(57)【要約】本発明は、少なくとも１つのヒトパピローマウイルス抗原を含む構築体を発現する組換え型リステリア株を対象に投与する工程を含む、ヒトパピローマウイルス関連の腫瘍またはガンの治療、予防、およびそれに対する免疫応答を誘発する方法を提供する。本発明は、例えば、組換え型核酸を含む組換え型リステリア株を含むものである免疫原性組成物であって、前記核酸は、機能可能であるように縦列型で連結した、４つの異種ＨＰＶ抗原またはその機能断片を含む組換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記機能可能であるように連結した異種ＨＰＶ抗原またはその機能断片は、最Ｎ末端の異種抗原のＮ末端において、ＬＬＯタンパク質のＮ末端断片に融合し、前記組換え型核酸は、代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含むものである、免疫原性組成物を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え型核酸を含む組換え型リステリア株を含むものである免疫原性組成物であって、前記核酸は、機能可能であるように縦列型で連結した、４つの異種ＨＰＶ抗原またはその機能断片を含む組換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記機能可能であるように連結した異種ＨＰＶ抗原またはその機能断片は、最Ｎ末端の異種抗原のＮ末端において、ＬＬＯタンパク質のＮ末端断片に融合し、前記組換え型核酸は、代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含むものである、免疫原性組成物。
【請求項２】
ＬＬＯタンパク質の前記Ｎ末端断片が、配列番号２を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記組換え型リステリア株が組換え型リステリア・モノサイトゲネス株である、請求項１〜２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記組換え型ポリペプチドが前記組換え型リステリア株によって発現される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記核酸分子が、前記組換え型リステリア株内の染色体外プラスミド内にある、請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記プラスミドが前記組換え型リステリア株内で安定して維持される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記リステリア株が、ゲノムのｄａｌ、ｄａｔ、およびａｃｔＡ遺伝子の突然変異、欠失または不活性化を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記代謝酵素が前記突然変異、欠失または不活性化を相補する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記第１のオープンリーディングフレームによりコードされる前記組換え型ポリペプチドの構造は、Ｎ末端ＬＬＯ−抗原１−抗原２−抗原３−抗原４を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記４つの異種ＨＰＶ抗原またはその機能断片は、ＨＰＶ１６  Ｅ６抗原、ＨＰＶ１６  Ｅ７抗原、ＨＰＶ１８  Ｅ６抗原、ＨＰＶ１８  Ｅ７抗原およびその断片よりなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
抗原１はＨＰＶ１６  Ｅ６であり、抗原２はＨＰＶ１６  Ｅ７であり、抗原３はＨＰＶ１８  Ｅ６であり、および抗原４はＨＰＶ１８  Ｅ７である、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記第１のオープンリーディングフレームは、最後の異種抗原のＣ末端に機能可能であるように連結したタンパク質タグ配列をさらにコードする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記タンパク質タグ配列は、ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６×ＨＩＳ配列である、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記第１のオープンリーディングフレームは、配列番号３２を含む、請求項１２〜１３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記第１のオープンリーディングフレームは、配列番号３３を含むタンパク質をコードする、請求項１２〜１３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記組換え型リステリア株が動物宿主を通して継代されてきた、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
アジュバントをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
前記アジュバントが、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、ＳＢＡＳ２、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、免疫刺激サイトカイン、クイルグリコシド、細菌毒素、および細菌マイトジェンを含むリストから選択される、請求項１７のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記組換え型リステリア株が冷凍または凍結乾燥細胞バンクに保存されている、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
対象において腫瘍またはガンを治療する方法であって、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項２１】
ヒト対象を腫瘍またはガンから守る方法であって、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項２２】
ヒト対象に抗腫瘍細胞毒性Ｔ細胞応答を誘発するための方法であって、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組換え型リステリア株を含む組成物を前記対象に投与する工程を含む方法。
【請求項２３】
前記組成物は、約１×１０６ＣＦＵから約１×１０９ＣＦＵの用量で投与される、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物は、約１×１０６ＣＦＵから約１×１０８ＣＦＵの用量で投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物は、約１×１０６ＣＦＵから約１×１０７ＣＦＵの用量で投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物は、約１×１０７ＣＦＵから約１×１０９ＣＦＵの用量で投与される、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つのヒトパピローマウイルス抗原を含む構築体を発現する組み換え型リステリア株を対象に投与する工程を含む、ヒトパピローマウイルス関連の腫瘍またはガンの治療、予防、およびそれに対する免疫応答を誘発する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連口腔咽頭ガン（ＨＰＶＯＰＣ）の罹患率が米国で増加している（１９８８年から２００４年までに２２５％）。ＨＰＶＯＰＣ患者は若くなる傾向があり、予後は好ましく、ＨＰＶ陰性患者と比べて死亡リスクは６９％少ない。しかし、大部分のＨＰＶＯＰＣ患者は進行ステージを呈し、標準化学放射線レジメンはかなりの毒性と関連する可能性がある。従って、予後が良好な患者は、逆説的に、治療に関連した長期的な生活の質の転帰が不良となるリスクが大きい。免疫療法は化学放射線レジメンの段階的縮小を通して毒性を減少する可能性があり、長期疾患コントロールを強化する可能性がある。
【０００３】
ＨＲ−ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７タンパク質は異形成およびガン腫内で一貫して発現され、細胞周期調節タンパク質ｐ５３およびｐＲｂをそれぞれ妨害する。異形成悪性病変および浸潤性悪性病変の両方、ならびにこれらのタンパク質のウイルス起源によるＥ６およびＥ７の必須発現は、これらをＨＰＶ療法的ワクチンのための優れた標的にする。
【０００４】
リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）は、ヒト、特に高齢の個人、新生児、妊娠中の女性、および免疫障害を持つ個人にときおり疾患を生じる可能性がある食物媒介性のグラム陽性細菌である。先天性免疫の強い活性化および抗原提示細胞（ＡＰＣ）機能を強化するサイトカイン応答の誘発に加えて、Ｌｍは、主としてリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質の活性を通してファゴリソソームから抜け出した後、ＡＰＣのサイトゾル内で複製する能力を有する。この特有の細胞内ライフサイクルは、Ｌｍによって分泌された抗原がＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子の両方の状況で処理されかつ提示されるのを可能にし、結果として強力な細胞毒性ＣＤ８＋およびＴｈ１  ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性免疫応答をもたらす。
【０００５】
本発明では、いくつかのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原を含むリステリア・モノサイトゲネスベースの免疫療法を提供することによる、ＨＰＶ関連のガンを有する患者における改善された治療様式の必要性と、ＨＰＶ関連ガンの予防および治療に関して、それを使用することとに取り組む。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様では、本発明は組み換え型核酸を含有する組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物に関連し、前述の核酸は少なくとも１つの異種抗原またはその断片に機能可能に結合または融合したＬＬＯタンパク質の第１のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前述の組み換え型核酸は代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含む。別の態様では、前述の組み換え型リステリアは、内在性のｄａｌ、ｄａｔおよびａｃｔＡ遺伝子の突然変異、欠失または不活性化を含む。
【０００７】
さらなる態様では、本発明は組み換え型核酸を含有する組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物に関連し、前述の核酸は４つの異種抗原またはその断片に機能可能に結合または融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前述の組み換え型核酸は代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、前述の４つの異種抗原は、ＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７、ＨＰＶ１８  Ｅ６、及びＨＰＶ１８  Ｅ７抗原からなる群から選択される。別の態様では、前述の組み換え型リステリアは、内在性のｄａｌ、ｄａｔおよびａｃｔＡ遺伝子の突然変異、欠失または不活性化を含む。
【０００８】
以下の発明を実施するための形態、実施例、および図面から本発明の他の特徴および利点が明らかとなる。しかしながら、この発明を実施するための形態より本発明の趣旨および範囲内での様々な変更および修正が当業者に明らかとなるので、この発明を実施するための形態および具体的な実施例は本発明の好ましい実施形態を示す一方で、単に例示として提示されていることを理解するべきである。
【０００９】
以下の図面は本明細書の一部分を形成し、かつ本開示のある特定の態様をさらに実証するために含まれ、本明細書に提示した具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面のうちの１つ以上を参照することによって本発明をより良好に理解することができる。本特許ファイルまたは本特許出願ファイルは、少なくとも１つのカラーで作成された図面を含む。本特許または本特許出願のカラー図面付きの出版物の複製物は、要求に応じ、かつ必要な料金の支払いに応じて米国特許商標局から提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１：Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は異なる発現系を使用してＥ７を発現および分泌する。Ｌｍ−Ｅ７を、Ｌ．モノサイトゲネスゲノム（Ａ）のｏｒｆＺドメインの中へと遺伝子カセットを導入することによって生成した。ｈｌｙプロモーターはｈｌｙシグナル配列、およびＨＰＶ−１６  Ｅ７が後に続くＬＬＯの最初の５つのアミノ酸（ＡＡ）の発現を引き起こす。Ｂ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を、ｐｒｆＡ−株ＸＦＬ−７をプラスミドｐＧＧ−５５で形質転換することによって生成した。ｐＧＧ−５５は、ＬＬＯ−Ｅ７の非溶血性の融合の発現を駆動するｈｌｙプロモーターを有する。ｐＧＧ−５５は、ｐｒｆＡ遺伝子も含有し、インビボでＸＦＬ−７によってプラスミドの保持を選択する。
【００１１】
【図２】図２：Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７はＥ７を分泌する。Ｌｍ−Ｇａｇ（レーン１）、Ｌｍ−Ｅ７（レーン２）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（レーン３）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（レーン４）、ＸＦＬ−７（レーン５）、および１０４０３Ｓ（レーン６）をルリア−ベルターニ培地中、３７℃で一晩増殖させた。６００ｎｍのＯＤ吸光度によって決定される同等数の細菌をペレット化し、そして各上清１８ｍＬをＴＣＡ沈殿した。Ｅ７発現をウエスタンブロットによって分析した。ブロットを抗Ｅ７  ｍＡｂで調査し、それに続いてＨＲＰ結合抗マウス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で調査し、次いでＥＣＬ検出試薬を使用して発色させた。
【００１２】
【図３】図３：ＬＬＯ−Ｅ７融合体の腫瘍免疫療法有効性。腫瘍接種の７日、１４日、２１日、２８日、および５６日後におけるマウス内の腫瘍サイズがミリメートルで示されている。未感作マウス：白丸、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７：黒丸、Ｌｍ−Ｅ７：正方形、Ｌｍ−Ｇａｇ：白ひし形、そしてＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰ：黒三角。
【００１３】
【図４】図４：Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７−免疫されたマウスに由来する脾細胞はＴＣ−１細胞に曝露されると増殖する。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７株、Ｌｍ−Ｅ７株、または対照ｒＬｍ株を用いてＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫および追加免疫した。追加免疫の６日後に脾細胞を採取し、そして放射線照射したＴＣ−１細胞と共に表示されている比で培養皿に蒔いた。細胞を３Ｈチミジンでパルスラベルし、採取した。ｃｐｍは、（実験的ｃｐｍ）−（非ＴＣ−１対照）と定義される。
【００１４】
【図５】図５：Ａ．ＴＣ−１腫瘍細胞を投与し、これに続いてＬｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７を投与した、またはワクチンを投与しなかった（無処置）マウスでの、脾臓内でのＥ７特異的ＩＦＮ−ガンマ−分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導、および腫瘍に浸透する数。Ｂ．（Ａ）に記述したマウスの脾臓および腫瘍でのＥ７特異的ＣＤ８＋細胞の誘導および浸透。
【００１５】
【図６】図６：腫瘍の中のＥ７特異的リンパ球のより高いパーセンテージを誘導するＰＥＳＴ領域を含有するリステリア構成体。Ａ．１つの実験からの代表的データ。Ｂ．３つのすべての実験からのデータの平均およびＳＥ。
【００１６】
【図７Ａ】図７Ａ：組み換え型リステリアワクチンベクターの細菌負荷（病毒性）に対する継代の効果。上のパネル：Ｌｍ−Ｇａｇ。下のパネル：Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７。
【図７Ｂ】図７Ｂ：脾臓内での組み換え型Ｌｍ−Ｅ７の細菌負荷に対する継代の効果。４匹のマウスからの脾臓ホモジネート１ミリリットル当たりの生菌の平均ＣＦＵが示されている。
【００１７】
【図８】図８：継代されたＬｍ−Ｇａｇと継代されていないＬｍ−Ｇａｇの投与後のＨＩＶ−ＧａｇおよびＬＬＯに対する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘発を示す。１０３（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）または１０５（Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ）ＣＦＵの継代されたリステリアワクチンベクターを用いてマウスを免疫化し、抗原特異的Ｔ細胞を解析した。Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ：継代されていないリステリアワクチンベクター。Ａ〜Ｄ：ＭＨＣクラスＩ  ＨＩＶ−Ｇａｇペプチドに対する免疫応答。Ｅ〜Ｈ：ＬＬＯペプチドに対する免疫応答。Ｉ：ＨＰＶ  Ｅ７からの対照ペプチドで刺激された１０５ＣＦＵの継代Ｌｍ−Ｇａｇを用いて免疫化したマウスからの脾細胞。
【００１８】
【図９Ａ】図９Ａ：ＬＢ安定性試験全体を通したプラスミド分離を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂ：ＴＢ安定性試験全体を通したプラスミド分離を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃ：ＴＢ安定性試験の定量を示す。
【００１９】
【図１０】図１０：ＬＢ内で成長した細菌からの生菌クロラムフェニコール（ＣＡＰ）耐性およびＣＡＰ感受性コロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を示す図である。色付きのバー：ＣＡＰ＋；白抜きのバー：ＣＡＰ−。それぞれの時点に対する２本の色付きのバーと２本の白抜きのバーは、重複サンプルを表す。
【００２０】
【図１１】図１１：ＴＢ内で成長した細菌からの生菌ＣＡＰ耐性およびＣＡＰ感受性ＣＦＵの数を示す図である。色付きのバー：ＣＡＰ＋；白抜きのバー：ＣＡＰ。それぞれの時点に対する２本の色付きのバーと２本の白抜きのバーは、重複サンプルを表す。
【００２１】
【図１２】図１２：Ｄ１３３Ｖ突然変異の領域（矢印）を示す実際のクロマトグラムである。混合比を括弧内に示す。
【００２２】
【図１３】図１３：ＡＤＶ４５１、４５２、および４５３プライマー、ならびに反応で増幅されたｐｒｆＡ遺伝子のセグメントの場所の提示である。
【００２３】
【図１４】図１４：プライマーＡＤＶ４５１およびＡＤＶ４５３を使用したＰＣＲ反応の特異性である。
【００２４】
【図１５】図１５：プライマーＡＤＶ４５２およびＡＤＶ４５３を使用したＰＣＲ反応の特異性である。
【００２５】
【図１６】図１６：プライマーＡＤＶ４５２を使用しＤＮＡの初期量を１ｎｇとした、野生型ｐｒｆＡ配列を検出するためのＰＣＲ反応の感度。
【００２６】
【図１７】図１７：プライマーＡＤＶ４５２を使用しＤＮＡの初期量を５ｎｇとした、野生型ｐｒｆＡ配列を検出するためのＰＣＲ反応の感度。
【００２７】
【図１８】図１８：図１６に図示したＰＣＲからのバンドの平均密度である。
【００２８】
【図１９】図１９：図１７に図示したＰＣＲからのバンドの平均密度である。
【００２９】
【図２０】図２０：プライマーＡＤＶ４５２を使用して野生型ｐｒｆＡ配列を検出するためのＰＣＲ反応の検証である。
【００３０】
【図２１】図２１：図１６に図示したＰＣＲからのバンドの平均密度である。
【００３１】
【図２２】図２２：Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７でのＤ１３３Ｖ  ＰｒｆＡ突然変異の解析である。Ａ：濃度測定のために使用した元の画像、Ｂ：画像は低密度バンドの視覚化を容易にするためにデジタル強調された。
【００３２】
【図２３】図２３：（Ａ）ｋｌｋ３統合およびＡｃｔＡ欠失の後でのＬｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３の染色体領域の概略図を示す。（Ｂ）ｋｌｋ３遺伝子がＬｍｄｄおよびＬｍｄｄＡ染色体に統合されている。ｋｌｋ３特異的プライマーを使用した、それぞれのコンストラクトからの染色体ＤＮＡ調製物からのＰＣＲにより、野生型タンパク質の分泌シグナル配列を欠失しているｋｌｋ３遺伝子に対応する７１４ｂｐのバンドが増幅される。
【００３３】
【図２４】図２４：（Ａ）ｐＡｄｖ１３４プラスミドのマップである。（Ｂ）ＬｍｄｄＡ−１３４培養上清からのタンパク質を沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＬＬＯ−Ｅ７タンパク質が抗Ｅ７モノクローナル抗体を使用したウエスタンブロットにより検出された。抗原発現カセットは、ｈｌｙプロモーター、短縮型ＬＬＯのためのＯＲＦおよびヒトＰＳＡ遺伝子（ｋｌｋ３）からなる。（Ｃ）ｐＡｄｖ１４２プラスミドのマップである。（Ｄ）抗ＰＳＡおよび抗ＬＬＯ抗体を使用してＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の発現を示したウエスタンブロットである。
【００３４】
【図２５】図２５：ＨＰＶ  １６  Ｅ６およびＥ７を発現するＴＣ１腫瘍を接種したマウスで測定された腫瘍体積であり、それを（Ａ）漸減用量のＬｍｄｄａ−ＨＰＶＱｕａｄまたはＬｍｄｄＡ２７４で、（Ｂ）１×１０８Ｌｍｄｄａ−ＨＰＶＱｕａｄ、１×１０７Ｌｍｄｄａ−ＨＰＶＱｕａｄまたはＬｍｄｄＡ２７４で、（Ｃ）１×１０８Ｌｍｄｄａ−ＨＰＶＱｕａｄ、２．５×１０７Ｌｍｄｄａ−ＨＰＶＱｕａｄまたはＬｍｄｄＡ２７４で、（Ｄ）１×１０８Ｌｍｄｄａ−ＨＰＶＱｕａｄ、５×１０７Ｌｍｄｄａ−ＨＰＶＱｕａｄまたはＬｍｄｄＡ２７４で処置した。
【００３５】
【図２６】図２６：（Ａ）ＨＰＶ  １６  Ｅ６およびＥ７を発現するＴＣ１腫瘍を接種したマウスで測定された腫瘍体積であり、それを漸減用量のＡＸＡＬ／Ｌｍ−Ｅ７またはエンプティベクター（ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒ）のＬｍ−ｔＬＬＯで処置した。（Ｂ）ＨＰＶ  １６  Ｅ６およびＥ７を発現するＴＣ１腫瘍を接種したマウスで測定された腫瘍体積であり、それを漸減用量のＬｍｄｄａ−ＨＰＶＱｕａｄまたはエンプティベクターのＬｍ−ｔＬＬＯで処置した。１グループにつき、Ｎ＝５〜１０体の動物数である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
図示の単純化および明瞭化のために図に示される要素は必ずしも実寸に比例していないことを理解されたい。例えば、一部の要素の寸法は、明瞭化のために他の要素に対して相対的に誇張されている場合がある。さらに、適切と考えられる場合には、参照番号は対応するかまたは類似する要素を示す図の間で繰り返される場合がある。
【００３７】
本発明は、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）断片およびその疾患に関連する少なくとも１つの抗原または断片を含む組み換え型ポリペプチドを発現する組み換え型リステリア株を含む組成物と、疾患を治療、疾患からの保護、および疾患に対する免疫応答を誘発する方法であって、組み換え型リステリア株を含む組成物を投与する工程を含むものである、上記方法とを提供する。
【００３８】
一実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、異種抗原またはその断片を含む組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む。別の実施形態では、組み換え型ポリペプチドは異種抗原と融合したＮ末端ＬＬＯをさらに含む。別の実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含む。別の実施形態ではその代謝酵素は、前述の組み換え型リステリア株の染色体の中で失われている内在性遺伝子を相補する。別の実施形態ではその第２オープンリーディングフレームによってコードされる代謝酵素はアラニンラセマーゼ酵素（ｄａｌ）である。別の実施形態ではその第２オープンリーディングフレームによってコードされる代謝酵素はＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素（ｄａｔ）である。別の実施形態では、本明細書に開示されるリステリア株はゲノムのｄａｌ、ｄａｔ、またはａｃｔＡ遺伝子の突然変異、欠失または不活性化を含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるリステリア株はゲノムのｄａｌ、ｄａｔ、およびａｃｔＡ遺伝子の突然変異、欠失または不活性化を含む。別の実施形態では、リステリアはゲノムのｄａｌ、ｄａｔまたはＡｃｔＡ遺伝子を欠いている。別の実施形態では、リステリアはゲノムのｄａｌ、ｄａｔおよびＡｃｔＡ遺伝子を欠いている。
【００３９】
一実施形態では、第１の異種抗原アミノ酸配列が、第２の異種抗原ＡＡ配列と機能可能であるように連結するものであって、前述の第２の異種抗原ＡＡ配列は、少なくとも１つのさらなる異種抗原アミノ酸配列と機能可能であるように連結するものである、前述の第１の異種抗原ＡＡ配列に融合するＮ末端切断（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）である、これら要素を含む組み換え型ポリペプチドをコードする核酸コンストラクトが、本明細書において開示される。別の実施形態では前述の要素はＮ末端からＣ末端へと配置されているか、または機能的であるように連結されている。別の実施形態では、前述の核酸配列は、少なくとも１つの第１異種抗原と少なくとも１つの第２異種抗原との間に組み込まれている１つ以上のリンカー配列を含む。別の実施形態では、前述の核酸配列は、少なくとも１つの第１異種抗原と少なくとも１つの第２異種抗原から少なくとも１つの第３異種抗原との間に組み込まれている、少なくとも２つの異なるリンカー配列を含む。別の実施形態では１つ以上のリンカーは４×グリシンリンカーである。
【００４０】
別の実施形態では、本明細書において開示される組み換え型リステリア株は、少なくとも１つの異種抗原またはその断片に機能可能であるように連結または融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む、組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む、組み換え型核酸コンストラクトを含む。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は、複数の異種抗原またはその断片に機能可能であるように連結または融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む、組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む、組み換え型核酸コンストラクトを含む。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は、２つの異種抗原またはその機能断片に機能可能であるように連結または融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む、組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む、組み換え型核酸コンストラクトを含む。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は、２つから４つの異種抗原またはその機能断片に機能可能であるように連結または融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む、組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む、組み換え型核酸コンストラクトを含む。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は、４つの異種抗原またはその機能断片に機能可能であるように連結または融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む、組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む、組み換え型核酸コンストラクトを含む。一実施形態では、２つから４つの異種抗原は、最Ｎ末端の異種抗原のＮ末端において、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片に機能可能であるように縦列型で連結し融合する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は、４つより多い異種抗原またはその断片に機能可能であるように連結または融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む、組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む、組み換え型核酸コンストラクトを含む。
【００４１】
別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原は相互に直接融合している。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原をコードする遺伝子は相互に直接融合している。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原はリンカーペプチドを介して付着している。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原は異種ペプチドを介して付着している。別の実施形態ではＮ末端ＬＬＯタンパク質断片は異種抗原に対してＮ末端側にある。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片は、融合タンパク質のＮ最末端部分である。
【００４２】
一実施形態では、組み換え型リステリア株は四価エピソーム性発現ベクターを含み、ベクターはそれぞれが、異種抗原性ポリペプチドまたはその機能的断片をコードする第一、第二、第三、および第四の核酸分子を含み、第一から第四までの核酸分子それぞれは、Ｎ末端または切断または解毒リステリオリシンＯタンパク質（ＬＬＯ）と共に、オープンリーディングフレームの異種抗原性ポリペプチドまたはその機能的断片をコードする。別の実施形態では、ＰＥＳＴ含有ポリペプチドは、Ｎ末端または切断のＡｃｔＡタンパク質である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ含有ペプチドは、ＰＥＳＴアミノ酸配列である。
【００４３】
一実施形態では、四価発現ベクターによって発現される異種抗原はＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７、ならびにＨＰＶ１８  Ｅ６およびＥ７である。
【００４４】
一実施形態では、本発明は、抗腫瘍または抗ガン免疫応答をヒト対象内に誘発する方法を提供し、前述の方法は、組み換え型核酸を含む組み換え型リステリア株を含む組成物を前述の対象に投与する工程を含み、前述の核酸は異種抗原またはその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前述の組み換え型核酸は突然変異ＰｒｆＡ遺伝子または代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、これによって腫瘍またはガンに対する免疫応答を誘発する。別の実施形態では、前述の免疫応答は、前述の対象が化学療法または放射線を受ける必要性を減少させる。別の実施形態では、前述の免疫応答は、前述の対象が化学療法または放射線を受ける必要性をなくす。別の実施形態では、前述の免疫応答は、より低い量の化学療法または放射線で患者を治療することを可能にすることによって、前述の対象への化学療法または放射線の投与に関連する副作用の重症度を減少させる。
【００４５】
一実施形態では、本発明は、抗腫瘍または抗ガン免疫応答をヒト対象内に誘発する方法を提供し、前述の方法は、組み換え型核酸を含む組み換え型リステリア株を含む組成物を前述の対象に投与する工程を含み、前述の核酸は異種抗原またはその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前述の組み換え型核酸は代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、前述の免疫応答は前述の対象が化学療法または放射線治療を受ける必要性を減少させ、これによって腫瘍またはガンに対する免疫応答を誘発する。別の実施形態では、前述のリステリア株は内因性ｄａｌ／ｄａｔおよびａｃｔＡ遺伝子内の突然変異を含む。
【００４６】
本明細書で提供される組み換え型リステリアを含む組成物は、限定するものではないが、化学療法、放射線および／またはチェックポイント阻害剤を含む他の治療様式と組み合わせて投与され得る、ということを当業者は理解するであろう。別の実施形態では、本明細書に開示されるリステリアまたは本明細書に開示されるリステリアベースの免疫療法の投与は、腫瘍またはガンを持つ対象が化学療法または放射線治療を受ける必要性を減少させることができる。別の実施形態では、本明細書に開示されるリステリアまたは本明細書に開示されるリステリアベースの免疫療法の投与は、腫瘍またはガンを持つ対象が放射線または化学療法を受ける必要性をなくすことができる。別の実施形態では、本明細書に開示されるリステリアまたは本明細書に開示されるリステリアベースの免疫療法の投与は、腫瘍またはガンを持つ対象の放射線または化学療法に関連する副作用の重症度を減少させることができる。
【００４７】
一実施形態では、本発明は、組み換え型リステリア株の投与を含む、抗疾患細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答をヒト対象内に誘発するための方法、および前述の疾患に関連付けられた障害および症状を治療するための方法も提供する。
【００４８】
一実施形態では、組み換え型リステリア株であって、前述の組み換え型リステリア株が組み換え型核酸を含み、前述の核酸が異種抗原またはその断片に融合したＬＬＯタンパク質の第１のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、そして前述の組み換え型核酸が突然変異ＰｒｆＡ遺伝子をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含む、組み換え型リステリア株が本明細書に開示される。一実施形態では、突然変異ｐｒｆＡ遺伝子は、アミノ酸位置１３３のアミノ酸Ｄ（「Ａｓｐ」、「アスパルテート」または「アスパラギン酸」としても知られる）からアミノ酸Ｖ（「Ｖａｌ」または「バリン」としても知られる）までの点突然変異をコードする遺伝子である。一実施形態では、本明細書に開示される組み換え型リステリア株は、内因性ｐｒｆＡ遺伝子内のゲノム突然変異または欠失を含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるリステリアのｐｒｆＡ遺伝子の染色体突然変異または欠失は、Ｄ１３３Ｖアミノ酸置換を含む突然変異ＰｒｆＡタンパク質をコードする突然変異ｐｒｆＡ遺伝子をコードする核酸配列を含むプラスミドによって補足される。別の実施形態では、Ｄ１３３Ｖアミノ酸置換を含む突然変異ＰｒｆＡタンパク質は、本明細書に開示されるリステリアの内因性ｐｒｆＡ突然変異を相補する。
