(57)【要約】操作され、修飾されたCry6Aa殺虫性毒素、その毒素をコードするポリヌクレオチド、害虫を制御するためのその毒素の使用、およびその毒素を産生するトランスジェニック植物が開示される。【選択図】図２
2018529652.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾タンパク質分解感受性領域、コアタンパク質に対するカルボキシ末端ペプチド（CTP）の親和性の増加、および細胞内輸送ペプチドの付加からなる群から選択される修飾を含む、修飾Cry6Aa殺虫性タンパク質。
【請求項２】
配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号64、 配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、 配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、 配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号106、配列番号108、配列番号110、配列番号112、配列番号114、 配列番号116、配列番号118、配列番号120、配列番号132、配列番号136、配列番号138、配列番号140、および配列番号144からなる群から選択される、請求項1に記載の修飾Cry6Aa殺虫性タンパク質。
【請求項３】
配列番号110、配列番号112、配列番号114、配列番号116、配列番号118、配列番号120、配列番号128、配列番号132、配列番号140、および配列番号144からなる群から選択される、請求項1に記載の改変Cry6Aa殺虫性タンパク質。
【請求項４】
配列番号116、配列番号118、配列番号120、配列番号140、配列番号144からなる群から選択される、請求項1に記載の修飾Cry6Aa殺虫性タンパク質。
【請求項５】
配列番号116である、請求項1に記載の修飾Cry6Aa殺虫性タンパク質。
【請求項６】
請求項1に記載の修飾Cry6Aa殺虫性タンパク質をコードする核酸配列。
【請求項７】
請求項2に記載の修飾Cry6Aa殺虫性タンパク質をコードする核酸配列。
【請求項８】
請求項3に記載の修飾Cry6Aa殺虫性タンパク質をコードする核酸配列。
【請求項９】
請求項4に記載の修飾Cry6Aa殺虫性タンパク質をコードする核酸配列。
【請求項１０】
請求項5に記載の修飾Cry6Aa殺虫性タンパク質をコードする核酸配列。
【請求項１１】
植物において発現を駆動することができるプロモーターに作用可能に連結された、請求項6に記載の核酸配列を含むDNA構築物。
【請求項１２】
請求項6に記載の核酸配列を含むトランスジェニック植物または植物部位。
【請求項１３】
請求項8に記載の核酸配列を含むトランスジェニック植物または植物部位。
【請求項１４】
前記害虫が前記殺虫性タンパク質を摂取するように、殺虫に有効な量の請求項1に記載の殺虫性タンパク質を送達することを含む、植物に対する害虫被害を制御する方法。
【請求項１５】
前記害虫被害は、鞘翅目の昆虫によって引き起こされる、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記害虫被害は、ウェスタンコーンルートワーム、Diabrotica virgifera virgifera LeConteによって引き起こされる、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
請求項12に記載のトランスジェニック植物を調製することと、前記植物を害虫群に提供することとを含む、植物に対する害虫被害を制御する方法。
【請求項１８】
請求項13に記載のトランスジェニック植物を調製することと、前記植物を害虫群に提供することとを含む、植物に対する害虫被害を制御する方法。
【請求項１９】
前記害虫被害は、鞘翅目の昆虫によって引き起こされる、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記害虫被害は、ウェスタンコーンルートワーム、Diabrotica virgifera virgifera LeConteによって引き起こされる、請求項18に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して農業科学に適用される分子生物学の分野に関する。より具体的には、ある特定の実施形態では、殺虫性タンパク質の発現のための診断プローブおよびテンプレートとしてのDNAセグメントの使用方法に関する。トランスジェニック植物細胞ならびに植物における植物組織保護剤の開発において、請求項に記載された核酸セグメントを作製および使用する方法が開示される。
【背景技術】
【０００２】
昆虫および他の害虫によって、農業従事者は年間何十億ドルもの作物の損失、そして害虫を制御するための出費を被っている。農業生産環境における害虫による損失は、収穫量の減少、作物の品質低下、そして収穫費用の増加、を含む。
【０００３】
鞘翅目は毎年作物に広範な被害を引き起こす、重大な農業害虫のグループである。鞘翅目には以下のような例があるが、これらに限定されない：コロラド歯虫（CPB）、コーンルートワーム、アルファルファタコゾウムシ、ワタミハナゾウムシ、およびマメコガネ。コロラド歯虫は、ジャガイモ、ナス、トマト、トウガラシ、タバコ、および他のナス属の植物の葉を餌とする、経済的に重要な害虫である。コロラド歯虫は、問題のあるジャガイモの食葉性昆虫であって、というのも、部分的には、殺虫剤の多くの種類に耐性を有するようになってきているからである。
【０００４】
ウェスタンコーンルートワーム（WCR：western corn rootworm）、（Diabrotica virgifera virgifera Leconte）は、北米で最も破壊的な鞘翅目のうちの1種であり、米国中西部のトウモロコシを栽培している地域において特に懸案事項となっている。米国のトウモロコシ約930万エーカーが、毎年コーンルートワーム種複合に荒らされる。ノーザンコーンルートワーム（NCR：northern corn rootworm）、（Diabrotica barberi Smith and Lawrence）は、WCRとほぼ同じ地域に共に生息する近縁の種である。米国で多大な影響を与えているジアブロティカ（Diabrotica）の関連亜種は他に数種ある：メキシカンコーンルートワーム（MCR：Mexican corn rootworm）（D.D. virgifera zeae Krysan and Smith）；サザンコーンルートワーム（SCR：southern corn rootworm）（D. undecimpunctata howardiBarber）；D.バルテアタ・ルコンテ（D. balteata LeConte）；D.ウンデシムプンクタタ・テネラ（D. undecimpunctata tenella）；D.スペシオサ・ゲルマール（D. speciose Germar）；及びジュウイチホシウリハムシ（D. u. undecimpunctata Mannerheim）。米国農務省は、コーンルートワームによって毎年10億ドルの収入減が生じていると推測しており、そのうち8億ドルが収穫高の損失、2億ドルが処置のためのコストである。
【０００５】
WCR及びNCRの両方の卵が、夏季に土壌中に産卵される。昆虫は卵期のままで越冬する。幼虫は5月下旬または6月初旬に孵化し、トウモロコシの根を摂食する。コーンルートワームは3つの幼虫齢を経る。数週間、摂食をした後、幼虫は蛹へと脱皮する。コーンルートワームは土壌中で蛹となり、その後、7月と8月に成虫として土壌から出てくる。
【０００６】
トウモロコシのルートワーム被害の大部分は幼虫の摂食によるものである。新たに孵化したルートワームはトウモロコシの細根を最初に食べ始め、根端へと潜り込む。幼虫が大きく成長するにつれ、一次根を食べ、そして潜り込む。コーンルートワームが多くなると、幼虫の摂食によって頻繁に、トウモロコシの茎の根本にまで幅広く根の削り込みが生じる。深刻な根の損傷により、水と栄養素を植物へと移送する根の能力が損なわれ、植物の生育が低下し、穀物生産高の低下が生じ、多くの場合、その結果として全生産高の劇的な低下が生じる。また深刻な根の損傷は多くの場合、トウモロコシ植物の倒伏が生じ、そのために収穫がより困難となり、さらには生産高の低下も生じる。また、成虫がトウモロコシの生殖組織を食べることにより、穂先の絹糸の削り込みが生じる場合もある。もし花粉飛散期間にこの「毛の刈り取り」が充分に深刻なものであった場合、受粉が妨害されてしまう可能性がある。加えて、Diabrotica属の種は、家庭菜園で成長しているそれらと同様に、商業生産中のウリ科の作物（キュウリ、メロン、スクアッシュ、など）及び多くの野菜と作物をも攻撃する。
【０００７】
輪作、化学殺虫剤、例えば芽胞形成グラム陽性菌、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis（B.t.））、Bt毒素を発現するトランスジェニック植物、又はそれらの組み合わせなどのバイオ農薬により、コーンルートワームの制御が試みられてきた。輪作は、農地用途に望ましくない制限をかけるという不利益に悩まされる。さらに、一部のルートワーム種は大豆農地にも産卵するため、トウモロコシと大豆で輪作を行った場合の効果は損なわれる。
【０００８】
化学殺虫剤がコーンルートワームの制御の実現に関し、最も信頼されている戦略である。化学殺虫剤の使用は不完全なコーンルートワーム制御戦略である；高密度の幼虫、多雨、及び不適切な殺虫剤の散布はすべて、不十分なコーンルートワームの制御を生じさせる場合がある。さらに、殺虫剤の継続的な使用によって殺虫剤耐性のルートワーム株が選択され、ならびに非標的種に対する毒性が原因となり深刻な環境問題が生じる場合がある。
【０００９】
線形動物により引き起こされる被害はまた、一般的かつ深刻な経済問題である。線形動物は、多くの植物の種に広範かつ深刻な被害を与える。多くの線形動物の属がそのような被害を引き起こすことが知られている。植物寄生性の線形動物は、無大節ぜん虫、ハリセンチュウ（Tylenchida)目、ニセハリセンチュウ（Dorylaimide）目の仲間を含む。ハリセンチュウ（Tylenchida)目において、植物寄生性の線形動物は二つの上科に見出される：ハリセンチュウ上科およびワセンチュウ上科（Criconematoidea）。10万以上の記載された線形動物の種が存在する。
【００１０】
化学殺虫剤は効果的な害虫制御の方法を提供してきたが、世間は食品、地下水、および環境における残留化学物質の量を懸念するようになってきた。化学殺虫剤の使用への厳格な新しい規制及び一部の効果的な殺虫剤の市場からの消失は、犠牲の大きな害虫を制御するための経済的かつ効果的な選択肢を制限し得る。したがって、新たな害虫制御剤及び組成物を特定することが、喫緊のニーズである。
【００１１】
望まない害虫の制御のための化学殺虫剤の常用により、化学物質耐性の株を選択し得る。化学物質耐性は経済的に重要な昆虫の多くの種において発生し、また羊、ヤギ、馬の線形動物においても発生している。例えば、線形動物の制御の受容された手法は、薬物ベンズイミダゾールとその同類物を中心としている。これらの薬剤の広範囲での使用が、線虫群の間に多くの耐性化の例をもたらす結果となっている（Prichard, R.K.ら）。殺虫剤耐性の発達により、異なる作用機序を有する新たな防除剤の継続した模索が必要となる。
【００１２】
現時点では、感染しやすい宿主や作物への甚大な被害を引き起こす、多くの鞘翅目および線形動物を制御する、より有効な手法に対するニーズが存在する。有利には、そういった有益な手法は高度に選択的な生物学的毒素を採用する。いくつかのBt Cryタンパク質が殺線虫性だと示されており、これらの中にはCry5B、Cry6A、Cry14A、およびCry21Aを含む。（Weiら、2003年；Aroian及びLi（2010））
【００１３】
B.t.は、デルタエンドトキシンまたはCryタンパク質として知られる結晶性殺虫性タンパク質を生成する土壌伝播性の細菌である。Cryタンパク質は、感染しやすい昆虫の中腸細胞に作用することにより機能する経口中毒性物質である。一部のCrｙ毒素は線形動物に対する活性を持つことが示されてきた。デルタエンドトキシンンの広範なリストは、Neil Crickmoreにより管理されるバチルス・チューリンゲンシス毒素学名（Bacillus thuringiensis Toxin Nomenclature）のウェブサイトにおいて、保持され、および定期的に更新される。（http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/toxins2.html およびCrickmoreら 1998、p.808 を参照のこと）Cry1B、Cry1I、Cry2A、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A、およびCyt2Cのメンバーを含むCry毒素（Frankenhuyzen、2009）のファミリーは、鞘翅目害虫に対する殺虫活性を有する。
【００１４】
コーンルートワームおよび他の鞘翅目に対して活性の一部のB.t. 毒素が現在知られている。Cry6Aaは鞘翅目および線形動物害虫に対する報告された活性を有する（米国特許第5,186,934号、米国特許第6,632,792号B2、米国特許第2011/0225681号、米国特許第2011/0239334A1号、およびWeiら、2003）例えば、米国特許出願第4,849,217号は、アルファルファタコゾウムシに対する活性を有するとして、PS52A1及びPS86A1を含む様々な単離株を開示している。米国特許第5,208,017号は、ウェスタンコーンルートワームに対する活性を有するとして、PS86A1を開示している。米国特許第5,427,786号及び5,186,934号は、それぞれ、鞘翅目に対して有効なB.t.単離株及び毒素を開示している。これらの特許において特に開示されるのは、PS86A1として知られる単利株、及び86A1として知られるものから入手可能な鞘翅目に対して有効な毒素である。毒素86A1は現在Cry6A（CryVIA）として知られている。野生型Cry6Aa毒素は、約54.1 kDaである。Cry6B毒素もまた知られている。この毒素は、PS69D1単離株から入手可能である。Cry6Aaはウェスタンコーンルートワームに対する新規の作用機序として認識され、Cry3Aa及びCry34Ab1/Cry35Ab1（Liら、2013）を補足して、統合された害虫耐性管理プログラム（米国特許第2013/0167269A1号、及び米国特許第2013/0263331A1号）におけるピラミッドパートナーとしている。
【００１５】
全長のCry6A及びCry6B毒素は、線形動物に対する活性を有することが知られている。PS69D1単離株は、線形動物に対する活性を有すると報告されている。（米国特許第4,948,734号；第5,093,120号；第5,262,399号；及び第5,439,881号）CryVI毒素のアミノ酸配列の一般式が国際特許第92/19739号において開示されており、また全長の毒素は線形動物に対する活性を有することを教示している。PS52A1及びPS69D1の単離株がそこに開示される。米国特許第5,262,159号及び第5,468,636号はまた、アブラムシに対する活性を有する毒素の一般式も開示する。
【００１６】
Cry6A毒素は、特定の鞘翅目の成長を阻害し、及び酵素的に切断をすることで活性化し、ウェスタンコーンワーム（米国特許第6,831,062号B2）などの鞘翅目に致命的なアミノ末端コア毒素を産生し得る。加えて、短縮（truncated）Cry6Aは、線形動物に対して有効である。米国特許第6,831,062は、Cry6A短縮ホロ毒素と融合タンパク質と融合遺伝子について記載している。Thompsonらは、切断部位によって残基12-390及び12-443であると特定される殺虫的に有効なペプチド断片を開示している。トリプシンまたは他のタンパク質消化から生じる、おおよそ残基12-390または12-443からの大きな断片は、コア断片または毒素と称される。Cry6Aaのトリプシン処理は、組み換え型B.t.から産生され、WCRに対する活性が増大される。（米国特許第5,874,288号；米国特許第6,831,062号B2；及び米国特許第6,303,364号B1）
【００１７】
現在配備される、トランスジェニック植物におけるCryタンパク質の生成は、上記に述べた害虫からの強力な保護をもたらし得、それにより穀物収量を保護し、成虫の害虫が人工的な感染試験で出現しているが、決して完全な幼虫の害虫制御であるとはいえないことを示唆している。加えて、耐性化した害虫群の発達が、害虫制御におけるCryタンパク質の長期耐久性を脅かしている。鞘翅目害虫はCryタンパク質に対して圃場で耐性を獲得してきている。（Gassmanら、PLoS ONE 2011年7月、第6巻、第7号、e22629）害虫のB.t.に対する耐性 Cryタンパク質はいくつかの機構を通して発達し得る。（Heckelら、2007、Pigott及びEllar、2007）Cryタンパク質のための複数の受容体タンパク質のクラスが害虫において特定されてきており、及び複数の例が各受容体クラスに存在する。例えば、受容体タンパク質のカドヘリンドメインの毒素結合部分内での突然変異によって、特定のCryタンパク質への耐性が発達され得る。さらなる耐性化の手段が、タンパク質処理プロテアーゼを通して媒介され得る。
【００１８】
B.t.株で自然に発現されるネイティブCry6AaがWCR及びある線形動物に対して高い効果を示す一方、有効な植物組織保護剤としての用途は、植物細胞で発現されるときのタンパク質分解への感受性のために、行われていない。したがって、Cry6Aをエンジニアリングして、植物細胞で発現されたとき、よりタンパク質分解に耐性であるようにすることは、植物組織保護剤として、組み換え植物、特にトウモロコシにおける使用のために非常に望ましいと考えられる。
【発明の概要】
【００１９】
本発明は、部分的には、重要なカルボキシ末端ペプチド（CTP）の損失を制限するよう設計された、変異体及びアナログを含む、操作されたCry6Aをベースとした殺虫性タンパク質毒素、を含む。本発明の他の実施形態は、請求項に記載された殺虫性毒素をコードする核酸、請求項に記載された核酸配列から発現される毒素を使用して害虫を制御する方法、そのような核酸を含むトランスジェニック宿主細胞、及びトランスジェニック植物種子において毒素を生成する方法、及び毒素を発現する植物、を含む。
【００２０】
本発明の修飾Cry6Aa殺虫性タンパク質は、修飾タンパク質分解感受性領域（配列番号1の残基390−451）、コアタンパク質のCTPのアフィニティ増加、及び細胞内の輸送ペプチドの添加の群から選択される修飾を含む。Cry6Aa変異体殺虫性タンパク質の好ましい群は、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号106、配列番号108、配列番号110、配列番号112、配列番号114、配列番号116、配列番号118、配列番号120、配列番号132、配列番号136、配列番号138、及び配列番号140である。変異体のより好ましい群は、配列番号110、配列番号112、配列番号114、配列番号116、配列番号118、配列番号120、配列番号128、配列番号132、及び配列番号144である。変異体のより強く好ましい群は、配列番号110、配列番号116、配列番号118、配列番号120、配列番号132である。変異体のさらに好ましい群は、配列番号116、配列番号118、配列番号120である。そして最も好ましい変異体は、配列番号116である。
【００２１】
Cry6Aa変異体殺虫性タンパク質をコードする核酸配列の好ましい群は、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号91、配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号119、配列番号131、配列番号135、配列番号137、配列番号139、配列番号141、配列番号142、及び配列番号143である。核酸のより好ましい群は、配列番号109、配列番号111、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号119、配列番号127、及び配列番号131である。核酸のより強く好ましい群は、配列番号109、配列番号115、配列番号117、配列番号119、配列番号131、及び139である。核酸のさらに好ましい群は、配列番号115、配列番号117、配列番号119、及び配列番号139である。そして最も好ましい核酸は、配列番号115である。
【００２２】
他の実施形態では、本発明は、本明細書に開示される操作されたCry6Aa殺虫性ポリペプチドを含む植物を提供する。
【００２３】
他の実施形態では、本発明は、害虫が殺虫性タンパク質を摂取するように植物組織に本発明の殺虫性タンパク質の殺虫的有効量を送達することにより、害虫群と植物への被害を制御するための方法を提供する。
【００２４】
他の実施形態では、本発明は、本明細書に開示される操作されたCry6Aa殺虫性ポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。
【００２５】
他の実施形態では、本発明は、植物における発現を促進可能なプロモーターと作用可能に連結される操作されたCry6Aa殺虫性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及びメッセンジャーRNAを安定化する他の調節配列、を含むDNA構築物を提供する。プロモーターは、B.t.に対して異種または天然であって良い。
【００２６】
本発明はまた、そのゲノムに安定に組み込まれるDNA構築物を含むトランスジェニック植物及び前述の植物へ構築物を導入することを含む、害虫から植物を守るための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図1は、実施例3で記載されるように、試験されたDIG-177（Cry6Aa）の試料1〜4の模式図である。この模式図は、ジスルフィド結合還元の有無別のトリプシン消化後の試料を示す。
【図２】図2は、配列番号2の残基12-125、128-387及び445-472を表すトリプシン処理されたDIG-177（Cry6Aa）（左）のリボン3Ｄ構造モデルである。図2（右）は、トリプシン処理された構造（左）から失われている残基が模式化された、配列番号2の残基12‐472のリボンモデルである。両方の構造におけるカルボキシ末端ペプチドは、黒色で示される。
【図３】図3は、残基12-472（左、図2より）と変異体DIG-1000（右）の構造モデルの比較を描写したものである。カルボキシ末端ペプチド（CTP）は左側に黒色で示され、CTPおよび操作されたリンカーはDIG-1000（右）において黒色で示される。
【図４】図4は、実施例10に記載された条件下、プロテイナーゼＫで処理されたDIG-177及びDIG-1000のSDS-PAGE分析を示す。ＦＬは、未処理、未消化の全長タンパク質を指し、0〜50はインキュベーション時間を分で表している。
【図５】図5は、Cry6Aaタンパク質のウェスタンブロッティングを用いたトウモロコシの一過性発現分析を示す。抗血清がDIG-177、Cry6Aaのために特に使用された。衝撃後プラスミドDNAによりコードされたタンパク質が記録された：レーン1、蛍光分子量マーカー（ペンシルバニア州ピッツバーグ ＧＥヘルスケア）；レーン2、非ボンバード胚制御；レーン3、TraP8によるDIG-177；レーン4、DIG-177；レーン5、DIG-1000；レーン6、TraP8によるDIG-1000；レーン7、PAT（陰性対照）；レーン8、YFP（陰性対照）；レーン9、DIG-177標準 0.5ng/レーン；レーン10、DIG-1000標準 1ng/レーン。
【図６】図6は、Ｔ1トウモロコシの葉の発現についてのウェスタンブロッティング実験の結果を示す。
【００２８】
配列の簡単な説明
配列番号1は、全長DIG-177（Cry6Aa）を含むDNA配列である。
配列番号2は、推定DIG-177タンパク質配列である。
配列番号3は、DIG-177の最適化バージョンのトウモロコシコドンであり、IRDIG.522.28としても知られ、配列番号2と特定されるタンパク質をコードする。
配列番号4は、コードされたミトコンドリア輸送ペプチドによる、DIG-177のバイアスバージョンのトウモロコシコドンであり、IRDIG.552.60としても知られる。
配列番号5は、配列番号4によってコードされたポリペプチドである。
配列番号6は、コードされたミトコンドリア輸送ペプチドによる、DIG-177の最適化バージョンのトウモロコシコドンであり、IRDIG.552.61としても知られる。
配列番号7は、配列番号6によってコードされたポリペプチドである。
配列番号8は、コードされたミトコンドリア及び葉緑体輸送ペプチドの組合せによる、DIG-177の最適化バージョンのトウモロコシコドンであり、IRDIG.552.62としても知られる。
配列番号9は、配列番号8によってコードされたポリペプチドである。
配列番号10は、コードされたペルオキシソーム輸送ペプチドによる、DIG-177の最適化バージョンのトウモロコシコドンであり、IRDIG.552.63としても知られる。
配列番号11は、配列番号10によってコードされたポリペプチドである。
配列番号12は、コードされたペルオキシソーム輸送ペプチドによる、DIG-177の最適化バージョンのトウモロコシコドンであり、IRDIG.552.64としても知られる。
配列番号13は、配列番号12によってコードされたポリペプチドである。
配列番号14は、コードされたペルオキシソーム輸送ペプチドによる、DIG-177の最適化バージョンのトウモロコシコドンであり、IRDIG.552.65としても知られる。
