(57)【要約】  本発明は抗体のためのエピトープを選択するための特定の新しい方法に関する。また本発明は、タンパク質に対する抗体（例えば、機能性抗体）を産生する方法に関し、その方法は、（ｉ）タンパク質を少なくとも１つのプロテアーゼと接触させることによってタンパク質を限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に供し、前記プロテアーゼの作用によって少なくとも１つの消化型、分解型、又はトランケート型の前記タンパク質及び前記タンパク質から切断された少なくとも１つの表面露出ペプチドを形成することによって、前記タンパク質の抗原性エピトープを同定すること、並びに前記表面露出ペプチドに基づく抗原性エピトープを産生すること、並びに（ｉｉ）前記抗原性エピトープに対する抗体を産生することを含む。また本発明は、抗原性エピトープ及びそのようなエピトープに対する抗体に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質に対する抗体を産生する方法であって、
（ｉ）前記タンパク質を少なくとも１つのプロテアーゼと接触させることによって前記タンパク質を限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に供し、前記プロテアーゼの作用によって少なくとも１つの消化型、分解型、又はトランケート型の前記タンパク質および前記タンパク質から切断された少なくとも１つの表面露出ペプチドを形成し、前記表面露出ペプチドに基づく抗原性エピトープを産生することにより、前記タンパク質の抗原性エピトープを同定すること；および
（ｉｉ）前記抗原性エピトープに対する抗体を産生すること
を含む方法。
【請求項２】
タンパク質に対する抗体を産生する方法であって、
（ｉ）前記プロテアーゼの作用によって少なくとも１つの消化型、分解型、又はトランケート型の前記タンパク質および前記タンパク質から切断された少なくとも１つの表面露出ペプチドを形成し、前記タンパク質を少なくとも１つのプロテアーゼと接触させることによって前記タンパク質を限定的なタンパク質分解又は制限的なタンパク質分解に供すること；および
（ｉｉ）前記ペプチドが前記限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解の間に前記タンパク質から切断若しくは除去された際に、前記タンパク質の生物学的機能の欠如又は著しい変化をもたらす前記タンパク質中の領域にある前記少なくとも１つの表面露出ペプチドで、表面露出エピトープを同定することによって抗原性エピトープを同定すること、又は
バイオインフォマティクス及び／又は前記タンパク質の生物学的機能の既知データに基づいて前記タンパク質内の少なくとも１つの標的領域を選択し、前記少なくとも１つの標的領域にある前記少なくとも１つの表面露出ペプチドのうちで表面露出エピトープを同定することによって抗原性エピトープを同定すること、および
（ｉｉｉ）前記抗原性エピトープに対する抗体を産生すること
を含む方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つのプロテアーゼが、最大で８個または最大で７個または最大で５個の表面露出ペプチド、もしくは、最大で８個または最大で７個または最大で５個の独特の表面露出ペプチドが、タンパク質分解消化材料の試料中の前記プロテアーゼの作用によって前記タンパク質から切断される結果になる条件下で使用され、随意にさまざまな時間及び／又は前記プロテアーゼのさまざまな濃度で随意に複数の試料が順次又は並行して同時に採取又は処理される請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
最大で８個または最大で７個または最大で５個の表面露出ペプチドが前記プロテアーゼの作用によって前記タンパク質から切断されるという結果になる条件下で、前記少なくとも１つのプロテアーゼが使用される請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つのプロテアーゼの動的活性が、試料中で前記表面露出ペプチドが一度に１個又は最大で一度に数個、例えば、一度に最大で８個または最大で７個、または最大で５個切断される程度にまで落とされ、随意に複数の試料が順次又は並行して同時に採取又は処理される請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記切断された表面露出ペプチドが前記少なくとも１つのプロテアーゼと接触した後の出現の順に基づいてランク付けされ、最初に切断されるか、又は前記プロテアーゼの最低濃度で切断される前記表面露出ペプチドが高いランクを与えられ、後に遅れて切断されるか、又は前記プロテアーゼの最高濃度で切断される前記表面露出ペプチドが低いランクを与えられ、随意に、中間に切断される表面露出ペプチドがその出現の順にランク付けされうる請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
抗原性エピトープ開発にランクの高い表面露出ペプチドを選ぶこと及び前記抗原性エピトープに対する抗体を産生することを含む請求項６の方法。
【請求項８】
ランクの高い表面露出ペプチドを選ぶこと、前記表面露出ペプチドに基づく抗原性エピトープを構築すること、及び前記抗原性エピトープに対する抗体を産生することを含む請求項６の方法。
【請求項９】
ランクの高い表面露出ペプチドを選ぶこと、前記表面露出ペプチドを前記タンパク質の定義されている生物学的特性と互いに関係づけること、前記表面露出ペプチドに基づく抗原性エピトープを構築すること、及び前記抗原性エピトープに対する抗体を産生することを含む請求項６の方法。
【請求項１０】
単一のプロテアーゼが、前記タンパク質を消化、分解、及び／又はトランケートするのに使用される請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
複数のプロテアーゼが、前記タンパク質を消化、分解、及び／又はトランケートするのに使用される請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数のプロテアーゼが、１個ずつ順番に使用される、並行して同時に使用される、又は複数のプロテアーゼの単一のカクテル中で使用される請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記複数のプロテアーゼが、オーバーラップする、補完的な、又は独特の表面露出ペプチドを同定するのに使用される請求項１１又は請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記プロテアーゼが、トリプシン、Ａｒｇ−Ｃプロテイナーゼ、Ａｓｐ−Ｎエンドペプチダーゼ、クロストリパイン、グルタミルエンドペプチダーゼ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ｌｙｓ−Ｎ、キモトリプシン、プロテイナーゼＫ、テルモリシン、ペプシン、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、グランザイムＢ、好中球エラスターゼ、プロリン−エンドペプチダーゼ、ブドウ球菌ペプチダーゼＩ、及びトロンビンからなる群より選択される請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記プロテアーゼがトリプシンである請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質が細胞由来のプロテオリポソームに存在する膜タンパク質である請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記プロテオリポソームがフローセルに固定されて膜タンパク質の固定相を作る請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質が、表面に結合しているか、溶液に懸濁されているタンパク質含有脂質小胞にある請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質が、表面に結合しているか、溶液に懸濁されている無傷細胞にある請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質が溶液にある請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記タンパク質がヒトプロテオームのいずれかのタンパク質である請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記タンパク質が、膜結合タンパク質、可溶性タンパク質、細胞外タンパク質、又は細胞内タンパク質である請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記タンパク質が膜タンパク質又は膜関連タンパク質である請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記タンパク質がＴＲＰスーパーファミリーのイオンチャネルである請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記タンパク質がＴＲＰＶ１又はＴＲＰＶ２である請求項２４の方法。
【請求項２６】
前記タンパク質が興奮性アミノ酸受容体である請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質がＮＭＤＡ受容体又はＧタンパク質である請求項２６の方法。
【請求項２８】
前記タンパク質が発がん性タンパク質である請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記タンパク質が、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、及びＨＲＡＳからなる群より選択される発がん性低分子量Ｇタンパク質である請求項２８の方法。
【請求項３０】
前記タンパク質が免疫調節タンパク質である請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記タンパク質が、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＧＩＴＲ、及びＣＤ２０からなる群より選択される請求項３０の方法。
【請求項３２】
前記切断されたペプチドが質量分析を用いて同定される請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記切断されたペプチドがＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて同定される請求項２４の方法。
【請求項３４】
前記生物学的機能が、リガンド又は受容体などの標的に結合する前記タンパク質の能力、前記タンパク質の酵素活性、イオンチャネル活性、トランスポーター活性、並びにインスリン放出などの放出及び取り込み機構からなる群より選択される請求項２〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
抗原性エピトープに対する抗体を産生することが、ハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ技術によって、又は動物を前記抗原性エピトープで免疫することによって行われる請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体がモノクローナル又はポリクローナルである請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１〜３６のいずれか一項の前記方法によって生成される抗体。
【請求項３８】
ＬＬＳＱＤＳＶＡＡＳＴＥＫ（配列番号２）、
ＬＬＳＱＤＳＶＡＡＳＴＥＫＴＬＲ（配列番号３）、及び
ＱＦＳＧＳＬＫＰＥＤＡＥＶＦＫＳＰＡＡＳＧＥＫ（配列番号４）
からなる群より選択されたアミノ酸配列又はそれらに実質的に相同な配列を含むＴＲＰＶ１の抗原性エピトープであって、
前記実質的に相同な配列が、所与のアミノ酸配列と比較して１つ、２つ、若しくは３つのアミノ酸置換または削除を含む配列、又は所与のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列、又は所与のアミノ酸配列の少なくとも６個の連続したアミノ酸を有する配列である抗原性エピトープ。
【請求項３９】
ＬＬＳＱＤＳＶＡＡＳＴＥＫＴＬＲＬＹＤＲＲＳ（配列番号５）及び
ＧＲＨＷＫＮＦＡＬＶＰＬＬＲＥ（配列番号６）
からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むＴＲＰＶ１の抗原性エピトープ。
【請求項４０】
ＬＶＥＮＧＡＤＶＱＡＡＡＨＧＤＦ（配列番号７）のアミノ酸配列又はそれに実質的に相同な配列を含むＴＲＰＶ１の抗原性エピトープであって、
前記実質的に相同な配列が、所与のアミノ酸配列と比較して１つ、２つ、若しくは３つのアミノ酸置換または削除を含む配列、又は所与のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列、又は所与のアミノ酸配列の少なくとも６個の連続したアミノ酸を有する配列である抗原性エピトープ。
【請求項４１】
ＤＧＰＴＧＡＲＬＬＳＱ（配列番号８）及び
ＤＡＥＶＦＫＳＰＡＡＳＧＥＫ（配列番号９）
からなる群より選択されたアミノ酸配列又はそれらに実質的に相同な配列を含むＴＲＰＶ１の抗原性エピトープであって、
前記実質的に相同な配列が、所与のアミノ酸配列と比較して１、２、若しくは３つのアミノ酸置換または削除を含む配列、又は所与のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列、又は所与のアミノ酸配列の少なくとも６個の連続したアミノ酸を有する配列である抗原性エピトープ。
【請求項４２】
ＳＱＤＳＶＡＡＳＴＥＫＴＬ  （配列番号１０）及び
ＳＧＳＬＫＰＥＤＡＥＶＦ  （配列番号１１）
からなる群より選択されたアミノ酸又はそれらに実質的に相同な配列を含むＴＲＰＶ１の抗原性エピトープであって、
前記実質的に相同な配列が、所与のアミノ酸配列と比較して１、２、若しくは３つのアミノ酸置換または削除を含む配列、又は所与のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列、又は所与のアミノ酸配列の少なくとも６個の連続したアミノ酸を有する配列である抗原性エピトープ。
【請求項４３】
ＶＳＰＶＩＴＩＱＲＰＧＤ（配列番号１２）、
ＶＳＰＶＩＴＩＱＲＰＧＤＧＰＴＧＡ（配列番号１３）、
ＬＮＬＨＤＧＱＮＴＴＩＰＬＬＬ（配列番号１４）、
ＹＴＤＳＹＹＫＧＱ（配列番号１５）、
ＳＬＰＳＥＳＴＳＨ（配列番号１６）、
ＥＤＰＧＮＣＥＧＶＫＲ（配列番号１７）、
ＤＲＱＳＡＱＰＥＥＶＹＬＲ（配列番号１８）、及び
ＱＳＡＱＰＥＥＶＹＬＲ（配列番号１９）
からなる群より選択されたアミノ酸又はそれらに実質的に相同な配列を含むＴＲＰＶ１の抗原性エピトープであって、
前記実質的に相同な配列が、所与のアミノ酸配列と比較して１つ、２つ、若しくは３つのアミノ酸置換または削除を含む配列、又は所与のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列、又は所与のアミノ酸配列の少なくとも６個の連続したアミノ酸を有する配列である抗原性エピトープ。
【請求項４４】
ＦＡＰＱＩＲＶＮＬＮＹＲＫＧＴＧ（配列番号２０）、
ＡＳＱＰＤＰＮＲＦＤＲＤＲ（配列番号２１）、
ＬＮＬＫＤＧＶＮＡＣＩＬＰＬＬ（配列番号２２）、
ＣＴＤＤＹＹＲＧＨ（配列番号２３）、
ＬＶＥＮＧＡＮＶＨＡＲＡＣＧＲＦ（配列番号２４）、
ＥＤＰＳＧＡＧＶＰＲ（配列番号２５）、及び
ＧＡＳＥＥＮＹＶＰＶＱＬＬＱＳ（配列番号２６）
からなる群より選択されたアミノ酸又はそれらに実質的に相同な配列を含むＴＲＰＶ２の抗原性エピトープであって、
前記実質的に相同な配列が、所与のアミノ酸配列と比較して１つ、２つ、若しくは３つのアミノ酸置換または削除を含む配列、又は所与のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列、又は所与のアミノ酸配列の少なくとも６個の連続したアミノ酸を有する配列である抗原性エピトープ。
【請求項４５】
請求項３８〜４４のいずれか一項の抗原性エピトープに対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、限定されないが、抗体（例えば、機能性抗体）産生に利用される、標的タンパク質のエピトープを選択するためのいくつかの新しい方法に関する。よって本発明はいくつかの態様において抗体を産生する方法に関する。そのような方法は典型的に、抗原性エピトープの同定及びその抗原性エピトープに対する抗体の産生を含む。また本発明は、抗原性エピトープ及びそのような抗原性エピトープに結合する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
いくつかのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）療法、例えば、ヒュミラ、アバスチン、ハーセプチンで臨床的成果がみられること、並びにアリロクマブ及びエボロクマブなどの、例えば、ＰＣＳＫ９を標的にする新しいコレステロール降下ｍＡｂ治療が有望であることに大きく起因して、抗体治療薬が急成長している。しかし、現在市場にある抗体すべて及び臨床開発の進んだ段階にある抗体はすべて、概して細胞外の標的を対象としており、それらの抗体は一般的にアフィニティー又は結合強度に重点を置いたスクリーニングプラットホームを用いて発見及び開発されている。しかし、細胞内で作用する抗体及び「難しい標的」、すなわち、従来の抗体発見方法論が不成功に終ってきた標的に対する抗体の開発は困難な課題であり、有効な抗体を発見及び開発するための新しい技術の進歩が必要である。細胞内で作用する抗体には、適切な標的臓器の細胞に抗体がインターナリゼーションするための新しい手段もまた必要である。さらに、現在の抗体発見及び開発プラットホームは一般に疾患などの所与の生体系における特定の抗体の働きを予測できる機能的関連、薬理学的関連、及び作用機序関連を欠いている。
【０００３】
今日、成功している抗体治療薬の開発及び発見に向けた戦略はフルサイズモノクローナル抗体に限定されない。タンパク質工学の進歩により、この２０年間に幅広い種類の改変抗体断片が産生されてきた。例えば、Ｆａｂ断片、ＳｃＦｖ断片、ダイアボディ（diabodies）、テトラボディ（tetrabodies）、タンパク質複合体で機能化された抗体断片、及び２つの抗原に結合する二重特異性断片が挙げられる。これらの新しい構築物は、高い特異性及びアフィニティー、深い組織浸透、高い安定性、並びに低い毒性をもつ抗体及び抗体由来生物製剤に開発を試みる際に、かなり大きいツールボックスを提供する。しかし、抗体療法に伴う主要な障害の１つは依然として残る。抗体療法が一般的に細胞外の標的に限定されることである。抗体は大きすぎて、且つ極性がありすぎて細胞膜を通って入ることができない。くわえて、抗体は一般に細胞質基質の還元性環境中で不安定である。細胞内の標的にアクセスするためにいくつかの技術が開発されてきており、例えば、さまざまな輸送媒介物、例えば、トランスフェクション試薬及びタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を用いて細胞膜を横切る抗体の輸送、並びに標的細胞内への直接的な抗体の発現、いわゆる細胞内抗体がある。細胞内抗体は、細胞内抗体の遺伝子配列を細胞内輸送シグナルと融合することによってさまざまな細胞コンパートメントを標的にするように構築することができる。それでもなお、細胞内抗体をコードする遺伝子材料は標的細胞への送達に依然として必要であるので、効率のよい送達ベクターの必要性は細胞内抗体治療の極めて重要なステップである。
【０００４】
ハイブリドーマ技術によるモノクローナル抗体の作製は１９７５年に初めて開発された。簡単に説明すると、哺乳類に対象の抗原を注入して、その免疫応答を誘発する。次いで動物の脾臓から脾細胞を取り出し、その後不死化骨髄腫細胞と融合させる。細胞は単一細胞にまで希釈されて、マルチウェルプレートに分けられる。１個の細胞が各々独立したコロニーを生じるので、単一ウェル中に作製された抗体はモノクローナルであることになる。次のステップは、抗原に結合する最良の候補について、相異なるウェルのすべてをスクリーニングすることである。
【０００５】
フルサイズ抗体と比較した小さい抗体断片の大きな利点は、それらの抗体断片はさまざまな発現系、例えば、大腸菌、酵母、及び哺乳類細胞で作製でき、もはやハイブリドーマ技術を用いた作製に限定されない。これにより、低コストで大量の作製が可能になり、遺伝子的に抗体の特性を改変できる可能性が大きくなる。抗体断片は繊維状ファージの表面にディスプレイすることができ、いわゆるファージディスプレイすることができる。該ディスプレイは所望の抗原に対してスクリーニングされる大きな抗体ライブラリーの作製に使用可能である。スクリーニング手順が抗原に結合する抗体候補を評価する。最初のサイクルでは非特異的に結合するため、数サイクル繰り返されることが多い。ある特定の環境に対して最も好適な候補を見つけるためにスクリーニングサイクルの間の条件は変えることができ、例えば、より安定した抗体は条件の厳しい環境を用いることによって選択することができる。アフィニティーが非常に高い抗体を選択する別の方法は、非常に低い濃度の抗原を用いてスクリーニングを行うことであり、結果としてそのような条件の間に結合できる抗体のみが残る。数社がその会社独自のスクリーニング技術を開発してきており、多くの場合大きな抗体ライブラリーをもっている。例えば、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ社（regeneron.com）又はＡｌｌｉｇａｔｏｒ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社（alligatorscience.se）を参照されたい。
【発明の概要】
【０００６】
１つの態様では、本発明は、
（ｉ）前記タンパク質を少なくとも１つのプロテアーゼと接触させることによって前記タンパク質を限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に供し、前記プロテアーゼの作用によって少なくとも１つの消化型、分解型、又はトランケート型の前記タンパク質及び前記タンパク質から切断された少なくとも１つの表面露出ペプチドを形成し、前記表面露出ペプチドに基づく抗原性エピトープを産生することにより、前記タンパク質の抗原性エピトープを同定すること；および
（ｉｉ）前記抗原性エピトープに対する抗体を産生すること
を含むタンパク質に対する抗体を産生する方法を提供する。
【０００７】
別の態様では、本発明は、
（ｉ）前記プロテアーゼの作用によって少なくとも１つの消化型、分解型、又はトランケート型の前記タンパク質及び前記タンパク質から切断された少なくとも１つの表面露出ペプチドを形成し、前記タンパク質を少なくとも１つのプロテアーゼと接触させることによって前記タンパク質を限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に供すること；および
（ｉｉ）前記ペプチドが前記限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解の間に前記タンパク質から切断若しくは除去された際に、前記タンパク質の生物学的機能の欠如又は著しい変化をもたらす前記タンパク質中の領域にある前記少なくとも１つの表面露出ペプチドで表面露出エピトープを同定することによって抗原性エピトープを同定すること、又は
バイオインフォマティクス及び／又は前記タンパク質の生物学的機能の既知データに基づいて前記タンパク質内の少なくとも１つの標的領域を選択し、前記少なくとも１つの標的領域内にある前記少なくとも１つの表面露出ペプチドで表面露出エピトープを同定することによって抗原性エピトープを同定すること、並びに
（ｉｉｉ）前記抗原性エピトープに対する抗体を産生すること
を含むタンパク質に対する抗体を産生する方法を提供する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、
（ｉ）前記プロテアーゼの作用によって少なくとも１つの消化型、分解型、又はトランケート型の前記タンパク質及び前記タンパク質から切断された少なくとも１つの表面露出ペプチドを形成し、タンパク質を少なくとも１つのプロテアーゼと接触させることによって前記タンパク質を限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に供すること、および
（ｉｉ）前記ペプチドが前記限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解の間に前記タンパク質から切断若しくは除去された際に前記タンパク質の生物学的機能の欠如又は著しい変化をもたらす前記タンパク質中の領域にある前記少なくとも１つの表面露出ペプチドで表面露出エピトープを同定することによって抗原性エピトープを同定すること、又は
