(57)【要約】本明細書で提供されているのは核酸試料の起源を特定する方法である。方法は、単一細胞に由来する核酸分子を含む核酸試料とバーコードのセットとを含む反応混合物を形成する工程と、試料の核酸分子にバーコードのセットを組み込む工程と、単一細胞の核酸分子に組み込まれたバーコードのセットを特定し、それによって核酸試料の起源を特定する工程とを含む。2018538006.tif 000006
2018538006.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸試料の起源を特定する方法であって、
（ａ）単一細胞に由来する核酸分子を含む核酸試料とバーコードのセットとを含む反応混合物を形成する工程と、
（ｂ）前記試料の前記核酸分子にバーコードの前記セットを組み込む工程と、
（ｃ）前記単一細胞の前記核酸分子に組み込まれたバーコードの前記セットを特定し、それによって前記核酸試料の起源を特定する工程と
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記反応混合物を形成する工程が、
バーコードの前記セットに前記単一細胞を接触させることと、
前記単一細胞に由来する前記核酸試料を提供するために、前記細胞を溶解することと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反応混合物を形成する工程が、
懸濁緩衝液中の細胞を提供することと、
前記単一細胞とバーコードの前記セットとを含む前記反応混合物を形成するための条件下で、バーコードの前記セットを含むバーコーディング緩衝液に、前記細胞を含む前記懸濁緩衝液を接触させることと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
バーコードの前記セットが、独特の５’バーコードを各構築物が含む１つ以上の５’核酸構築物と、独特の３’バーコードを各構築物が含む１つ以上の３’核酸構築物とを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記反応混合物を形成する工程が、
懸濁緩衝液中の細胞を提供することと、
前記単一細胞と少なくとも１つの５’核酸構築物と少なくとも１つの３’核酸構築物とを含む前記反応混合物を形成するための条件下で、前記５’核酸構築物と前記３’核酸構築物とを含むバーコーディング緩衝液に、前記懸濁緩衝液を接触させることと
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記反応混合物を形成する工程が、
懸濁緩衝液中の細胞を提供することと、
前記単一細胞と少なくとも１つの５’核酸構築物と少なくとも１つの３’核酸構築物とを含む前記反応混合物を形成するための条件下で、前記５’核酸構築物を含む第１のバーコーディング緩衝液及び前記３’核酸構築物を含む第２のバーコーディング緩衝液に、前記懸濁緩衝液を接触させることと
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記構築物が、独特の分子識別子（ＵＭＩ）配列をさらに含む、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
各５’核酸構築物が、固体表面に結合された複数コピーで提供される、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
各３’核酸構築物が、固体表面に結合された複数コピーで提供される、請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記固体表面が、ビーズ、マイクロビーズ、微粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、ナノビーズまたはヒドロゲルである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記反応混合物が、前記単一細胞に由来する前記核酸試料と、複数コピーの前記５’核酸構築物を含む少なくとも１つのビーズと、複数コピーの前記３’核酸構築物を含む少なくとも１つのビーズとを含む、請求項４〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
各５’核酸構築物及び３’核酸構築物が、光切断可能なリンカーまたは制限酵素部位をさらに含む、請求項４〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
各５’核酸構築物が光切断可能なリンカーをさらに含み、且つ各３’核酸構築物が制限酵素部位をさらに含む、請求項４〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
各５’核酸構築物が制限酵素部位をさらに含み、且つ各３’核酸構築物が光切断可能なリンカーをさらに含む、請求項４〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記反応混合物を制限酵素に接触させる工程と、
前記固体表面から前記５’核酸構築物及び前記３’核酸構築物を遊離させるために、前記反応混合物をＵＶ光に曝露する工程と
をさらに含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記５’核酸構築物及び前記３’核酸構築物が制限酵素部位をさらに含み、
前記方法が、
前記固体表面から前記５’核酸構築物及び前記３’核酸構築物を遊離させるために、前記反応混合物を制限酵素に接触させる工程
をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記５’核酸構築物及び前記３’核酸構築物が光切断可能なリンカーをさらに含み、
前記方法が、
前記固体表面から前記５’核酸構築物及び前記３’核酸構築物を遊離させるために、前記反応混合物をＵＶ光に曝露する工程
をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記５’核酸構築物が、プロモータを含む二本鎖核酸構築物であり、且つ前記５’核酸構築物が、複数コピーの前記５’核酸構築物を作り出すための鋳型として役立つ、請求項４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
バーコードの前記セットが、１、２、３、４、５、６、７、または８個の５’核酸構築物と、１、２、３、４、５、６、７、または８個の３’核酸構築物とを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸試料における５’バーコードと３’バーコードとの組み合わせが、前記核酸試料の起源を特定する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記３’核酸構築物が結合配列をさらに含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記結合配列がポリ−Ｔ配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリ−Ｔ配列が、前記試料の前記核酸分子におけるポリ−Ａ配列に結合する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記３’核酸構築物における前記バーコードが、逆転写によって組み込まれる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記逆転写が、前記３’バーコード配列を含む核酸分子を作り出す、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記逆転写酵素が、前記試料の前記核酸分子の末端に２〜５個のシステイン残基を付加する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記２〜５個のシステイン残基が、前記５’核酸構築物における結合配列に相補性の結合配列を提供する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記５’核酸構築物における前記結合配列が、ポリ−Ｇ配列を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記５’核酸構築物における前記結合配列が、前記試料の前記核酸分子におけるポリ−Ｃ配列に結合する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記５’核酸構築物が、逆転写酵素を用いて前記核酸試料に組み込まれる、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記逆転写酵素がＭ−ＭＬＶ酵素である、請求項２４〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記逆転写酵素がＭＭＬＶ  Ｈ−逆転写酵素である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
５’バーコード及び３’バーコードを各配列が含む複数の核酸配列の複数コピーを作り出すために、前記核酸試料がさらに増幅される、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸分子がｍＲＮＡを含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ｍＲＮＡが、少なくとも１、３、１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、１０，０００、３０，０００、１００，０００、３００，０００、または１，０００，０００個のｍＲＮＡを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記核酸試料における前記バーコードが、配列決定によって特定される、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
バーコードの前記セットが、独特の５’バーコードを各構築物が含む少なくとも２つの５’核酸構築物を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
バーコードの前記セットが、独特の３’バーコードを各構築物が含む少なくとも２つの３’核酸構築物を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記核酸分子の１つ以上が、２つ以上の独特のバーコードを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記独特のバーコードが、前記核酸分子の５’末端、３’末端、または５’末端と３’末端の双方に位置する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
複数の反応混合物を形成する工程を含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
２つ以上の独特のバーコードが、前記反応混合物の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％に存在する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記複数の反応混合物を形成する工程が、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０または５．０より大きいラムダで複数の反応混合物にバーコードの前記セットを加えることを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記反応混合物が液滴である、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
核酸試料の起源を特定する方法であって、
（ａ）独特の３’バーコード配列と結合配列とバーコード関連配列とを各構築物が含む３’核酸構築物のセットを提供する工程と、
（ｂ）単一細胞に由来する核酸分子を含む核酸試料を提供する工程と、
（ｃ）前記核酸試料を３’核酸構築物の前記セットに接触させる工程と、
（ｄ）前記バーコード関連配列から前記３’バーコード配列及び結合配列を分離する工程と、
（ｅ）前記３’核酸構築物に由来する前記３’バーコード配列を前記核酸分子に組み込む工程と、
（ｆ）前記バーコード関連配列を用いて３’バーコード配列の前記セットを特定し、それによって前記単一細胞に由来する前記核酸試料の起源を特定する工程と
を含む、前記方法。
【請求項４６】
３’核酸構築物の前記セットが、２、３、４、５、６、７または８個の３’核酸構築物を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記３’核酸構築物が、独特の分子識別子（ＵＭＩ）配列をさらに含む、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記３’核酸構築物が、ヘアピンを形成することができる、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記３’バーコード配列及び結合配列が、制限酵素配列または光切断可能なリンカーによって前記バーコード関連セグメントから分離される、請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記３’核酸構築物の複数コピーが、固体表面に結合される、請求項４５〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記固体表面が、ビーズ、マイクロビーズ、微粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、ナノビーズまたはヒドロゲルである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
制限酵素が、前記３’バーコード配列を前記固体表面から遊離させ、且つ前記結合配列を前記バーコード関連セグメントから分離する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ＵＶ光が、前記３’ バーコード配列を前記固体表面から遊離させ、且つ前記結合配列を前記バーコード関連セグメントから分離する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記３’核酸構築物における前記結合配列が、ポリ−Ｔ配列を含む、請求項４５〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記３’核酸構築物の前記結合配列が、前記試料の前記核酸分子におけるポリ−Ａ配列に結合する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記３’核酸構築物における前記バーコード配列が、逆転写によって組み込まれる、請求項４５〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記逆転写が、前記３’バーコード配列を含む核酸分子を作り出す、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記バーコード関連セグメントがプライミング配列を含む、請求項４５〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記プライミング配列が回文配列である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
一方のバーコード関連セグメントの前記プライミング配列が、前記核酸試料における他の任意のバーコード関連セグメントのプライミング配列と結合することができる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
