(57)【要約】本明細書では、ヒト患者にオリゴクローナル抗上皮成長因子受容体（抗ＥＧＦＲ）抗体の組み合わせ（例えば、第１のモノクローナル抗体（Ｐ１Ｘ）、第２のモノクローナル抗体（Ｐ２Ｘ）、及び第３のモノクローナル抗体（Ｐ３Ｘ）を含み、Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ、及びＰ３Ｘが２：２：１のモル比である、ＭＭ−１５１）を投与することによって、ヒト患者の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）変異癌を治療する方法を提供する。一実施形態では、この癌は、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ、Ｓ４６４Ｌ、Ｋ４６７Ｔ、Ｇ４６５Ｒ、Ｇ４６５Ｅ、Ｉ４９１Ｍ、及びＳ４９２Ｒからなる群より選択されるＥＧＦＲの細胞外ドメインにおける少なくとも１つの変異を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）変異癌の治療における、オリゴクローナル抗上皮成長因子受容体（抗ＥＧＦＲ）抗体の組み合わせの使用であって、前記癌が、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ、Ｓ４６４Ｌ、Ｋ４６７Ｔ、Ｇ４６５Ｒ、Ｇ４６５Ｅ、Ｉ４９１Ｍ、及びＳ４９２Ｒからなる群より選択されるＥＧＦＲのＥＣＤにおける少なくとも１つの検出された変異を有し、前記オリゴクローナル抗上皮成長因子受容体（抗ＥＧＦＲ）抗体の組み合わせが、３つのモノクローナル抗体を含み、第１のモノクローナル抗体がＰ１Ｘであり、第２のモノクローナル抗体がＰ２Ｘであり、第３のモノクローナル抗体がＰ３Ｘであり、前記オリゴクローナル抗体の組み合わせが、Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ、及びＰ３Ｘを２：２：１のモル比で含む、使用。
【請求項２】
ヒト患者におけるＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）変異癌の治療におけるオリゴクローナル抗上皮成長因子受容体（抗ＥＧＦＲ）抗体の組み合わせの使用であって、前記オリゴクローナル抗体の組み合わせが、
ａ．それぞれ配列番号１、２、及び３の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号４、５、及び６の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１のモノクローナル抗体と、
ｂ．それぞれ配列番号７、８、及び９の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１０、１１、及び１２の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２のモノクローナル抗体と、
ｃ．それぞれ配列番号１３、１４、及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１６、１７、及び１８の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第３のモノクローナル抗体と、を含む、使用。
【請求項３】
前記第１のモノクローナル抗体がＰ１Ｘであり、前記第２のモノクローナル抗体がＰ２Ｘであり、前記第３のモノクローナル抗体がＰ３Ｘであり、前記オリゴクローナル抗体の組み合わせがＰ１Ｘ、Ｐ２Ｘ、及びＰ３Ｘを２：２：１のモル比で含む、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
異なる抗ＥＧＦＲ療法による前記癌の治療後の、請求項１または２に記載の使用。
【請求項５】
前記ヒト患者におけるセツキシマブ、パニツムマブ、またはＳｙｍ００４による前記癌の治療及びＥＧＦＲの前記ＥＣＤ領域におけるエクソン１２変異の検出後の、請求項１または２に記載の使用。
【請求項６】
前記患者におけるＥＧＦＲの前記ＥＣＤ領域におけるエクソン１２変異の検出後の、請求項２〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記癌がＫ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、及び／またはＢＲＡＦ野生型転移性結腸直腸癌である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記患者の血液または尿中の前記ＥＧＦＲ細胞外ドメインのドメインＩＩＩにおける変異の検出後の、請求項２〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記患者から血液サンプルを採取し、前記血液サンプルが、ＥＧＦＲの前記細胞外ドメインをコードする配列中の１つ以上の変異を有する循環ＤＮＡを含有することを決定した後の、請求項２〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
ＥＧＦＲの前記細胞外ドメインにおける前記少なくとも１つの変異が、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ、Ｓ４６４Ｌ、Ｋ４６７Ｔ、Ｇ４６５Ｒ、Ｇ４６５Ｅ、Ｉ４９１Ｍ、及びＳ４９２Ｒからなる群より選択されるタンパク質配列の変化、またはタンパク質配列の変化をもたらすＤＮＡもしくはＲＮＡコード領域である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記癌が頭頸部癌またはＲａｓ野生型結腸直腸癌である、請求項１〜９のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、以下の米国仮出願、２０１５年４月２４日に出願された第６２／１５２，７０７号、２０１５年１０月２２日に出願された第６２／２４４，９９１号、２０１６年３月１５日に出願された第６２／３０８，６９７号、２０１６年４月１５日に出願された第６２／３２３，４７５号の優先権を主張し、その利益を主張する。上記の出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、典型的には上皮成長因子（ＥＧＦ）のような多くの細胞外リガンドのいずれかの結合により活性化された場合に、シグナル（細胞増殖を推進する分裂促進シグナルを含む）を細胞の内部に伝達するＨＥＲ／ＥｒｂＢ受容体ファミリーの細胞表面膜貫通受容体である。
【０００３】
セツキシマブ及びパニツムマブなどのＥＧＦＲ標的化モノクローナル抗体は、ＥＧＦＲ発現腫瘍に対して常に有効であるとは限らない。多くの場合、これらの抗体調製物に応答し、これらの抗体調製物から恩恵を受ける患者は、治療に対する二次的耐性を発生させる。この耐性の１つの原因は、腫瘍細胞をセツキシマブ及び／またはパニツムマブに応答しなくするＥＧＦＲの外部ドメインにおける１つ以上の変異の発生である。
抗ＥＧＦＲ抗体の有効性を改善する目的で行われた１つのアプローチは、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン上の異なる部位（エピトープ）を標的とする抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（すなわち、オリゴクローナル抗体）の混合物を開発することである。例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１１／１４０２５４号及び米国特許第７，８８７，８０５号を参照されたい。これらの開発により、その腫瘍が、モノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体に対し非応答性にする特徴を有するがん患者の同定を可能にする必要性が生じており、そのような患者は、オリゴクローナル抗ＥＧＦＲ抗体の投与を介して効果的な治療を受けることができる。本開示は、この必要性に応えかつ他の利益を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１１／１４０２５４号
【特許文献２】米国特許第７，８８７，８０５号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書では、モノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体、例えば、セツキシマブまたはパニツムマブ、に対して進行しているか、または不応性になっている、癌患者の治療方法及び治療を選択する方法を提供し、本方法は、患者の腫瘍細胞が細胞外ドメインをコードするＥＧＦＲ遺伝子領域において変異を獲得したかどうかを決定することを含み、選択された治療には、ＥＧＦＲ細胞外ドメインに結合する抗ＥＧＦＲ抗体のオリゴクローナル混合物を含む。
【０００６】
また、腫瘍（例えば、悪性腫瘍）が、単独のモノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、セツキシマブ、パニツムマブ）またはＳｙｍ００４による治療には反応しないが、本明細書に記載のオリゴクローナル抗ＥＧＦＲ抗体での治療に応答するかどうかを予測する方法も提供され、該方法は、患者の腫瘍細胞が細胞外ドメインをコードするＥＧＦＲ遺伝子領域において変異を獲得したかどうかを決定することを含む。
【０００７】
さらに提供されるのは、ＥＧＦＲ細胞外ドメインにおいて少なくとも１つの変異を有する腫瘍含有細胞を抱える患者を治療する方法であって、この方法は、ＥＧＦＲ細胞外ドメインに結合する抗ＥＧＦＲ抗体のオリゴクローナル混合物（例えば、単一組成物における）の有効量を患者に投与することを含む。
【０００８】
一実施形態では、選択された抗ＥＧＦＲ抗体のオリゴクローナル混合物は、（ａ）それぞれ配列番号１、２及び３の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号４、５及び６の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含むモノクローナル抗体と、（ｂ）それぞれ配列番号７、８及び９の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１０、１１及び１２の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含むモノクローナル抗体と、（ｃ）それぞれ配列番号１３、１４及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ配列番号１６、１７及び１８の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含むモノクローナル抗体と、を含む。
【０００９】
別の実施形態では、選択された抗ＥＧＦＲ抗体のオリゴクローナル混合物は、（ａ）配列番号１９を含む重鎖可変領域及び配列番号２０を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体、（ｂ）配列番号２１を含む重鎖可変領域及び配列番号２２を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体、（ｃ）配列番号２３を含む重鎖可変領域及び配列番号２４を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体を含む。
【００１０】
使用することができる他の抗ＥＧＦＲオリゴクローナル抗体組成物は、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１１／１４０２５４号及び対応する係属中の米国特許公開番号及び対応する係属中の米国特許第９，０４４，４６０号及び係属中の米国特許第９，２２６，９６４号及び第７，８８７，８０５号（「オリゴクローナル出願」ならびに他の抗ＥＧＦＲ抗体と組み合わせたこのような抗体のオリゴクローナル混合物は、癌、例えば悪性の（新生物性の）腫瘍の治療に有用である。
【００１１】
一実施形態では、選択されたオリゴクローナル抗体（例えば、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む）は、２：２：１のモル比で（例えば組成物で）互いに組み合わせる。
【００１２】
別の実施形態では、患者は、セツキシマブ、Ｓｙｍ００４またはパニツムマブのような、ＥＧＦＲ細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体治療の１つまたは複数に不応性である。別の実施形態において、患者は、フルオロピリミジン含有レジメン、オキサリプラチン含有レジメン、またはイリノテカン含有レジメンにおいてまたはその後に疾患進行を有している。別の実施形態では、患者は、抗悪性腫瘍剤による前治療後、抗腫瘍療法において進行したか、または抗腫瘍療法に不応性になっている。別の実施形態では、患者は、抗悪性腫瘍剤による前治療後に抗腫瘍療法に耐性になっている。別の実施形態において、患者は、抗悪性腫瘍薬による前治療後の、疾患の進行または再発後に治療される。別の実施形態において、患者は、抗悪性腫瘍剤による治療の失敗後に治療される。別の実施形態において、癌は、抗悪性腫瘍剤に対する耐性を獲得した癌として同定される。
【００１３】
別の実施形態において、患者は、結腸直腸癌、転移性結腸直腸癌（例えば、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、及び／またはＢＲＡＦ野生型転移性結腸直腸癌）、扁平上皮細胞頭頸部癌、再発性または転移性頭頸部癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、腎癌、胃腸／結腸癌、肺癌（例えば、ＮＳＣＬＣ）、または前立腺癌である。
【００１４】
さらに他の実施形態において、本発明の方法に従って試験及び／または治療される腫瘍は、皮膚、中枢神経系、頭部、頸部、食道、胃、結腸、直腸、肛門、肝臓、膵臓、胆管、胆嚢、肺、乳房、卵巣、子宮、子宮頸部、膣、精巣、生殖細胞、前立腺、腎臓、尿管、膀胱、副腎、下垂体、甲状腺、骨、筋肉または結合組織の腫瘍を含む。
【００１５】
一実施形態では、腫瘍は、ＦＤＡ承認試験に基づいて、ＥＧＦＲ細胞外ドメインに少なくとも１つの変異を有する細胞を含むと決定される。別の実施形態では、腫瘍は、ＥＧＦＲ細胞外ドメインのドメインＩＩＩに変異を有する細胞を含む。別の実施形態では、腫瘍は、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１２に変異を有する細胞を含む。
【００１６】
特定の実施形態では、本発明の方法は、腫瘍の生検サンプルを取得することと、ポリメラーゼ連鎖反応または次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を用いて、該腫瘍がＥＧＦＲの細胞外ドメインをコードするＤＮＡまたはＲＮＡに少なくとも１つの変異を有するかどうかを決定することとを含む。別の実施形態では、この方法は、腫瘍の生検サンプルを取得することと、免疫組織化学的検査または質量分析を用いて、該腫瘍がＥＧＦＲの細胞外ドメインに少なくとも１つの変異を有するかどうかを決定することとを含む。別の実施形態では、この方法は、患者から血液サンプルを得ることと、該血液サンプルが、ＥＧＦＲの細胞外ドメインをコードする配列中に１つ以上の変異を有する循環ＤＮＡを含むかどうかを決定することとを含む。
【００１７】
特定の実施形態では、循環ＤＮＡは、血液サンプルから単離された無細胞ＤＮＡであるか、または血液サンプル中の循環腫瘍細胞から単離される。他の実施形態では、循環ＤＮＡは、血液サンプル中の循環エキソソームから単離されたＤＮＡまたはＲＮＡである。他の実施形態において、循環ＤＮＡは、尿サンプルから単離された無細胞ＤＮＡである。他の実施形態では、生検腫瘍細胞、循環腫瘍細胞、または無細胞ＤＮＡは、ＥＧＦＲの細胞外ドメインをコードするＤＮＡまたはＲＮＡにおける少なくとも１つの変異を有し、かつこの少なくとも１つの変異は、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１２にある。
【００１８】
別の実施形態では、ＥＧＦＲの細胞外ドメインにおける変異は、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ、Ｓ４６４Ｌ、Ｋ４６７Ｔ、Ｇ４６５Ｒ、Ｇ４６５Ｅ、Ｉ４９１Ｍ、及びＳ４９２Ｒ及びから本質的になる群より選択される、タンパク質配列変化にあるか、またはタンパク質配列変化をもたらすＤＮＡもしくはＲＮＡコード領域にある。特定の実施形態では、タンパク質配列変化はＳ４９２Ｒにある。
【００１９】
別の実施形態では、本明細書に記載の治療方法は、抗ＥＧＦＲ抗体を１つ以上の他の抗悪性腫瘍剤（例えば、他の化学療法剤または他の小分子薬物）と組み合わせて投与することを含む。一実施形態では、治療サイクル内に３つ以下の他の抗悪性腫瘍剤を投与する。別の実施形態では、２つ以下の他の抗悪性腫瘍剤が治療サイクル内に投与される。別の実施形態では、１つのみの他の抗悪性腫瘍剤が治療サイクル内に投与される。別の実施形態では、治療サイクル内に他の抗悪性腫瘍剤は投与されない。
【００２０】
また、患者にオリゴクローナル抗上皮成長因子受容体（抗ＥＧＦＲ）抗体の組み合わせを投与することを含む、ヒト患者における上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）変異癌を治療する方法も提供される。一実施形態では、第１のモノクローナル抗体はＰ１Ｘであり、第２のモノクローナル抗体はＰ２Ｘであり、第３のモノクローナル抗体はＰ３Ｘであり、かつオリゴクローナル抗体の組み合わせは２：２：１のモル比でＰ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘを含む。別の実施形態では、第１のモノクローナル抗体は、それぞれ配列番号１、２及び３の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号４、５及び６の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含み、第２のモノクローナル抗体は、それぞれ配列番号７、８及び９の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１０、１１及び１２の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含み、そして第３のモノクローナル抗体は、それぞれ配列番号１３、１４及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１６、１７及び１８の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む。別の実施形態では、第１のモノクローナル抗体は、それぞれ配列番号１、２及び３の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号４、５及び６の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含み、第２のモノクローナル抗体は、それぞれ配列番号７、８及び９の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１０、１１及び１２の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含み、そして第３のモノクローナル抗体は、それぞれ配列番号１３、１４、及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１６、１７及び１８の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む。一実施形態では、この方法は、異なる抗ＥＧＦＲ療法（例えば、セツキシマブ、パニツムマブまたはＳｙｍ００４）による癌の治療後に、ヒト患者のＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）変異癌を治療することを含む。一実施形態では、患者から血液サンプルを得て、ＥＧＦＲの細胞外ドメインをコードする配列中の１つ以上の変異を有する循環ＤＮＡを含むと決定した後、オリゴクローナル抗体の組み合わせを患者に投与する。一実施形態では、患者の血液中のＥＧＦＲ細胞外ドメインのドメインＩＩＩまたはドメインＩＶの変異の検出後に、オリゴクローナル抗体の組み合わせを患者に投与する。別の実施形態では、ヒト患者のＥＧＦＲのＥＣＤ領域におけるエクソン１２変異の検出後に、オリゴクローナル抗体の組み合わせを患者に投与する。
【００２１】
１つの実施形態において、癌は、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ、Ｓ４６４Ｌ、Ｋ４６７Ｔ、Ｇ４６５Ｒ、Ｇ４６５Ｅ、Ｉ４９１Ｍ、及びＳ４９２Ｒからなる群より選択される、タンパク質配列変化であるか、または、タンパク質配列変化をもたらすＤＮＡもしくはＲＮＡコード領域である、ＥＧＦＲの細胞外ドメインにおける少なくとも１つの変異を含む。別の実施形態では、ＥＧＦＲの細胞外ドメインにおける変異は、配列番号２７（すなわち、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに対応するアミノ酸配列）の４５１位のアルギニンからシステインである。別の実施形態では、ＥＧＦＲの細胞外ドメインにおける変異は、配列番号２７の４６４位のセリンからロイシンである。別の実施形態では、ＥＧＦＲの細胞外ドメインにおける変異は、配列番号２７の４６７位のリシンからトレオニンである。別の実施形態では、ＥＧＦＲの細胞外ドメインにおける変異は、配列番号２７の４６５位のグリシンからアルギニンである。別の実施形態では、ＥＧＦＲの細胞外ドメインにおける変異は、配列番号２７の４６５位でグリシンからグルタミン酸である。別の実施形態では、ＥＧＦＲの細胞外ドメインにおける変異は、配列番号２７の４９１位のイソロイシンからメチオニンである。別の実施形態では、ＥＧＦＲの細胞外ドメインにおける変異は、配列番号２７の位置４９２のセリンからアルギニンである。
【００２２】
一実施形態では、治療方法は、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、及び／またはＢＲＡＦ野生型転移性結腸直腸癌などのＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）変異癌の治療を含む。一実施形態では、変異癌は、ＦＤＡ承認試験によって決定されたＫ−Ｒａｓ野生型、ＥＧＦＲ発現転移性結腸直腸癌である。別の実施形態において、変異癌は、頭頸部癌（例えば、頭頸部の局所的または局所的に進行した扁平上皮癌）である。別の実施形態において、変異癌は、ＦＤＡ承認試験によって決定されるように、Ｒａｓ−野生型ＫＲＡＳ（エクソン２）転移性結腸直腸癌（ｍＣＲＣ）である。
【００２３】
別の態様において、該方法は、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ、Ｓ４６４Ｌ、Ｋ４６７Ｔ、Ｇ４６５Ｒ、Ｇ４６５Ｅ、Ｉ４９１Ｍ、及びＳ４９２Ｒからなる群より選択されるＥＧＦＲのＥＣＤにおいて検出された変異を少なくとも１つ有する上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）変異癌を有するヒト患者を治療することを包含し、該方法は、３つのモノクローナル抗体であって、第１のモノクローナル抗体はＰ１Ｘであり、第２のモノクローナル抗体はＰ２Ｘであり、第３のモノクローナル抗体はＰ３Ｘであり、このオリゴクローナル抗体の組み合わせは、Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘを２：２：１のモル比で含む、該３つのモノクローナル抗体でオリゴクローナル抗上皮成長因子レセプター（抗ＥＧＦＲ）抗体の組み合わせを患者に投与することを含む。
【００２４】
別の態様では、該方法は、ＥＧＦＲのＥＣＤのドメインＩＩＩまたはドメインＩＶにおいて検出された変異を有する上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）変異癌を有するヒト患者を治療することを含み、該方法は該患者にＭＭ−１５１オリゴクローナル抗上皮成長因子レセプター（抗ＥＧＦＲ）抗体の組み合わせの治療有効量を投与することを含み、このオリゴクローナル抗体の組み合わせはＰ１Ｘモノクローナル抗体、Ｐ２Ｘモノクローナル抗体及びＰ３Ｘモノクローナル抗体の２：２：１のモル比からなる。
【００２５】
また、ヒト患者のＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）変異癌の治療におけるオリゴクローナル抗上皮成長因子受容体（抗ＥＧＦＲ）抗体の組み合わせ（例えば、ＭＭ−１５１）の使用が提供される。一実施形態では、第１のモノクローナル抗体はＰ１Ｘであり、第２のモノクローナル抗体はＰ２Ｘであり、第３のモノクローナル抗体はＰ３Ｘであり、このオリゴクローナル抗体の組み合わせは、Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘを２：２：１のモル比で含む。別の実施形態では、第１のモノクローナル抗体は、それぞれ配列番号１、２及び３の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号４、５、６及び７の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含み、第２のモノクローナル抗体は、それぞれ配列番号７、８及び９の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１０、１１及び１２の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含みそして第３のモノクローナル抗体は、それぞれ配列番号１３、１４、及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１６、１７及び１８の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む。別の実施形態では、第１のモノクローナル抗体は、それぞれ配列番号１、２及び３の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号４、５、６及び７の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含み、第２のモノクローナル抗体は、それぞれ配列番号７、８及び９の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１０、１１及び１２の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含み、そして第３のモノクローナル抗体は、それぞれ配列番号１３、１４、及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１６、１７及び１８の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む。
【００２６】
一実施形態では、ヒト患者のＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）変異癌の治療におけるオリゴクローナル抗上皮成長因子受容体（抗ＥＧＦＲ）抗体の組み合わせ（例えば、ＭＭ−１５１）の使用は、異なる抗ＥＧＦＲ療法（例えば、セツキシマブ、パニツムマブまたはＳｙｍ００４）による治療に続く。一実施形態では、この使用は、ヒト患者のＥＧＦＲ細胞外ドメインのドメインＩＩＩまたはドメインＩＶの変異の検出に続く。別の実施形態では、この使用は、ヒト患者のＥＧＦＲのＥＣＤ領域におけるエクソン１２変異の検出に続く。別の実施形態では、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ、Ｓ４６４Ｌ、Ｋ４６７Ｔ、Ｇ４６５Ｒ、Ｇ４６５Ｅ、Ｉ４９１Ｍ、及びＳ４９２Ｒからなる群より選択される、タンパク質配列の変化であるＥＧＦＲの細胞外ドメインに少なくとも１つの変異、またはタンパク質配列の変化をもたらすＤＮＡもしくはＲＮＡコード領域にある。一実施形態では、変異は、患者から血液サンプルを得て、血液サンプルがＥＧＦＲの細胞外ドメインをコードする配列中の１つ以上の変異を有する循環ＤＮＡを含有することを決定した後に検出される。
【００２７】
一実施形態では、この使用は、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、及び／またはＢＲＡＦ野生型転移性結腸直腸癌などのＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）変異癌の治療を含む。一実施形態では、変異癌は、ＦＤＡ承認試験によって決定されたＲａｓ野生型、ＥＧＦＲ発現転移性結腸直腸癌である。別の実施形態において、変異癌は、頭頸部癌（例えば、頭頸部の局所的または局所的に進行した扁平上皮癌）である。別の実施形態において、変異癌は、ＦＤＡ承認試験によって決定されるように、Ｒａｓ−野生型転移性結腸直腸癌（ｍＣＲＣ）である。
【００２８】
さらに提供されるのは、ＥＧＦＲのＥＣＤにおいて少なくとも１つの検出された変異を有する上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）変異癌の処置における、オリゴクローナル抗上皮成長因子受容体（抗ＥＧＦＲ）（抗ＥＧＦＲ）抗体の組み合わせが、３つのモノクローナル抗体を含み、第１のモノクローナル抗体がＰ１Ｘである、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ、Ｓ４６４Ｌ、Ｋ４６７Ｔ、Ｇ４６５Ｒ、Ｇ４６５Ｅ、Ｉ４９１Ｍ及びＳ４９２Ｒからなる群より選択される。第２のモノクローナル抗体はＰ２Ｘであり、第３のモノクローナル抗体はＰ３Ｘであり、このオリゴクローナル抗体の組み合わせは２：２：１のモル比のＰ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｇは、ＥＧＦリガンドとＥＧＦＲ変異体との相互作用を示す７つのグラフである。示されたＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ＥＧＦＲ変異体を発現するプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、次いで過剰量の未標識ＥＧＦの存在下（丸いマーカー付きのライトグレーの線）または非存在下（三角マーカー付きの黒い線）で、ＥＧＦトレーサー（ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）−ＥＧＦ）の用量を増加させて処理して、ＥＧＦトレーサーがＥＧＦＲ野生型（図１Ａ）、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図１Ｂ）、Ｓ４６４Ｌ（図１Ｃ）、Ｋ４６７Ｔ（図１Ｄ）及びＥＧＦＲ野生型（図１Ｅ）、Ｉ４９１Ｍ（図１Ｆ）及びＳ４９２Ｒ（図１Ｇ）を含む、ＮａｎｏＬｕｃ−ＥＧＦＲに効果的に結合できることを評価した。非標識ＥＧＦ（四角マーカー付きのダークグレーの線）の増加用量が、測定されたシグナルがＨａｌｏＴａｇ（登録商標）−ＥＧＦに対応することを実証するために、アッセイ対照として使用された。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｇは、ＥＧＦリガンドとＥＧＦＲ変異体との相互作用を示す７つのグラフである。示されたＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ＥＧＦＲ変異体を発現するプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、次いで過剰量の未標識ＥＧＦの存在下（丸いマーカー付きのライトグレーの線）または非存在下（三角マーカー付きの黒い線）で、ＥＧＦトレーサー（ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）−ＥＧＦ）の用量を増加させて処理して、ＥＧＦトレーサーがＥＧＦＲ野生型（図１Ａ）、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図１Ｂ）、Ｓ４６４Ｌ（図１Ｃ）、Ｋ４６７Ｔ（図１Ｄ）及びＥＧＦＲ野生型（図１Ｅ）、Ｉ４９１Ｍ（図１Ｆ）及びＳ４９２Ｒ（図１Ｇ）を含む、ＮａｎｏＬｕｃ−ＥＧＦＲに効果的に結合できることを評価した。非標識ＥＧＦ（四角マーカー付きのダークグレーの線）の増加用量が、測定されたシグナルがＨａｌｏＴａｇ（登録商標）−ＥＧＦに対応することを実証するために、アッセイ対照として使用された。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｇは、ＥＧＦリガンドとＥＧＦＲ変異体との相互作用を示す７つのグラフである。示されたＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ＥＧＦＲ変異体を発現するプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、次いで過剰量の未標識ＥＧＦの存在下（丸いマーカー付きのライトグレーの線）または非存在下（三角マーカー付きの黒い線）で、ＥＧＦトレーサー（ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）−ＥＧＦ）の用量を増加させて処理して、ＥＧＦトレーサーがＥＧＦＲ野生型（図１Ａ）、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図１Ｂ）、Ｓ４６４Ｌ（図１Ｃ）、Ｋ４６７Ｔ（図１Ｄ）及びＥＧＦＲ野生型（図１Ｅ）、Ｉ４９１Ｍ（図１Ｆ）及びＳ４９２Ｒ（図１Ｇ）を含む、ＮａｎｏＬｕｃ−ＥＧＦＲに効果的に結合できることを評価した。非標識ＥＧＦ（四角マーカー付きのダークグレーの線）の増加用量が、測定されたシグナルがＨａｌｏＴａｇ（登録商標）−ＥＧＦに対応することを実証するために、アッセイ対照として使用された。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｇは、ＥＧＦリガンドとＥＧＦＲ変異体との相互作用を示す７つのグラフである。示されたＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ＥＧＦＲ変異体を発現するプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、次いで過剰量の未標識ＥＧＦの存在下（丸いマーカー付きのライトグレーの線）または非存在下（三角マーカー付きの黒い線）で、ＥＧＦトレーサー（ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）−ＥＧＦ）の用量を増加させて処理して、ＥＧＦトレーサーがＥＧＦＲ野生型（図１Ａ）、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図１Ｂ）、Ｓ４６４Ｌ（図１Ｃ）、Ｋ４６７Ｔ（図１Ｄ）及びＥＧＦＲ野生型（図１Ｅ）、Ｉ４９１Ｍ（図１Ｆ）及びＳ４９２Ｒ（図１Ｇ）を含む、ＮａｎｏＬｕｃ−ＥＧＦＲに効果的に結合できることを評価した。非標識ＥＧＦ（四角マーカー付きのダークグレーの線）の増加用量が、測定されたシグナルがＨａｌｏＴａｇ（登録商標）−ＥＧＦに対応することを実証するために、アッセイ対照として使用された。
【図１Ｅ】図１Ａ〜１Ｇは、ＥＧＦリガンドとＥＧＦＲ変異体との相互作用を示す７つのグラフである。示されたＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ＥＧＦＲ変異体を発現するプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、次いで過剰量の未標識ＥＧＦの存在下（丸いマーカー付きのライトグレーの線）または非存在下（三角マーカー付きの黒い線）で、ＥＧＦトレーサー（ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）−ＥＧＦ）の用量を増加させて処理して、ＥＧＦトレーサーがＥＧＦＲ野生型（図１Ａ）、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図１Ｂ）、Ｓ４６４Ｌ（図１Ｃ）、Ｋ４６７Ｔ（図１Ｄ）及びＥＧＦＲ野生型（図１Ｅ）、Ｉ４９１Ｍ（図１Ｆ）及びＳ４９２Ｒ（図１Ｇ）を含む、ＮａｎｏＬｕｃ−ＥＧＦＲに効果的に結合できることを評価した。非標識ＥＧＦ（四角マーカー付きのダークグレーの線）の増加用量が、測定されたシグナルがＨａｌｏＴａｇ（登録商標）−ＥＧＦに対応することを実証するために、アッセイ対照として使用された。
