(57)【要約】本発明は、高度に強力だが、全身毒性が過剰な白金−アクリジン抗癌剤の新しいクラスのエステルプロドラッグ、アミドプロドラッグまたはカルバメートプロドラッグを生成するための、多用途の合成アプローチの使用に関する。この新しいハイブリッドは、開裂可能な親油性アシル部分でマスキングされているヒドロキシル基を含む。これらの化合物にブタン酸（酪酸）エステルおよびより嵩高い２−プロパンペンタン酸（バルプロ酸）エステルを導入した。この設計の目的は、そのＤＮＡ介在性の細胞殺傷潜在性を低下させることなく、ファルマコフォアの薬剤様特性（たとえば、ｌｏｇＤ）を向上させることであった。【選択図】図３
2018501187.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Ｉの化合物または薬学的に許容される塩であって、
【化１】
2018501187.tif 000015
式中、Ｌは各々独立にＮＨ３であるか、または前記Ｌは、それらが結合している白金原子と一緒になって脂肪族ジアミンで構成される環を形成し；
式中、Ｒ’は１〜１０個の炭素原子を含む第一級アルコール基、第二級アルコール基もしくは第三級アルコール基、またはカルボン酸基もしくはアミド官能基を含む第一級、第二級もしくは第三級アルキル基；またはアルコール基、カルボン酸基もしくはアミド基を含むアリール基であり、あるいはＲ’はアルキル−アリール、または任意に１つもしくは複数の置換基でさらに置換されていてもよいアルコール基、カルボン酸基またはアミド基を含むアリール基であり、前記置換基はハロ、ヒドロキシル、カルボキシル、ニトロ、アミノ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニルまたはＣ２〜６アルキニルであり；
ｎは１〜６であり；
ｍは１または２であり；
かつＸはハロまたはＮＯ３である、
化合物または薬学的に許容される塩。
【請求項２】
式Ｉの前記Ｌは、それらが連結している白金化合物と環を形成して、エタン−１，２−ジアミン、プロパン−１，３−ジアミン、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン（Ｒ，Ｒ、Ｓ，ＳおよびＲ，Ｓ異性体）または２，３−ジアミノブタン（Ｒ，Ｒ、Ｓ，ＳおよびＲ，Ｓ異性体）を含む基を形成している、請求項１に記載の化合物または薬学的に許容される塩。
【請求項３】
Ｒ’はカルボン酸基を含む、請求項１に記載の化合物または薬学的に許容される塩。
【請求項４】
Ｒ’はアルコールを含む、請求項３に記載の化合物または薬学的に許容される塩。
【請求項５】
Ｒ’はアミド官能基を含む、請求項３に記載の化合物または薬学的に許容される塩。
【請求項６】
ｎは１〜３である、請求項３に記載の化合物または薬学的に許容される塩。
【請求項７】
ｎは１である、請求項３に記載の化合物または薬学的に許容される塩。
【請求項８】
ｎは３である、請求項３に記載の化合物または薬学的に許容される塩。
【請求項９】
ＸはＣｌまたはＮＯ３である、請求項３に記載の化合物または薬学的に許容される塩。
【請求項１０】
ＸはＮＯ３である、請求項３に記載の化合物または薬学的に許容される塩。
【請求項１１】
下記式Ｉの化合物または薬学的に許容される塩であって、
【化２】
2018501187.tif 000016
式中、Ｌは各々独立にＮＨ３であるか、または前記Ｌは、それらが結合している白金原子と一緒になって脂肪族ジアミンで構成される環を形成し；
式中、Ｒ’は１〜１０個の炭素原子を含む第一級アルコール基、第二級アルコール基もしくは第三級アルコール基、またはカルボン酸基もしくはアミド官能基を含む第一級、第二級もしくは第三級アルキル基；またはアルコール基、カルボン酸基もしくはアミド基を含むアリール基であり、あるいはＲ’はアルキル−アリール、または任意に１つもしくは複数の置換基でさらに置換されていてもよいアルコール基、カルボン酸基またはアミド基を含むアリール基であり、前記１つまたは複数の置換基はハロ、ヒドロキシル、カルボキシル、ニトロ、アミノ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニルまたはＣ２〜６アルキニルであり；
ｎは１〜６であり；
ｍは１または２であり；
かつＸはハロまたはＮＯ３である、
化合物または薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
式Ｉの前記Ｌは、それらが連結している白金化合物と環を形成して、エタン−１，２−ジアミン、プロパン−１，３−ジアミン、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン（Ｒ，Ｒ、Ｓ，ＳおよびＲ，Ｓ異性体）または２，３−ジアミノブタン（Ｒ，Ｒ、Ｓ，ＳおよびＲ，Ｓ異性体）を含む基を形成している、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
Ｒ’はカルボン酸を含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
Ｒ’はアルコールを含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
Ｒ’はアミド官能基を含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ｎは１〜３である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ＸはＣｌまたはＮＯ３である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
薬学的に許容される用量の下記式Ｉの化合物を、癌の処置を必要とする被検体に投与するステップを含む癌を処置する方法であって、
【化３】
2018501187.tif 000017
式中、Ｌは各々独立にＮＨ３であるか、または前記Ｌは、それらが結合している白金原子と一緒になって脂肪族ジアミンで構成される環を形成し；
式中、Ｒ’は１〜１０個の炭素原子を含む第一級アルコール基、第二級アルコール基もしくは第三級アルコール基、またはカルボン酸基もしくはアミド官能基を含む第一級、第二級もしくは第三級アルキル基；またはアルコール基、カルボン酸基もしくはアミド基を含むアリール基であり、あるいはＲ’はアルキル−アリール、または任意に１つもしくは複数の置換基でさらに置換されていてもよいアルコール基、カルボン酸基またはアミド基を含むアリール基であり、前記置換基はハロ、ヒドロキシル、カルボキシル、ニトロ、アミノ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニルまたはＣ２〜６アルキニルであり；
ｎは１〜６であり；
ｍは１または２であり；
かつＸはハロまたはＮＯ３である、方法。
【請求項１９】
前記癌は肺腺癌である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｒ’はアルコールまたはカルボン酸を含む、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、３５  ＵＳＣ  １１９（ｅ）に基づき、どちらもその全内容を全体として援用する、２０１４年６月２２日に出願された米国特許仮出願第６２／０１５，４７８号、および２０１５年３月２２日に出願された米国特許仮出願第６２／１３６，５６２号の優先権を主張する。
【０００２】
本研究は、少なくとも一部を米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）／米国国立癌研究所（ＮＣＩ）（Ｇｒａｎｔ  ＣＡ１０１８８０）の助成を受けたものであった。したがって、連邦政府は本発明における権利を有する。
【０００３】
本発明は、ある種の癌の処置に強い効力を有するエステル部分、カルバメート部分および／またはアミド部分を含む一連の新規な白金アクリジン薬に関する。本化合物は、ある種の癌に対してマイクロモル以下の細胞毒性を維持しながら、優れた安定性、全身毒性の低減および好ましい活性化プロファイルを示す。本化合物は、そのプロファイルにより、現存する化合物と比較して循環時間の延長、早すぎる腎クリアランスの低下および選択的な開裂／脱保護特性を有することが期待される。
【背景技術】
【０００４】
伝統的な化学療法薬は、多くの場合、全身毒性が高い、および治療濃度域が狭いという難点がある。抗癌薬の薬物動態（ＰＫ：ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）および毒性プロファイルを向上させるため、ナノサイズの送達プラットフォーム、受容体を標的としたコンジュゲート、およびプロドラッグ設計などの様々な手段が探求されている。この最後のアプローチの背後にある理論的根拠は、投与後に酵素的にまたは化学的刺激に反応して、薬剤の実際の生理活性分子形態に変換される前駆体分子を生成することである。生体内活性化は、吸収中、循環中または腫瘍部位で起こり得る。親油性プロドラッグの利点として、循環中および循環から吸収中の保持の効率性のほか、向上した膜の透過性および標的組織における蓄積がある。
【０００５】
ＤＮＡを標的とした白金−アクリジンハイブリッド薬は、いくつかの充実性腫瘍モデルで強い効力を示した。特に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ：ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）細胞は、このファルマコフォアに対して非常に感受性があることが判明している。シスプラチンおよびそのアナログと異なり、ＰＴＡＣＲＡＭＴＵ（１）から誘導される白金−アクリジンは、ＤＮＡ塩基と架橋しないが、前者の二官能性付加体より本質的により重度のＤＮＡ損傷形態である、構造的に独特なハイブリッド付加体を生じさせる。しかしながら、化学療法抵抗性難治性癌におけるその有望な細胞殺傷にもかかわらず、現存する白金−アクリジン化合物の多くは、好ましくないＡＤＭＥ（吸収、分布、代謝および排泄）特性を示し、これによりその前臨床開発が遅れている。
【０００６】
原型化合物１’は、たとえば、マウスに異種移植したＮＣＩ−Ｈ４６０腫瘍の増殖を阻害する一方、試験動物において重度の毒性の徴候を示し、結果として最大耐量（ＭＴＤ：ｍａｘｉｍｕｍ  ｔｏｌｅｒａｔｅｄ  ｄｏｓｅ）が小さくなった。１’による処置後に剖検したマウスは、正常組織において高レベルの白金を示したが、腫瘍における蓄積が不十分であるほか、肝毒性または腎毒性が起こり得る徴候、腎臓の変色も示した。
【０００７】
【化１】
2018501187.tif 000003
【０００８】
チャート１。第１および第２世代白金−アクリジンハイブリッド薬の一般的構造
化合物１（ＰＴ−ＡＣＲＡＭＴＵ、チャート１；ＡＣＲＡＭＴＵ＝１−［２−（アクリジン−９−イルアミノ）エチル］−１，３−ジメチルチオ尿素）は、いくつかの充実性腫瘍モデルで強い効力を示した、ＤＮＡを標的とする白金−アクリジンハイブリッド薬のクラスの原型である。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞は、このファルマコフォアに対して特に感受性があることが判明しており、より新しい誘導体は、ＮＳＣＬＣ細胞株において低ナノモル域のＩＣ５０値を、および腫瘍異種移植片において活性を示す。古典的な構造活性相関（ＳＡＲ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）アプローチおよびモジュールライブラリーのスクリーニングを用いて、化学的安定性を調整することができ、ファルマコフォアのオフターゲットの反応性を低下させることもできた。いくつかの所望の改良は、求電子性金属の周囲の配位子およびドナーのセットを修飾することにより達成できた。これらの努力が、シスプラチンより３桁高い効力を示す誘導体（１’’’、チャート１）の開発につながった（ＮＣＩ−Ｈ４６０およびＡ５４９肺癌細胞において１’’’のＩＣ５０値はそれぞれ１．３ｎＭおよび３．９ｎＭであった）。
【０００９】
白金−アクリジンは、化学療法抵抗性難治性癌における有望な細胞殺傷の結果にもかかわらず、ＡＤＭＥ（吸収、分布、代謝、および排泄）特性が好ましくないことから、修飾化合物の開発が急務となっている。化合物１’などの現存する化合物は、たとえば、マウスに異種移植したＮＣＩ−Ｈ４６０腫瘍の増殖を阻害する一方、試験動物において重度の毒性の徴候を示し、結果として最大耐量（ＭＴＤ）が小さくなった。化合物１’による処置後に剖検したマウスは、正常組織において高レベルの白金を示したが、腫瘍における蓄積が不十分であるほか、肝毒性または腎毒性が起こり得る徴候、腎臓の変色も示した。これらの欠点を念頭に置いて本発明は開発された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一実施形態では、本発明は、向上した薬理学的特性を有する白金−アクリジン化合物に関する。これらの白金−アクリジン化合物は、これらの薬を用いた全身処置の治療機会を開く。
【００１１】
白金−アクリジンの薬理学的特性を向上させるため、およびこれらの薬を用いた全身処置の治療機会を開くため、本発明は、新たに設計した親油性エステルベースのプロドラッグであって、循環中に、吸収中にまたは直接癌組織において化学的または酵素的加水分解を起こすように特異的に調整することができるプロドラッグに関する。この新たなコンセプトの結果、いくつかの抗癌プロドラッグの活性化に関わる重要な酵素、ヒトカルボキシルエステラーゼ−２（ｈＣＥＳ−２）により基質として認識される白金含有薬の最初の事例が生まれた。本開示に提示した技術は、白金−アクリジンをベンチからベッドサイドへ促すのに最も重要なステップと考えられ得る。
【００１２】
そのうえ、本発明の化合物は、ＮＳＣＬＣ細胞株において低ナノモル範囲でＩＣ５０値を、および腫瘍異種移植片において活性を示す。
【００１３】
本発明の化合物はさらに、抗ウイルス化合物または抗アルツハイマー化合物として使用できる可能性があるかもしれない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】リン酸塩緩衝液、ＰＢ、ｐＨ７．４（パネルＡ）、リン酸塩緩衝生理食塩水、ＰＢＳ、ｐＨ７．４（パネルＢ）、およびｈＣＥＳ−２の存在下でのＰＢＳ（パネルＣ）中の加水分解反応について、定量ＨＰＬＣによりモニターした化合物２〜８のエステル部分の開裂を示す。プロットしたデータは、３回のインキュベーションの平均±標準偏差である。パネルＣの化合物７の変換率は、識別不能な生成物が得られた化学的開裂（より少ない（ｍｉｎｏｒ））および酵素的開裂（より多い（ｍａｊｏｒ））の合計を表す。反応は３７℃で行った。
【図２】ＰＢ（Ａ）中、ＰＢＳ（Ｂ）中、およびｈＣＥＳ−２（Ｃ）による化合物２のエステル開裂により生じた反応生成物の分離に関する逆相ＨＰＬＣ追跡を示す。ａ〜ｄと表記した画分についてポジティブイオンモードで記録した質量スペクトルと、対応する構造および分子イオンのｍ／ｚ値とをそれぞれパネルＤおよびＥに示す。
【図３】１Ｈ  ＮＭＲ分光法［Ｄ２Ｏ、ｐＨ＊７．０、１０ｍＭのＰＢ中の２ｍＭのＰｔ（黒色の追跡）またはＰＢＳ（赤色の追跡）］により３７℃で２４時間モニターした化合物２のエステル加水分解の反応速度を示す。データセットは、一次指数減衰関数ｙ＝ｙ０＋Ａｅ−ｘ／ｔにフィッティングさせ、ここでｔ−１は速度定数、ｋ［ｈ−１］であり、ｘは反応時間、ｔ［ｈ］である。データポイントは、少なくとも３つの積分したシグナル強度の平均±標準偏差を表す。実験は２回ずつ行い、同様の結果を得た。
【図４】ｈＣＥＳ−２による（Ａ）化合物８のエステル開裂により生じた反応生成物の分離に関する逆相ＨＰＬＣ追跡を示す。ａおよびｂと表記した画分についてポジティブイオンモードで記録した質量スペクトルと、対応する構造および分子イオンのｍ／ｚ値とをそれぞれパネルＢおよびＣに示す。
【図５】Ａ５４９（Ａ）およびＮＣＩ−Ｈ１４３５（Ｂ）癌細胞における化合物１’〜８の化学療法感受性に関するスクリーニングの結果を示す。相対的細胞生存率は、３回ずつ行った２つの独立した実験の平均±標準偏差である。
【図６】３７℃でインキュベートした１０ｍＭのＰＢ中の錯体２の加水分解反応に関する経時的１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを用いた反応速度論的研究（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｙ）を示す。錯体２の特徴的なプロトンＡ、ＢおよびＣをモニターしてシグナル帰属を行った。電子吸引性白金により引き起こされるＣＨ酸性度の増加を原因とするプロトンのＨ／Ｄ交換は、「Ｄ」と表記した点に留意されたい。
【図７】化合物１’’’で処理した非小細胞肺癌細胞株（Ａ）Ａ５４９および（Ｂ）ＮＣＩ−Ｈ４６０における細胞増殖アッセイの薬剤反応曲線を示す。エラーバーは、３回ずつ行った２つの独立した実験の平均からの±標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