双方のバーコード関連セグメントを単一核酸に組み込むために、互いに接触している前記バーコード関連セグメントが、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記核酸分子に組み込まれた前記バーコード配列を特定する工程をさらに含む、請求項４５〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記核酸試料における前記バーコード配列が、配列決定によって特定される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記バーコード関連セグメントが、配列決定によって特定される、請求項６２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる２０１５年１１月４日に出願された米国仮特許出願番号６２，２５０，９００の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細胞集団のゲノム及びトランスクリプトームのプロファイリングは、バイオテクノロジー及び医学の分野におけるかなりの影響と共に強く高い関心のある領域である。核酸の配列決定技術における最近の進歩によって従来のアプローチの実践的な処理能力をはるかに上回るペースでの規模でプロファイリング研究が可能になっている。単一細胞のゲノムまたはトランスクリプトームのプロファイリングに向けた初期の試みには、ゲノムまたはトランスクリプトームの最適な解析方法を適用することができるＦＡＣＳ選別またはさらにマルチウェルマイクロタイタープレートのウェルのような別個の反応バイアルへの個々の細胞の手選が含まれた。この形式では、別個の反応は個々に操作され、制御され得る。たとえば、各ウェルが単一細胞のみを含有することを確実にするのは比較的簡単である。複数細胞の同時隔離はこれらの細胞のゲノムまたはトランスクリプトームのプロファイリングが互いに巻き込まれ合ってしまい、個々のプロファイリングを解きほぐすことが難しいまたは不可能であるので、このことは重要である。これらの形式の短所は、それらは時間がかかり、試薬がかかり、人手がかかり、これらの理由で相対的に低い処理能力のプロセスしかできないことである。さらに最近のアプローチは細胞の隔離に向かう傾向があり、マイクロウェルまたはナノウェルまたは液滴のようなナノリットルまたはピコリットルの大きさの容器で化学試薬及び分子試薬を必要としている。これらの形式は時間、コスト及び処理能力という点で大幅な改善を可能にするが、細胞及び他の反応成分を容器に正確に負荷するのを制御するのがかなり難題であるという短所を伴う。成分は無作為に容器に割り当てられることが多く、その場合、多数の容器の間での成分の分配はポアソン分布に従う。細胞の場合、たとえば、システムが、細胞の少なくとも９５％が単独で隔離される（言い換えれば、細胞を伴う容器のたった５％が２つ以上の細胞を含有するのを容認される）ことを必要とするのであれば、条件は各容器が平均で０．１の細胞を受け取るように設定されなければならない。ポアソン用語では、これは０．１の期待値、または「ラムダ」である。この場合、容器の９０．４８％は細胞を受け取らず、９．０５％の容器は単一細胞を受け取り、０．４５％は２個の細胞を受け取り、０．０２％は３個の細胞を受け取り、さらに低い比率は４、５、６個等の細胞を受け取るであろう。この場合、細胞を受け取る容器のうち、９５．１％は正確に１個の細胞を含有する。反応容器すべての９０％を超えるものが細胞を欠いており非生産的なので、そのようなシステムの非効率性は明らかである。これらのポアソン分布の２つ以上の交点が含まれる場合、非効率性は度合を増す。ゲノム及びトランスクリプトームのプロファイリングに対する一般的なアプローチには、細胞を起源とする遺伝子及び／または転写産物にその後付加される核酸バーコードと共にその細胞を隔離することが含まれる。その後、バーコードを用いて各遺伝子または転写産物を起源の細胞に明瞭に割り当て、結果としてその細胞のゲノム及びトランスクリプトームのプロファイルを含む。そのようなスキームの曖昧性解消は、単独で隔離される細胞だけでなく、単独のバーコードのみを受け取る同一容器にも左右される。バーコードは単一の核酸分子であってもよいが、さらに一般的には、その表面が同一核酸バーコードの多数のコピーで官能化されるポリスチレンビーズのような粒子を介して届けられる。いずれの場合も、独特のバーコードの反応容器への無作為な割り当ては、前と同じ負荷統計、すなわち、期待値（ラムダ）によって決定されるポアソン分布に従うであろう。正確に１個の細胞が正確に１つのバーコードと共に同時隔離される容器のみが明白なゲノムまたはトランスクリプトームのプロファイルを生じるであろう。特定のバーコードとの多重細胞隔離は、上流データの解析の際、同時隔離した細胞の個々のプロファイルの結合体である単一のゲノムまたはトランスクリプトームのプロファイルのように見えるであろう。複数細胞の複数バーコードとの同時隔離の場合は一層さらに複雑な曖昧性を生じる。この曖昧性は単一細胞の遺伝子またはトランスクリプトームのプロファイリングを含むあらゆる適用に対して有害な意味合いを有する。たとえば、適用にトランスクリプトームのプロファイルによって特定される特定のクローンの定量が関与するのであれば、複数のバーコードがそのクローン型の細胞と共に同時隔離される場合は下流の解析ではそのクローン型の複数細胞の見掛けを与えるので、試料における細胞の集団全体のその見掛けの比率を人為的に誇張する。細胞とバーコードを受け取る容器の少なくとも９５％が正確に１個の細胞と正確に１つのバーコードを受け取ることを要求するこの設計のプロファイリングシステムについては、所望の結果を与える細胞とバーコードのラムダの組み合わせの連続した繋がりがある（容器がそれぞれの少なくとも一方を受け取れなければ、それは非生産性であり、考慮から除外することに留意のこと）。代表的な組み合わせの１つは細胞及びバーコードの双方について０．０５のラムダである。この場合、容器は平均で０．０５の細胞と０．０５のバーコードを受け取るであろう。それぞれ細胞とバーコードのうち、容器の９５．１２％は何も受け取らず、４．７６％は１つ受け取り、０．１２％は２つ受け取り、さらに低い比率は３、４、５個等を受け取るであろう。少なくとも１個の細胞を受け取る容器のうち、９７．５２％が正確に１個の細胞を受け取り、バーコードについても同様である。これら２つの比率を重ね合わせると、９７．５２％×９７．５２％＝９５．１％の正確に１個の細胞と正確に１つのバーコードとしての細胞・バーコード同時隔離の事象を生じる。しかしながら、この基準を達成するために、９９．７６％を超える容器が細胞を受け取らない、バーコードを受け取らない、または両方とも受け取らないので非生産的である。言い換えれば、０．２４％未満の容器が細胞プロファイルを作り出す機会を有するであろう。加えて、５％未満の細胞がバーコードと共に同時隔離されるので、９５％を超える細胞が解析から失われる。これはシステムの処理能力を大きく低下させ、これは解析からの細胞の９５％の喪失を生じるので、解析する対象とする細胞が稀な細胞である場合、特に有害である。これらのピコリットル及びナノリットル規模の方法は、バーコードを受け取る容器の比率をバーコー���ィングスキームの忠実性を犠牲にすることなく増やせれば、処理能力（すなわち、処理される細胞の数）及び試料の適用範囲（すなわち、処理される原試料における細胞の総数の比率）という点で意味のある改善を実現してもよい。
【０００３】
核酸バーコードの単クローン性の「パケット」または「セット」、たとえば、バーコード核酸で官能化したビーズ、核酸バーコードを負荷したヒドロゲルまたは類似のバーコード送達法を使用するゲノム及びトランスクリプトームのプロファイリングのアプローチについては、核酸バーコードのパケットはほぼ常にある程度の多クローン性を示す。多クローン性の程度はバーコードのパケットを作り出すのに使用される方法に左右される。たとえば、方法の１つは、汎用プライミング配列を持つＤＮＡオリゴで官能化され、その後ＰＣＲによってビーズの表面で増幅する個々のバーコード分子で乳化されるビーズを使用する。このスキームでは、エマルションにおける各液滴はすべてが同一のバーコードを受け取る幾つかのビーズを含有してもよいが、理想的な場合、所与の液滴はたった１つのバーコード核酸のみを受け取ることになる。２つ以上のバーコード核酸が単一の液滴に入るのであれば、その液滴で生じるビーズは多クローン性であろう。バーコード核酸分子はバーコードの濃度を変えることによって調整することができるポアソン分布に従って液滴に割り当てられるであろう。ここで再び二律背反がある。低い濃度のバーコードは高い程度の単クローン性を有するビーズを作り出すが、全体的に少ないバーコード付きのビーズが作り出されるというコストのマイナス面がある。さらに高い濃度は、多くの比率のビーズが高い多クローン性を示すであろうバーコード付きビーズの収量を増やすであろう。多クローン性はこの方法の設計に組み込まれている。核酸バーコードをパッケージングする別の方法には組み合わせ合成が含まれる。３８４ウェルプレートで実施され、各ウェルは多数の粒子―この場合ヒドロゲルを含有し―それは汎用ＤＮＡオリゴプライマーで官能化される。各ウェルはＰＣＲを介してそのウェルの各ヒドロゲルに組み込まれる違った最初のバーコード配列も含有する。次いでヒドロゲルは一緒にプールされ、別の３８４ウェルプレートに再分配され、その各ウェルは、再びＰＣＲによって各ヒドロゲルに組み込まれる違った二次バーコード配列を含有する。この方法によって得られるヒドロゲルのライブラリは約１５０Ｋのバーコードの多様性を有し、理論的には高い程度の単クローン性を示すはずである。しかしながら、実際のところ、方法は無視できない程度（約８％）の多クローン性を生じることが報告されている（Ｋｌｅｉｎ，Ａ．Ｃｅｌｌ，１６１（２０１５）（非特許文献１））。この多クローン性は、いずれかのＰＣＲ工程でのＰＣＲプレートのウェル間におけるヒドロゲルもしくはバーコード核酸の混入、または元のバーコード核酸ライブラリ―当初のまたは二次的なまたは双方のバーコード配列の混入のいずれかから生じてもよい。設計によってまたは混入によって、バーコードパケットのライブラリに対する多クローン性は、単一バーコードを各細胞に割り当てるように設計されているゲノム及びトランスクリプトームのプロファイリングのシステムを混乱させるであろう。バーコーディングスキームは、バーコードのパケットのライブラリにおけるある程度の多クローン性に対処する能力から利益を得る。
【０００４】
核酸バーコードのポアソン系分布から生じる非効率性を克服するまたは回避するのに利用されているアプローチの幾つかの例がある。個々のバーコードが充填され、細胞（０．１〜０．２のラムダを持つポアソン分布に従って無作為に負荷される）と共に液滴に封入される直前に液滴装置の水性の流れに導入されるヒドロゲル粒子を使用するトランスクリプトームのプロファイリング法が報告されている。ヒドロゲルは高度に従順なので、それらは狭い流入口の単一の縦列に詰めることができ、液滴形成の速度に同期化することができる高度に秩序のある行列に導入することができる。その結果、液滴はほぼすべて独特のバーコードの多数のコピーと共に１個のヒドロゲル粒子（Ａｂａｔｅ，Ｒ．Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ，９，（２００９）（非特許文献２））を受け取る。しかしながら、そのように慎重に調整された実験が高度に最適化された環境で且つ専門家の手によって実行できる一方で、このアプローチが広汎な使用のために十分に拡張可能且つ着実であるかどうかは今後の課題である。加えて、スキームは多クローン性のバーコードパケットについては堅固ではない。他のアプローチには、重複伸長ＰＣＲの場合のように、複数のゲノムまたはトランスクリプトームの対象とする標的を一緒に単一の連続アンプリコンに組み込むことが関与している。これらのアプローチは、各標的にバーコードを付加することではなく、対象とする標的を物理的に連結するための誂えた汎用プライマーのセットを頼る。プライマーのセットは汎用であり、多数のコピーが容器ごとに導入されるので、それによって標的が起源のその細胞に割り当てられるメカニズムはポアソン系分布の短所に直面しない。しかしながら、これらのアプローチは各細胞から標的とされることができる潜在的な遺伝子または転写産物の数で厳しく限定される。全部ではないが既存の方法のほとんどは現在２つに限定されている（ＤｅＫｏｓｋｙ，ＢＪ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（２）（２０１３）（非特許文献３））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋｌｅｉｎ，Ａ．Ｃｅｌｌ，１６１（２０１５）
【非特許文献２】Ａｂａｔｅ，Ｒ．Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ，９，（２００９）
【非特許文献３】ＤｅＫｏｓｋｙ，ＢＪ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（２）（２０１３）
【発明の概要】
【０００６】
本明細書で提供されるのは、核酸試料の起源を特定する方法である。該方法は、単一細胞に由来する核酸分子を含む核酸試料とバーコードのセットとを含む反応混合物を形成する工程と、バーコードのセットを試料の核酸分子に組み込む工程と、単一細胞の核酸分子に組み込まれたバーコードのセットを特定し、それによって核酸試料の起源を特定する工程とを含む。提供されるのはまた、各構築物がそれぞれ独特の５’バーコード配列または３’バーコード配列を含む５’核酸構築物及び３’核酸構築物のセットを提供する工程と、単一細胞に由来する核酸分子を含む核酸試料を提供する工程と、核酸試料を５’核酸構築物及び３’核酸構築物のセットに接触させる工程と、それぞれ５’核酸構築物及び３’核酸構築物に由来する５’バーコード配列及び３’バーコード配列を核酸分子に組み込む工程と、５’バーコード配列及び３’のバーコード配列のセットを特定し、それによって単一細胞に由来する核酸試料の起源を特定する工程とを含む、核酸試料の起源を特定する方法である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】液滴形成について流れ集束の構成で油流入流路とその後の水性流入流路があるマイクロ流体液滴チップ：（１）懸濁緩衝液中の細胞及び（２）バーコーディングミックス中のバーコード付きビーズの模式図である。懸濁緩衝液及びバーコーディングミックスは、合流して液滴中で所望される最終的なミックスを構成する比で成分を融合させる、異なるマイクロ流体流路に位置する。バーコード付きビーズ及び細胞はポアソン分布によって記載されたように水性液滴に負荷される。液滴当たりのビーズ及び液滴当たりの細胞の平均値（ラムダ）はそれらの流入の流れにおけるその成分の濃度の関数である。液滴はその中でバーコーディング反応が行われる反応容器である。
【図２】２つのビーズのセット（３’及び５’）の例となる組成を示す模式図である。各３’ビーズにおけるバーコード核酸は、ビーズからバーコード配列を切断するのに使用される制限部位（ＲＳ）と、下流の解析で使用される独特の分子識別子配列（ＵＭＩ）と、バーコード配列（ＢＣ３）と、ポリ−Ｔ配列（ＴＴＴ）とを含む。各５’ビーズにおけるバーコード核酸は、制限部位（ＲＳ）と、バーコード配列（ＢＣ５）と、３つのグアニン残基とを含む。
【図３】液滴の中で、細胞が溶解され、ｍＲＮＡ転写産物が遊離され、バーコーディング反応にアクセス可能であることを示す模式図である。制限酵素（ＲＥ）が制限部位でビーズから３’及び５’双方のバーコードを切断する。３’バーコードのポリ−Ｔ配列がｍＲＮＡ転写産物の３’末端でポリ−Ａ尾部にアニーリングすると逆転写が開始される。この３’バーコードのプライマーから出発して、逆転写（ＲＴ）酵素が５’から３’の方向に逆転写して３’バーコードとｍＲＮＡ配列の双方を含む単一のｃＤＮＡアンプリコンを作り出す。転写産物の末端に達すると、ＲＴ酵素（Ｍ−ＭＬＶ酵素）は、５’バーコードの３つのグアニン残基のためにアニーリング部位を提供する幾つかのシトシン残基を付加する。５’バーコードがいったんアニーリングされると、ＲＴ酵素は「鋳型切り替え」を行い、５’バーコード配列を同じｃＤＮＡに組み込む。
【図４】２つの３’バーコード付きビーズ及び３つの５’バーコード付きビーズが細胞と共に同時封入されることを示す模式図である。各３’バーコードは各５’バーコードを対合し、逆もまた同様で、この細胞を起源とするような転写産物すべてを特定するまとまりのある独特のバーコードのセットを形成する。
【図５】逆転写が時期尚早に終結すると、ｃＤＮＡは５’バーコードを組み込めないこと示す模式図である。３’バーコードのライブラリは、１つのバーコードが複数の細胞と共に同時封入されることはまずあり得ないような方法（バーコードの総数という点で）で設計することができる。この場合、非完全長のバーコード付きｃＤＮＡは程度の高い信頼性で適正なプロファイルに割り当てることができる。
【図６】同じ２つの３’バーコード配列が２つの異なる液滴に同時封入されるが、それにもかかわらず２つのバーコードのセットは一方の液滴における余分な３’バーコードのせいで区別可能であることを示す模式図である。この第３の３’ＢＣは他の液滴の２つの５’ＢＣとは対合しないので、２つのバーコードのセットを分離するラインは明白に引くことができる。
【図７】例となるバーコードのセットの使用を示す模式図である。ここで、５’バーコードのビーズのセットは二本鎖ＤＮＡオリゴで官能化され、そのハイブリッド形成した（非共有結合）鎖はＴ７プロモータ配列（「Ｔ７」）と、バーコード配列と、３つのシトシン残基とを含む。制限酵素によってビーズ表面から切断されるのではなく、Ｔ７プロモータは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼがビーズ表面のＤＮＡオリゴ鋳型に由来するＲＮＡバーコードのコピーを結合し、転写できるようにする。これらのＲＮＡバーコードのコピーは、完全長の３’バーコード付きｃＤＮＡの３’末端にそれらがアニーリングするのを可能にする３つのグアニン残基によって３’末端で終結するであろう。ＲＴ酵素は５’バーコードＲＮＡオリゴ鋳型に対して鋳型切り替えを行い、５’バーコードをｃＤＮＡに組み込む。
【図８】各ビーズはその表面が一本鎖バーコードオリゴヌクレオチドで官能化されることを示す模式図である。オリゴは、二本鎖セグメントが制限部位を含有するヘアピン構造を形成する。制限酵素は双方の鎖を切断し、転写産物・バーコーディングセグメントとループ状セグメントを遊離する。ループ状セグメントは、転写産物・バーコーディングセグメント上のバーコードと同一であるまたは単にそれに関連するバーコードと「バーコード関連セグメント」（ＢＡＳ）を含む。ＢＡＳは、単一のアンプリコンにて２つのループ状セグメントの２つのバーコードを一緒に物理的に連結するＤＮＡポリメラーゼ反応にて複数のループ状セグメントが互いにプライムオフできるようにする。これを達成するには、ＢＡＳは回文状であってもよいし、またはその双方が各ビーズに組み込まれる違うセット（たとえば、２つの相補性の配列）で構成され得る。
【図９】ｍＲＮＡのポリ−Ａ尾部に選択的にアニーリングするポリ−Ｔ尾部を持つ転写産物・バーコーディングセグメントを示す模式図である。転写産物の配列はバーコードも運ぶ単一のｃＤＮＡに逆転写される。
【図１０】２つのバーコード付きビーズが細胞と共に同時封入される場合、その細胞に由来する各転写産物は２つのバーコード（ＢＣ１ａまたはＢＣ２ａ）のいずれかによってバーコード付けされてもよいことを示す模式図である。同じ液滴は、それら２つの転写産物のバーコードのそれぞれに相当するループ状セグメントの多数のコピーも含有するであろう。
