(57)【要約】いくつかの態様では、導入遺伝子ならびにＤＨＦＲＦＳ及び／またはＴＹＭＳＳＳを含むか、または発現する、単離された遺伝子導入細胞（例えば、遺伝子導入Ｔ細胞）が提供される。遺伝子導入細胞の選択方法も提供される。ＭＴＸ及び５−ＦＵに対する耐性を有する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の選択的増殖方法であって、ａ）ＡＴｈｙＲ遺伝子を含むベクターを用いたＰＢＭＣへの遺伝子導入と、ｂ）チミジン合成阻害剤を用いた前記遺伝子導入ＰＢＭＣの処理と、ｃ）前記ＡＴｈｙＲ遺伝子を発現するＰＢＭＣの選択と、を含む、前記選択的増殖方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
導入遺伝子及びＤＨＦＲＦＳを含むか、または発現する、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞。
【請求項２】
導入遺伝子及びＴＹＭＳＳＳを含むか、または発現する、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞。
【請求項３】
導入遺伝子、ＤＨＦＲＦＳ、及びＴＹＭＳＳＳを含むか、または発現する、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞。
【請求項４】
ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳを含むか、または発現する単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞。
【請求項５】
前記単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞が、ヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｃ細胞またはＣＴＬ）、メモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）、エフェクターＴ細胞（ＴＥＭ細胞）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞；抑制性Ｔ細胞としても知られる）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、粘膜関連インバリアントＴ細胞、アルファ−ベータＴ細胞（Ｔαβ細胞）、及びガンマ−デルタＴ細胞（Ｔγδ細胞）からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞。
【請求項６】
哺乳類Ｔ細胞におけるＡＴｈｙ毒性の阻害方法であって、前記哺乳類Ｔ細胞におけるＡＴｈｙＲ導入遺伝子の発現を含む、前記阻害方法。
【請求項７】
前記ＡＴｈｙＲ導入遺伝子が、ＤＨＦＲＦＳである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ＡＴｈｙＲ導入遺伝子が、ＴＹＭＳＳＳである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
哺乳類Ｔ細胞が、ヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｃ細胞またはＣＴＬ）、メモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）、エフェクターＴ細胞（ＴＥＭ細胞）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞；抑制性Ｔ細胞としても知られる）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、粘膜関連インバリアントＴ細胞、アルファ−ベータＴ細胞（Ｔαβ細胞）、及びガンマ−デルタＴ細胞（Ｔγδ細胞）からなる群から選択される、請求項６〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
対象導入遺伝子を発現するＴ細胞の選択方法であって、
ａ）前記対象導入遺伝子及びＤＨＦＲＦＳを発現するＴ細胞を含む複数のＴ細胞に対するチミジン合成阻害剤の適用と、
ｂ）前記チミジン合成阻害剤の適用から７日後以降に生存している１つまたは複数のＴ細胞の選択と、
を含み、前記１つまたは複数のＴ細胞が、前記対象導入遺伝子及びＤＨＦＲＦＳを含むベクターを発現する、前記選択方法。
【請求項１１】
前記チミジン合成阻害剤が、トトレキサート（ＭＴＸ）、５−ＦＵ、ラルチトレキセド、及びペメトレキセドからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｔ細胞が、ヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｃ細胞またはＣＴＬ）、メモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）、エフェクターＴ細胞（ＴＥＭ細胞）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞；抑制性Ｔ細胞としても知られる）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、粘膜関連インバリアントＴ細胞、アルファ−ベータＴ細胞（Ｔαβ細胞）、及びガンマ−デルタＴ細胞（Ｔγδ細胞）からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ＭＴＸ及び５−ＦＵに対する耐性を有する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の選択的増殖方法であって、
ａ）ＡＴｈｙＲ遺伝子を含むベクターを用いたＰＢＭＣへの遺伝子導入と、
ｂ）チミジン合成阻害剤を用いた前記遺伝子導入ＰＢＭＣの処理と、
ｃ）前記ＡＴｈｙＲ遺伝子を発現するＰＢＭＣの選択と、
を含む、前記選択的増殖方法。
【請求項１４】
前記遺伝子導入ＰＢＭＣに由来するＴ細胞集団の増殖をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記チミジン合成阻害剤が、ＭＴＸである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記チミジン合成阻害剤が、メトトレキサート（ＭＴＸ）、５−ＦＵ、ラルチトレキセド、及びペメトレキセドからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＡＴｈｙＲ遺伝子が、ＴＹＭＳＳＳである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＡＴｈｙＲ遺伝子が、ＤＨＦＲＦＳである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
対象導入遺伝子と、ＤＨＦＲＦＳをコードするヌクレオチド配列と、を含む核酸配列を含む、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞。
【請求項２０】
対象導入遺伝子と、ＴＹＭＳＳＳをコードするヌクレオチド配列と、を含む核酸配列を含む、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞。
【請求項２１】
対象導入遺伝子と、ＤＨＦＲＦＳをコードするヌクレオチド配列と、を含む核酸を含む、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞であって、前記対象導入遺伝子と、ＤＨＦＲＦＳをコードする前記ヌクレオチド配列と、が機能可能なように連結される、前記単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞。
【請求項２２】
前記対象導入遺伝子と、ＤＨＦＲＦＳをコードする前記ヌクレオチド配列とが、発現に際して、同一のｍＲＮＡにコードされる、請求項２１に記載の遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞。
【請求項２３】
前記対象導入遺伝子をコードする前記配列と、ＤＨＦＲＦＳをコードする前記ヌクレオチド配列とが、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）またはリボソームスリップ配列によって分離される、請求項２１に記載の遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞。
【請求項２４】
前記対象導入遺伝子が、ＤＨＦＲＦＳをコードする前記ヌクレオチド配列に対して、３’側に位置する、請求項２１に記載の遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞。
【請求項２５】
対象導入遺伝子と、ＴＹＭＳＳＳをコードするヌクレオチド配列と、を含む核酸を含む、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞であって、前記対象導入遺伝子と、ＴＹＭＳＳＳをコードする前記ヌクレオチド配列と、が機能可能なように連結される、前記単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞。
【請求項２６】
前記対象導入遺伝子と、ＴＹＭＳＳＳをコードする前記ヌクレオチド配列とが、発現に際して、同一のｍＲＮＡにコードされる、請求項２５に記載の遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞。
【請求項２７】
前記対象導入遺伝子をコードする前記配列と、ＴＹＭＳＳＳをコードするヌクレオチド配列とが、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）またはリボソームスリップ配列によって分離される、請求項２５に記載の遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞。
【請求項２８】
前記対象導入遺伝子が、ＴＹＭＳＳＳをコードする前記ヌクレオチド配列に対して、３’側に位置する、請求項２５に記載の遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞。
【請求項２９】
ＤＨＦＲＦＳをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２５に記載の遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞。
【請求項３０】
前記対象導入遺伝子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物、ポリペプチドホルモン、自殺遺伝子、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする、請求項２５に記載の遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞。
【請求項３１】
前記対象導入遺伝子が、増殖因子またはサイトカインをコードする、請求項２５に記載の遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞。
【請求項３２】
前記サイトカインが、ＩＬ−１２である、請求項３１に記載の遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞。
【請求項３３】
前記サイトカインが、ＩＬ−１５である、請求項３１に記載の遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞。
【請求項３４】
導入遺伝子及びＤＨＦＲＦＳを発現する、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞であって、前記Ｔ細胞が、（１）前記導入遺伝子をコードする配列を含むポリヌクレオチドと、（２）前記ＤＨＦＲＦＳをコードする配列を含むポリヌクレオチドと、を含む、前記単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞。
【請求項３５】
導入遺伝子及びＴＹＭＳＳＳを発現する、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞であって、前記Ｔ細胞が、（１）前記導入遺伝子をコードする配列を含むポリヌクレオチドと、（２）前記ＴＹＭＳＳＳをコードする配列を含むポリヌクレオチドと、を含む、前記単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞。
【請求項３６】
前記Ｔ細胞が、ヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｃ細胞またはＣＴＬ）、メモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）、エフェクターＴ細胞（ＴＥＭ細胞）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞；抑制性Ｔ細胞としても知られる）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、粘膜関連インバリアントＴ細胞、アルファ−ベータＴ細胞（Ｔαβ細胞）、及びガンマ−デルタＴ細胞（Ｔγδ細胞）からなる群から選択される、請求項１９〜３５のいずれかに記載の単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞。
【請求項３７】
癌を有する患者の治療方法であって、請求項１〜４及び請求項１６〜２１のいずれかに記載の単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞の、治療上有効な量での患者に対する投与を含む、前記治療方法。
【請求項３８】
前記図のいずれかにおいて示されるか、または前記説明に記載の対象導入遺伝子を発現するＴ細胞の、選択方法。
【請求項３９】
前記図のいずれかにおいて示されるか、または前記説明に記載の、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞。
【請求項４０】
前記図のいずれかにおいて示されるか、または前記説明に記載の、ＭＴＸ、５−ＦＵ、ラルチトレキセド、及びペメトレキセドのうちの１つまたは複数に対する耐性を有するヒトＴ細胞の、選択的増殖方法。
【請求項４１】
前記Ｔ細胞が、ヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｃ細胞またはＣＴＬ）、メモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）、エフェクターＴ細胞（ＴＥＭ細胞）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞；抑制性Ｔ細胞としても知られる）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、粘膜関連インバリアントＴ細胞、アルファ−ベータＴ細胞（Ｔαβ細胞）、及びガンマ−デルタＴ細胞（Ｔγδ細胞）からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
哺乳類から単離されたＴ細胞集団における制御性Ｔ細胞の濃縮方法であって、前記Ｔ細胞集団と、ＭＴＸ、５−ＦＵ、ラルチトレキセド、及びペメトレキセド、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるチミジン合成阻害剤と、の接触によって、前記集団におけるエフェクターＴ細胞を選択的に枯渇させる、前記濃縮方法。
【請求項４３】
哺乳類から単離された前記Ｔ細胞集団が、ＭＴＸ及び５−ＦＵの両方と接触する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
哺乳類から単離されたＴ細胞集団における制御性Ｔ細胞の枯渇方法であって、１つまたは複数のアミノグリコシドの存在下で前記Ｔ細胞集団を培養して、前記培養において前記制御性Ｔ細胞を選択的に枯渇させることによる前記枯渇方法としてさらに定義される、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記Ｔ細胞が、ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳのうちの１つまたは複数を発現する、請求項４０〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
哺乳類から単離された制御性Ｔ細胞の選択方法であって、
ａ）チミジン合成阻害剤を用いた、ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳのうちの１つまたは複数を発現する複数のＴ細胞の処理と、
ｂ）制御性Ｔ細胞のマーカーを発現する制御性Ｔ細胞の選択と、
を含む、前記選択方法。
【請求項４８】
前記複数のＴ細胞が、ＤＨＦＲＦＳを発現する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記選択段階が、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ３９抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ１５２抗体、及び抗ＬＡＰ抗体のうちの１つまたは複数を使用する、磁気ビーズによる選別を用いた細胞の単離を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記選択段階が、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３９抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ１５２抗体、抗ＫＩ−６７抗体、及び抗ＦｏｘＰ３抗体のうちの１つまたは複数を使用する、磁気ビーズによる選別を用いた細胞の単離を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記チミジン合成阻害剤が、メトトレキサート（ＭＴＸ）である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記チミジン合成阻害剤が、５−ＦＵである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
前記チミジン合成阻害剤が、ラルチトレキセドまたはペメトレキセドである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
ｃ）葉酸（ｆｏｌａｔｅ）を用いた、前記制御性Ｔ細胞の処理、
をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５５】
ｃ）制御性Ｔ細胞における葉酸（ｆｏｌａｔｅ）合成の回復、
をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５６】
ｃ）ロイコボリン及びＦＵのうちの１つまたは複数を用いた、前記制御性Ｔ細胞の処理、
をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５７】
ｃ）ロイコボリン及びＭＴＸのうちの１つまたは複数を用いた、前記制御性Ｔ細胞の処理、
をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５８】
哺乳類から単離された第１の複数のＴ細胞と、チミジン合成阻害剤と、を含む組成物であって、哺乳類から単離され、チミジン合成阻害剤を含まない第２の複数のＴ細胞と比較して、前記第１の複数のＴ細胞の制御性Ｔ細胞が濃縮される、前記組成物。
【請求項５９】
第１の導入遺伝子の発現制御の提供方法であって、ＴＹＭＳＳＳをコードするヌクレオチド配列に機能可能なように連結された前記第１の導入遺伝子を含む核酸を含む遺伝子導入哺乳類細胞の提供を含み、前記細胞が、ＤＨＦＲＦＳをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、前記提供方法。
【請求項６０】
前記第１の導入遺伝子と、ＴＹＭＳＳＳをコードするヌクレオチド配列とが、発現に際して、同一のｍＲＮＡにコードされる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記第１の導入遺伝子をコードする前記配列と、ＴＹＭＳＳＳをコードする前記ヌクレオチド配列とが、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）またはリボソームスリップ配列によって分離される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記第１の対象導入遺伝子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記第１の対象導入遺伝子が、ポリペプチドホルモン、ケモカイン、またはサイトカインである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記サイトカインが、ＩＬ−１２である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記サイトカインが、ＩＬ−１５である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
ＤＨＦＲＦＳをコードする前記ヌクレオチド配列が、機能可能なように第２の導入遺伝子に連結される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６７】
前記第２の導入遺伝子と、ＤＨＦＲＦＳをコードする前記ヌクレオチド配列とが、発現に際して、同一のｍＲＮＡにコードされる、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記第２の対象導入遺伝子をコードする前記配列と、ＤＨＦＲＦＳをコードするヌクレオチド配列とが、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）またはリボソームスリップ配列によって分離される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記第２の導入遺伝子が、自殺遺伝子、ＣＡＲ、ＴＣＲ、ポリペプチドホルモン、サイトカイン、ケモカイン、または転写因子である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記自殺遺伝子が、誘導性自殺遺伝子である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記自殺遺伝子が、誘導性カスパーゼ９である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記哺乳類細胞が、Ｔ細胞である、請求項５９に記載の方法。
【請求項７３】
ＴＹＭＳＳＳと、第１の導入遺伝子をコードする配列と、をコードする、組換えＲＮＡ。
【請求項７４】
５’から３’に向かって、ＴＹＭＳＳＳをコードする配列と、ＩＬ−１２をコードする配列と、を含む組換え核酸分子であって、発現に際して、ＴＹＭＳＳＳをコードする前記配列と、ＩＬ−１２をコードする配列と、が同一ＲＮＡにコードされる、前記組換え核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年２月２４日出願の米国仮特許出願第６２／１２０，３２９号、２０１５年２月２５日出願の米国仮特許出願第６２／１２０，７９０号、及び２０１５年６月１５日出願の米国仮特許出願第６２／１７５，７９４号の利益を主張し、これらの文献はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
配列リストの援用
２０１６年２月２日に作成され、「ＵＴＦＣＰ１２７２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と命名された１３ＫＢ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）において計測）のファイルに含まれる配列リストは、電子的に提出されることによって、本明細書と共に出願され、参照によって本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
１．本発明の分野
本開示は、遺伝子導入Ｔ細胞の調製と、哺乳類から単離されたＴ細胞集団における制御性Ｔ細胞の濃縮と、を目的とする方法及び組成物に関する。
【０００４】
２．関連技術分野の説明
ヒト疾患をＴ細胞の標的にするということが進められて、２５年を超える期間が経過した。Ｙｅｅ  Ｃ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０１４，２５７（１）：２５０−２６３を参照のこと。臨床試験の初期の目的は、Ｔ細胞を方向付けることで、例えば、転移性メラノーマ及び白血病といった、びまん性の癌を標的として死滅させることあった。Ｙｅｅ  Ｃ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０１４，２５７（１）：２５０−２６３、及びＲｏｄｄｉｅ  Ｃ  ａｎｄ  Ｐｅｇｇｓ  ＫＳ，Ｅｘｐｅｒｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１１，１１（４）：４７３−４８７を参照のこと。
【０００５】
本明細書に開示の刊行物は、本出願の出願日より前に開示されたもののみを対象として提供される。発明が先行するという理由によって、本明細書の内容構成が、本発明がそのような刊行物に先行する権利は有さないということの承認となることはない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の公開日付とは異なり得るものであり、個別に確認する必要があり得る。
【０００６】
癌に存在する抗原は、過剰発現するか、または非癌性細胞に見られるタンパク質の変異型であることが多い。理想的には、癌抗原によって癌のみが区別されるが、実例の多くでは、癌抗原は、非癌性細胞にも見られるため、腫瘍以外が標的となり、病的状態及び死につながることが多い重篤な合併症を引き起こす毒性が生じるという危険性を有している。Ｔ細胞治療が強力な性質を有しているということが、Ｔ細胞が治療として継続的に探索される理由の１つであるが、いずれの形態の疾患についても、ＦＤＡの承認にたどり着いたものは未だ存在しない。
【０００７】
Ｔ細胞を用いる臨床試験の多くは、治療標準に勝る強力な利点を示している一方で、Ｔ細胞治療の生成費用、及び患者への危険性が存在することで、ごく一部の特殊センターを除き、こうした技術の開発が妨げられるという状況が続いている。さらに、腫瘍には複雑な免疫抑制環境が存在し、適切な腫瘍抗原の同定は困難であるため、制限が存在する。Ｃｏｒｒｉｇａｎ−Ｃｕｒａｙ  Ｊ，Ｋｉｅｍ  ＨＰｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１４，２２（９）１５６４−１５７４を参照のこと。癌のＴ細胞治療は、初期には、メラノーマ及び白血病の治療を対象として開発され、その間の四半世紀において、大きな逸脱なしに、そうした癌を標的としてきたことに留意されるべきである。免疫調節剤の継続的な研究開発に加えて、Ｔ細胞治療の技術的な側面をさらに改良することで、癌を対象とするＴ細胞癌治療が継続的に発展し、こうした治療の適用性が潜在的に広がるであろう。
【０００８】
現在、免疫調節薬物療法または免疫抑制薬物療法の標的は、過剰な炎症を伴う疾患である。こうした治療は、有効であることが多いが、上記セクションにおいて議論したような、思いも寄らぬ副作用を有する。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を使用することによって、標的性が向上した免疫抑制が可能であり得る。Ｔｒｅｇに対する理解は進んでおり、培養手法は、より先進化しているため、Ｔｒｅｇの再構成に基づく細胞治療は、より迅速に臨床試験に移行する可能性を有していることになる。臨床試験におけるＴｒｅｇの使用は、その大部分が、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の後に生じるＧｖＨＤの予防に限定されたものだった。Ｔｒｅｇの使用数は、多くの他の形態の炎症が前臨床モデルにおいて標的となるにつれて拡大するであろう可能性を有している。現在のところ、Ｔｒｅｇの単離及び増殖に関する技術的な課題によって、このＴ細胞治療の進展が制限されている。Ｓｉｎｇｅｒ  ＢＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１４，５：４６を参照のこと。
【０００９】
ＭＨＣ依存性のＴ細胞増殖法の開発は、Ｔ細胞治療の大きな技術的進展であった。抗原特異性非依存性選択（ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＳＩＳ）によってＴ細胞が増殖すると、患者へ再注入するためのＴ細胞が多く生成する。特異性の直接選択がなされることなくＴ細胞が増殖することは、反直感的に思えるかもしれないが、標的とする抗原に特異的なＴ細胞のサブセットを活性化及び増殖させて、多くのＴ細胞に含めることができる。遺伝子導入Ｔ細胞の選択増進、及び治療的に有用なＴ細胞表現型の選択を目的として新規のＡＳＩＳ法が探索されている。キメラサイトカイン受容体を使用する、インビトロでのＡＳＩＳが、非免疫原性選択の方法として最近報告されたが、この方法は、Ｔ細胞活性化における第３のシグナル、すなわち、サイトカインシグナル伝達を利用しているにすぎない。Ｗｉｌｋｉｅ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１０，２８５（３３）：２５５３８−２５５４４を参照のこと。抗原特異性に依存することなくＴ細胞を活性化及び増殖させるヒト遺伝子による第１及び第２のＴ細胞活性化シグナル（ＣＤ３及び同時刺激のシグナル伝達）を利用できる方針があれば、さらに利点を有し得るものである。
【００１０】
抗原特異的Ｔ細胞の養子移入は、癌免疫療法において急速に発展中の領域であり、抗原特異的Ｔ細胞のさまざまな製造手法が試験中であり、新たな抗原が標的とされているところである。ＨＬＡ（ＨＬＡは、ＭＨＣのヒト型である）の発現に依存することなく癌関連抗原（ＴＡＡ）を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように、免疫療法向けにＴ細胞を遺伝子改変することができる。初期臨床試験から得られた最近の結果によって、ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＣＡＲＴ）治療は、悪性疾患の部分的及び完全な寛解につながり得ることが示されており、こうした悪性疾患には、進行性／再発性Ｂ細胞腫瘍を有する何人かのレシピエントに生じたものが含まれる。Ｋａｌｏｓ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１１，３（９５）：９５ｒａ７３、及びＫｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ＪＮ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２０１２，１１９（１２）：２７０９−２７２０を参照のこと。
