(57)【要約】  本発明は、特に、組織のユーザー定義領域、ユーザー定義細胞、および／または細胞内のユーザー定義細胞下構造内のタンパク質および／また核酸発現の同時の、多重検出および定量のためのプローブ、組成物、方法、およびキットに関する。
2018529314.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）サンプル中の少なくとも１つの細胞内のまたはそこからの少なくとも１つの核酸標的を、標的結合ドメインおよびシグナルオリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブと接触させ；
（２）該シグナルオリゴヌクレオチドを放出するのに十分な力を該サンプルのある位置に加え；および
（３）放出されたシグナルオリゴヌクレオチドを回収および同定し、それによって、該力を加えたサンプル中の特定の位置のまたはそこからの少なくとも１つの核酸標的を検出すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記検出が、少なくとも１つの核酸標的の同一性および量を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの核酸標的が、
少なくとも２つの異なった核酸標的または同じ核酸標的の少なくとも２つのコピーを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記検出が、異なった核酸標的のそれぞれの量を比較することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルの少なくとも第二の特定の位置に対して少なくともステップ（２）および（３）を反復することを更に含み、前記第二の特定の位置が、少なくとも第二の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記検出が、特定の位置内のまたはそこからの少なくとも１つの核酸標的の量を、少なくとも第二の特定の位置のまたはそこからのものと比較することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの細胞と少なくとも第二の細胞とが、同じ細胞型である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの細胞と少なくとも第二の細胞とが、異なった細胞型である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記検出が、第一の細胞型内のまたはそこからの少なくとも１つの核酸標的、および少なくとも第二の細胞型内のまたはそこからのものの量を比較することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第一の細胞型および少なくとも第二の細胞型が、正常細胞および異常細胞から独立に選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの細胞が、表面に直接固定されるか、または少なくとも１つの他の細胞を介して表面に間接的に固定される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルが、２〜１０００μｍ厚の組織切片である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組織切片が、ホルマリンで固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルから得られる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの細胞が、培養細胞、初代細胞、または外植片からの解離細胞である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの細胞が、固定されるかまたは固定されていない、請求項１２または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの細胞が、ステップ（２）の前に染色または標識され、それによって、染色または標識された細胞の細胞下構造、細胞構造、または組織関連構造の視覚化を可能にする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのプローブが、標的結合ドメインとシグナルオリゴヌクレオチドとの間に位置するリンカーを更に含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記シグナルオリゴヌクレオチドが、一本鎖核酸または部分的に二本鎖核酸である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記逆精製が、放出されたシグナルオリゴヌクレオチドから完全なプローブ分子を取り出すために使用される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記逆精製が、完全なプローブを、完全なプローブの一部に相補的な固定されたオリゴヌクレオチドまたは完全なプローブの一部を認識し、結合する固定化抗体もしくはタンパク質結合モチーフと接触させることを含む親和性精製を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記完全なプローブの標的結合ドメインが、普遍的な精製タグ、あるいは、固定されたオリゴヌクレオチドに部分的に相補的であるか、または固定化抗体もしくはタンパク質結合モチーフによって認識されるか、または結合されることができる配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記リンカーが、切断可能リンカーを含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記切断可能リンカーが、光切断可能である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記供給される力が光である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記光が、アーク燈、レーザー、集束ＵＶ光源、および発光ダイオード（ＬＥＤ）から成る群から選択される光源によって供給される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記光が、少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの細胞下構造に照射される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記検出が、少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの細胞下構造内のまたはそこからの少なくとも１つの核酸標的の量を決定することを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記力が、アーク燈、レーザー、集束ＵＶ光源、および発光ダイオード（ＬＥＤ）から成る群から選択される光源によって供給され、かつ、該光源が、少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの細胞下構造に照射され、そして、少なくとも第二の細胞の少なくとも１つの細胞下構造に照射される、請求項５に記載の方法。
【請求項２９】
前記検出が、少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの細胞下構造内のまたはそこからの少なくとも１つの核酸標的の量と、少なくとも第二の細胞の少なくとも１つの細胞下構造内またはそこからのものとを比較することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的結合ドメインが、一本鎖核酸または部分的二本鎖核酸を含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記検出が、ポリメラーゼ反応、逆転写酵素反応、オリゴヌクレオチドマイクロアレイへのハイブリダイゼーション、質量分析法、蛍光分子ビーコンへのハイブリダイゼーション、シークエンシング反応、またはnCounter（登録商標）分子バーコードを含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記核酸標的が、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＲＮＡが、ｃＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＤＮＡがｃＤＮＡである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記シグナルオリゴヌクレオチドが、サンプルと、流体デバイスまたはサンプル上に配置された不透水層との間の２５〜５００μｍの深さを有するチャンネルにおける液層、乱流、または遷移流を経由してサンプルから回収される、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記シグナルオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの細胞の近位溶液から回収される、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記近位溶液が、少なくとも１つの細胞の少なくともすぐ上に存在する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記近位溶液が、吸引することによって回収される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記吸引が、ピペット、毛細管、マイクロアレイピン、および／または穴を備えたフローセルによってである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記毛細管が、光の力を少なくとも１つの細胞まで透過させることができる光学デバイスを備えている、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記光の力が、ＵＶ光である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ピペットまたはマイクロアレイピンが、複数のピペットまたはマイクロアレイピンを備えたアレイに取り付けられる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記近位溶液が、陰イオン性重合体、好ましくは硫酸デキストラン、および／またはサケ精子ＤＮＡを含む、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記回収したシグナルオリゴヌクレオチドが、陰イオン性重合体、好ましくは硫酸デキストラン、および／またはサケ精子ＤＮＡを含む溶液に加えられる、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記方法が、レーザー走査デバイスを使用して関心領域に照射をおこなうことを更に含む、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記方法が、デジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）を使用して関心領域に照射をおこなうことを更に含む、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記方法が、サンプルに関する同時の空間分解ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質検出を提供する、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記デジタル読み出し値が、＞５ログの線形ダイナミックレンジを有する、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記サンプルが、スライドに接着され、最初に、蛍光を使用して画像化され、次に、タンパク質および／また核酸発現が、サンプルからデジタル的にカウントされる、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記プローブが、５ｎＭ以下の濃度にて用意される、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記プローブが、１ｎＭ以下の濃度にて用意される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記プローブが、０．４ｎＭ以下の濃度にて用意される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記プローブが、０．２ｎＭ以下の濃度にて用意される、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願に関する相互参照
本出願は、２０１５年７月１７日に出願された米国特許仮出願第６２／１９３，８０９号、２０１５年１２月１日に出願された米国特許仮出願第６２／２６１，６５７号、２０１６年１月１１日に出願された米国特許仮出願第６２／２７７，２８９号、および２０１６年４月１５日に出願された米国特許仮出願第６２／３２３，０２３号に対する優先権および利益を主張する。前述の出願それぞれは、参照によりその全体を本明細書に援用する。
【０００２】
背景技術
標準的な免疫組織化学法およびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は、３〜４個の標的が典型的ではあるが、多くても６〜１０個のタンパク質または核酸標的の同時検出を可能にする。組織のユーザー定義領域、ユーザー定義細胞、および／または細胞内のユーザー定義細胞下構造内のタンパク質および／または核酸発現の同時の、多重検出および定量のためのプローブ、組成物、方法、およびキットの必要性が存在している。
【発明の概要】
【０００３】
発明の概要
本発明は、組織のユーザー定義領域、ユーザー定義細胞、および／または細胞内のユーザー定義細胞下構造内のタンパク質および／または核酸発現の同時の、多重検出および定量のためのプローブ、組成物、方法、およびキットに関する。
【０００４】