【図１１】ループ状セグメントは、ＢＡＳを介したループ状セグメント間の相互アニーリングが、ループ状構造で自己アニーリングされたままの単一のループ状セグメントに対比して好まれるように設計することができることを示す模式図である。ＤＮＡポリメラーゼを含んで各ループ状セグメントを伸長し、他のバーコードの相補体を組み込むことができる。
【図１２】試料に関連付けたバーコードを示す模式図である。５’バーコード（５’ＢＣ）または３’バーコード（３’ＢＣ）は、いずれかの試料に関連付けることができ：（ａ）試料に関連付けた核酸の各末端で一方が、または（ｂ）核酸の５’末端で双方が、または（ｃ）核酸の３’末端で双方が、または（ｄ〜ｆ）核酸の中で、または試料に関連付けられた２つの核酸が共有結合する場合、内部的に関連付けられ得る。バーコードは、ライゲーション技術またはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅技術を含むが、これらに限定されない既知の方法を介して試料に付加することができる。
【図１３】試料に関連付けたバーコードのセットの解析を示す模式図である。バーコード付きの核酸は、丸い頂点（５’バーコード）と四角の頂点（３’バーコード）が辺（核酸を表す）によって接続される二部グラフとして表すことができる。反応容器では、５’バーコードと３’バーコードの組み合わせすべてを核酸に関連付けることができるので、丸い頂点はすべて辺によって四角の頂点に接続されるはずであり、最大クリークを形成する。最大クリークを使用することは試料の中でバーコードと核酸を正しく関連付けるであろう。
【図１４】試料に関連付けられた複数のバーコードのセットがバーコードの「不一致」を解決することを示す模式図である。（上）単独のバーコードのセットが使用され、異なる反応容器が偶然同一のバーコードのビーズを含有すれば、異なる試料に由来する核酸の誤った関連付けが生じるであろう。（真ん中）複数のバーコードのセットが使用されるとしたら、双方の反応容器における同一のバーコード（５’バーコード）は他のバーコードのセット（ここでは３’バーコード）との関連によって明白にすることができる。共有される５’バーコードは双方のクリークに属するであろうが、５’バーコードの頂点からの辺（核酸を表す）はたった１つのクリークに独特に属するであろう。（下）２つの反応容器にて同一の５’バーコード及び３’バーコードがあるならば、辺は双方のクリークに属するであろうし、核酸がどの試料に関連付けられるのかは不明である。これは検出することができ、解析からは捨てられ得る（点線によって示される）。
【図１５】観察された回数の数（ｘ軸、カウント）に対比した配列読み取り対で観察されたバーコード対の頻度（ｙ軸、割合）を示す模式図である。半分を超えるバーコード対が正確に１回観察されたが、それは直接除去されてもよい実験的ノイズ（たとえば、配列決定の誤差）を表すものと矛盾しない。わずかなバーコード対が１０回を超えて観察された。５０でのビンに５０回以上観察されたバーコードの対すべてが含まれる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の詳細な説明
反応容器に単一の独特のバーコードを導入するように試みるのではなく、本出願は、生産反応のほとんどの場合またはすべての場合、その容器にてゲノムまたはトランスクリプトーム標的すべてについて起源の細胞を特定する区別可能なバーコードのセットを形成する複数のバーコードの計画的導入を指向する。これは幾つかの異なる方法のいずれかで実施することができ、決定的な共通する特徴は、対象とするゲノムまたはトランスクリプトーム標的にバーコードを付けることに加えて、単一の容器に複数のバーコードを導入する場合、容器におけるバーコードすべてを直接または間接的にその容器における他のバーコードすべてに関連付けることができるメカニズムも存在することである。単一バーコードではなく複数バーコードが個々の容器に割り当てられると、容器の大半が空なので非生産的であるという要件なしでバーコードの無作為な分配を適用することができる。提供される方法はまた、２つ以上のポアソン分布の交点を適用することの非効率性も低下させる。
【０００９】
処理能力及び適用範囲という点でそのようなバーコーディングスキームの利益を実証するために、細胞とバーコードを受け取る容器の少なくとも９５％が正確に１つの細胞と１つのバーコードを受け取る場合を考察する。多重バーコードのスキームでは、相当する要件は、受け取られるバーコードの数が今や無関係の実践的検討のためのものなので、細胞を受け取る容器の９５％を超えるものが正確に１個の細胞を受け取ることである。容器当たり０．１個の細胞の平均値でこの評点に達し、その場合、少なくとも１個の細胞を受け取る容器の９５．１％は正確に１個の細胞を受け取るであろう。容器当たりのバーコードの平均数は、バーコードの無駄のなさ、下流の解析の複雑さ及び他の因子の間での試料の適用範囲の間での所望の均衡に基づいて選択することができる。容器当たり３つのバーコードの平均値については、相当するポアソン分布は容器の９５．０２％が少なくとも１つのバーコードを受け取るであろうことを決定づけている。単一バーコードのアプローチでは、容器の０．２４％未満が少なくとも１個の細胞と１つのバーコードを受け取るのでゲノムまたはトランスクリプトームのプロファイリングシステムに生産的に加わる機会を有するの対して、この類似の多重バーコードのアプローチでは、容器の９．０４％が少なくとも１個の細胞と１つのバーコードを受け取る。これは潜在的に生産的な容器の数でほぼ４０倍の増加であり、得られる処理能力（プロファイルされる細胞の数という点で）は従って高まると期待され得る。重要なことに、このことはプロファイリングされる細胞の数だけでなく比率も反映する。単一バーコードのアプローチでは容器の４．８８％のみが少なくとも１つのバーコードを受け取るにすぎないので、それに応じて低い比率の細胞がプロファイリングされるのに対して、容器当たり３つのバーコードの平均値を伴う多重ビーズのアプローチでは、容器の９５．０２％が少なくとも１つのバーコードを受け取る。これは試料の適用範囲でほぼ２０倍の増加を可能にし、容器当たりのバーコードのさらに大きな平均数が選択されれば一層さらに大きな前進を実現することができる。試料適用範囲のこの改善は極めて有益であり、相対的に稀な細胞クローンのプロファイルが求められる適用について特にそうである。
【００１０】
多重バーコードのアプローチの別の利益は、単クローン性のバーコードのセットを作り出すことを目指す方法のほとんどまたはすべての共通する結果である多クローン性に対してスキームが安定していることである。単一バーコードのアプローチでは、２つ以上の違うバーコードを含有する単一のセットがそのバーコードのセットが割り当てられる細胞のプロファイルを混乱させるのに対して、所与の容器におけるバーコードすべてを一緒に包括的なバーコードのセットの中に関連付けるプロファイリングシステムは多クローン性のバーコードのセットに対処することができる。それはまた、ビーズのバーコーディング過程に対する収率及び／またはコストという点で有意な改善を可能にすることもできる。例として本明細書に記載されているエマルションＰＣＲに基づく方法を用いて、容認できる閾値がバーコード付きビーズの少なくとも９５％は単クローン性でなければならないということであれば、ビーズの１０％未満はバーコードを受け取り、ビーズの残りは無駄であるという結果を伴って、乳化過程の間でのバーコードコピーのラムダは０．１に設定されなければならない。システムが多クローン性のビーズのさらに大きな割合が認容できる―たとえば、ビーズの９９％が単コード化、二重コード化、または三重コード化されなければならない（この場合、約７０％が単コード化される）のであれば―バーコードコピーのラムダは０．７に設定することができ、ビーズの＞５０％は少なくとも１つのバーコードを受け取るという結果を伴う。これは生産収量で５倍を超える増加をもたらす。
【００１１】
（表１）ラムダ＝０．１の場合に対比させたバーコード付きビーズの収量の対応する倍率増加を伴った、ｅｍＰＣＲビーズバーコーディング反応における液滴当たりのバーコードの平均コピー数（ラムダ）の関数としてのビーズのクローン性の百分率
2018538006.tif 000003
【００１２】
単一バーコードによってではなく、バーコードの区別できるセットを用いて個々の遺伝子またはトランスクリプトームのプロファイルを特定することによって、スキームはバーコードの任意の１つが複数の反応容器に入る例を特定することができる。単一バーコード配列の２つの他の違うセットとの関連付けは、そのような場合が特定され、別の解析メカニズムによって分類されるまたは廃棄されるようにする。
【００１３】
バーコードと試料に関連付けられた核酸との正確な割り当ては、グラフ理論を用いて、特に二部グラフを用いて及び最大クリークを探索して行うことができる。二部グラフは、頂点（またはノード）を、各辺が第１の集合における頂点を第２の集合における頂点に接続する２つの互いに素な集合に分割することができるグラフである。我々の目的では、頂点の２つの集合は２つのバーコードのセット（５’バーコード及び３’バーコードのセット）を表し、頂点を接続する辺はその中に組み込まれたその５’バーコードとその特定の３’バーコードを有する核酸を表す（図１３）。反応容器では、５’バーコードと３’バーコードの組み合わせすべてを核酸に関連付けることができるので、丸い頂点はすべて辺によって四角の頂点すべてに接続されて最大クリークを形成するはずである。クリークは、クリークにおける２つの違う頂点がどれも皆隣接するような無向グラフの頂点のサブセットである。最大クリークは、１つ以上の隣接する頂点を含めることによって伸長できない、それがさらに大きなクリークのサブセットではないことを意味するクリークである。コンピュータプログラムを用いて最大クリークを情報学的に解き明かすことは試料内でバーコードと核酸を正しく関連付けるであろう（図１３及び１４を参照のこと）。図１４は複数バーコードのセットを使用することの追加の利点を説明している。いずれか１つのバーコードが複数の反応容器に入る例（またはバーコード「不一致」）を検出し、解決することができる。これはたった１つのバーコードを使用する場合可能ではない。
【００１４】
機能的なセット内での複数バーコードの組み合わせはさらに大きな多様性をコード空間に本質的に加える。たとえば、各ｃＤＮＡにコピーが各末端（５’及び３’）でバーコード１つを受け取り、各セット（５’及び３’）でのコード空間が１００である本発明の考えられる一実施形態では、システムのコード空間全体は１００×１００＝１０，０００の可能なバーコードの組み合わせである。さらに大きなバーコーディングの忠実性で多数の細胞にバーコードを付けるために、これは作り出されるバーコード付きビーズのさらに小さなライブラリを可能にすることができる。
【００１５】
便宜上、バーコードのセットは５’バーコード及び３’バーコードと呼ばれる。複数のバーコードのセットを用いて核酸を適当な反応容器に割り当てるので核酸試料の起源を特定することができる。バーコードのセットを５’末端及び３’末端のいずれかで、または５’末端で双方を、または３’末端で双方を、または核酸試料内で内部的に核酸試料に関連付けることができる（図１２を参照のこと）。たとえば、増幅（たとえば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、ライゲーション反応及び転位反応（Ｇｒｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２）を参照してください）のような、しかしこれらに限定されない、当該技術で既知の方法を用いてバーコードを核酸に付加することができる。少なくとも２つ以上のバーコードセットが核酸試料に関連付けられる限り、バーコードビーズ入りの負荷反応容器におけるポアソン統計を克服すること及びいずれか１つのバーコードが複数の反応容器に入るバーコード「不一致」を解決することを含む本明細書で言及される利点すべてを伴う適当な反応容器（及び従って試料）に核酸を割り当てることができ、その際、任意の１つのバーコードが複数の反応容器に入る。
【００１６】
複数のバーコード付きビーズを単一の液滴に含めることは、それを介して遺伝子または転写産物のバーコーディング反応が進む分子生物学から利益が得られる可能性もある。バーコード核酸分子はバーコーディング反応の反応物質であり、反応の効率はその反応物質の供給に直接関係するので、当然、各反応で複数のバーコードを含むことはバーコード付き産物の高い収量をもたらすであろう。
【００１７】
本明細書で提供されているのは、核酸試料の起源を特定する方法である。該方法は、単一細胞に由来する核酸分子を含む核酸試料とバーコードのセットとを含む反応混合物を形成する工程と、試料の核酸分子にバーコードのセットを組み込む工程と、単一細胞の核酸分子に組み込まれたバーコードのセットを特定し、それによって核酸試料の起源を特定する工程とを含む。任意で、バーコードのセットは各構築物が独特の５’バーコードを含む少なくとも２つの５’核酸構築物を含む。任意で、バーコードのセットは、各構築物が独特の３’バーコードを含む少なくとも２つの３’核酸構築物を含む。任意で、核酸分子の１つ以上は、２つ以上の独特のバーコードを含む。任意で、独特のバーコードは核酸分子の５’末端、３’末端、または５’末端と３’末端の双方に位置する。任意で、方法は複数の反応混合物を形成する工程を含む。任意で、２つ以上の独特のバーコードは、反応混合物の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％に存在する。任意で、複数の反応混合物を形成する工程は、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０または５．０を超えるラムダで複数の反応混合物にバーコードのセットを加えることを含む。
【００１８】
提供されるのはまた、各構築物が独特の３’バーコード配列を含む３’核酸構築物のセットを提供する工程と、単一細胞に由来する核酸分子を含む核酸試料を提供する工程と、３’核酸構築物のセットに核酸試料を接触させる工程と、３’核酸構築物に由来する３’バーコード配列を核酸分子に組み込む工程と、３’バーコード配列のセットを特定し、それによって単一細胞に由来する核酸試料の起源を特定する工程とを含む、核酸試料の起源を特定する方法である。
【００１９】
用語が本明細書で使用されるとき、配列をポリヌクレオチドに「組み込むこと」は、たとえば、ホスホジエステル結合によってポリヌクレオチドの３’または５’の末端にてポリヌクレオチドの残りに一連のヌクレオチドを共有結合することを指し、その際、ヌクレオチドは配列によって指示される順序で連結される。ポリヌクレオチドが配列またはその相補体を含有するのであれば、その配列はそのポリヌクレオチドに「組み込まれて」おり、または同等にそのポリヌクレオチドはその配列を「組み込む」。配列のポリヌクレオチドへの組込みは酵素的に（たとえば、ライゲーションまたは重合によって）または化学合成（たとえば、ホスホロアミダイト化学反応によって）を用いて生じることができる。
【００２０】
用語「プライマー」は、標的核酸に選択的にアニーリングし、またはハイブリッド形成することができるポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）またはその類似体を指す。プライマーは、たとえば、適当な酵素（複数可）、補因子、基質、たとえば、ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）等の存在下で好適な条件下にてＤＮＡ合成のための開始プライマーとして役立つ。プライマーは、対応するポリヌクレオチド鋳型、隣接配列またはプライマーの３’末端からの増幅産物に対して相補性の配列の合成を可能にする。通常、プライマーは約１０〜１００ヌクレオチドの間の長さであることができる。プライマーの結合部位または汎用プライミング配列はプライマーが結合して増幅を開始することができる核酸配列を指す。
【００２１】
本明細書で使用されるとき、用語「増幅する」及び「増幅」は、配列またはその相補体も含有するさらに多くのポリヌクレオチドを生成するように全体としてまたは部分的にポリヌクレオチドの配列を酵素的にコピーすることを指す。コピーされる配列は鋳型配列と呼ばれる。増幅の例には、ＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡが鋳型のＲＮＡ合成、逆転写酵素によるＲＮＡが鋳型の第１の鎖のｃＤＮＡの合成、及び熱安定性のＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡが鋳型のＰＣＲ増幅が挙げられる。増幅にはプライマーによる伸長反応すべてが含まれる。
【００２２】
本明細書で使用されるとき、用語「等温の」は、一定の温度または温度の範囲で行われる、酵素反応などの反応を指す。
【００２３】
用語「関連した」は、試料と、その試料を起源とするまたはそれに由来するＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子または他のポリヌクレオチドとの間の関係を指すのに本明細書で使用される。その用語は、１つのバーコード配列と別のバーコード配列との間、または１つのバーコード配列と他のバーコードのセットとの間の関係を指すのに使用することができる。たとえば、バーコードがバーコードの同じセットにあるのであれば、そのバーコードは別のバーコードに関連する。或いは、バーコード配列がバーコード配列のセットにおけるバーコードの１つであるならば、そのバーコードはバーコードのセットに関連することができる。ポリヌクレオチドは、それが内在性ポリヌクレオチドならば、すなわち、試料が選択される時点でそれが試料に存在するならば、または内在性ポリヌクレオチドに由来するならば、その試料に関連する。たとえば、細胞にとって内在性のｍＲＮＡはその細胞に関連する。これらのｍＲＮＡの逆転写から生じるｃＤＮＡ及びｃＤＮＡのＰＣＲ増幅から生じるＤＮＡアンプリコンはそのｍＲＮＡの配列を含有し、その細胞にも関連する。試料に関連するポリヌクレオチドは試料に位置する必要はなくまたは試料で合成される必要はなく、試料が破壊された後（たとえば、細胞が溶解された後）でさえ、試料に関連すると見なされる。分子バーコーディングの技法または他の技法を用いて混合物におけるどのポリヌクレオチドが特定の試料に関連するのかを判定することができる。
