(57)【要約】  本明細書では、幹細胞由来の網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞集団を濃縮する方法が提供される。この方法は、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ５６陽性細胞、および／またはＣＤ９０陽性細胞を枯渇させることによって、ＲＰＥ細胞の出発集団から汚染細胞を除去することを含み得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に富んだ集団を提供する方法であって、
ａ）ＲＰＥ細胞を含む出発細胞集団を得る工程；および
ｂ）前記出発細胞集団と比較してＲＰＥ細胞が濃縮されたＲＰＥ細胞に富んだ細胞集団を提供するように、前記出発細胞集団からＣＤ２４に対して陽性の細胞、ＣＤ５６に対して陽性の細胞および／またはＣＤ９０に対して陽性の細胞を除去することによって前記出発細胞集団をＲＰＥ細胞について濃縮する工程を含む、ＲＰＥ細胞に富んだ集団を提供する方法。
【請求項２】
前記ＲＰＥに富んだ集団におけるＲＰＥ細胞の濃縮レベルを決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記濃縮レベルが、ＢＥＳＴ１、ＣＲＡＬＢＰ、ＴＹＲＰ１、ＰＭＥＬ１７およびＭＩＴＦからなる群から選択される網膜上皮特異的マーカーの使用を介して決定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＰＥに富んだ細胞集団が、ＢＥＳＴ１選別により測定した場合に前記開始細胞集団と比較してＲＰＥ細胞が濃縮されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＲＰＥに富んだ細胞集団の少なくとも９５％がＲＰＥ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＰＥに富んだ細胞集団の少なくとも９９％がＲＰＥ細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＰＥに富んだ細胞集団が本質的に純粋なＲＰＥ細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＰＥ細胞がヒトＲＰＥ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記出発細胞集団が多能性幹細胞から調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣＤ２４に対して陽性の細胞、ＣＤ５６に対して陽性の細胞および／またはＣＤ９０に対して陽性の細胞が、磁気ビーズに基づく選別または蛍光に基づく選別によって除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＤ２４に対して陽性の細胞、ＣＤ５６に対して陽性の細胞および／またはＣＤ９０に対して陽性の細胞を、ＣＤ２４、ＣＤ５６および／またはＣＤ９０を認識する抗体またはアプタマーを用いて除去する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＲＰＥに富んだ細胞集団が遺伝的に改変されていない、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
工程ｂ）が、前記出発細胞集団を遺伝子操作することなく実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記出発細胞集団からＣＤ２４に対して陽性の細胞を除去することによって、前記出発細胞集団がＲＰＥ細胞について濃縮される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記出発細胞集団からＣＤ５６に対して陽性の細胞を除去することによって、前記出発細胞集団がＲＰＥ細胞について濃縮される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記出発細胞集団からＣＤ９０に対して陽性の細胞を除去することによって、前記出発細胞集団がＲＰＥ細胞について濃縮される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記出発細胞集団からＣＤ９０に対して陽性の細胞、ＣＤ５６陽性の細胞およびＣＤ２４陽性の細胞を除去することによって、前記出発細胞集団がＲＰＥ細胞について濃縮される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年９月８日に出願された米国仮出願第６２／２１５，２７２号の優先権を主張するものであり、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
１．技術分野
本発明は、一般に、幹細胞生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、幹細胞由来の網膜色素上皮細胞集団を濃縮する方法に関する。
【０００３】
２．関連技術の説明
