(57)【要約】  組織操作の方法、より具体的には、多様な血管新生3D組織（例えば3D血管新生胚様体及びオルガノイド）を作製するための方法及び組成物が記載される。ある種の実施態様は、機能的ヒト組織を作製する方法に関し、前記方法は以下の工程を含む：第一の血管ネットワーク及び第二の血管ネットワークを含み各血管ネットワークが1つ以上の相互に接続された血管チャネルを含む組織構築物に、胚様体又はオルガノイドを埋め込む工程；当該胚様体又はオルガノイドを、1つ以上の生物学的因子、生物学的因子勾配、圧、及び/又は酸素分圧勾配に暴露し、それによっては胚様体又はオルガノイドへ向かう及び/又は胚様体又はオルガノイドから出る毛細血管の脈管形成を誘導する工程；及び、当該胚様体又はオルガノイドが血管を新生させ、当該毛細血管が第一の血管ネットワークを第二の血管ネットワークに接続し、それによって単一の血管ネットワーク及び灌流可能組織構造を作製する工程。
2018506988.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、機能的なヒト組織を作製する方法：
胚様体又はオルガノイドを組織構築物に埋め込む工程であって、前記組織構築物が第一の血管ネットワーク及び第二の血管ネットワークを含み、各血管ネットワークが1つ以上の相互接続血管チャネルを含む、前記埋め込み工程；
当該胚様体又はオルガノイドを、1つ以上の生物学的因子、生物学的因子勾配、圧、及び/又は酸素分圧勾配に暴露し、それによっては胚様体又はオルガノイドへ向かう及び/又は胚様体又はオルガノイドから出る毛細血管の脈管形成を誘導する工程；及び
当該胚様体又はオルガノイドが血管を新生し、当該毛細血管が第一の血管ネットワークを第二の血管ネットワークに接続し、それによって単一の血管ネットワーク及び灌流可能組織構造を作製する工程。
【請求項２】
1つ以上の生物学的因子が以下の1つ以上を含む、請求項1に記載の方法：
増殖因子、モルフォゲン、小分子、薬剤、ホルモン、DNA、shRNA、siRNA、ナノ粒子、mRNA、修飾mRNA。
【請求項３】
1つ以上の相互接続血管チャネルが、血管形成、脈管形成又は細管形成の少なくとも1つを含むことができる機械的製造プロセス又は生物学的発生プロセスによって形成される、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
1つ以上の生物学的因子、生物学的因子勾配、圧、及び/又は酸素分圧勾配がさらに胚様体又はオルガノイドの発生、分化、及び/又は機能発揮を指令する、請求項1−3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
第一の血管ネットワーク及び第二の血管ネットワークを別個に対処することができる、請求項1−4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
第一の血管ネットワーク及び第二の血管ネットワークが互に接触しない、請求項1−5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
第一の血管ネットワークが動脈叢を含み、第二の血管ネットワークが静脈叢を含む、請求項1−6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
単一の血管ネットワークが相互貫入血管ネットワーク及び/又は分枝した相互貫入血管ネットワークを含む、請求項1−7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
単一の血管ネットワークが相互接続動脈及び静脈チャネルを含む、請求項1−8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
胚様体又はオルガノイドが、多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、前駆細胞、最終分化細胞、内皮細胞、内皮前駆細胞、不死化細胞株又は初代細胞の少なくとも1つを培養することによって作製される、請求項1−9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
胚様体又はオルガノイドが多能性又は多分化能性幹細胞を培養することによって作製される、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
培養が、ハンギングドロップ法、マイクロウェル内凝集、又はスピンニングバイオリアクターの使用によって低接着基質上で行われる、請求項10又は11に記載の方法。
【請求項１３】
埋め込み前、埋め込み中及び/又は埋め込み後に、胚葉体又はオルガノイドをさらに、多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、前駆細胞、最終分化細胞、内皮細胞、内皮前駆細胞、不死化細胞株又は初代細胞の少なくとも1つを含む組織に分化させる、請求項1−12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
胚様体又はオルガノイドが、大脳オルガノイド、甲状腺オルガノイド、腸管又は消化管オルガノイド、肝オルガノイド、膵オルガノイド、胃オルガノイド、腎オルガノイド、網膜オルガノイド、心オルガノイド、骨オルガノイド、及び上皮オルガノイドから成る群から選択される、請求項1−13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
胚様体又はオルガノイドが、1つ以上の生物学的因子に暴露されるか、及び/又は組織構築物内の1つ以上の生物学的因子の拡散による生物学的因子勾配に暴露される、請求項1−14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
胚様体又はオルガノイドが、1つ以上の生物学的因子に暴露されるか、及び/又は組織構築物内での1つ以上の生物学的因子を積載した素材の局所的沈積によって生物学的因子勾配に暴露される、請求項1−15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
胚様体又はオルガノイドが、1つ以上の生物学的因子に暴露されるか、及び/又は限局タンパク質翻訳による増殖因子の局所的de-novo生成によって生物学的因子勾配に暴露される、請求項1−16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
胚様体又はオルガノイドが、1つ以上の生物学的因子に暴露されるか、及び/又は1つ以上の生物学的因子の第一及び第二の血管ネットワークの一方又は両方の灌流を介する生物学的因子勾配に暴露される、請求項1−17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
第一及び第二の血管ネットワークの一方だけが1つ以上の生物学的因子を灌流させる、請求項1−18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
第一及び第二の血管ネットワークの両方が1つ以上の生物学的因子を灌流させ、第一の血管ネットワークの生物学的因子濃度が第二の血管ネットワークの生物学的因子濃度と相違する、請求項1−18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
第一及び第二の血管ネットワークの両方が1つ以上の生物学的因子を灌流させ、第一の血管ネットワークの生物学的因子濃度が、第二の血管ネットワークの生物学的因子濃度と同じである、請求項1−18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
生物学的因子が以下の増殖因子の1つ以上を含む、請求項1−21のいずれか1項に記載の方法：血管内皮増殖因子（VEGF）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、スフィンゴシン1リン酸（S1P）、ホルボールミリステートアセテート（PMA）、肝細胞増殖因子（HGF）、単球走化性タンパク質1（MCP-1）、アンギオポイエチンANG-1、アンギオポイエチンANG-2、形質転換増殖因子ベータ（TGF-β）、表皮増殖因子（EGF）、ヒト成長因子、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）、及びヒスタミン。
【請求項２３】
酸素分圧勾配が、灌流中に第一及び第二の血管ネットワークの一方又は両方に導入される、請求項1−22のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２４】
酸素分圧勾配が、脱酸素媒体を第一及び第二の血管ネットワークの一方に導入し、さらに第一及び第二の血管ネットワークの他方に含酸素媒体を導入することによって形成される、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
灌流が約1マクロリットル/分から約1リットル/分の流速で実施される、請求項18−24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２６】
第一及び第二の血管ネットワークの一方又は両方が灌流中に経壁圧を受ける、請求項18−25のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２７】
胚様体又はオルガノイドが、当該胚様体又はオルガノイドを組織構築物に埋め込む前に細胞外マトリックス素材中に被包化される、請求項1−26のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２８】
細胞外マトリックス素材がゲルを含む、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
胚様体又はオルガノイドが、胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団及び胚様体又はオルガノイド細胞の第二の集団を含む、請求項1−28のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３０】
胚様体又はオルガノイドが、多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、前駆細胞、最終分化細胞、内皮細胞、内皮前駆細胞、不死化細胞株、神経細胞、初代細胞又は前記の組み合わせの少なくとも2つを含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
胚様体又はオルガノイドが、大脳オルガノイド、甲状腺オルガノイド、腸管又は消化管オルガノイド、肝オルガノイド、膵オルガノイド、胃オルガノイド、腎オルガノイド、網膜オルガノイド、心オルガノイド、骨オルガノイド、及び上皮オルガノイドから成る群から選択される、請求項29−30のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３２】
胚様体又はオルガノイドが以下の工程によって作製される、請求項29−31のいずれかに記載の方法：
野生型細胞集団及び遺伝的に操作された誘導可能な細胞の集団を培地中で培養する工程；
遺伝的に操作された誘導可能な細胞の集団の胚葉体又はオルガノイド細胞の第一の集団への直進的分化及び/又はトランス分化を誘導する工程；
野生型細胞集団の胚様体又はオルガノイド細胞の第二の集団への分化を誘導する工程；及びそれによって少なくとも胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団及び胚様体又はオルガノイド細胞の第二の集団を含む胚様体又はオルガノイドを形成する工程。
【請求項３３】
遺伝的に操作された誘導可能な細胞の集団が、構成的プロモーター、小分子誘導性プロモーター、細胞自律性プロモーター、細胞非自律性プロモーター、選別マーカー又は前記の組み合わせの少なくとも1つを含むDNAデリバリーエレメントを導入することによって作製される、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団が、多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、前駆細胞、最終分化細胞、内皮細胞、内皮前駆細胞、不死化細胞株又は初代細胞を含む、請求項32−33のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
胚様体又はオルガノイド細胞の第二の集団が神経前駆細胞を含む、請求項32−34のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
神経前駆細胞が、興奮性ニューロン、抑制性ニューロン、運動ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、痛覚受容体ニューロン、星状細胞、乏突起神経膠細胞前駆細胞、乏突起神経乏突起膠細胞の少なくとも1つを形成する、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
遺伝的に操作された誘導可能な細胞の集団の直進的分化及び/又はトランス分化を誘導する工程が、転写因子、薬剤、小分子、増殖因子、モルフォゲン、ホルモン、DNA、shRNA、siRNA、ナノ粒子、mRNA、修飾mRNA、熱、光、及び機械的力から成る群から選択される少なくとも1つのキューを導入する工程を含む、請求項32−36のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
誘導される直進的分化及び/又はトランス分化が二次遺伝子誘導を伴う、請求項32−37のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
二次遺伝子誘導が、転写因子、薬剤、小分子、増殖因子、モルフォゲン、ホルモン、DNA、shRNA、siRNA、ナノ粒子、mRNA、修飾mRNA、熱、光、及び機械的力から成る群から選択される少なくとも1つのキューの提供を介する、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
二次遺伝子誘導のために選択されるキューが、遺伝的に操作された誘導可能な細胞の集団の直進的分化及び/又はトランス分化を誘導する工程のために選択されるキューと同じである、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団が、二次遺伝子の誘導のために更なる発生を経る、請求項32−37のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
二次遺伝子の誘導が構成的に活性なPKCタンパク質の発現を誘導し、それによって胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団のスプラウト行動及び神経突起伸長の少なくとも1つを強化する、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団が内皮細胞である、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
培養工程が、ハンギングドロップ法を介して、マイクロウェル内凝集を介して、又はスピンニングバイオリアクターの使用によって低接着基質上で行われる、請求項32−43のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団対胚様体又はオルガノイド細胞の第二の集団の比が1：1である、請求項32−44のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