本発明の態様は、（１）組織サンプル中の少なくとも１つの細胞内のまたはそこからの少なくとも１つの標的を、標的結合ドメインおよびシグナルオリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブと接触させ；（２）該シグナルオリゴヌクレオチドを放出するのに十分な力を該組織サンプルのある位置に加え；および（３）放出されたシグナルオリゴヌクレオチドを回収および同定し、それによって、該力を加えた組織サンプル中の特定の位置のまたはそこからの少なくとも１つの標的を検出すること、から成るステップを含む方法に関する。特定の位置とは、組織のユーザー定義領域、ユーザー定義細胞、および／または細胞内のユーザー定義細胞下構造である。前記標的は、核酸（例えば、ｍＲＮＡやｍｉＲＮＡ）であっても、および／またはタンパク質あってもよい。標的−結合ドメインは、一本鎖核酸、部分的二本鎖核酸、またはタンパク質結合分子、例えば、抗体、ペプチド、アプタマー、およびペプトイドであってもよい。複数の実施形態では、２以上の標的（タンパク質、核酸およびその組み合わせ）が検出される。複数の実施形態では、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個またはそれ以上、およびそれらの間の任意の数の標的が検出される；例えば、８００個以上の異なった標的が検出され得る。複数の実施形態では、検出することは、それぞれの標的の量を定量することを含む。
【０００５】
複数の実施形態では、前記方法は、前記組織サンプルの少なくとも第二の特定の位置に対して少なくともステップ（２）および（３）を反復することを更に含み、前記第二の特定の位置は、少なくとも第二の細胞を含む。複数の実施形態では、検出することは、第一の特定の位置内のまたはそこからの少なくとも１つの標的の量を、少なくとも第二の特定の位置のまたはそこからのものと比較することを含む。前記少なくとも１つの細胞と少なくとも第二の細胞とは、同じ細胞型であっても、または異なった細胞型であってもよい。いくつかの複数の実施形態では、検出することは、第一の細胞型内のまたはそこからの少なくとも１つの標的、および少なくとも第二の細胞型内のまたはそこからのものの量を定量することを含む。複数の実施形態では、第一および第二の細胞型は、正常細胞および異常細胞、例えば、病的および癌性細胞、から独立に選択される。
【０００６】
複数の実施形態では、前記少なくとも１つの細胞は、表面に直接固定されるか、または少なくとも１つの他の細胞を介して表面に間接的に固定される。組織サンプルは、例えば、ホルマリンで固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）のサンプルまたは固定されていないサンプルから得られた、２〜１０００μｍ厚の組織切片であり得る。少なくとも１つの細胞は、固定されていても、または未固定であってもよい。少なくとも１つの細胞は、染色または標識された細胞の細胞下または細胞構造の視覚化を可能にする、ステップ（２）前に染色または標識されてもよい。或いは、組織切片について、プローブと接触させた切片に隣接した切片は、ステップ（２）の前に染色または標識されてもよく、それによって、プローブと接触させた切片内の対応する細胞または近くの細胞内の細胞下、または細胞、または組織関連構造について判断することを可能にする。斯かる染色または標識技術は、当該技術分野で周知である。
【０００７】
上記の態様において、少なくとも１つのプローブは、標的結合ドメインとシグナルオリゴヌクレオチドとの間に位置するリンカー（例えば、切断可能リンカー）を更に含む。切断可能リンカーは、光切断可能であってもよく、そしてそれは、好適なコヒーレント光源（例えば、レーザーおよびＵＶ光源）または好適なインコヒーレント光源（例えば、アーク燈および発光ダイオード（ＬＥＤ））によって供給される光によって切断される。光源は、少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの細胞下構造に照射されることができ、そして、少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの細胞下構造内のまたはそこからの少なくとも１つの核酸標的の量は、検出され得る。また、光源は、最初に、少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの細胞下構造に照射され、その後、少なくとも第二の細胞の少なくとも１つの細胞下構造に照射されることができ、少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの細胞下構造内のまたはそこからの少なくとも１つの標的の量と、少なくとも第二の細胞の少なくとも１つの細胞下構造内またはそこからのものとの比較を可能にする。
【０００８】
複数の実施形態では、前記シグナルオリゴヌクレオチドは、一本鎖核酸または部分的に二本鎖核酸である。
【０００９】
複数の実施形態では、前記サンプルは、スライドに固定された、培養細胞であっても、または解離細胞（固定または未固定）であってもよい。前記サンプルは、細胞（初代細胞および培養細胞株の両方を含む）および／または組織（培養されたものまたは外植されたものを含む）を含んでもよい。前記サンプルは、培養細胞、初代細胞、または外植片からの解離細胞を含んでもよい。
【００１０】
複数の実施形態では、その視野より小さい関心領域（例えば、単独細胞または細胞内の細胞下構造）の照射では、レーザー走査デバイス（例えば、共焦）または光を誘導するためのデジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）の使用を含む。
【００１１】
複数の実施形態では、プローブは、好ましくは抗体のヒンジ領域の重鎖に対して、安定して、部位選択的であるシステイン生体共役反応法によって調製される。複数の実施形態では、プローブは、抗体毎に複数（すなわち、２以上、例えば、２、３、４、５またはそれ以上）の標識オリゴヌクレオチドを含み得る。
【００１２】
検出することとは、ポリメラーゼ反応、逆転写酵素反応、オリゴヌクレオチドマイクロアレイへのハイブリダイゼーション、質量分析法、蛍光分子ビーコンへのハイブリダイゼーション、シークエンシング反応、またはnCounter（登録商標）分子バーコードを含む。好ましい実施形態では、nCounter（登録商標）システムおよびNanoString Technologies（登録商標）による方法が使用される。
【００１３】
複数の実施形態では、前記シグナルオリゴヌクレオチドは、液層、乱流、または遷移流を経由して組織から回収される。流れは、例えば、組織と、流体デバイスまたは組織上に配置された不透水層との間の２５〜５００μｍの深さを有する、チャンネルを経由したものであってもよい。
【００１４】
複数の実施形態では、前記シグナルオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの細胞の、例えば、少なくともすぐに上の、近位溶液から回収される。前記近位溶液は、例えば、ピペット、毛細管、マイクロアレイピン、穴を備えたフローセル、もしくは当該技術分野で知られている別の好適な吸引システム、またはそれらの任意の組み合わせによって吸引することによって回収されてもよい。前記毛細管は、光の力、例えば、ＵＶ光、を少なくとも１つの細胞まで透過させることができる光学デバイスを備えていてもよい。前記ピペットまたはマイクロアレイピンは、複数のピペットまたはマイクロアレイピンを備えたアレイに取り付けられていてもよい。前記近位溶液は、陰イオン性重合体、例えば、硫酸デキストラン、および／またはサケ精子ＤＮＡを含んでもよい、そして／あるいは、回収したシグナルオリゴヌクレオチドは、陰イオン性重合体、例えば、硫酸デキストラン、および／またはサケ精子ＤＮＡを含む溶液に添加されてもよい。サケ精子ＤＮＡに加えて、またはその代わりに、当該技術分野で知られている他の非特異的ブロッキング剤が使用されてもよい。
【００１５】
複数の実施形態では、前記方法は、組織サンプルに関する同時の空間分解ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質検出を提供する。
【００１６】
複数の実施形態では、デジタル読み出し値は、５ログ以上の線形ダイナミックレンジを有する。
【００１７】
複数の実施形態では、プローブは、典型的に、免疫組織化学（ＩＨＣ）またはin situハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）に使用されるより低い濃度にてサンプルに提供される。あるいは、前記濃度は、ＩＨＣまたはＩＳＨに使用されるより著しく低くてもよい。例えば、前記プローブ濃度は、１／２、１／５、１／１０、１／２０、１／２５、１／３０、１／５０、１／６０、１／７０、１／８０、１／９０、１／１００、１／２００、１／３００、１／４００、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、１／１０００、１／２０００、またはそれ未満、およびその間の任意の値であり得る。複数の実施形態では、プローブは、１００ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０１ｎＭ、およびそれ未満、ならびにその間の任意の値の濃度にて提供される。
【００１８】
複数の実施形態では、組織サンプルは、スライドに接着され、そして、最初に、蛍光（例えば、蛍光標識抗体および蛍光染色（例えば、ＤＡＰＩ））を使用して画像化し、次に、タンパク質および／または核酸発現がサンプルからデジタル的にカウントされる。
【００１９】
複数の実施形態では、例えば、完全なプローブ分子を、完全なプローブの一部に相補的な固定されたオリゴヌクレオチドまたは完全なプローブの一部を認識し、結合する固定化抗体もしくはタンパク質結合モチーフと接触させることを含む親和性精製法を含めた逆精製が、放出されたシグナルオリゴヌクレオチドから完全なプローブ分子を取り出すために使用される。複数の実施形態では、完全なプローブの標的結合ドメインは、普遍的な精製タグ、あるいは、固定されたオリゴヌクレオチドに部分的に相補的であるか、または固定化抗体もしくはタンパク質結合モチーフによって認識されるか、または結合されることができる配列を含む。当該技術分野で周知の任意の斯かるタグまたは配列が、これらの実施形態に使用されてもよい。
【００２０】
本明細書中に記載したいずれの態様または実施形態も、本明細書中に開示されるいずれの他の態様または実施形態とも組み合わせることができる。開示はその詳細な説明と関連づけて記載された一方で、上記の説明は例示することを意図したものであって、添付の請求項の範囲によって規定される開示の範囲を制限することを意図していない。他の態様、利点、および修飾も以下の請求項の範囲内にある。
【００２１】
本明細書で参照された特許および科学文献は、当業者が利用可能である知識を確立した。本明細書で引用されたすべての米国特許および公開されたまたは未公開の米国特許出願は本明細書によって援用される。本明細書で引用されたすべての公開された外国特許および特許出願は本明細書によって援用される。本明細書で引用されたすべての他の公表された参照文献、文書、原稿および科学論文は、本明細書によって援用される。
【００２２】
特許または出願ファイルは、カラーで仕上げられた少なくとも１枚の図面を含んでいる。カラー図面を伴った本願の特許または特許出願公開のコピーは、請求と必要な料金の支払いにより特許庁によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】２つの代表的なプローブを示す。核酸骨格（一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡのいずれか）を、まっすぐな黒色の線として示す。プローブはそれぞれ、赤色で示した標的結合ドメインを含む。上のプローブは、核酸骨格にハイブリダイズした標識ＲＮＡセグメントを含み、それに対して、下のプローブは、核酸骨格にハイブリダイズした標識ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む。切断可能モチーフ（例えば、切断可能リンカー、未掲載）は、骨格と標的結合ドメインとの間、または骨格の中に配置され得る。切断可能モチーフは、結合された標的核酸またはタンパク質からのシグナルオリゴヌクレオチドの放出を可能にし；その後、シグナルオリゴヌクレオチドは、回収され、検出される。
【図２】標的核酸に直接結合し得る第一タイプのプローブを示す（上部）。以下の画像で、プローブは、青色の曲線として示した標的核酸に結合した。この図面およびそれ以降の図面では、レポータープローブを、（色付けした円によって示される）標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる６つの場所を含む。プローブを標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる位置を含むので、プローブはまた、レポータープローブと呼ぶこともできる。
【図３】本発明の第一タイプの二重プローブ組成物を示す。ここで、第一タイプのプローブは、標的核酸に直接結合し、そして、第一タイプの捕捉プローブは、標的核酸に直接結合する。前記捕捉プローブは、少なくとも１つの親和性試薬を含んでもよく、それを星印として示す。サンプル中の標的核酸を、青色の曲線として示す。
【図４】サンプル中の標的核酸に間接的に結合できる第二タイプのプローブ（またはレポータープローブ）を示す（上部）。ここで、プローブの標的は、緑色で示した媒介オリゴヌクレオチドであり、そしてそれは、下部画像において青色の曲線として示したサンプル中の標的核酸に順番に結合する。媒介オリゴヌクレオチドが、本明細書中に規定したプローブであると言われる場合がある。なぜなら、それが、核酸骨格を含んでいるので、標的核酸に結合できるからである。
【図５】本発明の第二タイプの二重プローブ組成物を示す。ここで、第二タイプのプローブは、（緑色で示した媒介オリゴヌクレオチドを介して）サンプル中の標的核酸に間接的に結合し、そして、第二タイプの捕捉プローブは、（オレンジ色で示した別の媒介オリゴヌクレオチドを介して）サンプル中の標的核酸に間接的に結合する。前記捕捉プローブは、少なくとも１つの親和性試薬を含んでもよく、それを星印として示す。
【図６】サンプル中の標的核酸に間接的に結合した（図４で例示した）第二タイプのプローブからのシグナルオリゴヌクレオチドの放出を示す。プローブ（またはレポータープローブ）内の切断可能モチーフの位置は、どの材料が放出シグナルオリゴヌクレオチドに含まれるかに影響する。
