(57)【要約】本発明は、下記化学式Ｉ又は化学式ＩＩで表される染料化合物に関する。本発明に係る染料化合物は、従来のシアニン染料に比べて量子効率が著しく改善されており、強い蛍光を発するので、光学画像が必要な様々な生物学的システムに対するプローブなどの広範囲な分野において有効に活用することができる。特に、ミトコンドリアを標識して追跡できるＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒとして活用でき、生体又は細胞組織内のミトコンドリアを定量的に画像化することができる。また、生細胞のｐＨを測定できるｐＨプローブとして適用することができる。2018530630.tif 0001062018530630.tif 000107【選択図】図１Ａ
2018530630.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式Ｉ又は化学式ＩＩで表される染料化合物であって、
【化１】
2018530630.tif 000093
【化２】
2018530630.tif 000094
前記化学式Ｉ又は化学式ＩＩにおいて、
Ａｒ１は、置換または非置換の炭素数６〜２０のアリール、あるいは置換または非置換の炭素数２〜２０のヘテロアリールであり、
前記Ａｒ１は、それぞれ１種以上の置換基で置換されていてもよく、前記１種以上の置換基は、水素、重水素、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアルケニル、置換または非置換のアルキニル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のヘテロアリール、置換または非置換のアリールアルキル、置換または非置換のアリールオキシ、置換または非置換のアリールオキシアルキル、置換または非置換のアルコキシ、置換または非置換のアルコキシアルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、ヒドロキシ、アルデヒド、アミノ、アミド、ヒドラジン、チオール、アセタール、ケタール、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、スルホヒドロキシ、スルホニル、スルホネート、スルフェート、カルボキシレート、アジド、グアニジウム、カルボニル、チオカルボニル、アミノチオカルボニル、カルボキシル、カルボン酸、ケトン、スルフヒドリル、アシルクロリド、スルホン酸、エステル、ポリアルキレンオキシド、ポリエチレングリコール、及び４次アンモニウムから選択されるいずれか１つであり、
前記１種以上の置換基が、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アリールオキシ、アリールオキシアルキル、アルコキシ、及びアルコキシアルキルから選択されるいずれか１つである場合、１種以上の置換基でさらに置換されていてもよく、前記１種以上の置換基は、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、ヒドロキシ、アルデヒド、アミノ、アミド、ヒドラジン、チオール、アセタール、ケタール、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、スルホヒドロキシ、スルホニル、スルホネート、スルフェート、カルボキシレート、アジド、グアニジウム、カルボニル、チオカルボニル、アミノチオカルボニル、カルボキシル、カルボン酸、ケトン、スルフヒドリル、アシルクロリド、スルホン酸、エステル、ポリアルキレンオキシド、ポリエチレングリコール、及び４次アンモニウムから選択され、
Ｅは、ＣＲ１またはＮであり、
Ｚ１は、ＮＲ２Ｒ３、ＯＲ４、またはＳＲ５であり、Ｚ２は、ＮＲ６、Ｏ、Ｓ、またはＯ＋Ｒ７であり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ８Ｒ９、ＳｉＲ１０Ｒ１１、ＣＲ１２Ｒ１３、またはＳｅであり、
Ｙは、ＣＲ１４Ｒ１５、ＮＲ１６、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＳｉＲ１７Ｒ１８、またはＣＲ１９Ｒ２０＝ＣＲ２１Ｒ２２であり、
Ｗは、ＣＲ２３Ｒ２４、ＣＲ２５Ｒ２６＝ＣＲ５２７Ｒ２８、Ｏ、−［ＣＲ２９Ｒ３０−ＣＲ３１Ｒ３２］−、または−［ＣＲ３３Ｒ３４−Ｏ］−であり、
前記Ｒ２３〜Ｒ３４は、互いに同一または異なり、それぞれ独立に、水素、重水素、アルキル、またはアシルオキシであり、隣接する２つは互いに選択的に連結されて脂環族炭化水素を形成し、
前記Ｒ１〜Ｒ３のうちの２つは隣接する置換基のうちの２つと脂環族炭化水素環、または単環又は多環の芳香族炭化水素環を選択的に形成し、前記形成された脂環族または芳香族炭化水素環の炭素原子は、Ｎ、Ｓ、Ｏ、Ｓｅ、Ｔｅ、Ｐｏ、ＮＲ３５、ＳｉＲ３６Ｒ３７、ＧｅＲ３８Ｒ３９、ＰＲ４０、及びＢＲ４１から選択されるいずれか１つによって選択的に置換されていて、
前記Ｒ１〜Ｒ２２及びＲ２９〜Ｒ４１は、互いに同一または異なり、それぞれ独立に、水素、重水素、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアルケニル、置換または非置換のアルキニル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のヘテロアリール、置換または非置換のアリールアルキル、置換または非置換のアリールオキシ、置換または非置換のアリールオキシアルキル、置換または非置換のアルコキシ、置換または非置換のアルコキシアルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、ヒドロキシ、アルデヒド、アミノ、アミド、ヒドラジン、チオール、アセタール、ケタール、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、スルホヒドロキシ、スルホニル、スルホネート、スルフェート、カルボキシレート、アジド、グアニジウム、カルボニル、チオカルボニル、アミノチオカルボニル、カルボキシル、カルボン酸、ケトン、スルフヒドリル、アシルクロリド、スルホン酸、エステル、ポリアルキレンオキシド、ポリエチレングリコール、及び４次アンモニウムから選択されるいずれか１つであり、
前記Ｒ１〜Ｒ２２及びＲ２９〜Ｒ４１が、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アリールオキシ、アリールオキシアルキル、アルコキシ及びアルコキシアルキルから選択されるいずれか１つである場合、１種以上の置換基でさらに置換されていてもよく、前記１種以上の置換基は、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、ヒドロキシ、アルデヒド、アミノ、アミド、ヒドラジン、チオール、アセタール、ケタール、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、スルホヒドロキシ、スルホニル、スルホネート、スルフェート、カルボキシレート、アジド、グアニジウム、カルボニル、チオカルボニル、アミノチオカルボニル、カルボキシル、カルボン酸、ケトン、スルフヒドリル、アシルクロリド、スルホン酸、エステル、ポリアルキレンオキシド、ポリエチレングリコール、及び４次アンモニウムから選択され、
Ａ−は、有機又は無機イオンであって、アニオン又はＡ＋で表されるカチオンであり、Ａ−は、存在してもよく、存在しなくてもよい染料化合物。
【請求項２】
前記Ｒ１〜Ｒ２２及びＲ２９〜Ｒ４１、及びこれらの置換基は、前記染料化合物が標識される標識対象物質に結合する反応性置換基（ＲＸ）であって、
前記反応性置換基（ＲＸ）は、活性エステル（ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｅｓｔｅｒｓ）、カルボキシル（ｃａｒｂｏｘｙｌ）、アミド（ａｍｉｄｅ）、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅｓ）、アジド（ａｚｉｄｅ）、アシルアジド（ａｃｙｌ  ａｚｉｄｅｓ）、ハロゲン化アシル（ａｃｙｌ  ｈａｌｉｄｅｓ）、アルキン（ａｌｋｙｎｅ）、アミン（ａｍｉｎｅ）、アルデヒド（ａｌｄｅｈｙｄｅｓ）、ケトン（ｋｅｔｏｎｅｓ）、ハロゲン化アルキル（ａｌｋｙｌ  ｈａｌｉｄｅｓ）、スルホン酸アルキル（ａｌｋｙｌ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅｓ）、ハロゲン化アリール（ａｒｙｌ  ｈａｌｉｄｅｓ）、アジリジン（ａｚｉｒｉｄｉｎｅｓ）、ボロネート（ｂｏｒｏｎａｔｅｓ）、ジアゾアルカン（ｄｉａｚｏａｌｋａｎｅｓ）、エポキシド（ｅｐｏｘｉｄｅｓ）、ハロプラチネート（ハロ白金酸塩、ｈａｌｏｐｌａｔｉｎａｔｅ）、ハロトリアジン（ｈａｌｏｔｒｉａｚｉｎｅｓ）、イミドエステル（ｉｍｉｄｏ  ｅｓｔｅｒｓ）、イソシアネート（ｉｓｏｃｙａｎａｔｅｓ）、シリルハライド（ｓｉｌｙｌ  ｈａｌｉｄｅｓ）、スルホン酸エステル（ｓｕｌｆｏｎａｔｅ  ｅｓｔｅｒｓ）、ハロゲン化スルホニル（ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｈａｌｉｄｅｓ）、スクシンイミジルエステル（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ）、スルホスクシンイミジルエステル（ｓｕｌｐｈｏ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ）、無水物（ａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ）、酸ハロゲン化物（酸ハライド、ａｃｉｄ  ｈａｌｉｄｅｓ）、イソチオシアネート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ビニルスルホン（ｖｉｎｙｌｓｕｌｐｈｏｎｅ）、ジクロロトリアジン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｅｓ）、ハロアセトアミド（ｈａｌｏａｃｅｔａｍｉｄｅｓ）、マレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅｓ）、カルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、ホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ）、ヒドラジン（ｈｙｄｒａｚｉｎｅｓ）、及びヒドラジド（ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）から選択されるいずれか１つであり、
前記活性エステルは−ＣＯＲ´であり、前記Ｒ´は、スクシンイミジルオキシ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙ、−ＯＣ４Ｈ４Ｏ２）、スルホスクシンイミジルオキシ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙ、−ＯＣ４Ｈ３Ｏ２−ＳＯ３Ｈ）、または−１−オキシベンゾトリアゾリル（−１−ｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｙｌ、−ＯＣ６Ｈ４Ｎ８）であるか；又は、非置換のアリールオキシ、またはニトロ、ハロゲン、シアノ及びハロゲンアルキルから選択された１種以上で置換されたアリールオキシであるか；又は、カルボン酸であることを特徴とする、請求項１に記載の染料化合物。
【請求項３】
前記反応性置換基（ＲＸ）は、リンカー（Ｌ）に共有結合で連結された−Ｌ−ＲＸ構造であり、前記Ｌは、単一結合であるか、又は、炭素（Ｃ）、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）及び硫黄（Ｓ）原子から構成される群から選択された原子が１〜２０個連結された直鎖又は分岐鎖の鎖であるか、又は、脂肪族炭化水素環、芳香族炭化水素環、脂肪族ヘテロ環及び芳香族ヘテロ環から選択されたいずれか１つであり、前記Ｌは、＋又は−電荷を有することができることを特徴とする、請求項２に記載の染料化合物。
【請求項４】
前記標識対象物質は、アミノ基、スルフヒドリル基、カルボニル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、チオール基、リン酸基及びチオリン酸基から選択される１種以上を含む生体分子、ナノ粒子、または有機化合物であり、
前記生体分子は、抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）；抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）；脂質（ｌｉｐｉｄ）；タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）；ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）；炭水化物（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）；デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）；脂肪酸（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ）；リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）；リポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙ  ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）；アミノ基、スルフヒドリル基、カルボニル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、チオール基、リン酸基及びチオリン酸基のうちの１つ以上を含むか、または含むように誘導化されたヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）又はオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；アミノ基、スルフヒドリル基、カルボニル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、チオール基、リン酸基及びチオリン酸基のうちの１つ以上を含むか、または含むように誘導化されたオキシポリ核酸（ｏｘｙｐｏｌｙｎｕｃｅｏｔｉｄｅ）又はデオキシポリ核酸（ｄｅｏｘｙｐｏｌｙｎｕｃｅｏｔｉｄｅ）；微生物；薬物；ホルモン；細胞；細胞膜；及び毒素（ｔｏｘｉｎｓ）；からなる群から選択されるいずれか１つ以上であることを特徴とする、請求項２に記載の染料化合物。
【請求項５】
前記化学式Ｉ又は化学式ＩＩで表される染料化合物は、下記［化学式１］〜［化学式１１３］から選択されるいずれか１つであることを特徴とする、請求項１に記載の染料化合物。
【化３】
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【化４】
2018530630.tif 000096
【化５】
2018530630.tif 000097
【化６】
2018530630.tif 000098
【化７】
2018530630.tif 000099
【化８】
2018530630.tif 000100
【化９】
2018530630.tif 000101
【化１０】
2018530630.tif 000102
【化１１】
2018530630.tif 000103
【化１２】
2018530630.tif 000104
【化１３】
2018530630.tif 000105
【請求項６】
前記染料化合物は、細胞内のミトコンドリアに選択的に染色されることを特徴とする、請求項１に記載の染料化合物。
【請求項７】
前記染料化合物は、細胞内ｐＨに応じて蛍光の強度が変わることを特徴とする、請求項１に記載の染料化合物。
【請求項８】
（ａ）標識対象物質を含む試料に請求項１に記載の染料化合物を注入し、インキュベートするステップを含む、化合物標識方法。
【請求項９】
（ｂ）前記標識対象物質と結合された染料化合物の蛍光発光を測定するステップをさらに含み、蛍光強度によって標識対象物質を定量化することを特徴とする、請求項８に記載の化合物標識方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、染料化合物に関し、より詳細には、量子効率、蛍光強度及び光安定性などの光特性に優れ、高水溶性であり、生体分子との結合又は生体分子内で優れた光特性の維持が可能な新規な染料化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光は、生命科学分野において非破壊的に生物学的分子を追跡又は分析する際に最も一般的に用いられる技法である。自発光するタンパク質や自発光する分子も知られているが、一般に、タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、脂質（ｌｉｐｉｄｓ）、小さな分子に発光特性を有する染料を標識（ｌａｂｅｌｉｎｇ）すれば、光学的追跡及び分析が可能となる。単なる発光特性の変化、発光特性の変化に基づく画像、エネルギー移動、周辺環境の変化による発光特性の変化、化学反応による構造の変化による発光特性の変化など、様々な化学的・光学的特性の変化を分析することによって、生命科学分野における有用な情報を得ることができる。
【０００３】
このような現象を分析するシステムとして、細胞観察のための蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、流細胞分析機、マイクロアレイ、重合酵素連鎖反応装置、核酸やタンパク質の分離のための電気泳動装置、リアルタイムバイオイメージングシステム、免疫測定システム、ＤＮＡ序列分析システム、ＰＣＲ分析システム、核酸及びタンパク質用の診断キット及び診断装備、画像支援手術用の内視鏡装備などの診断及び治療のためのシステムが挙げられる。より正確かつ簡易に分析するために新たな応用分野及び数多くのシステムが、現在も開発・改良されている。
【０００４】
分析技術に適した蛍光染料として使用されるためには、生体分子が存在する媒質、すなわち、水溶性媒質における高輝度特性、様々なｐＨ条件における安定性、光安定性、蛍光システムに適した励起及び発光波長特性などが要求される。このような要求条件に合致する蛍光染料として、キサンタン（ｘａｎｔｈａｎｅ）系列のフルオレセイン及びローダミン、及びポリメチン（ｐｏｌｙｍｅｔｈｉｎｅ）系列のシアニン誘導体染料化合物が広く知られている。特に、シアニン発色団を有する蛍光染料は、代表的な染料のカテゴリーに属するものとして広く活用されている。