培養工程が分化培地で行われる、請求項32−45のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
分化培地がドキシサイクリン（DOX）を含む、請求項32−46のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
1つ以上の相互接続血管チャネルが、は血管形成、脈管形成又は細管形成の少なくとも1つを含むことができる機械的製造プロセス又生物学的発生プロセスによって形成される、請求項1−47のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
1つ以上の生物学的因子、生物学的因子勾配、圧、及び/又は酸素分圧勾配が、さらに当該胚様体又はオルガノイドの発生、分化、及び/又は機能発揮を指令する、請求項1−48のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
野生型細胞集団が、人工多能性幹細胞（iPSC）又はiPSCから誘導される特許固有の細胞株を含む、請求項32−50のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
胚様体又はオルガノイドを組織構築物へ埋め込む工程が以下を含む、請求項1−50のいずれか1項に記載の方法：
1つ以上の細胞搭載フィラメントを基質上に沈積させて1つ以上の組織パターンを形成する工程であって、前記フィラメントの各々は複数の生存細胞を含み、当該組織パターンの各々が1つ以上の予め定められた細胞タイプを含む、前記工程；
1つ以上のサクリファイスフィラメントを当該基質上に沈積させて、当該1つ以上の組織パターンに相互貫入する血管パターンを形成する工程であって、当該サクリファイスフィラメントの各々が一過性インクを含む、前記工程；
当該血管パターン内に胚様体又はオルガノイドを沈積させる工程；
当該1つ以上の組織パターン及び血管パターンを細胞外マトリックス組成物で少なくとも部分的に取り囲む工程；及び
当該一過性インクを除去し、それによって埋め込まれた胚様体又はオルガノイドを含む組織構築物を形成する工程。
【請求項５２】
1つ以上の細胞搭載フィラメントの少なくとも一部が1つ以上の生物学的因子を含む、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
第一及び第二の血管ネットワークの一方又は両方が微細流チャネルを含む、請求項1−52のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５４】
複数の胚様体又はオルガノイドが組織構築物に埋め込まれる、請求項1−53のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５５】
胚様体又はオルガノイドが異なる表現型を含む、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
胚様体又はオルガノイドが同じ表現型を含む、請求項54に記載の方法。
【請求項５７】
さらに組織構築物のアレイを含み、埋め込み、暴露及び血管新生が各組織構築物で実施される、請求項1−56のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５８】
請求項1−58のいずれか1項に記載の方法によって形成される、機能的ヒト組織又は機能的ヒト組織のアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）本特許文書は、米国仮特許出願62/127,549（2015年3月3日出願）、米国仮特許出願62/250,338（2015年11月3日出願）及び米国特許出願62/294,118（2016年2月11日出願）（前記は参照により本明細書に含まれる）の出願日に関し35 U.S.C.セクション119（e）に基づき優先権を主張する。
本明細書に引用する全ての特許、特許出願及び刊行物並びに他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に含まれる。これら刊行物のその完全な開示は、本明細書で説明し特許請求する本発明の日付前の当業者に公知の最新技術をより詳しく説明するために、参照によりその全体が本明細書に含まれる。
（連邦政府支援の研究開発）本発明は、米国立衛生研究所（NIH）が提供するグラント番号1RM1HG008525-01により政府の支援を受けて達成された。当該政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
三次元の血管新生組織をオンデマンドで作製できることは、組織操作、薬剤スクリーニング、毒物学、3D組織培養及び器官修復で学術的及び技術的進歩を可能にするであろう。天然の組織（最終的には器官）を模倣する3D操作組織構築物を作製するためには、いくつかの重要成分（細胞、細胞外マトリックス（ECM）及び血管構造）を複雑な編成で組み立てることが必要とされよう。これら成分の各々が必須の役割を担っている。すなわち細胞は全ての生命系の基本単位であり、ECMは構造的支持を提供し、血管ネットワークは、効率的な栄養と老廃物の輸送、温度調節、必須因子のデリバリー及び長距離シグナリング経路を提供する。各細胞の数百ミクロン以内に灌流可能な血管構造がなければ、三次元組織は急速に壊死領域を生じる。組織構築物へ血管ネットワークを埋め込むことができないということが数十年間にわたって3D組織操作の進展を阻んできた。
半世紀前に実施された古典的実験は脊椎動物細胞の壮大な自己組織化能力を示した。完全に分解した後でも、細胞は再凝集して器官の本来の構造を再構築できる。より最近では、この目覚ましい特徴を用いて、組織又は胚性幹細胞から器官部分又は場合によっては完全な器官が再建された。そのような幹細胞由来三次元培養物はオルガノイドと称される。オルガノイドは、ヒト幹細胞から及び患者由来の人工多能性幹細胞から増殖させることができるので、それらは、人間の発育及び疾患並びに三次元の生体疑似環境のモデルとなる潜在能力を有する（Lancaster MA, et al., Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature 501(7467):373-9, 2013）。さらにまた、それらは薬剤試験、場合によっては将来の器官取替え戦略の潜在能力を有する（Lancaster et al., 2013）。オルガノイドはしばしばスピンニングバイオリアクターで発育させられる。
組織の発生及び疾患の研究の他に移植に適切な胚様体又はオルガノイド及び組織構築物を作製する新規な方法が希求される。
【発明の概要】
【０００３】
組織操作方法、より具体的には多様な血管新生3D組織（例えば3D血管新生胚様体及びオルガノイド）を作製する方法及び組成物が記載される。
ある種の実施態様は機能的なヒト組織を作製する方法に関し、前記方法は以下の工程を含む：第一の血管ネットワーク及び第二の血管ネットワークを含み各血管ネットワークが1つ以上の相互に接続される血管チャネルを含む組織構築物中に、胚様体又はオルガノイドを埋め込む工程；当該胚様体又はオルガノイドを、1つ以上の生物学的因子、生物学的因子勾配、圧、及び/又は酸素分圧勾配に暴露し、それによっては胚様体又はオルガノイドへ向かう及び/又は胚様体又はオルガノイドから出る毛細血管の脈管形成を誘導する工程；及び、当該胚様体又はオルガノイドが血管を新生し、前記毛細血管が第一の血管ネットワークを第二の血管ネットワークに接続し、それによって単一の血管ネットワーク及び灌流可能組織構造を作製する工程。当該1つ以上の生物学的因子は、増殖因子、モルフォゲン、小分子、薬剤、ホルモン、DNA、shRNA、siRNA、ナノ粒子、mRNA、修飾mRNAの1つ以上を含む。当該1つ以上の相互接続血管チャネルは、血管形成、脈管形成又は細管形成の少なくとも1つを含むことができる機械的製造プロセス又は生物学的発生プロセスによって形成され得る。1つ以上の生物学的因子、生物学的因子勾配、圧、及び/又は酸素分圧勾配はさらに当該胚様体又はオルガノイドの発生、分化、及び/又は機能発揮を指令することができる。第一の血管ネットワーク及び第二の血管ネットワークは別個に取り扱うことができる。第一の血管ネットワーク及び第二の血管ネットワークは互に接触しなくてもよい。第一の血管ネットワークは動脈叢を含むことができ、第二の血管ネットワークは静脈叢を含むことができる。単一血管ネットワークは相互貫入血管ネットワーク及び/又は分枝した相互貫入血管ネットワークを含むことができる。単一血管ネットワークは相互接続動脈チャネル及び静脈チャネルを含むことができる。胚様体又はオルガノイドは、多能性幹細胞、多分化能性（multipotent）幹細胞、前駆細胞、最終分化細胞、内皮細胞、内皮前駆細胞、不死化細胞株又は初代細胞の少なくとも1つを培養することによって作製できる。胚様体又はオルガノイドは多能性又は多分化能性幹細胞を培養することによって作製できる。培養は、ハンギングドロップ法、マイクロウェル内凝集、微細チャネル内凝集を介して、又はスピンニングバイオリアクターの使用によって低接着基質上で生じさせることができる。当該方法では、埋め込み前、埋め込み中及び/又は埋め込み後に、胚葉体又はオルガノイドをさらに、多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、前駆細胞、最終分化細胞、内皮細胞、内皮前駆細胞、不死化細胞株又は初代細胞の少なくとも1つを含む組織に分化させることができる。胚様体又はオルガノイドは、大脳オルガノイド、甲状腺オルガノイド、腸管又は消化管オルガノイド、肝オルガノイド、膵オルガノイド、胃オルガノイド、腎オルガノイド、網膜オルガノイド、心オルガノイド、骨オルガノイド、癌オルガノイド、又は上皮オルガノイドであり得る。胚様体又はオルガノイドは、1つ以上の生物学的因子に暴露するか、及び/又は組織構築物内の1つ以上の生物学的因子の拡散による生物学的因子勾配に暴露してもよい。また別に或いは前記に加えて、胚様体又はオルガノイドは、1つ以上の生物学的因子に暴露するか、及び/又��組織構築物内の1つ以上の生物学的因子を充填した素材の局所的沈積によって生物学的因子勾配に暴露してもよい。また別に或いは前記に加えて、胚様体又はオルガノイドは、1つ以上の生物学的因子に暴露するか、及び/又は局所的タンパク質翻訳による増殖因子の局所的de-novo生成によって生物学的因子勾配に暴露してもよい。また別に或いは前記に加えて、胚様体又はオルガノイドは、1つ以上の生物学的因子に暴露するか、及び/又は第一及び第二の血管ネットワークの一方又は両方を介する1つ以上の生物学的因子の灌流による生物学的因子勾配に暴露してもよい。当該方法では、第一及び第二の血管ネットワークの一方だけが当該1つ以上の生物学的因子を灌流させることができる。また別には、第一及び第二の血管ネットワークの両方が当該1つ以上の生物学的因子を灌流させることができ、第一の血管ネットワークの生物学的因子濃度は第二の血管ネットワークの生物学的因子濃度と相違する。また別には、第一及び第二の血管ネットワークの両方が当該1つ以上の生物学的因子を灌流させ、第一の血管ネットワークの生物学的因子濃度は、第二の血管ネットワークの生物学的因子濃度と同じである。生物学的因子は以下の増殖因子又は小分子の1つ以上を含むことができる：血管内皮増殖因子（VEGF）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、スフィンゴシン1リン酸（S1P）、ホルボールミリステートアセテート（PMA）、肝細胞増殖因子（HGF）、単球走化性タンパク質1（MCP-1）、アンギオポイエチンANG-1、アンギオポイエチンANG-2、形質転換増殖因子ベータ（TGF-β）、表皮増殖因子（EGF）、ヒト成長因子、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）、ドキシサイクリン及びヒスタミンである。当該方法では、酸素分圧勾配は、第一及び第二の血管ネットワークの一方又は両方に灌流中に導入できる。酸素分圧勾配は、脱酸素媒体を第一及び第二の血管ネットワークの一方に導入し、さらに第一及び第二の血管ネットワークの他方に含酸素媒体を導入することによって形成できる。媒体は、当該媒体中への窒素ガスの持続的曝気によって、及び/又はグルコースの存在下で酵素のグルコースオキシダーゼ及びカタラーゼを添加することによって酸素を除去できる。灌流は、約1マクロリットル/分から約1リットル/分の流速で実施できる。当該方法では、第一及び第二の血管ネットワークの一方又は両方が灌流中に経壁圧を受ける。当該方法では、胚様体又はオルガノイドを組織構築物に埋め込む前に、当該胚様体又はオルガノイドは細胞外マトリックス素材中に被包化される。細胞外マトリックス素材はゲルを含むことができる。当該方法では、胚様体又はオルガノイドは、胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団及び胚様体又はオルガノイド細胞の第二の集団を含むことができ、ここで、当該胚様体又はオルガノイドは、多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、前駆細胞、最終分化細胞、内皮細胞、内皮前駆細胞、不死化細胞株、神経細胞、初代細胞又は前記の組み合わせの少なくとも2つを含むことができる。
【０００４】
