(57)【要約】  本明細書において提供されているのは、アッセイプレートとその使用である。特に、本明細書において提供されているのは、生物学的および化学的アッセイを行ない、アッセイ結果を検出する際に使用する流体光学チャネルおよびマイクロポストを含んでいるアッセイプレートである。説明されているプレートは、アッセイ時間および試料体積を減少させ、生物学的および化学的アッセイにおいて感度および特異性を増加させることができる。
2018529968.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体光学アレイプレートであって、
複数のウェルを含んでおり、各ウェルが、液体流入口と、複数のマイクロポストを含む、光学的に明澄な、流体の検出チャネルと、液体流出口と、を含んているアレイプレート。
【請求項２】
請求項１に記載のアレイプレートであって、上記流入口が上記検出チャネルからオフセットされている、アレイプレート。
【請求項３】
請求項１または２に記載のアレイプレートであって、上記検出チャネルが複数の曲線を含んている、アレイプレート。
【請求項４】
請求項３に記載のアレイプレートであって、上記曲線がＵ字型である、アレイプレート。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載のアレイプレートであって、上記検出チャネルのサイズが対称的である、アレイプレート。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載のアレイプレートであって、上記流入口が漏斗である、アレイプレート。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載のアレイプレートであって、上記流出口がノズルである、アレイプレート。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載のアレイプレートであって、上記アレイプレートの底面が反射層を含んている、アレイプレート。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項に記載のアレイプレートであって、上記アレイプレートが９６のウェルを含んている、アレイプレート。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１項に記載のアレイプレートであって、上記光学的に明澄なチャネルが、すべての側またはすべての方向において透明である、アレイプレート。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載のアレイプレートであって、上記光学的に明澄なチャネルが、１つまたは２つの側または方向において透明であり、残りの側または方向において光学的に不透明であるか、または遮蔽されている、アレイプレート。
【請求項１２】
システムであって、
ａ）請求項１から１１のいずれか１項に記載のアレイプレートと、
ｂ）上記アレイプレートの底部に付着するように構成されている底部プレートまたは膜であって、上記ウェルのそれぞれに対応する、底部が開いた複数の流体流出口を含んでいる底部プレートまたは膜と、
を含んでいるシステム。
【請求項１３】
請求項１２に記載のシステムであって、上記アレイプレートおよび上記底部プレートが密閉されている、システム。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載のシステムであって、上記膜が打ち抜き穴を有する接着膜である、システム。
【請求項１５】
請求項１２から１４のいずれか１項に記載のシステムであって、上記システムが液体輸送ポンプをさらに含んでいる、システム。
【請求項１６】
請求項１２から１５のいずれか１項に記載のシステムであって、複数のアッセイ試薬をさらに含んでいる、システム。
【請求項１７】
請求項１６に記載のシステムであって、上記アッセイ試薬が、緩衝剤、核酸プライマー、核酸、プローブ、抗体、および検出試薬からなる群から選択される、システム。
【請求項１８】
請求項１２から１７のいずれか１項に記載のシステムであって、検出用構成要素をさらに含んでいる、システム。
【請求項１９】
請求項１８に記載のシステムであって、上記検出用構成要素が分光光度計またはプレートリーダーである、システム。
【請求項２０】
アッセイを行なう方法であって、
ａ）分析物を含んでいるものと推測されている試料を、請求項１２から１９のいずれか１項に記載のシステムと接触させる工程と、
ｂ）上記システムを用いて検出アッセイを行なう工程と、
を含んでいる方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、上記分析物がタンパク質または核酸である、方法。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載の方法であって、上記アッセイが、イムノアッセイ、核酸増幅アッセイ、または核酸ハイブリダイゼーションアッセイである、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、上記イムノアッセイがＥＬＩＳＡアッセイである、方法。
【請求項２４】
請求項２０から２３のいずれか１項に記載の方法であって、上記試料中の上記分析物の存在を検出する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、アッセイプレートとその使用とについて記載する。特に、本明細書は、生物学的および化学的アッセイを行なって、アッセイ結果を検出するためのアッセイプレートついて記載する。
【背景技術】
【０００２】
強力かつ広く使用されている現在の診断技術である酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）は、感度を向上させ、アッセイ時間を減少させることが要求されている。現在のＥＬＩＳＡの主な検出原理は、紫外・可視吸収、化学発光、および蛍光の検出に基づくものである。従来のＥＬＩＳＡには、以下の欠点がある。（１）試験時間が長いこと（３〜６時間＋一晩のコーティング）。これにより、結果を１５〜３０分以内で得るべき、救急看護（例えば、心臓発作、敗血症性ショック、外傷性脳損傷など）に対処する時には、ＥＬＩＳＡはほとんど役に立たない。（２）試料および試薬の消費量が多いこと（各センサーウェルに５０〜１００μＬ）。これにより、顧客にとって費用が著しく高額になる（各試験に〜２００ドル）。（３）検出限界が不十分であること。一般的に１０〜１００ｐｇ／ｍＬのオーダーである。これにより、臨床的に有意な数多くのバイオマーカーを低い濃度で測定することが不可能となる。これらの欠点がすべて、微量の分析物に対する迅速かつ低コストの高感度性試験を必要とする種々の応用においてＥＬＩＳＡが採用されることを妨げている。
【発明の概要】
【０００３】
本明細書は、アッセイプレートとその使用とについて記載する。特に、本明細書は、生物学的および化学的アッセイを行なって、アッセイ結果を検出するためのアッセイプレートついて記載する。
【０００４】
例えば、いくつかの実施形態において、本開示は、流体光学アレイプレートであって、複数のウェルを含んでおり、各ウェルが、液体流入口と、複数のマイクロポストを含む、光学的に明澄な、検出チャネルと、液体流出口と、を含んているアレイプレート、を提供する。いくつかの実施形態において、上記流入口は、上記検出チャネルからオフセットされている。いくつかの実施形態において、上記検出チャネルは、複数の曲線（例えば、対称的なＵ字型の曲線）を含んでいる。いくつかの実施形態において、上記流入口は漏斗である。いくつかの実施形態において、上記流出口はノズルである。いくつかの実施形態において、上記アレイプレートの底面は反射層（例えば、金属層）を含んでいる。いくつかの実施形態において、上記アレイプレートは、９６のウェルを含んでいるか、または９６のウェルからなるが、他の大きさも具体的に検討されている（例えば、２、４、６、２４、９６、３８４、または１５３６のウェル）。
【０００５】
さらなる実施形態は、システムであって、ａ）本明細書において説明されているアレイプレートと、ｂ）上記アレイプレートの底部に付着するように構成されている底部プレートまたは膜（例えば、打ち抜き穴を有する接着膜）であって、上記ウェルのそれぞれに対応する、底部が開いた複数の流体流出口を含んでいる底部プレートと、を含んでいるシステムを提供する。いくつかの実施形態において、上記アレイプレートおよび上記底部プレートは密閉されている。いくつかの実施形態において、上記システムは液体輸送ポンプをさらに含んでいる。いくつかの実施形態において、上記システムは複数のアッセイ試薬（例えば、緩衝剤、核酸プライマー、核酸、プローブ、抗体、または検出試薬）をさらに含んでいる。いくつかの実施形態において、上記システムは検出用構成要素（例えば、プレートリーダーまたは分光光度計）をさらに含んでいる。
【０００６】
さらなる実施形態は、アッセイを行なう方法であって、ａ）分析物を含んでいるものと推測されている試料を、本明細書において説明されているシステムと接触させる工程と、上記システムを用いて検出アッセイを行なう工程と、を含んでいる方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記分析物はタンパク質または核酸である。いくつかの実施形態において、上記アッセイは、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、核酸増幅アッセイ、または核酸ハイブリダイゼーションアッセイである。いくつかの実施形態において、上記試料中の上記分析物の存在を検出する。
【０００７】
さらなる実施形態が、本明細書に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
添付の図によって、この技術の種々の非限定的な実施形態の理解が容易になる。
【図１】Ａに、マイクロポストアレイ埋め込み型流体光学多重井戸プレートの上面図を示す。Ｂに、その底面図を示す。Ｃに、その正面図を示す。Ｄに、その背面図を示す。Ｅに、その左側面図を示す。Ｆに、その右側面図を示す。
【図２】Ａに、マイクロポストアレイ埋め込み型流体光学多重井戸プレートの分解斜視図を示す。Ｂに、その斜視図を示す。Ｃに、隠れ線を付したその斜視図を示す。
【図３】Ａに、部分Ａの等角図を示す。Ｂに、その底面図を示す。
【図４】Ａに、部分Ｂの等角図を示す。Ｂに、その底面図を示す。
【図５】Ａに、マイクロポストアレイ埋め込み型流体光学モジュールの模式的な詳細を示す。Ｂは、マイクロポストアレイ埋め込み型流体光学チャネルの詳細である。
【図６】Ａに、組み立てが完了したマイクロポストアレイ埋め込み型流体光学多重井戸プレートの上面斜視図の３Ｄ表示画像を図示する。Ｂに、その底面斜視図の３Ｄ表示画像を図示する。
【図７】製造された（Ａ）部分Ａ、（Ｂ）部分Ｂ、および（Ｃ）打ち抜いた接着膜の写真を示す。
【図８】３×３ウェル（０．００８インチ×０．００８インチのチャネル）の顕微鏡画像を示し、（Ａ）流体光学モジュールと、（Ｂ）マイクロポスト（矢印）アレイのレイアウトとの顕微鏡画像を示す。
【図９】製造された部分Ａ（０．０１８インチ×０．０２２インチのチャネル）の写真を示し、（Ａ）明澄で透明な流体光学ウェルプレートの正面図と、（Ｂ）その背面図と、の写真を示す。
