(57)【要約】本発明は、癌の分野に関連する。特に、癌細胞の免疫療法薬に対する感受性を高めるための方法および癌治療の有効性を評価するための方法に関連する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
CaSRを発現する癌を持つ被験体のCTAに基づいた免疫療法薬に対する感受性を高めるときの使用のためのCaSR活性化剤。
【請求項２】
請求項1に記載の使用のためのCaSR活性化剤であって、CaSR活性化剤は、CaSRアロステリック活性化因子であり、好ましくはシナカルセト、NPS-R568、カリンドール、カルシウム受容体作動薬B、AC-265347およびこれらの組み合わせから選択され；およびより好ましくは、CaSR活性化剤は、シナカルセトである、CaSR活性化剤。
【請求項３】
請求項1または2に記載の使用のためのCaSR活性化剤であって、癌細胞は、副甲状腺腺腫および癌腫、大腸癌、乳癌、前立腺癌、膠腫、ライディヒ細胞癌、卵巣癌、神経芽腫、神経節芽細胞腫および神経節性神経腫、骨転移およびこれらの組み合わせから選択される癌からの細胞であり；好ましくは、神経芽腫、神経節芽細胞腫および神経節性神経腫から選択され；およびより好ましくは、神経芽腫である、CaSR活性化剤。
【請求項４】
請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用のためのCaSR活性化剤であって、SSXファミリーのCTAに基づいた免疫療法薬に対する、および／またはGAGEファミリーのCTAに基づいた免疫療法薬に対する感受性を高めるときの使用のための、CaSR活性化剤。
【請求項５】
請求項4に記載の使用のためのCaSR活性化剤であって、MAGEファミリーのCTAに基づいた免疫療法薬に対する、および／または非-X-ファミリーCTAに基づいた免疫療法薬に対する感受性を高めるときの使用のための、CaSR活性化剤。
【請求項６】
CaSRを発現する癌の治療における使用のための、CTAに基づいた免疫療法薬と組み合わせたCaSR活性化剤。
【請求項７】
請求項6に記載の使用のためのCaSR活性化剤であって、CaSR活性化剤は、CaSRアロステリック活性化因子であり、好ましくはシナカルセト、NPS-R568、カリンドール、カルシウム受容体作動薬B、AC-265347およびこれらの組み合わせから選択され；およびより好ましくは、CaSR活性化剤は、シナカルセトである、CaSR活性化剤。
【請求項８】
請求項6または7に記載の使用のためのCaSR活性化剤であって、癌細胞は、副甲状腺腺腫および癌腫、大腸癌、乳癌、前立腺癌、膠腫、ライディヒ細胞癌、卵巣癌、神経芽腫、神経節芽細胞腫および神経節性神経腫、骨転移およびこれらの組み合わせから選択される癌からの細胞であり；好ましくは、神経芽腫、神経節芽細胞腫および神経節性神経腫から選択され；およびより好ましくは、神経芽腫である、CaSR活性化剤。
【請求項９】
請求項6〜8のいずれか1項に記載の使用のためのCaSR活性化剤であって、CTAに基づいた免疫療法薬は：
-SSXファミリー；好ましくは、SSX 4および／またはSSX 4Bから選択される、SSXファミリーのCTAおよび／または
-GAGEファミリー；好ましくは、GAGE1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2E、GAGE 4、GAGE 5、GAGE 6、GAGE 7、GAGE 8、GAGE 10、GAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12F、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12I、GAGE 12J、GAGE 13およびこれらの組み合わせから選択される、GAGEファミリーのCTA
に特異的な免疫療法薬を含む、CaSR活性化剤。
【請求項１０】
請求項9に記載の使用のためのCaSR活性化剤であって、CTAに基づいた免疫療法薬は、MAGEファミリー；好ましくはMAGE A2および／またはMAGE A3のCTAに特異的な免疫療法薬を含む、CaSR活性化剤。
【請求項１１】
請求項9または10に記載の使用のためのCaSR活性化剤であって、CTAに基づいた免疫療法薬は、非-X-CTA；好ましくはCTCFLに特異的な免疫療法薬を含む、CaSR活性化剤。
【請求項１２】
同時の、別々の、または連続した投与のための組み合わせとしてCaSR活性化剤およびCTAに基づいた免疫療法薬を含むキット。
【請求項１３】
請求項12に記載のキットであって、CaSR活性化剤は、CaSRアロステリック活性化因子であり、好ましくは、シナカルセト、NPS-R568、カリンドール、カルシウム受容体作動薬B、AC-265347およびこれらの組み合わせから選択され；およびより好ましくは、CaSR活性化剤は、シナカルセトである、キット。
【請求項１４】
請求項12または13に記載のキットであって、CTAに基づいた免疫療法薬は：
-SSXファミリー；好ましくはSSX 4および／またはSSX 4B、のCTAおよび／または
-GAGEファミリー；好ましくはGAGE1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2E、GAGE 4、GAGE 5、GAGE 6、GAGE 7、GAGE 8、GAGE 10、GAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12F、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12I、GAGE 12J、GAGE 13およびこれらの組み合わせから選択される、GAGEファミリーのCTA
に特異的な免疫療法薬を含む、キット。
【請求項１５】
請求項14に記載のキットであって、CTAに基づいた免疫療法薬は、MAGEファミリー；好ましくはMAGE A2および／またはMAGE A3のCTAに特異的な免疫療法薬を含む、キット。
【請求項１６】
請求項14または15に記載のキットであって、CTAに基づいた免疫療法薬は、非-X-CTA；好ましくはCTCFLに特異的な免疫療法薬を含む、キット。
【請求項１７】
CaSRを発現する癌を持つ被験体に投与される療法の有効性を評価するためのインビトロでの方法であって：
a）療法前および後に前記被験体からの生物学的試料におけるCTA遺伝子の発現レベルを定量化する工程、および
b）前記生物学的試料におけるCTA遺伝子の発現レベルを比較する工程、
を含む方法であり、
投与される療法は、CaSR活性化剤を含み、および療法前の前記CTA遺伝子の発現レベルに対して療法後のCTA遺伝子の発現レベルの上昇は、療法が有効であることを示している、
方法。
【請求項１８】
請求項17に記載の方法であって、発現レベルは：
a）CTA遺伝子のmRNAを検出すること；
b）CTA遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること；および
c）CTA遺伝子によってコードされるタンパク質と少なくとも90%の同一性を有する任意のアミノ酸配列を検出すること、
から選択されるいずれか1つの方法によって定量化される、方法。
【請求項１９】
請求項17または18に記載の方法であって、生物学的試料は、腫瘍組織試料または生物学的液体であり、好ましくは生物学的液体である、方法。
【請求項２０】
請求項17〜19のいずれか1項に記載の方法であって、CaSR活性化剤は、CaSRアロステリック活性化因子であり；好ましくは、シナカルセト、NPS-R568、カリンドール、カルシウム受容体作動薬B、AC-265347およびこれらの組み合わせから選択され；およびより好ましくは、シナカルセトである、方法。
【請求項２１】
請求項17〜20のいずれか1項に記載の方法であって、癌は、副甲状腺腺腫および癌腫、大腸癌、乳癌、前立腺癌、膠腫、ライディヒ細胞癌、卵巣癌、神経芽腫、神経節芽細胞腫および神経節性神経腫、骨転移およびこれらの組み合わせから選択され；好ましくは、神経芽腫、神経節芽細胞腫および神経節性神経腫から選択され；およびより好ましくは、神経芽腫である、方法。
【請求項２２】
請求項17〜21のいずれか1項に記載の方法であって、工程a）は：
-SSXファミリー；好ましくはSSX 4および／またはSSX 4B、のCTAおよび／または
-GAGEファミリー；好ましくはGAGE1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2E、GAGE 4、GAGE 5、GAGE 6、GAGE 7、GAGE 8、GAGE 10、GAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12F、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12I、GAGE 12J、GAGE 13およびこれらの組み合わせから選択される、GAGEファミリーのCTA
の発現レベルを定量化することを含む、方法。
【請求項２３】
請求項22に記載の方法であって、工程a）は、MAGEファミリー；好ましくはMAGE A2および／またはMAGE A3のCTAの発現レベルを定量化することを含む、方法。
【請求項２４】
請求項22または23に記載の方法であって、工程a）は、非-X-CTA；好ましくはCTCFLの発現レベルを定量化することを含む、方法。
【請求項２５】
請求項22〜24のいずれか1項において定義された方法を実施するキットであって：
-SSXファミリー；好ましくはSSX 4および／またはSSX 4B、のCTAおよび
-GAGEファミリー；好ましくはGAGE1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2E、GAGE 4、GAGE 5、GAGE 6、GAGE 7、GAGE 8、GAGE 10、GAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12F、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12I、GAGE 12J、GAGE 13およびこれらの組み合わせから選択される、GAGEファミリーのCTA
および随意に：
-MAGEファミリー；好ましくはMAGE A2および／またはMAGE A3、のCTAおよび／または
-非-X-CTA；好ましくはCTCFL、の発現レベルを定量化するための適切な手段
および適切なパッケージング
を含む、キット。
【請求項２６】
CaSR活性化剤での治療に対するCaSRを発現する癌の腫瘍応答の代用マーカーとしてのCTA遺伝子の使用。
【請求項２７】
請求項26に記載の使用であって、CaSR活性化剤は、CaSRアロステリック活性化因子であり、好ましくはシナカルセト、NPS-R568、カリンドール、カルシウム受容体作動薬B、AC-265347およびこれらの組み合わせから選択され、およびより好ましくは、シナカルセトである、使用。
【請求項２８】
