(57)【要約】  本発明はカゼインキナーゼ１δ（ＣＫ１δ）の阻害方法を提供し、該方法は、本明細書に記載されている式（Ｉ）の化合物、例えば化合物ＳＲ−３０２９とＣＫ１δを接触させることを含む。本発明者らは、ＣＳＮＫ１Ｄがヒト乳房腫瘍において増幅され及び／又は過剰発現されること、ならびにＣＫ１δが、このキナーゼを過剰発現するヒト乳癌亜型において医学的に標的化可能であることを示す。本発明は更に、癌、例えば乳癌、黒色腫、膠芽腫、髄芽腫、腎癌、膀胱癌もしくは結腸癌または脳、肺もしくは骨に転移する癌（ただし、この場合、ＣＫ１δおよびβ−カテニン依存性の両方の上昇がそれらの転移性疾患に関与している）の治療方法を提供する。癌は三種陰性サブクラスの乳癌（ＴＮＢＣ）またはＨＥＲ＋  乳癌でありうる。【選択図】図１
2018538241.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2018538241.tif 000008
［式中、
各Ｒは、独立して選択される水素もしくは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、または窒素原子に結合した２個のＲ基は該窒素原子と一緒になって、Ｏ、ＳおよびＮＲ’（ここで、Ｒ’は水素または（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである）からなる群から選択される１または２個のヘテロ原子を所望により更に含んでいてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成しうるものであり；
Ａｒ１はアリールまたは５員もしくは６員ヘテロアリールであり、これは置換されていないか、または１〜３個の独立して選択されるハロ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）フルオロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシル、シアノ、ニトロ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）ＲまたはＣ（＝Ｏ）ＯＲで置換されている；
Ｈｅｔ１は単環式または二環式ヘテロアリールであり、これは置換されていないか、または１〜３個の独立して選択されるハロ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）フルオロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシル、シアノ、ニトロ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）ＲまたはＣ（＝Ｏ）ＯＲで置換されている］
の化合物またはその医薬上許容される塩の有効な量または濃度とカゼインキナーゼ１δ（ＣＫ１δ）を接触させることを含む、カゼインキナーゼ１δ（ＣＫ１δ）の阻害方法。
【請求項２】
式（Ｉ）の化合物がＳＲ−３０２９
【化２】
2018538241.tif 000009
またはその医薬上許容される塩である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
式（Ｉ）
【化３】
2018538241.tif 000010
［式中、
各Ｒは、独立して選択される水素もしくは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、または窒素原子に結合した２個のＲ基は該窒素原子と一緒になって、Ｏ、ＳおよびＮＲ’（ここで、Ｒ’は水素または（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである）からなる群から選択される１または２個のヘテロ原子を所望により更に含んでいてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成しうるものであり；
Ａｒ１はアリールまたは５員もしくは６員ヘテロアリールであり、これは置換されていないか、または１〜３個の独立して選択されるハロ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）フルオロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシル、シアノ、ニトロ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）ＲまたはＣ（＝Ｏ）ＯＲで置換されている；
Ｈｅｔ１は単環式または二環式ヘテロアリールであり、これは置換されていないか、または１〜３個の独立して選択されるハロ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）フルオロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシル、シアノ、ニトロ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）ＲまたはＣ（＝Ｏ）ＯＲで置換されている］
の化合物またはその医薬上許容される塩の有効量を、癌に罹患した患者に投与することを含む、癌の治療方法。
【請求項４】
癌が、ＣＫ１δおよびβ−カテニンの両方の発現レベルのアップレギュレーションを示す癌である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
癌が乳癌、黒色腫、膠芽腫、髄芽腫、腎癌、膀胱癌もしくは結腸癌であり、または脳、肺もしくは骨に転移する癌であり、ただし、この場合、ＣＫ１δおよびβ−カテニン依存性の両方の上昇がそれらの転移性疾患に関与している、請求項３記載の方法。
【請求項６】
乳癌が三種陰性サブクラスの乳癌（ＴＮＢＣ）またはＨＥＲ＋  乳癌である、請求項４記載の方法。
【請求項７】
式（Ｉ）の化合物がＳＲ−３０２９
【化４】
2018538241.tif 000011
またはその医薬上許容される塩である、請求項３記載の方法。
【請求項８】
癌の治療のための、請求項１記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項９】
該化合物がＳＲ−３０２９
【化５】
2018538241.tif 000012
またはその医薬上許容される塩である、請求項８記載の化合物。
【請求項１０】
癌が乳癌、黒色腫、膠芽腫、髄芽腫、腎癌、膀胱癌もしくは結腸癌であり、または脳、肺もしくは骨に転移する癌であり、ただし、この場合、ＣＫ１δおよびβ−カテニン依存性の両方の上昇がそれらの転移性疾患に関与している、請求項８記載の化合物。
【請求項１１】
乳癌が三種陰性サブクラスの乳癌（ＴＮＢＣ）またはＨＥＲ＋  乳癌である、請求項１０記載の化合物。
【請求項１２】
患者におけるＣＫ１δのレベルおよびβ−カテニンのレベルを決定すること、ならびにそれらのレベルの両方が上昇している場合には、抗癌薬としてＣＫ１δインヒビターを選択することを含む、患者における癌の治療に有効な抗癌薬を特定する方法。
【請求項１３】
ＣＫ１δおよびβ−カテニンレベルの上昇が患者において存在するかどうかを決定すること、ならびに両方のレベルが上昇している場合には、治療レジメンのためにＣＫ１δインヒビターを選択することを含む、乳癌、黒色腫、膠芽腫、髄芽腫、または腎臓、膀胱もしくは結腸癌、または脳、肺もしくは骨に転移する癌の、患者における治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は乳癌におけるカゼインキナーゼ１δの治療標的化に関する。
【０００２】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１５年１０月１３日付け出願の米国仮特許出願第６２／２４０，６８９号（その開示の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）の優先権を主張するものである。
【０００３】
政府の援助の陳述
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）からのＣＡ１７５０９４に基づく米国政府の援助によってなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
乳癌は全ての癌診断の約４分の１を占め、世界中の女性の癌関連死の主要原因である（１，２）。現在、乳癌の治療選択は病理学的情報および組織学的等級ならびにエストロゲン（ＥＲ）、プロゲステロン（ＰＲ）および表皮増殖因子２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）受容体の発現状態に基づいており、この場合、受容体機能を阻止する標的化治療は全生存の改善をもたらしている（１，３）。実際、ＥＲおよび／またはＰＲの発現は良好な予後因子であり、内分泌療法からの利益に関する予測指標であり、ＨＥＲ２の過剰発現は有害な予後を暗示するが、患者は抗ＨＥＲ２標的化治療から大きな利益を得る（４，５）。
【０００５】
これとは対照的に、ＥＲおよびＰＲ受容体の非存在およびＨＥＲ２増幅の欠如により定義される三種陰性サブクラスの乳癌（ＴＮＢＣ）は標的化治療の選択肢を有さず、高侵襲性であり、予後不良を示す（６，７）。乳癌研究は標的化治療の臨床的利益を開拓し、強調しているが、無病生存期間を延長させ、癌患者の生活を改善するように標的化療法の開発を仕向けるためには、特にＴＮＢＣおよびＨＥＲ２乳癌に関する駆動因子および関連シグナル伝達経路の更なる特定が必要とされている。
【０００６】
カゼインキナーゼ１デルタ（ＣＫ１δ）およびイプシロン（ＣＫ１ε）は、概日リズム、膜輸送および細胞骨格を含む多様な細胞過程を調節することが知られている２つの非常に関連したセリン／トレオニンキナーゼであり、共に癌に関連づけられている（８〜１１）。例えば、ミリストイル化ＣＫ１εは乳房上皮細胞をインビトロでトランスフォームするのに十分であり、一方、ＣＫ１δのドミナントネガティブ突然変異体の発現はＳＶ４０誘導性乳房発癌をインビボで妨げる（１２）。キナーゼとして、ＣＫ１δおよびＣＫ１εは小分子薬物の発見に非常に容易に利用可能である。それにもかかわらず、ヒト癌へのこれらのキナーゼの寄与は十分には理解されておらず、既に報告されているＣＫ１δ／ＣＫ１εインヒビターの非選択的特性は抗癌標的としてのこれらのキナーゼの検証を妨げている（９，１３〜１５）。実際、ＣＫ１δ／ＣＫ１εの抑制に基づくと元々考えられていた薬理学的効果は、現在では、使用される非選択的インヒビターのオフターゲット作用によるものであることが公知である（１３，１６）。
【発明の概要】
【０００７】
概要
本発明は、種々の態様において、式（Ｉ）
【化１】
2018538241.tif 000003
【０００８】
［式中、
各Ｒは、独立して選択される水素もしくは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、または窒素原子に結合した２個のＲ基は該窒素原子と一緒になって、Ｏ、ＳおよびＮＲ’（ここで、Ｒ’は水素または（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである）からなる群から選択される１または２個のヘテロ原子を所望により更に含んでいてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成しうるものであり；
Ａｒ１はアリールまたは５員もしくは６員ヘテロアリールであり、これは置換されていないか、または１〜３個の独立して選択されるハロ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）フルオロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシル、シアノ、ニトロ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）ＲまたはＣ（＝Ｏ）ＯＲで置換されている；
Ｈｅｔ１は単環式または二環式ヘテロアリールであり、これは置換されていないか、または１〜３個の独立して選択されるハロ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）フルオロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシル、シアノ、ニトロ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）ＲまたはＣ（＝Ｏ）ＯＲで置換されている］
の化合物またはその医薬上許容される塩の有効な量または濃度とＣＫ１δを接触させることを含む、ＣＫ１δの阻害方法に関する。
【０００９】
種々の実施形態においては、本発明は、乳癌、黒色腫、膠芽腫、髄芽腫、腎癌、膀胱癌および結腸癌（これらに限定されるものではない）を含む癌の治療方法に関する。また、脳、肺、骨に転移する乳癌のような癌も、ＣＫ１δおよびβ−カテニン依存性の両方の上昇がそれらの転移性疾患に関与している限り、本発明者らのＣＫ１δインヒビターでの治療に適している。該治療方法は、それに罹患している患者に前記式（Ｉ）の化合物の有効量を投与することを含む。
【００１０】
より詳細には、式（Ｉ）の化合物は、
【化２】
2018538241.tif 000004
【００１１】
またはその医薬上許容される塩でありうる。
【００１２】
本発明は更に、ＣＫ１δインヒビターでの治療に特に感受性である癌は、ＣＫ１δおよびβ−カテニンの両方の発現レベルのアップレギュレーションを示す癌であることを開示する。したがって、種々の実施形態において、本発明は、患者におけるＣＫ１δのレベルおよびβ−カテニンのレベルを決定すること、ならびにそれらのレベルの両方が上昇している場合には、治療レジメンのためにＣＫ１δインヒビターを選択することを含む、患者における癌の治療に有効な抗癌薬を特定する方法を提供する。更に、本発明は、ＣＫ１δおよびβ−カテニンレベルの上昇が患者において存在するかどうかを決定すること、ならびに両方のレベルが上昇している場合には、治療レジメンのためにＣＫ１δインヒビターを選択することを含む、乳癌、黒色腫、膠芽腫、髄芽腫、または腎臓、膀胱もしくは結腸癌、または脳、肺もしくは骨に転移する癌の、患者における治療方法を提供する。
【００１３】
種々の実施形態においては、本発明は三種陰性サブクラスの乳癌（ＴＮＢＣ）の治療方法を提供する。他の実施形態においては、本発明はＨＥＲ＋  乳癌の治療方法を提供する。該方法は、該乳癌に罹患している患者に式（Ｉ）の化合物の有効量を投与することを含む。
【００１４】
詳細な説明
標的化治療の開発を導くためには、ヒトの癌の特異的駆動因子の特定が必要である。本発明において、本発明者らは、ＣＳＮＫ１Ｄがヒト乳房腫瘍において増幅され及び／又は過剰発現されること、ならびにＣＫ１δが、このキナーゼを過剰発現するヒト乳癌亜型の未開発の標的化可能体（ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ）であることを示す。特に、ＣＫ１δの選択的ノックダウンまたは社内の高選択的かつ強力なＣＫ１δインヒビターでの治療はエクスビボにおけるＣＫ１δ発現性乳房腫瘍細胞のアポトーシス、三種陰性乳癌の同所性モデル（患者由来の異種移植片を含む）における強力な腫瘍退縮およびＨＥＲ２＋  乳癌モデルにおける腫瘍増殖抑制を誘発する。特に、本発明者らは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達が、ＣＫ１δを過剰発現するヒト腫瘍の特徴であること、ＣＫ１δの無効化がβ−カテニンの核蓄積およびＴ細胞因子転写活性を阻止すること、ならびに構成的に活性なβ−カテニンがＣＫ１δの阻害またはサイレンシングの効果を無効にすることを示す。したがって、ＣＫ１δの阻害は、Ｗｎｔ／β−カテニンの関与を伴うヒト乳癌における標的化治療のための有望な戦略に相当する。
【００１５】