ある種の実施態様では、胚様体又はオルガノイドは、野生型細胞集団及び遺伝的に操作された誘導可能な細胞の集団を培地中で培養し、遺伝的に操作された誘導可能な細胞の集団の第一の胚葉体又はオルガノイド細胞集団への直進的分化及び/又はトランス分化を誘導し、野生型細胞集団の胚様体又はオルガノイド細胞の第二の集団への分化を誘導し、それによって少なくとも胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団及び胚様体又はオルガノイド細胞の第二の集団を含む胚様体又はオルガノイドを形成することによって作製できる。遺伝的に操作された誘導可能な細胞の集団は、構成的プロモーター、小分子誘導性プロモーター、細胞自律性プロモーター、細胞非自律性プロモーター、選別マーカー又は前記の組み合わせの少なくとも1つを含むDNAデリバリーエレメントを導入することによって作製できる。胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団は、多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、前駆細胞、最終分化細胞、内皮細胞、内皮前駆細胞、不死化細胞株又は初代細胞を含むことができる。胚様体又はオルガノイド細胞の第二の集団は神経前駆細胞を含むことができ、ここで当該神経前駆細胞は、興奮性ニューロン、抑制性ニューロン、運動ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、痛覚受容体ニューロン、星状細胞、乏突起神経膠細胞の前駆細胞、及び/又は乏突起神経膠細胞の少なくとも1つを形成することができる。遺伝的に操作された誘導可能な細胞の集団の直進的分化及び/又はトランス分化を誘導する工程は、転写因子、薬剤、小分子、増殖因子、モルフォゲン、ホルモン、DNA、shRNA、siRNA、ナノ粒子、mRNA、修飾mRNA、熱、光、及び機械的力から成る群から選択される少なくとも1つのキューを導入する工程を含むことができる。直進的的分化及び/又はトランス分化の誘導は二次遺伝子誘導を伴うことができる。二次遺伝子誘導は、転写因子、薬剤、小分子、増殖因子、モルフォゲン、ホルモン、DNA、shRNA、siRNA、ナノ粒子、mRNA、修飾mRNA、熱、光、及び機械的力から成る群から選択される少なくとも1つのキューの提供を介することができる。二次遺伝子誘導のために選択されるキューは、遺伝的に操作された誘導可能な細胞の集団の直進的分化及び/又はトランス分化を誘導する工程のために選択されるキューと同じであってもよく又は異なっていてもよい。胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団は、二次遺伝子の誘導のために更なる発生を経ることができる。二次遺伝子の誘導は、構成的に活性なタンパク質キナーゼC（PKC）タンパク質の発現を含み、それによって胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団の内皮スプラウト行動及び神経突起伸長の少なくとも1つを強化することができる。胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団は内皮細胞である。培養工程は、ハンギングドロップ法、微細チャネル内凝集、マイクロウェル内凝集を介して、又はスピンニングバイオリアクターの使用によって低接着基質上で生じさせることができる。胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団と胚様体又はオルガノイド細胞の第二の集団との比は1：1であり得る。その他の比もまた考慮される（例えば1：2、1：3、1：4など、2：1、3：1、4：1など）。培養工程は分化培地で実施されてもよい。分化培地は、ドキシサイクリン（DOX）又��薬剤誘導性プロモーターと密接に関係する他の薬剤を含むことができる。1つ以上の相互接続血管チャネルは、機械的製造プロセス又は生物学的発生プロセス（血管形成、脈管形成又は細管形成の少なくとも1つを含むことができる）によって形成することができる。1つ以上の生物学的因子、生物学的因子勾配、圧、及び/又は酸素分圧勾配はさらに胚様体又はオルガノイドの発生、分化、及び/又は機能発揮を指令することができる。野生型細胞集団は人工多能性幹細胞（iPSC）又はiPSCから誘導された特許に固有の細胞株を含むことができる。
【０００５】
上記方法において、胚様体又はオルガノイドを組織構築物へ埋め込む工程は以下を含む：1つ以上の細胞搭載フィラメントを基質上に沈積させて1つ以上の組織パターンを形成させる工程（前記フィラメントの各々は複数の生存細胞を含む）であって、当該組織パターンの各々が1つ以上の予め定められた細胞タイプを含む前記工程、その各々が一過性インクを含む1つ以上のサクリファイスフィラメントを当該基質上に沈積させて、当該1つ以上の組織パターンに相互貫入する血管パターンを形成する工程、当該血管パターン内に胚様体又はオルガノイドを沈積させる工程、当該1つ以上の組織パターン及び当該血管パターンを細胞外マトリックス組成物で少なくとも部分的に取り囲む工程、及び当該一過性インクを除去し、それによってその中に埋め込まれた胚様体又はオルガノイドを含む組織構築物を形成する工程を含む。
ある種の実施態様では、1つ以上の細胞搭載フィラメントの少なくとも一部は1つ以上の生物学的因子を含むことができる。
第一及び第二の血管ネットワークの一方又は両方は微細流チャネルを含む。
ある種のさらに別の実施態様では、複数の胚様体又はオルガノイドを組織構築物に埋め込むことができる。当該胚様体又はオルガノイドは異なる表現型を含むことができ、又は同じ表現型を含むことができる。
ある種の実施態様で組織構築物のアレイが存在する方法では、埋め込み工程、暴露工程及び血管新生工程は各組織構築物で実施され得る。
さらに別のある種の実施態様は、本明細書に記載の方法によって形成される機能的ヒト組織又は機能的ヒト組織のアレイに関する。
本発明のこれら及び他の特徴並びに利点は、下記に詳細に記載する好ましい実施態様を添付の図面と一緒に斟酌して明白となるであろう。
当該特許又は出願ファイルは少なくとも1枚の着色図面を含む。カラー図面を含む本特許又は特許出願広報のコピーは申請と必要料金の支払いにより当局によって提供されるであろう）
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】Lancasterら（Lancaster et al., 2013）による試験の結果を示す（前記試験では、in vitroで発生させた大脳オルガノイドは灌流可能血管ネットワークを欠いていた）。
【図２】内部の発生中の血管叢を用いて発生中の胚様体又はオルガノイドを単一の細胞から開始して血管新生器官へと増殖させる構想の図解である。
【図３Ａ−Ｂ】図３Aは3Dプリントされた灌流系内で細胞オルガノイドを発生させる戦略を図解する。‘原案’は、内皮細胞で裏打ちされたプリント微細チャネルから脈管形成を引き出す工程を含み、それによってスプラウト内皮が移植オルガノイドに侵入する。図３Bは3Dプリントされた灌流系内で細胞オルガノイドを発生させるまた別の戦略を図解する。‘修正案’は、オルガノイド又は胚様体内に含まれる内皮細胞集団から脈管形成を引き出す工程及び当該スプラウトをプリントチャネルへ引き寄せる工程を含み、その結果それらが動脈及び静脈ネットワークを接続する。
【図４】灌流可能な血管新生オルガノイドを作製する戦略を示す。
【図５Ａ−Ｃ】図５Aは大脳オルガノイドを含むスピンニングバイオリアクターの写真を示す。図５Bはスピンニングバイオリアクターで増殖させた14日目のオルガノイドを示す。図５Cはスピンニングバイオリアクターで増殖させた22日目のオルガノイドを示す。
【図６】胚様体又はオルガノイドをiPSCから発生させるために用いられる培養系の模式図、及び胚様体又はオルガノイドのin vitro発生の各ステージで得られた例示的画像又はオルガノイドを示す。
【図７Ａ−Ｉ】図７AはT＝0日目で得られたオルガノイドの画像を示す。図７BはT＝1日目で得られた発生中のオルガノイドの画像を示す。図７CはT＝1日目で採集したオルガノイドの画像を示す。図７DはT＝5日目で得られた発生中のオルガノイドの画像を示す。図７EはT＝7日目で得られた発生中のオルガノイドの画像を示す。図７FはT＝8日目で得られた発生中のオルガノイドの画像を示す。図７GはT＝10日目で得られた発生中のオルガノイドの画像を示す。図７HはT＝11日目で得られたマトリゲル（MG）で発生中のオルガノイドの画像を示す。図７IはT＝12日目で得られたマトリゲル（MG）で発生中のオルガノイドの画像を示す。
【図８Ａ−Ｂ】図８Aは内部叢を有する培養大脳オルガノイドの写真を示す。図８Bは内部叢を有する培養大脳オルガノイドの写真を示す。
【図９】野生型細胞及び誘導性細胞の混合集団を作製する方法の模式図を示す。
【図１０】胚様体又はオルガノイドのマルチ集団を作製する方法の模式図を示す。
【図１１】複数の転写因子を細胞にデリバリーし混合オルガノイド集団を作製するために用いられるDNAデリバリーエレメントの模式図を示す。
【図１２】灌流可能な血管新生オルガノイドを作製する戦略の模式図である。
【図１３】スプラウトしつつある胚様体から誘導された血管球を示す。
【図１４Ａ−Ｇ】細胞外マトリックス組成物中で血管チャネルのネットワークを作製する方法を示す。
【図１５】プリント鋳型又はインターフェース構造の例示的設計を示す。
【図１６】カスタム灌流チップの例示的3Dプリンティング方法を示す。
【図１７】血管組織のプリンティングを示す。
【図１８】血管新生組織のプリンティングを示す。
【図１９】自然な毛細血管の発生を可能にして動脈及び静脈ネットワークを接続させるために作製された、かけ渡されて互に交差しない2つの分枝血管ネットワークを示す。
【図２０】図２０Aはプルロニック（Pluronic）F-127サクリファイスフィラメントのプリント動静脈ネットワークの上面図を示す。前記フィラメントは、ゲルにキャスティングして冷却し、さらに液化サクリファイスプルロニックF-127を除去した後で動静脈叢を作製するために用いることができる。  図20Bはプリントされたシリコーン灌流チップ内でプリントされた図20AのプルロニックF127構造を示す。  図20Cは、どのようにルアーコネクターをシリコーンチップに接続して外部ポンプへの接続を可能にするかを示す。  図20Dは、どのようにルアーコネクターをシリコーンチップに接続して外部ポンプへの接続を可能にするかを示す。
【図２１】3Dプリントされた血管ネットワークへの胚様体の導入を示す模式図である。
【図２２】図22Aは血管新生組織への胚様体の埋め込みを示す（2日目）。  図22Bは、血管新生組織への胚様体の埋め込みを示す（3日目）。  図22Cは、血管新生組織への胚様体の埋め込みを示す（5日目）。  図22Dは、スプラウトオルガノイドを移植し灌流するために外部に接続される例示的な灌流チップを示す。
【図２３】オルガノイド及び血管の発生の促進並びに必須因子のデリバリーのための戦略を示す。
【図２４】記載の方法によって作製された内皮血管チャネルを示す。HUVECは空にしたGelMAゲル中に存在する。
【図２５】血管新生組織の写真を示す。
【図２６】血管新生組織の能動的灌流プロセスを示す。
【図２７】左画像は、ネスチン（緑色）（神経前駆細胞マーカー及び内皮マーカー）及びSox 1（赤色）（神経前駆細胞マーカー）について免疫蛍光によって分析したオルガノイドを示す。右画像は細胞の細管の形態を示す。
【図２８】ニューロン構造の存在について染色したオルガノイドを示す。
【図２９】iPSCに由来する血管新生大脳オルガノイドを示す。
【図３０】灌流可能な血管新生マトリックス内の大脳オルガノイドを示す。
【図３１】ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を人工多能性幹細胞（iPSC）と混合する‘コモンセンス’アプローチを示す。
【図３２】ニューロンプロトコル及び内皮プロトコルを結合させたハイブリッドプロトコルによって作製したオルガノイドを示す。
【図３３】種々の転写因子のためのドキシサイクリン誘導性プロモーターで形質転換したiPSC集団は、ドキシサイクリンをmTeSRI培地に添加したとき種々の効率で内皮細胞に直進的に分化させることができることを示す。
【図３４】2つの内皮遺伝子（PECAM-1（CD31としても知られている）及び血管内皮カドヘリン（VECad））のためのフローサイトメトリーデータを示す。
【図３５】dox-誘導性ETV2ベクターで形質転換しdox含有mTeSR1で5日間培養したiPSCを示す。
【図３６】3日目にAggrewellTMから採集し、ドキシサイクリンを含む神経誘導培地に浸したマトリゲル小滴で培養したdox-誘導性ETV2胚様体の時系列位相差顕微鏡写真を示す。
【図３７】ドキシサイクリン、VEGF又はPMAの存在下及び非存在下で大脳オルガノイドの培養条件を用いてマトリゲルで培養した10日間の血管スプラウトを示す。
【図３８】実施例10に記載したようにマトリゲルで調製したドキシサイクリン誘導性ETV2発現iPSC懸濁物を用いて形成された胚様体を示す。
【図３９】ドキシサイクリン誘導性ETV2発現iPSC懸濁物を用いて形成された胚様体を示す。
【図４０】免疫蛍光染色した血管新生大脳オルガノイドを示す。
【図４１】血管スプラウトを有するオルガノイド（右）の作製に用いた3Dプリンティング装置（左）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
胚葉体（例えば大脳オルガノイド）は、三次元の生体疑似環境で組織の発生プロセス（例えば神経発生プロセス）を研究するための有望なプラットフォームである。しかしながら、以前に開発されたオルガノイドは灌流可能な脈管構造を欠いていた。広く行きわたる灌流可能な脈管構造を欠くために、それらオルガノイドは、そのサイズが直径約1mmを超えるとたちまち壊死中心を生じた（図1；Lancaster et al., 2013）。
血管新生胚様体又はオルガノイドを三次元（3D）バイオプリンティングにより作製する新規なアプローチを開発し、本開示で説明する。規模の拡大が極めて容易なこのプラットフォームは、血管構造、複数の細胞タイプ及び場合によって他の機能性化学物質（例えば薬剤、毒素、タンパク質及び/又はホルモン）が細胞外マトリックス内の所望位置にプログラム可能態様で配置される、操作胚様体又はオルガノイドの構築を可能にする。この技術は、組織の発生及び疾患の研究の他に移植に必要な機能的な3D組織（すなわち“組織構築物”）及び器官の迅速な製造をもたらすことができる。本発明の血管新生胚様体又はオルガノイドはまた、当該組織内の細胞の増殖及び活性に対する外的（例えば薬剤又は他の刺激）又は内的（変異）影響の作用を調べる研究ツールとして用いることができる。
本記載方法によって作製できる器官、胚葉体、オルガノイド又は組織構築物の例には、甲状腺、膵、子宮、膀胱、尿道、副腎、肺、肝、松果腺、副甲状腺、胸腺、副腎、虫垂、胆嚢、脾、前立腺、生殖器官、神経組織及び血管組織が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
したがって、ある種の実施態様は、発生中の血管新生胚様体又はオルガノイド（例えば大脳オルガノイド）を作製する方法に関し、前記方法は、移植及び薬剤スクリーニングへの利用とともに器官発生の基礎的長期的研究のためにより大きくより複雑な胚様体又はオルガノイドの作製に必要な灌流を介する栄養素のデリバリーを可能にする。プリントされる血管新生胚様体又はオルガノイド及び内部の発生中の血管叢を用いて当該胚様体又はオルガノイドを作製する方法が本明細書に記載される。図2は、脳微細血管内皮細胞（BMEC）で裏打ちされたプリント微細チャネルに隣接する内部の発生中の血管叢を用いて、発生中の胚葉体又はオルガノイドを単一細胞から当該隣接チャネルと吻合した血管新生器官に増殖させる構想の図解を提供する。このプロセスは3Dプリンティングアプローチを発生生物学と結合させて、薬品開発及び再生医療に利用される、血管が新生された機能的なヒト組織を作製する。従来の技術では、無血管オルガノイドを発生させるか、又は血管をプリントして成熟細胞の生存能を維持するアプローチが記載されている。対照的に、本明細書では、自家性プリント血管と3Dプリントされた灌流系内で発生中の胚様体又はオルガノイドの組合せを利用する方法が記載される。
【０００８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられるように、単数形の“a”、“an”及び“and”は、文脈が明白にそうでないことを示さないかぎり複数の対象物を含む。したがって、例えば“a protein（タンパク質）”と言えば、複数のそのようなタンパク質を含み、“the progenitor cell（前駆細胞）”と言えば、当業者に公知の1つ以上の前駆細胞への言及を含むという具合である。
特段の規定がなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本開示が属する業界の業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載する方法及び材料と同様又は等価のものを本開示の方法の実施及び組成物で用いることができるが、例示的な方法、組成物、装置及び材料を本明細書に記載する。
“胚様体”という用語は、三次元の球体、回転楕円体又は他の三次元形状に形成された多能性又は多分化能性幹細胞を含む複数の細胞を指す。
“オルガノイド”という用語は、細胞がある程度の分化を経ている胚様体を指す。