バイオインフォマティクス及び／又は前記タンパク質の生物学的機能の既知データに基づいて前記タンパク質内の少なくとも１つの標的領域を選択し、前記少なくとも１つの標的領域内にある前記少なくとも１つの表面露出ペプチドで表面露出エピトープを同定することによって抗原性エピトープを同定すること
を含む抗原性エピトープを同定する方法を提供する。
【０００９】
本発明はタンパク質のアミノ酸配列を検出及び同定する方法に関し、前記アミノ酸配列は良好に露出され、且つ機能的に関連し、少なくともそれらのアミノ酸配列は良好に露出される。よって、我々が「ホットスポット」と呼ぶこれらのアミノ酸配列は、抗体ターゲティング、発見、開発を導く抗原性エピトープとして利用されうる。さらに、これらのアミノ酸配列はタンパク質分解消化後のその出現に基づいて、且つバイオインフォマティクスのデータ又は機能／薬理学的試験から既に既知の機能的な関連に基づいてランク付けることができる。よって、タンパク質分解消化から生じる数個のアミノ酸配列のリストから、（機能及び構造的アーギュメント（ａｒｇｕｍｅｎｔｓ）に基づく）最適なアミノ酸配列を抗原性エピトープ発見及び開発のために選ぶことができる。タンパク質分解消化は、限定条件下で行われる。すなわち、ほんの１個又数個の表面露出ペプチドだけが標的タンパク質から一度に切断される程度でプロテアーゼ又はいくつかのプロテアーゼの活性は非常に低い。すなわち、プロテアーゼは標的タンパク質に結合する抗体についてのドラッガビリティープローブとして使用される。
【００１０】
ある実施形態では、抗体は薬理学的に活性である。別の実施形態では、抗体は薬理学的に活性であり、治療利用に開発される。より具体的に、そのような方法は標的タンパク質のホットスポットエピトープを明らかにするプロテオミクスツールを含む。
【００１１】
本発明の態様では、タンパク質はプロテアーゼ作用を通して消化、分解、及び／又はトランケートされ、良好に露出されたアミノ酸配列はすべて抗原性エピトープ産生に使用され、前記抗原性エピトープに基づいて開発された抗体は、製薬業界で用いられる抗体発見の慣用として、効力、有効性、薬理学的プロフィリング、及び他の試験が試される。
【００１２】
本発明の態様では、タンパク質はプロテアーゼ作用を通して消化、分解、及び／又はトランケートされ、並行して同時に消化、分解、及び／又はトランケートされたタンパク質に関する機能アッセイによって精査され、タンパク質の機能的に重要である領域を明らかにする。関連タンパク質は本明細書において時として標的タンパク質を意味する。
【００１３】
ある実施形態では、標的タンパク質の消化、分解及び／又はトランケーションは並行して同時に行われ、抗体産生ためのエピトープ選択を導く標的タンパク質の機能的に重要である領域を明らかにする。
【００１４】
ある実施形態では、消化、分解、及び／又はトランケーとされたタンパク質並びに天然の標的タンパク質の消化、分解、及び／又はトランケーション、並びに機能アッセイは、タンパク質機能に関する他のバイオインフォマティクスによる事実及び別な方法では既知の事実と組み合わせて、抗体産生ためのエピトープ選択を導く標的タンパク質の機能的に重要である領域を明らかにする。
【００１５】
ある実施形態では、単一のプロテアーゼが標的タンパク質を消化、分解、及び／又はトランケートするのに使用されうる。別の実施形態では、複数のプロテアーゼが標的タンパク質を１個ずつ順番に又は並行して同時に消化、分解、及び／又はトランケートするのに使用されうる。そのようなプロテアーゼとしては、Ａｒｇ−Ｃプロテイナーゼ、Ａｓｐ−Ｎエンドペプチダーゼ、クロストリパイン、グルタミルエンドペプチダーゼ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ｌｙｓ−Ｎ、トリプシン、キモトリプシン、プロテイナーゼＫ、及びテルモリシンが例となるが、これらに限定されない。いくつかのプロテアーゼによって容易に消化される領域はタンパク質の露出領域であるはずで、単一のプロテアーゼによってのみ消化される領域は恐らく、より隠れた領域に位置する。代替的に、プロテアーゼは独特の切断特異性又は／及び物理化学的特性又は／及び構造的特徴をもち、他のプロテアーゼが識別できない標的タンパク質の表面露出ペプチドを識別することができる。よって、複数のプロテアーゼの使用が好ましく、異なるプロテアーゼは各々、表面露出ペプチドが抗原性エピトープとして適しているかについて補完的又は独特の情報を生み出すことができる。
【００１６】
実施形態は、薬理学的研究に使用できる、薬理学的に活性がある抗体の迅速で且つ的確な開発のための新しい方法論／技術を可能にし、例えば、それらの抗体は、例えば、細胞での方法又はインビトロアッセイにおいて生体化合物を検出するツールとして使用することができる。さらに重要なことには、前記抗体はヒト及び動物の疾患を治療するのに使用しうる。実施形態は、可溶性又は膜結合、細胞外又は細胞内のすべてのタンパク質に適用することができる。さらに実施形態は、タンパク質機能の新らたな基本的理解を生むのに利用することができる。
【００１７】
また本発明は、本発明の方法によって産生される抗体を提供する。
また本発明は、本発明の方法によって同定される抗原性エピトープを提供する。
また本発明は、本発明の抗原性エピトープに対する抗体を提供する。
【００１８】
他の本発明の特徴及び利点は以下の詳細な説明から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
添付図面とともに以下の説明を参照することによって実施形態並びにさらなる目的及び利点が良く理解されるであろう。
【図１】５μｇ／ｍｌトリプシンを用いた室温での限定タンパク質分解後にＴＲＰＶ１から検出されたペプチド、ｎ＝６。Ａ：ＴＲＰＶ１の３Ｄモデルに示された検出されたペプチドの位置。ペプチドは０．５分（マゼンタ）、５分（オレンジ）、及び１５分（青）後に検出された。Ｂ：ＴＲＰＶ１の略図に示された検出されたペプチドの位置。ペプチドは０．５分（マゼンタ）、５分（オレンジ）、及び１５分（青）後に検出された。Ｃ：５μｇ／ｍｌトリプシンを用いた限定タンパク質分解後にＴＲＰＶ１から消化され、検出されたペプチドのバープロット、どの時点でそれらのペプチドが確認されたかを示している。
【図２】５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、又は４０μｇ／ｍｌトリプシン（Ｔｒ）への５分間露出後の、ＴＲＰＶ１から消化されたペプチド及びそれらを除去した後の電流応答の変化。Ａ〜Ｃ：ＴＲＰＶ１の消化されたペプチドの位置。フローセル内で消化されたペプチド（シアン）及びフローセル内で消化された後に一晩完全消化されたペプチド（黄）を示す。Ｄ：１μＭ  カプサイシン（Ｃａｐ）で活性化された後にバッファー又はトリプシンのいずれかに５分間供され、カプサイシンでさらに活性化された際のＴＲＰＶ１のインサイド−アウト記録の代表的なトレース。上段から下段に：それぞれ５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、及び４０μｇ／ｍｌトリプシンに５分間供した。図での提示のみを目的として、トレースは１００Ｈｚでデジタル方式フィルター処理を施されている。
【図３】バッファーｎ＝１１又は抗体ｎ＝６のいずれかで処理した後、カプサイシンでの第１の活性化に関する積分の％割合として計算された、カプサイシンでの第２の活性化に関する電流トレース時間積分を示すＴＲＰＶ１機能の電気生理学パッチクランプ記録。データは平均値±ＳＥＭとして提示されている。
【図４】ｈＴＲＰＶ１の表面モデルにおける可視化されたＯＴＶ１の抗原決定基（赤）、ペプチドａａ９６〜１１７の位置。Ａ：各単量体が青色と紫色とで交互に色付けされているＴＲＰＶ１の側面図。Ｂ：各単量体が青色と紫色とで交互に色付けされているＴＲＰＶ１の上面図。
【図５】ｈＴＲＰＶ１の表面モデルにおける可視化されたＯＴＶ２の抗原決定基（赤）、ペプチドａａ７８５〜７９９の位置。Ａ：見やすいように、２個の単量体が省かれているＴＲＰＶ１の側面図。Ｂ：各単量体が青色と紫色とで交互に色付けされているＴＲＰＶ１の底面図。
【図６】ＴＲＰＶ１の発現が有る（Ａ）及び無い（Ｂ）固定細胞でのＯＴＶ１（左）及びＯＴＶ２（右）の局在。ＯＴＶ１及びＯＴＶ２はヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ４８８二次抗体を用いて可視化された。細胞を横切る線分（黒）に沿った強度値が各画像の下に与えられている。異なるレーザー設定がＯＴＶ１とＯＴＶ２とに使用され、それら抗体間の比較はなされるべきではない。
【図７】抗体での処理した後のＴＲＰＶ１機能の電気生理学パッチクランプ記録。Ａ：バッファー（ｎ＝１１）又はＯＴＶ１（ｎ＝６）のいずれかで処理した後、カプサイシンでの第１の活性化に関する積分の％割合として計算された、カプサイシンでの第２の活性化に関する電流トレース時間積分。Ｂ：カルモジュリンのみ（ｎ＝１１）又はカルモジュリン及びＯＴＶ２のいずれかで処理した後、カプサイシンでの第１の活性化に関する積分の％割合として計算された、カルモジュリン（ＣａＭ）及びＯＴＶ２の存在下におけるカプサイシンでの第２の活性化に関する電流トレース時間積分。ＯＴＶ２での処理は、チップ超音波処理の１５分以内の測定（ｎ＝４）とチップ超音波処理チップ超音波処理の３０分以内の測定（ｎ＝７）とに分けられている。データは平均値±ＳＥＭとして提示されている。
【図８】Ａ：カルシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水中のＯＴＶ１でエレクトロポレーション後のＴＲＰＶ１媒介ＹＯ−ＰＲＯ取り込み。上段：ＯＴＶ１の蛍光強度（ｎ＝１１）及び対照（ｎ＝１１）。下段：ＯＴＶ１及び対照の対応蛍光強度率。Ｂ：５０μＭ  Ｃａ2+の存在下においてＯＴＶ２でエレクトロポレーションした後のＴＲＰＶ１媒介ＹＯ−ＰＲＯ取り込み。上段：ＯＴＶ２の蛍光強度（ｎ＝９）及び対照（ｎ＝７）。下段：ＯＴＶ２（緑）及び対照（赤）の対応蛍光強度率。データは平均値±ＳＥＭとして提示されている。
【図９】エレクトロポレーションによる抗体のインターナリゼーションの蛍光を利用した検証。細胞は、エレクトロポレーション、固定、透過処理し、且つヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ４８８二次抗体とインキュベーションした。蛍光強度は共焦点顕微鏡法で測定した。ＯＴＶ１又はＯＴＶ２にいずれかに供した、エレクトロポレーションした細胞とエレクトロポレーションしなかった細胞、及び二次抗体にのみ供した細胞との間で強度を比較した。異なるレーザー設定がＯＴＶ１とＯＴＶ２とに使用され、強度値の比較はなされるべきではない。データは平均値±ＳＥＭとして提示されている。
【図１０】トリプシンを用いた限定タンパク質分解後のＴＲＰＶ１の検出されたペプチド。ＴＲＰＶ１の３Ｄモデルに示された検出されたペプチドの位置。実験の詳細は実施例３に与えられている。最初に消化されたペプチドは黒で示される。のちに遅れて消化されたペプチドは灰色で示される。
【図１１】Ａｓｐ−Ｎを用いた限定タンパク質分解後のＴＲＰＶ１の検出されたペプチド。ＴＲＰＶ１の３Ｄモデルに示された検出されたペプチドの位置。実験の詳細は実施例３に与えられている。最初に消化されたペプチドは黒で示される。のちに遅れて消化されたペプチドは灰色で示される。
【図１２】キモトリプシンを用いた限定タンパク質分解後のＴＲＰＶ１の検出されたペプチド。ＴＲＰＶ１の３Ｄモデルに示された検出されたペプチドの位置。実験の詳細は実施例３に与えられている。最初に消化されたペプチドは黒で示される。のちに遅れて消化されたペプチドは灰色で示される。
【図１３】ペプシンを用いた限定タンパク質分解後のＴＲＰＶ１の検出されたペプチド。ＴＲＰＶ１の３Ｄモデルに示された検出されたペプチドの位置。実験の詳細は実施例３に与えられている。最初に消化されたペプチドは黒で示される。のちに遅れて消化されたペプチドは灰色で示される。
【図１４】プロテイナーゼＫを用いた限定タンパク質分解後のＴＲＰＶ１の検出されたペプチド。ＴＲＰＶ１の３Ｄモデルに示された検出されたペプチドの位置。実験の詳細は実施例３に与えられている。最初に消化されたペプチドは黒で示される。のちに遅れて消化されたペプチドは灰色で示される。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書で提供される説明及び方法論に関連して本発明の前述及び他の態様をより詳細に記載する。本発明はさまざまな形で具体化され、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきはないことが理解されるべきである。むしろ、これらの実施形態は本開示が徹底的且つ完全であり、本発明の範囲を当業者に十分に伝えることになるように提供される。
【００２１】
別に定義されない限り、本明細書で使われる専門用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味をもつ。明細書では、単数形は文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り複数形も含む。本明細書に記載のものと同様又は等価な方法及び材料が本発明の実行又は試験に使用できるが、好適な方法及び材料が下に記載される。本明細書で言及される刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照により組み込まれる。本明細書で引用される参考文献は、特許請求された発明に対する先行技術であることを認めない。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先することになる。くわえて、材料、方法、及び例は説明のためだけであり、限定することを意図されていない。
【００２２】
本明細書で本発明の記載に使用される術語は、特定の実施形態を記載する目的のためであり、本発明を限定することを意図されていない。本発明の実施形態の記載に使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」は、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、複数形も包含することが意図される。また、本明細書では「及び／又は（and/or）」は、１つ以上の関連列挙事項のあらゆる考えられる組み合わせを指し、且つ包含する。さらに、本明細書で「約」という用語は、化合物の量、投与量、時間、温度などの測定可能な値に言及するとき、指定された量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、又はひいては０．１％の変動を包含することを意味する。範囲（例えば、ｘ〜ｙの範囲）が用いられる場合、測定可能な値が約ｘ〜約ｙの範囲又は約ｘ１〜約ｙ１などのその中のいずれかの範囲を意味する。さらに、本明細書で使用される場合、「含む（comprises）」及び／又は「含む（comprising）」という用語は、規定された特徴、整数、ステップ、操作、要素、及び／又は構成要素の存在を特定するが、１つ以上の他の特徴、整数、ステップ、操作、要素、構成要素、及び／又はその群の存在又は追加を排除しないことが理解されるであろう。別に定義されない限り、本明細書で使われる専門用語及び科学用語を含む用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味をもつ。
【００２３】
１つの態様では、本発明はタンパク質に対する抗体を産生する方法を提供し、その方法は、
（ｉ）前記タンパク質を少なくとも１つのプロテアーゼと接触させることによって前記タンパク質を限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に供し、前記プロテアーゼの作用によって少なくとも１つの消化型、分解型、又はトランケート型の前記タンパク質及び前記タンパク質から切断された少なくとも１つの表面露出ペプチドを形成し、前記表面露出ペプチドに基づく抗原性エピトープを産生することにより、前記タンパク質の抗原性エピトープを同定すること；および
（ｉｉ）前記抗原性エピトープに対する抗体を産生すること
を含む。
【００２４】
別の態様では、本発明はタンパク質に対する抗体を産生する方法を提供し、その方法は、
（ｉ）前記プロテアーゼの作用によって少なくとも１つの消化型、分解型、又はトランケート型の前記タンパク質及び前記タンパク質から切断された少なくとも１つの表面露出ペプチドを形成し、前記タンパク質を少なくとも１つのプロテアーゼと接触させることによって前記タンパク質を限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に供すること；および
（ｉｉ）前記ペプチドが前記限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解の間に前記タンパク質から切断若しくは除去された際に、前記タンパク質の生物学的機能の欠如又は著しい変化をもたらす前記タンパク質中の領域にある前記少なくとも１つの表面露出ペプチドで表面露出エピトープを同定することによって抗原性エピトープを同定すること、又は
バイオインフォマティクス及び／又は前記タンパク質の生物学的機能の既知データに基づいて前記タンパク質内の少なくとも１つの標的領域を選択し、前記少なくとも１つの標的領域にある前記少なくとも１つの表面露出ペプチドのうちで表面露出エピトープを同定することによって抗原性エピトープを同定すること、並びに
（ｉｉｉ）前記抗原性エピトープに対する抗体を産生すること
を含む。
【００２５】
代替的に見ると、本発明はタンパク質に対する抗体を産生する方法を提供し、その方法は、
（ｉ）前記タンパク質を少なくとも１つのプロテアーゼと接触させることによって前記タンパク質を限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に供し、前記プロテアーゼの作用によって少なくとも１つの消化型、分解型、又はトランケート型の前記タンパク質及び前記タンパク質から切断された少なくとも１つの表面露出ペプチドを形成すること、および
（ｉｉ）前記タンパク質にとって機能的に重要であるか、又はそうであると予測されるアミノ酸配列を有する切断された表面露出ペプチドを同定することによって抗原性エピトープを同定し、そのような表面露出ペプチドに基づいて抗原性エピトープを産生すること；並びに
（ｉｉｉ）その抗原性エピトープに対する抗体を産生すること
を含む。
【００２６】
別の態様では、本発明はタンパク質に対する抗体を産生する方法を提供し、その方法は、
（ｉ）前記タンパク質を少なくとも１つのプロテアーゼと接触させることによって前記タンパク質を限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に供し、前記プロテアーゼの作用によって少なくとも１つの消化型、分解型、又はトランケート型の前記タンパク質及び前記タンパク質から切断された少なくとも１つのペプチドを形成することによって、前記タンパク質の表面露出ペプチドを同定すること、並びに
（ｉｉ）少なくとも１つの表面露出ペプチドに基づいて線状又は立体構造抗原性エピトープを構築すること、並びに
（ｉｉｉ）その抗原性エピトープに対する抗体を産生すること
を含む。
【００２７】
別の態様では、本発明はタンパク質に対する抗体を産生する方法を提供し、その方法は、
（ｉ）前記タンパク質を少なくとも１つのプロテアーゼと接触させることによって前記タンパク質を限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に供し、前記プロテアーゼの作用によって少なくとも１つの消化型、分解型、又はトランケート型の前記タンパク質及び前記タンパク質から切断された少なくとも１つの表面露出ペプチドを形成することによって、前記タンパク質の表面露出ペプチドを同定すること、および
（ｉｉ）限定タンパク質分解または制限的タンパク質分解の間に、タンパク質から切断または除去され、前記タンパク質の生物学的機能において、欠如又は著しい変化をもたらす、表面露出ペプチドを同定すること、又は
前記表面露出ペプチドのバイオインフォマティクス及び／若しくはタンパク質の生物学的機能の既知データとの関連付けに基づいて、少なくとも１つの同定された（ｉ）の表面露出ペプチドを選択すること、および
（ｉｉｉ）少なくとも１つの表面露出ペプチドに基づいて線状又は立体構造抗原性エピトープを構築すること、並びに
（ｉｖ）その抗原性エピトープに対する抗体を産生すること
を含む。
【００２８】
別の態様では、本発明はタンパク質に対する抗体を産生する方法を提供し、その方法は、
（ｉ）前記タンパク質を少なくとも１つのプロテアーゼと接触させることによって前記タンパク質を限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に供し、前記プロテアーゼの作用によって少なくとも１つの消化型、分解型、又はトランケート型の前記タンパク質及び前記タンパク質から切断された少なくとも１つの表面露出ペプチドを形成することによって、前記タンパク質の抗原性エピトープを同定すること、および
（ｉｉ）その抗原性エピトープに対する抗体を産生すること
を含む。
【００２９】
本発明による抗体を産生する方法は、別の態様では代替的に、タンパク質に特異的に結合する抗体を作製する方法として見られうる。また、本明細書に記載の抗体を産生する方法の例示的且つ好ましい実施形態は、変更すべきところは変更して、タンパク質に特異的に結合する抗体を作製する方法に適用される。
【００３０】
別の態様では、本発明は抗原性エピトープを同定する方法を提供し、その方法は、
（ｉ）プロテアーゼの作用によって少なくとも１つの消化型、分解型、又はトランケート型のタンパク質及びタンパク質から切断された少なくとも１つの表面露出ペプチドを形成し、タンパク質を少なくとも１つのプロテアーゼと接触させることによってタンパク質を限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に供すること、；および
（ｉｉ）ペプチドが前記限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解の間にタンパク質から切断若しくは除去された際に、タンパク質の生物学的機能の欠如又は著しい変化をもたらす前記タンパク質中の領域にある少なくとも１つの表面露出ペプチドで、表面露出エピトープを同定することによって抗原性エピトープを同定すること、又は
バイオインフォマティクス及び／又はタンパク質の生物学的機能の既知データに基づいてタンパク質内の少なくとも１つの標的領域を選択すること、および少なくとも１つの標的領域にある前記少なくとも１つの表面露出ペプチドのうちで表面露出エピトープを同定することによって抗原性エピトープを同定すること
を含む。
【００３１】
随意に、本発明の方法は前記抗原性エピトープに対する抗体を産生するステップをさらに含む。
【００３２】
代替的に見ると、本発明は抗原性エピトープを同定する方法を提供し、その方法は、
（ｉ）プロテアーゼの作用によって少なくとも１つの消化型、分解型、又はトランケート型のタンパク質及びタンパク質から切断された少なくとも１つの表面露出ペプチドを形成し、タンパク質を少なくとも１つのプロテアーゼと接触させることによってタンパク質を限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に供すること、および
（ｉｉ）タンパク質にとって機能的に重要であるか、又はそうであると予測されるアミノ酸配列を有する切断された表面露出ペプチドを同定することによって抗原性エピトープを同定し、そのような表面露出ペプチドに基づいて抗原性エピトープを産生すること
を含む。
【００３３】
随意に、この方法は前記抗原性エピトープに対する抗体を産生するステップをさらに含む。
【００３４】