【図１Ｆ】図１Ａ〜１Ｇは、ＥＧＦリガンドとＥＧＦＲ変異体との相互作用を示す７つのグラフである。示されたＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ＥＧＦＲ変異体を発現するプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、次いで過剰量の未標識ＥＧＦの存在下（丸いマーカー付きのライトグレーの線）または非存在下（三角マーカー付きの黒い線）で、ＥＧＦトレーサー（ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）−ＥＧＦ）の用量を増加させて処理して、ＥＧＦトレーサーがＥＧＦＲ野生型（図１Ａ）、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図１Ｂ）、Ｓ４６４Ｌ（図１Ｃ）、Ｋ４６７Ｔ（図１Ｄ）及びＥＧＦＲ野生型（図１Ｅ）、Ｉ４９１Ｍ（図１Ｆ）及びＳ４９２Ｒ（図１Ｇ）を含む、ＮａｎｏＬｕｃ−ＥＧＦＲに効果的に結合できることを評価した。非標識ＥＧＦ（四角マーカー付きのダークグレーの線）の増加用量が、測定されたシグナルがＨａｌｏＴａｇ（登録商標）−ＥＧＦに対応することを実証するために、アッセイ対照として使用された。
【図１Ｇ】図１Ａ〜１Ｇは、ＥＧＦリガンドとＥＧＦＲ変異体との相互作用を示す７つのグラフである。示されたＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ＥＧＦＲ変異体を発現するプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、次いで過剰量の未標識ＥＧＦの存在下（丸いマーカー付きのライトグレーの線）または非存在下（三角マーカー付きの黒い線）で、ＥＧＦトレーサー（ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）−ＥＧＦ）の用量を増加させて処理して、ＥＧＦトレーサーがＥＧＦＲ野生型（図１Ａ）、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図１Ｂ）、Ｓ４６４Ｌ（図１Ｃ）、Ｋ４６７Ｔ（図１Ｄ）及びＥＧＦＲ野生型（図１Ｅ）、Ｉ４９１Ｍ（図１Ｆ）及びＳ４９２Ｒ（図１Ｇ）を含む、ＮａｎｏＬｕｃ−ＥＧＦＲに効果的に結合できることを評価した。非標識ＥＧＦ（四角マーカー付きのダークグレーの線）の増加用量が、測定されたシグナルがＨａｌｏＴａｇ（登録商標）−ＥＧＦに対応することを実証するために、アッセイ対照として使用された。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｇは、ＭＭ−１５１が薬物置換アッセイにおいて全てのＥＧＦＲ外部ドメイン変異体に結合できることを示す７つのグラフである。ＨＥＫ２９３細胞に、野生型ＥＧＦＲ（図２Ａ）Ｒ及びＮａｎｏＬｕｃ−ＥＧＦＲ変異体ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図２Ｂ）、Ｓ４６４Ｌ（図２Ｃ）、Ｋ４６７Ｔ（図２Ｄ）、Ｇ４６５Ｒ（図２Ｅ）、Ｉ４９１Ｍ（図２Ｆ）、及びＳ４９２Ｒ（図２Ｇ）を発現するプラスミドをトランスフェクトした。変異を次に抗ＥＧＦＲ薬セツキシマブ（「ＣＭＡＢ」、グレーの三角）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」、ライトグレーの円）またはＭＭ−１５１（黒い四角）及びＨａｌｏＴａｇ−ＥＧＦトレーサー（１８ｎｇ／ｍＬの濃度で）の漸増用量（０〜１００μｇ／ｍｌ）で処置した。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｇは、ＭＭ−１５１が薬物置換アッセイにおいて全てのＥＧＦＲ外部ドメイン変異体に結合できることを示す７つのグラフである。ＨＥＫ２９３細胞に、野生型ＥＧＦＲ（図２Ａ）Ｒ及びＮａｎｏＬｕｃ−ＥＧＦＲ変異体ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図２Ｂ）、Ｓ４６４Ｌ（図２Ｃ）、Ｋ４６７Ｔ（図２Ｄ）、Ｇ４６５Ｒ（図２Ｅ）、Ｉ４９１Ｍ（図２Ｆ）、及びＳ４９２Ｒ（図２Ｇ）を発現するプラスミドをトランスフェクトした。変異を次に抗ＥＧＦＲ薬セツキシマブ（「ＣＭＡＢ」、グレーの三角）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」、ライトグレーの円）またはＭＭ−１５１（黒い四角）及びＨａｌｏＴａｇ−ＥＧＦトレーサー（１８ｎｇ／ｍＬの濃度で）の漸増用量（０〜１００μｇ／ｍｌ）で処置した。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｇは、ＭＭ−１５１が薬物置換アッセイにおいて全てのＥＧＦＲ外部ドメイン変異体に結合できることを示す７つのグラフである。ＨＥＫ２９３細胞に、野生型ＥＧＦＲ（図２Ａ）Ｒ及びＮａｎｏＬｕｃ−ＥＧＦＲ変異体ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図２Ｂ）、Ｓ４６４Ｌ（図２Ｃ）、Ｋ４６７Ｔ（図２Ｄ）、Ｇ４６５Ｒ（図２Ｅ）、Ｉ４９１Ｍ（図２Ｆ）、及びＳ４９２Ｒ（図２Ｇ）を発現するプラスミドをトランスフェクトした。変異を次に抗ＥＧＦＲ薬セツキシマブ（「ＣＭＡＢ」、グレーの三角）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」、ライトグレーの円）またはＭＭ−１５１（黒い四角）及びＨａｌｏＴａｇ−ＥＧＦトレーサー（１８ｎｇ／ｍＬの濃度で）の漸増用量（０〜１００μｇ／ｍｌ）で処置した。
【図２Ｄ】図２Ａ〜２Ｇは、ＭＭ−１５１が薬物置換アッセイにおいて全てのＥＧＦＲ外部ドメイン変異体に結合できることを示す７つのグラフである。ＨＥＫ２９３細胞に、野生型ＥＧＦＲ（図２Ａ）Ｒ及びＮａｎｏＬｕｃ−ＥＧＦＲ変異体ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図２Ｂ）、Ｓ４６４Ｌ（図２Ｃ）、Ｋ４６７Ｔ（図２Ｄ）、Ｇ４６５Ｒ（図２Ｅ）、Ｉ４９１Ｍ（図２Ｆ）、及びＳ４９２Ｒ（図２Ｇ）を発現するプラスミドをトランスフェクトした。変異を次に抗ＥＧＦＲ薬セツキシマブ（「ＣＭＡＢ」、グレーの三角）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」、ライトグレーの円）またはＭＭ−１５１（黒い四角）及びＨａｌｏＴａｇ−ＥＧＦトレーサー（１８ｎｇ／ｍＬの濃度で）の漸増用量（０〜１００μｇ／ｍｌ）で処置した。
【図２Ｅ】図２Ａ〜２Ｇは、ＭＭ−１５１が薬物置換アッセイにおいて全てのＥＧＦＲ外部ドメイン変異体に結合できることを示す７つのグラフである。ＨＥＫ２９３細胞に、野生型ＥＧＦＲ（図２Ａ）Ｒ及びＮａｎｏＬｕｃ−ＥＧＦＲ変異体ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図２Ｂ）、Ｓ４６４Ｌ（図２Ｃ）、Ｋ４６７Ｔ（図２Ｄ）、Ｇ４６５Ｒ（図２Ｅ）、Ｉ４９１Ｍ（図２Ｆ）、及びＳ４９２Ｒ（図２Ｇ）を発現するプラスミドをトランスフェクトした。変異を次に抗ＥＧＦＲ薬セツキシマブ（「ＣＭＡＢ」、グレーの三角）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」、ライトグレーの円）またはＭＭ−１５１（黒い四角）及びＨａｌｏＴａｇ−ＥＧＦトレーサー（１８ｎｇ／ｍＬの濃度で）の漸増用量（０〜１００μｇ／ｍｌ）で処置した。
【図２Ｆ】図２Ａ〜２Ｇは、ＭＭ−１５１が薬物置換アッセイにおいて全てのＥＧＦＲ外部ドメイン変異体に結合できることを示す７つのグラフである。ＨＥＫ２９３細胞に、野生型ＥＧＦＲ（図２Ａ）Ｒ及びＮａｎｏＬｕｃ−ＥＧＦＲ変異体ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図２Ｂ）、Ｓ４６４Ｌ（図２Ｃ）、Ｋ４６７Ｔ（図２Ｄ）、Ｇ４６５Ｒ（図２Ｅ）、Ｉ４９１Ｍ（図２Ｆ）、及びＳ４９２Ｒ（図２Ｇ）を発現するプラスミドをトランスフェクトした。変異を次に抗ＥＧＦＲ薬セツキシマブ（「ＣＭＡＢ」、グレーの三角）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」、ライトグレーの円）またはＭＭ−１５１（黒い四角）及びＨａｌｏＴａｇ−ＥＧＦトレーサー（１８ｎｇ／ｍＬの濃度で）の漸増用量（０〜１００μｇ／ｍｌ）で処置した。
【図２Ｇ】図２Ａ〜２Ｇは、ＭＭ−１５１が薬物置換アッセイにおいて全てのＥＧＦＲ外部ドメイン変異体に結合できることを示す７つのグラフである。ＨＥＫ２９３細胞に、野生型ＥＧＦＲ（図２Ａ）Ｒ及びＮａｎｏＬｕｃ−ＥＧＦＲ変異体ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図２Ｂ）、Ｓ４６４Ｌ（図２Ｃ）、Ｋ４６７Ｔ（図２Ｄ）、Ｇ４６５Ｒ（図２Ｅ）、Ｉ４９１Ｍ（図２Ｆ）、及びＳ４９２Ｒ（図２Ｇ）を発現するプラスミドをトランスフェクトした。変異を次に抗ＥＧＦＲ薬セツキシマブ（「ＣＭＡＢ」、グレーの三角）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」、ライトグレーの円）またはＭＭ−１５１（黒い四角）及びＨａｌｏＴａｇ−ＥＧＦトレーサー（１８ｎｇ／ｍＬの濃度で）の漸増用量（０〜１００μｇ／ｍｌ）で処置した。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｈは、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異体を過剰発現し、セツキシマブまたはセツキシマブ及びパニツムマブに耐性であるＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す８つのグラフである。ＬＩＭ１２１５を、示されたＥＧＦＲ外部ドメイン変異体を発現するレンチウイルスに感染させ、選択された細胞を、漸増濃度のセツキシマブ（「ＣＭＡＢ」；三角マーカー付きのダークグレーの線）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」、丸いマーカー付きライトグレーの線）及びＭＭ−１５１（正方形のマーカー付きの黒い線）で６日間処理した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。示した変異体及び対照は、ＧＦＰ対照（図３Ａ）、ＥＧＦＲ野生型（図３Ｂ）、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図３Ｃ）、Ｓ４６４Ｌ（図３Ｄ）、Ｋ４６７Ｔ（図３Ｅ）、Ｇ４６５Ｒ（図３Ｆ）、Ｉ４９１Ｍ（図３Ｇ）、及びＳ４９２Ｒ（図３Ｈ）である。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｈは、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異体を過剰発現し、セツキシマブまたはセツキシマブ及びパニツムマブに耐性であるＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す８つのグラフである。ＬＩＭ１２１５を、示されたＥＧＦＲ外部ドメイン変異体を発現するレンチウイルスに感染させ、選択された細胞を、漸増濃度のセツキシマブ（「ＣＭＡＢ」；三角マーカー付きのダークグレーの線）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」、丸いマーカー付きライトグレーの線）及びＭＭ−１５１（正方形のマーカー付きの黒い線）で６日間処理した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。示した変異体及び対照は、ＧＦＰ対照（図３Ａ）、ＥＧＦＲ野生型（図３Ｂ）、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図３Ｃ）、Ｓ４６４Ｌ（図３Ｄ）、Ｋ４６７Ｔ（図３Ｅ）、Ｇ４６５Ｒ（図３Ｆ）、Ｉ４９１Ｍ（図３Ｇ）、及びＳ４９２Ｒ（図３Ｈ）である。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｈは、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異体を過剰発現し、セツキシマブまたはセツキシマブ及びパニツムマブに耐性であるＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す８つのグラフである。ＬＩＭ１２１５を、示されたＥＧＦＲ外部ドメイン変異体を発現するレンチウイルスに感染させ、選択された細胞を、漸増濃度のセツキシマブ（「ＣＭＡＢ」；三角マーカー付きのダークグレーの線）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」、丸いマーカー付きライトグレーの線）及びＭＭ−１５１（正方形のマーカー付きの黒い線）で６日間処理した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。示した変異体及び対照は、ＧＦＰ対照（図３Ａ）、ＥＧＦＲ野生型（図３Ｂ）、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図３Ｃ）、Ｓ４６４Ｌ（図３Ｄ）、Ｋ４６７Ｔ（図３Ｅ）、Ｇ４６５Ｒ（図３Ｆ）、Ｉ４９１Ｍ（図３Ｇ）、及びＳ４９２Ｒ（図３Ｈ）である。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｈは、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異体を過剰発現し、セツキシマブまたはセツキシマブ及びパニツムマブに耐性であるＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す８つのグラフである。ＬＩＭ１２１５を、示されたＥＧＦＲ外部ドメイン変異体を発現するレンチウイルスに感染させ、選択された細胞を、漸増濃度のセツキシマブ（「ＣＭＡＢ」；三角マーカー付きのダークグレーの線）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」、丸いマーカー付きライトグレーの線）及びＭＭ−１５１（正方形のマーカー付きの黒い線）で６日間処理した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。示した変異体及び対照は、ＧＦＰ対照（図３Ａ）、ＥＧＦＲ野生型（図３Ｂ）、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図３Ｃ）、Ｓ４６４Ｌ（図３Ｄ）、Ｋ４６７Ｔ（図３Ｅ）、Ｇ４６５Ｒ（図３Ｆ）、Ｉ４９１Ｍ（図３Ｇ）、及びＳ４９２Ｒ（図３Ｈ）である。
【図３Ｅ】図３Ａ〜３Ｈは、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異体を過剰発現し、セツキシマブまたはセツキシマブ及びパニツムマブに耐性であるＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す８つのグラフである。ＬＩＭ１２１５を、示されたＥＧＦＲ外部ドメイン変異体を発現するレンチウイルスに感染させ、選択された細胞を、漸増濃度のセツキシマブ（「ＣＭＡＢ」；三角マーカー付きのダークグレーの線）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」、丸いマーカー付きライトグレーの線）及びＭＭ−１５１（正方形のマーカー付きの黒い線）で６日間処理した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。示した変異体及び対照は、ＧＦＰ対照（図３Ａ）、ＥＧＦＲ野生型（図３Ｂ）、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図３Ｃ）、Ｓ４６４Ｌ（図３Ｄ）、Ｋ４６７Ｔ（図３Ｅ）、Ｇ４６５Ｒ（図３Ｆ）、Ｉ４９１Ｍ（図３Ｇ）、及びＳ４９２Ｒ（図３Ｈ）である。
【図３Ｆ】図３Ａ〜３Ｈは、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異体を過剰発現し、セツキシマブまたはセツキシマブ及びパニツムマブに耐性であるＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す８つのグラフである。ＬＩＭ１２１５を、示されたＥＧＦＲ外部ドメイン変異体を発現するレンチウイルスに感染させ、選択された細胞を、漸増濃度のセツキシマブ（「ＣＭＡＢ」；三角マーカー付きのダークグレーの線）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」、丸いマーカー付きライトグレーの線）及びＭＭ−１５１（正方形のマーカー付きの黒い線）で６日間処理した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。示した変異体及び対照は、ＧＦＰ対照（図３Ａ）、ＥＧＦＲ野生型（図３Ｂ）、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図３Ｃ）、Ｓ４６４Ｌ（図３Ｄ）、Ｋ４６７Ｔ（図３Ｅ）、Ｇ４６５Ｒ（図３Ｆ）、Ｉ４９１Ｍ（図３Ｇ）、及びＳ４９２Ｒ（図３Ｈ）である。
【図３Ｇ】図３Ａ〜３Ｈは、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異体を過剰発現し、セツキシマブまたはセツキシマブ及びパニツムマブに耐性であるＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す８つのグラフである。ＬＩＭ１２１５を、示されたＥＧＦＲ外部ドメイン変異体を発現するレンチウイルスに感染させ、選択された細胞を、漸増濃度のセツキシマブ（「ＣＭＡＢ」；三角マーカー付きのダークグレーの線）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」、丸いマーカー付きライトグレーの線）及びＭＭ−１５１（正方形のマーカー付きの黒い線）で６日間処理した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。示した変異体及び対照は、ＧＦＰ対照（図３Ａ）、ＥＧＦＲ野生型（図３Ｂ）、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図３Ｃ）、Ｓ４６４Ｌ（図３Ｄ）、Ｋ４６７Ｔ（図３Ｅ）、Ｇ４６５Ｒ（図３Ｆ）、Ｉ４９１Ｍ（図３Ｇ）、及びＳ４９２Ｒ（図３Ｈ）である。
【図３Ｈ】図３Ａ〜３Ｈは、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異体を過剰発現し、セツキシマブまたはセツキシマブ及びパニツムマブに耐性であるＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す８つのグラフである。ＬＩＭ１２１５を、示されたＥＧＦＲ外部ドメイン変異体を発現するレンチウイルスに感染させ、選択された細胞を、漸増濃度のセツキシマブ（「ＣＭＡＢ」；三角マーカー付きのダークグレーの線）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」、丸いマーカー付きライトグレーの線）及びＭＭ−１５１（正方形のマーカー付きの黒い線）で６日間処理した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。示した変異体及び対照は、ＧＦＰ対照（図３Ａ）、ＥＧＦＲ野生型（図３Ｂ）、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図３Ｃ）、Ｓ４６４Ｌ（図３Ｄ）、Ｋ４６７Ｔ（図３Ｅ）、Ｇ４６５Ｒ（図３Ｆ）、Ｉ４９１Ｍ（図３Ｇ）、及びＳ４９２Ｒ（図３Ｈ）である。
【図４Ａ−Ｄ】図４Ａ〜４Ｈは、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異体を過剰発現するＬＩＭ１２１５細胞におけるＥＧＦＲシグナル伝達のウェスタンブロット分析の一連の画像である。示されたＥＧＦＲ外部ドメイン変異体を発現するレンチウイルスにＬＩＭ１２１５細胞を感染させた。示した変異体及び対照は、ＧＦＰ対照（図３Ａ）、ＥＧＦＲ野生型（図３Ｂ）、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図３Ｃ）、Ｓ４６４Ｌ（図３Ｄ）、Ｋ４６７Ｔ（図３Ｅ）、Ｇ４６５Ｒ（図３Ｆ）、Ｉ４９１Ｍ（図３Ｇ）、及びＳ４９２Ｒ（図３Ｈ）である。選択された細胞をセツキシマブ（「ＣＥＴＵＸ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）またはＭＭ−１５１の存在下で２時間培養し、次いでＥＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）で１５分間刺激した。ホスホＥＧＦＲ（「ｐＥＧＦＲ」）、総細胞ＥＧＦＲ（「ＴＯＴ  ＥＧＦＲ」）、ホスホＡＫＴ（「ｐＡＫＴ」）、総細胞ＡＫＴ（「ＴＯＴ  ＡＫＴ」）、ホスホＥＲＫ（「ｐＥＲＫ」）、総細胞ＥＲＫ（「ＴＯＴ  ＥＲＫ」）ならびにビンキュリン（パネル内のサンプルにわたって同様のタンパク質濃度を示すハウスキーピング対照）を含む、示されたタンパク質に特異的な抗体を用いて細胞溶解物に対してウェスタンブロット分析を行った。
【図４Ｅ−Ｈ】図４Ａ〜４Ｈは、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異体を過剰発現するＬＩＭ１２１５細胞におけるＥＧＦＲシグナル伝達のウェスタンブロット分析の一連の画像である。示されたＥＧＦＲ外部ドメイン変異体を発現するレンチウイルスにＬＩＭ１２１５細胞を感染させた。示した変異体及び対照は、ＧＦＰ対照（図３Ａ）、ＥＧＦＲ野生型（図３Ｂ）、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図３Ｃ）、Ｓ４６４Ｌ（図３Ｄ）、Ｋ４６７Ｔ（図３Ｅ）、Ｇ４６５Ｒ（図３Ｆ）、Ｉ４９１Ｍ（図３Ｇ）、及びＳ４９２Ｒ（図３Ｈ）である。選択された細胞をセツキシマブ（「ＣＥＴＵＸ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）またはＭＭ−１５１の存在下で２時間培養し、次いでＥＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）で１５分間刺激した。ホスホＥＧＦＲ（「ｐＥＧＦＲ」）、総細胞ＥＧＦＲ（「ＴＯＴ  ＥＧＦＲ」）、ホスホＡＫＴ（「ｐＡＫＴ」）、総細胞ＡＫＴ（「ＴＯＴ  ＡＫＴ」）、ホスホＥＲＫ（「ｐＥＲＫ」）、総細胞ＥＲＫ（「ＴＯＴ  ＥＲＫ」）ならびにビンキュリン（パネル内のサンプルにわたって同様のタンパク質濃度を示すハウスキーピング対照）を含む、示されたタンパク質に特異的な抗体を用いて細胞溶解物に対してウェスタンブロット分析を行った。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｅは、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異の発現によってセツキシマブに対する耐性を獲得したＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す５つのグラフである。獲得した耐性は、３〜９ヶ月間の反復細胞継代にわたって１．４μＭセツキシマブへの連続曝露によりインビトロで生成された。次いで、ＥＧＦＲ細胞外ドメインへの変異を獲得した亜個体群を単離するために、サブクローニングを行った。次いで、細胞をセツキシマブ（「ＣＥＴＵＸ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）またはＭＭ−１５１の存在下で６日間培養した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。このアッセイの対照は、親細胞株（「ＬＩＭ１２１５  ＷＴ」、図５Ａ）及びＳ４９２Ｒ変異体（「ＬＩＭ１２１５  ＫＩ  ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ」、図５Ｅ）を発現するように操作された細胞系である。獲得した耐性細胞株は、「Ｒ５」個体群（図５Ｂ）及びＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｒ変異を有すると同定されたサブクローン化細胞株（図５Ｄ）である。また、ＥＧＦＲ  Ｉ４９１Ｍ変異を有すると同定された「Ｒ１」個体群由来のサブクローン化細胞株（図５Ｃ）も示される。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｅは、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異の発現によってセツキシマブに対する耐性を獲得したＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す５つのグラフである。獲得した耐性は、３〜９ヶ月間の反復細胞継代にわたって１．４μＭセツキシマブへの連続曝露によりインビトロで生成された。次いで、ＥＧＦＲ細胞外ドメインへの変異を獲得した亜個体群を単離するために、サブクローニングを行った。次いで、細胞をセツキシマブ（「ＣＥＴＵＸ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）またはＭＭ−１５１の存在下で６日間培養した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。このアッセイの対照は、親細胞株（「ＬＩＭ１２１５  ＷＴ」、図５Ａ）及びＳ４９２Ｒ変異体（「ＬＩＭ１２１５  ＫＩ  ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ」、図５Ｅ）を発現するように操作された細胞系である。獲得した耐性細胞株は、「Ｒ５」個体群（図５Ｂ）及びＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｒ変異を有すると同定されたサブクローン化細胞株（図５Ｄ）である。また、ＥＧＦＲ  Ｉ４９１Ｍ変異を有すると同定された「Ｒ１」個体群由来のサブクローン化細胞株（図５Ｃ）も示される。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｅは、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異の発現によってセツキシマブに対する耐性を獲得したＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す５つのグラフである。獲得した耐性は、３〜９ヶ月間の反復細胞継代にわたって１．４μＭセツキシマブへの連続曝露によりインビトロで生成された。次いで、ＥＧＦＲ細胞外ドメインへの変異を獲得した亜個体群を単離するために、サブクローニングを行った。次いで、細胞をセツキシマブ（「ＣＥＴＵＸ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）またはＭＭ−１５１の存在下で６日間培養した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。このアッセイの対照は、親細胞株（「ＬＩＭ１２１５  ＷＴ」、図５Ａ）及びＳ４９２Ｒ変異体（「ＬＩＭ１２１５  ＫＩ  ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ」、図５Ｅ）を発現するように操作された細胞系である。獲得した耐性細胞株は、「Ｒ５」個体群（図５Ｂ）及びＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｒ変異を有すると同定されたサブクローン化細胞株（図５Ｄ）である。また、ＥＧＦＲ  Ｉ４９１Ｍ変異を有すると同定された「Ｒ１」個体群由来のサブクローン化細胞株（図５Ｃ）も示される。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｅは、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異の発現によってセツキシマブに対する耐性を獲得したＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す５つのグラフである。獲得した耐性は、３〜９ヶ月間の反復細胞継代にわたって１．４μＭセツキシマブへの連続曝露によりインビトロで生成された。次いで、ＥＧＦＲ細胞外ドメインへの変異を獲得した亜個体群を単離するために、サブクローニングを行った。次いで、細胞をセツキシマブ（「ＣＥＴＵＸ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）またはＭＭ−１５１の存在下で６日間培養した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。このアッセイの対照は、親細胞株（「ＬＩＭ１２１５  ＷＴ」、図５Ａ）及びＳ４９２Ｒ変異体（「ＬＩＭ１２１５  ＫＩ  ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ」、図５Ｅ）を発現するように操作された細胞系である。獲得した耐性細胞株は、「Ｒ５」個体群（図５Ｂ）及びＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｒ変異を有すると同定されたサブクローン化細胞株（図５Ｄ）である。また、ＥＧＦＲ  Ｉ４９１Ｍ変異を有すると同定された「Ｒ１」個体群由来のサブクローン化細胞株（図５Ｃ）も示される。
【図５Ｅ】図５Ａ〜５Ｅは、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異の発現によってセツキシマブに対する耐性を獲得したＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す５つのグラフである。獲得した耐性は、３〜９ヶ月間の反復細胞継代にわたって１．４μＭセツキシマブへの連続曝露によりインビトロで生成された。次いで、ＥＧＦＲ細胞外ドメインへの変異を獲得した亜個体群を単離するために、サブクローニングを行った。次いで、細胞をセツキシマブ（「ＣＥＴＵＸ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）またはＭＭ−１５１の存在下で６日間培養した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。このアッセイの対照は、親細胞株（「ＬＩＭ１２１５  ＷＴ」、図５Ａ）及びＳ４９２Ｒ変異体（「ＬＩＭ１２１５  ＫＩ  ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ」、図５Ｅ）を発現するように操作された細胞系である。獲得した耐性細胞株は、「Ｒ５」個体群（図５Ｂ）及びＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｒ変異を有すると同定されたサブクローン化細胞株（図５Ｄ）である。また、ＥＧＦＲ  Ｉ４９１Ｍ変異を有すると同定された「Ｒ１」個体群由来のサブクローン化細胞株（図５Ｃ）も示される。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｃは、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異の発現によりセツキシマブに対する耐性を獲得したＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す３つのグラフである。獲得した耐性は、３〜９ヶ月間の反復細胞継代にわたって１．４μＭセツキシマブへの連続曝露によりインビトロで生成された。次いで、サブクローニングを行い、ＥＧＦＲ細胞外ドメインへの変異を獲得した亜個体群を単離した。次いで、細胞をセツキシマブ（「ＣＥＴＵＸ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）またはＭＭ−１５１の存在下で６日間培養した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。このアッセイの対照は、親細胞株（「ＯＸＣＯ２  ＷＴ」、図６Ａ）である。得られた耐性細胞株は、「Ｒ２」個体群（図６Ｂ）及びＥＧＦＲ  Ｉ４９１Ｍ及びＮＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ変異の同時発現を有するとして同定されたサブクローン化細胞株（「ＯＸＣＯ２  Ｒ２  ｃｌ．８８」、図６Ｃ）である。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｃは、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異の発現によりセツキシマブに対する耐性を獲得したＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す３つのグラフである。獲得した耐性は、３〜９ヶ月間の反復細胞継代にわたって１．４μＭセツキシマブへの連続曝露によりインビトロで生成された。次いで、サブクローニングを行い、ＥＧＦＲ細胞外ドメインへの変異を獲得した亜個体群を単離した。次いで、細胞をセツキシマブ（「ＣＥＴＵＸ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）またはＭＭ−１５１の存在下で６日間培養した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。このアッセイの対照は、親細胞株（「ＯＸＣＯ２  ＷＴ」、図６Ａ）である。得られた耐性細胞株は、「Ｒ２」個体群（図６Ｂ）及びＥＧＦＲ  Ｉ４９１Ｍ及びＮＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ変異の同時発現を有するとして同定されたサブクローン化細胞株（「ＯＸＣＯ２  Ｒ２  ｃｌ．８８」、図６Ｃ）である。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｃは、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異の発現によりセツキシマブに対する耐性を獲得したＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す３つのグラフである。獲得した耐性は、３〜９ヶ月間の反復細胞継代にわたって１．４μＭセツキシマブへの連続曝露によりインビトロで生成された。次いで、サブクローニングを行い、ＥＧＦＲ細胞外ドメインへの変異を獲得した亜個体群を単離した。次いで、細胞をセツキシマブ（「ＣＥＴＵＸ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）またはＭＭ−１５１の存在下で６日間培養した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。このアッセイの対照は、親細胞株（「ＯＸＣＯ２  ＷＴ」、図６Ａ）である。得られた耐性細胞株は、「Ｒ２」個体群（図６Ｂ）及びＥＧＦＲ  Ｉ４９１Ｍ及びＮＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ変異の同時発現を有するとして同定されたサブクローン化細胞株（「ＯＸＣＯ２  Ｒ２  ｃｌ．８８」、図６Ｃ）である。
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｄは、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異の発現によってセツキシマブに対する耐性を獲得したＣＣＫ８１及びＨＣＡ４６細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す４つのグラフである。獲得した耐性は、反復細胞継代についての３〜９ヶ月間の１．４μＭセツキシマブの連続的な曝露（ＨＣＡ４６）または６ヶ月間の６８０ｎＭ〜１．４μＭのセツキシマブの段階的（ＣＣＫ８１）によりインビトロで生成された。次いで、ＥＧＦＲ細胞外ドメインへの変異を獲得した亜個体群を単離するために、サブクローニングを行った。次いで、細胞をセツキシマブ（「ＣＥＴＵＸ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）またはＭＭ−１５１の存在下で６日間培養した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。このアッセイの対照は、それぞれの親細胞系「ＣＣＫ８１  ＷＴ」（図７Ａ）及び「ＨＣＡ４６  ＷＴ」（図７Ｃ）である。示されているのは、それぞれＥＧＦＲ  Ｓ４６４Ｌ及びＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｅ変異を有する、ＣＣＫ８１（図７Ｂ）及びＨＣＡ４６（図７Ｄ）の獲得された耐性サブクローン細胞株である。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｄは、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異の発現によってセツキシマブに対する耐性を獲得したＣＣＫ８１及びＨＣＡ４６細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す４つのグラフである。獲得した耐性は、反復細胞継代についての３〜９ヶ月間の１．４μＭセツキシマブの連続的な曝露（ＨＣＡ４６）または６ヶ月間の６８０ｎＭ〜１．４μＭのセツキシマブの段階的（ＣＣＫ８１）によりインビトロで生成された。次いで、ＥＧＦＲ細胞外ドメインへの変異を獲得した亜個体群を単離するために、サブクローニングを行った。次いで、細胞をセツキシマブ（「ＣＥＴＵＸ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）またはＭＭ−１５１の存在下で６日間培養した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。このアッセイの対照は、それぞれの親細胞系「ＣＣＫ８１  ＷＴ」（図７Ａ）及び「ＨＣＡ４６  ＷＴ」（図７Ｃ）である。示されているのは、それぞれＥＧＦＲ  Ｓ４６４Ｌ及びＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｅ変異を有する、ＣＣＫ８１（図７Ｂ）及びＨＣＡ４６（図７Ｄ）の獲得された耐性サブクローン細胞株である。
