(57)【要約】  本開示は、一般に、心筋梗塞関連合併症、異常伝導を特徴とする心機能障害及び他の心臓の状態を、処置する、予防する、その進行を阻害する又はその発生の可能性を低減させるための方法に関する。本開示は、一般に、コネキシン45の1種以上の阻害剤にも関する。【選択図】図１４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における心筋梗塞関連合併症を、処置する、予防する、その進行を阻害する又はその発生の可能性を低減させる方法であって、Cx45の阻害剤を対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記心筋梗塞関連合併症が、不整脈、異常伝導、突然心臓死、左心室機能不全及び心室同期不全からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記心筋梗塞関連合併症が、不整脈である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
対象における異常伝導を特徴とする心機能障害を、処置する、予防する、その進行を阻害する又はその発生の可能性を低減させる方法であって、Cx45の阻害剤を対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項５】
前記心機能障害が、不整脈、左脚ブロック、右脚ブロック、束枝ブロック、房室ブロック、非特異的心室内伝導障害、非特異的心室間伝導障害、左心室機能不全及び心室同期不全からなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記異常伝導が、心臓細胞において伝導速度が遅くなることである、請求項4又は5に記載の方法。
【請求項７】
前記異常伝導が不整脈を引き起こす、請求項4〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
前記不整脈が、心室性不整脈である、請求項2、3、5又は7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記心室性不整脈が、心室細動である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記心室性不整脈が、心室性頻拍である、請求項8に記載の方法。
【請求項１１】
前記心室性不整脈が、心室細動及び心室性頻拍である、請求項8に記載の方法。
【請求項１２】
前記Cx45の阻害剤が、対象におけるQRS間隔及び/又はPR間隔の延長を低減又は阻害するのに有効な量で投与される、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
前記Cx45の阻害剤が、小分子、タンパク質又は核酸である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
前記Cx45の阻害剤が、RNA分子である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
前記RNA分子が、第1の配列及び第2の配列を含み、前記第1の配列は、少なくとも12ヌクレオチド長であり、配列番号1に示すmRNA転写物の標的領域に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、前記第2の配列は、前記第1の配列の逆の相補物に対して少なくとも70%の配列同一性を有する、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記第1の配列が、前記標的領域に対して100%の配列同一性を有する、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記第2の配列が、前記第1の配列の逆の相補物に対して95%の配列同一性を有する、請求項15又は16に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的領域が、配列番号3、15又は18のいずれか1つに示される、請求項15〜17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
対象における心筋梗塞関連合併症を、処置する、予防する、その進行を阻害する又はその発生の可能性を低減させるための医薬の製造におけるCx45の阻害剤の使用。
【請求項２０】
対象における異常伝導を特徴とする心機能障害を、処置する、予防する、その進行を阻害する又はその発生の可能性を低減させるための医薬の製造におけるCx45の阻害剤の使用。
【請求項２１】
対象における心筋梗塞関連合併症を、処置する、予防する、その進行を阻害する又はその発生の可能性を低減させることに使用するためのCx45の阻害剤。
【請求項２２】
対象における異常伝導を特徴とする心機能障害を、処置する、予防する、その進行を阻害する又はその発生の可能性を低減させることに使用するためのCx45の阻害剤。
【請求項２３】
請求項2、3又は5〜18のいずれか1項以上の特徴により改変された、請求項19若しくは20に記載の使用、又は請求項21若しくは22に記載の阻害剤。
【請求項２４】
第1の配列及び第2の配列を含むRNA分子であって、前記第1の配列は、少なくとも12ヌクレオチド長であり、配列番号1に示すmRNA転写物の標的領域に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、前記第2の配列は、前記第1の配列の逆の相補物に対して少なくとも70%の配列同一性を有する、RNA分子。
【請求項２５】
前記第1の配列が、前記標的領域に対して100%の配列同一性を有する、請求項24に記載のRNA分子。
【請求項２６】
前記第2の配列が、前記第1の配列の逆の相補物に対して95%の配列同一性を有する、請求項24又は25に記載のRNA分子。
【請求項２７】
前記標的領域が、配列番号3、15又は18のいずれか1つに示される、請求項24〜26のいずれか1項に記載のRNA分子。
【請求項２８】
請求項24〜27のいずれか1項に記載のRNA分子をコードする核酸。
【請求項２９】
請求項24〜27のいずれか1項に記載のRNA分子又は請求項28に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項３０】
ウイルスベクターである、請求項29に記載のベクター。
【請求項３１】
組換えアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項29又は30に記載のベクター。
【請求項３２】
前記組換えアデノ随伴ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス血清型2/9ウイルスベクターである、請求項31に記載のベクター。
【請求項３３】
請求項24〜27のいずれか1項に記載のRNA分子又は請求項28に記載の核酸又は請求項29〜32のいずれか1項に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項３４】
請求項24〜27のいずれか1項に記載のRNA分子又は請求項28に記載の核酸又は請求項29〜32のいずれか1項に記載のベクター及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、2015年8月14日に出願されたオーストラリア仮出願第2015903282号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、一般に、心筋梗塞関連合併症、異常伝導を特徴とする心機能障害及び他の心臓の状態を、処置する、予防する、その進行を阻害する又はその発生の可能性を低減させるための方法に関する。本開示は、一般に、コネキシン45の1種以上の阻害剤にも関する。
【背景技術】
【０００３】
心臓血管疾患は、先進国における自然死の唯一の最も一般的な原因であり続けている。心臓が原因の(一般的には、「院外死亡」、「来院時死亡」又は「突然死」とも呼ばれる)突然心臓死は、心臓血管原因によるすべての死のおよそ50%を占めると推定されている。突然心臓死の一般的原因は、例えば、安静時心拍数が正常よりも速い心室性頻拍;心室の心筋の非協調的収縮があり、筋肉を適切に収縮させずに震えさせる心室細動;又は心室性頻拍と心室細動の両方が存在する不整脈状態を含む心室性不整脈である。心室性不整脈は、わかっている心疾患を有するか若しくは有さない、又は構造的な心臓の異常を伴う人において発生する、急性の心臓イベントがしばしば引き金となる。
【０００４】
心疾患の根底を成す数種の分子メカニズムは、ギャップ結合の役割を研究することにより解明された。ギャップ結合は、細胞間コミュニケーションを可能とするチャネルである。哺乳動物組織において、これらのチャネルは偏在性に発現され、多様な生物学的機能に役立つ(Saez、2003年)。心臓内で、ギャップ結合は心臓機能に必要な電気的活性の伝播に必須である。加えて、ギャップ結合のリモデリングが心疾患において発生し、心臓不整脈の病理生理学に貢献し得る。
【０００５】
機能的ギャップ結合は、それぞれが2つの隣接する細胞により提供される2つの半チャネルで構成される(Saez、2003年)。各ヘミチャネルは、6個のコネキシン(Cx)タンパク質からなる。タンパク質のアセンブリは、ホモマー又はヘテロマーのチャネルをもたらすことができる。脊椎動物における20種のコネキシンの中で、心臓中で最も豊富なコネキシンは、Cx37、Cx40、Cx43及びCx45である。Cx37、Cx40及びCx43は、心臓の電気刺激の伝播及び心臓発生に関与する。Cx45は、胚の心臓発生に必須であり、出生後の正常な心臓機能には全く必要でないかもしれない。これに関しては、最近、Baoら(2011年)が、活性化及び伝導が、Cx45を過剰発現している心臓で変化がなく、Cx45欠損心臓では、伝導の速度又はパターンに違いが認められなかったことを報告した。
【０００６】
心室性不整脈の現代の臨床管理は、薬理作用のある薬剤及び装置に基づく電気療法からなる。薬物は有効性が中程度であり、ほとんどの患者において、予防的な植込み型心臓除細動器に対する必要性を未然に防ぐ。加えて、心室性頻拍及び/又は心室細動を予防するために使用される多くの薬物は、不整脈誘発を含む重い副作用を有する。植込み型心臓除細動器は、抗頻拍ペーシング又は除細動のいずれかによって心室性頻拍及び/又は心室細動を検出することにおいて有効であるが、植込み型心臓除細動器を使用することには、意識がありながら直流通電ショックを受ける痛み、到来するショックの予期不安及び費用に加えて、植込みに伴う死亡及びハードウェアの維持などの多くの不利益がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、心筋梗塞関連合併症、異常伝導を特徴とする心機能障害、不整脈及び他の心臓の状態の処置のための方法及び組成物に対する、満たされない必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、コネキシン45(Cx45)の阻害が、心筋梗塞関連合併症を含む、異常伝導を特徴とする心機能障害の発生率を顕著に低減させることをはじめて実証した。よって、本開示は、心機能障害及び心筋梗塞関連合併症を処置することにおけるCx45阻害剤の新規治療適応を提供する。
【０００９】
したがって、一態様において、本開示は、対象における心筋梗塞関連合併症を、処置する、予防する、その進行を阻害する又はその発生の可能性を低減させる方法であって、Cx45の阻害剤を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００１０】
心筋梗塞関連合併症は、不整脈、異常伝導、突然心臓死、左心室機能不全及び心室同期不全(ventricular dyssynchrony)からなる群から選択され得る。特定の一例において、心筋梗塞関連合併症は、不整脈である。
【００１１】
本開示は、対象における異常伝導を特徴とする心機能障害を、処置する、予防する、その進行を阻害する又はその発生の可能性を低減させる方法であって、Cx45の阻害剤を対象に投与するステップを含む、方法も提供する。
【００１２】
心機能障害は、不整脈、左脚ブロック、右脚ブロック、束枝ブロック、房室ブロック、非特異的心室内伝導障害、非特異的心室間伝導障害、左心室機能不全及び心室同期不全からなる群から選択され得る。
【００１３】
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、異常伝導は、心臓細胞において伝導速度が遅くなることであり得る。異常伝導は、心室性不整脈、心室細動又は心室性頻拍のうちのいずれか1つ以上のような不整脈を引き起こし得る。
【００１４】
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、Cx45の阻害剤は、対象におけるQRS間隔及び/又はPR間隔の延長を低減又は阻害するのに有効な量で投与されてもよい。
【００１５】
本明細書に記載の方法のいずれかは、Cx45の阻害剤を対象に投与する前に、対象における異常伝導を特徴とする心機能障害又は心筋梗塞関連合併症の存在又は発生の可能性を同定することにより、処置のための対象を選択するステップをさらに含んでもよい。例えば、本明細書に記載の方法のいずれかは、先に心筋梗塞を患った対象を選択するステップ及び本明細書に記載のCx45の阻害剤をその対象に投与するステップを含んでもよい。
【００１６】
Cx45の阻害剤は、小分子、タンパク質又は核酸であってもよい。
【００１７】
一例において、Cx45の阻害剤は、RNA分子である。RNA分子は、第1の配列及び第2の配列を含んでもよく、第1の配列は、少なくとも12ヌクレオチド長であり、配列番号1に示すmRNA転写物の標的領域に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、第2の配列は、第1の配列の逆の相補物に対して少なくとも70%の配列同一性を有する。第1の配列は、標的領域に対して100%の配列同一性を有し得る。第2の配列は、第1の配列の逆の相補物に対して95%の配列同一性を有し得る。特定例において、標的領域は、配列番号3、15又は18のいずれか1つに示され得る。
【００１８】
本開示は、対象における心筋梗塞関連合併症を、処置する、予防する、その進行を阻害する又はその発生の可能性を低減させるための医薬の製造におけるCx45の阻害剤の使用も提供する。
【００１９】
本開示は、対象における異常伝導を特徴とする心機能障害を、処置する、予防する、その進行を阻害する又はその発生の可能性を低減させるための医薬の製造におけるCx45の阻害剤の使用も提供する。
【００２０】
本開示は、対象における心筋梗塞関連合併症を、処置する、予防する、その進行を阻害する又はその発生の可能性を低減させることに使用するためのCx45の阻害剤も提供する。
【００２１】
本開示は、対象における異常伝導を特徴とする心機能障害を、処置する、予防する、その進行を阻害する又はその発生の可能性を低減させることに使用するためのCx45の阻害剤も提供する。
【００２２】
本開示は、第1の配列及び第2の配列を含むRNA分子であって、第1の配列は、少なくとも12ヌクレオチド長であり、配列番号1に示すmRNA転写物の標的領域に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、第2の配列は、第1の配列の逆の相補物に対して少なくとも70%の配列同一性を有する、RNA分子も提供する。第1の配列は、標的領域に対して100%の配列同一性を有し得る。第2の配列は、第1の配列の逆の相補物に対して95%の配列同一性を有し得る。特定例において、標的領域は、配列番号3、15又は18のうちのいずれか1つに示され得る。第1の配列は、第2の配列にハイブリダイズし得る。
【００２３】
本開示は、本開示のRNA分子をコードする核酸も提供する。
【００２４】
本開示は、本開示のRNA分子又は本開示の核酸を含むベクターも提供する。ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスベクターのようなウイルスベクターであってもよい。一例において、組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス血清型2/9ウイルスベクターである。
【００２５】
本開示は、本開示のRNA分子又は本開示の核酸又は本開示のベクターを含む細胞も提供する。
【００２６】
本開示は、本開示のRNA分子又は本開示の核酸又は本開示のベクター及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む医薬組成物も提供する。
【００２７】
ヌクレオチド配列表のキー
配列番号1 - (NCBI寄託番号U03493により同定されるCx45のcDNA配列由来の)ホモサピエンス(Homo sapiens)コネキシン45(Cx45)のmRNA転写物のヌクレオチド配列
配列番号2 - (NCBI寄託番号NM_001085381により同定されるCx45のcDNA配列由来の)ドブネズミ(Rattus norvegicus)コネキシン45(Cx45)のmRNA転写物のヌクレオチド配列
配列番号3 - Cx45-shRNA#1標的配列
配列番号4 - Cx45-shRNA#1フォワードオリゴヌクレオチド配列
配列番号5 - Cx45-shRNA#1リバースオリゴヌクレオチド配列
配列番号6 - Cx45-shRNA#2標的配列
配列番号7 - Cx45-shRNA#2フォワードオリゴヌクレオチド配列
配列番号8 - Cx45-shRNA#2リバースオリゴヌクレオチド配列
配列番号9 - Cx45-shRNA#3標的配列
配列番号10 - Cx45-shRNA#3フォワードオリゴヌクレオチド配列
配列番号11 - Cx45-shRNA#3リバースオリゴヌクレオチド配列
配列番号12 - Cx45-shRNA#4標的配列
配列番号13 - Cx45-shRNA#4フォワードオリゴヌクレオチド配列
配列番号14 - Cx45-shRNA#4リバースオリゴヌクレオチド配列
配列番号15 - Cx45-shRNA#5標的配列
配列番号16 - Cx45-shRNA#5フォワードオリゴヌクレオチド配列
配列番号17 - Cx45-shRNA#5リバースオリゴヌクレオチド配列
配列番号18 - Cx45-shRNA#6標的配列
配列番号19 - Cx45-shRNA#6フォワードオリゴヌクレオチド配列
配列番号20 - Cx45-shRNA#6リバースオリゴヌクレオチド配列
配列番号21 - Cx45-shRNA#7標的配列
配列番号22 - Cx45-shRNA#7フォワードオリゴヌクレオチド配列
配列番号23 - Cx45-shRNA#7リバースオリゴヌクレオチド配列
配列番号24 - Cx45-shRNA#8標的配列
配列番号25 - Cx45-shRNA#8フォワードオリゴヌクレオチド配列
配列番号26 - Cx45-shRNA#8リバースオリゴヌクレオチド配列
配列番号27 - ループ領域のヌクレオチド配列。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】Cx45を過剰発現するベクターによる形質導入後の、新生仔ラットの心室心筋細胞におけるCx45の細胞局在を示す蛍光顕微鏡画像である。
【図２】Cx45を過剰発現するベクターによる形質導入後の、新生仔ラットの心室心筋細胞におけるCx45の発現レベルを示す代表的ブロットである。
【図３】ラット心筋の心室切片におけるCx43及びCx45の共局在化を示す共焦点顕微鏡画像である。
【図４】Cx43とCx45の免疫共沈降を示す、代表的なブロットを示す。心室組織からのライセートを、Cx43抗体又はCx45抗体のいずれかとともに免疫沈降させ、相互作用を検出するために、お互いのタンパク質に対する抗体を用いてイムノブロッティングした。Cx45をCx43免疫沈降物中で検出し(図4A)、Cx43をCx45免疫沈降物中で検出した(図4B)。Cx45及びCx43を表す特異的なタンパク質バンドを、ブロットの右側の矢印により示す。
【図５】Cx43又はCx45を過剰発現するベクターによる形質導入後の、ECGパラメータを示す表である。
【図６】Cx43又はCx45を過剰発現するベクターによる形質導入後の、ラットにおける心室性不整脈の傾向のグラフ表示である。
【図７】Cx43又はCx45を過剰発現するベクターによる形質導入後の、ラットにおける炎症スコアのグラフ表示である。
【図８】Cx43又はCx45を過剰発現するベクターによる形質導入後の、ラットにおける心筋内線維化のパーセンテージのグラフ表示である。
【図９】偽ラットモデル(偽)又は心筋梗塞のラットモデル(MI)におけるCx45の発現レベルを示す代表的ブロットである。
【図１０】Cx45-GFP融合タンパク質及びCx45を標的とするshRNA(Cx45-shRNA#1、Cx45-shRNA#2、Cx45-shRNA#3、Cx45-shRNA#4)又は対照スクランブル配列(shNS)を共発現するラットにおけるCx45の発現を示す、蛍光顕微鏡画像である。
【図１１】Cx45を過剰発現し、Cx45を標的とするshRNA(Cx45-shRNA#1)又は対照スクランブル配列(shNS)で処置したラットにおける、Cx45の発現を示す蛍光顕微鏡画像である。
【図１２】Cx45を過剰発現し、Cx45を標的とするshRNA(Cx45-shRNA#1)又は対照スクランブル配列(shNS)で処置したラットにおける、Cx43及びCx45の発現レベルを示す代表的ブロットである。
【図１３】Cx45を標的とするshRNA(Cx45-shRNA#1)又は対照スクランブル配列(shNS)で処置したラットにおける、Cx43及びCx45のレベルを示す代表的ブロットである。
【図１４】Cx45を標的とするshRNA(Cx45-shRNA#1)又は対照スクランブル配列(shNS)による形質導入後の、梗塞を起こしたラットにおける、心室性不整脈の傾向のグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
実施形態の説明
一般
特段の定めのない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、(例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学及び生化学において)当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有すると理解されるものとする。
【００３０】
別段の指示のない限り、本発明において利用される組換えタンパク質、細胞培養、ウイルス学、微生物学及び免疫学の技術は、当業者に周知の標準的な手順である。そのような技術は、J. Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning、John Wiley and Sons (1984年)、J. Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989年)、T.A. Brown(編)、Essential Molecular Biology: A Practical Approach、1及び2巻、IRL Press (1991年)、D.M. Glover及びB.D. Hames(編)、DNA Cloning: A Practical Approach、1〜4巻、IRL Press (1995年及び1996年)、及びF.M. Ausubelら(編)、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988年、現在までのすべてのアップデートを含む)、Ed Harlow及びDavid Lane (編)、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbour Laboratory、(1988年)、及びJ.E. Coliganら(編)、Current Protocols in Immunology、John Wiley & Sons (現在までのすべてのアップデートを含む)、Maniatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982年)、DNA Cloning:A Practical Approach、I及びII巻、(D. Glover編)、Oligonucleotide Synthesis (N. Gait編、1984年)、Nucleic Acid Hybridization (B. Hames及びS. Higgins編、1985年)、Transcription and Translation (B. 