【００４９】
別の実施形態では、組み換え型リステリアは、弱毒化リステリアである。「弱毒化」または「弱毒化された」は、宿主に対する毒性を減少するように修飾された、細菌、ウイルス、寄生生物、感染性生命体、プリオン、腫瘍細胞、感染性生命体中の遺伝子、およびこれに類するものを包含する場合があることが理解されるであろう。宿主は、ヒトの宿主もしくは動物、または器官、組織、もしくは細胞とすることができる。非限定的な実施例を挙げると、宿主細胞への結合を減少するために、１つの宿主細胞から別の宿主細胞への拡散を減少するために、細胞外成長を減少するために、または宿主細胞内での細胞内成長を減少するために、細菌を弱毒化することができる。一実施形態では、例えば、毒性の兆候、ＬＤ５０、器官からの除去率、または競争指標を測定することによって弱毒化を評価することができる（例えば、Ａｕｅｒｂｕｃｈ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６９：５９５３−５９５７を参照）。一般的に、弱毒化は、結果として、少なくとも２５％の、より一般的には少なくとも５０％の、最も一般的には少なくとも１００％（２倍）の、標準的には少なくとも５倍の、より標準的には少なくとも１０倍の、最も標準的には少なくとも５０倍の、しばしば少なくとも１００倍の、よりしばしば少なくとも５００倍の、また最もしばしば少なくとも１０００倍の、通常少なくとも５０００倍の、より通常の場合少なくとも１０，０００倍の、そして最も通常の場合少なくとも５０，０００倍の、および最もしばしば少なくとも１００，０００倍の、ＬＤ５０の増加および／または除去率の増加をもたらす。別の実施形態では、弱毒化は、少なくとも２５％の、ＬＤ５０の増加および／または除去率の増加をもたらす。別の実施形態では、弱毒化は、３〜５倍の、ＬＤ５０の増加および／または除去率の増加をもたらす。その他の実施形態では、弱毒化は、５〜１０倍、１１〜２０倍、２１〜３０倍、３１〜４０倍、４１〜５０倍、５１〜１００倍、１０１〜５００倍、５０１〜１，０００倍、１００１〜１０，０００倍、または１０，００１〜１００，０００倍の、ＬＤ５０の増加および／または除去率の増加をもたらす。
【００５０】
「弱毒化された遺伝子」という用語が、毒性、病理、または病毒性を宿主に媒介し、宿主内で成長し、または宿主内で生存する遺伝子を包含する場合があり、ここで遺伝子は毒性、病理、または病毒性を軽減、減少、または除去するように突然変異することを当業者は理解するであろう。減少または除去を、突然変異した遺伝子によって媒介された病毒性または毒性を突然変異していない（または親）遺伝子によって媒介されたもの比較することによって評価することができる。「突然変異した遺伝子」は遺伝子の調節領域、遺伝子のコード領域、遺伝子の非コード領域、またはこれらの任意の組み合わせでの欠失、点突然変異、逆位、短縮およびフレームシフト突然変異を包含する。
【００５１】
一実施形態では、本発明は、腫瘍またはガンに対する免疫応答を対象内に誘発する方法が本明細書に開示されており、前述の方法は、組み換え型核酸を含む組み換え型リステリア株を前述の対象に投与する工程を含み、前述の核酸は異種抗原またはその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前述の組み換え型核酸は突然変異ＰｒｆＡタンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、これによって腫瘍またはガンに対する免疫応答を誘発する。一実施形態では、本発明は、本明細書に開示される組み換え型リステリア株を対象に投与する工程を含む、ヒト対象のガンを治療する方法を提供している。別の実施形態では、本発明は子宮頸ガンからヒト対象を保護する方法を提供し、これには対象に本明細書に開示される組み換え型リステリア株を投与する工程を含む。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態ではその組み換え型リステリア株はその組換えポリペプチドをコードするプラスミドを含む。別の実施形態では、方法は本発明の組み換え型リステリア株を用いてヒト対象をブーストする工程をさらに含む。別の実施形態では、方法は本明細書に開示される異種抗原またはその断片を含む免疫原性組成物を用いてヒト対象をブーストする工程をさらに含む。別の実施形態では、方法は対象の細胞に異種抗原を発現するように導く免疫原性組成物を用いてヒト対象をブーストする工程をさらに含む。別の実施形態では、細胞は腫瘍細胞である。別の実施形態では、方法は本発明のワクチンを用いてヒト対象をブーストする工程をさらに含む。
【００５２】
一実施形態では、本明細書に開示されるＬＬＯタンパク質およびＡｃｔＡタンパク質の状況でのその断片は、ＬＬＯまたはＡｃｔＡタンパク質の少なくとも５個の連続アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを指す。別の実施形態では、この用語はＬＬＯまたはＡｃｔＡタンパク質またはポリペプチドの、少なくとも１０連続アミノ酸残基、少なくとも１５連続アミノ酸残基、少なくとも２０連続アミノ酸残基、少なくとも２５連続アミノ酸残基、少なくとも４０連続アミノ酸残基、少なくとも５０連続アミノ酸残基、少なくとも６０連続アミノ残基、少なくとも７０連続アミノ酸残基、少なくとも８０連続アミノ酸残基、少なくとも９０連続アミノ酸残基、少なくとも１００連続アミノ酸残基、少なくとも１２５連続アミノ酸残基、少なくとも１５０連続アミノ酸残基、少なくとも１７５連続アミノ酸残基、少なくとも２００連続アミノ酸残基、アミノ酸配列の少なくとも２５０連続アミノ酸残基、少なくとも３００連続アミノ酸残基、少なくとも３５０連続アミノ酸残基、少なくとも４００連続アミノ酸残基、または少なくとも４５０連続アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを指す。
【００５３】
別の実施形態では、断片は、（例えば、Ｎ末端ＬＬＯ／異種抗原融合タンパク質またはＮ末端ＡｃｔＡ／異種抗原融合タンパク質の形態にあるとき、疾患関連抗原に対する免疫応答を引き出すために）本発明で意図されるように働く機能的断片である。別の実施形態では、断片は融合していない形態で機能性である。別の実施形態では、断片は免疫原性断片である。
【００５４】
ある特定の実施形態では、本発明はリステリアとは異種の核酸、またはリステリアに対して内在性の核酸のコドン最適化を提供する。Ｌ．モノサイトゲネスによって各々のアミノ酸のために利用される最適なコドンが、米国特許公開第２００７／０２０７１７０号に示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。核酸内の少なくとも１つのコドンがＬ．モノサイトゲネスによってそのアミノ酸に対して元の配列内のコドンより頻繁に使用されるコドンで置き換えられる場合、核酸はコドン最適化されている。
【００５５】
本明細書に開示されるように、ＬＬＯ−抗原融合を発現する組み換え型リステリア株は抗腫瘍免疫性を誘発し（実施例１）、抗原特異的Ｔ細胞増殖を引き出し（実施例２）、抗原特異的で、かつ腫瘍を浸潤するＴ細胞を生成する（実施例３）。
【００５６】
別の実施形態では、本発明は、ヒト対象内の子宮頸ガンを治療する方法を提供し、これには組み換え型リステリア株を対象に投与する工程を含み、組み換え型リステリア株は、ＬＬＯタンパク質およびＨＰＶ  Ｅ７抗原のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドを含み、これによって組み換え型リステリア株はＥ７抗原に対して免疫応答を誘発し、これによってヒト対象内の子宮頸ガンを治療する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態ではその組み換え型リステリア株はその組換えポリペプチドをコードするプラスミドを含む。
【００５７】
一実施形態では、本発明は、ＨＰＶ関連ガンからヒト対象（ｈｕｍａｎ  ｓｕｂｊｅｃｔ）を保護する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は子宮頸ガンからヒト対象を保護する方法を提供し、これには組み換え型リステリア株を対象に投与する工程を含み、組み換え型リステリア株はＬＬＯタンパク質および少なくとも１つのＨＰＶ抗原のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドを含み、これによって組み換え型リステリア株はＨＰＶ抗原に対して免疫応答を誘発し、これによって子宮頸ガンからヒト対象を保護する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態ではその組み換え型リステリア株はその組換えポリペプチドをコードするプラスミドを含む。
【００５８】
一実施形態では、本発明は、ＨＰＶ関連ガンに対して免疫応答を誘発する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、ヒト対象内の子宮頸ガンに対して免疫応答を誘発するための方法を提供し、これには対象に組み換え型リステリア株を投与する工程を含み、組み換え型リステリア株は、ＬＬＯタンパク質および少なくとも１つのＨＰＶ抗原のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドを含み、これによってヒト対象内の子宮頸ガンに対する免疫応答を誘発する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態ではその組み換え型リステリア株はその組換えポリペプチドをコードするプラスミドを含む。
【００５９】
一実施形態では、本発明は、ＨＰＶ関連ガンを治療する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、ヒト対象内の子宮頸ガンを治療する方法を提供し、これには組み換え型リステリア株を対象に投与する工程を含み、組み換え型リステリア株はＬＬＯタンパク質および少なくとも１つのＨＰＶ抗原のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドを含み、これによって組み換え型リステリア株は異種抗原に対する免疫応答を誘発し、これによってヒト対象内の子宮頸ガンを治療する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態ではその組み換え型リステリア株はその組換えポリペプチドをコードするプラスミドを含む。
【００６０】
一実施形態では、本発明は、ＨＰＶ関連ガンからヒト対象を保護する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は子宮頸ガンからヒト対象を保護する方法を提供し、これには組み換え型リステリア株を対象に投与する工程を含み、組み換え型リステリア株はＡｃｔＡタンパク質および少なくとも１つのＨＰＶ抗原のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドを含み、これによって組み換え型リステリア株は異種抗原に対する免疫応答を誘発し、これによって子宮頸ガンからヒト対象を保護する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態ではその組み換え型リステリア株はその組換えポリペプチドをコードするプラスミドを含む。
【００６１】
一実施形態では、本発明は、ＨＰＶ関連ガンに対して免疫応答を誘発する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、ヒト対象内の子宮頸ガンに対して免疫応答を誘発するための方法を提供し、これには対象に組み換え型リステリア株を投与する工程を含み、組み換え型リステリア株は、ＡｃｔＡタンパク質および少なくとも１つの異種抗原のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドを含み、これによってヒト対象内の子宮頸ガンに対する免疫応答を誘発する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態ではその組み換え型リステリア株はその組換えポリペプチドをコードするプラスミドを含む。一実施形態では、本発明は、ＨＰＶ関連ガンに対する免疫応答を治療する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、ヒト対象内の子宮頸ガンに対して免疫応答を誘発するための方法を提供し、これには対象に組み換え型リステリア株を投与する工程を含み、組み換え型リステリア株は、ＡｃｔＡタンパク質および少なくとも１つの異種抗原のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドを含み、これによってヒト対象内の子宮頸ガンに対する免疫応答を処置する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態ではその組み換え型リステリア株はその組換えポリペプチドをコードするプラスミドを含む。
【００６２】
一実施形態では、本発明は、ＨＰＶ関連ガンからヒト対象を保護する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は子宮頸ガンからヒト対象を保護する方法を提供し、これには組み換え型リステリア株を対象に投与する工程を含み、組み換え型リステリア株はＰＥＳＴ配列および少なくとも１つのＨＰＶ抗原を含む組み換え型ポリペプチドを含み、これによって組み換え型リステリア株は異種抗原に対する免疫応答を誘発し、これによって子宮頸ガンからヒト対象を保護する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態ではその組み換え型リステリア株はその組換えポリペプチドをコードするプラスミドを含む。
【００６３】
一実施形態では、本発明は、ＨＰＶ関連ガンに対する免疫応答を誘発する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、ヒト対象内の子宮頸ガンに対して免疫応答を誘発するための方法を提供し、これには対象に組み換え型リステリア株を投与する工程を含み、組み換え型リステリア株は、ＰＥＳＴ配列および少なくとも１つの異種抗原を含む組み換え型ポリペプチドを含み、これによってヒト対象内の子宮頸ガンに対する免疫応答を誘発する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態ではその組み換え型リステリア株はその組換えポリペプチドをコードするプラスミドを含む。一実施形態では、本発明は、ＨＰＶ関連ガンに対する免疫応答を治療する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、ヒト対象内の子宮頸ガンに対して免疫応答を誘発するための方法を提供し、これには対象に組み換え型リステリア株を投与する工程を含み、組み換え型リステリア株は、ＰＥＳＴ配列および少なくとも１つの異種抗原を含む組み換え型ポリペプチドを含み、これによってヒト対象内の子宮頸ガンに対する免疫応答を処置する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態ではその組み換え型リステリア株はその組換えポリペプチドをコードするプラスミドを含む。
【００６４】
別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および少なくとも１つの異種抗原は相互に直接融合している。別の実施形態ではＮ末端ＬＬＯタンパク質断片をコードする遺伝子および少なくとも異種抗原をコードする遺伝子は相互に直接融合している。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および少なくとも異種抗原はリンカーペプチドを介して付着している。別の実施形態ではＮ末端ＬＬＯタンパク質断片および少なくとも異種抗原は異種ペプチドを介して接続されている。別の実施形態ではＮ末端ＬＬＯタンパク質断片は少なくとも異種抗原に対してＮ末端側にある。別の実施形態ではＮ末端ＬＬＯタンパク質断片は全ての異種抗原に対してＮ末端側にある。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片は、融合タンパク質のＮ最末端部分である。
【００６５】
別の実施形態では、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片および少なくとも１つの異種抗原は相互に直接融合している。別の実施形態ではＮ末端ＡｃｔＡタンパク質断片をコードする遺伝子および少なくとも１つの異種抗原をコードする遺伝子は相互に直接融合している。別の実施形態では、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片および少なくとも１つの異種抗原はリンカーペプチドを介して付着している。別の実施形態ではＮ末端ＡｃｔＡタンパク質断片および少なくとも１つの異種抗原は異種ペプチドを介して接続されている。別の実施形態ではＮ末端ＡｃｔＡタンパク質断片は少なくとも異種抗原に対してＮ末端側にある。別の実施形態ではＮ末端ＡｃｔＡタンパク質断片は全ての異種抗原に対してＮ末端側にある。別の実施形態ではＮ末端ＡｃｔＡタンパク質断片は融合タンパク質の最Ｎ末端部分である。
【００６６】
ＰＥＳＴ配列および少なくとも１つの異種抗原は、別の実施形態では、相互に直接融合している。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列および少なくとも１つの異種抗原をコードする遺伝子は、相互に直接融合している。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列および少なくとも１つの異種抗原は、リンカーペプチドを介して付着している。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列および少なくとも１つの異種抗原は、異種ペプチドを介して付着している。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、少なくとも異種抗原に対するＮ末端である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、全ての異種抗原に対するＮ末端である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、融合タンパク質のＮ最末端部分である。
【００６７】
別の実施形態では、本発明はヒト対象にＨＰＶに対するワクチンを接種するための方法を提供し、これには本明細書に開示される組み換え型リステリア株を対象に投与する工程を含み、リステリアはＨＰＶ  Ｅ７抗原を発現し、リステリアは突然変異ＰｒｆＡタンパク質を発現する。別の実施形態では、突然変異ｐｒｆＡ遺伝子はＰｒｆＡタンパク質のＤ１３３Ｖ突然変異をコードする。別の実施形態では、突然変異ｐｒｆＡ遺伝子は前述の組み換え型リステリア株内のプラスミドの中にある。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態ではその組み換え型リステリア株はその組換えポリペプチドをコードするプラスミドを含む。
【００６８】
一実施形態では、本明細書に開示される、２つから４つの異種抗原またはその機能断片のうちの少なくとも１つは、前述のリステリアにおける染色体外プラスミドから発現され、本明細書に開示される、２つから４つの異種抗原またはその機能断片のうちの少なくとも１つは、前述のリステリアのゲノムから発現される。
【００６９】
一実施形態では本明細書において使用される「機能可能であるように連結される」という用語は、転写が開始されるように転写および翻訳の調節性核酸があらゆるコード配列に対して配置されることを意味する。一般的に、これはプロモーターおよび転写開始または始動配列がコード領域の５’側に配置されることを意味する。別の実施形態では、「機能可能にリンクする」という用語は本明細書で使用される場合、単一の連続的リーディングフレームを形成し、連続して配列されたオリジナルのタンパク質の配列を組み込むタンパク質の発現をもたらすように、いくつかのオープンリーディングフレームが融合されていることを意味する。
【００７０】
一実施形態では、「融合される」とは共有結合による機能可能な連鎖を指す。一実施形態ではこの用語は（核酸配列またはそのオープンリーディングフレームの）組換え技術による融合を含む。別の実施形態ではこの用語は化学的結合を含む。
【００７１】
一実施形態では、複数の異種抗原またはその断片に機能可能であるように連結または融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む組み換え型核酸は、さらにタグ配列と機能可能であるように連結されている。一実施形態では、前述のタグは、第１のオープンリーディングフレームのアミノ末端に配置される。別の実施形態では、前述のタグは、第１のオープンリーディングフレームのカルボキシ末端に配置され、最後の異種抗原配列と機能可能であるように連結されている。別の実施形態では各核酸コンストラクトはタグ配列の後に少なくとも１つの終止コドンを含む。別の実施形態では各核酸コンストラクトはタグ配列の後に２つの終止コドンを含む。
【００７２】
一実施形態では前述のタグ配列はＣ末端ＳＩＩＮＦＥＫＬおよび６Ｈｉｓアミノ酸を含む。別の実施形態ではそのタグ配列は融合ポリペプチドの簡単な検出を可能にするアミノ酸配列または核酸配列である。別の実施形態ではそのタグ配列は本明細書において開示される融合ポリペプチドの分泌を確認するのに有益なアミノ酸配列または核酸配列である。当業者は、それらのタグの配列が前述のプラスミドベクターまたはファージベクター上の融合ペプチド配列に組み込まれる場合があることを理解する。これらのタグが発現し、臨床医がこれらの「タグ」配列ペプチドに対する免疫応答を追跡することにより、分泌されたペプチドの免疫原性を追跡することを可能にする抗原性エピトープが提示される場合がある。そのような免疫応答は、限定されないが、これらのタグに対して特異的なモノクローナル抗体およびＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブをはじめとする多数の試薬を使用してモニターされ得る。
【００７３】
一実施形態では、本明細書に開示される組み換えポリペプチドは、本明細書に開示される組み換え型リステリアによって発現され分泌される。別の実施形態ではポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグに特異的に結合するタンパク質、分子、または抗体（またはその断片）を使用して本明細書において開示される抗原またはポリペプチド（融合またはキメラ）の分泌が検出される。別の実施形態では、本明細書に開示される融合ポリペプチドは、本明細書に開示される組み換え型リステリアによって発現され分泌される。別の実施形態ではＳＩＩＮＦＥＫＬ−Ｓ−６×ＨＩＳタグに結合する抗体、タンパク質、または分子を使用して本明細書において開示される抗原または組み換えポリペプチドの分泌が検出される。別の実施形態では本明細書において開示される組み換えポリペプチドは、限定されないが、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）およびポリ（ＮＡＮＰ）をはじめとする当技術分野において知られている他のあらゆるタグを含む。
【００７４】
別の実施形態では、組み換え型核酸の第１のオープンリーディングフレームによりコードされた、機能可能であるように連結した４つの異種抗原は、ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７ならびにＨＰＶ１８  Ｅ６およびＥ７を含む。別の実施形態では、本明細書で開示される第１のオープンリーディングフレームから発現されて、本明細書で開示される組み換え型リステリアによって分泌された、組み換え型ポリペプチドは、以下の構造を含む：Ｎ末端ＬＬＯ−ＨＰＶ１６  Ｅ７−ＨＰＶ１６  Ｅ６−ＨＰＶ１８  Ｅ７−ＨＰＶ１８  Ｅ６−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−Ｓ−６×ＨＩＳタグ。別の実施形態では、本明細書で開示される組み換え型ポリペプチドは、配列番号３３を含む。別の実施形態では、本明細書で開示される組み換え型ポリペプチドは、配列番号３２によりコードされる。別の実施形態では、機能可能であるように連結した４つの異種抗原は、その他の順序で配列される。別の実施形態では、ＨＰＶ  Ｅ６配列（配列番号１５および配列番号１６）およびＨＰＶ  Ｅ７配列（配列番号１３および配列番号１４）は、機能可能であるように連結され、それによって四価異種抗原配列をコードする。別の実施形態では、上記四価抗原配列は、Ｎ末端またはＣ末端において、さらに切断ＬＬＯと機能可能であるように連結する。別の実施形態では、上記四価抗原配列は、切断ＬＬＯおよびペプチドタグ配列と機能可能であるように連結する。
【００７５】
一実施形態では、本明細書で開示される組み換え型ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、以下の構造を含む：抗原１−抗原２−抗原３−抗原４。一実施形態では、本明細書で開示される組み換え型ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、以下の構造を含む：Ｎ末端ＬＬＯ−抗原１−抗原２−抗原３−抗原４。一実施形態では、本明細書で開示される組み換え型ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、以下の構造を含む：Ｎ末端ＬＬＯ−抗原１−抗原２−抗原３−抗原４−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−Ｓ−６×ＨＩＳタグ。一実施形態では、本明細書で開示される組み換え型ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、以下の構造を含む：Ｎ末端ＬＬＯ−ＨＰＶ１６  Ｅ７−ＨＰＶ１６  Ｅ６−ＨＰＶ１８  Ｅ７−ＨＰＶ１８  Ｅ６−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−Ｓ−６×ＨＩＳタグ。一実施形態では、本明細書で開示される組み換え型ポリペプチドは、配列番号３１を含む核酸配列によってコードされる。一実施形態では、タグ配列に機能可能であるように連結した４つの異種抗原配列をコードする組み換え型ヌクレオチドは、配列番号３１で示される配列を含む。
atgcatggagatacacctacattgcatgaatatatgttagatttgcaaccagagacaactgatctctactgttatgaacaattaaatgacagctcagaggaggaggatgaaatagatggtccagctggacaagcagaaccggacagagcccattacaatattgtaaccttttgttgcaagtgtgactctacgcttcggttgtgcgtacaaagcacacacgtagacattcgtactttggaagacctgttaatgggcacactaggaattgtgtgccccatctgttctcagaaaccaatgcatcaaaaacgtacagcaatgtttcaggacccacaggagcgacccagaaagttaccacagttatgcacagagctgcaaacaactatacatgatataatattagaatgtgtgtactgcaagcaacagttactgcgacgtgaggtatatgactttgcttttcgggatttatgcatagtatatagagatgggaatccatatgctgtatgtgataaatgtttaaagttttattctaaaattagtgagtatagacattattgttatagtttatatggaacaacattagaacagcaatacaacaaaccgttgtgtgatttgttaattaggtgtattaactgtcaaaagccactgtgtcctgaagaaaagcaaagacatctggacaaaaagcaaagattccataatataaggggtcggtggaccggtcgatgtatgtcttgttgcagatcatcaagaacacgtagagaaacccagctgatgcatggacctaaggcaacattgcaagacattgtattgcatttagagccccaaaatgaaattccggttgaccttctatgtcacgaacaattaagcgactcagaggaagaaaacgatgaaatagatggagttaatcatcaacatttaccagcccgacgagccgaaccacaacgtcacacaatgttgtgtatgtgttgtaagtgtgaagccagaattgagctagtagtagaaagctcagcagacgaccttcgagcattccagcagctgtttctgaacaccctgtcctttgtgtgtccgtggtgtgcatcccagcagatggcgcgctttgaggatccaacacggcgaccctacaagctacctgatctgtgcacggaactgaacacttcactgcaagacatagaaataacctgtgtatattgcaagacagtattggaacttacagaggtatttgaatttgcatttaaagatttatttgtggtgtatagagacagtataccgcatgctgcatgtcataaatgtatcgatttttattcaagaattagagaattaagacattattcagactctgtgtatggagacacattggaaaaactaactaacactgggttatacaatttattaataaggtgcctgcggtgtcagaaaccgttgaatccagcagaaaaacttagacaccttaatgaaaaacgacgatttcacaacatagctgggcactatagaggccagtgccattcgtgctgcaaccgagcacgacaggaacgactccaacgacgcagagaaacacaagtagcacgttctattattaacttcgaaaaattatctcatcatcatcatcatcattaataa
【００７６】
一実施形態では、Ｎ末端に切断ＬＬＯに機能可能であるように連結した４つの異種抗原配列と、Ｃ末端にペプチドタグ配列とを含む、組み換え型ポリペプチドをコードする核酸コンストラクトは、配列番号３２を含む。
atgaaaaaaataatgctagtttttattacacttatattagttagtctaccaattgcgcaacaaactgaagcaaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccatggcaccaccagcatctccgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacggagatgcagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgttgtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgcaatttcgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaatcaaccagatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggtatgactaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgccactaaatcaaacgttaacaacgcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttatccaaatgtaagtgcaaaaattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttggtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagtgaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgttaatgaacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaagcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgtcaagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgatgctgccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaattcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccaggagttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattatgatctcgagatgcatggagatacacctacattgcatgaatatatgttagatttgcaaccagagacaactgatctctactgttatgaacaattaaatgacagctcagaggaggaggatgaaatagatggtccagctggacaagcagaaccggacagagcccattacaatattgtaaccttttgttgcaagtgtgactctacgcttcggttgtgcgtacaaagcacacacgtagacattcgtactttggaagacctgttaatgggcacactaggaattgtgtgccccatctgttctcagaaaccaatgcatcaaaaacgtacagcaatgtttcaggacccacaggagcgacccagaaagttaccacagttatgcacagagctgcaaacaactatacatgatataatattagaatgtgtgtactgcaagcaacagttactgcgacgtgaggtatatgactttgcttttcgggatttatgcatagtatatagagatgggaatccatatgctgtatgtgataaatgtttaaagttttattctaaaattagtgagtatagacattattgttatagtttatatggaacaacattagaacagcaatacaacaaaccgttgtgtgatttgttaattaggtgtattaactgtcaaaagccactgtgtcctgaagaaaagcaaagacatctggacaaaaagcaaagattccataatataaggggtcggtggaccggtcgatgtatgtcttgttgcagatcatcaagaacacgtagagaaacccagctgatgcatggacctaaggcaacattgcaagacattgtattgcatttagagccccaaaatgaaattccggttgaccttctatgtcacgaacaattaagcgactcagaggaagaaaacgatgaaatagatggagttaatcatcaacatttaccagcccgacgagccgaaccacaacgtcacacaatgttgtgtatgtgttgtaagtgtgaagccagaattgagctagtagtagaaagctcagcagacgaccttcgagcattccagcagctgtttctgaacaccctgtcctttgtgtgtccgtggtgtgcatcccagcagatggcgcgctttgaggatccaacacggcgaccctacaagctacctgatctgtgcacggaactgaacacttcactgcaagacatagaaataacctgtgtatattgcaagacagtattggaacttacagaggtatttgaatttgcatttaaagatttatttgtggtgtatagagacagtataccgcatgctgcatgtcataaatgtatcgatttttattcaagaattagagaattaagacattattcagactctgtgtatggagacacattggaaaaactaactaacactgggttatacaatttattaataaggtgcctgcggtgtcagaaaccgttgaatccagcagaaaaacttagacaccttaatgaaaaacgacgatttcacaacatagctgggcactatagaggccagtgccattcgtgctgcaaccgagcacgacaggaacgactccaacgacgcagagaaacacaagtagcacgttctattattaacttcgaaaaattatctcatcatcatcatcatcattaataa.
