(57)【要約】  本発明は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含むダイマーに関し、ここで、前記第１および第２のポリペプチドの各々は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）と、システイン部分を（好ましくはＣ末端において）含むＣ末端伸長とを含み、ここで、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとは、前記第１のポリペプチドのシステイン部分と前記第２のポリペプチドのシステイン部分との間のジスルフィド結合を介して、共有結合により連結されており、ここで、ダイマーは、多様なアッセイにおいて、ベンチマークコンストラクト、例えばコグネートな多価および多重特異性コンストラクトより優れている。本発明は、本発明のダイマーを作製するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイマーを作製する方法であって、少なくとも以下のステップ：
（ｉ）第１のポリペプチドを提供すること、ここで、前記第１のポリペプチドは、
−  少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）および
−  システイン部分を、好ましくはＣ末端において含む、Ｃ末端伸長
を含む；
（ｉｉ）第２のポリペプチドを提供すること、ここで、前記第２のポリペプチドは、
−  少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）および
−  システイン部分を、好ましくはＣ末端において含む、Ｃ末端伸長
を含む；ならびに
（ｉｉｉ）前記第１のポリペプチドのＣ末端における前記システイン部分のチオール部分および前記第２のポリペプチドのＣ末端における前記システイン部分のチオール部分を、任意に、酸化性銅イオン（Ｃｕ２＋）を添加することにより、および好ましくはｐＨ６．５〜ｐＨ７．５において、ジスルフィド誘導型シスチンへと酸化すること；
（ｉｖ）任意に、ジスルフィド誘導型シスチンを、シスチンから誘導される２個のシステイン残基の間に架橋を形成するコンジュゲート剤と反応させること、ここで、前記コンジュゲート剤は、式（Ｉ）：
【化１】
2018509394.tif 000033
の官能基を含み、
ここで、
Ｗは、電子求引性基を表し；Ａは、Ｃ１〜５アルキレンもしくはアルケニレン鎖を表し；Ｂは、結合またはＣ１−４アルキレンもしくはアルケニレン鎖を表し；および、各々のＬは、独立して、脱離基を表す；を含み、ISVDの完全性が維持されることを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
コンジュゲート剤が、式（Ｉａ）：
【化２】
2018509394.tif 000034
ここで、Ｑは、連結基を表し、Ｄは、診断、治療もしくは標識剤（例えば薬物など）、または診断、治療もしくは標識剤（例えば薬物など）のための結合剤（例えばリンカー）を表す、
の官能基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
コンジュゲート剤が、式（Ｉｂ）の官能基を含み、ここで、Ｗは、シアノ基を表し：
【化３】
2018509394.tif 000035
ここで、Ｑは、連結基を表し、Ｄは、診断、治療もしくは標識剤（例えば薬物など）、または診断、治療もしくは標識剤（例えば薬物など）のための結合剤（例えばリンカー）を表す、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
コンジュゲート剤が、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）あるいは（ＩＶ）：
【化４】
2018509394.tif 000036
ここで、ＸおよびＸ’のうちの一方は、ポリマーを表し、他方は、水素原子を表し；
Ｑは、連結基を表し；
Ｗは、電子求引性基を表すか；または、Ｘ’がポリマーを表す場合、Ｘ−Ｑ−Ｗは、一緒に、電子求引性基を表してもよく；
Ａは、Ｃ１〜５アルキレンもしくはアルケニレン鎖を表し；
Ｂは、結合またはＣ１〜４アルキレンもしくはアルケニレン鎖を表し；ならびに
各々のＬは、独立して、脱離基を表す；
【化５】
2018509394.tif 000037
ここで、Ｘ、Ｘ’、Ｑ、Ｗ、ＡおよびＬは、一般式ＩＩについて示される意味を有し、加えて、Ｘがポリマーを表す場合、Ｘ’および電子求引性基Ｗは、介在原子と一緒に、環を形成してもよく、ｍは、整数１、２、３または４を表す；あるいは
Ｘ−Ｑ−Ｗ−ＣＲ１Ｒ１’−ＣＲ２．Ｌ．Ｌ’                    （ＩＶ）
ここで、Ｘ、ＱおよびＷは、一般式ＩＩについて示される意味を有し、
Ｒ１は、水素原子またはＣ１〜４アルキル基を表し、Ｒ１’は、水素原子を表し、ＬおよびＬ’の各々は、独立して、脱離基を表す；または
Ｒ１は、水素原子またはＣ１〜４アルキル基を表し、Ｌは、脱離基を表し、および
Ｒ１とＬ’とは、一緒に、結合を表す；または
Ｒ１とＬとは、一緒に、結合を表し、Ｒ１とＬ’とは、一緒に、結合を表し；ならびに
Ｒは、水素原子またはＣ１〜４アルキル基を表す、
の官能基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
薬物が、細胞分裂阻害剤、細胞傷害剤、化学療法剤、増殖阻害剤、トキシン（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素活性トキシン、またはそのフラグメント）、トキシン部分、および放射性同位元素からなる群より選択される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
薬物が、MMAEである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
結合剤が、診断、治療または標識剤のためのリンカーである、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドが、マレイミド-val-cit-MMAEをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
リンカーが、非切断可能リンカーである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
リンカーが、細胞の酵素（例えば細胞エステラーゼ、カテプシンＢなどの細胞プロテアーゼ）のための切断部位を含む切断可能リンカー、例えばｐＨ切断可能リンカーである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
薬物対ダイマー比（ＤＡＲ）が、１である、請求項２、３または５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
第１および第２のポリペプチドの少なくとも８０％、例えば８５％、９０％、９５％、９９％またはそれより多く、例えば１００％が、二量体化されることが、例えば質量分析により決定される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
好ましくは分子ふるいクロマトグラフィーを介して、ダイマーを精製するステップをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとが、同一である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとが異なる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドが、システイン部分を、好ましくはＣ末端において含む、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１アミノ酸残基のＣ末端伸長を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
Ｃ末端伸長が、ポリペプチド中の最Ｃ末端に位置するISVDのＣ末端に遺伝子融合される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含むダイマーであって、
ここで、前記第１のポリペプチドは、
−  少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）および
−  システイン部分を（好ましくはＣ末端において）含むＣ末端伸長
を含み；
ここで、前記第２のポリペプチドは、
−  少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）および
−  システイン部分を（好ましくはＣ末端において）含むＣ末端伸長
を含み；および
ここで、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとは、前記第１のポリペプチドのＣ末端伸長中のシステイン部分（Ｃ）のチオエーテル結合および前記第２のポリペプチドのＣ末端伸長中のシステイン部分（Ｃ）のチオエーテル結合を介して、式（Ｖ）または式（ＶＩ）による化合物
【化６】
2018509394.tif 000038
と、共有結合により連結されており、
ここで、
「−Ｃ−」は、本発明のポリペプチドのＣ末端伸長中のシステイン部分を表し；
「−Ｃ」は、本発明のポリペプチドのＣ末端伸長のＣ末端におけるシステイン部分を表し；
Ｒ１は、Ｃ１〜４アルキル基を表し；Ｄは、診断、治療もしくは標識剤（例えば薬物など）、または診断、治療もしくは標識剤（例えば薬物など）のための結合剤（例えばリンカー）を表す、
前記ダイマー。
【請求項１９】
薬物が、細胞分裂阻害剤、細胞傷害剤、化学療法剤、増殖阻害剤、トキシン（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素活性トキシン、またはそのフラグメント）、トキシン部分、および放射性同位元素からなる群より選択される、請求項１８に記載のダイマー。
【請求項２０】
薬物が、MMAEである、請求項１８または１９に記載のダイマー。
【請求項２１】
マレイミド-val-cit-MMAEを含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のダイマー。
【請求項２２】
結合剤が、診断、治療または標識剤のためのリンカーである、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のダイマー。
【請求項２３】
リンカーが、非切断可能リンカーである、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のダイマー。
【請求項２４】
リンカーが、細胞の酵素（例えば細胞エステラーゼ、カテプシンＢなどの細胞プロテアーゼ）のための切断部位を含む切断可能リンカー、例えばｐＨ切断可能リンカーである、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載のダイマー。
【請求項２５】
薬物対ダイマー比（ＤＡＲ）が、１である、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のダイマー。
【請求項２６】
ダイマーが、競合FACSにより決定されるとき、最高でも１００ｎＭ、例えば５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、好ましくはさらに最高でも２ｎＭ、例えば１ｎＭのＩＣ５０で標的に結合する、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載のダイマー。
【請求項２７】
ダイマーが、好ましくは競合FACSにより決定されるとき、ベンチマークのＩＣ５０より少なくとも１０％、例えば２０％、３０％、５０％、８０％、９０％、または１００％も良好なＩＣ５０で標的に結合する、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載のダイマー。
【請求項２８】
ダイマーが、好ましくは競合FACSにより決定されるとき、ベンチマークのＩＣ５０より少なくとも２倍、例えば３倍または４倍、および５倍または１０倍も良好なＩＣ５０で標的に結合する、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載のダイマー。
【請求項２９】
第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドが、システイン部分を（好ましくはＣ末端において）含む、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１アミノ酸残基のＣ末端伸長を含む、請求項１８〜２８のいずれか一項に記載のダイマー。
【請求項３０】
Ｃ末端伸長が、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＣｙｓ（配列番号４）、ＧｌｙＧｌｙＣｙｓ（配列番号３）、ＧｌｙＣｙｓ（配列番号２）またはＣｙｓ（配列番号１）からなる、請求項２９に記載のダイマー。
【請求項３１】
Ｃ末端伸長が、配列番号１〜１５からなる群より選択される、請求項２９に記載のダイマー。
【請求項３２】
第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとが同一である、請求項１８〜３１のいずれか一項に記載のダイマー。
【請求項３３】
第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとが異なる、請求項１８〜３１のいずれか一項に記載のダイマー。
【請求項３４】
がんの処置における使用のための請求項１８〜３３のいずれか一項に記載のダイマーであって、内部移行する、前記ダイマー。
【請求項３５】
がんの処置のための医薬の製造のための請求項１〜３３のいずれか一項に記載のダイマーであって、内部移行する、前記ダイマーの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含むダイマーに関し、ここで、前記第１および第２のポリペプチドの各々は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）と、システイン部分を（好ましくはＣ末端において）含むＣ末端伸長とを含み、ここで、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとは、前記第１のポリペプチドのシステイン部分と前記第２のポリペプチドのシステイン部分との間のジスルフィド結合を介して、共有結合により連結されており、ここで、ダイマーは、多様なアッセイにおいて、ベンチマークコンストラクト、例えばコグネートな多価および多重特異性コンストラクトより優れている。本発明は、本発明のダイマーを作製するための方法を提供する。本発明はさらに、本発明の方法により入手可能な可変ドメイン（本明細書において定義されるとおり）および１つ以上の可変ドメインを含むポリペプチド（また「本発明のポリペプチド」とも称される）、ならびに、１つ以上の基、残基または部分にカップリングされた、かかる可変ドメインおよび／またはポリペプチドを含む化合物（また「本発明の化合物」とも称される）を提供する。
【０００２】
本発明はまた、かかる可変ドメインおよび／またはポリペプチドをコードする核酸；かかる核酸を含むか、ならびに／あるいは、かかる可変ドメインおよび／またはポリペプチドを発現するかまたはこれを発現することができる宿主細胞；かかる可変ドメインおよび／またはポリペプチド、化合物、核酸および／または宿主細胞を含む組成物、および特に医薬組成物；ならびに、特に標識、予防、治療または診断の目的のための、かかる可変ドメイン、ポリペプチド、核酸、宿主細胞および／または組成物の使用に関する。
本発明の他の側面、態様、利点および用途は、本明細書におけるさらなる説明から明らかとなるであろう。
【背景技術】
【０００３】
背景
治療のために承認されている２０を超える、および臨床開発におけるより多くのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）により、このクラスの分子は、多様な疾患について確立された処置モダリティーとなってきた（Reichert（2011）MAbs 3：76-99；Nelson et al. (2010）Nat Rev Drug Discov 9：767-74）。しかし、がんまたは炎症性障害などの複雑な疾患は、通常は、本質的に多因子性であり、これは、疾患を媒介するリガンドおよび受容体の重複、ならびにシグナル伝達経路間のクロストークを含む。複数の標的または１つの標的上の複数の部位の遮断は、改善された治療効力をもたらす筈である。慣用的なモノクローナル抗体治療は、顕著な抗腫瘍活性を導入する限定的な能力を有し、このことが、２つの異なる抗原に同時に結合することができる二重特異性抗体の開発をもたらしてきた（Kontermann（2012）mAbs 4：182-197）。過去１０年間、二重特異性抗体による二重ターゲティングが、組み合わせ治療または混合物の使用に対する代替として出現してきた。二重特異性抗体による二重ターゲティングは、１つの薬物による複数の疾患を調節する分子のターゲティングに基づく。技術的および規制の観点から、このことが開発をより複雑でないものとする。なぜならば、製造、前臨床および臨床試験が、単一の二重特異性分子へ縮小されるからである（Kontermann (2012)上記）。組み合わせではなく、単一の二重ターゲティング薬物による治療はまた、患者にとってもより複雑でないものとなるであろう。
【０００４】
二重特異性抗体は、生化学的または遺伝子的手段を介して生成することができる。組み換え技術は、多様な範囲の二重特異性抗体を生成し、過去２０年間において４５の形式を生み出してきた（Byrne et al (2013) Trends Biotechnol. 31, 621-32）。この多様なトポロジーにも関わらず、アプローチは、全てのタンパク質の組み合わせについて好適なわけではない。ＮまたはＣ末端を介するタンパク質の融合は、しばしば生理活性の低下または喪失をもたらし、フォールディングおよびプロセッシングにおける混乱に起因する発現量の変動性が観察され得る（Schmidt (2009) Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 12, 284-295；Baggio et al. (2004) Diabetes 53, 2492-2500；Chames and Baty (2009) mAbs 1, 539-47）。
【０００５】
二重特異性治療剤を生成する代替的アプローチは、ホモまたはヘテロ二官能性カップリング試薬を用いる化学的コンジュゲーションである（Doppalapudi et al. (2010）Proc Natl Acad Sci USA 107：22611-6）。現在までのところ、これは、かかるコンジュゲートを生成する方法としてあまり成功していなかった。この領域において使用される科学技術における根本的欠陥は、リジン残基を修飾することに対するそれらの依存性であった。慣用的な抗体１つあたり平均１００個のリジン残基が存在し、それらの分布は、抗体またはそのフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆｃおよび免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）領域の表面トポロジー全体にわたって均一である。したがって、リジン残基を用いるコンジュゲーション技術は、抗体分子の実質的に全ての領域に対して無作為に架橋することになり、予測不能な特性を有する生成物の高度に不均質な混合物を生じる。
【０００６】
この問題を克服するための戦略は、化学リンカーの部位特異的な導入を可能にする非天然のアミノ酸の挿入により提供される。しかし、非天然のアミノ酸の置換はしばしば不完全であり、発現量は、必要な高濃度における人工アミノ酸の細胞毒性に起因して、一般に低い。
【０００７】
無作為架橋による問題を克服するための別のアプローチは、部位特異的変異誘発により提供され、ここで、抗体中の所望される部位において単一の求核性システイン残基が導入される。システイン残基は、タンパク質中での量は天然では低いが、しばしば分子内ジスルフィド結合中で結びついて見出され、構造および機能的な完全性を提供している；なぜならば、遊離のシステイン残基は、抗体および抗体フラグメントにおいて欠如しているからである（Fodje and Al-Karadaghi（2002）Protein Eng. Des. Sel. 15, 353-358）。これらの試薬を用いて分子内架橋対分子間架橋の制御を達成することは、非常に困難である。タンパク質／試薬比、ｐＨ、イオン強度などの反応パラメーターの適切な選択を通して、何らかの制御を達成することはできるが、結果は不満足なままである。
【０００８】
WO2004/03019は、可変ドメインが、例えば各々ドメインのＣ末端においてシステインを有するｄＡｂの提供により、一緒に連結して多価リガンドを形成し得、システインは、２，２’−ジチオジピリジン（２，２’−ＤＴＤＰ）および還元されたモノマーを用いる化学カップリングの手法を用いて一緒にジスルフィド結合していると仮定した。しかし、２，２’−ＤＴＤＰは刺激物であり、その実質的な使用は制限される。加えて、その使用は、２，２’−ＤＴＤＰがまた細胞からのＣａ２＋を動態化する反応性ジスルフィドであるために、さらに限定される。この方法が特に分子内チオール結合を妨害および再配置することなく実際に実現可能か否かについて、WO2004/03019が言及しないのみならず、２，２’−ＤＴＤＰの特性を考慮すると、この剤を完全に取り除くには、面倒な手段を取らなければならない。
【０００９】
Bakerら（2014, Bioconjugate Chem., DOI：10.1021/bc5002467）は、合成されたビス−ジブロモマレイミドクロスリンカーを用いる抗体フラグメントジスルフィド結合の還元および架橋を通しての二重特異性抗体コンストラクトを記載する。
Carlssonら（1978 Biochem J. 173：723-737）は、可逆性のタンパク質−タンパク質コンジュゲーションをもたらす、ｎ−サクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナートを用いるタンパク質のためのチオ化の手法を提案する。当該手法は、しかし、大規模な精製を必要とする。加えて、当該プロトコルに従った場合の活性の低下が報告されている（Carlssonら、1978）。Carlssonら（1978）は、当該手法を抗体またはそのフラグメントについて用いることができるか否かについては言及していない。
【００１０】
一般的に、システイン残基の導入を介した分子間架橋は、システイン変異誘発が、一般に発現量の低下および望ましくない特性（所望されない二量体化に対する感受性、混合ジスルフィド形成またはジスルフィドスクランブリングなど）をもたらすので、限定されている（Schmiedl et al. (2000) J. Immunol. Methods 242, 101-14；Junutula et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26, 925-32；Albrecht et al. (2004) Bioconjugate Chem. 15, 16-26）。
【００１１】
GrazianoおよびGuptillは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの重鎖間ジスルフィド結合の還元により生じる遊離のチオールの使用を介して、Ｆａｂ’×Ｆａｂ’の化学的に連結された二重特異体を作製するための方法を議論する。しかし、重鎖−軽鎖ジスルフィド結合の大規模な還元なしで重鎖間ジスルフィドの効率的な還元が達成されるように、条件を選択しなければならない。ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏ−ＰＤＭ）法を使用して生成される二重特異体が、Ellman試薬（５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）またはＤＴＮＢ）により生成されるものよりも安定であり得ると述べられているが、ｏ−ＰＤＭにより生成された二重特異体を生化学的均質性まで精製することは、より困難であった。ｏ−ＰＤＭ法の別の特徴的な欠点は、抗体分子において奇数数の重鎖間ジスルフィド結合がマレイミド化されている必要があることである（GrazianoおよびGuptill（2004）第５章：Chemical Production of Bispecific Antibodies（Methods in Molecular Biology、第２８３巻：Bioconjugation Protocols：Strategies and Methods；C. M. Niemeyer編（著作権）Humana Press Inc., Totowa, NJ.）から、７１〜８５頁）。このことが、ヒト−ヒト二重特異体の構築におけるその適用を妨げる。
したがって、ダイマーを生成するための効率的および／または好適な方法を提供することにおいて、問題が残る。
【００１２】
処置、特にがんの処置を改善するためのさらなる戦略は、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を使用することである。現在、５０を超える特徴的なＡＤＣが臨床試験において存在するが、それらのいくつかは活性であり、ＡＤＣの開発、精製および毒性の防止においては広範な問題が残る。まず第一に、抗体あたりのコンジュゲートしている薬物の数、ＰＫ／体内分布、ペイロードおよび送達ビヒクルに起因するＡＤＣの不均質性などの物理化学的特性に対して、殆ど制御が存在しない。例えば、多くの薬物がリジンを介して抗体にコンジュゲートする。上述のとおり、リジンは抗体全体にわたって散在するので、このことが、薬物対抗体比を制御することを困難とする。加えて、このカップリングが、リジンカップリングを利用する二重特異性の概念をも妨げる。さらに、がんの処置において用いられる多くの薬物は、極めて疎水性であり、このことが、予測不能かつ多くの場合に好ましくないＡＤＣ部分の凝集、ＰＫおよび体内分布プロフィールをもたらす。このことは、小さい抗体フラグメントについて特に真実である。慣用的な抗体は約１５０ｋＤのサイズを有するが、一方、薬物は、平均して約１ｋＤのサイズを有する。したがって、抗体：薬物のサイズ比は、約１５０：１である。慣用的な抗体とは大きく対照的に、ISVDなどの抗体フラグメントは、僅か約１５ｋＤのサイズを有する。結果として、ISVD：薬物のサイズ比は、僅か１５：１であり、すなわち、慣用的な抗体についてよりも１０倍小さい。したがって、薬物に特徴的な疎水性は、コンジュゲートした抗体フラグメントの物理化学的特性に対して、不釣り合いにより大きな影響を有する。実際に、コンジュゲートした抗体フラグメントによる主な問題は、凝集である（Feng et al. 2014 Biomedicines 2: 1-13）。分析はさらに、ＩｇＧサイズの巨大分子コンストラクトが、全身クリアランスと血管外漏出との間の有利なバランスを示し、最大の腫瘍取り込みをもたらすことを示唆する（Dane Wittrup et al. 2012 Methods Enzym. 503、第10章、pp255-268）。これらの困難は、薬物をより小さな抗体フラグメントにコンジュゲートすることの使用を、効果的に限定する。
【００１３】
WO2005/007197は、タンパク質中のジスルフィド結合から誘導される両方の硫黄原子とコンジュゲートしてチオエーテルコンジュゲートを生じる能力を有するコンジュゲーション試薬を用いる、タンパク質へのポリマーのコンジュゲーションのためのプロセスを記載する。この方法において、ジスルフィド結合は、還元されて２個の遊離システイン残基を生じ、次いで、ポリマーが共有結合する架橋試薬を用いて再形成される。この方法は、しかし、抗体分子中の多くの鎖内ジスルフィド結合がジスルフィド結合スクランブリングをもたらすので、抗体をコンジュゲートするためには推奨されない。
【００１４】
WO2013/190292は、抗体に関するWO2005/007197の欠陥を克服すると考えられ、これらの抗体のヒンジ領域における単一の重鎖間ジスルフィド結合から誘導される２個のシステイン残基の間に架橋を形成するコンジュゲーション試薬を介する、ポリマーのコンジュゲーションのためのプロセスを記載する。WO2013/190292は、ヒンジ領域に位置しないシステイン残基のコンジュゲーションについては言及しない。実際に、WO2013/190292は、ヒンジ領域を欠落する免疫グロブリン単一可変ドメインについては言及しない。
【００１５】
上皮増殖因子受容体（EGFR；別名HER-1）は、HER-2、HER-3およびHER-4と共に、HERキナーゼファミリーのメンバーである。EGFRは、非小細胞肺癌、乳癌、頭部頸部癌、胃癌、直腸結腸癌、食道癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌および卵巣癌を含む多様なヒト腫瘍において過剰発現される。EGFRの活性化は、細胞分裂、運動性の増大、血管新生およびアポトーシスの減少をもたらし得るシグナル伝達を引き起こす。これらの効果は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）およびホスファチジルイノシトール−３キナーゼ（PI3K）経路の関与などの、複雑な連続したシグナル伝達機構により媒介される。
EGFRはまた、炎症性関節炎および肺における粘液の分泌亢進などのいくつかの他の疾患にも関連付けられている。
【００１６】
IMC-C225（Erbitux, Imclone）、EMD72000（Merck Darmstadt）、ABX-EGF（Abgenix）、h-R3（theraCIM, YM Biosciences）およびHumax-EGFR（Genmab）などのEGFRを標的とする抗体の多くは、リガンドの受容体への結合を妨げる抗体として単離された。しかし、これらの抗体または現在利用可能な薬物のいずれも、癌の処置のために完全に有効ではなく、多くは、重篤な毒性により限定される。
したがって、当該分野において、薬物をダイマーにコンジュゲートするための効率的および／または好適な方法を提供するために、問題が残る。
【発明の概要】
【００１７】
先行技術の欠点のうちの少なくとも１つを克服または改善すること、および有用な代替を提供することが、本発明の目的である。
それらのモジュール性を考慮すると、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）および特にNanobodyは、多価コンストラクトに組み合わせるために例外的に好適である。多価コンストラクトを生成するための便利かつ好ましい様式は、ISVDをコードする個々の核酸のアミド結合を介する遺伝子融合によるものであり、ここで、ISVDをコードするヌクレオチド配列は、その３’末端核酸を介して、ISVDをコードする別のヌクレオチド配列の５’末端核酸に（必要な場合には多様な長さの（核酸）リンカーを介して）カップリングされる。したがって、ISVDは、アミド結合を介して（おそらくはペプチドリンカーを介して）カップリングされる。
【００１８】
ISVDは、当該部分の完全性および機能性を維持するために、システイン間で分子内ジスルフィド結合を含む。ISVDをコードするヌクレオチド配列の遺伝子融合の後で、カノニカル（分子内とも称される）ジスルフィド結合を形成する固有の特性は、個々のISVDにおいては翻訳の際に影響を受けないことが、大規模に示されている。
遺伝子融合の容易性および多用途性を考慮して、ISVDの化学コンジュゲーションは、特に、それが分子内ジスルフィド結合を妨害することなくISVDを予め決定された部位において選択的にカップリングするために困難な方法を必要とし、および／または非自己の潜在的に有害な成分を用いることから、好ましい方法ではない。
【００１９】
本発明は、実質的にいかなる有害な妨害またはISVDの分子内ジスルフィド結合の関与を伴わず、２つのポリペプチド間のジスルフィド結合を介する分子間二量体化を促進する、便利な方法を提供する。この方法は、ISVDをさらに含むポリペプチドのＣ末端伸長におけるシステインの導入を用いる。
【００２０】
本発明はまた、本発明のダイマーを作製するための方法を提供する。特に、本発明は、（ポリペプチド−）ダイマーを作製する方法に関し、該方法は、少なくとも以下のステップを含む：
（ｉ）第１のポリペプチドを提供すること、ここで、前記第１のポリペプチドは、
−  少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）および
−  システイン部分を、好ましくはＣ末端において含む、Ｃ末端伸長
を含む；
（ｉｉ）第２のポリペプチドを提供すること、ここで、前記第２のポリペプチドは、
−  少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）および
−  システイン部分を、好ましくはＣ末端において含む、Ｃ末端伸長
を含む；ならびに
（ｉｉｉ）前記第１のポリペプチドのＣ末端伸長における前記システイン部分のチオール部分、および前記第２のポリペプチドのＣ末端伸長における前記システイン部分のチオール部分を、任意に酸化性銅イオン（Ｃｕ２＋）を添加することにより、および好ましくはｐＨ６．５〜ｐＨ７．５において、ジスルフィド誘導型シスチンへと酸化すること；および前記シスチンは、ダイマー中に存在する唯一の分子間ジスルフィド結合であり；それにより、前記ダイマーを作製する。
【００２１】
好ましくは、前記ダイマーの前記（Ｃ末端）シスチンを還元するステップは、前記第１のポリペプチドおよび／または前記第２のポリペプチドの分子内ジスルフィド結合が酸化されたままである条件下において行われる。言い換えると、ISVDの完全性が維持される。方法は、任意に、前記ダイマーの前記（Ｃ末端に位置する）シスチンを還元するステップをさらに含んだ。
【００２２】
さらに、驚くべきことに、本発明のダイマーが、多様なアッセイにおいて、ベンチマークコンストラクト、例えばコグネートな多価および多重特異性コンストラクトより優れていたことが見出された。ベンチマークコンストラクトは、本発明のダイマーと同じポリペプチドからなったが、ベンチマークコンストラクトは、これらのポリペプチドをコードする核酸の遺伝子融合により生成された。なぜならば、第１のポリペプチドが、アミド結合を介して、Ｎ末端からＣ末端方向で、第２のポリペプチドにカップリングされるからである。特に、本発明のダイマーは、親和性（ベンチマーク、例えばコグネートな二価コンストラクトより良好なＫＤ値（実際のまたは見かけ上の）、ＫＡ値（実際のまたは見かけ上の）、ｋｏｎ速度および／またはｋｏｆｆ速度として、好適に測定および／または表現される）を有する標的に結合することができる。 一方、本発明のダイマーは、２つのアルブミン結合ISVDを含む場合であってすら、１つのみのアルブミン結合ISVDを含むベンチマークと類似の体内分布プロフィールを示した。
【００２３】
さらに、本発明のダイマーは、予想外に、低い標的発現を有する細胞においては特に、ベンチマークコンストラクトと比較して改善された内部移行を示した。内部移行は、良好な効力のために重大であるため、改善された内部移行は、より良好な効力をもたらす可能性がある。加えて、内部移行が改善されることにより、必要とされる薬物がより少量となり、標的から離脱する薬物がより少量となるために、毒性などの副作用が軽減され得る。標的発現が低い細胞におけるダイマーの内部移行は、処置に対してアクセス可能な腫瘍の範囲を拡大し、薬物耐性を生じる機会を減少させ得る。一方、本発明のダイマーは、ベンチマークコンストラクトと類似の、好ましい体内分布プロフィールを示した。
【００２４】
したがって、本発明は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含むダイマーに関し、ここで、前記第１のポリペプチドは、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）と、システイン部分を（好ましくはＣ末端において）含むＣ末端伸長とを含み；ここで、前記第２のポリペプチドは、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）と、システイン部分を（好ましくはＣ末端において）含むＣ末端伸長とを含み；およびここで、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとは、前記第１のポリペプチドのＣ末端伸長中のシステイン部分と前記第２のポリペプチドのＣ末端伸長中のシステイン部分との間のジスルフィド結合を介する共有結合により連結されている。
したがって、本発明は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む（ポリペプチド）ダイマーに関し、ここで、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとは、Ｃ末端に位置するジスルフィド結合を介する共有結合により連結されている。
【００２５】
本発明者らはさらに、本発明のダイマーが、予想外の好ましい結合および機能的特徴を有することを観察した。これらの特徴はまた、何らの見かけ上または実質的な効力の喪失を伴うことなく、長期間にわたり保持された。このことが、ダイマーを、貯蔵および輸送のために有用にする。したがって、本発明はさらに、反応性システイン部分を含むポリペプチドを貯蔵するための方法に関し、該方法は、少なくとも、ジスルフィド誘導型シスチンの前記反応性システイン部分のチオール部分を酸化して、それにより、前記反応性システイン部分を一時的に不活化するステップを含み、ここで、前記ポリペプチドはさらに、（内部）シスチン結合を含む。 
【００２６】