本発明者らは、乳癌における利用可能な標的化可能体としてのＣＫ１δおよび／またはＣＫ１εの機能的役割および潜在的臨床的関連性を評価することを試みた。ここにおいて、本発明者らは、ＣＫ１δが乳癌治療のための有望な標的であることを立証し、ＣＫ１δを過剰発現する乳癌亜型に対して有効である社内の選択的かつ強力な小分子インヒビターの有効性を示す。更に、本発明者らは、ＣＫ１δをコードする遺伝子であるＣＳＮＫ１Ｄが、主要乳癌亜型のそれぞれにわたって、ヒト乳癌のサブセットにおいて頻繁に増幅および／または過剰発現されること、ならびにＣＫ１δのノックダウンまたは阻害がＴＮＢＣおよびＨＥＲ２＋乳癌の患者由来異種移植片および乳癌細胞系同所性異種移植モデルにおいて乳癌退縮を引き起こすことを示す。特に、本発明者らのメカニズム研究は、ＣＫ１δ活性が、乳癌患者における予後不良と関連していることが知られている分子的表現型である、乳癌におけるＷｎｔ／β−カテニン経路活性化の決定的に重要な駆動因子であることを立証している。
【００１６】
本発明者らの結果は後記に更に詳細に記載されている。本発明者らの発明はカゼインキナーゼ１δ（ＣＫ１δ）の阻害方法を提供し、したがって、乳癌の治療方法を提供し、該方法は、例えば生きた患者の組織におけるＣＫ１δを有効量の式（Ｉ）の化合物、またはより詳細には、前記で示されている構造式を有するＳＲ−３０２９の化合物と接触させることを含む。
【００１７】
ＣＳＮＫ１Ｄはヒト乳癌のサブセットにおいて増幅および／または過剰発現される
ヒト乳癌におけるＣＫ１δおよびＣＫ１εの関与を評価するために、本発明者らは、正常乳腺組織と比較して、ヒト乳房腫瘍検体における各アイソフォームの発現を調べた。癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）データセットの解析は、浸潤性乳癌（図１Ａ）および独立したデータセットにおける、ＣＫ１δ（ＣＳＮＫ１Ｄ）の発現の高度な上昇を示した。４つの腫瘍乳癌亜型（Ｐａｍ５０固有分類）（１８）にわたるＣＫ１アイソフォーム発現の評価は、各主要クラスにわたる腫瘍のサブセット内でＣＫ１δが広範に過剰発現されることを示した（図１Ｂ）。これとは対照的に、ＣＫ１ε発現は、基底様サブクラスに、より限局されており（図１Ｂ）、浸潤性乳癌とは関連していない。顕著なことには、遺伝子コピー数分析（ＴＣＧＡ）は、ヒト乳房腫瘍の３分の１以上（３６％）でＣＳＮＫ１Ｄ遺伝子座を含む１７ｑ２５．３の増幅（高レベルおよび低レベル）を示しており、管腔Ｂおよび基底様クラスにおける増幅の、より高い頻度を示した。これとは対照的に、ＣＳＮＫ１Ｅ遺伝子座は乳癌において増幅されなかった（データ非表示）。特に、ＣＳＮＫ１Ｄコピー数はＣＫ１δ転写産物の発現と有意に相関しており（ｐ値＜０．０００１）、管腔Ａ腫瘍と比較してＨＥＲ２＋、基底様および管腔Ｂ亜型において相関の増大が認められる（図１ＣおよびＤ）。これらの知見と一致して、免疫組織化学的分析は、正常乳房組織と比較した場合のヒト乳房腫瘍検体におけるＣＫ１δの過剰発現を証明しており、ヒト乳癌細胞系のパネル全体にわたってＣＫ１δが過剰発現された（図１Ｅ）。これとは対照的に、高いＣＫ１ε発現は、分析された乳癌細胞系の僅か３つにおいて検出されたに過ぎず（図１Ｅ）、両方のＣＫ１アイソフォームの発現は不死ヒトＭＣＦ１０Ａ乳房上皮細胞ならびにＭＣＦ７およびＴ４７Ｄ  ＥＲ＋乳癌細胞においては低かった。
【００１８】
強力で高特異的なＣＫ１δ／ＣＫ１εインヒビターは乳癌細胞の増殖および生存を選択的に抑制する
本発明者らは最近、ＣＫ１δよびＣＫ１εの一連の小分子二重インヒビターの最初の構造活性相関を報告した（１６）。例えば、ＳＲ−３０２９（図１Ｆ）は、並外れた効力および選択性を有するＡＴＰ競合インヒビターであり、したがって、ＣＫ１δ／ＣＫ１ε生物学の理想的な小分子プローブである。細胞増殖アッセイは、ＣＫ１δを過剰発現する乳癌細胞型がＣＫ１δ／ＣＫ１ε阻害に対して極めて感受性であることを示しており、低いナノモル範囲（５〜７０ｎＭ）のＥＣ５０を示した。これとは対照的に、ＭＣＦ７およびＴ４７Ｄ乳癌細胞ならびにＭＣＦ１０Ａ細胞系（これらは全て、低レベルのＣＫ１δを発現した）はＳＲ−３０２９に対して２〜３桁低い感受性を示した（図１Ｇ）。ＣＫ１δを過剰発現する乳癌細胞に対するこの選択性はクローン原性増殖アッセイにおいて確認され、この場合、ＳＲ−３０２９はＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のクローン原性増殖および生存を完全に阻止したが、ＭＣＦ７乳癌細胞のコロニー形成能には全く影響を及ぼさなかった（図１Ｈ）。最後に、ＦＡＣＳ分析は、ＳＲ−３０２９での処理がＣＫ１δ過剰発現乳癌細胞の迅速なアポトーシスを選択的に誘発することを立証した（図１Ｉ）。
【００１９】
本発明者らは、ＳＲ−３０２９の抗癌作用がＣＫ１δおよび／またはＣＫ１εの標的上（オン・ターゲット）の阻害によるものであることを確認した。第１に、ＣＫ１δの強制的過剰発現は、ＧＦＰ発現対照と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＴＮＢＣ細胞のクローン原性増殖を増強し、ＳＲ−３０２９の増殖抑制効果をレスキューするのに十分であった（図１Ｊ）。第２に、ＣＫ１δおよびＣＫ１εの同時ノックダウンまたはＣＫ１δのみのサイレンシングはアポトーシスを誘発し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖を妨げた（図１Ｋ、Ｌ）。この効果は特異的であった。なぜなら、ｓｉＲＮＡ耐性ＣＫ１δ  ｃＤＮＡの発現はＣＫ１δサイレンシングの増殖抑制効果を有効にレスキューしたからである。特に、ＣＫ１εのみのノックダウンはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖および生存に全く影響を及ぼさなかった。最後に、本発明者らは、オフ・ターゲット（ｏｆｆ  ｔａｒｇｅｔ）効果が存在するかどうかを調べた。ＳＲ−３０２９はカイノームの僅か１％を阻害するに過ぎず、ＣＫ１δおよびＣＫ１εに加えて、僅か３つのキナーゼ（ＣＤＫ４、ＭＹＬＫ４およびＦＬＴ３）に対する、より弱いアフィニティを有する（１６）。これらのうち、ＦＬＴ３のみが、ＳＲ−３０２９、ならびにその近類似体であるＳＲ−２８９０およびＳＲ−１２７７の共通の（および弱い）オフ・ターゲットであり、これらは全て、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＴＮＢＣ細胞を含むヒト癌細胞に対する類似した抗増殖活性を示す（１６）。これとは対照的に、これらの細胞は、ＦＬＴ３およびＦＬＴ３突然変異体の低ナノモルインヒビターであるＡＣ２２０に対しては非感受性である。総合すると、これらの知見は、ある乳癌細胞の増殖および生存に必要とされる、ＳＲ−３０２９の生物学的に関連する標的としてのＣＫ１δを立証している。
【００２０】
ＣＫ１δのサイレンシングまたは阻害はインビボでの強力な抗腫瘍効果を誘発する
ＳＲ−３０２９は、インビボ試験に適した薬物動態学的特性を示す（１６）。したがって、本発明者らは前臨床腫瘍モデルにおいてＳＲ−３０２９の有効性を試験した。ホタルルシフェラーゼを発現するように操作されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＴＮＢＣ細胞を免疫不全ヌードマウスの乳房脂肪パッド内に移植し、７日後に処理を開始した。単一の物質として、ＳＲ−３０２９（２０ｍｇ／ｋｇ、毎日、腹腔内）は腫瘍増殖を著しく妨げた（図２Ａ、Ｂ）。実際、ＳＲ−３０２９療法を受けた被投与体の僅か２匹だけが腫瘍を発生し、これらは、ビヒクル処理マウスにおいて生じたものと比較してサイズが顕著に小さかった（図２Ｂ、Ｃ）。次に、同所性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＴＮＢＣ）、ＳＫＢＲ３およびＢＴ４７４（ＨＥＲ２＋）腫瘍異種移植片を、処理前に平均サイズ１００ｍｍ３に到達させた。ＳＲ−３０２９（２０ｍｇ／ｋｇ）の毎日のｉ．ｐ．投与は全ての異種移植モデルにおいて顕著な腫瘍増殖抑制を引き起こした（図２Ｄ）。特に、侵襲性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍の退縮は劇的なアポトーシス（図２Ｅ）および著しく延長した寿命（図２Ｆ）に関連づけられた。更に、体重、血液化学および組織完全性の組織化学的分析は、ＳＲ−３０２９の長期間の毎日の投与（４８日間）が、明白な毒性を伴うことなく良好に耐容されることを示した（図２Ｇ）。
【００２１】
インビボでの腫瘍増殖の抑制に対するＣＫ１δ阻害の効果を確認するために、ＣＫ１δに対するドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性ｓｈＲＮＡを安定に発現するようにＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を操作した（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｓｈＣＫ１δ）。エクスビボでのＤｏｘでのこれらの細胞の処理はＣＫ１δの効率的かつ選択的なノックダウンおよび迅速なアポトーシス／細胞増殖抑制をもたらし、この効果はｓｈＲＮＡ耐性ＣＫ１δの外因性発現によりレスキューされた（図３Ａ、Ｂ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｓｈＣＫ１δ腫瘍（＞１００ｍｍ３）の同所性異種移植片の確立の後、Ｄｏｘの投与およびＣＫ１δの誘導性ノックダウンは、ＳＲ−３０２９で得られた結果と合致して、腫瘍増殖の顕著な抑制をもたらした（図３Ｃ、Ｄ）。本発明者らはまた、初代患者由来異種移植（ＰＤＸ）モデルＢＣＭ−４０１３（ダサチニブおよびドセタキセルでの治療に対する限られた応答を示す侵襲性基底様浸潤性乳管癌）の増殖に対するＳＲ−３０２９の効果を評価した。特に、この安定して継代されたＰＤＸの組織学的および分子的プロファイリングは、治療への応答を含む該原発腫瘍の多数の特徴を再現する（１９）。
【００２２】
インビボでのＢＣＭ−４０１３  ＰＤＸモデルの増殖の後、同所性腫瘍を確立し、ＣＫ１δの発現に関して試験し（図３Ｅ）、有効性の試験を行った。細胞系モデルと合致して、ＳＲ−３０２９の投与（２０ｍｇ／ｋｇ、毎日、ｉ．ｐ．）はこれらのＰＤＸ腫瘍の増殖を有意に抑制し、腫瘍細胞アポトーシスを誘発した（図３Ｆ〜Ｈ）（ｐ＝０．０００２）。これらの研究は、ＣＫ１δ発現がＳＲ−３０２９に対する感受性を予測することを立証しており、ＣＫ１δが、ヒト疾患に対する潜在的関連性を有する有効な乳癌標的であることを示している。
【００２３】
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達はＣＫ１δ発現性乳癌の特徴である
ヒト乳癌においてＣＫ１δにより調節される経路を定め、ＣＫ１δ阻害に関する潜在的バイオマーカーを特定するために、ＴＣＧＡ患者の腫瘍データセットを、ＣＫ１δ過剰発現に関連した遺伝子シグネチャーに関して分析した。発現がＣＫ１δ発現と有意に相関している６１２個の遺伝子を特定した（変化倍数＞２、ｐ値＜０．０５）。インジェヌイティ・パスウェイ分析（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＩＰＡ）はカノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）Ｗｎｔ経路の遺伝子［Ｗｎｔ／β−カテニン標的（ＣＣＮＤ１）、Ｗｎｔ経路成分（ＦＺＤ９）および該経路の内因性モジュレーター（ＷＮＴ３、ＷＮＴ９ＡおよびＳＦＲＰ１）（分泌フリズルド（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）関連タンパク質１）を含む］との有意な重複を特定した（図４Ａ）。
【００２４】
重要なことに、活性化Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は不良な臨床成績と関連しているが、他の癌型に典型的な経路活性化突然変異は乳癌においては稀である（２０，２１）。これらの知見は、ＣＫ１δがヒト乳房腫瘍発生におけるＷｎｔ経路の重要なアクチベーターであること、およびこの経路により調節される遺伝子が、ＣＫ１δインヒビターの更なる前臨床開発および臨床開発に必要とされるバイオマーカーとして潜在的に有用でありうるという仮説を示唆した。
【００２５】
発生および疾患におけるＣＫ１δおよびＣＫ１εの役割はＷｎｔ依存的役割およびＷｎｔ非依存的役割の両方によるものと考えられている（１０，１５，２２，２３）。更に、カノニカルＷｎｔ／β−カテニン経路の活性化におけるＣＫ１δ／ＣＫ１εの必要性は細胞型およびコンテクスト特異性の両方に関して議論の的となっている（１３，２２）。したがって、本発明者らはＣＫ１δ発現性乳癌細胞におけるβ−カテニン活性に対するＣＫ１δ阻害の効果を評価した。Ｗｎｔシグナル伝達の活性化はβ−カテニンの安定化および核移行をもたらし、これは、ＴＣＦ／ＬＥＦ転写因子と共に、乳癌腫瘍発生に関連した下流標的遺伝子の発現を誘導する（２４〜２６）。ＳＲ−３０２９での（ＣＫ１δを過剰発現する）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＢＴ４７４乳癌細胞の処理はβ−カテニンの活性核プールの発現を顕著に低下させた（図４Ｂ）。更に、ＣＫ１δのノックダウンまたはＳＲ−３０２９での処理はβ−カテニンの非リン酸化活性型の減少をもたらし（ＡＢＣ、図４Ｃ）、内因性β−カテニン／ＴＣＦ転写活性を顕著に減少させた。これは、ＴＣＦ依存性ルシフェラーゼレポーターを安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において測定されるとおりである（図４Ｄ）。したがって、ＣＫ１δの選択的ノックダウンまたはＳＲ−３０２９による阻害は、ＣＣＮＤ１、ＭＹＣ、ＣＤ４４ならびにＷＮＴ３およびＷＮＴ９Ａ（これらは全て、ヒト腫瘍におけるＣＫ１δ発現に関連づけられた）を含む内因性β−カテニン／ＴＣＦ標的遺伝子の発現を抑制した（図４Ｅ、Ｆ）。更に、ＳＲ−３０２９での処理はまた、内因性ＷｎｔアンタゴニストＳＦＲＰ１の発現の顕著な増加をもたらしたが、乳癌病理発生に強く関与しているもう１つの経路であるＮｏｔｃｈ経路ｍＲＮＡ（ＪＡＧ１、ＮＵＭＢ、ＤＴＸ）には影響を及ぼさなかった（図４Ｇ）（２７）。
【００２６】
ＣＫ１δ／ＣＫ１εの阻害が、Ｗｎｔリガンドに応答してカノニカルＷｎｔシグナル伝達のスイッチを切るのに十分であるかどうかを試験するために、本発明者らは、ＴＣＦ依存性ルシフェラーゼレポーターを安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を作製した。予想どおり、ＳＲ−３０２９での処理またはＣＫ１δのノックダウンによりＴＣＦレポーターのＷｎｔ−３ａ特異的誘導が阻止された（図４ＨおよびＩ）。更に、β−カテニンの構成的に活性な（核）突然変異体（Ｓ３３Ｙ）（２８）の強制的発現はＴＣＦレポーター活性を増強し、これはＳＲ−３０２９の阻害効果に対して不応性であった（図４Ｉ）。したがって、ＣＫ１δの阻害は、ヒト乳癌細胞における活性化β−カテニンシグナル伝達およびカノニカルシグナル伝達による該経路のＷｎｔ誘導性活性化を阻止するのに十分である。
【００２７】
ＣＫ１δ阻害に感受性であるヒト乳癌細胞亜型の腫瘍化増殖に対するＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害の影響を評価するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞においてβ−カテニンｓｈＲＮＡを発現させた。これらの細胞型のそれぞれは高レベルの核β−カテニンを発現し（図４Ｊ）、持続的な細胞増殖および生存のためにはβ−カテニンに依存的であった（図４Ｋ）。逆に、核β−カテニンをほとんど乃至は全く発現しないＭＣＦ７細胞はβ−カテニンノックダウンに非感受性であり、これは、ＣＫ１δのその低い発現およびＳＲ−３０２９に対する相対的非感受性に合致している（図４Ｋ）。標的化ＣＫ１δの抗腫瘍活性におけるβ−カテニンシグナル伝達の阻害の役割をより直接的に評価するために、２つの構成的に活性なβ−カテニン突然変異体を使用した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＳＲ−３０２９またはＣＫ１δノックダウンのいずれかの増殖抑制効果およびアポトーシス効果をレスキューするためには、β−カテニン−Ｓ３３ＹまたはＮＨ２末端構成的活性突然変異体（β−カテニンＮ９０）の強制的発現で十分であった（図５Ａ、Ｂ）。したがって、ＣＫ１δは、乳癌細胞の増殖および生存に必要なβ−カテニン活性を制御する。
【００２８】