【図７】タンパク質を検出するために使用する３つのタイプのプローブを示す。最上部の形態では、プローブは、タンパク質結合ドメインに取り付けられた核酸を備え；この形態では、切断可能モチーフ（例えば、切断可能リンカー、未掲載）は、核酸とタンパク質結合ドメインとの間、または核酸自体の中に含まれ得る。真ん中の形態では、タンパク質結合ドメインは、核酸に取り付けられ、そして、プローブは、その核酸にハイブリダイズしている。（標的結合ドメインおよび（緑色で示した）タンパク質結合ドメインに取り付けられた核酸を備えた）プローブは、その標的結合ドメインがタンパク質標的に結合する前後に、プローブによって結合され得る（図８に示したとおり）。切断可能モチーフは、骨格またはタンパク質結合ドメインに取り付けられた核酸のいずれかまたはその両方に含まれ得る。図２および４に示した第一または第二タイプのプローブは、タンパク質を検出するためにこの形態で使用されてもよい。下部の形態では、タンパク質結合ドメインは、核酸に取り付けられ、そして、媒介オリゴヌクレオチド（赤色で示した）は、プローブとタンパク質結合ドメインに取り付けられた核酸との両方にハイブリダイズする。図２および４に示した第一または第二タイプのプローブは、タンパク質を検出するためにこの形態で使用されてもよい。
【図８】図７の真ん中と下部のプローブを示す。上部の２つの画像は、それがタンパク質に結合した前後のプローブを示す。次の画像は、その切断可能モチーフが切断された後のプローブを示す；この画像では、切断可能モチーフは、核酸と標的結合ドメインの間にある。核酸が放出されると、それは、シグナルオリゴヌクレオチドであると見なされ得る。下部画像では、前記シグナルオリゴヌクレオチド（プローブの放出された核酸）には、（例えば、図２および４に示したように）レポータープローブが結合する。
【図９】図７に示した真ん中の形態のプローブおよび図８のプローブからのシグナルオリゴヌクレオチドの放出を示す。プローブ（またはレポータープローブ）内の切断可能モチーフの位置は、放出されたシグナルオリゴヌクレオチドにどの材料が含まれるかに影響する。
【図１０】ある関心領域（ＲＯＩ）からのシグナルオリゴヌクレオチドを検出する本発明の方法のステップを示す。
【図１１】関心領域が組織サンプルの第一連続切片に位置していて、そして、プローブが組織サンプルの第二連続切片に適用される本発明の方法のステップを示す。シグナルオリゴヌクレオチドは、第二連続切片の第一関心領域において標的に結合したプローブから放出され、回収される。次に、前記シグナルオリゴヌクレオチドは、第二連続切片の第二（ｎ番目までの）関心領域において標的に結合したプローブから放出され、回収される。
【図１２】第一関心領域からの複数の標的核酸および／またはタンパク質の多重検出と、それに続く、第二関心領域からの複数の標的核酸および／またはタンパク質の多重検出をおこなう。
【図１３】本発明の方法のステップを例示する。示した方法は、本明細書中で「nCounter（登録商標）デジタル多重免疫組織化学（ＩＨＣ）」とも呼ばれ得る。
【図１４】標準的なＴＳＡベースの多重ＩＨＣ（下部）と比較して、nCounter（登録商標）デジタル多重ＩＨＣ（上部）で可能となる、簡略化されたワークフローおよびより高度な多重化を実証するフローチャートである。
【図１５】Ｔｉ−Ｅ顕微鏡に取り付けられたデジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）（上部）およびＦＦＰＥ組織切片（下部）の明視野画像を示す写真である。ＦＦＰＥ組織（明視野像）上の光照射（白点）は、サイズが約〜１０−２０μｍ、すなわち、単独細胞サイズの複数のＲＯＩを示す。
【図１６】前記方法がデジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）の使用を伴うときの、本発明に関連する構成要素と光路を例示する。ＤＭＤを用いた広視野照射が、サンプルに焦点を合わせた。ＬＥＤは、一度に視野全体を励起させるのに十分な照射であって、そして、〜８０−６００ＤＭＤピクセルが１０μｍの直径の細胞に照射されるような単独細胞照射を提供する。通常グレードのＤＭＤは、十分な単独細胞分解能を提供するであろう。ＤＳ：ダイクロイックミラー、ＦＷ：フイルターホイール、およびＤＭＤ：デジタルミラーデバイス。
【図１７】前記方法がレーザー走査デバイス（例えば、共焦走査デバイス）の使用を伴うときの、本発明に関連する構成要素と光路を例示する。共焦走査構成では、亜鉛メッキ鏡が光を誘導する。この方法は、安価な４０５ｎｍレーザーを必要とする。ＤＳ：ダイクロイックミラー、ＦＷ：フイルターホイール、およびＭＭ：電動式の鏡。
【図１８】Ｋｉ−６７（緑色の細胞増殖マーカー）およびＣＤ３（赤色の免疫細胞マーカー）の二色の蛍光を使用して最初に画像化した扁桃腺サンプルの全体的な組織形態を確立する顕微写真を示す。１２カ所の領域（図１９で拡大した４つの領域を含む）が、白枠で識別される。
【図１９】図１８に示した４つの領域に関するＫｉ−６７およびＣＤ３のnCounter（登録商標）データカウントを示すグラフである。（調査すべき様々な追加対照を許容するように）画像を連続切片から得た。一般に、サンプルは、蛍光抗体を用いて画像化され、次に、同じスライドを使用して、（ＵＶ曝露によって）デジタル的にカウントされ得る。（ここに示した４つの領域を含めて）１２の領域にわたって分析される多重標的は、Ｋｉ−６７およびＣＤ３の局在性の異なったプロファイルを示す。以下のグラフは、４つの領域の倍率である。
【図２０】図１８に示した扁桃腺サンプルから１２の関心領域（ＲＯＩ）に対する３０ｐｌｅｘのオリゴ抗体カクテルによる代表的なカウントを示す。（調査すべき様々な追加対照を許容するように）データを連続切片から得た。
【図２１】ＣＤ３（赤色）、ＣＤ８（緑色）、およびＤＡＰＩ（青色）の三色の蛍光を使用して最初に画像化したリンパ節からの黒色腫サンプル中のＴ細胞の全体的な組織形態を確立する顕微写真を示す。白丸は、直径２５μｍであり、３つの細胞を囲んでいる。
【図２２】ＵＶ照射領域（直径１００μｍ〜１ｍｍ）の作用としてＦＦＰＥリンパ節組織切片（５μｍ厚）から放出されたＣＤ３複合体に関するnCounter（登録商標）データを示す。視野の絞りサイズを、図の下に示す。
【図２３】ＵＶ照射領域（直径１００μｍ〜１ｍｍ）の作用としてＦＦＰＥリンパ節組織切片（５μｍ厚）から、および図２１および２２に示したのと同じ実験から放出されたＣＤ４５複合体に関するnCounter（登録商標）データを示す。
【図２４】ＵＶ照射領域（直径１００μｍ〜１ｍｍ）の作用としてＦＦＰＥリンパ節組織切片（５μｍ厚）から、および図２１〜２３に示したのと同じ実験から放出されたＰＤ１複合体に関するnCounter（登録商標）データを示す。
【図２５】ＩＨＣ染色によってＨｅｒ２蛍光を同定する顕微写真（中央のパネル）に示した可変レベルのＨｅｒ２タンパク質を含めた、乳房腫瘍組織の組織マイクロアレイ（ＴＭＡ；左のパネル）を示す。右のパネルは、中央のパネルの単一領域の拡大図を示す。
【図２６】４８の代表的な領域対Ｈｅｒ２状況（ＡＳＣＯ−ＣＡＰガイドライン）に関するnCounter（登録商標）カウントデータを示す。
【図２７】図２６について言及した４８の領域に関するnCounter（登録商標）カウント対合計ピクセル強度（×１０３）のプロット。
【図２８】ＣＤ３（赤色）とＤＡＰＩ（青色）の二色の蛍光を使用して最初に画像化した黒色腫サンプルの全体的な組織形態を確立する顕微写真である。１０の代表的な領域が、白枠で識別される。
【図２９】図２８に示したサンプルからの１０の関心領域（ＲＯＩ）に対する３０ｐｌｅｘのオリゴ抗体カクテルによる代表的なカウントを示す。
【図３０Ａ】扁桃腺組織サンプル（緑色）中の単独細胞（青色）のデジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）を使用したＵＶ照射を示す顕微写真である。
【図３０Ｂ】扁桃腺組織サンプル（緑色）中の単独細胞（青色）のデジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）を使用したＵＶ照射を示す顕微写真である。
【図３１Ａ】扁桃腺組織サンプル中の単独細胞（明るい白色）のデジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）を使用したＵＶ照射を示す顕微写真である。
【図３１Ｂ】扁桃腺組織サンプル中の単独細胞（明るい白色）のデジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）を使用したＵＶ照射を示す顕微写真である。図３１Ｂは、図３１Ａで触れた単独細胞を強調する。
【図３１Ｃ】扁桃腺組織サンプル中の単独細胞（明るい白色）のデジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）を使用したＵＶ照射を示す顕微写真である。
【図３１Ｄ】扁桃腺組織サンプル中の単独細胞（明るい白色）のデジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）を使用したＵＶ照射を示す顕微写真である。図３１Ｄは、図３１Ｃで触れた単独細胞を強調する。
【図３２】空間分解ＦＦＰＥ組織タンパク質アッセイのステップを示す。該ステップは、核酸検出アッセイにおいて、サンプルが、抗体よりむしろ核酸標的結合ドメインを含むプローブに結合されることを除いて、核酸検出アッセイのものと同様である。
【図３３】空間分解ＦＦＰＥ組織タンパク質アッセイのステップを示す。
【図３４】組織全体またはサンプル全体が、例えば、標準的なＵＶゲルボックスを用いて、照射されて、プローブに取り付けられる前にシグナルオリゴヌクレオチドが放出される実施形態からのデータを示す。
【図３５】組織またはサンプルの一部に、例えば、顕微鏡を用いて、照射される実施形態、すなわち、顕微鏡下でのＵＶ切断を示す（時間滴定実験）。
【図３６】組織またはサンプルの一部に、例えば、顕微鏡を用いて、照射される実施形態、すなわち、顕微鏡下でのＵＶ切断を示す（照射領域滴定実験）。
【図３７】組織またはサンプルの一部に、例えば、顕微鏡を用いて、照射される実施形態、すなわち、顕微鏡下でのＵＶ切断を示す（照射領域滴定実験−多重標的）。
【図３８】組織（例えば、乳癌サンプル）内の関心領域が最初に、マーカーの発現に関して同定され、次に、この関心領域は（例えば、ＵＶを）照射されて、プローブからシグナルオリゴヌクレオチドが放出されるにある実施形態を示す。
【図３９】フローセルに組織が包埋された実施形態を示す。複数の画分に関するデータが示される。図３８のデータと同様に、ここで、関心領域は、蛍光標識マーカーの発現に関してあらかじめ同定される。また、装置の形態を示す写真および図解も示され得る。
【図４０】小さい穴を備えたフローセル内に組織が包埋されている実施形態を示す。また、装置の形態を示す写真および図解も示される。
【図４１Ａ】小さい穴を備えたフローセルを使用する実施形態が、組織の全表面からの溶出液の回収よりむしろ有意なシグナル対ノイズの改善を有することを示す。また、装置の形態を示す写真および図解も示される。
【図４１Ｂ】小さい穴を備えたフローセルを使用する実施形態が、組織の全表面からの溶出液の回収よりむしろ有意なシグナル対ノイズの改善を有することを示す。また、装置の形態を示す写真および図解も示される。
【図４１Ｃ】小さい穴を備えたフローセルを使用する実施形態が、組織の全表面からの溶出液の回収よりむしろ有意なシグナル対ノイズの改善を有することを示す。また、装置の形態を示す写真および図解も示される。
【図４２Ａ】小さい穴（１２または９６穴形式）を備えたフローセルを使用した実施形態におけるデータを示す。
【図４２Ｂ】小さい穴（１２または９６穴形式）を備えたフローセルを使用した実施形態におけるデータを示す。
【図４２Ｃ】小さい穴（１２または９６穴形式）を備えたフローセルを使用した実施形態におけるデータを示す。
【図４３Ａ】全組織溶出を実施したフローセルからのバックグラウンドシグナル（図４３Ａ）を、溶出が関心領域の上で直接起こったフローセルからのバックグラウンドシグナル（図４３Ｂ）と比較した際のデータを示す。
【図４３Ｂ】全組織溶出を実施したフローセルからのバックグラウンドシグナル（図４３Ａ）を、溶出が関心領域の上で直接起こったフローセルからのバックグラウンドシグナル（図４３Ｂ）と比較した際のデータを示す。
【図４４】複数の関心領域の吸引の実施形態のための開放表面での溶出液回収を示す図解である。ここでは、回転弁の切り替えを用いた溶出液の吸引／分配ためのマルチチューブアレイを示す。
【図４５】溶出液回収が毛細管（マイクロアスピレーター）を通してである実施形態を示す写真および図解を含む。
【図４６Ａ】溶出液回収が毛細管（マイクロアスピレーター）を通してである図４５の実施形態からのデータを示す。
【図４６Ｂ】溶出液回収が毛細管（マイクロアスピレーター）を通してである図４５の実施形態からのデータを示す。
【図４７】複数の関心領域の吸引の実施形態または単独の関心領域のための開放表面での溶出液回収を示す図解である。ここでは、吸引／分配のためのピペッティング対毛管作用を使用したマルチチューブアレイ、または固定された位置の単一の管／ピペットを示す。
【図４８】組み合わせた毛細管とレンズによる照射および流体回収を示す図解である。
【図４９】９６ウェル格子を備えた空間分解ＦＦＰＥ組織アッセイに関する実施形態のステップを示す図解である。
【図５０】本明細書中に記載した方法および装置を使用して単独細胞または２つの細胞から得られたタンパク質発現データを示す。
【図５１】単一の腫瘍サンプルから連続切片上に位置する関心領域を同定する。
【図５２】実施例１６のアッセイに含まれる９つのＲＮＡプローブのうち６つについて得られたカウントを示す。
【図５３】図５２に示したカウントの平均および標準偏差を示す。
【図５４】nCounter（登録商標）分子バーコードに同時にハイブリダイズさせ、そして、NanoString Technologies（登録商標）製のnCounter（登録商標）システムによってデジタル的にカウントされたプローブに関するＲＮＡ発現データとタンパク質データを示す。
【図５５】一本鎖ＤＮＡプローブおよび部分的二本鎖ＤＮＡプローブから得られたＲＮＡ発現データを示す。
【図５６】サケ精子ＤＮＡの存在下でハイブリダイズさせたプローブから得られたＲＮＡ発現データを示す。
【図５７】ＰＳＡ（前立腺特異抗原）に特異的なプローブによるＲＮＡ発現データを示す。
【図５８】プローブの特異性が、非標準的な、ｎＭ未満（sub-nM）の濃度にて増強されることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明は、組織のユーザー定義領域、ユーザー定義細胞、および／または細胞内のユーザー定義細胞下構造内のタンパク質および／または核酸発現の同時の、多重検出および定量のためのプローブ、組成物、方法、およびキットに一部基づいている。
【００２５】