本発明者らは、ダイマーが、例えばＣ末端システインを用いる、例えばマレイミド化学による、官能基のカップリングなどの、即時使用のために特に好適であり得ると仮定した。ダイマーの分子間ジスルフィド架橋が還元されて、構成要素であるポリペプチドのチオール基を活性化する、温和な還元条件を用いるプロトコルを開発した。至適条件は、内部カノニカルISVDジスルフィド架橋を還元することなく、ダイマーを形成するジスルフィドの還元をもたらした。したがって、本発明は、反応性システイン部分を含むポリペプチドを生成するための方法に関し、該方法は、少なくとも以下のステップ：
（ｉ）シスチン結合を介して二量体化したポリペプチドを提供すること；
（ｉｉ）前記シスチン結合を還元すること；
を含み、これにより、反応性システイン部分を含むポリペプチドを生成する。好ましくは、前記シスチン結合は、前記ポリペプチドのＣ末端に位置する。好ましくは、前記ステップ（ｉｉ）の還元条件は、内部シスチン結合が還元されないように選択される。
【００２７】
加えて、本発明はまた、非情に制御された薬物対抗体比（ＤＡＲ）および９５％を超える純度により、本発明のポリペプチドおよび／またはダイマーに対してペイロードをコンジュゲートさせるための方法を提供する。完全に予想外なことに、ポリペプチドにペイロードを（ＤＡＲ＝１で）コンジュゲートさせることは、体内分布プロフィールに対して何らの効果も有しない。さらに、これらのコンジュゲートしたポリペプチドは、in vitroでの細胞傷害性およびin vivoでの腫瘍増殖の阻害を示した。したがって、本発明は、本発明のポリペプチドおよび／またはダイマーを用いて対象を処置するための方法を提供する。
【００２８】
特に、本発明は、ダイマーを作製する方法に関し、該方法は、少なくとも以下のステップ：
（ｉ）第１のポリペプチドを提供すること、ここで、前記第１のポリペプチドは、
−  少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）および
−  システイン部分を、好ましくはＣ末端において含む、Ｃ末端伸長
を含む；
（ｉｉ）第２のポリペプチドを提供すること、ここで、前記第２のポリペプチドは、
−  少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）および
−  システイン部分を、好ましくはＣ末端において含む、Ｃ末端伸長
を含む；ならびに
（ｉｉｉ）前記第１のポリペプチドのＣ末端における前記システイン部分のチオール部分および前記第２のポリペプチドのＣ末端における前記システイン部分のチオール部分を、任意に酸化性銅イオン（Ｃｕ２＋）を添加することにより、および好ましくはｐＨ６．５〜ｐＨ７．５において、ジスルフィド誘導型シスチンへと酸化すること；
（ｉｖ）任意にジスルフィド誘導型シスチンを、シスチンから誘導される２個のシステイン残基の間に架橋を形成するコンジュゲート剤と反応させること、ここで、前記コンジュゲート剤は、式（Ｉ）：
【化１】
2018509394.tif 000002
の官能基を含み、
ここで、Ｗは、電子求引性基を表し；Ａは、Ｃ１〜５アルキレンもしくはアルケニレン鎖を表し；Ｂは、結合またはＣ１〜４アルキレンもしくはアルケニレン鎖を表し；および各々のＬは、独立して、脱離基を表す；
を含み、ISVDの完全性が維持されることを特徴とする。
【００２９】
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーを作製する方法に関し、ここで、コンジュゲート剤は、式（Ｉａ）：
【化２】
2018509394.tif 000003
の官能基を含み、
ここで、Ｑは、連結基を表し、Ｄは、診断、治療もしくは標識剤（例えば薬物など）、または診断、治療もしくは標識剤（例えば薬物など）のための結合剤（例えばリンカー）を表す。
【００３０】
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーを作製する方法に関し、ここで、コンジュゲート剤は、式（Ｉｂ）の官能基を含み、ここで、Ｗは、シアノ基を表し：
【化３】
2018509394.tif 000004
ここで、Ｑは、連結基を表し、Ｄは、診断、治療もしくは標識剤（例えば薬物など）、または診断、治療もしくは標識剤（例えば薬物など）のための結合剤（例えばリンカー）を表す。
【００３１】
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーを作製する方法に関し、ここで、コンジュゲート剤は、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）：
【化４】
2018509394.tif 000005
の官能基を含み、
ここで、ＸおよびＸ’のうちの一方は、ポリマーを表し、他方は、水素原子を表し；
Ｑは、連結基を表し；
Ｗは、電子求引性基を表すか；または、Ｘ’がポリマーを表す場合、Ｘ−Ｑ−Ｗは、一緒に、電子求引性基を表してもよく；
Ａは、Ｃ１〜５アルキレンもしくはアルケニレン鎖を表し；
Ｂは、結合またはＣ１〜４アルキレンもしくはアルケニレン鎖を表し；および
各々のＬは、独立して、脱離基：
【化５】
2018509394.tif 000006
ここで、Ｘ、Ｘ’、Ｑ、Ｗ、ＡおよびＬは、一般式ＩＩについて示される意味を有し、加えて、Ｘがポリマーを表す場合、Ｘ’および電子求引性基Ｗは、介在原子と一緒に、環を形成してもよく、ｍは、整数１、２、３または４を表す；あるいは
Ｘ−Ｑ−Ｗ−ＣＲ１Ｒ１’−ＣＲ２．Ｌ．Ｌ’                  （ＩＶ）
を表し；
ここで、Ｘ、ＱおよびＷは、一般式ＩＩについて示される意味を有し、ならびに、
Ｒ１は、水素原子またはＣ１〜４アルキル基を表し、Ｒ１’は、水素原子を表し、ＬおよびＬ’の各々は、独立して、脱離基を表すか；あるいは
Ｒ１は、水素原子またはＣ１〜４アルキル基を表し、Ｌは、脱離基を表し、および
Ｒ１とＬ’とは、一緒に、結合を表すか；あるいは
Ｒ１とＬとは、一緒に、結合を表し、Ｒ１とＬ’とは、一緒に、結合を表し；および
Ｒは、水素原子またはＣ１〜４アルキル基を表す。
【００３２】
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーを作製する方法に関し、ここで、前記薬物は、細胞分裂阻害剤、細胞傷害剤、化学療法剤、増殖阻害剤、トキシン（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素活性トキシン、またはそのフラグメント）、トキシン部分、および放射性同位元素からなる群より選択される。
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーを作製する方法に関し、ここで、前記薬物は、MMAEである。
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーを作製する方法に関し、ここで、前記結合剤は、診断、治療または標識剤のためのリンカーである。
【００３３】
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーを作製する方法に関し、ここで、前記第１のポリペプチドおよび／または前記第２のポリペプチドは、マレイミド-val-cit-MMAEをさらに含む。
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーを作製する方法に関し、ここで、前記リンカーは、非切断可能リンカーである。
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーを作製する方法に関し、ここで、前記リンカーは、細胞の酵素（例えば細胞エステラーゼ、カテプシンＢなどの細胞プロテアーゼ）のための切断部位を含む切断可能リンカー、例えばｐＨ切断可能リンカーである。
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーを作製する方法に関し、ここで、薬物対ダイマー比（ＤＡＲ）は、１である。
【００３４】
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーを作製する方法に関し、ここで、前記第１および前記第２のポリペプチドの少なくとも８０％、例えば８５％、９０％、９５％、９９％またはそれより多く、例えば１００％が、二量体化されることが、例えば質量分析により決定される。
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーを作製する方法に関し、該方法は、さらに、好ましくは分子ふるいクロマトグラフィーを介して、前記ダイマーを精製するステップを含む。
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーを作製する方法に関し、ここで、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとは、同一である。
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーを作製する方法に関し、ここで、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとは、異なる。
【００３５】
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーを作製する方法に関し、ここで、前記第１のポリペプチドおよび／または前記第２のポリペプチドは、システイン部分を（好ましくはＣ末端において）含む、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１アミノ酸残基のＣ末端伸長を含む。
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーを作製する方法に関し、ここで、前記Ｃ末端伸長は、前記ポリペプチド中の最Ｃ末端に位置するISVDのＣ末端に遺伝子融合される。
【００３６】
特に、本発明は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含むダイマーに関し、ここで、前記第１のポリペプチドは、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）およびシステイン部分を（好ましくはＣ末端において）含むＣ末端伸長を含み；ここで、前記第２のポリペプチドは、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）およびシステイン部分を（好ましくはＣ末端において）含むＣ末端伸長を含み；およびここで、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとは、式（Ｖ）または式（ＶＩ）による化合物による、前記第１のポリペプチドのＣ末端伸長中のシステイン部分（Ｃ）のチオエーテル結合および前記第２のポリペプチドのＣ末端伸長中のシステイン部分（Ｃ）のチオエーテル結合を介して、共有結合により連結されている：
【化６】
2018509394.tif 000007
ここで、
「−Ｃ−」は、本発明のポリペプチドのＣ末端伸長中のシステイン部分を表し；
「−Ｃ」は、本発明のポリペプチドのＣ末端伸長のＣ末端におけるシステイン部分を表し；
Ｒ１は、Ｃ１〜４アルキル基を表し；およびＤは、診断、治療もしくは標識剤（例えば薬物など）、または診断、治療もしくは標識剤（例えば薬物など）のための結合剤（例えばリンカー）を表す。
【００３７】
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記薬物は、細胞分裂阻害剤、細胞傷害剤、化学療法剤、増殖阻害剤、トキシン（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素活性トキシン、またはそのフラグメント）、トキシン部分、および放射性同位元素からなる群より選択される。
【００３８】
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記薬物は、MMAEである。
特に、本発明は、マレイミド-val-cit-MMAEを含む、本明細書において記載されるダイマーに関する。
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記結合剤は、診断、治療または標識剤のためのリンカーである。
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記リンカーは、非切断可能リンカーである。
【００３９】
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記リンカーは、細胞の酵素（例えば細胞エステラーゼ、カテプシンＢなどの細胞プロテアーゼ）のための切断部位を含む切断可能リンカー、例えばｐＨ切断可能リンカーである。
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、薬物対ダイマー比（ＤＡＲ）は、１である。
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記ダイマーは、競合FACS（competition FACS）により決定されるとき、最高でも１００ｎＭ、例えば５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、好ましくはさらに最高でも２ｎＭ、例えば１ｎＭのＩＣ５０で標的に結合する。
【００４０】
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記ダイマーは、好ましくは競合FACSにより決定されるとき、ベンチマークのＩＣ５０よりも少なくとも１０％、例えば２０％、３０％、５０％、８０％、９０％、または１００％も良好なＩＣ５０で標的に結合する。
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記ダイマーは、好ましくは競合FACSにより決定されるとき、ベンチマークのＩＣ５０より少なくとも２倍、例えば３倍または４倍、および５倍または１０倍も良好なＩＣ５０で標的に結合する。
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記第１のポリペプチドおよび／または前記第２のポリペプチドは、システイン部分を（好ましくはＣ末端において）含む、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１アミノ酸残基のＣ末端伸長を含む。
【００４１】
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記Ｃ末端伸長は、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＣｙｓ（配列番号４）、ＧｌｙＧｌｙＣｙｓ（配列番号３）、ＧｌｙＣｙｓ（配列番号２）またはＣｙｓ（配列番号１）からなる。
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記Ｃ末端伸長は、配列番号１〜１５からなる群より選択される。
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとは、同一である。
【００４２】
特に、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとは、異なる。
特に、本発明は、がんの処置における使用のための本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記ダイマーは、内部移行する。
特に、本発明は、がんの処置のための医薬の製造のための本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記ダイマーは、内部移行する。
図の説明
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】用いられた多様なコンストラクトの模式的描写。
【図２】競合的結合FACS。
【図３】HER14細胞におけるEGFにより媒介されるEGFRのリン酸化の遮断（０．５ｍＭのEGF）。
【図４】Ｃ末端GGC伸長ポリペプチドのジスルフィドダイマーの還元の模式図。
【図５】還元システイン伸長ポリペプチドのSECプロフィール。タンパク質マーカーのＭＷは、破線（− ‐ −）により示され、６７０ｋＤａ、１５８ｋＤａ、４４ｋＤａ、１７ｋＤａおよび１．３５ｋＤａである。ｍＡＵは、２８０ｎｍにおけるミリ吸光単位である。
【００４４】
【図６】マレイミド-val-cit-MMAE。
【図７】T0238-00001-mc-val-cit-PAB-MMAE（ABL100-NC003-1）のSDS-PAGE分析。１）Novexマーカー；２）T0238-00001ダイマー；３）還元T0238-00001（１０ｍＭのＤＴＴ、２〜８℃、Ｏ／Ｎ）；４）ABL100-NC003-1粗コンジュゲート混合物；５）ABL100-NC003-1。
【図８】還元T023800001-A（酸化）T023800001-A（還元）およびT0238-00001-mc-val-cit-PAB-MMAEについての、オーバーレイした疎水性相互作用クロマトグラム。
【図９】ポリペプチド−MMAEコンジュゲートのin vitroでの細胞殺傷：正規化された細胞インデックス（ＣＩ）の変動として測定される、MDA-MB-468細胞の増殖に対する、様々な濃度の非コンジュゲートおよびコンジュゲートNanobodyの効果のインペディメトリック（impedimetric）モニタリング。データ分析のために、矢印は投与の時点（すなわち播種の２０時間後）を示し、点線はエンドポイント（すなわち播種の１１６時間後）を示す。Nanobodyの不在下における細胞増殖から得られた細胞インデックスを、対照として取得する。
【図１０】非コンジュゲートおよびMMAEコンジュゲートポリペプチドの用量依存的効果。
【００４５】
【図１１】ポリペプチド−MMAEコンジュゲートのin vitroでの効力。
【図１２】ThioBridge（商標）技術の原理。
【図１３】Nanobodyダイマーに対するペイロードに付着したThioBridge（商標）テクノロジー。
【図１４】二重特異性ThioBridge（商標）ダイマーを生成するためのスキーム（スキーム１）。
【図１５】ThioBridge（商標）を用いる、Ｎｂ−薬物コンジュゲートの二重特異体の生成（スキーム２）。
【００４６】
【図１６】適応させたThioBridge（商標）プロトコルにおいて保護基を用いる、Ｎｂ−薬物コンジュゲートの二重特異体の生成（スキーム３）。
【図１７】NCS-Bz-Dfおよび８９Ｚｒを用いるＮｂの修飾および放射標識
【図１８】３つのポリペプチドについての平均の％ＩＤ／ｇ。
【図１９】内部移行したポリペプチドおよびコンストラクトの用量応答曲線。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
発明の詳細な説明
本明細書全体にわたる先行技術の任意の議論は、決して、かかる先行技術が、広範に知られていたか、当該分野における一般常識の一部を形成することを承認するものとみなされるべきではない。
他に示されるか定義されない限り、用いられる全ての用語は、当業者には明らかであろう当該分野におけるそれらの通常の意味を有する。例えば、Sambrookら、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」（第２版）、第１〜３巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）；F. Ausubelら、「Current protocols in molecular biology」、Green Publishing and Wiley Interscience, New York（1987）；Lewin「Genes II」、John Wiley & Sons, New York, N.Y.,（1985）；Oldら、「Principles of Gene Manipulation：An Introduction to Genetic Engineering」、第２版、University of California Press, Berkeley, CA（1981）；Roittら、「Immunology」（第６版）、Mosby/Elsevier, Edinburgh（2001）；Roittら、Roitt’s Essential Immunology、第１０版、Blackwell Publishing, UK（2001）；およびJanewayら、「Immunobiology」（第６版）、Garland Science Publishing/ Churchill Livingstone, New York（2005）などの標準的なハンドブック、ならびに本明細書において引用される一般的な背景技術について参照がなされる。
【００４８】
他に示されない限り、特に詳細に記載されない全ての方法、ステップ、技術および操作は、当業者には明らかであろうそれ自体公知の様式において行うことができ、行われた。やはり、標準的なハンドブックおよび本明細書において言及される一般的な背景技術について；ならびに、例えば以下の総説について参照がなされる：Presta、2006（Adv. Drug Deliv. Rev. 58 (5-6): 640-56）、LevinおよびWeiss、2006（Mol. Biosyst. 2 (1): 49-57）、Irvingら、2001（J. Immunol. Methods 248 (1-2): 31-45）、Schmitzら、2000（Placenta 21 Suppl. A：S106-12）、Gonzalesら、2005（Tumour Biol. 26 (1): 31-43）；これらは、親和性成熟などのタンパク質工学についての技術、ならびに免疫グロブリンなどのタンパク質の特異性および他の所望される特性を改善するための他の技術を記載する。
【００４９】
核酸配列またはアミノ酸配列は、それが、通常は前記ソースまたは培地中では関連している少なくとも１つの他の成分（別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生体成分または巨大分子または少なくとも１つの夾雑物、不純物または微量成分などの）から分離されている場合に、例えば、それが得られた反応媒質または培養培地と比較して、「本質的に単離されている（形態）（で）」あるとみなされる。特に、核酸配列またはアミノ酸配列は、それが、少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、さらに特に少なくとも１００倍、および１０００倍以上にまで精製されている場合に、「本質的に単離されている」とみなされる。「本質的に単離された形態で」ある核酸配列またはアミノ酸配列は、好ましくは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの好適なクロマトグラフィー技術などの好適な技術を用いて測定される場合に、本質的に均質である。
【００５０】
文脈が明らかに他を要求しない限り、説明および請求の範囲全体にわたり、単語「含む（comprise）」、「含む（comprising）」などは、排他的または網羅的な意味とは反対の、包括的な意味において、つまり、「〜を含むが、これらに限定されない」の意味において、解釈されるべきである。
【００５１】
例えば、ヌクレオチド配列、アミノ酸配列またはポリペプチドが、それぞれ、別のヌクレオチド配列、アミノ酸配列またはポリペプチド「を含む」、または、別のヌクレオチド配列、アミノ酸配列またはポリペプチド「から本質的になる」と言われる場合、これは、後者のヌクレオチド配列、アミノ酸配列またはポリペプチドが、それぞれ、最初に言及されたヌクレオチド配列、アミノ酸配列またはポリペプチドに組み込まれていることを意味するが、より普通には、これは、一般に、最初に言及された配列がどのようにして実際に生成されたか、または得られたかに関わらず（これは例えば本明細書において記載される任意の好適な方法によるものであってもよい）、最初に言及されたヌクレオチド配列、アミノ酸配列またはポリペプチドが、それぞれ、その配列中に、それぞれ後者の配列と同じヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有するヌクレオチドまたはアミノ酸残基のストレッチを含むことを意味する。非限定的な例として、本発明のポリペプチドが免疫グロブリン単一可変ドメインを含むと言われる場合、これは、前記免疫グロブリン単一可変ドメイン配列が、本発明のポリペプチドの配列中に組み込まれていることを意味してもよいが、より普通には、これは、一般に、前記本発明のポリペプチドがどのようにして生成されたか、または得られたかに関わらず、本発明のポリペプチドが、その配列中に、免疫グロブリン単一可変ドメインの配列を含むことを意味する。また、核酸またはヌクレオチド配列が別のヌクレオチド配列を含むと言われる場合、最初に言及された核酸またはヌクレオチド配列は、好ましくは、それが発現生成物（例えばポリペプチド）に発現される場合に、後者のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列が、前記発現生成物の一部を形成するように（言い換えると、後者のヌクレオチド配列が、最初に言及されたより大きな核酸またはヌクレオチド配列と同じリーディングフレーム中にあるように）存在する。
【００５２】
「〜から本質的になる」または「本質的に〜からなる」などにより、本明細書において用いられるポリペプチドが、本発明のポリペプチドと正確に同じであるか、または、限定された数のアミノ酸残基、例えば１〜２０アミノ酸残基、例えば１〜１０アミノ酸残基および好ましくは１〜６アミノ酸残基、例えば１、２、３、４、５または６アミノ酸残基が、免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ末端において、カルボキシ末端において、またはアミノ末端とカルボキシ末端の両方に付加された、本発明のポリペプチドに対応することが意味される。
【００５３】
特異的な抗原決定基、エピトープ、抗原またはタンパク質（または少なくとも１つの部分について、そのフラグメントもしくはエピトープ）に（特異的に）結合することができるか、これについての親和性を有するか、および／またはこれに特異性を有するアミノ酸配列（例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン、抗体、本発明のポリペプチド、または一般に、抗原結合タンパク質またはそのポリペプチドもしくはフラグメント）は、前記抗原決定基、エピトープ、抗原またはタンパク質に「対する」、またはこれに「対して向けられている」と言われる。
【００５４】
親和性は、分子相互作用の強度または安定性を表す。親和性は、一般にＫＤまたは解離定数により示され、これは、ｍｏｌ／リットル（またはＭ）の単位を有する。親和性はまた、会合定数、ＫＡとして表すこともでき、これは１／ＫＤに等しく、（ｍｏｌ／リットル）−１（またはＭ−１）の単位を有する。本明細書において、２つの分子の間の相互作用の安定性は、主に、それらの相互作用のＫＤ値に関して表されるであろう；関係ＫＡ＝１／ＫＤを考慮すると、分子相互作用の強度をそのＫＤ値で特定することはまた、対応するＫＡ値を計算するためにも用いることができることは、当業者には明らかである。ＫＤ値は、周知の関係ＤＧ＝ＲＴにより結合の自由エネルギー（ＤＧ）の変化に関係しているので、熱力学的な意味においても分子相互作用の強度を特徴づける。ｌｎ（ＫＤ）（同等に、ＤＧ＝−ＲＴ．ｌｎ（ＫＡ））において、Ｒは気体定数に等しく、Ｔは絶対温度に等しく、ｌｎは自然対数を表す。
【００５５】
有意義である（例えば特異的である）とみなされる生物学的相互作用についてのＫＤは、典型的には、１０−１２Ｍ（０．００１ｎＭ）〜１０−５Ｍ（１００００ｎＭ）の範囲である。相互作用が強いほど、そのＫＤは低くなる。ＫＤはまた、ｋｏｆｆとして表される複合体の解離速度定数の、ｋｏｎとして表されるその会合の速度に対する比としても表すことができる（したがって、ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎおよびＫＡ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）。オフ（off）速度ｋｏｆｆは、単位ｓ−１（ここでｓは、秒のＳＩ単位記号である）を有する。オン（on）速度ｋｏｎは、単位Ｍ−１ｓ−１を有する。オン速度は、１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１で変化し得、生体分子相互作用についての拡散により限定される会合速度定数に近づく。オフ速度は、関係ｔ１／２＝ｌｎ（２）／ｋｏｆｆにより、所与の分子相互作用の半減期に関連する。オフ速度は、１０−６ｓ−１（数日間のｔ１／２による不可逆性複合体付近）〜１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）の間で変化し得る。
【００５６】
ISVDなどの抗原結合タンパク質の抗原または抗原決定基に対する特異的結合は、それ自体公知の任意の好適な様式において決定することができ、これは、例えば、スキャッチャード分析および／または競合的結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（RIA）、酵素イムノアッセイ（EIA）およびサンドウィッチ競合アッセイ、およびそれ自体が当該分野において公知のそれらの様々なバリアント；ならびに本明細書において限定される他の技術を含む。
【００５７】
２つの分子間の分子相互作用の親和性は、それ自体公知の様々な技術、例えば、一方の分子をバイオセンサーチップ上に固定して、他方の分子を、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ測定を生じ、およびそれによりＫＤ（またはＫＡ）値を得られる流動条件下において、固定された分子の上を通過させる、周知の表面プラズモン共鳴（SPR）バイオセンサー技術（例えばOber et al. 2001, Intern. Immunology 13: 1551-1559を参照）を介して測定することができる。これは、例えば、周知のBIACORE（登録商標）装置（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden）を用いて行うことができる。結合平衡除外法（Kinetic Exclusion Assay：KINEXA（登録商標））（Drake et al. 2004, Analytical Biochemistry 328: 35-43）は、結合パートナーを標識せずに溶液中の結合イベントを測定し、複合体の解離を動力学的に除外することに基づく。
GYROLAB（登録商標）イムノアッセイシステムは、自動化生体分析および迅速な試料のターンアラウンドのためのプラットフォームを提供する（Fraley et al. 2013, Bioanalysis 5: 1765-74）。
【００５８】
測定プロセスが、何らかの形で、例えば一方の分子のバイオセンサー上のコーティングに関連するアーチファクトにより、読み取られた分子の固有の結合親和性に影響を及ぼす場合、測定されたＫＤが、見かけ上のＫＤに対応し得ることも、当業者にはまた明らかであろう。また、一方の分子が他方の分子についての１以上の認識部位を含む場合にも、見かけ上のＫＤが測定され得る。かかる状況において、測定された親和性は、２つの分子による相互作用の結合活性により影響を受け得る。当業者には明らかであり、WO 08/020079の５３〜５６頁において記載されるとおり、解離定数は、実際のまたは見かけ上の解離定数であってよい。解離定数を決定するための方法は、当業者には明らかであり、例えば、WO 08/020079の５３〜５６頁において言及される技術を含む。
【００５９】
用語「特異性」は、WO 08/020079の５３〜５６頁における段落ｎ）においてそれに与えられる意味を有し；そこにおいて言及されるとおり、特定の抗原結合分子または抗原結合タンパク質（例えば本発明のダイマーまたはポリペプチド）分子が結合することができる多数の様々な型の抗原または抗原決定基を指す。抗原結合タンパク質の特異性は、WO 08/020079（本明細書において参考として援用され、これはまた、抗原結合分子（例えば本発明のポリペプチドまたはISVD）と関連する抗原との間の結合を測定するためのいくつかの好ましい技術を記載する）の５３〜５６頁において記載されるとおり、親和性および／または結合活性に基づいて決定することができる。典型的には、抗原結合タンパク質（例えば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／またはポリペプチド）は、それらの抗原に、１０−５〜１０−１２モル／リットル以下、および好ましくは１０−７〜１０&#8209;１２モル／リットル以下、およびより好ましくは１０−８〜１０−１２モル／リットルの解離定数（ＫＤ）で（すなわち、１０５〜１０１２リットル／モル以上、および好ましくは１０７〜１０１２リットル／モル以上、およびより好ましくは１０８〜１０１２リットル／モルの会合定数（ＫＡ）で）結合するであろう。１０−４ｍｏｌ／リットルより高い任意のＫＤ値（または１０４リットル／ｍｏｌより低い任意のＫＡ値）は、一般に、非特異的結合を示すとみなされる。好ましくは、本発明の一価の免疫グロブリン単一可変ドメインは、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性で、所望される抗原に結合するであろう。
【００６０】
親和性を評価するために用いることができる別のアプローチは、Friguetら、1985（J. Immunol. Methods 77: 305-19）の２ステップELISA（酵素結合免疫吸着測定）法である。この方法は、溶液相結合平衡測定を確立し、プラスチックなどの支持体上での分子のうちの１つの吸着に関する、起こり得るアーチファクトを回避する。
しかし、ＫＤの正確な測定は、非常に労働集約的であり得、結果として、しばしば、２つの分子の結合強度を評価するために、見かけ上のＫＤ値が決定される。全ての測定が一貫した方法において行われる（例えば、アッセイ条件を不変に保つ）限り、見かけ上のＫＤ測定を、真のＫＤの近似として用いることができ、したがって、本文書において、ＫＤおよび見かけ上のＫＤは、同等の重要性および関連性をもって扱われるべきであることに留意すべきである。
【００６１】
最後に、多くの状況において、経験を積んだ科学者は、いくつかの参照分子と比較して結合親和性を測定するために便利であるように、それを判断することができることに、留意すべきである。例えば、分子ＡとＢとの間の結合強度を評価するために、例えば、Ｂに結合すること、およびELISAもしくはFACS（蛍光励起細胞分取）における容易な検出のためのビオチンなどのフルオロフォアもしくは発色団基または他の化学部分、または他の形式（蛍光検出のためのフルオロフォア、吸光検出のための発色団、ストレプトアビジン媒介ELISA検出のためのビオチン）で好適に標識されることが知られている、参照分子Ｃを用いることができる。典型的には、参照分子Ｃは、固定された濃度に保たれ、Ｂの所与の濃度または量について、Ａの濃度を変化させる。結果として、Ａの不在下においてＣについて測定されたシグナルが半分となるＡの濃度に対応するＩＣ５０値が得られる。参照分子のＫＤであるＫＤｒｅｆ、ならびに参照分子の合計濃度ｃｒｅｆが知られていると仮定して、相互作用Ａ−Ｂについての見かけ上のＫＤは、以下の式から得ることができる：ＫＤ＝ＩＣ５０／（１＋ｃｒｅｆ／ＫＤｒｅｆ）。ｃｒｅｆ＜＜ＫＤｒｅｆである場合、ＫＤ≒ＩＣ５０であることに留意する。比較される結合剤についてＩＣ５０の測定を一貫した方法において行う（例えばｃｒｅｆを固定したままにする）と仮定して、分子相互作用の強度または安定性は、ＩＣ５０により評価することができ、本文全体にわたり、この測定は、ＫＤと、または見かけ上のＫＤと等しいものとして判断される。
【００６２】
最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）は、生物学的または生化学的機能、例えば薬理学的効果を阻害することにおける化合物の有効性の尺度である。この定量的尺度は、所与の生物学的プロセス（またはプロセスの成分、すなわち、酵素、細胞、細胞受容体、走化性、退形成、転移、浸潤性など）の半量を阻害するために、どれほどのISVD（例えばNanobody）（阻害剤）が必要とされるかを示す。言い換えると、それは、物質の最大半量（５０％）阻害濃度（ＩＣ）である（５０％ＩＣまたはＩＣ５０）。薬物のＩＣ５０は、用量応答曲線を構築し、アゴニスト活性を逆転させることについて、様々な濃度のアンタゴニスト（本発明のISVD（例えばNanobody）など）の効果を試験することにより決定することができる。本発明のISVD（例えばNanobody）などの所与のアンタゴニストについてのＩＣ５０値は、アゴニストの最大生物学的応答の半量を阻害するために必要とされる濃度を決定することにより、計算することができる。
【００６３】
用語、最大半量有効濃度（ＥＣ５０）は、基線と、特定された暴露時間の後の最大値との間の半分の応答を誘導する化合物の濃度を指す。本文脈において、それは、ポリペプチドの、ISVDの（例えばNanobodyの）効力の尺度として用いられる。計量的な用量応答曲線のＥＣ５０は、その最大の効果の５０％が観察される化合物の濃度を表す。濃度は、好ましくは、モル濃度単位で表される。
【００６４】
生体の系において、リガンド濃度の僅かな変化は、典型的には、シグモイド関数に従う応答の迅速な変化をもたらす。増大するリガンド濃度による応答の増大が失速し始める屈曲点が、ＥＣ５０である。これは、最良適合直線を導くことにより数学的に決定することができる。概算のためにグラフに頼ることは、多くの場合において便利である。例においてＥＣ５０が提供される場合、実験は、ＫＤを可能な限り正確に反映するように設計された。言い換えると、ＥＣ５０値は、したがって、ＫＤ値とみなされ得る。用語「平均ＫＤ」とは、少なくとも１回であるが、好ましくは１回より多く、例えば少なくとも２回の実験において得られた平均ＫＤ値を指す。用語「平均」とは、数学用語「平均」（データの合計をデータ中の項目の数により除算したもの）を指す。