一実施形態では、本発明は、向上した薬理学的特性を有する白金−アクリジン化合物に関する。これらの白金−アクリジン化合物は、これらの薬を用いた全身処置の治療機会を開く。一実施形態では、これらの親油性エステルベースのプロドラッグ／化合物は、循環中に、吸収中にまたは直接癌組織において化学的または酵素的加水分解を起こすように特異的に調整することができる。この新たなコンセプトの結果、いくつかの抗癌プロドラッグの活性化に関わる重要な酵素、ヒトカルボキシルエステラーゼ−２（ｈＣＥＳ−２）により基質として認識される白金含有薬の最初の事例が生まれた。本開示に提示した技術は、白金−アクリジンをベンチからベッドサイドへ促すのに最も重要なステップの１つと考えられるべきである。
【００１６】
そのうえ、本発明の化合物は、ＮＳＣＬＣ細胞株において低ナノモル範囲でＩＣ５０値を、および腫瘍異種移植片において活性を示す。
【００１７】
本発明の化合物はさらに、抗ウイルスまたは抗アルツハイマー化合物として使用できる可能性があるかもしれない。
【００１８】
したがって、一実施形態では、本発明は、下記に示した式Ｉの化合物を用いた化合物、組成物および方法に関する。
【００１９】
【化２】
2018501187.tif 000004
【００２０】
式中、Ｌは各々独立にＮＨ３であるか、またはＬは、それらが結合している白金原子と一緒になって脂肪族ジアミンで構成される環を形成し；
Ｒは独立にＨ、ＮＯ２またはハロであり；
Ｒ’は、１〜１０個の炭素原子、もしくはその代わりに７〜１０個の炭素原子、もしくはその代わりに１〜８個の炭素原子、もしくはその代わりに１〜６個の炭素原子を含む第一級アルコール基、第二級アルコール基または第三級アルコール基、あるいはカルボン酸基もしくはアミド官能基を含む第一級、第二級または第三級アルキル基；あるいはアルコール基、カルボン酸基もしくはアミド基を含むアリール基である。Ｒ’はさらに、アルキル−アリール、または任意に１つもしくは複数の置換基、たとえばハロ、ヒドロキシル、カルボキシル、ニトロ、アミノ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニルもしくはＣ２〜６アルキニルでさらに置換されていてもよいアルコール基、カルボン酸基またはアミド基を含むアリール基であってもよく；
ｎは１〜６であり；
ｍは１または２であり；
かつＸはハロまたはＮＯ３である。
【００２１】
一実施形態では、Ｒ’は、コハク酸、グリコール酸もしくは３−ヒドロキシプロピオン酸などの天然または合成生成物に由来する官能基に結合していてもよい。
【００２２】
一実施形態では、Ｒ’は、天然または合成生成物、たとえばアルコールまたはカルボン酸もしくは脂肪酸アミンを含む第一級、第二級アルキルおよび／またはアリールアミン、アニリン、ピペリジンに由来する官能基；またはポリマー、たとえばキトサン；またはルカパリブもしくはエンドキシフェンなどの種々の生理活性分子に結合していてもよい。
【００２３】
一実施形態では、Ｒ’は、アルコール（エステルを生成するため）または第一級もしくは第二級アミン（アミドを生成するため）を含む化合物に由来する基であってもよい。たとえば、Ｒ’になる官能基を生成する、使用してもよい化合物として、コハク酸、エンドキシフェン、ある種のチロシンキナーゼ阻害剤、ルカパリブ、ＤＰＰＥリン脂質、アニノアジド（ａｎｉｎｏａｚｉｄｅ）、ｏ−メチルアルギニンおよびある種の脂肪酸アミンがある。以下は、第一級もしくは第二級アミノ官能基またはアルコール官能基が本発明の化合物を生成するために反応性部位として使用される、Ｒ’になり得る化合物の例である。
【００２４】
たとえばコハク酸が使用される場合、以下の一般的な構造から生成され得る化合物が示唆される。
【００２５】
【化３】
2018501187.tif 000005
【００２６】
いくつかの実施形態では、以下の３つの構造が生成された。これらの構造は、ＮＭＲおよびＬＣＭＳにより確認および／または特徴付けが行われた。
【００２７】
【化４】
2018501187.tif 000006
【００２８】
一実施形態では、Ｒ’の一部として含まれるアミドになる第一級または第二級アミンを有する化合物としては下記がある。
【００２９】
【化５】
2018501187.tif 000007
【００３０】
一実施形態では、本発明の範囲内に適合する化合物として、Ｒ’としてのエンドキシフェン部分、または下記などのそれ以外の上記の化合物の一部がある。
【００３１】
【化６−１】
2018501187.tif 000008
【化６−２】
2018501187.tif 000009
【００３２】
上記の構造は、ＮＭＲおよび／またはＬＣＭＳより確認および／または特徴付けが行われた。
【００３３】
アルコール、第一級または第二級アミンを含む多種多様な化合物は、本発明の白金化合物を変化させずに（ｉｎｔａｃｔ）送達するのに有用であり得ることを理解すべきである。その後これらの化合物は、癌細胞への送達時に加水分解の加速が起こり得る。
【００３４】
一実施形態では、式ＩのＬが、それらが連結している白金化合物と環を形成するとき、Ｌは、脂肪族ジアミン、たとえばエタン−１，２−ジアミン、プロパン−１，３−ジアミン、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン（Ｒ，Ｒ、Ｓ，ＳおよびＲ，Ｓ異性体）、２，３−ジアミノブタン（Ｒ，Ｒ、Ｓ，ＳおよびＲ，Ｓ異性体）、および他の同様の官能基であってもよい。
【００３５】
一実施形態では、Ｒ’は、直鎖アルキル基、たとえばｎ−プロピル（酪酸）；分岐対称アルキル基、たとえば２−プロピルペンチル（バルプロ酸）；分岐非対称アルキル基、たとえば３−メチル−ｎ−ブチリル、２−メチル−ｎ−バレリルであってもよい。変化例では、Ｒ’は、環式基、たとえばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルまたはシクロノニルであってもよい。変化例では、Ｒ’は、飽和または不飽和脂肪酸、たとえばオレイン酸、リノール酸、ステアリン酸、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）またはＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）であってもよい。変化例では、Ｒ’は、オリゴペプチド、たとえばＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）、ポリ−グルタミン酸またはポリ−アスパラギン酸の残基を含んでもよい。変化例では、Ｒ’は、デンドリマーまたは種々の生理活性分子天然物であってもよい。あるいは、Ｒ’は、シアル（ｓｙａｌｉｃ）酸、オレアノール酸、葉酸および／またはサリチル酸に存在する部分の一部または全部を含んでもよい。
【００３６】
一実施形態では、Ｒ’はプロピルまたは４−イルヘプチルであってもよい。
【００３７】
一実施形態では、ｎは１〜３である。変化例では、ｎは１である。変化例では、ｎは３である。
【００３８】
一実施形態では、ＸはＣｌまたはＮＯ３である。変化例では、ＸはＮＯ３である。
【００３９】
一実施形態では、Ｌはアミノ基であるか、あるいは、Ｌはそれらが結合している白金原子と一緒になって、環−ＮＨ２−（ＣＨ２）ｖ−ＮＨ２−を形成し、ｖは１、２、３または４であるか、あるいは、両方のＬは一緒に、以下の基ａ〜ｈのいずれかであってもよい。
【００４０】
【化７】
2018501187.tif 000010
【００４１】
式中、Ａは各々独立にＨ、−ＣＨ３、−ＯＣＨ３、ＣＦ３またはＮＯ２であり；Ｒ１１はハロ、ヒドロキシル、カルボキシル、ニトロ、アミノ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル  、Ｃ２〜６アルキニル、−ＯＣＨ３またはＣＦ３である。
【００４２】
一実施形態では、式Ｉの化合物は、癌を処置する医薬組成物および／または方法に使用してもよい。本方法は、処置を必要とする被検体に使用してもよい。本方法は、肺癌、精巣癌、卵巣癌、頭頸部癌、白血病およびリンパ腫を含む癌を処置するのに使用してもよい。一実施形態では、癌は肺腺癌である。
【００４３】
医薬組成物は、その薬学的に許容される塩、溶媒和物およびプロドラッグを含んでもよく、希釈剤、賦形剤、担体、または本発明の化合物のバイオアベイラビリティーを高めるもしくは寿命を延ばすのに必要な他の物質を含んでもよい。
【００４４】
本発明の化合物および組成物により処置してもよい被検体として、ウマ、雌ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、イヌ、ネコ、霊長類、たとえばチンパンジー、ゴリラ、アカゲザルおよびヒトがあるが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、被検体は癌処置を必要とするヒトである。
【００４５】
本発明の化合物を含む医薬組成物は、それ自体であるいは代わりにリポソーム、ミセルおよび／もしくはナノスフェアを用いて、注射に好適な形態をとってもよい。
【００４６】
注射に好適な医薬組成物は、どちらもそれらの全体を援用するＬａｍｍｅｒｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１６１，１７５−１８７（２０１２）、またはＢａｒｅｎｈｏｌｚ，Ｙ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１６０，１１７−１３４，（２０１２）に開示されたように製造することができる。あるいは、注射向けの組成物は任意の既知の方法によって調製してもよく、そうした組成物は、溶媒、共溶媒、可溶化剤、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、増粘剤、キレート化剤、酸化防止剤、還元剤、抗菌性保存剤、緩衝液、ｐＨ調整剤、充填剤、保護剤、張度調整薬および特殊な添加剤からなる群から選択される１つまたは複数の薬を含んでもよい。そのうえ、注射剤の製造に好適である他の無毒の薬学的に許容される賦形剤を使用してもよい。
【００４７】
水性懸濁剤は、水性懸濁剤の製造に好適な賦形剤との混合物において活性化合物を含んでもよい。こうした賦形剤には、懸濁化剤、たとえばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントゴムおよびゴムアカシアがあり；分散剤または湿潤剤は、天然ホスファチド、たとえばレシチンでも、あるいはアルキレンオキシドの脂肪酸との縮合生成物、たとえばステアリン酸ポリオキシエチレン、またはエチレンオキシドの長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、たとえば、ヘプタデカエチル−エネオキシセタノール、またはエチレンオキシドの、脂肪酸およびヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合生成物、たとえばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、またはエチレンオキシドの、脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとの縮合生成物、たとえばポリエチレンソルビタンモノオレエートであってもよい。水性懸濁剤は、１つまたは複数の着色剤をさらに含んでもよい。
【００４８】
油性懸濁剤は、活性成分を植物油、たとえばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはヤシ油、または流動パラフィンなどの鉱油に懸濁することにより製剤化してもよい。油性懸濁剤は、増粘剤、たとえば蜜蝋、固形パラフィンまたはセチルアルコールを含んでもよい。服用しやすい経口調製物を得るため、上述したものなどの甘味剤、および着香剤を加えてもよい。これらの組成物は、アスコルビン酸などの酸化防止剤の添加により保存してもよい。
【００４９】
一実施形態では、本発明は、理想的には経口送達に適した化合物、組成物および方法に関する。残基Ｒ’は、式Ｉに親油性を付与し、分子を経口送達に非常に都合のよいものにする。
【００５０】
水の添加による水性懸濁剤の調製に好適な分散性散剤および顆粒剤は、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤および１つまたは複数の防腐剤と混合した活性化合物である。好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤として、既に上述したものが挙げられる。追加の賦形剤、たとえば、甘味剤、香味料および着色剤がさらに存在してもよい。
【００５１】
本発明の医薬組成物は、水中油型エマルジョンの形態であってもよい。油相は、植物油、たとえば、オリーブ油もしくはラッカセイ油、または鉱油、たとえば流動パラフィン、またはそれらの混合物であってもよい。好適な乳化剤は、天然ゴム、たとえばゴムアカシアまたはトラガントゴム、天然ホスファチド、たとえば大豆、レシチン、ならびに脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導されるエステルまたは部分エステル、たとえばソルビタンモノオレエート、ならびに前記部分エステルのエチレンオキシドとの縮合生成物、たとえばポリオキシエチレンソルビタンオレエートであってもよい。本医薬組成物は無菌の注射用水性または油性懸濁液の形態であってもよい。この懸濁液は、上述の好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて既知の方法によって製剤化してもよい。無菌の注射用調製物はさらに、無毒の非経口的に許容可能な希釈剤もしくは溶媒中の無菌の注射用溶液または懸濁液、たとえば１，３−ブタンジオール溶液としてもよい。特に利用してもよい許容可能なビヒクルおよび溶媒は、水、無菌注射用水（ＳＷＦＩ：ｓｔｅｒｉｌｅ  ｗａｔｅｒ  ｆｏｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、リンゲル液および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌の不揮発性油も溶媒または懸濁媒体として利用すると都合がよい。このような場合に、合成モノまたはジグリセリドを用いて任意の刺激のない不揮発性油を利用してもよい。さらに、オレイン酸などの脂肪酸も注射剤の調製に使用される。
【００５２】
したがって、別の実施形態では、本発明は、式Ｉの化合物またはその塩を含む医薬製剤溶液を提供する。
【００５３】
本発明の溶液は、単位剤形あるいは複数の剤形にてシール容器、特にガラス性のもので提供してもよい。
【００５４】
本発明の溶液の調製には、式Ｉの化合物の任意の薬学的に許容される塩を使用してもよい。好適な塩の例は、たとえば、無機鉱酸、たとえば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸および同種のものとの塩、およびある種の有機酸、たとえば酢酸、コハク酸、酒石酸、アスコルビン酸、クエン酸、グルタミン酸、安息香酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸および同種のものとの塩であってもよい。一実施形態では、式Ｉの化合物はモノ、ジまたはトリヒドロクロリドを含む塩酸塩である。
【００５５】
薬学的に許容され、かつ式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を溶解できる任意の溶媒を使用してもよい。本発明の溶液は、１つまたは複数の追加の要素、たとえば共可溶化剤（溶媒と同じであってもよい）、張度調整剤、安定化剤、防腐剤またはそれらの混合物をさらに含んでもよい。溶液製剤に好適であり得る溶媒、共可溶化剤、張度調整剤、安定化剤および防腐剤の例は、以下に記載する。
【００５６】
好適な溶媒および共可溶化剤は、以下に限定されるものではないが、水；無菌注射用水（ＳＷＦＩ）；生理食塩水；アルコール、たとえばエタノール、ベンジルアルコールおよび同種のもの；グリコールおよび多価アルコール、たとえばプロピレングリコール、グリセリンおよび同種のもの；多価アルコールのエステル、たとえばジアセチン、トリアセチンおよび同種のもの；ポリグリコールおよびポリエーテル、たとえばポリエチレングリコール４００、プロピレングリコールメチルエーテルおよび同種のもの；ジオキソラン、たとえばイソプロピリデングリセリンおよび同種のもの；ジメチルイソソルビド；ピロリドン誘導体、たとえば２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ポリビニルピロリドン（共可溶化剤のみ）および同種のもの；ポリオキシエチレン化脂肪アルコール；ポリオキシエチレン化脂肪酸のエステル；ポリソルベート、たとえば、Ｔｗｅｅｎ（商標）、ポリプロピレングリコールのポリオキシエチレン誘導体、たとえば、プルロニック（商標）を挙げることができる。
【００５７】
