(57)【要約】  本技術は、生細胞の代謝ベースラインおよび代謝能を迅速に決定するための方法に関する。実施形態は、細胞内の２つの主要なエネルギー生成経路であるミトコンドリア呼吸および解糖のそれぞれの活性を、最初にベースライン条件下で測定し、細胞にストレスを加えてエネルギー供給の増加を必要にさせた後に再び測定することに関する。いくつかの実施形態において、ストレスは、細胞を、ミトコンドリア脱共役剤およびＡＴＰシンターゼ阻害剤の２つの化合物の組合せに曝露することにより加えることができる。一実施形態において、ミトコンドリア呼吸経路の代謝エネルギー生成活性は、生細胞による酸素消費の速度を測定することにより決定され、解糖経路の代謝エネルギー生成活性は、細胞からのプロトンの分泌に起因する細胞外酸性化の測定から決定される。他の実施形態は、マルチウェルプレートのウェル内にある細胞サンプルの代謝能を決定するための装置に関する。
2018509170.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞サンプルの代謝能を決定する方法であって、
前記細胞サンプルの酸素消費の初期速度および細胞外の酸性化の初期速度を測定するステップと、
その後、前記細胞サンプルにミトコンドリア脱共役剤およびＡＴＰシンターゼ阻害剤を同時に投与するステップと、
その後、前記細胞サンプルの酸素消費の事後速度および細胞外の酸性化の事後速度を同時に測定するステップと、
前記細胞サンプルの前記代謝能を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記ミトコンドリア脱共役剤の少なくとも１つが、カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（「ＦＣＣＰ」）、カルボニルシアニド−ｍ−クロロフェニルヒドラゾン（「ＣＣＣＰ」）または２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはＢＡＭ１５を含み、前記ＡＴＰシンターゼ阻害剤が、オリゴマイシンまたは７−クロロ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−１−メチル−３−（ナフタレン−２−イルメチル）−４，５，−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］ジアゼピン−２（３Ｈ）−オン（Ｂｚ−４２３）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ミトコンドリア脱共役剤がカルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（「ＦＣＣＰ」）を含み、前記ＡＴＰシンターゼ阻害剤がオリゴマイシンを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞サンプルが、培地中に配置された複数の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記酸素消費の初期速度を測定するステップが、前記培地中に配置された細胞成分を検知するステップを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞サンプルの前記細胞外の酸性化の初期速度を測定するステップが、前記培地中に配置された細胞成分を検知するステップを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記培地中の前記投与されたミトコンドリア脱共役剤の濃度が、約０．１μＭ〜約２．０μＭの範囲にある、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記培地中の前記投与されたミトコンドリア脱共役剤の濃度が、約０．５μＭである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記培地中の前記投与されたＡＴＰシンターゼ阻害剤の濃度が、約０．１μＭ〜２μＭである、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記培地中の前記投与されたＡＴＰシンターゼ阻害剤の濃度が、約１．０μＭである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ミトコンドリア脱共役剤および前記ＡＴＰシンターゼ阻害剤を、前記細胞サンプルに投与する前に混合するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞サンプルの前記酸素消費の初期速度および前記細胞外の酸性化の初期速度を同時に測定する前に、マルチウェルプレートのウェル内に前記細胞サンプルを配置するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ミトコンドリア脱共役剤および前記ＡＴＰシンターゼ阻害剤を投与するステップが、少なくとも１つのポートから前記ウェルに前記共役剤および前記阻害剤を同時に導入するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞サンプルの前記代謝能を決定するステップが、（ｉ）ソフトウェアプログラムへ前記酸素消費の初期速度、前記細胞外の酸性化の初期速度、前記酸素消費の事後速度および前記細胞外の酸性化の事後速度を提供するステップと、（ｉｉ）前記ソフトウェアプログラムを使用して前記代謝能を算出するステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞サンプルの前記酸素消費の初期速度および細胞外の酸性化の初期速度が同時に測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
マルチウェルプレートのウェル内にある細胞サンプルの代謝能を決定するための装置であって、前記装置は、
（ｉ）マルチウェルプレートを支持するように構成されている台、
（ｉｉ）前記マルチウェルプレートのウェル内にある前記細胞サンプルと関連する細胞成分を検知するように構成されているセンサー、および
（ｉｉｉ）前記ウェルに流体を導入するように構成されている分配システム
を含み、
ここで、前記台、センサー、および分配システムが協働して、
前記センサーを使用して、前記細胞サンプルの酸素消費の初期速度および細胞外の酸性化の初期速度を同時に測定し、
その後、前記分配システムを使用して、前記細胞サンプルにミトコンドリア脱共役剤およびＡＴＰシンターゼ阻害剤を同時に投与し、
その後、前記センサーを使用して、前記細胞サンプルの酸素消費の事後速度および細胞外の酸性化の事後速度を同時に測定し、
前記細胞サンプルの前記代謝能を決定する、装置。
【請求項１７】
前記分配システムが、前記ウェルの上に配置されている少なくとも１つのポートを含む、請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
前記センサーが、光学センサーを含む、請求項１６に記載の装置。
【請求項１９】
前記センサーが、フルオロフォアを検知するように構成されている、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
前記センサーによりコンピュータモジュールに通信される情報に基づいて前記代謝能を算出するように構成されているコンピュータモジュールと、ソフトウェアとを更に含む、請求項１６に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、２０１５年３月２７日に出願の米国仮特許出願第６２／１３９，４３２号の利益を主張し、その開示の全体は参照により本明細書の一部をなすものとする。
【背景技術】
【０００２】
Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅは、細胞の２つの主なエネルギー生成経路のそれぞれに対する代謝ベースラインおよび代謝能の２つの独立した試験を開発した。各試験は、３つの化合物の添加および１つの代謝経路の活性の測定を必要とする。ミトコンドリア機能試験についての例示的な刊行物として、Ｓ．Ｗ．Ｃｈｏｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．（２００９）１０９、１１７９〜１１９１頁；Ｌ．Ｓ．Ｐｉｋｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（２０１０）、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂａｂｉｏ．２０１０．１０．０２２；Ｂ．Ｂ．Ｈｉｌｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２００９）４２４、９９〜１０７頁；Ｄ．Ｇ．Ｎｉｃｈｏｌｓら、ＪｏＶＥ．（２０１０）４６．ｗｗｗ．ｊｏｖｅ．ｃｏｍ／ｄｅｔａｉｌｓ．ｐｈｐ？ｉｄ−２５１１、ｄｏｉ：１０．３７９１／２５１１；Ｂ．Ｐ．Ｄｒａｎｋａら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５１（２０１１）１６２１〜１６３５頁が挙げられる。解糖機能試験についての例示的な刊行物として、Ｐｉｋｅら、およびＡ．Ｉｂｒａｈｉｍ−Ｈａｓｈｉｍら、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  Ｔｈｅｒ．（２０１１年１１月１９日）、補遺１（４）が挙げられる。両方の経路を合わせた測定については、Ｄ．Ａ．Ｆｅｒｒｉｃｋら、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ（２００８年３月）１３、５／６に開示されている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明の実施形態は、生細胞への組み合わせ化合物の１回の曝露を使用して代謝経路ベースラインと代謝能の両方を同時に測定するための、特定の化合物の組合せを含む。驚くべきことに、この試験の測定結果は、２つの経路のロバストな測定を同時に提供する。