別の実施形態では、上記核酸コンストラクトは、配列番号３２の変異体である。別の実施形態では、上記核酸コンストラクトは、配列番号３２の相同体である。
【００７７】
別の実施形態では、本明細書で開示される核酸コンストラクトによってコードされる組み換え型ポリペプチド、ｔＬＬＯ−ＨＰＶ１６Ｅ７−ＨＰＶ１６Ｅ６−ＨＰＶ１８Ｅ７−ＨＰＶ１６Ｅ６  ＳＩＩＮＦＥＫＬ−Ｓ−６×ＨＩＳタグのアミノ酸配列は、配列番号３３を含む。
【００７８】
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDLEMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKPMHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQLMHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQMARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAACHKCIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQVARSIINFEKLSHHHHHH（配列番号３３）。別の実施形態では、上記核酸コンストラクトは、配列番号３３の変異体である。別の実施形態では、上記核酸コンストラクトは、配列番号３３の同形（ｉｓｏｍｏｒｐｈ）である。別の実施形態では、核酸コンストラクトは、配列番号３３の相同体である。
【００７９】
一実施形態では、本明細書に開示されるＮ末端もしくは切断もしくは解毒のリステリオリシンＯタンパク質（ＬＬＯ）、切断ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列に融合した、２つ、３つまたは４つの異種抗原を発現する二価、三価または四価の組み換え型リステリア株を本明細書で開示する。
【００８０】
一実施形態では、本明細書に開示されるＮ末端もしくは切断もしくは解毒のリステリオリシンＯタンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列に融合した、３つの異種抗原を発現する三価または四価の組み換え型リステリア株を本明細書で開示する。
【００８１】
一実施形態では、Ｎ末端または切断または解毒のリステリオリシンＯタンパク質（ＬＬＯ）に融合した、４つの異種抗原を発現する四価の組み換え型リステリア株を本明細書で開示する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ含有ポリペプチドは、本明細書で開示されるＮ末端、切断のＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列である。別の実施形態では、本明細書で開示される異種抗原は、Ｎ末端もしくは切断のＬＬＯまたは切断ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ配列に対して、前述のＬＬＯ、切断ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ配列のＮ末端またはＣ末端において、独立に融合する。別の実施形態では、本明細書で開示される異種抗原のそれぞれは、Ｎ末端もしくは切断のＬＬＯ、切断ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ配列に対して、前述のＬＬＯ、切断ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ配列のＮ末端またはＣ末端において、独立に融合する。
【００８２】
一実施形態では、本明細書に開示される二価、三価または四価組み換え型リステリア株は、染色体外プラスミドまたはエピソームのオープンリーディングフレームから少なくとも１つの異種抗原を発現する。別の実施形態では、本明細書に開示される二価、三価、または四価の組み換え型リステリア株は、少なくとも１つの染色体外プラスミドまたはエピソームについてオープンリーディングフレームから少なくとも１つの異種抗原を発現する。別の実施形態では、本明細書に開示される二価組み換え型リステリア株は、二つの染色体外プラスミドまたはエピソームのそれぞれのオープンリーディングフレームから二つの異種抗原を発現する。別の実施形態では、本明細書に開示される三価組み換え型リステリア株は、三つの染色体外プラスミドまたはエピソームのそれぞれのオープンリーディングフレームから三つの異種抗原を発現する。別の実施形態では、本明細書に開示される四価組み換え型リステリア株は、四つの染色体外プラスミドまたはエピソームのそれぞれのオープンリーディングフレームから四つの異種抗原を発現する。
【００８３】
一実施形態では、本明細書に開示される二価、三価または四価組み換え型リステリア株は、リステリアのゲノムのオープンリーディングフレームから少なくとも１つの異種抗原を発現する。別の実施形態では、本明細書に開示される二価、三価または四価組み換え型リステリア株は、染色体外プラスミドまたはエピソームから、および本明細書に開示されるリステリアのゲノムの両方から、少なくとも１つの異種抗原を発現する。別の実施形態では、各異種抗原は、Ｎ末端または切断または解毒のリステリオリシンＯタンパク質（ＬＬＯ）との融合タンパク質において発現される。別の実施形態では、ＰＥＳＴ含有ポリペプチドは、Ｎ末端または切断のＡｃｔＡタンパク質である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ含有ペプチドは、本明細書に開示されるＰＥＳＴアミノ酸配列である。
【００８４】
一実施形態では、本発明に包含される二価および多価の組み換え型リステリアは、以下の米国特許出願公開公報に記載されているものを含む。米国特許出願公開第２０１１／０１２９４９９号および米国特許出願公開第２０１２／０１３５０３３号であって、両公報は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【００８５】
別の実施形態では、対象はＨＰＶ媒介性発ガン性（例えば、子宮頸ガン）を高めるリスクがある。別の実施形態では、対象はＨＰＶ陽性である。別の実施形態では、対象は子宮頸部上皮内腫瘍を呈する。別の実施形態では、対象は扁平上皮内病変を呈する。別の実施形態では、対象は子宮頸部に異形成を呈する。
【００８６】
一実施形態では、異種抗原は当技術分野で知られており本明細書に開示されている任意の腫瘍関連抗原である。別の実施形態では、異種抗原は自己免疫抗原である。別の実施形態では、異種抗原は感染性疾患抗原である。別の実施形態では、異種抗原はＨＰＶ関連抗原である。
【００８７】
本発明の方法の標的であるＨＰＶは、別の実施形態ではＨＰＶ  １６である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−１８である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８から選択される。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−３１である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−３５である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−３９である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−４５である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−５１である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−５２である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−５８である。別の実施形態ではＨＰＶは高リスクＨＰＶタイプである。別の実施形態ではＨＰＶは粘膜ＨＰＶタイプである。
【００８８】
別の実施形態では、本発明は異種抗原に対してヒト対象にワクチン接種する方法を提供し、方法は異種抗原を含むかまたは発現する組み換え型リステリア株をヒト対象に静脈内投与する工程を含み、第一のペプチドは、（ａ）ＬＬＯタンパク質のＮ末端断片、（ｂ）ＡｃｔＡタンパク質またはそのＮ末端断片、および（ｃ）ＰＥＳＴアミノ酸配列含有ペプチドから選択され、これによってヒト対象に異種抗原に対するワクチン接種をする。
【００８９】
別の実施形態では、本発明は異種抗原に対してヒト対象にワクチン接種する方法を提供し、方法は第一のペプチドの異種抗原への融合物を含む免疫原性組成物をヒト対象に静脈内投与する工程を含み、免疫原性ペプチドは、（ａ）ＬＬＯタンパク質のＮ末端断片、（ｂ）ＡｃｔＡタンパク質またはそのＮ末端断片、および（ｃ）ＰＥＳＴアミノ酸配列含有ペプチドから選択され、これによってヒト対象に異種抗原に対するワクチン接種をする。
【００９０】
別の実施形態では、本発明は異種抗原に対するワクチンをヒト対象に接種する方法を提供し、方法は組み換え型ポリペプチドを含む組み換え型リステリア株をヒト対象に静脈内投与する工程を含み、組み換え型ポリペプチドは異種抗原に融合した第一のペプチドを含み、第一のペプチドは、（ａ）ＬＬＯタンパク質のＮ末端断片、（ｂ）ＡｃｔＡタンパク質またはそのＮ末端断片、および（ｃ）ＰＥＳＴアミノ酸配列含有ペプチドから選択され、これによってヒト対象に異種抗原に対するワクチン接種をする。
【００９１】
別の実施形態では、本発明はヒト対象内に異種抗原に対するＣＴＬ応答を誘発する方法を提供し、方法は異種抗原を含むまたは発現する組み換え型リステリア株をヒト対象に投与する工程を含み、これによってヒト対象内に異種抗原に対するＣＴＬ応答を誘発する。別の実施形態では、投与する工程は、静脈内投与である。
【００９２】
本明細書に開示されるように、ＬＬＯ−抗原融合を発現する組み換え型リステリア株は抗腫瘍免疫性を誘発し（実施例１）、抗原特異的Ｔ細胞増殖を引き出し（実施例２）、抗原特異的で、かつ腫瘍を浸潤するＴ細胞を生成する（実施例３）。したがって、本発明のワクチンは、Ｅ７およびＥ６に対して免疫応答を誘発するのに有効である。
【００９３】
別の実施形態では、本発明は対象内のガンの退行を誘発する方法を提供し、これには本明細書に開示される組み換え型リステリア株を対象に投与する工程を含む。
【００９４】
別の実施形態では、本発明は対象内のガンの再発の発生率を減少する方法を提供し、これには本明細書に開示される組み換え型リステリア株を対象に投与する工程を含む。
【００９５】
別の実施形態では、本発明は対象内での腫瘍の形成を抑制する方法を提供し、これには本明細書に開示される組み換え型リステリア株を対象に投与する工程を含む。
【００９６】
別の実施形態では、本発明は対象内のガンの寛解を誘発する方法を提供し、これには本明細書に開示される組み換え型リステリア株を対象に投与する工程を含む。
【００９７】
別の実施形態では、本発明はヒト対象内の腫瘍成長を妨げる方法を提供し、これには本明細書に開示される組み換え型リステリア株を対象に投与する工程を含む。
【００９８】
別の実施形態では、本発明は対象内の腫瘍の大きさを減少する方法を提供し、これには本明細書に開示される組み換え型リステリア株を対象に投与する工程を含む。
【００９９】
一実施形態では、疾患は感染性疾患、自己免疫疾患、呼吸器疾患、前ガン状態、またはガンである。
【０１００】
「前ガン状態」という用語が、異形成、新生物発生前結節；マクロ再生結節（ｍａｃｒｏｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｎｏｄｕｌｅ、ＭＲＮ）；軽度異形成結節（ＬＧ−ＤＮ）；高度異形成結節（ＨＧ−ＤＮ）；胆管上皮異形成；変性肝細胞の病巣（ＦＡＨ）；変性肝細胞の結節（ＮＡＨ）；染色体不均衡；テロメラーゼの異常活性化；テロメラーゼの触媒サブユニットの再発現；ＣＤ３１、ＣＤ３４、およびＢＮＨ９などの内皮細胞マーカーの発現を包含する場合があることを当業者は良好に理解するであろう（例えば、Ｔｅｒｒａｃｃｉａｎｏ  ａｎｄ  Ｔｏｍｉｌｌｏ（２００３）Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ  ９５：７１−８２；Ｓｕ  ａｎｄ  Ｂａｎｎａｓｃｈ（２００３）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：１２６−１３３；Ｒｏｃｋｅｎ  ａｎｄ  Ｃａｒｌ−ＭｃＧｒａｔｈ（２００１）Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．１９：２６９−２７８；Ｋｏｔｏｕｌａ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｌｉｖｅｒ  ２２：５７−６９；Ｆｒａｃｈｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．３４：８５０−８５７；Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ  Ｐａｎｃｒｅａｔ．Ｓｕｒｇ．７：５４２−５５０；Ｎａｋａｎｕｍａ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ  Ｐａｎｃｒｅａｔ．Ｓｕｒｇ．１０：２６５−２８１を参照）。ガンおよび異形成の診断方法が開示されている（例えば、Ｒｉｅｇｌｅｒ（１９９６）Ｓｅｍｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｄｉｓ．７：７４−８７；Ｂｅｎｖｅｇｎｕ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｌｉｖｅｒ  １２：８０−８３；Ｇｉａｎｎｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．３４：９５−９７；Ａｎｔｈｏｎｙ（１９７６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３６：２５７９−２５８３を参照）。
【０１０１】
一実施形態では、感染性疾患は以下の病原体（しかしこれに限定されない）のうちの１つによって生じたものである。ＢＣＧ／結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、Ｂ型肝炎、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ）、汎発性インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌Ａ＋Ｃ、経口ポリオワクチン、一価、二価、および三価、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス（炭疽菌）、クロストリジウム・ボツリヌス毒素（ボツリヌス中毒症）、エルシニア・ペスチス（ペスト）、大痘瘡（天然痘）、および他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス（野兎病）、ウイルス性出血熱、アレナウイルス（ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱）、ブニヤウイルス（ハンタウイルス、リフトバレー熱）、フラビウイルス（デング）、フィロウイルス（エボラ、マールブルグ）、バークホルデリア・シェードマレイ、コクシエラ・バーネティー（Ｑ熱）、ブルセラ種（ブルセラ症）、バークホルデリア・マレイ（鼻疽）、クラミジア・シタッシ（オウム病）、リシン毒素（リシナス・コンムニス由来）、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンＢ、発疹チフス（リケッチア・プロワゼキ）、他のリケッチア食品由来および水由来の病原体、細菌（下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ種、サルモネラＢＣＧ／、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ）、ウイルス（カルシウイルス、Ａ型肝炎、西ナイルウイルス、ラクロス、カリフォルニア脳炎、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、原虫（クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ）、真菌類（微胞子虫）、黄熱病、薬剤耐性ＴＢを含む結核、狂犬病、プリオン、コロナウイルスに関連付けられた重症急性呼吸器症候（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性腟症、トラコーマクラミジア、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、腟トリコモナス、または本明細書に列挙されていない当該技術分野で公知の任意の他の感染性疾患。
【０１０２】
別の実施形態では前述の感染症は家畜の感染症である。別の実施形態では家畜の疾患は、人間に伝染する可能性があり、「人獣共通感染症」と呼ばれる。別の実施形態ではこれらの疾患に口蹄疫、西ナイルウイルス、狂犬病、イヌパルボウイルス、ネコ白血病ウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ウシ感染性鼻気管炎（ＩＢＲ）、仮性狂犬病、ブタコレラ（ＣＳＦ）、牛の１型ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ−１）感染によって生じるＩＢＲ、および豚の仮性狂犬病（オーエスキー病）、トキソプラズマ症、炭疽病、水疱性口内炎ウイルス、ロドコッカス・エクイ、野兎病、ペスト（エルシニア・ペスチス）、トリコモナスが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０３】
別の実施形態では、本明細書に開示される疾患は呼吸器または炎症性疾患である。別の実施形態では、呼吸器または炎症性疾患は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。別の実施形態では、疾患は喘息である。
【０１０４】
一実施形態では、生きた弱毒化リステリア株は、抗炎症剤または気管支拡張剤などの他の治療薬を同時投与せずに喘息の症状を軽減する能力を有する。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、対象に生きた弱毒化リステリア株および１つ以上の治療薬を同時投与する工程をさらに含む。別の実施形態では、治療薬は抗喘息薬である。別の実施形態では、薬剤は抗炎症剤、非ステロイド抗炎症剤、抗生物質、抗コリン剤、気管支拡張剤、副腎皮質ステロイド、短時間作用型β作動薬、長時間作用型β作動薬、組み合わせ吸入器、抗ヒスタミン剤、またはこれらの組み合わせである。
【０１０５】
一実施形態では、本明細書に開示される疾患は癌または腫瘍である。一実施形態では、この腫瘍はガン性である。別の実施形態では、このガンは乳ガンである。別の実施形態ではこの癌は子宮頚部癌である。別の実施形態では、このガンはＨｅｒ２を含有するガンである。別の実施形態ではこの癌は黒色腫である。別の実施形態ではこの癌は膵臓癌である。別の実施形態ではこの癌は卵巣癌である。別の実施形態ではこの癌は胃癌である。別の実施形態ではこの癌は膵臓の癌病巣である。別の実施形態ではこの癌は肺腺癌である。別の実施形態では、これは多形神経膠芽腫である。別の実施形態ではこの癌は大腸腺癌である。別の実施形態ではこの癌は肺扁平腺癌である。別の実施形態ではこの癌は胃腺癌である。別の実施形態ではこの癌は卵巣表面上皮性新生物（例えば、その良性の、増殖性の、または悪性の変種）である。別の実施形態ではこの癌は口腔扁平上皮癌である。別の実施形態ではこの癌は肺非小細胞癌である。別の実施形態ではこの癌は子宮内膜癌である。別の実施形態ではこの癌は膀胱癌である。別の実施形態ではこの癌は頭頸部癌である。別の実施形態ではこの癌は前立腺癌である。別の実施形態ではこの癌は口腔咽頭癌である。別の実施形態ではこの癌は肺癌である。別の実施形態ではこの癌は肛門癌である。別の実施形態ではこの癌は肺癌である。別の実施形態ではこの癌は膣癌である。別の実施形態ではこの癌は大腸癌である。別の実施形態ではこの癌は食道癌である。本発明の方法によって標的化される子宮頚腫瘍は、別の実施形態では、扁平上皮ガンである。別の実施形態では、この子宮頸腫瘍は腺ガンである。別の実施形態では、子宮頸腫瘍は腺扁平上皮ガンである。別の実施形態では、この子宮頸腫瘍は小細胞ガンである。別の実施形態では、この子宮頸腫瘍は、当該技術分野で公知の任意の他のタイプの子宮頸腫瘍である。
【０１０６】
別の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、対象の肛門細胞内腫瘍に対する免疫応答を誘発し、前述の腫瘍を予防しまたは治療するのに有用である。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、対象の膣細胞内腫瘍に対する免疫応答を誘発し、前述の腫瘍を予防しまたは治療するのに有用である。
【０１０７】
本発明の方法によって標的化される子宮頚腫瘍は、別の実施形態では、扁平上皮ガンである。別の実施形態では、この子宮頸腫瘍は腺ガンである。別の実施形態では、子宮頸腫瘍は腺扁平上皮ガンである。別の実施形態では、この子宮頸腫瘍は小細胞ガンである。別の実施形態では、この子宮頸腫瘍は、当該技術分野で公知の任意の他のタイプの子宮頸腫瘍である。
【０１０８】
一実施形態では、抗原は外来であってもよく、すなわち、宿主に対して異種であってもよく、本明細書では「異種抗原」と称される。別の実施形態では、抗原は、自己抗原であり、これは宿主内に存在するが、免疫寛容のために宿主はこれに対する免疫応答を引き出さない。当業者にとっては当然のことながら、異種抗原ならびに自己抗原は、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、または血管形成抗原を包含しうる。さらに、異種抗原は、感染性疾患抗原を包含する場合がある。
【０１０９】
一実施形態では、本明細書に開示される抗原は、異種腫瘍抗原であり、これは本明細書に「腫瘍抗原」、「抗原性ポリペプチド」、または「外来性抗原」とも称される。別の実施形態では、本明細書に開示される抗原は自己抗原である。
【０１１０】
「異種」という用語が、参照種とは異なる種に由来する核酸、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を包含することが当業者によって理解されるであろう。したがって、例えば、異種ポリペプチドを発現するリステリア株は１つの実施形態ではそのリステリア株にとって固有または内在性のものではないペプチドを発現することになり、または別の実施形態ではそのリステリア株によって通常発現されないポリペプチドを発現することになり、または別の実施形態ではそのリステリア株以外の供給源に由来するポリペプチドを発現することになる。別の実施形態では異種という用語は同一の種の中の異なる生物に由来するものを説明するために使用される。別の実施形態では前述の異種抗原は、リステリアの組換え株によって発現され、その組換え株が哺乳類細胞に感染するとプロセッシングを受け、且つ、細胞傷害性Ｔ細胞に提示される。別の実施形態ではリステリア種によって発現されるその異種抗原は、その哺乳類内で自然に発現する対応する未修飾の抗原またはタンパク質を認識するＴ細胞応答が生じる限り、腫瘍細胞または感染性因子の中のその未修飾の抗原またはタンパク質と厳密に一致する必要がない。「異種抗原」という用語は本明細書において「抗原性ポリペプチド」、「異種タンパク質」、「異種タンパク質抗原」、「タンパク質抗原」、「抗原」などと呼ばれる場合がある。
【０１１１】
一実施形態では、抗原は、ヒトパピローマウイルス−Ｅ７（ＨＰＶ−Ｅ７）抗原であり、これは一実施形態では、ＨＰＶ１６（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ３３２５３）由来であり、また別の実施形態では、ＨＰＶ１８（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ０６７８８）由来である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはＨＰＶ−Ｅ６であり、これは一実施形態では、ＨＰＶ１６（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＤ３３２５２、ＡＡＭ５１８５４、ＡＡＭ５１８５３、またはＡＡＢ６７６１５）由来であり、また別の実施形態ではＨＰＶ１８（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｐ０６４６３）由来である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、Ｈｅｒ／２−ｎｅｕ抗原である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドは前立腺特異抗原（ＰＳＡ）（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＤ３０８４４、ＣＡＤ５４６１７、ＡＡＡ５８８０２、またはＮＰ＿００１６３９）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドは角質層キモトリプシン様酵素（ＳＣＣＥ）抗原（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＫ６９６５２、ＡＡＫ６９６２４、ＡＡＧ３３３６０、ＡＡＦ０１１３９、またはＡＡＣ３７５５１）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはウィルムス腫瘍抗原１であり、これは別の実施形態では、ＷＴ−１テロメラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｐ４９９５２、Ｐ２２５６１、ＮＰ＿６５９０３２、ＣＡＣ３９２２０．２、またはＥＡＷ６８２２２．１）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはｈＴＥＲＴまたはテロメラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ００３２１９（変異体１）、ＮＭ１９８２５５（変異体２）、ＮＭ１９８２５３（変異体３）、またはＮＭ１９８２５４（変異体４）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはプロテイナーゼ３（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ２９１４２、Ｍ７５１５４、Ｍ９６８３９、Ｘ５５６６８、ＮＭ００２７７、Ｍ９６６２８、またはＸ５６６０６）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはチロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１９１３、ＡＢＩ７３９７６、ＡＡＰ３３０５１、またはＱ９５１１９）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドは高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１８８８、ＡＡＩ２８１１１、またはＡＡＱ６２８４２）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはテスティシン（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＦ７９０２０、ＡＡＦ７９０１９、ＡＡＧ０２２５５、ＡＡＫ２９３６０、ＡＡＤ４１５８８、またはＮＰ＿６５９２０６）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはＮＹ−ＥＳＯ−１抗原（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ０５９０８、Ｐ７８３５８、ＡＡＢ４９６９３、またはＮＰ＿６４０３４３）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはＰＳＣＡ（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＨ６５１８３、ＮＰ＿００５６６３、ＮＰ＿０８２４９２、Ｏ４３６５３、またはＣＡＢ９７３４７）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはインターロイキン（ＩＬ）１３受容体α（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０００６３１、ＮＰ＿００１５５１、ＮＰ＿０３２３８２、ＮＰ＿５９８７５１、ＮＰ＿００１００３０７５、またはＮＰ＿９９９５０６）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドは炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＩ１３４５５、ＣＡＩ１０９８５、ＥＡＷ５８３５９、ＮＰ＿００１２０７、ＮＰ＿６４７４６６、またはＮＰ＿００１１０１４２６）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはガン胎児性抗原（ＣＥＡ）（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ６６１８６、ＣＡＡ７９８８４、ＣＡＡ６６９５５、ＡＡＡ５１９６６、ＡＡＤ１５２５０、またはＡＡＡ５１９７０．）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはＭＡＧＥ−Ａ（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿７８６８８５、ＮＰ＿７８６８８４、ＮＰ＿００５３５２、ＮＰ＿００４９７９、ＮＰ＿００５３５８、またはＮＰ＿００５３５３）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはサバイビン（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＣ５１６６０、ＡＡＹ１５２０２、ＡＢＦ６０１１０、ＮＰ＿００１００３０１９、またはＮＰ＿００１０８２３５０）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはＧＰ１００（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション入番号ＡＡＣ６０６３４、ＹＰ＿６５５８６１、またはＡＡＢ３１１７６）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドは当該技術分野で公知の任意の他の抗原性ポリペプチドである。別の実施形態では、組成物および本発明の方法の抗原性ペプチドは抗原性ポリペプチドの免疫原性部分を含む。
【０１１２】
別の実施形態では、抗原はＨＰＶ−Ｅ６である。別の実施形態ではその抗原はテロメラーゼ（ＴＥＲＴ）である。別の実施形態ではその抗原はＬＭＰ−１である。別の実施形態ではその抗原はｐ５３である。別の実施形態では、抗原はメソテリンである。別の実施形態では、抗原はＥＧＦＲＶＩＩＩである。別の実施形態ではその抗原は炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）である。別の実施形態ではその抗原はＰＳＭＡである。別の実施形態ではその抗原はＨＭＷ−ＭＡＡである。別の実施形態ではその抗原はＨＩＶ−１  Ｇａｇである。別の実施形態ではその抗原はチロシナーゼ関連タンパク質２である。別の実施形態では、抗原は、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＰＶ−Ｅ６、Ｈｅｒ−２、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、ＬＭＰ−１、ｐ５３、ＰＳＭＡ、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＬＭＰ−１、カリクレイン関連ペプチダーゼ３（ＫＬＫ３）、ＫＬＫ９、Ｍｕｃ、チロシナーゼ関連タンパク質２、Ｍｕｃ１、ＦＡＰ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＰＳＡ（前立腺特異的な抗原）、ｇｐ−１００、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ−７０）、β−ＨＣＧ、ＥＧＦＲ−ＩＩＩ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、アンジオゲニン、アンジオポエチン−１、Ｄｅｌ−１、線維芽細胞成長因子：酸性（ａＦＧＦ）もしくは塩基性（ｂＦＧＦ）、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）／分散因子（ＳＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、レプチン、ミッドカイン、胎盤成長因子、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、プログラヌリン、プロリフェリン、形質転換成長因子−α（ＴＧＦ−α）、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）／血管透過性因子（ＶＰＦ）、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／ＦＬＫ−１）もしくはその断片、ＦＬＫ−１もしくはそのエピトープ、ＦＬＫ−Ｅ１、ＦＬＫ−Ｅ２、ＦＬＫ−Ｉ１、エンドグリンもしくはその断片、ニューロピリン１（ＮＲＰ−１）、アンジオポエチン１（Ａｎｇ１）、Ｔｉｅ２、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、エンドグリン、ＴＧＦ−β受容体、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３１、エフリン、ＩＣＡＭ−１、Ｖ−ＣＡＭ−１、ＶＡＰ−１、Ｅ−セレクチン、プラスミノーゲン活性化剤、プラスミノーゲン活性化剤阻害剤−１、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）、ＣＯＸ−２、ＡＣ１３３、もしくはＩｄ１／Ｉｄ３、アンジオポエチン３、アンジオポエチン４、アンジオポエチン６、ＣＤ１０５、ＥＤＧ、ＨＨＴ１、ＯＲＷ、ＯＲＷ１もしくはＴＧＦβ共受容体、またはこれらの組み合わせから選択される。一実施形態では、抗原は米国特出願公開第２０１１／０１４２７９１号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記述されるキメラＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原である。本明細書に開示される抗原の断片の使用も本発明に包含される。
