(57)【要約】  本発明は、植物ゲノムの部位特異的改変の実施に非遺伝物質を適用する方法を開示する。本方法は以下：対象植物の細胞または組織または植物部分に非遺伝物質を導入するステップを含み、その際、前記非遺伝物質は標的部分に特異的なヌクレアーゼであるか、または前記ヌクレアーゼを発現するｍＲＮＡであり、前記ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）ヌクレアーゼ、またはゲノム編集を実現しうるあらゆるヌクレアーゼである。前記ヌクレアーゼは前記標的部分を切断する役割を果たし、次いで前記植物のＤＮＡ修復により該標的部分の部位特異的改変が完了される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物において標的遺伝子の標的断片に対して部位特異的改変を行うための方法であって、特に以下：
対象植物の細胞または組織または部分に非遺伝物質を導入するステップ
を含む方法において、
前記非遺伝物質は、前記標的断片に特異的なヌクレアーゼであるか、または前記ヌクレアーゼを発現するｍＲＮＡであり、それにより前記標的断片が前記ヌクレアーゼにより切断され、かつ前記植物におけるＤＮＡ修復により前記標的断片に対する部位特異的改変が達成される方法。
【請求項２】
前記ヌクレアーゼが、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、またはゲノム編集を達成しうる他の任意のヌクレアーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記非遺伝物質が、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼであるか、または対を成すＴＡＬＥＮタンパク質を発現しうるｍＲＮＡであり、その際、前記ＴＡＬＥＮタンパク質は、前記標的断片を認識してこれに結合しうるＤＮＡ結合ドメインと、Ｆｏｋ  Ｉドメインと、から構成される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記非遺伝物質が、ジンクフィンガーヌクレアーゼであるか、または対を成すＺＦＮタンパク質を発現しうるｍＲＮＡであり、その際、前記ＺＦＮタンパク質は、前記標的断片を認識してこれに結合しうるＤＮＡ結合ドメインと、Ｆｏｋ  Ｉドメインと、から構成される、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記非遺伝物質が、Ｃａｓ９タンパク質かまたはＣａｓ９タンパク質を発現しうるｍＲＮＡと、ガイドＲＮＡと、から構成され、その際、前記ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の部分的な塩基対形成により形成される回文構造を有するＲＮＡであり、前記ｃｒＲＮＡは、前記標的断片に相補的に結合しうるＲＮＡ断片を含む、請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、前記非遺伝物質を導入できかつ組織培養によりインタクト植物へと再生しうる任意の細胞であり、前記組織が、前記非遺伝物質を導入できかつ組織培養によりインタクト植物へと再生しうる任意の組織であるか、または前記植物の前記部分が、前記非遺伝物質を導入しうるインタクト植物の任意の部分である、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、プロトプラスト細胞もしくは懸濁細胞であり、前記組織が、カルス、未熟胚もしくは成熟胚であり、または前記植物の前記部分が、葉、茎頂、花序もしくは花粉管である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
パーティクルボンバードメント、ＰＥＧ媒介型プロトプラスト形質転換、花粉管による手法、または非遺伝物質の導入に使用しうる他の任意の手法により、前記非遺伝物質を前記対象植物の細胞または組織または部分に導入する、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記部位特異的改変が、前記標的断片におけるヌクレオチドの挿入、欠失および／または置換である、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
導入遺伝子を含まない変異体植物の製造方法であって、特に以下：
請求項１から９までのいずれか１項記載の方法により対象植物において標的遺伝子の標的断片に対して部位特異的改変を行うことにより、植物であって、前記標的遺伝子の機能が喪失または変更されており、かつ該植物のゲノムは組み込まれた外来遺伝子を含まない植物を得るステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物遺伝子工学の分野に属し、非遺伝物質を用いることにより植物ゲノムを部位特異的に改変する方法に関し、詳細には、タンパク質またはｍＲＮＡを用いることにより遺伝子導入を行わずに植物ゲノムを部位特異的に改変するための方法に関する。
【０００２】
技術的背景
ゲノム編集技術は、遺伝子機能を探索しかつ作物を遺伝的に改良するための最も有望な手段である。現在利用可能なゲノム編集技術としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、ＴＡＬＥＮ）、および規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ）に関与する系（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）が挙げられ、これらは配列特異的ヌクレアーゼ（ＳＳＮ）と称される。それらの共通の特徴は、それらがエンドヌクレアーゼとして作用して特定のＤＮＡ配列を切断して、ＤＮＡ２本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらしうる点にある。ＤＳＢにより、細胞の固有の修復機構である非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換え（ＨＲ）を活性化することができ、それによりＤＮＡ損傷が修復される。それにより、部位特異的な置換または挿入の変異体を生成することができる。現在、一部の植物（例えばイネ、シロイヌナズナ、トウモロコシ、コムギ）において植物ゲノムを改変するためのゲノム編集技術が効率的に用いられており、こうしたゲノム編集技術は、重要な作物の農業形質の改良における大きな将来性を示している。
【０００３】
しかし、ゲノム編集によって作物改良の有望な可能性が生じてはいるものの、依然として大きな課題がある。ゲノムの編集を行うには、配列特異的ヌクレアーゼを細胞内で発現させるべきである。目下、植物細胞内で配列特異的ヌクレアーゼを発現させる方法は、ヌクレアーゼを発現する発現ベクターまたはＤＮＡ断片を従来の形質転換手法（アグロバクテリウム媒介型形質転換、パーティクルボンバードメント、注入など）により細胞に送達するという方法である。これらの遺伝物質が植物の染色体に無秩序に組み込まれて転写されて、編集が行われる。こうした従来の形質転換手法は、植物ゲノムへの外来遺伝子の組込みを伴うとともに、形質転換の際に選択マーカー（選択圧）を必要とし、これによって望ましくない表現型が生じる場合がある。得られた植物の適用は、ＧＭＯ規則で規制されるものと考えられる。したがって、遺伝物質ＤＮＡを導入する必要なく植物においてゲノム編集を行うための方法を確立する必要がある。
【０００４】
発明の概要
本発明の目的は、植物において標的遺伝子の標的断片に対して部位特異的改変を行うための方法を提供することである。
【０００５】
本発明で提供される、植物において標的遺伝子の標的断片に対して部位特異的改変を行うための方法は、特に以下：
対象植物の細胞または組織または部分に非遺伝物質を導入するステップ
を含み、その際、前記非遺伝物質は、前記標的断片に特異的なヌクレアーゼであるか、または前記ヌクレアーゼを発現するｍＲＮＡであり、それにより前記標的断片が前記ヌクレアーゼにより切断され、かつ前記植物におけるＤＮＡ修復により前記標的断片に対する部位特異的改変が達成される。
【０００６】
本方法において、対象植物の細胞または組織または部分に非遺伝物質を導入する。非遺伝物質は、標的断片に対して部位特異的改変を行うためのヌクレアーゼを発現しうるか、または非遺伝物質は、標的断片に直接作用して部位特異的改変を達成しうる。部位特異的改変に伴って、またはその後に、前記非遺伝物質は細胞内の代謝機構により分解されうる。改変された細胞または組織は、従来の組織培養によりインタクト植物へと再生されうる。その結果、導入遺伝子を含まない変異体植物であって、標的断片のみが改変されただけで外来遺伝物質は導入されていない変異体植物が得られる。
【０００７】
本方法において、前記ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、またはゲノム編集を達成しうる他の任意のヌクレアーゼである。
【０００８】
相応して、非遺伝物質を以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかから選択することができる：
（ａ）非遺伝物質は、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼであるか、または対を成すＴＡＬＥＮタンパク質を発現しうるｍＲＮＡであり、その際、前記ＴＡＬＥＮタンパク質は、標的断片を認識してこれに結合しうるＤＮＡ結合ドメインと、Ｆｏｋ  Ｉドメインと、から構成される。
【０００９】