【０００４】
本発明の実施形態は、１回の注入による、主要な代謝／エネルギー両経路の急速な刺激、ならびにその１回の注入に基づいた、これら主要な経路（すなわちミトコンドリア呼吸および解糖）の代謝能の決定を可能にする。ミトコンドリアおよび解糖は、ＡＴＰについて細胞のエネルギーの大半を産生し、バイオマスおよび細胞成分を作製する生合成反応に不可欠である。
【０００５】
従来の手法は、２つの主要なエネルギー経路の、個別の刺激および解析に限定されていた。従来の手法は、主要なエネルギー経路の両方を同時に刺激することができる化合物を同定および送達することができない。更に、従来の手法は、ストレスに対する２つの主要なエネルギー経路の同時応答を測定することができない。
【０００６】
少なくとも４つの理由により、両方の経路を同時に刺激することができる化合物の同定および送達は、当業者に明らかでない。第１に、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅが細胞外フラックス（「ＸＦ」）機器を商業化するまで、生細胞において両方の経路を測定できる技術はなかったので、その問題が考慮されることすらほとんどなかった。第２に、当業技術者の圧倒的多数は、ミトコンドリアの専門家または解糖のどちらか一方の専門家である。代謝とは、多くの「サブシステム」の膨大な集合であり、ミトコンドリアおよび解糖はそのうちの２つにすぎない。代謝が調査される場合、疾患および学問分野の大半における当業者は、その者の研究に最も関連するサブシステムにしか重点を置かず、したがって両方の経路に関連する実験を実行し、それを解釈する方法を知らないことになる。
【０００７】
第３に、本発明の実施形態において、１回の注入で送達される２つの化合物である脱共役剤およびＡＴＰシンターゼ阻害剤（オリゴマイシン）は、ミトコンドリアを調査するために開発されたものであり、解糖を調査するためではない。多くの研究者がミトコンドリア機能の理解におけるＡＴＰシンターゼ阻害剤の使用を実証したが、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅは、解糖の機能を理解するためにそれを使用した最初の企業である。例えば、Ｓｅａｈｏｒｓｅは、解糖ストレス試験において解糖系に対するストレッサーとしてオリゴマイシンを用いた最初の企業であった。
【０００８】
最後に、当業者は、解糖および酸化的リン酸化が、互いを補償するために働くと仮定している。したがって、以前の手法は一般に、一方の経路を刺激すると他方が低下するという前提に基づいている。本発明の実施形態は、両方の経路が同時に刺激されることを予想しているので、基本的に異なる手法を含んでいる。
【０００９】
Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅは、酸素消費速度（「ＯＣＲ」）および細胞外酸性化速度（「ＥＣＡＲ」）を同時に測定することを可能にする技術を実証した。Ｆｅｒｒｉｃｋらを参照のこと。しかしながら、脱共役剤とＡＴＰシンターゼ阻害剤の両方を注入し、それと同時に、両方のエネルギー経路に同時にストレスを与え、それにより代謝能すなわちその表現型の、単一の指標を得ることは行われていない。２つの別々の手法および２つの別々のサンプルを使用してストレス下応答をそれぞれ独立に決定し、次いでデータを数学的に組み合わせて、合計を決定することができる。これに対し、本明細書に記述される本発明の実施形態による方法は、単一のサンプルおよび１回の注入を用い、それにより、利用者はミトコンドリア呼吸と解糖の両方を表す細胞の単一の代謝ベースラインおよび代謝能を決定することができる。
【００１０】
本明細書に記述した本発明の実施形態による方法は、細胞の代謝容量を決定する従来方法よりもいくつかの有意な利点を有する。例えば、脱共役剤およびＡＴＰシンターゼ阻害剤の投薬が１回の注入によって行われるので、データをより迅速に収集することができ、代謝容量をハイスループット規模で測定することが可能になる。例えば、先行技術の方法は、ＡＴＰシンターゼ阻害剤の投薬と脱共役剤の投薬との間に２０分間の間隔を必要としたが、それは本明細書に記述される方法において排除される。そのかわり、本明細書に記述される本発明のある特定の実施形態による方法は、先行技術の方法のＡＴＰシンターゼ阻害剤の投薬と脱共役剤との投薬の間に２０分未満の間隔を必要とする。例えば、本明細書に記述される本発明のある特定の実施形態による特定の方法は、ＡＴＰシンターゼ阻害剤の投薬と脱共役剤との投薬の間の間隔が、２０分未満、１５分未満、１０分未満、５分未満、２分未満または１分未満であることを実証する。本明細書に記述される本発明のある特定の実施形態による他の方法は、ＡＴＰシンターゼ阻害剤および脱共役剤を同時にまたは本質的に一緒に（例えば、直ちに連続して）投薬できることを実証する。
【００１１】
同様に、ＯＣＲおよびＥＣＡＲを別々のサンプルで並行して測定する先行技術の方法と比較して、所与の実験に使用される細胞サンプル数を半分に低減することができる。これは、希少または培養が困難な細胞型、特に初代細胞培養を扱う研究者にとって重要な利点である。１回の注入に脱共役剤およびＡＴＰシンターゼ阻害剤を組み合わせることにより、分配システムの要素が不用になり、より複雑な実験が可能になる。最後に、各複製について脱共役剤およびＡＴＰシンターゼ阻害剤の比は固定されているので、先行技術の方法と比較して、変動の重大な発生源が、本明細書に開示する方法によって得られるデータから除去される。
【００１２】
一態様において、本発明のいくつかの実施形態は、細胞サンプルの代謝能を決定する方法を含む。細胞サンプルの酸素消費の初期速度および細胞外の酸性化の初期速度を同時に測定する。その後、細胞サンプルにミトコンドリア脱共役剤およびＡＴＰシンターゼ阻害剤を同時に投与する。その後、細胞サンプルの酸素消費の事後速度および細胞外の酸性化の事後速度を同時に測定する。細胞サンプルの代謝能を決定する。
【００１３】
以下の特徴の１つまたは複数を含むことができる。ミトコンドリア脱共役剤の少なくとも１つは、カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（「ＦＣＣＰ」）、カルボニルシアニド−ｍ−クロロフェニルヒドラゾン（「ＣＣＣＰ」）または２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはＢＡＭ１５を含むことができ、あるいはＡＴＰシンターゼ阻害剤は、オリゴマイシンまたは７−クロロ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−１−メチル−３−（ナフタレン−２−イルメチル）−４，５，−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］ジアゼピン−２（３Ｈ）−オン（Ｂｚ−４２３）を含むことができる。
【００１４】
ミトコンドリア脱共役剤はカルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（「ＦＣＣＰ」）を含むことができ、ＡＴＰシンターゼ阻害剤はオリゴマイシンを含むことができる。
【００１５】
細胞サンプルは、培地中に配置された複数の細胞を含むことができる。細胞サンプルの酸素消費の初期速度を測定することおよび／または細胞外の酸性化の初期速度を測定するステップは、培地中に配置された細胞成分を検知するステップを含む。
【００１６】
培地中に投与されるミトコンドリア脱共役剤の濃度は、約０．１μＭ〜約２．０μＭの範囲、例えば、約０．５μＭであってもよい。培地中の投与されたＡＴＰシンターゼ阻害剤の濃度は、約０．１μＭ〜約２μＭ、例えば、約１．０μＭである。細胞サンプルに投与する前に、ミトコンドリア脱共役剤およびＡＴＰシンターゼ阻害剤を混合することができる。
【００１７】
細胞サンプルの酸素消費の初期速度および細胞外の酸性化の初期速度を同時に測定する前に、マルチウェルプレートのウェル内に細胞サンプルを配置することができる。ミトコンドリア脱共役剤およびＡＴＰシンターゼ阻害剤は、少なくとも１つのポートからウェルに同時に共役剤および阻害剤を同時に導入することにより投与することができる。
【００１８】
細胞サンプルの代謝能を決定するステップは、（ｉ）ソフトウェアプログラムへ酸素消費の初期速度、細胞外の酸性化の初期速度、酸素消費の事後速度および細胞外の酸性化の事後速度を提供するステップと、（ｉｉ）ソフトウェアプログラムを使用して代謝能を算出するステップとを含むことができる。
【００１９】
別の態様において、本発明の実施形態は、マルチウェルプレートのウェル内にある細胞サンプルの代謝能を決定するための装置を含む。装置は、（ｉ）マルチウェルプレートを支持するように構成されている台、（ｉｉ）マルチウェルプレートのウェル内にある細胞サンプルと関連する細胞成分を検知するように構成されているセンサー、および（ｉｉｉ）ウェルに流体を導入するように構成されている分配システムを含む。台、センサーおよび分配システムが協働して、センサーを使用して、細胞サンプルの酸素消費の初期速度ならびに細胞外の酸性化の初期速度を同時に測定する。その後、分配システムを使用して、細胞サンプルにミトコンドリア脱共役剤およびＡＴＰシンターゼ阻害剤を同時に投与する。その後、センサーを使用して、細胞サンプルの酸素消費の事後速度および細胞外の酸性化の事後速度を同時に測定する。細胞サンプルの代謝能を決定する。