胚葉体又はオルガノイドは、多能性細胞、多分化能性細胞、前駆細胞、最終分化細胞、内皮細胞、不死化細胞株の少なくとも1つを培養することによって作製され、下記で詳細に記載される。
胚様体とオルガノイドとの間の区別は依然として不明確であることを我々は承知し、当該用語の使用は互換的であると考えるべきである。
胚葉体又はオルガノイドは、大脳オルガノイド、甲状腺オルガノイド、腸管オルガノイド、消化管オルガノイド、肝オルガノイド、膵オルガノイド、胃オルガノイド、腎オルガノイド、網膜オルガノイド、心オルガノイド、骨オルガノイド、及び上皮オルガノイドであり得る。
“大脳オルガノイド”という用語は、ヒト多能性幹細胞を例えば三次元回転バイオリアクターで培養することによって作製された人工三次元組織培養物を指す。大脳オルガノイドは、いくつかのタイプの神経細胞を含み、哺乳動物の脳に似る解剖学的特徴物を有する合成組織であり得る。例えば、大脳オルガノイドは、少なくとも2つの異なる前駆細胞の不均一細胞集団及びニューロン分化層を含むことができる。大脳オルガノイドは、多様な脳領域の不均一な区画化とともに良く組織化された複雑な大脳皮質を提示することができる。大脳オルガノイドは、皮質と呼ばれるニューロン層及び脈絡叢に極めて類似する。いくつかの事例では、網膜、髄膜及び海馬に類似する構造物も同様に形成できる。
【０００９】
“内部叢”という用語は、発生中の胚葉体又はオルガノイドの内部及び/又は表面に存在する血管内皮細胞の相互接続ネットワークを指す。
プリントされた組織構築物の別のパターン又はネットワークに“相互貫入する”パターン又はネットワークは、1つ以上のフィラメント、チャネル又は部分を含み、それらは、当該他のパターン又はネットワークの1つ以上のフィラメント、チャネル又は部分と層を成し、部分的に若しくは完全に重なり合い、部分的に若しくは完全に下部ではみ出し、その周囲を取り巻き、その中に埋め込まれ、及び/又は織り合わされていると理解することができる。“ある基質に沈積される”フィラメントは、当該基質に直接沈積されるか、又は当該基質に先に沈積又は形成された別のフィラメント、チャネル又は部分に直接沈積されると理解できる。
“PKC”という用語はタンパク質キナーゼCの略語として用いられ、前記はタンパク質キナーゼCのアイソフォーム（PKC-アルファ、PKC-ベータ1、PKC-ベータ2、PKC-ガンマ、PKC-デルタ、PKC-エプシロン、PKC-エータ、PKC-シータ、PKC-イオタ及びPKC-ゼータを含む）のいずれも指すことができる。
“オルトゴナルプロモーター”という用語は、遺伝子誘導に別個のキュー（合図）が存在する2つの異なるプロモーター設計を指す。例えば、2つの誘導性遺伝子が存在する場合、‘遺伝子1’は‘プロモーター1’によって活性化され、‘遺伝子2’は‘プロモーター2’によって活性化され、このとき、下記の記述の両方が当てはまるならばプロモーター1及び2はオルトゴナルである：
1）‘遺伝子2’の発現に直接的影響を与えることなく‘遺伝子1’の発現を特異的に誘導する‘キュー1’が存在し；さらに
2）‘遺伝子1’の発現に直接的影響を与えることなく‘遺伝子2’の発現を特異的に誘導する‘キュー2’が存在する。
“スプラウト”、より具体的には“内皮スプラウト”という用語は、脈管形成又は血管新生を経て管状構造物を生じる内皮構造物を指す。
ヒト組織を指して“機能的”という用語は、記載の方法にしたがって合成された組織が、作製を意図した器官と同じか又は類似する機能を有することを意味する。
【００１０】
図3A−Bに示すように、3Dプリントされた灌流系内で細胞オルガノイドを発生させるために2つの可能な戦略が考えられる。
第一の戦略では、図3Aに模式的に示すように、幹細胞を、胚葉体増殖培地（例えばAggrewellTM（AW）（StemCell Technologies Inc.）で培養して胚様体を発生させ、さらに別個に脳微細血管構造分化培地（Brain Microvasculature Differentiation Medium（BMEC））（Lippmann ES, et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol 30(8):783-91, 2012）で培養して脳微細血管内皮細胞を発生させる。続いて、BMECを3Dプリントされた灌流可能動脈微細チャネルに導入し、当該チャネル壁に接着させる。次に、生物学的因子勾配を静脈チャネルに添加して、発生中のオルガノイドの内部血管叢と吻合する脈管形成スプラウトを誘導することができる。いったん内皮スプラウトが動脈ネットワークと静脈ネットワーク間の空間に広がると、胚葉体又はオルガノイドに外部ポンプを介して直接灌流することができる。
第二の戦略では、図3Bに示すように、幹細胞をAWでインキュベートして胚様体を形成することができ、前記胚葉体を続いてBMEC又は神経誘導培地（NIM）（Lancaster et al., 2013）でインキュベートしてスプラウト胚様体を形成する。このスプラウト胚様体を続いてEGMとともにNIMでインキュベートし、さらに3Dプリントされた灌流系に置いて血管新生器官を形成する。
第二の戦略はさらに図4に図解されている。図4では、in vitroで増殖させた大脳オルガノイドをプリントされた血管構造内に置き、埋め込んでチップ上で増殖させる。
幹細胞を培養しニューロン細胞及び組織に分化させる方法は以下の論文から公知である：Eiraku (2008), US 2011/0091869 A1及びWO 2011/055855 A1（前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。米国特許公開広報US 2015/0330970（Lancaster et al．）及びLancasterらの論文（Lancaster et al., “Cerebral organoids model human brain development and microcephaly,” Nature 501, 373-379, 2013）（前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）に記載された方法は、胚葉体又はオルガノイドを入手する第一の工程（特に、多能性幹細胞の多細胞凝集物を提供し、当該多細胞凝集物を神経誘導培地で培養する工程）に用いることができる。
【００１１】
胚葉体又はオルガノイドを形成するために（それらに関連する全ての更なる実施態様を含む）用いられる細胞は、ヒト細胞又は非ヒト霊長動物細胞、多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、前駆細胞、最終分化細胞、内皮細胞、内皮前駆細胞、不死化細胞株又は初代細胞である。
“多能性”幹細胞は増殖して完全な生物になることはできないが、全ての三胚葉（すなわち中胚葉、内胚葉及び外胚葉）から発生する細胞タイプを生じる能力を有し、ある生物の全ての細胞タイプを生じる能力を有し得る。多能性は、例えばある種の幹細胞では細胞それ自体の特徴であり得るが、多能性はまた人工的に誘導することができる。例えば、ある種の実施態様では、多能性幹細胞は、体細胞、多分化能性細胞、単能性細胞又は前駆細胞から派生し、この場合、多能性が誘導される。そのような細胞は、本明細書では“人工多能性幹細胞”又は“iPSC”と称される。体細胞、多分化能性細胞、単分化能性細胞又は前駆細胞は、例えば患者由来のものを用いることができ、前記を多能性幹細胞に変化させて記載の方法に付す。そのような細胞又は得られた組織を、例えば記載の方法による組織培養での発生中に異常について調べることができる。患者は、例えば神経学的異常又は大脳組織の奇形を有し得る。異常又は奇形の特徴を記載の胚様体又はオルガノイドで再現して精査することができる。
“多分化能性”細胞は、ある生物の2つ以上の異なる器官又は組織の各々に由来する少なくとも1つの細胞タイプを生じることができ、この場合、当該細胞タイプは同じ胚葉又は異なる胚葉に由来し得るが、ある生物の全細胞タイプを生じる能力はない。
対照的に、“単分化能性”細胞はただ1つの細胞系列の細胞に分化する能力を有する。
“前駆細胞”は、幹細胞のように、特定の細胞タイプに分化する能力を有し、分化の選択肢は限定され、通常はただ1つの標的細胞に分化する。前駆細胞は通常は単分化能性細胞であり、前記はまた多分化能性細胞であることが可能であるがしばしばより限定的な分裂能力を有する。
【００１２】
好ましくは、記載の胚様体又はオルガノイドは、多能性幹細胞又は多分化能性幹細胞の初期集団を培養することによって作製される。
ある種の実施態様では、胚様体又はオルガノイドは、培養多能性幹細胞から入手できる。倫理的根拠が許容されるならば、原則として、細胞はまた全能性であってもよい。“全能性”細胞は、発生において通常生じるような刺激に暴露された後で身体の任意の細胞タイプ（生殖細胞系を含む）に分化できる。したがって、全能性細胞は、増殖して（すなわち発育して）完全な生物になる能力を有する細胞と定義できる。
本発明の方法で用いられる細胞は、好ましくは全能性ではなく（厳密には）多能性である。
培養方法は当業界で公知である。例えば、培養は、低接着基質上で（Doetschman TC, et al., The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. J Embryol Exp Morphol 87:27-45, 1985）、ハンギングドロップ法により（Reubinoff BE, et al., Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol 18(4):399-404, 2002）、マイクロウェル内凝集により（Mohr JC, et al., 3-D microwell culture of human embryonic stem cells. Biomaterials 27(36):6032-42, 2006）、微細チャネル内凝集により（Onoe H, et al., Differentiation Induction of Mouse Neural Stem Cells in Hydrogel Tubular Microenvironments with Controlled Tube Dimensions. Adv Healthc Mater. (2016), doi:10.1002/adhm.201500903）、又はスピンニングバイオリアクターの使用（Carpenedo RL, et al., Rotary suspension culture enhances the efficiency, yield, and homogeneity of embryoid body differentiation. Stem Cells 25(9):2224-34, 2007）によって行うことができる（図5A）。図5B及び5Cは、スピンニングバイオリアクターで増殖させたそれぞれ14日目及び22日目のオルガノイドを示す。
【００１３】
記載の方法にしたがえば、典型的な胚様体又はオルガノイドプロトコルは、単離した胚性幹細胞又は多能性幹細胞（例えば人工多能性幹細胞又はiPSC細胞又はiPSC）から開始する。
オルガノイド培養はin vitroで増殖させる（培養工程）。すなわちオルガノイド培養は、いずれかの段階で動物から単離された器官（例えば脳又は腎）ではない。前記はヒトの多能性幹細胞から増殖するので、これは、ヒト胎児の組織サンプルの入手を必要とせずにヒト組織の増殖を可能にする。
例えば、凝集物を培養する工程で、多能性幹細胞を誘導してある組織（例えば神経組織）に分化させることができ、前記組織は、多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、前駆細胞、最終分化細胞、内皮細胞、内皮前駆細胞、不死化細胞株又は初代細胞の少なくとも1つを含む。多細胞凝集物を提供するために、例えば当該多細胞凝集物由来の多能性幹細胞を培養することが可能である。例えば、図6は、iPSCから胚様体又はオルガノイドを発生させるために用いられる培養系の模式図、及びin vitroでの胚様体又はオルガノイド発生の各ステージで得られた画像又はオルガノイドを示す。8日目の神経上皮ロゼットの発生によって、初期大脳オルガノイドに向かう胚葉体の分化を見ることができる。
図7A−Iは、発生中の種々の時期に種々の媒体で得られる多様なオルガノイドの画像を示す。これは下記実施例のセクションで詳細に記載されるであろう。
【００１４】
胚様体又はオルガノイドを培養する例示的培地には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：アグリウェル(商標)（AggrewellTM）培地（AW）（以下から入手できる：StemCell Technologies, Inc.）、神経誘導培地（NIM）（DMEM/F12培地を含み、1：100のN2サプリメント、1μg/mL硫酸ヘパリン、1mMグルタマックス及びMEM非必須アミノ酸が補充されている）。小分子smad阻害剤SB431542をNIMに10nMの濃度で添加できる。タンパク質のノギンを添加して神経特化を強化できる。大脳オルガノイドは神経分化培地1期（NDM1）でさらに分化させることができる。NDM1は以下を含む：DMEM/F12及び1：200 N2サプリメント補充神経基礎培地の1：1混合物、1：100のB27サプリメント（ビタミンAを含まない）、2-メルカプトエタノールの3.5μL/L、1：4000インスリン、1：100グルタマックス、及び1：200のMEM非必須アミノ酸。更なる大脳成熟は、神経分化培地2期（NDM2）でオルガノイドを培養することによって達成できる。NDM2は以下を含む：例えば、DMEM/F12及び1：200 N2サプリメント補充神経基礎培地の1：1混合物、1：100のB27サプリメント（ビタミンAを含む）、2-メルカプトエタノールの3.5μL/L、1：4000インスリン、1：100グルタマックス、及び1：200のMEM非必須アミノ酸。
ある種の実施態様では、内皮細胞は、脳微細血管内皮細胞（BMEC)培地（例えば、20ng/mLのFGF、1%の希血小板血漿由来ウシ血清、及び10μMのレチノイン酸を補充した内皮無血清培地を含む）で当該細胞を培養することによって分裂及び脳微細血管表現型への特化を促進され得る。
ある種の実施態様では、多様な生物学的因子又は因子を当該培地と組み合わせて用いることができる。記載の方法で用いることができる例示的な生物学的因子又は因子には例えば以下が含まれる：塩基性FGF、ノギン、小分子TGF-ベータ阻害剤SB431542、アクチンA、BMP-4、Wnt、表皮増殖因子（EGF）、アスコルビン酸、レチノイン酸、ウシ脳抽出物、ヘパリン、ヒドロコルチゾン、ゲンタマイシン、ウシ胎児血清、インスリン様増殖因子（IGF）、及び血管内皮増殖因子（VEGF）。
【００１５】
ある種の実施態様では、大脳オルガノイドの合成に関して、細胞凝集物は発生中に分極化した神経上皮構造物及び神経上皮シートを形成することができ、前記はいくつかの球形クラスター（ロゼット）を発生させるであろう。これらの工程は、以下に記載されるように神経誘導培地によって制御され得る（Eiraku, 2008：US 2011/0091869 A1及びWO 2011/055855 A1）。
神経誘導培地が存在しないとき（例えば標準的分化培地の使用により）、当該方法は、三次元マトリックス（好ましくはゲル、特に硬質の安定ゲル）での培養を含むことができる。したがって、ある種の実施態様では、当該方法はまた、三次元マトリックス（好ましくはゲル）で細胞凝集物を培養する工程を含み、前記は、上皮の分極化の強化及び皮質層形成の改善をもたらすことができる。例えば、神経上皮の更なる増殖及び/又は分化が、三次元マトリックスで培養された胚様体又はオルガノイドで観察できる。