【００２４】
用語が本明細書で使用されるとき、「反応容量」（または同等に「容器」または「区画」）は、液体、たとえば、水溶液の容量が保持され、液体または周りの媒体の他のそのような容量から隔離された（たとえば、単離された）ままであることができる空間である。反応容量とその周囲の間の隔離は反応容量の周りの固体バリアからまたは位相分離から生じることができる。たとえば、疎水性のキャリア流体に浮遊された水性のマイクロ流体液滴は、水がキャリア流体と非混和性であるので、反応容量を構成することができる。従って、キャリア流体にて互いに分離されている２つの液滴は隔離されたままであり、一方の液滴に溶解された核酸または他の親水性の種は液滴から出ることはできず、または別の液滴に移行することはできない。反応容量はまた、たとえば、フラスコ、ビーカー、遠心管、及びマルチウェルプレートのウェルによっても定義することができる。
【００２５】
たとえば、単一細胞に由来する試料に関連したＲＮＡにバーコードのセットを「付加すること」には、バーコードと単一細胞または単一細胞に由来するＲＮＡとを含有する反応混合物を形成することが含まれるので、ＲＮＡ及びバーコードがバーコーディング反応に加わることができる。いったん付加されると、バーコードは、たとえば、ＲＮＡとのハイブリッド形成によって１つ以上のＲＮＡと直接反応することができ、または重合反応もしくはＲＮＡ分子が鋳型として役立つ一連の反応（たとえば、逆転写またはＲＴ−ＰＣＲ）に加わることができる。
【００２６】
用語「ポリヌクレオチド（複数可）」は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子及びそれらの類似体（たとえば、ヌクレオチド類似体を用いて、または核酸化学を用いて生成されるＤＮＡまたはＲＮＡ）のような核酸を指す。所望のように、ポリヌクレオチドは、たとえば、当該技術で承認されている核酸化学を用いて合成で、またはたとえば、ポリメラーゼを用いて酵素的に作られてもよく、所望であれば修飾することができる。典型的な修飾には、メチル化、ビオチン化、及び他の当該技術で知られる修飾が挙げられる。加えて、ポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であることができ、所望であれば、検出可能な部分に連結することができる。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、たとえば、ＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子を含むことができる。
【００２７】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」及び「Ｕ」はそれぞれ一般にそれぞれ塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、チミジン及びウラシルを含有するヌクレオチドを表す。しかしながら、用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」は、修飾されたヌクレオチドまたは代理置換部分も指すことができることが理解されるであろう。当業者は、そのような置換部分を持つヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性を実質的に変えることなく、グアニン、シトシン、アデニン及びウラシルが他の部分によって置き換えられてもよいことを十分に承知している。たとえば、限定しないで、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドはアデニン、シトシンまたはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対合してもよい。従って、ウラシル、グアニンまたはアデニンを含有するヌクレオチドは、たとえば、イノシンを含有するヌクレオチドによってヌクレオチド配列にて置き換えられてもよい。別の例では、オリゴヌクレオチドにおけるどこかでのアデニン及びシトシンはそれぞれグアニン及びウラシルで置き換えて標的ｍＲＮＡとのＧ−Ｕのゆらぎ塩基対合を形成することができる。そのような置換部分を含有する配列は本明細書に記載されている組成物及び方法に好適である。
【００２８】
本明細書で使用されるとき、且つ特に指示されない限り、用語「相補性の」は、第２のヌクレオチド配列に関連して第１のヌクレオチド配列を記載するのに使用される場合、当業者によって理解されるように、第１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの特定の条件下で第２のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、二本鎖構造を形成する能力を指す。そのような条件は、たとえば、ストリンジェントな条件であることができ、ストリンジェントな条件には４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡで５０℃または７０℃にて１２〜１６時間にその後の洗浄が含まれてもよい。生物の内部で遭遇してもよいような生理的に関連する条件のような他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリッド形成したヌクレオチドの最終的な適用に従って２つの配列の相補性を調べるのに最も適する一揃いの条件を決定することができるであろう。
【００２９】
相補性の配列は、一方または双方のヌクレオチド配列の長さまたは長さの一部にわたる第２のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの領域に対する第１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの領域の塩基対合を含む。そのような配列は本明細書では互いに関して「相補性である」と呼ぶことができる。しかしながら、本明細書で第１の配列が第２の配列に関して「実質的に相補性である」と言われる場合、２つの配列は相補性であることができ、またはそれらは、塩基が対合する領域内で１つ以上の、しかし一般に約５、４、３または２つを超えないミスマッチの塩基対を含んでもよい。ミスマッチの塩基対を伴う２つの配列については、２つのヌクレオチド配列が塩基の対合を介して互いに結合する限り、配列は「実質的に相補性である」と見なされるであろう。
【００３０】
「相補性の」配列は本明細書で使用されるとき、ハイブリッド形成するその能力に関する上記の実施形態が満たされる限り、非ワトソン・クリック塩基対及び／または非天然のヌクレオチドや修飾されたヌクレオチドから形成される塩基対を含んでもよく、またはそれらから全体的に形成されてもよい。そのような非ワトソン・クリック塩基対には、Ｇ：Ｕゆらぎ塩基対合またはフーグスティーン型塩基対合が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
２つ以上の核酸またはポリペプチドの配列の文脈で用語、パーセント「同一性」は、以下に記載されている配列比較アルゴリズム（たとえば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮまたは当業者に利用可能な他のアルゴリズム）の１つを用いて、または目視検査によって測定されるような、最大一致について比較し、並べたとき、特定の比率の同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸の残基を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。適用に応じて、パーセント「同一性」は比較される配列の領域、たとえば、機能的ドメインにわたって存在することができ、または代わりに比較される２つの配列の完全長にわたって存在することができる。
【００３２】
配列比較については通常、一方の配列は試験配列が比較される参照配列として役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムのプログラムパラメータを指定する。次いで配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて参照配列と比べた試験配列（複数可）のパーセント配列同一性を算出する。
【００３３】
比較のための配列の最適な整列化は、たとえば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列化アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４（１９８８）の類似性法についての検索によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．）によって、または目視検査（一般に、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，上記を参照のこと）によって行うことができる。
【００３４】
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに好適であるアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０  （１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウエアは全米バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトを介して公的に利用できる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータ、Ｗ、Ｔ及びＸは整列化の感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮのプログラム（ヌクレオチド配列用）は、１１の語長（Ｗ）、期待値（Ｅ）または１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び双方の鎖の比較を初期設定として使用する。
【００３５】
同一の配列は、一方または双方のヌクレオチド配列の全長にわたって第２のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに対する第１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの１００％同一性を含む。そのような配列は本明細書では互いに関して「完全に同一である」ということができる。しかしながら、一部の態様では、第１の配列が本明細書では第２の配列に関して「実質的に同一である」と言われる場合、２つの配列は完全に相補性であることができ、またはそれらは整列化の際、１つ以上の、しかし一般に約５、４、３または２つを超えないミスマッチのヌクレオチドを有してもよい。一部の態様では、第１の配列が本明細書では第２の配列に関して「実質的に同一である」と言われる場合、２つの配列は完全に相補性であることができ、またはそれらは、互いに少なくとも約５０、６０、７０、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であってもよい。本明細書に記載されている２つのヌクレオチド配列のパーセント同一性を決定するには、上述のＢＬＡＳＴＮの初期設定の設定を使用することができる。
【００３６】
第１の配列が本明細書では第２の配列の同一性に関して「違う」と言われる場合、２つの配列は整列化の際、少なくとも１つ以上のミスマッチのヌクレオチドを有する。一部の態様では、違う配列は整列化の際、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個以上のミスマッチのヌクレオチドを有することができる。一部の態様では、違う配列は互いに約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％未満同一であることができる。一部の態様では、第１の配列が本明細書では第２の配列に関して「違う」と言われる場合、２つの配列は実質的にまたは完全に同一の配列を有することができるが、代わりに配列内の修飾の異なるパターンに基づいて互いに異なることができる。そのような修飾、たとえば、メチル化は当該技術で一般に知られている。
【００３７】
一部の態様では、ポリヌクレオチドはポリヌクレオチドのライブラリに存在することができる。一部の態様では、ポリヌクレオチドのライブラリは複数のポリヌクレオチドを含むことができる。一部の態様では、複数のポリヌクレオチドにおける各ポリヌクレオチドは単一試料に由来することができる。一部の態様では、単一試料は単一細胞である。
【００３８】
ヌクレオチド配列を記載するのに本明細書では従来の表記法を使用する：一本鎖ヌクレオチド配列の左側末端は５’末端であり；二本鎖ヌクレオチド配列の左側方向は５’方向と呼ぶ。新生ＲＮＡ転写産物への５’から３’へのヌクレオチドの付加の方向は転写方向と呼ばれる。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は「コーディング鎖」と呼ばれる。
【００３９】
用語「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」はイントロンがなく、ポリペプチドに翻訳することができるＲＮＡを指す。
【００４０】
用語「ｃＤＮＡ」は一本鎖または二本鎖の形態でｍＲＮＡに対して相補性であるまたは同一であるＤＮＡを指す。
【００４１】
用語「アンプリコン」は核酸増幅反応、たとえば、ＲＴ−ＰＣＲの増幅産物を指す。
【００４２】
用語「ハイブリッド形成する」は相補性の核酸との配列に特異的な非共有結合の相互作用を指す。ハイブリッド形成は核酸配列の全部または一部に生じてもよい。当業者は核酸二本鎖またはハイブリッドの安定性はＴｍによって決定され得ることを認識するであろう。ハイブリッド形成の条件に関する追加の指針はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９，６．３．１−６．３．６及びＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９，Ｖｏｌ．３にて見いだされてもよい。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、「領域」はポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の連続する部分を指す。領域の例は本明細書に記載されており、それらには同定領域、試料同定領域、バーコード領域、結合領域、ｃＤＮＡ領域、等が挙げられる。一部の態様では、ポリヌクレオチドは１つ以上の領域を含むことができる。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、２つ未満、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個、またはそれ以上の領域を含むことができる。一部の態様では、領域は結合することができる。一部の態様では、領域は操作可能に結合することができる。一部の態様では、領域は物理的に結合することができる。
【００４４】
本明細書で使用されるとき、「バーコード」または「バーコード配列」は、たとえば、少なくとも１つのヌクレオチド配列を後で特定するためにその少なくとも１つのヌクレオチド配列に結合することができる独特の配列標識を指す。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、「バーコードセット」または「バーコードのセット」は試料に由来するヌクレオチド配列に結合することができる配列の独特のセットを指し、その際、たとえば、ヌクレオチド配列を後で特定するためにそのヌクレオチド配列はセットにおける１つのバーコード配列に結合する。
【００４６】
用語「バーコード構築物」、「バーコード付き構築物」及び「バーコード構築物分子」は独特のバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを指すのに本明細書では相互交換可能に使用される。
【００４７】
用語「３’核酸構築物」または「３’核酸バーコード構築物」は、３’から「５’核酸バーコード構築物」であるバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを指す。３’核酸構築物は核酸分子、たとえば、ｍＲＮＡの３’末端に組み込むことができる。用語「３’バーコード」または「３’バーコード配列」は３’核酸構築物または３’核酸バーコード構築物に位置するバーコードを指す。通常、３’核酸構築物は核酸分子の３’末端で配列に相補性の配列を含有し、たとえば、３’核酸構築物はｍＲＮＡのポリ−Ａ配列に相補性のポリ−Ｔ配列を含む。通常、３’構築物はｍＲＮＡ配列の３’末端に結合し、逆転写されてその５’末端で３’核酸構築物を含むｃＤＮＡ分子を生成する。たとえば、図２及び３を参照のこと。それはまた、５’末端で、３’末端で、または内部的に（それは核酸の３’末端で及び別の核酸の５’末端で組み込まれて１つのさらに長い核酸を形成する）核酸に組み込むこともできる。たとえば、図１２を参照のこと。３’核酸バーコード構築物は、バーコード配列に加えて、汎用プライミング配列、または汎用プライミング領域、及び結合部位を含むことができる。
【００４８】