【００２０】
以下の特徴の１つまたは複数を含むことができる。分配システムは、ウェルの上に配置されている少なくとも１つのポートを含むことができる。センサーは、光学センサーを含むことができる。センサーは、フルオロフォアを検知するように構成されていることができる。装置は、センサーによりコンピュータモジュールに通信される情報に基づいて代謝能を算出するように構成されているコンピュータモジュールおよびソフトウェアを含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージ細胞におけるオリゴマイシン存在下でのＦＣＣＰ滴定の結果を示すグラフである。
【図２】ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージ細胞における代謝能に対するＬＰＳ処理の効果を示す実験の結果を示す図である。
【図３】Ｈｅｌａ細胞の代謝能に対するＤＣＡによる処理の効果を示す実験の結果を示す図である。
【図４】Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞に対するＵＫ５０９９による処理の効果を示す実験の結果を示す図である。
【図５】Ａ５４９細胞、ラットアストロサイト、マウス骨髄由来初代マクロファージ、ＢＴ４７４細胞、ＨＣＴ１１６細胞およびＨｅｐＧ２細胞の代謝能を示す実験の結果を示す図である。
【図６】ヒト臍帯静脈内皮細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＭＣＦ−７細胞、新生児ラット心室筋細胞、ＰＣ１２細胞およびＳＫＢＲ−３細胞の代謝能を示す実験の結果を示す図である。
【図７】Ｃ２Ｃ１２筋管の代謝能に対するエトモキシルの効果を示す実験の結果を示す図である。
【図８】Ｊｕｒｋａｔ細胞の代謝能に対するラパマイシンによる処理の効果を示す実験の結果を示す図である。
【図９】本明細書に記述される本発明の実施形態による特定の一方法により生成され得る例示的なデータのグラフである。
【図１０】本明細書に記述される本発明の特定の一実施形態と合わせて使用され得る例示的なユーザインターフェースのスクリーンショットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
細胞エネルギー表現型試験は、生細胞の代謝ベースラインおよび代謝能を迅速に決定するための方法である。これは、細胞内の２つの主要なエネルギー生成経路であるミトコンドリア呼吸および解糖のそれぞれの活性を、最初にベースライン条件下で測定し、細胞にストレスを加えてエネルギー供給の増加を必要にさせた後に再び測定することにより達成される。
【００２３】
ストレスは、細胞を、ミトコンドリア脱共役剤およびＡＴＰシンターゼ阻害剤の２つの化合物の組合せに曝露することにより加えることができる。これらの化合物は、２つの代謝経路に対する見かけのエネルギー需要を増加させ、各経路内の活性を最大容量程度まで増加させる。
【００２４】
ストレス下とベースライン条件との間で測定されるエネルギー生成活性の差異は、代謝能を定義する。代謝ベースラインおよび代謝能の組合せは、細胞のエネルギー表現型を構成する。
【００２５】
一実施形態において、ミトコンドリア呼吸経路の代謝エネルギー生成活性は、生細胞による酸素消費の速度を測定することにより決定され、解糖経路の代謝エネルギー生成活性は、細胞からのプロトンの分泌に起因する細胞外の酸性化の測定から決定される。
【００２６】
［実験手法］
本発明の実施形態によると、脱共役剤のプロトタイプであるカルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（「ＦＣＣＰ」）は、ミトコンドリア内膜を跨ぐ陽子勾配を消散させることにより好気的な系にストレスを与える。これは、細胞にミトコンドリア活性を最大まで増加させる。オリゴマイシンは、複合体ＶのＡＴＰアーゼを遮断し、したがってアデノシン三リン酸（「ＡＴＰ」）の加水分解を妨げ、これは、この複合体を介したＦＣＣＰの効果を打ち消すであろう逆方向へと電子を供給するであろう。オリゴマイシンは、解糖系にも「ストレスを与え」て、より多くのＡＴＰを産生させ、それによりミトコンドリアＡＴＰアーゼの阻害によって引き起こされるＡＴＰの消失を打ち消す。
【００２７】
［必要な材料］
１．本発明の実施形態による解析を実行するのに適当な解析ツールは、例えば、
ａ．Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ
ｂ．Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＸＦｅ２４細胞外フラックスアナライザ
ｃ．Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＸＦｅ９６細胞外フラックスアナライザ
ｄ．Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＸＦ２４細胞外フラックスアナライザ
ｅ．Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＸＦ２４−３細胞外フラックスアナライザ
ｆ．Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＸＦ９６細胞外フラックスアナライザ
のうちいずれか１つの機器であり得る。
【００２８】
これらの装置のそれぞれは、マルチウェルプレートのウェル内にある細胞サンプルの代謝能を決定することができる。装置は、（ｉ）マルチウェルプレートを支持するように構成されている台、（ｉｉ）マルチウェルプレートのウェル内にある細胞サンプルと関連する細胞成分を検知するように構成されているセンサー、および（ｉｉｉ）ウェルに流体を導入するように構成されている分配システムを含む。装置の構成要素は、例えば米国特許第７，２７６，３５１号および同第８，６５８，３４９号に記述されており、両方を、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【００２９】
後述するように、台、センサーおよび分配システムが協働して、センサーを使用して、細胞サンプルの酸素消費の初期速度および細胞外の酸性化の初期速度を同時に測定する。その後、分配システムを使用して、細胞サンプルにミトコンドリア脱共役剤およびＡＴＰシンターゼ阻害剤を同時に投与する。その後、センサーを使用して、細胞サンプルの酸素消費の事後速度および細胞外の酸性化の事後速度を同時に測定する。細胞サンプルの代謝能を決定する。
【００３０】
２．細胞培養培地。通常は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なダルベッコ変法イーグル培地（「ＤＭＥＭ」）に、１０ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸を補充したもの。
【００３１】
３．アッセイ培地（通常は、炭酸水素ナトリウムを除いたＤＭＥＭ（ＸＦ基礎培地としてＳｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能）に、１０ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸を補充したもの）。
【００３２】
４．使用される機器に適当なアッセイカートリッジ、例えば、ＸＦｅ９６  ＦｌｕｘＰａｋ。
【００３３】
５．培養における細胞（限定されるものではないが、通常は哺乳動物）。必要とされる細胞の数は、使用される機器および細胞の型に基づいて変化する。典型的には、数は、１ウェル当たり１０，０００〜１，０００，０００個である。ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージ細胞を利用する原型例において、ＸＦｐミニプレートの１ウェル当たりに８０，０００個の細胞を播種することができる。
【００３４】
６．試薬（ａまたはｂのいずれか）
ａ．オリゴマイシンおよびＦＣＣＰ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅからそれぞれ入手可能）
ｂ．ＸＦｐ機器の場合、オリゴマイシンおよびＦＣＣＰは、キット、すなわちＸＦｐ細胞エネルギー表現型試験キットとして提供される。
【００３５】
一般に、試薬は、好ましくはミトコンドリア脱共役剤およびＡＴＰシンターゼ阻害剤の組合せを含む。適当なミトコンドリア脱共役剤には、例えば、カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（「ＦＣＣＰ」）、カルボニルシアニド−ｍ−クロロフェニルヒドラゾン（「ＣＣＣＰ」）または２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはＢＡＭ１５が挙げられる。適当なＡＴＰシンターゼ阻害剤には、例えば、オリゴマイシンまたは７−クロロ−５−（４−ヒドロキシフェニル）−１−メチル−３−（ナフタレン−２−イルメチル）−４，５，−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］ジアゼピン−２（３Ｈ）−オン（Ｂｚ−４２３）が挙げられる。
【００３６】
［例示的なプロトコール］
１．培養細胞を、使用される機器用の適当なマイクロプレート（本明細書ではマルチウェルプレートとも称する）のウェルに先ず播種する（上記の通り）。
【００３７】
２．マイクロプレートに付着させた後に、細胞を所望の通り増殖させておく、または直ちに代謝能のアッセイを行うこともできる。