請求項26または27に記載の使用であって、癌は、副甲状腺腺腫および癌腫、大腸癌、乳癌、前立腺癌、膠腫、ライディヒ細胞癌、卵巣癌、神経芽腫、神経節芽細胞腫および神経節性神経腫、骨転移およびこれらの組み合わせから選択され；好ましくは、神経芽腫、神経節芽細胞腫および神経節性神経腫から選択され；およびより好ましくは、神経芽腫である、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の分野、特に癌免疫療法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
カルシウム感知受容体（CaSR）は、血漿における最小のCa2+変動を感知し、およびそれに応じて副甲状腺ホルモンの分泌を調節して、非常に狭い範囲内でこの陽イオンの細胞外濃度を維持するファミリーC Gタンパク質共役受容体（GPCR）である。また、CaSRは、Ca2+ホメオスタシスに含まれない多くの器官および組織において発現される。このGPCRは、その他の物質の中で、その他のイオン、ポリアミンおよびL-アミノ酸の変化を検出し、およびいくつかのGタンパク質（Gq/11、G12/13、GiおよびGs）に結合することができ、したがって、様々な下流のシグナリング経路を活性化する。この多用途の機構は、CaSRが、癌を含む生理的、および病理学的状態における多種多様の細胞型特異的役割を果たすことを可能にする。
【０００３】
CaSR活性化因子は、オルソステリックリガンドまたは直接的CaSRアゴニスト（1型アゴニストまたはI型カルシウム受容体作動薬としても知られる）およびCaSRのアロステリック活性化因子（2型アゴニストまたはII型カルシウム受容体作動薬としても知られる）に分けられることができる。Ca2+、Mg2+、Gd3+、ネオマイシン、Lアミノ酸などのI型カルシウム受容体作動薬は、その細胞外ドメインとの直接相互作用によってCaSRを活性化する。それに対して、シナカルセトなどのアロステリック活性化因子は、それ自体が受容体を活性化しないが、その三次元構造をむしろ修飾し、そうすると、それはカルシウム刺激に感受性がより高くなる。シナカルセトは、外科的な治療が可能でないときに、慢性腎疾患のために透析されている患者における重篤な上皮小体機能亢進症（HPT）、副甲状腺癌と関連する高カルシウム血症および原発性HPTを持つ患者における重篤な高カルシウム血症を治療するために承認された。その上、WO2013144397は、神経芽細胞腫瘍の治療におけるシナカルセトの使用を記述する。
【０００４】
神経芽細胞腫瘍は、末梢の神経系前駆細胞から生じる発達した悪性腫瘍の不均一なグループを包含し、および神経芽腫、神経節芽細胞腫および神経節性神経腫を含む。これらの一部は、自発性後退を経て、およびその他は局所的領域性の腫瘍としてのみ進行するが、約50%は、転移性神経芽腫として存在する。前者の2つのグループにおける大部分の患者の予後は、細胞毒性の療法がなくても優秀である。しかし、転移性疾患と診断された患者の全体の生存率は、化学療法、外科手術、放射線療法、自己骨髄移植、分化誘導薬および免疫療法を含む現在の多様式アプローチにもかかわらず40%未満のままである。その上、18カ月より年上の患者における転移性神経芽腫の約60%は、最終的に再発し、および現在まで、これらの患者のために根治的である公知の治療がない。
【０００５】
腫瘍関連抗原、ジシアロガングリオシドGD2をターゲットとする免疫療法薬は、リスクの大きい神経芽腫（転移性の場合および不応性の局所的領域性の腫瘍）のための標準治療の一部になった。顆粒白血球-マクロファージコロニー刺激因子およびインターロイキン-2と組み合わさったch14.18（キメラヒト-マウス抗GD2モノクローナル抗体）を持つ免疫療法薬は、リスクの大きい神経芽腫を持つ患者における標準的な療法と比較して有意に改善された結果と関連すると報告されていた。しかし、また、GD2は、ニューロン、皮膚メラノサイトおよび末梢感覚神経繊維において発現される。発現のこのパターンは、この免疫療法薬投薬計画の重要な治療関連毒性作用の一因となり、重篤な疼痛、低血圧、毛細血管漏出症候群および過敏性反応を含む。
【０００６】
その上、癌における分子標的治療を限定するのは、投与された薬物への腫瘍応答を評価することを可能にするマーカー、特に非侵襲的技術を使用して検出されることができるマーカーの欠如である。これらの薬物の多くは、撮像技術によってモニターされることができる腫瘍容積の劇的な収縮を生じさせず、生検を繰り返し行わない限り薬物の効果を評価することが困難である。
【０００７】
したがって、最高水準の技術において、正常な組織に影響を及ぼさずに免疫療法薬に対する癌細胞の感受性を高め、新たな癌療法を提供し、および前記癌の治療のために投与される療法に対する癌と診断される患者の反応を評価することを可能にする代用マーカーを提供する必要がある。
【発明の概要】
【０００８】
第1の側面において、本発明は、CaSRを発現する癌を持つ被験体のCTAに基づいた免疫療法薬に対するCaSRを発現する感受性を高めるときの使用のためのCaSR活性化剤に関連する。
【０００９】
第2の側面において、本発明は、CaSRを発現する癌の治療における使用のためのCTAに基づいた免疫療法薬と組み合わせたCaSR活性化剤に関連する。
【００１０】
第3の側面において、本発明は、同時の、別々の、または連続した投与のための組み合わせとしてCaSR活性化剤およびCTAに基づいた免疫療法薬を含むキットに関連する。
【００１１】
第4の側面において、本発明は、CaSRを発現する癌を持つ被験体に投与される療法の有効性を評価するためのインビトロでの方法であって：
a）療法前および後に前記被験体からの生物学的試料におけるCTA遺伝子の発現レベルを定量化する工程、および
b）生物学的試料におけるCTA遺伝子の発現レベルを比較する工程、を含む方法であり、
投与される療法は、CaSR活性化剤を含み、および療法前の前記CTA遺伝子の発現レベルに対して療法後のCTA遺伝子の発現レベルの上昇は、療法が有効であることを示す。
【００１２】
第5の側面において、本発明は、SSXファミリーのCTA遺伝子およびGAGEファミリーのCTA遺伝子の発現レベルを測定する適切な手段および適切なパッケージングを含む、CaSRを発現する癌を持つ被験体に投与される療法の有効性を評価するためのキットに関連する。
【００１３】
第6の側面において、本発明は、CaSR活性化剤での治療に対するCaSRを発現する癌の腫瘍応答の代用マーカーとしてのCTA遺伝子の使用に関連する。
【００１４】
本出願のその他の目的、特徴、利点および側面は、以下の記述および添付の特許請求の範囲から当業者にとって明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】3日間（3d）および14日間（14d）1μMシナカルセト（C）またはDMSO（溶媒（V））に曝露されるLA-N-1細胞の形態学的評価を示す顕微鏡写真である。
【図２】（A）時間（日）あたりのシナカルセト（三角）または溶媒（丸）で治療されたインビボでの神経芽腫モデルにおける生存率（%）におけるシナカルセト治療の効果；（B）時間（週）あたりのシナカルセト（三角）または溶媒（丸）を受けているマウスにおける血漿イオン性Ca2+濃度（mmol/L）、を示すグラフを含む。
【図３】シナカルセト（C）または溶媒（V）で治療された異なる検体についての種々の遺伝子（図3における93および図4における34のプローブセット）の発現プロファイルの視覚的描写である。ヒートマップにおいて、アップレギュレートされた遺伝子は赤で表され、グレースケールではより暗い色合いによって示される傾向がある。グレースケールにおいてより明るい色合いは、ヒートマップ上で緑で存在する傾向がある（アップレギュレートされない遺伝子）。
【図４】シナカルセト（C）または溶媒（V）で治療された異なる検体についての種々の遺伝子（図3における93および図4における34のプローブセット）の発現プロファイルの視覚的描写である。ヒートマップにおいて、アップレギュレートされた遺伝子は赤で表され、グレースケールではより暗い色合いによって示される傾向がある。グレースケールにおいてより明るい色合いは、ヒートマップ上で緑で存在する傾向がある（アップレギュレートされない遺伝子）。
【図５】（A）シナカルセト（C）または溶媒（V）で治療された検体における逆転写定量的PCR（RT-qPCR）によって決定されるCTCFLの相対的mRNA発現、（B）同じモデルにおけるSSX4/4B（黒）、MAGE A3（白）、MAGE A2（縞模様）の相対的mRNA発現、（C）同じモデルにおけるNTRK3の相対的mRNA発現、（D）同じモデルにおけるADCY8（黒）、PRKCA（白）、RYR2（縞模様）の相対的mRNA発現、を示すグラフを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本出願に使用されるように、単数形「1つ」、「1つ」および「その」は、文脈によって別途はっきり指示されない限りこれらの対応する複数形を含むことを留意されたい。
【００１７】
癌の治療に免疫療法を適用することにおける現在の課題は、適切な腫瘍抗原の同定を含む。免疫療法のための理想的な標的は、免疫原性であり、および腫瘍細胞において特異的に発現されるこれらの抗原であるだろう。
【００１８】
癌-精巣抗原（CTA）は、240を超える腫瘍関連抗原の大ファミリーを包含し、その詳細は、http://www.cta.lncc.brから得ることができる。CTAは、X染色体上の遺伝子マッピングによってコードされたもの、X-CTA遺伝子およびX染色体上の遺伝子マッピングによってコードされないもの、非-X-CTA遺伝子に分けられることができる。X-CTAは、X染色体に沿ってクラスターで構成される多重遺伝子族を含み、およびとりわけ、MAGE、GAGE、SSXおよびNY-ESO遺伝子ファミリーを含む。非-X-CTAは、ゲノムの全体にわたって分配されて、大部分は単一コピー遺伝子であり、およびとりわけ、BORIS（CTCFL）遺伝子を含む。
【００１９】
CTAは、様々な組織形成の腫瘍において発現されるが、免疫系にアクセス可能でない精巣、胎児の卵巣および胎盤を除いて、正常な組織では発現されない。そのうえ、CTAは、強力なインビボでの免疫原性を有する。したがって、これらの腫瘍制限された発現パターンおよび強力な免疫原性は、CTAを、様々な腫瘍特異的免疫療法アプローチのための理想的な標的とする。
【００２０】
CTAは免疫原性の腫瘍抗原であるが、CTAの著しい腫瘍間および腫瘍内の不均一な発現は、治療に対する癌患者の適格性を限定し；および／または新生細胞の免疫認識を低下させ、したがってCTAに基づいた免疫療法の有効性を減少させている。
【００２１】