網膜は、眼の内面を覆っている層状の光感受性の組織である。網膜における光受容細胞（桿体細胞また錐体細胞のいずれか）は光を直接感じ、化学的光シグナルを、神経インパルスを引き起こす電気的事象に変換する。網膜色素上皮（ＲＰＥ）は、血液網膜関門を形成する色素細胞の層である。ＲＰＥ細胞は、視覚機能の維持および網膜下腔から血液へのイオン、水および代謝産物の輸送において重要な役割を果たす（ストラウスら、２００５）。さらに、ＲＰＥ細胞は、免疫抑制因子を分泌することによって眼の免疫特権を確立している。ＲＰＥ細胞が障害または損傷を受けると、網膜の変性、視覚機能の喪失および失明が起こり得る。急性および加齢性黄斑変性症ならびにベスト病などの網膜のいくつかの障害はＲＰＥの変性を伴うため、視力を保持するための治療オプションとして、細胞補充療法が考えられる（ブシュホルツら、２００９）。
【０００４】
一般に、幹細胞は、一連の成熟した機能性細胞を生じることが可能な未分化細胞である。例えば、造血幹細胞は、様々な、最終分化した血液細胞のいずれをも生じ得る。胚性幹（ＥＳ）細胞は、胚由来の多能性細胞であり、ＲＰＥ細胞を含む任意の臓器または組織型にも発生する能力を有する。
【０００５】
２００６年に確立された、成体マウスの体細胞からの人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の作製は、幹細胞研究、創薬、疾患モデル、および細胞治療の重要な突破口となった（タカハシら、２００６）。ヒトｉＰＳＣは、特定の細胞型に分化させることができ、再生医療にむけた、患者特異的な、免疫型の一致した細胞生産の可能性を有する（ユーら、２００７）。
【０００６】
ｉＰＳＣは、ＲＰＥ細胞を含む眼細胞をも生じることが分かっている（ヒラミら、２００９）。しかし、ｉＰＳＣ由来のＲＰＥ細胞を治療、スクリーニングアッセイ、網膜疾患モデル、ＲＰＥ生物学の研究に使用するには、分化したＲＰＥ細胞集団から汚染細胞を除去することおよび／または目的の集団を濃縮（enrichment）することが必要である。
【発明の概要】
【０００７】
本態様は、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ５６陽性細胞、および／またはＣＤ９０陽性細胞の除去によって、出発ＲＰＥ細胞集団から網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に富んだ集団を得る方法を提供することによって、当該技術分野の大きな欠点を克服するものである。特定の態様において、出発ＲＰＥ細胞集団は、例えば、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞のような多能性幹細胞から得ることができる。
【０００８】
一態様では、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に富んだ集団を提供するための方法が提供され、この方法は、（ａ）ＲＰＥ細胞を含む出発細胞集団を得ること、および（ｂ）前記出発細胞集団と比較してＲＰＥ細胞が濃縮されたＲＰＥ細胞に富んだ細胞集団を提供するように、前記出発細胞集団からＣＤ２４に対して陽性の細胞、ＣＤ５６に対して陽性の細胞および／またはＣＤ９０に対して陽性の細胞を除去することによって前記出発細胞集団を濃縮することを含む。いくつかの局面において、出発細胞集団は、遺伝子操作されていないか、または遺伝子改変されていない。いくつかの局面では、細胞集団を濃縮することは、細胞を遺伝子操作することを含まない。したがって、特定の局面において、ＲＰＥに富んだ細胞集団は、遺伝子操作されていないか、または遺伝子改変されていない細胞である。
【０００９】
いくつかの局面では、本方法はさらに、ＲＰＥに富んだ集団におけるＲＰＥ細胞の濃縮レベルを決定することを含む場合がある。特定の局面において、濃縮レベルは、網膜上皮特異的マーカーを使用して測定される。例えば、網膜上皮特異的マーカーは、ＢＥＳＴ１、ＣＲＡＬＢＰ、ＴＹＲＰ１、ＰＭＥＬ１７またはＭＩＴＦであり得る。特定の局面において、ＲＰＥに富んだ細胞集団とは、ＢＥＳＴ１選別によって測定した場合に、出発細胞集団と比較して、ＲＰＥ細胞が濃縮されたものである。
【００１０】
特定の局面において、ＲＰＥに富む集団とは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％がＲＰＥ細胞である。他の局面において、ＲＰＥに富む集団とは、本質的に純粋なＲＰＥ細胞である。
【００１１】
態様の特定の局面において、出発細胞集団は、多能性幹細胞から調製される。さらなる局面において、多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞である。例えば、ＲＰＥ細胞は、ヒトＲＰＥ細胞でもよい。
【００１２】
特定の局面では、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ５６陽性細胞および／またはＣＤ９０陽性細胞が除去される。例えば、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ５６陽性細胞および／またはＣＤ９０陽性細胞は、磁気ビーズを使用した選別または蛍光を使用した選別によって除去することができる。特定の局面において、ＣＤ２４陽性の細胞、ＣＤ５６陽性細胞および／またはＣＤ９０陽性細胞は、ＣＤ２４、ＣＤ５６および／またはＣＤ９０を認識する抗体またはアプタマーを用いて除去される。
【００１３】
