(57)【要約】本発明は、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法であって、（ａ）ｒＡＡＶ粒子を産生する細胞から事前に取得された出発材料の深層ろ過を行う工程であって、前記出発材料が、細胞溶解物および培養上清を含む群において選択される、それによりｒＡＡＶ含有清澄化組成物が提供される工程と、（ｂ）ｒＡＡＶ含有清澄化組成物をアフィニティー精製のステップに供する工程であって、それにより第１のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、（ｃ）第１のｒＡＡＶ濃縮組成物を少なくとも１回、（ｃ１）塩勾配（好ましくは直線的な塩勾配）を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における陰イオン交換クロマトグラフィーのステップであって、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供されるステップ；または（ｃ２）密度勾配遠心分離のステップであって、ｒＡＡＶ含有画分が回収される、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供されるステップ；に供する工程と、（ｄ）第２のｒＡＡＶ濃縮組成物をタンジェンシャルフローろ過のステップに供する工程であって、それにより、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）が提供される工程と、を含む方法を説明する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法であって、
（ａ）ｒＡＡＶ粒子を産生する細胞から事前に取得された出発材料の深層ろ過を行う工程であって、前記出発材料が、細胞溶解物および培養上清を含む群において選択される、それによりｒＡＡＶ含有清澄化組成物が提供される工程と、
（ｂ）前記ｒＡＡＶ含有清澄化組成物をイムノアフィニティー精製のステップに供する工程であって、それにより第１のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｃ）前記第１のｒＡＡＶ濃縮組成物を少なくとも１回、
（ｃ１）塩勾配（好ましくは直線的な塩勾配）を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における陰イオン交換クロマトグラフィーのステップであって、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供されるステップ；または
（ｃ２）密度勾配遠心分離のステップであって、ｒＡＡＶ含有画分が回収される、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供されるステップ；
に供する工程と、
（ｄ）前記第２のｒＡＡＶ濃縮組成物をタンジェンシャルフローろ過のステップに供する工程であって、それにより、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）が提供される工程と、
を含む方法。
【請求項２】
前記ｒＡＡＶ粒子に向けられた抗体またはその断片が固定されているクロマトグラフィー担体を用いて工程（ｂ）が実施される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体がモノクローナルである、先行する請求項に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体がラクダ科動物の抗体である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
ＡＶＢ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）担体を用いて工程（ｂ）が実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｃ１）における少なくとも１つのクロマトグラフィー担体が、モノリス型クロマトグラフィー担体である、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
２０ｋＤａ〜１５０ｋＤａの範囲の分子量カットオフ値を有するフィルター膜を用いて工程（ｄ）が実施される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびアカゲザル由来血清型（ＡＡＶｒｈ１０を含む）ならびにそれらの混合物を含む群において選択されるＡＡＶ血清型、特にＡＡＶ４、に属する、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ｒＡＡＶ粒子が、ヒトＰＤＥ６βをコードする発現カセットを含むＤＮＡを含むｒＡＡＶ５粒子からなる、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ｒＡＡＶ粒子が、ヒトＲＰＥ６５をコードする発現カセットを含むＤＮＡを含むｒＡＡＶ４粒子からなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記精製されたｒＡＡＶ粒子が、遺伝子治療のための使用に適している、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって得られるｒＡＡＶ粒子。
【請求項１３】
ヒトＰＤＥ６βをコードする発現カセットを含むＡＡＶプラスミド。
【請求項１４】
先行する請求項に記載のＡＡＶプラスミドでトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１５】
先行する請求項に記載の宿主細胞によって産生されるｒＡＡＶ粒子。
【請求項１６】
遺伝子治療に使用するための、先行する請求項に記載のｒＡＡＶ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）の精製の分野に関する。特に、本発明は、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法に関する。本発明はまた、前記方法を用いて得ることができる、精製されたｒＡＡＶ粒子およびその組成物にも関する。本発明はさらに、ＡＡＶプラスミド、および前記プラスミドでトランスフェクトされた宿主細胞、ならびに前記宿主細胞によって産生されるｒＡＡＶ粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子送達は、後天性疾患および遺伝性疾患の処置のための有望な方法である。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を利用した系を含め、遺伝子導入を目的とするウイルスを利用した系がいくつか説明されている。ＡＡＶは、ディペンドウイルス属に属するヘルパー依存型ＤＮＡパルボウイルスである。増殖性感染が起こるためには、ＡＡＶは、無関係のヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニア）との同時感染を必要とする。ヘルパーウイルスの非存在下では、ＡＡＶは、そのゲノムを宿主細胞の染色体に挿入することにより潜伏状態を確立する。その後のヘルパーウイルスの感染が、組み込まれたウイルスゲノムをレスキューし、その後、このウイルスゲノムは複製して感染性のウイルス子孫を産生できる。
【０００３】
ＡＡＶは、幅広い宿主域を有し、好適なヘルパーウイルスの存在下で任意の種の細胞において複製することができる。例えば、ヒトＡＡＶは、イヌアデノウイルスと同時感染したイヌ細胞において複製するであろう。ＡＡＶは、いかなるヒトまたは動物の疾患とも関連付けられておらず、組み込み時に宿主細胞の生物学的特性を変化させるとは思われない。ＡＡＶの総説については、例えば、Ｂｅｒｎｓ  ａｎｄ  Ｂｏｈｅｎｚｋｙ（１９８７）  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）  ３２：２４３−３０７を参照のこと。
【０００４】
Ｌｅ  ｍｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（「Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｓｉｏｎ  ｉｎ  ＲＰＥ６５−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｂｒｉａｒｄ  ｄｏｇｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ＡＡＶ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ４  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ」；Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；Ｖｏｌ．１４，  ２９２−３０３；２００７）は、ＲＰＥ６５を欠損したイヌにおいて視力を回復させるためのｒＡＡＶの使用を教示する。
【０００５】
Ｐｅｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．（「Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｄｅ６β−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｄｏｇ，  ａ  Ｌａｒｇｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｒｏｄ−ｃｏｎｅ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ」；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ；Ｖｏｌ．２０，  ｎｏ．１１，  ２０１９−２０３０；２０１２）は、ＰＤＥ６βを欠損したイヌにおいて視力を回復させるためのｒＡＡＶの使用を教示する。
【０００６】
これら全ての理由から、遺伝子治療のためのアデノ随伴ウイルスの使用が提唱されている。しかし、臨床用途に十分なだけの純度および／または感染力を有する調製物を必要とするため、未だに適用されていない。
【０００７】
従って、アデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を精製するための新規の方法が依然として必要とされている。特に、明確に定義されており、再現性があり、適正製造規範（ＧＭＰ）に従う管理された環境条件内にある、拡張可能な方法が依然として必要とされている。
【０００８】
特に、限られた数の工程を必要とする、アデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を精製するための方法が依然として必要とされている。
【０００９】
また、医薬としての使用および／または遺伝子治療に適しているアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を精製するための方法も依然として必要とされている。
【００１０】
従って、純度および感染力が高いｒＡＡＶ粒子およびその組成物を精製するための拡張可能な方法が依然として必要とされている。
【００１１】
アデノ随伴ウイルス粒子を精製するための方法は、先行技術において報告されている。しかし、それらの方法は、そのままで医薬としての使用および／または遺伝子治療に適しているｒＡＡＶ粒子の生産に関して必ずしも十分なものではない。
【００１２】
国際公開第２０１１／０９４１９８号は、イオン交換カラムクロマトグラフィーの工程とタンジェンシャルフローろ過の工程とを含む、ＡＡＶ粒子を精製するための方法を教示する。
【００１３】
国際公開第０３／０９７７９７号は、混入ＤＮＡのレベルが低下したウイルス粒子を精製するための方法を教示し、この方法は、細胞溶解、深層ろ過および／または遠心分離、超遠心分離、ヌクレアーゼ処理、陰イオン交換クロマトグラフィーならびにタンジェンシャルフローろ過の工程を含んでよい。
【００１４】
一方で、利用可能な技術の多くは、細胞抽出物の大規模な事前処理（密度勾配、クロマトグラフィー工程の前のヌクレアーゼと洗浄剤での処理を含む）を必要とするという欠点を有する。このような追加的処理は、プロセス全体を工業規模では不十分なものにする。
【００１５】
イムノアフィニティークロマトグラフィーは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の精製のための迅速な一段階の精製方法として報告されている。しかし、その利用は、クロマトグラフィー担体上への固定時の抗体またはその断片の非常に特異的な性質のせいで、依然として限られている。さらに、イムノアフィニティークロマトグラフィー担体は、一段階の精製方法に使用される場合、空の粒子の大部分が混入した精製ｒＡＡＶを生成する傾向があり、そのため、それを遺伝子治療における直接投与に使用することを妨げる。
【００１６】
イムノアフィニティークロマトグラフィーまたは抗体を利用したアフィニティークロマトグラフィーの代替手段として、ペプチドアフィニティー精製が報告されている。
【００１７】
Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．（「Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ＡＡＶ  ｃａｐｓｉｄ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」；Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．；１８（１０）：１０２０−１０２４；２０１１）は、Ｐｅｐ８に基づくペプチドを用いたペプチドアフィニティー精製の工程の後に陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、ＡＡＶ８カプシドを精製するための方法を報告する。しかし、この方法は、ＡＡＶ８カプシドに限定されるという欠点を有し、臨床グレードのｒＡＡＶ粒子調製物を生産するために多大な最適化を必要とする。
【００１８】
特に、ペプチドアフィニティー精製は、新規のペプチドリガンドを単離して特徴付けすること、および、これらのリガンドと適合するＧＭＰのクロマトグラフィーカラムを作製すること（時間がかかり、広範囲に及び、そのため、プロセス全体の拡張性のボトルネックとなる可能性があるステップ）を必要とする。
【００１９】
従って、適正製造規範の事項に関してスケールアップでき、依然として経済的観点から許容でき、医薬としての使用または遺伝子治療に好適である、新規の方法が依然として必要とされている。
【００２０】
また、複数の血清型に属するｒＡＡＶ粒子を含む出発材料からｒＡＡＶ粒子を精製するための方法も依然として必要とされている。
【００２１】
また、精製されたｒＡＡＶ粒子に混入する空の粒子が減少する、イムノアフィニティークロマトグラフィーでｒＡＡＶ粒子を精製するための方法も依然として必要とされている。
【００２２】
また、前記プロセスによってさらに精製でき、所与の宿主細胞におけるｒＡＡＶ粒子の産生に依然として好適である、それ自体としての、および／または医薬としての使用もしくは遺伝子治療のための、新規の精製されたｒＡＡＶ粒子およびその組成物も依然として必要とされている。
【発明の概要】
【００２３】
本発明は、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法であって、
（ａ）ｒＡＡＶ粒子を産生する細胞から事前に取得された出発材料の深層ろ過を行う工程であって、前記出発材料が、細胞溶解物および培養上清を含む群において選択される、それによりｒＡＡＶ含有清澄化組成物が提供される工程と、
（ｂ）ｒＡＡＶ含有清澄化組成物をアフィニティー精製のステップに供する工程であって、それにより第１のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｃ）第１のｒＡＡＶ濃縮組成物を少なくとも１回、
（ｃ１）塩勾配（好ましくは直線的な塩勾配）を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における陰イオン交換クロマトグラフィーのステップであって、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供されるステップ；または
（ｃ２）密度勾配遠心分離のステップであって、ｒＡＡＶ含有画分が回収される、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供されるステップ；
に供する工程と、
（ｄ）第２のｒＡＡＶ濃縮組成物をタンジェンシャルフローろ過のステップに供する工程であって、それにより、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）が提供される工程と、
を含む方法に関する。
【００２４】
特に、本発明は、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法であって、
（ａ）ｒＡＡＶ粒子を産生する細胞から事前に取得された出発材料の深層ろ過を行う工程であって、前記出発材料が、細胞溶解物および培養上清を含む群において選択される、それによりｒＡＡＶ含有清澄化組成物が提供される工程と、
（ｂ）ｒＡＡＶ含有清澄化組成物をイムノアフィニティー精製のステップに供する工程であって、それにより第１のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｃ）第１のｒＡＡＶ濃縮組成物を少なくとも１回、
（ｃ１）塩勾配（好ましくは直線的な塩勾配）を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における陰イオン交換クロマトグラフィーのステップであって、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供されるステップ；または
（ｃ２）密度勾配遠心分離のステップであって、ｒＡＡＶ含有画分が回収される、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供されるステップ；
に供する工程と、
（ｄ）第２のｒＡＡＶ濃縮組成物をタンジェンシャルフローろ過のステップに供する工程であって、それにより、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）が提供される工程と、
を含む方法に関する。
【００２５】
本発明はまた、上述される方法の実施によって得られる精製されたｒＡＡＶ粒子にも関する。本発明はさらに、上記で定義されるような精製されたｒＡＡＶ粒子を少なくとも１つ含む、精製されたｒＡＡＶ粒子の組成物に関する。
【００２６】
本発明はさらに、遺伝子治療に使用するための、および／または遺伝子治療に使用するための医薬の調製のための、前記精製されたｒＡＡＶ粒子およびその組成物に関する。
【００２７】
本発明はまた、ヒトＰＤＥ６βをコードする発現カセットを含むＡＡＶプラスミド、ならびに前記ＡＡＶプラスミドでトランスフェクトされた宿主細胞、さらには前記宿主細胞によって産生されるｒＡＡＶ粒子にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】ヒトＰＤＥ６βをコードするＡＡＶプラスミドの発現カセットの地図。ヒトＰＤＥ６βタンパク質をコードする核酸配列は、その５’末端でヒトロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーターに、その３’末端でウシ成長ホルモンポリアデニル化部位（ｂＧＨｐＡ）につながっており、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列に挟まれている。
【図１Ｂ】ヒトＲＰＥ６５をコードするＡＡＶプラスミドの発現カセットの地図。ヒトＲＰＥ６５タンパク質をコードする核酸配列は、その５’末端でヒトＲＰＥ６５プロモーターに、その３’末端でウシ成長ホルモンポリアデニル化部位（ｂＧＨｐＡ）につながっており、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列に挟まれている。