【図７Ｃ】図７Ａ〜７Ｄは、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異の発現によってセツキシマブに対する耐性を獲得したＣＣＫ８１及びＨＣＡ４６細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す４つのグラフである。獲得した耐性は、反復細胞継代についての３〜９ヶ月間の１．４μＭセツキシマブの連続的な曝露（ＨＣＡ４６）または６ヶ月間の６８０ｎＭ〜１．４μＭのセツキシマブの段階的（ＣＣＫ８１）によりインビトロで生成された。次いで、ＥＧＦＲ細胞外ドメインへの変異を獲得した亜個体群を単離するために、サブクローニングを行った。次いで、細胞をセツキシマブ（「ＣＥＴＵＸ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）またはＭＭ−１５１の存在下で６日間培養した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。このアッセイの対照は、それぞれの親細胞系「ＣＣＫ８１  ＷＴ」（図７Ａ）及び「ＨＣＡ４６  ＷＴ」（図７Ｃ）である。示されているのは、それぞれＥＧＦＲ  Ｓ４６４Ｌ及びＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｅ変異を有する、ＣＣＫ８１（図７Ｂ）及びＨＣＡ４６（図７Ｄ）の獲得された耐性サブクローン細胞株である。
【図７Ｄ】図７Ａ〜７Ｄは、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異の発現によってセツキシマブに対する耐性を獲得したＣＣＫ８１及びＨＣＡ４６細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す４つのグラフである。獲得した耐性は、反復細胞継代についての３〜９ヶ月間の１．４μＭセツキシマブの連続的な曝露（ＨＣＡ４６）または６ヶ月間の６８０ｎＭ〜１．４μＭのセツキシマブの段階的（ＣＣＫ８１）によりインビトロで生成された。次いで、ＥＧＦＲ細胞外ドメインへの変異を獲得した亜個体群を単離するために、サブクローニングを行った。次いで、細胞をセツキシマブ（「ＣＥＴＵＸ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）またはＭＭ−１５１の存在下で６日間培養した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。このアッセイの対照は、それぞれの親細胞系「ＣＣＫ８１  ＷＴ」（図７Ａ）及び「ＨＣＡ４６  ＷＴ」（図７Ｃ）である。示されているのは、それぞれＥＧＦＲ  Ｓ４６４Ｌ及びＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｅ変異を有する、ＣＣＫ８１（図７Ｂ）及びＨＣＡ４６（図７Ｄ）の獲得された耐性サブクローン細胞株である。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｄは、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異の発現によってセツキシマブに対する耐性を獲得したＬＩＭ１２１５（図８Ａ）、ＯＸＣＯ２（図８Ｂ）、ＣＣＫ８１（図８Ｃ）、及びＨＣＡ４６（図８Ｄ）細胞におけるＥＧＦＲシグナル伝達のウェスタンブロット分析の一連の画像である。獲得した耐性は、反復細胞継代についての３〜９ヶ月間の１．４μＭのセツキシマブへの連続的曝露（ＬＩＭ１２１５、ＯＸＣＯ２及びＨＣＡ４６）または６ヶ月間の６８０ｎＭから１．４μＭへのセツキシマブの段階的曝露（ＣＣＫ８１）によりインビトロで生成された。次いで、ＥＧＦＲ細胞外ドメインへの変異を獲得した亜個体群を単離するために、サブクローニングを行った。選択された細胞をセツキシマブ（「ＣＥＴＵＸ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）またはＭＭ−１５１の存在下で２時間培養し、次いでＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で１５分間刺激した。ホスホＥＧＦＲ（「ｐＥＧＦＲ」）、全細胞ＥＧＦＲ（「ＴＯＴ  ＥＧＦＲ」）、ホスホＡＫＴ（「ｐＡＫＴ」）、全細胞ＡＫＴ（「ＴＯＴ  ＡＫＴ」）、ホスホＥＲＫ（「ｐＥＲＫ」）、総細胞ＥＲＫ「ＴＯＴ  ＥＲＫ」）及びビンキュリン（パネル内のサンプルにわたって同様のタンパク質濃度を示すハウスキーピング対照）を含む、示されたタンパク質に特異的な抗体を用いて、細胞溶解物についてウェスタンブロット分析を行った。ＬＩＭ１２１５細胞株について示されたのは、親細胞株（「ＬＩＭ１２１５  ＷＴ」）、「Ｒ５」獲得耐性個体群、ＥＧＦＲ  Ｇ５６５Ｒ変異を保有する「「Ｒ５」個体群の「ＣＬ５５」サブクローン、ＥＧＦＲ  Ｉ４９１ＭとＮＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ変異の共発現を保有する「「Ｒ１」個体群の「ＣＬＯＮＥ４」サブクローンであり、及び「ＬＩＭ１２１５  ＫＩ」細胞株はＳ４９２Ｒ変異を発現するように操作された。ＯＸＣＯ２細胞株について示されたのは、親細胞株（「ＯＸＣＯ２  ＷＴ」）、「Ｒ２」獲得耐性個体群、ＥＧＦＲ  Ｉ４９１Ｍ及びＮＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ変異の同時発現を保有する「Ｒ２」個体群の「ＣＬ８８」サブクローン、及びＮＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ変異の発現を保有する「Ｒ２」個体群の「ＣＬ１１３」サブクローンである。ＣＣＫ８１細胞株について示されたのは、親細胞株（「ＣＣＫ８１  ＷＴ」）及びＥＧＦＲ  Ｓ４６４Ｌ変異の発現を保有する「Ｒ１」獲得耐性個体群のサブクローンである。ＨＣＡ４６細胞株について示されたのは、親細胞株（「ＨＣＡ４６  ＷＴ」）及びＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｅ変異の発現を保有する「Ｒ５」個体群のサブクローングである。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｄは、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異の発現によってセツキシマブに対する耐性を獲得したＬＩＭ１２１５（図８Ａ）、ＯＸＣＯ２（図８Ｂ）、ＣＣＫ８１（図８Ｃ）、及びＨＣＡ４６（図８Ｄ）細胞におけるＥＧＦＲシグナル伝達のウェスタンブロット分析の一連の画像である。獲得した耐性は、反復細胞継代についての３〜９ヶ月間の１．４μＭのセツキシマブへの連続的曝露（ＬＩＭ１２１５、ＯＸＣＯ２及びＨＣＡ４６）または６ヶ月間の６８０ｎＭから１．４μＭへのセツキシマブの段階的曝露（ＣＣＫ８１）によりインビトロで生成された。次いで、ＥＧＦＲ細胞外ドメインへの変異を獲得した亜個体群を単離するために、サブクローニングを行った。選択された細胞をセツキシマブ（「ＣＥＴＵＸ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）またはＭＭ−１５１の存在下で２時間培養し、次いでＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で１５分間刺激した。ホスホＥＧＦＲ（「ｐＥＧＦＲ」）、全細胞ＥＧＦＲ（「ＴＯＴ  ＥＧＦＲ」）、ホスホＡＫＴ（「ｐＡＫＴ」）、全細胞ＡＫＴ（「ＴＯＴ  ＡＫＴ」）、ホスホＥＲＫ（「ｐＥＲＫ」）、総細胞ＥＲＫ「ＴＯＴ  ＥＲＫ」）及びビンキュリン（パネル内のサンプルにわたって同様のタンパク質濃度を示すハウスキーピング対照）を含む、示されたタンパク質に特異的な抗体を用いて、細胞溶解物についてウェスタンブロット分析を行った。ＬＩＭ１２１５細胞株について示されたのは、親細胞株（「ＬＩＭ１２１５  ＷＴ」）、「Ｒ５」獲得耐性個体群、ＥＧＦＲ  Ｇ５６５Ｒ変異を保有する「「Ｒ５」個体群の「ＣＬ５５」サブクローン、ＥＧＦＲ  Ｉ４９１ＭとＮＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ変異の共発現を保有する「「Ｒ１」個体群の「ＣＬＯＮＥ４」サブクローンであり、及び「ＬＩＭ１２１５  ＫＩ」細胞株はＳ４９２Ｒ変異を発現するように操作された。ＯＸＣＯ２細胞株について示されたのは、親細胞株（「ＯＸＣＯ２  ＷＴ」）、「Ｒ２」獲得耐性個体群、ＥＧＦＲ  Ｉ４９１Ｍ及びＮＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ変異の同時発現を保有する「Ｒ２」個体群の「ＣＬ８８」サブクローン、及びＮＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ変異の発現を保有する「Ｒ２」個体群の「ＣＬ１１３」サブクローンである。ＣＣＫ８１細胞株について示されたのは、親細胞株（「ＣＣＫ８１  ＷＴ」）及びＥＧＦＲ  Ｓ４６４Ｌ変異の発現を保有する「Ｒ１」獲得耐性個体群のサブクローンである。ＨＣＡ４６細胞株について示されたのは、親細胞株（「ＨＣＡ４６  ＷＴ」）及びＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｅ変異の発現を保有する「Ｒ５」個体群のサブクローングである。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８Ｄは、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異の発現によってセツキシマブに対する耐性を獲得したＬＩＭ１２１５（図８Ａ）、ＯＸＣＯ２（図８Ｂ）、ＣＣＫ８１（図８Ｃ）、及びＨＣＡ４６（図８Ｄ）細胞におけるＥＧＦＲシグナル伝達のウェスタンブロット分析の一連の画像である。獲得した耐性は、反復細胞継代についての３〜９ヶ月間の１．４μＭのセツキシマブへの連続的曝露（ＬＩＭ１２１５、ＯＸＣＯ２及びＨＣＡ４６）または６ヶ月間の６８０ｎＭから１．４μＭへのセツキシマブの段階的曝露（ＣＣＫ８１）によりインビトロで生成された。次いで、ＥＧＦＲ細胞外ドメインへの変異を獲得した亜個体群を単離するために、サブクローニングを行った。選択された細胞をセツキシマブ（「ＣＥＴＵＸ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）またはＭＭ−１５１の存在下で２時間培養し、次いでＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で１５分間刺激した。ホスホＥＧＦＲ（「ｐＥＧＦＲ」）、全細胞ＥＧＦＲ（「ＴＯＴ  ＥＧＦＲ」）、ホスホＡＫＴ（「ｐＡＫＴ」）、全細胞ＡＫＴ（「ＴＯＴ  ＡＫＴ」）、ホスホＥＲＫ（「ｐＥＲＫ」）、総細胞ＥＲＫ「ＴＯＴ  ＥＲＫ」）及びビンキュリン（パネル内のサンプルにわたって同様のタンパク質濃度を示すハウスキーピング対照）を含む、示されたタンパク質に特異的な抗体を用いて、細胞溶解物についてウェスタンブロット分析を行った。ＬＩＭ１２１５細胞株について示されたのは、親細胞株（「ＬＩＭ１２１５  ＷＴ」）、「Ｒ５」獲得耐性個体群、ＥＧＦＲ  Ｇ５６５Ｒ変異を保有する「「Ｒ５」個体群の「ＣＬ５５」サブクローン、ＥＧＦＲ  Ｉ４９１ＭとＮＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ変異の共発現を保有する「「Ｒ１」個体群の「ＣＬＯＮＥ４」サブクローンであり、及び「ＬＩＭ１２１５  ＫＩ」細胞株はＳ４９２Ｒ変異を発現するように操作された。ＯＸＣＯ２細胞株について示されたのは、親細胞株（「ＯＸＣＯ２  ＷＴ」）、「Ｒ２」獲得耐性個体群、ＥＧＦＲ  Ｉ４９１Ｍ及びＮＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ変異の同時発現を保有する「Ｒ２」個体群の「ＣＬ８８」サブクローン、及びＮＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ変異の発現を保有する「Ｒ２」個体群の「ＣＬ１１３」サブクローンである。ＣＣＫ８１細胞株について示されたのは、親細胞株（「ＣＣＫ８１  ＷＴ」）及びＥＧＦＲ  Ｓ４６４Ｌ変異の発現を保有する「Ｒ１」獲得耐性個体群のサブクローンである。ＨＣＡ４６細胞株について示されたのは、親細胞株（「ＨＣＡ４６  ＷＴ」）及びＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｅ変異の発現を保有する「Ｒ５」個体群のサブクローングである。
【図８Ｄ】図８Ａ〜８Ｄは、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異の発現によってセツキシマブに対する耐性を獲得したＬＩＭ１２１５（図８Ａ）、ＯＸＣＯ２（図８Ｂ）、ＣＣＫ８１（図８Ｃ）、及びＨＣＡ４６（図８Ｄ）細胞におけるＥＧＦＲシグナル伝達のウェスタンブロット分析の一連の画像である。獲得した耐性は、反復細胞継代についての３〜９ヶ月間の１．４μＭのセツキシマブへの連続的曝露（ＬＩＭ１２１５、ＯＸＣＯ２及びＨＣＡ４６）または６ヶ月間の６８０ｎＭから１．４μＭへのセツキシマブの段階的曝露（ＣＣＫ８１）によりインビトロで生成された。次いで、ＥＧＦＲ細胞外ドメインへの変異を獲得した亜個体群を単離するために、サブクローニングを行った。選択された細胞をセツキシマブ（「ＣＥＴＵＸ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）またはＭＭ−１５１の存在下で２時間培養し、次いでＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で１５分間刺激した。ホスホＥＧＦＲ（「ｐＥＧＦＲ」）、全細胞ＥＧＦＲ（「ＴＯＴ  ＥＧＦＲ」）、ホスホＡＫＴ（「ｐＡＫＴ」）、全細胞ＡＫＴ（「ＴＯＴ  ＡＫＴ」）、ホスホＥＲＫ（「ｐＥＲＫ」）、総細胞ＥＲＫ「ＴＯＴ  ＥＲＫ」）及びビンキュリン（パネル内のサンプルにわたって同様のタンパク質濃度を示すハウスキーピング対照）を含む、示されたタンパク質に特異的な抗体を用いて、細胞溶解物についてウェスタンブロット分析を行った。ＬＩＭ１２１５細胞株について示されたのは、親細胞株（「ＬＩＭ１２１５  ＷＴ」）、「Ｒ５」獲得耐性個体群、ＥＧＦＲ  Ｇ５６５Ｒ変異を保有する「「Ｒ５」個体群の「ＣＬ５５」サブクローン、ＥＧＦＲ  Ｉ４９１ＭとＮＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ変異の共発現を保有する「「Ｒ１」個体群の「ＣＬＯＮＥ４」サブクローンであり、及び「ＬＩＭ１２１５  ＫＩ」細胞株はＳ４９２Ｒ変異を発現するように操作された。ＯＸＣＯ２細胞株について示されたのは、親細胞株（「ＯＸＣＯ２  ＷＴ」）、「Ｒ２」獲得耐性個体群、ＥＧＦＲ  Ｉ４９１Ｍ及びＮＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ変異の同時発現を保有する「Ｒ２」個体群の「ＣＬ８８」サブクローン、及びＮＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ変異の発現を保有する「Ｒ２」個体群の「ＣＬ１１３」サブクローンである。ＣＣＫ８１細胞株について示されたのは、親細胞株（「ＣＣＫ８１  ＷＴ」）及びＥＧＦＲ  Ｓ４６４Ｌ変異の発現を保有する「Ｒ１」獲得耐性個体群のサブクローンである。ＨＣＡ４６細胞株について示されたのは、親細胞株（「ＨＣＡ４６  ＷＴ」）及びＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｅ変異の発現を保有する「Ｒ５」個体群のサブクローングである。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｃは、ＥＧＦＲ外部ドメインにおけるＧ４６５Ｅ変異を保有する臨床結腸直腸腫瘍サンプル（「ゼノ患者（ｘｅｎｏｐａｔｉｅｎｔ）」）に由来する細胞株がＭＭ−１５１に感受性であることを示す一連の３つのグラフである。サブクローニングは、Ｇ４６５Ｅ変異もまた保有する亜個体群を単離するために行った。次いで、細胞をセツキシマブ（「ＣＥＴＵＸ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）またはＭＭ−１５１の存在下で６日間培養した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。示されたのはゼノ患者由来の細胞株（図９Ａ）及び２つのサブクローン化細胞株（図９Ｂ及び図９Ｃ）である。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｃは、ＥＧＦＲ外部ドメインにおけるＧ４６５Ｅ変異を保有する臨床結腸直腸腫瘍サンプル（「ゼノ患者（ｘｅｎｏｐａｔｉｅｎｔ）」）に由来する細胞株がＭＭ−１５１に感受性であることを示す一連の３つのグラフである。サブクローニングは、Ｇ４６５Ｅ変異もまた保有する亜個体群を単離するために行った。次いで、細胞をセツキシマブ（「ＣＥＴＵＸ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）またはＭＭ−１５１の存在下で６日間培養した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。示されたのはゼノ患者由来の細胞株（図９Ａ）及び２つのサブクローン化細胞株（図９Ｂ及び図９Ｃ）である。
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｃは、ＥＧＦＲ外部ドメインにおけるＧ４６５Ｅ変異を保有する臨床結腸直腸腫瘍サンプル（「ゼノ患者（ｘｅｎｏｐａｔｉｅｎｔ）」）に由来する細胞株がＭＭ−１５１に感受性であることを示す一連の３つのグラフである。サブクローニングは、Ｇ４６５Ｅ変異もまた保有する亜個体群を単離するために行った。次いで、細胞をセツキシマブ（「ＣＥＴＵＸ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）またはＭＭ−１５１の存在下で６日間培養した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。示されたのはゼノ患者由来の細胞株（図９Ａ）及び２つのサブクローン化細胞株（図９Ｂ及び図９Ｃ）である。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｃは、同一のＥＧＦＲ分子と同時に関与する３種の抗体の組み合わせにおける個々の抗体の能力を示す一連の３つのグラフである。バイオセンサーにコンジュゲートされた組み合わせ内の１つの抗体を用いてバイオレイヤー干渉アッセイ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標））を行い、その後、組換えＥＧＦＲ細胞外ドメイン変異体とインキュベートし、次いで、その組み合わせ内の残りの抗体とインキュベートした。インキュベーションの順序は各図のパネルに示されている通りである。ＥＧＦＲ細胞外ドメイン変異体Ｋ４６７Ｔ、Ｒ４５１Ｃ、及びＳ４９２Ｒが評価されている。評価される抗体の組み合わせは、ＭＭ−１５１（図１０Ａ）、３つの抗体の組み合わせ（２５Ｅ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ、図１０Ｂ）、及び２つの抗体の組み合わせ（Ｓｙｍ９９２及びＳｙｍ１０２４、図１０Ｃ）である。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｃは、同一のＥＧＦＲ分子と同時に関与する３種の抗体の組み合わせにおける個々の抗体の能力を示す一連の３つのグラフである。バイオセンサーにコンジュゲートされた組み合わせ内の１つの抗体を用いてバイオレイヤー干渉アッセイ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標））を行い、その後、組換えＥＧＦＲ細胞外ドメイン変異体とインキュベートし、次いで、その組み合わせ内の残りの抗体とインキュベートした。インキュベーションの順序は各図のパネルに示されている通りである。ＥＧＦＲ細胞外ドメイン変異体Ｋ４６７Ｔ、Ｒ４５１Ｃ、及びＳ４９２Ｒが評価されている。評価される抗体の組み合わせは、ＭＭ−１５１（図１０Ａ）、３つの抗体の組み合わせ（２５Ｅ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ、図１０Ｂ）、及び２つの抗体の組み合わせ（Ｓｙｍ９９２及びＳｙｍ１０２４、図１０Ｃ）である。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜１０Ｃは、同一のＥＧＦＲ分子と同時に関与する３種の抗体の組み合わせにおける個々の抗体の能力を示す一連の３つのグラフである。バイオセンサーにコンジュゲートされた組み合わせ内の１つの抗体を用いてバイオレイヤー干渉アッセイ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標））を行い、その後、組換えＥＧＦＲ細胞外ドメイン変異体とインキュベートし、次いで、その組み合わせ内の残りの抗体とインキュベートした。インキュベーションの順序は各図のパネルに示されている通りである。ＥＧＦＲ細胞外ドメイン変異体Ｋ４６７Ｔ、Ｒ４５１Ｃ、及びＳ４９２Ｒが評価されている。評価される抗体の組み合わせは、ＭＭ−１５１（図１０Ａ）、３つの抗体の組み合わせ（２５Ｅ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ、図１０Ｂ）、及び２つの抗体の組み合わせ（Ｓｙｍ９９２及びＳｙｍ１０２４、図１０Ｃ）である。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｂは、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を過剰発現し、代表的なＥＧＦＲリガンドによって活性化されるＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す一連の２つのグラフである。ＬＩＭ１２１５に、Ｓ４９２Ｒ  ＥＧＦＲ外部ドメイン変異体を発現するように安定的にトランスフェクトし、選択した細胞を、８ｎＭの組換えヒトＥＧＦリガンドの存在下で、増加する濃度のセツキシマブ（「ＣＭＡＢ」、三角マーカー付きのダークグレーの線）、Ｓｙｍ９９２及びＳｙｍ１０２４抗体（「Ｓｙｍ００４」、丸マーカー付きのライトグレーの線）及びＭＭ−１５１（四角マーカー付きの黒い線）の組み合わせで３日間処理した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。示されているのは、親ＬＩＭ１２１５細胞株（トランスフェクトされていない、野生型ＥＧＦＲのみを発現する）（図１１Ａ）及びＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を過剰発現するトランスフェクトしたＬＩＭ１２１５細胞株である（図１１Ｂ）。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｂは、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を過剰発現し、代表的なＥＧＦＲリガンドによって活性化されるＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す一連の２つのグラフである。ＬＩＭ１２１５に、Ｓ４９２Ｒ  ＥＧＦＲ外部ドメイン変異体を発現するように安定的にトランスフェクトし、選択した細胞を、８ｎＭの組換えヒトＥＧＦリガンドの存在下で、増加する濃度のセツキシマブ（「ＣＭＡＢ」、三角マーカー付きのダークグレーの線）、Ｓｙｍ９９２及びＳｙｍ１０２４抗体（「Ｓｙｍ００４」、丸マーカー付きのライトグレーの線）及びＭＭ−１５１（四角マーカー付きの黒い線）の組み合わせで３日間処理した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。示されているのは、親ＬＩＭ１２１５細胞株（トランスフェクトされていない、野生型ＥＧＦＲのみを発現する）（図１１Ａ）及びＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を過剰発現するトランスフェクトしたＬＩＭ１２１５細胞株である（図１１Ｂ）。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｃは、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を過剰発現するか、またはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現するように操作されたＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）が、インビボネズミ異種移植モデルにおいてＭＭ−１５１に感受性であることを示す一連の３つのグラフである。体重１６±０．５ｇの４〜５週齢のメスｎｕ／ｎｕマウス（ＮＵ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ）に、成長因子が減少したマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有するＰＢＳ中０．２ｍＬのＬＩＭ１２１５（＃２）、ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ、またはＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ細胞懸濁液を１マウス当たり５×１０６細胞の濃度で接種する。腫瘍の体積が約３００ｍｍ３に達したら、ＰＢＳ、セツキシマブ１２．５または２５ｍｇ／ｋｇ、またはＭＭ−１５１ツール化合物（２５Ｅ、Ｐ２Ｘ、及びＰ３Ｘ抗体からなる）を受ける治療群（マウス１０匹／群）にマウスを無作為にグループ分けした。治療は、セツキシマブ、２５Ｅ、Ｐ３Ｘを用いて週１回（Ｑ７Ｄ）スケジュール（例えば、月曜日）で、及びではＰ２Ｘを用いて週３回（３ｘ  ｗｅｅｋｌｙ）スケジュール（例えば、月曜日、水曜日、金曜日）で、腹腔内注射により投与した。ＭＭ−１５１ツール化合物は、１２．５ｍｇ／ｋｇ（週１回６．２５ｍｇ／ｋｇの２５Ｅ、週３回８．７５ｍｇ／ｋｇのＰ２Ｘ、週１回３．１２５ｍｇ／ｋｇのＰ３Ｘ）及び２５ｍｇ／ｋｇ（週１回１２．５ｍｇ／ｋｇの２５Ｅ、週３回１７．５ｍｇ／ｋｇのＰ２Ｘ、週１回６．２５ｍｇ／ｋｇのＰ３Ｘ）のセツキシマブ用量レベルに相当する組み合わせに対する合計曝露量をもたらすように計算された用量で投与された。セツキシマブ、２５Ｅ、及びＰ３Ｘには、初回投与時に２倍ローディング用量を投与し、その後の次の投与では示された用量レベルで維持用量を続けた。腫瘍寸法を、ノギスで毎週３回測定し、腫瘍体積を式：π／６×Ｌ×Ｗ２（ここで、Ｌ及びＷはそれぞれ、より大きい及びより小さい腫瘍直径を表す。）を用いて計算した。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｃは、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を過剰発現するか、またはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現するように操作されたＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）が、インビボネズミ異種移植モデルにおいてＭＭ−１５１に感受性であることを示す一連の３つのグラフである。体重１６±０．５ｇの４〜５週齢のメスｎｕ／ｎｕマウス（ＮＵ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ）に、成長因子が減少したマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有するＰＢＳ中０．２ｍＬのＬＩＭ１２１５（＃２）、ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ、またはＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ細胞懸濁液を１マウス当たり５×１０６細胞の濃度で接種する。腫瘍の体積が約３００ｍｍ３に達したら、ＰＢＳ、セツキシマブ１２．５または２５ｍｇ／ｋｇ、またはＭＭ−１５１ツール化合物（２５Ｅ、Ｐ２Ｘ、及びＰ３Ｘ抗体からなる）を受ける治療群（マウス１０匹／群）にマウスを無作為にグループ分けした。治療は、セツキシマブ、２５Ｅ、Ｐ３Ｘを用いて週１回（Ｑ７Ｄ）スケジュール（例えば、月曜日）で、及びではＰ２Ｘを用いて週３回（３ｘ  ｗｅｅｋｌｙ）スケジュール（例えば、月曜日、水曜日、金曜日）で、腹腔内注射により投与した。ＭＭ−１５１ツール化合物は、１２．５ｍｇ／ｋｇ（週１回６．２５ｍｇ／ｋｇの２５Ｅ、週３回８．７５ｍｇ／ｋｇのＰ２Ｘ、週１回３．１２５ｍｇ／ｋｇのＰ３Ｘ）及び２５ｍｇ／ｋｇ（週１回１２．５ｍｇ／ｋｇの２５Ｅ、週３回１７．５ｍｇ／ｋｇのＰ２Ｘ、週１回６．２５ｍｇ／ｋｇのＰ３Ｘ）のセツキシマブ用量レベルに相当する組み合わせに対する合計曝露量をもたらすように計算された用量で投与された。セツキシマブ、２５Ｅ、及びＰ３Ｘには、初回投与時に２倍ローディング用量を投与し、その後の次の投与では示された用量レベルで維持用量を続けた。腫瘍寸法を、ノギスで毎週３回測定し、腫瘍体積を式：π／６×Ｌ×Ｗ２（ここで、Ｌ及びＷはそれぞれ、より大きい及びより小さい腫瘍直径を表す。）を用いて計算した。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜１２Ｃは、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を過剰発現するか、またはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現するように操作されたＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）が、インビボネズミ異種移植モデルにおいてＭＭ−１５１に感受性であることを示す一連の３つのグラフである。体重１６±０．５ｇの４〜５週齢のメスｎｕ／ｎｕマウス（ＮＵ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ）に、成長因子が減少したマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有するＰＢＳ中０．２ｍＬのＬＩＭ１２１５（＃２）、ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ、またはＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ細胞懸濁液を１マウス当たり５×１０６細胞の濃度で接種する。腫瘍の体積が約３００ｍｍ３に達したら、ＰＢＳ、セツキシマブ１２．５または２５ｍｇ／ｋｇ、またはＭＭ−１５１ツール化合物（２５Ｅ、Ｐ２Ｘ、及びＰ３Ｘ抗体からなる）を受ける治療群（マウス１０匹／群）にマウスを無作為にグループ分けした。治療は、セツキシマブ、２５Ｅ、Ｐ３Ｘを用いて週１回（Ｑ７Ｄ）スケジュール（例えば、月曜日）で、及びではＰ２Ｘを用いて週３回（３ｘ  ｗｅｅｋｌｙ）スケジュール（例えば、月曜日、水曜日、金曜日）で、腹腔内注射により投与した。ＭＭ−１５１ツール化合物は、１２．５ｍｇ／ｋｇ（週１回６．２５ｍｇ／ｋｇの２５Ｅ、週３回８．７５ｍｇ／ｋｇのＰ２Ｘ、週１回３．１２５ｍｇ／ｋｇのＰ３Ｘ）及び２５ｍｇ／ｋｇ（週１回１２．５ｍｇ／ｋｇの２５Ｅ、週３回１７．５ｍｇ／ｋｇのＰ２Ｘ、週１回６．２５ｍｇ／ｋｇのＰ３Ｘ）のセツキシマブ用量レベルに相当する組み合わせに対する合計曝露量をもたらすように計算された用量で投与された。セツキシマブ、２５Ｅ、及びＰ３Ｘには、初回投与時に２倍ローディング用量を投与し、その後の次の投与では示された用量レベルで維持用量を続けた。腫瘍寸法を、ノギスで毎週３回測定し、腫瘍体積を式：π／６×Ｌ×Ｗ２（ここで、Ｌ及びＷはそれぞれ、より大きい及びより小さい腫瘍直径を表す。）を用いて計算した。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３Ｂは、早期相臨床試験（ＮＣＴ＃０１５２０３８９）においてＭＭ−１５１で処置した２人のヒト結腸直腸癌患者における臨床応答とＥＧＦＲ  ＥＣＤ変異の存在のオーバーレイを示す一連の２つのグラフである。示された日付においてＭＭ−５１の投与前に血清サンプルを採取し、ＥＧＦＲ  ＥＣＤ変異の存在が変異特異的プライマーを有する液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって検出された。各ＥＧＦＲ  ＥＣＤ変異の対立遺伝子頻度は、示された変異を保有する血清サンプル中の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のパーセントを反映している。臨床的応答は、固形腫瘍（ＲＥＣＩＳＴ）１．１ガイドラインの応答評価基準によって定義され、示された来診時に測定された（ＭＭ−１５１での治療前、ＭＭ−１５１での治療中、及び疾患の進行に伴うベースラインを含む）。第１の患者（０９５）は２０１４年８月２９日に臨床試験に登録検査され、２０１４年９月２３日に最初に治療され、２０１５年１月２２日に疾患進行が評価されるまで治療された。第２の患者（０５１）は、２０１３年２月２５日に臨床試験へ登録検査され、２０１３年３月１９日に最初に治療され、２０１３年８月２８日に疾患進行が評価されるまで治療された。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜１３Ｂは、早期相臨床試験（ＮＣＴ＃０１５２０３８９）においてＭＭ−１５１で処置した２人のヒト結腸直腸癌患者における臨床応答とＥＧＦＲ  ＥＣＤ変異の存在のオーバーレイを示す一連の２つのグラフである。示された日付においてＭＭ−５１の投与前に血清サンプルを採取し、ＥＧＦＲ  ＥＣＤ変異の存在が変異特異的プライマーを有する液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって検出された。各ＥＧＦＲ  ＥＣＤ変異の対立遺伝子頻度は、示された変異を保有する血清サンプル中の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のパーセントを反映している。臨床的応答は、固形腫瘍（ＲＥＣＩＳＴ）１．１ガイドラインの応答評価基準によって定義され、示された来診時に測定された（ＭＭ−１５１での治療前、ＭＭ−１５１での治療中、及び疾患の進行に伴うベースラインを含む）。第１の患者（０９５）は２０１４年８月２９日に臨床試験に登録検査され、２０１４年９月２３日に最初に治療され、２０１５年１月２２日に疾患進行が評価されるまで治療された。第２の患者（０５１）は、２０１３年２月２５日に臨床試験へ登録検査され、２０１３年３月１９日に最初に治療され、２０１３年８月２８日に疾患進行が評価されるまで治療された。