ＭＣＦ７  ＥＲ＋乳癌細胞は低レベルのＣＫ１δを発現し（図１Ｅ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と比べて低下した、活性（核）β−カテニンの発現を示し、ＳＲ−３０２９に対して不応性であり（図１Ｇ）、他のヒト乳癌細胞と比べて限定された腫瘍化能を有する（２９〜３１）。特に、ＣＫ１δを過剰発現するように操作されたＭＣＦ７細胞は核β−カテニン（図５Ｃ、Ｄ）および下流Ｗｎｔ標的遺伝子（ＣＣＮＤ１、ＣＤ４４、ＷＮＴ３およびＷＮＴ９Ａを含む）（図５Ｅ、Ｆ）の発現の増強を示した。更に、ＣＫ１δの強制的過剰発現はＭＣＦ７細胞のクローン原性増殖を増強し、短期および長期の両方の増殖アッセイにおいてそれをＳＲ−３０２９に対して感作する（図５Ｇ）。特に、β−カテニンのノックダウンは、外因性ＣＫ１δ駆動性ＭＣＦ７細胞増殖を阻害するのに十分であった（図５Ｈ）。このことはＣＫ１δの増殖促進活性におけるＷｎｔ／β−カテニン経路の決定的に重要なメカニズム的役割を証明している。
【００２９】
ＣＫ１δ阻害がＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達をインビボで妨げるかどうか、およびこの経路のモジュレーションが予測バイオマーカーに相当するかどうかを評価するために、２０ｍｇ／ｋｇのＳＲ−３０２９またはビヒクルで７日間処理（１日１回、ｉ．ｐ．投与）されたマウスから単離されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を活性化β−カテニンシグナル伝達のマーカーに関して分析した。ビヒクル処理対照と比較して、ＳＲ−３０２９処理マウス由来の腫瘍においては、核β−カテニンの発現が顕著に低下し（図６Ａ）、これはＣＣＮＤ１、ＷＮＴ３、ＷＮＴ９ＡおよびＲＡＲＡ  ｍＲＮＡ転写産物の減少ならびにＳＦＲＰ１転写産物の発現の顕著な増強に関連づけられた（図６Ｂ）。更に、ＳＲ−３０２９処理マウス由来の腫瘍およびＣＫ１δのＤｏｘ誘導性サイレンシングを受けた腫瘍においては、タンパク質レベルでＣＣＮＤ１のダウンレギュレーションが観察された（図６Ｃ）。最後に、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は再生組織のホメオスタシスにおいて中心的な役割を果たすことが知られているため、小腸の完全性に対する長期ＳＲ−３０２９治療の影響を評価した。注目すべきことに、ヘマトキシリン−エオジン染色は全体的な形態学的欠損を全く示さず、ＴＵＮＥＬ染色はアポトーシスの証拠を検出しなかった。これは、対応する腫瘍において観察されるものとは対照的であった（図２Ｅ）。
【００３０】
総合すると、これらの知見はＣＫ１δからβ−カテニンへの経路の活性化とＳＲ−３０２９に対する感受性との間の関連性を立証しており、この経路の特徴が、この標的化療法に応答する腫瘍を定めることを示唆した。特に、追加的なＴＣＧＡ癌データセットの分析は乳頭状腎細胞癌患者の７０％以上および膀胱癌患者の約５０％においてＣＳＮＫ１Ｄコピー数増幅（高および低）を示し、これらの腫瘍における遺伝子増幅はＣＫ１δ発現とも相関していた（図６Ｄ、Ｅ）。注目すべきことに、両方の癌型において、ＣＫ１δ遺伝子シグネチャーリストとＷｎｔ経路遺伝子との間に有意な重複が存在していた（ＣＫ１δ高対ＣＫ１δ低，ｐ＜０．０５，変化倍数１．５）（図６Ｆ）。したがって、ＣＫ１δからβ−カテニンへのシグナル伝達回路はヒト悪性疾患のスペクトルにわたる未開発の標的化可能体（ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ）でありうる。
【００３１】
ヒト乳癌の特異的駆動因子の特定はＨＥＲ２増幅乳癌の治療のためのトラスツズマブおよびＥＲ＋乳癌の治療のためのホルモン療法のような標的化療法の開発を導き、これらの標的化物質はこれらの疾患の生存および臨床的対応を改善した（３２）。これとは対照的に、再発性疾患を有する患者およびＴＮＢＣを有する患者は標的化療法を欠いており、満たされていない緊急の臨床的必要性を示している。本明細書に示されているデータは、ＣＫ１δを異常に発現するＨＥＲ２＋およびＴＮＢＣ乳癌患者にとって潜在的な利益となる、非常に魅力的な治療標的としてのＣＫ１δを示している。
【００３２】
これまでのところ、ヒト癌におけるＣＫ１δの役割は十分には理解されておらず、ＣＫ１δの従来の小分子モジュレーターは、ＣＫ１δを抗癌標的として検証するのに必要な効力および／または選択性を欠いている（９，１３〜１５，３３）。例えば、幾つかの研究において使用されたプローブ分子ＩＣ２６１は、ＣＫ１δ／ＣＫ１εの阻害によってではなく、むしろチューブリン機能の阻害によって作用することが後に示されている（１３）。更に、ＣＫ１δ／ＣＫ１ε二重インヒビターＰＦ６７０４６２を使用した研究は、それが抗癌活性が欠いていること（１３，１４）、およびこれが、アポトーシス促進活性を有する幾つかのものを含む複数のキナーゼに対する重要なオフ・ターゲット活性によるものでありうることを示している（１６）。これとは対照的に、本発明者らの小分子インヒビター（ＳＲ−３０２９）はヒト乳癌の複数の前臨床モデルにおいて非常に選択的であり、強力であり（１６）、有効である。更に、本発明者らの知見は、ＣＫ１δの過剰発現が、細胞に基づく乳癌モデルにおいて、ＳＲ−３０２９に対する感受性を予測することを示しており、これは、ＣＫ１δに対する依存性が細胞型およびコンテクスト特異的であることを示唆している。
【００３３】
ＣＫ１δの過剰発現は４つの主要乳癌亜型のそれぞれにわたって広範に広がっており、したがって、この標的化治療戦略に応答する腫瘍を特定しうる。この仮説を詳細に検討するためには、より広範な患者由来腫瘍サンプルにわたる更なる研究が必要である。
【００３４】
Ｗｎｔ経路の正（β−カテニン）および負（ＡＰＣ、ＡＸＩＮ１など）の調節成分における機能獲得および機能喪失突然変異はヒト癌において高頻度で広く存在している（（３４）に概説されている）。これとは対照的に、Ｗｎｔ経路の異常活性は乳癌において頻繁に見られるが（２１，３５，３６）、これらの悪性疾患におけるＷｎｔ経路成分における突然変異は稀である（２０，２１，３７）。ここで、本発明者らは、ヒト乳癌のＣＫ１δからβ−カテニンへのシグナル伝達がヒト乳癌の一部において活性化されることを示しており、この場合、β−カテニン活性を無効にし、乳癌細胞のアポトーシスを誘発するためには、ＣＫ１δのサイレンシングまたは薬理学的阻害で十分である。したがって、本発明者らの知見は、幾つかの乳癌亜型において現れる異常なＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を無効にするために（例えばＳＲ−３０２９により）利用されうる鍵標的キナーゼとしてのＣＫ１δを示している。これまでの報告は、ＣＫ１δが重要な役割を果たす幾つかの経路を記載している（２３，３３）。したがって、ＳＲ−３０２９の抗乳癌活性は明らかにＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を標的とするが、追加的なエフェクターがその実質的な抗腫瘍活性にインビボで寄与しうるであろう。
【００３５】
総合すると、本明細書に示されている知見は、選択された癌のサブセット（限定的なものではないが、乳癌を含む）における臨床的関連性に関する大きな可能性を有する有効な治療標的としてＣＫ１δを特定しており、ここで、ＣＫ１δは、（ｉ）増幅および／または過剰発現を介して活性化され、（ｉｉ）これらの腫瘍亜型におけるβ−カテニン活性の必要な駆動因子であり、（ｉｉｉ）ヒト乳癌の細胞および前臨床モデルの増殖および生存に必要である。
【００３６】
したがって、種々の態様において、本発明は、式（Ｉ）
【化３】
2018538241.tif 000005
【００３７】
［式中、
各Ｒは、独立して選択される水素もしくは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、または窒素原子に結合した２個のＲ基は該窒素原子と一緒になって、Ｏ、ＳおよびＮＲ’（ここで、Ｒ’は水素または（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである）からなる群から選択される１または２個のヘテロ原子を所望により更に含んでいてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成しうるものであり；
Ａｒ１はアリールまたは５員もしくは６員ヘテロアリールであり、これは置換されていないか、または１〜３個の独立して選択されるハロ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）フルオロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシル、シアノ、ニトロ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）ＲまたはＣ（＝Ｏ）ＯＲで置換されている；
Ｈｅｔ１は単環式または二環式ヘテロアリールであり、これは置換されていないか、または１〜３個の独立して選択されるハロ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）フルオロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシル、シアノ、ニトロ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）ＲまたはＣ（＝Ｏ）ＯＲで置換されている］
の化合物またはその医薬上許容される塩の有効な量または濃度とＣＫ１δを接触させることを含む、カゼインキナーゼ１δ（ＣＫ１δ）の阻害方法を提供しうる。
【００３８】
本発明は更に、種々の実施形態においては、式（Ｉ）
【化４】
2018538241.tif 000006
【００３９】
［式中、
各Ｒは、独立して選択される水素もしくは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、または窒素原子に結合した２個のＲ基は該窒素原子と一緒になって、Ｏ、ＳおよびＮＲ’（ここで、Ｒ’は水素または（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである）からなる群から選択される１または２個のヘテロ原子を所望により更に含んでいてもよい５〜７員ヘテロシクリルを形成しうるものであり；
Ａｒ１はアリールまたは５員もしくは６員ヘテロアリールであり、これは置換されていないか、または１〜３個の独立して選択されるハロ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）フルオロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシル、シアノ、ニトロ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）ＲまたはＣ（＝Ｏ）ＯＲで置換されている；
Ｈｅｔ１は単環式または二環式ヘテロアリールであり、これは置換されていないか、または１〜３個の独立して選択されるハロ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）フルオロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシル、シアノ、ニトロ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）ＲまたはＣ（＝Ｏ）ＯＲで置換されている］
の化合物またはその医薬上許容される塩の有効量を、癌に罹患した患者に投与することを含む、癌の治療方法を提供する。
【００４０】
例えば、式（Ｉ）の化合物は、
【化５】
2018538241.tif 000007
【００４１】
またはその医薬上許容される塩でありうる。
【００４２】
式（Ｉ）の化合物の有効量で治療されうる癌は、ＣＫ１δおよびβ−カテニンの両方の発現レベルのアップレギュレーションを示す癌でありうる。例えば、該癌は乳癌、黒色腫、膠芽腫、髄芽腫、腎癌、膀胱癌または結腸癌であることが可能であり、あるいは、脳、肺または骨に転移する癌であることが可能であり、ただし、この場合、ＣＫ１δおよびβ−カテニン依存性の両方の上昇がそれらの転移性疾患に関与している。例えば、乳癌は三種陰性サブクラスの乳癌（ＴＮＢＣ）であることが可能であり、あるいはＨＥＲ＋  乳癌である。
【００４３】
したがって、本発明は、癌の治療のための、請求項１記載の式（Ｉ）の化合物、例えばＳＲ−３０２９、またはその医薬上許容しうる塩を提供しうる。
【００４４】
式（Ｉ）の化合物の有効量で治療されうる癌は乳癌、黒色腫、膠芽腫、髄芽腫、腎癌、膀胱癌または結腸癌であることが可能であり、あるいは、脳、肺または骨に転移する癌であることが可能であり、ただし、この場合、ＣＫ１δおよびβ−カテニン依存性の両方の上昇がそれらの転移性疾患に関与している。例えば、乳癌は三種陰性サブクラスの乳癌（ＴＮＢＣ）であることが可能であり、あるいはＨＥＲ＋  乳癌である。
【００４５】
本発明は更に、ＣＫ１δインヒビターでの治療に特に感受性である癌がＣＫ１δおよびβ−カテニンの両方の発現レベルのアップレギュレーションを示す癌であることを開示する。したがって、種々の実施形態において、本発明は、患者におけるＣＫ１δのレベルおよびβ−カテニンのレベルを決定すること、ならびにそれらのレベルの両方が上昇している場合には、抗癌薬としてＣＫ１δインヒビターを選択することを含む、患者における癌の治療に有効な抗癌薬を特定する方法を提供する。更に、本発明は、ＣＫ１δおよびβ−カテニンレベルの上昇が患者において存在するかどうかを決定すること、ならびに両方のレベルが上昇している場合には、治療レジメンのためにＣＫ１δインヒビターを選択することを含む、乳癌、黒色腫、膠芽腫、髄芽腫、または腎臓、膀胱もしくは結腸癌、または脳、肺もしくは骨に転移する癌の、患者における治療方法を提供しうる。ＣＫ１δのレベルおよびβ−カテニンのレベルは、本明細書の開示内容と共に当技術分野における通常の技術および知識を用いて決定されうる。患者におけるＣＫ１δまたはβ−カテニンのレベルが「上昇している」とみなされるのは、身体組織におけるその濃度が同等患者における平均レベルより統計的に有意に高い場合である。
【００４６】
本明細書における意味における「治療する」または「治療」は、障害もしくは疾患に関連する症状の緩和、またはそれらの症状の更なる進行もしくは悪化の抑制、または疾患もしくは障害の予防もしくは防止、または疾患もしくは障害の治癒を意味する。同様に、本明細書中で用いる、本発明の化合物の「有効量」または「治療的有効量」は、障害もしくは状態に関連する症状を全体的もしくは部分的に緩和する、またはそれらの症状の更なる進行もしくは悪化を停止もしくは遅延させる、または障害もしくは状態を予防する若しくはその予防を提供する、該化合物の量を意味する。特に、「治療的有効量」は、所望の治療結果を達成するのに、必要な投与量および期間において、有効な量を意味する。治療的有効量はまた、本発明の化合物の任意の毒性効果または有害な効果よりも、治療上有益な効果が上回る量である。
【００４７】
「有効量」なる表現は、障害に罹患している個体への治療を示すために用いられる場合、個体の組織においてＣＫ１δを阻害するのに又はＣＫ１δに作用するのに有効である、本発明の化合物の量または濃度を意味し、ここで、ＣＫ１δは乳癌のような障害に関与しており、そのような阻害または他の作用は、有益な治療効果をもたらすのに十分な度合で生じる。
【００４８】
本明細書中で用いる、合成方法の文脈における「与えるのに適した条件下」または「与えるのに十分な条件下」などの語句は、反応生成物の有用な量または収率を与える、実験者が変化させるための通常の技術の範囲内である時間、温度、溶媒、反応物濃度などのような反応条件を意味する。所望の反応生成物が単離可能であり又は更に使用可能である限り、所望の反応生成物が唯一の反応生成物であること、または出発物質が完全に消費されることは必要とされない。本発明の実施において有用な化合物は、有機合成における通常の知識および技術と組合された文献方法に従い製造されうる。
【００４９】