【図２】ヒトＰＤＥ６βをコードする発現カセットを含むＡＡＶプラスミド全体の地図。発現カセットは、図１で定義されるようなＩＴＲ配列によって区切られている。制限部位は、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩと定義されている。プラスミドは、追加的なカナマイシン（Ｋａｎ／ｎｅｏＲ）耐性マーカーおよびＣｏｌ１開始点を含む。配列の方向は、標準的な命名法に従って矢印で示されている。
【図３Ａ】完了したＡＶＢカラム工程のクロマトグラム。曲線は２８０ｎｍ（Ａの線）および２６０ｎｍ（Ｂの線）における吸光度（左側の軸（ｍＡＵ））を表す。線Ｃは伝導率（ｍＳ／ｃｍ）（右側の軸）を表す。線ＤはｐＨを表す。空の四角は、サンプルの注入および溶出の段階を示す。
【図３Ｂ】ＡＶＢカラム工程からの、溶出されたＡＡＶのピークの拡大表示。曲線は２８０ｎｍ（Ａの線）および２６０ｎｍ（Ｂの線）における吸光度（左側の軸（ｍＡＵ））を表す。線Ｃは伝導率（ｍＳ／ｃｍ）（右側の軸）を表す。線ＤはｐＨを表す。空の四角は、ＡＡＶ含有画分が溶出される箇所を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は前述の必要性に対処する。
【００３０】
本発明は、（１）種々のＡＡＶ血清型／カプシドバリアントの高純度精製に使用でき、そのままで臨床用途に好適である調製物を作製するのに適している、モジュール式プラットフォームプロセス；および（２）アフィニティークロマトグラフィー（イムノアフィニティークロマトグラフィーまたはペプチドアフィニティークロマトグラフィー）の後に少なくとも１回の密度勾配遠心分離工程または好ましくは直線的な塩勾配を用いて実施される少なくとも１回の陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、独特な順序のプロセスの工程；という、本発明を現在の「工業規格の」拡張可能なＡＡＶ粒子精製プロセスと区別する２つの独特な特徴を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子の精製方法を提供する。
【００３１】
驚くべきことに、これらの特徴は、細胞溶解物または培養上清などの出発材料の精製に関して、予想外の拡張性をもたらす。特に、このプロセスは、最適な感染性を有し遺伝子治療に適している精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子を調製するための最適化に適しているという利点を有する。
【００３２】
１つ以上の追加的工程（陰イオンクロマトグラフィー工程および／または密度勾配遠心分離を含む）の使用は、前記担体上の空の粒子と完全な粒子の最適な分離をもたらし、従って、改善された様式でｒＡＡＶ粒子を単離するのに適している。
【００３３】
有利なことに、この多段階の精製方法は、工業規模で、臨床グレードのｒＡＡＶ調製物を精製することを可能にする。
【００３４】
有利なことに、組成物は、直線的な塩勾配を用いて陰イオン交換クロマトグラフィー担体に通すことができる。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、直線的な塩勾配は、段階的な塩勾配と比較して、より効率的な溶出種の分離をもたらすとも発明者等は考えている。その差は、より小さな勾配の傾きにあり、これが、塩濃度の穏やかな増加の形成を可能にし、従って、クロマトグラフィー担体内でのｒＡＡＶ粒子の最適な分離を可能にする。
【００３５】
発明者等の知る限り、これは、アフィニティークロマトグラフィー工程（特にイムノアフィニティークロマトグラフィー工程）を含む多段階の精製法を伴う、臨床グレードのｒＡＡＶ粒子（特にＡＡＶ４血清型に属するｒＡＡＶ粒子）を精製するための、初めて説明される「工業規格の」方法である。
【００３６】
実際、以前に報告されたｒＡＡＶ粒子を精製するための方法は、一段階のアフィニティークロマトグラフィーまたはイムノアフィニティークロマトグラフィーの工程を伴い、および／または「工業規格の」方法ではなかった。
【００３７】
また、本発明の方法は、最終産物において完全な粒子の割合がより高いため、ｒＡＡＶの特定の血清型を精製するのに特に適している。
【００３８】
また、プロセス終了時の残留ＤＮＡは、洗浄剤とヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅを含む）での処理を行わなくても、臨床基準に合致する。
【００３９】
従って、本発明は、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法に関し、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびアカゲザル由来血清型（ＡＡＶｒｈ１０を含む）ならびにそれらの混合物を含む群またはそれらからなる群において選択されるＡＡＶ血清型（特にＡＡＶ４）に属するｒＡＡＶ粒子を精製するのに特に適している。
【００４０】
本発明は、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法であって、
（ａ）ｒＡＡＶ粒子を産生する細胞から事前に取得された出発材料の深層ろ過を行う工程であって、前記出発材料が、細胞溶解物および培養上清を含む群において選択される、それによりｒＡＡＶ含有清澄化組成物が提供される工程と、
（ｂ）ｒＡＡＶ含有清澄化組成物をアフィニティー精製のステップに供する工程であって、それにより第１のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｃ）第１のｒＡＡＶ濃縮組成物を少なくとも１回、
（ｃ１）塩勾配（好ましくは直線的な塩勾配）を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における陰イオン交換クロマトグラフィーのステップであって、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供されるステップ；または
（ｃ２）密度勾配遠心分離のステップであって、ｒＡＡＶ含有画分が回収される、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供されるステップ；
に供する工程と、
（ｄ）第２のｒＡＡＶ濃縮組成物をタンジェンシャルフローろ過のステップに供する工程であって、それにより、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）が提供される工程と、
を含む方法に関する。
【００４１】
アフィニティー精製のステップは、ペプチドアフィニティー精製のステップまたはイムノアフィニティー精製のステップからなってよい。
【００４２】
第１の実施形態によれば、本発明は、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法であって、
（ａ）ｒＡＡＶ粒子を産生する細胞から事前に取得された出発材料の深層ろ過を行う工程であって、前記出発材料が、細胞溶解物および培養上清を含む群において選択される、それによりｒＡＡＶ含有清澄化組成物が提供される工程と、
（ｂ）ｒＡＡＶ含有清澄化組成物をイムノアフィニティー精製のステップに供する工程であって、それにより第１のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｃ）第１のｒＡＡＶ濃縮組成物を少なくとも１回、
（ｃ１）塩勾配（好ましくは直線的な塩勾配）を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における陰イオン交換クロマトグラフィーのステップであって、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供されるステップ；または
（ｃ２）密度勾配遠心分離のステップであって、ｒＡＡＶ含有画分が回収される、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供されるステップ；
に供する工程と、
（ｄ）第２のｒＡＡＶ濃縮組成物をタンジェンシャルフローろ過のステップに供する工程であって、それにより、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）が提供される工程と、
を含む方法に関する。
【００４３】
出発材料は、ＡＡＶ４、ＡＡＶ２、ＡＡＶ１０および／またはＡＡＶ５の血清型に属するｒＡＡＶ粒子を含め、１つの血清型に属するｒＡＡＶ粒子または複数の血清型に属するｒＡＡＶ粒子のいずれかを含んでよい。
【００４４】
特に、出発材料は、ＡＡＶ４および／またはＡＡＶ５の血清型に属するｒＡＡＶ粒子を含め、１つの血清型に属するｒＡＡＶ粒子または複数の血清型に属するｒＡＡＶ粒子のいずれかを含んでよい。
【００４５】
好ましくは、本発明は、精製されたＡＡＶ４血清型に属する組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法であって、
（ａ）ＡＡＶ４血清型に属する前記ｒＡＡＶ４粒子を産生する細胞から事前に取得された出発材料の深層ろ過を行う工程であって、前記出発材料が、細胞溶解物および培養上清を含む群において選択される、それによりｒＡＡＶ含有清澄化組成物が提供される工程と、
（ｂ）ｒＡＡＶ４含有清澄化組成物をイムノアフィニティー精製のステップに供する工程であって、それにより第１のｒＡＡＶ４濃縮組成物が提供される工程と、
（ｃ）第１のｒＡＡＶ４濃縮組成物を少なくとも１回、
（ｃ１）塩勾配（好ましくは直線的な塩勾配）を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における陰イオン交換クロマトグラフィーのステップであって、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供されるステップ；または
（ｃ２）密度勾配遠心分離のステップであって、ｒＡＡＶ含有画分が回収される、それにより第２のｒＡＡＶ４濃縮組成物が提供されるステップ；
に供する工程と、
（ｄ）第２のｒＡＡＶ４濃縮組成物をタンジェンシャルフローろ過のステップに供する工程であって、それにより、精製されたＡＡＶ４血清型に属する組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）が提供される工程と、
を含む方法に関する。
【００４６】
本発明の精製されたｒＡＡＶ粒子は、所望の遺伝子産物をコードする異種核酸を含む。このような産物には、限定されるものではないが、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡ、リボザイム等が包含される。他の産物には、ホルモン、増殖受容体、リガンド、および遺伝子治療に有用なタンパク質、をコードする核酸が包含される。
【００４７】
第２の実施形態によれば、本発明は、上記で説明されるような方法の実施によって得られる精製されたｒＡＡＶ粒子、およびその組成物に関する。
【００４８】
第３の実施形態によれば、本発明は、遺伝子治療に使用するための、前記精製されたｒＡＡＶ粒子およびその組成物に関する。
【００４９】
第４の実施形態によれば、本発明は、ヒトＰＤＥ６βをコードする発現カセットを含むＡＡＶプラスミド、前記ＡＡＶプラスミドでトランスフェクトされた宿主細胞、および前記宿主細胞によって産生されるｒＡＡＶ粒子（それ自体、ならびに遺伝子治療に使用するためのもの）に関する。
【００５０】
本発明によれば、「工程を含む」などにおける「含む」なる表現は、「工程からなる」などにおける「からなる」とも理解される。
【００５１】
精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子を得るための方法
本発明は、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法であって、
（ａ）ｒＡＡＶ粒子を産生する細胞から事前に取得された出発材料の深層ろ過を行う工程であって、前記出発材料が、細胞溶解物および培養上清を含む群において選択される、それによりｒＡＡＶ含有清澄化組成物が提供される工程と、
（ｂ）ｒＡＡＶ含有清澄化組成物をアフィニティー精製のステップ（イムノアフィニティー精製のステップまたはペプチドアフィニティー精製のステップなど）に供する工程であって、それにより第１のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｃ）第１のｒＡＡＶ濃縮組成物を少なくとも１回、
（ｃ１）塩勾配（好ましくは直線的な塩勾配）を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における陰イオン交換クロマトグラフィーのステップであって、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供されるステップ；または
（ｃ２）密度勾配遠心分離のステップであって、ｒＡＡＶ含有画分が回収される、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供されるステップ；
に供する工程と、
（ｄ）第２のｒＡＡＶ濃縮組成物をタンジェンシャルフローろ過のステップに供する工程であって、それにより、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）が提供される工程と、
を含む方法に関する。
【００５２】
特に、アフィニティー精製のステップは、イムノアフィニティー精製のステップである。
【００５３】
より具体的には、本発明は、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法であって、
（ａ）ｒＡＡＶ粒子を産生する細胞から事前に取得された出発材料の深層ろ過を行う工程であって、前記出発材料が、細胞溶解物および培養上清を含む群において選択される、それによりｒＡＡＶ含有清澄化組成物が提供される工程と、
（ｂ）ｒＡＡＶ含有清澄化組成物をイムノアフィニティー精製のステップに供する工程であって、それにより第１のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｃ）第１のｒＡＡＶ濃縮組成物を少なくとも１回、
（ｃ１）塩勾配（好ましくは直線的な塩勾配）を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における陰イオン交換クロマトグラフィーのステップであって、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供されるステップ；または
（ｃ２）密度勾配遠心分離のステップであって、ｒＡＡＶ含有画分が回収される、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供されるステップ；
に供する工程と、
（ｄ）第２のｒＡＡＶ濃縮組成物をタンジェンシャルフローろ過のステップに供する工程であって、それにより、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）が提供される工程と、
を含む方法に関する。
【００５４】
一部の実施形態によれば、方法は、洗浄剤および／またはヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅを含む）での処理の工程を含む。
【００５５】
一部の実施形態によれば、方法は、洗浄剤および／またはヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅを含む）での処理の工程を含まない。
【００５６】
別の実施形態によれば、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびアカゲザル由来血清型（ＡＡＶｒｈ１０を含む）ならびにそれらの混合物を含む群において選択されるＡＡＶ血清型（特にＡＡＶ４）に属する。
【００５７】
代替的な一実施形態によれば、ｒＡＡＶ粒子は、ヒトＰＤＥ６βをコードする発現カセットを含むＤＮＡを含むｒＡＡＶ５粒子からなる。
【００５８】
前記実施形態によれば、前記発現カセットは配列番号１のものである。
【００５９】
一実施形態によれば、ｒＡＡＶ５粒子は、配列番号２を含むＤＮＡを含む。
【００６０】
別の代替的な実施形態によれば、ｒＡＡＶ粒子は、ヒトＲＰＥ６５をコードする発現カセットを含むＤＮＡを含むｒＡＡＶ４粒子からなる。
【００６１】
「組換えＡＡＶビリオン」、「ｒＡＡＶビリオン」、「ＡＡＶ粒子」、「完全なカプシド」および「完全な粒子」なる用語は、本明細書では、両側にＡＡＶのＩＴＲが隣接している目的の異種ヌクレオチド配列をカプシドで包んでいる、ＡＡＶのタンパク質の殻を含む感染性の複製欠損ウイルスと定義される。ｒＡＡＶビリオンは、その中にＡＡＶヘルパー機能およびアクセサリー機能が導入された、ＡＡＶプラスミドを指定する配列を有している好適な宿主細胞において産生される。このように、宿主細胞は、ＡＡＶプラスミド（目的の組換えヌクレオチド配列を含む）を後の遺伝子送達のための感染性組換えビリオン粒子にパッケージングするのに必要とされるＡＡＶのポリペプチドをコードすることができるようになっている。
【００６２】
「組換えウイルス」は、例えば粒子内への異種核酸コンストラクトの添加または挿入によって、遺伝学的に改変されているウイルスを意味する。
【００６３】
「ＡＡＶビリオン」は、野生型（ｗｔ）ＡＡＶウイルス粒子（ＡＡＶカプシドタンパク質外被と結合した直線状の一本鎖ＡＡＶ核酸ゲノムを含む）など、完全なウイルス粒子を意味する。この点に関して、相補的センス（例えば、「センス」鎖または「アンチセンス」鎖）のいずれかの一本鎖ＡＡＶ核酸分子が、任意の１つのＡＡＶビリオンにパッケージングされてよく、両方の鎖は、同等に感染性である。
【００６４】
「宿主細胞」なる用語は、例えば、ＡＡＶヘルパーコンストラクト、ＡＡＶプラスミド、アクセサリー機能プラスミドまたは他の導入ＤＮＡの一時的または永久的な安定産生細胞株レシピエントとして使用できるか使用されている微生物、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞を意味する。この用語には、トランスフェクトされた最初の細胞の子孫が包含される。従って、本明細書で使用される場合、「宿主細胞」は一般に、外因性のＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を指す。１つの親細胞の子孫は、天然の、偶然の、または意図的な変異に起因して、形態またはゲノムもしくは全ＤＮＡの相補物が必ずしも元の親と完全に同一であるわけではない可能性があるということが理解される。
【００６５】
「ｒＡＡＶ含有清澄化組成物」なる用語は、細胞溶解物または培養上清などの出発材料の深層ろ過の工程の後に得られる、ｒＡＡＶ粒子を含む任意の組成物を包含する。「ｒＡＡＶ含有清澄化組成物」は、「ｒＡＡＶ濃縮組成物」および／または精製されたｒＡＡＶ粒子とは異なる。
【００６６】
従って、「ｒＡＡＶ含有清澄化組成物」は、深層ろ過された出発材料（細胞溶解物または培養上清など）から直接得られる、濃縮および／または精製の工程にさらに供されていない、ｒＡＡＶ粒子を含む任意の組成物（イオン（例えば陽イオン）交換クロマトグラフィーの工程に供されていないものを含む）を包含してよい。
【００６７】
前記実施形態によれば、本発明は、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法であって、
（ａ）細胞溶解物および／または培養上清の深層ろ過を行う工程であって、それによりｒＡＡＶ含有清澄化組成物が提供される工程と、
（ｂ）ｒＡＡＶ含有清澄化組成物をアフィニティー精製のステップ（イムノアフィニティー精製のステップまたはペプチドアフィニティー精製のステップなど）に供する工程であって、それにより第１のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｃ）第１のｒＡＡＶ濃縮組成物を少なくとも１回、
（ｃ１）塩勾配（好ましくは直線的な塩勾配）を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における陰イオン交換クロマトグラフィーのステップであって、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供されるステップ；または
