(57)【要約】本発明は、mRNA翻訳に及ぼすコドン文脈および同義コドン変化の効果に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
5'から3'方向で6番目、7番目、8番目、9番目、および10番目のコドンのうちの少なくとも1つが同義コドンである少なくとも10コドンを有する変異トリアコンタヌクレオチド(triacontanucleotide)配列を含む、組換え核酸分子。
【請求項２】
5'から3'方向で6番目、7番目、8番目、および9番目のコドンのうちの少なくとも1つが同義コドンである少なくとも10コドンを有する変異トリアコンタヌクレオチド配列からなる、組換え核酸分子。
【請求項３】
変異トリアコンタヌクレオチド配列が、アミノ酸配列
2018529365.tif 000010
をコードする、請求項1記載の組換え分子。
【請求項４】
変異トリアコンタヌクレオチド配列が、関心対象のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド配列に機能的に連結される、請求項1記載の組換え分子。
【請求項５】
関心対象のポリペプチドが、表1に記載されるポリペプチドから選択される、請求項4記載の組換え分子。
【請求項６】
関心対象のポリペプチドが、インスリン、クモ糸タンパク質MaSp1、またはクモ糸タンパク質MaSp2である、請求項4記載の組換え分子。
【請求項７】
変異トリアコンタヌクレオチド配列が、5'から3'方向でポリヌクレオチド配列に機能的に連結される、請求項4記載の組換え分子。
【請求項８】
変異トリアコンタヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列の最もアミノ末端側の10コドンに取って代わり、かつ異種ポリヌクレオチド配列が、関心対象のポリペプチドをコードする、請求項4記載の組換え分子。
【請求項９】
変異トリアコンタヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 3をコードする、請求項1記載の組換え分子。
【請求項１０】
変異トリアコンタヌクレオチド配列がリボ核酸配列である、請求項1または4記載の組換え分子。
【請求項１１】
変異トリアコンタヌクレオチド配列がデオキシリボ核酸配列である、請求項1または4記載の組換え分子。
【請求項１２】
ポリヌクレオチド配列がリボ核酸配列である、請求項1または4記載の組換え分子。
【請求項１３】
ポリヌクレオチド配列がデオキシリボ核酸配列である、請求項1または4記載の組換え分子。
【請求項１４】
変異トリアコンタヌクレオチド配列が合成配列である、請求項1または4記載の組換え分子。
【請求項１５】
変異トリアコンタヌクレオチド配列およびポリヌクレオチド配列の一方または両方が合成配列である、請求項4記載の組換え分子。
【請求項１６】
5'から3'方向で6番目および8番目のコドンが同義コドンである、請求項1記載の組換え分子。
【請求項１７】
請求項1〜16のいずれか一項記載の組換え分子を含む、ベクター。
【請求項１８】
ベクターが発現ベクターであり、変異トリアコンタヌクレオチド配列およびポリヌクレオチド配列が、異種プロモーターに機能的に連結される、請求項17記載のベクター。
【請求項１９】
異種プロモーターが、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターである、請求項18記載のベクター。
【請求項２０】
誘導性プロモーターがParaBADまたはPsalプロモーターである、請求項19記載のベクター。
【請求項２１】
請求項1〜16のいずれか一項記載の組換え分子を含む、宿主細胞。
【請求項２２】
ポリヌクレオチド配列が宿主細胞内での発現のためにコドン最適化されている、請求項21記載の宿主細胞。
【請求項２３】
サルモネラ(Salmonella)または大腸菌(Escherichia coli)細胞である、請求項21記載の宿主細胞。
【請求項２４】
サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)細胞である、請求項23記載の宿主細胞。
【請求項２５】
請求項17〜19のいずれか一項記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２６】
サルモネラまたは大腸菌細胞である、請求項25記載の宿主細胞。
【請求項２７】
サルモネラ・エンテリカ細胞である、請求項26記載の宿主細胞。
【請求項２８】
5'から3'方向で6番目、7番目、8番目、9番目、および10番目のコドンのうちの少なくとも1つが同義コドンである配列
2018529365.tif 000011
を含む、調節された翻訳速度を有する組換え核酸分子。
【請求項２９】
6番目のコドンが同義コドンACU、ACA、またはACGであり、かつ組換え分子が、非改変配列を含む分子と比較して上昇した翻訳速度を有する、請求項28記載の組換え分子。
【請求項３０】
6番目のコドンが同義コドンであり、分子が、非改変配列を含む分子と比較して約9から15倍上昇した翻訳速度を有する、請求項28記載の組換え分子。
【請求項３１】
8番目のコドンが同義コドンCCGであり、かつ組換え分子が、非改変配列を含む分子と比較して低下した翻訳速度を有する、請求項28記載の組換え分子。
【請求項３２】
8番目のコドンが同義コドンであり、組換え分子が、非改変配列を含む分子と比較して約0.03から0.07倍に低下した翻訳速度を有する、請求項28記載の組換え分子。
【請求項３３】
6番目のコドンが同義コドンACUであり、8番目のコドンが同義コドンCCGであり、かつ組換え分子が、非改変配列を含む分子と比較して上昇した翻訳速度を有する、請求項28記載の組換え分子。
【請求項３４】
6番目のコドンが同義コドンであり、8番目のコドンが同義コドンであり、かつ組換え分子が、非改変配列を含む分子と比較して約27.5から40.5倍上昇した翻訳速度を有する、請求項28記載の組換え分子。
【請求項３５】
関心対象のポリペプチドをコードする核酸配列に機能的に連結された、請求項28〜34のいずれか一項記載の組換え分子を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３６】
請求項28〜35のいずれか一項記載の組換え分子またはポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項３７】
請求項28〜35のいずれか一項記載の組換え分子またはポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
【請求項３８】
サルモネラまたは大腸菌細胞である、請求項37記載の宿主細胞。
【請求項３９】
サルモネラ・エンテリカ細胞である、請求項37記載の宿主細胞。
【請求項４０】
タンパク質発現に十分な条件下で宿主細胞を培養する段階を含む、宿主細胞内のタンパク質産生を調節する方法であって、請求項4〜9、12、13、および15のいずれか一項記載の組換え分子が宿主細胞に安定に導入されている、方法。
【請求項４１】
宿主細胞がサルモネラまたは大腸菌細胞である、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
宿主細胞がサルモネラ・エンテリカ細胞である、請求項40記載の方法。
【請求項４３】
6番目のコドンが同義コドンACU、ACA、またはACGであり、かつタンパク質産生が、野生型トリアコンタヌクレオチド配列を利用する対応する宿主細胞と比較して増加する、請求項40記載の方法。
【請求項４４】
6番目のコドンが同義コドンであり、野生型トリアコンタヌクレオチド配列を利用する対応する宿主細胞と比較して約9から15倍増加したタンパク質産生を生じる、請求項40記載の方法。
【請求項４５】
8番目のコドンが同義コドンCCGであり、かつタンパク質産生が、野生型トリアコンタヌクレオチド配列を利用する対応する宿主細胞と比較して減少する、請求項40記載の方法。
【請求項４６】
8番目のコドンが同義コドンであり、野生型トリアコンタヌクレオチド配列を利用する対応する宿主細胞と比較して約0.03から0.07倍に減少したタンパク質産生を生じる、請求項40記載の方法。
【請求項４７】
6番目のコドンが同義コドンACUであり、8番目のコドンが同義コドンCCGであり、かつタンパク質産生が、野生型トリアコンタヌクレオチド配列を利用する対応する宿主細胞と比較して増加する、請求項40記載の方法。
【請求項４８】
6番目のコドンが同義コドンであり、8番目のコドンが同義コドンであり、野生型トリアコンタヌクレオチド配列を利用する対応する宿主細胞と比較して約27.5から40.5倍増加したタンパク質産生を生じる、請求項40記載の方法。
【請求項４９】
タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であって、10コドンを含み、
2018529365.tif 000012
をコードする野生型トリアコンタヌクレオチド配列に機能的に連結されたポリヌクレオチド配列を提供する段階、ならびに5'から3'方向で6番目、7番目、8番目、9番目、および10番目のコドンのうちの少なくとも1つが同義コドンとなるようにトリアコンタヌクレオチド配列を変異させる段階を含む、ポリヌクレオチド配列の翻訳速度を上昇させる方法。
【請求項５０】
(a) 関心対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、10コドンを含み、
2018529365.tif 000013
をコードする野生型トリアコンタヌクレオチド配列に機能的に連結されたポリヌクレオチド配列を提供する段階、(b) 5'から3'方向で6番目、7番目、8番目、9番目、および10番目のコドンのうちの少なくとも1つが同義コドンとなるようにトリアコンタヌクレオチド配列を変異させる段階；(c) ポリヌクレオチド配列を宿主細胞に導入する段階；(d) 導入されたポリヌクレオチドが発現される条件下で細胞をインキュベートする段階；ならびに (d) 関心対象のポリペプチドを単離する段階を含む、宿主細胞において関心対象のポリペプチドの比細胞生産性を上昇させる方法。
【請求項５１】
得られた変異トリアコンタヌクレオチド配列の6番目のコドンが、同義コドンACU、ACA、またはACGを含み、かつポリヌクレオチド配列の翻訳速度が、野生型トリアコンタヌクレオチド配列の制御下における翻訳と比較して上昇する、請求項49または50記載の方法。
【請求項５２】
約9から15倍の翻訳速度の上昇をもたらす、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
6番目のコドンが同義コドンACUであり、8番目のコドンが同義コドンCCGであり、かつポリヌクレオチド配列の翻訳速度が、野生型トリアコンタヌクレオチド配列の制御下における翻訳と比較して上昇する、請求項49または50記載の方法。
【請求項５４】
約27.5から40.5倍の翻訳速度の上昇をもたらす、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
タンパク質またはポリペプチドが、インスリン、インスリン分子、またはインスリン類似体をコードする異種ポリヌクレオチド配列に機能的に連結される、請求項40〜54のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
1961年にCrickらは、画期的なNature論文、「General nature of the genetic code for proteins」(Crick, F. H., et al. Nature 192:1227-32 (1961))（非特許文献1）を発表した。Crickらは、+1フレームシフト変異と-1フレームシフト変異を組み合わせるという簡単でありながら巧妙な遺伝的アプローチを用いて、分子生物学のセントラルドグマ：DNAはRNAポリメラーゼによりmRNAに転写され、mRNAはリボソームによりタンパク質に翻訳される、の一部であるトリプレットコードの証拠を提供した。タンパク質のアミノ酸配列の遺伝コードは、20種類のアミノ酸および翻訳終結の部位（終止コドン）を特定する64種類のトリプレットコドンから構成される。翻訳されるmRNA中の特定のコドンと、同族アミノアシル-tRNAのアンチコドンを規定する3塩基（アンチコドンループ内の塩基36、35、および34）との間の相互作用が、解読工程を決定する (Grosjean, H., et al., FEBS Lett. 584:252-264 (2010)（非特許文献2）)。