【００６５】
それはまた、化合物の阻害の尺度（５０％阻害）であるＩＣ５０に関係する。競合結合アッセイおよび機能的アンタゴニストアッセイについて、ＩＣ５０は、用量応答曲線の最も一般的な要約尺度である。アゴニスト／刺激因子アッセイについては、最も一般的な要約尺度は、ＥＣ５０である。
【００６６】
阻害剤定数Ｋｉは、阻害剤がどれほど強力であるかの指標である；それは、最大半量阻害をもたらすために必要とされる濃度である。絶対阻害定数Ｋｉは、チェン＝プルソフ（Cheng-Prusoff）の式を用いて計算することができる：
【数１】
2018509394.tif 000008
ここで、［Ｌ］は、リガンドの固定された濃度である。
【００６７】
用語「遺伝子融合」とは、本明細書において用いられる場合、アミド結合を介した個々の核酸（例えばISVDをコードするもの）のカップリングを指し、ここで、ISVDをコードするヌクレオチド配列が、その３’末端核酸を介して、ホスホジエステル結合を介して、別のISVDをコードするヌクレオチド配列の５’末端核酸に（適切な場合には多様な長さの（核酸）リンカーを介して）カップリングされ、例えば、ISVDをコードするヌクレオチド配列が、その３’末端核酸を介して、ホスホジエステル結合を介して、リンカー配列の５’末端核酸にカップリングされ、これが、その３’末端核酸を介して、ホスホジエステル結合を介して、別のISVDをコードするヌクレオチド配列の５’末端核酸にカップリングされる（すなわち、ISVDおよび任意にリンカーが、遺伝子融合される）。遺伝子融合は、標準的な組み換えDNAプロトコル（上記）に従って、または例のセクションにおいて、例えばGaraicoecheaら（2008, J Virol. 82: 9753-9764）において記載されるように、行うことができる。
【００６８】
アミノ酸配列は、文脈に依存して、単一のアミノ酸または２つ以上のアミノ酸の非分枝状配列を意味するように解釈される。ヌクレオチド配列は、３個以上のヌクレオチドの非分枝状配列を意味するように解釈される。
【００６９】
アミノ酸は、天然に存在するタンパク質中に一般的に見出されるＬ−アミノ酸であり、以下の表１において列記される。Ｄ−アミノ酸を含むアミノ酸配列は、この定義により包含されることを意図されない。翻訳後に修飾されるアミノ酸を含む任意のアミノ酸配列は、初めに、以下の表において示される記号を用いて、修飾された位置（例えばヒドロキシル化またはグリコシル化）と共に翻訳されるが、これらの修飾は、アミノ酸配列中に明示的に示されない場合がある。配列が修飾された連結、架橋およびエンドキャップ、非ペプチジル結合などとして表すことができる任意のペプチドまたはタンパク質は、この定義により包含される。
【表１】
2018509394.tif 000009
【００７０】
用語「タンパク質」、「ペプチド」、「タンパク質/ペプチド」および「ポリペプチド」は、本開示全体にわたり交換可能に用いられ、各々が、本開示の目的のために、同じ意味を有する。各々の用語は、２個以上のアミノ酸の直鎖からなる有機化合物を指す。化合物は、１０個以上のアミノ酸；２５個以上のアミノ酸；５０個以上のアミノ酸；１００個以上のアミノ酸、２００個以上のアミノ酸、および３００個以上ものアミノ酸を有していてもよい。当業者は、ポリペプチドは一般にタンパク質よりも少ないアミノ酸を含むが、当該分野において認識されているポリペプチドとタンパク質とを区別するアミノ酸の数のカットオフ点は存在しないこと；ポリペプチドは、化学合成または組み換え法により作製することができること；ならびにタンパク質は一般に、当該分野において公知であるようにin vitroまたはin vivoで組み換え方法により作製されることを理解するであろう。
【００７１】
本発明の理解を容易にするために、本発明と関連して用いられる用語の簡単な議論を提供する。慣習により、ポリペプチドの一次構造中のアミド結合は、ポリペプチドのアミン末端（Ｎ末端）が常に左側となり、酸末端（Ｃ末端）が右側となるようにアミノ酸が記述される順序となる。
本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）と、システイン部分を（好ましくはＣ末端において）含むＣ末端伸長とを含む。その最も簡単な形態において、本発明のポリペプチドは、１つのISVDと、それに続く（これに結合しているかまたはこれにコンジュゲートしている）システインからなる。
Ｃ末端伸長は、最後の（最もＣ末端側に位置する）ISVDの最後のアミノ酸残基（通常はセリン残基）のＣ末端に存在し、システイン残基を含む。好ましくは、本発明のシステイン部分は、Ｃ末端伸長のＣ末端に存在または位置する。
【００７２】
本発明に関して、Ｃ末端伸長は、少なくとも１個のアミノ酸、すなわちシステイン部分、またはＣ末端伸長のＣ末端に存在または位置する少なくとも１つのシステイン残基を含む最大５０個までのアミノ酸残基の少なくとも２つのアミノ酸残基のアミノ酸配列からなる。Ｃ末端伸長は、好ましくは、２〜４０個のアミノ酸残基、例えば２〜３０個のアミノ酸残基、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５または２０個のアミノ酸残基などからなる。例えば、Ｃ末端伸長は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸残基からなっていてもよく、このうち、Ｃ末端に位置するアミノ酸はシステイン部分である（例えばＣ末端伸長は、システイン残基のみからなるなど）；例えばＣ末端伸長は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個のアミノ酸残基と、それに続くシステイン部分からなっていてもよい；例えばＣ末端伸長は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個のグリシン残基と、それに続くシステイン部分からなっていてもよい；例えばＣ末端伸長は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個のアラニン残基と、それに続くシステイン部分からなっていてもよい。ポリペプチドのＣ末端伸長は、好ましくは１個のみのシステイン部分を含むことは、明らかであろう。
【００７３】
別の側面において、システイン残基は、Ｃ末端伸長における、Ｃ末端（Ｃ末端）とは異なる部位に存在または位置する。例えば、システイン残基は、Ｃ末端伸長の最後のアミノ酸残基の前（上流）のアミノ酸残基（すなわち、本発明のポリペプチドの最後から２番目のアミノ酸残基）において、またはＣ末端伸長の最後の２個のアミノ酸残基の前（上流）のアミノ酸残基（すなわち、本発明のポリペプチドの最後から３番目のアミノ酸残基）において、存在または位置する。例えば、Ｃ末端伸長は、２、３、４、５、６、７または８個のアミノ酸残基（例えばグリシンまたはアラニンなど）からなっていてもよく、このうち、それぞれ第１、第２、第３、第４、第５、第６または第７のアミノ酸残基は、システインである（すなわち、本発明のポリペプチドの最後から２番目のアミノ酸残基）；あるいは、Ｃ末端伸長は、３、４、５、６、７または８個のアミノ酸残基（例えばグリシンまたはアラニンなど）からなっていてもよく、このうち、それぞれ第１、第２、第３、第４、第５または第６のアミノ酸残基（すなわち、本発明のポリペプチドの最後から３番目のアミノ酸残基）は、システインである。
【００７４】
Ｃ末端伸長の好ましい例は、表２において示す。
【表２】
2018509394.tif 000010
【００７５】
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記第１のポリペプチドおよび／または前記第２のポリペプチドは、システイン部分、好ましくは１個のみのシステイン部分を含む、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１アミノ酸残基のＣ末端伸長を含む。システイン部分は、好ましくはＣ末端に位置する。一態様において、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記Ｃ末端伸長は、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＣｙｓ（配列番号４）、ＧｌｙＧｌｙＣｙｓ（配列番号３）、ＧｌｙＣｙｓ（配列番号２）またはＣｙｓ（配列番号１）からなる。
【００７６】
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記第１のポリペプチドおよび／または前記第２のポリペプチドは、システイン部分、好ましくは１個のみのシステイン部分、およびＣ末端に位置するアラニン部分を含む、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１アミノ酸残基のＣ末端伸長を含む。一態様において、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記Ｃ末端伸長は、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＣｙｓＡｌａ（配列番号８５）、ＧｌｙＧｌｙＣｙｓＡｌａ（配列番号８４）、ＧｌｙＣｙｓＡｌａ（配列番号８３）またはＣｙｓＡｌａ（配列番号８２）からなる。
【００７７】
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記ポリペプチド配列番号１〜１５および８２〜９６からなる群より、好ましくは配列番号１〜１５より選択されるＣ末端伸長を含む。
Ｃ末端伸長は、当業者に公知の任意の好適な技術を介して、例えば遺伝子融合について上で記載される組み換えDNA技術などにより、ISVDにカップリングすることができる。
【００７８】
本発明のポリペプチドは、１つより多くのISVD、例えば２、３、４またはそれより多くのISVDを含んでもよい。したがって、本発明は、少なくとも２つのISVDを含む本発明のポリペプチドに関する。加えて、本発明は、本明細書において記載される第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含むダイマーに関し、ここで、前記第１のポリペプチドは、少なくとも２つのISVDを含み、および／または前記第２のポリペプチドは、少なくとも２つのISVDを含む。
【００７９】
本発明のポリペプチド中に含まれるISVDは、同じであっても異なっていてもよい。一態様において、ISVDは、ISVDが同じであるか異なっているかに関わらず、同じ標的に結合することができる。したがって、本発明は、同一のISVD、同じ標的に結合するISVD、および／またはそれぞれ同じCDR1、CDR2およびCDR3を含むISVDを含む、本発明のポリペプチドに関する。一態様において、ISVDは、異なる標的に結合することができる。一態様において、本発明は、本明細書において記載される第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含むダイマーに関し、ここで、前記第１のポリペプチドの前記少なくとも２つのISVDは、同一であり、および／または前記第２のポリペプチドの前記少なくとも２つのISVDは、同一である。
本発明のポリペプチドにおいて、本発明のダイマー中に含まれるか否かに関わらず、ISVDは、直接連結されていても、リンカーを介して連結されていてもよい。
【００８０】
相対的な親和性は、ポリペプチド中のISVDの位置に依存し得る。本発明のポリペプチド中のISVDの順序（向き）は、当業者の必要に従って選択することができることが、理解されるであろう。個々のISVDの順序、ならびにポリペプチドがリンカーを含むか否かは、設計上の選択の問題である。いくつかの向きは、リンカーがあってもなくても、他の無機と比較して、好ましい結合の特徴を提供し得る。例えば、本発明のポリペプチド中の第１のISVD（例えばISVD 1）および第２のISVD（例えばISVD 2）の向きは、以下であってよい（Ｎ末端からＣ末端へ）：（ｉ）ISVD 1（例えばNanobody 1）−［リンカー］−ISVD 2（例えばNanobody 2）；または（ｉｉ）ISVD 2（例えばNanobody 2）−［リンカー］−ISVD 1（例えばNanobody 1）；（ここでリンカーは任意である）。全ての向きは、本発明により包含される。所望される結合の特徴を提供する向きでISVDを含むポリペプチドは、例えば例のセクションにおいて例示されるような慣用的なスクリーニングにより、容易に同定することができる。
【００８１】
本発明のポリペプチドにおいて、２つ以上のISVD（Nanobodyなど）は、互いに直接連結していても（例えばWO 99/23221において記載されるように）、および／または１つ以上の好適なリンカーを介して互いに連結されていても、またはこれらの任意の組み合わせであってもよい。本発明のポリペプチドにおける使用のために好適なリンカーは、当業者には明らかであり、一般に、アミノ酸配列を連結するために当該分野において用いられる任意のリンカーであってよい。好ましくは、前記リンカーは、薬学的使用のために意図されるタンパク質またはポリペプチドを構築することにおける使用のために好適である。
【００８２】
いくつかの特に好ましいリンカーは、抗体フラグメントまたは抗体ドメインを連結するために当該分野において用いられるリンカーを含む。これらは、上で引用される刊行物において言及されるリンカー、ならびに、例えば二重特異性抗体またはｓｃＦｖフラグメントを構築するために当該分野において用いられるリンカーを含む（このことに関しては、しかし、二重特異性抗体において、およびｓｃＦｖフラグメントにおいて、用いられるリンカー配列は、適切なＶＨおよびＶＬドメインが一緒になって完全な抗原結合部位を形成することができる長さ、可撓性の程度および他の特性を有するべきであるが、本発明のポリペプチドにおいて用いられるリンカーの長さまたは可撓性について特に限定は存在しないことに留意すべきである。なぜならば、各々のISVD（Nanobodyなど）は、それ自体が、完全な抗原結合部位を形成するからである）。
【００８３】
例えば、リンカーは、好適なアミノ酸またはアミノ酸配列、および特に１〜５０個、好ましくは１〜３０個、例えば１〜１０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列であってよい。かかるアミノ酸配列のいくつかの好ましい例は、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカー、例えばWO 99/42077において記載されるような（ｇｌｙｘｓｅｒｙ）ｚ型、例えば（例えば（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３または（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）３のもの、および本明細書において言及されるAblynxによる出願（例えばWO 06/040153およびWO 06/122825を参照）において記載されるGS30、GS15、GS9およびGS7リンカー、ならびに、ヒンジ様領域、例えば天然に存在する重鎖抗体のヒンジ領域または類似の配列（WO 94/04678において記載されるものなど）を含む。好ましいリンカーは、表３において表される。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記リンカーは、配列番号１６〜２６からなる群より選択される。
【００８４】
本発明の範囲は、用いられるリンカーの長さ、可撓性の程度および／または他の特性は（通常はｓｃＦｖフラグメントにおいて用いられるリンカーのためのものであるので、決定的なものではないが）、最終的な本発明のポリペプチドおよび／またはダイマーの特性（限定されないがケモカインまたは他の抗原のうちの１つ以上に対する親和性、特異性またはアビディティーを含む）に対して何らかの影響を有し得ることを包含する。本明細書における開示に基づいて、当業者は、任意にいくらかの限定された慣用的な実験の後で、特定の本発明のポリペプチドおよび／またはダイマーにおける使用のための最適なリンカーを決定することができるであろう。
本発明のポリペプチドにおいて２つ以上のリンカーが用いられる場合、これらのリンカーは、同じであっても異なっていてもよい。やはり、本明細書における開示に基づいて、当業者は、任意にいくらかの限定された慣用的な実験の後で、特定の本発明のポリペプチドにおける使用のための最適なリンカーを決定することができるであろう。
【００８５】
本発明のポリペプチドにおいて、ISVDは、Ｎ末端伸長に先行されていてもよい。本発明に関して、Ｎ末端伸長は、少なくとも１つのアミノ酸残基から最大４０アミノ酸残基、好ましくは２〜３０アミノ酸残基、例えば２〜２０アミノ酸残基、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸残基などのアミノ酸配列からなる。Ｎ末端伸長は、本発明のポリペプチド中の第１の（すなわち、最もＮ末端側に位置する）ISVDの、第１の（すなわち、最もＮ末端側に位置する、一般にKabatの番号付けによるアミノ酸１により指定される）アミノ酸残基の、Ｎ末端側に存在する。したがって、本発明は、Ｎ末端伸長を含む第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドに関する。
【００８６】
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記第１のポリペプチドの前記の少なくとも２つのISVDは同一であり、および／または前記第２のポリペプチドの前記の少なくとも２つのISVDは、同一である。
一態様において、ダイマーの本発明の第１のポリペプチドと本発明の第２のポリペプチドとは異なる。
【００８７】
一態様において、ダイマーを形成する本発明の第１のポリペプチドと本発明の第２のポリペプチドとは同じである。したがって、本発明の第１のポリペプチドと本発明の第２のポリペプチドとは同一である。
【表３】
2018509394.tif 000011
【００８８】
下でさらに詳述するとおり、ISVDは、ＶＨＨ、ＶＨまたはＶＬドメインから誘導することができるが、ISVDは、本発明のポリペプチドにおいて、または本発明のダイマーにおいて、ＶＨおよびＶＬドメインの相補対を形成しないように選択される。Nanobody、ＶＨＨおよびヒト化ＶＨＨは、軽鎖を有さない天然のラクダ科抗体から誘導される点において普通ではなく、実際に、これらのドメインは、ラクダ科軽鎖と結合して相補的なＶＨＨおよびＶＬ対を形成することができない。したがって、本発明のダイマーおよびポリペプチドは、相補的ISVDを含まず、および／または例えば相補的ＶＨ／ＶＬ対などの相補的ISVD対を形成しない。
【００８９】
一価ポリペプチドは、１つのみの結合ユニット（例えば免疫グロブリン単一可変ドメインなど）を含むか、これから本質的になる。２つ以上の結合ユニット（例えば免疫グロブリン単一可変ドメインなど）を含むポリペプチドはまた、本明細書において「多価」ポリペプチドとして言及され、かかるポリペプチド中に存在する結合ユニット／免疫グロブリン単一可変ドメインはまた、本明細書において、「多価形式」にあるものとして言及されるであろう。例えば、「二価」ポリペプチドは、任意にリンカー配列を介して連結された、２つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよく、一方、「三価」ポリペプチドは、任意に２つのリンカー配列を介して連結された、３つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよく；一方、「四価」ポリペプチドは、任意に３つのリンカー配列を介して連結された、４つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい、など。
【００９０】
多価ポリペプチドにおいて、２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、同じであっても異なっていてもよく、同じ抗原または抗原決定基に対して（例えば同じ部分もしくはエピトープに対して、または異なる部分もしくはエピトープに対して）向けられていてもよく、あるいは、代替的に、異なる抗原または抗原決定基に対して向けられていてもよく；あるいは、これらの任意の好適な組み合わせであってもよい。少なくとも１つの結合ユニットが第１の標的の第１の抗原に対して向けられ、少なくとも１つの結合ユニットが第２の標的の抗原（例えば 第１の標的とは異なるもの）に対して向けられている、少なくとも２つの結合ユニット（例えば免疫グロブリン単一可変ドメインなど）を含むポリペプチドは、また、「多重特異性」ポリペプチドとして言及され、かかるポリペプチド中に存在する結合ユニット（例えば免疫グロブリン単一可変ドメインなど）はまた、本明細書において、「多重特異性形式」にあるものとして言及されるであろう。したがって、例えば、本発明の「二重特異性」ポリペプチドは、第１の標的の第１の抗原に対して向けられた少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン、および第２の抗原（すなわち、前記第１の標的の第１の抗原とは異なるもの）に対して向けられた少なくとも１つのさらなる免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドである、など。
【００９１】
例えば「二重パラトピック（biparatopic）ポリペプチド」または「三重パラトピック（triparatopic）ポリペプチド」などの「多重パラトピック（multiparatopic）ポリペプチド」は、各々が異なるパラトープを有する２つ以上の結合ユニットを含むか、これらから本質的になる。さらなる側面において、本発明のポリペプチドは、例えば「本発明の二重パラトピックポリペプチド」または「本発明の三重パラトピックポリペプチド」などの多重パラトピックポリペプチド（本明細書においてまた「本発明の多重パラトピックポリペプチド」と称される）である。用語「多重パラトピック」（抗原−）結合分子または「多重パラトピック」ポリペプチドは、本明細書において用いられる場合、少なくとも２つの（すなわち２つ以上の）免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドであって、ここで、「第１の」免疫グロブリン単一可変ドメインは第１の標的に対して向けられ、「第２の」免疫グロブリン単一可変ドメインは同じ第１の標的に対して向けられ、ここで、前記「第１」および「第２」の免疫グロブリン単一可変ドメインは、異なるパラトープを有するものを意味するべきである。したがって、多重パラトピックポリペプチドは、第１の標的に対して向けられた２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか、これらからなり、ここで、少なくとも１つの「第１の」免疫グロブリン単一可変ドメインは、前記第１の標的上の第１のエピトープに対して向けられ、少なくとも１つの「第２の」免疫グロブリン単一可変ドメインは、前記第１の標的上の第１のエピトープとは異なる前記第１の標的上の第２のエピトープに対して向けられる。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記第１のポリペプチドおよび／または前記第２のポリペプチドは、一価、二価、多価、単一特異性、二重特異性および多重特異性のポリペプチドの群から選択される。
【００９２】
本明細書において用いられる場合、本発明の「標的」は、ISVDが結合することができる任意の好適な抗原（例えば目的の任意の標的）である。本発明のISVDは、例えば悪性病変に関与する、例えば受容体チロシンキナーゼ（RTK）またはＧタンパク質共役受容体（GPCR）などの標的の、抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたは立体構造（適用可能である場合）に結合することができるか、またはこれに対して向けられていてもよい。本発明の標的は、任意の標的、例えば細胞の表面上の細胞受容体など、例えば悪性病変に関与することが知られている、腫瘍の開始、維持、血管新生および脈管の増殖に関与する、受容体チロシンキナーゼ（RTK）およびRTKにより媒介されるシグナル伝達経路の成分などであってよい。約２０の異なるRTKのクラスが同定されており、そのうち、最も広範に研究されているものは、以下である：１．RTKクラスＩ（EGF受容体ファミリー）（ErbBファミリー）、２．RTKクラスＩＩ（インスリン受容体ファミリー）、３．RTKクラスＩＩＩ（PDGF受容体ファミリー）、４．RTKクラスＩＶ（FGF受容体ファミリー）、５．RTKクラスＶ（VEGF受容体ファミリー）、６．RTKクラスＶＩ（HGF受容体ファミリー）、７．RTKクラスＶＩＩ（Trk受容体ファミリー）、８．RTKクラスＶＩＩＩ（Eph受容体ファミリー）、９．RTKクラスＩＸ（AXL受容体ファミリー）、１０．RTKクラスＸ（LTK受容体ファミリー）、１１．RTKクラスＸＩ（TIE受容体ファミリー）、１２．RTKクラスＸＩＩ（ROR受容体ファミリー）、１３．RTKクラスＸＩＩＩ（DDR受容体ファミリー）、１４．RTKクラスＸＩＶ（RET受容体ファミリー）、１５．RTKクラスＸＶ（KLG受容体ファミリー）、１６．RTKクラスＸＶＩ（RYK受容体ファミリー）、１７．RTKクラスＸＶＩＩ（MuSK受容体ファミリー）。特に、上皮増殖因子受容体（EGFR）、血小板由来増殖因子受容体（PDGFR）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、c-Met、HER3、プレキシン、インテグリン、CD44、RONなどの標的、ならびにRas／Raf／マイトジェン活性化タンパク質（MAP）キナーゼおよびホスファチジルイノシトール−３キナーゼ（PI3K）／Akt／哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（mammalian target of rapamycin：mTOR）経路などの経路に関与する受容体上のものが好ましい。
【００９３】
したがって、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記第１の標的および前記第２の標的は、独立して、以下からなる群より選択される：GPCR、受容体チロシンキナーゼ、DDR1、ジスコイジンＩ（CD167a抗原）、DDR2、ErbB-1、C-erbB-2、FGFR-1、FGFR-3、CD135抗原、CD117抗原、タンパク質チロシンキナーゼ−１、c-Met、CD148抗原、C-ret、ROR1、ROR2、Tie-1、Tie-2、CD202b抗原、Trk-A、Trk-B、Trk-C、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、Notch受容体1-4、FAS受容体、DR5、DR4、CD47、CX3CR1、CXCR-3、CXCR-4、CXCR-7、ケモカイン結合タンパク質２、およびCCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10およびCCR11；MART-1、癌胎児抗原（「CEA」）、gp100、MAGE-1、HER-2、およびLewisＹ抗原、CD123、CD44、CLL-1、CD96、CD47、CD32、CXCR4、Tim-3、CD25、TAG-72、Ep-CAM、PSMA、PSA、GD2、GD3、CD4、CD5、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD45、CD52、およびCD147；ErbB3およびErbB4を含む増殖因子受容体；ならびに以下を含むサイトカイン受容体：インターロイキン−２受容体ガンマ鎖（CD132抗原）；インターロイキン−１０受容体アルファ鎖（IL-10R-A）；インターロイキン−１０受容体ベータ鎖（IL-10R-B）；インターロイキン−１２受容体β−１鎖（IL-12R−ベータ１）；インターロイキン−１２受容体β−２鎖（IL-12受容体ベータ−２）；インターロイキン−１３受容体アルファ−１鎖（IL-13R-アルファ−１）（CD213 al抗原）；インターロイキン−１３受容体アルファ−２鎖（インターロイキン−１３結合タンパク質）；インターロイキン−１７受容体（IL-17受容体）；インターロイキン−１７Ｂ受容体（IL-17B受容体）；インターロイキン２１受容体前駆体（IL-21R）；インターロイキン−１受容体、Ｉ型（IL-1R-1）（CD121a）；インターロイキン−１受容体、ＩＩ型（IL-1R-ベータ）（CDw121b）；インターロイキン−１受容体アンタゴニストタンパク質（IL-1ra）；インターロイキン−２受容体アルファ鎖（CD25抗原）；インターロイキン−２受容体ベータ鎖（CD122抗原）；インターロイキン−３受容体アルファ鎖（IL-3R-アルファ）（CD123抗原）。例示的な分子標的（例えば抗原）として、以下が挙げられる：CDタンパク質、例えばCD2、CD3、CD4、CD8、CD11、CD19、CD20、CD22、CD25、CD33、CD34、CD40、CD52；ErbB受容体ファミリーのメンバー、例えばEGF受容体（EGFR、HER1、ErbB1）、HER2（ErbB2）、HER3（ErbB3）またはHER4（ErbB4）受容体；CRIgなどのマクロファージ受容体；TNFaまたはTRAIL/Apo-2などの腫瘍壊死因子；細胞接着分子、例えばLFA-1、Mad、p150、p95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、およびａまたはβサブユニットのいずれかを含むανβ３インテグリン；増殖因子および受容体、例えばEGF、FGFR（例えばFGFR3）およびVEGF；IgE；IL1などのサイトカイン；IL2受容体などのサイトカイン受容体；血液型抗原；flk2/flt3受容体；肥満（OB）受容体；mpl受容体；CTLA-4；タンパク質Ｃ；ニューロピリン；エフリンおよび受容体；ネトリンおよび受容体；スリット（slit）および受容体；ケモカインおよびケモカイン受容体、例えばCCL5、CCR4、CCR5；アミロイドベータ；補体因子Ｄなどの補体因子；酸化LDL（oxLDL）などのリポタンパク質；リンホトキシンアルファ（LTa）などのリンホトキシン。他の分子標的として、Tweak、B7RP-1、プロタンパク質転換酵素スブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）、スクレロスチン、c-kit、Tie-2、c-fmsおよび抗M1が挙げられる。
【００９４】
好ましい態様において、ISVDのうちの少なくとも１つは、上皮増殖因子受容体（EGFR）、好ましくはヒトEGFR、またはその任意のアイソフォーム（Uniprotデータベース（http://www.uniprot.org/uniprot/P00533）により提供されるとおりのP00533-1、P00533-2、P00533-3またはP00533-4により表されるようなもの）、さらにより好ましくは配列番号６１により表されるhEGFRに結合する。
【数２】
2018509394.tif 000012
【００９５】
一態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号２７〜３１および６２〜８１から選択される。
一態様において、本発明のポリペプチドは、CD4、CD123、IL23、CXCR4、IL12Rb1、IL12Rb2またはCEACAM5に結合するISVDのうちの少なくとも１つを含み、好ましくは、前記ISVDは、独立して、配列番号９７〜１１０から選択される（表６を参照）。
また、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドおよび／またはダイマーは、一般にその標的の全ての天然に存在するかまたは合成のアナログ、バリアント、変異体、対立遺伝子、部分およびフラグメントに結合するであろうことが予測される。
したがって、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記第１のポリペプチドの前記ISVDは、第１の標的に結合し、および／または前記第２のポリペプチドの前記ISVDは、第２の標的に結合する。
【００９６】
したがって、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記第１のポリペプチドは、第１の標的に：
−  競合FACSにより決定されるとき、最高でも１００ｎＭ、例えば５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、好ましくはさらに最高でも２ｎＭ、例えば１ｎＭのＩＣ５０で；
−  １０−５〜１０−１２モル／リットル以下、および好ましくは１０−７〜１０−１２モル／リットル以下、およびより好ましくは１０−８〜１０−１２モル／リットルの解離定数（ＫＤ）で；
−  １０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１の会合の速度（ｋｏｎ速度）で；ならびに／または
−  １ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１の解離の速度（ｋｏｆｆ速度）で、
結合する。
【００９７】
したがって、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記第２のポリペプチドは、第２の標的に：
−  競合FACSにより決定されるとき、最高でも１００ｎＭ、例えば５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、好ましくはさらに最高でも２ｎＭ、例えば１ｎＭのＩＣ５０で；
−  １０−５〜１０−１２モル／リットル以下、および好ましくは１０−７〜１０−１２モル／リットル以下、およりより好ましくは１０−８〜１０−１２モル／リットルの解離定数（ＫＤ）で；
−  １０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１の会合の速度（ｋｏｎ速度）で；ならびに／または
−  １ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１の解離の速度（ｋｏｆｆ速度）で
結合する。
【００９８】
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記第１の標的と前記第２の標的とは、異なる。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記第１の標的と前記第２の標的とは、同一である。
【００９９】
他に示されない限り、用語「免疫グロブリン配列」とは、本明細書において重鎖抗体に言及して用いられるか、慣用的な４鎖抗体に言及して用いられるかに関わらず、フルサイズの抗体、その個々の鎖、ならびにその部分、ドメインまたはフラグメント（抗原結合ドメインまたはフラグメント、例えばそれぞれＶＨＨドメインまたはＶＨ／ＶＬドメインを含むが、これらに限定されない）の全てを含むような一般的用語として用いられる。加えて、用語「配列」とは、本明細書において（例えば「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」または「タンパク質配列」などの用語中で）用いられる場合、文脈がより限定された解釈を必要としない限り、一般に、関連するアミノ酸配列、ならびにそれをコードする核酸またはヌクレオチド配列の全てを含むように理解されるべきである。
【０１００】
免疫グロブリン単一可変ドメインは、ポリペプチドの調製のための「結合ユニット」、「結合ドメイン」または「構成要素（building block）」（これらの用語は、交換可能に用いられる）として用いられる場合があり、これは任意に、結合ユニットとして働き得る（すなわち、同じ標的の同じまたは異なるエピトープに対する、および／または１つ以上の異なる標的に対する）１つ以上のさらなる免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
【０１０１】
用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（「ISVD」）は、「単一可変ドメイン」（「SVD」）と交換可能に用いられ、抗原結合部位が、単一の免疫グロブリンドメイン上に存在するか、またはこれにより形成される分子を定義する。免疫グロブリン単一可変ドメインのこのセットは、２つの免疫グロブリンドメイン、特に２つの可変ドメインが、相互作用して抗原結合部位を形成する「慣用的な」免疫グロブリンまたはそれらのフラグメントとは異なる。典型的には、慣用的な免疫グロブリンにおいて、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、相互作用して抗原結合部位を形成する。この場合、ＶＨおよびＶＬの両方の相補性決定領域（CDR）が抗原結合部位に寄与し、すなわち、全６個のCDRが抗原結合部位の形成に関与する。
【０１０２】
対照的に、免疫グロブリン単一可変ドメインの結合部位は、単一のＶＨまたはＶＬドメインにより形成される。したがって、免疫グロブリン単一可変ドメインの抗原結合部位は、３個以下のCDRにより形成される。
用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」および「単一可変ドメイン」は、このように、抗原結合部位の形成のために少なくとも２つの可変ドメインの相互作用を必要とする慣用的な免疫グロブリンまたはそれらのフラグメントを含まない。しかし、これらの用語は、抗原結合部位が単一可変ドメインにより形成される、慣用的な免疫グロブリンのフラグメントを含む。
【０１０３】