【０００５】
但し、現在知られているインドカルボシアニン、インドジカルボシアニン及びインドトリカルボシアニン骨格を有するカルボシアニンは、モル吸光係数は高く、蛍光量子効率は低いことが知られており、このような欠点により、生体分子にカップリングされた後、低い輝度（ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ）しか示さないと報告されている。
【０００６】
したがって、前記のような問題点を改善して、より強い蛍光を発することによって有効に光学画像を得ることができる新たな染料に対する開発が必要であるのが現状である。
【０００７】
また、ポリメチンシアニン染料は、１８５６年以来、染料が適用される様々な分野において不変の地位を占めており、このような課題に対して、様々な領域において毎年数多くの適用例が報告されている。
【０００８】
一般に、シアニン染料は、２つの窒素を中心に構成されており、そのうちの一方は正に帯電されて、奇数個の炭素原子からなる接合鎖によって他方の窒素原子に連結されている。このような特徴は、「プッシュ−プル」アルケンとして研究されており、ポリメチン染料の基礎を形成するところ、ポリメチン染料は、発色団としてストレプトポリメチン単位を含む。ストレプトポリメチン単位の電荷に応じて、これらの染料は、以下のように分類される。
【０００９】
カチオン性ストレプトポリメチンシアニン及びヘミシアニン染料（１）、アニオン性ストレプトポリメチンオキソノール染料（２）、中性ストレプトポリメチンメロシアニン染料（３）、双性イオン性スクアライン系シアニン染料（４）。
【００１０】
【化１】
2018530630.tif 000003
【００１１】
一般に、前記染料は、安定した形態でオールトランスジオメトリを有する。ときには、このような染料は、光異性化（ｐｈｏｔｏｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）過程を経る。これらの種の生成は、閃光光分解（ｆｌａｓｈ  ｐｈｏｔｏｌｙｓｉｓ）、一時的吸収（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）、及びピコ秒時間−分解スペクトロスコピー（ｐｉｃｏｓｅｃｏｎｄｓ  ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）のような様々な技術を用いて調べることができる。また、前記染料は、ハロゲン化銀フォトグラフィ及びバンド−ギャップ半導体物質におけるスペクトル増減剤、光ディスクにおける記録媒体、太陽エネルギーを捕獲するための産業用ペイント、レーザー物質、光合成の光捕獲システム、光屈折物質、抗癌剤及び生物学的システムに対するプローブなどの広範囲な分野において活用されている。
【００１２】
一般に、前記染料は、高いモル吸光係数を有するため、濃い色を示すが、量子効率（Ｑｕａｎｔｕｍ  ｙｉｅｌｄ）が低いという致命的な欠点がある。その理由は、シアニン染料は、回転（ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ）、並進（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）、振動（ｖｉｂｒａｔｉｏｎａｌ）モードがあるため、励起状態のエネルギーを蛍光ではなく非放射過程（ｎｏｎ−ｒａｄｉａｔｉｖｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ）において損失するためである(D. F. O’Brien, T. M.Kelly, and L. F. Costa(1974). Excited state Properties of some Carbocyanine dyes and the energy transfer mechanism of spectral sensitisation. Photogr. Sci. Eng. 18(1), 76-84.)。したがって、本発明の発明者は、このような蛍光損失を低減するために、シアニン染料のポリメチン鎖を強固（Ｒｉｇｉｄ）にデザインすることによって、蛍光量子効率を著しく増加させた。
【００１３】
また、市販のＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ染料は、正に帯電しているため、細胞内のミトコンドリアに選択的に結合する特性を有しており、高い蛍光輝度及び優れた光安定性のためＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒとして使用するのに適しており、ミトコンドリアを標識するために簡単なインキュベーション（Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）過程のみでも十分な染色が行われる。
【００１４】
しかし、その後の実験では、細胞をホルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）のような試薬中にフィクセーション（ｆｉｘａｔｉｏｎ）させる作業が必要であり、この作業において、市販されているいくつかのＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒは蛍光が維持されないという欠点を有している。
【００１５】
＜Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社が販売するＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ製品＞
【００１６】
【化２】
2018530630.tif 000004
【００１７】
そこで、本発明の発明者は、フィクセーション後も蛍光が安定的に維持される染料を開発し、また、様々な波長において蛍光を発するように設計して、望みの波長を発光するＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒを選択できるようにした。
【００１８】
他のプローブ（Ｐｒｏｂｅ）と蛍光の波長が重なる場合、分析を行うことが困難であるため、狭いバンド幅（Ｂａｎｄｗｉｄｔｈ）で様々な波長において蛍光を発する材料は、重要な要素である。そこで、本発明の発明者は、様々な波長を有するＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒの開発を試みた。
【００１９】
また、細胞内ｐＨ（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ）や細胞質ｐＨ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｐＨ）を測定すれば、細胞の機能を非常に簡易に確認することができる(Methods Mol Biol 637, 311 (2010);Nanotechnology 24, 365 (2013))。細胞内ｐＨの変化を通じて、イオンホメオスタシス（ｉｏｎｉｃ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）、活性酸素種のバランス（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｂａｌａｎｃｅ）、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、細胞周期（ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ）、細胞モビリティ（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ）など多くの細胞活動を測定することができる(Circulation 124, 1806(2011);Yonsei Med J 6, 473(1995);J Bacteriol 185, 1190(2003))。
【００２０】
細胞内ｐＨを測定するためにｐＨ検出プローブ（ｐＨ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ）が使用される。本発明の発明者は、ｐＨの変化に応じて蛍光強度が変わる染料を開発し、この特性を用いて、生細胞のｐＨを測定可能なｐＨプローブとしての染料の使用を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
したがって、本発明は、上記の問題を解決するために、より強い蛍光を発することによって有効な光学画像を得ることができる新たな染料を提供する。
【００２２】
また、本発明は、従来のＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒが有している問題点であるフィクセーション過程後にも蛍光が安定的に維持される染料、及び様々な波長において蛍光を発光するように設計して、使用者が望みの波長を発光するＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒを選択することができる染料を提供する。
【００２３】
また、本発明は、ｐＨの変化に応じて蛍光強度が変わり、生細胞のｐＨを測定するｐＨプローブとして活用できる染料を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は、上記課題を解決するために、下記化学式Ｉ及び化学式ＩＩから選択されるいずれか１つの染料化合物を提供する。
【００２５】
【化３】
2018530630.tif 000005
【００２６】
【化４】
2018530630.tif 000006
【００２７】
前記化学式Ｉ及び化学式ＩＩの置換基についての具体的な説明は後述する。
【００２８】
また、本発明は、前記染料化合物と標識対象物質を結合させるステップを含む化合物標識方法を提供する。
【発明の効果】
【００２９】
本発明に係る染料化合物は、従来のシアニン染料に比べて量子効率が著しく改善され、より強い蛍光を発する。これにより、本発明に係る染料化合物は、光学画像が必要な様々な生物学的システムに対するプローブなどに広範囲な分野において有効に活用することができる。
【００３０】
特に、本発明に係る染料化合物は、ミトコンドリアを標識して追跡できるＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒとして活用できる。これにより、本発明に係る染料化合物は、生体又は細胞組織内においてミトコンドリアを定量的に画像化することができる。また、生細胞のｐＨを測定するためのｐＨプローブ（ｐｒｏｂｅ）としても適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】本発明に係る［化学式１］の化合物をＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧで標識した後の吸収（Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）スペクトルである。
【図１Ｂ】Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８をＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧで標識した後の吸収スペクトルである。
【図１Ｃ】本発明に係る［化学式１］の化合物をＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧで標識した後の蛍光発光（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ）スペクトルである。
【図１Ｄ】Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８をＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧで標識した後の蛍光発光スペクトルである。
【図１Ｅ】本発明に係る［化学式１］の化合物とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８をＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧで標識した後の輝度（ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ）を確認した結果である。
【図１Ｆ】本発明に係る［化学式１］の化合物とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８の生体活性（ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ）を比較確認したグラフである。
【図２Ａ】本発明に係る［化学式３］の化合物をＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧで標識した後の吸収スペクトルである。
【図２Ｂ】Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４をＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧで標識した後の吸収スペクトルである。
【図２Ｃ】本発明に係る［化学式３］の化合物をＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧで標識した後の蛍光発光スペクトルである。
【図２Ｄ】Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４をＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧで標識した後の蛍光発光スペクトルである。
【図２Ｅ】本発明に係る［化学式３］の化合物とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４をＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧで標識した後の輝度を確認した結果である。
【図２Ｆ】本発明に係る［化学式３］の化合物とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４の生体活性を比較確認したグラフである。
【図３Ａ】本発明に係る［化学式５０］の化合物をＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧで標識した後の吸収スペクトルである。
【図３Ｂ】本発明に係る［化学式５０］の化合物とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６をＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧで標識した後の輝度を確認した結果である。
【図３Ｃ】［化学式５０］の化合物とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６の生体活性を比較確認したグラフである。
【図４Ａ】本発明に係る［化学式１１０］の化合物で標識されたＲａｗ  ２６４．７細胞の画像イメージであって、励起波長は５５２ｎｍであり、５６０−６００ｎｍの放出波長で取得した。
【図４Ｂ】ＭＴＧ（Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＭ）で標識されたＲａｗ  ２６４．７細胞の画像イメージであって、励起波長は４８８ｎｍであり、４７０−５２０ｎｍの放出波長で取得した。
【図４Ｃ】図４Ａと図４Ｂを重ね合わせた画像であり、ピアソンの共局在化（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）効率を示す係数（Ａ＝０．７３）は、ＬＡＳ  ＡＦソフトウェアを用いて計算された値である。
【図５】本発明に係る［化学式１１０］の化合物（１．０μＭ）で染色されたＨｅＬａ  Ａ４３１細胞の３つの領域（Ａ，Ｂ，Ｃ）の蛍光強度を２秒間隔で３５００秒間測定したグラフである。
【図６Ａ】本発明に係る［化学式９７］の化合物で標識されたＨｅＬａ  Ａ４３１細胞の画像であって、励起波長は５５２ｎｍであり、５７１−６５０ｎｍの放出波長で取得した。
【図６Ｂ】ＭＴＧで標識されたＨｅＬａ  Ａ４３１細胞の画像であって、励起波長は４８８ｎｍであり、４９８−５４０ｎｍの放出波長で取取得した。
【図６Ｃ】図６Ａと図６Ｂを重ね合わせた画像である。
【図７】本発明に係る［化学式９８］の化合物（１．０μＭ）で染色されたＨｅＬａ  Ａ４３１細胞の４つ領域（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）の蛍光強度を２秒間隔で３５００秒間測定したグラフである。
【図８】比較実験の結果であって、Ｃｙ３Ｂ（１．０μＭ）で染色されたＨｅＬａ  Ａ４３１細胞のＡ、Ｂの２つの部分の蛍光強度を２秒間隔で２０００秒間測定したグラフである。
【図９】本発明に係る［化学式１１１］の化合物のｐＨプローブとしての特性を確認したグラフである。
【図１０】本発明に係る［化学式９７］の化合物のｐＨプローブとしての特性を確認したグラフである。
【図１１】ＰＢＳ緩衝溶液及びエタノールにおける本発明に係る［化学式９７］、及び［化学式１００］〜［化学式１０２］の化合物の二光子活性スペクトルである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００３３】
本発明は、蛍光量子効率が著しく改善され、強い蛍光を発して光学画像を効果的に得ることができるように設計されて、様々な生物学的システムに対するプローブなどとして活用できる新規な構造の染料化合物に関する。
【００３４】
本発明の一態様は、下記化学式Ｉ及び化学式ＩＩで表される新規な染料化合物に関する。
【００３５】
【化３】
2018530630.tif 000007
【００３６】
【化４】
2018530630.tif 000008
【００３７】
前記化学式Ｉ及び化学式ＩＩにおいて、Ａｒ１は、置換または非置換の炭素数６〜２０のアリール、あるいは置換または非置換の炭素数２〜２０のヘテロアリールである。
【００３８】