タンパク質内の表面に露出された機能的に活性なエピトープに関する詳細な知見は、役に立つ抗体の開発の助けとなり、抗体候補の量を減らすことによって複雑なスクリーニング手順の必要性を減少させうる。タンパク質の表面トポロジーを評価するのに可能な方法は、限定及び制御されたタンパク質分解を行うことによってプロテアーゼの活性を制限して、タンパク質の最も柔軟性で且つ表面に露出された部分のみを消化することである。このアイデアは、ペプチドが１つずつ又は一度に最大で数個切断される程度でプロテアーゼ活性のキネティックスを落とすことである。次いで、切断されたペプチドはプロテアーゼに供された後に出現する順序に基づいてランク付けすることができる。最初にタンパク質から切断されるペプチドはタンパク質によって良好に露出され、容易にプロテアーゼによってアクセスすることができる。我々はこれらのペプチドに高いランクを与え、我々は、容易にプロテアーゼによって切断されるペプチドはまた、容易に抗体によって認識されるという仮説をたてた。後に遅れた切断されるペプチドに我々は低いランクを与え、その間のすべてのペプチドに、プロテアーゼに供された後の時間を単位とする出現に基づいて高いスコアから低いスコアを与える。よって、該方法はアミノ酸配列に基づき、配列は我々に既知であるので、抗体が前記標的タンパク質のどこに結合するかが具体的に分かる。第２のステップでは、タンパク質中で標的にされる具体的なアミノ酸配列を知っているので、我々は既報のデータ若しくは既知の他のバイオインフォマティクスデータ又はトランケートされたタンパク質の薬理学的研究から、前記アミノ酸配列の機能的意義を調べることができる。アミノ酸配列が機能的重要性、例えば結合部位、調節部位、構造的に重要な部位、チャネル領域などをもつ既知のアミノ酸配列と一致又は関連又は重複する場合、前記ペプチドは高いスコアを与えられ、抗原性エピトープ及び後の抗体開発の良好な候補と判断される。具体的には、例えば、低い温度、低い濃度、及び／又は短い消化時間を用いてプロテアーゼの活性を制御することによって、これは達成することができる。限定タンパク質分解が既知の構造をもつタンパク質で行われる場合、主に３つの構造決定因子がどこでタンパク質分解活性が起こるかに影響を及ぼすと理解されている。それらは柔軟性、表面露出、及び局所相互作用の数を含む。ペプチド鎖がプロテアーゼ内の活性部位に入るために、柔軟性及びタンパク質が局所的に折り畳み構造をほどく能力が必要とされる。表面における領域はより容易に折り畳み構造がほどけ、且つ立体障害がより少ないという事実に起因して、表面露出はタンパク質分解のための切断部位を与える可能性が高い。水素結合及びジスルフィド架橋の点で局所相互作用の量も重要である。局所相互作用が少ないほうがタンパク質分解に都合がよい。これらの３つの構造決定因子はすべて、通常タンパク質内で互いに関連する。したがって、限定タンパク質分解は、前記タンパク質鎖は局所的に折り畳み構造がほどけうるものとして、主に表面露出領域を切断することになる。限定タンパク質分解は詳細構造が未知のタンパク質の表面露出領域を決定する方法として使用されてきた。
【００３５】
脂質に基づいたタンパク質固定（ＬＰＩ）技術により、柔軟性のある化学を膜タンパク質上で行うことができる。細胞からプロテオリポソームを得て、それをフローセル内に固定することによって、膜タンパク質の固定相が作り出され、それは一連の溶液に数回供され、且つ例えば、酵素によるさまざまなタイプの化学修飾に供することができる。プロテオリポソームの段階的な酵素消化から生じるペプチドを液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）とで分析するプロテオミクスによる特徴付け用の逐次連続トリプシン消化プロトコールが開発されている［１〜３］。
【００３６】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、タンパク質は、プロテオリポソーム（例えば、細胞、例えば、ヒト細胞由来のプロテオリポソーム）中に（例えば、プロテオリポソームの脂質二重層中に）存在するタンパク質（例えば、膜タンパク質）である。したがって、いくつかの実施形態では、限定タンパク質分解はプロテオリポソームで行われる。プロテオリポソームはタンパク質を含む脂質小胞である。プロテオリポソームは精製された膜タンパク質及び脂質から再構築することができるか、又は細胞膜から（例えば、小胞形成を通して）若しくは細胞の溶解を通して直接的に得ることができる。好ましくは、プロテオリポソームは溶解した細胞の細胞膜から得られる（から調製される）。プロテオリポソームはどの対象の細胞タイプからでも得られうる。簡便な細胞タイプはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【００３７】
プロテオリポソームを調製する方法は当該技術分野において公知であり、それらのいずれを使用してもよい（例えば、Jansson et al. Anal. Chem., 2012, 84:5582-5588に記載の方法）。プロテオリポソームを調製する例示的且つ好ましい方法は本明細書で実施例に記載されている。典型的には、直径が約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍのプロテオリポソームが好ましい。
【００３８】
溶解細胞の細胞膜から生じた（調製された）プロテオリポソームを使用することは、（例えば、実施例で言及される方法を用いて）そのようなやり方で調製されたプロテオリポソームは、プロテオリポソームの外側の膜タンパク質の細胞内の部分（又はドメイン）に存在しうるので、そうでなければプロテアーゼにアクセスできないタンパク質のいくつかの部分を蛋白質分解切断（及び結果として抗原性エピトープ同定）に利用可能にするので好ましい。
【００３９】
１つの態様では、我々は、ＬＰＩマイクロフルイディクスプラットフォーム［１、４］を利用して潜在的なエピトープ候補を産生することによって標的抗体技術を開発してきた。これはスクリーニングに基づくよりもむしろ機構に基づいた方法論である。簡単に説明すると、ＬＰＩ技術は限定タンパク質分解などの柔軟性のある化学が膜タンパク質で行わることを可能にする。細胞からプロテオリポソームを得て、フローセル内に固定することによって、膜タンパク質の固定相を作り出す。プロテオリポソームの段階的な酵素消化から生じるペプチドをＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析するプロテオミクスによる特徴付け用の逐次連続消化プロトコールが開発されている。そのようなペプチドは、ＬＰＩフローセル内で速度論的に制御された消化から産生され、標的タンパク質内に露出され且つアクセス可能な領域、抗体結合に利用しされやすい潜在性をもつ領域を明らかにする。さらにこれらの潜在的なエピトープは、優れた結合特性及び生物学的効率をもつ抗体をもたらすことになるエピトープを見出すために既知の機能データに対して関連付けられる。最後に、選ばれたエピトープ／ペプチドは、抗体を作製するためにホスト動物を免疫するのに使用しうることが言及されるべきである。限定タンパク質分解消化を行う他の方法及び技術は当技術分野において公知であり、例えば、可溶性タンパク質に使用されうる。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態では、前記タンパク質（例えば、膜タンパク質）は限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解の前に（例えば、固体担体上に）固定化されてタンパク質の固定相を作り出す。よって、いくつかの実施形態では、タンパク質は表面に結合している。
【００４１】
いくつかの実施形態では、前記タンパク質（例えば、膜タンパク質）はプロテオリポソーム（例えば、細胞由来のプロテオリポソーム）中に存在し、前記プロテオリポソームは、限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解の前に（例えば、固体担体上に）固定化されてタンパク質の固定相を作り出す。
【００４２】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、タンパク質は細胞由来のプロテオリポソームに存在する膜タンパク質であり、前記プロテオリポソームはフローセルに固定化されて膜タンパク質の固定相を作り出す。好適なフローセルは当技術分野において公知であり、例えば、Ｊａｎｓｓｏｎら（Anal. Chem., 2012, 84:5582-5588）によって記述されたフローセルがある。
【００４３】
いくつかの実施形態では、タンパク質（例えば、膜タンパク質）はプロテオリポソーム（例えば、細胞由来のプロテオリポソーム）中に存在し（又はプロテオリポソーム上に存在し）、前記プロテオリポソームは懸濁液中にある（例えば、溶液に懸濁されている）。
【００４４】
いくつかの実施形態では、前記タンパク質は、表面に結合しているか、又は懸濁液中にある（例えば、溶液に懸濁されている）タンパク質含有脂質小胞中にある（又はタンパク質含有脂質小胞上に存在する）。
【００４５】
いくつかの実施形態では、前記タンパク質は、その機能的又は天然コンフォメーションが保存されるように、いずれの適切なエンティティの一部であるか、又はいずれの適切なエンティティ上に存在し、例えば、脂質二重層若しくは膜の一部であるか、又はスキャホールド若しくは粒子上に存在する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、前記タンパク質は、表面に結合しているか、又は懸濁液中にある（例えば、溶液に懸濁されている）ナノ粒子又は他のコロイド粒子などの粒子中にある（又は粒子上に存在する）。
【００４７】
いくつかの実施形態では、前記タンパク質、表面に結合しているか、又は懸濁液中にある（例えば、溶液に懸濁されている）スキャホールド又はケージ化化合物などの他の化学エンティティにある（又はその上に存在する）。
【００４８】
いくつかの実施形態では、前記タンパク質、表面に結合しているか、又は懸濁液中にある（例えば、溶液に懸濁されている）無傷細胞（生体細胞、例えば、ヒト細胞）中にある（又は無傷細胞上に存在する）。
【００４９】
プロテオリポソーム中のタンパク質に関連して、小胞又は無傷細胞を含有するタンパク質は、プロテオリポソーム、脂質小胞又は細胞を含有するタンパク質の外側に延びる（且つ結果として外側に露出される）タンパク質を包含する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、前記タンパク質は溶液中にある。溶液は、精製されたタンパク質の溶液であってもよく、タンパク質の混合物を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、例えば、制御可能な（例えば、テトラサイクリンで制御可能な）発現系を介してタンパク質を過剰発現する。いくつかの実施形態では、そのような細胞に由来するプロテオリポソームが使用される。
【００５１】
我々は、一過性受容体電位バニロイド１（ＴＲＰＶ１）イオンチャネルの機能を変化させる能力を有する生物学的に活性のある抗体を開発するための潜在的なエピトープを見出すことを目的として、このイオンチャネルの限定タンパク質分解から産生されたペプチドを調べた。ＴＲＰＶ１は２つの異なるプロテアーゼでの限定タンパク質分解に供され、消化されたペプチドは機能データと関連付けされた。我々はこの情報を使って、ヒトＴＲＰＶ１（ｈＴＲＰＶ１）イオンチャネルの細胞内側で作用する２つのポリクローナル抗体、ＯＴＶ１及びＯＴＶ２を開発した。両抗体は薬理学的に活性があり、それらの標的エピトープ領域は、それらの消化されやすさ（又は表面露出（限定タンパク質分解後に高くランク付けされたペプチド））及び機能的な重要性に基づいて選ばれた。作動剤カプサイシンで刺激したとき、ＯＴＶ１はタンパク質に対して強い阻害作用を示す。ＯＴＶ２は、ＴＲＰＶ１を通したカルシウム流入によって誘発される過程であるＴＲＰＶ１のカルモジュリン／Ｃａ2+依存脱感作を妨害する。ＯＴＶ１及びＯＴＶ２の有効性は、ＴＲＰＶ１の細胞内側を抗体溶液に曝露できるインサイド−アウトパッチクランプ及び抗体が生細胞内にエレクトロポレーションされた後のＴＲＰＶ１媒介蛍光取り込みアッセイの両方で調べた。
【００５２】
パッチクランプ実験に適した迅速な溶液交換のため、ＬＰＩフローセルとオープンボリュリームマイクロフルイディクスフローセルとを併用する方法が以前から報告されてきている。この長所は細胞膜を裏返しにでき、イオンチャネルの細胞内ドメインを直接調べられることができることである。この方法では、限定タンパク質分解及び制御タンパク質分解を用いて関連する構造及び機能データを得ることができる。ＴＲＰＶ１は侵害受容一次感覚ニューロンに発現する陽イオンチャネルである。全長タンパク質については詳細な結晶構造は得られていないが、Ｎ末端のアンキリンリピートドメイン（ＡＲＤ）は結晶化がラットＴＲＰＶ１で成功している。ＴＲＰＶ１で限定タンパク質分解を行った際に短い時間で消化されたペプチドが、既知の機能的に活性がある領域に比較されている。検出されたペプチドの３分の１が、機能的に重要であると示唆される残基を含んだ。
【００５３】
技術分野の概説（the survey of the field）に記載されているＴＲＰＶ１表面トポロジーのスクリーニングを、ＴＲＰＶ１を含むプロテオリポソームをフローセルに固定し、さらにそれを限定トリプシンタンパク質分解に曝露することによって行った［１、４］。トリプシンの活性は室温でさまざまな消化時間を用いることによって制御した。累積インキュベーション時間と逐次プロトコールが使用され、消化されたペプチドはＬＣ−ＭＳ／ＭＳで検出された。ペプチド数の増加が時間とともに検知され、アクセス可能で容易に消化されるタンパク質の領域及び堅い領域を明らかにした。図１にこれを図示する。ＬＰＩフローセルでのＴＲＰＶ１の限定タンパク質分解後に、切断されたペプチドとしてＬＣ−ＭＳ／ＭＳで見られた数個の領域が、カルモジュリン、ＡＴＰ、及びＰＩＰ２に関する既知の相互作用部位と関連する。
【００５４】
また、我々はトリプシン消化でさまざまな構造セグメントを取り除いた後に、ＴＲＰＶ１の機能性を調べた［４］。ＴＲＰＶ１イオンチャネルの活性はインサイド−アウトパッチクランプ記録及びフローセル消化に続いて、化学的なトランケーションの構造的効果を評価するプロテオミクス解析で調査した。我々はインサイド−アウトパッチクランプ記録構成を使用し、それによりＴＲＰＶ１の細胞内の部分をトリプシンに曝露でき、トリプシン濃度の増加に伴う電流応答の減少を測定することができる（図２）。
【００５５】
我々は、イオンチャネルＴＲＰＶ１は同一の実験条件下で２つの異なるマイクロフルイディクスフローセル中で限定トリプシンタンパク質分解及び制御トリプシンタンパク質分解に曝露できることを示す。１つの例では、パッチクランプ記録は薬理学的研究のために行われ、オープンボリュリームマイクロフルイディクス装置でチャネル機能動態に関する情報を得た。この設計により、パッチクランプピペット及び細胞パッチが灌流チャネルにアクセスを得ることが可能になる。別の例では、同等のクローズドボリュリームフローセルを用いて試料が薄まることなくイオンチャネルのペプチドを消化した。切断されたペプチドはＬＣ−ＭＳ／ＭＳで同定された。次いで、２つの実験からのデータが比較されて、構造機能関係が評価することができた。我々はこの方法論的アプローチを使って、柔軟性が高いＴＲＰＶ１の領域及びその作動剤カプサイシンで活性化された間に機能的チャネル特性に影響を及ぼす極めて重要な領域を同定した。
【００５６】
また、このタイプの方法論は他のタンパク質（すなわち、ＴＲＰＶ１ではないタンパク質）にも使用することができる。
ｈＴＲＰＶ１のアミノ酸配列を下に示す（配列番号１）。ＭＫＫＷＳＳＴＤＬＧＡＡＡＤＰＬＱＫＤＴＣＰＤＰＬＤＧＤＰＮＳＲＰＰＰＡＫＰＱＬＳＴＡＫＳＲＴＲＬＦＧＫＧＤＳＥＥＡＦＰＶＤＣＰＨＥＥＧＥＬＤＳＣＰＴＩＴＶＳＰＶＩＴＩＱＲＰＧＤＧＰＴＧＡＲＬＬＳＱＤＳＶＡＡＳＴＥＫＴＬＲＬＹＤＲＲＳＩＦＥＡＶＡＱＮＮＣＱＤＬＥＳＬＬＬＦＬＱＫＳＫＫＨＬＴＤＮＥＦＫＤＰＥＴＧＫＴＣＬＬＫＡＭＬＮＬＨＤＧＱＮＴＴＩＰＬＬＬＥＩＡＲＱＴＤＳＬＫＥＬＶＮＡＳＹＴＤＳＹＹＫＧＱＴＡＬＨＩＡＩＥＲＲＮＭＡＬＶＴＬＬＶＥＮＧＡＤＶＱＡＡＡＨＧＤＦＦＫＫＴＫＧＲＰＧＦＹＦＧＥＬＰＬＳＬＡＡＣＴＮＱＬＧＩＶＫＦＬＬＱＮＳＷＱＴＡＤＩＳＡＲＤＳＶＧＮＴＶＬＨＡＬＶＥＶＡＤＮＴＡＤＮＴＫＦＶＴＳＭＹＮＥＩＬＭＬＧＡＫＬＨＰＴＬＫＬＥＥＬＴＮＫＫＧＭＴＰＬＡＬＡＡＧＴＧＫＩＧＶＬＡＹＩＬＱＲＥＩＱＥＰＥＣＲＨＬＳＲＫＦＴＥＷＡＹＧＰＶＨＳＳＬＹＤＬＳＣＩＤＴＣＥＫＮＳＶＬＥＶＩＡＹＳＳＳＥＴＰＮＲＨＤＭＬＬＶＥＰＬＮＲＬＬＱＤＫＷＤＲＦＶＫＲＩＦＹＦＮＦＬＶＹＣＬＹＭＩＩＦＴＭＡＡＹＹＲＰＶＤＧＬＰＰＦＫＭＥＫＴＧＤＹＦＲＶＴＧＥＩＬＳＶＬＧＧＶＹＦＦＦＲＧＩＱＹＦＬＱＲＲＰＳＭＫＴＬＦＶＤＳＹＳＥＭＬＦＦＬＱＳＬＦＭＬＡＴＶＶＬＹＦＳＨＬＫＥＹＶＡＳＭＶＦＳＬＡＬＧＷＴＮＭＬＹＹＴＲＧＦＱＱＭＧＩＹＡＶＭＩＥＫＭＩＬＲＤＬＣＲＦＭＦＶＹＩＶＦＬＦＧＦＳＴＡＶＶＴＬＩＥＤＧＫＮＤＳＬＰＳＥＳＴＳＨＲＷＲＧＰＡＣＲＰＰＤＳＳＹＮＳＬＹＳＴＣＬＥＬＦＫＦＴＩＧＭＧＤＬＥＦＴＥＮＹＤＦＫＡＶＦＩＩＬＬＬＡＹＶＩＬＴＹＩＬＬＬＮＭＬＩＡＬＭＧＥＴＶＮＫＩＡＱＥＳＫＮＩＷＫＬＱＲＡＩＴＩＬＤＴＥＫＳＦＬＫＣＭＲＫＡＦＲＳＧＫＬＬＱＶＧＹＴＰＤＧＫＤＤＹＲＷＣＦＲＶＤＥＶＮＷＴＴＷＮＴＮＶＧＩＩＮＥＤＰＧＮＣＥＧＶＫＲＴＬＳＦＳＬＲＳＳＲＶＳＧＲＨＷＫＮＦＡＬＶＰＬＬＲＥＡＳＡＲＤＲＱＳＡＱＰＥＥＶＹＬＲＱＦＳＧＳＬＫＰＥＤＡＥＶＦＫＳＰＡＡＳＧＥＫ
したがって本発明は、その天然の脂質環境に存在する標的膜タンパク質に関して、具体的なエピトープの機能的研究又は新規抗体の推定結合部位の評価を可能にする。
【００５７】
本発明においては、抗原性エピトープは典型的に、限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解の間にタンパク質からの切断された表面露出ペプチドに基づく。代替的に見ると、表面露出ペプチドは典型的に抗原性エピトープを産生するのに使用される。
【００５８】
これに関して、抗原性エピトープは表面露出ペプチドのアミノ酸配列又はそれらに実質的に相同な配列を含みうる。抗原性エピトープは表面露出ペプチドのアミノ酸配列又はそれらに実質的に相同な配列から成りうる。抗原性エピトープは表面露出ペプチドのアミノ酸配列又はそれらに実質的に相同な配列とオーバーラップしうる。
【００５９】
表面露出ペプチドに「実質的に相同な」アミノ酸配列としては、所与の表面露出ペプチドのアミノ酸配列と比較して、１個、２個、又は３個のアミノ酸置換（好ましくは、１個又は２個、より好ましくは１個）をもつ配列を有する又は含む配列が挙げられる。
【００６０】
表面露出ペプチドに「実質的に相同な」アミノ酸配列としては、表面露出ペプチドの少なくとも５個若しくは少なくとも６個の連続したアミノ酸含む（又はから成る）（又は表面露出ペプチドの少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、若しくは少なくとも２５個）連続したアミノ酸を含む若しくはから成る）配列が挙げられる。６個のアミノ酸が、抗体によって認識又は結合されるペプチド／タンパク質配列の典型的な長さである。
【００６１】
表面露出ペプチドに「実質的に相同な」アミノ酸配列としては、所与の表面露出ペプチド配列に対して、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の配列同一性をもつ配列を有する又は含む配列が挙げられる。少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の配列同一性が好ましい。
【００６２】
抗原性エピトープは、表面露出ペプチドの伸長型、又は表面露出ペプチドに実質的に相同なアミノ酸配列の伸長型を含みうる（又はから成りうる）。例えば、１つ以上のさらなるアミノ酸（例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、又は少なくとも２０個のアミノ酸）が、表面露出ペプチド配列（のそれらに実質的に相同な配列）の一端又は両端に存在してよい。
【００６３】
抗原性エピトープは、表面露出ペプチドのトランケート型、又は表面露出ペプチドに実質的に相同なアミノ酸配列のトランケート型を含みうる（又はから成りうる）。例えば、１個以上のアミノ酸（例えば、少なくとも２個、少なくとも個３、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個）が、表面露出ペプチド配列（又はそれらに実質的に相同な配列）の一端又は両端になくてよい。
【００６４】
表面露出ペプチドが空間的に互いに接近して配置される場合、抗原性エピトープは、例えば、１個又は数個の表面露出ペプチドに実質的に相同な環状ペプチドでありうる。
抗原性エピトープは長さが、少なくとも５個、又は少なくとも６個、又は少なくとも７個のアミノ酸、例えば、長さが６〜１０個、６〜１２個、６〜１５個、６〜２０個、６〜２５個、６〜３０個、６〜４０個、６〜５０個、６〜６０個、又は６〜７５個のアミノ酸でありうる。抗原性エピトープは長さが、例えば、５〜７個、又は５〜８個、又は５〜９個（例えば、７〜９個のアミノ酸）でありうる。
【００６５】
相同性（例えば、配列同一性）はいずれの簡便な方法でも評価されうる。しかし、配列間の相同性（例えば、同一性）の度合いを決定するには、複数の配列のアラインメントを作成するコンピュータープログラムが有用であり、例えば、クラスタルダブル（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ）（Thompson, Higgins, Gibson, Nucleic Acids Res., 22:4673-4680, 1994）がある。所望の場合、クラスタルダブル（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ）アルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919, 1992）並びにギャップ開始ペナルティーを１０及びギャップ伸長ペナルティーを０．１として使用することができ、結果として、最上位の一致が２つの配列間で得られ、配列の１つの全長の少なくとも５０％がアラインメントに含まれる。配列をアラインメントするのに使用されうる他の方法は、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981）によって改変されたＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアラインメント方法（Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970）であり、最上位のマッチが２つの配列間で得られ、同一アミノ酸の数が２つの配列間で決定される。２つのアミノ酸配列間の同一性の％率を計算する他の方法は一般に当該技術分野において認識されており、例えば、Ｃａｒｉｌｌｏ及びＬｉｐｔｏｎ（Carillo and Lipton, SIAM J. Applied Math., 48:1073, 1988）によって記載のもの及びComputational Molecular Biology, Lesk, e.d. Oxford University Press, New York, 1988, Biocomputing: Informatics and Genomics Projectsに記載にものが挙げられる。
【００６６】
一般に、そのような計算にはコンピュータープログラムが採用されることになる。ＡＬＩＧＮ（Myers and Miller, CABIOS, 4:11-17, 1988）、ＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448, 1988; Pearson, Methods in Enzymology, 183:63-98, 1990）、及びギャップＢＬＡＳＴ（Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、又はＧＣＧ（Devereux, Haeberli, Smithies,  Nucleic Acids Res., 12:387, 1984）といった、一対の配列を比較及びアラインメントするプログラムもこの目的のために有用である。さらに、欧州バイオインフォマティクス研究所のＤａｌｉサーバーはタンパク質配列の構造に基づいたアラインメントを提供する（Holm, Trends in Biochemical Sciences, 20:478-480, 1995; Holm, J. Mol. Biol., 233:123-38, 1993; Holm, Nucleic Acid Res., 26:316-9, 1998）。
【００６７】
本発明による抗原性エピトープは、線状エピトープ又は立体構造エピトープでありうる。
いくつかの実施形態では、本発明による抗原性エピトープは環化されたエピトープでありうる。
【００６８】
免疫に使用される線状抗原性エピトープを調製するのに用いられる一般的な手法はＦｍｏｃ  ＳＰＰＳ（ペプチド固相合成）である。ＳＰＰＳでは、その上にペプチド鎖が洗浄−カップリング−洗浄の反復サイクルを用いて構築できる小さな多孔性ビーズが官能性リンカーで処理される。次いで合成されたペプチドは化学開裂を用いてビーズから切り離される。環状ペプチドの合成については、一般的な方法は、ジスルフィド架橋（架橋が２つのシステインによって形成された架橋である）の形成によって又は架橋が典型的なペプチド結合から成る「頭−尾（head-to-tail）」架橋の形成によって環化を利用する。環状ペプチドは固体担体上で形成することができる。一般的には、立体構造エピトープに対する抗体はタンパク質全体又はタンパク質の大部分を用いて産生される。
【００６９】