【０１１３】
別の実施形態では、本明細書に開示される異種腫瘍抗原は腫瘍関連抗原であり、これは、一実施形態では、以下の腫瘍抗原のうちの１つである。ＭＡＧＥ（メラノーマ関連抗原Ｅ）タンパク質、例えば、ＭＡＧＥ  １、ＭＡＧＥ  ２、ＭＡＧＥ  ３、ＭＡＧＥ  ４、チロシナーゼ；突然変異ｒａｓタンパク質；突然変異ｐ５３タンパク質；進行ガンと関連付けられたｐ９７メラノーマ抗原、ｒａｓペプチドもしくはｐ５３ペプチド；子宮頸ガンと関連付けられたＨＰＶ１６／１８抗原、乳ガンと関連付けられたＫＬＨ抗原、大腸ガンと関連付けられたＣＥＡ（ガン胎児抗原）、メラノーマと関連付けられたＭＡＲＴ１抗原、または前立腺ガンと関連付けられたＰＳＡ抗原。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法のための抗原はメラノーマ−関連抗原であり、これは、一実施形態では、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ、またはこれらの組み合わせである。当業者であれば、本明細書に記述されていないが当該技術分野で公知の任意の異種抗原を、本明細書に開示される方法および組成物で使用できるであろうことが理解される。本発明は、明細書に開示される抗原のうちの少なくとも１つをコードする核酸を含む弱毒化されたリステリアを提供するが、これによって限定されないことも理解するべきである。本発明は、開示されている抗原の突然変異体、突然変異タンパク質、スプライス変異体、断片、切断変異体、可溶性変異体、細胞外ドメイン、細胞内ドメイン、成熟配列、およびこれに類するものをコードする核酸を包含する。これらの抗原のエピトープ、オリゴ、およびポリペプチドをコードする核酸が開示されている。リステリア内での発現を最適化した、コドン最適化実施形態も開示される。引用した参考文献、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、ならびに本明細書に開示される核酸、ペプチド、およびポリペプチドは、すべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、選択された核酸配列は全長の遺伝子または切断遺伝子、融合遺伝子またはタグ付き遺伝子をコードすることができ、これはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＤＮＡ断片とすることができ、好ましくはｃＤＮＡとすることができる。これを突然変異することができ、または所望により別の方法で修飾することができる。これらの修飾は、選択された宿主細胞または細菌、すなわち、リステリア内でコドンの使用を最適化するためのコドン最適化を含む。選択された配列は分泌されたポリペプチド、細胞質ポリペプチド、核ポリペプチド、膜結合型ポリペプチド、または細胞表面ポリペプチドをコードすることもできる。
【０１１４】
一実施形態では、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、脈管形成（胚循環系の形成）および血管形成（既存の血管系からの血管の成長）の両方に関与する重要なシグナリングタンパク質である。一実施形態では、ＶＥＧＦ活性は、主に脈管内皮の細胞に制限されるが、これは限られた数の他の細胞タイプ（例えば、刺激単球／マクロファージ遊走）にも効果を有する。インビトロでは、ＶＥＧＦは内皮細胞有糸分裂誘発および細胞遊走の刺激を示している。ＶＥＧＦは、微小血管の透過性も強化するので、これはしばしば脈管透過性因子と称される。
【０１１５】
一実施形態では、ＶＥＧＦファミリーのすべてのメンバーは、細胞表面上でチロシンキナーゼ受容体（ＶＥＧＦＲ）へと結合することによって細胞応答を刺激し、これらを二量体化させ、トランスリン酸化を通して活性化させる。ＶＥＧＦ受容体は、７つの免疫グロブリン様ドメイン、単一の膜貫通領域、および分割したチロシンキナーゼドメインを含有する細胞内部分から構成される細胞外部分を有する。
【０１１６】
一実施形態では、ＶＥＧＦ−Ａは、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）リガンド、ならびにＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）リガンドである。一実施形態では、ＶＥＧＦＲ−はＶＥＧＦに対する既知のほとんどの細胞応答を媒介する。ＶＥＧＦＲ−１の機能はあまりよく定義されていないが、一実施形態ではＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ−２結合からの隔離を通してＶＥＧＦＲ−２シグナル伝達を調節すると考えられており、一実施形態では、これは胎芽内での脈管形成の間特に重要である。一実施形態では、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦＲ−３受容体のリガンドであり、これは、一実施形態では、リンパ脈管形成を媒介する。
【０１１７】
一実施形態では、本発明の組成物はＶＥＧＦ受容体またはその断片を含み、これは、一実施形態では、ＶＥＧＦＲ−２であり、また別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−１であり、さらに別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−３である。
【０１１８】
一実施形態では、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）は活性化した内皮細胞（ＥＣ）上で高度に発現され、新しい血管の形成に関与している。一実施形態では、ＶＥＧＦＲ２はＶＥＧＦの５つのアイソフォームすべてを結合する。一実施形態では、ＥＣ上のＶＥＧＦＲ２を通したＶＥＧＦのシグナル伝達は増殖、遊走、および最終的な分化を誘発する。一実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のマウスホモログは胎児肝臓キナーゼ遺伝子−１（Ｆｌｋ−１）であり、これは強力な治療標的であり、また腫瘍増殖、浸潤、および転移において重要な役割を有する。一実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は、キナーゼインサートドメイン受容体（タイプＩＩＩ受容体チロシンキナーゼ）（ＫＤＲ）、表面抗原分類３０９（ＣＤ３０９）、ＦＬＫ１、Ｌｙ７３、Ｋｒｄ−１、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−２、または６１３０４０１Ｃ０７とも称される。
【０１１９】
別の実施形態では、抗原は、菌類病原体、細菌、寄生虫、蠕虫、またはウイルスに由来する。別の実施形態では、抗原は、破傷風トキソイド、インフルエンザウイルスからの血球凝集素分子、ジフテリアトキソイド、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質、ＩｇＡプロテアーゼ、インシュリンペプチドＢ、粉状そうか病菌抗原、ビブリオ症菌抗原、サルモネラ抗原、肺炎球菌抗原、呼吸器合胞体ウイルス抗原、インフルエンザ菌外膜タンパク質、ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ、髄膜炎菌ピリン、淋菌ピリン、メラノーマ−関連抗原（ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ）、タイプＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−３３、−３５、または−４５からのヒトパピローマウイルス抗原Ｅ１およびＥ２、腫瘍抗原ＣＥＡ、突然変異したまたはしていないｒａｓタンパク質、突然変異したまたはしていないｐ５３タンパク質、Ｍｕｃ１、またはｐＳＡから選択される。
【０１２０】
他の実施形態では、抗原は以下の疾患のうちの１つと関連付けられる。コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、麻疹、髄膜炎、おたふく風邪、百日咳、天然痘、肺炎球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、結核、腸チフス、水痘帯状疱疹、百日咳３、黄熱病、アジソン病由来のイムノゲンおよび抗原、アレルギー、アナフィラキシー、ブルートン症候群、固形および血液由来の腫瘍を含むガン、湿疹、橋本甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、後天性免疫不全症候群、腎臓、心臓、すい臓、肺、骨、および肝臓などの移植拒否反応、グレーブス病、多内分泌自己免疫疾患、肝炎、顕微鏡的多発性動脈炎、結節性多発動脈炎、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変症、悪性貧血、セリアック病、抗体媒介性腎炎、糸球体腎炎、リウマチ性疾患、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、血清反応陰性脊椎関節症、鼻炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、硬化性胆管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、疱疹状皮膚炎、乾癬、白斑、多発性硬化症、脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、ランバート・イートン筋無力症候群、強膜、上強膜、ブドウ膜炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、じんましん、乳児一過性低ガンマグロブリン血症、骨髄腫、Ｘ連鎖高Ｉｇｍ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、アミロイド症、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、マラリアのスポロゾイト周囲タンパク、微生物抗原、ウイルス抗原、自己抗原、およびリステリア症。
【０１２１】
別の実施形態では、子宮頸ガンを治療する、子宮頸ガンから保護する、または子宮頸ガンに対する免疫応答を誘発するための本発明の方法で、Ｅ７抗原の代わりに、またはＥ７抗原に加えてＨＰＶ  Ｅ６抗原が利用される。
【０１２２】
別の実施形態では、子宮頸ガンを治療する、子宮頸ガンから保護する、または子宮頸ガンに対する免疫応答を誘発するための本発明の方法で、ＬＬＯ断片の代わりに、またはＬＬＯ断片に加えてＡｃｔＡタンパク質断片が利用される。
【０１２３】
別の実施形態では、子宮頸ガンを治療する、子宮頸ガンから保護する、または子宮頸ガンに対する免疫応答を誘発するための本発明の方法で、ＬＬＯ断片の代わりに、またはＬＬＯ断片に加えてＰＥＳＴアミノ酸配列含有タンパク質断片が利用される。
【０１２４】
別の実施形態では、本発明は、本発明の組み換え型リステリアを含む免疫原性組成物を提供する。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の免疫原性組成物は、本発明の組み換え型ワクチンベクターを含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は本発明のプラスミドを含む。別の実施形態では、免疫原性組成物はアジュバントを含む。一実施形態では、本発明のベクターは、ワクチン組成物の一部として投与されうる。
【０１２５】
別の実施形態では、本発明のワクチンはアジュバントと共に送達される。一実施形態では、アジュバントは主にＴｈ１媒介の免疫応答を助ける。別の実施形態では、アジュバントはＴｈ１タイプの免疫応答を助ける。別の実施形態では、アジュバントはＴｈ１媒介の免疫応答を助ける。別の実施形態では、アジュバントは、抗体媒介の応答よりも細胞媒介性免疫応答を助ける。別の実施形態では、アジュバントは当該技術分野で公知の任意の他のタイプのアジュバントであるか、またはこれを含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は標的タンパク質に対するＴ細胞免疫応答の形成を誘発する。
【０１２６】
別の実施形態では、本発明はヒト対象内で抗Ｅ７細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を誘発するための方法を提供し、これには組み換え型リステリア株を対象に投与する工程を含み、組み換え型リステリア株はＬＬＯタンパク質およびＨＰＶ  Ｅ７抗原のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドを含み、これによってヒト対象内で抗Ｅ７  ＣＴＬ応答を誘発する。別の実施形態ではその組み換え型リステリア株はその組換えポリペプチドをコードするプラスミドを含む。別の実施形態では、方法は本発明の組み換え型リステリア株を用いて対象をブーストする工程をさらに含む。別の実施形態では、方法はＥ７抗原を含む免疫原性組成物を用いて対象をブーストする工程をさらに含む。別の実施形態では、方法は対象の細胞がＥ７抗原を発現するように導く免疫原性組成物を用いて対象をブーストする工程をさらに含む。別の実施形態では、ＣＴＬ応答は、ＨＰＶ媒介性疾患、ＨＰＶ媒介性障害、またはＨＰＶ媒介性症状に対して治療有効性の能力を有する。別の実施形態では、ＣＴＬ応答は、ＨＰＶ媒介性疾患、ＨＰＶ媒介性障害、またはＨＰＶ媒介性症状に対して予防的有効性の能力を有する。
【０１２７】
別の実施形態では、本発明は、対象のＨＰＶ媒介性疾患、ＨＰＶ媒介性障害、またはＨＰＶ媒介性症状を治療または改善する方法を提供し、これには組み換え型リステリア株を対象に投与する工程を含み、組み換え型リステリア株は、ＬＬＯタンパク質およびＨＰＶ  Ｅ７抗原のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドを含み、これによって組み換え型リステリア株はＥ７抗原に対して免疫応答を誘発し、これによって対象内のＨＰＶ媒介性疾患、ＨＰＶ媒介性障害、またはＨＰＶ媒介性症状を治療または改善する。別の実施形態では、対象はヒト対象である。別の実施形態では、対象はヒト以外の哺乳類である。別の実施形態では、対象は当該技術分野で公知の任意の他のタイプの対象である。
【０１２８】
別の実施形態では、疾患、障害、または症状を起こしているＨＰＶはＨＰＶ−１６である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−１８である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−３１である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−３５である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−３９である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−４５である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−５１である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−５２である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−５８である。別の実施形態ではＨＰＶは高リスクＨＰＶタイプである。別の実施形態ではＨＰＶは粘膜ＨＰＶタイプである。
【０１２９】
別の実施形態では、ＨＰＶ媒介性疾患、ＨＰＶ媒介性障害、またはＨＰＶ媒介性症状は、陰部疣贅である。別の実施形態では、ＨＰＶ媒介性疾患、ＨＰＶ媒介性障害、またはＨＰＶ媒介性症状は、非陰部疣贅である。別の実施形態では、ＨＰＶ媒介性疾患、ＨＰＶ媒介性障害、またはＨＰＶ媒介性症状は、呼吸器パピローマである。別の実施形態では、ＨＰＶ媒介性疾患、ＨＰＶ媒介性障害、またはＨＰＶ媒介性症状は、当該技術分野で公知の任意の他のＨＰＶ媒介性疾患、ＨＰＶ媒介性障害、またはＨＰＶ媒介性症状である。
【０１３０】
別の実施形態では、ＨＰＶ  Ｅ６抗原が、本発明の方法のＥ７抗原の代わりにまたはＥ７抗原に加えて、ＨＰＶ媒介性疾患、障害、または症状を治療もしくは軽快するために利用される。
【０１３１】
別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質断片が、本発明の方法のＬＬＯ断片の代わりにまたはＬＬＯ断片に加えて、ＨＰＶ媒介性疾患、障害、または症状を治療もしくは軽快するために利用される。
【０１３２】
別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列含有タンパク質断片が、本発明の方法のＬＬＯ断片の代わりにまたはＬＬＯ断片に加えて、ＨＰＶ媒介性疾患、障害、または症状を治療もしくは軽快するために利用される。
【０１３３】
別の実施形態では、ＨＰＶ  Ｅ６抗原が、本発明の方法のＥ７抗原の代わりにまたはＥ７抗原に加えて、ＨＰＶ媒介性疾患、障害、または症状を治療もしくは軽快するために利用される。
【０１３４】
本発明の方法および組成物の抗原は、別の実施形態では、ＨＰＶ  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態では、抗原はＨＰＶ  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態では、抗原は当該技術分野で公知の任意の他のＨＰＶタンパク質である。
【０１３５】
「Ｅ７抗原」は、別の実施形態では、Ｅ７タンパク質を指す。別の実施形態では、この用語はＥ７断片を指す。別の実施形態では、この用語はＥ７ペプチドを指す。別の実施形態では、この用語は当該技術分野で公知の任意の他のタイプのＥ７抗原を指す。
【０１３６】
本発明の方法および組成物のＥ７タンパク質は、別の実施形態では、ＨＰＶ  １６  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質はＨＰＶ−１８  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、ＨＰＶ−３１  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、ＨＰＶ−３５  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、ＨＰＶ−３９  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、ＨＰＶ−４５  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、ＨＰＶ−５１  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、ＨＰＶ−５２  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、ＨＰＶ−５８  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、高リスクＨＰＶタイプのＥ７タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、粘膜ＨＰＶタイプのＥ７タンパク質である。
【０１３７】
「Ｅ６抗原」は、別の実施形態では、Ｅ６タンパク質を指す。別の実施形態では、この用語はＥ６断片を指す。別の実施形態では、この用語はＥ６ペプチドを指す。別の実施形態では、この用語は当該技術分野で公知の任意の他のタイプのＥ６抗原を指す。
【０１３８】
本発明の方法および組成物のＥ６タンパク質は、別の実施形態では、ＨＰＶ  １６  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質はＨＰＶ−１８  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質はＨＰＶ−３１  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質はＨＰＶ−３５  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質はＨＰＶ−３９  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質はＨＰＶ−４５  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質はＨＰＶ−５１  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質はＨＰＶ−５２  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質はＨＰＶ−５８  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は、高リスクＨＰＶタイプのＥ６タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は、粘膜ＨＰＶタイプのＥ６タンパク質である。
【０１３９】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物によって誘発される免疫応答はＴ細胞応答である。別の実施形態ではその免疫応答はＴ細胞応答を含む。別の実施形態では、応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。別の実施形態ではその応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む。
【０１４０】
一実施形態では、本発明の組成物はインターフェロンガンマの強い先天的な刺激を誘発し、一実施形態では、これは抗血管形成特性を有する。一実施形態では、本発明のリステリアはインターフェロンガンマの強い先天的な刺激を誘発し、一実施形態では、これは抗血管形成特性を有する（Ｄｏｍｉｎｉｅｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００５  Ｍａｙ；５４（５）：４７７−８８．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｏｃｔ  ６、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｅａｔｔｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  Ｆｅｂ  １５；１６６（４）：２２７６−８２、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、本発明の方法はインターフェロンガンマ産生細胞のレベルを増加する。一実施形態ではリステリアの抗血管新生特性はＣＤ４＋Ｔ細胞によって媒介される（Ｂｅａｔｔｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，２００１）。別の実施形態ではリステリアの抗血管新生特性はＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介される。別の実施形態ではリステリアワクチン接種の結果としてのＩＦＮ−ガンマ分泌は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔｈ１  ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＣ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはこれらの組み合せによって媒介される。
【０１４１】
別の実施形態では、本発明の組成物は１つ以上の抗血管形成タンパク質または因子の生産を誘発する。一実施形態ではその抗血管新生タンパク質はＩＦＮ−γである。別の実施形態ではその抗血管新生タンパク質は色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、アンジオスタチン、エンドスタチン、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ（ｓＦｌｔ）−１、または可溶性エンドグリン（ｓＥｎｇ）である。一実施形態では、本発明のリステリアは、抗血管形成因子の放出に関与し、したがって一実施形態では、抗原を対象に導入するためのベクターとしての役割に加えて、治療的な役割を有する。本発明の別個の実施形態により各リステリア株およびその株のタイプが表される。
【０１４２】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物によって誘発される免疫応答は、標的腫瘍細胞のプログラム細胞死受容体１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）発現の抑制である。別の実施形態では、免疫応答は、腫瘍内のプログラム細胞死受容体１（ＰＤ−１）発現免疫細胞のレベル増加を含む。別の実施形態では、免疫応答は、ＰＤ−Ｌ１発現に対するＰＤ−１発現レベルの比の増加を含む。別の実施形態では、免疫応答は、腫瘍ＰＤ−Ｌ１媒介免疫抑制の阻害を含む。
【０１４３】
別の実施形態では、本発明の組成物の投与は、堅牢な全身性抗原特異的免疫を誘発する。別の実施形態では、本発明の組成物の投与は、エピトープ拡散を誘発する。別の実施形態では、本発明の組成物の投与は、自己由来腫瘍抗原に対する幅広い応答を誘発する。別の実施形態では、本発明の方法および組成物によって誘発される免疫応答は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）中のサプレッサー免疫細胞とエフェクター免疫細胞の全体的バランスの改善を含む。別の実施形態では、本発明の方法および組成物によって誘発される免疫応答は、サプレッサー免疫細胞とエフェクター免疫細胞の全身バランスの改善を含む。
【０１４４】
一実施形態では、本明細書に開示される組成物およびその使用方法は、腫瘍に浸潤し、腫瘍細胞を破壊し、そして疾患を撲滅することができるエフェクターＴ細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の使用方法はＴエフェクター細胞による腫瘍浸潤を増加する。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。
【０１４５】
一実施形態では、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、結腸、卵巣、およびメラノーマなどのいくつかの腫瘍でより良い予後に関連付けられる。結腸ガンでは、微小転移巣の兆候を有しない腫瘍は免疫細胞の浸潤およびＴｈ１発現プロファイルの増加を有し、これは患者の生存の改善と相関する。さらに、Ｔ細胞による腫瘍の浸潤は、前臨床試験と人体試験との両方で免疫療法アプローチの成功に関連付けられた。一実施形態では、リンパ球の腫瘍部位の中への浸潤は、腫瘍血管系の内皮細胞内の接着分子の上方調節に依存し、一般的にＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１などの炎症促進性のサイトカインによる。細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、血管内皮細胞接着分子１（Ｖ−ＣＡＭ−１）、血管接着タンパク質１（ＶＡＰ−１）およびＥ−セレクチンを含む腫瘍内へのリンパ球の浸潤のプロセス中にいくつかの接着分子が暗示される。しかしながら、これらの細胞接着分子は腫瘍血管系内で一般に下方調節される。したがって、一実施形態では、本明細書に開示されるガンワクチンはＴＩＬを増加し、接着分子（一実施形態では、ＩＣＡＭ−１、Ｖ−ＣＡＭ−１、ＶＡＰ−１、Ｅ−セレクチン、またはこれらの組み合せ）を上方調節し、炎症促進性のサイトカイン（一実施形態では、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、またはこれらの組み合わせ）、またはこれらの組み合わせを上方調節する。
【０１４６】
別の実施形態では本発明の方法および組成物のＮ末端ＬＬＯタンパク質断片は配列番号２を含む。別の実施形態ではその断片はＬＬＯシグナルペプチドを含む。別の実施形態ではその断片は配列番号２を含む。別の実施形態ではその断片はほぼ配列番号２から構成される。別の実施形態ではその断片は配列番号２から本質的に構成される。別の実施形態ではその断片は配列番号２に対応する。別の実施形態ではその断片は配列番号２と相同である。別の実施形態ではその断片は配列番号２の断片と相同である。いくつかの実施例で使用されるΔＬＬＯは、システイン４８４を含有する活性化ドメインを含むアミノ末端からの８８個の残基が切断されたので、４１６  ＡＡ長さ（シグナル配列を含まない）であった。活性化ドメインを有しない、そして特にシステイン４８４を有しない任意のΔＬＬＯは本発明の方法および組成物のために好適であることが当業者には明らかであろう。別の実施形態では、Ｅ７またはＥ６抗原の、ＰＥＳＴアミノ酸ＡＡ配列、配列番号１を含む任意のΔＬＬＯへの融合は、媒介される細胞および抗原の抗腫瘍免疫性を強化する。
【０１４７】
本発明のワクチンを構築するために利用されるＬＬＯタンパク質は、別の実施形態では、以下の配列を有する：
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDPEGNEIVQHKNWSENNKSKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWEWWRTVIDDRNLPLVKNRNISIWGTTLYPKYSNKVDNPIE（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ１３１２８；配列番号３；核酸配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ１５１２７で表される）。この配列に対応するプロタンパク質の最初の２５個のＡＡはシグナル配列であり、それらは細菌によってＬＬＯが分泌されるときにそれから切断される。したがって、この実施形態では全長活性型ＬＬＯタンパク質は５０４残基長である。別の実施形態では、上記のＬＬＯ断片は本発明のワクチンに組み込まれるＬＬＯ断片の供給源として使用される。
【０１４８】
別の実施形態では本発明の組成物および方法において利用されるＬＬＯタンパク質のＮ末端断片は、以下の配列を有する：
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYD  （配列番号２）。
【０１４９】
別の実施形態ではそのＬＬＯ断片は本明細書において利用されるＬＬＯタンパク質のおよそＡＡ２０〜４４２に対応する。
【０１５０】
別の実施形態ではそのＬＬＯ断片は以下の配列を有する：
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTD  （配列番号４）。
【０１５１】
別の実施形態では、「切断ＬＬＯ」または「ΔＬＬＯ」はＰＥＳＴアミノ酸ドメインを含むＬＬＯの断片を指す。別の実施形態では、これらの用語はＰＥＳＴ配列を含むＬＬＯ断片を指す。
【０１５２】
別の実施形態では、この用語はアミノ末端において活性化ドメインを含有せず、システイン４８４を含まないＬＬＯ断片を指す。別の実施形態では、これらの用語は溶血性でないＬＬＯ断片を指す。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、活性化ドメインの欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、システイン４８４の欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、別の場所における欠失または突然変異によって非溶血性にされる。
【０１５３】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質のおよそ最初の４４１  ＡＡから構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯのおよそ最初の４２０  ＡＡから構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質の非溶血性の形態である。
【０１５４】
別の実施形態ではそのＬＬＯ断片は上記のＡＡ範囲のうちの１つに対応する相同ＬＬＯタンパク質の残基を含有する。別の実施形態ではそれらの残基番号は上に列挙した残基番号と必ずしも正確に対応する必要はなく、例えば、相同ＬＬＯタンパク質が本明細書において利用されるＬＬＯタンパク質と比べて挿入または欠失を有する場合、残基番号を適宜調節することができる。
【０１５５】
別の実施形態ではそのＬＬＯ断片は当技術分野において知られている他のあらゆるＬＬＯ断片である。
【０１５６】