【図１０】製造された部分Ａ（０．０１８インチ×０．０２２インチのチャネル）の写真を示し、（Ａ）黒色で不透明な流体光学ウェルプレートの正面図と、（Ｂ）その背面図と、の写真を示す。
【図１１】３×３ウェル（０．０１８インチ×０．０２２インチのチャネル）の流体光学モジュールと、マイクロポスト（矢印）アレイのレイアウトとの顕微鏡画像を示す。
【図１２】３Ｄ印刷されたウェルプレートアダプター（黒）の写真を示す。
【図１３】（１）従来の９６ウェルのプレート、（２）ＯＰＴＩＭＩＳＥＲＴＭウェルプレート、および（３）本開示の実施形態の流体光学ウェルプレートの３つの異なるウェルプレートの、実行ごとの変動の比較を示す。
【図１４】（１）従来の９６ウェルのプレート、（２）ＯＰＴＩＭＩＳＥＲＴＭウェルプレート、および（３）本開示の実施形態の流体光学ウェルプレートの３つの異なるウェルプレートの、ウェルごとの変動の比較を示す。
【図１５】７種類の異なるチャネルサイズにおける０．５μＭのローダミン  ６Ｇの蛍光強度の比較を示す。
【図１６】（Ａ）明澄で透明なウェルプレートを使用した蛍光の、（Ｂ）明澄で透明なウェルプレートを使用した化学発光の、および（Ｃ）黒色で不透明なウェルプレートを使用した化学発光の、クロストーク分析を示す。
【図１７】蛍光検出方法を使用した緩衝剤中のＩＬ−６の標準的な曲線と、本開示の実施形態の明澄で透明な流体光学ウェルプレート（０．００８インチ×０．００８インチのチャネル）の統計的な分析とをを示し、（Ａ）４パラメータ論理（４−ＰＬ）の曲線を当てはめた、各濃度における３つのデータポイントと、（Ｂ）３つのウェルの標準偏差を有する平均値と、（Ｃ）変動係数と、（Ｄ）各ＩＬ−６濃度のＰ値と、を示す。
【図１８】蛍光検出方法を使用した緩衝剤中のＩＬ−６の標準的な曲線と、本開示の実施形態の明澄で透明な流体光学ウェルプレート（０．０１８インチ×０．０２２インチのチャネル）の統計的な分析とをを示し、（Ａ）４パラメータ論理（４−ＰＬ）の曲線を当てはめた、各濃度における３つのデータポイントと、（Ｂ）３つのウェルの標準偏差を有する平均値と、（Ｃ）変動係数と、（Ｄ）各ＩＬ−６濃度のＰ値と、を示す。
【図１９】蛍光検出方法を使用した血清中のＩＬ−６の標準的な曲線と、本開示の実施形態の明澄で透明な流体光学ウェルプレート（０．０１８インチ×０．０２２インチのチャネル）の統計的な分析とをを示し、（Ａ）４パラメータ論理（４−ＰＬ）の曲線を当てはめた、各濃度における３つのデータポイントと、（Ｂ）３つのウェルの標準偏差を有する平均値と、（Ｃ）変動係数と、（Ｄ）各ＩＬ−６濃度のＰ値と、を示す。
【図２０】化学発光検出方法を使用した緩衝剤中のＩＬ−６の標準的な曲線と、本開示の実施形態の黒色で不透明な流体光学ウェルプレート（０．０１８インチ×０．０２２インチのチャネル）の統計的な分析とをを示し、（Ａ）４パラメータ論理（４−ＰＬ）の曲線を当てはめた、各濃度における３つのデータポイントと、（Ｂ）３つのウェルの標準偏差を有する平均値と、（Ｃ）変動係数と、（Ｄ）各ＩＬ−６濃度のＰ値と、を示す。
【図２１】化学発光検出方法を使用した血清中のＩＬ−６の標準的な曲線と、本開示の実施形態の黒色で不透明な流体光学ウェルプレート（０．０１８インチ×０．０２２インチのチャネル）の統計的な分析とをを示し、（Ａ）４パラメータ論理（４−ＰＬ）の曲線を当てはめた、各濃度における３つのデータポイントと、（Ｂ）３つのウェルの標準偏差を有する平均値と、（Ｃ）変動係数と、（Ｄ）各ＩＬ−６濃度のＰ値と、を示す。
【図２２】従来の９６ウェルのプレートと流体光学ウェルプレート（０．０１８インチ×０．０２２インチのチャネル）との比較を示し、（Ａ）蛍光検出方法を使用した、従来の９６ウェルのプレートおよび明澄で透明な流体光学ウェルプレートでの緩衝剤中のＩＬ−６の標準的な曲線と、（Ｂ）蛍光検出方法を使用した、従来の９６ウェルのプレートおよび明澄で透明な流体光学ウェルプレートでの血清中のＩＬ−６の標準的な曲線と、（Ｃ）化学発光検出方法を使用した、従来の９６ウェルのプレート（ＣＯＲＮＩＮＧＴＭ９６−Ｗｅｌｌ  Ｃｌｅａｒ  Ｂｏｔｔｏｍ  Ｂｌａｃｋ  Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）および黒色で不透明な流体光学ウェルプレートでの緩衝剤中のＩＬ−６の標準的な曲線と、（Ｄ）化学発光検出方法を使用した、従来の９６ウェルのプレート（ＣＯＲＮＩＮＧＴＭ  ９６−Ｗｅｌｌ  Ｃｌｅａｒ  Ｂｏｔｔｏｍ  Ｂｌａｃｋ  Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）および黒色で不透明な流体光学ウェルプレートでの血清中のＩＬ−６の標準的な曲線と、を示す。
【０００９】
定義
本開示の理解を容易にするために、いくつかの用語および語句を以下に定義する。用語は、本開示の他の箇所に定義されている可能性もある。
【００１０】
「試料」という用語は、その最も広い意味で使用される。すなわち、一方では、検体や培養物をその意味に含み、他方では、生体試料および環境試料の両方をその意味に含む。
【００１１】
生体試料は、ヒトを含む動物、流体、固体（例えば、糞便）、または組織であってもよく、さらには、乳製品、野菜、食肉および食肉処理の副産物、ならびに廃棄物などの液体および固体の食物ならびに飼料製品およびその材料を含んでいてもよい。生体試料は、家畜の種々の科から得てもよく、さらには、有蹄動物、クマ、魚、ウサギ目、齧歯動物などの動物、またはそれらの組み合わせを含む野生化した、または野生の動物から得てもよいが、これらには限定されない。
【００１２】
環境試料は、地表物質、土、水、および産業用の試料などの環境物質を含み、さらには、食物・乳加工用の器具、装置、機器、用具、使い捨てのおよび非使い捨ての物品、またはそれらの組み合わせから得られる試料を含む。これらの例は、本開示に適用可能な試料の種類を限定するものとは解釈されない。
【００１３】
本明細書において使用される「試験管内で（の）」という用語は、人工環境および人工環境内で起こるプロセスまたは反応を指す。試験管内の環境は、試験管および／または細胞培養物からなることができるが、これらには限定されない。「生体内で（の）」という用語は、自然環境（例えば、動物または細胞）および自然環境内で起こるプロセスまたは反応を指す。
【００１４】
「試験化合物」および「候補化合物」という用語は、疾病、病気、不調、または身体的機能の疾患を治療または予防するために使用される候補としての、あらゆる化学的な実体、医薬品、薬剤などを指す。試験化合物は、既知の治療用化合物および潜在的な治療用化合物の両方を含む。試験化合物は、本開示のスクリーニング方法、装置、および／またはシステムを使用するスクリーニングによって治療効果があるものと判断してもよい。本開示のあるいくつかの実施形態では、試験化合物は、アンチセンス化合物、低分子干渉ＲＮＡ化合物、および／または低分子ヘアピン型ＲＮＡ化合物を含んでいてもよい。
【００１５】
「スフェロイド」という用語は、細胞および／または細胞群体のクラスターまたは凝集体をを指す。スフェロイドは、例えば、一次細胞、細胞株、腫瘍細胞、幹細胞などの種々の細胞型から形成されてもよい。スフェロイドは、球状の、または不規則な形状を有していてもよい。スフェロイドは、細胞、細胞型、ならびに増殖性細胞、静止細胞、および壊死細胞などの異なる状態の細胞の異種集団を含んでいてもよい。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下の記載は、共通の特色および特徴を共有している可能性があるいくつかの実施形態に関して提供されている。ある実施形態の１または複数の特徴を他の実施形態の１または複数の特徴と組み合わせることができる点は理解されるであろう。加えて、いずれの実施形態の単一の特徴または特徴の組み合わせも、追加の実施形態を構成し得る。
[0039]
本明細書において、「comprising」という単語は、「open」な意味、すなわち「including」の意味で理解するものとし、「closed」な意味、すなわち「consisting only of」の意味に制限されるものではない。「comprise」、「comprised」、および「comprises」という対応する単語が使用されている場合、対応する意味が適用される。
【００１７】
詳細な記載で使用される標題の見出しは、読者にとっての参照の容易さのためにのみ含まれており、本開示または請求項に記載される主題を限定するのに使用されるべきではない。標題の見出しは、請求項の範囲または請求項の限定事項の解釈に使用されるべきではない。
【００１８】
本明細書は、アッセイプレートとその使用とについて記載する。特に、本明細書は、生物学的および化学的アッセイを行なって、アッセイ結果を検出するためのアッセイプレートついて記載する。いくつかの実施形態において、上記プレートは、標準の９６ウェルの、または他の大きさのプレートの寸法に適合する複数（例えば、９６）の流体光学モジュールを含んでいる。よって、上記プレートは、蛍光、冷光、ラマン散乱、表面増強ラマン散乱、および、市場で入手可能なあらゆる標準のプレートリーダーを用いた吸光を測定するために使用することができる。本開示は、９６ウェルの流体光学プレートには制限されない。いくつかの実施形態において、設計は、流体光学モジュールの所望の数およびその位置、ならびに、個々の流体光学モジュールの大きさなどの顧客の要求に基づいてカスタマイズする。そのうえ、いくつかの実施形態において、反射層で上記プレートの外面を被覆することで、光学検出効率を向上させる。
【００１９】
本明細書において説明するプレートは、既存の技術と比較して顕著な利点を有する。例えば、上記流入口を検出領域から離れて配置させることで、光学測定および上記流入口に残留する液体との潜在的な干渉を避けることができる。これにより、著しく測定の変動性を減少させ、信号強度を向上させることができる（「実験」欄を参照）。加えて、チャネルが対称であることにより、信号変動なしに、光学検出位置の大きな公差を許容する。検出チャネル内にポストを含むことにより、表面積対体積比率および／または質量輸送率が増加して、分析物を捕捉する効率が向上し、捕捉される分析物の総数が増加する。これにより、全体のアッセイ時間が減少し、信号強度が増加する。加えて、各ポストは、光を光検出器に誘導する光導波路として機能してもよく、その結果、さらに信号強度が増加する。流出口ノズルおよび任意でポンプを付加することにより、流体チャネル内の流れが向上し、その結果、アッセイ時間および測定変動が減少する。任意の反射層をアッセイプレートの底部に含むことにより、光は検出器の方向に反映し、信号が増加する。
【００２０】
例示的なプレートを図１〜１２に示す。これらの図に示すプレートは、９６ウェルの構成を利用したものであるが、他の構成についても検討されている。上記プレートは２つの部分を有しており、それらは、上部である部分Ａと、下部である部分Ｂとである。これらの部分は、互いに貼り付けられ、接着膜もしくは接着剤を用いて、または超音波プラスチック溶接技術もしくは他の好適な方法を使用して、密閉されている。あるいは、部分Ｂは、打ち抜き穴を有する接着膜に置き換えることができる。上部の部分Ａには、９６個の流体光学モジュールが、８×１２の形式のアレイで配置されており、市場で入手可能な標準のプレートリーダー用いて読み取れるようになっている。各モジュールは、流体流入口と、流体光学チャネルのループとを有する。底部が開いた９６個の流体流出口が、部分Ｂまたは打ち抜いた接着膜の底部に設けられている。微細構造を有するポストが、上記流入口と上記流出口とに接続されている流体光学チャネルのループに規則正しく配置されている。いくつかの実施形態において、上記プレートの底面積、高さ、底部、および外側フランジは、ＡＮＳＩ（米国規格協会）／ＳＬＡＳ（ラボラトリオートメーション・スクリーニング協会）における９６ウェルのプレートの規格に適合する。測定中、試薬および試料は上記流入口から加えられ、その後、ループチャネルを通って流れ、最終的に、ウィッキングまたは差圧によって上記流出口から排出される。光信号は、標準のマイクロプレートリーダーを調整することなく、チャネルのループの中央で検出することができる。
