的に用いられ、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基で構成される化合物をいう。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含まなくてはならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成しうるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって相互につなぎ合わされた2つまたはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書において用いられる場合、この用語は、例えば、当技術分野において一般的にはペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーともいわれる短鎖と、当技術分野において一般にタンパク質といわれる長鎖の両方をいい、そのなかには多くのタイプがある。「ポリペプチド」には、とりわけ、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変種、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【００６８】
本明細書において用いられる「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始させるために必要な、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるDNA配列と定義される。
【００６９】
本明細書において用いられる場合、「プロモーター/調節配列」という用語は、プロモーター/調節配列に機能的に連結された遺伝子産物の発現のために必要とされる核酸配列を意味する。ある場合には、この配列はコアプロモーター配列であってよく、他の場合には、この配列はエンハンサー配列および遺伝子産物の発現に必要とされる他の調節エレメントを含んでもよい。プロモーター/調節配列は、例えば、組織特異的な様式で遺伝子産物を発現させるものであってもよい。
【００７０】
「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合、細胞のほとんどまたは全ての生理学的条件の下で、遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列である。
【００７１】
「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合、実質的にはプロモーターに対応する誘導因子が細胞内に存在する場合にのみ遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列である。
【００７２】
「組織特異的」プロモーターは、遺伝子をコードするまたは遺伝子によって特定されるポリヌクレオチドと機能的に連結された場合、実質的には細胞が、プロモーターに対応する組織型の細胞である場合にのみ遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列である。
【００７３】
本明細書において用いられる「精製された」という用語は、純度が増したことを意味するが、ここで「純度」は、相対的な用語であって、必ずしも絶対的純度として解釈されるべきでない。例えば、物質、例えば、限定されるものではないが、核酸の純度は、少なくとも約50%であることができ、60%、70%、80%、90%、95%超であることができ、または100%であることができる。本明細書において用いられる場合、「精製された」または「実質的に精製された」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞である。実質的に精製された細胞はまた、天然に存在する状態で通常会合している他の細胞型から分離された細胞をいう。ある場合には、実質的に精製された細胞集団は、均質な細胞集団をいう。他の場合には、この用語は、天然状態で通常会合している細胞から単離された細胞を単にいう。いくつかの態様において、細胞はインビトロで培養される。他の態様において、細胞はインビトロで培養されない。
【００７４】
「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす種々のシグナル伝達分子間の生化学的関係をいう。「細胞表面受容体」という語句は、シグナルを受け取り、細胞の原形質膜を越えてシグナルを伝達しうる分子および分子の複合体を含む。
【００７５】
「一本鎖抗体」とは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖断片が、操作されたアミノ酸の長さを介してFv領域に連結されている、組み換えDNA技法によって形成された抗体をいう。米国特許第4,694,778号; Bird (1988) Science 242:423-442; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Ward et al. (1989) Nature 334:54454; Skerra et al. (1988) Science 242:1038-1041に記述されているものを含めて、一本鎖抗体を作製する様々な方法が知られている。
【００７６】
TCRまたは抗体のような、抗原結合分子に関して本明細書において用いられる用語「特異的に結合する」とは、特異的抗原を認識するが、サンプル中の他の分子を実質的に認識またはそれに結合しない抗原結合分子を意味する。例えば、1つの種由来の抗原に特異的に結合する抗原結合分子が、1つまたは複数の種由来のその抗原に結合してもよい。しかし、そのような異種間反応性はそれ自体で、特異的としての抗原結合分子の分類を変化させることはない。別の例において、抗原に特異的に結合する抗原結合分子が、その抗原の異なる対立遺伝子型に結合してもよい。しかし、そのような交差反応性はそれ自体で、特異的としての抗原結合分子の分類を変化させることはない。場合によっては、「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語を、抗原結合分子、抗体、タンパク質またはペプチドと第2の化学種との相互作用に関連して用い、相互作用が化学種上の特定の構造(例えば、抗原決定基またはエピトープ)の存在に依存することを意味してもよい; 例えば、抗原結合分子または抗体は、タンパク質全体ではなく特定のタンパク質構造を認識し、それに結合する。抗原結合分子(例えばTCR)がエピトープ「A」に特異的であるなら、エピトープAを含む分子(または遊離した、標識されていないA)の存在は、標識された「A」およびその抗原結合分子を含む反応において、その抗原結合分子に結合した標識されたAの量を減らすであろう。
【００７７】
用語「刺激」とは、刺激分子(例えば、TCR/CD3複合体)がその同族リガンドと結合し、それによって、限定されるものではないが、TCR/CD3複合体を介するシグナル伝達のような、シグナル伝達事象を媒介することにより誘導される、一次応答を意味する。刺激は、TGF-ベータのダウンレギュレーション、および/または細胞骨格構造の再編成などのような、ある特定の分子の発現の変化を媒介することができる。
【００７８】
「刺激分子」とは、この用語が本明細書において用いられる場合、抗原提示細胞上に存在する同族刺激リガンドと特異的に結合する、T細胞上の分子を意味する。
【００７９】
本明細書において用いられる「刺激リガンド」は、抗原提示細胞(例えば、aAPC、樹状細胞、B細胞など)上に存在する場合、T細胞上の同族結合パートナー(本明細書において「刺激分子」といわれる)と特異的に結合し、それによって活性化、免疫応答の開始、増殖などを含むが、これらに限定されない、T細胞による一次応答を媒介することのできるリガンドを意味する。刺激リガンドは当技術分野において周知であり、とりわけ、ペプチドが負荷されたMHCクラスI分子、抗CD3抗体、スーパーアゴニスト抗CD28抗体およびスーパーアゴニスト抗CD2抗体を包含する。
【００８０】
「対象」という用語は、免疫応答が誘発されうる生物(例えば、哺乳動物)を含むよう意図される。本明細書において用いられる「対象」または「患者」は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物でありうる。非ヒト哺乳動物には、例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコおよびネズミ哺乳動物のような、家畜およびペットが含まれる。好ましくは、対象はヒトである。
【００８１】
「標的部位」または「標的配列」とは、結合が起きるのに十分な条件の下で結合分子が特異的に結合しうる核酸の部分を規定するゲノム核酸配列をいう。
【００８２】
本明細書において用いられる場合、「T細胞受容体」または「TCR」という用語は、抗原の提示に応答してT細胞の活性化に関与する膜タンパク質の複合体をいう。TCRは、主要組織適合遺伝子複合体分子に結合した抗原を認識する役割を担う。TCRは、アルファ(α)およびベータ(β)鎖のヘテロ二量体から構成されるが、一部の細胞ではTCRはガンマおよびデルタ(γ/δ)鎖からなる。TCRは、構造的に類似しているが、異なる解剖学的位置および機能を有するアルファ/ベータおよびガンマ/デルタ形態で存在しうる。各鎖は、2つの細胞外ドメイン、つまり可変ドメインおよび定常ドメインから構成され、いくつかの態様において、TCRは、TCRを含む任意の細胞（例えば、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、記憶T細胞、調節性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、およびガンマデルタT細胞を含む）上で改変されうる。
【００８３】
本明細書において用いられる「治療的」という用語は、処置および/または予防を意味する。治療効果は、疾患状態の抑制、寛解または根絶によって得られる。
【００８４】
本明細書において用いられる「トランスフェクションされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入される過程をいう。「トランスフェクションされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクションされた、形質転換された、または形質導入されたものである。この細胞には初代対象細胞およびその子孫が含まれる。
【００８５】
疾患を「処置する」とは、この用語が本明細書において用いられる場合、対象が被っている疾患または障害の少なくとも1つの徴候または症状の頻度または重症度を低減することを意味する。
【００８６】
本明細書において用いられる「転写制御下」または「機能的に連結された」という語句は、RNAポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するためにプロモーターがポリヌクレオチドに関して正しい位置および方向にあることを意味する。