用語「５’核酸構築物」または「５’核酸バーコード構築物」は５’から「３’核酸バーコード構築物」であるバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを指す。５’核酸構築物は核酸分子、たとえば、ｍＲＮＡの５’末端またはｃＤＮＡの３’末端に組み込むことができる。用語「５’バーコード」または「５’バーコード配列」は５’核酸構築物または５’核酸バーコード構築物に位置するバーコードを指す。通常、５’核酸構築物は核酸分子の３’末端で配列に相補性の配列を含有し、たとえば、５’核酸構築物はｃＤＮＡ配列の３’末端に組み込まれるのポリ−Ｃ配列に相補性のポリ−Ｇ配列を含む。５’核酸構築物は、３’核酸構築物を含むｃＤＮＡ分子の３’末端に組み込むことができる。たとえば、図２及び３を参照のこと。それはまた、５’末端で、３’末端で、または内部的に（それは核酸の３’末端で及び別の核酸の５’末端で組み込まれて１つのさらに長い核酸を形成する）核酸に組み込むこともできる。たとえば、図１２を参照のこと。５’核酸バーコード構築物は、バーコード配列に加えて、汎用プライミング配列、または汎用プライミング領域、及び結合部位を含むことができる。
【００４９】
本明細書で使用されるとき、「バーコード構築物ビーズ」は１つ以上のバーコード構築物に結合されるビーズを指す。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、バーコーディングミックスは１つ以上のバーコード構築物を含む組成物を指す。ミックスは、細胞を溶解すること、逆転写、制限酵素消化及び／またはバーコーディング反応を行うことのための追加の試薬を含むことができる。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、「バーコーディング」または「バーコーディング反応」はバーコード配列またはバーコード配列の相補体を核酸に連結する反応を指す。バーコード構築物は必ずしも核酸と共有結合する必要はないが、バーコード配列の情報自体が核酸に結び付けられるまたは組み込まれる。「バーコーディング核酸」、「バーコーディング細胞」、「細胞に由来するバーコーディング核酸」、「反応容器に由来するバーコーディング核酸」、及び「バーコーディング反応容器」は相互交換可能に使用される。
【００５２】
本明細書で使用されるとき、「同定領域」は、たとえば、少なくとも１つのヌクレオチド配列の後での同定のために、その少なくとも１つのヌクレオチド配列に結合することができるヌクレオチド配列の標識（たとえば、独特のバーコード配列）を指す。一部の態様では、バーコードのセットは試料の同定領域として使用される。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、「アダプター領域」または「アダプター分子」は第１のヌクレオチド配列を第２のヌクレオチド配列に結合するリンカーを指す。一部の態様では、アダプター領域はリンカーとして作用するヌクレオチド配列の連続する部分を含むことができる。
【００５４】
用語「試料」は、対象（たとえば、哺乳類対象、動物対象、ヒト対象、または非ヒト動物対象）から採取されるＲＮＡ、ＤＮＡ、単一細胞または複数細胞、または細胞の断片、または体液のアリコートを含むことができる。試料は、遠心分離、静脈穿刺、採血、切除、ぬぐい取り、射精、マッサージ、生検、針吸引、洗浄試料、剥離、外科切除、レーザー捕捉顕微解剖、勾配分離、または当該技術で既知の介入または他の手段を含む、今や既知のまたは最近発見された任意の手段を用いて当業者によって選択され得る。試料はまた、対象とする試料に関連することが知られている１つ以上のマーカーを用いて当業者によって選択され得る。試料はまた、細胞選別及びＦＡＣＳのような当該技術で既知の方法を用いて選択され得る。
【００５５】
本発明の方法は所望の試料で実践することができる。一部の実施形態では、各試料は細胞を含み、たとえば、単一細胞であることができる。細胞はマイクロ流体液滴のような反応容量の中に入れることができ、所望であれば、溶解して反応容量の中にＲＮＡ分子を遊離することができる。この目的で、細胞は都合のよいときに溶解緩衝液に接触させることができる。
【００５６】
本明細書で提供されているのは、核酸試料の起源を特定する方法である。任意で、方法は、単一細胞に由来する核酸分子を含む核酸試料とバーコードのセットとを含む反応混合物を形成する工程と、試料の核酸分子にバーコードのセットを組み込む工程と、単一細胞の核酸分子に組み込まれたバーコードのセットを特定し、それによって核酸試料の起源を特定する工程とを含む。任意で、反応混合物を形成する工程は、バーコードのセットに単一細胞を接触させることと、細胞を溶解して単一細胞に由来する核酸試料を提供することとを含む。任意で、反応混合物を形成する工程は、単一細胞とバーコードのセットとを含む反応混合物を形成するための条件下で、懸濁緩衝液中の細胞を提供することと、細胞を含む懸濁緩衝液を、バーコードのセットを含むバーコーディング緩衝液に接触させることとを含む。任意で、反応混合物は液滴である。
【００５７】
本明細書で提供されるとき、バーコードのセットは少なくとも２つの独特のバーコードの１つ以上のコピーを含む。従って、たとえば、バーコードのセットはそれぞれ独特の５’バーコードを含む５’核酸構築物の１つ以上と、それぞれ独特の３’バーコードを含む３’核酸構築物の１つ以上とを含むことができる。任意で、バーコードのセットは各構築物が独特の３’バーコードを含む少なくとも２つの３’核酸構築物を含む。任意で、バーコードのセットは１、２、３、４、５、６、７、または８個の５’核酸構築物と１、２、３、４、５、６、７、または８個の３’核酸構築物とを含む。１、２、３、４、５、６、７、または８種の核酸構築物のそれぞれは独特のバーコード配列を有し、複数のコピーで提供され得る。任意で、バーコードのセットは、２つの異なる５’バーコードを含む２つの異なる５’核酸構築物と、２つの異なる３’バーコードを含む２つの異なる３’核酸構築物とを含む。任意で、バーコードのセットは３つの異なる５’バーコード含む３つの異なる５’核酸構築物と３つの異なる３’バーコード含む３つの異なる３’核酸構築物とを含む。任意で、バーコードのセットは、２つの異なる３’バーコードを含む２つの異なる３’核酸構築物と、３つの異なる５’バーコードを含む３つの異なる５’核酸構築物とを含む。各種類の核酸構築物の複数のコピーには同じバーコードを有する同じ種類の複数のコピーのそれぞれが提供され得る。従って、たとえば、バーコードのセットは、異なる種類のそれぞれが独特の５’または３’のバーコード配列を有する、１、２、３、４、５、６、７、または８つの異なる種類の５’核酸または３’核酸の構築物の複数のコピーを含むことができる。言い方を変えれば、バーコードのセットは、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、または第８の種類のうちの１つ以上の５’核酸構築物の１つ以上のコピーと、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、または第８の種類のうちの１つ以上の３’核酸構築物の１つ以上のコピーとを含むことができる。任意で、バーコードのセットは、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、または第８の種類のうちの１つ以上の３’核酸構築物の１つ以上のコピーを含む。構築物はＲＮＡまたはＤＮＡの分子、またはＲＮＡ‐ＤＮＡのハイブリッドであることができる。たとえば、構築物は共通のオリゴヌクレオチド鎖にてＤＮＡヌクレオチドに共有結合したＲＮＡヌクレオチドを含むことができる。構築物は一本鎖または二本鎖であることもできる。二本鎖であれば、構築物は１つ以上の平滑末端または一本鎖オーバーハングを伴う末端を有することができる。
【００５８】
本明細書で提供されているのはまた、３’核酸構築物のセットを用いて核酸試料の起源を特定する方法である。方法は、各構築物が独特の３’バーコード配列、結合配列及びバーコード関連配列を含む３’核酸構築物のセットを提供する工程と、単一細胞に由来する核酸分子を含む核酸試料を提供する工程と、核酸試料を３’核酸構築物のセットに接触させる工程と、３’バーコード配列及び結合配列をバーコード関連配列から分離する工程と、３’核酸構築物に由来する３’バーコード配列を核酸分子に組み込む工程と、バーコード関連配列を用いて３’バーコード配列のセットを特定し、それによって単一細胞に由来する核酸試料の起源を特定する工程とを含む。任意で、３’核酸構築物のセットは２、３、４、５、６、７、または８個の３’核酸構築物を含む。任意で、３’核酸構築物の複数のコピーは固体表面、たとえば、ビーズ、マイクロビーズ、微粒子、ミクロスフェア、ナノビーズまたはヒドロゲルに結合される。任意で、各ビーズは同じ核酸構築物を含み、複数のビーズがバーコードのセットにて提供される。従って、任意で、各固体表面、たとえば、ビーズは同じ種類の３’核酸構築物の複数のコピーを含有する。従って、たとえば、バーコードのセットは、独特の３’バーコードを含む第１の３’核酸構築物の複数のコピーを含む第１の表面と、第１の構築物上のバーコードとは異なる独特の３’バーコードを含む第２の３’核酸構築物の複数のコピーを含む第２の表面とを含むことができる。
【００５９】
任意で、反応混合物を形成する工程は、懸濁緩衝液中の細胞を提供することと、単一細胞を含む反応混合物を形成するための条件下で５’核酸構築物及び／または３’核酸構築物を含むバーコード緩衝液に懸濁緩衝液を接触させることとを含む。反応混合物は各構築物が独特のバーコード有する少なくとも２つの構築物と単一細胞とを含む。任意で、反応混合物は少なくとも１つの５’核酸構築物と少なくとも１つの３’核酸構築物とを含む。任意で、反応混合物は少なくとも２つの３’核酸構築物を含む。任意で、反応混合物を形成する工程は、懸濁緩衝液中の細胞を提供することと、単一細胞及び少なくとも１つの５’核酸構築物及び少なくとも１つの３’核酸構築物を含む反応混合物を形成するための条件下で５’核酸構築物を含む第１のバーコーディング緩衝液及び３’核酸構築物を含む第２のバーコーディング緩衝液に懸濁緩衝液を接触させることとを含む。任意で、反応混合物は、単一細胞に由来する核酸試料と、５’核酸構築物の複数コピーを含む少なくとも１つのビーズと、３’核酸構築物の複数コピーを含む少なくとも１つのビーズとを含む。
【００６０】
溶解に先立って、浸透圧保護剤を含む細胞懸濁緩衝液に細胞を有利に浮遊させることができる。浸透圧保護剤は、細胞を浸透圧ストレスから保護することができ、バーコーディングに先立って、必ず、細胞生理が安定で、落ち着いたままであるようにすることができる。一部の実施形態では、細胞はバーコード構築物と共に細胞懸濁緩衝液に浮遊させる。一部の実施形態では、細胞は、逆転写、ＰＣＲ及び／または溶解のための試薬と接触させる前に細胞懸濁緩衝液に浮遊させる。細胞懸濁緩衝液はどんな反応容量にも含めることができ、水性反応容量を形成し、組み合わせるための本明細書に記載されている方法と適合性である。
【００６１】
細胞は、逆転写、ＰＣＲ及び／または溶解のための試薬と接触させる前に細胞懸濁緩衝液に浮遊させる。細胞懸濁緩衝液はどんな反応容量にも含めることができ、水性反応容量を形成し、組み合わせるための本明細書に記載されている方法と適合性である。
【００６２】
任意で、各５’核酸構築物は固体表面に結合された複数コピーで提供される。任意で、各３’核酸構築物は固体表面に結合された複数コピーで提供される。本方法及び組成物で使用することができる固体表面を有する固形支持体の例には、ビーズ、クロマトグラフィの樹脂、マルチウェルプレート、微量遠心分離管、または固体表面を有する他の物体が挙げられる。任意で、固体表面はビーズ、マイクロビーズ、微粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、ナノビーズまたはヒドロゲルである。従って、所望のメカニズムまたは捕捉化学、たとえば、ビオチン・アビジン、ビオチン・ストレプトアビジン、または金・ジオールの相互作用を用いてバーコード構築物を固形支持体に結合することができる。任意で、バーコード構築物が結合される固体表面は水溶液に接触させられ、バーコード構築物はこの溶液中に遊離される。水溶液は、たとえば、バーコード構築物が付加される、単一細胞に由来する試料に関連するＲＮＡ分子と同じ反応容量であることができる。或いは、バーコード構築物用の固体表面に接触する水溶液は、標的のＲＮＡまたは細胞とは異なる反応容量で保持することができ、バーコード構築物は、２つの反応容量を合わせて、バーコードのセットと単一細胞または単一細胞に由来するＲＮＡ試料とを含む反応混合物を生成する際に、これらのＲＮＡまたは細胞に加えることができる。
【００６３】
提供されているのは、ポリヌクレオチドを固形支持体に結合する方法であり、該ポリヌクレオチドはバーコード配列を含有する。ポリヌクレオチドはバーコード構築物であることができる。任意で、方法には、逆エマルションの親水性区画（すなわち、水性液滴）を生成することが含まれる。区画は、所望のように、たとえば、疎水性キャリア流体に水溶液を混合すること、及び任意で混合物を撹拌することによって生成することができる。水溶液は、固形支持体、オリゴヌクレオチド、及びその中に懸濁される試薬を有することができるので、各区画は、区画が形成されるとポリヌクレオチドを固形支持体に結合するために必要な成分すべてを含有する。これらの実施形態では、区画に固形支持体を加えることに先立って、捕捉部分を介してオリゴヌクレオチドを固形支持体の表面に結合する。このオリゴヌクレオチドは本明細書では「結合されたオリゴヌクレオチド」と呼ばれ、バーコードオリゴヌクレオチドの３’配列に対して相補性の３’配列を含有する。従って、ポリヌクレオチドは、結合されたオリゴヌクレオチドとバーコードオリゴヌクレオチドが関与するポリメラーゼ伸長反応を介して固形支持体上で形成され、この反応は区画の中で行われる。
【００６４】
任意で、親水性区画が形成される場合、バーコードオリゴヌクレオチドは低い濃度または限界濃度（たとえば、区画当たり１モル）で存在する。無作為化配列を有するバーコードオリゴヌクレオチドのライブラリを用いて複数のバーコード構築物ビーズを調製する場合、この濃度は好都合である。バーコードオリゴヌクレオチドがどれも皆、異なるバーコード配列を有すると想定され、各区画の固形支持体がたった１つのバーコードを有することが所望であるならば、そのときは、１つのバーコードオリゴヌクレオチド（多くてもまたは平均で）が区画ごとに存在することができる。いったんこの条件が満たされると、複数の固形支持体（たとえば、複数のビーズ）が区画に存在することができ、または結合されたオリゴヌクレオチドの複数コピーが各固形支持体に結合することができるが、区画におけるポリメラーゼ伸長反応から生じるオリゴヌクレオチドすべてが同じバーコード配列を含有するであろう。
【００６５】
本方法で使用するための固形支持体には、ビーズ、たとえば、約０．１〜１０マイクロメートルの範囲での直径を有する金属及び／またはポリマー材料で作られる球形ビーズが含まれる。他の特徴を有するビーズを代わりにまたは追加で使用することができる。固形支持体は捕捉部分で官能化されてオリゴヌクレオチドを表面に結合することができる。補足部分の例には、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、カルボキシル基、エポキシ基、ヒドロキシル基、チオール基及び金が挙げられる。一部の補足部分はそれらが特異的に且つ非共有結合で結合する結合相手を有する。たとえば、ストレプトアビジンは結合相手としてビオチンを利用する。そのような捕捉部分は固形支持体に直接（たとえば、共有結合で）結合することができ、結合相手は結合されるオリゴヌクレオチドに結合することができ、逆もまた同様なので、結合されるオリゴヌクレオチドは非共有結合の相互作用を介して固形支持体に結合する。他の補足部分は結合されるオリゴヌクレオチドと固形支持体との間で直接的な共有結合を提供する。
【００６６】
結合されるオリゴヌクレオチドは好ましくは、その５’末端で固形支持体に結合する一本鎖ＤＮＡ分子である。従って、結合されるオリゴヌクレオチドの３’末端は溶液中で遊離であり、バーコードオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成するとき、ＤＮＡポリメラーゼのような酵素によって伸長することができる。伸長反応はバーコードオリゴヌクレオチドを用いて鋳型化されるので、バーコード配列はビーズに結合したＤＮＡ鎖に組み込まれる。所望であれば、結合されるオリゴヌクレオチド及び／またはバーコードオリゴヌクレオチドは分子内二次構造を出来るだけ抑えるように設計された配列を有することができる。
【００６７】
ポリヌクレオチドを固形支持体に結合するための本明細書に記載されている方法のいずれかを用いて、試料、細胞またはＲＮＡにバーコードを付けるのに使用するために１つ以上の固形支持体を調製することができる。各固形支持体に結合されるポリヌクレオチド（複数可）はバーコード配列を含み、バーコード構築物として役立つことができる。本方法を使用してバーコードライブラリを調製することもでき、それは、それぞれバーコード配列に関連する複数の固形支持体を含む。任意の２つの固形支持体（たとえば、ビーズ）は、全体的にまたは部分的に互いに異なるバーコード配列を有することができる。任意で、バーコードライブラリにおける固形支持体はどれも皆、異なるバーコード配列に関連付けられる。
【００６８】
本方法に従って調製されるバーコード構築物ビーズはバーコード構築物に結合したビーズを含む。ビーズはバーコード構築物の複数のコピー、たとえば、少なくとも１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、１０，０００、３０，０００、１００，０００、３００，０００または１，０００，０００のコピーに結合することができる。任意で、１つのビーズに結合したバーコード構築物の各コピーは同じバーコード配列を含む。本方法は複数のバーコード構築物ビーズを含むビーズ状のバーコードライブラリの調製も可能にする。ライブラリにおけるビーズはどれも皆、異なるバーコード配列に関連付けることができ、各ビーズにおけるバーコード構築物のコピーは同じバーコード配列を含むことができる。