適切な三次元マトリックスは、I型コラーゲン又はマトリゲルを含むことができる。ある種の実施態様では、三次元マトリックスは、エンゲルブレス-ホーム-スワン腫に由来する細胞外マトリックス若しくはその任意の成分、コラーゲン（好ましくは4型コラーゲン）、エンタクチン、及び場合によってさらにヘパラン硫酸化されたプロテオグリカン、又は前記の任意の組合せを含む。そのようなマトリクスはマトリゲルである。マトリゲルは以前に米国特許4,829,000号に記載された（前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。
ある種の実施態様では、マトリックスは少なくとも3.7mg/mLの濃度で含まれ、前記は重量割合で約60−85%のラミニン、5−30%のコラーゲンIV、場合によって1−10%のニドゲン、場合によって1−10%のヘパラン硫酸プロテオグリカン及び1−10%のエンタクチンを含む。マトリゲルの固形成分は、通常は約60%のラミニン、30%のコラーゲンIV、及び8%のエンタクチンを含む。エンタクチンは、ラミニン及びコラーゲンと相互作用する架橋分子である。三次元マトリックスは、例えば以下のいずれか1つの増殖因子をさらに含むことができる：EGF（表皮増殖因子）、FGF（線維芽細胞増殖因子）、NGF、PDGF、IGF（インスリン様増殖因子、特にIGF-1）、TGF-β、組織プラスミノーゲンアクチベーター。三次元マトリックスはまたこれら増殖因子を一切含まなくてもよい。
【００１６】
ある種の実施態様では、三次元マトリックスは生物適合性マトリックスの三次元構造物であり得る。前記は、コラーゲン、ゼラチン、キトサン、ヒアルロナン、メチルセルロース、ラミニン及び/又はアルギネートを含むことができる。マトリックスはゲル、特にヒドロゲルであり得る。有機化学ヒドロゲルは、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリル酸ポリマー及び豊富な親水基とのコポリマーを含むことができる。ヒドロゲルは、親水性ポリマー鎖のネットワークを含み、時にはこれらは水を分散媒体とするコロイド状ゲルとして見いだされる。ヒドロゲルは、高度に吸収性（それらは99%を超える水を含むことができる）の天然又は合成ポリマーである。ヒドロゲルはまた、その顕著な水分含有量のために天然の組織に類似するある程度の可撓性を保持する。
増殖後に、細胞凝集物は懸濁培養物中で、好ましくはバイオリアクター（例えばスピンニングバイオリアクター）内で培養することができる（図5A）。懸濁培養での培養は、好ましくは神経誘導培地の非存在下で実施される。適切な培地は標準的な分化培地である。“スピンニングバイオリアクター”は、細胞培養環境下で図5Aに示すように細胞又は組織を増殖させるために意図される装置又は系を指す。これらの装置は、組織工学又は生化学工学で使用するために開発されている。例えば、適切なスピンニングバイオリアクターはホィートン社（Wheaton Inc.）から購入でき、回転細胞培養系はシンテコン（Synthecon）から購入できる。
バイオリアクター中の細胞は、三次元増殖を支援するタンパク質性マトリックス（例えばマトリゲル）中で培養できる。図5B及び5Cは、スピンニングバイオリアクター内で発生中の、それぞれ14日目及び22日目の大脳オルガノイドを示す。
図7A−7Iは、スピンニングバイオリアクター内で発生中の大脳オルガノイドを示す（スケールバーは100μm）。
【００１７】
図8A−8Bに示すように、記載の方法にしたがって培養したオルガノイドは、内皮細胞ネットワーク（PECAM-1（CD-31）の抗体染色によって識別される）によって可視化できる内部血管叢を形成する。図8Aのオルガノイドを作製する具体的培地条件は、アグリゲル(商標)（3日）、神経誘導培地（5日）、神経分化培地（1期；5日）及び神経分化培地（2期；5日）を含む。図8Bのオルガノイドを作製する具体的培地条件は、アグリゲル(商標)（3日）、脳微細血管内皮培地（5日）、神経分化培地（1期；5日）及び神経分化培地（2期；5日）を含む。
一定期間後に、オルガノイドは、研究のために、又は足場若しくは3Dプリント血管構造で満たされた生物学的足場への移植のために十分に成熟する。
重要なことに、移植又は埋め込み前に、その最中に及び/又はその後で、胚様体又はオルガノイドをNIM、NDM1、EGM-2又はNDM2培地の組み合せを用いてさらに分化させて、多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、前駆細胞、最終分化細胞、内皮細胞、内皮前駆細胞、不死化細胞株又は初代細胞の少なくとも1つを含む組織が得られる。
上述の実施態様では、幹細胞（例えばiPSC）を培養して細胞凝集物を形成し、多能性幹細胞を誘導して、多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、前駆細胞、最終分化細胞、内皮細胞、内皮前駆細胞、不死化細胞株又は初代細胞の少なくとも1つを含む組織（例えば神経組織）に分化させることができる。多細胞凝集物を提供するために、例えば当該多細胞凝集物由来の多能性幹細胞を培養することが可能である。例えば、図6は、iPSCからオルガノイドを発生させるために用いられる培養系の模式図、及び各ステージで得られた例示的画像又はオルガノイドを示す。
【００１８】
ある種のまた別の実施態様では、少なくとも2つの異なるオルガノイド又は胚葉体細胞集団（すなわちの胚様体又はオルガノイド細胞の第一集団及び胚様体又はオルガノイド細胞の第二の集団）を含む胚様体又はオルガノイドは、作製した後で血管を新生させることができる。例えば、ある種の実施態様では、胚様体又はオルガノイドは、複数の細胞集団（すなわち少なくとも2つの異なる細胞系列；図9）、例えば内皮及びニューロン細胞集団を含むことができ、前記は同じ培養条件を用いてiPSCの分化によって入手される。
図10に模式的に示すように、胚様体又はオルガノイドのマルチ集団を作製する方法は、野生型細胞集団及び遺伝的に操作した誘導可能な細胞の集団を培地で培養する工程、遺伝的に操作した誘導可能な細胞の集団の胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団への直進的分化及び/又はトランス分化を誘導する工程、野生型細胞集団の胚様体又はオルガノイド細胞の第二の集団への分化を誘導する工程、それによって少なくとも胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団及び胚様体又はオルガノイド細胞の第二の集団を含む胚様体又はオルガノイドを形成する工程を含む。
“直進的分化”又は“定方向分化”という用語は、多能性又は多分化能性幹細胞のより分化した特定の状態への分化を優先的に促進する条件下の当該幹細胞の培養を指す。例えば、特定の多分化能性幹細胞（例えば神経前駆細胞）の濃縮集団を生じる条件下で、多能性幹細胞を培養することができる。また別には、多分化能性幹細胞（例えば神経幹細胞）は、より分化した状態（例えばニューロン、星状細胞又は乏突起神経膠細胞）に直進的に分化させることができる。
“トランス分化”という用語は、多分化能性若しくは単分化能性幹細胞であり得る1つの細胞タイプ又は最終分化成熟細胞表現型を、異なる多分化能性若しくは単分化能性幹細胞であり得る異なる細胞タイプ又は最終分化成熟表現型へ変換することを指す。例えば、神経幹細胞、放射状グリア又はニューロンは内皮細胞にトランス分化させることができる。
【００１９】
遺伝的に操作された誘導可能な細胞の集団は、構成的プロモーター、小分子誘導性プロモーター、細胞自律性プロモーター、細胞非自律性プロモーター、選択マーカー又は前記の組み合わせの少なくとも1つを含むDNAデリバリーエレメント（図11に図解）を導入することによって作製できる。
構成的プロモーターの例には、例えばEFIアルファ、PGK、ユビキチン、及びCMVが含まれる。小分子誘導性プロモーターの例には、例えばドキシサイクリン又はクメイト（cumate）誘導性プロモーターが含まれる。細胞自律性プロモーターの例には、例えば細胞タイプ特異的プロモーター、例えばDCXが含まれる。細胞非自律性プロモーターの例には、例えば熱誘導性及び光誘導性プロモーターが含まれる。
DNAデリバリーエレメントは、レンチウイルス逆向き反復配列、パッケージングシグナル（例えばpLIX403ベクター）、トランスポゾン組み込みエレメント（例えばPiggyBacベクター）、エピソーム複製エレメントから選択できる。また別には、エレクトロポレーション又はリポフェクションによる一過性発現を用いることができる。
選別マーカーは、薬剤耐性マーカー（例えばピューロマイシン、ネオマイシン及びブラスチシジン）から選択できる。また別に、選別マーカーではなく一過性発現とその後に続く細胞分割による希釈を用いてもよい。
任意のオルガノイド内の内皮細胞（例えば血管構造の内皮細胞）の誘導、及びオルガノイド内の混合集団の作製に用いることができる特異的な転写因子の例には以下が含まれる：ETV2/ER71、FLI1、ERG（Ginsberg et al. 2012 Cell）（前記は成熟羊水細胞の内皮細胞への分化を誘導する）；Gata2、FOXC1、FOXC2、HEY1、HEY2、SOX7、SOX18、PROX1（Park et al. 2013 Circulation Research）（前記は幹細胞の多様な内皮細胞サブタイプ（例えば静脈、動脈リンパ管）への分化を誘導する）；Brachyury/T（前記は、in vivoでの原条形成に要求される可能な中胚葉誘導に用いることができる）。
【００２０】
任意のオルガノイド内でニューロンの誘導のために（例えば内部器官の自律神経系制御）用いることができる特異的な転写因子の例には以下が含まれる：NEUROG1/2（Busskamp, et al., Molecular Systems Biology, 2014）（前記は興奮性ニューロンの形成を誘導する）；ASCL1（Chanda, et al., Stem Cell Reports, 2014）（前記は興奮性ニューロンの形成を誘導する）；ASCL1、BRN2、MYT1L、LHX3、HB9、ISL1、NGN2（Son et al. 2011 Cell Stem Cell）（前記は運動ニューロンの形成を誘導する）；及びASCL1、MYT1L、KLF7（Wainger, et al., Nature Neuroscience, 2014）（前記は痛覚受容体ニューロンの形成を誘導する）。
胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団は、多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、前駆細胞、最終分化細胞、内皮細胞、内皮前駆細胞、不死化細胞株又は初代細胞を含むことができる。
胚様体又はオルガノイド細胞の第二の集団は神経前駆細胞を含む。神経前駆細胞は、興奮性ニューロン、抑制性介在ニューロン、運動ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、痛覚受容体ニューロン、星状細胞、乏突起神経膠細胞前駆細胞、乏突起神経膠細胞の少なくとも1つを形成できる。
遺伝的に操作した誘導可能な細胞の集団の直進的分化及び/又はトランス分化を誘導する工程は、転写因子、薬剤、小分子、増殖因子、モルフォゲン、ホルモン、DNA、shRNA、siRNA、ナノ粒子、mRNA、修飾mRNA、熱、光、及び機械的刺激から成る群から選択される少なくとも1つのキューを導入する工程を含むことができる。
ある種の実施態様では、直進的分化は異なる遺伝子の二次誘導、例えば二次オルトゴナル誘導を伴うことができる。この二次誘導は、第一の遺伝子誘導より早い時期に、同時に又は遅れて実施できる。二次遺伝子誘導は、転写因子、薬剤、小分子、増殖因子、モルフォゲン、ホルモン、DNA、shRNA、siRNA、ナノ粒子、mRNA、修飾mRNA、熱、光、及び機械的刺激から成る群から選択される少なくとも1つのキューの提供を介して実施できる。
ある種の実施態様では、二次遺伝子誘導のために選択されるキューは、遺伝的に操作された誘導可能な細胞の集団の直進的分化及び/又はトランス分化を誘導する工程のために選択されるキューと同じである。また別には、二次遺伝子誘導のために選択されるキューは、遺伝的に操作された誘導可能な細胞の集団の直進的分化及び/又はトランス分化を誘導する工程のために選択されるキューと相違し、さらにオルトゴナルである。
ある種の実施態様では、胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団は、二次遺伝子の誘導のために更なる発生を経ることができる。二次遺伝子の誘導は、構成的に活性なPKCタンパク質の発現を誘導し、それによって胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団のスプラウト行動又は神経突起伸長の少なくとも1つを強化する。胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団は内皮細胞であり得る。
胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団と胚様体又はオルガノイド細胞の第二の集団との比は1：1、1：2、1：3、1：4、1：5など、又は5：1、4：1、3：1、2：1であり得る。
培養工程は分化培地中で実施し得る。ある種の実施態様では、分化培地は、ドキシサイクリン（DOX）又は別の薬剤を含む。
【００２１】
重要なことには、同じシグナルによって誘導される第二の遺伝子を追加するか又は第二のオルトゴナルな誘導のキュー（例えばドキシサイクリンとは異なる薬剤）を追加することによって、分化だけでなく特定のプログラムされた細胞行動を誘導するという構想が記載される。本出願は、内皮細胞のスプラウト行動を劇的に強化する構成的に活性なPKCタンパク質の発現の誘導を意図しよう。PKCはまた神経突起伸長の強化を促進する。大脳オルガノイドで神経伸長を指令する内因性PKCシグナリングが影響を受けないことが重要である。したがって、当該サブセットでのみPKCを活性化することによって、内皮細胞でのスプラウトが特異的に達成される。
いったん胚様体又はオルガノイドが、酸素又は栄養素が制限されるサイズに増殖したら或いは増殖する前に（典型的には胚様体又はオルガノイドの直径が約1mmに達し（1−22日）、上述の所望の特徴を示したら）、当該胚様体又はオルガノイドは、足場又は3Dプリント血管構造で満たされた生物学的足場に移植されるか又は埋め込まれる。
図13に示すようにある種の実施態様では、例えばコラーゲン（例えばコラーゲンI）への胚様体又はオルガノイドの埋め込みは、（血管球からの）血管スプラウトを促進する。
図12は、胚葉体がマトリゲル又はコラーゲンに埋め込まれ、続いて動脈及び静脈循環に対して灌流可能なチップ上の血管新生マトリックスに埋め込まれる工程を模式的に示す。
血管新生組織構築物及び3Dプリンティング技術を用い細胞外マトリックス組成物で血管チャネルを作製する方法は、以前にWO2015/069619（参照によりその全体が本明細書に含まれる）で記載されている。
例えば、血管チャネルは、1つ以上のサクリファイスフィラメント（各々は一過性インク及び/又は複数の生存細胞を含む）を基質上に沈積させて血管パターンを形成することによって作製できる。続いて一過性インクを除去し、細胞外マトリックス組成物中に血管チャネルのネットワークを作製する（図14A−G）。