したがって、文献における既報内容にかかわらず、遺伝子導入Ｔ細胞の調製方法、治療的な治療を目的とするＴ細胞の増殖方法、及び制御性Ｔ細胞の選択方法を改善する必要がある。さらに、遺伝子導入Ｔ細胞の調製方法及び使用方法、ならびに遺伝子導入Ｔ細胞の増殖及び選択を制御する薬剤があれば、癌、自己免疫疾患、感染性疾患、及び免疫系が役割を担う任意の数の他の医学的病状の治療に大いに役立つこととなる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｙｅｅ  Ｃ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０１４，２５７（１）：２５０−２６３
【非特許文献２】Ｒｏｄｄｉｅ  Ｃ  ａｎｄ  Ｐｅｇｇｓ  ＫＳ，Ｅｘｐｅｒｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１１，１１（４）：４７３−４８７
【非特許文献３】Ｃｏｒｒｉｇａｎ−Ｃｕｒａｙ  Ｊ，Ｋｉｅｍ  ＨＰｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１４，２２（９）１５６４−１５７４
【非特許文献４】Ｓｉｎｇｅｒ  ＢＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１４，５：４６
【非特許文献５】Ｗｉｌｋｉｅ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１０，２８５（３３）：２５５３８−２５５４４
【非特許文献６】Ｋａｌｏｓ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１１，３（９５）：９５ｒａ７３
【非特許文献７】Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ＪＮ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２０１２，１１９（１２）：２７０９−２７２０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
１つの態様では、導入遺伝子と、ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳのうちの１つまたは複数と、を含むか、または発現する、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞が提供される。いくつかの実施形態では、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞は、導入遺伝子、ＤＨＦＲＦＳ、及びＴＹＭＳＳＳを含むか、または発現する。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、自殺遺伝子である。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子は、追加で含まれる。いくつかの実施形態では、ＤＨＦＲＦＳ、ＴＹＭＳＳＳ、またはそれらの両方に対してコドン最適化が実施される。
【００１３】
別の態様では、哺乳類Ｔ細胞における抗チミジル酸物質（ａｎｔｉ−ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ）（ＡＴｈｙ）による毒性の阻害方法が提供され、当該方法は、当該哺乳類Ｔ細胞における、抗チミジル酸物質耐性（ａｎｔｉ−ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）（ＡＴｈｙＲ）導入遺伝子の発現を含む。いくつかの実施形態では、ＡＴｈｙＲ導入遺伝子は、ＤＨＦＲＦＳである。いくつかの実施形態では、ＡＴｈｙＲ導入遺伝子は、ＴＹＭＳＳＳである。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、自殺遺伝子である。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子は、追加で含まれる。いくつかの実施形態では、ＤＨＦＲＦＳ、ＴＹＭＳＳＳ、またはそれらの両方に対してコドン最適化が実施される。
【００１４】
別の態様では、対象導入遺伝子を発現するＴ細胞の選択方法が提供される。方法は、対象導入遺伝子及びＤＨＦＲＦＳを発現するＴ細胞を含む複数のＴ細胞に対するチミジン合成阻害剤の適用と、チミジン合成阻害剤の適用から７日後以降に生存している１つまたは複数のＴ細胞の選択と、を含み、１つまたは複数のＴ細胞は、ベクターに含まれる対象導入遺伝子及びＤＨＦＲＦＳを発現する。チミジン合成阻害剤は、メトトレキサート（ＭＴＸ）、５−ＦＵ、ラルチトレキセド、及びペメトレキセドからなる群から選択してよい。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、自殺遺伝子である。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子は、追加で含まれる。いくつかの実施形態では、ＤＨＦＲＦＳ、ＴＹＭＳＳＳ、またはそれらの両方に対してコドン最適化が実施される。
【００１５】
さらに別の態様は、ＭＴＸ及び５−ＦＵに対する耐性を有する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の選択的増殖方法である。方法は、ＡＴｈｙＲ遺伝子を含むベクターを用いた末梢ＰＢＭＣへの遺伝子導入と、チミジン合成阻害剤を用いた遺伝子導入ＰＢＭＣの処理と、ＡＴｈｙＲ遺伝子を発現するＰＢＭＣの選択と、を含む。この態様のいくつかの実施形態では、方法は、遺伝子導入ＰＢＭＣに由来するＴ細胞集団の増殖をさらに含む。いくつかの実施形態では、チミジン合成阻害剤は、メトトレキサート（ＭＴＸ）、５−ＦＵ、ラルチトレキセド、及びペメトレキセドからなる群から選択してよい。いくつかの実施形態では、チミジン合成阻害剤は、ＭＴＸである。いくつかの実施形態では、ＡＴｈｙＲ遺伝子は、ＴＹＭＳＳＳである。いくつかの実施形態では、ＡＴｈｙＲ遺伝子は、ＤＨＦＲＦＳである。いくつかの実施形態では、ＤＨＦＲＦＳ、ＴＹＭＳＳＳ、またはそれらの両方に対してコドン最適化が実施される。
【００１６】
別の態様は、対象導入遺伝子と、ＤＨＦＲＦＳまたはＴＹＭＳＳＳをコードするヌクレオチド配列と、を含む核酸配列を含む、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞は、対象導入遺伝子と、ＤＨＦＲＦＳをコードするヌクレオチド配列と、を含む核酸を含み、対象導入遺伝子と、ＤＨＦＲＦＳをコードするヌクレオチド配列と、は機能可能なように連結される。いくつかの実施形態では、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞は、対象導入遺伝子と、ＴＹＭＳＳＳをコードするヌクレオチド配列と、を含む核酸を含み、対象導入遺伝子と、ＴＹＭＳＳＳをコードするヌクレオチド配列と、は機能可能なように連結される。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、自殺遺伝子である。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子は、追加で含まれる。いくつかの実施形態では、ＤＨＦＲＦＳ、ＴＹＭＳＳＳ、またはそれらの両方に対してコドン最適化が実施される。
【００１７】
別の態様では、導入遺伝子及びＤＨＦＲＦＳを発現する、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞が提供され、Ｔ細胞は、（１）導入遺伝子をコードする配列を含むポリヌクレオチドと、（２）ＤＨＦＲＦＳをコードする配列を含むポリヌクレオチドと、を含む。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、自殺遺伝子である。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子は、追加で含まれる。いくつかの実施形態では、ＤＨＦＲＦＳに対してコドン最適化が実施される。
【００１８】
別の態様では、導入遺伝子及びＴＹＭＳＳＳを発現する、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞が提供され、当該Ｔ細胞は、（１）導入遺伝子をコードする配列を含むポリヌクレオチドと、（２）ＴＹＭＳＳＳをコードする配列を含むポリヌクレオチドと、を含む。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、自殺遺伝子である。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子は、追加で含まれる。いくつかの実施形態では、ＴＹＭＳＳＳに対してコドン最適化が実施される。
【００１９】
さらに別の態様では、癌を有する患者の治療方法が提供され、当該方法は、上記の実施形態のいずれかに記載の単離されたＴ細胞に含まれるＴ細胞の、治療上有効な量での患者に対する投与を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、抗腫瘍免疫を改善するために、ＡＴｈｙＲ＋Ｔ細胞とＡＴｈｙによる治療との組み合わせ治療を使用することができる。ＡＴｈｙＲ＋表現型を有する、単離されたＴ細胞は、ＭＴＸ、５−ＦＵ、ラルチトレキセド、及びペメトレキセド、または任意の他のチミジン合成阻害剤と共に投与することができる。
【００２１】
さらに別の態様では、図のいずれかにおいて示されるか、または説明に記載の対象導入遺伝子を発現するＴ細胞の選択方法が提供される。
【００２２】
さらに別の態様では、図のいずれかにおいて示されるか、または説明に記載のＴ細胞が提供される。
【００２３】
別の態様では、図のいずれかにおいて示されるか、または説明に記載の、ＭＴＸ、５−ＦＵ、ラルチトレキセド、及びペメトレキセドのうちの１つまたは複数に対する耐性を有するヒトＴ細胞の選択的増殖方法が提供される。いくつかの実施形態では、ヒトＴ細胞は、初代ヒトＴ細胞である。
【００２４】
別の態様は、哺乳類から単離されたＴ細胞集団における制御性Ｔ細胞の濃縮方法であり、当該方法は、当該集団と、ＭＴＸ、５−ＦＵ、ラルチトレキセド、及びペメトレキセド、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるチミジン合成阻害剤と、を接触させることで、集団におけるエフェクターＴ細胞を選択的に枯渇させることによるものである。いくつかの実施形態では、哺乳類から単離されたＴ細胞集団は、ＭＴＸ及び５−ＦＵの両方と接触する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳのうちの１つまたは複数を発現する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳの両方を発現する。いくつかの実施形態では、ＤＨＦＲＦＳ、ＴＹＭＳＳＳ、またはそれらの両方に対してコドン最適化が実施される。
【００２５】
別の態様は、哺乳類から単離されたＴ細胞集団における制御性Ｔ細胞の枯渇方法であり、当該方法は、１つまたは複数のアミノグリコシダーゼの存在下で当該集団を培養することで、当該培養において制御性Ｔ細胞を選択的に枯渇させることによるものである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳのうちの１つまたは複数を発現する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳの両方を発現する。いくつかの実施形態では、ＤＨＦＲＦＳ、ＴＹＭＳＳＳ、またはそれらの両方に対してコドン最適化が実施される。
【００２６】
別の態様は、哺乳類から単離された制御性Ｔ細胞の選択方法である。方法は、チミジン合成阻害剤を用いた、ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳのうちの１つまたは複数を発現する複数のＴ細胞の処理と、制御性Ｔ細胞のマーカーを発現する制御性Ｔ細胞の選択と、を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＤＨＦＲＦＳを発現する。いくつかの実施形態では、選択段階は、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３９抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ１５２抗体、抗ＫＩ−６７抗体、抗ＬＡＰ抗体、及び抗ＦｏｘＰ３抗体のうちの１つまたは複数を使用する、磁気ビーズによる選別を用いた細胞の単離を含む。いくつかの実施形態では、チミジン合成阻害剤は、メトトレキサート（ＭＴＸ）、５−ＦＵ、ラルチトレキセド、またはペメトレキセドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、方法は、葉酸（ｆｏｌａｔｅ）、ロイコバリン（ｌｅｕｃｏｖａｒｉｎ）、及びＦＵのうちの１つまたは複数を用いた、制御性Ｔ細胞の処理をさらに含む。
【００２７】
別の態様では、哺乳類から単離された第１の複数のＴ細胞と、チミジン合成阻害剤と、を含む組成物が提供される。哺乳類から単離され、チミジン合成阻害剤を含まない第２の複数のＴ細胞と比較して、第１の複数のＴ細胞の制御性Ｔ細胞は濃縮される。
【００２８】
本発明の対象、優位性、及び特徴で、前述のもの、及び本明細書で後に明らかとなる他のものに関して、本発明の性質は、本発明の好ましい実施形態に関する下記の詳細な説明、及び添付の特許請求の範囲を参照することによって、より明瞭に理解し得るものである。
【００２９】
別の態様では、導入遺伝子及びＤＨＦＲＦＳを発現する、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞が提供され、Ｔ細胞は、（１）導入遺伝子をコードする配列を含むポリヌクレオチドと、（２）ＤＨＦＲＦＳをコードする配列を含むポリヌクレオチドと、を含む。いくつかの実施形態では、ＤＨＦＲＦＳ及び／または対象導入遺伝子をコードする配列に対してコドン最適化が実施される。いくつかの実施形態では、対象導入遺伝子と、ＤＨＦＲＦＳをコードするヌクレオチド配列とは、発現に際して、同一のｍＲＮＡにコードされる。追加の実施形態では、対象導入遺伝子をコードする配列と、ＤＨＦＲＦＳをコードするヌクレオチド配列とは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）またはリボソームスリップ配列（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｓｌｉｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）によって分離される。ある特定の実施形態では、対象導入遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ホルモン（例えば、グルカゴン）、サイトカイン、ケモカイン、自殺遺伝子、転写因子、または受容体（例えば、インテグリン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、もしくはホルモン受容体）などの細胞表面ポリペプチドをコードし得る。
【００３０】
別の態様では、導入遺伝子及びＴＹＭＳＳＳを発現する、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞が提供され、当該Ｔ細胞は、（１）導入遺伝子をコードする配列を含むポリヌクレオチドと、（２）ＴＹＭＳＳＳをコードする配列を含むポリヌクレオチドと、を含む。いくつかの実施形態では、ＴＹＭＳＳＳ及び／または対象導入遺伝子をコードする配列に対してコドン最適化が実施される。ある特定の実施形態では、対象導入遺伝子と、ＴＹＭＳＳＳをコードするヌクレオチド配列とは、発現に際して、同一のｍＲＮＡにコードされる。いくつかの実施形態では、対象導入遺伝子をコードする配列と、ＴＹＭＳＳＳをコードするヌクレオチド配列とは、ＩＲＥＳまたはリボソームスリップ配列によって分離される。特定の実施形態では、導入遺伝子及びＴＹＭＳＳＳを発現する、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞は、ＤＨＦＲＦＳをコードするヌクレオチド配列（任意選択で、ＤＨＦＲＦＳをコードするヌクレオチド配列は、機能可能なように第２の対象導入遺伝子に連結される）をさらに含む。いくつかの実施形態では、対象導入遺伝子（例えば、機能可能なようにＴＹＭＳＳＳに連結されたもの）は、増殖因子、ＣＡＲ構築物、ＴＣＲ、ホルモン（例えば、グルカゴン）、サイトカイン、ケモカイン、自殺遺伝子、転写因子（例えば、ＦｏｘＰ３）、または受容体（例えば、インテグリン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、もしくはホルモン受容体）などの細胞表面ポリペプチドである。特定の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−１２またはＩＬ−１５であり得る。
【００３１】
さらに、追加の態様は、第１の導入遺伝子の発現制御の提供方法であり、当該方法は、ＴＹＭＳＳＳをコードするヌクレオチド配列に機能可能なように連結された第１の導入遺伝子を含む核酸を含む遺伝子導入哺乳類細胞の提供を含み、当該細胞は、ＤＨＦＲＦＳをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１の導入遺伝子と、ＴＹＭＳＳＳをコードするヌクレオチド配列とは、発現に際して、同一のｍＲＮＡにコードされる。追加の実施形態では、第１の導入遺伝子をコードする配列と、ＴＹＭＳＳＳをコードするヌクレオチド配列とは、ＩＲＥＳまたはリボソームスリップ配列によって分離される。ある特定の実施形態では、第１の対象導入遺伝子は、増殖因子、ＣＡＲ構築物、ＴＣＲ、ホルモン（例えば、グルカゴン）、サイトカイン、ケモカイン、自殺遺伝子、転写因子（例えば、ＦｏｘＰ３）、または受容体（例えば、インテグリン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、もしくはホルモン受容体）などの細胞表面ポリペプチドである。特定の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−１２またはＩＬ−１５であり得る。
【００３２】
追加の実施形態では、ＤＨＦＲＦＳをコードするヌクレオチド配列は、機能可能なように第２の導入遺伝子に連結される。いくつかの実施形態では、第２の導入遺伝子と、ＤＨＦＲＦＳをコードするヌクレオチド配列とは、発現に際して、同一のｍＲＮＡにコードされる。他の実施形態では、第２の対象導入遺伝子をコードする配列と、ＤＨＦＲＦＳをコードするヌクレオチド配列とは、ＩＲＥＳまたはリボソームスリップ配列によって分離される。ある特定の実施形態では、第２の導入遺伝子は、自殺遺伝子である。特定の実施形態では、自殺遺伝子は、誘導性自殺遺伝子である。特定の実施形態では、自殺遺伝子は、誘導性カスパーゼ９である。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、Ｔ細胞である。
【００３３】
別の態様では、ＴＹＭＳＳＳと、第１の導入遺伝子をコードする配列と、をコードする組換え核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、ＴＹＭＳＳＳをコードする配列、及び／または対象導入遺伝子をコードする配列のコドンが最適化される。ある特定の実施形態では、組換え核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、対象導入遺伝子をコードする配列と、ＴＹＭＳＳＳをコードするヌクレオチド配列とは、ＩＲＥＳまたはリボソームスリップ配列によって分離される。いくつかの実施形態では、対象導入遺伝子は、増殖因子、ＣＡＲ構築物、ＴＣＲ、ホルモン（例えば、グルカゴン）、サイトカイン、ケモカイン、自殺遺伝子、転写因子（例えば、ＦｏｘＰ３）、または受容体（例えば、インテグリン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、もしくはホルモン受容体）などの細胞表面ポリペプチドである。特定の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−１２またはＩＬ−１５であり得る。
【００３４】
図面は、例にすぎず、本発明を限定するように構成されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１Ａ】ＤＮＡ複製及び細胞生存におけるチミジン合成の役割を示す経路を示す。
【図１Ｂ】ＡＴｈｙによる毒性に対する耐性を有する推定ＡＴｈｙＲ導入遺伝子の設計を示し、当該推定ＡＴｈｙＲ導入遺伝子は、ＡＴｈｙによる化学療法との組み合わせ治療において使用される可能性を有するＴ細胞に対して耐性を付与するためのものである。導入遺伝子を含む生存細胞を示すために、ＡＴｈｙＲを蛍光タンパク質と共に同時発現した。こうした導入遺伝子では、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）において、安定した導入遺伝子発現を誘導するために、スリーピングビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ）トランスポゾン／トランスポザーゼ系を利用した。この試験では、ＭＴＸ耐性を有するヒト変異タンパク質であるＤＨＦＲＦＳ（左）、５−ＦＵ耐性を有するヒト変異タンパク質であるＴＹＭＳＳＳ（中央）、及びＧ４１８耐性を有し、薬物耐性遺伝子の典型であるネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）（右）を使用した。ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳの天然コドンを置き換えて、ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳをコドン最適化（ＣｏＯｐ）型とすることで、既知の転写後制御機構がＡＴｈｙＲによる選択及び生存に影響を与えるかを試験した。
【図１Ｃ】３つの異なるパネルを示し、異なる濃度のＭＴＸ（左パネル）、５−ＦＵ（中央パネル）、及びＧ４１８（右パネル）を用いて処理した後のｅＧＦＰ＋生存ジャーカットＴ細胞の割合が示される。左パネルは、ＤＨＦＲＦＳ−２Ａ−ＧＦＰ（ＤＧ）、ＣｏＯｐ  ＤＧ、及びＤＮＡなしに関し、これらを電気穿孔によってジャーカットに導入し、２日後にＭＴＸに曝露した。中央パネルは、ＴＹＭＳＳＳ−２Ａ−ＧＦＰ（ＴＳＧ）、ＣｏＯｐ  ＴＳＧ、及びＤＮＡなしに関し、これらを電気穿孔によってジャーカットに導入し、２日目に５−ＦＵで処理した。右パネルは、ＮｅｏＲ−ＧＦＰ及びＤＮＡなしに関し、これらを電気穿孔によってジャーカットに導入し、２日目にＧ４１８で処理した。Ｃの各実験について、ｅＧＦＰ＋生存ジャーカットの割合は、薬物添加後の８〜１０日目に試験した後に得られたものである。
【図１Ｄ】天然のＤＨＦＲ及びＴＹＭＳを発現する細胞（「ＤＮＡなし」）、または発現する細胞の生存に対するＭＴＸ及びペメトレキセドの作用を示す。ＤＨＦＲＦＳとＴＹＭＳＳＳとの組み合わせによって、ＭＴＸ（左）またはペメトレキセド（右）に対する生存が増進するかを決定するために、電気穿孔によってＤＧ及びＴＹＭＳＳＳ−２Ａ−ＲＦＰ（ＴＳＲ）をジャーカットに同時導入した。
【図１Ｅ】１μＭのＭＴＸにおいて２週間選択した後、［ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳ］＋ジャーカットによって、均一かつ再現性のあるパターンの発現相関が示されたことを示す。ここでは、［ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳ］＋ジャーカットを使用した４つの別々の実験が、異なる色調の重ね合わせで示される。実験は、４〜６連で少なくとも２回、独立して繰り返した。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。；ジヒドロ葉酸（ＤＨＦ）；ＤＨＦ還元酵素（ＤＨＦＲ）；デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）；デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）；５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸（５，１０  ＣＨ２ＴＨＦ）；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）。
【図２Ａ−２Ｃ】図２Ａ−Ｉは、ＤＨＦＲＦＳ（左）、ＴＹＭＳＳＳ（右）、及びＮｅｏＲ（中央）で得られたジャーカット細胞の生存率に関する実験を示す。図２Ａ−ＩＩは、ＤＨＦＲＦＳ（左）、ＴＹＭＳＳＳ（右）、及びＮｅｏＲ（中央）で得られたｅＧＦＰの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の交互変化（ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ）に関する実験を示す。図２Ｂは、Ｒａｌで処理したジャーカットに対して、電気穿孔によってラルチトレキセドならびにＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳを同時導入すると生存が増進するかを決定したものを示す。図２Ｃは、独立して発現させたＤＨＦＲＦＳプラスミド及びＴＹＭＳＳＳプラスミドの発現相関を示す。独立したプラスミドとしてＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳを発現する細胞では、各プラスミドの発現相関が生じることが、観測から示唆された。このことは、ＤＨＦＲＦＳとＴＹＭＳＳＳとが同時制御されていることを示している可能性がある。したがって、複数濃度のＭＴＸ、Ｐｅｍ、及びＲａｌを用いた処理で、ｅＧＦＰのＭＦＩとＲＦＰのＭＦＩとが相関した。図では、直線回帰データが示される。各実験は、４〜６連で少なくとも２回、独立して繰り返した。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。電気穿孔によってモックを導入したジャーカットに勝る発現の改善、及び５μＭの５−ＦＵでは、生存の若干の改善が観測された。理論に拘束されるものではないが、生存が有意に増進しなかった理由は、５−ＦＵが毒性に寄与する機構が別に存在するためである可能性があり、これは、５−ＦＵがｍＲＮＡ及びｒＲＮＡの合成を阻害するという既知のものである可能性がある。Ｌｏｎｇｌｅｙ  ＤＢ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１０，２８５（１６）：１２４１６−１２４２５を参照のこと。
【図３Ａ】増殖スキームを示し、ＡａＰＣによる最初の刺激が示される。ＡａＰＣによる刺激の２日後に、０．１μＭのＭＴＸ、５μＭの５−ＦＵ、または１．４ｍＭのＧ４１８を共培養物に添加し、１４日目まで保持した。１〜３５日目の間、７日ごとにＡａＰＣを１：１の比で用いて共培養物を再刺激し、５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を添加した。薬物を投与した最初の１４日間、及び薬物投与終了後の２１日間、導入遺伝子の発現における表現型の変化を追跡した。
【図３Ｂ】図３Ｂ−ｉは、適切な選択薬物の存在下（２〜１４日目）、その後の非存在下（１４〜３５日目）で、ＡＴｈｙＲであるＤＨＦＲＦＳ−ＤＧ、ＴＹＭＳＳＳ−ＴＧ、［ＤＧ及びＴＳＲ］の両方、ならびにＮｅｏＲ−ＮＲＧの発現について、Ｔ細胞を追跡したものを示す。実験はすべて、生物学的に５〜６連とし、各実験は独立して２回繰り返した。＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１；＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。図３Ｂ−ｉｉは、図４Ｂ−Ｉに示されるＴ細胞が、共受容体であるＣＤ４を発現する割合を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃ−ｉは、５−ＦＵによって選択されるＡＴｈｙＲの選択を改善するために、Ｍｙｃ−ｆｆＬｕｃ−２Ａ−ＮｅｏＲ（ＮＲＦ）と、ＡＴｈｙＲ導入遺伝子である［ＤＧ及びＮＲＦ］、［ＴＳＧ及びＮＲＦ］、ならびに［ＤＧ及びＴＳＲ及びＮＲＦ］のそれぞれと、を組み合わせた発現について、Ｔ細胞を追跡したものを示す。選択は、図４Ｂ−Ｉと同一条件下で生じたが、用いた条件では、Ｇ４１８で処理した細胞の増殖促進のために、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を添加した。実験はすべて、生物学的に５〜６連とし、各実験は独立して２回繰り返した。＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１；＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。図３Ｃ−ｉｉは、図４Ｃ−Ｉに示されるＴ細胞が、共受容体であるＣＤ４を発現する割合を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄ−ｉは、電気穿孔によってＤＨＦＲＦＳと共にＴ細胞に同時導入したＤＨＦＲＦＳ、ＲＦＰ、またはＴＹＭＳＳＳ−ＲＦＰ（ＴＳＲ）の選択に対する、５−ＦＵ及びＴＹＭＳＳＳの影響の解明を示す。実験はすべて、生物学的に５〜６連とし、各実験は独立して２回繰り返した。＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１；＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。図３Ｄ−ｉｉは、図４Ｄ−Ｉに示されるＴ細胞が、共受容体であるＣＤ４を発現する割合を示す。
