(57)【要約】  本発明は、ベースヘリックスとＲＲ１との間に存在するヒンジループ中に、１つまたは複数の変異を含む、融合前コンフォメーションで安定な融合前クラスＩ融合タンパク質を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベースヘリックスとＲＲ１との間に存在するヒンジループ中に、１つまたは複数の変異を含む、安定な融合前クラスＩ融合タンパク質。
【請求項２】
前記クラスＩ融合タンパク質がフィロウイルス融合Ｆタンパク質である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記フィロウイルスＦタンパク質がエボラウイルスＦタンパク質である、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
ヒンジループ中に、５７７位のアミノ酸残基Ｔｈｒの変異および／または５７９位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異を含む、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記クラスＩ融合タンパク質が、
ＧＬＩＣＧＬＲＱＬＡＮＥＴＴＱＡＬＱＬＦＬＲＡＴＰＥＬＲＴＦＳＩＬＮＲＫＡＩＤＦＬＬＱＲ（配列番号１１）；および
ＧＬＩＣＧＬＲＱＬＡＮＥＴＴＱＡＬＱＬＦＬＲＡＴＴＥＰＲＴＦＳＩＬＮＲＫＡＩＤＦＬＬＱＲ（配列番号１２）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むエボラウイルスＦタンパク質である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記フィロウイルスＦタンパク質がマールブルグウイルスＦタンパク質である、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項７】
ヒンジループ中に、５７８位のアミノ酸残基Ｔｈｒの変異、および／または５８０位のアミノ酸残基Ｇｌｕの変異を含む、請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記クラスＩ融合タンパク質が、
ＮＬＶＣＲＬＲＲＬＡＮＱＴＡＫＳＬＥＬＬＬＲＶＴＰＥＥＲＴＦＳＬＩＮＲＨＡＩＤＦＬＬＡＲ（配列番号１５）；および
ＮＬＶＣＲＬＲＲＬＡＮＱＴＡＫＳＬＥＬＬＬＲＶＴＴＥＰＲＴＦＳＬＩＮＲＨＡＩＤＦＬＬＡＲ（配列番号１６）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むマールブルグウイルスＦタンパク質である、請求項６または７に記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記クラスＩ融合タンパク質がレトロウイルスのＨＩＶ−１エンベロープタンパク質である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１１】
ヒンジループ中に、５５５位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異、５５６位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異、および／または５５８位のアミノ酸残基Ａｌａの変異を含む、請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記クラスＩ融合タンパク質が、
ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＰＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩ（配列番号３）；
ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＰＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩ（配列番号４）；
ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＰＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩ（配列番号５）；
ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＳＮＰＬＲＡＩＥＡＱＱＨＭＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＴＲＶ（配列番号６）；
ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＳＮＬＰＲＡＩＥＡＱＱＨＭＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＴＲＶ（配列番号７）；および
ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＳＮＬＬＲＰＩＥＡＱＱＨＭＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＴＲＶ（配列番号８）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＩＶ−１エンベロープタンパク質である、請求項１０または１１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
前記タンパク質が、クラスＩ融合タンパク質が、レトロウイルスのＨＩＶ−２エンベロープタンパク質である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１４】
ヒンジループ中に、５５３位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異および／または５５４位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異、５５６位のアミノ酸残基Ａｌａの変異、および／または５５７位のアミノ酸残基Ｖａｌの変異を含む、請求項１３に記載のタンパク質。
【請求項１５】
前記クラスＩ融合タンパク質が、
ＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＰＬＤＡＶＫＲＱＱＥＬＬＲＬＴＶＷＧ（配列番号３１）；
ＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＬＰＤＡＶＫＲＱＱＥＬＬＲＬＴＶＷＧ（配列番号３２）；
ＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＬＬＤＰＶＫＲＱＱＥＬＬＲＬＴＶＷＧ（配列番号３３）；および
ＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＬＬＤＡＰＫＲＱＱＥＬＬＲＬＴＶＷＧ（配列番号３４）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＩＶ−２エンベロープタンパク質である、請求項１３または１４に記載のタンパク質。
【請求項１６】
前記クラスＩ融合タンパク質がインフルエンザＨ１ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１７】
ＨＡ２のヒンジループ（Ｂループ）中に、６３位のアミノ酸残基Ｐｈｅの変異および／または７３位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異を含む、請求項１６に記載のタンパク質。
【請求項１８】
前記クラスＩ融合タンパク質が、
【化１】
2018529331.tif 000022
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むインフルエンザＨ１ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質である、請求項１６または１７に記載のタンパク質。
【請求項１９】
前記クラスＩ融合タンパク質がインフルエンザＨ３ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項２０】
ＨＡ２のヒンジループ（Ｂループ）中に、７２位のアミノ酸残基Ｐｈｅの変異および／または８２位のアミノ酸残基Ｖａｌの変異を含む、請求項１９に記載のタンパク質。
【請求項２１】
前記クラスＩ融合タンパク質が、
【化２】
2018529331.tif 000023
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むインフルエンザＨ３ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質である、請求項１９または２０に記載のタンパク質。
【請求項２２】
前記クラスＩ融合タンパク質がインフルエンザＢウイルスのインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項２３】
ＨＡ２のヒンジループ（Ｂループ）中に、６２位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異および／または７２位のアミノ酸Ｌｅｕの変異を含む、請求項２２に記載のタンパク質。
【請求項２４】
前記クラスＩ融合タンパク質が、
【化３】
2018529331.tif 000024
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むインフルエンザＢウイルスのインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドである、請求項２２または２３に記載のタンパク質。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸配列。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか／一項に記載のタンパク質および／または核酸を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬の分野に関する。本発明は、具体的には、組換え融合前クラスＩ融合タンパク質、および例えば免疫原性組成物におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス融合タンパク質は、準安定な融合前コンフォメーションから安定な融合後コンフォメーションへの不可逆的なタンパク質リフォールディングによって膜融合を駆動する動的な融合機構である。タンパク質の膜融合性はウイルス感染にとって重要である。
【０００３】
エンベロープウイルスの融合タンパク質は、ウイルスが標的細胞と融合するのを駆動するために示す一般的な不可逆的フォールディング機序に基づいて、異なるタイプに分類することができる。無関係なウイルス由来の融合タンパク質、例えば、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）の融合タンパク質Ｆ、エボラＧＰ、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）エンベロープタンパク質、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）スパイク、ヘルペスビリデア（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄｅａ）ｇＢ、オルトミクソビリデアエ（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄｅａｅ）ヘマグルチニン（ＨＡ）およびヘマグルチニンエステラーゼ（ＨＥ）、ならびにその他のものはクラスＩ融合タンパク質に分類され、これらは意味のある配列相同性を何ら呈していないのだが、類似の機序によって不安定な融合前状態から安定な融合後状態にリフォールディングされる。このように、クラスＩ融合タンパク質は、不安定な融合前コンフォメーションから安定な融合後コンフォメーションへの不可逆的なタンパク質リフォールディングにより、ウイルス膜と宿主細胞膜とを融合する。種々のクラスＩ融合タンパク質について、融合前コンフォメーションおよび融合後コンフォメーションの構造が解明され、この複雑な融合機構の機序に洞察が得られている。