Hames及びS. Higgins編、1984年), Animal Cell Culture (R. Freshney編、1986年)のような情報源の文献全体にわたって記載され、説明されている。
【００３１】
用語「及び/又は」、例えば、「X及び/又はY」は、「X及びY」又は「X又はY」のいずれかを意味すると理解されるものとし、両方の意味又はいずれかの意味への明確な裏付けを提供するものとする。
【００３２】
文脈上、明らかな別段の指示のない限り、「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「その(the)」のような単語の単数形は、これらの単語の複数形も含む。
【００３３】
反対の記述のない限り、用語「約」は、指定値の±20%、より好ましくは±10%を指す。疑義を避けるために、指定値が続く用語「約」は、まさにその指定値自体も包含すると解釈されるべきである(例えば、「約10」は、正確に10も包含する)。
【００３４】
用語「ハイブリダイズ」及び「アニール」並びにこれらの文法的同義語は、本明細書において互換的に使用され、それらの相補性のためにワトソン-クリック塩基対を形成することができるヌクレオチド配列を指す。当業者は、非ワトソン-クリック塩基対形成も、特にRNA配列の関連において可能であることを理解すると予想される。例えば、所謂「揺らぎ対」は、RNA中のグアノシン及びウラシル残基の間で形成し得る。
【００３５】
本明細書全体を通して、用語「含む(comprise)」、又は「含む(comprises)」若しくは「含んでいる(comprising)」のような変形は、記述された要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群を包含するという意味を含むが、任意の他の要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群を除外しないと理解される。
【００３６】
コネキシン45
用語「コネキシン45」又は「Cx45」は、ギャップ結合に含まれる特定のコネキシンタンパク質を意味すると理解されるものとする。Cx45は、ギャップ結合及び電気機械的結合に伴う構造的及び/又は生化学的機能を有し得る。Cx45は、どの哺乳動物にも由来し得る。代表的な哺乳動物としては、ヒト、霊長類、家畜(例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ)又はコンパニオンアニマル(例えば、イヌ、ネコ)が挙げられるが、これらに限定されない。一例において、Cx45は、哺乳動物のCx45である。特定例において、Cx45はヒトCx45である。Cx45のアミノ酸配列及びcDNA配列は決定されており、例えば、UniProt、Swiss-Prot、TrEMBL及びNCBIのような多くのオンラインデータベースを介して公的に利用可能である。当業者は、どのようにしてDNA配列からmRNA転写物の配列を得るかを理解している。例えば、DNA配列をmRNA転写物に変換するヌクレオチド配列ソフトウェアが公的に利用可能である。例えば、ヒトCx45 mRNA転写物は、NCBI寄託番号U03493において見いだされるCx45 cDNA配列に由来し得る。ヒトCx45 mRNA転写物は、配列番号1に示すヌクレオチド配列を含むか又はそれからなることができる。代替的に、ヒトCx45 mRNA転写物は、その長さ全体にわたって、配列番号1に示すヌクレオチド配列に対して少なくとも70%、又は少なくとも75%、又は少なくとも80%、又は少なくとも85%、又は少なくとも90%、又は少なくとも95%、又は少なくとも96%、又は少なくとも97%、又は少なくとも98%、又は少なくとも99%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はそれからなることができる。ヒトCx45 mRNA転写物は、その転写物が機能的Cx45タンパク質をコードするという条件で、(自然起源の変異であり得る)そのような配列変異を組み込み得る。ラットCx45 mRNA転写物は、NCBI寄託番号NM_001085381において見いだされるCx45 cDNA配列に由来し得る。ラットCx45 mRNA転写物は、配列番号2に示すヌクレオチド配列を含むか又はそれからなることができる。代替的に、ラットCx45 mRNA転写物は、その長さ全体にわたって、配列番号1に示すヌクレオチド配列に
対して少なくとも70%、又は少なくとも75%、又は少なくとも80%、又は少なくとも85%、又は少なくとも90%、又は少なくとも95%、又は少なくとも96%、又は少なくとも97%、又は少なくとも98%、又は少なくとも99%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はそれからなることができる。ヒトCx45 mRNA転写物は、その転写物が機能的Cx45タンパク質をコードするという条件で、(天然の変異であり得る)そのような配列変異を組み込み得る。
【００３７】
Cx45の阻害剤
本明細書に記載の阻害剤は、Cx45の発現又は機能を阻害することができるいずれの化合物であってもよい。本明細書において使用される場合、用語「阻害する」又は「阻害すること」は、Cx45の発現又は機能を遮断する、部分的に遮断する、妨害する、減少させる又は低減させる化合物の能力を指す。よって、当業者は、用語「阻害する」が、Cx45の発現及び/又は活性の完全な及び/又は部分的な喪失を包含する。例えば、阻害剤は、Cx45の発現及び/又は活性を、阻害剤の非存在下でのCx45の発現及び/又は活性に比較して、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%又は100%阻害し得る。Cx45の発現を阻害する化合物の能力は、当分野で公知の好適な方法により試験され得る。そのような方法としては、例えば、Cx45に特異的な抗体を利用するウェスタンブロッティングのような技術が挙げられる。抗Cx45抗体は、当分野で周知であり、多くの商業的供給源から入手可能である。代替的に、抗Cx45抗体は、当分野で公知の日常的な方法により作製されてもよい。Cx45の発現及び/又は活性を阻害する化合物の能力を決定するための他の方法は、Cx45 mRNAに特異的なプライマーを利用するRT-PCR、又は培養中の形質転換された細胞に対する免疫蛍光技術を含み得る。
【００３８】
本明細書に記載の阻害剤は、小分子、タンパク質又は核酸分子であってもよい。タンパク質は、遺伝子編集用タンパク質であってもよい。例えば、遺伝子編集用タンパク質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALEN、(国際公開第WO2013/176772号、同第WO2014/018423号、同第WO2014/022702号、同第WO2014/065596号、同第WO2014/089290号、同第WO2014/093595号、同第WO2014/093622号、同第WO2014/093635号、同第WO2014/093655号、同第WO2014/093661号、同第WO2014/093694号のうちのいずれか1つ以上、又はこれらの文献に記載されたテクノロジーのいずれかの繰り返しにおいて定義された)クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)関連タンパク質、ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、又はニッカーゼであってもよい。阻害剤は、CRISPR-Cas系キメラRNA(chiRNA)を含んでもよい。chiRNAは、本明細書に記載の標的配列(すなわち、Cx45標的配列)、トレーサーメイト配列及び/又はトレーサー配列にハイブリダイズすることができるガイド配列を含んでもよい。阻害剤は、chiRNAをコードするポリヌクレチドを含んでもよい。阻害剤は、少なくとも1つ以上の核局在配列を含むCRISPR酵素をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでもよい。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の、又はそうでなければCRISPR-Cas媒介性の遺伝子発現の調節をもたらすのに好適であることが公知のいずれの好適なベクター内に含有されてもよい。対象の細胞内で発現された場合、トレーサーメイト配列は、トレーサー配列にハイブリダイズしてもよく、ガイド配列は、CRISPR複合体の標的配列への配列特異的な結合に向かわせ得る。CRISPR複合体は、標的配列にハイブリダイズしたガイド配列及び/又はトレーサー配列にハイブリダイズしたトレーサーメイト配列と複合体化されたCRISPR酵素を含んでもよい。いずれの好適なCRISPR酵素が採用されてもよい。酵素は、Cas酵素であることが好ましい。特定例において、酵素はCas9酵素である。
【００３９】
核酸分子は、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNAS(tRNA)、ミトコンドリアRNA(mtRNA)、リボソームRNA(rRNA)及び核RNA(nRNA)のようないずれのリボ核酸に由来してもよい。
【００４０】
本明細書に記載の阻害剤は、RNA分子であってもよい。一例において、RNA分子は、Cx45の転写及び/又は翻訳を阻害し得る。好適なRNA分子としては、低分子干渉RNA(siRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、逆方向反復、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)、一時的に制御された低分子RNA(small temporally regulated RNA)(stRNA)、放射状のクラスター化された阻害性RNA(radial clustered inhibitory RNA)、非対称なクラスター化された阻害性RNA、線状のクラスター化された阻害性RNA及び複合体化(complex)又は複合化された(compound)クラスター化された阻害性RNAを含む、クラスター化された阻害性RNA、ダイサー基質、DNA依存性RNAi(ddRNAi)、一本鎖RNAi(ssRNAi)、マイクロRNA(miRNA)アンタゴニスト、マイクロRNA模倣体、マイクロRNAアゴニスト、ブロックマー(blockmir)、マイクロRNA模倣体、マイクロRNAアドバック(microRNA addback)、並びにスーパーmiR(supermiR)が挙げられる。好ましくは、RNA分子は、shRNAである。siRNAを形成するために、対象においてshRNAがプロセシングされ得ることは理解されよう。したがって、別の特定例において、RNA分子はsiRNAである。
【００４１】
RNA分子は、第1の配列を含んでもよい。第1の配列は、いずれの長さであってもよい。例えば、第1の配列は、長さが、少なくとも12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50個又はそれを超えるヌクレオチドを含むか又はそれから成ることができる。したがって、RNA分子は、12から50個までのヌクレオチド、例えば、12から25個までのヌクレオチド又は12から21個までのヌクレオチドを含むか又はそれから成ることができる。別の例において、RNA分子は、19から21個までの分子から成るか又はそれを含むことができる。RNA分子は第2の配列を含んでもよい。第2の配列は、いずれの長さであってもよい。第2の配列の長さは、第1の配列の長さと同じであってもよい。代替的には、第2の配列の長さは、第1の配列の長さと異なって(すなわち、より長いか又はより短い)もよい。例えば、第2の配列は、長さが、少なくとも12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50又はそれを超えるヌクレオチドを含むか又はそれから成ることができる。
【００４２】
第1の配列及び第2の配列は、単一の連続したRNA分子を形成してもよい。例えば、RNA分子は、第1の配列と第2の配列の間に位置するループ領域を含んでもよい。ループ領域は、いずれの長さであってもよい。ループ領域の長さは、第1の配列と第2の配列が相互にハイブリダイズするようにRNA分子のフォールディングを可能とするのに十分であってもよい。例えば、ループ領域は、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15ヌクレオチドからなることができる。
【００４３】
第1の配列及び第2の配列は、2つの別個の分子を形成してもよい。2つの別個の配列は、相互にハイブリダイズして、単一のRNA分子を形成してもよい。
【００４４】
第1の配列は、Cx45 mRNA転写物の標的領域に対して、少なくとも70%の配列同一性を有し得る。例えば、第1の配列は、Cx45の標的領域に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。標的領域は、当分野で公知の方法を使用して選択されてもよい。例えば、標的領域は、本明細書に記載のRNA分子の使用を介して達成される最大レベルの阻害を可能とするものとして選択されてもよい。本明細書に記載の実験方法(例えば、本明細書の実施例の項に記載されたもの)は、好適な標的領域(そしてしたがって、好適なRNA分子又は他のヌクレオチド阻害剤)を選択するために使用され得る。
【００４５】
第2の配列は、第1の配列の逆の相補物に対して、少なくとも70%の配列同一性を有し得る。例えば、第2の配列は、第1の配列の逆の相補物に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。
【００４６】
RNA分子は、分子の3'末端及び/又は5'末端にオーバーハングを含んでもよい。例えば、オーバーハングは、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10ヌクレオチド長であってもよい。一例において、オーバーハングは、2ヌクレオチド長であってもよい。よって、RNA分子は、3'末端及び5'末端に2ヌクレオチドのオーバーハングを有しても(又は有するようにプロセシングされても)よい。2ヌクレオチドのオーバーハング(又はオーバーハング(複数))は、配列UUを含んでもよい。
【００４７】
RNA分子は、1個以上の天然のヌクレオチドを含んでもよい。RNAは、1個以上の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。いずれの好適な修飾ヌクレオチドも使用され得る。例えば、修飾ヌクレオチドは、RNA分子の安定性を増大させるように選択されてもよい。代表的な修飾ヌクレオチドとしては、2'-O-メチル修飾ヌクレオチド、5'-ホスホロチオエート基を有するヌクレオチド及びコレステリル誘導体に連結された末端ヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。代替的に、修飾ヌクレオチドは、2'-デオキシ-2'-フルオロ修飾ヌクレオチド、2'-デオキシ-修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2'-アミノ修飾ヌクレオチド、2'-アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミド酸及びヌクレオチドを含む非天然塩基からなる群から選択されてもよい。他の修飾ヌクレオチドは、当業者に公知と予想される。
【００４８】
用語「配列同一性」は、用語「相同性」、「相同性パーセント」、「同一性パーセント」又は「類似性パーセント」と互換的に使用されることができる。配列同一性は、2つの配列の類似性又は関連性を指すために使用される。当業者は、配列同一性をどのようにして決定するかを容易に理解している。例えば、配列同一性は、手動で又はBLAST(Basic Local Alignment Search Tool; Altschulら、1993年);www.ncbi.nih.gov/BLAST/も参照されたい)、アラインメントのClustal法(Higgins及びSharp、1989年)などのようなコンピュータに基づく配列比較及び同定ツールを使用することによって計算されることができ、当業者に理解される通り、各特定の配列比較のための適切なパラメータが選択され得る。