【０００２】
現在、解読工程はより複雑であることが知られている。リボソームが所与のコドンを翻訳する能力は、その隣接コドン（翻訳に及ぼすコドン文脈効果と称される）およびおそらくはmRNA二次構造に多大な影響を受ける (Goodman, D. B., et al., Science 342:475-478 (2013)（非特許文献3）)。所与のコドンの翻訳は、mRNAオープンリーディングフレーム内のそのコドンの位置にも影響を受ける。さらに、同義変異（コードされるアミノ酸を変化させない、コドン内のヌクレオチド変化）は、進化的にサイレントであると長い間考えられていたが (Nei, M. Mol. Biol. Evol. 22:2318-2342 (2005)（非特許文献4）)、今では、同義コドンが翻訳の速度および精度、翻訳時折りたたみ、タンパク質分泌、ならびに全体的な発現レベルに影響を及ぼすことが知られている (Hunt, R. C., et al., Trends Genet. 30:308-321 (2014)（非特許文献5）)。最近の証拠により、同義コドンをもたらす変異と癌などのヒト疾患との関連性が支持される (Sauna, Z. E., and C. Kimchi-Sarfaty, Nat Rev Genet 12:683-91 (2011)（非特許文献6）；Supek, F., et al., Cell 156:1324-35 (2014)（非特許文献7）)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Crick, F. H., et al. Nature 192:1227-32 (1961)
【非特許文献２】Grosjean, H., et al., FEBS Lett. 584:252-264 (2010)
【非特許文献３】Goodman, D. B., et al., Science 342:475-478 (2013)
【非特許文献４】Nei, M. Mol. Biol. Evol. 22:2318-2342 (2005)
【非特許文献５】Hunt, R. C., et al., Trends Genet. 30:308-321 (2014)
【非特許文献６】Sauna, Z. E., and C. Kimchi-Sarfaty, Nat Rev Genet 12:683-91 (2011)
【非特許文献７】Supek, F., et al., Cell 156:1324-35 (2014)
【発明の概要】
【０００４】
発明の簡単な概要
本発明は、異なるリボソーム翻訳の速度および精度、タンパク質折りたたみ、ならびに発現をもたらす、コドン対における同義変化を提供する。1つの態様において、本発明は、遺伝子組み換え生物においてタンパク質の発現を操作するための15塩基対配列を提供する。本発明はまた、疾患状態と関連した有害作用をもたらすポリヌクレオチド変異を選別するための方法を提供する。
【０００５】
1つの態様において、本発明は、所望のタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチド配列に付加された場合に、そのタンパク質の翻訳効率を増減させ、それによって関心対象のポリペプチドの産生調節をもたらす、操作されたFlgMコード配列またはその10コドン断片を提供する。
【０００６】
1つの態様において、本発明はさらに、所望のタンパク質を培養液中に分泌させ、ひいてはタンパク質回収のために細胞溶解を必要とする方法よりも効率的なタンパク質産生法を提供するために、細菌分泌系（鞭毛III型分泌 (T3S) 系 (T3SS) など）を利用する。
【０００７】
本発明はまた、5'から3'方向で6番目、7番目、8番目、9番目、および10番目のコドンのうちの少なくとも1つが同義コドンである10コドンを有する変異トリアコンタヌクレオチド（triacontanucleotide）配列を含む組換え核酸分子を提供する。ある特定の態様において、組換え核酸分子は変異トリアコンタヌクレオチド配列からなる。別の態様において、変異トリアコンタヌクレオチド配列は、アミノ酸配列MSIDRTSPLK (SEQ ID NO:1) をコードする。他の態様において、変異トリアコンタヌクレオチド配列は、全長FlgMアミノ酸配列：
2018529365.tif 000002
をコードする配列の一部である。
【０００８】
1つの態様において、変異トリアコンタヌクレオチド配列は、関心対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結される。別の態様において、変異トリアコンタヌクレオチド配列は、5'から3'方向で関心対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結される。ある特定の態様において、変異トリアコンタヌクレオチド配列は、アミノ酸配列SEQ ID NO: 3をコードし、5'から3'方向で関心対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結される。
【０００９】
1つの態様において、変異トリアコンタヌクレオチド配列はさらに、切断部位ヌクレオチド配列に機能的に連結される。1つの態様において、切断部位は、タバコエッチウイルス (TEV) プロテアーゼ切断部位またはエンテロキナーゼ (ETK) 切断部位をコードする。別の態様において、変異トリアコンタヌクレオチド配列は、切断部位ヌクレオチド配列、およびポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結される。
【００１０】
1つの態様において、変異トリアコンタヌクレオチド配列は、関心対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の最も5'側の10コドンに取って代わる。1つの態様において、関心対象のポリペプチドは、変異トリアコンタヌクレオチド配列に対して異種である。
【００１１】
1つの態様において、変異トリアコンタヌクレオチド配列はリボ核酸配列である。別の態様において、変異トリアコンタヌクレオチド配列はデオキシリボ核酸配列である。
【００１２】
1つの態様において、変異トリアコンタヌクレオチド配列は合成配列である。
【００１３】
1つの態様において、5'から3'方向で変異トリアコンタヌクレオチド配列の6番目および8番目のコドンは、同義コドンである。
【００１４】
1つの態様において、ベクターは本発明の変異配列を含む。別の態様において、ベクターは発現ベクターである。
【００１５】
1つの態様において、ベクターは、関心対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結され、切断部位をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された変異トリアコンタヌクレオチド配列を含む。別の態様において、切断部位ヌクレオチド配列は、変異トリアコンタヌクレオチド配列と関心対象のポリヌクレオチド配列との間にある。別の態様において、ベクターは、変異トリアコンタヌクレオチド配列に機能的に連結された、精製タグをコードする核酸配列をさらに含む。
【００１６】
1つの態様において、変異トリアコンタヌクレオチド配列は、関心対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、精製タグをコードする核酸配列、および任意に切断部位をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結される。
【００１７】
1つの態様において、変異トリアコンタヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列は、異種プロモーターに機能的に連結される。別の態様において、プロモーターは誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターである。本発明の誘導性プロモーターは、ParaBAD (ΔaraBAD) プロモーターなどのアラビノース誘導性プロモーターまたはPsalプロモーターなどのサリチル酸誘導性プロモーターであってよい。1つの態様において、宿主細胞は組換え分子を含む。別の態様において、宿主細胞は、細菌、真菌、酵母、ウイルス、植物、昆虫、または哺乳動物細胞である。別の態様において、宿主細胞は、サルモネラまたは大腸菌 (Escherichia coli) 細胞である。別の態様において、宿主細胞はサルモネラ・エンテリカ (Salmonella enterica) 細胞である。1つの態様において、ポリヌクレオチド配列に機能的に連結され、任意にはさらに切断部位に機能的に連結された変異トリアコンタヌクレオチド配列は、宿主細胞ゲノム中に動作可能に組み込まれる。
【００１８】
1つの態様において、宿主細胞は本発明のベクターを含む。
【００１９】
1つの態様において、ベクター内のポリヌクレオチド配列は、宿主細胞内での発現のためにコドン最適化されている。
【００２０】
本発明は、5'から3'方向で6番目、7番目、8番目、9番目、および10番目のコドンのうちの少なくとも1つが同義コドンである10コドンを有する核酸配列を含む組換え分子を提供する。1つの態様において、核酸配列はポリヌクレオチド配列に機能的に連結される。
【００２１】
本発明は、5'から3'方向で6番目、7番目、8番目、9番目、および10番目のコドンのうちの少なくとも1つが同義コドンであるデカコドン配列5'-
2018529365.tif 000003
を含む、調節された翻訳速度を有する組換え核酸分子を提供する。ある特定の態様において、核酸分子はこの核酸配列を含み、アミノ酸配列SEQ ID NO: 3をコードする。
【００２２】
1つの態様において、6番目のコドンは同義コドンACU、ACA、またはACGであり、この場合、組換え分子は、該デカコドン配列を含む分子と比較して上昇した翻訳速度を有する。1つの態様において、6番目のコドンは同義コドンであり、分子は、天然デカコドン配列を含む分子と比較して約5から約15倍上昇した翻訳速度を有する。別の態様において、分子は、天然デカコドン配列を含む分子と比較して約9から約15倍上昇した翻訳速度を有する。
【００２３】
1つの態様において、8番目のコドンは同義コドンCCGであり、この場合、組換え分子は、天然デカコドン配列を含む分子と比較して低下した翻訳速度を有する。1つの態様において、8番目のコドンは同義コドンであり、組換え分子は、天然デカコドン配列を含む分子と比較して約0.01から約0.10倍に低下した翻訳速度を有する。別の態様において、分子は、天然デカコドン配列を含む分子と比較して約0.03から約0.07倍に低下した翻訳速度を有する。
【００２４】
1つの態様において、6番目のコドンは同義コドンACUであり、8番目のコドンは同義コドンCCGであり、この場合、組換え分子は、天然デカコドン配列を含む分子と比較して上昇した翻訳速度を有する。1つの態様において、6番目のコドンは同義コドンであり、8番目のコドンは同義コドンであり、この場合、組換え分子は、天然デカコドン配列を含む分子と比較して約10から50倍上昇した翻訳速度を有する。別の態様において、分子は、約20から約50倍上昇した翻訳速度を有する。別の態様において、分子は、約30から約50倍上昇した翻訳速度を有する。別の態様において、分子は、約40から約50倍上昇した翻訳速度を有する。別の態様において、分子は、天然デカコドン配列を含む分子と比較して約27.5から40.5倍上昇した翻訳速度を有する。
【００２５】
1つの態様において、デカコドン配列は、関心対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結される。
【００２６】