特定の局面において、細胞集団は、この細胞集団からＣＤ２４陽性細胞を除去することによって、ＲＰＥ細胞が濃縮される。他の局面において、細胞集団は、この細胞集団からＣＤ５６陽性細胞を除去することによって、ＲＰＥ細胞が濃縮される。さらに別の局面において、細胞集団は、この細胞集団からＣＤ９０陽性細胞を除去することによって、ＲＰＥ細胞が濃縮される。さらなる局面において、細胞集団は、この細胞集団から、ＣＤ９０陽性細胞、ＣＤ５６陽性細胞およびＣＤ２４陽性細胞を除去することによって、ＲＰＥ細胞が濃縮される。
【００１４】
本明細書で提供される細胞集団は、線維芽細胞または未分化多能性幹細胞などの非ＲＰＥ細胞の混入を本質的に含まなくてもよい。さらなる局面において、ＲＰＥ細胞は、マウスまたはヒトＲＰＥ細胞である。特定の局面においてＲＰＥ細胞は、凍結保存されたＲＰＥ細胞であってよい。
【００１５】
本明細書中の方法によって産生されるＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ細胞の分野で現在知られている任意の方法および用途に使用することができる。例えば、ＲＰＥ細胞に対する化合物の薬理学的特性または毒物学的特性をアッセイすることを含む、化合物の評価方法を提供することができる。また、ＲＰＥ細胞に対する効果について化合物を評価する方法であって、ａ）本明細書で提供されるＲＰＥ細胞を化合物と接触させること；およびｂ）ＲＰＥ細胞に対する化合物の効果をアッセイすることを含む、化合物の評価方法も提供され得る。
【００１６】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい態様を示してはいるが、例示のために示されているだけであり、この詳細な説明から、本発明の精神および範囲内の様々な変更および修正が当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の局面をさらに示すために含まれるものである。本発明は、本明細書に提示される特定の態様の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つ以上を参照することにより、よりよく理解され得る。
【００１８】
【図１Ａ】コンフルエントに達する前のｉＰＳＣの画像。
【図１Ｂ】分化２５日目のＲＰＥの画像例。
【図１Ｃ】分化４０日目のＲＰＥの画像例。
【図１Ｄ】４０日目にＲＰＥ−ＭＭを入れた培地に移した後の６０日目の画像例。明視野、１００倍。
【００１９】
【図２Ａ】ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞集団の細胞選別前の、ＭＡＰ２、ＮＥＳ、ＰＡＸ６、ＭＩＴＦ、ＰＭＥＬ１７、ＴＹＲＰ１、ＣＲＡＬＢＰおよびＢＥＳＴ１を含む関連マーカーのフローサイトメトリー分析。
【図２Ｂ】ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞集団の細胞選別前の、ＭＡＰ２、ＮＥＳ、ＰＡＸ６、ＭＩＴＦ、ＰＭＥＬ１７、ＴＹＲＰ１、ＣＲＡＬＢＰおよびＢＥＳＴ１を含む関連マーカーのフローサイトメトリー分析。
【００２０】
【図３Ａ−１】ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ２４およびＣＤ５６陽性細胞、ＣＤ２４およびＣＤ９０陽性細胞、ならびにＣＤ２４、ＣＤ５６およびＣＤ９０陽性細胞を除去するために、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞集団を細胞選別した後の、ＭＡＰ２、ＮＥＳ、ＰＡＸ６、ＭＩＴＦ、ＰＭＥＬ１７、ＴＹＲＰ１、ＣＲＡＬＢＰおよびＢＥＳＴ１を含む関連マーカーのフローサイトメトリー分析。
【図３Ａ−２】ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ２４およびＣＤ５６陽性細胞、ＣＤ２４およびＣＤ９０陽性細胞、ならびにＣＤ２４、ＣＤ５６およびＣＤ９０陽性細胞を除去するために、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞集団を細胞選別した後の、ＭＡＰ２、ＮＥＳ、ＰＡＸ６、ＭＩＴＦ、ＰＭＥＬ１７、ＴＹＲＰ１、ＣＲＡＬＢＰおよびＢＥＳＴ１を含む関連マーカーのフローサイトメトリー分析。
【図３Ｂ−１】ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ２４およびＣＤ５６陽性細胞、ＣＤ２４およびＣＤ９０陽性細胞、ならびにＣＤ２４、ＣＤ５６およびＣＤ９０陽性細胞を除去するために、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞集団を細胞選別した後の、ＭＡＰ２、ＮＥＳ、ＰＡＸ６、ＭＩＴＦ、ＰＭＥＬ１７、ＴＹＲＰ１、ＣＲＡＬＢＰおよびＢＥＳＴ１を含む関連マーカーのフローサイトメトリー分析。
【図３Ｂ−２】ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ２４およびＣＤ５６陽性細胞、ＣＤ２４およびＣＤ９０陽性細胞、ならびにＣＤ２４、ＣＤ５６およびＣＤ９０陽性細胞を除去するために、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞集団を細胞選別した後の、ＭＡＰ２、ＮＥＳ、ＰＡＸ６、ＭＩＴＦ、ＰＭＥＬ１７、ＴＹＲＰ１、ＣＲＡＬＢＰおよびＢＥＳＴ１を含む関連マーカーのフローサイトメトリー分析。