特定の立体化学または異性体が特に示されていない限り、構造の全ての単一のエナンチオマー、ジアステレオマーおよびラセミ体が意図される。幾つかの例においては、具体的に特許請求されている化合物のなかの個々の立体異性体が記載されているが、立体化学の表示は、代替的異性体形態がそれほど好ましくない、望ましくない又は特許請求されていないことを意味しない。本発明において使用される化合物は、記載から明らかな任意のまたは全ての不斉原子における、任意の富化度で富化または分割された光学異性体を含みうる。ラセミおよびジアステレオマーの両混合物ならびに個々の光学異性体は、それらのエナンチオマーまたはジアステレオマー相手を実質的に含有しないように単離または合成されることが可能であり、これらは全て、本発明の範囲内である。
【００５０】
本明細書中で用いる「安定化合物」および「安定構造」なる語は、反応混合物からの有用な純度への単離および有効な治療剤への処方（製剤化）に耐えるのに十分な程度に頑強な化合物を示すと意図される。本明細書においては安定化合物のみが想定される。
【００５１】
ある基、例えばアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールなどにおける炭素原子の数が範囲として特定されている場合、炭素原子の数を表す個々の整数が意図される。例えば、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基という記載は、該アルキル基がメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、またはｔｅｒｔ−ブチルのいずれかでありうることを示す。炭素原子の数の特定は整数によるものでなければならないと理解される。
【００５２】
一般に、「置換」（「置換されている」）は、本明細書において定められている有機基において、それに含有される水素原子への１以上の結合が非水素原子への１以上の結合により置換されていることを意味し、該非水素原子としては、限定的なものではないが例えば以下のものが挙げられる：ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）；ヒドロキシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、オキソ（カルボニル）基、カルボン酸を含むカルボキシル基、カルボキシラートおよびカルボン酸エステルのような基における酸素原子；チオール基、アルキルおよびアリールスルフィド基、スルホキシド基、スルホン基、スルホニル基およびスルホンアミド基のような基における硫黄原子；アミン、ヒドロキシルアミン、ニトリル、ニトロ基、ニトロソ基、Ｎ−オキシド、ヒドラジド、アジドおよびエナミンのような基における窒素原子；ならびに種々の他の基における他のヘテロ原子。置換炭素（または他の）原子に結合可能な置換基の非限定的な例には、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ、ＣＮ、ＮＯ、ＮＯ２、ＯＮＯ２、アジド、ＣＦ３、ＯＣＦ３、Ｒ、Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオノ）、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ、Ｎ（Ｒ）２、ＳＲ、ＳＯＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２Ｎ（Ｒ）２、ＳＯ３Ｒ、Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｃ（Ｓ）Ｒ、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、（ＣＨ２）０−２Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、（ＣＨ２）０−２Ｎ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｎ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）ＣＯＮ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）ＳＯ２Ｒ、Ｎ（Ｒ）ＳＯ２Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（ＣＯＲ）ＣＯＲ、Ｎ（ＯＲ）Ｒ、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｒ）２、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＲ）Ｒ、またはＣ（＝ＮＯＲ）Ｒが含まれ、ここで、Ｒは水素または炭素系部分であることが可能であり、ここで、炭素系部分は、それ自体が更に置換されていることが可能であり、例えば、Ｒは水素、アルキル、アシル、シクロアルキル、アリール、アルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルであることが可能であり、ここで、任意のアルキル、アシル、シクロアルキル、アリール、アルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルは更に、独立して、前記で列挙されている官能基の一部もしくは全部で又は他の官能基で一置換または多置換されていることが可能であり、あるいは、ここで、窒素原子または隣接窒素原子に結合した２個のＲ基は該窒素原子の１以上と一緒になってヘテロシクリルを形成していることが可能であり、これは更に、前記で列挙されている官能基の一部もしくは全部で又は他の官能基で一置換されている、または独立して、多置換されていることが可能である。
【００５３】
種々の実施形態において、置換基はハロ、ニトロ、シアノ、ＯＲ、ＮＲ２またはＲであることが可能であり、あるいはＣ（Ｏ）ＯＲ、Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ２またはそれらのチオ／チオノ類似体であることが可能である。Ｏを含有する基に関する「そのチオ／チオノ類似体」は、該基における任意または全てのＯ原子がＳ原子により置換されうることを意味する。例えば、基Ｃ（Ｏ）ＯＲの場合、「そのチオ／チオノ類似体」はＣ（Ｓ）ＯＲ、Ｃ（Ｏ）ＳＲおよびＣ（Ｓ）ＳＲを含み、例えば、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２の場合、「そのチオ／チオノ類似体」はＳＣ（Ｏ）ＮＲ２、ＯＣ（Ｓ）ＮＲ２およびＳＣ（Ｓ）ＮＲ２を含む、などである。
【００５４】
種々の実施形態において、置換基はハロ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイル、（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイルオキシ、シアノ、ニトロ、アジド、Ｒ２Ｎ、Ｒ２ＮＣ（Ｏ）、Ｒ２ＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｒ２ＮＣ（Ｏ）ＮＲ、（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、（Ｃ６−Ｃ１０）アリールオキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アロイル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリールオキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリールオキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（３〜９員）ヘテロシクリル、（３〜９員）ヘテロシクリル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（３〜９員）ヘテロシクリル（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（５〜１０員）ヘテロアリール、（５〜１０員）ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（５〜１０員）ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシまたは（５〜１０員）ヘテロアロイルのいずれかでありうる。
【００５５】
アルキル基には、１〜約２０個の炭素原子、典型的には１〜１２個の炭素、または幾つかの実施形態においては１〜８個の炭素原子または１〜４個の炭素原子を有する直鎖および分枝炭素系基が含まれる。直鎖アルキル基の例には、１〜８個の炭素原子を有するもの、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチルおよびｎ−オクチル基が含まれる。分枝アルキル基の例には、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ネオペンチル、イソペンチルおよび２，２−ジメチルプロピル基が含まれるが、これらに限定されるものではない。本明細書中で用いる「アルキル」なる語は、ｎ−アルキル、イソアルキルおよびアンテイソアルキル基ならびにアルキルの他の分枝鎖形態を包含する。
【００５６】
「ハロ」または「ハロゲン」または「ハロゲン化物」なる語は、それ自体で又は別の置換基の一部として、特に示されていない限り、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子、好ましくはフッ素、塩素または臭素を意味する。
【００５７】
「フルオロアルキル」なる語はモノフルオロアルキル基およびポリフルオロアルキル基を含み、具体例はＣＦ３、Ｃ２Ｆ５などを含む。
【００５８】
「アルコキシ」または「アルコキシル」なる語は、アルキル基に連結された酸素原子を意味し、前記のシクロアルキル基を包含する。直鎖アルコキシ基の例には、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。分枝アルコキシの例には、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、イソペンチルオキシ、イソヘキシルオキシなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。典型的なアルコキシ基には、それぞれＣ１−６アルコキシおよびＣ２−６アルコキシと称される１〜６個または２〜６個の炭素原子のアルコキシ基が含まれるが、これらに限定されるものではない。典型的なアルコキシ基には、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
アリール基は、環内にヘテロ原子を含有しない環状芳香族炭化水素である。当技術分野でよく知られているとおり、芳香族化合物は、４ｎ＋２π電子（ここで、ｎは整数である）を含有する多重不飽和環系である。したがって、アリール基は単環系および多環系を含む。幾つかの実施形態においては、アリール基は、該基の環部分に約６〜約１４個の炭素を含有する。アリール基は、前記のとおり、非置換体または置換体でありうる。代表的な置換アリール基は一置換体または２回以上置換された置換体、例えば、２−、３−、４−、５−もしくは６−置換フェニルまたは２−８置換ナフチル基であることが可能であり、これらは炭素または非炭素基（例えば、前記のもの）で置換されうる。
【００６０】
ヘテロシクリル基または「ヘテロシクリル」なる語は、例えばＮ、ＯおよびＳ（これらに限定されるものではない）のようなヘテロ原子である１以上の環原子を含む３以上の環メンバーを含有する芳香族および非芳香族環化合物を含む。したがって、ヘテロシクリルはシクロヘテロアルキルまたはヘテロアリールであることが可能であり、あるいは多環式の場合には、それらの任意の組合せが可能である。幾つかの実施形態においては、ヘテロシクリル基は３〜約２０個の環メンバーを含み、他のそのような基は３〜約１５個の環メンバーを有する。
【００６１】
ヘテロアリール基は、例えばＮ、ＯおよびＳ（これらに限定されるものではない）のような１以上のヘテロ原子を含む５以上の環メンバーを含有する複素環式芳香環化合物である。例えば、ヘテロアリール環は５〜約８−１２個の環メンバーを有しうる。ヘテロアリール基は、芳香族電子構造を有する種々のヘテロシクリル基であり、それは、４ｎ＋２π電子（ここで、ｎは整数である）を含有する多重不飽和環系である。
【００６２】
「医薬上許容される塩」なる語は、医薬用途に有用な範囲内の毒性プロファイルを有する塩を意味する。それでも、医薬上許容されない塩が、例えば、高い結晶性のような特性を有する可能性があり、それは、本発明の実施における有用性、例えば、本発明の化合物の合成、精製または製剤化の方法における有用性を有する。「医薬上または薬理学的に許容される」は、動物またはヒトに適切に投与された場合に、有害な、アレルギー性の又は他の有害な反応をもたらさない分子実体および組成物を含む。ヒトへの投与の場合、製剤は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ基準により要求されている無菌性、発熱性、および一般的安全性および純度基準を満たすべきである。
【００６３】
ＣＫ１δの阻害における有効性に関して、および前記の又は科学文献で見出される方法を用いる種々の細胞アッセイにおいて、本明細書に開示および特許請求されている化合物を評価することは、通常の技術の範囲内である。したがって、当業者は、過度の実験を行うことなく、任意の特許請求されている化合物を製造し、評価することが可能である。
【００６４】
ＣＫ１δの有効なインヒビターであることが判明した任意の化合物が、投与量および治療レジメン（例えば乳癌の治療のためのもの）の選択を導く研究者の技術および経験を用いて、動物モデルおよびヒト臨床試験において同様に試験されうる。
【００６５】
本発明の方法の実施において使用される化合物は、本発明者の或る者による公開ＰＣＴ出願「ＷＥＥ１分解インヒビター（Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」，ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０２７７８４，ＷＯ２０１３／１３０４６１（その開示の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）の方法を含む文献方法に基づいて、合成有機化学の通常の知識および技術を用いて製造されうる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１：ＣＫ１δは、選択された乳癌亜型の臨床的に関連した有効な標的である。（Ａ）浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）と隣接正常組織との比較におけるＣＫ１δｍＲＮＡ発現（＊＊＊，ｐ＝６．７８ｅ−１５）。（Ｂ）ＲＮＡ−Ｓｅｑデータに基づくＰＡＭ５０乳癌亜型にわたるＣＫ１α１、ＣＫ１δおよびＣＫ１εの発現（ｎ＝９７２個の腫瘍サンプル、１１３個の正常固形組織）。Ｌｏｇ２正規化読取りカウント（ＲＳＥＭ）が示されている。（Ｃ）ＣＫ１δ発現に従いクラスター化された浸潤性乳癌におけるＣＳＮＫ１Ｄ  ＤＮＡコピー数分析（ｎ＝３０３）。ホモ接合欠失、単一コピー欠失、二倍体正常コピー、低レベルコピー数増幅または高レベルコピー数増幅を表す遺伝子レベルコピー数推定値（ＧＩＳＴＩＣ２閾値）、すなわち、−２、−１、０、１、２が示されている。（Ｄ）Ｌｏｇ２コピー数の値に対するＣＳＮＫ１Ｄ  Ｌｏｇ２  ｍＲＮＡ発現の散布図（９７２名の乳癌患者）。（Ｅ）示されている乳癌細胞系およびＭＣＦ１０Ａ乳房上皮細胞におけるＣＫ１δおよびＣＫ１εタンパク質発現。（Ｆ）ＳＲ−３０２９の化学構造。（Ｇ）示されている乳癌細胞系におけるＳＲ−３０２９の抗増殖能力。データはビヒクルに対する増殖率（％）としてプロットされている（ｎ＝６）。（Ｈ）ＳＲ−３０２９またはビヒクルの存在下の、示されている細胞のクローン原性増殖および生存（ｎ＝３；ｐ＝０．０００８）。（Ｉ）示されている用量のＳＲ−３０２９での７２時間の処理の後のＰＩ／アネキシンＶ  ＦＡＣＳによるアポトーシス率（％）（ｎ＝３；＊＊＊，左から右へ  ｐ＝０．０００７および０．０００１）。（Ｊ）左，ＣＫ１δまたはＧＦＰをＳＲ−３０２９の存在下または非存在下で過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のクローン原性増殖（ｎ＝３；＊＊＊，ｐ＝０．００１，＊＊，ｐ＝０．００３５）。右，４８時間における３０ｎＭ  ＳＲ−３０２９の存在下または非存在下のＣＫ１δ過剰発現を証明するウエスタンブロット。（Ｋ）非標的化（ＮＴ）またはＣＫ１δ  ｓｉＲＮＡでのＭＤＡ−ＭＢ−２３１のトランスフェクションの５日後、相対的増殖（左；ｎ＝３，ｓｉδ１；ｐ＝０．０１，ｓｉδ２；ｐ＝０．００３）および細胞死率（％）（トリパンブルー排除によるもの）を測定した（右；ｎ＝３，ｓｉδ１；ｐ＝０．０１，ｓｉδ２  ｐ＝０．０２７）。（Ｌ）ＣＫ１δのノックダウンを証明しているが、ＣＫ１εのノックダウンを証明していないｑＰＣＲデータおよびイムノブロット（ｎ＝３；＊＊＊，ｐ＜０．０００１）。