驚くべきことに、本発明者らは、新生細胞におけるCTA発現を調節するアプローチを開発した。特に、本発明者らは、CaSR活性化剤がインビトロおよびインビボでのCTA遺伝子の発現を増加させ、および興味深いことに、過剰発現する遺伝子の大部分がX-CTA遺伝子であり、それはCTAで最も免疫原性のグループであることを見いだした。したがって、本発明者らは、免疫原性の標的の発現レベルを上昇させるアプローチを提供し、それは本質的に腫瘍特異的であり、CTAに基づいた免疫療法薬に対してより感受性の高い癌細胞を作り、およびCTAに基づいた免疫療法薬での治療の有効性を増強する。驚くべきことに、また、本発明者らは、CTA発現におけるこのような上昇が、CaSR活性化剤での治療に対する癌反応の代用マーカーとして使用されることができることを見いだした。したがって、CTA発現におけるこの上昇は、新たな使用、方法および製品を提供し、それは本発明の目的である。
【００２２】
実施例に示したように、シナカルセト、CaSR活性化剤は、インビトロおよびインビボでのCTA遺伝子の発現を増加させることができる。CTAは、ほぼ癌においてのみ発現される遺伝子であり、およびしたがって、これらの発現レベルを上昇させることは、腫瘍細胞およびしたがって、このような細胞を持つ被験体における、前記CTAに対して特異的に作られた免疫療法薬に対する感受性をより高くさせる。したがって、第1の側面において、本発明は、免疫療法薬CaSRを発現する癌を持つ被験体のCTAに基づいた免疫療法薬に対する感受性を高めるときの使用のためのCaSR活性化剤に関連する。
【００２３】
CaSR活性化剤は、少なくとも1つのCTA遺伝子の発現レベルを上昇させ、したがって、また、本発明の第1の側面は、免疫療法薬CaSRを発現する癌を持つ被験体のCTAに基づいた免疫療法薬に対する感受性を高めるときの使用のためのCaSR活性化剤に関連し、CaSR活性化剤は、少なくとも1つのCTA遺伝子の発現レベルを上昇させる。
【００２４】
また、本発明の第1の側面は、免疫療法薬CaSRを発現する癌を持つ被験体におけるCTAに基づいた免疫療法薬に対する感受性を高めるためのCaSR活性化剤の使用に関連する。
【００２５】
また、本発明の第1の側面は、免疫療法薬CaSRを発現する癌を持つ被験体のCTAに基づいた免疫療法薬に対する感受性のエンハンサーとしてのCaSR活性化剤の使用に関連する。
【００２６】
さらに、本発明の第1の側面は、CaSRを発現する癌を持つ被験体のCTAに基づいた免疫療法薬に対する感受性を高めるための方法に関連し、CTA遺伝子の発現レベルを上昇させるために被験体へのCaSR活性化剤の投与を含む。
【００２７】
本発明の文脈において、用語「CaSR活性化剤」は、直接的CaSRアゴニストおよびCaSRのアロステリック活性化因子をいう。上の段落のいずれかに記載の本発明の第1の側面の好ましい態様において、CaSR活性化剤は、CaSRアロステリック活性化因子である。CaSRの複数のアロステリック活性化因子、とりわけ、シナカルセト、NPS-R568、カリンドール、カルシウム受容体作動薬BおよびAC-265347がある。したがって、より好ましい態様において、CaSR活性化剤は、シナカルセト、NPS-R568、カリンドール、カルシウム受容体作動薬BおよびAC-265347並びにこれらの組み合わせから選択され、およびさらにより好ましい態様において、CaSR活性化剤は、シナカルセトである。
【００２８】
これらの化合物は、当業者によって周知であり、および標準的な技術、たとえばEP1913941 A1、Nemeth et al. (Calcimimetics with potent and selective activity on the parathyroid calcium receptor”. Proc Natl Acad Sci USA. 1998 31;95(7):4040-5)に記述されたものを使用して合成されることができる。その上、これらの化合物は、たとえば、シナカルセト（Amgen, Selleck Chemicals）、NPS-R-568（NPS Pharmaceuticals/Shire）、カルシウム受容体作動薬B（Amgen）、AC-265347（ACADIA Pharmaceuticals, Sigma-Aldrich）、カリンドール（Toronto Research Chemicals）の商業支店から市販されている。
【００２９】
本発明の文脈において、用語「CTAに基づいた免疫療法薬」は、少なくともCTAに特異的な免疫療法薬、すなわち少なくともCTAが、免疫療法薬のための標的分子である薬剤をいう。CTAは、CTA遺伝子、それらの断片、CTAタンパク質、それらの断片（CTAペプチド）またはこれらの組み合わせをいう。免疫療法薬は、免疫応答を刺激することができる薬剤をいう。前記免疫応答は、疾患の進行の治療、寛解および／または遅滞をもたらす。特に、免疫療法薬は、数ある中でも、ワクチン接種薬剤としてCTAペプチドを使用するワクチン；これらのペプチドでパルスされた樹状細胞ワクチン；およびこれらのペプチドを認識する天然の、または操作された受容体を発現するT細胞である。
【００３０】
本発明の文脈において、用語「CTAに基づいた免疫療法薬に対する感受性」は、CTAに基づいた免疫療法薬に対する感度をいう。免疫療法薬CaSRを発現する癌細胞のCTAに基づいた免疫療法薬に対する感受性または感度の高まりに伴い、CaSRを発現する癌薬剤を持つ被験体のCTAに基づいたこのような免疫療法薬での治療のより優れた有効性は、予想される。
【００３１】
同様に、用語「CTAに基づいた免疫療法薬に対する感受性のエンハンサーとして」は、CTAに基づいた免疫療法薬の感受性または感度を増強する薬剤をいう。
【００３２】
用語「CaSRを発現する癌」は、CaSRが癌細胞の細胞膜において発現される癌をいう。上の段落のいずれかに記載の本発明の第1の側面の特定の態様において、CaSRを発現する癌は、副甲状腺腺腫および癌腫、大腸癌、乳癌、前立腺癌、膠腫、ライディヒ細胞癌、卵巣癌、神経芽腫、神経節芽細胞腫、神経節性神経腫、骨転移（特に、腎臓癌癌腫、乳癌または前立腺癌の骨転移）およびこれらの組み合わせから選択される。好ましい態様において、CaSRを発現する癌は、神経芽腫、神経節芽細胞腫、神経節性神経腫およびこれらの組み合わせから選択され；およびより好ましくは、CaSRを発現する癌は、神経芽腫である。文献に示したように、全てのこれらの癌は、CaSRを発現する癌である。
【００３３】
実施例1、3および4に示したように、SSXおよびGAGEファミリーのCTAの発現レベルは、インビトロおよびインビボでのシナカルセトの投与により増加し、およびそれはマイクロアレイによって、およびRT-qPCRによって検出される。したがって、上の段落のいずれかに記載の本発明の第1の側面の特定の態様において、SSXファミリーのCTAに基づいた免疫療法薬に対する感受性は高まり、もう一つの態様において、GAGEファミリーのCTAに基づいた免疫療法薬に対する感受性は高まり、およびもう一つの態様において、SSXファミリーのCTAに基づいた免疫療法薬に対する、およびGAGEファミリーのCTAに基づいた免疫療法薬に対する感受性は高まる。好ましい態様において、SSXファミリーのCTAは、SSX 4および／またはSSX 4Bから選択され；およびGAGEファミリーのCTAは、GAGE1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2E、GAGE 4、GAGE 5、GAGE 6、GAGE 7、GAGE 8、GAGE 10、GAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12F、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12I、GAGE 12J、GAGE 13およびこれらの組み合わせから選択される。好ましくは、GAGEファミリーのCTAは、GAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2Eの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせ、GAGE 10およびGAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12Jの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせである。なおさらにより好ましい態様において、SSX 4および／またはSSX 4B；およびGAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2Eの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせ、GAGE 10およびGAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12Jの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせに特異的な免疫療法薬に対する感受性が高まる。およびより好ましくは、SSX 4、SSX 4B、GAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2E、GAGE 10、GAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12HおよびGAGE 12Jに特異的な免疫療法薬に対する感受性が高まる。
【００３４】
実施例4に示したように、MAGEファミリーのCTAの発現レベルは、シナカルセトの投与により上昇する。したがって、前の段落の態様に記載の本発明の第1の側面のもう一つの好ましい態様において、MAGEファミリーのCTAに基づいた免疫療法薬に対する感受性が高まる。好ましくは、MAGEファミリーのCTAは、MAGE A2および／またはMAGE A3、より好ましくは、MAGE A2およびさらにより好ましくは、MAGE A2およびMAGE A3である。
【００３５】
前の2つの段落の態様のいずれかに記載の本発明の第1の側面のもう一つの好ましい態様において、非-X-CTAファミリーのCTAに基づいた免疫療法薬に対する感受性は、高まり、好ましくはCTCFLに基づく。
【００３６】
より好ましくは、SSX 4、SSX 4B、GAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2E、GAGE 10、GAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12J、MAGE A2、MAGE A3およびCTCFLに特異的な免疫療法薬に対する感受性が高まる。
【００３７】
CTAの発現が、著しい腫瘍間および腫瘍内不均一分布を示すと記述されたので（すなわち異なる腫瘍は、異なるCTA発現パターンを示し、および同じ腫瘍内の異なる細胞は、これらの抗原の発現の異なるパターンを示す）、最善の免疫療法薬は、上の段落において記述した薬剤のように、同時にいくつかのCTAをターゲットとするいくつかの免疫療法薬を含むだろう。この種の複数ターゲットアプローチはまた、ターゲットとされる抗原が、高い腫瘍間および腫瘍内不均一発現を示すところである、グリア芽細胞腫の治療のために樹状細胞ワクチンなどのその他の免疫療法を行う状況において最も有効であることを示した。