好適な張度調整剤として、以下に限定されるものではないが、薬学的に許容される無機塩素、たとえば塩化ナトリウム；デキストロース；ラクトース；マンニトール；ソルビトールおよび同種のものが挙げられる。
【００５８】
生理的投与に好適な防腐剤は、たとえば、パラヒドロキシ安息香酸のエステル（たとえば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステルおよびブチルエステル、またはそれらの混合物）、クロロクレゾールおよび同種のものであってもよい。
【００５９】
好適な安定化剤として、以下に限定されるものではないが、単糖類（たとえば、ガラクトース、フルクトースおよびフコース）、二糖類（たとえば、ラクトース）、多糖類（たとえば、デキストラン）、環状オリゴ糖（たとえば、α−、β−、γ−シクロデキストリン）、脂肪族ポリオール（たとえば、マンニトール、ソルビトールおよびチオグリセロール）、環状ポリオール（たとえばイノシトール）および有機溶媒（たとえば、エチルアルコールおよびグリセロール）がある。
【００６０】
上記の溶媒および共可溶化剤、張度調整剤、安定化剤および防腐剤は、溶液製剤中に単独で使用しても、あるいは２つ以上の混合物として使用してもよい。
【００６１】
一実施形態では、医薬溶液製剤は、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩、および塩化ナトリウム溶液（すなわち、生理食塩水）、デキストロース、マンニトールまたはソルビトールからなる群から選択される薬を含んでもよく、薬は５％と同等またはそれ以下の量である。さらに、こうした製剤のｐＨを、薬学的に許容される酸または塩基を用いて調整して保存安定性を向上させてもよい。
【００６２】
本発明の溶液では式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩の濃度は、１００ｍｇ／ｍＬ未満、または５０ｍｇ／ｍＬ未満、または１０ｍｇ／ｍＬ未満、または１０ｍｇ／ｍＬ未満、および０．０１ｍｇ／ｍＬ超、または０．５ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬ、または１ｍｇ／ｍＬ〜３ｍｇ／ｍＬであってもよい。一実施形態では、使用される濃度は、癌細胞に対して十分に細胞傷害性であり、それにもかかわらず他の細胞への毒性を限定する理想的濃度である。
【００６３】
医薬溶液製剤の好適なパッケージングはすべて、非経口使用向けに承認された容器、たとえばプラスチックおよびガラス容器、すぐに使用できる状態（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）のシリンジおよび同種のものであればよい。一実施形態では、容器はシールガラス容器、たとえばバイアルまたはアンプルである。密封ガラスバイアルは特に好ましい。
【００６４】
本発明の実施形態によれば、生理学的に許容される溶媒中に式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を含み、かつ２．５〜３．５のｐＨを有する無菌の注射液をシールガラス容器で提供する。溶液製剤の場合、本発明の様々な化合物は、ｐＨ６未満の溶液で溶解性が高くなる、またはより長い期間安定であり得る。さらに、本発明の化合物の酸性塩は、それらの遊離塩基対応物より水溶液に対して溶解性が高くなることがあるが、酸性塩を水溶液に加える場合、溶液のｐＨが低すぎて投与に好適であり得ないことがある。したがって、ｐＨ４．５を超えるｐＨを有する溶液製剤を、投与前に７より大きいｐＨの希釈溶液と組み合わせて、投与される組み合わせ製剤のｐＨがｐＨ４．５以上になるようにしてもよい。一実施形態では、希釈溶液は水酸化ナトリウムなどの薬学的に許容される塩基を含む。別の実施形態では、希釈溶液は１０〜１２のｐＨである。別の実施形態では、投与される組み合わせた製剤のｐＨは５．０より大きい。別の実施形態では、投与される組み合わせた製剤のｐＨはｐＨ５．０〜７．０である。
【００６５】
本発明はまた、２．５〜３．５のｐＨの滅菌溶液を作るためのプロセスであって、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を薬学的に許容される溶媒に溶解させるステップを含むプロセスを提供する。式Ｉの化合物の薬学的に許容される酸性塩が使用される場合、溶液のｐＨは、薬学的に許容される塩基または塩基性溶液を用いて調整し、生理学的に許容される酸または緩衝液を加えて所望の範囲内にｐＨを調整してもよい。本方法は、得られた溶液を滅菌フィルターに通すステップをさらに含んでもよい。
【００６６】
溶液を滅菌フィルターに通す前に、溶液に１つまたは複数の追加の要素、たとえば前に明記した種類の共可溶化剤、張度調整剤、安定化剤および防腐剤を加えてもよい。
【００６７】
さらなる変化例では、本発明は、本発明の化合物を他のシスプラチン化合物と併用して使用することができる併用療法を意図している。この併用療法の有効性は、第１世代のシスプラチン化合物が示す作用機序および機構が本発明の化合物と比較して異なるため、高まる可能性がある。本発明の化合物と併用して他の抗腫瘍薬／化合物を使用できることも意図しており、したがって本発明の範囲内である。本発明の化合物と使用できる抗腫瘍薬／化合物は、細胞傷害性化合物および非細胞傷害性化合物を含む。
【００６８】
例として、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標）（トラスツズマブ）、ＲＩＴＵＸＡＮ（商標）（リツキシマブ）、ＺＥＶＡＬＩＮ（商標）（イブリツモマブチウキセタン）、ＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ（商標）（エプラツズマブ）、ＧＬＥＥＶＡＣ（商標）およびＢＥＸＸＡＲ（商標）（ヨウ素１３１トシツモマブ）などの抗腫瘍薬がある。
【００６９】
本発明の化合物と併用して使用できる他の抗腫瘍薬／化合物として、抗血管新生化合物、たとえばＥＲＢＩＴＵＸ（商標）（ＩＭＣ−Ｃ２２５）、ＫＤＲ（ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：キナーゼドメイン受容体）阻害薬（たとえば、キナーゼドメイン受容体に特異的に結合する抗体および抗原結合領域）、抗ＶＥＧＦ薬（たとえば、ＶＥＧＦまたは可溶性ＶＥＧＦ受容体もしくはそのリガンド結合領域に特異的に結合する抗体または抗原結合領域）、たとえばアバスチン（商標）またはＶＥＧＦ−ＴＲＡＰ（商標）、および抗ＶＥＧＦ受容体薬（たとえば、それらに特異的に結合する抗体または抗原結合領域）、ＥＧＦＲ阻害薬（たとえば、それに特異的に結合する抗体または抗原結合領域）、たとえばＡＢＸ−ＥＧＦ（パニツムマブ）、ＩＲＥＳＳＡ（商標）（ゲフィチニブ）、ＴＡＲＣＥＶＡ（商標）（エルロチニブ）、抗Ａｎｇ１および抗Ａｎｇ２薬（たとえば、それらまたはそれらの受容体に特異的に結合する抗体または抗原結合領域、たとえば、Ｔｉｅ２／Ｔｅｋ）、および抗Ｔｉｅ２キナーゼ阻害薬（たとえば、それに特異的に結合する抗体または抗原結合領域）がある。
【００７０】
本発明の化合物と併用して使用できる他の抗血管新生化合物／薬として、キャンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）、ＩＬ−８、Ｂ−ＦＧＦ、Ｔｅｋアンタゴニスト、抗ＴＷＥＡＫ薬（たとえば、特異的に結合する抗体もしくは抗原結合領域または可溶性ＴＷＥＡＫ受容体アンタゴニスト）、インテグリンのそのリガンドへの結合を拮抗するＡＤＡＭディスインテグリン（ｄｉｓｔｉｎｔｅｇｒｉｎ）ドメイン、特異的に結合する抗ｅｐｈ受容体および／または抗ｅｐｈｒｉｎ抗体もしくは抗原結合領域、および抗ＰＤＧＦ−ＢＢアンタゴニスト（たとえば、特異的に結合する抗体または抗原結合領域）のほか、ＰＤＧＦ−ＢＢリガンドに特異的に結合する抗体または抗原結合領域、およびＰＤＧＦＲキナーゼ阻害薬（たとえば、それに特異的に結合する抗体または抗原結合領域）がある。
【００７１】
本発明の化合物と併用して使用できる他の抗血管新生／抗腫瘍薬として、ＳＤ−７７８４（ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ）、米国）；シレンギチド（メルク（Ｍｅｒｃｋ）ＫＧａＡ、ドイツ、ＥＰＯ  ７７０６２２）；ペガプタニブオクタナトリウム（ギリアドサイエンシズ（Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、米国）；アルファスタチン（Ａｌｐｈａｓｔａｔｉｎ）（バイオアクタ（ＢｉｏＡｃｔａ）、英国）；Ｍ−ＰＧＡ（セルジーン（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、米国）；イロマスタット（アリバ（Ａｒｒｉｖａ）、米国）；エマキサニブ（ｅｍａｘａｎｉｂ）（ファイザー、米国）；バタラニブ（ノバルティス（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、スイス）；２−メトキシエストラジオール（エントレメッド（ＥｎｔｒｅＭｅｄ）、米国）；ＴＬＣ  ＥＬＬ−１２（エラン（Ｅｌａｎ）、アイルランド）；酢酸アネコルタブ（アルコン（Ａｌｃｏｎ）、米国）；α−Ｄ１４８  Ｍａｂ（アムジェン（Ａｍｇｅｎ）、米国）；ＣＥＰ−７０５５（セファロン（Ｃｅｐｈａｌｏｎ）、米国）；抗Ｖｎ  Ｍａｂ（クルーセル（Ｃｒｕｃｅｌｌ）、オランダ）ＤＡＣ：抗血管新生剤（コンジュケム（ＣｏｎｊｕＣｈｅｍ）、カナダ）；アンギオシジン（Ａｎｇｉｏｃｉｄｉｎ）（インキンファーマシューティカル（ＩｎＫｉｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、米国）；ＫＭ−２５５０（協和発酵（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ）、日本）；ＳＵ−０８７９（ファイザー、米国）；ＣＧＰ−７９７８７（ノバルティス、スイス）；アリアド（Ａｒｉａｄ）のＡＲＧＥＮＴ技術、米国；ＹＩＧＳＲ−Ｓｔｅａｌｔｈ（ジョンソン・エンド・ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）、米国）；フィブリノーゲン−Ｅフラグメント（バイオアクタ、英国）；トリゲン（Ｔｒｉｇｅｎ）の血管新生阻害剤、英国；ＴＢＣ−１６３５（エンサイシブファーマシューティカルズ（Ｅｎｃｙｓｉｖｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、米国）；ＳＣ−２３６（ファイザー、米国）；ＡＢＴ−５６７（アボット（Ａｂｂｏｔｔ）、米国）；メタスタチン（Ｍｅｔａｓｔａｔｉｎ）（エントレメッド、米国）；血管新生阻害剤（トライペップ（Ｔｒｉｐｅｐ）、スウェーデン）；マスピン（そーせい（Ｓｏｓｅｉ）、日本）；２−メトキシエストラジオール（オンコロジー・サイエンシズ・コーポレーション（Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、米国）；ＥＲ−６８２０３−００（ＷＶＡＸ、米国）；ベネフィン（Ｂｅｎｅｆｉｎ）（レーンラボ（Ｌａｎｅ  Ｌａｂｓ）、米国）；Ｔｚ−９３（ツムラ（Ｔｓｕｍｕｒａ）、日本）；ＴＡＮ−１１２０（武田（Ｔａｋｅｄａ）、日本）；ＦＲ−１１１１４２（藤沢（Ｆｕｊｉｓａｗａ）、日本）；血小板因子４（レプリジェン（ＲｅｐｌｉＧｅｎ）、米国）；血管内皮細胞増殖因子アンタゴニスト（ボレアン（Ｂｏｒｅａｎ）、デンマーク）；ベバシズマブ（ｐＩＮＮ）（ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、米国）；ＸＬ  ７８４（エクセリクシス（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、米国）；ＸＬ  ６４７（エクセリクシス、米国）；ＭＡｂ、α５β３インテグリン、第２世代（アプライド・モレキュラー・エボリューション（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）、米��およびメドイミューン（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、米国）；遺伝子治療薬、網膜症（オックスフォード・バイオメディカ（Ｏｘｆｏｒｄ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａ）、英国）；エンザスタウリン塩酸塩（ＵＳＡＮ）（リリー（Ｌｉｌｌｙ）、米国）；ＣＥＰ  ７０５５（セファロン、米国およびサノフィ・サンテラボ（Ｓａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ）、フランス）；ＢＣ  １（ジェノア・インスティテュート・オブ・キャンサー・リサーチ（Ｇｅｎｏａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、イタリア）；血管新阻害剤（アルケミア（Ａｌｃｈｅｍｉａ）、オーストラリア）；ＶＥＧＦアンタゴニスト（リジェネロン（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、米国）；ｒＢＰＩ  ２１およびＢＰＩ由来抗血管新生剤（ＸＯＭＡ、米国）；ＰＩ  ８８（プロゲン（Ｐｒｏｇｅｎ）、オーストラリア）；シレンギチド（ｐＩＮＮ）（メルクＫＧａＡ、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎ）；ミュンヘン工科大学（Ｍｕｎｉｃｈ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、ドイツ、スクリプス臨床研究所（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｃｌｉｎｉｃ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、米国）；セツキシマブ（ＩＮＮ）（アベンティス（Ａｖｅｎｔｉｓ）、フランス）；ＡＶＥ  ８０６２（味の素（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）、日本）；ＡＳ  １４０４（キャンサー・リサーチ・ラボラトリー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニュージーランド）；ＳＧ  ２９２（テリオス（Ｔｅｌｉｏｓ）、米国）；エンドスタチン（ボストン小児病院（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）、米国）；ＡＴＮ  １６１（アッテヌオン（Ａｔｔｅｎｕｏｎ）、米国）；アンジオスタチン（ボストン小児病院、米国）；２−メトキシエストラジオール（ボストン小児病院、米国）；ＺＤ  ６４７４（アストラゼネカ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、英国）；ＺＤ  ６１２６（アンジオジーン・ファーマシューティカルズ（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、英国）；ＰＰＩ  ２４５８（プレシス（Ｐｒａｅｃｉｓ）、米国）；ＡＺＤ  ９９３５（アストラゼネカ、英国）；ＡＺＤ  ２１７１（アストラゼネカ、英国）；バタラニブ（ｐＩＮＮ）（ノバルティス、スイスおよびシエーリング（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧ）、ドイツ）；組織因子経路阻害剤（エントレメッド、米国）；ペガプタニブ（Ｐｉｎｎ）（ギリアドサイエンシズ、米国）；キサントリゾール（延世大学校（Ｙｏｎｓｅｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、韓国）；ワクチン、遺伝子ベース、ＶＥＧＦ−２（スクリプス臨床研究所、米国）；ＳＰＶ５．