【図１４】野生型ＥＧＦＲ（ＬＩＭ１２１５（＃２））を発現するか、またはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異（ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ）を発現するように操作されるＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）上のＥＧＦＲに関与する個々の抗体の能力を示すグラフである。抗体はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８色素で標識し、フローサイトメトリーで測定した細胞表面のＥＧＦＲと結合した。評価される抗体は、セツキシマブ（「ＣＭＡＢ」）、Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘである。各個々の抗体についての結果を、ＬＩＭ１２１５（＃２）対照細胞株にて観察された結合値に対して標準化する。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜１５Ｃは、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を過剰発現するか、またはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現するように操作され、代表的なＥＧＦＲリガンドによって活性化されるＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に対して感受性であることを示す一連の３つのグラフである。ＬＩＭ１２１５（＃２）細胞を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的ゲノム編集システムを介して操作して、Ｓ４９２Ｒ  ＥＧＦＲ外部ドメイン変異体を発現させた。細胞を、８ｎＭの組換えヒトＥＧＦリガンドの存在下で、セツキシマブ（「ＣＭＡＢ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）、Ｓｙｍ９９２及びＳｙｍ１０２４抗体の組み合わせ（「Ｓｙｍ００４」）及びＭＭ−１５１で３日間処理した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。図１５Ａには、それぞれが各阻害剤の１μＭ濃度で処理された、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を発現するＬＩＭ１２１５（＃２）細胞株（野生型ＥＧＦＲのみを発現する）、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を発現する操作したＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ細胞株、及びＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒを過剰発現するトランスフェクトしたＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ細胞株が示される。図１５Ｂ及び１５Ｃには、それぞれが増加する濃度のセツキシマブ（三角マーカー付きのダークグレーの線）、パニツムマブ（菱形マーカー付きのライトグレーの線）、Ｓｙｍ００４（丸マーカー付きのグレーの線）またはＭＭ−１５１（四角マーカー付きの黒い線）で治療された、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異をそれぞれ発現する親ＬＩＭ１２１５（＃２）細胞株及び操作されたＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ細胞株が示される。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜１５Ｃは、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を過剰発現するか、またはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現するように操作され、代表的なＥＧＦＲリガンドによって活性化されるＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に対して感受性であることを示す一連の３つのグラフである。ＬＩＭ１２１５（＃２）細胞を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的ゲノム編集システムを介して操作して、Ｓ４９２Ｒ  ＥＧＦＲ外部ドメイン変異体を発現させた。細胞を、８ｎＭの組換えヒトＥＧＦリガンドの存在下で、セツキシマブ（「ＣＭＡＢ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）、Ｓｙｍ９９２及びＳｙｍ１０２４抗体の組み合わせ（「Ｓｙｍ００４」）及びＭＭ−１５１で３日間処理した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。図１５Ａには、それぞれが各阻害剤の１μＭ濃度で処理された、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を発現するＬＩＭ１２１５（＃２）細胞株（野生型ＥＧＦＲのみを発現する）、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を発現する操作したＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ細胞株、及びＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒを過剰発現するトランスフェクトしたＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ細胞株が示される。図１５Ｂ及び１５Ｃには、それぞれが増加する濃度のセツキシマブ（三角マーカー付きのダークグレーの線）、パニツムマブ（菱形マーカー付きのライトグレーの線）、Ｓｙｍ００４（丸マーカー付きのグレーの線）またはＭＭ−１５１（四角マーカー付きの黒い線）で治療された、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異をそれぞれ発現する親ＬＩＭ１２１５（＃２）細胞株及び操作されたＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ細胞株が示される。
【図１５Ｃ】図１５Ａ〜１５Ｃは、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を過剰発現するか、またはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現するように操作され、代表的なＥＧＦＲリガンドによって活性化されるＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に対して感受性であることを示す一連の３つのグラフである。ＬＩＭ１２１５（＃２）細胞を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的ゲノム編集システムを介して操作して、Ｓ４９２Ｒ  ＥＧＦＲ外部ドメイン変異体を発現させた。細胞を、８ｎＭの組換えヒトＥＧＦリガンドの存在下で、セツキシマブ（「ＣＭＡＢ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）、Ｓｙｍ９９２及びＳｙｍ１０２４抗体の組み合わせ（「Ｓｙｍ００４」）及びＭＭ−１５１で３日間処理した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。図１５Ａには、それぞれが各阻害剤の１μＭ濃度で処理された、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を発現するＬＩＭ１２１５（＃２）細胞株（野生型ＥＧＦＲのみを発現する）、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を発現する操作したＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ細胞株、及びＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒを過剰発現するトランスフェクトしたＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ細胞株が示される。図１５Ｂ及び１５Ｃには、それぞれが増加する濃度のセツキシマブ（三角マーカー付きのダークグレーの線）、パニツムマブ（菱形マーカー付きのライトグレーの線）、Ｓｙｍ００４（丸マーカー付きのグレーの線）またはＭＭ−１５１（四角マーカー付きの黒い線）で治療された、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異をそれぞれ発現する親ＬＩＭ１２１５（＃２）細胞株及び操作されたＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ細胞株が示される。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜１６Ｂは、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２ＲまたはＧ４６５Ｒ外部ドメイン変異を発現するように操作されたＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がセツキシマブによる治療の過程で拡大するが、ＭＭ−１５１に感受性であることを示すグラフである。２つのＬＩＭ１２１５細胞株プールが使用され、１つはＥＧＦＲ野生型及びＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異体を発現する細胞の混合物を含み、そして第２のものはＥＧＦＲ野生型及びＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｒを発現する細胞を含む。これらのプールは、ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ及びＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｒ  ＫＩ細胞株を操作する過程で生成された。ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異体プールにおける０日目の初期対立遺伝子頻度は４．６％であると測定され（野生型ＥＧＦＲに対する変異型ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ）、ＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｒ変異体プールにおける０日目の初期対立遺伝子頻度は０．６％であった。細胞をセツキシマブ（「ＣＭＡＢ」、三角マーカー付きのダークグレーの線）、ＭＭ−１５１（四角マーカー付きの黒い線）または培地のみ（丸マーカー付きのライトグレーの線）で１５日間（Ｓ４９２Ｒ）または７日間（Ｇ４６５Ｒ）処理し、４、１０及び１５日目（Ｓ４９２Ｒ）または０、３及び７日目（Ｇ４６５Ｒ）に採取したゲノムＤＮＡで測定したＥＧＦＲ外部ドメイン変異の対立遺伝子頻度を測定した。陰性対照として、野生型ＥＧＦＲを発現するＬＩＭ１２１５（＃２）細胞の原液プレート（点線）及び全ての処理条件について全ての時点で測定した０％の対立遺伝子頻度でも実験を行った。
【図１６Ｂ】図１６Ａ〜１６Ｂは、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２ＲまたはＧ４６５Ｒ外部ドメイン変異を発現するように操作されたＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がセツキシマブによる治療の過程で拡大するが、ＭＭ−１５１に感受性であることを示すグラフである。２つのＬＩＭ１２１５細胞株プールが使用され、１つはＥＧＦＲ野生型及びＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異体を発現する細胞の混合物を含み、そして第２のものはＥＧＦＲ野生型及びＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｒを発現する細胞を含む。これらのプールは、ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ及びＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｒ  ＫＩ細胞株を操作する過程で生成された。ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異体プールにおける０日目の初期対立遺伝子頻度は４．６％であると測定され（野生型ＥＧＦＲに対する変異型ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ）、ＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｒ変異体プールにおける０日目の初期対立遺伝子頻度は０．６％であった。細胞をセツキシマブ（「ＣＭＡＢ」、三角マーカー付きのダークグレーの線）、ＭＭ−１５１（四角マーカー付きの黒い線）または培地のみ（丸マーカー付きのライトグレーの線）で１５日間（Ｓ４９２Ｒ）または７日間（Ｇ４６５Ｒ）処理し、４、１０及び１５日目（Ｓ４９２Ｒ）または０、３及び７日目（Ｇ４６５Ｒ）に採取したゲノムＤＮＡで測定したＥＧＦＲ外部ドメイン変異の対立遺伝子頻度を測定した。陰性対照として、野生型ＥＧＦＲを発現するＬＩＭ１２１５（＃２）細胞の原液プレート（点線）及び全ての処理条件について全ての時点で測定した０％の対立遺伝子頻度でも実験を行った。
【図１７Ａ】図１７Ａ〜１７Ｂは、ヒトＥＧＦＲ遺伝子の模式図及びＥＧＦＲ外部ドメイン変異の表である。図１７Ａに示すのは、７つの構造タンパク質ドメイン、２８個のＤＮＡコードエクソン、及び各タンパク質ドメイン間の境界を記すアミノ酸配列番号に注目するマーキングを有するヒトＥＧＦＲ遺伝子の模式図である。アミノ酸１〜２４を含む推定上のシグナルペプチドは示さない。４つの細胞外ドメイン（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ）が存在し、それらはともに以下の６２１個のアミノ酸及び最初の１５個のエクソンを含む（エクソン＃１５は細胞外ドメインＩＶ及び膜貫通ドメインに及ぶ）。ＥＧＦＲ外部ドメイン変異は、アミノ酸４３３−４９９をコードするエクソン１２において同定されている。この領域は、細胞外ドメインＩＩＩの末端部分及びドメインＩＶの開始部分に及ぶ。図１７Ｂに示すのは、臨床及び／または前臨床サンプル中で同定され、文献に発表されているＥＧＦＲ外部ドメイン変異を列挙する表である。変異は、アミノ酸変化、ＤＮＡ塩基変化、及びＤＮＡコドン変化によって同定される。
【図１７Ｂ】図１７Ａ〜１７Ｂは、ヒトＥＧＦＲ遺伝子の模式図及びＥＧＦＲ外部ドメイン変異の表である。図１７Ａに示すのは、７つの構造タンパク質ドメイン、２８個のＤＮＡコードエクソン、及び各タンパク質ドメイン間の境界を記すアミノ酸配列番号に注目するマーキングを有するヒトＥＧＦＲ遺伝子の模式図である。アミノ酸１〜２４を含む推定上のシグナルペプチドは示さない。４つの細胞外ドメイン（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ）が存在し、それらはともに以下の６２１個のアミノ酸及び最初の１５個のエクソンを含む（エクソン＃１５は細胞外ドメインＩＶ及び膜貫通ドメインに及ぶ）。ＥＧＦＲ外部ドメイン変異は、アミノ酸４３３−４９９をコードするエクソン１２において同定されている。この領域は、細胞外ドメインＩＩＩの末端部分及びドメインＩＶの開始部分に及ぶ。図１７Ｂに示すのは、臨床及び／または前臨床サンプル中で同定され、文献に発表されているＥＧＦＲ外部ドメイン変異を列挙する表である。変異は、アミノ酸変化、ＤＮＡ塩基変化、及びＤＮＡコドン変化によって同定される。
【図１８】ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を過剰発現するか、またはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現するように操作され、及び代表的なＥＧＦＲリガンドによって活性化される、ＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）が、ＭＭ−１５１に感受性であることを示す、ＥＧＦＲシグナル伝達のウェスタンブロット分析の一連の画像である。野生型ＥＧＦＲの発現、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異の操作された発現、またはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異の過剰発現をそれぞれ保有するＬＩＭ１２１５（＃２）、ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ、及びＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ細胞が示される。細胞を１００ｎＭのセツキシマブ、Ｓｙｍ００４またはＭＭ−１５１の存在下で２４時間培養し、次いでＡＲＥＧ（８ｎＭ）またはＥＧＦ（８ｎＭ）リガンドで１０分間刺激した。対照として、細胞を未処理のまま（薬物またはリガン供与体し）、または示したように各リガンドのみで放置した。ホスホＥＧＦＲ（「ｐＥＧＦＲ」）及びアクチン（パネル内のサンプルにわたって同様のタンパク質濃度を示すハウスキーピング対照）を含む示されたタンパク質に特異的な抗体を用いて、細胞溶解物に対してウェスタンブロット分析を行った。
【図１９Ａ】図１９Ａ〜１９Ｃは、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を過剰発現するか、またはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現するように操作され、代表的なＥＧＦＲリガンドによって活性化されるＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）が、ＭＭ−１５１に感受性であることを示す、ＥＲＫシグナル伝達のＥＬＩＳＡ分析の一連の３つのプロットである。野生型ＥＧＦＲの発現、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異の操作された発現、またはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異の過剰発現をそれぞれ保有するＬＩＭ１２１５（＃２）、ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ、及びＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ細胞が示される。細胞を、セツキシマブ、Ｓｙｍ００４、またはＭＭ−１５１を用いて、増加する濃度（１０００及び０．２４４ｎＭの間の１：４連続希釈）で２時間処理し、次いでＡＲＥＧ（８ｎＭ）またはＥＧＦ（８ｎＭ）リガンドで１０分間刺激した。ホスホＥＲＫタンパク質をＥＬＩＳＡにより測定した。結果は、リガンド刺激のみ（薬物なし）である対照サンプルの中央値に対してリガンド刺激（ＥＧＦまたはＡＲＥＧ）により、規準化した。図１９Ａに示されるのは、増加する濃度の薬物及びＥＧＦリガンドによる刺激による治療後の規準化されたホスホ−ＥＲＫ応答のヒートマップ表現である。図１９Ｂ及び１９Ｃに示されるのは、それぞれ２５０ｎＭの薬物での治療及びＥＧＦまたはＡＲＥＧによる刺激後の規準化されたホスホ−ＥＲＫ応答の棒グラフ（ｂａｒ  ｐｌｏｔ）である。
【図１９Ｂ】図１９Ａ〜１９Ｃは、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を過剰発現するか、またはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現するように操作され、代表的なＥＧＦＲリガンドによって活性化されるＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）が、ＭＭ−１５１に感受性であることを示す、ＥＲＫシグナル伝達のＥＬＩＳＡ分析の一連の３つのプロットである。野生型ＥＧＦＲの発現、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異の操作された発現、またはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異の過剰発現をそれぞれ保有するＬＩＭ１２１５（＃２）、ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ、及びＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ細胞が示される。細胞を、セツキシマブ、Ｓｙｍ００４、またはＭＭ−１５１を用いて、増加する濃度（１０００及び０．２４４ｎＭの間の１：４連続希釈）で２時間処理し、次いでＡＲＥＧ（８ｎＭ）またはＥＧＦ（８ｎＭ）リガンドで１０分間刺激した。ホスホＥＲＫタンパク質をＥＬＩＳＡにより測定した。結果は、リガンド刺激のみ（薬物なし）である対照サンプルの中央値に対してリガンド刺激（ＥＧＦまたはＡＲＥＧ）により、規準化した。図１９Ａに示されるのは、増加する濃度の薬物及びＥＧＦリガンドによる刺激による治療後の規準化されたホスホ−ＥＲＫ応答のヒートマップ表現である。図１９Ｂ及び１９Ｃに示されるのは、それぞれ２５０ｎＭの薬物での治療及びＥＧＦまたはＡＲＥＧによる刺激後の規準化されたホスホ−ＥＲＫ応答の棒グラフ（ｂａｒ  ｐｌｏｔ）である。
【図１９Ｃ】図１９Ａ〜１９Ｃは、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を過剰発現するか、またはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現するように操作され、代表的なＥＧＦＲリガンドによって活性化されるＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）が、ＭＭ−１５１に感受性であることを示す、ＥＲＫシグナル伝達のＥＬＩＳＡ分析の一連の３つのプロットである。野生型ＥＧＦＲの発現、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異の操作された発現、またはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異の過剰発現をそれぞれ保有するＬＩＭ１２１５（＃２）、ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ、及びＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ細胞が示される。細胞を、セツキシマブ、Ｓｙｍ００４、またはＭＭ−１５１を用いて、増加する濃度（１０００及び０．２４４ｎＭの間の１：４連続希釈）で２時間処理し、次いでＡＲＥＧ（８ｎＭ）またはＥＧＦ（８ｎＭ）リガンドで１０分間刺激した。ホスホＥＲＫタンパク質をＥＬＩＳＡにより測定した。結果は、リガンド刺激のみ（薬物なし）である対照サンプルの中央値に対してリガンド刺激（ＥＧＦまたはＡＲＥＧ）により、規準化した。図１９Ａに示されるのは、増加する濃度の薬物及びＥＧＦリガンドによる刺激による治療後の規準化されたホスホ−ＥＲＫ応答のヒートマップ表現である。図１９Ｂ及び１９Ｃに示されるのは、それぞれ２５０ｎＭの薬物での治療及びＥＧＦまたはＡＲＥＧによる刺激後の規準化されたホスホ−ＥＲＫ応答の棒グラフ（ｂａｒ  ｐｌｏｔ）である。
【図２０Ａ】図２０Ａ〜２０Ｉは、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を過剰発現するか、またはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現するように操作され、及び代表的なＥＧＦＲリガンドによって活性化されるＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す、細胞増殖率分析の一連の９つのプロットである。野生型ＥＧＦＲの発現、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異の操作された発現、またはＥＧＦＲの過剰発現をそれぞれ保有するＬＩＭ１２１５（＃２）、ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ、及びＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ細胞が示される。リガン供与体し、ＡＲＥＧ（８ｎＭ）またはＥＧＦ（８ｎＭ）の存在下、細胞を増加する濃度（０．１５〜１０００ｎＭの間）のセツキシマブ、パニツムマブ、Ｓｙｍ００４、またはＭＭ−１５１で治療した。細胞コンフルエンシーを、生存細胞イメージャにおいて７２時間の期間にわたって２時間間隔で測定した。成長速度を各処理条件について計算し、結果を各細胞株について対照サンプル（薬物なし）に対し規準化した。
【図２０Ｂ】図２０Ａ〜２０Ｉは、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を過剰発現するか、またはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現するように操作され、及び代表的なＥＧＦＲリガンドによって活性化されるＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す、細胞増殖率分析の一連の９つのプロットである。野生型ＥＧＦＲの発現、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異の操作された発現、またはＥＧＦＲの過剰発現をそれぞれ保有するＬＩＭ１２１５（＃２）、ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ、及びＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ細胞が示される。リガン供与体し、ＡＲＥＧ（８ｎＭ）またはＥＧＦ（８ｎＭ）の存在下、細胞を増加する濃度（０．１５〜１０００ｎＭの間）のセツキシマブ、パニツムマブ、Ｓｙｍ００４、またはＭＭ−１５１で治療した。細胞コンフルエンシーを、生存細胞イメージャにおいて７２時間の期間にわたって２時間間隔で測定した。成長速度を各処理条件について計算し、結果を各細胞株について対照サンプル（薬物なし）に対し規準化した。
【図２０Ｃ】図２０Ａ〜２０Ｉは、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を過剰発現するか、またはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現するように操作され、及び代表的なＥＧＦＲリガンドによって活性化されるＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す、細胞増殖率分析の一連の９つのプロットである。野生型ＥＧＦＲの発現、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異の操作された発現、またはＥＧＦＲの過剰発現をそれぞれ保有するＬＩＭ１２１５（＃２）、ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ、及びＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ細胞が示される。リガン供与体し、ＡＲＥＧ（８ｎＭ）またはＥＧＦ（８ｎＭ）の存在下、細胞を増加する濃度（０．１５〜１０００ｎＭの間）のセツキシマブ、パニツムマブ、Ｓｙｍ００４、またはＭＭ−１５１で治療した。細胞コンフルエンシーを、生存細胞イメージャにおいて７２時間の期間にわたって２時間間隔で測定した。成長速度を各処理条件について計算し、結果を各細胞株について対照サンプル（薬物なし）に対し規準化した。
【図２０Ｄ】図２０Ａ〜２０Ｉは、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を過剰発現するか、またはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現するように操作され、及び代表的なＥＧＦＲリガンドによって活性化されるＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す、細胞増殖率分析の一連の９つのプロットである。野生型ＥＧＦＲの発現、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異の操作された発現、またはＥＧＦＲの過剰発現をそれぞれ保有するＬＩＭ１２１５（＃２）、ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ、及びＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ細胞が示される。リガン供与体し、ＡＲＥＧ（８ｎＭ）またはＥＧＦ（８ｎＭ）の存在下、細胞を増加する濃度（０．１５〜１０００ｎＭの間）のセツキシマブ、パニツムマブ、Ｓｙｍ００４、またはＭＭ−１５１で治療した。細胞コンフルエンシーを、生存細胞イメージャにおいて７２時間の期間にわたって２時間間隔で測定した。成長速度を各処理条件について計算し、結果を各細胞株について対照サンプル（薬物なし）に対し規準化した。
【図２０Ｅ】図２０Ａ〜２０Ｉは、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を過剰発現するか、またはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現するように操作され、及び代表的なＥＧＦＲリガンドによって活性化されるＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す、細胞増殖率分析の一連の９つのプロットである。野生型ＥＧＦＲの発現、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異の操作された発現、またはＥＧＦＲの過剰発現をそれぞれ保有するＬＩＭ１２１５（＃２）、ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ、及びＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ細胞が示される。リガン供与体し、ＡＲＥＧ（８ｎＭ）またはＥＧＦ（８ｎＭ）の存在下、細胞を増加する濃度（０．１５〜１０００ｎＭの間）のセツキシマブ、パニツムマブ、Ｓｙｍ００４、またはＭＭ−１５１で治療した。細胞コンフルエンシーを、生存細胞イメージャにおいて７２時間の期間にわたって２時間間隔で測定した。成長速度を各処理条件について計算し、結果を各細胞株について対照サンプル（薬物なし）に対し規準化した。
【図２０Ｆ】図２０Ａ〜２０Ｉは、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を過剰発現するか、またはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現するように操作され、及び代表的なＥＧＦＲリガンドによって活性化されるＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す、細胞増殖率分析の一連の９つのプロットである。野生型ＥＧＦＲの発現、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異の操作された発現、またはＥＧＦＲの過剰発現をそれぞれ保有するＬＩＭ１２１５（＃２）、ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ、及びＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ細胞が示される。リガン供与体し、ＡＲＥＧ（８ｎＭ）またはＥＧＦ（８ｎＭ）の存在下、細胞を増加する濃度（０．１５〜１０００ｎＭの間）のセツキシマブ、パニツムマブ、Ｓｙｍ００４、またはＭＭ−１５１で治療した。細胞コンフルエンシーを、生存細胞イメージャにおいて７２時間の期間にわたって２時間間隔で測定した。成長速度を各処理条件について計算し、結果を各細胞株について対照サンプル（薬物なし）に対し規準化した。
【図２０Ｇ】図２０Ａ〜２０Ｉは、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を過剰発現するか、またはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現するように操作され、及び代表的なＥＧＦＲリガンドによって活性化されるＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す、細胞増殖率分析の一連の９つのプロットである。野生型ＥＧＦＲの発現、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異の操作された発現、またはＥＧＦＲの過剰発現をそれぞれ保有するＬＩＭ１２１５（＃２）、ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ、及びＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ細胞が示される。リガン供与体し、ＡＲＥＧ（８ｎＭ）またはＥＧＦ（８ｎＭ）の存在下、細胞を増加する濃度（０．１５〜１０００ｎＭの間）のセツキシマブ、パニツムマブ、Ｓｙｍ００４、またはＭＭ−１５１で治療した。細胞コンフルエンシーを、生存細胞イメージャにおいて７２時間の期間にわたって２時間間隔で測定した。成長速度を各処理条件について計算し、結果を各細胞株について対照サンプル（薬物なし）に対し規準化した。
【図２０Ｈ】図２０Ａ〜２０Ｉは、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を過剰発現するか、またはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現するように操作され、及び代表的なＥＧＦＲリガンドによって活性化されるＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す、細胞増殖率分析の一連の９つのプロットである。野生型ＥＧＦＲの発現、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異の操作された発現、またはＥＧＦＲの過剰発現をそれぞれ保有するＬＩＭ１２１５（＃２）、ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ、及びＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ細胞が示される。リガン供与体し、ＡＲＥＧ（８ｎＭ）またはＥＧＦ（８ｎＭ）の存在下、細胞を増加する濃度（０．１５〜１０００ｎＭの間）のセツキシマブ、パニツムマブ、Ｓｙｍ００４、またはＭＭ−１５１で治療した。細胞コンフルエンシーを、生存細胞イメージャにおいて７２時間の期間にわたって２時間間隔で測定した。成長速度を各処理条件について計算し、結果を各細胞株について対照サンプル（薬物なし）に対し規準化した。
【図２０Ｉ】図２０Ａ〜２０Ｉは、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を過剰発現するか、またはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現するように操作され、及び代表的なＥＧＦＲリガンドによって活性化されるＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌）がＭＭ−１５１に感受性であることを示す、細胞増殖率分析の一連の９つのプロットである。野生型ＥＧＦＲの発現、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異の操作された発現、またはＥＧＦＲの過剰発現をそれぞれ保有するＬＩＭ１２１５（＃２）、ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ、及びＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ細胞が示される。リガン供与体し、ＡＲＥＧ（８ｎＭ）またはＥＧＦ（８ｎＭ）の存在下、細胞を増加する濃度（０．１５〜１０００ｎＭの間）のセツキシマブ、パニツムマブ、Ｓｙｍ００４、またはＭＭ−１５１で治療した。細胞コンフルエンシーを、生存細胞イメージャにおいて７２時間の期間にわたって２時間間隔で測定した。成長速度を各処理条件について計算し、結果を各細胞株について対照サンプル（薬物なし）に対し規準化した。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