【００４９】
用語「標的領域」は、Cx45 mRNA転写物のいずれの連続ヌクレオチド配列であることもできる。標的領域は、Cx45 mRNA転写物のいずれの領域に位置することもできる。標的領域は、当分野で公知の方法を使用して選択され得る。例えば、標的領域を同定するためのガイドラインが、Laganaら、2014年に記載されている。
【００５０】
標的領域は、Cx45 mRNA転写物のAUG翻訳開始コドンの50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600又はそれを超えるヌクレオチド下流付近に位置し得る。用語「付近に位置する」は、一般に、述べられた位置の25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1ヌクレオチド以内を意味するものとする。用語「下流」は、Cx45 mRNA転写物の3'末端に向かって、を意味する。標的領域は、Cx45 mRNA転写物のUAA、UAG又はUGA翻訳終止コドンの50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600又はそれを超えるヌクレオチド上流付近に位置し得る。用語「上流」は、Cx45 mRNA転写物の5'末端に向かって、を意味する。
【００５１】
標的領域は、配列番号1の位置50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、850、900、950、1000、1050、1100、1150付近に位置し得る。例えば、標的領域は、配列番号3、配列番号15又は配列番号18に示すヌクレオチド配列を含むか又はそれからなることができる。
【００５２】
治療方法
本発明者らにより、Cx45の過剰発現を低減させると不整脈の発生率を低減させることが示された。よって、本開示は、本明細書に記載のCx45の阻害剤を投与することにより、心筋梗塞関連合併症、異常伝導を特徴とする心機能障害及び他の心臓の状態を、処置する、予防する、その進行を阻害する又はその発生の可能性を低減させるための方法を提供する。
【００５３】
用語「処置する」、「処置すること」及び「処置」は、疾患、障害若しくは状態、又は疾患、障害若しくは状態に伴う1種以上の症状の根絶又は寛解を指す。例えば、この用語は、疾患、障害又は状態を有する対象への1種以上のCx45の阻害剤の投与によりもたらされる、そのような疾患、障害又は状態の伝播又は悪化を最小化することを指すことができる。用語「寛解」は、永久的又は一時的、持続的又は一過性であるかにかかわらず、Cx45の阻害剤の投与に帰するか又は伴い得るいずれの減少も指す。処置又は寛解の程度を決定する方法は、当業者に公知であろう。例えば、CX45の発現のレベル、又はPR間隔、又はQRS間隔を決定するための(本明細書の実施例の項に開示された方法のような)本明細書に記載の方法が使用されてもよい。ヒト対象の処置又は寛解の程度を決定するのに特に適合された代替方法も使用されてもよい。
【００５４】
用語「予防する」、「予防すること」及び「予防」は、疾患、障害若しくは状態、又は疾患、障害若しくは状態に伴う1種以上の症状の発症、再発若しくは伝播の予防を指す。例えば、これらの用語は、症状の発症前の、特に本明細書に記載の疾患、障害又は状態のリスクのある対象へのCx45の阻害剤による処置又はその投与を指す。これらの用語は、特定の疾患、障害又は状態の症状の阻害又は低減を包含する。疾患、障害又は状態の家族歴を有する対象は、予防的レジメンのための潜在的な候補である。加えて、症状の再発歴を有する対象も、予防の潜在的な候補である。これに関して、用語「予防」は、用語「予防的処置」と互換的に使用されてもよい。
【００５５】
用語「進行を阻害すること」は、疾患、障害若しくは状態又は疾患、障害若しくは状態の症状の進行を遮断し、部分的に遮断し、妨害し、減少させ、又は低減させる、Cx45の阻害剤の能力を指す。
【００５６】
用語「発生の可能性を低減させること」は、本明細書に提供される疾患、障害又は状態に伴う病態を発症するリスクを減少させることを指す。低減の程度は制限されなくてもよい。例えば、低減は、検出可能な任意の低減であってもよい。代替的に、特別な治療上有益な転帰を達成する「低減」の閾値レベルは、有意な「低減」の好ましい指標として、当分野で公知の方法に従って選択され得る。
【００５７】
用語「心筋梗塞関連合併症」は、心筋梗塞に伴う、関連した又はそれによりもたらされるいずれの疾患、障害又は状態も指す。そのような疾患、障害又は状態は、不整脈、異常伝導を特徴とする心機能障害、突然心臓死、左心室機能不全及び心室同期不全からなる群から選択され得る。
【００５８】
用語「不整脈」は、心臓におけるインパルスの初期化及び/又は伝播の攪乱を含むいずれの心臓異常も指す。不整脈は、不規則なリズム、心拍数の低減、心拍数の亢進、又は心臓の機械機能を低減し得る心筋収縮の脱同期化をもたらし得る。不整脈は、心房性、房室性又は心室性であり得る。例えば、不整脈は、心室性頻拍性不整脈であり得る。一例において、心室性頻拍性不整脈は、心室細動であり得る。一例において、心室性頻拍性不整脈は、心室性頻拍であり得る。一例において、心室性頻拍性不整脈は、心室細動及び心室性頻拍であり得る。不整脈を同定するための方法は、当業者に周知である。例えば、不整脈は、心エコー図、冠動脈造影、電気生理学的検査に基づいて、又は当分野で公知の任意の他の好適な方法により判定され得る。
【００５９】
用語「心エコー図検査」は、心臓を検査し、反射された超音波の形態の情報を記録するために超音波を利用する一群の試験を指す。磁気共鳴映像法も、心内圧及び心臓の解剖学的構造を決定するための非侵襲的手段として使用されてもよい。
【００６０】
用語「冠動脈造影」は、心臓の血管のX線検査を含む手順を指す。
【００６１】
「心臓の電気生理学的検査」は、登録(registration)電極を有するプローブが食道腔に挿入又は導入される方法を指す。食道は、そのある特定の一部が左心房の後壁及び左心室の後壁の十分近くに隣接しており、したがって、食道内のECGシグナルがこれらの心臓コンパートメントの活動を選択的に登録する。食道内心電図検査が、心室性不整脈を診断するために使用されてもよい。
【００６２】
用語「異常伝導を特徴とする心機能障害」は、対象の心臓の刺激伝達系の任意の部分における異常伝導若しくは催不整脈性領域又は心筋細胞間の異常伝導を伴う、それに関連した又はそれによりもたらされるの状態も指す。催不整脈性領域は、不整脈の開始又は永続化に関与する心臓組織の領域と定義される。心機能障害は、脱分極の正常な興奮前面の伝導遅延をもたらす、洞房結節から右心房へ、又は右心房内の任意の位置における、右心房から左心房への連結、又は左心房の異常伝導を含み得る。例えば、心機能障害は、心筋細胞における心臓の遅い電気伝導又は遅い伝導速度であり得る。当業者は、心筋細胞における心臓の電気伝導遅延又は低下した伝導速度が、QRS間隔の延長及び/又はPR間隔の延長として顕在化し得ることを理解している。QRS間隔又はPR間隔の延長は、対象の年齢、性別、既往歴及び他の臨床知見に基づく正常な間隔を超えて延長したQRS間隔又はPR間隔の心電図変化を指す。正常なQRS間隔及びPR間隔は、当業者に明らかである。例えば、20歳の男性については、正常なQRS間隔は、80〜120msの間の持続時間(小さな升目2つから3つ)であることができ及び/又は正常なPR間隔は、120〜200msの間の持続時間(小さな升目3つから5つ)であることができる。異常伝導を特徴とする心機能障害は、以下の構造:心室、AV結節、ヒス束、右脚及び左脚、プルキンエネットワーク又は心室心筋細胞を通る又はその間の異常伝導も含む。異常伝導は、対象の心臓伝導系に、継続的又は断続的に存在し得る。異常伝導疾患としては、洞房ブロック、心房内伝導遅延、房室結節ブロック、右脚ブロック、左脚ブロック及び心室内伝導遅延が挙げられる。心機能障害は、不整脈を引き起こし得る。異常伝導を特徴とする心機能障害を同定するための方法は、当業者に周知である。心機能障害は、異常な心拍数、心電図、電気生理学検査に基づいて、又は当業者に公知の任意の他の好適なメカニズムにより決定されてもよい。伝導異常の機能的影響も、心電図検査、心エコー図検査、心臓カテーテル、心臓の磁気共鳴映像法、心臓核医学画像法又はいずれの他の好適な方法を使用しても評価され得る。
【００６３】
用語「突然心臓死」は、心臓機能の突然の喪失を特徴とするいずれの状態も指す。これに関して、用語「突然心臓死」は、用語「心停止」、「突然停止」、「突然死」及び「突然心停止」と互換的に使用され得る。心血管症状の発症から短時間で死が発生する。例えば、突然心臓死は、症状発症の1時間以内、症状発症の45分以内、症状発症の30分以内、症状発症の15分以内、症状発症の10分以内又は症状発症の5分以内に発生する可能性がある。
【００６４】
用語「左心室機能不全」は、心エコー図検査により定義された40%未満の左心室駆出率を特徴とするいずれの状態も指す。
【００６５】
用語「心室同期不全」は、心室内のさまざまな心筋セグメントにおける収縮のタイミングの遅延を特徴とするいずれの状態も指す。
【００６６】
本明細書に記載の治療方法は、治療有効量のCx45の阻害剤を対象に投与するステップを含み得る。Cx45の阻害剤の「治療有効量」又は「有効量」という用語は、単独で又は1種以上の他の薬剤と組み合わせて、本明細書に記載の任意の疾患、障害又は状態の処置又は管理において治療効果を提供する、或いは本明細書に記載の任意の疾患、障害又は状態に伴う1種以上の症状を寛解させ、遅延させ又は最小化するのに十分な、Cx45の阻害剤の量を意味する。例えば、Cx45の阻害剤の量は、QRS間隔及び/又はPR間隔の延長を低減させ又は阻害するのに十分であってもよい。当業者は、QRS間隔又はPR間隔の心電図のいずれの変化も検出することができる。用語「有効量」は、治療全体を改善し、本明細書に記載の任意の疾患、障害又は状態の症状を低減させ又は回避する量を包含し得る。
【００６７】
本明細書に記載のCx45の阻害剤の投与のための用量範囲は、所望の治療効果をもたらすのに十分に大きいものである。例えば、用量は、QRS間隔及び/又はPR間隔の延長を低減又は阻害するのに十分であり得る。本明細書に記載の対象における使用に好適な用量は、過度の有害副作用を回避又は最小化するものであることが好ましい。有害副作用としては、悪心、嘔吐、毒性、刺激、アレルギー反応及び死を挙げることができるが、これらに限定されない。有害副作用は、本明細書に記載のCx45の阻害剤により提供される利益よりもリスクが重い場合、「過度」であり得る。
【００６８】
一般に、用量は、年齢、体重、性別、状態、本明細書に記載の疾患、障害若しくは状態の程度及び/又は本来の目的により変化し得る。用量は、いずれの禁忌、抵抗性又は同様の状態の場合にも調整され得る。当業者は、そのような因子を容易に評価することができ、この情報に基づいて、本来の目的のために使用されるCx45の阻害剤の具体的な有効濃度を決定することができる。
【００６９】
Cx45の阻害剤は、いずれの適切な方法で投与されてもよい。投与のための方法としては、静脈内注射、経皮経管冠動脈形成術中のカテーテルを介したボーラス注射、ステントのようなコーティングされた若しくは含侵された埋込装置又は標的組織への直接注入が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、標的組織は、心臓の梗塞領域中又はその周囲にあってもよい。埋込装置及びステントの例としては、米国特許第6,709,379号、同第6,273,913号、同第5,843,172号、同第4,355,426号、同第4,101,984号、同第3,855,638号、同第5,571,187号、同第5,163,958号及び同第5,370,684号;米国特許出願公開第US2002/0098278号及び同第US2004/0073284号;国際公開第WO2004/043292号;並びにヨーロッパ特許出願公開第0875218号に記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
用語「対象」は、いずれのヒト又は非ヒト動物も含む。好ましくは、対象はヒトである。用語「非ヒト動物」としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット、マウス、ラット及びモルモットなどの齧歯類、ニワトリなどの鳥類、両生類並びに爬虫類などの脊椎動物が挙げられるが、これらに限定されない。用語「対象」、「患者」及び「個体」は、本明細書において互換的に使用され得る。対象は、心臓血管系への傷害を患っているか又は将来的なリスクを有してもよい。用語「心臓血管系への傷害」は、いずれの手段により引き起こされるいずれの形態の傷害も指す。例えば、心臓血管系への傷害は、心筋梗塞、不整脈、異常伝導を特徴とする心機能障害、突然心臓死、左心室機能不全、心室同期不全又は心臓血管機能不全に伴ういずれの他の状態であってもよい。例えば、対象は、心筋梗塞を患っているか(若しくは患ったか)又は将来的なリスクを有してもよい。心筋梗塞は、高血圧、虚血性心疾患、心毒性化合物への曝露、心筋炎、甲状腺疾患、ウイルス感染、歯肉炎、薬物中毒、アルコール中毒、心膜炎、動脈硬化、血管病、肥大型心筋症、急性心筋梗塞、左心室収縮不全、冠動脈バイパス術、飢餓、摂食障害、遺伝子異常、傷害又は他の原因のうちの1つ以上に起因し得る。対象は、異常伝導を特徴とする心機能障害を患っているか(若しくは患ったか)又は将来的なリスクを有してもよい。
【００７１】
対象が心臓血管系への傷害を患っているか又は将来的なリスクを有し得るかを決定するために、当分野で公知のいずれの方法が使用されてもよい。例えば、任意の公知のリスク因子の測定に基づいて心臓血管系への傷害の将来的なリスクを予測するために、リスク因子スコアが使用されてもよい。リスク因子の例としては、年齢、性別、収縮期血圧、喫煙、耐糖能異常、左心室肥大、総コレステロール、低密度リポタンパク質レベル及び高密度リポタンパク質レベルが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリスク因子を測定するための方法は、当業者に公知であろう。一例において、Framinghamリスク因子スコアを使用して、リスク因子スコアが決定され得る。本明細書に記載の方法が、対象の心臓血管系への傷害を患うリスクをモニターするために使用されてもよい。例えば、第1の時点及び第2の時点において、Cx45の発現及び/又は活性のレベルを測定することは、対象が心臓血管系への傷害のリスクを有する兆候を提供し得る。例えば、第1の時点に比較して増大した、第2の時点におけるCx45の発現及び/又は活性のレベルは、対象が心臓血管系への傷害のリスクを有することを示し得る。例えば、第1の時点及び第2の時点において、QRS間隔及び/又はPR間隔の持続時間を測定することは、対象の心臓血管系への傷害のリスクの兆候を提供し得る。例えば、第1の時点に比較して延長した、第2の時点におけるQRS間隔及びPR間隔は、対象が心臓血管系への傷害のリスクを有することを示し得る。
【００７２】
ベクター