本発明の一実施形態（実施例１）において、前記非遺伝物質は、配列番号３および配列番号４のｍＲＮＡから構成される。本発明の他の実施形態（実施例３）において、前記非遺伝物質は、配列番号７および配列番号８のタンパク質から構成される。
【００１０】
（ｂ）非遺伝物質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼであるか、または対を成すＺＦＮタンパク質を発現しうるｍＲＮＡであり、その際、前記ＺＦＮタンパク質は、標的断片を認識してこれに結合しうるＤＮＡ結合ドメインと、Ｆｏｋ  Ｉドメインと、から構成される。
【００１１】
（ｃ）非遺伝物質は、Ｃａｓ９タンパク質かまたはＣａｓ９タンパク質を発現しうるｍＲＮＡと、ガイドＲＮＡと、から構成され、その際、前記ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の部分的な塩基対形成により形成される回文構造を有するＲＮＡであり、前記ｃｒＲＮＡは、標的断片に相補的に結合しうるＲＮＡ断片を含む。
【００１２】
本発明の一実施形態（実施例４）において、前記非遺伝物質は、配列番号１０に示されるタンパク質と、配列番号１１に示されるｓｇＲＮＡと、から構成される。本発明の他の実施形態（実施例５）において、前記非遺伝物質は、配列番号１０に示されるタンパク質と、配列番号１２に示されるｓｇＲＮＡと、から構成される。
【００１３】
本方法において、前記細胞は、非遺伝物質を導入できかつ組織培養によりインタクト植物へと再生しうるいずれの細胞であってもよい。前記組織は、非遺伝物質を導入できかつ組織培養によりインタクト植物へと再生しうるいずれの組織であってもよい。前記植物の前記部分は、非遺伝物質を導入しうるインタクト植物の部分（エクスビボ部分ではない）である。
【００１４】
具体的には、前記細胞は、プロトプラスト細胞または懸濁細胞であってよい。前記組織は、カルス、未熟胚または成熟胚であってよい。前記植物の部分は、葉、茎頂、胚軸、若い花穂または花粉管であってよい。
【００１５】
前記方法において、対象植物の細胞または組織または部分に非遺伝物質を導入するための手法は、パーティクルボンバードメント、ＰＥＧ媒介型プロトプラスト形質転換、花粉管による手法（ｐｏｌｌｅｎ  ｔｕｂｅ  ａｐｐｒｏｃｈ）、または非遺伝物質の導入に使用しうる他の任意の手法であってよい。
【００１６】
前記方法において、部位特異的改変とは、標的断片におけるヌクレオチドの挿入、欠失および／または置換である。
【００１７】
本発明の他の目的は、導入遺伝子を含まない変異体植物の製造方法を提供することである。
【００１８】
本発明の導入遺伝子を含まない変異体植物の製造方法は特に、以下：
対象植物において標的遺伝子の標的断片に対して部位特異的改変を行うことにより、植物であって、前記標的遺伝子の機能が喪失または変更されており、かつ該植物のゲノムは組み込まれた外来遺伝子を含まない植物を得るステップ
を含みうる。
【００１９】
本発明において、植物は単子葉植物であっても双子葉植物であってもよい。いくつかの実施形態において、植物は、イネ、トウモロコシ、コムギまたはタバコである。
【００２０】
遺伝物質ＤＮＡと比較して、タンパク質およびｍＲＮＡは、防御機構により細胞内で容易に分解されうる２種類の非遺伝物質である。配列特異的ヌクレアーゼのｍＲＮＡまたはタンパク質を一過的に導入することにより、部位特異的にノックアウトされた遺伝子を有する変異体であって、配列特異的ヌクレアーゼの遺伝子またはベクターの断片が植物ゲノムに組み込まれていない、すなわち導入遺伝子を含まない変異体を得ることができる。本発明の方法によってより高い生物学的安全性が達成され、また本方法により生産された作物変種がＧＭＯとして規制されることはないものと考えられる。本発明は、基礎研究および作物育種において極めて重要な価値を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡとを用いたコムギ未熟胚の形質転換により、ＴａＧＷ２遺伝子の変異が生成されたことを示す。図１Ａ：ｍＲＮＡ転写キット（ＡＭ１３４４、Ａｍｂｉｏｎ）を用いたインビトロでの転写により合成されたＣａｓ９−ｍＲＮＡのゲル電気泳動図。図１Ｂ：Ｃａｓ９  ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡ−ＧＷ２−Ｃ１４とにより生成された、Ｔ０植物におけるＴａＧＷ２の標的部位での変異を示すＰＣＲ／ＲＥ結果。図１Ｃ：これらのシーケンシング結果から、インビトロでの転写により合成されたＣａｓ９  ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡ−ＧＷ２−Ｃ１４とにより標的部位での変異が誘導されたことが判明した。ＷＴは野生型遺伝子配列を表し、「−」は欠失を伴う配列を表し、「＋」は挿入を伴う配列を表し、「−／＋」の後の数字は、欠失または挿入されたヌクレオチドの数を表す。
【図２】図２は、ｍＲＮＡ−ＴＡＬＥＮを用いたイネプロトプラストの一過的な形質転換により、ＯｓＢＡＤＨ２遺伝子の変異が生成されたことを示す。図２Ａ：ｍＲＮＡ転写キット（ＡＭ１３４４、Ａｍｂｉｏｎ）を用いたインビトロでの転写によるＴ−ＢＡＤＨ２ｂ−ＬおよびＴ−ＢＡＤＨ２ｂ−Ｒの合成を示すゲル電気泳動図であり、このｍＲＮＡの３’末端にＰｏｌｙＡ尾部を付加した。図２Ｂ：インビトロでの転写により合成されたｍＲＮＡによって生成された、プロトプラストにおける標的部位での変異を示すＰＣＲ／ＲＥ結果。図２Ｃ：これらのシーケンシング結果から、インビトロでの転写により合成されたｍＲＮＡによって標的部位での変異が誘導されたことが判明した。ＷＴは野生型遺伝子配列を表し、「−」は欠失を伴う配列を表し、「＋」は挿入を伴う配列を表し、「−／＋」の後の数字は、欠失または挿入されたヌクレオチドの数を表す。
【図３】図３は、ＭＬＯ−ＴＡＬＥＮタンパク質を用いたコムギプロトプラストの形質転換によるコムギＭＬＯ遺伝子の変異誘発を示す。図３Ａ：ＭＬＯ標的部位に対するＴ−ＭＬＯ−ＬおよびＴ−ＭＬＯ−Ｒの原核での発現および精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果。図３Ｂ：ＴＡＬＥＮタンパク質により生成された、プロトプラストにおける標的部位での変異を示すＰＣＲ／ＲＥ結果。図３Ｃ：これらのシーケンシング結果から、インビトロで生成されたＴＡＬＥＮタンパク質により標的部位での変異が誘導されたことが判明した。ＷＴは野生型遺伝子配列を表し、「−」は欠失を伴う配列を表し、「＋」は挿入を伴う配列を表し、「−／＋」の後の数字は、欠失または挿入されたヌクレオチドの数を表す。
【図４】図４は、Ｃａｓ９タンパク質とインビトロでの転写により合成されたｓｇＲＮＡとを用いたコムギプロトプラストの形質転換による、コムギＴａＧＡＳＲ７遺伝子の変異誘発を示す。図４Ａ：Ｃａｓ９タンパク質の原核での発現および精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果。図４Ｂ：Ｃａｓ９タンパク質とインビトロでの転写により合成されたｓｇＲＮＡとにより生成された標的部位での変異を示すＰＣＲ／ＲＥ結果。図４Ｃ：これらのシーケンシング結果から、インビトロで生成されたＣａｓ９タンパク質とインビトロでの転写により合成されたｓｇＲＮＡとにより標的部位での変異が誘導されたことが判明した。ＷＴは野生型遺伝子配列を表し、「−」は欠失を伴う配列を表し、「＋」は挿入を伴う配列を表し、「−／＋」の後の数字は、欠失または挿入されたヌクレオチドの数を表す。
【図５】図５は、Ｃａｓ９タンパク質とインビトロでの転写により合成されたｓｇＲＮＡとをタバコプロトプラストに導入して同時形質転換を行うことによりＮｔＰＶＹ遺伝子の変異が生成され、かつ再生により変異体植物が得られたことを示す。図５Ａ：Ｃａｓ９タンパク質とインビトロでの転写により合成されたｓｇＲＮＡとにより生成された標的部位での変異を示すプロトプラストのＰＣＲ／ＲＥ結果。図５Ｂ：これらのシーケンシング結果から、インビトロで生成されたＣａｓ９タンパク質とインビトロでの転写により合成されたｓｇＲＮＡとをタバコプロトプラストに導入して同時形質転換を行うことにより、標的部位での変異が誘導されたことが判明した。図５Ｃ：プロトプラストから再生された変異体植物の検出、および標的部位のシーケンシング結果。ＷＴは野生型遺伝子配列を表し、「−」は欠失を伴う配列を表し、「＋」は挿入を伴う配列を表し、「−／＋」の後の数字は、欠失または挿入されたヌクレオチドの数を表す。
【００２２】
詳細な実施形態
以下の実施例において用いた実験方法は、別段の記載がない限りいずれも従来の方法である。
【００２３】
以下の実施例において使用した材料、試薬は、別段の記載がない限りいずれも市販されている。
【００２４】
コムギ変種Ｂｏｂｗｈｉｔｅは、”Ｗｅｅｋｓ，  Ｊ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｐｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｌｉｎｅｓ  ｏｆ  ｆｅｒｔｉｌｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｗｈｅａｔ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １０２：１０７７−１０８４，（１９９３）”に開示されており、中国科学院遺伝学発生生物学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）より入手可能である。
【００２５】