【図３Ｃ−１】ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ２４およびＣＤ５６陽性細胞、ＣＤ２４およびＣＤ９０陽性細胞、ならびにＣＤ２４、ＣＤ５６およびＣＤ９０陽性細胞を除去するために、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞集団を細胞選別した後の、ＭＡＰ２、ＮＥＳ、ＰＡＸ６、ＭＩＴＦ、ＰＭＥＬ１７、ＴＹＲＰ１、ＣＲＡＬＢＰおよびＢＥＳＴ１を含む関連マーカーのフローサイトメトリー分析。
【図３Ｃ−２】ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ２４およびＣＤ５６陽性細胞、ＣＤ２４およびＣＤ９０陽性細胞、ならびにＣＤ２４、ＣＤ５６およびＣＤ９０陽性細胞を除去するために、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞集団を細胞選別した後の、ＭＡＰ２、ＮＥＳ、ＰＡＸ６、ＭＩＴＦ、ＰＭＥＬ１７、ＴＹＲＰ１、ＣＲＡＬＢＰおよびＢＥＳＴ１を含む関連マーカーのフローサイトメトリー分析。
【００２１】
【図４Ａ】ｉＰＳＣ−ＲＰＥ未処理細胞およびＰＧＥ２で処理したｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞のベータカテニンおよびＦ−アクチン染色。ベータカテニン染色は、未処理細胞の細胞質および処理細胞の膜に見られる。
【図４Ｂ】ｉＰＳＣ−ＲＰＥ未処理細胞およびＰＧＥ２で処理したｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞のｐＥＲＭ（エズリン）およびＺＯ１染色。ＥＲＭ染色は未処理細胞の細胞質では弱く、処理細胞の細胞質では強いが、ＺＯ１染色は未処理および処理細胞の両方の原形質膜のタイトジャンクションで見られる。
【図４Ｃ】ｉＰＳＣ−ＲＰＥ未処理細胞およびＰＧＥ２で処理したｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞のＲＰＥ６５およびＺＯ１染色。ＲＰＥ６５染色は未処理細胞の細胞質では弱く、処理細胞の細胞質では高強い。
【図４Ｄ】ｉＰＳＣ−ＲＰＥ未処理細胞およびＰＧＥ２で処理したｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞の透過電子顕微鏡写真。ＰＧＥ２で処理された細胞は、より広範な頂端プロセスを有する。
【００２２】
【図５Ａ】ＩＷＰ２＋エンド−ＩＷＲ１、ＩＷＰ２またはＬｉＣｌで処理した細胞のベータカテニン染色。ＩＷＰ２またはＩＷＰ２＋エンド−ＩＷＲ１で処理した細胞では、細胞膜上にベータカテニンが見られる。ＬｉＣｌで処理した細胞では核内にベータカテニンが見られ、未処理細胞では細胞質においてベータカテニンが見られる。
【図５Ｂ】ＩＷＰ２＋エンド−ＩＷＲ１、ＩＷＰ２またはＬｉＣｌで処理した細胞のｐ２７染色。ＩＷＰ２またはＩＷＰ２＋エンド−ＩＷＲ１で処理された細胞は核内でより高いｐ２７発現を示し、細胞が細胞周期から離脱したことを示唆している。未処理細胞またはＬｉＣｌで処理された細胞は、核内で弱いｐ２７発現を示している。
【図５Ｃ】ＩＷＰ２＋ＩＷＲ１、ＩＷＰ２またはＬｉＣｌで処理した細胞のＲＰＥ６５およびＺＯ１タイトジャンクション。ＲＰＥ６５は、ＩＷＰ２＋ＩＷＲ１処理細胞およびＩＷＰ２細胞の細胞質において強く、未処理細胞では弱く見られ、ＬｉＣｌ処理細胞では染色は見られない。
【図５Ｄ】ＩＷＰ２＋ＩＷＲ１、ＩＷＰ２またはＬｉＣｌで処理した細胞の機能性タイトジャンクションの電子顕微鏡画像。
【００２３】
【図６Ａ】複数のオペレーターによるＲＰＥの分化。データは、複数のオペレーターが行った、３つの系統にわたって最適化したプロトコールによるＲＰＥ分化の結果を、ＲＰＥマーカーであるレチンアルデヒド結合タンパク質（Ｒｅｔｉｎａｌｄｅｈｙｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｃｒａｌｂｐ）１を用いたフローサイトメトリーの測定値として表している。
【図６Ｂ】３Ｄ１、ＡＭＤ１Ｂ、ＢＥＳＴ１Ｌ、ＢＥＳＴ３Ａ、ＢＥＳＴ８Ａ、ＡＭＤドナー３Ｄ、ＡＭＤドナー３ＣおよびＨＬＡ細胞系Ａを含む様々な出発細胞株集団に関するＲＰＥ分化プロトコールの再現性。
【図６Ｃ−１】様々な出発細胞株集団に関するＲＰＥ分化プロトコールの再現性。データは、１３人のドナーから提供された２８のｉＰＳＣ細胞株に関して５人のオペレーターが行った１０９回の分化の結果を示す。精製前の細胞集団では純度がばらばらだったのに対し、Ｃｒａｌｂｐ陽性細胞のパーセンテージが９０〜１００％に増加した。
【図６Ｃ−２】様々な出発細胞株集団に関するＲＰＥ分化プロトコールの再現性。データは、１３人のドナーから提供された２８のｉＰＳＣ細胞株に関して５人のオペレーターが行った１０９回の分化の結果を示す。精製前の細胞集団では純度がばらばらだったのに対し、Ｃｒａｌｂｐ陽性細胞のパーセンテージが９０〜１００％に増加した。
【図６Ｄ】様々な出発細胞株集団に関するＲＰＥ分化プロトコールの再現性。データは、１３人のドナーから提供された２８のｉＰＳＣ細胞株に関して５人のオペレーターが行った１０９回の分化の結果を示す。精製前の細胞集団では純度がばらばらだったのに対し、Ｃｒａｌｂｐ陽性細胞のパーセンテージが９０〜１００％に増加した。
【００２４】