【００８７】
「ベクター」は、単離された核酸を含み、かつ単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用できる組成物である。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結び付いたポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含むが、これらに限定されない、多数のベクターが当技術分野において公知である。したがって、「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、例えばポリリジン化合物、リポソームなどのような、細胞内への核酸の移入を容易にする非プラスミド性および非ウイルス性の化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００８８】
範囲: 本開示の全体を通じて、本発明のさまざまな局面を範囲の形式で提示することができる。範囲の形式の記述は、単に簡便にするためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限と解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記述は、可能な全ての部分範囲およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、1〜6のような範囲の記述は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などのような部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3および6を具体的に開示したものとみなされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【００８９】
説明
本発明は、HER2/Neu (ERBB2)発現がん細胞を処置するための組成物および方法に関する。いくつかの態様において、本発明は、標的細胞上のERBB2369〜377エピトープに高い親和性を有し、かつそれに特異的に結合する単離されたT細胞受容体(TCR)を含む。他の態様は、ERBB2特異的TCRを発現するように改変されたT細胞またはT細胞集団を含む。さらなる態様は、ERBB2発現がん細胞を処置するためにERBB2特異的TCR遺伝子移入を使用する方法を含む。
【００９０】
T細胞受容体
本発明は、標的細胞上の表面抗原に高い親和性を有し、かつそれに特異的に結合する精製されたT細胞受容体(TCR)に関する。1つの態様において、TCRはチロシン-タンパク質キナーゼHER2/Neu (ERBB2)特異的TCRである。別の態様において、ERBB2特異的TCRは、SEQ ID NO: 2または6を含むTCRα鎖およびSEQ ID NO: 4または7を含むTCRβ鎖より選択される少なくとも1つのTCR鎖を含む。
【００９１】
1つの態様において、本発明は、ERBB2受容体タンパク質のエピトープに対する抗原特異性を有する精製されたTCRを提供する。1つの態様において、TCRは、369〜377番目の位置のアミノ酸を含む、ERBB2のエピトープ: KIFGSLAFL (SEQ ID NO: 9)に高い親和性を有し、それに特異的に結合する。
【００９２】
1つの態様において、表面抗原(例えばERBB2)はHLA-A2+標的細胞上に提示される。さらなる標的細胞は、HLA-A＊0201、HLA-A＊0202、HLA-A＊0203、HLA-A＊0204、HLA-A＊0205、HLA-A＊0206、および/またはHLA-A＊0207対立遺伝子のような、他のHLA-A2+対立遺伝子を含む(European Molecular Biology Laboratory, 2013)。
【００９３】
1つの態様において、本発明は、標的細胞上のERBB2に高い親和性を有し、かつそれに特異的に結合するT細胞受容体(TCR)をコードするヌクレオチド配列を含む精製された核酸を含む。他の態様において、精製された核酸配列は、TCRα鎖、TCRβ鎖および連結されたTCRα鎖およびβ鎖からなる群より選択される少なくとも1つのTCR鎖を含むERBB2特異的TCRをコードする。さらに他の態様において、TCRα鎖をコードするヌクレオチド配列はSEQ ID NO: 1であり、TCRβ鎖の核酸配列はSEQ ID NO: 3であり、連結されたTCRα鎖およびβ鎖の核酸配列はSEQ ID NO: 5である。
【００９４】
1つの態様において、TCR鎖のヌクレオチド配列の少なくとも1つは、遺伝子発現、翻訳効率および/またはタンパク質発現の増加に有利に働くようにコドン最適化され、さらに、ERBB2369〜377 (SEQ ID NO: 9)に対してより高い親和性を有し、かつ/またはそれに対してより特異的に結合する。そのようなコドン最適化戦略は、翻訳開始領域の改変、mRNA構造要素の改変、および異なるコドンバイアスの使用を含みうるが、これらに限定されることはない。
【００９５】
1つの態様において、本発明は、TCR鎖のヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つに相補的である、すなわち、SEQ ID NO: 1、3または5に相補的な精製されたヌクレオチド配列に関する。
【００９６】
1つの態様において、本発明の精製された核酸は、ストリンジェントな条件の下でSEQ ID NO: 1、3または5のうちの少なくとも1つとハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。別の態様において、本発明の精製された核酸は、高度にストリンジェントな条件の下でSEQ ID NO: 1、3または5のうちの少なくとも1つとハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
【００９７】
1つの態様において、本発明の核酸は組み換え発現ベクターに組み入れられる。本発明は、本発明の核酸のいずれかを含む組み換え発現ベクターを提供する。組み換え発現ベクターは、当技術分野において公知の任意の適当な組み換え発現ベクターであり、任意の適当な細胞を形質転換またはトランスフェクションするために用いることができる。適当なベクターには、例えばプラスミドおよびウイルスなど、増殖および増大のために、もしくは発現のために、またはその両方のためにデザインされたものが含まれる。1つの態様において、組み換え発現ベクターはウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターのようなレトロウイルスベクターである。
【００９８】
本発明の組み換え発現ベクターは、標準的な組み換えDNA技法(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2012))を用いて調製することができる。
【００９９】
他の態様において、組み換え発現ベクターは、転写および翻訳開始および終止コドンのような、調節配列を含む。組み換え発現ベクターは、形質転換またはトランスフェクションされた宿主の選択を可能にする1つまたは複数のマーカー遺伝子を含むことができる。適当なマーカー遺伝子には、例えば、ネオマイシン/G418耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。組み換え発現ベクターは、TCRをコードするヌクレオチド配列、またはTCRをコードするヌクレオチド配列に相補的であるかもしくはそれとハイブリダイズするヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターを含むことができる。当業者は、強い、弱い、誘導性、組織特異的および発生特異的などの、最も適当なタイプのプロモーターを選択することができる。プロモーターは、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーター、例えばサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、SV40プロモーター、RSVプロモーター、およびネズミ幹細胞ウイルス(例えばMSCV長末端反復配列(LTR)を利用するネズミ幹細胞ウイルス(MSCV)に基づくスプライス-gagベクター(pMSGV) (Cohen et al., 2005))の長末端反復配列に見出されるプロモーターであることができる。組み換え発現ベクターは、一過性発現のために、安定発現のために、またはその両方のためにデザインすることができる。また、組み換え発現ベクターは、構成性発現のためにまたは誘導性発現のためにデザインすることができる。
【０１００】
1つの態様において、本発明は、外因性T細胞受容体(TCR)を含むT細胞を含む。1つの局面において、本発明は、T細胞の集団を増大させる段階、および標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含む改変T細胞受容体(TCR)をコードする核酸を、増大されたT細胞に導入する段階を含む、改変T細胞を作製するための方法を含む。この態様において、T細胞は、改変TCRを発現することができる。
【０１０１】
1つの態様において、TCRは、野生型TCR、高親和性TCR、またはキメラTCRを含む。TCRが改変される場合、それは野生型TCRよりも標的細胞抗原に対して高い親和性を有しうる。TCRがキメラTCRである態様において、TCRは、例えば、TCRのアミノ酸鎖のうちの少なくとも1つの鎖のC末端に共刺激シグナル伝達ドメインなどのキメラドメインを含んでもよい。別の態様において、TCRは、改変されたアルファ鎖またはベータ鎖のような、改変された鎖を含みうる。そのような改変には、N-脱グリコシル化、変化したドメイン(特異的な抗原を標的とするまたは親和性を増加させるために操作された可変領域など)、1つまたは複数のジスルフィド結合の付加、異なる種に由来する鎖の全体または断片、およびそれらの任意の組み合わせが含まれうるが、これらに限定されることはない。
【０１０２】
1つの態様において、TCRは、α鎖およびβ鎖を連結するリンカーペプチドを含む単一のタンパク質として発現されうる。いくつかの態様において、本発明のα鎖およびβ鎖は、リンカーペプチドをさらに含みうる。リンカーペプチドをコードする核酸は、宿主細胞中でのTCRをコードする核酸の発現を有利に促進しうる。ある特定の態様において、リンカーペプチドは、宿主細胞中でのTCRの発現後に切断され、その結果、分離されたα鎖およびβ鎖を細胞中にもたらしうる。リンカーペプチドの非限定的な例としては、2A-ペプチドおよび(GGGGS)nリンカーが挙げられる。
【０１０３】