前記Ａｒ１は、それぞれ１種以上の置換基で置換されていてもよく、前記１種以上の置換基は、水素、重水素、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアルケニル、置換または非置換のアルキニル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のヘテロアリール、置換または非置換のアリールアルキル、置換または非置換のアリールオキシ、置換または非置換のアリールオキシアルキル、置換または非置換のアルコキシ、置換または非置換のアルコキシアルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、ヒドロキシ、アルデヒド、アミノ、アミド、ヒドラジン、チオール、アセタール、ケタール、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、スルホヒドロキシ、スルホニル、スルホネート、スルフェート、カルボキシレート、アジド、グアニジウム、カルボニル、チオカルボニル、アミノチオカルボニル、カルボキシル、カルボン酸、ケトン、スルフヒドリル、アシルクロリド、スルホン酸、エステル、ポリアルキレンオキシド、ポリエチレングリコール、及び４次アンモニウムから選択される。
【００３９】
また、前記１種以上の置換基が、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アリールオキシ、アリールオキシアルキル、アルコキシ、及びアルコキシアルキルから選択されるいずれか１つである場合、１種以上の置換基でさらに置換されていてもよく、前記１種以上の置換基は、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、ヒドロキシ、アルデヒド、アミノ、アミド、ヒドラジン、チオール、アセタール、ケタール、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、スルホヒドロキシ、スルホニル、スルホネート、スルフェート、カルボキシレート、アジド、グアニジウム、カルボニル、チオカルボニル、アミノチオカルボニル、カルボキシル、カルボン酸、ケトン、スルフヒドリル、アシルクロリド、スルホン酸、エステル、ポリアルキレンオキシド、ポリエチレングリコール、及び４次アンモニウムから選択される。
【００４０】
Ｅは、ＣＲ１またはＮであり、Ｚ１は、ＮＲ２Ｒ３、ＯＲ４、またはＳＲ５である。
【００４１】
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ８Ｒ９、ＳｉＲ１０Ｒ１１、ＣＲ１２Ｒ１３、またはＳｅである。
【００４２】
Ｙは、ＣＲ１４Ｒ１５、ＮＲ１６、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＳｉＲ１７Ｒ１８、またはＣＲ１９Ｒ２０＝ＣＲ２１Ｒ２２である。
【００４３】
Ｗは、ＣＲ２３Ｒ２４、ＣＲ２５Ｒ２６＝ＣＲ５２７Ｒ２８、Ｏ、−［ＣＲ２９Ｒ３０−ＣＲ３１Ｒ３２］−、または−［ＣＲ３３Ｒ３４−Ｏ］−である。
【００４４】
前記Ｒ２３〜Ｒ３４は、互いに同一または異なり、それぞれ独立に、水素、重水素、アルキル、またはアシルオキシであり、隣接する２つの置換基は互いに連結して脂環族炭化水素を形成していてもよい。
【００４５】
前記Ｒ１〜Ｒ３及びこれと隣接する置換基から選択される２つは互いに連結して脂環族炭化水素環、または単環又は多環の芳香族炭化水素環を形成していてもよく、前記形成された脂環族又は芳香族炭化水素環の炭素原子は、Ｎ、Ｓ、Ｏ、Ｓｅ、Ｔｅ、Ｐｏ、ＮＲ３５、ＳｉＲ３６Ｒ３７、ＧｅＲ３８Ｒ３９、ＰＲ４０、及びＢＲ４１から選択されるいずれか１つによって置換されてもよい。
【００４６】
前記Ｒ１〜Ｒ２２及びＲ３５〜Ｒ４１は、互いに同一または異なり、それぞれ独立に、水素、重水素、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアルケニル、置換または非置換のアルキニル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のヘテロアリール、置換または非置換のアリールアルキル、置換または非置換のアリールオキシ、置換または非置換のアリールオキシアルキル、置換または非置換のアルコキシ、置換または非置換のアルコキシアルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、ヒドロキシ、アルデヒド、アミノ、アミド、ヒドラジン、チオール、アセタール、ケタール、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、スルホヒドロキシ、スルホニル、スルホネート、スルフェート、カルボキシレート、アジド、グアニジウム、カルボニル、チオカルボニル、アミノチオカルボニル、カルボキシル、カルボン酸、ケトン、スルフヒドリル、アシルクロリド、スルホン酸、エステル、ポリアルキレンオキシド、ポリエチレングリコール、及び４次アンモニウムから選択されるいずれか１つである。
【００４７】
前記Ｒ１〜Ｒ２２及びＲ３５〜Ｒ４１がアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アリールオキシ、アリールオキシアルキル、アルコキシ及びアルコキシアルキルから選択されるいずれか１つである場合、１種以上の置換基でさらに置換されていてもよく、前記１種以上の置換基は、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、ヒドロキシ、アルデヒド、アミノ、アミド、ヒドラジン、チオール、アセタール、ケタール、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、スルホヒドロキシ、スルホニル、スルホネート、スルフェート、カルボキシレート、アジド、グアニジウム、カルボニル、チオカルボニル、アミノチオカルボニル、カルボキシル、カルボン酸、ケトン、スルフヒドリル、アシルクロリド、スルホン酸、エステル、ポリアルキレンオキシド、ポリエチレングリコール、及び４次アンモニウムから選択される。
【００４８】
Ａ−は、有機又は無機イオンであって、特に制限されず、用途に応じて、有機溶剤内で本発明に係る染料の溶解性や安定性の観点で適切に選択すればよく、また、アニオン、または必要に応じてはカチオンＡ＋であってもよい。
【００４９】
一般に、化学式Ｉ及び化学式ＩＩにおけるＡ−は、六フッ化リン酸イオン、ハロゲンイオン、リン酸イオン、過塩素酸イオン、過ヨウ素酸イオン、六フッ化アンチモン酸イオン、六フッ化錫酸イオン、ホウフッ化水素酸イオン、テトラフルオロボレートイオンなどのような無機酸アニオンであってもよく、チオシアン酸イオン、ベンゼンスルホン酸イオン、ナフタレンスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、アルキルスルホン酸イオン、ベンゼンカルボン酸イオン、アルキルカルボン酸イオン、トリハロアルキルカルボン酸イオン、アルキルスルホン酸イオン、トリハロアルキルスルホン酸、ニコチン酸イオンなどのような有機酸イオンであってもよく、ビスフェニルジチオール、チオビスフェノールキレート、ビスジオール−α−ジケトンなどのような金属化合物イオンであってもよい。また、化学式Ｉ及び化学式ＩＩにおけるＡ−は、ナトリウム及びカリウムなどのような金属イオンまたは４次アンモニウムイオンであってもよい。
【００５０】
本発明の一実施例によれば、化学式Ｉ及び化学式ＩＩにおけるＡ−は、ハロゲンイオン、−ＳＯ４２−、−Ｓ２Ｏ３２−、−ＳＯ３−、−ＣｌＯ４−、−ＢＦ４−、−ＰＦ６−、−ＳｂＦ６−、−ＢｉＣｌ５−、−ＡｓＦ６−、−ＳｂＣｌ６−、−ＳｎＣｌ６−、−ＣＯＯ−、−ＨＳＯ４−、−ＳＯ３ＣＨ３−、Ｎａ＋、Ｋ＋、４次アンモニウムイオン、アセテート、プロピオネート、及びシアネート並びにこれらの組み合わせから選択される１種以上であってもよく、カチオンと置換されたアニオンのイオン価数に応じて、Ａ−は、存在してもよく、存在しなくてもよい。
【００５１】
一方、本発明に係る化学式Ｉ及び化学式ＩＩの各染料化合物は、上述したように、標識対象物質と結合できるように１以上の反応性置換基を含むことができ、水に対する溶解性の増加、蛍光染料間の相互作用の防止、及び染料と様々な標識因子との間の望まない標識発生の防止のために、１以上の極性電荷置換基を含むことができる。
【００５２】
本発明の好ましい一実施例によれば、置換基のうちの少なくとも１つは、アミン、チオール、アルコール、アルデヒド、ケトンなどの１以上の置換基を有する標識対象物質と結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）してもよい。
【００５３】
前記標識対象物質は、生体分子、ナノ粒子、または有機化合物などから選択され得るが、特に制限されない。前記標識対象物質は、具体的には、抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）；抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）；脂質（ｌｉｐｉｄ）；タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）；ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）；炭水化物（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）；デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）；脂肪酸（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ）；リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）；リポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙ  ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）；アミノ基、スルフヒドリル基、カルボニル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、チオール基、リン酸基及びチオリン酸基のうちの１つ以上を含むか、または含むように誘導化されたヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）又はオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；アミノ基、スルフヒドリル基、カルボニル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、チオール基、リン酸基及びチオリン酸基のうちの１つ以上を含むか、または含むように誘導化されたオキシポリ核酸（ｏｘｙｐｏｌｙｎｕｃｅｏｔｉｄｅ）又はデオキシポリ核酸（ｄｅｏｘｙｐｏｌｙｎｕｃｅｏｔｉｄｅ）；微生物；薬物；ホルモン；細胞；細胞膜；及び毒素（ｔｏｘｉｎｓ）；及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか１つ以上であってもよい。
【００５４】
具体的に、本発明に係る反応性置換基は、活性エステル（ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｅｓｔｅｒｓ）、カルボキシル（ｃａｒｂｏｘｙｌ）、アミド（ａｍｉｄｅ）、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅｓ）、アジド（ａｚｉｄｅ）、アシルアジド（ａｃｙｌ  ａｚｉｄｅｓ）、ハロゲン化アシル（ａｃｙｌ  ｈａｌｉｄｅｓ）、アルキン（ａｌｋｙｎｅ）、アミン（ａｍｉｎｅ）、アルデヒド（ａｌｄｅｈｙｄｅｓ）、ケトン（ｋｅｔｏｎｅｓ）、ハロゲン化アルキル（ａｌｋｙｌ  ｈａｌｉｄｅｓ）、スルホン酸アルキル（ａｌｋｙｌ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅｓ）、ハロゲン化アリール（ａｒｙｌ  ｈａｌｉｄｅｓ）、アジリジン（ａｚｉｒｉｄｉｎｅｓ）、ボロネート（ｂｏｒｏｎａｔｅｓ）、ジアゾアルカン（ｄｉａｚｏａｌｋａｎｅｓ）、エポキシド（ｅｐｏｘｉｄｅｓ）、ハロプラチネート（ハロ白金酸塩、ｈａｌｏｐｌａｔｉｎａｔｅ）、ハロトリアジン（ｈａｌｏｔｒｉａｚｉｎｅｓ）、イミドエステル（ｉｍｉｄｏ  ｅｓｔｅｒｓ）、イソシアネート（ｉｓｏｃｙａｎａｔｅｓ）、シリルハライド（ｓｉｌｙｌ  ｈａｌｉｄｅｓ）、スルホン酸エステル（ｓｕｌｆｏｎａｔｅ  ｅｓｔｅｒｓ）、ハロゲン化スルホニル（ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｈａｌｉｄｅｓ）、スクシンイミジルエステル（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ）、スルホスクシンイミジルエステル（ｓｕｌｐｈｏ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ）、無水物（ａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ）、酸ハロゲン化物（酸ハライド、ａｃｉｄ  ｈａｌｉｄｅｓ）、イソチオシアネート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ビニルスルホン（ｖｉｎｙｌｓｕｌｐｈｏｎｅ）、ジクロロトリアジン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｅｓ）、ハロアセトアミド（ｈａｌｏａｃｅｔａｍｉｄｅｓ）、マレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅｓ）、カルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、ホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ）、ヒドラジン（ｈｙｄｒａｚｉｎｅｓ）、ヒドラジド（ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）などであってもよく、好ましくは、カルボン酸のスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミドなどであってもよい。
【００５５】
前記活性エステルは、構造式−ＣＯＲ´によって表され、前記Ｒ´は、本発明の属する技術分野において既知の置換反応における優れた脱離基であって、例えば、スクシンイミジルオキシ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙ、−ＯＣ４Ｈ４Ｏ２）、スルホスクシンイミジルオキシ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙ、−ＯＣ４Ｈ３Ｏ２−ＳＯ３Ｈ）、又は−１−オキシベンゾトリアゾリル（−１−ｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｙｌ、−ＯＣ６Ｈ４Ｎ８）であるか；又は、アリールオキシ、又は電子吸引性基に属するニトロ、ハロゲン、シアノ、ハロゲンアルキルなどを１種以上含むアリールオキシであるか、；又は、無水物（ａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ、−ＯＣＯＲａ又は−ＯＣＮＲａＮＨＲｂ）を構成するカルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）によって活性化されたカルボン酸（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）であってもよく、前記Ｒａ又はＲｂは、炭素数１〜６のアルキル、炭素数１〜６のアルコキシ、シクロヘキシル、３−ジメチルアミノプロピル、Ｎ−モルホリノエチルなどである。
【００５６】
また、本発明に係る反応性置換基ＲＸは、様々なリンカーＬに共有結合で連結され、ＲＸ−Ｌ−構造を形成するものであってもよい。
【００５７】
このようなリンカーは、単一結合、又は好ましくは、炭素（Ｃ）、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）及び硫黄（Ｓ）原子から構成される群から選択された原子が１〜２０個連結された直鎖又は分岐鎖の鎖であってもよく、脂肪族炭化水素環、芳香族炭化水素環、脂肪族ヘテロ環、又は芳香族ヘテロ環であってもよい。また、このようなリンカーは、正（＋）又は負（−）の電荷を有していてもよい。
【００５８】
本発明によれば、前記化学式Ｉ及び化学式ＩＩで表される染料化合物は、下記の化学式１〜化学式１１３から選択されるいずれか１つ以上であってもよい。但し、これによって本発明の化学式Ｉ及び化学式ＩＩの範囲が限定されるものではない。
【００５９】
【化５】
2018530630.tif 000009
【００６０】
【化６】
2018530630.tif 000010
【００６１】
【化７】
2018530630.tif 000011
【００６２】
【化８】
2018530630.tif 000012
【００６３】
【化９】
2018530630.tif 000013
【００６４】
【化１０】
2018530630.tif 000014
【００６５】
【化１１】
2018530630.tif 000015
【００６６】
【化１２】
2018530630.tif 000016
【００６７】
【化１３】
2018530630.tif 000017
【００６８】
【化１４】
2018530630.tif 000018
【００６９】
【化１５】
2018530630.tif 000019
【００７０】
しかしながら、本発明の化学式Ｉ及び化学式ＩＩの範囲は、化学式１〜化学式１１３の化合物に限定されるものではない。
【００７１】
また、本発明に係る染料化合物は、細胞内のミトコンドリアを選択的に染色して画像化できるので、ミトコンドリアの標識及び追跡プローブ（Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ）に適用することができる。
【００７２】
特に、本発明に係る染料化合物は、様々な波長の蛍光を発するように設計できるので、使用者が望みの波長の蛍光を発する染料化合物を選択して使用することにより、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒとして活用することができる。このような様々な波長を有するＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒが必要な理由は、他のプローブ（Ｐｒｏｂｅ）と蛍光の波長が重なると、分析が困難であるので、狭いバンド幅を有する様々な波長の蛍光を発することを選択的に設計できることは、商業的に非常に重要な要素であるからである。
【００７３】
また、本発明に係る染料化合物は、細胞内ｐＨの変化に応じて蛍光の強度が変わることを特徴としており、これにより、生細胞のｐＨを測定するｐＨプローブ、さらに、これを含む細胞内ｐＨ測定センサなどに活用することができる。
【００７４】