（ｃ２）密度勾配遠心分離のステップであって、ｒＡＡＶ含有画分が回収される、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供されるステップ；
に供する工程と、
（ｄ）第２のｒＡＡＶ濃縮組成物をタンジェンシャルフローろ過のステップに供する工程であって、それにより、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）が提供される工程と、
を含む方法に関する。
【００６８】
別の実施形態によれば、本発明は、本発明の精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法であって、アフィニティーのステップ（イムノアフィニティー精製のステップまたはペプチドアフィニティー精製のステップ）の第１段階に供されるｒＡＡＶ含有清澄化組成物が、工程（ａ）の終了時に直接得られる組成物である、方法に関する。従って、前記実施形態によれば、工程（ａ）と工程（ｂ）は、連続した工程である。
【００６９】
「連続した工程」は、クロマトグラフィー（特にイオン（陽イオン）交換クロマトグラフィー）のステップという中間工程は除外される、第１の工程の後に来る任意の工程を意味する。一方、別段の記載がない限り、「連続した工程」は、前記組成物の緩衝液の条件（すなわち、塩濃度、ｐＨ）を改変することを目的とした、緩衝液の交換および／または希釈の工程を除外しない。
【００７０】
一実施形態によれば、本発明の方法は、陽イオン交換クロマトグラフィーの工程を含まない。
【００７１】
一実施形態によれば、本発明の方法は、アパタイトクロマトグラフィーの工程を含まない。
【００７２】
好ましい一実施形態によれば、本発明は、本発明の精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法であって、アフィニティー精製（イムノアフィニティー精製またはペプチドアフィニティー精製）工程と陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、あるいはアフィニティー精製（イムノアフィニティー精製またはペプチドアフィニティー精製）と密度勾配遠心分離が、連続した工程である、方法に関する。従って、前記実施形態によれば、工程（ｂ）と工程（ｃ）は、連続した工程である。
【００７３】
別の実施形態によれば、工程（ｃ）と工程（ｄ）は連続している。
【００７４】
別の実施形態によれば、工程（ｂ）と工程（ｃ）と工程（ｄ）は連続している。
【００７５】
別の実施形態によれば、工程（ａ）と工程（ｂ）と工程（ｃ）は連続している。
【００７６】
別の実施形態によれば、工程（ａ）と工程（ｂ）と工程（ｃ）と工程（ｄ）は連続している。
【００７７】
従って、本発明はまた、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法であって、
（ａ）ｒＡＡＶ粒子を産生する細胞から事前に取得された出発材料の深層ろ過を行う工程であって、前記出発材料が、細胞溶解物および培養上清を含む群において選択される、それによりｒＡＡＶ含有清澄化組成物が提供される工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られたｒＡＡＶ含有清澄化組成物をアフィニティー精製のステップ（イムノアフィニティー精製のステップまたはペプチドアフィニティー精製のステップ）に供する工程であって、それにより第１のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた第１のｒＡＡＶ濃縮組成物を少なくとも１回、
（ｃ１）塩勾配（好ましくは直線的な塩勾配）を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における陰イオン交換クロマトグラフィーのステップであって、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供されるステップ；または
（ｃ２）密度勾配遠心分離のステップであって、ｒＡＡＶ含有画分が回収される、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供されるステップ；
に供する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた第２のｒＡＡＶ濃縮組成物をタンジェンシャルフローろ過のステップに供する工程であって、それにより、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）が提供される工程と、
を含む方法にも関する。
【００７８】
別の実施形態によれば、工程（ａ）と工程（ｂ）と工程（ｃ）と工程（ｄ）は連続しており、工程（ａ）における出発材料は、細胞溶解物または培養上清から直接得られる。
【００７９】
前記実施形態によれば、本発明は、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法であって、
（ａ）細胞溶解物および／または培養上清の深層ろ過を行う工程であって、それによりｒＡＡＶ含有清澄化組成物が提供される工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られたｒＡＡＶ含有清澄化組成物をアフィニティー精製のステップ（イムノアフィニティー精製のステップまたはペプチドアフィニティー精製のステップ）に供する工程であって、それにより第１のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた第１のｒＡＡＶ濃縮組成物を少なくとも１回、
（ｃ１）塩勾配（好ましくは直線的な塩勾配）を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における陰イオン交換クロマトグラフィーのステップであって、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供されるステップ；または
（ｃ２）密度勾配遠心分離のステップであって、ｒＡＡＶ含有画分が回収される、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供されるステップ；
に供する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた第２のｒＡＡＶ濃縮組成物をタンジェンシャルフローろ過のステップに供する工程であって、それにより、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）が提供される工程と、
を含む方法に関する。
【００８０】
上述の方法は全て、少なくとも、（１）１回の出発材料の深層ろ過の工程、（２）第１のアフィニティー（イムノアフィニティーまたはペプチドアフィニティー）クロマトグラフィーの工程、（３）第２の陰イオン交換クロマトグラフィーまたは密度勾配遠心分離の工程、および（４）タンジェンシャルフローろ過の工程を含む。個々の工程はそれぞれ、以下でさらに定義される。
【００８１】
追加的工程はそれぞれ、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子の拡張性および高純度に寄与するとも発明者等は考えている。
【００８２】
深層ろ過
深層ろ過の工程は、混入したＤＮＡおよびタンパク質の大部分を排除することを可能にする。この工程は、ｒＡＡＶ含有清澄化組成物から直接、イムノアフィニティークロマトグラフィーによってｒＡＡＶ粒子を精製することを可能にする。
【００８３】
一実施形態によれば、工程（ａ）で使用される出発材料は、ｒＡＡＶ粒子を産生する細胞の培養物を、少なくとも洗浄剤または界面活性剤（好ましくは洗浄剤）を含む組成物と接触させることによって得られる細胞溶解物である。
【００８４】
一実施形態によれば、工程（ａ）で使用される出発材料は、ｒＡＡＶ粒子を産生する細胞の培養物を、洗浄剤または界面活性剤を含んでも含まなくてもよい組成物と接触させることによって得られる細胞溶解物であるが、この細胞溶解物は、ＤＮＡｓｅなどのヌクレアーゼで処理されない。
【００８５】
細胞溶解のための好適な洗浄剤の例としては、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、ＮＰ−４０、Ｂｒｉｊ−３５、Ｂｒｉｊ−５８、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳおよびＣＨＡＰＳＯが挙げられる。
【００８６】
好ましい一実施形態によれば、工程（ａ）は、ホウケイ酸ガラスのマイクロファイバーの層とセルロースの混合エステルの層とを含むデプスフィルター膜を用いて行われる。
【００８７】
例示的な一実施形態によれば、工程（ａ）は、Ｐｏｌｙｓｅｐ（商標）  ＩＩ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））フィルターを用いて行われる。
【００８８】
アフィニティークロマトグラフィー
本明細書で使用される場合、「アフィニティークロマトグラフィー」または「アフィニティー精製」なる用語は、分子間の特異的な結合相互作用を利用する任意の方法を指し示す。特定のリガンドが固体担体に化学的に固定または「カップリング」され、その結果、複合混合物がカラムを通過する際に、このリガンドに対する特異的な結合親和性を有する分子が結合する。サンプルの他の構成成分が洗い流された後、結合した分子が担体からはがされ、その結果、元のサンプルから精製されたことになる。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「イムノアフィニティークロマトグラフィー」なる用語は、固定された抗体またはその断片をアフィニティークロマトグラフィーにおいて利用する任意の方法を指し示す。
【００９０】
「抗体またはその断片」なる用語は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、天然に存在する抗体および天然には存在しない抗体、抗体全体およびその断片（Ｆｖ領域、Ｆａｂ領域およびＦ（ａｂ’）２領域などの抗原結合断片を含む）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、単一ドメイン抗体、ナノボディならびにそれらの混合物を包含してよい。
【００９１】
「その断片」なる用語は、元の抗体の一部を除去することによって得ることができる抗体の任意の断片を包含してよく、これには、非限定的ではあるが、そのＦｃ領域、または可変領域の一部（ＣＤＲを含む）、が除去されている任意の抗体が包含される。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「ペプチドアフィニティークロマトグラフィー」なる用語は、固定されたペプチドをアフィニティークロマトグラフィーにおいて利用する任意の方法を指し示す。ペプチドアフィニティークロマトグラフィーは、当技術分野で周知である（例えばＰｕｌｉｃｈｅｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１．  Ｇｅｎ  Ｔｈｅｒ  １８（１０）：１０２０−１０２４を参照のこと）。
【００９３】
クロマトグラフィー担体上に固定される場合、この用語は、精製されるｒＡＡＶ粒子の表面に存在する少なくとも１つのエピトープに結合する能力をそれが保持する限りにおいて、上述のバリアントのうちのいずれかを包含する。
【００９４】
特に、そのような抗体またはその断片には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭのサブクラスというアイソタイプが包含されてよい。
【００９５】
特定の一実施形態によれば、抗体またはその断片は、モノクローナルである。
【００９６】
本発明で考慮される抗体は、天然に存在するもの、または天然には存在しないものであってよい。それらは、ヒト起源または非ヒト起源のものであってよい。
【００９７】
例示的な一実施形態によれば、抗体は、ラクダ科動物（ヒトコブラクダ、ラクダ、リャマおよびアルパカを含む）またはサメの免疫化によって得られるものなどの単鎖抗体である。
【００９８】
抗体およびその断片は、例えばＭｏｓｅｒ  ＆  Ｈａｇｅ（「Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：  ａｎ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ」；Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ；２（４）：７６９−７９０；２０１０）において説明されるように、取得され、共有結合から吸着に基づく方法にわたる様々な技術を用いて担体上に固定されてよい。
【００９９】
モノクローナル抗体は、培養中の連続細胞株による抗体分子の産生をもたらす任意の技術を用いて調製されてよい。これらには、限定されるものではないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶハイブリドーマ技術が包含される（Ｋｏｈｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９７５，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７；Ｋｏｚｂｏｒ，ｅｔ  ａｔ，  １９８５，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８１：３１−４２；Ｃｏｔｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９８３，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ８０：２０２６−２０３０；Ｃｏｌｅ，ｅｔ  ａｌ，１９８４，  ＭｏＬ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ６２：１０９−１２０）。
【０１００】
本発明で使用するための好適なイムノアフィニティークロマトグラフィー担体がいくつか知られており、これらには、限定されるものではないが、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ（Ｂｉｏｒａｄ）；Ａｆｆｉｎｉｃａ  Ａｇａｒｏｓｅ／Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）；ＡｖｉｄＧｅｌ  （ＢｉｏＰｒｏｂｅ）；Ｂｉｏ−Ｇｅｌ（ＢｉｏＲａｄ）；Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（ＥＭ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）；ＨＥＭＡ−ＡＦＣ（Ａｌｌｔｅｃｈ）；Ｒｅａｃｔｉ−Ｇｅｌ（Ｐｉｅｒｃｅ）；Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ（ＩＢＦ）；ＴＳＫ  Ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（ＴｏｓｏＨａａｓ）；Ｕｌｔｒａｇｅｌ（ＩＢＦ）；ＡｖｉｄＧｅｌ  ＣＰＧ（ＢｉｏＰｒｏｂｅ）；ＨｉＰＡＣ（ＣｈｒｏｍａｔｏＣｈｅｍ）；Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｐａｃｋｉｎｇ（Ｗａｔｅｒｓ）；Ｕｌｔｒａｆｆｉｎｉｔｙ−ＥＰ（Ｂｏｄｍａｎ）およびＥｍｐｈａｚｅ（３Ｍ  Ｃｏｒｐ．／Ｐｉｅｒｃｅ）が包含される。
【０１０１】
他のクロマトグラフィー担体には、アフィニティーモノリス型クロマトグラフィー担体およびＰＯＲＯＳ（登録商標）アフィニティークロマトグラフィー担体が包含される。
【０１０２】
好ましくは、抗体およびその断片は、アガロースマトリックス上に固定されてよい。
【０１０３】
従って、一実施形態によれば、方法は、前記ｒＡＡＶ粒子に向けられた抗体またはその断片が固定されているクロマトグラフィー担体を用いて実施される工程（ｂ）を含む。
【０１０４】
特に、抗体またはその断片は、親水性のスペーサーアームによってアガロースマトリックスに固定される。
【０１０５】
一実施形態によれば、工程（ｂ）は、ＡＡＶ粒子上に存在する少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体を使用して実施される。一実施形態において、前記エピトープは少なくとも、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０を含む群において選択される血清型に属する。
【０１０６】
一実施形態において、前記エピトープは少なくとも、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３およびＡＡＶ５を含む群またはそれらからなる群において選択される血清型に属する。
【０１０７】
特定の一実施形態によれば、工程（ｂ）は、ＡＡＶ粒子上に存在する少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するラクダ科動物の単鎖抗体またはＶＨＨ抗体を使用して実施される。一実施形態において、前記エピトープは少なくとも、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０を含む群において選択される血清型に属し、これには、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３およびＡＡＶ５を含む群またはそれらからなる群より選択されるエピトープが包含される。
【０１０８】
さらに、例示的な一実施形態によれば、工程（ｂ）は、ＡＶＢ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）担体を使用して実施される。
【０１０９】
好ましい一実施形態によれば、イムノアフィニティーカラムにロードする前において、ｒＡＡＶ含有清澄化組成物（特にｒＡＡＶ４、ｒＡＡＶｒｈ１０またはｒＡＡＶ２を含有する清澄化組成物）のｐＨは、中性〜塩基性のｐＨであり、これには、６．０〜８．０の範囲のｐＨが包含される。
【０１１０】
最も好ましい一実施形態によれば、ｒＡＡＶ含有清澄化組成物は、ｒＡＡＶ４含有清澄化組成物である。
【０１１１】
さらに、例示的な一実施形態によれば、ｒＡＡＶ含有清澄化組成物は、カルシウムおよびマグネシウムを追加したＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、で平衡化したＡＶＢカラムにロードされる。
【０１１２】
さらに、例示的な一実施形態によれば、第１のｒＡＡＶ濃縮組成物は、酸性ｐＨでイムノアフィニティーカラムから溶出される。酸性ｐＨは、７．０未満（５．０未満または３．０未満を含む）の任意のｐＨを指してよい。
【０１１３】
前記例示的な実施形態によれば、第１のｒＡＡＶ濃縮組成物は、酸性ｐＨでイムノアフィニティーカラムから溶出され、ここで前記ｐＨは３．０未満であり、これには約２．０というｐＨが包含される。
【０１１４】
上述のイムノアフィニティーの担体および方法は、ＡＡＶ４、ＡＡＶ１０（すなわちＡＡＶｒｈ１０）またはＡＡＶ２の血清型に属するｒＡＡＶ粒子（特にＡＡＶ４血清型に属するｒＡＡＶ粒子）を精製するための本発明の方法において特に便利である。
【０１１５】
溶出されると、第１のｒＡＡＶ濃縮組成物のｐＨは、好ましくは、中性または塩基性のｐＨ（これには、８．５を含め、８．０以上のｐＨが包含される）を有する第１のｒＡＡＶ濃縮組成物を得るのに好適な様式で中和される。ｒＡＡＶ４粒子を含め、ｒＡＡＶ粒子は、酸性ｐＨを有する組成物中で維持されると、その完全性および／または感染性を失う傾向があるというのがその理由である。
【０１１６】
例示的な一実施形態によれば、第１のｒＡＡＶ濃縮組成物は、約８．５のｐＨを有するＴｒｉｓ緩衝液で中和される。
【０１１７】
別の例示的な実施形態によれば、第１のｒＡＡＶ濃縮組成物は、約８．０のｐＨを有するＴｒｉｓ緩衝液で中和される。
【０１１８】