用語「ＥＧＦＲ」及び「ＥＧＦレセプター」は、本明細書において互換的に用いられ、ヒトＥＧＦＲタンパク質（ＥｒｂＢ１またはＨＥＲ１とも呼ばれる）を指す。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ｅｎｔｒｙ  Ｐ００５３３を参照されたい。ＥＧＦＲ細胞外ドメイン、またはＥＧＦＲ−ＥＣＤは、インビボで細胞表面を越えて伸びるＥＧＦＲタンパク質の部分であり、したがって、細胞の外部の抗体にアクセス可能である。野生型ＥＧＦＲ−ＥＣＤタンパク質配列は、配列番号１９に記載されている。本明細書で使用する場合、「ＥＧＦＲ−ＥＣＤ変異」または「ＥＧＦＲの細胞外ドメインにおける変異」は、野生型配列と比較して少なくとも一つのアミノ酸残基が異なるＥＧＦＲ−ＥＣＤタンパク質配列を指すことができ、「ＥＧＦＲ−ＥＣＤ変異」はまた、ＥＧＦＲの細胞外ドメインのタンパク質配列の変化に対応するＤＮＡまたはＲＮＡコード配列のその部分における変化を指してもよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡまたはＲＮＡコード配列の変化は、ＥＧＦＲ遺伝子または転写物のエクソン１２に生じる。他の実施形態では、ＥＧＦＲ−ＥＣＤ変異は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインのドメインＩＩＩに対応するタンパク質配列の変化である。
【００３１】
用語「抗体」は、少なくとも１つの抗体由来抗原結合部位（例えば、ＶＨ／ＶＬ領域またはＦｖ、またはＣＤＲ）を含むポリペプチドを記載する。抗体には、既知の形態の抗体が含まれる。例えば、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、またはキメラ抗体であり得る。抗体はまた、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ＳｃＦｖ、ＳＭＩＰ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）、ナノボディ、またはドメイン抗体であってもよい。抗体はまた、次のいずれかのアイソタイプ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ及びＩｇＥであり得る。抗体は、天然に存在する抗体であってもよく、またはタンパク質工学技術によって（例えば、変異、欠失、置換、非抗体部分への結合によって）操作された抗体であってもよい。例えば、抗体は、抗体の特性（例えば、機能的特性）を変化させる（天然に存在する抗体と比較して）１つ以上の変異体アミノ酸を含み得る。例えば、半減期、エフェクター機能、及び／または患者の抗体に対する免疫応答に影響を与える多くのそのような改変が、当技術分野において知られている。用語抗体はまた、少なくとも１つの抗体由来の抗原結合部位を含む人工的または操作されたポリペプチド構築物を含む。
【００３２】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体、すなわち個体群を構成する個々の抗体は少量で存在し得る可能性のある天然の変異を除いて同一である抗体の個体群から得られる抗体を指す。用語「オリゴクローナル抗体混合物」または「抗体混合物」は、単一の組成物中に存在する２つ以上の抗体、例えばモノクローナル抗体の組み合わせを指す。特定の実施形態では、オリゴクローナル抗体混合物または抗体混合物はＭＭ−１５１である。抗体混合物の別の例はＳｙｍ００４（Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ）である。
【００３３】
本明細書に記載の方法で使用される本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントは、当技術分野で認識されている様々な技術を用いて生成することができる。モノクローナル抗体は、当業者によく知られている様々な技術によって得ることができる。要するに、所望の抗原で免疫化された動物由来の脾臓細胞は、一般にミエローマ細胞との融合によって不死化される（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍａｎｏｌ．６：５１１−５１９（１９７６）参照）。不死化の代替方法には、エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ）、癌遺伝子またはレトロウイルスによる形質転換、または当該分野で周知の他の方法が含まれる。単一の不死化細胞から生じるコロニーを、所望の特異性及び抗原に対する親和性の抗体の産生についてスクリーニングし、そのような細胞によって産生されるモノクローナル抗体の収量は、脊椎動物宿主の腹腔への注射を含む様々な技術によって増大され得る。あるいは、Ｈｕｓｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）によって概説された一般的プロトコルに従って、ヒトＢ細胞からＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体またはその結合フラグメントをコードするＤＮＡ配列を単離することができる。
【００３４】
本明細書で使用する用語「阻害」は、活性の完全な遮断を含む、生物学的活性の統計的に有意な減少を指す。例えば、「阻害」は、生物学的活性において約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または約１００％の統計的に有意な減少を意味することができる。
【００３５】
本明細書で使用するリン酸化の阻害は、抗体の非存在下（対照）でのシグナル伝達に対する基質タンパク質のリン酸化を統計学的に有意に低下させる抗体の能力を指す。当技術分野で知られているように、細胞内シグナル伝達経路には、例えばホスホイノシチド３’−キナーゼ／Ａｋｔ（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＰＴＥＮまたはＡＫＴ）及び／またはマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫまたは「ＥＲＫ」）経路を含む。当技術分野でも知られているように、ＥＧＦＲ媒介シグナル伝達は、基質のリン酸化レベル（例えば、ＡＫＴ及び／またはＥＲＫのリン酸化またはリン酸化なし）をアッセイすることによって測定することができる。したがって、一実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせ及び組成物は、このような抗体の非存在下（対照）でのＡＫＴ及び／またはＥＲＫのリン酸化レベルと比較して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または約１００％の、ＡＫＴ及びＥＲＫのいずれかまたは両方のリン酸化レベルの統計学的に有意な阻害を提供する。そのようなＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達は、ＥＧＦＲを含む細胞カスケード中のタンパク質を測定する当該分野で認識されている技術を用いて測定することができ、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタン、またはＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）のような多重方法を使用して測定することができる。語句「ＥＧＦＲ下流シグナル伝達の阻害」は、例えば、ＡＫＴ及び／またはＥＲＫのリン酸化の量の減少によって測定される、ＥＧＦ受容体からのシグナル伝達レベルを低下させる抗体または抗体混合物の能力を指す。
【００３６】
本明細書で使用される語句「細胞増殖の阻害」は、インビボまたはインビトロのいずれかで抗体の非存在下（対照）での細胞または細胞類の増殖と比較して、ＥＧＦＲを発現する細胞または細胞類の増殖を統計的に有意に減少させる抗体または抗体混合物の能力を指す。一実施形態では、細胞が組み合わせの抗体組成物の非存在下（対照）で測定された増殖と比較して、本明細書に開示された組み合わせの抗体組成物と接触させる場合、あるいは細胞がモノクローナル抗体の単一の種と接触した場合に、ＥＧＦＲを発現する細胞（例えば、癌細胞）の増殖を少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または約１００％減少させることができる。細胞分裂率、細胞分裂中の細胞個体群内の細胞割合、及び／または最終分化または細胞死に起因する細胞個体群からの細胞喪失率を測定する当技術分野で認識されている技術を用いて（例えば、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）または同様のアッセイを用いて）、細胞増殖をアッセイすることができる。
【００３７】
本明細書で使用する用語「治療する」、「治療すること」及び「治療」は、本明細書に記載の治療または予防措置を指す。「治療」の方法は、本明細書中に開示される対象、例えば、ＥＧＦＲ依存性シグナル伝達に関連する障害を有するかまたはそのような疾患または障害を有する素因を有する対象への、抗体または抗体対もしくは三つ組の投与を用いて、疾患もしくは障害または再発性疾患もしくは障害の１つまたは複数の症状の重篤度を予防、治癒、遅延、軽減または寛解するため、またはそのような治療の非存在下で予想されるものを超える対象の生存を延長するために使用される。
【００３８】
用語「患者」には、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒト及び他の哺乳動物対象が含まれる。
【００３９】
用語「サンプル」は、患者から採取された、組織、体液、または細胞（または上記のいずれかの一部）を指す。通常、組織または細胞は患者から取り出されるが、インビボ診断も考慮される。固形腫瘍の場合、組織サンプルは、外科的に取り出された腫瘍から採取され、従来の技術によって試験のために調製され得る。リンパ腫及び白血病の場合、リンパ球、白血病細胞またはリンパ組織が得られ（例えば、血液由来の白血病細胞）、適切に調製され得る。尿、涙、血清、血漿、脳脊髄液、糞便、喀痰、細胞抽出物、悪性胸水などを含む他のサンプルも、特定の癌に対して有用であり得る。
【００４０】
当業者によって使用される任意の生検技術を、対象からサンプルを単離するために使用することができる。生検は、全身麻酔を用いた開腹生検でもよいし、開腹生検よりも小さな切開を行う閉鎖生検でもよい。生検は、組織の一部が取り出されるコアまたは切開生検であり得る；病変全体を取り出す試みがなされる切除生検、組織または液体のサンプルを針で取り出す針吸引（経皮的）生検（細針吸引生検）である。針は細い中空の針であってもよく、それを塊に挿入して塊から細胞を抽出することができる。一実施形態では、サンプルは、組織サンプル、例えば、任意の種類の外科的切除または生検（例えば、コア針生検、細針吸引（ＦＮＡ）生検など）によって得られる組織サンプルである。別の実施形態では、サンプルは血液サンプル（例えば、血漿、血清または全血サンプル）であるか、または尿サンプルである。
【００４１】
生検は処理することができる。例えば、生検はホルマリン固定及びパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）によって組織を保存することができる。生検はより小さな部分に処理することができる。生検は、ＲＮＡを保存するために処理することができる。生検は、ウェットアイス（約４℃）、室温（約２５℃）で保存、約−２０℃または約−８０℃で保存、例えばドライアイスでの保存、または液体窒素もしくはドライアイス／アルコールスラリー中で凍結させて保存することができる。組織は、外科的切除の０．５、１、５、１０、１５、３０、６０、１２０、または２４０分以内に凍結することができる。生検組織に使用することができる固定剤には、例えば、メタノール−アセトン、Ｃａｒｎｏｙ固定剤（６０％エタノール、３０％クロロホルム、１０％氷酢酸）、Ｂｏｕｉｎ固定剤、エタノール、アセトン、ホルマリン、メタカン（（ｍｅｔｈａｃａｒｎ）、Ｃａｒｎｏｙのエタノールを６０％メタノールに置き換える）、ＵＭＦＩＸ（ユニバーサル分子固定剤）、Ｏｍｎｉｆｉｘ及びＦＩＮＥｆｉｘが含まれる。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「抗悪性腫瘍剤」または「抗癌剤」は、ヒトの新生物、特に悪性（癌性）病変、例えば癌腫、肉腫、リンパ腫、または白血病、の発生または進行を阻害する機能的特性を有する薬物である。転移の阻害はしばしば抗悪性腫瘍剤の特性である。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、「Ｒａｓ−野生型」とは、Ｋ−ＲａｓまたはＮ−Ｒａｓのエクソン２（コドン１２及び１３）、エクソン３（コドン５９及び６１）及びエクソン４（コドン１１７及び１４６）の体細胞変異を保有しない癌を指し、以後「Ｒａｓ」と呼ぶ。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、「ＢＲＡＦ野生型」は、コドン６００（例えば、Ｖ６００Ｅ）において体細胞変異を保有しない癌を指す。
【００４５】
Ｉ．抗ＥＧＦＲ抗体
本発明における使用に適した抗ＥＧＦＲ抗体（またはそれに由来するＶＨ／ＶＬドメイン）の組成物は、当該分野で周知の方法を用いて生成することができる。あるいは、Ｓｙｍ−００４（Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ）、セツキシマブ、パニツムマブ及びニモツズマブのような当該分野で認識されている抗ＥＧＦＲ抗体を含む組成物を使用することができる。他の薬学的抗ＥＧＦＲ抗体には、開発中のザルツムマブ及びマツズマブが含まれる。使用することができるさらなる抗ＥＧＦＲオリゴクローナル抗体組成物は、ＰＣＴ国際公開ＷＯ／２０１１／１４０２５４号及び対応する係属中の米国特許第９，０４４，４６０号及び係属中の米国特許第９，２２６，９６４号及び第７，８８７，８０５号（「オリゴクローナル出願（「Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」）に記載されており、ならびに他の抗ＥＧＦＲ抗体と組み合わせた抗体のオリゴクローナル混合物は、癌、例えば、悪性（腫瘍性）腫瘍の治療に有用である。ＥＧＦＲへの結合に関してこれらの当技術分野で認識されている抗体のいずれかと競合する抗体もまた使用することができる。
【００４６】
本発明における使用に適した抗ＥＧＦＲ抗体の例示的な組成物は、「ＭＭ−１５１」である。ＭＭ−１５１は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）のシグナル伝達に結合してそれを阻害するように設計された３つの完全ヒトモノクローナル抗体の混合物からなるオリゴクローナル治療薬である。ＭＭ−１５１は、３つの独立した抗体（Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ）の混合物であり、ＥＧＦＲ上の３つの非重複部位に結合して、リガンド依存性及び独立したシグナル伝達の阻害を最大化する（例えば、ＷＯ２０１３／００６５４７参照、その教示は参照により本明細書に明示的に組み込まれる）。Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘモノクローナル抗体は、ＷＯ２０１１／１４０２５４に開示されているｃａ、ｃｄ及びｃｈとそれぞれ呼ばれる親抗体の親和性成熟抗体であり、その教示は参照により本明細書に明示的に組み込まれる。Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３ＸのＣＤＲアミノ酸配列を以下の表１に示す：
【表１−１】
2018516870.tif 000002
【表１−２】
2018516870.tif 000003
【００４７】
Ｐ１Ｘの全長ＶＨ及びＶＬアミノ配列をそれぞれ配列番号１９及び配列番号２０に示す。Ｐ２Ｘの全長ＶＨ及びＶＬアミノ配列をそれぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示す。Ｐ３Ｘの全長ＶＨ及びＶＬアミノ配列をそれぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示す。さらに、本明細書中に示されるＶＨ及びＶＬ  ＣＤＲセグメントは、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ末端からカルボキシ末端の順に配置される。
【００４８】
一実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体の組成物は、（１）それぞれ配列番号１、２、及び３の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号４、５、及び６の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１のモノクローナル抗体と、（２）それぞれ配列番号７、８、及び９の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１０、１１、及び１２の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２のモノクローナル抗体と、（３）それぞれ配列番号１３、１４、及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１６、１７、及び１８の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第３のモノクローナル抗体と、を含む。
【００４９】
別の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体の組成物は、（１）配列番号１９を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体と、（２）配列番号２１を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体と、（３）配列番号２３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体と、を含む。
【００５０】
別の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体の組成物は、（１）配列番号２０を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体と、（２）配列番号２２を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体と、（３）配列番号２４を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体と、を含む。
【００５１】
別の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体の組成物は、（１）配列番号１９を含む重鎖可変領域及び配列番号２０を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体と、（２）配列番号２１を含む重鎖可変領域及び配列番号２２を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体と、（３）配列番号２３を含む重鎖可変領域及び配列番号２４を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体と、を含む。
【００５２】
別の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体（１）、（２）及び（３）は、互いに２：２：１のモル比で組成物中に存在する。
【００５３】
抗ＥＧＦＲ抗体は、単独で、またはＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達に関連する疾患を治療するために、オリゴクローナル抗体と併せてまたは相乗的に作用する別の治療剤と共に投与することができる。
【００５４】
別の実施形態では、本明細書に記載の治療方法は、抗ＥＧＦＲ抗体を１つ以上の他の抗悪性腫瘍剤（例えば、他の化学療法剤または他の小分子薬物）と組み合わせて投与することを含む。一実施形態では、治療サイクル内に３つ以下の他の抗悪性腫瘍剤を投与する。別の実施形態では、治療サイクル内に２つ以上の他の抗悪性腫瘍剤を投与する。別の実施形態では、治療サイクル内に１つを超えない他の抗悪性腫瘍剤を投与する。別の実施形態では、治療サイクル内に他の抗悪性腫瘍剤は投与されない。
【００５５】
本明細書で使用される場合、補助的または組み合わせ投与（共投与）には、抗ＥＧＦＲ抗体及び１つ以上の抗悪性腫瘍剤を同じまたは異なる剤形で同時投与すること、または抗ＥＧＦＲ抗体及び１つ以上の抗悪性腫瘍剤を別々に投与すること（例えば、連続投与）が含まれる。このような同時または連続投与は、好ましくは、治療される患者に抗ＥＧＦＲ抗体及び１種以上の薬物の両方が同時に存在することとなる。
【００５６】
ＩＩ．治療の方法
本明細書では、ヒト患者の癌を治療するための方法を提供する。一実施態様では、癌は、皮膚、中枢神経系、頭部、頸部、食道、胃、結腸、直腸、肛門、肝臓、膵臓、胆管、胆嚢、肺、乳房、卵巣、子宮、子宮頚部、膣、精巣、生殖細胞、前立腺、腎臓、尿管、膀胱、副腎、下垂体、甲状腺、骨、筋肉または結合組織である。別の実施形態において、癌は、結腸直腸癌、転移性結腸直腸癌、非小細胞肺癌、扁平上皮細胞頭頸部癌、または再発性または転移性頭頸部癌からなる群より選択される。別の実施形態では、患者は、Ｋ−Ｒａｓ野生型転移性結腸直腸癌と診断されている。別の実施形態では、癌は、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、及び／またはＢＲＡＦ野生型転移性結腸直腸癌などのＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）変異癌である。別の実施形態では、変異癌は、ＦＤＡ承認試験によって決定されるＫ−Ｒａｓ野生型、ＥＧＦＲ発現転移性結腸直腸癌である。別の実施形態において、変異癌は、頭頸部癌（例えば、頭頸部の局所的なまたは局所的に進行した扁平上皮癌）である。別の実施形態において、変異癌は、ＦＤＡ承認試験によって決定されるように、Ｒａｓ−野生型野生型ＫＲＡＳ（エクソン２）転移性結腸直腸癌（ｍＣＲＣ）である。
【００５７】
別の実施形態において、腫瘍は、ＦＤＡ承認試験に基づいてＥＧＦＲ細胞外ドメインに少なくとも１つの変異を保有する細胞を含むと判定される。別の実施形態において、癌は、ＥＧＦＲ細胞外ドメインのドメインＩＩＩまたはドメインＩＶに変異を保有する細胞を含む腫瘍である。別の実施形態では、癌は、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１２に変異を保有する細胞を含有する腫瘍である。別の実施形態では、タンパク質配列変化であるＥＧＦＲの細胞外ドメインにおける少なくとも１つの変異、またはタンパク質配列変化をもたらすＤＮＡまたはＲＮＡコード領域は、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ、Ｓ４６４Ｌ、Ｋ４６７Ｔ、Ｇ４６５Ｒ、Ｇ４６５Ｅ、Ｉ４９１Ｍ、及びＳ４９２Ｒからなる群より選択される。一実施形態では、ＥＧＦＲの細胞外ドメインにおける変異は、配列番号２７（すなわち、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに対応する配列）の４５１位のアルギニンからシステインへの変異である。別の実施形態では、ＥＧＦＲの細胞外ドメインにおける変異は、配列番号２７の４６４位のセリンからロイシンである。別の実施形態では、ＥＧＦＲの細胞外ドメインにおける変異は、配列番号２７の４６７位のリシンからトレオニンである。別の実施形態では、ＥＧＦＲの細胞外ドメインにおける変異は、配列番号２７の４６５位のグリシンからアルギニンである。別の実施形態では、ＥＧＦＲの細胞外ドメインにおける変異は、配列番号２７の４６５位でグリシンからグルタミン酸である。別の実施形態では、ＥＧＦＲの細胞外ドメインにおける変異は、配列番号２７の４９１位のイソロイシンからメチオニンである。別の実施形態では、ＥＧＦＲの細胞外ドメインにおける変異は、配列番号２７の４９２位のセリンからアルギニンである。
【００５８】
一態様では、ＥＧＦＲ細胞外ドメインにおいて少なくとも１つの変異を保有する細胞を含む腫瘍のある患者を治療する方法が提供され、この方法は、ＥＧＦＲ細胞外ドメインに結合する有効量のモノクローナル抗体混合物を患者に投与することを含み、この方法は本明細書に記載されているように、ＥＧＦＲ細胞外ドメインに結合する抗ＥＧＦＲ抗体のオリゴクローナル混合物を患者に単一の組成物で投与することを含む。
【００５９】
別の態様では、この方法は、ＥＧＦＲ細胞外ドメイン（例えば、セツキシマブまたはパニツムマブ）に結合するモノクローナル抗体の１つ以上で進行したかまたは不応性になった患者を治療することを含む。別の実施形態では、患者は、抗悪性腫瘍剤による前治療後に進行したか、または抗悪性腫瘍剤療法に不応性になっている。別の実施形態では、患者は、抗悪性腫瘍剤による前治療後に抗悪性腫瘍剤療法に耐性になっている。別の実施形態において、患者は、抗悪性腫瘍剤による前治療後の疾患の進行または再発後に治療される。別の実施形態において、患者は、抗悪性腫瘍剤による治療の失敗後に治療される。別の実施形態において、この癌は、抗悪性腫瘍剤に対する耐性を獲得した癌として同定される。
【００６０】
別の態様では、この方法は、フルオロピリミジン含有レジメン、オキサリプラチン含有レジメンまたはイリノテカン含有レジメンにおいてまたはその後に疾患進行を有している患者を治療することを含む。
【００６１】
別の態様では、本方法は、ヒト患者の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）変異癌を、オリゴクローナル抗上皮成長因子受容体（抗ＥＧＦＲ）抗体の組み合わせ（例えば、ＭＭ−１５１）を患者に投与することによって、治療することを含む。
【００６２】
別の態様では、本方法は、ヒト患者の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）変異癌を、（ａ）患者の（例えば、患者の血液中の）ＥＧＦＲのＥＣＤのエクソン１２における変異を検出することと、次に（ｂ）治療有効量のオリゴクローナル抗上皮成長因子受容体（抗ＥＧＦＲ）抗体の組み合わせ（例えば、ＭＭ−１５１）を該患者に投与することとによって、治療することを含む。
【００６３】
別の態様において、本方法は、ヒト患者の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）変異癌であって、頭頸部癌及び結腸直腸癌からなる群より選択されるこの癌を、（ａ）（例えば、患者の血液中の）ＥＧＦＲ細胞外ドメインのドメインＩＩＩまたはドメインＩＶにおける変異を検出することと、次に（ｂ）治療有効量のＭＭ−１５１オリゴクローナル抗上皮成長因子受容体（抗ＥＧＦＲ）抗体の組み合わせ（例えば、ＭＭ−１５１）を患者に投与することとによって、治療することを含む。別の態様では、本方法は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）変異癌であって、ＥＧＦＲのＥＣＤのドメインＩＩＩまたはドメインＩＶに検出された変異を有する癌である、ヒト患者を治療することを含み、該方法は、治療有効量のＭＭ−１５１オリゴクローナル抗上皮成長因子受容体（抗ＥＧＦＲ）抗体の組み合わせを患者に投与することを含み、該オリゴクローナル抗体の組み合わせが、２：２：１のモル比におけるＰ１Ｘモノクローナル抗体、Ｐ２Ｘモノクローナル抗体及びＰ３Ｘモノクローナル抗体からなる。
【００６４】
さらなる態様において、本方法は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）変異癌であって、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ、Ｓ４６４Ｌ、Ｋ４６７Ｔ、Ｇ４６５Ｒ、Ｇ４６５Ｅ、Ｉ４９１Ｍ、及びＳ４９２Ｒからなる群より選択されるＥＧＦＲのＥＣＤに少なくとも１つの検出された変異を有する癌であるヒト患者を治療することを含み、該方法は、３つのモノクローナル抗体を含むオリゴクローナル抗上皮成長因子受容体（抗ＥＧＦＲ）抗体の組み合わせの治療有効量を患者に投与することを含み、第１のモノクローナル抗体はＰ１Ｘであり、第２のモノクローナル抗体はＰ２Ｘであり、第３のモノクローナル抗体はＰ３Ｘであり、及びオリゴクローナル抗体の組み合わせは、Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘを２：２：１のモル比で含む
【００６５】
さらなる態様において、本方法は、ヒト患者における上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）変異癌を、該患者にオリゴクローナル抗上皮成長因子受容体抗体（抗ＥＧＦＲ）の組み合わせ（例えば、ＭＭ−１５１）を投与することによって、その出現を阻止するか、または増殖を阻害することを含む。一実施形態では、オリゴクローナル抗上皮成長因子受容体（抗ＥＧＦＲ）抗体の組み合わせは、以前の抗ＥＧＦＲ療法（例えば、セツキシマブ、パニツムマブ、またはＳｙｍ００４による治療）を受けていない患者に投与される。一実施形態では、オリゴクローナル抗上皮成長因子受容体（抗ＥＧＦＲ）抗体の組み合わせは、以前の抗ＥＧＦＲ療法（例えば、セツキシマブ、パニツムマブ、またはＳｙｍ００４による治療）を受けた患者に投与される。一実施形態において、オリゴクローナル抗上皮成長因子受容体（抗ＥＧＦＲ）抗体の組み合わせは、ＥＧＦＲ  ＥＣＤ変異の検出直後（例えば、検出後数時間または数日以内）に投与される。
【００６６】
ＥＧＦＲ変異の存在は、既知の技術を用いて任意の適切な生物学的サンプル（例えば、組織、血液、尿など）中で検出することができる。例えば、一実施形態では、アレル特異的プライマーを用いたリアルタイムＰＣＲ、対立遺伝子特異的ＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ、定量的シークエンシング（ＰＣＲベースの配列決定）、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、ＢＥＡＭｉｎｇ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ、及びより低い変性温度における改良された完全濃縮ＣＯ増幅（ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ＣＯ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｔ  ｌｏｗｅｒ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）（ＩＣＥ  ＣＯＬＤ）−ＰＣＲを含むがこれに限定されない、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法を用いてＥＧＦＲ変異を検出する。別の実施形態において、ＥＧＦＲ変異は、例えば、Ｊｏｒｇｅ  Ｓ  Ｒｅｉｓ−Ｆｉｌｈｏによって記載されるように（Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９，１１（Ｓｕｐｐｌ  ３）：Ｓ１２）、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を用いて検出される。ＮＧＳ（「ハイスループット配列決定（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」または「マッシブリーパラレル配列決定（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」としても知られている）は、多くの様々な近年の配列決定技術を記載するために使用される用語であり、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）（ソレクサ（Ｓｏｌｅｘａ））配列決定、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）４５４配列決定、イオントレント：プロトン／ＰＧＭ配列決定、及びＳＯＬｉＤ配列決定を含むが、これに限定されないＥＧＦＲ変異を分析するための他のプラットフォームには、例えば、Ｓａｎｇｅｒ法、一塩基多型（ＳＮＰ）アレイ、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析、ＦＩＳＨなどが含まれる。ＥＧＦＲ  ＥＣＤドメイン変異を測定するための例示的なアッセイには、ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＯｎｅ（Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＮＧＳ）、ＯｎｃｏＢＥＡＭ（Ｓｙｓｍｅｘ  Ｉｎｏｓｔｉｃｓ、ＰＣＲ）、Ｇｕａｒｄａｎｔ３６０（Ｇｕａｒｄａｎｔ  Ｈｅａｌｔｈ、ＮＧＳ）、Ｔｒｏｖａｇｅｎｅ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＰＣＭ）（Ｔｒｏｖａｇｅｎｅ、ＰＣＲ）、ＭＸ−ＩＣＰ  ＥＧＦＲエクソン１２（Ｓ４９２Ｒ）（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ、ＰＣＲ）及びＯｍｎｉＳｅｑ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｐａｎｅｌ（Ｏｍｎｉｓｅｑ  ＬＬＣ、ＮＧＳ）含むが、これに限定されない。
【００６７】
ＥＧＦＲ変異（例えば、ＥＧＦＲエクソン１２における変異）の有無を決定することは、様々な方法で行うことができる。そのような試験は、一般に、生物学的サンプルから収集されたＤＮＡまたはＲＮＡを用いて行われる。一実施形態では、そのような変異を検出するためのアッセイは、任意の適切なプロトコル及び／または標準的なメーカー使用説明書に従って実施することができる。一実施形態では、ＥＧＦＲエクソン１２の変異を検出するためのＮＧＳベースの方法は、エクソン１２の全てをカバーすることを提供する。別の実施形態において、ＰＣＲに基づく方法は、エクソン１２の全てのコドンについてのコドン特異的アッセイを提供する。別の実施形態において、他の方法はエクソン１２を評価するのに使用する。アッセイがエクソン１２の全てをカバーしない特定の実施形態において、アッセイは、好ましくは、少なくとも全ての既知のエクソン１２変異を評価する。しかしながら、変異のサブセットのみを評価する限られたアッセイが変異を同定することができる場合、ＥＧＦＲ−ＥＣＤ変異の陽性を決定するのに十分である。アッセイ感度に関して、ＥＧＦＲ−ＥＣＤ変異状態は、アッセイの検出限界を超える変異の存在によって決定される。検出限界（すなわち、ＥＧＦＲ変異の最小レベル）より高いカット点（閾値）を用いる必要はない。ＥＧＦＲ−ＥＣＤ対立遺伝子頻度（野生型ＤＮＡに対する％変異体ＤＮＡの尺度）についての公表された報告は、０．１％という低いレベルを示す。一実施形態では、適切なアッセイは、潜在的な偽陰性を防止するために、＜１％（好ましくは、より低い）の検出限界を有するべきである。好ましい実施形態において、アッセイは、臨床検査改善修正法案（ＣＬＩＡ）（すなわち、ＣＬＩＡ認定アッセイ）によって認定することができる。
【００６８】
治療成果は、腫瘍応答の標準的な尺度を用いて評価することができる。治療に対する標的病変（腫瘍）応答は、以下のように分類される：
完全応答（ＣＲ）：全ての標的病変の消失。任意の病理学的リンパ節（標的であろうと非標的であろうと）は、短軸の減少が＜１０ｍｍでなければならない。
部分応答（Ｐａｒｔｉａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ、ＰＲ）：ベースラインの直径合計を基準として標的病変部の直径の合計の少なくとも３０％減少。
進行性疾患（ＰＤ：研究において最小の合計を基準として（調査において最も小さい場合、これはベースライン合計を含む）標的病変の直径の合計が少なくとも２０％増加。２０％の相対的増加に加えてこの合計は少なくとも５ｍｍの絶対的増加を示さなければならない（注：１つ以上の新しい病変の出現も進行と見なされる）。及び
安定的疾患（ＳＤ）：調査中の最小合計直径を基準として、ＰＲの要件を満たす十分な収縮も、ＰＤの要件を満たす十分な増加もない。（注：５ｍｍ以上の直径の合計を増加させない２０％以下の変化は、安定した疾患として規定される）。安定した病気の状態が指定されるためには、最低６週間の間隔で調査開始後少なくとも１回、安定した疾患基準を満たしていなければならない。
【００６９】
治療に対する非標的病変の応答は、以下のように分類される：
完全応答（ＣＲ）：全ての非標的病変の消失及び腫瘍マーカーレベルの正常化。全てのリンパ節は、非病理学的サイズ（＜１０ｍｍ短軸）でなければならない。腫瘍マーカーが最初は正常上限を上回っている場合、完全な臨床的応答を考慮して患者を正常化する必要がある、