一般に、単一可変ドメインは、４個のフレームワーク領域（それぞれFR1〜FR4）および３個の相補性決定領域（それぞれCDR1〜CDR3）から本質的になるアミノ酸配列である。かかる単一可変ドメインおよびフラグメントは、最も好ましくは、免疫グロブリンの折り畳み（fold）を含むか、好適な条件下において、免疫グロブリンの折り畳みを形成することができるようなものである。したがって、単一可変ドメインは、例えば、軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ−配列）もしくはその好適なフラグメント；または重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列もしくはＶＨＨ配列）もしくはその好適なフラグメントを含んでもよい（それが単一の抗原結合ユニット（すなわち、単一可変ドメインから本質的になる機能的な抗原結合ユニット（したがって、例えば例えば慣用的な抗体中に存在する可変ドメイン、および機能的な抗原結合ドメインを形成するために別の可変ドメインと（例えばＶＨ／ＶＬ相互作用を通して）相互作用する必要があるｓｃＦｖフラグメントについての場合のように、単一の抗原結合ユニットが、機能的な抗原結合ユニットを形成するために別の可変ドメインと相互作用する必要がない））を形成することができる限りにおいて）。
【０１０４】
本発明の一態様において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ−配列）、または重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ−配列）である；より具体的には、免疫グロブリン単一可変ドメインは、慣用的な４鎖抗体から誘導される重鎖可変ドメイン配列、または重鎖抗体から誘導される重鎖可変ドメイン配列であってよい。
例えば、単一可変ドメインまたは免疫グロブリン単一可変ドメイン（または免疫グロブリン単一可変ドメインとしての使用のために好適なアミノ酸）は、（単一）ドメイン抗体（または（単一）ドメイン抗体としての使用のために好適なアミノ酸）、「ｄＡｂ」もしくはｄＡｂ（またはｄＡｂとしての使用のために好適なアミノ酸）またはNanobody（本明細書において定義されるとおりであり、VHHを含むがこれに限定されない）；他の単一可変ドメイン、またはそのうちの任意の１つの任意の好適なフラグメントであってよい。
【０１０５】
（単一）ドメイン抗体の一般的説明についてはまた、本明細書において引用される先行技術に対する、ならびにEP 0368684に対する参照がなされる。用語「ｄＡｂ」については、例えば、Wardら、1989（Nature 341: 544-546）に対して、Holtら、2003（Trends Biotechnol. 21: 484-490）に対して；ならびに、例えばWO 04/068820、WO 06/030220、WO 06/003388、WO 06/059108、WO 07/049017、WO 07/085815およびDomantis Ltd.の他の公開された特許出願に対して、参照がなされる。また、哺乳動物に由来するものではないので本発明に関しては好ましさが低いが、単一可変ドメインは、ある種のサメから誘導することができることにも、留意すべきである（例えば、いわゆる「IgNARドメイン」、例えばWO 05/18629を参照）。
特に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、NANOBODY（登録商標）（本明細書において定義されるとおり）またはその好適なフラグメントであってよい［注意：NANOBODY（登録商標）、NANOBODIES（登録商標）およびNANOCLONE（登録商標）は、Ablynx N.V.の登録された商標である］。Nanobodyの一般的説明については、以下のさらなる記載、ならびに本明細書において引用される先行技術（例えばWO 08/020079（１６頁）において記載されるものなど）に対して参照がなされる。
【０１０６】
ＶＨＨおよびNanobodyのさらなる説明については、Muyldermans 2001（Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302）による総説論文に対して、ならびに、一般的な背景技術として言及される以下の特許出願に対して、参照がなされる：Vrije Universiteit BrusselのWO 94/04678、WO 95/04079およびWO 96/34103；UnileverのWO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231およびWO 02/48193；Vlaams Instituut voor Biotechnologie（VIB）のWO 97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016およびWO 03/055527；Algonomics N.V.およびAblynx N.V.のWO 03/050531；National Research Council of CanadaのWO 01/90190；Institute of AntibodiesのWO 03/025020；ならびに、Ablynx N.V.によるWO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551、WO 05/044858、WO 06/40153、WO 06/079372、WO 06/122786、WO 06/122787およびWO 06/122825、およびAblynx N.V.によるさらなる公開された特許出願。また、これらの出願において言及されるさらなる先行技術、および特に国際出願WO 06/040153の４１〜４３頁において言及される参考文献のリストに対して参照がなされ、このリストおよび参考文献は、本明細書において参考として援用される。これらの参考文献において記載されるとおり、Nanobody（特にVHH配列および部分的にヒト化されたNanobody）は、特に、フレームワーク配列のうちの１つ以上における１つ以上の「ホールマーク（Hallmark）残基」の存在により特徴づけることができる。Nanobodyのヒト化および／またはラクダ化（camelization）、ならびに他の修飾、部分またはフラグメント、誘導体または「Nanobody融合体」、多価コンストラクト（リンカー配列のいくつかの非限定的な例を含む）、およびNanobodyの半減期を延長するための様々な修飾、およびそれらの調製を含む、Nanobodyのさらなる説明は、例えば、WO 08/101985およびWO 08/142164において見出すことができる。
【０１０７】
したがって、本発明の意味において、用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」または「単一可変ドメイン」は、非ヒトのソース、好ましくはラクダ科、好ましくはラクダ科重鎖抗体から誘導されるポリペプチドを含む。それらは、先に記載されるようにヒト化されていてもよい。さらに、当該用語は、例えばDaviesおよびRiechmann、1994（FEBS 339: 285-290）、1995（Biotechnol. 13: 475-479）、1996（Prot. Eng. 9: 531-537）ならびにRiechmannおよびMuyldermans、1999（J. Immunol. Methods 231: 25-38）において記載されるような、非ラクダ科ソース、例えばマウスまたはヒトから誘導されるポリペプチドであって「ラクダ化（camelized）」されているものを含む。
【０１０８】
用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヒトおよびラクダの免疫グロブリン配列を含む、異なる起源の免疫グロブリン配列を包含する。それはまた、完全なヒトの、ヒト化された、またはキメラの免疫グロブリン配列を含む。例えば、それは、ラクダ免疫グロブリン配列およびヒト化ラクダ免疫グロブリン配列、またはラクダ化免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばWardら、1989年（例えばWO 94/04678ならびにDaviesおよびRiechmann、1994、1995および1996年を参照）により記載されるラクダ化dAb、ならびにラクダ化ＶＨを含む。
【０１０９】
やはり、かかる免疫グロブリン単一可変ドメインは、任意の好適な様式において、および任意の好適なソースから誘導することができ、例えば天然に存在するＶＨＨ配列（すなわち、ラクダ科の好適な種）であっても、合成もしくは半合成のアミノ酸配列であってもよく、これは、限定されないが、部分的にまたは完全に「ヒト化された」ＶＨＨ、「ラクダ化された」免疫グロブリン配列（および特にラクダ化ＶＨ）、ならびに親和性成熟（例えば、合成の、ランダムな、または天然に存在する免疫グロブリン配列、例えばＶＨＨ配列から出発する）、CDRグラフティング（grafting）、べニアリング（veneering）、異なる免疫グロブリン配列から誘導されるフラグメントを組み合わせること、重複プライマーを用いるPCRアセンブリ、および当業者に周知の免疫グロブリン配列を操作するための類似の技術などの技術により得られたNanobodyおよびＶＨＨ；または、前述のいずれかの任意の好適な組み合わせを含む。
【０１１０】
免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列および構造は、（しかしそれに限定されることなく）、４つのフレームワーク領域または「FR」からなるものと考えることができ、これらは、当該分野においておよび本明細書において、それぞれ、「フレームワーク領域１」または「FR1」として；「フレームワーク領域２」または「FR2」として；「フレームワーク領域３」または「FR3」として；および「フレームワーク領域４」または「FR4」として言及され；このフレームワーク領域は、３つの相補性決定領域または「CDR」により断続し、これらは、当該分野において、それぞれ、「相補性決定領域１」または「CDR1」として；「相補性決定領域２」または「CDR2」として；および「相補性決定領域３」または「CDR3」として言及される。
【０１１１】
したがって、一般に、ISVDは、（一般的）構造：
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
を有するアミノ酸配列として定義することができ、ここで、FR1〜FR4は、それぞれ、フレームワーク領域１〜４を指し、ここで、CDR1〜CDR3は、ぞれぞれ、相補性決定領域１〜３を指す。特に、Nanobodyは、（一般的）構造：
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
を有するアミノ酸配列であってよく、ここで、FR1〜FR4は、それぞれ、フレームワーク領域１〜４を指し、ここで、CDR1〜CDR3は、ぞれぞれ、相補性決定領域１〜３を指し、ここで、ホールマーク残基のうちの１つ以上は、本明細書において引用される参考文献において、または表Ｂ−２において、さらに定義される。
【表４】
2018509394.tif 000013
【０１１２】
したがって、別の好ましいが限定的ではない側面において、本発明のNanobodyは、
（一般的）構造：
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
を有するアミノ酸配列として定義することができ、ここで、FR1〜FR4は、それぞれ、フレームワーク領域１〜４を指し、ここで、CDR1〜CDR3は、ぞれぞれ、相補性決定領域１〜３を指し、およびここで：（ｉ）Kabat番号付けによる１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４および１０８位におけるアミノ酸残基の１つ以上は、表Ｂ−２において言及されるホールマーク残基から選択され；およびここで：（ｉｉ）CDR1、CDR2およびCDR3は、本明細書において定義されるとおりである。
【０１１３】
好ましいが非限定的な側面において、本発明は、例えばEGFRなどの標的に対するISVD（Nanobodyなど）に関し、これは、４つのフレームワーク領域（それぞれFR1〜FR4）および３つの相補性決定領域（それぞれCDR1〜CDR3）からなり、ここで：
−  CDR1は、以下からなる群より選択される：
（ａ）配列番号４７および５５のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４７および５５のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号４７および５５のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つと３、２または１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
ならびに／または
−  CDR2は、以下からなる群より選択される：
（ｄ）配列番号４９および５７のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号４９および５７のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４９および５７のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つと３、２または１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
ならびに／または
−  CDR3は、以下からなる群より選択される：
（ｇ）配列番号５１および５９のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号５１および５９のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉ）配列番号５１および５９のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つと３、２または１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
または、かかるアミノ酸配列の任意の好適なフラグメント。
【０１１４】
好ましいが非限定的な側面において、本発明は、例えばEGFRなどの標的に対するISVD（Nanobodyなど）に関し、これは、４つのフレームワーク領域（それぞれFR1〜FR4）および３つの相補性決定領域（それぞれCDR1〜CDR3）からなり、ここで：
−  FR1は、以下からなる群より選択される：
（ｉ）配列番号４６および５４のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号４６および５４のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号４６および５４のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と３、２または１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
ならびに／または
−  CDR1は、以下からなる群より選択される：
（ａ）配列番号４７および５５のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４７および５５のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号４７および５５のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つと３、２または１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
ならびに／または
−  FR2は、以下からなる群より選択される：
（ｉｖ）配列番号４８および５６のアミノ酸配列；
（ｖ）配列番号４８および５６のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
（ｖｉ）配列番号４８および５６のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つと３、２または１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
ならびに／または
−  CDR2は、以下からなる群より選択される：
（ｄ）配列番号４９および５７のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号４９および５７のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４９および５７のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つと３、２または１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
ならびに／または
−  FR3は、以下からなる群より選択される：
（ｖｉｉ）配列番号５０および５８のアミノ酸配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号５０および５８のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉｘ）配列番号５０および５８のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つと３、２または１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
ならびに／または
−  CDR3は、以下からなる群より選択される：
（ｇ）配列番号５１および５９のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号５１および５９のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉ）配列番号５１および５９のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つと３、２または１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
ならびに／または
−  FR4は、以下からなる群より選択される：
（ｘ）配列番号５２および６０のアミノ酸配列；
（ｘｉ）配列番号５２および６０のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
（ｘｉｉ）配列番号５２および６０のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つと３、２または１個のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
または、かかるアミノ酸配列の任意の好適なフラグメント。
【０１１５】
好ましくは、ISVDは、配列番号４５〜５３からなる群より選択される。
免疫グロブリン単一可変ドメイン中のアミノ酸残基の合計数は、１１０〜１２０の範囲であってよく、好ましくは１１２〜１１５であり、最も好ましくは１１３である。
【０１１６】
WO 08/020079（本明細書において参考として援用される）の５８および５９頁における段落ｑ）においてさらに記載されるとおり、免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸残基は、RiechmannおよびMuyldermans、2000（J. Immunol. Methods 240: 185-195；例えば本刊行物の図２を参照）の論文においてラクダ科からのＶＨＨドメインに適用されるとおり、Kabatらにより示されたＶＨドメインの一般的な番号付け（「Kabat番号付け」）に従って番号付けられ（「Sequence of proteins of immunological interest」、US Public Health Services、NIH Bethesda, MD、刊行物番号91）、したがって、免疫グロブリン単一可変ドメインのFR1は、１〜３０位におけるアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのCDR1は、３１〜３５位におけるアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのFR2は、３６〜４９位におけるアミノ酸を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのCDR2は、５０〜６５位におけるアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのFR3は、６６〜９４位におけるアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのCDR3は、９５〜１０２位におけるアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのFR4は、１０３〜１１３位におけるアミノ酸残基を含む。
【０１１７】
本明細書において、ならびにWO 08/020079において、WO 06/040153において、および 本明細書において引用されるさらなる免疫グロブリン単一可変ドメインに関連する参考文献において示される免疫グロブリン単一可変ドメイン配列の例に基づいて、アミノ酸残基の正確な数はまた、免疫グロブリン単一可変ドメイン中に存在する特定のCDRの長さに基づくであろうことは、明らかであろう。CDRに関して、当該分野において周知であるとおり、Kabatの定義（配列変異性に基づき、最も一般的に用いられる）、およびChothiaの定義（構造的ループ領域の位置に基づく）などの、ＶＨまたはＶＨＨフラグメントのCDRを定義および記載するための複数の慣習が存在する。例えば、ウェブサイトhttp://www.bioinf.org.uk/abs/に対する参照がなされる。本明細書および請求の範囲の目的のために、KabatによるCDRもまた言及され得るが、CDRは、最も好ましくは、Abmの定義（Oxford Molecular'のAbM 抗体モデリングソフトウェアに基づく）に基づく。なぜならば、これがKabatとChothiaとの定義の間の最適な折衷案であると考えられるからである。やはり、ウェブサイトhttp://www.bioinf.org.uk/abs/に対して参照がなされる。
【０１１８】
一態様において、FR4は、Ｃ末端アミノ酸配列ＶＴＶＳＳ、すなわち、１０９、１１０、１１１、１１２および１１３位の各々を含む。本発明はまた、１０９、１１０、１１１または１１２位で終わるISVDを包含する。本発明の側面において、FR4は、Ｃ末端アミノ酸配列ＶＴＶＳ（１０９〜１１２位）で終わり、FR4は、Ｃ末端アミノ酸配列ＶＴＶ（１０９〜１１１位）で終わり、FR4は、Ｃ末端アミノ酸配列ＶＴ（１０９〜１１０位）で終わるか、またはFR4は、Ｃ末端アミノ酸Ｖ（１０９位）で終わる。Ｃ末端伸長は、FR4の最後のアミノ酸残基、例えばＶ１０９、Ｔ１１０、Ｖ１１１、Ｓ１１２またはＳ１１３の、または最後の（最もＣ末端に位置する）ISVDのＣ末端に存在してもよく、ここで、本発明のシステイン部分は、好ましくはＣ末端伸長のＣ末端に存在または位置する。一態様において、FR4は、Ｃ末端アミノ酸配列ＶＴＶＳＳを含み、Ｃ末端伸長は、システインである（例えば、ＶＴＶＳＳＣにおいて終わる本発明のポリペプチド）。一態様において、FR4は、Ｃ末端アミノ酸配列ＶＴＶＳを含み、Ｃ末端伸長は、システインである（例えば、ＶＴＶＳＣにおいて終わる本発明のポリペプチド）。一態様において、FR4は、Ｃ末端アミノ酸配列ＶＴＶを含み、Ｃ末端伸長は、システインである（例えば、ＶＴＶＣにおいて終わる本発明のポリペプチド）。一態様において、FR4は、Ｃ末端アミノ酸配列ＶＴを含み、Ｃ末端伸長は、システインである（例えば、ＶＴＣにおいて終わる本発明のポリペプチド）。一態様において、FR4は、Ｃ末端アミノ酸Ｖを含み、Ｃ末端伸長は、システインである（例えば、ＶＣにおいて終わる本発明のポリペプチド）。
【０１１９】
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、ISVDは、軽鎖可変ドメイン配列（ＶＬ）であるか、重鎖可変ドメイン配列（ＶＨ）であるか、慣用的な４鎖抗体から誘導されるか、または重鎖抗体から誘導される。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記ISVDの各々は、独立して、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適なアミノ酸配列、ドメイン抗体としての使用のために好適なアミノ酸配列、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適なアミノ酸配列、Nanobody、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、およびラクダ化ＶＨからなる群より選択される。好ましくは、ISVDは、１００〜１４０個のアミノ酸、例えば１１０〜１３０個のアミノ酸を含む。
【０１２０】
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記ISVDの各々は、独立して、Nanobody、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、およびラクダ化ＶＨからなる群より選択され、１０５〜１２５個のアミノ酸、例えば好ましくは１１０〜１２０個のアミノ酸、例えば１１０個、１１１個、例えば１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９または１２０個のアミノ酸、最も好ましくは１１３個のアミノ酸を含む。
本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記ISVDの各々は、独立して、Nanobody、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、およびラクダ化ＶＨからなる群より選択され、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９または１２０位のアミノ酸において、好ましくはKabat番号付けに従う１１３位のアミノ酸において終わる。
【０１２１】
本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記ISVDの各々は、独立して、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適なアミノ酸配列、ドメイン抗体としての使用のために好適なアミノ酸配列、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適なアミノ酸配列およびラクダ化ＶＨからなる群より選択され、ここで、前記単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適なアミノ酸配列、ドメイン抗体としての使用のために好適なアミノ酸配列、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適なアミノ酸配列およびラクダ化ＶＨは、ＶＨから誘導される。
【０１２２】
本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適なアミノ酸配列、ドメイン抗体としての使用のために好適なアミノ酸配列、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適なアミノ酸配列およびラクダ化ＶＨは、１１０〜１３０個のアミノ酸、好ましくは１１５〜１２７個のアミノ酸、例えば１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６または１２７個のアミノ酸、最も好ましくは１２３個のアミノ酸を含む。好ましくは、ここで、前記単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適なアミノ酸配列、ドメイン抗体としての使用のために好適なアミノ酸配列、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適なアミノ酸配列およびラクダ化ＶＨは、Kabat番号付けに従うアミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９または１３０において、好ましくはアミノ酸１２３において終わる。
【０１２３】
したがって、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記ISVDの各々は、独立して、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適なアミノ酸配列、ドメイン抗体としての使用のために好適なアミノ酸配列、ｄＡｂおよびｄＡｂとしての使用のために好適なアミノ酸配列からなる群より選択され、ここで、前記単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適なアミノ酸配列、ドメイン抗体としての使用のために好適なアミノ酸配列、ｄＡｂまたはｄＡｂとしての使用のために好適なアミノ酸配列は、ＶＬから誘導される。好ましくは、ここで、前記単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適なアミノ酸配列、ドメイン抗体としての使用のために好適なアミノ酸配列、ｄＡｂおよびｄＡｂとしての使用のために好適なアミノ酸配列は、１００〜１２０個のアミノ酸、好ましくは１０５〜１１５個のアミノ酸、例えば１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９または１２０個のアミノ酸、最も好ましくは１０８個のアミノ酸を含む。好ましくは、ここで、前記単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適なアミノ酸配列、ドメイン抗体としての使用のために好適なアミノ酸配列、ｄＡｂおよびｄＡｂとしての使用のために好適なアミノ酸配列は、Kabat番号付けに従うアミノ酸１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９または１２０において、好ましくはアミノ酸１０８において終わる。
【０１２４】
本発明の特定の側面において、本発明のポリペプチドまたはダイマーは、対応する本発明のポリペプチドまたはダイマーと比較して延長した半減期を有していてもよい。かかるポリペプチドまたはダイマーのいくつかの好ましいが非限定的な例は、本明細書におけるさらなる開示に基づいて、当業者に明らかとなり、例えば、その半減期を延長するように（例えばペグ化により）化学修飾された本発明のポリペプチド；血清タンパク質（血清アルブミンなど）に結合するための少なくとも１つのさらなる結合部位を含む本発明のポリペプチド；または、本発明のポリペプチドの半減期を延長する少なくとも１つの部分に連結される少なくとも１つの本発明のポリペプチドを含む、本発明のポリペプチドを含む。
【０１２５】
本発明の、特定の好ましいが非限定的な側面によれば、本発明のポリペプチドは、標的細胞上のエピトープに対して向けられた１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインの他に、少なくとも１つのヒト血清アルブミンに対する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。これらのヒト血清アルブミンに対する免疫グロブリン単一可変ドメインは、一般に、本明細書において引用されるAblynx N.V.による出願（例えばWO 04/062551を参照）において記載されるようなものであってよい。延長された半減期を提供され、本発明のポリペプチドにおいて用いることができる、いくつかの特に好ましいISVD、例えばNanobodyは、ISVD、例えばWO 06/122787において開示されるNanobody ALB-1〜ALB-10（表ＩＩおよびＩＩＩを参照）を含み、このうち、ALB-8（WO 06/122787における配列番号６２）、ならびに、ISVD、例えばWO 2012/175400において開示されるNanobody（WO 2012/175400における配列番号１〜１１）、およびISVD、例えば、同時係属のＵＳ仮出願番号No 62/047,560、表題「Improved Immunoglobulin single variable domains」（出願日：２０１４年９月８日；譲受人：Ablynx N.V.）において開示される配列番号１０９を有するNanobodyが特に好ましい。
【０１２６】
さらなる側面において、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記第１のポリペプチドおよび／または前記第２のポリペプチドはさらに、１つ以上の他の基、残基、部分または結合ユニット（本明細書において定義されるもの）を含み、ここで、前記の１つ以上の他の基、残基、部分または結合ユニットは、ダイマーの半減期を（前記の１つ以上の他の基、残基、部分または結合ユニットを欠くダイマーと比較して）延長する。好ましくは、ダイマーの半減期を延長する前記の１つ以上の他の基、残基、部分または結合ユニットは、ダイマーの半減期を延長するISVDである。
【０１２７】
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、ダイマーの半減期を延長する前記ISVDは、血清アルブミン、好ましくはヒト血清アルブミン、または血清イムノグロブリン、好ましくはヒトＩｇＧに結合する。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、これは、ダイマーの半減期を延長する前記ISVDを含まない対応するダイマーの半減期よりも、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍、または２０倍より長い血清半減期を有する。
【０１２８】
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、これは、ダイマーの半減期を延長する対応する前記ISVDと比較して、１時間より長く、好ましくは２時間より長く、より好ましくは６時間より長く、例えば１２時間より長く、または２４、４８または７２時間より長くまでも延長された血清半減期を有する。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、これは、ヒトにおいて、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間以上の；例えば、少なくとも５日間（例えば約５〜１０日間）、好ましくは少なくとも９日間（例えば約９〜１４日間）、より好ましくは少なくとも約１０日間（例えば約１０〜１５日間）、または少なくとも約１１日間（例えば約１１〜１６日間）、より好ましくは少なくとも約１２日間（例えば約１２〜１８日間以上）、または１４日間より長く（例えば約１４〜１９日間）の血清半減期を有する。
【０１２９】
本発明の特に好ましいが非限定的な側面において、本発明は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含み；さらに、本明細書において記載されるような１つ以上（好ましくは１つの）血清アルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばAlb11、Alb23、Alb129、Alb132、Alb8、Alb11（S112K）-A、Alb82、Alb82-A、Alb82-AA、Alb82-AAA、Alb82-G、Alb82-GG、Alb82-GGG（表１０を参照）の、例えば配列番号３２〜４４から選択される血清アルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、本発明のポリペプチドを提供する。
【表５】
2018509394.tif 000014
ISVD（Nanobodyなど）は、高度に保存された内部（別名、カノニカルまたは分子内）ジスルフィド架橋を含む。これらの特定の内部ジスルフィド架橋を取り除くことは、ISVDの活性を損なう。
【０１３０】
本発明者らは、驚くべきことに、本発明の第１のポリペプチドのＣ末端伸長において、好ましくはＣ末端において位置する不対システイン残基（Ｃｙｓ、ｃｙｓまたはＣとして略される；２−アミノ−３−スルフヒドリルプロパン酸；これは、化学式ＨＯ２ＣＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＳＨを有するα−アミノ酸である）のチオール部分（−ＳＨ）、および本発明の第２のポリペプチドのＣ末端伸長において、好ましくはＣ末端において位置する不対システイン部分のチオール部分を酸化すると、ジスルフィド誘導型シスチンがもたらされ、それによりダイマーが作製されるが、ここで分子内チオール部分が反応していないことを観察した。言い換えると、例のセクションにおいて示すように、Ｃ末端に位置するシステインのチオール基が、特異的に酸化されて、異常を生じることなく、または分子内チオール基を再酸化することなく、それによりISVDの完全性を維持しつつ、分子間結合を形成した。ポリペプチドのダイマーへのカップリングは、化学的コンジュゲーションにより行われ、ここで、２つのポリペプチドの各々におけるＣ末端伸長におけるシステインのチオール部分が、ジスルフィド誘導型シスチンへと酸化された。好ましくは、前記シスチン（例えばジスルフィド架橋）は、ダイマー中に存在する唯一の鎖間ジスルフィド結合であり、例えば、
【数３】
2018509394.tif 000015
ここで、
【数４】
2018509394.tif 000016
は、ジスルフィド誘導型シスチンを表し；
−［Ｃｙｓ−Ｓ］および−［ＡＡｘ］−［Ｃｙｓ−Ｓ］−［ＡＡｙ］は、前記ポリペプチドのシステインを含むＣ末端伸長を表し；