【０００４】
通常、エボラＧＰおよびヘルペスｇＢを除き、不活性の成熟クラスＩ融合タンパク質（例えばパラミクソウイルスのＦ０、オルトミクソウイルスのＨＡ）は、細胞内成熟の間に開裂（多くの場合フューリン様プロテアーゼによる）を必要とし、その結果、Ｎ末端部分とＣ末端部分とになる。開裂部位は２０〜２５疎水性アミノ酸の伸長（融合ペプチド）の近傍にあるか、または隣接しており、その次にＣ末端部分の７アミノ酸繰り返し領域がある。これらはクラスＩ膜タンパク質であるため、Ｃ末端は膜貫通ドメイン（ＴＭ）を含有し、開裂後に、膜が結合したＣ末端部分はＮ末端の疎水性融合ペプチド（ＦＰ）を露出する（図１）。融合前コンフォメーションから融合後コンフォメーションにリフォールディングするためには、リフォールディングするために必要な２つの領域があり、これらはリフォールディング領域１（ＲＲ１）およびリフォールディング領域２（ＲＲ２）と呼ばれる。クラスＩ融合タンパク質ではすべて、ＲＲ１はＦＰおよび７アミノ酸繰り返しＡ（ＨＲＡ）を含む。トリガー発生後、三量体の３つすべてのプロトマーのＨＲＡは、ヘリックスから、またはループのアセンブリーおよび二次的な構造から変形して、長い連続した三量体ヘリックスコイルドコイルになる（図１）。ＲＲ１のＮ末端セグメントに位置するＦＰは、その後、ウイルス膜から伸びて標的細胞の近位膜に入ることができる。次に、よりＴＭに近いＲＲ２に向かって置かれたＣ末端であり、７アミノ酸繰り返しＢ（ＨＲＢ）を含むことが多いリフォールディング領域２（ＲＲ２）は、融合タンパク質の反対側へと移動し、ＨＲＡコイルドコイル三量体をＨＲＢドメインに結合させて、またはインフルエンザＨＡのように伸長したポリペプチド鎖に結合させて、６ヘリックスバンドル（６ＨＢ）を形成する。これらの類似性は、これらの配列および構造的特徴を有するウイルス融合タンパク質を、いわゆるクラスＩウイルス融合タンパク質グループとする命名によって認識されている（Ｅａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８５：２６−６６，（２００５）；Ｊａｒｄｅｔｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５：２４−３３（２０１４））。
【０００５】
ウイルス融合タンパク質がワクチン成分として使用される場合、膜融合機能は重要ではない。事実、ウイルスに結合することができる交差反応性抗体を誘導するために重要なのは、成分の模倣のみである。したがって、強力で有効なワクチン成分の開発のためには、準安定な融合タンパク質が、その融合前コンフォメーションで維持されることが望ましい。融合前コンフォメーションで安定化した融合タンパク質は、有効な免疫応答を誘導することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、融合前コンフォメーションで安定化した、安定な、組換え、クラスＩ融合タンパク質を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
特定の実施形態では、融合前ポリペプチドは可溶性である。
【０００８】
本発明はまた、本発明による融合前ポリペプチドをコードする核酸分子およびそのような核酸分子を含むベクターも提供する。
【０００９】
本発明はまた、クラスＩ融合前ポリペプチド、核酸分子、および／またはベクターを含む組成物、好ましくは免疫原性組成物、ならびにクラスＩ融合タンパク質に対する免疫応答を誘導するためのその使用、具体的にはワクチンとしてのその使用にも関する。
【００１０】
本発明はまた、対象に抗ウイルス免疫応答を誘導する方法であって、融合前ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードする核酸分子、および／または前記核酸分子を含むベクターの有効量を対象に投与するステップを含む方法に関する。好ましくは、誘導された免疫応答は、ウイルスに対する中和抗体および／または前記ウイルス感染に対する防御免疫を特徴とする。特定の態様において、本発明は、対象に抗ウイルス中和抗体を誘導する方法であって、融合前ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードする核酸分子、および／または前記核酸分子を含むベクターを含む、有効量の免疫原性組成物を、対象に投与するステップを含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】融合タンパク質三量体の、融合前コンフォメーションの図（左上）および中間状態の図（右上）、ならびにクラスＩ融合タンパク質の融合ドメインの保存要素の概略図（下）。融合ペプチド（ＦＰ）、リフォールディング領域１（ＲＲ１）、リフォールディング領域２（ＲＲ２）および膜貫通領域（ＴＭ）が示されている。融合タンパク質の分子構造はきわめて多様であり、分離型の受容体結合ドメインを含有する場合がある（左上、市松模様）が、すべての融合タンパク質は識別可能な融合ドメインを含有する（斜線部、黒塗りつぶし）。一般に、ＦＰはＣ末端部分に７アミノ酸繰り返し領域（黒塗りつぶしおよび斜線縞部）が続き、両者がＲＲ１を形成する。トリガー発生後、ヒンジループを介してベースヘリックス（斜線部）に結合しているＲＲ１のＮ末端部分（黒）がベースヘリックスの上にアセンブルして、長い連続したヘリックスコイルドコイルを形成する。融合タンパク質の融合後形態は、リフォールディング領域２がリフォールディングされたＲＲ１を束ねる際に形成される。これらはクラスＩ膜タンパク質であるため、Ｃ末端は膜貫通ドメイン（ＴＭ）を含有する。
【図２】いくつかのクラスＩ融合タンパク質の、ＲＲ１（黒）、ヒンジループおよびベースヘリックス（斜線縞部）のフラグメントの、融合前コンフォメーション（上の列）および融合後コンフォメーション（下の列）の図。トリガー発生後、ヒンジループを介してベースヘリックス（斜線縞部）に結合しているＲＲ１のＮ末端部分（黒塗りつぶし）（上）がベースヘリックスの上にアセンブルして、長い連続したヘリックスを形成する（下）。ＲＳＶ  ＦおよびＨＩＶ  ｇｐ４１のヒンジの小さな白い円は、融合前コンフォメーションを安定化させるプロリンへの置換を表す。小さな黒い円は、白い円と構造的に相同な可能性のある位置であり、安定化置換の可能性のある位置である。
【図３】５０１〜６０５位に安定化ジスルフィドを有するクレードＣのＥｎｖ（ＣｏｎＣ＿ＳＯＳ）のコンセンサス配列に基づいたＨＩＶ−１  ｅｎｖ配列におけるプロリン置換の、三量体のパーセンテージおよび収量。Ａ）Ｃタグ精製したＥｎｖを用いたＥＬＩＳＡ（黒い棒）および無細胞の上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡ（灰色の棒）を使用して測定した三量体のパーセンテージ。ＥＬＩＳＡによって得られたＩ５５９Ｐ変異体の三量体のパーセンテージを使用して、ＡｌｐｈａＬＩＳＡデータセットを正規化した。Ｂ）精製したＥｎｖを用いたＥＬＩＳＡ（黒い棒）および無細胞の上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡ（灰色の棒）を使用して測定した三量体の収量。データを、Ｉ５５９Ｐ変異体を基準として正規化した。ＮＤ：未決定。ＨＩＶ−１  ｅｎｖのプロリン置換変異体は、表３に一層詳細に説明されている。
【図４】Ａ）ガランサス・ニバルス（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｕｓ）レクチン精製したＨＩＶ−１  ＣｏｎＣ＿ＳＯＳ  Ｅｎｖ変異体（Ｉ５５９Ｐ置換（左）、およびＬ５５６Ｐ、Ｉ５５９Ｐの二重置換（右））のＳＥＣ−ＭＡＬＳプロファイル。クロマトグラムは、凝集体（クロマトグラムの左）、次いで三量体、次いでそれより小さいサブユニットの２つのピークを示す。Ｂ）ＡｌｐｈａＬＩＳＡ中でＰＧＴ１４５結合を使用した、ＨＩＶ−１  ｅｎｖ変異体の未処理の上清を６０℃で１時間インキュベートした後に残っている三量体の全個体数のパーセンテージ。
【図５】Ａ）ヒンジループ中でプロリン置換したエボラＧＰ変異体の無細胞の上清のＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ解析。トランスフェクトしたｅｘｐｉ２９３細胞の上清をＮａｔｉｖｅＰＡＧＥで解析し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅで染色した。レーンは変異体の発現および四次構造を示す。Ｂ）野生型、Ｔ５７７Ｐ変異体およびＬ５７９変異体の、三量体および単量体のバンドを判定し、それらの相対的パーセンテージを計算した。
【図６】示差走査蛍光光度法（ＤＳＦ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ）を使用した、野生型エボラＧＰ、ＥＢＯＶ１４株およびＴ５７７Ｐ置換した変異体の融解温度（Ｔｍ）の解析。
【図７】Ａ）エボラ株であるＭａｙｉｎｇａおよびＳｕｄａｎ  Ｇｕｌｕ、ならびにヒンジループ中５７７位でプロリンに置換した変異体の、可溶性ＧＰをＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ解析して得られたバンドに基づいた三量体のパーセンテージ。Ｂ）ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥに基づく、異なる可溶性ＧＰの三量体の相対的収量。
【図８】Ａ）ヒンジループ中７３位にプロリンまたはロイシンを有するインフルエンザミニＨＡ変異体の多量体特異的結合。Ｂ）ミニＨＡ変異体の、発現レベル、広域中和抗体への結合および三量体結合（Ａに示したとおり）の概要。Ｃ）多量体含有量を、６３Ｙを有する対照を基準とした６３Ｐのパーセンテージとして示した、６３位にＴｙｒまたはＰｒｏを有するミニＨＡ変異体の多量体含有量。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
ウイルス−細胞融合は、ヒト病原体、例えば、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびエボラウイルスなどを含むすべてのエンベロープウイルスが、細胞に侵入し、疾患を引き起こす複製のサイクルを開始する手段である。ウイルス−細胞融合は、一般に融合タンパク質と呼ばれるものを含む１種または複数種のウイルス表面糖タンパク質によって行われる。エンベロープウイルスの融合タンパク質は、それらの一般的な不可逆的フォールディング機序に基づいて、異なるタイプに分類することができる。したがって、無関係なウイルス由来の融合タンパク質、例えば、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）の融合タンパク質Ｆ、エボラＧＰ、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）エンベロープタンパク質、オルトミクソビリデア（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄｅａ）ヘマグルチニン（ＨＡ）およびヘマグルチニンエステラーゼ（ＨＥ）はクラスＩ融合タンパク質に分類される。クラスＩ融合タンパク質は、不安定な融合前コンフォメーションから安定な融合後コンフォメーションへの不可逆的なタンパク質リフォールディングにより、ウイルス膜と宿主細胞膜とを融合する。
【００１３】