本発明は、タンパク質発現に十分な条件下で本発明の宿主細胞を培養する段階を含む、宿主細胞内のタンパク質産生を調節する方法であって、組換え核酸分子が宿主細胞に安定に導入されている、方法を提供する。1つの態様において、組換え核酸分子は、5'から3'方向で6番目、7番目、8番目、9番目、および10番目のコドンのうちの少なくとも1つが同義コドンである10コドンを有する変異トリアコンタヌクレオチド配列を含む。1つの態様において、組換え核酸分子は、5'から3'方向で6番目、7番目、8番目、9番目、および10番目のコドンのうちの少なくとも1つが同義コドンである10コドンを有する核酸配列を含む。別の態様において、同義コドンを含む核酸配列はアミノ酸配列SEQ ID NO: 3をコードする。
【００２７】
1つの態様において、6番目のコドンは同義コドンACU、ACA、またはACGであり、この場合、タンパク質産生は、野生型トリアコンタヌクレオチド配列を利用する対応する宿主細胞と比較して増加する。1つの態様において、6番目のコドンは同義コドンであり、分子のタンパク質産生は、野生型トリアコンタヌクレオチド配列を利用する対応する宿主細胞と比較して約5から約15倍増加する。別の態様において、分子のタンパク質産生は、野生型トリアコンタヌクレオチド配列を利用する対応する宿主細胞と比較して約9から約15倍増加する。
【００２８】
1つの態様において、8番目のコドンは同義コドンCCGであり、この場合、タンパク質産生は、野生型トリアコンタヌクレオチド配列を利用する対応する宿主細胞と比較して減少する。1つの態様において、8番目のコドンは同義コドンであり、組換え分子のタンパク質産生は、野生型トリアコンタヌクレオチド配列を利用する対応する宿主細胞と比較して約0.01から約0.10倍に減少する。別の態様において、分子のタンパク質産生は、野生型トリアコンタヌクレオチド配列を利用する対応する宿主細胞と比較して約0.03から約0.07倍に減少する。
【００２９】
1つの態様において、6番目のコドンは同義コドンACUであり、8番目のコドンは同義コドンCCGであり、この場合、タンパク質産生は、野生型トリアコンタヌクレオチド配列を利用する対応する宿主細胞と比較して増加する。
【００３０】
1つの態様において、6番目のコドンは同義コドンであり、8番目のコドンは同義コドンであり、この場合、組換え分子のタンパク質産生は、野生型トリアコンタヌクレオチド配列を利用する対応する宿主細胞と比較して約10から50倍増加する。別の態様において、分子のタンパク質産生は、野生型トリアコンタヌクレオチド配列を利用する対応する宿主細胞と比較して約20から約50倍増加する。別の態様において、分子のタンパク質産生は、野生型トリアコンタヌクレオチド配列を利用する対応する宿主細胞と比較して約30から約50倍増加する。別の態様において、分子のタンパク質産生は、野生型トリアコンタヌクレオチド配列を利用する対応する宿主細胞と比較して約40から約50倍増加する。別の態様において、分子のタンパク質産生は、野生型トリアコンタヌクレオチド配列を利用する対応する宿主細胞と比較して約27.5から40.5倍増加する。
【００３１】
本発明は、タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であって、10コドンを含み、
2018529365.tif 000004
をコードする野生型トリアコンタヌクレオチド配列に機能的に連結されたポリヌクレオチド配列を提供する段階、ならびに5'から3'方向で6番目、7番目、8番目、9番目、および10番目のコドンのうちの少なくとも1つが同義コドンとなるようにトリアコンタヌクレオチド配列を変異させる段階を含む、ポリヌクレオチド配列の翻訳速度を上昇させる方法を提供する。さらなる態様において、野生型トリアコンタヌクレオチド配列および変異トリアコンタヌクレオチド配列は、アミノ酸配列SEQ ID NO: 3をコードする。
【００３２】
1つの態様において、得られた変異トリアコンタヌクレオチド配列の6番目のコドンは、同義コドンACU、ACA、またはACGを含み、この場合、ポリヌクレオチド配列の翻訳速度は、野生型トリアコンタヌクレオチド配列の制御下における翻訳と比較して上昇する。
【００３３】
1つの態様において、得られた変異トリアコンタヌクレオチド配列の8番目のコドンは、同義コドンCCGを含み、この場合、ポリヌクレオチド配列の翻訳速度は、野生型トリアコンタヌクレオチド配列の制御下における翻訳と比較して低下する。
【００３４】
1つの態様において、6番目のコドンは同義コドンACUであり、8番目のコドンは同義コドンCCGであり、この場合、ポリヌクレオチド配列の翻訳速度は、野生型トリアコンタヌクレオチド配列の制御下における翻訳と比較して上昇する。
【００３５】
本発明は、関心対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結された変異トリアコンタヌクレオチド配列を含む宿主細胞を培養する段階を含む、関心対象のポリペプチドを産生する方法を提供する。1つの態様において、変異トリアコンタヌクレオチド配列およびポリヌクレオチド配列は、切断部位をコードするヌクレオチド配列および／または精製タグをコードする核酸配列に機能的に連結される。1つの態様において、ペプチドは培養液から精製される。1つの態様において、培養液からペプチドを精製するために精製タグが利用される。1つの態様において、トリアコンタヌクレオチド配列は、アミノ酸配列SEQ ID NO: 3を有するFlgMタンパク質をコードし、ペプチドはFlgMタンパク質から単離される。別の態様において、FlgMタンパク質からポリペプチドを単離するために切断部位が利用される。
【００３６】
本発明は、III型分泌系を有し、かつまた所望のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド配列に機能的に連結された変異トリアコンタヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の細菌細胞を培養する段階を含む、関心対象のポリペプチドを産生する方法を提供し、この場合、ポリペプチドは培養液中に分泌される。1つの態様において、細菌細胞はサルモネラまたはエシェリキア細胞のいずれかである。1つの態様において、トリアコンタヌクレオチド配列は全長FlgMペプチドをコードする。1つの態様において、トリアコンタヌクレオチド配列およびポリヌクレオチド配列は、精製タグをコードするヌクレオチド配列および／または切断部位に機能的に連結される。1つの態様において、本方法は、関心対象のポリペプチドの産生のために連続流製造システムを利用する。1つの態様において、連続流製造システムは、インスリン、MaSp1、またはMaSp2 タンパク質を産生する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】組み立てと共役したサルモネラ・エンテリカ鞭毛遺伝子調節を示す。
【図２】対数期培養物における、FlgM抗σ28活性に及ぼすflgMのコドンThr6およびPro8における同義変化の効果を示す。データは、FlgM抗σ28活性のレベルとして示される。野生型コドン (ACC) は、アッセイされた同義的Thr6コドンおよびPro8コドンの15の組み合わせのそれぞれについて、最も低いFlgM活性／ルシフェラーゼ活性を示した。
【図３】flgMのPro8 CCG翻訳欠損対立遺伝子の抑制に及ぼす同義コドン変異誘発の効果を示す。指示薬培地上で野生型FlgM活性を示した変異体を、FlgM配列の上に示す。FlgM活性がわずかに増加した変異体は、Ser2（ACGからAGT）、Thre6（ACCから終止）、Val12（GTTからGTGおよびGTTからGTC）である。FlgM配列の下に示された残りの変異体（10種の単離菌）には、表現型はなかった。括弧内の数字は反復回数を示す。
【図４】抗6xHis抗体を用いるウェスタンブロットによる、操作されたサルモネラ細胞の分泌画分（上部）および細胞性画分（下部）内のFlgM::6xHis::ETK::インスリン-グラルギンキメラタンパク質の検出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
発明の詳細な説明
定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語および語句を以下に定義する。以下の用語および語句の当技術分野で認識される同義語または代替語は、たとえ明確に記載されていなくても企図される。
【００３９】
本開示および特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「1つの (a)」、「1つの (an)」、および「その」は、特に文脈によって明白に指示されていない限り、複数形も含む；すなわち、特に示されない限り、「1つの」は「1つまたは複数」を意味する。
【００４０】
「約」または「およそ」という用語は、大体、おおよそ、またはほぼを意味する。「約」または「およそ」という用語はさらに、当業者によって決定された特定の値に対する許容可能な状況的誤差範囲内を意味し、それは、その値がどのように測定または決定されたか、すなわち、測定系の限界、または例えば栄養製剤内の栄養素の量といった特定の目的のために必要とされる精度に一部依存するであろう。「約」または「およそ」という用語が数値範囲と共に用いられる場合、それは、記載される数値の上下に境界を広げることによってその範囲を修飾する。例えば、「約5.5から6.5 g/l」は、数値範囲の境界が5.5よりも下および6.5よりも上に広がることを意味し、したがって問題となっている特定の値はその範囲内と同じ機能的結果を達成する。例えば、「約」および「およそ」は、当技術分野における実施による1つまたは複数の標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」および「およそ」は、所与の値の20%まで、好ましくは10%まで、より好ましくは5%まで、およびより好ましくは1%までの範囲を意味し得る。
【００４１】
「Aおよび／またはB」などの語句で用いられる「および／または」という用語は、「AおよびB」、「AまたはB」、「A」、ならびに「B」を含むことが意図される。同様に、「A、B、および／またはC」などの語句で用いられる「および／または」という用語は、以下の態様：A、B、およびC；A、B、またはC；AまたはC；AまたはB；BまたはC；AおよびC；AおよびB；BおよびC；A（のみ）；B（のみ）；ならびにC（のみ）のそれぞれを包含することが意図される。
【００４２】
特に既定されない限り、「A%〜B%」、「A〜B%」、「A%からB%」「AからB%」、「A%〜B」、「A%からB」という指定はすべて、所与のそれらの通常のおよび慣例的な意味である。いくつかの態様において、これらの指定は同義語である。
【００４３】
「実質的に」または「実質的な」という用語は、記載されるかまたは特許請求される状態が、記載される基準としてすべての重要な局面において機能することを意味する。したがって、「実質的に含まない」は、たとえ数値がいくらかの不純物または物質の存在を示すとしても、不含状態としてすべての重要な局面において機能する状態を包含することが意図される。「実質的な」は一般に、90%よりも大きい、好ましくは95%よりも大きい、最も好ましくは99%よりも大きい値を意味する。特定の値が本明細書および本特許請求の範囲において用いられる場合には、特に明記されない限り、「実質的に」という用語は、特定の値に対する許容可能な誤差範囲内を意味する。
【００４４】
「任意の」または「任意に」は、その後に記載される事象、状況、または材料が発生または存在してもしなくてもよいこと、ならびにその記載が、その事象、状況、または材料が発生または存在する場合およびそれが発生または存在しない場合を含むことを意味する。
【００４５】
「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、核酸分子（例えば、発現ベクター）のレシピエント細胞への導入を意味する。形質転換またはトランスフェクション技法は、当技術分野に周知である。核酸配列（例えば、発現ベクターによって運ばれるコード配列）が該レシピエント（宿主）細胞のゲノム（染色体DNA）中に導入される（組み込まれる）ことが規定され得る。
【００４６】