【図４Ａ−４Ｃ】図４Ａ〜４Ｃは、ＭＴＸ、５−ＦＵ、及び／またはＧ４１８の存在下または非存在下での、ＡＴｈｙＲ＋Ｔ細胞の増殖特性を示す。図４Ａは、電気穿孔によってＡＴｈｙＲ及びＮｅｏＲを導入した初代Ｔ細胞と、電気穿孔によってモックを導入して同一条件で処理したＴ細胞と、を２１日目に比較したものを示す。各実験は、５〜６連で少なくとも２回、独立して繰り返した。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１。図４Ｂ−Ｉは、図５Ａの実験の３５日目に増殖が継続していることを示す。各実験は、５〜６連で少なくとも２回、独立して繰り返した。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１。図４Ｂ−ＩＩは、ＮｅｏＲと、ＤＨＦＲＦＳ及び／またはＴＹＭＳＳＳとを組み合わせると初代Ｔ細胞の増殖潜在能力が３５日目に変化することを示す。各実験は、５〜６連で少なくとも２回、独立して繰り返した。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１。図４Ｃは、３５日目における初代Ｔ細胞の増殖潜在能力保護に対する５−ＦＵの影響を示す。各実験は、５〜６連で少なくとも２回、独立して繰り返した。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｈは、ｍＲＮＡ配列とは無関係に、ＤＨＦＲＦＳの下流のシス−導入遺伝子がＭＴＸ存在下で増加し、この増加は、チミジン合成が回復することによって抑制されることを示す。図５Ａは、ＭＴＸ耐性を有するＦＬＡＧ−ＤＨＦＲＦＳ−２Ａ−ｅＧＦＰ  ｐＳＢＳＯ（ＤＦＳＧ）（ｎ＝４）、ＤＦＳＧの既知のｍＲＮＡ結合要素を除去したコドン最適化（ＣｏＯｐ）ＤＦＳＧ（ｎ＝５）、及びＭＴＸ耐性のＴＹＭＳＳＳを付加することによってＭＴＸ耐性がＤＦＳＧ単独を超えて増進した［ＤＦＳＧ及びＦＬＡＧ−ＴＹＭＳＳＳ−２Ａ−ＲＦＰ  ｐＳＢＳＯ（ＴＳＳＳＲ）］（ｎ＝７）を発現するようにジャーカット細胞を遺伝子改変したものを示す。遺伝子改変したジャーカット細胞を、１μＭのＭＴＸにおいて２週間選択した後、ＭＴＸ非存在下で３〜５週間培養した。ＭＴＸ非存在下で、蛍光タンパク質が安定して発現していることが、平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって示されている。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｈは、ｍＲＮＡ配列とは無関係に、ＤＨＦＲＦＳの下流のシス−導入遺伝子がＭＴＸ存在下で増加し、この増加は、チミジン合成が回復することによって抑制されることを示す。図５Ｂ−Ｉは、ジャーカット細胞を０．５μＭのＭＴＸで７２時間処理または処理しなかったのものを示す。ＭＦＩの差異（Δ＝ＭＴＸ処理由来のｅＧＦＰのＭＦＩ−ＭＦＩ未処理由来のｅＧＦＰのＭＦＩ）が示される。図５Ｂ−ＩＩは、ジャーカットにおいてＤＨＦＲＦＳ（左ピーク）及びＣｏＯｐ  ＤＨＦＲＦＳ（右ピーク）でＭＴＸによって誘導されたｅＧＦＰのＭＦＩ変化を示す代表的なヒストグラムを示す。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｈは、ｍＲＮＡ配列とは無関係に、ＤＨＦＲＦＳの下流のシス−導入遺伝子がＭＴＸ存在下で増加し、この増加は、チミジン合成が回復することによって抑制されることを示す。図５Ｃ〜５Ｄは、細胞傷害性薬物の存在下で、初代Ｔ細胞において導入遺伝子であるＤＨＦＲＦＳ、ＴＹＭＳＳＳ、またはそれらの組み合わせを２週間選択した後、選択なしで３週間増殖させたものを示す（実施例を参照のこと）。３５日目に、ＭＴＸの存在下または非存在下で、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、及び５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を用いてＴ細胞を刺激した。図５Ｃでは、未処理の細胞の蛍光タンパク質のＭＦＩが示され、図５Ｄ−Ｉでは、０．５μＭのＭＴＸで処理してから７２時間後のΔＭＦＩが、処理なしと比較で示される。
【図５Ｄ−１】図５Ａ〜５Ｈは、ｍＲＮＡ配列とは無関係に、ＤＨＦＲＦＳの下流のシス−導入遺伝子がＭＴＸ存在下で増加し、この増加は、チミジン合成が回復することによって抑制されることを示す。図５Ｃ〜５Ｄは、細胞傷害性薬物の存在下で、初代Ｔ細胞において導入遺伝子であるＤＨＦＲＦＳ、ＴＹＭＳＳＳ、またはそれらの組み合わせを２週間選択した後、選択なしで３週間増殖させたものを示す（実施例を参照のこと）。３５日目に、ＭＴＸの存在下または非存在下で、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、及び５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を用いてＴ細胞を刺激した。図５Ｃでは、未処理の細胞の蛍光タンパク質のＭＦＩが示され、図５Ｄ−Ｉでは、０．５μＭのＭＴＸで処理してから７２時間後のΔＭＦＩが、処理なしと比較で示される。図５Ｄ−ＩＩは、ＭＴＸの存在下または非存在下で、ＤＨＦＲＦＳ＋Ｔ細胞でｅＧＦＰの蛍光シフトが観測されたことを示す代表的なヒストグラムを示す（ｎ＝５）。（ＤＮＡなし＝左端のピーク；ＤＦＳＧ及びＮＲＦ、Ｔｒｘなし＝高中央のピーク；ＤＦＳＧ及びＮＲＦ、ＭＴＸ＝高右ピーク；ＤＦＳＧ及びＴＳＳＳＲ、Ｔｒｘなし＝低中央ピーク及び低右ピーク；ＤＦＳＧ及びＴＳＳＳＲ、ＭＴＸ＝最低ピーク）
【図５Ｄ−２】図５Ａ〜５Ｈは、ｍＲＮＡ配列とは無関係に、ＤＨＦＲＦＳの下流のシス−導入遺伝子がＭＴＸ存在下で増加し、この増加は、チミジン合成が回復することによって抑制されることを示す。図５Ｃ〜５Ｄは、細胞傷害性薬物の存在下で、初代Ｔ細胞において導入遺伝子であるＤＨＦＲＦＳ、ＴＹＭＳＳＳ、またはそれらの組み合わせを２週間選択した後、選択なしで３週間増殖させたものを示す（実施例を参照のこと）。３５日目に、ＭＴＸの存在下または非存在下で、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、及び５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を用いてＴ細胞を刺激した。図５Ｃでは、未処理の細胞の蛍光タンパク質のＭＦＩが示され、図５Ｄ−Ｉでは、０．５μＭのＭＴＸで処理してから７２時間後のΔＭＦＩが、処理なしと比較で示される。図５Ｄ−ＩＩは、ＭＴＸの存在下または非存在下で、ＤＨＦＲＦＳ＋Ｔ細胞でｅＧＦＰの蛍光シフトが観測されたことを示す代表的なヒストグラムを示す（ｎ＝５）。（ＤＮＡなし＝左端のピーク；ＤＦＳＧ及びＮＲＦ、Ｔｒｘなし＝高中央のピーク；ＤＦＳＧ及びＮＲＦ、ＭＴＸ＝高右ピーク；ＤＦＳＧ及びＴＳＳＳＲ、Ｔｒｘなし＝低中央ピーク及び低右ピーク；ＤＦＳＧ及びＴＳＳＳＲ、ＭＴＸ＝最低ピーク）
【図５Ｅ−５Ｆ】図５Ａ〜５Ｈは、ｍＲＮＡ配列とは無関係に、ＤＨＦＲＦＳの下流のシス−導入遺伝子がＭＴＸ存在下で増加し、この増加は、チミジン合成が回復することによって抑制されることを示す。図５Ｅは、トランス制御性のパターンが、ＤＨＦＲ及びＴＹＭＳに連結された蛍光タンパク質で観測されたことを示す。電気穿孔によってモックを導入した未選択（ＤＮＡなし−左下のクラスター）のジャーカット及びＤＦＳＧ＋ジャーカット（右下のクラスター）が、ＲＦＰチャネルにおいて球状の外観を有している一方で、［ＤＦＳＧ及びＴＳＳＳＲ］＋ジャーカットにおいてＤＨＦＲＦＳとＴＹＭＳＳＳとが同時発現すると、直線的なクラスター化が生じる（上右のクラスター）ことが、１μＭのＭＴＸで選択され、（５Ａ）において未処理のままとしたジャーカットに由来する代表的なフロープロットによって示された。図５Ｆは、電気穿孔によってＴ細胞にＤＨＦＲＦＳを導入し、ＲＦＰ対照またはＦＬＡＧ−ＴＹＭＳＳＳ−２Ａ−ＲＦＰ  ｐＳＢＳＯ（ＴＳＳＳＲ）のいずれかを用いて同時形質転換してから、前述（５Ｃ）のように、２〜１４日目にかけて０．１μＭのＭＴＸにおいて選択して増殖させた後、ＭＴＸの非存在下で増殖を継続したものを示す。同一ドナーに由来する、初代ヒトＴ細胞の代表的なフロープロットであり、［ＤＦＳＧ及びＲＦＰ（右端のクラスター）］、［ＤＦＳＧ及びＴＳＳＳＲ（上右のクラスター）］、及び形質転換なしのＴ細胞（左下の四分円）で２１日目のものが示される。ＴＹＭＳＳＳと同時発現させると、ＤＨＦＲＦＳの直線的なクラスター化が再び確認され、これは、ＲＦＰ単独との同時発現では確認されないものである。
【図５Ｇ】図５Ａ〜５Ｈは、ｍＲＮＡ配列とは無関係に、ＤＨＦＲＦＳの下流のシス−導入遺伝子がＭＴＸ存在下で増加し、この増加は、チミジン合成が回復することによって抑制されることを示す。図５Ｇは、ＤＨＦＲＦＳとＴＹＭＳＳＳとの間の発現のつながりにおけるトランスのパターンを同定する追加試験を示し、電気穿孔によって［ＤＦＳＧ及びＴＳＳＳＲ］をジャーカットに導入し、抗葉酸物質であるＭＴＸ［０、０．０１、０．１、０．５、１、５μＭ］、ペメトレキセド［０、１０、５０、１００μＭ］、及びラルチトレキセド［０、１、５、１０μＭ］における選択で同定されたものである。２〜１４日目に実施した選択の後、ＤＦＳＧ及びＴＳＳＳＲのＭＦＩをプロットしてそれぞれの発現パターンを示した。値をプロットし、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）の相関に由来するＲ２を用いた直線フィッティングを実施して、直線回帰の傾きをグラフに示した。このデータは、技術的に４連で構築されたものである。
【図５Ｈ】図５Ａ〜５Ｈは、ｍＲＮＡ配列とは無関係に、ＤＨＦＲＦＳの下流のシス−導入遺伝子がＭＴＸ存在下で増加し、この増加は、チミジン合成が回復することによって抑制されることを示す。図５Ｈは、ＤＨＦＲ及びＴＹＭＳの転写後制御のモデルを示す。図５Ｇに示されるものを除き、実験はすべて独立して２回繰り返した。多変量解析を用いる有意差の決定には、クラスカル・ワリス（Ｋｒｕｓｋａｌｌ−Ｗａｌｌｉｓ）検定を使用した；＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。ＴＭＰ−チミジン一リン酸；ＵＭＰ−ウリジン一リン酸；ＤＨＦ−ジヒドロ葉酸；ＴＨＦ−テトラヒドロ葉酸；５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸（５，１０  ＣＨ２ＴＨＦ）。
【図５Ｉ】図５Ｉ〜５Ｌは、ＭＴＸ存在下で、ＤＨＦＲＦＳとＴＹＭＳＳＳとを同時発現することによって、ＴＹＭＳＳＳ及びシス導入遺伝子の発現制御が生じることを示す。図５Ｉ〜５Ｊは、図５Ｆに記載の実験に由来するＴ細胞を３５日目まで増殖させたものを示す。抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、及び異なる濃度のＭＴＸを用いて、Ｔ細胞を７２時間刺激した。（５Ｉ）では、ＤＨＦＲＦＳのｅＧＦＰのＭＦＩ変化がＭＴＸによって誘導されたことが示され、（５Ｊ）では、ＲＦＰに対するＭＴＸの影響、及びＴＹＭＳＳＳと共に同時発現したＲＦＰ（ＴＳＳＳＲ）に対するＭＴＸの影響が示される（ｎ＝６で独立して２回繰り返し、二元配置ＡＮＯＶＡによって解析し、シダック（Ｓｉｄａｋ）の多重比較検定を実施）。
【図５Ｊ】図５Ｉ〜５Ｌは、ＭＴＸ存在下で、ＤＨＦＲＦＳとＴＹＭＳＳＳとを同時発現することによって、ＴＹＭＳＳＳ及びシス導入遺伝子の発現制御が生じることを示す。図５Ｉ〜５Ｊは、図５Ｆに記載の実験に由来するＴ細胞を３５日目まで増殖させたものを示す。抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、及び異なる濃度のＭＴＸを用いて、Ｔ細胞を７２時間刺激した。（５Ｉ）では、ＤＨＦＲＦＳのｅＧＦＰのＭＦＩ変化がＭＴＸによって誘導されたことが示され、（５Ｊ）では、ＲＦＰに対するＭＴＸの影響、及びＴＹＭＳＳＳと共に同時発現したＲＦＰ（ＴＳＳＳＲ）に対するＭＴＸの影響が示される（ｎ＝６で独立して２回繰り返し、二元配置ＡＮＯＶＡによって解析し、シダック（Ｓｉｄａｋ）の多重比較検定を実施）。
【図５Ｋ】図５Ｉ〜５Ｌは、ＭＴＸ存在下で、ＤＨＦＲＦＳとＴＹＭＳＳＳとを同時発現することによって、ＴＹＭＳＳＳ及びシス導入遺伝子の発現制御が生じることを示す。図５Ｋは、この制御パターンを臨床的に関連する問題に適用した：サイトカインであるインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、Ｔ細胞の抗腫瘍活性を強力に促進するものであるが、毒性が非常に強い。ＩＬ−１２の発現を調節するために、ＴＹＭＳＳＳに続いてＩＬ−１２を発現する、ＴＳＳＳＩＬ−１２と呼ばれる構築物と、ＤＦＳｉＣ９という構築物と、を組み合わせて使用した。ＤＦＳｉＣ９は、Ｔ細胞をＤＨＦＲＦＳで選択するか、またはＴ細胞を誘導性カスパーゼ９（ｉＣ９）で枯渇させる能力を有する。同一ドナーの代表的なフロー図は、［ＤＦＳｉＣ９及びＴＳＳＳＩＬ−１２］を発現するＴ細胞においてＩＬ−１２及びｃ−Ｍｙｃ−ｉＣ９が細胞内で発現していることを示している。示されるこうした細胞は、２〜１４日目に０．１μＭのＭＴＸにおいて選択した後の２１日目のものであり、１４日〜２１日目に０．５μＭのＭＴＸで次の処理を実施した細胞（右クラスター）または未実施の細胞（左クラスター）である。細胞からのＩＬ−１２排出を６時間遮断した後、細胞内染色を実施した。ゲーティングは、同一の方法で染色した、形質転換なしの未選択Ｔ細胞の染色に基づくものである。
【図５Ｌ】図５Ｉ〜５Ｌは、ＭＴＸ存在下で、ＤＨＦＲＦＳとＴＹＭＳＳＳとを同時発現することによって、ＴＹＭＳＳＳ及びシス導入遺伝子の発現制御が生じることを示す。図５Ｌは、３つのドナーを（Ｋ）と同様に処理し、０．５μＭのＭＴＸで処理してから７日後に確認された導入遺伝子の発現変化を示す。各測定値は、ｔ−検定によって解析した。ｎｓ＝有意差なし；＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【図６Ａ−６Ｃ】図６は、ＡＴｈｙＲの実験の３５日目における導入遺伝子発現のフロープロットを示す。フロープロットは、ドナーＴ細胞における導入遺伝子発現の選択及び維持を特徴づけるように設計された一連の実験の３５日目におけるＣＤ４及びＧＦＰの発現を示す。上記のフロープロットで確認されたように、Ｔ細胞は、３５日間増殖したものであり、２〜１４日目は、細胞傷害性薬物であるＭＴＸ、５−ＦＵ、Ｇ４１８、またはそれらの組み合わせの存在下にあったものである。図６Ａは、図３Ｂに記載の実験に相当する実験の状態を示す。図６Ｂは、図３Ｃに記載の実験に相当する実験の状態を示す。図６Ｃは、図３Ｄに記載の実験に相当する実験の状態を示す。
【図６Ｄ】図６は、ＡＴｈｙＲの実験の３５日目における導入遺伝子発現のフロープロットを示す。フロープロットは、ドナーＴ細胞における導入遺伝子発現の選択及び維持を特徴づけるように設計された一連の実験の３５日目におけるＣＤ４及びＧＦＰの発現を示す。上記のフロープロットで確認されたように、Ｔ細胞は、３５日間増殖したものであり、２〜１４日目は、細胞傷害性薬物であるＭＴＸ、５−ＦＵ、Ｇ４１８、またはそれらの組み合わせの存在下にあったものである。図６Ｄは、図６Ｂに記載の実験の３５日目にｆｆＬｕｃ−２Ａ−ＮｅｏＲ（ＮＲＦ）が存在することを示し、Ｄ−ルシフェリンを使用することで、Ｔ細胞において化学発光を誘導して示されたものである。各実験は、６連で少なくとも２回、独立して繰り返した。代表的なフロープロットが示される。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図７Ａ−１】図７は、ＭＴＸにおいて７２時間処理した後、ＡＴｈｙＲ＋Ｔ細胞及びＡＴｈｙＲｎｅｇＴ細胞のＡＴｈｙＲによる救助（ｒｅｓｃｕｅ）を実施したものを示す。異なる用量のＭＴＸ［０、０．１、０．５、１μＭ］と共に、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、及びＩＬ−２を用いて、図３Ｄに記載の実験に由来するＴ細胞を３５日目に７２時間刺激した。図７Ａは、ゲーティング方針及び代表的なフロープロットを示す。
【図７Ａ−２】図７は、ＭＴＸにおいて７２時間処理した後、ＡＴｈｙＲ＋Ｔ細胞及びＡＴｈｙＲｎｅｇＴ細胞のＡＴｈｙＲによる救助（ｒｅｓｃｕｅ）を実施したものを示す。異なる用量のＭＴＸ［０、０．１、０．５、１μＭ］と共に、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、及びＩＬ−２を用いて、図３Ｄに記載の実験に由来するＴ細胞を３５日目に７２時間刺激した。図７Ａは、ゲーティング方針及び代表的なフロープロットを示す。
【図７Ｂ】図７は、ＭＴＸにおいて７２時間処理した後、ＡＴｈｙＲ＋Ｔ細胞及びＡＴｈｙＲｎｅｇＴ細胞のＡＴｈｙＲによる救助（ｒｅｓｃｕｅ）を実施したものを示す。異なる用量のＭＴＸ［０、０．１、０．５、１μＭ］と共に、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、及びＩＬ−２を用いて、図３Ｄに記載の実験に由来するＴ細胞を３５日目に７２時間刺激した。図７Ｂは、ＡＴｈｙＲ＋Ｔ細胞の培養における生存率の増進を示す。
【図７Ｃ】図７は、ＭＴＸにおいて７２時間処理した後、ＡＴｈｙＲ＋Ｔ細胞及びＡＴｈｙＲｎｅｇＴ細胞のＡＴｈｙＲによる救助（ｒｅｓｃｕｅ）を実施したものを示す。異なる用量のＭＴＸ［０、０．１、０．５、１μＭ］と共に、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、及びＩＬ−２を用いて、図３Ｄに記載の実験に由来するＴ細胞を３５日目に７２時間刺激した。図７Ｃは、生存，ＣＤ３＋，ＧＦＰｎｅｇ，ＲＦＰｎｅｇＴ細胞（ＡＴｈｙＲｎｅｇ）の生存評価を示す。各実験は、生物学的に全部で６連として、少なくとも２回、独立して繰り返した。代表的なフロープロットが、開始値を１として示される；ｎｓ＝有意差なし；＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１；＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【図８Ａ】図８は、ＡＴｈｙＲによる対象遺伝子の選択例を示す。自殺遺伝子などの対象遺伝子を単離することが困難な場合は、ＤＨＦＲＦＳによって選択を増やすことが望ましい。図８Ａは、（Ａ）に示されるプラスミドＤＦＳｉＣ９において、ＤＨＦＲＦＳと共に、自殺遺伝子である誘導性カスパーゼ９（ｉＣ９）が発現するように設計された構築物を示す。
【図８Ｂ】図８は、ＡＴｈｙＲによる対象遺伝子の選択例を示す。自殺遺伝子などの対象遺伝子を単離することが困難な場合は、ＤＨＦＲＦＳによって選択を増やすことが望ましい。図８Ｂは、３人の健康なドナーに由来するＰＢＭＣにおいて、図８Ａに示される構築物を試験したものを示し、当該ＰＢＭＣは、２日目から、ＯＫＴ３結合型ＡａＰＣを１：１の比で用いて刺激すると共にＭＴＸで処理し、生存する場合は、７日目まで継続したものが示される。
【図８Ｃ】図８は、ＡＴｈｙＲによる対象遺伝子の選択例を示す。自殺遺伝子などの対象遺伝子を単離することが困難な場合は、ＤＨＦＲＦＳによって選択を増やすことが望ましい。図８Ｃは、ＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＤＦＳｉＣ９、及びＳＢトランスポザーゼを電気穿孔によってＴ細胞に導入し、ＭＴＸの存在下で、ＣＡＲＬ＋Ｋ５６２で２１日間増殖させることで、ＣＡＲＬを用いて各導入遺伝子の選択を実施したものを示す。ＣＡＲＬは、ＣＡＲリガンドの略語である。同時刺激性のＴ細胞受容体であるＣＤ４、ＣＤ８、ならびに導入遺伝子であるＣＡＲ及びＤＨＦＲＦＳの２１日目の発現が示され、ＣＡＲＬで増殖した遺伝子導入Ｔ細胞と、電気穿孔によってモックが導入され、ＯＫＴ３結合型ＡａＰＣクローン４で増殖したＴ細胞と、が比較されている。実験は、４つの正常なドナーで実施し、２回繰り返した。各比較の有意性は、二元配置ＡＮＯＶＡによって最初に決定した後、シダック（Ｓｉｄａｋ）の事後解析を実施した；＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【図８Ｄ】図８は、ＡＴｈｙＲによる対象遺伝子の選択例を示す。自殺遺伝子などの対象遺伝子を単離することが困難な場合は、ＤＨＦＲＦＳによって選択を増やすことが望ましい。図８Ｄは、ＤＨＦＲＦＳ＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞の細胞傷害性に対するＭＴＸの作用を試験したものを示し、当該試験は、１４日目の刺激の後、ＭＴＸの存在下または非存在下で、ＣＡＲ＋Ｔ細胞を７日間刺激することによって実施した。細胞傷害性は、ＣＤ１９陽性またはＣＤ１９陰性のマウスリンパ種ＥＬ−４細胞を使用し、クロム放出アッセイ（ＣＲＡ）によって２１日目に評価した。Ｔ細胞は、標的とエフェクターとの比を１：５として、ＥＬ−４と共に同時インキュベートした。実験は、４つの正常なドナーで実施し、２回繰り返した。各比較の有意性は、二元配置ＡＮＯＶＡによって最初に決定した後、シダック（Ｓｉｄａｋ）の事後解析を実施した；＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【図８Ｅ】図８は、ＡＴｈｙＲによる対象遺伝子の選択例を示す。自殺遺伝子などの対象遺伝子を単離することが困難な場合は、ＤＨＦＲＦＳによって選択を増やすことが望ましい。図８Ｅは、Ｔ細胞を１０ｎＭのＡＰ２０１８７において４８時間休止させることによって、２１日目にｉＣ９の機能性を評価したもの示す。Ｔ細胞は、ＭＴＸの存在下または非存在下で事前に７日間刺激したものである。生存ＣＡＲ＋Ｔ細胞と、対応する未処理細胞と、が比較されている。実験は、４つの正常なドナーで実施し、２回繰り返した。各比較の有意性は、二元配置ＡＮＯＶＡによって最初に決定した後、シダック（Ｓｉｄａｋ）の事後解析を実施した；＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。ＣＡＲというよりはむしろ、ｉＣ９と共にＤＨＦＲＦＳを同時発現することで、ｉＣ９の化学的２量体形成誘導物質であるＡＰ２０１８７の添加を介してＴ細胞を除去するという潜在能力が追加された。ＡＰ２０１８７を添加することによって、ＭＴＸとは無関係に、休止（ｒｅｓｔｉｎｇ）ＣＡＲ＋Ｔ細胞が有意に枯渇した。このことは、ＤＦＳｉＣ９が、ｉＣ９の発現の選択を生じさせることができ、遺伝子改変したＴ細胞を必要に応じて枯渇させることができるということを示している。ＤＨＦＲＦＳを使用することで、抗原特異性及び抗原発現とは無関係に、Ｔ細胞における導入遺伝子発現の選択が生じるという利点が得られ、このことが、ＤＨＦＲＦＳを、さまざまなＴ細胞試験において使用するためのポータブル性が向上したツールとしている。
【図９】チミジン合成の転写後制御によって、ＤＨＦＲからＴＹＭＳにかけての発現がロックされることを示す。ＤＨＦＲ発現のＭＴＸ誘導性の増加は、チミジン合成（ＵＭＰ−ウリジン一リン酸からＴＭＰ−チミジン一リン酸へ）が回復することによって阻害された。同様に、ＭＴＸ誘導性のＴＹＭＳ発現の減少は、ＤＨＦ−ジヒドロ葉酸を還元してＴＨＦ−テトラヒドロ葉酸とするＤＨＦＲ活性が回復することによって正常レベルに回復した。
【図１０Ａ−１０Ｄ】図１０は、ＭＴＸによるＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の薬物選択は、部分的には毒性を介して生じることを示す。ＭＴＸによるＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の既知の選択は、ＭＴＸ作用に寄与する酵素を標的とすることによって分析された。ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３は、ＰＢＭＣの希少成分であるため、薬物に基づく阻害は、現象解析のために元々は探索された。ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の選択をアッセイするために、ＭＴＸと類似の作用を有する薬物が複数使用された。今回は、γ−照射、Ｇ４１８、及びシスプラチン（ＣＤＤＰ）を対照として使用した。これは、こうした処理のいずれも、ＭＴＸの既知の酵素標的に作用しないためである。図１０Ａは、各薬物とＭＴＸの酵素標的との関連を示す。図１０Ｂ−Ｉは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８及び可溶性ヒトＩＬ−２を用いて刺激したＰＢＭＣに対して各処理を致死用量で実施し、７日後に生存率をアッセイしたものを示す。図１０Ｂ−ＩＩは、こうした処理の結果として、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３にさまざまな選択が生じ、その７日目が示される。ＤＨＦＲ、ＴＹＭＳ、またはＧＡＲＦＴを標的とする葉酸アナログが、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の有意な選択能力を有さなかったことから、この選択には、ＡＩＣＡＲｔｆ／イノシン一リン酸（ＩＭＰ）シクロヒドロラーゼ（ＡＴＩＣ）の阻害が寄与することが示唆された。ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の選択におけるＡＴＩＣ阻害剤の寄与を分析した後、用量依存試験を実施した。Ｂ−ＩＩにおける試験では、Ｇ４１８がＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３を枯渇させることが確認されたため、これを負の対照として使用し、ラパマイシン（Ｒａｐａ）によるＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の既知の選択を正の対照とした。ＡＴＩＣを阻害することが知られる非葉酸アナログ（ｉＡＴＩＣ）を、ＡＴＩＣの特異的阻害剤として使用した。図１０Ｃ−Ｉは、Ｇ４１８の細胞傷害性を示す。図１０Ｄ−Ｉは、ＭＴＸの細胞傷害性を示す。図１０Ｃ−ＩＩは、Ｇ４１８を用いたＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の選択を示す。図１０Ｄ−ＩＩは、ＭＴＸを用いたＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の選択を示す。
【図１０Ｅ−１０Ｆ】図１０は、ＭＴＸによるＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の薬物選択は、部分的には毒性を介して生じることを示す。ＭＴＸによるＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の既知の選択は、ＭＴＸ作用に寄与する酵素を標的とすることによって分析された。ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３は、ＰＢＭＣの希少成分であるため、薬物に基づく阻害は、現象解析のために元々は探索された。ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の選択をアッセイするために、ＭＴＸと類似の作用を有する薬物が複数使用された。今回は、γ−照射、Ｇ４１８、及びシスプラチン（ＣＤＤＰ）を対照として使用した。これは、こうした処理のいずれも、ＭＴＸの既知の酵素標的に作用しないためである。図１０Ｅ−Ｉは、ｉＡＴＩＣの細胞傷害性を示す。図１０Ｆ−Ｉは、Ｒａｐａの細胞傷害性を示す。図１０Ｅ−ＩＩは、ｉＡＴＩＣを用いたＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の選択を示す。図１０Ｆ−ＩＩは、Ｒａｐａを用いたＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の選択を示す。
【図１０Ｇ】図１０は、ＭＴＸによるＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の薬物選択は、部分的には毒性を介して生じることを示す。ＭＴＸによるＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の既知の選択は、ＭＴＸ作用に寄与する酵素を標的とすることによって分析された。ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３は、ＰＢＭＣの希少成分であるため、薬物に基づく阻害は、現象解析のために元々は探索された。ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の選択をアッセイするために、ＭＴＸと類似の作用を有する薬物が複数使用された。今回は、γ−照射、Ｇ４１８、及びシスプラチン（ＣＤＤＰ）を対照として使用した。これは、こうした処理のいずれも、ＭＴＸの既知の酵素標的に作用しないためである。図１０Ｇは、ＣＤ４及びＦｏｘＰ３の発現を対象としたフロープロットを示す。Ｒａｐａの作用と類似してｉＡＴＩＣによってＦｏｘＰ３の発現が増進しており、このことは、ＭＴＸによる選択が、細胞傷害性に部分的に依存すると共に、部分的にはＡＴＩＣの阻害によるものであり、その結果として、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の選択が増進することを示している。アッセイはすべて、４〜７つのドナーを使用して実施し、独立して２〜３回繰り返した。統計学的有意性は、生存率については一元配置ＡＮＯＶＡを使用し、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の割合についてはクラスカル・ワリス（Ｋｒｕｓｋａｌｌ−Ｗａｌｌｉｓ）検定を使用して評価した；＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【図１１Ａ】図１１は、ＭＴＸの抗ＤＨＦＲ作用及び抗ＴＹＭＳ作用に対する耐性を介して生じる、初代Ｔ細胞からのＴｒｅｇの選択について得られた相関性の知見を示す。図１１Ａは、各実験においてＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の選択を２１日目に評価したものを示す。ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の選択についての評価は、各実験において２１日目に実施した。Ａでは、図２のカラムＩと対応する実験におけるＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の選択が示される。ＮｅｏＲを用いることでＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の救助が生じ、ＭＴＸによるＤＨＦＲＦＳ選択を用いることでＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の早期選択が生じることは、注目すべきことである。
【図１１Ｂ】図１１は、ＭＴＸの抗ＤＨＦＲ作用及び抗ＴＹＭＳ作用に対する耐性を介して生じる、初代Ｔ細胞からのＴｒｅｇの選択について得られた相関性の知見を示す。図１１Ｂは、同一実験の３５日目の刺激後のフロープロットを示し、上の横列はＦｏｘＰ３とＩＬ−２との同時発現、中央の横列はＦｏｘＰ３とＬＡＰとの同時発現、下の横列はＦｏｘＰ３とＣＴＬＡ−４との同時発現である。この実験は、５つのドナーを利用したものであり、独立して２回繰り返した。有意性は、二元配置ＡＮＯＶＡ及びシダック（Ｓｉｄａｋ）の事後解析によって評価した；＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１。