既知の他のクラスＩ融合タンパク質には、例えば、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）のＧＰタンパク質、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）のＥ１／Ｅ２タンパク質、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）のＥタンパク質、Ｅ（ＴＢＥＶ）、Ｅ１／Ｅ２（ＨＣＶ）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）のＧＮ／ＧＣタンパク質、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）のＧタンパク質、およびヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）のｇＢ、ｇＤ、ｇＨタンパク質がある。
【００１４】
クラスＩ融合タンパク質はすべて、通常、同じ構造的特徴を含む（図１を参照）。リフォールディング領域１（ＲＲ１）は融合ペプチド（ＦＰ）および７アミノ酸繰り返しＡ（ＨＲＡ）を含む。トリガー発生後、三量体の３つすべてのプロトマーのＨＲＡおよびＦＰは、ヘリックスから変形し、またはループのアセンブリーおよび二次的な構造を形成して、長い連続した三量体ヘリックスコイルドコイルになる（図１）。ＲＲ１のＮ末端セグメントに位置するＦＰは、その後、ウイルス膜から伸びて標的細胞の近位膜に入ることができる。次に、よりＴＭに近いＲＲ２に向かって置かれたＣ末端であり、７アミノ酸繰り返しＢ（ＨＲＢ）を含むことが多いリフォールディング領域２（ＲＲ２）は、融合タンパク質の反対側へと移動し、ＨＲＡコイルドコイル三量体をＨＲＢドメインに結合させて、またはインフルエンザＨＡのように伸長したポリペプチド鎖に結合させて、６ヘリックスバンドルを形成する。これらの類似性は、これらの配列および構造的特徴を有するウイルス融合タンパク質を、いわゆるクラスＩウイルス融合タンパク質グループとする命名によって認識されている（Ｅａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８５：２６−６６，（２００５）；Ｊａｒｄｅｔｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５：２４−３３（２０１４）。
【００１５】
ＲＲ１コイルドコイルの形成および６ヘリックスバンドルを完成させるためのＲＲ２の移動は基本的な類似性であるが、融合機序における多様性は高い。いくつかのクラスＩ融合タンパク質の構造研究は、それらがきわめて異なる構造的サブファミリーを表していることを示した。融合タンパク質の包括的なフォールディング、およびアンフォールディングのトリガーはファミリーメンバーによって異なり、イベントの配列は各クラスＩ融合タンパク質によって異なる場合がある。例えば、多種のパラミクソウイルスについて、ＨＲＢは、ＨＲＡドメインの放出および形成の前に、露出され、放出されると提唱されている。
【００１６】
ＲＲ１およびＲＲ２は別にして、既知のクラスＩ融合タンパク質はすべて、別の特有の構造的特徴を共有しており、それを本明細書ではベースヘリックスと呼んでいる。ベースヘリックスとは、融合前コンフォメーションから融合後コンフォメーションへの変形中にコンフォメーションを変化させない、動的な融合タンパク質の一部である。ベースヘリックスは融合タンパク質の中心にあり、三量体のヘリックスベースを形成する。トリガーが発生し、リフォールディングが開始した後、三量体のヘリックスベースはＲＲ１の最初のヘリックスのアセンブリーによって伸ばされる。呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質（ＲＳＶ  Ｆ）では、ベースヘリックスはヘリックスα５である。リフォールディングの後は、ヘリックスα４が、構造的に保護され、予め形成されたα５ヘリックスベースの上にアセンブルする最初の構造要素である。フレキシブルなα４−α５ループは、α５の上のα４というアセンブリーを実現するためにつなぎ合わす必要のある、この動的タンパク質の最初の領域であるため、重要な構造要素である（図２）。
【００１７】
本発明を導いた研究において、このヒンジループ中の疎水性残基、特にプロリン（Ｐｒｏ）置換がループを安定化することができることが発見された。安定性は疎水性相互作用によって得られるが、特にヒンジ領域中のペプチド鎖の骨格コンフォメーションを制限するプロリンの強固性によって得られる。このきわめて重要なヒンジ領域中の、プロリン置換により、ＲＳＶ  Ｆの融合前コンフォメーションは、ヒンジ運動が制限され、ヘリックス５の上のヘリックス４の運動およびアセンブリーが妨げられることによって安定化された。驚くべきことに、ＨＩＶについても、ヒンジループ中の安定化プロリン置換が記述されている（Ｓａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７６，８８７５−８８８９（２００２））。
【００１８】
近年、ＨＩＶの融合ドメインｇｐ４１の融合前コンフォメーションの結晶構造が解明された（Ｐａｎｃｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１４，４５５−４６１（２０１４））。それをｇｐ４１の融合後６ＨＢの既知の構造と比較することによって、ヘリックス７をベースヘリックスとして同定することができる。ＲＲ１のリフォールディング後に、α６とα７の間のヒンジループとヘリックスα６とがベースヘリックスα７の上に乗って、長く伸びたコイルドコイルを形成する。ＲＳＶ融合前Ｆのα４−α５ヒンジループと同様に、融合前ＨＩＶ  ｇｐ４１のα６−α７ヒンジループもまた、融合タンパク質の最も不規則な要素である。ｇｐ４１のα６−α７ループは、実際、完全に不規則であり、結晶構造中の電子密度を測定することができなかった。融合前ｇｐ４１の安定性を高める重要な置換は、ＲＳＶ−Ｆの安定化Ｓ２１５Ｐと構造的に相同な位置に位置しているＩ５５９Ｐである。ｇｐ４１  Ｉ５５９Ｐは構造が不可視であるが、ベースヘリックスと上に乗ったヘリックスとの間のヒンジループ中の位置は、融合前ＲＳＶ−Ｆのヒンジループ中の２１５位ときわめて似ている（図２）。Ｉ５５９Ｐは６ＨＢ融合後コンフォメーションを不安定にするように設計されたが、融合前ＲＳＶ  Ｆにおいて２１５位のプロリンがα４−α５ヒンジのヒンジ運動を阻害するのと同様に、５５９位のプロリンはα６−α７ループのヒンジ運動を防止する（Ｋｒａｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ８１４３（２０１５），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ９１４３）。この２種の無関係なクラスＩ融合タンパク質の類似性により、ＲＲ１のリフォールディングにおけるきわめて重要なステップとしてヒンジの重要性が明らかになる。それはまた、不安定なヒンジループを安定化することが、クラスＩ融合タンパク質の不安定な融合前コンフォメーションの安定化を成功させる戦略であることも示す。このように、ヒンジループに、好ましくはベースヘリックスの比較的近傍にプロリンを導入することは、クラスＩ融合タンパク質の融合前コンフォメーションを安定化するための共通の解決策として使用することができ、これにより、クラスＩ融合タンパク質を優れたワクチン成分にすることになる。
【００１９】
本発明によって、いくつかのクラスＩ融合タンパク質、特に、インフルエンザＨＡ、レトロウイルスのエンベロープタンパク質およびエボラＧＰのように、融合前の構造が解明されているクラスＩ融合タンパク質について、安定化したヒンジループが設計された。これらの例のすべてについて、ベースヘリックスへのヒンジループＣ末端のプロリン残基が融合前コンフォメーションを安定化することが本発明によって示されている。したがって、クラスＩ融合タンパク質のベースヘリックスを同定し、ＲＳＶ  ＦおよびＨＩＶ  ｇｐ４１のヒンジループ中の安定化プロリンの位置を基に、他のヒンジループ中の安定化プロリンのおおよその位置を推定した（図２および表１）。
【００２０】
したがって、本発明は、融合前コンフォメーションで安定化した、組換え融合前クラスＩ融合タンパク質を提供する。本発明の安定なクラスＩ融合前タンパク質は融合前コンフォメーションであり、すなわちそれは融合タンパク質の融合前コンフォメーションに特異的なエピトープを含む（提示する）。融合前コンフォメーションのタンパク質に特異的なエピトープは、融合後コンフォメーションでは提示されないエピトープである。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、クラスＩ融合タンパク質の融合前コンフォメーションは、天然のビリオンに発現するタンパク質上のエピトープと同じエピトープを含有することができ、したがって、防御中和抗体を誘発する利点を備え得ると考えられる。したがって、特定の実施形態では、本発明のタンパク質は融合前に特異的なモノクローナル抗体によって認識される少なくとも１つのエピトープを含む。
【００２１】
本発明により、クラスＩ融合タンパク質は、ベースヘリックスとＲＲ１との間に存在するヒンジループ中で、１つまたは複数の特定のアミノ酸残基の変異によって、特に１つまたは複数の特定の疎水性アミノ酸残基からプロリン（Ｐｒｏ）への変異によって安定化することができることが示された。表２は、いくつかのクラスＩ融合タンパク質のヒンジループを含む領域のアミノ酸配列を開示している。実際のヒンジループは表２の下線部の配列に相当する。
【００２２】
特定の実施形態では、クラスＩ融合タンパク質はレトロウイルスのエンベロープタンパク質である。
【００２３】
特定の実施形態では、レトロウイルスのエンベロープタンパク質はＨＩＶ−１エンベロープタンパク質である。特定の実施形態では、ヒンジループ（下線部）はアミノ酸配列：
【化１】
2018529331.tif 000002
の中に含まれる。
【００２４】
特定の実施形態では、本発明による安定なＨＩＶ−１エンベロープタンパク質は、ヒンジループ中に、５５５位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異、５５６位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異、および／または５５８位のアミノ酸残基Ａｌａの変異を含む。
【００２５】
特定の実施形態では、本発明による安定な融合前ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質は、ヒンジループ中に、５５５位のアミノ酸残基ＬｅｕからＰｒｏへの変異、５５６位のアミノ酸残基ＬｅｕからＰｒｏヘの変異、および／または５５８位のアミノ酸残基ＡｌａからＰｒｏヘの変異を含む。
【００２６】
特定の実施形態では、本発明による安定な融合前ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質は、
【化２】
2018529331.tif 000003
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２７】
アミノ酸残基の番号付けは完全長ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質におけるアミノ酸残基の番号付けに関連していることが、当業者には理解されるであろう。
【００２８】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、５５５位、５５６位および／または５５８位のアミノ酸残基がプロリンであるアミノ酸配列を含む、安定な融合前ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を提供する。
【００２９】