T細胞受容体の操作および発現のための技法には、それぞれのサブユニットを連結する天然のジスルフィド架橋を含むTCRヘテロ二量体の産生が含まれるが、これに限定されることはない(Garboczi, et al., (1996), Nature 384(6605): 134-41; Garboczi, et al., (1996), J Immunol 157(12): 5403-10; Chang et al., (1994), PNAS USA 91: 11408-11412; Davodeau et al., (1993), J. Biol. Chem. 268(21): 15455-15460; Golden et al., (1997), J. Imm. Meth. 206: 163-169; 米国特許第6,080,840号)。
【０１０４】
1つの局面において、本発明は、標的細胞上のERBB2に対する親和性を含むT細胞受容体(TCR)をコードするヌクレオチド配列を含む改変T細胞の集団であって、その中にTCRをコードする核酸を導入する前に増大される該T細胞の集団を含む。別の局面において、本発明は、標的細胞上のERBB2に親和性を有するまたは特異的に結合するTCRをコードするヌクレオチド配列を含む改変T細胞の集団であって、その中にTCRをコードする核酸を導入した後に増大される該T細胞の集団を含む。別の局面において、T細胞を改変する方法は、細胞の形質導入、トランスフェクションまたはエレクトロポレーションを含む。さらに別の局面において、T細胞を改変する方法は、当技術分野において公知の任意の適当な方法であることができる。核酸をT細胞に導入する方法の例は、本明細書の他の箇所に記述されている。
【０１０５】
共刺激分子
1つの態様において、本発明の改変T細胞は、改変T細胞が共刺激分子を発現するような、共刺激分子をコードする核酸をさらに含む。ある特定の態様において、共刺激ドメインは、CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1およびPD1Lより選択される。
【０１０６】
核酸は、本明細書の他の箇所に記載されるようにT細胞に形質導入を行うか、T細胞にトランスフェクションを行うか、またはT細胞にエレクトロポレーションを行うことにより、T細胞に導入されうる。
【０１０７】
核酸の導入
細胞に核酸を導入する方法には、物理的方法、生物学的方法および化学的方法が含まれる。DNAまたはRNAのような、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。エレクトロポレーション(Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany))、(ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.)またはGene Pulser II (BioRad, Denver, Colo.)、Multiporator (Eppendort, Hamburg Germany)を含む市販の方法を用いて、RNAを標的細胞に導入することができる。リポフェクションを用いたカチオン性リポソーム媒介トランスフェクションを用いて、ポリマーカプセル化を用いて、ペプチド媒介トランスフェクションを用いて、または「遺伝子銃」のような微粒子銃粒子送達系を用いて、RNAを細胞に導入することもできる(例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)を参照のこと)。
【０１０８】
関心対象のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法には、DNAおよびRNAベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、および特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞に遺伝子を挿入するための最も広く使われている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来しうる。例えば、米国特許第5,350,674号および同第5,585,362号を参照されたい。
【０１０９】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段には、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズのような、コロイド分散系、ならびに水中油型乳剤、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含めて脂質に基づく系が含まれる。インビトロおよびインビボでの送達媒体として用いるための例示的なコロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。
【０１１０】
使用に適した脂質は、商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(「DMPC」)は、Sigma, St. Louis, MOから得ることができ; リン酸ジセチル(「DCP」)は、K & K Laboratories (Plainview, NY)から得ることができ; コレステロール(「Choi」)は、Calbiochem-Behringから得ることができ; ジミリスチルホスファチジルグリセロール(「DMPG」)および他の脂質は、Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL)から得られうる。クロロホルムまたはクロロホルム/メタノール中の脂質のストック溶液は、約-20℃で保存することができる。クロロホルムはメタノールよりも容易に蒸発するので、唯一の溶媒として用いられる。「リポソーム」は、密閉された脂質二重層または凝集体の生成によって形成される種々の単層状および多層状脂質媒体を包含する一般用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部水性媒体を有する小胞構造を有すると特徴付けることができる。多層状リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質を過剰の水溶液に懸濁させると、自発的に形成される。脂質成分は閉鎖構造の形成前に自己再構成を受け、脂質二重層の間に水および溶解溶質を閉じ込める(Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10)。しかしながら、通常の小胞構造とは溶液中で異なる構造を有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造をとり、または脂質分子の不均一な凝集体として単に存在しうる。リポフェクトアミン-核酸複合体も企図される。
【０１１１】
外因性核酸を宿主細胞に導入するために、またはその他の方法で本発明の阻害剤に細胞を曝露するために用いられる方法にかかわらず、宿主細胞における核酸の存在を確認するために、種々のアッセイ法が実施されうる。そのようなアッセイ法には、例えば、サザンおよびノザンブロッティング、RT-PCRおよびPCRのような、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ法; 例えば、免疫学的手段(ELISAおよびウエスタンブロット)によって、または本発明の範囲に入る薬剤を同定するための本明細書において記述されるアッセイ法によって、特定のペプチドの存在または非存在を検出するような「生化学的」アッセイ法が含まれる。
【０１１２】
T細胞の供給源
増大の前に、T細胞の供給源が対象から得られる。対象の非限定的な例としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が挙げられる。好ましくは、対象はヒトである。T細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、臍帯および腫瘍を含む、いくつかの供給源から得ることができる。ある特定の態様において、当技術分野において利用可能な任意の数のT細胞株が用いられうる。ある特定の態様において、T細胞は、フィコール(Ficoll)分離のような、当業者に公知の任意の数の技法を用いて、対象から収集された血液の単位から得ることができる。1つの態様において、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスまたは白血球除去輸血によって得られる。アフェレーシス生成物は、典型的には、T細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球および血小板を含めて、リンパ球を含む。アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)のような、適切な緩衝液もしくは培地またはその後の加工処理段階のため、カルシウムを欠くかつマグネシウムを欠きうるか、もしくは全部ではないが多くの二価陽イオンを欠きうる洗浄溶液の中に細胞を配してもよい。洗浄後、細胞は、例えば、Ca不含、Mg不含PBSのような、種々の生体適合性緩衝液に再懸濁されうる。あるいは、アフェレーシスサンプルの望ましくない成分が除去され、細胞は培地に直接再懸濁されうる。
【０１１３】
別の態様において、T細胞は、赤血球を溶解し、例えばパーコール(PERCOLL)(商標)勾配を通じた遠心分離によって単球を枯渇させることにより、末梢血から単離される。あるいは、T細胞は臍帯から単離することができる。いずれにせよ、T細胞の特定の亜集団は、陽性または陰性選択技法によってさらに単離することができる。
【０１１４】
このように単離された臍帯血単核細胞は、CD34、CD8、CD14、CD19およびCD56を含むが、これらに限定されない、特定の抗原を発現する細胞を枯渇させることができる。これらの細胞の枯渇は、単離された抗体、腹水のような、抗体を含む生体サンプル、物理的支持体に結合した抗体、および細胞結合抗体を用いて達成することができる。
【０１１５】
陰性選択によるT細胞集団の濃縮は、陰性選択細胞に特有の表面マーカーに向けられた抗体の組み合わせを用いて達成することができる。好ましい方法は、陰性選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを用いる陰性磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および/または選択である。例えば、陰性選択によりCD4+細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、およびCD8に対する抗体を含む。
【０１１６】