別の実施形態では、組み換え型リステリア株を１×１０９〜３．３１×１０１０ＣＦＵの用量でヒト対象に投与する。別の実施形態では、用量は５〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は７〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は３０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は７０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１００〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１５０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜３００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜２００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜１５０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜１００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜７０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜５０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜３０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜２０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１〜３０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１〜２０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２〜３０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１〜１０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２〜１０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は３〜１０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２〜７×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２〜５×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は３〜５×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、組み換え型リステリア株を約１×１０６〜約３．３１×１０１０ＣＦＵの用量でヒト対象に投与する。別の実施形態では、用量は約１×１０６〜約１×１０１０ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は約１×１０６〜約１×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は約１×１０６〜約１×１０７ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は約１×１０６〜約１×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は約１×１０７ＣＦＵ〜約１×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は約１×１０８ＣＦＵ〜約１×１０９ＣＦＵである。
【０１５７】
別の実施形態では、用量は１×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は１．５×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は２×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は３×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は４×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は５×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は６×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は７×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は８×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は１０×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は１．５×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は２×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は２．５×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は３×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は３．３×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は４×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は５×１０１０生命体である。
【０１５８】
別の実施形態では、本発明の方法の組み換え型ポリペプチドは組み換え型リステリア株によって発現される。別の実施形態では、発現は組み換え型リステリア株によって担持されるヌクレオチド分子によって媒介される。
【０１５９】
別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドをコードするプラスミドによって組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態では、プラスミドは細菌の転写因子をコードする遺伝子を含む。別の実施形態では、プラスミドはリステリア転写因子をコードする。別の実施形態では、転写因子はＰｒｆＡである。別の実施形態では、ＰｒｆＡは突然変異ＰｒｆＡである。別の実施形態では、ＰｒｆＡはＤ１３３Ｖアミノ酸突然変異を含有する。別の実施形態では、転写因子は当該技術分野で公知の任意の他の転写因子である。
【０１６０】
別の実施形態では、プラスミドは代謝酵素をコードする遺伝子を含む。別の実施形態では、代謝酵素は細菌の代謝酵素である。別の実施形態では、代謝酵素はリステリアの代謝酵素である。別の実施形態ではその代謝酵素はアミノ酸代謝酵素である。別の実施形態では、アミノ酸代謝遺伝子は細胞壁合成経路に関与する。別の実施形態では、代謝酵素はＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（ｄａｔ）の産物である。別の実施形態では、代謝酵素はアラニンラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）の産物である。別の実施形態では、代謝酵素は当該技術分野で公知の任意の他の代謝酵素である。
【０１６１】
別の実施形態では、本発明の方法は、本発明の組み換え型リステリア株を用いてヒト対象をブーストする工程をさらに含む。別の実施形態では追加免疫接種で使用されるその組み換え型リステリア株は、最初の「準備刺激」接種で使用される株と同一である。別の実施形態ではその追加免疫株は準備刺激株と異なる。別の実施形態では準備刺激接種と追加免疫接種において同一の用量が使用される。別の実施形態ではより大きい用量が追加免疫に使用される。別の実施形態ではより小さい用量が追加免疫に使用される。
【０１６２】
別の実施形態では、本発明の方法はＥ７抗原を含む免疫原性組成物をヒト対象に接種する工程をさらに含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は組み換え型Ｅ７タンパク質またはその断片を含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は組み換え型Ｅ７タンパク質またはその断片を発現するヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、リステリア接種の後に非リステリア接種が実施される。別の実施形態では、リステリア接種の前に非リステリア接種が実施される。
【０１６３】
別の実施形態では、「ブースティング」とは、追加的なワクチン用量の対象への投与を指す。本発明の方法の別の実施形態では、２回のブースト（すなわち、合計３回の接種）が投与される。別の実施形態では、３回のブーストが投与される。別の実施形態では、４回のブーストが投与される。別の実施形態では、５回のブーストが投与される。別の実施形態では、６回のブーストが投与される。別の実施形態では、７回以上のブーストが投与される。
【０１６４】
別の実施形態では本発明の方法および組成物の組み換え型リステリア株は、組み換え型リステリア・モノサイトゲネス株である。別の実施形態ではそのリステリア株は組み換え型リステリア・シーリゲリ｝株である。別の実施形態ではそのリステリア株は組み換え型リステリア・グレイ株である。別の実施形態ではそのリステリア株は組み換え型リステリア・イバノビ株である。別の実施形態ではそのリステリア株は組み換え型リステリア・ムライ株である。別の実施形態ではそのリステリア株は組み換え型リステリア・ウェルシメリ株である。別の実施形態ではそのリステリア株は、当技術分野において知られている他のあらゆるリステリア種の組換え株である。
【０１６５】
本発明は、本発明の弱毒化リステリアを作成または改変するための多くのリステリア種および株を提供する。一実施形態では、リステリア株は、Ｌ．モノサイトゲネス１０４０３Ｓ野生型である（Ｂｉｓｈｏｐ  ａｎｄ  Ｈｉｎｒｉｃｈｓ（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２００５−２００９；Ｌａｕｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂａｃｔ．１８４：４１７７−４１８６を参照。）別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスＤＰ−Ｌ４０５６（ファージキュアリング）である（Ｌａｕｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂａｃｔ．１８４：４１７７−４１８６を参照）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスＤＰ−Ｌ４０２７であり、これはファージキュアリングされ、かつｈｌｙ遺伝子内で欠失される（Ｌａｕｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂａｃｔ．１８４：４１７７−４１８６；Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｒｔｎｏｙ（１９９４）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６５：５６０８−５６１３を参照）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスＤＰ−Ｌ４０２９であり、これはファージキュアリングされ、ＡｃｔＡ内で欠失される（Ｌａｕｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂａｃｔ．１８４：４１７７−４１８６；Ｓｋｏｂｌｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５０：５２７−５３８を参照）。別の実施形態では、リステリア株は、Ｌ．モノサイトゲネスＤＰ−Ｌ４０４２（デルタＰＥＳＴ）である（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７；ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを参照）。別の実施形態では、リステリア株は、Ｌ．モノサイトゲネスＤＰ−Ｌ４０９７（ＬＬＯ−Ｓ４４Ａ）である（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７；ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを参照）。別の実施形態では、リステリア株は、Ｌ．モノサイトゲネスＤＰ−Ｌ４３６４（デルタｌｐｌＡ、ｌｉｐｏａｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｇａｓｅ）である（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７；ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを参照）。別の実施形態では、リステリア株は、Ｌ．モノサイトゲネスＤＰ−Ｌ４４０５（デルタｉｎｌＡ）である（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７；ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを参照）。別の実施形態では、リステリア株は、Ｌ．モノサイトゲネスＤＰ−Ｌ４４０６（デルタｉｎｌＢ）である（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７；ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを参照）。別の実施形態では、リステリア株は、Ｌ．モノサイトゲネスＣＳ−Ｌ０００１（デルタＡｃｔＡ−デルタ  ｉｎｌＢ）である（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ，  ｅｔ  ａｌ．（���００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７；ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを参照）。別の実施形態では、リステリア株は、Ｌ．モノサイトゲネスＣＳ−Ｌ０００２（デルタＡｃｔＡ−デルタｌｐｌＡ）である（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７；ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを参照）。別の実施形態では、リステリア株は、Ｌ．モノサイトゲネスＣＳ−Ｌ０００３（Ｌ４６１Ｔ−デルタｌｐｌＡ）である（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７；ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを参照）。別の実施形態では、リステリア株は、Ｌ．モノサイトゲネスＤＰ−Ｌ４０３８（デルタＡｃｔＡ−ＬＬＯ  Ｌ４６１Ｔ）である（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７；ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを参照）。別の実施形態では、リステリア株は、Ｌ．モノサイトゲネスＤＰ−Ｌ４３８４（Ｓ４４Ａ−ＬＬＯ  Ｌ４６１Ｔ）である（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７；ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを参照）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスである。リポ酸タンパク質内の突然変異（Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２：４６２−４６４を参照）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスＤＰ−Ｌ４０１７（１０４０３Ｓ  ｈｌｙ（Ｌ４６１Ｔ）であり、溶血素遺伝子中に点突然変異を有する（２００３年７月２４日出願の米国特許仮出願番号第６０／４９０，０８９号を参照）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスＥＧＤである（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＬ５９１８２４を参照）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスＥＧＤ−ｅである（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００３２１０、ＡＴＣＣ受入番号ＢＡＡ−６７９を参照）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスｕｖｒＡＢでＤＰ−Ｌ４０２９が欠失（２００４年２月２日出願の米国特許仮出願番号第６０／５４１，５１５号、２００３年７月２４日出願の米国特許仮出願番号第６０／４９０，０８０号を参照）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスＡｃｔＡ−／ｉｎｌＢ−二重突然変異体（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−５５６２を参照）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスｌｐｌＡ突然変異体またはｈｌｙ突然変異体である（Ｐｏｒｔｎｏｙらの米国特許出願第２００４００１３６９０号を参照）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスＤＡＬ／ＤＡＴ二重突然変異である（米国特許出願第２００５００４８０８１（ＦｒａｎｋｅｌおよびＰｏｒｔｎｏｙの出願）を参照のこと）。本発明は、上記のリステリア株、ならびにｈｌｙ（ＬＬＯ；��ステリオリシン）；ｉａｐ（ｐ６０）；ｉｎｌＡ；ｉｎｌＢ；ｉｎｌＣ；ｄａｌ（アラニンラセマーゼ）；ｄａｔ（Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ）；ｐｌｃＡ；ｐｌｃＢ；ａｃｔＡの遺伝子のうちの１つまたは任意の組み合せをコードする核酸を含むように例えばプラスミドおよび／またはゲノムの組み込みによって修飾されたこれらの株、または成長、拡散、単層ベシクル（ｓｉｎｇｌｅ  ｗａｌｌｅｄ  ｖｅｓｉｃｌｅ）の分解、二層ベシクル（ｄｏｕｂｌｅ  ｗａｌｌｅｄ  ｖｅｓｉｃｌｅ）の分解、宿主細胞への結合、宿主細胞による取込みを媒介する任意の核酸を含む試薬および方法を包含する。本発明は、上記に開示された特定の株によって限定されない。
【０１６６】
別の実施形態では本発明の組み換え型リステリア株は動物宿主を通して継代されている。別の実施形態では、継代は株のワクチンベクターとしての有効性を最大化する。別の実施形態ではその継代はそのリステリア株の免疫原性を安定化する。別の実施形態ではその継代はそのリステリア株の病原性を安定化する。別の実施形態ではその継代はそのリステリア株の免疫原性を増加する。別の実施形態ではその継代はそのリステリア株の病原性を増加する。別の実施形態ではその継代はそのリステリア株の不安定な亜系を除去する。別の実施形態ではその継代はそのリステリア株の不安定な亜系の普及を低下させる。別の実施形態ではそのリステリア株は抗原含有組換えペプチドをコードする遺伝子のゲノム挿入物を含む。別の実施形態ではそのリステリア株は抗原含有組換えペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドを担持する。別の実施形態では、本明細書に記述されるように継代を遂行する（例えば、実施例１２において）。別の実施形態では当技術分野において知られている他のあらゆる方法によってその継代が実施される。
【０１６７】
別の実施形態では、本発明の方法で利用される組み換え型リステリア株は凍結細胞バンク内で保存されている。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は凍結細胞バンクに保存されている。
【０１６８】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の細胞バンクはマスター細胞バンクである。別の実施形態では、細胞バンクはワーキング細胞バンクである。別の実施形態では、細胞バンクは製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）の細胞バンクである。別の実施形態では、細胞バンクは臨床グレード材料の生産を目的としている。別の実施形態では、細胞バンクはヒトへの使用のための規制実施に適合する。別の実施形態では、細胞バンクは当該技術分野で公知の任意の他のタイプの細胞バンクである。
【０１６９】
別の実施形態では、「製造管理および品質管理に関する基準」は米国連邦規則集の（２１  ＣＦＲ  ２１０−２１１）によって定義される。別の実施形態では、「製造管理および品質管理に関する基準」は、臨床グレードの材料生産のため、またはヒトの摂取のための他の基準、例えば、米国以外の国の基準などによって定義される。
【０１７０】
別の実施形態では、本発明の方法で利用される組み換え型リステリア株はワクチン用量のバッチ由来である。
【０１７１】
別の実施形態では、本発明の方法で利用される組み換え型リステリア株は、米国特許第８，１１４，４１４号（参照により本明細書に組み込まれる）で開示される方法によって生産された凍結または凍結乾燥したストック由来である。
【０１７２】
別の実施形態では本発明のペプチドは融合ペプチドである。別の実施形態では、「融合ペプチド」はペプチド結合または他の化学結合によって互いに連結した２つ以上のタンパク質を含むペプチドまたはポリペプチドを指す。別の実施形態では前述のタンパク質はペプチド結合または他の化学結合によって直接的に互いに連結されている。別の実施形態では、タンパク質は、２つ以上のタンパク質の間の１つ以上のＡＡ（例えば、「スペーサー」）によって互いに連結している。
【０１７３】
別の実施形態では、本発明のワクチンはアジュバントをさらに含む。別の実施形態では本発明の方法および組成物において使用されるアジュバントは顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質である。別の実施形態ではそのアジュバントはＧＭ−ＣＳＦタンパク質を含む。別の実施形態ではそのアジュバントはＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態ではそのアジュバントはＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態ではそのアジュバントはサポニンＱＳ２１である。別の実施形態ではそのアジュバントはサポニンＱＳ２１を含む。別の実施形態ではそのアジュバントはモノホスホリルリピドＡである。別の実施形態ではそのアジュバントはモノホスホリルリピドＡを含む。別の実施形態ではそのアジュバントはＳＢＡＳ２である。別の実施形態ではそのアジュバントはＳＢＡＳ２を含む。別の実施形態ではそのアジュバントは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。別の実施形態ではそのアジュバントは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態ではそのアジュバントは免疫刺激サイトカインである。別の実施形態ではそのアジュバントは免疫刺激サイトカインを含む。別の実施形態ではそのアジュバントは免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態ではそのアジュバントは免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態ではそのアジュバントはクイルグリコシドであるか、またはこれを含む。別の実施形態ではそのアジュバントは細菌マイトジェンであるか、またはこれを含む。別の実施形態ではそのアジュバントは細菌毒素であるか、またはこれを含む。別の実施形態ではそのアジュバントは当技術分野において知られている他のあらゆるアジュバントであるか、またはこれを含む。
【０１７４】
別の実施形態では、本発明のヌクレオチドは、リステリア株内のコードしたペプチドの発現を駆動するプロモーター／調節性配列に機能可能に連結している。遺伝子の構成的発現を引き起こすために有用なプロモーター／調節性配列は当技術分野において周知であり、これらには、例えば、リステリアのＰｈｌｙＡプロモーター、ＰＡｃｔＡプロモーター、およびｐ６０プロモーター、ストレプトコッカスｂａｃプロモーター、ストレプトマイセス・グリセウスｓｇｉＡプロモーター、およびバチルス・チューリンゲンシスｐｈａＺプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、本発明のペプチドをコードする核酸の誘発性でかつ組織に特異的な発現は、ペプチドをコードする核酸を誘発性または組織特異的プロモーター／調節性配列の制御下に置くことによって遂行される。この目的のために有用な組織特異的または誘導性プロモーター／調節性配列の実施例としては、ＭＭＴＶ  ＬＴＲ誘導性プロモーター、およびＳＶ４０後期エンハンサー／プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では金属、グルココルチコイドなどのような誘導剤に応答して誘導されるプロモーターが利用される。したがって、本発明は、既知または未知のどちらかであるプロモーター／調節性配列であって、その配列に機能可能であるように連結されている所望のタンパク質の発現を引き起こすことができるあらゆるプロモーター／調節性配列の使用を含むことが理解される。
【０１７５】
本発明の方法および組成物で利用されるＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片は、別の実施形態では、配列番号５で示される配列を有する。
MRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIKELEKSNKVRNTNKADLIAMLKEKAEKGPNINNNNSEQTENAAINEEASGADRPAIQVERRHPGLPSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLTYPDKPTKVNKKKVAKESVADASESDLDSSMQSADESSPQPLKANQQPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIVDKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIIRETASSLDSSFTRGDLASLRNAINRHSQNFSDFPPIPTEEELNGRGGRP.別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は配列番号５に示される配列を含む。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片は当技術分野において知られている他のあらゆるＡｃｔＡ断片である。
【０１７６】
別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする組み換え型ヌクレオチドは、配列番号６に示される配列を含む。
Atgcgtgcgatgatggtggttttcattactgccaattgcattacgattaaccccgacataatatttgcagcgacagatagcgaagattctagtctaaacacagatgaatgggaagaagaaaaaacagaagagcaaccaagcgaggtaaatacgggaccaagatacgaaactgcacgtgaagtaagttcacgtgatattaaagaactagaaaaatcgaataaagtgagaaatacgaacaaagcagacctaatagcaatgttgaaagaaaaagcagaaaaaggtccaaatatcaataataacaacagtgaacaaactgagaatgcggctataaatgaagaggcttcaggagccgaccgaccagctatacaagtggagcgtcgtcatccaggattgccatcggatagcgcagcggaaattaaaaaaagaaggaaagccatagcatcatcggatagtgagcttgaaagccttacttatccggataaaccaacaaaagtaaataagaaaaaagtggcgaaagagtcagttgcggatgcttctgaaagtgacttagattctagcatgcagtcagcagatgagtcttcaccacaacctttaaaagcaaaccaacaaccatttttccctaaagtatttaaaaaaataaaagatgcggggaaatgggtacgtgataaaatcgacgaaaatcctgaagtaaagaaagcgattgttgataaaagtgcagggttaattgaccaattattaaccaaaaagaaaagtgaagaggtaaatgcttcggacttcccgccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacaccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcagaaccgagctcattcgaatttccaccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacgccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcggaaccgagctcgttcgaatttccaccgcctccaacagaagatgaactagaaatcatccgggaaacagcatcctcgctagattctagttttacaagaggggatttagctagtttgagaaatgctattaatcgccatagtcaaaatttctctgatttcccaccaatcccaacagaagaagagttgaacgggagaggcggtagacca.別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは配列番号６に示される配列を有する。別の実施形態ではその組み換え型ヌクレオチドはＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする他のあらゆる配列を含む。
【０１７７】
本発明の方法および組成物の別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸ＡＡ配列はＥ７抗原またはＥ６抗原に融合される。本明細書に開示されるように、ＰＥＳＴアミノ酸配列−抗原融合を発現する組み換え型リステリア株は抗腫瘍免疫性を誘発し（実施例３）、抗原特異的、腫瘍−浸潤Ｔ細胞を生成する（実施例４）。さらに、細胞媒介免疫性（ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）の強化が、抗原および、ＰＥＳＴアミノ酸ＡＡ配列ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫ（配列番号１）を含有するＬＬＯを含む融合タンパク質に対して実証された。
【０１７８】
したがって、他の原核生物に由来する他のＬＭ  ＰＥＳＴアミノ酸配列およびＰＥＳＴアミノ酸配列への抗原の融合は、抗原の免疫原性も強化する。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸ＡＡ配列は配列番号７〜１２から選択される配列を有する。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列はＬＭ  ＡｃｔＡタンパク質由来のＰＥＳＴアミノ酸配列である。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列は、ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ（配列番号７）、ＫＡＳＶＴＤＴＳＥＧＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫ（配列番号８）、ＫＮＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号９）、またはＲＧＧＩＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号１０）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列は、ストレプトコッカス種のストレプトリジンＯタンパク質由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列は、ストレプトコッカス・ピオゲネスストレプトリジンＯ、例えば、ＡＡ  ３５〜５１においてＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号１１）由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列は、ストレプトコッカス・エクイシミリスストレプトリジンＯ、例えば、ＡＡ  ３８〜５４においてＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号１２）由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列は、原核生物に由来する別のＰＥＳＴアミノ酸ＡＡ配列である。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列は、当該技術分野で公知の任意の他のＰＥＳＴアミノ酸配列である。
【０１７９】
他の原核生物のＰＥＳＴアミノ酸配列を、例えば、ＬＭについてＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒおよびＲｏｇｅｒｓ（１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：２６７−２７１）により記述されているものなどの方法に従って同定することができる。あるいは、この方法に基づいて他の原核生物由来のＰＥＳＴアミノ酸ＡＡ配列も同定することもできる。ＰＥＳＴアミノ酸ＡＡ配列が期待される他の原核生物には、他のリステリア種が含まれるが、これに限定されない。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列は抗原タンパク質の中に埋め込まれる。したがって、別の実施形態では、「融合」は、抗原の一方の端部にリンクしているかまたは抗原の中に埋め込まれるかのどちらかで、抗原とＰＥＳＴアミノ酸配列との両方を含む抗原タンパク質を指す。
【０１８０】
別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列は、当該技術分野で公知の任意の他の方法またはアルゴリズム、例えば、ＣａＳＰｒｅｄｉｃｔｏｒ（Ｇａｒａｙ−Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ  ＨＭ，Ｏｃｃｈｉｕｃｃｉ  ＪＭ，Ａｌｖｅｓ  Ｊ，Ｂｅｌｉｚａｒｉｏ  ＪＥ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００５  Ｊｕｎ；２１  Ｓｕｐｐｌ  １：ｉ１６９−７６）を使用して同定される。別の実施形態では、以下の方法が使用される。