本発明に係る染料化合物を用いて、細胞内ｐＨ（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ）や細胞質ｐＨ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｐＨ）を測定すれば、イオンホメオスタシス（ｉｏｎｉｃ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）、活性酸素種のバランス（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｂａｌａｎｃｅ）、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、細胞周期（ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ）、細胞モビリティ（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ）などの細胞活動を直接的又は間接的に識別することができる。
【００７５】
特に、本発明に係る染料化合物は、使用目的に応じて、ｐＨ２〜６の間の酸性条件で強い蛍光を発するタイプ、又はｐＨ８〜１２の間の塩基性条件で強い蛍光を発するタイプを選択して使用可能であるので、ｐＨプローブとしてさらに有用に活用することができる。
【００７６】
さらに、生細胞の染色を通じてｐＨを測定する方法以外に、最近は、プレートリーダー（ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）を用いて細胞のｐＨを測定する方法が活用されており、本発明に係る染料化合物は、これにも適用可能であり、ｐＨを測定することが必要な様々な適用分野において多様に用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
以下では、本発明に係る具体的な染料化合物の合成方法について説明する。実施例及び比較実験を通じてさらに詳細に本発明を説明する。但し、実施例は、本発明の例示に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【００７８】
合成例１：［化学式１］で表される化合物の合成
（１）［化学式１−ａ］で表される化合物の合成
下記［反応式１−１］によって［化学式１−ａ］で表される化合物を合成した。
【００７９】
【化１６】
2018530630.tif 000020
【００８０】
２−メチルアセト酢酸エチル（Ｅｔｈｙｌ  ２−ｍｅｔｈｙｌａｃｅｔｏａｃｅｔａｔｅ）（２３．５ｇ、１６３ｍｍｏｌ）と６−ブロモヘキサン酸エチル（Ｅｔｈｙｌ  ６−ｂｒｏｍｏｈｅｘａｎｏａｔｅ）（４０．０ｇ、１７９ｍｍｏｌ）をエタノール２００ｍＬに入れ、攪拌した。そして、液体ナトリウムエトキシドを滴加し、８０℃で１０時間攪拌した。反応終了後、固体は濾過し、濾過された溶液を減圧蒸留した。残留物をジクロロメタンと２Ｎ塩酸水溶液とで抽出した。有機層を乾燥硫酸ナトリウムで処理した後、濾過して減圧蒸留した（４７．７ｇ）。溶媒を除去した後、水３００ｍＬを添加して、１０時間還流撹拌した。反応終了後、ジクロロメタンで抽出した後、硫酸ナトリウムで処理して濾過し、減圧蒸留した（２５ｇ、７１％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝１８５．８４［Ｍ＋］
【００８１】
（２）［化学式１−ｂ］で表される化合物の合成
下記［反応式１−２］によって［化学式１−ｂ］で表される化合物を合成した。
【００８２】
【化１７】
2018530630.tif 000021
【００８３】
ｐ−ヒドラジノベンゼンスルホン酸（ｐ−Ｈｙｄｒａｚｉｎｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（２０ｇ、１０６ｍｍｏｌ）と［反応式１−１］から得た［化学式１−ａ］で表される化合物（５９．４ｇ、３１９ｍｍｏｌ）を６Ｎ塩酸水溶液３０ｍＬ／エタノール６０ｍＬに加えた後、１２時間還流撹拌した。そして、常温まで冷却し、生成された固体を濾過した。この固体を酢酸エチルで洗浄した後、減圧乾燥した。水酸化カリウム（１．４ｇ、２５．４ｍｍｏｌ）をプロパノール３５ｍＬに溶解させ、濾過された固体（５．１ｇ、２１．２ｍｍｏｌ）をメタノール３５ｍＬに溶解させ、滴加した後、常温で１２時間攪拌した。固体を濾過した後、乾燥させ、Ｃ１８逆相クロマトグラフィーを用いて水／メタノールで精製した（１１．１ｇ、３０％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝４０４．８６［Ｍ＋］
【００８４】
（３）［化学式１−ｃ］で表される化合物の合成
前記［反応式１−３］によって［化学式１−ｃ］で表される化合物を合成した。
【００８５】
前記［反応式１−２］から得た［化学式１−ｂ］で表される化合物（３．０ｇ、７．４ｍｍｏｌ）を常温、窒素気流下でエタノールと共に攪拌し、４８％塩酸水溶液（１０．０ｍＬ）を滴加した。１時間後、反応液を減圧蒸留した。反応器にアセトニトリル（１２０．０ｍＬ）、酢酸（３．０ｍＬ）及びアクロレインジエチルアセタール（１７．３ｇ、１３３．０ｍｍｏｌ）を添加した。７０℃で２時間反応させた。反応液を減圧蒸留し、ＨＰＬＣ（Ｒａｉｎｉｎ  Ｄｙｎａｍａｘ  Ｃ１８）８μｍカラム、水／アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）の展開液で６０分間、１０〜１００％まで２０ｍＬ／ｍｉｎで精製した（１．２ｇ、３０％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝４９６．９６［Ｍ＋］
【００８６】
（４）［化学式１−ｄ］で表される化合物の合成
下記［反応式１−４］によって［化学式１−ｄ］で表される化合物を合成した。
【００８７】
【化１８】
2018530630.tif 000022
【００８８】
３−アミノフェノール（３−Ａｍｉｎｏｐｈｅｎｏｌ）（５．０ｇ、４．５ｍｍｏｌ）と１，３−プロパンスルトン（１，３−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｔｏｎｅ）（０．５６ｇ、４．６ｍｍｏｌ）をｎ−ブタノールに入れ、３０分間還流撹拌した。反応液を常温に冷却させた後、一晩攪拌した。反応液を濾過して灰色の固体を分離した後、メタノールで洗浄した（０．８ｇ、８０％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝２３１．３０［Ｍ＋］
【００８９】
（５）［化学式１−ｅ］で表される化合物の合成
前記［反応式１−５］によって［化学式１−ｅ］で表される化合物を合成した。
【００９０】
前記［反応式１−４］から得た［化学式１−ｄ］で表される化合物（１ｇ、４．３ｍｍｏｌ）と１，３−プロパンスルトン（０．５４ｇ、４．４ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド５ｍＬに入れた後、１３０℃で２時間攪拌した。常温まで冷却した後、減圧蒸留し、逆相クロマトグラフィーで精製した（１．４８ｇ、９５％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３５３．１９［Ｍ＋］
【００９１】
（５）［化学式１−ｆ］で表される化合物の合成
前記［反応式１−６］によって［化学式１−ｆ］で表される化合物を合成した。
【００９２】
前記［反応式１−５］によって得た［化学式１−ｅ］で表される化合物（３．０ｇ、８．０ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．３ｇ、８．０ｍｍｏｌ）が入っている反応器に投入した。５０℃で１２時間反応させた。反応終了後、水で希釈した後、中和した。溶媒を除去した後、逆相クロマトグラフィーで精製した（０．８ｇ、２５％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３８０．８４［Ｍ＋］
【００９３】
（５）［化学式１］で表される化合物の合成
下記［反応式１−７］によって［化学式１］で表される化合物を合成した。
【００９４】
【化１９】
2018530630.tif 000023
【００９５】
前記［反応式１−３］によって合成した［化学式１−ｃ］で表される化合物（１．０ｇ、１．９ｍｍｏｌ）と［反応式１−６］によって合成した［化学式１−ｆ］で表される化合物（０．８ｇ、１．９ｍｍｏｌ）をエタノール２０ｍＬに溶解した後、８０℃で８時間攪拌した。反応終了後、減圧濃縮して溶媒を除去した。濃縮された反応物をクロロホルム５０ｍＬに溶解した後、５０％硫酸１ｍＬを滴加した。ジクロロメタンで希釈して、水で抽出した。有機層を減圧濃縮した後、ＨＰＬＣ（Ｒａｉｎｉｎ  Ｄｙｎａｍａｘ  Ｃ１８）８μｍカラム、水／アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）の展開液で６０分間、１０〜１００％まで２０ｍＬ／ｍｉｎで精製した（０．４ｇ、５１％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝７３９．７９［Ｍ＋］
【００９６】
合成例２：［化学式２］で表される化合物の合成
（１）［化学式２−ａ］で表される化合物の合成
下記［反応式２−１］によって［化学式２−ａ］で表される化合物を合成した。
【００９７】
【化２０】
2018530630.tif 000024
【００９８】
２−メチルアセト酢酸エチル（Ｅｔｈｙｌ  ２−ｍｅｔｈｙｌａｃｅｔｏａｃｅｔａｔｅ）（２３．５ｇ、１６３ｍｍｏｌ）と６−ブロモヘキサン酸エチル（Ｅｔｈｙｌ  ６−ｂｒｏｍｏｈｅｘａｎｏａｔｅ）（４０．０ｇ、１７９ｍｍｏｌ）をエタノール２００ｍＬに入れ、攪拌し、これに液体ナトリウムエトキシドを滴加した。８０℃で１０時間攪拌した。反応終了後、固体は濾過し、濾過された溶液を減圧蒸留した。残留物をジクロロメタンと２Ｎ塩酸水溶液で抽出した。有機層を乾燥硫酸ナトリウムで処理後、濾過して減圧蒸留した（４７．７ｇ）。溶媒を除去した後、水溶液３００ｍＬを添加し、１０時間還流撹拌した。反応終了後、ジクロロメタンで抽出した後、硫酸ナトリウムで処理して濾過し、減圧蒸留した（２５ｇ、７１％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝１８５．８４［Ｍ＋］
【００９９】
（２）［化学式２−ｂ］で表される化合物の合成
下記［反応式２−２］によって［化学式２−ｂ］で表される化合物を合成した。
【０１００】
【化２１】
2018530630.tif 000025
【０１０１】
フェニルヒドラジン塩酸塩（５．０ｇ、３４．６ｍｍｏｌ）と［反応式２−１］によって得た［化学式２−ａ］で表される化合物（３２．２ｇ、１７３ｍｍｏｌ）を６Ｎ塩酸水溶液３０ｍＬ／エタノール６０ｍＬに加えた後、１２時間還流撹拌した。常温まで冷却した後、反応液に酢酸エチルを滴加した。固体が析出されると、濾過した後、濾過液を減圧蒸留した後、シリカゲルカラムで精製して、液状化合物を得た（３．２ｇ、６１％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝２９６．８９［Ｍ＋］
【０１０２】
（３）［化学式２−ｃ］で表される化合物の合成
前記［反応式２−３］によって［化学式２−ｃ］で表される化合物を合成した。
【０１０３】
前記［反応式２−２］によって得た［化学式２−ｂ］で表される化合物（３．０ｇ、７．４ｍｍｏｌ）を常温、窒素気流下でエタノールと共に攪拌し、４８％塩酸水溶液（１０．０ｍＬ）を滴加した。１時間後、反応液を減圧蒸留した。反応器にアセトニトリル（１２０．０ｍＬ）、酢酸（３．０ｍＬ）及びアクロレインジエチルアセタール（１７．３ｇ、１３３．０ｍｍｏｌ）を添加した。これを７０℃で２時間反応させた。反応液を減圧蒸留し、ＨＰＬＣ（Ｒａｉｎｉｎ  Ｄｙｎａｍａｘ  Ｃ１８）８μｍカラム、水／アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）の展開液で６０分間、１０〜１００％まで２０ｍＬ／ｍｉｎで精製した（１．２ｇ、３０％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝４１８．０１［Ｍ＋］
【０１０４】
（４）［化学式２］で表される化合物の合成
下記［反応式２−４］によって［化学式２］で表される化合物を合成した。
【０１０５】
【化２２】
2018530630.tif 000026
【０１０６】
前記［反応式２−３］によって合成した［化学式２−ｃ］で表される化合物（１．０ｇ、１．９ｍｍｏｌ）と９−ホルミル−８−ヒドロキシジュロリジン（０．８ｇ、１．９ｍｍｏｌ）をエタノール２０ｍＬに溶解した後、８０℃で８時間攪拌した。反応終了後、減圧濃縮して溶媒を除去した。濃縮された反応物をクロロホルム５０ｍＬに溶解した後、５０％硫酸１ｍＬを滴加した。これをジクロロメタンで希釈して水で抽出した。抽出物を減圧蒸留した後、反応液をシリカゲルカラムで精製した（０．３ｇ、４０％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝４９６．９１［Ｍ＋］
【０１０７】
合成例３：［化学式３］で表される化合物の合成
（１）［化学式３−ａ］で表される化合物の合成
下記［反応式３−１］によって［化学式３−ａ］で表される化合物を合成した。
【０１０８】
【化２３】
2018530630.tif 000027
【０１０９】
２−メチルアセト酢酸エチル（Ｅｔｈｙｌ  ２−ｍｅｔｈｙｌａｃｅｔｏａｃｅｔａｔｅ）（２３．５ｇ、１６３ｍｍｏｌ）と６−ブロモヘキサン酸エチル（Ｅｔｈｙｌ  ６−ｂｒｏｍｏｈｅｘａｎｏａｔｅ）（４０．０ｇ、１７９ｍｍｏｌ）をエタノール２００ｍＬに入れ、攪拌し、液体ナトリウムエトキシドを滴加した。これを８０℃で１０時間攪拌した。反応終了後、固体は濾過し、濾過された溶液を減圧蒸留した。残留物をジクロロメタンと２Ｎ塩酸水溶液で抽出した。有機層を乾燥硫酸ナトリウムで処理後、濾過して減圧蒸留し（４７．７ｇ）、溶媒を除去した。これに水溶液３００ｍＬを添加して１０時間還流撹拌した。反応終了後、ジクロロメタンで抽出した後、硫酸ナトリウムで処理して濾過し、減圧蒸留した（２５ｇ、７１％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝１８５．８４［Ｍ＋］
【０１１０】
（２）［化学式３−ｂ］で表される化合物の合成
下記［反応式３−２］によって［化学式３−ｂ］で表される化合物を合成した。
【０１１１】
【化２４】
2018530630.tif 000028
【０１１２】
ｐ−ヒドラジノベンゼンスルホン酸（ｐ−Ｈｙｄｒａｚｉｎｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（２０ｇ、１０６ｍｍｏｌ）と［反応式３−１］によって得た［化学式３−ａ］で表される化合物（５９．４ｇ、３１９ｍｍｏｌ）を６Ｎ塩酸水溶液３０ｍＬ／エタノール６０ｍＬに加えた後、１２時間還流撹拌した。これを常温まで冷却し、生成された固体を濾過し、酢酸エチルで洗浄した後、減圧乾燥した。水酸化カリウム（１．４ｇ、２５．４ｍｍｏｌ）をプロパノール３５ｍｌに溶解させ、濾過された固体（５．１ｇ、２１．２ｍｍｏｌ）をメタノール３５ｍＬに溶解させて滴加した後、常温で１２時間攪拌した。固体を濾過した後、乾燥した。Ｃ１８逆相クロマトグラフィーを用いて水／メタノールで精製した（１１．１ｇ、３０％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝４０４．８６［Ｍ＋］
【０１１３】
（３）［化学式３−ｃ］で表される化合物の合成
前記［反応式３−３］によって［化学式３−ｃ］で表される化合物を合成した。
【０１１４】
前記［反応式３−２］によって得た［化学式３−ｂ］で表される化合物（３．０ｇ、７．４ｍｍｏｌ）を常温、窒素気流下でエタノールと共に攪拌し、４８％塩酸水溶液（１０．０ｍＬ）を滴加した。１時間後、反応液を減圧蒸留した。減圧蒸留された反応物にアセトニトリル（１２０．０ｍＬ）、酢酸（３．０ｍＬ）及びアクロレインジエチルアセタール（１７．３ｇ、１３３．０ｍｍｏｌ）を添加した。これを７０℃で２時間反応させた。反応液を減圧蒸留し、ＨＰＬＣ（Ｒａｉｎｉｎ  Ｄｙｎａｍａｘ  Ｃ１８）８μｍカラム、水／アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）の展開液で６０分間、１０〜１００％まで２０ｍＬ／ｍｉｎで精製した（１．２ｇ、３０％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝４９６．９６［Ｍ＋］
【０１１５】
（４）［化学式３−ｄ］で表される化合物の合成
下記［反応式３−４］によって［化学式３−ｄ］で表される化合物を合成した。
【０１１６】
【化２５】
2018530630.tif 000029
【０１１７】
７−メトキシ−２，２，４−トリメチル−１，２−ヒドロキノリン（１０．０ｇ、４９ｍｍｏｌ）と１，３−プロパンスルホン（６．６ｇ、５４ｍｍｏｌ）を１４５℃で３時間攪拌した。反応終了後、カラム精製した。このときジクロロメタンとメタノールを使用した（１０．０ｇ、６３％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３２５．０１［Ｍ＋］
【０１１８】
（５）［化学式３−ｅ］で表される化合物の合成
前記［反応式３−５］によって［化学式３−ｅ］で表される化合物を合成した。
【０１１９】
前記［反応式３−４］によって［化学式３−ｄ］で表される化合物（１０．０ｇ、３１ｍｍｏｌ）が入っている反応器にスルホン酸（９．８ｍＬ）を滴加した。これを３０分間攪拌した後、０℃で２０．０％オレウム（３．９ｍＬ）を滴加した。４８時間反応させた。反応終了後、低温状態の水に投入し、水酸化ナトリウムで中和し、エタノールを用いて再結晶させた（１１．０ｇ、８８％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝４０４．８８［Ｍ＋］
【０１２０】
（６）［化学式３−ｆ］で表される化合物の合成
前記［反応式３−６］によって［化学式３−ｆ］で表される化合物を合成した。
前記［反応式３−５］によって得た［化学式３−ｅ］で表される化合物（１２．０ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）、１０％Ｐｄ／Ｃ（０．９ｇ）及びメタノール１２０ｍＬを入れ、水素雰囲気下で常温攪拌した。１２時間攪拌した後、固体を濾過した。濾過された溶液を減圧蒸留し、エタノールを用いて再結晶させた（１１．５ｇ、９５％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝４０６．７８［Ｍ＋］
【０１２１】
（７）［化学式３−ｇ］で表される化合物の合成