本明細書に記載のCx45の阻害剤は、対象におけるその発現を可能とするために、任意の好適なベクター中に組み込まれてもよい。好適な発現ベクターは、当分野で公知である。一般に、発現ベクターは、外来性又は異種性の核酸配列をコードするようにデザインされている。操作された非ウイルスベクターは、当分野で公知であり、例えば、Ramamoorth及びNarvekar、2011年に記載されている。多様なウイルスベクター系も当分野で公知である。好適なウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AVV)ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、狂犬病ウイルスベクター、ウシパピローマウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクター又はセンダイウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。一例において、ベクターはアデノウイルスベクターであってもよい。一例において、ベクターはアデノ随伴ウイルス(AVV)ベクターであってもよい。例えば、AAVベクターは、AAV6、AAV2、rAAV2/1、rAAV2/2、rAAV2/3、rAAV2/4、rAAV2/5、rAAV2/6、rAAV2/7、rAAV2/8、rAAV2/9又はrAAV2/10ベクターであってもよい。一例において、ベクターはヘルペスウイルスベクターであってもよい。例えば、ヘルペスウイルスベクターは、単純ヘルペスウイルス2型ベクター、ヒトサイトメガロウイルスベクター、エプスタイン-バーウイルスベクター、バリセラゾスターウイルスベクター又はカポシ肉腫随伴ヘルペスウイルスベクターであってもよい。一例において、ベクターはレトロウイルスベクターであってもよい。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスベクター又はレンチウイルスベクターであってもよい。例えば、レンチウイルスベクターは、HIVウイルスベクター、ネコ免疫不全ウイルスベクター、ウシ免疫不全ウイルスベクター又はシミアン免疫不全ウイルスベクターであってもよい。一例において、ベクターはバキュロウイルスベクターであってもよい。
【００７３】
本明細書に記載のベクターは、本明細書に記載のCx45の阻害剤を、対象の細胞中へ移行させるために使用されてもよい。よって、ベクターは、対象の細胞を形質転換するために使用されてもよい。対象の細胞を形質転換する(又は「形質導入する」又は「トランスフェクトする」)ための好適な方法は、当業者に公知である。例えば、かん流、ネイキッドDNAのトランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、カプセル封入及び受容体媒介性のエンドサイトーシスのようなDNAの直接送達が挙げられるが、これらに限定されない非ウイルス方法が採用されてもよい。
【００７４】
採用され得る具体的なベクターのさらなる詳細は、例えば、米国出願第2013/287739号に記載されている。よって、好適なベクターは以下のものを含む。
【００７５】
アデノ随伴ウイルス(AVV)
アデノ随伴ウイルス(AVV)は、ヒトの臨床試験において遺伝子治療のための遺伝子を送達するために有望であることが示されている。非病原性の複製欠損ウイルスに基づく唯一のウイルスベクター系として、組換えAAVウイルスは、多様な組織中の増殖性細胞及び最終分化した細胞の両方の効率的かつ持続的な遺伝子導入を確立するために成功裏に使用された。
【００７６】
AAVゲノムは、約4681ヌクレオチドを含有する線状の一本鎖DNA分子である。一般に、AAVゲノムは、各末端に末端逆位配列(ITR)がある内部非反復ゲノムを含む。ITRは、およそ145塩基対(bp)の長さである。ITRは、DNA複製の開始点として、及びウイルスゲノムのためのパッケージングシグナルとしての機能を含む複数の機能を有する。ゲノムの内部非反復部分は、AAV複製(rep)及びカプシド(cap)遺伝子として公知の2つの大きなオープンリーディングフレームを含む。rep及びcap遺伝子は、ウイルスが複製し、ビリオンにパッケージングすることを可能とするウイルスタンパク質をコードする。特に、少なくとも4つのウイルスタンパク質のファミリーが、それらの見かけの分子量に従って名付けられたAAV rep領域、Rep78、Rep68、Rrep52及びRep40から発現される。AAV cap領域は、少なくとも3つのタンパク質、VP1、VP2及びVP3をコードする。
【００７７】
AVVは、AVVゲノムの内部非反復部分(すなわち、rep及びcap遺伝子)を除去し、ITRの間に異種遺伝子を挿入することによって、目的の遺伝子を送達するように操作されている。異種遺伝子は、典型的に、適切な条件下で患者の標的細胞における遺伝子発現を推進することができる異種プロモーター(構成的、細胞特異的又は誘導性)に機能的に又は作動可能に連結される。ポリアデニル化部位のような終止シグナルも含まれてよい。
【００７８】
本明細書において使用される場合、用語「AAVベクター」は、制限なく、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9を含むアデノ随伴ウイルス及びこれらの変異型に由来するベクターを意味する。AAVベクターは、AAV野生型遺伝子のうちの1つ以上、好ましくはrep及び/又はcap遺伝子、が全体として又は部分的に除去されていてもよいが、機能的な隣接ITR配列を保持していてもよい。高い相同性にもかかわらず、異なる血清型は異なる組織に対する指向性を有する。AAV1の受容体は未知であるが、AAV1はAAV2よりも効率的に骨格筋及び平滑筋に形質導入することが公知である。理論に束縛されることを望むものではないが、ほとんどの研究がAAV2 ITRに隣接したベクターDNAが別の血清型のカプシドにパッケージングされる、偽型ベクターを用いて行われたため、生物学的相違が、ゲノムよりもカプシドに関連することは明らかである。最近の証拠は、AAV1カプシドにパッケージングされたDNA発現カセットが、心筋細胞に形質導入することにおいて、AAV2カプシドにパッケージングされたものよりも、少なくとも1log10効率的であることを示している。
【００７９】
機能的ITR配列は、AAVビリオンのレスキュー、複製及びパッケージングに必要である。よって、AAVベクターは、本明細書において、ウイルスの複製及びパッケージングのためにはシス(cis)であることが必要とされる配列(例えば、機能的ITR)を少なくとも含むと定義される。ITRは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、配列が機能的レスキュー、複製及びパッケージングを提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失又は置換によって変更されてもよい。
【００８０】
AAVベクターは、複製され、AAV粒子にパッケージングされ、効率的に細胞染色体に組み込まれるために、1コピーのAAV末端逆位配列(ITR)をゲノムの各末端に有さなければならない。しかしながら、ITRにより促進される核酸は、いずれの所望の配列であってもよい。例えば、核酸は、本明細書に記載の(例えば、対象の細胞中で発現された場合に、Cx45の発現及び/又は活性を阻害し得る)RNA分子をコードしてもよい。
【００８１】
ITRは、AAV DNAゲノムの左側末端におけるヌクレオチド1〜145及びAAV DNAゲノムの右側末端における対応するヌクレオチド4681〜4536(すなわち、同じ配列)からなる。よって、AAVベクターは、全部で少なくとも300ヌクレオチドの末端配列を有さなければならない。したがって、大きなコード領域をAAVベクター粒子にパッケージングするためには、転写プロモーター及びポリA付加シグナルのような可能な最小の制御配列を開発することが重要である。
【００８２】
したがって、本明細書において使用される場合、AAVは、AAVのすべての血清型(すなわち、1〜9)及びその変異型を指す。よって、当分野では、すべてのAAV血清型のITRが、複製、組込み、切除及び転写メカニズムに関して同様の構造及び機能を有すると予測されるため、他の血清型のAAVからのITR配列を使用することが日常的である。
【００８３】
AAVは、ヘルパー依存性ウイルスでもある。すなわち、AAVは、AAVビリオンを形成するために、ヘルパーウイルス(例えば、アデノ、ヘルペス又はワクシニア)との同時感染を必要とする。ヘルパーウイルスとの同時感染がない場合、AAVは、ウイルスゲノムが宿主細胞染色体へ挿入されるが、感染性ビリオンは生成されない、潜在状態を確立する。ヘルパーウイルスによる後の感染は、組み込まれたゲノムを「レスキュー」し、それが複製し、そのゲノムを感染性AAVビリオン中にパッケージングすることを可能とする。AAVが異なる種由来の細胞に感染できる一方、ヘルペスウイルスは、宿主細胞と同じ種のものでなければならない。よって、例えば、ヒトAAVは、イヌアデノウイルスに同時感染したイヌ細胞中で複製する。
【００８４】
用語「AAVヘルパー機能」は、発現されて、次に増殖性AAVの複製のためにトランスに機能するゲノム産物を提供し得るAVV由来のコード配列を指す。よって、AAVヘルパー機能は、両方の主要AVVオープンリーディングフレーム(ORF)、rep及びcapを含む。Rep発現産物は、中でも、DNA複製のAAV開始点の認識、結合及びニッキング;DNAヘリカーゼ活性;及びAAV(又は他の異種)プロモーターからの転写の調節を含む、多くの機能を有することが示されている。Cap発現産物は、必要なパッケージング機能を供給する。AAVヘルパー機能は、本明細書において、AAVベクターから失われたトランスで機能するAAVを補完するために使用される。
【００８５】
したがって、用語「AAVヘルパー構築物」は、一般に、目的のヌクレオチド配列の送達のための形質導入用ベクターを作製するために使用される、AAVベクターから除去されたAAV機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。AAVヘルパー構築物は、一般的に、溶菌性AAVの複製に必要な、失われたAAV機能を補完するために、AAV rep及び/又はcapの一過性の発現を提供するために使用されるが、ヘルパー構築物は、AAV ITRを欠いており、自身を複製もパッケージングもできない。AAVヘルパー構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス又はビリオンの形態であってもよい。多くのAAVヘルパー構築物及びRep及び/又はCapの発現産物をコードするベクターが記載された。
【００８６】
典型的に、組換えAAV(rAAV)ウイルスは、2つのAAV末端反復に隣接した(本明細書に記載のヌクレオチド阻害剤のような)目的の分子を含有するプラスミド及び/又は末端反復を含まない野生型AAVコード配列を含有する発現プラスミド、例えば、pIM45を同時導入することによって作製される。細胞はまた、AAVヘルパー機能に必要なアデノウイルス遺伝子を担持するアデノウイルス及び/又はプラスミドにより感染及び/又はトランスフェクトされる。そのような様式で作製されたrAAVウイルス原液には、rAAV粒子から(例えば、塩化セシウム密度遠心法又はカラムクロマトグラフィーによって)物理的に分離されなければならないアデノウイルスが混入する。代替的に、AAVコード領域を含有するアデノウイルスベクター並びに/或いはAAVコード領域及び/又はアデノウイルスヘルパー遺伝子の一部若しくはすべてを含有する細胞株が使用され得る。rAAV DNAを組み込まれたプロウイルスとして担持する細胞株も使用されてもよい。
【００８７】
本明細書において使用される場合、用語「アクセサリー機能」は、AAVがその複製のために依存する、非AAV由来ウイルス及び/又は細胞機能を指す。よって、この用語は、AAV遺伝子の転写、段階特異的なAAV mRNAのスプライシング、AAV DNAの複製、Cap発現産物の合成及びAAVカプシド集合の活性化に関与する部分を含む、AAV複製に必要なタンパク質及びRNAをとらえる。ウイルスに基づくアクセサリー機能は、アデノウイルス、(単純ヘルペスウイルス1型を除く)ヘルペスウイルス及びワクシニアウイルスのような公知のヘルパーウイルスのいずれか由来であってもよい。
【００８８】
したがって、「アクセサリー機能ベクター」は、一般に、アクセサリー機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。アクセサリー機能ベクターは、好適な宿主細胞へトランスフェクトされ、次いで、このベクターは宿主細胞におけるAAVビリオンの産生を支援することができる。アデノウイルス、ヘルペスウイルス又はワクシニアウイルス粒子のような感染性のウイルス粒子は、自然に存在するため、この用語から明らかに除外される。よって、アクセサリー機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン又はコスミドの形態であってもよい。
【００８９】
特に、アデノウイルス遺伝子の完全な相補物がアクセサリーヘルパー機能に必要でないことが実証された。特に、DNA複製及び後期遺伝子合成できないアデノウイルス突然変異体が、AAV複製に対して許容状態であることが示された。同様に、E2B及びE3領域内の突然変異体は、AAV複製を支援することが示され、E2B及びE3領域がアクセサリー機能を提供することにおそらく関与していないことを示している。しかしながら、E1領域が不完全なアデノウイルス又はE4領域が除去されたアデノウイルスは、AAV複製を支援することができない。よって、E1A及びE4領域は、おそらく直接的又は間接的にAAV複製に必要とされる。他の特徴付けされたAd突然変異体としては:E1B;E2A;E2B;E3;及びE4が挙げられる。E1Bコード領域に突然変異を有するアデノウイルスにより提供されるアクセサリー機能の研究が、相反する結果を生じたが、最近、E1B55%がAAVビリオン産生に必要とされるが、E1B19Kは必要でないことが報告された。
【００９０】
代表的なアクセサリー機能ベクターとしては、アデノウイルスVA RNAコード領域、アデノウイルスE4 ORF6コード領域、アデノウイルスE2A 72kDコード領域、アデノウイルスE1Aコード領域及び完全なE1B55kコード領域を欠くアデノウイルスE1B領域が挙げられる。
【００９１】
「効率的なrAAVビリオン産生を支援することができる」により、アデノウイルスヘルパーウイルスによる宿主細胞の感染に際して得られ得るものと実質的に等しいか又はそれよりも高いレベルで、特定の宿主細胞におけるrAAVビリオン産生を補完するのに十分なアクセサリー機能を提供する、アクセサリー機能ベクター又は系の能力が意味される。よって、効率的なrAAVビリオン産生を支援する、アクセサリー機能ベクター又は系の能力は、アクセサリー機能ベクター又は系を使用して得られたrAAVビリオン力価と、感染性アデノウイルスによる感染を使用して得られた力価を比較することによって決定され得る。より具体的には、アクセサリー機能ベクター又は系は、同数の宿主細胞から得られたビリオンの量が、アデノウイルス感染を使用して得られた量よりも200倍少ないか又はそれ未満、より好ましくは、約100倍少ないか又はそれ未満、最も好ましくは、アデノウイルス感染を使用して得られた量に等しいか又はそれを超える場合に、感染性アデノウイルスを使用して得られたrAAVビリオン産生に実質的に等しいか又はそれを超える、効率的なrAAVビリオン産生を支援する。
【００９２】
したがって、「AAVビリオン」により、(AVVカプシドタンパクコートを伴う線状の一本鎖AAV核酸ゲノムを含む)野生型(wt)AAVウイルス粒子のような完全なウイルス粒子が意味される。これに関して、相補性の面で、例えば、「センス」又は「アンチセンス」鎖いずれかの一本鎖AAV核酸分子は、いずれか1つのAAVビリオンにパッケージングされることができ、両鎖は同等に感染性である。明らかに、本明細書に記載のベクターはAAVビリオンであり得る。
【００９３】
同様に、「組換えAAVビリオン」又は「rAAVビリオン」は、本明細書において、両側にAAV ITRが隣接している(本明細書に記載のヌクレオチド阻害剤のような)目的の異種ヌクレオチド配列にカプシド形成しているAVVタンパク質シェルを含む、感染性の複製欠損ウイルスとして定義される。rAAVビリオンは、AAVベクター、そこへ導入されたAAVヘルパー機能及びアクセサリー機能を有した好適な宿主細胞において産生される。このようにして、宿主細胞は、(目的の組換えヌクレオチド配列を含有する)AAVベクターを、後の遺伝子送達のための感染性組換えビリオン粒子にパッケージングするために必要なAAVポリペプチドをコードすることができるようになる。よって、ベクターはrAVVビリオンであってもよい。
【００９４】