【００２１】
各流体光学モジュールの寸法は、本開示中の寸法から変更して小さく、または大きくすることができる。いくつかの実施形態において、任意の反射層で、検出の反対側のプレートの表面が被覆されている（これにより、例えば、光学検出効率を向上させる）。
【００２２】
この設計には、以下の利点がある。（１）標準のウェルプレートリーダーと完全に互換性がある。（２）微細構造を有するポストにより、表面積対体積比率および／または質量輸送率が増加して、その結果、分析物を捕捉する効率が向上し、捕捉される分析物の総数が増加し、感度が強まる。（３）貫流設計により、試料（溶液）の添加および除去が容易になり、アッセイ時間の減少を図ることができる。（４）発せられた光の一部は、信号収集を増強し、それゆえに感度を増強する、微細構造を有するポストの長手方向に沿って誘導され、蓄積される。（５）（任意）収集効率を、上記プレートの外面における反射性のコーティングまたは反射性の鏡を使用して、さらに増加させることができる。
Ｉ．プレート
図１Ａ〜Ｆに、マイクロポストアレイ埋め込み型流体光学多重井戸プレートを示す。いくつかの実施形態において、プレートは、標準の円形ウェルとして示されているが、他の形状および大きさのウェルも具体的に検討されている（例えば、ＡＮＳＩ規格よりも大型もしくは小型のウェル、または、正方形もしくは抽象的な形状のウェル）。図には、（１）漏斗型ウェルを取り付けたマイクロポストアレイ埋め込み型流体光学モジュール、すなわち部分Ａと、（２）ドレイン穴、または、打ち抜き穴を有する接着膜、すなわち部分Ｂと、を示す。流体光学流出口３４（図３）は、ドレイン穴４４（図４）とよく位置合わせされている。プレートの底面積、高さ、底部、および外側フランジ、ならびにウェルの位置および寸法は、ＡＮＳＩ（米国規格協会）／ＳＬＡＳ（ラボラトリオートメーション・スクリーニング協会）の１−２００４、２−２００４、３−２００４、および４−２００４にそれぞれ適合する。よって、上記プレートは、あらゆる標準のプレートリーダーと互換性がある。プレートの基部の底面の長さおよび幅の外形寸法は、それぞれ５．０２９９インチおよび３．３６５４インチである。上記プレートの高さは、０．５６５インチである。上記プレートは、縁辺のスカート部４２と、上面３８と、マイクロポストアレイ埋め込み型流体光学チャネル３６に取り付けられた漏斗型ウェル３２のアレイとを有する（図３）。検出範囲５６は、標準のマイクロプレートリーダーの励起・収集位置に、１２行、８列で配置されている。隣接する検出範囲のそれぞれの中心は、互いから０．３５４２インチ離れている。流体光学の９６ウェルは、本開示に記載の方法と同様の方法で、あらゆるカスタマイズした数のウェルの形式に採用することができる。いくつかの実施形態において、部分Ａおよび部分Ｂは、射出成形によって形成され、プラスチック（例えば、ポリスチレン、ＰＭＭＡ（ポリ（メタクリル酸メチル）））からなる。いくつかの実施形態において、これらの部分は、互いに接合され、接着膜もしくは接着剤を用いて、または超音波プラスチック溶接技術もしくは他の好適な方法を使用して、密閉されている。
【００２３】
流入口３２は、いくつかの実施形態において漏斗形状で示されているが、他の形状も具体的に検討されいてる。上記流入口は、図５Ａに示すような漏斗形状、円柱状、三角形、逆さ漏斗形状、または他の構成であってもよい。試薬、試料などを上記ウェルに入れることが可能ないかなる構成も、利用することができる。
【００２４】
図２Ａ、図２Ｂ、および図２Ｃは、本開示の分解斜視図、斜視図、および隠れ線を付した斜視図を示す。部分Ａと部分Ｂとは、図２Ａに示すように積み重ねられ、位置合わせされ、その後、図２Ｂに示すように互いに接合される。９６個の個々の流体光学モジュール２２のアレイは、図２Ｃに見ることができる。
【００２５】
図３Ａは、部分Ａの等角図であり、図３Ｂは部分Ａの底面図である。流体光学モジュールのアレイは、１２行、８列で配置されている。隣接するモジュールのそれぞれの中心は、互いから０．３５４２インチ離れている。各モジュールは、漏斗型ウェル３２を有しており、この漏斗型ウェル３２は、深さが０．１１８インチであり、入口における直径が０．１１８インチであり、マイクロチャネル３６の入口の隣りに位置する出口における直径が０．０３９インチである。上記マイクロチャネルは、特定の大きさおよび形状には制限されない。いくつかの実施形態において、上記チャネルは、輪状、楕円形、正方形、または他の形状であり、直径がおよそ０．００１〜０．１インチである。いくつかの実施形態において、マイクロチャネルは、Ｕ字形またはＳ字形の曲線状に連続して（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、５０、またはそれ以上）配置されているが、応用対象によっては他の構成についても具体的に検討されている。上記マイクロポストアレイ埋め込み型ループ流体光学チャネル３６のもう一方の端部は、直径が０．０２インチの開口３４を有している。空間およびアッセイ構成に基づいて、他の大きさが具体的に検討されている。部分Ａの上層の漏斗型ウェル３２によって、対応する流体光学チャネル３６に試料／試薬が簡単、便利、かつ効率的な方法で送達される。
【００２６】
図４Ａは、部分Ｂの等角図であり、図４Ｂは部分Ｂの底面図である。スキット部４２の部分Ｂは、あらゆる標準のプレートリーダーに適合する。高さ０．０７８インチ、内径０．０２インチ、外径０．０５９インチの円柱状の管４４が、１２行、８列で配置されている。上記円柱状の管４４は、部分Ａの流体出口開口と位置合わせされている。
【００２７】
図５Ａは、マイクロポストアレイ埋め込み型流体光学モジュール２２の模式的な詳細である。試料および試薬は、漏斗型ウェル３２からマイクロポストアレイ埋め込み型ループ流体光学チャネル３６を通って流れることができる。それらの流体は、開口３４および円柱状の管４４または打ち抜き穴を有する接着膜から、ウィッキングまたは差圧を用いて除去することができる。光信号は、標準のマイクロプレートリーダーの光学的な励起・収集位置の流体光学ループ５６の中心で取得することができる。図５Ｂは、ループ流体光学チャネル３６の部分５２におけるマイクロポストアレイ埋め込み型流体光学チャネルの詳細である。流体光学チャネル３６の深さおよび幅は、それぞれ０．００８インチおよび０．００８インチである。隣接する２つのチャネルの間には、厚さ０．００８インチの壁が存在する。チャネル３６には、直径０．００２インチ、高さ０．００８インチ（チャネル３４の深さと同じ）のマイクロポスト５４が、０．００３インチ離れて位置している。上記チャネルの深さおよび幅の所望の範囲、上記ポストの高さおよび直径の所望の範囲、ならびに上記ポストの所望の配置（例えば、実施例を参照）は、製造可能性および用途に基づいて調整される。
【００２８】
複数のポスト５４を示す。本開示は、上記ポストの数、大きさ、または形状に制限されない。いくつかの実施形態において、各チャネル３６は、１０〜１０００（例えば、２０〜７５０、５０〜５００、または５０〜２５０）のポスト５４を有する。いくつかの実施形態において、上記ポスト５４は、円柱状、角柱、矩形、台形、または他の形状を有する。いくつかの実施形態において、上記ポスト５４は、直径がおよそ０．００２〜０．００４インチであり、高さがおよそ０．０００２〜０．００８インチであるが、他の大きさも具体的に検討されいてる。いくつかの実施形態において、上記ポストは、アッセイ試薬（例えば、抗体または核酸）のための追加の結合箇所を提供することにより、アッセイの感度を増加させる役割を果たす。
【００２９】
図６Ａおよび６Ｂは、組み立てが完了したマイクロポストアレイ埋め込み型流体光学多重井戸プレートの外観を示す上部斜視図および底部斜視図である。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本開示は、単独の、またはアッセイを行なうための試薬（例えば、核酸プライマーおよびプローブ、抗体、検出試薬、緩衝剤、試験化合物、対照など）と組み合わせた、装置（例えば、アッセイプレート）を含むシステムおよび／またはキットを提供する。いくつかの実施形態において、システムおよびキットは、高スループット解析のためにロボット工学を利用する（例えば、試料取り扱いおよび分析（例えば、プレートリーダー）機器）。いくつかの実施形態において、システムは、検出用構成要素（例えば、プレートリーダーおよび分光光度計）をさらに含む。
ＩＩ．用途
本開示のあるいくつかの実施形態のアッセイプレート装置には、様々な用途がある（例えば、診断、スクリーニング、および研究用途）。いくつかの実施形態において、試料（例えば、生体試料）中の分析物の存在を確認するためにアッセイを行なう。様々な核酸・アミノ酸検出アッセイを上記アッセイプレートで行なうことができる。例示的なアッセイを以下に記載する。
【００３１】
いくつかの実施形態において、試薬（例えば、捕捉核酸または抗体）が、試料流入口を通って添加される。試薬は、その後マイクロポストおよびチャネル壁に付着する。次に、試料（例えば、分析物の含有が疑われる試験試料）が上記流入口を介して添加される。過剰な試薬が、流出口を介して除去される。アッセイが完了すると、プレートリーダーまたは分光器を使用して、ウェルによってチャネル結果のアッセイを視覚化する。いくつかの実施形態において、コンピュータシステムおよび／またはコンピュータソフトウェアを使用して、アッセイ結果（例えば、試験試料中の分析物の存在）を確認し、ユーザインタフェース（例えば、コンピュータスクリーン、タブレット、スマートフォンなど）を介してユーザに報告する。いくつかの実施形態において、上記結果は、研究、診断、または治療方針の決定において使用される。
【００３２】
説明のための非限定的なイムノアッセイの例には、免疫沈降、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、免疫細胞化学、免疫クロマトグラフィ、フローサイトメトリー、および免疫ＰＣＲを含むが、これらには制限されない。当業者には既知の種々の技術を使用して検出可能に標識された、多クローン性または単クローン性の抗体（例えば、比色分析、蛍光、化学発光、または放射性の標識）は、上記イムノアッセイでの使用に好適である。
【００３３】
免疫沈降は、溶液から抗原を、その抗原に特異的な抗体を使用して沈降させる技術である。このプロセスは、特定のタンパク質または複合体に含まれていると信じられているタンパク質を標的にすることにより、細胞抽出物に存在するタンパク質またはタンパク質複合体を同定するために用いることができる。上記複合体は、プロテインＡおよびプロテインＧなどの細菌から初めに単離された、不溶性の抗体結合タンパク質によって溶液から取り出される。上記抗体は、溶液から容易に単離することができるセファロースビーズと連結することもできる。洗浄後、沈降物は、質量分析、ウェスタンブロット法、または、複合体の構成要素を同定するための、数多くの他の方法を用いて分析することができる。