【００２２】
有利には、組成物は内皮細胞の付着及び分裂を支援するように設計される。前記内皮細胞は血管チャネルを裏打ちして液の拡散に対する障壁を提供するが、同時にホメオスタシス機能を促進し多様な組織に固有の血管性ニッチの確立を助ける。内皮形成を促進するために、いくつかの実施態様では、一過性インクを含むサクリファイスフィラメントはさらに複数の内皮細胞又は他の生存細胞を含むことができる。図14A−14Cに示すように、細胞をサクリファイスフィラメントとともに沈積させ、一過性インクの除去後に血管チャネルに維持することができる。チャネルの直接的細胞化は、一過性インクの除去後に細胞がチャネル壁に吸着する場合に達成され得る。このアプローチは、非常に曲がりくねったネットワーク又は細いチャネル（強い流れ抵抗のために直接注入で充填することは困難なことがある）に生存細胞を取り込むことを可能にする。一過性インクの撤去によって形成される内皮細胞及びプルロニックF127を含む例示的なプリント組織構築物は図14D−14Gに示され、前記は以前にWO 2015/069619で記載された。
具体的には、一過性インク及び/又は複数の内皮細胞又は他の生存細胞を含む1つ以上のサクリファイスフィラメントを基質上に沈積させて血管パターンを形成することができる。この血管パターンは、1つ以上のサクリファイスフィラメントによる二次元又は三次元の相互に接続された配置又はネットワークを含む。細胞外マトリックス組成物による部分的又は完全な被包化後の一過性インクの除去は、血管チャネルの灌流可能なネットワークを生じる。サクリファイスフィラメントは、マイクロノズルからの押出しを必要とする3Dプリンティングプロセスで沈積させることができるので、一過性インクが（1）せん断減粘性を示すこと；（2）所定の降伏応力Tyを示すこと；及び/又は（3）室温でG’＞G”である、せん断弾性係数G’及びせん断粘性係数G”を有することは有利であり得る。
【００２３】
沈積のために基質は、典型的にはガラス又は他のセラミック、PDMS、アクリルポリマー、ポリウレタン、ポリスチレン又は他のポリマーのような素材を含む。いくつかの実施態様では、基質は、生きている組織又は脱水組織、又は上記に記載の細胞外マトリックス組成物を含むことができる。基質は清浄で、プリントする前に表面処理を実施できる。例えば、ガラス基質には、細胞搭載フィラメントのガラス基質への結合を促進するためにシラン処理を施すことができる。いくつかの実施態様では、基質は固相素材でなくてもよく、その代わりに液相又はゲル相であってもよく、さらに例えばW. Wuら（W. Wu et al., Adv. Mater. 23 (2011) H178-H183（参照によりその全体が本明細書に含まれる））が記載するように注意深く制御されたレオロジー特性を有するものでもよい。Wuらの研究では、一過性インクは合成ヒドロゲルに直接プリントされてネットワーク構造を生じる。しかしながら、これらの合成素材は細胞付着及び分裂を支援せず、その使用は非生物学的適用に限られる。本開示では、細胞付着、遊走、分裂及び組織特異的機能を促進し、一方でプリンティングのために適切なレオロジーを維持する細胞外マトリックス組成物が記載される。サクリファイスフィラメントはプリンティング中に細胞外マトリックス組成物に埋め込まれ、したがって細胞外マトリックス組成物による血管パターンの少なくとも部分的な取り囲みは、サクリファイスフィラメントの各々の沈積中に生じる。これは、プリンティング中に支持素材を必要とすることがある恣意的に複雑な3D構造を含む。血管パターンの形成及び埋め込みが同時に生じるとき、沈積が実施される基質は、細胞外マトリックス組成物又は細胞外マトリックス組成物そのものを保持する容器であると考えることができる。
【００２４】
細胞外マトリックス組成物を形成するために、ミクロゲル（例えばポリ(アクリル酸)（PAA）ミクロゲル）をレオロジー改変物質として用い、以前に示されたように1つ以上の細胞外マトリックス素材（例えばゼラチンメタクリレート）とブレンドすることができる。部分的相互貫入ポリマーネットワーク（セミ-IPN）を形成できる。ミクロゲルは、化学的架橋三次元ポリマーネットワークから構成されるコロイドゲル粒子を含むと理解できる。ミクロゲルは、殻のみを有し芯をもたない立体的に安定化されたコロイドとして機能できる。それらは組成が多様で、PAA、ポリスチレン、PEG、及び/又は他の生物系素材を含むことができる。天然の細胞外マトリックス又は生物系素材をミクロゲル形に変換して理想的なレオロジーを付与することが意図される。適切な生物系素材の例には、ヒアルロン、コラーゲン、アルギネート、フィブリン、アルブミン、フィブロネクチン、エラスチン、又はマトリゲルが含まれる。また別には、合成素材（例えばPEG、アクリレート、ウレタン、又はシリコーン）を同様な態様で改変することができる。
埋め込みプリンティングに適切なインク及びマトリックスのレオロジーの代表的なレオロジー測定値は以前にWO 2015/069619に記載された。ある例では、高分子量（＞1.25MDa）のPAAミクロゲルをレオロジー改変物質として用い、ゼラチンメタクリレート（GelMa）とブレンドして、複雑な3D血管ネットワークの作製を支援する細胞外マトリックス組成物を作製することができる。前記ネットワークは、ある種の実施態様では、WO 2015/069619に記載されたように内皮化できる。細胞外マトリックス組成物の透明性は置換度及びメッシュサイズを変更することによって変化させることができる。
【００２５】
当該方法はさらに、細胞外マトリックス組成物で周囲を取り巻く前に又は被包化する前に、1つ以上の構造フィラメントを予め定めたパターンで基質上に1層ずつ沈積させて鋳型を形成する工程を含むことができる。構造フィラメントは、上記に提供した例示的な細胞外マトリックス組成物又は細胞外マトリックス素材の中から選択される1つ以上の構造素材を含むことができる。鋳型は被包化中に細胞外マトリックス組成物を保持することができ、さらに鋳型は組織構築物の部分として残されても又は加工後に除去されてもよい。構造フィラメントは、基質上の組織構築物の外周及びXY平面外の組織構築物の三次元形状の全部又は少なくとも一部分を規定することができる。
鋳型はまた構築物の形状を規定する以外に他の機能を有することができる。例えば、鋳型は、プリントされた組織構築物中のチャネルの灌流のためのインターフェースとして機能することができる。図15は、プリントされた鋳型又はインターフェース構造の例示的設計を示す。鋳型（インターフェース構造とも称することができる）は、鋳型の台座部分（PDMSを含むことができる）と上部カバー（ガラスを含むことができる）との間で組織構築物を固定することによって、振動中に血管新生組織を適切な位置に保持することができる。
図15の鋳型の設計は、能動的なポンプによる灌流を可能にし、血管チャネルと流体連結される（例えば血管チャネルと連続する）流路を含む。流路として機能する導管を鋳型それ自体に部分的に又は完全に埋め込むことができ、中空管（例えば金属管）を用いて血管チャネルに結びつけることができる。図15に示される例示的な鋳型は、流路（鋳型の内部に延びる中空ピンを含む）を含む複数の控え壁を有する壁を有し、ここで組織構築物が組み立てられる。組織構築物の血管チャネルは中空ピンの開口部と連続して流路に接続された管から血管チャネルに流れを導入することを可能にし、液体は1つ以上の他の開口部を抜けて血管チャネルから除去できる。
【００２６】
ある例では、鋳型はエラストマー性シリコーンで形成できる。前記シリコーンは、粘弾性、非毒性、生物適合性であって、復元可能な押付け嵌合シール（press-to-fit seal）を形成できることが知られている構造素材である。構造素材を3Dプリントして1つ以上の非硬化構造フィラメントを形成でき、前記構造フィラメントは、シリコーン、エポキシ樹脂、アクリル酸エステル、又は上記に提供した細胞外マトリックス組成物の1つから1つ以上を含む。プリンティング完了後、構造フィラメントを適切な時間（例えば約1時間以上）硬化させることができる（例えば加熱又は光重合による）。その後、鋳型は所望の素材特性を示すことができる。
血管パターンの被包化は、液化させたマトリックス前駆物質を鋳型にキャスティングする（流し込む）工程、及びマトリックス前駆物質をゲル化させて細胞外マトリックス組成物を形成する工程を含むことができる。マトリックス前駆物質のキャスティングは約25℃から約40℃の温度で実施できる。例えば、ゼラチンメタクリレート（又はGelMA）は約37℃の温度でキャスティングできる。キャスティング後、マトリックス前駆物質を冷却し（例えばGelMAの場合は約15℃に）、硬い物理ゲルを形成できる。また別には、被包化は、上記に示すように、埋め込み又は全方向性3Dプリンティングプロセスで血管パターンの沈積中に生じ得る。サクリファイスフィラメントと同様に、フィラメント沈積によって細胞外マトリックス組成物を沈積することもまた意図される。例えば、細胞外マトリックス組成物を含む1つ以上のECMフィラメントをノズルから押し出し、基質に1層ずつ沈積させて所望の3D幾何学構造を構築できる。そのような事例では、細胞外マトリックス組成物の収納に鋳型を利用することは必然とは言えない。
細胞外マトリックス組成物を一過性インクの除去前又は除去後に硬化させて、永久的化学的に架橋された構造を形成できる。細胞外マトリックス組成物に応じて、硬化には加熱、UV照射又は化学添加物（例えば酵素的硬化）を伴うことができる。
基質に沈積されるフィラメントのいずれか又は全部（相互貫入する血管パターン又は機能的チャネルパターンを規定する1つ以上のサクリファイスフィラメント、鋳型を規定する1つ以上の構造フィラメント、及び/又は細胞外マトリックス組成物を生成できる1つ以上のECMフィラメントを含む）を、基質に沈積させる前にノズルから押し出すことができる。この押出しプロセスは以前にWO2015/069619で記載された（前記は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。
【００２７】
血管ネットワークは、血管チャネルが相互に貫入した二次元又は三次元の配置であることができる。当該ネットワークは、親血管チャネルから1つ以上枝分かれし（例えば二分枝、三分枝など）、複数の分枝血管チャネルを含むことができる。ネットワークは階層的分枝構造を有することができ、より大きな直径のチャネルがより小さな直径のチャネルに分枝する。血管チャネルのいくつか又は全てが湾曲路をたどり、したがって曲線であると考えられる。ネットワークの血管チャネルの全てが同じ直径を有することができるが、血管チャネルの少なくとも1つ、いくつか又は全てが異なる直径を有することがある。いくつかの事例では、血管チャネルの1つ以上がその全長にわたって均一でない直径を有することがある。
図16は、カスタム灌流チップの例示的な3Dプリンティング方法を示す。
血管新生組織のプリンティングは図17に示される。提示の実施態様では、PDMS境界線が最初にプリントされ、一過性インクを含むフィラメントの沈積が続いて血管チャネルを生じる。次の工程は第一の細胞充填インク及び第二の細胞充填インクの沈積を含む。この工程は2−4回繰り返され、その後にECMによる埋積が続く。次に、図18に示すように、マトリックスを冷却し（約4℃）、一過性インクを撤去して血管ネットワークを作製する。続いてヒト臍帯血内皮細胞（HUVEC）を導入して血管を作製する。
ある種の実施態様では、図19に示すように、かけ渡されて互に交差せずに分枝する2つの血管ネットワーク（すなわち動静脈叢）を作製し、自然な毛細血管発生を可能にして動脈及び静脈ネットワークを接続する。
【００２８】
図20A−20Dは、オルガノイド本体又はオルガノイドを灌流するための3Dプリントインターフェース装置の例を示す。具体的には、図20Aは、プルロニックF-127サクリファイスフィラメントのプリントされたネットワークの上面図を示す。前記サクリファイスフィラメントは、ゲルにキャスティングし冷却し、さらに液化させたサクリファイスプルロニックF-127を除去した後で動静脈叢の作製に用いることができる。この構成では、図19に図解するように、互いに接触することなく絡み合う2つの独立したネットワークが存在する。このようにして、2つの独立したチャネルネットワーク（動脈及び静脈叢）で空間が満たされる。図20Bは、プリントされたシリコーン灌流チップの内部にプリントされた図20AのプルロニックF-127構造を示す。このチップは、サクリファイスフィラメントを取り囲むゲルのキャスティング、サクリファイス素材の除去、及びその後の2つの独立したチャネルネットワークの活発な灌流を促進する。図20C及び20Dは、どのようにルアーコネクターをシリコーンチップに接続して外部ポンプへ接続させるかを示す。
胚葉体又はオルガノイド及びかけ渡されて互に交差せずに分枝する2つの血管ネットワーク（すなわち第一の血管ネットワーク及び第二の血管ネットワークで、各血管ネットワークは1つ以上の相互に接続する血管チャネルを含む）を含む血管新生マトリックスを上記で詳述したように調製したら直ちに、胚葉体又はオルガノイドを当該血管新生マトリックスに埋め込むか又は移植する（図21）。1つ以上の相互に接続される血管チャネルは、上記で述べたように、血管形成、脈管形成又は細管形成の少なくとも1つを含むことができる機械的製造プロセス又は生物学的発生プロセスによって形成される。
胚葉体又はオルガノイドは、プルロニックカラムの周囲にゲルをキャスティングし、当該プルロニックを除去してマイクロウェルを作製し、当該マイクロウェルに胚葉体又はオルガノイドを静置することによって導入できる。図22A−Dは、血管新生組織への胚葉体の埋め込みを示す。具体的には、図22A−Cは、それぞれ移植後2日目、3日目及び5日目の胚葉体を示す。赤色細胞は、プリント血管チャネルを裏打ちするHUVECである。2つの独立した血管チャネルは中央の胚葉体又はオルガノイド（緑色）を取り巻き、栄養素及び酸素を提供し、老廃物を除去する。図22Dは、スプラウトオルガノイドの移植及び灌流のために外部と接続される例示的な灌流チップを示す。
【００２９】
ある種の実施態様では、胚葉体又はオルガノイドを血管新生マトリックスに埋め込む前に、胚葉体又はオルガノイドは上記で述べたように細胞外マトリックス素材で被包化できる。好ましくは、細胞外マトリックス素材はゲルを含むことができる。胚葉体又はオルガノイドを被包化するために用いることができるマトリックスの追加例には、コラーゲンI、フィブリン、マトリゲル、ゼラチン、ゼラチンメタクリレート、ラミニン、カルボポール、NIPAM、PEG、PHEMA、生糸、ヒアルロン酸、又は前記の組み合わせの少なくとも1つが含まれるが、ただしそれらに限定されない。
また別には、ある種の実施態様では、胚葉体又はオルガノイドは、それを血管新生マトリックスに埋め込む前に細胞外マトリックス素材で被包化されない。
ある種の実施態様では、胚葉体又はオルガノイドは、マトリゲル又はコラーゲンに埋め込まれた胚葉体又はオルガノイドを灌流可能チップ上の血管新生マトリックスに沈積させることによって血管新生マトリックスに埋め込まれる。上記で述べたように、灌流可能チップは出口を含み動静脈循環を提供する。灌流可能な血管新生オルガノイドを作製する戦略は図12に模式的に示されている。
続いて、1つ以上の生物学的因子若しくは因子、生物学的因子勾配、圧、及び/又は酸素分圧勾配に胚葉体又はオルガノイドを暴露し、それによって当該胚葉体又はオルガノイドに向かう及び/又は胚葉体又はオルガノイドから出る毛細血管の脈管形成を誘導する（図23）。支持線維芽細胞及びオルガノイド又は胚葉体は緑色で示され、周囲のチャネルを通って灌流される栄養素による増殖と認めることができる。HUVECは赤色で示される。