【００３８】
３．アッセイの際には、細胞培養培地を、使用するマイクロプレートに適当な体積のアッセイ培地と交換して、培地中に配置された複数の細胞を含む細胞サンプルを作製する。マイクロプレートを、ＣＯ２なしのインキュベーター中で、３７℃で１時間インキュベートすることができる。
【００３９】
４．いくつかの細胞において、アッセイ培地に交換する間にリポ多糖（「ＬＰＳ」）を１μｇ／ｍｌの終濃度になるように添加することができる。細胞を、アッセイ前にＣＯ２なしのインキュベーター中で、３７℃で１時間インキュベートすることができる。ＬＰＳ処理は、アッセイの間は除くことができない。
【００４０】
５．適当な機器をコマンド指示でプログラムして、例えば、測定を３回遂行し、ウェル内の細胞サンプル上に配置したカートリッジのポートから溶液を注入し、次いで追加の測定を５回遂行する。
【００４１】
６．オリゴマイシン原液を、アッセイ培地中で１０μＭの使用濃度になるように調製する。ＦＣＣＰを、アッセイされる特定の細胞型用に最適化された使用濃度になるようにこの溶液に添加する。例えば、ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージの場合には、５μＭの使用溶液が調製される。
【００４２】
７．注入によって使用溶液が所望の終濃度になるようにアッセイ培地中に希釈されるように、十分な体積の使用溶液をアッセイカートリッジに添加する。例えば、ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージにおいて、最終的な所望の濃度は、１．０μＭオリゴマイシンおよび０．５μＭのＦＣＣＰである。これらの濃度の両方とも、最適な効果の滴定により決定された。
【００４３】
８．ＸＦｅ９６機器における最適なＦＣＣＰ濃度を滴定するために、ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージを様々な濃度の薬物に曝露し、得られたＯＣＲを測定する。この例において、細胞を１．０μＭオリゴマイシン（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で最初に処理し、ＯＣＲを測定し、次いで０．１２５、０．２５、０．５、１．０または２．０μＭ（アッセイ培地２２２μｌ中の終濃度）のうち１つの濃度のＦＣＣＰを添加した。次いで得られたＯＣＲを例図のようにプロットして、ＯＣＲの最大刺激を実現する最低濃度を決定する。
【００４４】
９．オリゴマイシンおよびＦＣＣＰを含有する水和したアッセイカートリッジを機器に装填する。
【００４５】
１０．アッセイカートリッジを較正した後に、細胞培養マイクロプレートを機器に装填する。次いで、機器が、上で概説したプログラムされた測定ステップを実行する。
【００４６】
１１．細胞サンプルの代謝能は、（ｉ）ソフトウェアプログラムへ酸素消費の初期速度、細胞外酸性化の初期速度、酸素消費の事後速度および細胞外酸性化の事後速度を提供するステップと、（ｉｉ）ソフトウェアプログラムを使用して代謝能を算出するステップとによって決定できる。それにより、実験の完了時に、データを各経路の刺激の程度に基づいて代謝能を算出するエクセルマクロを使用して解析することができる。エクセルマクロは、任意のＸＦ機器により生成されるデータを解析する。ストレッサー注入前の最後の測定によって定義される酸素消費および細胞外酸性化のベースライン速度を決定することにより、データ解析を始める。ストレス下データポイントを、オリゴマイシンおよびＦＣＣＰの同時注入後に最大に刺激されるデータポイントを使用して決定する。これらのデータを視覚的にプロットし、Ｙ軸はＯＣＲを表し、Ｘ軸はＥＣＡＲを表す。代謝能を、ベースラインより高いストレッサーによる各経路（ＯＣＲおよびＥＣＡＲ）のパーセント刺激を決定することによって各要素について別々に決定する。本明細書に記述される本発明の実施形態による特定の方法により生成され得るデータ型の例を、図９に示す。本明細書に記述される本発明の特定の一実施形態と合わせて使用され得る例示的なユーザインターフェースのスクリーンショットを、図１０に示す。
【００４７】
適当なアッセイキットは、オリゴマイシンおよびＦＣＣＰのチューブを含むことができる。化合物は、好ましくは前測定され、安定性のために凍結乾燥される。
【００４８】
時間分解データに対して計算を実行して、ベースラインおよびストレス下表現型、ならびに組み合わせた代謝能を決定することができる。データは、１つの実験マイクロプレート内の複数の技術的複製から平均することができる。
【実施例】
【００４９】
［実施例１］
＜ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージ細胞におけるオリゴマイシン存在下でのＦＣＣＰ滴定＞
ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージ細胞を、８．０×１０４個細胞／ウェルの密度でＸＦｅ９６マイクロプレート（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に播種した。ＲＡＷ  ２６４．７細胞は半付着性なので、細胞を各ウェルに添加し、次いでマイクロプレートを３００×ｇで２分間遠心分離してウェル底に細胞を沈ませた。細胞を、２５ｍＭグルコース、４ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸および１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で２４時間培養した。
【００５０】
培養培地を、アッセイ培地（ＸＦ基礎培地としてＳｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な、炭酸水素ナトリウムを除いた改変ＤＭＥＭ；１０ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸を補充）で置き換えた。
【００５１】
ＦＣＣＰ滴定を、製造業者の指示にしたがってＸＦｅ９６細胞外フラックスアナライザ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＸＦｅ９６アッセイカートリッジ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して実行した。簡潔には、細胞を１．０μＭオリゴマイシン（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で最初に処理し、ＯＣＲを測定し、次いで０．１２５μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ、１．０μＭ、または２μＭ（アッセイ培地２２２μｌ中の終濃度）のうち１つの濃度のＦＣＣＰを添加した。次いで得られたＯＣＲを例図のようにプロットして、ＯＣＲの最大刺激を実現する最低濃度を決定した。
【００５２】
滴定の結果を、図１に示す。データは、１．０μＭオリゴマイシン＋指示濃度のＦＣＣＰ存在下におけるＲＡＷ  ２６４．７マクロファージ細胞の酸素消費速度である。示したデータは、処理群当たり３つの複製の平均±標準偏差である。これらのデータは、最大ＯＣＲが、１．０μＭオリゴマイシン存在下で０．５μＭのＦＣＣＰで実現されることを示す。
【００５３】
［実施例２］
＜ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージ細胞における代謝能に対するＬＰＳ処理の効果＞
ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージ細胞を、８．０×１０４個細胞／ウェルの密度でＸＦｐマイクロプレートに播種した。ＲＡＷ  ２６４．７細胞は半付着性なので、細胞を各ウェルに添加し、次いでマイクロプレートを３００×ｇで２分間遠心分離してウェル底に細胞を沈ませた。細胞を、２５ｍＭグルコース、４ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸および１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で２４時間培養した。
【００５４】
培養培地を、アッセイ培地（ＸＦ基礎培地としてＳｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な、炭酸水素ナトリウムを除いた改変ＤＭＥＭ；１０ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸を補充）で置き換えた。ＬＰＳで処理した細胞には１μｇ／ｍｌのＬＰＳを含有する培地を与え、対照細胞にはアッセイ培地を与えた。細胞を、アッセイ前にＣＯ２なしのインキュベーター中で、３７℃で１時間インキュベートした。
【００５５】
代謝能を、ＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＸＦｐアッセイカートリッジ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。簡潔には、ＬＰＳ処理および対照細胞を含有するマイクロプレートをＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ内に入れ、初期ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行う。次いで、処理および対照ウェルを、０．５μＭのＦＣＣＰおよび１．０μＭオリゴマイシン（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で同時に処理し、ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定をその後行った。