コムギＴａＭＬＯ遺伝子を標的とするＴＡＬＥＮベクターＴ−ＭＬＯは、”Ｗａｎｇ，  Ｙ．，  Ｃｈｅｎｇ，  Ｘ．，  Ｓｈａｎ，  Ｑ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｙ．，  Ｌｉｕ，  Ｊ．，  Ｇａｏ，  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｑｉｕ，  Ｊ．Ｌ．（２０１４）．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｈｏｍｏｅｏａｌｌｅｌｅｓ  ｉｎ  ｈｅｘａｐｌｏｉｄ  ｂｒｅａｄ  ｗｈｅａｔ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｐｏｗｄｅｒｙ  ｍｉｌｄｅｗ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  ３２，  ９４７−９５１”に開示されており、中国科学院遺伝学発生生物学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）より入手可能である。
【００２６】
原核の発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔを、Ｓｈａｎｇｈａｉ  ＢｅｉＮｕｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．ｌ１１００２４より入手した。
【００２７】
Ｃａｓ９−ｍＲＮＡインビトロ転写ベクターｐＸＴ７−Ｃａｓ９は、”Ｃｈａｎｇ  Ｎ，  Ｓｕｎ  Ｃ，  Ｇａｏ  Ｌ，  Ｚｈｕ  Ｄ，  Ｘｕ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３．  Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｅｍｂｒｙｏｓ．  Ｃｅｌｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３：４６５−７２”に開示されており、著者らより入手可能である。
【００２８】
ｐＴ７−ｇＲＮＡベクターは、”Ａ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７（６０９６）：８１６−８２１”に開示されており、中国科学院遺伝学発生生物学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）より入手可能である。
【００２９】
トウモロコシ変種ＨｉＩＩは、”Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，  Ｃ．Ｌ．，  Ｇｒｅｅｎ，  Ｃ．Ｅ．＆  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  Ｒ．Ｌ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｇｅｒｍｐｌａｓｍ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｍａｉｚｅ  Ｇｅｎｅｔ．  Ｃｏｏｐ．  Ｎｅｗｓ  Ｌｅｔｔ．  ６５，９２−９３  （１９９１）”に開示されており、中国科学院遺伝学発生生物学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）より入手可能である。
【００３０】
イネプロトプラストの調製および形質転換に用いた溶液を、表１から表５までに示す。
【００３１】
表１：酵素分解溶液５０ｍｌ
【表１】
2018508221.tif 000002
【００３２】
表２：Ｗ５  ５００ｍｌ
【表２】
2018508221.tif 000003
【００３３】
表３：ＭＭＧ溶液１０ｍｌ
【表３】
2018508221.tif 000004
【００３４】
表４：ＰＥＧ溶液４ｍｌ
【表４】
2018508221.tif 000005
【００３５】
表５  ＷＩ溶液  ２５０ｍｌ
【表５】
2018508221.tif 000006
【００３６】
上記表１から表５までにおける％は、質量／体積百分率（ｇ／１００ｍｌ）を示す。
【００３７】
コムギ組織の培養に使用した培地は、以下のものを含む：
高張培地：ＭＳ最少培地、９０ｇ／Ｌマンニトール、５ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌスクロースおよび３ｇ／Ｌフィトゲル（ｐｈｙｔｏｇｅｌ）、ｐＨ５．８。
【００３８】
誘導培地：ＭＳ最少培地、２ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、０．６ｍｇ／Ｌ硫酸銅、０．５ｍｇ／Ｌカゼイン加水分解物、３０ｇ／Ｌスクロースおよび３ｇ／Ｌフィトゲル（ｐｈｙｔｏｇｅｌ）、ｐＨ５．８。
【００３９】
分化培地：ＭＳ最少培地、０．２ｍｇ／Ｌカイネチン、３０ｇ／Ｌスクロースおよび３ｇ／Ｌフィトゲル（ｐｈｙｔｏｇｅｌ）、ｐＨ５．８。
【００４０】
発根培地：１／２ＭＳ最少培地、０．５ｍｇ／Ｌエタンスルホン酸、０．５ｍｇ／Ｌ  α−ナフチル酢酸、３０ｇ／Ｌスクロースおよび３ｇ／Ｌフィトゲル（ｐｈｙｔｏｇｅｌ）、ｐＨ５．８。
【００４１】
実施例１  インビトロでの転写により合成されたＣａｓ９  ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡとを用いたコムギ未熟胚の形質転換による、ＴａＧＷ２の部位特異的編集
Ｉ．標的断片：標的Ｃ１４の設計
標的Ｃ１４：（コムギＴａＧＷ２のＡ群、Ｂ群およびＤ群のエクソン８の保存された領域における）５’−ＣＣＡＧＧＡＴＧＧＧＧＴＡＴＴＴＣＴＡＧＡＧＧ−３’。
【００４２】
ＩＩ．Ｃａｓ９−ｍＲＮＡの、インビトロでの転写による合成および精製
１．ｐＸＴ７−Ｃａｓ９ベクターをＸｂａＩで消化した。精製キット（Ａｘｙｇｅｎ）を用いてこの消化産物を１００ｎｇ／μｌより高い濃度に精製し、これをｐＸＴ７−Ｃａｓ９−ＸｂａＩと命名した。
【００４３】
２．精製産物ｐＸＴ７−Ｃａｓ９−ＸｂａＩを、インビトロ転写キット（ＡＭ１３４４、Ａｍｂｉｏｎ）で転写した。ｍＲＮＡ精製キット（ＡＭ１９０８、Ａｍｂｉｏｎ）を用いてこの産物を５００ｎｇ／μｌより高い濃度に精製した。インビトロでの転写により合成されたＣａｓ９−ｍＲＮＡのアガロースゲル電気泳動図を、図１Ａに示した。
【００４４】
ＩＩＩ．標的部位を狙うｓｇＲＮＡの、インビトロでの転写による合成
１．ＴａＧＷ２の標的部位から、ｐＴａＵ６−ｇＲＮＡベクターを構築した。
【００４５】
以下の、粘着末端（下線）を有する１本鎖オリゴヌクレオチドを合成した：
Ｃ１４Ｆ：５’−ＣＴＴＧＣＡＧＧＡＴＧＧＧＧＴＡＴＴＴＣＴＡＧ−３’；
Ｃ１４Ｒ：５’−ＡＡＡＣＣＴＡＧＡＡＡＴＡＣＣＣＣＡＴＣＣＴＧ−３’。
【００４６】
Ｃ１４Ｆ／Ｃ１４Ｒ間のアニーリングにより粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡを形成させ、これをｐＴａＵ６−ｇＲＮＡプラスミド中の２つのＢｂｓＩ制限部位の間に挿入して、Ｃ１４部位を含むｐＴａＵ６−ｇＲＮＡプラスミドを得た。陽性プラスミドをシーケンシングによって確認した。５’−ＣＴＴＧＣＡＧＧＡＴＧＧＧＧＴＡＴＴＴＣＴＡＧ−３’で示されるＤＮＡ断片をｐＴａＵ６−ｇＲＮＡプラスミドのＢｂｓＩ制限部位で順方向に挿入することにより得られた組換えプラスミドは陽性であり、これをｐＴａＵ６−ｇＲＮＡ−Ｃ１４と命名した。
【００４７】
２．Ｔ７−ＴａＧＷ２−ｇＲＮＡのＤＮＡ断片の、インビトロでの増幅および精製
プライマー設計
Ｔ７−ＴａＧＷ２−Ｆ：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＡＧＧＡＴＧＧＧＧＴＡＴＴＴＣＴＡＧ；
ｇＲＮＡ−ＰＣＲ−Ｒ：ＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴ。
【００４８】
ｐＴａＵ６−ｇＲＮＡ−Ｃ１４をテンプレートとして用いてＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ精製キット（ＡＰ−ＧＸ−２５０Ｇ、Ａｘｙｇｅｎ）を用いて、ＰＣＲ産物を１００ｎｇ／μｌより高い濃度に精製した。得られたＰＣＲ産物は、Ｔ７プロモーターとＴａＧＷ２標的部位とを含むｓｇＲＮＡであり、これをＴ７−ＴａＧＷ２−ｇＲＮＡと命名する。
【００４９】
３．ＴａＧＷ２標的部位を含むｓｇＲＮＡの、インビトロでの転写による合成
Ｔ７インビトロ転写キット（Ｅ２０４０Ｓ、ＮＥＢ）を用いたインビトロでの転写により、（配列番号１７に示す）ｓｇＲＮＡ−ＧＷ２−Ｃ１４を合成した。
【００５０】
ＩＶ．インビトロでの転写により合成されたＣａｓ９−ｍＲＮＡとインビトロでの転写により合成されたｓｇＲＮＡとをパーティクルボンバードメントにより導入して形質転換を行うことによる、コムギＴａＧＷ２遺伝子の部位特異的編集
１．インビトロでの転写により合成されたＣａｓ９−ｍＲＮＡとインビトロでの転写により合成されたｓｇＲＮＡとへの、０．６ｎｍの金粉末の負荷
０．６ｎｍの金粉末５μｌ、Ｃａｓ９−ｍＲＮＡ  ３μｌ、ｓｇＲＮＡ−ＧＷ２−Ｃ１４  １μｌ、５Ｍ酢酸アンモニウム１μｌ、イソプロパノール２０μｌを混合し、−２０℃で１時間沈殿させることにより、Ｃａｓ９−ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡ−ＧＷ２−Ｃ１４とをこの金粉末に付着させる。この混合物を１０００ｒｐｍで５秒間遠心分離し、上清を廃棄した後に無水アルコール１００μｌで洗浄し、その後再び１０００ｒｐｍで５秒間遠心分離し、上清を廃棄した後に無水アルコール２０μｌ中に再懸濁させた。
【００５１】
２．パーティクルボンバードメントを用いたコムギレシピエント材料の形質転換