本発明は、第一関心領域（例えば、組織型、（正常および異常細胞を含めた）細胞、および細胞内の細胞下構造）に存在する標的タンパク質および／または標的核酸の同一性および量と、第二関心領域に存在する標的タンパク質および／または標的核酸の同一性および量との比較を提供する。関心領域および実施できる比較の数に対してあらかじめ定義された上限はなく；上限は、サンプルサイズに対する関心領域のサイズに関連する。例として、単独細胞が関心領域の標本となるとき、その場合には、切片は数百〜数千もの関心領域を有する可能性があるが；しかしながら、組織切片が２つの細胞型しか含んでいないのであれば、その場合には、その切片は、（それぞれ１つの細胞型のみを含む）２つの関心領域しか有していない可能性がある。
【００２６】
本発明は、標準的な免疫組織化学的またはin situハイブリダイゼーションで可能であるより高度な多重度を提供する。標準的な免疫組織化学法は、最大６〜１０個のタンパク質標的の同時検出を可能にするが、３〜４個のタンパク質標的がより典型的である。同様に、in situハイブリダイゼーションは、１０個未満の核酸標的の同時検出に制限される。本発明は、サンプルの規定領域から多数の組み合わせの核酸標的および／またはタンパク質標的の検出を実現する。本発明は、デジタル定量による客観的測定の増大、ならびに増強された信頼性および整合性を実現し、それによって、複数のセンター間での結果の比較を可能にする。
【００２７】
本発明のプローブは、少なくとも１つの標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイズ（非共有結合）することができる規定の位置を有する核酸骨格（一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ）を有してもよい。図１を参照。（少なくとも１つの標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができる規定の位置を有する）斯かるプローブもまた、本明細書中でレポータープローブと呼ばれる。レポータープローブ骨格上の位置の数は、１〜１００またはそれ以上に及ぶ。複数の実施形態では、位置の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０〜１５、２０、３０、４０、もしくは５０、またはその間の任意の範囲に及ぶ。実際には、斯かる骨格の設計が十分に当業者の能力の範囲内にあるので、（標的核酸を検出するため、および／または標的タンパク質を検出するための）骨格上の位置の数には制限がない。１セットのプローブによって検出可能な標的核酸および／またはタンパク質の数は、プローブ骨格に含まれる位置の数に依存する。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、標識オリゴヌクレオチドとは、検出可能な標識を含むＲＮＡセグメントまたは検出可能な標識を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドに関する。
【００２９】
核酸骨格のある位置が、少なくとも１つの標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイズ（非共有結合）され得る。あるいは、ある位置が、検出可能な標識を欠く少なくとも１つのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされ得る。各位置は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１〜１００またはそれ以上の標識（または非標識）オリゴヌクレオチドとハイブリダイズできる。各位置にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチドの数は、その位置の長さおよびオリゴヌクレオチドのサイズに依存する。位置は、長さが約３００〜約１５００ヌクレオチドであり得る。標識（または非標識）オリゴヌクレオチドの長さは、約２０〜約１５００ヌクレオチドの長さで変化する。複数の実施形態では、標識（または非標識）オリゴヌクレオチドの長さは、約８００〜約１３００リボヌクレオチドの間で変化する。他の複数の実施形態では、標識（または非標識）オリゴヌクレオチドの長さは、約２０〜約５５デオキシリボヌクレオチドで変化する；斯かるオリゴヌクレオチドは、約６５〜約８５℃、例えば、約８０℃、の融解／ハイブリダイゼーション温度を有するように設計される。例えば、長さが約１１００ヌクレオチドの位置は、長さが約４５〜２５デオキシリボヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを含めた約２５〜４５オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る。複数の実施形態では、各位置を、長さで約３３デオキシリボヌクレオチドの約３４の標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。標識オリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡであることが好ましい。
【００３０】
各標識オリゴヌクレオチドは、１もしくは複数の検出可能な標識モノマーで標識されてもよい。該標識は、オリゴヌクレオチドの末端であっても、オリゴヌクレオチドの中の点であっても、またはその組み合わせであってもよい。オリゴヌクレオチドは、アミン修飾を伴ったヌクレオチドを含んでもよく、そしてそれが、ヌクレオチドへの検出可能な標識のカップリングを可能にする。
【００３１】
本発明の標識オリゴヌクレオチドは、例えば、蛍光色素、量子ドット、色素、酵素、ナノ粒子、化学発光マーカー、ビオチン、あるいは直接（例えば、発光で）または間接的（例えば、蛍光標識している抗体の結合で）に検出できる当該技術分野で知られているその他のモノマーなどのさまざまな標識モノマーのいずれかで標識できる。本発明で利用できる標識の好ましい例は、蛍光色素分子である。これだけに限定されるものではないが、ＧＦＰ関連タンパク質、シアニン色素、フルオレセイン、ローダミン、Alexa Flour（商標）、Texas Red、ファム、JOE、TAMRA、およびROXを含めた、ヌクレオチドを標識するための標識モノマーとして、いくつかの蛍光色素分子が使用できる。全スペクトルに及ぶいくつかの異なった蛍光色素分子が知られており、より長く産生され続ける。
【００３２】
（標識オリゴヌクレオチドと位置のハイブリダイゼーションによる）各位置に関連する標識は、その前の位置またはその後の位置の該標識と、空間的に分離可能であり、かつ、スペクトル的に分解可能である。空間的に分離可能、かつ、スペクトル的に分解可能であるプローブの標識の順序集合は、本明細書中ではバーコードまたは標識コードとも呼ばれるバーコードまたは標識コードは、特定のプローブによって結合された標的核酸または標的タンパク質の識別を可能にする。
【００３３】
標識オリゴヌクレオチドは、標準的なハイブリダイゼーション反応下、例えば、６５℃、５ｘＳＳＰＥ、でそれらの位置にハイブリダイズする；これは、レポータープローブまたはプローブの自己組み立てを可能にする。（例えば、ＵＳ２００３／００１３０９１に記載のように）標識オリゴヌクレオチドとして、より長いＲＮＡ分子を使用するプローブは、エンドユーザーによるというよりむしろ製造場所にて、そして、より長いＲＮＡ分子を介した複数の骨格の架橋を避けるためにより高い温度にて、予備組み立てされなければならない；該予備組み立てステップの後には、ＲＮＡ分子のバックグラウンドを増大させる（デオキシリボヌクレオチドを含めた）余分な非ハイブリダイズＲＮＡ分子を取り除くための精製が続く。（例えば、デオキシリボヌクレオチドを含めた）短い一本鎖標識オリゴヌクレオチドの使用は、プローブの製造を大いに簡素化し、さらに、その製造方法に関連するコストを削減する。
【００３４】
複数の実施形態では、プローブは、典型的に、免疫組織化学（ＩＨＣ）またはin situハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）に使用されるより低い濃度にてサンプルに提供される。あるいは、前記濃度は、ＩＨＣまたはＩＳＨに使用されるより著しく低くてもよい。例えば、前記プローブ濃度は、１／２、１／５、１／１０、１／２０、１／２５、１／３０、１／５０、１／６０、１／７０、１／８０、１／９０、１／１００、１／２００、１／３００、１／４００、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、１／１０００、１／２０００、またはそれ未満、およびその間の任意の値であり得る。複数の実施形態では、プローブは、１００ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０１ｎＭ、およびそれ未満、ならびにその間の任意の値の濃度にて提供される。
【００３５】
プローブは、商業的に入手可能なカートリッジ、ソフトウェア、システム、例えば、nCounter（登録商標）カートリッジを使用したnCounter（登録商標）システムを使用して検出および定量できる。
【００３６】
タンパク質検出中の、バックグラウンドノイズは、完全なプローブ分子の逆精製をおこなうことによって低減され得る。これは、関心領域からの溶出液の回収後に抗体または光切断可能リンカーの親和性精製を実施することによってできる。通常、放出されたシグナルオリゴヌクレオチドは、溶液から取り出されない。ピペットチップ、チューブ、またはプレートにおけるプロテインＧまたはＯ機構がこのステップに使用できる。斯かるデバイスおよび試薬が市販されている。
【００３７】
核酸検出中の、バックグラウンドノイズは、完全なプローブ分子の逆精製をおこなうことによって低減され得る。これは、関心領域からの溶出液の回収後に標的結合ドメインまたは光切断可能リンカーの親和性精製を実施することによってできる。通常、放出されたシグナルオリゴヌクレオチドは、溶液から取り出されない。逆精製における支援のために、普遍的な精製配列がプローブ、例えば、標的結合ドメイン、の中に含まれていてもよい。
【００３８】
図１は、一本鎖核酸骨格および赤色で示した標的結合ドメインを含む２つの代表的なプローブを示す。上のプローブは、骨格内の位置にハイブリダイズした標識ＲＮＡセグメントを含み、それに対して、下のプローブは、核酸骨格内の位置にハイブリダイズした標識ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む。図１に示した色およびこの開示の他の部分所は、限定されない；当該技術分野で知られている他の色の標識および他の検出可能な標識が、本発明のプローブに使用できる。
【００３９】
本発明のプローブは、標的核酸を検出するために使用できる。図２および４は、この態様を例示する。斯かるプローブは、少なくとも骨格および標的核酸結合性領域を含む。該標的核酸結合性領域は、長さが少なくとも１５ヌクレオチドであることが好ましく、そして、長さが少なくとも２０ヌクレオチドであることがより好ましい。特定の実施形態では、該標的核酸結合性領域は、長さが約１０〜５００、２０〜４００、２５、３０〜３００、３５、４０〜２００、または５０〜１００ヌクレオチドである。標的核酸に結合および同定するためのプローブおよび方法は、例えば、ＵＳ２００３／００１３０９１、ＵＳ２００７／０１６６７０８、ＵＳ２０１０／００１５６０７、ＵＳ２０１０／０２６１０２６、ＵＳ２０１０／０２６２３７４、ＵＳ２０１０／０１１２７１０、ＵＳ２０１０／００４７９２４、およびＵＳ２０１４／０３７１０８８に記載されており、そのそれぞれは、その全体を参照により本明細書中に援用する。
標的核酸は、ＤＮＡであっても、またはＲＮＡであってもよく、好ましくは、ｃＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはｍｉＲＮＡであり；該ＤＮＡは、ｃＤＮＡであることが好ましい。
【００４０】
本発明のプローブは、標的核酸に直接ハイブリダイズするために使用されてもよい。図２は、この実施形態のプローブ（または組成物）を例示する。該プローブは、赤色で示した標的核酸結合ドメインを含む。該標的核酸は、青色の曲線として示される。図３は、図２のプローブおよび捕捉プローブを含む二重プローブ組成物を例示する。該捕捉プローブは、星印で示した少なくとも１つの親和性試薬を含む。該少なくとも１つの親和性部分は、共有結合または非共有結合によって捕捉プローブに取り付けられ得る。精製および／または固定に適当な様々な親和性部分が、当該技術分野で知られている。好ましくは、該親和性部分は、ビオチン、アビジン、またはストレプトアビジンである。他の親和性タグは、特異的結合パートナーによって認識され、それによって、（固体支持体除に固定され得る）結合パートナーへの親和性結合による分離および固定を容易にする。これらの図面では、各プローブは、標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする６つの位置を含んでおり、各位置は色付きの円によって識別される。
【００４１】
本発明のいずれのプローブも親和性部分を備え得る。
【００４２】
本発明のプローブは、（媒介オリゴヌクレオチドを介して）サンプル中に存在する標的核酸に間接的にハイブリダイズするために使用され得る。図４は、この実施形態のプローブ（または組成物）を例示する。該プローブは、生体サンプル中の標的核酸に順番に結合する合成オリゴヌクレオチド（媒介オリゴヌクレオチド；緑色で示した）に結合する、赤色で示した標的核酸結合ドメインを含む。該媒介オリゴヌクレオチドは、本明細書中に規定されるプローブであると言われる場合がある。なぜなら、それが、核酸骨格を含んでいて、標的核酸に結合できるからである。生体サンプル中に存在する標的核酸を、青色の曲線として示す。図５は、図４のプローブおよび捕捉プローブを含む二重プローブ組成物を例示する。これらの実施形態では、プローブの標的核酸結合性領域は、サンプル中に存在する標的核酸と異なった媒介オリゴヌクレオチド（すなわち、合成オリゴヌクレオチド）の領域にハイブリダイズする。よって、プローブの標的結合領域は、サンプル中の最終的な標的核酸とは無関係である。これは、標的（サンプル中に存在）特異的成分のアッセイが、より高価なプローブよりむしろ安価で幅広く入手可能な合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドに含まれるので、アッセイデザインにおける経済的および迅速な柔軟性を可能にする。斯かる合成オリゴヌクレオチドは、サンプル中に存在する標的核酸にハイブリダイズする領域およびプローブにハイブリダイズする領域を含むように単純に設計される。そのため、１セットの間接的に結合するプローブは、アッセイの標的特異的な（合成の）オリゴヌクレオチド部分を置き換えることによって、単純に異なった実験の無限に多様な標的核酸（サンプル中に存在）を検出するために使用できる。
【００４３】