【００３８】
CaSR活性化剤が、CaSRを発現する癌細胞における少なくとも1つのCTAの発現レベルを上昇させ、前記細胞を前記CTAに基づいた少なくとも1つの免疫療法薬に対してより感受性を高くさせるため、本発明はまた、CaSRを発現する癌の治療における使用のための、併用療法としてのCaSR活性化剤およびCTAに基づいた免疫療法薬に関連する。したがって、第2の側面において、本発明は、CaSRを発現する癌の治療における使用のためのCTAに基づいた免疫療法薬と組み合わせたCaSR活性化剤に関連する。また、本発明の第2の側面は、CaSRを発現する癌の治療のための医薬の製造のためのCTAに基づいた免疫療法薬と組み合わせたCaSR活性化剤の使用に関連する。
【００３９】
本発明の第2の側面の特定の態様において、CaSR活性化剤は、CaSRのアロステリック活性化因子であり、好ましい態様において、CaSR活性化剤は、シナカルセト、NPS-R568、カリンドール、カルシウム受容体作動薬B、AC-265347およびこれらの組み合わせから選択され、およびより好ましくは、CaSR活性化剤は、シナカルセトである。
【００４０】
上の段落のいずれかにおいて定義したように本発明の第2の側面のもう一つの特定の態様において、CaSRを発現する癌は、副甲状腺腺腫および癌腫、大腸癌、乳癌、前立腺癌、膠腫、ライディヒ細胞癌、卵巣癌、神経芽腫、神経節芽細胞腫および神経節性神経腫、骨転移およびこれらの組み合わせから選択される。好ましい態様において、CaSRを発現する癌は、神経芽腫、神経節芽細胞腫、神経節性神経腫およびこれらの組み合わせから選択され；およびより好ましくは、神経芽腫である。
【００４１】
本明細書に使用される、用語「組み合わせて」は、CaSR活性化剤およびCTAに基づいた免疫療法薬が、被験体に投与される順序を制限しない。CaSR活性化剤は、CTAに基づいた免疫療法薬の投与の前に（たとえば、少なくとも3日、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週または12週前に）、同時に、またはその後に（たとえば、少なくとも3日、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週または12週後に）被験体に投与されることができる。CaSR活性化剤およびCTAに基づいた免疫療法薬の投与は、同じまたは異なる経路によってであってもよい。
【００４２】
上の段落のいずれかに記載の本発明の第2の側面の特定の態様において、CaSR活性化剤は、CTAに基づいた免疫療法薬より前に、および／またはそれと同時に投与される。好ましくは、CaSR活性化剤は、CTAに基づいた免疫療法薬の前に投与されるため、CTAの発現は、CTAに基づいた免疫療法薬の投与の前に増加し、およびその後免疫療法薬は、投与される。好ましくは、CaSR活性化剤の投与は、CTAに基づいた免疫療法薬を投与した後でさえ維持されるため、CTAに基づいた免疫療法薬を投与する間にCaSR活性化剤の効果は、維持される。
【００４３】
上の段落の態様のいずれか1つに記載の本発明の第2の側面の特定の態様において、CTAに基づいた免疫療法薬は、SSXファミリーのCTAに特異的な免疫療法薬および／またはGAGEファミリーのCTAに特異的な免疫療法薬を含む。
【００４４】
上の段落に記載の第2の側面の好ましい態様において、CTAに基づいた免疫療法薬は：
-SSX 4および／またはSSX 4Bから選択されるSSXファミリーのCTA、および／または
-GAGE1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2E、GAGE 4、GAGE 5、GAGE 6、GAGE 7、GAGE 8、GAGE 10、GAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12F、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12I、GAGE 12J、GAGE 13およびこれらの組み合わせから選択されるGAGEファミリーのCTA、に特異的な免疫療法薬を含む。特に、前に言及されたGAGEの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22。好ましくは、GAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2Eの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせ、GAGE 10およびGAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12Jの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせ。まださらにより好ましい態様において、CTAに基づいた免疫療法薬は、SSX 4および／またはSSX 4B；およびGAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2Eの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせ、GAGE 10およびGAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12Jの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせに特異的な免疫療法薬を含む。およびさらにより好ましくは、SSX 4、SSX 4B、GAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2E、GAGE 10、GAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12HおよびGAGE 12Jに特異的である。
【００４５】
また、MAGEファミリーのCTA遺伝子の発現レベルが上昇するため（実施例1および4を参照されたい）、前の2つの段落の態様のいずれかに記載の本発明の第2の側面の特定の態様において、CTAに基づいた免疫療法薬はまた、MAGEファミリーのCTAに特異的な免疫療法薬を含む。好ましくは、MAGEファミリーのCTA遺伝子は、MAGE A2および／またはMAGE A3であり、より好ましくは、MAGE A2であり、およびさらにより好ましくは、MAGE A2およびMAGE A3である。
【００４６】
実施例1、3および4に示したように、非-X-CTAファミリーのCTA遺伝子の発現レベルにおける上昇もまた検出され、したがって、前の3つの段落のいずれかに記載の本発明の第2の側面の特定の態様において、CTAに基づいた免疫療法薬はまた、非-X-CTAに特異的な免疫療法薬を含み、好ましくは、それはCTCFLに特異的な免疫療法薬を含む。
【００４７】
本発明の第2の側面の好ましい態様において、CaSR活性化剤は、シナカルセトであり；CaSRを発現する癌は、神経芽腫、神経節芽細胞腫、神経節性神経腫およびこれらの組み合わせから選択され；およびより好ましくは、CaSRを発現する癌は、神経芽腫であり；およびCTAに基づいた免疫療法薬は：
-SSXファミリーのCTA、好ましくはSSX4および／またはSSX4B、および
-GAGEファミリーのCTA、好ましくはGAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2E、GAGE 4、GAGE 5、GAGE 6、GAGE 7、GAGE 8、GAGE 10、GAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12F、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12I、GAGE 12J、GAGE 13およびこれらの組み合わせから選択され；より好ましくは、GAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2Eの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせ、GAGE 10およびGAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12Jの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせ、および随意に：
-MAGEファミリーのCTA、好ましくはMAGE A2および／またはMAGE A3、および／または
-非-X-ファミリーCTA、好ましくはCTCFLに特異的な免疫療法薬を含む。
【００４８】
前の段落に記載の本発明の第2の側面のさらにより好ましい態様において、CTAに基づいた免疫療法薬は、SSX 4、SSX 4B、GAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2E、GAGE 10、GAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12J、MAGE A2、MAGE A3およびCTCFLに特異的な免疫療法薬を含む。
【００４９】
第3の側面において、本発明は、同時の、別々の、または連続的投与のための組み合わせとしてCaSR活性化剤およびCTAに基づいた免疫療法薬を含むキットに関連する。本発明の第3の側面のキットは、CaSRを発現する癌の治療のために使用される。CaSR活性化剤およびCTAに基づいた免疫療法薬は、薬学的に許容される担体を含む組成物として製剤化されてもよい。したがって、特定の態様において、キットは、これらの同時の、別々の、または連続的投与のための組み合わせとして、CaSR活性化剤を含む組成物（1）およびCTAに基づいた免疫療法薬を含む組成物（2）を含む。
【００５０】
本発明の第3の側面によるキットは、CaSRを発現する癌の治療のために使用される。特定の態様において、CaSRを発現する癌は、副甲状腺腺腫および癌腫、大腸癌、乳癌、前立腺癌、膠腫、ライディヒ細胞癌、卵巣癌、神経芽腫、神経節芽細胞腫および神経節性神経腫、骨転移およびこれらの組み合わせから選択される。好ましい態様において、CaSRを発現する癌は、神経芽腫、神経節芽細胞腫、神経節性神経腫およびこれらの組み合わせから選択され；およびより好ましくは、神経芽腫である。
【００５１】
本発明の第3の側面のキットの特定の態様において、CaSR活性化剤は、CaSRアロステリック活性化因子である。好ましい態様において、CaSR活性化剤は、シナカルセト、NPS-R568、カリンドール、カルシウム受容体作動薬BおよびAC-265347およびこれらの組み合わせから選択され、およびより好ましい態様において、CaSR活性化剤は、シナカルセトである。
【００５２】
上の段落のいずれか1つに記載のキットの特定の態様において、CTAに基づいた免疫療法薬は、SSXファミリーのCTAに特異的な免疫療法薬および／またはGAGEファミリーのCTAに特異的な免疫療法薬を含む。