本明細書に記載のベクターは、選択マーカーをコードする配列も含んでもよい。本明細書において使用される句「選択マーカー」又は「選択遺伝子産物」としては、哺乳動物細胞において薬物G418に対する抵抗性を与える(ネオ遺伝子とも呼ばれる)細菌アミノグリコシド3'ホスホトランスフェラーゼ遺伝子;抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を与える細菌ハイグロマイシンGホスホトランスフェラーゼ(hyg)遺伝子;及びミコフェノール酸の存在下で成長する能力を与える(gpt遺伝子とも呼ばれる)細菌キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を挙げることができるが、これらに限定されない遺伝子の使用を指す。加えて、本明細書に記載のベクターとしてはさらに、視覚的に検出可能なマーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)又は当分野における任意の他の検出可能マーカーの標準をコードする遺伝子を挙げることもでき、これらは当業者により認められ、利用が可能である。
【００９５】
当業者は、高度に特殊化した性質を有する独特のベクターを作製する手段として、アデノウイルスだけでなく他のタイプのウイルス由来の所望の特徴を取り込んだアデノウイルス「ハイブリッド」ウイルスを使用することによって、アデノウイルスに基づくベクターの制限の一部を回避した。例えば、ウイルスベクターキメラは、アデノウイルスとアデノ随伴ウイルス(AAV)との間で作製された。そのようなハイブリッドウイルス又はウイルスベクターキメラは、対象の細胞を本明細書に記載のCx45阻害剤でトランスフェクトするためにも使用されてもよい。よって、本開示は、Cx45の阻害剤を含むハイブリッドウイルス又はウイルスベクターキメラも提供する。
【００９６】
本明細書に記載のヌクレオチドCx45阻害剤の送達のための別法は、アデノウイルス発現ベクターの使用を含む。本明細書において使用される場合、用語「アデノウイルス発現ベクター」は、(a)構築物のパッケージングを支援し並びに/或いは(b)そこへクローニングされた組織及び/又は細胞特異的な構築物をパッケージングを最終的に発現させるために十分なアデノウイルス配列を含有する構築物を含むことを意図される。
【００９７】
発現ベクターは、アデノウイルスの遺伝子操作された形態を含んでもよい。アデノウイルスの遺伝子構成に関する知識、36kbの線状の二本鎖DNAウイルス、は7kb以下の外来配列によるアデノウイルスDNAの大きな部分の置換を可能とする(Grunhaus及びHorwitz、1992年)。レトロウイルスとは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染は、染色体への組込みをもたらさず、それは、アデノウイルスDNAが、エピソーム的方法で潜在的な遺伝毒性を生じさせずに複製し得るからである。また、アデノウイルスは、構造的に安定であり、広範な増幅後にゲノム再配列は検出されていない。
【００９８】
アデノウイルスの増殖及び操作は当業者に公知であり、in vitro及びin vivoで広い宿主範囲を示す。この群のウイルスは、高い力価、例えば、1mLあたり109〜1011プラーク形成単位で得られることができ、これらは高度に感染性である。アデノウイルスの生活環は宿主細胞ゲノムへの組込みを必要としない。アデノウイルスベクターにより送達された外来ポリヌクレオチドは、エピソーム性であることから、宿主細胞への遺伝毒性は低い。野生型アデノウイルスによるワクチン接種の研究において副作用は報告されておらず、in vivoのポリヌクレオチド導入ベクターとしてのそれらの安全性及び/又は治療可能性を実証している。
【００９９】
アデノウイルスベクターは、真核生物遺伝子の発現及びワクチン開発において使用されてきた。最近、動物試験が、組換えアデノウイルスが遺伝子治療のために使用され得ることを示唆した(例えば、Stratford-Perricaudetら、1991年; Richら、1993年を参照されたい)。さまざまな組織へ組換えアデノウイルスを投与することにおける研究は、筋肉注射、末梢静脈内注射及び脳への定位接種を含む。組換えアデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスは、どちらも非分裂性のヒト初代細胞に感染し、形質導入し得る。
【０１００】
アデノウイルスベクターの使用が考えられるが、遺伝子治療試験におけるそのような使用は、現在、短命な導入遺伝子発現により制限される(Vassalliら、2003年)。これは、アデノウイルス抗原に対する細胞性免疫のせいである。改善された「生命力のない」アデノウイルスベクターは、免疫原性が低減しているが、治療効果のために6カ月超の導入遺伝子の最大発現が必要とされるか又は望ましい場合には、なお依然として有効でない。AAVベクターは、長期の発現(>1年)を実証し、発現が長期に必要な場合の治療効果に好ましいベクターである。
【０１０１】
レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、それらのポリヌクレオチドを宿主ゲノムに組込み、大量の外来遺伝材料を導入し、広いスペクトルの種及び細胞型に感染するそれらの能力及び特定の細胞株にパッケージングされることのために、阻害剤送達ベクターとして選択され得る。
【０１０２】
レトロウイルスゲノムは、カプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素及びエンベロープ成分をそれぞれコードする3つの遺伝子、gag、pol及びenvを含有する。gag遺伝子の上流に見いだされる配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルを含有する。2つの末端反復配列(LTR)がウイルスゲノムの5'及び3'末端に存在する。これらは、強力なプロモーター及びエンハンサー配列を含有し、宿主細胞ゲノムへの組込みにも必要とされる。
【０１０３】
レトロウイルスベクターを構築するために、目的のポリヌクレオチドをコードする核酸が、ある特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入されて、複製欠損のウイルスをもたらす。ビリオンを産生するために、gag、pol及び/又はenv遺伝子を含有するが、LTR及び/又はパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株が構築される。レトロウイルスLTR及びパッケージング配列とともにcDNAを含有する組換えプラスミドがこの細胞株に(例えば、リン酸カルシウム沈降法により)導入された場合、パッケージング配列が組換えプラスミドのRNA転写物がウイルス粒子にパッケージングされることを可能とし、次いで、これが培地に分泌される。次いで、組換えレトロウイルスを含有する培地が収集され、任意選択で濃縮され、遺伝子導入のために使用される。レトロウイルスベクターは、広範な細胞型に感染することができる。しかしながら、組込み及び安定な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする。
【０１０４】
ヘルペスウイルス
単純ヘルペスウイルス(HSV)は向神経性であるため、神経系の障害を処置することにおいてかなりの興味をかき立てた。さらに、潜伏期の間に活性であるプロモーターの存在と併せて、宿主細胞の染色体に組み込まれることも宿主細胞の代謝を変更することもなく、非分裂性の神経細胞において潜伏感染を確立するHSVの能力は、HSVを魅力的なベクターとする。HSVの向神経的応用に大きな注目が集まったが、このベクターはその広い宿主範囲を考えると、他の組織にも活用され得る。
【０１０５】
HSVを魅力的なベクターとする別の因子は、ゲノムのサイズとゲノム構成である。HSVは大きいため、複数のヌクレオチド又は発現カセットの組込みは、他のより小さなウイルス系よりも問題が少ない。加えて、(時間的、強度などの)さまざまな能力を有するさまざまなウイルス制御配列の利用可能性は、他の系におけるよりも発現を大きく制御することを可能とする。このウイルスが、遺伝子操作をさらに容易化する比較的少数のスプライシングされたメッセージを有することも有益である。
【０１０６】
HSVはまた、操作が比較的容易であり、高い力価まで増殖させ得る。よって、十分な感染効率((MOI)を達成するために必要な体積及び反復投与の必要が減ることの両方に関して、送達の問題は少ない。遺伝子治療ベクターとしてのHSVの総説については、Gloriosoら、(1995年)を参照されたい。HSVの非病原性変異体が開発され、遺伝子治療環境で使用するのに容易に利用可能である(米国特許第5,672,344号)。
【０１０７】
レンチウイルスベクター
レンチウイルスは、複雑なレトロウイルスであり、共通のレトロウイルス遺伝子gag、pol及びenvに加えて、制御機能又は構造機能を有する他の遺伝子を含有する。高い複雑性は、このウイルスが、潜伏感染のうちにその生活環を調節することを可能とする。レンチウイルスのいくつかの例としては、ヒト免疫不全ウイルス(HTV1、REV2)及びシミアン免疫不全ウイルス(SIV)が挙げられる。レンチウイルスベクターは、HIV病原性遺伝子を何倍も弱毒化することによって作製され、例えば、遺伝子env、vif、vpr、vpu及びnefが除去されて、ベクターを生物学的に安全にする。
【０１０８】
レンチウイルスベクターは、当分野で公知であり、例えば、米国特許第6,013,516号及び同第5,994,136号を参照されたい。一般に、ベクターは、プラスミドをベースとするか又はウイルスをベースとして、外来核酸を組み込むため、選択のため及び核酸の宿主細胞への導入のために必須の配列を担持するように構成されている。目的のベクターのgag、pol及びenv遺伝子も当分野で公知である。よって、妥当なポリヌクレオチドが、選択されたベクター中にクローニングされ、次いで、目的の標的細胞を形質転換するために使用される。
【０１０９】
非分裂性の細胞に感染することができる組換えレンチウイルスであって、好適な宿主細胞が、パッケージング機能、すなわち、gag、pol及びenvだけでなく、rev及びtatを担持する2種以上のベクターでトランスフェクトされるウイルスが、米国特許第5,994,136号に記載されている。これは、パッケージング細胞を作製するために、ウイルスのgag及びpol遺伝子をコードする核酸を提供し得る最初のベクター並びにウイルスのenvをコードする核酸を提供し得る別のベクターを記載する。異種遺伝子を提供するベクターをこのパッケージング細胞に導入することは、目的の外来遺伝子を担持する感染性のウイルス粒子を放出する産生細胞を生じさせる。envは、ヒト及び他の種の細胞の形質導入を可能とするアンホトロピックなエンベロープタンパク質であることが好ましい。
【０１１０】
ワクシニアウイルスベクター
ワクシニアウイルスベクターは、その構築の容易性、得られる比較的高い発現レベル、広い宿主範囲及びDNAを担持するための大きな容量のために、広く使用されてきた。ワクシニアは、顕著な「A-T」優先性を示す、約186kbの線状の二本鎖DNAゲノムを含有する。約10.5kbの末端逆位配列がゲノムに隣接する。必須遺伝子の大半は、ポックスウイルスの間で最も高度に保存されている中心領域内に位置するようである。ワクシニアウイルスの推定オープンリーディングフレームは、150から200までの数に達する。両鎖がコードしているが、リーディングフレームの広範な重複は一般的でない。
【０１１１】
少なくとも25kbがワクシニアウイルスゲノムに挿入され得る。プロトタイプであるワクシニアベクターは、相同組換えによりウイルスチミジンキナーゼ遺伝子に挿入されたトランス遺伝子を含有する。ベクターは、tk表現型に基づいて選択される。脳心筋炎ウイルスの非翻訳リーダー配列の封入は、24時間で感染細胞のタンパク質の10%以上に蓄積したトランス遺伝子により、慣用ベクターよりも高い発現のレベルをもたらす。
【０１１２】
ポリオーマウイルスベクター
マウスポリオーマウイルスのようなパポバウイルスの空のカプシドが、遺伝子導入のための可能性のあるベクターとして注目された。空のポリオーマの使用は、ポリオーマDNAと精製された空のカプシドが無細胞系でインキュベートされたときに最初に記載された。新しい粒子のDNAは、膵臓DNaseの作用から保護された。再構成された粒子は、ラットFIII細胞にトランスフォーミングポリオーマDNA断片を導入するために使用された。空のカプシド及び再構成された粒子は、3つのポリオーマカプシド抗原、VP1、VP2及びVp3すべてからなる。米国特許第6,046,173号は、パポバウイルス主要カプシド抗原から形成され、非主要カプシド抗原が除外され、遺伝子導入のための外来材料を組み込んだ偽カプシドの使用を開示している。
【０１１３】
他のウイルスベクター
シンドビスウイルス又はサイトメガロウイルスのようなウイルスに由来するベクターなどの他のウイルスベクターが、本開示において発現構築物として採用されてもよい。これらは、さまざまな哺乳動物細胞のための数種の魅力的な特徴を提案する(例えば、Friedmann、1989年;Horwichら、1990年を参照されたい)。
【０１１４】
欠陥B型肝炎ウイルスを認識することにより、さまざまなウイルス配列の構造-機能関係への新たな洞察が得られた。in vitroの研究は、そのゲノムの最大80%の欠失にもかかわらず、このウイルスがヘルパー依存性のパッケージング及び逆転写のための能力を保持できたことを示した(Horwichら、1990年)。これは、ゲノムの大きな部分が外来遺伝子材料で置換され得ることを示唆した。Changらは、ポリメラーゼ、表面及び/又はプレ表面コード配列の代わりに、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子をアヒルR型肝炎ウイルスゲノムに導入した。これが、野生型ウイルスとともにトリ肝細胞腫細胞へ同時導入された。初代子アヒル肝細胞に感染させるために、高力価の組換えウイルスを含有する培地を使用した。トランスフェクション後の少なくとも24日間、安定なCAT遺伝子発現が検出された(Changら、1991年)。
【０１１５】
改変ウイルス
Cx45の阻害剤は、特異的な結合リガンドを発現するように操作されている感染性ウイルス内で送達されてもよい。したがって、ウイルス粒子は、標的細胞の同族受容体に特異的に結合し、内容物を細胞に送達する。例えば、レトロウイルスベクターの特異的ターゲティングを可能とするためにデザインされた新規アプローチが、ウイルスエンベロープへのラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学修飾に基づいて開発された。この改変は、シアロ糖タンパク質受容体を介する肝細胞の特異的感染を許容し得る。本明細書に記載のベクターが心臓細胞を特異的に標的とすることを可能とする代わりのタンパク質が使用されてもよい。
【０１１６】
組換えレトロウイルスのターゲティングのための別のアプローチがデザインされ、レトロウイルスエンベロープタンパク質に対する又は特異的細胞受容体に対するビオチン化抗体が使用された。抗体は、ストレプトアビジンを使用することによって、ビオチン成分を介して結合された。彼らは、主要組織適合性複合体クラスI及び/又はクラスII抗原に対する抗体を使用して、これらの表面抗原を有する多様なヒト細胞の、狭宿主性ウイルスによるin vitroでの感染を実証した。好適な抗体が、心臓細胞マーカーを特異的に標的とするために使用されることができ、本明細書に記載のベクターを心臓細胞に送達するために使用されてもよい。
【０１１７】
非ウイルス性の導入
本明細書に記載のCx45の阻害剤は、細胞に送達され得る。例えば、非ウイルス性の方法を使用して核酸が導入され得る。
【０１１８】
培養哺乳動物細胞への発現構築物の導入のための数種の非ウイルス性の方法が、本開示により考慮される。本開示による使用のための核酸送達の好適な方法は、本明細書に記載の方法又は当業者に公知と予想される方法を含む。そのような方法としては、血管系を介する「ネイキッド」DNAプラスミドの直接送達(米国特許第6,867,196号);リポソーム媒介性トランスフェクション(Nicolau及びSene、1982年;Fraleyら、1979年;Nicolauら、1987年;Wongら、1980年;Kanedaら、1989年; Katoら、1991年)及び受容体媒介性トランスフェクション(Wu及びWu、1987年;Wu及びWu、1988年)による;炭化ケイ素線維との攪拌(Kaepplerら、1990年;米国特許第5,302,523号及び同第5,464,765号)による;カチオン性脂質;ネイキッドDNAの使用;又はマイクロカプセル化DNAによるもの(米国特許出願第2005/0037085号)が挙げられるが、これらに限定されない。これらのような技術の適用にもかかわらず、標的細胞又は組織は安定的に又は一過性に形質転換され得る。