【図２】ＣＫ１δ／ＣＫ１εの阻害はインビボでの同所性乳房腫瘍増殖を妨げる。（Ａ）ＭＤ１−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ腫瘍の増殖および樹立に対するＣＫ１δ／ＣＫ１εインヒビターの効果を経時的に発光強度によりモニターした。マウスを２０ｍｇ／ｋｇのＳＲ−３０２９またはビヒクル（１０：１０：８０，ＤＭＳＯ：Ｔｗｅｅｎ−８０：水）で１日１回、腹腔内注射により処理した。矢印は治療の開始を示す（各コホートに関してｎ＝８，＊＊，ｐ＝０．０１）。（Ｂ）発光による腫瘍サイズおよび（Ｃ）総腫瘍サイズ（第５５日におけるもの）の比較。代表的な腫瘍が示されている。（Ｄ）前記のとおりビヒクル（黒線）またはＳＲ−３０２９（青線）で処理されたマウスにおける、示されているＴＮＢＣ腫瘍モデルの増殖曲線。矢印は初回投与の時機を示す（各コホートに関してｎ＝８〜１０；＊＊，ｐ＝０．０１；＊＊＊，ｐ＝０．０００８）。（Ｅ）ビヒクルおよびＳＲ−３０２９で処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍の連続切片上のＴＵＮＥＬ染色（代表的なイメージが示されている）（白線スケール＝２００μｍ）。（Ｆ）（Ｄ）において示されている研究に対応するカプラン−マイヤー生存曲線（ｐ値は、対数順位検定を用いて計算された）。（Ｇ）ＳＲ−３０２９（青線）またはビヒクル（黒線）で毎日処理されたマウスの体重を８週間追跡した（ｎ＝８〜１０）。
【図３】ＣＫ１δのサイレンシングまたは阻害は乳房腫瘍退縮を誘発し、ＰＤＸ乳房モデルの成長を効率的に阻止する。（Ａ）左，ｑＰＣＲデータであり、これは、Ｄｏｘ（０．３μｇ／ｍｌ）でのＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｓｈＣＫ１δ発現細胞の処理の後のＣＫ１δの効率的なノックダウンを証明しているが、ＣＫ１ε転写産物のそれは証明していない（ｎ＝３；＊＊＊，ｐ＝０．０００３）。右，対応するＣＫ１δタンパク質発現。（Ｂ）Ｄｏｘ誘導性ＣＫ１δまたは非標的化（ＮＴ）ｓｈＲＮＡを発現する細胞を１μｇ／ｍｌ  Ｄｏｘで７２時間処理し、ｓｈＲＮＡに抵抗性である、ＣＫ１δまたはＧＦＰ  ｃＤＮＡを発現するベクターでトランスフェクトした。更に７２時間の後、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｓｈＣＫ１δ（黒色）および非標的化ｓｈＲＮＡを発現する細胞（ＮＴ−  白色）において、トリパンブルー排除により細胞死率（％）を測定した（ｎ＝４；＊＊＊，ｐ＝０．０００１）。（Ｃ）Ｄｏｘ（固形飼料中で自由摂取で投与される；２００ｍｇ／ｋｇ）の存在下または非存在下のマウスにおける同所性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｓｈＣＫ１δ腫瘍の成長をキャリパー測定でモニターした（各コホートに関してｎ＝８，＊＊，ｐ＝０．００６）。矢印はＤｏｘの添加を示す。（Ｄ）Ｄｏｘ投与の開始の７日後の３匹の独立したマウスから単離された腫瘍組織におけるＣＫ１δノックダウン。（Ｅ）ヒト正常乳房または３つの独立したＢＭＣ−４０１３  ＰＤＸ腫瘍の抽出物におけるＣＫ１δ発現を比較する免疫ブロット。（Ｆ）ビヒクル（黒線）またはＳＲ−３０２９（青線）で処理されたマウスにおけるＢＣＭ−４０１３  ＰＤＸ腫瘍の増殖曲線。矢印は初回投与の時機を示す（各コホートに関してｎ＝１２；＊＊＊，ｐ＝０．０００２）。（Ｇ）（Ｆ）において示されている研究に対応するカプラン−マイヤー生存曲線（ｐ値は、対数順位検定を用いて計算された）。（Ｈ）ビヒクルおよびＳＲ−３０２９で処理されたＢＭＣ−４０１３腫瘍の連続切片上のＴＵＮＥＬ染色（代表的なイメージが示されている）（白線スケール＝２００μｍ）。
【図４】Ｗｎｔ／β−カテニン経路のモジュレーションはＣＫ１δの活性および阻害に関するバイオマーカーである。（Ａ）ＣＫ１δを過剰発現するヒト乳房腫瘍において有意に富むＷｎｔ経路遺伝子（変化倍数＞２、ｐ値＜０．０５）（赤色はＣＫ１δ遺伝子）。（Ｂ）示されている乳癌細胞系における核β−カテニンおよび細胞質β−カテニンに対するＳＲ−３０２９（＋）またはビヒクル（−）処理（１８時間、３０ｎＭ）の効果の比較。（Ｃ）ＳＲ−３０２９もしくはビヒクルでの１８時間の処理の後またはＣＫ１δ  ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションの後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（４８時間の時点で集められた）における活性β−カテニン（ＡＢＣ）の発現。（Ｄ）示されているｓｈＲＮＡの発現を活性化するための１μｇ／ｍｌ  Ｄｏｘでの５日間の処理の後の又は漸増用量のＳＲ−３０２９で６時間処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＴＣＦ依存性ルシフェラーゼ活性の阻害（ｎ＝３；＊，ｐ＝０．０１３；＊＊＊，ｐ＝０．０００２）。（Ｅ）示されているタンパク質の発現、および（Ｆ）ｍＲＮＡに関する、それぞれ免疫ブロットまたはｑＰＣＲによる、ＣＫ１δの阻害（左，１００ｎＭ  ＳＲ−３０２９での２４時間の処理）またはノックダウン（右，トランスフェクションの４８時間後）の効果（ｎ＝３）。（Ｇ）１００ｎＭ  ＳＲ−３０２９での処理の２４時間後の、示されているｍＲＮＡの発現（ｎ＝３；＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊＊，ｐ＜０．００１；ＳＦＲＰ１  ｐ＝０．０００３；ＷＮＴ３  ｐ＝０．００１；ＷＮＴ９Ａ  ｐ＝０．０００７；ＭＹＣ  ｐ＝０．０２７１；ＣＣＮＤ１  ｐ＝０．００５４；ＣＤ４４  ｐ＝０．００７１）。（Ｈ）ＣＫ１δ  ｓｈＲＮＡ発現（＋／−  １μｇ／ｍｌ  Ｄｏｘで７２時間）およびそれに続く１μｇ／ｍｌ  Ｗｎｔ−３ａでの３時間の処理の存在下または非存在下のＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＴＣＦ依存性ルシフェラーゼ活性（＊＊＊，ｐ＝７．２３Ｅ−０５および５．５７Ｅ−０６、左から右へ）。（Ｉ）ＴＣＦ依存性ルシフェラーゼレポーターを安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、対照ベクターまたはβ−カテニンの構成的に活性な（核）突然変異体（Ｓ３３Ｙ）でトランスフェクトし、ＳＲ−３０２９の存在下または非存在下で一晩インキュベートした後、組換えＷｎｔ−３ａを加えた（３時間）（３つの独立した実験の代表例が示されている；＊＊＊，ｐ＝０．０００４（左）および０．０００２（右））。（Ｊ）ＡＢＣ発現に関する免疫染色（白線スケール＝２００μｍ）。（Ｋ）非標的化（ＮＴ）またはβ−カテニンｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスによる、示されている細胞系の感染の４日後の相対的増殖（ｎ＝３；左から右へ；＊，ｐ＝０．０５，＊＊＊，ｐ＝０．０００９，＊＊＊，ｐ＝０．００１，＊＊＊，ｐ＝０．００１）および対応するウェスタンブロット（右パネル）。
【図５】ＣＫ１δはヒト乳癌におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の必要かつ十分な駆動因子である。（Ａ）空ベクターまたはβ−カテニン−Ｓ３３ＹでトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞においてＳＲ−３０２９の存在下または非存在下の７２時間後に測定された細胞増殖（左）およびアポトーシス（右）（ｎ＝４；＊，ｐ＝０．０５）。（Ｂ）Ｄｏｘ（４日間、１μｇ／ｍｌ）で処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｓｈＣＫ１δ細胞を空ベクターまたはβ−カテニン−Ｓ３３Ｙでトランスフェクトし、７２時間後に細胞数を測定した（ｎ＝３；＊＊＊，ｐ＝０．００１）。（Ｃ）ＣＫ１δまたはＧＦＰを過剰発現するように操作されたＭＣＦ７細胞における核および細胞質β−カテニンの発現。下，ヒストンＨ４に対して正規化された核β−カテニン発現の定量（ｎ＝３；＊，ｐ＝０．０２）。（Ｄ）ＣＫ１δまたはＧＦＰを過剰発現するＭＣＦ７細胞におけるＡＢＣに関する免疫染色（白線スケール＝２００μｍ）。（Ｅ）ＭＣＦ７−ＣＫ１δ細胞およびＭＣＦ７−ＧＦＰ細胞におけるβ−カテニン標的のｑＰＣＲ分析の比較（ｎ＝３；＊＊，ｐ＝０．０１；＊＊＊，ｐ＝０．００１）。（Ｆ）ＣＫ１δの過剰発現およびサイクリンＤ１の増加を証明する免疫ブロット。（Ｇ）ＣＫ１δを過剰発現するＭＣＦ７細胞およびＧＦＰを過剰発現するＭＣＦ７細胞のクローン原性増殖に対するＳＲ−３０２９の効果の比較（ｎ＝６；左から右へ；＊＊，ｐ＝０．０１，＊＊，ｐ＝０．００２）。（Ｈ）β−カテニンｓｈＲＮＡレンチウィルスによる感染の４日後のＭＣＦ７−ＣＫ１δおよびＭＣＦ７−ＧＦＰ細胞の増殖（ｎ＝３，左から右へ；＊＊＊，ｐ＝０．０００６；＊＊，ｐ＝０．００４，＊＊，ｐ＝０．００１）。右パネル，ＣＫ１δの過剰発現およびβ−カテニンのノックダウンを示す免疫ブロット。
【図６】ＣＫ１δはインビボでのＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の駆動因子である。２０ｍｇ／ｋｇ  ＳＲ−３０２９またはビヒクルで７日間毎日処理されたマウスからのＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍における、（Ａ）核および細胞質β−カテニンの発現の比較、ならびに（Ｂ）示されているｍＲＮＡの発現の比較（ｎ＝４；＊，ｐ＝０．０５；＊＊，ｐ＝０．０１；＊＊＊，ｐ＝０．００１）。（Ｃ）第７日における腫瘍のサイクリン−Ｄ１タンパク質発現に対するＳＲ−３０２９の効果。右パネルは定量である（ｎ＝３；＊＊，ｐ＝０．０１）。（Ｄ）腎乳頭細胞癌（腎乳頭）および膀胱癌腫瘍におけるＣＳＮＫ１Ｄコピー数増幅（ＴＣＧＡ）の頻度（ＴＣＧＡ）。（Ｅ）腎乳頭細胞癌（ｎ＝１７２）および膀胱癌（ｎ＝２２０）におけるＣＳＮＫ１Ｄ  ＤＮＡコピー数とＣＫ１δ発現との相関。（Ｆ）示されている癌型に関する、Ｗｎｔ／β−カテニン経路遺伝子とＣＫ１δシグネチャーリストとの間の有意な重複を示す−ｌｏｇ１０ｐ値（ｐ＜０．０５，変化倍数＞１．５）（赤線は有意性の閾値である，ｐ＝０．０５）。
【００６７】
実施例
研究設計
この研究は、ヒト乳癌におけるＣＫ１δおよびＣＫ１εの関与を評価するために、ならびにヒト乳癌の前臨床モデルにおける社内の高特異的二重ＣＫ１δ／ＣＫ１εインヒビターの有効性を研究するために設計された。５つのヒト同所性乳房異種移植モデル、薬理学的および遺伝学的研究を用いて、このキナーゼを過剰発現する乳癌のサブセットにおける標的化ＣＫ１δを検証した。検出力分析は、９０％の信頼度に関する各群内の腫瘍体積の標準偏差および群間の腫瘍体積の差異に基づいて、少なくとも７以上のｎが必要であることを示唆した。したがって、本発明者らの実験は実験または対照（ビヒクル）コホート当たり７〜１２匹の腫瘍担持マウスを含み、ここで、コホート間の腫瘍サイズ中央値が同じになるように無作為サンプリングを決定するために、マウスは処理（治療）前に無作為化された。全ての腫瘍サイズは実験期間を通して測定され、いずれのサンプルをも除外することなく図面においてグラフ化された。生存分析のために、マウスを、瀕死状態になったとき、および／または腫瘍が潰瘍化し若しくは１．２ｃｍ３以上に達したときに、安楽死させた。細胞に基づく全てのアッセイは三重重複で行い、少なくとも３回反復した。
【００６８】
マウスの異種移植腫瘍モデルおよび生物発光イメージング
全ての動物実験はＳｃｒｉｐｐｓ  Ｆｌｏｒｉｄａ  ＩＡＣＵＣにより承認されている。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｌｕｃ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＳＫＢＲ３またはＢＴ４７４細胞の安定プールを、６週齢雌無胸腺ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の乳房脂肪パッド内への２×１０６個の癌細胞の注射により確立した。ＢＣＭ−４０１３患者由来異種移植片の確立は記載どおりであった（１９）。簡潔に説明すると、新鮮な異種移植腫瘍断片（〜約１ｍｍ３）をレシピエントＳＣＩＤ／Ｂｇマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の透明化乳房脂肪パッド内に移植した。毎日のｉ．ｐ．注射により２０ｍｇ／ｋｇのＳＲ−３０２９またはビヒクル（１０：１０：８０，ＤＭＳＯ：Ｔｗｅｅｎ−８０：水）でマウスを処理した。ルシフェリン（１５ｍｇ／ｍｌ，Ｇｏｌｄｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の皮下注射の後、キャリパーを使用して、またはＩＶＩＳ  １００イメージャ（露出時間，１〜６０秒；ビンニング８；視野１５ｃｍ；絞り値１；オープンフィルター）を使用する発光イメージングにより、示されている間隔で腫瘍体積を測定した。Ｌｉｖｉｎｇ−Ｉｍａｇｅ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）分析ソフトウェアを使用して、腫瘍関心領域（ＲＯＩ）から平均放射輝度（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）を決定した。
【００６９】
細胞増殖およびクローン原性アッセイ
ＳＲ−３０２９またはビヒクル処理の７２時間後、Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の指示に従い使用して、細胞増殖を測定した。非線形回帰および４パラメータアルゴリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５）を使用して、ＥＣ５０値を決定した。クローン原性アッセイのために、６ウェルディッシュ内で５００〜１０００細胞／ウェルの密度で三重に細胞をプレーティングした。一晩のインキュベーションの後、ＳＲ−３０２９またはビヒクル（ＤＭＳＯ）を培地に７２時間加え、細胞を７〜１０日間増殖させ、その間に化合物の非存在下で２〜３日ごとに培地を交換した。コロニーを４％  パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で固定し、５０％  エタノール中の０．５％  メチレンブルーで室温で１時間染色し、水で脱染色した。低倍率光学顕微鏡を使用して、５０個を超える細胞を有するコロニーを計数した。
【００７０】
試薬、細胞系およびトランスフェクション
特に示されていない限り、全ての化学物質はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＨＳ５７８Ｔ、ＢＴ４７４、ＳＫＢＲ３、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＣＦ７およびＴ４７Ｄ乳癌細胞ならびに不死ＭＣＦ−１０Ａ乳房上皮細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）からのものであった。ＣＫ１δおよびＣＫ１εのノックダウンのために、ｓｉＲＮＡ二本鎖を製造業者の説明（Ｑｉａｇｅｎ）に従い調製し、特異的ノックダウン条件を、ＨｉＰｅｒｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して最適化した。２０ｎＭ  全ｓｉＲＮＡの最終濃度を用いてノックダウンを達成した。ＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を、製造業者の説明に従い、ＤＮＡトランスフェクションに使用した。