【００６９】
任意で、本方法を用いて、バーコード構築物ビーズ上で１つ以上の試料（たとえば、細胞）から調製されたまたは得られたｃＤＮＡを物理的に捕捉することによってポリヌクレオチドのライブラリを調製することができる。各ビーズは３’末端にてｃＤＮＡ結合部位を伴ったバーコード構築物を含む。ビーズは酵素に接触させて結合部位を一本鎖にすることができる（たとえば、溶液中で遊離の鋳型分子の末端で３’オーバーハングを脱離すること）。次いで、ｃＤＮＡが結合部位を介して鋳型分子のコピーに結合するように試料に由来する１つ以上のｃＤＮＡにビーズを接触させる。好まれる実施形態では、結合部位は１つ以上のＧヌクレオチド、たとえば、ポリ−Ｇトラクトを含み、逆転写酵素によってｃＤＮＡの末端に付加される鋳型化されないポリ−Ｃトラクトに対して相補性である。
【００７０】
ポリヌクレオチドのライブラリにおけるビーズを所望に応じて用いて、たとえば、複数の試料に由来するｃＤＮＡの配列を決定し、または様々な試料からｃＤＮＡを分離することができる。後者の場合、様々な試料に対応するビーズを遠心分離または磁気作用を用いて沈殿させ、次いで常法を用いて再浮遊させ、分離することができる。所望であれば、ビーズ上の鋳型分子へのｃＤＮＡの結合に続いて、鋳型分子を酵素的に伸長させ、それによってビーズに結合したＤＮＡ二本鎖にｃＤＮＡ配列を組み込み、これらの配列をバーコード配列に関連付けることができる。試料に由来するｃＤＮＡ分子のコピーの数がビーズ上のバーコード構築物のコピーの数に匹敵するのであれば、その時は、これらのｃＤＮＡ分子を少数のビーズ上で（たとえば、試料当たり多くても約１、３、１０、３０、１００、３００、または１０００個のビーズ）捕捉することができる。常法を用いて、または上記で議論されたように、試料に由来するＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを生成することができる。
【００７１】
核酸構築物が固体表面に結合されてバーコードを含む構築物を核酸試料の核酸に組み込ませるようにする場合、種々の方法を用いて５’核酸構築物及び３’核酸構築物を遊離することができる。たとえば、５’核酸構築物及び３’核酸構築物はそれぞれ光切断可能なリンカーまたは制限酵素部位を含むことができる。任意で、各５’核酸構築物はさらに光切断可能なリンカーを含み、各３’核酸構築物はさらに制限酵素部位を含む。任意で、各５’核酸構築物はさらに制限酵素部位を含み、各３’核酸構築物はさらに光切断可能なリンカーを含む。任意で、方法はさらに、反応混合物を制限酵素に接触させ、且つ反応混合物をＵＶ光に曝露して固体表面から５’核酸構築物及び３’核酸構築物を遊離させることを含む。任意で、５’核酸構築物及び３’核酸構築物はさらに制限酵素部位を含み、方法はさらに、反応混合物を制限酵素に接触させて固体表面から５’核酸構築物及び３’核酸構築物を遊離させることを含む。任意で、５’核酸構築物及び３’核酸構築物はさらに光切断可能なリンカーを含み、方法はさらに、反応混合物をＵＶ光に曝露して固体表面から５’核酸構築物及び３’核酸構築物を遊離させることを含む。
【００７２】
上記で言及されたように、任意で、３’核酸構築物は独特の３’バーコードと結合配列とバーコード関連配列とを含む。任意で、３’核酸構築物はヘアピンを形成することができる。任意で、３’バーコード配列及び結合配列は制限酵素配列または光切断可能なリンカーによってバーコード関連セグメントから分離される。任意で、制限酵素は固体表面から３’バーコード配列を遊離させ、バーコード関連セグメントから結合配列を分離する。任意で、ＵＶ光は固体表面から３’バーコード配列を遊離させ、バーコード関連セグメントから結合配列を分離する。任意で、３’核酸構築物上の結合配列はポリ−Ｔ配列を含む。任意で、３’核酸構築物上の結合配列は試料の核酸分子上のポリ−Ａ配列に結合する。任意で、３’核酸構築物上のバーコード配列は逆転写によって組み込まれる。任意で、逆転写は３’バーコード配列を含む核酸分子を作り出す。任意で、バーコード関連セグメントはプライミング配列を含む。任意で、プライミング配列は回文配列である。任意で、一方のバーコード関連セグメントのプライミング配列は、核酸試料における他の任意のバーコード関連セグメントのプライミング配列と結合することができる。任意で、互いに接触しているバーコード関連セグメントはＤＮＡポリメラーゼによって伸長されて双方のバーコード関連セグメントを単一の核酸に組み込む。
【００７３】
制限酵素及び制限酵素部位は既知であり、酵素は市販されている。制限酵素消化は、核酸分子における特定の位置のみで機能する酵素による核酸分子の触媒的切断を指す。そのような酵素の使用は当業者によって理解されている。従って、５’核酸構築物及び３’核酸構築物は、適当な酵素（たとえば、制限エンドヌクレアーゼ）への曝露の際、構築物の切断を促すエンドヌクレアーゼ制限部位を含有することができる。任意で、制限酵素は、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、及びＮｔ．ＢｓｍＡＩから成る群から選択される。任意で、固体表面に結合された５’核酸構築物及び３’核酸構築物は二本鎖であり、構築物の一方の鎖のみが固体表面から遊離される。従って、任意で、５’核酸構築物及び／または３’核酸構築物はニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位を含むことができ、１つ以上のニッキングエンドヌクレアーゼ酵素を用いて鎖を遊離することができる。ニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位は、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、及びＮｔ．ＢｓｍＡＩから成る群から選択される酵素に特異的な部位であることができる。任意で、鎖を置き換えるＤＮＡポリメラーゼは制限酵素と共に含められ得る。鎖を置き換えるポリメラーゼはニッキングエンドヌクレアーゼ酵素の前に、と同時にまたはその後で添加することができる。鎖を置き換えるＤＮＡポリメラーゼは、クレノウエキソ−、Ｂｓｔ大断片及びＢｓｔ大断片の操作された変異体から成る群から選択することができる。
【００７４】
光切断可能なリンカー及びその使用方法も既知である。本明細書で使用されるとき、用語「光切断可能なリンカー」は２つの分子、たとえば、２つの核酸または核酸と固体表面を結合するまたは操作可能に連結する任意の化学基を指す。任意で、リンカーは２−ニトロベンジル部分を含む。たとえば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第５，６４３，７２２号を参照のこと。光切断可能なリンカーには、アルファ−置換した２−ニトロベンジル部分［たとえば、１−（２−ニトロフェニル）エチル部分］、３，５−ジメトキシベンジル部分、チオヒドロキサム酸、７−ニトロインドリン部分、９−フェニルキサンチル部分、ベンゾイン部分、ヒドロキシフェナシル部分、及びＮＨＳ−ＡＳＡ部分が挙げられるが、これらに限定されない。リンカーは、適当な波長の光、たとえば、紫外線への曝露によって切断され、基質から核酸分子を回収することができる（Ｊ．Ｏｌｅｊｎｉｋ及びＫ．Ｒｏｔｈｓｃｈｉｌｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，２９１：１３５−１５４，１９９８を参照のこと）。
【００７５】
任意で、提供される構築物は独特の分子識別子（ＵＭＩ）配列を含むことができる。任意で、ＵＭＩ配列は無作為化したヌクレオチドを含有し、バーコード配列とは無関係にバーコード構築物に組み込まれる。従って、同一バーコード配列を含有するバーコード構築物のセットは異なるＵＭＩ配列を含有することができる。同一バーコード配列を含有するが、異なるＵＭＩ配列を含有するバーコード構築物のセットが１つの試料に関連するＲＮＡに加えられる場合、ＲＮＡ配列はどれも皆バーコーディングの間に、異なるＵＭＩ配列に連結することができる。各ビーズ上の構築物が同一バーコード配列と異なるＵＭＩ配列のライブラリとを含有する場合、ＵＭＩ配列を伴ったバーコード構築物ビーズを生成することができる。
【００７６】
バーコード構築物は、バーコード配列に加えて、汎用プライミング配列または汎用プライミング領域、及び結合部位を含むことができる。従って、任意で、３’核酸構築物及び５’核酸構築物は通常結合配列を含む。任意で、プライマー結合部位または汎用プライミング配列を含む５’核酸構築物及び３’核酸構築物。任意で、３’核酸構築物はポリ−Ｔ配列を含む結合配列を有する。ポリ−Ｔ配列は試料の核酸分子のポリ−Ａ配列に結合する。３’核酸構築物の核酸分子への結合の際、そのとき、３’核酸構築物におけるバーコードは逆転写によって組み込むことができる。逆転写は３’バーコード配列を含む核酸分子を作り出す。従って、３’核酸構築物は逆転写のためのプライマーとして役立つことができる。ここで、構築物の結合部位はＲＮＡ結合部位（たとえば、ｍＲＮＡ結合部位）であり、１つ以上のＲＮＡにおける配列領域に相補性の配列領域を含有する。任意で、結合部位は、バーコード構築物が加えられる試料におけるＲＮＡすべてに共通する配列領域に対して相補性である。たとえば、結合部位はポリ−Ｔトラクトであることができ、それは真核細胞ｍＲＮＡのポリ−Ａ尾部に対して相補性である（図３）。代わりにまたは加えて、結合部位は無作為配列トラクトを含むことができる。試料に関連するＲＮＡに３’構築物を加える際、逆転写が生じ、ｃＤＮＡの第１の鎖が合成され得るので、３’バーコード配列はｃＤＮＡの第１の鎖に組み込まれる。逆転写は、適当な条件、たとえば、適当な緩衝液や逆転写酵素の存在、及びバーコード構築物のＲＮＡへのアニーリングに適する温度及び酵素の活性を必要とすることが認識されるであろう。プライマーの３’末端が鋳型に相補性であり、鋳型に直接アニーリングすることができる場合、ＤＮＡプライマーとＲＮＡ鋳型が関与する逆転写が最も効率的であることも認識されるであろう。従って、３’核酸構築物は結合部位がＲＮＡの３’末端に存在するように設計することができる。
【００７７】
上記で議論したように、任意で、バーコードと結合配列とバーコード関連配列とを含む３’核酸構築物のセットが使用される。任意で、プライマー結合部位または汎用プライミング配列を含む３’核酸構築物。各構築物はヘアピン構造を形成する一本鎖ＤＮＡオリゴであることができる。任意で、構築物は線状である。ヘアピン用の構築物がヘアピンの二本鎖セグメントであるならば、双方の鎖の制限を指示する制限部位を組み込むことができる。これは、バーコードと同様に「バーコード関連配列」（ＢＡＳ）も含有してもよい別個のループ状のセグメントからバーコード及び結合領域を切断し、分離する。たとえば、図８を参照のこと。線状のオリゴは、ビーズから切断される２つ以上のセグメントも生じる複数の制限部位と共に使用することができる。バーコード領域には、バーコードと、ポリ−Ｔセグメントと、任意でＵＭＩとが含まれる。このセグメントは、液滴内の細胞によって遊離されるｍＲＮＡ転写産物のポリ−Ａ尾部にアニーリングし、そのｍＲＮＡの逆転写に刺激を与えるので、作り出されるｃＤＮＡにバーコードを組み込む。たとえば、図９を参照のこと。これとは別に、ループ状のセグメントはそれが切断されるバーコードと同一であるまたはそれに相当するそれ自体のバーコードを含む。複数のビーズが細胞と共に同時封入される場合、２つの転写産物バーコーディングセグメント（ＢＣ１ａ及びＢＣ２ａ、図１０）は双方ともＲＴバーコーディング反応のためのプライマーとして役立つであろうし、その細胞に由来するトランスクリプトームは双方のバーコードを組み込むであろう。これとは別に、そのそれぞれのバーコード（ＢＣ１ｂ及びＢＣ２ｂ、図１０）を運ぶ２つの対応するループ状セグメントも存在するであろう。ＢＡＳ上の結合領域はＢＣ１ｂ及びＢＣ２ｂループ状セグメントが交差アニーリングするのを可能にするであろうし、ＤＮＡポリメラーゼは反応ミックスに含まれて各セグメントを伸長し、他のバーコードの相補体を組み込むことができる（図１１）。このようにＢＡＳ’は、その細胞に由来するトランスクリプトームを一体化するためのセットとしてバーコードを関連付けるために、その後下流で配列決定することができる単一アンプリコンにて物理的に連結される。ＢＡＳ上の結合配列は回文配列であることができ、各ＢＡＳは実施例でさらに記載されるように別のＢＡＳ上の配列に相補性である配列を含むことができる。
【００７８】
５’核酸構築物及び３’核酸構築物を使用する場合、いったん３’核酸構築物がｃＤＮＡの第１の鎖に組み込まれると、任意で、逆転写酵素は試料における核酸分子の末端に２〜５個のシステイン残基を付加する。２〜５個のシステイン残基は５’核酸構築物上の結合配列に相補性である結合配列を提供する。任意で、５’核酸構築物上の結合配列はポリ−Ｇ配列を含む。５’核酸構築物上の結合配列は次いで試料の核酸分子におけるポリ−Ｃ配列に結合することができる。５’核酸構築物は逆転写酵素を用いて核酸試料に組み込まれる。たとえば、図３を参照のこと。この過程は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ２０１２／１４８４９７に少なくとも記載されている。手短には、Ｈ−ＭＭＬＶ逆転写酵素は３’ｄＣテイリング活性を有し、非鋳型化ｄＣを第１の鎖ｃＤＮＡに付加する。少なくとも１Ｇで終了するバーコード付き構築物、たとえば、５’核酸構築物も存在するのであれば、構築物は第１の鎖ｃＤＮＡの３’ｄＣと塩基対合することができ、逆転写酵素は鋳型切り替えを受け、転写を継続する。従って、逆転写酵素はホスホジエステル結合を介して第１の鎖ｃＤＮＡの３’末端にバーコード配列を共有結合で付加する。得られる構築物は、たとえば、図７で示すように、５’から３’で５’バーコード―ｃＤＮＡ配列―３’バーコードの配列を一般に含む核酸分子である。任意で、核酸試料はさらに増幅されて複数の核酸配列の複数のコピーを作り出し、各配列は５’バーコード及び３’バーコードを含む。任意で、５’核酸構築物及び３’核酸構築物は５’バーコード及び３’バーコードを含む核酸配列を増幅するのに使用される汎用プライミング部位を含む。
【００７９】
任意で、逆転写酵素はＭ−ＭＬＶ酵素である。任意で逆転写酵素はＭＭＬＶ  Ｈ−逆転写酵素である。
【００８０】
上記で言及されたように、溶解試薬が液滴に存在し、細胞からＲＮＡを遊離すれば、且つ逆転写酵素とプライマーと他の適当な試薬が存在すれば、逆転写は起こり得る。溶解及び逆転写を促す酵素及び試薬は、たとえば、酵素と試薬を含有する液滴をバーコードと細胞を含有する液滴と合わせることによって一度にいっせいに加えることができ、または段階的に加えることができる。
【００８１】
任意で、５’核酸構築物は、プロモータを含む二本鎖核酸構築物であり、５’核酸構築物は５’核酸構築物の複数コピーを作り出す鋳型として役立つ。任意で、プロモータはＲＮＡポリメラーゼのプロモータである。たとえば、図７を参照のこと。従って、任意で、５’核酸は以下の配列：５’−Ｔ７プロモータ―汎用プライミング配列―バーコード配列―結合配列−３’を有する二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）鋳型分子である。Ｔ７プロモータ配列はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによる鋳型からの５’核酸構築物の合成を可能にする。汎用プライミング配列は下流で使用されるＰＣＲプライマーに対する相補性のために使用される。結合配列は１つ以上のグアニン塩基（Ｇ）から成り、第１の鎖ｃＤＮＡの３’末端へのバーコード付き構築物の相補性の塩基対合を可能にする。それぞれＴ３及びＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡバーコード付きの構築物の合成を可能にするＴ３及びＳＰ６のプロモータ配列のような、しかし、これらに限定されない他のプロモータ配列を使用することができる。完全長またはほぼ完全長の５’核酸構築物が大部分の場合に合成される限り、特異的なプロモータ配列を有さない他のＲＮＡポリメラーゼも使用されてもよい。
【００８２】
提供される核酸試料は単一細胞に由来し、試料に関連するＲＮＡはｍＲＮＡを含むことができる。試料は、たとえば、少なくとも１、３、１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、１０，０００、３０，０００、１００，０００、３００，０００、または１，０００，０００個のｍＲＮＡ分子を含むことができ、それは遺伝子、対立遺伝子、リーディングフレームまたは違う配列の数を表すことができる。任意で、試料に関連するＲＮＡは、試料に由来するｍＲＮＡすべて、細胞の完全なまたは部分的なトランスクリプトーム、または細胞に由来する全ＲＮＡを含む。
【００８３】
任意の理論に束縛されないで、本方法は試料当たりバーコードを付けることができるＲＮＡの数に制限を設けない。従って、試料当たり作り出される対象とするポリヌクレオチドの数は少なくとも１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、１０，０００、３０，０００、１００，０００、３００，０００、または１，０００，０００個であることができる。対象とする各ポリヌクレオチドは複数コピーで存在することができる。さらに、方法の１回の実行にてバーコードを付けることができる細胞または試料の数は、バーコード配列の独特の組み合わせでバーコードのセットを調製する難題（上記で議論された）によってのみ限定される。一部の実施形態では、１つ以上の試料は少なくとも１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、１０，０００、３０，０００、１００，０００、３００，０００、または１，０００，０００個の細胞を含む。試料（たとえば、それぞれ単一細胞である）は同一対象または異なる対象から得ることができる。たとえば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００個の異なる対象が試料を提供することができる。