１）コムギ変種ＫＮ１９９の未熟胚を採取し、高張培地を用いて４時間処理した。
【００５２】
２）ステップ１）において高張培養したコムギ未熟胚に、パーティクルボンバードメント装置を用いて撃込みを行った。ｓｇＲＮＡ−Ｃａｓ９−ｍＲＮＡ混合物２０μｌを膜上に負荷して撃ち込んだ。各撃込みの撃込み間隔は６ｃｍであり、撃込み圧力は１１００ｐｓｉであり、撃込み直径は２ｃｍであった。
【００５３】
３）ステップ２）で撃込みを行ったコムギ未熟胚を、１６時間高張培養した。
【００５４】
４）次いで、ステップ３）で高張培養したコムギ未熟胚を順次、１４日間のカルス組織誘導培養、２８日間の分化培養および１４〜２８日間の発根培養に供して、コムギ植物を得た。
【００５５】
５）ステップ４）で生成させたコムギ実生からＤＮＡを抽出し、遺伝子ノックアウト（部位特異的）を伴う変異体をＰＣＲ／ＲＥ試験により検出した（詳細な試験方法については、ステップＩＶを参照）。野生型コムギ変種Ｋｎ１９９を対照として用いた。
【００５６】
コムギ内在性遺伝子ＴａＧＷ２の標的断片中には制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩにより認識される配列が存在するため、ＸｂａＩを使用してＰＣＲ／ＲＥ試験を行った。ＰＣＲ増幅において使用されるプライマーは、Ａ群、Ｂ群およびＤ群に特異的なプライマーであり、以下の配列を有する：
ＴａＧＷ２−ＡＦ：５’−ＣＴＧＣＣＡＴＴＡＣＴＴＴＧＴＡＴＴＴＴＧＧＴＡＡＴＡ−３’；
ＴａＧＷ２−ＢＦ：５’−ＧＴＴＣＡＧＡＴＧＧＣＡＡＴＣＴＡＡＡＡＧＴＴ−３’；
ＴａＧＷ２−ＤＦ：５’−ＧＣＡＴＧＴＡＣＴＴＴＧＡＴＴＧＴＴＴＧＣＧＴＧＡ−３’；
ＴａＧＷ２−Ｒ：５’−ＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴＣＴＴＡＣＣＡＣＴＴＣＣＣ−３’。
【００５７】
いくつかの検出試験の結果から、コムギＴａＧＷ２遺伝子の標的部位で変異が生じたことが判明した。シーケンシングのためにバンドを回収した。これらのシーケンシング結果から、コムギＴａＧＷ２遺伝子の標的部位で挿入／欠失（インデル）が生じたことが判明した（図１Ｂおよび図１Ｃ）。
【００５８】
実施例２  インビトロでの転写により合成されたＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡを用いたイネプロトプラストの形質転換による、ＯｓＢＡＤＨ２遺伝子の部位特異的編集
Ｉ．ＴＡＬＥＮ標的断片
イネＢＡＤＨ２遺伝子の配列を、配列番号１に示す。
【００５９】
ＴＡＬＥＮ標的断片はイネＢＡＤＨ２遺伝子の第４エクソンに位置し、以下の配列を有する：
５’−ＧＣＴＧＧＡＴＧＣＴＴＴＧＡＧＴＡｃｔｔｔｇｃａｇａｔｃｔｔｇｃａｇａＡＴＣＣＴＴＧＧＡＣＡＡＡＡＧＧＣ−３’（配列番号１の１５８９〜１６４０の位置）。
【００６０】
中央の小文字はスペーサー配列を表し、隣接する大文字は、ＴＡＬＥＮモジュールにより認識される配列（これをＬ−ｂおよびＲ−ｂと命名する）を表す。下線が付されているのは、ＢｇｌＩＩにより認識される配列である。
【００６１】
ＩＩ．ＴＡＬＥＮコード遺伝子の設計および合成
この標的配列中のＬ−ｂを認識するＴＡＬＥＮタンパク質をＴ−ＢＡＤＨ２ｂ−Ｌと命名し、コード配列は配列番号２の７〜２９５２の位置に示される。配列番号２の７〜２７の位置は核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードし、４６３〜２１５４の位置はＬ−ｂ配列認識モジュールタンパク質をコードし、２３５０〜２９５３の位置（６０３ｂｐ）はエンドヌクレアーゼＦｏｋ  Ｉをコードする。
【００６２】
この標的配列中のＲ−ｂを認識するＴＡＬＥＮタンパク質をＴ−ＢＡＤＨ２ｂ−Ｒと命名し、コード配列は配列番号２の３０８５〜６０１８の位置に示される。配列番号２の３０８５〜３１０５の位置は核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードし、３５４１〜５２３２の位置はＲ−ｂ配列認識モジュールタンパク質をコードし、５４２８〜６０１８の位置（５９１ｂｐ）はエンドヌクレアーゼＦｏｋ  Ｉをコードする。
【００６３】
配列番号２の２９５３〜３００６の位置はＴ２Ａをコードする。このＴ２Ａは１８のアミノ酸から構成され、このＴ２Ａによって、同一発現カセットにおいて発現されたＴ−ＢＡＤＨ２ｂ−ＬとＴ−ＢＡＤＨ２ｂ−Ｒとが２つの個々のタンパク質へと分かれうる。
【００６４】
ＩＩＩ．ＴＡＬＥＮ遺伝子のｍＲＮＡの、インビトロでの合成
Ｔ７プロモーターを用いて転写を開始することにより、イネＢＡＤＨ２遺伝子に関するＴＡＬＥＮの２つの成分であるＴ−ＢＡＤＨ２ｂ−ＬとＴ−ＢＡＤＨ２ｂ−Ｒとを、ｍＲＮＡ転写キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてインビトロで転写した。ｍＲＮＡ−Ｌ−Ｔ−ＯｓＢＡＤＨ２ｂおよびｍＲＮＡ−Ｒ−Ｔ−ＯｓＢＡＤＨ２ｂが得られ、そしてこのｍＲＮＡの安定性を高めるためにそれらの３’末端にＰｏｌｙＡ尾部を付加した。
【００６５】
ｍＲＮＡ−Ｌ−Ｔ−ＯｓＢＡＤＨ２ｂの配列を配列番号３に示し、ｍＲＮＡ−Ｒ−Ｔ−ＯｓＢＡＤＨ２ｂの配列を配列番号４に示す。
【００６６】
ＩＶ．インビトロでの転写による合成によって得られたＴＡＬＥＮの２つのｍＲＮＡの混合物の、イネプロトプラストへの導入
１．材料の調製
使用したイネ変種は、日本晴である。種子を７５％エタノール中ですすぎ、次いで２．５％次亜塩素酸ナトリウムで２０分間処理し、滅菌水で５回超洗浄し、１／２ＭＳ培地内で２６℃で１２時間明所下で７〜１０日間培養した（１５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１）。１つの大きなガラス製培養瓶内で、１５個の種子を培養することができる。１回の実験で４０〜６０個の実生が必要であり、単離されたプロトプラストの量は６個のプラスミドの形質転換に十分である。
【００６７】
２．プロトプラストの単離
１）プロトプラストの単離に、苗条および葉鞘を用いた。これらを切断して０．５ｍｍの糸状物とした。
【００６８】
２）これらの糸状物をすぐに０．６Ｍのマンニトール溶液に移し、暗所に１０分間置いた。
【００６９】
３）このマンニトール溶液をろ過により除去し、糸状物を酵素分解溶液に移し、暗所で真空ポンプ中で−１５〜−２０（ｍｍＨｇ）で３０分間処理した。
【００７０】
４）これらのサンプルを（振盪機で１０ｒｐｍの速度で）穏やかに振盪しながらさらに４〜５時間消化した。
【００７１】
５）消化後に等体積のＷ５溶液を加えた。プロトプラストを放出させるには、この溶液を１０秒間振盪することが望ましい。
【００７２】
６）４０μｍのナイロンろ過膜を用いてこれらのプロトプラストをろ過して５０ｍｌ丸底遠沈管に入れ、Ｗ５溶液を加えて洗浄した。
【００７３】
７）２５０×ｇの遠心分離を３分間行ってこれらのプロトプラストを沈殿させ、上清を廃棄した。
【００７４】
８）これらのプロトプラストをＷ５  １０ｍｌ中に再懸濁させ、２５０×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。
【００７５】
９）適量のＭＭＧ溶液を加えることにより、これらのプロトプラストを再懸濁させた。血球計算器を用いた計数により測定した場合に、これらのプロトプラストの濃度は２×１０６／ｍｌである。
【００７６】
注釈：上記ステップをいずれも室温で行った。
【００７７】
３．プロトプラストの形質転換
１）ｍＲＮＡ−Ｌ−Ｔ−ＯｓＢＡＤＨ２ｂ  １０μｇとｍＲＮＡ−Ｒ−Ｔ−ＯｓＢＡＤＨ２ｂ  １０μｇとを、２ｍｌ遠沈管に加えた。プロトプラスト２００μｌ（約４×１０５個の細胞）を加えた。次いで、新鮮なＰＥＧ溶液２２０μｌを加えて混合した。形質転換を、室温で暗所で１０〜２０分間行った。
【００７８】
２）形質転換後、Ｗ５  ８８０μｌをゆっくりと加え、反転により混合し、２５０×ｇの遠心分離を３分間行い、上清を廃棄した。
【００７９】
３）ＷＩ  １ｍｌを加えることによりこれらのプロトプラストを再懸濁させ、これらを（予めＷＩ  １ｍｌを加えておいた）６ウェルプレートに移し、次いで室温または２８℃で暗所で６〜１６時間（これらのプロトプラストをゲノムＤＮＡ抽出に使用する場合には４８時間）培養させた。
【００８０】
４．インビトロでの転写により合成されたＴＡＬＥＮにより生じたイネ内在性遺伝子ＢＡＤＨ２の変異誘発の、ＰＣＲ／ＲＥ実験を用いた解析
プロトプラストの形質転換の４８時間後にゲノムＤＮＡを抽出し、これをＰＣＲ／ＲＥ（ポリメラーゼ連鎖反応／制限消化）実験解析用テンプレートとして使用した。同時に、野生型イネ変種日本晴のプロトプラストを対照として用いた。ＰＣＲ／ＲＥ解析方法は、Ｓｈａｎ，  Ｑ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ａｎｄ  Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｕｓｉｎｇ  ＴＡＬＥＮｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ  （２０１３）に基づく。イネ内在性遺伝子ＢＡＤＨ２の標的部位は制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩ認識配列を含むため、ＰＣＲ／ＲＥ試験を行うために実験において制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩを使用した。ＰＣＲ増幅に使用したプライマーは、以下の通りである：