例えば、1つ以上の生物学的因子、生物学的因子勾配、圧、及び/又は酸素分圧勾配は、胚様体又はオルガノイドの内部の血管叢が、3Dプリントされた胚葉体又はオルガノイドに導入される増殖因子の手段によって、発生中の胚葉体又はオルガノイドから外部へのスプラウトを促進する。さらにまた、1つ以上の生物学的因子、生物学的因子勾配、圧、及び/又は酸素分圧勾配はさらに、胚様体又はオルガノイドの発生、分化及び/又は機能発揮を指令する。
【００３０】
ある種の実施態様では、増殖因子及び酸素は、灌流可能チップを用いる灌流により直接供給されて、胚葉体又はオルガノイドを増殖させることができる（図20A−D）。血管構造の接続を促進する増殖因子のいくつかの例には、血管内皮増殖因子（VEGF）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、スフィンゴシン-1-ホスフェート（S1P）、ホルボールミリステートアセテート（PMA）、肝細胞増殖因子（HGF）、単球走化性タンパク質-1（MCP-1）、アンギオポイエチンANG-1、アンギオポイエチンANG-2、形質転換増殖因子ベータ（TGF-β）、表皮増殖因子（EGF）、ヒト成長因子、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）及びヒスタミンが含まれるが、ただし前記に限定されない。
ある種の実施態様では、胚葉体又はオルガノイドは1つ以上の生物学的因子に暴露されるか、又は血管新生マトリックス内の1つ以上の生物学的因子の拡散による生物学的因子勾配に暴露される。また別には、胚葉体又はオルガノイドは1つ以上の生物学的因子に暴露されるか、及び/又は組織構築物内の1つ以上の生物学的因子を積載した素材の局所的沈積によって生物学的因子勾配に暴露される。また別には、胚様体又はオルガノイドは1つ以上の生物学的因子に暴露されるか、及び/又は局所的タンパク質翻訳による増殖因子の局所的de-novo生成によって生物学的因子勾配に暴露される。また別には、胚様体又はオルガノイドは1つ以上の生物学的因子に暴露されるか、及び/又は1つ以上の生物学的因子の第一及び第二の血管ネットワークの一方又は両方の灌流を介して生物学的因子勾配に暴露される。
ある種の実施態様では、第一及び第二の血管ネットワークの一方だけが1つ以上の生物学的因子を灌流させる。
ある種の実施態様では、第一及び第二の血管ネットワークの両方が1つ以上の生物学的因子を灌流させ、この場合、第一の血管ネットワークの生物学的因子濃度は第二の血管ネットワークの生物学的因子濃度と相違する。
ある種の実施態様では、第一及び第二の血管ネットワークの両方が1つ以上の生物学的因子を灌流させ、この場合、第一の血管ネットワークの生物学的因子濃度は、第二の血管ネットワークの生物学的因子濃度と同じである。
【００３１】
1つ以上の生物学的因子は以下の1つ以上を含むことができる（ただしこれらに限定されない）：増殖因子、モルフォゲン、小分子、薬剤、ホルモン、DNA、shRNA、siRNA、ナノ粒子、mRNA、修飾mRNA。
さらにまた、生物学的因子は以下の増殖因子の1つ以上を含むことができる：血管内皮増殖因子（VEGF）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、スフィンゴシン1リン酸（S1P）、ホルボールミリステートアセテート（PMA）、肝細胞増殖因子（HGF）、単球走化性タンパク質1（MCP-1）、アンギオポイエチンANG-1、アンギオポイエチンANG-2、形質転換増殖因子ベータ（TGF-β）、表皮増殖因子（EGF）、ヒト成長因子、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）、及びヒスタミン。
ある種の実施態様では、酸素分圧勾配は、灌流中に第一及び第二の血管ネットワークの一方又は両方に導入される。酸素分圧勾配は、脱酸素媒体を第一及び第二の血管ネットワークの一方に導入し、さらに第一及び第二の血管ネットワークの他方に含酸素媒体を導入することによって形成される。ある種の実施態様では、灌流は約1マクロリットル/分から約1リットル/分の流速で実施できる。ある種の実施態様では、灌流中に第一及び第二の血管ネットワークの一方又は両方が経壁圧にさらされることがある。
ある種の実施態様では、胚葉体又はオルガノイドを1つ以上の生物学的因子、生物学的因子勾配、圧及び/又は酸素分圧勾配に暴露した後で、毛細血管が第一の血管ネットワークを第二の血管ネットワークに接続し、それによって単一の血管ネットワーク及び灌流可能な組織構築物が作製される。ある種の実施態様では、単一血管ネットワークは、相互貫入血管ネットワーク及び/又は分枝相互貫入血管ネットワークを含む。好ましくは、単一血管ネットワークは相互接続動静脈チャネルを含む。
【００３２】
ある種の実施態様では、第一の血管ネットワーク及び第二の血管ネットワークは別個に対処され得る。ある種の実施態様では、第一の血管ネットワーク及び第二の血管ネットワークは互に接触しない。
ある種の実施態様では、第一の血管ネットワークは動脈叢を含み、第二の血管ネットワークは静脈叢を含む。
ある種の実施態様では、胚葉体又はオルガノイドを血管新生マトリックスに埋め込む工程は、1つ以上の細胞搭載フィラメント（前記フィラメントの各々は複数の生存細胞を含む）を基質上に沈積させて1つ以上の組織パターンを形成させる工程であって、当該組織パターンの各々が1つ以上の予め定められた細胞タイプを含む前記工程、その各々が一過性インクを含む1つ以上のサクリファイスフィラメントを当該基質上に沈積させて、当該1つ以上の組織パターンに相互貫入する血管パターンを形成する工程、当該血管パターン内に胚様体又はオルガノイドを沈積させる工程、当該1つ以上の組織パターン及び当該血管パターンを細胞外マトリックス組成物で少なくとも部分的に取り囲む工程、及び当該一過性インクを除去し、それによって埋め込まれた胚様体又はオルガノイドを含む組織構築物を形成する工程を含む。当該1つ以上の細胞搭載フィラメントの少なくとも一部は1つ以上の生物学的因子を含むことができる。第一及び第二の血管ネットワークの一方又は両方が微細流チャネルを含むことができる。
ある種の実施態様では、複数の胚葉体又はオルガノイドが血管新生マトリックスに埋め込まれる。胚葉体又はオルガノイドは異なる表現型を含んでも、又は同じ表現型を含んでもよい。
ある種の実施態様では、胚葉体又はオルガノイドを血管新生マトリックスに埋め込む工程はまた、血管新生マトリックスのアレイに胚葉体又はオルガノイドを埋め込む工程を含むことができ、ここで埋め込み、暴露及び血管新生は各血管新生マトリックスで実施される。
【００３３】
上述したように、胚様体又はオルガノイドの内部の血管叢は、例えば、3Dプリントされた胚様体又はオルガノイドに導入される増殖因子の手段によって、発生中の胚様体又はオルガノイドのスプラウトを促進する。スプラウト叢が3Dプリントされた血管に到達した後、胚様体又はオルガノイドは、蠕動ポンプ及び灌流装置（前記は国際公開WO2015/069619に概略）の使用によって灌流され得る。図20A−20D及び20E−20Gはプリントされた鋳型又はインターフェース構造の例示的設計を示す。図15に示される例示的鋳型は受動的な振動灌流のために設計される。鋳型（インターフェース構造とも称することができる）は、鋳型の台座部分（PDMSを含むことができる）と上部カバー（ガラスを含むことができる）との間で組織構築物を固定することによって、振動中に血管新生組織を適所に保持することができる。
ある種の実施態様では、当該鋳型設計は、組織構築物の能動的なポンプによる灌流を可能にし、組織構築物の血管チャネルと流体連結される（例えば血管チャネルと連続する）流路を含む。流路として機能する導管を鋳型それ自体に部分的に又は完全に埋め込むことができ、中空ピン（例えば金属ピン）を用いて血管チャネルに結びつけることができる。図15に示される例示的な鋳型は、流路（鋳型の内部に延びる中空ピンを含む）を含む複数の控え壁を有する壁を有し、ここで組織構築物が組み立てられる。組織構築物の血管チャネルは中空ピンの開口部と連続して流路に接続された管から血管チャネルに流れを導入することを可能にし、液体は1つ以上の他の開口部を抜けて血管チャネルから取り除かれ得る。
追加の特徴では、本発明は、神経学的組織の発生の影響（例えば欠陥、特に発生の欠陥）を解明する方法を提供し、前記方法は、記載の方法の任意の段階で細胞の問題の遺伝子の発現を低下又は増加させる工程を含む。
【００３４】
ある種のさらに別の実施態様は、問題の神経学的組織の発生における欠陥の治療に適切な治療薬剤候補をスクリーニングする方法に関する。この特徴にしたがえば、治療薬剤候補は、変異を有する任意の細胞（前記は上述のように導入できる）に対する影響を有するか否かについてスクリーニングできる。もちろん、ある変異を有する患者の細胞を使用することもまた可能であり、この場合は、多能性幹細胞状態を導入し本方法を実施して上述のように組織の発生を誘導する。
もちろん、候補薬品（例えば治療薬候補）が異常な発生を生じる変異をもたない正常組織に対してなんらかの影響を有するか否かも同様にスクリーニングすることも可能である。したがって、さらに別の特徴では、本発明は、候補薬品を神経学的影響について試験する方法に関し、前記方法は、人工的培養に候補薬品を投与する工程、前記培養の細胞の問題の活性を決定する工程、及び前記活性と前記候補薬品を投与されなかった培養の細胞の活性とを比較する工程を含み、ここで、弁別的な活性は神経学的影響の指標である。本発明の細胞又は組織におけるいずれの種類の活性も（代謝回転又はニューロン細胞シグナリングを含む）候補薬品で探索することができる。本質的には、本発明の高度に分化した組織を大脳の行動のモデルとして用いて、任意の薬品の任意の影響について試験することができる。そのような方法を用いて、任意の種類の疾患の治療を意図する治療薬を神経（特に脳組織）に対して、本発明の組織培養で観察できるように副作用を有するか否かについて試験することもまた可能であり得よう。
ある種のさらに別の実施態様はニューロン細胞を入手する方法に関する。特に本発明は分化神経細胞を入手する方法を提供し、前記方法は、人工的培養を提供して問題の分化神経細胞を単離する工程を含むか、又は本発明にしたがって人工的組織培養を作製する工程及び問題の分化神経細胞を単離する工程を含む。本発明の培養又は組織から単離したそのような細胞は、上述のように非ヒト動物又はヒトの大脳組織から単離された細胞と類似する形態学的特性を表すという利点を有する。
ある種の追加の実施態様は、記載の方法によって形成される機能的ヒト組織又は機能的ヒト組織のアレイに関する。
【実施例１】
【００３５】
血管新生組織のプリンティング
3Dプリント血管新生組織を作製するために以下の方法を用いた（図17及び18に図解）：
工程1：SE1700（Dow chemicals）を用いてPDMS境界線を3Dプリントした。
工程2：一過性インク、プルロニックF-127又はゼラチンを3Dプリントして、血管チャネルを作製した。
工程3：細胞充填インク#1（10%wt/vゼラチン-フィブリノゲン又はゼラチンメタクリレート（GelMA）ヒドロゲル（光開始剤Irgacure-2959を0.3%wt/vで含む）中で混合された細胞を含む）を3Dプリントした。
工程4：細胞充填インク#2（10%wt/vゼラチンゼラチンメタクリレートヒドロゲル（光開始剤Irgacure-2959を0.3%wt/vで含む）中で混合された細胞を含む）を3Dプリントした。
上記の工程1−4を繰り返した。
生成された一過性インク及び細胞搭載フィラメントを細胞外マトリックス（0.3%wt/vのIrgacure-2959光開始剤を含む10%wt/vのゼラチンメタクリレートを含む）で埋積した。
続いて前記構造物を暴露してゼラチンメタクリレートを化学的に架橋した。
状況：
青い核を有し緑色：DAPIで染色されたGFP HNDF。
青い核を有し赤色：DAPIで染色されたRFP HUVEC。
青い核を有し非蛍光性：10T1/2 MF。
続いて、ECMとじ込み構築物を4℃に冷却し、一過性インクを撤去して血管ネットワークを作製した。
次に、HUVECを導入してチャネルを裏打ちして血管を作製した。
図24は記載の方法によって作製した内皮血管チャネルを示す。HUVECは撤去されたGleMAゲル内に存在する。チャネルの直径は約350−450ミクロンであった。緑色で示される生細胞はカルセインで染色され、赤色で示される死細胞はエチジウムホモダイマーで染色された。
図25は、GelMAゲル内でプリントされた2つの細胞タイプ（10T1/2線維芽細胞及びNIH3T3）のプリント領域によって取り囲まれた内皮血管チャネル（赤色細胞）を示す。
図26は、周囲のHDNF線維芽細胞（緑色）の増殖を支援する内皮血管チャネル（赤色）の灌流を示す。チャネルは記載の方法を用いてゲル内に作製され、ゲルは、当該組織と外部の蠕動ポンプ（内皮細胞が裏打ちするチャネルを通る流れを駆動する）との接続を促進する灌流チップ内に埋め込まれる。
【実施例２】
【００３６】
内皮細胞充填一過性フィラメントのプリンティング
図14A−Gに示すように、一過性インク（プルロニック-F127又はゼラチン）は生HUVEC細胞を含んでいた。
まず初めに細胞をプルロニック-F127インク中に分散させ（図14A及びD）、続いてDMEM培地中の10%wt/vゼラチンメタクリレート（0.3%wt/vの光開始剤Irgacure-2959を含む）を細胞周囲にキャスティングし（図14B及びE）、UVに暴露して架橋した。次に、プルロニック-F127インクを4℃に冷却することによって液化させ、インク中に懸濁された細胞を定着させて壁に付着させた（図14C及びF）。インクを除去して数日細胞を培養した後、細胞を壁に接着したままにした（図14G）。
【実施例３】
【００３７】
大脳オルガノイドの作製
大脳オルガノイド（図7A−Iに示す）を合成するために以下の方法を用いた。
ヒトESC認証増殖因子枯渇マトリゲルを室温で1時間インキュベートすることによって、6ウェルプレートをマトリゲルで被覆した（前記マトリゲルは製造業者（Corning）の推奨するバッチ固有濃度でDMEM/F12培地により希釈された）。
ヒトiPSCをマトリゲル被覆プレート上のmTeSR培地中で維持し、コロニーが出現し始めたらアキュターゼ（Accutase）を用いて継代した。
継代時には、ヒトiPSCを1mLのアキュターゼ試薬を用いて15分間解離させ、続いて11mLのDMEM/F12培地で希釈し、200gで5分間遠心分離し、1mLのAW培地に再懸濁し、細胞カウント装置を用いて計測し、AggrewellTM 400プレートの各ウェルに付き600,000細胞密度で播種した（前記は各マイクロウェルにつき500 iPSCの密度に相当する）（図7A）。培地体積をAW（10μMのROCK阻害剤Y-27632を含む）を用いて2mLとした。‘0日目’の時点は、iPSCがAggrewellTMに最初に播種された日に一致する。
24時間後（1日目）、iPSCは胚葉体を形成した（図7B）。この胚葉体を穏かなピペット吸引で採集し、超低接着プレート（Corning, Inc.）に移し、ROCK阻害剤を含まないAW培地で2日間維持した。
3日目に、胚葉体をNIMに移し、5日間培養した（図7D−F）後で、NDMIに移した（図7G）。
11日目に、氷冷マトリゲルの800nLをピペット吸引してパラフィルムシートに移し、さらにオルガノイドを含む培地の200nLを前記小滴に添加することによって、大脳オルガノイドを1μLのマトリゲル小滴に移した。続いて、前記マトリゲル小滴を37℃で10分間維持してマトリゲルをゲル化させ、続いてNDMIを含むスピンニングバイオリアクターに移した（図5Aに示す）。