【０１１９】
構築物が細胞に送達されたら、治療遺伝子をコードする核酸が位置決めされ、さまざまな部位において発現され得る。例えば、治療遺伝子をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定的に組み込まれ得る。この組込みは、相同組換え(遺伝子置換)を介して同族位置及び配向であることができるか、又は無作為の非特異的位置に組み込まれてもよい(遺伝子増強)。例えば、核酸は、DNAの別個のエピソームセグメントとして細胞中に安定に維持されることができる。そのような核酸セグメント又は「エピソーム」は、宿主細胞周期から独立した又は宿主細胞周期と同期した維持及び複製を許容するのに十分な配列をコードする。発現構築物がどのように細胞に送達され、細胞のどこに核酸が残っているかは、採用される発現構築物の種類に依存する。
【０１２０】
ベクター又は発現構築物は、リポソームに封入されてもよい。リポソームは、リン脂質二重層及び内部水性媒体を特徴とするベシクル構造体である。多重膜リポソームは、水性媒体で分離された複数の脂質層を有する。リン脂質が過剰の水溶液中に懸濁されると、これらは自然発生的に形成する。脂質成分は、閉じた構造の形成前に自己再構成を起こし、水と溶解した溶質を脂質二重層の間に封入する。カチオン性リポソームへのDNAの添加は、リポソームから光学的複屈折の液体-結晶が濃縮された小球へのトポロジー転移を引き起こす。これらのDNA-脂質複合体は、遺伝子治療における使用のための可能性のある非ウイルスベクターである。
【０１２１】
リポソーム媒介性の核酸送達及び外来DNAのin vitroの発現は非常に成功している。β-ラクタマーゼ遺伝子を使用して、研究者らは、培養トリ胚、HeLa及び肝細胞腫細胞における、外来DNAのリポソーム媒介性の送達及び発現の実現可能性を実証した。ラットにおける静脈注射後の成功裏のリポソーム媒介性の遺伝子導入も、達成されている。「リポフェクション」技術を含む多様な商業的アプローチも含まれる。
【０１２２】
リポソームは、血球凝集ウイルス(HVJ)と複合体化されてもよい。これは、細胞膜との融合を容易化し、リポソームに封入されたDNAの細胞への進入を促進することが示されている。例えば、リポソームは、核の非ヒストン染色体タンパク質(HMG-1)と複合体形成させられるか又は一緒に使用されてもよい。例えば、リポソームは、HVJ及びHMG-1の両方と複合体形成させられるか又は一緒に使用されてもよい。そのような発現構築物が成功裏に核酸のin vitro及びin vivoでの導入及び発現に採用されたという点において、これらは本開示に適用可能である。
【０１２３】
Cx45阻害剤をコードする核酸を細胞中へ送達するために採用され得る他のベクター送達システムは、受容体媒介性の送達ビヒクルである。これらは、ほとんどすべての真核細胞において、受容体媒介性のエンドサイトーシスによる巨大分子の選択的取り込みを利用する。さまざまな受容体の細胞型特異的分布のために、送達は、高度に特異的である(Wu及びWu、1993年)。リポソームが採用される場合、エンドサイトーシスに関連した細胞膜表面タンパク質に結合する他のタンパク質、例えば、特定の細胞型に向性のカプシドタンパク質又はその断片、循環中に内部移行を起こすタンパク質の抗体、及び細胞内局在を標的とし、細胞内半減期を亢進するタンパク質が、ターゲティングのため及び/又は取り込みを容易化するために使用されてもよい。
【０１２４】
受容体媒介性の遺伝子ターゲティングビヒクルは、一般に、2つの成分:細胞受容体特異的なリガンド及びDNA結合剤からなる。数種のリガンドが、受容体媒介性のポリヌクレオチド導入に使用されてきた。最も広く特徴付けされたリガンドは、アシアロオロソムコイド(ASOR)及びトランスフェリン(transferring)である(Wagnerら、1990年)。ASORと同じ受容体を認識する合成ネオ糖タンパク質は、遺伝子送達ビヒクルとして使用されてきた。上皮成長因子(EGF)も、扁平上皮がん細胞へ遺伝子を送達するために使用されてきた。
【０１２５】
例えば、ベクター又は送達ビヒクルは、リガンド及びリポソームを含んでもよい。例えば、研究者らは、リポソーム中に取り込まれたラクトシルセラミド、ガラクトース末端アシアロガングリオシドを採用し、肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増大を観察した。よって、Cx45阻害剤をコードする核酸も、リポソームを含むか又は含まない任意の数の受容体-リガンドシステムによって、心臓細胞のような細胞型に特異的に送達され得ることが実現可能である。
【０１２６】
ベクター又は発現構築物は、単純に、ネイキッド組換えDNA又はプラスミドからなっていてもよい。構築物の導入は、物理的又は化学的に細胞膜を透過する上述の方法のいずれかによっても実行され得る。これは、特に、in vitroの導入に適用可能であるが、in vivoの使用にも同様に適用され得る。治療用DNAも同様の方法でin vivoで導入され得ることが予想される。Wolffら(米国特許第6,867,196号)は、心臓組織中への効率的な遺伝子導入が、心臓の静脈又は動脈へのプラスミドDNA溶液の注射によって取得できることを教示する。Wolffは、RNA、非プラスミドDNA及びウイルスベクターの投与も教示する。
【０１２７】
本開示において有用なベクターは、さまざまな導入効率を有する。結果として、ウイルス又は非ウイルスベクターは、標的とされた血管領域の少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%の細胞、それを超える又はそれに等しい細胞に形質導入し得る。1種を超えるベクター(ウイルス若しくは非ウイルス、又はその組み合わせ)が同時に、又は連続して使用され得る。これは、1種以上のポリヌクレオチドを導入し、及び/又は1種以上の細胞型を標的とするために使用され得る。複数のベクター又は複数の薬剤が使用される場合、1つを超える導入/トランスフェクション効率が生じ得る。
【０１２８】
細胞
本明細書に記載のCx45の阻害剤は、細胞に取り込まれ得る。細胞はin vitroで培養され、対象の心筋への移植に利用され得る。細胞は、新たな又は凍結された培地から得られ得る。好適な細胞としては、筋細胞、(間葉及び造血)幹細胞、線維芽細胞及び心臓細胞が挙げられる。細胞は(宿主から得られた)内在性の細胞又は適切な培養細胞株由来であってもよい。細胞は、哺乳動物対象から採取され及び/又はバイオプシー(例えば、筋肉バイオプシー)により採取され、宿主心筋への組換え細胞株の自家移植を可能としてもよい。
【０１２９】
医薬組成物
本明細書に記載のCx45の阻害剤は、ヒト又は動物の使用のための医薬組成物に取り込まれてもよい。医薬組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤のうちの1種以上を含んでもよい。治療用途のために許容される担体又は希釈剤は薬学分野で周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro編、1985年)に記載されている。医薬担体、賦形剤又は希釈剤の選択肢は、意図される投与経路及び標準的な薬務に関して選択され得る。
【０１３０】
採用されるさまざまな送達システムに依存して、さまざまな組成物/製剤の必要性があり得る。例えば、医薬組成物は、非経口投与(例えば、静脈内、経皮、皮下、筋内、腹腔内、髄腔内、心内、関節内、胸膜内、脳内、頭蓋内、心筋内、動脈内又は静脈内)、粘膜投与(例えば、経口、直腸内、鼻腔内、頬側内、膣内、呼吸器)、腸内投与(例えば、錠剤、カプセル又はドロップによるような、経口)又は経皮投与(局所、例えば、経皮、吸入、鼻腔内、点眼薬)のために製剤化されてもよい。
【０１３１】
非経口投与に好適な組成物/製剤は、Cx45の阻害剤の水性又は非水性注射液を含んでもよい。これらの組成物/製剤は、緩衝液及び組成物/製剤を目的の対象の血液と等張にする溶質を含有してもよい。水性又は非水性懸濁液は、懸濁剤及び増粘剤を含んでもよい。
【０１３２】
組成物/製剤は、Cx45の阻害剤又はその塩を含む、注射可能な安定した無菌の組成物を含んでもよい。Cx45の阻害剤は、対象へのその注射に適した液体組成物を形成するために、好適な薬学的に許容される担体により再構成できる凍結乾燥物の形態で提供されてもよい。当業者は、組成物/製剤が、組成物/製剤の薬学的許容可能性に寄与する薬剤を含み得ることを理解していると予想される。例えば、薬剤としては、生理食塩水、ホスファチジルコリン又はグルコースを挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１３３】
心筋梗塞、不整脈、異常伝導を特徴とする心臓疾患、突然心臓死、左心室機能不全又は心室同期不全の処置のために使用される任意の好適な薬学的に有効な薬物は、本明細書に記載のCx45の阻害剤と同時投与されてもよい。
【０１３４】
本発明は、以下の制限のない実施例を参照してさらに記載される。
【実施例】
【０１３５】
[実施例1]
材料及び方法
プラスミド
組換えアデノ随伴ウイルス血清型2/9(rAAV)ベクターを、University of PennsylvaniaのDr. Jim Wilsonから入手した。ベクターは、Woodchuck肝炎ウイルス翻訳後(WPRE)調節エレメントを含有していた。ラットCx43及びCx45の完全長cDNAを、ラット心臓cDNAライブラリーからPCR増幅し、rAAVベクターのマルチクローニングサイトにクローニングした。ベクターを配列決定し、それぞれ、rAAV.Cx43及びrAAV.Cx45を名付けた。対照実験のために、GFPをrAAVベクターにサブクローニングした。対照ベクターを配列決定し、rAAV.GFPと名付けた。
【０１３６】
Cx45を標的とする低分子ヘアピン型RNA(Cx45-shRNA)を、ウエブベースの予測ソフトウェアを使用してデザインした。配列がラットCx45に特有であることを確実にするために、ラットゲノムデータベースを使用して、各オリゴヌクレオチドについて相同性解析を行った。ループ領域で接続されたセンス配列(すなわち、第1の配列)及びアンチセンス配列(すなわち、第2の配列)を含有したフォワードオリゴヌクレオチドをデザインした。フォワード配列に相補的なリバースオリゴヌクレオチドも作製した。フォワード及びリバースオリゴヌクレオチドをアニーリングして、二本鎖DNA構築物を作製し、これを、先に記載した通りに(Cingolaniら、2007年)、レンチウイルスshRNA発現ベクターにクローニングした。このアプローチを使用して、以下のCx45-shRNAを作製した。Cx45-shRNA#1の標的領域は、配列番号3に示すヌクレオチド配列を有する。(すなわち、第1の配列、ループ領域配列及び第2の配列だけでなく、追加の5‘及び3'配列を含む)Cx45-shRNA#1についてのフォワード及びリバースオリゴヌクレオチド配列を、それぞれ、配列番号4及び配列番号5に示す。Cx45-shRNA#2の標的領域は、配列番号6に示すヌクレオチド配列を有する。Cx45-shRNA#2についてのフォワード及びリバースオリゴヌクレオチド配列を、それぞれ、配列番号7及び配列番号8に示す。Cx45-shRNA#3の標的領域は、配列番号9に示すヌクレオチド配列を有する。Cx45-shRNA#3についてのフォワード及びリバースオリゴヌクレオチド配列を、それぞれ、配列番号10及び配列番号11に示す。Cx45-shRNA#4の標的領域は、配列番号12に示すヌクレオチド配列を有する。Cx45-shRNA#4についてのフォワード及びリバースオリゴヌクレオチド配列を、それぞれ、配列番号13及び配列番号14に示す。Cx45-shRNA#5の標的領域は、配列番号15に示すヌクレオチド配列を有する。Cx45-shRNA#5についてのフォワード及びリバースオリゴヌクレオチド配列を、それぞれ、配列番号16及び配列番号17に示す。Cx45-shRNA#6の標的領域は、配列番号18に示すヌクレオチド配列を有する。Cx45-shRNA#6についてのフォワード及びリバースオリゴヌクレオチド配列を、それぞれ、配列番号19及び配列番号20に示す。Cx45-shRNA#7の標的領域は、配列番号21に示すヌクレオチド配列を有する。Cx45-shRNA#7についてのフォワード及びリバースオリゴヌクレオチド配列を、それぞれ、配列番22及び配列番号23に示す。Cx45-shRNA#8の標的領域は、配列番号24に示すヌクレオチド配列を有する。Cx45-shRNA#8についてのフォワード及びリバースオリゴヌクレオチド配列を、それぞれ、配列番号25及び配列番号26に示す。対照実験のために、いかなる公知の哺乳動物遺伝子配列にも相補的でないスクランブル対照配列も作製した(shNS)。
【０１３７】
デザインしたshRNAのCx45の発現を阻害する有効性を決定するために、完全長ラットCx45cDNAを、Cx45cDNAがフレーム内でGFPのcDNAに融合されて、Cx45の発現の蛍光定量化のためのGFPタグを有するCx45タンパク質を産生するように、市販のベクター(Clontech)にクローニングした。HEK-293細胞株において、Cx45の発現を阻害する個々のshRNAの能力を検査した。Cx45を発現するベクター及びCx45又はスクランブル対照配列のいずれかを標的とするshRNAを発現するベクターを、HEK-293細胞に同時導入した。同時導入の48時間後にCx45の発現を検査した。GFPの発現レベルを、Cx45の発現の指標として使用した。次いで、安定したshRNAの送達のために、選択したshRNAをrAAVベクターのRNAポリメラーゼIIIプロモーターの下流のKpnI部位にクローニングした。対照実験のために、スクランブル対照配列をrAAVベクターにクローニングした。
【０１３８】
動物
すべての動物実験が、Western Sydney Area Health Service Animals Ethics Committeeにより承認された。体重およそ200グラムの雌性Sprague-Dawleyラットをすべての実験に使用し、Australian Resource Centre (ARC, Canning Vale, West Australia)から提供された。一定の周囲温度(22℃)、湿度及び12時間の明暗サイクルの条件下でラットを収容した。市販のペレット(Allied Foods, Sydney, Australia)をラットに給餌し、飼料及び水を利用できるようにした。ワイヤー製の上端が開放した、寝藁のための鉋屑を含むケージ(550×370×170mm)にラットを収容した。ケージ当たり、最大3頭のラットを入れた。プロトコールが完了したら、すべての動物をCO2チャンバーを使用して屠殺した。
【０１３９】
カスタムメイドのPerspexチャンバー中で、小動物麻酔器(The Stinger; Advanced Anaesthesia Specialists)から柔軟なPVC管を介して供給した酸素と5%イソフルラン(Aerrane; Baxter Healthcare)の混合物により、麻酔を開始した。箱への流速を、一回換気量4mLに設定した。意識がなくなったら、背面を下にして、頸部伸展を容易にするカスタムメイドの挿管ボード上にラットを置いた。直接咽頭鏡下で、直線状ののこぎり状の鉗子(Fine Science Tools)で舌を引き出し、前頸部組織を支持するために、堅くて曲がらない海馬ツール(Fine Science Tools)を咽頭へ通した。声帯が見えたら、18ゲージの静脈内カニューレ(Becton, Dickinson and Company)の管を直視下でSeldinger法を使用して通した。次に、背面を下にしてラットをパン切リ台(Ikea)に移した。1分あたり呼吸70回の割合で2.5mLの一回換気量を送達するように設定した小動物ベンチレーター(Harvard Apparatus)への柔軟なPVC管をカニューレに取り付けた。ベンチレーターは、酸素と2%イソフルランの混合物を小動物麻酔器から受け入れた。