【００５６】
実験の結果を、図２に示す。示したデータは、処理群当たり３つの複製の平均±標準偏差である。これらのデータは、ＬＰＳで処理した細胞の好気性代謝能が、対照細胞と比較して増加し、解糖能はおおよそ不変のままであることを示す。
【００５７】
［実施例３］
＜Ｈｅｌａ細胞の代謝能に対するＤＣＡによる処理の効果＞
Ｈｅｌａ細胞を、１．２×１０４個細胞／ウェルの密度でＸＦｐマイクロプレートに播種した。細胞を、５．５ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１０％ＦＢＳを補充したＭＥＭ中で２４時間培養した。
【００５８】
培養培地を、アッセイ培地（ＸＦ基礎培地としてＳｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な、炭酸水素ナトリウムを除いた改変ＤＭＥＭ；１０ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸を補充）で置き換えた。処理した細胞に、１０ｍＭジクロロ酢酸（ＤＣＡ）を含有する培地を与え、対照細胞にアッセイ培地を与えた。細胞を、アッセイ前にＣＯ２なしのインキュベーター中で、３７℃で１時間インキュベートした。
【００５９】
代謝能を、ＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＸＦｐアッセイカートリッジ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。簡潔には、ＤＣＡ処理および対照細胞を含有するマイクロプレートをＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ内に入れ、初期ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行う。次いで、処理および対照ウェルを、０．７５μＭのＦＣＣＰおよび１．０μＭオリゴマイシン（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で同時に処理し、ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定をその後行った。
【００６０】
実験の結果を、図３に示す。示したデータは、処理群当たり３つの複製の平均±標準偏差である。これらのデータは、処理した細胞の好気性代謝能が対照細胞と比較してわずかに増加し、解糖能が低下することを示す。
【００６１】
［実施例４］
＜Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞に対するＵＫ５０９９による処理の効果＞
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を、１．２×１０４個細胞／ウェルの密度でＸＦｐマイクロプレートに播種した。細胞を、２５ｍＭグルコース、４ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸および１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で２４時間培養した。
【００６２】
培養培地を、アッセイ培地（ＸＦ基礎培地としてＳｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な、炭酸水素ナトリウムを除いた改変ＤＭＥＭ；１０ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸を補充）で置き換えた。処理した細胞に、２μＭ  ＵＫ５０９９（ミトコンドリアピルビン酸キャリアの強力な阻害剤）を含有する培地を与え、対照細胞にアッセイ培地を与えた。細胞を、アッセイ前にＣＯ２なしのインキュベーター中で、３７℃で１時間インキュベートした。
【００６３】
代謝能を、ＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＸＦｐアッセイカートリッジ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。簡潔には、ＵＫ５０９９処理および対照細胞を含有するマイクロプレートをＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ内に入れ、初期ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行う。次いで、処理および対照ウェルを、０．５μＭのＦＣＣＰおよび１．０μＭオリゴマイシン（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で同時に処理し、ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定をその後行った。
【００６４】
実験の結果を、図４に示す。示したデータは、処理群当たり３つの複製の平均±標準偏差である。これらのデータは、ＵＫ５０９９で処理した細胞の好気性および解糖代謝能が対照細胞と比較して低下することを示す。
【００６５】
［実施例５］
＜実施例５Ａ．Ａ５４９細胞の代謝能＞
Ａ５４９細胞を、１．０×１０４個細胞／ウェルの密度でＸＦｐマイクロプレートに播種した。細胞を、１１ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で２４時間培養した。
【００６６】
培養培地を、アッセイ培地（ＸＦ基礎培地としてＳｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な、炭酸水素ナトリウムを除いた改変ＤＭＥＭ；１０ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸を補充）で置き換えた。細胞を、アッセイ前にＣＯ２なしのインキュベーター中で、３７℃で１時間インキュベートした。
【００６７】
代謝能を、ＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＸＦｐアッセイカートリッジ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。簡潔には、細胞を含有するマイクロプレートをＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ内に入れ、初期ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行った。次いで、処理および対照ウェルを、１．０μＭオリゴマイシン（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で処理した。オリゴマイシン処理後に、中間ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行った。２０分間後に、処理および対照ウェルを、０．５μＭのＦＣＣＰ（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で処理し、最後のＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定をその後行った。
【００６８】
実験の結果を、図５に示す。示したデータは、処理群当たり３つの複製の平均±標準偏差である。
【００６９】
＜実施例５Ｂ．ラットアストロサイトの代謝能＞
単離１４日間後にラットアストロサイトを、２．０×１０４個細胞／ウェルの密度でＸＦｐマイクロプレートに播種した。細胞を、５．５ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で４８時間培養した。
【００７０】
培養培地を、アッセイ培地（ＸＦ基礎培地としてＳｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な、炭酸水素ナトリウムを除いた改変ＤＭＥＭ；１０ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸を補充）で置き換えた。細胞を、アッセイ前にＣＯ２なしのインキュベーター中で、３７℃で１時間インキュベートした。
【００７１】
代謝能を、ＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＸＦｐアッセイカートリッジ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。簡潔には、細胞を含有するマイクロプレートをＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ内に入れ、初期ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行った。次いで、処理および対照ウェルを、１．０μＭオリゴマイシン（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で処理した。オリゴマイシン処理後に、中間ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行った。２０分間後に、処理および対照ウェルを、２．０μＭのＦＣＣＰ（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で処理し、最後のＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定をその後行った。