本発明のプローブまたはプローブは、好適な力の適用後にシグナルオリゴヌクレオチドの放出を可能にする領域を含む。限定されることのない一例では、該領域は、切断可能モチーフ（例えば、制限酵素部位または切断可能リンカー）である。該切断可能モチーフは、結合した標的核酸またはタンパク質からのシグナルオリゴヌクレオチドの放出を可能にし、その後、そのシグナルオリゴヌクレオチドは回収され、検出される。本明細書中で使用される場合、シグナルオリゴヌクレオチドとは、現在、少なくとも１つの標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる位置を有するか、またはプローブの標的結合ドメインから放出され得るプローブ（例えば、核酸分子）の領域であるプローブの領域である。シグナルオリゴヌクレオチドは、それがプローブの残りと切り離される（すなわち、切断され、放出される）とき、放出可能であると言われる。切断可能モチーフの例としては、これだけに限定されるものではないが、光切断可能リンカーが挙げられる。
【００４４】
（本明細書中に記載した）本発明のプローブでは、切断可能モチーフは、核酸と標的結合ドメインとの間、骨格と標的結合ドメインとの間、または骨格の中に配置され得る。図６では、切断可能モチーフの位置に関する限定されない選択肢が、プローブ内のギャップまたは媒介オリゴヌクレオチド内のギャップから推測され得る。
【００４５】
本発明のプローブは、標的タンパク質を検出するために使用できる。図７は、この実施形態のプローブ（または組成物）を例示する。斯かるプローブは、少なくとも骨格および標的タンパク質結合領域を含む。本発明のタンパク質標的化プローブでは、シグナルオリゴヌクレオチドは、タンパク質結合ドメインに取り付けられた核酸であってもよい。これらのプローブでは、シグナルオリゴヌクレオチドは、標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするための位置を含むプローブによって標的化され、結合される。斯かるプローブを、図７の中央の画像に示す。そこでは、シグナルオリゴヌクレオチドを、緑色の線として見られる。該プローブは、そのプローブが（タンパク質結合ドメインを介して）タンパク質に結合する前かまたはそれがタンパク質に結合した後に、プローブによって結合され得る。シグナルオリゴヌクレオチドは、それが標的結合ドメイン（この実施形態では未掲載）から既に放出されるまで、該プローブによって結合される必要はない。
【００４６】
標的タンパク質に結合することができるプローブの領域としては、少なくとも１つの標的タンパク質、少なくとも１つの標的タンパク質代替物、またはその両方と結合し、そして、適当な条件下で、タンパク質プローブおよび標的タンパク質を含む分子複合体を形成できるように設計された分子または組み立て物が挙げられる。標的タンパク質に結合することができる領域としては、抗体、ペプチド、アプタマー、またはペプトイドが挙げられる。該抗体は、これだけに限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナルな抗体、単一特異性抗体、遺伝子組み換えにより発現された抗体、ヒト化抗体、植物抗体（plantibodies）などを含めた、さまざまな起源から得られる。タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、およびアミノ酸配列といった用語は、任意の長さのアミノ酸の重合体を指すために、本明細書において互換的に使用される。該重合体は、直鎖であってもまたは分岐であってもよく、それは修飾アミノ酸を含んでもよく、そして、それは、非アミノ酸または合成アミノ酸によって分断されてもよい。該用語はまた、例えば、ジスルフィド結合生成、グリコシル化反応、脂質化、アセチル化、リン酸化、または、例えば、標識成分との結合などその他の操作によって、修飾されたアミノ酸重合体も包含する。本明細書中で使用される場合、アミノ酸という用語は、天然および／または非天然、あるいは、これだけに限定されるものではないが、グリシンとＤまたはＬ光学異性体の両方、アミノ酸アナログおよびペプチド模倣体を含めた、合成アミノ酸のいずれかを指す。標的タンパク質に結合し、同定するためのプローブおよび方法は、例えば、ＵＳ２０１１／００８６７７４に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書中に援用される。
【００４７】
複数の実施形態では、プローブは、好ましくは、抗体のヒンジ領域重鎖、に対して安定な、部位選択的であるシステイン生体共役反応法によって調製される。この製造法は、比較的制御可能な標識オリゴヌクレオチド対抗体の化学量論比をもたらす。プローブは、１抗体あたり複数（すなわち、２以上、例えば、２、３、４、５またはそれ以上）の標識オリゴヌクレオチドを含む。一般的に、（１抗体あたり３または４つの標識オリゴヌクレオチドを含む）「より重い」プローブは、標識オリゴヌクレオチドを欠く抗体または（１抗体あたり１または２つの標識オリゴヌクレオチドを含む）「より軽い」プローブより著しく感度を欠く。
【００４８】
タンパク質標的化プローブと核酸標的化プローブは、条件がタンパク質標的および核酸標的の両方の結合を可能にする限り、同時に適用され得る。あるいは、タンパク質標的化プローブと核酸標的化プローブは、タンパク質標的と核酸標的の両方の結合を可能にする条件が可能でないとき、連続して適用され得る。
【００４９】
１セットのプローブは、プローブの組成物と同義である。１セットのプローブは、少なくとも１つのプローブの種、すなわち、１つの標的を対象とものを含む。１セットのプローブは、少なくとも２、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれ以上のプローブの種を含むことが好ましい。１つのプローブセットは、プローブのそれぞれの種の１または複数のコピーを含んでもよい。
【００５０】
第一セットのプローブのみがサンプルに適用されてもよい。あるいは、第二セット（またはより大きい数）のプローブが、その後にサンプルに適用されてもよい。第一セットおよび第二（またはより大きい数）セットは、核酸のみ、タンパク質のみ、またはその組み合わせを標的としてもよい。
【００５１】
本発明では、２以上の標的（すなわち、タンパク質、核酸、またはその組み合わせ）が検出される；３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれ以上、およびその間の任意の数の標的が検出される。
【００５２】
１セットのプローブは、標的とされる細胞型または組織型に基づいて事前に規定されてもよい。例えば、組織が乳癌であれば、その場合には、プローブのセットは、乳癌細胞（例えば、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、およびＰＲ）に関連するタンパク質を対象としたプローブ、および／または正常乳房組織に関連するタンパク質を対象としたプローブを含む。さらに、該プローブのセットは、標的とされる細胞または組織の分化状態に基づいて事前に規定されてもよい。あるいは、該プローブのセットは、例えば、着目の細胞下局在性、例えば、核、細胞質、および膜、に基づいて事前に規定されてもよい。例えば、Ｆｏｘｐ３、ヒストンＨ３、またはＰ−Ｓ６を対象とした抗体は、核を標識し、ＣＤ３、ＣＤ４、ＰＤ−１、またはＣＤ４５ＲＯを対象とした抗体は、細胞質を標識し、およびＰＤ−Ｌ１を対象とした抗体は、膜を標識する。
【００５３】
プローブは、化学的に合成されても、またはそのプローブをコードする核酸がクローン化されたベクターを使用して生物学的に作製されてもよい。
【００５４】
本明細書中に記載した任意のプローブまたはプローブセットが、本発明の方法およびキットで使用されてもよい。
【００５５】
本明細書中に記載したプローブに関しては、標的核酸または標的タンパク質に対する標識コードの関連づけが決定されていない。
【００５６】
本発明のプローブは、任意のサンプル、例えば、生体サンプル、中に存在する標的核酸またはタンパク質を検出するために使用できる。当業者によって理解されるように、該サンプルは、これだけに限定されるものではないが：細胞（初代細胞および培養細胞株の両方を含む）および組織（培養されたものまたは外植されたものを含む）、を含めたいろいろなものを含んでいてもよい。複数の実施形態では、（固定または未固定）組織サンプルは、包埋され、連続的に切片にされ、そして、顕微鏡用スライド上に固定される。周知のとおり、一組の連続切片は、両方の連続切片中に存在する少なくとも１つの細胞を含む。第一連続切片に位置する構造および細胞型は、隣接する連続切片と同様の位置を有する。該サンプルは、スライド上に固定された培養細胞であっても、または解離細胞（固定または未固定）であってもよい。
【００５７】
複数の実施形態では、組織サンプルは、生検腫瘍またはその一部、すなわち、臨床的に関連する組織サンプルである。例えば、腫瘍は、乳癌由来であってもよい。該サンプルは、切除されたリンパ節であってもよい。
【００５８】
前記サンプルは、例えば、植物、真菌、および動物界の、多細胞生物を含めた事実上あらゆる生物体から入手できる；好ましくは、該サンプルは、動物、例えば、哺乳動物、から入手される。ヒトサンプルが特に好まれる。
【００５９】
いくつかの複数の実施形態では、本明細書中に記載したプローブ、組成物、方法、およびキットは、病気の診断に使用される。本明細書中で使用される場合、診断または病気の診断という用語は、病気の予測または診断、病気に対する素因の決定、病気に対する処置の観察、疾患の治療反応の診断、および病気の予後診断、病気の進行、ならびに病気の特定の処置に対する応答を含む。例えば、組織サンプルは、（非病的状態に対して）サンプル中の疾患または悪性細胞型のマーカーの存在および／または数量を測定し、それによって、疾患または癌を診断するかまたは病期診断するために、本明細書中に記載した任意のプローブ、方法、またはキットに従ってアッセイできる。
【００６０】
一般に、スライドに接着されたサンプルは、形態学、関心領域、着目の細胞型、および単独細胞を同定するために、最初に、蛍光（例えば、蛍光抗体または蛍光染色（例えば、ＤＡＰＩ））を使用して画像化され、そして次に、タンパク質および／または核酸の発現が同じスライド上のサンプルからデジタル的にカウントされ得る。
【００６１】
本発明の組成物およびキットは、プローブおよび他の試薬、例えば、サンプル中のタンパク質および／または核酸の結合を容易にすることが当該技術分野で知られている、すなわち、ハイブリダイゼーション反応を実施するための、バッファーおよび他の試薬を含み得る。
【００６２】
キットはまた、これだけに限定されるものではないが、標識オリゴヌクレオチドをプローブにハイブリダイズするため、プローブを標的特異性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするため、標的特異性ヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズするためおよび／またはプローブを標的タンパク質にハイブリダイズするために必要な情報を含めた、キットの要素を使用するための取扱説明書も含む。
【００６３】
標的核酸および／または標的タンパク質を検出するための代表的なプロトコールは、次のように、および図１０〜１４（上部）に示されるように説明される。
【００６４】
多重免疫組織化学法および／または核酸in situハイブリダイゼーション法に従って調製される細胞（生細胞または固定）または組織切片（例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ））は、調製され、そして、ガラススライドまたは好適な固体支持体上に固定される。細胞または組織切片の表面への接近は維持され、流体交換を可能にする；これは、流体チャンバー試薬交換システム（例えば、Grace（商標）Bio-Labs, Bend OR）を使用することによって達成できる。関心領域（ＲＯＩ）は、プローブが提供される連続切片上、または隣接する連続切片上で同定される。第一に、着目の細胞／組織の全体的な巨視的特徴を測定するために、着目の細胞／組織に対する完全な「巨視的特徴」の画像化方法論、例えば、ＤＡＰＩ染色、膜染色、ミトコンドリア染色、特異的なエピトープ染色、および特異的な転写産物染色、が実施される。あるいは、関心領域（ＲＯＩ）は、プローブを提供する連続切片に隣接した連続切片上で同定される；ここで、完全な「巨視的特徴」の画像化（先に記載したように）が、第一連続切片に対して実施される（図１１および１２の切片番号１）。一般的に、この画像化は、好適かつ指示された力の適用により、シグナルオリゴヌクレオチドがプローブから放出される、隣接する連続切片（図１０のパネルＢの赤線、ならびに図１１および１２の切片番号２の緑色の楕円形および緑色の三角形）の領域を同定する。連続切片は、互いに約５μｍ〜１５μｍ離れている。
【００６５】
図１３および図１４（上部）は、本発明のステップを更に例示する。図１３に示したステップは、次のものを含む。（１）プロセス：ＦＦＰＥスライド封入組織は、限定数の可視波長画像化試薬と一緒に、光切断可能リンカーを介してＤＮＡオリゴに結合された一次抗体カクテルとインキュベートされる。（２）概観：関心領域（ＲＯＩ）は、腫瘍切片の全体的な「構造」を確立するための低ｐｌｅｘでの可視光ベースの画像化試薬を用いて同定される（例えば、核の画像および／または１もしくは２つの主要な腫瘍バイオマーカーを使用した画像）。（３）プロファイル：抜粋ＲＯＩが、高解像度の多重プロファイリングのために選択されて、そして、ＵＶ光への曝露後に、選択された領域からオリゴが放出される。（４）プレーティング：次に、遊離の光切断されたオリゴが、例えば、微小毛細管ベースの「シッパー（sipper）」を介して回収され、その後の定量のためにマイクロプレートウェル内で保存される。（５）デジタル的カウント：デジタルカウントステップ中、マイクロプレート内の空間分解ＲＯＩからの光切断オリゴを４色、６スポットの光学バーコードにハイブリダイズさせて、標準的なNanoString nCounter（登録商標）読み出し器具（例えば、ＳＰＲＩＮＴ、Ｆｌｅｘ、およびＭＡＸ）を使用して、単独のＲＯＩにおいて（最大８００ｐｌｅｘマーカーの中に分配された）タンパク質標的の最大〜１００万デジタルカウントを可能にする。
【００６６】
関心領域は、サンプル中に存在する組織型、細胞型、細胞、または細胞内の細胞下構造であってもよい。
【００６７】
１セットのプローブ（各プローブが放出可能なシグナルオリゴヌクレオチドを含む）を含む組成物が、連続切片に適用される。該プローブのセットは、タンパク質を標的とするプローブ、核酸を標的とするプローブ、またはその両方のプローブを含んでいてもよい。該組成物は、捕捉プローブを含んでもよい。プローブが間接的に標的（タンパク質および／または核酸）に結合するとき、適用される組成物は、媒介オリゴヌクレオチドを含む。該組成物には、サンプル中のタンパク質および／または核酸の結合を容易にすることが当該技術分野で知られている他の試薬が含まれるであろう。