２（スプラテック（Ｓｕｐｒａｔｅｋ）、カナダ）；ＳＤＸ  １０３（カリフォルニア大学サンディエゴ校（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ａｔ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、米国）；ＰＸ  ４７８（プロイキス（ＰｒｏＩＸ）、米国）；メタスタチン（ＭＥＴＡＳＴＡＴＩＮ）（エントレメッド、米国）；トロポニンＩ（ハーバード大学（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、米国）；ＳＵ  ６６６８（スージェン（ＳＵＧＥＮ）、米国）；ＯＸＩ  ４５０３（オキシジーン（ＯＸｉＧＥＮＥ）、米国）；ｏ−グアニジン（ディメンショナル・ファーマシュー���ィカルズ（Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、米国）；モツポラミンＣ（ブリティッシュコロンビア大学（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、カナダ）；ＣＤＰ  ７９１（セルテクグループ（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ）、英国）；アチプリモド（ｐＩＮＮ）（グラクソスミスクライン（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、英国）；Ｅ  ７８２０（エーザイ（Ｅｉｓａｉ）、日本）；ＣＹＣ  ３８１（ハーバード大学、米国）；ＡＥ  ９４１（エテルナ（Ａｅｔｅｒｎａ）、カナダ）；ワクチン、血管新生（エントレメッド、米国）；ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子インヒビター（デンドレオン（Ｄｅｎｄｒｅｏｎ）、米国）；オグルファニド（ｐＩＮＮ）（メルモット（Ｍｅｌｍｏｔｔｅ）、米国）；ＨＩＦ−１α阻害剤（キセノバ（Ｘｅｎｏｖａ）、英国）；ＣＥＰ  ５２１４（セファロン、米国）；ＢＡＹ  ＲＥＳ  ２６２２（バイエル（Ｂａｙｅｒ）、ドイツ）；アンギオシジン（インキン、米国）；Ａ６（オングストローム（Ａｎｇｓｔｒｏｍ）、米国）；ＫＲ  ３１３７２（韓国化学研究所（Ｋｏｒｅａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、韓国）；ＧＷ  ２２８６（グラクソスミスクライン、英国）；ＥＨＴ  ０１０１（エグゾニ（ＥｘｏｎＨｉｔ）、フランス）；ＣＰ  ８６８５９６（ファイザー、米国）；ＣＰ  ５６４９５９（ＯＳＩ、米国）；ＣＰ  ５４７６３２（ファイザー、米国）；７８６０３４（グラクソスミスクライン、英国）；ＫＲＮ  ６３３（キリンビール（Ｋｉｒｉｎ  Ｂｒｅｗｅｒｙ）、日本）；薬物送達システム、眼内、２−メトキシエストラジオール（エントレメッド、米国）；アンギネキス（ａｎｇｉｎｅｘ）（マーストリヒト大学、オランダおよびミネソタ大学、米国）；ＡＢＴ  ５１０（アボット、米国）；ＡＡＬ  ９９３（ノバルティス、スイス）；ＶＥＧＩ（プロテオームテック（ＰｒｏｔｅｏｍＴｅｃｈ）、米国）；腫瘍壊死因子−α阻害剤（米国国立老化研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｎ  Ａｇｉｎｇ）、米国）；ＳＵ  １１２４８（ファイザー、米国およびスージェン  米国）；ＡＢＴ  ５１８（アボット、米国）；ＹＨ１６（烟台栄昌（Ｙａｎｔａｉ  Ｒｏｎｇｃｈａｎｇ）、中国）；Ｓ−３ＡＰＧ（ボストン小児病院、米国およびエントレメッド、米国）；ＭＡｂ、ＫＤＲ（イムクローン・システムズ（ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）；ＭＡｂ、α５β１（プロティンデザイン（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ）、米国）；ＫＤＲキナーゼ阻害剤（セルテクグループ、英国およびジョンソン・エンド・ジョンソン、米国）；ＧＦＢ  １１６（南フロリダ大学（Ｓｏｕｔｈ  Ｆｌｏｒｉｄａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、米国およびエール大学（Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、米国）；ＣＳ  ７０６（三共（Ｓａｎｋｙｏ）、日本）；コンブレタスタチンＡ４プロドラッグ（アリゾナ州立大学（Ａｒｉｚｏｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、米国）；コンドロイチナーゼＡＣ（ＩＢＥＸ、カナダ）；ＢＡＹ  ＲＥＳ  ２６９０（バイエル、ドイツ）；ＡＧＭ  １４７０（ハーバード大学、米国、武田、日本およびタッ��（ＴＡＰ）、米国）；ＡＧ  １３９２５（アゴウロン（Ａｇｏｕｒｏｎ）、米国）；テトラチオモリブデート（ミシガン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ）、米国）；ＧＣＳ  １００（ウェイン州立大学（Ｗａｙｎｅ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、米国）ＣＶ  ２４７（アイビーメディカル（Ｉｖｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ）、英国）；ＣＫＤ  ７３２（チョングンダン（Ｃｈｏｎｇ  Ｋｕｎ  Ｄａｎｇ）、韓国）；ＭＡｂ、血管内皮増殖因子（キセノバ、英国）；イルソグラジン（ＩＮＮ）（日本新薬（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｓｈｉｎｙａｋｕ）、日本）；ＲＧ  １３５７７（アベンティス、フランス）；ＷＸ  ３６０（ヴィレックス（Ｗｉｌｅｘ）、ドイツ）；スクアラミン（ｐＩＮ）（ゲナエラ（Ｇｅｎａｅｒａ）、米国）；ＲＰＩ  ４６１０（シマ（Ｓｉｍａ）、米国）；ヘパラナーゼ阻害剤（インサイト（ＩｎＳｉｇｈｔ）、イスラエル）；ＫＬ  ３１０６（コーロン（Ｋｏｌｏｎ）、韓国）；ホノキオール（エモリー大学（Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、米国）；ＺＫ  ＣＤＫ（シエーリング、ドイツ）；ＺＫ  Ａｎｇｉｏ（シエーリング、ドイツ）；ＺＫ  ２２９５６１（ノバルティス、スイスおよびシエーリング、ドイツ）；ＸＭＰ  ３００（ゾーマ（ＸＯＭＡ）、米国）；ＶＧＡ  １１０２（大正（Ｔａｉｓｈｏ）、日本）；ＶＥＧＦ受容体モジュレーター（ファーマコペイア（Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）、米国）；ＶＥ−カドヘリン−２アンタゴニスト（イムクローン・システムズ、米国）；バソスタチン（米国国立衛生研究所、米国）；ワクチン、Ｆｌｋ−１（イムクローン・システムズ、米国）；ＴＺ  ９３（ツムラ、日本）；タムスタチン（ベスイスラエル病院（Ｂｅｔｈ  Ｉｓｒａｅｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）、米国）；切断型可溶性ＦＬＴ１（血管内皮細胞増殖因子受容体１）（メルクアンドカンパニー（Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ）、米国）；Ｔｉｅ−２リガンド（リジェネロン、米国）；およびトロンボスポンジン１阻害剤（アレゲーニー・ヘルス・エジュケーション・リサーチ・ファウンデーション（Ａｌｌｅｇｈｅｎｙ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、米国）がある。
【００７２】
本発明の化合物は、特定の受容体または癌細胞を標的とするように修飾してもよいし、あるいは様々なインビボ環境に耐えられるように修飾してもよいことを意図しており、したがって本発明の範囲内である。
【００７３】
さらなる変化例では、本発明の化合物は、ヌクレオチド除去修復のアップレギュレーションおよび他の耐性機構のアップレギュレーションを示す充実性腫瘍、細胞株および細胞株組織に対して使用してもよい。
【００７４】
設計および化学。白金−アクリジンは、優れた細胞毒性を示す一方、好ましくない薬剤様特性を示すことがある。最も細胞傷害性が強い誘導体は、その完全にプロトン化されたジカチオン体で存在する［ｐＫａ（９−アミノアクリジン）は９．５〜１０とほぼ等しい］。これらのハイブリッドは親水性が高すぎるため、不十分な組織分布を示し、腎クリアランスにより循環から除去されるのが速すぎる可能性が最も高い。この仮説に基づき、ここで導入される構造修飾の目標は、良好な水溶性を維持しながら、この薬の親油性を増加させることであった。アミジンドナー基のアルキル残基（残基Ｒ、Ｙ＝ＮＨの場合、チャート１を参照）を、カルボン酸エステル基の結合の部位として選択した。本設計は、１’〜１’’’のＲとして単純なＭｅおよびＥｔの代わりにヒドロキシメチル（ＭｅＯＨ）または伸長３−ヒドロキシプロピル（Ｐｒ３−ＯＨ）基の導入、および対応するプロドラッグにおける親油性エステルとしての末端ＯＨ官能基のマスキングを含んでいた（スキーム１を参照）。アシル要素として第一級カルボン酸、ブタン酸（酪酸）、および分岐第二級カルボン酸、２−プロピルペンタン酸（バルプロ酸）を導入した（スキーム１を参照）。後者の残基は、ｈＣＥＳ−２により開裂する抗癌薬ゲムシタビンのアミド保護プロドラッグにおいて以前利用されたことがある。１１
【００７５】
本設計の追加で考えられる利点として、ＤＮＡ結合ファルマコフォア上に導入される嵩高い疎水性エステル基は、親水性ＤＮＡ主溝との相性が悪く、細胞傷害性付加体の形成を遅らせ、不活性なプロドラッグという考えを支持し得ることがある。対照的に、「脱保護」Ｐｒ３−ＯＨリンカーを含む活性型のハイブリッド薬のＤＮＡ付加体のために生成された分子モデルは、ＤＮＡリン酸塩との水素結合距離に末端ヒドロキシル基を示し、これは、ＤＮＡ結合に都合がよい可能性がある。
【００７６】
【化８】
2018501187.tif 000011
スキーム１。標的化合物の合成
試薬および条件：（ｉ）ＡｇＮＯ３、ＤＭＦ、ｒｔ；（ｉｉ）適切なニトリル−エステル（１１ａ〜ｄ）、ＤＭＦ、６０℃、４時間、（ｉｉｉ）（１）１３、ＤＭＦ、４℃、（２）１ＭのＨＮＯ３。略語：ｅｎ＝エタン−１，２−ジアミン、ｐｎ＝プロパン−１，３−ジアミン。
プロドラッグ活性化の２つの異なる機構、すなわち化学的加水分解および酵素的加水分解を提案する。前者の機構は、逆エステル結合（Ｐｔ−リンカー−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、本発明に使用されるＰｔ−リンカー−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’ではない）を含む、化学的に関連したカルボン酸修飾白金−アクリジンにおいて以前に観察されたことがある。カルボン酸修飾白金−アクリジンは、クロリドイオン濃度依存性の白金補助によるエステル開裂を含む。細胞内の低クロリドは、ルイス酸性メタロヒドロラーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）として働く白金のアクア化に都合がよいと提案される。循環中ではクロリド濃度が著しく高なり、クロロ配位子の減少を抑え、エステル加水分解を抑制すると考えられる。第２の活性化の様式は、遍在するカルボキシルエステラーゼアイソザイム、特に胃腸管および肝臓だけでなく腫瘍組織においても高レベルで発現するｈＣＥＳ−２を含む。１  標的酵素としてｈＣＥＳ−１ではなくｈＣＥＳ−２を選択するのは、この２形態の十分に立証された基質選択性に基づくものであった。それによればｈＣＥＳ−２は、相対的により小さいアシル部分と組み合わせて嵩高いアルコールを含むエステル（この場合、ヒドロキシル修飾ハイブリッド薬自体）を優先的に認識する。
【００７７】
全体で７種のエステル保護ハイブリッドを合成した。この一連の化合物の構造多様性は、鎖長ｎ、およびアシル残基Ｒ’の性質を変化させることにより達成された（スキーム１）。さらに、様々な非脱離アミン（Ｌ）を導入して白金部分の反応性を調整した（下記の考察を参照）。化合物２〜８は、適切なエステル修飾ニトリル配位子（１１ａ〜ｇ）を含む白金前駆体（１２ａ〜ｇ）から生成された。短鎖ニトリル−エステル（ｎ＝１、１２ａ〜ｄ）を含む前駆体錯体が生じる配位子置換反応は、長鎖誘導体（ｎ＝３、１２ｅ〜ｇ）を用いて行った反応より収率が著しく低くなった（２０〜３０％対８０〜９０％）。この以前に観察された作用は、望ましくない錯体の２量体形成が生じる、前者の一連の誘導体のニトリル配位子における高いＣＨ酸性度に起因し得る。１２  同様に、ｎ＝２の類似の誘導体を生成するための試みは、予期しないヒドロキシル基のβ脱離により失敗した（データ示さず）。ハイブリッド薬２〜８（収率＞７５％、分析純度＞９５％）を得る最終ステップは、金属活性化ニトリル三重結合を挟んでＮ−（アクリジン−９−イル）−Ｎ’−メチルエタン−１，２−ジアミン（１３）においてＮＨＭｅ基を付加し、所望のアミジン結合、続いてプロトン化を得てジニトレート塩を生成するステップを含んでいた。ハイブリッド２〜５が生じる付加反応の立体化学において異常が観察された。伸長鎖エステル誘導体（６、７および８）および原型（１’）は、典型的には第二級アミンから形成されるアミジン配位子で観察されるように、白金部分およびアミジン−ＮＭｅ基が、Ｎ（イミノ）＝Ｃ二重結合に対してトランス配値をとる、Ｅ異性体としてほぼ例外なく（＞９０％）存在する。対照的に、ハイブリッド２〜５は、比較的に多くの量のＺ異性体（＞２５％、１Ｄおよび２Ｄ  ＮＭＲ解析に基づく）を形成する。この結果は、ニトリル基の周囲の短鎖（ｎ＝１）アシル基により生じる立体障害の増加に起因し得る。イミノプロトンとエステル基との間の分子内水素結合（ＮＨ・・・Ｏ＝Ｃ−Ｏ）もこの作用に寄与している可能性がある。
【００７８】
新たに合成されたハイブリッドはすべて、関連する水性媒体に対して＞１０ｍｇ／ｍＬという優れた溶解性を維持する。化合物の親水／親油バランスに対するペンダントエステル基の作用を立証するため、選択した誘導体の分配をオクタノールとリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）との間で研究した（ｌｏｇ［ｃオクタノール／ｃＰＢＳ］＝ｌｏｇＤ、プロトン化可能なファルマコフォアの分布係数で表す）。実験は、以下のセクションに記載されているような錯体のアクア化および白金介在性のエステル加水分解を抑えるため、水ではなくｐＨ７．４のＰＢＳで行った。この構成はさらに、血漿中の条件を忠実に模倣するためｌｏｇＤのｐＨ依存性も考慮に入れている。非修飾親水性薬、１’では、−０．９８（±０．１９）のｌｏｇＤが測定された。対照的に、最も親油性が大きいと思われる誘導体、化合物８（ｎ＝３、バルプロ酸エステル、Ｌ＝ｐｎ）は、オクタノール相に優先的に分配され、ｌｏｇＤは０．７３（±０．０６）であり、化合物１’と比較して親油性の５０倍増加を反映している。化合物７（ｎ＝３、Ｌ＝ｅｎ、酪酸エステル）では−０．３１（±０．０６）という中間のｌｏｇＤが測定された。しかしながら、この化合物で得られたｌｏｇＤ値は、実験の条件下での不可避な部分エステル加水分解のため（＜１０％、以下のセクションを参照）、慎重に解釈しなければならない。
【００７９】
金属補助によるエステル加水分解。プロドラッグとしての化合物２〜８の活性化について提案した機構の１つは、白金促進によるエステル開裂を含む。循環中の血清と標的細胞に取り込まれた後の血清との間に存在するクロリドイオンの濃度差を模倣するため、化合物をそれぞれＰＢＳ（約１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）およびリン酸塩緩衝液（ＰＢ、ｐＨ７．４）中、３７℃でインキュベートした。反応混合物は、インライン高速液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレー質量分析法（ＬＣ−ＥＳＭＳ）により適切な時点で解析した。反応生成物は、ポジティブイオンモードで記録した質量スペクトルで１＋または２＋の電荷を持つ分子イオンとして同定され、アクリジン特異的波長のＵＶ−可視ＨＰＬＣ追跡の積分により定量した。
【００８０】
ヒドロキシル修飾白金−アクリジンおよび酪酸／バルプロ酸を与えるエステル加水分解の経時変化を、両方の媒体について図１にまとめてある。一般に、白金とエステル部分を結合する共通のスペーサー（ｎ）により特徴付けを行ったアナログのセットでは、バルプロ酸エステルは、酪酸エステルより著しく遅い変換を示すか、あるいは全く変換を示さない（３〜５対２、および６、８対７）。クロリドの非存在下でのリン酸緩衝溶液では（図１Ａ）、最も大規模な加水分解は、酪酸エステルベースの化合物２（ｎ＝１）および７（ｎ＝３）で観察され、前者は、３６時間の連続インキュベーション後に約２倍高いレベルの開裂生成物を与えた。加水分解活性は、バルプロ酸エステル誘導体３、４および５（すべてｎ＝１）でも観察されるが、かなり遅い速度で観察される。最も際立つのは、同じ第二級アシル部分を含むが、伸長リンカー（ｎ＝３）上に含むハイブリッド６および８が、これらの条件下で開裂に対して完全な抵抗性があることである。生理的クロリドを追加した緩衝液中でインキュベーションが行われた場合、クロリドを含まない媒体中の反応と比較して、エステル加水分解の最大７５％の大きな減少が観察され（図１Ｂ）、白金部分の（可逆的）アクア化が開裂機構において役割を担っているという考えと整合する。
【００８１】