【００７１】
レンチウイルス・トランスダクション
ＣＫ１δ（Ｙ３９８９−Ｌｖ１０５−０２００，ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ）、ＧＦＰ（ＥＧＦＰ−Ｌｖ１０５−０２００，ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ）、ルシフェラーゼまたはＴＣＦレポーター７ＴＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｒｏｅｌ  Ｎｕｓｓｅ）を発現するレンチウイルスベクターをｐＰＡＣＫＨ１パッケージングプラスミドと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトして、製造業者の推奨（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従いレンチウイルス粒子を得た。特定のｓｈＲＮＡを安定に発現させるために、推奨プロトコール（３８）に従い、ｓｈＲＮＡオリゴヌクレオチドをＴｅｔ−ｐＬＫＯ−Ｐｕｒｏベクター内にクローニングし、Ｍｉｓｓｉｏｎ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｇｍａ）を使用してレンチウイルスを作製した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を最適化力価のレンチウイルスでトランスダクションし、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）またはブラスチシジン（ルシフェラーゼレンチウイルスの場合には５μｇ／ｍｌ）を含有する培地内で選択して、安定感染プールを増殖させた。
【００７２】
免疫ブロット法
ＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を行い、トランス−ブロットトランスファー媒体（Ｂｉｏｒａｄ）を使用する半乾燥トランスファーによりＰＶＤＦ膜に移した。膜をＯｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファー（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中でブロッキングし、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴ（２０ｍＭ  トリス，ｐＨ７．６，１４０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）での反復洗浄の後、ブロットを適切なＩＲＤｙｅ結合二次抗体（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共にインキュベートし、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙを使用してイメージングした。Ｏｄｙｓｓｅｙソフトウェア（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してバンドを定量した。この研究においては以下の抗体を使用した：ＣＫ１δおよびＨｉｓｔｏｎｅ  Ｈ４（Ａｂｃａｍ）、ＣＫ１ε、ｃ−Ｍｙｃ（９Ｅ１０）、サイクリン−Ｄ１およびβ−アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、β−カテニン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＧＡＰＤＨ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびＣＤ４４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。
【００７３】
定量的リアルタイムＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを得、１〜２μｇのＲＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で逆転写した。Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＡＢＩ７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、定量的ＰＣＲを行った。ΔΔＣｔ法を用いてＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現に対して正規化することにより得られた各関心遺伝子に関する相対発現値およびＰｒｉｍｅｒ３アルゴリズムを使用して、イントロンにわたる遺伝子特異的プライマーペアを設計した。
【００７４】
免疫細胞化学およびＨ＆Ｅ染色
凍結切片におけるアポトーシス検出のために、腫瘍および小腸を１０％  緩衝化ホルマリン中で２時間固定し、２０％  スクロース中で一晩インキュベートし、ＯＣＴ中で包埋した。凍結切片（５μＭ）をマウントし、ＡｐｏｐＴａｇ  Ｒｅｄ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｋｉｔを製造業者の説明（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）に従い使用して染色した。Ｈ＆Ｅ染色のために、組織を１０％  緩衝化ホルマリン中で４８時間固定し、７０％  エタノール／ＰＢＳに移し、パラフィン中で包埋した。脱パラフィン（ＡＭＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）後、５μＭ  切片上で染色を行った。
【００７５】
フローサイトメトリー
６ウェルディッシュ内に三重重複で播かれた２×１０５個の細胞をＳＲ−３０２９またはビヒクルと共に７２時間培養した。ついで細胞を回収し、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を製造業者の説明に従い使用してアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＰＩで染色し、ＬＳＲＩ  ＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）使用して分析した。スタウロスポリン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）処理細胞（１μＭ）を陽性／補正対照として使用した。
【００７６】
ＴＣＦレポーターアッセイ
ＴＣＦルシフェラーゼレポーター７ＴＦＰ（３９）を安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＨＥＫ２９３細胞をβ−カテニン−Ｓ３３Ｙまたは空ベクター（ｐｃＤＮＡ）でトランスフェクトした。１８時間後、細胞を６０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート上に播いた。２４時間後、細胞をＳＲ−３０２９またはビヒクルで処理し、６時間インキュベートした後、１μｇ／ｍｌ  組換えヒトＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＰＢＳを加えた。３時間後、ＢｒｉｔｅＬｉｔｅ  Ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）（これは等体積で培地に直接添加された）を使用してレポーターアッセイを行い、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して発光を読取った。
【００７７】
バイオインフォマティクス分析
癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）データ検索；乳癌（ＢＲＣＡ）、腎乳頭状細胞癌（ＫＩＲＣ）および膀胱癌（ＢＬＣＡ）遺伝子発現およびコピー数データセットをＴＣＧＡポータル（ｈｔｔｐ：／／ｔｃｇａ−ｄａｔａ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）からダウンロードした。発現プロファイリングのために、ＲＮＡＳｅｑＶ２プラットフォームからの２０，４７５遺伝子のレベル３発現データをダウンロードした。
【００７８】
遺伝子発現プロファイリング分析のために、期待値最大化（ＲＳＥＭ）正規化カウントによるＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）を用いて、ＴＣＧＡ乳癌データセットからのＲＮＡＳｅｑＶ２データに関する遺伝子発現推定を分析した。Ｌｏｇ２正規化カウントをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ  Ｖ１２．１（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内にインポートした。各データセット（９１９個の乳房、２２８個の腎臓および２６０個の膀胱癌サンプル）に関する全サンプルの中央値としてベースライン変換を設定した。
【００７９】
ＣＫ１δ遺伝子シグネチャーリストを特定するために、上方の１００個および下方の１００個の乳房腫瘍サンプル（ＣＫ１δ−高群およびＣＫ１δ−低群）または上部および下部四分位（より小さいデータセットに関するもの）（腎癌および膀胱癌）を、ＣＫ１δ（ＣＳＮＫ１Ｄ）発現に基づいて定めた。２０，５０１個の遺伝子のうち、少なくとも１つのサンプルにおける中央値より高い発現を示す遺伝子のみを下流分析のためにフィルターした。ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  Ｖｏｌｃａｎｏ  Ｐｌｏｔ機能を使用して、ＣＫ１δ高およびＣＫ１δ低群間の差次的発現遺伝子を特定した。統計的検定パラメーターを以下のとおりに設定した：選択された検定、独立ｔ検定；ｐ値計算、漸近的多重検定補正、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ。補正ｐ値カットオフを０．０５に設定した。変化倍数カットオフは、本文中に示されているとおりであった。はテキストに示された通りであった。
【００８０】
ヒートマップを作製するために、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ階層クラスタリングアルゴリズムを使用した。類似尺度はピアーソン中心に設定し、リンケージ規則は平均に設定した。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、乳癌データセットにおけるＣＫ１δ遺伝子シグネチャーとの重複を有するカノニカル経路を同定した。有意性に関してはフィッシャー直接検定を用いた（ｐ値＜０．０５）。追加的癌データセットの分析のために、ＩＰＡ  Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達遺伝子（１７２個の遺伝子）のリストをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ内にインポートし、ＣＫ１δシグネチャーリストとの重複のｐ値を、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア（重複確率の式）を使用して計算した。
【００８１】
コピー数分析、ＴＣＧＡ  ＲＮＡ−ｓｅｑおよびＧＩＳＴＩＣ２閾値化コピー数データを、ＣＳＮＫ１Ｄ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ発現に基づいて処理した。相関を確認するために、ｌｏｇ２  ｍＲＮＡ発現およびｌｏｇ２  コピー数値に基づいて、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６において散布図を作成した（４０）。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を使用して、ピアソンｒおよびｐ値を計算した。
【００８２】
統計分析
特に示されていない限り、図面における全ての値は平均±ＳＥとして示されている。生存曲線は、カプラン−マイヤー法を用いて計算し、曲線間の差は、対数順位検定により決定した。相関係数は、ピアソン検定を用いて計算した。バイオインフォマティクス分析に関する詳細な情報は前記に示されている。全ての他の実験は、エクセルまたはプリズムにおいてスチューデント両側ｔ検定を用いて分析した。ここで、０．０５以下のｐ値が有意だとみなされた。
【００８３】
引用文書：
１．  Ｅ．Ａ．Ｒａｋｈａ，Ｊ．Ｓ．Ｒｅｉｓ−Ｆｉｌｈｏ，Ｆ．Ｂａｅｈｎｅｒ，Ｄ．Ｊ．Ｄａｂｂｓ，Ｔ．Ｄｅｃｋｅｒ，Ｖ．Ｅｕｓｅｂｉ，Ｓ．Ｂ．Ｆｏｘ，Ｓ．Ｉｃｈｉｈａｒａ，Ｊ．Ｊａｃｑｕｅｍｉｅｒ，Ｓ．Ｒ．Ｌａｋｈａｎｉ，Ｊ．Ｐａｌａｃｉｏｓ，Ａ．Ｌ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．Ｓｃｈｎｉｔｔ，Ｆ．Ｃ．Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｐ．Ｈ．Ｔａｎ，Ｇ．Ｍ．Ｔｓｅ，Ｓ．Ｂａｄｖｅ，Ｉ．Ｏ．Ｅｌｌｉｓ，Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｒａ：ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｇｒａｄｅ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２，２０７（２０１０）１０．１１８６／ｂｃｒ２６０７）．
２．  Ｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｏｒｔｒａｉｔｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｕｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４９０，６１−７０（２０１２）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＯｃｔ  ４（１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１４１２）．
３．  Ｒ．Ｓｉｅｇｅｌ，Ｊ．Ｍａ，Ｚ．Ｚｏｕ，Ａ．Ｊｅｍａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２０１４．ＣＡ：ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ  ６４，９−２９（２０１４）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＪａｎ−Ｆｅｂ（１０．３３２２／ｃａａｃ．２１２０８）．
４．  Ｆ．Ａｎｄｒｅ，Ｋ．Ｓｌｉｍａｎｅ，Ｔ．Ｂａｃｈｅｌｏｔ，Ａ．Ｄｕｎａｎｔ，Ｍ．Ｎａｍｅｒ，Ａ．Ｂａｒｒｅｌｉｅｒ，Ｏ．Ｋａｂｂａｊ，Ｊ．Ｐ．Ｓｐａｎｏ，Ｈ．Ｍａｒｓｉｇｌｉａ，Ｒ．Ｒｏｕｚｉｅｒ，Ｓ．Ｄｅｌａｌｏｇｅ，Ｍ．Ｓｐｉｅｌｍａｎｎ，Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ：ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｄｕｒｉｎｇ  ａ  １４−ｙｅａｒ  ｐｅｒｉｏｄ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２２，３３０２−３３０８（２００４）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＡｕｇ  １５（１０．１２００／ＪＣＯ．２００４．０８．０９５）．