【図７Ａ】ＲＰＥ分化プロトコールを用いて生成されたＲＰＥ細胞のバリア機能の機能性を、単層全体のイオン勾配の経上皮電位（ＴＥＰ）測定によって示す。
【図７Ｂ】ＩＷＰ２またはＩＷＰ２＋エンド−ＩＷＲ２で処理したＲＰＥ細胞の機能性。
【図７Ｃ】未処理細胞の経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）およびＴＥＰ（薄い線）。
【図７Ｄ】ＰＧＥ２処理細胞の経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）およびＴＥＰ（薄い線）。
【図７Ｅ】ＩＷＰ２＋エンド−ＩＷＲ１処理細胞の経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）およびＴＥＰ（薄い線）。
【図７Ｆ】ｉＰＳＣ由来分化プロトコールの５４日目から７５日目までの期間、５０μＭまたは１００μＭのＰＧＥ２を加えたＲＰＥ−ＭＭ＋ＰＧＥ２培地中で成熟させた細胞の機能的応答（ＴＥＲ）。分化プロトコールの５４日目から７５日目までの期間、５０μＭのＰＧＥ２を加えたＲＰＥ−ＭＭ＋ＰＧＥ２培地で培養したｉＰＳＣ由来のＲＰＥと比較して、１００μＭのＰＧＥ２を加えた培地で分化させた細胞では、ＴＥＲ測定値が漸増した。これは、ＰＧＥ２の濃度を高くすると、ｉＰＳＣ由来のＲＰＥ培養の成熟および機能的効率が促進されることを示している。
【図７Ｇ】５０μＭまたは１００μＭのＰＧＥ２を添加した培地で成熟させたｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞の７５日目の純度。この実験は、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ分化プロトコールの５４日目から７５日目に開始し、ＲＰＥマーカーの発現のパーセンテージとして示している。５０μＭのＰＧＥ２を添加して培養したｉＰＳＣ由来ＲＰＥでは、Ｐｍｅｌ１７、Ｔｒｙｐ１およびＣｒａｌｂｐ（ＲＰＥ特異的マーカー）の発現がかなり見られる。これは、ＰＧＥ２が一定の濃度範囲にわたってｉＰＳＣ由来のＲＰＥ分化を促進することを示している。Ｂｅｓｔ１マーカー（後期成熟ＲＰＥマーカー）の発現は、５０μＭのＰＧＥ２で処理した細胞と比較して、１００μＭのＰＧＥ２で処理した細胞ではるかに高く、ＰＧＥ２の濃度を増加させるとｉＰＳＣ由来ＲＰＥの純度および成熟度が向上することを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本開示は、幹細胞由来の網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の集団を濃縮するための方法を提供することによって、現在の技術におけるいくつかの主要な問題を克服するものである。ＲＰＥ細胞は、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞から誘導することができるが、既存の技術を用いた場合、幹細胞由来のＲＰＥ集団内でさえも、一定の量で、ＲＰＥ以外の細胞（例えば、未分化幹細胞）が混入することが判明している。本発明は、ＲＰＥ細胞の出発集団から汚染細胞を分離および除去する方法を提供する。ＲＰＥ細胞集団を汚染する細胞は、ＣＤ２４、ＣＤ５６および／またはＣＤ９０などの、集団から汚染された非ＲＰＥ細胞を枯渇させるために使用することができる特異的細胞表面抗原を有する。したがって、これら特定の細胞表面マーカーの１つ以上に対して陽性である細胞を除去することにより、出発集団よりも高い割合のＲＰＥ細胞を有するＲＰＥに富んだ細胞集団を得ることができる。そのような表面抗原に応じて様々な細胞集団を分離するには、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ（登録商標））、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、または単細胞選別などの特定の方法論が当該技術分野では知られている。本開示は、好ましい態様において、ＲＰＥに富んだ細胞集団を得るために、出発ＲＰＥ細胞集団からＣＤ２４、ＣＤ５６および／またはＣＤ９０陽性細胞を枯渇させるために、これらの選別方法、好ましくはＭＡＣＳを用いる方法を含む。従って本方法によれば、再生可能な供給源である幹細胞から、より短時間で効率的に、治療のためのＲＰＥに富んだ細胞集団の製造が可能になる。本開示のさらなる態様および利点を以下に記載する。
【００２６】
Ｉ．定義
「精製された」という用語は絶対的な純度を意味するものではなく、むしろ、相対的な用語として意図されている。したがって、細胞の精製された集団は、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超えて、または１００％の純度であり、本質的に他の細胞型を含まない。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、特定の成分に関して「本質的に」または「本質的に含まない」とは、特定の成分がいずれも意図的に組成物に処方されていない、および／または汚染物質としてのみ、または微量において存在することを意味している。従って、意図しない組成物の汚染に起因する特定の成分の総量は、０．０５％未満、好ましくは０．０１％未満である。最も好ましいのは、組成物中に含まれる特定の成分の量が、標準的な分析方法で検出することができないレベルであることである。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「１つ（ａ）」または「１種（ａｎ）」は、１つ以上であることを意味し得る。添付の特許請求の範囲において使用されるように、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と併せて使用される場合、単語「１つ（ａ）」または「１種（ａｎ）」は、１つまたは複数のことを意味し得る。