「FlgM」および「flgM」は、それぞれIII型分泌系においてフラジェリン合成を負に調節するタンパク質およびポリヌクレオチド配列を指す (Gillen and Hughes, Molecular Characterization of flgM, a Gene Encoding a Negative Regulator of Flagellin Synthesis in Salmonella typhimurium , J. Bacteriology 173(20): 6453-6459 (1991))。
【００４７】
「組換え体」または「変異体」という用語は、参照産物が、天然に存在するその対応物に関して変更されていることを意味する。
【００４８】
「トリアコンタヌクレオチド配列」という用語は、少なくとも30ヌクレオチド長であるヌクレオチド配列を意味する。例えば、本発明のトリアコンタヌクレオチド配列は30ヌクレオチドからなってよく、または例えば全長FlgMタンパク質をコードするより大きな配列の一部であってよい。
【００４９】
「コドン」という用語は、まとまって1アミノ酸をコードする3つの連続したヌクレオチドを指す。
【００５０】
「デカコドン」という用語は、少なくとも5コドン（すなわち、少なくとも15ヌクレオチド）を含むヌクレオチド配列を意味する。例えば、本発明のデカコドン配列は10コドンからなってよく、または約97コドンを含み、全長FlgMペプチドをコードし得る。
【００５１】
「同義コドン」という用語は、野生型と比較して変更されているが、野生型コドンと同じアミノ酸をコードするコドンを意味する。
【００５２】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「ヌクレオチド」という用語は、本明細書において同義的に用いられる。「ポリヌクレオチド」という用語は、単数形または複数形で用いられる場合、非修飾RNAもしくはDNAまたは修飾RNAもしくはDNAであってよい、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを一般的に指す。したがって、例えば、本明細書において定義されるポリヌクレオチドには、非限定的に、一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖および二本鎖領域を含むDNA、一本鎖および二本鎖RNA、ならびに一本鎖および二本鎖領域を含むRNA、一本鎖もしくはより典型的には二本鎖であってよい、または一本鎖および二本鎖領域を含み得るDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子が含まれる。したがって、安定性のためまたは他の理由のために修飾された骨格を有するDNAまたはRNAは、この用語が本明細書において意図される「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシンなどの通常にはない塩基またはトリチウム標識塩基などの修飾塩基を含むDNAまたはRNAも、本明細書において定義される「ポリヌクレオチド」という用語内に含まれる。一般に、「ポリヌクレオチド」という用語は、非修飾ポリヌクレオチドの、化学的に、酵素的に、および/または代謝的に修飾された形態をすべて包含する。ポリヌクレオチドは、インビトロ組み換えDNA媒介技法を含む種々の方法により、ならびに細胞および生物内でのDNAの発現により作製され得る。
【００５３】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、本明細書において同義的に用いられる。本明細書で用いられる場合、「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」および複数の「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合（ペプチド結合としても公知である）によって直線的に連結された単量体（アミノ酸）から構成された分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、2つまたはそれ以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、特定の長さの産物を指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または2つもしくはそれ以上のアミノ酸の鎖を指すために用いられる任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはこれらの用語のいずれかと互換的に使用され得る。「ポリペプチド」という用語はまた、非限定的に、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、または非天然起源のアミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことが意図される。ポリペプチドは天然の生物学的供給源に由来しても、または組み換え技術により産生されてもよいが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるわけではない。ポリペプチドは、化学合成によるなどの任意の様式で作出され得る。本発明のある特定の態様は、少なくともFlgMペプチドおよびポリペプチドを含む融合ペプチドを含み、ポリペプチドとFlgMペプチドは天然では互いに会合していない（すなわち、ポリペプチドはFlgMペプチドに対して異種である）。そのようなポリペプチドは、「異種ポリペプチド」、「標的ポリペプチド」、「所望のポリペプチド」、または「関心対象のポリペプチド」と称され得る。
【００５４】
「単離された」生体成分（核酸分子またはタンパク質など）は、この成分が天然に存在する生物の細胞中の他の生体成分、すなわち、他の染色体および染色体外のDNAおよびRNA、タンパク質、ならびに細胞小器官から実質的に分離されるか、または精製されている。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。この用語はまた、宿主細胞での組み換え発現によって調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学合成された核酸を包含する。
【００５５】
「異種の」、「外来の」、または「非天然の」という用語は、例えば天然では互いに会合していない2つの構造を指す。例えば、ヌクレオチド配列が異種プロモーターに機能的に連結される場合、該ヌクレオチド配列と該プロモーター配列が同じ生物に由来し得るとしても、該ヌクレオチド配列は天然では該プロモーターと会合していない。
【００５６】
「リボ核酸」および「RNA」という用語は、本明細書において同義的に用いられる。
【００５７】
「デオキシリボ核酸」および「DNA」という用語は、本明細書において同義的に用いられる。
【００５８】
本明細書で用いられる「ベクター」は、クローニングベクター、発現ベクター、BACもしくはYACベクターを含むプラスミド、またはポリヌクレオチド配列を細胞内に輸送することができる他の核酸分子であってよい。ベクターは、ポリヌクレオチド配列の貯蔵、クローニングのために設計され得、および／またはポリヌクレオチド配列の発現のために設計され得る。プラスミドはベクターの一般的に使用される形態であるため、「プラスミド」と「ベクター」は互換的に使用され得る。「発現ベクター」という用語は、細胞による発現に適した形態の（例えば、転写制御エレメントに連結された）遺伝子構築物を含む任意のベクター（例えば、プラスミド、コスミド、またはファージ染色体）を含む。本明細書で用いられる「構築物」または「遺伝子構築物」は、染色体および／またはミトコンドリアゲノム全体を含むわけではない。特定の宿主細胞内で使用するのに適した発現ベクターは公知であり、日常的な実験および公知の技法を用いて容易に同定される（例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,785,830号；第8,663,980号；第8,628,954号を参照されたい）。
【００５９】
本明細書で用いられる「宿主細胞」は、分子が導入されるかまたは導入されている細胞を指す。一般に、本明細書における宿主細胞は、外来（異種、非天然）分子が導入されるかまたは導入されている細胞を指す。ある特定の態様において、本明細書における宿主細胞は細菌細胞である。ある特定の態様において、宿主細胞はグラム陰性菌細胞である。ある特定の態様において、宿主細胞は、III型分泌 (T3S) 系 (T3SS) などの分泌系を含む細菌細胞である。ある特定の態様において、本明細書における宿主細胞は、サルモネラ、シゲラ、クラミジア、エルシニア、シュードモナス、およびエシェリキア細胞からなる群より選択される。ある特定の態様において、本明細書における宿主細胞は、サルモネラ・エンテリカ血清型チフィムリウム (Salmonella enterica serovar Typhimurium)、フレクスナー赤痢菌 (Shigella flexneri)、トラコーマクラミジア (Chlamydia trachomatis)、仮性結核菌 (Yersinia pseudotuberculosis)、緑膿菌 (Pseudomonas aeruginosa)、および大腸菌細胞からなる群より選択される。
【００６０】
本明細書で用いられる「精製タグ」は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および／またはアフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質精製を補助するリガンドを指す。精製タグおよびそれらの使用は当技術分野に周知であり（例えば、Thermo Scientific Protein Purification Handbook 2010を参照されたい）、例えば、ポリヒスチジン、グルタチオンS-トランスフェラーゼ (GST)、Myc、HA、FLAG、またはマルトース結合タンパク質 (MBP) であってよい。したがって、タンパク質を精製、回収、取得、または単離する段階は、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、またはアフィニティークロマトグラフィーを含み得る。ある特定の態様において、FlgMペプチドまたはFlgMを含む融合（キメラ）タンパク質を精製する段階は、アフィニティークロマトグラフィー、および例えば、σ28アフィニティーカラム、またはFlgMもしくは融合タンパク質の別のメンバーと結合する抗体を含むアフィニティーカラムを利用する。1つの態様において、少なくともFlgMペプチドおよび精製タグを含む融合タンパク質を精製する段階は、アフィニティークロマトグラフィー、および例えば精製タグと結合するアフィニティーカラムを利用する。
【００６１】