「ＡＡ」は、本明細書において定義される任意のアミノ酸を表し；
接頭語「Ｎ」は、ポリペプチドのＮ末端を表し；
接尾語「Ｃ」は、ポリペプチドのＣ末端を表し；
添字「ｘ」、「ｙ」、「ｐ」および「ｑ」は、独立して、０〜５０の範囲、例えば１〜４０の範囲、または２〜３０の範囲、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０などから選択される数を表す。例えば、「ｘ」、「ｙ」、「ｐ」および「ｑ」の全てが０である場合、Ｃ末端伸長は、システインのみである；「ｙ」および「ｑ」の両方が０であるが、「ｘ」および「ｐ」が０出ない場合、Ｃ末端伸長のＣ末端はシステインである。
【０１３１】
本発明は、（ポリペプチド−）ダイマーを作製する方法に関し、該方法は、少なくとも以下のステップを含む：（ｉ）第１のポリペプチドを提供すること、ここで、前記第１のポリペプチドは、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）、およびシステイン部分を（好ましくはＣ末端において）含むＣ末端伸長を含む；（ｉｉ）第２のポリペプチドを提供すること、ここで、前記第２のポリペプチドは、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）、およびシステイン部分を（好ましくはＣ末端において）含むＣ末端伸長を含む；ならびに（ｉｉｉ）前記第１のポリペプチドのＣ末端伸長における、好ましくはＣ末端における前記システイン部分のチオール部分、および前記第２のポリペプチドのＣ末端伸長における、好ましくはＣ末端における前記システイン部分のチオール部分を、ジスルフィド誘導型シスチンに参加すること；それにより前記ダイマーを作製すること；ならびに前記ジスルフィド誘導型シスチンは、ダイマーに存在する唯一の分子間ジスルフィド結合である。
【０１３２】
ポリペプチドのダイマーへのカップリングは、例えばPichiaに使用され培地（Pichia spent medium）中での化学的コンジュゲーションにより行うことができ、ここで、例えばｐＨ６．５〜ｐＨ７．５、例えばｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、ｐＨ６．８、ｐＨ６．９、ｐＨ７．０、ｐＨ７．１、ｐＨ７．２、ｐＨ７．３、ｐＨ７．４およびｐＨ７．５などの中性付近のｐＨにおいて、前記の２つのポリペプチドの各々におけるＣ末端伸長におけるシステイン（好ましくはＣ末端に位置する）が、それらのチオール部分を介してジスルフィド誘導型シスチンへと酸化される。
【０１３３】
一態様において、酸化プロセスは、酸化性銅イオン（Ｃｕ２＋）を、例えばＣｕＳＯ４の形態において添加することにより最適化される。銅処置の後で、Ｃ末端に位置するチオール部分のほぼ１００％が酸化されたことが観察された。したがって、本発明は、前記第１および／または前記第２のポリペプチドの少なくとも８０％、例えば８５％、９０％、９５％、９９％または９９％より多く、例えば１００％が二量体化される、本明細書において記載される方法に関する。酸化の程度は、任意の好適な方法により決定することができるが、好ましくは、質量分析により決定される。
【０１３４】
本発明はさらに、本明細書において記載される方法に関し、ここで、前記第１のポリペプチドは、少なくとも２つのISVDを含む、および／または前記第２のポリペプチドは、少なくとも２つのISVDを含む。
本発明はさらに、本明細書において記載される方法に関し、ここで、前記第１のポリペプチドの前記少なくとも２つのISVDは同一である、および／または前記第２のポリペプチドの前記少なくとも２つのISVDは、同一である。
本発明はさらに、本明細書において記載される方法に関し、ここで、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドは、同一であるか、異なっている。
【０１３５】
本明細書において用いられる場合、用語「二重特異性ダイマー」は、第１および第２のポリペプチドの原子価（例えば一価、二価または多価）または特異性（例えば単一特異性、二重特異性または多重特異性）に関わらず、ダイマーの第１のポリペプチドがダイマーの第２のポリペプチドと異なるダイマーを指す。ダイマーは、２つの同一であるが二重特異性のポリペプチド（本明細書において「単一特異性ダイマー」としてみなされるであろう）を含んでもよいことが、理解されるであろう。
【０１３６】
例えばダイマーの第１のポリペプチドが第２のポリペプチドと異なる二重特異性ダイマーの生成のために、方法が提供される。第１の態様において、宿主株、例えばPichia株を、２つの異なるベクターで形質転換し、ここで、第１のベクターは第１のポリペプチドをコードし、第２のベクターは第２のポリペプチドをコードする。あるいは、１つのベクターが用いられるが、ベクターは、第１のポリペプチドをコードする第１の遺伝子および第２のポリペプチドをコードする第２の遺伝子を含む。あるいは、各々が一方または他方のポリペプチドを発現する２つの宿主細胞が用いられる；例えば、第１のポリペプチドをコードする第１のベクターは、第１の宿主細胞（例えばPichia）において発現され、第２のポリペプチドをコードする第２のベクターは、第２の宿主細胞（例えばまたPichia）において発現される、など、
【０１３７】
ポリペプチドの二重特異性ダイマーへのカップリングは、例えばPichiaに使用され培地中での化学的コンジュゲーションにより行うことができ、ここで、例えばｐＨ６．５〜ｐＨ７．５、例えばｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、ｐＨ６．８、ｐＨ６．９、ｐＨ７．０、ｐＨ７．１、ｐＨ７．２、ｐＨ７．３、ｐＨ７．４およびｐＨ７．５などの中性付近のｐＨにおいて、前記の２つのポリペプチドの各々におけるＣ末端伸長におけるシステイン（好ましくはＣ末端に位置する）は、それらのチオール部分を介してジスルフィド誘導型シスチンに酸化される。
【０１３８】
一態様において、本発明は、二重特異性ダイマーを作製するための方法に関し、該方法は、少なくとも以下のステップを含む：
（ｉ）第１のポリペプチドを提供すること、ここで、前記第１のポリペプチドは、
−  少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）および
−  システイン部分を、好ましくはＣ末端において含む、Ｃ末端伸長
を含む；
（ｉｉ）第２のポリペプチドを提供すること、ここで、前記第２のポリペプチドは、
−  少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）および
−  システイン部分を、好ましくはＣ末端において含む、Ｃ末端伸長
を含む；
ここで、前記第１のポリペプチドは、前記第２のポリペプチドと異なる；ならびに
（ｉｉｉ）前記第１のポリペプチドのＣ末端における前記システイン部分のチオール部分および前記第２のポリペプチドのＣ末端における前記システイン部分のチオール部分を、任意に、好ましくはｐＨ６．５〜ｐＨ７．５において、酸化性銅イオン（Ｃｕ２＋）を添加することにより、ジスルフィド誘導型シスチンへと酸化し；それにより前記ダイマーを作製すること。
好ましくは、ISVDの完全性は維持され、前記シスチンは、ダイマー中に存在する唯一の分子間ジスルフィド結合である。
【０１３９】
用語「完全性」とは、本明細書において用いられる場合、ISVDの構造、安定性および／または機能の維持、例えば、免疫グロブリンドメインの逆平行βシート構造の２つの層を連結し、そのコグネートな抗原に結合する、適切な分子内ジスルフィド結合の維持などを指す。好ましくは、アミノ酸２２位と９２位との間（Kabatに従う）のジスルフィド結合（シスチン）が維持され、存在する場合には、CDR1とCDR3との間のさらなるジスルフィド結合が維持される。
【０１４０】
本発明は、本明細書において記載される方法に関し、ここで、第１のポリペプチドをコードする遺伝子と第２のポリペプチドをコードする遺伝子とは、２つの異なるベクター上に存在する。好ましくは、前記ベクターは、１つの宿主細胞、例えばPichia中に存在する。あるいは、前記ポリペプチドは、１つのベクター法に配置された異なる遺伝子によりコードされる。
本発明のベクターは、例えばプラスミド、コスミド、YAC、ウイルスベクターまたはトランスポゾンなどの任意の好適なベクターであってよい。特に、ベクターは発現ベクター、すなわち、in vitroおよび／またはin vivoでの（例えば好適な宿主細胞、宿主生物および／または発現系において）発現を提供することができるベクターであってよい。
【０１４１】
本発明のベクターは、宿主細胞または宿主生物を形質転換するために、すなわち、本発明のポリペプチドの発現および／または産生のために用いることができる。好適な宿主または宿主細胞は、当業者には明らかであり、例えば任意の好適な真菌、原核生物または真核生物細胞または細胞系統または任意の好適な真菌、原核生物または（非ヒト）真核生物、例えば以下であってよい：
−  以下を含むがこれらに限定されない細菌株：グラム陰性株、例えばEscherichia coli；Proteus、例えばProteus mirabilis；Pseudomonas、例えばPseudomonas fluorescensの株；およびグラム陽性株、例えばBacillus、例えばBacillus subtilisまたはBacillus brevis；Streptomyces、例えばStreptomyces lividans；Staphylococcus、例えばStaphylococcus carnosus；およびLactococcus、例えばLactococcus lactisの株；
−  以下を含むがこれらに限定されない真菌細胞：Trichodermaの種、例えばTrichoderma reeseiからのもの；Neurospora、例えばNeurospora crassa；Sordaria、例えばSordaria macrospora；Aspergillus、例えばAspergillus nigerまたはAspergillus sojae；または他の糸状菌からの細胞；
−  以下を含むがこれらに限定されない酵母細胞：Saccharomycesの種、例えばSaccharomyces cerevisiae；Schizosaccharomyces、例えばSchizosaccharomyces pombe；Pichia、例えばPichia pastorisまたはPichia methanolica；Hansenula、例えばHansenula polymorpha；Kluyveromyces、例えばKluyveromyces lactis；Arxula、例えばArxula adeninivorans；Yarrowia、例えばYarrowia lipolyticaからの細胞；
−  両生類の細胞または細胞系統、例えばXenopus oocytes；
−  昆虫由来の細胞または細胞系統、例えば限定されないがSpodoptera SF9およびSf21細胞を含む鱗翅類由来の細胞または細胞系統、またはDrosophila由来の細胞または細胞系統、例えばSchneiderおよびKc細胞；
−  植物または植物細胞、例えばタバコ植物；ならびに／あるいは
−  哺乳動物の細胞または細胞系統、例えばヒト由来の細胞または細胞系統、限定されないがCHO細胞（例えばCHO-K1細胞）、BHK細胞を含む哺乳動物由来の細胞または細胞系統、ならびにHeLa、COS、Caki、NIH3T3およびHEK293H細胞などのヒト細胞または細胞系統；
ならびに、抗体および抗体フラグメント（限定されないが（単一）ドメイン抗体およびｓｃＦｖフラグメントを含む）の発現および産生のためにそれ自体公知の全ての他の宿主細胞または（非ヒト）宿主；これらは、当業者には明らかであろう。また、本明細書において上で引用される一般的な背景技術に対して、ならびに、例えばWO 94/29457；WO 96/34103；WO 99/42077；Frenkenら（Res Immunol. 149: 589-99, 1998）；RiechmannおよびMuyldermans（1999）、上記；van der Linden（J. Biotechnol. 80: 261-70, 2000）；Joostenら（Microb. Cell Fact. 2: 1, 2003）；Joostenら（Appl. Microbiol. Biotechnol. 66: 384-92, 2005）；および本明細書において引用されるさらなる参考文献に対して、参照がなされる。
【０１４２】
本記載において、遺伝子は、機能的ポリペプチドの合成のために必要である核酸配列全体として定義される。したがって、遺伝子は、ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド（コード領域）だけでなく、また、特定のRNA転写物の合成のために必要とされる全てのDNA配を含む。好ましくは、ステップ（ｉｉｉ）は、Pichiaに使用され培地において行われる。
核酸を操作するための方法（例えば、ISVDをコードする核酸と比較して、核酸を付加する、挿入する、変異誘発する、置き換えるまたは欠失させることなど）は、当業者に周知である。上記の標準的なハンドブックに対して参照がなされる。
【０１４３】
本発明者らは、二重特異性ダイマーを作製するためのさらに最適化されたプロトコルを提供し、ここで、効率は、５０％より高く、例えば６０％、７０％、８０％または９０％より高く、例えば＞９５％であった。これは、第１の反応性ポリペプチドを（固体の）キャリアに結合させ、キャリア上に結合した第１のポリペプチドの上に第２の反応性ポリペプチドを流すことにより達成された。任意の反応しなかった第２のポリペプチドは、再生（還元）して、再びキャリア上に結合した第１のポリペプチドの上に流すことができる。このステップは、全ての第１および／または第２のポリペプチドが反応するまで繰り返すことができる。
【０１４４】
ステップ１において、第１のポリペプチドを還元して、単量体材料、好ましくは１００％の単量体材料を得る。典型的なポリペプチド溶液を還元するための一般的な条件は、本明細書において述べられる。
ステップ２において、バッファー中の第１のポリペプチドを、還元条件下において、キャリアに結合させる。キャリアは、好ましくはクロマトグラフィー樹脂である。好ましくは、キャリアは、第１のポリペプチドにのみ結合し、第２のポリペプチドには結合しない。固定されたままで、起こり得る第１のポリペプチドのホモダイマーの形成を回避するために、第１のポリペプチドを、キャリアに対して低い密度で固定することができる。個々の第１のポリペプチドのかかる空間的分離は、最適以下の結合条件（例えば典型的な親和性樹脂にとっては高すぎる流速）を用いて、または拡張式床式クロマトグラフィー（expanded bed chromatography）を介して、キャリアをロードすることにより、達成することができる。キャリア上の個々のポリペプチドを空間的に分離するための方法および条件は、一般常識に属するか、当業者による慣用的な実験により達成することができる。好ましい態様において、キャリアは、第１のポリペプチドにのみ結合し、第２のポリペプチドには結合しない。例えば、タンパク質Ａなどのキャリアは、第１のポリペプチド（および好ましくは第２のポリペプチドではない）がタンパク質Ａに結合する場合に用いることができる。あるいは、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの両方がキャリアに結合する場合には、キャリアは、第１のポリペプチドを固定した後で、第２のポリペプチドを適用する前に、非システイン伸長Nanobodyなどのダミーポリペプチドで飽和させる。
【０１４５】
ステップ３において、第２のポリペプチドの過剰量は、これもまた還元された形態において（上を参照）、バッファー中に適用し、カラム上を循環させる（任意に僅かに酸化性の条件下において）。第２のポリペプチドは、固定された第１のポリペプチドが、ジスルフィド結合を介して第２のポリペプチドと完全に複合体化（コンジュゲーション）されるまで、キャリア上を通過させる。好ましくは、これに続いて、飽和した第１のポリペプチド集団と整合するように、第２のポリペプチドの濃度低下を測定する。必要な場合には、このステップのために、条件を、第２のポリペプチドの単一特異性ダイマーの形成の量を限定するために最適化することは、当業者には周知である。キャリアに結合していない第２のポリペプチドの集団は、回収して、将来的なカップリング反応において用いることができる（例えば、再び還元して、第１のポリペプチドが飽和するまで第１のポリペプチドを有するカラムに適用するなど）。
ステップ４において、当業者には周知である用いられるキャリアについての典型的な溶離条件（例えばタンパク質Ａについては酸性条件）により、二重特異性ダイマーをキャリアから回収する。
【０１４６】
本文脈において、用語「固定」とは、空間におけるその移動が、固体構造、例えばキャリアへの付着により、完全に、または小さな限定された領域に制限された分子を指す。一般的に、用語、固定は、移動を限定するか、または移動を不可能にする、例えば移動を遅延させる作用を指す。本発明のダイマーは、任意の好適な方法により、例えば吸着、共有結合、封入、カプセル封入および（可逆性）架橋などにより、好ましくは共有結合、より好ましくは親和性により、固定することができる。固定のための任意の好適なキャリアを用いることができる。当業者は、キャリアの好適性が固定の方法に依存することを、理解するであろう。例えば、共有結合のためのキャリアは、アガロース、セルロース、架橋デキストラン、ポリスチレン、ポリアクリルアミドゲルおよび多孔性シリカゲルである。好ましいキャリアは、タンパク質Ａ樹脂である。
好適なバッファーとして、これらに限定されないが、酢酸バッファー、リン酸バッファー、クエン酸バッファー、硫酸バッファー、グリシンバッファー、カルボン酸バッファー、および／またはトリスバッファーが挙げられ得る。
【０１４７】
還元および酸化条件は、当該分野において周知である。例のセクション、説明に対して、および例えば標準的な化学のハンドブック、例えばPrinciples of Modern Chemistry（2011年、Oxtoby、GillisおよびCampion著、第７版）に対して参照がなされる。好ましい還元条件は、１〜１５ｍＭ、例えば２〜１２ｍＭ、４〜１１ｍＭ、５〜１０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭのＤＴＴ中で、最短１時間（最大８時間まで）にわたり室温で、または、カノニカル−Ｓ−Ｓ−を酸化されたままに維持するために、一晩４℃で、ポリペプチド１０ｍｇ／ｍｌまでの濃度において行う。好ましい酸化条件は、０．１〜１０ｍＭ、０．５〜５ｍＭ、好ましくは１ｍＭのＣｕＳＯ４中で、１〜４時間、好ましくは２時間にわたり、室温で、または、当業者が容易に決定することができる便利な酸化還元対を用いることにより、行う。
【０１４８】
したがって、本発明は、二重特異性ダイマーを作製するための方法に関し、該方法は、少なくとも以下のステップを含む：
１．  第１のポリペプチドを提供すること、ここで、前記第１のポリペプチドは、
−  少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）および
−  システイン部分を、好ましくはＣ末端において含む、Ｃ末端伸長
を含む；
２．  前記第１のポリペプチドを還元すること；
３．  ステップ２の還元された第１のポリペプチドを、還元条件下において、キャリアに結合させること；
４．  第２のポリペプチドを提供すること、ここで、前記第２のポリペプチドは、
−  少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）、
−  システイン部分を、好ましくはＣ末端において含む、Ｃ末端伸長
を含み、
ここで、前記第１のポリペプチドは、前記第２のポリペプチドと異なる；
５．  前記第２のポリペプチドを還元すること；
６．  任意に僅かに酸化性の条件下において、ステップ５の還元された第２のポリペプチドを、ステップ３のキャリアに結合した還元された第１のポリペプチドに適用し、前記第１のポリペプチドの、好ましくはＣ末端における前記システイン部分のチオール部分、および前記第２のポリペプチドの、好ましくはＣ末端における前記システイン部分のチオール部分を、ジスルフィド誘導型シスチンに酸化して；それにより、前記二重特異性ダイマーを作製すること（任意に、第１のポリペプチドの全てが、ジスルフィド結合を介して、完全に第２のポリペプチドにコンジュゲートするまで）；
７．  任意に、コンジュゲートしていない第２のポリペプチドを取り除き、還元し、再びステップ５および６に従って適用する；
８．  二重特異性ダイマーをキャリアから溶離させる。
【０１４９】
本発明はさらに、本明細書において記載される任意の方法に関し、ここで、前記第１のポリペプチドおよび／または前記第２のポリペプチドは、Ｎ末端伸長を含む。
本発明はさらに、本明細書において記載される方法に関し、ここで、前記第１のポリペプチドおよび／または前記第２のポリペプチドは、システイン部分を（好ましくはＣ末端において）含む、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１アミノ酸残基のＣ末端伸長を含む。。
本発明はさらに、本明細書において記載される方法に関し、ここで、前記Ｃ末端伸長は、配列番号１〜１５からなる群より選択され、好ましくは前記Ｃ末端伸長は、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＣｙｓ（配列番号４）、ＧｌｙＧｌｙＣｙｓ（配列番号３）、ＧｌｙＣｙｓ（配列番号２）またはＣｙｓ（配列番号１）からなる。
【０１５０】
本発明はさらに、本明細書において記載される方法に関し、ここで、前記Ｃ末端伸長は、前記ポリペプチド中の最Ｃ末端に位置するISVDのＣ末端に遺伝子融合される。
さらなる態様において、ダイマーは、均質になるまで精製される。精製は、当該分野において公知の任意の好適な技術、例えばクロマトグラフィー、好ましくは分子ふるいクロマトグラフィーにより達成することができ、これについては、当業者が熟知する。したがって、本発明は、本明細書において記載される方法に関し、該方法はさらに、任意に分子ふるいクロマトグラフィーを介して、前記ダイマーを精製するステップを含む。したがって、本発明は、本明細書において記載される方法に関し、ここで、前記ダイマーは、少なくとも９０％以上の純度、例えば９５％以上の純度、例えば９７％、９８％、９９％、または１００％にすら、精製される。純度は、当該分野において公知の任意の好適な方法により決定することができ、好ましくは、質量分析により決定される。
【０１５１】
一態様において、本発明は、上記の方法により調製可能なダイマーに関する。
本発明者らは、驚くべきことに、ダイマー中のポリペプチドの結合および効力などの他の機能的特徴が、保持されるのみならず、対応するベンチマークと比較して、回復されたことを観察した。いかなる理論によっても拘束されることなく、ISVDのパラトープが、このダイマーの組み立てにおいて、対応するベンチマークの組み立てにおけるものよりも、抗原認識のためにより「好ましい」位置にあり得ると仮定した。
【０１５２】
本明細書において用いられる場合、「ベンチマーク」は、例えば本明細書において記載されるような親和性、有効性および効力などの、分子の１つ以上の機能的特徴などの性能を評価するための参照の点として用いられる。特定のダイマーは、当業者により容易に評価することができるあるベンチマークの適切さを決定するであろう。好ましくは、ベンチマークは、ダイマーのISVDの数および／またはアイデンティティーと同じ数および／または同じISVDからなるであろう。好ましくは、ベンチマークは、ダイマーを構成する同じポリペプチドを含むが、ベンチマークにおいては、これらのポリペプチドは、本明細書において記載されるような化学的コンジュゲーションの代わりに、遺伝子融合により形成される（例えば例のセクションを参照）。ダイマーと、個々にダイマーを構成する一方または両方のポリペプチドとの間の比較が、既に、ダイマーの性能についての重要な情報を提供する。
【０１５３】
本発明のダイマーは、少なくとも１つのISVDを含む第１のポリペプチド、および少なくとも１つのISVDを含む第２のポリペプチドを含む。ダイマーの親和性は、全体として、例えば両方のポリペプチドを一緒にして決定してもよく、または、ダイマーの親和性は、ダイマーを個々に構成する各々のポリペプチドの親和性を決定することにより、決定してもよい。言い換えると、後者の場合において、親和性は、一方のポリペプチドについて、他方のポリペプチドに起因するアビディティー効果に関わりなく決定される。
【０１５４】
本明細書において用いられる場合、用語「効力」は、ダイマー、ベンチマーク、ポリペプチド、ISVDまたはNanobodyなどの剤の、その生物学的活性の尺度である。剤の効力は、例えば例のセクションにおいて記載されるような当該分野において公知の任意の好適な方法により決定することができる。細胞培養に基づく効力のアッセイは、しばしば、生物学的活性を決定するための好ましい形式である。なぜならば、それらは、剤により誘発された生理学的応答を測定し、相対的に短い期間内に結果を生じることができるからである。生成物の作用の機序に基づいて、多様な型の細胞ベースのアッセイを用いることができ、これは、限定されないが、増殖アッセイ、細胞傷害性アッセイ、レポーター遺伝子アッセイ、細胞表面受容体結合アッセイ、および機能的に必須のタンパク質または他のシグナル分子（例えばリン酸化されたタンパク質、酵素、サイトカイン、cAMPなど）の誘導／阻害を測定するアッセイを含み、全て当該分野において周知である。細胞ベースの効力のアッセイからの結果は、本発明のダイマーと、対応するベンチマークについて得られた応答との比較により決定された「相対的効力」として表すことができる（例のセクションを参照）。
【０１５５】
化合物、例えば本発明のダイマーは、所与のアッセイにおいて、化合物、例えば本発明のダイマーについて得られた応答が、参照化合物、例えば対応するベンチマークにより得られた応答よりも、少なくとも１．５倍、例えば２倍であるが、好ましくは少なくとも３倍、例えば少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍、およびさらにより好ましくは少なくとも１００倍も、またはそれよりさらに良好（例えば機能的に良好）である場合に、ベンチマーク、例えば、対応するポリペプチドを含むコンストラクトなどの参照化合物よりも強力であると言われる。
【０１５６】
本発明のダイマー、免疫グロブリン単一可変ドメインおよびポリペプチド、およびそれを含む組成物の有効性または効力は、関連する特定の疾患または障害に依存して、それ自体公知の任意の好適なin vitroアッセイ、細胞ベースのアッセイ、in vivoアッセイおよび／または動物モデル、またはそれらの任意の組み合わせを使用して試験することができる。好適なアッセイおよび動物モデルは、当業者には明らかであり、例えばリガンド置換アッセイ（例えばBurgess et al., Cancer Res 2006 66: 1721-9）、二量体化アッセイ（例えばWO2009/007427A2, Goetsch, 2009）、シグナル伝達アッセイ（例えばBurgess et al., Mol Cancer Ther 9: 400-9）、増殖／生存アッセイ（例えばPacchiana et al., J Biol Chem 2010 Sep M110.134031）、細胞接着アッセイ（例えばHolt et al., Haematologica 2005 90: 479-88）および遊走アッセイ（例えばKong-Beltran et al., Cancer Cell 6：75-84）、内皮細胞出芽アッセイ（例えばWang et al., J Immunol. 2009; 183: 3204-11）、およびin vivo異種移植片モデル（例えばJin et al., Cancer Res. 2008 68: 4360-8）、ならびに以下の実験の部分において、および本明細書において引用される先行技術において用いられるアッセイおよび動物モデルを含む。in vitroでの前記第１の標的の阻害を表すための手段は、ＩＣ５０による。
【０１５７】
特に、本発明のダイマーは、ベンチマークより良好な親和性（ＫＤ値（実際のまたは見かけ上の）、ＫＡ値（実際のまたは見かけ上の）、ｋｏｎ速度および／またはｋｏｆｆ速度として好適に測定される、および／または表される）で、標的に結合する。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるポリペプチドを含むダイマーに関し、ここで、前記ダイマーは、例えばリガンド競合アッセイ、競合FACS、機能的細胞アッセイ、例えばリガンドにより誘導される走化性の阻害、ALPHASCREEN（登録商標）アッセイなどにおいて、好ましくは競合FACSにより決定されるとき、ベンチマークのＩＣ５０よりも少なくとも１０％、例えば２０％、３０％、５０％、８０％、９０％、または１００％以上も良好なＩＣ５０で、標的に結合する。
【０１５８】
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるポリペプチドを含むダイマーに関し、ここで、前記ダイマーは、例えばリガンド競合アッセイ、競合FACS、機能的細胞アッセイ、例えばリガンドにより誘導される走化性の阻害、ALPHASCREEN（登録商標）アッセイなど、好ましくは競合FACSにより決定されるとき、ベンチマークのＩＣ５０よりも少なくとも１．５倍、例えば２倍、３倍または４倍、および５倍または１０倍も良好なＩＣ５０で標的に結合する。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるポリペプチドを含むダイマーに関し、例えばリガンド競合アッセイ、競合FACS、機能的細胞アッセイ、例えばリガンドにより誘導される走化性の阻害、ALPHASCREEN（登録商標）アッセイなどにおいて決定される２００ｎＭ〜０．０１ｎＭ、例えば０．０１、０．０５、０．１、０．１５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００ｎＭのＩＣ５０を有する。
【０１５９】
輸送、製造、貯蔵および送達のプロセスは、ポリペプチドに対して、化学的および物理学的ストレスなどの多様なストレスを及ぼし得る。貯蔵の間に、例えば脱アミド、ラセミ化、加水分解、酸化、異性化、ベータ脱離またはジスルフィド交換などの化学修飾が起こり得る。物理学的ストレスは、変性およびアンフォールディング、凝集、粒子形成、沈殿、石濁（opalescence）または吸着を引き起こし得る。これらのストレスが、タンパク質治療剤、例えば抗体治療剤の物理化学的完全性に影響を及ぼし得ることは、公知である。
【０１６０】
上で記述されるとおり、本発明者らは、本発明のダイマーが、予想外の好ましい結合および機能の特徴を有することを観察した。これらの特徴はまた、何らかの見かけ上のまたは実質的な効力の喪失を伴うことなく、長期間にわたり保持された。このことが、ダイマーを、貯蔵および輸送のために有用にする。本発明は、本発明の安定なダイマーを提供する。「安定な」とは、一般に、ダイマーが、長期間、例えば１か月〜３６か月にわたる貯蔵の際に、高温（＋２５℃以上）、または振盪もしくは撹拌などの物理学的ストレスなどの、１つ以上の化学または物理学的ストレスに暴露された場合であっても、著しい物理学的または化学的変化（特に酸化）を受けないことを意味する。とりわけ、「安定な」とは、長期間（定義されたとおり）にわたる条件（定義されたとおり）下における貯蔵の際に、１つ以上の分解生成物（例えば本発明のダイマーの低分子量（ＬＭＷ）誘導体（例えばポリペプチド）；および／または例えばダイマーの凝集により形成される高分子量（ＨＭＷ）誘導体（オリゴマーまたはポリマー）の形成が、ほんの限定されたものであることを意味する。
【０１６１】
したがって、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記ダイマーは、少なくとも２か月、例えば４か月、６か月、１２か月またはそれより長く、例えば１８か月、２４か月または３６か月にわたり、−２０℃、＋４℃、室温、例えば＋２０℃において、または＋２５℃においてすら安定であり、ここで、前記安定性は、ＬＭＷおよび／またはＨＭＷの限定された形成または無形成、例えば１０％未満、例えば５％未満、２％未満のＬＭＷおよび／またはＨＭＷ、または検出可能なＬＭＷおよび／またはＨＭＷが存在しないことにより特徴づけられる。
【０１６２】
タンパク質の安定性を評価するために用いることができる一般的技術として、静的光散乱、接線流濾過、フーリエ変換赤外分光法、円二色性法、尿素により誘導されるタンパク質のアンフォールディング、内因性トリプトファン蛍光および／または１−アニリン−β８−ナフタレンスルホン酸タンパク質結合が挙げられる。これらの技術は、本発明のダイマーにも適用可能である。加えて、本発明のダイマーは、貯蔵の経過において、および／または本明細書において定義される１つ以上のストレスの影響下において、効力／生物学的活性の喪失を殆どまたは全く示さない。
したがって、本発明は、反応性システイン部分を含むポリペプチドを貯蔵するための方法に関し、該方法は、少なくとも、ジスルフィド誘導型シスチンの前記反応性システイン部分のチオール部分を酸化して、それにより、前記反応性システイン部分を一時的に不活化するステップを含み、ここで、前記ポリペプチドはさらに、（内部）シスチン結合を含む。
【０１６３】
本発明のダイマーの好ましい機能的特性にも関わらず、本発明者らは、ダイマーが、例えば（例えばマレイミド化学による）Ｃ末端システインを用いる官能基のカップリングなどの即時使用のためのツールとして、特に好適であり得ることを仮定した。温和な還元条件によるプロトコルを開発した。ここで、ダイマーの分子間ジスルフィド架橋が還元されて、構成要素であるポリペプチドのチオール基を活性化する。至適条件は、内部カノニカルISVDジスルフィド架橋を還元することなく、ダイマーを形成するジスルフィドの還元をもたらした。
【０１６４】
好ましい還元剤は、酸ベースの還元剤、例えばシュウ酸（Ｃ２Ｈ２Ｏ４）、ギ酸（ＨＣＯＯＨ）、アスコルビン酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ６）、亜リン酸、またはβ−メルカプトエタノール、水酸化アルミニウムリチウム（ＬｉＡｌＨ４）、発生期（原子）水素、ナトリウムアマルガム、ジボラン、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、Ｓｎ２＋イオンを含む化合物、例えばスズ（ＩＩ）塩化物、亜硫酸化合物、ヒドラジン、亜鉛−水銀アマルガム（Ｚｎ（Ｈｇ））、ヒドリドジイソブチルアルミニウム（DIBAL-H）、リンドラー触媒、亜リン酸エステル、次亜りん酸塩、Ｆｅ２＋を含む化合物、例えば鉄（ＩＩ）硫酸塩、一酸化炭素（ＣＯ）、炭素（Ｃ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）およびトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ（ＴＣＥＰ）、好ましくはＤＴＴおよびＴＣＥＰである。
還元剤の好ましい最終濃度は、５０ｍＭおよび１ｍＭ、例えば４０ｍＭ〜２ｍＭ、３０ｍＭ〜５ｍＭ、および２０ｍＭ〜７．５ｍＭ、好ましくは１０ｍＭである。
【０１６５】
１０ｍＭのＤＴＴによる４℃における一晩の（または少なくとも２時間の間、室温での）処置は、内部カノニカルジスルフィド結合に影響を及ぼすことなく、１０ｍｇ／ｍｌまでの濃度においてISVDの分子間ジスルフィド結合を還元するために非常に好適であったことが決定された。還元は、好ましくは、ＤＴＴまたはＴＣＥＰを用いて行うことができる。ＴＣＥＰと異なり、ＤＴＴは、好ましくは、取り除かれて、最適なカップリング条件を作り出す。分子ふるいクロマトグラフィー（SEC）を介して、単量体ポリペプチドは、還元されていないダイマーおよびＤＴＴから分離することができる。
還元の程度は、当該分野において公知の任意の手段を介して、例えば、非還元条件におけるSECまたはSDS-PAGEなどを介して、モニタリングすることができる。
したがって、本発明は、本明細書において記載される方法に関し、該方法は、好ましくは、前記第１のポリペプチドおよび／または前記第２のポリペプチドの内部ジスルフィド結合が酸化されたままである条件下において、前記ダイマーの前記（Ｃ末端）シスチンを還元するステップをさらに含む。
【０１６６】
したがって、本発明は、反応性システイン部分を含むポリペプチドを生成するための方法に関し、該方法は、少なくとも以下のステップを含む：
（ｉ）シスチン（２つのシステインの間のジスルフィド結合；ＳＳ結合またはジスルフィド架橋）を介して二量体化される、本発明によるポリペプチドを提供すること
（ｉｉ）前記シスチンを還元すること；
それにより、反応性システイン部分を含むポリペプチドを生成すること；好ましくは前記シスチン結合は、前記ポリペプチドのＣ末端に位置する。好ましくは、前記ステップ（ｉｉ）の還元条件は、内部（カノニカル）シスチン結合が還元されないように選択される。
【０１６７】
ダイマーの還元の後で、還元された単量体ポリペプチドは、好ましくはすぐに、例えば０．５時間以内にコンジュゲーションのために用いられるが、好ましくは１０分間以内に用いられるか、または再酸化を防止するために凍結されるが、再酸化は、凍結によっては完全には防止されない。実験的証左は、還元された単量体本発明のポリペプチドが、Ｄ−ＰＢＳ中で４℃で２４時間まで安定であることを示唆する。
一態様において、本発明のダイマーおよび構成要素であるポリペプチドは、１個以上の官能基、残基または部分を含む。好ましくは、前記１個以上の官能基、残基または部分は、診断、治療および標識剤、好ましくは薬物の群から選択される。
【０１６８】