【０１８１】
ＰＥＳＴ指数は、１の値をアミノ酸Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、またはＧｌｎに割り当てることによって、各３０〜３５ＡＡストレッチに対して計算される。ＰＥＳＴ残基の各々に対する係数値（ＣＶ）は、１であり、また他のＡＡ（非ＰＥＳＴ）の各々に対する係数値は０である。
【０１８２】
別の実施形態では、本発明のＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはその断片は、正確に本明細書に示される配列通りに示される必要はないが、本明細書のどこかに示される抗原に融合したＬＬＯまたはＡｃｔＡタンパク質の機能的な特徴を保持する他の改変、修飾、または変更を行うことができる。別の実施形態では、本発明はＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはその断片の類似体を利用する。別の実施形態では、保存ＡＡ配列の差異によって、または配列に影響しない修飾によって、または両方によって、類似体は自然発生したタンパク質またはペプチドとは異なる。
【０１８３】
別の実施形態では、Ｅ７タンパク質全体またはその断片のいずれかは、ＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列含有ペプチドに融合され、本発明の方法の組み換え型ペプチドを生成する。別の実施形態では、（全体で、または断片の供与源としてのどちらかで）利用されるＥ７タンパク質は、次の配列
【０１８４】
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP  （配列番号１３）である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は配列番号１３の相同体である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は配列番号１３の変異体である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は配列番号１３の異性体である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は配列番号１３の断片である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は配列番号１３の相同体の断片である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は配列番号１３の変異体の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号１３の異性体の断片である。
【０１８５】
別の実施形態ではそのＥ７タンパク質の配列は、
【０１８６】
MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ  （配列番号１４）である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は配列番号１４の相同体である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は配列番号１４の変異体の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号１４の異性体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号１４の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号１４の相同体の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号１４の変異体の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号１４の異性体の断片である。
【０１８７】
別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は以下のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つ、すなわち、Ｍ２４２１５、ＮＣ＿００４５００、Ｖ０１１１６、Ｘ６２８４３、またはＭ１４１１９で表される配列を有する。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つの配列の相同体である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つの配列の変異体である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つの配列の異性体である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つの配列の断片である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つの配列の相同体の断片である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つの配列の変異体の断片である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つの配列の異性体の断片である。
【０１８８】
別の実施形態では、Ｅ６タンパク質全体またはその断片のいずれかは、ＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列含有ペプチドに融合され、本発明の方法の組み換え型ペプチドを生成する。別の実施形態では、（全体でまたは断片の供与源としてのいずれかで）利用されるＥ６タンパク質は、配列
【０１８９】
MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL（配列番号１５）である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号１５の相同体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号１５の変異体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号１５の異性体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号１５の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号１５の相同体の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号１５の変異体の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号１５の異性体の断片である。
【０１９０】
別の実施形態では、Ｅ６タンパク質の配列は、
【０１９１】
MARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAACHKCIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQV（配列番号１６）別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号１６の相同体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号１６の変異体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号１６の異性体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号１６の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号１６の相同体の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号１６の変異体の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号１６の異性体の断片である。
別の実施形態では、そのＥ６タンパク質は以下のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つ、すなわち、Ｍ２４２１５、Ｍ１４１１９、ＮＣ＿００４５００、Ｖ０１１１６、Ｘ６２８４３、またはＭ１４１１９のいずれか１つに記載される配列を有する。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の相同体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の変異体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の異性体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の相同体の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の変異体の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の異性体の断片である。
【０１９２】
別の実施形態では、「相同」は、ＬＬＯ配列（例えば、配列番号２〜４のうちの１つ）に対する同一性が７０％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号２〜４のうちの１つに対する同一性が６４％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号２〜４のうちの１つに対する同一性が６８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号２〜４のうちの１つに対する７２％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号２〜４のうちの１つに対する７５％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号２〜４のうちの１つに対する７８％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号２〜４のうちの１つに対する８０％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号２〜４のうちの１つに対する８２％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号２〜４のうちの１つに対する８３％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号２〜４のうちの１つに対する８５％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号２〜４のうちの１つに対する８７％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号２〜４のうちの１つに対する８８％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号２〜４のうちの１つに対する９０％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号２〜４のうちの１つに対する９２％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号２〜４のうちの１つに対する９３％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号２〜４のうちの１つに対する９５％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号２〜４のうちの１つに対する９６％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号２〜４のうちの１つに対する９７％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号２〜４のうちの１つに対する９８％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号２〜４のうちの１つに対する９９％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号２〜４のうちの１つに対する１００％の同一性を指す。
【０１９３】
別の実施形態では、「相同」は、Ｅ７配列（例えば、配列番号１３〜１４のうちの１つ）に対する同一性が７０％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１３〜１４のうちの１つに対する同一性が６２％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１３〜１４のうちの１つに対する同一性が６４％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１３〜１４のうちの１つに対する同一性が６８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１３〜１４のうちの１つに対する同一性が７２％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１３〜１４のうちの１つに対する同一性が７５％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１３〜１４のうちの１つに対する同一性が７８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１３〜１４のうちの１つに対する同一性が８０％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１３〜１４のうちの１つに対する同一性が８２％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１３〜１４のうちの１つに対する同一性が８３％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１３〜１４のうちの１つに対する同一性が８５％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１３〜１４のうちの１つに対する同一性が８７％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１３〜１４のうちの１つに対する同一性が８８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１３〜１４のうちの１つに対する同一性が９０％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１３〜１４のうちの１つに対する同一性が９２％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１３〜１４のうちの１つに対する同一性が９３％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１３〜１４のうちの１つに対する同一性が９５％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１３〜１４のうちの１つに対する同一性が９６％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１３〜１４のうちの１つに対する同一性が９７％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１３〜１４のうちの１つに対する同一性が９８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１３〜１４のうちの１つに対する同一性が９９％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１３〜１４のうちの１つに対する同一性が１００％であることを指す。
【０１９４】
別の実施形態では、「相同」は、Ｅ６配列（例えば、配列番号１５〜１６のうちの１つ）に対する同一性が７０％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１５〜１６のうちの１つに対する同一性が６４％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１５〜１６のうちの１つに対する同一性が６８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１５〜１６のうちの１つに対する同一性が７２％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１５〜１６のうちの１つに対する同一性が７５％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１５〜１６のうちの１つに対する同一性が７８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１５〜１６のうちの１つに対する同一性が８０％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１５〜１６のうちの１つに対する同一性が８２％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１５〜１６のうちの１つに対する同一性が８３％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１５〜１６のうちの１つに対する同一性が８５％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１５〜１６のうちの１つに対する同一性が８７％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１５〜１６のうちの１つに対する同一性が８８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１５〜１６のうちの１つに対する同一性が９０％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１５〜１６のうちの１つに対する同一性が９２％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１５〜１６のうちの１つに対する同一性が９３％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１５〜１６のうちの１つに対する同一性が９５％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１５〜１６のうちの１つに対する同一性が９６％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１５〜１６のうちの１つに対する同一性が９７％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１５〜１６のうちの１つに対する同一性が９８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１５〜１６のうちの１つに対する同一性が９９％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１５〜１６のうちの１つに対する同一性が１００％であることを指す。
【０１９５】
別の実施形態では、「相同」は、ＰＥＳＴアミノ酸配列（例えば、配列番号１および７〜１２のうちの１つ）またはＡｃｔＡ配列（例えば、配列番号５〜６のうちの１つ）に対する同一性が７０％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１および７〜１２、または配列番号５〜６のうちの１つに対する同一性が６０％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１および７〜１２、または配列番号５〜６のうちの１つに対する同一性が６４％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１および７〜１２、または配列番号５〜６のうちの１つに対する同一性が６８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１および７〜１２、または配列番号５〜６のうちの１つに対する同一性が７２％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１および７〜１２、または配列番号５〜６のうちの１つに対する同一性が７５％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１および７〜１２、または配列番号５〜６のうちの１つに対する同一性が７８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１および７〜１２、または配列番号５〜６のうちの１つに対する同一性が８０％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１および７〜１２、または配列番号５〜６のうちの１つに対する同一性が８２％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１および７〜１２、または配列番号５〜６のうちの１つに対する同一性が８３％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１および７〜１２、または配列番号５〜６のうちの１つに対する同一性が８５％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１および７〜１２、または配列番号５〜６のうちの１つに対する同一性が８７％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１および７〜１２、または配列番号５〜６のうちの１つに対する同一性が８８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１および７〜１２、または配列番号５〜６のうちの１つに対する同一性が９０％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１および７〜１２、または配列番号５〜６のうちの１つに対する同一性が９２％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１および７〜１２、または配列番号５〜６のうちの１つに対する同一性が９３％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１および７〜１２、または配列番号５〜６のうちの１つに対する同一性が９５％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１および７〜１２、または配列番号５〜６のうちの１つに対する同一性が９６％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１および７〜１２、または配列番号５〜６のうちの１つに対する同一性が９７％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１および７〜１２、または配列番号５〜６のうちの１つに対する同一性が９８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１および７〜１２、または配列番号５〜６のうちの１つに対する同一性が９９％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１および７〜１２、または配列番号５〜６のうちの１つに対する同一性が１００％であることを指す。
【０１９６】
本明細書に列挙された任意のＡＡ配列に対するタンパク質および／またはペプチド相同性は、一実施形態では、免疫ブロット解析を含む当該技術分野において十分に記述される方法によって、または確立された方法を介して利用可能な任意の数のソフトウェアパッケージを利用したＡＡ配列のコンピューターアルゴリズム解析を介して決定される。これらのパッケージのうちのいくつかとしてはＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＭＰｓｒｃｈ、またはＳｃａｎｐｓパッケージが挙げられ、そして他の実施形態では、これらは、例えば、スミス−ウォーターマンアルゴリズムの使用、および／または解析のための広範囲／局所的もしくはＢＬＯＣＫＳアラインメントを採用する。
【０１９７】
別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはその断片は抗原に化学的結合によって付着する。別の実施形態では、結合のためにグルタルアルデヒドが使用される。別の実施形態では、結合は当該技術分野で公知の任意の好適な方法を使用して遂行される。
【０１９８】
別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、例えば、クローニングおよび適切な配列の制限、または以下に考察する方法による直接的化学合成を含む任意の好適な方法によって調製される。別の実施形態では、部分配列はクローニングされ、また適切な部分配列は適切な制限酵素を使用して分割される。別の実施形態では、次いで断片は連結され、望ましいＤＮＡ配列が生産される。別の実施形態では、融合タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を使用して生産される。まず、未変性のＤＮＡのいずれかの側の新しい末端の区分を別個に増幅する。１つの増幅した配列の５’端はペプチドリンカーをコードし、一方でもう１つの増幅した配列の３’端もペプチドリンカーをコードする。第一の断片の５’端は第二の断片の３’端の相補なので、２つの断片を（例えば、ＬＭＰアガロース上での部分的な精製後）第三のＰＣＲ反応での重複テンプレートとして使用することができる。増幅した配列は、コドン、開放部位のカルボキシ側上の区分（ここではアミノ配列を形成している）、リンカー、および開放部位のアミノ側上の配列（ここではカルボキシル配列を形成している）を含有することになる。次いでインサートをプラスミドへと連結する。
【０１９９】
別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはこれらの断片、および抗原、またはその断片は、当業者に公知の手段によって結合される。別の実施形態では、抗原またはその断片は、直接またはリンカー（スペーサー）を通してのいずれかでＡｃｔＡタンパク質またはＬＬＯタンパク質に結合される。別の実施形態では、キメラ分子は単一鎖融合タンパク質として組み換えによって発現される。
【０２００】
別の実施形態では、本発明の融合ペプチドは標準的な化学ペプチド合成技法を使用して合成される。別の実施形態では、キメラ分子は単一の連続ポリペプチドとして合成される。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはそれらの断片、および抗原またはその断片は別個に合成され、次いで１つの分子のアミノ末端ともう一方の分子のカルボキシル末端との縮合によって融合され、これによってペプチド結合を形成する。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質またはＬＬＯタンパク質、および抗原は、各々ペプチドスペーサー分子の一端部と縮合され、これによって連続融合タンパク質を形成する。
【０２０１】
別の実施形態では、本発明のペプチドおよびタンパク質は、ＳｔｅｗａｒｔらによってＳｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８４，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．で記述されるように、またはＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＢｏｄａｎｓｚｋｙによって記述される（Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８４，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）ように、固体相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって調製される。別の実施形態では、好適に保護されたＡＡ残基はそのカルボキシル基を通して、誘導体化した、不溶性高分子サポート（架橋ポリスチレンまたはポリアミド樹脂など）に付着される。「好適に保護された」とは、アミノ酸のアルファアミノ基および、任意の側鎖官能基の両方の上の保護基の存在を指す。側鎖保護基は、合成を通して使用される溶剤、試薬、および反応条件に対して一般的に安定であり、そしてこれは最終的なペプチド製品に影響しない条件下で除去可能である。オリゴペプチドの段階的合成は、Ｎ−保護基の初期ＡＡからの除去、およびそこに所望のペプチドの配列の次のＡＡのカルボキシル端部を連結することによって実施される。このＡＡも好適に保護される。カルボジイミド、対称型酸無水物、またはヒドロキシベンゾトリアゾールもしくはペンタフルオロフェニルエステルなどの、「活性エステル」基への形成などの、反応基への形成によって、入ってくるＡＡのカルボキシルを支持結合ＡＡのＮ末端と反応するように活性化することができる。
【０２０２】
別の実施形態では、本発明は、本発明のワクチン、アプリケーター、本発明の方法の使用を説明する取扱説明資料を含むキットを提供する。モデルキットが以下に記述されるが、他の有用なキットの含有物は本開示を考慮すれば当業者には明らかであろう。これらのキットの各々は本発明の別個の実施形態を表す。
【０２０３】
本明細書で使用される時、「約」という用語は定量的な用語プラスもしくはマイナス５％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス１０％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス１５％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス２０％を意味する。
【０２０４】
「対象」という用語は、一実施形態では、症状もしくはその後遺症の療法を必要とする、または症状もしくはその後遺症を受けやすい、ヒトを含む哺乳類を指す。対象は、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびペットマウス、ならびにヒトを含んでもよい。対象には、家畜も含まれうる。一実施形態では、「対象」という用語は、あらゆる点で健康であり、また疾患または障害の徴候を持ったり見せたりしない個体を除外しない。
【０２０５】
特定の実施形態には、以下の実施形態が含まれる。
１．  組換え型核酸を含有する組換え型リステリア株を含む免疫原性組成物であって、前述の核酸が少なくとも１つの異種抗原またはその断片に機能可能に結合、または融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前述の組換え型核酸は代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含む、免疫原性組成物。
２．  ＬＬＯタンパク質の前述のＮ末端断片が、配列番号２を含む、実施形態１に記載の免疫原性組成物。
３．  前述の組換え型リステリア株が組換え型リステリア・モノサイトゲネス株である、実施形態１〜２に記載の免疫原性組成物。
４．  前述の組換え型ポリペプチドが前述の組換え型リステリア株によって発現される、実施形態１〜３に記載の免疫原性組成物。
５．  前述の核酸分子が、前述の組換え型リステリア株内のプラスミド内にある、実施形態１〜４に記載の免疫原性組成物。
６．  前述のプラスミドは、前述の組換え型リステリア株内で安定して維持される、実施形態１〜５に記載の免疫原性組成物。
７．  前述のリステリア株が、ゲノムのｄａｌ、ｄａｔ、およびａｃｔＡ遺伝子の突然変異、欠失または不活性化を含む、実施形態１〜６に記載の免疫原性組成物。
８．  前述の代謝酵素が前述の突然変異、欠失または不活性化を相補する、実施形態１〜７に記載の免疫原性組成物。
９．  前述の第１のオープンリーディングフレームは、機能可能であるように縦列型で連結した、２つから４つの異種抗原または機能断片をコードするものであって、Ｎ末端において、最Ｎ末端の異種抗原またはその断片が、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片に、機能可能であるように連結または融合する、実施形態１〜８に記載の免疫原性組成物。
１０．  前述の第１のオープンリーディングフレームは、機能可能であるように縦列型で連結した、４つの異種抗原または機能断片を含む組換え型ポリペプチドをコードするものであって、前述の機能可能であるように連結した異種抗原は、最Ｎ末端の異種抗原のＮ末端において、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片に融合する、実施形態１〜９に記載の免疫原性組成物。
１１．  前述の第１のオープンリーディングフレームによりコードされた前述の組換え型ポリペプチドの構造は、Ｎ末端ＬＬＯ−抗原１−抗原２−抗原３−抗原４を含む、実施形態１０に記載の免疫原性組成物。
１２．  前述の２つから４つの異種抗原または前述の４つの異種抗原は、ＨＰＶ１６  Ｅ６抗原、ＨＰＶ１６  Ｅ７抗原、ＨＰＶ１８  Ｅ６抗原およびＨＰＶ１８  Ｅ７抗原よりなる群から選択される、実施形態１０〜１１のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
１３．  抗原１はＨＰＶ１６  Ｅ６であり、抗原２はＨＰＶ１６  Ｅ７であり、抗原３はＨＰＶ１８  Ｅ６であり、抗原４はＨＰＶ１８  Ｅ７である、実施形態１０〜１２のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