限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解は、完了まで進まないタンパク質のタンパク質分解性の消化を含む。よって、限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解を介して、所与のタンパク質は単に部分的に消化される（又は部分的に分解される又は部分的にトランケートされる）だけでありうる。限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解は部分的タンパク質分解とみなされてよい。限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解下で、所与のタンパク質が、あるいくつかの数の所与のプロテアーゼに対する潜在的な切断点（すなわち、切断のために所与のプロテアーゼによって認識可能な部位）をもつ場合、そのプロテアーゼはそれらの切断部位の一部でのみ切断しうる。
【００７０】
また、限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解は、プロテアーゼ活性のキネティックスがタンパク質からペプチドが１個ずつ又は一度に最大で数個切断される程度に落とされる限定条件下で行われるタンパク質分解を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つのプロテアーゼの速度論的活性は、前記表面露出ペプチドが、１個ずつ又は一度に最大で数個、例えば、一度に最大で８個（１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、若しくは８個）（例えば、本明細書において別のところに記載されているように、例えば、試料中の最大で８個のペプチド又は最大で８個の独特のペプチド）、又は一度に最大で７個（１個、２個、３個、４個、５個、６個、若しくは７個）（例えば、本明細書において別のところに記載されているように、例えば、試料中の最大で７個のペプチド又は最大で７個の独特のペプチド）、又は一度に最大で５個（１個、２個、３個、４個、若しくは５個）（例えば、本明細書において別のところに記載されているように、例えば、試料中の最大で５個のペプチド又は最大で５個の独特のペプチド）切断される程度に落とされる。そのような実施形態のいくつかでは、前記タンパク質が所与のプロテアーゼによって切断できるペプチドが使い尽くされるようにタンパク質分解反応は完了まで進みうる。
【００７１】
本明細書において別のところに記載されているように、限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解は典型的に、前記タンパク質の最も柔軟性がある部分及び／又は表面露出部分のみがプロテアーゼによって切断されるという結果になる。
【００７２】
本発明のいくつかの実施形態では、前記少なくとも１つのプロテアーゼは、最大で８個の表面露出ペプチド（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、又は８個の表面露出ペプチド）（例えば、本明細書において別のところに記載されているように、例えば、試料中の最大で８個のペプチド又は最大で８個の独特のペプチド）が前記プロテアーゼの作用によってタンパク質から切断されるという結果になる条件下で使用される。
【００７３】
好ましい実施形態では、前記少なくとも１つのプロテアーゼは、最大で７個の表面露出ペプチド（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、若しくは７個の表面露出ペプチド）又は最大で５個の表面露出ペプチド（例えば、１個、２個、３個、４個、若しくは５個の表面露出ペプチド）（例えば、本明細書において別のところに記載されているように、例えば、試料中の最大で７個若しくは最大で５個のペプチド又は最大で７個若しくは最大で５個の独特のペプチド）が前記プロテアーゼの作用によってタンパク質から切断されるという結果になる条件下で使用される。
【００７４】
本発明による限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解は典型的に、例えば、プロテアーゼ活性のキネティックスを、前記タンパク質からペプチドが１個ずつ又は一度に最大で数個切断される程度に落とすことによって達成することができる。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つのプロテアーゼの速度論的活性は、前記表面露出ペプチドが、１個ずつ又は一度に最大で数個、例えば、上記のように、一度に最大で８個（１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、若しくは８個）、又は一度に最大で７個（１個、２個、３個、４個、５個、６個、若しくは７個）、又は一度に最大で５個（１個、２個、３個、４個、若しくは５個）切断される程度に落とされる。
【００７５】
前記タンパク質の最も柔軟性がある及び／又は表面露出部分のみがプロテアーゼによって切断されるという結果、例えば、最大で８個の表面露出ペプチド、又は最大で７個の表面露出ペプチド、又は最大で５個の表面露出ペプチドがプロテアーゼによって切断されるという結果になるために、どの好適な条件を限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に用いてもよい。限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解を導く条件は、消化反応の温度及び／又はプロテアーゼの濃度及び／又は消化反応の時間及び／又はバッファー条件に変化をもたせることによって確定しうる。特定の条件下でペプチドから切断されるペプチドの数は（例えば、質量分析又はタンパク質化学又は生化学に基づいて）当業者によって決定することができる。また、限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に適切な条件を確立する好適な方法は本明細書において別のところに記載されている。適切な限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解条件は、さまざまなタンパク質又はさまざまなプロテアーゼ又は使用されるタンパク質及びプロテアーゼの特定の組み合わせについて確立することができる。限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に特に好ましい条件は本明細書の実施例に記載されている。典型的には、限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に用いられる条件は前記タンパク質の天然の構成（天然型）を変えない（又は著しく変えない）。前記タンパク質の補因子は、限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解の間に存在してもよいが、必ずしも存在する必要はない。
【００７６】
限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に適切な条件はプロテアーゼ及び／又はタンパク質に依存して異なりうるが、一般には、当該プロテアーゼに対する最適以下の条件、例えば、プロテアーゼ活性のキネティックスが著しく落とされるか減じられる程度の条件である。
【００７７】
低い（例えば、最適タンパク質分解活性より低いか、著しく低い）プロテアーゼのタンパク質分解活性を与える（又はもたらす）条件が一般に用いられる。そのような条件としては、プロテアーゼの低い濃度及び／又は当該プロテアーゼにとって最適以下である作業温度及び／又は当該プロテアーゼに標準的ではないバッファー若しくは最適以下のバッファー及び／又はプロテアーゼのタンパク質との短い接触（インキュベーション）時間を用いることが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
いくつかの実施形態では、限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解（例えば、トリプシンを用いて、又は例えば、３７oＣ以上の最適作業温度のプロテアーゼを用いて）は室温（例えば、約２０oＣ又は１７〜２３oＣ）で行われた。
【００７９】
いくつかの実施形態では、限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解は、使用プロテアーゼの最適作業温度より少なくとも２oＣ、少なくとも５oＣ、少なくとも１０oＣ、又は少なくとも２０oＣ高い若しくは低い、又は著しく高い若しくは低い、（好ましくは低い）温度で行われる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、最大で５μｇ／ｍｌのプロテアーゼ（例えば、トリプシン）の濃度が限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に用いられる。いくつかの実施形態では、限定タンパク質分解反応は、５分間、１０分間、１５分間、３０分間、１時間、又は５時間以下で進行でき、短いインキュベーション時間のほうが一般に好ましい。そのような実施形態のいくつかでは、限定タンパク質分解は室温で行われる。よって、いくつかの実施形態では、限定タンパク質分解は、最大で５μｇ／ｍｌプロテアーゼ（例えば、約５μｇ／ｍｌプロテアーゼ）の濃度で室温にて最大で約５分間（例えば、約５分間）行われる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、タンパク質分解消化反応はギ酸又はアンモニア水を用いて止められうる。例えば、トリプシン、Ａｓｐ−Ｎ、プロテイナーゼＫ、及びキモトリプシンはギ酸を用いて止められうる。ペプシンはアンモニア水を用いて止められうる。
【００８２】
本発明のいくつかの実施形態では、切断された表面露出ペプチドは、前記少なくとも１つのプロテアーゼと接触した後に出現する順序に基づいてランク付けられ、最初に（又は早期に）切断され、且つ最初の（又は早期の）サンプリングポイントで検出される表面露出ペプチドは高いランクが与えられ、後に遅れて切断され、後のサンプリングポイントで検出される表面露出ペプチドは低いランクが与えられる。短時間で標的タンパク質から外れ、機能的な重要性も有する、高くランク付けられたペプチドが典型的に、エピトープ開発、免疫、及び後に続く抗体産生に使用されうる。
【００８３】
本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載されているように低いタンパク質分解活性の（厳しさを抑えた）条件下で切断される表面露出ペプチド（例えば、低い（より低い）プロテアーゼ濃度、低い（より低い）インキュベーション温度、及び／又は短い（より短い）インキュベーション時間、概して容易に消化されたペプチド）は高いランクが与えられ、本明細書に記載されているように高いタンパク質分解活性の（より厳しい）条件下で切断される表面露出ペプチド（例えば、高い（より高い）プロテアーゼ濃度、高い（より高い）インキュベーション温度、及び／又は長い（より長い）インキュベーション時間、概して容易には消化されないペプチド）は低いランクが与えられる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、タンパク質分解消化材料（若しくはタンパク質分解消化反応からの溶離液）の複数の試料が、限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解反応（例えば、順次）の間に採取されてよく、及び／又は複数の試料（例えば、複数の限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解反応）が別々にプロセス（若しくは処理）されうる（例えば、並行して同時にプロセス（若しくは処理）されうる）。
【００８５】
いくつかの実施形態では、タンパク質分解消化材料（又はタンパク質分解消化反応からの溶離液）の複数の試料は、タンパク質の限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解の間に時間間隔（例えば、１分、２．５分、若しくは５分間隔）で採取されうる（又は得られうる）。そのような実施形態のいくつかでは、プロテアーゼと接触（又はインキュベーション）の時間（又は期間）に基づいて試料が変動するとともに、プロテアーゼ及び／又は（典型的には「及び」）プロテアーゼ濃度（及び／又は本明細書において別のところに記載されているようにタンパク質分解をもたらす他の条件）は、試料各々について（又は試料各々において）一定でありうる。そのような実施形態のいくつかでは、試料は順番に得られうる（連続消化）。
【００８６】
いくつかの実施形態では、複数の試料（例えば、複数の限定消化反応又は制限的消化反応）は別々にプロセス（又は処理）され、各試料はタンパク質の限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解のための相異なるタンパク質分解条件又はタンパク質分解活性をもち、例えば、本明細書において別のところで論じられているように、例えば、相異なるプロテアーゼ及び／又は相異なるプロテアーゼ濃度及び／又は相異なる温度及び／又は相異なるインキュベーション時間が相異なる試料に使用されうる。そのような実施形態のいくつかでは、プロテアーゼとの接触（又はインキュベーション）の時間（又は期間）は典型的には（及び好ましくは）、試料各々について（又は試料各々において）一定である。そのような実施形態のいくつかでは、試料は並行して同時にプロセス（若しくは処理）されうる。
【００８７】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、前記プロテアーゼの作用によってタンパク質から切断される表面露出ペプチドの数は一定のプロテアーゼ濃度で時間によって調節され、いくつかの試料が時間とともに採取されるか、又は前記プロテアーゼの作用によってタンパク質から切断される表面露出ペプチドの数は一定の時間でプロテアーゼの濃度によって調節され、いくつかの試料がプロテアーゼのいくつかの相異なる濃度で採取（又は処理）できるか、又は前記プロテアーゼの作用によってタンパク質から切断される表面露出ペプチドの数は時間と前記プロテアーゼの濃度との両方によって調節される。
【００８８】
各試料（又は好ましい試料）は、タンパク質から切断された１個又は数個のペプチド（例えば、最大８個のペプチド若しくは最大８個の独特のペプチド）を好ましくは含む。よって、タンパク質から切断された１個又は数個のペプチド（例えば、最大８個のペプチド若しくは最大８個の独特のペプチド）は各試料で検出されうる。独特のペプチドは、前試料に存在しないか、又はより弱い（若しくは厳しさを抑えた）タンパク質分解条件で試料に存在しない（例えば、前試料に存在するか、又はより弱いタンパク質分解条件で試料に存在するペプチドと異なる又は違った）ペプチドである。したがって、最大８個の独特なペプチドを含有する試料は８個を超える相異なるペプチドを含みうるが、これらのペプチドの１つ以上は前試料又はより弱いタンパク質分解条件で試料中に検出されうる（よって、これらのペプチドの１つ以上は独特でないペプチドでありうる）。
【００８９】
理想的且つ好ましくは、各試料は単一の切断されたペプチドのみを含むことになる。例えば、単一の切断されたペプチドは最初の試料（又はサンプリングポイント）で検出されうる。単一の切断されたペプチドは１つ以上の後の試料（又はサンプリングポイント）で検出されうる。他の例では、複数の切断されたペプチド（例えば、最大８個のペプチド又は最大で８個の独特のペプチド）は、最初及び／又は後の試料（サンプリングポイント）で検出されうる。１つの試料につき１個又は数個の切断されたペプチド（例えば、１つの試料につき最大８個のペプチド又は最大で８個の独特のペプチド）を生じさせる条件は、短いサンプリング間隔、さまざまなプロテアーゼ濃度、さまざまなバッファー組成、さまざまな温度、さまざまな塩濃度、又はプロテアーゼ阻害剤（又はそれらの組み合わせ）を用いることによって確立することができる。切断されたペプチドは、それらのペプチドが出現する試料（サンプリングポイント）に基づいてランク付けされうる。例えば、サンプリングポイント当たり１個のペプチドのみが検出されるという結果になる条件下で、最初に採取された試料のペプチドは最高のランクが与えられ、２番目に採取された試料のペプチドはランク２が与えられるなどである。各サンプリングポイントで単一の切断されたペプチドのみが検出される条件を用いて、個々のペプチドをランク付けすることが可能である。各サンプリングポイントで複数の切断されたペプチドのみが検出される条件を用いて、ペプチド群をランク付けすることが可能である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、より高くランクの表面露出ペプチド（切断されたペプチド）が好ましい。いくつかの実施形態では、本発明による表面露出ペプチド（例えば、高いランクのペプチド）は、最初に採取された試料で検出される（又は存在する）切断されたペプチドである。いくつかの実施形態では、本発明による表面露出ペプチド（例えば、高いランクのペプチド）は、タンパク質の限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解の間に採取された試料に出現する順序の点から、ランク上位８個のペプチド（例えば、ランク上位８個の独特のペプチド）の１個であるか、又はランク上位８個ペプチド（例えば、ランク上位７個若しくはランク上位５個のペプチド）（例えば、上位８個、上位７個、若しくは上位５個の独特のペプチド）の１個を含有する試料に存在する切断されたペプチドである。そのようなペプチドは最初に採取された試料中に検出される（又は存在する）こともあり、１つ以上のその後に採取された試料に存在することもある。
【００９１】
最初に（又は早期に）タンパク質から切断されるペプチド（例えば、上記のように最初（最初のサンプリングポイント）に採取された試料中のもの又は上記のように限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解の間に出現する順序に基づいてランク上位８個のペプチド（例えば、ランク上位８個の独特のペプチド）にランク付けされるもの））は典型的に、良好に露出され（例えば、表面に露出され）、よってプロテアーゼによって容易にアクセスされるものである。そのような最初に（又は早期に）消化されたペプチドは、高いランクが与えられる（例えば、最初に出現するペプチドはランク１が与えられ、２番目に出現するペプチドはランク２が与えられるなどである）。後に遅れて（例えば、早期ペプチドより後のサンプリングポイントで）タンパク質から消化されたペプチドは典型的に、良好に露出されておらず、よってプロテアーゼによって容易にアクセスされないものである。そのような後に遅れて消化されたペプチドはより低いランクが与えられる。本発明では、高いランクをもつペプチドが典型的に好まれる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、タンパク質の表面で最も露出されているアミノ酸配列を有する切断されたペプチド（表面露出ペプチド）が抗原性エピトープ開発に好ましい。
いくつかの実施形態では、ペプチド（切断されたペプチド）は、タンパク質とってのそのペプチドの機能的重要性又は予測される機能的重要性に基づいてランク付けされうる。典型的には、タンパク質にとって機能的に重要である又は機能的に重要であると予測されるアミノ酸配列を有するペプチドは、機能的に重要でない又は機能的に重要でないと予測されるものと比べてより高いランクが与えられる。いくつかの実施形態では、好ましいのはより高いランクのペプチドである。
【００９３】
いくつかの実施形態では、タンパク質にとって機能的に重要であるか又は機能的に重要であると予測されるアミノ酸配列をもち（例えば、機能的重要性に関して高いランクをもち）、くわえて、表面露出に基づく高いランクをもつ（例えば、上記のように最初に採取された試料（最初のサンプリングポイント）ペプチド又は上記のように限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解の間に出現する順序に基づいて上位８個のペプチドランク付けされたペプチド（例えば、上位８個にランク付けされた独特のペプチド）が、抗原性エピトープ開発に好ましい（又は言い換えれば、抗原性エピトープの基礎となる好ましいペプチドである）。
【００９４】
いくつかの実施形態では、タンパク質にとって機能的に重要であるか又は機能的に重要であると予測されるアミノ酸配列をもつ（例えば、機能的重要性に関して高いランクをもつ）が、くわえて表面露出に基づく高いランクをもつ（例えば、上記のように最初に採取された試料（最初のサンプリングポイント）ペプチドでもなく、上記のように限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解の間に出現する順序に基づいて上位８個のペプチドランク付けされたペプチド（例えば、上位８個にランク付けされた独特のペプチド）でもないペプチドが、抗原性エピトープ開発に使用されうる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、タンパク質にとって機能的に重要でないか又は機能的に重要でないと予測されるアミノ酸配列をもつ（例えば、機能的重要性に関して低いランクをもつ）が、表面露出に基づく高いランクをもつ（例えば、上記のように最初に採取された試料（最初のサンプリングポイント）のペプチド又は上記のように限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解の間に出現する順序に基づいて上位８個のペプチドランク付けされたペプチド（例えば、上位８個にランク付けされた独特のペプチド））が、抗原性エピトープ開発に使用されうる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、抗原性エピトープは、切断されたペプチドのアミノ酸配列の機能的重要性又は予測される機能的重要性に関係なく、上記のように最初に（又は早期に）前記タンパク質から切断された表面露出ペプチド（例えば、上記のように最初に採取された試料（最初のサンプリングポイント）のペプチド、又は上記のように限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解の間に出現する順序に基づいて上位８個のペプチドにランク付けされたペプチド（例えば、上位８個にランク付けされた独特のペプチド））に基づく。
【００９７】
いくつかの実施形態では、抗原性エピトープは、タンパク質にとって機能的に重要である、又は機能的に重要であると予測されるアミノ酸配列をくわえてもつペプチドの、限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解の間に出現する順序に基づいて上位８個のペプチドにランク付けされたペプチド（例えば、上位８個にランク付けされた独特のペプチド）に基づく。これらのペプチドは（上記のように）出現する順序のみに基づいて絶対的に上位にランク付けされた８個のペプチドのセットと必ずしも同じである必要はない（が同じでありうる）。
【００９８】
いくつかの実施形態では、タンパク質にとって機能的に重要であるか、又はそうであると予測されるタンパク質上の対象の領域が特定又は選択され、且つ抗原性エピトープは、前記対象の領域から切断されたアミノ酸配列をくわえて有するペプチドの、限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解の間に出現する順序に基づいて上位８個のペプチド（例えば、上位８個にランク付けされた独特のペプチド）にランク付けされた表面露出ペプチドに基づく。これらのペプチドは（上記のように）出現する順序のみに基づいて絶対的に上位にランク付けされた８個のペプチドのセットと必ずしも同じである必要はない（が同じでありうる）。
【００９９】
いくつかの実施形態では、抗体産生のための抗原性エピトープは、限定タンパク質分解の間にプロテアーゼの作用によって前記タンパク質から最初に（又は早期に）切断され、よって高いランクをもつペプチド（表面露出ペプチド）（例えば、上記のように最初に採取された試料（最初のサンプリングポイント）のペプチド又は上記のように限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解の間に出現する順序に基づいて上位８個のペプチドにランク付けされたペプチド（例えば、上位８個にランク付けされた独特のペプチド））のアミノ酸配列に基づく。
【０１００】