化合物２〜５のＬＣ−ＥＳＭＳプロファイルは、共通の特徴を持ち、白金介在性のエステル開裂について提案した機構を支持する。化合物２を選択して、１Ｈ  ＮＭＲ分光法による反応速度論的研究（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｙ）および詳細な考察を行った。ＰＢ中の化合物２のインキュベーションで形成された唯一の加水分解生成物は、クロロ脱離基が、開裂した酪酸エステルの保護されていないヒドロキシル酸素で置換されているキレートとして同定された（図２Ａに「ａ」と表記したピーク、および図２Ｄ／Ｅの対応する質量スペクトル／構造をそれぞれ参照）。少量の化学的に変化してない化合物２、およびリン酸塩を含む未変化のエステルによるクロリドの置換により生じる生成物も、インキュベーションの３６時間後に観察された（ピークｂおよびｃ）。化合物２がＰＢＳ中の塩化ナトリウムの存在下でインキュベートされたときも、同じ一連の生成物が観察されたが、エステル開裂およびキレート形成は、各種の相対存在量に基づき著しく抑えられた（図２Ｂ）。この高クロリド環境において開環キレート体が存在しないことから、５員アミジン−Ｎ／ヒドロキシル−Ｏキレートの不活性が証明される。これは、この生成物が全く反応しない、生物学的窒素および硫黄モデル求核剤とのインキュベーションでも確認された（データ示さず）。化合物２〜５（ｎ＝１）と異なり、化合物７（ｎ＝３）は、ダングリング（ｄａｎｇｌｉｎｇ）ヒドロキシル基を含む加水分解生成物をもっぱら形成することから、安定性が低下すると思われる７員キレートの形成は不都合であることが示唆される。エステル加水分解の反応速度に対するクロリドイオンの劇的な作用は、化合物２のアレイ化１Ｈ  ＮＭＲ実験で確認された。酪酸エステルの開裂は、それぞれ５時間および１６時間の半減期に相当する速度定数をＰＢ中、ｋ＝３．９×１０−５ｓ−１およびＰＢＳ中、ｋ＝１．２×１０−５ｓ−１とする（擬）一次速度式に従う（図３）。したがって、クロリドは、錯体２のペンダントエステルの開裂を約７０％遅らせる。上記の生成物解析に基づき、白金介在性の分子内エステル開裂の機構が提案される（スキーム２）。
【００８２】
開裂は、白金錯体の（可逆的）アクア化が引き金となる。ルイス酸性金属は、アシル炭素に求核攻撃を行ってエステル結合の開裂を促進するヒドロキソ配位子へのアクアの脱プロトン化を補助する。開裂の結果、カルボン酸としてのアシル保護基がはずれ、ダングリング（ｄａｎｇｌｉｎｇ）またはキレート化したアルコール／アルコキシド部分が生じる。クロリド濃度が高いとアクア化反応がクロロ置換ハイブリッドに移行し、エステル開裂を抑制する。白金関連水酸化物による分子内攻撃は、以下の観察結果によっても支持される：（ｉ）エステルの加水分解は、アンミン（ＮＨ３）非脱離基を有する錯体４では、ｅｎ−置換アナログ３より約２倍効率的である。この作用は、Ｐｔ−アンミン錯体ではＰｔ−ｅｎ錯体よりアクア配位子のｐＫａ値が低いため、より反応性が高いヒドロキソ配位子がより高濃度になることと整合する。（ｉｉ）同じアシル部分を含む誘導体では、エステル開裂は、ｎ＝３ではｎ＝１に対して劇的に減少する。この作用は、前者の化合物のヒドロキソ配位子による内部の求核攻撃には、熱力学的に不利な９員の大環状中間体の形成が必要とされることで合理的に説明することができる。
【００８３】
【化９】
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スキーム２。化学的および酵素的エステル開裂について提案される機構
ヒトカルボキシルエステラーゼ−２（ｈＣＥＳ−２）によるエステル開裂。化合物２〜８が薬理学的に妥当なプロドラッグ変換酵素による脱エステル化に対して感受性であるかどうかを判定するため、組換えヒトカルボキシエステラーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒｓｅ）−２（ｈＣＥＳ−２）とのインキュベーションを行った。使用した特に操作された形態のこのタンパク質は、長い反応時間（＞３０分）にわたり酵素活性を発揮するのに十分な耐久性があり、ゆっくりと代謝される非古典的基質の開裂生成物の同定を可能にする。反応は、非酵素的加水分解を抑えるためクロリドを追加した緩衝液中で行い、経時的な酵素活性の消失および化学的加水分解の作用を最小限に抑えるため比較的短時間モニターした。後者の経路からの不可避な関与は、可能であれば、図１Ｃに示したデータから差し引いてある。反応混合物のＬＣ−ＥＳＭＳ解析から、短いスペーサー（ｎ＝１）を含む化合物２および化合物３〜５のエステルの酵素介在性開裂がそれぞれ、ごくわずか、あるいは全くないことが示される。対照的に、誘導体６〜８（ｎ＝３）は、これらの条件下でゆっくりとした脱エステル化が起こり、収率は１０時間時点で約２０％である。特に、化学的加水分解に対して完全な抵抗性がある化合物６および８の嵩高いバルプロ酸エステルは、本酵素により効率的に開裂される。酵素とのインキュベーションの１０時間後の化合物２について記録したＨＰＬＣ追跡（図２Ｃ）は、ＰＢおよびＰＢＳ中で形成された同じ反応生成物だけでなく、化学的加水分解で観察されなかった追加のピーク（ｄ、約５％）を示す。ポジティブイオン質量スペクトルでは、この生成物がダングリング（ｄａｎｇｌｉｎｇ）ヒドロキシル基（図２Ｄ、Ｅ）を含む白金−クロロ錯体として明確に同定され、非金属介在性の開裂と整合する。
【００８４】
ｎ＝１の誘導体の化学的加水分解で開環キレートが検出されず、５員Ｎ，Ｏキレートのみが検出されたことは、前者が酵素特異的生成物でなければならないという証拠と見なすことができる。キレート化アミノアルコラト配位子を含むシスプラチン誘導体に関する以前の研究から、その形成には、アルコールを脱プロトン化しやすくする塩基性条件が必要とされる一方、そうしたキレートの開環は酸性条件下でのみ起こることが立証されている。これは、これら２つの形態（ピークａおよびｄ、図２Ｃ）が本アッセイの条件および時間スケールで互いに交換されないという観察と一致する。最後に、ダングリング（ｄａｎｇｌｉｎｇ）ヒドロキシル形態のハイブリッド薬が生じる二重開裂反応性を示す酪酸エステル誘導体７と異なり、バルプロ酸エステル誘導体６および８は、対応する脱エステル化形態を生じる酵素介在性の開裂のみが起こる（図４に化合物８について示す）。伸長リンカー上に導入されたエステルのみがｈＣＥＳ−２の有効な基質であり、かつ化学的に頑強なバルプロ酸エステルのみが酵素的開裂に対する真の選択性を与えると結論することができる。
【００８５】
細胞毒性研究。新たに生成した化合物２〜８の細胞殺傷特性を、比色細胞増殖アッセイを用いて評価し、原型１’（クロリド塩）のそれと比較した。（注記：本アッセイのスクリーニングのため２〜８の脱エステル化された、提案した活性ヒドロキシル形態を純粋な形で合成する試みは、白金−ニトリル前駆体錯体の化学的不安定性により、うまくいかなかった。）２種のＮＳＣＬＣ腺癌細胞株、すなわち白金−アクリジンを用いた処理によく反応するＡ５４９、およびＤＮＡ修復に巧みで高い化学療法抵抗性の本癌の形態であるＮＣＩ−Ｈ１４３５を、化学療法感受性についてスクリーニングした。後者の細胞株はまた、Ａ５４９および他の肺腺癌より著しく高レベル（＞３倍）のｈＣＥＳ−２酵素を発現することも示されている。よって、２種の細胞株で観察された細胞毒性レベルはさらに、潜在的な細胞内プロドラッグ活性化に関するヒントを与える可能性がある。化合物１’で確立された相対的な化学療法感受性に基づき選択した３つの濃度で、両方の細胞株にハイブリッド薬を７２時間投薬した。Ａ５４９は、５．０ｎＭ、５０ｎＭおよび５００ｎＭで投薬した一方、ＮＣＩ−Ｈ１４３５では、この細胞株で観察された相対的により高い抵抗性を考慮して２０倍高い濃度、０．１μＭ、１．０μＭおよび１０μＭを選択した。化学療法感受性のスクリーニングから得られた用量反応データを図５に示す。
【００８６】
一般的な傾向として、エステル修飾誘導体は、非修飾ハイブリッド１’と比較して細胞毒性レベルの低下を示す。ただし、両方の細胞株において原型の細胞毒性レベルと同様の反応を示す化合物７を除く。このブチレート保護誘導体は、細胞培養アッセイに関連する時間スケールで化学的および酵素的の両方で効率的に開裂するため（前のセクションを参照）、この薬のヒドロキシル形態が細胞殺傷の主要な寄与因子であることが提案される。さらに、１’のＥｔ残基に代わる脱エステル化７のｎ−Ｐｒ３−ＯＨ残基は、ファルマコフォアの効力を損なわず、おそらくＤＮＡ付加体レベルで類似の機構を示すであろうことも示唆される。対照的に、バルプロ酸エステルを含む誘導体は、活性の大きな低下を示す。たとえば、化合物７と同じ活性なヒドロキシル形態を生成すると考えられる化合物６、および化合物８は、Ａ５４９では最も高い用量でも細胞殺傷を示さず、ＮＣＩ−Ｈ１４３５では活性の著しい低下を示す。この観察結果は、それらの未変化の形態で、おそらく核内ＤＮＡに十分に高レベルの付加体を生じさせることができないことが原因で細胞傷害性がより低い嵩高い方のバルプロ酸エステル６および８が、細胞内開裂の効率がよくないことと一致する。同じ傾向は、化学的および酵素的加水分解に対して比較的抵抗性を示すことが立証された化合物３〜５でも観察される。同じリンカーおよびエステル部分を共有する化合物では、非脱離基の性質の活性に対する作用は、ごくわずかあるいは全くなかった。最後に、そのブチレートエステルがクロリド除去媒体中で非常に効率的に開裂する化合物２（前のセクションを参照）は、原型より低い活性を示した。この結果は、このプロセスで生成される５員キレートの置換不活性のため、予想された。
【００８７】
ｈＣＥＳ−２により開裂する化合物２、６および８は、化合物１’に比較してＡ５４９（低ｈＣＥＳ−２）よりＮＣＩ−Ｈ１４３５（高ｈＣＥＳ−２）で活性のより顕著な増強を示すようである。化合物７の場合は逆のようである。これら２種の細胞株において予想した開裂機構と細胞毒性との間に関係が存在し得るかどうかを評価するため、選択性インデックスＳを、プロドラッグ感受性の指標として定義した：Ｓ＝［ＣＶｉ、ＮＣＩ−Ｈ１４３５／ＣＶ１’、ＮＣＩ−Ｈ１４３５］／［ＣＶｉ、Ａ５４９／ＣＶ１’、Ａ５４９］、式中、ＣＶｉおよびＣＶ１’はそれぞれ、エステルベースの化合物および化合物１’の、それらの最高用量での生存率である。ＣＶ１’は、２種の細胞株間の化学療法感受性における差を標準化するために導入した。ＣＶ１’が活性化エステルプロドラッグのいずれかで達成され得る最も高い細胞殺傷であると想定した場合、Ｓ値が「１」より小さいと、所定の誘導体のＮＣＩ−Ｈ１４３５における相対的な優位性が示されると考えられ、その逆も同様である。化合物２、６、７および８ではそれぞれ、０．４、０．６、１．４および０．５のＳ値が算出された。化学的に開裂しない（６、８）または不活性と思われるキレートに変換される（２）けれども、ｈＣＥＳ−２介在性の開裂を示すプロドラッグは、ＮＣＩ−Ｈ１４３５において相対的により良い効果を現すと結論され得る。逆に、酵素非依存性経路を介してその活性型に変換し得る化合物７は、Ａ５４９において相対的な優位性を有するようである。これらの知見から、高レベルのｈＣＥＳ−２がプロドラッグ活性化を促進し、化学的に不活性なエステルに、ＮＣＩ−Ｈ１４３５細胞に対する感受性を与えることが示され得る。しかしながら、２つの異なる細胞株間のプロドラッグ反応の直接的な比較は、慎重に解釈されなければならない点に留意されたい。数ある要因の中でも細胞の取り込みおよび排出も、細胞傷害性反応において観察された差に寄与し得るため、同じタイプのｈＣＥＳ−２ノックダウンまたはｈＣＥＳ−２トランスフェクト細胞における追加の実験が必要である。
【００８８】
化合物７および８は、それらの物理化学的特性、化学的反応性、それらのｈＣＥＳ−２基質として働く能力、および細胞株におけるそれらの性能に基づき、将来のＰＫおよび有効性研究にとってヒット（ｈｉｔ）と見なされる。伸長リンカー上に酪酸エステルまたはバルプロ酸エステルを含む誘導体はどちらも、ｈＣＥＳ−２によるゆっくりとした開裂の有望なプロドラッグ候補である。化合物７は、二重のプロドラッグ開裂様式を備える可能性を秘めており、この場合、化学的活性化が、血漿中の親油性プロドラッグの循環を延長し、その後細胞内加水分解を加速することを必要とする用途に必須であり得る。対照的に、親油性が高く化学的反応性の低い方のアナログ８は、循環中に一層長い半減期を達成するはずであるが、肝臓（抗癌プロドラッグイリノテカンと同様に）または腫瘍組織に発現する標的酵素による活性化を必要とすると考えられる。酪酸エステルおよびバルプロ酸エステルが他の遍在する血清エステラーゼによる加水分解を起こしやすいかどうかは、今後の検討が必要である。この目的のため、ヒト血清のモデルとして一般に用いられるウシ胎仔血清（ＦＢＳ、サーモ・サイエンティフィック・ハイクローン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＨｙＣｌｏｎｅ））と２〜８のインキュベーションを行ったところ、そうした望ましくない反応性に関する情報を得られなかった。これは、本アッセイにおけるタンパク質画分への白金の不可逆的結合による（データ報告せず）。
【００８９】
白金−アクリジンの嵩高いプロドラッグのもう１つの潜在的な利点は、その乏しいＤＮＡ結合特性であり得る。エステル開裂が主に腫瘍組織の細胞内で起こる場合、エステル保護した（不活性）ヒドロキソ（活性）形態のハイブリッド薬による特異的な（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）ＤＮＡ認識により、正常な細胞を回避する一方、プロドラッグの癌細胞に対する選択性が付与される。親油性プロドラッグは、向上したＡＤＭＥプロファイルに加えて、さらに薬剤安全性を向上させるという潜在的な利点も有する。１  この仮説がプロドラッグ設計に適用されるかどうかを試験するため、Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスで化学的に頑強な誘導体８を用いて用量漸増試験を行った。マウスはこのアナログに忍容性があり、１．６ｍｇ／ｋｇの用量で５日間連続して１日１回（ｑｄ×５）腹腔内に（ｉ．ｐ．）注射したところ、毒性および体重減少の徴候を示さなかった。比較のため、化合物１’は著しく毒性が大きくなり、同じ投与スケジュールを適用したところ０．１ｍｇ／ｋｇのＭＴＤを示した。
【００９０】
よって、本発明の一実施形態では、強力な白金−アクリジンの薬理学的パラメーターを調整するための多用途プラットフォームが発見された。本発明は、金属ベースのファルマコフォアが酵素的プロドラッグ活性化という古典的なコンセプトに適合することを立証する。これらの特徴は、より好ましいＡＤＭＥおよび安全性の向上につながる可能性がある。
【実施例】
【００９１】
材料、一般的な手順および器具。試薬はすべて、他に記載がない限り、さらに精製することなく商業的供給源から入手したまま使用した。化合物１’５（クロリド塩）およびＮ−（アクリジン−９−イル）−Ｎ’−メチルエタン−１，２−ジアミン（１３）は、公表された手順に従い調製した。白金−ニトリル前駆体（１２ａ〜ｇ）は、対応するニトリル（１１ａ〜ｄ）および銀イオン活性化ジア（ン）ミンジクロロ白金（ＩＩ）錯体から合成した。
【００９２】
標的化合物および中間体の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｄｖａｎｃｅ  ＤＲＸ−５００および３００ＭＨｚ機器で記録した。プロトン−デカップリング１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、１２５．８ＭＨｚで運転するＢｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ−５００機器で記録した。２Ｄ  １Ｈ−１３Ｃグラジエント選択異核種多重結合相関（ｇｓＨＭＢＣ：ｇｒａｄｉｅｎｔ−ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｂｏｎｄ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）実験および温度依存スペクトルは、ＴＢＩプローブおよび温度可変ユニットを備えたＢｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ−５００機器で取得した。２Ｄ  ＨＭＢＣスペクトルは、ｔ２中の２０４８ｐｔｓ（ｓｗ＝６５１０Ｈｚ）、ｔ１中の２５６ｐｔｓ（ｓｗ＝２７６７０Ｈｚ）、ｔ１増分（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔ）毎に１２８スキャン、および１．５秒の待ち時間（ｒｅｃｙｃｌｅ  ｄｅｌａｙ）（ｄ１）で収集した。化学シフト（δ）は、内部標準テトラメチルシラン（ＴＭＳ）に対する百万分率（ｐｐｍ）単位で示す。１Ｈ  ＮＭＲデータは、化学シフト（δ、ｐｐｍ）、多重度（ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｑ＝四重線、ｍ＝多重線、ｂｒ＝幅広）、結合定数（Ｈｚ）、およびシグナル積分値を含む通常の形態で報告する。１３Ｃ  ＮＭＲデータは、化学シフトリスト（δ、ｐｐｍ）として報告する。ＮＭＲスペクトルは、ＭｅｓｔＲｅＮｏｖａソフトウェアパッケージを用いて処理および解析した。
【００９３】