【図１２Ａ−１２Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｄは、ＭＴＸの抗ＤＨＦＲ作用及び抗ＴＹＭＳ作用に対する耐性を有する初代Ｔ細胞においてＴｒｅｇが優先的に増殖することを示す。ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の選択に対する各経路の寄与を評価するために、ＤＨＦＲＦＳ導入遺伝子及びＴＹＭＳＳＳ導入遺伝子を電気穿孔によって初代Ｔ細胞に導入した。ＤＨＦＲＦＳ導入遺伝子及びＴＹＭＳＳＳ導入遺伝子は、それぞれＭＴＸの抗ＤＨＦＲ作用及び抗ＴＹＭＳ作用に対する耐性を有するものである。薬物耐性導入遺伝子発現するプラスミドを電気穿孔によってＴ細胞に導入し、週に１回、人工抗原提示細胞（ＡａＰＣ）を１：１の比で用いて刺激した。ＴＹＭＳＳＳ−２Ａ−ＲＦＰ（ＴＳＲ）と組み合わせてＭＴＸ及び５ＦＵの両方を使用して選択するか、または対照選択ベクターであるＮｅｏＲ−２Ａ−ＧＦＰ（ＮＲＧ）と組み合わせてＧ４１８を使用して選択することで、Ｔ細胞を２週間選択した。５−ＦＵによるＴＹＭＳＳＳの選択は不完全であった。したがって、カラムＩＩに示される実験では、形質転換されなかったＴ細胞を除去するために、ＭＴＸ耐性導入遺伝子であるＤＧ、ＴＳＧ、または［ＤＧ及びＴＳＲ］と共に、ｆｆＬｕｃ−２Ａ−ＮｅｏＲ（ＮＲＦ）ベクターを含めた。各導入遺伝子を対象とした同等の選択によって、ＭＴＸ耐性のＤＨＦＲが存在すると、ＭＴＸによってＴｒｅｇの選択が増進することが示された。ＴＹＭＳの酵素活性または５−ＦＵが、Ｔｒｅｇの選択の一部を担ったのかどうかということは依然として不明であった。したがって、Ｔｒｅｇの選択におけるＴＹＭＳ阻害の影響を試験するために、カラムＩＩＩに示される実験を実施した。Ｔｒｅｇ表現型の選択は、５−ＦＵと関連するが、ＴＹＭＳ活性とは無関係であることが明らかとなった。生物学的に５〜６連とした群間の差異評価には、クラスカル・ワリス（Ｋｒｕｓｋａｌｌ−Ｗａｌｌｉｓ）検定を使用し、試験は独立して２回繰り返した；＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１。
【図１２Ｃ−１２Ｄ】図１２Ａ〜１２Ｄは、ＭＴＸの抗ＤＨＦＲ作用及び抗ＴＹＭＳ作用に対する耐性を有する初代Ｔ細胞においてＴｒｅｇが優先的に増殖することを示す。ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の選択に対する各経路の寄与を評価するために、ＤＨＦＲＦＳ導入遺伝子及びＴＹＭＳＳＳ導入遺伝子を電気穿孔によって初代Ｔ細胞に導入した。ＤＨＦＲＦＳ導入遺伝子及びＴＹＭＳＳＳ導入遺伝子は、それぞれＭＴＸの抗ＤＨＦＲ作用及び抗ＴＹＭＳ作用に対する耐性を有するものである。薬物耐性導入遺伝子発現するプラスミドを電気穿孔によってＴ細胞に導入し、週に１回、人工抗原提示細胞（ＡａＰＣ）を１：１の比で用いて刺激した。ＴＹＭＳＳＳ−２Ａ−ＲＦＰ（ＴＳＲ）と組み合わせてＭＴＸ及び５ＦＵの両方を使用して選択するか、または対照選択ベクターであるＮｅｏＲ−２Ａ−ＧＦＰ（ＮＲＧ）と組み合わせてＧ４１８を使用して選択することで、Ｔ細胞を２週間選択した。５−ＦＵによるＴＹＭＳＳＳの選択は不完全であった。したがって、カラムＩＩに示される実験では、形質転換されなかったＴ細胞を除去するために、ＭＴＸ耐性導入遺伝子であるＤＧ、ＴＳＧ、または［ＤＧ及びＴＳＲ］と共に、ｆｆＬｕｃ−２Ａ−ＮｅｏＲ（ＮＲＦ）ベクターを含めた。各導入遺伝子を対象とした同等の選択によって、ＭＴＸ耐性のＤＨＦＲが存在すると、ＭＴＸによってＴｒｅｇの選択が増進することが示された。ＴＹＭＳの酵素活性または５−ＦＵが、Ｔｒｅｇの選択の一部を担ったのかどうかということは依然として不明であった。したがって、Ｔｒｅｇの選択におけるＴＹＭＳ阻害の影響を試験するために、カラムＩＩＩに示される実験を実施した。Ｔｒｅｇ表現型の選択は、５−ＦＵと関連するが、ＴＹＭＳ活性とは無関係であることが明らかとなった。生物学的に５〜６連とした群間の差異評価には、クラスカル・ワリス（Ｋｒｕｓｋａｌｌ−Ｗａｌｌｉｓ）検定を使用し、試験は独立して２回繰り返した；＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１。
【図１３】Ｔｒｅｇの選択に影響すると考えられる生化学的相互作用及びタンパク質相互作用の図表記を示す。
【図１４Ａ】図１４は、複製性ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３を選択的に枯渇させるアミノグリコシドであるＧ４１８によるリボソーム阻害を示す。図１４Ａは、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）、またはラパマイシンの濃度を増やして存在させ、抗ＣＤ３／ＣＤ２８及びＩＬ−２を用いて、解凍ＰＢＭＣを７日間刺激し、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３を選択したものを示す。
【図１４Ｂ−１４Ｅ】図１４は、複製性ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３を選択的に枯渇させるアミノグリコシドであるＧ４１８によるリボソーム阻害を示す。図１４Ｂは、ＦｏｘＰ３及びＣＤ４の発現のフロープロットを示し、これによって、１つのドナーで、各薬物使用後の代表的な傾向が示された。図１４Ｃの上パネルは、Ｇ４１８の存在下または非存在下で９日の過程にわたって、未刺激の解凍ＰＢＭＣにおけるＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の減少を試験したものを示し、下パネルは、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の増殖及び非増殖に対するＧ４１８の作用を示し、Ｋｉ−６７によって示されるものである。図１４Ｄにおいて、１つドナーを対象とした代表的なフロープロットを示し、これによって、上パネルでは、ＣＤ４及びＦｏｘＰ３の発現に対するＧ４１８の作用が示され、下パネルでは、ＦｏｘＰ３及びＫｉ−６７の発現が示されている。ゲンタマイシンは、ＦＤＡが承認したアミノグリコシド抗生物質であり、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の枯渇について、７日の期間にわたってＧ４１８と比較して後に試験した。実験はすべて、６つの正常なドナーで実施し、独立して２回繰り返した。図１４Ｅは、アミノグリコシン（ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｎ）であるゲンタマイシン処理から７日後の休止ＰＢＭＣにおけるＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の枯渇を示し、これによって、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の枯渇におけるアミノグリコシドの作用が示される。ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の枯渇が、Ｔｒｅｇマーカーの発現減少、またはＴｒｅｇに対する選択毒性と対応するかどうかを次に試験した。
【図１５Ａ−１５Ｄ】図１５は、選別したＴｒｅｇに対するＭＴＸ、５−ＦＵ、及びＧ４１８の作用を示す。図１５Ａは、前述のようにＭＴＸ、５−ＦＵ、またはＧ４１８を用いてＴｒｅｇ及びＴｅｆｆを７日間処理した後、実験の残りの２週間は、薬物なしで刺激したものを図式として示す。図１５Ｂは、図１５Ｂは、Ｔｒｅｇの選択または枯渇に対する各薬物の寄与を決定するために、２１日目にＴｒｅｇのマーカー及び活性を評価したものを示し、Ｂでは、２１日目の生存ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３が示される。図１５Ｃは、可溶性の抗ＣＤ３／ＣＤ２８及びＩＬ−２を用いて４８時間刺激した後のＴ細胞の評価を示し、Ｃ−Ｉでは、ＦｏｘＰ３とＣＤ２５との同時発現の評価、Ｃ−ＩＩでは、ＦｏｘＰ３とＣＴＬＡ−４との同時発現の評価、Ｃ−ＩＶでは、ＦｏｘＰ３とＬＡＰとの同時発現の評価が示される。Ｃ−ＩＩＩでは、ＦｏｘＰ３を発現するＴ細胞におけるＩＬ−２分泌の減少を評価するために、ＰＭＡ／イオノマイシンを用いて６時間刺激した。Ｄでは、処理したＴｒｅｇと未処理のＴｅｆｆとを混合することによって７２時間の抑制アッセイを実施し、２つの別々の濃度で［３Ｈ］チミジンの取り込みを観測したものが示される。この実験は、５つの正常なドナーで実施し、２回繰り返した。実験はすべて、二元配置ＡＮＯＶＡで評価し、有意性は、シダック（Ｓｉｄａｋ）の事後解析によって決定した；＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【図１６Ａ】図１６は、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３を刺激することで、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）キナーゼ（ＡＭＰＫ）の活性化が増進し、翻訳伸長因子であるｅＥＦ２の阻害が生じることを示す。刺激を実施及び未実施の実験においてゲーティングを実施することによって、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｎｅｇＴ細胞からのＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の差次化が達成された。図１６Ａは、上パネルは、刺激後にＴ１７２のリン酸化によって活性化したＡＭＰＫの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示し、下パネルは、部位Ｓ２３５／Ｓ２３６のリン酸化によって活性化したＳ６のＭＦＩを示す。
【図１６Ｂ】図１６は、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３を刺激することで、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）キナーゼ（ＡＭＰＫ）の活性化が増進し、翻訳伸長因子であるｅＥＦ２の阻害が生じることを示す。刺激を実施及び未実施の実験においてゲーティングを実施することによって、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｎｅｇＴ細胞からのＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の差次化が達成された。図１６Ｂは、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３及びＣＤ４＋ＣＤ２５ｎｅｇＴ細胞のリン酸化の変化と、ゲートしたＣＤ４＋細胞におけるＦｏｘＰ３の発現と、を関連付けたフロープロットを示し、上パネルでは、ＡＭＰＫのリン酸化が対象であり、下パネルでは、Ｓ６のリン酸化が対象とされる。
【図１６Ｄ】図１６は、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３を刺激することで、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）キナーゼ（ＡＭＰＫ）の活性化が増進し、翻訳伸長因子であるｅＥＦ２の阻害が生じることを示す。刺激を実施及び未実施の実験においてゲーティングを実施することによって、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｎｅｇＴ細胞からのＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の差次化が達成された。図１６Ｄは、イメージサイトメーターをｐ−ｅＥＦ２  Ｔ５６のＭＦＩの解析に使用したものを示し、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の活性化が増加していることが示される。
【図１６ＣＥ】図１６は、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３を刺激することで、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）キナーゼ（ＡＭＰＫ）の活性化が増進し、翻訳伸長因子であるｅＥＦ２の阻害が生じることを示す。刺激を実施及び未実施の実験においてゲーティングを実施することによって、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｎｅｇＴ細胞からのＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の差次化が達成された。図１６Ｃは、刺激後のＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３における蛍光変化及び形態学的変化を示すイメージサイトメトリーギャラリーである。図１６Ｅは、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３ｎｅｇＴ細胞に由来する差異をイメージサイトメトリーギャラリーで示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。本発明の試験を実施する際は、本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法及び材料を使用することができるが、本明細書では、好ましい材料及び方法が記載される。本発明の説明及び請求では、下記の用語が使用されることになる。
【００３７】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態の説明のみを目的とし、限定は意図されないと理解されることにもなる。別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語はすべて、当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。下記の用語が以下に提供される。
【００３８】
本明細書では、「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、その冠詞の文法的な対象の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指す。例として、「要素」は、１つの要素または複数の要素を意味する。したがって、例えば、「細胞」という記載は、同一型の複数の細胞を含む。
【００３９】
本明細書では、「約」は、量、時間的な期間、及び同様のものなどの、測定可能な値を指すとき、特定の値からの＋／−２０％または＋／−１０％、より好ましくは、＋／−５％、さらにより好ましくは＋／−１％、及びさらにより好ましくは＋／−０．１％の変動を含むことを意味し、したがって、変動は、開示の方法を実施するために妥当なものである。
【００４０】
「動物」は、脊椎動物（例えば、カエル、サンショウウオ、ニワトリ、またはウマ）及び無脊椎動物（例えば、虫（ｗｏｒｍ）等）を含む、動物界の任意のメンバーを意味する。「動物」は、「哺乳類」を含むことも意味する。好ましい動物には、家畜動物（例えば、ウシ、バッファロー、ウマ、ヒツジ、ブタ、及びヤギなどの有蹄動物）ならびにげっ歯類（例えば、マウス、ハムスター、ラット、及びモルモット）、イヌ、ネコ、霊長類、オオカミ（ｌｕｐｉｎｅ）、ラクダ科、シカ科、げっ歯類、トリ、及び魚類が含まれる。
【００４１】
本明細書では、「抗体」という用語は、完全な未変化の抗体、ならびにそのＦａｂ断片及びＦ（ａｂ）２断片を指すことを意味する。完全な未変化の抗体には、マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、及びヒト化抗体などのモノクローナル抗体が含まれる。抗体の産生、完全な未変化の抗体、Ｆａｂ断片、及びＦ（ａｂ）２断片のタンパク質構造、ならびにそのような分子をコードする遺伝子配列の構成はよく知られており、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）において説明されており、当該文献は、参照によって本明細書に援用される。
【００４２】
本明細書では、「自己の」という用語は、それが個体に後に再導入されることになる個体と同一の個体から得られた任意の材料を指すことを意味する。
【００４３】
本明細書では、「有効量」は、治療的または予防的な利点を与える量を意味する。
【００４４】
「コードする」は、定義されたヌクレオチド配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）または定義されたアミノ酸配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおいて他のポリマー及び巨大分子の合成のための鋳型として働く、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどの、ポリヌクレオチドにおける特定のヌクレオチド配列の固有特性、ならびにそこから生じる生物学的特性を指す。したがって、細胞または他の生物学的な系において、その遺伝子に対応するｍＲＮＡが転写及び翻訳されることで、そのタンパク質が産生するのであれば、遺伝子は、タンパク質をコードする。ｍＲＮＡ配列と同一のヌクレオチド配列であり、通常、配列リストにおいて提供されるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖と、は両方共、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードするものであると称することができる。
【００４５】
「エピトープ」は、抗体またはその免疫原性断片が特異的に結合する抗原分子の領域を意味する。エピトープは、タンパク質抗原分子の異なる領域に存在する残基から形成される３次元エピトープであり得、こうした残基は、未変性状態では、タンパク質のフォールディングに起因して近接して並置される。本明細書では、「エピトープ」は、ペプチドまたはマトリプターゼのハプテン部分によって創出されるエピトープ、及び非３次元エピトープも意味し得る。
【００４６】
本明細書では、「発現」という用語は、そのプロモーターによって推進される、特定のヌクレオチド配列の転写及び／または翻訳として定義される。
【００４７】
「発現ベクター」は、発現することになるヌクレオチド配列に機能可能なように連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用性要素を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞またはインビトロの発現系によって供給することができる。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドが組込まれたコスミド、プラスミド（例えば、そのままのもの、またはリポソームに含まれるもの）、ならびにウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）などの、当該技術分野において知られるもののすべてが含まれる。
【００４８】
本明細書では、「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」という用語は、１つの連続したタンパク質へと機能可能なように連結された、少なくとも２つのポリペプチドと、任意選択で連結配列と、からなるポリペプチドである。融合タンパク質において連結された２つのポリペプチドは、典型的には、２つの独立した供給源に由来し（すなわち、同一の親ポリペプチドに由来しない）、したがって、融合タンパク質には、天然では通常、連結形態としては見られない２つのポリペプチドが連結されて含まれる。典型的には、２つのポリペプチドは、ペプチド結合によって機能可能なように直接結合することができるか、またはスペーサードメインなどの連結基によって結合することができる。融合ポリペプチドの例は、抗原向けの受容体として機能するポリペプチドであり、細胞外ドメインを形成する抗原結合ポリペプチドが異なるポリペプチドに融合することで、「キメラ抗原受容体」が形成される。
【００４９】
標的遺伝子の「ノック・イン（ｋｎｏｃｋ−ｉｎ）」は、標的遺伝子の発現変化（例えば、増加であり、異所性のものが含まれる）が生じる、宿主細胞ゲノムの変更を意味し、こうした変更は、例えば、標的遺伝子の追加コピーの導入によるものか、または標的遺伝子の内在性コピーの発現増進をもたらす制御配列の、機能可能な形での挿入によるものである。例えば、６，１７５，０５７を参照のこと。
【００５０】
遺伝子の「ノック・アウト（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）」は、好ましくは、標的遺伝子の発現が検出不可能または僅かとなるような、標的遺伝子機能の減少が生じる、遺伝子配列の変更を意味する。６，１７５，０５７を参照のこと。
【００５１】
「調節」または「制御」は、個々の生物において観測される野生型レベルから、特定の遺伝子、タンパク質、因子、または他の分子の活性を変更する薬剤の能力を意味する。
【００５２】
ポリペプチドまたはその部分（ポリペプチドの機能性ドメインなど）に関する「変異体」は、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、または挿入によって、対応する野生型ポリペプチドのアミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なるポリペプチドを意味する。アミノ酸配列またはポリペプチドにおける「欠失」は、野生型タンパク質との比較で、１つまたは複数のアミノ酸残基が存在しない、アミノ酸配列における変化であると定義される。本明細書では、アミノ酸配列またはポリペプチドにおける「挿入」または「追加」は、野生型タンパク質との比較で、１つまたは複数のアミノ酸残基の追加が生じる、アミノ酸配列における変化である。
【００５３】
本明細書では、アミノ酸配列またはポリペプチドにおける「置換」は、野生型タンパク質と比較した際にそれぞれ異なるアミノ酸によって１つまたは複数のアミノ酸が置換されることで生じる。
【００５４】
「単離された」は、天然の状態から変更または取り出されたことを意味する。例えば、生きた動物において天然に存在する核酸またはペプチドは、「単離された」ではないが、その天然の状態に共存する材料から部分的または完全に分離された同一の核酸またはペプチドは、「単離された」である。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または例えば、宿主細胞などの、非天然の環境に存在し得る。
【００５５】
「単離された核酸」は、天然に生じる状態においてそれに隣接する配列から分離された核酸のセグメントまたは断片を指し、当該断片は、すなわち、通常はその断片に隣接する配列から取り出されたＤＮＡ断片であり、当該配列は、すなわち、それが天然に生じるゲノムにおいてその断片に隣接する配列である。用語は、核酸に付随する他の天然成分、すなわち、細胞においてその核酸に付随する天然のＲＮＡまたはＤＮＡまたはタンパク質から実質的に精製された核酸にも適用される。したがって、用語には、例えば、ベクターに組込まれた組換えＤＮＡ、自己複製性のプラスミドもしくはウイルスに組込まれた組換えＤＮＡ、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組込まれた組換えＤＮＡ、あるいは他の配列とは無関係の別の分子として（すなわち、ＰＣＲまたは制限酵素消化によって産生するｃＤＮＡまたはゲノムもしくはｃＤＮＡの断片として）存在する組換えＤＮＡが含まれる。用語には、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子部分である組換えＤＮＡも含まれる。
【００５６】
本発明との関連では、一般に生じる核酸塩基に対して下記の略語が使用され、「Ａ」は、アデノシンを指し、「Ｃ」は、シトシンを指し、「Ｇ」は、グアノシンを指し、「Ｔ」は、チミジンを指し、及び「Ｕ」は、ウリジンを指す。
【００５７】
別段の記載がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、お互いの変性型であるヌクレオチド配列のすべて、及び同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列のすべてを含む。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が型によってはイントロン（複数可）を含むという点において、イントロンも含み得る。
【００５８】
本明細書では、「レンチウイルス」は、レトロウイルス科ファミリーの属を指す。レンチウイルスは、非分裂性細胞への感染が可能であるという点において、レトロウイルスの中でも独特であり、宿主細胞のＤＮＡに顕著な量の遺伝子情報を送達することができることから、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、及びＦＩＶはすべて、レンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、インビボで顕著なレベルの遺伝子導入を達成する手段を提供するものである。
【００５９】
本明細書では、「リンカー」という用語は、「スペーサー」または「スペーサードメイン」とも称され、融合タンパク質における２つのアミノ酸配列の間に任意選択で位置するアミノ酸またはアミノ酸配列を指す。
【００６０】
「機能可能なように連結された」という用語（及び「転写制御下」という用語としても記載される）は、制御配列と、異種性の核酸配列と間の機能的な繋がりを指し、この繋がりによって、異種性の核酸配列の発現が生じる。例えば、第１の核酸配列と、第２の核酸配列とが、機能性の関係において配置されるとき、第１の核酸配列と、第２の核酸配列とは機能可能なように連結されている。例えば、プロモーターが、コード配列の転写または発現に影響を与えるのであれば、プロモーターは、コード配列に機能可能なように連結されている。一般に、機能可能なように連結されたＤＮＡ配列は近接しており、必要な場合は、同一のリーディングフレームにおいて２つのタンパク質コード領域が連結される。
【００６１】
免疫原性組成物の「非経口」投与には、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、または胸骨内への注射手法または注入手法が含まれる。
【００６２】
「患者」、「対象」、「個体」という用語、及び同様のものは、本明細書で互換的に使用され、ヒトを指す。
【００６３】
「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖であり、「核酸」としても知られる。本明細書では、ポリヌクレオチドには、限定はされないが、当該技術分野において利用可能な任意の手段によって得られる核酸配列のすべてが含まれ、天然に生じる核酸及び合成の核酸の両方が含まれる。
【００６４】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、ペプチド結合によって、共有結合で連結されたアミノ酸残基からなる化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含んでいなくてはならず、タンパク質配列またはペプチド配列を含み得るアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合によってお互いが連結された２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書では、用語は、当該技術分野において、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、及びオリゴマーとも一般に称される短鎖と、その型は多く存在するが、当該技術において一般にタンパク質と称される長鎖と、の両方を指す。「ポリペプチド」には、数ある中でも例えば、生物学的に活性な断片、実質的に同族であるポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ２量体、ヘテロ２量体、ポリペプチドの変異体、改変されたポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然のペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【００６５】
「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特定の転写の開始に必要な、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を意味する。
【００６６】
「体細胞」は、多細胞生物、好ましくは動物の任意の細胞であって、配偶子にならない任意の細胞を意味する。
【００６７】
「治療上有効な量」という用語は、研究者または臨床医が求めている、組織、系、または動物の生物学的または医学的な応答を誘発するであろう薬物の量または医薬的な薬剤の量を意味するものとする。
【００６８】
「遺伝子導入された」または「形質転換された」または「形質導入されたという用語は、それによって外来性の核酸が宿主細胞に導入（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ）されるか、または導入（ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ）されるプロセスを意味する。「遺伝子導入された」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外来性の核酸を用いて遺伝子導入、形質転換、または形質導入された細胞である。形質導入された細胞には、初代対象細胞及びその子孫が含まれる。
【００６９】
本明細書で使用される用語としての、疾患の「治療」は、対象に生じる疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状の頻度または重症度の低減を意味する。
【００７０】
「ベクター」は、単離された核酸を含み、細胞内部への単離された核酸の送達に使用することができる物質の組成物である。ベクターの例には、限定はされないが、直鎖ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性の化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスが含まれる。したがって、「ベクター」という用語は、自己複製性のプラスミドまたはウイルスを含む。用語は、例えば、ポリリジン化合物、リポソーム、及び同様のものなどの、細胞への核酸導入を促進する非プラスミド性及び非ウイルス性の化合物を含むようにも構成される。ウイルスベクターの例には、限定はされないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及び同様のものが含まれる。
【００７１】
範囲：本開示の全体を通して、本発明のさまざまな態様が、範囲形式で提示され得る。範囲形式の説明は、単に簡便化を目的としており、本発明の範囲に対する、柔軟性を欠いた限定として構成されるべきではないと理解されるべきである。したがって、範囲の説明は、具体的に開示された可能な部分範囲のすべて、ならびにその範囲内の個々の数値を含むと考えられるべきである。例えば、１〜６などの範囲の説明は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等などの、具体的に開示された部分範囲、ならび例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６といった、その範囲内の個々の数を含むと考えられるべきである。このことは、範囲の幅を問わず適用される。
【００７２】
任意のアミノ酸配列が、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ．またはＧＥＮＢＡＮＫの受入番号によって具体的に参照される場合、その配列は、参照によって本明細書に援用される。シグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、プロモーター配列、及び翻訳開始点の同定などの、受入番号と関連する情報もまた、参照によってその全体が本明細書に援用される。