陽性または陰性選択による所望の細胞集団の単離のため、細胞および表面(例えば、ビーズのような粒子)の濃度を変えることができる。ある特定の態様において、細胞およびビーズの最大の接触を確実にするために、ビーズおよび細胞が一緒に混合される体積を有意に減少させる(すなわち、細胞の濃度を増加させる)ことが望ましい場合がある。例えば、1つの態様において、20億個の細胞/mlの濃度が用いられる。1つの態様において、10億個の細胞/mlの濃度が用いられる。さらなる態様において、1億個超の細胞/mlが用いられる。さらなる態様において、10、15、20、25、30、35、40、45、または50百万個の細胞/mlの細胞濃度が用いられる。さらに別の態様において、75、80、85、90、95、または100百万個の細胞/mlの細胞濃度が用いられる。さらなる態様において、125または150百万個の細胞/mlの濃度を用いることができる。高濃度を用いることで、細胞収量、細胞活性化、および細胞増大の増加をもたらすことができる。
【０１１７】
T細胞は、単球除去段階を必要としない、洗浄段階の後に凍結することもできる。理論によって束縛されることを望むわけではないが、凍結およびその後の解凍段階は、顆粒球およびある程度は単球を細胞集団中で除去することにより、いっそう均一な生成物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄段階の後、細胞は凍結用溶液中に懸濁されうる。多くの凍結用溶液およびパラメータが当技術分野において公知であり、この文脈において有用であるが、非限定的な例において、1つの方法は、20% DMSOおよび8%ヒト血清アルブミンを含有するPBS、または他の適当な細胞凍結用培地を用いることを伴う。次に、細胞を毎分1℃の割合で-80℃まで凍結させ、液体窒素貯蔵タンクの気相中に貯蔵する。制御凍結の他の方法、ならびに-20℃でまたは液体窒素中での瞬時の無制御凍結が用いられうる。
【０１１８】
1つの態様において、T細胞の集団は、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたT細胞集団、およびT細胞株のような細胞内に含まれる。別の態様において、末梢血単核細胞は、T細胞の集団を含む。さらに別の態様において、精製されたT細胞は、T細胞の集団を含む。
【０１１９】
1つの態様において、改変T細胞は、ERBB2特異的TCRを発現するように改変される前に増大される。1つの態様において、キメラ膜タンパク質の細胞外ドメイン部分はERBB2を標的とする。別の態様において、TCRの細胞外ドメイン部分は、369〜377番目のアミノ酸を含む、ERBB2受容体タンパク質のエピトープ(ERBB2369〜377, SEQ ID NO: 9)を特異的に標的とする。
【０１２０】
T細胞の増大
1つの態様において、T細胞を増大させることは、T細胞を培養することをさらに含む。別の態様において、増大させるT細胞の供給源は、末梢血単核細胞である。
【０１２１】
一般に、T細胞は、CD3/TCR複合体関連シグナルを刺激する作用物質およびT細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを付着させた表面との接触によって増大する。
【０１２２】
培養後、T細胞は培養装置内の細胞培地中である期間の間、または細胞を別の培養装置に通す前に最適な継代のため細胞が集密もしくは高い細胞密度に達するまでインキュベートすることができる。培養装置は、インビトロで細胞を培養するために一般に使用される任意の培養装置のものであることができる。好ましくは、細胞を別の培養装置に継代する前のコンフルエントのレベルは70%またはそれ以上である。より好ましくは、該コンフルエントのレベルは90%またはそれ以上である。ある期間は、インビトロでの細胞の培養に適した任意の時間であることができる。T細胞培地は、T細胞の培養中にいつでも交換されうる。好ましくは、T細胞培地は約2〜3日ごとに交換される。次いでT細胞を培養装置から採取し、T細胞を直ちに使用するか、または凍結保存して後で使用するために貯蔵することができる。1つの態様において、本発明は、増大させたT細胞を凍結保存することを含む。凍結保存されたT細胞は、TCRをコードする核酸をT細胞に導入する前に解凍される。
【０１２３】
1つの局面において、T細胞を増大させる方法は、T細胞を単離する段階をさらに含むことができる。別の態様において、本発明は、増大させたT細胞を凍結保存することをさらに含む。
【０１２４】
本明細書において記述される培養段階は、非常に短くてもよく、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23時間のような、24時間未満であってもよい。本明細書においてさらに記述される培養段階は、もっと長くてもよく、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14またはそれ以上の日数であってもよい。
【０１２５】
培養細胞を記述するために、様々な用語が用いられる。細胞培養は、一般に、生物から採取され、制御された条件下で増殖された細胞をいう。初代細胞培養は、生物から直接採取された、かつ最初の継代培養前の、細胞、組織または臓器の培養である。細胞は、細胞増殖および/または分裂を促進する条件の下で増殖培地に入れられた場合、培養下で増大し、より大きな細胞集団をもたらす。細胞が培養下で増大する場合、細胞増殖の速度は、典型的には、倍加時間としても知られる、細胞が倍になるのに必要な時間量によって測定される。
【０１２６】
継代培養の各回は、継代といわれる。細胞が継代培養される場合、その細胞は継代されたといわれる。特定の細胞集団、または細胞株は、継代された回数によって言及されるか、または特徴付けられることもある。例えば、10回継代された培養細胞集団は、P10培養といわれうる。初代培養、すなわち、組織からの細胞単離後の最初の培養はP0に指定される。最初の継代培養の後に、細胞は二次培養(P1または継代1)として記述される。第2の継代培養後、細胞は三次培養(P2または継代2)となる、など。継代中に多くの集団倍加が存在しうることが当業者によって理解されよう; それゆえ培養の集団倍加数は継代数よりも多い。継代間の期間中の細胞の増大(すなわち、集団倍加の数)は、播種密度、基質、培地および継代間の時間を含むが、これらに限定されない、多くの因子に依存する。
【０１２７】
1つの態様において、細胞は数時間(約3時間)〜約14日間、またはその間の任意の時間単位の整数値の間、培養されうる。T細胞培養に適切な条件には、血清(例えば、ウシ胎仔血清もしくはヒト血清)、インターロイキン-2 (IL-2)、インスリン、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGF-βおよびTNF-α、または当業者に公知の細胞増殖のための任意の他の添加剤を含む、増殖および生存に必要な因子を含有しうる適切な培地(例えば、最小必須培地もしくはRPMI培地1640または、X-vivo 15, (Lonza))が含まれる。細胞増殖のための他の添加剤には、界面活性剤、プラスマネート、ならびにN-アセチル-システインおよび2-メルカプトエタノールのような還元剤が含まれるが、これらに限定されることはない。培地は、RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、およびX-Vivo 20、Optimizerにアミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンを添加したものであって、無血清であるか、適切な量の血清(もしくは血漿)もしくは規定のホルモン群、ならびに/またはT細胞の増殖および増大に十分な量のサイトカインを補充したかのいずれかのものを含むことができる。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的培養物にのみ含められ、対象に注入しようとする細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば、適切な温度(例えば、37℃)および雰囲気(例えば、空気に加えて5% CO2)の下で維持される。
【０１２８】
T細胞を培養するために用いられる培地は、T細胞を共刺激できる作用物質を含みうる。例えば、CD3を刺激できる作用物質はCD3に対する抗体であり、CD28を刺激できる作用物質はCD28に対する抗体である。これは、本明細書において開示されるデータによって実証されるように、本明細書において開示される方法によって単離された細胞は、約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍、またはそれ以上増大されうるからである。1つの態様において、T細胞は、改変された（例えば形質導入された、形質転換された、またはエレクトロポレーションされた）集団を培養することにより約20倍〜約50倍、またはそれ以上の範囲内で増大する。
【０１２９】
1つの態様において、本方法は、標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含むT細胞受容体(TCR)をコードする核酸を、増大されたT細胞に導入する段階を含む。別の態様において、標的細胞上の表面抗原は、369〜377番目のアミノ酸を含む、ERBB2受容体タンパク質のエピトープ(SEQ ID NO: 9)である。
【０１３０】
ある特定の態様において、本方法は、CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1およびPD1Lからなる群より選択される少なくとも1つの共刺激分子を用いて増大T細胞を刺激する段階をさらに含む。さらに他の態様において、T細胞を増大させる方法は、さらなる適用のために増大T細胞を単離する段階をさらに含むことができる。さらなる態様において、改変され増大されたT細胞は、TCRをコードする核酸を導入した後に凍結保存される。
【０１３１】
治療
本明細書において記述される改変T細胞は、対象の処置のための組成物中に含まれうる。組成物は、薬学的組成物を含み、薬学的に許容される担体をさらに含みうる。改変T細胞を含む薬学的組成物の治療的有効量が投与されうる。
【０１３２】
1つの局面において、本発明は、有効量の改変T細胞を対象に投与する段階を含む、対象において標的細胞または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法を含む。この態様において、T細胞またはT細胞集団は、標的細胞の表面上に発現されたERBB2369〜377エピトープに特異的なT細胞受容体(TCR)を含むように改変されている。改変T細胞は、例えば誘導される溶解が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)である場合など、標的細胞または組織の溶解を誘導するために投与されうる。
【０１３３】
別の局面において、本発明は、がんまたは対象に有害な免疫反応を処置する(または予防する)ために、改変T細胞の集団を、その必要のある対象に投与する段階を含む、養子細胞移入療法のための方法を含む。改変されたT細胞またはT細胞集団は、標的細胞の表面上に発現されたERBB2369〜377エピトープに特異的なT細胞受容体(TCR)を含む。
【０１３４】