【００５３】
上の段落に記載のキットの好ましい態様において、CTAに基づいた免疫療法薬は：
-SSX 4および／またはSSX 4Bから選択されるSSXファミリーのCTA、および／または
-GAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2E、GAGE 4、GAGE 5、GAGE 6、GAGE 7、GAGE 8、GAGE 10、GAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12F、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12I、GAGE 12J、GAGE 13およびこれらの組み合わせから選択されるGAGEファミリーのCTAに特異的な免疫療法薬を含む。特に、前に言及されたGAGEの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22。より好ましくは、GAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2Eの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせ、GAGE 10およびGAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12Jの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせに特異的である。まださらにより好ましい態様において、CTAに基づいた免疫療法薬は、SSX 4および／またはSSX 4B；およびGAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2Eの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせ、GAGE 10およびGAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12Jの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせに特異的な免疫療法薬を含む。より好ましくは、SSX 4、SSX 4B、GAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2E、GAGE 10、GAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12HおよびGAGE 12Jに特異的である。
【００５４】
前の2つの段落のいずれかに記載のキットの特定の態様において、CTAに基づいた免疫療法薬はまた、MAGEファミリーのCTAに特異的な免疫療法薬を含む。好ましくは、MAGEファミリーのCTAは、MAGE A2および／またはMAGE A3であり、より好ましくは、それはMAGE A2であり、およびさらにより好ましくは、MAGE A2およびMAGE A3である。
【００５５】
前の3つの段落のいずれかに記載のキットのもう一つの特定の態様において、CTAに基づいた免疫療法薬はまた、非-X-CTA遺伝子に特異的な免疫療法薬を含み、好ましくは、それは、CTCFLに特異的な免疫療法薬を含む。
【００５６】
本発明の第3の側面の好ましい態様は、シナカルセトおよびCTAに基づいた免疫療法薬を含むキットに関連し：
-SSXファミリーのCTA、好ましくはSSX4および／またはSSX4B、および
-GAGEファミリーのCTA、好ましくはGAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2E、GAGE 4、GAGE 5、GAGE 6、GAGE 7、GAGE 8、GAGE 10、GAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12F、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12I、GAGE 12J、GAGE 13およびこれらの組み合わせから選択され；より好ましくは、GAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2Eの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせ、GAGE 10およびGAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12Jの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせ、および随意に：
-MAGEファミリーのCTA、好ましくはMAGE A2および／またはMAGE A3、および／または
-非-X-ファミリーCTA、好ましくはCTCFLに特異的な免疫療法薬を含む。
【００５７】
前の段落に記載の本発明の第3の側面のさらにより好ましい態様において、CTAに基づいた免疫療法薬は、SSX 4、SSX 4B、GAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2Eの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせ、GAGE 10およびGAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12Jの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせ、MAGE A2、MAGE A3およびCTCFLに特異的な免疫療法薬を含む。およびより好ましくは、SSX 4、SSX 4B、GAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2E、GAGE 10、GAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12J、MAGE A2、MAGE A3およびCTCFLに特異的である。
【００５８】
さらにまた、本発明者らは、CaSR活性化剤がCaSRを発現する癌を持つ被験体に投与された後にCTA遺伝子の発現レベルが上昇することが、驚くべきことに前記CaSR活性化剤での治療の有効性の生物マーカーとして役立つことを見いだした。特定の治療に対する癌反応の最善の指標は、腫瘍容積または腫瘍成長の減少である。これは、その腫瘍容積減少および／または安定性が、大量の腫瘍細胞死および／または細胞周期退出および分化を示すと仮定して、化学療法に対する反応を通常評価する方法である。しかし、劇的な腫瘍収縮は、多くのいわゆる分子標的療法または生物学的標的療法での癌治療においては生じず、したがって、代用マーカーを使用して腫瘍応答を評価することが必要になる。実施例に示したように、上述したCTAのアップレギュレーションは、インビトロおよびインビボ両方でのシナカルセトに曝露される神経芽腫モデルにおいて観察され、およびこれは正常な細胞において起こらない。したがって、シナカルセト治療によるこれらの遺伝子の発現のアップレギュレーションは、CaSR活性化剤での治療に対する癌反応のマーカーとしてCTAの使用をサポートする。これらのマーカーの解析は、腫瘍（生検）の、およびまた、CTAはタンパク質およびmRNA両方として血液中を循環するため、末梢血を含む生物学的液体における直接分析によって行われることできる。したがって、また、本発明は、CTAの発現のレベルを定量化することによってCaSR活性化剤でのCaSRを発現する癌の治療の有効性を評価するための方法に、および代用マーカーとしてのCTAの使用に関連する。
【００５９】
したがって、第4の側面において、本発明は、CaSRを発現する癌を持つ被験体に投与される療法の有効性を評価するためのインビトロでの方法であって：
a）療法前および後に前記被験体からの生物学的試料におけるCTA遺伝子の発現レベルを定量化する工程、および
b）生物学的試料におけるCTA遺伝子の発現レベルを比較する工程、を含み、
投与される療法は、CaSR活性化剤を含み、および療法前の前記CTA遺伝子の発現レベルに対して療法後のCTA遺伝子の発現レベルの上昇は、療法が有効であることを示す。
【００６０】
本発明の文脈において、用語「被験体」は、限定されないが、ヒトおよびチンパンジーおよびその他の類人猿およびサル種などの人間以外の霊長類；牛、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマなどの家畜；イヌおよびネコなどの家畜哺乳類；マウス、ラットおよびモルモットおよび同様のものなどの齧歯類を含む実験動物を含むほ乳綱の任意のメンバーをいう。用語は、特定の年齢または性別を意味しない。したがって、雄または雌であるにせよ、成体および新生児の被験体並びに胎児は、この用語の範囲内に含まれると意図される。被験体は、好ましくはヒトである。
【００６１】
生物学的試料におけるCTA遺伝子の発現レベルは、前記遺伝子の転写から生じるRNA（mRNA）に基づいて、またはあるいは、前記遺伝子の相補的DNA（cDNA）に基づいて定量化されることができる。したがって、特定の態様において、CTA遺伝子の発現レベルを定量化することは、CTA遺伝子のmRNA、前記mRNAの断片、CTA遺伝子のcDNA、前記cDNAの断片またはそれらの混合物を定量化することを含む。加えて、本発明の方法は、総RNAを得る目的で抽出工程を行うことを含むことができ、それは従来の技術を用いてなされることができる。
【００６２】
実質的に、任意の従来方法は、CTA遺伝子によってコードされるmRNAまたはその対応するcDNAのレベルを検出し、および定量化するために、本発明のフレームワーク内で使用されることができる。非限定的な例証の目的で、mRNAのレベルは、従来方法、たとえば、mRNA増幅、および電気泳動および染色などの前記mRNA増幅の産物を定量化することを含む方法の使用によって、または代わりに、ノーザンブロット法および対象の遺伝子（CTA）のmRNAまたはその対応するcDNAの特異的プローブの使用、S1ヌクレアーゼによるマッピング、RT-PCR、ハイブリダイゼーション、マイクロアレイ、その他によって定量化されることができる。同様にまた、CTA遺伝子によってコードされる前記mRNAに対応するcDNAのレベルは、従来技術の使用によって定量化されることができる。この場合において、本発明の方法は、対応するmRNAの逆転写によって対応するcDNAを合成する工程を含み、その後に前記cDNA増幅の産物の増幅および定量化が続く。発現レベルを定量化するための従来方法は、たとえば、Sambrook et al., 2001. "Molecular cloning: a Laboratory Manual", 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3に見出されることができる。
【００６３】