【００７３】
例示の実施形態の説明
１つの態様では、導入遺伝子と、ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳのうちの１つまたは複数と、を含むか、または発現する、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞が提供される。いくつかの実施形態では、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞は、導入遺伝子、ＤＨＦＲＦＳ、及びＴＹＭＳＳＳを含むか、または発現する。簡潔に記載すると、Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍から得ることができる。当該技術分野において利用可能なＴ細胞株を使用してよい。好ましくは、Ｔ細胞は、当業者に知られる任意の数の手法を使用して対象から収集した一定単位の血液から得られる。Ｔ細胞の単離は、ＵＳ２０１３／０２８７７４８Ａ１において説明されるように、当該技術分野において知られる手順に従って進めてよい。その後、収集したＴ細胞は、ＵＳ２０１３／０２８７７４８Ａ１において説明されるものなどの、当該技術分野においてよく知られる方法を使用して増殖させる。
【００７４】
１つの実施形態によれば、下記のように、Ｔ細胞は収集され、レンチウイルスによる形質導入に向けた処理が実施される。患者の末梢血単核細胞は、１％のヒト血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）において精製及び洗浄される。リンパ球は、既知の方法に従って磁気ビーズを使用して単球を枯渇させることによって濃縮される。リンパ球は、Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８），Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  ７：４３７−４４８によって以前に報告された医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）の規制に従って培養される。例えば、１０％の正常ヒト抗体血清が添加された、Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．のＸ−ＶＩＶＯ１５（化学的に定義された無血清造血細胞培地）といった、無血清造血細胞培地において、細胞をエクスビボで１４日間増殖させた後、培養から１４日目に、再注入に向けた処理が実施される。磁気ビーズは、磁気細胞分離システムを使用して除去される。細胞は収集され、１％のヒト血清アルブミンを含むＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａにおいて洗浄及び再懸濁された後、レンチウイルスベクターを用いて形質導入される。
【００７５】
本明細書に示されるように、Ｔ細胞は、抗チミジル酸物質耐性（ＡＴｈｙＲ）導入遺伝子、及び他の導入遺伝子を発現するように遺伝子改変される。ＡＴｈｙＲは、５−ＦＵならびにＤＨＦＲ及びＴＹＭＳを標的とする抗葉酸物質によって媒介されるＡＴｈｙ毒性などの、抗チミジル酸物質物質（ＡＴｈｙ）である薬物の毒性からＴ細胞を救助することが示されている。また、本明細書に示されるように、ＤＨＦＲＦＳなどのＤＨＦＲ変異タンパク質は、チミジン依存性である導入遺伝子発現をメトトレキサート（ＭＴＸ）誘導性に増加させることが可能であり、ＴＹＭＳＳＳなどのＴＹＭＳ変異タンパク質は、ジヒドロ葉酸依存性である導入遺伝子発現をＭＴＸ誘導性に減少させることが可能である。本明細書にさらに示されるように、ＡＴｈｙＲは、免疫原性遺伝子または磁気選択を使用することなく、対象導入遺伝子の陽性選択に使用することができる。
【００７６】
ＡＴｈｙＲ導入遺伝子であるＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳを単独または組み合わせて、対象導入遺伝子を発現するＴ細胞へと操作導入して使用することで、バルク集団内の導入遺伝子発現を対象とした特有の選択能力が得られ、対象導入遺伝子のシスでの発現ならびにトランスでの発現を調節することができると共に、ＡＴｈｙの毒性濃度における生存を促進することができる。したがって、腫瘍を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞などの、対象導入遺伝子を発現するＴ細胞を、ＤＨＦＲＦＳ及び／またはＴＹＭＳＳＳなどのＡＴｈｙＲを発現するようにさらに操作することで、新たな治療選択肢が必要な、肺、結腸、乳房、及び膵臓などの癌の治療において有用性が見出される。
【００７７】
本明細書に示されるように、ＡＴｈｙＲであるＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳをＴ細胞において組み合わせることで、ＡＴｈｙであるＭＴＸ、Ｐｅｍ、または５−ＦＵを毒性濃度で用いて処理したそのような細胞に顕著な生存優位性が生じる。こうしたＡＴｈｙ薬物は、数ある他の一般の癌の中でも特に、肺癌及び結腸癌の治療に通常は使用される。本明細書に記載の知見は、ＡＴｈｙＲを有するＴ細胞が、毒性ＡＴｈｙ濃度で生存可能であることを示している。５−ＦＵのような化学療法の免疫調節作用と、５−ＦＵの細胞傷害性作用に対する耐性を有するＴ細胞と、を組み合わせることで、いずれかが単独使用される治療のものに勝って、患者の抗癌応答を実質的に改善することができる。
【００７８】
本明細書に記載のように、Ｔ細胞における発現向けの対象導入遺伝子の選択目的のために、ＡＴｈｙＲと、最も初期の薬物耐性導入遺伝子の１つであるＮｅｏＲと、が比較された。本明細書に記載のように、生存、選択、及び代表的な導入遺伝子（ｅＧＦＰ）発現の薬物依存的な増加を促進するという点において、ＤＨＦＲＦＳは、ＮｅｏＲよりも優れていることが明らかとなった。注目すべきことに、ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳが有する、ヒトタンパク質としての免疫原性は低く、ＭＴＸは、導入遺伝子の選択を改善するためにインビトロ及びインビボの両方で使用することができる一方で、Ｇ４１８は使用することができない。本明細書に記載の知見は、ＤＨＦＲＦＳを使用することで、自殺遺伝子であるｉＣ９などの導入遺伝子を発現する細胞の選択ができることを示している。したがって、ＤＨＦＲＦＳならびに［ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳ］は、１つまたは複数の対象導入遺伝子を発現するＴ細胞を選択するための、磁気ビーズに代わる魅力的な代替物である。実際、ＭＴＸを使用してＡＴｈｙＲ＋Ｔ細胞をインビボで選択する潜在能力は、エクスビボというよりむしろ患者の体内で導入遺伝子の選択を実施できることを示している。
【００７９】
別の態様では、哺乳類Ｔ細胞におけるＡＴｈｙ毒性の阻害方法が提供され、当該方法は、当該哺乳類Ｔ細胞におけるＡＴｈｙＲ導入遺伝子の発現を含む。いくつかの実施形態では、ＡＴｈｙＲ導入遺伝子は、ＤＨＦＲＦＳである。いくつかの実施形態では、ＡＴｈｙＲ導入遺伝子は、ＴＹＭＳＳＳである。
【００８０】
別の態様では、対象導入遺伝子を発現するＴ細胞の選択方法が提供される。方法は、対象導入遺伝子及びＤＨＦＲＦＳを発現するＴ細胞を含む複数のＴ細胞に対するチミジン合成阻害剤の適用と、チミジン合成阻害剤の適用から７日後以降に生存している１つまたは複数のＴ細胞の選択と、を含み、１つまたは複数のＴ細胞は、ベクターに含まれる対象導入遺伝子及びＤＨＦＲＦＳを発現する。チミジン合成阻害剤は、メトトレキサート（ＭＴＸ）、５−ＦＵ、ラルチトレキセド、及びペメトレキセドからなる群から選択してよい。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子に由来するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列は、ベクターに挿入される。レトロウイルスに由来するベクターが好ましく、この理由は、当該ベクターによって、以降まで続く長期的な遺伝子導入が生じて、導入遺伝子の安定組込みが実現し、導入遺伝子が娘細胞に伝わるためである。本明細書に記載のＡＴｈｙＲをコードする核酸の発現は、よく知られる分子生物学の手法を使用して、プロモーターにＡＴｈｙＲをコードする核酸を機能可能なように連結し、適した発現ベクターに構築物を組込むことによって達成してよい。ベクターは、複製及び組込みに使用する真核生物に適したものであってよい。典型的なクローン化ベクターは、転写及び翻訳のターミネーター、開始配列、及び所望の核酸配列の発現制御に有用なプロモーターを含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＤＮＡ構築物は、導入遺伝子と、ＡＴｈｙＲ、ＤＨＦＲＦＳ、及びＴＹＭＳＳＳのうちの１つまたは複数をコードする１つまたは複数のＤＮＡ構築物と、をコードする。他の実施形態では、導入遺伝子と、ＡＴｈｙＲ、ＤＨＦＲＦＳ、及びＴＹＭＳＳＳのうちの１つまたは複数と、は機能可能なように連結される。１つまたは複数の導入遺伝子と、ＡＴｈｙＲ、ＤＨＦＲＦＳ、及びＴＹＭＳＳＳのうちの１つまたは複数と、をコードするさまざまなヌクレオチド配列をコードするキメラ構築物は、成分をコードする天然由来の核酸または合成的に調製された核酸から、よく知られる分子生物学の手法によって調製してよい。キメラ構築物は、天然の配列を使用して調製してよい。天然の遺伝子は単離し、必要に応じて、さまざまなドメインの適切な連結が可能になるように操作してよい。したがって、遺伝子の所望の部分の欠失が生じる適切なプライマーを使用し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることによって、配列を切り詰めた部分を調製してよい。あるいは、対象配列が適切な宿主にクローン化し得るプライマー修復を使用してよい。いずれの場合にしても、ＣＡＲタンパク質をコードする所望のオープンリーディングフレームが生じる配列アニーリングが可能な末端が生じるプライマーを用いてよい。したがって、配列は、平滑末端である制限部位、または相補性の重複部分を有する制限部位が得られるように選択してよい。好ましくは、構築物は、重複性（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ＰＣＲによって調製される。
【００８３】
本明細書に示されるように、ＭＴＸによって例示される抗チミジル酸物質またはチミジン合成阻害剤は、導入遺伝子の発現を制御して、ＤＨＦＲＦＳまたはＴＹＭＳＳＳに対してシスで発現する導入遺伝子の発現レベルを向上または低下させるために使用することができる。シス−導入遺伝子をＭＴＸ誘導性に正または負に調節することは、ある特定のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはサイトカインを発現する導入遺伝子などの、Ｔ細胞に存在する、危険であるが必要な導入遺伝子の発現を空間的及び時間的に調節するためにＭＴＸが使用される状況において、臨床的に有用であると考えられる。ＤＨＦＲＦＳと、トランスに発現したＴＹＭＳＳＳと、の発現相関は、ほぼ同等量で発現する必要があるＴＣＲα及びＴＣＲβなどのタンパク質の発現であって、２Ａ媒介性の切断部位を使用するとタンパク質の構造及び機能に有害な影響が生じ得るタンパク質の発現においても有用である。
【００８４】
さらに別の態様は、ＭＴＸ及び５−ＦＵに対する耐性を有する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の選択的増殖方法である。方法は、ＡＴｈｙＲ遺伝子を含むベクターを用いた末梢ＰＢＭＣへの遺伝子導入と、チミジン合成阻害剤を用いた遺伝子導入ＰＢＭＣの処理と、ＡＴｈｙＲ遺伝子を発現するＰＢＭＣの選択と、を含む。この態様のいくつかの実施形態では、方法は、遺伝子導入ＰＢＭＣに由来するＴ細胞集団の増殖をさらに含む。いくつかの実施形態では、チミジン合成阻害剤は、メトトレキサート（ＭＴＸ）、５−ＦＵ、ラルチトレキセド、及びペメトレキセドからなる群から選択してよい。いくつかの実施形態では、チミジン合成阻害剤は、ＭＴＸである。いくつかの実施形態では、ＡＴｈｙＲ遺伝子は、ＴＹＭＳＳＳである。いくつかの実施形態では、ＡＴｈｙＲ遺伝子は、ＤＨＦＲＦＳである。
【００８５】
別の態様は、対象導入遺伝子と、ＤＨＦＲＦＳまたはＴＹＭＳＳＳをコードするヌクレオチド配列と、を含む核酸配列を含む、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞は、対象導入遺伝子と、ＤＨＦＲＦＳをコードするヌクレオチド配列と、を含む核酸を含み、対象導入遺伝子と、ＤＨＦＲＦＳをコードするヌクレオチド配列と、は機能可能なように連結される。いくつかの実施形態では、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞は、対象導入遺伝子と、ＴＹＭＳＳＳをコードするヌクレオチド配列と、を含む核酸を含み、対象導入遺伝子と、ＴＹＭＳＳＳをコードするヌクレオチド配列と、は機能可能なように連結される。
【００８６】
別の態様では、導入遺伝子及びＤＨＦＲＦＳを発現する、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞が提供され、Ｔ細胞は、（１）導入遺伝子をコードする配列を含むポリヌクレオチドと、（２）ＤＨＦＲＦＳをコードする配列を含むポリヌクレオチドと、を含む。
【００８７】
ある特定の態様では、ＤＨＦＲＦＳをコードする配列は、配列番号１２と比較して、その少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＤＨＦＲＦＳをコードする配列は、配列番号１２と比較して、アミノ酸の欠失、挿入、または置換が、１残基以下、２残基以下、３残基以下、４残基以下、５残基以下、６残基以下、７残基以下、８残基以下、９残基以下、または１０残基以下であるポリペプチドをコードする。
【００８８】
別の態様では、導入遺伝子及びＴＹＭＳＳＳを発現する、単離された遺伝子導入哺乳類Ｔ細胞が提供され、当該Ｔ細胞は、（１）導入遺伝子をコードする配列を含むポリヌクレオチドと、（２）ＴＹＭＳＳＳをコードする配列を含むポリヌクレオチドと、を含む。
【００８９】
ある特定の態様では、ＴＹＭＳＳＳをコードする配列は、配列番号１１と比較して、その少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＴＹＭＳＳＳをコードする配列は、配列番号１１と比較して、アミノ酸の欠失、挿入、または置換が、１残基以下、２残基以下、３残基以下、４残基以下、５残基以下、６残基以下、７残基以下、８残基以下、９残基以下、または１０残基以下であるポリペプチドをコードする。
【００９０】
追加の態様では、複数のヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）を含む組成物が提供され、細胞は、ＴＹＭＳＳＳ及び第１の導入遺伝子をコードする配列を含み、当該細胞は、ＭＴＸで処理され（例えば、培養物または生きた生物において）、それによって、導入遺伝子の発現が変化する。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＣＡＲ、ＴＣＲ、ポリペプチドホルモン（例えば、グルカゴンなどの内分泌学的なホルモン）、サイトカイン、転写因子、またはケモカインをコードする。さらに追加の態様では、この実施形態の導入遺伝子は、インテグリン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、またはホルモン（例えば、神経学的なホルモンもしくは内分泌性のホルモン）の受容体などの細胞表面ポリペプチドをコードする。
【００９１】
さらに追加の態様では、複数のヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）を含む組成物が提供され、細胞は、ＤＨＦＲＳＳ及び第１の導入遺伝子をコードする配列を含み、当該細胞は、ＭＴＸで処理され（例えば、培養物または生きた生物において）、それによって、導入遺伝子の発現が変化する。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＣＡＲ、ＴＣＲ、ポリペプチドホルモン（例えば、グルカゴンなどの内分泌学的なホルモン）、サイトカイン、転写因子、またはケモカインをコードする。さらに追加の態様では、この実施形態の導入遺伝子は、インテグリン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、またはホルモン（例えば、神経学的なホルモンもしくは内分泌性のホルモン）の受容体などの細胞表面ポリペプチドをコードする。
【００９２】
追加の態様では、哺乳類から単離され、チミジン合成阻害剤で処理された第１の複数のＴ細胞を含む組成物が提供され、哺乳類から単離され、チミジン合成阻害剤によって枯渇させた第２の複数のＴ細胞と比較して、第１の複数のＴ細胞では、抗体（複数可）を用いた刺激の間に制御性Ｔ細胞が濃縮され、当該抗体（複数可）の使用によって、抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ２８、抗４１ＢＢ、抗ＯＸ４０、植物性血球凝集素（ＰＨＡ）、イオノマイシン、またはペプチドをパルスした抗原提示細胞（合成的もしくは生物学的であるかを問わず、細胞起源は任意であり、ヒトであるかもしくはそうでなければＴ細胞の複製が開始するような様式でＴ細胞刺激に利用できるものであれば起源は問われない）のいずれかの単独使用またはそれらを組み合わせた使用の必要性を下げることができる。
【００９３】
さらに別の態様では、癌を有する患者の治療方法が提供され、当該方法は、上記の実施形態のいずれかに記載の単離されたＴ細胞に含まれるＴ細胞の、治療上有効な量での患者に対する投与を含む。現在のところ、ＦＤＡが承認した細胞治療はほとんどなく、細胞に基づく遺伝子治療に至っては未承認であるが、本明細書に報告される遺伝子導入手法のいずれも、癌を有する患者に対する投与のための組成物の調製に使用することができる。さらに、ＣＡＲ媒介性のエクスビボでの増殖は、上記の実施形態のいずれかに記載の単離されたＴ細胞に含まれるＴ細胞を治療上有効な量とするために使用することができる。
【００９４】
本発明の、処理された細胞は、癌またはＩｇＥ媒介性のアレルギー疾患を対象として治療されることになる患者の自己Ｔ細胞などのＴ細胞に対して、上記核酸構築物のいずれかを含むレンチウイルスベクターを導入することによって生成させることができる。自己Ｔ細胞を含む組成物は、そのような治療が必要な患者から収集される。本明細書に記載の方法及び当該技術分野において知られる方法を使用して、細胞は、エクスビボで操作されることで処理されたＴ細胞となり、活性化し、増殖した後、患者に注入して戻される。処理されたＴ細胞は、インビボで複製し、その結果、癌細胞または他のｍＩｇＥ発現細胞に対する存続性の免疫が生じる。
【００９５】
上記の単離されたＴ細胞のいずれかを処理してよく、その後、処理されたＴ細胞に対して、上記のレンチウイルスベクターを形質導入することで、投与に向けた、処理されたＴ細胞が生成する。形質導入は、既知のプロトコールに従って実施される。
【００９６】
処理されたＴ細胞は、ＩｇＥ媒介性のアレルギー疾患に対する治療が必要な対象に投与される。処理されたＴ細胞は、インビボで複製する能力を有しており、これによって、アレルギー疾患の長期制御につながり得る長期存続性が得られる。処理されたＴ細胞は、単独で投与してよく、あるいは１つもしくは複数の医薬的に許容可能な担体、希釈剤、もしくは賦形剤、及び／またはサイトカインもしくは他の細胞集団などの他の成分と組み合わせた医薬組成物として投与してよい。そのような組成物は、中性の緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、及び同様のものなどの緩衝剤、グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストラン、マンニトールなどの糖質、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、ならびに保存剤を含んでよい。組成物は、好ましくは、静脈内投与向けに製剤化される。好ましくは、Ｔ細胞は、対象から取り出された自己Ｔ細胞を含み、ＣＡＲを発現するようにエクスビボで操作されてから、対象に投与される。
【００９７】
処理されたＴ細胞またはその医薬組成物は、薬理学的作用が得られるように、有効量の細胞が効果的に患者に送達される経路によって投与してよい。投与は、典型的には、非経口投与である。好ましい経路は、免疫療法において一般に知られる注入手法を使用する静脈内投与である（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照のこと）。ＣＡＲ＋Ｔ細胞の量及び投与頻度は、患者の病状、ならびに患者の疾患の型及び重症度などの要因によって決定されるが、適切な投与量は、臨床試験によって決定してよい。「有効量」は、患者の年齢、体重、疾患の状態、及び疾患の重症度における個々の差異が考慮され、医師によって決定される。一般に、単回の投与量で投与されるＣＡＲ＋Ｔの量の範囲は、約１０６〜１０９個細胞／ｋｇ体重となり、そうした範囲に入る整数値はすべて含まれる。ＣＡＲ＋Ｔは、こうした投与量で複数回投与してよい。特定の患者に対する最適な投与量及び治療レジメンは、患者の疾患徴候を監視し、それに沿って治療を調節することによって、医学分野の当業者であれば容易に決定することができる。
【００９８】
さらに別の態様では、図のいずれかにおいて示されるか、または説明に記載の対象導入遺伝子を発現するＴ細胞の選択方法が提供される。
【００９９】
さらに別の態様では、図のいずれかにおいて示されるか、または説明に記載のＴ細胞が提供される。
【０１００】
別の態様は、図のいずれかにおいて示されるか、または説明に記載の、ＭＴＸ、５−ＦＵ、ラルチトレキセド、及びペメトレキセドのうちの１つまたは複数に耐性を有する初代ヒトＴ細胞の選択的増殖方法である。
【０１０１】
別の態様は、哺乳類から単離されたＴ細胞集団における制御性Ｔ細胞の濃縮方法であり、当該方法は、当該集団と、ＭＴＸ、５−ＦＵ、ラルチトレキセド、及びペメトレキセド、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるチミジン合成阻害剤と、を接触させることで、集団におけるエフェクターＴ細胞を選択的に枯渇させることによるものである。いくつかの実施形態では、哺乳類から単離されたＴ細胞集団は、ＭＴＸ及び５−ＦＵの両方と接触する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳのうちの１つまたは複数を発現する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳの両方を発現する。
【０１０２】
５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボシド（ＡＩＣＡＲ）合成の特異的な阻害は、Ｔ細胞に対して毒性を与えるものでもなく、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の選択を生じさせるものでもないことが本明細書で示された。ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３におけるＦｏｘＰ３の発現は、特異的なＡＩＣＡＲｔｆ阻害作用によって増進することがここで明らかとなり、このことは、何らかのＡＭＰＫ作用が、Ｔｒｅｇの表現型を改善し得ることを示唆している。理論に拘束されるわけではないが、本明細書に記載のＴｒｅｇ単離試験は、ＭＴＸの作用が２つの要素からなることを示している：１）Ｔｒｅｇの選択は、Ｔｅｆｆの枯渇に依存するということ。これは、Ｔｅｆｆを除去すると、ＭＴＸ処理後にＴｒｅｇの増殖選択性が阻止されるためである。２）ＭＴＸの作用は、何らかの点においてＴｒｅｇの機能的な活性を実際に増進するということ。これは、潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）の発現及びＴｅｆｆの分化抑制が、未処理のＴｒｅｇに勝って増加したためである。遺伝子導入Ｔ細胞を用いた実験において、ＭＴＸによる葉酸の枯渇が生じずにＡＭＰＫの活性化が達成され、機能性のＴｒｅｇ表現型を有するＴ細胞の割合が増加した。したがって、ＭＴＸは、Ｔｅｆｆを枯渇させ、免疫抑制性のＴｒｅｇ表現型を促進する。
【０１０３】
別の態様は、哺乳類から単離されたＴ細胞集団における制御性Ｔ細胞の枯渇方法であり、当該方法は、１つまたは複数のアミノグリコシダーゼ（ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ）の存在下で当該集団を培養することで、当該培養において制御性Ｔ細胞を選択的に枯渇させることによるものである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳのうちの１つまたは複数を発現する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳの両方を発現する。いくつかの実施形態では、Ｇ４１８による毒性を阻止するネオマイシン耐性遺伝子が存在すると、Ｇ４１８媒介性の枯渇からのＴｒｅｇの救助が生じ得る。アミノグリコシドによる枯渇は、制御性Ｔ細胞に特に限られたものであり得る。アミノグリコシドは、数十年間使用されてきたものであるが、この薬物がＴｒｅｇを枯渇させる能力を有するという報告はなかった。理論に拘束されるものではないが、最も可能性のある説明は、この薬物が、インビトロでＴｒｅｇを枯渇させるために使用されるものと比較して、インビボでははるかに少ない用量で使用されるものであり、複数の組織に毒性が生じるために使用が中止されることが多いということである。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、アミノグリコシドは、抗腫瘍活性を増進するために、癌を有する患者に投与することができる。アミノグリコシドは、例えば、治療において、前治療によって投与することができる。
【０１０５】
別の態様は、哺乳類から単離された制御性Ｔ細胞の選択方法である。方法は、チミジン合成阻害剤を用いた、ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳのうちの１つまたは複数を発現する複数のＴ細胞の処理と、制御性Ｔ細胞のマーカーを発現する制御性Ｔ細胞の選択と、を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＤＨＦＲＦＳを発現する。いくつかの実施形態では、選択段階は、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３９抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ１５２抗体、抗ＫＩ−６７抗体、及び抗ＦｏｘＰ３抗体のうちの１つまたは複数を使用する、磁気ビーズによる選別を用いた細胞の単離を含む。いくつかの実施形態では、チミジン合成阻害剤は、メトトレキサート（ＭＴＸ）、５−ＦＵ、ラルチトレキセド、またはペメトレキセドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、方法は、葉酸（ｆｏｌａｔｅ）、ロイコバリン（ｌｅｕｃｏｖａｒｉｎ）、及びＦＵのうちの１つまたは複数を用いた、制御性Ｔ細胞の処理をさらに含む。
【０１０６】
本明細書でさらに示されるように、ＡＴｈｙＲは、ＭＴＸまたはＰｅｍに由来する抗葉酸物質毒性から、ＡＴｈｙＲを有するＴ細胞を保護する。ＭＴＸは、Ｐｅｍと比較してＴ細胞に対する毒性が高く、１μＭ未満のＭＴＸに対するＭＴＸ感受性は、ＤＨＦＲＦＳのコドンを最適化するか、またはＴ細胞においてＤＨＦＲＦＳにＴＹＭＳＳＳを追加することによって完全に抑止できるということが、本明細書に記載の結果によって確立された。最大１μＭというＭＴＸ濃度は、関節リウマチの治療の間に達成される濃度である。高用量のＭＴＸは、癌化学療法においてロイコボリンを併用して達成される（＞１ｍＭ  ＭＴＸ）。ロイコボリンは、ＤＨＦＲＦＳとＴＹＭＳＳＳとの組み合わせと同一の経路を介してチミジン合成を救助する。したがって、［ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳ］＋Ｔ細胞は、免疫抑制及び癌治療の両方で生じる範囲のＭＴＸによって誘導される細胞傷害性に対して耐性を有する可能性があるであろうと考えられる。
【０１０７】
別の態様では、哺乳類から単離された第１の複数のＴ細胞と、チミジン合成阻害剤と、を含む組成物が提供される。哺乳類から単離され、チミジン合成阻害剤を含まない第２の複数のＴ細胞と比較して、第１の複数のＴ細胞の制御性Ｔ細胞は濃縮される。
【０１０８】
上記の態様のいずれかのさまざまな実施形態、及びいくつかの実施形態では、本明細書で使用されるＴ細胞（Ｔリンパ球）は、任意の天然に生じる免疫細胞、または任意の人工的（例えば、合成的、遺伝子的、組換え的）に操作された免疫細胞を含み得るか、またはそれからなり得、当該免疫細胞は、天然に生じるＴ細胞受容体もしくはその部分を発現するか、または人工的（例えば、合成的、遺伝子的、組換え的）に操作されたＴ細胞受容体もしくはその部分を発現するように調製されるか、または人工的（例えば、合成的、遺伝子的、組換え的）に操作されたＴ細胞受容体もしくはその部分を細胞表面に提示するものであり、当該Ｔ細胞受容体には、例えば、限定はされないが、キメラＴ細胞受容体、ヒト化Ｔ細胞受容体、異種性Ｔ細胞受容体、ゼノジニック（ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）Ｔ細胞受容体、アロジェニック（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）Ｔ細胞受容体、及び自己Ｔ細胞受容体が含まれる。
【０１０９】
上記の態様のいずれかのさまざまな実施形態、及びいくつかの実施形態では、本明細書で使用される「Ｔ細胞」には、例えば、限定はされないが、ヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｃ細胞またはＣＴＬ）、メモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）、エフェクターＴ細胞（ＴＥＭ細胞）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞；抑制性Ｔ細胞としても知られる）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、粘膜関連インバリアントＴ細胞、アルファ−ベータＴ細胞（Ｔαβ細胞）、及びガンマ−デルタＴ細胞（Ｔγδ細胞）といった、Ｔ細胞のすべての型が含まれる。
【０１１０】
前述の一般的な説明及び下記の詳細な説明は両方共、例示的及び説明的なものにすぎず、請求される本発明の限定ではないと理解されることになる。添付の図面は、参照によって本明細書に援用され、本明細書の一部を構成するものであり、詳細な説明と共に、本発明の、ある特定の実施形態を例示し、本発明の原理説明の役割を果たす。
【０１１１】
本出願において引用及び参照される特許及び出版物はすべて、それらの全体が参照によって本明細書に援用される。