ＯｓＢＡＤＨ−Ｆ：５’−ＧＡＴＣＣＣＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＣＴＴＣＧＴＣＧ−３’；
ＯｓＢＡＤＨ２−Ｒ：５’−ＧＡＧＧＡＡＴＡＡＡＡＴＣＴＣＡＡＡＴＧＴＣＴＴＣＡＡＣＴＴ−３’。
【００８１】
ＰＣＲ／ＲＥ実験の結果を図２Ｂに示す。その結果から、ＢＡＤＨ２遺伝子の標的部位で変異が生じ、変異誘発効率は約５％であることが判明した。図中のバンドを回収してシーケンシングしたところ、これらのシーケンシング結果から、ＢＡＤＨ２遺伝子の標的部位で挿入／欠失（インデル）が生じたことが判明した（図２Ｃ）。
【００８２】
実施例３  原核の発現系におけるＴＡＬＥＮタンパク質の発現および精製、ならびに該ＴＡＬＥＮタンパク質をコムギプロトプラストまたは未熟胚に導入して形質転換させることによるＭＬＯ遺伝子の部位特異的改変
Ｉ．標的配列の選択およびＴＡＬＥＮの設計
コムギＭＬＯ遺伝子のエクソン２における保存された領域を標的配列として使用して、一対のＴＡＬＥＮ（これは、ＴＡＬ−ＭＬＯ−Ｌタンパク質とＴＡＬ−ＭＬＯ−Ｒタンパク質とからなり、ＴＡＬ−ＭＬＯ−Ｌタンパク質は、２つの機能的断片、すなわち、標的配列の上流のヌクレオチドに特異的に結合する断片と、ＥＬ変異を伴うＦｏｋ  Ｉエンドヌクレアーゼと、から構成され、ＴＡＬ−ＭＬＯ−Ｒタンパク質は、２つの機能的断片、すなわち、標的配列の下流のヌクレオチドに特異的に結合する断片と、ＫＫ変異を伴うＦｏｋ  Ｉエンドヌクレアーゼと、から構成される）を設計した。ＴａＭＬＯ−Ａ遺伝子、ＴａＭＬＯ−Ｂ遺伝子およびＴａＭＬＯ−Ｄ遺伝子における前記ＴＡＬＥＮの標的配列を、以下に列挙する：
ＴａＭＬＯ−Ａ遺伝子：
５’−ＴＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＧＴｃａｃｇｃａｇｇａｃｃｃａａｔｃｔｃＣＧＧＧＡＴＡＴＧＣＡＴＣＴＣＣＣＡ−３’；
ＴａＭＬＯ−Ｂ遺伝子：
５’−ＴＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＧＴｇａｃｇｃａｇｇａｃｃｃｃａｔｃｔｃＣＧＧＧＡＴＡＴＧＣＡＴＣＴＣＣＧＡ−３’；
ＴａＭＬＯ−Ｄ遺伝子：
５’−ＴＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＧＴｇａｃｇｃａｇｇａｃｃｃａａｔｃｔｃＣＧＧＧＡＴＡＴＧＣＡＴＣＴＣＣＧＡ−３’。
【００８３】
コムギ細胞において、ＴＡＬ−Ｌ断片およびＴＡＬ−Ｒ断片がそれぞれの結合領域に結合すると、２つの異なる単量体Ｆｏｋ  Ｉエンドヌクレアーゼ（ＥＬ変異を伴うＦｏｋ  ＩエンドヌクレアーゼおよびＫＫ変異を伴うＦｏｋ  Ｉエンドヌクレアーゼ）により活性Ｆｏｋ  Ｉ  ２量体エンドヌクレアーゼが形成され、この２量体エンドヌクレアーゼにより標的配列領域（標的配列および隣接配列を含む）が切断されることで２本鎖切断が生じるものと考えられる。前記切断が細胞により修復される間に、多数の変異が導入されるものと考えられる。本明細書において「変異」とは、挿入、欠失、置換などを含む広い意味を有するが、その大半は遺伝子機能の喪失をもたらす。
【００８４】
上記標的配列において、下線部は、制限ヌクレアーゼＡｖａＩＩが切断しうるＡｖａＩＩ認識配列である。切断が生じた後、変異が生じてＡｖａＩＩ認識配列が中断された場合にはＡｖａＩＩは標的配列を切断できず、変異が生じない場合にはＡｖａＩＩは標的配列を切断できる。
【００８５】
ＩＩ．原核の発現系におけるＭＬＯ遺伝子標的のためのＴＡＬＥＮタンパク質の発現および精製
１．ＴＡＬＥＮタンパク質を発現するための、原核の発現ベクターの構築
１）ＴＡＬＥＮ遺伝子のＴＡＬ−Ｌ（配列番号５）およびＴＡＬ−Ｒ（配列番号６）のコード領域から原核の発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔを構築し、ｐＧＥＸ−４ＴのＢａｍＨＩ部位とＸｂａＩ部位との間に順方向に挿入されたＴＡＬ−Ｌコード領域（配列番号５）と、ｐＧＥＸ−４ＴのＸｂａＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間に順方向に挿入されたＴＡＬ−Ｒコード領域（配列番号６）と、を有する組換えベクターを得た。この組換えベクターを大腸菌ＢＬ２１に導入して形質転換させた。アンピシリンとクロラムフェニコールとを補充したＬＢ培地に陽性コロニーを接種し、３７℃で一晩培養した。次いで、この培養物を新鮮なＬＢ培地５ｍｌに１：１００の割合で接種し、２２５ｒｐｍで３７℃でＯＤ６００≒０．５となるように培養した。この培養物１ｍｌを陰性対照（誘導なし）とした。誘導ありまたは誘導なしの空のｐＧＥＸ−４Ｔベクターの対照も準備した。残りの培養のためにＩＰＴＧを加えて（最終濃度１ｍＭ）、発現を３７℃で２２５ｒｐｍで８時間誘導した。
【００８６】
２）対照または誘導された培養物各１ｍｌを採取し、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細菌細胞を収集し、上清を廃棄した。５０μＬタンパク質ローディングバッファーを加えることによりこれらの細胞を再懸濁させ、７分間沸騰させた。上清を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。各ＴＡＬＥＮタンパク質の分子量は、約１００Ｋｄａである。ＴＡＬ−ＭＬＯ−Ｌタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号７に示す。ＴＡＬ−ＭＬＯ−Ｒタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号８に示す。
【００８７】
２．ＴＡＬＥＮタンパク質の精製
この細菌培養物を４℃で１０分間遠心分離して、細菌細胞を収集した。このペレットに溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、ｐＨ８．５）１０ｍｌを加え、氷上で４５分間混合した。超音波処理後、遠心分離によりペレットを収集し、４Ｍイミダゾールで洗浄した。さらなる遠心分離後に得られたペレットを、ｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸バッファー（８Ｍ尿素含有）に溶解させた（図３Ａ）。
【００８８】
ＩＩＩ．精製されたＴＡＬＥＮタンパク質をコムギプロトプラストに導入することによる、ＭＬＯ遺伝子の部位特異的編集
ＭＬＯの標的部位を狙う精製されたＴＡＬＥＮタンパク質を、ＰＥＧ媒介型の手法によりコムギ変種Ｂｏｂｗｈｉｔｅのプロトプラストに次のように導入した：
１．コムギ実生の生長
コムギ種子を、培養室内で、２５±２℃、照度１０００Ｌｘ、明所１４〜１６ｈ／日で約１〜２週間生長させた。
【００８９】
２．プロトプラストの単離
１）コムギの柔らかい葉を採取し、カッター刃を使用してこの葉の中央部分を切断して０．５〜１ｍｍの糸状物とし、これらを暗所で（溶媒として水を使用した）０．６Ｍマンニトール溶液中に１０分間置いた。次いで、フィルターを用いてこの混合物をろ過し、次いで酵素分解溶液５０ｍｌ中に入れて５時間消化した（酵素分解を真空中で０．５時間行い、次いで１０ｒｍｐでゆっくりと４．５時間振盪した）。
【００９０】
注釈：酵素分解時の温度を２０〜２５℃に保持することが望ましく、この反応を暗所で行うことが望ましく、また反応後に溶液を穏やかに振盪してプロトプラストを放出させることが望ましい。
【００９１】
２）Ｗ５  １０ｍｌを加えることによりこの酵素分解物を希釈し、７５μｍのナイロンろ過膜を用いてこれをろ過して、５０ｍｌ丸底遠沈管に入れた。
【００９２】
注釈：ナイロンろ過膜を７５％（体積％）エタノール中に沈め、水で洗浄し、次いで使用前にＷ５中に２分間浸漬させることが望ましい。
【００９３】
３）２３℃で１００×ｇの遠心分離を３分間行い、上清を廃棄した。
【００９４】
４）このペレットをＷ５  １０ｍｌで懸濁させ、これを氷上に３０分間置いた。これらのプロトプラストは、最終的に沈降物を形成した。そして上清を廃棄した。
【００９５】
５）適量のＭＭＧ溶液を加えることによりこれらのプロトプラストを懸濁させ、形質転換を行うまでこれらを氷上に置いた。
【００９６】
注釈：これらのプロトプラストの濃度を顕微鏡検査（×１００）により測定する必要がある。プロトプラストの量は、２×１０５／ｍｌ〜１×１０６／ｍｌであった。
【００９７】
３．コムギプロトプラストの形質転換
１）ＴＡＬＥＮタンパク質（ＴＡＬ−ＭＬＯ−Ｌタンパク質とＴＡＬ−ＭＬＯ−Ｒタンパク質とを等量混合したもの）１５μｇまたはＴ−ＭＬＯベクター（対照）２０μｇを、２ｍｌ遠沈管に加えた。ピペットを用いて、単離したプロトプラスト２００μｌを加え、次いでこれらを穏やかに叩くことにより混合し、３〜５分間静置した。次いでＰＥＧ４０００  ２５０μｌを加え、穏やかに叩くことにより混合した。形質転換を、暗所で３０分間行った。
【００９８】
２）Ｗ５（室温）９００μｌを加え、反転により混合し、１００×ｇの遠心分離を３分間行い、かつ上清を廃棄した。
【００９９】
３）Ｗ５  １ｍｌを加え、反転により混合し、内容物を（予めＷ５  １ｍｌを加えておいた）６ウェルプレートに穏やかに移し、次いで２３℃で一晩培養した。
【０１００】
４．精製されたＴＡＬＥＮタンパク質により生じたコムギ内在性遺伝子ＭＬＯの変異誘発の、ＰＣＲ／ＲＥ実験を用いた解析