本明細書で用いられる「切断部位」は、化学物質またはタンパク質（例えば、制限酵素またはプロテアーゼ）によって認識および／または切断される配列を指す。切断部位は当技術分野に周知である（例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられるUS PG PUB NO. 2015/0037868を参照されたい）。切断部位はポリヌクレオチド配列（例えば、制限酵素部位）またはアミノ酸配列（例えば、ペプチダーゼ部位）であり得るため、当業者は、それが列挙される文脈に基づいて、「切断部位」がポリヌクレオチド配列を指すのかまたはアミノ酸配列を指すのかを認識するであろう。例示的な切断部位には、アラニンカルボキシペプチダーゼ、ナラタケ (Armillaria mellea) アスタシン、細菌性ロイシルアミノペプチダーゼ、癌凝血原、カテプシンB、クロストリパイン、サイトゾルアラニルアミノペプチダーゼ、エラスターゼ、エンドプロテイナーゼArg-C、エンテロキナーゼ、ガストリクシン、ゼラチナーゼ、Gly-Xカルボキシペプチダーゼ、グリシルエンドペプチダーゼ、ヒトライノウイルス3Cプロテアーゼ、ヒポデルミンC、Iga特異的セリンエンドペプチダーゼ、ロイシルアミノペプチダーゼ、ロイシルエンドペプチダーゼ、lysC、リソソームpro-Xカルボキシペプチダーゼ、リシルアミノペプチダーゼ、メチオニルアミノペプチダーゼ、粘液細菌、ナリジリシン、膵エンドペプチダーゼE、ピコルナイン2A、ピコルナイン3C、プロエンドペプチダーゼ、プロリルアミノペプチダーゼ、プロタンパク質転換酵素I、プロタンパク質転換酵素II、ルスセリリシン、サッカロペプシン、セメノゲラーゼ、T-プラスミノーゲン活性化因子、トロンビン、組織カリクレイン、タバコエッチウイルス (TEV)、トガビリン、トリプトファニルアミノペプチダーゼ、U-プラスミノーゲン活性化因子、V8、ベノンビンA、ベノンビンAB、およびXaa-proアミノペプチダーゼからなる群より選択されるプロテアーゼによって認識されるものが含まれる。全体として参照により本明細書に組み入れられるUS PG PUB NO. 2015/0037868を参照されたい。いくつかの態様において、切断部位はプロテアーゼ切断部位である。いくつかの態様において、切断部位は、タバコエッチウイルス (TEV) またはエンテロキナーゼ (ETK) 切断部位である。融合（キメラ）ペプチドの成分は、融合ペプチド精製の段階の前、間、または後に、切断部位における切断によって分離（遊離）することができる。例えば、融合ペプチドが、異種ポリペプチドおよび切断部位に融合されたFlgMタンパク質を含み、融合ペプチドが培養液中に分泌されている場合、培養液からの精製の段階の前にプロテアーゼを培養液に適用することによってFlgMタンパク質とポリペプチドを分離することができ、または融合ペプチドを培養液から精製することができ、次いでプロテアーゼを融合ペプチドに適用して、ポリペプチドからFlgMタンパク質を遊離させることができる。ある特定の態様において、融合ペプチド分解（切断）の段階は、精製の段階と同時に行われる。例えば、融合ペプチドをアフィニティーカラムに通過させることができ、異種ポリペプチドまたは精製タグがアフィニティーカラムと結合し得、結合している間に、切断部位が切断され融合ペプチドが分解するように切断剤を適用することができる。
【００６２】
通常通り、「NH2」または「N-」という指定はアミノ酸配列のN末端を指し、「COOH」または「C-」という指定はアミノ酸配列のC末端を指す。
【００６３】
本明細書で用いられる「天然に存在する」、「天然の」、または「野生型」という用語は、対象物に適用される場合、対象物が自然界において見出され得るという事実を指す。例えば、天然源から単離され得、かつ人間によって実験室内でまたは別の方法で意図的に改変されていない、生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、野生型である。
【００６４】
本明細書で用いられる「変異」は、野生型配列と比較した場合の、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列における変動を指す。本明細書における変異または「変更」とは、通常、代替的であるが同義的なコドン（すなわち、変異の結果として変化しない、コードされるアミノ酸残基）をもたらす、コードポリヌクレオチド配列内に生成された核酸変化である。そのような変異体の生成および同定、最適化された同義コドン、配列は、本明細書においてさらに記載される通りである。
【００６５】
本明細書で用いられる「制御配列」という用語は、それらが連結されているコード配列の発現およびプロセシングをもたらすのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。「制御配列」という用語は、最低でも、その存在が発現およびプロセシングに不可欠であるすべての成分を含むことが意図され、その存在が有利となる付加的な成分、例えばリーダー配列および融合パートナー配列もまた含み得る。制御配列は「転写制御エレメント (TCE)」であってよく、その性質は宿主生物に応じて異なる。当業者は、原核生物では、そのようなTCEは一般にプロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含み、真核生物では、一般にそのようなTCEはプロモーターおよび転写終結配列を含むことを認識するであろう。制御配列は、調節可能（例えば、誘導性）であっても、または構成的であってもよい。
【００６６】
本発明に従って、任意のプロモーターを使用することができる。プロモーターは通常、コード配列の上流（5'側）のヌクレオチド配列を指し、RNAポリメラーゼ、および正確な転写に必要な他の因子の認識を提供することによって、コード配列の発現を制御する。本発明に従って使用されるプロモーターは、発現制御のために調節エレメントが付着している、転写開始部位を特定する最小プロモーターを含み得る。
【００６７】
本明細書で用いられる「機能的に連結された」または「動作可能に連結された」という用語は、成分が、意図されたように機能することを可能にする関係にあるような、成分の位置決めを指す。当業者は、ある特定の状況において、および成分（例えば、切断部位または精製タグ）の性質に応じて、共に「機能的に連結された」2つまたはそれ以上の成分が、必ずしも隣接して連結されていないか、または隣接して会合していないことを認識するであろう。コード配列に「機能的に連結された」制御配列は、制御配列と適合する条件下でコード配列の発現が達成されるように連結されている。2つのポリヌクレオチド配列が、転写制御エレメント (TCE)（または2つ以上の転写制御エレメント）などの制御配列と機能的に連結されると称される場合、当業者は、種々の配置が機能的であり、包含されることを認識するであろう。例えば、当業者は、少なくとも以下の配置のすべてが包含されることを認識するであろう：NH2‐転写制御エレメント‐第1ポリヌクレオチド配列‐第2ポリヌクレオチド配列‐COOH；NH2‐転写制御エレメント‐第2ポリヌクレオチド配列‐第1ポリヌクレオチド配列‐COOH；NH2‐第1転写制御エレメント‐第1ポリヌクレオチド配列‐第2転写制御エレメント‐第2ポリヌクレオチド配列‐COOH；NH2‐第2転写制御エレメント‐第2ポリヌクレオチド配列‐第1転写制御エレメント‐第1ポリヌクレオチド配列‐COOH；NH2‐第1転写制御エレメント‐第2ポリヌクレオチド配列‐第2転写制御エレメント‐第1ポリヌクレオチド配列‐COOH；NH2‐第2転写制御エレメント‐第1ポリヌクレオチド配列‐第1転写制御エレメント‐第2ポリヌクレオチド配列‐COOH；およびこれらの組み合わせ。さらに、例えば、変異トリアコンタヌクレオチド配列が、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、精製タグをコードする核酸配列、および切断部位と機能的に連結されると称される場合、当業者は、種々の配置が機能的であり、包含されることを認識するであろう。例えば、そのような当業者は、少なくとも以下の配置が包含されることを認識するであろう（5'から3'末端に）：5'-（変異トリアコンタヌクレオチド配列）-（切断部位）-（ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列）‐3'；5'-（精製タグをコードする核酸配列）-（変異トリアコンタヌクレオチド配列）-（切断部位）-（ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列）‐3'；5'-（変異トリアコンタヌクレオチド配列）-（切断部位）-（ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列）‐（精製タグをコードする核酸配列）-3'；およびこれらの組み合わせ。
【００６８】
2つの核酸配列または2つのアミノ酸配列の間の類似性は、「配列同一性」と称される。配列同一性は、同一性（または類似性）の割合という点で測定される場合が多い；割合が高いほど、2つの配列はより類似している。ヒトポリペプチドの相同体またはオルソログ、および対応するcDNAまたは遺伝子配列は、標準的な方法を用いて整列させた場合、比較的高度の配列同一性を有するであろう。この配列同一性は、オルソロガスなタンパク質または遺伝子またはcDNAが、より遠縁にある種（例えば、ヒトおよび線虫 (C. elegans) の配列）と比較して、より近縁にある種（例えば、ヒトおよびチンパンジーの配列）に由来する場合に、より顕著となるであろう。
【００６９】
比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野において周知である。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、Smith & Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981；Needleman & Wunsch J. Mol. Biol. 48: 443, 1970；Pearson & Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988；Higgins & Sharp Gene, 73: 237-244, 1988；Higgins & Sharp CABIOS 5: 151-153, 1989；Corpet et al. Nuc. Acids Res. 16, 10881-90, 1988；Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8: 155-65, 1992；およびPearson et al. Meth. Mol. Bio. 24:307-31, 1994に記載されている。Altschul et al. J. Mol. Biol. 275:403-410, 1990には、配列アラインメント法および相同性計算の詳細な検討が提示されている
【００７０】
NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al. J. Mol. Biol. 275:403-410, 1990) は、配列解析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastn、およびtblastxと関連した使用のために、National Center for Biotechnology Information（NCBI、Bethesda, Md.）およびインターネット上を含むいくつかの情報源から利用可能である。例として、約30アミノ酸超のアミノ酸配列の比較については、デフォルトパラメータ（ギャップ存在コスト11、および1残基当たりのギャップコスト1）に設定されたデフォルトBLOSUM62マトリックスを用いて、Blast 2配列関数が使用される。短いペプチド（およそ30アミノ酸より少ない）を整列させる場合には、デフォルトパラメータ（オープンギャップ9、伸長ギャップ1のペナルティ）に設定されたPAM30マトリックスを使用して、Blast 2配列関数を用いてアラインメントが行われる。
【００７１】
2つの核酸分子が密接に関連しているという別の示唆は、2つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするということである。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる環境パラメータにおいては異なる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHにおいて、特定の配列の熱融点 (Tm) よりも約5℃から20℃低くなるように選択される。Tmは、標的配列の50%が、完全に一致するプローブまたは相補鎖とハイブリダイズされたままとなる（規定のイオン強度およびpHにおける）温度である。核酸ハイブリダイゼーションの条件およびストリンジェンシーの計算は、Sambrookら (In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1989) およびTijssen (Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I, Chapter 2, Elsevier, New York, 1993) において見出すことができる。
【００７２】