非ＣＲ／非ＰＤ：１つ以上の非標的病変の持続及び／または正常な限度を超える腫瘍マーカーレベルの維持；及び
進行性疾患（ＰＤ）：１つ以上の新しい病変の出現及び既存の非標的病変の明白な進行のいずれかまたは両方。この文脈において、明らかな進行は、単一の病変の増加ではなく、全体的な疾患状態の変化を表していなければならない。
【００７０】
本明細書に開示される方法に従って治療される患者は、好ましくは、癌の少なくとも１つの徴候において改善を経験する。例えば、治療は、腫瘍のサイズの縮小、転移の減少、完全寛解、部分寛解、安定疾患、全体的奏功率の増加、または病的完全応答からなる群より選択される少なくとも１つの治療効果を生じ得る。応答はまた、測定可能な腫瘍病変の量及び／またはサイズの減少によって測定され得る。測定可能な病変は、１０ｍｍ超でＣＴスキャンにより（ＣＴスキャンスライス厚は５ｍｍ以下）、１０ｍｍで臨床検査でのキャリパー測定により、または２０ｍｍ超で胸部Ｘ線によるように少なくとも一次元で正確に測定できるものとして定義される（最も長い直径が記録される）。非標的病変、例えば、病理学的リンパ節のサイズも、改善のために測定することができる。病変は、例えば、Ｘ線、ＣＴ、またはＭＲＩ画像を用いて測定することができる。顕微鏡検査、細胞学または組織学を用いて、治療に対する応答性を評価することもできる。測定可能な腫瘍が応答または安定した疾患の基準を満たしている治療中に現れるかまたは悪化する滲出液は、腫瘍の進行を示すと考えられるが、滲出液の新生物起源の細胞学的確認がある場合のみである。
【００７１】
別の実施形態において、そのように治療された患者は、腫瘍収縮及び／または成長率の低下、すなわち腫瘍増殖の抑制を経験する。別の実施形態では、腫瘍細胞の増殖が低減または阻害される。あるいは、以下のうちの１つ以上は、治療に対する有益な応答を示すことができる：癌細胞の数を減少させることができる、腫瘍の大きさを減らすことができる、末梢器官への癌細胞の浸潤を抑制、遅延、減速、または停止することができる、腫瘍の転移を遅らせるかまたは阻害することができる、腫瘍の増殖を抑制することができる。腫瘍の再発を予防または遅延させることができる。癌に関連する１つ以上の症状をある程度緩和させることができる。好ましい応答の他の適応には、測定可能な腫瘍病変または非標的病変の量及び／またはサイズの減少が含まれる。
【００７２】
ＩＩＩ．選択の方法
本明細書ではまた、ＥＧＦＲを発現する腫瘍を有する患者の治療を選択する方法であって、患者が抗体ベースの抗ＥＧＦＲ治療に対して不応性である方法を提供する。
【００７３】
一実施形態では、この方法は、ａ）腫瘍由来の細胞が、ＥＧＦＲの細胞外ドメインにおける少なくとも１つの変異を保有するかどうかを決定することと、ｂ）もしそうであれば、本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体組成物を含む治療を選択することとを含む。さらなる実施形態では、この方法は、腫瘍の生検サンプルを取得することと、腫瘍が、ＥＧＦＲの細胞外ドメインをコードするＤＮＡまたはＲＮＡに少なくとも１つの変異を有するかどうかを、ポリメラーゼ連鎖反応または次世代シーケンシングを含む方法を用いて決定することとを含む。さらなる実施形態では、この方法は、腫瘍の生検サンプルを取得することと、腫瘍がＥＧＦＲの細胞外ドメインに少なくとも１つの変異（を有するかどうかを決定する例えば、免疫組織化学または質量分析によって）こととを含む。さらなる実施形態では、この方法は、患者から血液サンプルを得て、血液サンプルが、ＥＧＦＲの細胞外ドメインをコードする配列中の１つ以上の変異を有する循環ＤＮＡ（例えば、血液サンプルから単離された無細胞ＤＮＡまたは血液サンプル中の循環腫瘍細胞から単離されたＤＮＡ）を含むかどうかを決定することを含む。さらなる実施形態では、生検腫瘍細胞、循環腫瘍細胞、または無細胞ＤＮＡが、ＥＧＦＲの細胞外ドメインをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡにおける少なくとも１つの変異を保有し、少なくとも１つの変異は、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１２にある。さらなる実施形態では、ＥＧＦＲの細胞外ドメインにおける少なくとも１つの変異は、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ、Ｓ４６４Ｌ、Ｋ４６７Ｔ、Ｇ４６５Ｒ、Ｉ４９１Ｍ、及びＳ４９２Ｒから本質的になる群より選択されるタンパク質配列変化、またはタンパク質配列変化をもたらすＤＮＡもしくはＲＮＡコード領域にある。さらなる実施形態において、腫瘍は、ＦＤＡ承認試験によって検出されるように、ＥＧＦＲ細胞外ドメインにおける少なくとも１つの変異を保有する細胞を含むと決定される。
【００７４】
ＩＶ．予測の方法
また、抗ＥＧＦＲ抗体の単一の種のみを含む１つ以上のモノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体調製物での治療に対して不応性の癌である患者を治療するためにオリゴクローナル抗体混合物を使用することができるかどうかを決定する方法も本明細書に提供される。癌の治療のためのオリゴクローナル抗ＥＧＦＲ抗体の使用が記載され、ここで癌はＥＧＦＲを発現し、ＥＧＦＲは細胞外ドメインに少なくとも１つの変異を有すると決定される。
【００７５】
一実施形態では、どの腫瘍（例えば、悪性腫瘍）がオリゴクローナル抗ＥＧＦＲ抗体による治療に反応するが、単一モノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、セツキシマブ、パニツムマブ）による治療に応答しないかを予測する方法であって、患者の腫瘍細胞は、細胞外ドメインをコードするＥＧＦＲ遺伝子領域において変異を獲得しているかどうか決定することを含む。
【００７６】
他の実施形態は、以下の非限定的な実施例に記載される。以下の実施例は単なる例示であり、本開示を読むことにより当業者には多くの変形及び均等物が明らかになるであろうように、本開示の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００７７】
本出願を通して引用された全ての参考文献、Ｇｅｎｂａｎｋエントリー、特許及び公開特許出願の内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【実施例】
【００７８】
材料及び方法
実施例を通して、他に記載がない限り、以下の材料及び方法が使用される。
【００７９】
一般に、他に示さない限り、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、免疫学（特に抗体技術）の従来技術、及びポリペプチド調製における標準的技術が使用される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５１０、Ｐａｕｌ、Ｓ．、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ、１６９）、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ、Ｅｄ．、Ｉｒｌ  Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ、Ｐｕｂ．（１９９９）、及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９２）を参照されたい。
【００８０】
細胞培養及び耐性細胞の生成
ＯＸＣＯ−２細胞を、５％ＦＢＳを添加したＩｓｃｏｖｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養し、ＬＩＭ１２１５細胞を５％ＦＢＳ及びインスリン（１ｍｇ／ｍＬ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養し、ＨＣＡ−４６細胞を、５％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養し、及びＣＣＫ８１細胞を、５％ＦＢＳを補充したＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。全ての培地には２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミンと抗生物質（１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）も含まれており、及び細胞は３７℃及び５％ＣＯ２空気インキュベーターで増殖させた。ＯＸＣＯ−２細胞株は、２０１０年３月にＤｒ．Ｖ．Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ（英国  オックスフォード  Ｏｘｆｏｒｄ大学、Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）から寄贈されたものである。ＬＩＭ１２１５親細胞株は以前に記載されており（Ｒ．Ｈ．Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｆ．Ａ．Ｍａｃｒａｅ，Ｄ．Ｊ．Ｓｔ  Ｊｏｈｎ，Ｊ．Ｍａ，Ａ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（ＬＩＭ１２１５）  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｎｏｎｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．７４、７５９−７６５  （１９８５））、Ｌｕｄｗｉｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（スイス、チューリッヒ）の許可を得て、Ｐｒｏｆ．Ｒｏｂｅｒｔ  Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ（Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ大学、テネシー州、ナッシュビル）から入手した。ＨＣＡ−４６細胞株は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓｒｌにより配給）から入手した。ＣＣＫ８１細胞株は、Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｂａｎｋから入手した。ＨＥＫ２９３細胞株はＡＴＣＣ（ＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｓ．ｒ．ｌ）から購入し、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。
【００８１】
各細胞株の同一性は、Ｃｅｌｌ  ＩＤ  Ｓｙｓｔｅｍ及びＧｅｎｅ  Ｐｒｉｎｔ  １０  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、１０の異なる座位（Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ２１Ｓ１１、ｖＷＡ、ＴＨ０１、ＴＰＯＸ、ＣＳＦ１ＰＯ及びアメロゲニン）においてショートタンデムリピート（ＳＴＲ）を介して試験及び認証された。マルチプレックスＰＣＲからのアンプリコンをキャピラリー電気泳動（３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により分離し、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＧｅｎｅＭａｐｐｅｒＩＤソフトウェアを用いて分析した。得られた細胞株ＳＴＲプロフィールは、ＡＴＣＣ、ＥＣＡＣＣ、及びＣｅｌｌＢａｎｋ  Ａｕｓｔｒａｌｉａリポジトリのオンラインデータベースから入手可能なＳＴＲと相互比較及び適合させた。全ての細胞株を試験し、Ｖｅｎｏｒ  ＧｅＭ  Ｃｌａｓｓｉｃ  Ｋｉｔ（Ｍｉｎｅｒｖａ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてマイコプラズマ汚染について陰性とした。
【００８２】
ＬＩＭ１２１５  Ｒ１は、１．４μＭの濃度で薬物に連続的に曝露することによって生成した。ＬＩＭ１２１５  Ｒ２は、ＬＩＭ１２１５についてセツキシマブの投与量を段階的に３５０ｎＭから１．４μＭに増加させることによって得られた。ＬＩＭ１２１５  Ｒ３〜５及びＯＸＣＯ−２、及びＨＣＡ−４６セツキシマブ耐性誘導体は、ＮＣＩＨ５０８については０．３μＭ、及びＬＩＭ１２１５、ＯＸＣＯ−２及びＨＣＡ−４６については１．４μＭの濃度で薬物に３〜９カ月間連続曝露した後に生成した。ＣＣＫ８１セツキシマブ耐性誘導体は、セツキシマブ投与量を６ヶ月間に６８０ｎＭから１．４μＭまで段階的に増加させることによって得た。
【００８３】
細胞株における変異分析
ゲノムＤＮＡサンプルをＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により抽出した。サンガー法のために、全てのサンプルをＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７３０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）による自動配列決定に供した。プライマー配列は他の場所に記載されている（６、９）。以下の遺伝子及びエクソンを分析した：ＫＲＡＳ（エクソン２、３及び４）、ＮＲＡＳ（エクソン２及び３）、ＰＩＫ３ＣＡ（エクソン９及び２０）、ＢＲＡＦ（エクソン１５）、ＥＧＦＲ（エクソン１２）。独立したＰＣＲ反応から出発して、全ての変異を２回確認した。
【００８４】
ＫＩ細胞の生成（ＬＩＭ１２１５  ＫＩ  ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ）
ＬＩＭ１２１５細胞を、６０〜８０％コンフルエンスになるまで１０ｃｍディッシュで増殖させた。次いで、培地を吸引し、２μｌのｒＡＡＶ（ｐＡＡＶ０２２３  ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）及び５ｍｌの新鮮な適切な増殖培地を細胞に添加した。ウイルスを３７℃で４時間細胞に感染させた。その後、５ｍｌの増殖培地を細胞に加え、次いで１４〜１６時間後に新鮮な培地で完全に改新した。感染した細胞を４８時間増殖させた後、トリプシン処理により採取し、９６ウェルプレートにジェネティシン（Ｇ４１８、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）含有培地で分配した。収穫及び組換え体のスクリーニングの前にプレートを２週間３７℃でインキュベートした。左相同アームの外側に位置するフォワードプライマーＦＷ：５’ＡＡＧＡＴＧＧＧＧＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＣ３’（配列番号２８）及びＮｅｏ遺伝子内に位置するリバースプライマーＲＶ：５’ＧＣＡＴＧＣＴＣＣＡＧＡＣＴＧＣＣＴＴＧ３’（配列番号２９）を用いて、「ネオスクリーニング」ＰＣＲにより、遺伝子座特異性相同組換え事象をスクリーニングした。単一クローンからのゲノムＤＮＡは、メーカーの使用説明書に従ってＬｙｓｅ−Ｎ−ＧｏＴＭ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で細胞を溶解することによって得た。ＰＣＲスクリーニングは、以下の条件を用いて１０μｌの反応容量で行った：９４℃で３分間の１サイクル；９４℃で１５秒間、６４℃で３０秒間、７０℃で１分３０秒間の３サイクル；９４℃で１５秒間、６１℃で３０秒間間、７０℃で１分３０秒間の３サイクル；９４℃で１５秒間、５８℃で３０秒間、７０℃で１分３０秒間の３サイクル；９４℃１５秒間、５５℃３０秒間、７０℃１分３０秒間の３５サイクル； ７０℃で５分間、１サイクル。陽性クローンにおいて、Ｓ４９２Ｒ変異の導入及び発現を、ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡレベルで配列決定することによって確認した。
【００８５】
ＬｏｘｅｄＰ  Ｎｅｏカセットを除去するために、ＬＩＭ１２１５  ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒノックイン細胞を、適切な増殖培地５ｍＬ中のＣｒｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅアデノウイルス１μｌと共にインキュベートした。ウイルスを３７℃で４時間細胞に感染させた。次いで、５ｍｌの増殖培地を細胞に加え、次いで１４〜１６時間後に新鮮な培地で完全に改新した。次に、単一クローンを単離するため限界希釈で細胞を９６ウェルプレートに播種した。単一のクローンがコンフルエンスの５０〜６０％に達したとき、それらを採取し、前の段落で記載したＬｙｓｅ−Ｎ−Ｇｏ  ＰＣＲＴＭ試薬を用いて各ウェルからゲノムＤＮＡを抽出し、Ｎｅｏカセットの除去を評価するために二重ＰＣＲスクリーニングを行った。ネガティブであると考えられる第１のＰＣＲ反応は、上記の「ネオスクリーニング」と同様であった。それは、ゲノムＤＮＡ、ＦＷ：５’ＡＡＧＡＴＧＧＧＧＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＣ３’（配列番号３０）及びネオマイシン遺伝子ＲＶ：５’ＧＣＡＴＧＣＴＣＣＡＧＡＣＴＧＣＣＴＴＧ３’（配列番号３１）にアニーリングするプライマーを用いて行った。このＰＣＲはＣＲＥアウトクローンに対して陰性であった。第２のＰＣＲ反応は変異の存在を確認することが期待された。ＰＣＲ反応は、ネオスクリーニングのために上記したのと同じ条件、サイクル時間及び温度を用いて、それぞれ１０μｌ及び２０μｌの反応容量で実施した。機能レベルでのＮｅｏカセットの除去を証明するために、選択されたクローンをＧ４１８含有（０．８ｍｇ／ｍＬ）培地及びＧ４１８を含まない培地の両方に播種した。予想通り、ＣＲＥクローンはＧ４１８を含まない培地でのみ生存することができた。次いで、これらのクローンを増大させ及び最終変異分析にかけた。
【００８６】
ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ細胞株の生成
ＬＩＭ１２１５細胞を追加の細胞バンク（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から取得し、本明細書ではこれらの細胞を「ＬＩＭ１２１５（＃２）」と呼ぶ。細胞は、メーカーによるショートタンデムリピートプロファイリングによって認証され、メーカーの使用説明書に従って３ヶ月未満の間実験室で継代された。ＬＩＭ１２１５（＃２）細胞を、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内で、加湿インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。ＥＦ１αプロモーターからのＳ４９２Ｒ変異を保有するＥＧＦＲを発現するｐＤ２５３９安定発現構築物をＤＮＡ２．０から獲得した。この構築物は、ＤＮＡ２．０によって多段階プロセスで生成された。第１に、全長ＥＧＦＲは、以下のサイレント変異を有するＤＮＡ合成によって生成された−２つのＢｓａＩ制限酵素部位の除去、２つのＢｓａＩ指向性エンドヌクレアーゼ部位の付加による塩基１２５３と１５７２との間の短いクローニングカセット（これには、ＥＧＦＲエクソン１２の全てが含まれる）の生成、及び発現を監視するための固有の「ｍｏｄ１ａ」及び「ｍｏｄ２ａ」ｑＰＣＲプライマー結合部位の挿入。第２に、このＥＧＦＲ配列をＰＭ２６９ベクターに挿入して「ＰＭ２６９−ＥＧＦＲ」構築物を生成した。第３に、Ｓ４９２Ｒ変異（１４７４Ａ＞Ｃ）を含むクローニングカセットを合成し、挿入された２つのＢｓａＩ指向性エンドヌクレアーゼ部位を用いてＰＭ２６９−ＥＧＦＲ構築物に挿入した。第４に、Ｅｌｅｃｔｒａサブクローニングシステム（ＤＮＡ２．０）を使用して、修飾ＥＧＦＲ配列（配列番号３３）をｐＤ２５３９安定発現ベクターに移した、本明細書では「ｐＤ２５３９−ＥＧＦＲ−Ｓ４９２Ｒ」と呼ぶ。
【００８７】
ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ  ｃａｔ＃１１−８１４−４４３−００１）を用いて、ＬＩＭ１２１５（＃２）細胞にｐＤ２５３９−ＥＧＦＲ−Ｓ４９２Ｒをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、１０％ＦＢＳ及び１μｇ／ｍＬピューロマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で２週間増殖させて、安定な発現プールを生成した。ＲＮｅａｓｙプラスミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを集め抽出し、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて逆転写を行った。ＳＹＢＲグリーンリアルタイムＰＣＲをＶｉｉＡ７装置（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で行い、ｍｏｄ１ａプライマー（５’ＧＧＧＴＴＣＧＣＡＴＣＡＧＡＴＣＴＣＧＴＴＡ３’（配列番号３６）５’ＴＣＡＡＧＣＡＣＣＴＡＴＧＡＡＣＴＣＧＧＡＣ３’（配列番号３７））を使用して、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ｍＲＮＡの発現を確認した。Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｓ＿ＡＣＴＢ＿１＿ＳＧ）から得られたプライマーを用いて発現をβ−アクチンハウスキーピング対照に対して正規化した。
【００８８】
ｐＤ２５３９−ＥＧＦＲ−Ｓ４９２Ｒプラスミドの安定した発現を保有するＬＩＭ１２１５（＃２）細胞株を、プレート当たり５０細胞の開始濃度で１０ｃｍ培養プレートに播種し、１μｇ／ｍＬピューロマイシンで、選択圧下で増殖させた。培地を５日ごとに交換し、２４個の単一クローンをクローニングディスクで採取し、選択圧力下で増殖させた。その後、２４個のクローンにおいてＳ４９２Ｒ  ｍＲＮＡの発現を評価し、さらなる実験のために選択した最高発現を有するクローンを評価した。全ＥＧＦＲタンパク質の発現をイムノブロットにより測定し、親ＬＩＭ１２１５（＃２）細胞株より約５．７倍高いことが判明した。このクローンを本明細書では「ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ」と称する。
【００８９】
ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ細胞株の生成
ＥＧＦＲ  Ｓ４９２領域（「Ｓ４９２」；５’ＡＡＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＣＣＧＧ３’（配列番号３８））
及び対照としての非特異的配列（「ｒｇ＿０１１１」；５’ＡＣＧＧＡＧＧＣＴＡＡＧＣＧＴＣＧＣＡＡ３’（配列番号３９））を標的とするために、ＣＲＩＳＰＲ設計ツール（マサチューセッツ工科大学；ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）を用いて単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を設計した。２つのｓｇＲＮＡ配列をＤＮＡ２．０から得られた哺乳類Ｃａｓ９ゲノム編集ベクター（ｐＤ１３２１−ＡＤ、ＣＡＧ−Ｃａｓ９−２Ａ−ＧＦＰ）に別々にクローニングしたが、それぞれ本明細書では「ｐＤ１３２１−ＡＤ−Ｓ４９２Ｒ」及び「ｐＤ１３２１−ＡＤ−ｒｇ＿０１１１」と称する。ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を含む一本鎖供与体オリゴヌクレオチドを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（配列番号３４）によって合成した。
【００９０】
各プラスミド（ｐＤ１３２１−ＡＤ−Ｓ４９２Ｒ及びｐＤ１３２１−ＡＤ−ｒｇ＿０１１１）について、ＬＩＭ１２１５（＃２）細胞にプラスミドとＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ一本鎖供与体オリゴヌクレオチド（配列番号３４）の両方を一時的にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、プラスミド上にコードされたＧＦＰタンパク質の発現に基づいてフローサイトメトリーにより選別した。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、Ｑｉａｇｅｎ製のＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡミニキット（カタログ＃５１３０６）を用いてメーカーの使用説明書に従って抽出した。ｇＤＮＡを５０μＬの溶出緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０）で溶出し、ｇＤＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）２０００Ｃ  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でメーカーの使用説明書に従って測定した。Ｓ４９２Ｒ変異の存在は、サンガー法によって確認された。
【００９１】
プールされた培養物からの単一細胞を９６ウェルプレートの個々のウェルに単離し、遺伝子型判定のためにｇＤＮＡを抽出した。ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を含むと同定された単一のクローンをさらなる実験のためにバンクし選択した。フローサイトメトリー抗体結合アッセイを実施して、Ｐ２Ｘ結合を維持しながらセツキシマブ結合を減少させるクローン（両方とも野生型ＥＧＦＲを発現するＬＩＭ１２１５（＃２）細胞株への結合と比較して）を同定した。このクローンを本明細書では「ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ」と呼ぶ。
【００９２】
フローサイトメトリー実験を、ｐＤ１３２１−ＡＤ−ｒｇ＿０１１１プラスミド（野生型ＥＧＦＲ遺伝子型を維持する非標的配列）を用いてプールした培養物で実施し、野生型ＥＧＦＲを発現するＬＩＭ１２１５（＃２）細胞株と比較してセツキシマブ及びＰ２Ｘ抗体の結合が維持されていることを確認した。このプールした培養物を、本明細書では「ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２野生型」と称する。
【００９３】
ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｒ  ＫＩ細胞株の生成
単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を、ＥＧＦＲ  Ｇ４６５領域（「Ｇ４６５ｓｇ１」、５’ＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＴＡＴＣＴＣＣＴＴＧ３’（配列番号４０）、
「Ｇ４６５ｓｇ２」、５’ＧＣＴＡＴＧＣＡＡＡＴＡＣＡＡＴＡＡＡＣ３’（配列番号４１））
及び対照としての非特異的配列（「ｄｕａｌ−ｒｇ０１１１」、５’ＡＣＧＧＡＧＧＣＴＡＡＧＣＧＴＣＧＣＡＡ３’（配列番号４２）「ｄｕａｌ−ｒｇ−０１３５」、５’ＣＧＣＴＴＣＣＧＣＧＧＣＣＣＧＴＴＣＡＡ３’（配列番号４３）））を標的とするためにＣＲＩＳＰＲ設計ツール（マサチューセッツ工科大学；ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）を用いて設計した。２つのｓｇＲＮＡ配列を、ＤＮＡ２．０から得られた哺乳類ニカーゼＣａｓ９−Ｄ１０Ａゲノム編集ベクター（ｐＤ１４３１−ＡＤ、ＥＦ１ａ−Ｃａｓ９Ｎ−２Ａ−ＧＦＰ）にクローニングし、それぞれ本明細書では「ｐＤ１４３１−ＡＤ−ｎＣａｓ９Ｇ４６５Ｒ」及び「ｐＤ１４３１−ＡＤ−ｎＣａｓ９  ｎｏｎ＿ｔａｒｇｅｔｉｎｇ」と称する。ＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｒ変異を含む一本鎖供与体オリゴヌクレオチドを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（配列番号３５）によって合成した。
【００９４】
各プラスミド（ｐＤ１４３１−ＡＤ−ｎＣａｓ９Ｇ４６５Ｒ及びｐＤ１４３１−ＡＤ−ｎＣａｓ９  ｎｏｎ＿ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）について、ＬＩＭ１２１５（＃２）細胞に、プラスミド及びＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｒ一本鎖供与体オリゴヌクレオチド（配列番号３５）の両方を一時的にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、プラスミド上にコードされたＧＦＰタンパク質の発現に基づいてフローサイトメトリーにより選別した。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、Ｑｉａｇｅｎ製のＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡミニキット（カタログ＃５１３０６）を用いてメーカーの使用説明書に従って抽出した。ｇＤＮＡを５０μＬの溶出緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０）で溶出し、ｇＤＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）２０００Ｃ  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でメーカーの使用説明書に従って測定した。サンガー法により、Ｇ４６５Ｒ変異の存在が確認された。
【００９５】
野生型ＥＧＦＲを発現する細胞とＥＧＦＲ  ＥＣＤ変異を発現する細胞との混合物を用いたインビトロプール培養系におけるＥＧＦＲ  ＥＣＤ変異の分析
実験の初日に、野生型ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲ外部ドメイン変異の両方の発現を保有する細胞のプールを、２４ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルの濃度で播種する。それぞれＥＧＦＲ  Ｓ４９２ＲまたはＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｒ遺伝子編集を保有する細胞を含むＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ及びＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｒ  ＫＩ細胞株の発生中に２つのプールがそれぞれ生成された。細胞を、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、加湿インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。陰性対照として、野生型ＥＧＦＲのみを発現する細胞のプールを同様にプレーティングし、培養した（このプールは、ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２野生型対照細胞株の発生中に生成した）。
【００９６】
また、最初の日に、５ｘ１０５個の細胞を卓上遠心分離機中、３０００ＲＰＭで５分間ペレット化し、上清を除去し、後のゲノムＤＮＡ抽出のために細胞ペレットを−８０℃で保存した。翌日、細胞を１μＭ濃度の抗体または培地のみ（対照）で処理した。４、１０及び１５日目に、後のゲノムＤＮＡ抽出のために、各プレートウェルの細胞の半分を新しいプレートに移し、細胞の半分を用いて、後のゲノムＤＮＡ抽出のために上記のように細胞ペレットを形成した。
【００９７】
全ての細胞ペレットを回収した後、サンプルを解凍し、２００μＬのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、Ｑｉａｇｅｎ製のＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（カタログ＃５１３０６）を用いてメーカーの使用説明書に従ってゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡを５０μＬの溶出緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０）で溶出し、ｇＤＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）２０００Ｃ  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でメーカーの使用説明書に従って測定した。
【００９８】
各ゲノムＤＮＡサンプルにおけるＥＧＦＲ  ＥＣＤ変異の対立遺伝子頻度を、ＱＸ２００（商標）Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ（商標）ＰＣＲシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって評価した。ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ及びＧ４６５Ｒ変異及び対応する野生型に特異的なｄｄＰＣＲプライマーを含むカスタムＴａｑＭａｎ（登録商標）ＳＮＰジェノタイピングアッセイキットをＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カタログ＃４３３１３４９、アッセイＩＤ：ＡＨＮ１ＹＥＫ、ＥＧＦＲＳ４９２Ｒ；アッセイＩＤ：ＡＨＰＡＷＫＳ、ＥＧＦＲＧ４６５Ｒ）から得た。ｄｄＰＣＲアッセイは、反応当たり２０ｎｇのゲノムＤＮＡを使用してメーカーの使用説明書に従って実施し、対立遺伝子頻度は、全（ＥＧＦＲ変異体＋野生型）ＤＮＡ対立遺伝子に対するＥＧＦＲ変異体ＤＮＡ対立遺伝子のパーセンテージとして計算した。
【００９９】
ＮａｎｏＢＲＥＴアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞に、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ＃Ｅ２３１１）を一過的にトランスフェクトして、ＥＧＦＲ−ＮａｎｏＬｕｃ変異体の発現を可能にした。次いでトランスフェクトされた細胞を、増加する用量（０〜１００μｇ／ｍｌ）の薬物及び１８ｎｇ／ｍｌの濃度で３０分間ＨａｌｏＴａｇ−ＥＧＦ（トレーサー）で処理した。その後、ＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）Ｎａｎｏ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを添加し、プレートをＧｌｏＭａｘ（登録商標）−Ｍｕｌｔｉ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｒｅａｄｅｒで分析する。生のＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）比の値を計算するために、アクセプタ発光値（６１０ｎｍ）を各サンプルの供与体発光値（４５０ｎｍ）で割る。
【０１００】
細胞生存率アッセイＣｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ
セツキシマブ及びパニツムマブは、イタリア、ミラノのＮｉｇｕａｒｄａ  Ｃａ  ’Ｇｒａｎｄａ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの薬局から入手した。ＭＭ−１５１はＭｅｒｒｉｍａｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから入手した。細胞株を、９６ウェル培養プレート中で、以下の濃度（ＬＩＭ１２１５、ＨＣＡ−４６、ＮＣＩＨ５０８、及びＯＸＣＯについては２×１０３、ＣＣＫ８１については３×１０３）で１００μＬの培地に播種した。翌日、各薬物（セツキシマブ、パニツムマブ、ＭＭ−１５１）の連続希釈液１００μＬを無血清培地中の細胞に添加して、１００〜０μｇ／ｍｌの最終濃度を達成した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で６日間インキュベートした後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞生存率をＡＴＰ含量によって評価した。Ｖｉｃｔｏｒ−Ｘ４プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて測定値を記録した。処理されたウェルを未処理のものに対して標準化する。