よって、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、抗原性エピトープ開発のために高いランクをもつ表面露出ペプチド（例えば、上記のように最初に採取された試料（最初のサンプリングポイント）のペプチド又は上記のように限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解の間に出現する順序に基づいて上位８個のペプチドにランク付けされたペプチド（例えば、上位８個にランク付けされた独特のペプチド））を選ぶこと、並びに前記表面露出ペプチドに基づく（又は前記表面露出ペプチドから開発された）前記抗原性エピトープに対する抗体を産生することを含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、高いランクをもつ表面露出ペプチド（例えば、上記のように最初に採取された試料（最初のサンプリングポイント）のペプチド又は上位８個のペプチドにランク付けされたペプチド（例えば、上記のように限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解の間に出現する順序に基づいて上位８個にランク付けされた独特のペプチド））を選ぶこと、前記表面露出ペプチドに基づく抗原性エピトープを構築すること、並びに前記抗原性エピトープに対する抗体を産生することを含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、高いランクをもつ表面露出ペプチド（例えば、上記のように最初に採取された試料（最初のサンプリングポイント）のペプチド又は上記のように限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解の間に出現する順序に基づいて上位８個のペプチドにランク付けされたペプチド（例えば、上位８個にランク付けされた独特のペプチド））を選び、それをタンパク質の定義された生物学的特性（又は生物学的機能）と関連付けること、前記表面露出ペプチドに基づく抗原性エピトープを構築すること、並びに前記抗原性エピトープに対する抗体を産生することを含む。タンパク質の定義された生物学的特性（又は機能）と関連するアミノ酸配列をもつペプチドが典型的に好ましい。
【０１０３】
切断されたペプチド（表面露出ペプチド）を同定するどの手段を採用してもよい。いくつかの実施形態では、切断されたペプチドは質量分析を用いて同定される。いくつかの実施形態では、質量分析と併用して液体クロマトグラフィーが使用される。好ましくは、切断されたペプチド（表面露出ペプチド）はＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法）を用いて特定される。例示的且つ好ましい質量分析方法論が実施例で記載されている。タンデム質量分析スペクトルは、ＭＡＳＣＯＴ（マトリックスサイエンス社、ロンドン、英国）によって、例えば、実施例に記載の適切なデータベースに対して検索されうる。
【０１０４】
本明細書でいう消化、分解、又はトランケートされたタンパク質は、プロテアーゼによってその長さに沿って１つ以上の部位で切断されたタンパク質である。そのようなタンパク質切断は、タンパク質から切断された（すなわち、切り離された）１つ以上のペプチド（表面露出ペプチド）をもたらす。よって表面露出ペプチドは、プロテアーゼの作用によってタンパク質から切断されたペプチドである。「表面に露出された」という用語は、通常、全長タンパク質（すなわち、切断されていないタンパク質）に照らして、切断された（切り離された）ペプチド配列に対応するタンパク質の部分が良好に露出され、プロテアーゼにアクセス可能であることを示す。
【０１０５】
本発明は、治療用抗体発見のための新しい方法及びヒトＴＲＰＶ１タンパク質に対する新らたな薬理学的に活性のある抗体を提供する。
本発明は、良好に露出され、よって抗体ターゲティングのガイドとして利用しうるタンパク質のエピトープを検出する方法に関する。
【０１０６】
本発明のいくつかの方法は、前記タンパク質にとって機能的に重要（例えば、生物学的重要）であるか、又はそうであると予測されるアミノ酸配列を有する切断された表面露出ペプチドを同定することによって抗原性エピトープを同定し、そのような表面露出ペプチドに基づいて抗原性エピトープを産生するステップを含む。いくつかの実施形態では、抗体はそのような抗原性エピトープに対して産生される。
【０１０７】
前記タンパク質から切断された表面露出ペプチドが前記タンパク質にとって機能的に重要であるか又は機能的に重要であると予測されるアミノ酸配列を有するか否かを識別することは、いずれの好適な手段によっても行うことができ、当業者であれば容易にそれを実行することができる。
【０１０８】
例えば、いくつかの実施形態では、限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解の間に消化、分解、又はトランケートされたタンパク質は機能アッセイで調べられ、その機能又機能活性（例えば、生物学的機能）が変化したかどうか評価できる。これは、消化、分解、又はトランケートされたタンパク質の機能活性のレベルを、限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に供されていないタンパク質の機能活性のレベルと比較することによってなされうる（限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に供されていないタンパク質の機能活性のレベルは対照レベルとみなすことができる）。もしタンパク質の生物学的機能が限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解の後に（又は間に）変化していたら、これは、切断されたペプチド（表面露出ペプチド）がタンパク質に機能的な関連のある（例えば、生物学的に重要である）タンパク質の領域から切断された（切り離された）ことを示す。したがって、切断された表面露出ペプチドはタンパク質における機能的重要性を評価するための機能的データと関連付けられる。切断されたペプチドは、例えば、並行実験で、本明細書において別のところに記載されているように（例えば、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって）同定することができる（例えば、切断されたペプチドの配列を明らかにすることができる）。タンパク質からのペプチド（表面露出ペプチド）の切断がタンパク質の機能活性の変化をもたらした場合、これは、表面露出ペプチドが本発明の抗原性エピトープ産生に特に有用でありうることを示す。代替的に見ると、そのような表面露出ペプチドに基づく抗原性エピトープは抗体産生に特に有用で且つ好ましい可能性がある。
【０１０９】
１つの実施形態では、タンパク質はＴＲＰＶ１であり、ＴＲＰＶ１にとっての切断されたペプチドの機能的重要性を決定するアッセイは本明細書において別のところに記載されているようにインサイド−アウトパッチクランプアッセイである。
【０１１０】
「変化させた」機能若しくは機能活性、又は機能若しくは機能活性「の変化」は、いずれの測定可能な変化、好ましくは、顕著な変化、より好ましくは、統計的に有意な変化であることができる。「変化させた」機能又は「機能の変化」は機能の増加又は減少でありうる。機能の例示的な変化は、≧２％、≧３％、≧５％、≧１０％、≧２５％、≧５０％、≧７５％、≧１００％、≧２００％、≧３００％、≧４００％、≧５００％、≧６００％、≧７００％、≧８００％、≧９００％、≧１０００％、≧２０００％、≧５０００％、又は≧１０，０００％の変化である。変化は典型的に、適切な対照レベルの機能又は機能活性と比べて、例えば、限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に供されていない同等のタンパク質の機能又は機能活性と比べて評価される。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、抗原性エピトープは、タンパク質から切断されたときに、タンパク質の機能又は機能活性の変化をもたらす表面露出ペプチドのアミノ酸配列に基づく。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、表面露出ペプチド配列が機能的に重要（例えば、生物学的に重要）であるか否かは、バイオインフォマティクス的手段及び／又はタンパク質の機能的に重要な領域について既に知られている（例えば、学術文献中の）他の情報を利用することによって予測又は決定される。したがって、切断された表面露出ペプチドは、タンパク質の機能的に重要な領域に関する既知データと関連付けてタンパク質にとっての切断されたペプチドの機能的重要性を予測又は決定することができる。表面露出ペプチドのアミノ酸配列が機能的に重要であることが知られている（又は機能的に重要であると予測される）なら、これは、表面露出ペプチドが本発明の抗原性エピトープ産生に特に有用でありうることを示す。代替的に見ると、そのような表面露出ペプチドに基づく抗原性エピトープは抗体産生に特に有用であり好ましい可能性がある。
【０１１３】
よって、いくつかの実施形態では、抗原性エピトープは、例えば、バイオインフォマティクス分析に基づいて、且つ／又はタンパク質の機能的に重要な領域について既に知られている（例えば、学術文献中の）他の情報に基づいて機能的に重要であることが知られている（又はそうであることが予測される）表面露出ペプチドのアミノ酸配列に基づく。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、抗原性エピトープは、ＴＲＰＶ１のカルモジュリン結合配列又はＴＲＰＶ１のカプサイシン結合部位と関連する（又は対応する）表面露出ペプチドのアミノ酸配列に基づくＴＲＰＶ１の抗原性エピトープである。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、バイオインフォマティクス的手段及び／又はタンパク質の機能的に重要な領域について既に知られている（例えば、学術文献中の）他の情報を用いることによって表面露出ペプチドの機能的重要性を予測又は決定することにくわえて、表面露出ペプチドの機能的重要性を決定する機能アッセイが行われる。
【０１１６】
「バイオインフォマティクス的手段」、「バイオインフォマティクス分析」、「バイオインフォマティクスデータ」、及び「バイオインフォマティクス情報」としては、データベース検索（例えば、ＢＬＡＳＴ検索）、構造モデリング、又は構造生物学、及びそれらによって得られたデータ／情報が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
機能（例えば、生物学的機能）は、当該タンパク質に関するいずれの生物学的又は生理学的に関連する機能を含むことができる。機能（例えば、生物学的機能）としては、（リガンド又は受容体などの）標的又は他の結合パートナー、例えば、補因子に結合するタンパク質の能力、シグナル伝達活性、タンパク質の酵素活性、イオンチャネル活性、トランスポーター活性、放出、例えば、インリン放出、及び取り込み機構などが挙げられるが、これらに限定されない。よって、タンパク質の機能的に関連する領域又は機能的に重要な領域としては、（リガンド又は受容体などの）標的又は他の結合パートナー、例えば、補因子に結合するタンパク質の能力を与える領域、シグナル伝達活性を与える領域、タンパク質の酵素活性を有する領域、イオンチャネル活性を与える領域、トランスポーター活性を与える領域、並びに分子（例えば、インスリン）の放出及び取り込みをもたらす領域が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
１つの実施形態では、本発明の方法はさらに、（例えば、前記１つ以上のプロテアーゼの既知の認識配列に基づいてタンパク質の切断点を同定できるコンピュータープログラムを用いることによって）１つ以上のプロテアーゼによってタンパク質から切断されうる一連の推定ペプチド（例えば、すべての推定ペプチド）をコンピューター内で産生するステップ、及び随意に、前記コンピューター内で産生された一連の推定ペプチドをフィルターして、（例えば、配列データベース、例えば、ＢＬＡＳＴ検索又は他の文献において）以前に記載されているペプチドを除外することによって推定ペプチドのフィルターをかけた後のリストを得ること、推定ペプチドのフィルターをかけた後のリストをタンパク質の限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解によって同定されたペプチドのリストと比較すること、前記フィルターをかけた後のリストと前記タンパク質の限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解によって同定されたペプチドのリストとの両方に共通するペプチドを同定すること、両リストに共通するペプチドに基づいた抗原性エピトープを同定（又は構築）すること、及び随意に、前記抗原性エピトープに対する抗体を産生することを含む。
【０１１９】
別の態様では、本発明は抗原性エピトープを同定する方法を提供し、その方法は、
（ｉ）第１のタンパク質を少なくとも１つのプロテアーゼと接触させることによって第１のタンパク質を限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に供し、前記プロテアーゼの作用によって第１のタンパク質から切断された少なくとも１つの消化型、分解型、又はトランケート型の第１のタンパク質及び少なくとも１つの表面露出ペプチドを形成すること、
（ｉｉ）第１のタンパク質から切断された表面露出ペプチドのアミノ酸配列と同一又は実質的に相同な第２のタンパク質の領域（又は一部又は部分）のアミノ酸配列を同定すること、並びに
（ｉｉｉ）第１のタンパク質から切断された表面露出ペプチドのアミノ酸配列と同一又は実質的に相同な前記第２のタンパク質の前記領域（又は一部又は部分）のアミノ酸配列に基づいて抗原性エピトープを産生すること、並びに随意に
（ｉｖ）その抗原性エピトープに対する抗体を産生すること
を含む。
【０１２０】
実質的に相同な配列の例示的な種類は本明細書において別のところで議論されている。そのような方法は、異なるタンパク質（第１のタンパク質）で行われた限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に基づいてタンパク質（第２のタンパク質）の抗原性エピトープ産生を促進することができる。特にこれは、第１のタンパク質及び第２のタンパク質が同じタンパク質ファミリーにあるか、そうでなければ関連する場合に有用でありうる。例えば、ＴＲＰＶ１で行われた限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解からのデータはＴＲＰＶ２抗原性エピトープを同定するのに使用されうる。第２のタンパク質の実質的に相同なタンパク質を決定（又は同定）することは、いずれの好適な手段（例えば、コンピュータープログラム）を用いても行われうる。当業者ならそれらについて精通しているであろう。単に例として、ＥＭＢＬ−ＥＢＩによって提供されているＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅプログラムは好適なコンピュータープログラムである。ＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅは、２つのインプット配列を読み込み、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアラインメントアルゴリズムを用いてそれらの全長に沿って２つの配列の最適なアラインメント（ギャップを含む）を見出した計算結果である最適グローバル配列アラインメントを書き出す。
【０１２１】
本発明のいくつかの実施形態では、抗原性エピトープは、他のタンパク質と保存されているアミノ酸配列（例えば、進化的に保存された配列又は表面露出ペプチドのアミノ酸配列に同一若しくは実質的に相同な配列）を有する表面露出ペプチドに基づかない。これにより、そのような抗原性エピトープに対して産生された抗体の交差反応（又は非特異的結合）が最小限になりうる。言い換えれば、独特のアミノ酸配列（又は他のタンパク質に見られない配列）に基づいた抗原性エピトープはいくつかの実施形態で使用することができる。
【０１２２】
本発明は、機能的に関連があり、よって抗体ターゲティングのための指針として利用されうるタンパク質のエピトープを検出する方法に関する。より具体的に、そのような方法は、標的タンパク質のホットスポットエピトープを明らかにするプロテオミクスツールを含む。抗体の作製における抗原として使用される可能性があるこれらのエピトープは、本明細書において抗原性エピトープを意味する。
【０１２３】
本発明の態様では、タンパク質はプロテアーゼ作用を通して消化、分解、及び／又はトランケートされ、且つ並行して同時に消化、分解、及び／又はトランケートされたタンパク質に関する１つ以上の機能アッセイによって精査してタンパク質の機能的に重要な領域を明らかにする。
【０１２４】
ある実施形態では、タンパク質の消化、分解、及び／又はトランケーションは機能アッセイによって並行して同時に行われ、抗体産生のためのエピトープ選択を導くタンパク質の機能的に重要である領域を明らかにする。
【０１２５】
ある実施形態では、単一のプロテアーゼが使用されてタンパク質を消化、分解、及び／又はトランケーションしうる。別の実施形態では、複数のプロテアーゼが使用されて、標的タンパク質を１個ずつ又は並行して同時に消化、分解及び／又はトランケーションしうる。そのようなプロテアーゼとしては、Ａｒｇ−Ｃプロテイナーゼ、Ａｓｐ−Ｎエンドペプチダーゼ、クロストリパイン、グルタミルエンドペプチダーゼ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ｌｙｓ−Ｎ、トリプシン、キモトリプシン、プロテイナーゼＫ、及びテルモリシンによって例となるが、これらに限定されない。数種のプロテアーゼによって容易に消化される領域はタンパク質の露出領域にあるはずであり、単一のプロテアーゼでのみ消化される領域は恐らくより隠れた領域にある。代替的に、プロテアーゼは独特の切断特異性又は／及び物理化学的特性又は／及び構造的特徴を有し、他のプロテアーゼが識別できない標的タンパク質の表面露出ペプチドを識別する。よって、複数のプロテアーゼの使用が好ましく、各々の異なるプロテアーゼは、抗原性エピトープとしての表面露出ペプチド適性に関する補完的又は独特の情報を生み出すことができる。
【０１２６】
複数のプロテアーゼの逐次連続使用とは、さまざまなプロテアーゼがタンパク質と次々とインキュベーションされる、すなわち、１つのプロテアーゼがインキュベーションされ、続いて別のプロテアーゼが後の時点でインキュベーションされ、随意に１つ以上の他の異なるプロテアーゼが後の時点でインキュベーションされることを意味する。
【０１２７】
単一のプロテアーゼの逐次連続使用とは、同一のプロテアーゼ（例えば、同じ濃度のプロテアーゼ）がタンパク質と、例えば、いくつかの異なる（逐次連続した）時点で数回インキュベーションされるか、又はいくつかの試料がタンパク質分解消化反応から時間とともに採取され、反応で産生された新しい又は独特のペプチドの出現が経時的に検出及び追跡されることを意味する。
【０１２８】
並行同時使用とは、複数の別個の単一プロテアーゼ消化反応が行われ、各反応は異なるプロテアーゼで行われるか、又はプロテアーゼは同じであるが相異なるタンパク質分解条件、例えば、本明細書において別のところに記載されているように、例えば、相異なるプロテアーゼ濃度及び／若しくは温度及び／若しくは時点で行われることを意味する。
【０１２９】
複数のプロテアーゼは、オーバーラップする、補完的な、又は独特の表面露出ペプチドを同定するために使用されうる。これに関連して「オーバーラップしている」とは、１つのプロテアーゼでの限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解を介して同定された表面露出ペプチドが、１つ以上の他の（すなわち異なる）プロテアーゼでの限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解を介して同定された表面露出ペプチドのアミノ酸配列と（部分的又は完全に）重複するアミノ酸配列を有することを意味する。これに関連して、「補完的な」とは、１つのプロテアーゼを用いた限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解を介して同定された表面露出ペプチドが、全タンパク質配列（すなわち、限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解前の全タンパク質配列）に照らして、１つ以上の他の（すなわち、相異なる）プロテアーゼを用いた限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解を介して同定された表面露出ペプチドのアミノ酸配列に隣接又は近接（又は該アミノ酸配列と部分的にオーバーラップしさえする）アミノ酸配列を有することを意味する。「独特の」表面露出ペプチドは、試験したプロテアーゼの１個又は数個（少数）を用いて限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解した後にのみ同定される表面露出ペプチドである。
【０１３０】
理論に拘束されるものではないが、複数のプロテアーゼによって切断されたタンパク質の領域はタンパク質の良好に露出された（例えば、表面露出）領域にある可能性が高い。よって、複数のプロテアーゼによって切断されたタンパク質の領域からの表面露出ペプチドは、抗原性エピトープの基礎となる、特に有用な表面露出ペプチドを表わしうる。
【０１３１】
複数のプロテアーゼを使用することとしては、限定されないが、２個、３個、４個、５個のプロテアーゼを使用することが挙げられる。
本発明の方法のいくつかの実施形態では、プロテアーゼは、トリプシン、Ａｒｇ−Ｃプロテイナーゼ、Ａｓｐ−Ｎエンドペプチダーゼ、クロストリパイン、グルタミルエンドペプチダーゼ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ｌｙｓ−Ｎ、キモトリプシン、プロテイナーゼＫ、テルモリシン、ペプシン、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、グランザイムＢ、好中球エラスターゼ、プロリン−エンドペプチダーゼ、ブドウ球菌ペプチダーゼＩ、及びトロンビンからなる群より選択される。
【０１３２】
いくつかの好ましい実施形態では、プロテアーゼは、トリプシン、Ａｓｐ−Ｎエンドペプチダーゼ、キモトリプシン、ペプシン、及びプロテイナーゼＫからなる群より選択される。好ましい実施形態では、プロテアーゼはトリプシンである。
【０１３３】
本発明のさらに別の態様では、いくつかのプロテアーゼのカクテルが、一定濃度又はさまざまな濃度の１つ又はいくつかのプロテアーゼでの単回又は時間間隔を空けた複数回の曝露に使用される。よって、いくつかの実施形態では、複数のプロテアーゼの単一のカクテル（混合物）が使用される。
【０１３４】
複数のプロテアーゼが使用される場合、ランク付けリストが個々のプロテアーゼについて作られる。
この方法は、タンパク質機能の新らたな基本的理解並びにヒト及び／又は動物の疾患を治療するのに使用できる薬理学的に活性のある抗体の迅速で且つ的確な開発のための新しい方法論／技術を生むことになる。該方法は、可溶性又は膜結合、細胞外又は細胞内のすべてのタンパク質に汎用することができる。
【０１３５】
本明細書で提案する方法によって産生されたエピトープのリストは、精選されたバイオインフォマティクスデータ及び機能アッセイに対して分類されることが好ましい。該方法は実験及びバイオインフォマティクス情報の両方からの入力データを用いることが好ましい。ある実施形態では、注目点は膜タンパク質及び膜結合性タンパク質にあることになる。そのようなタンパク質としては、ヒト侵害受容器ＴＲＰＶ１、ＴＲＰスーパーファミリーの他のイオンチャネル、ＮＭＤＡ受容体を含むいくつかの興奮性アミノ酸受容体、及びＧタンパク質が例となるが、これらに限定されない。これらのタンパク質（例えば、イオンチャネル）には、例えば、パッチクランプを用いて詳細にわたって直接的に調べることができるという利点がある。対象のタンパク質の他のクラスは、発がん性低分子量Ｇタンパク質であるＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、及びＨＲＡＳを含む発がん性タンパク質に関係する。ＫＲＡＳは膵臓癌、結腸癌、及び肺癌を含むいくつかの転移性悪性腫瘍の鍵となるタンパク質である。ＧＴＰアーゼ活性は、例えば、ＧＴＰを放射性同位体標識した後に、ＧＴＰがＧＤＰに加水分解した後の遊離３２Ｐを測定すること、プルダウンアッセイした後にウェスタンブロッティングすることによって調べることができる。さらに、他の興味深いタンパク質クラスは、ほんの数例としてＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＤ４０などのがん治療における免疫調節に関与する免疫調節タンパク質である。
【０１３６】
本発明による「タンパク質」はいずれのタンパク質であってもよい。