さらに、改変T細胞は、がんまたは免疫反応を抑制するために動物、好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくはヒトに投与することができる。1つの局面において、本発明は、改変T細胞の集団を含む薬学的組成物の治療的有効量を対象に投与する段階を含む、対象において、例えばがんなどの状態を処置することを含む。いくつかの態様において、処置される状態またはがんは、ERBB2の異常な発現に関する。
【０１３５】
がんの非限定的な例としては、乳房、卵巣、胃、腎臓、結腸、膀胱、前立腺、子宮頸部、唾液腺、子宮内膜、膵臓、肺、皮膚、骨および脳のがんが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１３６】
別の態様において、本明細書において記述されるT細胞は、その必要のある対象における免疫応答の処置のための医薬の製造に用いられうる。
【０１３７】
本発明の細胞は、適切な前臨床および臨床の実験および試験において判定される投与量および経路でならびに時間で投与することができる。細胞組成物は、これらの範囲内の投与量で複数回投与されうる。本発明の細胞の投与は、当業者によって判定される所望の疾患または状態を処置するのに有用な他の方法と組み合わされてもよい。
【０１３８】
投与される本発明の細胞は、治療を受けている対象に関して自己、同種異系または異種でありうる。
【０１３９】
本発明の細胞の投与は、当業者に公知の任意の簡便な様式で行われうる。本発明の細胞はエアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、植込みまたは移植により対象に投与されうる。本明細書において記述される組成物は患者へ経動脈的に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、リンパ節内に(intranodally)、髄内に、筋肉内に、静脈内(i.v.)注射により、または腹腔内に投与されうる。他の例では、本発明の細胞は、対象における炎症部位、対象における局所疾患部位、リンパ節、臓器、腫瘍などに直接注射される。
【０１４０】
本明細書において記述される細胞は、多くのマトリックスを用いて投与することもできる。本発明では、そのようなマトリックスを、人工リンパ系器官として、典型的にはT細胞の調節によって免疫系を支持、維持または調節するように作用するという新しい状況のなかで利用する。したがって、本発明は、組織工学において有用性が実証されているマトリックス組成物および製剤を利用することができる。したがって、本発明の組成物、装置および方法において使用されうるマトリックスのタイプは、実質的に無限であり、生物学的マトリックスおよび合成マトリックスの両方を含みうる。1つの特定の例では、米国特許第5,980,889号; 同第5,913,998号; 同第5,902,745号; 同第5,843,069号; 同第5,787,900号; または同第5,626,561号によって記載されている組成物および装置が利用され、したがってこれらの特許は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。マトリックスは哺乳動物宿主に投与した場合に生体適合性であることに一般に関係する特徴を含む。マトリックスは天然材料および/または合成材料から形成されてもよい。マトリックスは、インプラントのような、動物の体内に永久的な構造もしくは除去可能な構造を残すことが望ましい場合には、非生分解性であっても; または生分解性であってもよい。マトリックスはスポンジ、インプラント、管、テルファパッド(telfa pad)、繊維、中空糸、凍結乾燥成分、ゲル、粉末、多孔性組成物、またはナノ粒子の形態をとりうる。さらに、マトリックスは、播種された細胞または産生されたサイトカインもしくは他の活性剤の持続放出を可能にするようにデザインすることができる。ある特定の態様において、本発明のマトリックスは可撓性および伸縮性であり、無機塩、水性液および酸素を含む溶存気体剤のような物質を透過させる半固体足場と記述されうる。
【０１４１】
本明細書ではマトリックスを生体適合性物質の一例として用いる。しかしながら、本発明はマトリックスに限定されるわけではないので、マトリックスという用語が出てきた場合、これらの用語はいずれも、細胞の保持または細胞の横断を許し、生体適合性であり、その物質の中を高分子が直接横断することを許すのでその物質そのものが半透過性膜であるか、または特定の半透過性物質と一緒に用いることができる、装置および他の物質を含むと読み取られるべきである。
【０１４２】
薬学的組成物
本発明の薬学的組成物は、本明細書において記述される改変T細胞集団を、1つまたは複数の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含みうる。そのような組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などのような緩衝液; グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストランのような炭水化物、マンニトール; タンパク質; ポリペプチドまたはグリシンのようなアミノ酸; 抗酸化剤; EDTAまたはグルタチオンのようなキレート剤; アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム); および保存料を含みうる。本発明の組成物は、好ましくは、静脈内投与のために製剤化される。
【０１４３】
本発明の薬学的組成物は、処置される(または予防される)疾患に適切な様式で投与されうる。臨床試験によって適切な投与量が判定されうるが、投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度のような因子によって判定されよう。
【０１４４】
投与される本発明の薬学的組成物の正確な量は、患者(対象)の年齢、体重、免疫応答および状態の個体差を考慮して医師により決定されることができる。本明細書において記述される改変T細胞を含む薬学的組成物は、104〜109個の細胞/kg体重、好ましくは105〜106個の細胞/kg体重の投与量で、それらの範囲内の全ての整数値を含めて、投与されうると一般に言及することができる。T細胞組成物はまた、これらの投与量で複数回投与されうる。細胞は、免疫療法において一般に知られている注入技法を用いることにより投与することができる(例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988を参照のこと)。特定の患者に対する最適な投与量および処置計画は、疾患の徴候について患者を監視し、それに応じて処置を調整することにより、医学分野の当業者によって容易に判定されることができる。
【０１４５】
ある特定の態様において、活性化T細胞を対象に投与し、続いて血液を再び採血し(またはアフェレーシスを行い)、本発明にしたがってそれからT細胞を活性化し、これらの活性化および増大したT細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは数週間ごとに複数回行うことができる。ある特定の態様において、T細胞は、10 ml〜400 mlの採血から活性化されうる。ある特定の態様において、T細胞は、20 ml、30 ml、40 ml、50 ml、60 ml、70 ml、80 ml、90 mlまたは100 mlの採血から活性化される。理論によって束縛されるべきではないが、この複数の採血/複数の再注入プロトコルを用いて、T細胞のある特定の集団を選び出すことができる。
【０１４６】
本発明のある特定の態様において、本明細書において記述される方法、またはT細胞が治療レベルにまで増大される当技術分野において公知の他の方法を用いて増大および改変された細胞は、化学療法剤、放射線、免疫抑制剤、例えばサイクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノレートおよびFK506、抗体、または他の免疫除去剤、例えばCAMPATH、抗CD3抗体もしくは他の抗体療法、サイトキシン(cytoxin)、フルダリビン、サイクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、ならびにサイトカインなどの薬剤による処置を含むが、これらに限定されない多くの関連処置法と一緒に(例えば、その前に、それと同時にまたはその後に)患者に投与される。
【０１４７】
患者に投与される前記処置の投与量は、処置される状態および処置のレシピエントの正確な性質によって変化する。ヒト投与のための投与量の拡大縮小は、当技術分野において認められている実践にしたがって行うことができる。CAMPATHの用量は、例えば、一般的に、成人患者については1〜約100 mgの範囲であり、通常、1〜30日間、毎日投与される。好ましい一日用量は1〜10 mg/日であるが、場合によっては、40 mg/日までの高用量が用いられてもよい(米国特許第6,120,766号に記述されている)。
【０１４８】
本発明において有用な方法および組成物は、実施例に記載の特定の製剤に限定されないことが理解されるべきである。以下の実施例は当業者に、本発明の、細胞を作製および使用する方法、増大および培養方法、ならびに治療方法の完全な開示かつ記述を提供するために記載されており、本発明者らがその発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。
【０１４９】
本発明の実践には、別段の指示がない限り、分子生物学(組み換え技法を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技法が利用され、それらは十分に当業者の認識範囲内である。そのような技法は、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, fourth edition (Sambrook, 2012);「Oligonucleotide Synthesis」(Gait, 1984);「Culture of Animal Cells」(Freshney, 2010);「Methods in Enzymology」「Handbook of Experimental Immunology」(Weir, 1997);「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(Miller and Calos, 1987);「Short Protocols in Molecular Biology」(Ausubel, 2002);「Polymerase Chain Reaction: Principles, Applications and Troubleshooting」, (Babar, 2011);「Current Protocols in Immunology」(Coligan, 2002)のような、文献のなかで十分に説明されている。これらの技法は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に適用可能であり、したがって、本発明の形成(making)および実践において考慮されうる。特定の態様に特に有用な技法は、以下の項で論じられる。