【００６８】
ブロッキングステップは、組成物が適用される前後に実施される。
【００６９】
光切断可能リンカーを含むプローブに関して、前記固体支持体（例えば、顕微鏡用スライド）は、光切断可能リンカーを切断することができる波長にて励起光を供給できる顕微鏡内に置かれる。第一関心領域（図１０のパネルＢの赤線、ならびに図１１および１２のＲＯＩｉ）は光で励起され、それによって、光切断可能リンカーが切断され、そして、シグナルオリゴヌクレオチドが放出される。図６および９で例示するように、シグナルオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの標識オリゴヌクレオチドと結合する位置を現在有するプローブの少なくとも１つの領域、あるいは、レポータープローブによって結合されるまたは結合され得るプローブからの核酸を包含する。励起光をＲＯＩｉのみに向けることによって、シグナルオリゴヌクレオチドは、ＲＯＩｉ内のプローブから放出されるのみであり、ＲＯＩｉ外に位置したプローブからは放出されず、それらのシグナルオリゴヌクレオチドはそのままである。よって、シグナルオリゴヌクレオチドは、ＲＯＩｉ内の標的に結合されたプローブに関してのみ回収され、それによって、ＲＯＩｉ内に位置する標的（タンパク質および／または核酸）の同一性および数量の検出を可能にする。
【００７０】
切片の表面は、少量のバッファーで洗浄され、そして（〜５−３０μｌ）溶出液（放出されたシグナルオリゴヌクレオチドを含む）は、第一サンプルコンテナ内に回収される（図１２でサンプル「ｉ」と示した）。切片の表面は、溶出液に入らなかったすべての放出シグナルオリゴヌクレオチドを取り除くために、更にすすがれる。
【００７１】
第二関心領域（図１１および１２のＲＯＩｊ）は光で励起され、それによって、光切断可能リンカーが切断され、そして、第二関心領域からシグナルオリゴヌクレオチドが放出される。同様に、励起光をＲＯＩｊのみに向けることによって、シグナルオリゴヌクレオチドは、ＲＯＩｊ内のプローブから放出されるのみであり、ＲＯＩｊ外に位置したプローブからは放出されず、それらのシグナルオリゴヌクレオチドはそのままである。よって、シグナルオリゴヌクレオチドは、ＲＯＩｊ内の標的に結合されたプローブに関してのみ回収され、それによって、ＲＯＩｊ内に位置する標的（タンパク質および／または核酸）の同一性および数量の検出を可能にする。
【００７２】
切片の表面は、少量のバッファーで洗浄され、そして（〜５−３０μｌ）溶出液（放出されたシグナルオリゴヌクレオチドを含む）は、第一サンプルチューブ内に回収される（図１２でサンプル「ｊ」と示した）。切片の表面は、溶出液に入らなかったすべての放出シグナルオリゴヌクレオチドを取り除くために、更にすすがれる。
【００７３】
励起ステップ、洗浄ステップ、およびすすぎステップは、すべての関心領域（最大ＲＯＩｎ）からシグナルオリゴヌクレオチドが回収されるまで反復される。
【００７４】
本発明の更なる利点、特徴、および実施形態は、共に出願された付記に例示される。例として、シグナルオリゴヌクレオチドを回収するための様々な方法およびデバイス、ならびに力を供給する様々な方法が示される。そのうえ、意外なことに、付記は、他の実施形態を超える本発明の特定の実施形態から得られた改善された結果をもたらした。約７倍〜約２００倍のシグナル対ノイズの改善を実証するデータを示す。
【００７５】
検出は、当該技術分野で知られているあらゆる顕微鏡タイプデバイスまたはシステムを使用できる。デバイスまたはシステムは、デジタルミラーデバイス（ＤＭＤ；図１５および１６を参照）と共に広視野照射を含み得る。この利点としては、ＤＭＤおよびコントローラは（プローブを光切断する）ＬＥＤも駆動できるので、実質的に別途費用を追加することなく、１０〜４０ｍｍの細胞を含むであろう〜１ｍｍの小さな特徴サイズを可能にし、さらに（プロジェクターのような）入手可能な家庭用電化製品を利用する、実施の容易さをもたらすので、削減されたコストが挙げられる。デバイスまたはシステムには、例えば、共焦の、レーザー走査デバイスが含まれ得る、図１６を参照。この利点は、より小さい形態学的特徴が、照射され、そして、画像化されることである；しかしながら、別途費用はこれらのデバイスに関係する。
【００７６】
サンプルの各関心領域中に存在する複数の標的タンパク質および／または標的核酸は、ポリメラーゼ反応、逆転写酵素反応、オリゴヌクレオチドマイクロアレイへのハイブリダイゼーション、質量分析、蛍光分子ビーコンへのハイブリダイゼーション、シークエンシング反応、またはnCounter（登録商標）分子バーコードを使用してそれぞれの溶出液サンプルで同定される。ＵＳ２００３／００１３０９１、ＵＳ２００７／０１６６７０８、ＵＳ２０１０／００１５６０７、ＵＳ２０１０／０２６１０２６、ＵＳ２０１０／０２６２３７４、ＵＳ２０１０／０１１２７１０、ＵＳ２０１０／００４７９２４、ＵＳ２０１４／０３７１０８８、およびＵＳ２０１１／００８６７７４に記載のNanoString Technologies（登録商標）製のnCounter（登録商標）システムおよび方法は、標的タンパク質および／または標的核酸を同定するための好ましい手段である。NanoString Technologies（登録商標）製のnCounter（登録商標）システムおよび方法は、複数（８００以上）の異なった標的タンパク質および／または標的核酸の同時多重識別を可能にする。
【００７７】
同時に、第一関心領域に存在する標的タンパク質および／または標的核酸の同一性および量（例えば、組織型、細胞型（正常および異常細胞を含む））と、第二関心領域に存在する標的タンパク質および／または標的核酸の同一性および量、或いはさらに多くの関心領域の比較ができる。
【００７８】
本発明は、腫瘍（例えば）とその隣接する正常組織内の不連続領域からの最大８００種類の着目のタンパク質の多重検出および比較を実現し、それによって、腫瘍とその微小環境の系統的な調査を可能にする。
【００７９】
本発明は、免疫療法および他の標的療法に対する新規な応答を解明するための臨床試験を進めるのに使用できる。
【００８０】
本発明はまた、（例えば）コンパニオン診断の開発に使用され得る、腫瘍の免疫バイオマーカーの発見も可能にする。
【００８１】
免疫組織化学は、ＦＦＰＥ組織切片におけるタンパク質の発現および局在を分析するための効果的な技術である。しかしながら、それは、ダイナミックレンジの不足、難しい定量、および非常に限定された多重化のため労働集約型のワークフローを含めた多くの課題に苦しんでいる。高度に多重化（最大８００ｐｌｅｘ）されたアッセイ、すなわち、nCounter（登録商標）デジタル多重免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイにおいてタンパク質の空間分解された、デジタル的な特徴づけを可能にするnCounter（登録商標）バーコーディング技術に基づく新規プラットフォームを、ここで開示する。該アッセイは、集束させた対象透過ＵＶ（例えば、〜３６５ｎｍ）曝露を使用して組織の不連続領域から放出される光切断可能オリゴヌクレオチドタグに連結された抗体に依存している。切断タグが、nCounter（登録商標）アッセイで定量され、カウントが組織分布に戻ってマッピングされ、そして、タンパク質量の空間分解デジタルプロファイルをもたらす。タンパク質検出は、光切断可能オリゴヌクレオチドタグを含む核酸プローブを使用する核酸検出アッセイと共に、またはそれとは別個に実施され得る。よって、本発明は、タンパク質量の空間分解デジタルプロファイル、タンパク質および核酸量の空間分解デジタルプロファイル、または核酸量の空間分解デジタルプロファイルを提供し得る。
【００８２】
前記アッセイの利点としては、これだけに限定されるものではないが：高感度（例えば、〜１−４細胞）であり、全てデジタル的にカウントされ、広いダイナミックレンジを有し（＞１０５）、高度に多重化され（３０個の標的、そして、例えば、８００個の標的まで器具を変えることのない拡張性）、簡単なワークフロー、ＦＦＰＥとの適合性、（タンパク質検出のために）二次抗体または増幅試薬を必要としない、ならびに臨床アッセイの可能性、が挙げられる。
【００８３】
この明細書および添付の請求項で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段の明確な文脈指示のない限り、複数の指示物も含む。
【００８４】
具体的に記載されるかまたは文脈から明白でない限り、本明細書中に使用される場合、「または」という語句は、包括的であると理解されるので、「または」と「および」の両方を網羅する。
【００８５】
具体的に記載されるかまたは文脈から明白でない限り、本明細書中に使用される場合、「約」という語句は、例えば、当該技術分野における標準的な許容性の範囲内、例えば、平均の２標準偏差の範囲内にあると理解される。約は、記載された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％の範囲内と理解され得る。別段文脈から明確でない限り、本明細書中に提供されたすべての数値が、「約」という語句によって修飾される。
【００８６】
別段の規定がない限り、本明細書中に使用されるすべての学術用語および科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載したものと類似したまたは同等の他のプローブ、組成物、方法、およびキットが本発明の実施において使用可能であるが、好ましい材料および方法を本明細書中に記載している。本明細書中に使用される専門用語は、特定の実施形態だけを記載する目的のためのものであって、制限することを意図するものではないことは、理解されるべきである。
【実施例】
【００８７】
実施例１：本発明は、ＦＦＰＥ組織切片内の多重標的を定量するための「バーコーディングの可能性」をもたらす。
【００８８】
腫瘍内の不均一性が、標的とした治療薬の実施に対する重要な課題として現れる。歴史的に、免疫組織化学（ＩＨＣ）は、タンパク質の空間的不均一性を評価するために使用された；しかしながら、高度な多重化および広いダイナミックレンジにてタンパク質量を定量することは難しい。
【００８９】
この実施例では、ホルマリンで固定したパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片内のタンパク質を、光切断可能リンカーおよび蛍光バーコードを含んだ抗体含有プローブで標識した。−ＦＦＰＥ組織切片のユーザー規定ＲＯＩにおける−プローブを、続いて集束ＵＶ光
に当て、それによって、ＲＯＩから（蛍光バーコードを含む）シグナルオリゴヌクレオチドを放出させる。放出されたシグナルオリゴヌクレオチドを、ＦＦＰＥサンプルから洗い流し、回収した。次に、該放出されたシグナルオリゴヌクレオチドからの蛍光バーコードを、NanoString Technologies（登録商標）製のnCounter（登録商標）システムによって認識し、デジタル的にカウントし、それによって、組織切片のユーザー規定の空間的領域内のそれぞれの標的タンパク質の量を定量した。第一ＲＯＩからのシグナルオリゴヌクレオチドを放出させ、回収した後に、集束ＵＶ光を、ＦＦＰＥ組織切片の第二ユーザー規定ＲＯＩに当て、それによって、第二ＲＯＩからシグナルオリゴヌクレオチドを放出させた。この制限されることのない例では、観察されたカウント数対ＵＶ照射面積の高度な直線性（０．９７＜Ｒ２＜０．９９）が観察され、そして、約１００μｍ×１００μｍ、または約１００細胞の検出空間分解能を有した。意外なことに、本発明は、単独のＦＦＰＥ組織切片において、対数５．５（基数１０）のダイナミックレンジにて、最大８００個の標的を定量するための「バーコーディングの可能性」をもたらした。
【００９０】
実施例２：本発明は、シグナル増幅なしにタンパク質発現を定量するため、およびＦＦＰＥ組織切片における高次な標的抗原の多重化を達成するための実用的かつ実現可能なアプローチを提供する。
【００９１】
定量的な、多重免疫組織化学が、腫瘍学の中の非常に興味深い分野として現れた。なぜなら、それが、チェックポイントの遮断が腫瘍の微小環境にどのように影響を与えるかをさらに規定する、空間時間的組織および相互依存性を識別する独特な能力を有するからである。この実施例は、ＦＦＰＥ組織切片内で標的抗原と相互作用する光切断可能なオリゴタグを付与した一次抗体を使用する、ワンステップの、増幅不要の染色法を説明する。該抗体からオリゴを放出する紫外（ＵＶ）光の照射が適用され、そして、溶出液回収、定量、および抗原量に相当するデジタルカウントがその後に続く。
【００９２】
最初に、さまざまな結合方法を調査した；これが、安定な、主にヒンジ領域重鎖に対して部位選択的であり、そのうえ、オリゴヌクレオチド対抗体の化学量論比に関して比較的制御可能であるシステイン生体共役反応法を確立した。
【００９３】
次に、ＵＶ誘発性切断面積と、計測されたデジタルタンパク質カウントとの間の相関を判定するために、線形回帰分析を実施した；これから、高度な直線性（０．９７＜Ｒ２＜０．９９）が観察され、ＦＦＰＥ組織に対するこの多重タンパク質カウント法に関連する基本機構／前提を確認した。
【００９４】
抗体−抗原相互作用に対する結合オリゴヌクレオチドの存在の影響を判定するために、ＦＦＰＥ組織切片において同一条件下での無修飾抗体に対する標識オリゴヌクレオチド結合抗体の性能を、感度、特異性、およびシグナル強度に関して比較した。抗体性能と標的抗原の細胞下配置との相関を判定するために、核、細胞質、または膜に局在する抗原を標的とした抗体を選択した。選択した抗体は、Ｆｏｘｐ３、ヒストン Ｈ３、Ｐ−Ｓ６（核抗原）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＰＤ−１、ＣＤ４５ＲＯ（細胞質抗原）、およびＰＤ−Ｌ１（膜抗原）を標的とした。感度に関して、一般的に、「より重い」オリゴヌクレオチド結合抗体（１抗体あたり３または４つの標識オリゴヌクレオチドを有する）は、非結合抗体または「より軽い」オリゴヌクレオチド結合抗体（１抗体あたり１または２つの標識オリゴヌクレオチドを有する）と比較したときに、著しく感度を欠くことがわかった。核、細胞質、および膜の標的抗原を通じて、感度、特異性、または強度に関して、非結合抗体と、「より軽い」オリゴヌクレオチド結合抗体との間で顕著な違いは観察されなかった。
【００９５】
本発明は、免疫治療介入前およびその最中における腫瘍の免疫状況を包括的に規定するための実用的かつ実現可能な方法を使用して、絶対タンパク質発現レベルを計測する高度に多重化したタンパク質プロファイリングを提供する。
【００９６】
実施例３：本発明は、ＦＦＰＥ組織から空間分解した、多重タンパク質検出を提供する。
【００９７】
方法
【００９８】