１４．  前述の第１のオープンリーディングフレームは、最後の異種抗原のＣ末端に機能可能であるように連結したタンパク質タグ配列をさらにコードする、実施形態１０〜１３のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
１５．  前述のタンパク質タグ配列は、ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６×ＨＩＳ配列である、実施形態１４に記載の免疫原性組成物。
１６．  前述の第１のオープンリーディングフレームは、配列番号３２を含む、実施形態１４〜１５のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
１７  前述の第１のオープンリーディングフレームは、配列番号３３を含むタンパク質をコードする、実施形態１４〜１５のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
１８．  前述の組換え型リステリア株は、動物宿主を通して継代されている、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
１９．  アジュバントをさらに含む、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
２０．  前述のアジュバントが、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、ＳＢＡＳ２、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、免疫刺激サイトカイン、クイルグリコシド、細菌毒素、および細菌マイトジェンを含むリストから選択される、実施形態１９に記載の免疫原性組成物。
２１．  前述の組換え型リステリア株が冷凍または凍結乾燥細胞バンクに保存されている、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
２２．  対象において腫瘍またはガンを治療する方法であって、実施形態１〜２１に記載の免疫原性組成物を前述の対象に投与する工程を含む、方法。
２３．  ヒト対象を腫瘍またはガンから守る方法であって、実施形態１〜２１に記載の組成物を前述の対象に投与する工程を含む方法。
２４．  ヒト対象において抗腫瘍細胞毒性Ｔ細胞応答を誘発するための方法であって、実施形態１〜２１に記載の組換え型リステリア株を含む組成物を前述の対象に投与する工程を含む方法。
【０２０６】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に例示するために提示される。しかしながら、これらは本発明の幅広い範囲を制限するものとはけっして理解するべきでない。
【実施例】
【０２０７】
実験詳細セクション
実施例１：ＬＬＯ−抗原融合が抗腫瘍免疫性を誘発
材料および実験方法（実施例１〜２）
細胞株
Ｃ５７ＢＬ／６同系ＴＣ−１腫瘍をＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７で不死化し、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ癌遺伝子で形質転換した。Ｔ．Ｃ．Ｗｕ（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、米国メリーランド州Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）によって開示されたＴＣ−１は、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７で低いレベルを発現する腫瘍形成性の高い肺上皮細胞であり、またｃ−Ｈａ−ｒａｓガン遺伝子で形質転換される。ＴＣ−１を、ＲＰＭＩ  １６４０、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００μＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０マイクロモル（ｍｃＭ）の２−ＭＥ、４００マイクログラム（ｍｃｇ）／ｍＬのＧ４１８、および１０％のナショナルコレクションタイプカルチャー−１０９培地中、３７°で１０％のＣＯ２を用いて培養した。Ｃ３は、ＨＰＶ  １６の完全ゲノムで不死化され、且つ、ｐＥＪ−ｒａｓで形質転換されたＣ５７ＢＬ／６マウス由来のマウス胚細胞である。ＥＬ−４／Ｅ７は、レトロウイルスによってＥ７を形質導入された胸腺腫ＥＬ−４である。
Ｌ．モノサイトゲネス株および増殖
【０２０８】
使用されたリステリア株は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（エピソーム発現系内のｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子、図１Ａ）、Ｌｍ−Ｅ７（リステリアゲノムへと組込まれる単一コピーＥ７遺伝子カセット）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（「ＤＰ−Ｌ２０２８」、エピソーム発現系内のｈｌｙ−ＮＰ融合遺伝子）、およびＬｍ−Ｇａｇ（「ＺＹ−１８」、染色体へと組込まれる単一コピーＨＩＶ−１Ｇａｇ遺伝子カセット）であった。Ｅ７を、プライマー
【化１】
2018530588.tif 000003
（配列番号１７、ＸｈｏＩ部位は下線付き）および
【化２】
2018530588.tif 000004
（配列番号１８、ＳｐｅＩ部位は下線付き）を使用してＰＣＲによって増幅し、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）へと連結させた。ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩ消化によってＥ７をｐＣＲ２．１から切り出し、ｐＧＧ−５５にライゲーションした。このｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子および多能性の転写因子ＰｒｆＡをマルチコピーシャトルプラスミド（Ｗｉｒｔｈ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６５：８３１，１９８６）であるｐＡＭ４０１へとクローニングし、ｐＧＧ−５５を生成した。ｈｌｙプロモーターはｈｌｙ遺伝子産物（以下に「ΔＬＬＯ」と称される溶血性のＣ末端を欠いている）の最初の４４１  ＡＡの発現を駆動し、これはＸｈｏＩ部位によってＥ７遺伝子に連結され、ｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子を生じ、これは転写されてＬＬＯ−Ｅ７として分泌される。リステリアのｐｒｆＡ陰性株、ＸＦＬ−７（ペンシルバニア大学のＤｒ．Ｈａｏ  Ｓｈｅｎによって開示された）のｐＧＧ−５５を用いた形質転換が、インビボでのプラスミドの保持に対して選択された（図１Ａ〜図１Ｂ）。ｈｌｙプロモーターおよび遺伝子断片は、プライマー
【化３】
2018530588.tif 000005
（配列番号１９、ＮｈｅＩ部位は下線付き）、および
【化４】
2018530588.tif 000006
（配列番号２０、ＸｈｏＩ部位は下線付き）を用いて作成した。ｐｒｆＡ遺伝子は、プライマー
【化５】
2018530588.tif 000007
（配列番号２７、ＸｂａＩ部位は下線付き）、および
【化６】
2018530588.tif 000008
（配列番号２１、ＳａｌＩ部位は下線付き）を用いてＰＣＲ増幅した。ｈｌｙプロモーターとＥ７の発現と分泌を引き起こすシグナル配列とを含有する発現カセットをＬＭゲノムのｏｒｆＺドメインへと導入することによってＬｍ−Ｅ７を作製した。Ｅ７をプライマー
【化７】
2018530588.tif 000009
（配列番号２２、ＢａｍＨＩ部位は下線付き）および
【化８】
2018530588.tif 000010
（配列番号２３、ＸｂａＩ部位は下線付き）を使用してＰＣＲ増幅した。次いでＥ７をｐＺＹ−２１シャトルベクターにライゲーションした。結果として得られるプラスミドｐＺＹ−２１−Ｅ７でＬＭ株１０４０３Ｓを形質転換したが、このプラスミドはＬＭゲノムのｏｒｆＸ、Ｙ、Ｚドメインに対応する１．６ｋｂ配列の中央に挿入された発現カセットを含む。その相同性ドメインが相同組換えによるＥ７遺伝子カセットのｏｒｆＺドメインへの挿入を可能にする。Ｅ７遺伝子カセットのｏｒｆＺドメインへの組込みについてクローンをスクリーニングした。クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）を含むブレインハートインフュージョン培地中で細菌を培養し（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰ）、またはクロラムフェニコールを含まない同培地中で細菌を培養した（Ｌｍ−Ｅ７およびＺＹ−１８）。細菌は、アリコートで−８０℃にて凍結させた。ウエスタンブロット法によって発現を検証した（図２）。
ウエスタンブロット法
【０２０９】
リステリア株をルリア−ベルターニ培地中に３７℃で培養し、６００ｎｍで測定された同一の光学密度で採取した。上清をＴＣＡ沈殿し、０．１ＮのＮａＯＨを補充した１×サンプルバッファー中に再懸濁した。同一量の各細胞ペレットまたは各ＴＣＡ沈殿上清を４〜２０％のトリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮＯＶＥＸ、カリフォルニア州サンディエゴ）上に負荷した。それらのゲルを二フッ化ポリビニリデンに転写し、抗Ｅ７モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州サウス・サンフランシスコ）で調査し、次いでＨＲＰ−結合抗マウス二次Ａｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、英国リトル・チャルフォント）とインキュベートし、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ検出試薬で発色させ、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に露光させた。
腫瘍増殖の測定
【０２１０】
１日おきに表面の最短径及び最長径にキャリパーをわたして腫瘍を測定した。これら２つの測定値の平均を平均腫瘍径としてミリメートルの単位で様々な時点に対してプロットした。腫瘍径が２０ｍｍに達したとき、マウスを殺処理した。各時点に対する腫瘍の測定値は生きているマウスに対してのみ示されている。
定着した腫瘍増殖に対するリステリア組換え体の効果
【０２１１】
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）が左脇腹の皮下に２×１０５ＴＣ−１細胞を受容した。腫瘍接種の一週間後、腫瘍は直径４〜５ｍｍの触知可能なサイズに達した。次いで８匹のマウスからなる群を７日目および１４日目に０．１ＬＤ５０の  Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１０７ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１０６ＣＦＵ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（１０７ＣＦＵ）、またはＬｍ−Ｇａｇ（５×１０５ＣＦＵ）で腹腔内処置した。
５１Ｃｒリリースアッセイ
【０２１２】
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを０．１ＬＤ５０のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ、またはＬｍ−Ｇａｇで腹腔内免疫した。免疫の１０日後に脾臓を採取した。脾細胞をフィーダー細胞としての放射線照射ＴＣ−１細胞と培養して（１００：１、脾細胞：ＴＣ−１）確立し、インビトロで５日間刺激し、次いで以下の標的を使用して標準的５１Ｃｒリリースアッセイに使用した。ＥＬ−４、ＥＬ−４／Ｅ７、またはＥ７  Ｈ−２ｂペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）でパルスしたＥＬ−４。Ｅ：Ｔ細胞比は、３回繰り返して、８０：１、４０：１、２０：１、１０：１、５：１、および２．５：１であった。３７℃で４時間のインキュベーション後、細胞をペレット化し、５０μｌの上清を各ウェルから取り出した。Ｗａｌｌａｃ  １４５０シンチレーションカウンター（米国メリーランド州ゲイザースバーグ）を用いてサンプルをアッセイした。特異的溶解率は、［（実験による一分当たりのカウント（ｃｐｍ）−自然発生ｃｐｍ）／（総ｃｐｍ−自然発生ｃｐｍ）］×１００として決定された。
ＴＣ−１特異的増殖
【０２１３】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ、またはＬｍ−Ｇａｇを用いてＣ５７ＢＬ／６マウスを０．１ＬＤ５０で免疫し、２０日後に１ＬＤ５０で腹腔内注射により追加免疫した。追加免疫の６日後、免疫したマウスおよび未感作マウスから脾臓を採取した。Ｅ７  Ａｇ源としてのウェル当たり２．５×１０４細胞、１．２５×１０４細胞、６×１０３細胞、または３×１０３細胞の放射線照射ＴＣ−１細胞と共に、またはＴＣ−１細胞を含まずに、または１０μｇ／ｍｌのＣｏｎ  Ａと共に平底９６ウェルプレート中に５×１０５細胞／ウェルの密度で培養して脾細胞を確立した。４５時間後に０．５μＣｉ［３Ｈ］チミジン／ウェルを用いて細胞をパルスした。プレートはＴｏｍｔｅｃハーベスター９６（米国コネチカット州オレンジ）を使用して１８時間後に回収され、Ｗａｌｌａｃ  １４５０シンチレーションカウンターを用いて増殖が評価された。ｃｐｍの変化は、実験的ｃｐｍ−Ａｇを含まないｃｐｍとして計算された。
フローサイトメトリー分析
【０２１４】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、０．１  ＬＤ５０のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＬｍ−Ｅ７を用いて静脈内（ｉ．ｖ．）免疫し、３０日後に追加免疫した。ＣＤ８（５３−６．７、ＰＥ結合）、ＣＤ６２リガンド（ＣＤ６２Ｌ、ＭＥＬ−１４、ＡＰＣ結合）、およびＥ７  Ｈ−２Ｄｂ四量体に対する３色フローサイトメトリーを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメーターとＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州マウンテンビュー）を使用して実施した。追加免疫の５日後に採取した脾細胞を、Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）または対照（ＨＩＶ−Ｇａｇ）ペプチドを負荷したＨ−２Ｄｂ四量体を用いて、室温（ｒｔ）で染色した。四量体は１／２００に希釈して使用され、これらの四量体は、Ｄｒ．Ｌａｒｒｙ  Ｒ．Ｐｅａｓｅ（Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ、米国ミネソタ州Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）およびＮＩＡＩＤ  Ｔｅｔｒａｍｅｒ  Ｃｏｒｅ  ＦａｃｉｌｉｔｙおよびＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈならびに標準試薬プログラムによって開示された。四量体＋、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞を分析した。
Ｂ１６Ｆ０−Ｏｖａ実験
【０２１５】
２４匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに５×１０５細胞のＢ１６Ｆ０−Ｏｖａ細胞を接種した。３日目、１０日目、および１７日目に０．１ＬＤ５０のＬｍ−ＯＶＡ（１０６ｃｆｕ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＯＶＡ（１０８ｃｆｕ）を用いて８匹のマウスの群を免疫し、８匹のマウスを処置しないままにした。
統計
【０２１６】
腫瘍径の比較のため、各群の腫瘍サイズの平均値とＳＤを決定し、スチューデントのｔ−検定によって統計的有意性を決定した。ｐ≦０．０５を有意と見なした。
結果
【０２１７】
Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７をＴＣ−１の増殖に影響を与える能力に関して比較した。皮下腫瘍をＣ５７ＢＬ／６マウスの左の脇腹に確立した。７日後、腫瘍は触診可能なサイズ（４〜５ｍｍ）に達した。７日目および１４日目に０．１ＬＤ５０のＬｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、または対照としてのＬｍ−ＧａｇおよびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰをマウスにワクチン接種した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、定着したＴＣ−１腫瘍の７５％の完全な退行を誘発し、一方でこの群の中の他の２匹のマウスでは腫瘍増殖が制御された（図３）。対照的に、Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−Ｇａｇを用いた免疫は腫瘍退行を誘導しなかった。この実験は複数回繰返され、常に非常に類似した結果であった。加えて、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７については異なる免疫プロトコル下でも類似の結果が達成された。別の実験では、定着した５ｍｍのＴＣ−１腫瘍を有するマウスを単回の免疫で治癒することができた。
【０２１８】
他の実験では、２つの他のＥ７発現腫瘍細胞株であるＣ３とＥＬ−４／Ｅ７を使用して類似の結果が得られた。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を用いたワクチン接種の有効性を確認するため、腫瘍を除去した動物にＴＣ−１腫瘍細胞またはＥＬ−４／Ｅ７腫瘍細胞をそれぞれ６０日目または４０日目に再負荷した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で免疫された動物は実験終了まで腫瘍が無いままであった（ＴＣ−１の場合１２４日目、ＥＬ−４／Ｅ７については５４日目）。
【０２１９】
したがってΔＬＬＯとの融合タンパク質としての抗原の発現によりその抗原の免疫原性が強化される。
実施例２：ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７治療がＴＣ−１特異的脾細胞増殖を引き出す
【０２２０】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を有するＬｍ−Ｅ７によるＴ細胞の誘導を測定するため、抗原特異的免疫能の尺度であるＴＣ−１特異的増殖性応答を免疫されたマウスにおいて測定した。脾細胞においてＥ７の供給源として照射したＴＣ−１細胞に曝露したとき、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で免疫化したマウスからの脾細胞を増殖した。ＴＣ−１比は２０：１、４０：１、８０：１、および１６０：１である（図４）。反対に、Ｌｍ−Ｅ７およびｒＬｍ対照で免疫されたマウスに由来する脾細胞はバックグラウンドレベルの増殖を示しただけであった。
実施例３：ＬＬＯ、ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴアミノ酸配列へのＥ７の融合はＥ７特異的免疫性を強化し、腫瘍浸潤Ｅ７特異的ＣＤ８＋細胞を生成する
材料および実験方法
【０２２１】
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１００ｍｃｌ（マイクロリットル）の２×１０５細胞のＴＣ−１腫瘍細胞に加えて４００ｍｃｌのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州フランクリン・レイクス）を含む５００ｍｃｌのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）を１２匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの左脇腹に皮下移植した（ｎ＝３）。マウスを７日目、１４日目、および２１日目に腹腔内免疫し、脾臓および腫瘍を２８日目に採取した。腫瘍ＭＡＴＲＩＧＥＬをマウスから取り出し、氷上で、２ミリリットル（ｍＬ）のＲＰ  １０培地を含有する試験管内において４℃で一晩インキュベートした。鉗子を用いて腫瘍を細かく切り刻み、２ｍｍのブロックに切断し、３ｍｌの酵素混合物（ＰＢＳ中の０．２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＰ、１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅ−１）と共に３７℃で１時間インキュベートした。四量体およびＩＦＮ−γ染色のため、組織懸濁液をナイロンメッシュに通して濾過し、ＰＢＳ中の５％胎児ウシ血清＋０．０５％ＮａＮ３で洗浄した。
【０２２２】
ブレフェルジンＡの存在下で１０７細胞／ｍＬの脾細胞および腫瘍細胞を１マイクロモル（ｍｃｍ）のＥ７ペプチドと共に５時間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、５０ｍｃｌの抗マウスＦｃ受容体上清（２．４  Ｇ２）中、４℃で１時間または一晩インキュベートした。細胞を表面分子ＣＤ８およびＣＤ６２Ｌについて染色し、透過処理し、透過処理キットＧｏｌｇｉ−ｓｔｏｐ（登録商標）またはＧｏｌｇｉ−Ｐｌｕｇ（登録商標）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して固定し、ＩＦＮ−γについて染色した。２レーザーフローサイトメーター、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを使用して５００，０００イベントを取得し、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリン・レイクス）を使用して分析した。活性化（ＣＤ６２Ｌｌｏｗ）ＣＤ８＋Ｔ細胞内のＩＦＮ−γ分泌細胞のパーセンテージを計算した。
【０２２３】
四量体染色のために、Ｈ−２Ｄｂ四量体にフィコエリスリン（ＰＥ）結合Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、配列番号２４）を負荷し、室温で１時間染色し、抗アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合ＭＥＬ−１４（ＣＤ６２Ｌ）およびＦＩＴＣ−結合ＣＤ８□で４℃にて３０分間染色した。脾臓および腫瘍内の四量体＋ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞を比較して細胞を解析した。
結果
【０２２４】
抗原特異的免疫を強化するＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７の能力を分析するため、マウスにＴＣ−１腫瘍細胞を移植し、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０７ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１×１０６ＣＦＵ）、またはＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（２×１０８ＣＦＵ）のいずれかで免疫するか、または無処置（未感作）とした。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７群からのマウスの腫瘍は、Ｌｍ−Ｅ７または無処置マウスよりも、より高いパーセンテージのＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞（図５Ａ）および四量体特異的ＣＤ８＋細胞（図５Ｂ）を含有していた。
【０２２５】
別の実験では、腫瘍担持マウスにＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、またはＬｍ−Ｅ７ｅｐｉを投与し、腫瘍中のＥ７特異的リンパ球のレベルを測定した。０．１ＬＤ５０の４つのワクチンを用いて、７日目および１４日目にマウスを処置した。腫瘍を２１日目に採取し、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８に対する抗体を用いて、およびＥ７／Ｄｂ四量体を用いて染色した。腫瘍内の四量体陽性リンパ球のパーセンテージの増大が、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７を用いてワクチン接種したマウスで見られた（図６Ａ）。この結果は３つの実験にわたって再現性があった（図６Ｂ）。
【０２２６】
したがって、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７、およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導および腫瘍退行において各々有効である。
実施例４：マウスを通したリステリアワクチンベクターの継代が異種抗原および内在性抗原に対する免疫応答の増加を引き出す
材料および実験方法
細菌株
【０２２７】
Ｌ．モノサイトゲネス株１０４０３Ｓ、セロタイプ１（ＡＴＣＣ、米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）が、これらの研究で使用した野生型の生命体であり、かつ以下に記述する構築体の親株である。株１０４０３Ｓは、ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射したとき、ＬＤ５０はおよそ５×１０４ＣＦＵである。「Ｌｍ−Ｇａｇ」は、修飾型シャトルベクターｐＫＳＶ７を使用してリステリア染色体へと安定して組み込まれる、ＨＩＶ−１株ＨＸＢ（シンシチウム形成表現型を含むサブタイプＢ実験室株）ｇａｇ遺伝子のコピーを含有する組換え型ＬＭ株である。ウエスタンブロットによって判定した時、Ｇａｇタンパク質が株によって発現され、かつ分泌された。すべての株はブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培地または寒天培地プレート（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｓ、米国ミシガン州Ｄｅｔｒｏｉｔ）内で成長させた。
細菌培養
【０２２８】
パッセンジャー抗原および／または融合タンパク質を発現する単一のクローン由来の細菌を選択し、ＢＨＩ培地で一晩培養した。この培養物のアリコートを添加物を用いずに−７０℃で凍結した。このストックから、培養物を６００ｎｍで０．１〜０．２Ｏ．Ｄ．まで成長させ、アリコートを再度添加剤を用いずに−７０℃で凍結した。クローニングした細菌プールを調製するために上記の手順を使用したが、各々の継代の後、ある数の細菌のクローンを選択し、そして本明細書に記述されるように標的抗原の発現を検査した。外来抗原の発現が確認されたクローンが、次の継代に使用された。
マウス内での細菌の継代
【０２２９】
生後６〜８週間のメスのＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国メーン州Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ）から購入し、病原体の無いマイクロアイソレーター環境で維持した。−７０℃で凍結保存されたストック培養物のアリコート内の生菌の力価を、解凍中かつ使用前にＢＨＩ寒天培地プレート上にプレーティングすることによって判定した。合計で、５×１０５の細菌をＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内注射した。３日後、脾臓を採取し、ホモジナイズし、脾臓ホモジネートの段階希釈物をＢＨＩ培地内で一晩インキュベートし、ＢＨＩ寒天培地プレート上にプレーティングした。さらなる継代のために、アリコートを０．１〜０．２Ｏ．Ｄ．まで再度成長させ、−７０℃で凍結し、細菌の力価を段階希釈によって再度判定した。初回継代（継代０）の後、この一連の手順を全部で４回繰り返した。
ＩＦＮ−γに対する細胞内サイトカイン染色
【０２３０】
リンパ球を、５０Ｕ／ｍＬのヒトの組換え型ＩＬ−２および１マイクロリットル／ｍＬのブレフェルジンＡ（Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ（商標）；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を添加した完全ＲＰＭＩ−１０培地内で５時間の間、１マイクロモル濃度の、ＨＩＶ−ＧＡＧ（ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ；配列番号２５）に対する細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープ、リステリアＬＬＯ（ＧＹＫＤＧＮＥＹＩ；配列番号２６）またはＨＰＶウイルス遺伝子Ｅ７（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ；配列番号２４）の存在下または不在下で培養した。細胞を最初に表面染色し、次いで洗浄し、そして製造業者（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）の推奨に従ってＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキットを使用して細胞内サイトカイン染色に供した。細胞内ＩＦＮ−γ染色のためには、ＦＩＴＣ−結合ラット抗マウスＩＦＮ−γモノクローナル抗体（クローンＸＭＧ  １．２）およびそのアイソタイプ対照Ａｂ（ラットＩｇＧ１；両者ともＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから入手）が使用された。合計で１０６の細胞を、１％のウシ血清アルブミンおよび０．０２％のアジ化ナトリウム（ＦＡＣＳ緩衝液）を含有するＰＢＳ中、４℃で３０分間染色し、続いてＦＡＣＳ緩衝液中で３回洗浄した。サンプルデータが、ＦＡＣＳｃａｎ（商標）フローサイトメーターまたはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）機器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）のいずれかで取得された。ＣＤ８（ＰＥＲＣＰ結合、ラット抗マウス、クローン５３−６．７、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、ＣＤ６２Ｌ（ＡＰＣ結合、ラット抗マウス、クローンＭＥＬ−１４）、および細胞内ＩＦＮ−γに対する３色フローサイトメトリーを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーターを使用して実施し、データをＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてさらに解析した（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国カリフォルニア州Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ）。ＣＤ８＋に対して解析し、かつ細胞内ＩＦＮ−γ染色する前に、細胞をＣＤ８  ｈｉｇｈおよびＣＤ６２Ｌｌｏｗ上でゲーティングした。
結果
マウスでの継代が組換え型リステリア・モノサイトゲネスの病毒性を増加する
【０２３１】
組換え型リステリアワクチンベクターに対する継代の影響を判定するために３つの異なる構築体が使用された。これらの構築体のうちの２つはパッセンジャー抗原のゲノム挿入を担持する。第一の構築体はＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子（Ｌｍ−Ｇａｇ）を含み、そして第二の構築体はＨＰＶ  Ｅ７遺伝子（Ｌｍ−Ｅ７）を含む。第三の構築体（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７）は、ＬＬＯの切断バージョンおよびｐｒｆＡ（リステリア病毒性因子を制御する陽性調節因子）をコードする遺伝子と融合したパッセンジャー抗原（ＨＰＶ  Ｅ７）に対する融合遺伝子を有するプラスミドを含む。このプラスミドを使用してｐｒｆＡ陰性突然変異を相補したので、生きている宿主内では、これが無ければ細菌は非病毒性であるので、選択圧力がプラスミドの保存を支持するようになる。多くの細菌の世代に対して３つの構築体すべてが広範囲にインビトロで繁殖されてきた。
【０２３２】
脾臓内で生存している細菌の数によって測定する時、細菌の継代は、最初の２回の継代の各々で細菌の病毒性の増加をもたらす。Ｌｍ−ＧａｇおよびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７については、継代２までの各々の継代で病毒性が増加した（図７Ａ）。プラスミド含有構築体、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、病毒性の最も劇的な増加を示した。継代の前に、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の初期免疫化用量は１０７まで細菌を増加する必要があり、細菌を回収するために２日目に脾臓を採取する必要があった（一方で、Ｌｍ−Ｇａｇに対する１０５細菌の初期用量は３日目に採取した）。初期継代の後、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の標準投与量は３日目の採取を可能にするのに十分であった。Ｌｍ−Ｅ７については、病毒性の程度は継代されていない細菌に対して１．５倍ほど増加した（図７Ｂ）。
【０２３３】
こうして、マウスを通した継代はリステリアワクチン株の病毒性を増加する。
継代はＬ．モノサイトゲネスのＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発する能力を増加する
【０２３４】