【００２９】
特許請求の範囲において用語「または」を使用することは、選択肢の一方のみのことを言うことを明示しない限り、または選択肢が相互に排他的である場合を除いて「および／または」を意味する。本明細書中で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２のまたはそれ以上を意味し得る。
【００３０】
本出願を通じて、「約」という用語は、ある値が、装置の誤差の固有の変動、値を決定するために使用される方法、または被験者の間に存在する変動を含むことを示すために使用される。
【００３１】
本明細書において「細胞」という用語は、独立して複製することができ、膜によって囲まれていて、生体分子および遺伝物質を含む、生物の構造的および機能的単位のことを言うために使用される。本明細書で使用される細胞は、天然に存在する細胞または人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞など）であり得る。
【００３２】
本明細書において「細胞集団」という用語は、一群の細胞、典型的には、型が共通した一群の細胞のことを言うために使用される。細胞集団は、共通の前駆細胞に由来し得るか、または１より多い細胞型を含み得る。「濃縮された（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）」細胞集団とは、出発細胞集団（例えば、未分画の異種細胞集団）に由来し、特定の細胞型を出発集団中のその細胞型のパーセンテージよりも大きな割合で含む細胞集団のことを言う。細胞集団は、１つ以上の細胞型について濃縮されていても、または、１つ以上の細胞型が枯渇されていてもよい。
【００３３】
本明細書において「幹細胞」という用語は、適切な条件下で多様な範囲の特殊化した細胞型に分化することができ、他の適切な条件下では自己複製して本質的に未分化多能性状態にとどまる細胞のことを言う。「幹細胞」という用語は、多能性細胞、多分化能性細胞、前駆細胞および前駆体細胞も包含する。例示的なヒト幹細胞は、骨髄組織から得られる造血幹細胞または間葉系幹細胞、胚組織から得られる胚性幹細胞、または胎児の生殖器組織から得られる胚性生殖細胞から得ることができる。例示的な多能性幹細胞はまた、多能性に関連する特定の転写因子を発現させることで体細胞を多能性状態にリプログラミングすることによって体細胞からも産生され得る。このような細胞は、「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」と呼ばれている。
【００３４】
「多能性」という用語は、胚体外または胎盤細胞を除いた、生物体の他のすべての細胞型に分化する細胞の性質のことを言う。多能性幹細胞は、長期間培養した後においても、３つの胚葉の全ての細胞型（例えば、外胚葉、中胚葉および内胚葉細胞型）に分化することができる。多能性幹細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚性幹細胞である。他の態様において、多能性幹細胞は、体細胞をリプログラミングすることによって誘導される人工多能性幹細胞である。
【００３５】
「分化」という用語は、特殊化されていない細胞が構造的および／または機能的特性の変化を伴って、より特殊化した細胞型になるプロセスのことを言う。成熟細胞は、典型的には、変化した細胞構造と組織特異的タンパク質を有する。本方法の文脈においては、より具体的には、ヒト幹細胞が網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の細胞型になり、前記ＲＰＥ細胞が成熟した最終分化細胞であることを示す特徴を示すまでのプロセスを意味する。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「未分化」とは、胚または成人起源の最終分化細胞とは明確に区別される、未分化細胞の特徴的マーカーおよび形態学的特徴を示す細胞のことを言う。
【００３７】
「胚様体（ＥＢ）」は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の細胞に分化することができる多能性幹細胞の凝集体である。多能性幹細胞が凝集し、ＥＢを非付着性で浮遊培養できるときに、球状構造が形成される。
【００３８】
「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」細胞は、生体または培養物中の他の細胞から実質的に分離または精製されている。単離された細胞は、例えば、少なくとも９９％、少なくとも９８％の純度、少なくとも９５％の純度、または少なくとも９０％の純度であり得る。
【００３９】
「胚」とは、受精卵または人工的にリプログラミングされた核を有する活性化卵母細胞の１つまたは複数の区画から得られる細胞塊をいう。
【００４０】