抗体−この実施例および実施例４〜６に使用した抗体としては：「標的（クローンＩＤ、供給業者）」：Ｈ３（Ｄ１Ｈ２、CST）、ＣＤ８（ＯＴＩ３Ｈ６、Origene）、ＣＤ４（ＳＰ３５、Spring Bio）、ＦＯＸＰ３（Ｄ２Ｗ８Ｅ、CST）、Ｂ７−Ｈ３（Ｄ９Ｍ２Ｌ、CST）、Ｓ６（５４Ｄ２、CST）、Ｂ７−Ｈ４（Ｄ１Ｍ８Ｉ、CST）、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ（ＯＴＩ４Ｅ４、Origene）、Ｋｉ６７（８Ｄ５、CST）、ＰＤ−１（Ｎａｔ１０５、Cell Marque）、ＣＤ３（ＭＲＱ−３９、Cell Marque）、Ｖｉｓｔａ（Ｄ１Ｌ２Ｇ、CST）、Ｈｅｒ２（２９Ｄ８、CST）、ＰＲ（Ｄ８Ｑ２Ｊ、CST）、ＥＲ（ＳＰ１、Spring Bio）、ＥＧＦＲ（Ｄ３８Ｂ１、CST）、ＣＤ５６（ＭＲＱ−４２、Cell Marque）、ＰＤ−Ｌ１（Ｅ１Ｌ３Ｎ、CST）、ＣＤ４５（２Ｂ１１＆ＰＤ７／２６、Cell Marque）、ＴＩＭ−３（Ｄ５Ｄ５Ｒ、CST）、およびＰａｎ Ｋｅｒａｔｉｎ（Ｃ１１、CST）、ＣＤ４５ＲＯ（ＵＣＨＬ１、Cell Marque）が挙げられる。
【００９９】
扁桃腺の顕微鏡法−扁桃腺ＦＦＰＥブロック（Amsbio）の５μｍ切片を、スライド上に封入した。ＩＨＣを、標準プロトコールを使用して実施した。抗原回復を、圧力鍋を用いて実施した。扁桃腺切片の染色を、ＣＤ３一次抗体ＭＲＱ−３９（ウサギｍＡｂ、Cell Marque）およびＫｉ−６７一次抗体８Ｄ５（マウスｍＡｂ、CST）を用いて実施した。二次インキュベーションを、Ａｌｅｘａ５９４標識ヤギαウサギ（Life Tech）およびＡｌｅｘａ４８８標識ヤギαマウス（Life Tech）と共に実施した。
【０１００】
ここで、スライドに接着したサンプルを、最初に、蛍光抗体を使用して画像化し、次に、タンパク質発現を、サンプルからデジタル的にカウントした。
【０１０１】
図１０〜図１４（上部）に例示したものと同様のステップを使用した。選択したＲＯＩのＵＶ切断は、３０ｐｌｅｘすべてのデジタルプロファイリングを可能にした（nCounter（登録商標）カウント）。
【０１０２】
結果
【０１０３】
図１８は、Ｋｉ−６７（緑色の細胞増殖マーカー）およびＣＤ３（赤色の免疫細胞マーカー）の二色の蛍光を使用して最初に画像化した扁桃腺サンプルの全体的な組織形態を確立する顕微写真を示す。１２カ所の領域（図１９で拡大した４つの領域を含む）にわたる多重標的分析は、Ｋｉ−６７およびＣＤ３の局在性に関する３つの異なったプロファイルを示す。図１９は、図１８に示した４つの領域に関するＫｉ−６７およびＣＤ３のnCounter（登録商標）カウントを示す。図２０は、図１８に示した扁桃腺サンプルから１２の関心領域（ＲＯＩ）に対する３０ｐｌｅｘのオリゴ抗体カクテルによる代表的なカウントを示す。（調査すべき様々な追加対照を許容するように）データを連続切片から得た。示したように、組織サンプルの領域を、発現されたマーカーの強度および同一性に基づいて分類した。示した代表的な分類：「ＣＤ３豊富」「Ｋｉ６７豊富」、「混合」、および「結合組織」。
【０１０４】
これらのデータは、本発明が複数（ここでは、少なくとも３０）のタンパク質標識の空間分解検出を提供することを示す。使用するタンパク質プローブ（抗体）数の規模を拡大することによって、最大８００の異なったタンパク質標識を、同様の分解能で検出できる。
【０１０５】
実施例４：本発明は、ＦＦＰＥ組織からの多重タンパク質検出、および単独細胞分解能アプローチを提供する。
【０１０６】
方法
【０１０７】
黒色腫の顕微鏡法−メラノーマ（リンパ節由来）ＦＦＰＥブロック（Asterand）の５μｍ切片を、スライド上に封入した。ＩＨＣを、標準プロトコールを使用して実施した。抗原回復を、圧力鍋を用いて実施した。
【０１０８】
ここで、サンプルを、最初に、蛍光を使用して画像化し、次に、タンパク質発現を、サンプルからデジタル的にカウントした。
【０１０９】
図１０〜図１４（上部）に例示したものと同様のステップを使用した。
【０１１０】
結果
【０１１１】
図２１は、ＣＤ３（赤色）、ＣＤ８（緑色）、およびＤＡＰＩ（青色）の三色の蛍光を使用して最初に画像化したリンパ節の黒色腫サンプル中のＴ細胞の全体的な組織形態を確立する顕微写真を示す。白丸は、直径２５μｍであり、３つの細胞を囲んでいる。
【０１１２】
図２２は、ＵＶ照射領域（直径１００μｍ〜１ｍｍ）の作用としてＦＦＰＥリンパ節組織切片（５μｍ厚）から放出されたＣＤ３複合体に関するnCounter（登録商標）データを示す。検出カウントの制限（ＬＯＤ＝バックグラウンドカウント＋２×標準偏差）は、直径で２６μｍの空間分解能に相当する。視野の絞りサイズを、図面の下部に示す。図２３および図２４は、（それぞれ、同じ実験からの）ＣＤ４５およびＰＤ１に関するデータを示す。
【０１１３】
前記データは、本発明の空間的検出能力が約１〜４細胞に相当することを示す。
【０１１４】
実施例５：本発明は、臨床関連アッセイにおける定量性能を提供する。
【０１１５】
方法
【０１１６】
図１０〜図１４（上部）に例示したものと同様のステップを使用した。
【０１１７】
乳癌組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）：ＴＭＡ ＢＲ１５０４ａを、US Biomax, Inc.から入手し、Ｈ＆Ｅ染色画像を、US Biomaxウェブサイト（World Wide Web (www) biomax.us/tissue-arrays/Breast/BR1504a）から入手した。図２５の左側のパネルに示した切片と同じブロックからの切片を、Ｈｅｒ２一次抗体２９Ｄ８（ウサギｍＡｂ、CST）およびＡｌｅｘａ５９４標識ヤギαウサギ（Life Tech）を用いて染色した。カウントもまた、ヒストン Ｈ３、リボソームタンパク質Ｓ６、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、マウスＩｇＧアイソタイプ対照、およびウサギＩｇＧアイソタイプ対照に関して得た（データ未掲載）。ＴＭＡ ＢＲ１５０４ａのＨｅｒ２病理学者スコアは、US Biomax, Inc.によって提供された（World Wide Web (www) biomax.us/tissue-arrays/Breast/BR1504a）。Ｈｅｒ２一次抗体２９Ｄ８（ウサギｍＡｂ、CST）およびＡｌｅｘａ５９４標識ヤギαウサギ（Life Tech）を用いて、染色を実施した。他のウサギ一次抗体を一次カクテル中に使用したが、それらの抗体からの蛍光は、Ｈｅｒ２蛍光と比較して、ごくわずかであった。合計ピクセル強度（λ＝５９４における）を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して得た。これに関して、バックグラウンド値を強度＝０に設定し、そして、最も高い強度を強度＝２５５に設定した。ＲＯＩあたりの全ピクセル強度の合計を示す。
【０１１８】
ここで、サンプルを、最初に、蛍光を使用して画像化し、次に、タンパク質発現を、サンプルからデジタル的にカウントした。
【０１１９】
結果
【０１２０】
図２５（左のパネル）は、ＩＨＣ染色によってＨｅｒ２蛍光を同定する顕微写真（中央のパネル）に示した可変レベルのＨｅｒ２タンパク質を含めた、乳房腫瘍組織の組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を示す。右のパネルは、中央のパネルの単一領域の拡大図を示す：斯かる領域を、多重抗体カクテルで染色した。
【０１２１】
図２６は、４８の代表的な領域対Ｈｅｒ２状況（ＡＳＣＯ−ＣＡＰガイドライン）に関するnCounter（登録商標）カウントデータを示す。図２７では、図２６について言及した４８の領域に関するnCounter（登録商標）カウント対合計ピクセル強度（×１０３）をプロットする。
【０１２２】
これらのデジタルカウントデータは、ＡＳＣＯ−ＣＡＰガイドラインによる目視によるＨｅｒ２状況のスコアリング（Ｒ２＝０．５１、図２６）と比較して、蛍光強度（Ｒ２＝０．９２、図２７）との高い相関関係を示す。
【０１２３】
実施例６：本発明は、組織サンプル内の特定の細胞型の量を明らかにする。
【０１２４】
図１０〜図１４（上部）に例示したものと同様のステップを使用した；
スライドに接着した黒色腫のサンプルを、最初に、蛍光を使用して画像化し、次に、タンパク質発現を、サンプルからデジタル的にカウントした。
【０１２５】
図２８は、ＣＤ３（免疫細胞マーカー、赤色）とＤＡＰＩ（細胞核、青色）の二色の蛍光を使用した黒色腫サンプルの全体的な組織形態を確立する顕微写真を示す。３０個の抗体のカクテルを使用した発現データを、白枠で識別される１０の領域から得た。図２９は、図２８に示した黒色腫サンプルからの１０の関心領域（ＲＯＩ）に対する３０ｐｌｅｘのオリゴ抗体カクテルによる代表的なnCounter（登録商標）カウントを示す。それぞれがバックグラウンドを超える発現カウントを有する、１３のマーカーに関するカウントを示す。「免疫浸潤が豊富」であると確認された領域５、６、７は、Ｔ細胞性マーカーおよびＴ細胞調節マーカーの最も高い発現を有した。
【０１２６】
これらのデータは、本発明が複数（ここでは、少なくとも３０）のタンパク質マーカーの空間分解検出を実現することを示す。使用するタンパク質プローブ（抗体）の数の規模を拡大することによって、最大８００の異なったタンパク質標識を、同様の分解能で検出できる。
【０１２７】
実施例７：デジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）は、単独細胞の照射を可能にする。
【０１２８】
図３０Ａおよび３０Ｂは、扁桃腺組織サンプル中の単独細胞に照射する場合、デジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）を使用したＵＶ照射が可能であることを示す顕微写真である。
【０１２９】
これらのデータは、ＤＭＤを使用したときに、本発明が単独細胞分解可能であることを示す。
【０１３０】
実施例８：ゲルボックスは、サンプル全体に照射をおこない、そして、サンプル全体に結合したプローブからシグナルオリゴヌクレオチドを放出させることができる。
【０１３１】
図３４：組織またはサンプル全体が、例えば、標準的な実験室用ＵＶゲルボックスを用いて、照射された実施形態からのデータを示す。ここで、ＦＦＰＥ組織スライドを、ライトパネル上に置き、ワックスペンを使用して、バッファー溶液（ＴＢＳ）を保持し、ＦＦＰＥ組織を被覆し、そして、ＵＶ光曝露（２７６〜３６２ｎｍ、例えば、３０２ｎｍ；〜５ｍＷ／ｃｍ２）を、ガラススライド（１ｍｍ厚）を通して組織に適用した。データは、約１分以内のＵＶ曝露で、シグナルオリゴヌクレオチドの大部分が、ＦＦＰＥ結合抗体から放出されたことを示す。カウントを、陽性対照に対して標準化する。
【０１３２】
実施例９：顕微鏡からの照射は、サンプルの関心領域を照射し、そして、関心領域に結合されたプローブからシグナルオリゴヌクレオチドを放出させることを可能にする。
【０１３３】
図３５は、組織またはサンプルの一部に、例えば、顕微鏡を用いて、照射される実施形態、すなわち、顕微鏡下でのＵＶ切断を示す（時間滴定実験）。これは、サンプル全体が照射される実施例８の実験と対照的である。ここで、ＵＶ ＬＥＤ（３６５ｎｍにて）は、２０×対物レンズを用いて〜１５０ｍＷ／ｃｍ２にて適用される。ＵＶ照射は、以前の蛍光（〜５９０ｎｍの励起）明視野画像化によって同定した全組織領域を走査した。視野（ＦＯＶ）あたり約１秒以内のＵＶ曝露で、ほとんどのシグナルオリゴヌクレオチドがＦＦＰＥ結合プローブから放出される。実施例８のゲルボックス実験を、非空間分解１００％放出対照として利用した。カウントを、陽性対照に対して標準化する。青色：可変の露出時間を用いた顕微鏡データ；赤色：ゲルボックス２．５分曝露のデータ。顕微鏡装置の形態を示す写真および図解も示す。
【０１３４】
図３６は、シグナルオリゴヌクレオチドが肺組織サンプルに結合した均一に分布した抗ヒストン（Ｈ３）抗体から放出されることを示す。組織を、約４５０μｍ×３３０μｍ＝０．１５ｍｍ２の視野（ＦＯＶ）あたり１秒のＵＶ（３６５ｎｍ、２０×対物レンズを用いて〜１５０ｍＷ／ｃｍ２）に当てた。流出液を回収するために使用される「マクロ体積」は、約７０μｌであった。これは、約５μｌの回収流出液を用いた（ＦＯＶ／５）〜９９μｍ×９９μｍまでの検出限界を低下させた。したがって、この実施例では、検出限界は約１０細胞×１０細胞ニッシェある。これらのデータは、抗体シグナルが、空間分解照射領域ＦＯＶに比例し、「マクロ流体」検出限界（ＬＯＤ）を評価することを示す。
【０１３５】
図３７は、組織またはサンプルの一部に、例えば、顕微鏡を用いて、照射される実施形態、すなわち、顕微鏡下での、および多重標的に関するＵＶ切断を示す（照射領域滴定実験）。組織における多重標的：２つの陽性標的（ヒストンＨ３およびリボソーム Ｓ６）および８つの陰性標的、のＵＶ切断を示す。１つの陰性標的（Ｏｘ４０）のみが、高いバックグラウンドを示した。ゼロ、１、４、９、および１６視野からのデータを示す。
【０１３６】
実施例１０：関心領域は、標識技術によってあらかじめ同定されてもよく、次に、関心領域は照射され、シグナルオリゴヌクレオチドが、あらかじめ同定した関心領域に結合したプローブから放出される。
【０１３７】
図３８は、組織（例えば、乳癌サンプル）内の関心領域が最初に、マーカー（ここでは、Ｈｅｒ２）の発現に関して同定され、次に、この関心領域は（例えば、ＵＶを）照射されて、結合プローブからシグナルオリゴヌクレオチドが放出されるにある実施形態を示す。示したデータは、２つの位置：Ｈｅｒ２＋とあらかじめ識別した１つの関心領域およびＨｅｒ２−とあらかじめ識別した１つの関心領域、から放出された２つの標的（ここで、Ｈｅｒ２およびヒストン Ｈ３）に関して、シグナルオリゴヌクレオチドの量を比較する。
【０１３８】
実施例１１：フローセルに包埋された包埋されたサンプルは、照射された関心領域からだけでなく、シグナルオリゴヌクレオチドが放出されるところからも、サンプル全体から溶出の回収を実現する。
【０１３９】
図３９は、フローセルに組織が包埋された実施形態を示す。ここで、微小流体フローセルに包埋されたＦＦＰＥ組織は（約２５μｌの体積を有する１００μｍの高さがある９ｍｍの円形チャンバー（フローセルが３００μｍの高さであるとき、大体の体積は７５μｌである））、シリンジポンプによって制御される。ＵＶはフローセルの内側を切断し、そして、ある領域（９ＦＯＶｓ）の照射、そして溶出、次に、別の領域（９ＦＯＶｓ）の照射、そして溶出の溶出プロファイルを示した。複数の画分に関するデータが示される。実施例１０のデータと同様に、ここで、関心領域は、蛍光標識マーカーの発現に関してあらかじめ同定された。
【０１４０】