【００７２】
実験の結果を、図５に示す。示したデータは、処理群当たり３つの複製の平均±標準偏差である。
【００７３】
＜実施例５Ｃ．マウス骨髄由来初代マクロファージの代謝能＞
マウス骨髄由来初代マクロファージを、ＧＭ−ＣＳＦを使用して分化させ、７日間培養で増殖させた。細胞を、８．０×１０４個細胞／ウェルの密度でＸＦｐマイクロプレートに播種した。細胞を、１０ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸および１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で２４時間培養した。
【００７４】
培養培地を、アッセイ培地（ＸＦ基礎培地としてＳｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な、炭酸水素ナトリウムを除いた改変ＤＭＥＭ；１０ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸を補充）で置き換えた。細胞を、アッセイ前にＣＯ２なしのインキュベーター中で、３７℃で１時間インキュベートした。
【００７５】
代謝能を、ＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＸＦｐアッセイカートリッジ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。簡潔には、細胞を含有するマイクロプレートをＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ内に入れ、初期ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行った。次いで、処理および対照ウェルを、１．０μＭオリゴマイシン（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で処理した。オリゴマイシン処理後に、中間ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行った。２０分間後に、処理および対照ウェルを、１．０μＭのＦＣＣＰ（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で処理し、最後のＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定をその後行った。
【００７６】
実験の結果を、図５に示す。示したデータは、処理群当たり３つの複製の平均±標準偏差である。
【００７７】
＜実施例５Ｄ．ＢＴ４７４細胞の代謝能＞
ＢＴ４７４細胞を、２．０×１０４個細胞／ウェルの密度でＸＦｐマイクロプレートに播種した。細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＡＴＣＣ  Ｈｙｂｒｉｃａｒｅ培地中で２４時間培養した。
【００７８】
培養培地を、アッセイ培地（ＸＦ基礎培地としてＳｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な、炭酸水素ナトリウムを除いた改変ＤＭＥＭ；１０ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸を補充）で置き換えた。細胞を、アッセイ前にＣＯ２なしのインキュベーター中で、３７℃で１時間インキュベートした。
【００７９】
代謝能を、ＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＸＦｐアッセイカートリッジ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。簡潔には、細胞を含有するマイクロプレートをＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ内に入れ、初期ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行った。次いで、処理および対照ウェルを、１．０μＭオリゴマイシン（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で処理した。オリゴマイシン処理後に、中間ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行った。２０分間後に、処理および対照ウェルを、０．５μＭのＦＣＣＰ（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で処理し、最後のＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定をその後行った。
【００８０】
実験の結果を、図５に示す。示したデータは、処理群当たり３つの複製の平均±標準偏差である。
【００８１】
＜実施例５Ｅ．ＨＣＴ１１６細胞の代謝能＞
ＨＣＴ１１６細胞を、１．２×１０４個細胞／ウェルの密度でＸＦｐマイクロプレートに播種した。細胞を、１１ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で２４時間培養した。
【００８２】
培養培地を、アッセイ培地（ＸＦ基礎培地としてＳｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な、炭酸水素ナトリウムを除いた改変ＤＭＥＭ；１０ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸を補充）で置き換えた。細胞を、アッセイ前にＣＯ２なしのインキュベーター中で、３７℃で１時間インキュベートした。
【００８３】
代謝能を、ＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＸＦｐアッセイカートリッジ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。簡潔には、細胞を含有するマイクロプレートをＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ内に入れ、初期ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行った。次いで、処理および対照ウェルを、１．０μＭオリゴマイシン（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で処理した。オリゴマイシン処理後に、中間ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行った。２０分間後に、処理および対照ウェルを、０．２５μＭのＦＣＣＰ（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で処理し、最後のＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定をその後行った。
【００８４】
実験の結果を、図５に示す。示したデータは、処理群当たり３つの複製の平均±標準偏差である。
【００８５】
＜実施例５Ｆ．ＨｅｐＧ２細胞の代謝能＞
ＨｅｐＧ２細胞を、２．０×１０４個細胞／ウェルの密度でＸＦｐマイクロプレートに播種した。細胞を、１１ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で２４時間培養した。
【００８６】
培養培地を、アッセイ培地（ＸＦ基礎培地としてＳｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な、炭酸水素ナトリウムを除いた改変ＤＭＥＭ；１０ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸を補充）で置き換えた。細胞を、アッセイ前にＣＯ２なしのインキュベーター中で、３７℃で１時間インキュベートした。
【００８７】
代謝能を、ＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＸＦｐアッセイカートリッジ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。簡潔には、細胞を含有するマイクロプレートをＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ内に入れ、初期ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行った。次いで、処理および対照ウェルを、１．０μＭオリゴマイシン（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で処理した。オリゴマイシン処理後に、中間ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行った。２０分間後に、処理および対照ウェルを、０．５μＭのＦＣＣＰ（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で処理し、最後のＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定をその後行った。
【００８８】
実験の結果を、図５に示す。示したデータは、処理群当たり３つの複製の平均±標準偏差である。
【００８９】
［実施例６］
＜実施例６Ａ．ヒト臍帯静脈内皮細胞の代謝能＞
ヒト臍帯静脈内皮細胞を、１．２×１０４個細胞／ウェルの密度でＸＦｐマイクロプレートに播種した。細胞を、ＥＧＭ−２  Ｂｕｌｌｅｔｋｉｔ培地（Ｌｏｎｚａ）中で２４時間培養した。