【実施例】
【０１１２】
実施例１
材料及び方法
細胞及び培養条件：
細胞：Ｇｕｌｆ  Ｃｏａｓｔ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｂｌｏｏｄ  ＢａｎｋまたはＭＤＡＣＣ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ（両機関共にテキサス州ヒューストン）において健康なドナーから得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  Ｔｏｗｎｓｈｉｐ，ＮＪ；カタログ番号１７−１４４０−０２）を使用した密度勾配遠心に供した。ＰＢＭＣをＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｌｕｓ  ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号１３０−０７０−５２５）において１回洗浄し、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，カタログ番号Ｄ８５３７）において２回洗浄した後、ＲＰＭＩ１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ；カタログ番号ＳＨ３００９６．０１）、１０％の熱非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｙｃｌｏｎｅ，カタログ番号ＳＨ３００７０．０３）、及び２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸサプリメント（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ；カタログ番号３５０５００６１）から調製された完全培地（ＣＭ）において休止させた。あるいは、５０％の熱非働化ＦＢＳ、４０％のＲＰＭＩ１６４０、及び１０％のＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＰＡ；カタログ番号Ｄ２６５０）から調製された混合物を凍結培地（ＦＭ）として使用し、ＰＢＭＣを４Ｘ１０７個細胞／ｍＬとして凍結した。休止または凍結したＰＢＭＣの使用概要は、以下の各実験に記載される。ヒトＴ細胞急性リンパ性白血病の細胞由来であるジャーカット細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，カタログ番号ＴＩＢ−１５２）を使用し、ＣＭにおいて維持した。この細胞株の同定は、短いタンデムリピートを有するＤＮＡを用いるフィンガープリンティング法を使用し、ＭＤＡＣＣ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｇｒａｎｔ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｃｏｒｅによって確実に実施された。Ｔ細胞の刺激には、活性化及び増殖用細胞（Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）（ＡａＰＣ）を使用した。膜結合型ＩＬ−１５と共にＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ６４を発現するＡａＰＣ細胞株Ｋ５６２のクローン４を改変することで、Ｔ細胞のポリクローナル刺激向けにＯＫＴ３抗体を提示した。これは、既報のとおりに実施した（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１４，３７（４）：２０４−２１３）。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）＋Ｔ細胞の増殖には、ＡａＰＣ  ＣＡＲＬ＋  Ｋ５６２（Ｒｕｓｈｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１４，３７（４）：２０４−２１３）を利用した。
【０１１３】
ＡａＰＣはすべて、３７℃の水浴において急速解凍し、２回洗浄した後、Ｔ細胞の刺激に使用した（前出のＳｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．）。ジャーカット及びＡａＰＣは、マイコプラズマの存在を試験してから使用した。細胞の計数は、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ  Ｋ２  Ｉｍａｇｅ  Ｃｙｏｔｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ＭＡ）を用いて、０．１％のトリパンブルー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔ８１５４）の混合物において達成した。
【０１１４】
化学的薬剤及び生物学的薬剤：
ＣＤ３及びＣＤ２８を介した刺激は、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，カタログ番号１６−００３７−８５）、１００ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，カタログ番号ＣＢＬ５１７）を添加することによって達成した。組換えヒトＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ  Ｌａｂｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含めてＴ細胞を刺激した。記載があるときは、下記の薬物を使用した：５−ＦＵ、ＭＴＸ、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、Ｇ４１８、及びＡＰ２０１８７。各薬物に関する追加情報は、表１に示される。
【０１１５】
ＤＮＡ発現プラスミド：
抗チミジル酸物質耐性（ＡＴｈｙＲ）導入遺伝子を試験するためのＤＮＡプラスミドは、既報のＤＮＡプラスミドであるＧ４ＣＡＲ（前出のＲｕｓｈｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．）を骨格として使用して生成させた。商業的に合成されたＦＬＡＧ−ＤＨＦＲＦＳ、コドン最適化（ＣｏＯｐ）ＤＨＦＲＦＳ、ＦＬＡＧ−ＴＹＭＳＳＳ、及びＣｏＯｐ  ＴＹＭＳＳＳのＤＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｅｎｅ  Ａｒｔ）、ならびにネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）のＤＮＡ産物は、ＮｈｅＩ及びＡｐａＩによって切断した。レポーター遺伝子としては、Ｎ末端にＳＶ４０核局在化配列を有するｍＣｈｅｒｒｙ（ＲＦＰ）、誘導性自殺遺伝子であるＣｏＯｐ  ｉＣ９（両遺伝子共にＧｅｎｅＡｒｔが製造）、及び高感度緑色蛍光タンパク質を使用した。
【０１１６】
【表１】
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【０１１７】
（ｅＧＦＰ）ＤＮＡは、ＡｐａＩ及びＫｐｎＩによって消化した。Ｇ４ＣＡＲ骨格は、ＮｈｅＩ及びＫｐｎＩによる制限酵素消化を実施した。Ｇ４ＣＡＲ骨格と、ＮｈｅＩ及びＡｐａＩで消化した断片と、ＡｐａＩ及びＫｐｎＩで消化した断片とは、３成分連結で連結した。ＮｈｅＩ、ＫｐｎＩ、及びＡｐａＩの酵素消化位置は、図１Ｂに示される。薬物耐性成分（ＤＨＦＲＦＳ、ＴＹＭＳＳＳ、またはＮｅｏＲ）は、導入遺伝子（ＲＦＰ、ＣｏＯｐ  ｉＣ９、及びＧＦＰ）と共にさまざまな構成で用いることで、下記のＤＮＡプラスミドを調製した：ＦＬＡＧ−ＤＨＦＲＦＳ−２Ａ−ｅＧＦＰ  ｐＳＢＳＯ（ＤＧ）、ＦＬＡＧ−ＣｏＯｐ  ＤＨＦＲＦＳ−２Ａ−ｅＧＦＰ  ｐＳＢＳＯ（ＣｏＯｐ  ＤＧ）、ＦＬＡＧ−ＴＹＭＳＳＳ−２Ａ−ＧＦＰ  ｐＳＢＳＯ（ＴＳＧ）、ＦＬＡＧ−ＣｏＯｐ  ＴＹＭＳＳＳ−２Ａ−ＧＦＰ  ｐＳＢＳＯ（ＣｏＯｐ  ＴＳＧ）、ＦＬＡＧ−ＴＹＭＳＳＳ−２Ａ−ＲＦＰ  ｐＳＢＳＯ（ＴＳＲ）、ＮｅｏＲ−２Ａ−ＧＦＰ  ｐＳＢＳＯ（ＮＲＧ）、及びＦＬＡＧ−ＤＨＦＲＦＳ−２Ａ−ｉＣ９  ｐＳＢＳＯ（ＤＦＳｉＣ９）。構築物であるＦＬＡＧ−ＴＹＭＳＳＳ−２Ａ−ＩＬ−１２ｐ３５−２Ａ−ＩＬ−１２ｐ４０  ｐＳＢＳＯ（ＴＳＳＳＩＬ−１２）は、コドンが最適化された（ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＩＬ−１２  ｐ３５導入遺伝子、及びＩＬ−１２  ｐ４０導入遺伝子から合成したものであり、２Ａ領域内で消化して、ＩＬ−１２  ｐ３５及びＩＬ−１２  ｐ４０と、同様に２Ａ領域内を消化したＴＹＭＳＳＳ断片と、を連結したものである。ＴＳＳＳＧ骨格を消化し、その５’がＴＹＭＳＳＳの開始部位、その３’がＩＬ−１２ｐ４０の終始部位に向く方向で、これら３成分を、４つの部位で連結してＴＳＳＳＧ骨格に連結導入した。Ｍｙｃ−ＤＨＦＲＦＳ−２Ａ（Ｍｙｃ−ＤＨＦＲＦＳ−２Ａに対応するポリペプチド配列は、配列番号１０として示される）をコードする構築物も提供される。ＴＹＭＳＳＳのポリペプチド配列は、配列番号１１として提供される。ＤＨＦＲＦＳのポリペプチド配列は、配列番号１２として提供される。ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳのＤＮＡのコドン最適化は、それぞれＤＨＦＲ及びＴＹＭＳのタンパク質がｍＲＮＡ転写物に結合しなくなるように実施した。ＤＨＦＲ及びＴＹＭＳのｍＲＮＡには、それぞれＤＨＦＲ（Ｔａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ２００４，３７８（Ｐｔ  ３）：９９９−１００６）及びＴＹＭＳ（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０００，２８（６）：１３８１−１３８９）が認識するＲＮＡ結合モチーフが存在することが知られている。ｍＲＮＡ転写物のタンパク質結合性を回避するために、ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳのコドンを変更したが、その際、各タンパク質のアミノ酸配列は可能な限り維持した。既報のＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（前出のＲｕｓｈｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．）は、改変せずに利用した。
【０１１８】
Ｍｙｃ−ｆｆＬｕｃ−ＮｅｏＲ  ｐＳＢＳＯ（ＮＲＦ）は、ＮｈｅＩ及びＳｐｅＩを用いた制限消化の後に単離したＣＤ１９−２Ａ−Ｎｅｏ  ｐＳＢＳＯ（前出のＲｕｓｈｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．）の骨格を使用して構築した。ＮｈｅＩ及びＳｐｅＩで消化したＭｙｃ−ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）挿入断片をＣＤ１９−２Ａ−Ｎｅｏ骨格に連結した後、連結産物をＳｐｅＩ及びＥｃｏＲＶで消化した。その後、消化した骨格に対して、ＳｐｅＩ及びＥｃｏＲＶで消化したＮｅｏＲ断片を連結することで、ＮＲＦを得た。ＳＢトランスポザーゼ存在下でのゲノムへの組込みを誘導するために、スリーピングビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ）（ＳＢ）非直列／直列反復配列（ｉｎｄｉｒｅｃｔ／ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔ）（ＩＲ／ＤＲ）部位をすべての構築物に含めた。各導入遺伝子は、伸長因子１アルファ（ＥＦ１−α）プロモーターを使用して推進される。構築物のイラスト表記は、図１Ｂ及び図８Ａで確認することができる。選択用ＤＮＡ及びタンパク質配列は、表２で確認することができる。
【０１１９】
【表２−１】
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【表２−２】
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【０１２０】
遺伝子改変及び細胞増殖：
ジャーカット及びヒトＰＢＭＣは両方共、電気穿孔にはＡｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）ＩＩ（Ｌｏｎｚａ，Ａｌｌｅｎｄａｌｅ，ＮＪ）を使用した。ジャーカット細胞の電気穿孔では、５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．２の１２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、及び５０ｍＭのＤＭＳＯを含む改変緩衝液（Ｃｈｉｃａｙｂａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ２００２，９９（６）：３４００−３４０５）を利用し、プログラムＴ−１４を使用して、ジャーカット細胞をキュベット当たり１０６個として電気穿孔し、その直後にＣＭに移した。電気穿孔の４８時間後に薬物を添加し、電気穿孔から１０〜１２日目の遺伝子発現を調べるために試料採取するまでそのまま細胞を培養した。ヒトＰＢＭＣの電気穿孔は、既報のプロトコール（前出のＲｕｓｈｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．）に従った。簡潔に記載すると、解凍ＰＢＭＣをキュベット当たり１〜２Ｘ１０７個とし、プログラムＵ１４を使用して、Ａｍａｘａ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号ＶＰＡ−１００２）において電気穿孔した。別段の記載がない限り、次の日に、新鮮なＣＭにおいて、１：１の比でＡａＰＣを用い、５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含めてＰＢＭＣを刺激した。細胞の共培養濃度は、それぞれの刺激で１０６個細胞／ｍＬを維持し、同一濃度を使用してＰＢＭＣ由来のＴ細胞を７日ごとに再刺激した。刺激の間に培地交換を行うときは、ＩＬ−２を添加した。共培養開始の４８時間後に薬物処理を開始し、１４日目まで継続した。薬物添加には、必ず新鮮なＣＭを用いた。
【０１２１】
ウエスタンブロット：
培養物から１０６個のＴ細胞を遠心分離し、上清を吸引除去し、液体窒素中でペレットを急速凍結した。５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＮＰ−４０、０．５％のデオキシコール酸塩（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、１５０ｍＭのｐニトロフェニルリン酸（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、及び０．３μＭのアプロチニンをｐＨ  ７．４で使用し、全細胞抽出物を収集した。タンパク質は、還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、表３に示される特異的な一次抗体を使用して分析した。検出は、高感度化学発光検出システムを使用して実施した。
【０１２２】
フローサイトメトリー：
培養した細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳ染色液において１回洗浄した（前出のＲｕｓｈｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．）。導入遺伝子の単独発現を探索するのであれば、試料はフローサイトメーターで分析した。ＲＦＰ発現の分析には、ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。そうでない場合は、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。抗体による表面染色は、蛍光色素複合型抗体を用いて、ＦＡＣＳ染色溶液において４℃で少なくとも３０分間実施した。抗体の標的、濃度、及び製造者は、表４に示される。フローサイトメトリーのデータ解析には、ＦｌｏｗＪｏ  ｖ１０．０．５（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を利用した。
【０１２３】
ルシフェラーゼアッセイ：
培養したＴ細胞におけるｆｆＬｕｃ導入遺伝子の存続性は、Ｄ−ルシフェリンの切断によって試験した（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，カタログ番号１２２７９６）。再懸濁した細胞をプレートに播種し、Ｄ−ＰＢＳにおいて１回洗浄した後、Ｄ−ルシフェリンを０．１４ｍｇ／ｍＬで含むＤ−ＰＢＳ溶液において試験した。３７℃で１０分間インキュベートした後、プレートをＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で分析した。
【０１２４】
【表３】
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【０１２５】
【表４】
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【０１２６】
クロム放出アッセイ（Ｃｈｒｏｍｉｕｍ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ａｓｓａｙ）：
抗原特異的細胞傷害性は、ＣＲＡによってアッセイした。このアッセイは、既報のものである（前出のＲｕｓｈｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．）。簡潔に記載すると、各細胞株に５１Ｃｒを３時間負荷し、その後、標的とエフェクター細胞との比を１：５としてＣＤ１９特異的ＣＡＲ＋Ｔ細胞と共に６時間インキュベートした後、抗原陽性のＣＤ１９＋ＥＬ−４と、抗原陰性のＣＤ１９ｎｅｇＥＬ−４と、を比較した。細胞が溶解して生じる５１Ｃｒ放出を、ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴシンチレーションカウンターによって評価した。
【０１２７】
統計解析：
データの統計解析及び図表記は、Ｐｒｉｓｍ  ｖ６．０（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して達成した。変数が複数存在する実験は、多変量解析によって解析した：適切なときは、シダック（Ｓｉｄａｋ）の多重比較検定と共に二元配置ＡＮＯＶＡを使用し、適切なときであり、適用可能な場合は、チューキー（Ｔｕｋｅｙ）またはダネット（Ｄｕｎｎｅｔｔ）の多重比較検定と共に一元配置ＡＮＯＶＡを使用した。非正規分布は、クラスカル・ワリス（Ｋｒｕｓｋａｌｌ−Ｗａｌｌｉｓ）検定の後、ダン（Ｄｕｎｎ）の多重比較検定によって評価した。単一変数の検定（実験と対照との比較）は、マン・ホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）検定を使用して実施した。統計学的有意性は、α＜０．０５とした。
【０１２８】
結果
Ａ．ジャーカットにおけるＡＴｈｙＲ導入遺伝子の選択試験
悪性腫瘍の初期治療において使用される毒性用量のＡＴｈｙに対する耐性を獲得するようにＴ細胞を遺伝子改変することができるかを、ＤＨＦＲＦＳを使用して決定した。ＭＴＸに対する耐性を有するＤＨＦＲＦＳ＋Ｔ細胞は、Ｊｏｎｎａｌａｇａｄｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２０１３，８（６）：ｅ６５５１９、及びＪｏｎｎａｌａｇａｄｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１３，２０（８）：８５３−８６０によって報告されている。５−ＦＵ耐性であり、細菌培養系内で以前に同定されたＴＹＭＳ変異タンパク質（Ｌａｎｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００１，６１（２）：６６６−６７２）は、ヒト細胞で試験し（データ未掲載）、追加試験には、ＴＹＭＳＳＳを選択した。
【０１２９】
各ＡＴｈｙＲによる生存増進を試験するために、ｅＧＦＰの上流にスリーピングビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ）（ＳＢ）転位因子を含む同一骨格へと、ＤＨＦＲＦＳ、ＴＹＭＳＳＳ、及びＮｅｏＲを個々に発現する構築物を連結した（図１Ｂ）。生存している遺伝子改変Ｔ細胞の優位性追跡には、ｅＧＦＰを使用した。各構築物と、各構築物のゲノムへの組込みを媒介するＳＢ１１トランスポザーゼ（Ｓｉｎｇｈｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００８，６８（８）：２９６１−２９７１）とを、電気穿孔によってジャーカット細胞に同時導入した。電気穿孔の２日後に、細胞傷害性薬物を添加した。１０〜１２日目に、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色された細胞を除外することによって、生存細胞におけるｅＧＦＰの発現を対象として、ジャーカットを評価した（図１Ｃ）。薬物存在下での導入遺伝子選択の尺度として、ｅＧＦＰの発現増加割合を探索した。全生存及びｅＧＦＰの平均蛍光強度（ＭＦＩ）についても、それぞれ図２ＡＩ及び図２ＡＩＩに示される。全体的に見て、伝統的な薬物耐性導入遺伝子であるＮｅｏＲと比較して、ＤＨＦＲＦＳによる選択は、はるかに良好であることをデータは示している。ＴＹＭＳＳＳは、ジャーカットの生存を独立して増進する能力を有さないことも、データは示している。
【０１３０】
より具体的には、ＤＨＦＲＦＳによって、０．０１〜０．５μＭの濃度範囲でＭＴＸに対する耐性が得られ、ＤＨＦＲＦＳのコドン最適化によって、ＣｏＯｐ  ＤＨＦＲＦＳの薬物耐性範囲が０．０１〜１μＭへと増進することが明らかとなった（図１Ｃ）。コドン最適化によって、ＤＨＦＲＦＳのｍＲＮＡに対する内在性ＤＨＦＲの潜在的結合性、ならびにマイクロＲＮＡ結合ドメインが生じる可能性が除去された。注目すべきことに、ｅＧＦＰ＋細胞のゲートによって、ＤＨＦＲＦＳ構築物は、ＭＴＸ依存的にｅＧＦＰのＭＦＩが増加させることが示された。したがって、単一細胞内でのｅＧＦＰの発現は、ＭＴＸの添加に基づいて増加した。この知見は、ＭＴＸが５μＭとなるまでは、ｍＲＮＡの制御とは無関係に得られたものであり、ＭＴＸが５μＭでは、内在性コドンを有するＤＨＦＲＦＳの発現は、ＣｏＯｐ  ＤＨＦＲＦＳと比較して有意に減少した（ｐ＜０．０００１）（図２Ａ−ＩＩ）。薬物誘導性の導入遺伝子発現は希少な現象である。この現象は、希少ではあるが、新規のことではない。ｅＧＦＰのシスでの発現をＭＴＸ依存的な様式で増加させるというＤＨＦＲの能力は、未変化のＤＨＦＲで既に報告されているが、ＭＴＸがＤＨＦＲに結合し、ＤＨＦＲがＤＨＦＲのｍＲＮＡから離れ、ＤＨＦＲの遊離ｍＲＮＡが、ＤＨＦＲタンパク質の翻訳増加を引き起こすということが現象の原因であるとされた（Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ２００２，９９（６）：３４００−３４０５）。ここで、現象は、ＭＴＸ耐性のＤＨＦＲＦＳでも生じ、ＤＨＦＲＦＳでは、ＭＴＸが０．０１〜１μＭにおいてｍＲＮＡの制御とは無関係に現象が生じることに留意されたい。したがって、いかなる理論にも拘束されるものではないが、ＤＨＦＲの発現制御の一部は、ｍＲＮＡに依存しない、これまで未知であった機構を介して生じるものと考えられる。
【０１３１】
５−ＦＵを用いて試験すると、ＴＹＭＳＳＳを発現するジャーカットに薬物選択優位性は存在しなかった（図１Ｃ）。コドンが未変化のＴＹＭＳＳＳでは、ＤＮＡなしのジャーカットに勝る発現優位性は、いずれの５−ＦＵ濃度でも存在しなかった。ｅＧＦＰ＋細胞のｅＧＦＰのＭＦＩをさらに分析することによって、ＣｏＯｐ  ＴＹＭＳＳＳと比較して、ＴＹＭＳＳＳが発現するｅＧＦＰのＭＦＩは低いことが明らかとなった（図２Ａ）。ｍＲＮＡに基づく抑制に起因してＴＹＭＳＦＳの発現が低いということが、ＴＹＭＳＳＳの生存優位性欠如に寄与していると結論づけられる。ｍＲＮＡの制御機構が、コドン最適化によって除去されると、ＴＹＭＳＳＳは、電気穿孔によってモックを導入したジャーカットに勝る有意な発現優位性を有し、５−ＦＵが５μＭでは、僅かな生存優位性を有する。いかなる理論に拘束されるものではないが、生存が有意に増進しなかった理由は、おそらく、５−ＦＵが毒性に寄与する機構が別に存在するためである。
【０１３２】
Ｇ４１８の存在下でＮｅｏＲを使用してジャーカットの生存増進を選択した。これによって、ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳの有用性をはかる標準として役立てることを意図した。電気穿孔によってジャーカットにＮｅｏＲを導入することで、Ｇ４１８を０．７２〜１．１ｍＭとしたＧ４１８存在下で生存が改善した（図１Ｃ）。ＤＮＡなしに勝るＮｅｏＲの生存優位性は、変動に起因して有意ではなかったが（図２Ａ）、Ｇ４１８に依存してＧＦＰのＭＦＩが増加することが確認された。ＧＦＰのＭＦＩは、１．４ｍＭのＧ４１８においてＤＮＡなしのジャーカットに勝って有意に増加した（図２Ａ−ＩＩ）。ＤＨＦＲＦＳ及びＮｅｏＲは、生存ジャーカットにおいて用量依存的に導入遺伝子を選択するという優位性を与える能力を有していることを、こうした結果は後押しするものである。しかしながら、この実験では、ジャーカットに対して信頼できる生存優位性を与えたものは、ＤＨＦＲＦＳのみであった（図２Ａ−ＩＩ）。
【０１３３】
次の実験では、電気穿孔によって各プラスミドをジャーカットに同時導入することによってＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳを組み合わせた。一般に使用される抗葉酸物質でありＡＴｈｙでもあるＭＴＸ、Ｐｅｍ、及びラルチトレキセド（Ｒａｌ）に抵抗する能力を、組み合わせた導入遺伝子で試験した。前述のように、２日目に薬物を添加し、１０〜１２日目に細胞を試験した。同様に処理したＤＮＡなし、または未処理の［ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳ］＋ジャーカットと比較すると、０．１〜１μＭのＭＴＸにおいて、［ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳ］を発現するジャーカットが明瞭に選択された（図１Ｄ）。こうした実験では、内在性コドンを有するＤＨＦＲＦＳを使用しており、実験条件を他に変更することなく、０．５μＭ（図１Ｃ）〜１μＭ（図１Ｄ）のＭＴＸにおいて、ＴＹＭＳＳＳの追加によってＭＴＸに対する耐性が増進したことに留意されるべきである。５０〜１００μＭのＰｅｍついても選択が生じることが確認された（図１Ｄ）。未処理の［ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳ］＋ジャーカットと比較すると、１０μＭのＲａｌにおいて中程度の選択が生じることも確認された（図２Ｂ）。Ｒａｌは、主にＴＹＭＳを標的とする一方で、ＭＴＸ及びＰｅｍは、ＤＨＦＲ及びＴＹＭＳの両方を標的とする（Ｗａｌｌｉｎｇ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  ｎｅｗ  ｄｒｕｇｓ  ２００６，２４（１）：３７−７７）ことから、［ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳ］＋ジャーカットにおいて生じる選択改善は、ＭＴＸ及びＰｅｍがＲａｌを上回った。１μＭのＭＴＸに２週間曝露した後、生存する［ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳ］＋ジャーカットの培地を未処理培地と交換して新しくし、３〜５週間増殖させた。その後、［ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳ］＋ジャーカットにおける導入遺伝子の発現安定性を試験した。この試験は、図１Ｅに示されるように、ＤＨＦＲＦＳの発現に相当するｅＧＦＰと、ＴＹＭＳＳＳの発現に相当するＲＦＰと、の同時発現を用いてフローサイトメトリーによって実施した。それぞれの色は、別々の実験に相当し、重ね合わせることで、相関様式でＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳの同時発現傾向を示す。実際、ＤＨＦＲＦＳの発現に相当するＧＦＰのＭＦＩと、ＴＹＭＳＳＳの発現に相当するＲＦＰのＭＦＩとを、抗葉酸物質である複数の薬物にまたがり、複数濃度で分析したところ、ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳの同時発現は、強いピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）の相関（Ｒ２＝０．９）を有することが示された（図２Ｃ）。理論に拘束されるものではないが、この知見は、ＤＨＦＲＦＳの発現がＴＹＭＳＳＳの発現によって幾分か制御されており、逆もまた同様であることを示唆している。
【０１３４】
Ｂ．ＭＴＸ及び／または５−ＦＵに対する耐性を有する初代ヒトＴ細胞の選択的増殖
示されるように、ＴＹＭＳＳＳは、ＭＴＸ及びＰｅｍの存在下で、ＤＨＦＲＦＳを発現するジャーカットの生存能力を増進し、ＭＴＸ及びＰｅｍは両方共、内在性のＤＨＦＲ及びＴＹＭＳを標的とすることでチミジン合成を阻止するものである。ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳによって毒性濃度のＭＴＸに対する生存強固性が向上することを考慮し、抗葉酸物質及びＡＴｈｙへの耐性を示すために、ＭＴＸを用いた実験を試みた。電気穿孔によってヒトＰＢＭＣに導入することによって、ヒト細胞においてＴＹＭＳＳＳをＤＨＦＲＦＳと共に試験した。電気穿孔の次の日に、ポリクローナルなＴ細胞増殖を生じさせる能力を有するＯＫＴ３結合型ＡａＰＣを用いて細胞を刺激した。増殖スキームは、図３Ａに示される。図３に示されるように、ＡａＰＣによる刺激の２日後に、０．１μＭのＭＴＸ、５μＭの５−ＦＵ、または１．４ｍＭのＧ４１８を共培養物に添加し、１４日目まで保持した。１〜３５日目の間、７日ごとにＡａＰＣを１：１の比で用いて共培養物を再刺激し、５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を添加した。薬物を投与した最初の１４日間、及び薬物投与終了後の２１日間、導入遺伝子発現における表現型の変化を追跡した。図３Ｂ−Ｉ、図Ｃ−Ｉ、図Ｄ−Ｉでは、導入遺伝子の週ごとの発現変化を確認することができる。
【０１３５】