配列番号15は、配列番号14によってコードされたポリペプチドである。
配列番号16は、コードされた空胞輸送ペプチドによる、DIG-177の最適化バージョンのトウモロコシコドンであり、IRDIG.552.66としても知られる。
配列番号17は、配列番号16によってコードされたポリペプチドである。
配列番号18は、コードされた空胞輸送ペプチドによる、DIG-177の最適化バージョンのトウモロコシコドンであり、IRDIG.552.67としても知られる。
配列番号19は、配列番号18によってコードされたポリペプチドである。
配列番号20は、コードされた空胞輸送ペプチドによる、DIG-177の最適化バージョンのトウモロコシコドンであり、IRDIG.552.68としても知られる。
配列番号21は、配列番号20によってコードされたポリペプチドである。
配列番号22は、コードされたアポプラスト輸送ペプチドによる、DIG-177の最適化バージョンのトウモロコシコドンであり、IRDIG.552.69としても知られる。
配列番号23は、配列番号22によってコードされたポリペプチドである。
配列番号24は、コードされた小胞体輸送ペプチドによる、DIG-177の最適化バージョンのトウモロコシコドンであり、IRDIG.552.70としても知られる。
配列番号25は、配列番号24によってコードされたポリペプチドである。
配列番号26は、コードされた核輸送ペプチドによる、DIG-177の最適化バージョンのトウモロコシコドンであり、IRDIG.552.71としても知られる。
配列番号27は、配列番号26によってコードされたポリペプチドである。
配列番号28は、コードされた核輸送ペプチドによる、DIG-177の最適化バージョンのトウモロコシコドンであり、IRDIG.552.72としても知られる。
配列番号29は、配列番号28によってコードされたポリペプチドである。
配列番号30は、コードされた葉緑体輸送ペプチドによる、DIG-177の最適化バージョンのトウモロコシコドンであり、IRDIG.552.73としても知られる。
配列番号31は、配列番号30によってコードされたポリペプチドである。
配列番号32は、コードされた葉緑体輸送ペプチドによる、DIG-177の最適化バージョンのトウモロコシコドンであり、IRDIG.552.74としても知られる。
配列番号33は、配列番号32によってコードされたポリペプチドである。
配列番号34は、突然変異C88>Aをコードする、DIG-177コード配列であり、DIG-614としても知られる。
配列番号35は、配列番号34によってコードされたポリペプチドである。
配列番号36は、突然変異C88>Sをコードする、DIG-177コード配列であり、DIG-615としても知られる。
配列番号37は、配列番号36によってコードされたポリペプチドである。
配列番号38は、突然変異C162>Aをコードする、DIG-177コード配列であり、DIG-616としても知られる。
配列番号39は、配列番号38によってコードされたポリペプチドである。
配列番号40は、突然変異C162>Sをコードする、DIG-177コード配列であり、DIG-617としても知られる。
配列番号41は、配列番号40によってコードされたポリペプチドである。
配列番号42は、突然変異C451>Aをコードする、DIG-177コード配列であり、DIG-618としても知られる。
配列番号43は、配列番号42によってコードされたポリペプチドである。
配列番号44は、突然変異C451>Sをコードする、DIG-177コード配列であり、DIG-619としても知られる。
配列番号45は、配列番号44によってコードされたポリペプチドである。
配列番号46は、突然変異C88>S及びC451>Sをコードする、DIG-177コード配列であり、DIG-983としても知られる。
配列番号47は、配列番号46によってコードされたポリペプチドである。
配列番号48は、突然変異C88>A及びC451>Aをコードする、DIG-177コード配列であり、DIG-984としても知られる。
配列番号49は、配列番号48によってコードされたポリペプチドである。
配列番号50は、ＬＦ（ラージフラグメント）であり、配列番号2のアミノ酸12-390である。
配列番号51は、CTP 1（カルボキシ末端ペプチド1）であり、配列番号2のアミノ酸444-475である。
配列番号52は、CTP2（カルボキシ末端ペプチド2）であり、配列番号2のアミノ酸451-475である。
配列番号53は、配列番号2の残基1-443のタンパク質をコードし、DIG-137としても知られる。
配列番号54は、配列番号53によってコードされたポリペプチドである。
配列番号55は、配列番号2の残基1-432のタンパク質をコードし、DIG-138としても知られる。
配列番号56は、配列番号55によってコードされたポリペプチドである。
配列番号57は、配列番号2の残基1-423のタンパク質をコードし、DIG-147としても知られる。
配列番号58は、配列番号57によってコードされたポリペプチドである。
配列番号59は、配列番号2の残基1-400のタンパク質をコードし、DIG-148としても知られる。
配列番号60は、配列番号59によってコードされたポリペプチドである。
配列番号61は、配列番号2の残基1-390のタンパク質をコードし、DIG-149としても知られる。
配列番号62は、配列番号61によってコードされたポリペプチドである。
配列番号63は、配列番号2のアミノ酸残基391-395のために消失したタンパク質をコードし、DIG-921として知られる。
配列番号64は、配列番号63によってコードされたポリペプチドである。
配列番号65は、配列番号2のアミノ酸残基396-400のために消失したタンパク質をコードし、DIG-922として知られる。
配列番号66は、配列番号65によってコードされたポリペプチドである。
配列番号67は、配列番号2のアミノ酸残基401-405のために消失したタンパク質をコードし、DIG-923として知られる。
配列番号68は、配列番号67によってコードされたポリペプチドである。
配列番号69は、配列番号2のアミノ酸残基406-410のために消失したタンパク質をコードし、DIG-924として知られる。
配列番号70は、配列番号69によってコードされたポリペプチドである。
配列番号71は、配列番号2のアミノ酸残基406-410のために消失したタンパク質をコードし、DIG-925として知られる。
配列番号72は、配列番号71によってコードされたポリペプチドである。
配列番号73は、配列番号2のアミノ酸残基416-420のために消失したタンパク質をコードし、DIG-926として知られる。
配列番号74は、配列番号73によってコードされたポリペプチドである。
配列番号75は、配列番号2のアミノ酸残基421-425のために消失したタンパク質をコードし、DIG-927として知られる。
配列番号76は、配列番号75によってコードされたポリペプチドである。
配列番号77は、配列番号2のアミノ酸残基441-445のために消失したタンパク質をコードし、DIG-931として知られる。
配列番号78は、配列番号77によってコードされたポリペプチドである。
配列番号79は、配列番号2のアミノ酸残基391-400のために消失したタンパク質をコードし、DIG-969として知られる。
配列番号80は、配列番号79によってコードされたポリペプチドである。
配列番号81は、配列番号2のアミノ酸残基401-410のために消失したタンパク質をコードし、DIG-970として知られる。
配列番号82は、配列番号81によってコードされたポリペプチドである。
配列番号83は、配列番号2のアミノ酸残基411-420のために消失したタンパク質をコードし、DIG-971として知られる。
配列番号84は、配列番号83によってコードされたポリペプチドである。
配列番号85は、配列番号2のアミノ酸残基421-430のために消失したタンパク質をコードし、DIG-972として知られる。
配列番号86は、配列番号85によってコードされたポリペプチドである。
配列番号87は、配列番号2のアミノ酸残基431-440のために消失したタンパク質をコードし、DIG-973として知られる。
配列番号88は、配列番号87によってコードされたポリペプチドである。
配列番号89は、配列番号2のアミノ酸残基391-405のために消失したタンパク質をコードし、DIG-985として知られる。
配列番号90は、配列番号89によってコードされたポリペプチドである。
配列番号91は、配列番号2のアミノ酸残基406-420のために消失したタンパク質をコードし、DIG-986として知られる。
配列番号92は、配列番号91によってコードされたポリペプチドである。
配列番号93は、配列番号2のアミノ酸残基421-435のために消失したタンパク質をコードし、DIG-987として知られる。
配列番号94は、配列番号93によってコードされたポリペプチドである。
配列番号95は、配列番号2のアミノ酸残基429-443のために消失したタンパク質をコードし、DIG-988として知られる。
配列番号96は、配列番号95によってコードされたポリペプチドである。
配列番号97は、配列番号2のアミノ酸残基391-410のために消失したタンパク質をコードし、DIG-989として知られる。
配列番号98は、配列番号97によってコードされたポリペプチドである。
配列番号99は、配列番号2のアミノ酸残基411-430のために消失したタンパク質をコードし、DIG-990として知られる。
配列番号100は、配列番号99によってコードされたポリペプチドである。
配列番号101は、配列番号2のアミノ酸残基424-443のために消失したタンパク質をコードし、DIG-991として知られる。
配列番号102は、配列番号101によってコードされたポリペプチドである。
配列番号103は、配列番号2のアミノ酸残基391-415のために消失したタンパク質をコードし、DIG-992として知られる。
配列番号104は、配列番号103によってコードされたポリペプチドである。
配列番号105は、配列番号2のアミノ酸残基415-440のために消失したタンパク質をコードし、DIG-993として知られる。
配列番号106は、配列番号105によってコードされたポリペプチドである。
配列番号107は、配列番号2のアミノ酸残基419-443のために消失したタンパク質をコードし、DIG-994として知られる。
配列番号108は、配列番号107によってコードされたポリペプチドである。
配列番号109は、配列番号2のアミノ酸残基401-443のために消失したタンパク質をコードし、DIG-995として知られる。
配列番号110は、配列番号109によってコードされたポリペプチドである。
配列番号111は、配列番号2のアミノ酸残基391-433のために消失したタンパク質をコードし、DIG-996して知られる。
配列番号112は、配列番号111によってコードされたポリペプチドである。
配列番号113は、配列番号2のアミノ酸残基391-414及び425-443のために消失したタンパク質をコードし、DIG-997として知られる。
配列番号114は、配列番号113によってコードされたポリペプチドである。
配列番号115は、プロテアーゼ感受性セグメントのペプチドリンカー置換によりDIG-177変異体をコードし、DIG-1000としても知られる。
配列番号116は、配列番号115によってコードされたポリペプチドである。
配列番号117は、プロテアーゼ感受性セグメントのペプチドリンカー置換によりDIG-177変異体をコードし、DIG-1049としても知られる。
配列番号118は、配列番号117によってコードされたポリペプチドである。
配列番号119は、プロテアーゼ感受性セグメントのペプチドリンカー置換によりDIG-177変異体をコードし、DIG-1052としても知られる。
配列番号120は、配列番号119によってコードされたポリペプチドである。
配列番号121は、プロテアーゼ感受性セグメントのペプチドリンカー置換によりDIG-177変異体をコードし、DIG-1038としても知られる。
配列番号122は、配列番号121によってコードされたポリペプチドである。
配列番号123は、プロテアーゼ感受性セグメントのペプチドリンカー置換によりDIG-177変異体をコードし、DIG-1055としても知られる。
配列番号124は、配列番号123によってコードされたポリペプチドである。
配列番号125は、プロテアーゼ感受性セグメントのペプチドリンカー置換によりDIG-177変異体をコードし、DIG-1039としても知られる。
配列番号126は、配列番号125によってコードされたポリペプチドである。
配列番号127は、プロテアーゼ感受性セグメントのペプチドリンカー置換によりDIG-177変異体をコードし、DIG-1056としても知られる。
配列番号128は、配列番号127によってコードされたポリペプチドである。
配列番号129は、プロテアーゼ感受性セグメントのペプチドリンカー置換によりDIG-177変異体をコードし、DIG-1040としても知られる。
配列番号130は、配列番号129によってコードされたポリペプチドである。
配列番号131は、プロテアーゼ感受性セグメントのペプチドリンカー置換によりDIG-177変異体をコードし、DIG-1057としても知られる。
配列番号132は、配列番号131によってコードされたポリペプチドである。
配列番号133は、プロテアーゼ感受性セグメントのペプチドリンカー置換によりDIG-177変異体をコードし、DIG-1041としても知られる。
配列番号134は、配列番号133によってコードされたポリペプチドである。
配列番号135は、プロテアーゼ感受性セグメントのペプチドリンカー置換によりDIG-177変異体をコードし、DIG-1058としても知られる。
配列番号136は、配列番号135によってコードされたポリペプチドである。
配列番号137は、DIG-1000のバイアスバージョンのトウモロコシコドンである。
配列番号138は、配列番号137によってコードされたポリペプチドである。
配列番号139は、葉緑体輸送ペプチドによる、DIG-1000のバイアスバージョンのトウモロコシコドンである。
配列番号140は、配列番号139によってコードされたポリペプチドである。
配列番号141は、DIG-1036のバイアスバージョンのトウモロコシコドンである。
配列番号142は、ＥＲ局在化配列による最高GC+ERLSトウモロコシ最高ＧＣバージョンのDIG-1036である。
配列番号143は、空胞局在化配列による最高GC+VLSトウモロコシ最高GCバージョンのDIG-1036である。
配列番号144は、DIG-1036によってコードされたポリペプチドである（DIG-1000マイナスグリコシル化部位：N69>Q; N144>Q; N403>Q; N409>Q）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、植物細胞において生成されるCry6A毒素に対する、タンパク質分解ダメージの源及び標的部位を発見するように設計された、タンパク質エンジニアリング研究の結果である。Cry6Aaトリプシン消化結晶構造の判定を含めた、高解析分析、が完成された。この研究によりいくつかのCry6Aa殺虫性タンパク質がいかに機能するかについての驚くべき分子詳細が開示された。
【００３０】
これらの発見において、Cry6Aaは構造同一性に基づくタンパク質のαらせん状ヘモリジン群に属するものと判定され、このグループの他のメンバーにはHlyE及びBLB-B（Eiflerら、2006、Tzokovら、2006、Wallaceら、2000、Muellerら、2009、Madegowdaら、2008）を含む。
【００３１】
システイン残基88と451の間、及びシステイン402-404の間の二つのジスルフィド結合が同定された。最も驚くべきことは、これらのジスルフィド結合は、人工的食餌ベースのWCRバイオアッセイにおいて、全長Cry6Aaの殺虫活性には必要とされないことであった。
【００３２】
第三の発見は、トリプシン処理毒素の殺虫活性に関するものである。残基444-475または451-475のいずれかから成るカルボキシ末端ペプチド（CTP）が、コア毒素断片にジスルフィド結合されることが発見され、活性に必要とされることが発見された。CTPの小さなサイズ及びジスルフィド結合の不安定な性質は、それが今まで特定されなかったことの理由となると考えられる。（米国特許第5,874,288号、米国特許第6,831,062号、米国特許第6,303,364号）
【００３３】
植物（植物導入保護剤）における頑健なトランスジェニック特性としてのCry6Aaの有用性とは、特にWCRに対する保護であり、活性殺虫性タンパク質の細胞内蓄積に依拠する。植物細胞中など還元性環境での残基390-451の間のタンパク質切断は、カルボキシ末端ペプチドの分離を引き起こし殺虫活性の消失をもたらすと考えられている。
【００３４】
植物発現Cry6Aa毒素の殺虫活性の消失を防ぐいくつかの手段が、この発明の基礎を成している。そのような手段は、例えば残基およそ390-451の間の領域など、対象毒素の感受性領域におけるタンパク質分解を減少させること、もしくは、必要なCTPの溶解を最小化することのいずれかから成り、そして単独でまたは組合せで使用され得る。それらは下記の通り：
1.感受性領域を短縮してプロテアーゼに対する感受性を低くすることを含むプロテアーゼによって認識されないように、感受性領域のアミノ酸一次構造を再設計する。
2.発現したCry6Aa毒素を、プロテアーゼにアクセス不能な細胞内または細胞外の区画へと方向転換する。
3.対象毒素が蓄積する細胞環境におけるプロテアーゼをダウンレギュレートするまたは阻害する。
4.発現されたCry6Aaを小胞体に方向転換することにより、CTPのコアタンパク質との関連を維持し、コアCTPジスルフィド結合が残ったままとする。このような状況において、Cry6Aaタンパク質はタンパク質分解に続いて殺虫活性を保持する。
5.タンパク質分解が起こったとき、タンパク質エンジニアリングを通して、コアタンパク質とCTPの間のアフィニティを増加する。このような手段は、タンパク質エンジニアリングの当業者において公知であり、コアとCTPポリペプチドの間の水素結合をエンジニアリングすることを含む。他の方法は、非共有連結されたペプチドの間の塩橋においてエンジニアリングすることである。第三の手段は、CTPとコアタンパク質の間の疎水性相互作用をエンジニアリングすることである。第四の手段は、還元に対する感受性が低くなるように新規または既存のジスルフィド結合をエンジニアリングすることである。
【００３５】
「単離された（isolated）」とは、ヌクレオチドまたはポリペプチド分子がそれらのネイティブ環境から除去され、人の手により異なる環境に置かれたことを意味する。したがって、単離されたヌクレオチド及びポリペプチド分子は、精製された、濃縮された、またはBacillus thuringiensis 細胞形質成分を実質的に含まないようにされた、DNAまたはタンパク質分子を含む。単離された操作されたCry6Aa殺虫性ポリペプチドまたはヌクレオチド分子の実施形態は、（乾燥重量で）約30％未満、約20％未満、約10％未満、約9％未満、約8％未満、約7％未満、約6％未満、約5％未満、約4％未満、約3％未満、約2％未満、約1％未満の混入タンパク質（例えば、Bacillus thuringiensisから）を有する。単離された操作されたCry6Aa殺虫性ポリペプチドまたはヌクレオチドの実施形態が組み換えで生成される場合、培地材料、化学前駆体、及び／または操作されていないCry6Aa殺虫性ポリペプチドまたはヌクレオチドは、（乾燥重量で）約30％未満、約20％未満、約10％未満、約5％未満、約4％未満、約3％未満、約2％未満、約1％未満の単離された操作されたCry6Aa殺虫性ポリペプチドまたはヌクレオチドを示す。
【００３６】
Ｃｒy6Aa及び変異体は、その有効性とユニークな配列及び構造同一性によって、Cry34Ab1/Cry35Ab及び他のコーンルートワーム殺虫剤の潜在的なピラミッドパートナーである。加えて、それらは、Cry34Ab1/Cry35Ab1またはCry3Aaを有するWCRブラッシュボーダー膜小胞上の結合部位について競合しない。（Ｌｉら、2013）サイトゾルにおいてCry6Aaを発現するトランスジェニック植物は有効であり、分析によれば、実施例3の記載と同様に、タンパク質はタンパク質分解処理及び潜在的な不活性化に対して感受性であることが示される。タンパク質分解を制限する一つの戦略は、実施例1の記載の通り、組み換えタンパク質を細胞内区画（Benchabaneによるレビュー、2008）に向けることである。タンパク質分解及び潜在的な不活性化を制限する他の戦略は、タンパク質エンジニアリングを通して行われる。
【００３７】
操作されたCry6Aa殺虫性毒素  本発明は、殺虫活性操作されたCry6Aaその変異体を含む。用語「変異体（variant）」は、断片、特定の欠失及び挿入変異株、置換、及び特定の融合またはキメラタンパク質を含むことを意図している。
【００３８】
本発明は、配列番号2のアミノ酸1〜475と90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一な毒素セグメントを有するDIG-177殺虫性タンパク質変異体を含む。ランダムな変異または変異体を作ることによって形成され得る変異体が設計され得る。設計された突然変異体の場合、生物学的活性を説明する毒素の重要な領域にアミノ酸同一性が維持される場合、または最終的に生物学的活性の原因となる3次元構造の決定に関与する場合には、天然毒素と類似の活性を有する変異体を生成する可能性が高い。置換が保存的である場合、活性が保持される可能性が高い。アミノ酸は、非極性、非荷電極性、塩基性、及び酸性のクラスに置かれ得る。一つのクラスのアミノ酸が他のいずれかのタイプのアミノ酸と入れ替わる保存的置換は、変異体の生物活性を実質的に変化させる可能性は低い。表1は、各クラスに属すアミノ酸の例のリストを提供する。
【００３９】
表1  アミノ酸の生化学的クラス
【表１】
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【００４０】
非保存的置換もまた行われ得る場合がある。これらの置換が毒素の生物活性を顕著に減じてはならないということが必要不可欠な要因である。変異体は、変異誘発によってアミノ酸配列の異なるポリペプチドを含む。本発明に含まれる変異体タンパク質は生物活性であり、それらは殺虫活性を保持する、ネイティブタンパク質の所望の生物活性を継続して保有する。
【００４１】
変異体タンパク質はまた配列レベルが異なるように設計され得るが、同一またはそれに相同な全体的に必須な三次元的構造、表面電荷分布などを保持する。例えば、米国特許第7058515号；Larsonら（2002）、Stemmer（1994a, 1994b, 1995）及びCrameriら（1996a, 1996b, 1997）米国特許第8,513,492B2号を参照のこと。
【００４２】
核酸  操作されたCry6Aa殺虫性毒素をコードする、単離された核酸及びその補体は本発明の一態様である。用語「単離された（isolated）」は本明細書では上記のように定義される。遺伝子コードの冗長性のため、様々な異なるDNA配列が本明細書で開示されるアミノ酸配列をコードし得る。訓練を受けた当業者であれば、同じまたは本質的に同じ殺虫性タンパク質をコードするこれら代替のDNA配列を制作することができるだろう。
【００４３】
遺伝子人工合成  本明細書に記載される操作されたCry6Aa殺虫性タンパク質をコードする遺伝子は当分野に公知の様々な方法によって作成され得る。例えば、人工合成遺伝子セグメント及び人工合成遺伝子は、亜リン酸トリエステル及びホスホロアミダイト化学物質（Caruthersら、1987）から作成され得、また必要に応じて商業供給業者による遺伝子人工合成も可能である。全長遺伝子は、例えば制限断片のライゲーションまたは重複するオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ連鎖反応アセンブリ（Stewart及びBurgin、2005）などを含む様々な方法でアセンブリされ得る。さらに、端部遺伝子欠失及び追加は、部位特異的末端オリゴヌクレオチドを使用してPCR増幅によりなされる。
【００４４】
操作されたCry6Aa殺虫性タンパク質をコードする核酸は、例えば現在一部の商業供給業者によって実践されている方法による人工合成構築により作成され得る。（例えば、米国特許第7,482,119号）  これらの遺伝子またはタンパク質またはその変異体はまた、例えば遺伝子合成機の使用及び例えば米国特許第5,380,831号の設計方法などにより、人工合成的に構築され得る。あるいは、人工合成または自然的発生遺伝子のバリエーションが、点変異、追加、及び／または欠失を作成するために標準的な分子生物学技術を使用することにより手軽に構築され得る。これらの遺伝子の断片は、標準的な手順に従って、市販されているエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを使用して作成し得る。例えば、Bal31 などの酵素または部位特異的な変異誘発は、これらの遺伝子の末端からヌクレオチドを体系的に切り離すのに使用され得る。また、活性な毒素断片をコードする遺伝子断片は様々な制限酵素を使用して得られる。
【００４５】
操作されたCry6Aa殺虫性タンパク質のためのアミノ酸配列を鑑みると、コードする配列は意図した宿主によって好まれる同義コドンを使用してコード配列を逆翻訳し、そして代替の同義コドンを使用して転写、翻訳、またはmRNA安定性に問題を引き起こし得る配列を除去して配列を精製することにより、設計され得る。さらに、同義コドンは操作されていないCry6Aa読み枠（すなわち、読み枠2、3、4、5及び6）に停止コドンを導入させ偽の長いORFを消去するのに採用され得る。