前記［反応式３−７］によって［化学式３−ｇ］で表される化合物を合成した。
【０１２２】
前記［反応式３−６］によって得た［化学式３−ｆ］で表される化合物（１２．０ｇ、２９．０ｍｍｏｌ）、ヨウ化ナトリウム（１１．０ｇ、７４．０ｍｍｏｌ）及び臭化水素（７２．０ｇ、１７４．０ｍｍｏｌ）を反応器に入れ、１０５℃で１２時間攪拌した。反応終了後、炭酸水素ナトリウム水溶液を用いて中和させた。溶媒を除去し、水／アセトン／エタノールを用いて結晶を生成させた。メタノール／アセトンを用いて再結晶させ、アセトンで洗浄した（３．０ｇ、２７％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３９２．９３［Ｍ＋］
【０１２３】
（８）［化学式３−ｈ］で表される化合物の合成
前記［反応式３−８］によって［化学式３−ｈ］で表される化合物を合成した。
【０１２４】
前記［反応式３−７］によって得た［化学式３−ｇ］で表される化合物（３．０ｇ、８．０ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．３ｇ、８．０ｍｍｏｌ）が入っている反応器に投入した。５０℃で１２時間反応させた。反応終了後、水で希釈した後、中和した。溶媒を除去した後、メタノール／アセトンを用いて結晶を生成し、エタノールを用いて再結晶させた（０．８ｇ、２５％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝４２０．７４［Ｍ＋］
【０１２５】
（９）［化学式３］で表される化合物の合成
下記［反応式３−９］によって［化学式３］で表される化合物を合成した。
【０１２６】
【化２６】
2018530630.tif 000030
【０１２７】
前記［反応式３−３］によって合成した［化学式３−ｃ］で表される化合物（１．０ｇ、１．９ｍｍｏｌ）と［反応式３−８］によって合成した［化学式３−ｈ］で表される化合物（０．８ｇ、１．９ｍｍｏｌ）をエタノール２０ｍＬに溶解した後、８０℃で８時間攪拌した。反応終了後、減圧濃縮して溶媒を除去した。濃縮された反応物をクロロホルム５０ｍＬに溶解した後、５０％硫酸１ｍＬを滴加した。これをジクロロメタンで希釈して水で抽出した。有機層を減圧濃縮した後、ＨＰＬＣ（Ｒａｉｎｉｎ  Ｄｙｎａｍａｘ  Ｃ１８）８μｍカラム、水／アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）の展開液で６０分間、１０〜１００％まで２０ｍＬ／ｍｉｎで精製した（０．４ｇ、５１％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝７８０．０１［Ｍ＋］
【０１２８】
（１０）［化学式３６；化学式３−ＮＨＳ］で表される化合物の合成
下記反応式によって［化学式３−ＮＨＳ］で表される化合物を合成した。
【０１２９】
【化２７】
2018530630.tif 000031
【０１３０】
前記［反応式３−９］によって得た［化学式３］で表される化合物（０．２４ｇ、０．５ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（０．０３ｇ、０．０３ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．０５４ｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍｌ）に溶解して、１時間常温で攪拌した。反応終了後、ＨＰＬＣ（Ｒａｉｎｉｎ  Ｄｙｎａｍａｘ  Ｃ１８）８μｍカラム、水／アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）の展開液で６０分間、１０〜１００％まで２０ｍｌ／ｍｉｎで精製した（０．１５ｇ、５６．６％）。
【０１３１】
合成例４：［化学式４］で表される化合物の合成
【０１３２】
【化２８】
2018530630.tif 000032
【０１３３】
【化２９】
2018530630.tif 000033
【０１３４】
（１）［化学式４−ａ］で表される化合物の合成
前記［反応式４−１］によって［化学式４−ａ］で表される化合物を合成した。
【０１３５】
Ｐ−ヒドラジノベンゼンスルホン酸（ｐ−ｈｙｄｒａｚｉｎｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（２０ｇ、１０６ｍｍｏｌ）と３−メチル−２−ブタノン（２７．４８ｇ、３１９ｍｍｏｌ）を用いて、［反応式１−２］によって合成した（１１．１ｇ、３０％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝２７７．０２［Ｍ＋］
【０１３６】
（２）［化学式４−ｂ］で表される化合物の合成
前記［反応式４−２］によって［化学式４−ｂ］で表される化合物を合成した。
【０１３７】
前記［反応式４−１］によって得た［化学式４−ａ］で表される化合物を［反応式１−３］によって合成した（５．０ｇ、３４．０％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝４０８．１２［Ｍ＋］
【０１３８】
（３）［化学式４−ｃ］で表される化合物の合成
前記［反応式４−３］によって［化学式４−ｃ］で表される化合物を合成した。
【０１３９】
３−メトキシ−Ｎ−メチルアニリン（１０．０ｇ、７３．０ｍｍｏｌ）と６−ブロモヘキサン酸（１７．１ｇ、８７．５ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１００ｍｌで還流撹拌した。反応終了後、カラム精製した（１３．６ｇ、７４．３％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝２５２．１５［Ｍ＋］
【０１４０】
（４）［化学式４−ｄ］で表される化合物の合成
前記［反応式４−４］によって［化学式４−ｄ］で表される化合物を合成した。
【０１４１】
前記［反応式４−４］によって得た［化学式４−ｄ］で表される化合物を用いて、［反応式３−７］によって合成した（５．１ｇ、４５．６％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝２３８．１４［Ｍ＋］
【０１４２】
（５）［化学式４−ｅ］で表される化合物の合成
前記［反応式４−５］によって［化学式４−ｅ］で表される化合物を合成した。
【０１４３】
前記［反応式４−５］によって得た［化学式４−ｄ］で表される化合物を用いて、［反応式１−６］によって合成した（２．０ｇ、３５．１％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝２６６．１３［Ｍ＋］
【０１４４】
（６）［化学式４−ｆ］で表される化合物の合成
前記［反応式４−６］によって［化学式４−ｆ］で表される化合物を合成した。
【０１４５】
前記［反応式４−２］によって合成した［化学式４−ｂ］で表される化合物及び［反応式４−５］によって合成した［化学式４−ｅ］で表される化合物を用いて、［反応式１−７］によって合成した（０．４６ｇ、２３．５％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝５２５．２０［Ｍ＋］
【０１４６】
（７）［化学式４］で表される化合物の合成
前記［反応式４−７］によって［化学式４］で表される化合物を合成した。
【０１４７】
前記［反応式４−２］によって合成した［化学式４−ｂ］で表される化合物（１．０ｇ、１．９ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１．０ｍｌに溶解した後、塩化ホスホリル０．５ｍｌを添加して加熱した。これに２−アミノエタン−１，１−ジスルホン酸を投入し、常温攪拌した後、カラム精製した（０．２ｇ、１５．２％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝６９６．１４［Ｍ＋］
【０１４８】
合成例５：［化学式５］で表される化合物の合成
（１）［化学式５−ａ］で表される化合物の合成
【０１４９】
【化３０】
2018530630.tif 000034
【０１５０】
［化学式５−ａ］で表される化合物を７−メトキシ−２，２−４−トリメチル−１，２−ジヒドロキノリンを用いて［反応式５−１］のように合成した（１５．０ｇ、５２．６％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３１８．２０［Ｍ＋］
【０１５１】
（２）［化学式５−ｂ］で表される化合物の合成
前記［反応式５−２］によって［化学式５−ｂ］で表される化合物を合成した。
【０１５２】
前記［反応式５−１］によって得た［化学式５−ａ］で表される化合物を用いて［反応式５−２］によって合成した。（１３．０ｇ、６５．０％）
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝４２０．１４［Ｍ＋］
【０１５３】
（３）［化学式５−ｃ］で表される化合物の合成
前記［反応式５−３］によって［化学式５−ｃ］で表される化合物を合成した。
【０１５４】
前記［反応式５−２］によって得た［化学式５−ｂ］で表される化合物を用いて［反応式５−３］によって［化学式５−ｃ］で表される化合物を合成した（７．２ｇ、５６．０％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝４０６．１２［Ｍ＋］
【０１５５】
（４）［化学式５−ｄ］で表される化合物の合成
前記［反応式５−４］によって［化学式５−ｄ］で表される化合物を合成した。
【０１５６】
前記［反応式５−３］によって得た［化学式５−ｃ］で表される化合物を用いて［反応式３−８］によって［化学式５−ｄ］で表される化合物を合成した（２．５ｇ、３０％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝４３４．１２［Ｍ＋］
【０１５７】
（５）［化学式５］で表される化合物の合成
前記［反応式５−５］によって［化学式５］で表される化合物を合成した。
【０１５８】
前記［反応式４−２］によって合成した［化学式４−ｂ］で表される化合物及び［反応式５−４］によって合成した［化学式５−ｄ］で表される化合物を用いて、［反応式４−６］によって［化学式５］で表される化合物を合成した（０．５１ｇ、３２．０％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝６９３．１８［Ｍ＋］
【０１５９】
合成例６：［化学式６］で表される化合物の合成
【０１６０】
【化３１】
2018530630.tif 000035
【０１６１】
【化３２】
2018530630.tif 000036
【０１６２】
（１）［化学式６−ａ］で表される化合物の合成
前記［反応式６−１］によって［化学式６−ａ］で表される化合物を合成した。２，３，３−トリエチルインドレニンを用いて［反応式１−３］によって［化学式６−ａ］で表される化合物を合成した（１０．０ｇ、６２．５％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝２６１．１６［Ｍ＋］
【０１６３】
（２）［化学式６−ｂ］で表される化合物の合成
前記［反応式６−２］によって［化学式６−ｂ］で表される化合物を合成した。ｍ−アニシジンを用いて［反応式４−３］によって［化学式６−ｂ］で表される化合物を合成した（８．１ｇ、４２．１％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝２３８．１４［Ｍ＋］
【０１６４】
（３）［化学式６−ｃ］で表される化合物の合成
前記［反応式６−３］によって［化学式６−ｃ］で表される化合物を合成した。
【０１６５】
前記［反応式６−２］によって合成した［化学式６−ｂ］で表される化合物（５．０ｇ、２１．０ｍｍｏｌ）、１−クロロ−３−メチル−２−ブタン（５．２ｇ、２５．３ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（３．５ｇ、２５．３ｍｏｌ）及びアセトニトリル２５．０ｍｌを還流撹拌した。反応終了後、カラム精製した（４．０ｇ、６２．０％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３０６．２０［Ｍ＋］
【０１６６】
（４）［化学式６−ｄ］で表される化合物の合成
前記［反応式６−４］によって［化学式６−ｄ］で表される化合物を合成した。
【０１６７】
前記［反応式６−３］によって合成した［化学式６−ｃ］で表される化合物（４．０ｇ、１３．１ｍｍｏｌ）とメタンスルホン酸４．０ｍｌを入れ、還流撹拌した。反応終了後、中和して抽出し、カラム精製した（３．０ｇ、７５．２％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３０６．２０［Ｍ＋］
【０１６８】
（５）［化学式６−ｅ］で表される化合物の合成
前記［反応式６−４］によって［化学式６−ｅ］で表される化合物を合成した。
【０１６９】
前記［反応式６−４］によって合成した［化学式６−ｄ］で表される化合物を用いて［反応式３−７］によって［化学式６−ｅ］で表される化合物を合成した（２．５ｇ、８７．３％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝２９２．１８［Ｍ＋］
【０１７０】
（６）［化学式６−ｆ］で表される化合物の合成
前記［反応式６−５］によって［化学式６−ｆ］及び［化学式６−ｇ］で表される化合物を合成した。
【０１７１】
前記［反応式６−４］によって合成した化合物を用いて［反応式３−８］によって［化学式６−ｅ］（０．８４ｇ、３１．８％）及び［化学式６−ｇ］（０．５６ｇ、２１．２％）で表される化合物を合成した。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３２０．４［Ｍ＋］
【０１７２】
（７）［化学式６］で表される化合物の合成
前記［反応式６−６］によって［化学式６］で表される化合物を合成した。
【０１７３】
前記［反応式６−１］によって合成した［化学式６−ａ］で表される化合物及び［反応式６−５］によって合成した［化学式６−ｆ］で表される化合物を用いて、［反応式１−７］によって［化学式６］で表される化合物を合成した（０．３５ｇ、３２．０％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝５００．３０［Ｍ＋］
【０１７４】
合成例７：［化学式７］で表される化合物の合成
（１）［化学式７］で表される化合物の合成
前記［反応式６−６］によって［化学式７］で表される化合物を合成した。
【０１７５】
前記［反応式６−１］によって合成した［化学式６−ａ］で表される化合物及び［反応式６−５］によって合成した［化学式６−ｇ］で表される化合物を用いて、［反応式１−７］によって［化学式７］で表される化合物を合成した（０．２４ｇ、３５．０％）。
ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝５００．３０［Ｍ＋］
【０１７６】
合成例８：［化学式４４］で表される化合物の合成
（１）［化学式８−ａ］で表される化合物の合成
下記［反応式８−１］によって［化学式８−ａ］で表される化合物を合成した。
【０１７７】
【化３３】
2018530630.tif 000037
【０１７８】
２−メチルアセト酢酸エチル（Ｅｔｈｙｌ  ２−ｍｅｔｈｙｌａｃｅｔｏａｃｅｔａｔｅ）（２３．５ｇ、１６３ｍｍｏｌ）と６−ブロモヘキサン酸エチル（ｅｔｈｙｌ  ６−ｂｒｏｍｏｈｅｘａｎｏａｔｅ）（４０．０ｇ、１７９ｍｍｏｌ）をエタノール２００ｍｌに入れて攪拌し、液体ナトリウムエトキシドを滴加した。これを８０℃で１０時間攪拌した。反応終了後、固体は濾過し、濾過された溶液を減圧蒸留し、ジクロロメタンと２Ｎ塩酸水溶液で抽出した。有機層を乾燥硫酸ナトリウムで処理後、濾過して減圧蒸留した（４７．７ｇ）。溶媒を除去した後、水３００ｍｌを添加して、１０時間還流撹拌した。反応終了後、反応液をジクロロメタンで抽出した後、硫酸ナトリウムで処理して濾過し、減圧蒸留した（２５ｇ、７１％）。
【０１７９】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１０．８５（１Ｈ，ｓ），２．５２（１Ｈ，ｍ），２．３６（２Ｈ，ｍ）２．３０（３Ｈ，ｓ），１．６５（４Ｈ，ｍ），１．３５（４Ｈ，ｍ），１．０９（３Ｈ，ｄ）
【０１８０】
（２）［化学式８−ｂ］で表される化合物の合成
下記［反応式８−２］によって［化学式８−ｂ］で表される化合物を合成した。
【０１８１】
【化３４】
2018530630.tif 000038
【０１８２】
フェニルヒドラジン塩酸塩（ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（８．６ｇ、７５ｍｍｏｌ）と［化学式８−ａ］で表される化合物（４２ｇ、２２５ｍｍｏｌ）をエタノール８６ｍｌに入れ、塩酸２１．５ｍｌを加えた後、１２時間還流撹拌した。これを常温に冷却させ、酢酸エチル５０ｍｌを添加した。生成された固体を濾過し、酢酸エチルで洗浄した後、減圧乾燥した。残留物をジクロロメタンと２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で抽出した。有機層を減圧乾燥し、シリカカラムで精製した（８．５ｇ、４０％）。
【０１８３】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．９２（１Ｈ，ｑ），７．５１（２Ｈ，ｍ），７．４２（１Ｈ，ｑ），４．０９（２Ｈ，ｑ），２．８２（３Ｈ，ｓ），２．１８（２Ｈ，ｔ），２．１２（２Ｈ，ｍ），１．９７（２Ｈ，ｍ），１．４９（３Ｈ，ｓ），１．４６（２Ｈ，ｍ），１．２６（２Ｈ，ｍ），１．２３（３Ｈ，ｔ），０．７３（２Ｈ，ｍ）
【０１８４】
（３）［化学式８−ｃ］で表される化合物の合成
下記［反応式８−３］によって［化学式８−ｃ］で表される化合物を合成した。
【０１８５】
【化３５】
2018530630.tif 000039
【０１８６】
前記［反応式８−２］によって得た［化学式８−ｂ］で表される化合物８ｇ（２８ｍｍｏｌ）を、常温、窒素気流下でエタノール４００ｍｌと共に攪拌し、４８％塩酸水溶液（８０ｍｌ）を滴加した。１時間後、反応液を減圧蒸留した。反応器にアセトニトリル（３２０ｍｌ）、酢酸（８ｍｌ）及びアクロレインジエチルアセタール（６５．７２ｇ、５０５ｍｍｏｌ）を添加した。これを７０℃で２時間反応させた。反応液を減圧蒸留し、ＨＰＬＣ（Ｒａｉｎｉｎ  Ｄｙｎａｍａｘ  Ｃ１８）８μｍカラム、水／アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）の展開液で６０分間、１０〜１００％まで２０ｍｌ／ｍｉｎで精製した。
【０１８７】
（４）［化学式８−ｄ］で表される化合物の合成