特定の実施形態では、本発明は、５５５位、５５６位および／または５５８位のアミノ酸残基がプロリンである配列番号９のアミノ酸配列を含む、安定な融合前ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を提供する。
【００３０】
特定の実施形態では、安定な融合前ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質は、さらに５５９位にプロリンを含む。
【００３１】
特定の実施形態では、レトロウイルスのエンベロープタンパク質はＨＩＶ−２エンベロープタンパク質である。
【００３２】
特定の実施形態では、ヒンジループ（下線部）はアミノ酸配列：
５３８  ＱＳＲＴＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＬＬＤＡＶＫＲＱＱＥＬＬＲＬＴＶＷＧＴＫＮＬＱＳＲＶ  ５７８（配列番号３０）の中に含まれる。
【００３３】
特定の実施形態では、本発明による安定なＨＩＶ−２エンベロープタンパク質は、ヒンジループ中に、５５３位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異および／または５５４位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異、５５６位のアミノ酸残基Ａｌａの変異、および／または５５７位のアミノ酸残基Ｖａｌの変異を含む。
【００３４】
特定の実施形態では、本発明による安定なＨＩＶ−２エンベロープタンパク質は、ヒンジループ中に、５５３位のアミノ酸残基ＬｅｕからＰｒｏヘの変異、５５４位のアミノ酸残基ＬｅｕからＰｒｏヘの変異、５５６位のアミノ酸残基ＡｌａからＰｒｏヘの変異、および／または５５７位のアミノ酸残基ＶａｌからＰｒｏヘの変異を含む。
【００３５】
特定の実施形態では、本発明による安定な融合前ＨＩＶ−２エンベロープタンパク質は、
ＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＰＬＤＡＶＫＲＱＱＥＬＬＲＬＴＶＷＧ（配列番号３１）；
ＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＬＰＤＡＶＫＲＱＱＥＬＬＲＬＴＶＷＧ（配列番号３２）；
ＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＬＬＤＰＶＫＲＱＱＥＬＬＲＬＴＶＷＧ（配列番号３３）；および
ＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＬＬＤＡＰＫＲＱＱＥＬＬＲＬＴＶＷＧ（配列番号３４）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３６】
アミノ酸残基の番号付けは完全長ＨＩＶ−２エンベロープタンパク質におけるアミノ酸残基の番号付けに関連していることが、当業者には理解されるであろう。
【００３７】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、５５３位、５５４位、５５６位および／または５５７位のアミノ酸残基がプロリンであるアミノ酸配列を含む、安定な融合前ＨＩＶ−２エンベロープタンパク質を提供する。
【００３８】
特定の実施形態では、本発明は、５５３位、５５４位、５５６位および／または５５７位のアミノ酸残基がプロリンである配列番号３５のアミノ酸配列を含む、安定な融合前ＨＩＶ−２エンベロープタンパク質を提供する。
【００３９】
特定の実施形態では、クラスＩ融合タンパク質はフィロウイルス融合タンパク質（ＧＰ）である。
【００４０】
特定の実施形態では、フィロウイルスＧＰタンパク質はエボラウイルスＧＰタンパク質である。
【００４１】
特定の実施形態では、ヒンジループ（下線部）はアミノ酸配列
【化３】
2018529331.tif 000004
の中に含まれる。
【００４２】
特定の実施形態では、本発明による安定なエボラウイルスＧＰタンパク質は、ヒンジループ中に、５７７位のアミノ酸残基Ｔｈｒの変異、および／または５７９位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異を含む。特定の実施形態では、本発明による安定なエボラウイルスＧＰタンパク質は、ヒンジループ中に、５７７位のアミノ酸残基ＴｈｒからＰｒｏヘの変異、および／または５７９位のアミノ酸残基ＬｅｕからＰｒｏヘの変異を含む。
【００４３】
特定の実施形態では、本発明による安定なエボラウイルスＧＰタンパク質は、
【化４】
2018529331.tif 000005
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４４】
アミノ酸残基の番号付けは完全長エボラウイルスＧＰタンパク質におけるアミノ酸残基の番号付けに関連していることが、当業者には理解されるであろう。
【００４５】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、５７７位および／または５７９位のアミノ酸残基がプロリンである、安定な融合前エボラウイルスＧＰタンパク質を提供する。
【００４６】
特定の実施形態では、本発明は、５７７位および／または５７９位のアミノ酸残基がプロリンである配列番号１３のアミノ酸配列を含む、安定な融合前エボラウイルスＧＰタンパク質を提供する。
【００４７】
特定の実施形態では、フィロウイルスＧＰタンパク質はマールブルグウイルスＧＰタンパク質である。
【００４８】
特定の実施形態では、ヒンジループ（下線部）はアミノ酸配列
【化５】
2018529331.tif 000006
の中に含まれる。
【００４９】
特定の実施形態では、本発明によるマールブルグウイルスＧＰタンパク質は、ヒンジループ中に、５７８位のアミノ酸残基Ｔｈｒの変異、および／または５８０位のアミノ酸残基Ｇｌｕの変異を含む。
【００５０】
特定の実施形態では、本発明によるマールブルグウイルスＧＰタンパク質は、ヒンジループ中に、５７８位のアミノ酸残基ＴｈｒからＰｒｏヘの変異、および／または５８０位のアミノ酸残基ＧｌｕからＰｒｏヘの変異を含む。
【００５１】
特定の実施形態では、本発明による安定なマールブルグウイルスＧＰタンパク質は、
【化６】
2018529331.tif 000007
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００５２】
アミノ酸残基の番号付けは完全長マールブルグウイルスＧＰタンパク質におけるアミノ酸残基の番号付けに関連していることが、当業者には理解されるであろう。
【００５３】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、５７８位および／または５８０位のアミノ酸残基がプロリンである、安定な融合前マールブルグウイルスＧＰタンパク質を提供する。
【００５４】
特定の実施形態では、本発明は、５７８位および／または５８０位のアミノ酸残基がプロリンである配列番号１７のアミノ酸配列を含む、安定な融合前マールブルグＧＰタンパク質を提供する。
【００５５】
特定の実施形態では、クラスＩ融合タンパク質は、インフルエンザＡウイルスのインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質である。特定の実施形態では、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質は、系統発生群１のインフルエンザＡウイルスのＨＡタンパク質である。特定の実施形態では、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質はＨ１  ＨＡタンパク質である。
【００５６】
インフルエンザＨＡタンパク質は、通常、ＨＡ１ドメイン（約３２９アミノ酸残基を含む）およびＨＡ２ドメイン（約１７５アミノ酸残基を含む）から構成される。
【００５７】
特定の実施形態では、ヒンジループ（下線部）は、アミノ酸配列３８
【化７】
2018529331.tif 000008
の中に含まれる。
【００５８】
特定の実施形態では、ＨＡタンパク質は、ＨＡ２のヒンジループ（Ｂループ）中に、６３位（ＨＡ２の番号付け）のアミノ酸残基Ｐｈｅの変異および／または７３位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異を含む。
【００５９】
特定の実施形態では、ＨＡタンパク質は、ヒンジループ中に、６３位のアミノ酸残基ＰｈｅからＰｒｏヘの変異、および／または７３位のアミノ酸残基ＬｅｕからＰｒｏヘの変異を含む。
【００６０】
特定の実施形態では、本発明による安定な融合前Ｈ１  ＨＡタンパク質は、
【化８】
2018529331.tif 000009
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６１】
アミノ酸残基の番号付けはＨＡ２ドメインにおけるアミノ酸残基の番号付けに関連していることが、当業者には理解されるであろう。
【００６２】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、ＨＡ２ドメインの６３位および／または７３位のアミノ酸残基がプロリンである、安定な融合前ＨＡタンパク質を提供する。
【００６３】
特定の実施形態では、本発明は、ＨＡ２ドメインの６３位および／または７３位のアミノ酸残基がプロリンである配列番号２１のアミノ酸配列を含む、安定な融合前ＨＡタンパク質を提供する。
【００６４】
特定の実施形態では、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質は、系統発生群２のインフルエンザＡウイルスのＨＡタンパク質である。特定の実施形態では、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質はＨ３  ＨＡタンパク質である。
【００６５】
特定の実施形態では、ヒンジループ（下線部）は、アミノ酸配列
【化９】
2018529331.tif 000010
の中に含まれる。
【００６６】
特定の実施形態では、安定なインフルエンザＨＡタンパク質は、ＨＡ２のヒンジループ（Ｂループ）中に、７２位のアミノ酸残基Ｐｈｅの変異および／または８２位のアミノ酸残基Ｖａｌの変異を含む。
【００６７】
特定の実施形態では、安定なインフルエンザＨＡタンパク質は、ＨＡ２のヒンジループ（Ｂループ）中に、７２位のアミノ酸残基ＰｈｅからＰｒｏヘの変異および／または８２位のアミノ酸残基ＶａｌからＰｒｏヘの変異を含む。
【００６８】
特定の実施形態では、本発明による安定な融合前Ｈ３  ＨＡタンパク質は、
【化１０】
2018529331.tif 000011
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６９】
アミノ酸残基の番号付けはＨＡ２ドメインにおけるアミノ酸残基の番号付けに関連していることが、当業者には理解されるであろう。
【００７０】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、ＨＡ２ドメインの７２位および／または８２位のアミノ酸残基がプロリンである、安定な融合前ＨＡタンパク質を提供する。
【００７１】
特定の実施形態では、本発明は、７２位および／または８２位のアミノ酸残基がプロリンである配列番号２５のアミノ酸配列を含む、安定な融合前ＨＡタンパク質を提供する。
【００７２】
特定の実施形態では、クラスＩ融合ポリペプチドは、インフルエンザＢウイルスのインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドである。
【００７３】
特定の実施形態では、ヒンジループは、アミノ酸配列
ＬＫＳＴＱＥＡＩＮＫＩＴＫＮＬＮＳＬＥＬＥＶＫＮＬＱＲＬＳＧＡＭＤＥＬＨＮＥＩＬＥＬＤＥＫＶＤＤＬＲＡＤ（配列番号２６）
の中に含まれる。
【００７４】