「胚性幹（ＥＳ）細胞」は、胚盤胞期の内部細胞塊などの初期段階で胚から得られる未分化多能性細胞、または人為的手段（例えば、核移植）によって産生される未分化多能性細胞であり、生殖細胞（例えば、精子および卵）を含む、胚または成体の任意のより分化した細胞型を生じることができる細胞である。
【００４１】
「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」は、ある因子の組み合わせ（本明細書ではリプログラミング因子と呼ばれる）を発現させる、または発現を誘導することにより細胞をリプログラミングすることによって作製される細胞である。ｉＰＳＣは、胎児、出生後、新生児、若年または成体の体細胞を用いて作製することができる。特定の態様において、体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングするために使用され得る因子は、例えば、Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ３／４と呼ばれることもある）、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８を含む。いくつかの態様においては、体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングするために、体細胞は、少なくとも２つのリプログラミング因子、少なくとも３つのリプログラミング因子、または４つのリプログラミング因子を発現させることによってリプログラミングされる。
【００４２】
「対立遺伝子」は、遺伝子の２つ以上の形態のうちの１つのことを言う。ヒトのような二倍体は、各染色体の２つのコピーを含むことになるため、それぞれに１つの対立遺伝子を持つと言える。
【００４３】
「ホモ接合体」という用語は、特定の遺伝子座に同じ対立遺伝子を２つ含むことと定義される。「ヘテロ接合性」という用語は、特定の遺伝子座に２つの異なる対立遺伝子を含むものを言う。
【００４４】
「ハプロタイプ」は、単一の染色体に沿った複数の遺伝子座における対立遺伝子の組み合わせのことを言う。ハプロタイプは、単一の染色体上の一塩基多型（ＳＮＰ）の組み合わせおよび／または主要組織適合複合体の対立遺伝子に基づく場合がある。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、「ハプロタイプ一致（ｈａｐｌｏｔｙｐｅ−ｍａｔｃｈｅｄ）」という用語は、細胞（例えばｉＰＳＣ細胞）を定義するものであり、治療される対象は１以上の主要組織適合遺伝子座ハプロタイプが共通している。対象のハプロタイプは、当技術分野でよく知られているアッセイを用いて容易に決定することができる。ハプロタイプが一致するｉＰＳＣ細胞は、自己細胞または同種異系細胞であり得る。組織培養で増殖し、ＲＰＥ細胞に本質的に分化した自己細胞は、対象とハプロタイプが一致する。
【００４６】
「ＨＬＡ型が実質的に同一」とは、ドナーの体細胞に由来するｉＰＳＣの分化を誘導して得られた移植細胞を移植する場合に移植することができる程度に、ドナーのＨＬＡ型と患者のＨＬＡ型とが一致することを示す。
【００４７】
本明細書において「スーパードナー」とは、特定のＭＨＣクラスＩ遺伝子およびクラスＩＩ遺伝子がホモ接合の個体のことを言う。これらのホモ接合個体はスーパードナーとして機能し得、その細胞を含有している組織および他の物質を含むそれらの細胞を、そのハプロタイプについてホモ接合性またはヘテロ接合性の個体に移植することができる。スーパードナーは、それぞれＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰまたはＨＬＡ−ＤＱ座／座位対立遺伝子についてホモ接合であり得る。
【００４８】
本明細書において「フィーダーを使わない」または「フィーダー非依存性」とは、フィーダー細胞層の代わりにサイトカインおよび増殖因子（例えば、ＴＧＦβ、ｂＦＧＦ、ＬＩＦ）を補充した培養物を意味するために使用される。したがって、「フィーダーを使わない」またはフィーダー非依存性の培養系および培地を用いて、分化多能性細胞を未分化の状態および増殖性の状態で培養および維持することができる。場合によっては、フィーダーを使わない培養物を、動物性の基質（例えば、マトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）（登録商標））を利用するか、またはフィブロネクチン、コラーゲンもしくはビトロネクチンなどの基質上で増殖させる。これらのアプローチにより、マウス線維芽細胞「フィーダー層」を使用せずに、ヒト幹細胞を本質的に未分化状態にとどめることが可能になる。
【００４９】
本明細書において「フィーダー層」は、培養皿の底面などに施される細胞のコーティング層として定義される。フィーダー細胞は、培地中に栄養素を放出し、多能性幹細胞などの他の細胞が付着し得る表面を提供することができる。
【００５０】