一態様において、本発明は、１つ以上の他の基、残基、部分または結合ユニットをさらに含む、本明細書において記載されるダイマーに関する。一態様において、本発明は、前記第１のポリペプチドおよび／または前記第２のポリペプチドが、１つ以上の他の基、残基、部分または結合ユニットをさらに含む、本明細書において記載されるダイマーに関する。例えば、官能基、残基または部分は、ポリペプチドのＣ末端におけるシステイン残基の（反応性）チオール部分とカップリングまたは連結させてもよく、および／または、官能基、残基または部分は、本発明のポリペプチドのＮ末端とカップリングまたは連結させてもよい。一態様において、本発明のダイマーのＮ末端の一方または両方が、官能基、残基または部分を含む。
【０１６９】
かかる基、残基または部分、ならびに、かかる基、残基または部分を付着させるために用いることができる方法および技術、ならびにかかる基、残基または部分の潜在的な用途および利点の例は、当業者には明らかであろう。限定されることなく、抗体修飾のためのチオール反応性基として、マレイミド、ビニルスルホン、ハロアセチルまたはピリジルジスルフィド基が挙げられる。マレイミドは、中性ｐＨにおいてシステインと選択的に反応するが、より高いｐＨ値においては、アミン基との反応性が存在する。安定なチオエーテル結合が生成される。
【０１７０】
本発明のダイマーおよび／またはポリペプチドに１つ以上の所望される特性または機能性を付与する１つ以上の官能基、残基または部分を、本発明のダイマーおよび／またはポリペプチドに付着させてもよい。かかる官能基、残基または部分の例は、当業者には明らかであろう。例えば、かかる１つ以上の官能基、残基または部分は、本発明のダイマーおよび／またはポリペプチドの半減期、可溶性および／または吸収を増大させ得、かかる１つ以上の官能基、残基または部分は、本発明のダイマーおよび／またはポリペプチドの免疫原性および／または毒性を軽減し得、かかる１つ以上の官能基、残基または部分は、本発明のダイマーおよび／またはポリペプチドの任意の望ましくない副作用を除去するかまたは減弱させ得、ならびに／あるいは、かかる１つ以上の官能基、残基または部分は、本発明のダイマーおよび／またはポリペプチドに他の有利な特性を付与するか、および／またはこれの望ましくない特性を減少させ得る；あるいは前述のものの２つ以上の任意の組み合わせである。かかる官能基、残基または部分、およびそれらを導入するための技術の例は、当業者には明らかであり、一般に、本明細書において引用される一般的な背景技術において言及される全ての官能基、残基または部分および技術、ならびに、医薬用タンパク質の修飾のための、および特に抗体または抗体フラグメント（ｓｃＦｖ単一ドメイン抗体を含む）の修飾のための、それ自体公知の官能基、残基または部分および技術を含み得、これについては、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第１６版、Mack Publishing Co., Easton, PA（1980）に対して参照がなされる。
【０１７１】
特異性を考慮すると、本発明のダイマーおよび／またはポリペプチドはまた、本明細書においてまた標識剤として示されるイメージング剤に対するコンジュゲーションのために非常に好適である。抗体をコンジュゲートするために好適なイメージング剤は、当該分野において周知であり、本発明のダイマーおよび／またはポリペプチドに対するコンジュゲーションのためにも、同様に有用である。好適なイメージング剤として、これらに限定されないが、好ましくは、有機分子、酵素標識、放射活性標識、有色標識、蛍光標識、発色標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属錯体、金属、コロイド金、蛍光標識、金属性標識、ビオチン、化学発光、生物発光、発色団およびそれらの混合物からなる群より選択される分子が挙げられる。
【０１７２】
したがって、本発明は、イメージング剤をさらに含む、本発明によるダイマーおよび／またはポリペプチドに関し、イメージング剤は、これらに限定されないが、好ましくは、有機分子、酵素標識、放射活性標識、有色標識、蛍光標識、発色標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属錯体、金属、コロイド金、蛍光標識、金属性標識、ビオチン、化学発光、生物発光、発色団およびそれらの混合物からなる群より選択される分子を含む。
【０１７３】
１つ以上の検出可能な標識または他のシグナルを生成する基、残基または部分を、標識されるポリペプチドの意図される使用に依存して、本発明のダイマーおよび／またはポリペプチドにカップリングしてもよい。好適な標識、およびそれらを付着させる、使用するおよび検出する技術は、当業者には明らかであり、例えば、これらに限定されないが、WO 08/020079の１０９頁において言及されるものなどの蛍光標識、リン光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性同位元素、金属、金属キレート、金属カチオン、発色団および酵素を含む。検出剤としてのその有用性について当該分野において知られている放射性同位元素および放射性核種として、これらに限定されないが、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１ｌｎ、１２３ｌ、１２４ｌ、１２５ｌ、１３１ｌ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２０３Ｐｂ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａおよび２２５Ａｃが挙げられる。インジウム１１１が、診断用放射性核種として特に好ましい。なぜならば、約１〜約１０ｍＣｉを、検出可能な毒性を伴わずに安全に投与することができ、その後のPDC分布のイメージングデータが、一般に予測的であるからである（上を参照）。例えば、Murray 26 J. Nuc. Med. 3328（1985）およびCarraguillo et al, 26 J. Nuc. Med. 67（1985）を参照。
【０１７４】
他の好適な標識は、当業者には明らかであり、例えば、NMRまたはESR分光法を用いて検出することができる部分を含む。例えば、本発明のポリペプチドは、例のセクションにおいて例示されるように、８９Ｚｒで放射標識することができる。かかる標識された本発明のポリペプチドは、具体的な標識の選択に依存して、例えば、in vitro、in vivo、またはin situでのアッセイ（ELISA、RIA、EIAおよび他の「サンドウィッチアッセイ」などのそれ自体公知のイムノアッセイを含む）、ならびにin vivoでの診断およびイメージングの目的のために、用いることができる。好ましい態様において、放射標識された本発明のポリペプチドおよび／またはダイマーは、microPETイメージングを介して検出される。画像は、AMIDE Medical Image Data Examinerソフトウェア（バージョン1.0.4、Stanford University）を用いて再構成することができる。
【０１７５】
ビオチン−（ストレプト）アビジン結合対などの特定の結合対の一部である官能基、残基または部分を付着させることができる。かかる官能基は、本発明のダイマーおよび／またはポリペプチドを、結合対の他方の半分に結合している別のタンパク質、ポリペプチドまたは化学的化合物に（すなわち結合対の形成を通して）連結させるために、用いることができる。例えば、本発明のダイマーおよび／またはポリペプチドをビオチンにコンジュゲートさせても、アビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートした別のタンパク質、ポリペプチド、化合物またはキャリアに連結させてもよい。例えば、かかるコンジュゲートしたダイマーおよび／またはポリペプチドは、レポーターとして、例えば診断系において用いることができ、ここで、検出可能なシグナル生成剤は、アビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートしている。かかる結合対は、例えばまた、本発明のダイマーおよび／またはポリペプチドを、医薬の目的のために好適なキャリアを含むキャリアに結合させるために用いてもよい。１つの非限定的な例は、CaoおよびSuresh、2000（Journal of Drug Targeting 8(4): 257）により記載されるリポソーム処方物である。かかる結合対はまた、治療活性剤を本発明のポリペプチドに連結させるために用いることができる。
【０１７６】
他の潜在的な化学および酵素修飾は、当業者には明らかであろう。かかる修飾はまた、研究目的のために（例えば、機能−活性の関係を研究するために）導入してもよい。例えば、LundbladおよびBradshaw、1997（Biotechnol. Appl. Biochem. 26: 143-151）に対して参照がなされる。
本発明のダイマーおよび／またはポリペプチドは、薬物などの治療剤にコンジュゲートすることができる。したがって、いくつかの態様において、本発明のダイマーおよび／またはポリペプチドは、薬物とコンジュゲートして、ダイマー／ポリペプチド−薬物コンジュゲート（本明細書において集合的に「PDC」と略される）を形成する。
【０１７７】
同時（contemporaneous）抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、腫瘍学的適用において用いられ、ここで、細胞傷害剤または細胞分裂阻害剤、トキシンまたはトキシン部分などの薬物の局所送達のための抗体−薬物コンジュゲートの使用は、薬物部分の腫瘍へのターゲティングされた送達を可能にし、これが、より高い有効性、より低い毒性などを可能にし得る。これらのＡＤＣは、３つの成分を有する：（１）モノクローナル抗体が、（２）リンカーを通して、（３）薬物部分、例えばトキシン部分またはトキシンにコンジュゲートしている。このテクノロジーの概説は、Ducry et al., Bioconjugate Chem., 21: 5-13 (2010)、Carter et al., Cancer J. 14(3): 154 (2008)およびSenter, Current Opin. Chem. Biol. 13: 235-244 (2009)において提供され、これらの全ては、本明細書によりその全体において参考として援用される。本発明のPDCはまた、３つの成分を有する：（１）ダイマーまたはポリペプチドが、（２）リンカーを通して、（３）薬物、例えばトキシン部分またはトキシンにコンジュゲートしている。上記のとおり、リンカーおよび薬物のコンジュゲーションは、抗体フラグメント、例えば本発明のポリペプチドの凝集、体内分布およびＰＫプロフィールに対して、より大きなサイズの抗体よりも高く、好ましくない効果を有するが、当業者は、ＡＤＣのテクノロジー、方法、手段などは、一般的に、ＰＤＣに対しても同等に適用可能であることを理解するであろう（上記のFengらを参照）。
【０１７８】
本発明は、薬物、例えばトキシンまたはトキシン部分を（本発明のダイマーにおいて含まれるか否かに関わらず）含む本発明のポリペプチドを提供する。完全性のために、本発明は、薬物、例えばトキシンまたはトキシン部分を含む本発明のダイマーを提供する。
【０１７９】
薬物、例えばトキシン部分またはトキシンは、任意の好適な方法を用いて、ダイマーおよび／またはポリペプチドに連結またはコンジュゲートすることができる。一般に、コンジュゲーションは、当該分野において公知であるように、ダイマーおよび／またはポリペプチドに対する共有的付着により行われ、一般に、リンカー、しばしばペプチド連結に依存する。例えば、薬物、例えばトキシン部分またはトキシンは、直接、または好適なリンカーを通して、ポリペプチドに共有結合させることができる。好適なリンカーとして、非切断可能または切断可能なリンカー、例えば、細胞の酵素（例えば細胞エステラーゼ、カテプシンＢなどの細胞プロテアーゼ；例えば例のセクションを参照）のための切断部位を含むｐＨ切断可能リンカーが挙げられ得る。かかる切断可能リンカーは、ポリペプチドが内部移行した後で、薬物、例えばトキシン部分またはトキシンを放出することができるリガンドを調製するために用いることができる。当業者には明らかであるが、ダイマーおよび／またはポリペプチドごとの薬物部分の数は、反応の条件に依存して変化し得、薬物：ポリペプチドが１：１〜２０：１で変化し得る（また、薬物−抗体比またはＤＡＲとして示される）。これもまた当業者には明らかであるが、反応および／または精製が緊密に制御されない場合には、実際の数は、平均である。好ましくは、本発明のダイマーはさらに、薬物を含み、ここで、薬物対ダイマー比（ＤＡＲ）は、１である。薬物、例えばトキシン部分またはトキシンをダイマーおよび／またはポリペプチドに連結またはコンジュゲートさせるために、多様な方法を用いることができる。選択される特定の方法は、連結またはコンジュゲートされるべき薬物、例えばトキシン部分またはトキシン、およびダイマーおよび／またはポリペプチドに依存するであろう。所望される場合、末端官能基を含むリンカーは、ダイマーおよび／またはポリペプチドと、薬物、例えばトキシン部分またはトキシンとを連結させるために用いることができる。一般に、コンジュゲーションは、反応性官能基を含む（または反応性官能基を含むように修飾された）薬物、例えばトキシン部分またはトキシンを、リンカーと、または直接的にダイマーおよび／またはポリペプチドと反応させることにより達成される。共有結合は、適切な条件下において第２の化学基と反応して、それにより共有結合を形成することができる、化学部分または官能基を含む（またはこれを含むように修飾された）薬物、例えばトキシン部分またはトキシンを反応させることにより形成される。所望される場合、好適な反応性化学基を、ポリペプチドにまたはリンカーに、任意の好適な方法を用いて付加することができる（例えばHermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press：San Diego, CA（1996）を参照）。多くの好適な反応性化学基の組み合わせが、当該分野において公知であり、例えばアミン基は、トシラート、メシラート、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、Ｎ−ヒドロキシサクシニミジルエステル（NHS）などの求電子基と反応することができる。チオールは、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロイル、ピリジルジスルフィド、５−チオール−２−ニトロ安息香酸チオール（TNB−チオール��などと反応することができる。アルデヒド官能基は、アミンまたはヒドラジドを含有する分子にカップリングすることができ、アジド基は、三価の亜リン酸基と反応して、ホスホルアミデートまたはホスホルイミド連結を形成することができる。活性化基を分子中に導入する好適な方法は、当該分野において公知である（例えば、上記のHermansonを参照）。
【０１８０】
例において示されるように、予想外なことに、Ｃ末端においてシステイン部分を含むＣ末端伸長を含む本発明のポリペプチドが、極めて制御された様式において、ポリペプチド１つあたり特定の数の薬物（例えばＤＡＲ＝１）をコンジュゲートするために、著しく好適であることが見出された。このことは、先行技術の分子と比較して、より良好に制御された有効性および安全性のプロフィールをもたらす。したがって、本発明は、単一のコンジュゲートした薬物を含む（例えばＤＡＲ＝１）、本明細書において記載されるポリペプチドに関する。本発明のプロセスは、したがって、均質性が改善されたポリペプチドおよびダイマーが生成されることを可能にする（より良好に制御可能なＰＫ／ＰＤプロフィール、有効性および最終的には患者の安全性をもたらす）。
【０１８１】
以下に記載されるように、ＰＤＣの薬物は、任意の数の剤であってよく、これは、これらに限定されないが、細胞分裂阻害剤、細胞傷害剤、例えば化学療法剤、増殖阻害剤、トキシン（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素活性トキシン、またはそのフラグメント）、トキシン部分を含み、または放射活性同位元素（すなわち、放射性コンジュゲート（radioconjugate））が提供される。他の態様において、本発明はさらに、ＰＤＣを用いる方法を提供する。本発明はまた、放射免疫療法（ＲＩＴ）に関し、ここで、本発明のポリペプチドまたはダイマーは、細胞傷害性の放射線を標的細胞に送達するために、放射活性同位元素で標識される。
【０１８２】
本発明における使用のための薬物として、細胞傷害性の薬物、特に、がんの治療のために用いられるものが挙げられる。かかる薬物として、一般的に、ＤＮＡ傷害剤、代謝拮抗薬、天然の生成物およびそれらのアナログが挙げられる。例示的な細胞傷害剤のクラスとして、酵素阻害剤、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤、およびチミジル酸シンターゼ阻害剤、ＤＮＡ干渉物質、ＤＮＡ切断物質（cleaver）、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリンファミリーの薬物、ビンカ薬物、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞傷害性のヌクレオシド、プテリジンファミリーの薬物、ジイネン（diynene）、ポドフィロトキシン、ドラスタチン、マイタンシノイド、分化誘導因子、およびタキソールが挙げられる。
【０１８３】
これらのクラスのメンバーとして、例えば、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、ロイロシン、ロイロシデイン（leurosideine）、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシンおよびポドフィロトキシン誘導体、例えばエトポシドまたはリン酸エトポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール、レチノイン酸タキソテールを含むタキサン、酪酸、N8-アセチルスペルミジン、カンプトテシン、カリチアマイシン、エスペラミシン、エンジイン、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、カリチアマイシン、カンプトテシン、マイタンシノイド（DM1を含む）、モノメチル-アウリスタチンＥ（MMAE）、モノメチルアウリスタチンＦ（MMAF）、およびマイタンシノイド（DM4）ならびにそれらのアナログ、好ましくはMMAEが挙げられる。好ましくは、薬物、例えばトキシンまたはトキシン部分にコンジュゲートした前記ポリペプチドは、ABL 100-NC003-1、ABL 100-NC003-3、ABL 100-NC003-5、ABL 100-NC003-6およびABL 100-BF012-1からなる群より選択され、最も好ましくはABL 100-BF012-1である。
【０１８４】
トキシンなどの薬物は、ポリペプチド−トキシンコンジュゲートおよび／またはダイマー−トキシンコンジュゲートとして用いることができ、これは、ジフテリア毒素などの細菌トキシン、リシンなどの植物トキシン、低分子トキシン、例えばゲルダナマイシン（Mandler et al. (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581；Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028；Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786-791）、マイタンシノイド（EP 1391213；Liu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623）、およびカリチアマイシン（Lode et al. (1998) Cancer Res. 58: 2928；Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53: 3336-3342）を含む。トキシンは、チューブリン結合、DNA結合、またはトポイソメラーゼ阻害を含む機構により、その細胞傷害性および細胞分裂停止効果を発揮し得る。
【０１８５】
本発明のポリペプチドおよび／またはダイマーと、マイタンシノイド、ドラスタチン、アウリスタチン、トリコテシン、カリチアマイシンおよびCC1065、トキシン活性を有するこれらのトキシンの誘導体などの１つ以上の低分子トキシンとのコンジュゲートが企図される。
本発明のダイマーおよび／またはポリペプチドにコンジュゲートすることができる他の薬物、例えば抗腫瘍剤として、BCNU、ストレプトゾトシン、ビンクリスチンおよび５−フルオロウラシル、米国特許第5,053,394号、同第5,770,710号において記載される集合的にLL-E33288複合体として知られるファミリーの剤、ならびにエスペラミシン（米国特許第5,877,296号）が挙げられる。
【０１８６】
用いることができる酵素活性トキシンおよびそのフラグメントなどの薬物として、ジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Pseudomonas aeruginosaからのもの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質（PAPI、PAPIIおよびPAP-S）、Momordica charantiaの阻害剤、クルシン、クロチン、Saponaria officinalisの阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテシンが挙げられる。例えば、１９９３年１０月２８日に公開されたWO 93/21232を参照。
【０１８７】
本発明はさらに、本発明のダイマーおよび／またはポリペプチドと、核酸分解活性を有する化合物（例えばリボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；DNase）との間で形成されるＰＤＣを企図する。腫瘍の選択的な破壊のために、本発明のダイマーおよび／またはポリペプチドは、高度に放射活性な元素を含んでもよい。多様な放射性同位元素が、放射性コンジュゲートＰＤＣの生成のために利用可能である。例として、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２およびＬｕの放射性同位元素が挙げられる。
【０１８８】
放射標識または他の標識は、公知の方法においてコンジュゲート中に組み込まれる。例えば、ポリペプチドおよび／またはダイマーは、例えば、水素の代わりにフッ素−１９を含めて、生合成しても、好適なアミノ酸前駆体を用いる化学的なアミノ酸合成により合成してもよい。Ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８およびＩｎ１１１などの標識は、ペプチド中のシステイン残基を介して付着させることができる。
イットリウム−９０は、リジン残基を介して付着させることができる。ヨードゲン法（Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57は、ヨウ素−１２３を組み込むために用いられる。ヨウ素−１２５は、Valentine et al., (1989) J. Biol. Chem. 264: 11282において記載されるヨードビーズ（iodobead）法により放射標識することができる。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」（Chatal, CRC Press 1989）は、他の方法を詳細に記載する。
【０１８９】
当業者は、放射性コンジュゲートＰＤＣの有効な単回処置用量（例えば治療有効量）を確立することができ、これは、とりわけ、特定の放射標識、ＰＤＣの半減期、毒性、標的などに依存する。好ましくは、有効単回処置用量は、好ましくは約５〜約７５ｍＣｉ、より好ましくは約１０〜約４０ｍＣｉの範囲である。
ＰＤＣ化合物の生成は、ＡＤＣの分野における当業者に公知の任意の技術により達成することができる。簡単に述べると、ＰＤＣ化合物は、抗体単位として本発明のダイマーおよび／またはポリペプチド、薬物、ならびに任意に薬物および本発明のダイマーおよび／またはポリペプチドを接合するリンカーを含んでもよい。
【０１９０】
薬物または抗体−薬物コンジュゲートが、細胞に対して効果、例えば細胞分裂停止および／または細胞傷害性効果を発揮するか否かを決定する方法は、公知である。一般に、抗体薬物コンジュゲートの効果、例えば細胞傷害性または細胞分裂停止活性は、以下：抗体薬物コンジュゲートの標的タンパク質を発現する哺乳動物細胞を細胞培養培地中で暴露すること；約６時間〜約５日間の期間にわたり細胞を培養すること；および、細胞バイアビリティーを測定することにより測定することができる。細胞ベースのin vitroアッセイは、抗体薬物コンジュゲートのバイアビリティー（増殖）、細胞傷害性、およびアポトーシスの誘導（カスパーゼ活性化）を測定するために用いることができる。これらの方法は、PDCに同等に適用可能である。
【０１９１】
したがって、本発明は、薬物、例えばトキシンまたはトキシン部分をさらに含む本発明のポリペプチド（本発明のダイマー中に含まれるか否かに関わらず）に関する。明確性のために、本発明は、薬物、例えばトキシンまたはトキシン部分をさらに含むダイマー（本発明のポリペプチドを含む）に関する。
したがって、本発明は、薬物、例えばトキシンまたはトキシン部分にコンジュゲートした、本発明によるポリペプチド（本発明のダイマー中に含まれるか否かに関わらず）に関する。明確性のために、本発明は、、薬物、例えばトキシンまたはトキシン部分にコンジュゲートしたダイマー（本発明のポリペプチドを含む）に関する。
【０１９２】
ＰＤＣは、高度に選択的なターゲティング部分の選択性と薬物の殺傷効力とを組み合わせる。本発明によるポリペプチドについて（本発明のダイマー中に含まれるか否かに関わらず）、ＰＤＣの首尾よい成分として機能するために、ポリペプチドは、標的細胞、例えば腫瘍細胞上の標的抗原に結合する必要がある。多くの薬物について、ＰＤＣは、
効果的であるために、細胞により内部移行されることになる（例えばTrail 2013 Antibodies 2: 113-129の総説を参照）。内部移行の後で、ＰＤＣは、リソソームに輸送され、ここで、その後のＰＤＣの細胞内プロセッシングにより、生物活性薬が放出されて、腫瘍細胞などの標的細胞に対するその（毒性）効果を発揮する。生物活性薬のみが内部移行されるべきではなく、放射免疫療法（ＲＩＴ）のための放射性同位元素もまた、好ましくは、放射活性なペイロードの毒性効果を高度に限局化するために、内部移行される。放射標識された本発明のポリペプチド（本発明のダイマー中に含まれるか否かに関わらず）による正確なターゲティングは、選択的かつ極めて有効な標的細胞（例えば腫瘍細胞）の細胞傷害性を引き起こし、副作用を最小化する。
【０１９３】
本発明者らは、本発明のダイマーの全体的な内部移行が、特に少ない数の標的を有する細胞において、対応するモノマーおよび二価ベンチマークよりも強力かつ効果的であると考えられることを示した。この内部移行の差は、標的を極めて高いレベルで発現する細胞においては、それほど顕著ではないが、それでもなお著しい。
したがって、本発明は、がんの処置における使用のための本発明のダイマーに関し、ここで、前記ダイマーは、内部移行する。好ましくは前記ダイマーは、（細胞傷害性の）薬物にコンジュゲートしている。
したがって、本発明は、がんの処置のための医薬の製造のための本発明のダイマーの使用に関し、ここで、前記ダイマーは、内部移行する。好ましくは前記ダイマーは、（細胞傷害性の）薬物にコンジュゲートしている。
【０１９４】
一態様において、本発明のダイマーは、対応するISVDに対する少ない数の結合部位、例えば１０*１０５未満の結合部位、例えば５*１０５未満の結合部位、またはわずか１０*１０４未満の結合部位、５*１０４の結合部位、１*１０４の結合部位、または５０００未満の結合部位を発現する細胞をターゲティングするために用いることができる
一態様において、本発明は、 がんの処置における使用のための本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記ダイマーは、内部移行する。好ましくは前記ダイマーは、（細胞傷害性の）薬物にコンジュゲートしている。
【０１９５】
一態様において、本発明は、がんの処置のための医薬の製造のための本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記ダイマーは、内部移行する。好ましくは前記ダイマーは、（細胞傷害性の）薬物にコンジュゲートしている。
【０１９６】
本発明者らはまた、本発明のダイマーが、関連する遺伝子融合されたコンストラクトと比較して、優れた特徴を有することを示した。上記のとおり、本発明のダイマーは、第１のポリペプチドのシステイン部分と第２のポリペプチドのシステイン部分との間のジスルフィド結合を介して（例えばジスルフィド誘導型シスチンを介して）、直接コンジュゲートすることができる。このコンジュゲーションの機構を介して、２つのポリペプチド間の可撓性が限定される。このことは、多くの場合においては申し分なく、対応するベンチマークと比較して改善された結合の特徴すらもたらした。
【０１９７】
しかし、いくつかの場合においては、２つの個々のポリペプチドの間により高い可撓性が必要とされ得る。いくつかの例において、より高い可撓性を可能にする、本発明のポリペプチドにコンジュゲートすることができ、および好ましくは薬物にもコンジュゲートすることができる、リンカーを有することが、有利であり得る。
【０１９８】
ThioBridge（登録商標）リンカーによるコンジュゲーションは、WO 2005/007197およびWO 2013/190292において広範に記載されており、これらは本明細書において参考として明示的に援用される。このThioBridge技術は、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２などの抗体およびそのフラグメントのために確立される。特に、ThioBridge技術は、抗体のヒンジ領域における単一の重鎖間ジスルフィド結合のために、または抗体の軽鎖のＣＬドメインと重鎖のＣＨ１ドメインとの間に位置する鎖間ジスルフィド結合を横切って、用いることができる（WO2013/190292）。しかし、ThioBridge技術は、NanobodyなどのISVDのダイマーのためには用いられてこなかった。実際に、WO 2005/007197およびWO 2013/190292において用いられる慣用的な抗体と本発明のダイマーとの間には、重要な違いが存在する。鎖間ジスルフィド架橋が、慣用的な抗体またはそのフラグメントにおいて、ThioBridge技術を介して還元される場合において、これらの抗体およびフラグメント、例えばＶＨおよびＶＬドメインは、疎水性および静電相互作用ならびにファンデルワールス力を介して結合したままとなる。対照的に、本発明のダイマー中のポリペプチドは、互いに完全に独立しており、すなわち、一般的に、これらのポリペプチドの間には、ジスルフィド架橋以外には、相互作用は何ら存在しない。結果として、ｃｙｓで連結されたNanobodyダイマーを還元する場合、反応性−Ｓ−部分は、その近傍における任意の利用可能なアクセプター基と対形成することができ、これは必ずしもThioBridgeリンカーではない。したがって、ThioBridge技術の成功率は、劇的に低下する。
ThioBridge（登録商標）リンカーによるコンジュゲーションが本発明のダイマーにとって受入可能であることは、予想外である。
【０１９９】
したがって、好ましい態様において、本発明は、本発明のダイマーが、ジスルフィド結合に由来するシステイン残基との間に架橋を形成するコンジュゲーション試薬と反応する方法に関する。好ましくは、コンジュゲーション試薬は、ポリマーを含む。さらにより好ましくは、コンジュゲーション試薬は、官能基（thiobridge）：
【化７】
2018509394.tif 000017
を含み、ここで、Ｗは、電子求引性基を表し；Ａは、Ｃ１〜５アルキレンもしくはアルケニレン鎖を表し；Ｂは、結合またはＣ１〜４アルキレンもしくはアルケニレン鎖を表し；および各々のＬは、独立して、脱離基を表す。
【０２００】
好ましくは、ポリマーは、例えば上で定義される薬物などの診断、治療または標識剤、例えば薬物などの診断、治療または標識剤に結合することができる結合剤（例えば上で定義されるリンカー）、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群より診断される。試薬は、好ましくは、式（Ｉａ）を有するか、またはＷがシアノ基を表す場合には（ｌｂ）を有し：
【化８】
2018509394.tif 000018
ここで、Ｑは、連結基を表し、Ｄは、診断、治療または標識剤（例えば薬物など）、あるいは診断、治療または標識剤（例えば薬物など）のための結合剤を表す。いくつかの好ましい基Ｑは、式ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶにおいて示される。
【０２０１】
一態様において、本発明は、本明細書において記載される方法に関し、ここで、試薬は、式ＩＩ、ＩＩＩあるいはＩＶのものであり：
【化９】
2018509394.tif 000019
ここで、ＸおよびＸ’のうちの一方は、ポリマーを表し、他方は、水素原子を表し；
Ｑは、連結基を表し；
Ｗは、電子求引性基を表すか；または、Ｘ’がポリマーを表す場合、Ｘ−Ｑ−Ｗは、一緒に、電子求引性基を表してもよく；
Ａは、Ｃ１〜５アルキレンもしくはアルケニレン鎖を表し；
Ｂは、結合またはＣ１〜４アルキレンもしくはアルケニレン鎖を表し；および
各々のＬは、独立して、脱離基を表す；
【化１０】
2018509394.tif 000020
ここで、Ｘ、Ｘ’、Ｑ、Ｗ、ＡおよびＬは、一般式ＩＩについて示される意味を有し、加えて、Ｘがポリマーを表す場合、Ｘ’および電子求引性基Ｗは、介在原子と一緒に、環を形成してもよく、ｍは、整数１、２、３または４を表す；あるいは
Ｘ−Ｑ−Ｗ−ＣＲ１Ｒ１’−ＣＲ２．Ｌ．Ｌ’                  （ＩＶ）
ここで、Ｘ、ＱおよびＷは、一般式ＩＩについて示される意味を有し、ならびに
Ｒ１は、水素原子またはＣ１〜４アルキル基を表し、Ｒ１’は、水素原子を表し、ＬおよびＬ’の各々は、独立して、脱離基を表す；または
Ｒ１は、水素原子またはＣ１〜４アルキル基を表し、Ｌは、脱離基を表し、および
Ｒ１とＬ’とは、一緒に、結合を表す；または
Ｒ１とＬとは、一緒に、結合を表し、Ｒ１とＬ’とは、一緒に、結合を表す；および
Ｒは、水素原子またはＣ１〜４アルキル基を表す。
【０２０２】
連結基Ｑおよび脱離基Ｌは、好ましくは、WO2013/190292において記載されるとおりであり、この内容は、本明細書において参考として明示的に援用される。例えば、脱離基Ｌは、例えば−ＳＲ、−ＳＯ２Ｒ、−ＯＳＯ２Ｒ、−Ｎ＋Ｒ３、−Ｎ＋ＨＲ２、−Ｎ＋Ｈ２Ｒ、ハロゲン、または−Ｏφを表してもよく、ここで、Ｒは上で示される意味を有し、φは、置換されたアリール、特にフェニル基を表し、これは、少なくとも１つの電子求引性置換基、例えば−ＣＮ，−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＲ、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＯＣＯ２Ｒ、−ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＨＣＯ２Ｒ、−ＮＲ’ＣＯ２Ｒ、−ＮＯ、−ＮＨＯＨ、−ＮＲ’ＯＨ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣＯＲ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＲ’ＣＯＲ、−Ｎ＋Ｒ３、−Ｎ＋ＨＲ２、−Ｎ＋Ｈ２Ｒ、ハロゲン、特に塩素、または特にフッ素、−Ｃ≡ＣＲ、−Ｃ＝ＣＲ２および−Ｃ＝ＣＨＲを含み、ここで、各々のＲは、独立して、上で示される意味のうちの１つを有する。
本発明は、生じるコンジュゲート中の電子求引性基Ｗを還元するさらなるステップを含む、本明細書において記載される方法に関する。
【０２０３】
一般に、本発明のポリペプチドとコンジュゲーション試薬との反応は、ダイマー中のシスチンジスルフィド結合を還元すること、およびその後に、還元された生成物をコンジュゲーション試薬と反応させることを含む。好適な反応条件は、WO2013/190292において示される。
本発明は、コンジュゲーション試薬が、ポリペプチドのＣ末端におけるジスルフィド架橋に由来する２個の硫黄原子を介してダイマーに結合しているダイマーに関し；前記ジスルフィド架橋が、ダイマー中に存在する唯一の重鎖間ジスルフィド結合であることを特徴とする。
【０２０４】
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドは、thiobridgeに再架橋される。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるダイマーに関し、ここで、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとは、thiobridgeを介してコンジュゲートされる。
一態様において、本発明は、前記薬物がthiobridgeを介してダイマーに共有結合している、本発明によるダイマーに関する。
【０２０５】
本発明は、ダイマーに関し、ここで、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとは、前記第１のポリペプチドのＣ末端伸長中のシステイン部分（Ｃ）と前記第２のポリペプチドのＣ末端伸長中のシステイン部分（Ｃ）とのチオエーテル結合を介して、式（Ｖ）または式（ＶＩ）により、共有結合により連結されており、
【化１１】
2018509394.tif 000021
ここで、
「−Ｃ−」は、Ｃ末端伸長のＣ末端におけるシステイン部分を含む、本発明のポリペプチドのＣ末端伸長中のシステイン部分を表し；