高度の配列同一性を示さない核酸配列は、遺伝暗号の縮重のために、それでもなお類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を用いて核酸配列に変化を起こして、すべてが実質的に同じタンパク質をコードする複数の核酸分子を生成することができることが理解される。
【００７３】
「翻訳に及ぼす同義コドンおよびコドン文脈の効果」という語句は、頭字語CEOT（codon effects on translation（翻訳に及ぼすコドン効果））を用いて称され得る。本明細書における「同義コドン変異体」(SCM) という語句は、野生型コード配列と比較して1つまたは複数の同義コドンを含むように変異誘発されたコード配列を指す。「SCM flgM」という語句は、変異誘発され、その変異誘発の結果として1つまたは複数の同義コドンを含む、flgMコード配列を指す（すなわち、「SCM flgM」は変異flgMコード配列を指す）。本明細書で用いられる場合、「同義コドン変異誘発／変更」(SCA) は、得られた変異／変更配列が、対応する対照配列と比較して1つまたは複数の同義コドンを含むように、コード配列を変異させる（すなわち、変更する）段階を指す。
【００７４】
翻訳速度をアッセイする方法
本発明は、サルモネラのヒスチジン生合成 (his) オペロンにおける、転写減衰と称される調節機構の特徴を利用した、翻訳速度を決定するためのアッセイに関する（Chevance et al., PLOS Genetics 10(6):1-14 (2014) を参照されたい）。his構造遺伝子の転写は、細胞内の荷電ヒスチジル-tRNAのレベルに依存し、mRNAまたはリーダーペプチドの安定性に依存しない。hisオペロンの5'領域は、7個の連続したHisコドンを伴う16アミノ酸のオープンリーディングフレームを有する。荷電His-tRNAレベルが高い場合には、減衰が起こり、RNAポリメラーゼはhisオペロンの転写を停止する。荷電His-tRNAが低い場合には、リボソームが7個のHisコドンのひと続き内で失速し、減衰機構は阻止され、その結果、RNAポリメラーゼはHis-tRNAの限定に応答してhis構造遺伝子へと続く。個々のコドン、コドンの対、三つ組等を介した翻訳の速度を測定し、リボソームが、同じアミノ酸に対する異なるコドン（いわゆるサイレントコドンまたは同義コドン）を介していかに速く翻訳し得るかをインビボで測定するための系が開発された。このような方法で、翻訳速度に関し、かつ1つまたは複数の同義コドンが翻訳速度にいかに影響を及ぼすかを判定するためのアッセイが開発された。
【００７５】
his構造遺伝子を、His減衰のレポーターとしてのlacオペロンと置き換えることにより、例示的な系が構築された。his減衰系がlacオペロン転写を制御する状態で、この系は呈色指示薬培地を利用して、減衰の簡単な定量的色読み取りを提供し得る。コロニー‐色表現型に基づいて、減衰されるかまたは減衰されないかのいずれかであるhis-lac構築物のレベルが決定される。lacオペロンレポーター系を用いて、リーダーペプチドのHis5位が63コドンのすべてと置換され、リーダーペプチド領域におけるリボソーム失速の程度に及ぼす個々のコドンの効果が測定された（同文献）。His5におけるコドン変化に起因するリボソームの失速によって生じた脱減衰のレベルが測定された。終止コドン（UAA、UAG、およびUGA）は最も高レベルの脱減衰を示し、アルギニンコドンAGAおよびAGGは高レベルの脱減衰を示した（同文献）。単一のtRNA種によって読み取られる第3位NNU対NNCを比較したところ、NNUの翻訳は、NNCと比較してより高レベルの脱減衰を示した（同文献）。これは、NNGが単一のtRNA種によって同族NNUよりも速く翻訳されることを示すインビトロ研究と一致する。
【００７６】
翻訳速度に及ぼすコドン文脈の効果を測定するためのこの翻訳速度計アッセイの使用は、UCAコドンとの5'および3'文脈における各コドンの効果を測定することによってさらに実証された。UCAコドンは、たった1つの必須tRNA種、SerT tRNAによって翻訳されるという理由で、特に有用である。hisオペロンリーダーペプチド中のHis4-His5に配置されたすべてのUCA-NNNおよびNNN-UCAコドン対について、Mac-Lac指示薬培地上でhis-lac発現が決定された。64コドンのうちの22コドンが、コドン文脈効果を示した。換言すると、64コドンのうちの22コドンについて、UCA-NNNおよびNNN-UCAコドン対で翻訳速度が異なった。最も著しい文脈効果は、チロシンコドンを用いて得られた。UCA-UAUおよびUCA-UAC構築物は、終止コドンによって生じたものに匹敵するレベルの脱減衰を示した。しかしながら、逆方向のUAU-UCAおよびUAC-UCAでは、脱減衰は低い。UCA-UAUおよびUCA-UACコドン対は緩やかな速度で翻訳されるのに対して、逆方向のUAU-UCAおよびUAC-UCAは速い速度で翻訳される。CGUコドンによるコドン文脈効果もまた著しい。UCA-CGUおよびCGU-UCAはいずれも速い翻訳速度を示すが、His4-His-5位におけるCAU (His)-CGUは非常に遅い速度で翻訳される。
【００７７】
翻訳速度を調節する方法
細菌は、異なる構造および機能を有する種々の分泌系を含む。例えばグラム陰性菌は、外膜および内膜の一方または両方にまたがり、環境応答、接着、または病原性過程において役割を果たす、少なくとも6種類の異なる分泌系（I〜VI型）を含む（例えば、Costa et al., Secretion systems in Gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights, Nature Reviews, Microbiology 13:343-359 (2015) を参照されたい)。例えば鞭毛の組み立てに関して、細菌は分泌系（例えば、T3SS）を利用することができ、これによって鞭毛の構造および組み立てに必要なタンパク質は細胞質から運び出され、外膜を通過し、そして成長中の鞭毛構造を貫通する。
【００７８】
サルモネラ・エンテリカの鞭毛は、細胞壁および膜に埋め込まれている、フック-基部体 (HBB) 複合体として知られている複雑なモーター構造を含む。HBBは、細胞表面から約10ミクロン伸びる長い外部繊維とつながっている。最大で10,000個までのFlicサブユニットを含む外部繊維が、HBBから伸びる。各繊維は、全細胞タンパク質の約1%に相当する。プロトン駆動力がモーター-繊維の回転に動力を供給して、細菌を液体環境を通しておよび表面を横切って推進させる。HBBはまた、構造の中央チャネルを通して物質が分泌するように指示するIII型分泌系を含む。サブユニットは成長中の細胞小器官の先端に移動し、そこで正しい位置に自己組織化する。
【００７９】
鞭毛レギュロン内には60を超える遺伝子が存在し、これには化学受容系の遺伝子が含まれる。これらの遺伝子の転写は、図1に示されるように鞭毛組み立てと共役している。鞭毛レギュロンは、3つのプロモータークラスの転写階層で構成されている。クラス1オペロンは、マスターオペロンと称される場合が多く、転写調節因子FlhDおよびFlhCをコードする。FlhDタンパク質とFlhCタンパク質は複合体、FlhD4C2を形成し、これは鞭毛クラス2プロモーターからのσ70 RNAポリメラーゼ依存性転写を指示する。クラス2プロモーターから発現される遺伝子は、HBB複合体の構造および組み立てに必要なタンパク質をコードする。HBB遺伝子に加えて、いくつかの調節タンパク質がクラス2プロモーターから転写される；これらの中で顕著なのは、σ28構造遺伝子、FliA、および抗σ28遺伝子、FlgMである。σ28およびFlgMは、鞭毛クラス3プロモーターの転写をHBBの完了と共役させる調節タンパク質である。σ28タンパク質は、RNAポリメラーゼに鞭毛クラス3プロモーターから転写するように指示する鞭毛特異的転写因子である。クラス3遺伝子には、鞭毛繊維の構造遺伝子、および細胞外リガンドの濃度変化に従って鞭毛回転の方向を制御する化学受容シグナル伝達系の遺伝子が含まれる。
【００８０】
HBBの組み立て中、鞭毛III型分泌 (T3S) 系はロッド-フック分泌基質に特異的である。HBBが完了すると、T3S装置のFlhB成分が立体構造変化を起こし、分泌特異性が後期または繊維型分泌に切り替わる。HBBが完了する前は、FlgMが鞭毛クラス3プロモーターからのσ28依存性転写を阻害する。FlgMは後期分泌基質であり、HBBが完了し、分泌特異性が切り替わると、FlgMが細胞から分泌されてσ28を放出し、クラス3プロモーターから転写が行われる。
【００８１】
FlgMタンパク質は、分泌過程中に切断されないそのN末端に、分泌シグナルを含む。T3SSを介した基質分泌は、分泌装置への基質のシャペロン支援送達によって促進される場合が多い。このような方法で、FlgM分泌は、分泌シャペロンσ28がFlgMのC末端側半分に結合することによって大幅に強化される。
【００８２】
FlgMは小型のT3S基質であり、最終的な鞭毛構造の一部ではないため、外来タンパク質をペリプラズムまたは細胞外環境に直接分泌させるための媒体としてこれを使用することができる。本発明者らは、異種コード配列に機能的に連結されたFlgMポリヌクレオチド配列が、様々な生物において発現され、鞭毛T3S系によって分泌され得ることを示した（全体として参照により本明細書に組み入れられるPG PUB NO. 2015/0225466を参照されたい）。具体的には、異種タンパク質に融合されたFlgMペプチドを含むキメラタンパク質は、発現され、鞭毛T3SS構造を介して培養液中に分泌される（全体として参照により本明細書に組み入れられるPG PUB NO. 2015/0225466を参照されたい）。本発明者らは、FlgM融合ペプチドの発現を、誘導性および／または過剰発現制御配列を用いて制御することができ、それを培地中の塩濃度（例えば、NaClおよびKCl）によって操作することができ、種々の手段を用いて融合ペプチドまたはその成分を培地から単離することができることをさらに示した（同文献）。
【００８３】
本明細書における実施例では、キメラタンパク質の産生調節および培地中への分泌のためのT3SSの使用をさらに実証する。1つの態様において、ポリペプチドはインスリンである。
【００８４】
本明細書で用いられる場合、「インスリン」という用語は、動物の体内における炭水化物の代謝に影響を及ぼし、かつ糖尿病の処置に有用である膵臓の有効成分を意味する。本用語は、構造、使用、および意図される効果が天然に存在するインスリンと同じかまたは類似しており、糖尿病の処置に有用である合成および生物工学由来の産物を含む。
【００８５】
「インスリン」または「インスリン分子」という用語は、SEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸配列を有するA鎖ペプチドおよびSEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列を有するB鎖ペプチドを含む51アミノ酸ヘテロ二量体を指定する総称であり、A鎖の6位と11位のシステイン残基はジスルフィド結合で連結されており、A鎖の7位とB鎖の7位のシステイン残基はジスルフィド結合で連結されており、A鎖の20位とB鎖の19位のシステイン残基はジスルフィド結合で連結されている。「インスリン」という用語はまた、インスリン分子の前駆体も含む。
【００８６】