本発明のいくつかの実施形態では、タンパク質は、膜結合タンパク質、可溶性（例えば、循環）タンパク質、細胞外タンパク質、又は細胞内タンパク質である。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、タンパク質は膜タンパク質又は膜結合性タンパク質である。
いくつかの実施形態では、タンパク質は、イオンチャネル、例えば、ＴＲＰスーパーファミリーのイオンチャネル（例えば、ＴＲＰＶ１又はＴＲＰＶ２）である。好ましい実施形態では、タンパク質はＴＲＰＶ１である。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、タンパク質は興奮性アミノ酸受容体である。そのような実施形態のいくつかでは、タンパク質はＮＭＤＡ受容体又はＧタンパク質である。
いくつかの実施形態では、タンパク質は発がん性タンパク質である。そのような実施形態のいくつかでは、タンパク質は、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、及びＨＲＡＳからなる群より選択される発がん性低分子量Ｇタンパク質である。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、タンパク質は免疫調節タンパク質である。そのような実施形態のいくつかでは、タンパク質は、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＧＩＴＲ、及びＣＤ２０からなる群より選択される。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、タンパク質はヒトプロテオームのいずれのタンパク質でもある。言い換えれば、ヒトタンパク質が好ましい。
単一又は複数のプロテアーゼの限定消化プロトコールをその標的に使用することは、ホットスポットエピトープに対する新しい抗体の発見につながることになるであろう。相異なるプロテアーゼはさまざまな切断されたペプチドを生じることになる。ある実施形態では、膜タンパク質は分解され、このひとつひとつのトランケーションの効果は、タンパク質機能に対する効果について精査される。ある種のプロテアーゼでのみ見られる稀なスポットも同定されることになる。次いで同定されたデータは、精選されたバイオインフォマティクスのデータ対して解析され、トランケートされたタンパク質の機能アッセイからも解析され、当該タンパク質の機能的に重要である領域を認識することになる。
【０１４１】
実施形態の態様は、タンパク質の抗原性エピトープを同定する方法に関する。該方法は、タンパク質を少なくとも１つのプロテアーゼに接触させることによってタンパク質を限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に供し、少なくとも１つの消化型、分解型、又はトランケート型のタンパク質及び少なくとも１つの表面露出ペプチドを形成することを含む。別の実施形態では、該方法はまた、タンパク質の少なくとも１つの生物学的機能を試験、確認、又は検証する機能アッセイにおいて少なくとも１つの消化型、分解型、又はトランケート型のタンパク質を精査することを含む。該方法はさらに、少なくとも１つの表面露出ペプチドの中で、機能アッセイに基づいて決定されたタンパク質の生物学的機能の発現に関与するタンパク質の領域にある表面露出ペプチドとしてタンパク質の抗原性エピトープを同定することを含む。
【０１４２】
ある実施形態では、タンパク質を限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に曝露することは、タンパク質を少なくとも１つのプロテアーゼに、ｉ）選ばれた温度若しくは温度範囲にて、ｉｉ）少なくとも１つのプロテアーゼの（タンパク質の濃度に相対的な）選ばれた濃度若しくは濃度範囲で、且つ／又はｉｉ）選ばれた時間で接触させることを含む。これにより今度は、少なくとも１つのプロテアーゼがタンパク質の表面露出領域を切断するがタンパク質の柔軟な領域及び／又は内部領域は切断しないことが可能になる。
【０１４３】
タンパク質を少なくとも１つのプロテアーゼに接触させることによってタンパク質を限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に供することは、タンパク質が穏やかなタンパク質分解に供されることを示唆する。結果として、タンパク質の特に表面に露出されている柔軟性のあるペプチド部分が、少なくとも１つのプロテアーゼの作用によってアミノ酸配列から切断されることになる。タンパク質分解に用いられる温度、濃度、及び／又は時間は典型的に、特定のプロテアーゼ及び今般のタンパク質に依存する。よって実施形態では、タンパク質分解条件の候補のセットが、消化に用いられる好適な温度、プロテアーゼの濃度、及び／又は時間、並びにタンパク質を分解又はトランケートして少なくとも１つの表面露出ペプチドを得るバッファー条件を選択又は特定するために最初に試験される。例えば、タンパク質及びプロテアーゼの今般の組み合わせに最も適切なタンパク質分解条件を特定するために、タンパク質分解は、複数の、すなわち少なくとも２つの異なる反応温度にて、複数の相異なるプロテアーゼ濃度（タンパク質の濃度に相対的な）、及び／又は複数の相異なる反応時間、例えば、図１で示されるようにさまざまなバッファー条件で行うことができる。
【０１４４】
好適なプロテアーゼ条件は、例えば、タンパク質を１個又は最大でＮ個の表面露出ペプチドにする消化、分解、又はトランケーションをもたらす温度、濃度、及び／又は時間である。パラメーターＮの典型的な値は７であり、好ましくは、６若しくは５、より好ましくは、４若しくは３、又はさらに好ましくは、２若しくは１である。
【０１４５】
ある実施形態では、機能アッセイは、タンパク質の少なくとも１つの生物学的機能を試験、確認、又は検証する。そのような生物学的機能の非限定的な例としては、タンパク質のリガンド又は受容体などの標的に結合する能力、タンパク質の酵素活性、イオンチャネル活性などが挙げられる。
【０１４６】
ある実施形態では、タンパク質を限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に供することは、タンパク質を複数のプロテアーゼに接触させることによってタンパク質を限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に供し複数の消化型、分解型、又はトランケート型のタンパク質及び複数の表面露出ペプチドを形成することを含む。特定の実施形態では、タンパク質は複数のプロテアーゼに連続して、すなわち、次から次へと順々に接触する。別の特定の実施形態では、タンパク質は複数のプロテアーゼに並行して同時に接触する。
【０１４７】
ある実施形態では、抗原性エピトープを同定することは、限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解の間にその領域がタンパク質から切断又は除去された際にタンパク質の生物学的機能の欠如又は著しい改変をもたらす領域にある少なくとも１つの表面露出ペプチドのなかで表面露出エピトープを同定することを含む。
【０１４８】
ある実施形態では、該方法はまた、バイオインフォマティクス及び／又はタンパク質の生物学的機能の既知データに基づいてタンパク質内の少なくとも１つの標的領域を選択することを含む。そのような場合では、抗原性エピトープを同定することは、少なくとも１つの標的領域の中でタンパク質の領域にある少なくとも１つの表面露出ペプチドのなかで表面露出ペプチドを同定することを含む。
【０１４９】
この実施形態では、バイオインフォマティクス及び／又は生物学的機能の他の既知データが抗原性エピトープ選択を導くのに使用される。これは、選ばれた標的領域の１つにある表面露出ペプチドのみが抗原性エピトープを同定又は選択する際に候補として使用されることを意味する。したがって、いずれかの生物学的機能を欠くことが知られている領域及び／又はタンパク質の生物学的機能を発現するのに関与しないことが知られている領域にある表面露出ペプチドを除去又は除外することによって候補の数を減らすことができる。
【０１５０】
実施形態の別の態様は、タンパク質の抗原性エピトープを同定する上記の方法に従って同定された、抗原性エピトープに関する。
１つの実施形態では、本発明は、
ＬＬＳＱＤＳＶＡＡＳＴＥＫ（配列番号２）；
ＬＬＳＱＤＳＶＡＡＳＴＥＫＴＬＲ（配列番号３）；及び
ＱＦＳＧＳＬＫＰＥＤＡＥＶＦＫＳＰＡＡＳＧＥＫ（配列番号４）
からなる群より選択されるアミノ酸配列又はそれらに実質的に相同な配列を含む（又はから成る）ＴＲＰＶ１の抗原性エピトープを提供する。
【０１５１】
別の実施形態では、本発明は、
ＬＬＳＱＤＳＶＡＡＳＴＥＫＴＬＲＬＹＤＲＲＳ  （配列番号５）；及び
ＧＲＨＷＫＮＦＡＬＶＰＬＬＲＥ  （配列番号６）
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む（又はから成る）ＴＲＰＶ１の抗原性エピトープを提供する。
【０１５２】
１つの実施形態では、本発明は、ＬＶＥＮＧＡＤＶＱＡＡＡＨＧＤＦ（配列番号７）のアミノ酸配列又はそれらに実質的に相同な配列を含む（又はから成る）ＴＲＰＶ１の抗原性エピトープを提供する。
【０１５３】
別の実施形態では、本発明は、
ＤＧＰＴＧＡＲＬＬＳＱ  （配列番号８）；及び
ＤＡＥＶＦＫＳＰＡＡＳＧＥＫ（配列番号９）
からなる群より選択されるアミノ酸配列又はそれらに実質的に相同な配列を含む（又はから成る）ＴＲＰＶ１の抗原性エピトープを提供する。
【０１５４】
別の実施形態では、本発明は、
ＳＱＤＳＶＡＡＳＴＥＫＴＬ（配列番号１０）；及び
ＳＧＳＬＫＰＥＤＡＥＶＦ  （配列番号１１）
からなる群より選択されるアミノ酸配列又はそれらに実質的に相同な配列を含む（又はから成る）ＴＲＰＶ１の抗原性エピトープを提供する。
【０１５５】
１つの実施形態では、本発明は、
ＶＳＰＶＩＴＩＱＲＰＧＤ  （配列番号１２）；
ＶＳＰＶＩＴＩＱＲＰＧＤＧＰＴＧＡ（配列番号１３）；
ＬＮＬＨＤＧＱＮＴＴＩＰＬＬＬ（配列番号１４）；
ＹＴＤＳＹＹＫＧＱ（配列番号１５）
ＳＬＰＳＥＳＴＳＨ（配列番号１６）
ＥＤＰＧＮＣＥＧＶＫＲ（配列番号１７）
ＤＲＱＳＡＱＰＥＥＶＹＬＲ（配列番号１８）；及び
ＱＳＡＱＰＥＥＶＹＬＲ（配列番号１９）
からなる群より選択されたアミノ酸又はそれらに実質的に相同な配列を含む（又はから成る）ＴＲＰＶ１の抗原性エピトープを提供する。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、本発明は本明細書の実施例３の表２、表３、表４、表５、及び表６の各表における２番目の見出し項目（二重アスタリスク（＊＊）で印付けされた見出し項目）に提示されているアミノ酸配列を含むＴＲＰＶ１の抗原性エピトープ又はそれらに実質的に相同な配列を提供する。そのようなペプチドは、より高いタンパク質分解活性（又はより厳しい若しくはより強いタンパク質分解条件）を用いて消化されており、より低いタンパク質分解活性（又は厳しさを抑えた若しくはより弱いタンパク質分解条件）（例えば、１番目の見出し項目（表２、表３、表４、表５、及び表６の各表における単一アスタリスク（＊）で印付けされている見出し）に提示されているような、例えば、より短い時間及び／又はより低い濃度）を用いて消化されたペプチドと比べて、一般的には好ましくない。しかし、もしそれらのペプチドが、タンパク質にとって機能的に重要であるか又は機能的に重要であると予測されるなら、特に興味をひくものでありうる。表２、表３、表４、表５、及び表６における２番目の見出し項目（＊＊）に提示されているペプチドは後に遅れて消化されたペプチドとみなされうる。表２、表３、表４、表５、及び表６における１番目の見出し項目（＊）に提示されているペプチドは最初に消化されたペプチドとみなされうる。
【０１５７】
上記ＴＲＰＶ１の抗原性エピトープに関連して、前記実質的に相同な配列は、所与のアミノ酸配列と比較して１個、２個、３個、４個、５個、若しくは６個（好ましくは、１個、２個、若しくは３個）のアミノ酸の置換又は削除を含む配列、又は所与のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列、又は所与のアミノ酸配列の少なくとも６個の連続したアミノ酸を有する配列でありうる。「実質的に相同な」配列の他の例は、表面露出ペプチドに「実質的に相同な」アミノ酸配列と関連して本明細書において別のところで記載されており、それらの「実質的に相同な」配列の例はまた、上述の具体的なペプチド配列にも適用可能である。上述の具体的なペプチド配列は表面露出ペプチド配列である。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、本発明は、伸長型、トランケート型、又は環状型の上述のペプチド配列（又はそれらに実質的に相同な配列）を含む（又はから成る）抗原性エピトープを提供する。伸長型、トランケート型、及び環状型のペプチドは、伸長、トランケート、及び環状表面露出ペプチドに関連して本明細書において別のところで論じられ、その論考は上述のペプチド配列にも適用可能である。上述の具体的なペプチド配列は表面露出ペプチド配列である。
【０１５９】
１つの実施形態では、本発明は、
ＦＡＰＱＩＲＶＮＬＮＹＲＫＧＴＧ（配列番号２０）；
ＡＳＱＰＤＰＮＲＦＤＲＤＲ（配列番号２１）
ＬＮＬＫＤＧＶＮＡＣＩＬＰＬＬ（配列番号２２）
ＣＴＤＤＹＹＲＧＨ（配列番号２３）
ＬＶＥＮＧＡＮＶＨＡＲＡＣＧＲＦ（配列番号２４）
ＥＤＰＳＧＡＧＶＰＲ（配列番号２５）；及び
ＧＡＳＥＥＮＹＶＰＶＱＬＬＱＳ（配列番号２６）
からなる群より選択されたアミノ酸又はそれらに実質的に相同な配列を含む（又はから成る）ＴＲＰＶ２の抗原性エピトープを提供する。例示的な実質的に相同な配列は本明細書の別のところで議論されている。
【０１６０】
実施形態のさらなる態様は、抗体の作製に使用されるように構成された複合体に関する。複合体は、ペプチド担体に結合させるか又はペプチド担体と混ぜられたと定義され、少なくとも１つの抗原性エピトープを含む。
【０１６１】
よって、１つの態様では、本発明の抗原性エピトープ又は本発明によって同定された（若しくは作製された）抗原性エピトープを含む複合体を本発明は提供する。複合体は、抗原性エピトープ及びいずれの別個のエンティティ（すなわち、抗原性エピトープと異なるいずれのエンティティ）、例えば、標識又はペプチド担体を含みうる。典型的には、複合体は抗原性エピトープ及びペプチド担体を含み、前記抗原性エピトープは前記ペプチド担体に結合させるか、ペプチド担体と混ぜられる。
【０１６２】
ある実施形態では、ペプチド担体はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）及びオボアルブミンからなる群より選択される。結合は、例えば、共有結合又はジスルフィド架橋であることができる。１つの実施形態では、キーホールリンペットヘモシアニンが好ましいペプチド担体である。いくつかの実施形態では、抗原性エピトープは、そのＮ末端又はＣ末端（好ましくは、Ｎ末端）にシステイン残基を備えうる。そのようなシステイン残基は、抗原性エピトープのペプチド担体（例えば、ＫＬＨ）への結合を容易にしうる。
【０１６３】
実施形態のさらに別の態様は、タンパク質に特異的に結合する抗体の作製のための抗原性エピトープ及び／又は上記による複合体の使用に関する。
実施形態のさらに別の態様は、タンパク質に特異的に結合する抗体を作製する方法に関する。方法は、抗原性エピトープ及び／又は上記による複合体に対する抗体を産生すること、並びにその抗体を単離することを含む。抗体を単離することは、抗体が産生若しくは作製された細胞（例えば、宿主細胞）及び／又は成長培地／上清から抗体を単離することを含みうる。
【０１６４】
特定の実施形態では、該方法は、タンパク質を少なくとも１つのプロテアーゼと接触させることによってタンパク質を限定タンパク質分解又は制限的タンパク質分解に供し、少なくとも１つの消化型、分解型、又はトランケート型のタンパク質及び少なくとも１つの表面露出ペプチドを形成することを含む。また該方法は、タンパク質の少なくとも１つの生物学的機能を試験、確認、又は検証する機能アッセイにおいて、少なくとも１つの消化型、分解型、又はトランケート型のタンパク質を精査することを含む。さらに該方法は、少なくとも１つの表面露出ペプチドのなかで、機能アッセイに基づいて決定されたタンパク質の生物学的機能の発現に関与するタンパク質の領域にある表面露出ペプチドとしてタンパク質の抗原性エピトープを同定することを含む。さらに該方法は、その抗原性エピトープに対する抗体を産生すること及びその抗体を単離することを含む。
【０１６５】
抗原性エピトープに対する抗体を産生することは、本明細書においてすでに記載されているように、ハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ技術などを含む当該技術分野において公知である技術に従って行うことができる。
【０１６６】
実施形態のさらなる態様は、抗原性エピトープ及び／又は上記による複合体に対する抗体に関する。その抗体はそのタンパク質に特異的に結合する。
よって１つの態様では、本発明は、本発明の方法によって産生された（又は作製された）抗体を提供する。
【０１６７】
別の態様では、本発明は本発明の抗原性エピトープに対する抗体を提供する。別の見方では、本発明は本発明の抗原性エピトープに結合する抗体を提供する。別の見方では、本発明は本発明の抗原性エピトープに特異的に結合する抗体を提供する。
【０１６８】
例として、本発明は、ＬＬＳＱＤＳＶＡＡＳＴＥＫＴＬＲＬＹＤＲＲＳ（配列番号５）及びＧＲＨＷＫＮＦＡＬＶＰＬＬＲＥ（配列番号６）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む（又はから成る）抗原性エピトープに対する抗体を提供する。１つの実施形態では、アミノ酸配列ＬＬＳＱＤＳＶＡＡＳＴＥＫＴＬＲＬＹＤＲＲＳ（配列番号５）を含む（又はから成る）抗原性エピトープに対する抗体は、ＴＲＰＶ１に対するアンタゴニスト（阻害）抗体であり、好ましくは、実施例の項に記載された抗体ＯＴＶ１に関する１つ以上の機能的特性を有する。このエピトープはＴＲＰＶ１のＮ末端細胞内ドメインに位置するアミノ酸配列にあたる。１つの実施形態では、アミノ酸配列ＧＲＨＷＫＮＦＡＬＶＰＬＬＲＥ（配列番号６）を含む（又はから成る）抗原性エピトープに対する抗体は、ＴＲＰＶ１に対するアゴニスト抗体であり、好ましくは、実施例の項に記載された抗体ＯＴＶ２に関する１つ以上の機能的特性を有する。このエピトープはＴＲＰＶ１のＣ末端細胞内ドメインに位置するアミノ酸配列にあたる。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、抗体は細胞内のＴＲＰＶ１エピトープ（又はドメイン）に対する場合がある。そのような実施形態のいくつかでは、抗体は細胞内のＴＲＰＶ１エピトープ（又はドメイン）に対するアンタゴニスト（阻害）抗体でありうる。他のそのような実施形態では、抗体は細胞内のＴＲＰＶ１エピトープ（又はドメイン）に対するアゴニスト抗体でありうる。
【０１７０】
ある実施形態では、抗体のタンパク質への結合は、タンパク質の生物学的機能の欠如又は著しい変化をもたらす。
よって、抗体は機能性抗体、例えば、アゴニスト抗体又はアンタゴニスト抗体（例えば、ＴＲＰＶ１又はＴＲＰＶ２に対するアンタゴニスト抗体又はアゴニスト抗体）でありうる。アンタゴニスト抗体は、タンパク質に結合し、タンパク質の機能を阻害するか又は低下させることができる。アゴニスト抗体は、タンパク質に結合し、タンパク質の機能を増強するか又は増加させることができる。ＴＲＰＶ１又はＴＲＰＶ２（又は他のいずれのイオンチャネル）の場合、関係している機能はイオン輸送活性でありうる。例えば、抗体のカプサイシン又はカルモジュリンとの結合を阻止する（減少させる）又は強化する（増加させる）抗体の能力が評価されうる。そのような能力をもつ抗体は本発明の好ましい実施形態を形成する。
【０１７１】
実施形態の関連する態様は、上記のような薬剤としての使用に従って、抗体と定義する。
抗原性エピトープに対する抗体及び／又は複合体は、実施形態による１つ以上の抗原性エピトープ及び／又は１つ以上の複合体で動物を免疫することによって得られうる。免疫される動物は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヒト以外の霊長類、ヤギ、ウマ、及び家禽を含む群から選択されうる。
【０１７２】
実施形態による抗体は、実施形態による１つ以上の抗原性エピトープ及び／又は１つ以上の複合体を用いるインビトロ免疫法によっても得られうる。
本発明による抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。
【０１７３】
抗体は、リガンド、Ｆａｂ（抗原結合性フラグメント）断片、Ｆ（ａｂ）’２断片（２つのＦａｂを含有する断片）、ＳｃＦｖ断片（一本鎖可変断片）、二特異性抗体、四特異性抗体などの抗体の１つ以上の断片、又は完全抗体でありうる。
【０１７４】
本発明の抗体は一般的に、タンパク質の全長型、例えば、（例えば、細胞内又は細胞上の）天然の形態のタンパク質の全長型に対して、結合（例えば、特異的に結合）することができる。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書において別のところに記載されているタンパク質（又はタンパク質の種類）の１つに対する抗体である。
抗体及び抗原性エピトープは単離又は精製されてよい。この文脈で使用される「単離された」又は「精製された」という用語は、その自然環境から単離されるか、精製されるか、若しくはその自然環境に関して制約が実質的にない、例えば、（確かにそれらの分子が天然に存在する場合）生物から単離又は精製された場合、そのような分子を指し、又は技術的な方法で作製された場合、そのような分子を指し、つまり、組換え及び合成的に作製された分子を含む。よって、「単離された」又は「精製された」という用語は典型的に、由来する源からの細胞物質又は他のタンパク質を実質的に含まない抗体又は抗原性エピトープを指す。いくつかの実施形態では、そのような単離又は精製された分子は組換え技術で作製される場合には培養培地を実質的に含まず、化学合成される場合には前駆的化学物質又は他の化学物質を実質的に含まない。
【０１７６】
本発明によって産生された抗体のその標的タンパク質に対する機能的効果は評価されることがあり、当業者なら、例えば、標的タンパク質の性質に基づいて使用する好適なアッセイを容易に決定することができるであろう。例えば、抗体がＴＲＰＶ１（又は他のいずれのイオンチャネル）に対する抗体である場合、その抗体の機能的効果は、例えば、本明細書において実施例２に記載の電気生理学及び／又はＹＯ−ＰＲＯ取り込みアッセイを用いて評価しうる。
【０１７７】
本発明の方法は、多様な下流用途のために単離、作製、又は製造できる抗体を産生するのに使用することができる。よって本発明のさらなる態様は、抗体を作製若しくは製造及び／又は単離する方法を提供する。
【０１７８】
本発明の方法によって１つ以上の抗体が、産生、作製、選択、同定、単離及び／又は精製されてきた場合、これらの抗体、又はその構成要素、断片、変異体、若しくは誘導体は、少なくとも１つの薬理学的に許容される担体又は賦形剤とともに製造又は所望の場合には製剤されうる。製造されたそのような分子、又はその構成要素、断片、変異体、若しくは誘導体もまた本発明によって包含される。代替的に、これらの分子は前記抗体をコードする核酸の形をとってもよく、その核酸は次に適切な発現ベクターに組み込まれてもよく且つ／又は好適な宿主細胞に含まれてもよい。よって、前記抗体をコードする核酸分子又は前記核酸分子を含有する発現ベクターは本発明のさらなる態様を形成する。
【０１７９】
本発明に即して特定の抗体、又はその構成要素、断片、変異体、若しくは誘導体が産生又は作製されると、抗体をコードする発現ベクターは容易に使用（又は使用に適合）されて、適切な宿主細菌又は系での発現、及び宿主細胞若しくは系、又はその成長培地若しくは上清から抗体を適宜単離することによって充分な量の分子を作製することができる。ポリクローナル抗体については、抗体は免疫した動物の血清から単離又は精製しうる。
【０１８０】
よって、本発明のさらなる態様は、上記の本発明の方法に従って抗体を産生又は作製するステップ、前記抗体、又はその構成要素、断片、変異体、若しくは誘導体を製造又は作製するステップ、及び前記製造された抗体を少なくとも１つの薬理学的に許容される担体又は賦形剤と随意に製剤するステップを含む抗体を作製又は製造する方法を提供する。
【０１８１】
抗体の前記変異体又は誘導体としては、ペプトイド等価物、非ペプチド性合成骨格をもつ分子、及びポリペプチドが挙げられる。元の同定されたポリペプチドに関連又は由来するポリペプチドにおいて、アミノ酸配列は、例えば、脱グリコシル化又はグリコシル化によって化学的に修飾されたアミノ酸での置換又は付加を、代替的又は付加的には含みうる単一又は複数のアミノ酸置換、付加、及び／又は削除によって改変されている。好都合なことに、そのような誘導体又は変異体は、それらが由来する元のポリペプチドに対して少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、又は９９％の配列同一性を有しうる。