生物学的試料におけるCTA遺伝子の発現レベルは、前記遺伝子、すなわちCTAタンパク質またはCTA遺伝子によってコードされるタンパク質と少なくとも90%の同一性を有する任意のアミノ酸配列、さらにより好ましくは、前記タンパク質に対して少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の同一性、によってコードされるタンパク質に基づいて定量化されることができる。2つのアミノ酸配列の間の同一性の程度は、たとえば、BLASTなどの当該技術の水準において公知の標準的な配列整列アルゴリズムをたとえば用いて従来方法によって決定されることができる(Altschul S. et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990. 215(3):403-410)。
【００６４】
CTAタンパク質の発現レベルは、被験体からの試料における前記タンパク質を検出し、および定量化することを可能にする任意の従来方法によって定量化されることができる。本発明において使用されることができる公知の多種多様のアッセイ法があり、これらの技術は、ウェスタンブロット、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、RIA（放射免疫アッセイ）、競合的EIA（競合的酵素免疫測定法）、DAS-ELISA（二重抗体サンドイッチELISA）、免疫細胞化学的および免疫組織化学的技術、タンパク質バイオチップの使用に基づいた技術またはコロイド性沈澱に基づいた特異的抗体またはアッセイ法を含むマイクロアレイを含む。前記CTAタンパク質を検出し、および定量化する方法は、アフィニティークロマトグラフィー技術、リガンド結合アッセイ法、その他を含む。特定の態様において、CTA遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルは、ウェスタンブロット、免疫組織化学またはELISAによって定量化される。
【００６５】
本発明の第4の側面に従って方法の特定の態様において、工程a）において、発現レベルは：
a）CTA遺伝子のmRNAを検出すること；
b）CTA遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること；および
c）CTA遺伝子によってコードされるタンパク質と少なくとも90%の同一性を有する任意のアミノ酸配列を検出すること、から選択されるいずれか1つの方法によって定量化される。
【００６６】
さらにより好ましい態様において、工程a）において、発現レベルは、CTA遺伝子のmRNAを検出することによって、好ましくはRTqPCRによって、またはマイクロアレイによって定量化される。
【００６７】
本発明の方法を実行に移すことは、研究される被験体から生物学的試料を得ることを含む。また、CTAは、腫瘍組織試料において発現し、およびこれらは、癌と診断された被験体の生物学的液体において検出されることができる。したがって、特定の態様において、生物学的試料は、腫瘍組織試料または生物学的液体であり、およびさらにもう一方のなおいっそうの特定の態様は、生物学的液体であるため、本方法は、生検によって採取される腫瘍組織試料を必要とするものより非侵襲的である。好ましい態様において、生物学的試料は、血液、血清、血漿、腹水、心膜液体、胸水、脳脊髄液および関節腔内の液体から選択される生物学的流体であり、好ましくは、生物学的液体は、血液、血清および血漿から選択され、およびより好ましくは、生物学的試料は、血液である。
【００６８】
上の段落において定義した本発明の第4の側面による方法の特定の態様において、CaSR活性化剤は、CaSRのアロステリック活性化因子であり、好ましい態様において、CaSR活性化剤は、シナカルセト、NPS-R568、カリンドール、カルシウム受容体作動薬B、AC-265347およびこれらの組み合わせから選択され、およびより好ましくは、CaSR活性化剤は、シナカルセトである。
【００６９】
上の段落のいずれかにおいて定義した本発明の第4の側面による方法のもう一つの特定の態様において、CaSRを発現する癌は、副甲状腺腺腫および癌腫、大腸癌、乳癌、前立腺癌、膠腫、ライディヒ細胞癌、卵巣癌、神経芽腫、神経節芽細胞腫および神経節性神経腫、骨転移およびこれらの組み合わせから選択される。好ましい態様において、CaSRを発現する癌は、神経芽腫、神経節芽細胞腫、神経節性神経腫およびこれらの組み合わせから選択され；およびより好ましくは、神経芽腫である。
【００７０】
CTAに基づいた免疫療法の限定の1つは、CTA発現の腫瘍内および腫瘍間不均一性の顕著な程度である。これは、遺伝子/抗原のこのファミリーのいくつかのマーカーを同時に解析することを合理的にする。実施例に記述したデータにおいて、最も一貫してアップレギュレートされたマーカーは、GAGEおよびSSXファミリーのものであった。したがって、上の段落のいずれか1つに記載の本発明の第4の側面の方法の特定の態様において、工程a）は、SSXファミリーのCTA遺伝子および／またはGAGEファミリーのCTA遺伝子の発現レベルを定量化することを含む。好ましくは、SSXファミリーのCTA遺伝子は、SSX 4および／またはSSX 4Bであり、より好ましくはSSX 4およびSSX 4Bであり、およびGAGEファミリーのCTA遺伝子は、GAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2E、GAGE 4、GAGE 5、GAGE 6、GAGE 7、GAGE 8、GAGE 10、GAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12F、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12I、GAGE 12J、GAGE 13およびこれらの組み合わせから選択される。特に、前に言及されたGAGEの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22。より好ましくは、GAGEファミリーのCTAは、GAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2Eの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせ、GAGE 10およびGAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12Jの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせである。より好ましくは、第4の側面の方法において、工程a）は、この段落において上記のようにSSXファミリーおよびGAGEファミリーのCTAの発現レベルを定量化することを含み、およびより好ましくは、SSX 4、SSX 4B、GAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2E、GAGE 10、GAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12HおよびGAGE 12Jの発現レベルを定量化することを含む。
【００７１】
CTAの組み合わせの定量化は、療法前の腫瘍に存在する遺伝子発現の不均一パターンを考慮し、およびしたがって、おそらくまたCaSR活性化薬剤での療法によって最も強い結果を生じるだろう。したがって、前の段落に記載の本発明の第4の側面のもう一つの好ましい態様において、また、工程a）は、MAGEファミリー、好ましくはMAGE A2および／またはMAGE A3、より好ましくはMAGE A2およびさらにより好ましくはMAGE A2およびMAGE A3のCTA遺伝子の発現レベルを定量化することを含む。
【００７２】
前の2つの段落のいずれかに記載の本発明の第4の側面のもう一つの好ましい態様において、また、工程a）は、非-X-CTA遺伝子、好ましくはCTCFLの発現レベルを定量化することを含む。
【００７３】
好ましい態様において、工程a）は：SSX 4、SSX 4B、GAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2Eの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせ、GAGE 10およびGAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12Jの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせ、MAGE A2、MAGE A3およびCTCFLのCTA遺伝子の発現レベルを定量化することを含む。およびより好ましくは、SSX 4、SSX 4B、GAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2E、GAGE 10、GAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12J、MAGE A2、MAGE A3およびCTCFL。
【００７４】
第5の側面において、本発明は、本発明の第4の側面の態様のいずれかによる方法を実施するためのキットに関連し、CTA遺伝子の発現レベルを測定する適切な手段および適切なパッケージングを含む。用語「パッケージング」は、製品の購入および使用を容易にする第一目的で販売の前の包み込みおよびパッキングをいう。
【００７５】
第5の側面の特定の態様において、キットは、SSXファミリーのCTA遺伝子の、およびGAGEファミリーのCTA遺伝子の発現レベルを測定する適切な手段を含む。好ましくは、キットは、SSX 4および／またはSSX 4Bから選択されるSSXファミリーのCTA遺伝子およびGAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2E、GAGE 4、GAGE 5、GAGE 6、GAGE 7、GAGE 8、GAGE 10、GAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12F、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12I、GAGE 12J、GAGE 13およびこれらの組み合わせから選択されるGAGEファミリーのCTA遺伝子の発現レベルを測定する適切な手段を含む。特に、前に言及されたGAGEの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22。より好ましくは、GAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2Eの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせ、GAGE 10およびGAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12Jの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせ。まださらにより好ましい態様において、第5の側面のキットは：SSX 4、SSX 4B、GAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2Eの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせ、GAGE 10およびGAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12Jの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせ、およびより好ましくはSSX 4、SSX 4B、GAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2E、GAGE 10、GAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12HおよびGAGE 12JのCTAの発現レベルを測定する適切な手段を含む。