「−Ｃ」は、本発明のポリペプチドのＣ末端伸長のＣ末端におけるシステイン部分を表し；
Ｒ１は、Ｃ１〜４アルキル基を表し；およびＤは、診断、治療もしくは標識剤（例えば薬物など）、または診断、治療もしくは標識剤（例えば薬物など）のための結合剤（例えばリンカー）を表す。
【０２０６】
したがって、本発明は、本明細書において記載される第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含むダイマーに関し、ここで、前記第１のポリペプチドは、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）およびシステイン部分を（好ましくはＣ末端において）含むＣ末端伸長を含み；ここで、前記第２のポリペプチドは、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）およびシステイン部分を（好ましくはＣ末端において）含むＣ末端伸長を含み；およびここで、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとは、前記第１のポリペプチドのＣ末端伸長中のシステイン部分（Ｃ）のチオエーテル結合および前記第２のポリペプチドのＣ末端伸長中のシステイン部分（Ｃ）のチオエーテル結合を介して、式（Ｖ）または式（ＶＩ）による化合物と、共有結合により連結されている。
【０２０７】
例えば薬物などの診断、治療または標識剤は、本明細書において記載される例えば薬物などの診断、治療または標識剤を既に担持しているコンジュゲーション試薬を用いることにより、直接的にダイマーにコンジュゲートされていてもよく、あるいは、例えば、例えば薬物などの診断、治療または標識剤に対する結合基を含むコンジュゲーション試薬の使用により、例えば薬物などの診断、治療または標識剤を、コンジュゲーション試薬とダイマーとのコンジュゲーションの後で添加してもよい。
【０２０８】
本発明は、単一のコンジュゲートされた薬物を含む、本明細書において記載されるダイマー（例えばＤＡＲ＝１）に関する。本発明のプロセスは、したがって、均質性が改善されたポリペプチドおよびダイマーが生成されることを可能にする。特に、ダイマーの鎖間ジスルフィド結合を横切って結合するコンジュゲーション試薬の使用は、改善されたローディング化学量論を有し、ISVDのネイティブな鎖間（カノニカル）ジスルフィド結合を破壊することなく特異的な付着の部位が存在するダイマーコンジュゲートを提供する。単一の分子間ジスルフィド結合を有するダイマーの使用はまた、ジスルフィド結合のスクランブリングを軽減する。システイン対のジスルフィド結合への不正確なアセンブリーであるジスルフィドスクランブリングは、ISVDの抗原結合能力に影響を及ぼし、活性の低下をもたらすことが知られている。本発明の使用によりスクランブリングを最小化することは、コンジュゲートされたダイマーの均質性を改善する。均質性が改善されたダイマー−薬物コンジュゲートは、治療における利益を提供する。均質なダイマーコンジュゲートはまた、診断およびイメージング用途において、より正確かつ一貫した測定を提供する。
【０２０９】
がんの処置において用いられる多くの薬物は、疎水性である。これらの疎水性薬物は細胞膜を透過することができるので、このことは有利である。しかし、これらの薬物は、非癌性細胞からの任意の膜をも透過することができる。癌細胞は「正常な」細胞よりも迅速に分裂するので、これらの薬物はなお有効である。これらの薬物の使用が深刻な副作用をもたらすことは、理解されるであろう。よりターゲティングされたアプローチのために、これらの薬物のうちのいくつかは、好ましくは癌細胞を標的とするためのビヒクルとして用いられる慣用的な抗体にカップリングされてきた。これらの慣用的な抗体は、約１５０ｋＤのサイズを有し、一方、薬物は、平均で約１ｋＤのサイズを有する。したがって、抗体：薬物のサイズ比は、約１５０：１である。この比は、薬物の疎水性が、全体において抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）にとって殆ど影響を及ぼさないことの理由の一つである。
【０２１０】
ISVDの物理化学的特性は、その表面に暴露された、溶媒に暴露されることになるアミノ酸に、大いに依存することが示されてきた。このことは、ISVDのために用いられる様々な処方物のうちの大多数において反映される。慣用的な抗体とは大いに対照的に、ISVDは、僅か約１５ｋＤのサイズを有する。結果として、ISV：薬物のサイズ比は、わずか１５：１であり、すなわち、慣用的な抗体についてのものよりも１０倍小さい。したがって、薬物の疎水性特徴は、ＰＤＣの特性に対して、不釣り合いにより大きな影響を有する。実際に、ＰＤＣの主な問題は、凝集である。しかし、驚くべきことに、本発明のＰＤＣは安定であり、in vivoでの投与に適用可能であり、in vivoで腫瘍の増殖を減少させることができたことが観察された。
【０２１１】
一態様において、本発明は、例えばがんを処置するために、それを必要とする対象を処置することにおける使用のための、本明細書において記載されるトキシンにコンジュゲートしたポリペプチド、またはトキシンにコンジュゲートした本明細書において記載されるダイマーを提供する。
本発明は、治療における使用のための、好ましくはがんの処置における使用のための、上記のダイマーに関する。また、本発明は、がんの処置のための医薬の製造のための、上記のダイマーの使用に関する。
【０２１２】
用語「がん」とは、悪性新生物細胞の増殖により引き起こされる、任意のがん、例えば腫瘍、新生物、細胞腫、肉腫、白血病およびリンパ腫を指す。処置のための目的のがんとして、これらに限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、リンパ性腫瘍、乳房のがん、卵巣のがん、精巣のがん、肺のがん、結腸のがん、直腸のがん、膵臓のがん、肝臓のがん、中枢神経系のがん、頭部頸部のがん、腎臓のがん、骨のがん、血液のがんまたはリンパ系のがんが含まれる。かかるがんのより特定の例として、扁平上皮細胞癌（例えば上皮扁平上皮癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜のがん、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃（gastric／stomach）癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、口腔癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路のがん、ヘパトーマ、例えばHER2陽性乳癌を含む乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓（kidney／renal）癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、メラノーマ、多発性骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫、脳癌、頭部頸部癌、および関連する転移が挙げられる。
【０２１３】
「固形腫瘍癌」とは、異常な組織の塊を含むがんである。いくつかの態様において、がんは、固形腫瘍癌（例えば細胞腫、リンパ腫、乳癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、膵臓癌、頭部頸部癌、結腸癌、肉腫、または副腎皮質癌）である。
本発明は、がん（例えば上で定義されるもの）に関連する障害を処置および／または予防および／または緩和するための方法に関する。
【０２１４】
本明細書において用いられる場合、および当該分野においてよく理解されているとおり、状態を「処置する」または状態の「処置」（例えば、がんなどの本明細書において記載される状態）は、有益な、または所望される結果、例えば臨床的結果を得るためのアプローチである。有益な、または所望される結果として、これらに限定されないが、１つ以上の症状または状態の緩和または寛解；疾患、障害または状態の程度の減弱；安定化された（すなわち、悪化していない）疾患、障害または状態の状況；疾患、障害または状態の拡散を予防すること；疾患、障害または状態の進行を遅延または失速させること；疾患、障害または状態の寛解（palliation／palliation）；検出可能であるか検出不能であるかに関わらず、寛解（remission）（部分的であるか完全であるかに関わらず）が挙げられ得る。疾患、障害または状態を「寛解させる」とは、処置の不在下における程度または時間経過と比較して、疾患、障害または状態の程度および／もしくは望ましくない臨床的徴候が減少するか、ならびに／または進行の時間経過が失速または延ばされることを意味する。
【０２１５】
用語、剤（例えば前述のコンジュゲートのうちのいずれか）の「有効量」とは、本明細書において用いられる場合、有益な、または所望される結果、例えば臨床的結果をもたらすために十分な量であり、したがって、「有効量」は、適用されている文脈に依存する。
「対象」により、ヒトまたは非ヒト動物（例えば哺乳動物）が意味される。
本発明は、がん、例えば腫瘍を処置する方法に関し、該方法は、患者への本発明のダイマー、ポリペプチドおよび／またはＰＤＣの投与を含む。
【０２１６】
本発明はまた、関節リウマチ、乾癬、または肺における粘液の分泌亢進に関連する障害を処置および／または予防および／または緩和するための方法を提供し、該方法は、かかる処置を必要とする患者に、本明細書において記載されるトキシンにコンジュゲートしたポリペプチド（の有効量）を投与することを含む。
本発明は、トキシンにコンジュゲートした予防的または治療的ポリペプチドまたはダイマーを、体内の特定の位置、組織または細胞型に送達するための方法を提供し、該方法は、対象に、本明細書において記載されるトキシンにコンジュゲートしたポリペプチドまたは本明細書において記載されるトキシンにコンジュゲートしたダイマーを投与するステップを含む。本発明は、それを必要とする対象を処置するための方法を提供し、該方法は、本明細書において記載されるトキシンにコンジュゲートしたポリペプチドを投与することを含む。
【０２１７】
一態様において、本発明は、上で記載されるトキシンにコンジュゲートしたポリペプチドまたは本明細書において記載されるトキシンにコンジュゲートしたダイマーを含む医薬組成物に関する。本発明は、本発明のダイマーを、薬学的に受入可能なキャリアと一緒に；任意にさらなる剤と一緒に提供する。
したがって、本発明は、本発明のダイマー中に含まれるか否かに関わらず、本明細書において記載される薬物、例えばトキシンまたはトキシン部分にコンジュゲートした本発明のポリペプチドを提供する。好ましくは、前記ポリペプチドは、EGFRに対して向けられたISVDを含み、潜在的に、血清アルブミンに対して向けられたISVDをさらに含む。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるトキシンにコンジュゲートしたポリペプチドを提供し、ここで、少なくとも１つのISVDは、上皮増殖因子（EGF）とEGFRとの相互作用を阻害および／または遮断する。
【０２１８】
用語「医薬組成物」、本明細書において用いられる場合、薬学的に受入可能な賦形剤と共に処方された本明細書において記載される化合物を含む組成物を表す。いくつかの態様において、医薬組成物は、哺乳動物における疾患の処置のための治療レジメンの一部として、政府の規制当局の承認により、製造または販売される。医薬組成物は、例えば、経口投与のために単位投与形態において（例えば錠剤、カプセル、カプレット、ジェルキャップまたはシロップ）；局所投与のために（例えばクリーム、ゲル、ローションまたは軟膏として）；静脈内投与のために（例えば、粒子性栓子を含まない、静脈内での使用のために好適な溶媒系中の、無菌の溶液として）；または、本明細書において記載される任意の他の処方において処方することができる。
【０２１９】
一態様において、本発明は、本発明のダイマー、ポリペプチドおよび／またはＰＤＣを含む組成物に関し、好ましくは、前記組成物は、医薬組成物であり、任意に少なくとも１つの薬学的に受入可能なキャリア、希釈剤または賦形剤および／またはアジュバントをさらに含み、任意に１つ以上のさらなる医薬活性ポリペプチドおよび／または化合物を含む。有効量を含む組成物は、放射線処置の計画、診断的または治療的処置のために投与することができる。放射線処置の計画または診断目的のために投与される場合、コンジュゲートは、診断有効用量、および／または治療有効用量を決定するために有効な量で、対象に投与される。治療的適用においては、組成物は、既に状態（例えばがん）を罹患している対象に、障害およびその合併症の症状を治癒させるかまたはこれを少なくとも部分的に停止させるために十分な量で投与される。この目的を達成するために適切な量は、疾患または医学的状態に関連する少なくとも１つの症状を実質的に改善するために十分な化合物の量である「治療有効量」として定義される。例えば、がんの処置において、疾患または状態の任意の症状を軽減するか、予防するか、遅延させるか、抑制するか、または停止させる剤または化合物は、治療上有効であろう。剤または化合物の治療有効量は、疾患または状態を治癒させる必要はないが、疾患または状態の発症が遅延されるか、妨げられるか、または予防される、あるいは疾患または状態の症状が寛解するか、疾患または状態の期間が変化するか、または例えばより重篤でなくなるか、または個体において回復が加速される（上を参照）ような、疾患または状態のための処置を提供するであろう。本発明のダイマー、ポリペプチドおよび／またはＰＤＣは、対象に、前述のダイマー、ポリペプチドおよび／またはＰＤＣまたは組成物のうちのいずれかの第１の用量を、放射線処置の計画のために有効な量で投与すること、およびその後に、前述のダイマー、ポリペプチドおよび／またはＰＤＣまたは組成物のうちのいずれかの第２の用量を、治療有効量で投与することにより、がんの処置のために用いることができる。
【０２２０】
これらの使用のために有効な量は、疾患または状態の重篤度、ならびに対象の体重および一般的状態に依存し得る。哺乳動物（例えばヒト）に適用される本発明の方法において用いられるダイマーおよび本発明の組成物の治療有効量は、当業者により、当該哺乳動物の年齢、体重および状態の個々の差異を考慮することにより、決定することができる。本発明の特定のＰＤＣは、癌細胞を標的とする増強された能力を示し残留するので、本発明の化合物の投与量は、コンジュゲートされていない剤の治療効果のために必要とされる同等の量より低く（例えば約９０％、７５％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１２％、１０％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％以下に）なり得る。本発明の剤は、対象（例えばヒトなどの哺乳動物）に、処置される対象において望ましい結果をもたらす量である有効量で投与される。治療有効量はまた、当業者により経験的に決定することができる。有効量を含む本発明の組成物の単回または複数回の投与は、処置している医師により選択される用量のレベルおよびパターンにより行うことができる。用量および投与のスケジュールは、対象における疾患または状態の重篤度に基づいて決定および調整することができ、これは、医師により一般的に実施される方法または本明細書において記載されるものによる処置の経過全体にわたり、モニタリングすることができる。
【０２２１】
本発明のダイマーは、処置または治療の慣用的な方法と組み合わせて用いても、あるいは、処置または治療の慣用的な方法とは別に使用してもよい。
本発明のダイマーが他の剤との併用治療において投与される場合、それらは、連続的に、または同時に、個体に投与することができる。あるいは、本発明による医薬組成物は、本明細書において記載されるように、薬学的に受入可能な賦形剤と付随した本発明の化合物の組み合わせ、および当該分野において公知の別の治療または予防剤からなってもよい。
【０２２２】
一般に、医薬用途のために、本発明のダイマー、ＰＤＣおよび／またはポリペプチドは、少なくとも１つの本発明のダイマー、ＰＤＣおよび／またはポリペプチド、ならびに少なくとも１つの薬学的に受入可能なキャリア、希釈剤または賦形剤および／またはアジュバント、ならびに任意に１つ以上のさらなる医薬活性ポリペプチドおよび／または化合物を含む、医薬調製物または組成物として処方してもよい。非限定的な例として、かかる処方物は、経口投与のために、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内もしくは皮下注射または静脈内注入による）のために、局所投与のために、吸入による、皮膚貼付剤による、インプラントによる、坐剤などによる投与のために好適な形態であってよく、ここで、非経口投与が好ましい。かかる好適な投与形態（投与の様式に依存して固体、半固体または液体であってよい）、ならびにその調製における使用のための方法およびキャリアは、当業者には明らかであり、本明細書においてさらに記載される。かかる医薬調製物または組成物は、一般に、本明細書において「医薬組成物」として言及されるであろう。非ヒト生物における使用のための医薬調製物または組成物は、一般に、「獣医学組成物」として言及されるであろう。
【０２２３】
したがって、さらなる側面において、本発明は、少なくとも１つの本発明のポリペプチド、少なくとも１つの本発明のＰＤＣまたは少なくとも１つの本発明のダイマー、および少なくとも１つの好適なキャリア、希釈剤または賦形剤（すなわち、医薬用途のために好適なもの）、および任意に１つ以上のさらなる活性物質を含む医薬組成物に関する。
一般に、本発明のポリペプチド、ＰＤＣおよび／またはダイマーは、それ自体公知の任意の好適な様式において処方および投与することができる。上で引用される一般的背景技術について（ならびに特にWO 04/041862について、WO 04/041863、WO 04/041865、WO 04/041867およびWO 08/020079について）、ならびに標準的なハンドブック、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences、第１８版、Mack Publishing Company, USA（1990）、Remington、Science and Practice of Pharmacy、第２１版、Lippincott Williams and Wilkins（2005）；またはHandbook of Therapeutic Antibodies（S. Dubel編）、Wiley, Weinheim、2007（例えば２５２〜２５５頁を参照）について参照がなされる。
【０２２４】
本発明のポリペプチド、ＰＤＣおよび／またはダイマーは、慣用的な抗体および抗体フラグメント（ｓｃＦｖおよび二重特異性抗体を含む）ならびに他の医薬活性タンパク質のための、それ自体公知の任意の様式において処方または投与することができる。かかる処方およびこれを調製するための方法は、当業者には明らかであり、例えば、非経口投与（例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、腔内、動脈内または髄腔内投与）のため、または局所（すなわち、経皮または皮内）投与のために好適な調製物を含む。
【０２２５】
非経口投与のための調製物は、例えば、注入または注射のために好適な、無菌の溶液、懸濁液、分散または乳液であってよい。かかる調製物のために好適なキャリアまたは希釈剤として、例えば、限定することなく、WO 08/020079の１４３頁において言及されるものが挙げられる。通常、水性の溶液または懸濁液が好ましい。
【０２２６】
したがって、本発明のポリペプチド、ＰＤＣおよび／またはダイマーは、例えば経口で、不活性な希釈剤または吸収可能な可食性キャリアなどの薬学的に受入可能なビヒクルと組み合わせて、全身投与してもよい。これらは、ハードまたはソフトシェルゼラチンカプセル中に封入しても、圧縮して錠剤にしても、または患者の食事の食品に直接組み込んでもよい。経口治療的投与のために、本発明のポリペプチドＰＤＣおよび／またはダイマーは、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハースなどの形態において用いてもよい。かかる組成物および調製物は、少なくとも０．１％の本発明のポリペプチド、ＰＤＣおよび／またはダイマーを含むべきである。組成物および調製物中のそれらのパーセントは、無論、変化してもよく、便利に、所与の単位投与形態の重量の約２〜約６０％であってよい。かかる治療的に有用な組成物中の本発明のポリペプチド、ＰＤＣおよび／またはダイマーの量は、有効な投与量レベルが得られるようなものである。
【０２２７】
錠剤、トローチ、丸剤、カプセルなどはまた、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤および甘味剤または香味剤、例えばWO 08/020079の１４３〜１４４頁において言及されるものを含んでもよい。単位投与形態がカプセルである場合、それは、上の型の材料に加えて、植物油またはポリエチレングリコールなどの液体のキャリアを含んでもよい。多様な他の材料が、コーティングとして、または他に固体単位投与形態の物理的形状を改変するために、存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルは、ゼラチン、ロウ、シェラックまたは糖などでコーティングしてもよい。シロップまあはエリキシルは、本発明のダイマー、ＰＤＣ、ポリペプチド、化合物および／またはコンストラクト、スクロースまたはフルクトースを甘味剤として、メチルおよびプロピルパラベンを保存剤として、色素およびチェリーもしくはオレンジ香味などの香味剤を含んでもよい。無論、任意の単位投与形態を調製するために用いられる任意の材料は、薬学的に受入可能であり、かつ使用される量において実質的に非毒性であるべきである。加えて、本発明のポリペプチド、ＰＤＣおよび／またはダイマーは、徐放性調製物およびデバイス中に組み込んでもよい。
【０２２８】
また、経口投与のための調製物および処方物に、本発明のコンストラクトが胃の環境に耐えて腸へと通過することを可能にする腸溶性コーティングを提供してもよい。より一般的に、経口投与のための調製物および処方物は、胃腸管の任意の所望される部分への送達のために好適に処方してもよい。加えて、胃腸管中への送達のために好適な坐剤を用いてもよい。
本発明のポリペプチド、ＰＤＣおよび／またはダイマーはまた、静脈内または腹腔内に、注入または注射により、投与することができる。特定の例は、WO 08/020079の１４４頁および１４５頁において、またはPCT/EP2010/062975（文書全体）においてさらに記載されるとおりである。
【０２２９】
局所投与のために、本発明のポリペプチド、ＰＤＣおよび／またはダイマーは、純粋な形態において（すなわち、それらが液体である場合には）投与してもよい。しかし、一般には、それらを組成物または処方物の形態において、皮膚科学的に受入可能なキャリア（これは固体であっても液体であってもよい）と組み合わせて、皮膚に投与することが望ましいであろう。特定の例は、WO 08/020079の１４５頁においてさらに記載されるとおりである。
本発明のＰＤＣ、ポリペプチド、ダイマー、化合物および／またはコンストラクトの有用な投与量は、それらのin vitroでの活性、および動物モデルにおけるin vivoでの活性を比較することにより、決定することができる。マウスおよび他の動物（ヒトまで）における有効な投与量の推定のための方法は公知である；例えば、US 4,938,949を参照。
【０２３０】
一般に、ローションなどの液体組成物中の本発明のポリペプチド、ＰＤＣおよび／またはダイマーの濃度は、約０．１〜２５ｗｔ−％、好ましくは約０．５〜１０ｗｔ−％であろう。ゲルまたは粉末などの半固体または固体の組成物中の濃度は、約０．１〜５ｗｔ−％、好ましくは約０．５〜２．５ｗｔ−％であろう。
【０２３１】
処置における使用のために必要とされる本発明のポリペプチド、ＰＤＣおよび／またはダイマーの量は、選択される特定のポリペプチド、ＰＤＣおよび／またはダイマーによってのみならず、投与の経路、処置されている条件の性質、ならびに患者の年齢および状態によっても変化し、最終的には、担当の医師または臨床家の裁量となるであろう。また、本発明のポリペプチド、ＰＤＣおよび／またはダイマーの投与量は、標的の細胞、腫瘍、組織、移植片または器官に依存して変化する。
所望される用量は、単回用量において、または適切な間隔を空けて投与される分割された用量として、例えば１日あたり２回、３回、４回またはそれより多くの部分用量として便利に提示することができる。部分用量それ自体は、さらに、例えば多数の別々の緩やかに間隔を空けた投与に分割することができる。
【０２３２】
投与レジメンは、長期間の、毎日の処置を含み得る。「長期間」により、少なくとも２週間、および好ましくは数週間、数か月間、または数年間の期間が意味される。この投与量範囲における必要な改変は、当業者により、本明細書における教示に基づいて、慣用的な実験のみを用いて決定することができる。投与量はまた、任意の合併症のイベントにおいて、個々の医師により調整することができる。
【０２３３】
例
１  構成要素の生成
P. pastorisにおいて、表４において表されるように、EGFR結合Nanobody 7D12および9G08、ならびにアルブミン結合Nanobody ALB11から出発して、多様なコンストラクトを生成した。
【表６】
2018509394.tif 000022
【０２３４】
１．１  遺伝子融合
T023800001、T023800003、T023800005およびT023800006における多様な転位（順序）における構成要素7D12およびAlb11およびリンカーのカップリングを、例えばGaraicoecheaら（Garaicoechea et al. (2008) J Virol. 82: 9753-9764）により記載されるような標準的なプロトコルに従う遺伝子融合により行った。多様なリンカーの長さおよび組成を含むポリペプチドを生成した（ISVDの順序および個々のISVD）。ＧＧＣを含むＣ末端伸長は、遺伝子融合によってもまた構築した。T023800001（配列番号２７）、T023800003（配列番号２８）、T023800005（配列番号２９）およびT023800006（配列番号３０）およびT023800008（配列番号３１）の配列は、表６において提供された。
【０２３５】
Ｃ末端においてシステイン部分を含む様々なＣ末端伸長を構築することの実現可能性を、様々なＣ末端伸長：−Ｃ（配列番号１）、−ＧＣ（配列番号２）、−ＧＧＣ（配列番号３）、−ＧＧＧＣ（配列番号４）、−ＣＧ（配列番号１０）、−ＧＣＧ（配列番号１１）、−ＧＧＧＣＧ（配列番号１３）、−ＧＧＧＧＣＧＧＧＧ（配列番号１５）および−ＡＡＡＣ（配列番号８）（データは示さず）を有する多様なポリペプチドを製造することにより示した。
【０２３６】
１．２  アラニン伸長
良好に確立されたプロトコルに従って（以下を参照）、アラニン部分（Ｎ−マレオイル−β−アラニン；Sigma-Aldrich）を、中性付近の条件（ｐＨ６．５〜７．５）において、Ｃ末端に位置するシステインのスルフヒドリル群（−ＳＨ）に対するマレイミド化学を介してコンジュゲートして、安定なチオエーテル連結を形成させた。簡単に述べると、初めに、組織におけるポリペプチドの濃度を決定する。２〜５モル濃度の過剰量のＮ−マレオイル−β−アラニンを、ポリペプチドに添加して、全ての利用可能なシステインを遮断した。混合物を、１時間ＲＴでインキュベートし、その後、一晩４℃でインキュベートした。翌日、LC MSを介してコンジュゲーションの効率を確認した。Ａｌａ−伸長を含むポリペプチドをSECクロマトグラフィーを介して均質になるまで精製して、過剰のＮ−マレオイル−β−アラニンを取り除いた。生じたコンストラクトを、T023800001-A、T023800003-A、T023800005-AおよびT023800006-Aと命名した（図１；表４）。
また、アラニンが、ＧＧＣとは異なるシステインを含むＣ末端伸長を有するコンストラクトに抱合し得たことを、さらに示した（また上の１．１を参照；データは示さず）。
【０２３７】
１．３  二量体化
ポリペプチドのダイマーへのカップリングは、Pichiaに使用され培地中での化学的コンジュゲーションにより行い、ここで、前記の２つのポリペプチドの各々におけるＣ末端伸長におけるＣ末端システインが、中性付近のｐＨにおいて、それらのチオール部分を介してジスルフィド誘導型シスチンに酸化された。酸化プロセスを最適化するために、本質的にはWO2010/125187において記載されるように、酸化性銅イオンを添加した（ＣｕＳＯ４の形態におけるＣｕ２＋）。ダイマーを、均質になるまで精製し、その後、分子ふるいクロマトグラフィーを介して分析した。試料をまた、LC-MSにより検証した。生じたデータは、１ｍＭのＣｕＳＯ４による２時間にわたる室温での処置の後で、チオール部分のほぼ１００％が酸化されたことを示した。クロマトグラムのいずれにおいても、顕著な（望ましくない）プレピークの形成は観察されなかった。さらに、クロマトグラムのいずれにおいても、顕著なプレピークの形成についての証左は観察されず、このことは、銅処置が、タンパク質中のメチオニンを酸化せず、また、全体的な質量分析が任意の＋１６Ｄａ質量の増大を検出しないことを示し、これは、例えばメチオニンに対する１回の酸化と一致するであろう。
T023800001、T023800003、T023800005およびT023800006からダイマーを調製した。T023800001のダイマー（T023800001-ダイマーと命名した）を、図１において示す。
【０２３８】
１．４  安定性
本発明の様々なコンストラクト、例えばダイマー、ポリペプチドおよびベンチマークを、ストリンジェントなストレス条件下における貯蔵の後で、安定性について試験した。これらの条件は、本質的にはWO2014/184352において記載されるように、長期間（３週間および６週間）にわたる、異なる温度（２５℃および４０℃）における、本発明のポリペプチドのインキュベーションからなった。
例えばシステイン部分を含むＣ末端伸長を有する本発明のポリペプチド、およびダイマーは、それらが由来する親分子と類似の特性を有し、４℃、２５℃ならびに４０℃において、著しい化学的分解および改変を伴うことなく、長期間にわたり安定であったことを示した（データは示さず）。加えて、多様な凍結融解のサイクルおよび４℃での長期間（すなわち、＞４日間）にわたる貯蔵の後で、安定性は変化しなかったことが、機能的アッセイにおいて示された（以下を参照）。
【０２３９】
１．５  先端的リンカー
上記のとおり、Ｃ末端においてシステイン部分を含む様々なＣ末端伸長を構築することの実現可能性を、遺伝子融合により様々なＣ末端伸長を有する多様なポリペプチド：−Ｃ（配列番号１）、−ＧＣ（配列番号２）、−ＧＧＣ（配列番号３）、−ＧＧＧＣ（配列番号４）、−ＣＧ（配列番号１０）、−ＧＣＧ（配列番号１１）、−ＧＧＧＣＧ（配列番号１３）、−ＧＧＧＧＣＧＧＧＧ（配列番号１５）および−ＡＡＡＣ（配列番号８）を製造することにより示した（例１．１を参照）。その後、アラニン部分を、マレイミド化学を介して、Ｃ末端に位置するシステインのスルフヒドリル基（−ＳＨ）に対してコンジュゲートさせた（例１．２を参照）。
代替的アプローチにおいて、システイン−部分（これもまた既にＣ末端に位置するアラニンを含む）を含む様々なＣ末端伸長を提供する。これらのリンカーを、その後、例１．１において記載されるように、遺伝子の連結により、コンストラクトにコンジュゲートさせる。これらのＣ末端伸長の例は：−ＣＡ、−ＧＣＡ、−ＧＧＣＡ、−ＧＧＧＣＡ、−ＧＧＧＧＣＡ、−ＡＣＡ、−ＡＡＣＡ、−ＡＡＡＣＡ、−ＡＡＡＡＣＡ、−ＣＧＡ、−ＧＣＧＡ、−ＧＧＣＧＡ、−ＧＧＧＣＧＡ、−ＧＧＧＧＣＧＡ、および−ＧＧＧＧＣＧＧＧＧＡである。
【０２４０】
１．６  さらなるコンストラクト
本発明のダイマーのユビキタスな適用性および特徴をさらに示すために、WO2015044386において記載されるように、多様な二重特異性コンストラクトを生成した。これらのポリペプチドの要旨を、表１．６において提供する。個々の構成要素ならびに二重特異性ポリペプチドの両方の親和性および効力などの多様な特徴を試験した（ＩＣ５０、ＫＤ）。結果はまた、WO2015044386においても提供される。生じる配列を、表６において提供する。
【表７】
2018509394.tif 000023
【０２４１】
１．７  さらなるダイマー
利便性のために、例１．５のリンカー−ＧＧＧＣＡのみを、例１．６の二重特異性ポリペプチドの各々に遺伝子連結し、このＣ末端伸長を有する２０種のコンストラクトを生じる。これらの二重特異性ポリペプチドの親和性および効力を含む完全性を、本質的にWO2015044386において記載されるように、試験する。任意の実質的な親和性および効力の喪失の不在下において、これらのポリペプチドを、その上で、例１．３において記載されるように二量体化する。生じるダイマーを、例１．６およびWO2015044386の手順に従って、親二重特異性ポリペプチドと同様に試験し、その後、多様な結果を比較する。
【０２４２】
例２および３の結果（以下）と同様に、ダイマーが、対応するベンチマークより優れているであろうことが予測され、これは、本発明のユビキタスな適用性をさらに示す。しかし、WO2015044386において記述されるとおり、いくつかの例において、ダイマーを異なる位置における構成要素と比較した場合に、個々の構成要素の向きに依存して、親和性および／または効力に対する効果が存在し得る；例えば、ポリペプチドCXCR4-CD123を含むダイマーと比較した、ポリペプチドCD123-CXCR4を含むダイマーを参照。
【０２４３】
２  ポリペプチドのMDA-MB-468細胞への結合の特徴づけ
EGFR結合親和性を評価するための結合競合アッセイにおいて、ポリペプチドを特徴づけた。
MDA-MB-468乳癌細胞系統（乳腺／乳房；転移部位に由来：胸水；ABL216）を用いた。
EGFRを発現する細胞へのポリペプチドの結合を検出するために、、FLAGでタグ付けされた7D12を競合相手として用いた。アッセイをセットアップするために、初めに、MDA-MB-468細胞において、FLAGでタグ付けされた7D12の滴定シリーズを行った。タグ付けされていないポリペプチドを滴定した競合セットアップにおいては、FLAGタグ付けされた7D12のＥＣ９０（４１ｎＭ）を選択した。
【０２４４】
簡単に述べると、１０００００個の細胞を、プレートに移した。プレートを、２００ｇでの３分間にわたる４℃での遠心分離により２回洗浄した。上清を取り除き、５０μｌの精製されたポリペプチドを、５０μｌのFLAGでタグ付けされた7D12（最終濃度４１ｎＭ）と一緒に、１ウェルあたり合計１００μｌで、ウェルに添加した。９０分間の４℃でのインキュベーションの後で、プレートを、３０分間にわたる４℃での遠心分離により３回洗浄した。上清を取り除き、１ウェルあたり１００μｌの０．５μｇのマウス抗flag mAb（Sigma-Aldrich、cat＃F1804）またはFACSバッファーを添加し、その後、３０分間にわたり４℃でインキュベートした。細胞を、２００ｇで３分間の４℃での遠心分離により３回洗浄した。上清を取り除いた後、１ウェルあたり１１０μｌのヤギ抗マウスPEまたはまたはヤギ抗ヒトIgG PEを細胞に添加し、３０分間にわたり４℃でインキュベートした。次いで、プレートを３０分間にわたり２００ｇで４℃で遠心分離し、上清を取り除き、１ウェルあたり１００μｌのFACSバッファーを添加し、その後、プレートを、３分間にわたる４℃での２００ｇにおける遠心分離により、３回洗浄した。次に、１ウェルあたり１００μｌのTOPRO（Molecular Probes、T3605）で死細胞を染色し、その後、細胞をFACS Canto（Becton Dickinson）において測定した。最初に、ゲートを、散乱プロフィールから決定されるとおり、完全細胞にセットした。次いで、死細胞を、TOPRO染色（５ｎＭ、Molecular probes、T3605）からのそれらの蛍光プロフィールから、ゲートアウトした。対照として、ポリペプチドが存在しないか、既知の無関係のポリペプチドが存在する条件を取得した（データは示さず）。
【０２４５】
T023800001-A（本明細書においてまたT023800001として示される）、T023800003-A（本明細書においてまたT023800003として示される）、T23800005-A（本明細書においてまたT023800005として示される）、T023800006-A（本明細書においてまたT023800006として示される）および還元されていないT023800001-ダイマーを評価した。
結果を図２において表す。
これらの結果から、T023800001、T023800003、T023800005およびT023800006 とＥＣ９０の7D12-FLAG（すなわち、４１ｎＭ）との競合が、それぞれ、T023800001、T023800003、T023800005およびT023800006について１５ｎＭ、０．６３ｎＭ、０．２５ｎＭおよび１．１６ｎＭのＫｉをもたらすことを結論付けることができる。チェン＝プルソフの式を用いて絶対阻害定数Ｋｉを計算した。
【数５】
2018509394.tif 000024
予想外にも、T023800001−ダイマーは、０．１２ｎＭのＫｉを示し、これは、最良に機能する遺伝子融合コンストラクトであるT023800005-Aよりも２倍良好であり、T023800001-ダイマーの直接競合相手であるT023800006-Aよりも９倍よりもさらに良好である。
【０２４６】
３  HER14細胞系統におけるEGFRのリン酸化の定量
競合FACSにおいて観察されるような効力の増大（上の例２を参照）がまた、EGFRにより媒介されるシグナル伝達の調節に反映されるか否かを検証するために、本発明者らは、NIH3T3/HER14細胞における、Nanobodyによる、EGFにより媒介されるEGFRのリン酸化の遮断実験に着手した。用いられたコンストラクトは、T023800001-AおよびT023800006-AならびにT023800001-ダイマーであった。EGFRのリン酸化の用量依存的阻害を、EGFRのみを発現するHER14細胞において評価した。