有利なことに、中和の前、間または後に、第１のｒＡＡＶ濃縮組成物は、非イオン性界面活性剤（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）  Ｆ−６８（Ｇｉｂｃｏ））を追加されてよい。
【０１１９】
非イオン性界面活性剤は、組成物の総体積の０．０００１％〜０．１％（ｖ／ｖ）の範囲の量で存在してよく、これには、組成物の総体積の０．０００５％〜０．００５％（ｖ／ｖ）の範囲の量が包含され、これには、組成物の総体積の約０．００１％（ｖ／ｖ）が包含される。
【０１２０】
有利なことに、アデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）濃縮組成物は、上記で定義されるような量の非イオン性界面活性剤（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）  Ｆ−６８（Ｇｉｂｃｏ））の存在下で濃縮される。
【０１２１】
また、有利なことに、アデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）含有組成物は、上記で定義されるような非イオン性界面活性剤を、やはり上記で定義されるような量で、さらに含んでよい眼用塩類溶液（Saline Ocular Solution）に対してダイアフィルトレーションおよび濃縮される。
【０１２２】
上記で定義されるような、および他の工程における、非イオン性界面活性剤の使用はさらに、方法の効率および拡張性に寄与する。特に、上記で定義されるような、非イオン性界面活性剤の使用は、精製の前、間および後に、ｒＡＡＶ粒子の凝集または接着を防止する。
【０１２３】
陰イオン交換クロマトグラフィー
本発明で使用するための好適な陰イオン交換体がいくつか知られており、これらには、限定されるものではないが、ＭＡＣＲＯ  ＰＲＥＰ  Ｑ（ＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．）から入手可能な強力な陰イオン交換体）、ＵＮＯＳＰＨＥＲＥ  Ｑ（ＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．）から入手可能な強力な陰イオン交換体）、ＰＯＲＯＳ  ５０ＨＱ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）から入手可能な強力な陰イオン交換体）、ＰＯＲＯＳ  ５０Ｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）から入手可能な弱い陰イオン交換体）、ＰＯＲＯＳ  ５０ＰＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）から入手可能な弱い陰イオン交換体）、ＳＯＵＲＣＥ  ３０Ｑ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｎ．Ｊ．）から入手可能な強力な陰イオン交換体）、ＤＥＡＥ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）から入手可能な弱い陰イオン交換体）、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）から入手可能な強力な陰イオン交換体）、Ｃａｐｔｏ  ＱおよびＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｎ．Ｊ．）が包含される。
【０１２４】
好適なモノリス型クロマトグラフィー担体の例は、当技術分野で公知であり、これらには、非限定的ではあるが、モノリス型カラムＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）  ＱＡ、ＣＩＭ（登録商標）  ＱＡ、ＣＩＭ  ＤＥＡＥおよびＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）  ＤＥＡＥ（Ｂｉａ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）が包含される。
【０１２５】
クロマトグラフィーモノリスは、融合したマイクロメートルサイズのシリカの小球、またはクロマトグラフィーチューブ内で直接合成できる有機ポリマー、でできた一体型の多孔質固体である。このおかげで、この担体は、非常に耐久性があり、すぐに使用でき、パッケージパラメータ（package parameters）のばらつきがない。
【０１２６】
モノリスは、相互につながっている流路（perfusion channel）からなる、連続した多孔質ベッドのマトリックスを有する均一なカラムである。これらの流路は、充填ベッド粒子を利用したクロマトグラフィーの典型的な孔径（５〜１００ｎｍ）と比較すると、比較的大きい（１〜５μｍ）。これの１つの利点は、接触可能な表面が大きいために、それが、ウイルスなどの巨大分子の潜在的結合容量を増加させるということである。これらの担体は、高流速および低いずり速度においてさえ、低い逆圧を生じさせる。
【０１２７】
充填ベッドカラムと比較すると、モノリス型担体の向上した物質輸送は、巨大分子の効率的な分離をもたらす。
【０１２８】
実用的観点からすると、これらのカラムの使用は、流速とは関係なく高い結合容量および良好な分解能を伴いつつ、充填ベッドカラムと比較して高流速でウイルス産物（それが細胞溶解物である場合でも）を扱うことを可能にする。これらの担体の高分解能は、精製工程の削減およびプロセス全体の拡張性に寄与する。
【０１２９】
一部の実施形態によれば、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程を１つしか含まない。
【０１３０】
一部の実施形態によれば、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法は、２つ以上の陰イオンクロマトグラフィー工程を含み、これには、特に２つ、３つまたは４つの陰イオンクロマトグラフィー工程が包含される。方法が２つ以上の陰イオン交換クロマトグラフィー工程を含む場合、上述の工程は、同種の担体上または異なる担体上で達成されてよい。
【０１３１】
例示的な実施形態によれば、ステップ（ｃ１）における少なくとも１つのクロマトグラフィー担体は、モノリス型クロマトグラフィー担体である。
【０１３２】
陰イオン交換カラムはまず、標準的な緩衝液を用いて、製造業者の仕様書に従って平衡化される。例えば、カラムは、例えば５〜５０ｍＭの、好ましくは７〜２０ｍＭ（２０ｍＭなど）の、Ｔｒｉｓ緩衝液で平衡化されてよい。次に、サンプルがロードされ、２種類の溶出緩衝液（１種類の低塩濃度緩衝液および１種類の高塩濃度緩衝液）が使用される。
【０１３３】
塩勾配を生じさせる低塩濃度緩衝液と高塩濃度緩衝液の漸進的混合（progressive mix）に沿って画分が回収され、それらの画分において、溶出された物質が標準的な技術（２６０ｎｍおよび２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収のモニタリングなど）を用いて検出される。陰イオン交換体を用いる場合、低塩濃度の溶出液に由来するタンパク質のピークはＡＡＶの空のカプシドを含み、高塩濃度の画分はＡＡＶ粒子を含む。
【０１３４】
特に、陰イオン交換カラム上において、ＡＡＶ粒子は、約ｐＨ５〜ｐＨ１２の、好ましくはｐＨ６〜ｐＨ１０の、さらに好ましくはｐＨ７〜ｐＨ９．５（ｐＨ７．１、７．２、７．３、７．４〜８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５〜９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５など）のｐＨの、または上記の範囲内の任意のｐＨの、適切な緩衝液を用いてさらに精製されてよい。
【０１３５】
陰イオン交換カラムで使用するための適切な緩衝液は、当技術分野で周知であり、一般的には陽イオン性または双性イオン性である。このような緩衝液には、限定されるものではないが、以下の緩衝イオンを有する緩衝液が包含される：Ｎ−メチルピペラジン、ピペラジン、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、トリエタノールアミン、Ｔｒｉｓ、Ｎ−メチルジエタノールアミン、１，３−ジアミノプロパン、エタノールアミン、酢酸等。サンプルを溶出するために、適切なｐＨで塩（ＮａＣｌ、ＫＣｌ、硫酸塩、ギ酸塩または酢酸塩など）を用いて開始緩衝液のイオン強度が高められる。
【０１３６】
有利なことに、陰イオン交換クロマトグラフィーの間、前または後に使用される緩衝液は全て、緩衝液組成物の総体積の０．０００１％〜０．１％（ｖ／ｖ）の範囲の量で非イオン性界面活性剤（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）  Ｆ−６８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を含み、当該量には、緩衝液組成物の総体積の０．０００５％〜０．００５％（ｖ／ｖ）の範囲の量が包含され、当該量には、緩衝液組成物の総体積の約０．００１％（ｖ／ｖ）が包含される。
【０１３７】
使用される樹脂（すなわち、強力な、または弱い、イオン交換体）の性質ならびに、塩濃度、使用される緩衝液およびｐＨについての条件は、ＡＡＶカプシドバリアント（すなわち、ＡＡＶカプシドの血清型または偽型）によって異なるであろう。公知のＡＡＶカプシドバリアントは全て、サイズおよび形状などの特徴が共通しているが、分子トポロジーおよび表面電荷分布という細部において異なる。従って、全てのカプシドバリアントが、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製に適していると予想され、妥当な方法は、クロマトグラフィーの樹脂および緩衝液のスクリーニング実験を用いて体系的に決定できるが、効率的なＡＡＶ粒子の精製を達成するには、ＡＡＶカプシドバリアントごとに異なる条件が必要となるであろう。このような条件の決定は、当業者には明白である。
【０１３８】
有利なことに、工程（ｂ）の終了時に、ｒＡＡＶ含有清澄化組成物のｐＨは、工程（ｃ）で使用される少なくとも１つの陰イオンクロマトグラフィー担体上におけるｒＡＡＶ粒子の最適な保持を確実にするために、塩基性のｐＨに調整される。
【０１３９】
８．５のｐＨまたは８．５超（９を含む）のｐＨは、陰イオン交換カラムへのｒＡＡＶ４粒子またはｒＡＡＶ４含有清澄化組成物の結合に特に便利である。
【０１４０】
従って、例示的な一実施形態によれば、工程（ｂ）の終了時に、陰イオン交換カラムへの結合のためのｒＡＡＶ４含有清澄化組成物の最適ｐＨは、ｐＨ８．５または８．５超（９を含む）に調整される。
【０１４１】
８．５のｐＨまたは８．５超（９を含む）のｐＨは、陰イオン交換カラムへのｒＡＡＶｒｈ１０粒子またはｒＡＡＶｒｈ１０含有清澄化組成物の結合に特に便利である。
【０１４２】
従って、例示的な一実施形態によれば、工程（ｂ）の終了時に、陰イオン交換カラムへの結合のためのｒＡＡＶｒｈ１０含有清澄化組成物の最適ｐＨは、ｐＨ８．５または８．５超（９を含む）に調整される。
【０１４３】
８．５のｐＨまたは８．５超（９を含む）のｐＨは、陰イオン交換カラムへのｒＡＡＶ２粒子またはｒＡＡＶ２含有清澄化組成物の結合に特に便利である。
【０１４４】
従って、例示的な一実施形態によれば、工程（ｂ）の終了時に、陰イオン交換カラムへの結合のためのｒＡＡＶ２含有清澄化組成物の最適ｐＨは、ｐＨ８．５または８．５超（９を含む）に調整される。
【０１４５】
陰イオン交換カラムで使用するための適切な緩衝液は、当技術分野で周知であり、一般的には陽イオン性または双性イオン性である。このような緩衝液には、限定されるものではないが、以下の緩衝イオンを有する緩衝液が包含される：Ｎ−メチルピペラジン、ピペラジン、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、トリエタノールアミン、Ｔｒｉｓ、Ｎ−メチルジエタノールアミン、１，３−ジアミノプロパン、エタノールアミン、酢酸等。サンプルを溶出するために、適切なｐＨで塩（ＮａＣｌ、ＫＣｌ、硫酸塩、ギ酸塩または酢酸塩など）を用いて開始緩衝液のイオン強度が高められる。
【０１４６】
また、溶出の前に、陰イオン交換クロマトグラフィーは、溶出工程に一般的に使用される塩濃度よりも低い塩濃度で担体または陰イオン交換カラムを処理する任意選択の工程を含んでもよい。このような処理は、本明細書では「プレ溶出」工程と呼称されることもある。
【０１４７】
従って、本発明の一実施形態では、陰イオン交換カラムはまず、低塩濃度（例えば、５〜１００ｍＭの塩；特に５〜１００ｍＭのＮａＣｌ；５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５〜１００ｍＭ、またはこれらの範囲内の任意の濃度など）で処理される。例えば、「第１のプレ溶出工程」における塩濃度は、最初は、ロード後にｒＡＡＶ粒子をカラムに結合させるために使用される緩衝液の塩濃度と一致してよい。
【０１４８】
一部の実施形態では、最初の処理の後、次に、不純物を溶出させるために、より高いＮａＣｌ濃度など、より高い塩濃度で、またはより大きなイオン強度を有する別の緩衝液で、カラムが処理される。第２の緩衝液としての使用の一例は、酢酸ナトリウム緩衝液またはＴｒｉｓ系緩衝液である。この追加的工程はまた、本明細書では「第２のプレ溶出」工程と呼称されることもある。この場合、塩濃度は、カラムからＡＡＶ粒子を溶出させない程度に十分に低いままであるように注意される可能性がある。
【０１４９】
さらなる不純物をカラムから溶出させた後、次に、溶出工程において、より高い塩濃度を用いてＡＡＶ粒子を回収できる。
【０１５０】
一部の実施形態において、クロマトグラフィー担体上における溶出のｐＨは、精製されるｒＡＡＶ粒子に応じて調整される。最適ｐＨでの溶出は、所与の粒子の最適な感染力を維持するという利点を有する。
【０１５１】
また、工程（ｃ）におけるクロマトグラフィー担体からのｒＡＡＶ粒子の溶出（特にｒＡＡＶ４粒子の溶出）は、ｐＨ８に調整されてもよい。
【０１５２】
好ましくは、クロマトグラフィー担体からのｒＡＡＶ粒子の溶出は、直線的な塩勾配を用いて行われる。塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、硫酸塩、ギ酸塩および酢酸塩からなる群より選択されてよく、好ましくはＮａＣｌであってよい。
【０１５３】
「直線的な塩勾配の傾き」なる用語は、直線的勾配の２つの点（Ａ，Ｂ）の間の傾きを指し、以下の式に従って、クロマトグラフィー担体中の塩濃度および経時的に溶出されるカラム体積（ＣＶ）の両方に依存する。
傾き（Ａ，Ｂ）＝（Ｂにおける塩濃度−Ａにおける塩濃度）／（Ｂにおけるカラム体積−Ａにおけるカラム体積）
【０１５４】
従って、直線的な塩勾配の傾きは、Ｍ／ＣＶまたはｍＭ／ＣＶで表すことができ、好ましくは、標準的なプロトコルに従った緩やかな塩勾配である。
【０１５５】
一実施形態によれば、工程（ｃ）における直線的な塩勾配の傾きは、０．１Ｍ／ＣＶ以下であり、特に０．０１５〜０．０９Ｍ／ＣＶの範囲である。
【０１５６】
一実施形態によれば、工程（ｃ）における直線的な塩勾配の傾きは、０．０７Ｍ／ＣＶ以下であり、特に０．０１〜０．０６Ｍ／ＣＶの範囲である。
【０１５７】
有利なことに、該方法は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程の前または後にｒＡＡＶ濃縮組成物の希釈という追加的工程を含んでよい。希釈の工程は、例えば、緩衝液の交換の工程の形態であってよい。
【０１５８】
好ましい一実施形態によれば、工程（ｃ）の終了時に、第２のｒＡＡＶ濃縮組成物は、工程（ｄ）の実施のために使用するまで凍結された形態で保存される。
【０１５９】
密度勾配遠心分離
密度勾配遠心分離において、懸濁液媒体の密度は、密度勾配用容器（例えば遠心管）の一方の端部から他方の端部にかけて既知の様式で変動する。遠心力の影響下にある粒子が、その等密度点に達すると、すなわち、周囲の液体の密度がｒＡＡＶ粒子の密度と等しい場合に、ｒＡＡＶ粒子は、力ベクトルに従った移動を止めることになる。
【０１６０】
本発明で考慮される遠心分離のための密度勾配を確立するために使用される溶質系には、非限定的ではあるが、無機塩（塩化セシウム、臭化カリウム、塩化ナトリウム）、スクロースおよびいくつかの市販の溶質（スクロースの架橋によって作製される合成多糖であるＦｉｃｏｌｌ（登録商標）；ポリビニルピロリドンで被覆されたシリカ粒子の懸濁液であるＰｅｒｃｏｌｌ（商標）；および合成分子メトリゾ酸の誘導体（メトリザミド）であるＮｙｃｏｄｅｎｚ（登録商標）など）が包含される。Ｎｙｃｏｄｅｎｚ（登録商標）の二量体であるイオジキシノール（Iodixinol）またはイオジキサノールも広く使用されている。
【０１６１】
従って、工程（ｃ）は、工程（ｂ）で得られた第１のｒＡＡＶ濃縮組成物を少なくとも１回、密度勾配遠心分離のステップに供する工程であって、ｒＡＡＶ含有画分が回収される、それにより第２のｒＡＡＶ４濃縮組成物が提供される工程を含んでよい。
【０１６２】
一実施形態によれば、密度勾配遠心分離のステップは、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配遠心分離、イオジキサノール勾配遠心分離、スクロース勾配遠心分離、Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）勾配遠心分離、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）遠心分離から選択され、最も好ましくは、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配遠心分離である。
【０１６３】
有利なことに、密度勾配を利用した遠心分離の前に、第１のｒＡＡＶ濃縮組成物を、特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００など）の存在下で、密度勾配遠心分離工程を行うために好適な体積の材料を得るために沈殿させてよい。
【０１６４】
また、それは、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）によってダイアフィルトレーションおよび濃縮されてもよい。
【０１６５】
従って、一実施形態によれば、第１のｒＡＡＶ濃縮組成物を、ＰＥＧ８０００（例えば、約５〜１０％（ｗ／ｖ）という終濃度のＰＥＧ８０００）の存在下で、沈殿させる。さらに、その後、サンプルは、密度勾配を利用した遠心分離の前に、さらなる処理のための沈殿したｒＡＡＶ粒子の回収を促進するために遠心分離されてよい。
【０１６６】
最も一般的実施形態によれば、密度勾配を利用した遠心分離の方法は、少なくとも、
（ｉ）目的のサンプルを含む、密度勾配形成溶液を提供する工程と、
（ｉｉ）第２のｒＡＡＶ濃縮組成物を含む層を少なくとも１つ有する密度勾配をもたらすのに好適な様式で、工程（ｉ）で提供された溶液を遠心分離する工程と、
（ｉｉｉ）任意選択で、第２のｒＡＡＶ濃縮組成物を含む層を回収する工程と、
を含む。
【０１６７】
従って、目的のサンプルは、第１のｒＡＡＶ濃縮組成物を含むか、第１のｒＡＡＶ濃縮組成物からなってよい。
【０１６８】
本発明によれば、「密度勾配形成溶液」は、遠心分離の前に連続的勾配または非連続的勾配のいずれかの形態である溶液、あるいは遠心分離中に勾配が自己形成される溶液である。
【０１６９】
「密度勾配形成溶液」は、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）、イオジキサノール、スクロース、Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）およびＦｉｃｏｌｌ（登録商標）の溶液からなる群より選択されてよく、最も好ましくは、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）溶液またはイオジキサノールである。
【０１７０】
調整に関する理由（reglementary reasons）を含め、イオジキサノールが好ましい。
【０１７１】
工程（ｉ）の一部の実施形態において、目的のサンプルは、単に、密度勾配形成溶液と混合された状態であってよい。
【０１７２】
工程（ｉ）の他の一部の実施形態において、目的のサンプルは、密度勾配形成溶液の上に、すなわち前記勾配形成溶液と大気との間の境界面に、積層されてよい。