【０１４０】
尾静脈注射
その最先端において尾静脈にカニューレ挿入するために25ゲージ針を使用した。シリンジを通して血流がはっきり表れたら、止血帯を外し、ウイルスベクター、すなわち、rAAV.Cx43、rAAV.Cx45、rAAV.GFP、Cx45-shRNA#1、Cx45-shRNA#2、Cx45-shRNA#3、Cx45-shRNA#4、Cx45-shRNA#5、Cx45-shRNA#6、Cx45-shRNA#7、Cx45-shRNA#8又はrAAV.shNS(1×1012個のベクターゲノムを0.9%生理食塩水で500μLに希釈した)をゆっくりと注射した。ベクターの注射に続いて、500μLの0.9%生理食塩水で洗い流した。次いで、ラットをノーズコーンから外し、放置して回復させた。
【０１４１】
新生仔ラット心室心筋細胞の単離
二腹のラットの子ども(1〜3日齢のSprague-Dawley)を新生仔ラット心室心筋細胞の各培養のために使用した。子どもに、70%エタノールを噴霧し、大きな直線状の手術用ハサミ(Roboz Surgical Instrument Co)で首を切り落とし、曲がった繊細なハサミ(Roboz Surgical Instrument Co)で開胸した。心室を切除し、カルシウム及びマグネシウムを含まない氷冷ハンクス平衡塩類溶液(HBSS) (Sigma-Aldrich)中で細かく切り刻んだ。氷冷HBSSで2回すすいだ後、心室組織を40mLのトリプシン/HBSS溶液を入れたガラスジャーに移し、75rpm、4℃で16時間、オービタルシェーカー上で攪拌した。次いで、培地を吸引して廃棄した。温かい10%血清培地を添加し、37℃の水浴中で4分間、穏やかに攪拌した。再度培地を吸引して廃棄した。新たなコラゲナーゼ/HBSS(8mL)を組織に添加し、37℃の水浴中、1分間、穏やかに攪拌した。コラゲナーゼ/HBSS溶液を吸引して廃棄した。8mLの新たなコラゲナーゼ/HBBS溶液を組織に添加し、37℃の水浴中、1分間、穏やかに攪拌した。筋細胞の分離を支援するために、組織及び培地を10mLの血液用ピペットで1回上下させた。培地を吸引し、氷冷HBSSに添加して、氷上に保持した。再度、8mLのコラゲナーゼ/HBSSを組織に添加し、このプロセスを3回反復した。分離した細胞を含有するHBSS溶液の4つのアリコートを、4℃において50×gで8分間、沈殿させた。上清を吸引し、ペレットを8mLの氷冷HBSSに再懸濁した。細胞懸濁液を40μmの細胞ストレーナー(BD Biosciences)でろ過した。ろ液を、4℃において50×gで6分間遠心分離し、上清を吸引して廃棄した。ペレットを温かい10%血清培地に再懸濁し、150cm2の組織培養フラスコに予め蒔き、37℃、5%CO2において2時間インキュベートした。このプレプレーティングステップは、線維芽細胞の除去を可能とした。
【０１４２】
次いで、非付着性心筋細胞を含有する培地を吸引して、50mLのポリプロピレン管に入れた。組織培養フラスコを、10%血清培地で注意深くすすぎ、すすぎ液も50mLのポリプロピレン管に添加した。培地を1回、ピペットで上下させることによって穏やかに混合した。さらなる10%血清培地を細胞懸濁液に添加して、7×105個の心筋細胞/mLの最終密度を達成した。コンフルエントな単層を、この濃度でのプレーティング後24時間で達成した。
【０１４３】
心筋細胞のプレーティングの24時間後、培地を吸引し、予め温めた37℃のPBSで筋細胞を1回洗浄した。37℃に予め温めておいた新たな10%血清培地を筋細胞に添加し、細胞を加湿したインキュベーターに戻した。線維芽細胞の増殖を防止するために、プレーティングの48時間及び90時間後に、培地を新たな予め37℃まで温めておいた2%血清培地に交換した。
【０１４４】
細胞を24ウエルプレートにおいて培養した。新生仔RVMを、1ウエル当たり1×1011個のベクターゲノムのオーダーのrAAV.Cx45で形質導入した。48時間後、それらを固定して免疫染色した。
【０１４５】
心室組織の調製
CO2でラットを安楽死させて、重さを量った。心臓を取り出し、PBSですすぎ、その後重さを量った。
【０１４６】
タンパク質及びmRNAの研究のために、心臓を遠心管中に入れ、液体窒素で凍結して、-80℃での保管に移した。その後、心臓組織を6μmの切片に切断し、免疫染色、炎症及び線維化の研究のためにスライドガラスに載せた。
【０１４７】
組織学及び免疫組織化学の研究のために、rAAV.Cx43又はrAAV.Cx45で形質導入したラットを、直ちにTissue-Tek OCTコンパウンド(Sakura)に包埋した。rAAV.GFPで形質導入したラットについては、Tissue-Tek OCT中の包埋の前に、4℃で終夜、4%PFA中で心臓を固定した。すべての包埋組織を液体窒素で凍結して-80℃での保管に移した。
【０１４８】
タンパク質抽出
凍結した心室組織を氷冷丸底微量遠心管に入れた。タンパク質抽出のために使用した組織を、収集時に窒素で瞬間凍結した。ドライアイス表面上の金属板の上で外科用メスを使用して、組織を50mgの切片に分割し、次いで、新たな微量遠心管に入れ、ドライアイス上に保持した。氷冷したスチールボール(Qiagen)を、500μLの氷冷溶解液(RIPA緩衝液(Sigma-Aldrich)、1% (v/v)ホスファターゼ阻害剤カクテル2 (Sigma-Aldrich)及び4% (v/v)プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma-Aldrich))とともに管に挿入した。組織を、30Hzに設定したTissueLyser(Qiagen)を使用してビーズミルによる3分間の破壊に供した。組織がよくホモジナイズされることを確実にするために、これを2回行った。次いで、懸濁液を4℃において10,000rpmで5分間、遠心分離した。上清を第2の微量遠心管にデカントし、氷の上に保持し、タンパク質評価の準備ができた。
【０１４９】
Bradford法を使用してタンパク質評価を実施した。標準品及び試料を3回反復してアッセイした。1μLの増加量で1μLから8μLまで、96ウエルプレートの異なるウエルにウシ血清アルブミン(1mg/mL)を添加し、標準曲線を作製するために使用した。抽出したタンパク質試料を、MQ H2Oで5倍に希釈し、ウエルに1μL添加した。タンパク質アッセイ染料試薬濃縮液(Bio-Rad)を、4倍希釈し、200μLを各ウエルに添加した。測定に使用した吸光度は、Victor2 Multilabel Counter (PerkinElmer Life Sciences)を使用して595nmであった。タンパク質の量を、その吸光度を標準曲線に比較することによって計算した。次いで、これを希釈度について補正し、平均して、個々の溶解上清の元のタンパク質濃度を決定した。
【０１５０】
イムノブロッティング
ポリアクリルアミド4〜12%勾配Bis-Trisプレキャストゲル(NuPAGE; Invitrogen)を使用した。これらを、泳動バッファー(MOPS, NuPAGE; Invitrogen)を含有するゲル電気泳動チャンバー(XCell SureLock Min-Cell; Invitrogen)中に置いた。各試料について、20mgのタンパク質を、2μLの還元剤(NuPAGE; Invitrogen)、5μLのLDSサンプルバッファー(NuPAGE; Invitrogen)及びMQH20を含む20μLの最終体積に、微量遠心管中で希釈した。次いで、試料を95℃の熱に10分間供して、タンパク質を変性させ、次いで、別個のゲルウエルに添加した。タンパク質の分離及びおよそのタンパク質サイズを評価するために予め着色したタンパク質ラダー(PageRuler Plus; Thermo Scientific)を使用し、被験試料の隣のウエルに入れた。200Vの定電流勾配を1時間、ゲルに印加した。電気泳動による分離に続いて、IBLOTゲル転写システム(Invitrogen)を使用してタンパク質をゲルからメンブレンに転写した。ゲルをゲル転写スタック(Invitrogen)中に入れ、IBLOTのデフォルトの7分間の転写プロトコールを使用した。次いで、メンブレンを、TBST(0.05% Tween 20、トリス緩衝生理食塩水)中、5%スキムミルク溶液で2時間、ブロッキングし、その後、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体(マウスCx45モノクローナル抗体、1:200、Millipore;又はウサギCx43モノクローナル抗体、1:800、Millipore)とともにインキュベートした。これらを4℃における終夜の穏やかな攪拌のためにオービタルシェーカー上に置いた。
【０１５１】
翌朝、それぞれ5分間のTBSTによる洗浄を3回行い、ブロッキング溶液で希釈した二次抗体(HRP-結合ウサギ抗マウス抗体、1:10000、Sigma;又はHRP-結合ヤギ抗ウサギ抗体、1:10000、Sigma)とともに1時間、インキュベートした。再度、これを穏やかな攪拌のためにオービタルシェーカー上に置いた。メンブレンをもう一度TBSTでそれぞれ5分間、3回洗浄した。次いで、SuperSignal Pico Chemiluminescent基質(Thermo Fisher Scientific)ブロッティング検出試薬をメンブレンに5分間で添加し、これを製造者の指示に従って1;1の割合で混合した。弱いシグナルの検出を可能とするために、SuperSignal west Femto(Thermo Scientific)を1:10の割合でPico基質と混合し、次いで、メンブレンに5分間添加した。メンブレンをオートラジオグラフィーカセット(Hypercassette; Amersham Biosciences)に移した。暗室中で、X線フィルム(Hyperfilm ECL; Amersham)を、オートラジオグラフィーカセット中のニトロセルロースメンブレンに露光した。露光に要する時間は、実験の要求に依存した。次いで、製造者の指示に従って、フィルムをAGFAフィルムプロセッサーで加工した。
【０１５２】
共免疫沈降
凍結した心室組織を粉砕し、ホモジナイズし、1.5% NP-40、1% Triton X-100、0.1% SDS、0.1% BSA及びプロテアーゼ阻害剤を含有する緩衝溶液中に溶解した。プルダウン実験のために、抗Cx43モノクローナル抗体又は抗Cx45モノクローナル抗体のいずれかを、プロテインGセファロースとともに4℃において1時間、シェーカー上でインキュベートした。次いで、4℃においてビーズを溶解バッファーで3回洗浄した。次いで、Cx43及びCx45それぞれに結合したタンパク質を免疫沈降させるために、各1mg等量のタンパク質を含有するライセートを抗体が結合したビーズとともに、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigmaカタログ番号P8340)の存在下、4℃において1時間インキュベートした。マウスIgG1(Sigmaカタログ番号1538)を陰性対照として使用した。免疫沈降物を、4℃における16,000×g、15分間の微量遠心において沈降させ、BSAを含む溶解バッファーで3回洗浄し、β-メルカプトエタノールを含む試料添加液に懸濁し、95℃において10分間熱失活させ、上記のイムノブロット分析に供した。イムノブロッティングのためにウサギCx45ポリクローナル抗体(Dr M. Kovalからの寄付)及びウサギCx43ポリクローナル抗体(Chemicon)を使用した。
【０１５３】
心室組織の切片作成
Microm HM 505Eミクロトームクリオスタットにより、すべての凍結切片作成を実施した。組織の取り扱い及び切断を始める前に、冷却チャンバーの温度を-20℃に設定した。OCTコンパウンドに包埋した凍結心室組織をドライアイスで予め冷却したクリオスタットチャックに載せ、クリオスタットアーム上に置いた。ミクロトームナイフを使用して、最初に検体をトリミングし、次いで、心室の5μm〜7μm切片を切断し、スライドガラス(Superfrost Ultra Plus; Thermo Scientific)に移し、使用のために必要となるまでの-20℃の冷凍庫への移動まで、チャンバー中に保持した。
【０１５４】
固定、透過処理及び免疫染色
心室組織切片を4%(w/v)パラホルムアルデヒドで固定し、15分間、PBS中、0.1%(v/v)Triton X-100(Sigma-Aldrich)による透過処理に供し、無血清Dako Protein Blockでブロッキングした。次いで、試料を、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体(マウスCx45モノクローナル抗体、1:200、Millipore;及びウサギCx43モノクローナル抗体、1:800、Millipore)とともに、4℃において終夜インキュベートした。PBST中、0.1%(v/v)の冷した魚皮膚ゼラチンで希釈した二次抗体(Alexa488-結合マウス抗体、1:1000、Invitrogen;又はAlexa594-結合マウス抗体、1:2000、Invitrogen;又はAlexa594-結合ウサギ抗体、1:2000、Invitrogen)を、暗所、室温で1時間、スライドガラスに塗布した。試料をDAPI(Life Technologies)を含むProlong Gold退色防止剤を備えたカバースリップ(Deckglaser; Menzel-Glaser)で覆い、4℃において暗所で終夜、定着させた。
【０１５５】
共免疫染色
心室組織切片を、室温で15分間、4%(v/v)パラホルムアルデヒドで固定した。パラホルムアルデヒドは、56℃において、カルシウム及びマグネシウムを含有する80mLのPBSに3.2gを溶解することによって、新たに調製した。5M NaOHでpHを7.4に調整した。スライドガラスを、各回5分間、PBSで3回洗浄した。試料を、15分間、PBS中、0.1%(v/v)Triton X-100(Sigma-Aldrich)による透過処理に供した。これに、オービタルシェーカー上の、PBS中、0.05%(v/v)Tween20(Sigma-Aldrich)(PBST)による各回5分間で3回の穏やかな洗浄が続いた。洗浄及び透過処理に続いて、非特異的部位を、Dakoからのブロッキング溶液(Protein Block、無血清)で1時間、ブロッキングした。次いで、ブロッキング溶液を取り除き、次いで、試料をブロッキング溶液で希釈した一次抗体とともに4℃において終夜インキュベートした。これが共免疫染色のためであることを考慮して、2つの一次抗体を混合して、使用した(異なる二次抗体が使用されることを可能とするために、両者の宿主種は異なった)。
【０１５６】
炎症-ヘマトキシリン及びエオシン染色
心室組織切片を、ヘマトキシリンに全部で4分間、Scottの青み付け溶液に1分間、及び0.1%エオシンに1分間浸漬した。次いで、試料を無水エタノールで30秒間脱水し、キシレン透明化溶液中に入れた。次いで、スライドガラスにカラーファスト(colourfast)(Fronine)を含む疎水性のマウント剤(mounting agent)、Ultramount No. 4とともにカバースリップをマウントした。スライドガラスを終夜、定着させた。次いで、炎症の程度について手作業で画像を評価し、Igarrashiら、(1993年)によるスケールに基づいて等級付けした。
【０１５７】
線維化-ピクロシリウスレッド(Pico-Sirius Red)染色
心室組織切片を、4%パラホルムアルデヒドで15分間固定し、次いで、各5分間、PBSで3回洗浄した。次いで、切片を、暗所でオービタルシェーカー上のピクロシリウスレッド溶液(0.1% Direct Red 80 (Sigma)、0.1% Fast Green FCF (Sigma)、飽和ピクリン酸(Sigma))中に、1時間入れた。次いで、切片をMQH20で注意深く2回洗浄し、続いて、切片の脱水を支援するために、各1分間、100%エタノールで3回洗浄した。次いで、これらを1時間、空気乾燥し、次いで、カラーファスト(Fronine)を含む疎水性のマウント剤、Ultramount No. 4とともにカバースリップをマウントする前に、キシレン透明化溶液に5秒間浸漬した。スライドガラスを終夜、放置して定着させた。次いで、客観的に赤色(コラーゲン)及び緑色(筋細胞)の相対面積を計算するためにデザインしたカスタムメイドのソフトウェアにより、切片を分析した。