【０１８２】
本発明は抗体の産生に関するので、前記変異体又は誘導体はさらに、抗体分子の１つのフォーマットから別のフォーマットへの変換（例えば、ＦａｂからｓｃＦｖへの変換若しくはその逆の変換、又は本明細書において別のところに記載されている抗体分子のいずれのフォーマットの間での変換、例えば、本明細書において記載されている他のいずれのタイプの抗体断片への変換）、又は抗体分子の特定のクラスへの抗体分子の変換（例えば、特に治療用抗体に適したＩｇＧ又はそのサブクラス、例えば、ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ３への抗体分子の変換）又はいずれの抗体のヒト化若しくはキメラ型の形成を含む。
【０１８３】
前記変異体又は誘導体はさらに、例えば、前記抗体の下流用途に有用でありうる、さらなる機能的構成要素を伴う抗体の結合を含む。例えば抗体は、体内の特定の部位に抗体を向かわせる構成要素、又は例えば、イメージング若しくは他の診断用途に有用な検出可能な部分、又は免疫複合体の形で放射性同位体、毒素、又は化学療法剤などのペイロードと結合しうる。
【０１８４】
明らかに、パートナー分子又は標的エンティティに結合するそのような構成要素、断片、変異体、又は誘導体の主要な要件は、それらが結合能の点で元来の機能活性を保持すること又は機能活性が向上することである。
【０１８５】
本発明の方法を用いて産生又は作製又は製造された抗体分子は、標的エンティティに特異的な抗体（例えば、特定の抗原に特異的な抗体）が必要とされるいずれの方法にも使用されうる。よって、抗体は分子ツールとして使用でき、本発明のさらなる態様は、本明細書で定義されるそのような抗体を含む試薬を提供する。くわえて、そのような分子は、生体内治療若しくは予防用途、生体内若しくはインビトロ診断若しくはイメージング用途、又はインビトロアッセイに使用することができる。
【０１８６】
本発明の他の特徴及び利点は下記の例から明らかである。提供された例は本発明を実行するのに有用なさまざまな構成要素及び方法論を説明する。それらの例は特許請求された発明を限定しない。本開示に基づいて、当業者は本発明を実行するのに有用な他の構成要素及び方法論を特定して採用することができる。
【実施例】
【０１８７】
実施例１
この実施例では、我々が提案した発明及び包含する方法に基づいて、ヒトＴＲＰＶ１イオンチャネルの細胞内側に作用するポリクローナル抗体ＯＴＶ１の発見及び開発に成功した方法を記載する。抗体は薬理学的に活性があり、作動剤カプサイシンで刺激された際にタンパク質に対する強い阻害作用を示す。我々の知る限りでは、ＴＲＰＶ１の細胞内ドメインを標的にする阻害抗体の最初の発見である。このことから、コンセプトが高い確率で実際に使えることや、仮により豊富な複数のプロテアーゼデータセットに由来するエピトープの出発マトリックスが利用可能であれば、より良好で且つ最適化された抗体が同定されうることが証明される。限定タンパク質分解及びバイオインフォマティクス解析の多くのヒットから抗体が選択された。抗体は最初に選択され、それは有効性の強力な証拠を示した。これは、薬理学的に活性のある抗体によって標的にできる独特のエピトープを直接もたらし、スクリーニングステップが必要ないので、著しい進歩であり、現在の抗体を同定する試みを補完する。
【０１８８】
標的エピトープ領域は、ＬＰＩマイクロフルイディクスプラットフォームの最適化プロトコールを用いて標的タンパク質の限定消化に基づいて選び、さらに最適化した。標的ペプチドエピトープをシステイン残基で修飾し、それをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合することによってポリクローナル抗体を産生した。特異的抗体の作製は、特異的なペプチドと結合したＫＬＨの注射を受けて特定の病原体が存在しない（ＳＰＦ）ウサギを免疫することによって行った。抗体を精製し、標準プロトコールに従ってＥＬＩＳＡテストに供した。線状エピトープに対する抗体価をＥＬＩＳＡで行い、０．２５μｇ／ｍｌの濃度という結果になった。天然ＴＲＰＶ１に対する抗体の有効性は、ＴＲＰＶ１の細胞内側を抗体溶液に供することができるインサイド−アウトパッチクランプで調べた。パッチクランプ記録用マイクロフルイディクス装置（Ｄｙｎａｆｌｏｗ、Ｃｅｌｌｅｃｔｒｉｃｏｎ  ＡＢ、ヨーテボリ、スウェーデン）を用いてインサイド−アウト記録を行った。電流振幅は、いくつかのイオンチャネルを含有するパッチを抗体有り無し両方でカプサイシンに供することによって測定した。対照は１μＭのカプサイシンに３０秒間供した後、バッファーに７０秒間、続いて再度１μＭカプサイシンに３０秒間供した。抗体で処理したパッチは、１μＭカプサイシンに３０秒間供した後、０．１４ｍｇ／ｍｌ抗体に７０秒間、続いて０．１４ｍｇ／ｍｌ抗体とともに１μＭカプサイシンに３０秒間供した。すべての測定について、脱感作又は増強のいかなる影響も除外するために、抗体有りの活性をバッファーのみに供した後の活性と比較した。電流時間積分面積を計算し、第２及び第１の電流に関する積分面積の比を計算し、処理間で比較した。抗体で処理した細胞に関して、バッファーのみ処理と比較して電流応答の５０％減少が見られた（図３）。統計的有意性はスチューデントのｔ検定（ｐ＞０．０５）を用いて計算した。
【０１８９】
実施例２
治療用モノクローナル抗体市場は急速に成長しており、２０２０年には約１２５０億米ドルの価値になると予想されている。新規モノクローナル抗体が次々と当局の承認を得て、ＰＤ１阻害剤などの免疫に基づいたモノクローナル抗体はある特定のタイプの難治転移がんの転帰を大きく改善するので、現在それらがかなり話題になっている。しかし、治療目的の新規抗体の発見は主にスクリーニングに依存し、手さぐりで行われている。アフィニティーに着目し、良好な結合特性を示す抗体のサブセットについての生物学的効果をさらに調べる。結合相互作用、抗原決定基、及び作用機序の詳細はわかっていない。
【０１９０】
マイクロフルイディクス法及び質量分析を用いる限定タンパク質分解のキネティックチャレンジ（kinetic challenge）に基づいて抗原エピトープを選択する方法を我々は提示する。タンパク質分解ステップは、プロテアーゼへ供した後、抗原がその時点で１個又は数個のペプチドを分離させる程度に十分ゆっくりと行う。最初に生じるペプチドは、容易にポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体にアクセス可能あり、したがって、より到達し難いと思われるタンパク質の領域に存在する、あとで遅れて生じるペプチドより好ましい。次いで、これらのペプチドをランク付けし、精選されたバイオインフォマティクスデータを用いて配列に基づいた機能的意義に対して相互に関連付けする。標的タンパク質から短時間で離れ、且つ機能的意義を有し、高いランクを付けられたペプチドが、エピトープ開発、免疫、及びそれに続く抗体産生に使用される。また、トランケートされたタンパク質は薬理学的試験に使用することができる。この方法は、配列に基づいた情報に依存し、抗体発見の薬理学的な作用機序に基づいた方法であり、細胞内標的、循環標的、及び細胞外標的のどれにも使用することができる。我々はこの方法を用いて２つ抗体、カルモジュリン結合配列に対応し活性化するもの、及びヒトＴＲＰＶ１イオンチャネルの細胞内領域のＮ末端のカプサイシン結合部位に対応し阻害するものを開発してきた。
【０１９１】
治療用抗体を開発する際に２つの重要なパラメーターは、結合アフィニティー及び生物学的効率である。抗体は約１５０ｋＤａの大きなタンパク質であり、タンパク質表面にある抗原性部位に主に結合する。天然タンパク質構造の表面の近くのアミノ酸の位置が、それらの部位の特定及び予測を導くことができる。我々は限定タンパク質分解を使用してタンパク質の表面露出及び柔軟性を精査した。限定タンパク質分解は、プロテアーゼの活性を温度、濃度、及び／又は消化時間を制御することによって限定する方法である。局所的に折り畳み構造をほどき、プロテアーゼを収容できる柔軟な領域、表面露出領域、並びに水素結合及びジスルフィド架橋などの局所的な相互作用がほとんどない領域のみが、そのような条件下で消化されることになる。構造に関する情報の取得を最大にするために、我々は数種のプロテアーゼを並行して使用した。数種のプロテアーゼによって簡単に消化される領域は、タンパク質の最も露出され、最もアクセス可能な領域に位置するはずであり、その後の抗体開発に適合性が高いはずである。単一のプロテアーゼによってのみ消化される領域はタンパク質の隠れた領域に位置し、アクセスしにくい可能性が高い。それら領域に達して消化できるプロテアーゼの生理化学的特性は、そのような場合における抗体開発を導く可能性がありうる。我々は、どのパラメーターがタンパク質分解を限定するのに用いられたかに応じた、消化されやすさに基づいて、消化されたペプチドをランク付けした。それは、タンパク質が消化された時点、どの濃度又は温度が使用されたかでありうる。次いで、タンパク質の最もアクセス可能な領域に由来するそれらのペプチドを見出すために、各プロテアーゼから消化されたペプチドを関連付けした。
【０１９２】
従来の抗体開発の間では、生物学的効率は一般的に陽性結合が抗体と抗原との間で確認された後に調べられる。抗体開発は、可能性のある抗原決定部位をすべて標的する抗体を作り出すよりもむしろ、生物学的活性部位中又はその近くのアクセス可能部位に免疫を集中させることによる早期機序主導の（early mechanistic driven）アプローチのほうに利点があることになると我々は考える。このアプローチは、スクリーニング手順及び生物学的活性部位から離れた領域に高い結合アフィニティーを有する抗体を最適化するリスクを最小限にする。我々は標的タンパク質にとって機能的重要性も有するアクセス可能なエピトープを見つけることを望んだ。それは、タンパク質分解からのランク付けされたペプチドをバイオインフォマティクスデータと比較することによってなされた。
【０１９３】
我々はヒトＴＲＰＶ１イオンチャネルをモデルタンパク質として用いて機構主導アプローチを示した。ＴＲＰＶ１は低ｐＨ、高温（Ｔ＞４２℃）、カプサイシン、及びいくつかの炎症性メディエーターなどの侵害刺激に感受性が高いイオンチャネルである。ＴＲＰＶ１イオンチャネルは主に末梢神経系の侵害受容ニューロンに位置し、四量体のコンフォメーションに配置される。その４つの単量体の各々は、６回膜貫通領域から成り、そのＮ末端及びＣ末端の両方が細胞膜の細胞内側に向いている。ポア領域は５番目と６番目の膜貫通領域に含まれる。ＴＲＰＶ１の細胞内部分は熱活性化、感作、及び脱感作に重要な多くの調節領域を保持する。
【０１９４】
エピトープ産生
ＴＲＰＶ１を含むプロテオリポソームをＣＨＯ細胞から得て、トリプシン及びＡｓｐ−Ｎを別々に用いてＬＰＩフローセル内でタンパク質分解に供した。プロテアーゼの活性は室温及び低濃度を使って数個のペプチドのみが消化される程度に制限した。次いで、消化したペプチドを液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）とで検出した。３個のペプチドがトリプシンでのタンパク質分解後に検出され、１個のペプチドがＡｓｐ−Ｎでのタンパク質分解後に検出された。それらのペプチドを既知の機能データに比較して、表１に挙げたようにいくつかのペプチドを機能的に重要な領域と関連付けた。２個のペプチド、ａａ９６〜１１７及びａａ７８５〜７９９をさらなる抗体開発に選び、それぞれＯＴＶ１及びＯＴＶ２と名付けた。ＴＲＰＶ１構造内でのエピトープを可視化したものを図４及び５に見ることができる。ＯＴＶ１のペプチド配列は、カプサイシン又はプロトンでの活性化に重要であることが示されているａｒｇ１１５（ｒＴＲＰＶ１についてはａｒｇ１１４）を含む。両プロテアーゼはともにこのアミノ酸に近い領域を消化し、タンパク質三次構造の露出領域である可能性が上がった。ＯＴＶ２のペプチド配列はカルモジュリン結合部位ａａ７８６〜ａａ７９８（ｒＴＲＰＶ１についてａａ７８５〜ａａ７９７）を含み、トリプシンによってのみ消化された。ＴＲＰＶ１の部分には、Ａｓｐ及びＣｙｓのＮ末端側を切断するＡｓｐ−Ｎの消化部位はない。ａａ９６〜１１７とａａ７８５〜７９９の合成ペプチドをリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）に結合して、ＫＬＨ結合ペプチドの注射を受けたウサギの免疫によってポリクローナル抗体を作製するのにさらに使用した。作製した抗体は凍結したとき及び溶液中で時間とともに凝集する傾向を示す。結果として、新たに融かした抗体は使用前にチップ超音波処理し、すべての実験はチップ超音波処理から３０分以内に行った。
【０１９５】
表１−Ａｓｐ−Ｎ及びトリプシンで消化されたペプチド、及びその生物学的関連性
【０１９６】
【表１】
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【０１９７】
免疫細胞化学
ＴＲＰＶ１発現ＣＨＯ細胞内の抗体分布を可視化するために免疫細胞化学を行った（図６）。未誘発細胞を非特異的結合の対照とした。細胞を固定し、ＯＴＶ１又はＯＴＶ２のいずれかで染色し、続いてヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ４８８二次抗体で染色した。細胞膜の明らかな染色は誘導細胞のみ見られ、ＯＴＶ１及びＯＴＶ２の両方で観察された。二次抗体の非特異的結合は無視できる程度であった（データ示さず）。
【０１９８】
電気生理学
カプサイシン誘導ＴＲＰＶ１活性に対するＯＴＶ１の機能的効果及びカルモジュリン／Ｃａ2+依存脱感作に対するＯＴＶ２の効果をインサイド−アウトパッチクランプ記録を用いて評価した。いくつかのイオンチャネルを含む膜パッチをＣＨＯ細胞から切り取り、抗体がＴＲＰＶ１の細胞内領域に露出するのを可能にした。ＯＴＶ１については、ＴＲＰＶ１をカプサイシンで活性化して、次いでＯＴＶ１で処理し、続いてＯＴＶ１の存在下においてカプサイシンで活性化した。対照はカプサイシンで活性化して、バッファーで処理し、再びカプサイシンで活性化した。ＯＴＶ１での処理をバッファーのみでの処理と比較すると、カプサイシン媒介電流の５０％の減少が見られた（図７）。カルモジュリン／Ｃａ2+依存脱感作を妨げるその能力についてＯＴＶ２を調べた。ＴＲＰＶ１をカプサイシンで活性化して、次いでカルモジュリン、Ｃａ2+、及びＯＴＶ２で処理し、続いてカルモジュリン、Ｃａ2+、及びＯＴＶ２の存在下においてカプサイシンで活性化した。対照はカプサイシンで活性化し、カルモジュリン及びＣａ2+で処理し、カルモジュリン及びＣａ2+の存在下においてカプサイシンで活性化した。カルモジュリンはカルシウムの存在下でＴＲＰＶ１を脱感作する。ＯＴＶ２での処理はこの効果を４５％減少させた（図７）。
【０１９９】
ＴＲＰＶ１媒介ＹＯ−ＰＲＯ取り込みアッセイ
全細胞内の抗体の有効性を、エレクトロポレーションを送達法として用いた後、ＴＲＰＶ１媒介ＹＯ−ＰＲＯ取り込みをレーザー走査共焦点顕微鏡法で測定して調べた。ＯＴＶ１、ＯＴＶ２、又はバッファーのいずれかの存在下でネオントランスフェクションシステム（ライフテクノロジーズ）を用いて細胞をエレクトロポレーションした。ＯＴＶ１又はバッファーでエレクトロポレーションした細胞を、カルシウムキレート剤を含有するリン酸緩衝生理食塩水中のカプサイシン及びＹＯ−ＰＲＯに供した。それに続いてＴＲＰＶ１媒介ＹＯ−ＰＲＯ取り込みに起因した細胞内の蛍光の増加をモニターした。ＯＴＶ１で処理した細胞の取り込み率において６０％の減少が活性化の最初の１２秒間観察できた。最も高い取り込み率は、対照の８秒後に対してＯＴＶ１で処理した細胞では２０秒後に見られた（図８）。ＯＴＶ２又はバッファーでエレクトロポレーションした細胞を、カルシウムを含有リン酸緩衝生理食塩水中のカプサイシン及びＹＯ−ＰＲＯに供し、加えたカルシウムによって誘発された内在性カルモジュリンを通して脱感作をした。取り込み率において８０％の増加がＯＴＶ２で処理した細胞の活性化の１５秒後に観察できた。免疫細胞化学を用いてエレクトロポレーションでの抗体のインターナリゼーションを確認した（図９）。
【０２００】
我々は、標的タンパク質の機能的に重要な領域の中及び／又は近くの、露出されてアクセス可能な抗原決定部位の位置を特定する抗体産生のためのマイクロフルイディクス法を開発した。アクセス可能な領域はＬＰＩフローセル内の速度論的に制限されたタンパク質分解を用いて精査される。例えば、補因子が存在することを許容することによってその環境の複雑さが注意深く調節される間に標的タンパク質はその天然の状態で保たれる。これにより、精製タンパク質を用いる結合アッセイと比較して、抗原決定部位へのアクセスしやすさがより良好なものとなる。該方法は別な方法では界面活性剤なしで精製して結合アッセイに使用するのが難しい膜貫通標的に良好に適している。この方法を用いて細胞内ドメイン及び細胞外ドメインの両方を標的にすることができる。
【０２０１】
抗原決定部位の位置及びその生物学的機能に関する知見は、他のタンパク質との非特異的結合及び交差反応性の予測及び評価に非常に重要である。交差反応性を最小限にするために、非常によく保存された領域にあるエピトープは潜在的なエピトープ候補の分析から除外されうる。
【０２０２】
本明細書で開発された抗体は、全タンパク質での免疫から生じてはいないが、ポリクローナルである。我々の方法は、ハイブリドーマ及びそれに続くスクリーニング手順を用いるモノクローナル抗体の作製のための従来のプロトコールに匹敵する。最初のステップとして、ポリクローナル抗体を使用していくつかの有望なエピトープ候補から生物学的効率を実験的に検証した後に、最良のエピトープ／エピトープ（複数）を用いてモノクローナル抗体を作製し、そして高い結合アフィニティーによってスクリーニング手順が続くことで、両方の良いところを合わせている。
抗体インターナリゼーションの検証
エレクトロポレーションを用いた抗体のインターナリゼーションは、エレクトロポレーションの２４時間後に免疫細胞化学で検証した。リン酸緩衝生理食塩水中で０．１４ｍｇ／ｍｌ  ＯＴＶ１又は０．２７ｍｇ／ｍｌ  ＯＴＶ２の存在下で細胞をエレクトロポレーションした。次いでエレクトロポレーションした細胞をガラス底ディッシュ（Ｗｉｌｌｃｏ  Ｗｅｌｌｓ）で２４時間培養した。２つの異なる対照を作製した。１つのセットはエレクトロポレーションせず、それ以外は同様に処理して同じ抗体溶液に供た。もう１つのセットはＯＴＶ１及びＯＴＶ２に供さなかった。後者は二次抗体の非特異的結合を定量するために使用した。２４時間培養後、細胞を注意深くリン酸緩衝生理食塩水で洗い、固定の間に細胞に入りうる残存抗体を除去した。次いで細胞を固定し、Ｉｍａｇｅ−ｉＴ（登録商標）固定／透過処理キット（インビトロジェン）を用いて透過処理した。固定し、透過処理した細胞をヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ４８８二次抗体（インビトロジェン）と室温で３０分間インキュベーションした。最終の洗浄ステップの後に細胞を可視化し、蛍光強度をエレクトロポレーションした細胞、エレクトロポレーションしなかった細胞、及び二次抗体にのみに供した細胞、で比較した（図９）。強度値の明らかな違いがエレクトロポレーションした細胞とエレクトロポレーションしなかった細胞との間で見られた。統計解析はスチューデントのｔ検定を用いて行い、ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとした。低いレベルの一次抗体がエレクトロポレーションしなかった細胞で見られ、恐らく固定及び透過処理中に入った残存抗体である可能性が高い。
【０２０３】
我々は本明細書において、マイクロフルイディクスと限定タンパク質分解とを組み合わせて活用することによって、アフィニティーが高く、生物学的に活性のある抗体を産生する方法を提示した。ヒトＴＲＰＶ１イオンチャネルを用いてその方法を実証し、２つの抗体を開発した。両抗体はそれぞれのエピトープの領域の機能的重要性に基づき、ＴＲＰＶ１応答において予測された変化を引き起こした。
【０２０４】
材料と方法
試薬  細胞培養培地（グルタミンを含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２）、ウシ胎仔血清、及びアクターゼはＰＡＡから購入した。ゼオシン、Ｎａ4ＢＡＰＴＡ、Ｋ4ＢＡＰＴＡ、及びヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ４８８二次抗体はインビトロジェンから購入した。シークエンシンググレード修飾化トリプシン及びシークエンシンググレードＡｓｐ−Ｎはプロメガから購入した。他の化学薬品はすべてシグマから購入した。次のバッファーを使用した：Ａ：３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、Ｂ：２０ｍＭ  ＮＨ4ＨＣＯ3、ｐＨ８．０、Ｃ：１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2  １０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  Ｄ−ブドウ糖、１０ｍＭ  Ｎａ4ＢＡＰＴＡ  ｐＨ７．４、Ｄ：１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、１０ｍＭ  Ｋ4ＢＡＰＴＡ  ｐＨ７．２、Ｅ：１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．２、Ｆ：１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ4、ｐＨ７．４、Ｇ：１２０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  Ｋ4ＢＡＰＴＡ  ｐＨ８．０
【０２０５】
細胞培養
テトラサイクリン制御発現系（Ｔ−ＲＥｘ）をもつ付着性チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、１０％ウシ胎仔血清、ゼオシン（３５０μｇ／ｍｌ）とブラストサイジン（５μｇ／ｍｌ）とを補充した培地（グルタミンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）中にてガラススライド有り無し両方で、培養フラスコ又は培養ディッシュ（Ｎｕｎｃ）で培養した。使用前１８〜２４時間、ヒトＴＲＰＶ１の発現を誘導するために、細胞を１０％ウシ胎仔血清とドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）を加えた培地（グルタミンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）で培養した。細胞株は常にマイコプラズマ感染の検査をした。
【０２０６】
プロテオリポソーム調製
プロテオリポソームは既に参考文献［１］に記載されている通りにバッファーＡ中で調製した。各プロテオリポソーム調製物はいくつかのの異なる培養フラスコに由来した。
【０２０７】
消化プロトコール
フローセル内での単一消化は参考文献［１］に記載の通りに行った。５μｇ／ｍｌトリプシン及び５μｇ／ｍｌ  Ａｓｐ−ＮをそれぞれバッファーＧ及びＢに溶かした。各プロテアーゼでのフローセル内消化を室温で５分間行った。ギ酸を最終濃度で１２％加えることによって溶離液中でのさらなる消化を阻害した。
【０２０８】
液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析
ＣＨＯ−プロテオリポソームの消化由来のペプチド試料は、ヨーテボリ大学にあるプロテオミクスコア施設（ヨーテボリ、スウェーデン）で、参考文献［１］に記載の方法で分析した。すべてのタンデムマススペクトルはＵｎｉＰｒｏｔＫＢを参照したＭＡＳＣＯＴ（マトリックスサイエンス、ロンドン、英国）で検索した。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢの参照については、トリプシンでの消化は、リリース２０１３＿０４（ヒト、［ホモサピエンス］）、Ａｓｐ−Ｎでの消化は、リリース２０１５＿０６（ヒト、［ホモサピエンス］）とした。ペプチドとタンパク質の同定に基づいてＭＳ／ＭＳを確認するためにＴｈｅｒｍｏ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒバージョン１．３（サーモサイエンティフィック）を使用した。データベース検索（ｒｅｖｅｒｓｅｄ  ｄａｔａｂａｓｅ）でペプチドレベルで０．０１の誤発見率を使用し、決定した。
【０２０９】
抗体開発
ｈＴＲＰＶ１のアミノ酸配列を参照してａａ９６〜１１７及びａａ７８５〜７９９の合成ペプチドを、Ｎ末端側の追加のシステイン残基を含めて合成し精製した。次いで、ペプチドをシステイン残基によってキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させた後、ＫＬＨ結合ペプチドの注入に伴い、特定の病原体が存在しない（ＳＰＦ）ウサギを免疫することによってポリクローナル抗体を産生した。抗体を精製し、ＥＬＩＳＡテストに供した。両合成ペプチド及びポリクローナル抗体の産生はＩｎｎｏｖａｇｅｎ  ＡＢ（ルンド、スウェーデン）によって行われた。