【００８４】
核酸試料における５’バーコード及び３’バーコードの組み合わせは単一細胞に由来する核酸試料の起源を特定する。任意で、核酸試料におけるバーコードは配列決定によって特定される。各バーコード配列は、バーコード配列が独特のバーコードセットで再利用されるので、異なる試料に由来する集合コンティグに関連付けられるように期待される。用語コンティグは本明細書で使用されるとき、重複する配列データ（読み取り）を指す。同一のコンティグがバーコード配列ａ、ｂ、ｃを使用しているのが観察されてもよい。そしてバーコード配列ａ、ｂ及びｄは別のコンティグに関連するのが観察されてもよい。これから、次いで、ａ、ｂ及びｃはバーコードセット１を構成し、ａ、ｂ及びｄはバーコードセット２を構成すると結論付けることができる。バーコードセット１は１つの細胞に由来する核酸試料に関連する一方でバーコードセット２は第２の異なる細胞に由来する核酸試料に関連する。セットにおける５’バーコードすべてがセットにおける３’バーコードすべてに関連付けられるので、それらは最大二部クリークとしてグラフ理論で表すことができる（図１３を参照のこと）。最大二部クリークはバーコードセット及び核酸を単一細胞に関連付けるであろう。
【００８５】
提供されるのはまた、本明細書で開示されている方法を用いて生成される組成物である。従って、本出願はその生成のためのＲＮＡ及びＤＮＡの構築物の組成物を提供する。提供されるのはまた、とりわけ、バーコード構築物ビーズのライブラリ、ＲＮＡバーコード構築物と共に負荷されるエマルション液滴のライブラリ、細胞と共にバーコード構築物のライブラリを含有するエマルション、バーコード付きｃＤＮＡのライブラリ、及びマイクロ流体液滴を生成する装置である。
【００８６】
提供されるのは、バーコード付きビーズの集団を含む組成物である。組成物は複数のビーズを含み、各ビーズはその表面に複数コピーの５’核酸構築物または３’核酸構築物を結合している。従って、提供されるのは、各ビーズがその表面に複数コピーの５’核酸構築物を結合している、複数のビーズを有する組成物である。提供されるのはまた、各ビーズがその表面に複数コピーの３’核酸構築物を結合している、複数のビーズを含む組成物である。任意で、組成物は、細胞を含む懸濁緩衝液に適宜加えると、５’核酸構築物を含む少なくとも１つのビーズと３’核酸構築物を含む少なくとも１つのビーズと単一細胞とを含む反応混合物を生じるバーコーディングミックスである。好ましくは、反応混合物は少なくとも３つの異なる核酸構築物、たとえば、２つの５’核酸構築物と１つの３’核酸構築物、または２つの３’核酸構築物と１つの５’核酸構築物を含む。
【００８７】
本明細書でさらに開示されるのは、本明細書に記載されている提供されている構築物を含むキットである。キットは本明細書に記載されているバーコード構築物に結合された複数の固形支持体を含むことができる。任意で、キットは１つ以上のバーコード構築物のライブラリを含み、各ライブラリは同一バーコードを持つ複数のバーコード構築物を含む。たとえば、提供されるのは、１、２、３、４、５、６、７、８以上の種類の５’核酸構築物及び／または３’核酸構築物を含む、５’核酸構築物及び３’核酸構築物を含むバーコードビーズのライブラリを含むキットである。任意で、キットは本明細書に記載されているバーコーディングミックス及び／または懸濁緩衝液を含む。キットは使用のための指示書を含むことができる。キットは、好適な容器にて、本明細書で開示されているようなビーズ、構築物、またはライブラリ、１つ以上の対照、及び当該技術で周知の種々の緩衝液、試薬、酵素及び他の標準成分を含んでもよい。従って、キットはさらに、細胞溶解、制限酵素消化及びバーコーディング反応を行うための酵素または他の試薬を含むことができる。
【００８８】
容器は１つ以上のウェルを含むプレートにて少なくとも１つのウェルを含むことができる。容器には、その中で提供される試薬、核酸構築物、ビーズ、ライブラリまたは細胞が入れられてもよく、一部の例では好適に等分されてもよい少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ビン、注射器、液滴または他の容器手段を挙げることができる。追加の成分が提供される場合、キットはこの成分が入れられてもよい追加の容器を含有することができる。キットはまた、試薬、核酸構築物、ビーズ、ライブラリまたは細胞を含有するための手段及び市販のために厳重な管理下にある他の試薬容器も含むことができる。そのような容器は、所望のバイアルが保持される射出成形または中空成形のプラスチック容器を含んでもよい。容器は使用及び／または警告のための指示書を伴ったラベル付けを含むことができる。
【００８９】
提供されるのはまた、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ.１４／５８６，８５７に記載されたもののような反応容量を生成し、輸送するための装置である。これらの容量はマイクロ流体規模で存在することができ、キャリア流体から位相分離することができる。装置によって取り扱うことができる反応容量の例には逆エマルション（すなわち、水／油エマルション）における水性液滴が挙げられる。装置は、バーコード構築物、試料（たとえば、細胞）、及び／またはこれらの試料から得られるＲＮＡが別々にまたは一緒に液滴に封入されるようにする。装置はまた試薬も液滴に導入されるようにするので、バーコード構築物分子を酵素的に生成することができ、個々の試料に由来するＲＮＡにバーコードを付けることができる。
【００９０】
装置は一般に３つのマイクロ流体経路を含み、それぞれ圧力源及び流れセンサーに繋がれる。マイクロ流体経路のための圧力源は経路を介して流体を運び、圧力源の下流に存在する流れセンサーを用いて経路を介する流れの速度を測定することができる。一部の実施形態では、第１の経路と第２の経路が第１の接合部で合流して複合経路を形成する。たとえば、図１を参照のこと。
【００９１】
本明細書に記載されているような装置は、ＩＤＥＸ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｌａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）から入手可能な配管及び流体工学成分から、及びＤｏｌｏｍｉｔｅ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｗｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）から入手可能なマイクロ流体液滴チップを用いて組み立てることができる。マイクロ流体液滴チップの一部の特徴は、参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第７，２６８，１６７号、同第７，３７５，１４０号、同第７，７１７，６１５号、同第７，７７２，２８７号、同第８，７４１，１９２号及び同第８，８８３，８６４号に記載されている。好適な圧力源には注射器ポンプ及び圧力ポンプが挙げられる。圧力ポンプはＤｏｌｏｍｉｔｅ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓから入手可能である。圧力源は独立して制御することができる。
【００９２】
任意で、第１と第２のマイクロ流体経路が水溶液を輸送する。各経路は注入ポートと弁（たとえば、四方弁）を含んで、経路でインラインの注入ポートに導入される溶液を移動させる。任意で、水性のキャリア流体を保持するリザーバを各四方弁の上流に配置する。キャリア流体は下流に運ばれるので、または第１の接合部に向かって水溶液のプラグを下流に押すので、水性のキャリア流体は四方弁で水溶液と混ざり合うことができる。任意で、流れ抵抗器が各マイクロ流体経路に配置される。
【００９３】
いったん水溶液が第１または第２のマイクロ流体経路に導入されると、それは、第１の接合部に向かう溶液の流れを測る試料ループを通過することができる。測ることは、所望に応じて、たとえば、試料ループに沿って配置される流体抵抗または弁を用いて達成することができる。任意で、１つの試料ループが第１及び第２のマイクロ流体経路のそれぞれに関連付けられ、試料ループは熱冷却ユニットに接触する。熱冷却ユニットが含まれて水溶液における酵素、核酸または他の生体成分の熱変性を防ぎ、または酵素反応のための最適な温度を定めることができる。第１及び第２のマイクロ流体経路のための試料ループに接触した熱冷却ユニットの部分は独立してまたは一緒に制御することができる。それが試料ループを通過する水溶液の温度を常温から逸脱させることができるという条件で、物質または装置を熱冷却ユニットとして使用することができる。好適な熱冷却装置の例はＰｅｌｔｉｅｒ装置及びアイスビンである。
【００９４】
任意で、第１のマイクロ流体経路を通って輸送される水溶液は細胞及びバーコード構築物ビーズを含有する。一部の実施形態では、第２のマイクロ流体経路を通って輸送される水溶液は細胞溶解のための試薬及び対象とするポリヌクレオチドを作り出すための試薬（たとえば、バーコード構築物分子を生成するための酵素）を含有する。各マイクロ流体経路に関連付けられた注入ポート、弁及び／または試料ループはその経路を通過する水溶液の内容物を受け入れるように構成するまたは特注することができる。たとえば、第１のマイクロ流体経路に関連する試料ループは細胞及びビーズを受け入れるために大きな内径を有することができる。第１と第２のマイクロ流体経路の間で細胞、ビーズ及び試薬を割り当てるために多数の他の選択肢が存在するので、これらの成分のすべてが第１の接合部で混ぜ合わせられることが認識されるであろう。たとえば、第１のマイクロ流体経路を通って細胞を輸送することができ、第２のマイクロ流体経路を通ってビーズを輸送することができる。各経路は所望のように、それが運ぶ水溶液の内容物を考慮して構成することができる。
【００９５】
組み合わせた経路の合流から生じる、液滴を含有する流体経路は試料経路を構成する。試料経路は、第２の接合部の下流に存在する試料回収容器に届けられる。試料回収容器では、液滴を熱循環に供することができる。液滴を壊して開け、バーコード付きの核酸を回収することができる。
【００９６】
操作中、装置を用いてバーコード構築物ビーズ及び細胞を水性のマイクロ流体液滴に封入するので、各液滴は平均でほぼ２つのビーズと１つの細胞を含有する。各液滴におけるビーズ及び細胞の数は、たとえば、装置に負荷される溶液におけるビーズまたは細胞の濃度を調整することによって、または３つのマイクロ流体経路における流速を調整することによって所望のように調整することができる。各液滴に含まれる試薬はバーコード構築物分子が液滴にてビーズ１つから酵素的に生成されるようにする。これらの試薬は細胞１つが溶解され、細胞に由来するＲＮＡがバーコーディング反応を受けることができるようにする。従って、細胞に由来するＲＮＡは液滴内でバーコードを付けることができ、これらのＲＮＡに由来する（及びバーコード配列を含有する）核酸は、複数の細胞に由来する核酸が混合される場合、後で１つの細胞に辿り着くことができる。
【００９７】
開示されているのは、開示されている方法及び組成物で使用することができる、それらと併せて使用することができる、それらを調製することで使用することができる材料、組成物及び成分、またはそれらの生成物である。これらの及び他の材料は本明細書で開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群等が開示される場合、これらの化合物のそれぞれ種々の個々の及び総体の組み合わせ及び順列の特定の参照は明白に開示されなくてもよい一方で、それぞれは具体的に熟考され、本明細書に記載されていることが理解される。たとえば、方法が開示され、議論され、方法を含む多数の分子に対して行うことができる多数の修飾が議論されるのであれば、方法の組み合わせと順列のそれぞれ及びどれも皆、ならびに可能である修飾は、特に反対に指示されない限り、具体的に熟考される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも具体的に熟考され、開示される。この概念は、開示されている組成物を用いた方法における工程を含むが、これらに限定されない本開示の態様すべてに適用される。従って、実施することができる種々の追加の工程があるならば、これらの追加の工程のそれぞれは開示されている方法の具体的な方法工程または方法工程の組み合わせで実施することができ、そのような組み合わせまたは組み合わせのサブセットのそれぞれは具体的に熟考されており、開示されると見なされるべきであることが理解される。
【００９８】
本明細書で引用されている出版物及びそれらが引用されている材料はその全体が参照によって本明細書に具体的に組み入れられる。
【００９９】
多数の実施形態が記載されている。それにもかかわらず、種々の改変が行われてもよいことが理解されるであろう。従って、他の実施形態は以下のクレームの範囲の中にある。
【実施例】
【０１００】
実施例１．単一細胞に関連する核酸の解析のための核酸バーコードのセット
バーコード付きビーズライブラリの２つの違うセット（５’セット及び３’セット）を用いて各細胞のトランスクリプトームにバーコードを付ける。図２を参照のこと。各３’バーコードは制限部位と独特の分子識別子とバーコード配列とｍＲＮＡ転写産物のポリ−Ａ尾部を標的とするポリ−Ｔ配列（従って各真核細胞にて全ＲＮＡのかなり大半を構成するリボソームＲＮＡ及びｔＲＮＡを回避する）とから成る。各５’バーコードは３’ビーズセットの制限部位と同じであってもよい制限部位（ＲＥ）と最終的なバーコード配列の相補体と３つのグアニン残基とを含む。対象とする細胞と共にこれら２つのビーズのセットを液滴に封入する。図１にて示すもののような液滴装置を使用することができる。
【０１０１】
所望の比率の液滴が各セットのビーズを少なくとも１つ受け取るように各ビーズのセット（３’及び５’）の濃度を調整する。たとえば、液滴当たり各種の３つのビーズの平均値については、９０％を超える液滴が各種のビーズを少なくとも１つ受け取るであろう。処理能力と単一細胞の封入との間の最適な均衡について同様に細胞濃度を調整する。この実施例の目的で、平均値は液滴当たり０．１個の細胞であり、その際、細胞を受け取る液滴の９５％を超える事例が正確に１個の細胞を受け取るであろう。生産的な液滴は１個の細胞と５’及び３’のセットのそれぞれから少なくとも１つのビーズを受け取るであろう。成功した封入事象ののち、反応は図３で説明されたように進むことができる。
【０１０２】
ｍＲＮＡは完全に逆転写され、ｃＤＮＡの各末端でのバーコード配列の組込みが生じる。各種のビーズ正確に１個が１つの細胞と共に同時封入される場合、完全に逆転写されているｍＲＮＡ転写産物は、その細胞にとって独特であるバーコードのセットを含む５’バーコード及び３’バーコードの同一対を示すであろう。一方または双方のビーズの複数が１つの細胞と共に同時封入される場合、５’／３’の組み合わせのどれも皆、生産されるｃＤＮＡライブラリにて示されると予想され、５’／３’の組み合わせのこのセットがその細胞に独特であるバーコードのセットである。ｃＤＮＡのどれも皆少なくとも３’バーコードを運ぶであろう。逆転写が不完全である場合、５’バーコードはｃＤＮＡに組み込まれなくてもよい。３’バーコードのみが組み込まれるような場合でさえ、バーコードがその液滴にて十分な数の５’バーコードと関連してそのバーコードのセットの一部としてそれを構築している限り、不完全なｃＤＮＡは下流の解析ではその適正なトランスクリプトームに依然として潜在的に割り当てられ得る。
【０１０３】
図４は、各バーコードセットの複数のバーコード付きビーズが１つの細胞と共に単一の液滴に同時封入される場合を説明している。各細胞内での多数のｍＲＮＡ転写産物のせいで、上述のバーコーディングのスキームによって、３’バーコードはすべて液滴にて５’バーコードすべてと一致する機会を有するであろう。これらのバーコードは細胞を起源とする転写産物すべてを特定する独特のバーコードセットを形成する。
【０１０４】
多くの場合、コーディング反応は完了に達することができなくてもよく、転写産物配列の一部のみが転写されるであろう。不完全ではあるけれども、これはとにかく潜在的に有用な情報である。図５は、５’バーコードを組み込むことができない非完全長のｃＤＮＡの場合でさえ、これらのｃＤＮＡは依然として適正なバーコードセットに割り当てられ得ることを説明している。従って、１つのバーコードしか持たない核酸を高度の信頼で正しいトランスクリプトームに割り当てることができる（逆もまた同様に同じことが言える）。これについての要件は、３’バーコードのコード空間（独特の３’バーコードの総数）が十分に大きいので任意の１つの３’バーコードが複数の細胞と共に同時封入される可能性が十分に低いことである。それが生じる場合でさえ、この重複は検出することができ、その特定の共有された３’バーコードを持つ非完全長のｃＤＮＡを安全に捨てることができる。対照的に、単一のバーコードシステムの場合、同一バーコードを受け取っている２つの細胞のプロファイルは解析の間に統合されることになる。
【０１０５】
図６は同じ個々のバーコードの若干の重複がある場合でさえ、バーコードのセットは独特のバーコード１つの包含によって区別することができることを明らかにしている。
【０１０６】