【００４６】
ポリペプチドまたは核酸配列同一性の定量化  二つのアミノ酸配列または二つの核酸配列の同一性割合はまず最適な比較目的のために配列をアラインすることにより決定される。二つの配列の間の同一性割合は、配列により共有される同一位置の数の関数（すなわち、同一性割合＝同一位置の数／位置の総数（例えば、重複する位置）ｘ100）である。一実施形態において、二つの配列は同じ長さである。二つの配列の間の同一性割合は以下に記載されるものと似た技術を使用して、ギャップ有または無しによって、決定され得る。同一性割合の計算において、通常、完全な一致がカウントされる。
【００４７】
二つの配列の間の同一性割合の決定は、数学的アルゴリズムを使用して完成される。そのようなアルゴリズムの非限定的な例には、Altschulら（1990）、Karlin及びAltschul（1990）、Karlin及びAltschulにおける修正（1993）、そしてBLASTN及びBLASTXプログラムに組み込まれたもの、がある。BLAST は核またはタンパク質データベース内のクエリ配列に相同（相似した）配列を同定するのに便利に使用され得る。BLASTNは本発明の請求項に記載された核酸分子との相同性を有するヌクレオチド配列を同定するために実施され得る（スコア＝100、語長＝12）。BLASTXは本発明の請求項に記載された殺虫性タンパク質分子との相同性を有するアミノ酸配列を同定するために実施され得る（スコア＝50、語長＝3）。
【００４８】
ギャップありBLAST（Altschul ら、1997）は比較目的のためギャップのあるアラインメントを得るために使用され得る。あるいは、PSI-Blastは分子間の類縁関係を検出する反復サーチを実施するために使用され得る（Altschulら、1997）。BLAST、ギャップありBLAST、及びPSI-Blastプログラムを使用するとき、各プログラムのデフォルトのパラメータが使用され得る。www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照のこと。
【００４９】
配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの非限定的な例には、ClustalWアルゴリズム（Thompsonら、1994）がある。ClustalWは、アミノ酸またはDNA配列の全体の配列及びアラインを比較し、したがってアミノ酸配列またはヌクレオチド配列全体の配列保存に関するデータを提供し得る。ClustalWアルゴリズムは、例えばVector NTIプログラムスイート（カリフォルニア州カールスバッド Invitrogen, Inc.）のALIGNXモジュールなど、一部の市販されているDNA／アミノ酸分析ソフトウエアパッケージで使用されている。ALIGNXでアミノ酸配列をアラインするとき、便利には、Gapオープンペナルティ10、Gap伸長ペナルティ0.1、及びblosum63mt2比較マトリックスのデフォルト設定を使用して二つの配列の間のアミノ酸相同性割合（コンセンサス）または同一性を評価し得る。ALIGNXでDNA配列をアラインするとき、便利には、Gapオープンペナルティ15、Gap伸長ペナルティ6.6、及びswgapdnamt比較マトリックスのデフォルト設定を使用して二つの配列の間の同一性割合を評価し得る。
【００５０】
配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの他の非限定的な例には、Myers及びMiller (1988) がある。そのようなアルゴリズムは、wEMBOSS配列アラインメントソフトウエアパッケージ（http://emboss.sourceforge.net/で入手可能）の一部である、wSTRETCHERプログラムに組み込まれる。wSTRETCHERは線形空間を用いたクラシックダイナミックプログラミングアルゴリズムの修正を使用して二つの配列の最適なグローバルアラインメントを計算する。アラインメントを計算するために使用される置換マトリックス、ギャップ挿入ペナルティ、及びギャップ伸長ペナルティが特定され得る。wSTRETCHERプログラムをヌクレオチド配列の比較のために使用するとき、Gapオープンペナルティ16及びGap伸長ペナルティ4がスコアリングマトリックスファイルEDNAFULLとともに使用され得る。アミノ酸配列を比較するために使用されるとき、Gapオープンペナルティ12及びGap伸長ペナルティ2がEBLOSUM62スコアリングマトリックスファイルとともに使用され得る。
【００５１】
配列の比較に使用される数学的アルゴリズムのさらなる非限定的な例には、配列アラインメントソフトウエアパッケージGAPバージョン10及びwNEEDLE（http://emboss.sourceforge.net/）に組み込まれる、Needleman及びWunsch（1970）がある。GAPバージョン10は、次のパラメータを使用して配列同一性または相同性を決定するのに使用され得る：ヌクレオチド配列については、同一性割合と相同性割合がGAPウェイト50及びレングスウエイト3、またnwsgapdna. cmpスコアリングマトリックスを使用して検出される。アミノ酸配列比較については、ＧＡＰウェイト8およびレングスウェイト2、またBLOSUM62スコアリングプログラムを使用して同一性割合または相同性割合が決定される
【００５２】
wNEEDLEは、インプットされた2つの配列を読み取り、それらの全長に沿って最適なアラインメント（ギャップ含む）を検出し、それらの最適なグローバル配列アラインメントをファイルに書き込む。アルゴリズムは、可能性のある各残基またはヌクレオチドの一致の値を含む．ａスコアリングマトリックスを使用して、全ての可能性のあるアラインメントを探索し、最良のものを選択する。ｗＮＥＥＤＬＥは、アラインメントのスコアが、整列させた配列における開始および伸長ギャップから生じるペナルティを差し引いた、スコアリングマトリックスから取られた一致の合計に等しい、最大に可能性のあるスコアを有するアラインメントを検出する。置換マトリックスおよびギャップ開始および伸長ペナルティは、ユーザー指定である。アミノ酸配列を比較する場合、デフォルトのGapオープンペナルティ10、Gap伸長ペナルティ0．5およびEBLOSUM62比較マトリックスを使用する。wNEEDLEを使用してDNA配列を比較する場合、Gapオープンペナルティ10、Gap伸長ペナルティ0．5およびEDNAFULL比較マトリックスを使用する。
【００５３】
同等のプログラムも使用し得る。「同等のプログラム」により、ALIGNX、wNEEDLEまたはwSTRETCHERにより生じる対応するアラインメントと比較すると、問題の任意の2つの配列について、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の一致および同一の配列同一性パーセントを有するアラインメントを生じる、任意の配列比較プログラムが意図される。同一性％は、報告された整列した領域（鎖長における任意のギャップを含む）にわたる、2つの配列間の完全な一致の百分率であり、相同性％は、報告された整列させた領域（鎖長における任意のギャップを含む）にわたる、2つの配列間の一致の百分率である。
【００５４】
アラインメントを目視により手入力で行ってもよい。
【００５５】
組換え宿主  本発明の殺虫性タンパク質コード遺伝子を、多様な微生物、真菌、または植物宿主に導入し得る。殺虫性タンパク質遺伝子を発現させることにより、直接的または間接的に、殺虫性タンパク質の細胞内産生および維持がもたらされる。適切な微生物宿主、例えばシュードモナス属（Pseudomonas）を用いて、微生物を、微生物が増殖し摂食される有害生物環境に対し適用することができる。結果は害虫の制御である。あるいは、殺虫性タンパク質遺伝子を宿す微生物を、タンパク質の活性を延長し、組換え宿主細胞を安定化させる条件下で処理し得る。殺虫活性を保持する本発明の処理された殺虫性ポリペプチドを含む処理細胞は、害虫を制御するために標的害虫の周囲に適用し得る。
【００５６】
B.t.殺虫タンパク質遺伝子を、例えばベクターなど適切なDNA構築物を介して微生物宿主に導入し、その宿主を生きた状態で環境に適用する場合、特定の宿主微生物を使用することが不可欠である。1つまたは複数の対象の作物の「植物圏」（phytosphere）（葉面、葉圏、根圏および／または根面）を占有することが知られている微生物宿主が選択される。これらの微生物は、特定の環境（作物およびその他の昆虫生息地）において野生型の常在性微生物と競合して勝つことができ、ポリペプチド殺虫剤を発現する遺伝子の安定な維持および発現をもたらし、望ましくは、環境による分解および不活性化からの殺虫剤の防御の改善をもたらすように選択される。
【００５７】
多数の微生物が、多様な重要な作物の葉面（植物の葉表面）および／または根圏（植物根を取り巻く土壌）に生息することが知られている。これらの微生物には、細菌、藻類および菌類が含まれる。特に興味深いのは、細菌、例えばシュードモナス（Pseudomonas）、エルウィニア（Erwinia）、セラチア（Serratia）、クレブシエラ（Klebsiella）、キサントモナス（Xanthomonas）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、リゾビウム（Rhizobium）、シノリゾビウム（Sinorhizobium）、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）、メチロフィラス（Methylophilius）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、アセトバクター（Acetobacter）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、アルスロバクター（Arthrobacter）、アゾトバクター（Azotobacter）、ロイコノストック（Leuconostoc）およびアルカリゲネス（Alcaligenes）などの微生物である。特に興味深いのは、植物圏の細菌種、例えばシュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）、ロドシュードモナス・スフェロイデス（Rhodopseudomonas spheroides）、キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）（前リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti））、アルカリゲネス・ユートロファス（Alcaligenes eutrophus）およびアゾトバクター・ビネランジー（Azotobacter vinelandii）などである。さらに興味深いのは、真菌、特に酵母、例えばサッカロミケス（Saccharomyces）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、クルイウェロマイセス（Kluyveromyces）、Sporobolomyces、ロドトルラ（Rhodotorula）、およびアウレオバシジウム（Aureobasidium）などであり、また特に興味深いのは、植物圏の酵母、例えば ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）、ロドトルラ・グルティニス（R. glutinis）、ロドトルラ・マリーナ（R. marina）、ロドトルラ・アウランティアカ（R. aurantiaca）、クリプトコッカス・アルビドゥス（Cryptococcus albidus）、クリプトコッカス・ディフルーエンス（C. diffluens）、クリプトコッカス・ラウレンティ（C. laurentii）などであり、 サッカロミセス・ロゼイ（Saccharomyces rosei）、サッカロミセス・プレトリエンシス（S. pretoriensis）、サッカロミセス・セレビシエ（S.cerevisiae）、スポロボロマイセス・ロセウス（Sporobolomyces roseus）、スポロボロマイセス・オドラス（S. odorus）、クリベロマイセス・ベロネ（Kluyveromyces veronae）、およびアウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pollulans）などである。中でも特に興味深いのは、色素性微生物である。
【００５８】
単離された毒素ポリペプチドおよび本発明の組成物  本発明の操作されたCry6Aa殺虫性毒素ポリペプチドは、例えば製剤化された殺虫組成物を製造するために処理または調製し得る。製剤化された殺虫組成物の例には、タンパク質組成物、噴霧可能なタンパク質組成物、餌母剤、または他の送達システムが含まれる。一例では、本発明の操作されたCry6Aa殺虫性タンパク質を発現するB.t.細胞または組換え宿主細胞は、標準的な技術培地および発酵技術を用いて培養される。発酵サイクルの完了時に、B.t.胞子または他の組換え宿主細胞および/または発酵ブロスからの殺虫性タンパク質結晶は、当技術分野で公知の方法によって単離され得る。B.t.胞子または組換え宿主細胞はまた、植物に適用するために適用または配合される前に処理され得る。例えば、単離されたB.t.胞子および/または毒素の結晶を化学的に処理して殺虫活性を延長させ、それによって本発明の処理されたポリペプチドを含ませ得る。組換え宿主中でB.t.殺虫性ポリペプチドを増殖させ、次いでB.t.を処理して殺虫活性を延長する方法が公知であり、公開されている。例えば、米国特許第4,695,462号、及び第4,695,455号、ならびにGaertnerら、1993を参照のこと。
【００５９】
本発明の単離または処理された操作されたCry6Aa殺虫性タンパク質は、細かく分割された粒状固体顆粒、ペレット、水和粉末、粉末、水性懸濁液または分散剤、エマルジョン、スプレー、液体濃縮物または他の殺虫製剤の組成物に製剤化され得る。これらの殺虫製剤は、本明細書の操作されたCry6Aa殺虫性ポリペプチドをアジュバント、希釈剤、界面活性剤、分散剤、不活性担体および他の成分と組み合わせて作製され、1つまたは複数の標的害虫を制御するための取り扱いおよび適用を容易にする。そのような製剤成分と同様に、適用方法および所望の殺虫活性を提供するB.t.胞子および/または単離された操作されたCry6Aaポリペプチド結晶のレベルを決定する方法についても、当技術分野で公知である。
【００６０】
害虫の制御方法  害虫が、殺虫性組成物（例えば、製剤化されたタンパク質組成物、噴霧可能なタンパク質組成物、餌母剤、トランスジェニック植物発現、または他の送達システム）を介して送達される、本明細書に開示される有効量の操作されたCry6Aa殺虫性タンパク質を摂取すると、その結果、典型的には昆虫は死亡するか、または昆虫が摂取可能な殺虫性タンパク質を作る供給源を摂食しなくなる。本明細書において「送達される（delivered）」または「送達する（delivering）」という用語は、殺虫に有効な量のタンパク質毒素を植物組織上または組織中に配置または提供する任意の方法を含むことを意味する。これには、植物の細胞内に殺虫性タンパク質を発現させること、または植物の任意の表面に有効量を適用することが含まれる。
【００６１】
対象のタンパク質昆虫毒素は、様々な方法で標的昆虫と接触するように「適用される（applied）」または提供し得る。例えば、本発明の操作されたCry6Aa殺虫性タンパク質は、アジュバント、希釈剤、担体などと配合して、細かく分割した粒状固体、顆粒、ペレット、水和粉末、粉末、水性懸濁液または分散剤、およびエマルジョンの形態の組成物を提供しした後、適用し得る。あるいは、操作されたCry6Aa殺虫性ポリペプチドは、トランスジェニック植物（タンパク質が植物によって産生され、植物中に存在する）によって送達され得、当技術分野で公知である。毒素遺伝子の発現はまた、例えば根、葉など、植物の特定の組織において選択的に達成し得る。これは、例えば、組織特異的プロモーターの使用を介して達成し得る。スプレー式適用はまた別の例であり、当技術分野で公知である。対象のタンパク質は、所望の最終用途のために適切に製剤化され、次いで、寄生が発見される前、標的昆虫が発見された後、その前後両方など場合に、植物上および／または植物の周辺／防護されるべき植物の周辺に噴霧（または適用）され得る。例えば、餌用顆粒も使用可能であり、当技術分野において公知である。
【００６２】
トランスジェニック植物  本明細書で開示される操作されたCry6Aa殺虫性タンパク質を、害虫による被害から任意の種類の植物を実質的に防御するために使用し得る。そのような植物の例には、ジャガイモ、ナス、トマト、コショウ、タバコ、その他のナス属の植物が含まれる。このような植物の例には、数例を挙げれば、トウモロコシ、ヒマワリ、ダイズ、ワタ、キャノーラ、イネ、モロコシ、コムギ、オオムギ、野菜、観賞植物、コショウ（トウガラシ含む）、テンサイ、果実および芝生が含まれる。植物を形質転換させる方法は当技術分野で公知であり、例示的な形質転換方法を実施例に記載する。
【００６３】
本発明の好ましい一実施形態は、操作されたCry6Aa殺虫性タンパク質および変異体をコードする遺伝子による遺伝子形質転換植物である。形質転換された植物の細胞内に、制御量の本発明の殺虫性タンパク質または変異体が存在するおかげで、形質転換された植物は、標的害虫による攻撃に対し耐性である。本発明の殺虫性タンパク質をコードする遺伝物質を組み込むことにより、成虫または幼虫が請求項に記載の毒素を含む植物組織を消費した後死亡する。単子葉類および双子葉類の数多くの種が形質転換されてきた。トランスジェニック農作物ならびに果実および野菜が商業的に重要である。このような作物には、限定するものではないが、トウモロコシ、イネ、ダイズ、キャノーラ、ヒマワリ、アルファルファ、モロコシ、コムギ、ワタ、ピーナッツ、トマト、ジャガイモなどが含まれる。より好ましい作物群は、トウモロコシ、ダイズおよびワタである。最も好ましい作物はトウモロコシである。
【００６４】
いくつかの技術が、外部の遺伝物質を植物細胞に導入するために、かつ導入された遺伝子を安定に維持し発現する植物を得るために存在する。このような技術には、微粒子にコーティングされた遺伝物質を、直接細胞へと加速させることが含まれる（米国特許第4945050号明細書および米国特許第5141131号）。植物は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）技術を使用して形質転換され得る。米国特許第5177010号、欧州特許第EP131624B1号、欧州特許第EP159418B1号、欧州特許第EP176112B1号、米国特許第5149645号、欧州特許第120516B1号、米国特許第5464763号、米国特許第4693976号、欧州特許第EP116718B1号、 欧州特許EP290799B1号、欧州特許EP320500B1号、欧州特許EP604662B1号、米国特許第7060876号、米国特許第6037526号、米国特許第6376234号、欧州特許第292435B1号、米国特許第5231019号、米国特許第5463174号、米国特許 米国特許第4762785号、米国特許第5608142号、および米国特許第5159135を参照のこと。その他の形質転換技術には、WHISKERS（商標）技術が含まれる。米国特許第5302523号および米国特許第5464765号を参照のこと。エレクトロポレーション技術も、植物を形質転換させるために使用されてきた。国際特許第1987006614号、米国特許第5472869号、米国特許第5384253号、国際特許第199209696号、米国特許第6074877号、国際特許第1993021335号、および米国特許第5679558号を参照のこと。植物を形質転換させるための数多くの技術に加えて、外部の遺伝子と接触する組織の種類も変化させ得る。このような組織は、限定するものではないが、胚形成組織、カルス組織タイプＩおよびタイプＩＩ、胚軸、分裂組織、などを含む。ほぼ全ての植物組織を、当業者の技術の範囲内の適切な技術を使用して脱分化中に形質転換し得る。
【００６５】
操作されたCry6Aa殺虫性タンパク質をコードする遺伝子を、本明細書上記の通り、当技術分野で周知の様々な技術を使用して植物細胞に挿入し得る。例えば、形質転換された微生物細胞の選択を可能にするマーカー、および大腸菌（Escherichia coli）において機能する複製系を含む多数のクローニングベクターが、高等植物に挿入するための外部遺伝子を調製および修飾するために利用可能である。このような操作には、例えば、意図される使用にとって望ましい、突然変異の挿入、トランケーション、付加または置換が含まれ得る。ベクターは、例えば、pBR322、pUC系、M13mp系、pACYC184などを含む。したがって、本発明のタンパク質毒素または変異体をコードする配列を、適切な制限部位でベクターに挿入し得る。生じたプラスミドを大腸菌（E. coli）の形質転換に使用し、その細胞を適切な栄養培地で培養し、次いで収集し、実用的な量のプラスミドが回収されるように溶解させる。配列分析、制限断片分析、電気泳動およびその他の生化学-分子生物学的方法が、分析方法として一般的に実施される。各操作後、使用したDNA配列を切断し、次のDNA配列に連結させ得る。操作された各DNA配列を、同じまたはその他のプラスミドにクローニングし得る。
【００６６】
植物細胞の形質転換のためのT-DNA含有ベクターの使用が、欧州特許第120516B1号；LeeおよびGelvin (2008)、Fraleyら (1986)、およびAnら (1985)で集中的に研究され、十分に記載されており、当技術分野において十分に確立されている。
【００６７】
一旦、挿入されたDNAが植物ゲノムに組み込まれると、DNAは次世代にわたって比較的安定である。植物細胞を形質転換させるために使用されるベクターは、通常、ビアラホス、カナマイシン、G418、ブレオマイシンまたはハイグロマイシンなど除草剤に対する耐性または抗生物質に対する耐性を形質転換植物に付与するタンパク質をコードする選択的マーカー遺伝子、またはグリホサート、メトトレキセート、イミダゾリノン、スルホニルウレアおよびトリアゾロピリミジン系除草剤、例えばクロロスルフロン、ブロモキシニル、ダラポンなど、に対する耐性をコードする遺伝子を含む。AAD遺伝子（米国特許出願第20090093366号）に例示されるように、ハロキシホップ、キザロホップ、ジクロホップなどの除草剤に対する耐性を付与する遺伝子がさらに重要である。したがって、個別に使用される選択可能なマーカー遺伝子は、形質転換された細胞の選択を可能にするべきであり、一方、挿入されたDNAを含まない細胞の増殖は選択的化合物により抑制されるべきである。
【００６８】
DNAを宿主植物細胞に挿入するために、多数の技術が利用可能である。これらの技術として、限定するものではないが、形質転換剤としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）により送達されるT-DNAを用いた形質転換が含まれる。さらに、植物プロトプラストと、送達されるべきDNAを含むリポソームとの融合、DNAの直接注射、バイオリステック形質転換（微粒子衝撃）またはエレクトロポレーション、およびその他の可能性のある方法が使用され得る。
【００６９】
本発明の好ましい一実施形態において、植物は、タンパク質コード領域のコドン使用が植物に最適化された遺伝子により形質転換される。例えば、米国特許第5,380,831号を参照のこと。例えば、本発明の操作されたCry6Aa殺虫性毒素は、ジャガイモ、ナス、トマト、コショウ、タバコ、またはナス属の他の植物のような双子葉植物における発現のために最適化され得る。本発明の操作されたCry6Aa殺虫性毒素はまた、ダイズおよびワタなどの他の双子葉、またはZea mays（トウモロコシ）などの単子葉植物における発現のために最適化され得る。また、有利には、短縮型毒素をコードする植物を使用し得る。短縮型毒素は、典型的には全長毒素の約55％〜約80％をコードする。植物において使用するための合成B.t.遺伝子を作成する方法は、当技術分野で公知である（Stewart 2007）。
【００７０】
形質転換技術に関わらず、遺伝子は好ましくは、ベクターに植物プロモーターを含めることにより植物細胞においてB.t.殺虫性毒素遺伝子および変異体を発現するように適合させた、遺伝子導入ベクターに組み込まれる。植物プロモーターに加えて、様々な起源由来のプロモーターを植物細胞において効率的に使用し、外部の遺伝子を発現させ得る。例えば、細菌由来のプロモーター、例えばオクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、マンノピンシンターゼプロモーター；ウイルス由来のプロモーター、例えばカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sおよび19Sプロモーターなどが使用可能である。植物プロモーターには、リブロース-1，6-ビスリン酸（RUBP）カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）、β-コングリシニンプロモーター、ファゼオリンプロモーター、ADH（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、熱ショックプロモーター、ADF（アクチン脱重合因子）プロモーター、および組織特異的なプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。プロモーターは、転写効率を改善しうる特定のエンハンサー配列エレメントも含み得る。典型的なエンハンサーは、ADH1-イントロン1およびADH1-イントロン6を含むが、これらに限定されない。構造性プロモーターが使用されてもよい。構造性プロモーターは、ほぼ全ての細胞の種類においてほぼ常に、持続的な遺伝子発現を誘導する（例えば、アクチン、ユビキチン、CaMV 35S）。組織特異的なプロモーターは、特定の細胞または組織の種類、例えば葉または種子などにおける遺伝子発現に寄与し（例えば、ゼイン、オレオシン、ナピン、ACP（アシル輸送タンパク質））、これらのプロモーターが使用され得る。特定の植物組織および器官において活性なだけでなく、植物の発育における特定の段階の間活性なプロモーターも使用可能である。このようなプロモーターの例には、根において特異的な、花粉において特異的な、胚において特異的な、トウモロコシ絹糸において特異的な、綿繊維において特異的な、種子胚乳において特異的な、師部において特異的なプロモーターなどを含むが、これらに限定されない。