すべてのＨＰＬＣおよび質量分析法の実験でＨＰＬＣグレードの溶媒を使用した。ＬＣ−ＥＳＭＳ解析は、大気圧エレクトロスプレーイオン化源を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００ＬＣ／ＭＳＤイオントラップ質量分析計で行った。溶離液の噴霧は、５０ｐｓｉのＮ２圧力で達成し、溶媒蒸発は、Ｎ２乾燥ガス（３５０℃）の流れで補助した。ポジティブイオン質量スペクトルは、２８００Ｖのキャピラリー電圧および１５０〜２２００ｍ／ｚの質量対電荷比のスキャン範囲を用いて記録した。標的化合物の純度を確認するため、サンプルを、０．１％ギ酸を含むメタノールで希釈し、以下の溶媒系：溶媒Ａ、最適な水および溶媒Ｂ、メタノール／０．１％ギ酸を、０．５ｍＬ／分の流速および９５％Ａから５％Ａまで３０分のグラジエントで使用することにより、２５℃の４．６ｍｍ×１５０ｍｍの逆相Ａｇｉｌｅｎｔ  ＺＯＲＢＡＸ  ＳＢ−Ｃ１８（５μｍ）分析カラムを用いて分離した。ＨＰＬＣ追跡は、３６３〜４６３ｎｍのモニタリング波長範囲で記録した。ピークの積分は、ＬＣ／ＭＳＤ  Ｔｒａｐ  Ｃｏｎｔｒｏｌ４．０データ解析ソフトウェアを用いて行った。こうして分析および生物学的実験の前にすべての標的化合物について９５％を超える分析純度が確認された。
【００９４】
［ＰｔＣｌ（ｅｎ）Ｃ２２Ｈ２７Ｎ４Ｏ２］（ＮＯ３）２（２）の合成。前駆体錯体１２ａ（２４０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を１０ｍＬの無水ＤＭＦに溶解させ、この溶液を−２０℃まで冷却した。溶液にアクリジン−アミン１３（１３８ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を加え、懸濁物を４℃で２４時間撹拌した。この反応混合物を２００ｍＬの無水エチルエーテルに滴下して加え、得られた黄色のスラリーを３０分間撹拌した。沈殿物を膜濾過により回収し、一晩真空中で乾燥させ、１当量のＨＮＯ３を含む２０ｍＬのメタノールに溶解させた。回転蒸発による溶媒の除去後、粗生成物を高温のエタノールから再結晶して、２をＥおよびＺ異性体の３：１混合物として得た。収量：２３８ｍｇ（７１％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）δ  ８．６１−８．５１（ｍ，２Ｈ），８．１３−７．７５（ｍ，４Ｈ），７．７５−７．４５（ｍ，２Ｈ），６．５７−６．８７（ｍ，１Ｈ），５．５０（ｓ，１．５Ｈ，Ｅ−異性体），５．４９−５．３９（ｍ，４Ｈ），４．７６（ｓ，０．５Ｈ，Ｚ−異性体），４．５９（ｍ，０．５Ｈ，Ｚ−異性体），４．４５（ｔ，Ｊ＝６．３  Ｈｚ，１．５Ｈ，Ｅ−異性体），４．０２（ｔ，Ｊ＝６．３  Ｈｚ，１．５Ｈ，Ｅ−異性体），３．５６−３．３９（ｍ，０．５Ｈ，Ｚ−異性体），３．１４（ｓ，２．２５Ｈ，Ｅ−異性体），２．６１  −２．５７（ｍ，４Ｈ），２．３８−２．０６（ｍ，２Ｈ），１．７６−１．４０（ｍ，２Ｈ），１．０２−０．７５（ｍ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）δ  １７２．５０，１７１．７６，１６５．１４，１６３．３８，１５８．４８，１３９．８７，１３５．２１，１２４．９９，１２４．０２，１１８．２８，１１２．６３，６３．５５，６１．８７，３５．０３，１７．６９，１２．４３。ＭＳ（ＥＳＩ，ポジティブイオンモード）：ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ２４Ｈ３５ＣｌＮ６Ｏ２Ｐｔ（［Ｍ］＋），６６９．２２；ｆｏｕｎｄ，６６９．３。
【００９５】
［ＰｔＣｌ（ｅｎ）Ｃ２６Ｈ３５Ｎ４Ｏ２］（ＮＯ３）２（３）の合成。化合物３を、２について記載した手順に従い、前駆体１２ｂから調製し、収率は６９％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）δ  ８．８２−８．４０（ｍ，２Ｈ），８．１１−７．７８（ｍ，４Ｈ），７．７７−７．５０（ｍ，２Ｈ），５．５２（ｓ，１．５Ｈ，Ｅ−異性体），５．４２  −５．１３（ｍ，４Ｈ），４．６４−４．５４（ｍ，０．５Ｈ，Ｚ−異性体），４．４８（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１．５Ｈ，Ｅ−異性体），４．０３（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ，Ｅ−異性体），３．１５（ｓ，３Ｈ），２．７５  −２．４７（ｍ，４Ｈ），２．４４−２．１１（ｍ，１Ｈ），１．５４−１．１３（ｍ，８Ｈ），０．９７−０．７１（ｍ，６Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）δ  １７６．６５，１７６．０１，１６７．３０，１６４．８５，１５９．９０，１４１．３８，１３６．７７，１２６．４９，１２５．６１，１１９．８８，１１４．１２，６６．９０，６５．２７，４９．８７，４８．１６，３５．４８，２１．５８，１５．４５，１４．３１。ＭＳ（ＥＳＩ，ポジティブイオンモード）：ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ２８Ｈ４３ＣｌＮ６Ｏ２Ｐｔ（［Ｍ−Ｈ］＋），７２４．２８；ｆｏｕｎｄ，７２４．４。
【００９６】
［ＰｔＣｌ（ＮＨ３）２Ｃ２６Ｈ３５Ｎ４Ｏ２］（ＮＯ３）２（４）の合成。化合物４を、２について記載した手順に従い、前駆体１２ｃから調製し、収率は７４％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）δ  ８．５６（ｄ，Ｊ＝８．７，２Ｈ），８．０３（ｄｄｔ，Ｊ＝９．２，５．８，１．８Ｈｚ，２Ｈ），７．９５−７．７９（ｍ，２Ｈ），７．７５−７．５１（ｍ，２Ｈ），５．５６（ｓ，１．５Ｈ，Ｅ−異性体），４．６７−４．５４（ｓ，０．５Ｈ，Ｚ−異性体），４．４８（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１．５Ｈ，Ｅ−異性体），４．１８（ｂｓ，３Ｈ），４．０２（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１．５Ｈ），３．９３（ｂｓ，３Ｈ），３．１４（ｓ，３Ｈ），２．３６−２．１６（ｍ，１Ｈ），１．５６−１．０３（ｍ，８Ｈ），０．９０−０．６８（ｍ，６Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）δ  １７６．６７，１７６．０７，１６４．７４，１５９．８９，１４１．３９，１３６．７６，１３６．７６，１２６．７７，１２５．６０，１１９．８８，１１４．２０，６５．３２，４６．３３，４６．１４，３５．４９，２１．５８，１４．２９。ＭＳ（ＥＳＩ，ポジティブイオンモード）：ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ２６Ｈ４１ＣｌＮ６Ｏ２Ｐｔ（［Ｍ］＋），６９９．２６；ｆｏｕｎｄ，６９９．３。
【００９７】
［ＰｔＣｌ（ｐｎ）Ｃ２６Ｈ３５Ｎ４Ｏ２］（ＮＯ３）２（５）の合成。化合物５を、２について記載した手順に従い、前駆体１２ｄから調製し、収率は７７％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）δ  ８．６１（ｄｄ，Ｊ＝２０．８，８．５Ｈｚ，２Ｈ），８．１４−７．９５（ｍ，２Ｈ），７．８７（ｄｄ，Ｊ＝９．０，４．２Ｈｚ，２Ｈ），７．７５−７．５３（ｍ，２Ｈ），６．８３−６．７３（ｍ，１Ｈ），５．５３（ｓ，１．５Ｈ，Ｅ−異性体），５．２９−４．８８（ｍ，４Ｈ），４．６８−４．５８（ｍ，０．５Ｈ，Ｚ−異性体），４．５５（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１．５Ｈ，Ｅ−異性体），４．０３（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１．５Ｈ，Ｅ−異性体），３．６８−３．４４（ｍ，０．５Ｈ，Ｚ−異性体），３．１５（ｓ，２Ｈ），２．９５−２．５２（ｍ，４Ｈ），２．４１−２．０７（ｍ，１Ｈ），１．９２−１．６９（ｍ，２Ｈ），１．５９−０．９８（ｍ，８Ｈ），０．９８−０．６４（ｍ，６Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）δ  １７６．６８，１７６．２２，１６４．８９，１５９．９０，１４１．４１，１３６．７６，１２６．５６，１２５．６０，１１９．８８，１１９．８８，１１３．４８，４９．８６，４６．２９，４４．４２，４３．６３，４３．５５，３５．５４，２９．３９，２１．６０，１４．３１。ＭＳ（ＥＳＩ，ポジティブイオンモード）：ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ２９Ｈ４５ＣｌＮ６Ｏ２Ｐｔ（［Ｍ］＋），７３９．２９；ｆｏｕｎｄ，７３９．４。
【００９８】
［ＰｔＣｌ（ｅｎ）Ｃ２８Ｈ３９Ｎ４Ｏ２］（ＮＯ３）２（６）の合成。化合物６を、２について記載した手順に従い、前駆体１２ｅから調製し、収率は８３％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）δ  ８．４６（ｄｄ，Ｊ＝２０．８，８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．９１（ｍ，２Ｈ），７．７７（ｄｄ，Ｊ＝９．０，４．２Ｈｚ，２Ｈ），７。５４（ｍ，２Ｈ），６．０８（ｓ，１Ｈ），５．３６−５．１１（ｍ，４Ｈ），４．３３（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），４．０３（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．８８（ｍ，２Ｈ），３．０３（ｓ，３Ｈ），２．９７（ｍ，２Ｈ），２．５５−２．３７（ｍ，４Ｈ），２．１０−２．０３（ｍ，３Ｈ），１．５９−０．９８（ｍ，８Ｈ），０．９８−０．６４（ｍ，６Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）δ  １７８．０８，１７０．０２，１５９．９８，１４１．３７，１３６．７１，１２６．５２，１２５．５３，１１９．８５，１１４．１０，６４．８３，４６．５３，３５．８１，２９．３９，２７．１５，２１．６７，１４．３４。ＭＳ（ＥＳＩ，ポジティブイオンモード）：ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ３０Ｈ４７ＣｌＮ６Ｏ２Ｐｔ（［Ｍ］＋），７５２．３１；ｆｏｕｎｄ，７５２．４。
【００９９】
［ＰｔＣｌ（ｅｎ）Ｃ２４Ｈ３１Ｎ４Ｏ２］（ＮＯ３）２（７）の合成。化合物７を、２について記載した手順に従い、前駆体１２ｆから調製し、収率は８９％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）δ  ８．７２−８．４６（ｍ，２Ｈ），８．０１（ｄｄｄ，Ｊ＝８．１，６．９，１．０Ｈｚ，３Ｈ），７．９２−７．８０（ｍ，３Ｈ），７．６４（ｄｄｄ，Ｊ＝８．３，６．９，１．２Ｈｚ，２Ｈ），６．１６（ｓ，１Ｈ），５．４４  −５．２２（ｍ，４Ｈ），４．４２（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），４．１８（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），３．９８（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），３．１２−３．０２（ｍ，５Ｈ），２．７４−２．４６（ｍ，４Ｈ），２．３４−１．９９（ｍ，４Ｈ），１．５８（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），０．９０（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）δ  １７５．３３，１７０．１１，１６０．０４，１４１．３８，１３６．６９，１２６．４３，１２５．５０，１１９．８７，１１４．１２，６４．７，３６．８４，３２．０７，２７．１０，１９．３７，１３．９４。ＭＳ（ＥＳＩ，ポジティブイオンモード）：ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ２６Ｈ３９ＣｌＮ６Ｏ２Ｐｔ（［Ｍ］＋），６９７．２５；ｆｏｕｎｄ，６９７．３。
【０１００】
［ＰｔＣｌ（ｐｎ）Ｃ２８Ｈ３９Ｎ４Ｏ２］（ＮＯ３）２（８）の合成。錯体８を、２について記載した手順に従い、前駆体１２ｇから調製し、収率は７６％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）δ  ８．５４（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），８．１０−７．７６（ｍ，４Ｈ），７．５９（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），４．４０（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），４．１７（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ），３．９７（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，３Ｈ），３．２１−２．９８（ｍ，５Ｈ），２．９４−２．５４（ｍ，４Ｈ），２．４０−１．９５（ｍ，３Ｈ），１．７９（ｓ，２Ｈ），１．５６−０．９９（ｍ，８Ｈ），０．９２−０．６８（ｍ，６Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）δ  １７８．０２，１６９．８７，１５９．８５，１４１．３３，１３６．６７，１２６．６１，１２５．５０，１１９．８７，１１４．１３，６４．８６，４６．５６，４４．３１，４３．６３，３５．８３，２９．２９，２６．７６，２１．６９，１４．３７。ＭＳ（ＥＳＩ，ポジティブイオンモード）：ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ３１Ｈ４９ＣｌＮ６Ｏ２Ｐｔ（［Ｍ］＋），７６７．３３；ｆｏｕｎｄ，７６７．４。
【０１０１】
以下の頭字語は、様々な試薬に使用される：ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド；ＤＣＭ：ジクロロメタン；ＭｅＯＨ：メタノール；ＴＥＡ：トリエチルアミン；およびＴＦＡ：トリフルオロ酢酸。
【０１０２】
スキームＳ．１は、様々な中間体をどのように製造したかに関する一般的な合成スキームを示す。
【化１０】
2018501187.tif 000013
【０１０３】
スキームＳ．１。前駆体Ｓ１〜Ｓ４の調製のための一般的な合成スキーム
１１ａの合成。８０ｍｌのアセトニトリル中の酪酸（１０．６ｇ、０．１２ｍｏｌ）、無水炭酸カリウム（２０．７ｇ、０．１５ｍｏｌ）およびヨウ化ナトリウム（２２．５ｇ、０．１５ｍｏｌ）の混合物に、５ｍｌのアセトニトリル中の２−クロロアセトニトリル（７．５ｇ、０．１ｍｏｌ）を室温で加えた。添加が終了したときに、混合物を１６時間還流した。次いでアセトニトリルを回転蒸発により除去し、残渣を１００ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に再溶解させ、１０％水性Ｋ２ＣＯ３およびブラインで洗浄した。有機層を集めて、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。この粗材料を真空中にて４５℃で一晩乾燥させて、未反応２−クロロアセトニトリルを除去し、１１．２ｇの１１ａを無色油として得た（収率：８８％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ４．７３（ｓ），２．４０（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．６８（ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ），０．９８（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １７１．９４，１１４．５８，４８．１２，３５．２２，１８．０９，１３．４６。
【０１０４】
１１ｂの合成。化合物１１ｂを、４−クロロブタンニトリルを前駆体として使用することにより１１ａについて記載した手順に従い調製し、収率は７４％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）δ  ４．１９（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．４７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．３１（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．０１（ｈ，Ｊ＝７．０，５．８Ｈｚ，２Ｈ），１．６６（ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），０．９６（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １７３．２７，１１８．９０，６１．８６，３５．８９，２４．８０，１８．２８，１４．２１，１３．５８。