【実施例】
【０１５０】
実験的実施例
本発明は、以下の実験的実施例を参照して、さらに詳細に説明される。これらの実施例は、例示のみを目的として提供されており、特記しない限り、限定することを意図したものではない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供された教示の結果として明らかになる、ありとあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。
【０１５１】
さらなる説明なしに、当業者は、上記の説明および以下の実施例を用いて、本発明の化合物を作製して利用し、かつ特許請求の範囲に記載の方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい態様を具体的に指し示したものであり、本開示の残りの部分を多少なりとも限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１５２】
これらの実験に用いた材料および方法を以下に説明する。
【０１５３】
細胞
レトロウイルスパッケージングは、不死化正常胎児腎293GP細胞(Center of Cancer Research, National Cancer Institute, Bethesda, MD)において実施された。ヒト細胞株: 卵巣がん細胞株SKOV3、OVCAR3、OVCAR-2およびOV55-2、ヒト乳がん細胞株MDA231、黒色腫細胞株624および938、ヒトT細胞リンパ芽球性リンパ腫細胞株SupT1、ならびにT2リンパ芽球様細胞株。細胞株は、10% (体積比)熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)、2 mmol/lのL-グルタミン、100 μg/mlのペニシリンおよび100 U/mlのストレプトマイシンを補充したRPMI-1640 (Invitrogen)中で維持された。全ての細胞株は、マイコプラズマ汚染がないか日常的に試験された。
【０１５４】
ERBB2ペプチド負荷単球由来樹状細胞の調製
全ての患者は、ペンシルバニア大学病院のアフェレーシスユニット(Apheresis Unit)において単球濃縮のセッティングを用いBaxter CS3000で初期白血球除去輸血を受けた。白血球除去輸血および洗浄を組み合わせてワクチン接種後の患者から末梢血単球を得た。単球を洗浄し、計数し、滅菌24ウェルプレート中にて10%ウシ胎仔血清(FBS)、500 IU/mlの組み換え研究等級のヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)および250 IU/mlのインターロイキン-4 (IL-4)を補充したRPMI培地中3×106個/mlで4日間培養した。5日目に、1,000単位/ mlのIFN-γを培養物に添加し、続けて37℃で終夜インキュベーションを行った。6日目に、LPSを6時間10 ng/mlで添加して、樹状細胞の成熟を完了させた。樹状細胞のDC1表現型を、CD80、CD86、CD83およびCD40に対するモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーによって分析した。その後、DC1の半分にHLAクラスI結合ERBB2369〜377特異的ペプチドを、残りの半分にERBB2689〜697ペプチドを2時間パルスした。2時間後に細胞を収集し、洗浄し、計数し、CD8+ T細胞との共培養の前に生存性について評価した。
【０１５５】
ERBB2ペプチドをパルスした樹状細胞(DC1)を用いたインビトロでのCD8+ T細胞プライミング
自己ERBB2ペプチド負荷樹状細胞を、カラム精製されたワクチン接種後CD8+ T細胞とともに、48ウェルプレート中にて10:1の比率で共培養した。2日目に培養物にIL-2 (50 IU/ml)を添加した。感作の10日後、CD8+ T細胞を収集し、関連のあるもしくは関連のないペプチドを用いてパルスしたT2細胞または腫瘍細胞株で再刺激した。24時間後に上清を収集し、ELISAにより分析した。
【０１５６】
サイトカイン放出アッセイ法
サイトカイン放出アッセイ法は、1ウェルあたり1×105個のT細胞を1×105個の腫瘍細胞またはペプチド負荷T2細胞と96ウェル丸底プレート中3つ組で完全培地200 μl中で共培養することにより行った。ペプチド負荷T2 APCの調製のため、後者を1×107個/mlで再懸濁し、37℃で2時間、さまざまなペプチド濃度(1 ng/ml〜10 μg/ml)でERBB2またはMART1ペプチドを負荷した。次いで、T2細胞をPBSで2回洗浄し、10%熱不活性化FBSを補充したRPMI-1640により1×106個/mlで再懸濁した。20〜24時間後、BioLegend ELISA MAX(商標) Deluxeキットを用いて、無細胞上清をIFN-γの存在についてアッセイした。
【０１５７】
レトロウイルスベクターの構築
TCR遺伝子の配列を同定するために、T細胞クローンから単離されたRNAを用いて、CDR3を含むTCRα鎖およびTCRβ鎖の可変領域を増幅する5'-RACE-PCR (Kit)を実施した。RACE-PCR産物を配列決定した。TCRα鎖およびTCRβ鎖を2Aペプチドリンカー(TCRb-P2A-TCRa)によって連結し、MSCV長末端反復配列(LTR)を利用するベクターpMSGV [ネズミ幹細胞ウイルス(MSCV)に基づくスプライス-gagベクター]の誘導体であるレトロウイルスベクタープラスミドpMSGV1ベクターの骨格に完全な構築体をクローニングした(Cohen et al., J Immunol 175, 5799-5808, 2005)。
【０１５８】
組み換えレトロウイルス産生
複製欠損レトロウイルスベクターは、既述のように産生した(Wargo et al., cancer immunology, immunotherapy : CII 58, 383-394, 2009)。簡潔に言えば、Lipofectamine 2000試薬(Invitrogen)およびOptimem培地(BD Biosciences)を用いて6ウェルプレート中1×106個の293-GP細胞(一過性ウイルス産生細胞)に、各構築体由来のレトロウイルスベクターDNA 1.5 μgおよびエンベロープDNA (RD114) 0.5 μgを同時にトランスフェクションした。18時間後に10% FBSを有するDMEMに培地を交換し、48時間の時点でウイルス上清を収集した。
【０１５９】
ヒトT細胞形質導入
初代ヒトCD8+ T細胞は、ペンシルベニア大学のHuman Immunology Coreから購入し、陰性選択によって白血球除去輸血後に健常ボランティアドナーから単離した。全ての試料は、大学施設審査委員会が承認したプロトコルのもとで収集し、各ドナーから書面による同意を得た。T細胞を24ウェルプレート(Costar)中1×106個/mlで、完全培地(10%熱不活性化FBS、100 U/mlのペニシリン、100 μg/mlの硫酸ストレプトマイシン、10 mM HEPESを補充したRPMI 1640)中にプレーティングし、形質導入の前に18〜24時間、製造業者(Invitrogen)によって記述されているように抗CD3および抗CD28-mAbコーティングビーズで刺激した(Levine et al., J Immunol 159, 5921-5930, 1997)。レトロウイルス形質導入のため、非組織培養処理した12ウェルプレート(Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ)を、製造業者(RetroNectin, Takara, Otsu, Japan)によって記述されているように4℃で25 μg/mlの組み換えレトロネクチンで処理した。終夜インキュベーションの後、レトロネクチンを除去し、ウェルを室温で30分間PBS中2%のBSAによりブロッキングした。次いで、レトロウイルスベクター上清(2〜3 ml)を遠心分離(2時間2000×g)によって適用し、吸引によって除去した。刺激されたT細胞5×105個を、RMPI増殖培地1 mlの最終容量中で各ウェルに添加した。プレートを1000×gで10分間遠心分離し、終夜インキュベートした。翌日、形質導入プロセスを繰り返した。形質導入後、10% FBSを有するRPMI中で細胞を増殖させ、ヒト組み換えインターロイキン-2 (IL-2) (Novartis)を1日おきに100 IU/mlの終濃度まで添加した。0.5〜1×106個の細胞/mlの細胞密度を維持した。
【０１６０】
フローサイトメトリー
T細胞抗原特異性を判定するため、抗CD8-FITCおよびアロフィコシアニン(APC)標識ERBB2369〜377またはMART127〜35四量体(Becton Dickinson, San Jose, CA)でCD8+ T細胞を染色した。T細胞活性化表現型を評価するため、T細胞を上記の試薬にPerCPCy5.5標識抗ヒトCD69 mAbを加えたもので染色した。CD14-PerCPCy5.5、CD11c-APC、HLA-DR-PE、CD80-FITC、CD86-FITC、CD83-FITCおよびCD40-FITCを用いて、樹状細胞の表現型を評価した。全ての抗体はBD Biosciencesから購入した。
【０１６１】
リアルタイムPCR
RT-PCRを用いて、腫瘍細胞株におけるヒトTAP1、TAP2、タパシン、LMP2 (APM成分)の発現を分析した。RNA easyキット(Qiagen)を用いて、RNAをまず腫瘍細胞から単離した。次いで、First Strand Ready-To-Goビーズ(GE Healthcare)を用いてRNA 1 μgからcDNAを生成した。次いで、TAP1、TAP2、タパシン、LMP2およびβ-アクチンに特異的なApplied Biosystemのタックマン(taqman)プライマーを用いて、リアルタイムPCRを3つ組で行った。mRNAレベルをβ-アクチンに対して正規化し、APM欠損T2細胞のmRNAレベルと比較した。データはmRNAレベルの倍数として提示される。
【０１６２】
乳がんの異種移植モデル
全ての動物は、ペンシルベニア大学のAbramson Cancer Centerの幹細胞および異種移植コア(Stem Cell and Xenograft Core)から得た。マウスは、ペンシルベニア大学IACUC承認プロトコルのもと病原体のない条件下にて組織内で飼育され、処置され、維持された。インビボT細胞機能評価のため、6〜12週齢の雌性NSGマウスの脇腹に、PBS 0.2 ml中1×106個のERBB2特異的T細胞と予め混合された1×106個のMDA231細胞を皮下注射した。対照マウスに、1×106個のMART1特異的T細胞と混合されたMDA231腫瘍細胞を注射した。各群は5匹のマウスからなっていた。キャリパー測定によって経時的に腫瘍成長を判定し、長さが最大縦径であり、幅が最大横径である式V=1/2(長さ×幅2)を用いて腫瘍体積を計算した。マウスは40日後に、または苦しみ瀕死になった場合はそれよりも早く絶命(terminate)させた。絶命(termination)後、腫瘍を切除し、撮影し、秤量した。