コムギプロトプラストの形質転換の４８時間後にゲノムＤＮＡを抽出し、これをＰＣＲ／ＲＥ（ポリメラーゼ連鎖反応／制限消化）実験解析用テンプレートとして使用した。同時に、Ｔ−ＭＬＯプラスミドを用いて形質転換させたプロトプラストか、または野生型コムギ変種Ｂｏｂｗｈｉｔｅのプロトプラストを、対照として使用した。ＰＣＲ／ＲＥ解析方法は、Ｓｈａｎ，  Ｑ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ａｎｄ  Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｕｓｉｎｇ  ＴＡＬＥＮｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ  （２０１３）に基づく。コムギ内在性遺伝子ＭＬＯの標的断片は制限エンドヌクレアーゼＡｖａＩＩ認識配列を含むため、ＰＣＲ／ＲＥ試験を行うために実験においてＡｖａＩＩを使用した。ＰＣＲ増幅に用いたプライマーは、以下の通りであった：
ＴａＭＬＯ−Ｆ：５’−ＴＣＡＴＣＧＴＣＴＣＣＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＡ−３’；
ＴａＭＬＯ−Ｒ：５’−ＴＧＧＴＡＴＴＣＣＡＡＧＧＡＧＧＣＧＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴ−３’。
【０１０１】
これらのＰＣＲ／ＲＥ実験の結果から、ＭＬＯの遺伝子の標的部位で変異が生じたことが判明した。バンドを回収してシーケンシングしたところ、これらのシーケンシング結果から、ＭＬＯ遺伝子の標的部位で挿入／欠失（インデル）が生じたことが判明した（図３Ｂおよび図３Ｃ）。
【０１０２】
ＩＶ．パーティクルボンバードメントを用いたＴＡＬＥＮタンパク質の導入によるＭＬＯ遺伝子の部位特異的編集
一般には、発現プラスミドをパーティクルボンバードメントにより細胞に導入して形質転換を行う際に、細胞にＤＮＡプラスミドを運ぶキャリアとして金粉末が用いられる。しかしタンパク質は金粉末に結合しにくいため、タンパク質にとって金粉末はキャリアとしては適さない。本発明においては、パーティクルボンバードメントを用いたタンパク質の導入による形質転換のためのキャリアとして、シリカを使用する。
【０１０３】
１．シリカへのタンパク質の負荷
１０ｎｍの開口部を有するシリカＡｕ−ＭＳＮを、キャリアとして使用した。音波処理のために、Ａｕ−ＭＳＮ  ２０ｍｇをｐＨ７．４のリン酸バッファー（ＰＢＳ）５ｍｌに加え、次いで、精製されたＴＡＬ−ＭＬＯ−Ｌタンパク質および精製されたＴＡＬ−ＭＬＯ−Ｒタンパク質７ｍｇを加えた。この混合物を２２℃で２４時間撹拌し、１２０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を廃棄した。このペレットを、ＰＢＳバッファーで懸濁させた。
【０１０４】
２．パーティクルボンバードメントを用いたコムギレシピエント材料の形質転換
１）コムギ変種Ｂｏｂｗｈｉｔｅの未熟胚を採取し、高張培地を用いて４時間処理した。
【０１０５】
２）ステップ１）で高張培養したコムギ未熟胚への撃込みを行うために、パーティクルボンバードメント装置を使用した。ＴＡＬＥＮタンパク質（５μｌ、２０μｇ／μｌ）を負荷させたＡｕ−ＭＳＮを膜上に負荷して撃ち込んだ。各撃込みの撃込み間隔は６ｃｍであり、撃込み圧力は１１００ｐｓｉであり、撃込み直径は２ｃｍであった。
【０１０６】
３）ステップ２）で撃込みを行ったコムギ未熟胚を、１６時間高張培養した。
【０１０７】
４）次いで、ステップ３）で高張培養したコムギ未熟胚を順次、１４日間のカルス組織誘導培養、２８日間の分化培養および１４〜２８日間の発根培養に供して、コムギ植物を得た。
【０１０８】
５）ステップ４）で生成させたコムギ実生からＤＮＡを抽出し、遺伝子ノックアウト（部位特異的）を伴う変異体をＰＣＲ／ＲＥ試験により検出した（詳細な試験方法については、ステップＩＩＩを参照）。野生型コムギ変種Ｂｏｂｗｈｉｔｅを対照として用いた。
【０１０９】
いくつかの変異体のこれらの検出結果から、コムギＭＬＯ遺伝子の標的部位で変異が生じたことが判明した。シーケンシングのためにバンドを回収した。これらのシーケンシング結果から、コムギＭＬＯ遺伝子の標的部位で挿入／欠失（インデル）が生じたことが判明した。
【０１１０】
上記の結果から、ヌクレアーゼタンパク質をコムギに導入することにより標的部位の部位特異的編集を達成できることが実証された。この方法により得られた変異体は外来ＤＮＡを含まず、また導入されたタンパク質は植物細胞により分解されるものと考えられる。したがって、本方法により得られた変異体は、導入遺伝子を含まずかつ高い生物学的安全性を有する植物である。
【０１１１】
実施例４  原核の発現系において発現および精製されたＣａｓ９タンパク質とインビトロでの転写により合成されたｓｇＲＮＡとを導入して同時形質転換を行うことによる、ＴａＧＡＳＲ７遺伝子の部位特異的編集
Ｉ．標的断片：標的Ｃ５の設計
標的Ｃ５：（ジェンバンク登録番号ＥＵ０９５３３２の２４８〜２６８の位置に示されるＴａＧＡＳＲ７遺伝子における）５’−ＣＣＧＣＣＧＧＧＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＣ−３’。
【０１１２】
ＩＩ．Ｃａｓ９タンパク質の、原核での発現および精製
１．Ｃａｓ９遺伝子（コドン使用頻度を植物に最適化し、かつ両端にＮＬＳを付加したもの）から原核の発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔを構築し、このｐＧＥＸ−４ＴベクターのＢａｍＨＩとＳｐｅＩとの間に挿入された配列番号９のＣａｓ９遺伝子（コドン使用頻度を植物に最適化し、かつ両端にＮＬＳを付加したもの）を有する組換えベクターを得た。この組換えベクターを大腸菌ＢＬ２１に導入して形質転換させた。アンピシリンとクロラムフェニコールとを補充したＬＢ培地に陽性コロニーを接種し、３７℃で一晩培養した。次いで、この培養物を新鮮なＬＢ培地５ｍｌに１：１００の割合で接種し、２２５ｒｐｍで３７℃でＯＤ６００≒０．５となるように培養した。この培養物１ｍｌを陰性対照（誘導なし）とした。誘導ありまたは誘導なしの空のｐＧＥＸ−４Ｔベクターの対照も準備した。残りの培養のためにＩＰＴＧを加えて（最終濃度１ｍＭ）、発現を３７℃で２２５ｒｐｍで８時間誘導した。
【０１１３】
２．対照または誘導された培養物各１ｍｌを採取し、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細菌細胞を収集し、上清を廃棄した。５０μＬタンパク質ローディングバッファーを加えることによりこれらの細胞を再懸濁させ、７分間沸騰させた。上清を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。Ｃａｓ９タンパク質の分子量は、約２００Ｋｄａである。Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号１０に示す。
【０１１４】
２．Ｃａｓ９タンパク質の精製
この細菌培養物を４℃で１０分間遠心分離して、細菌細胞を収集した。このペレットに溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、ｐＨ８．５）１０ｍｌを加え、氷上で４５分間混合した。超音波処理後、遠心分離によりペレットを収集し、４Ｍイミダゾールで洗浄した。さらなる遠心分離後に得られたペレットを、ｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸バッファー（８Ｍ尿素含有）に溶解させた（図４Ａ）。
【０１１５】
ＩＩＩ．標的部位のｓｇＲＮＡの、インビトロでの転写による合成
１．ＴａＧＡＳＲ７の標的部位から、ｐＴ７−ｇＲＮＡベクターを構築した。
【０１１６】
Ｃ５は、標的Ｃ５に相補的に結合しうるＲＮＡをコードするＤＮＡ配列である。
【０１１７】
以下の、粘着末端（下線）を有する１本鎖オリゴヌクレオチドを合成した：
Ｃ５Ｆ：５’−ＣＴＴＧＴＴＧＣＣＧＴＡＧＧＴＧＣＣＣＧＧ−３’；
Ｃ５Ｒ：５’−ＡＡＡＣＣＣＧＧＧＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡ−３’。
【０１１８】
オリゴヌクレオチドのアニーリング処理により粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡを形成させ、これをｐＴ７−ｇＲＮＡプラスミド中の２つのＢｂｓＩ制限部位の間に挿入して、Ｃ５部位を含むｐＴ７−ｇＲＮＡプラスミドを得た。陽性プラスミドをシーケンシングによって確認した。５’−ＣＴＴＧＴＴＧＣＣＧＴＡＧＧＴＧＣＣＣＧＧ−３’で示されるＤＮＡ断片をｐＴ７−ｇＲＮＡプラスミドのＢｂｓＩ制限部位で順方向に挿入することにより得られた組換えプラスミドは陽性であり、これをｐＴ７−ｇＲＮＡ−Ｃ５と命名した。
【０１１９】
２．ＴａＧＡＳＲ７の標的部位を含むｓｇＲＮＡの、インビトロでの転写による合成
転写を開始するためのＴ７プロモーターを用いて、ｍＲＮＡ転写キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いたインビトロでの転写により、ＴａＧＡＳＲ７遺伝子に対するｓｇＲＮＡを合成してｓｇＲＮＡ−ＧＡＳＲ７−Ｃ５（配列番号１１）とし、そしてこのｍＲＮＡの安定性を高めるためにその３’末端にＰｏｌｙＡ尾部を付加した。
【０１２０】
ＩＶ．Ｃａｓ９タンパク質とインビトロでの転写により合成されたｓｇＲＮＡとをコムギプロトプラストに導入して同時形質転換を行うことによる、ＴａＧＡＳＲ７遺伝子の編集
１．プロトプラストの調製は、実施例３と同一である。
【０１２１】
２．プロトプラストの形質転換
１）精製されたＣａｓ９タンパク質１５μｇとｓｇＲＮＡ−ＧＡＳＲ７−Ｃ５  ２０μｇとを、２ｍｌ遠沈管に加えた。プロトプラスト２００μｌ（約４×１０５個の細胞）を加え、次いで新鮮なＰＥＧ溶液２５０μｌを加えて混合した。形質転換を、暗所で３０分間行った。
【０１２２】