【００７１】
特定の状況下では、誘導性プロモーターを使用することが望ましい場合がある。誘導性プロモーターは、特定のシグナル、例えば：物理的刺激（例えば熱ショック遺伝子）；光（例えばRUBPカルボキシラーゼ）；ホルモン（例えばグルココルチコイド）；抗生物質（例えばテトラサイクリン）；代謝物；およびストレス（例えば干ばつ）などに対する反応による遺伝子の発現に寄与する。植物において機能するその他の望ましい転写および翻訳エレメント、例えば5' 非翻訳リーダー配列、RNA転写終結配列およびポリアデニル酸付加シグナル配列などを使用し得る。数多くの植物特異的な遺伝子導入ベクターが当技術分野で公知である。
【００７２】
標的害虫  本発明の操作されたCry6Aa殺虫性タンパク質は、害虫の制御における使用に特に好適である。鞘翅目は、毎年多大な被害を起こす農業、園芸、また家庭の害虫の一つの重要な群である。この大きな科目の害虫は、例えば、ハムシ、テントウムシ、ゾウムシ、カツオブシムシ、コメツキムシ、コガネムシ、キクイムシ、及びコミムシダマシの科目のメンバーを含む、葉部および根部を摂食する幼虫及び成虫を含む。これらの仲間に含まれるのは、ハムシ科（Chrysomelidae）、コロラドハムシ（例えばコロラドポテトビートル（Leptinotarsa decemlineata Say））、コゴメスゲ（Colaspis brunnea Fabricius）、シリアルリーフビートル（cereal leaf beetle）(Oulema melanopus Linnaeus)、サンフラワービートル（Zygogramma exclamationis Fabricius）のハムシ類および潜葉性昆虫、およびテントウムシ（Coccinellidae）科（例えば、メキシカンコーンビートル（Epilachna varivestis Mulsant）の甲虫である。さらなる例は、コガネムシ科の甲虫（chafers）および他のコガネムシ（Scarabaeidae）科の甲虫（例えば、マメコガネ（Popillia japonica Newman）、ノーサンマスクドコガネムシ（地虫、Cyclocephala borealis Arrow）、サザンマスクトコガネムシ（地虫、Cyclocephala immaculata Olivier）、ヨーロッパコガネムシ（Rhizotrogus majalis Razoumowsky）、地虫（Phyllophaga crinita Burmeister）、キャロットビートル（Ligyrus gibbosus De Geer）、およびクロコガネ種およびメロロンタ種の甲虫）である。さらなる甲虫類昆虫の例はゾウムシ（例えば、ワタミハナゾウムシ（Anthonomus grandis Boheman、イネミズゾウムシ（Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel）、グラナリアコクゾウムシ（Sitophilus grananus Linnaeus）、ココクゾウムシ（Sitophilus oryzae Linnaeus）、およびオオタコゾウムシ（Hypera punctata Fabricius））である。トウモロコシハムシ（Sphenophorus maidis Chittenden）、ノミハムシ（例えば、トウモロコシノミハムシ（Chaetocnema pulicara Melsheimer）、および十字花植物ノミハムシ（Phyllotreta cruciferae Goeze））、ジュウイチホシウリハムシ（Diabrotica undecimpunctata）、およびルートワーム、（例えば、ウェスタンコーンルートワーム（Diabrotica virgifera virgifera LeConte）、ノーザンコーンルートワーム（Diabrotica barben Smith & Lawrence）サザンコーンルートワーム（Diabrotica undecimpunctata howardi Barber）、メキシカンコーンルートワーム（D. virgifera zeae Krysan and Smith）、Ｄ.バルテアタ・ルコンテ（D. balteata LeConte）、D．ウンデシムプンクタタ・テネラ（D. undecimpunctata tenella）、Ｄ.スペシオサ・ゲルマール（D. speciosa Germar）、およびジュウイチホシウリハムシ（D. u. undecimpunctata Mannerheim））もまた含まれる。さらなる甲虫類害虫の例は、アノマラ属の甲虫（A. marginata、A. lucicola、A. obliviaおよびセマダラコガネ（A. orientalisを含む））などのスジコガネ（Rutelinae）亜科の甲虫である。追加される甲虫類は、カツオブシムシ（Dermestidae）科のメマルカツオブシムシ、コメツキムシ（Elateridae）科のハリガネムシ（例えば、クシコメツキ属、コノデルス属、リモニウス属、アグリオテス（Agriotes）属、Ctenicera属、Aeolus属の種）、キクイムシ亜科の樹皮下甲虫、およびゴミムシダマシ科の甲虫（例えば、ピナカテ属の種など）である。上記（及びその他）に挙げる属は、一般に、操作されたCry6Aa殺虫性ポリペプチドを含む殺虫性組成物単独または他の殺虫剤との組合せによって、対象発明の一部として標��とされ得る。（標的として）追加されるこれらの属の任意の害虫もまた、本発明の範囲に含まれる。
【００７３】
作物植物の鞘翅目害虫を制御するための操作されたCry6Aa殺虫性タンパク質の使用が予期される。いくつかの実施形態において、Ｃｒｙタンパク質は、限定されないが、例えば、ウェスタンコーンルートワーム（Diabrotica virgifera virgifera LeConte)、ノーザンコーンルートワーム (Diabrotica barberi Smith and Lawrence)、サザンコーンルートワーム (Diabrotica undecimpunctata howardi Barber), メキシカンコーンルートワーム (D. virgifera zeae Krysan and Smith)、D.バルテアタ・ルコンテ（D. balteata LeConte）、D. undecimpunctata tenella、Ｄ.スペシオサ・ゲルマール（D. speciosa Germar）、及びジュウイチホシウリハムシ（D. u. undecimpunctata Mannerheim）などのルートワーム、及び Cyclocephala borealis （ノーザンマスクドシェイファー）、Cyclocephala immaculate (サザンマスクドシェイファー）、及びPopillia japonica（マメコガネ）の幼虫、などの地虫を含む、害虫の制御のために経済的に使用され得る。
【００７４】
鱗翅目もまた、毎年多大な被害を起こす、農業、園芸、及び家庭の害虫の別の重要な群である。本発明は、操作されたCry6Aa殺虫性タンパク質の、この属の害虫を制御するための他の殺虫剤との組合せによる使用を提供する。この大きな科目の害虫は、限定しないが、例えば、ヒトリガ、キバガ、シャクガ、カレハガ、ドクガ、ヤガ、メイガ、スカシバガ、ヒロズコガ、及びハマキガの科目のメンバーを含む、葉部および根部を摂食する幼虫及び成虫を含む。鱗翅目害虫は、限定しないが、コハチノスツヅリガ（Achoroia grisella）、アクレリスグロベラナ（Acleris gloverana）(ウェスタンブラックヘッデッドバッドワーム)、アクレリスバリアナ（Acleris variana）、リンゴコカクモンハマキ（Adoxophyes orana）、アグロティスイプシロン（Agrotis ipsilon）(タマナヤガ)、アラバマアルギラシア（Alabama argillacea）、アルソフィラポメタリア（Alsophila pometaria）、アミエロイストランシテラ（Amyelois transitella）、スジコナマダラメイガ（Anagasta kuehniella）、モモキバガ（Anarsia lineatella）（モモキバガ）、アニソタセナトリア（Anisota senatoria）、サクサン（Antheraea pernyi）、アンチカルシアゲマタリス（Anticarsia gemmatalis）、ハマキガ属（Archips sp.）、アルギロタエニア属（Argyrotaenia sp.）、アテチスミンダラ（Athetis mindara）、カイコガ（Bombyx mori）、ブツクラトリクススベリエラ（Bucculatrix thurberiella）、スジマダラメイガ（Cadra cautella）、コリストネウラ属（Choristoneura sp.）、コキラス ホスペス（Cochylls hospes）、コリアスユリテム（Colias eurytheme）、コルシラ セファロニカ（Corcyra cephalonica）、シジラ ラチフェレナス（Cydia latiferreanus）、シジラ ポモネラ（Cydia pomonella）、ダタナ インテグリマ（Datana integerrima）、デンドロリマス・シベリカス（Dendrolimus sibericus）、デスミア・フェネラリス（Desmia feneralis）、ジアファニア・ヒアリナタ（Diaphania hyalinata）、ジアファニア・ニチダリス（Diaphania nitidalis）、ジアトラエ・グランジオセラ（Diatraea grandiosella）（サウスウェスタンコーンボーラー）、ジアトラエ・サッカラリス（Diatraea saccharalis ）（サトウキビボーラー）、エノモススブシグナリア（Ennomos subsignaria）、エオレウマロフチニ（Eoreuma loftini）（メキシカンライスボーラー）、エスフェスティア・エルテラ（Esphestia elutella）、エラニス・チラリア（Erannis tilaria）（リンデンルーパー）、エスティグメネ・アクレア（Estigmene acrea）、エウリア・サルブリコラ（Eulia salubricola）、ユーポコエリア・アンビグエァ（Eupocoellia ambiguella）、ブドウホソハマキ（Eupoecilia ambiguella）、ユープロクチス・クリソロェ（Euproctis chrysorrhoea）、ユーキソアメッソリア（Euxoa messoria）、ハチノスツヅリガ（Galleria mellonella）、ナシヒメシンクイ（Grapholita molesta）、ハリシナ・アメリカナ（Harrisina americana）、ヘリコベルパ・サブフレクサ（Helicoverpa subflexa）、ヘリコベルパ・ゼア（Helicoverpa zea）（コーンイヤーワーム）、ヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）、ヘミレウカ・オリビアエ（Hemileuca oliviae）、ホモエオソマ・エレクテルム（Homoeosoma electellum）、アメリカシロヒトリ（Hyphantria cunea）、ケイフェリア・リコペルシセラ（Keiferia lycopersicella）、ラムデイナ・フィスセラリア・フィスセラリア（Lambdina fiscellaria fiscellaria）、ラムディナ・フィスセラリア・ルグブロサ（Lambdina fiscellaria lugubrosa）��ヤナギドクガ（Leucoma salicis）、ロベシア・ボトラナ（Lobesia botrana）、ロキサグロチス・アルビコスタ（Loxagrotis albicosta）（ウェスタンビーンカットワーム）、ロキソステジ・スティクティカリス（Loxostege sticticalis）、マイマイガ（Lymantria dispar）、マカラ・シルシサリス（Macalla thyrsisalis）、マラコソマ属（Malacosoma sp.）、ヨトウガ（Mamestra brassicae）、マメストラ・コンフィグラタ（Mamestra configurata）、マンジュカ・キンケマクラタ（Manduca quinquemaculata）、マンジュカ・セクスタ（Manduca sexta）、マルカ・テスツラリス（Maruca testulalis）、メランクラ・ピクタ（Melanchra picta）、ナミスジフユナミシャク（Operophtera bmata）、オルギア属（Orgyia sp.）、オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）(European corn borer)、パレアクリタベルナタ（Paleacrita vernata）、パピアペマ・ネブリス（Papiapema nebris）（コモンストークボーラー）、パピリオ・クレスフォンテス（Papilio cresphontes）、ワタアカミムシ（Pectinophora gossypiella）、フリガニジア・カリフォルニカ（Phryganidia califoraica）、フィロノリクテル・ブランカルデラ（Phyllonorycter blancardella）、ピエリス・ナピ（pieris napi）、ピエリス・ラパエ（pieris rapae）、プラチペナ・スカブラ（Plathypena scabra）、プラチノタ・フロウエンダナ（Platynota flouendana）、プラチノタ・スルタナ（Platynota sultana）、プラチプチリア・カルジュイダクチラ（Platyptilia carduidactyla）、プロディア・インテルプンクテラ（Plodia interpunctella）、コナガ（Plutella xylostella）(diamondback moth),ポンチア・プロトディセ（Pontia protodice）、シューダレチア・ウニプンクタ（Pseudaletia unipuncta）(armyworm),シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）、サブロデス・アエグロタタ（Sabulodes aegrotata）、シズラ・コンシナ（Schizura concinna）、シトトロガ・セレアレラ（Sitotroga cerealella）、スピロノタ・オセラナ（Spilonota ocellana）、ツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）（フォールアームワーム）、スポドプテラ・エクシグア（Spodoptera exigua）（ビートアーミーワーム)、タウルンストポエア・ピチオカンパ（Thaurnstopoea pityocampa）、エンソラ・ビセリエラ（Ensola bisselliella）、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）（キャベツルーパー）、ウデア・ルビガリス（Udea rubigalis）、キシロミゲス・クリアリス（Xylomyges curialis）、およびヨーロッパリンゴスガ（Yponomeuta padella）が含まれる。
【００７５】
寄生性の線形動物、限定しないが、例えば、ネコブセンチュウ（Meloidogyne incognita）、ダイズシストセンチュウ（Heterodera glycines）など、を制御するための操作されたCry6Aa殺虫性タンパク質の使用が予期される。
【００７６】
抗毒素抗体  本明細書に開示される毒素に対する抗体、または同等の毒素、またはこれらの毒素の断片が、当分野の標準的な手順を使用して手軽に調整され得る。そのような抗体は操作されたCry6Aa毒素の存在を精製または検出するのに有用である。
【００７７】
一旦B.t.殺虫性タンパク質が単離されると、このタンパク質に特異な抗体が当業者に公知の従来の方法により惹起され得る。数週間または数ヶ月にわたる、選択した宿主内への反復した注入により、免疫反応が誘発され、顕著な抗B.t.毒素血清力価をもたらす。好ましい宿主は哺乳種であり、より好ましい種は、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、及びマウスである。そのような免疫性を与えられた動物は、B.t.殺虫性毒素と反応する抗血清（ポリクローナル抗体）を獲得するための確立された方法により、処理され得る。次いで、抗血清は当分野において公知の技術による毒素の吸着によってアフィニティ精製され得る。アフィニティ精製抗血清は、当分野で公知の手順を用いて抗血清内の免疫グロブリン画分を単離することによってさらに精製され得る。得られた物質は、B.t.殺虫性毒素と反応する免疫グロブリンの不均一な種である。
【００７８】
抗 B.t毒素抗体は、免疫原性担体に結合したB.t.殺虫性毒素の合成ペプチド断片からなる半合成免疫原を調製することにより生成し得る。ペプチド断片を作製するために有用な多くのスキームおよび器具は、当技術分野で公知である。ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンなどの多くの好適な免疫原性担体もまた、免疫原および担体タンパク質をカップリングする技術と同様に、当技術分野で公知である。一旦、半合成免疫原が構築されると、B.t.殺虫性毒素断片に特異な抗体を作成する手順は、天然のB.t毒素と反応する抗体を作製する手順と同一である。
【００７９】
抗B.t毒素モノクローナル抗体（MAbs）は、精製されたB.t.殺虫性タンパク質を用いて手軽に調整される。MAbを産生するための方法は、20年以上にわたって実施されており、当業者に公知である。アジュバントでの精製されたB.t.殺虫性タンパク質の反復した腹腔内または皮下注射により、ほとんどの動物において免疫応答が誘発される。過免疫されたBリンパ球を動物から取り出し、無期限に培養することができる適切な融合パートナー細胞株と融合させる。Bリンパ球が高度に免疫化され、MAbの産生に使用され得る好ましい動物は哺乳動物である。より好ましい動物はラットおよびマウスであり、最も好ましいのはBALB/cマウス株である。
【００８０】
多くの哺乳動物細胞株が、ハイブリドーマの産生に好適な融合パートナーである。多くのそのような細胞株は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（バージニア州マナッサス ATCC）および商業供給者から入手可能である。好ましい融合パートナー細胞株はマウス骨髄腫に由来し、HL-1（登録商標）親和性骨髄腫-653細胞株（メイン州ポートランド Ventrex）が最も好ましい。一旦融合されたら、得られたハイブリドーマを選択増殖培地で1〜2週間培養する。混合ハイブリドーマ培養物から、融合していない骨髄腫細胞、または骨髄腫細胞間の融合物を除去するための2つの公知の選択系が利用可能である。選択系の選択は、使用した免疫化されたマウス及び骨髄腫融合パートナーの株に依存する。Taggart及びSamloff（1983）によって記述されたAAT選択系が使用され得るが、Littlefield（1964）によって記載されたHAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択系が、上記の好ましいマウス株及び融合パートナーとの適合性のために好ましい。次いで、使用された増殖培地を免疫特異的MAb分泌についてスクリーニングする。酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）手順は、この目的のために最も好適であり、大量のスクリーニングに適合した放射免疫アッセイも許容される。かなりの数の無関係または望ましくない培養物を連続的に分離するように設計された複数のスクリーニングが実施され得る。B.t.殺虫性毒素と反応するMAbを分泌する培養物は、既知のB.t.殺虫性毒素との交差反応性についてスクリーニングされ得る。好ましいB.t.殺虫性毒素に優先的に結合するMAbは、市販のアッセイを用いてアイソタイプに分けられ得る。好ましいMAbはIgGクラスであり、より好ましいMAbはIgG1およびIgG2aサブタイプである。
【００８１】
好ましいMAbを分泌するハイブリドーマ培養物は、モノクローナル性および安定性を確立するために数回サブクローニングされ得る。真核細胞、非接着細胞培養物をサブクローニングするための公知の方法には、限界希釈、軟質アガロースおよび蛍光活性化セルソーター技術が含まれる。各サブクローニング後、得られた培養物は、好ましくは、抗体分泌及びアイソタイプについて再アッセイされ、安定した好ましいMAb分泌培養が確立されていることを確実にする。
【００８２】
抗B.t.毒素抗体は、本発明のB.t.殺虫性毒素及びその変異体または断片を検出する様々な方法において有用である。報告グループで標識された抗体を用いて、様々な環境における抗原の存在を同定し得ることが公知である。放射性同位元素で標識された抗体は、種々の生体液中の抗原の存在を高精度かつ高感受性で同定するために、放射免疫アッセイにおいて数十年間使用されてきた。より最近では、酵素標識抗体は、ELISAアッセイにおいて放射性標識された抗体の代替物として使用されている。さらに、本発明のB.t.殺虫性毒素と免疫反応する抗体は、ポリスチレンウェルまたは粒子などの固定化物質に結合され得、免疫アッセイで使用してB.t.毒素が試験試料中に存在するか否かを判定し得る。
【００８３】
プローブを用いた検出  本発明のポリペプチドおよび遺伝子を同定するためのさらなる方法は、オリゴヌクレオチドプローブの使用によるものである。これらのプローブは、検出可能なヌクレオチド配列である。これらの配列は、適切な放射性標識により検出可能され得、または米国特許第6268132号に記載されているように本質的に蛍光性とし得る。当技術分野で公知の通り、プローブ分子と核酸試料が2つの分子間に強い塩基対形成結合を形成することによってハイブリダイズする場合、プローブと試料は実質的な配列相同性を有すると合理的に推定し得る。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、例えば、Keller及びManak（1993）に記載されているように、当技術分野で公知の技術によってストリンジェントな条件下で実施される。プローブの検出により、公知の方法でハイブリダイゼーションが起こったか否かを判定するための手段を提供される。そのようなプローブ分析は、対象発明の毒素コード遺伝子を同定する迅速な方法を提供する。本発明によるプローブとして使用されるヌクレオチドセグメントは、DNA合成装置及び標準的な手順を使用して合成し得る。これらのヌクレオチド配列は、本発明の遺伝子を増幅するためのPCRプライマーとしても使用し得る。
【００８４】
ハイブリダイゼーション  分子生物学の当業者に公知の通り、2つの核酸の相同性は、それらがハイブリダイズする傾向によって特徴づけし得る。本明細書で使用される「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、プローブがその標的配列と他の配列よりも高度に検出可能な程度にハイブリダイズする（アニーリングする）条件下（例えば、バックグラウンドの少なくとも2倍）を指すことを意図している。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる環境中では異なってくる。ハイブリダイゼーション及び／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに対して100％相補的である標的配列を同定し得る（相同的プロービング）。あるいは、より低い程度の相同性が検出される（異種のプロービング）ように、ある程度のミスマッチを許容するようにストリンジェンシー条件を調整し得る。一般に、プローブは、長さが約1000ヌクレオチド未満、好ましくは長さが500ヌクレオチド未満である。
【００８５】
典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約1.5M Naイオン未満、典型的にはpH7.0〜pH8.3で約0.01〜1.0M Naイオン濃度（または他の塩）であり、温度は短いプローブ（例えば10〜50ヌクレオチド）については少なくとも30℃、長いプローブ（例えば50ヌクレオチド以上）については少なくとも約60℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成され得る。例示的な低ストリンジェンシー条件は、37℃で、30％〜35％ホルムアミド、1M NaCl、1％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液によるハイブリダイゼーションおよび1X〜2X SSC（20X SSC = 3.0M NaCl /0.3M クエン酸三ナトリウム）により50℃〜55℃で洗浄することを含む。 典型的な中程度のストリンジェンシー条件には、37℃で、40％〜45％ホルムアミド、1.0M NaCl、1％SDS中によるハイブリダイゼーション、および0.5X〜1X SSCにより55℃〜60℃で洗浄することが含まれる。 例示的な高ストリンジェンシー条件は、37℃で、50％ホルムアミド、1M NaCl、1％SDSによるハイブリダイゼーションおよび0.1X SSCにより60℃〜65℃で洗浄することを含む。 任意で、洗浄緩衝液は約0.1％〜約1％のSDSを含み得る。ハイブリダイゼーションの持続時間は、一般に約24時間未満、通常約4〜約12時間である。