【００３４】
ウェスタンブロット法、すなわち免疫ブロットは、組織ホモジェネートまたは抽出物の一定の試料中のタンパク質を検出する方法である。この方法は、ゲル電気泳動を利用して、質量基準で変性タンパク質を分離する。タンパク質は、その後、ゲルから膜（一般的には、ポリビニルジフルオライドまたはニトロセルロース）上に取り出され、そこで注目しているタンパク質に特異的な抗体を使用してプローブされる。その結果、研究者は、一定の試料中のタンパク質の量を調べ、いくつかの群の間のレベルを比較することができる。
【００３５】
ＥＬＩＳＡは、酵素結合免疫吸着検定法の略語であり、試料中の抗体または抗原の存在を検出する生化学的な技術である。少なくとも２種類の抗体を利用するが、そのうちの１種類は抗原に特異的であり、もう１種類は酵素に結合される。２つ目の抗体は、発色性または蛍光発生的な基材に信号を生成させる。ＥＬＩＳＡの種類には、サンドイッチＥＬＩＳＡ法、競合ＥＬＩＳＡ法、およびＥＬＩＳＰＯＴが含まれる。ＥＬＩＳＡを行なうことで、試料中の抗原の存在または抗体の存在を評価することができるため、血清抗体濃度の測定と、抗原の存在の検出との両方に有用な手段である。
【００３６】
免疫組織化学および免疫細胞化学は、それぞれ、組織または細胞中の抗原がそれぞれの抗体と結合する原理によって、組織切片または細胞中のタンパク質を局在化させるプロセスを指す。発色する、または蛍光のタグによって抗体にタグをつけることにより、可視化を可能にする。色タグの典型的な例には、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼが含まれるが、これらには限定されない。フルオロフォアタグの典型的な例には、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）が含まれるが、これらには限定されない。
【００３７】
フローサイトメトリーは、流体の流れの中で浮遊させている微小な粒子または細胞を数え、調べる、さらに任意で分類するための技術である。この技術によって、光学／電子検出装置を通って流れる単一の細胞の物理的および／または化学的特色を同時に多パラメターで分析することが可能になる。単一の周波数または色を有する光線（例えば、レーザ光線）を、流体力学的に集束する流体の流れの上に誘導する。いくつかの検出器が、上記流れが光線を通過する箇所に向けられている。１つは、上記光線と直列であり（前方散乱、ＦＳＣ）、いくつかはそれと垂直である（側方散乱（ＳＳＣ）、さらに１または複数の蛍光検出器）。上記光線を通過する各浮遊粒子は、上記光をあるかたちで散乱させ、上記粒子内の蛍光性化学物質が励起させて、光源よりも低い周波数で光を発光させてもよい。散乱光と蛍光の組み合わせは、上記検出器によって拾われ、各検出器で１つの蛍光発光ピークについて明度の変動を分析することにより、個々の粒子の物理的および化学的構造についての種々の事実を推定することが可能なとなる。ＦＳＣは、細胞体積と相関し、ＳＳＣは、粒子の密度または内部複雑度と相関する（例えば、核の形状、細胞質顆粒の量および種類、または膜の粗さ）。
【００３８】
免疫ポリメラーゼ連鎖反応（ＩＰＣＲ）は、核酸増幅技術を利用して、抗体を用いたイムノアッセイにおいて信号発生を増加させるものである。タンパク質においてＰＣＲに相当するものが存在しない、つまり、タンパク質は、ＰＣＲ中に核酸が複製されるのと同じようには複製できないので、検出感度を増加させる唯一の方法は、信号増幅である。標的タンパク質は、オリゴヌクレオチドと直接的または間接的に共役した抗体と結合する。結合していない抗体は洗い流されて、残りの結合した抗体は、増幅されたオリゴヌクレオチドを有している。タンパク質の検出は、リアルタイムの方法を含む標準の核酸検出方法を用いて、増幅されたオリゴヌクレオチドを検出することで行われる。
【００３９】
本明細書において説明されているアッセイプレートで行なうことができる例示的な核酸検出方法は、配列決定アッセイ、増幅アッセイ、およびハイブリダイゼーションアッセイを含むが、これらには限定されない。
【００４０】
説明のための非限定的な核酸配列決定技術の例には、連鎖停止剤（サンガー）配列決定方法、ダイターミネーター配列決定方法、または高スループット配列決定方法が含まれるが、これらには限定されない。本開示は、いかなる特定の配列決定方法に制限されることも意図しない。ＲＮＡは、細胞内で安定度が低く、実験ではヌクレアーゼの攻撃をより受けやすいので、ＲＮＡは、普通は配列決定前にＤＮＡに逆転写することは、当業者であれば認識するであろう。
【００４１】
いくつかの実施形態において、上記配列決定は、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社が開発したリアルタイム単一分子配列決定システムである（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５５：６４１〜６５８、２００９；ＭａｃＬｅａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、７：２８７〜２９６；米国特許第７，１７０，０５０号；米国特許第７，３０２，１４６号；米国特許第７，３１３，３０８号；米国特許第７，４７６，５０３号；これらのすべてを本願に引用して援用する）。このシステムは、直径５０〜１００ｎｍの反応ウェルを使用し、およそ２０ゼプトリットル（１０×１０−２１Ｌ）の反応体積を取り囲む。配列決定反応は、固定化した鋳型、修正ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、および高い局所濃度の蛍光標識されたｄＮＴＰを用いて実施する。高い局所濃度および連続的な反応条件によって、レーザ励起、光導波路、およびＣＣＤカメラを用いることで、蛍光信号検出によって、取り込み現象をリアルタイムで捕捉することが可能になる。
【００４２】
蛍光に基づく配列決定方法を含む、他の数多くのＤＮＡ配列決定技術を用いることができる（例えば、Ｂｉｒｒｅｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ＤＮＡ、１、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク；その全体を本願に引用して援用する）。いくつかの実施形態において、関連する技術分野で理解されている自動化された配列決定技術が利用される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ塩基配列決定は、平行オリゴヌクレオチド伸長によって達成される（例えば、Ｍａｃｅｖｉｃｚらの米国特許第５，７５０，３４１号およびＭａｃｅｖｉｃｚらの米国特許第６，３０６，５９７号を参照。これらの両方の全体を本願に引用して援用する）。配列決定技術の追加の例には、チャーチポロニー技術（Ｍｉｔｒａら、２００３、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２０、５５〜６５；Ｓｈｅｎｄｕｒｅら、２００５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９、１７２８〜１７３２；米国特許第６，４３２，３６０号、米国特許第６，４８５，９４４号、米国特許第６，５１１，８０３号。これらの全体を本願に引用して援用する）、４５４社☆ピコタイターピロシーケンス技術（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓら、２００５  Ｎａｔｕｒｅ  ４３７、３７６〜３８０；ＵＳ２００５０１３０１７３；これらの全体を本願に引用して援用する）、Ｓｏｌｅｘａ単一塩基添加技術（Ｂｅｎｎｅｔｔら、２００５、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ、６、３７３〜３８２；米国特許第６，７８７，３０８号、米国特許第６，８３３，２４６号；これらの全体を本願に引用して援用する）、Ｌｙｎｘ超並列シグネチャー配列決定技術（Ｂｒｅｎｎｅｒら（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：６３０〜６３４；米国特許第５，６９５，９３４号；米国特許第５，７１４，３３０号；これらの全体を本願に引用して援用する）、および、ＡｄｅｓｓｉＰＣＲコロニー技術（Ａｄｅｓｓｉら（２０００）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８、Ｅ８７；ＷＯ０００１８９５７；この全体を本願に引用して援用する）が含まれる。
【００４３】
「次世代の配列決定」技術と呼ばれる一組の方法が、サンガー配列決定方法およびダイターミネーター配列決定方法の代方法として登場した（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５５：６４１〜６５８、２００９；ＭａｃＬｅａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、７：２８７〜２９６；それぞれの全体を本願に引用して援用する）。次世代の配列決定（ＮＧＳ）方法は、それ以前の配列決定方法と比較して費用を低く抑えることを目的として、超並列かつ高スループットの方針を共通の特徴として有している。ＮＧＳ方法は、鋳型の増幅を必要とするものとそうでないものとに大まかに分けることができる。増幅を必要とする方法には、４５４社の技術プラットホームとしてロシュ社によって商用化されたピロシーケンス（例えば、ＧＳ  ２０およびＧＳ  ＦＬＸ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社によって商用化されたＳｏｌｅｘａプラットホーム、および、アプライドバイオシステム社によって商用化されたＳｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）プラットホームが含まれる。非増幅手法（単一分子配列決定としても知られている）の例としては、Ｈｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社によって商用化されたＨｅｌｉＳｃｏｐｅプラットホーム、ならびに、ＶｉｓｉＧｅｎ社、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、および、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のそれぞれによって商用化された新興のプラットホームがある。
【００４４】