【０１７３】
従って、第２のｒＡＡＶ濃縮組成物を含む層を少なくとも１つ有する密度勾配をもたらすのに好適な様式で溶液を遠心分離する工程（ｉｉ）は、遠心分離の前に連続的勾配または非連続的勾配のいずれかの形態である密度勾配形成溶液、あるいは遠心分離中に勾配が自己形成される密度勾配形成溶液、を遠心分離することによって達成できる。
【０１７４】
前記実施形態によれば、工程（ｉ）で提供される溶液は、既に、連続的密度勾配または非連続的密度勾配の形態であってよい。例えば、工程（ｉ）で提供される溶液は、上から底にかけて、密度の増加する複数の層を有する、層の組の形態であってよい。
【０１７５】
連続的密度勾配および非連続的密度勾配の調製は、当技術分野で周知である。
【０１７６】
別の実施形態によれば、工程（ｉ）で提供される密度勾配形成溶液は、遠心分離中に密度勾配が自己形成される溶液（例えば、等密度溶液）であってよい。
【０１７７】
前記実施形態によれば、密度勾配は、遠心分離する工程（ｉｉ）の間に形成されてよい。例えば、遠心分離中の密度勾配の形成は、等密度の塩化セシウム（ＣｓＣｌ）溶液から開始することによって生じる可能性がある。
【０１７８】
一実施形態によれば、工程（ｉ）で提供されるＡＡＶ含有溶液は、１〜１．６ｇ／ｃｍ３の範囲の密度を有するＣｓＣｌ溶液であり、この密度には、１、１．１、１．２、１．３、１．４、および１．５〜１．６ｇ／ｃｍ３が包含され、この密度には、１．３〜１．５ｇ／ｃｍ３が包含され、この密度には１．３７６ｇ／ｃｍ３が包含される。
【０１７９】
一実施形態によれば、工程（ｉ）における目的のサンプルは、遠心分離前に前記溶液の最上層に存在する。
【０１８０】
溶液を遠心分離する工程（ｉｉ）は、当技術分野で公知であり、少なくとも上から底にかけて勾配が形成されるまで前記溶液に遠心力場を適用することからなる。
【０１８１】
遠心力は一般に、工程（ｉ）の溶液を含む遠心管を所与の時間（すなわち数時間）、所与の強度（１分あたりの回転すなわちｒｐｍで、あるいはｇで、見積もられる）および所与の遠心ローター内温度で回転させることによって適用される。
【０１８２】
好ましいプロトコルの一例が実施例１で説明される。
【０１８３】
好ましいプロトコルの別の例が実施例２で説明される。
【０１８４】
一実施形態によれば、工程（ｉｉ）で使用されるローターはＳＶ４１ローターである。
【０１８５】
一実施形態によれば、工程（ｉｉ）は、完全な粒子を「空の」粒子から分離するために、工程（ｉ）で提供された溶液をＳＷ４１ローターにおいて約３０，０００〜５０，０００ｒｐｍ（３８，０００ｒｐｍを含む）で約２４〜７２時間（４８時間を含む）、約４℃〜２０℃の温度の範囲の温度（１５℃を含む）にて遠心分離することからなる。第２のｒＡＡＶ濃縮組成物を含む層が、精製されたｒＡＡＶのバンド形成密度（banding density）に基づいて工程（ｉｉｉ）で回収されてよい。
【０１８６】
精製されたｒＡＡＶのバンド形成密度の決定も当技術分野で公知であり、基準値との比較によって、あるいは経験的に、決定できる。
【０１８７】
ｒＡＡＶの密度は、ｇ／ｃｍ３で表すことができる。
【０１８８】
参考までに、公知のｒＡＡＶ粒子（完全または空のいずれか）の密度は、Ｑｕ  ｅｔ  ａｌ（「Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ２  ｅｍｐｔｙ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｒｏｍ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂｙ  ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｏｌｕｍｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ；２００６）において説明されている：空のカプシドについては約１．３２ｇ／ｍＬ、ゲノムを含むカプシドについては約１．４０ｇ／ｍＬ。
【０１８９】
１つの所与の調製物の全体密度は、ｒＡＡＶの血清型および調製物中の完全な粒子または空の粒子の存在の両方に依存する可能性がある。
【０１９０】
特に、生じる勾配の分解能は、非限定的ではあるが、工程（ｉ）で使用される溶液の性質、溶液の遠心分離のために工程（ｉｉ）で使用されるパラメータおよび回収される必要のあるｒＡＡＶのバンド形成密度を含め、様々なパラメータに依存するであろう。
【０１９１】
例えば、イオジキサノールは、臨床用途に使用される、当技術分野で公知のヨウ素化された密度勾配媒体である。イオジキサノール中での巨大分子の見かけの密度はＣｓＣｌ中でのものとは異なるため、精製されたｒＡＡＶのバンド形成密度は、経験的に決定されなければならない。ｒＡＡＶカプシドの場合、密度は、ＣｓＣｌ中で約１．４０ｇ／ｍＬであり、イオジキサノール中で１．２６６ｇ／ｍＬである。
【０１９２】
工程（ｉｉｉ）において、および勾配の分取の後に、陽性画分が定量的ＰＣＲによって特定されてもよく、任意選択でプールされてもよい。
【０１９３】
任意選択で、ｒＡＡＶ粒子含有画分は、例えばタンジェンシャルフローろ過を用いて、さらに濃縮および／または透析されてもよい。
【０１９４】
任意選択で、ｒＡＡＶ粒子含有画分は、追加的な密度勾配遠心分離に供されてもよい。
【０１９５】
密度勾配遠心分離を用いてｒＡＡＶ粒子調製物を精製するためのプロトコルは、当技術分野で公知であり、例えばＺｏｌｏｔｕｋｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｔｉｔｅｒ  ａｎｄ  ｙｉｅｌｄ」；Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）において、さらに説明されている。
【０１９６】
タンジェンシャルフローろ過およびその後の工程
タンジェンシャルフローろ過は、フィルターの細孔を介した濃縮とダイアフィルトレーションのサイクルによって小さな粒子関連の不純物を排除することを可能にする洗練工程である。この洗練工程は、溶出画分の緩衝液の変更およびｒＡＡＶの濃縮に適しているという別の利点を有する。
【０１９７】
タンジェンシャルフローろ過は、好ましくは、フィルターとして中空糸フィルターを用いて達成される。
【０１９８】
一実施形態によれば、工程（ｄ）は、１５０ｋＤａ以下（特に２０ｋＤａ〜１５０ｋＤａ、好ましくは２５ｋＤａ〜１５０ｋＤａ、の範囲；約３０ｋＤａを含む）の分子量カットオフ値を有するフィルター膜を用いて行われる。
【０１９９】
当業者であれば、精製されるｒＡＡＶ粒子のタイプおよび溶出のパラメータ（ｐＨ、塩）に応じて分子量カットオフが調整されなければならないということを理解するであろう。
【０２００】
一部の実施形態によれば、塩および／または洗浄剤および／または界面活性剤および／またはヌクレアーゼが、タンジェンシャルフローろ過の間、前または後（特にタンジェンシャルフローろ過の間または前）に添加されてよい。
【０２０１】
一実施形態によれば、方法は、タンジェンシャルフローろ過の間、前または後に、洗浄剤、界面活性剤および／またはヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅを含む）での処理の工程をさらに含んでよい。
【０２０２】
有利なことに、アデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）含有組成物は、非イオン性界面活性剤（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）  Ｆ−６８（Ｇｉｂｃｏ））の存在下でダイアフィルトレーションおよび濃縮される。
【０２０３】
非イオン性界面活性剤は、組成物の総体積の０．０００１％〜０．１％（ｖ／ｖ）の範囲の量で存在してよく、これには、組成物の総体積の０．０００５％〜０．００５％（ｖ／ｖ）の範囲の量が包含され、これには、組成物の総体積の約０．００１％（ｖ／ｖ）が包含される。
【０２０４】
また、有利なことに、アデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）含有組成物は、上記で定義されるような非イオン性界面活性剤を、やはり上記で説明されるような量で、さらに含んでよい眼用塩類溶液に対してダイアフィルトレーションおよび濃縮される。
【０２０５】
一実施形態によれば、工程（ｃ）または工程（ｄ）で得られる精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）は、追加的な勾配に供され、これは分画遠心法の工程を包含し、これは密度勾配を包含し、特に、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配遠心分離、イオジキサノール勾配遠心分離、スクロース勾配遠心分離から選択される。
【０２０６】
好ましい一実施形態によれば、方法は、前記追加的な勾配の後に、追加的なタンジェンシャルフローろ過の工程をさらに含んでよい。
【０２０７】
一実施形態によれば、工程（ｄ）で得られる精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）は、滅菌される。
【０２０８】
一実施形態によれば、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）は、０．２μｍ以下の孔径を有するフィルター膜による滅菌ろ過の工程に供される。
【０２０９】
本発明はまた、上記で定義されるような方法の実施によって得られる精製されたｒＡＡＶ粒子にも関する。
【０２１０】
精製されたｒＡＡＶ粒子の特性評価
有利なことに、上述の方法は、遺伝子治療、および／または遺伝子治療のための医薬の調製、に適している精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るために用いることができる。
【０２１１】
好ましい一実施形態によれば、前記精製されたｒＡＡＶ粒子は、遺伝子治療に使用するのに適している。
【０２１２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子調製物の純度はまた、臨床上の遺伝子導入の安全性および有効性の両方に関して重要な意味を有する。
【０２１３】
ｒＡＡＶ粒子を精製するために用いられる方法は、宿主細胞のタンパク質の混入の量および完全な粒子／全粒子の比という点で調製物の純度に劇的に影響し得る。
【０２１４】
ベクター粒子の濃度は、実施例１に示されるように定量的ＰＣＲ（ゲノム含有粒子）またはＥＬＩＳＡ（全ベクター粒子）によって評価できる。
【０２１５】
調製物の純度は、最も一般的には、実施例１に示されるように、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって評価される。
【０２１６】
ウイルスの構造（カプシド）タンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３に対応するバンドは染色後に可視化されてよく、それらのサイズおよび相対強度が、混入したタンパク質に対して評価される。参考までに、ＡＡＶ４およびＡＡＶ５の血清型に属するＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、配列番号１０〜１５の配列の核酸によってコードされる。
【０２１７】
ＡＡＶ４血清型に属するＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、それぞれ、配列番号１０〜１２の配列の核酸によってコードされてよい。
【０２１８】
ＡＡＶ５血清型に属するＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、それぞれ、配列番号１３〜１５の配列の核酸によってコードされてよい。
【０２１９】
上述の配列は、参考として提示されている。
【０２２０】
従って、「純度」なる用語は、一般的不純物が存在しないことを指す。純度は、パーセンテージとして表され、クマシーブルーで染色されたポリアクリルアミドゲルにおいて検出されるタンパク質の総量と比較したＶＰ１タンパク質、ＶＰ２タンパク質およびＶＰ３タンパク質の総量に関する。
【０２２１】
「一般的不純物」なる用語は、出発材料中に存在したが粒子関連の不純物とはみなされない不純物を指す。従って、一般的不純物は、宿主細胞に由来するがＡＡＶ粒子ではない不純物を包含する。
【０２２２】
「粒子関連の不純物」なる用語は、真正の組換えＡＡＶ粒子以外の全てのタイプのＡＡＶ粒子を指す。粒子関連の不純物には、空のＡＡＶカプシド（「空のもの（empties）」または「空の粒子」とも呼称される）、および意図される粒子ゲノム以外のポリヌクレオチド配列を含むＡＡＶ粒子（「ＡＡＶのカプシドで包まれた核酸の不純物」または「ＡＡＶのカプシドで包まれたＤＮＡの不純物」とも呼称される）が包含される。
【０２２３】
残留ＤＮＡまたは宿主細胞のＤＮＡは、ｒＡＡＶ調製物中に混入物として存在し得る。残留ＤＮＡは悪影響を与え得るため、製造業者は、宿主細胞から得られる最終産物が含む残留ＤＮＡが必ず許容レベルであるようにしなければならない。
【０２２４】
残留ＤＮＡ試験は、実施例１で説明されるプロトコルを用いて、定量的ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲを含む）により評価できる。残留ＤＮＡは、１ｍＬあたりのｎｇで、あるいは１用量あたりのｎｇで、表される。
【０２２５】
好ましくは、残留ＤＮＡは、ｑＰＣＲによって、既知量のＥ１ＡアンプリコンＤＮＡを用いて確立された検量線と比較して組成物中のＥ１ＡアンプリコンＤＮＡの相対量を決定することにより決定される。
【０２２６】
「用量」は、１×１０１２個のベクターゲノム（ｖｇ）に相当する調製物の量と定義される。
【０２２７】
有利なことに、本発明の組成物はさらに、それらの空のｒＡＡＶ粒子／完全なｒＡＡＶ粒子の比を特徴とし得る。
【０２２８】
「空のカプシド」および「空の粒子」なる用語は、ＡＡＶのタンパク質の殻を含むが、両側にＡＡＶのＩＴＲが隣接している目的の異種ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドコンストラクトの全体または一部を欠いている、ＡＡＶビリオンを指す。従って、空のカプシドは、目的の遺伝子を宿主細胞中に導入するようには機能しない。
【０２２９】
空のｒＡＡＶ粒子／完全なｒＡＡＶ粒子の比は、実施例１で説明されるプロトコルを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより評価できる。
【０２３０】
感染性粒子の濃度はまた、実施例１で説明されるＩＣＡのプロトコルを用いて評価できる。
【０２３１】
従って、本発明の組成物は、上述の方法のうちのいずれか１つを用いた少なくとも１つの精製されたｒＡＡＶ粒子を含み、好ましくは、以下の特徴のうちの少なくとも１つを有する：
・９０％以上（好ましくは９９％超または１００％）の純度；
・１用量あたり５０ｎｇ以下の細胞性残留ＤＮＡの量。
【０２３２】
１用量あたり５０ｎｇ以下の細胞性残留ＤＮＡの量には、１用量あたり５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６または５ｎｇ以下が包含される。
【０２３３】
特に、本発明の組成物は、上述の方法のうちのいずれか１つを用いた少なくとも１つの精製されたｒＡＡＶ粒子を含み、以下の特徴を有する：
・９９％以上または１００％の純度；および
・１用量あたり２５ｎｇ以下の細胞性残留ＤＮＡの量（１用量あたり１５ｎｇを含む）。
【０２３４】
最も好ましくは、組成物の純度は９９％超であり、これには１００％の純度が包含される。
【０２３５】
好ましい実施形態によれば、本発明の精製されたｒＡＡＶ粒子の組成物は、任意選択で非イオン性界面活性剤を追加されていてもよい、本発明に従って精製されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物である。
【０２３６】
好ましい実施形態によれば、本発明の精製されたｒＡＡＶ粒子の組成物は、任意選択で非イオン性界面活性剤を追加されていてもよい、本発明に従って精製されたｒＡＡＶ粒子を含む眼用塩類溶液である。
【０２３７】
例示的な実施形態によれば、組成物は、上述の方法のうちの１つから直接得られる。
【０２３８】
本発明に適している眼用塩類溶液は、ＢＤ  Ｍｅｄｉｃａｌから入手されてよい（例えばＢＤ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＳｏｌｕｔｉｏｎまたはＢＤ  Ａｑｕｅｏ  Ｐｒｅｍｉｕｍ（商標）など）。
【０２３９】
前記例示的な実施形態によれば、非イオン性界面活性剤は、好ましくはＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）  Ｆ−６８（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））である。
【０２４０】
非イオン性界面活性剤（すなわち、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）  Ｆ−６８）は、組成物の総体積の０．０００１％〜０．１％（ｖ／ｖ）の範囲の量で存在してよく、これには、組成物の総体積の０．０００５％〜０．００５％（ｖ／ｖ）の範囲の量が包含され、これには、組成物の総体積の約０．００１％（ｖ／ｖ）が包含される。
【０２４１】
投与用組成物および／または遺伝子治療に使用される組成物を含め、以下でさらに説明されるような本発明の組成物は、好ましくは無菌である。
【０２４２】
遺伝子治療に使用するためのｒＡＡＶ粒子
本発明はさらに、遺伝子治療に使用するための、および／または遺伝子治療に好適な医薬の調製に使用するための、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法に関する。
【０２４３】
有利なことに、このようなｒＡＡＶ粒子およびその組成物はまた、それ自体が、遺伝子治療のための使用および／または遺伝子治療に好適な医薬の調製のための使用に適している。
【０２４４】
「遺伝子治療」は、疾患の発生の可能性を処置および／または防止および／または低減するために核酸配列を個体に投与することを意味する。当技術分野では、いくつかのアプローチが提唱されている。上記を考慮すると、ｒＡＡＶ粒子は、処置される個体に前記核酸配列を送達するための媒体として使用される。
【０２４５】
疾患を引き起こす変異した遺伝子を健全な遺伝子のコピーで置き換える可能性がある。
【０２４６】
不適切に機能している変異した遺伝子を不活化（ノックアウト）する可能性がある。
【０２４７】
疾患の発生の可能性を処置および／または防止および／または低減するために新しい遺伝子を体内に導入する可能性がある。
【０２４８】
報告される方法およびプラスミドは、眼疾患（失明、より具体的には桿体特異的な欠損に起因する桿体錐体ジストロフィー、を含む）のための医薬の調製のための使用に特に効果的である。
【０２４９】
特に、前記疾患は、ホスホジエステラーゼ６（ＰＤＥ６）関連疾患（ＰＤＥ６β関連疾患を含む）および網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（Retinal Pigment Epithelium-specific 65 kDa protein）（ＲＰＥ６５）関連疾患から選択されてよい。
【０２５０】
ＲＰＥ６５関連疾患には、レーバー先天性黒内障および網膜色素変性症が包含される。ＰＤＥ６関連疾患には、桿体錐体ジストロフィーおよび網膜色素変性症が包含される。
【０２５１】
処置される個体には、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物が包含される。
【０２５２】
ＡＡＶ粒子およびその組成物は、局所投与または非経口投与されてよく、これには、眼窩内投与および眼内投与が包含される。さらに、眼内投与には、硝子体内投与、網膜下投与および角膜内投与が包含される。
【０２５３】
従って、前記ＡＡＶ粒子を含む組成物は、好ましくは、局所投与または非経口投与に適しており、これには、眼内投与（好ましくは硝子体内投与および網膜下投与）および角膜内投与が包含される。
【０２５４】