【０１０１】
ＬＩＭ１２１５（＃２）細胞株及びそれに由来する細胞株の実験は、改変された方法を使用する。セツキシマブはＭｙｏｄｅｒｍから得、Ｓｙｍ００４組み合わせ（Ｓｙｍ９９２＋Ｓｙｍ１０２４）抗体は特許文献からの配列情報を用いて発現及び精製され、及びＭＭ−１５１はＭｅｒｒｉｍａｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから得た。細胞株を、９６ウェル培養プレート中の１０％ウシ胎仔血清を補充した１００μＬＲＰＭＩ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に５×１０３細胞／ウェルの濃度で播種した。翌日、各薬物（セツキシマブ、Ｓｙｍ００４、ＭＭ−１５１）の連続希釈物１００μＬを、８ｎＭ  ＥＧＦリガンド（Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充したＲＰＭＩ培地中の細胞に添加して、最終濃度を１０００〜１ｎＭとした。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベートした後、細胞生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＡＴＰ含量によって評価した。Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて測定値を記録した。処理したウェルを、８ｎＭのＥＧＦリガンドのみで処理したウェルに対して標準化する。
【０１０２】
細胞増殖率アッセイ
セツキシマブはＭｙｏｄｅｒｍから得られ、Ｓｙｍ００４組み合わせ（Ｓｙｍ９９２＋Ｓｙｍ１０２４）抗体は特許文献からの配列情報を用いて発現及び精製され、ＭＭ−１５１はＭｅｒｒｉｍａｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから得られた。細胞株を、９６ウェル培養プレート中１０％ウシ胎仔血清を補充した１００μＬＲＰＭＩ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に５×１０３細胞／ウェルの濃度で播種した。翌日、播種培地を、２％ウシ胎仔血清及び各薬物の連続希釈液（１０００〜０．１５ｎＭの最終濃度を達成する）を含み及び、リガンドなし、８ｎＭ  ＥＧＦリガンドＰｅｐｒｏｔｅｃｈ）、または８ｎＭ  ＡＲＥＧリガンド（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加した３００μＬのＲＰＭＩ処理培地と交換した。プレートを直ちにＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭ生細胞イメージャに移し、位相差画像を２時間間隔で７２時間取得した。増殖率を計算するために、コンフルエンスデータ（細胞によって覆われたウェル表面のパーセント）が自然対数変換され、得られた線の傾きが線形回帰によって決定された。高いコンフルエンスでの増殖飽和を排除するために、０〜７０％コンフルエンスの間の測定値のみを使用した。増殖率を、各細胞株のための対照（薬物なし）条件に対して標準化した。
【０１０３】
ホスホ−ＥＲＫ細胞シグナル伝達アッセイ
９６ウェル培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ；カタログ＃３９９７）中、３．５×１０４細胞／ウェルの濃度で１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１００μＬに細胞株を播種した。翌日、播種培地を、１％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ培地１００μＬと交換した。翌日、細胞を、１％ウシ胎仔血清を含有する１００μＬの培地及び各薬物の連続希釈液（１０００〜０．１５ｎＭの最終濃度を達成するため）で２時間処理した。次いで、細胞を、１％ウシ胎児血清及び、リガンドなし、ＥＧＦリガンド（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、またはＡＲＥＧリガンド（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含む５０μＬＲＰＭＩで１０分間刺激した。添加後、リガンドの最終濃度は８ｎＭであった。次いで、細胞を１５０μＬの冷ＰＢＳで洗浄し、５４μＬのＭＰＥＲ緩衝液＋１５０ｍＭのＮａＣｌ＋ホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ；カタログ＃０４９０６８３７００１及び４６９３１２４００１）で溶解した。溶解物を−８０℃で１５分間凍結させ、次いで氷上で３０分間解凍した。
【０１０４】
ホスホ−ＥＲＫをサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。９６ウェルブランクＭＳＤプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；カタログ＃Ｌ１５ＸＡ−３）をＰＢＳ（１：５０）中１００倍希釈した２５μＬの２Ｘ捕獲抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ＃Ｒ９２ＴＣ−１）で被覆し、室温で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＢＩＯＴＥＫプレート洗浄機で１００μＬ／ウェルＰＣＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。続いて１５０μＬのＭＳＤブロック（ＰＢＳ中１％、０．２μｍフィルター）で室温にて１時間プレートをブロックした。プレートをＢＩＯＴＥＫプレート洗浄機で１００μＬ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。２５μＬ／ウェルで細胞溶解物（ニート）またはホスホ−ＥＲＫ標準（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；  カタログ＃ＤＹＣ１０１８ＢＥ）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＢＩＯＴＥＫプレート洗浄機で１００μＬ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。検出抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ＃Ｒ９２ＴＣ−１）を１％ＭＳＤブロック溶液（１：５０）中で１００倍から２倍に希釈し、２５μＬ／ウェルで加え、室温で２時間インキュベートした。プレートをＢＩＯＴＥＫプレート洗浄機で１００μＬ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。Ｓｕｌｆｏ−ｔａｇを有する二次検出抗マウスＩｇＧ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；カタログ＃Ｒ３２ＡＣ−５）を１％ＭＳＤブロック溶液で１：１０００に希釈し、２５μＬ／ウェルで添加し、オービタルシェイカー（３００ｒｐｍ）で室温にて１時間インキュベートした。プレートをＢＩＯＴＥＫプレート洗浄機で１００μＬ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。界面活性剤を含むＭＳＤ読み取りバッファー（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；カタログ＃Ｒ９２ＴＣ−１）をｄｄＨ２０中で４倍から２倍に希釈し、１５０μＬ／ウェルで添加した。プレートをＭＳＤ  ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ２４００（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で読み取った。結果はバックグラウンドシグナルの減算、組換えＥＲＫ標準への回帰、及び希釈係数を補正するためのバック計算によって分析した。複製サンプルを平均し、標準偏差を計算した。
【０１０５】
ＤＮＡ構築物及び変異誘発
ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）−ＥＧＦＲ  ＷＴベクターはＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入したが、ｐＬＸ３０１−ＥＧＦＲ  ＷＴ構築物はＤｒ．Ｃ  ＳｕｎとＰｒｏｆ．Ｒ．Ｂｅｒｎａｒｄｓ（ＮＫＩ、アムステルダム、オランダ）からの寛大な贈り物であった。
【０１０６】
鋳型ＤＮＡとしてＷＴ対応プラスミドを用いたＡｇｉｌｅｎｔ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ部位特異的変異誘発キットを用いて、６点変異（Ｒ４５１Ｃ、Ｓ４６４Ｌ、Ｇ４６５Ｒ、Ｋ４６７Ｔ、Ｉ４９１Ｍ、及びＳ４９２Ｒ）を含むＥＧＦＲ変異体を構築した。変異の存在は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１０７】
イムノブロット解析
生化学分析の前に、親細胞を、５％ＦＢＳ培地中の１０％ＦＢＳ、ＫＩ細胞を補充したそれらの特異的培地中で増殖させた。１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、１００ｍＭの弗化ナトリウム及びプロテアーゼ阻害剤（ペプスタチン、ロイペプチン、アプロチニン及びＳＴＩ）の混合物の存在下で、冷ＥＢ緩衝液（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％グリセロール、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＥＧＴＡ；Ｆｌｕｋａ製のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を除く全ての試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからのものであった）に細胞を可溶化することによって、全細胞タンパク質を抽出した。抽出物を遠心分離によって清澄化し、タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キット（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて測定した。ウェスタンブロット検出は、強化化学発光システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて行った。以下の一次抗体をウエスタンブロッティングに使用した（記載の場合を除き、全てＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）：抗ホスホｐ４４／４２ＥＲＫ（ｔｈｒ２０２／ｔｙｒ２０４）；抗ｐ４４／４２  ＥＲＫ；抗ホスホ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、抗ＡＫＴ；抗ホスホＥＧＦＲ（ｔｙｒ１０６８）；抗ＥＧＦＲ（クローン１３Ｇ８、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）；抗ビンキュリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。翌日、適切な二次抗体との１時間のインキュベーションの後、ＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてシグナルを発生させた。
【０１０８】
ＬＩＭ１２１５（＃２）細胞株及びそれに由来する細胞株の実験は、改変された方法を使用する。６ウェルプレートで５×１０５の濃度で１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ培地２ｍＬに細胞を播種した。翌日、播種培地を、１％ウシ胎仔血清を補充した１ｍＬのＲＰＭＩ培地と交換した。翌日、細胞を、１％ウシ胎仔血清及び薬物（最終濃度１００ｎＭを達成する）を含む１１１μＬの培地で２４時間処理した。翌日、細胞を、１％ウシ胎仔血清を含み、リガンドなし、ＥＧＦリガンド（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、またはＡＲＥＧリガンド（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含む１２３μＬＲＰＭＩで１０分間刺激した。添加後、リガンドの最終濃度は８ｎＭであった。次いで、細胞を冷ＰＢＳ１ｍＬで洗浄し、１００μＬＭＰＥＲ緩衝液＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋ホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ；カタログ＃０４９０６８３７００１及び４６９３１２４００１）で溶解した。抽出物を−８０℃で凍結した。後日、抽出物を遠心分離によって清澄化し、タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて測定した。
【０１０９】
ウェスタンブロット分析のためにサンプルを以下のように調製した。４０μｇのタンパク質を、１０％ｂ−メルカプトエタノール及びＭＰＥＲ緩衝液を補充したローディングバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で３０μＬの最終容量まで希釈した。サンプルを９０℃で５分間煮沸し、次にボルテックスし、遠心分離した。サンプル２５μＬを４〜１２％のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＸＴ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；カタログ＃３４５０１２４）のウェルにローディングし、１８０Ｖで９０分間メーカーの使用説明書に従って実行した。次いで、ゲルを２Ｘ  ＮｕＰＡＧＥトランスファー緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中シェイカー上で２０分間インキュベートし、次いで、ｉＢｌｏｔトランスファーシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてニトロセルロース膜上に転写した。膜をオデッセイブロッキングバッファー（Ｌｉ−ｃｏｒ；カタログ＃９２７−４００００）中シェイカー上で室温にて１時間ブロックし、次いでブロックバッファーで希釈した一次抗体をシェイカー上４℃で一晩インキュベートした（ｐＥＧＦＲ：Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ＃３７７７；総ＥＧＦＲ：Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ＃４２６７；アクチンハウスキーピング対照：Ｓｉｇｍａ  カタログ＃Ａ１９７８）。翌日、膜をＴＢＳ−Ｔ溶液で３回それぞれ５分間洗浄し、次いでブロッキング緩衝液中で二次抗体とともにシェイカー上室温で１時間インキュベートした。使用した二次抗体は、ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｌｉ−ｃｏｒ、カタログ＃９２６−３２２１１）及びＩＲＤｙｅ  ６８０ＲＤヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）であった（Ｌｉ−ｃｏｒ、カタログ＃９２６−６８０７０  ）。次いで膜をＴＢＳ−Ｔ溶液で３回それぞれ５分間洗浄し、次いでＰＢＳで１回洗浄した。次いで、膜をＯｄｙｓｓｅｙ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｌｉ−Ｃｏｒ）を用いてスキャンした。
【０１１０】
フローサイトメトリーによる抗体結合の評価
細胞を、４５μＬのＦＡＣＳ緩衝液（１％ウシ胎仔血清及び０．１％アジ化ナトリウムを補充したリン酸緩衝化血清、ｐＨ７．４）及び５μＬのヒトＴｒｕＳｔａｉｎ  ＦｃＸ（商標）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｉｎｃ；カタログ＃４２２３０２）溶液中、１×１０５細胞／ウェルの濃度でＵ底９６ウェルプレート（ファルコン；カタログ＃３５３０７７）に移した。細胞を氷上で１０分間インキュベートした（４℃）。次いで、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）とコンジュゲートし、ＦＡＣＳ緩衝液で希釈した抗体を、０．１μＭの最終濃度で１時間添加した。結合特異性を確認するために、ウェルの半分を最初に非標識抗体（最終濃度５μＭ）と共に１時間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（氷上で４℃）で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１００００に希釈したＴＯ−ＰＲＯ（登録商標）−３  Ｉｏｄｉｄｅ（６４２／６６１）溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；カタログ＃Ｔ３６０５）に再懸濁した。次に、細胞を分析のためにＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にローディングした。生細胞を選択し（ＴＯ−ＰＲＯ（登録商標）−３  ｎｅｇａｔｉｖｅ）、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８の強度を測定した。ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）を用いて各サンプルの平均蛍光強度を計算した。
【０１１１】
マウス異種移植研究
体重１６±０．５ｇの４−５週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウス（ＮＵ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ；  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ）に、０．２ｍＬのＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ、０．２ｍＬのＬＩＭ１２１５（＃２  ）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ、または成長因子減少Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有するＰＢＳ中０．２ｍＬのＬＩＭ１２１５（＃２）細胞懸濁液を、１マウス当たり５×１０６細胞の濃度でインキュベートした。腫瘍の体積が約３００ｍｍ３に達したら、マウスをＰＢＳ（ビヒクル対照）または薬物を受ける処置群にランダム化した。処置はＩＰ注射によって実施した。腫瘍寸法を、ノギスで毎週３回測定し、腫瘍体積を式：π／６×Ｌ×Ｗ２（ここで、Ｌ及びＷはそれぞれ、より大きい及びより小さい腫瘍直径を表す）を用いて計算した。
【０１１２】
抗体の投与スケジュールは、それらの薬物動態学に基づいて決定される。ネズミＥＧＦＲ（２５Ｅ、Ｐ３Ｘ、セツキシマブ）と交差反応しない抗体は、マウスにおいて約４〜５日のほぼ同等の半減期値を有することが観察され、Ｑ７ｄスケジュール（例えば、月曜日）に投与される。ネズミＥＧＦＲ（Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ）と交差反応する抗体は、標的媒介性薬物配置のためにより迅速なクリアランスを有することが観察され、週３回のスケジュール（例えば、月曜日、水曜日、金曜日）で投与される。
【０１１３】
２５Ｅ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘ抗体からなる３抗体混合物を、マウスの腫瘍増殖実験のためのＭＭ−１５１ツール化合物として利用する。抗体２５ＥはマウスＥＧＦＲに関与しないため、セツキシマブ比較器に適合する週１回投与スケジュールを可能にし、ヒト患者の薬物動態をよりよく反映するはずであるため、Ｐ１Ｘの代わりとなる。Ｐ１Ｘは２５Ｅ（１１対１４５ｐｍｏｌ／Ｌ）の親和性成熟変異体であり、抗体はＥＧＦＲ上の重複エピトープに関与する。ＭＭ−１５１ツール化合物中の３つの抗体の用量は、対応する用量のセツキシマブと同等の合計血清曝露をもたらすために各抗体の薬物動態モデルの計算シミュレーションを使用して計算した。
【０１１４】
ヒト患者からの循環無細胞ＤＮＡにおけるＥＧＦＲ  ＥＣＤ変異の解析
難治性進行性固形腫瘍を有する患者におけるＭＭ−１５１の第１相試験を実施して、安全性を評価し、単剤療法またはイリノテカンと組み合わせたＭＭ−１５１の最大耐量を確立した（プロトコルＭＭ−１５１−０１−０１−０１、  ＮＣＴ＃０１５２０３８９）。このプロトコルの一環として、血液及び腫瘍組織サンプルを採取し、ＭＭ−１５１の応答及び／または安全性を予測または評価するのに役立つ可能性のあるバイオマーカーをさらに特徴づけ及び相関させるための探索的バイオマーカー分析のため全患者からインフォームドコンセントを得た。調査は、現地のガイドラインに基づき、各サイトの機関レビュー委員会によってレビューされ承認された。この研究は、ＭＭ−１５１の漸増用量を様々なスケジュールで評価するように設計された。患者は、進行性疾患（最初の投与日から８週間ごとに放射線スキャンにより評価）まで、耐えられない毒性または研究者によって評価された中断のための他の理由まで治療された。バイオマーカー分析をサポートするために、プロトコル定義の時点で血清サンプルを収集した。各採取時点で、添加物のない赤色の上部チューブに血液９．５ｍＬを集め、室温で１５〜３０分間凝固させた。次いで、サンプルを３０００ｒｐｍで１０〜１５分間遠心分離して細胞を血清から分離した。血清を２つの等しいアリコートに分割し、中央貯蔵施設に輸送するまで−８０℃の貯蔵に置いた。
【０１１５】
ＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）をメーカーの使用説明書に従って使用して、循環する無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を血清から単離した。次いで、６μｌのｃｔＤＮＡをＧＥ／ｍｌ測定のための各ｑＰＣＲ反応の鋳型として使用した。全てのサンプルを三重に分析した。ＰＣＲ反応は、５μｌのＧｏＴａｑ（登録商標）ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ＣＸＲ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄｙｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で２Ｘ及びＬＩＮＥ−１  ［１．５μｍｏｌ］フォワード及びリバースプライマーを含有する最終容量１０μｌを用いて行った。各ＥＧＦＲ  ＥＣＤ変異に特異的なプライマーを用いて、ｄｄＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して単離されたｃｆＤＮＡを増幅した。液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）をメーカーのプロトコルに従って行い、その結果を、全（変異＋野生型）ＤＮＡ対立遺伝子に対する変異ＤＮＡ対立遺伝子のパーセンテージまたは部分存在比（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ）として報告した。８〜１０μｌのＤＮＡ鋳型を１０μｌのｄｄＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）及び２μｌのプライマー／プローブ混合物に添加した。この２０μｌのサンプルを７０μｌのＤｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｏｉｌ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に加え、液滴生成に使用した。次いで、以下の条件：９５℃で５分間、９４℃で３０秒間の４０サイクル、５５℃で１分間後、９８℃で１０分間（勾配速度２℃／秒）で、液滴を熱サイクルさせた。次いで、ＦＡＭ及びＨＥＸプローブの蛍光測定のために、サンプルをＱＸ２００液滴リーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。ゲーティングは、陽性対照及び陰性対照に基づいて行われ、変異個体群が同定された。野生型ＤＮＡバックグラウンドにおける変異型ＤＮＡの部分存在比を、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて各サンプルについて計算した。各サンプルについて複数の複製（最低３回）を行った。細胞株からの正常対照ｇＤＮＡ及びＤＮＡ鋳型（水）対照のｄｄＰＣＲ分析を、汚染のない対照として複数の複製を含む全てのサンプルと並行して行った。
【０１１６】
実施例１：ＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）変異体は、リガンド及びモノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体調製物に結合する能力が低下した。
バイオルミネセンス共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）は、生細胞内のタンパク質間の相互作用を定量的に測定するために使用される。生物発光エネルギー供与体としてＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ及びエネルギー受容体として蛍光標識ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質と共にＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用する。ＥＧＦリガンドがＥＧＦＲ変異体に結合できるかどうかを決定するために、ＥＧＦＲトレーサー用量反応アッセイを実施した。示されたＮａｎｏＬｕｃ−ＥＧＦＲ変異体を発現するプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし（図１）、過剰量の存在下（ダークグレーの線）または非存在下（黒い線）でＥＧＦトレーサー（ＨａｌｏＴａｇ−ＥＧＦ）  ＥＧＦトレーサーがＮａｎｏＬｕｃ−ＥＧＦＲに効果的に結合できることを評価するために非標識ＥＧＦを添加した。ＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）Ｎａｎｏ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを添加し、プレートをＧｌｏＭａｘ（登録商標）−Ｍｕｌｔｉ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｒｅａｄｅｒで分析した。生のＮａｎｏＢＲＥＴ（登録商標）比の値を計算するために、アクセプタ発光値（６１８ｎｍ）を各サンプルの供与体放出値（４６０ｎｍ）で割った。
【０１１７】
図１に示すように、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図１Ｂ）、Ｓ４６４Ｌ（図１Ｃ）、Ｋ４６７Ｔ（図１Ｄ）及びＥＧＦＲ野生型（図１Ａ）を含む変異体及び細胞外ドメイン変異体を測定し、変異体はリガンド（図１Ｄ）、Ｇ４６５Ｒ（図１Ｅ）、Ｉ４９１Ｍ（図１Ｆ）及びＳ４９２Ｒ（図１Ｇ）を含む。ＥＧＦＲ  Ｉ４９１Ｍを除いて試験した全てのＥＧＦＲ変異体は、このＥＧＦＲトレーサー用量応答アッセイにおいてＥＧＦトレーサーに結合することができた。
【０１１８】
Ｅｘａｍｐｌｅ  ２：  ＭＭ−１５１  ｉｓ  ａｂｌｅ  ｔｏ  ｂｉｎｄ  ａｌｌ  ＥＧＦＲ  ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｉｎ  ａ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｓｓａｙ
実施例２：ＭＭ−１５１は、薬物置換アッセイにおいて全てのＥＧＦＲ外部ドメイン変異体に結合することができる
ＥＧＦＲ変異体と抗ＥＧＦＲ治療薬との間の相互作用を評価するために、薬物置換アッセイを行った。ＨＥＫ２９３細胞に、野生型ＥＧＦＲ（図２Ａ）及びＮａｎｏＬｕｃ−ＥＧＦＲ変異体ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図２Ｂ）、Ｓ４６４Ｌ（図２Ｃ）、Ｋ４６７Ｔ（図２Ｄ）、Ｇ４６５Ｒ（図２Ｅ）、Ｉ４９１Ｍ（図２Ｆ）及びＳ４９２Ｒ（図２Ｇ）を発現するプラスミドをトランスフェクトした。次いで、抗ＥＧＦＲ薬セツキシマブ（「ＣＭＡＢ」、グレーの三角）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」、ライトグレーの円）またはＭＭ−１５１（黒い四角）の用量を増加させて（０〜１００μｇ／  ｍｌ）及びＨａｌｏＴａｇ−ＥＧＦ（トレーサー）を１８ｎｇ／ｍｌの濃度で３０分間処置した。ＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）Ｎａｎｏ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを添加し、プレートをＧｌｏＭａｘ（登録商標）−Ｍｕｌｔｉ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｒｅａｄｅｒで分析した。生のＮａｎｏＢＲＥＴ（登録商標）比の値を計算するために、アクセプタ発光値（６１８ｎｍ）を各サンプルの供与体放出値（４６０ｎｍ）で割った。
【０１１９】
図２に示すように、ＭＭ−１５１は試験した全てのＥＧＦＲ変異体に効果的に結合するが、セツキシマブはＥＧＦＲ−Ｓ４６４Ｌ、ＥＧＦＲ−Ｇ４６５Ｒ、またはＥＧＦＲ−Ｓ４９２Ｒに結合せず、パニツムマブはＥＧＦＲ−Ｓ４６４Ｌまたは、ＥＧＦＲ−Ｇ４６５Ｒに効果的に結合しなかった。したがって、試験した薬物のうちのＭＭ−１５１のみが、変異ＥＧＦＲ細胞外ドメインの全てに結合するであろう。
【０１２０】
Ｅｘａｍｐｌｅ  ３：  ＬＩＭ１２１５  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＥＧＦＲ  ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ  ｍｕｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ｏｒ  ｂｏｔｈ  ｔｏ  ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ａｎｄ  ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ  ａｒｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｔｏ  ＭＭ−１５１
実施例３：ＥＧＦＲ外部ドメイン変異体を過剰発現し、セツキシマブまたはセツキシマブ及びパニツムマブに耐性であるＬＩＭ１２１５は、ＭＭ−１５１に感受性である
ＬＩＭ１２１５細胞（ヒト結腸直腸癌、ＣｅｌｌＢａｎｋ  Ａｕｓｔｒａｌｉａカタログ＃＃ＣＢＡ−  ０１６１）を、ＧＦＰ対照（図３Ａ）、ＥＧＦＲ野生型（図３Ｂ）、ＥＧＦＲ  Ｒ４５１Ｃ（図３Ｃ）、Ｓ４６４Ｌ（図３Ｄ）、Ｋ４６７Ｔ（図３Ｅ）、Ｇ４６５Ｒ（図３Ｆ）、Ｉ４９１Ｍ（図３Ｇ）及びＳ４９２Ｒ（図３Ｈ）を含む、示されたＥＧＦＲ外部ドメイン変異体及び対照を発現するレンチウイルスに感染させた。選択された細胞を、増加する濃度のセツキシマブ（「ＣＭＡＢ」、ダークグレーの線）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」、ライトグレーの線）及びＭＭ−１５１（黒い線）で６日間処理した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。図３に示すように、セツキシマブは変異Ｓ４６４Ｌ、Ｇ４６５Ｒ、Ｋ４６７Ｔ、Ｉ４９１Ｍ、またはＳ４９２ＲでＥＧＦＲを発現する細胞の増殖を阻害することができなかった。パニツムマブは変異Ｓ４６４Ｌ、Ｇ４６５Ｒ、またはＩ４９１ＭでＥＧＦＲを発現する細胞の増殖を阻害することができなかった。対照的に、ＭＭ−１５１は、全ての変異体及び対照において細胞増殖を阻害することができた。
【０１２１】
実施例４：ＭＭ−１５１は、セツキシマブまたはセツキシマブ及びパニツムマブの両方に耐性であるＬＩＭ１２１５過剰発現ＥＧＦＲ外部ドメイン変異体におけるＥＧＦＲ下流シグナリングをブロックする
前の実施例で観察された増殖阻害がＥＧＦシグナル伝達カスケードの遮断によるものであることを実証するために、ＬＩＭ１２１５ヒト結腸直腸癌細胞をレンチウイルスが発現するベクターなし対照（図４Ａ）、野生型ＥＧＦＲ（図４Ｂ）またはＲ４５１Ｃ（図４Ｃ）、Ｓ４６４Ｌ（図４Ｄ）、Ｋ４６７Ｔ（図４Ｅ）、Ｇ４６５Ｒ（図４Ｆ）、Ｉ４９１Ｍ（図４Ｇ）及びＳ４９２Ｒ（図４Ｈ）を含むＥＧＦＲ細胞外ドメイン変異体に感染させた。選択された細胞をセツキシマブ（「ＣＥＴＵＸ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）またはＭＭ−１５１の存在下で２時間培養し、ＥＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）で１５分間刺激した。イムノブロッティングは、ホスホＥＧＦＲ（「ｐＥＧＦＲ」）、総ＥＧＦＲ（「ＴＯＴ  ＥＧＦＲ」）、ホスホＡＫＴ（「ｐＡＫＴ」）、総ＡＫＴ（「ＴＯＴ  ＡＫＴ」）、ホスホＥＲＫ（「ｐＥＲＫ」）、総ＥＲＫ（「ＴＯＴ  ＥＲＫ」））に対する抗体及びローディング対照としてのビンキュリンを用いて行った。
【０１２２】
図４Ａ〜４Ｈに示されるように、ＭＭ−１５１は、全ての対照細胞及びＥＧＦＲ細胞外ドメイン変異体を発現する細胞におけるＥＧＦＲ下流シグナリングを阻害することができる。対照的に、セツキシマブは、Ｋ４６７ＴまたはＳ４９２Ｒ変異を発現する細胞におけるシグナル伝達を阻害するのに有効ではなく、セツキシマブもパニツムマブも、Ｓ４６４Ｌ、Ｇ４６５ＲまたはＩ４９１Ｍ変異を発現する細胞におけるシグナル伝達を抑制するのに有効ではなかった。
【０１２３】
実施例５：ＭＭ−１５１は、ＥＧＦＲ外部ドメイン変異が発現された場合のＬＩＭ１２１５セツキシマブ耐性クローン細胞個体群の増殖を効果的に阻害する
ＬＩＭ１２１５野生型細胞、ＬＩＭ１２１５耐性細胞個体群（すなわち、野生型及び耐性細胞の混合物を有する細胞個体群であり、そのいくつかはＥＧＦＲ−ＥＣＤ変異を保有する）、及びＬＩＭ１２１５耐性クローン（すなわち、クローン個体群に増殖させたＥＧＦＲ−ＥＣＤ変異を発現する単離された細胞）を、セツキシマブ、パニツムマブまたはＭＭ−１５１の増加する濃度（０．０１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ）で６日間処理した。細胞生存率は、上記のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。全てのアッセイは、少なくとも３回独立して実施した  ＣＭＡＢ：セツキシマブ；  ＰＭＡＢ：パニツムマブ。
【０１２４】
図５Ａに示すように、３つの薬物は全て、野生型細胞における細胞生存を阻害することができた。対照的に、３つの薬物のいずれも、１つの耐性細胞個体群の細胞生存率を強く阻害することができなかった（図５Ｂ、「ＬＩＭ１２１５  Ｒ５  ｐｏｐ」）。ＭＭ−１５１のみが、細胞の個体群がＥＧＦＲ−ＥＣＤ変異Ｇ４６５Ｒを有する第２の耐性細胞個体群（図５Ｃ、「ＬＩＭ１２１５  Ｒ５  ｐｏｐ  ＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｒ」）の細胞生存を阻害することができた。ＥＧＦＲ−ＥＣＤ変異Ｉ４９１Ｍ（図５Ｄ）を有するクローン個体群では、ＭＭ−１５１で処理した細胞の生存率がわずかに低下したにもかかわらず、３つの薬物のいずれも細胞生存度を大きく阻害することができなかった。ＥＧＦＲ−ＥＣＤ変異Ｓ４９２Ｒ（図５Ｅ）を有するクローン個体群では、セツキシマブのみが細胞増殖を阻害しなかった。総合すると、これらの結果は、ＥＧＦＲ−ＥＣＤ変異体を発現する細胞に対する３つの薬物のそれぞれの有効性についての上記の実施例に見られる観察を裏付けている。
【０１２５】
実施例６：ＭＭ−１５１は、ＯＸＣＯ−２セツキシマブ耐性細胞の増殖に軽度に影響する
ＬＩＭ１２１５野生型細胞と同様に、ＯＸＣＯ−２細胞は内在的にＥＧＦＲを発現し、抗ＥＧＦＲ治療薬に感受性である。したがって、ＯＸＣＯ−２細胞を、実施例５に上記した方法を用いて評価した。図６Ａに示されるように、３つの薬物は全て、野生型細胞における細胞生存を阻害することができた。対照的に、ＭＭ−１５１はセツキシマブ及びパニツムマブと比較して細胞生存率に対してわずかな効果を有するようであったが、３つの薬物のいずれも、１つの耐性細胞個体群（図６Ｂ）の細胞生存率を強く阻害することができなかった。同様の結果が図６Ｃに見られ、細胞はＥＧＦＲ  ＥＣＤ変異Ｉ４９１Ｍを発現するクローン個体群である。