【００７６】
前の段落に記載の本発明の第5の側面のもう一つの好ましい態様において、キットは、MAGEファミリーのCTA遺伝子の発現レベルを測定する適切な手段を含む。好ましくは、MAGEファミリーのCTA遺伝子は、MAGE A2および／またはMAGE A3であり、より好ましくは、MAGE A2であり、およびさらにより好ましくは、MAGE A2およびMAGE A3である。
【００７７】
前の2つの段落のいずれかに記載の本発明の第5の側面のもう一つの好ましい態様において、キットは、非-X-CTA遺伝子、好ましくはCTCFLの発現レベルを測定する適切な手段を含む。
【００７８】
本発明の第5の側面のより好ましい態様において、キットは：SSX 4、SSX 4B、GAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2Eの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせ、GAGE 10およびGAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12Jの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせ、MAGE A2、MAGE A3およびCTCFLのCTAの発現を測定する適切な手段を含む。およびより好ましくは、SSX 4、SSX 4B、GAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2E、GAGE 10、GAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12J、MAGE A2、MAGE A3およびCTCFL。
【００７９】
CTA特異的プライマー、プローブ、抗体などの発現を測定する適切な手段は、市販でありえ、または当業者によって作製されることができる。適切な手段は、とりわけ、本出願の実施例に記述したもの、特に表1に記述したもの、特別に配列番号1〜配列番号20のプライマーであり、それは前記表1に示したCTAに特異的である。
【００８０】
実施例に示したように、インビトロおよびインビボ両方において、および2つの独立した技術を使用して、CTAは、神経芽腫モデルにおけるシナカルセト治療によってアップレギュレートされることを見いだされた。その他の分子は、同様にアップレギュレートされた（たとえば、NTRK3、PRKCAおよびRYR2、実施例1および3を参照されたい）。しかし、また、これらの遺伝子は、CTAが腫瘍細胞においてほぼ独占的に過剰発現される一方で、正常な組織において発現される。これは、CTAをこれらの癌モデルにおける全てのアップレギュレートされた遺伝子のうち、CaSR活性化因子での治療に対する腫瘍応答の最も好ましいマーカーにする。したがって、第6の側面において、本発明は、CaSR活性化剤での治療に対するCaSRを発現する癌の腫瘍応答の代用マーカーとして、CTAの使用に、またはCTAの発現のレベルの使用に関連する。これらの代用マーカーのレベルを上昇させることは、CaSR活性化剤が、腫瘍容積における劇的な、または迅速な変化がないにもかかわらず、CaSRを発現する癌細胞に対して我々のその機能を効率的に保持することを示すだろう。
【００８１】
本発明の第6の側面による使用の特定の態様において、CaSR活性化剤は、CaSRのアロステリック活性化因子であり、好ましい態様において、CaSR活性化剤は、シナカルセト、NPS-R568、カリンドール、カルシウム受容体作動薬B、AC-265347およびこれらの組み合わせから選択され、およびより好ましくは、CaSR活性化剤は、シナカルセトである。
【００８２】
上の段落のいずれかにおいて定義した本発明の第6の側面による使用のもう一つの特定の態様において、CaSRを発現する癌は、副甲状腺腺腫および癌腫、大腸癌、乳癌、前立腺癌、膠腫、ライディヒ細胞癌、卵巣癌、神経芽腫、神経節芽細胞腫および神経節性神経腫、骨転移およびこれらの組み合わせから選択される。好ましい態様において、CaSRを発現する癌は、神経芽腫、神経節芽細胞腫、神経節性神経腫およびこれらの組み合わせから選択され；およびより好ましくは、神経芽腫である。
【００８３】
本発明の第6の側面の好ましい態様において、使用されるCTAは、SSXファミリーのCTAであり、好ましくはSSX4および／またはSSX4B；および／またはGAGEファミリーのCTA、好ましくはGAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2E、GAGE 4、GAGE 5、GAGE 6、GAGE 7、GAGE 8、GAGE 10、GAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12F、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12I、GAGE 12J、GAGE 13およびこれらの組み合わせから選択される。特に、前に言及されたGAGEの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22。より好ましくは、GAGEファミリーのCTAは、GAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2Eの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせ、GAGE 10およびGAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12Jの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせである。まださらにより好ましい態様において、使用されるCTAは：SSX 4、SSX 4B、GAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2Eの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせ、GAGE 10およびGAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12Jの少なくとも1つおよびこれらの組み合わせ、MAGE A2、MAGE A3およびCTCFLである。およびより好ましくは、SSX 4、SSX 4B、GAGE 1、GAGE 2A、GAGE 2B、GAGE 2C、GAGE 2D、GAGE 2E、GAGE 10、GAGE 12B、GAGE 12C、GAGE 12D、GAGE 12E、GAGE 12G、GAGE 12H、GAGE 12J、MAGE A2、MAGE A3およびCTCFL。
【００８４】
上の段落において記述した態様のいずれかによる、なおさらにより好ましい態様において、また、MAGEファミリーのCTA、好ましくはMAGE A2および／またはMAGE A3、より好ましくは、MAGE A2およびより好ましくは、MAGE A2およびMAGE A3；および／または非-X-ファミリーのCTA、好ましくはCTCFLが、使用される。
【００８５】
以下の実施例は、本発明をさらに図示し、および本明細書における使用および方法がどのように実施されるかという完全な開示および記述を当業者に提供するのに役に立ち、および発明の範囲を限定するように意図されない。
【実施例】
【００８６】
実施例1.シナカルセトは、神経芽腫インビトロモデルにおける細胞分化およびCTAのアップレギュレーションを誘導する
3つの神経芽腫株化細胞LA-N-1、SK-N-LPおよびSH-SY5Yをこの目的のために使用した。我々は、LA-N-1細胞が低レベルであるが内在性CaSR発現を示す一方で、CaSR遺伝子がSK-N-LP細胞において後成的機構によって発現抑制されるとすでに報告した。（Casala C, et al. The calcium-sensing receptor gene is silenced by genetic and epigenetic mechanisms in unfavorable neuroblastomas and its reactivation induces ERK1/2-dependent apoptosis. Carcinogenesis 2013; 34:268-76）。CaSRの発現は、SH-SY5Yにおいても検出可能でない。したがって、SK-N-LPおよびSH-SY5YをpCMV-CaSR-GFPまたはpCMV-GFPで安定してトランスフェクトした。全ての株化細胞をP100プレートで21日間1μMシナカルセト（Selleck Chemicals, S1260）またはDMSOの存在下で成長させた。形態を毎日評価した。総RNAを1、3、5、7、10、14および21日に単離した。いくつかのマーカーをSYBRgreenおよび特異的プライマーまたはTaqman技術および遺伝子特異的Assays-on-Demand（Applied Biosystems）を使用してRT-qPCRによって解析した（表1）。
表1.RT-qPCRによって発現解析のために使われるAssays on Demandおよびプライマー。
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【００８７】
GAGE P1：ヒトG抗原（GAGE）：12B、2B、12D、12E、12C、12G、12C、2C、1（転写物バリアントX1）、12J、1（転写物バリアント3、非コードRNA）、1（転写物バリアント2）、2A、2E、12H、2D、10。
【００８８】
GAGE P2：ヒトG抗原（GAGE）：12B、2B、2A、12D、12E、12C、12H、12G、2C、1（転写物バリアントX1）、12J、1（転写物バリアント3、非コードRNA）、1（転写物バリアント2）。
【００８９】
GAGE P3：ヒトG抗原（GAGE）：12B、2B、2A、12D、12E、12C、12H、12G、1（転写物バリアントX1）、12J、1（転写物バリアント3、非コードRNA）、1（転写物バリアント2）、2E、2D、10。