【００９０】
培養培地を、アッセイ培地（ＸＦ基礎培地としてＳｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な、炭酸水素ナトリウムを除いた改変ＤＭＥＭ；１０ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸を補充）で置き換えた。細胞を、アッセイ前にＣＯ２なしのインキュベーター中で、３７℃で１時間インキュベートした。
【００９１】
代謝能を、ＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＸＦｐアッセイカートリッジ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。簡潔には、細胞を含有するマイクロプレートをＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ内に入れ、初期ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行った。次いで、処理および対照ウェルを、１．０μＭオリゴマイシン（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で処理した。オリゴマイシン処理後に、中間ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行った。２０分間後に、処理および対照ウェルを、１．０μＭのＦＣＣＰ（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で処理し、最後のＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定をその後行った。
【００９２】
実験の結果を、図６に示す。示したデータは、処理群当たり３つの複製の平均±標準偏差である。
【００９３】
＜実施例６Ｂ．ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の代謝能＞
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、２．０×１０４個細胞／ウェルの密度でＸＦｐマイクロプレートに播種した。細胞を、１１ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で２４時間培養した。
【００９４】
培養培地を、アッセイ培地（ＸＦ基礎培地としてＳｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な、炭酸水素ナトリウムを除いた改変ＤＭＥＭ；１０ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸を補充）で置き換えた。細胞を、アッセイ前にＣＯ２なしのインキュベーター中で、３７℃で１時間インキュベートした。
【００９５】
代謝能を、ＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＸＦｐアッセイカートリッジ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。簡潔には、細胞を含有するマイクロプレートをＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ内に入れ、初期ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行った。次いで、処理および対照ウェルを、１．０μＭオリゴマイシン（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で処理した。オリゴマイシン処理後に、中間ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行った。２０分間後に、処理および対照ウェルを、１．０μＭのＦＣＣＰ（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で処理し、最後のＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定をその後行った。
【００９６】
実験の結果を、図６に示す。示したデータは、処理群当たり３つの複製の平均±標準偏差である。
【００９７】
＜実施例６Ｃ．ＭＣＦ−７細胞の代謝能＞
ＭＣＦ−７細胞を、２．０×１０４個細胞／ウェルの密度でＸＦｐマイクロプレートに播種した。細胞を、１１ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で２４時間培養した。
【００９８】
培養培地を、アッセイ培地（ＸＦ基礎培地としてＳｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な、炭酸水素ナトリウムを除いた改変ＤＭＥＭ；１０ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸を補充）で置き換えた。細胞を、アッセイ前にＣＯ２なしのインキュベーター中で、３７℃で１時間インキュベートした。
【００９９】
代謝能を、ＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＸＦｐアッセイカートリッジ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。簡潔には、細胞を含有するマイクロプレートをＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ内に入れ、初期ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行った。次いで、処理および対照ウェルを、１．０μＭオリゴマイシン（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で処理した。オリゴマイシン処理後に、中間ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行った。２０分間後に、処理および対照ウェルを、０．２５μＭのＦＣＣＰ（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で処理し、最後のＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定をその後行った。
【０１００】
実験の結果を、図６に示す。示したデータは、処理群当たり３つの複製の平均±標準偏差である。
【０１０１】
＜実施例６Ｄ．新生児ラット心室筋細胞の代謝能＞
新生児ラット心室筋細胞を、５．０×１０４個細胞／ウェルの密度でＸＦｐマイクロプレートに播種した。細胞を、５．５ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸を補充したＤＭＥＭ中で４８時間培養した。
【０１０２】
培養培地を、アッセイ培地（ＸＦ基礎培地としてＳｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な、炭酸水素ナトリウムを除いた改変ＤＭＥＭ；１０ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸を補充）で置き換えた。細胞を、アッセイ前にＣＯ２なしのインキュベーター中で、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１０３】
代謝能を、ＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＸＦｐアッセイカートリッジ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。簡潔には、細胞を含有するマイクロプレートをＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ内に入れ、初期ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行った。次いで、処理および対照ウェルを、１．０μＭオリゴマイシン（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で処理した。オリゴマイシン処理後に、中間ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行った。２０分間後に、処理および対照ウェルを、１．０μＭのＦＣＣＰ（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で処理し、最後のＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定をその後行った。
【０１０４】
実験の結果を、図６に示す。示したデータは、処理群当たり３つの複製の平均±標準偏差である。
【０１０５】
＜実施例６Ｅ．ＰＣ１２細胞の代謝能＞
ＰＣ１２細胞を、８．０×１０４個細胞／ウェルの密度でＸＦｐマイクロプレートに播種した。細胞を、アッセイ培地（ＸＦ基礎培地としてＳｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な、炭酸水素ナトリウムを除いた改変ＤＭＥＭ；１０ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸を補充）中で培養した。細胞を、アッセイ前にＣＯ２なしのインキュベーター中で、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１０６】