下記［反応式８−４］によって［化学式８−ｄ］で表される化合物を合成した。
【０１８８】
【化３６】
2018530630.tif 000040
【０１８９】
前記［反応式８−３］によって得た［化学式８−ｃ］で表される化合物２ｇ（４．７ｍｍｏｌ）と２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド０．５８ｇ（４．７ｍｍｏｌ）をエタノール２０ｍｌに入れ、３時間還流攪拌した。これを常温に冷却して減圧蒸留した後、シリカカラムで精製した。精製した物質にクロロホルム１０ｍｌと５０％硫酸水溶液１ｍｌを入れ、常温で２０分間攪拌した。２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７〜８に調整し、塩化メチレンで抽出し、減圧蒸留後、シリカカラムで精製した（０．３ｇ、１５％）。
【０１９０】
（５）［化学式４４］で表される化合物の合成
下記［反応式８−５］によって［化学式４４］で表される化合物を合成した。
【０１９１】
【化３７】
2018530630.tif 000041
【０１９２】
前記［反応式８−４］によって得た［化学式８−ｄ］で表される化合物０．３ｇ（０．６７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル１．３ｍｌに入れ、６Ｎ塩酸溶液１．３ｍｌを添加して１２時間攪拌した。これを２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ７〜８に調整し、減圧蒸留し、ＨＰＬＣ（Ｒａｉｎｉｎ  Ｄｙｎａｍａｘ  Ｃ１８）８μｍカラム、水／アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）の展開液で精製した（９０ｍｇ、３２％）。
【０１９３】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）：δ＝８．２８（１Ｈ，ｓ），７．６８（２Ｈ，ｍ），７．６１（２Ｈ，ｍ），７．４８（１Ｈ，ｄ），６．５８（１Ｈ，ｄ），６．４０（１Ｈ，ｓ），５．４２（１Ｈ，ｍ），６．７０（１Ｈ，ｍ），４．３０（１Ｈ，ｍ），２．８７（１Ｈ，ｍ），２．５４（１Ｈ，ｍ），２．１４（２Ｈ，ｍ），１．８０（２Ｈ，ｍ），１．２９（３Ｈ，ｓ），０−３（６Ｈ，ｍ）
【０１９４】
合成例９：［化学式４５］で表される化合物の合成
（１）［化学式９−ａ］で表される化合物の合成
下記［反応式９−１］によって前記［反応式８−２］と同様の方法で［化学式９−ａ］で表される化合物を合成した。
【０１９５】
【化３８】
2018530630.tif 000042
【０１９６】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．９２（２Ｈ，ｄｄ），７．８１（１Ｈ，ｄ），７．７６（１Ｈ，ｄ），７．４９（１Ｈ，ｔ），７．３９（１Ｈ，ｔ），４．０１（２Ｈ，ｑ），２．３８（１Ｈ，ｍ）２．３２（３Ｈ，ｓ），２．０４（２Ｈ，ｔ），１．９７（１Ｈ，ｍ），１．４７（３Ｈ，ｓ），１．３５（２Ｈ，ｍ），１．１６（３Ｈ，ｔ），１．０７（２Ｈ，ｍ），０．５８（１Ｈ，ｍ），０．３９（１Ｈ，ｍ）
【０１９７】
（２）［化学式９−ｂ］で表される化合物の合成
下記［反応式９−２］によって［化学式９−ｂ］で表される化合物を合成した。
【０１９８】
【化３９】
2018530630.tif 000043
【０１９９】
前記［反応式９−１］によって得た［化学式９−ａ］で表される化合物１０ｇ（３０ｍｍｏｌ）と硫酸溶液５ｍｌを入れ、１８０℃で２時間加熱攪拌した。常温に冷却した後、これこれに氷を入れ、５０％水酸化ナトリウム溶液５ｍｌをゆっくり滴加した。常温で２４時間攪拌した後、生成された沈殿物を濾過し、濾液に飽和硫酸ナトリウム水溶液５ｍｌを添加した。生成された沈殿物を濾過し、固体を水で２回再結晶した。得られた固体を真空乾燥した（８ｇ、６０％）。
【０２００】
（３）［化学式９−ｃ］で表される化合物の合成
下記［反応式９−３］によって、前記［反応式８−３］と同様の方法で［化学式９−ｃ］で表される化合物を合成した。
【０２０１】
【化４０】
2018530630.tif 000044
【０２０２】
（４）［化学式９−ｄ］で表される化合物の合成
下記［反応式９−４］によって、前記［反応式８−４］と同様の方法で［化学式９−ｄ］で表される化合物を合成した。
【０２０３】
【化４１】
2018530630.tif 000045
【０２０４】
（５）［化学式４５］で表される化合物の合成
下記［反応式９−５］によって［化学式４５］で表される化合物を合成した。
【０２０５】
【化４２】
2018530630.tif 000046
【０２０６】
前記［反応式９−４］によって得た［化学式９−ｄ］で表される化合物０．３ｇ（３０ｍｍｏｌ）に硫酸溶液１ｍｌを入れ、４０℃で２時間加熱攪拌した。これを常温に冷却し、氷を入れ、５０％水酸化ナトリウム溶液をゆっくり滴加して中性に調整した。ＨＰＬＣ（Ｒａｉｎｉｎ  Ｄｙｎａｍａｘ  Ｃ１８）８μｍカラム、水／アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）の展開液で６０分間、１０〜１００％まで２０ｍｌ／ｍｉｎで精製した。
【０２０７】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）：δ＝８．１３（２Ｈ，ｍ），７．９７（３ｈ，ｍ），７．７２（２Ｈ，ｍ），５．４８（１Ｈ，ｍ），４．６５（１Ｈ，ｍ）４．４３（１Ｈ，ｍ），２．９８（１Ｈ，ｍ），２．６１（１Ｈ，ｍ），２．４４（１Ｈ，ｍ），２．２４（１Ｈ，ｍ），１．７７（３Ｈ，ｄ），１．７０（２Ｈ，ｍ），０．８５（４Ｈ，ｍ）０．４６（１Ｈ，ｍ），−０．０１（１Ｈ，ｍ）
【０２０８】
合成例１０：［化学式４６］で表される化合物の合成
下記反応式によって［化学式４６］で表される化合物を合成した。
【０２０９】
【化４３】
2018530630.tif 000047
【０２１０】
前記［反応式８−５］によって得た［化学式４４］で表される化合物（０．５ｇ、０．１３８ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（０．０８ｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．１４２ｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍｌ）に溶解し、１時間常温で攪拌した。反応終了後、これをＨＰＬＣ（Ｒａｉｎｉｎ  Ｄｙｎａｍａｘ  Ｃ１８）８μｍカラム、水／アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）の展開液で６０分間、１０〜１００％まで２０ｍｌ／ｍｉｎで精製した（０．３８ｇ、６０．０％）。
【０２１１】
合成例１１：［化学式４７］で表される化合物の合成
（１）［化学式１１−ａ］で表される化合物の合成
下記［反応式１１−１］によって、前記［反応式８−３］と同様の方法で［化学式１１−ａ］で表される化合物を合成した。
【０２１２】
【化４４】
2018530630.tif 000048
【０２１３】
（２）［化学式１１−ｂ］で表される化合物の合成
下記［反応式１１−２］によって、前記［反応式８−４］と同様の方法で［化学式１１−ｂ］で表される化合物を合成した。
【０２１４】
【化４５】
2018530630.tif 000049
【０２１５】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）：δ＝７．９０（１Ｈ，ｓ），７．４５（２Ｈ，ｍ），７．２５（２Ｈ，ｍ），７．００（１Ｈ，ｄ），６．３１（１Ｈ，ｄ），５．１５（１Ｈ，ｍ），４．３６（１Ｈ，ｍ），３．９２（１Ｈ，ｍ），２．７８（１Ｈ，ｍ），２．４１（１Ｈ，ｍ），１．７３（６Ｈ，ｄ）
【０２１６】
（３）［化学式４７］で表される化合物の合成
下記［反応式１１−３］によって［化学式４７］で表される化合物を合成した。
【０２１７】
【化４６】
2018530630.tif 000050
【０２１８】
前記［反応式１１−２］によって得た［化学式１１−ｂ］で表される化合物０．３ｇ（１ｍｍｏｌｅ）を、５０℃、窒素気流下で水酸化カリウム０．１ｇ（２ｍｍｏｌｅ）、エタノール３ｍｌと共に３０分間加熱攪拌した。これに５−ヨードペンタン酸エチルエステル０．３ｇ（１ｍｍｏｌｅ）を添加し、３時間還流撹拌した。反応終了後、減圧濃縮した。ＨＰＬＣ（Ｒａｉｎｉｎ  Ｄｙｎａｍａｘ  Ｃ１８）８μｍカラム、水／アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）の展開液で６０分間、１０〜１００％まで２０ｍＬ／ｍｉｎで精製した。
【０２１９】
Ｍ＋＝４４８．２，１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ＝８．２８（１Ｈ，ｓ），７．５５−７．８０（４Ｈ，ｍ），７．３１（１Ｈ，ｓ），６．６０（１Ｈ，ｓ），５．５１（１Ｈ，ｓ），４．７４（１Ｈ，ｍ），４．０８（１Ｈ，ｍ），２．９４（１Ｈ，ｍ），２．６６（１Ｈ，ｍ），１．８２（６Ｈ，ｄ），１−４．５（１０Ｈ，ｍ）
【０２２０】
合成例１２：［化学式４８］で表される化合物の合成
（１）［化学式１２−ａ］で表される化合物の合成
下記［反応式１２−１］によって、前記［反応式８−３］と同様の方法で［化学式１２−ａ］で表される化合物を合成した。
【０２２１】
【化４７】
2018530630.tif 000051
【０２２２】
（２）［化学式４８］で表される化合物の合成
下記［反応式１２−２］によって、前記［反応式８−４］と同様の方法で［化学式４８］で表される化合物を合成した。
【０２２３】
【化４８】
2018530630.tif 000052
【０２２４】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）：δ＝７．４０（１Ｈ，ｓ），８．３７（１Ｈ，ｄ），８．２０（１Ｈ，ｄ），８．１３（１Ｈ，ｄ），７．８４（１Ｈ，ｄ），７．７７（１Ｈ，ｔ），７．６７（１Ｈ，ｔ），７．４９（１Ｈ，ｄｄ），６．５９（１Ｈ，ｄｔ），６．４１（１Ｈ，ｓ），５．４６（１Ｈ，ｍ），４．８２（１Ｈ，ｍ），４．４２（１Ｈ，ｍ），２．９２（１Ｈ，ｍ），２．６０（１Ｈ，ｍ），２．１０（２Ｈ，ｍ），２．０１（２Ｈ，ｔ），１．２９（３Ｈ，ｓ），１．３３（２Ｈ，ｍ），１．１１（２Ｈ，ｍ），０．８４（１Ｈ，ｍ），０．４３（１Ｈ，ｍ）
【０２２５】
合成例１３：［化学式４９］で表される化合物の合成
（１）［化学式４９］で表される化合物の合成
下記［反応式１３−１］によって、前記［反応式８−４］と同様の方法で［化学式４９］で表される化合物を合成した。
【０２２６】
【化４９】
2018530630.tif 000053
【０２２７】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）：δ＝８．３９（１Ｈ，ｓ），８．３３（１Ｈ，ｄ），８．１７（１Ｈ，ｄｄ），８．０９（１Ｈ，ｄ），７．８３（１Ｈ，ｄｄ），７．７４（１Ｈ，ｔ），７．６４（１Ｈ，ｔ），７．５４（１Ｈ，ｄｄ），６．７０（１Ｈ，ｄｔ），６．５６（１Ｈ，ｍ），５．４６（１Ｈ，ｍ），４．８４（１Ｈ，ｍ），４．４１（１Ｈ，ｍ），３．８６（３Ｈ，ｓ），３．７０（１Ｈ，ｍ），２．９０（２Ｈ，ｍ），２．６３（３Ｈ，ｍ），１．９４（２Ｈ，ｔ），１．２５（３Ｈ，ｓ），１．０７（２Ｈ，ｔ），０．８０（１Ｈ，ｍ），０．４０（１Ｈ，ｍ）
【０２２８】
合成例１４：［化学式５０］で表される化合物の合成
（１）［化学式５０］で表される化合物の合成
下記［反応式１４−１］によって、前記［反応式９−５］と同様の方法で［化学式５０］で表される化合物を合成した。
【０２２９】
【化５０】
2018530630.tif 000054
【０２３０】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ＝８．６２（１Ｈ，ｓ），８．４０（１Ｈ，ｍ），８．３１（１Ｈ，ｍ），８．３７（１Ｈ，ｄ），７．９９（１Ｈ，ｄｄ），７．９２（１Ｈ，ｄ），８．０５（１Ｈ，ｓ），６．４３（１Ｈ，ｓ），５．４８（１Ｈ，ｍ），４．８４（１Ｈ，ｍ），４．４２（１Ｈ，ｍ），２．８０（５Ｈ，ｍ），２．５８（１Ｈ，ｍ），１．９８（３Ｈ，ｓ），１．９５（２Ｈ，ｔ），１．２０（１Ｈ，ｍ），１．０４（１Ｈ，ｍ），０．７６（１Ｈ，ｍ），０．２５（１Ｈ，ｍ）
【０２３１】
合成例１５：［化学式５１］で表される化合物の合成
（１）［化学式１５−ａ］で表される化合物の合成
下記［反応式１５−１］によって、前記［反応式８−４］と同様の方法で［化学式５１］で表される化合物を合成した。
【０２３２】
【化５１】
2018530630.tif 000055
【０２３３】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１０．１５（１Ｈ，ｓ），７．８０（１Ｈ，ｓ），７．６６（１Ｈ，ｓ），７．３６（２Ｈ，ｍ），７．２８（１Ｈ，ｄ），７．１２（１Ｈ，ｄ），５．９７（１Ｈ，ｓ），５．１２（１Ｈ，ｍ），４．２５（１Ｈ，ｍ），３．９３（１Ｈ，ｍ），２．７３（１Ｈ，ｍ），２．３３（１Ｈ，ｍ），１．６８（３Ｈ，ｓ），１．６３（３Ｈ，ｓ）
【０２３４】
（２）［化学式１５−ｂ］で表される化合物の合成
下記［反応式１５−２］によって［化学式１５−ｂ］で表される化合物を合成した。
【０２３５】
【化５２】
2018530630.tif 000056
【０２３６】
４−アミノ安息香酸５ｇ（３６ｍｍｏｌｅ）とチオシアン酸カリウム１９．０３ｇ（１９５ｍｍｏｌｅ）を酢酸７０ｍｌに入れ、５０分間常温で攪拌した。これに０℃でブロム２．０６ｍｌ（４０ｍｍｏｌｅ）をゆっくり滴加した。得られた混合物を常温で２４時間攪拌した。反応液に水２００ｍｌを添加し、７０〜８０℃で１．５時間加熱攪拌した。反応混合物を減圧濾過し、濾過液を０℃でアンモニウム溶液を添加してｐＨを６に調整し、減圧濾過し、固体を乾燥した。
【０２３７】
（３）［化学式１５−ｃ］で表される化合物の合成
下記［反応式１５−３］によって［化学式１５−ｃ］で表される化合物を合成した。
【０２３８】
【化５３】
2018530630.tif 000057
【０２３９】
水酸化カリウム２０ｇを水６０ｍｌに入れ、３０分間常温で攪拌した。これに前記［反応式１５−２］から得た［化学式１５−ｂ］で表される化合物９．４ｇを添加し、光を遮断した状態で１２０℃で２４時間還流撹拌した。得られた混合物に塩酸を添加してｐＨを４に調整し、濾過したする。固体を水で複数回洗浄した後、乾燥させた。
【０２４０】
（４）［化学式５１］で表される化合物の合成
下記［反応式１５−４］によって［化学式５１］で表される化合物を合成した。
【０２４１】
【化５４】
2018530630.tif 000058
【０２４２】
前記［反応式１５−１］によって得た［化学式１５−ａ］で表される化合物０．２ｇ（０．５８ｍｍｏｌｅ）、［反応式１５−３］によって得た［化学式１５−ｃ］で表される化合物０．６９ｇ（０．６９ｍｍｏｌｅ）、及びｐ−トルエンスルホン酸０．０１１ｇ（０．０５８ｍｍｏｌｅ）を、ジメチルホルムアミドに入れ、８０〜９０℃で２４時間加熱攪拌した。反応終了後、水を添加し、減圧濾過し、水で複数回洗浄した後、乾燥させた。
【０２４３】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ＝１２．８５（１Ｈ，ｓ），８．７８（１Ｈ，ｓ），８．７４（１Ｈ，ｓ），８．０４（１Ｈ，ｍ），７．８０（１Ｈ，ｑ），７．５７（１Ｈ，ｍ），７．４４（１Ｈ，ｄ），７．０８（１Ｈ，ｄ），６．５９（１Ｈ，ｓ），５．４４（１Ｈ，ｑ），４．６８（１Ｈ，ｑ），４．２３（１Ｈ，ｍ），２．７８（１Ｈ，ｍ），２．２６（１Ｈ，ｍ），１．７８（６Ｈ，ｄ）
【０２４４】
合成例１６：［化学式５２］で表される化合物の合成
（１）［化学式１６−ａ］で表される化合物の合成
下記［反応式１６−１］によって［化学式１６−ａ］で表される化合物を合成した。
【０２４５】
【化５５】
2018530630.tif 000059
【０２４６】
４−アミノフェニル酢酸１５．１ｇ（０．１ｍｏｌｅ）と炭酸ナトリウム１０．５ｇ（０．１ｍｏｌ）を水１２０ｍｌに入れ、１０分間攪拌した。これに、ナトリウムニトリル６．９ｇ（０．１ｍｏｌｅ）を溶解させた水３０ｍｌにゆっくり滴加した。熱が開放され、泡を発した。１０分間攪拌した後、塩酸１４０ｍｌをゆっくり滴加し、３０分間攪拌した。塩化スズ二水和物４５．１ｇ（０．２ｍｏｌｅ）を溶解させた塩酸をゆっくり滴加した後、常温で攪拌した。反応終了後、反応混合物を減圧濾過し、冷水とエタノールで洗浄した（２２ｇ）。
【０２４７】
（２）［化学式１６−ｂ］で表される化合物の合成
下記［反応式１６−２］によって［化学式１６−ｂ］で表される化合物を合成した。
【０２４８】
【化５６】
2018530630.tif 000060
【０２４９】
前記［反応式１５−１］によって得た［化学式１５−ａ］で表される化合物２２ｇ（０．１３２ｍｏｌｅ）を酢酸２２０ｍｌに入れ、攪拌した。これ物に３−メチル−２−ブタノン２７．４ｇ（０．３１８ｍｏｌｅ）を添加し、３０分間常温で攪拌した。還流撹拌は完全に溶解するまで続けた。反応液を常温に冷却し、塩化メチレンと水を用いて抽出した。減圧濃縮後、乾燥した（褐色固体１０ｇ）。
【０２５０】
（３）［化学式１６−ｃ］で表される化合物の合成
下記［反応式１６−３］によって［化学式１６−ｃ］で表される化合物を合成した。
【０２５１】
【化５７】
2018530630.tif 000061
【０２５２】
０℃に冷却したエタノール１００ｍｌに塩化チオニル７ｍｌをゆっくり滴加し、１０分間攪拌した。これに前記［反応式１５−１］によって得た［化学式１５−１ａ］で表される化合物１０ｇ（０．０５ｍｏｌｅ）を溶解させたエタノールをゆっくり滴加し、常温で攪拌した。減圧濃縮後、乾燥した（紫色液状１３ｇ）。
【０２５３】
（４）［化学式１６−ｄ］で表される化合物の合成
下記［反応式１６−４］によって、前記［反応式８−３］と同様の方法で［化学式１６−ｄ］で表される化合物を合成した。
【０２５４】
【化５８】
2018530630.tif 000062
【０２５５】
（４）［化学式１６−ｅ］で表される化合物の合成
下記［反応式１６−５］によって、前記［反応式８−４］と同様の方法で［化学式１６−ｅ］で表される化合物を合成した。
【０２５６】
【化５９】
2018530630.tif 000063
【０２５７】
（５）［化学式５２］で表される化合物の合成
下記［反応式１６−６］によって［化学式５２］で表される化合物を合成した。
【０２５８】
【化６０】
2018530630.tif 000064
【０２５９】
前記［反応式１６−５］によって得た［化学式１６−ｅ］で表される化合物０．６ｇ（１ｍｍｏｌｅ）を、メタノール、テトラヒドロフラン、水がそれぞれ１１ｍｌずつ混合されている溶媒に入れ、攪拌した。これに水酸化リチウム一水和物３．８ｇ（９ｍｍｏｌｅ）を添加し、２４時間攪拌した。そして、１Ｎ塩酸水溶液を用いてｐＨ４以下に調整し、塩化メチレンを用いて抽出した。抽出物を減圧蒸留した後、シリカカラムで精製した（０．５ｇ）。