本発明のｒＡＡＶ粒子は、好ましくは、以下でさらに説明されるような、ヒトＰＤＥ６β遺伝子またはヒトＲＰＥ６５遺伝子をコードする発現カセット（それぞれ配列番号１および配列番号７の配列のもの）を含む。
【０２５５】
好ましい一実施形態によれば、精製されたｒＡＡＶ粒子は、本明細書で説明される方法のうちのいずれか１つを実施することによって得ることができる。精製されたｒＡＡＶ粒子の組成物は、前記精製されたｒＡＡＶ粒子のうちの少なくとも１つを含む。精製されたｒＡＡＶ粒子およびその組成物は、遺伝子治療のための使用に適している。
【０２５６】
ＡＡＶプラスミド
前記ｒＡＡＶ粒子の生産のためのＡＡＶプラスミドが、さらに開示される。
【０２５７】
感染性の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの構築は説明されている。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際公開第９２／０１０７０号（１９９２年１月２３日公開）および同第９３／０３７６９号（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  ８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５８：９７−１２９；ならびにＫｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１を参照のこと。
【０２５８】
「ＡＡＶプラスミド」は、限定されるものではないがＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ１０ならびにアカゲザル由来血清型（ＡＡＶｒｈ１０を含む）を含む、アデノ随伴ウイルス血清型に由来するプラスミドを意味する。ＡＡＶプラスミドは、ＡＡＶの野生型遺伝子のうちの１つ以上（好ましくはｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子）が全体的または部分的に欠失していてよいが、機能的なフランキングＩＴＲ配列を保持する。機能的なＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケージングに必要である。従って、ＡＡＶプラスミドは、本明細書では、少なくとも、ウイルスの複製およびパッケージングにｃｉｓに必要とされるこれらの配列（例えば、機能的なＩＴＲ）を含むと定義される。ＩＴＲは、野生型のヌクレオチド配列である必要はなく、その配列が機能的なレスキュー、複製およびパッケージングをもたらす限りにおいて、例えばヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更されてよい。また、「ＡＡＶ粒子」は、標的細胞の核への核酸の送達のための効果的な媒体を提供する、タンパク質の殻またはカプシドを意味する。
【０２５９】
特に、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶｒｈ１０および／またはＡＡＶ２の血清型に属するＡＡＶから選択されるアデノ随伴ウイルスに由来する。
【０２６０】
好ましくは、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ４またはＡＡＶ５の血清型に属するＡＡＶから選択されるアデノ随伴ウイルスに由来する。
【０２６１】
「ＡＡＶヘルパー機能」は、発現してＡＡＶの遺伝子産物をもたらすことができ、次に当該遺伝子産物が増殖性のＡＡＶの複製のためにｔｒａｎｓに機能する、ＡＡＶ由来のコード配列を指す。従って、ＡＡＶヘルパー機能には、主要なＡＡＶのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であるｒｅｐおよびｃａｐの両方が包含される。Ｒｅｐの発現産物は、多くの機能（特に、ＡＡＶのＤＮＡ複製開始点の認識、結合およびニッキング；ＤＮＡヘリカーゼ活性；ならびにＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写の調節を含む）を有することが示されている。Ｃａｐの発現産物は、必要なパッケージング機能を供給する。ＡＡＶヘルパー機能は、本明細書では、ＡＡＶプラスミドが失っているＡＡＶ機能をｔｒａｎｓに補完するために用いられる。
【０２６２】
「ＡＡＶヘルパーコンストラクト」なる用語は、一般的には、目的のヌクレオチド配列の送達のための形質導入粒子を作製するために使用されるべきＡＡＶプラスミドから除去されたＡＡＶ機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。ＡＡＶヘルパーコンストラクトは一般に、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子の一過性または安定な発現を提供してＡＡＶの複製に必要である失われたＡＡＶ機能を補完するために用いられる。しかし、ヘルパーコンストラクトは、ＡＡＶのＩＴＲを欠いており、自身を複製することもパッケージングすることもできない。ＡＡＶヘルパーコンストラクトは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルスまたはビリオンの形態であってよい。一般に使用されるプラスミドである、ＲｅｐおよびＣａｐの発現産物の両方をコードするｐＡＡＶ／ＡｄおよびｐＩＭ２９＋４５など、いくつかのＡＡＶヘルパーコンストラクトが説明されている。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６３：３８２２−３８２８およびＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６５：２９３６−２９４５を参照のこと。Ｒｅｐおよび／またはＣａｐの発現産物をコードする、いくつかの他のプラスミドが説明されている。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号および同第６，３７６，２３７号を参照のこと。
【０２６３】
「トランスフェクション」なる用語は、細胞による外来性のＤＮＡの取り込みを指すために使用され、外因性のＤＮＡが細胞膜の内側に導入された場合、細胞は「トランスフェクトされ」ている。当技術分野では、いくつかのトランスフェクション技術が一般的に知られている。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）  Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照のこと。このような技術を用いて、好適な宿主細胞内に１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を導入できる。
【０２６４】
「核酸」、「ヌクレオチド配列」または「ポリヌクレオチド配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列を指す。当該用語は、限定されるものではないが４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン（beta-D-mannosylqueosine）、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル（uracil-5-oxyacetic acid methylester）、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン（oxybutoxosine）、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｂウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル（Buracil-5-oxyacetic acid methylester）、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシンおよび２，６−ジアミノプリンなど、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基類似体のうちのいずれかを含む配列を包含する
【０２６５】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合にｉｎ  ｖｉｖｏで、転写され（ＤＮＡの場合）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）、核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列に対して３’側に転写終結配列が位置する可能性がある。
【０２６６】
ＤＮＡ「制御配列」なる用語は、レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写および翻訳を集合的にもたらす、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン（upstream regulatory domain）、複製開始点、配列内リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサー等を集合的に指す。選択されたコード配列が適切な宿主細胞において複製、転写および翻訳されることが可能である限り、これらの制御配列の全てが常に存在する必要があるわけではない。「プロモーター」なる用語は、本明細書では、その通常の意味で使用され、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチドの領域を指し、ここで、この調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼと結合して下流（３−方向）のコード配列の転写を開始することが可能である遺伝子に由来する。転写プロモーターには、（そのプロモーターに機能可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現がアナライト、コファクター、調節タンパク質等によって誘導される）「誘導性プロモーター」、（そのプロモーターに機能可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現がアナライト、コファクター、調節タンパク質等によって誘導される）「抑制性プロモーター」および「恒常的プロモーター」が包含され得る。
【０２６７】
「異種」なる用語は、通常はつながっていない、および／または特定の細胞と通常は関連していない、配列を表す。従って、核酸コンストラクトまたはプラスミドの「異種」領域は、天然では他方の分子と結び付いて見出されることのない別の核酸分子内の、またはそれに結合した、核酸のセグメントである。異種核酸を含む導入遺伝子は、いくつかの有用な産物をコードし得る。これらには、例えばｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子およびｍｉＲＮＡが包含され得る。あるいは、導入遺伝子は、ホルモンならびに増殖因子および分化因子をコードし得る。
【０２６８】
ＡＡＶプラスミドは、ＡＡＶゲノムの内部部分を全体的または部分的に除去してＩＴＲとＩＴＲの間に目的のＤＮＡ配列を挿入することによって目的の異種ヌクレオチド配列（例えば、治療用タンパク質、アンチセンス核酸分子、リボザイム、ｍｉＲＮＡ等をコードする選択された遺伝子）を保持するように改変されてよい。このようなプラスミドにおいて、ＩＴＲは機能を有したままであり、目的の異種ヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にする。異種ヌクレオチド配列はまた、典型的には、特定の条件下で患者の標的細胞において遺伝子発現を駆動することが可能なプロモーター配列に連結されている。ポリアデニル化部位などの終結シグナルもプラスミドに含まれ得る。
【０２６９】
「発現カセット」なる用語は、少なくとも１つの目的の遺伝子、１つのオープンリーディングフレームおよび３’非翻訳領域（通常、真核生物ではポリアデニル化部位を含む）を含むＤＮＡ核酸配列を指す。
【０２７０】
従って、一般的な実施形態によれば、本発明による発現カセットは、一般式：
［５’ＩＴＲ］−［目的の遺伝子］−［ＰｏｌｙＡ］ｚ−［３’ＩＴＲ］−
を有するＤＮＡ核酸配列を含むか、からなる可能性があり、式中、
［５’ＩＴＲ］および［３’ＩＴＲ］は逆方向末端反復（ＩＴＲ）であり、
［目的の遺伝子］は、目的のタンパク質をコードする任意の遺伝子であり、
［ＰｏｌｙＡ］はポリアデニル化シグナルであり、ｚは０または１であり、
［５’ＩＴＲ］、［目的の遺伝子］、［ＰｏｌｙＡ］および［３’ＩＴＲ］はそれぞれ、任意選択で、１つの追加的なリンカー配列で隔てられていてもよい。
【０２７１】
本発明の意味において、「目的のタンパク質をコードする遺伝子」は、目的のタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列、および好ましくは少なくとも１つのプロモーター、を含む。
【０２７２】
好ましくは、目的の遺伝子は、ヒトＰＤＥ−６βまたはヒトＲＰＥ６５をコードする核酸である。
【０２７３】
一実施形態によれば、ＡＡＶプラスミドは、配列番号１の、ヒトＰＤＥ−６βをコードする核酸を含む発現カセットを含む。
【０２７４】
代替的な一実施形態によれば、ＡＡＶプラスミドは、配列番号７の、ヒトＲＰＥ６５をコードする核酸を含む発現カセットを含む。
【０２７５】
特定の一実施形態によれば、ＡＡＶプラスミドは、配列番号２の、ヒトＰＤＥ−６βをコードする核酸を含む。
【０２７６】
一実施形態によれば、［５’ＩＴＲ］および［３’ＩＴＲ］は、ＡＡＶ−２に由来する逆方向末端反復であり、これらは、好ましくは、それぞれ配列番号３および配列番号４の配列のものである。
【０２７７】
有利なことに、ＡＡＶプラスミドは、ポリアデニル化部位とＡＡＶ２に由来するＩＴＲとヒトＰＤＥ６βをコードする発現カセットとを含む。
【０２７８】
好ましくは、ヒトＰＤＥ６β遺伝子の発現は、好ましくは配列番号５の配列の、ロドプシンキナーゼのプロモーターの制御下にある。
【０２７９】
代替的な実施形態によれば、ＡＡＶプラスミドは、ポリアデニル化部位とＡＡＶ２に由来するＩＴＲとヒトＲＰＥ６５をコードする発現カセットとを含む。
【０２８０】
好ましくは、ヒトＲＰＥ６５遺伝子の発現は、好ましくは配列番号８の配列の、ＲＰＥ６５プロモーターの制御下にある。
【０２８１】
一実施形態によれば、ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）に由来し、好ましくは配列番号６の配列のものである。
【０２８２】
上述の実施形態は、個別に、または組み合わせて、考慮されてよい。
【０２８３】
最も好ましい一実施形態によれば、ＡＡＶプラスミドは、上記で開示されるような、および図１Ａに示されるような、ＰＤＥ６βをコードする核酸を含む発現カセットを含む。
【０２８４】
代替的な一実施形態によれば、ＡＡＶプラスミドは、上記で開示されるような、および図１Ｂに示されるような、ＲＰＥ６５をコードする核酸を含む発現カセットを含む。
【０２８５】
本発明はさらに、上記で定義されるようなＡＡＶプラスミドでトランスフェクトされた宿主細胞、および前記宿主細胞によって産生されるｒＡＡＶ粒子に関する。
【０２８６】
本発明はさらに、遺伝子治療に使用するための、宿主細胞によって産生されるｒＡＡＶ粒子に関する。
【０２８７】
本発明はさらに、上記で説明されるようなＡＡＶプラスミドを含むｒＡＡＶ粒子に関する。特に、本発明はさらに、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびアカゲザル由来血清型（ＡＡＶｒｈ１０を含む）を含む群において選択されるｒＡＡＶ粒子に関する。
【０２８８】
特に、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ１０（すなわちＡＡＶｒｈ１０）および／またはＡＡＶ２の血清型に属するｒＡＡＶ粒子から選択される。
【０２８９】
好ましくは、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ４および／またはＡＡＶ５の血清型に属するｒＡＡＶ粒子から選択される。
【０２９０】
特に、本発明は、上記で定義されるようなヒトＰＤＥ６βをコードする発現カセットを含むＤＮＡを含むｒＡＡＶ５粒子に関する。
【実施例】
【０２９１】
実施例１：イムノアフィニティークロマトグラフィーという第１段階を用いる、ＡＡＶ４粒子を精製するための二段階のクロマトグラフィー
【０２９２】
Ａ．材料および方法
【０２９３】
Ａ１．細胞溶解物の回収
【０２９４】
トランスフェクトされた細胞を、ＣｅｌｌＳｔａｃｋ  １０（ＣＳ１０）の全ての面を軽くたたくことによってトランスフェクションから９６±５時間後に回収する。全懸濁液をＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ（ＢＰＣ）に移す。ウイルス粒子の大部分は上清中に放出される。
【０２９５】
この段階で、ウイルスベクターの大部分は既に上清中に放出されているが、細胞からのＡＡＶ４の抽出を最適化するために、不純物から粒子を分離させるのに寄与するために、および最後に上清中のＡＡＶ４の回収を最適化するために、および次の深層ろ過の工程を最適化するために、０．５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００での処理（１時間、撹拌、室温）が必要である。
【０２９６】
Ａ２．細胞溶解物の清澄化
【０２９７】
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の作用の後に得られた懸濁液をＭｉｌｌｉｐｏｒｅのデプスフィルターＰｏｌｙｓｅｐ  ＩＩ  １／０．２μｍに通してろ過し、細胞の残骸を排除する。ろ過工程の終了時に、空気で押すことによってろ過ユニットを空にする。これが清澄化溶解物である。
【０２９８】
この工程の間に、ＤＮＡおよび可溶性タンパク質の大部分が同様に排除される。
【０２９９】
Ａ３．クロマトグラフィーによるイムノアフィニティー精製工程
【０３００】
この工程は、Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアによって制御されるＡｋｔａ  Ｐｉｌｏｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実施される。清澄化溶解物を１５０ｃｍ／ｈの線流速で注入して、カルシウムおよびマグネシウムを追加したＤＰＢＳで平衡化したＡＶＢカラム（１８５ｍＬの充填マトリックス）に通す。この工程の間に、ＡＡＶがカラムに特異的に結合する。不純物はカラムに結合せず、フロースルー中に排除される。次に、非特異的に結合した物質を洗浄するために、ＤＰＢＳでカラムをリンスする。
【０３０１】
ｐＨ２．０のＰＢＳ緩衝液でＡＡＶを溶出させる。溶出画分を１０％の緩衝液（Ｔｒｉｓ  １Ｍ、ＭｇＣｌ２  ２０ｍＭ、ＣａＣｌ  １０ｍＭ、ｐＨ８．５）で同時に中和する。
【０３０２】
Ｔｒｉｓ緩衝液で中和した溶出画分を、各画分中のＡＡＶの量を検出するためのＱＰＣＲによるＡＡＶの力価測定まで−７０℃未満または−８０℃未満で凍結する。
【０３０３】
Ａ４．第１の選択肢：イムノアフィニティー精製工程の後のＣｓＣｌ勾配
【０３０４】
ＡＶＢカラムから溶出された、ＡＡＶを含む画分をプールする。ＡＡＶを沈殿させ、勾配に好適な体積を得るために、ＰＥＧ８０００を終濃度が８％となるように添加する。８％（ｗ／ｖ）のＰＥＧで一晩沈殿させた後、ＡＡＶを含む懸濁液を４０００ｒｐｍで１時間、４℃にて遠心分離する。
【０３０５】
ＡＡＶを含むペレットを１．３７６ｇ／ｃｍ３の密度のＣｓＣｌ  １２ｍＬ中に再懸濁し、ＳＷ４１ローター用のＵｌｔｒａＣｌｅａｒチューブに移す。この勾配を３８，０００ｒｐｍで４８時間、１５℃にて遠心分離し、完全な粒子を「空の」粒子から分離する。濃縮された完全な粒子のバンドを５または１０ｍＬのシリンジで回収する。次に、このウイルス懸濁液をタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）に供する。
【０３０６】
Ａ５．第２の選択肢：イムノアフィニティー精製工程の後のＣＩＭｍｕｌｔｕｓ陰イオン交換クロマトグラフィー
【０３０７】