２）Ｗ５（室温）９００μｌを加え、反転により混合し、１００×ｇの遠心分離を３分間行い、上清を廃棄した。
【０１２３】
３）Ｗ５  １ｍｌを加え、反転により混合し、内容物を（予めＷ５  １ｍｌを加えておいた）６ウェルプレートに穏やかに移し、次いで２３℃で一晩培養した。
【０１２４】
３．精製されたＣａｓ９タンパク質とインビトロでの転写により合成されたｓｇＲＮＡとにより生じたコムギ内在性遺伝子ＴａＧＡＳＲ７の変異誘発の、ＰＣＲ／ＲＥ実験を用いた解析
コムギプロトプラストの形質転換の４８時間後にゲノムＤＮＡを抽出し、これをＰＣＲ／ＲＥ（ポリメラーゼ連鎖反応／制限消化）実験解析用テンプレートとして使用した。同時に、野生型コムギ変種Ｂｏｂｗｈｉｔｅのプロトプラストを、対照として使用した。ＰＣＲ／ＲＥ解析方法は、Ｓｈａｎ，  Ｑ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ａｎｄ  Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｕｓｉｎｇ  ＴＡＬＥＮｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ  （２０１３）に基づく。コムギ内在性遺伝子ＴａＧＡＳＲ７（ジェンバンク登録番号ＥＵ０９５３３２）の標的部位（ジェンバンク登録番号ＥＵ０９５３３２の２４８〜２６８の位置）は制限エンドヌクレアーゼＮｃｉＩ認識配列（５’−ＣＣＳＧＧ−３’）を含むため、ＰＣＲ／ＲＥ試験を行うために実験においてＮｃｉＩを使用した。ＰＣＲ増幅に用いたプライマーは、以下の通りであった：
ＴａＧＡＳＲ７−Ｆ：５’−ＧＧＡＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＧ−３’；
ＴａＧＡＳＲ７−Ｒ：５’−ＣＴＧＧＧＡＧＧＧＣＡＡＴＴＣＡＣＡＴＧＣＣＡ−３’。
【０１２５】
これらのＰＣＲ／ＲＥ実験の結果から、ＴａＧＡＳＲ７遺伝子の標的部位で変異が生じたことが判明した。図中のバンドを回収してシーケンシングしたところ、これらのシーケンシング結果から、ＴａＧＡＳＲ７遺伝子の標的部位で挿入／欠失（インデル）が生じたことが判明した（図４Ｂおよび図４Ｃ）。
【０１２６】
Ｖ．精製されたＣａｓ９タンパク質とインビトロでの転写により合成されたｓｇＲＮＡとをパーティクルボンバードメントにより導入して形質転換を行うことによる、コムギＴａＧＡＳＲ７遺伝子の部位特異的編集
１．精製されたＣａｓ９タンパク質とインビトロでの転写により合成されたｓｇＲＮＡとの、シリカへの負荷
１０ｎｍの開口部を有するシリカＡｕ−ＭＳＮを、キャリアとして使用した。音波処理のために、Ａｕ−ＭＳＮ  ２０ｍｇをｐＨ７．４のリン酸バッファー（ＰＢＳ）５ｍｌに加えた。次いで、精製されたＣａｓ９タンパク質７ｍｇを加えた。この混合物を２２℃で２４時間撹拌し、１２０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を廃棄した。このペレットを、ＰＢＳバッファーで懸濁させた。インビトロでの転写により合成されたｓｇＲＮＡ（２５０ｎｇ／μｌ）４μｌを、Ｃａｓ９タンパク質−Ａｕ−ＭＳＮ（１０μｇ／μｌ）キャリア１０μｌに加えた。次いで、２．５Ｍ  ＣａＣｌ２  １２．５μｌと０．１Ｍスペルミジン５μｌとを加え、５０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離し、上清を廃棄した。このＣａｓ９タンパク質を担持しかつｍＲＮＡで被覆されたＡｕ−ＭＳＮを、１００％エタノールで２回洗浄し、１００％エタノール５μｌ中に再懸濁させ、これをｓｇＲＮＡ−Ｃａｓ９−Ａｕ−ＭＳＮと命名した。
【０１２７】
２．パーティクルボンバードメントを用いたコムギレシピエント材料の形質転換
１）コムギ変種Ｂｏｂｗｈｉｔｅの未熟胚を採取し、高張培地を用いて４時間処理した。
【０１２８】
２）ステップ１）で高張培養したコムギ未熟胚への撃込みを行うために、パーティクルボンバードメント装置を使用した。ｓｇＲＮＡ−Ｃａｓ９−Ａｕ−ＭＳＮ  ５μｌを膜上に負荷して撃ち込んだ。各撃込みの撃込み間隔は６ｃｍであり、撃込み圧力は１１００ｐｓｉであり、撃込み直径は２ｃｍであった。
【０１２９】
３）ステップ２）で撃込みを行ったコムギ未熟胚を、１６時間高張培養した。
【０１３０】
４）次いで、ステップ３）で高張培養したコムギ未熟胚を順次、１４日間のカルス組織誘導培養、２８日間の分化培養および１４〜２８日間の発根培養に供して、コムギ植物を得た。
【０１３１】
５）ステップ４）で生成させたコムギ実生からＤＮＡを抽出し、遺伝子ノックアウト（部位特異的）を伴う変異体をＰＣＲ／ＲＥ試験により検出した（詳細な試験方法については、ステップＩＶを参照）。野生型コムギ変種Ｂｏｂｗｈｉｔｅを対照として用いた。
【０１３２】
いくつかの変異体のこれらの検出結果から、コムギＴａＧＡＳＲ７遺伝子の標的部位で変異が生じたことが判明した。シーケンシングのためにバンドを回収した。これらのシーケンシング結果から、コムギＴａＧＡＳＲ７遺伝子の標的部位で挿入／欠失（インデル）が生じたことが判明した。
【０１３３】
実施例５  精製されたＣａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡとを花粉管による手法により植物に導入することによる、トウモロコシ内在性ＺｍＩＰＫ遺伝子の部位特異的編集
Ｉ．標的断片：標的Ｃ２の設計
標的Ｃ２：５’−ＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＣ−３’（ジェンバンク登録番号ＡＹ１７２６３５に示される遺伝子ＺｍＩＰＫの３９３〜４１５の位置）
ＩＩ．Ｃａｓ９タンパク質の、原核での発現および精製
実施例３のステップＩＩと同一である。
【０１３４】
ＩＩＩ．標的部位のｓｇＲＮＡの、インビトロでの転写による合成
１．ＺｍＩＰＫの標的部位から、ｐＴ７−ｇＲＮＡベクターを構築した。
【０１３５】
Ｃ２は、標的Ｃ２に相補的に結合しうるＲＮＡをコードするＤＮＡ配列である。
【０１３６】
以下の、粘着末端（下線）を有する１本鎖オリゴヌクレオチドを合成した：
Ｃ２−１Ｆ：５’−ＡＧＣＡＧＴＣＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴ−３’；
Ｃ２−１Ｒ：５’−ＡＡＡＣＡＧＣＴＣＧＡＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＣ−３’。
【０１３７】
オリゴヌクレオチドのアニーリング処理により粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡを形成させ、これをｐＴ７−ｇＲＮＡプラスミド中の２つのＢｂｓＩ制限部位の間に挿入して、Ｃ２部位を含むｐＴ７−ｇＲＮＡプラスミドを得た。陽性プラスミドをシーケンシングによって確認した。５’−ＡＧＣＡＧＴＣＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴ−３’で示されるＤＮＡ断片をｐＴ７−ｇＲＮＡプラスミドのＢｂｓＩ制限部位で順方向に挿入することにより得られた組換えプラスミドは陽性であり、これをｐＴ７−ｇＲＮＡ−Ｃ２と命名した。
【０１３８】
２．ＺｍＩＰＫの標的部位を含むｓｇＲＮＡの、インビトロでの転写による合成
転写を開始するためのＴ７プロモーターを用いて、ｍＲＮＡ転写キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いたインビトロでの転写により、ＺｍＩＰＫ遺伝子に対するｓｇＲＮＡを合成してｓｇＲＮＡ−ＩＰＫ−Ｃ２（配列番号１２）とし、そしてこのｍＲＮＡの安定性を高めるためにその３’末端にＰｏｌｙＡ尾部を付加した。
【０１３９】
ＩＶ．精製されたＣａｓ９タンパク質とインビトロでの転写により合成されたｓｇＲＮＡとを花粉管による手法により導入することによる、トウモロコシ内在性ＺｍＩＰＫ遺伝子の部位特異的編集
野外のトウモロコシ近交系ＨｉＩＩの強い植物を、レシピエント材料として選択した。これらの植物を、晴天日の１４：００〜１６：００に自家受精させた。受粉の１６〜２０時間後、すなわち翌日の１０：００〜１２：００に、これらのレシピエントの花柱を切断した。この切開部に、１０μｇ／μｌ  Ｃａｓ９タンパク質と２５０ｎｇ／μｌ  ｓｇＲＮＡとの混合物を滴下した。結実するまで、柱頭を袋に入れた。得られたトウモロコシ種子を生長させ、そしてＰＣＲ／ＲＥ実験においてテンプレートとして使用するためにゲノムＤＮＡを抽出した。並行して、野生型トウモロコシ変種ＨｉＩＩを対照として準備した。ＰＣＲ／ＲＥ解析方法は、Ｓｈａｎ，  Ｑ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ａｎｄ  Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｕｓｉｎｇ  ＴＡＬＥＮｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ  （２０１３）に基づく。トウモロコシ内在性遺伝子ＺｍＩＰＫ（ジェンバンク登録番号ＡＹ１７２６３５）の標的断片（ジェンバンク登録番号ＡＹ１７２６３５の３９３〜４１５の位置）は制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩ認識配列（５’−ＧＡＧＣＴＣ−３’）を含むため、ＰＣＲ／ＲＥ試験を行うために実験において制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩを使用した。ＰＣＲ増幅に用いたプライマーは、以下の通りであった：