【０２４７】
簡単に述べると、HER14細胞を、２組で、０．１％のゼラチンでコートされた９６ウェルの培養プレート中に播種し、１０％のＦＢＳ／ＢＳを含むＤＭＥＭ培養培地中で２４時間にわたり増殖させた。翌日、細胞を、０．１％のＦＣＳを補充した培地中で２４時間にわたり血清不足にして、次いで、コンストラクトと共にインキュベートし、その後、０．５ｎＭの組み換えヒトEGF（R&D Systems、cat＃236-EG）で１０分間にわたり刺激した。EGF濃度は、HER14細胞において得られたＥＣ５０に基づいた（ＥＣ５０＝３．５ｎｇ／ｍｌ）。各々のプレートにおいて、無関係な対照ポリペプチドを、参照として含めた（データは示さず）。単層を、氷冷Ｄ−ＰＢＳで２回リンスし、その後、１ｍＭのPMSFで置換した氷冷ＲＩＰＡバッファー中で溶解した。Phospho(Tyr1173)/Total EGFR Whole Cell Lysate Kit（Meso Scale Discovery−K15104D）を用いて、細胞ライセート中でのEGF依存的な受容体の活性化を測定した。プレートに、３０μｌのライセートをロードし、１時間ＲＴで振盪しながらインキュベートし、製造者のプロトコルに従って処理した。プレートをSector Imager 2400（Meso Scale Discovery）において読み込んだ。全タンパク質に対するホスホ−タンパク質のパーセンテージを、以下の式を用いて計算した：（２×ｐ−タンパク質）／（ｐ−タンパク質＋全タンパク質）×１００。
【０２４８】
結果を図３において表す。
EGFRのリン酸化の用量依存的阻害は、EGFRを発現するHER14細胞においてのみ観察された。機能的リン酸化は、EGFRシグナル伝達を介してのみ媒介されるので、多価形式によるアビディティーの増大は、細胞特異的な様式において、EGFRのリン酸化の阻害の増大に反映されることが予測される。
競合FACSからの結果よりもさらに顕著に、T023800001-ダイマー（４．４ｎＭ）は、確立された二価NanobodyであるT023800006-A（２６．６ｎＭ）と比較した場合に、５〜６倍の効力の増大を示す。T023800001-Aは、１０５ｎＭの効力を生じた。
【０２４９】
４  SECを介したシステイン伸長単量体Nanobodyの調製
４．１背景の情報
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）およびＣ末端においてシステイン部分を含むＣ末端伸長を含む本発明のポリペプチドが、マレイミド化学に基づくカップリング反応のために好適であることが分かった（上の例１．２を参照）。
ダイマーを単量体ポリペプチドに変換し、Ｃ末端システインをカップリングのために利用可能にするために、還元を行う必要があった。しかし、内部カノニカルISVDジスルフィド架橋を還元することなくジスルフィドダイマーの還元をもたらす最適化された条件を設計するためには、注意すべきである。還元は、好ましくは、ＤＴＴまたはＴＣＥＰを用いて行った。ＴＣＥＰとは異なり、最適なカップリング条件を作り出すためにはＤＴＴを取り除く必要がある。分子ふるいクロマトグラフィー（SEC）を介して、還元されていない二量体NanobodyおよびＤＴＴから単量体Nanobodyを分離する。
【０２５０】
４．２  還元プロトコル
還元プロトコルは、Ｄ−ＰＢＳ中での、１０ｍＭのＤＴＴによる４℃での一晩の（または最短２時間の室温での）処置からなった。ISVDの濃度は、２〜１０ｍｇ／ｍｌであった。これらの条件が、内部カノニカルジスルフィド結合に影響を及ぼさなかったことが示された（図４を参照）。ＴＣＥＰを用いて、類似の結果が得られ、ここで、本発明者らは、固定されたＴＣＥＰ（Pierce,  Immobilized ＴＣＥＰ Disulfide Reducing Gel、＃77712）を、製造者のプロトコルに従って用いた。あるいは、４℃で３０分間にわたるりｍ１０ｍＭのＴＣＥＰへの短時間の暴露を用いた。
【０２５１】
４．３  分子ふるいクロマトグラフィー（SEC）
精製のために、３つまでのISVDを含むポリペプチドについて、単量体の還元された生成物を生成するために、好ましくはSuperdex 75カラム（GE Healthcare）を用いた（分離範囲５〜１００ｋＤａ）。分析目的のために、Agilent SEC-3などのＨＰＬＣカラムを用いた。平衡化およびランニングバッファーは、Ｄ−ＰＢＳであった。
SEC後の完全に還元された純粋な生成物の例は、図５において提供される。
SECの後で、還元された単量体ポリペプチドは、ただちにコンジュゲーションのために用いるか、またはダイマーへの再酸化を防止するために凍結した。実験的証左は、ＧＧＣ伸長ポリペプチドの還元された単量体の画分が、Ｄ−ＰＢＳ中において４℃で２４時間まで安定であることを示唆した（データは示さず）。２つのISVDを含むポリペプチドを、１０ｍＭのＤＴＴで２時間室温で還元し、Ｄ−ＰＢＳ中で平衡化したSuperdex 75 XK 16/60カラム（GE Healthcare）でサイズ分類した。ほんのわずかな量のダイマーを検出した；材料の残りは、モノマーに還元され、したがって、コンジュゲーションのための用意ができていた。ゲル濾過標準物（Biorad）の分子量を、破線により示す。
【０２５２】
５  MMAEにカップリングされたポリペプチド
疎水性の有糸分裂阻害剤であるモノメチルアウリスタチンＥ（MMAE）は、天然の生成物であるドラスタチン１０の合成アナログである。MMAEは、分裂中の細胞におけるチューブリン重合の強力な阻害剤である。
この例において、本発明者らは、MMAEを、本発明のポリペプチドの遊離のＣ末端システインにカップリングさせることに着手した。簡単に述べると、MMAEを、薬物ターゲティング目的のために、バリン−シトルリンリンカーを介してポリペプチドにコンジュゲートさせた。バリン−シトルリンリンカーは、血清中で高度に安定であるが、標的細胞によるコンジュゲートの内部移行の後で、カテプシンＢのようなリソソームの酵素により切断される。以下のリンカー略号を、本明細書において用い、示される定義を有する：Val Citは、プロテアーゼ切断可能リンカーにおけるジペプチド部位であるバリン−シトルリンである；PABは、ｐ−アミノベンゾイルである；mcは、マレイミドにコンジュゲートしている。
【０２５３】
Nanobodyは、１０ｍＭのＤＴＴにより４℃で一晩還元し、次いで、ＤＴＴの過剰量を取り除くためにバッファーを交換した。mc-val-cit-PAB-MMAEとのコンジュゲーション（ＭＷ約０．７ｋＤａ；図６）は、２２℃において行った。１時間後に、遊離の薬物１当量あたり２０当量のＮ−アセチル−システインで反応をクエンチした。生じた生成物を、遠心分離による濃縮により精製し、バッファーを最終バッファーに交換した。より大きなスケールにおける精製のためには、遠心分離ではないダイアフィルトレーション法が、より好適である。生成物溶液を、無菌濾過した（０．２ｍｍ）。
【０２５４】
MMAEにコンジュゲートしたポリペプチド：
T023800001＝＞T023800001-mc-val-cit-PAB-MMAE（ABL 100-NC003-1またはT023800001-MMAE）
T023800003＝＞T023800003-mc-val-cit-PAB-MMAE（ABL 100-NC003-3またはT023800003-MMAE）
T023800005＝＞T023800005-mc-val-cit-PAB-MMAE（ABL 100-NC003-5またはT023800005-MMAE）
T023800006＝＞T023800006-mc-val-cit-PAB-MMAE（ABL 100-NC003-6またはT023800006-MMAE）
T023800008＝＞T023800008-mc-val-cit-PAB-MMAE（ABL 100-BF012-1）
【０２５５】
HIC-HPLC分析を行って、薬物対ポリペプチド比（ＤＡＲ）を決定した。簡単に述べると、Dionex Ultimate 3000RS HPLCシステムに接続したTOSOH、TSKgel Butyl-NPRカラム（３５×４．６ｍｍ）を用いて、コンジュゲートの分析的HICを行った。１００％のバッファーＡ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中１．５Ｍの硫酸アンモニウム）から１００％のバッファーＢ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム中２０％のイソプロパノール（ｖ／ｖ））への、３０分間をかけた、０．８ｍＬ／分の流速における直線勾配。カラムの温度を、分析全体にわたって３０℃に維持し、ＵＶ検出は、２８０ｎｍで行った。各々の分析について、１０μｇの試料を注入した。より高い滞留時間へのシフトに基づいて、およびＡ２４８／Ａ２８０比により、ピークを薬物対ポリペプチド比（ＤＡＲ）を割り当てた。平均ＤＡＲを計算した。個々のＤＡＲ値の合計に種の分数を乗算したものを取得することにより計算した（小数点以下１桁として表す）。用いたポリペプチドは、ABL 100-NC003-1、ABL 100-NC003-3、ABL 100-NC003-5およびABL 100-NC003-6であった。
【０２５６】
【表８】
2018509394.tif 000025
【０２５７】
SDS-PAGE分析を行って、ポリペプチドの酸化状態を決定した。簡単に述べると、SDS-PAGE分析は、NUPAGE（登録商標）４〜１２％のビス−トリスゲル（Invitrogen、Cat＃NP0321BOX）を用いて、ＭＥＳバッファーによる非還元条件下において行った。分析のために、１レーンあたり１μｇの試料（タンパク質に基づいて）をゲル上にロードした。２００Ｖで３５分間、電気泳動を行った。ゲルを、タンパク質検出のためのINSTANTBLUE（商標）（Expedeon、Cat＃ISB1LUK）で染色し、IMAGEQUANT（登録商標）イメージング機器（GE Healthcare）を用いて分析した。
結果の要旨もまた、表５において提供される。例示的な結果は、図７として提供される。
【０２５８】
SDS-PAGEの結果をさらに確認および詳述するために、SE-HPLC分析を行い、純度のパーセンテージおよび凝集を決定した。簡単に述べると、SE-HPLCは、Agilent Infinity 1260 Bioinertシステムに接続したWaters ACQUITY（登録商標）UPLC BEH200 SECカラム（４．６ｍｍ×３０ｃｍ、１．７μｍ）を用いて行った。流動層は、１５％の（ｖ／ｖ）イソプロパノールを含む０．１Ｍのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．８）であった。流速は、０．１５ｍＬ／分において一定に保った。分析全体を通して、カラムを２５℃に維持した。分析は、３０分間に、均一濃度の溶離において、２８０ｎｍにおけるＵＶ検出により行った。各々の分析について、１０μｇの試料を注入した。存在する純度の％および凝集の％は、それぞれ、メインピークおよび初期溶離ピークのピーク面積を、全ピーク面積と比較することにより計算した。
【０２５９】
結果を表５において要約する。カップリングの結果の例示的なHIC分析を、図８において表す。
これは、全てのポリペプチドについて、反応が、ＡＤＣへのコンジュゲーションについて、ポリペプチドのうちの９８％を超える効率をもたらすことを示す。さらに、反応は、ＤＡＲ＝１をもたらし、このことは、一方では、ISVDが完全である、例えば内部チオールは用いられなかったことを示し、他方では、ポリペプチド１つあたりの薬物の数が極めて制御されていることを示す。このことは、慣用的な抗体にコンジュゲートした薬物のガウス分布と対照的に、より良好な安全性プロフィールをもたらす。
【表９】
2018509394.tif 000026
2018509394.tif 000027
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【０２６０】
５．１．  MMAEにカップリングされたポリペプチドのin vitroでの細胞毒性
XCELLIGENCE（登録商標）装置（アナライザーモデルW380；SN：281081212038、Roche）を用いて、細胞増殖および／または細胞毒性に対するMMAEコンジュゲートポリペプチドの効果を試験した。装置は、培養ディッシュ中に細胞が付着して分散するにつれての電気的インピーダンスの変化を定量し、それらを、細胞によりカバーされる組織細胞ウェルの全面積に対して直接比例する、細胞インデックスと称される無次元のパラメーターとして提示する（Duchateau et al. 2013. Phys. Status Solidi 10: 882-888およびGiaever and Keese 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7896-7900）。XCELLIGENCE（登録商標）装置（Analyser Model W380；SN：281081212038）は、細胞を播種するための組織培養ウェルプレートとして、E-plates 96（ACEA Biosciences；cat＃05 232 368 001；lot＃20140138；plate 1：ID＃079605；plate 2：ID＃079606）を利用する。用いられたコンストラクトは、T023800001-AおよびT023800001-MMAE、T023800003-AおよびT023800003-MMAE、T023800005-AおよびT023800005-MMAE、ならびにT023800006-AおよびT023800006-MMAEであった。MDA-MB-468（乳腺/乳房；転移部位に由来：胸水；ABL216）細胞増殖に対する非コンジュゲートおよびMMAEコンジュゲートNanobodyの用量依存的阻害効果は、XCELLIGENCE（登録商標）装置により、以下のプロトコルを用いて評価した。
【０２６１】
簡単に述べると、XCELLIGENCE（登録商標）ステーションを、５％のＣＯ２の存在下において、３７℃のインキュベーター中に置く。MDA-MB-468細胞を、１％のＰ／Ｓ（１０，０００Ｕ／ｍＬのストックのペニシリン−ストレプトマイシン；Gibco、Cat Nr：15140-122）；１％のピルビン酸Ｎａ（Gibco、Cat Nr：11360-039）および１０％のＦＢＳ（Sigma-Aldrich、Cat Nr：F7524）を補充したRPMI（Gibco, Cat Nr：72400-021）を含むT175フラスコにおいて増殖させる。トリプシン処理、遠心分離により細胞を回収し、それらを、示された細胞密度まで再懸濁する。E-plate 96のそれぞれのウェルに５０μｌの細胞培地を添加し、XCELLIGENCE（登録商標）システムにおいてブランクの読み取りを行って、細胞の不在下におけるバックグラウンドインピーダンスを測定した。６０００個の細胞（５０μｌ）を、E-plate 96の各々のウェルに移し、２０時間にわたりインキュベートして、細胞を接着させた。１００μＬの各々のポリペプチドを、５００ｎＭから始める１：３希釈シリーズにおいて投与した（１ウェルあたりの合計容積は２００μｌである）。インピーダンスの読み取りは、１５分間の間隔においてプログラムした。実験は、１６２時間の時点において停止した（±７日）。全ての試験された濃度についての播種の後１１６時間の時点において測定した細胞インデックスを、用量応答分析のために用いた。
【０２６２】
増殖曲線および用量応答曲線を、ぞれぞれ、図９および図１０において表す。得られたＩＣ５０値を、表７において示す。
【表１０】
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【０２６３】
非コンジュゲートポリペプチドT023800001-A、T023800003-A、T023800005-AおよびT023800006-Aは、MDA-MB-468細胞の増殖特性に対して、細胞増殖に対して僅かな阻害効果を示す二重パラトピックT023800005-Aを例外として、何らの見かけ上の効果も示さなかった。対照的に、MMAEコンジュゲートポリペプチドT023800001-MMAE、T023800003-MMAE、T023800005-MMAEおよびT023800006-MMAEは、明らかに、細胞増殖に対して用量依存的阻害効果を示し、図９において示されるとおり、最高用量においてほぼ完全な阻害を示す。
【０２６４】
５．２  MMAEにカップリングされたポリペプチドのin vivoでの有効性
抗EGFRポリペプチド薬物コンジュゲートのin vivoでの有効性の研究を、皮下異種移植片マウスモデルにおいて評価した。
６〜８週齢の健康なSWISSヌードのメスマウスの右側腹部への１×１０７のFaDu細胞の皮下注射により、腫瘍を誘導した。FaDu細胞系統は、５６歳のコーカサス／ヒンドゥー人の男性患者から取り除かれた下咽頭腫瘍のパンチ生検から確立された、頭部頸部癌の細胞系統である。処置は、腫瘍が１００〜２００ｍｍ３の平均容積に達した場合に開始した。
【０２６５】
動物に、１日１回５ｍｇ／ｋｇのT023800008-MMAEの注射を、４日間毎に、全６回の注射を行った（Ｑ４Ｄｘ６）。第１の対照群には、非EGFR結合であるが、MMAEにコンジュゲートしたポリペプチドの注射を、等モル用量で、１日１回、４日間毎に合計６日間行った。第２の対照群には、１日１回のビヒクルの注射を、４日毎に、全６回の注射を行った。各々の群は、１２個体の動物からなった。
腫瘍の長さおよび幅を、１週間に２回、ノギスで測定し、腫瘍の容積を、以下の式により計算した：
ポリペプチド−MMAEコンジュゲートT023800008-MMAEは、２つの対照群と比較して、腫瘍増殖の顕著な阻害剤を示した（図１１）。
【０２６６】
６  二重特異性ダイマーの生成
この例において、二重特異性ダイマー、すなわち、ポリペプチド１がポリペプチド２と異なるダイマーの生成を可能にするプロトコルを提供する。
６．１  標準的なプロトコル
第１の例においては、上の例１．３のプロトコルに従うが、ここで、１つのPichia株が、両方の異なるポリペプチドを生成する。ポリペプチドのダイマーへのカップリングはまた、Pichiaに使用され培地中での化学的コンジュゲーションにより行われ、ここで、前記の２つのポリペプチドの各々におけるＣ末端伸長におけるＣ末端システインは、中性付近のｐＨにおいて、それらのチオール部分を介して、ジスルフィド誘導型シスチンに酸化される。酸化プロセスを最適化するために、本質的にはWO2010/125187において記載されるように、酸化性銅イオンを添加する（ＣｕＳＯ４の形態におけるＣｕ２＋）。ダイマーは、均質になるまで精製し（イオン交換クロマトグラフィー）、その後、分子ふるいクロマトグラフィーを介して分析する。試料はまた、LC-MSにより検証する。標準的なプロトコルは、意図される二重特異性NB1-NB2ダイマーを生成するであろう。しかし、画分は、単一特異性ダイマー、例えばNB1-NB1およびNB2-NB2もまた含むであろうことが予測される。
【０２６７】
６．２  代替的プロトコル
Nanobodyヘテロダイマー（二重特異性ダイマー）は、２つの区別し得るＣ末端でシステイン伸長したＮｂを用いて、架橋剤を使用することなく、生成することができる。
これは、第１のNanobody（=ＮｂＡ）の非共有結合的固定を介しつつ、その遊離のスルフヒドリルを、第２のNanobody（＝ＮｂＢ）がＣ末端ヘテロ二量体ジスルフィド結合を形成するために利用可能することにより、達成することができる。
第１のステップにおいて、ＮｂＡを、１００％の単量体材料を得るために還元する。典型的なNanobody 溶液［５〜１０ｍｇ／ｍｌ］を還元するための一般的な条件は、Ｄ−ＰＢＳ中１０ｍＭのＤＴＴに、４℃で一晩、または室温（ＲＴ）で１〜２時間の間である。好ましくは、最適な条件は、そのカノニカルジスルフィド結合が完全なままであるように、各々の個々のNanobodyについて決定する。
【０２６８】
ステップ２において、ＮｂＡ単量体の画分を、還元条件下において、キャリアに結合させる。かかるキャリアは、好ましくはＮｂＡにのみ結合し、ＮｂＢには結合しないクロマトグラフィー樹脂であってよい。ＮｂＡは、固定される間のＮｂＡ−ＮｂＡダイマーの形成を回避するために、低い密度において固定する。個々のＮｂＡのかかる空間的分離は、最適以下の結合条件（すなわち、典型的な親和性樹脂のためには高すぎる流速）を用いて、または拡張式床式クロマトグラフィー（expanding bed chromatography）を介して、カラムをロードすることにより達成することができる。好ましくはキャリアは、ＮｂＡにのみ結合する。したがって、タンパク質Ａは、ＮｂＡがタンパク質Ａ結合剤である（および好ましくはＮｂＢはそうではない）場合に、用いることができる。Nanobody AおよびBの両方がキャリアに結合する場合には、キャリアは、ＮｂＡを固定した後に、ＮｂＢに適用する前に、非システイン伸長Nanobodyで飽和させるべきである。
【０２６９】
ステップ３において、これもまた還元された形態の（上を参照）過剰量の第２のNanobody（ＮｂＢ）を適用し、カラム上に循環させる（任意に僅かに酸化性の条件下において）。ＮｂＢを、固定されたＮｂＡがジスルフィド結合を介して完全にＮｂＢと複合体化するまで、キャリア上を通過させる。この後に、ＮｂＢの濃度低下を測定して、飽和したＮｂＡ集団に適合させる。このステップのために、ＮｂＢ−ＮｂＢダイマー形成の量を限定するために、条件を最適化する。この集団は、キャリアには結合せず、取り除いてさらなるカップリング反応において用いることができる。
ステップ４において、ＮｂＡ−ＮｂＢダイマー調製物を、そのカラムについての典型的な溶離条件（すなわち、タンパク質Ａについては酸性条件）により樹脂から回収し、さらに処理／処方する。
【０２７０】
７  ThioBridge（商標）を介してコンジュゲートされるポリペプチド
例２および３において示されるとおり、本発明のダイマーは、関連する遺伝子融合コンストラクトと比較して優れた特徴を有する。上記のダイマーは、第１のポリペプチドのシステイン部分と第２のポリペプチドのシステイン部分との間のジスルフィド結合を介して（例えば、ジスルフィド誘導型シスチンに）、直接コンジュゲートされた。このコンジュゲーション機構を介して、２つのポリペプチドの間の可撓性が限定される。このことは、殆ど場合において申し分ない。しかし、いくつかの場合においては、２つの個々のポリペプチドの間により高い可撓性が必要とされる場合がある。さらに、ダイマーのポリペプチドを、薬物へのコンジュゲーションのために適応させなければならない。これもまた上記のとおり、これらの薬物は、多くはリンカーを介してコンジュゲートして、例えばPDCを形成する。したがって、いくつかの例において、本発明のポリペプチドをコンジュゲートさせることができ、より高い可撓性を可能にし、および好ましくは薬物をコンジュゲートさせることもできるリンカーを有することは、有利であり得る。
【０２７１】
この例において、ThioBridge（商標）技術を介して本発明のポリペプチドをコンジュゲーションさせることができるか否かを整理した。
ThioBridgeリンカーによるコンジュゲーションは、WO 2005/007197およびWO 2013/190292において、いずれもPolythericsの名称において、広範に記載されている。本質において、ThioBridgeテクノロジーは、抗体またはそのフラグメントなどの天然のタンパク質において自然にジスルフィド架橋を形成する２つの硫黄原子をコンジュゲートする。ThioBridge技術の一般的原理を、図１２において表す。
【０２７２】
上記のとおり、ThioBridge技術は、抗体ならびにＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２などのそのフラグメントについて確立される。ThioBridge技術は、NanobodyなどのISVDのダイマーのためには用いられてこなかったが、実際、WO 2005/007197およびWO 2013/190292において用いられる慣用的な抗体と、本発明のダイマーとの間には、重要な差異が存在する。ThioBridge技術を介した慣用的な抗体またはそのフラグメントにおいて鎖間ジスルフィド架橋が還元される場合、これらの抗体ならびにＶＨおよびＶＬドメインなどのフラグメントは、疎水性および静電相互作用ならびにファンデルワールス力を介して結合したままとなる。対照的に、本発明のダイマー中のポリペプチドは、互いに完全に独立しており、すなわち、一般的に、これらのポリペプチドの間には、ジスルフィド架橋以外には、相互作用は何ら存在しない。結果として、ｃｙｓで連結されたNanobodyダイマーを還元する場合、反応性−Ｓ−部分は、その近傍における任意の利用可能なアクセプター基と対形成することができ、これは必ずしもThioBridgeリンカーではない。したがって、ThioBridge技術の成功率は、劇的に低下すると予測される。
【０２７３】
本発明者らは、本発明のポリペプチドのためのThioBridge技術プロトコルを最適化および確立することに着手した。全ての研究パッケージにおいて、ダイマーを均質になるまで精製し、その後、分子ふるいクロマトグラフィーを介して分析する。試料もまた、LC-MSにより検証する。
第１の研究パッケージ（ＷＰ１）において、、ダイマーの第１および第２のポリペプチドは同一である（図１３におけるＮＢ１およびＮＢ１）。このことは、第１および第２のポリペプチドの間のジスルフィド結合が還元されるときの、対形成、すなわち、正しいダイマー（ThioBridgeダイマー）への第２の付加を促進する。上記のような慣用的な抗体と本発明のポリペプチドとの間の差異が、慣用的なThioBridgeプロトコルの直接的な適用性を損なうであろうことが、予測される。ThioBridgeテクノロジープロトコルを首尾よく考案したら、異なるポリペプチド、すなわち、ＮＢ２およびＮＢ２からなるダイマー２を用いてプロトコルを繰り返すことにより、ＷＰ１のユビキタスな適用性をチェックする。
【０２７４】
ＷＰ１が首尾よく終了したら、ThioBridge技術を用いる二重特異性Nanobody薬物コンジュゲート、すなわち、図１５において表されるようなＮＢ１−ＮＢ１からなるダイマーおよびＮＢ２−ＮＢ２からなるダイマーの生成のために、第２の研究パッケージ（ＷＰ２）を開始する。第１の例において、ＷＰ１において確立されたThioBridge技術プロトコルを用いて、ダイマー１（ＮＢ１およびＮＢ１からなる）のポリペプチド（ＮＢ１）ならびにダイマー２（ＮＢ２およびＮＢ２からなる）のポリペプチド（ＮＢ２）のジスルフィド結合を、ＮＢ１およびＮＢ２からなるThioBridge二重特異性ダイマーへと再架橋する（図１５を参照）。複雑性を考慮して、生じるダイマーの大部分が、新たに再架橋された場合であっても、親ダイマー：ＮＢ１−ＮＢ１のThioBridgeダイマーおよびＮＢ２−ＮＢ２のThioBridgeダイマーと同一であり、一方、ＮＢ１−ＮＢ２のThioBridgeダイマーは、存在するが、少数であることが予測される。
【０２７５】
成功率を増大させ、ＮＢ１−ＮＢ２ダイマー画分を濃縮するために、ＷＰ２において用いられたThioBridge技術プロトコルを、以下のように適用させた（ＷＰ３−図１６）。第３の研究パッケージ（ＷＰ３）の第１のステップにおいて、ポリペプチド１（ＮＢ１）およびポリペプチド２（ＮＢ２）のダイマーを、ＷＰ１およびＷＰ２におけるものと類似の様式において還元する。第２の付加ステップにおいて、および再架橋の前に、親ダイマー（ＮＢ１−ＮＢ１およびＮＢ２−ＮＢ２）の形成を回避するために、還元されたポリペプチド１の画分および還元されたポリペプチド２の画分に保護基をロードする；例えば、保護基は、以前に記載されたキャリアである。第３のステップにおいて、ポリペプチド１の保護された画分を、ポリペプチド１の反応性画分から分離し、ポリペプチド２からの保護された画分を、ポリペプチド２からの反応性画分から分離する。第４のステップにおいて、ポリペプチド１の保護された画分を、ポリペプチド２の反応性画分と混合し、ポリペプチド２の保護された画分を、ポリペプチド１の反応性画分と混合する。この後、保護された画分からの保護基を取り除き、これにより、二重特異性のヘテロダイマー（ＮＢ１−ＮＢ２およびＮＢ２−ＮＢ１）の形成が可能となる。保護基を考慮すると、反応は一方向に向けられるので、所望される二重特異性ダイマーの生成は、ＷＰ２の方法を介するものよりも高い。
【０２７６】
研究パッケージ４（ＷＰ４）において、ＷＰ２およびＷＰ３と相対的な代替的戦略を、二重特異性ThioBridgeダイマーの生成のために用いる。特に、Ｃｙｓ連結されたNanobodyダイマーは、既に二重特異性である（例６を参照）。第１の例において、ＷＰ１において確立されたThioBridge技術プロトコルを、二重特異性ダイマーにおけるジスルフィド結合を再架橋を確立して、ポリペプチド１およびポリペプチド２の二重特異性ThioBridgeダイマーをもたらすために用いる（図１４を参照）。成功率を増大させるために、必要な場合にはThioBridge技術プロトコルを適用させる。ＷＰ４による二重特異性ThioBridgeダイマーの形成は、ＷＰ２よりも効果的であることが予測される。しかし、いくつかの例においては、ＷＰ２またはＷＰ３のプロトコルを用いることが、ＷＰ４のプロトコルよりも有利である場合がある。
【０２７７】
８  ダイマーおよび薬物コンジュゲートポリペプチドのＰＫ研究
上で示すとおり、既に、サイズの差異に起因して、薬物の本発明のポリペプチドへの二量体化およびコンジュゲーションは、慣用的な抗体に対するものよりもはるかに大きな影響を有する。したがって、本発明者らは、NanobodyにＤＡＲ＝１でコンジュゲートされたペイロードのＰＫ特性に対する効果を評価することに着手した。
【０２７８】
加えて、本発明者らは、２つのヒト血清アルブミン結合ドメイン（「Ａｌｂ」）を含む本発明のダイマーのＰＫ特性を評価することに着手した。上の例からの明白であろうが、２つの同一の部分を含むダイマー（すなわち、ポリペプチド１＝ポリペプチド２）は、生成および精製することが、２つの異なる部分によるダイマーよりも容易であり、より費用対効果が高い。ヒト血清アルブミン結合ドメインは、多様な例において、コンストラクトの半減期を延長するために必要である。しかし、さらなるヒト血清アルブミン結合ドメインを有することは、コンストラクトのＰＫプロフィールに対していかなる負の効果も有するべきではない。
【０２７９】
８．１  ポリペプチドの放射標識
ＰＫ特性は、放射標識されたポリペプチドを介して試験した。簡単に述べると、ポリペプチドを、遊離の−ＮＨ２に対する無作為なコンジュゲーションを介して、８９Ｚｒ、NCS-Bz-Dfで放射標識した（図１７を参照）。２２ｎｍｏｌのポリペプチド（１．０ｍｇ）を、０．９％のＮａＣｌと、５００μＬの最終容積まで混合した（最終濃度２ｍｇ／ｍＬ）。次に、０．１ＭのＮａ２ＣＯ３を添加することにより、ｐＨを８．９〜９．１に設定した。最終的に、ＤＭＳＯ（３当量、１０μＬ）中の６６ｎｍｏｌのNCS-Bz-Dfの溶液を添加し、３０分間３７℃で反応させた。３０分後、５０ｍＭのＮａＯＡｃ／２００ｍＭのスクロースでプレ洗浄したPD10カラムを用いて、反応混合物を精製した。生成物を１．０ｍＬの画分において回収した。Df-PK-ポリペプチドを、次に、ｐＨ〜７で６０分間にわたり室温において、８９Ｚｒで放射標識した（反応混合物は以下を含んだ：８９Ｚｒを含む１００μＬの１Ｍのシュウ酸。４５μＬの２ＭのＮａ２ＣＯ３、５００μＬの０．５ＭのHepesバッファー（ｐＨ７．２）および３５５μＬのNCS-Df−ポリペプチド（〜０．４ｍｇ））。次に、５０ｍＭのＮａＯＡｃ／２００ｍＭのスクロースでプレ洗浄したPD10カラム上で、反応混合物を精製し、生成物を１．５ｍＬにおいて回収した。
【０２８０】
放射標識の結果を、表８において要約する。
放射標識収量は、９．６％〜３７．６％で変化した（通常、７０％の放射標識収量が予測される）。恐らく、この低い標識収量は、修飾の間に用いられた低いポリペプチドの量と関係している。HPLCおよびスピンフィルター（Spinfilter）分析は、放射化学的純度は、89Zr-T023800006Aおよび89Zr-T023800006-MMAEについては申し分なかったことを示した（＞９６％）。89Zr-T023800001は、スピンフィルター分析については＜９０．０％の純度を示し、HPLCは、８．６％の遊離の８９Ｚｒを示した。通常は、コンストラクトは、＞９０．０％の放射標識純度を有するべきである。この場合、ＰＫ研究のために、結局は89Zr-T023800001を用いることを決定した。なぜならば、89Zr-T023800001の純度は９０％に近く、HPLC分析は、＞９０％純粋な生成物を示したからである。Lindmoの結合は、全てのポリペプチドについて＞９０％であった（データは示さず）。
【０２８１】
その後、８９Ｚｒ−ＰＫ放射標識ポリペプチドを、０．２２ＭＢｑ／マウスの活性、濃度５０μｇ／ｍＬ、および１３０μＬの注射容積に処方した。
【表１１】
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【０２８２】
まとめると、放射標識収量は、予測されたほど効率的ではなかった。89Zr-T023800006Aおよび89Zr-T023800006-MMAEの放射化学的純度は良好であった（スピンフィルターにより＞９７％、およびHPLCにより＞９６％）。Lindmo結合は高く、＞９０％であった。89Zr-T023800001は、スピンフィルター分析により必要とされるほどに純粋ではなかった。最終的に、なお89Zr-T023800001を用いることを決定した。全てのポリペプチドを処方し、首尾よく注射した。
【０２８３】
８．２  in vivoでのＰＫ研究
３個体のマウスに、放射標識された（８９Ｚｒ）ポリペプチドを注射し、ｃｐｍ（カウント毎分（counts per minute））値を、９つの時点において検出した：５分間、１時間、３時間、２４時間、４８時間、７２時間、１４０時間、１６８時間および１９２時間。これらの値を、次いで、マウス１ｇあたりのポリペプチドの％注射用量（％ＩＤ／ｇ）を計算するために用いた。各々のポリペプチドについて、３個体のマウスの結果を平均した。
結果を図１８において要約する。
【０２８４】
結果は、予想外に、二価ポリペプチド（T023800006-A）の体内分布プロフィールが、薬物コンジュゲートポリペプチド（T023800006-MMAE）の体内分布プロフィールと類似することを示す。本発明のポリペプチドをペイロードとコンジュゲートすることは、体内分布プロフィールに対して何らの効果も有さなかった。いかなる理論にも拘束されることなく、緊密に制御されたＤＡＲ＝１をもたらすコンジュゲーションのプロセスは、ＰＫ特性について予測的であることを仮定した（この場合、非コンジュゲートポリペプチドと比較して変化はなかった）。
また予想外にも、ｃｙｓで連結された本発明のダイマー（T023800001）の体内分布プロフィールは、対応する二価ポリペプチド（T023800006-A）のものと類似する。ｃｙｓで連結された本発明のダイマーにおける２つのヒト血清アルブミン結合ユニットの存在は、分布プロフィールに影響を及ぼさない。
【０２８５】
９  ダイマーにより改善された内部移行
この実験の目的は、Ｃｙｓで連結されたダイマー（DIM T023800001、すなわち、官能性の観点からすると二価のもの）が、その単量体カウンターパート（T023800001-A）および古典的に連結された（遺伝子融合）二価形式（T023800006-A）と比較して増大した内部移行を示すか否かを評価することであった。この目的のために、EGF受容体を中程度に発現するNCI-H292細胞について、内部移行実験を行った。pHrodo（商標）で標識したアルブミン（５０μｇ／ｍｌ）を検出ツールとして用いて、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）を介して、生細胞における内部移行したNanobodyの蓄積を測定した。pHrodo（登録商標）色素は、ｐＨ感受性の分子プローブであり、中性ｐＨにおいてはほぼ非蛍光性である。エンドソームおよびリソソームにおけるもののような酸性環境において、それは明るい蛍光を発する。細胞（３０．０００細胞／ウェル）を平底の９６ウェルプレート中に移し、５時間にわたり３７℃で、様々な濃度の特定のポリペプチドおよびコンストラクトと共に、pHrodo（商標）標識アルブミン（５０μｇ／ｍｌ）と一緒にインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、収集し、ＦＣＭにおいて測定して分析した。
【０２８６】
得られた用量応答曲線を、図１９において表し、相関づけられたＥＣ５０値および最高のＭＦＩの最高レベルを表９において列記する。
【表１２】
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注目すべきことに、NCI-H292細胞において、DIM T023800001の全体的な内部移行は、モノマーT023800001-Aおよび古典的に連結された二価NanobodyであるT023800006-Aよりも強力かつ効果的であると考えられた。さらに、この内部移行の差異は、MDA-MB-468などのEGFRを極めて高いレベルで発現する細胞においては、やや明白ではなかったが、それでもなお顕著である（データは示さず）。
【０２８７】
本願全体を通して引用される参考文献の全て（学術文献、発行された特許、公開された特許出願および同時係属の特許出願を含む）の全内容は、本明細書において上で参照される教示については特に、本明細書により参考として明確に援用される。
図面および実験のパート／例は、単に本発明をさらに説明するために示され、本明細書において他に明示的に示されない限りにおいて、決して本発明および／または添付される請求の範囲の範囲を限定するものとして理解または解釈されるべきではない。
【０２８８】
【表１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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