特定の実施形態では、安定なＨＡポリペプチドは、ＨＡ２のヒンジループ（Ｂループ）中に、６２位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異および／または７２位のアミノ酸Ｌｅｕの変異を含む。
【００７５】
特定の実施形態では、安定なＨＡポリペプチドは、ＨＡ２のヒンジループ（Ｂループ）中に、６２位のアミノ酸残基ＬｅｕからＰｒｏヘの変異および／または７２位のアミノ酸ＬｅｕからＰｒｏヘの変異を含む。
【００７６】
特定の実施形態では、本発明による安定な融合前Ｂ  ＨＡタンパク質は、
ＬＫＳＴＱＥＡＩＮＫＩＴＫＮＬＮＳＬＥＬＥＶＫＮＰＱＲＬＳＧＡＭＤＥＬＨＮＥＩＬＥＬＤＥＫＶＤＤＬＲＡＤ（配列番号２７）；および
ＬＫＳＴＱＥＡＩＮＫＩＴＫＮＬＮＳＬＥＬＥＶＫＮＬＱＲＬＳＧＡＭＤＥＰＨＮＥＩＬＥＬＤＥＫＶＤＤＬＲＡＤ（配列番号２８）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００７７】
アミノ酸残基の番号付けは完全長インフルエンザＢウイルスＨＡ２タンパク質におけるアミノ酸残基の番号付けに関連していることが、当業者には理解されるであろう。
【００７８】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、ＨＡ２の６２位および／または７２位のアミノ酸残基がプロリンである、安定な融合前ＨＡタンパク質を提供する。
【００７９】
特定の実施形態では、本発明は、ＨＡ２の６２位および／または７２位のアミノ酸残基がプロリンである配列番号２９のアミノ酸配列を含む、安定な融合前ＨＡタンパク質を提供する。
【００８０】
したがって、本発明によれば、安定な融合前クラスＩタンパク質は、野生型クラスＩ融合と比較して、ヒンジループ中に少なくとも１つの安定化するための変異を含む。本出願の全体にわたって使用される場合、アミノ酸位置は、完全長クラスＩ融合タンパク質の配列を参照して（またはインフルエンザＨＡタンパク質についてはＨＡ２ドメインを参照して）付与される。配列アラインメントは、当該技術分野で周知の方法を使用して、例えばＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＢｉｏｅｄｉｔまたはＣＬＣ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈによって行うことができる。
【００８１】
本発明によるアミノ酸は、２０種の天然アミノ酸（もしくは「標準」アミノ酸）、または例えばＤ−アミノ酸（キラル中心を有するアミノ酸のＤ−エナンチオマー）などのそれらの変異体のいずれであってもよく、または例えばノルロイシンなど、タンパク質中に天然には見出されないいずれの変異体であってもよい。標準アミノ酸は、その特性に基づいて、いくつかのグループに分類することができる。重要な因子としては、電荷、親水性または疎水性、サイズ、および官能基がある。これらの特性は、タンパク質構造およびタンパク質−タンパク質間相互作用にとって重要である。アミノ酸の中には、他のシステイン残基とジスルフィド共有結合（またはジスルフィド架橋）を形成することができるシステイン、ポリペプチド骨格のターンを誘導するプロリン、および他のアミノ酸よりもフレキシブルなグリシンなど、特別な特性を有するものがある。表１は、標準アミノ酸の略語および特性を示す。
【００８２】
特定の実施形態では、安定な融合前クラスＩタンパク質は完全長である。
【００８３】
特定の実施形態では、安定な融合前クラスＩタンパク質は可溶性タンパク質、例えば外部ドメインまたは外部ドメインのサブドメインをベースにした可溶性タンパク質である。
【００８４】
タンパク質に対する変異は、慣例の分子生物学手順により行い得ることが当業者にはわかるであろう。本発明による変異は、好ましくは、これらの変異を含まないクラスＩ融合ポリペプチドと比較して、融合前クラスＩポリペプチドの発現レベルが増加し、および／または安定性が高くなる。
【００８５】
本発明による融合前クラスＩ融合タンパク質ポリペプチドは安定である、すなわち、例えば精製、凍結融解サイクル、および／または保存などの、ポリペプチドの処理を行っても、融合後コンフォメーションへと容易に変化しない。
【００８６】
特定の実施形態では、本発明による融合前クラスＩ融合タンパク質ポリペプチドは、変異のないクラスＩ融合タンパク質ポリペプチドと比較して、４℃での保存時の安定性が高くなっている。特定の実施形態では、ポリペプチドは、４℃での保存時に、少なくとも３０日間、好ましくは少なくとも６０日間、好ましくは少なくとも６カ月間、より一層好ましくは少なくとも１年間安定である。
【００８７】
特定の実施形態では、本発明によるクラスＩ融合タンパク質ポリペプチドは、前記変異のないクラスＩ融合タンパク質ポリペプチドと比較して、熱に曝されたときに安定性が高い。特定の実施形態では、クラスＩ融合タンパク質ポリペプチドの融合前コンフォメーションは、５５℃の温度、好ましくは５８℃の温度、より好ましくは６０℃の温度で少なくとも３０分間熱に安定である。「熱に安定」とは、ポリペプチドが、少なくとも３０分間、高温（すなわち、５５℃以上の温度に曝された後も依然として少なくとも１つの融合前特異的エピトープを提示することを意味する。
【００８８】
特定の実施形態では、タンパク質は、適切な製剤緩衝剤中で１〜６回の凍結融解サイクルに供された後も、少なくとも１つの融合前特異的エピトープを提示する。
【００８９】
本出願の全体にわたって使用される場合、当該技術分野での慣例として、ヌクレオチド配列は、５’から３’の方向で提示され、アミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端の方向で提示される。
【００９０】
本発明は、本発明による融合前クラスＩタンパク質をコードする核酸分子をさらに提供する。
【００９１】
好ましい実施形態では、本発明によるタンパク質をコードする核酸分子は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞における発現用にコドン最適化される。コドン最適化の方法は既知であり、これまでに記述されている（例えば、国際公開第９６／０９３７８号パンフレット）。野生型配列と比べて少なくとも１つの好ましくないコドンがより好ましいコドンで置換される場合に、配列はコドン最適化されると考えられる。本明細書では、好ましくないコドンとは、生物において、同じアミノ酸をコードする別のコドンと比べて使用される頻度が低いコドンであり、より好ましいコドンとは、生物において、好ましくないコドンと比べて使用される頻度が高いコドンである。特定の生物におけるコドン使用の頻度は、コドン頻度表、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎに見出すことができる。好ましくは、２つ以上の好ましくないコドン、好ましくは、ほとんどまたはすべての好ましくないコドンがより好ましいコドンに置き換えられる。好ましくは、生物で最も高頻度に使用されるコドンがコドン最適化配列に使用される。好ましいコドンに置き換えると、概して発現が高くなる。
【００９２】
多くの異なるポリヌクレオチドおよび核酸分子が、遺伝暗号の縮重の結果として同じポリペプチドをコードし得ることが当業者に理解されるであろう。当業者が慣例の技術を使用して、ポリペプチドを発現させることになる任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映するように、核酸分子がコードするポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行い得ることも、理解される。したがって、特に指定されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、相互の縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含んでも含まなくてもよい。
【００９３】
核酸配列は、慣例の分子生物学技術を使用してクローン化することができ、またはＤＮＡ合成により新規に作製することができ、それは、ＤＮＡ合成および／または分子クローニングの分野の事業を有するサービス会社（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）により、慣例の手順を使用して実施することができる。
【００９４】
本発明はまた、上記の核酸分子を含むベクターを提供する。したがって、特定の実施形態では、本発明による核酸分子はベクターの一部である。このようなベクターは、当業者に周知の方法により容易に操作することができ、例えば、原核細胞および／または真核細胞において複製できるように設計することができる。加えて、多くのベクターは、真核細胞の形質転換に使用することができ、そのような細胞のゲノムに全体としてまたは部分的に組み込まれ、その結果、そのゲノムに所望の核酸を含む安定な宿主細胞が得られる。使用されるベクターは、ＤＮＡのクローニングに適し、目的の核酸の転写に使用することができるいずれのベクターでもよい。本発明による好適なベクターは、例えば、Ａｄ２６またはＡｄ３５などのアデノベクター、アルファウイルス、パラミクソウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスベクターなどである。当業者は好適な発現ベクターを選択し、機能的方法で本発明の核酸配列を挿入することができる。
【００９５】
融合前クラスＩタンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞も本発明の一部を形成する。融合前クラスＩタンパク質は、宿主細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、腫瘍細胞株、ＢＨＫ細胞、ヒト細胞株、例えばＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、もしくは酵母、真菌、昆虫細胞など、またはトランスジェニック動物もしくはトランスジェニック植物における分子の発現を含む組換えＤＮＡ技術によって生成することができる。特定の実施形態では、細胞は多細胞生物由来であり、特定の実施形態では、細胞は脊椎動物または無脊椎動物起源である。特定の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、細胞はヒト細胞である。一般に、宿主細胞における、本発明の融合前クラスＩタンパク質などの組換えタンパク質の生成は、発現可能形式でそのクラスＩタンパク質をコードする異種核酸分子の宿主細胞への導入、核酸分子の発現に資する条件下での細胞の培養、および前記細胞におけるポリペプチド発現を可能にすることを含む。発現可能形式でタンパク質をコードする核酸分子は、発現カセットの形態であってもよく、通常、エンハンサー、プロモーター、ポリアデニル化シグナルなど、核酸の発現をもたらすことができる配列を必要とする。当業者は、宿主細胞内での遺伝子の発現を得るのに様々なプロモーターが使用可能であることを認識している。プロモーターは構成的であっても調節的であってもよく、ウイルス、原核生物、もしくは真核生物の供給源を含む種々の供給源から入手すること、または人為的に設計することが可能である。
【００９６】
細胞培養培地は種々のベンダーから入手可能であり、好適な培地は、宿主細胞が、目的のタンパク質、ここでは融合前クラスＩタンパク質を発現するように慣例的に選択することができる。好適な培地は血清を含有しても含有しなくてもよい。
【００９７】