蛍光タンパク質と共に同時発現したＤＨＦＲＦＳ、ＴＹＭＳＳＳ、及びＮｅｏＲの最初の試験によって、ＭＴＸを用いたＤＨＦＲＦＳの発現、及びＧ４１８を用いたＮｅｏＲの発現について、選択が迅速かつ存続性に生じ、ほぼ完全な選択に至ることが示された（図３Ｂ−Ｉ）。ＡＴｈｙＲ＋Ｔ細胞（ＴＡＴｈｙＲ）の生存及び増殖と、ＤＮＡなしのＴ細胞と、を２１日目に比較することで、ＡＴｈｙＲまたはＮｅｏＲを有する導入遺伝子は、Ｔ細胞の生存及び増殖において一定の役割を担う存在であることが示された（図４Ａ）。３５日目に、ＡＴｈｙＲ導入遺伝子を発現するＴ細胞及びＮｅｏＲ導入遺伝子を発現するＴ細胞と、ＤＮＡなしの未処理のＴ細胞と、の推定総細胞数を比較したところ、３５日目に有意に増殖が低下したＴ細胞はＮｅｏＲ＋Ｔ細胞のみであった（図４Ｂ−Ｉ）。ジャーカットにおける実験とは反対に、ＴＹＭＳＳＳによって、５−ＦＵの存在下で２１日目に生存Ｔ細胞の集団内において選択が生じることが示された。しかしながら、選択されたＴＹＭＳＳＳ発現Ｔ細胞は、３５日目まで存続することはなく、ＭＴＸ及び５−ＦＵを使用して［ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳ］を選択したときも、存続性の欠如が確認された。いかなる理論にも拘束されるものではないが、チミジン合成がＴＹＭＳＳＳによって回復し得た後、チミジントランスポーターを介すことで、形質転換されなかった細胞がチミジンを利用できるようになる。いかなる理論にも拘束されるものではないが、この現象は、５−ＦＵの流入を可能にするトランスポーターと同一であり、チミジンの平衡輸送も媒介する平衡型ヌクレオシドトランスポーターによって媒介される可能性がある。図３Ｂ−Ｉで確認されるように、ＴＹＭＳＳＳが、メトトレキサートの存在下でチミジン合成を回復させるため、ＤＨＦＲＦＳは、ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳを発現するＴ細胞の選択を生じさせる能力をもはや有さない。
【０１３６】
組み合わせ治療における使用実現に向けて、ＴＹＭＳＳＳによる完全な選択を達成するために、電気穿孔によって、ＤＨＦＲＦＳ、ＴＹＭＳＳＳ、及び［ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳ］と共にＮｅｏＲを初代Ｔ細胞に導入した。Ｇ４１８で選択したＴ細胞で既に確認された増殖の乏しさを補うために、１４〜３５日目に添加するＩＬ−２を、５０ＩＵ／ｍＬではなく、１００ＩＵ／ｍＬとして増殖方法に変更を加え、これを唯一の変更とした。Ｔ細胞の選択に向けてＧ４１８及び５−ＦＵを組み合わせると、高用量のＩＬ−２は、増殖の乏しさを救助するには不十分であった（図４Ｂ−ＩＩ）。ＤＨＦＲＦＳ及び／またはＴＹＭＳＳＳを発現するＴ細胞にＮｅｏＲを同時導入すると、選択遺伝子の１００％近い選択が観測され、導入遺伝子の選択動態学はすべての群間で同一であった（図３Ｃ−Ｉ）。
【０１３７】
ＭＴＸに曝露したＴ細胞において、ＤＨＦＲＦＳによる選択に対するＴＹＭＳＳＳの影響を試験した。ＤＨＦＲＦＳを発現するプラスミドを、ＲＦＰを同時発現するＴＹＭＳＳＳまたはＲＦＰを単独発現するベクターのいずれかと共に、電気穿孔によってＴ細胞に導入した。この実験では、図３Ｂを対象に記載したものと同一の方針に従った。技術的な制限に起因して、電気穿孔によって同一数のＴ細胞に導入されたＤＨＦＲＦＳ発現プラスミドＤＮＡの総量は少なかった。結果的に、実験の開始時点で、初期にＤＨＦＲＦＳを発現したＴ細胞が少なく、１４日という期間内でＭＴＸの添加によって生じたＤＨＦＲＦＳ選択は不完全であった（図３Ｄ−Ｉ）。１４日目以後に、ＤＨＦＲＦＳの減少が進行したことは、図３Ｂ−Ｉで示されたＴＹＭＳＳＳの発現が生じたことを暗示している。このことは、集団内で安定発現を維持し、大部分を占めるＴ細胞集団を対象として、ＡＴｈｙＲ導入遺伝子が選択されなくてはならないことを示している。ＤＨＦＲＦＳによる選択に対するＴＹＭＳＳＳの影響に関して、［ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳ］を発現するＴ細胞の選択と比較して、［ＤＨＦＲＦＳ及びＲＦＰ］を発現するＴ細胞の選択は、より強固なものであったため、ＴＹＭＳＳＳは、ＤＨＦＲＦＳによるＴ細胞の選択を鈍らせるように思われる。このことは、ＴＹＭＳＳＳが存在することで生じるチミジンの回復に起因する（図３Ｄ−Ｉ）。５−ＦＵが存在すると、ＴＹＭＳＳＳの存在有無にかかわらず、ＤＨＦＲＦＳによる選択は阻止され、このことは、ＴＹＭＳＳＳとは無関係なｍＲＮＡ阻害及びｒＲＮＡ阻害に起因する。
【０１３８】
遺伝子導入による選択を実施すると、Ｔ細胞実験のすべてにおいて、３５日目までにＣＤ４＋Ｔ細胞の集団が増殖する傾向があることも確認され、このことは、未改変のＴ細胞培養では見られないことであった。このことは、細胞傷害性薬物の存在下で１つまたは複数の導入遺伝子を選択した実験のいずれにおいても確認された（図３Ｂ−ＩＩ、図３Ｃ−ＩＩ、図３Ｄ−ＩＩ、それぞれのフロープロットは、図６Ａ、図６Ｂ、及び図６Ｃで見られる）。これは、細胞傷害性薬物によって引き起こされるものではなく、むしろ、細胞傷害性薬物と組み合わせた導入遺伝子が存在することで、３５日目までにＣＤ４＋Ｔ細胞が優勢となることが、図３Ｄ−ＩＩの実験によって示された。ＡＴｈｙＲ＋Ｔ細胞を対象とする最初の薬物選択から７日後は、ＣＤ４＋Ｔ細胞が優勢となるような選択は確認されず（図４Ｃ）、このことは、ＤＨＦＲＦＳＴ細胞を使用して以前に報告された知見と一致する（Ｊｏｎｎａｌａｇａｄｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１３，２０（８）：８５３−８６０）。以前の実験を長期的に追跡することで、ＣＤ８＋Ｔ細胞が細胞傷害性の侵襲後に長期間存続することができないか、またはＣＤ４＋Ｔ細胞が選択的に増殖するという、以前に知られていなかった現象が示された。
【０１３９】
Ｃ．ＭＴＸは、ＤＨＦＲＦＳ＋Ｔ細胞におけるシス−導入遺伝子の発現を増加させる
導入遺伝子の発現をＭＴＸ媒介性に変化させることは、動物及びヒトの両方において、導入遺伝子の発現をインビボで制御するために有用である。したがって、本発明によれば、臨床的に利用可能な薬物であるＭＴＸを使用することで、Ｔ細胞における導入遺伝子の発現向上または発現低下のいずれも媒介される。この制御の存続性を調べるために、ジャーカットにおいて発現したＤＨＦＲＦＳ、ＣｏＯｐ  ＤＨＦＲＦＳ、及び［ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳ］を、１μＭのＭＴＸにおいて２週間選択し、３〜５週間休止させた後、ＤＨＦＲＦＳの発現におけるＭＴＸ媒介性の制御を試験した。図５Ａでは、選択されたＤＨＦＲＦＳ及びコドン最適化（ＣｏＯｐ）ＤＨＦＲＦＳのジャーカットＴ細胞株における発現は一定であったことが示される。シスで発現したｅＧＦＰによって示されるように、ＣｏＯｐ  ＤＨＦＲＦＳは、ＤＨＦＲＦＳの有意な発現上昇に寄与することもなく、導入遺伝子発現のＭＴＸ誘導性の増加を阻止することもないことが、図５Ｂにおいて確認された。これは、予想外のことであった。しかしながら、図５Ａ及び図５Ｂに示されるように、ＴＹＭＳＳＳをＤＨＦＲＦＳと同時発現すると、ＤＨＦＲＦＳ発現のＭＴＸ誘導性の増加が減少することが確認された。ＴＹＭＳＳＳを追加すると、ＭＴＸの非存在下で、未変化のＤＨＦＲＦＳの発現に僅かな減少が生じた。ＭＴＸを添加しても、いずれかのＤＨＦＲＦＳ型の完全発現の間に見られたＤＨＦＲＦＳ発現のものと同一の増加を誘導することはできなかった。したがって、ＴＹＭＳＳＳは、ＤＨＦＲＦＳのＭＴＸ誘導性の増加において一定の役割を担っている。ある特定の実験では、ジャーカットにおいてＴＹＭＳＳＳをＤＨＦＲＦＳと共に同時発現すると、ｅＧＦＰのＭＦＩの、ＭＴＸ誘導性の増加が鈍る（図３Ｂ−Ｉ）。したがって、ＭＴＸ媒介性のＴＹＭＳ阻害に依存するシス−導入遺伝子のＭＴＸ誘導性の発現は、ＤＨＦＲＦＳによって維持される。
【０１４０】
ＤＨＦＲＦＳの発現がＭＴＸ誘導性に増加し、この発現増加は、ＴＹＭＳＳＳによって阻止されるという知見を、次に、こうした導入遺伝子の発現を初代Ｔ細胞において再現しようと試みた。ネオマイシン耐性を含む選択ベクターを含めると、ＭＴＸ、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、及びＧ４１８のそれぞれの薬物と共に２〜１４日目にかけて増殖させて選択することによって、ＤＨＦＲＦＳ、ＴＹＭＳＳＳ、または［ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳ］の発現が、安定性及び純度を伴って達成された。図５Ｃでは、ＤＨＦＲＦＳ、ＴＹＭＳＳＳ、または［ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳ］について、ＤＨＦＲＦＳに連結されたｅＧＦＰと、ＴＹＭＳＳＳに連結されたＲＦＰと、の発現を確認することができる。ジャーカットにおいて見られたように、ＤＨＦＲＦＳの発現は、ＭＴＸの存在下で増加するが（図５Ｄ）、この増加は、ＴＹＭＳＳＳがＤＨＦＲＦＳと同時発現すると鈍り、もはや有意ではなくなることが再び確認された。注目すべきは、５−ＦＵを用いた選択と、Ｇ４１８によって選択されるトランスのネオマイシン耐性遺伝子と、によって、ＤＨＦＲＦＳを含まないＴＹＭＳＳＳの発現が初代Ｔ細胞において成功裏に達成されたことである。高用量のＭＴＸの存在下で誘導されるＴＹＭＳＳＳの変化を試験すると（図５Ｄ）、ＴＹＭＳＳＳに連結されたＲＦＰは有意に減少することが明らかとなった。同一の処理条件において、ＤＨＦＲＦＳがＴＹＭＳＳＳと共に存在すると、この減少は阻止された。ＴＹＭＳＳＳの発現は、ＭＴＸ誘導性に減少し、ＭＴＸ耐性のＤＨＦＲＦＳによって回復した。こうした知見は、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸（５，１０  ＣＨ２ＴＨＦ）の欠乏によってＴＹＭＳＳＳが抑圧されている可能性を示している。いかなる特定の機構にも限定はされないが、ＭＴＸは、５，１０  ＣＨ２ＴＨＦの低下を引き起こすものであり、ＴＹＭＳ及びＴＹＭＳＳＳのｍＲＮＡに対するＴＹＭＳタンパク質の結合を引き起こし、これによって発現が阻止されるということが提唱される。ＴＹＭＳＳＳは、点変異が生じていることを除いては、未変化の配列と等価であることに留意されるべきである。
【０１４１】
図５Ａ〜５Ｂの知見に基づくと、ＤＨＦＲＦＳの発現は、チミジン合成によっても制御されることが提唱される。同様に、図５Ｃ及び図５Ｄの知見に基づくと、ＴＹＭＳＳＳの発現は、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）の合成によって制御されることが提唱される。ＴＨＦの誘導体は、チミジン合成に使用されるため、ＤＨＦＲＦＳは、ＴＹＭＳＳＳの発現を制御し、ＴＹＭＳＳＳは、ＤＨＦＲＦＳの発現を制御すると、論理的に結論付けた。したがって、ＤＨＦＲＦＳとＴＹＭＳＳＳとの発現相関は、個々の細胞内で生じることに留意されるべきである。図５Ｅではジャーカットのフロープロット、及び図５Ｆでは初代Ｔ細胞のフロープロットを観測することによって、ＤＨＦＲＦＳとＴＹＭＳＳＳとの発現相関を試験したところ、相関が確認された。対照ＲＦＰベクターは、ＤＨＦＲＦＳを同時発現するが、ＴＹＭＳＳＳのシスでの発現によって調節されておらず、同一の同時発現パターンを有していないように思われた（図５Ｆ）。この観測を定量化するために、抗葉酸物質であるＭＴＸ、ペメトレキセド、及びラルチトレキセドを異なる濃度で用いて、［ＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳ］を発現するジャーカットを２週間処理した。その後、それぞれ別々のウェルを対象として、ＤＨＦＲＦＳに連結されたｅＧＦＰのＭＦＩと、ＴＹＭＳＳＳに連結されたＲＦＰのＭＦＩと、をプロットし、それらは相関していた。ＤＨＦＲＦＳとＴＹＭＳＳＳとの発現の結びつきは有意であり、直線回帰に適合した（図５Ｇ）。こうした知見は、ＤＨＦＲ及びＴＹＭＳの一般的な制御機構の存在を支持し、当該制御機構は、ＤＨＦＲＦＳとＴＹＭＳＳＳとの直線的な同時発現を生じさせるものである。このモデルは、図５Ｈに示される。
【０１４２】
図５Ｈの上記モデルに基づくと、ＴＹＭＳＳＳの発現は、ＭＴＸの存在下で生じる強力な発現変更に由来して、ＤＨＦＲＦＳによって安定化するであろうと思われる。図５Ｉでは、このことを、ＲＦＰ、またはＴＹＭＳＳＳに連結されたＲＦＰのいずれかと共にＤＨＦＲＦＳを発現する初代Ｔ細胞を用い、ＭＴＸ用量を増加させて適用することによって試験した。予想されたとおり、ＤＨＦＲＦＳに連結されたｅＧＦＰは、ＭＴＸの濃度増加によって増加し、この増加は、ＴＹＭＳＳＳが存在することによって鈍った（図５Ｉ〜５Ｊ）。このことは、チミジン合成が回復することによってＤＨＦＲＦＳにおけるＭＴＸ誘導性の増加が阻止されるという、図５Ｈのモデルを支持するものである。さらにこのモデルが支持されることには、ＴＹＭＳＳＳに連結されたＲＦＰは、使用したＭＴＸのいずれの濃度でも有意に増加しなかった（図５Ｉ〜５Ｊ）。ＤＨＦＲＦＳに連結されたｅＧＦＰが増加すると、対照ＲＦＰも同様に増加しており、ＲＦＰ単独の発現増加は予想外のことであった。可能性のある説明としては、この増加は、０．５μＭを超えるＭＴＸで確認されており、ＤＨＦＲＦＳ単独では、０．５μＭのＭＴＸに耐性を示すにすぎないということである。９このことは、ＭＴＸの用量が高まると、ＤＨＦＲＦＳ及び関連遺伝子の遺伝子含量が高い細胞の選択が始まることを示唆している。注目すべきことに、ＴＹＭＳＳＳと同時発現したＤＨＦＲＦＳは、最大で１μＭのＭＴＸ濃度に対する耐性を有している。このことは、ＴＹＭＳＳＳを使用することで、導入遺伝子の発現が調節されて、ＤＨＦＲＦＳと共にシスまたはトランスで発現する遺伝子の遺伝子発現レベルが高まる方向へ向かうという望まない選択が阻止されるということをさらに支持するものである。
【０１４３】
次に、誘導性自殺遺伝子である誘導性カスパーゼ９（ｉＣ９）をシスで発現するＤＨＦＲＦＳ構築物を用いた。この構築物は、ＤＦＳｉＣ９と呼ばれ、ＭＴＸの存在下でＤＦＳｉＣ９を発現するＴ細胞の選択を生じさせると共に、ｉＣ９を活性化してアポトーシスを誘導する薬物の存在下でＤＦＳｉＣ９＋Ｔ細胞を除去するものである。上記の知見に基づくと、ＤＨＦＲＦＳは、制御なしでは毒性が高すぎて発現させることができない対象導入遺伝子の発現を調節及び潜在的に除去するためにＤＦＳｉＣ９において使用できる可能性がある。インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）が、そのような導入遺伝子にあたる。ＩＬ−１２は、腫瘍特異的Ｔ細胞から、腫瘍に対する強力な免疫応答を誘導する能力を有するサイトカインである。しかしながら、合成ＩＬ−１２は、毒性が高く、有効性は低い。本明細書では、代替手法が提示され、当該手法では、ＩＬ−１２の発現レベルを減少及び安定化するために、ＩＬ−１２は、ＴＹＭＳＳＳに対してシスで発現される。図５Ｋのフロープロットでは、ＴＹＭＳＳＳと共にシスで発現したＩＬ−１２の発現と、ＤＨＦＲＦＳの発現と共にシスで発現したｉＣ９と、が示される。ドナー細胞は、未処理のままとするか、または高用量のＭＴＸで７日間処理した。この発現パターンは、毒性用量のＭＴＸへの曝露が長期に及んだとしても、ＩＬ−１２が安定して発現し得ることを示しているように思われる。同様に操作されたドナーの追加解析は（図５Ｌ）、ＴＹＭＳＳＳが、ＤＨＦＲＦＳと共に同時発現すると、潜在的に毒性を有する対象導入遺伝子であるＩＬ−１２の発現を安定化する潜在能力を有していることを示している。
【０１４４】
図３Ｄに示される実験に由来するＴ細胞もまた、さまざまな濃度のＭＴＸに曝露した。３５日目に、Ｔ細胞に抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を与え、０〜１μＭの範囲のＭＴＸに７２時間曝露した。３５日目に、ＤＨＦＲＦＳをバックグラウンドに勝って有意に発現するＴ細胞群は存在せず、このことは、同時発現するｅＧＦＰによって示された（図３Ｄ−Ｉ）。しかしながら、ＭＴＸ単独で選択したＤＨＦＲＦＳ＋Ｔ細胞は、最大０．５μＭのＭＴＸ濃度でＭＴＸが再導入されると、有意な生存改善に十分なほど存続した（図７Ｂ）。図７Ａのフロープロットでは、１つのドナーで、導入遺伝子の発現がＭＴＸ依存性に増加し、導入遺伝子を発現するＴ細胞の生存が改善したことが示される。［ＤＨＦＲＦＳ＋及びＴＹＭＳＳＳ］＋Ｔ細胞におけるＴＹＭＳＳＳの追加は、１μＭのＭＴＸにおける導入遺伝子陰性細胞の生存を可能としたが、これは、ＭＴＸに曝露したＴＹＭＳＳＳｎｅｇＴ細胞では見られなかったことに留意されるべきである（図７Ｃ）。
【０１４５】
Ｄ．ＡＴｈｙＲは、対象導入遺伝子の独立した選択を可能にする
ＡＴｈｙＲは、ヒトタンパク質であり、それ故に、ＮｅｏＲまたは典型的には細菌を起源とする類似の薬物耐性導入遺伝子と比較して、ヒトにおける免疫原性が低い。したがって、免疫原性が低く、インビトロでの取り扱いが容易であるため、対象導入遺伝子の選択には、ＡＴｈｙＲを使用することが望ましい。示されるように、ＤＦＳｉＣ９と命名された構築物においてｉＣ９をＤＨＦＲＦＳと共に同時発現することによって、自殺遺伝子である誘導性カスパーゼ９（ｉＣ９）を選択した（図８Ａ）。ｉＣ９を選択する現行の方法は、表面に発現した抗原を利用し、磁気ビーズによって単離するというものである。しかしながら、この選択方法は、薬物添加と比較して労働集約性が高く、ＡＴｈｙ耐性という機能性を付加するものではない。０．１μＭのＭＴＸへ曝露した２〜７日目の日数を含む、ＡａＰＣに基づく７日間の刺激後に、ＤＦＳｉＣ９プラスミドはＴ細胞の生存を対象として有意に選択された（図８Ｂ）。次に、電気穿孔によってＣＡＲと共にＤＦＳｉＣ９を同時導入してＴ細胞で発現させた。ＣＡＲは、ＣＡＲ細胞外ドメイン結合リガンド（ＣＡＲＬ）＋Ｋ５６２  ＡａＰＣ（前出のＲｕｓｈｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．）によって特異的に選択し、ＤＦＳｉＣ９は、０．１μＭのＭＴＸを使用して選択した。２〜１４日目にかけて、０．１μＭのＭＴＸに曝露した後、ＣＡＲ＋ＤＦＳｉＣ９＋Ｔ細胞を、ＭＴＸを含めずに休止させるか、またはさらに７日間、０．１μＭのＭＴＸにおいて選択した。図８Ｃでは、２〜２１日目にかけて０．１μＭのＭＴＸにおいて選択したＴ細胞と、電気穿孔によってモックを導入したＴ細胞と、の比較が示される。前述のように、２１日目までＭＴＸで選択した後、ＣＤ４＋Ｔが優勢となる方向に向かう選択は生じていない。
【０１４６】
こうした細胞は、標的：エフェクターの比を５：１とした際に予想されるレベルの細胞傷害性も示した（図８Ｄ）。ＣＡＲというよりはむしろ、ｉＣ９と共にＤＨＦＲＦＳを同時発現することで、ｉＣ９の化学的２量体形成誘導物質であるＡＰ２０１８７の添加を介してＴ細胞を除去するという潜在能力が追加された（図８Ｅ）。ＡＰ２０１８７を添加することによって、ＭＴＸとは無関係に、休止ＣＡＲ＋Ｔ細胞が有意に枯渇した。このことは、ＤＦＳｉＣ９が、ｉＣ９の発現の効率的な選択を生じさせることができ、遺伝子改変したＴ細胞を必要に応じて枯渇させることができるということを示している。ＤＨＦＲＦＳを使用することで、抗原特異性及び抗原発現とは無関係に、Ｔ細胞における導入遺伝子発現の選択が生じるという利点が得られる。
【０１４７】
実施例２
材料及び方法
健康なドナーに由来する末梢血は、テキサス州ヒューストンのＭＤＡＣＣ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋから入手し、密度勾配遠心に供すことで単核細胞を単離した。単離した単核細胞は、完全培地（ＣＭ）において休止させるか、または既に要約したように凍結した。末梢血由来の単核細胞（ＰＢＭＣ）を休止または凍結したものの使用については、各実験において要約した。活性化及び増殖用細胞（ＡａＰＣ）であるＯＫＴ３抗体結合型Ｋ５６２のクローン番号４を解凍して使用し、ＰＢＭＣ由来のＴ細胞を刺激した。Ｓｉｎｇｈ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ，ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２０１３，８（５）を参照のこと。ＡａＰＣにおけるマイコプラズマの存在を試験してから、Ｔ細胞の刺激を実施した。細胞の計数は、自動化細胞計数機（ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ）（Ｎｅｘｃｅｌｃｏｍ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ＭＡ）を使用し、０．１％のトリパンブルー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔ８１５４）で染色された細胞を除外することによって達成した。細胞の単離は、製造者の説明書に従って、ＣＤ４＋，ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１３０−０９１−３０１）を用いた、磁気ビーズに基づく選別を使用して達成した。簡潔に記載すると、ＣＤ４＋Ｔ細胞を陰性に選択した後、抗ＣＤ２５ビーズを用いた選別を１回実施することで、エフェクターＴ細胞（ＣＤ２５ｎｅｇ）とＴｒｅｇ（ＣＤ２５ｐｏｓ）とを区別した。
【０１４８】
培養条件：無細胞刺激は、既に記載した可溶性の３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３、１００ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８、及び５０ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ−２を、既に記載したように使用して達成した。記載があるときは、下記の薬物を使用した：５−ＦＵ、ＭＴＸ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢ、ゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）、ラパマイシン、メトホルミン、ＡＩＣＡＲｔｆ／イノシン一リン酸（ＩＭＰ）シクロヒドロラーゼ（ＡＴＩＣ）２量体化阻害剤（ｉＡＴＩＣ）（表５）。無細胞刺激を行う実験では、刺激と同日に毒性薬物の添加またはそれによる処理を実施した。
【０１４９】
【表５】
2018506995.tif 000007
【０１５０】
ＤＮＡ発現プラスミド：
選択ベクター：ＦＬＡＧ−ＤＨＦＲＦＳ−２Ａ−ｅＧＦＰ  ｐＳＢＳＯ（ＤＨＦＲＦＳ−ＧＦＰ（ＤＧ）と記載）、ＦＬＡＧ−ＴＹＭＳＳＳ−２Ａ−ｅＧＦＰ  ｐＳＢＳＯ（ＴＹＭＳＳＳ−ＧＦＰ（ＴＳＧ）と記載）、ＮＬＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ  ｐＳＢＳＯ（ＲＦＰ）、ＦＬＡＧ−ＴＹＭＳＳＳ−２Ａ−ＮＬＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ  ｐＳＢＳＯ（ＴＹＭＳＳＳ−ＲＦＰ（ＴＲＧ）と記載）、ネオマイシン耐性（ＮｅｏＲ）−２Ａ−ｅＧＦＰ  ｐＳＢＳＯ（ＮｅｏＲ−ＧＦＰ（ＮＲＧ）と記載）、及びＭｙｃ−ｆｆＬｕｃ−ＮｅｏＲ  ｐＳＢＳＯ（ＮＲＦ）を、既に記載したように設計、構築、及び利用した。ＳＢトランスポザーゼを用いたゲノムへの組込みを誘導するために、スリーピングビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ）（ＳＢ）非直列／直列反復配列（ＩＲ／ＤＲ）部位を各構築物に存在させた。各導入遺伝子は、伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）プロモーターによって発現させた。
【０１５１】
遺伝子形質転換及び細胞増殖：
既に記載したように、ヒトＰＢＭＣの形質転換には、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）ＩＩを利用し、プログラムＵ１４を使用して、Ａｍａｘａ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液において１〜２＊１０７の解凍ＰＢＭＣを電気穿孔した。次の日に、ＣＭにおいて、ＡａＰＣを１：１の比で用い、５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含めてＰＢＭＣを刺激した。後に実施する刺激のそれぞれで、Ｔ細胞とＡａＰＣとの共培養は、１＊１０６個細胞／ｍＬに維持した。記載の濃度でＩＬ−２及びＡａＰＣＴを用いて、７日ごとに共培養物を再刺激することによって、細胞の増殖を促進した。刺激の間に培地交換を行うときは、ＩＬ−２を新たに添加した。遺伝子導入実験の間、共培養開始から４８時間後に薬物を添加し、１４日目まで所与の濃度を維持した。１４日目以降は、Ｔ細胞培養物への薬物添加は実施しなかった。
【０１５２】
ウエスタンブロット：
記載のあるときは、ウエスタンブロットに向けて、１＊１０６個のＴ細胞を遠心することによってＴ細胞を培養物から分離し、液体窒素中で細胞ペレットを急速凍結した。細胞ペレットは、５０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＮＰ−４０、０．５％のデオキシコール酸、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、１５０ｍＭのｐ−ニトロフェニルリン酸、及び０．３μＭのアプロチニンをｐＨ７．４で用いて溶解及び調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したタンパク質、及び表６に示される一次抗体を使用することで、化学発光を介してタンパク質の存在を検出した。
【０１５３】
【表６】
2018506995.tif 000008
【０１５４】
フローサイトメトリー：
培養したＴ細胞は、ＦＡＣＳ染色溶液［９５］において洗浄した後、ＦＡＣＳ染色溶液において、蛍光色素複合型抗体を用いて４℃で少なくとも３０分間、抗体による表面染色を実施した。細胞内転写因子及びサイトカインの染色は、表面染色後に実施し、その際、ＦｏｘＰ３／転写因子染色緩衝液セットを利用し、製造者のプロトコール（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，００−５５２３−００）に従った。ＦｏｘＰ３を発現する試料のほとんどで、分析にはＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。抗体の標的、濃度、及び製造者は、表７に示される。フローサイトメトリーのデータ解析には、ＦｌｏｗＪｏ  ｖ１０．０．５（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を利用した。リン酸化抗原を染色した細胞のフローサイトメトリーによるイメージングは、下記のプロコールに従ってＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ  Ｍａｒｋ  ＩＩ（Ａｍｎｉｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を使用して達成した；表面染色の後、１００％のメタノール（Ｓｉｇｍａ）において試料を４℃で１時間固定化した後、製造者のプロコールに要約されるように、ＦｏｘＰ３／転写因子染色緩衝液セットの洗浄用緩衝液において洗浄及び染色を実施した。イメージサイトメトリーのデータ解析には、Ａｍｎｉｓ  ＩＤＥＡＳ  ｖ６．０を利用した。
【０１５５】
【表７】
2018506995.tif 000009
【０１５６】
チミジン取り込みアッセイ：
チミジン取り込みアッセイは、各ウェルに２＊１０５個の生存細胞を含め、抗ＣＤ３／ＣＤ２８及びＩＬ２を使用し、生存細胞を刺激して実施した。エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）とＴｒｅｇとをさまざまな比で各ウェルにおいて混合し、Ｕ底の９６ウェルプレートにおいて、ウェルをすべて３連にして実験を実施した。４８時間時点で、１μＣｉの［３Ｈ］チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を各ウェルに添加し、２４時間後に、Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ  ＮＸＴ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）で細胞の放射能を評価した。Ｔｒｅｇ媒介性の成長抑制を下記式によって決定した：（処理なしのＴｅｆｆ［ｃｐｍ］−（Ｔｒｅｇ及び処理なしのＴｅｆｆ［ｃｐｍ］））／処理なしのＴｅｆｆ［ｃｐｍ］。
【０１５７】
統計解析：
図表記及びデータの統計解析は、Ｐｒｉｓｍ  ｖ６．０（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を用いて実施した。適切なときであり、適用可能な場合は、チューキー（Ｔｕｋｅｙ）またはダネット（Ｄｕｎｎｅｔｔ）の多重比較検定と共に一元配置ＡＮＯＶＡを使用した。非正規分布は、クラスカル・ワリス（Ｋｒｕｓｋａｌｌ−Ｗａｌｌｉｓ）検定の後、ダン（Ｄｕｎｎ）の多重比較検定によって評価した。ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３に関わる総細胞数及び発現データは、非正規分布となる傾向を有していた。単一変数の検定（実験と対照との比較）は、マン・ホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）検定を使用して実施した。統計学的有意性は、α＜０．０５とした。
【０１５８】
結果
ＭＴＸによるＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の薬物選択の一部は、毒性を介して生じる。
ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の選択にＭＴＸがどのように寄与するかを決定するために、細胞傷害性薬物または致死性のγ線照射の存在下で、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体及びＩＬ−２を用いて、新たに得られたＰＢＭＣを刺激した。７日後、刺激と共に細胞傷害性の侵襲のいずれを与えて刺激したＴ細胞においても、生存マーカーであるアネキシンＶ及び７−ＡＡＤに有意差が存在した（図１Ｂ−Ｉ）。ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の選択は、細胞傷害性とは一致しなかった。７日間の刺激の後、２グレイのγ線照射は、生存集団におけるＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の量を有意に増加させた（図１Ｂ−ＩＩ）。この致死性処理は、考えられる一般経路を標的としたものでもなく、シスプラチンもそうではないが、両方がＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３を増加させた。しかしながら、シスプラチンによって誘導されたＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の増加は僅かであった。５−ＦＵ及びＭＴＸでは、有意な増加が生じた。リボソーム伸長阻害剤であるＧ４１８は例外であったが、それぞれの細胞傷害性処理は、生存ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の割合を増加させるものであると思われる。Ｂａｒ−Ｎｕｎ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ａｃｔａ  １９８３，７４１（１）：１２３−１２７を参照のこと。さまざまな細胞傷害性の侵襲に対して、このようなパターンでＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の割合が増加することは、ある特定の薬剤によって増進し得る一般経路の存在を示唆するものである。理論に拘束されるものではないが、この経路は、Ｔｒｅｇの増殖速度の減少と関係する可能性があり、リボソームによって媒介されるもののように思われる。この理由は、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の割合が増加するという、この一般的な傾向をＧ４１８が阻害し得るためである。Ｃａｏ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１１，８７（１）：７１−８０を参照のこと。