【００９０】
広範な神経突起成長などの神経細胞分化の形態学的特徴は、3日目にすでに明らかであった。これらの特徴は、7日〜14日の間に最大の発現に到達した（図1）。RT-qPCRによるmRNA発現の解析は、神経芽腫細胞分化と関連する遺伝子およびCTAをコードするいくつかの遺伝子のアップレギュレーションを示した（表2）。神経芽腫細胞分化は、より良性に、より増殖性でないようになっているこの腫瘍の指標である。したがって、分化関連遺伝子のアップレギュレーションは、シナカルセトが神経芽腫の場合には抗腫瘍効果を及ぼすことを示す。その上、インビトロおよびインビボ両方での（実施例2-4を参照されたい）これらの分化関連遺伝子およびCTAのアップレギュレーションは、シナカルセトでの治療に対する神経芽腫反応を評価する優れたモデルとして、提唱されたインビトロモデル（使用される用量、露出時間など）を確証する。
表2．シナカルセトでの治療後の神経芽腫インビトロモデルにおけるアップレギュレートされた遺伝子。
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ns:有意でない。
実施例2.シナカルセトは、インビボでの神経芽腫腫瘍成長を阻害する
神経芽腫のインビボモデルは、4〜6週間目の雌の胸腺欠損Nude-Foxn1 nu/nuマウス（Charles River）において作成し、LA-N-1細胞（107）を皮下に接種した。腫瘍は、大きさが7×7mmに到達するまで成長させることができた。次いで、マウスは、腫瘍容積が2cm3に到達するまで1週につき6日経口経管栄養によって溶媒（後述する）またはシナカルセト（10mg/kg/日）いずれかを受けるようにランダム化した。シナカルセトは、Mimpara（登録商標）錠剤（Amgen）で調製した。乳鉢においてMimpara（登録商標）錠剤を均質化した後、生じた粉末は、20mg/mLの終濃度とし、0.5%のTween 20（20%、v/v）およびカルボキシメチルセルロース（0.25%、w/v）とともに再構成した。それぞれの用量は、マウス重量1グラムにつき5μLのこの混合物を含んだ。腫瘍の大きさは、デジタルノギスを使用して週3回測定した。腫瘍容積は、mmにおける長さを「L」で示し、およびmmにおける幅を「W」で示し、L×W2/2として算出した。実験の終わりに、それぞれのマウスは、対応する異種移植片が最終的な予め定められた容積2cm3に到達したときに屠殺し、腫瘍を切除し、およびそれぞれの検体の半分を分子解析のために液体窒素において凍結し、およびその他を10%のホルマリンにおいて固定した。無再発生存率（EFS）解析については、発症は、2cm3を超えた腫瘍サイズとして定義した。ログランク統計を群の間のEFS確率を比較するのに使用した。P<0.05を有意と考慮した。
【００９１】
図2Aに示したように、対照（P=0.034）と比較してシナカルセトで治療されたマウスにおいて、有意な腫瘍成長阻害を観察した。軽度の、非症候性の、低カルシウム血症をシナカルセトで治療されたマウスにおいて考証した（図2B）。この結果は、上皮小体および腎臓におけるシナカルセト作用の予想される結果であり、およびしたがって、正確に投与され、および吸収された薬物の優れた指標である。毒性の徴候は、観察されなかった（図示せず）：マウスは食べ、および正常に成長し、および軽度の低カルシウム血症をよく許容した。
【００９２】
全体として、このマウスのモデルは、シナカルセトに対する長期にわたる曝露が、インビボでの神経芽腫腫瘍成長を減少させることを示し、この抗腫瘍効果が十分許容的な用量にて得られた。
実施例3.インビボ治療でのシナカルセトによる神経芽腫におけるCTAのアップレギュレーション：マイクロアレイ解析
総RNAを対照群（V）から8つおよびシナカルセト（C）に曝露された8異種移植片から単離した。これらは、それぞれの群において切除された最後の8腫瘍であり、その結果、解析された異種移植片は、最も長い治療期間曝露したものであった（V5-V12、およびC4-C11）。2つの異なるmRNA発現解析を行った：マイクロアレイ（実施例3）により、およびRT-qPCR（実施例4）によるゲノム全体の発現解析。ゲノム全体の発現解析を製造業者のプロトコルに従って、Affymetrix Human and Mouse Gene Array 2.1 ST（Affymetrix、ヒト遺伝子アレイのための照会番号902136およびマウス遺伝子アレイのための902120）を使用して行った。結果を解析する手順は：アレイの品質制御（この工程の後、異種移植片C6をさらなる解析から取り除いた）；フィルタリングおよび規準化；異なって発現された遺伝子の選択；単一の比較（対照試料に対して治療されたもの）；有意性によってランクを付けられた異なって発現された遺伝子の一覧；最も異なって発現された遺伝子を示すVolcanoプロット；クラスター形成した発現プロファイルのヒートマップ；およびGene Ontologies、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）およびIngenuity pathwaysに対する濃縮解析を通して生物学的重要性の解析を含んだ。
【００９３】
最初のゲノム全体の発現解析は、対照（V5-V12）と比較してシナカルセト治療された腫瘍（C4、C5、C7-C11）における潜在的にアップレギュレートされた遺伝子（ログ倍率変化＞1）に対応する13のプローブの群を同定した。興味深いことに、これらの13のプローブ中11は、CTA遺伝子でハイブリダイズした（太字、表3）。しかし、遺伝子発現のこれらの相違は、統計的に有意でなく、調整されたP値＞0.05であった（表3）。それにもかかわらず、この第1の解析において、図3上のヒートマップに対応して、遺伝子の群が最も長い期間シナカルセトに曝露された3つの腫瘍において特異的に調節されたことは明らかであった。これを、8つの溶媒治療された腫瘍（V5-V12）と比較してこれらの3つの検体（C9-C11）において異なって発現された遺伝子を調べた第2のゲノム全体の発現解析によって確認した（図4）。
表3.シナカルセト治療された異種移植片対溶媒治療された異種移植片におけるアップレギュレートされた遺伝子（ログ倍率変化＞1）
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この第2の解析は、シナカルセト治療された検体において有意に調節される遺伝子の群を同定した。この遺伝子サイン（または異なって発現される遺伝子の群）は、シナカルセト処理群において有意にアップレギュレートされた遺伝子でハイブリダイズされた34のプローブを包含した（ログ倍率変化＞1、調整されたP値＜0.05、表4）。これらの34のプローブの中で、11（32%）は、CTA（太字）でハイブリダイズした。これらは、X染色体に位置する遺伝子によってコードされるCTAであった（GAGEファミリーおよびSSX4/4B）。GAGEファミリーは、同様に第1の解析においてアップレギュレートされると見いだされた（表3）。
【００９４】
この第2の解析におけるその他の有意にアップレギュレートされた遺伝子は、PRKCA、RYR2およびGABRA3を含んだ。最初の2つは、CaSRの下流に活性化されるシグナリング経路において重要であるタンパク質をコードし、およびGABA受容体は、良好な経過の神経芽細胞腫瘍においてアップレギュレートされる。
【００９５】
また、2つのその他の関連した遺伝子（CTCFLおよびNTRK3）は、調整されたP値がカットオフ値（CTCFLおよびNTRK3両方について0.0514678）より下で正しかったが、この第2の解析においてアップレギュレートされると見いだされた。CTCFL（BORISとも呼ばれる）は、いくつかの状況においてその他のCTAの発現を制御すると示された非-X-CTAであり、およびNTRK3はTrkファミリーの受容体であり、それは良性の、良好な経過の神経芽細胞腫瘍において過剰発現すると示された。
【００９６】
全体として、マイクロアレイデータのこの第2の解析は、神経芽腫腫瘍が、その延長期間シナカルセトに曝露されるときに分化されて、より良性になることを示し、およびCaSR活性化薬剤の全く予想外の驚くべき効果：有意に前記薬物の投与により神経芽腫細胞におけるCTAのアップレギュレーションを同定した。
表4.最も長いシナカルセト治療に曝露された3つの異種移植片対溶媒治療された異種移植片におけるアップレギュレートされた遺伝子。
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実施例4.インビボ治療でのシナカルセトによる神経芽腫におけるCTAのアップレギュレーション：RT-qPCR解析
マイクロアレイデータのバリデーションをRT-qPCRを用いて行った。この技術をSYBRgreenおよび特異的プライマーまたはTaqman技術および遺伝子特異的Assays-on-Demand（Applied Biosystems）を使用して行った（表1）。
【００９７】
また、この技術をその他のCTA（MAGEファミリーのメンバーおよびCTCFL）の発現、分化と関連する遺伝子およびカルシウム-シグナリング経路をさらに詳しく解析するのに使用した。CTCFL（図5A）、MAGE A2、MAGE A3およびSSX4/4B（図5B）、NTRK3（図5C）、ADCY8、PRKCAおよびRYR2（図5D）のアップレギュレーションをシナカルセト（C10-C11）に最も長い時間曝露された2つの検体において主に検出した。
【００９８】
また、異なった発現をこの実験に含まれる動物の全てのコホートにおいて調べ、シナカルセト（C11）で長期の治療を受けた検体におけるGAGE mRNAのmRNA発現に対して100倍までの増加を観察した（データ示さず）。
実施例5.シナカルセトは、正常な周囲組織におけるCTAのアップレギュレーションを誘導しない
CTAのアップレギュレーションが、腫瘍特異的効果であったかどうか、またはそれが同様に正常な周囲組織において誘導されていたかどうかについて評価するために、マイクロアレイによるゲノム全体の発現解析をチップを使用して行い、ヒトアレイにおいて解析した同じRNAにおいて異なって発現されるマウス遺伝子を検出した。表5に示したように、ほとんどの遺伝子が、最後の3つの検体C9-C11を解析したときでさえ、アップレギュレートされず（ログ倍率変化＞1）、どれも有意でなく（調整されたP値＞0.05）、およびCTAは過剰発現された遺伝子の間になかった。したがって、興味深いことに、シナカルセトは、腫瘍におけるCTAの過剰発現を誘導するが、周辺非腫瘍性組織においては誘導せず、免疫療法薬に適切な標的を提供する。
表5. マイクロアレイによるハツカネズミ（Mus musculus）遺伝子発現解析：アップレギュレートされた遺伝子
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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