「異種核酸分子」（本明細書では「導入遺伝子」とも呼ぶ）は、宿主細胞に天然には存在しない核酸分子である。それは、例えば、標準の分子生物学技術によりベクターに導入される。導入遺伝子は、一般に、発現制御配列と作動可能に連結される。これは、例えば、導入遺伝子をコードする核酸をプロモーターの制御下に置くことで実施され得る。さらなる調節配列を加えることもできる。導入遺伝子の発現のために多くのプロモーターが使用可能であり、それらは当業者に公知であり、例えば、それらは、ウイルス、哺乳動物、合成のプロモーターなどを含んでもよい。真核細胞内での発現を得るのに適したプロモーターの非限定的な例として、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号明細書）、例えばＣＭＶ最初期プロモーター、例えばＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサー／プロモーターからのｎｔ．−７３５〜＋９５を含むものが挙げられる。ポリアデニル化シグナル、例えばウシ成長ホルモンのポリＡシグナル（米国特許第５，１２２，４５８号明細書）を導入遺伝子の後に存在させることができる。あるいは、いくつかの広く使用されている発現ベクターが当該技術分野で商用供給源から入手可能であり、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡおよびｐＥＦベクター系列、ＢＤ  ＳｃｉｅｎｃｅｓのｐＭＳＣＶおよびｐＴＫ−Ｈｙｇ、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔなどがあり、これらは、目的のタンパク質を組換えにより発現させるために、または好適なプロモーターおよび／もしくは転写ターミネーター配列、ポリＡ配列などを得るために使用することができる。
【００９８】
細胞培養は、付着細胞培養、例えば培養容器の表面またはマイクロキャリアに付着した細胞、および懸濁培養を含む、いずれのタイプの細胞培養でもよい。大抵の大規模懸濁培養は、操作およびスケールアップが最も簡単であるため、バッチ工程または流加工程として操作される。最近では、灌流原理に基づく連続工程がより一般的になりつつあり、また好適でもある。好適な培地も当業者に周知であり、一般に、商用供給源から大量に得ること、または標準プロトコルに従って注文生産することが可能である。培養は、例えば、バッチ、流加、連続系などを使用して、シャーレ、ローラーボトルまたはバイオリアクター内で行うことができる。細胞を培養するための好適な条件は既知である（例えばＴｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３）、およびＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．，２０００，ＩＳＢＮ  ０−４７１−３４８８９−９）を参照）。
【００９９】
本発明は、上記のような融合前クラスＩタンパク質および／または核酸分子、および／またはベクターを含む組成物をさらに提供する。したがって、本発明は、クラスＩタンパク質の融合前コンフォメーションには存在するが、融合後コンフォメーションには存在しないエピトープを提示する融合前クラスＩタンパク質を含む組成物を提供する。本発明はまた、このような融合前クラスＩタンパク質をコードする核酸分子および／またはベクターを含む組成物も提供する。本発明は、上記のような融合前クラスＩタンパク質および／または核酸分子、および／またはベクターを含む免疫原性組成物をさらに提供する。本発明はまた、前記クラスＩタンパク質に対する免疫応答を対象に誘導するための、本発明による安定化した融合前クラスＩタンパク質、核酸分子、および／またはベクターの使用も提供する。さらに、クラスＩ融合タンパク質に対する免疫応答を対象に誘導するための方法であって、本発明による融合前クラスＩ融合タンパク質および／または核酸分子、および／またはベクターを対象に投与するステップを含む方法を提供する。さらに、前記クラスＩ融合タンパク質に対する免疫応答を対象に誘導する際に使用するための、本発明による融合前クラスＩ融合タンパク質、核酸分子および／またはベクターも提供する。さらに、前記クラスＩ融合タンパク質に対する免疫応答を対象に誘導する際に使用する薬剤を製造するための、本発明による融合前クラスＩ融合タンパク質および／または核酸分子、および／またはベクターの使用を提供する。特定の実施形態では、本発明による融合前クラスＩタンパク質はワクチンとして使用するためのものである。
【０１００】
本発明による融合前クラスＩ融合タンパク質、核酸分子および／またはベクターは、例えば、前記クラスＩ融合タンパク質を含むウイルスを原因とする疾患または病態のスタンドアロンの処置および／または予防に、あるいは（既存または将来の）ワクチン、抗ウイルス剤および／またはモノクローナル抗体など、他の予防処置および／または治療処置と組み合わせて、使用することができる。
【０１０１】
本発明は、本発明による融合前クラスＩ融合タンパク質、核酸分子および／またはベクターを利用して、対象のウイルス感染を防止および／または処置する方法をさらに提供する。特定の実施形態では、対象のウイルス感染を防止および／または処置する方法は、それを必要とする対象に、上記の融合前クラスＩ融合タンパク質、核酸分子および／またはベクターの有効量を投与するステップを含む。治療有効量とは、前記クラスＩ融合タンパク質を含むウイルスによる感染に起因する疾患または病態を防止する、寛解させる、および／または処置するのに有効なクラスＩ融合タンパク質、核酸分子またはベクターの量を指す。防止は、ウイルスの伝播の阻害もしくは低減、または前記ウイルスによる感染に関連した症状の１つもしくは複数の発症、進展もしくは進行を阻害もしくは低減することを包含する。本明細書で使用される寛解とは、目に見えるもしくは認知できる疾患の症状、ウイルス血症、またはウイルス感染の他の任意の測定可能な徴候の低減を指すことができる。
【０１０２】
ヒトなどの対象に投与するために、本発明は、本明細書に記載の融合前クラスＩ融合タンパク質、核酸分子、および／またはベクターと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物を使用することができる。この場合、「薬学的に許容される」という用語は、担体または賦形剤が、使用する投与量および濃度で、それらを投与する対象に望ましくない影響も悪影響も何ら引き起こさないことを意味する。このような薬学的に許容される担体および賦形剤は、当該技術分野で周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ［２０００］を参照）。融合前クラスＩポリペプチドまたは核酸分子は、凍結乾燥製剤を利用することも可能であり得るが、滅菌溶液として製剤化し、投与することが好ましい。滅菌溶液は、滅菌濾過または当該技術分野でそれ自体知られている他の方法によって調製される。その後、溶液は凍結乾燥されるか、または医薬投与容器に充填される。溶液のｐＨは一般に、ｐＨ３．０〜９．５、例えばｐＨ５．０〜７．５の範囲である。
【０１０３】
特定の実施形態では、本発明による組成物は、１種または複数種のアジュバントをさらに含む。適用される抗原決定基に対する免疫応答をさらに高めるアジュバントが当該技術分野で公知である。「アジュバント」および「免疫刺激剤」という用語は、本明細書では同義的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１種または複数種の物質と定義される。これに関連して、アジュバントは、本発明のクラスＩ融合タンパク質に対する免疫応答を増強するために使用される。好適なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；油−エマルジョン組成物（または水中油型組成物）、例えば、ＭＦ５９などのスクアレン−水エマルジョン（例えば、国際公開第９０／１４８３７号パンフレットを参照）；サポニン製剤、例えばＱＳ２１および免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）など（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号明細書；国際公開第９０／０３１８４号パンフレット、国際公開第９６／１１７１１号パンフレット、国際公開第２００４／００４７６２号パンフレット、国際公開第２００５／００２６２０号パンフレットを参照）；細菌または微生物の派生物（これらの例には、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧ−モチーフ含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰ−リボシル化細菌毒素またはその変異体、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴなどがある）；真核生物のタンパク質（例えば、抗体もしくはそのフラグメント（例えば、抗原自体またはＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ８０に向けられたもの）および受容体へのリガンド（例えば、ＣＤ４０Ｌ、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦなど）（これらは受容細胞と相互作用すると、免疫応答を刺激する））が挙げられる。特定の実施形態では、本発明の組成物は、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カリウムアルミニウム、またはそれらの組み合わせの形態のアルミニウムを、１用量当たり０．０５〜５ｍｇ、例えば０．０７５〜１．０ｍｇの濃度のアルミニウム含有量で、アジュバントとして含む。
【０１０４】
他の実施形態では、組成物はアジュバントを含まない。
【０１０５】
以下の実施例で本発明をさらに説明する。
【実施例】
【０１０６】
実施例１
ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の不安定な融合前コンフォメーションを安定化するために、ヒンジループ中の５５５位、５５６位および５５８位（ＨＸＢ２の番号付けによる）のアミノ酸残基をプロリン残基に置換した。エンベロープの全ｇｐ１４０発現、三量体の性質（三量体のパーセンテージ）および三量体の全収量を、既知の安定化Ｉ５５９Ｐ置換を有する変異体（Ｓａｎｄｅｒｓ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２００２，ｓｕｐｒａ）およびヒンジループ中にプロリン置換のないエンベロープタンパク質と比較した。三量体のパーセンテージ、収量および安定性を、ＥＬＩＳＡ、ＡｌｐｈａＬＩＳＡおよび／またはＳＥＣ−ＭＡＬＳを使用して測定した。野生型ヒンジループ、単Ｐｒｏ置換、二重Ｐｒｏ置換および三重Ｐｒｏ置換の一部を表３に示す。
【０１０７】
ＨＩＶ−１  ＥｎｖコンセンサスＣ配列の生成
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ配列はクレードＣに基づくコンセンサス配列に基づくものとした。したがって、アラインメントをＬｏｓ  Ａｌａｍｏｓデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｉｎｄｅｘ）からダウンロードした（ＨＩＶ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ。全部で３，４３４配列）。Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  ＨＩＶデータベースウェブサイトのコンセンサスメーカーの中で、Ｃ−クレードＥＮＶ（１，２５２配列）のみを使用した。
【０１０８】