【００８６】
特異性は、典型的にはハイブリダイゼーション後洗浄の関数であり、最終洗浄溶液のイオン強度および温度が重要な因子である。DNA / DNAハイブリッドについては、熱融点（Tm）は、相補的な標的配列の50％が完全に一致したプローブにハイブリダイズする温度（設定されたイオン強度およびpH下で）である。Tm はミスマッチの1％ごとに約1℃低下し、 したがって、Tm、ハイブリダイゼーション条件、及び/または洗浄条件は、所望の同一性の配列のアニーリングを容易にするように調整され得る。例えば、90％以上の同一性を有する配列が求められる場合、Tm は10℃低下させ得る。一般的に、ストリンジェントな条件は、設置されたイオン強度およびpHにおける特定の配列及びその相補体についてのTmよりも約5℃低く選択される。しかしながら、高度にストリンジェントな条件は、Tmよりも1℃、2℃、3℃、または4℃低い温度でハイブリダイゼーション及び/または洗浄を利用し得る。中程度にストリンジェントな条件は、Tmよりも6℃、7℃、8℃、9℃または10℃低いハイブリダイゼーション及び/または洗浄を利用し得、低ストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーション及び/ Tmよりも11℃、12℃、13℃、14℃、15℃または20℃低いハイブリダイゼーション及び／または洗浄を利用し得る。
【００８７】
Tm（℃）は、実験的に決定され得、また計算によって近似され得る。DNA-DNAハイブリッドの場合、Tm はMeinkoth及びWahl（1984）の式から近似し得る：
Tm（℃）= 81.5℃+16.6（logM）+0.41（GC％）-0.61（ホルムアミド％）- 500/L;
式中、Mは1価カチオンのモル濃度であり、％GCはDNA中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドの百分率であり、ホルムアミドはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの百分率（w/v）であり、Ｌは塩基対中のハイブリッドの長さである。あるいは、Tmは、以下の式（Beltzら、1983）によって記述される。
Tm（℃）=81.5℃+16.6（log [Na+]）+0.41（GC％）-0.61（ホルムアミド％）-600/L
式中、[Na+]はナトリウムイオンのモル濃度、％GCはDNA中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの百分率、％ホルムアミドはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの百分率（w：v）、およびＬは塩基対中のハイブリッドの長さである。
【００８８】
方程式、ハイブリダイゼーション及び洗浄組成物、また所望のTmを使用して、当業者はハイブリダイゼーション及び／または洗浄溶液のストリンジェンシーの変動が本質的に記載されることを理解するであろう。所望の程度のミスマッチが45℃（水溶液）または32℃（ホルムアミド溶液）未満のTmを生じる場合、より高い温度が使用し得るようにSSC濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な指針は、Tijssen（1993）及びAusubelら（1995）に見出し得る。また、Sambrookら (1989)も参照のこと。
【００８９】
放射性標識された遺伝子特異的プローブによるサザンブロット上の固定化DNAのハイブリダイゼーションは、標準的な方法（Sambrookら、前出）によって実施され得る。ポリヌクレオチドプローブを標識するために使用される放射性同位体は、32P、33P、14Cまたは3Hを含み得る。ポリヌクレオチドプローブ分子への放射性同位体の組み込みは、分子生物学分野の当業者に公知のいくつかの方法のうちの任意の方法によって実施され得る。（例えば、Sambrookら、上記を参照のこと）一般に、ハイブリダイゼーション及びその後の洗浄は、請求項に記載された殺虫性タンパク質をコードする遺伝子と相同性を有する標的配列の検出を可能にするストリンジェントな条件下で実施し得る。二本鎖DNA遺伝子プローブの場合、6X SSPE、5X デンハルト溶液、0.1％ SDS、0.1mg/mL 変性DNA（20X SSPEは3M NaCl、0.2M NaHPO4及び0.02M EDTA（エチレンジアミンテトラ酢酸ナトリウム塩）；100x デンハルト溶液は、20gm/Lのポリビニルピロリドン、20gm/LのFicollタイプ400及び20gm/Lのウシ血清アルブミン（第V画分））中のDNAハイブリッドのTmより20℃〜25℃低い温度で一晩ハイブリダイゼーションを実施し得る。
洗浄は、典型的には以下のように実施される：
1X SSPE、0.1％ SDS（低ストリンジェンシー洗浄）で、15分間室温で2回。
0.2X SSPE、0.1％SDS（中程度のストリンジェンシー洗浄）で、Tm−20℃で15分間1回。
【００９０】
オリゴヌクレオチドプローブでは、6X SSPE、5X デンハルト溶液、0.1％ SDS、0.1mg/mLの変性DNA中でハイブリッドのTmより10℃〜20℃低い温度で一晩ハイブリダイゼーションを実施し得る。オリゴヌクレオチドプローブのTmは、以下の式（Suggsら、1981）によって決定することができる。
Tm（℃）= 2（T/A塩基対の数）+ 4（G/C塩基対の数）
洗浄は、典型的には以下のように実施される：
1×SSPE、0.1％ SDS（低ストリンジェンシー洗浄）で、15分間室温で2回。
1X SSPE、0.1％ SDS（中程度のストリンジェンシーの洗浄）で、ハイブリダイゼーション温度で15分間1回。
【００９１】
ハイブリダイゼーションのためのプローブ分子及びプローブ分子と標的分子との間に形成されるハイブリッド分子は、放射性標識以外の手段によって検出可能とし得る。このような代替の方法は、本発明の範囲内と意図される。
【００９２】
本明細書における用語「遺伝物質」の使用は、全ての遺伝子、核酸、DNA及びRNAを含むことを意味する。「dsRNA」という用語は、二本鎖RNAを指す。ポリヌクレオチド、DNA、RNA、オリゴヌクレオチド、及びプライマーのヌクレオチド残基の指定、及びタンパク質のアミノ酸残基の指定のために、IUPAC標準の略語がこの文書を通して採用される。核酸配列は標準的な5'から3'方向に提示され、タンパク質配列は標準アミノ（N）末端からカルボキシ（C）末端方向に提示される。
【００９３】
具体的に指示、又は暗示された場合を除き、「a」、「an」、及び「the」は、本明細書において使用される場合、「少なくとも1つ」を示す。
【００９４】
全ての百分率は重量によるものであり、すべての溶媒混合物の比率は、別段の記載がない限り体積によるものである。全ての温度はセ氏である。
【００９５】
本明細書で参照または引用されたすべての特許、特許出願、仮出願および刊行物は、本明細書の明白な教示と矛盾しない限り、その全体が参照により組み込まれる。
【００９６】
本明細書に記載された実施例および実施形態は、説明のみを目的としたものあり、その様々な修正または変更が当業者に示唆され、本出願の趣旨および範囲内、及び添付の特許請求の範囲に含まれる。これらの実施例は、限定的と解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９７】
実施例1
輸送ペプチドによるDIG-177（野生型Cry6Aa）のトウモロコシへの形質転換
DIG-177 B.t.殺虫性ポリペプチドのコード配列の植物最適化バージョンの設計  植物分子生物学の当業者は、単一のアミノ酸配列をコードするように複数のDNA配列を設計し得ることを理解するであろう。対象のタンパク質のコード領域の発現を増加させる一般的な手段は、コドン組成物が、その遺伝子が発現されることが予定されている宿主の全コドン組成に類似するようにコード領域を調整することである。合成遺伝子の設計および作成に関するガイダンスは、例えば、国際特許第1997013402号、米国特許第6,166,302号、および米国特許第5,380,831号に見出し得る。
【００９８】
トウモロコシコドンバイアスを有するDNA配列を設計し、トランスジェニック単子葉植物（配列番号2）にDIG-177殺虫性タンパク質を産生するように合成した。GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）に寄託された配列から得られた何百ものタンパク質コード配列から、トウモロコシ（Zea mays L.）のコドン使用表を計算した。再調整されたトウモロコシコドンセットは、そのアミノ酸の全コドン使用の約10％未満のみしか使用されない合成コドンを除外した後、計算された。
【００９９】
DIG-177タンパク質をコードするトウモロコシ−コドン最適化DNA配列、DIG-177殺虫性タンパク質の変異体またはキメラ、またはその殺虫性断片を誘導するために、殺虫性タンパク質をコードする実験的に決定された（天然の）DIG-177 DNA配列（配列番号1）に対するコドン置換の対象が、結果として得られるDNA配列がトウモロコシに最適化されたコドンバイアス表の全コドン組成を有するように作成された。望ましくない制限酵素認識部位、潜在的な植物イントロンスプライス部位、A/TまたはC/G残基の長いラン、及び植物細胞のコード領域のmRNA安定性、転写または翻訳を妨害し得る他のモチーフを排除するために、配列のさらなる精製がなされた。所望の制限酵素認識部位を導入し、長い内部オープンリーディングフレーム（+1以外のフレーム）を排除するために、他の変更が行われた。これらの変化はすべて、トウモロコシにバイアスされた再調整されたコドン組成物を保持するという制約の中でなされた。DIG-177ポリペプチドをコードするトウモロコシに最適化されたDNA配列は、配列番号3として開示される。
【０１００】
構築物設計及びプラスミドリスト  全ての構築物は、標準的な核形質転換、核転写および細胞溶解翻訳のために設計された。トウモロコシユビキチンプロモーターおよびトウモロコシペルオキシダーゼ5 3''非翻訳領域を用いてDIG-177コード領域を調節した。除草剤の選択は、トウモロコシストリークウイルスリーダー及びトウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼイントロンを有するサトウキビ桿状型（Sugarcane Bacilliform）ウイルスプロモーターの制御下で、AAD-1遺伝子（Wrightら、2010）によって提供された。3'非翻訳領域はトウモロコシリパーゼ遺伝子由来であった。7つの異なる細胞内区画をDIG-177蓄積について試験した。用いた輸送ペプチドの要約を表2に示す。アポプラストを除いて、複数の輸送ペプチドを各区画について試験した。天然DIG-177開始メチオニンコドンをアミノ末端輸送ペプチドのために除去した。輸送ペプチドは、DIG-177コード領域と相同のコドンバイアスを反映するように調整した。
【０１０１】
表2
プラスミド、コード領域及び輸送ペプチドの概要
（Ｎはアミノ末端位置を示し、Ｃはカルボキシ末端位置を示す）
【表２】
2018529652.tif 000004
2018529652.tif 000005
【０１０２】
T0及びT1 実験設計  構築当たり25のトランスジェニック事象の目標が、低コピーである15に設定された。すべての事象を、挿入コピー数及びLC/MS/MSによるDIG-177葉の蓄積について分析した。低コピー事象は脇に置かれ、非発現体は廃棄され、発現体はT1種子生産のために繰り越された。これにより、T0バイオアッセイで失われ得る部分的に有効な事象の回復が確実となった。マルチコピー発現事象を、T0段階でバイオアッセイした。合格したものはT1種子の生産及びさらなる分析のために保存された。T1種子を植え、植物を葉及び根組織の両方のタンパク質（LC/MS/MSおよびウェスタンブロット）について分析し、5つの同胞をバイオアッセイで試験した。
【０１０３】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養の開始 DIG-177植物形質転換構築物（表2）を含むアグロバクテリウムチュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens ）株は、DAS組み換え培養収集所（DAS Recombinant Culture Collection）で入手された。培養物をグリセロールストックから、アグロバクテリウム（Agrobacterium）最少培地にストリークし、20℃の暗所で3日間インキュベートした。次いで、アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養物を、YEP培地のプレートにストリークし、20℃の暗所で1日間インキュベートした。
【０１０４】
実験当日、接種培地とアセトシリンゴンの混合物を、実験における構築物数に対して適切な量で調製した。100％ジメチルスルホキシドのアセトシリンゴンの1Ｍ原液を、200μＭのアセトシリンゴン最終濃度を調製するのに適切な量で接種培地を含むフラスコに加えた。
【０１０５】
各構築物について、YEPプレートからの1〜2白金耳のアグロバクテリウムを、無菌、使い捨ての50ｍｌ遠心管内の15ｍｌ接種培地／アセトシリンゴン混合物に懸濁し、600nm（O.D.600）の光学濃度を分光光度計で測定した。次いで、懸濁液を追加の接種培地/アセトシリンゴン混合液を使用して0.25〜0.35O.D.600に希釈した。次いで、アグロバクテリウム懸濁液チューブを使用前の1〜4時間、室温で約75rpmでプラットフォームシェーカーセット上に水平に配置した。
【０１０６】
穂の滅菌及び胚の単離  トウモロコシ（Zea mays）近交系Ｂ104由来の穂を温室で産生し、受粉後10〜12日で収穫した。収穫した穂の殻を剥き、市販の漂白剤（(Ultra Clorox（登録商標）Germicidal Bleach、6.15％次亜塩素酸ナトリウム）及び2滴の石鹸の20％溶液中に20分間浸漬することにより表面を滅菌し、その後、ラミナーフローフード内で無菌の脱イオン水で3度リンスした。未熟な接合胚（1.8〜2.2ｍｍ長）を各穂から無菌的に切除し、アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液2．0ｍＬを含む1つまたは複数の微量遠心管に分配し、そこへ10％Break-Thru（登録商標）Ｓ233界面活性剤2μＬを添加した。
【０１０７】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）共培養  胚単離の完了後、胚の試験管を閉じ、ロッカープラットフォーム（rocker platform）上に5分間配置した。次いで、試験管の内容物を、共培養培地のプレートに注ぎ、そして液体アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液を無菌の使い捨てトランスファーピペットで除去した。胚を含む共培養プレートをラミナーフローフードの後方に、蓋が半開きの状態で30分間配置し、その後、顕微鏡を用い、胚盤が上向いた状態に胚を指向させた。次いで、胚を含む共培養プレートをラミナーフローフードの後方に戻し、蓋が半開きの状態で15分配置した。次いで、プレートを閉じて3M Micropore（商標）テープで密封し、光合成有効放射（PAR）を約60μモルm-2 s-1の光強度で1日あたり明期24時間持続させた25℃のインキュベーター内に配置した。
【０１０８】
カルス選択、及びトランスジェニックイベントの再生  共培養期間後、胚は休止培地（resting medium）に移された。36個以下の胚を各プレートへと移動させた。プレートを、7〜10日間、PARを約50μｍｏｌ m-2 s-1 の光強度で、1日あたり明期24時間で持続させた状態で、27℃でインキュベートした。次いで、カルスを有する胚を、選択培地Iに移した。プレートを、7日間、PARを約50μｍｏｌ m-2 s-1 光強度で、1日あたり明期24時間で持続させた状態で、27℃でインキュベートした。次いで、カルスを有する胚を、選択培地ＩＩに移した。プレートを、14日間、PARを約50μｍｏｌ m-2 s-1の光強度で、1日あたり明期24時間で持続させた状態で、27℃でインキュベートした。
【０１０９】
この段階で、耐性のカルスを再生前培地に移動させた。プレートを、7日間、PARを約50μｍｏｌ m-2 s-1 光強度で、1日あたり明期24時間で持続させた状態で、27℃でインキュベートした。次いで、再生しているカルスをPhytatrays（商標）中の再生培地に移し、7〜14日間または苗条が生長するまで、PARを約150μｍｏｌ m-2 s-1の光強度で、1日あたり明期16時間／暗期8時間で、28℃でインキュベートした。次いで、一次根を有する小さい苗条を単離し、伸長培地（Robusting medium）に移した。約6ｃｍ以上の、根を張った小植物を土壌に移植し、寒さに慣らすため生育チャンバに移動させた。
【０１１０】
植物組織からのPCRのためのゲノムDNA単離。2枚の葉パンチに相当する組織試料、葉の断片を96ウェル収集プレート（ドイツヒルデン Qiagen）に集めた。組織破壊は、1つのステンレススチールビーズを用いて、Biosprint96 AP1溶解緩衝液中、Klecko（商標）組織粉砕機(カリフォルニア州バイセイリア Garcia Manufacturing）を使用して行われた。組織浸軟の後、ゲノムDNAをハイスループットフォーマットで単離した。適切なCpスコアを達成するためにqPCR反応を設定する前に、ゲノムDNAを2：3のDNA/H2Oで希釈した。
【０１１１】
加水分解プローブアッセイ  加水分解プローブアッセイによる導入遺伝子の検出は、リアルタイムPCRにより行われた。LightCycler（登録商標）Probe Design Software 2.0を使用して、対象遺伝子（GOI）Cry6Aa (IRDIG522.28) についてDow AgroSciencesでアッセイを設計した。RNA検出アッセイは、参照としてトウモロコシTIP41様のものを用いて単一反応として行った。増幅のために、LightCycler（登録商標）480 Probes Masterミックス（Roche Applied Science）を、各プライマーを0.4μM、各プローブを0.2μM含有する、10μL量のバイプレックス反応液中、1Xの最終濃度で調製した。2段階の増幅反応を、蛍光捕捉を用いて60℃で40秒間伸長させて行った。Cpスコア、適合点アルゴリズム（LightCycler（登録商標）ソフトウェアリリース1.5）とAbsolute Quantモジュール（ΔΔCt法に基づく）を使用した蛍光シグナルがバックグラウンド閾値と交差するポイント、がリアルタイムPCRデータの分析を行うために用いられた。
【０１１２】
T0温室  選択された事象を有する植物を5ガロンのポットに移植した。飛散花粉による相互汚染を防ぐために、苗条バッグを絹糸の出現前の苗条の上に被せた。次いで、2番目の苗条は覆われ、授粉に使用された。受粉のための均一な塗布が提供されるように、絹糸は授粉の前日にカットされた。近交系B104の花粉をすべての授粉に使用した。可能な場合には、逆交雑も行われた。授粉後21日目に穂を剥がして乾き性を高め、続いて授粉後42日目に完全な収穫（穂を植物から除去）した。穂を1週間乾燥機に入れ、続いて種子処理（脱莢、計数、包装）を行った。
【０１１３】
ウェスタンブロット及びLC/MS/MS分析のための葉部サンプリング  バイオアッセイ収集の日のうちに、植物をV-3〜V-5段階でサンプリングした。2つの6mm直径の葉試料を、分析の日まで、−80℃で96ウェルクラスターチューブラックに保存した。2つのDaisy（商標）スチールBB及び300μlの抽出緩衝液（0.05％のTween20及び5μl/mLのSigmaプロテアーゼ阻害剤を含有するPBS溶液）を各試験管に添加した。試料を最大設定で3分間、Kelcoビーズミルで粉砕した。試料を3,000×gで5分間遠心分離した。100μlの上清を空の試料管に移した。別の100μlの抽出緩衝液を植物試料に加え、さらに3分間ビーズミルで粉砕し、遠心分離し、この抽出物100μlを最初の100μlと合わせた。合わせた上清を混合し、抽出と同じ日に分析した。
【０１１４】
ウェスタンブロット及びLC/MS/MS分析のための根部サンプリング  完全な根系を収集し、水で洗浄し、V-3〜V-5段階でT1植物の全てについて−80℃で保存した。各植物は、個別のビニール袋で別々の試料のままとした。各根系は、工業用フードプロセッサーでドライアイスと粉砕し、ドライアイスを−20℃で昇華させ、試料を凍結させたままとした。粉砕した昇華した凍結試料を2週間凍結乾燥した。凍結乾燥した根系の一部を秤量し、96ウェルフォーマットの個別のクラスターチューブに入れた。試料は、葉のサンプリングについての上記の通り調製した。
【０１１５】
LC/MS/MSによるDIG-177 の定量  葉の試料を、25mM重炭酸アンモニウム＋0.05％ Tween20中で各植物について抽出した。試料をビーズミルで2回抽出し、プールした。根試料については、粉砕し凍結乾燥した根組織を秤量して瓶に入れ、上記のように抽出した。試料を6mM DTTにより95℃で20分間変性させた。試料を冷却した後、1μgのトリプシンを各試料に加え、試料を37℃で16時間消化した。消化後、試料を1％ギ酸で処理し、4℃で30分間インキュベートし、4,000rpmで10分間遠心分離した。消化した試料をLC/MS/MSで分析した。DIG-177ペプチド標準の標準曲線を消化したB104マトリックス（上記のように調製した）中で調製した。標準曲線は0.488〜31.25ng/mLの直線であった。Acquity UPLC BEH130C18,1.7μm 2.1×50mmカラムを使用して、Waters AcquityバイナリポンプLCおよびSciex QTRAP 6500で試料を分析した。各試料を20μlで注入し、クイック勾配（1分にわたり95％〜45％A、1分にわたり45〜10％A、1分間10％を保持、1分間10〜95％：緩衝液A：水＋0.1％ギ酸、緩衝液B：アセトニトリル＋0.1％ギ酸）を使用して溶出した。各試料について、2つのペプチドを追跡した（m/z 694.820およびm/z 586.778）。定量は、最大感受性遷移、m/z694.820〜m/z912.417に基いた。
【０１１６】
ウェスタンブロット  従来の電気泳動およびブロッティング（Gallagherら、2008）の方法を、Invitrogen（商標）装置および塩基性試薬と共に使用した。ウサギ抗Cry6a抗体は、葉および根におけるCry6aの検出のための一次抗体であった。すべてのタンパク質を、蛍光検出システム及びアビジン-ビオチン、アルカリホスファターゼ検出システムで検出した。
【０１１７】
T0及びT1トウモロコシ根部バイオアッセイ  非休眠性Diabrotica virgifera（ウェスタンコーンルートワーム、WCR）の卵をCrop Characteristics（ミネソタ州ファーミントン）からの土壌に入れ、28℃及び60％RHで10日間インキュベートした。インキュベーションの開始後（予想される孵化の約1日前）10日目に、卵をバイオアッセイ用に調製した。土壌は卵からリンスされた。卵を0.15％水寒天溶液に約100-200卵/0.5mlの濃度で懸濁し、孵化プレートに入れた。孵化プレート上の生存卵の数をカウントして、懸濁液中の卵のおおよその濃度を決定し、所望の寄生を達成するためにバイオアッセイ植物に添加するのに必要な懸濁液の量を計算した。プレートを暗箱中の28℃のインキュベーター内に維持した。
【０１１８】
WCRバイオアッセイの植え付けと調製  実験室からの形質転換された植物（T0）を、それらがV3-V4成長段階に達するまで維持されたconvironに移した。良好な根系を有するV3-V4の健康な植物を温室に移した。弱い、小さい、または根の発育が乏しい植物は、バイオアッセイのために十分に健康になるまでconvironに残した。温室で1〜2日後、植物をメトロミックス土壌で満たされた根のトレーナーに移植した。
【０１１９】
バイオアッセイのための最初のT0植物の入手が予想される少なくとも2週間前に、対照植物の種子を毎週根のトレーナーポットのMetro Mix土壌に直接植えた。移植後約4日後、T0植物に、同じ成長段階の各タイプの5つの対照植物とともに、WCR卵を寄生させた。
【０１２０】
陰性対照植物は以下の通りであった：B104近交系、7SH382 Herculex RW（HX-RW）近交系及び黄色蛍光タンパク質トランスジェニックの101556。陽性対照は、トウモロコシ系統7SH382RWトランスジェニックHerculex RW（HX-RW）であった。
【０１２１】
植物あたり約200個の卵を植物に寄生させた。孵化率は約50％と仮定されたので、各植物は約100匹の幼虫の孵化と根の摂食を有すると予想された。バイオアッセイの過程を通して給水を注意深く監視し、各ポットが湿ったままであることを確実とした。
【０１２２】