５．  Ｌ．Ｍｏｊａ，Ｌ．Ｔａｇｌｉａｂｕｅ，Ｓ．Ｂａｌｄｕｚｚｉ，Ｅ．Ｐａｒｍｅｌｌｉ，Ｖ．Ｐｉｓｔｏｔｔｉ，Ｖ．Ｇｕａｒｎｅｒｉ，Ｒ．Ｄ’Ａｍｉｃｏ，Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｍｅｎｓ  ｆｏｒ  ｅａｒｌｙ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅ  Ｃｏｃｈｒａｎｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ４，ＣＤ００６２４３（２０１２）１０．１００２／１４６５１８５８．ＣＤ００６２４３．ｐｕｂ２）．
６．  Ｌ．Ｃａｒｅｙ，Ｅ．Ｗｉｎｅｒ，Ｇ．Ｖｉａｌｅ，Ｄ．Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｌ．Ｇｉａｎｎｉ，Ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：ｄｉｓｅａｓｅ  ｅｎｔｉｔｙ  ｏｒ  ｔｉｔｌｅ  ｏｆ  ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ？  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ７，６８３−６９２（２０１０）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＤｅｃ（１０．１０３８／ｎｒｃｌｉｎｏｎｃ．２０１０．１５４）．
７．  Ｃ．Ｍ．Ｐｅｒｏｕ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  １６  Ｓｕｐｐｌ  １，６１−７０（２０１１）１０．１６３４／ｔｈｅｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ．２０１１−Ｓ１−６１）．
８．  Ｍ．Ｋａｕｃｋａ，Ｋ．Ｐｌｅｖｏｖａ，Ｓ．Ｐａｖｌｏｖａ，Ｐ．Ｊａｎｏｖｓｋａ，Ａ．Ｍｉｓｈｒａ，Ｊ．Ｖｅｒｎｅｒ，Ｊ．Ｐｒｏｃｈａｚｋｏｖａ，Ｐ．Ｋｒｅｊｃｉ，Ｊ．Ｋｏｔａｓｋｏｖａ，Ｐ．Ｏｖｅｓｎａ，Ｂ．Ｔｉｃｈｙ，Ｙ．Ｂｒｙｃｈｔｏｖａ，Ｍ．Ｄｏｕｂｅｋ，Ａ．Ｋｏｚｕｂｉｋ，Ｊ．Ｍａｙｅｒ，Ｓ．Ｐｏｓｐｉｓｉｌｏｖａ，Ｖ．Ｂｒｙｊａ，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｐｏｌａｒｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｄｒｉｖｅｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７３，１４９１−１５０１（２０１３）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＭａｒ  １（Ｄｏｉ  １０．１１５８／０００８−５４７２ｃａｎ−１２−１７５２）．
９．  Ｃ．Ｂｒｏｃｋｓｃｈｍｉｄｔ，Ｈ．Ｈｉｒｎｅｒ，Ｎ．Ｈｕｂｅｒ，Ｔ．Ｅｉｓｍａｎｎ，Ａ．Ｈｉｌｌｅｎｂｒａｎｄ，Ｇ．Ｇｉａｍａｓ，Ｂ．Ｒａｄｕｎｓｋｙ，Ｏ．Ａｍｍｅｒｐｏｈｌ，Ｂ．Ｂｏｈｍ，Ｄ．Ｈｅｎｎｅ−Ｂｒｕｎｓ，Ｈ．Ｋａｌｔｈｏｆｆ，Ｆ．Ｌｅｉｔｈａｕｓｅｒ，Ａ．Ｔｒａｕｚｏｌｄ，Ｕ．Ｋｎｉｐｐｓｃｈｉｌｄ，Ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＣＫ１  ｄｅｌｔａ  ａｎｄ  ｅｐｓｉｌｏｎ  ｉｎ  ｄｕｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ａｒｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ＩＣ２６１  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｇｕｔ  ５７，７９９−８０６（２００８）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＪｕｎ（１０．１１３６／ｇｕｔ．２００７．１２３６９５）．
１０．  Ｉ．Ｃ．Ｔｓａｉ，Ｍ．Ｗｏｏｌｆ，Ｄ．Ｗ．Ｎｅｋｌａｓｏｎ，Ｗ．Ｗ．Ｂｒａｎｆｏｒｄ，Ｈ．Ｊ．Ｙｏｓｔ，Ｒ．Ｗ．Ｂｕｒｔ，Ｄ．Ｍ．Ｖｉｒｓｈｕｐ，Ｄｉｓｅａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃａｓｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｉ  ｄｅｌｔａ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｍａｙ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ａ  Ｗｎｔ／ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２０，１００５−１０１２（２００７）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＭａｒ  １（１０．１００２／ｉｊｃ．２２３６８）．
１１．  Ｎ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｊ．Ｚ．Ｙａｎｇ，Ｋ．Ｈａｓｓｅｌｂｌａｔｔ，Ｓ．Ｂ．Ｌｉｕ，Ｙ．Ｌ．Ｚｈｏｕ，Ｊ．Ａ．Ｒａｕｈ−Ｈａｉｎ，Ｓ．Ｋ．Ｎｇ，Ｐ．Ｗ．Ｃｈｏｉ，Ｗ．Ｐ．Ｆｏｎｇ，Ｎ．Ｙ．Ｒ．Ａｇａｒ，Ｗ．Ｒ．Ｗｅｌｃｈ，Ｒ．Ｓ．Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｗ．Ｎｇ，Ｃａｓｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｉ  ｅｐｓｉｌｏｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｍｂｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４，９５２−９６３（２０１２）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＳｅｐ（ＤＯＩ  １０．１００２／ｅｍｍｍ．２０１１０１０９４）．
１２．  Ｈ．Ｈｉｒｎｅｒ，Ｃ．Ｇｕｎｅｓ，Ｊ．Ｂｉｓｃｈｏｆ，Ｓ．Ｗｏｌｆｆ，Ａ．Ｇｒｏｔｈｅｙ，Ｍ．Ｋｕｈｌ，Ｆ．Ｏｓｗａｌｄ，Ｆ．Ｗｅｇｗｉｔｚ，Ｍ．Ｒ．Ｂｏｓｌ，Ａ．Ｔｒａｕｚｏｌｄ，Ｄ．Ｈｅｎｎｅ−Ｂｒｕｎｓ，Ｃ．Ｐｅｉｆｅｒ，Ｆ．Ｌｅｉｔｈａｕｓｅｒ，Ｗ．Ｄｅｐｐｅｒｔ，Ｕ．Ｋｎｉｐｐｓｃｈｉｌｄ，Ｉｍｐａｉｒｅｄ  ＣＫ１  ｄｅｌｔａ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ＳＶ４０−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ７，ｅ２９７０９（２０１２）１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２９７０９）．
１３．  Ｊ．Ｋ．Ｃｈｅｏｎｇ，Ｔ．Ｈ．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｈ．Ｗａｎｇ，Ｐ．Ｔａｎ，Ｐ．Ｍ．Ｖｏｏｒｈｏｅｖｅ，Ｓ．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｄ．Ｍ．Ｖｉｒｓｈｕｐ，ＩＣ２６１  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ＣＫ１ｄｅｌｔａ／ｅｐｓｉｌｏｎ  ａｎｄ  Ｗｎｔ／ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｔｉｃ  ｓｐｉｎｄｌｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３０，２５５８−２５６９（２０１１）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＪｕｎ  ２（１０．１０３８／ｏｎｃ．２０１０．６２７）．
１４．  Ｓ．Ｙ．Ｋｉｍ，Ｉ．Ｆ．Ｄｕｎｎ，Ｒ．Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ，Ｐ．Ｇｕｐｔａ，Ｌ．Ｗａｒｄｗｅｌｌ，Ｋ．Ｒｅｐｉｃｈ，Ａ．Ｃ．Ｓｃｈｉｎｚｅｌ，Ｂ．Ｗｉｔｔｎｅｒ，Ｓ．Ｊ．Ｓｉｌｖｅｒ，Ｄ．Ｅ．Ｒｏｏｔ，Ｊ．Ｓ．Ｂｏｅｈｍ，Ｓ．Ｒａｍａｓｗａｍｙ，Ｅ．Ｓ．Ｌａｎｄｅｒ，Ｗ．Ｃ．Ｈａｈｎ，ＣＫ１ｅｐｓｉｌｏｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ５，ｅ８９７９（２０１０）１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００８９７９）．
１５．  Ｓ．Ｆｏｌｄｙｎｏｖａ−Ｔｒａｎｔｉｒｋｏｖａ，Ｐ．Ｓｅｋｙｒｏｖａ，Ｋ．Ｔｍｅｊｏｖａ，Ｅ．Ｂｒｕｍｏｖｓｋａ，Ｏ．Ｂｅｒｎａｔｉｋ，Ｗ．Ｂｌａｎｋｅｎｆｅｌｄｔ，Ｐ．Ｋｒｅｊｃｉ，Ａ．Ｋｏｚｕｂｉｋ，Ｔ．Ｄｏｌｅｚａｌ，Ｌ．Ｔｒａｎｔｉｒｅｋ，Ｖ．Ｂｒｙｊａ，Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＣＫ１ｅｐｓｉｌｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔ  Ｗｎｔ／ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｔｈｅ  Ｗｎｔ／Ｒａｃ１／ＪＮＫ  ａｎｄ  ＮＦＡＴ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｔｏ  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２，Ｒ３０（２０１０）ｂｃｒ２５８１［ｐｉｉ］  １０．１１８６／ｂｃｒ２５８１）．
１６．  Ｍ．Ｂｉｂｉａｎ，Ｒ．Ｊ．Ｒａｈａｉｍ，Ｊ．Ｙ．Ｃｈｏｉ，Ｙ．Ｎｏｇｕｃｈｉ，Ｓ．Ｓｃｈｕｒｅｒ，Ｗ．Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．Ｌｉｃｈｔ，Ｌ．Ｈ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．Ｌｉ，Ｙ．Ｆｅｎｇ，Ｍ．Ｄ．Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｄ．Ｒ．Ｄｕｃｋｅｔｔ，Ｊ．Ｌ．Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｗ．Ｒ．Ｒｏｕｓｈ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃａｓｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  １ｄｅｌｔａ／１ｅｐｓｉｌｏｎ（ＣＫ１ｄｅｌｔａ／ｅｐｓｉｌｏｎ）  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ２３，４３７４−４３８０（２０１３）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＡｕｇ  １（１０．１０１６／ｊ．ｂｍｃｌ．２０１３．０５．０７５）．
１７．  Ｇ．Ｆｉｎａｋ，Ｓ．Ｓａｄｅｋｏｖａ，Ｆ．Ｐｅｐｉｎ，Ｍ．Ｈａｌｌｅｔｔ，Ｓ．Ｍｅｔｅｒｉｓｓｉａｎ，Ｆ．Ｈａｌｗａｎｉ，Ｋ．Ｋｈｅｔａｎｉ，Ｍ．Ｓｏｕｌｅｉｍａｎｏｖａ，Ｂ．Ｚａｂｏｌｏｔｎｙ，Ａ．Ｏｍｅｒｏｇｌｕ，Ｍ．Ｐａｒｋ，Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｎｏｒｍａｌ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ８，Ｒ５８（２００６）１０．１１８６／ｂｃｒ１６０８）．
１８．  Ｊ．Ｓ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｍ．Ｍｕｌｌｉｎｓ，Ｍ．Ｃ．Ｃｈｅａｎｇ，Ｓ．Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｖｏｄｕｃ，Ｔ．Ｖｉｃｋｅｒｙ，Ｓ．Ｄａｖｉｅｓ，Ｃ．Ｆａｕｒｏｎ，Ｘ．Ｈｅ，Ｚ．Ｈｕ，Ｊ．Ｆ．Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ，Ｉ．Ｊ．Ｓｔｉｊｌｅｍａｎ，Ｊ．Ｐａｌａｚｚｏ，Ｊ．Ｓ．Ｍａｒｒｏｎ，Ａ．Ｂ．Ｎｏｂｅｌ，Ｅ．Ｍａｒｄｉｓ，Ｔ．Ｏ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｊ．Ｅｌｌｉｓ，Ｃ．Ｍ．Ｐｅｒｏｕ，Ｐ．Ｓ．Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｒｉｓｋ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２７，１１６０−１１６７（２００９）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＭａｒ  １０（１０．１２００／ＪＣＯ．２００８．１８．１３７０）．
１９．  Ｘ．Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｃｌａｅｒｈｏｕｔ，Ａ．Ｐｒａｔ，Ｌ．Ｅ．Ｄｏｂｒｏｌｅｃｋｉ，Ｉ．Ｐｅｔｒｏｖｉｃ，Ｑ．Ｌａｉ，Ｍ．Ｄ．Ｌａｎｄｉｓ，Ｌ．Ｗｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｒ．Ｓｃｈｉｆｆ，Ｍ．Ｇｉｕｌｉａｎｏ，Ｈ．Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｗ．Ｆｕｑｕａ，Ａ．Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ，Ｃ．Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，Ｊ．Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｍａｏ，Ａ．Ｃ．Ｐａｖｌｉｃｋ，Ａ．Ｍ．Ｆｒｏｅｈｌｉｃｈ，Ｍ．Ｆ．Ｗｕ，Ａ．Ｔｓｉｍｅｌｚｏｎ，Ｓ．Ｇ．Ｈｉｌｓｅｎｂｅｃｋ，Ｅ．Ｓ．Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｚｕｌｏａｇａ，Ｃ．Ａ．Ｓｈａｗ，Ｍ．Ｆ．Ｒｉｍａｗｉ，Ｃ．Ｍ．Ｐｅｒｏｕ，Ｇ．Ｂ．Ｍｉｌｌｓ，Ｊ．Ｃ．Ｃｈａｎｇ，Ｍ．Ｔ．Ｌｅｗｉｓ，Ａ  ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ  ｓｔａｂｌｅ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｎｄ  ｅｔｈｎｉｃａｌｌｙ  ｄｉｖｅｒｓｅ，ｐａｔｉｅｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７３，４８８５−４８９７（２０１３）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＡｕｇ  １（１０．１１５８／０００８−５４７２．ＣＡＮ−１２−４０８１）．
２０．  Ｋ．Ｒ．Ｂｒｅｎｎａｎ，Ａ．Ｍ．Ｂｒｏｗｎ，Ｗｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｒｙ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｍａｍｍａｒｙ  Ｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ９，１１９−１３１（２００４）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＡｐｒ（１０．１０２３／Ｂ：ＪＯＭＧ．０００００３７１５７．９４２０７．３３）．