ピロシーケンス（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５５：６４１〜６５８、２００９；ＭａｃＬｅａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、７：２８７〜２９６；米国特許第６，２１０，８９１号、米国特許第６，２５８，５６８号：それぞれの全体を本願に引用して援用する）では、鋳型ＤＮＡは断片化され、末端が修復され、アダプターと連結し、上記アダプターと相補的なオリゴヌクレオチドを担持したビーズを用いて単一の鋳型分子を捕捉することにより、同じ位置でクローン的に増幅される。単一の種類の鋳型を担持した各ビーズは、油中水型の微小胞内に区分され、鋳型は、エマルジョンＰＣＲと呼ばれる技術を用いてクローン的に増幅させる。エマルジョンは増幅後に乱され、ビーズは、配列決定反応の間、流動セルとして機能するピコタイタープレートの個々のウェル内に沈着する。配列決定酵素とルシフェラーゼなどの発光性レポーターとの存在下、上記流動セルで、上記４つのｄＮＴＰ試薬のそれぞれを規則正しく、反復して導入する。適切なｄＮＴＰが配列決定プライマーの３’末端に添加された場合、結果としてＡＴＰが生成され、これにより、ウェル内で発光が突如始まり、上記発光はＣＣＤカメラを用いて記録される。４００塩基以上の長さの読み取りが可能であり、１×１０６の配列の読み取りが可能であるため、５億塩基対（Ｍｂ）までの配列を読み取ることができる。
【００４５】
Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ社プラットホーム（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５５：６４１〜６５８、２００９；ＭａｃＬｅａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、７：２８７〜２９６；米国特許第６，８３３，２４６号；米国特許第７，１１５，４００号；米国特許第６，９６９，４８８号；それぞれの全体を本願に引用して援用する）では、配列決定データは、より短い長さの読み取り結果のかたちで生成される。この方法では、単鎖の断片化したＤＮＡの末端が修復されて、５’リン酸化平滑末端が生成され、続いて、単一のＡ塩基の、断片の３’末端に対するクレノウ媒介添加が起こる。Ａ添加により、Ｔオーバーハングアダプターオリゴヌクレオチドの添加が容易になり、上記オリゴヌクレオチドは、引き続き、オリゴヌクレオチドのアンカーが点在する流動セルの表面に鋳型アダプター分子を捕捉するために使用される。上記アンカーは、ＰＣＲプライマーとして使用されるが、上記鋳型の長さと、他の近くのアンカーオリゴヌクレオチドに対する近さのため、ＰＣＲによる延伸は上記分子が覆われる（「ａｒｃｈｉｎｇ  ｏｖｅｒ」）結果となり、隣接するアンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることにより、上記流動セルの表面に橋構造を形成する。これらのＤＮＡのループを、変性させ、切断する。前方の鎖は、その後、可逆性ダイターミネーターとともに配列を形成する。取り込まれたヌクレオチドの配列は、取り込み後の蛍光の検出によって確認されるが、各蛍光体およびブロックは、ｄＮＴＰ添加の次のサイクルに先立って除去される。配列読み取り長さは、３６ヌクレオチドから５０を超えるヌクレオチドまで範囲が及び、全体の出力は、１回の分析につき、１０億ヌクレオチド対を超える。
【００４６】
ＳＯＬｉＤ技術（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５５：６４１〜６５８、２００９；ＭａｃＬｅａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、７：２８７〜２９６；米国特許第５，９１２，１４８号；米国特許第６，１３０，０７３号；それぞれの全体を本願に引用して援用する）を用いた核酸分子の配列決定も、鋳型の断片化、オリゴヌクレオチドアダプターとの連結、ビーズへの付着、およびエマルジョンＰＣＲによるクローン的増幅を伴う。その後、鋳型を担持したビーズがガラス製流動セルの誘導体化した表面に固定化され、アダプターオリゴヌクレオチドと相補的なプライマーがアニールされる。しかしながら、３’延伸のためにこのプライマーを利用する代わりに、プローブに特異的な２つの塩基に続いて６つの変性塩基と４つの蛍光標識のうちの１つとを含有するインテロゲーションプローブとの連結のための５’リン酸基を提供するのに使用される。ＳＯＬｉＤシステムでは、インテロゲーションプローブは、各プローブの３’末端における２つの塩基と、５’末端における４つの蛍光体のうちの１つとの間で、１６の組み合わせが可能である。発光体の色と、よって各プローブの主体性とは、特定された色−空間符号体系に対応する。プローブのアニール、連結、および発光体検出が複数のラウンド（普通は７）行われた後に変性が起こり、その後、最初のプライマーと比べて１塩基だけオフセットするプライマーを用いた塩基配列の２ラウンド目が行われる。この方法では、鋳型の配列は、計算的に再構築することができ、鋳型の塩基は２回呼びかけられ、その結果、精度が増す。配列読み取り長さは、平均で３５ヌクレオチドであり、全体の出力は、１回の配列決定につき、４０億塩基を超える。
【００４７】
あるいくつかの実施形態において、ナノポア配列決定が採用される（例えば、Ａｓｔｉｅｒら、米国化学会誌  ２００６年２月８日；１２８（５）：１７０５−１０、これを本願に引用して援用する）。ナノポア配列決定の背後にある理論は、ナノポアが伝導性の流体に浸漬され、電位（電圧）が印加された時に起こることと関係がある。これらの条件下では、ナノポアを通るイオンの伝導によるわずかな電流も観察することができ、電流の量は、上記ナノポアの大きさに非常に影響されやすい。ＤＮＡ分子（またはＤＮＡ分子の一部）がナノポアを通過する場合、ナノポアを通る電流の大きさを変化させることができ、それにより、ＤＮＡ分子の配列を特定することが可能になる。
【００４８】
あるいくつかの実施形態において、Ｈｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社のＨｅｌｉＳｃｏｐｅが採用される（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５５：６４１〜６５８、２００９；ＭａｃＬｅａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、７：２８７〜２９６；米国特許第７，１６９，５６０号；米国特許第７，２８２，３３７号；米国特許第７，４８２，１２０号；米国特許第７，５０１，２４５号；米国特許第６，８１８，３９５号；米国特許第６，９１１，３４５号；米国特許第７，５０１，２４５号；それぞれの全体を本願に引用して援用する）。鋳型ＤＮＡは断片化され、３’末端がポリアデニル化され、最終的なアデノシンは蛍光標識を担持することになる。変性したポリアデニル化鋳型断片は、流動セルの表面でポリ（ｄＴ）オリゴヌクレオチドと連結する。捕捉ｓれた鋳型分子の最初の物理的な位置は、ＣＣＤカメラによって記録され、その後、標識は切断され、洗い流される。配列決定は、ポリメラーゼの添加および蛍光標識されたｄＮＴＰ試薬の連続添加によって達成される。取り込み現象は、ｄＮＴＰに対応する発光信号をもたらし、信号は、ｄＮＴＰ添加の各ラウンドの前にＣＣＤカメラによって捕捉される。配列読み取り長さは、２５〜５０ヌクレオチドの範囲であり、全体の出力は、１回の分析につき１０億ヌクレオチド対を超える。
【００４９】
あるいくつかの実施形態において、イオントレント技術（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を採用して、精製した標的核酸配列を配列決定する。イオントレント技術は、ＤＮＡの重合中に放出される水素イオンの検出に基づくＤＮＡの塩基配列決定方法である（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７（５９７０）：１１９０（２０１０）；米国特許出願公開第２００９００２６０８２、２００９０１２７５８９、２０１００３０１３９８、２０１００１９７５０７、２０１００１８８０７３、および２０１００１３７１４３、すべての目的のためにこれらの全体を引用して援用する）。マイクロウェルは、配列決定される鋳型ＤＮＡ鎖を含んでいる。マイクロウェルの層の下には、超高感度のＩＳＦＥＴイオンセンサが設けられている。すべての層が、ＣＭＯＳ半導体チップ内に含んでいる。これは、エレクトロニクス産業で使用されるものと同様である。ｄＮＴＰが、成長する相補的な鎖に組み込まれると、水素イオンが放出され、これにより、超高感度のイオンセンサが作動する。ホモポリマーリピートが鋳型配列に存在する場合、複数のｄＮＴＰ分子が単一のサイクルに組み込まれる。これにより、対応する数の水素原子が放出され、比例してより高い電子信号が生成される。この技術が他の配列決定技術と異なる点は、改変されたヌクレオチドおよび光学系が使用されない点である。イオントレント配列決定法の塩基ごとの精度は、５０塩基の読み取りで〜９９．６％であり、１回の実行で〜１００Ｍｂが生成される。読み取り長は、１００塩基対である。長さ５ホモポリマーリピートでの精度は、〜９８％である。イオン半導体配列決定の利点は、速い配列決定スピードと、低い初期・運転費用である。
【００５０】
本開示での使用に適合させることができる、他の例示的な核酸配列決定手法は、Ｓｔｒａｔｏｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社によって開発され、エクスパンドマーの使用を伴う。この配列決定プロセスは、一般的に、鋳型に誘導される合成によって生成された娘鎖を提供することを含んでいる。娘鎖は、個々のサブユニットがテザーと、少なくとも１つのプローブまたは核酸塩基残基と、少なくとも１つの選択的に切断可能な結合とを含む標的核酸の全部または一部の隣接したヌクレオチド配列に対応する配列に結合された複数のサブユニットを一般に含んでいる。選択的に切断可能な結合が切断されると、上記娘鎖の複数のサブユニットよりも長いエクスパンドマーが生じる。エクスパンドマーは、上記標的核酸の全部または一部の隣接したヌクレオチド配列に対応する配列中の遺伝子情報を解析するためのテザーおよびレポーター要素を一般的に含んでいる。エクスパンドマーのレポーター要素は、その後、検出される。エクスパンドマーに基づく手法についてのさらなる詳細は、例えば、米国特許公報第２００９００３５７７７号に記載されている。
【００５１】
単一分子配列決定の他の新たな方法には、ＶｉｓｉＧｅｎプラットホームを用いた合成によるリアルタイムの配列決定が含まれる（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５５：６４１〜６５８、２００９；米国特許第７，３２９，４９２号、米国特許出願通し番号第１１／６７１９５６号；米国特許出願通し番号第１１／７８１１６６号；それぞれの全体を本願に引用して援用する）。この方法では、固定化した、準備準備されたＤＮＡ鋳型を、蛍光で改変されたポリメラーゼと蛍光アクセプター分子とを使用して鎖延伸し、その結果、ヌクレオチド添加時に検出可能な蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）をもたらす。
【００５２】