寄生から2週間後、対照植物から始めて、各植物の根損傷について採点した。それぞれの植物を根のトレーナーポットから注意深く取り除き、根の質量を維持した。植物基部（節根の頂部）の摂食損傷を明確に観察するために、土壌の上部1〜2インチを根から掻き取って、その根の露出した部分を水で洗浄した。温室トウモロコシ実生の根の損傷評価の必要性について、刊行されたトウモロコシの根の損傷評価スケール0.0〜3.0（J.D. Olesonら、2005）に由来する0.0〜1.0の根損傷率評価スケールを用いて摂食損傷を採点した。陰性対照（RW近交系、B104及び101556）は高い損傷（約0.75〜1.0の根評価）を有すると予想され、陽性対照（トランスジェニックHerculex（商標）RW（HX-RW））は低い損傷（0.0〜0.25の根評価）と予想された。対照植物の評価が完了した後、合格/不合格法（0〜1.00の採点）を用いて鉢を可能な限り妨害しないようにして、T0植物を採点した。合格植物を直ちに、プロミックス-50-50土壌を有する5ガロンのポットに移植した。すべての植物を採点した後、合格植物をスプーン1杯のFORCE（a.i.テフルトリン）の土壌施用物で処理し、成長を通じて適切に世話をした。
【０１２３】
T1温室  選択された植物を5ガロンのポットに移植した。飛散花粉による相互汚染を防ぐために、苗条バッグを絹糸の出現前の苗条の上に被せた。次いで、2番目の苗条は覆われ、授粉に使用された。授粉のための均一な塗布が提供されるように、絹糸は授粉の前日にカットされた。植物の房からの花粉は、同じ植物の穂に授粉するために使用された。可能である場合、自家受粉を行った。自家受粉を行うことができなかった場合、B104花粉をトランスジェニック穂に付けた。授粉後21日目に穂を剥がして乾き性を高め、続いて授粉後42日目に完全な収穫（穂を植物から除去）した。穂を1週間乾燥機に入れ、続いて種子処理（脱莢、計数、予め印刷された封筒での包装）を行った。
【０１２４】
T0 事象からタンパク質蓄積結果  低コピー事象を発現する8〜28のDIG-177の範囲が、全体の形質転換頻度9％で得られた。15個の構築物の各々からの分子分析スクリーニングを通過した全ての再生事象を、LC/MS/MSによるDIG-177葉タンパク質蓄積について分析した。平均タンパク質蓄積を表3に示す。平均T0葉タンパク質蓄積レベルは0 ng/cm2〜98.9ng/cm2であり、前空胞を標的とする構築物pDAB117255が最低平均蓄積を有し、葉緑体を標的とする構築物pDAB117261が最高平均蓄積を有した。全体として、最高平均タンパク質蓄積レベルは、DIG-177タンパク質の標的を葉緑体とした、pDAB117260及びpDAB11261の2つの構築物からそれぞれ見出だされた。これら2つの構築物についてのタンパク質蓄積は、平均して23.6ng/cm2であった以前のサイトゾル実験で見られたものよりも高かった。逆に、空胞、前空胞及びアポプラストを標的とする構築物は、最低葉タンパク質蓄積をもたらした。
【０１２５】
表3
LC/MS/MSにより決定された平均DIG-177タンパク質の葉部蓄積
【表３】
2018529652.tif 000006
【０１２６】
15の構築物の各々についての選択されたT0事象からの葉組織をウェスタンブロットによって分析した。タンパク質は、輸送ペプチドの使用によって特定の区画に向けられた。前駆体タンパク質は、従って54.2kDaの全長野生型DIG-177タンパク質よりも大きな分子量を有していた。区画よっては、輸送ペプチド（TraP）は転座時に切断されてもされなくてもよく、その結果、タンパク質の成熟型が生じる。タンパク質の前駆体および成熟形態の予測分子量を表4に示す。
【０１２７】
表4
本検討で使用した輸送ペプチド修飾DIG-177タンパク質のプラスミド、タンパク質名、標的区画及び分子量の要点
【表４】
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【０１２８】
非トランスジェニック陰性対照試料は、DIG-177抗血清と反応するバックグラウンドバンドを示さなかった。トランスジェニック試料では、除去される輸送ペプチドと一致する明らかな成熟タンパク質（DIG-177標準と共に移動する（comigrating)）の明確なバンドが多くの試料で検出された。場合によっては、成熟タンパク質よりも大きなバンドもまた検出され、前駆体タンパク質（除去されない輸送ペプチド）の検出と一致する。全ての構築物は、タンパク質の部分分解と一致して、明らかな成熟バンド54kDaから約40kDaまでのDIG-177物質のスメアを示した。
【０１２９】
T0事象のバイオアッセイ結果   15種類の異なるバックグラウンドを表す事象からの根系が、成長のV3-V4段階のWCR幼虫を用いて2週間で試験された。試料は次に、根系への損傷について上記の合格/不合格評価システムを使用して採点された。合計228の事象がアッセイされ、そのうちの15の事象が「合格」と採点され、T1 バイオアッセイのために保存された。
【０１３０】
T1事象の分析  T1事象は、葉および根組織の両方におけるトランスジェニックタンパク質産生および蓄積について分析された。平均葉タンパク質蓄積は、T0からT1世代までの15のバックグラウンドのそれぞれについて増加し、11.6〜731.5ng/cm2の範囲に及んだ（上記表3）。T1根の蓄積は、すべてのバックグラウンドでT1葉の蓄積よりも顕著に低かった（表5）。
【０１３１】
表5
LC/MS/MSにより決定された葉及び根組織についてのDIG-177 T1タンパク質蓄積事象平均
【表５】
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【０１３２】
T1事象の各々からの葉及び根組織の両方を、ウェスタンブロットによってタンパク質安定性について分析した。結果はT0で見られたものと同様であった。明らかな成熟タンパク質（DIG-177標準と共存する）の明確なバンドは、除去される輸送ペプチドと一致する。さらに、前駆体タンパク質と一致して、成熟タンパク質よりも大きなバンドもまた検出された。最後に、全ての構築物は、約54kDa〜約40kDaのDIG-177物質のスメアを生じ、タンパク質の部分分解と一致した。
【０１３３】
T1事象のバイオアッセイ結果  15種類の異なるバックグラウンドを代表する事象からの5つの植物が、成長のV3-V4段階のWCR幼虫を用いて2週間で試験された。試料は、根系への損傷について以前と同様に等級分けされた。 根評価が0.5以下の植物は合格とみなされた。試験された事象のいずれもこのバイオアッセイを通過しなかった。いずれの事象も、根の保護に関して陰性対照とは顕著な差がなかった。従って、輸送ペプチドを用いた種々の細胞内区画単独への局在は、DIG-177をプロテアーゼ分解から十分に保護しなかった。
【０１３４】
ウェスタンブロット分析  T1トウモロコシ葉発現実験の結果を図6に示す。ウェスタン分析では、陰性対照：B104（レーン2）及びpDAB115782（レーン3）、またはYFPおよびPATを含有する形質転換対照（レーン12）においてCry6Aaタンパク質の発現は見られなかった。6つの右端のレーンは、DIG-1000（47.3 kDa）のタンパク質標準である。
【０１３５】
pDAB117261（DIG-177）レーン3、8、11および14は、DIG 1000と処理を比較する対照としてのT1試料を含む。結果はT0で見られたものと同様であった。明らかな成熟タンパク質（DIG-177標準と共存する）の明確なバンドは、除去される輸送ペプチドと一致する。さらに、前駆体タンパク質と一致して、成熟タンパク質よりも大きなバンドもまた検出された。この対照構築物は、約54kDa〜約40kDaのDIG-177物質のスメアを生じ、タンパク質の部分分解と一致した。
【０１３６】
ペルオキシソームを標的とするpDAB126937（DIG-1000）の結果は、図6のレーン5および10に位置する。DIG 1000標準に対応する正しいサイズで1つのメジャーバンドが産生された。レーン10は、DIG177で生成された40kDaスメアよりもわずかに低い1つの明確な小さなバンドを含み、1つの特定の処理部位を示す。
【０１３７】
ミトコンドリアpDAB126938を標的とするDIG-1000は、図6のレーン4、6、9および13に位置する。この構築物は、正しいサイズのものとわずかに高いものの2つのバンドを生成し、前駆体タンパク質を表す可能性が高い。これらのデータは、ウェスタンコーンルートワーム制御に有用な、植物細胞安定性、殺虫性タンパク質を発現するDIG-1000コード配列と一致する。
【０１３８】
実施例2
DIG-177ジスルフィド結合の同定
組換えタンパク質発現プラスミド  DIG-177およびDIG-177変異体コード配列を個々のシュードモナス（Pseudomonas）発現ベクターpDOW1169にクローニングした。次いで、発現ベクターをシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens ）に形質転換し、得られた形質転換コロニーを特徴付け、保存した。
【０１３９】
組換えタンパク質発現  1リットルのグリセロールストックを2.5L Ultra Yieldフラスコ（カリフォルニア州オーシャンサイドThomson Instrument Company）中の500mLの生産培地のUltara（商標）に接種し、1インチスローで225rpmで振盪しながら30℃で24時間インキュベートした。150μLの1M IPTGで発現を誘導した。細胞を25℃で24時間インキュベートし、その時点で0.5mLの試料を採取し、フラスコをシェーカーから取り外した。培養物を、JA-20ローター（カリフォルニア州ブレア Beckman Coulter）中で19,000rpmで10分間、またはFIBERLite（商標）F12-6X500 LEXローター（Thermo Scientific）中で11,409rpmで15分間、遠心分離することにより採集した。細胞ペーストを−80℃で保存した。
【０１４０】
組換えタンパク質濃縮  DIG-177および以下に記載の変異体タンパク質は封入体（IB）としてP. fluorescensに蓄積した。細胞ペーストを4℃で解凍した。細胞を溶解緩衝液（50mM Tris（pH7.5）、200mM NaCl、10％グリセロール、20mM EDTA、0.5％ Triton X-100、5mMのベンズアミジン、および1mMのDTTを使用直前に添加したもの）中で10％w/vまで懸濁し、ホモジナイザーで混合した。スラリーをMicrofluidics Microfluidizer（米国マサチューセッツ州 Westwood）に12000+psiで2回通した。溶解物を4℃で40分間、14,000×gで遠心分離した。上清を残した。封入体ペレットを溶解緩衝液中で10％ w/vに再懸濁し、リゾチーム（L-7651; ミズーリ州セントルイス Sigma-Aldrich）を最終濃度400μg/mLになるまで添加した。懸濁液を室温（約20℃）で60分間インキュベートし、遠心分離した。封入体ペレットを溶解緩衝液で1回、2回目にマイナスTriton（商標）X-100の溶解緩衝液で洗浄した。最後に、封入体ペレットを10mM EDTA溶液中30％w/vに再懸濁し、-80℃で2mLアリコート中で保存した。試料純度は、SDS-PAGE（NuPAGE Bis-Trisゲル、Protocol Pub. No. MAN0007894 Rev. A.0、マサチューセッツ州ウォルサム Invitrogen Life technologies）によって分析した。
【０１４１】
封入体の可溶化  -80℃で保存したIBペーストを4℃で一晩解凍し、その後4℃で25分間、23,000×gで遠心分離し、上清を除去した。IBペレットを100mM CAPS（pH11）中で20％（w/v）に懸濁し、室温で2時間可溶化した。試料を上記のように遠心分離し、上清を回収した。緩衝液をPD-10脱塩カラムにより10mM CAPS（pH10）に交換した。タンパク質は、"Quick Start（商標）Bradford Protein Assay-Bio-Rad"（カリフォルニア州ハーキュリーズ Bio-Rad）プロトコルに従ってBradfordタンパク質アッセイによって定量した。標準はBSA（ウシ血清アルブミン、ニューヨーク州グランドアイランド PierceのAlbumin Standard）であった。
【０１４２】
SDS-PAGE. Invitrogen Life technologiesのプロトコルNuPAGE Bis-Trisゲル（Protocol Pub. No. MAN0007894 Rev. A.0, Ref.2）に従ってSDS-PAGEを行った。手短に、試料を変性試料緩衝液（Invitrogen）プラス5mM DTT（還元PAGE）またはマイナスDTT（非還元性PAGE）と混合し、95℃で5分間加熱した。試料をInvitrogen Bis/Trisゲルに装填した。ゲルはMOPSまたはMES泳動緩衝液により200Vで約43分間用いられた。ゲルをCoomassieブルー染色溶液（Bio-Rad）で30分間染色し、バックグランドがなくなるまで脱染色溶液（7％酢酸および5％メタノール水溶液）で脱染色した。
【０１４３】
インタクトな分子量分析/帯電状態分布  インタクトな質量分析は、50℃に加熱したMichrom脱塩トラップを用いて、Agilent 1200 HPLC/MSD TOF 1969Aシステムで行った。 各試料を、10mM CAPS（pH11）緩衝液中で0.2μg/μLの濃度に希釈した。また、50mM TCEP（（2-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩）で10分間還元した後、試料を分析した。約1μgのタンパク質をカラムに注入した。勾配（10％緩衝液Dを1分間、10-60％緩衝液Dを2分間にわたって、60-98％緩衝液Dを2分間にわたって、10％緩衝液Dを1分間）を用いて試料を溶出し、ここで緩衝液Ａは0.1％ギ酸水溶液および緩衝液Dは70％イソプロパノール、20％アセトニトリル、10％水＋0.1％ギ酸である。質量は、Mass Hunter Qualitative Analysisソフトウェアおよび最大エントロピーデコンボリューションアルゴリズムを使用して計算した。
【０１４４】
還元条件下および非還元条件下の両方でのDIG-177の質量分光分析により、タンパク質中に存在する2つのジスルフィド結合が確認された。DIG-177は、位置88、162、402、404および451に位置する5つのシステイン残基を有する。ジスルフィド結合に寄与する残基を同定するために、選択されたシステインで突然変異を行い、組換えタンパク質を発現させた。変異体タンパク質のインタクトな分子量を、還元剤の存在下または非存在下で分析した。これらの条件下で、タンパク質中に存在する各ジスルフィド結合は、TCEPで還元したとき、2のm/z増加を説明すると予想される。野生型タンパク質（DIG-177）を還元すると、3.8のm/z増加が観察され、2つのジスルフィド結合がタンパク質中に存在することが示された。DIG-614（配列番号35）、615（配列番号37）、618（配列番号43）、619（配列番号45）、983（配列番号47）および984（配列番号49）は、還元時に約+2の質量変化を示し、単一のジスルフィド結合を表している。これらの変異体の各々は、システイン残基88及び451の間のジスルフィド結合の消失をもたらすと予想された。これらのデータに基づけば、システイン残基162、402または404のうちの2つを含む追加のジスルフィド結合が存在した。Cys162を含むジスルフィド結合を破壊することが予想される突然変異体DIG-616（配列番号39）および617（配列番号41）は、DIG-177と同様に、還元時に約+4の変化を示し、2つのジスルフィド結合の存在を示唆した。これらのジスルフィド結合の1つはシステイン88と451との間に見出されたので、第2のジスルフィド結合はシステイン残基402と404との間と推測により示された。
【０１４５】
表6
システイン突然変異体のインタクトなMW及びTCEPによるプラスおよびマイナス還元
【表６】
2018529652.tif 000009
【０１４６】
実施例3
トリプシン処理されたDIG-177の特徴付け
要約すると、トリプシン処理DIG-177（トリプシンコア、TC）は、大きな断片（LF；配列番号50のアミノ酸12〜390）およびカルボキシ末端ペプチド（CTP）と呼ばれる2つの小さな断片（アミノ酸444〜475（配列番号51）または451〜475（配列番号52））のいずれかから成る。LFとCTPは、cys88とcys451との間のジスルフィド結合を介して結合していることが見出された。非還元条件下では、トリプシン処理試料は殺虫活性を有し、還元条件下では、解離した断片（LFとCTP）および活性は減少した。試験したレベルでは、LFもCTPも殺虫活性を示さなかった。これらの観察は、LFに結合したCTPが、トリプシンタンパク質分解後の毒素の活性を維持するために必要であることを示唆している。
【０１４７】
調製され、特徴付けられ、また試験されたトリプシン処理された試料の概要  4種類の試料を調製し、特徴付けし、バイオアッセイして、ペプチドのどの組み合わせがWCR殺虫活性を有するかを決定した（図1参照）。
試料1  トリプシン処理したDIG-177、CTP存在、およびLFに結合したジスルフィド結合。
試料2 トリプシン処理したDIG-177、CTP存在、試料は消化後に還元剤で処理。その後還元剤を透析により除去。
試料3  トリプシン処理したDIG-177、単離されたLF
試料4  トリプシン処理したDIG-177、単離されたCTP
【０１４８】
トリプシン消化  DIG-177タンパク質は、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）で産生され、実施例2に記載のように精製された。組換えタンパク質をトリプシン（TPCK処理Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス）を含有する消化緩衝液（100mM CAPS緩衝液（pH10.5）、5mM CaCl2、5mM MgCl2）で処理し、15部のタンパク質対1部のトリプシン（W/W）の最終比率にした。室温で穏やかに揺すって反応を惹起した。分析のためにアリコートを各時点（5分、2時間および17時間）で除去し、5mM DTTを含むドデシル硫酸リチウム（LDS）試料緩衝液を添加し、95℃で5分間加熱することによって消化を停止させた。
【０１４９】
トリプシン処理タンパク質は、AKTAタンパク質精製器（ニュージャージー州ピスカタウェイ Amersham Pharmacia Biotech）を用いたイオン交換クロマトグラフィー（IEC）によって精製した。試料を10mM CAPS（pH10）で1：1で希釈し、0.22μM膜を有する真空駆動フィルターで濾過した。試料を3mL/分の流速で予め平衡化したHiTrap（商標）Qカラム（ペンシルバニア州ピッツバーグ GE）に注入し、カラムを約25mLの緩衝液A（50mM CAPS（pH10））で洗浄し、 タンパク質は20％緩衝液B（緩衝液A +1M NaCl）で溶出し、次いで30％、40％および50％緩衝液Bで溶出した。各溶出は約25mLであった。それぞれの溶出液からUV吸光度に基づいて画分を集めた。これらの画分をSDS-PAGE（プロトコルNuPAGE Bis-Trisゲル、Invitrogen Life technologies、Protocol Pub. No. MAN0007894 Rev. A.0参照）で分析した。
【０１５０】
標的タンパク質を含む画分をプールし、10kDa分子量カットオフ（MWCO）膜（マサチューセッツ州ビレリカ Millipore）を有する遠心フィルター装置を用いて約3mLまで濃縮した。透析により、試料緩衝液を10mM CAPS（pH10）に交換した。濃縮した試料をSlide-A-Lyzer（商標）透析カセット（Thermo Scientific）に移した。カセットを4Lの10mM CAPS（pH10）に入れ替え、4℃で一晩（約18時間）透析した。SDS-PAGE（実施例2に記載）により95％以上の純度で評価された試料を、WCRバイオアッセイおよび/または特徴付けのためにそれぞれ集めた。
【０１５１】
タンパク質濃度は、製造元のプロトコル"Quick Start（商標）Bradford Protein Assay-Bio-Rad"（Bio-Rad）に従ってBradfordタンパク質アッセイによって測定した。BSA（ウシ血清アルブミン）を標準として使用した。
【０１５２】
試料1  トリプシン処理DIG-177（LF+CTP）の調製および特徴付け  野生型DIG-177； 配列番号2）をトリプシンで16時間消化し、イオン交換カラム上でトリプシンを除去した。試料を還元変性条件下でSDS-PAGE（実施例2に記載）により分析した。未消化の全長物質は約54kDaで移動し、少量の二量体は約108kDaで出現した。DIG-177は、検出可能な量の高分子量凝集体を形成することができる。分画前のトリプシン処理した試料は、トリプシン切断部位に基づいて、残基12-390であると予測されるLFを表す約43kDaの単一バンドとした。
【０１５３】
N末端シークエンシング  LFのアミノ末端は、基本的なエドマン分解化学を用いてShimadzu Protein Sequencer（モデルPPSQ-33A）で行ったエドマン分解N末端シークエンシングにより確認した。タンパク質試料を還元条件下でSDS-PAGEで分離し、次いでタンパク質を液体移送によってPVDF膜上にブロットした。標的タンパク質バンドを切除し、ガラス反応チャンバに充填した。その後、チャンバをシークエンサーに挿入し、エドマン分解を行った。毎回20種類のPTH-アミノ酸（日本京都 島津製作所）の標準混合物を使用した。それぞれのエドマン分解サイクルからのアミノ酸残基を、標準と比較してそのC-18カラムからの保持時間に基づいて決定した。このプロセスを順次繰り返して、タンパク質のアミノ末端配列を得た。エドマン分解は、LFのN末端が配列番号2の残基12で開始することを決定した。
【０１５４】
タンパク質がインタクトな分子量分析（実施例2に記載）を還元せずに行い、46,844.19Daの質量を有する優占種（メジャー）および45,995.25Daの質量を有する少数種（マイナー）を生じた（表7）。デコンボリューションされたインタクトなMW平均値46,844.19Daは、鎖444〜475（CTP1）に結合した12〜390ジスルフィドのポリペプチド鎖を含むタンパク質について予想される理論値（46,843.43Da）と一致する。MW平均値45,995.25Daを有する少数種は、鎖451〜475（CTP2）に結合した12〜390ジスルフィドのポリペプチド鎖を含むタンパク質の理論値45,996.51に一致する。
【０１５５】
表7
非還元条件下における試料1のインタクトな分子量分析
【表７】
2018529652.tif 000010
【０１５６】
TCEP処理（還元条件）後、試料のインタクトな分子量を測定した。2つの成分が観察された（表8）。42,729.71Daでの主要成分は、トリプシン処理DIG-177LF（残基12-390、CTPなし）の理論質量42,729.4と一致する。質量が46,844.14Daのマイナー成分も観察され、CTP1が依然として結合している（不完全な還元）LFの質量と一致する。結果は、TCEPによる還元によってCTP1および2の大部分が除去されたことを示す。
【０１５７】
表8
還元条件下における試料1のインタクトな分子量分析
【表８】
2018529652.tif 000011
【０１５８】
試料2  トリプシン処理DIG-177（還元後のCTPを含むLF）の調製および特徴付け  トリプシン処理したDIG-177を、試料1について記載した通りに非還元条件下で精製した。DTTを試料に5mMの最終濃度で添加し、室温で10分間インキュベートした。次いで、試料を10mM CAPS（pH10）に対して一晩透析してDTTを除去し、試料2を作製した。試料1および2を、4〜12％Bis/TrisゲルおよびMOPS泳動バッファーを用いてSDS-PAGEにより分析し、約40kDa程度のより良い分解能を得た。還元条件下では、試料1および試料2（DTT処理）は、LF（12-390）と一致する約43kDaの予想分子量で1つのバンドを示し、ゲルの底部の第2のバンドは、ジスルフィド還元によって放出されたCTP（CTP1およびCTP2は、これらの条件下では分解されない）であった。非還元条件下では、試料1は、LF（残基12-390）および連結されているCTPと一致する約46kDaの予想される分子量で試験された。試料2（DTT処理、除去）は、2つのより高い分子量バンドを示し、1つは約43kDaであり、LF（残基12-390）と一致した。2つ目は約46kDaバンドであり、LFプラスCTPと一致する。CTPに対応するゲルの底に第3のバンドが存在する。これらの結果は、試料2では、大部分のCTPが大断片に連結されていないことを示している。試料の一部分は再結合されたように見える。
【０１５９】
TCEP処理のないスペクトルは、測定されたMW avgで、42,729.46、45,994.89および46,844.14Daの3つの支配的なピークを示した（表9）。42,729.46のピークは、LFの理論質量（42,729.0Da）、残基12-390と一致した。45,994.89の成分は、LFプラスCTP2（残基12-390 + 451-475）の理論質量（45,995.0Da）と一致した。46,844.14成分は、LFプラスCTP1（残基12-390 + 444-475）の理論上のMW平均（46,843.72Da）と一致した。
【０１６０】
表9
非還元条件下での試料2のインタクトな分子量分析
【表９】
2018529652.tif 000012
【０１６１】
50mMのTCEP処理によるスペクトルは、MW平均42,729.27を有する1つの成分のみを示した（表10）。このスペクトルウィンドウではCTPは捕捉されなかった。これらの結果により、DTT処理がCTPを放出し、DTTを除去した後、CTPの一部がLFと再結合したことが確認された。
【０１６２】
表10
還元条件下での試料2のインタクトな分子量分析。
【表１０】
2018529652.tif 000013
【０１６３】