２１．  Ｆ．Ｃ．Ｇｅｙｅｒ，Ｍ．Ｌａｃｒｏｉｘ−Ｔｒｉｋｉ，Ｋ．Ｓａｖａｇｅ，Ｍ．Ａｒｎｅｄｏｓ，Ｍ．Ｂ．Ｌａｍｂｒｏｓ，Ａ．ＭａｃＫａｙ，Ｒ．Ｎａｔｒａｊａｎ，Ｊ．Ｓ．Ｒｅｉｓ−Ｆｉｌｈｏ，ｂｅｔａ−Ｃａｔｅｎｉｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｗｉｔｈ  ＣＴＮＮＢ１  ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ  ２４，２０９−２３１（２０１１）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＦｅｂ（１０．１０３８／ｍｏｄｐａｔｈｏｌ．２０１０．２０５）．
２２．  Ｖ．Ｂｒｙｊａ，Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｅ，Ｅ．Ａｒｅｎａｓ，Ｗｎｔ−３ａ  ｕｔｉｌｉｚｅｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｌｏｗ  ｄｏｓｅ  ａｎｄ  ｒａｐｉｄ  ｐａｔｈｗａｙ  ｔｈａｔ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｒｅｑｕｉｒｅ  ｃａｓｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  １−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｖｌ  ｔｏ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  １９，６１０−６１６（２００７）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＭａｒ（１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌｓｉｇ．２００６．０８．０１１）．
２３．  Ｕ．Ｋｎｉｐｐｓｃｈｉｌｄ，Ｍ．Ｋｒｕｇｅｒ，Ｊ．Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｐ．Ｘｕ，Ｂ．Ｇａｒｃｉａ−Ｒｅｙｅｓ，Ｃ．Ｐｅｉｆｅｒ，Ｊ．Ｈａｌｅｋｏｔｔｅ，Ｖ．Ｂａｋｕｌｅｖ，Ｊ．Ｂｉｓｃｈｏｆ，Ｔｈｅ  ＣＫ１  Ｆａｍｉｌｙ：Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｆｒｏｎｔ  Ｏｎｃｏｌ  ４，９６（２０１４）１０．３３８９／ｆｏｎｃ．２０１４．０００９６）．
２４．  Ｐ．Ｗｅｎｄ，Ｓ．Ｒｕｎｋｅ，Ｋ．Ｗｅｎｄ，Ｂ．Ａｎｃｈｏｎｄｏ，Ｍ．Ｙｅｓａｙａｎ，Ｍ．Ｊａｒｄｏｎ，Ｎ．Ｈａｒｄｉｅ，Ｃ．Ｌｏｄｄｅｎｋｅｍｐｅｒ，Ｉ．Ｕｌａｓｏｖ，Ｍ．Ｓ．Ｌｅｓｎｉａｋ，Ｒ．Ｗｏｌｓｋｙ，Ｌ．Ａ．Ｂｅｎｔｏｌｉｌａ，Ｓ．Ｇ．Ｇｒａｎｔ，Ｄ．Ｅｌａｓｈｏｆｆ，Ｓ．Ｌｅｈｒ，Ｊ．Ｊ．Ｌａｔｉｍｅｒ，Ｓ．Ｂｏｓｅ，Ｈ．Ｓａｔｔａｒ，Ｓ．Ａ．Ｋｒｕｍ，Ｇ．Ａ．Ｍｉｒａｎｄａ−Ｃａｒｂｏｎｉ，ＷＮＴ１０Ｂ／ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＨＭＧＡ２  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．ＥＭＢＯ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５，２６４−２７９（２０１３）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＦｅｂ（１０．１００２／ｅｍｍｍ．２０１２０１３２０）．
２５．  Ｂ．Ｓｃｈａｄｅ，Ｒ．Ｌｅｓｕｒｆ，Ｖ．Ｓａｎｇｕｉｎ−Ｇｅｎｄｒｅａｕ，Ｔ．Ｂｕｉ，Ｇ．Ｄｅｂｌｏｉｓ，Ｓ．Ａ．Ｏ’Ｔｏｏｌｅ，Ｅ．Ｋ．Ａ．Ｍｉｌｌａｒ，Ｓ．Ｊ．Ｚａｒｄａｗｉ，Ｅ．Ｌｏｐｅｚ−Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｒ．Ｌ．Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｖ．Ｇｉｇｕｅｒｅ，Ｍ．Ｋａｈｎ，Ｍ．Ｈａｌｌｅｔｔ，Ｗ．Ｊ．Ｍｕｌｌｅｒ，ｂｅｔａ−Ｃａｔｅｎｉｎ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｉｓ  ａ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｅｖｅｎｔ  ｉｎ  ＥｒｂＢ２−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｍａｍｍａｒｙ  Ｔｕｍｏｒ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７３，４４７４−４４８７（２０１３）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＪｕｌ  １５（Ｄｏｉ  １０．１１５８／０００８−５４７２．Ｃａｎ−１２−３９２５）．
２６．  Ｍ．Ｍｏｕｍｅｎ，Ａ．Ｃｈｉｃｈｅ，Ｃ．Ｄｅｃｒａｅｎｅ，Ｖ．Ｐｅｔｉｔ，Ａ．Ｇａｎｄａｒｉｌｌａｓ，Ｍ．Ａ．Ｄｅｕｇｎｉｅｒ，Ｍ．Ａ．Ｇｌｕｋｈｏｖａ，Ｍ．Ｍ．Ｆａｒａｌｄｏ，Ｍｙｃ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍａｍｍａｒｙ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  １２，１３２（２０１３）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＯｃｔ  ３０（１０．１１８６／１４７６−４５９８−１２−１３２）．
２７．  Ｈ．Ａｌ−Ｈｕｓｓａｉｎｉ，Ｄ．Ｓｕｂｒａｍａｎｙａｍ，Ｍ．Ｒｅｅｄｉｊｋ，Ｓ．Ｓ．Ｓｒｉｄｈａｒ，Ｎｏｔｃｈ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １０，９−１５（２０１１）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＪａｎ（１０．１１５８／１５３５−７１６３．ＭＣＴ−１０−０６７７）．
２８．  Ｃ．Ｌｉｕ，Ｙ．Ｌｉ，Ｍ．Ｓｅｍｅｎｏｖ，Ｃ．Ｈａｎ，Ｇ．Ｈ．Ｂａｅｇ，Ｙ．Ｔａｎ，Ｚ．Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｌｉｎ，Ｘ．Ｈｅ，Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ／ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｄｕａｌ−ｋｉｎａｓｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｃｅｌｌ  １０８，８３７−８４７（２００２）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＭａｒ  ２２（
２９．  Ｊ．Ｉ．Ｙｏｏｋ，Ｘ．Ｙ．Ｌｉ，Ｉ．Ｏｔａ，Ｃ．Ｈｕ，Ｈ．Ｓ．Ｋｉｍ，Ｎ．Ｈ．Ｋｉｍ，Ｓ．Ｙ．Ｃｈａ，Ｊ．Ｋ．Ｒｙｕ，Ｙ．Ｊ．Ｃｈｏｉ，Ｊ．Ｋｉｍ，Ｅ．Ｒ．Ｆｅａｒｏｎ，Ｓ．Ｊ．Ｗｅｉｓｓ，Ａ  Ｗｎｔ−Ａｘｉｎ２−ＧＳＫ３ｂｅｔａ  ｃａｓｃａｄｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｓｎａｉｌ１  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８，１３９８−１４０６（２００６）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＤｅｃ（１０．１０３８／ｎｃｂ１５０８）．
３０．  Ｊ．Ｉ．Ｙｏｏｋ，Ｘ．Ｙ．Ｌｉ，Ｉ．Ｏｔａ，Ｅ．Ｒ．Ｆｅａｒｏｎ，Ｓ．Ｊ．Ｗｅｉｓｓ，Ｗｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｓｎａｉｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０，１１７４０−１１７４８（２００５）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＭａｒ  ２５（１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ４１３８７８２００）．
３１．  Ａ．Ｂａｆｉｃｏ，Ｇ．Ｌｉｕ，Ｌ．Ｇｏｌｄｉｎ，Ｖ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｓ．Ａ．Ａａｒｏｎｓｏｎ，Ａｎ  ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  Ｗｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ６，４９７−５０６（２００４）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＮｏｖ（１０．１０１６／ｊ．ｃｃｒ．２００４．０９．０３２）．
３２．  Ｍ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ｂａｓｅｌｇａ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２１，３７９７−３８０３（２０１１）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＯｃｔ（１０．１１７２／ＪＣＩ５７１５２）．
３３．  Ｊ．Ｋ．Ｃｈｅｏｎｇ，Ｄ．Ｍ．Ｖｉｒｓｈｕｐ，Ｃａｓｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  １：Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆａｍｉｌｙ．Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ４３，４６５−４６９（２０１１）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＡｐｒ（１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｃｅｌ．２０１０．１２．００４）．
３４．  Ｐ．Ｐｏｌａｋｉｓ，Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｂｉｏｌ  ４，（２０１２）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＭａｙ（１０．１１０１／ｃｓｈｐｅｒｓｐｅｃｔ．ａ００８０５２）．
３５．  Ｓ．Ｙ．Ｌｉｎ，Ｗ．Ｘｉａ，Ｊ．Ｃ．Ｗａｎｇ，Ｋ．Ｙ．Ｋｗｏｎｇ，Ｂ．Ｓｐｏｈｎ，Ｙ．Ｗｅｎ，Ｒ．Ｇ．Ｐｅｓｔｅｌｌ，Ｍ．Ｃ．Ｈｕｎｇ，Ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：ｉｔｓ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７，４２６２−４２６６（２０００）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＡｐｒ  １１（１０．１０７３／ｐｎａｓ．０６００２５３９７）．
３６．  Ｗ．Ｈ．Ｘｕ，Ｚ．Ｂ．Ｌｉｕ，Ｃ．Ｙａｎｇ，Ｗ．Ｑｉｎ，Ｚ．Ｍ．Ｓｈａｏ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１  ａｎｄ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｒｉｐｌｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７，ｅ３７６２４（２０１２）１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００３７６２４）．
３７．  Ａ．Ｍ．Ｂｒｏｗｎ，Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：ｈａｖｅ  ｗｅ  ｃｏｍｅ  ｆｕｌｌ  ｃｉｒｃｌｅ？Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ３，３５１−３５５（２００１）．
３８．  Ｄ．Ｗｉｅｄｅｒｓｃｈａｉｎ，Ｓ．Ｗｅｅ，Ｌ．Ｃｈｅｎ，Ａ．Ｌｏｏ，Ｇ．Ｙａｎｇ，Ａ．Ｈｕａｎｇ，Ｙ．Ｃｈｅｎ，Ｇ．Ｃａｐｏｎｉｇｒｏ，Ｙ．Ｍ．Ｙａｏ，Ｃ．Ｌｅｎｇａｕｅｒ，Ｗ．Ｒ．Ｓｅｌｌｅｒｓ，Ｊ．Ｄ．Ｂｅｎｓｏｎ，Ｓｉｎｇｌｅ−ｖｅｃｔｏｒ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ＲＮＡｉ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｔａｒｇｅｔ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ８，４９８−５０４（２００９）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＦｅｂ  １．
３９．  Ｃ．Ｆｕｅｒｅｒ，Ｒ．Ｎｕｓｓｅ，Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｔｏ  ｐｒｏｂｅ  ａｎｄ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５，ｅ９３７０（２０１０）１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００９３７０）．
４０．  Ｃ．Ｈ．Ｍｅｒｍｅｌ，Ｓ．Ｅ．Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｂ．Ｈｉｌｌ，Ｍ．Ｌ．Ｍｅｙｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｂｅｒｏｕｋｈｉｍ，Ｇ．Ｇｅｔｚ，ＧＩＳＴＩＣ２．０  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｃｏｎｆｉｄｅｎｔ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｆ  ｆｏｃａｌ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｏｐｙ−ｎｕｍｂｅｒ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １２，Ｒ４１（２０１１）ｇｂ−２０１１−１２−４−ｒ４１［ｐｉｉ］１０．１１８６／ｇｂ−２０１１−１２−４−ｒ４１）．
本明細書中で言及されている全ての特許および刊行物を、各個の刊行物の全体が参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個別に示されている場合と同様に、参照により本明細書に組み入れることとする。
【００８４】
用いられている用語および表現は記述の用語として用いられており、限定的なものではなく、また、そのような用語および表現の使用においては、示され記載されている特徴またはその一部のいずれの均等物をも除外する意図は無く、特許請求されている本発明の範囲内で種々の修飾が可能であると認識される。したがって、本発明は好ましい実施形態および随意的特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示されている概念の修飾および変更が当業者によって施されることが可能であり、そのような修飾および変更は、添付の特許請求の範囲により定められる本発明の範囲内とみなされると理解されるべきである。
【図１】
2018538241.tif 000013
【図２】
2018538241.tif 000014
【図３】
2018538241.tif 000015
【図４】
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【図５】
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【図６】
2018538241.tif 000018
【国際調査報告】
2018538241.tif 000019