【０１０５】
１１ｃの合成。化合物１１ｃを、バルプロ酸を前駆体として使用することにより１１ａについて記載した手順に従い調製し、収率は８４％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ  ４．６７（ｓ，２Ｈ），２．４３（ｍ，１Ｈ），１．４８（ｍ，４Ｈ），１．２４（ｍ，４Ｈ），０．８５（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，６Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １７４．８４，１１４．５５，４７．９６，４４．６９，３４．３２，２０．４９，１３．８４，０．９６。
【０１０６】
１１ｄの合成。化合物１１ｄを、４−クロロブタンニトリルおよびバルプロ酸を前駆体として使用することにより１１ａについて記載した手順に従い調製し、収率は６９％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ  ４．０９（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．３７（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），２．３０（ｍ，１Ｈ），１．９２（ｍ，２Ｈ），１．４０（ｍ，４Ｈ），１．１８（ｍ，４Ｈ），０．８１（ｍ，６Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １７６．１０，１１８．７７，６１．６６，４５．０９，３４．５０，２４．８４，２０．５６，１４．１３，１３．８８。
【０１０７】
【化１１】
2018501187.tif 000014
スキームＳ．２。前駆体１２ａ〜１２ｇの化学構造。
前駆体１２ａの合成。１０ｍＬの無水ＤＭＦ中の０．６５２ｇ（２．００ｍｍｏｌ）の［ＰｔＣｌ２（ｅｎ）］と０．３３８ｇ（２．００ｍｍｏｌ）のＡｇＮＯ３との混合物を室温にて暗所で１６時間撹拌した。沈殿したＡｇＣｌをセライトパッドで濾別し、濾液に１．７８ｇ（１４ｍｍｏｌ）の１１ａを加え、懸濁物を５５℃にて暗所で３時間撹拌した。この溶液を真空中にて３０℃で蒸発乾固し、黄色の残渣を得、これを２０ｍｌの乾燥メタノールに溶解させた。活性炭を加え、この溶液を１５分間撹拌した。炭素を濾別し、溶液を５ｍＬの最終容量まで濃縮し、これをさらに２００ｍＬの無水エチルエーテル沈殿させて２９７ｍｇ（収率：３２％）のオフホワイトの微結晶沈殿物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ  ５．９８−５．５８（ｍ，２Ｈ），５．２５（ｓ，２Ｈ），２．８６−２．３６（ｍ，５Ｈ），１．６４（ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），０．９２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲは、生成物の化学的不安定性のため取得しなかった。
【０１０８】
前駆体１２ｂの合成。前駆体１２ｂを、［ＰｔＣｌ２（ｅｎ）］および１１ｂを前駆体として使用することにより１２ａについて記載した手順に従い調製し、収率は３７％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ  ５．９５−５．４３（ｍ，２Ｈ），５．２２（ｓ，１Ｈ），２．７９−２．４２（ｍ，５Ｈ），１．６５−１．３９（ｍ，４Ｈ），１．２３（ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ），０．８３（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，６Ｈ）。
【０１０９】
前駆体１２ｃの合成。前駆体１２ｃを、［（ＮＨ３）２ＰｔＣｌ２］および１１ｂを前駆体として使用することにより１２ａについて記載した手順に従い調製し、収率は２９％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ  ４．７７（ｓ，２Ｈ），２．４６−２．３５（ｍ，１Ｈ），１．６２−１．３３（ｍ，４Ｈ），１．３２−１．１３（ｍ，４Ｈ），０．８２（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，６Ｈ）。
【０１１０】
前駆体１２ｄの合成。前駆体１２ｄを、［ＰｔＣｌ２（Ｐｎ）］および１１ｂを前駆体として使用することにより１２ａについて記載した手順に従い調製し、収率は３９％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ  ５．９５−５．４３（ｍ，２Ｈ），５．２２（ｓ，１Ｈ），２．８３−２．３８（ｍ，５Ｈ），１．７８  −１．６６（ｍ，２Ｈ），１．６５−１．３９（ｍ，４Ｈ），１．２３（ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ），０．８３（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，６Ｈ）。
【０１１１】
前駆体１２ｅの合成。前駆体１２ｅを、［ＰｔＣｌ２（ｅｎ）］および１１ｄを前駆体として使用することにより１２ａについて記載した手順に従い調製し、収率は８４％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ  ４．２１（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），３．０８（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），２．６９−２．４１（ｍ，５Ｈ），２．１９−２．０３（ｍ，２Ｈ），１．７２−１．３９（ｍ，４Ｈ），１．４２−１．２４（ｍ，４Ｈ），０．９４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ）。
【０１１２】
前駆体１２ｆの合成。前駆体１２ｆを、［ＰｔＣｌ２（ｅｎ）］および１１ｃを前駆体として使用することにより１２ａについて記載した手順に従い調製し、収率は８６％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ  ４．２１（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．０８（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．８２−２．４８（ｍ，２Ｈ），２．４２（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．１９−１．９９（ｍ，２Ｈ），１．６８（ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），０．９８（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ）。
【０１１３】
前駆体１２ｇの合成。前駆体１２ｇを、［ＰｔＣｌ２（ｐｎ）］および１１ｄを前駆体として使用することにより１２ａについて記載した手順に従い調製し、収率は８４％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ  ４．７６−３．９４（ｍ，２Ｈ），３．００−２．８７（ｍ，２Ｈ），２．８１−２．２７（ｍ，５Ｈ），２．００（ｐ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．７３（ｐ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，３Ｈ），１．６２−１．２８（ｍ，４Ｈ），１．２９−１．１６（ｍ，４Ｈ），０．８３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，８Ｈ）。
【０１１４】
化合物１’’’の合成。化合物１’’’を、以前に報告された手順に従い調製した［１］。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＦ−ｄ７）δ  １３．８９（ｓ，１Ｈ），９．８９（ｓ，１Ｈ），８．７７−８．６７（ｍ，２Ｈ），８．１９−７．９１（ｍ，４Ｈ），７．６６−７．５９（ｍ，２Ｈ），６．１９（ｓ，１Ｈ），５．３５−４．９８（ｍ，４Ｈ），４．５１（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），４．１２（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），３．４８−３．３７（ｍ，４Ｈ），３．１９（ｓ，３Ｈ），２．６９（ｓ，３Ｈ），１．８３（ｂｒｓ，２Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＦ−ｄ７）δ  １６６．５７，１５９．２６，１４０．８１，１３５．９２，１２６．４８，１２４．５２，１１９．６０，１１３．６７，６５．８７，４７．６２，４３．９５，４３．３２，２８．５９，２２．３３，１５．５０。
【０１１５】
経時的ＮＭＲ分光法。アレイ化実験のＮＭＲスペクトルは、三重共鳴広帯域インバースプローブおよび温度可変ユニットを備えたＢｒｕｋｅｒ  ５００  ＤＲＸスペクトロメーターにて３７℃で収集した。反応は、６００μＬの１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ＰＢ、Ｄ２Ｏ、ｐＨ＊＝７．０）あるいは６００μＬのリン酸塩緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ、Ｄ２Ｏ、ｐＨ＊＝７．０）に溶解させた２ｍＭ白金錯体を用いて行った。１Ｄ  １Ｈ反応速度実験は、可変遅延リストを用いて標準的なＢｒｕｋｅｒ  アレイ化２Ｄ実験として行った。各増分１Ｄスペクトルを同じ手順を用いて処理し、エステル部分の好適なシグナルを積算した。データは、ＭｅｓｔＲｅＮｏｖａ  ＮＭＲソフトウェアを用いて処理した。各時点での白金錯体の濃度は、相対ピーク強度から推定し、プロトン緩和の差を考慮して複数のシグナルにわたって平均して、Ｏｒｉｇｉｎ  ８．０（オリジンラボ（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ）、ノーサンプトン（Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ）、マサチューセッツ州）の一次指数減衰関数にフィッティングさせた。
【０１１６】
化学的加水分解アッセイ。化合物２〜８のエステル加水分解研究は、１ｍＭの各被検化合物を１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）または約１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１×ＰＢＳ中で３７℃にてインキュベートすることにより行った。様々な時点で反応混合物からサンプルを採取し、インラインＬＣ−ＥＳＭＳにより解析した。クロマトグラフ分離は、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ逆相Ａｇｉｌｅｎｔ  ＺＯＲＢＡＸ  ＳＢ−Ｃ１８（５μｍ）分析カラムを用い、カラム温度を２５℃に維持して行った。以下の溶媒系：溶媒Ａ、最適な水および溶媒Ｂ、メタノール／０．１％ギ酸を、０．５ｍＬ／分の流速および９５％Ａから５％Ａまで１５分のグラジエントで使用した。
【０１１７】
酵素的開裂アッセイ。組換えヒトカルボキシルエステラーゼ−２（ｒｈＣＥＳ−２）による化合物２〜８のエステル開裂を研究するため、３０μＭの各化合物を、１×ＰＢＳ中の４００μｇ／ｍＬのｈＣＥＳ−２（ＢＤバイオサイエンシズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、サンノゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）、カリフォルニア州、米国）と３７℃でインキュベートした。アリコートを様々な時点で採取し、等量のメタノールでクエンチし、１００００ｇで５分間遠心してタンパク質を変性させ、沈殿させた。上清を集めて、インラインＬＣ−ＥＳＭＳを用いて生成物の分離および解析に供した。クロマトグラフィーは、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ逆相Ａｇｉｌｅｎｔ  ＺＯＲＢＡＸ  ＳＢ−Ｃ１８（５μｍ）分析カラムでカラム温度を２５℃に維持して行った。以下の溶媒系：溶媒Ａ、最適な水および溶媒Ｂ、メタノール／０．１％ギ酸を、０．５ｍＬ／分の流速および９５％Ａから５％Ａまで１５分のグラジエントで使用した。
【０１１８】
分配係数（ｌｏｇＤ）の測定。オクタノール飽和水および水飽和オクタノールを得るため、１００ｍＬのＰＢＳを１００ｍＬのオクタノールと共に２４時間撹拌し、続いて５分間遠心分離した。白金錯体を０．１ｍＭの典型的な濃度になるように１．０ｍＬのオクタノール飽和ＰＢＳに溶解させ、次いで１．０ｍＬの水飽和オクタノールと混合した。３回ずつの各実験をマルチチューブ・ボルテクサー・インキュベーターで室温にて１６時間混合し、５分間遠心した。層を慎重に分離し、白金−アクリジンの含有量を４１３ｎｍで分光光度的に測定した（オクタノール飽和ＰＢＳ中のε４１３＝１０，０００Ｍ−１ｃｍ−１、およびＰＢＳ飽和オクタノール中のε４１３＝８，６００Ｍ−１ｃｍ−１を用いて）。次いでサンプルの分配係数（Ｄ）を、化合物のオクタノール中の濃度を水層中の濃度で除した商として決定した。報告したｌｏｇＤ値は、３回の測定の平均±標準偏差である。
【０１１９】
細胞培養の維持。ヒト非小細胞肺癌細胞株、ＮＣＩ−Ｈ１４３５およびＡ５４９（腺癌）は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーランド州、米国）から取得した。Ａ５４９細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１０％ｐｅｎｓｔｒｅｐ（ピイ・アンド・エス（Ｐ＆Ｓ））、１０％Ｌ−グルタミンおよび１．５ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３を追加したＨＡＭ’ｓ  Ｆ１２Ｋ培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））で培養した。ＮＣＩ−Ｈ１４３５細胞は、２．４３６ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、０．０２ｍｇ／ｍＬのインスリン、０．０１ｍｇ／ｍＬのトランスフェリン、２５ｎＭの亜セレン酸ナトリウム、５０ｎＭのヒドロコルチゾン、１ｎｇ／ｍＬの上皮増殖因子、０．０１ｍＭのエタノールアミン、０．０１ｍＭのホスホリルエタノールアミン、１００ｐＭのトリヨードチロニン、０．５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび追加の２ｍＭのＬ−グルタミン（最終濃度４．５ｍＭ）を含む無血清の１：１ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ギブコ）で培養した。細胞は、５％ＣＯ２を含む湿潤雰囲気で３７℃の一定の温度にてインキュベートし、ゆっくりと増殖するＮＣＩ−Ｈ１４３５を除き２〜３日毎に継代培養して細胞を対数増殖状態に保った。ＮＣＩ−Ｈ１４３５は、７日毎に継代培養した。
【０１２０】
細胞毒性アッセイ。細胞毒性研究は、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ  ９６  ａｑｕｅｏｕｓ  ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙキット（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マディソン、ウィスコンシン州）を用いて標準的なプロトコルに従って行った。１’〜８の原液（５〜１０ｍＭ）をＤＭＦ中で作製し、癌細胞とのインキュベーションの前に培地で段階希釈した。すべての薬剤および対照を、２枚のプレートに３ウェルずつ表記の濃度で試験した。インキュベーションを７２時間行い、薬剤処理したウェルを対照細胞と比較することにより細胞生存率を決定した。
【０１２１】
ライブラリー構築のためのマイクロスケールコンジュゲートの合成（注記：本手順はプレスクリーニングを目的として使用され、動物試験および臨床応用用のバッチの調製にスケールアップすることができる）。