試料3 LFの調製および特徴付け  DIG-177トリプシン生成LFおよびCTPを分離するために、トリプシン消化後のIEC精製を還元条件下（5mM DTT）で行った。試料を非還元SDS-PAGEにより分析した。トリプシン処理された非還元試料は、約46kDaの予想される分子量で移動し、CTPに結合したLF（12〜390）の両方と一致した。開始時物質試料（調製中にDTTで処理）は、実質的に速く移動し、CTPの欠失と一致した。LFからCTPを差し引いたものが画分3で得られた。
【０１６４】
画分3の組成を確認するために、試料をインタクトな分子量分析に供した（表11）。TCEP処理のないスペクトルは、MW平均42,729.76Daの優占種ならびに45,995.19Daのマイナー成分を示した。42,729.76Daの優占成分は、トリプシンLF（残基12-390）の理論的MW平均（42,729.0Da）と一致し、CTPが除去されたことを確認した。45,995.19Daのマイナー成分は、LF（残基12-390）およびCTP2（残基451-475）からなる第2の種の理論的MW平均45,995.0Daと一致し、精製中に還元が完了しなかったことを示している。これらの結果により、試料の大部分がCTPなしのLFを表すことが確認された。
【０１６５】
表11
還元条件下での試料3のインタクトな分子量分析
【表１１】
2018529652.tif 000014
【０１６６】
試料4  C末端ペプチド（CTP）の単離および特徴付け  非還元条件下で精製したトリプシン消化DIG-177（上記参照）を5mM DTTで処理してC末端ペプチドを放出させた。処理した試料を、10kDa MWCO（Millipore）を有する遠心フィルター装置に通した。C末端ペプチドはフロースルーに存在し、大きな断片は濾過ユニットに保持された。フロースルーおよび保持された試料を回収し、透析によって緩衝液を10mM CAPS（pH10）で交換した。
【０１６７】
C末端ペプチド試料（試料4）をMALDI-TOF / TOF MSで分析してペプチド質量を決定し、続いてLIFTモードで断片化してペプチドの配列を確認した。MALDI-TOF MSおよびMS / MSは、Bruker UltraFlextreme（商標）質量分析計を用いて行った。C末端ペプチド試料を0.2％TFA（トリフルオロ酢酸）で1：1（v/v）で希釈し、C-18 Ziptip（Millipore）を用いて脱塩した。ペプチドを0.1％TFA中の60％アセトニトリル（ACN）で溶出し、2,5-ジヒドロキシ安息香酸（DHB）マトリックス（ACN：H2O（50:50）中15mg/mL）と混合した。1μLの混合物をMALDI試料プレート上にスポットした後、ペプチド質量を反射陽性モードを用いて分析し、ペプチドをLIFTモードを用いて断片化した。この機器をCM 2（calibration mixture 2、ペプチド質量標準キット（Peptide mass standards kit）、カリフォルニア州フォスターシティ Applied Biosystems Sciex）で較正した。質量スペクトルを収集し、フレックス解析ソフトウェアを用いて分析した。BioToolsソフトウェア（Bruker）およびMASCOT検索エンジン（マサチューセッツ州ボストン Matrix Science）を用いて配列を確認した。MALDI MSは、4,114.894、3,266.38、および2,154.933Daの3つのメジャーピーク、およびいくつかのマイナーピークを示した（表12）。4,114.89m/zのピークは残基444-475（CTP1）を示す理論上の質量4,113.66と一致した。3,266.38m/zのピークは残基451-475（CTP2）を示す理論上の質量3,265.26と一致した。2,154.933m/zのピークは、C末端のペプチドと一致せず、その由来は未だ決定されていない。
【０１６８】
表12
還元条件下での試料2のインタクトな分子量分析
【表１２】
2018529652.tif 000015
【０１６９】
2つのペプチド、m/z 4,114.894および3,266.38Daを、MALDI MS/MSによって配列決定した。 その結果により、配列番号51の残基444-475のCTP1配列と一致する配列NSNLEYKCPENNFMIYWYNNSDWYNNSDWYNN（下線の残基が同定され、割り当てられた）を有する4,114.894ピークが確認された。3,266.38ピークは、配列番号52の残基451-475のCTP2配列と一致する配列CPENNFMIYWYNNSDWYNNSDWYNNを有していた。
【０１７０】
試料1〜4の殺虫活性  非休眠性WCR卵（ミネソタ州ファーミントン Crop Characteristics Inc.）を土壌中28℃で10日間インキュベートした。これらの卵を土壌から水で洗浄し、10％ホルムアルデヒドで表面殺菌し、滅菌水で3回リンスした。これらの卵は、孵化し、独自のWCR食餌を与えられた。オーバーレイ食餌バイオアッセイ（Overlay diet bioassays）を、24ウェルタイタープレートで実施し、各ウェルは、1.5mLの人工WCR食餌を含有した。試験試料を100μg/cm2用量（80μL）で食餌表面上に適用し（特に明記しない限り）、ラミナーフローで室温で乾燥させた。各ウェルの処理食餌表面に5匹のD. virgifera生まれたばかりの幼虫（24〜48時間齢）を寄生させ、試験昆虫をBreathe Easy（登録商標）ガス透過性カバーを有するバイオアッセイプレートに封入し、プレートを密封し、制御された環境条件下で保持した（28℃、24時間暗期、相対湿度60-80％）。一反復試験につき、20匹の昆虫を試験した。5日間のインキュベーション後に、処理当たりの生存昆虫、死亡した昆虫および昆虫のプールした生体重の数値を記録した。死亡した昆虫の数と生き残った昆虫の体重を記録した。
【０１７１】
パーセント死亡率およびパーセント成長阻害を各処置について計算した。成長阻害（ＧＩ）は以下のように算出された：
GI = [1 - (TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]、
式中、TWITは治療中の昆虫の総重量（Total Weight of Insects in the Treatment）、TNITは治療中の昆虫の総数（Total Number of Insects in the Treatment）、TWIBCはバックグラウンド検証（緩衝液対照）中の昆虫の総重量（Total Weight of Insects in the Background Check）、TNIBCはバックグラウンド中の昆虫の総数検証（緩衝液対照）（Total Number of Insects in the Background Check）を示す。陰性対照は、20mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH3.5）、10mM CAPS緩衝液（pH10）および350μg/cm2 Cry1Faであった。陽性対照は、クエン酸ナトリウム緩衝液中の100μg/cm2 Cry34/35Ab1および/またはCAPS緩衝液中の100μg/cm2 DIG-177であった。トリプシン処理したDIG-177の試料1〜4を、100μg/cm2（LC50DIG-177〜40μg/cm 2）でバイオアッセイした。バイオアッセイの結果を表13に要約し、Cry1Faおよび2つの緩衝液試料を陰性対照として使用した。全長DIG-177を陽性対照として用いた。
【０１７２】
試料1では、大きな断片+CTPは全長陽性対照とほぼ同等の殺虫活性を示した。試料2は、放出されたCTPを含む大きな断片であり、試料中に存在していたが、DTTで処理し、続いて透析すると、殺虫活性が実質的に低下することが示され、低くはあるが測定可能な活性を有した。分析用質量分析データは、CTPのいくつかが大きな断片と関連してこれらの試料中に活性毒素複合体を生成することを示す。試料3および4、大きな断片およびCTPを別々に試験した。 すべての場合において、これらの試料は、この単一用量で陰性対照と顕著に異なる活性を示さず、両方の断片が必要であることが示された。
【０１７３】
表13
ウェスタンコーンルートワームに対するトリプシン処理DIG-177試料1〜4の殺虫活性
【表１３】
2018529652.tif 000016
*100μg/cm2に曝露した後の初齢ウェスタンコーンルートワームの平均幼虫死亡率（％）および平均成長阻害率（％）。陰性対照は、350μg/cm2のCry1Fa、10mMのCAPS（pH10）および20mMのクエン酸ナトリウム（pH3.5）緩衝液であり、陽性対照は100μg/cm2のCry34/35Ab1であった。
【０１７４】
表14
TcdA、Cry34/35Ab1、およびDIG-1000の用量応答
【表１４】
2018529652.tif 000017
【０１７５】
実施例4：
DIG-177のカルボキシ末端の遺伝的欠失
DIG-137（配列番号53）、DIG-138（配列番号55）、DIG-147（配列番号57）、DIG-148（配列番号59）、およびDIG-149（配列番号61）の5つのコード領域は、DIG-177のカルボキシ末端の連続的欠失を生じさせ、実施例2の記載のような発現をもたらした。組換えタンパク質は、シュードモナス（Pseudomonas）宿主細胞の可溶性画分に蓄積し、以下のように精製した：-80℃の冷凍庫から得た組換えタンパク質含有細胞ペーストを-20℃に一晩移し、抽出緩衝液（50mMトリス、5mM EDTA（pH8.0））に再懸濁した。これをホモジナイザーで完全に混合し、30％デューティサイクルで平坦な先端（プローブ）を有する250（Branson）Sonifierを用いて3分5サイクルで超音波処理した後、氷上で各サイクル後5分間休止した。細胞溶解後、混合物を4℃で25分間、22,000xgで遠心分離した。上清を0.45μmフィルターで濾過した。精製は、イオン交換および疎水性相互作用樹脂を用いる2段階クロマトグラフィープロトコルであった。最初に、上清を、50mM Tris、5mM EDTA（pH8.0）で予め平衡化したQカラム（ニュージャージー州ピスカタウェイ GE Healthcareの5mL HiTrap Q HPカラム）に注入し、タンパク質を0〜0.6M NaCl塩勾配で溶出した。UV吸光度に基づいて画分を集め、SDS-PAGEで検証した。組換えタンパク質を含有する画分をプールし、緩衝液A+2Mアンモニアスルフェート（1：1比）で希釈し、最終アンモニアスルフェート濃度は1Mに達した。試料をPhenyl HICカラム（5mL HiTrap Phenyl FF GEヘルスケアの高度サブカラム）上に適用し、タンパク質を1-0 M(NH4)2SO4勾配で溶出した。標的タンパク質を含む画分をプールし、10kDa MWCO遠心フィルターで濃縮し、10mM COPS（pH10）に対して透析した。タンパク質濃度をBradfordおよびDensitometryによって測定した。
【０１７６】
タンパク質試料の組成を、実施例3に記載の質量分析によって確認した。物質は、実施例3の記載の通り、ウェスタンコーンルートワームに対する殺虫活性について試験された。結果は、残基444-475（DIG-137）の領域の欠失が、試験した濃度でDIG-177と類似の活性を有したことを示す。トリプシンで処理した場合、DIG-137は減少した活性を示したが、DIG-177は実施例3に示すように還元されていないと活性を保持した。
【０１７７】
この観察により、CTPがトリプシン処理の非存在下での活性に特に必要とされなかったことが実証された。より大きな欠失（DIG-138、DIG-147、DIG-148およびDIG-149）は、DIG-177対照よりも少ない殺虫活性を示した。これらの試料のトリプシン処理は、トリプシン処理されていない試料よりもWCRに対する殺虫活性を低下させた。これらの結果は、Cry6Aaのカルボキシ末端欠損を示したWeiらのものと一致し、残基382までは、タンパク質分解の非存在下で線虫に対していくらかの活性を維持した。これらの結果により、強力な殺虫活性を維持するために、残基390-475の間の領域でDIG-177ポリペプチドを安定化することの重要性が確認された。
【０１７８】
表14
WCRに対するカルボキシ末端欠失の殺虫活性
【表１５】
2018529652.tif 000018
*100μg/cm2の種々の試料に曝露した後の初齢ウェスタンコーンルートワームの平均幼虫死亡率（％）および平均成長阻害率（％）、2つのデータセットの平均。陰性対照は、350μg/cm2のCry1Fa、10mMのCAPS（pH10）および20mMのクエン酸ナトリウム（pH3.5）緩衝液であり、陽性対照は100μg/cm2のCry34/35Ab1であった。
【０１７９】
実施例5
C88-C451ジスルフィド結合の研究
殺虫活性変異体DIG-616（C163>A；（配列番号39））およびDIG-984（C88>A；451>A；（配列番号49））に対するcys88-cys451ジスルフィド結合の重要性を調べるために、実施例2および3に記載の通り特徴付けた。DIG-616およびDIG-984タンパク質は、予想される分子量および質量分析によるジスルフィド結合の数を有することが示された。
【０１８０】
表15
非還元条件下および還元条件下でのDIG-177変異体のインタクトな分子量分析
【表１６】
2018529652.tif 000019
【０１８１】
DIG-616およびDIG-984はいずれも、食餌バイオアッセイにおいて、100μg/cm2でDIG-177と同等のWCRに対する殺虫活性を有していた（表17）。トリプシンで処理した場合、DIG-616は殺虫活性を維持したが、DIG-984はトリプシンで処理した場合にDIG-616またはDIG-177より殺虫活性が低かった。質量分光分析は、トリプシン処理したDIG-616がCTPを保持し、DIG-984がCTPを失ったことを示し、タンパク質分解後のウェスタンコーンルートワーム活性（表16）のためのペプチドの必要性およびジスルフィド結合の非存在下でのLFおよびCTPの限定的アフィニティが確認された。
【０１８２】
表16
非還元条件下および還元条件下でのトリプシン消化後のDIG-177変異体のインタクトな分子量分析
【表１７】
2018529652.tif 000020
【０１８３】
表17
WCRに対するトリプシン処理有り・なしでのDIG-177および突然変異体の殺虫活性
【表１８】
2018529652.tif 000021
*100μg/cm2の種々の試料に曝露した後の初齢ウェスタンコーンルートワームの平均幼虫死亡率（％）および平均成長率（％）。陰性対照は、350μg/cm2Cry1Fa、10mM CAPS（pH10）および20mMクエン酸ナトリウム（pH3.5）緩衝液であり、陽性対照は100μg/cm2DIG-177であった。
【０１８４】
実施例6：
DIG-177のプロテイナーゼK消化
DIG-177タンパク質のタンパク質分解感受性は、プロテイナーゼKを用いて決定した（プロテイナーゼKは、トリプシンよりも広い特異性を有し、脂肪族残基および芳香族残基のカルボキシル側で切断するが、トリプシンはリジンおよびアルギニン残基で切断した）。DIG-177試料タンパク質を実施例2に記載の通り調製した。20℃で穏やかに揺動させながら、プロテイナーゼK（ミズーリ州セントルイス SIGMA-ALDRICH）に40：1の質量比で濃度1mg/mLの50mM Tris（pH7.5）、2mM CaCl2中で消化した。0、5、10、30、50および90分で時点試料を採取し、PMSFを最終濃度5mMになるように添加することで消化を終結させた。0時点は、プロテイナーゼKを試料に添加した直後に採取した。実施例2および3に記載の通り、試料をSDS-PAGE、質量分析および昆虫バイオアッセイにより分析した。
【０１８５】
これらの条件下で全長DIG-177を50分間消化することにより、約43kDaの大きな断片が得られた。プロテイナーゼKの広い特異性のために、ペプチドの終点は、アミノ末端で残基5-73およびカルボキシル末端で残基386-456の不均一範囲であった。ペプチドの終点に依存して、場合によっては、CTP断片は、C88-C451ジスルフィド結合によって大きな断片に連結された。感受性のプロテイナーゼK領域は、実施例3に示されるトリプシン結果と一致することが見出された。
【０１８６】
実施例7
殺虫活性およびプロテイナーゼK安定性のためのDIG-177内部欠失の特徴付け
DIG-177のタンパク質分解的にプロセシングされた領域、配列番号2の残基およそ390-443にわたって、一連の連続的な欠失が行われた。第1の欠失セットは、タンパク質（DIG-921〜927（配列番号64、66、68、70、72、74、76）およびDIG-931（配列番号78）をもたらす5つのアミノ酸であり、第2は10（DIG-969〜973（配列番号80、82、84、86、88））、第3は（DIG-985〜997（配列番号90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114））は、15、20、25および43残基であった。各系列は、シュードモナス（Pseudomonas）で発現され、精製され、実施例2および3の記載の通り、ウェスタンコーンルートワームに対する殺虫活性について試験された。タンパク質の安定性は、上記のプロテイナーゼK消化による消化によって決定された。すべての場合において、突然変異タンパク質は殺虫活性を有していた。このタンパク質は、DIG-177とほぼ同程度にプロテイナーゼKに対して感受性であった。注目すべき例外は、より少ない消化を示した43アミノ酸欠失であるDIG-995（配列番号110）である。
【０１８７】
表18
DIG-177欠失の説明
【表１９】
2018529652.tif 000022
【０１８８】
実施例8
トリプシン処理されたDIG-177の結晶構造決定
封入体（IB）の調製   全長DIG-177（配列番号2）を発現するシュードモナス・フルオレッセンス由来細胞ペーストを-80℃の保存から4℃に移し、冷溶解緩衝液（50mM Tris、200mM NaCl、10％グリセロール、0.5％Triton X-100、20mM EDTA、1mM TCEP（pH7.5））中に20％w/vで再懸濁させ、手持ち式ホモジナイザーで完全に混合する。次いで、懸濁液をMicrofluidizer（M-110EH）に16,000psiで2回通し、次いで遠心分離した（SLC-6000ローター/ 14,000g/40分/ 4℃）。上清を捨てた。封入体ペレットを、0.4g/Lリゾチーム（L-6876; Sigma-Aldrich）を含む10％w/v室温溶解緩衝液中に再懸濁させ、ホモジナイザーにより完全に再懸濁させた。懸濁液を30℃で30分間インキュベートし、10分ごとに手短なホモジナイズを行った。次いで、封入体を遠心分離し（SLC-6000ローター/14,000g/40分/4℃）、上清を捨てた。ペレットをホモジナイザーを用いて10％w/v冷溶解緩衝液中に最終的に再懸濁させ、遠心分離（SLC-6000ローター/ 14,000g / 40分/ 4℃）し、上清を捨てた。封入体ペレットを、ホモジナイザーを用いてTriton X-100（50mM Tris、200mM NaCl、10％グリセロール、20mM EDTA、1mM TECP（pH7.5））を含まない冷溶解緩衝液中に10％w/vで懸濁し、遠心分離し （SLC-6000ローター/14,000g/40分/4℃）、上清を捨てた。この工程を繰り返した。封入体を10mM EDTA（pH8.0）中で30％（w/v）に再懸濁するか、1.5mLアリコートに分注し、必要になるまで-80℃で凍結させた。
【０１８９】
DIG-177トリプシンコアの調製  完全長DIG-177の8個の2ml IB懸濁チューブを解凍し、10mM CAPS（pH11.0）の最終容量（1：5希釈）80mlで抽出した。pHは9.1と測定され、NaOHで11.0に調整された。抽出液に、50mgの新たに調製したトリプシン、（1mM HCl、5mM CaCl2）中の（25mg/mLトリプシン溶液（Sigma、T1426-1G TLCK処理）を添加する。pHを11.0に維持し、4℃で一晩攪拌した。
【０１９０】
この溶液を、流速10mL/分で緩衝液A（25mM CAPS（pH11.0））中で予め平衡化したSource15Q 16/10カラムに適用し、緩衝液A+1M NaClの勾配で75分かけて溶出した。短縮型DIG-177は、単一の大きなピークとして溶出し、4℃、5000ｘgでJA-12ローター内で4つの15ml Amicon 10,000 MWCOスピン濃縮器を用いて100mLから10mLに濃縮した。濃縮イオン交換試料を、25mM CAPS（pH11.0）、および50mM NaClで予め平衡化したSuperdex 75 26/90ゲル濾過カラムに適用した。試料を2.5mL/分の流量を用いて溶出した。大きなDIG-177コアピークに含まれる画分をプールした（2.05mg/mLで80mL）。
【０１９１】
全長DIG-177の調製  約500mgのIBを4℃で解凍し、4℃で25分間、23,000xgで遠心分離した。上清を除去し、IBペレットを30mL、100mM CAPS（pH11.0）に可溶化し、懸濁液を室温で2時間静かに揺り動かし、DIG-177タンパク質を可溶化した。可溶化後、混合物を4℃で25分間、23,000×gで遠心分離した。上清を25mM CAPS（pH 10.0）に対して一晩透析した。
【０１９２】
次に、緩衝液で交換したDIG-177試料を0.22ミクロンシリンジフィルターで濾過し、5mL/分の流量でSource 15Q 16/6イオン交換カラムに適用した。カラムを緩衝液A（25mM CAPS（pH10））で予め平衡化した。20％、30％、40％および50％の緩衝液B（緩衝液A+1M NaCl）の段階的勾配でタンパク質を溶出させた。各溶出は約50mLであった。各溶出液からUV吸光度に基づいて画分を集め、SDS-PAGEで分析した。
【０１９３】
全長DIG-177を、プールされ、10kDa分子量カットオフ膜（Millipore）を有する遠心フィルター装置を用いて約30mLに濃縮された20％B画分に入れた。
【０１９４】
濃縮した試料をさらにサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。各実験について、4.0mLの試料を、25mM CAPS（pH10）、50mM NaCl緩衝液中で2.5mL/分の流量で予め平衡化したSuperdex 75 26/90ゲル濾過カラム上に適用した。2つのピークが観察され、最初のピークは、空隙体積で溶出され、DIG-177二量体を含んでいた。ピーク2からの画分は、主にモノマーを含有していた。ピーク2からの画分を別々にプールし、結晶化実験に供した。
【０１９５】
タンパク質濃度決定   1000μLの作用試薬を50μlの試薬に添加したことを除き、製造業者の指示に従ってBCAアッセイ（ニューヨーク州 グランドアイランド Pierce Life Technologies）を行った。1000μLの作用試薬を20μLの試料に加えたことを除き、Bradfordタンパク質アッセイ（米国カリフォルニア州ハーキュリーズ Bio-Rad）を製造業者の指示に従って実施した。
【０１９６】
DIG-177トリプシンコアの結晶化、データ収集および構造決定  DIG-177トリプシンコアを100mg/mLに濃縮した。Rigaku Reagents、Inc.のWizard Classic I（ワシントン州ベインブリッジアイランド）を用いて初期結晶を得た。複数の条件をスクリーニングした後、20％（w/v）PEG1000、0.1Mリン酸ナトリウム/クエン酸（pH4.2）；0.2M硫酸リチウムから適切な結晶を得た。LS-CAT（Advanced Proton Sources、Argonne National Laboratory）のMar CCD-300検出器で単結晶から100Kでデータを収集した。セル定数は、a=112.07、b=112.07、c=76.6、α= 90.0、β= 90.0、γ=120.0であった。原情報源（home source)での最初のデータ収集では、空間群P65またはP61が示唆された。 従って、データは最初にP65で処理された。しかしその後の分析により、空間群はP63であるという認識に至った。
【０１９７】
DIG-177毒素の切断型の構造は、PHASER（1）（CCP4パッケージ（Winn、M.D.ら、2011））を用いた分子置換法、続いて手動での再構築とモデルの改良によって解明された。残基19〜334からなるBacillus cereus由来のHemolysin B（Protein Data Bankエントリー2NRJ）の結晶構造のポリアラニン鎖を検索モデルとして使用した。最終的なモデルは、COOT（Emsleyら、2010）を用いた手動モデル構築、それに続くREFMAC（Murshudovら、1997）による抑制された精密化からなる数サイクルの精密化を行うことによって得られた。
【０１９８】
表19
DIG-177トリプシン処理（PDB：）の結晶学的データ収集および精密化統計
【表２０】
2018529652.tif 000023
Rmerge =100Σ（h）Σ（i）| I（i）-<I> | /Σ（h）Σ(i) I (i) 式中、<I>はi番目の反射hの強度測定値であり、<Ｉ>は複数の観察による平均強度である。
b Rcryst = Σ||Fobs|-|Fcalc||/ Σ|Fobs|. 式中、FobsおよびFcalc はそれぞれデータおよびモデルからの構造因子の振幅である。Rfreeは構造因子の10％のRcrystである。
【０１９９】