【０２６０】
合成例１７：［化学式５３］で表される化合物の合成
（１）［化学式１７−ａ］で表される化合物の合成
下記［反応式１７−１］によって、前記［反応式１６−３］と同様の方法で［化学式１７−ａ］で表される化合物を合成した。
【０２６１】
【化６１】
2018530630.tif 000065
【０２６２】
（２）［化学式１７−ｂ］で表される化合物の合成
下記［反応式１７−２］によって［化学式１７−ｂ］で表される化合物を合成した。
【０２６３】
【化６２】
2018530630.tif 000066
【０２６４】
塩化ホスホリル４．０１ｍｌ（２６ｍｍｏｌｅ）にジメトキシホルムアミド４．７８ｍｌ（６５．４ｍｍｏｌｅ）をゆっくり滴下し、常温で２時間攪拌した。これに前記［反応式１７−１］によって得た［化学式１７−ａ］で表される化合物５ｇ（２４ｍｍｏｌｅ）を溶解させたジメトキシホルムアミド１２．５ｍｌをゆっくり滴加し、２４時間攪拌した。反応液を過量の水にゆっくり滴加した。析出された固体を減圧濾過し、シリカカラムで精製した。
【０２６５】
（３）［化学式１７−ｃ］で表される化合物の合成
下記［反応式１７−３］によって［化学式１７−ｃ］で表される化合物を合成した。
【０２６６】
【化６３】
2018530630.tif 000067
【０２６７】
前記［反応式１７−２］から得た［化学式１７−ｂ］で表される化合物８ｇ（３４ｍｍｏｌｅ）をジクロロメタン２００ｍｌに入れ、攪拌した。これに塩化アルミニウム１３．４４ｇ（１０１ｍｍｏｌｅ）をゆっくり滴加し、４０℃で２４時間加熱攪拌した。常温に冷却した後、６Ｎ塩酸水溶液１００ｍｌを滴加し、抽出し、シリカカラムで精製した（４．３ｇ、５９％）。
【０２６８】
（４）［化学式１７−ｄ］で表される化合物の合成
下記［反応式１７−４］によって、前記［反応式１６−６］と同様の方法で［化学式１７−ｄ］で表される化合物を合成した。
【０２６９】
【化６４】
2018530630.tif 000068
【０２７０】
（５）［化学式１７−ｅ］で表される化合物の合成
下記［反応式１７−５］によって、前記［反応式９−３］と同様の方法で［化学式１７−ｅ］で表される化合物を合成した。
【０２７１】
【化６５】
2018530630.tif 000069
【０２７２】
（６）［化学式１７−ｆ］で表される化合物の合成
下記［反応式１７−６］によって、前記［反応式９−４］と同様の方法で［化学式１７−ｆ］で表される化合物を合成した。
【０２７３】
【化６６】
2018530630.tif 000070
【０２７４】
（７）［化学式５３］で表される化合物の合成
下記［反応式１７−７］によって、前記［反応式８−４］と同様の方法で［化学式５３］で表される化合物を合成した。
【０２７５】
【化６７】
2018530630.tif 000071
【０２７６】
合成例１８：［化学式９７］で表される化合物の合成
（１）［化学式１８−ａ］で表される化合物の合成
下記［反応式１８−１］によって［化学式１８−ａ］で表される化合物を合成した。
【０２７７】
【化６８】
2018530630.tif 000072
【０２７８】
２−（２−ブロモエチル）−１，３−ジオキソラン（２２ｍＬ、０．１８８ｍｏｌ）とヨウ化カリウム（６３ｇ、０．３７６ｍｏｌ）をアセトニトリル３００ｍｌに入れ、５０℃で１時間攪拌した。これに２，３，３−トリエチルインドレニン（３０ｇ、０．１８８ｍｏｌ）を滴加した後、１２時間還流撹拌した。冷却後、固体を濾過し、濾過された溶液を減圧蒸留し、シリカカラムで精製した（２５ｇ、３４％）。
【０２７９】
（２）下記［反応式１８−２］によって［化学式９７］で表される化合物を合成した。
【０２８０】
【化６９】
2018530630.tif 000073
【０２８１】
前記［反応式１８−１］によって得た［化学式１８−ａ］で表される化合物（５ｇ、１．３ｍｍｏｌ）と２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド（１．８ｇ、１．３ｍｍｏｌ）をエタノール１０ｍｌに入れ、３時間還流撹拌した。これを常温に冷却して減圧蒸留した後、シリカカラムで精製した。精製した物質にクロロホルム５００ｍｌと５０％硫酸水溶液１００ｍｌを入れ、常温で２０分間攪拌した。２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７〜８に調整し、塩化メチレンで抽出した。減圧蒸留後、シリカカラムで精製した。
【０２８２】
合成例１９：［化学式９８］で表される化合物の合成
下記［反応式１８−３］によって［化学式９８］で表される化合物を合成した。
【０２８３】
【化７０】
2018530630.tif 000074
【０２８４】
前記［反応式１８−１］によって得た［化学式１８−ａ］で表される化合物（１ｇ、４ｍｍｏｌ）と４−ジメチルアミノサリチルアルデヒド（０．７ｇ、４ｍｍｏｌ）をエタノール１０ｍｌに入れ、２時間還流撹拌した。これを常温に冷却して減圧蒸留した後、シリカカラムで精製した。精製した物質にクロロホルム１００ｍｌと５０％硫酸水溶液１０ｍｌを入れ、常温で２０分間攪拌した。２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７〜８に調整し、塩化メチレンで抽出した。減圧蒸留した後、シリカカラムで精製した。
【０２８５】
合成例２０：［化学式１０５］で表される化合物の合成
（１）Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１２，１８，１６１９６−１６２０２に記載された合成方法により、下記［反応式２０−１］によって［化学式２０−ａ］で表される化合物を合成した。
【０２８６】
【化７１】
2018530630.tif 000075
【０２８７】
（２）Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１０，１６，１５８−１６６に記載された合成方法により、下記［反応式２０−２］によって［化学式２０−ｂ］で表される化合物を合成した。
【０２８８】
【化７２】
2018530630.tif 000076
【０２８９】
（３）Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１０，１６，１５８−１６６に記載された合成方法により、下記［反応式２０−３］によって［化学式２０−ｃ］で表される化合物を合成した。
【０２９０】
【化７３】
2018530630.tif 000077
【０２９１】
（４）下記［反応式２０−４］によって［化学式２０−ｄ］で表される化合物を合成した。
【０２９２】
【化７４】
2018530630.tif 000078
【０２９３】
反応器にて、Ｎ−ジメチルホルムアミドを０℃に冷却したオキシ塩化リンに滴加した。これを１０分間攪拌し、［化学式４−ｃ］で表される化合物をＮ−ジメチルホルムアミドに希釈して滴加した。５０℃で１２時間反応させた後、常温に冷却した。反応物を氷水に注ぎ、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で中和した後、酢酸エチルで抽出した。溶液を減圧濃縮し、シリカカラムで精製した。
【０２９４】
（５）下記［反応式２０−５］によって［化学式１０５］で表される化合物を合成した。
【０２９５】
【化７５】
2018530630.tif 000079
【０２９６】
反応器にて、［化学式２０−ａ］で表される化合物（３ｇ、０．０１１５ｍｏｌ）とエタノール３０ｍｌを入れ、４０℃で攪拌した。［化学式４−ｄ］で表される化合物（２．８８ｇ、０．０１１２ｍｏｌ）をエタノールに希釈して反応物に投入し、１２時間還流撹拌した。常温に冷却し、減圧濃縮した。反応物をクロロホルム３００ｍｌに希釈した後、５０％硫酸水溶液３０ｍｌを常温で滴加し、２時間反応させた。１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で中和し、塩化メチレンで抽出した。減圧濃縮した後、カラムで精製した（０．８ｇ、１６％）。
【０２９７】
実験例１
本発明に係る［化学式１］〜［化学式７］の化合物に対して、吸収スペクトル（λａｂｓ）、発光スペクトル（λｅｍ）、モル吸光係数（ε）及び量子効率を測定した。測定結果を下記表１に示す。
【０２９８】
【化７６】
2018530630.tif 000080
【０２９９】
【表１】
2018530630.tif 000081
【０３００】
実験例２
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）と本発明に係る［化学式１］の化合物に対して、それぞれＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧで標識した後の吸収（Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）スペクトル及び蛍光発光（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ）スペクトルを確認した。
【０３０１】
図１Ａは、［化学式１］の化合物をＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧで標識した後の吸収スペクトルであり、図１Ｂは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８をＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧで標識した後の吸収スペクトルであり、図１Ｃは、［化学式１］の化合物をＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧで標識した後の蛍光発光スペクトルであり、図１Ｄは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８をＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧで標識した後の蛍光発光スペクトルである。
【０３０２】
本発明に係る［化学式１］の化合物は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８の吸収波長と類似し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８よりも凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）の発生が少ないことを確認することができ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８よりも蛍光発光強度もまたさらに大きいことが確認できた。
【０３０３】
実験例３
１．Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧを０．１Ｍ重炭酸ナトリウムバッファー（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）で希釈して、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を調製した。
【０３０４】
２．５個のチューブを準備し、各チューブに１２５μlずつタンパク質溶液を入れた。
【０３０５】
３．Ｄｙｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（５ｍｇ／ｍｌ）を１、２、３、４、５μlずつ、準備されたチューブに入れ、ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）させた。
【０３０６】
４．チューブを常温でロッカー（ｌｏｃｋｅｒ）内で約３０分間振とうした。
【０３０７】
５．Ａｍｉｃｏｎ遠心分離フィルター（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ｆｉｌｔｅｒ）に反応溶液を入れた。
【０３０８】
６．遠心分離でｆｒｅｅ  ｄｙｅが除去されるまでＰＢＳで洗浄した（１４，０００ｒｐｍ、１０分、５回）。
【０３０９】
７．Ａｍｉｃｏｎ  ｔｕｂｅに遠心分離フィルターを逆さに結合した後、濾液を回収した（１，０００ｒｐｍ、２分）。
【０３１０】
８．ＰＢＳ１ｍｌで希釈させた。
【０３１１】
９．マイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）でＵＶ、ＰＬ及び蛍光を測定した。
【０３１２】
標識（ｌａｂｅｌｉｎｇ）後、２８０ｎｍにおける色素（Ｄｙｅ）の吸光度の値及びタンパク質の吸光度の値を測定し、以下の式を用いて各サンプル中のタンパク質に対する色素の比率を決定した。
【０３１３】
【数１】
2018530630.tif 000082
【０３１４】
分母の因子Ｘは、色素の最大吸光度（Ａｄｙｅ）及び前記最大吸光度のａ％に相応する２８０ｎｍでの色素の吸光度を考慮したものである。
【０３１５】
図１Ｅは、本発明に係る［化学式１］の化合物及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８をＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧで標識した後の輝度（ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ）を確認した結果であり、本発明に係る［化学式１］の化合物はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８よりも輝度が高いことが確認できた。
【０３１６】
実験例４
１．ＩｇＧ  ｆｒｏｍ  Ｍｏｕｓｅ  Ｓｅｒｕｍ（ｐｒｉｍａｒｙ）をコーティングバッファー（ｃｏａｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）に溶解して１０ｕｇ／ｍｌの濃度とした。
【０３１７】
２．ＦＬＩＳＡ  Ｈ／Ｂ  ｂｌａｃｋ  ｃｏｒｎｉｎｇ  ｐｌａｔｅに１００μlずつウェル（ｗｅｌｌ）に分注した。
【０３１８】
３．トップシーリング（Ｔｏｐ  ｓｅａｌｉｎｇ）後、常温暗所で２時間インキュベーション（Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した。
【０３１９】
４．ウォッシングバッファー（Ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）を３００μlずつウエル（ｗｅｌｌ）に入れ、３回洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）した。
【０３２０】
５．ブロッキングバッファー（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）を３００μlずつウエル（ｗｅｌｌ）に入れ、トップシーリング後、常温暗所で１時間インキュベーションした。
【０３２１】
６．ブロッキングバッファーを除去した後、ウォッシングバッファーで３回洗浄した。
【０３２２】
７．色素結合（Ｄｙｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）された２次抗体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）（１０μｕ／ｍｌ）を１００μlずつ各ウェルに入れ、トップシーリング後、常温暗所で１時間インキュベーションした。
【０３２３】
８．溶液の除去後、ウォッシングバッファーを２００μlずつ各ウェルに入れ、５回洗浄した。
【０３２４】
９．サンプルが入っているウェルにＰＢＳを１００μlずつ入れた。
【０３２５】
１０．マイクロプレートリーダーで蛍光を測定した。
【０３２６】
下記表２は、本発明に係る［化学式１］の化合物とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８に対するＤ／Ｐ比（Ｄ／Ｐ  ｒａｔｉｏ）における蛍光測定値を示したものであり、図１Ｆは、［化学式１］の化合物とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８の生体活性（ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ）を比較確認したグラフである。
【０３２７】
【表２】
2018530630.tif 000083
【０３２８】
前記表２及び図１Ｆに示したように、本発明に係る［化学式１］の化合物は、Ｄ／Ｐ比が〜４．８であるとき、Ｄｙｅ−２次抗体が１次抗体に結合される効率が最も大きいことが確認でき、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８よりも輝度値が高くて遥かに明るく、生体内の作用活性がさらに優れていることが確認できた。
【０３２９】
実験例５
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）及び本発明に係る［化学式３］の化合物に対して、それぞれＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧで標識した後の吸収スペクトル及び蛍光発光スペクトルを確認した。
【０３３０】
図２Ａは、［化学式３］の化合物をＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧで標識した後の吸収スペクトルであり、図２Ｂは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４をＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧで標識した後の吸収スペクトルであり、図２Ｃは、［化学式３］をＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧで標識した後の蛍光発光スペクトルであり、図２Ｄは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４をＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧで標識した後の蛍光発光スペクトルである。
【０３３１】
本発明に係る［化学式３］の化合物は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４の吸収波長と類似し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４よりも蛍光発光強度がさらに大きいことが確認できた。
【０３３２】
実験例６