ＺｍＩＰＫ−１Ｆ：５’−ＴＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＧＣＡＧＡＧＣＡＡ−３’；
ＺｍＩＰＫ−１Ｒ：５’−ＧＡＧＡＣＣＴＧＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＣＧＧＡＴＣＣ−３’。
【０１４０】
ＰＣＲ／ＲＥ実験の結果から、ＺｍＩＰＫ遺伝子の標的部位で変異が生じたことが判明した。未切断バンドを回収してシーケンシングしたところ、これらのシーケンシング結果から、ＺｍＩＰＫ遺伝子の標的部位で挿入／欠失（インデル）が生じたことが判明した。
【０１４１】
実施例６  原核の発現系において発現および精製されたＣａｓ９タンパク質とインビトロでの転写により合成されたｓｇＲＮＡとをタバコプロトプラストに導入して同時形質転換を行うことによるＮｔＰＶＹ遺伝子の部位特異的編集、ならびに植物への再生
Ｉ．標的断片：標的Ｐ４の設計
標的Ｐ４：５’−ＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＴＡＴＡＣＡＣＧＧ−３’
ＩＩ．Ｃａｓ９タンパク質の、原核での発現および精製は、実施例３と同一である。
【０１４２】
ＩＩＩ．標的部位のｓｇＲＮＡの、インビトロでの転写による合成
１．ＮｔＰＶＹの標的部位から、ｐＨＳＮ４０１ベクターを構築した。
【０１４３】
Ｐ４は、標的Ｐ４に相補的に結合しうるＲＮＡをコードするＤＮＡ配列である。
【０１４４】
以下の、粘着末端（下線）を有する１本鎖オリゴヌクレオチドを合成した：
Ｐ４−Ｆ：５’−ＡＴＴＧＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＴＡＴＡＣＡ−３’；
Ｐ４−Ｒ：５’−ＡＡＡＣＴＧＴＡＴＡＧＣＣＡＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡ−３’．
オリゴヌクレオチドのアニーリング処理により粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡを形成させ、これをｐＨＳＮ４０１プラスミド中の２つのＢｓａＩ制限部位の間に挿入して、Ｐ４を含むｐＨＳＮ４０１プラスミドを得た。陽性プラスミドをシーケンシングによって確認した。５’−ＡＴＴＧＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＴＡＴＡＣＡ−３’で示されるＤＮＡ断片をｐＨＳＮ４０１プラスミドのＢｓａＩ制限部位で順方向に挿入することにより得られた組換えプラスミドは陽性であり、これをｐＨＳＮ４０１−Ｐ４と命名した。
【０１４５】
２．ＮＴＰＶＹの標的部位を含むｓｇＲＮＡの、インビトロでの転写による合成
転写を開始するためのＴ７プロモーターを用いて、ｍＲＮＡ転写キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いたインビトロでの転写により、ＮＴＰＶＹ遺伝子（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５）に対するｓｇＲＮＡを合成してｓｇＲＮＡ−ＰＶＹ−Ｐ４（配列番号１６）とした。
【０１４６】
ＩＶ．Ｃａｓ９タンパク質とインビトロでの転写により合成されたｓｇＲＮＡとをタバコプラストに導入して同時形質転換を行うことによる、ＮｔＰＶＹ遺伝子の編集
１．材料の調製
使用したタバコ変種は、Ｈｏｎｇｈｕａ  Ｄａｊｉｎｙｕａｎである。種子を２０％次亜塩素酸ナトリウムで２０分間処理し、滅菌水で５回超洗浄した。次いで、これらの種子を２５℃で１６時間明所で１／２ＭＳ培地上で培養した。
【０１４７】
２．プロトプラストの単離
１）３０日齢のタバコ植物の葉を６枚選択し、無菌条件下で切断して約１ｃｍの切片とした。酵素分解溶液１５ｍｌを含む培養プレートに、これらの切片を入れた。このプレートを密封し、２５℃で一晩（最も好ましくは１２時間）暗所で保持した。
【０１４８】
２）酵素分解反応の後、適量のＷ５溶液を加えた。このプレートを穏やかに振盪してプロトプラストを放出させた。次いで、このプロトプラスト懸濁液を１００μｍおよび４０μｍの滅菌フィルターでろ過し、７０×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。
【０１４９】
３）２２％スクロース溶液５ｍｌを加えることにより、これらのプロトプラストを再懸濁させた。次いで、Ｗ５溶液２ｍｌを加え、７０×ｇで５分間遠心分離した。その際、これらのプロトプラストは界面で懸濁した。
【０１５０】
４）これらのプロトプラストをこの界面から採取した。Ｗ５溶液５ｍｌを加えて混合し、次いで７０×ｇで５分間遠心分離した。
【０１５１】
５）上清を廃棄した。ＭＭＧ形質転換溶液１ｍｌを加えて、これらのプロトプラストを再懸濁させた。顕微鏡検査によりプロトプラストの収量を調べた。
【０１５２】
３．プロトプラストの形質転換および再生
１）精製されたＣａｓ９タンパク質２０μｇとｍＲＮＡ−ＰＶＹ−Ｐ４  ２０μｇとを、１４ｍｌ遠沈管に加えた。プロトプラスト３００μｌ（約５×１０５個の細胞）を加え、次いで新鮮なＰＥＧ溶液３００μｌを加えて混合し、暗所で２０分間保持した。
【０１５３】
２）Ｗ５  １０ｍｌを加えて混合し、７０×ｇで３分間遠心分離し、そして上清を廃棄した。このステップを繰り返した。
【０１５４】
３）０．６％シープラーク（Ｓｅａ  Ｐｌａｑｕｅ）アガロース（使用前に４０〜４５℃の水浴中でインキュベートしたもの）を含むＫ３：Ｈ培地１ｍｌを加えて混合した。この混合物を３０ｍｍ滅菌培養プレートに導入して形質転換させた。
【０１５５】
４）培地の固化後に、このプレートを２４℃で暗所に２４時間置き、最初の細胞分裂が生じるまでさらに６日間暗所で培養した。
【０１５６】
５）このアガロースゲルを９０ｍｍ培養プレートに移し、適量の液体培地を加えた。培養を２４℃で暗所で継続した。
【０１５７】
６）３〜４週間後、このプレートに、視認可能なカルスが出現した。そして、これらのカルスは５〜６週間の培養後に直径８〜１０ｍｍに達した。
【０１５８】
７）これらのカルスを分化培地に移し、表面上に不定芽が形成されるまで１〜２週間培養した。
【０１５９】
８）３〜４ｃｍの不定芽を切断して発根培地に移し、インタクト植物が形成されるまで根の生成を誘導した。
【０１６０】
９）根が一定の長さに達したら、これらの実生を土壌に移植した。
【０１６１】
このトランスジェニックタバコのＤＮＡを抽出し、これをＰＣＲ／ＲＥ（ポリメラーゼ連鎖反応／制限消化）解析用テンプレートとして使用した。並行して、野生型タバコＤＮＡを対照として使用した。ＰＣＲ／ＲＥ解析方法は、Ｓｈａｎ，  Ｑ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ａｎｄ  Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｕｓｉｎｇ  ＴＡＬＥＮｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ  （２０１３）に基づく。タバコ内在性遺伝子ＮｔＰＶＹの標的断片は制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩＩ認識配列（５’−ＣＡＧＣＴＧ−３’）を含むため、ＰＣＲ／ＲＥ試験において制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩＩを使用した。ＰＣＲ増幅に用いたプライマーは、以下の通りであった：
ＮｔＰＶＹ−Ｆ：５’−ＴＧＧＡＴＴＡＧＡＴＧＴＴＴＴＣＡＡＡＴＧＣ−３’；
ＮｔＰＶＹ−Ｒ：５’−ＣＡＴＴＣＴＴＴＴＧＧＧＧＡＣＧＧＡＣＡＡＡ−３’。
【０１６２】
ＰＣＲ／ＲＥ実験の結果から、Ｃａｓ９タンパク質とインビトロでの転写により合成されたｓｇＲＮＡとをタバコプロトプラストに導入して同時形質転換を行うことにより、ＮｔＰＶＹ遺伝子の標的部位で変異が生じたことが判明した。未切断バンドを回収してシーケンシングしたところ、これらのシーケンシング結果から、ＮｔＰＶＹ遺伝子の標的部位で挿入／欠失（インデル）が生じたことが判明した（図５Ａおよび図５Ｂ）。さらに、再生されたトランスジェニックタバコ植物もＮｔＰＶＹ遺伝子の標的部位で変異を示した。これらのシーケンシング結果から、ＮｔＰＶＹ遺伝子の標的部位で挿入／欠失（インデル）が生じたことが判明した（図５Ｃ）。
【０１６３】
タバコプロトプラストの単離および培養のための溶液を、以下の表６から表１０までに列挙する。
【０１６４】
表６  酵素分解溶液５０ｍｌ
【表６】
2018508221.tif 000007
【０１６５】
表７  Ｗ５  ５００ｍｌ
【表７】
2018508221.tif 000008
【０１６６】
表８  形質転換溶液１０ｍｌ
【表８】
2018508221.tif 000009
【０１６７】
表９  ＰＥＧ溶液４ｍｌ
【表９】
2018508221.tif 000010
【０１６８】
表１０  タバコプロトプラストの単離および培養のためのストック溶液
【表１０】
2018508221.tif 000011
【図１】
2018508221.tif 000012
【図２】
2018508221.tif 000013
【図３】
2018508221.tif 000014
【図４】
2018508221.tif 000015
【図５】
2018508221.tif 000016
【配列表】
2018508221000001.app
【国際調査報告】
2018508221.tif 000017
2018508221.tif 000018
2018508221.tif 000019
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