全長DIG-177の結晶化、データ収集、および構造決定  全長DIG-177タンパク質を、10mM HEPES緩衝液（pH7.5）および25mM NaCl中の10kDa分子量カットオフ（Millipore）を有するAmicon遠心分離フィルターを用いて15mg/mLに濃縮した。初期結晶化スクリーニングは、Mosquito Robotic System (英国ハートフォードシャー TTP LabTech）を使用し、96-丸底ウェル結晶化プレート（ドイツGreiner Bio-One GmbH）のシッティングドロップ法により、市販のClassics、Classics Lite、Classics II、PEG's、PEG's II、PhClearおよびPACTスクリーン（カリフォルニア州アリソ・ビエホ Hampton Research） を用いて行った。回折品質DIG-177タンパク質結晶を、3μLのタンパク質試料および1.5μLのリザーバー溶液（0.1Mクエン酸（pH4.6）、4％PEG6,000）を含有するシィッテングドロップから291Kで成長させた。結晶をSDS緩衝液に溶解することによって得られたタンパク質試料のSDS-PAGE分析は、分解産物を全く示さず、データ収集に使用した3ｓ中には完全長DIG-177タンパク質のみが存在することが確認された。
【０２００】
データ収集のために、結晶をリザーバー溶液中の20％（v/v）グリセロールで回収した。LS-CAT（Advanced Proton Sources、Argonne National Laboratory）のMar CCD-300検出器で単結晶から100Kで回折データを収集した。HKL-2000を用いてデータを索引付けして処理した（Z. Otwinowski及びW. Minor、1997）。結晶は斜方晶系空間群P21212に属し、非対称単位当たり1分子の完全長DIG-177を含んでいた。
【０２０１】
全長DIG-177の構造は、検索モデルとしてのDIG-177の切断型構造を有するPHASER（McCoy、A.J.J.Appl.Cryst（2007））を用いた分子置換によって解明された。完全長DIG-177毒素の最終モデルは、COOT（Winn、MDら、2011）を用いた手動モデル構築、それに続きREFMAC（Murshudovら、1997）による構造精密化からなるいくつかのサイクルを行うことによって得られた。
【０２０２】
表20
全長DIG-177のデータ収集および精密化統計
（PDB：提出を検証するロンダ）
【表２１】
2018529652.tif 000024
Rmerge =100Σ（h）Σ（i）| I（i）-<I> | /Σ（h）Σ(i) I (i) 式中、<I>はi番目の反射hの強度測定値であり、<Ｉ>は複数の観察による平均強度である。
b Rcryst = Σ||Fobs|-|Fcalc||/ Σ|Fobs|. 式中、FobsおよびFcalc はそれぞれデータおよびモデルからの構造因子の振幅である。Rfreeは構造因子の10％のRcrystである。
【０２０３】
トリプシン処理したDIG-177および全長DIG-177の分子構造  図2に示されるトリプシン処理されたCry6Aa（DIG-177）の分子構造のリボンダイヤグラムは、バンドル上に折り畳まれたαヘリカルヘアピン構造を有するαヘリックスバンドルコアからなる。構造的にDIG-177はαヘリックス溶血素として認識され、大腸菌Escherichia coli溶血素E（1QOY；Wallace 2000）およびBacillus cereusの溶血素BLのB成分（2NRJ；Madegowdaら、2008）との構造類似性を共有する。
【０２０４】
完全長DIG-177の分子構造は、トリプシン処理構造とほぼ重ね合わせることができ、125-128と387-451の間の残基は解析されず、387-452の間の残基をモデル化した。構造を図2に示す。
【０２０５】
実施例9
タンパク質分解安定性DIG-177変異体の構築
Cry6Aa (DIG-177)は、食餌バイオアッセイにおいて、ウェスタンコーンルートワーム（Diabrotica virgifera virgifera））に対する殺虫活性を有するBacillus thuringiensis由来の結晶タンパク質であることが示されている。およそ残基390-451の間の領域でのタンパク質分解は、殺虫活性の低下をもたらす。DIG-177のタンパク質分解感受性を制限するために、3D分子構造を用いてこの領域の置換リンカーを設計した。リンカーで置換されたセグメントは、残基381と残基457との間のいくつかの終点を使用した。いくつかのリンカーは、Chemical Computing Group（カナダ、ケベック州モントリオール）のMOE（Molecular Operating Environment）ソフトウェアのループモデラー機能を用いてモデル化した。
【０２０６】
新しい設計は、実施例4および6に記載の通り、精製され、殺虫活性および相対プロテイナーゼK耐性について試験されたシュードモナス菌Pseudomonasで発現された。この研究により、いくつかの変異体が、親タンパク質DIG-177よりも殺虫活性およびプロテイナーゼKに対する増加した耐性の両方を有することが実証された。
【０２０７】
表21
増加したプロテアーゼ耐性を提供するために試験されたDIG-177変異体
【表２２】
2018529652.tif 000025
リンカー配列は、スラッシュ記号の間に示される。ウェスタンコーンルートワームに対する殺虫活性を、実施例6に記載のプロテイナーゼKアッセイ（0＝DIG-177と類似のプロテイナーゼK感受性； +＝DIG-177より増加したプロテイナーゼK耐性）を用いて、死亡率（％）および相対プロテアーゼK耐性として示した。--は、DIG-177タンパク質内の欠失である。
【０２０８】
実施例10
DIG-1000の特徴付け
7残基リンカー：VATITSGでスレオニン387からプロリン452に置換した残基を有するCry6Aaの新しい変異体である、DIG-1000（配列番号116）が調製された。リンカー領域は、DIG-177トリプシンコアの3D結晶構造およびChemical Computing Group（カナダケベック州モントリオール）のMOE（分子操作環境）ソフトウェアのループモデラー機能を用いて選択された。リンカーは、より大きな感受性の高いループをより感受性の低いセグメントに置換することによって、タンパク質分解を制限するように設計された（図3参照）。
【０２０９】
DIG-1000は、実施例3に記載の通り、Pseudomonasで発現され、精製され、バイオアッセイされた。DIG-1000は、ウェスタンコーンルートワームに対して殺虫活性を有することが示された。
【０２１０】
表22
ウェスタンコーンルートワームに対するDIG-177およびDIG-1000の殺虫活性
【表２３】
2018529652.tif 000026
【０２１１】
プロテイナーゼK耐性  DIG-177およびDIG-1000を実施例3に記載の通り発現させ、精製した。実施例6と同様にプロテイナーゼK耐性に対する感受性についてタンパク質を試験した（図4）。DIG-177（54.2kDa）は、T＝0時点（プロテイナーゼ添加、直ちに回収された試料）で実質的な部分分解を示した。分解は、タンパク質分解的に安定なコアが90分で観察されるまで継続した。対照的に、DIG-1000（47.3kDa）はT＝0では分解を示さず、T＝5分で部分分解が観察され、10分で全長タンパク質の約50％が変換された。タンパク質分解的に安定なコアへの変換は50分で完了した。これらのデータにより、DIG-1000がin vitroでプロテイナーゼKに対して実質的により耐性であることが確認された。
【０２１２】
実施例11
DIG-1000の一過性トウモロコシ発現
DIG-177およびDIG-1000の一過性発現を、受粉後10〜12日に収穫した未成熟トウモロコシ（B104）胚の粒子照射を用いて試験した（国際特許第2014/028295A号；米国特許第2012/0060238Al号）。DIG-177（配列番号1）およびDIG-1000（配列番号115）のコード領域を、実施例1に記載のように再構築し、それぞれ配列番号3および配列番号137をもたらすトウモロコシ細胞における一過性試験のためにトウモロコシコドンバイアスを反映した。発現したタンパク質を葉緑体区画に向けるための輸送ペプチド（TraP）も、DIG-177およびDIG-1000で試験した。修飾されたコード領域は、配列番号32および配列番号139に示されており、それぞれ、ポリペプチド配列番号33および配列番号140をもたらす。
【０２１３】
表23に示すように、発現はトウモロコシユビキチンプロモーター、対象のコード領域、およびトウモロコシペルオキシダーゼ5 3'非翻訳領域を含むpUCベースのプラスミドから指向された。黄色蛍光タンパク質およびPAT（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）発現プラスミドを発現対照として用いた。
【０２１４】
表23
トウモロコシ胚の一過性発現に用いられるプラスミド
【表２４】
2018529652.tif 000027
【０２１５】
金粒子ストックは、滅菌2.0ml微量遠心管内で、0.6mgまたは1μm金マクロキャリア（カリフォルニア州ハーキュリーズ Bio-Rad）50mgを秤量することによって調製した。粒子をエタノールで3回洗浄し、続いて滅菌水で3回洗浄し、各洗浄で材料を微量遠心分離器により1500gで2分間回転させることによって収集した。粒子を500μlの滅菌50％グリセロールに懸濁し、-20℃で保存した。
【０２１６】
表面滅菌B104未成熟穂を胚の単離に用いた。3〜4穂の未成熟胚（受粉後10〜12日；1.8〜2.4mm）を、2.2〜4.3g/LのMS塩（MurshigeおよびSkoog、1962）および1 ml/Lの修飾MSビタミン溶液（1000x）、または4.3 LS培地（LinsmaierおよびSkoog, 1965）および1ml/LのChu N6ビタミン溶液（1000x）、68.4g/Lのショ糖、36g/Lのグルコース、100〜700mg/mLのL.プロリンのいずれかの液体1.75ml、また1.5mg/Lの2,4 D（2,4-ジクロロフェノキシ酢酸）を含みまたは含まずに、2mlμ微量遠心管内に単離した。
【０２１７】
胚分離後、液体培地を除去して捨てた。次いで、浸透処理のための半固体培地を含有するペトリ皿上で胚を培養した。この培地は、4.3g/LのMS塩、1ml/Lの修飾MSビタミン溶液（1000x）、500mg/LのMES、100mg/Lのミオイノシトール、100mg/Lのカゼイン酵素加水分解物、120g/L のショ糖または45g/Lのソルビトールおよびマンニトールのいずれか、3.3g /Lのジカンバ有無を問わず、15mg/Lの硝酸銀、および2.5g/Lのゲルザン（ゼライト）からなる。胚は、粒子衝撃のために標的領域内に5×8平方グリッドで配置された。全てのプレートを24時間インキュベートした後、27℃で50μMの低光度チャンバ下で24時間の粒子衝撃を行った。
【０２１８】
金粒子を被覆する前に、それぞれのDNAを対象の構築物から、標準遺伝子PATを含む対照構築物と1：1の比で混合した。さらに、YFP遺伝子を含有する構築物由来のDNAを、視覚的対照としての形質転換のために使用した。上記の50μlの金粒子ストックを含有する試験管の各々を、滅菌2.0ml試験管中に懸濁した。以下のものを各金粒子チューブに添加した：試験構築物DNA（5μg）/pDAB112364の対照構築物DNA（5μg）、50μlの2.5M CaCl2および20μlの0.1Mスペルミジン。次いで、試験管を室温で10-15分間高速でボルテックスした。200μlの100％エタノールで3回洗浄し、最後にコーティングした金粒子を30μlの100％エタノールに再懸濁し、全ての試験管を氷上に置いた。
【０２１９】
試験した構築物の各々について2つのマクロキャリアを標識し、5μlのDNA/Gold混合物をマクロキャリアの中心に均一に広げ、10分間乾燥させた。650〜1100psiの範囲の破裂ディスク（カリフォルニア州ハーキュリーズ Bio-Rad）を70％プロパノールで滅菌し、衝撃の前に部分的に乾燥させた。それぞれの構築物について40の胚を含む2枚のプレートに衝撃を与えた。衝撃を与えた胚を24時間同じ培地に維持し、50μMの低照度条件下、27℃で一晩インキュベートした。
【０２２０】
24時間の衝撃後、対照構築物pDAB100286を有する形質転換胚のYFP発現が観察された。この対照を用いて、DNA/金被覆処理ならびに粒子衝撃処理をモニタリングした。対照胚におけるYFP発現を確認した後、試験された構築物の各々からの2枚のプレートをタンパク質分析のためにサンプリングした。各試料は、形質転換プロセス、ならびにタンパク質分析のための複数の技術的反復試験を可能にする20の胚を含んでいた。各構築物の合計4つの試料をタンパク質分析のために提出した。
【０２２１】
衝撃およびインキュベーションの後、分析の日まで、試料を96ウェルクラスターチューブラックに-80℃で保存した。2つのDaisy（商標）スチールBBおよび300μlの抽出緩衝液（0.05％のTween20および5μl/mLのSigmaプロテアーゼ阻害剤を含有するPBS溶液、カタログ番号9599）を各試験管に添加した。試料を最大設定で3分間、Kelcoビーズミルで粉砕した。試料を3,000×gで5分間遠心分離した。100μlの上清を空の試料管に移した。
【０２２２】
従来の電気泳動およびブロッティング（Gallagher S.ら、2008）の方法をInvitrogen（商標）装置および塩基性試薬とともに使用した。ウサギ抗Cry6a抗体は、Cry6aの検出のための一次抗体であった。全てのタンパク質をCy3蛍光検出システムで検出し、GE Typhoon（商標）撮像システム（ペンシルバニア州ピッツバーグ GE Healthcare）を用いてスキャンした。
【０２２３】
発現実験の結果を図5に示す。ウェスタン分析では、非衝撃トウモロコシ胚、またYFPおよびPATプラスミドで衝撃を与えた胚を含む陰性対照において、Cry6Aaタンパク質の発現は示されなかった。2つの右端のレーンは、DIG-177、全長Cry6Aa（54.1kDa）およびDIG-1000（47.3kDa）のタンパク質標準である。DIG-177+TraPレーンは、標準より上に微弱なバンドを含み、前駆体タンパク質を表とみられる。他の3つのバンドが存在し、一つはDIG-177標準に近いサイズであり、他の二つは実質的により小さく、部分的な分解を示すとみられる。DIG-177レーンは類似のパターンを示すが、推定前駆タンパク質は存在しない。DIG-1000とDIG-1000+TraPは、DIG-1000標準（ゲルの最終レーンの歪みの原因となる）で移行するように見える単一バンドと同一である。これらのデータは、ウェスタンコーンルートワーム制御に有用な、植物細胞安定性、殺虫性タンパク質を発現するDIG-1000コード配列と一致する。
【０２２４】
実施例12
DIG-1000殺虫毒素の安定な双子葉発現
シロイヌナズナ（Arabidopsis）形質転換  シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）Col-01は、フローラルディップ法（WeigelおよびGlazebrook、2002）を用いて形質転換される。選択されたAgrobacteriumコロニーを使用して、選択のための適切な抗生物質を含むYEPブロスの1m〜15mLの培養物に接種する。培養物を220rpmで一定の攪拌をしながら28℃で一晩インキュベートする。各培養物を用いて、選択のための適切な抗生物質を含むYEPブロスの500mL培養液2つを接種し、新しい培養物を、絶え間なく攪拌しながら28℃で一晩インキュベートする。細胞を室温で約8700×gで10分間ペレット化し、得られた上清を捨てる。細胞ペレットを、以下を含有する500mLの浸透培地中に静かに再懸濁する。1/2x MurashigeおよびSkoog salts (Sigma-Aldrich)/Gamborg's B5 vitamins（ミズーリ州セントルイス Gold BioTechnology）、10％（w/v）ショ糖、0.044μMベンジルアミノプリン（DMSO中10μL/リットルの1mg/mLストック）および300μL/リットルのSilwet L-77。約1ヶ月齢の植物を15秒間培地に浸し、最新の花序が浸水するように注意を払う。その後、植物を横にして置き、24時間被覆（透明または不透明）し、水で洗浄し、直立させる。植物を、22℃、16時間の明期/ 8時間の暗期で成長させる。浸漬の約4週間後、種子を収穫した。
【０２２５】
シロイヌナズナ（Arabidopsis ）の成長と選択   新たに採取したT1種子を、乾燥剤の存在下、室温で少なくとも7日間乾燥させる。種子を0.1％寒天/水（Sigma-Aldrich）溶液中に懸濁させ、次いで4℃で2日間層状化する。植え付けの準備として、10.5インチ×21インチの発芽トレイ（ミネソタ州クリアウォーター T.O. Plastics Inc.）中のSunshine Mix LP5（ワシントン州ベルビュー Sun Gro Horticulture Inc.）を、微細なバーミキュライトで被覆し、ホーグランドの溶液（HoaglandおよびArnon、1950）で濡れるまで亜灌漑し、その後24時間排水させた。層状種子をバーミキュライト上に播種し、湿度ドーム（カナダオンタリオ州ブラマリー KORD Products）で7日間被覆した。種子は発芽し、Conviron（商標）成長チャンバ（モデルCMP4030またはCMP3244；カナダマニトバ州ウィニペグ Controlled Environments Limited）で、長日条件（明期16時間/暗期8時間）下、120〜150μmol/m2秒の光強度、一定温度（22℃）および湿度（40〜50％）下で成長させた。植物は最初にHoaglandの溶液で、その後脱イオン水で濡らして土壌を湿った状態であるが濡れていない状態に維持する。
【０２２６】
ドームは、播種の5〜6日後に除去され、植物に化学選択剤を噴霧して、非形質転換種子から発芽した植物を殺す。例えば、バイナリー植物形質転換ベクターによって提供される植物発現可能な選択マーカー遺伝子がpatまたはbar遺伝子である場合（Wehrmannら、1996）、形質転換植物は、1000倍のFinale（5.78％グルホシネートアンモニウム、アリゾナ州フェニックス Farnam Companies Inc.）を噴霧することにより選択され得る。その後の2回の噴霧は、5〜7日間隔で行われる。生存者（活発に生育する植物）は、最終噴霧の7〜10日後に同定され、Sunshine Mix LP5で調製されたポットに移植される。移植された植物を加湿ドームで3〜4日間被覆し、上記の成長条件下でConviron（商標）成長チャンバに配置する。
【０２２７】
双子葉植物形質転換の当業者は、他の植物発現可能な選択マーカー遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）が使用される場合、形質転換植物の他の選択方法が利用可能であることを理解するであろう。
【０２２８】
トランスジェニックシロイヌナズナ（Arabidopsis）の昆虫バイオアッセイ  DIG-1000殺虫性毒素タンパク質を発現するトランスジェニックシロイヌナズナ（Arabidopsis）系統は、人工食餌オーバーレイアッセイにおいて感受性昆虫種に対して活性であることが実証されている。トランスジェニックおよび非トランスジェニックのシロイヌナズナ（Arabidopsis）系統から抽出したタンパク質を適切な方法で定量し、タンパク質の濃度を標準化するために試料体積を調整する。バイオアッセイは、上記の人工食餌について実施される。非トランスジェニックシロイヌナズナ（Arabidopsis）および/または緩衝液および水はバックグラウンド検証処理としてアッセイに含まれる。
【０２２９】
実施例13
DIG-1000殺虫毒素の安定なトウモロコシの発現
トウモロコシのアグロバクテリウム（Agrobacterium）介在性形質転換。High II F1クロス（Armstrongら、1991）の種子を、95％のMetro-Mix 360未処理成長培地（ワシントン州ベルビュー Sun Gro Horticulture）と5％の粘土/ローム土壌の混合物を含有する5ガロンポットに植え付ける。植物は、高圧ナトリウムとメタルハライドランプの組み合わせを用いて、16時間の明期／8時間の暗期で温室内で成長させる。形質転換のための未成熟なF2胚を得るために、制御された同胞授粉が行われる。未成熟胚は、受粉後8〜10日に、胚が約1.0〜2.0mmのサイズである場合に単離される。
【０２３０】
寄生および共培養  トウモロコシの穂を液体石鹸で洗い、70％エタノールに2分間浸漬し、20％の市販漂白剤（0.1％次亜塩素酸ナトリウム）に30分間浸漬した後、滅菌水ですすいで滅菌する。スペクチノマイシン100mg/L、テトラサイクリン10mg/Lおよびストレプトマイシン250mg/Lを含むYEP固体培地上で生育した1〜2白金耳の細菌を、28℃で2〜3日間、100μMのアセトシリンゴンを含む5mLの液体感染培地（LS Basal Medium（LinsmaierおよびSkoog、1965）、N6ビタミン（Chuら、1975）、1.5mg/Lの2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）、68.5 gm/L ショ糖、36.0gm/Lグルコース、6mM L-プロリン（pH5.2））に移すことにより、スーパーバイナリーベクターを含む懸濁アグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞を調製する。この溶液を、均一な懸濁液が得られるまでボルテックスし、紫色フィルターを備えたKlett-Summerson比色計または600nm（OD600）で測定した同等の光学濃度を用いて、濃度を200Klett単位の最終密度に調整する。未成熟胚を2mLの感染培地を含む微量遠心管に直接単離する。培地を除去し、密度200Klett単位または同等のOD600を有する1mLのアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液と交換し、アグロバクテリウム（Agrobacterium）および胚の溶液を室温で5分間インキュベートし、次いで共培養培地（LS Basal Medium、N6ビタミン、1.5mg/L 2,4-D、30.0gm/L ショ糖、6mM L-プロリン、0.85mg/L AgNO3,、100μMアセトシリンゴン、3.0gm/L Gellanガム（カンザス州レネックスサ PhytoTechnology Laboratories）(pH5.8））中で、25℃、暗条件下で5日間培養する。
【０２３１】
共培養後、胚を選択培地に移した後、形質転換単離株を約8週間にわたって得る。植物発現可能なpatまたはbar選択マーカー遺伝子を含むスーパーバイナリープラスミドで形質転換されたトウモロコシ組織の選択のために、LSベース培地（LS Basal培地、N6ビタミン、1.5mg/L 2,4-D、0.5gm/L MES（2-(N-モルホリノ）エタンスルホン酸水和物；PhytoTechnologies Labr.）、30.0gm/L ショ糖、6mM L-プロリン、1.0mg/L AgNO3、250mg/L セフォタキシム、2.5gm/L ジェランガム（pH5.7））がBialaphos（Gold BioTechnology）とともに使用される。胚を増殖胚発生単離株が得られるまで、ビアラホス（Bialaphos）3mg/Lを含む選択培地に移す。回収された単離株は、再生およびさらなる分析のために、2週間の間隔で新しい選択培地に移すことによって嵩上げ（bulked up）される。
【０２３２】
トウモロコシ形質転換の当業者であれば、他の植物発現可能な選択マーカー遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）が使用される場合、形質転換植物の他の選択方法が利用可能であることを理解するであろう。
【０２３３】
再生と種子生産  再生のために、培養物を「28」誘導培地（MS塩およびビタミン、30gm/L ショ糖、5mg/Lベンジルアミノプリン、0.25mg/L 2,4-D、3mg/L Bialaphos、250mg/Lセフォタキシム、2.5gm/L ジェランガム（pH5.7））に、低光条件（14 μEm-2s-1）で1週間、次いで高光条件下（約89 μEm-2s-1）で1週間移した。次いで、組織を「36」再生培地に移す（植物成長調節因子の欠如を除いて誘導培地と同じ）。小植物が3〜5cmの長さになると、それらはSHGA培地（SchenkおよびHildebrandt（1972）塩およびビタミン）； PhytoTechnologies Labr.）、1.0gm/L ミオイノシトール、10gm/L ショ糖および2.0gm/Lジェランガム（pH5.8））を含むガラス培養管に移され、芽および根をさらに成長および発育させる。植物は、本明細書で先に記載したのと同じ土壌混合物に移植され、温室内で開花するまで生育される。種子生産のための制御された受粉が行われる。
【０２３４】
実施例14
トランスジェニックトウモロコシのバイオアッセイ
植物細胞中で産生された本発明の殺虫性毒素を発現する安定に形質転換された植物の生物活性は、従来のバイオアッセイ法（例えば、Huangら、2006参照）によって実証される。例えば、制御された摂食環境において、操作されたCry6Aa殺虫性毒素を産生する植物由来の様々な植物組織または組織片を標的昆虫に与えることによって、有効性を実証することができる。あるいは、タンパク質抽出物は、操作されたCry6Aa殺虫性毒素を産生する植物に由来する様々な植物組織から調製され得、抽出されたタンパク質は、本明細書において既に記載された通り人工食餌バイオアッセイに組み込まれる。そのような給餌アッセイの結果は、操作されたCry6Aa殺虫性毒素を産生しない宿主植物由来の適切な制御組織を使用した同様に実施されるバイオアッセイ、または他の対照試料と比較されることが理解されるべきである。
【０２３５】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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