本発明に係る［化学式３］の化合物に対して前記実験例３と同様に行った。
【０３３３】
図２Ｅは、本発明に係る［化学式３］の化合物及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４をＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧで標識した後の輝度を確認した結果であって、本発明に係る［化学式３］の化合物がＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４よりも輝度が高く、Ｄ／Ｐ比が大きいほど、［化学式３］の化合物はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４よりも輝度がさらに高いことが確認できた。
【０３３４】
実験例７
本発明に係る［化学式３］の化合物に対して前記実験例４と同様に行った。
【０３３５】
下記表３は、本発明に係る［化学式３］の化合物及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４に対するＤ／Ｐ比における蛍光測定値を示したものであり、図２Ｆは、［化学式３］の化合物とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４の生体活性を比較確認したグラフである。
【０３３６】
【表３】
2018530630.tif 000084
【０３３７】
前記表３及び図２Ｆに示したように、本発明に係る［化学式３］の化合物は、Ｄ／Ｐ比が〜３．４であるとき、Ｄｙｅ−２次抗体が１次抗体に結合される効率が最も高いことを確認することができ、Ｄ／Ｐ比が５以上であるとき、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４よりも輝度が遥かに高く、生体内の作用活性もさらに優れていることが確認できた。
【０３３８】
実験例８
本発明に係る［化学式４４］〜［化学式５３］の化合物に対して、吸収スペクトル（λａｂｓ）、発光スペクトル（λｅｍ）、モル吸光係数及び量子効率を測定した。測定結果を下記表４に示す。
【０３３９】
【化７７】
2018530630.tif 000085
【０３４０】
【表４】
2018530630.tif 000086
【０３４１】
実験例９
本発明に係る［化学式５０］の化合物に対して前記実験例３と同様に行った。
【０３４２】
下記の図３Ａは、本発明に係る［化学式５０］の化合物をＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧで標識した後の吸収スペクトルである。
【０３４３】
図３Ｂは、本発明に係る［化学式５０］の化合物及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６をＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧで標識した後の輝度を確認した結果であり、本発明に係る［化学式５０］の化合物がＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６よりも輝度が高いことが確認できた。
【０３４４】
実験例１０
本発明に係る［化学式５０］の化合物に対して前記実験例４と同様に行った。
【０３４５】
下記表５は、本発明に係る［化学式５０］の化合物及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６に対するＤ／Ｐ比における蛍光測定値を示したものであり、図３Ｃは、［化学式５０］の化合物及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６の生体活性を比較確認したグラフである。
【０３４６】
【表５】
2018530630.tif 000087
【０３４７】
前記表５及び図３Ｃに示したように、本発明に係る［化学式５０］の化合物は、Ｄ／Ｐ比が〜２．５であるとき、Ｄｙｅ−２次抗体が１次抗体に結合される効率が最も高いことを確認することができ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６よりも輝度が遥かに高いことが確認できた。
【０３４８】
実験例１１：本発明に係る化合物に対する光学特性の評価
本発明に係る染料化合物は、従来のシアニン染料化合物に比べて非常に高い蛍光量子効率を示す。下記表６に示すように、下記の比較化合物と比較して、モル吸光係数は低いが、蛍光量子収率は非常に高いため、（モル吸光係数×蛍光量子効率）の場合、比較化合物に比べて高かった。
【０３４９】
本発明の色素化合物の２つの因子（モル吸光係数×蛍光量子収率）の積は、比較化合物よりも遥かに大きかった。
【０３５０】
【化７８】
2018530630.tif 000088
【０３５１】
【表６】
2018530630.tif 000089
【０３５２】
実験例１２：本発明に係る化合物のミトコンドリア選択性
本発明に係る［化学式１１０］の化合物がミトコンドリアに特異な選択性を示すかを確認するために、Ｒａｗ  ２６４．７細胞を［化学式１１０］の化合物及び市販のミトコンドリアマーカー（ＭＴＧ、１μＭ  ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＭ  ｆｏｒ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）を用いて共局在化（Ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）させた。
【０３５３】
サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社のＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＭの構造式は、以下の通りである。
【０３５４】
【化７９】
2018530630.tif 000090
【０３５５】
ＯＰＭ画像は、それぞれ５６０−６００ｎｍ（化学式１１０、λｅｘ＝５５２ｎｍ）及び４７０−５２０ｎｍ（ＭＴＧ、λｅｘ＝４８８ｎｍ）で取得し、これらの画像を、それぞれ図４Ａ及び図４Ｂに示した。また、図４Ｃは、図４Ａと図４Ｂを重ね合わせた画像であり、ピアソンの共局在化効率を示す係数（Ａ）は、ＬＡＳ  ＡＦソフトウェアを用いて計算した。
［ＭＴＧ］＝１μＭ  ｆｏｒ  ３０ｍｉｎ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ、λｅｘ＝４８８ｎｍ
［化学式１１０］＝１μＭ  ｆｏｒ  ３０ｍｉｎ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ、λｅｘ＝５５２ｎｍ
【０３５６】
その結果、ＭＴＧと［化学式１１０］の化合物を共に染色して、それぞれの画像を重ね合わせたとき、重複度Ａは０．７３であり、ミトコンドリアが主として染色されたことが確認された。これは、本発明に係る染料［化学式１１０］の化合物は細胞内の他のオルガネラ（小器官）よりもミトコンドリアを選択的に染色し、ミトコンドリアを正確に画像化できることが分かった。
【０３５７】
実験例１３
本発明に係る［化学式１１０］の化合物１．０μＭで染色されたＨｅＬａ  Ａ４３１細胞の３つの領域（Ａ，Ｂ，Ｃ）の蛍光強度を２秒間隔で３５００秒間測定し、その結果を、図５に示した。
【０３５８】
図５に示したように、蛍光強度が１時間に渡ってほとんど減少せず、本発明に係る［化学式１１０］の化合物は光安定性が非常に優れていることが確認できた。
【０３５９】
実験例１４：本発明に係る化合物のミトコンドリア選択性
本発明に係る［化学式９７］の化合物がミトコンドリアに特異な選択性を示すかを確認するために、ＨｅＬａ  Ａ４３１細胞を［化学式９７］の化合物及び市販のミトコンドリアマーカー（ＭＴＧ、０．２μＭ  ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＭ  ｆｏｒ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）を用いて共局在化させた。
【０３６０】
ＯＰＭ画像は、それぞれ５７１−６５０ｎｍ（化学式９７、λｅｘ＝５５２ｎｍ）及び４９８−５４０ｎｍ（ＭＴＧ、λｅｘ＝４８８ｎｍ）で取得し、これらの画像を、それぞれの図６Ａ及び図６Ｂに示した。また、図６Ｃは、図６Ａと図６Ｂを重ね合わせた画像であり、ピアソンの共局在化効率を示す係数（Ａ）は、ＬＡＳ  ＡＦソフトウェアを用いて計算した。
【０３６１】
［ＭＴＧ］＝０．２μＭ  ｆｏｒ  ３０ｍｉｎ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ、λｅｘ＝４８８ｎｍ
［化学式９７］＝０．５μＭ  ｆｏｒ  ３０ｍｉｎ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ、λｅｘ＝５５２ｎｍ
その結果、ＭＴＧと［化学式９７］を共に染色して、それぞれの画像を重ね合わせたとき、重複度Ａは０．７４であり、ミトコンドリアが主として染色されたことが確認された。これは、本発明に係る染料［化学式９７］の化合物は細胞内の他のオルガネラよりもミトコンドリアを選択的に染色し、ミトコンドリアを正確に画像化できることが分かった。
【０３６２】
実験例１５
本発明に係る［化学式９８］の化合物１．０μＭで染色されたＨｅＬａ  Ａ４３１細胞の４つの領域（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）の蛍光強度を２秒間隔で３５００秒間測定し、その結果を、図７に示した。
【０３６３】
図７に示したように、蛍光強度が１時間渡ってほとんど減少せず、本発明に係る［化学式９８］は光安定性が非常に優れていることが確認できた。
【０３６４】
比較実験例
Ｃｙ３Ｂ  １．０μＭで染色されたＨｅＬａ  Ａ４３１細胞のＡ、Ｂの２つの部分の蛍光強度を２秒間隔で２０００秒間測定し、その結果を、図８に示した。
【０３６５】
図８に示したように、蛍光強度が１５００秒の間に大きく減少したので、光安定性が非常に劣り、本発明に係る染料化合物に比べて光安定性が非常によくないことが分かった。
【０３６６】
【化８０】
2018530630.tif 000091
【０３６７】
実験例１６及び１７：本発明に係る化合物のｐＨプローブとしての特性確認
図９及び図１０に示したように、本発明に係る［化学式１１１］の化合物は、酸性（Ａｃｉｄｉｃ）条件（ｐＨ１−６）で蛍光強度が増加し、塩基性（Ｂａｓｉｃ）条件（ｐＨ９−１２）で蛍光強度が減少するプローブタイプ（ｐｒｏｂｅ  ｔｙｐｅ）であり、酸性条件の細胞小器官に対する選択性が高いため、生細胞内で酸性オルガネラ（ａｃｉｄｉｃ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ）を標識できることが分かった。一方、［化学式９７］の化合物の場合には、酸性条件（ｐＨ１−６）で蛍光強度が減少し、塩基性条件（ｐＨ９−１２）で蛍光強度が増加するプローブタイプであることが分かった。また、［化学式９７］の化合物の吸収波長及び蛍光波長は、現在入手可能なレーザーライン（Ｌａｓｅｒ  ｌｉｎｅ）（４８８ｎｍ、５３２ｎｍ、５５０ｎｍ）によく一致する。
【０３６８】
すなわち、［化学式１１１］の化合物のｐＨプローブタイプは、ｐＨ２〜６の間で強い蛍光を発し、［化学式９７］の化合物のｐＨプローブタイプは、ｐＨ８〜１２の間で強い蛍光を発する。この２つのタイプの染料を活用して、使用目的に応じて選択して使用することができる。
【０３６９】
したがって、本発明に係る染料化合物は、ｐＨの変化に応じて蛍光強度が変わる特徴を有しているため、この特性を用いて、生細胞（Ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌ）のｐＨを測定できるｐＨプローブとしても使用可能である。また、生細胞の染色によってｐＨを測定する方法以外に、最近は、プレートリーダーを用いて細胞のｐＨを測定する方法が用いられており、本発明に係る染料化合物は、この方法にも用いることができ、ｐＨを測定する様々な分野に適用することができる。
【０３７０】
実験例１８
本発明に係る［化学式９７］、［化学式１００］〜［化学式１０２］の化合物に対して光物理的特性を評価し、評価結果を下記表７に示した。全ての測定は、ＤＭＳＯ、エタノール及びＰＢＳ  Ｂｕｆｆｅｒに対して行われた。また、二光子断面積（δ）は、フェムト秒単位（ｆｅｍｔｏ  ｓｅｃｏｎｄ、ｆｓ）の蛍光測定法を用いて測定した。
【０３７１】
また、図１１は、ＰＢＳ緩衝溶液及びエタノールでの本発明に係る［化学式９７］、及び［化学式１００］〜［化学式１０２］の化合物の二光子活性スペクトルである。
【０３７２】
【表７】
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【０３７３】
λｍａｘａｂｓ：一光子吸収スペクトルの最大波長（単位：ｎｍ）
λｍａｘｆｌ：一光子放出スペクトルの最大波長（単位：ｎｍ）
Φ：蛍光量子効率
ｅΦ：モル吸光係数×蛍光量子効率
λ（２）ｍａｘａｂｓ：二光子吸収スペクトルの最大波長（単位：ｎｍ）
ｄ：１０−５０ｃｍ４ｓ／ｐｈｏｔｏｎでの光子当たりのピーク二光子断面積（単位：ＧＭ）
ｄΦ：二光子作用断面積（ｔｗｏ  ｐｈｏｔｏｎ  ａｃｔｉｏｎ  ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎ）
【産業上の利用可能性】
【０３７４】
本発明に係る染料化合物は、従来のシアニン染料に比べて量子効率が著しく改善された効果を有し、より強い蛍光を発するので、光学画像が必要な様々な生物学的システムに対するプローブなどに広範囲な分野で有効に活用することができる。
【０３７５】
特に、ミトコンドリアを標識して追跡できるＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒとして活用できるので、生体又は細胞組織でミトコンドリアを定量的に画像化することができ、また、生細胞のｐＨを測定できるｐＨプローブとしても適用することができる。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
2018530630.tif 000109
【図１ｃ】
2018530630.tif 000110
【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
2018530630.tif 000113
【図２ａ】
2018530630.tif 000114
【図２ｂ】
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【図２ｃ】
2018530630.tif 000116
【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７】
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【図８】
2018530630.tif 000131
【図９】
2018530630.tif 000132
【図１０】
2018530630.tif 000133
【図１１】
2018530630.tif 000134
【誤訳訂正書】
【提出日】平成30年6月19日(2018.6.19)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１Ａ
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１Ａ】
2018530630.tif 000135
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１Ｄ
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１Ｄ】
2018530630.tif 000136
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図２Ａ
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図２Ａ】
2018530630.tif 000137
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図２Ｄ
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図２Ｄ】
2018530630.tif 000138
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図３】
2018530630.tif 000139
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図４】
2018530630.tif 000140
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図５】
2018530630.tif 000141
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図６】
2018530630.tif 000142
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図７】
2018530630.tif 000143
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図８】
2018530630.tif 000144
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図９】
2018530630.tif 000145
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１０】
2018530630.tif 000146
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１１】
2018530630.tif 000147
【手続補正書】
【提出日】平成30年6月19日(2018.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、染料化合物に関し、より詳細には、量子効率、蛍光強度及び光安定性などの光特性に優れ、高水溶性であり、生体分子との結合又は生体分子内で優れた光特性の維持が可能な新規な染料化合物に関する。（本研究は、大韓民国産業通商資源部の優秀技術研究センタ（ＡＴＣ）事業（１００７６９８８、蛍光体及び分子の診断のためのこれらの応用技術の開発）の研究費の支援を受けて行われた。）
【国際調査報告】
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