説明のための非限定的な核酸ハイブリダイゼーション技術の例には、インサイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、マイクロアレイ、およびサザンまたはノーザンブロットが含まれるが、これらには限定されない。インサイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、ハイブリダイゼーションの一種であり、標識された相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖をプローブとして使用することにより、組織の一部または部分（ｉｎ  ｓｉｔｕ）、または、上記組織が十分に小さい場合は組織全体（全組織標本ＩＳＨ）の特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を局在化させるものである。ＤＮＡ  ＩＳＨは、染色体の構造を特定するために使用することができる。ＲＮＡ  ＩＳＨは、組織切片または全組織標本内で、ｍＲＮＡおよび他の転写物を測定し、局在化させるために使用される。試料細胞および試料組織は、普通は、標的転写物を適所に固定し、プローブのアクセスを増加させるために処理される。プローブは、高温で標的配列にハイブリダイズし、その後、過剰プローブが洗い流される。放射標識、蛍光標識、または抗原標識された塩基で標識されたプローブは、オートラジオグラフィ、蛍光顕微鏡検査、または免疫組織化学的検査によって組織中で局在化および定量化される。ＩＳＨでは、放射能または他の非放射性の標識によって標識された２つ以上のプローブを使用して、２つ以上の転写物を同時に検出することもできる。
【００５３】
説明のための非限定的な核酸増幅技術の例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）が含まれるが、これらには限定されない。ある増幅技術（例えば、ＰＣＲ）では、増幅前にＲＮＡをＤＮＡに逆転写する（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）ことが必要であり、他の増幅技術は、直接的にＲＮＡを増幅する（例えば、ＴＭＡおよびＮＡＳＢＡ）ことは、当業者であれば認識するであろう。
【００５４】
増幅産物は、種々の自己ハイブリダイズ型プローブを使用してリアルタイムに検出してもよい。自己ハイブリダイズ型プローブのほとんどは、ステムループ構造を有している。そのような自己ハイブリダイズ型プローブは、自己ハイブリダイズした状態であるか、標的配列とのハイブリダイゼーションによって変化した状態であるかによって、異なって検出可能な信号を発するように標識されている。非限定的な例として、「分子トーチ」は、自己相補性の別個の領域（「標的結合ドメイン」および「標的閉鎖ドメイン」と呼ばれる）を含む自己ハイブリダイズ型プローブの一種である。これらの領域は、結合領域（例えば、非ヌクレオチドリンカー）によって接続され、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズする。好ましい実施形態では、分子トーチは、長さが１から約２０塩基の単鎖塩基領域を標的結合ドメインに含有し、鎖置換条件下で増幅反応中に存在する標的配列とのハイブリダイゼーションのためにアクセスできる。鎖置換条件下では、完全にまたは部分的に相補的な、分子トーチの２つの相補領域のハイブリダイゼーションが望ましいが、標的配列が存在する場合は別であり、その場合、標的配列は、標的結合ドメインに存在する単鎖領域と結合し、標的閉鎖ドメインの全部または一部を置換することになる。分子トーチの標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインは、検出可能な標識または相互作用する標識の対（例えば、発光性／消光剤）を含んでいる。上記標識は、上記分子トーチが標的配列とハイブリダイズしている場合と、上記分子トーチが自己ハイブリダイズしている場合とで異なる信号が生成されるように配置され、これにより、ハイブリダイズしていない分子トーチの存在下で試験試料中にのプローブと標的の二本鎖の検出が可能となる。分子トーチおよび蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）標識を含む様々な種類の相互作用する標識対は、例えば、米国特許第６，５３４，２７４号および第５，７７６，７８２号に開示されている。それぞれの全体を本願に引用して援用する。
【００５５】
２つの分子間の相互作用を検出することも、例えば、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用してできる（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚら、米国特許第５，６３１，１６９号；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，９６８，１０３号；それぞれを本願に引用して援用する）。フルオロフォア標識は、第１のドナー分子が発する蛍光エネルギーが、第２の「アクセプター」分子の蛍光標識に吸収され、その第２の「アクセプター」分子が吸収したエネルギーによって蛍光を発することができるように選択される。
【００５６】
あるいは、「ドナー」タンパク質分子は、トリプトファン残基の自然の蛍光エネルギーを単に利用してもよい。「アクセプター」分子標識を「ドナー」分子標識と区別できるように、異なる波長の光を発する標識を選ぶ。標識の間のエネルギー移動の効率は、分子間の距離に関係するので、分子の間の空間的関係を評価することができる。分子間で結合が起こる状況では、「アクセプター」分子標識の蛍光発光は最大となるだろう。ＦＲＥＴ結合現象は、関連技術分野において周知の、標準の蛍光測定検出手段によって（例えば、蛍光計を使用して）簡便に測定することができる。
【００５７】
自己相補性を有する検出プローブの他の例は、「分子ビーコン」である。分子ビーコンは、標的相補配列を有する核酸分子と、増幅反応に存在する標的配列がない状態で、閉鎖構造にプローブを保持する親和性対（核酸アーム）と、プローブが閉鎖構造にあるときに相互作用する標識対と、を含んでいる。標的配列と標的相補配列とのハイブリダイゼーションによって、親和性対のメンバーが分離され、これにより、プローブを開放構造に転換する。開放構造への転換は、標識対の相互作用の減少により検出可能である。上記標識対は、例えば、フルオロフォアおよび消光剤（例えば、ＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳ）であってもよい。分子ビーコンは、例えば、米国特許第５，９２５，５１７号および第６，１５０，０９７号に開示されている。これらの全体を本願に引用して援用する。
【００５８】
他の自己ハイブリダイズ型プローブは、当業者には周知である。非限定的な例として、例えば、米国特許第５，９２８，８６２号（その全体を本願に引用して援用する）に開示されているような、相互作用する標識を有するプローブ結合対を、本開示の実施形態の方法での使用に適合させてもよい。一塩基多型（ＳＮＰ）を検出するために使用されるプローブシステムを本発明に利用することも可能である。さらなる検出システムには、「分子スイッチ」が含まれる。分子スイッチは、米国公報第２００５００４２６３８号に開示されている。この全体を本願に引用して援用する。插入色素および／または蛍光色素を含むプローブなどの他のプローブも、本開示の実施形態の増幅産物検出方法に有用である。例えば、米国特許第５，８１４，４４７号（その全体を本願に引用して援用する）を参照のこと。
【００５９】
実験
以下の例は、本開示のあるいくつかの好ましい実施形態および態様を実証し、さらに例証するために提供されるものであり、本開示の範囲を限定するものとは解釈されない。
【実施例１】
【００６０】
流体光学ウェルプレートの製作（幅０．００８×深さ０．００８のチャネルと、直径０．００２のマイクロポストアレイ）
マイクロポストアレイ埋め込み型流体光学多重井戸プレートの部分Ａ（図７Ａ）および部分Ｂ（図７Ｂ）の３×３（３行、３列）のウェルレイアウトを、ポリスチレン材料で射出金型を用いて製造した。あるいは、９個の打ち抜き穴を有する片面接着膜（図７Ｃ）を、さらなる実験のために部分Ｂとして使用した。図８Ａおよび８Ｂに、部分Ａのチャネル内の流体光学モジュールおよびマイクロポストアレイの全体のレイアウトをそれぞれ示す。
【００６１】
光学性能調査：光学検出のバリエーション
光信号検出の変動を評価するために、本開示の流体光学ウェルプレートの性能を、従来の９６ウェルのウェルプレートおよびＯＰＴＩＭＩＳＥＲＴＭウェルプレートと比較した（図１３および１４）。
【００６２】
ＥＬＩＳＡ調査
緩衝液に溶解させた種々の濃度のヒトＩＬ−６を流体光学ウェルプレートを用いて試験した（図１７）。さらなる詳細については、ＥＬＩＳＡプロトコルのセクションを参照のこと。
【実施例２】
【００６３】
流体光学ウェルプレートの製作（幅０．０１８×深さ０．０２２のチャネルと、直径０．００４のマイクロポストアレイ）
マイクロポストアレイ埋め込み型流体光学多重井戸プレートの部分Ａの３×３（３行、３列）のウェルレイアウトを、ポリスチレン材料で射出金型を用いて製造した（図９Ａの正面画像および図９Ｂの背面画像に示すような明澄で透明なウェルプレート、ならびに、図１０Ａの正面画像および図１０Ｂの背面画像に示すような黒色で不透明なウェルプレート）。９個の打ち抜き穴を有する片面接着膜（図７Ｃ）を、さらなる実験のために、流体光学ウェルプレートのこれらの部分Ａとともに部分Ｂとして使用した。図１１に、部分Ａのチャネル内のマイクロポストアレイを示す。Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒを３×３のウェルプレートに適合させるために、図１２に示すような、３Ｄ印刷ウェルプレートを使用した。
【００６４】
光学性能調査：チャネルの大きさに依存
本開示の流体光学ウェルプレートの光学的な性能を評価するために、７種類の異なるチャネルサイズ（図１５）を、材料および方法のセクションに記載したように、メタノールに溶解させたローダミン  ６Ｇ（Ｒ６Ｇ）を用いて調査した。加えて、明澄で透明なポリスチレン製流体光学ウェルプレートおよび黒色で不透明なポリスチレン製流体光学ウェルプレートの光学的なクロストークを分析した（図１６）。
【００６５】
ＥＬＩＳＡ調査
緩衝液に溶解させた種々の濃度のヒトＩＬ−６および血清を、流体光学ウェルプレートを用いて、以下の２種類の検出方法によって試験した。すなわち、１．明澄で透明なウェルプレートを用いた蛍光検出と、２．黒色で不透明なウェルプレートを用いた化学発光検出である。さらなる詳細については、ＥＬＩＳＡプロトコルのセクションを参照のこと。従来の９６ウェルのプレートを、流体光学ウェルプレートに使用されたものと同じヒトＩＬ−６濃度で、ベンチマーキングのためにＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓの従来のＥＬＩＳＡプロトコルを用いて、試験した（図１８〜２２）。
【００６６】
光学性能調査のための材料および方法
ローダミン  ６Ｇ（Ｒ６Ｇ）粉末（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃２５２４３３）を９９．８％メタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃３２２４１５）に完全に溶解させて、１ｍＭの濃度とした。その後、溶液を順次希釈して所望の濃度とした。それらの溶液を、所望の量だけウェルまたはチャネルに充填した。Ｒ６Ｇ溶液１００μＬを従来の９６ウェルのプレートに使用した。Ｒ６Ｇ溶液１０μＬおよび３μＬの両方のをＯＰＴＩＭＩＳＥＲＴＭウェルプレートおよび流体光学ウェルプレートに使用した。
【００６７】
Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（パーキンエルマー  ＥｎＳｐｉｒｅＲ  ２３００）を使用して、蛍光強度を得た。帯域幅＜８ｎｍの励起波長４８０ｎｍ、帯域幅＜８ｎｍの発光波長５５０ｎｍ、および励起フラッシュ強度１００を使用した。蛍光強度の読取り値は、ウェルプレートの上方から取得した。励起チャネルおよび発光チャネルからなる測定ヘッドの高さは、ウェルプレートのそれぞれの種類で最大感度が得られるように調整した。３．８ｍｍ、１１．１ｍｍ、および７．５ｍｍの高さを、それぞれ、従来の９６ウェルのウェルプレート、ＯＰＴＩＭＩＳＥＲＴＭウェルプレート、および流体光学ウェルプレートで使用した。各ウェルプレートの三つ組の試料（３ウェル）を、３回（３度の実行）読み取り、各回におけるウェルの変動係数（ＣＶ）と、各ウェルでの実行のＣＶと、を算出した。
【００６８】
蛍光強度調査に依存するチャネルサイズについては、Ｒ６Ｇ溶液０．５μＭを７種類の異なるチャネルサイズで使用した。（１）幅０．００８×深さ０．００８、（２）幅０．０１２×深さ０．０１２、（３）幅０．０１４×深さ０．０１４、（４）幅０．０１６×深さ０．０１６、（５）幅０．０１８×深さ０．０１８、（６）幅０．０１８×深さ０．０２０、（７）幅０．０１８×深さ０．０２２。
【００６９】
流体光学ウェルプレートの表面改質のための材料および方法
流体光学ウェルプレートは、ポリスチレンから作成された。ポリスチレンは、疎水性の表面性質を有しており、ミクロンサイズのチャネルを通して試薬を流すのは不可能である。したがって、ウェルプレートは、以下の表面改質方法で前処理して、チャネルの表面を親水性とした。
【００７０】
１．プレートを、超音波洗浄器（ＧｅｍＯｒｏ  Ｍｏｄｅｌ：１０ＱＴＨ）で、９９．８％メタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃３２２４１５）を用いて、１５分間洗浄した。
【００７１】
２．プレートを、上記超音波洗浄器で、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて、５分間洗浄した。
【００７２】
３．プレートを、９６％硫酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃７６６４−９３−９）１００ｍＬと、ＮＯＣＨＲＯＭＩＸ（Ｓｉｇｍａ  ＃３２８６９３）５ｇとの混合物を用いて、６０分間処理した。
【００７３】
４．工程２を繰り返した。
【００７４】
５．プレートを、上記超音波洗浄器で、水酸化ナトリウム（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＣＡＳ  １３１０〜７３−２）１ｍｇ／ｍＬを用いて、３０分間洗浄した。
【００７５】
６．工程２を繰り返した。
【００７６】
７．プレートを、ポリエチレンイミン溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃１８１９７８−５Ｇ）０．２ｍｇ／ｍＬを用いて、３０分間保温した。
【００７７】
８．プレートを、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて、５分間洗浄した。
【００７８】
９．プレートを、１％グルタルアルデヒド溶液（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＣＡＳ  登録番号１：１１１−３０−８、ＣＡＳ登録番号２：７７３２−１８−５）を用いて、１５分間保温した。
【００７９】
１０．工程８を繰り返した。
【００８０】
１１．プレートを風乾した。
【００８１】
疎水性表面を親水性表面に変質させる表面改質方法は、プラズマ法および放射法などの他の確立された技術で代替することができる。
【００８２】
試薬準備および流体光学ウェルプレートのＥＬＩＳＡプロトコル
ヒトＩＬ−６  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（ＤＹ２０６）と、ＥＬＩＳＡプレートコーティング緩衝剤（ＤＹ００６）と、洗浄緩衝剤（ＷＡ１２６）と、試薬希釈剤（ＤＹ９９５）とをＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。試薬は、キットのユーザマニュアルに記載されている手順に従って準備した。まず、洗浄緩衝剤と試薬希釈剤との原液をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で希釈して、１×希釈標準溶液を準備した。その後、捕捉抗体希釈標準溶液１２μｇ／ｍＬを、ＰＢＳ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃ＤＹ００６）で希釈することにより準備した。検出抗体希釈標準溶液０．４μｇ／ｍＬを、１×試薬希釈剤で希釈することにより準備した。ヒトＩＬ−６標準物を、１×試薬希釈剤を緩衝媒体および血清として添加することにより希釈して所望の濃度とした。ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識されたストレプトアビジン（ＳＡｖ−ＨＲＰ）希釈標準溶液を、ＤＹ２０６キットのＳＡｖ−ＨＲＰ保存溶液１μＬを１×の試薬希釈剤４０μＬで希釈することにより、適用の直前に準備した。１×の試薬希釈剤（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）をブロッキング溶液として使用した。
【００８３】
ＱｕａｎｔａＲｅｄＴＭ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃１５１５９）を、ＥＬＩＳＡプロトコルの最後の工程で使用して、蛍光を発光させた。蛍光検出のための標準基質溶液を、ＱｕａｎｔａＲｅｄ１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン（ＡＤＨＰ）濃縮物２μｌ、エンハンサー溶液１００μｌ、および上記キットの安定過酸化物溶液１００μｌと室温で混合することにより、適用直前に準備した。化学発光検出の場合、同量のＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｆｅｍｔｏ  Ｌｕｍｉｎｏｌ／ＥｎｈａｎｃｅｒおよびＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＴＭ  ＥＬＩＳＡ  Ｆｅｍｔｏ  ＳｕｂｓｔｒａｔｅキットのＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｆｅｍｔｏ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｐｅｒｏｘｉｄｅを、光学検出工程の直前に室温で混合した。試薬の準備後、ＩＬ−６検出のために以下の手順を使用した。
【００８４】
１．プレートを、１２μｇ／ｍＬ捕捉抗体溶液１０μＬを用いて、１０分間、０．００８インチ×０．００８インチのウェルプレートで（４μｇ／ｍＬ捕捉抗体溶液２０μＬを用いて、６０分間、０．０１８インチ×０．０２２インチのウェルプレートで）保温した。
【００８５】
２．プレートを、１×の洗浄緩衝剤１０μＬを用いて、５分間、０．００８インチ×０．００８インチのウェルプレートで（１×の洗浄緩衝剤２０μＬを用いて、１分間、０．０１８インチ×０．０２２インチのウェルプレートで）洗浄した。
【００８６】
３．プレートを、ブロッキング緩衝剤（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）１０μＬを用いて、１０分間、０．００８インチ×０．００８インチのウェルプレートで（ブロッキング緩衝剤２０μＬを用いて、２９分間、０．０１８インチ×０．０２２インチのウェルプレートで）保温した。
【００８７】
４．プレートを、標準分析物であるＩＬ−６を含有する溶液（１×の試薬希釈剤または血清）１０μＬで充填し、１０分間、０．００８インチ×０．００８インチのウェルプレートで（標準分析物であるＩＬ−６を２０μＬで充填し、１５分間、０．０１８インチ×０．０２２インチのウェルプレートで）保温した。
【００８８】
５．プレートを、１×の洗浄緩衝剤１０μＬを用いて、５分間、０．００８インチ×０．００８インチのウェルプレートで（１×の洗浄緩衝剤２０μＬを用いて、１分間、０．０１８インチ×０．０２２インチのウェルプレートで）洗浄した。
【００８９】
６．プレートを、０．４μｇ／ｍＬの検出抗体溶液１０μＬを用いて、５分間、０．００８インチ×０．００８インチのウェルプレートで（０．１μｇ／ｍＬの検出抗体溶液２０μＬを用いて、１５分間、０．０１８インチ×０．０２２インチのウェルプレートで）保温した。
【００９０】
７．プレートを、１×の洗浄緩衝剤１０μＬを用いて、５分間、０．００８インチ×０．００８インチのウェルプレートで（１×の洗浄緩衝剤２０μＬを用いて、１分間、０．０１８インチ×０．０２２インチのウェルプレートで）洗浄した。
【００９１】
８．プレートを、１×のＳＡｖ−ＨＲＰ溶液１０μＬで充填し、５分間、０．００８インチ×０．００８インチのウェルプレートで（１．５×のＳＡｖ−ＨＲＰ溶液１０μＬを用いて、５分間、０．０１８インチ×０．０２２インチのウェルプレートで）保温した。
【００９２】
９．プレートを、１×の洗浄緩衝剤１０μＬを用いて、５分間、０．００８インチ×０．００８インチのウェルプレートで（１×の洗浄緩衝剤３０μＬを用いて、１分間、０．０１８インチ×０．０２２インチのウェルプレートで）洗浄した。
【００９３】
１０．工程９を繰り返した。
【００９４】
１１．蛍光検出のために、プレートを、ＱｕａｎｔａＲｅｄＴＭの標準基質溶液３μＬで充填し、上記溶液を明澄で透明な０．００８インチ×０．００８インチのウェルプレートに（ＱｕａｎｔａＲｅｄＴＭの標準基質溶液８μＬで充填し、上記溶液を明澄で透明な０．０１８インチ×０．０２２インチのウェルプレートに）静置した。
【００９５】
１２．工程１０の５分後、Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（パーキンエルマー  ＥｎＳｐｉｒｅＲ  ２３００）を使用して、蛍光信号を取得した。上記リーダーは、帯域幅＜８ｎｍの励起波長５５０ｎｍ、帯域幅＜８ｎｍの発光波長６０５ｎｍ、および励起フラッシュ強度１００に設定した。蛍光強度の読取り値は、ウェルプレートの上方から取得した。励起チャネルおよび発光チャネルからなる測定ヘッドの高さは、ウェルプレートで最大感度が得られるように１１．１ｍｍに調整した。
【００９６】
化学発光検出の場合、上記工程１１および１２は、下の工程１１（Ａ）および１２（Ａ）に置き換えられる。
【００９７】
１１（Ａ）．プレートを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＴＭ  ＥＬＩＳＡ  Ｆｅｍｔｏの標準基質溶液８μＬで充填し、上記溶液を黒色で不透明な０．０１８インチ×０．０２２インチのウェルプレートに静置した。
【００９８】
１２（Ｂ）．工程１０の１分後、Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（パーキンエルマー  ＥｎＳｐｉｒｅＲ  ２３００）を使用して、化学発光信号を取得した。化学発光強度の読取り値は、ウェルプレートの下方から取得した。
【００９９】
なお、本開示で報告されている測定はすべて室温で行なわれ、溶液は毛管力を利用して除去した。