安定化ＳＯＳ修飾（５０１Ｃ−６０５Ｃ）を有するコンセンサスＣに基づいた組換えタンパク質は、下記のように、Ｅｘｐｉ２９３細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に発現させた。ＥＬＩＳＡに使用したＥｎｖタンパク質は、Ｃ末端Ｃタグおよび追加のＩ２０１Ｃ−Ａ４３３Ｃ変異を含有していた（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，（２０１５），２２（７）：５２２−５３１）。ＡｌｐｈａＬＩＳＡおよびＳＥＣ−ＭＡＬＳに使用したＥｎｖタンパク質は、Ｃ末端のＳｏｒｔＡ−Ｆｌａｇ−３５ＧＳ−Ｈｉｓタグを含有していた。製造元の説明書に従い、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、細胞に一過性トランスフェクトし、振盪培養器中で３７℃および８％ＣＯ２にて培養した。ＨＩＶエンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）を含有する培養上清を、トランスフェクト後３日目（ＡｌｐｈａＬＩＳＡ用）または５日目（ＥＬＩＳＡおよびＳＥＣ−ＭＡＬＳ用）に回収し、滅菌濾過した。ＣタグのあるＥｎｖを、Ｃタグ親和性クロマトグラフィーを使用して精製し、ＳｏｒｔＡ−Ｆｌａｇ−３５ＧＳ−ＨｉｓタグのあるＥｎｖを、ガランサス・ニバルス（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｕｓ）レクチンクロマトグラフィーを使用して精製し、次いでＳＥＣ−ＭＡＬＳを行った。ガラントゥス・ニバリス（Ｇａｌａｎｔｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ）−レクチンカラム（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ、ＡＬ−１２４３、ロットＺ０３２５）を初回の精製に適用し、その後ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅカラム（ＧＥ）を残留汚染物質の除去のための仕上げ工程に適用する２段階精製プロトコルによって、組換えＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質を精製した。初回のレクチン工程では、培養上清を、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５で希釈し、４ｍｌ  ＣＶのＴｒｉｃｏｒｎ１０−５０レクチンアガロースカラムに分速４ｍｌで通過させた。その後、カラムを４カラム体積（ＣＶ）の４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５で洗浄し、４ＣＶの４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１Ｍ  マンノピロノシド（Ｍａｎｎｏｐｙｒｏｎｏｓｉｄｅ）ｐＨ７．５を１．６ｍＬ／分の上向流で溶離した。溶離液を、スピン濃縮器（ｓｐｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）（５０Ｋ，Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮し、タンパク質を、ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを使用し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４をランニングバッファーとして使用して、さらに精製した。２番目のピークはＨＩＶ  ｇｐの１４０三量体を含有していた。このピークを含有する画分を再びプールし、ＯＤ２８０を使用してタンパク質濃度を測定し、使用するまで４℃で保存した。バンドの同定は、ウエスタンブロッティング（示さず）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析およびウエスタンブロットを使用して検証した。細胞培養上清または精製したタンパク質サンプルを、４〜１２％（ｗ／ｖ）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥゲル、１Ｘ  ＭＯＰＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、還元条件下または非還元条件下にて解析し、ｉＢｌｏｔ技術（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ���を使用してブロットした。すべての手順を、製造元の説明書に従って行った。純度解析のために、ゲルをＫｒｙｐｔｏｎ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｉタンパク質染料（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で染色した。ブロットを抗Ｈｉｓ−ＨＲＰでプローブした。ゲルおよびブロット膜をＯｄｙｓｓｅｙ装置（Ｌｉ−Ｃｏｒ）でスキャンし、画像はＯｄｙｓｓｅｙ３．０ソフトウェア（Ｌｉ−Ｃｏｒ）を使用して解析した。
【０１０９】
ＥＬＩＳＡに投入するための全Ｅｎｖ発現レベルをＣタグ精製クロマトグラムの曲線下面積の計算によって求めた。ＣタグのあるＥｎｖを、Ｈｉｓタグのある抗ＣタグＶＨＨを使用して捕捉した。精製したタンパク質の正確な三量体のコンフォメーションを、ＥＬＩＳＡにおけるＰＧＴ１４５抗体への結合によって確認した。１００％三量体のＥｎｖを対照として使用して三量体のパーセンテージを計算した（図３Ａ）。三量体の収量は、三量体のパーセンテージを全Ｅｎｖ発現レベルに乗じて計算し、１と設定したＩ５５９Ｐを基準として正規化した（図３Ｂ）。置換したものはすべて、ヒンジループ中にプロリン置換のないタンパク質と比較して、三量体のパーセンテージおよび収量が高い。二重置換はすべて、Ｉ５５９Ｐ変異体と比較して、三量体のパーセンテージおよび特に三量体の収量が高い。これらの発見に基づいて、三重変異体Ｌ５５６Ｐ、Ａ５５８Ｐ、Ｉ５５９Ｐを構築し、Ｉ５５９Ｐならびに二重変異体Ｌ５５６Ｐ、Ｉ５５９ＰおよびＡ５５８Ｐ、Ｉ５５９Ｐと比較した。これらの変異体は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡを使用して無細胞の上清中で解析した。
【０１１０】
ＡｌｐｈａＬＩＳＡはビーズをベースにした近接アッセイであり、ドナービーズの高エネルギー放射によって生成した一重項酸素分子が、およそ２００ｎｍ以内の距離にあるアクセプタービーズに移動する。その後、次々と起こる一連の化学反応により、化学発光シグナルが生成する（Ｅｇｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｃｈｅｍ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（２００８），１：２−１０）。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アッセイでは、コンストラクトにＦｌａｇ−Ｈｉｓタグを（間に３５ＧＳリンカーを用いて）備えた。ＨＩＶコンストラクトをＥｘｐｉ２９３細胞中に発現させ、これを９６ウェルプレート（２００μｌ／ウェル）中で３日間培養した。未処理の上清を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡバッファー（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０＋０．５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）で１２０倍希釈した。その後、この希釈液１０μｌをハーフエリア９６ウェルプレートに移し、アクセプタービーズ４０μｌと混合し、ドナービーズおよびＰＧＴ１４５と混合した。ＰＧＴ１４５の配列はＰＤＢファイル３Ｕ１Ｓに由来し、Ｅｎｖ（フューリン無添加）のように発現させ、ＭＡｂ  ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。ビーズを十分に混合してから使用した。室温で、振盪せずに２時間インキュベートした後、シグナルをＮｅｏ（ＢｉｏＴｅｋ）で測定した。ドナービーズを、ｍＡｂに結合することができるＰｒｏｔＡ（Ｃａｔ＃：ＡＳ１０２Ｍ、Ｌｏｔ＃１８３１８２９、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）にコンジュゲートした。アクセプタービーズを抗Ｈｉｓ抗体（Ｃａｔ＃：ＡＬ１１２Ｒ、Ｌｏｔ＃２０３６８６０、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）にコンジュゲートして、タンパク質のＨｉｓタグを検出した。タンパク質収量の定量化には、ニッケルをコンジュゲートしたドナービーズ（Ｃａｔ＃：ＡＳ１０１Ｍ、Ｌｏｔ＃：２０２７４９８、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）と抗Ｆｌａｇ抗体を有するアクセプタービーズ（Ｃａｔ＃：ＡＬ１１２Ｒ、Ｌｏｔ＃：２０３６８６０、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）とを一緒にした組合せを使用した。平均偽シグナルを、様々なＥｎｖタンパク質について測定したＡｌｐｈａＬＩＳＡカウントから減算した。参照としてＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ骨格を使用し、全データセットをＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰシグナルで割って、シグナルを、当該骨格を基準として正規化した。これらの正規化したシグナルで、定量化のために得られた正規化したシグナルを割って、三量体のパーセンテージを得た。骨格三量体のパーセンテージを、ＳＥＣ−ＭＡＬＳの結果に従って３０％に設定した。
【０１１１】
正確な三量体のコンフォメーションを、ＰＧＴ１４５抗体結合に結合させることによって確認し、発現レベルを、ＳｏｒｔＡ−Ｆｌａｇ−３５ＧＳ−Ｈｉｓタグを検出することによって定量化した。三量体のパーセンテージは、ＰＧＴ１４５シグナルを定量化シグナルで割って計算した（図３Ａ）。三量体の収量は、ＰＧＴ１４５シグナルを、１と設定したＩ５５９Ｐのシグナルを基準として正規化することによって、ＡｌｐｈａＬＩＳＡから導いた（図３Ｂ）。三重変異体は、他のすべての変異体と比較して、三量体のパーセンテージおよび収量が最も高い。ガランサス・ニバルス（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｕｓ）レクチン精製したＩ５５９ＰおよびＬ５５６Ｐ、Ｉ５５９Ｐの、三量体のパーセンテージおよび収量を、高速液体クロマトグラフィーシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＯｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒＥＸ  Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｗｙａｔｔ）に連結したｍｉｎｉＤＡＷＮ  ＴＲＥＯＳ（Ｗｙａｔｔ）装置を使用する、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）および多角度光散乱（ＭＡＬＳ）解析を使用して確認した。全部で４０μｇのタンパク質を、ランニングバッファー（１５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中で１ｍＬ／分にて平衡化したＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に加えた。データをＡｓｔｒａ６ソフトウェアパッケージで解析し、分子量計算は屈折率シグナルから導いた。ＳＥＣ−ＭＡＬＳクロマトグラムによる三量体含有量は、曲線下面積を計算することによって求め、ＥＬＩＳＡおよびＡｌｐｈａＬＩＳＡと同程度の結果が得られた（図４Ａ）。三量体の安定性は、６０℃で１時間インキュベートした未処理の上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡ中のＰＧＴ１４５結合を使用して判定した。熱安定性アッセイについては、２０μｌの未処理の上清を、ＰＣＲブロック中で６０℃にて１時間加熱した。プレートを最高速度で５分遠心分離して、凝集体を除去した。未処理の上清および熱処理した上清を４０倍希釈した。次いで、定量化のために三量体の特異的抗体としてＰＧＴ１４５、およびニッケル／Ｆｌａｇを使用して、上記のようにＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイを行った。