この工程は、Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアによって制御されるＡｋｔａ  Ｐｉｌｏｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実現される。
【０３０８】
ＡＶＢカラムから溶出された、ＡＡＶを含む画分をプールし、ダイアフィルトレーションのためのＴＦＦ工程に供する。このＴＦＦ工程の目的は、ＡＶＢからの中和された溶出画分の緩衝液を変更して、ＡＡＶをＣＩＭｍｕｌｔｕｓ  ＱＡカラムに結合させることを可能にすることである。
【０３０９】
次に、ダイアフィルトレーションされたＡＡＶを注入して、カラムへのＡＡＶの結合を促進するために緩衝液１（Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、ｐＨ８．５）で平衡化したＭｏｎｏｌｉｔｈ  ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ  ＱＡカラムに通す。
【０３１０】
ＡＡＶを含む懸濁液の注入の終了時に、カラムを緩衝液１で洗浄して、非特異的に結合している可能性がある全てのものを除去する。
【０３１１】
溶出工程は、緩衝液１（Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、ｐＨ８．５）と緩衝液２（Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １Ｍ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、ｐＨ８．５）との混合の結果である、非常に緩やかな傾きを有するＮａＣｌの塩勾配である。塩の緩徐な増加は、ＡＡＶを徐々に溶出させること、および亜集団が存在する場合には完全な粒子としての亜集団と空の粒子としての亜集団とを分離すること、を可能にする。
【０３１２】
溶出画分をポリプロピレンのボトルに回収し、ＴＦＦまで−７０℃未満または−８０℃未満で保存する。
【０３１３】
Ａ６．タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）
【０３１４】
選択された画分をプールする（体積で約１Ｌ）。３０ＫＤａのカットオフを有するｍＰＥＳ中空糸を用いてＴＦＦを行う。ＡＡＶを眼用塩類溶液（ＳＳ０）に対してダイアフィルトレーションおよび濃縮する。
【０３１５】
プールされた画分をまず、僅かに濃縮し、１０容量の緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、最後に、期待される濃度に達するように濃縮する。ＴＦＦは、残っている小さな不純物を排除すること、ならびに注射用の正しい緩衝液中にウイルスベクターを配合すること、および正しいレベルまで濃縮すること、を可能にする。ろ過、精製および濃縮されたウイルスベクターは、力価測定まで−７０℃未満または−８０℃未満で保存する。
【０３１６】
Ａ７．滅菌ろ過
【０３１７】
患者への注射に必要とされる正確な濃度を得るためにＡＡＶをＳＳＯ（眼用塩類溶液）で希釈し、期待される量に従って最終的な容器に分注する前に０．２μｍのＰＥＳフィルターで滅菌ろ過する。用量は、注射まで−８０℃未満で保存する。
【０３１８】
Ａ８．ｑＰＣＲによるベクターゲノムの濃度（ｖｇ／ｍＬ）
【０３１９】
この方法は、導入遺伝子の発現カセット（導入遺伝子、ポリ（Ａ）、ＩＴＲまたはプロモーター）を標的とする定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によるゲノム含有粒子の定量にある。ｒＡＡＶのサンプルをまず、カプシドで包まれていないＤＮＡを排除するためにＤＮａｓｅで消化する。その後、プロテイナーゼＫでの処理により、ＡＡＶカプシドを分解し、その後のｑＰＣＲによる定量化のためのウイルスＤＮＡを放出させる。
【０３２０】
標的とされるアンプリコンを含むベクタープラスミドを用いてｑＰＣＲ用の検量線を生成する。各アッセイにおいて検量線の安定性および再現性を確実にするために、このプラスミドは、制限エンドヌクレアーゼ消化によって線状化され、分注され、−１８℃以下で保存される。
【０３２１】
１ｅ１０コピーのアンプリコンの算出は、以下の式に基づく：
ＤＮＡの量（ｇ）＝（６６０×プラスミドのサイズ（ｂｐ）×１ｅ１０コピー）／（６．０２×１０ｅ２３）
【０３２２】
ベクターゲノムＤＮＡの相対量は、既知量のアンプリコンＤＮＡを含む検量線から反応あたりのコピー数を外挿することによって割り当てる。
【０３２３】
結果は、１ｍＬあたりのベクターゲノムで表す。
【０３２４】
Ａ９．ＩＣＡによる感染性粒子の濃度（ｉｐ／ｍＬ）
【０３２５】
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）は、ｒＡＡＶのロット中の感染性粒子の定量化を可能にする。このアッセイは、増加する段階希釈のｒＡＡＶベクターで、および野生型のアデノウイルス（５型）で、ＡＡＶ２のｒｅｐおよびｃａｐの配列を安定に保持する許容細胞株（ＨｅＬａＲＣ３２、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２９７２）を感染させることを伴う。従って、細胞内に侵入する感染性のｒＡＡＶ粒子は複製可能であることになる。次に、複製イベントを、導入遺伝子に特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーションの後に化学発光によって検出し、定量化する（Ｓａｌｖｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，  １９９８）。
【０３２６】
感染から２６時間後に、細胞を回収し、溶解し、ナイロンメンブレン上にブロットする。フルオレセインで標識した特異的な導入遺伝子用プローブを用いてハイブリダイゼーションを行う。次に、アルカリホスファターゼを結合させた抗フルオレセイン抗体でシグナルを増幅し、化学発光によって検出する。
【０３２７】
最後に、Ｘ線撮影用フィルムへの露光の後にドットを計数することによって複製イベントを定量化する。
【０３２８】
Ａ１０．ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によるベクターカプシドの純度および識別
【０３２９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法は、タンパク質およびサンプルの他の構成成分を、それらの分子量およびそれらの電荷に応じて分離する、変性条件下でのポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動である。
【０３３０】
電気泳動の後、サンプル中のタンパク質だけを定量化するためにクマシーブルー（Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ）でゲルを染色する。ｒＡＡＶのタンパク質の識別は、それらの分子量（８７、７２および６２ＫＤａ）に関連してＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３と呼称されるＡＡＶの３種のカプシドタンパク質の存在により確認される。ｒＡＡＶのタンパク質の純度は、サンプル中に存在するタンパク質の総量と比較したカプシドタンパク質の相対量として算出される。
【０３３１】
クマシーブルー染色の後に、ＣＣＤカメラを有する発光画像分析器によって電気泳動ゲルを分析する。タンパク質のバンドはそれぞれ、ピークとして検出され、シグナルは分析器によって積分される。次に、各ピークの面積が算出される。１００％の純度の生成物は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の３種のタンパク質のバンドしか含まない。
【０３３２】
Ａ１１．ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によるベクター粒子の定量化
【０３３３】
Ｈｅｕｋｅｓｈｏｖｅｎ  ａｎｄ  Ｄｅｒｎｉｃｋ（Ｈｅｕｋｅｓｈｏｖｅｎ  ａｎｄ  Ｄｅｒｎｉｃｋ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，  １９８５）の方法論に基づく銀染色は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離されたタンパク質および核酸の検出を可能にする。
【０３３４】
検量線に使用されるｒＡＡＶと同じゲル上にサンプルをロードする。ｒＡＡＶ８ＲＳＭ（Ａｙｕｓｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０１４）と同じように作製および特徴付けされ、１００％の完全な粒子を含む、参照対象のｒＡＡＶのロットを用いて検量線を生成する。
【０３３５】
電気泳動の後、ＣＣＤカメラを有する画像分析器を用いてゲルを分析し、ＶＰ３に対応するバンドのシグナルをレーンごとに積分する。サンプル中に存在する全カプシドの量を検量線から外挿し、１ｍＬあたりの粒子で表す。
【０３３６】
完全な粒子／全粒子の比は、以下の計算に基づく：
１ｍＬあたりのベクターゲノムの力価／１ｍＬあたりの粒子の力価
【０３３７】
参考用：Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｌｖｅｒ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｓｉｌｖｅｒ  ｓｔａｉｎｉｎｇ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ６（１９８５）  １０３−１１２，  Ｈｅｕｋｅｓｈｏｖｅｎ，Ｊ．  ａｎｄ  Ｄｅｒｎｉｃｋ，Ｒ．）およびＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ８  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｍａｔｅｒｉａｌ，  Ａｙｕｓｏ  ｅｔ  ａｌ，（Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０１４  Ｏｃｔ  ２）。
【０３３８】
Ａ１２．ｑＰＣＲによる残留宿主細胞ＤＮＡ（ＨＥＫ２９３細胞に由来するアルブミンおよびＥ１Ａ）
【０３３９】
ヒトアルブミン遺伝子またはアデノウイルス５型Ｅ１Ａ遺伝子を標的とするリアルタイム定量的ＰＣＲ法を用いて、残留ヒト宿主細胞ＤＮＡを定量する。
【０３４０】
特定のアンプリコン（アルブミンおよびＥ１Ａ）を含むプラスミドを用いてｑＰＣＲ用の検量線を生成する。各アッセイにおいて検量線の安定性および再現性を確実にするために、このプラスミドは、制限エンドヌクレアーゼ消化によって線状化され、充填され、−１８℃以下で保存される。１ｅ１０コピーのアルブミン遺伝子配列の算出は、以下の計算に基づく：
ＤＮＡの量（ｇ）＝（６６０×プラスミドのサイズ（ｂｐ）×１ｅ１０コピー）／（６．０２×１０ｅ２３）
【０３４１】
アルブミンまたはＥ１ＡのアンプリコンＤＮＡの相対量は、既知量のアルブミンまたはＥ１ＡのアンプリコンＤＮＡを含む検量線から反応あたりのコピー数を外挿することによって割り当てる。
【０３４２】
第２の検量線は、１ウェルあたり５０ｐｇ〜５ｎｇのＨＥＫ２９３細胞株由来ゲノムＤＮＡを用いて実施される。この検量線は、アルブミンまたはＥ１Ａのコピーの量と対応するＨＥＫ２９３のＤＮＡの量（ｎｇ）との間の相関を指し示す。
【０３４３】
Ｂ．結果
【０３４４】
図３Ａおよび図３Ｂは、ＡＶＢカラム上でのイムノアフィニティークロマトグラフィーの工程（図３Ａを参照のこと）からの、ＡＡＶ４粒子を含む清澄化上清の溶出プロファイルを示す。図３Ｂに溶出プロファイルのピークの拡大図をさらに開示する。
【０３４５】
精製方法は、１Ｌスケールで達成される。各工程におけるベクターゲノムの力価測定および最終産物の特性評価は、上述のプロトコルに従って確立され、以下の表に要約される。
【０３４６】
【表１】
2018507707.tif 000002
【０３４７】
【表２】
2018507707.tif 000003
【０３４８】
結論：このプロトコルは、１Ｌスケールにおいて、非常に良好な収率で清澄化上清から臨床グレードのＡＡＶ４調製物を精製するのに効果的である。有利なことに、ＡＶＢカラムイムノクロマトグラフィー工程は、ベクターゲノムの量に中程度に影響するに過ぎない。
【０３４９】
実施例２：イムノアフィニティークロマトグラフィーという第１段階の後に陰イオン交換クロマトグラフィーという第２段階を用いる、ＡＡＶ４粒子を精製するための二段階のクロマトグラフィー（代替的プロトコル）
【０３５０】
Ａ．材料および方法
以下を除いて、実施例１の材料および方法のセクションを実施例２にも適用できる。
【０３５１】
Ａ３．クロマトグラフィーによるイムノアフィニティー精製工程（代替的プロトコル）
【０３５２】
この工程は、Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアによって制御されるＡｋｔａ  Ｐｉｌｏｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実施される。清澄化溶解物を１５０ｃｍ／ｈの線流速で注入して、ＰＢＳで平衡化したＡＶＢカラム（１８５ｍＬの充填マトリックス）に通す。この工程の間に、ＡＡＶがカラムに特異的に結合する。不純物はカラムに結合せず、フロースルー中に排除される。次に、非特異的に結合した物質を洗浄するために、ＰＢＳでカラムをリンスする。
【０３５３】
ｐＨ２．０のＰＢＳ緩衝液でＡＡＶを溶出させる。溶出画分を１０％の緩衝液（Ｔｒｉｓ  １Ｍ、ＭｇＣｌ２  ２０ｍＭ、ＣａＣｌ  １０ｍＭ、ｐＨ８）で同時に中和する。
【０３５４】
Ｔｒｉｓ緩衝液で中和した溶出画分に０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８を追加し、各画分中のＡＡＶの量を検出するためのＱＰＣＲによるＡＡＶの力価測定まで−７０℃未満または−８０℃未満で凍結する。
【０３５５】
Ａ４．第１の選択肢：イムノアフィニティー精製工程の後のＣｓＣｌ勾配（代替的プロトコル）
【０３５６】
ＡＶＢカラムから溶出された、ＡＡＶを含む画分をプールする。ＡＡＶを濃縮し、勾配に好適な体積を得るために、ＡＡＶの画分のプールを、０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８を含む眼用塩類溶液に対するタンジェンシャルフローろ過に供する。
【０３５７】
ダイアフィルトレーションされたＡＡＶを１．３７６ｇ／ｃｍ３の密度のＣｓＣｌ  １２ｍＬ中に再懸濁し、ＳＷ４１ローター用のＵｌｔｒａＣｌｅａｒチューブに移す。この勾配を３８，０００ｒｐｍで４８時間、１５℃にて遠心分離し、完全な粒子を「空の」粒子から分離する。濃縮された完全な粒子のバンドを５または１０ｍＬのシリンジで回収する。次に、このウイルス懸濁液をタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）に供する。
【０３５８】
Ａ５．第２の選択肢：イムノアフィニティー精製工程の後のＣＩＭｍｕｌｔｕｓ陰イオン交換クロマトグラフィー（代替的プロトコル）
【０３５９】
この工程は、Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアによって制御されるＡｋｔａ  Ｐｉｌｏｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実現される。
【０３６０】
ＡＶＢカラムから溶出された、ＡＡＶを含む画分をプールし、ダイアフィルトレーションのためのＴＦＦ工程に供する。このＴＦＦ工程の目的は、ＡＶＢからの中和された溶出画分の緩衝液を変更して、ＡＡＶをＣＩＭｍｕｌｔｕｓ  ＱＡカラムに結合させることを可能にすることである。
【０３６１】
ＩＥＸクロマトグラフィー工程の間に使用される緩衝液は全て、０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８を含む
【０３６２】
ダイアフィルトレーションされたＡＡＶを注入して、カラムへのＡＡＶの結合を促進するために緩衝液１（Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、ｐＨ９）で平衡化したＭｏｎｏｌｉｔｈ  ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ  ＱＡカラムに通す。
【０３６３】
ＡＡＶを含む懸濁液の注入の終了時に、カラムを緩衝液１で洗浄して、非特異的に結合している可能性がある全てのものを除去する。
【０３６４】
溶出工程は、緩衝液１（Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、ｐＨ８）と緩衝液２（Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ５００ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、ｐＨ８）との混合の結果である、非常に緩やかな傾きを有するＮａＣｌの塩勾配である。塩の緩徐な増加は、ＡＡＶを徐々に溶出させること、および亜集団が存在する場合には完全な粒子としての亜集団と空の粒子としての亜集団とを分離すること、を可能にする。
【０３６５】
溶出画分をポリプロピレンのボトルに回収し、ＴＦＦまで−７０℃未満または−８０℃未満で保存する。
【０３６６】
Ａ６．タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）（代替的プロトコル）
【０３６７】
選択された画分をプールする（体積で約０．５Ｌ）。１００ＫＤａのカットオフを有するｍＰＥＳ中空糸を用いてＴＦＦを行う。ＡＡＶを、０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８を含む眼用塩類溶液（ＳＳ０）に対してダイアフィルトレーションおよび濃縮する。
【０３６８】
プールされた画分をまず、僅かに濃縮し、１０容量の緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、最後に、期待される濃度に達するように濃縮する。ＴＦＦは、残っている小さな不純物を排除すること、ならびに注射用の正しい緩衝液中にウイルスベクターを配合すること、および正しいレベルまで濃縮すること、を可能にする。ろ過、精製および濃縮されたウイルスベクターは、力価測定まで−７０℃未満または−８０℃未満で保存する。
【０３６９】
Ａ７．滅菌ろ過（代替的プロトコル）
【０３７０】
注射に必要とされる正確な濃度を得るためにＡＡＶを、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８を含むＳＯＳ（眼用塩類溶液）で希釈し、期待される量に従って最終的な容器に分注する前に０．２μｍのＰＥＳフィルターで滅菌ろ過する。用量は、注射まで−７０℃未満または−８０℃未満で保存する。
【０３７１】
Ｂ．結果
【０３７２】
Ｂ１．１ＬスケールでのＡＡＶ４の結果
【０３７３】
精製方法は、１Ｌスケールで達成される。表３に示されるように、第２段階は、ＩＥＸクロマトグラフィー工程またはＣｓＣｌ勾配のいずれかである。各工程におけるベクターゲノムの力価測定は、以下の表に要約される。
【０３７４】
【表３】
2018507707.tif 000004
【０３７５】
Ｂ２．３ＬスケールでのＡＡＶ４の結果
【０３７６】
これは３Ｌスケールの例であり、ここで、ＡＡＶ４は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００での抽出、深層ろ過、アフィニティークロマトグラフィー工程、ＴＦＦ、ＩＥＸクロマトグラフィー工程、ＴＦＦおよび０．２μｍでの滅菌ろ過を含む上記で説明されるプロセスで精製される。
【０３７７】
ベクターゲノムの力価測定による、各工程の結果は、表４に要約される。
【０３７８】
溶出プロファイルをＩＥＸクロマトグラフィー工程から得る。各画分を、銀染色されたＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分析する。画分は全て、同じベクターゲノム量でロードした。カプシドタンパク質のシグナル（第１画分においてより重要）、ならびに２８０ｎｍおよび２５４ｎｍにおける吸光度の曲線の比は、溶出された第１画分が、大抵の場合、空のカプシドに汚染されているということを示す。