次に、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘発に対する継代の効果が、ＨＩＶ−ＧａｇペプチドＡＭＱＭＬＫＥＴＩ（配列番号２５）およびＬＬＯ９１−９９（ＧＹＫＤＧＮＥＹＩ；配列番号２６）を使用して、ＭＨＣ−クラスＩ特異的免疫優勢ペプチドを用いた細胞内サイトカイン染色で判定された。１０３ＣＦＵの継代細菌（Ｌｍ−Ｇａｇ）のマウスへの注射は、有意な数のＨＩＶ−Ｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発したが、継代されていないＬｍ−Ｇａｇの同一用量は、検出可能なＧａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発しなかった。継代されていない細菌の用量を１００倍に増加しても、これらの相対的な非病毒性を補填しなかった。実際、より高い用量でも検出可能なＧａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は誘発されなかった。継代細菌を用いた同一の用量増加は、Ｇａｇ特異的Ｔ細胞の誘発を５０％増加した（図８）。抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘発の同一のパターンが、ＬＬＯ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞で観察され、これらはＬＬＯ、内在性リステリア抗原で観察されたので、これらの結果がパッセンジャー抗原の特性によって生じたのではないことを示している。
【０２３５】
こうして、マウスを通した継代はリステリアワクチン株の免疫原性を増加する。
実施例５：ＰｒｆＡ含有プラスミドは、抗生剤がないとき、ＰｒｆＡ欠失を持つＬＭ株内で安定である
材料および実験方法
細菌
【０２３６】
Ｌ．モノサイトゲネス株ＸＦＬ７は、ｐｒｆＡ遺伝子内に３００個の塩基対欠失を含有し、ＸＦＬ７は、病毒性を部分的に回復し、かつＣＡＰ抵抗性を与えるｐＧＧ５５を担持し、これは米国特許出願公開第２００５００１１８１８４号に記述されている。
リステリアからのプラスミド抽出のためのプロトコルの開発
【０２３７】
１ｍＬのリステリア・モノサイトゲネスＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７研究ワーキング細胞バンクバイアルを、３４μｇ／ｍＬのＣＡＰを含有する２７ｍＬのＢＨ１培地へと接種し、３７℃および２００ｒｐｍで２４時間成長させた。
【０２３８】
培養物の２．５ｍＬサンプル７個をペレットにし（１５０００ｒｐｍで５分間）、ペレットを５０μｌのリゾチーム溶液を用いて０〜６０分の様々な長さの時間の間３７℃でインキュベートした。
【０２３９】
リゾチーム溶液：
−  ２９μｌの１Ｍリン酸水素二カリウム
−  ２１μｌの１Ｍリン酸二水素カリウム
−  ５００μｌの４０％スクロース（０．４５／μｍフィルターを通してフィルター滅菌した）
−  ４５０μｌの水
−  ６０μｌのリゾチーム（５０ｍｇ／ｍＬ）
【０２４０】
リゾチームを用いたインキュベーションの後、前述のように懸濁液を遠心分離し、上清は廃棄した。次いで、各々のペレットを、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、米国メリーランド州Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ）プロトコルの修正バージョンによってプラスミド抽出に供した。プロトコルに対する変更は以下のとおりである。
１．  増加した生物量の完全な溶解を可能にするために、緩衝液ＰＩ、Ｐ２、およびＮ３の体積をすべて３倍に増加させた。
２．  Ｐ２の添加の前に、２ｍｇ／ｍＬのリゾチームを再懸濁した細胞に添加した。次いで、中和の前に溶解溶液を３７℃で１５分間インキュベートした。
３．  濃度を増加するために、５０μｌではなく３０μｌ中でプラスミドＤＮＡを再懸濁した。
【０２４１】
他の実験では、細胞を１５分間Ｐ１緩衝液＋リゾチーム中でインキュベートし、次いで、Ｐ２（溶解緩衝液）およびＰ３（中和緩衝液）を用いて室温でインキュベートした。
【０２４２】
各々の二次培養物からの同体積の分離プラスミドＤＮＡを、エチジウムブロマイドで染色した０．８％のアガロースゲル上に通し、構造または分離の不安定性の何らかの兆候を調べるために可視化した。
【０２４３】
結果は、リゾチームを用いたインキュベーション時間が増加するほど（およそ５０分間のインキュベーション最適レベルまで）、Ｌ．モノサイトゲネスＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７からのプラスミド抽出の効率が増加することを示した。
【０２４４】
これらの結果は、リステリアワクチン株からのプラスミド抽出のための効果的な方法を提供する。
レプリカプレーティング
【０２４５】
元の培養物の希釈物を、ＬＢまたはＴＢ寒天培地を含有するプレートの上に３４μｇ／ｍＬのＣＡＰ無しで、または有りでプレーティングした。選択的寒天培地上での計数と非選択的な寒天培地上での計数と間の差異が、プラスミドの何らかの全体的な分離の不安定性があるかどうかを判定するために使用された。
結果
【０２４６】
抗生物質の不在下でのＬ．モノサイトゲネス株ＸＦＬ７のｐＧＧ５５プラスミドの遺伝的安定性（すなわち、選択圧力（例えば、抗生物質選択圧力）の不在下でプラスミドが細菌によって維持される、または細菌と安定して関連したままとなる程度）が、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ：５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｇ／ｍｌダイズペプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物）およびＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地（ＴＢ：１０ｇ／Ｌグルコース、１１．８ｇ／Ｌダイズペプトン、２３．６ｇ／Ｌ酵母抽出物、２．２ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、９．４ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４）両方の重複培地で、連続継代培養によって評価された。２５０ｍＬのバッフル付き振盪フラスコ内の５０ｍＬの新鮮培地に定数の細胞（１  ＯＤｍＬ）を接種し、次いでこれを２４時間間隔で二次培養した。培養物をオービタルシェーカー内で３７℃および２００ｒｐｍでインキュベートした。各々の二次培養物において、ＯＤ６００を測定し、ＬＢでは３０世代に達するまで、そしてＴＢでは４２世代に達するまで、経過した細胞倍増時間（または世代）を計算するために使用した。各々の二次培養段階における（およそ４世代ごと）既知の数の細胞（１５  ＯＤ  ｍＬ）を遠心分離によってペレット化し、上述のＱｉａｇｅｎ  ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（登録商標）プロトコルを使用してプラスミドＤＮＡを抽出した。精製後、プラスミドＤＮＡをアガロースゲルの電気泳動に供し、続いてエチジウムブロマイドで染色した。調製物のプラスミドの量はサンプルによって若干異なったが、全体的な傾向として、細菌の世代数に関してプラスミドの量は一定であった（図９Ａ〜図９Ｂ）。こうして、ｐＧＧ５５は、抗生剤が無い状態でも、株ＸＦＬ７内で安定性を呈した。
【０２４７】
安定性試験の間に二次培養の各々の段階で、寒天培地プレート上のレプリカプレーティングによってプラスミド安定性もモニターした。アガロースゲルの電気泳動からの結果と一致して、試験を通してＬＢまたはＴＢ液体培養物のいずれでもプラスミド含有細胞の数に全体的変化はなかった（それぞれ図１０および図１１）。
【０２４８】
これらの所見はＰｒｆＡをコードするプラスミドが、ｐｒｆＡ内に突然変異を含有するリステリア株内で、抗生剤無しで安定性を呈することを実証する。
材料および方法（実施例６〜１０）
【０２４９】
ＰＣＲ試薬：
【０２５０】
ｐｒｆＡ遺伝子の増幅およびＤ１３３Ｖ突然変異の区別に使用したプライマーを表１に示す。プライマーＡＤＶ４５１、４５２、および４５３のストック溶液を、プライマーをＴＥ緩衝液中、４００μＭまで希釈することによって調製した。ストック溶液のアリコートを水中２０μＭ（ＰＣＲグレード）までさらに希釈して希釈標準溶液を調製した。プライマーは−２０℃で保存した。ＰＣＲで使用した試薬を表２に示す。
【０２５１】
表１  プライマーＡＤＶ４５１、４５２、および４５３。
【表１】
2018530588.tif 000011
【０２５２】
表２  ＰＣＲ試薬
【表２】
2018530588.tif 000012
プラスミドＤＮＡ調製
【０２５３】
ｐｒｆＡ突然変異を含む（ｐＧＧ５５  Ｄ１３３Ｖ）、および含まない（ｐＧＧ５５  ＷＴ）ｐＧＧ５５プラスミドを、製造業者の取扱説明書に従いＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＨｉＰｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋ２１００−０５）を使用して、大腸菌またはリステリア・モノサイトゲネスのいずれかからミディプレップで抽出し、精製した。リステリアからのプラスミド精製については、ｐＧＧ５５  Ｄ１３３ＶまたはＷＴプラスミドを担持する細菌株を凍結ストックからクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）添加ＢＨＩ寒天培地プレート内に画線プレーティングした。各々の株からの単一コロニーを、５ｍＬの選択培地（２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＢＨＩ培地）内で６時間激しく振盪しながら３７℃で成長させ、類似の条件下で一晩の成長のために１：５００で１００ｍＬの選択培地に継代接種した。一晩培養からの細菌を４，０００×ｇで１０分間遠心分離して採取し、２ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ、Ｌ７００１）を含有する緩衝液Ｒ３（再懸濁緩衝液）に再懸濁した。細菌懸濁液を、標準プロトコルに進む前に少なくとも１時間、３７℃でインキュベートした。溶出したプラスミドの濃度および純度を分光光度計で２６０ｎｍおよび２８０ｎｍにおいて測定した。テンプレートＤＮＡを調製するために、ｐＧＧ５５  Ｄ１３３ＶおよびＷＴプラスミドをミディプレップストック溶液から最終濃度の１ｎｇ／μｌになるように水中で再懸濁した。ｐＧＧ５５  ＷＴプラスミドについては、１０−１から１０−７までの希釈に対応する１ｎｇ／μｌ溶液からの１０倍の段階希釈物を調製した。
臨床グレードの材料を試験するためのｐｒｆＡ特異的ＰＣＲプロトコル
【０２５４】
反応混合物は１×ＰＣＲ緩衝液、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．８ｍＭのｄＮＴＰ、０．４μＭの各々のプライマー、０．０５Ｕ／μｌのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、および０．０４ｎｇ／μｌのｐＧＧ５５  Ｄ１３３Ｖテンプレートプラスミドを含有していた。各々の試験のために１０本のチューブが必要であり、そして２５μｌの反応における各々のチューブ内の主要構成成分を表３に示す。ＰＣＲ反応のために、表４に示すように、１１個の反応のために十分な試薬を含むマスターミックスを調製し、各々のチューブにこのＰＣＲミックスのうちの２４μｌを添加した。引き続いて、合計１μｌの段階希釈したｐＧＧ５５  ＷＴプラスミドを、対応するチューブに添加した：チューブ３の中に１ｎｇ、チューブ４の中に１００ｐｇ、チューブ５の中に１０ｐｇ、チューブ６の中に１ｐｇ、チューブ７の中に１００ｆｇ、チューブ８の中に１０ｆｇ、チューブ９の中に１ｆｇ、チューブ１０の中に０．１ｆｇ。方法感度を判定する目的で標準曲線を較正するためにこの段階希釈を使用した。さらに、チューブ１に０．５μｌの水および０．５μｌのプライマー  ＡＤＶ４５１（２０μＭストック）を添加し、チューブ２に１μｌの水を添加し、２５μｌの最終体積を完了した。２５μｌの反応のためのチューブ当たりの各々の試薬の量を表５に示す。反応で使用されたＰＣＲサイクルの条件を表６に示す。
【０２５５】
ＰＣＲ反応の完了後、５μｌのゲルローディング緩衝液（６×、ブロモフェノールブルー入り）を各々のサンプルに添加し、１０μｌをＴＢＥ緩衝液中の１．２％のアガロースゲル内での電気泳動によって解析した。ゲルの寸法は７ｃｍ×７ｃｍ×１ｃｍであり、１５サンプルウェル（１ｍｍ×２ｍｍ）コームを有する。ゲルを１００Ｖで３０分間程度、ブロモフェノールブルー染料がゲルの中心に達するまで実行した。ゲルをエチジウムブロマイド（０．５μｇ／ｍＬ）中で２０分間染色し、水中で１０分間脱染した。ゲルをＵＶ光を用いた照明によって可視化し、写真撮影した。帯域濃度測定ソフトウェア（Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅバージョン４．５．１、ＢｉｏＲａｄ）を使用して画像を解析した。
【０２５６】
表３  Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７サンプル中の野生型ｐｒｆＡ配列の存在を検出する方法を検証するための個別のＰＣＲ反応の組。
【表３】
2018530588.tif 000013
【０２５７】
表４  マスターＰＣＲミックスの調製。
【表４】
2018530588.tif 000014
【０２５８】
表５  プライマーＡＤＶ４５１、４５２、および４５３を使用した、野生型ｐｒｆＡ配列の存在を検出する方法の検証のためのＰＣＲプロトコル。
【表５】
2018530588.tif 000015
ａｐＧＧ５５  ＷＴ（チューブ３中に１ｎｇ、チューブ４中に１００ｐｇ、チューブ５中に１０ｐｇ、チューブ６中に１ｐｇ、チューブ７中に１００ｆｇ、チューブ８中に１０ｆｇ、チューブ９中に１ｆｇ、チューブ１０中に０．１ｆｇ）。
ｂチューブ１内に０．５μｌの水および０．５μｌのプライマーＡＤＶ４５１（２０μＭストック）を添加、チューブ２内に１μｌの水を添加。
【０２５９】
表６  プライマーＡＤＶ４５１、４５２、および４５３を使用した野生型ｐｒｆＡ配列の存在を検出するためのＰＣＲサイクル条件。
【表６】
2018530588.tif 000016
シークエンシング：
【０２６０】
ジデオキシシークエンシング法を使用してプラスミドのシークエンシングを行った。プラスミドｐＧＧ５５  Ｄ１３３ＶとｐＧＧ５５  ＷＴを異なる比（１：１、１：１０、１；１００、１：１，０００、および１：１０，０００）で混合した。混合物中のプラスミドの合計量を一定（５００μｇ）に保ち、方法の感度を判定するために野生型配列を含有するプラスミドをＤ１３３Ｖプラスミドに関して１０倍に段階希釈した。
結果
実施例６：シークエンシングは、Ｄ１３３Ｖ突然変異の復帰を検出するためには感度の高い方法ではない。
【０２６１】
野生型ｐｒｆＡ配列を検出する際のシークエンシングの感度を見積もるために、ｐＧＧ５５  Ｄ１３３ＶおよびＷＴプラスミドを異なる比で混合し、シークエンシングした。結果を図１２に示し、シークエンシングが、ｐｒｆＡＤ１３３Ｖ突然変異を区別するうえで高い特異性を有することが明らかになった（図１２）。一方で、感度は低く、配列内に検出可能なピークを有する野生型ｐｒｆＡ  ｐＧＧ５５プラスミドの最大希釈は１０対１である（図１２）。結論として、シークエンシングは大変特異的だが、この方法の感度は低く、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７サンプル内でｐｒｆＡＤ１３３Ｖ突然変異の復帰突然変異体などの稀な事象の存在をスクリーニングするのには適切でない。
実施例７：Ｄ１３３Ｖ突然変異の復帰を検出するための高度に特異的で感度の高いＰＣＲ法の開発。
【０２６２】
稀な事象を検出するためのシークエンシングの感度が低いことを考えると、Ｄ１３３Ｖ突然変異の野生型への復帰を検出するために類似の特異性を有するより感度の高い方法を開発することが必要不可欠となる。この目標を達成するために、野生型配列を特異的に増幅するＰＣＲベースの方法を設計し、これはＤ１３３Ｖ突然変異した配列の１０，０００，０００個のコピーに対してｐｒｆＡの少なくとも１個の野生型コピーを検出するのに十分な感度である。この方法のために３つのプライマーを設計した。すなわち、ＡＤＶ４５１、ＡＤＶ４５２、およびＡＤＶ４５３である（表１）。ＡＤＶ４５１とＡＤＶ４５２の両方は、フォワードプライマーであり、ｐｒｆＡ遺伝子の３９８の位置でＡ→Ｔ（Ｄ１３３Ｖ）突然変異を区別するように、３’位置の最後のヌクレオチドが異なる。ＡＤＶ４５３プライマーは、ＡＤＶ４５１およびＡＤＶ４５２プライマーのアニーリング部位のおよそ３００ｂｐ下流に位置付けられたリバースプライマーである（図１３）。プライマーＡＤＶ４５１、またはＡＤＶ４５２、およびＡＤＶ４５３を用いて得られる予想ＰＣＲ帯域は３２６ｂｐである。厳しい条件の下では、ＡＤＶ４５１プライマーはｐＧＧ５５  Ｄ１３３Ｖプラスミドのみを増幅するべきであるが、一方でＡＤＶ４５２は野生型ｐｒｆＡ配列に特異的であることになる。
実施例８：ＰＣＲ法の特異性
【０２６３】
プライマーＡＤＶ４５１を使用した反応は、大変特異的であり、突然変異Ｄ１３３Ｖ  ｐｒｆＡ配列を増幅した（レーン１〜３）が、野生型配列（レーン４〜６）は増幅しなかった。しかしながら、５ｎｇのテンプレートＤＮＡを使用したときにはレーン４では大変かすかな帯域を検出することができるが、１ｎｇでは検出できなかった（図１４）。
【０２６４】
図１５に示すように、ＡＤＶ４５２プライマーを用いた反応は野生型ｐｒｆＡ配列（レーン４、５、および６）のみを増幅し、Ｄ１３３Ｖ  ＰｒｆＡ突然変異を担持するｐＧＧ５５をテンプレートとして使用したときには（レーン１、２、および３）、反応に５ｎｇのプラスミドを使用したときでも帯域を検出しなかった（図１６）。結論として、プライマーＡＤＶ４５１およびＡＤＶ４５２を用いたＰＣＲ反応は、大変特異的であり、ｐＧＧ５５プラスミド内のｐｒｆＡ遺伝子の位置３９８においてＡ←→Ｔ（Ｄ１３３Ｖ）突然変異を区別することができる。これらの結果に基づいて、反応に使用されるテンプレートＤＮＡの標準量として１ｎｇの量を選択した。
実施例９：ＰＣＲ法の感度
【０２６５】
１ｎｇのテンプレートＤＮＡを使用して反応の感度を試験した。野生型ｐｒｆＡ配列を担持するプラスミドに対して、感度を見積もるために漸減するＤＮＡの量（１０−１〜１０−７の１０倍希釈に対応する）も反応に含めた。これらの反応では、プライマーＡＤＶ４５２およびＡＤＶ４５３のみを使用した。３０サイクル（５３℃のアニーリング温度で１０サイクル、そして５０℃のアニーリング温度で追加的に２０サイクル）のＰＣＲ反応では、方法の感度は１対１００，０００であった（データ非表示）。図５に示すように、ＰＣＲサイクルの数を３７へと増加することは、Ｄ１３３Ｖ復帰突然変異体の検出に対して、特異性を著しく損なうことなく方法の視感度を１０−６へと改善した。ＤＮＡの初期量として１ｎｇのプラスミドが使用されたとき、１０−６希釈において明らかな帯域が見られ、これは１００万個のＤ１３３Ｖ突然変異に対する１コピーの野生型配列の検出レベルに対応した。より長い曝露後、レーン１およびレーン９では大変弱い帯域のみが目に見え、方法の堅牢な特異性を再確認した。一方で、５ｎｇのＤＮＡで開始したときには、１０−７希釈において帯域を容易に検出することができ、ＰＣＲの感度を増加した。しかしながら、ｐＧＧ５５  Ｄ１３３Ｖプラスミドを用いて類似の強度の帯域を検出することもでき、方法の特異性の限度を示す（図１７）  ｐＧＧ５５  Ｄ１３３Ｖプラスミドを用いて観察されたこの帯域は、サイクル数の増加で著しく蓄積しうるプライマーＡＤＶ４５２を用いたＤ１３３Ｖ突然変異の非特異的増幅に起因する可能性がある。これらの結果は、特異性を著しく損なうことなく、この方法に対する感度の限度が１対１，０００，０００〜１対１０，０００，０００にあることを示す。
実施例１０：ＬＬＯの融合タンパク質をＥ７に発現する組換え型リステリア（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７）
【０２６６】
この株は野生型の親株１０４０３Ｓよりおよそ４〜５ログ弱毒化されており、融合タンパク質ｔＬＬＯ−Ｅ７を分泌する。この免疫療法はバックボーンＸＦＬ７に基づき、このバックボーンは、病毒性遺伝子転写活性化剤ｐｒｆＡ内での不可逆な欠失によって１０４０３Ｓから派生する。ＰｒｆＡは、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）、ＡｃｔＡ、ＰｌｃＡ（ホスホリパーゼＡ）、ＰｌｃＢ（ホスホリパーゼＢ）などの、インビボ細胞内成長およびＬ．モノサイトゲネスの生存のために要求されるいくつかの病毒性遺伝子の転写を調節する。プラスミドｐＧＧ５５は、「クロラムフェニコール」を用いた選択手段により、インビトロでＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７によって保持される。しかしながら、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７によるプラスミドのインビボでの保持のために、それは突然変異ｐｒｆＡ（Ｄ１３３Ｖ）のコピーを担持し、これはＤＮＡ結合および病毒性遺伝子の転写の活性化では、野生型ＰｒｆＡより活性が低いことが実証されてきた。突然変異ＰｒｆＡを用いた相補は、野生型株１０４０３Ｓと比較するとＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７から分泌されたＬＬＯの量のおよそ４０倍の減少をもたらすことを観察した。これは株Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７が、ａｃｔＡ、ｉｎｌＡ、ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣ、ｐｌｃＢなどのＰｒｆＡによって調節される病毒性遺伝子の発現の減少を呈する可能性があることを暗示する。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７では、ｐｒｆＡの突然変異コピーを用いた相補が、ＰｒｆＡによって調節される異なる病毒性遺伝子の発現の減少を生じる可能性があり、結果としておよそ４〜５ログの全体的な弱毒化をもたらす。
実施例１１：弱毒化リステリア株ＬｍｄｄΔａｃｔＡの構築
【０２６７】
前立腺癌のマウスモデルにおいて腫瘍の退行に関連する強力なＰＳＡ特異的免疫応答を誘発する、ｔＬＬＯ（Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ）に融合されたＰＳＡを分泌する組換え型Ｌｍが開発され、ｐＡＤＶ１４２プラスミドベースのＰＳＡワクチンのための株についてのベクターに抗生物質耐性を付与する、ｐＧＧ５５ベースのプラスミド（表７）に由来するｔＬＬＯ−ＰＳＡの発現も開発された。この株は抗生物質耐性マーカーを有さず、ＬｍｄｄＡ−１４２と称される（表７）。この新株は、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡよりも１０倍弱毒化されている。加えて、ＬｍｄｄＡ−１４２はＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡよりも免疫原性がわずかに高く、且つ、ＰＳＡを発現する腫瘍の退行に関して著しく有効であった。
表７  プラスミドおよび株
【表７】
2018530588.tif 000017
【０２６８】
プラスミドｐＡｄｖ１４２（６５２３ｂｐ）の配列は次のとおりであった：
【０２６９】
【化９】
2018530588.tif 000018
【化１０】
2018530588.tif 000019
【化１１】
2018530588.tif 000020
このプラスミドは２００８年２月２０日にＧｅｎｅｗｉｚ試験施設にて大腸株から配列決定された。
実施例１２：ＬｍｄｄおよびＬｍｄｄａ株における、フレーム内ヒトｋｌｋ３遺伝子のｈｌｙ遺伝子への挿入
【０２７０】
Ｌｍ  ｄａｌ  ｄａｔ（Ｌｍｄｄ）株は、病毒性因子、ＡｃｔＡの不可逆的な欠失によって弱毒化された。下流遺伝子の発現に対するあらゆる極性効果を避けるようにａｃｔＡのフレーム内欠失をＬｍｄａｌｄａｔ（Ｌｍｄｄ）バックグラウンドで構築した。そのＬｍ  ｄａｌ  ｄａｔΔａｃｔＡはＡｃｔＡの５９１アミノ酸の欠失によってＮ末端の最初の１９アミノ酸とＣ末端の２８アミノ酸残基を含有する。
【０２７１】
そのａｃｔＡ欠失突然変異体は、ＰＣＲによってａｃｔＡの上流部分（６５７ｂｐ、オリゴＡｄｖ２７１／２７２）および下流部分（６２５ｂｐ、オリゴＡｄｖ２７３／２７４）に対応する染色体領域を増幅し、且つ、結合することにより作製された。この増幅に使用されるプライマーの配列は表８の通りである。ａｃｔＡの上流ＤＮＡ領域と下流ＤＮＡ領域をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ制限部位においてｐＮＥＢ１９３内にクローニングし、このプラスミドからＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩを温度感受性プラスミドｐＫＳＶ７内にさらにクローニングしてΔａｃｔＡ／ｐＫＳＶ７（ｐＡｄｖ１２０）を得た。
表８：ａｃｔＡの上流および下流のＤＮＡ配列の増幅に使用されたプライマーの配列
【表８】
2018530588.tif 000021
【０２７２】
その染色体位置からの遺伝子の欠失は、ＡｃｔＡ欠失領域に外部的に結合されるプライマーを使用して確認されたが、これは図２３にプライマー３（Ａｄｖ  ３０５−ｔｇｇｇａｔｇｇｃｃａａｇａａａｔｔｃ、配列番号３９）およびプライマー４（Ａｄｖ３０４−ｃｔａｃｃａｔｇｔｃｔｔｃｃｇｔｔｇｃｔｔｇ、配列番号４０）として示されている。ＬｍｄｄおよびＬｍｄｄΔａｃｔＡから単離された染色体ＤＮＡに対してＰＣＲ分析を実施した。Ｌｍｄｄの染色体ＤＮＡ内でのプライマー対１／２および３／４の２つの異なるセットによる増幅後のＤＮＡ断片のサイズは３．０Ｋｂおよび３．４Ｋｂであると予期された。一方で、ＬｍｄｄΔａｃｔＡ用のプライマー対１／２および３／４を使用するＰＣＲの期待サイズは１．２Ｋｂおよび１．６Ｋｂであった。したがって、図２３のＰＣＲ解析はａｃｔＡの１．８ｋｂ領域は、ＬｍｄｄΔａｃｔＡ株内では除去されていることを確認する。ＬｍｄｄΔａｃｔＡ株内のａｃｔＡ含有領域の欠失を確認するためにＰＣＲ産物に対してＤＮＡシーケンシングも実施した。
実施例１３：Ｌｍベクターによる抗原送達のための抗生物質非依存的エピソーム発現系の構築。
【０２７３】
Ｌｍベクター（ｐＡｄｖ１４２）による抗原送達のための抗生物質非依存的なエピソーム発現系は、次世代の抗生物質を含まないプラスミドｐＴＶ３である（Ｖｅｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ、２００４．７２（１１）：６４１８−２５、参照により本明細書に援用される）。リステリア株Ｌｍｄｄは染色体中に病原性遺伝子転写活性化因子の遺伝子である１コピーのｐｒｆＡ遺伝子を含むため、ｐｒｆＡをｐＴＶ３から欠失した。さらに、ＮｈｅＩ／ＰａｃＩ制限部位でのｐ６０−リステリアｄａｌ用のカセットは、ｐ６０−枯草菌ｄａｌにより置換され、その結果としてプラスミドｐＡｄｖ１３４が得られた（図２４Ａ）。リステリアとバチルスｄａｌ遺伝子の類似性は約３０％であり、Ｌｍｄｄ染色体内のｄａｌ遺伝子の残りの断片とそのプラスミドとの間で組換えが起こる可能性が実質的に排除される。プラスミドｐＡｄｖ１３４は抗原発現カセットｔＬＬＯ−Ｅ７を含んだ。ＬｍｄｄＡ株は、ｐＡｄｖ１３４プラスミドで形質転換し、選択したクローンからのＬＬＯ−Ｅ７タンパク質の発現がウエスタンブロットによって確認された（図２４Ｂ）。１０４０３Ｓ野生型株に由来するＬｍｄｄ系は、Ｌｍｄｄストレプトマイシン耐性を除き、抗生物質耐性マーカーを持っていない。
【０２７４】
さらに、ｐＡｄｖ１３４をＸｈｏＩ／ＸｍａＩで制限処理してヒトＰＳＡであるｋｌｋ３をクローニングしてプラスミドｐＡｄｖ１４２を得た。新しいプラスミド、ｐＡｄｖ１４２（図２４Ｃ、表７）は、リステリアｐ６０プロモーターの制御下でバシラスｄａｌ（Ｂ−Ｄａｌ）を含む。そのシャトルプラスミドｐＡｄｖ１４２は外因性Ｄ−アラニンの非存在下で大腸菌ａｌａ  ｄｒｘ  ＭＢ２１５９ならびにリステリア・モノサイトゲネス株Ｌｍｄｄの両方の増殖を相補した。プラスミドｐＡｄｖ１４２内の抗原発現カセットは、ｈｌｙプロモータープロモーターおよびＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質から構成される（図２４Ｃ）。
【０２７５】
プラスミドｐＡｄｖ１４２でリステリアのバックグラウンド株であるＬｍｄｄａｃｔＡ株を形質転換してＬｍ−ｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡを得た。株Ｌｍ−ｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡによるＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の発現および分泌は、抗ＬＬＯおよび抗ＰＳＡ抗体を使用したウエスタンブロットにより確認された（図２４Ｄ）。インビボでの２継代後にＬｍ−ｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株によるＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の安定した発現および分泌が存在した。
実施例１２：ＬＭＤＤＡＨＰＶＱＵＡＤ−タグの様々な投与濃度での免疫後のＴＣ１腫瘍制御
【０２７６】
以下の異なる用量（ＣＦＵ）によるＬｍ−ＨＰＶＱｕａｄ治療の治療有効性を評価するためのＴＣ−１肺上皮細胞を用いたＣ５７ＢＬ／６雌マウスにおける腫瘍退行実験：１×１０８、１×１０７、２．５×１０７および５×１０７。
【０２７７】
腫瘍接種  この実験で用いる腫瘍モデルは、ＴＣ−１腫瘍モデルである。ＴＣ−１細胞を完全培地中で培養する。マウスに腫瘍細胞を移植する２日前に、ＴＣ−１細胞を完全培地中に継代培養する。実験当日（０日目）に細胞をトリプシン処理し、培地で二回洗浄する。細胞を計数し、注射用にマウス当たり２００ｕｌのＰＢＳ中に１×１０５細胞の濃度で再懸濁する。各マウスの右脇腹に腫瘍細胞を皮下注射する。８日目に、投与１としてマウス当たりＩＰ／２００ｕＬで投与し、その後週に一度、合計で３投与する。直径が１２ｍｍの大きさに達するまで腫瘍を週に二回測定する。腫瘍が屠殺基準（ｓａｃｒｉｆｉｃｅ  ｃｒｉｔｅｒｉａ）を満たしたら、マウスはＡｄｖａｘｉｓ社の動物安楽死プロトコルに従って安楽死させ、腫瘍を切除して測定する。
【０２７８】
培養プロトコル：移植の２日前に、ＴＣ１細胞を、１：１０の比で継代培養した。移植当日、ＴＣ１細胞をトリプシン処理し、ｃ−ＲＰＭＩで洗浄した。細胞を計数し（１×１０＾６／ｍｌ、９７％生存、総量２０ｍｌ）、ＲＰＭＩで再度洗浄した。その後細胞を、氷冷したＰＢＳに再懸濁させ、７０ｕｍ濾過器で濾過し、再度計数した（１０ｍｌ中、２×１０＾６／ｍｌ、９７％生存）。細胞４ｍｌを、１２ｍｌの氷冷ＰＢＳと混合し、総量１６ｍｌ中で５×１０＾５／ｍｌを得た。１×１０＾５／２００ｕｌ用量が与えられる動物８０体に十分である。
【０２７９】
ＴＣ−１細胞用の完全培地  ４５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０、５０ｍｌの１０％ＦＢＳ、５ｍｌのＮＥＡＡ（１００ｕＭ）、５ｍｌのＬ−グルタミン（２ｕＭ）、５ｍＬのＰｅｎ／ｓｔｒｅｐ（１００Ｕ／ｍＬのペニシリン＋１００ｕｇ／ｍＬのストレプトマイシン）、Ｇ４１８（４００ｕｇ／ｍＬ）（分けるときに細胞に加える）とした。
【０２８０】
ワクチン調製  １．構築体毎に、１バイアルを−８０℃から、水浴で３７℃に解凍する。２．１４，０００ｒｐｍで２分間にわたって遠心分離し、上清を捨てる。３．１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、捨てる。４．適切な濃度までＰＢＳ中に再懸濁する。
【表９】
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【０２８１】
ＨＰＶ  １６  Ｅ６およびＥ７を発現するＴＣ１腫瘍を接種したマウスの腫瘍体積を測定し、それを漸減用量のＬｍｄｄａ−ＨＰＶＱｕａｄまたはエンプティのＬｍｄｄＡ２７４（ＨＰＶ抗原なしのリステリア）で処置した（図２５Ａ〜Ｄ）。
【０２８２】
マウスにおける最適用量１×１０８よりも１０分の１少ない用量（１×１０７）を最大として、ＨＰＶｑｕａｄを与えることが可能であり、それでもＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７発現腫瘍の有効な腫瘍制御を同様に維持することが可能であるという結果を表した。
実施例１３：ＡＸＡＬまたはＬＭＤＤＡ−ＨＰＶＱＵＡＤの様々な投与濃度での免疫後のＴＣ１腫瘍制御
【０２８３】
以下の異なる用量（ＣＦＵ）によるＡＸＡＬ（Ｌｍ−Ｅ７）またはＬｍ−ＨＰＶＱｕａｄ治療の治療有効性を評価するためのＴＣ−１肺上皮細胞（ＨＰＶ  １６：Ｅ６およびＥ７を発現する）を用いたＣ５７ＢＬ／６雌マウスにおける腫瘍退行実験：１×１０８、１×１０７、２．５×１０７および５×１０７。１グループにつき、Ｎ＝５〜１０体の動物数である。
【０２８４】
ＨＰＶ  １６  Ｅ６およびＥ７を発現するＴＣ１腫瘍を接種したマウスの腫瘍体積を測定し、それを漸減用量のＡＸＡＬ／Ｌｍ−Ｅ７またはエンプティベクターのＬｍ−ｔＬＬＯで処置した（図２６Ａ）。ＨＰＶ  １６  Ｅ６およびＥ７を発現するＴＣ１腫瘍を接種したマウスの腫瘍体積を測定し、それを漸減用量のＬｍｄｄａ−ＨＰＶＱｕａｄまたはエンプティベクターのＬｍ−ｔＬＬＯで処置した（図２６Ｂ）。
【０２８５】
ＨＰＶ１６  Ｅ７抗原のみを発現するＡＸＡＬは、標準用量１×１０８で有効であるという結果を表した。しかしながらＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７両方を発現するＨＰＶＱｕａｄは、標準用量より１０分の１少ない用量で、腫瘍増殖の制御に有効である。
【０２８６】
添付の図面を参照して本発明の実施形態を記述してきたが、本発明は厳密に実施形態に限定されず、かつ添付の特許請求の範囲に定義されるように、当業者によって本発明の範囲または趣旨から逸脱することなくこれらに様々な変更および修正がなされてもよいことが理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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