カルボン酸修飾白金−（ベンズ）アクリジン（１０ｍＭ）の原液、カップリング試薬ＰｙＢＯＰ（１０ｍＭ）、アミド結合形成により連結されるアミン（１０ｍＭ）、およびヒューニッヒ塩基（１０ｍＭ）を無水ＤＭＦ中で調製する。カップリング反応は、すべての反応要素を、以下の量：白金−アクリジン（１０μＬ）、ＰｙＢＯＰ（１２μＬ）、ヒューニッヒ塩基（１０μＬ）、および選択したアミン（１５μＬ）を用いて混合することにより１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ中で行う。反応混合物を室温で１６時間インキュベートする。反応をクエンチするため、１ｍＬのジエチルエーテルを加え白金錯体を沈殿させ、遠心分離により白金錯体を集めて、０．５ｍＬのジクロロメタンで洗浄し、２０μＬのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）に再溶解させる。微量の未反応前駆体および副成物は、ジエチルエーテルまたはジクロロメタンに可溶であり、固体を洗浄して上清を捨てることにより除去することができる。コンジュゲートの特徴付けを行うため、および変換収率を決定するため、ＰＢＳ溶液から５μＬのサンプルを除去し、ＬＣ−ＥＳＭＳ解析の前に０．１％ギ酸を含む４００μＬのメタノールで希釈する。クロマトグラフ分離は、４．６ｍｍ×１５０ｍｍの逆相Ａｇｉｌｅｎｔ  ＺＯＲＢＡＸ  ＳＢ−Ｃ１８（５μｍ）分析カラムを用い、カラム温度を２５℃に維持して行う。二成分系移動相は、溶媒Ａ、最適な水および溶媒Ｂ、メタノール／０．１％ギ酸からなり、９５％Ａから５％Ａまで３０分のグラジエント、および０．５ｍＬ／分の流速で送達した。白金−アクリジンの変換の形成および程度は、ＬＣ／ＭＳＤ  Ｔｒａｐ  Ｃｏｎｔｒｏｌ４．０データ解析ソフトウェアを用いて、対応するクロマトグラムでモニターした。
【０１２２】
本発明の実施形態に使用してもよい他のカップリング剤として
ＣＤＩ：１，１’−カルボニルジイミダゾール
ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＨＡＴＵ：（１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム−３−オキシドヘキサフルオロホスフェート）
ＨＢＴＵ：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＣＯＭＵ：（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ−モルホリノ−カルベニウムヘキサフルオロホスフェート
ＰｙＢＯＰ：（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＴＳＴＵ：Ｏ−（Ｎ−スクシニミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
がある。
【０１２３】
癌細胞株におけるライブラリーのプレスクリーニング
反応混合物は、その抗癌活性を評価するためヒト癌細胞株で直接試験してもよい。簡単に説明すると、細胞を３７℃で一晩プレインキュベートし、次いで適切な濃度（たとえば、２００ｎＭ）の反応混合物（混合物の濃度は、分光光度的に容易に評価することができる（λｍａｘ＝４１３ｎｍ、ε＝１０，０００Ｍ−１ｃｍ−１））由来のコンジュゲート、および対照としての対応する前駆体モジュールで処理する。７２時間のインキュベーション期間後、２０μＬのＭＴＳ／ＰＭＳ溶液（またはＭＴＴ、使用する細胞増殖キットによる）を各ウェルに加え、３７℃で４時間インキュベートする。テトラゾリウム色素の吸光度を、プレートリーダーを用いて４９０ｎｍで測定する。生細胞分率は、未処理対照に対する割合として計算し、各化合物の３回のインキュベーションの平均±標準偏差として報告する。ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（グラフパッドソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）、ラホヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）、カリフォルニア州）のシグモイド用量反応式を用いた非線形曲線フィットから計算し、３回ずつ行った２つの個別の実験の平均である。
【０１２４】
一実施形態では、本発明は、
・  他の機能体との、エステル、アミドおよびカルバメートベースのコンジュゲートを生成するための（伸長）カルボン酸エステル修飾白金−（ベンズ）アクリジン薬の合成。モジュールとして、以下に限定されるものではないが、保護基、親油性修飾基、ミセル形成分子および脂質、分子標的治療剤、ホルモン治療剤、化学療法増感剤、ペプチドがある；
・  一般的なカップリング試薬（上記に示したリストを参照）を用いて行うことができるコンジュゲーション反応は、白金との適合性があり、副生成物なしで穏和な条件下、高収率が得られ；かつモジュールライブラリーの構築およびハイスループットスクリーニングに適している。
・  エステル結合は、循環中に十分に安定であり、かつヒトエステラーゼ（たとえば、ｈＣＥＳ−２）による開裂に抵抗し、未変化のコンジュゲートの腫瘍部位への送達を可能にするが、癌細胞内に移行したならば加水分解の加速が起こるように設計することができる。
・  複数の薬が、最適な細胞取り込みおよび細胞内局在に適したコンジュゲートの形態で共送達され得る。
・  細胞傷害性ペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）のより安全な送達、薬物動態の向上  細胞傷害性ペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）のより安全な送達、薬物動態の向上
に関する。
【０１２５】
本発明の化合物、組成物および方法に関連する任意の特徴は、一緒に考察されていなくても、他の任意の特徴と組み合わせてもよいことを意図しており、したがって本発明の範囲内であることを理解すべきである。ある範囲が提示される場合、その範囲内に包含されるすべての整数を新たな部分範囲の端点と考えていることを意図している。さらに、マーカッシュ群または代替の実施形態を列挙する場合、そのマーカッシュ群の構成要素のいずれかまたは代替の実施形態のいずれかを放棄してもよいことを意図しており、したがって本発明の範囲内であることも意図している。最後に、本発明の精神および範囲から逸脱しない若干の修飾を意図している。
【０１２６】
以下の参考文献は、それらの全体を援用する。
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１１．Ｐｒａｔｔ，Ｓ．Ｅ．；Ｄｕｒｌａｎｄ−Ｂｕｓｂｉｃｅ，Ｓ．；Ｓｈｅｐａｒｄ，Ｒ．Ｌ．；Ｈｅｉｎｚ−Ｔａｈｅｎｙ，Ｋ．；Ｉｖｅｒｓｅｎ，Ｐ．Ｗ．；Ｄａｎｔｚｉｇ，Ａ．Ｈ．Ｈｕｍａｎ  ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒａｓｅ−２  ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｏｆ  ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ（ＬＹ２３３４７３７）ａｎｄ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１３，１９，１１５９−１１６８．
１２．Ｇｒａｈａｍ，Ｌ．Ａ．；Ｓｕｒｙａｄｉ，Ｊ．；Ｗｅｓｔ，Ｔ．Ｋ．；Ｋｕｃｅｒａ，Ｇ．Ｌ．；Ｂｉｅｒｂａｃｈ，Ｕ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｑｕｅｏｕｓ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ｅｓｔｅｒ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐｌａｔｉｎｕｍ−ａｃｒｉｄｉｎｅ  ｈｙｂｒｉｄ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１２，５５，７８１７−７８２７．
１３．Ｉｍａｉ，Ｔ．；Ｔａｋｅｔａｎｉ，Ｍ．；Ｓｈｉｉ，Ｍ．；Ｈｏｓｏｋａｗａ，Ｍ．；Ｃｈｉｂａ，Ｋ．Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｓｏｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２００６，３４，１７３４−１７４１．
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１５．Ｎａｔｉｌｅ，Ｇ．；Ｉｎｔｉｎｉ，Ｆ．Ｐ．；Ｂｅｒｔａｎｉ，Ｒ．；Ｍｉｃｈｅｌｉｎ，Ｒ．Ａ．；Ｍｏｚｚｏｎ，Ｍ．；Ｓｂｏｖａｔａ，Ｓ．Ｍ．；Ｖｅｎｚｏ，Ａ．；Ｓｅｒａｇｌｉａ，Ｒ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｉｄｉｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｔｒａｎｓ−［ＰｔＣｌ（ＮＨ３）−｛ＨＮ＝Ｃ（ＮＨ２）Ｒ｝２］Ｃｌ（Ｒ＝Ｍｅ，Ｐｈ，ＣＨ２Ｐｈ）ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＨ３  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  ｎｉｔｒｉｌｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓ−［ＰｔＣｌ２（ＮＣＲ）２］．Ｊ．Ｏｒｇａｎｏｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．２００５，６９０，２１２１−２１２７．
１６．Ｍｉｃｈｅｌｉｎ，Ｒ．Ａ．；Ｓｇａｒｂｏｓｓａ，Ｐ．；Ｓｂｏｖａｔａ，Ｓ．Ｍ．；Ｇａｎｄｉｎ，Ｖ．；Ｍａｒｚａｎｏ，Ｃ．；Ｂｅｒｔａｎｉ，Ｒ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｌａｔｉｎｕｍ  ａｍｉｄｉｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ  ２０１１，６，１１７２−１１８３．
１７．Ｈｏｃｈｒｅｕｔｈｅｒ，Ｓ．；Ｐｕｃｈｔａ，Ｒ．；ｖａｎ  Ｅｌｄｉｋ，Ｒ．Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ａｎｄ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｎｏｖｅｌ  ｄｉｎｕｃｌｅａｒ  ｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ）ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｂｉｄｅｎｔａｔｅ  Ｎ，Ｎ−ｄｏｎｏｒ  ｌｉｇａｎｄｓ．Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１１，５０，８９８４−８９９６．
１８．Ｗａｎｇ，Ｊ．；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｅ．Ｔ．；Ｂｏｕｒｇｅａ，Ｊ．；Ｗｏｎｇ，Ｙ．Ｎ．；Ｐａｔｔｅｎ，Ｃ．Ｊ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒａｓｅｓ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｂｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒａｓｅ  ２．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２０１１，３９，１３２９−１３３３．
１９．Ｖａｌｉａｈｄｉ，Ｓ．Ｍ．；Ｅｇｇｅｒ，Ａ．Ｅ．；Ｍｉｋｌｏｓ，Ｗ．；Ｊｕｎｇｗｉｒｔｈ，Ｕ．；Ｍｅｅｌｉｃｈ，Ｋ．；Ｎｏｃｋ，Ｐ．；Ｂｅｒｇｅｒ，Ｗ．；Ｈａｒｔｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｇ．；Ｇａｌａｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｊａｋｕｐｅｃ，Ｍ．Ａ．；Ｋｅｐｐｌｅｒ，Ｂ．Ｋ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ＤＮＡ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｐＨ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ２−ａｍｉｎｏａｌｃｏｈｏｌａｔｏｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ）ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１３，１８，２４９−２６０．
２０．Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ａ．；Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．；Ｗａｒｎｅｒ，Ｋ．Ａ．；Ｅｌｋｈａｉｒｉ，Ｆ．；Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．；Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．ＡＢＣＣ５，ＥＲＣＣ２，ＸＰＡ  ａｎｄ  ＸＲＣＣ１  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ  ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００５，４，１８．
２１．Ｂａｒｔｈｅｌ，Ｂ．Ｌ．；Ｚｈａｎｇ，Ｚ．；Ｒｕｄｎｉｃｋｉ，Ｄ．Ｌ．；Ｃｏｌｄｒｅｎ，Ｃ．Ｄ．；Ｐｏｌｉｎｋｏｖｓｋｙ，Ｍ．；Ｓｕｎ，Ｈ．；Ｋｏｃｈ，Ｇ．Ｇ．；Ｃｈａｎ，Ｄ．Ｃ．；Ｋｏｃｈ，Ｔ．Ｈ．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａ  ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒａｓｅ  ２−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｏｆ  ｄｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｅ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００９，５２，７６７８−７６８８．
２２．Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｅ．Ｔ．；Ｂａｒｕａｈ，Ｈ．；Ｋｒａｍａｒｃｚｙｋ，Ｊ．；Ｓａｌｕｔａ，Ｇ．；Ｄａｙ，Ｃ．Ｓ．；Ｋｕｃｅｒａ，Ｇ．Ｌ．；Ｂｉｅｒｂａｃｈ，Ｕ．Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｎｏｎ−ｃｉｓｐｌａｔｉｎ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｔｉｎｕｍ−ａｃｒｉｄｉｎｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００１，４４，４４９２−４４９６．
２３．Ｚｈａｎｇ，Ｚ．；Ｈａｔｔａ，Ｈ．；Ｔａｎａｂｅ，Ｋ．；Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．Ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ５−ｆｌｕｏｒｏ−２’−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｕｍｏｒ−ｈｏｍｉｎｇ  ｃｙｃｌｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＣＮＧＲＣ  ｂｙ  ｅｓｔｅｒ  ｌｉｎｋｅｒｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ−ｃｅｌｌ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２００５，２２，３８１−３８９．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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