【０１２６】
実施例７：ＭＭ−１５１は、高レベルのＥＧＦＲ外部ドメイン変異を発現するＣＣＫ８１及びＨＣＡ４６セツキシマブ耐性細胞の増殖を効果的に阻害する。
実施例５の細胞について記載したように、ＣＣＫ８１及びＨＣＡ４６野生型及び耐性細胞個体群を、漸増濃度のセツキシマブ、パニツムマブまたはＭＭ−１５１で６日間処理した。細胞生存率は、上記の方法で記載されたアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。他の細胞株と同様に、３つの薬物は全て、野生型ＣＣＫ８１細胞（図７Ａ）及び野生型ＨＣＡ４６細胞（図７Ｃ）の生存を阻害した。対照的に、Ｓ４６４Ｌ変異を有するＣＣＫ８１クローン細胞個体群は、セツキシマブまたはパニツムマブによる治療によって影響を受けなかったが、ＭＭ−１５１は細胞生存率を阻害することができた（図７Ｂ）。同様の結果が、Ｇ４６５Ｅ変異を有するＨＣＡ４６細胞のクローン個体群についても見られた（図７Ｄ）。
【０１２７】
実施例８：ＭＭ−１５１はセツキシマブ耐性細胞におけるＥＧＦＲ下流シグナリングをブロックする。
セツキシマブ（「ＣＥＴＵＸ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）またはＭＭ−１５１の存在下で野生型及びセツキシマブ耐性個体群及びクローンを２時間培養し、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で１５分間刺激した。ホスホＥＧＦＲ  （「ｐＥＧＦＲ」）、総ＥＧＦＲ（「ＴＯＴ  ＥＧＦＲ」）、ホスホＡＫＴ（「ｐＡＫＴ」）、総ＡＫＴ（「ＴＯＴ  ＡＫＴ」）、ホスホＥＲＫ（「ｐＥＲＫ」）、総ＥＲＫ（「ＴＯＴ  ＥＲＫ」）に対する抗体、及びローディング対照としてのビンキュリンを用いてイムノブロッティングを行った。
【０１２８】
抗ＥＧＦＲ感受性細胞系ＬＩＭ１２１５、ＯＸＣＯ−２、ＣＣＫ８１、及びＨＣＡ４６を評価した。図８Ａ〜８Ｄに示されるように、ＭＭ−１５１は、全ての対照細胞及びＥＧＦＲ細胞外ドメイン変異体を発現する細胞におけるＥＧＦＲ下流シグナル伝達を阻害することができた。ＬＩＭ１２１５細胞では、パニツムマブもセツキシマブも、セツキシマブ耐性細胞の混合個体群（「Ｒ５  ｐｏｐ」）、ＥＧＦＲ−ＥＣＤ変異Ｇ４６５Ｒ（「Ｒ５  ＣＬ５５」）、Ｉ４９１Ｍ（「Ｒ１  ＣＬＯＮＥ４」）、またはＳ４９２Ｒ（「ＫＩ」）を発現する細胞のクローン個体群を阻害することができなかった（図８Ａ）。ＯＸＣＯ−２細胞では、パニツムマブもセツキシマブも、セツキシマブ耐性細胞の混合個体群（「Ｒ２」）またはＥＧＦＲ−ＥＣＤ変異Ｉ４９１Ｍ（「Ｒ２  ＣＬ８８」）を発現する細胞のクローン個体群を阻害することができなかった。対照的に、ＮＲＡＳ変異を保有するがＥＧＦＲ−ＥＣＤ変異を保有しないクローンの細胞個体群（「Ｒ２ＣＬ１１３」）では、ＥＧＦＲシグナル伝達をわずかに阻害した（図８Ｂ）。ＣＣＫ８１細胞において、３つの全ての薬物は、野生型細胞を阻害したが、ＭＭ−１５１のみがＳ４６４Ｌ変異を保有する細胞のクローン個体群（「Ｒ１」）を阻害した（図８Ｃ）。最後に、ＨＣＡ４６細胞においては、ＣＣＫ８１細胞で見られるように、３つの全ての薬物は、野生型細胞を阻害したが、ＭＭ−１５１のみがＧ４６５Ｅ変異を保有する細胞のクローン個体群（「Ｒ５」）を阻害した（図８Ｄ）。
【０１２９】
実施例９：ＭＭ−１５１は、異種移植由来細胞及びＥＧＦＲ外部ドメイン変異を発現するクローンにおける増殖を効果的に阻害する
ゼノ患者ｉＣＲＣ０１０４（患者の腫瘍から単離され、次いでインビトロで培養された細胞）（ＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｅを有する）及び耐性誘導体クローンに由来する細胞を、増加する濃度のセツキシマブ、パニツムマブ及びＭＭ−１５１で６日間処理した。上記のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイにより、ＣＲＣ１０４培養物（図９Ａ）及び２つのクローン細胞個体群（ｃｌ．１、図９Ｂ及びｃｌ．２、図９Ｃ）の細胞生存率を測定した。３つ全ての培養物において、ＭＭ−１５１は細胞生存を阻害することができたが、セツキシマブ及びパニツムマブは、混合細胞個体群において生存性をごくわずかしか阻害することができず（図９Ａ）及び第２のクローン細胞個体群において高い濃度でのみであった（図９Ｃ）。セツキシマブ及びパニツムマブは、最初のクローン細胞個体群の細胞生存率を阻害しなかった（図９Ｂ）。
【０１３０】
実施例１０：３つの抗体混合物のＥＧＦＲ−ＥＣＤ変異体への結合
ドメインＩＩＩに加えて細胞外ドメインの他の部分に結合するＭＭ−１５１抗体混合物は、ＥＧＦＲ−ＥＣＤドメインのドメインＩＩＩに排他的に結合するモノクローナル抗体調製物とは異なり、多くのＥＧＦＲ−ＥＣＤ変異体に結合するのに有効である。他の混合物が同じ活性をもたらすかどうかを決定するために、以下に記載するように無細胞結合実験を行った。
【０１３１】
全ての試薬は平衡化され、サンプルは、バイオレイヤー干渉アッセイ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標））の前に室温にされた。ローディング前に、ストレプトアビジンバイオセンサーを、非特異的結合を最小にするために、タンパク質を含まないブロッキング緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）中で１０分間水和させた。アッセイは、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ソフトウェア及びメーカーの使用説明書に従った手順を用いて行った。アッセイは、以下のステップからなる：１Ｘ  ＰＢＳでの平衡化５分間、ビオチン化抗体ローディング（１０μｇ／ｍＬ）１分間、ベースライン安定化１分間、挙げられたＥＧＦＲの細胞外ドメイン変異体（５００ｎＭ）とのインキュベーション３分間、ベースライン安定化１分間、第１に列挙された抗体（５００ｎＭでＰ３Ｘまたは「ｓｙｍ９９２」）とのインキュベーション３分間、さらにベースライン安定化の１分間、続いて第２に列挙された抗体（５００ｎＭでＰ１Ｘまたは２５Ｅ）とのインキュベーション３分間。１Ｘ  ＰＢＳをマトリックス全体として使用した。データはＯｃｔｅｔ（登録商標）Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアで分析及び処理した。
【０１３２】
図１０Ａは、ＭＭ−１５１を評価する無細胞結合実験を示す。３つのＥＣＤ変異体Ｋ４６７Ｔ、Ｒ４５１Ｃ、及びＳ４９２Ｒは、抗体Ｐ２Ｘにうまく結合し、３つのＥＣＤ変異体の全てに対して、Ｐ３Ｘもまた結合することができた。ＥＣＤのドメインＩＩＩに結合するＰ１Ｘは、Ｋ４６７Ｔ及びＲ４５１Ｃ  ＥＣＤ変異体に結合することができたが、Ｓ４９２Ｒ変異体に結合することはできなかった。同様の結果が図１０Ｂに見られ、Ｐ１Ｘは類似の抗体２５Ｅによって置換されていた。図１０Ｃに示す２抗体混合物は、３つの変異体細胞外ドメインの全てを第１の抗体（「ｓｙｍ１０２４」）と結合することができ、Ｋ４６７Ｔ及びＲ４５１Ｃ  ＥＣＤ変異体に結合することができたが、Ｓ４９２Ｒ変異体には結合できなかった。合わせて、これらの結果は、ＭＭ−１５１オリゴクローナル混合物がＥＧＦＲ外部ドメイン変異体に少なくとも２つの抗体を関与させる能力についての上記実施例に見られる観察を裏付ける。さらに、これらの結果は、ｓｙｍ−９９２及びｓｙｍ−１０２４のオリゴクローナル混合物についてではなく、ＭＭ−１５１及び３つの抗体の関連する組み合わせについて有効性が観察されることを実証する。
【０１３３】
実施例１１：ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異体を過剰発現するＬＩＭ１２１５は、セツキシマブ及びＳｙｍ００４の両方に耐性であり、ＭＭ−１５１に感受性である
ＬＩＭ１２１５（＃２）細胞株に、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現するプラスミドを安定にトランスフェクトした。選択された細胞は、８ｎＭ  ＥＧＦリガンドの存在下で、漸増濃度のセツキシマブ（「ＣＭＡＢ」、ダークグレーの線）、Ｓｙｍ−９９２及びｓｙｍ−１０２４の二抗体混合物（「Ｓｙｍ００４」、ライトグレーの線）、ならびにＭＭ−１５１（黒い線）で３日間処理した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。図１１Ａ及び１１Ｂに示すように、セツキシマブは、野生型ＥＧＦＲ（非トランスフェクション対照）またはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を発現する細胞の増殖を阻害することができず、Ｓｙｍ００４二抗体混合物は、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を発現する細胞の増殖を阻害することができなかった。対照的に、ＭＭ−１５１は、野生型ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を発現する細胞の細胞増殖を阻害することができた。
【０１３４】
実施例１２：ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異体を発現または過剰発現するＬＩＭ１２１５は、セツキシマブの両方に耐性であり、インビボ異種移植モデルにおいてＭＭ−１５１に感受性である。
ＬＩＭ１２１５（＃２）、ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ（ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現するように操作された）、またはＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ（ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現するプラスミドを安定にトランスフェクトした）の３つの細胞株を接種したメスのｎｕ／ｎｕマウスでネズミ異種移植の有効性試験を行った。腫瘍を約３００ｍｍ３まで増殖させ、次いでマウスを１０の治療群に無作為にグループ分けした。無作為にグループ分けした後、マウスをＰＢＳ（ビヒクル対照）、セツキシマブ、またはＭＭ−１５１ツール化合物で２週間処置した。図１２Ａに示すように、親ＬＩＭ１２１５（＃２）細胞株は、２つの示された用量レベルでセツキシマブ及びＭＭ−１５１の両方に対して感受性である。図１２Ｂ及び１２Ｃに示すように、セツキシマブは、示された２つの用量レベルで、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異の発現を有する細胞株（図１２Ｂ）または過剰発現（図１２Ｃ）の腫瘍増殖を阻害することができなかった。対照的に、ＭＭ−１５１は、両方の用量レベルで腫瘍増殖を阻害することができた。
【０１３５】
実施例１３：患者の循環無細胞ＤＮＡにおけるＥＧＦＲ  ＥＣＤ変異の経時的モニタリングは、ＭＭ−１５１療法に対する応答のマーカーとして機能し得る
循環無細胞ＤＮＡにおけるＥＧＦＲ  ＥＣＤ変異の分析は、ＭＭ−１５１第１相臨床試験で採取した血清サンプルのサブセットで行った（ＮＣＴ＃０１５２０３８９）（２５）。このサブセットには、適切な血清サンプルが入手可能であった抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、セツキシマブ、パニツムマブ）に対する事前曝露が文書化された１１人の結腸直腸癌患者が含まれていた。ＥＧＦＲ  ＥＣＤ変異は、１１人の患者のうち２人にＭＭ−１５１を最初に投与する前のベースラインサンプルにおいて、液滴デジタルＰＣＲによって検出された。ＭＭ−１５１処置の過程で採取されたサンプル中で行われた縦モード解析は、ＭＭ−１５１投与中に無細胞ＤＮＡ中のＥＧＦＲ  ＥＣＤ変異の対立遺伝子頻度が変化することが強調された。患者０９５で観察されたＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｅ変異の対立遺伝子頻度の急激な減少は、約４週間後にＣＴスキャンによって測定された腫瘍体積の有意な減少を予期した（図１３Ａ）。ＥＧＦＲ  Ｓ４６４Ｌ及びＧ４６５Ｒ変異におけるそれぞれの減少及び安定化は、患者０５１で観察される長期の疾患安定化を伴う（図１３Ｂ）。これらの変異の対立遺伝子頻度の低下の逆は、２４週間での進行を予期した。
【０１３６】
実施例１４：ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を発現する細胞に対する個々の抗体の結合
セツキシマブ（「ＣＭＡＢ」）及びＭＭ−１５１混合物の３成分抗体（Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘ）がＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現するように操作された細胞（  「ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ」、グレーの棒）に結合する程度を評価するために、フローサイトメトリー結合実験を行った（図１４）。細胞を氷上（４℃）で１時間、飽和濃度（０．１μＭ）のＡｌｅｘａ−４８８標識抗体とともにインキュベートした。各抗体について、平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を測定し、ＥＧＦＲ野生型対照（ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２野生型、黒色棒）でＭＦＩに対して標準化した。実施例１０に記載の無細胞結合アッセイの結果と一致して、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現するように操作された細胞ではセツキシマブとＰ１Ｘの結合が減少するが、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘ抗体の結合は影響を受けない。
【０１３７】
実施例１５：ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異体を発現するように過剰発現または操作されたＬＩＭ１２１５は、セツキシマブ、パニツムマブ及びＳｙｍ００４に耐性であり、ＭＭ−１５１に対して感受性である
野生型ＥＧＦＲを発現する細胞（ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２野生型）、野生型ＥＧＦＲに加えてＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を過剰発現する細胞（ＬＩＭＩ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ）、及び遺伝子編集によりＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を発現する細胞（ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ）で細胞生存性実験を行った。細胞を、８ｎＭ  ＥＧＦリガンドの存在下で、セツキシマブ（「ＣＭＡＢ」）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」）、ｓｙｍ−９９２及びｓｙｍ−１０２４（「Ｓｙｍ００４」）及びＭＭ−１５１の２抗体混合物で３日間処理した。細胞生存率は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイによって測定した。
【０１３８】
図１５Ａに示すように、セツキシマブ（黒色）及びパニツムマブ（ダークグレー）は、野生型ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を発現する細胞の増殖を阻害することができず、
Ｓｙｍ００４の２抗体混合物（ライトグレー）は、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を発現する細胞の増殖を阻害することができなかった。対照的に、ＭＭ−１５１（白黒縞模様）は、野生型ＥＧＦＲを発現する細胞、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を過剰発現する細胞、またはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を発現するように操作された細胞の細胞増殖を阻害することができた。全ての抗体は１μＭの濃度で投与した。
【０１３９】
第２の実験は、ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２野生型及びＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ細胞で行うが、８ｎＭ  ＥＧＦリガンドの存在下で増加する濃度のセツキシマブ（三角マーカー付きのダークグレーの線）、パニツムマブ（菱形マーカー付きのライトグレーの線）、Ｓｙｍ００４（丸マーカー付きのグレーの線）またはＭＭ−１５１（四角マーカー付きの黒い線）を用いて、行った。（図１５Ｂ及び１５Ｃ）。セツキシマブ及びパニツムマブは、野生型ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を発現する細胞の増殖を阻害することができなかった。Ｓｙｍ００４は、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を発現する細胞を阻害することができなかった。対照的に、ＭＭ−１５１は、野生型ＥＧＦＲ（Ｓｙｍ００４に比べて効力が改善されている）及びＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を発現する細胞を阻害することができた。
【０１４０】
実施例１６：ＥＧＦＲ  Ｓ４９２ＲまたはＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｒ変異を発現する細胞の増殖は、セツキシマブによる処置の過程で観察され、ＭＭ−１５１によって阻害される
腫瘍におけるＥＧＦＲ変異を含む細胞（他の細胞が野生型ＥＧＦＲを発現する）の経時的選択的増殖を模倣するため、２つのインビトロプール培養実験を行い、セツキシマブ（三角マーカー付きのグレーの線）マーカー、ＭＭ−１５１（四角マーカー付きの黒い線）、または培地のみ（丸いマーカー付きのライトグレーの線）での処置にわたって、２つの代表的なＥＧＦＲ外部ドメイン変異−ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ（図１６Ａ）及びＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｒ（図１６Ｂ）−の対立遺伝子頻度の変化を評価した。ＥＧＦＲ  Ｓ４９２ＲまたはＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｒ外部ドメイン変異を発現するように操作された細胞（実線）を含むＬＩＭ１２１５（＃２）のプールされた培養物で、それぞれ１５または７日間の実験を行った。ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ実験における対照として、野生型ＥＧＦＲを発現するＬＩＭ１２１５（＃２）細胞のプールされた培養物（野生型ＥＧＦＲ遺伝子型を維持するための非標的化ｓｇＲＮＡで操作、点線）である。細胞を新しいプレートに移して（各プレートウェルの約半分の細胞）、ゲノムＤＮＡを抽出する前に、処理前の０日目（５ｘ１０５細胞）及び４、１０、１５日目に細胞をペレット化した。
【０１４１】
ゲノムＤＮＡ中のＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ及びＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｒ外部ドメイン変異の対立遺伝子頻度を、液滴デジタルＰＣＲによって評価した。予想されるように、Ｓ４９２Ｒ対立遺伝子頻度は、実験の全ての日に野生型対照ウェル（処理に関係なく）で０％として測定された。ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒウェルにおける処理前の平均Ｓ４９２Ｒ対立遺伝子頻度（第０日）は４．６％として測定され、１５日間培地のみの存在下で安定したままであった（範囲：４．６〜３．８％）。同様に、ＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｒウェルにおける処理前の平均Ｇ４６５Ｒ対立遺伝子頻度（０日目）は０．６％として測定され、７日間にわたり培地のみの存在下で安定したままであった（範囲０．３〜０．６％）。
【０１４２】
セツキシマブで処置したＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒウェルの平均対立遺伝子頻度は、１５日間にわたって４．６％から４２．１％に増加した。対照的に、ＭＭ−１５１での処置は、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒウェルにおける平均Ｓ４９２Ｒ対立遺伝子頻度の４．６％〜０．３％の減少をもたらした。同様に、セツキシマブで処置したＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｒウェルの平均対立遺伝子頻度は、７日間にわたって０．６％から９．８％に増加した。対照的に、ＭＭ−１５１での処理は、ＥＧＦＲ  Ｇ４６５Ｒウェルの平均Ｇ４６５Ｒ対立遺伝子頻度が０．６％〜０．３％に低下した。
【０１４３】
実施例１７：公知のＥＧＦＲ細胞外ドメイン変異をＥＧＦＲ上の６７アミノ酸配列に単離する。
ヒトＥＧＦＲ遺伝子は、１２１０個のアミノ酸配列をコードする２８個のエクソンからなる（図１７Ａ）。ＥＧＦＲタンパク質は、７つの構造タンパク質ドメイン及びアミノ酸１〜２４からなる推定上のシグナルペプチドからなる。６２１個のアミノ酸と最初の１５個のエクソン（エクソン＃１５は細胞外ドメインＩＶ及び膜貫通ドメインにまたがる）を一緒に含む４つの細胞外ドメイン（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ）が存在する。
【０１４４】
ＥＧＦＲ外部ドメイン変異は、アミノ酸４３３−４９９をコードするエクソン１２において同定されている。図１７Ｂは、臨床及び／または前臨床試験で同定され、文献に報告されている代表的な変異の表である。この領域は、細胞外ドメインＩＩＩの末端部分及びドメインＩＶの開始部分に及ぶ。
【０１４５】
実施例１８：ＭＭ−１５１は、代表的なＳ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現または過剰発現するＬＩＭ１２１５細胞における低親和性ＥＧＦＲリガンド及び高親和性ＥＧＦＲリガンドの両方によるＥＧＦＲの活性化をブロックする
前の実施例１５及び１６で観察された増殖阻害及びクローン増殖阻害がＥＧＦＲシグナル伝達の遮断によるものであることを実証するために、野生型ＥＧＦＲを発現する細胞（ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２野生型  野生型ＥＧＦＲ（ＬＩＭＩ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ）に加えてＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を過剰発現し、遺伝子編集（ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ）によりＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を発現する。ｓｙｍ−９９２及びｓｙｍ−１０２４（「Ｓｙｍ００４」）及びＭＭ−１５１の２抗体混合物であるセツキシマブで２４時間処理した後、８ｎＭ  ＥＧＦまたはＡＲＥＧリガンドで１０分間刺激した。イムノブロッティングは、ホスホＥＧＦＲに対する抗体（「ｐＥＧＦＲ」）及びローディング対照としてのアクチンを用いて行った。
【０１４６】
図１８に示すように、ＭＭ−１５１は、ＬＩＭ１２１５（＃２）対照細胞及びＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現または過剰発現する細胞におけるＡＲＥＧ及びＥＧＦリガンドによるＥＧＦＲ活性化を阻害することができる。対照的に、セツキシマブ及びＳｙｍ００４は、野生型ＥＧＦＲを発現する細胞においてＥＧＦＲ活性化を阻害することができるが、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を発現または過剰発現する細胞において、ＡＲＥＧ及びＥＧＦによって刺激されたホスホＥＧＦＲの部分的または非効果的阻害のみを誘発した。
【０１４７】
実施例１９：ＭＭ−１５１は、代表的なＳ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現または過剰発現するＬＩＭ１２１５細胞における低親和性ＥＧＦＲリガンド及び高親和性ＥＧＦＲリガンドの両方によるＥＲＫの活性化をブロックする
前の実施例１５及び１６で観察された増殖阻害及びクローン増殖阻害がＥＧＦＲの下流の細胞シグナル伝達の遮断に起因することを実証するために、野生型ＥＧＦＲを発現する細胞（ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２野生型）、野生型ＥＧＦＲに加えてＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を過剰発現する細胞（ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ）、及び遺伝子編集を介してＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を発現する細胞（ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ）を用いてホスホ−ＥＲＫ阻害アッセイを実施した。細胞をセツキシマブ、ｓｙｍ−９９２及びｓｙｍ−１０２４（「Ｓｙｍ００４」）２抗体混合物及びＭＭ−１５１で２時間処理した後、８ｎＭ  ＥＧＦまたはＡＲＥＧリガンドで１０分間刺激した。ＥＬＩＳＡ実験を実施して、ＥＲＫ（ホスホＥＲＫ）の活性化を測定した。
【０１４８】
図１９Ａに示すように、ＭＭ−１５１は、ＬＩＭ１２１５（＃２）対照細胞及びＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異を発現または過剰発現する細胞においてＥＧＦによるＥＲＫ活性化を阻害することができる。対照的に、セツキシマブ及びＳｙｍ００４は対照細胞においてのみホスホＥＲＫを阻害し、パニツムマブは対照細胞及び操作されたＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ細胞においてホスホ−ＥＲＫを阻害するに過ぎない。セツキシマブ、パニツムマブ、及びＳｙｍ００４は、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を過剰発現する細胞においてホスホ−ＥＲＫを阻害するのに効果的ではない。
【０１４９】
図１９Ｂ及び１９Ｃは、薬物２５０ｎＭの濃度での薬物による処理、続いて８ｎＭのＥＧＦまたはＡＲＥＧリガンドによる１０分間の刺激によるホスホ−ＥＲＫの阻害を示す。ＭＭ−１５１は、３つの細胞株においてＡＲＥＧ及びＥＧＦリガンドによって活性化されたホスホ−ＥＲＫを阻害することができる。対照的に、セツキシマブ及びパニツムマブは、ＥＧＦリガンドによって刺激されたホスホ−ＥＲＫを阻害するのに有効ではなく、Ｓｙｍ００４は、ＬＩＭ１２１５（＃２）対照細胞においてのみ中等度の阻害を提供する。セツキシマブ、パニツムマブ及びＳｙｍ００４は、ＬＩＭ１２１５（＃２）対照細胞においてＡＲＥＧリガンドによって活性化されるホスホ−ＥＲＫを阻害することができるが、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を発現または過剰発現する細胞において効果的でないまたは部分的な阻害を提供する。
【０１５０】
実施例２０：ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ外部ドメイン変異体を発現または過剰発現する低親和性または高親和性ＥＧＦＲリガンドによって刺激されたＬＩＭ１２１５細胞の増殖は、ＭＭ−１５１によって阻害され、セツキシマブに耐性で、パニツムマブ及びＳｙｍ００４によって選択的にのみ阻害される。
ＭＭ−１５１が、代表的なＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異の発現を保有する細胞における、リガンド非依存性及びリガンド刺激性細胞増殖を阻害することを実証するために、野生型ＥＧＦＲを発現する細胞（ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２野生型  ）、野生型ＥＧＦＲに加えてＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を過剰発現する細胞（ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ）、遺伝子編集を介してＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を発現する細胞（ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ）を用いて細胞増殖アッセイを行った。
【０１５１】
細胞を、８ｎＭ  ＥＧＦまたはＡＲＥＧリガンドの存在下で、増加する濃度のセツキシマブ（「ＣＭＡＢ」、三角マーカー付きのグレーの線）、パニツムマブ（「ＰＭＡＢ」、菱形マーカー付きのライトグレーの線）、ｓｙｍ−９９２及びｓｙｍ−１０２４（「Ｓｙｍ００４」、丸マーカー付きのダークグレーの線及びＭＭ−１５１（四角マーカー付きの黒い線）の２抗体混合物を含む生存細胞イメージャで３日間インキュベートした。ウェルのコンフルエンスを７２時間の実験にわたって２時間間隔で評価し、各条件下での細胞増殖率を計算するために使用した。
【０１５２】
図２０Ａ及び２０Ｂに示されるように、低親和性ＥＧＦＲリガンドＡＲＥＧで刺激されたリガンドのないＬＩＭ１２１５（＃２）細胞の細胞増殖率は、４つの薬物全てによって阻害される。しかしながら、図２０Ｃに示すように、セツキシマブ及びパニツムマブは、この細胞株において高親和性ＥＧＦＲリガンドＥＧＦによって刺激される細胞増殖を阻害することができず、一方、Ｓｙｍ００４は（リガンドなし対照に対して）部分的阻害を誘発する。対照的に、ＭＭ−１５１は強い阻害を誘発する（リガンドなし対照以下）。
【０１５３】
第２の実験は、ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ  ＫＩ細胞株を用いて行った。図２０Ｄ〜２０Ｆに示すように、ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を発現する細胞は、培地単独で、または外因性ＡＲＥＧまたはＥＧＦで増殖させた場合、セツキシマブに対して耐性である。図２０Ｅに示すように、低親和性ＥＧＦＲリガンドＡＲＥＧによる刺激は、Ｓｙｍ００４によってもたらされる阻害を減少させるが、パニツムマブ及びＭＭ−１５１に対する感受性を保持する（図２０Ｂの親細胞株と比較して）。図２０Ｆに示すように、ＥＧＦによって刺激された細胞増殖は、ＭＭ−１５１によってのみ阻害される。
【０１５４】
第３の実験は、ＬＩＭ１２１５（＃２）ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ細胞株を用いて行った（図２０Ｇ〜Ｉ）。ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を過剰発現する細胞は、培地単独で、または外因性ＡＲＥＧまたはＥＧＦで増殖させた場合、セツキシマブに対して耐性である。Ｓｙｍ００４は、培地単独での細胞増殖の部分的阻害を提供するが、リガンド依存性細胞増殖（ＡＲＥＧまたはＥＧＦ）の阻害はない。パニツムマブは培地単独及びＡＲＥＧの存在下で細胞増殖を阻害するが、ＥＧＦの存在下では阻害しない。対照的に、ＭＭ−１５１は、代表的なＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒ変異を過剰発現する細胞におけるリガンド非依存性及びリガンド依存性細胞増殖を阻害する。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１０】
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【表２−１１】
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【表２−１２】
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【表２−１３】
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【表２−１４】
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【表２−１５】
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【表２−１６】
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【表２−１７】
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【表２−１８】
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【表２−１９】
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【表２−２０】
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【表２−２１】
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【表２−２２】
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【表２−２３】
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【表２−２４】
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【表２−２５】
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【表２−２６】
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【表２−２７】
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【表２−２８】
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【表２−２９】
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【表２−３０】
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【表２−３１】
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【表２−３２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４Ａ−Ｄ】
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【図４Ｅ−Ｈ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
2018516870.tif 000099
【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２０Ｇ】
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【図２０Ｈ】
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【図２０Ｉ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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