【０１００】
結果の算出
データをプロットし、各ＩＬ−６濃度の三つ組の試料（３ウェル）の、平均値と、標準偏差と、変動係数（ＣＶ）と、統計的なＰ値とを算出した。４パラメータ論理（４−ＰＬ）を曲線の当てはめとして使用した。各濃度の異なる信頼水準におけるマージン誤差を、測定回数と、データセットの自由度と、スチューデントのｔの値と、測定した標準偏差とに基づいて算出した。信頼水準（％）は、上記マージン誤差を、ブランク（０ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６）と各濃度との間平均差と比較することにより分類した。
【０１０１】
結果および結論：光学性能
光学検出精度を評価するために、蛍光色素ローダミン  ６Ｇ（Ｒ６Ｇ）溶液をモデル分析物として使用した。図１３に、（１）従来の９６ウェルのプレート、（２）ＯＰＴＩＭＩＳＥＲＴＭウェルプレート、および（３）本開示の実施形態の流体光学ウェルプレートの３つの異なるウェルの種類からなる３つのウェルの、実行ごとの変動を示す（「実行ごと」とは、プレートの同じウェルをプレートリーダーで読み取り、取り出し、その後、押し込み、プレートリーダーで再度読み取ることである。各ウェルについて、上記手順を３回繰り返した）。従来の９６ウェルのプレートおよび流体光学ウェルプレートの変動係数（ＣＶ）はほぼ同じであり、５％を下回る一方、ＯＰＴＩＭＩＳＥＲＴＭウェルプレートのＣＶは、３μＬのＲ６Ｇ中で〜１５から３５％（図１３Ａ）であり、１０μＬのＲ６Ｇ中で〜１５から５０％（図１３Ｂ）である。実際に、ウェルの実行ごとの蛍光発光読取り値は、プレートリーダーシステムの変動以外に、いかなる変動も有さないものである。したがって、９６ウェルのプレートのＣＶは、リーダーの変動によるものである。その結果、９６ウェルのプレートと流体光学プレートとの両方のＣＶはほぼ同じであるから、本開示の実施形態の流体光学ウェルプレートは、いかなる追加の変動をも引き起こさないことが結論づけられた。他方で、ＯＰＴＩＭＩＳＥＲＴＭウェルプレートのＣＶは、他の２つのウェルプレートと比較して３から１０倍高いことが分かった。よって、さらなるＣＶの原因は、プレート自体にある。そのうえ、ＯＰＴＩＭＩＳＥＲＴＭウェルプレートの場合、１０μＬのＲ６Ｇを使用すると、３μＬのＲ６Ｇを使用した場合よりもより多くの変動を引き起こしたが、これは、光学励起・検出経路に位置する流入口により多くのＲ６Ｇが残留することに起因する可能性がある。本開示の実施形態のプレートの設計によって、この問題は一掃される。
【０１０２】
図１４に、３つの異なるウェルの種類を用いた３回の実行の、ウェルごとの変動を示す。従来の９６ウェルのプレートおよび流体光学ウェルプレートの最大ＣＶは、〜５％である。ＯＰＴＩＭＩＳＥＲＴＭウェルプレートの最大ＣＶは、３μＬのＲ６Ｇ中で〜２０％（図１４Ａ）であり、１０μＬのＲ６Ｇ中で〜１００％（図１４Ｂ）である。ここでも、ＯＰＴＩＭＩＳＥＲＴＭウェルプレートの場合に１０μＬのＲ６Ｇを使用すると変動がより多いのは、３μＬのＲ６Ｇを使用した場合よりも、上記流入口により多くのＲ６Ｇが残留することに起因する。その上、ＯＰＴＩＭＩＳＥＲＴＭウェルプレートの渦巻構造によってチャネルサイズが非対称なので、信号の一貫性のために正確な検出位置が必要となる。これに対して、本開示の実施形態の流体光学ウェルプレートにおけるマイクロ流体チャネルが直線的なＵターンである特徴によってチャネルサイズが対称であると、信号変動なしに、光学検出位置の大きな公差を受容する。
【０１０３】
図１５に、７種類の異なるチャネルサイズにおける、同じ濃度（０．５μＭ）のローダミン  ６Ｇ（Ｒ６Ｇ）の蛍光強度を示す。チャネルサイズが大きくなるにつれて、光学検出の深さが増すため、蛍光強度は増加する。０．０１８インチ×０．０２２インチのチャネルでは、０．００８インチ×０．００８インチのチャネルと比較して、強度が３倍を超えた。
【０１０４】
図１６Ａに示すように、蛍光検出においては、明澄で透明な流体光学ウェルプレートを使用した場合、クロストークは観察されなかった（全ウェルで０．２５％未満）。しかしながら、化学発光検出においては、同じ透明なウェルプレートを使用した場合、著しいクロストークが観察された（隣接ウェルで約１０％のクロストーク）（図１６Ｂ）。これに対して、黒色で不透明な流体光学ウェルプレートを使用すると、化学発光検出の場合にクロストークは見られなかった（全ウェルで０．０８％未満）（図１６Ｃ）。
【０１０５】
結果および結論：ＥＬＩＳＡ
表面改質は、チャネルの表面を疎水性から親水性に変化させる、ＥＬＩＳＡの前の重要な工程であり、これにより、試薬が流れることが可能になる。捕捉抗体の固定化および流体光学ウェルプレートのブロッキングには、０．００８インチ×０．００８インチのチャネルで２５分（０．０１８インチ×０．０２２インチのチャネルで９０分間）かかる一方、従来の９６ウェルのプレートでは一晩かかる。流体光学ウェルプレートでのアッセイ時間の合計は、基質の保温を含めて４５分以下である一方、従来の９６ウェルのプレートでは、＃ＤＹ００６キットのユーザマニュアルによると、３００分かかる。本明細書において説明されているプレートでは、従来のウェルプレートと比較して、６倍を超える速さである。そのうえ、流体光学ウェルプレートでは、分析物試料は１０μＬのみ必要であり、従来のＥＬＩＳＡで使用される量の１０倍少ない。加えて、流体光学ウェルプレートでは、表１に示すように、従来のウェルプレートと比較して、試薬（捕捉抗体、検出抗体、ＳＡｖ−ＨＲＰ、およびＱｕａｎｔａＲｅｄＴＭ）の消費が少ない。
【０１０６】
表１：流体光学プレート（０．００８インチ×０．００８インチのチャネルおよび０．０１８インチ×０．０２２インチのチャネル）および従来の９６ウェルのプレートを使用したＩＬ−６のＥＬＩＳＡの比較
【０１０７】
【表１】
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両対数スケールのＩＬ−６の実験結果は、４パラメータ論理（４−ＰＬ）でシミュレートした曲線と非常によく適合している。０．００８インチ×０．００８インチのチャネルの流体光学ウェルプレートの３点プロット（図１７Ａ）と平均プロット（図１７Ｂ）との両方において、上記両対数スケールの７５ｐｇ／ｍＬと２４００ｐｇ／ｍＬとの間で直線的な投影が観察された。図１７Ｃでは、０、３７．５、および６００ｐｇ／ｍＬを除くすべての変動係数が１０％未満である。図１７Ｄに示すように、９．３７ｐｇ／ｍＬおよび１８．７５ｐｇ／ｍＬの２つのＰ値のみが、ブランク（０ｐｇ／ｍＬ）に対してカットオフＰ値（０．０５）を上回っている。よって、それらの２つの濃度は、ブランクと統計的に区別することができない。９．３７ｐｇ／ｍＬ、１８．７５ｐｇ／ｍＬ、および７５ｐｇ／ｍＬの３つのＰ値は、隣接するより低い濃度に対してカットオフＰ値を上回っている。これは、これらの濃度は、隣接するより低い濃度と統計的に区別することができないことを表している（図１３Ｂ）。９５％を超える信頼水準は、３７．５ｐｇ／ｍＬ以上の濃度で見られる（表２）。要約すると、このＩＬ−６のＥＬＩＳＡでは、０．００８インチ×０．００８インチのチャネルを有する流体光学ウェルプレートを用いて、３７．５ｐｇ／ｍＬの検出限界と、３７．５ｐｇ／ｍＬから９６００ｐｇ／ｍＬの間の検出範囲を達成した。
【０１０８】
０．０１８インチ×０．０２２インチのチャネルの場合、緩衝剤を用いたＩＬ−６と血清との両方、および、蛍光検出方法（図１８ＡおよびＢならびに図１９ＡおよびＢ）と化学発光検出方法（図２０ＡおよびＢならびに図２１ＡおよびＢ）との両方で、両対数スケールの９．３７ｐｇ／ｍＬと４８００ｐｇ／ｍＬとの間で、直線的な投影はさらに伸長した。変動係数の大部分は。１０％未満であった（図１８Ｃ、図１９Ｃ、図２０Ｃ、および図２１Ｃ）。
【０１０９】
０．０１８インチ×０．０２２インチのチャネルを有する流体光学ウェルプレートのＰ値は、０．００８インチ×０．００８インチのチャネルと比較して著しく向上した。０．０１８インチ×０．０２２インチのチャネルの、隣接するより低い接続またはブランク（０ｐｇ／ｍＬ）に対するＰ値はすべて０．０５未満である（図１８Ｄ、図１９Ｄ、図２０Ｄ、および図２１Ｄ）。これは静的に有意であり、９．３７ｐｇ／ｍＬから９６００ｐｇ／ｍＬの間のＩＬ−６の濃度は、ブランク（０ｐｇ／ｍＬ）および隣接する濃度と区別可能である（例えば、９．３７ｐｇ／ｍＬに対して１８．７５ｐｇ／ｍＬ）。
【０１１０】
そのうえ、化学発光検出（＞９０％の信頼水準）の緩衝剤の９．３７ｐｇ／ｍＬを除いて、蛍光方法または化学発光方法を用いた緩衝剤または血清中の他の濃度はすべて、９５％を上回る信頼水準を示した（表２を参照）。
【０１１１】
全体として、０．０１８インチ×０．０２２インチのチャネルを使用した蛍光検出方法および化学発光検出方法の両方において、緩衝剤または血清中で、検出限界は９．３７ｐｇ／ｍＬ未満である。０．０１８インチ×０．０２２インチのチャネルの直線的な検出範囲は、４パラメータ論理（４−ＰＬ）の曲線に合わせて最高検出限界である９６００ｐｇ／ｍＬを維持したまま、９．３７ｐｇ／ｍＬから４８００ｐｇ／ｍＬまで増加した。０．０１８インチ×０．０２２インチのチャネルの統計的なＰ値および信頼水準は、０．００８インチ×０．００８インチのチャネルよりもはるかに良い。
【０１１２】
図２２に、緩衝剤中のＩＬ−６および血清を使用した、従来の９６ウェルのプレート（約３００分間のアッセイ時間）と流体光学ウェルプレート（４５分以下のアッセイ時間）とのベンチマーキング分析を示す。蛍光検出方法を用いた場合、緩衝剤（図２２Ａ）と血清（図２２Ｂ）との両方で、従来の９６ウェルのプレートの最高検出限界は１２００ｐｇ／ｍＬであり、流体光学プレートは９６００ｐｇ／ｍＬである。化学発光検出方法の場合、９６ウェルのプレートと流体光学ウェルプレートとの両方が、図２２ＣおよびＤに示すように、同様の傾向を示す。しかしながら、９６ウェルのプレートの最高検出限界は、緩衝剤（図２２Ｃ）と血清（図２２Ｄ）との両方で、およそ４８００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６である。他方で、流体光学ウェルプレートでは、緩衝剤（図２２Ｃ）と血清（図２２Ｄ）との両方で、９６００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６を検出することが可能になっている。
【０１１３】
表２：各濃度の信頼水準（％）の分類
【０１１４】
【表２】
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上記明細書で言及されている出版物および特許はすべて、それらの全体を本願に引用して援用する。説明されている装置、方法、および／またはシステムの種々の変更およびバリエーションは、本開示の範囲および精神から逸脱することなく、当業者にとって明らかであろう。開示内容は、具体的な好ましい実施形態に関して記載されているが、請求項中の開示内容は、そのような具体的な実施形態に不当に制限されるべきではないことが理解される必要がある。実際に、当業者にとって明白な、開示内容を実行する記載された様式の種々の変更は、以下の請求項の範囲内であることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【国際調査報告】
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