５’及び３’のセットのそれぞれについての必要とされるコード空間（独特のバーコードの数）が決定されなければならない。バーコードは十分に独特なので配列決定誤差の存在でそれらを区別することができなければならない、すなわち、少数の呼び間違えた塩基の事象にて１つのバーコードが別のバーコードに変換されるべきではない。バーコードのセットの確立は、配列決定誤差がバーコード間の曖昧さを作り出し得る事例を解決するのに役立つであろう。
【０１０７】
代替の一実施形態は、それには鋳型切り替えが関与するという点で上述のバーコーディングのスキームに類似するが、この場合、５’バーコードビーズセットは図７で示されるように異なる組成を有する。このことは、ｍＲＮＡ転写産物から完全に逆転写されているｃＤＮＡの各末端にバーコードを組み込む「鋳型切り替え」のバーコーディングスキームには複数のアプローチがあることを実証している。
【０１０８】
実施例２．単一細胞に関連する核酸の解析のための核酸バーコードのセット―非鋳型切り替え
この実施例は非鋳型切り替え法を記載している。バーコード付きビーズの単一セットしかない。各ビーズはヘアピン構造を形成する一本鎖ＤＮＡオリゴを有する。ヘアピンの二本鎖セグメントでは、双方の鎖の制限を指示する制限部位が組み込まれる。これは、転写産物のバーコーディングセグメントと、バーコードと同様に「バーコード関連配列」（ＢＡＳ）も含有する別のループ状セグメントとの双方を切断する。図８を参照のこと。
【０１０９】
転写産物のバーコードセグメントにはＵＭＩとバーコードとポリ−Ｔセグメントとが含まれる。このセグメントは、液滴内で細胞によって遊離されるｍＲＮＡ転写産物のポリ−Ａ尾部にアニーリングし、そのｍＲＮＡ配列の逆転写に刺激を与えるので、作り出されるｃＤＮＡにバーコードを組み込む（図９）。
【０１１０】
それとは別に、ループ状セグメントはそれが切断されるバーコードと同一であるまたはそれに相当するそれ自体のバーコードを含む。それはまたプライミング配列、回文配列であるＢＡＳも含む。
【０１１１】
複数のビーズが細胞と共に同時封入される事象では、２つの転写産物バーコーディングセグメント（ＢＣ１ａ及びＢＣ２ａ、図１０）が双方ともＲＴバーコーディング反応のプライマーとして役立ち、その細胞に由来するトランスクリプトームは双方のバーコードを組み込むであろう。それとは別に、各バーコード（ＢＣ１ｂ及びＢＣ２ｂ、図１０）を運ぶ２つの対応するループ状セグメントも存在するであろう。
【０１１２】
回文状のＢＡＳはＢＣ１ｂ及びＢＣ２ｂループ状セグメントが交差アニーリングするのを可能にし、ＤＮＡポリメラーゼが反応ミックスに含まれて各セグメントを伸長し、他のバーコードの相補体を組み込む（図１１）。このように、ＢＡＳは、バーコードをセットとして関連付けてその細胞に由来するトランスクリプトームを一体化するために、その後下流で配列決定することができる単一のアンプリコンに物理的に連結される。
【０１１３】
回文配列が望ましくなければ、ＢＡＳが２つの相補性の配列を含み、各ビーズが大まかに同等の比率で双方のＢＡＳ配列を運ぶシステムも設計されてもよい。「ループ状」セグメントとして記載されているものはループ状ではなく線状であってもよい。これは使用される制限酵素に左右される。同様に、ヘアピンを使用するのではなく、ビーズから切断される２つ以上のセグメントも生じる複数の制限部位を持つ線状オリゴを使用することができる。ここで再び、「ループ状」セグメントはループ状でなくてもよいが、代わりに線状である。
【０１１４】
実施例３．バーコードがどの容器に位置するのかという演繹的知識を持たずに複数のバーコードを用いてどの核酸が同一試料に関連するのかを特定すること
細胞にバーコードを付けるためのＰＢＭＣの調製。凍結保存したＰＢＭＣを解凍し、リン酸緩衝化生理食塩水（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）で細胞ペレットを３回洗浄し、９６ウェルプレートに一回ＦＡＣＳ選別した、または２５ｍＭのＮａＣｌと１５３ｍＭのベタインを含む等張細胞懸濁緩衝液（ＣＳＢ）に再浮遊させた。次いで細胞を数え、逆転写のためにウェル当たり平均１個の細胞にＣＳＢで希釈した。
【０１１５】
オリゴプレートの調製。バーコード付きオリゴＤＴオリゴ（３’バーコード、以後、「ｏＤＴ  ＢＣ」と呼ぶ）及びバーコード付き鋳型切り替えオリゴ（５’バーコード。以後「ｗＩＤ  ＢＣ」と呼ぶ）はＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から取り寄せた。到着の際、ｏＤＴ  ＢＣ及びｗＩＤ  ＢＣは双方とも１０μＭに希釈し、使用まで−２０℃で保った。それらは以下の配列を有する。
【０１１６】
（表２）オリゴの配列
2018538006.tif 000004
【０１１７】
バーコードは、それらが互いから少なくとも２編集距離離れるように、すなわち、１つのバーコードをもう１つのバーコードに変換するのに少なくとも２つの変異（置換、挿入または欠失）を要するように設計された。割り当ての誤りのせいで別のバーコードとして間違って割り当てられる機会を有するには少なくとも２つの配列決定の誤りを必要とするので、これはバーコードの割り当ての誤りを大きく減らす。
【０１１８】
逆転写及びバーコーディング。２のラムダを持つ無作為ポアソン分布を介して各ウェルに分配されたｏＤＴ  ＢＣ及びｗＩＤ  ＢＣを含有する９６ウェルプレートを調製した。そのような分布に伴って、一部のウェルはオリゴを受け取らず、他は複数のオリゴを受け取り、平均で各ウェルは２つのオリゴを受け取ることになる。無作為ポアソン分布のスクリプトはＲで記述されてどのオリゴが各ウェルに入れられるかを決定し、液体ハンドラー（ＦｅｌｉＸ，Ｃｙｂｉｏ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてバーコードをウェルに分配した。各ウェルにて６ｍＭのＭｇ２＋、０．３％のＴｗｅｅｎ２０、ＲＮＡ分解酵素阻害剤、Ｍａｘｉｍａ  Ｈ  Ｍｉｎｕｓ逆転写酵素及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＲＴ緩衝液で反応を行った。各ウェルでは、試料はＦＡＣＳを介して置かれた単一細胞だった。反応混合物を逆転写し、バーコード付きオリゴを５５℃で３分間、４２℃で１時間及び８５℃で１０分間、ｃＤＮＡに組み込んだ。次いでプレートを−２０℃で一晩凍結した。
【０１１９】
試料をプールすること、ライブラリの調製及び配列決定。試料をプールするために凍結したプレートを氷上で解凍した。各プレートのＲＴ産物を２等分（９６ウェルプレートの左半分と右半分）してプールし、製造元の指示書に従ってＳｅｌｅｃｔ−ａ−Ｓｉｚｅ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いて濃縮し、３００ｂｐより短い物質を除いた。手短には、５００μＬのｓｅｌｅｃｔ−ａ−ｓｉｚｅ  ＤＮＡ結合緩衝液を１００μＬのｃＤＮＡに加え、穏やかにピペッティングすることによって混合し、その後、１０，０００ｇで３０秒間遠心分離した。ｃＤＮＡを含有しているカラムをＤＮＡ洗浄緩衝液で２回洗浄し、ＤＮＡ溶出緩衝液を用いて１５μＬで溶出した。Ｑ５  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と０．２μＭのプライマーｐｌｔｗｌｌ＿ＬｉｂＰＣＲ＿Ｆｗ及びｐｌｔｗｌｌ＿ＬｉｂＰＣＲ＿ＲＶとを用いたＰＣＲに１μＬの各試料を使用した。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  Ｎｅｘｕｓ熱循環器（Ｈａｕｐｐａｕｇｅ，  ＮＹ）を用い、以下のＰＣＲ熱循環条件：９５℃で５分間の変性；９８℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、及び６８℃で１分間を１０サイクル；ならびに６８℃で５分間の最終伸長を用いた。以前記載されたようにｓｅｌｅｃｔ−ａ−Ｓｉｚｅ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いてＰＣＲ産物を再び濃縮して３００ｂｐより短い産物を取り除いた。次いで０．２μＭのプライマーｐｌｔｗｅｌｌ＿ＰＣＲ２＿Ｆｗ及びｐｌｔｗｅｌｌ＿ＰＣＲ２＿Ｒｖを用いて２回目のＰＣＲを行った。Ｐｉｐｐｉｎ  Ｐｒｅｐ  ＤＮＡサイズ選択システム（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて３００ｂｐ〜１２００ｂｐの産物をサイズ選択し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって配列決定した。
【０１２０】
解析及び結果。ライブラリのＭｉＳｅｑ配列決定に続いて、４８ウェルのセットから得られた読み取り対をＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いて解析した。ポアソン分布に従ったバーコードの無作為分布の結果、これらのウェルのうち３９個が、少なくとも１つのｗＩＤと少なくとも１つのｗＩＤとを含有した。９個のウェルは、ｗＩＤバーコードもｏＤＴバーコードも含有しなかった。読み取りの既知の構造（５’−ｗＩＤ−ＡＣＧＧＧ−ｍＲＮＡ−ＢｄＡ１６−Ｎ８−ｏＤＴ）を用いて、ｏＤＴ  ＢＣを逆行読み取りから特定し、ｗＩＤ  ＢＣを順行読み取りから特定した。後に続く解析でバーコードの既知の配列を使用しなかったということは、この方法が、バーコードがどの試料に関連するかという以前の知識を持たないで核酸の起源の試料を決定することができ、データ解析のやり方がシークエンサーによって導入される誤差に対して安定であることを実証している。
【０１２１】
「二重バーコード付き転写産物の読み取り」のセットはｏＤＴ  ＢＣ及びｗＩＤ  ＢＣの双方が特定される読み取り対から生成された。セットは、６，９６４個の違うバーコード対を含む合計１０７，７９５個の読み取り対から成った。二重バーコード付き転写産物から観察されたバーコード対の頻度のヒストグラムを図１５に示す。
【０１２２】
低レベルの交差混入がオリゴの合成から予想された（ＩＤＴ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｂａｒｃｏｄｅ  Ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｗｉｔｈ  ＴｒｕＧｒａｄｅ（商標）Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｄｅｃｏｄｅｄ，２（４），２０１２を参照のこと）。バーコードのオリゴはセットで一緒に合成した。一緒に合成されるＮ個のバーコードと共に、供給される各オリゴが他のＮ−１個のオリゴのそれぞれの等量混合物を含有するのであれば、各所望の産物オリゴが作り出されるオリゴの画分１−ｐのみを含むように、混入から生じる対に対比させた予想されるバーコード対を有するであろう読み取りの画分を推定することができる。予想される対を伴う読み取りの画分は（１−ｐ）＊（１−ｐ）として推定することができる。混入である画分は（１−（１−ｐ）＊（１−ｐ））として推定することができる。混入のせいで（Ｎ−１）個の異なるオリゴバーコードがあるならば、合計Ｎ＊Ｎ−１個の混入物対がある。次いで混入物対の比率はｆ＝（１−ｐ＊ｐ）／｛ｐ＊ｐ＊（Ｎ＊Ｎ−１）｝として推定することができ、読み取りの所与の数Ｒについての混入物当たりの読み取り対の数はｆ＊Ｒである。
【０１２３】
２４のプレートで合計２８８個のバーコードを一度に整えた。モルレベルで１０％までのオリゴの交差混入を控えめに可能にして、４０未満の違う読み取り対のバーコード対が混入であるらしいことが推定された。従って、我々の解析でのさらなる検討のために最低５０の読み取り対でバーコードの所与の対が観察されることを要する閾値が設定された。
【０１２４】
データのウェル及び細胞への割り当て。バーコードが各ウェルに分配された以前の知識を使用しないで出力読み取りを単一の細胞及びウェルに割り当てた。この解析の出発点は、少なくとも５０の読み取り対によってデータにて支持されたｗＩＤ  ＢＣとｏＤＴ  ＢＣの１８３対のセットだった。ＢＣのこれら１８３対は合計９４，７１２の読み取り対の合計によって支持された。これらの対の１つ１つは、その頂点が観察されたｗＩＤ  ＢＣ及びｏＤＴ  ＢＣであり、少なくとも５０の読み取りで辺に割り当てられたグラフにて辺（ｗＩＤ  ＢＣ、ｏＤＴ  ＢＣ）と見なされた。我々のデータセットを表すこのグラフは、ノードの一方の群を構成するｗＩＤ  ＢＣとノードの他方の群を構成するｏＤＴ  ＢＣを伴った二部であった。１つ以上のｗＩＤ  ＢＣ及び１つ以上のｏＤＴ  ＢＣを有する細胞／ウェルはデータにおける辺すべてから成るグラフの完全な二部部分グラフを形成する辺のセットを生成すべきであることが特徴とされた（図１３及び１４も参照のこと）。従って、データセットすべてのグラフを完全な二部グラフに分解するアルゴリズムを開発することによってグラフの辺を細胞／ウェルに割り当てた。
アルゴリズムの工程は以下のとおりだった。
１．グラフの連結成分すべてをコンピュータで計算する。
２．完全な二部グラフ（２クリーク）である連結成分をそれぞれウェル／細胞に割り当てた。
３．他の連結成分を以下のように２クリークの和集合に分解した。
ａ．成分の部分グラフである２クリークすべてを決定した（以下で説明されるアルゴリズム）
ｂ．３．ａ．におけるグラフの設定から、最大である（他の２クリークに含まれない）２クリークを選択した。
ｃ．「切り詰め（ｐｒｕｎｉｎｇ）」工程を適用してデータに存在しそうにない２クリークを除いた。
上記アルゴリズムの工程３ａ．は以下のように行った。
１．以下のように集合Ｏ及びＩが生成された。
ａ．連結成分における各ｗＩＤ  ＢＣについては、辺によってそれに接続され、それを退出（ｗＩＤ  ＢＣ）と呼ぶｏＤＴ  ＢＣの集合を決定し、次いでそれをＯ退出（ｗＩＤ  ＢＣ）とそのサブセットのすべての双方に加えた。
ｂ．ａ．と同様の方法で、集合Ｉを以下のように生成した：連結成分における各ｏＤＴ  ＢＣについては、辺によってそれに接続され、それを進入（ｏＤＴ  ＢＣ）と呼ぶｗＩＤ  ＢＣの集合を決定し、次いでそれをＩ進入（ｏＤＴ  ＢＣ）とそのサブセットのすべての双方に加えた。
２．Ｉにおける各集合ｉ及びＯにおける各集合ｏについて今や、ｉにおけるｗＩＤ  ＢＣとｏにおけるｏＤＴ  ＢＣとの間の辺すべてがデータに存在するかどうか、及びこれは、２クリークがその成分の部分グラフである２クリークすべての集合に加えられる場合であるかどうかを決定した。
上記アルゴリズムの工程３ｃ．は以下のように行った。
１．λ＝２のみで細胞の割合０．０１６６は所与の種類の５を超えるバーコードを有するであろう。従って、５を超えるｗＩＤ  ＢＣまたはｏＤＴ  ＢＣを有するアルゴリズムによって構築された２クリークは有効な構築物として拒絶され、フィルターで除去された。
２．単一のｗＩＤ  ＢＣまたは４以上のｏＤＴ  ＢＣを有するクリーク（または逆もまた同様）はさらに小さい２クリークで構成される曖昧な構築物であることの高い尤度を有した。この曖昧さを考慮して、これらの２クリークは同様にフィルターで除去された。
工程３ｂ．及び３ｃ．の経験則は、各成分をそれが構成する最もありそうな二部クリークに分解する最大尤度法によって置き換えられてもよく、これは結果をさらに改善すると予想される。尤度は、我々の経験則３ｃ．で議論したようなパラメータλに依存し、且つ成分構成する種々の２クリーク間でのｗＩＤ  ＢＣ及びｏＤＴ  ＢＣにおける重複の量にも依存する。
【０１２５】
（表３）解析の結果
2018538006.tif 000005
【０１２６】
表２は、このデータセットに寄与した３９ウェルに由来するデータが１５の成分を生成したことを示す（４８ウェルのうち３９だけがｗＩＤ  ＢＣ及びｏＤＴ  ＢＣ双方を有したことに留意のこと。９ウェルはｗＩＤバーコードのみまたはｏＤＴバーコードのみを有したのでバーコード対を得ることができなかった）。ｗＩＤ  ＢＣ及びｏＤＴ  ＢＣの数ならびに分解アルゴリズムから生じた切り詰め最大２クリークの数を提示する。加えて、表２は、予想クリークに正確に一致した、予想された２クリークの適正なサブセットだった、または１もしくは２の予想されたグラフと交差した２クリークの数を提示する。
【０１２７】
１５の連結成分から３４の完全な二部グラフが生成された。これら３４のうち、２３は予想されたグラフと完全な一致だった。さらに４つのグラフは予想されたグラフの適正なサブセットだった。従って、得られたクリークの２３／３４＝６７％は完全に生成され、２７／３４＝７９％は少なくとも部分的に再構築され、それらに割り当てられた間違った辺を有さなかった。全体で、実験に含まれたウェルのうち２７／４８＝５６％は上手く割り当てられた関連バーコードとｍＲＮＡだった。バーコードオリゴの製造の間での、データ処理にてフィルターで除去され得る交差混入のせいで誤った読み取り対のデータセットが存在するにもかかわらず、これらの思い通りの再構築が可能だった。
【０１２８】
この多重バーコーディングスキームは、目標が単一バーコードを各細胞に割り当てることである単一バーコーディングスキームよりも大きく優れている。ポアソン負荷による単一バーコーディングスキームでは、λ＝０．１以下を使用することが自然の選択となる（０．０６のラムダを使用するＭａｃｏｓｋｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６１：５（２０１５）を参照のこと）。λ＝０．１では、細胞のおよそ９０．４％がバーコードを受け取らず、およそ９．０％が正確に１つのバーコードを受け取り、およそ０．５％が１を超えるバーコードを受け取ることになる。ここで記載されている実験では、５．８倍に等しい５６％（１００〜９０．４％）もの多くの細胞が単一バーコーディングスキームを用いて上手く解析されている。
【図１】
2018538006.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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