実施例１２：関心領域の一面に小さい穴を含むフローセルに包埋されたサンプルは、照射された関心領域、およびシグナルオリゴヌクレオチドが放出された場所からの効果的な溶出の回収をもたらしたが、それはサンプル全体からではなかった。
【０１４１】
図４０は、小さい穴を備えたフローセル内に組織が埋め込まれている実施形態を示す。ここで、溶出は、関心領域上で直接起こる。流体チャンバー上の直径０．４〜１ｍｍの穴は、溶出液（例えば、５μｌの回収体積）の回収を可能にする。９穴、９６穴形式、および１２穴形式（組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）のため）を試験した。蛍光画像を、複数の視野を組み合わせることによって作成した。装置の形態を示す写真および図解も示す。
【０１４２】
図４１Ａ〜４１Ｃは、小さい穴を備えたフローセルを使用する実施形態が、組織の全表面からの溶出液の回収よりむしろ有意なシグナル対ノイズの改善を有することを示す。データは、関心領域上の穴を通して溶出液を回収するとシグナル対ノイズが約７倍増強されることを示す。この実施形態では、流体フローセル上の直径１ｍｍの穴（２５μｌのチャンバー）を、溶出液を回収するために使用した（５μｌの画分）。複数の画分に関するデータを示す。
【０１４３】
図４２Ａ〜４２Ｃは、小さい穴（１２または９６穴形式）を備えたフローセルを使用したデータを示す。データは、関心領域上の穴を通して溶出液を回収するとシグナル対ノイズが約７倍増強されることを示す。この実施形態では、視野照射を穴の中心に集中した；１穴あたり５μｌの体積の溶出。
【０１４４】
図４３ＡおよびＢは、全組織溶出を実施したフローセルからのバックグラウンドシグナル（図４３Ａ；実施例１１に示すように）を、溶出が関心領域の上で直接起こったフローセルからのバックグラウンドシグナル（図４３Ｂ）と比較した際のデータを示す。図４３Ａに見られるように、全組織溶出に関しては、図４３Ｂに見られるバックグラウンドに対して、より高いバックグラウンドである。さらに、図４３Ｂは、フローセル内インキュベーションと、非フローセルインキュベーションとの相違を示さない。
【０１４５】
実施例１３：放出されたシグナルオリゴヌクレオチドは、単一チューブ／ピペット、複数のチューブ／ピペット、またはマルチチューブ／ピペットアレイによって選択され得る。
【０１４６】
図４４は、複数の関心領域の吸引の実施形態のための開放表面での溶出液回収を示す図解である。ここでは、回転弁の切り替えを用いた溶出液の吸引／分配ためのマルチチューブアレイを示す。図４７も参照。
【０１４７】
図４５は、溶出液回収が毛細管（マイクロアスピレーター）を通してである実施形態を示す写真および図解を含む。図４７も参照。図４６ＡおよびＢは、溶出液回収が毛細管（マイクロアスピレーター）を通してである図４５の実施形態からのデータを示す。この実施形態は、シグナル対ノイズにおいて劇的な改善があった：シグナル対ノイズ比は、穴溶出によるフローセルと比較して、約１０倍増強され、そして、シグナル対ノイズ比は、全組織溶出と比較して、約２００倍増強される。ここで、ＬＯＤ面積は、約６０μｍ×６０μｍである。
【０１４８】
実施例１４：照射能力と溶出能力の両方を備えたデバイスは、規定した関心領域からの核酸および／またはタンパク質発現データを効率的かつ正確に得ることができる。
【０１４９】
図４８は、組み合わせた毛細管とレンズによる照射および流体回収を示す図解である。
【０１５０】
実施例１５：タンパク質発現は、単独細胞から検出および定量され得る。
【０１５１】
図５０は、本明細書中に記載した方法および装置を使用して単独細胞または２つの細胞から得られたタンパク質発現データを示す。上部パネルでは、Ｓ６タンパク質が、少なくとも１つの細胞から検出および定量され、下部パネルでは、ＣＤ４５タンパク質が、少なくとも１つの細胞から検出および定量される。
【０１５２】
実施例１６：本明細書中に記載した方法およびデバイスは、空間分解、多重ＲＮＡ標的および／またはタンパク質標的発現の正確、かつ、効果的な検出および定量を実現する。
【０１５３】
in situハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を実施して、それぞれ標的結合ドメイン、シグナルオリゴヌクレオチド、および光切断可能リンカーを備えるＤＮＡベースのオリゴプローブ（「ＲＮＡプローブ」）を内因性ＲＮＡにハイブリダイズさせる。５μｍのＦＦＰＥ ＨＥＲ２ ３＋乳房組織切片を、キシレン中で脱パラフィン処理し、段階的なエタノール中で部分的に再水和し、そして、７０％のエタノール中、室温にて１時間インキュベートした。次に、切片を、４０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ中で３７℃にて２５分間インキュベートした。次に、組織を、５０％のホルムアミド／２×ＳＳＣ中、室温にて１５分間インキュベートし、そして、１ｎＭプローブ、４０％のホルムアミド、１ｍｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡ、１０％の硫酸デキストラン、および２×ＳＳＣ中の０．２％のＢＳＡの溶液中、３７℃にて一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後に、５０％のホルムアミド／２×ＳＳＣ中での２回のストリンジェント洗浄を、それぞれ３７℃にて２５分間実施した。切片を、ＴＯ−ＰＲＯ（登録商標）−３（Thermo Fisher Scientific）蛍光核酸染色を用いて染色して、組織形態を可視化した。次に、半導体型反射デバイスによって誘導した集束ＵＶ光を使用して、プローブからユーザー規定の関心領域（ＲＯＩ）のＤＮＡシグナルオリゴヌクレオチドを切断した。各組織切片に関して、２つのＲＯＩが腫瘍組織を含み、２つのＲＯＩが正常組織を含み、および２つのＲＯＩが組織を含まなかった（組織スライド自体）。切断後に、シグナルオリゴヌクレオチドを回収し、nCounter（登録商標）分子バーコードにハイブリダイズし、そして、NanoString Technologies（登録商標）製のnCounter（登録商標）システムによってデジタル的にカウントした。Ｈ＆Ｅを組織切片に対して実施して、腫瘍および通常組織のＲＯＩについて確認した。
【０１５４】
連続切片に対して、標準的な免疫組織化学（ＩＨＣ）を、それぞれ標的結合ドメインとしての抗体、ＤＮＡシグナルオリゴヌクレオチド、および光切断可能リンカーを備えた「タンパク質プローブ」を使用して実施した。次に、切片を、抗ウサギＡｌｅｘａ５９４二次抗体およびＴＯ−ＰＲＯ（登録商標）−３（Thermo Fisher Scientific）蛍光核酸染色を用いて染色して、組織形態を可視化した。次に、半導体型反射デバイス（ＤＭＤ）によって誘導した集束ＵＶ光を使用して、プローブからユーザー規定の関心領域（ＲＯＩ）のＤＮＡシグナルオリゴヌクレオチドを切断した。各組織切片に関して、２つのＲＯＩが腫瘍組織を含み、１つのＲＯＩが正常組織を含み、および２つのＲＯＩが組織を含まなかった（組織スライド自体）。ＲＯＩを、ＩＳＨプローブ切断のために選択したＲＯＩに組み合わせた。切断後に、タンパク質標的からのシグナルオリゴヌクレオチドを、ＲＮＡ標的からのシグナルオリゴヌクレオチドと混合し、そして、すべてを先に記載したように定量した。Ｈ＆Ｅを組織切片に対して実施して、腫瘍および通常組織のＲＯＩについて確認し、さらに、ＲＯＩが、ＩＳＨとＩＨＣ組織との間で正しく組み合わせられたことを確認した。
【０１５５】
図５１は、同じ腫瘍サンプルの連続切片からサンプル抽出したＲＯＩを示す。領域１〜４は、この画像に未掲載であるが、代わりに、組織を含まなかった組織の一部から取った（陰性対照−「組織なし」）。領域５〜８は、わずかな数の腫瘍細胞を含んでいた（「正常組織」）。領域９〜１２は、多数の腫瘍細胞を含んでいた（「腫瘍」）。
【０１５６】
図５２は、このアッセイに含まれる９つのＲＮＡプローブのうち６つについて得られたカウントを示す。各ＲＯＩに関して、サンプルを、ＵＶ照射を適用する前（「−ＵＶ」データセット）および同じ領域からプラスＵＶサンプルを回収する前（「＋ＵＶ」データセット）に回収した。カウントのバックグラウンドレベルを、ＵＶがサンプルに適用されなかったときに得た；それによって、得られたシグナルのＵＶ依存性を示す。＋ＵＶであるが、組織に向けられていなかったＲＯＩが、バックグラウンドカウントをもたらした（すなわち、ＲＯＩ１〜４−「組織なし」）。本来正常組織であった領域（すなわち、ＲＯＩ５〜８−「正常組織」）は、ＨＥＲ２プローブに関して低いカウントを示した（グラフのオレンジ色の棒）。本来腫瘍組織であった領域（すなわち、ＲＯＩ９〜１２−「腫瘍」）は、ＨＥＲ２に関してより高いカウントを示した。同様の、しかしそれほど劇的でない、増大が、リボソーム Ｓ６プローブに関して見られた（グラフの緑色の棒）。この組織型で高度に発現されないと予想されるＲＮＡを対象とした追加の対照プローブは、正常組織と腫瘍組織との間で異なったレベルを示さず一貫したカウントを示した。これらの対照プローブを、ＣＤ４５、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、および２つの独特なＥＲＣＣ配列を標的とするように設計した。明確にするために、図５３は、図５２に示したデータの平均および標準偏差を示す。
【０１５７】
これらのＲＮＡプローブのサンプルもまた、腫瘍サンプルのサンプル領域を分析したタンパク質プローブと同時に実施した。これに関しては、ＲＮＡおよびタンパク質プローブを、同時に、NanoString Technologies（登録商標）製のnCounter（登録商標）分子バーコードにハイブリダイズし、そして、nCounter（登録商標）システムによってデジタル的にカウントした。このアッセイに関するカウントを図５４に示す。ＨＥＲ２ ＲＮＡプローブカウント（上部グラフの赤色の棒）およびタンパク質プローブカウント（下部グラフの赤色およびオレンジ色の棒）の増大は、正常領域と比較して、腫瘍領域において見られる。＋ＵＶサンプルのみを示す。先に記載したとおり、−ＵＶ対照サンプルはこのグラフに未掲載である。なぜなら、それらにバックグラウンドカウント（「組織なし」カウントと同様）がないからである。合致するタンパク質プローブサンプルを入手できなかったため、ＲＯＩ６およびＲＯＩ８をこの分析から除外した。よって、タンパク質プローブからのシグナルオリゴヌクレオチドとＲＮＡプローブからのシグナルオリゴヌクレオチドを、一緒に検出し、定量することができる。
【０１５８】
実施例１７：部分的二本鎖プローブは、一本鎖プローブと比較したときに、より高いシグナル対ノイズ比を有する。
【０１５９】
ＤＮＡプローブ（ｍＲＮＡを認識し、結合する）を、実施例１６に記載のとおり、５μｍのＦＦＰＥ組織においてＲＮＡにin situハイブリダイズさせた。ＵＶ切断を、別々のスライド上に封入した組織切片全体に対して、２×ＳＳＣ＋０．１％のＴｗｅｅｎ２０中でＵＶライトボックス（ゲルボックス）を使用して３分間実施した。切断およびシグナルオリゴヌクレオチドの放出後に、そのシグナルオリゴヌクレオチドを、実施例１６のようにピペットによって回収し、検出した。一本鎖ＤＮＡプローブ、部分的二本鎖ＤＮＡプローブ、および無プローブ対照カウントを、図５５（上部のグラフ）においてＨＥＲ２ ３＋乳房組織および扁桃腺組織に関して示す。シグナル対ノイズ比は、カウントを平均バックグラウンドカウントで割ることによって決定した（平均ＥＲＣＣカウント）。図５５、下部のグラフを参照。
【０１６０】
実施例１８：サケ精子ＤＮＡの追加がプローブハイブリダイゼーションを改善する。
【０１６１】
ＤＮＡプローブ（ｍＲＮＡを認識し、結合する）を、先に記載されるように、５μｍのＦＦＰＥ組織においてＲＮＡにin situにおいてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション中に、１ｍｇ／ｍｌの超音波処理した変性サケ精子ＤＮＡを、酵母ｔＲＮＡの代わりに使用した。スライドを、１ｎＭプローブ、４０％のホルムアミド、１ｍｇ／ｍｌの超音波処理した変性サケ精子ＤＮＡ、１０％の硫酸デキストラン、および２×ＳＳＣ中の０．２％のＢＳＡの溶液を用いてハイブリダイズさせた。ＵＶ切断、シグナルオリゴヌクレオチド回収、および検出を、実施例１７に記載のとおり実施した。一本鎖ＤＮＡプローブを、ＨＥＲ２ ３＋乳房および扁桃腺に示す（図５６）。シグナル対ノイズ比は、カウントを平均バックグラウンドカウントで割ることによって決定した（平均ＥＲＣＣカウント）。
【０１６２】
実施例１９：ＰＳＡ（前立腺特異抗原）ＲＮＡプローブは、高度に特異的である。
【０１６３】
ＤＮＡプローブ（ｍＲＮＡを認識し、結合する）を、先に記載されるように、ＦＦＰＥ前立腺の５μｍ切片においてＲＮＡにin situにおいてハイブリダイズさせた。ＭＥＳ中、９７℃にて１０分間のインキュベーションを、１時間のエタノールインキュベーションの代わりに使用した。ＵＶ切断、シグナルオリゴヌクレオチドの回収および検出、ならびにシグナル対ノイズ比の算出を、実施例１７に記載のとおり実施した。カウントおよび比を図５７に示す。
【０１６４】
実施例２０：プローブの特異性は、非標準的な、ｎＭ未満の濃度にて増強される。
【０１６５】
典型的には、ＲＮＡを認識するために使用されるin situハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）プローブは、５〜２００ｎＭにてハイブリダイズさせる。驚いたことに、本発明の核酸認識プローブは、０．２ｎＭまたはそれ未満で最もうまく働き、それは、標準的なＩＳＨプローブ濃度に比べて１／２５〜１／１０００の低さであった。
【０１６６】
ＤＮＡプローブを、先に記載されているように、ＦＦＰＥ ＨＥＲ２ ３＋乳房サンプルの５μｍ切片においてＲＮＡにin situにおいてハイブリダイズさせた。プローブを、５、１、０．２、および０．４ｎＭで使用した。ＵＶ切断、シグナルオリゴヌクレオチドの回収および検出、ならびに倍率変化の計算を、実施例１７に記載のとおり実施した。
【０１６７】
図５８は、プローブ濃度が低いほどカウントが低下することを示す（上部のグラフ）。しかしながら、意外なことに、プローブをｎＭ未満の濃度にてハイブリダイズさせるとき、陽性プローブカウントを陰性対照プローブと比較して、シグナル対ノイズにおいて顕著な増大があった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ−３１Ｂ】
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【図３１Ｃ−３１Ｄ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【国際調査報告】
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