【０１５９】
Ｇ４１８でＴｒｅｇが枯渇し、ＭＴＸによってＴｒｅｇが選択されるという知見を、前述のように、抗ＣＤ３／ＣＤ２８をＩＬ−２と共に用いて解凍ＰＢＭＣを７日間刺激することによって、用量依存性をさらに評価した。Ｇ４１８は、試験したすべての用量で有意な細胞傷害性を示したが、２つの中程度の薬物用量でＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３を有意に枯渇させた（図１０Ｃ）。ＭＴＸもまた、試験したすべての用量で細胞傷害性を示したが、低用量でＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３が有意に上昇した（図１０Ｄ）。ラパマイシン（Ｒａｐａ）は、Ｔｒｅｇ選択の対照として使用し［１３８］、細胞傷害性とは無関係に、中程度の薬物濃度でＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の類似した選択を生じさせたが、選択は最高用量のみで生じた（図１０Ｆ）。高用量というよりむしろ中程度の薬物用量でＴｒｅｇの選択またはＴｒｅｇに対する選択が生じたことは、薬物誘導性の選択または枯渇に対して、Ｔｒｅｇが有する治療域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｗｉｎｄｏｗ）が狭いことを示唆している。ＡＴＩＣの特異的阻害剤［１４２］を使用して、ＭＴＸがＡＴＩＣの阻害を介してＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の選択を媒介するかどうかを試験した。理論に拘束されるものではないが、ＡＩＣＡＲｔｆまたはＡＩＣＡＲｔｆを含むヘテロ２量体複合体であるＡＴＩＣを阻害すると、ＡＩＣＡＲが増加する。図１０Ｅは、ＡＴＩＣを単独で阻害しても、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３に対して細胞傷害性も選択性も示さなかったことを示す。図１０Ｇでは、同一ドナーによって示されたフロープロットをさらに解析し、使用薬剤のいくつかについて、ＣＤ４及びＦｏｘＰ３の発現を示している。ｉＡＴＩＣを使用するとＣＤ４＋Ｔ細胞においてＦｏｘＰ３の発現増加が特徴的に媒介され、これはＲａｐａで生じたものと類似していたが、ＭＴＸ、Ｇ４１８、またはＲａｐａのようにＦｏｘＰ３ｎｅｇＴ細胞の増殖を阻害することはなかった。したがって、ｉＡＴＩＣでは、ＣＤ４＋ＴにおけるＦｏｘＰ３の発現が増進したが、ＦｏｘＰ３ｎｅｇＴ細胞の増殖を許容することによって、こうした細胞の希釈が生じた。ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３のＭＴＸ媒介性の選択は、急速に増殖するエフェクターＴ細胞の枯渇と、Ｒａｐａと類似し、リボソーム阻害と関係する経路を介したＦｏｘＰ３の発現増進と、によって生じると思われる。リボソーム阻害剤であるＧ４１８に対するＴｒｅｇの感受性増加は、ＦｏｘＰ３の発現増進と、リボソーム阻害に対する感受性増加との、この関係性を確固たるものにするものである。
【０１６０】
ＭＴＸの抗葉酸物質作用及び抗チミジン物質作用に耐性を有する初代Ｔ細胞において、Ｔｒｅｇは優先的に増殖する。
制御性Ｔ細胞は、薬物による選択の後、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を阻害したという仮説を立てた。この仮説を試験するために、ＤＨＦＲＦＳ、ＴＹＭＳＳＳ、ＮｅｏＲ、またはそれらの組み合わせを形質転換することによって薬物耐性Ｔ細胞を得て、既に記載したように、数的に増殖させた。簡潔に記載すると、３５日目まで、７日ごとに、ＯＫＴ３結合型ＡａＰＣと、５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２とを用いて刺激しながら、２〜１４日目と命名したものと同様に、０．１μＭのＭＴＸ、５μＭの５−ＦＵ、または１．６ｍＭのＧ４１８の存在下で、形質転換Ｔ細胞を選択した。Ｓｉｎｇｈ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２０１３，８（５）を参照のこと。ＣＤ４＋Ｔ細胞集団におけるＦｏｘＰ３の発現上昇によってＴｒｅｇの試験を最初に実施したところ、ＤＨＦＲＦＳを発現するＴ細胞においてＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の割合が有意に増加することが示された。ＭＴＸを使用する選択において、電気穿孔によってモックを導入した（ＤＮＡなし）Ｔ細胞との比較を２１日目に実施したところ、この増加が示され（図１１）、この増加は、選択の間に５−ＦＵとＭＴＸとを組み合わせると、３５日目まで存続した（図１２Ａ）。選択の後、各実験集団では、遺伝子導入Ｔ細胞はほとんど完全にＣＤ４＋であったが、Ｔｒｅｇの優位性は、未操作のＣＤ４＋Ｔ細胞コンパートメントにおいて典型的に見られる５〜１０％を超えることが多いように思われた。Ｔｒｅｇ機能のマーカーも評価した。ＩＬ−２の発現が低いこと［］が、Ｔｒｅｇの形質として知られており、ＦｏｘＰ３の発現と併せて評価した。図１２Ｂでは、ＦｏｘＰ３ｐｏｓ、ＩＬ−２ｎｅｇの発現パターンを有するＴ細胞集団の割合が示される。図１２Ｃでは、ＴＧＦ−β複合体の一部である潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）の発現と、活性化Ｔｒｅｇとの強い関連が見られる。
【０１６１】
導入遺伝子であるＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳと、対照選択ベクターである、ＮｅｏＲを有するＴ細胞及び未処理でありＤＮＡなしのＴ細胞と、を個々及び組み合わせて比較した。図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ−Ｉでは、この実験で、選択がＴｒｅｇに向くことを確認することができる。この実験によって、ＭＴＸ及び５ＦＵの組み合わせにおいて選択された［ＤＨＦＲＦＳ−ＧＦＰ（ＤＧ）及びＴＹＭＳＳＳ−ＲＦＰ（ＴＳＲ）］＋Ｔ細胞では、モックを形質転換したＴ細胞と比較すると、Ｔｒｅｇに特徴的な細胞集団が増加していることが示された。Ｔｒｅｇの選択に対するＤＨＦＲＦＳ及びＴＹＭＳＳＳの寄与をさらに解明するために、ＮｅｏＲと、ＤＨＦＲＦＳ、ＴＹＭＳＳＳ、またはそれらの組み合わせと、を電気穿孔によって同時に導入した。ＮｅｏＲを追加すると、すべてのＴ細胞集団において、ＤＨＦＲＦＳ、ＴＹＭＳＳＳ、及びそれらの組み合わせを等価に選択することが可能となった。形質転換されなかったＴ細胞を除去することで、ＤＨＦＲＦＳ単独で、Ｔｒｅｇに特徴的な細胞を選択することができたが、ＴＹＭＳＳＳ単独ではこの選択は生じないことが明らかとなった（図１２Ａ、図１２Ｂ、及び図１２Ｃ−ＩＩ）。［ＤＧ及びＴＳＲ］＋Ｔ細胞では、Ｔｒｅｇの特徴を有する細胞の選択が継続した。最終的に、ＤＨＦＲＦＳによるＴｒｅｇの選択に対するＴＹＭＳＳＳの寄与を、電気穿孔によってＴＳＲまたは対照ベクターであるＲＦＰを同時導入することによって評価した。図１２Ａ、図１２Ｂ、及び図１２Ｃ−ＩＩＩでは、この実験に由来するＴｒｅｇの特性が示される。この実験は、ＭＴＸを用いたＤＨＦＲＦＳによる選択は、Ｔｒｅｇの増殖を増進することができ、５−ＦＵは、この選択をＴＹＭＳＳＳとは無関係に増進することを示している。Ｔｒｅｇの選択は、ＤＨＦＲＦＳによる葉酸救助（ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｓｃｕｅ）のおかげで生じる。葉酸は、Ｔｒｅｇの生存において一定の役割を担っていることが知られるため、このことは予想されることである。Ｋｕｎｉｓａｗａ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２０１２，７（２）：ｅ３２０９４を参照のこと。驚くべきことに、Ｔｒｅｇの選択には、チミジンのデノボ合成は必要ではなかった。この理由は、ＴＹＭＳＳＳは、ＭＴＸ及び５−ＦＵによるＴＹＭＳの阻害を軽減するものであるが、そのＴＹＭＳＳＳが必要とされなかったためである。
【０１６２】
以前の知見では、ＰＢＭＣにおける５−ＦＵ存在下での生存及び毒性は、ＴＹＭＳ及び代替機構によって媒介されることが示された。Ｅｉｓｅｎｔｈａｌ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００９，２９（１０）：３９２５−３９３０を参照のこと。Ｔｒｅｇ選択薬剤であるＭＴＸ、５−ＦＵ、及びラパマイシンの既知の機構を統合することによって、図１３に示す図を得た。この図は、各薬剤とリボソーム機能とがどのように相互作用するかを詳細に示すものである。捕捉の図１Ａに示される実験では、ネオマイシン耐性遺伝子によって、Ｇ４１８処理からＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３が救助されることが確認された。この知見は、Ｇ４１８の特異的作用が、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の枯渇を担っていることが示唆しており、この現象をさらに探求した。
【０１６３】
アミノグリコシドであるＧ４１８によるリボソーム阻害は、複製性ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３を選択的に枯渇させる。
代替用量のＧ４１８、異なるアミノグリコシドであるハイグロマイシンＢ、ＤＮＡを標的とする抗生物質であるゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）、及びＲａｐａの存在下で、抗ＣＤ３／ＣＤ２８をＩＬ−２と併せて用いて、解凍ＰＢＭＣを７日間活性化することで、アミノグリコシドによるＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の用量依存的な選択または枯渇を評価した（図１４Ａ）。アミノグリコシドであるＧ４１８の存在下で、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の枯渇が再び確認される。代替アミノグリコシドであるハイグロマイシンでは、０．２ｍＭのハイグロマイシンでＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の僅かな増加が生じた。この増加は、ハイグロマイシンを１．５ｍＭ及び２．３ｍＭとして高用量で用いると有意に減少した。ハイグロマイシンでは、未処理対照との比較で、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の有意な枯渇は示されなかった。
【０１６４】
アミノグリコシドであるＧ４１８によるリボソーム阻害は、複製性ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３を選択的に枯渇させる。
代替用量のＧ４１８、異なるアミノグリコシドであるハイグロマイシンＢ、［１４６］ＤＮＡを標的とする抗生物質であるゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）、及びＲａｐａの存在下で、抗ＣＤ３／ＣＤ２８をＩＬ−２と併せて用いて、解凍ＰＢＭＣを７日間活性化することで、アミノグリコシドによるＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の用量依存的な選択または枯渇を評価した（図１４Ａ）。アミノグリコシドであるＧ４１８の存在下で、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の枯渇が再び確認される。代替アミノグリコシドであるハイグロマイシンでは、０．２ｍＭのハイグロマイシンでＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の僅かな増加が生じた。この増加は、ハイグロマイシンを１．５ｍＭ及び２．３ｍＭとして高用量で用いると有意に減少した。ハイグロマイシンでは、未処理対照との比較で、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の有意な枯渇は示されなかった。
【０１６５】
この用量依存的なＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の枯渇は、Ｇ４１８で見られたものと一致するが、ゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）またはＲａｐａの用量を増加させた場合は確認さなかった。ゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）の用量を増加させるとＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の増加が確認されたが、これは僅かであり、図１０Ｂ−ＩＩにおいて他の細胞傷害性薬剤で見られたものと類似していた。図１４Ｂでは、同一ドナーに由来するＣＤ４及びＦｏｘＰ３の発現の代表的なフロープロットを見ることができ、ここでは傾向を視覚化して見ることができる。
【０１６６】
ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３のＧ４１８による枯渇では、ポリクローナルな刺激が何らかの部分を担い得ると考えられた。このことを試験するために、解凍後に、Ｇ４１８の存在下／非存在下でＰＢＭＣをＣＭにおいて９日間休止させ、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の存在を試験した。休止条件下で、Ｇ４１８によってＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の有意な枯渇が存続した（図１４Ｃの左パネル）。このことは複製依存的であり、この理由は、ＣＤ４＋，ＦｏｘＰ３＋，Ｋｉ−６７＋細胞が、Ｇ４１８媒介性の有意な枯渇を示した一方で、ＣＤ４＋，ＦｏｘＰ３＋，Ｋｉ−６７ｎｅｇ細胞には、同一の事後測定で、有意な枯渇が生じなかったためである（図１４Ｃの右パネル）。図１４Ｄの上パネルでは、休止ＰＢＭＣの代表的なフロー図によって、Ｇ４１８の処理後に、ＣＤ４＋Ｔ細胞でＦｏｘＰ３の発現が減少したことを示す。図１４Ｄの下パネルでは、Ｋｉ−６７及びＦｏｘＰ３の発現の別視点によって、ＦｏｘＰ３ｎｅｇＴ細胞がＧ４１８の存在下で増殖を続けることが示されており、このことは、この濃度においてＧ４１８が、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３を選択的に標的とすることをさらに支持している。したがって、増殖性ＴＣＤ４，ＦｏｘＰは、アミノグリコシドであるＧ４１８を用いた処理後に枯渇する。
【０１６７】
Ｇ４１８及びハイグロマイシンは、生きた動物に対して毒性を有すると考えられているため、ヒト及び動物モデルにおいて使用されることでよく知られるアミノグリコシドであるゲンタマイシンを用いて、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の選択的枯渇について試験した。Ｌｏｐｅｚ−Ｎｏｖｏａ  ＪＭ．ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ２０１１，７９（１）：３３−４５を参照のこと。図３Ｅは、７日後の休止ＰＢＭＣにおけるＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３のこの枯渇を示し、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の枯渇においてアミノグリコシドが一貫して作用することを示している。次に、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の枯渇が、Ｔｒｅｇマーカーの発現の減少または選択的なＴｒｅｇ毒性と対応するかどうかを試験した。
【０１６８】
Ｔｒｅｇを選別することで、バルクのＰＢＭＣにおける選択に対する、ＭＴＸ、５−ＦＵ、及びＧ４１８の作用が差次化される。
ＣＤ４及びＣＤ２５を発現するＰＢＭＣを磁気選別することで、Ｔｒｅｇを含むと広く考えられているＣＤ４＋ＣＤ２５＋集団と、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）のＣＤ２５ｎｅｇ集団と、を得た。Ｍｉｙａｒａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００９，３０（６）：８９９−９１１を参照のこと。こうした集団を、上記のように、ＡａＰＣとの共培養の最初の７日間、同一濃度のＭＴＸ、５−ＦＵ、Ｇ４１８で処理するか、または未処理とした。この期間の後、７日ごとにＡａＰＣを用いて刺激することによって、薬物なしで共培養を２１日目まで継続した。この時点で、前述のように、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＰ、及びＩＬ−２の細胞における発現をアッセイした。実験概要は、図１５Ａで確認することができる。増殖したＴｒｅｇの機能性に対する各薬物の作用を決定するために、［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイも実施した。
【０１６９】
生存ＣＤ４＋細胞を２１日目にアッセイすると、Ｔｅｆｆコンパートメントでも、薬物によるＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の有意な選択は生じず、Ｔｒｅｇコンパートメントでも、ＭＴＸ及び５−ＦＵは、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の選択を改善させないことが明らかとなった（図１５Ｂ）。最も一貫性を有する知見は、薬物処理の後、Ｇ４１８が生存Ｔｒｅｇを持続的に減少させたことであった。このことは、生存ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の減少によって示された（図１５Ｂ）。２１日目の刺激の後に、ＦｏｘＰ３の発現と組み合わせた、ＣＤ２５（図１５Ｃ−Ｉ）、ＣＴＬＡ−４（図１５Ｃ−ＩＩ）、ＩＬ−２の発現減少（図４Ｃ−ＩＩＩ）、またはＬＡＰ（図１５Ｃ−ＩＶ）などのＴｒｅｇマーカーも減少した。したがって、Ｔｒｅｇは、阻害というよりはむしろＧ４１８の毒性に起因して減少した可能性があり、この理由は、増殖を促進する共培養条件に２週間供しても、Ｇ４１８の処理後にＴｒｅｇを有意に回復させることはできなかったためである。
【０１７０】
ＭＴＸ及び５−ＦＵのＴｒｅｇ促進特性の一部は、Ｔｅｆｆの存在に依存するように思われる。この理由は、Ｔｅｆｆを培養系から除去した後は、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の選択増進はもはや顕著ではなかったためである（図１５Ｂ）。Ｔｒｅｇ表現型の方向に向かう選択改善は、Ｔｒｅｇの選別に混入することが知られるＴｅｆｆが枯渇することによって達成し得たものである。［１１３］Ｔｅｆｆと比較して、ＭＴＸまたは５−ＦＵの細胞傷害性の侵襲からＴｒｅｇが生存する能力を有しているということが、選択増進の主要な要素である可能性がある。ＭＴＸまたは５−ＦＵを使用すると、Ｔｒｅｇの表現型選択が改善方向に向かう傾向は存在するが（図１５Ｃ−Ｉ、図１５Ｃ−ＩＩ、図１５Ｃ−ＩＩＩ）、ＣＤ２５の発現、ＣＴＬＡ−４の発現、またはＩＬ−２の減少について、有意差は存在しなかった。しかしながら、Ｔｒｅｇ特異的マーカーであるＬＡＰは、ＭＴＸまたは５−ＦＵの早期処理によって有意に増加した（図１５Ｃ−ＩＶ）。アッセイしたそうしたマーカーで増加したものはＬＡＰのみであったため、ＬＡＰ及びＴＧＦ−βの関連発現［１４３］が、ＭＴＸ及び５−ＦＵで処理したＴｒｅｇの抑制が、未処理のＴｒｅｇに勝って改善したことの原因であることはほぼ確実でありそうである（図１５Ｄ）。したがって、ＭＴＸ及び５−ＦＵは、Ｔｒｅｇの選択増進において２つの要素を有していると思われる：１）ＭＴＸ及び５−ＦＵによるＴｅｆｆの選択的除去、及び２）ＭＴＸ及び５ＦＵによる、処理後数週間のＬＡＰ発現の増加。
【０１７１】
ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の刺激は、ＡＭＰＫ活性化を増進し、翻訳伸長において一定の役割を担う因子であるｅＥＦ２の阻害を引き起こす。
上で確認されたように（図１３）、ＡＭＰＫは、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の選択において一定の役割を担うと仮定される。さらに、ＡＭＰＫの活性が増進すると、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３においてｅＥＦ２の阻害が生じ得る。Ｂｒｏｗｎｅ  ＧＪ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００４，２７９（１３）：１２２２０−１２２３１を参照のこと。翻訳伸長が優先的に阻害されるのであれば、多くの細胞傷害性薬物の存在下でＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の選択が生じ、翻訳伸長阻害剤の存在下でＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の枯渇が生じるということを説明できる。このことを、ＰＢＭＣ活性化の２４時間後に、フローサイトメトリー（図１６Ａ及び図１６Ｂ）及びイメージングサイトメトリー（図１６Ｃ）を使用して、ＡＭＰＫのリン酸化を評価することによって試験した。Ｔ１７２でのＡＭＰＫのリン酸化は、活性化を示すものであり、未刺激のＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３を上回って、刺激したＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３で増進した。Ｈａｒｄｉｅ  ＤＧ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２０１３，６２（７）：２１６４−２１７２を参照のこと。このＡＭＰＫ活性化増進は、ＣＤ４＋，ＦｏｘＰ３ｎｅｇＴ細胞においても増加したが（図１６Ａの上パネル）、有意な増加（ｔ検定でｐ＝０．０３）は、事後解析後は存続しなかった。同様に、活性化ＡＭＰＫをＦｏｘＰ３と共に示したフロープロットは、このＡＭＰＫ活性化増進が、ＦｏｘＰ３発現サブセットにおいて顕著さが際立っていることを示している（図１６Ｂの上パネル）。ＭａｃＩｖｅｒ  ＮＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１１，１８７（８）：４１８７−４１９８を参照のこと。翻訳開始マーカーであるＳ６は、ｍＴＯＲによる制御に感受性であり、活性を有するときはリン酸化されている。Ｍａｈｏｎｅｙ  ＳＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００９，９０：５３−１０７を参照のこと。刺激後に、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３におけるリン酸化Ｓ６（ｐ−Ｓ６）は有意に増進し（図１６Ａの下パネル）、このことは以前にＣａｒｂｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．によって示されたことである。Ｃａｒｂｏｎｅ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１４，２０（１）：６９−７４を参照のこと。ｐ−Ｓ６は、ＦｏｘＰ３ｎｅｇＴ細胞において増加したが（ｔ検定でｐ＝０．０１）、この増加は、事後解析後は有意ではなかった。ｐ−Ｓ６の増進は、図１６Ｂの下パネルに示される代表的なフロープロットで観測可能である。代謝制御因子であるＡＭＰＫ及びＳ６の活性化は、活性化後のＦｏｘＰ３＋及びＦｏｘＰ３ｎｅｇであるＣＤ４＋Ｔ細胞の両方において増進したが、二元配置ＡＮＯＶＡをシダック（Ｓｉｄａｋ）の事後検定と組み合わせると、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３においてのみ、増加は有意であった。ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の活性化後に生じるＡＭＰＫ及びＳ６の活性化増進は、図１６Ｄに示されるイメージサイトメトリーのプロファイルで見ることができ、抗ＣＤ３／ＣＤ２８及びＩＬ−２を用いた刺激前は上パネル、刺激後は下パネルに示される。同一の補正及び視覚化を各パネルに適用することで、上パネルと下パネルの比較を実現した。
【０１７２】
理論に拘束されるものではないが、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３におけるＡＭＰＫの活性化増進は、
翻訳伸長がｅＥＦ２のリン酸化によって阻害され得ることを示唆しており、細胞傷害性薬物の存在下でＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の生存が増加し、アミノグリコシドのような翻訳伸長阻害剤に対する感受性が生じることの説明となる可能性がある。図１６Ａ〜１６Ｃのものと同一の実験を実施することで、ｅＥＦ２がＴ５６でリン酸化されることによって生じる不活性化の評価を実施した。［１３５］イメージサイトメトリーを使用することで、事象をすべて定量化及び視覚化した。図１６Ｄは、刺激後に、同一サブセットのＴ細胞、すなわち、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３においてｅＥＦ２のリン酸化が有意に増加することを示す。また、ｅＥＦ２に生じる阻害性のリン酸化は、刺激したＦｏｘＰ３ｎｅｇＴ細胞を上回って有意に増加し、このことは、ＡＭＰＫまたはＳ６のリン酸化では確認されなかったことである。ｅＥＦ２に生じるリン酸化が、刺激したＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３のみにおいて増加することは、Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．によって示されるように、刺激時におけるＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の複製能力が減少するであろうことを示唆している。活性ｅＥＦ２のレベル減少は、細胞周期を介した増殖を阻害するものであり、ｅＥＦ２のリン酸化増加は、図１０において確認された、細胞傷害性環境におけるＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の生存を説明し得ることを示唆している。同様に、翻訳能力が減少すれば、図１４においてアミノグリコシドで示されたように、翻訳伸長阻害剤に対する、ＴＣＤ４，ＦｏｘＰ３の感受性が増加することになる。したがって、ｅＥＦ２の活性は、こうした試験において、Ｔｒｅｇの選択及び枯渇の両方に影響する主要因子であり得る。
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【０１７３】
本明細書に開示及び請求される方法はすべて、本開示の観点において、過度の実験を伴うことなく構成及び実施することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して説明されたが、本発明の概念、趣旨、及び範囲から逸脱することなく、方法に対して、及び本明細書に記載の方法の段階または段階の順序において、変形形態を適用してよいことが、当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも両方で関連する、ある特定の薬剤を、本明細書に記載の薬剤の代わりとしてよく、その際、同一または類似の結果が達成されるであろうことが明らかであろう。当業者に明らかな、そのような類似の置換及び改変はすべて、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲、及び概念の範囲内であると見なされる。
【０１７４】
本出願において引用及び参照される特許及び刊行物はすべて、それらの全体が参照によって本明細書に援用される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ−２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ−４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ−１】
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【図５Ｄ−２】
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【図５Ｅ−５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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【図５Ｌ】
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【図６Ａ−６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ−１】
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【図７Ａ−２】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９】
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【図１０Ａ−１０Ｄ】
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【図１０Ｅ−１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ−１２Ｂ】
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【図１２Ｃ−１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ−１４Ｅ】
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【図１５Ａ−１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６ＣＥ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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