代謝能を、ＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＸＦｐアッセイカートリッジ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。簡潔には、細胞を含有するマイクロプレートをＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ内に入れ、初期ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行った。次いで、処理および対照ウェルを、１．０μＭオリゴマイシン（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で処理した。オリゴマイシン処理後に、中間ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行った。２０分間後に、処理および対照ウェルを、１．０μＭのＦＣＣＰ（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で処理し、最後のＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定をその後行った。
【０１０７】
実験の結果を、図６に示す。示したデータは、処理群当たり３つの複製の平均±標準偏差である。
【０１０８】
＜実施例６Ｆ．ＳＫＢＲ−３細胞の代謝能＞
ＳＫＢＲ−３細胞を、２．０×１０４個細胞／ウェルの密度でＸＦｐマイクロプレートに播種した。細胞を、１１ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で２４時間培養した。
【０１０９】
培養培地を、アッセイ培地（ＸＦ基礎培地としてＳｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な、炭酸水素ナトリウムを除いた改変ＤＭＥＭ；１０ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸を補充）で置き換えた。細胞を、アッセイ前にＣＯ２なしのインキュベーター中で、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１１０】
代謝能を、ＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＸＦｐアッセイカートリッジ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。簡潔には、細胞を含有するマイクロプレートをＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ内に入れ、初期ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行った。次いで、処理および対照ウェルを、１．０μＭオリゴマイシン（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で処理した。オリゴマイシン処理後に、中間ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行った。２０分間後に、処理および対照ウェルを、１．０μＭのＦＣＣＰ（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で処理し、最後のＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定をその後行った。
【０１１１】
実験の結果を、図６に示す。示したデータは、処理群当たり３つの複製の平均±標準偏差である。
【０１１２】
［実施例７］
＜Ｃ２Ｃ１２筋管の代謝能に対するエトモキシルの効果＞
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を、１．２×１０４個細胞／ウェルの密度でＸＦｐマイクロプレートに播種した。細胞を、２５ｍＭグルコース、４ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸および１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で２４時間培養した。次いでこの培地を除去し、２５ｍＭグルコース、４ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸および２％ウマ血清を補充したＤＭＥＭから構成される分化培地と置き換え、４日間筋管に分化させた。分化の間、培地を１日おきに新しい分化培地と置き換えた。
【０１１３】
培養培地を、アッセイ培地（ＸＦ基礎培地としてＳｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な、炭酸水素ナトリウムを除いた改変ＤＭＥＭ；１０ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸を補充）で置き換えた。処理した筋管には、４０μＭエトモキシル（カルニチン−パルミトイルトランスフェラーゼ−１の阻害剤、脂肪酸酸化に関係する）を含有する培地を与え、対照筋管にはアッセイ培地を与えた。筋管を、アッセイ前にＣＯ２なしのインキュベーター中で、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１１４】
代謝能を、ＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＸＦｐアッセイカートリッジ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。簡潔には、エトモキシル処理および対照筋管を含有するマイクロプレートをＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ内に入れ、初期ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行う。次いで、処理および対照ウェルを、０．５μＭのＦＣＣＰおよび１．０μＭオリゴマイシン（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で同時に処理し、ＯＣＲならびにＥＣＡＲ測定をその後行った。
【０１１５】
実験の結果を、図７に示す。示したデータは、処理群当たり３つの複製の平均±標準偏差である。これらのデータは、対照筋管と比較してエトモキシルで処理した筋管において好気性代謝能が増加し、解糖代謝能がわずかに低下したことを示す。
【０１１６】
［実施例８］
＜Ｊｕｒｋａｔ細胞の代謝能に対するラパマイシンによる処理の効果＞
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１．０×１０５個細胞／ウェルの密度でＸＦｐマイクロプレートに播種した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は半付着性なので、細胞を各ウェルに添加し、次いでマイクロプレートを３００×ｇで２分間遠心分離してウェル底に細胞を沈ませた。細胞を、ジェネティシン、１１ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０中で２４時間培養した。処理群の細胞を、１０ｎＭラパマイシン（ｍＴＯＲＣ１の阻害剤）を含有する培地中で２４時間培養した。
【０１１７】
培養培地を、アッセイ培地（ＸＦ基礎培地としてＳｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な、炭酸水素ナトリウムを除いた改変ＤＭＥＭ；１０ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸を補充）で置き換えた。細胞を、アッセイ前にＣＯ２なしのインキュベーター中で、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１１８】
代謝能を、ＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＸＦｐアッセイカートリッジ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。簡潔には、ＤＣＡ処理および対照細胞を含有するマイクロプレートをＸＦｐ細胞外フラックスアナライザ内に入れ、初期ＯＣＲおよびＥＣＡＲ測定を行う。次いで、処理および対照ウェルを、０．５μＭのＦＣＣＰおよび１．０μＭオリゴマイシン（アッセイ培地２００μｌ中の終濃度）で同時に処理し、ＯＣＲならびにＥＣＡＲ測定をその後行った。
【０１１９】
実験の結果を、図８に示す。示したデータは、処理群当たり３つの複製の平均±標準偏差である。これらのデータは、Ｊｕｒｋａｔ細胞において、ラパマイシンによる処理が対照と比較して基礎ならびにストレス下ＯＣＲおよびＥＣＡＲレベルを低下させ、好気性代謝能を低下させるが、解糖能をわずかに増加させたことを示す。
【０１２０】
本発明のいくつかの態様が、本明細書に記述および図示されるが、同じ目的を達成するために代替的な態様が当業技術者により実施され得る。したがって、添付の特許請求の範囲は、そのような代替的な態様の全てを本発明の真の精神および範囲に含まれるものとして網羅するものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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