【０１１２】
インキュベーション後の三量体の全個体数のパーセンテージは、インキュベーション前のＰＧＴ１４５シグナルおよびインキュベーション後のシグナルを分割して計算した。二重変異体および三重変異体はすべて、三量体の安定性がＩ５５９Ｐ変異体より高い（図４Ｂ）。これらの結果から、レトロウイルスのＨＩＶ−１のクラスＩ融合タンパク質についてヒンジ安定性が成功していることがわかる。
【０１１３】
実施例２
フィロウイルス融合タンパク質ＧＰの融合前コンフォメーションを安定化するために、ヒンジループ中の５７５位、５７６位、５７７位、５７９位、５８１位および５８３位の残基をプロリンに置換し、エボラＧＰの発現レベル、多量体の性質および安定性を、それぞれＮａｔｉｖｅＰＡＧＥおよび示差走査蛍光光度法（ＤＳＦ）を使用して入手した。図５は、５７５位、５７６位、５７７位、５７９位、５８１位および５８３位でプロリン置換したエボラＧＰ変異体由来の上清のＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ解析を示す。図５Ａに示すように、５７７位および５７９位で置換した変異体のみが、野生型配列と比較して発現が多く、三量体含有量が多かった。野生型、Ｔ５７７Ｐ変異体およびＬ５７９Ｐ変異体の、三量体および単量体のバンドを判定し（図５Ｂ）、それらの相対的パーセンテージを計算した（図５Ｃ）。ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲルシステム（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、一過性トランスフェクトした細胞由来の上清を解析した。その後、ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅで染色した。Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥゲルを、Ｂｉｏｒａｄ  ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰを使用してスキャンした。定量化は、Ｂｉｏｒａｄｓ  Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェアを使用し、「レーンおよびバンド」解析ツールを使用して行った。したがって、タンパク質レーンが強調され、目的のタンパク質バンドが選択される。強調されたバンドの強度をソフトウェアが計算し、それらの相対量が計算された。
【０１１４】
次に、ＨＩＳタグ精製したＧＰ変異体を、温度安定性についてＤＳＦで試験した。タンパク質を、９６ウェルオプティカルｑＰＣＲプレート中でＳＹＰＲＯ  ｏｒａｎｇｅ蛍光染料（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｓ６６５０）と混合した。最適な染料およびタンパク質の濃度を実験によって決定した。タンパク質の希釈はすべてＰＢＳで行い、減算参照用として染料のみを含有する陰性対照サンプルを使用した。測定はｑＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＶｉｉＡ  ７）により、次のパラメータ、すなわち毎秒０．０１５℃の速度での２５℃から８５℃までの温度勾配を使用して行った。データは連続的に取得した。Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅシグナルの最初の陰性派生物が、８５度までの温度勾配中に幾度か間隔をおいて測定された。ＶｉｉＡ７アウトプット（Ｓｙｐｒｏアッセイ用に使用した機械）の構文解析をし、サンプル情報を融解曲線データとマージするＲスクリプトを使用して、Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅアッセイの生データを解析した。Ｓｐｏｔｆｉｒｅソフトウェアを使用して、データから対照を減じた（Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅを有するバッファー）。次いで、それにより融解曲線の最大値と最小値を決定し、曲線を０〜１００の値に正規化する。二重反復試験から二重反復を平均化し、Ｔｍを最大値の半分に決定する。融解温度（シグナルが最大値の５０％に到達する点）は、Ｓｐｏｔｆｉｒｅを使用してデータあてはめをしてから、野生型タンパク質（６１．５℃）およびＴ５７７Ｐ変異体（６４℃）について決定することが可能である。あてはめをしたデータを図６に示す。Ｔ５７７Ｐ置換を有する変異体は野生型タンパク質より高い温度安定性を示した。
【０１１５】
Ｔ５７７Ｐの安定化効果の普遍性を試験するために、５７７Ｐ置換を、エボラＭａｙｉｎｇａ株（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿０６６２４６．１）、エボラＳｕｄａｎ  Ｇｕｌｕ株（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＹＰ＿１３８５２３．１）のＧＰ中でも評価した。図７に示すように、プロリン置換により、フィロウイルスＧＰの発現レベルおよび三量体含有量が増加した。これらの結果は、ヒンジ安定性が、エボラウイルスのクラスＩ融合タンパク質についても成功していることを示す。
【０１１６】
実施例３
インフルエンザの融合ドメインは、シアル酸（ヘマグルチニンの官能基）への結合を担う頭部ドメイン（ほとんどがＨＡ１）および融合ドメインを含有するステムドメイン（ほとんどがＨＡ２）を有するヘマグルチニンタンパク質中に隔離されている。インフルエンザヘマグルチニン融合ドメインの安定性を試験するために、半安定なステム領域に相当し、ＨＡ２外部ドメインおよびＨＡ１のフラグメントを含有する、いわゆるミニＨＡ（＃４６５０）（Ｉｍｐａｇｌｉａｚｚｏ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４  Ａｕｇｕｓｔ，２０１５）中に点変異を作製した。インフルエンザミニヘマグルチニン４６５０の半安定な融合前コンフォメーションを安定化するために、ＨＡ２  Ｓｅｒ７３をＬｅｕまたはＰｒｏに置換して７１位のグリカンを除去し、ヒンジループ（Ｂループ）中の、疎水性を強固にするプロリン残基対疎水性ロイシン残基の効果を試験した。ミニヘマグルチニンは頭部ドメインを含有しておらず、リシンは本来Ｂループと頭部ドメインとの間の保存塩橋に含まれるため、Ｌｙｓ６８をＧｌｎ６８に置換した変異体を作製した。頭部が除去されているため、塩橋はなく、リシンを中性のグルタミンに変更し得る。組換えタンパク質を２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞中に発現させた（下記のとおり）。ミニヘマグルチニン変異体の安定性を、タンパク質の多量体含有量が測定されるＥＬＩＳＡによって入手した。トランスフェクトした細胞の上清を、多量体ＥＬＩＳＡ中で試験した。プレートをステム特異的広域中和ＭＡｂ  ＣＲ９１１４でコーティングした（Ｄｒｅｙｆｕｓ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２０１２），３３７（６１００）：１３４３−８）。上清を滴定し、コーティングしたプレートでインキュベートした。洗浄後、捕捉した多量体をビオチン化ＣＲ９１１４と共にインキュベートした。次にウェルを、ＨＲＰをコンジュゲートしたストレプトアビジンと共にインキュベートし、次いでＨＲＰ基質を添加した（Ｉｍｐａｇｌｉａｚｚｏ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１５）。図８は、ヒンジループ（Ｂループ）中にＰ７３を有する変異体の方がＬ７３を有する変異体より多量体発現が多かったことを示す。加えて、ミニ−ＨＡ＃４６５０の６３位のＴｙｒからＰｒｏへの置換も、多量体発現がほぼ２倍であった（図８Ｃ）。これらの結果は、ヒンジ安定性が、オルトミクソウイルスインフルエンザＨＡのクラスＩ融合タンパク質についても成功していることを示す。
【０１１７】
実施例４
タンパク質コンストラクトの発現
ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ  ０８８５４）またはＧｅｎｅ  Ａｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）でコンストラクトを合成し、コドン最適化した。コンストラクトは、ｐＣＤＮＡ２００４にクローンしたか、または部位特異的変異生成およびＰＣＲを含む標準方法で生成し、配列決定した。製造元の説明書に従って、ＨＥＫ−Ｅｘｐｉ２９３細胞またはＨＥＫ２９３Ｆ細胞に、タンパク質をインサートしたｐＣＤＮＡ２００４プラスミド（およびＨＩＶ  Ｅｎｖの場合、９０％ｅｎｖおよび１０％フューリン−ｐＣＤＮＡ２００４）で一過性トランスフェクトし、３７℃および１０％ＣＯ２で５日間培養した。培養上清を回収し、３００ｇで５分間遠心して、細胞および細胞片を除去した。次いで、０．２２μｍの真空フィルターを使用して、遠心上清を滅菌濾過し、使用するまで４℃で保存した。
【０１１８】
【表１】
2018529331.tif 000012
【０１１９】
【表２】
2018529331.tif 000013
【０１２０】
【表３】
2018529331.tif 000014
【０１２１】
配列
シグナルペプチドを有するＨＩＶ−１  ＨＸＢ２  ｇｐ１６０（配列番号９）。
【化１１】
2018529331.tif 000015
【０１２２】
ＨＩＶ−２エンベロープタンパク質（配列番号３５）。
【化１２】
2018529331.tif 000016
【０１２３】
エボラＧＰ（配列番号１３）（ＭＡＹＩＮＧＡ−７６株）
【化１３】
2018529331.tif 000017
【０１２４】
マールブルグＧＰ（配列番号１７）
【化１４】
2018529331.tif 000018
【０１２５】
ヘマグルチニンインフルエンザＡウイルス（グループ１）（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）（配列番号２１）。
【化１５】
2018529331.tif 000019
【０１２６】
ヘマグルチニンインフルエンザＡウイルス（グループ２）Ｋ７Ｎ５Ｌ２＿９ＩＮＦＡ（配列番号２５）。
【化１６】
2018529331.tif 000020
【０１２７】
ヘマグルチニンインフルエンザＢウイルス（Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／１９９８）（配列番号２９）
【化１７】
2018529331.tif 000021
【図１】
2018529331.tif 000025
【図２】
2018529331.tif 000026
【図３】
2018529331.tif 000027
【図４】
2018529331.tif 000028
【図５】
2018529331.tif 000029
【図６】
2018529331.tif 000030
【図７】
2018529331.tif 000031
【図８】
2018529331.tif 000032
【配列表】
2018529331000001.xml
【国際調査報告】
2018529331.tif 000036
2018529331.tif 000037
2018529331.tif 000038
2018529331.tif 000039
2018529331.tif 000040
2018529331.tif 000041
2018529331.tif 000042