【０３７９】
選択された画分は、大抵の場合、完全なカプシドを含む。
【０３８０】
各画分のカプシドタンパク質の強度を、２回のＣｓＣｌ勾配によるプロセスでの精製によって得られた、９０％超の完全な粒子を含む参照用のＡＡＶ４調製物と比較した。
【０３８１】
【表４】
2018507707.tif 000005
【０３８２】
【表５】
2018507707.tif 000006
【０３８３】
ＡＡＶ４に対するＨｅＬａ細胞の許容度が低いためにｖｇ／ｐｉの比が非常に高いということが留意されるべきである。それにもかかわらず、この比は、ＡＡＶ４の参照用調製物の比に匹敵する。
【０３８４】
結論：このプロトコルは、３Ｌスケールにおいて、非常に良好な収率で清澄化上清から臨床グレードのＡＡＶ４調製物を精製するのに効果的である。有利なことに、ＩＥＸカラムクロマトグラフィー工程は、完全な粒子の量に影響する。
【０３８５】
実施例３：イムノアフィニティークロマトグラフィーという第１段階の後にＣｓＣｌ勾配または陰イオン交換クロマトグラフィーという第２段階を用いる、ＡＡＶｒｈ１０粒子を精製するための二段階のクロマトグラフィー（代替的プロトコル）
【０３８６】
Ａ．材料および方法
以下を除いて、実施例１の材料および方法のセクションを実施例３にも適用できる。
【０３８７】
Ａ１．細胞溶解物の回収（代替的プロトコル）
【０３８８】
２Ｌのバイオリアクターにおいてバキュロウイルスに感染させた昆虫Ｓｆ９細胞を、感染から９６±５時間後に回収する。全懸濁液をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理する（終濃度０．５％（ｖ／ｖ）、２７℃、２．５時間）。ウイルス粒子の大部分は上清中に放出される。
【０３８９】
Ａ３．クロマトグラフィーによるイムノアフィニティー精製工程（代替的プロトコル）
【０３９０】
この工程は、Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアによって制御されるＡｋｔａ  Ｐｉｌｏｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実施される。清澄化細胞溶解物を６０ｃｍ／ｈの線流速で注入して、カルシウムおよびマグネシウムを追加したＤＰＢＳで平衡化したＡＶＢカラム（１８５ｍＬの充填マトリックス）に通す。この工程の間に、ＡＡＶがカラムに特異的に結合する。不純物はカラムに結合せず、フロースルー中に排除される。次に、非特異的に結合した物質を洗浄するために、ＤＰＢＳでカラムをリンスする。
【０３９１】
３００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．４）でＡＡＶを溶出させる。溶出画分を１０％の緩衝液（Ｔｒｉｓ  １Ｍ、ＭｇＣｌ２  ２０ｍＭ、ＣａＣｌ  １０ｍＭ、ｐＨ８．５）で同時に中和する。
【０３９２】
Ａ４．第１の選択肢：イムノアフィニティー精製工程の後のＣｓＣｌ勾配（代替的プロトコル）
【０３９３】
ＡＶＢカラムから溶出された、ＡＡＶのピーク（２８０ｎｍおよび２５４ｎｍにおける吸光度の測定によって検出）を含む画分をプールする。ＡＡＶを濃縮し、勾配に好適な体積を得るために、ＡＡＶの画分のプールを、４℃で一晩、ＰＥＧ８０００による沈殿に供した後、４０００ｒｐｍで１時間、４℃にて遠心分離する。ペレットを１．３７６ｇ／ｃｍ３の密度のＣｓＣｌ  １２ｍＬ中に再懸濁し、ＳＷ４１ローター用のＵｌｔｒａＣｌｅａｒチューブに移す。この勾配を３８，０００ｒｐｍで４８時間、１５℃にて遠心分離し、完全な粒子を「空の」粒子から分離する。濃縮された完全な粒子のバンドを５または１０ｍＬのシリンジで回収する。次に、このウイルス懸濁液を、カルシウムおよびマグネシウムを含むＤＰＢＳに対する透析に供する。透析されたウイルス懸濁液に０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８を追加し、−８０℃未満で凍結する。
【０３９４】
Ａ５．第２の選択肢：イムノアフィニティー精製工程の後のＰＯＲＯＳ  ＨＱ陰イオン交換クロマトグラフィー（代替的プロトコル）
【０３９５】
この工程は、Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアによって制御されるＡｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実現される。
【０３９６】
ＡＶＢカラムから溶出された、ＡＡＶを含む画分をプールし、０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８を追加し、４℃で一晩保存する。翌日、このＡＡＶのプールをダイアフィルトレーションのためのＴＦＦ工程に供する。このＴＦＦ工程の目的は、ＡＶＢからの中和された溶出画分の緩衝液を変更して、ＡＡＶをＰＯＲＯＳ  ＨＱカラムに結合させることを可能にすることである。
【０３９７】
ダイアフィルトレーションされたＡＡＶを注入して、カラムへのＡＡＶの結合を促進するために緩衝液１（Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、ｐＨ８．５）で平衡化したＰＯＲＯＳ  ＨＱカラムに通す。
【０３９８】
ＡＡＶを含む懸濁液の注入の終了時に、カラムを緩衝液１で洗浄して、非特異的に結合している可能性がある全てのものを除去する。
【０３９９】
溶出工程は、緩衝液２（Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ、クエン酸ナトリウム  １０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、ｐＨ８、０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８）と緩衝液３（Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ、クエン酸ナトリウム  ５００ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、ｐＨ８、０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８）との混合の結果である、非常に緩やかな傾きを有するクエン酸ナトリウムの塩勾配である。塩の緩徐な増加（４０カラム体積において７０％の緩衝液３を得る勾配）は、ＡＡＶを徐々に溶出させること、および亜集団が存在する場合には完全な粒子としての亜集団と空の粒子としての亜集団とを分離すること、を可能にする。
【０４００】
溶出画分をポリプロピレンのチューブに回収し、ＴＦＦまで−８０℃未満で保存する。
【０４０１】
Ａ６．タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）（代替的プロトコル）
【０４０２】
選択された画分をプールする。１００ＫＤａのカットオフを有するｍＰＥＳ中空糸を用いてＴＦＦを行う。ＡＡＶを、カルシウムおよびマグネシウムと共に０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８を含むＤＰＢＳに対してダイアフィルトレーションおよび濃縮する。
【０４０３】
プールされた画分をまず、僅かに濃縮し、１０容量の緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、最後に、期待される濃度に達するように濃縮する。ろ過、精製および濃縮されたウイルスベクターは、力価測定まで−８０℃未満で保存する。
【０４０４】
Ｂ．結果
【０４０５】
Ｂ１．１ＬスケールでのＡＡＶｒｈ１０の結果
【０４０６】
精製方法は、１Ｌスケールで達成される。表６に示されるように、第２段階は、ＣｓＣｌ勾配またはＩＥＸクロマトグラフィー工程のいずれかである。各工程におけるベクターゲノムの力価測定は、以下の表に要約される。
【０４０７】
【表６】
2018507707.tif 000007
【０４０８】
実施例４：イムノアフィニティークロマトグラフィーという第１段階の後にＣｓＣｌ勾配という第２段階を用いる、ＡＡＶ２粒子を精製するための二段階のクロマトグラフィー（代替的プロトコル）
【０４０９】
Ａ．材料および方法
以下を除いて、実施例１の材料および方法のセクションを実施例４にも適用できる。
【０４１０】
Ａ１．細胞溶解物の回収（代替的プロトコル）
【０４１１】
２Ｌのバイオリアクターにおいてバキュロウイルスに感染させた昆虫Ｓｆ９細胞を、感染から９６±５時間後に回収する。全懸濁液をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理する（終濃度０．５％（ｖ／ｖ）、２７℃、２．５時間）。ヌクレアーゼ消化という追加的工程は、３７℃でさらに２時間、５Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼを添加することにより実現される。
【０４１２】
Ａ３．クロマトグラフィーによるイムノアフィニティー精製工程（代替的プロトコル）
【０４１３】
この工程は、Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアによって制御されるＡｋｔａ  Ｐｉｌｏｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実施される。清澄化溶解物を１１５ｃｍ／ｈの線流速で注入して、カルシウムおよびマグネシウムを追加したＤＰＢＳで平衡化したＡＶＢカラム（１８５ｍＬの充填マトリックス）に通す。この工程の間に、ＡＡＶがカラムに特異的に結合する。不純物はカラムに結合せず、フロースルー中に排除される。次に、非特異的に結合した物質を洗浄するために、ＤＰＢＳでカラムをリンスする。
【０４１４】
３００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．４）でＡＡＶを溶出させる。溶出画分を１０％の緩衝液（Ｔｒｉｓ  １Ｍ、ＭｇＣｌ２  ２０ｍＭ、ＣａＣｌ  １０ｍＭ、ｐＨ８．５）で同時に中和する。
【０４１５】
Ａ４．第１の選択肢：イムノアフィニティー精製工程の後のＣｓＣｌ勾配（代替的プロトコル）
【０４１６】
ＡＶＢカラムから溶出された、ＡＡＶのピーク（２８０ｎｍおよび２５４ｎｍにおける吸光度の測定によって検出）を含む画分をプールする。ＡＡＶを濃縮し、勾配に好適な体積を得るために、ＡＡＶの画分のプールを、４℃で一晩、ＰＥＧ８０００による沈殿に供した後、４０００ｒｐｍで１時間、４℃にて遠心分離する。ペレットを１．３７６ｇ／ｃｍ３の密度のＣｓＣｌ  １２ｍＬ中に再懸濁し、ＳＷ４１ローター用のＵｌｔｒａＣｌｅａｒチューブに移す。この勾配を３８，０００ｒｐｍで４８時間、１５℃にて遠心分離し、完全な粒子を「空の」粒子から分離する。濃縮された完全な粒子のバンドを５または１０ｍＬのシリンジで回収する。次に、このウイルス懸濁液を、カルシウムおよびマグネシウムを含むＤＰＢＳに対する透析に供する。透析されたウイルス懸濁液に０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８を追加し、−８０℃未満で凍結する。
【０４１７】
Ａ７．滅菌ろ過
【０４１８】
期待される量に従って最終的な容器に分注する前に０．２μｍのＰＥＳフィルターでＡＡＶをろ過する。用量は、−８０℃未満で保存する。
【０４１９】
Ｂ．結果
【０４２０】
Ｂ１．１ＬスケールでのＡＡＶ２の結果
【０４２１】
精製方法は、１Ｌスケールで達成される。表７に示されるように、第２段階はＣｓＣｌ勾配である。各工程におけるベクターゲノムの力価測定は、以下の表に要約される。
【０４２２】
【表７】
2018507707.tif 000008
【０４２３】
実施例５：本発明の方法と陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを含むｒＡＡＶ粒子を精製するための方法との間での比較
【０４２４】
Ａ．材料および方法
【０４２５】
陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを含む方法の説明
トランスフェクトされた細胞を、ＣｅｌｌＳｔａｃｋ  ５（ＣＳ５）の全ての面を軽くたたくことによってトランスフェクションから４８〜７２時間後に回収した。高圧ホモジナイザー（Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ  Ｃ５５、Ａｖｅｓｔｉｎ）において９００±５０ｂａｒでホモジナイズすることによってＡＡＶ４の全懸濁液を溶解させた。この系における圧力低下は細胞の破壊をもたらし、上清中へのＡＡＶ粒子の抽出および細胞の残骸のサイズの減少を可能にする。
【０４２６】
ホモジナイズされた細胞溶解物をＭｉｌｌｉｓｔａｃｋ  ＣＯＨＣユニット（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびＰＥＳ０．５／０．２μｍフィルターにより深層ろ過して細胞の残骸を除去する。
【０４２７】
Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）工程により清澄化細胞溶解物をプレ精製および濃縮した。この陰イオン交換膜は、高流速にてＡＡＶを膜に結合させること、ならびに、その後にＮａＣｌでＡＡＶを選択的に溶出させ、約８０％のＤＮＡ不純物および５０％のタンパク質不純物を排除すること、を可能にする。溶出体積が少ないため、ＡＡＶ生成物を１００倍濃縮することが可能である。
【０４２８】
プレ精製されたＡＡＶは、−８０℃未満で保存した。
【０４２９】
Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑからのプレ精製されたＡＡＶを、陽イオン交換特性および疎水性相互作用特性を伴うマルチモーダルなクロマトグラフィーマトリックスであるＣａｐｔｏ  ＭＭＣカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってさらに精製した。６００ｍＭのＮＨ４Ｃｌを含む緩衝液でＡＡＶ４を溶出させ、−８０℃未満で保存した。
【０４３０】
Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣからの溶出されたＡＡＶを希釈して、最後のクロマトグラフィー担体であるＣａｐｔｏ  Ｑカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合するように導電率およびｐＨのパラメータを調整した。この陰イオン交換工程は、１８０ｍＭのＮａＣｌを含むＴｒｉｓ緩衝液でＡＡＶが溶出された洗練工程である。
【０４３１】
Ｃａｐｔｏ  Ｑからの溶出されたＡＡＶを、ＡＡＶの製剤化および濃縮を可能にする１００ＫＤａの中空糸（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションされたＡＡＶを−８０℃未満で保存し、最後に０．２μｍで滅菌ろ過した。
【０４３２】
本発明の方法の説明
実施例１で説明されるような本発明の方法に従ってｒＡＡＶ４粒子を精製した。
【０４３３】
Ｂ．結果
【０４３４】
陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを含む方法で得られた全収率が約１〜２％であるのに対し、本発明の方法で得られた全収率は少なくとも２０％である。
【０４３５】
【表８】
2018507707.tif 000009
【図１Ａ】
2018507707.tif 000010
【図１Ｂ】
2018507707.tif 000011
【図２】
2018507707.tif 000012
【図３Ａ】
2018507707.tif 000013
【図３Ｂ】
2018507707.tif 000014
【配列表】
2018507707000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年10月12日(2017.10.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を得るための方法であって、
（ａ）ｒＡＡＶ粒子を産生する細胞から事前に取得された出発材料の深層ろ過を行う工程であって、前記出発材料が細胞溶解物および／または培養上清を含む、それによりｒＡＡＶ含有清澄化組成物が提供される工程と、
（ｂ）前記ｒＡＡＶ含有清澄化組成物をイムノアフィニティー精製のステップに供する工程であって、それにより第１のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｃ）前記第１のｒＡＡＶ濃縮組成物を少なくとも１回、
（ｃ１）塩勾配を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における陰イオン交換クロマトグラフィーのステップであって、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供されるステップ；または
（ｃ２）密度勾配遠心分離のステップであって、ｒＡＡＶ含有画分が回収される、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供されるステップ；
に供する工程と、
（ｄ）前記第２のｒＡＡＶ濃縮組成物をタンジェンシャルフローろ過のステップに供する工程であって、それにより、精製された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子が提供される工程と、
を含む方法。
【請求項２】
前記ｒＡＡＶ粒子に向けられた抗体またはその断片が固定されているクロマトグラフィー担体を用いて工程（ｂ）が実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体またはその断片がモノクローナルである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体またはその断片がラクダ科動物の抗体またはその断片である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
ＡＶＢ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）担体を用いて工程（ｂ）が実施される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｃ１）において、クロマトグラフィー担体が、モノリス型クロマトグラフィー担体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
２０ｋＤａ〜１５０ｋＤａの範囲の分子量カットオフ値を有するフィルター膜を用いて工程（ｄ）が実施される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびアカゲザル由来血清型（ＡＡＶｒｈ１０を含む）ならびにそれらの混合物からなる群より選択されるＡＡＶ血清型に属する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ４に属する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ｒＡＡＶ粒子が、ヒトＲＰＥ６５をコードする発現カセットを含むＤＮＡを含むｒＡＡＶ４粒子からなる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ５に属する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ｒＡＡＶ粒子が、ヒトＰＤＥ６βをコードする発現カセットを含むＤＮＡを含むｒＡＡＶ５粒子からなる、請求項１〜８または１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記精製されたｒＡＡＶ粒子が、遺伝子治療における使用に適している、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2018507707.tif 000015
2018507707.tif 000016
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