【０１６３】
統計分析
GraphPad Prism 4.0 (GraphPadソフトウェア)を統計分析に用いた。
【０１６４】
配列(5'−3')
TCRα鎖(TCR AV3)
2018506287.tif 000003
TCRβ鎖(TCR BV3-1 (CB2))
2018506287.tif 000004
連結されたTCRα鎖(TCR AV3)およびTCRβ鎖(TCR BV3-1 (CB2))
2018506287.tif 000005
上記の強調されたヌクレオチド領域は、TCRα鎖およびβ鎖を連結し、フリン切断配列領域(暗灰色)およびP2Aスキップ配列(薄灰色)を含む。
TCRα鎖(P2A切断後)
2018506287.tif 000006
TCRβ鎖(P2A切断後)
2018506287.tif 000007
注目すべきは、P2A由来アミノ酸残基の除去をもたらすフリン切断領域である(P2AペプチドはPTV1、ブタ・テスコウイルス-1由来である)。
受容体チロシン-タンパク質キナーゼErbB-2 (ERBB2)、ホモサピエンス(Homo sapiens) (Uniprot P04626)
2018506287.tif 000008
ERBB2−エピトープ669〜677 (ERBB2369〜377)
2018506287.tif 000009
【０１６５】
表
表1: TCRαおよびβDNA構築体
上部: HLA-A2/ErbB2多量体+ CD69+ CD8+ T細胞のTCR Vα/β使用量。23個のTCRα鎖クローンおよび14個のTCRβ鎖クローンをErbB2特異的CD8+ T細胞から単離した。TRAVおよびTRBVレパートリーは、配列決定によって決定された。各クローンの反復数が表の右側に示されている。下部: レトロウイルス粒子の増殖のために、8種の異なるTCRα/β組み合わせをコードする8種の異なるレトロウイルス骨格が構築された。TCRレパートリーに2回以上提示されたTCRα鎖およびβ鎖を、MSGV-1レトロウイルス骨格にサブクローニングした。
【０１６６】
これから実験の結果を以下の実施例において説明する。
【０１６７】
実施例1: ERBB2ペプチド負荷樹状細胞によるERBB2特異的CD8+ T細胞の誘導
HLAクラスI拘束ERBB2369〜377ペプチドを含む、HLAクラスIおよびクラスIIペプチドのカクテルを用いてパルスした自己樹状細胞(DC)で予めワクチン接種されていたHLA-A2+患者(M10)から末梢血単球および末梢血T細胞を得た(Czerniecki et al., Cancer Res 67, 1842-1852, 2007)。この患者のワクチン接種後のCD8 + T細胞は、ERBB2369〜377ペプチドを用いてパルスした自己DCに対するおよびHLA-A2+/ERBB2+乳がん細胞株MDA231に対する強いIFN-γ応答を示した。注目すべきことに、患者のワクチン接種前のCD8+ T細胞はいずれかの標的に対して低レベルのIFN-γを示し、強力なワクチン誘導抗ERBB2応答の証拠を確立するものであった。患者の末梢血単球は、インビトロ・プロトコルを利用してDCに成熟され、CD80、CD86、CD83およびCD40の比較的高い発現レベルを示した(図6)。次いで、成熟したDCをERBB2369〜377ペプチドを用いてパルスし、患者のワクチン接種後の末梢血から精製されたCD8+ T細胞のインビトロ刺激のために用いた。インビトロ刺激の7日後、生存CD8+ T細胞集団のほぼ3%が、HLA-A2/ERBB2369〜377四量体の結合によって評価した場合に刺激性ERBB2369〜377ペプチドを認識した(図1)。これは、ワクチン接種後の患者の血液中で観察されたERBB2特異的T細胞の開始時の割合と比べて、1週間の間に17倍の増加を示した。ERBB2特異的T細胞はMART-126〜35四量体複合体に結合せず、ERBB2369-377ペプチドに対するそれらの特異性を実証した。対照的に、MART-1 TCR形質導入T細胞は、ERBB2369〜377四量体複合体に結合しなかったが、MART-126〜35四量体複合体への強い結合を示した(図1)。まとめると、ERBB2ペプチド負荷DCは、ERBB2369〜377ペプチド特異的T細胞の頻度を高めることができた。
【０１６８】
実施例2: ERBB2特異的CD8+ T細胞は、ERBB2ペプチド負荷標的およびERBB2発現がん細胞に対して強力なエフェクタ機能を発揮する
ERBB2特異的T細胞を、そのエフェクタ機能を評価するために、最初にERBB2369〜377ペプチドを予め負荷したHLA-A2+ T2細胞に曝露した。ERBB2特異的T細胞は、関連するERBB2ペプチドを負荷した抗原提示細胞(T2細胞)との共培養の際に、高いペプチド特異的IFN-γ産生を呈した。予想通り、無関係のMART-126〜35ペプチドを用いてパルスしたT2細胞への曝露でIFN-γは産生されなかった。機能性の陽性対照として、MART-1特異的T細胞はMART-126〜35ペプチド負荷T2細胞を認識し、かつ該細胞に対して反応した(図2A)。
【０１６９】
これらのT細胞の機能的結合活性を、力価測定した量のERBB2369〜377ペプチドを用いてパルスしたT2標的T細胞とのインキュベーションに応答したIFN-γの産生を分析することによってさらに評価した。ERBB2369〜377特異的T細胞は、低濃度(1 nM)の特異的ペプチドでさえも多量のIFN-γを分泌することができたので、高い機能的結合活性を発揮した(図2B)。それゆえ、内因的にプロセッシングされたERBB2369〜377ペプチドを認識するERBB2特異的T細胞の能力を調べた。異なるレベルのERBB2タンパク質を発現するHLA-A2適合または不適合の卵巣がん細胞、乳がん細胞および黒色腫がん細胞とともにERBB2特異的T細胞を利用して、共培養アッセイ法を行った(Lanitis et al., PLoS ONE 7, e49829, 2012)。ERBB2369〜377特異的CD8+ T細胞は、ERBB2+ HLA-A2+卵巣または乳がん細胞との相互作用でIFN-γを特異的に認識し分泌したが、HLA-A2-またはERBB2-腫瘍の認識は観察されなかった(図2C)。腫瘍細胞株によるERBB2表面発現の強度とT細胞によるIFN-γ分泌との間に相関はなかった。この目的のため、これらの腫瘍細胞のペプチドプロセッシング経路に欠陥が存在していたかどうかを判定するために、リアルタイムPCR (RT-PCR)によりTAP1、TAP2、タパシンおよびLMP2を含めて、腫瘍細胞による抗原プロセッシング機構(APM)のさまざまな成分の発現を調べた。ERBB2369〜377特異的T細胞(SKOV-3およびOVCAR-3)によってそれほどではないにせよ認識されたERBB2+腫瘍細胞株(図2C)は、試験したAPM分子のmRNA発現の低減を呈した(図2D)。ERBB2369〜377特異的T細胞(OVCAR-2、OV55-2およびMDA231)によって十分に認識された腫瘍細胞株(図2C)は、調べられたAPM分子の大部分においてより高いレベルの発現を呈した(図2D)。それゆえ、ERBB2369〜377特異的T細胞によるいくつかの卵巣腫瘍の認識の欠如は、部分的には、他所で観察されたように、腫瘍細胞における必要なAPM成分の欠如に起因しうる(Han et al., Clin Cancer Res 14, 3372-3379, 2008)。この観察は、ERBB2分子およびHLA-A2分子の両方が必要であるが、最適な免疫認識のためには十分ではないことを強調する。総合して、ワクチン刺激されたERBB2369〜377特異的T細胞は、ペプチド負荷標的およびHLA-A2適合ERBB2発現腫瘍細胞に対して強力なエフェクタ機能を発揮すると結論付けることができる。
【０１７０】
実施例3: ERBB2特異的TCRα/β遺伝子の同定および単離
T細胞による腫瘍の認識は、早期活性化マーカーCD69のようなT細胞活性化表面抗原の特異的な上方制御を伴うことが多い。腫瘍提示されたERBB2369〜377ペプチドに対する高い結合活性を有するERBB2369〜377特異的T細胞を捕捉するために、ERBB2特異的T細胞をHLA-A2+ ERBB2+ MDA231細胞とともに24時間共培養した。CD69 (図7)および結合HLA-A2/ERBB2369〜377四量体を上方制御させたERBB2特異的T細胞を次に、蛍光活性化流動選別(FACS)によって単離した。捕捉されたERBB2特異的T細胞のTCR可変(TCRV)α鎖およびTCRVβ鎖レパートリーを判定するために、全RNAを選別細胞から単離し、5' RACEに供した。23個の個別α鎖cDNAクローンおよび14個の個別β鎖cDNAクローンを、2つの独立したPCR反応から完全に配列決定した。配列データは、β鎖のBV3-1 (9S1)ファミリーに属するTCRVβレパートリーにおける2つの比較的優性な配列を示した。TCRVαレパートリーではAV3およびAV12-1α鎖についてそれぞれ2つの反復を伴って、より多くの異種性が観察された(表1)。
【０１７１】
（表１）TCRαおよびβ DNA構築体
2018506287.tif 000010
【０１７２】
TCRレパートリーにおいて2回以上提示されたTCRα鎖およびβ鎖を、MSGV-1レトロウイルス骨格にサブクローニングした。α鎖およびβ鎖cDNAを担持する計8つのレトロウイルスベクターを構築した(表1)。8つの異なるTCRα/βの組み合わせをコードするレトロウイルスを作製し、SupT1細胞の形質導入に利用した。その後、遺伝子改変SupT1細胞をHLA-A2/ERBB2369〜377四量体で染色し、フローサイトメトリーにより評価して、ERBB2369〜377ペプチドに対する特異性を有するTCRを同定した。8中1つ(1/8)のTCR組み合わせが、HLA-A2/ERBB2369〜377四量体に対する特異的かつ強力な結合を示した(図3A)。ゆえに、AV3α鎖(SEQ ID NO: 1および2)ならびにBV3-1β鎖(SEQ ID NO: 3および4)を担持するこの対になったTCRを、さらなる特徴付けのために選択した(本明細書においてHLA-A2/ERBB2 TCR7として言及される、SEQ ID NO: 5、6および7)。
【０１７３】
実施例4: ERBB2369〜377特異的TCR7のCD8+ T細胞へのレトロウイルス移入は抗原特異性を付与する