【０２１０】
チップ超音波処理から３０分以内の新しい抗体を使用した。抗体はＳｏｎｉｃｓ  ＆  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｉｎｃ．（ニュータウン、コネチカット州、アメリカ合衆国）のＶｉｂｒａ  Ｃｅｌｌ  ＶＣＸ６００を用いて１４％振幅で１分の休止を間に挟んで３回超音波処理した。総超音波処理時間は４０秒で、パルス時間は０．５秒で、プローブによる加熱を減らすために休止時間は０．５秒であった。
【０２１１】
電気生理学
インサイド−アウト記録は、パッチクランプ記録用マイクロフルイディクス装置（Ｄｙｎａｆｌｏｗ、Ｃｅｌｌｅｃｔｒｉｃｏｎ  ＡＢ、ヨーテボリ、スウェーデン）をＨＥＫＡ  ＥＰＣ１０（Ｈｅｋａ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ、ドイツ）パッチクランプアンプと共に用いて行った。槽及びピペット溶液はバッファーＣを含んでいた。パッチを＋６０ｍＶに保ち、電流シグナルを２０ｋＨｚのサンプリング周波数及び５ｋＨｚのローパスフィルターで記録した。
【０２１２】
ＯＴＶ１については、いくつかのイオンチャネルを含まれるパッチを、抗体有り無しの両方でカプサイシンに供することによって電流振幅を測定した。対照はバッファーＤ中の１μＭカプサイシンに３０秒間供した後、バッファーＤに７０秒間、次いでバッファーＤ中の１μＭカプサイシンに３０秒供した。ＯＴＶ１で処理したパッチはバッファーＤ中の１μＭカプサイシンに３０秒間供した後、バッファーＤ中の０．１４ｍｇ／ｍｌ抗体に７０秒間、続いてバッファーＤ中の０．１４ｍｇ／ｍｌ抗体とともに１μＭカプサイシンに３０秒間供した。ＯＴＶ２については、抗体とカルモジュリン／Ｃａ2+の有り無し両方でパッチをカプサイシンに供することによって電流振幅を測定した。対照はバッファーＥ中の１μＭカプサイシンに３０秒間供した後、バッファーＥ中の０．５μＭカルモジュリン及び５０μＭ  Ｃａ2+に７０秒間、続いて再びバッファーＥ中の１μＭカプサイシンに３０秒間供した。抗体で処理したパッチはバッファーＥ中の１μＭカプサイシンに３０秒間供した後、バッファーＥ中の０．１４ｍｇ／ｍｌ抗体、０．５μＭカルモジュリン、及び５０μＭ  Ｃａ2+に７０秒間、次いでバッファーＥ中の０．１４ｍｇ／ｍｌ抗体、０．５μＭカルモジュリン、及び５０μＭ  Ｃａ2+とともに１μＭカプサイシンに３０秒間供した。処理後にシール抵抗（seal resistance）の大きなシフトがある測定はさらなる分析から除外した。
【０２１３】
データ解析電気生理学
測定すべてに関して、反復する活性化に起因する脱感作又は増強のいかなる影響も排除するために、抗体処理の活性をバッファーのみに供した後の活性と比較した。電流トレースを含むデータに関して、Ｆｉｔｍａｓｔｅｒ（ＨＥＫＡ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ、ドイツ）及びＭａｔｌａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）を用いて、ＯＴＶ１については添加と除去との間、及びＯＴＶ２については完全活性化（１０秒後）と除去との間の電流−時間積分面積をカプサイシンでの活性化について各々計算した。第２及び第１の電流の積分面積の比を計算し、処理間で比較した。ＯＴＶ２に関して、効果が時間依存的に減少したので。データ点を２つのカテゴリー（チップ超音波処理の＜１５分及びチップ超音波処理後の＜３０分）にグループ分けした。
【０２１４】
統計解析は、一元配置分散分析と、適用対象となる場合はダネットの事後検定とスチューデントのｔ検定とを併用して行う。ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。データは平均値±ＳＥＭとして提示する。
【０２１５】
エレクトロポレーション
細胞基質の抗体送達はネオントランスフェクションシステム（ライフテクノロジーズ）を用いて行った。アクターゼを用いて付着性ＣＨＯ細胞を剥離し、バッファーＦで洗浄した。１０５個の細胞をペレット化し、バッファーＦ、バッファーＦ中の０．１４ｍｇ／ｍｌ  ＯＴＶ１、又はバッファーＦ中の０．２７ｍｇ／ｍｌ  ＯＴＶ２のいずれかに再懸濁した。１０μｌの細胞／抗体懸濁液をネオンピペットチップを用いて移し、そのシステムのピペットステーションでエレクトロポレーションに供した。細胞を１５５０Ｖに１０ミリ秒間、３回のパルスに曝露する抗体送達用に最適化されたプロトコール［５］を使用した。エレクトロポレーションした細胞をガラス底ディッシュ（Ｗｉｌｌｃｏ  Ｗｅｌｌｓ）に移した。
【０２１６】
イメージング
免疫細胞化学による抗体局在及びＴＲＰＶ１媒介ＹＯ−ＰＲＯ取り込みは蛍光顕微鏡写真から関心領域（ＲＯＩ）測定を用いて測定した。顕微鏡写真は、ＴｈｏｒＩｍａｇｅＬＳソフトウェアに記録するＧａｌｖｏ：Ｒｅｓｏｎａｎｔスキャナー及び高感度ＧａＡｓＰ  ＰＭＴを備えたＴｈｏｒｌａｂｓ  ＣＬＳシステム（Ｔｈｏｒｌａｂｓ  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州、アメリカ合衆国）を用いて形成した。スキャナーユニットを油浸オイル６３×Ａ  １．４７  ライカＨＣＸ  ＰＬ  ＡＰＯ対物レンズをつけたライカＤＭＩＲＢ顕微鏡に取り付けた。Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  Ｓａｐｐｈｉｒｅ  ４８８  ＬＰレーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）を用いて４８８ｎｍで励起して蛍光検出を単一細胞から測定した。発光は５００〜５５０ｎｍで集めた。ＲＯＩデータはＩｍａｇｅ  Ｊ及びＭａｔｌａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）を用いて解析した。
【０２１７】
免疫細胞化学
細胞をガラス底ディッシュ（Ｗｉｌｌｃｏ  Ｗｅｌｌｓ）で培養し、いくつかのディッシュではＴＲＰＶ１発現を使用の１８〜２４時間前に誘導した。ＴＲＰＶ１を発現する細胞の入ったディッシュ及び誘導しなかった細胞の入ったディッシュはともに、Ｉｍａｇｅ−ｉＴ（登録商標）固定／透過処理キット（インビトロジェン）を用いてバッファーＦで洗浄、固定、及び透過処理した。固定及び透過処理した細胞をバッファーＦ中の２５μｇ／ｍｌ抗体に３７℃で３０分間供し、次いでバッファーＦで洗浄した後、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ４８８二次抗体と室温で３０分間インキュベーションした。最後の洗浄ステップの後に細胞を可視化し、抗体分布を誘導した細胞と誘導しなかった細胞との間で比較した。
【０２１８】
ＴＲＰＶ１媒介ＹＯ−ＰＲＯ取り込み
１０μｌのエレクトロポレーションした細胞の入ったガラス底ディッシュを顕微鏡にセットした。。記録は０．５Ｈｚのレートで初期化した。ＯＴＶ１については、バッファーＦ中にカプサイシン、ＹＯ−ＰＲＯ、及びＫ４ＢＡＰＴＡを含む２０μｌの液滴を、剥離を最小限にするために注意深くピペットを用いて、のエレクトロポレーションした細胞の上に移した。最終濃度がカプサイシンは１μＭ、ＹＯ−ＰＲＯは１μＭ、及びＫ4ＢＡＰＴＡは１０ｍＭとなった。ＯＴＶ２については、バッファーＦ中にカプサイシン、ＹＯ−ＰＲＯ、及びＣａ2+を含む２０μｌの液滴を、エレクトロポレーションした細胞の上に同様にピペットで移した。最終濃度がカプサイシンは１μＭ、ＹＯ−ＰＲＯは１μＭ、及びＣａ2+は５０μＭとなった。
【０２１９】
上記実施形態は本発明の少数の例示実施例として理解されるべきである。さまざまな変形、組み合わせ、及び変更が本発明の範囲から逸脱することなく実施形態になされうることを当業者なら理解するであろう。特に、相異なる実施形態における相異なる部分的解決は、技術的に可能であるならば、他の構成と組み合わせることができる。
参考文献
1 Jansson, E. T.; et. al., Anal. Chem. 2012, 84: 5582-5588
2 国際公開第２００６／０６８６１９号
3 欧州特許出願第２１７４９０８号（EP 2174908）
4 Trkulja, C. L., et al., J. Am. Chem. Soc. 2014, 136: 14875-14882
5 Freund, G. et al., MAbs, 2013, 5: 518-522
【０２２０】
実施例３
複数のプロテアーゼを用いた、ＣＨＯ細胞に発現したイオンチャネルＴＲＰＶ１限定消化及び質量分析によるペプチド同定
この例は、ＴＲＰＶ１由来のペプチドのプロテアーゼ特異的なセットを同定するために、並行した複数のプロテアーゼの使用について記す。この例で使用したプロテアーゼは、トリプシン、Ａｓｐ−Ｎ、ペプシン、プロテイナーゼＫ、及びキモトリプシンである。相互に比較したとき、ペプチドのプロテアーゼ特異的なセットはオーバーラップしている可能性、補完的である可能性、又は独特である可能性がある。さまざまなタンパク質分解活性が、さまざまなプロテアーゼ濃度を用いることによって、少数の例ではさまざまなインキュベーション時間を用いることによって得られた。
【０２２１】
材料と方法
細胞培養
簡単に説明すると、ＣＨＯ細胞をＴｒｋｕｌｊａら（J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 14875-14882）の通りに培養した。簡単に説明すると、テトラサイクリン制御発現系（Ｔ−ＲＥｘ）をもつ付着性チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、Ｔ１７５若しくはＴ５００培養フラスコ（Ｎｕｎｃ）中又はガラスディッシュ上で、１０％ＦＢＳ、ゼオシン（３５０μｇ／ｍＬ）、及びブラストサイジン（５μｇ／ｍＬ）を添加した培地（グルタミンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）で培養した。使用前（１８〜２４時間）、ヒトＴＲＰＶ１の発現を誘導するために、１０％ＦＢＳとドキシサイクリン（１μｇ／ｍＬ）を添加した培地（グルタミンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で、細胞を培養した。細胞株は常にマイコプラズマ感染の検査をした。細胞を採集した後、細胞を凍結し、−８０度で保存した。細胞をさらに下記のように処理した。
【０２２２】
細胞溶解及びホモジナイゼーション
細胞懸濁液を５８０ｘｇで３分間遠心分離した。上清を破棄し、４ｍｌの氷冷リン酸緩衝生理食塩水をチューブに注いだ。細胞ペレットを注意深く懸濁し、次いでチューブを氷冷リン酸緩衝生理食塩水で１４ｍｌにした。再び細胞懸濁液を５８０ｘｇで３分間遠心分離し、その手順を２回繰り返した。
【０２２３】
細胞ペレット（〜８００μｌ体積）を約６ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ７．４）に懸濁し、氷上で１０分間保持した。
次いで、溶解バッファー中の細胞を、各細胞懸濁液に対して１つのＤｏｕｎｃｅホモジナイザー（７ｍｌ）に移した。次いで、隙間の狭いペストルを用いて２０ストロークで細胞をホモジナイゼーションに供した。ホモジナイゼーション後、溶解した細胞を５８０ｘｇで３分間の遠心分離した。上清を集め、細胞ペレットは破棄した。上清を５８０ｘｇで３分間の２回目の遠心分離ステップに供し、細胞ペレット（少量）は破棄した。
【０２２４】
上清を集め、ベックマン遠心分離チューブ（５０ｍｌ）に移し、溶解バッファーを２０ｍｌになるまで加えた。上清を７３００ｘｇで１０分間遠心分離してミトコンドリア及び細胞残屑を除去した。上清を２本のファルコンチューブ（各１０ｍｌ）に分け、さらなる処理のために−８０度の冷凍庫で凍結した。
【０２２５】
超遠心分離
上清を氷上で融かし、２本のベックマン透明超遠心分離チューブ（ベックマン・コールター、品目番号３４４０５７）に移した。チューブを氷冷バッファー（１０ｍＭトリス、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）で満たし、注意深くバランスをとった後、ＳＷ５５  Ｔｉローター（ベックマン・コールター）を用いて１００，０００ｘｇ（３２９００ｒｐｍ）で４５分間遠心分離した。上清を破棄し、ペレットを氷冷バッファー（１０ｍＭトリス、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）に懸濁し、再びチューブを同じ氷冷バッファーで満たした。注意深くバランスをとり、１００，０００ｘｇ（３２９００ｒｐｍ）で４５分間遠心分離した後、上清を捨て、ペレット当たり約８００μｌで氷冷バッファー（１０ｍＭトリス、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）にペレットを懸濁した。合計で約１．６ｍｌの膜調製物を集め、−８０度で凍結した。
【０２２６】
チップ超音波処理
凍結した膜調製物を氷上で融かして合わせ後、ソニケーター（Ｖｉｂｒａｃｅｌｌ）を用いて氷冷コニカルバイアル中で超音波処理した。最初に膜調製物を氷冷バッファー（１０ｍＭトリス、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）で４ｍｌに希釈し、１５％振幅、０．５秒パルス／休止サイクルを用いる３０秒の超音波処理に供した。次いで、コニカルバイアル及び膜調製物を氷上で数分間冷やし、その後、膜調製物をさらに１５％振幅、０．５秒パルス／休止サイクルを用いる３０秒間のサイクルに供し、これを再度繰り返した。結果として生じた膜調製物（プロテオリポソーム）を３１０μｌに分注して−８０度で凍結した。
【０２２７】
プロテアーゼ
プロテアーゼはすべてプロメガから購入した。溶液はすべて、フィッシャーサイエンティフィックのＬＣ−ＭＳグレード水を用いて作製した。
【０２２８】
カタログ番号Ｖ１６２１
Ａｓｐ−Ｎ、シークエンシンググレード、２μｇ
カタログ番号Ｖ１９５９
ペプシン、２５０ｍｇ
カタログ番号Ｖ３０２１
プロテイナーゼＫ、１００ｍｇ
カタログ番号Ｖ１０６２
キモトリプシン、シークエンシンググレード、２５μｇ
カタログ番号Ｖ５１１１
シークエンシンググレード修飾化トリプシン、２０μｇ
トリプシン
トリプシンを１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム、Ａｍｂｉｃに溶かした。ｐＨ８
Ａｓｐ−Ｎ
Ａｓｐ−Ｎを１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム、Ａｍｂｉｃに溶かした。ｐＨ８
ペプシン
ペプシンを１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム、Ａｍｂｉｃに溶かした。
ｐＨ８プロテイナーゼＫ
プロテイナーゼＫを１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム、Ａｍｂｉｃに溶かした。ｐＨ８
キモトリプシン
キモトリプシンを１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2に溶かした。ｐＨ８
ＬＰＩプロセス
実験は消化用ＬＰＩ  ＨｅｘａＬａｎｅチップを用いて行った。各チップ内で１つのレーンを１つの消化に使用した。簡単に説明すると、分注したプロテオリポソームを室温に融かし、１００μｌピペットを用いて手作業でレーンに注入し、１時間固定した。
【０２２９】
レーンの洗浄も１００μｌピペットを用いて手作業で行った。各々のウェルを２００μｌの洗浄バッファーで洗浄した。（ペプシン消化プロトコール以外の消化バッファーと同じバッファー。ペプシン消化プロトコールでは１００ｍＭ  Ａｍｂｉｃ  ｐＨ８を洗浄バッファーとして使用した。これはフローセルを長時間、低ｐＨにすることを避けるためである）。次いで、１００μｌピペットを用いて４×１００μｌの洗浄バッファーでレーンを洗浄した。
【０２３０】
次に、プロテアーゼをレーンに注入し、下記明細に従って培養。消化後、２００μｌの消化バッファー（２×１００μｌ）を用いてレーンからペプチドを溶出させた。４μｌのギ酸を加えて、酸性化することでプロテアーゼ活性を止めた。結果としてペプチド溶液は約ｐＨ２となった。この操作をペプシン以外のすべての試料で行った。ペプシンでは溶液を塩基性（ｐＨ９）にするため１６μｌのアンモニア溶液（２５％）を代わりに加えた。
【０２３１】
以下の消化条件を各レーンに１つ実行した。
トリプシン
０．５μｇ／ｍｌ  ２．５分間
０．５μｇ／ｍｌ  ５分間
２μｇ／ｍｌ  ５分間
５μｇ／ｍｌ  ５分間
１０μｇ／ｍｌ  ５分間
２０μｇ／ｍｌ  ５分間
Ａｓｐ−Ｎ
２０μｇ／ｍｌ  ５分間
２μｇ／ｍｌ  ２４時間
キモトリプシン
５μｇ／ｍｌ  ５分間
１０μｇ／ｍｌ  ５分間
２０μｇ／ｍｌ  ５分間
プロテイナーゼ−Ｋ
５μｇ／ｍｌ  ５分間
１０μｇ／ｍｌ  ５分間
２０μｇ／ｍｌ  ５分間
ペプシン
２μｇ／ｍｌ  ５分間
５μｇ／ｍｌ  ５分間
１０μｇ／ｍｌ  ５分間
２０μｇ／ｍｌ  ５分間
試料にラベルをして−８０℃で凍結した。
【０２３２】
ＭＳ分析
製造業者のガイドラインに従ってＰｅｐＣｌｅａｎ  Ｃ１８スピンカラム（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）でトリプシンペプチドを脱塩し、乾燥して、０．１％ギ酸（シグマアルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州）を１５μｌ含む３％グラジエントグレードアセトニトリル（メルク  ＫＧａＡ、ダルムシュタット、ドイツ）で再溶解した。Ｅａｓｙ−ｎＬＣオートサンプラー（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）で試料を２μｌ注入し、インターフェースＱ  Ｅｘａｃｔｉｖｅハイブリッド質量分析計（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で分析した。ペプチドはプレカラム（４５×内径０．０７５ｍｍ）に通してから、室内で充填した逆相カラム、２００×０．０７５ｍｍ、３μｍ  Ｒｅｐｒｏｓｉｌ−Ｐｕｒ  Ｃ１８−ＡＱ粒子（Ｄｒ．  Ｍａｉｓｃｈ、アンマーブーフ、ドイツ）で分離した。。ナノＬＣ（液体クロマトグラフィー）グラジエントは２００ｎｌ／分とし、０．２％のギ酸を含む７％アセトニトリル（ＡＣＮ）から開始し、２５分間で２７％ＡＣＮに上げ、次いで５分間で４０％に上げ、そして最後に５分間で８０％ＡＣＮにし、８０％ＡＣＮを１０分間保持した。
【０２３３】
データ依存的陽イオンモード分析では、１．８ｋＶの電圧と摂氏３２０度のキャピラリー温度下でイオンを作り出し、質量分析計に噴霧している。オービトラップでは、ｍ／ｚ４００−１，６００の範囲、２〜６の電荷範囲で、分解能７０，０００、最大値２５０ｍｓの場合、１ｅ６のＡＧＣ標的値をフルスキャン（ＭＳ１）スペクトルで得た。ＭＳ／ＭＳスペクトルは、ｍ／ｚ１１０から３０％での高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）を用いて得られ、１１０ｍｓの注入時間の間、１ｅ５のＡＧＣ標的値まで２Ｄａのプリカーサー単離質量幅を用いて、分解能３５，０００の場合において、上位１０個の最も存在量の多い親イオンについてスペクトルを得た。ＭＳ／ＭＳ選択後３０秒間のダイナミックエクスクルージョンにより、可能な限り多くのプリカーサーの検出が可能であった。
【０２３４】
結果のまとめ
図１０は、トリプシンによる限定タンパク質分解後に検出されたペプチドのＴＲＰＶ１の３Ｄモデルにおける位置を示す。トリプシンよる限定タンパク質分解後に検出されたペプチドの配列を下記の表２に示す。０．５μｇ／ｍｌトリプシンで２．５分間消化したペプチドを最初に示す。０．５μｇ／ｍｌトリプシンで５分間、２μｇ／ｍｌトリプシンで５分間、５μｇ／ｍｌトリプシンで５分間、１０μｇ／ｍｌトリプシンで５分間、及び２０μｇ／ｍｌトリプシンで５分間、それぞれ消化したペプチドを提示のために集め、その次に示す。
【０２３５】
表２
【０２３６】
【表２】
2018509942.tif 000003
【０２３７】
図１１は、Ａｓｐ−Ｎによる限定タンパク質分解後に検出されたペプチドのＴＲＰＶ１の３Ｄモデルにおける位置を示す。Ａｓｐ−Ｎよる限定タンパク質分解後に検出されたペプチドの配列を下記の表３に示す。２０μｇ／ｍｌ  Ａｓｐ−Ｎで５分間消化したペプチドを最初に示す。２μｇ／ｍｌ  Ａｓｐ−Ｎで２４時間消化したペプチドをその次に示す。
【０２３８】
表３
【０２３９】
【表３】
2018509942.tif 000004
【０２４０】
図１２は、キモトリプシンによる限定タンパク質分解後に検出されたペプチドのＴＲＰＶ１の３Ｄモデルにおける位置を示す。キモトリプシンよる限定タンパク質分解後に検出されたペプチドの配列を下記の表４に示す。５μｇ／ｍｌキモトリプシンで５分間消化したペプチドを最初に示す。１０μｇ／ｍｌキモトリプシンで５分間、及び２０μｇ／ｍｌキモトリプシンで５分間、それぞれ消化したペプチドを提示のために集め、その次に示す。
【０２４１】
表４
【０２４２】
【表４】
2018509942.tif 000005
【０２４３】
図１３は、ペプシンによる限定タンパク質分解後に検出されたペプチドのＴＲＰＶ１の３Ｄモデルにおける位置を示す。ペプシンよる限定タンパク質分解後に検出されたペプチドの配列を下記の表５に示す。２μｇ／ｍｌペプシンで５分間消化したペプチドを最初に示す。５μｇ／ｍｌペプシンで５分間、１０μｇ／ｍｌペプシンで５分間、及び２０μｇ／ｍｌペプシンで５分間、それぞれ消化したペプチドを提示のために集め、その次に示す。
【０２４４】
表５
【０２４５】
【表５】
2018509942.tif 000006
【０２４６】
図１４は、プロテイナーゼＫによる限定タンパク質分解後に検出されたペプチドのＴＲＰＶ１の３Ｄモデルにおける位置を示す。プロテイナーゼＫよる限定タンパク質分解後に検出されたペプチドの配列を下記の表６に示す。５μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫで５分間消化したペプチドを最初に示す。１０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫで５分間、及び２０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫで５分間、それぞれ消化したペプチドを提示のために集め、その次に示す。
【０２４７】
表６
【０２４８】
【表６】
2018509942.tif 000007
【０２４９】
表２、表３、表４、表５、及び表６では、「始点」及び「終点」という用語はＴＲＰＶ１配列におけるアミノ酸残基の位置を指す。
データの評価は、Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｆｉｌｔｅｒｓ（ペプチド）下でＭａｓｃｏｔでの有意な閾値を０．０１に設定して行った。。
【０２５０】
トリプシンはペプチド数の増加をもたらし、プロテアーゼ濃度の増加とともに信頼（confidence）の増加をもたらした。
ペプシン及びキモトリプシンはともに低濃度でもより高い濃度でも多くのペプチドを生じた。
【図１−１】
2018509942.tif 000008
【図１−２】
2018509942.tif 000009
【図１−３】
2018509942.tif 000010
【図２−１】
2018509942.tif 000011
【図２−２】
2018509942.tif 000012
【図２−３】
2018509942.tif 000013
【図３】
2018509942.tif 000014
【図４】
2018509942.tif 000015
【図５】
2018509942.tif 000016
【図６−１】
2018509942.tif 000017
【図６−２】
2018509942.tif 000018
【図７】
2018509942.tif 000019
【図８】
2018509942.tif 000020
【図９】
2018509942.tif 000021
【図１０】
2018509942.tif 000022
【図１１】
2018509942.tif 000023
【図１２】
2018509942.tif 000024
【図１３】
2018509942.tif 000025
【図１４】
2018509942.tif 000026
【配列表】
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【国際調査報告】
2018509942.tif 000027
2018509942.tif 000028
2018509942.tif 000029
2018509942.tif 000030
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