【０１５８】
電気生理学的検査-表面心電図
4つの単極針電極(AD Instruments)を、鎖骨下及び腸骨窩領域の皮下の両側に設置した。1本のアース線も腹部領域の皮下に設置した。左/右下部電極対及び右/左上部電極対からの電位を併せて2誘導心電図を作成した。2kHzにおいてサンプリングした生体電位を、Ocal Bio Amp(AD Instruments)により増幅し、Powerlab 16/30(AD Instruments)データ取得システムを使用してデジタル化した。Dellラップトップにおいて実行するLabchart Pro 7(AD Instruments)のWindowsベースのバージョンを使用して、USBを介してデータを記録した。ソフトウェアのフィルタリングは使用しなかった。
【０１５９】
電気生理学的検査-経食道心臓ペーシング
Octal Bio Ampに接続した5フレンチサイズの8極カテーテル(Biosense Webster)を、口腔を介して食道に通し、中間の2つの電極からの記録の心室電位図の振幅が最大となる地点に位置決めした。記録は中間の2つの電極のみから作製し、刺激は、遠位の2つの電極のみを介して送達した。孤立したパルス刺激装置(モデル2100; A-M Systems)を介する、持続時間1ミリ秒の一定の60ボルト刺激を使用して、心室を捕捉した。第2のwindowsベースのラップトップ(Hewlett-Packard)にインストールしたカスタムデザインのソフトウェアを、そのトリガ入力を介して刺激装置を駆動するために使用した。
【０１６０】
心室性頻拍を誘発するために、プログラム心室刺激を使用した。心臓を、180ミリ秒の連結間隔で8刺激のドライブトレイン、続いて150ミリ秒で開始し、心室不応状態まで10ミリ秒の減少量で連続的に減少させた最大4回の期外刺激によりペーシングした。プログラム心室刺激がVTを誘導するのに失敗したら、90ミリ秒のサイクル長で30秒間を1回、必要に応じて、3分後に60ミリ秒のサイクル長で1回繰り返した。
【０１６１】
プログラム刺激及びバーストペーシングにより刺激を行った。プログラム刺激は、180ミリ秒の連結間隔を含む8拍のドライブトレイン、続く最大4拍の期外拍動を含んだ。バーストペーシングは、連結間隔90ミリ秒を30秒間、続いてさらに60ミリ秒を30秒間使用する電気刺激を含んだ。
【０１６２】
心筋梗塞
手短に言えば、麻酔、ベンチレーション及びベースラインのEP試験に続いて、背面を下にしてラットを置いた。全部で10μgの塩酸ブプレノルフィン(Temgesic; Schering-Plough)及び1mgのエンロフロキサシン(Baytril 50; Bayer Healthcare AG)を別個にそれぞれ1mLのPBSで希釈し、注射により皮下に投与した。前胸部の毛を70%(v/v)エタノール(Fronine)で湿らせ、電動クリッパー(Remington; Spectrum Brands)で剃り、除去した。皮膚切開前に最低5分間塗布した、10%w/vのポビドンヨード液(Povidine-Iodine) (Betadine; Sanofi-Aventis)又はクロルヘキシジン(Cholhexidine)で皮膚の消毒を実施した。切開前に200nLのリグノカイン0.1%を皮下投与して、これが冠動脈の結紮前に作用するように時間調整した。
【０１６３】
外科メスを使用して、第4肋間腔のレベルにおける腹側正中線から左前腋窩線までの皮膚を横切開した。周囲の皮膚を動かすために、直線状な止血鉗子(Fine Science Tools)による、下にある浅筋膜の鈍的切開を、切り口の両側でおよそ1cmまで実施した。左胸壁表面から肋骨までの筋肉も直線状な止血鉗子(Fine Science Tools)による鈍的切開により分離した。曲がった止血鉗子(Fine Science Tools)を使用して、第4肋間腔を介して胸腔に穿刺した。穿刺した肋間筋を同じ曲がった止血鉗子で鈍的切開し、カストロビージョリトラクター(Roboz)を挿入して、切開した肋間腔を開放して保持した。左心房が見えるようになり、そのすぐ下に、曲がった鉗子(Fine Science Tools)で心膜に穴をあけた。次いで、これを注意深く遠位心室心尖部までずっと切除した。左心耳のレベルにLAD冠動脈を認め、6-0 75cmの縫合糸を付属器官のおよそ1〜2mm下で動脈の周囲に置いた。縫合糸の両端をポリエチレン管に通して、自由端を有する「スネア」様のループを形成した。次いで、スネアループを10秒間引いて、チアノーゼの領域を査定し、次いで、緩めて正常な色に戻ることによって、LADの適切な閉塞を実証した。前部の見えるようになった壁のおよそ40〜50%がチアノーゼになったことが見えたとき、再度、永久的に閉塞させた。調節が必要であれば、縫合糸を取り除き、最終ステップを繰り返して、すべてのラットについて等しい量のチアノーゼを得た。LAD閉塞に続いて、リトラクターを外し、2ステッチの3.0被覆バイクリル縫合糸(Ethicon)で肋間腔を閉じた。次いで、3.0被覆バイクリル縫合糸(Ethicon)を使用する水平マットレス技術により、皮膚の切開を閉じた。次いで、回復のためにラットをケージに入れた。ラット用の飲料水に0.01%エンロフロキサシン(Baytril 25; Bayer Healthcare AG)を補充した。偽手術を受けたラットは、LADを結紮しなかったこと以外は全く同じ手術手順を受けた。
【０１６４】
データ解析及び統計学
必要な試料サイズを推定するためにNQuery Advisor(Statistical Solutions)を使用した。定量データは、平均±平均の標準誤差(SEM)として表した。(QRS間隔、PR間隔のような)連続変数を、スチューデントのT検定又はマン・ホイットニーのU検定を使用して解析した。フィッシャーの正確確率検定(セル中の試料が5以下の場合)を使用して、又はSPSS(バージョン17)において2標本ピアソンのカイ二乗(X2)検定(2×2表)を使用して、(例えば心室性頻拍性不整脈の誘発性の場合)2×2表の統計解析を実施した。有意性を、P≦0.05に設定した。
【０１６５】
[実施例2]
コネキシン45の過剰発現が心室性頻拍性不整脈を有意に増大させる
心臓生理学及び不整脈原性におけるCx45の役割を検証するために、in vitroの研究を実施した。実施例1に記載のプロトコールを使用して、新生仔ラットの心室心筋細胞にrAAV.Cx45の1×1011個のベクターゲノムで形質導入した。形質導入した新生仔ラット心室心筋細胞において、広範なCx45の発現を検出した(図1)。特に、接合膜において局在化したCx45の発現を観察した。形質導入しない新生仔ラット心室心筋細胞においては、内在性のCx45の発現を検出しなかった。抗Cx45抗体を使用したウェスタンブロッティングは、形質導入した新生仔ラット心室心筋細胞におけるCx45の発現を確認した(図2)。
【０１６６】
(心臓の電気インパルス伝播及び心臓発生に関与する)Cx43は、隣接細胞間の接合膜において発現する。Cx45の発現をCx43の発現と比較した。実施例1に記載のプロトコールを使用して、Sprague-Dawleyラットが、rAAV.Cx43(n=15)、rAAV.Cx45(n=22)又はrAAV.GFP(n=15)いずれかの1×1012個のベクターゲノムの尾静脈注射を受容した。注射後の28日目に、心室組織を取り出し、Cx43及びCx45の発現について調査した。図3に示す通り、rAAV.Cx43又はrAAV.Cx45のいずれかで形質導入したラットは、広く形質導入された心筋をもたらした。Cx43及びCx45の実質的な共局在化を、介在板で検出した。この知見は、コネクソンを形成することができるCx43及びCx45と一致する。
【０１６７】
Cx43の相互作用パートナーとしてのCx45の同定を、rAAV.Cx45で形質導入したラットからの心室組織に対する共免疫沈降実験を実施することにより確認した。免疫沈降したタンパク質を、SDS-PAGEにより解析し、実施例1に記載の抗Cx43又は抗Cx45抗体を使用した免疫ブロッティングに供した。図4Aに示す通り、rAAV.Cx45で形質転換したラットからの心室組織の抗Cx43免疫沈降物において、Cx45を認めた。加えて、rAAV.Cx45で形質転換したラットからの心室組織の抗Cx45免疫沈降物において、Cx43を認めた(図4B)。陰性対照においては、Cx43又はCx45のいずれも観察しなかった。これらのデータは、Cx43及びCx45が相互作用することを確かめるものである。
【０１６８】
増大したCx45の発現の電気生理学的効果を調べるために、rAAV.GFP、rAAV.Cx43又はrAAV.Cx45の尾静脈注射後の0日目及び28日目に、麻酔したラットにおいて電気生理学的検査を実施した。電気生理学的検査は、表面ECG及び実施例1に記載の経食道心臓ペーシングからなるものであった。手短に言えば、15頭のラットにrAAV.GFPを、15頭にrAAV.Cx43を、22頭にrAAV.Cx45を注射した。図5に示す通り、rAAV.Cx45で形質導入したラットにおける表面ECGは、28日間にわたるPR間隔(45.8±6.0対59.0±12.0ms)及びQRS間隔(14.8±1.9対16.2±1.8ms)の延長を示した。rAAV.Cx43で形質導入したラット又はrAAV.GFPで形質転換したラットのいずれも注目すべき電気生理学的変化はなかった。興味深いことに、房室ブロックを、rAAV.Cx45で形質転換した5頭のラットにおいて観察した。これらのデータは、延長したECGパラメータ、すなわち、延長したPR間隔及びQRS間隔、並びにAVブロックにより証明されたように、Cx45の心臓過剰発現が伝導を遅延させたことを示している。
【０１６９】
Cx45形質導入ラットにおいては、誘導性の心室性頻拍性不整脈の発生率の増大も観察した(図6)。28日目に、rAAV.Cx43で形質導入した2頭のラットに比較して、rAAV.Cx45で形質導入した13頭のラットは、誘導性の心室性頻拍性不整脈を有した。対照ベクターrAAV.GFPで形質導入したラットのいずれにおいても、誘導性の心室性頻拍性不整脈を観察しなかった。
【０１７０】
誘導性の心室性頻拍性不整脈の傾向の増大が、炎症又は心筋内の線維化により引き起こされたかを決定するために、組織学的分析を実施した。いずれの群の間でも、炎症又は心筋内の線維化における有意な差は観察しなかった(図7及び8)。これらのデータは、Cx45で形質導入したラットにおいて観察した誘導性の心室性頻拍性不整脈の傾向の増大が、炎症又は心筋内の線維化とは無関係であったことを示している。
【０１７１】
まとめると、これらの結果は、Cx45の過剰発現が心筋の電気的伝播の遅延及び催不整脈のリスク増大を伴うことを示している。よって、Cx45は、心室伝導において確かな役割を演じる。
【０１７２】
[実施例3]
shRNA媒介性のコネキシン45のノックダウンが、ラット心筋梗塞モデルにおいて心室性頻拍性不整脈を低減させる
催不整脈におけるCx45の役割をさらに理解するために、心筋梗塞のげっ歯類モデルにおいてCx45の発現レベルを調べた。このモデルは、これまで臨床試験においてヒトに適用されてきたプロトコールにおいて心筋梗塞後の左心室機能不全のための細胞療法及び遺伝子治療アプローチを評価するためのツールとして広く使用されてきた(Terrovitisら、2008年、Terrovitisら、2009年、del Monteら、2004年)。
【０１７３】
心筋梗塞後に、偽手術に供したラットに比較して、Cx45の発現レベルは、心室組織において有意に増大した(図9)。このモデルにおいてCx45を低減させることの効果を評価するために、Cx45を標的とする数種のshRNAを、実施例1に記載の通りにデザインした。
【０１７４】
候補shRNAの効率性及び特異性を決定するために、ラットCx45 mRNA転写物のさまざまな領域を標的とする8種のCx45-shRNAを作製した。これらのベクターを、GFPと融合したラットCx45(Cx45-GFP)をコードするプラスミドとともにHEK-293細胞にトランスフェクトした。Cx45の発現を阻害するCx45-shRNAの能力を、免疫蛍光法によって調べた。図10に示す通り、Cx45-shRNA#1、Cx45-shRNA#2、Cx45-shRNA#3及びCx45-shRNA#4の同時導入は、緑色蛍光を有する細胞数の減少として示す通り、Cx45-GFPの発現を大きく低減させるが、スクランブル対照配列(shNS)はそうでなかった。
【０１７５】
候補shRNAがin vivoでCx45の発現を阻害することができることを確認するために、rAAV.Cx45及び候補Cx45-shRNA又はrAAV.shNSのいずれかをラットに同時導入した。成体Sprague-Dawleyラットが、実施例1に記載のプロトコールを使用して、各ベクターの1×1012個のベクターゲノムの尾静脈注射を受容した。注射後の35日目に、Cx45心室組織を取り出し、Cx43及びCx45の発現について探索した。図11に示す通り、Cx45-shRNA#1は、初回形質導入の5週間後にCx45の発現を阻害することができた。これらのデータは、本明細書に記載のshRNAの延長した活性を示す。Cx43の発現に変化は観察しなかった(図12)。Cx43の発現レベルにおいて検出可能な変化を観察しなかったことから、これらのデータは、観察した阻害効果がCx45に特異的であったことを示す。
【０１７６】
心筋梗塞後の心室組織において、Cx45の上昇したレベルを観察したため、不整脈のような心筋梗塞関連合併症を低減させる、候補shRNAの能力を調べた。実施例1に記載のプロトコールを使用した左前下降動脈の閉塞後に、22頭のラットにCx45-shRNA#1を、17頭にrAAV.shNSを注射した。心筋梗塞及び形質導入の5週間後に、Cx45の発現の有意な低減を観察した(図12)。有意に低減された誘導性の心室性頻拍性不整脈の発生率も、Cx45-shRNA#1で形質導入したラットにおいて観察した(図13)。rAAV.shNSで形質導入した12頭のラットに比較して、Cx45-shRNA#1で形質導入した8頭のラットは誘導性の心室性頻拍性不整脈を有した。いずれの群においても、自然発生的な心室性頻拍性不整脈の証拠は観察されなかった。
【０１７７】
これらのデータは、Cx45の過剰発現を低減させることが、(心室性頻拍性不整脈のような)不整脈の発生率を低減させることを明らかに示す。さらに、これらのデータは、Cx45の発現を低減させることが、Cx45の発現の増大に伴う伝導の減速を低減させることによる有益な効果をもたらすことを実証している。よって、本明細書に提供されるデータは、Cx45のアンタゴニストの治療における用途を立証している。
【０１７８】
当業者は、本開示の広い一般的範囲から離れることなく、上記実施例に対して非常に多くの変形及び/又は改変がなされ得ることを理解している。したがって、本実施例は、すべての面において例示的であって制限的でないと考えられるべきである。
【０１７９】
特許、特許出願、論文、教科書などを含む、本明細書において引用されるすべての参考文献、並びに既に本明細において引用されていない限り、そこにおいて引用される参考文献は、それらの全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８０】
本明細書に含まれる文書、行為、材料、装置、記事などのいずれの議論も、単に本発明の環境を提供する目的のためのものである。これらの事項のいずれか又はすべては、従来技術の基礎の一部を成すこと、又はそれが本出願の各請求項の優先日前に存在したために本発明に関連した分野における一般常識であったことを認めるものと解釈されるべきでない。
【０１８１】
参考文献
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2018529759.tif 000004
2018529759.tif 000005
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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