次に、TCR7 (SEQ ID NO: 5、6および7)が初代ヒトT細胞における発現で付与する機能的特性を調べた。CD8+ T細胞へのレトロウイルスTCR遺伝子移入は、特異的HLA-A2/ERBB2369〜377四量体結合を生じた(図3B)。しかしながら、SupT1細胞と比較した場合、四量体+細胞の割合は低く(およそ10%)、形質導入されたTCRは、それらを検出できるようにアセンブルされえないこと、または内因性α鎖との誤対合が起こりえたことを示唆するものであった。重要なことに、低い四量体結合頻度でさえ、ERBB2 TCR7形質導入T細胞は、ペプチドをパルスしたAPC標的に対して特異的で強固な反応性を示した(図4A)。ERBB2 TCR T細胞は、1 ng/mlという低いペプチド濃度で高いIFN-γレベルを分泌したことから、高いペプチド結合活性を示した(図4C)。ERBB2 TCR CD8+ T細胞の腫瘍反応性を分析することにより、HLA-A2+ ERBB2+ OVCAR-2およびMDA231腫瘍細胞に応答して、最初のERBB2ポリクローナルT細胞集団によって産生されたものと同様のレベルでIFN-γ分泌が観察された(図2Cおよび図4B)。HLA-A2もしくはERBB2発現を欠く腫瘍または非常に低レベルのERBB2を発現するHLA-A2+ 624黒色腫細胞に対して反応性は観察されなかった(図4B)。
【０１７４】
実施例5: ERBB2369〜377特異的TCR7を発現するT細胞は、インビボで腫瘍成長を遅延させる
インビボでERBB2369〜377特異的TCR7を発現するT細胞の抗腫瘍効果を判定するため、等数のTCR7-または対照MART-126〜35 TCR-形質導入CD8+ T細胞およびMDA231腫瘍細胞を、NOD/SCID/IL2-γcnull (NSG)マウスの皮下に同時注射し、腫瘍成長をモニターした。MDA231腫瘍は注射から14日後に侵襲的に成長し、触診できる腫瘍が明白であった。MART-1 TCR特異的T細胞と比較して、ERBB2 TCR7形質導入T細胞は、経時的に腫瘍負荷を有意に遅延させることができた(図5A)。研究の終了時に、マウスを安楽死させ、腫瘍を摘出した。ERBB2 TCR7群からの切除腫瘍は、測定された腫瘍体積(図5A)と一致して、目に見えるほど小さく(図5B)、MART-1 TCRで処置したマウスにおけるものと比較して重量が有意に少なかった(図5C)。
【０１７５】
実施例6:
腫瘍特異的TCR遺伝子の導入は、腫瘍反応性T細胞を単離する必要なく、がん免疫療法用の新規抗腫瘍リンパ球を産生する方法として提案されている(Cordaro et al., J Immunol 168, 651-660, 2002; Sadelain et al., Nat Rev Cancer 3, 35-45, 2003; Schumacher, Nat Rev Immunol 2, 512-519, 2002; Willemsen et al., Hum Immunol 64, 56-68, 2003)。この提案では、多様なヒトがんに共通する腫瘍抗原の存在、およびこれらの天然腫瘍抗原を認識する適切なT細胞集団からの腫瘍反応性TCRの単離を必要とする。その発見以来、合成ERBB2369〜377ペプチドは、インビトロでの刺激(Anderson et al., Clin Cancer Res 6, 4192-4200, 2000; Brossart et al., Cancer Res 58, 732-736, 1998; Keogh et al., J Immunol 167, 787-796, 2001; Liu et al., Cancer Res 64, 4980-4986, 2004; Rongcun et al., J Immunol 163, 1037-1044, 1999; Seliger et al., Int J Cancer 87, 349-359, 2000; zum Buschenfelde et al., Cancer Res 62, 2244-2247, 2002)またはワクチン接種(Brossart et al., 2000; Knutson et al., 2002; Murray et al., 2002; Peoples et al., J Clin Oncol 23, 7536-7545, 2005; Zaks and Rosenberg, Cancer Res 58, 4902-4908, 1998)後のERBB2特異的CTLのエクスビボおよびインビボ生成について広く調べられている。いくつかのERBB2特異的T細胞は、ERBB2ペプチドに対して高い反応性を発揮するとはいえ、ERBB2+腫瘍によって提示される内因性にプロセッシングされたペプチドを認識することはできないが(Conrad et al., J Immunol 180, 8135-8145, 2008; Zaks and Rosenberg, , Cancer Res 58, 4902-4908, 1998)、最近の研究では、ERBB2369〜377特異的T細胞が重複性HLAクラスI拘束ERBB2373〜382ペプチドと交差反応することが実証されている(Henle et al., J Immunol 190, 479-488, 2013)。重要なことに、ERBB2373〜382は天然にプロセッシングされ、ERBB2373〜382特異的T細胞もERBB2369〜377ペプチドと交差反応する(Henle et al., J Immunol 190, 479-488, 2013)ことから、その天然のプロセッシングに関する論争は存在するものの、ERBB2369〜377ペプチドに対する継続的な臨床重要性が示唆された。
【０１７６】
本発明は、ERBB2 HLAクラスIおよびIIペプチドを用いてパルスした自己プレコンディショニング樹状細胞（DC1）でワクチン接種されたERBB2 +乳房腫瘍を有するHLA-A2 +患者からのERBB2反応性T細胞を単離および試験することを含む(Czerniecki et al., Cancer Res 67, 1842-1852, 2007)。DC1表現型に分極した樹状細胞は、抗腫瘍免疫を最大化するのに重要なサイトカインおよびケモカインを産生し(Xu et al., J Immunol 171, 2251-2261, 2003)、それゆえ抗腫瘍ワクチンの有効性を増強し、インビボおよびエクスビボで腫瘍反応性T細胞を誘導かつ増大させるための強力なアプローチを供与しうる。ERBB2369〜377ペプチドを負荷したDC1細胞を用いたエクスビボ刺激1ラウンド後、ERBB2369〜377ペプチド特異的T細胞の頻度は、堅牢な下流機能分析に十分なレベル(およそ3.4%)まで増加した。注目すべきことに、これらのT細胞は、nMレベルでT2細胞に負荷されたペプチドを認識することができたが、HLA-A2+ ERBB2発現腫瘍も認識することができた。蛍光活性化細胞選別により、ERBB2特異的T細胞の純度を最大(およそ95%)にすることができ、TCRレパートリーの分子分析およびその後のさまざまなTCRαおよびβの組み合わせの試験により、本明細書において新規なERBB2369〜377特異的TCR (TCR7 AV3/BV3-1) (SEQ ID NO: 1〜7)を同定かつ単離することにつながった。
【０１７７】
ERBB2 TCRをコードするレトロウイルス粒子を増殖させ、初代T細胞の遺伝子操作に利用した。ERBB2369〜377多量体への結合によって測定した場合、形質導入されたT細胞によるほぼ10%のTCR発現効率が観察された。初代ヒトT細胞では多量体+細胞の割合は低かったが、内因性TCRα鎖およびβ鎖を欠くSupT1細胞(およそ80%)におけるERBB2 TCRの高発現が観察され、内因性TCRα/β鎖との誤対合が形質導入T細胞の表面上の外因性TCR鎖の適切な対合アセンブリを損なうという可能性が示唆された。それにもかかわらず、ペプチドをパルスした標的ならびにHLA-A2+ ERBB2+卵巣がんおよび乳がん腫瘍細胞株に対するサイトカイン放出によって測定した場合、形質導入されたT細胞はHLA-A2拘束ERBB2特異的エフェクタT細胞機能を示した。出発ERBB2特異的T細胞集団と同様に、ERBB2369〜377 TCRにより形質導入されたT細胞の高機能結合活性は、非常に少量の同族ペプチド(1 ng/ml)を用いてパルスされたT2細胞を認識するその能力およびヒト乳がん異種移植モデルにおける腫瘍成長を有意に遅延させるその能力によって実証された。
【０１７８】
このTCR遺伝子アプローチのさらなる前臨床的な改良は、キメラ二量体形成を減少させ、T細胞表面上の外因性TCRの発現を増加させるために正当化される。これは、ヒトTCR鎖の定常領域をそのネズミ対応物で置き換えること(Cohen et al., Cancer Res 66, 8878-8886, 2006)、TCRα鎖およびβ鎖の定常領域内にさらなるシステイン残基を導入すること(Cohen et al., Cancer Res 67, 3898-3903, 2007; Voss et al., J Immunol 180, 391-401, 2008)、外因性CD3分子を供給すること(Ahmadi et al., Blood 118, 3528-3537, 2011)、ならびに/または内因性TCRを特異的に下方制御するための低分子干渉RNA (siRNA)を含めること(Okamoto et al., Clin Cancer Res 8, 3407-3418, 2009)により達成することができる。あるいは、ERBB2 TCR T細胞の反応性は、腫瘍細胞によって発現されることが多い、B7-H4のような、負の免疫調節分子に特異的な組み換えヒト抗体の同時投与による免疫チェックポイント遮断により増強することができる(Dangaj et al., Cancer research, 2013)。
【０１７９】
要約すると、本発明のERBB2369〜377特異的TCRは、各患者に固有の抗腫瘍T細胞を同定する必要なく、自己腫瘍抗原特異的T細胞を生成するために利用できる容易に入手可能な組成物を表す。本発明は、TCR遺伝子移入による正常なT細胞特異性の方向転換をもたらし、種々の一般的な上皮のまたは他のERBB2発現悪性腫瘍の処置のためにERBB2369〜377ペプチドに対する高い結合活性および特異性を有する十分な数のT細胞を産生することができる。したがって、本発明の組成物および方法は、養子免疫療法分野において大きな潜在的用途を提供する。
【０１８０】
本明細書で引用した各特許、特許出願および刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１８１】
本発明は特定の態様に関連して開示されているが、本発明の他の態様および変形は、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、当業者によって考案され得ることが明らかである。添付の特許請求の範囲は、全てのそのような態様および同等の変形を包含するように解釈されることが意図される。
【図１】
2018506287.tif 000012
【図２】
2018506287.tif 000013
【図３Ａ】
2018506287.tif 000014
【図３Ｂ】
2018506287.tif 000015
【図４】
2018506287.tif 000016
【図５】
2018506287.tif 000017
【図６】
2018506287.tif 000018
【図７】
2018506287.tif 000019
【配列表】
2018506287000001.app
【国際調査報告】
2018506287.tif 000020