18日目に、フラスコの培地をNDM2に変えた。前記培地は1週間毎に交換した。
【実施例４】
【００３８】
スプラウト胚葉体の内皮前駆細胞の確認
スプラウト胚葉体は実施例3で概略した手順に従って形成されたが、ただしNIMの使用をEGM-2培地に置き換え、NDM1及びNDM2培地に100ng/mLのVEGFを補充して内皮の発生及び分裂を促進した。
図27の左の画像に示すように、このプロセスを用いて形成したオルガノイドを、ネスチン（緑色）（神経前駆細胞マーカー及び内皮マーカー）及びSox1（赤色）（神経前駆細胞マーカー）の免疫蛍光によって分析した。ネスチンの強い染色及びSox1が存在しないこととともに細胞の管状形態は内皮系列を示唆する。（図27の右の画像）。Sox1（緑色）及びVE-カドヘリン（赤色）（特異的内皮マーカー）について染色したとき、胚葉体に神経ロゼット（緑色の環）の存在及び血管構造（赤色）の共存状況が検出された。
図28に示した結果は、成熟ニューロンとともに皮質構造の存在を立証する。
【実施例５】
【００３９】
神経構造の存在の確認
大脳オルガノイドに神経構造が存在することを確認するために、実施例3のプロトコルにしたがって大脳オルガノイドを発生させ、Sox1（緑色）及びニューロン特異的β-IIIチューブリン（クローンTuj-1としても知られている）（赤色）について免疫染色を実施した。図28に示すように、神経投射の放射状編成は大脳オルガノイドの表現型を裏づける。
【実施例６】
【００４０】
iPSCからの血管新生大脳オルガノイド作製
図29及び30に示すように、以下の方法を用いてiPSCから血管新生大脳オルガノイドを作製した。
血管新生大脳オルガノイドは、実施例3で概略した方法によって調製したが、ただしNIMを使用する代わりに、胚葉体を1：100のN2サプリメントで補充したEGM-2培地で培養した。NDM1及びNDM2もまた100ng/mLのVEGFで補充した。
このプロセスを用いて形成したオルガノイドを、神経前駆細胞（Sox1）及び血管内皮細胞（CD31）について免疫蛍光により分析した（前記はそれぞれ赤色及び緑色で上段左の画像で示される）。このプロセスを用いて培養したオルガノイド内に含まれる神経構造物をさらに試験するために、N-カドヘリン（緑色、上段右の画像）について染色する（前記は自然の神経発生に続いて脳室壁を裏打ちすることが示される）。下段右画像はSox2の染色であり、前記は、脳室様構造を取り巻く神経ロゼットを形成する神経幹細胞を識別する。上段右及び下段右の両画像はDAPI（青色）による染色で、DAPIは細胞核とともに局在する。
【実施例７】
【００４１】
マルチ集団オルガノイドの作製（アプローチ1）
ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を人工多能性幹細胞（iPSC）と混合する‘コモンセンス’アプローチを用いてマルチ集団オルガノイドを合成できるか否かを決定するために、下記の方法を用いた。
iPSCを実施例3に概略するように培養したが、ただしiPSCをAggrewellTMに添加する前に細胞を1：1の比でHUVECと混合し、続いてこの混合物をAggrewellTMに添加し100gで3分間遠心分離した。
図31に示すように、初期には2つのタイプの細胞が培地中に分散した。しかしながら、1日目には、HUVECとiPSCとを混合する‘コモンセンス’アプローチは、当該2つの細胞タイプの異なる2つの集団への‘相分離’をもたらす。iPSCは緑色で示され、HUVECは赤色で示される。
【実施例８】
【００４２】
マルチ集団オルガノイドの血管新生
ヒトの人工多能性幹細胞（iPSC）をビトロネクチンで被覆した組織培養非処理の6ウェルプレート上でmTeSR1培地中の培養で維持した。継代のために、細胞をアキュターゼで5分間処理し、DMEM/F12（15mMのHEPESを含む）で洗浄し、P1000ピペットチップを用い2回ピペットで出し入れすることによって穏かに粉砕した。続いて、10μMのRho-キナーゼ阻害剤（ROCK-i）を含むmTeSR1培地に前記細胞を再度プレートした。12−20時間後に、ROCK-iを含まないmTeSR1に細胞を置き換え、培地を毎日替えた。
胚葉体形成のために、‘0日目’に上述のように細胞を継代したが、ただしより長い15分のアキュターゼ処理を用いてコロニーを単一細胞に分離して正確な計測を助けた。計測したら直ちに、iPSCをAggrewellTM 400プレートにマイクロウェルに付き500細胞の総密度で添加し、100gで3分間遠心分離し、10μMのROCK-iを含む2mLのアキュターゼで培養して胚葉体を形成した。この時点で、遺伝的に改変したiPSC集団を用いようとする場合は、前記iPSCを野生型iPSCの単一細胞懸濁物に所定の細胞計測比で添加及び混合して、AggrewellTMプレートに添加し、続いて100gで3分間遠心分離して各マイクロウェルで混合細胞集団を作製することができる。
20時間後（‘1日目’）、胚様体がマイクロウェル中に形成され、培地をAggrewellTM培地（ROCK-iを含まない）に交換した。‘3日目’まで培地を毎日変えた。3日目の時点で、胚葉体を穏かなピペット操作によりマイクロウェルから取り出し、40μmのリバーシブルな細胞フィルターの表面で洗浄して清浄にし、その後で当該フィルターを反転させ、5mLのNIM（1：100のN2サプリメントを補充）を用いて前記胚葉体を遊離させた。胚葉体を超低接着性6ウェルプレートに懸濁培養のために移し、1日に2回撹拌して凝集を防いだ。
懸濁培養して4日間後（‘7日目’）、プルロニックF-127又はゼラチンのサクリファイスプリントフィラメント周囲でピン-キャスティング又は鋳造によって形成した微細血管足場に細胞を移植した。マトリックスは、ラット尾部I型コラーゲン（2mg/mL）又はフィブリノゲン（10mg/mL）と混合したマトリゲルで構成された。血管ネットワークは2つの独立したネットワーク（‘動脈’及び‘静脈’ネットワーク）を含んでいた。培養培地は、以下を含む神経分化培地1期に切り替えた：DMEM/F12と1：200 N2サプリメント補充神経基礎培地との1：1混合物、1：100のB27サプリメント（ビタミンAを含まない）、1：200のMEM-NEAA、1ｘグルタマックス、及び1ｘβ-メルカプトエタノール。次に、特異的な脈管形成因子をネットワークの一方又は両方に添加して、血管スプラウトを促進した。培地を2つの独立したネットワークから蠕動ポンプの手段によって送り込み、2日毎に培地を入れ替えた。
‘11日目’に、培地を神経分化培地2期に置き換えた。前記は神経分化培地1期と同じであるが、ただしビタミンAを含まないB27はビタミンAを含むB27に置き換えた。
DOXを100ng/mLで培地に加えて（分化プロセスの任意の期に添加できる）、遺伝的に改変されたiPSCのトランス分化又は定方向分化を誘導できる。さらにまた、第二のオルトゴナルシグナルを誘導内皮のスプラウトを誘導するために記載した培地条件に加えて、静脈及び動脈の両方の系を接続する毛細血管叢の形成を強化することができる。脈管形成因子の添加は勾配を提供して、方向性のある脈管形成を誘導することができる。
2つのネットワークを接続するために十分に脈管形成が生じたら直ちに、蠕動ポンプを介して陽圧を動脈側にのみ適用して接続毛細血管から静脈側へ液体を流れさせる。
図32に示すように、iPSCの蛍光及び非蛍光集団（それぞれ遺伝的改変亜集団及び野生型亜集団を表す）をAggrewellTMに添加する前に混合することができる（図32、左画像）。in vitroで20時間後に、iPSCは融合して、野生型及び遺伝的改変iPSCが均等に分布する混合集団を形成する。
【実施例９】
【００４３】
ETV2は内皮表現型を効率的に誘導することができる
図33は、種々の転写因子に対するドキシサイクリン誘導性プロモーターで形質転換したiPSCの集団は、mTeSR1培地にドキシサイクリンを添加したとき、様々な効率で内皮細胞に直接的に分化させることができることを示す。
具体的には、PiggyBacトランスポゾン系のエレクトロポレーションを用いて、iPSCの5つの別々の集団を転写因子ETS-関連遺伝子（ERG）、ETS-変種2（ETV2）、ブラチュリー（Brachury）（T）又は前記列挙した転写因子の4つ全ての組合せ（All 4）のいずれかで形質転換した。図34は、2つの内皮遺伝子PECAM-1（CD31としてもまた知られている）及び血管内皮カドヘリン（VECad）についてのフローサイトメトリーデータを示す。
この例では、ETV2のドキシサイクリン誘導過剰発現は、500ng/mLのドキシサイクリンを含むmTeSR1培地で5日後に最高パーセンテージの細胞（〜8%）の内皮細胞状態への変換をもたらした。4転写因子全ての過剰発現もまた血管マーカーの測定可能な発現をもたらしたが、ETV2単独の過剰発現よりも効率は低かった。
図35は以下を示す：dox-誘導性ETV2ベクターで形質転換し500ng/mLのドキシサイクリンを含むmTeSR1培地で5日間培養したiPSCは、内皮状の‘玉石’形態を示す顕著な数の細胞を生じ、前記は、免疫蛍光プロトコルを実施した後、VEカドヘリン（右画像、オレンジ色の細胞）について明るく染色され、いくつかはCD31で同時染色され（右画像、紫色の細胞）、一方、陽性Oct4染色によって可視化されているように（左パネル、緑色の細胞）、mTeSR1培地だけで培養した細胞は多能性を維持した。
【実施例１０】
【００４４】
ETV2過剰発現は3D培養で内皮を誘導できる
ETV2で形質転換したiPSCを用い実施例3に記載したように、胚葉体をAggrewellTMプレートで調製した。
図36は、3日目にAggrewellTMから採集し、さらに500ng/mLのドキシサイクリンを含む神経誘導培地に浸したマトリゲルの小滴で培養した胚葉体の時系列位相差顕微鏡写真を示す。目に見える血管スプラウトは培養12時間以内に突出を開始する。
図37は、大脳オルガノイド培養条件を用いてマトリゲルで10日間培養した血管のスプラウトを示す。10μMのPMA（PKC-アルファアクチベーター）の添加によって、血管スプラウトは劇的に増加した。しかしながら、PKCはまた神経突起伸長を媒介し、大脳オルガノイドの発生を妨げることがある。
【実施例１１】
【００４５】
100% ETV2誘導性細胞は血管叢を生じる
図38は、実施例10に記載したようにマトリゲルで調製したドキシサイクリン誘導性ETV2発現iPSCの懸濁物を用いて形成した胚葉体を示す。NIM及びNDM1培地を実施例3に記載したように用いたが、ただし500ng/mLのドキシサイクリンを補充した。11日目に、胚葉体を固定して、標準的な免疫蛍光プロトコルを用いて染色した。
図38を参照すれば、画像は、VE-カドヘリン（赤色）の陽性染色によって示されるようにスプラウト血管叢の発生を明示し、識別可能な神経前駆細胞は認められない（Sox 1発現細胞は存在しないことによって示される）。
【実施例１２】
【００４６】
大脳オルガノイドの長期培養
図39は、実施例10に記載したように調製したドキシサイクリン誘導性ETV2発現iPSCの懸濁物を用いて形成した胚葉体を示すが、ただし、胚葉体は1日目に採集され、2mg/mLのラットの尾のI型コラーゲンとAW培地中で混合され、さらに水酸化ナトリウムで中和された。続いて、胚葉体を含むコラーゲン溶液を6ウェルプレートにピペットで移して37℃でインキュベートし、コラーゲン原線維を形成させた。次に、2mLのAW培地をゲルの上部にピペットで加えた。3日目に胚葉体をドキシサイクリン非添加（上列）又はドキシサイクリン添加（下列）NIMに移し、5日間培養した。8日目に、NIM培地をドキシサイクリン添加（下列）又はドキシサイクリン非添加（上列）NDM1に置き換えた。10日目までに位相差画像は、ドキシサイクリン添加又は非添加で培養された胚葉体の明瞭な表現型の相違を示した。ドキシサイクリン非添加で培養された胚葉体は、位相差で目に見える大きな神経上皮領域（矢印）を有していた。ドキシサイクリン添加培養の胚葉体はスプラウト内皮表現型を示した。
【実施例１３】
【００４７】
野生型とETV2誘導性細胞の百分率の定量
胚葉体を実施例3に記載したように形成したが、ただし細胞をAggrewellTMプレートに播種する前に、野生型iPSC及び薬剤誘導性ETV2細胞の混合懸濁物を4：1（野生型：ETV2）の比で混合した。加えて、ドキシサイクリンを500ng/mLでNIM、NDM1及びNDM2に添加し、大脳オルガノイドはマトリゲルに埋め込まずにスピンニングフラスコを用いないで懸濁培養で培養した。14日目に生成された血管新生大脳オルガノイドを固定し、標準的な免疫蛍光プロトコルを用いて染色した。
図40は、免疫蛍光染色した血管新生大脳オルガノイドを示す。このオルガノイドでは、神経前駆細胞の明瞭な領域（Sox 1発現（紫色）によって強調される）が存在し、その後ろに神経細胞の外側層が続き、前記神経細胞は、ニューロン特異的βIIIチューブリン発現（緑色）によって示されるように神経幹細胞の下部層から生じる。さらにまた、当該オルガノイドは、VE-カドヘリン（赤色）に対する陽性染色によって示されるように血管叢によって取り巻かれている。
【実施例１４】
【００４８】
灌流可能チャネルの間のマトリゲルに混合オルガノイドを埋め込む
図41は下記手順を実施したオルガノイドを示す。
胚葉体を実施例3に概略したプロセスにしたがって形成したが、ただし、野生型（60%）及び薬剤誘導性ETV2細胞（40%）の混合物を用いてAggrewellTMに播種した。
AggrewellTMプレートに播種後1日目に、胚葉体を採集し、超低接着プレートのAW中に2日間置いた。
3日目に、培地を500ng/mLのドキシサイクリンを含むNIMに変えた。
5日目に、実施例10に概略した方法を用いて、胚葉体をマトリゲル小滴に注入した。
インキュベーターで37℃、10分間ゲル化させた後、このマトリゲル小滴を2つの線状の灌流可能チャネルを含むコラーゲンゲルに添加した。前記マトリゲルをオルガノイドが2つのチャネルの間に横たわるように配置した。次に、外部チャネルを液体貯留槽に接続した（前記貯留槽は静水圧によりチャネルを通じた重力送りを可能にし、静水圧は蠕動ポンプにより持続的に再循環される）。オルガノイドをドキシサイクリン含有神経誘導培地で合計8日間増殖させ、位相差画像は11日目に撮影された。図41を参照すれば、血管スプラウトは中央の密なオルガノイドから出現し、当該スプラウトは隣接する灌流可能チャネルに近づいていく。
【００４９】
本発明をその一定の実施態様に関して相当に詳細に記載してきたが、他の実施態様も本発明から逸脱することなく可能である。添付の特許請求の範囲の趣旨は、したがって本明細書に含まれる好ましい実施態様に限定されるべきではない。本特許請求の範囲の趣旨に（文字通り又は意義にしたがって）入る全ての実施態様がその中に包含されることを意図する。
さらにまた、上記に述べた利点が必ずしも本発明の唯一の利点ではなく、さらに記載した利点の全てが本発明の各実施態様で達成されるとは限らない。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ−Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｉ】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ−Ｇ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【国際調査報告】
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