本明細書で用いられる「インスリン類縁体」という用語は、天然のA鎖ペプチドおよび／またはB鎖ペプチドの1つまたは複数の修飾を含む任意のヘテロ二量体類似体を含む。修飾には、これらに限定されないが、A4、A5、A8、A9、A10、A12、A13、A14、A15、A16、A17、A18、A19、A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B15、B16、B17、B18、B20、B21、B22、B23、B26、B27、B28、B29、およびB30から選択される位置の天然アミノ酸をあるアミノ酸で置換すること；ならびに／またはB1〜4位およびB26〜30位のいずれかもしくはすべてを欠失させることが含まれる。インスリン類似体には、A鎖ペプチドおよび／またはB鎖ペプチドのNまたはC末端において1から10アミノ酸を有する分子が含まれる。インスリン類似体には、A鎖ペプチドおよび／またはB鎖ペプチドのC末端においてアミド化された分子がさらに含まれる。インスリン類似体の例には、これらに限定されないが、公開国際出願WO20100080606、WO2009/099763、およびWO2010080609に開示されているヘテロ二量体類似体が含まれ、それらの開示は参照により本明細書に組み入れられる。インスリングラルギン（Gly (A21)、Arg (B31)、 Arg (B32)‐ヒトインスリン）、インスリンリスプロ（Lys (B28)、Pro (B29)‐ヒトインスリン）、インスリングルリジン（Lys (B3)、Glu (B29)‐ヒトインスリン）、およびインスリンデテミル（Lys-ミリスチン酸 (B29)‐ヒトインスリン）は、市販のインスリン類似体の例である。
【００８７】
「インスリン類似体」という用語はさらに、インスリン受容体において検出可能な活性をほとんどまたは全く有さないが、1つまたは複数のアミノ酸修飾または置換を含むように修飾されており、天然インスリンと比較してインスリン受容体において少なくとも1%、10%、50%、75%、または90%の活性を有する、インスリン受容体における活性を有するヘテロ二量体ポリペプチド分子を含む。特定の局面において、インスリン類似体は、インスリン受容体において天然インスリンの1/2から1/100の活性を有する部分的作動薬である。他の局面において、インスリン類似体は、インスリン受容体において増強された活性を有する。
【００８８】
本明細書においてさらに記載されるのは、鞭毛分泌系遺伝子内の同義コドン変異体を利用する発現系、およびそのような変異体に機能的に付加された場合の異種ポリヌクレオチド翻訳を調節する方法である。本発明の同義コドン変異誘発は、宿主細胞（生物）のコドン使用（バイアス）に依存する従来のコドン最適化とは異なる。コドン使用バイアスは、特定のコドンが特定の生物によって使用される相対量に依存する。当技術分野では、生物間で、あるアミノ酸に対する1つの同義コドンが、同じアミノ酸に対する他の同義コドンと比較してより多く見られる（より高頻度で使用される）（すなわち、生物は、特定の同義コドンの使用を「好む」か、またはその使用に向かう「バイアス」を有する）ことが、長い間認識されてきた。多様な生物は異なる同義コドンを好む可能性があり、したがって異なるコドン使用バイアスを有し得る。
【００８９】
大腸菌およびサルモネラ・エンテリカにおけるコドン使用頻度の表を以下に示す。その中で、より高い使用頻度値は、その同義コドンに向かうより大きなバイアス（選好）に相当する（WorldWideWeb.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics/topics/rev-sup/wobble.html、最終訪問日2015年11月15日、において利用可能である）。The Codon Bias Database（WorldWideWeb.ホームページ、luc.edu/~cputonti/cbdb/genera/shigella.html）およびHilterbrandら (CBDB: The codon bias database, BMC Bioinformatics 13 (62):1-7 (2012)) もまた参照されたい。
2018529365.tif 000005
【００９０】
一般に、例えば宿主細胞内での異種ポリヌクレオチド配列の発現に関して、宿主細胞の好ましい同義コドンが存在すると、翻訳効率が上昇する。従来のコドン最適化技法は、翻訳効率を上昇させるために宿主細胞の好ましいコドンが存在するように、または翻訳効率を低下させるために宿主細胞の好ましいコドンが存在しないように、コード配列を変異誘発することによって、コドン使用バイアスを利用する。
【００９１】
遺伝子発現を増減させる、サルモネラIII型分泌系のfliA、fliC、およびflgM遺伝子における同義コドン変異が単離されている。fliAに関して、GAUからGACへの同義コドン13 (Asp) 変化は、産生されるσ28タンパク質の約2倍の増加をもたらした (Barker, C. S., et al., Assembling Flagella in Salmonella Mutant Strains Producing a Type III Export Apparatus without FliO, J. Bacteriol. 196(23):4001-4011 (2014))。同様に、サルモネラT3SSのfliC遺伝子に関して、UUGからCUGへの同義コドン13 (Leu) 変化により、約2倍多くのFliCタンパク質が産生されたのに対して、コドン14 (Thr) におけるACCからACAまたはACGのいずれかへの同義コドン変化により、それぞれ約2倍および約1.5倍多くのFliCタンパク質が産生された (Rosu, V., et al., Translation Inhibition of the Salmonella fliC Gene by the FliC 5' Untranslated Region, fliC Coding Sequences, and FlgM, J. Bacteriol. 188(12):4497-4507 (2006))。
【００９２】
例えば上記の表内に記載されるコドン使用バイアスに基づくと、サルモネラはAsp GAUコドン (33) をGAC (22) よりも好むため、GACコドンを用いてタンパク質産生が少なくとも約2倍増加したことは驚きである（Barker et al.、上記）。同様に、Thr ACCコドン (25) をACA (6) およびACG (15) コドンをよりも好むため、それぞれACAおよびACGコドンを用いてタンパク質産生が少なくとも約2倍および1.5倍増加したことは驚きである（Rosu et al.、上記）。
【実施例】
【００９３】
細菌株および培地
サルモネラ・エンテリカ血清型チフィムリウムの一般的に用いられる非病原性株LT2をすべての実験に使用した。LT2は、それを非病原性とするropSおよびmviA遺伝子における変異を有する（Yarns, Rates of aminoacyl-tRNA selection at 29 sense codons in vivo, J. Mol. Biol. 209: 65-77 (1989)；Hughes & Roth, Transitory cis complementation: a method for providing transposition functions to defective transposons, Genetics 119: 9-12 (1988)；Johnston & Roth, Genetic analysis of the histidine operon control region of Salmonella typhimurium, J. Mol. Biol. 145: 713-734 (1981)）。mviA遺伝子は、サルモネラ病原性に関与する2成分系の調節因子をコードする。rpoS遺伝子産物（定常期シグマ転写因子）は、複数の病原性因子の発現に必要とされる。サルモネラの病原性経路内の2つの変異は、病原性の弱毒化をもたらす。
【００９４】
ルリア-ベルターニ (LB) 培地で細胞を培養し、必要な場合には、アンピシリン（100 μg／ミリリットル）またはテトラサイクリン（15 μg／ミリリットル）を補充した。S.チフィムリウムの普遍形質導入ファージP22 HT105/1 int-201を、すべての形質導入交差において使用した (Johnston & Roth, DNA sequence changes of mutations altering attenuation control of the histidine operon of Salmonella typhimurium, J. Mol. Biol. 145: 735-756 (1981))。
【００９５】
株の構築
Datsenko and Wanner (One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, PNAS 97: 6640- 6645 (2000)) に記載されているように、L-Redリコンビナーゼ系を用いたtetRA挿入および置換によって、標的化染色体変異誘発を行った。
【００９６】
プライマーはすべて、Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) によって合成された。PCR反応はすべて、プルーフリーディングポリメラーゼ（Accuprime Pfx、InvitrogenまたはPhusion、Fermenta）を用いて行った。L-Redによってもたらされた組換え産物を、Taq DNAポリメラーゼを用いてPCRチェックし、さらに配列決定した。
【００９７】
翻訳が最も遅いコドン対の選別
上記のようにL-Red組換えを用いて、遅い対または速い対を含む株を構築した。エレクトロポレーションし、アンヒドロテトラサイクリンプレートにプレーティングした後、このプレートからマッコンキー-ラクトースプレートおよびテトラゾリウム-ラクトース指示薬プレート上にレプリカを取った。テトラゾリウムプレート上の白色コロニー (Lac+) を単離し、DNA配列解析に供した。終止コドンの単離を防ぐために、T-N-Nコドンは特別に回避した。Tz-Lacスクリーニングを用いて、Hisリーダー系において翻訳が遅いコドン対および翻訳が速いコドン対を同定した。
【００９８】
b-ガラクトシダーゼアッセイ
30マイクロリットルの一晩培養物を3 mlの新鮮なLB培地に継代培養した。内容物がOD 0.4の対数期中期密度に到達するまで、チューブを振盪させながら37℃でインキュベートした。培養物を氷上に置き、遠心沈殿させ、3 mlの冷-緩衝生理食塩水中に再懸濁した。0.5 mlの培養試料（必要に応じて希釈した）を、0.55 mlの完全Z緩衝液（Z緩衝液＋5 mlの10%ドデシル硫酸ナトリウムおよび100 mlのクロロホルム）に添加した (Stanley R. Maloy, EXPERIMENTAL TECHNIQUES IN BACTERIAL GENETICS. (Jones and Bartlett Publishers, Inc. 1990))。以前に記載されたように、アッセイを継続した（同文献）。各株に関して、3つの独立した生物学的複製物についてアッセイを行った。
【００９９】
疾患または状態と関連したコード配列内の同義コドン対の同定
疾患または状態と関連したポリヌクレオチド配列（例えば、コード配列）内の同義コドン変異の探索は、例えばデータベースを用いて行われる。同義変異は、任意の付加的な変異（挿入および欠失を含む）とは無関係である。両側に隣接している15塩基対配列に基づいて、同義変異を解析する。同義コドンが変異誘発された／変更された (SCA) ポリヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、ポリヌクレオチド発現に十分な条件において宿主細胞を培養することにより、同義コドン変異がポリヌクレオチド配列の発現（例えば、コードされるタンパク質の発現）に及ぼす効果を検証する。匹敵する対照細胞内の野生型ポリヌクレオチド発現と比較することにより、任意の効果を判定する。生じたタンパク質の産生は、SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングによって決定する。
【０１００】
SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティング
同義コドンが変異誘発されたポリヌクレオチド配列から発現された、FlgM（および任意にポリヒスチジン精製タグ）またはポリペプチドを含む発現されたキメラタンパク質を、全細胞溶解物または培養上清から回収し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、次いで検出のためにポリクローナル抗FlgM抗体、モノクローナル抗6xHis（ウサギ）抗体、または抗ポリペプチド抗体を用いる免疫ブロッティングによって解析する。LI-COR OdysseyまたはBio-Rad ChemiDoc画像システムを用いて、化学発光または赤外線検出によって、抗原-抗体複合体を可視化する。化学発光現像については、西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) 結合二次ヤギ抗ウサギ抗体 (Bio-Rad) およびECL検出キット (Amersham Biosciences) を使用する。赤外線検出については、二次抗ウサギIRDye690 (LI-COR) を使用する。Mac OS X用のImageJ 1.45を用いて、タンパク質バンドのデンシトメトリー測定を行う (Abramoff et al., Image processing with ImageJ, Biophotonics Int. 11:36-42(2004))。
【０１０１】
タンパク質融合物の組換え発現および精製
最適化融合タンパク質を発現する細胞を新鮮な単一コロニーから採取し、10 mlのLB中で一晩増殖させる。一晩培養物をバッフル付フラスコ中の1リットルの新鮮培地に入れて1:100希釈し、振盪インキュベーター内で200 rpmにて6〜12時間増殖させる。必要であれば、0.2%アラビノースまたはNa-サリチル酸の添加によって、最初の2時間後に発現を誘導する。遠心分離 (7,000 rpm) によって細胞をペレット化し、残存細菌を除去するために、関心対象の組換えポリペプチドを含む上清を0.22-μmポリエーテルスルホンフィルター (Corning, NY)、低タンパク質結合膜に通過させる。さらなる精製には、3 gのNi-IDA樹脂（Protino Ni-IDA；Machery-Nagel）を充填した重力流カラム (Bio-Rad) を使用し、250 mMイミダゾールを含む緩衝液を用いてpH 7.5の天然条件下でアフィニティータグ付加タンパク質を溶出する。
【０１０２】
分泌アッセイ
一晩培養物をLBで1:100希釈し、37℃で2時間増殖させてから、0.2% L-アラビノースを添加することによって各FlgM融合物の発現を誘導する。さらに4〜12時間にわたり細胞を37℃で維持し、その間に融合タンパク質を発現させる。その後、すべての株について600 nmでの光学密度 (OD600) を測定する。
【０１０３】
得られた細胞培養物の2ミリリットル分割量を4℃および7,000 rpmで10分間遠心分離して、各分割量についてペレットおよび上清を得る。上清を0.2-μm孔径の低タンパク質結合フィルター（Acrodiskシリンジフィルター；Pall Life Sciences）を通してろ過し、残存細胞を除去する。あるいは、分割量を最大速度で2回遠心分離して、残存細胞を除去する。ろ過したまたは2回遠心分離した上清中の分泌タンパク質を、TCA（10%最終濃度）の添加によって沈殿させる。上清試料を2μLのSDS試料緩衝液（100 mM Tris [pH 6.8]、4% SDS、10%グリセロール、2% B-メルカプトエタノール、25 mM EDTA、0.04%ブロモフェノールブルー）中で再懸濁し、20 OD600単位／μに調整する。細胞のペレット画分を2% SDS試料緩衝液中で懸濁し、20 OD600単位／μLとなるようにその体積を調整する。
【０１０４】
実施例1：翻訳に及ぼす同義コドン変異体の効果
鞭毛抗σ28遺伝子、flgMのアミノ酸Ser7に対するUCAの翻訳に欠陥のあるSerT tRNAの対立遺伝子が単離された (Chevance, F. F., et al., J Bacteriol 188:297-304 (2006))。サルモネラ鞭毛系にはセリンに対するUCAコドンを有する遺伝子が多く存在するにもかかわらず、serT tRNA変異対立遺伝子はflgM翻訳にのみ影響を及ぼした。理論によって縛られることはないが、flgMのUCA (Ser7) コドンの翻訳に及ぼすserT変異対立遺伝子の効果はコドン文脈効果であると考えられる。
【０１０５】
σ28依存性プロモーターからの転写は、FlgMによって阻害される。細菌ルシフェラーゼオペロン (lux) をレポーターとして使用して、FlgMの抗σ28活性を測定した。FlgM活性が高ければ、PmotA-luxのσ28依存性転写は低い。同義変異をSer7位に隣接して導入し、flgM mRNA翻訳に及ぼす隣接同義変異の効果を判定した。
【０１０６】
flgMのUCA Ser7コドンに隣接するThr6コドンおよびPro8コドンの同義変化の全16の組み合わせを作製した。σ28依存性PmotA-lux転写のFlgM阻害を測定した。結果は図2に示した通りである。
【０１０７】
Thr6におけるACU、ACA、またはACGへの同義変化は、FlgM阻害活性の約11から13倍の増加をもたらす。CCUからCCGへの同義的なPro8コドン変化により、FlgM阻害活性は約1/20に低下する。Thr6におけるACCからACUへの変化とPro8におけるCCUからCCGへの変化を組み合わせると、FlgM阻害活性は約34倍増加する。これらの結果から、コドン翻訳の効率が、最大で2つまでの隣接コドンによって影響を受けることが実証される（図2を参照されたい）。
【０１０８】
実施例2：FlgMの同義変異誘発を用いたポリヌクレオチド翻訳の調節
Pro8におけるCCUからCCGへの変化を含むflgM配列から開始して、平均して各オリゴヌクレオチドがアミノ酸2〜25について同義コドン変化を有するように設計されたドープ (doped) オリゴヌクレオチド変異誘発を用いて、アミノ酸2〜25をコードするflgM遺伝子の領域を改変した。結果は図3に示した通りである。
【０１０９】
Pro8に先行する2つのコドンおよびPro8 CCGの後のLeu9コドンにおける同義変化のみが、野生型FlgM阻害活性への回復をもたらした。これらの結果から、特定コドンの翻訳効率が隣接する2つのコドンに依存することが実証される。
【０１１０】
FlgMのアミノ酸Thr6-Ser7-Pro8-Leu9をコードする同義的変動は、約〜2倍の範囲のFlgMタンパク質レベルをもたらす。しかしながら、FlgMはσ28依存性fliC転写を阻害する調節タンパク質であるため、約2倍の範囲のFlgMタンパク質レベルは、約1000倍超の範囲のfliC転写活性を生じる。例えば、（プロリンをコードする）CCUからCCGへのflgMのコドン8における同義コドン変化は、約1/2のFlgMタンパク質レベルをもたらした。FlgMタンパク質レベルが約1/2に低下することで、σ28依存性fliCプロモーターの転写は約20倍増加した。
【０１１１】
実施例3：FlgMの同義変異誘発を用いた異種ポリヌクレオチド翻訳の調節
lacZの最初の10コドンをflgMの最初の10コドンと置き換え、Pro8（プロリンをコードする、flgMの5'から3'方向でコドン番号8）においてCCUからCCGへの同義コドン変化を含むようにflgM配列を変異させた。上記の結果と一致して、文脈-コドン最適化flgM配列の制御下での異種lacZ配列の発現は、β-ガラクトシダーゼ活性の減少をもたらした。β-ガラクトシダーゼ活性は約210から150単位減少した。
【０１１２】
これらの結果から、ポリペプチド（この場合はlacz）をコードするポリヌクレオチド配列が、文脈-コドン最適化FlgM配列 (SCM FlgM) に機能的に連結され、発現され、細菌分泌系（この場合は操作されたT3SS）を介して分泌される場合、FlgMのThr6-Ser7-Pro8-Leu9のうちの1つまたは複数における同義変化は、異種タンパク質産生（この場合はLacZ）レベルに影響を及ぼすことが実証される。
【０１１３】
本発明の分泌系を用いて組換えによって産生され得る例示的なポリペプチドを、以下の表1に記載する。
【０１１４】
【表１】
2018529365.tif 000006
【０１１５】
実施例4：T3SSを用いた異種タンパク質産生の調節
ヒトインスリングラルギン核酸配列、ポリヒスチジンヌクレオチド配列、エンテロキナーゼ切断部位、およびParaBADプロモーターに機能的に連結された全長野生型FlgMポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を、サルモネラ・エンテリカ血清型チフィムリウム細胞に導入し、その細胞内で発現させた。サルモネラ細胞は、本発明者らによって以前に記載されたように、いくつかのT3S遺伝子内で改変され（全体として参照により本明細書に組み入れられるU.S. PG PUB NO. 2015/0225466を参照されたい）、ParaBAD1::flgM-His6-ETK-インスリングラルギン ΔflgMN7753 ΔflgKL7770 PflhDC7793 fliA*5225 ΔfliB-T7771 fljBenx vh2を明確に含んだ（株TS1と称される）。FlgM::インスリンキメラタンパク質は細胞によって分泌され、抗6xHis抗体を用いるウェスタンブロットによって検出された。結果を図4に示す。
【０１１６】
実施例5：T3SSおよび同義変異誘発を用いた異種タンパク質産生の調節
ポリヒスチジン精製タグ核酸配列、切断部位（例えば、エンテロキナーゼ切断部位）、ならびにヒトインスリンのA鎖およびB鎖をコードするポリヌクレオチド配列（ヒトインスリンB鎖配列は同義コドン変異を含む）に機能的に連結されたFlgMヌクレオチド配列（野生型または同義コドン変異FlgM配列のいずれか）をサルモネラ細胞内に導入し、その細胞内で発現させることにより、操作されたサルモネラT3SSからのヒトインスリンの分泌をさらに最適化することができる。例えば、ヒトインスリンB鎖内の2つの隣接アルギニン残基を文脈コドン最適化して、インスリンの発現およびT3SSを介した分泌を増加させることができる。特に、野生型隣接アルギニンコドンCGCおよびCGG（5'から3'方向で）をCGUおよびCGU；CGUおよびCGC；CGCおよびCGU；CGCおよびCGC；またはCGGおよびCGCに変異させることができる。N末端からC末端方向でポリヒスチジン精製タグ、切断部位、およびヒトインスリンをコードする核酸配列を含む例示的構築物が、SEQ ID NO: 16によって提供される。本明細書の他所に、およびU.S. PG PUB NO. 2015/0225466（全体として参照により本明細書に組み入れられる）において本発明者らによって記載されるように、SEQ ID NO: 16によって提供される配列をFlgM配列に付加することができる。得られた同義コドン最適化アルギニンコドンの対がヒトインスリンの発現および分泌の増加をもたらすことが予測される。FlgM、ポリヒスチジン精製タグ、切断部位、およびインスリンを含むキメラタンパク質は、上記のように検出され、精製され得る。インスリンタンパク質は、上記のようにキメラタンパク質から単離され得る。
【０１１７】
【表２】
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2018529365.tif 000008
2018529365.tif 000009
【０１１８】
発明の概要および要約書の項ではなく、発明を実施するための形態の項を用いて特許請求の範囲を解釈するように意図されていることを理解されたい。発明の概要および要約書の項は、本発明者が企図するような本発明の1つまたは複数の例示的態様を記載しているが、そのすべてを記載しているわけではなく、したがって本発明および添付の特許請求の範囲を限定することは決して意図されていない。本明細書において引用される特許、特許出願、および参考文献はすべて、全体として参照により組み入れられる。
【０１１９】
特定機能の実行およびそれらの関係を説明する機能的構成要素を活用して、本発明を上述してきた。これらの機能的構成要素の境界は、説明の便宜上、本明細書では任意に定義されてきた。特定の機能およびそれらの関係が適切に実行される限り、代替的境界を定義することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年6月6日(2018.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018529365000001.app
【国際調査報告】
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2018529365.tif 000019
2018529365.tif 000020