培地、細胞外マトリックス、または培養条件に関して使用される場合、用語「定義された」または「完全に定義された」は、培地、細胞外マトリックス、または培養条件に含まれる化学組成およびほぼ全成分の量が分かっている、培地、細胞外マトリックス、または培養条件のことを言う。例えば、定義された培地は、ウシ胎仔血清、ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンなどの定義されていない因子を含まない。一般に、定義された培地は基礎培地（例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩、緩衝剤、酸化防止剤およびエネルギー源を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｆ１２、またはロズウェルパークメモリアル研究所培地（ＲＰＭＩ）１６４０）を含み、組換えアルブミン、化学的に定義された脂質、および組換えインスリンが添加される。完全に定義された培地の例としては、エッセンシャル（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ）８（商標）培地がある。
【００５１】
培地、細胞外マトリックス、または培養条件に関して使用される場合、「異種成分不含有（ゼノフリー、Ｘｅｎｏ−Ｆｒｅｅ、ＸＦ）」という用語は、異種動物由来成分を本質的に含まない培地、細胞外マトリックス、または培養条件のことを言う。ヒト細胞を培養する場合には、マウスのような非ヒト動物の任意のタンパク質が異種成分となり得る。特定の局面では、異種成分不含有マトリックスは、非ヒト動物由来成分を本質的に含まず、したがって、マウスフィーダー細胞またはマトリゲル（商標）も含まない場合がある。マトリゲル（商標）は、エンゲルブレス−ホルム−スワーム（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ、ＥＨＳ）マウス肉腫、つまり、ラミニン（主要成分）、コラーゲンＩＶ、ヘパラン硫酸プロテオグリカンおよびエンタクチン／ニドゲンを含む細胞外マトリックスタンパク質が豊富な腫瘍、から抽出された可溶性基底膜調製品である。
【００５２】
本明細書において「ノックアウト（ＫＮＯＣＫＯＵＴ）（登録商標）血清代替物」とは、未分化細胞（例えば幹細胞）の増殖および維持を最適化するための無血清製剤のことを言う。
【００５３】
「コンフルエントに達する前（Ｐｒｅ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）」とは、細胞によって覆われている培養表面の割合が約６０〜８０％の細胞培養のことを言う。通常、コンフルエントに達する前とは、培養表面の約７０％が細胞によって覆われている培養物をいう。
【００５４】
「網膜」とは、眼の内面を覆っている、層上の、光感受性の組織のことを言う。
【００５５】
「網膜色素上皮」は、脈絡膜、血管で満たされた層、および網膜の間の色素細胞の単層のことを言う。
【００５６】
「網膜系統細胞」は、本明細書において、ＲＰＥ細胞を生じさせるかまたは分化させることができる細胞のことを言う。
【００５７】
本明細書において「網膜誘導培地（ＲＩＭ）」は、ＷＮＴ経路阻害剤およびＢＭＰ経路阻害剤を含み、ＰＳＣを網膜系統細胞へと分化させ得る増殖培地のことを言う。ＲＩＭは、ＴＧＦβ経路阻害剤も含む。
【００５８】
本明細書において「網膜分化培地（ＲＤＭ）」は、ＷＮＴ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤およびＭＥＫ阻害剤を含み、網膜細胞を分化させる培地として定義される。ＲＤＭは、ＴＧＦβ経路阻害剤も含む。
【００５９】
「網膜培地（ＲＭ）」は、アクチビンＡおよびニコチンアミドを含む網膜細胞培養のための増殖培地として定義される。
【００６０】
本明細書において「ＲＰＥ−成熟培地（ＲＰＥ−ＭＭ）」は、タウリンおよびヒドロコルチゾンを含む、ＲＰＥ細胞を成熟させるための培地のことを言う。ＲＰＥ−ＭＭはまた、トリヨードチロニンを含む。ＲＰＥ−ＭＭはさらに、ＰＤ０３２５９０１またはＰＧＥ２を含み得る。
【００６１】
本明細書において「成熟した」ＲＰＥ細胞とは、Ｐａｘ６のような未成熟ＲＰＥマーカーの発現が減少し、ＲＰＥ６５などの成熟ＲＰＥマーカーの発現が上昇している細胞のことを言う。
【００６２】
本明細書において、ＲＰＥ細胞の「成熟」とは、ＲＰＥの発生経路が、成熟ＲＰＥ細胞を生成するように調節されたプロセスのことを言う。例えば、繊毛機能の調節は、ＲＰＥの成熟をもたらし得る。
【００６３】
本明細書で使用される「治療的有効量」とは、疾患または状態の治療のために対象に投与されたときに、そのような治療を行うのに十分な化合物の量のことを言う。
【００６４】
本明細書において「誘導因子」は、細胞内の遺伝子を活性化するなど、遺伝子の発現を制御する分子として定義される。誘導因子は、リプレッサーまたはアクチベータに結合する場合がある。誘導因子はリプレッサーを無効にすることによって機能する。
【００６５】
ＩＩ．多能性幹細胞
Ａ．胚性幹細胞
ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来し、インビトロでの高い分化能を有する。ＥＳ細胞は、発達中の胚の外側栄養外胚葉層を除去し、次いで、非増殖細胞のフィーダー層上で内部質量細胞を培養することによって単離され得る。再播種された細胞は増殖し続け、ＥＳ細胞の新しいコロニーを生成することができる。このＥＳ細胞を、回収し、分離し、再び播種して、増殖させることができる。未分化ＥＳ細胞を「継代培養」するこのプロセスは、未分化ＥＳ細胞を含む細胞株を産生するために何度も繰り返すことができる（米国特許第５，８４３，７８０号、第６，２００，８０６号、第７，０２９，９１３号）。ＥＳ細胞は、それらの多能性を維持しながら増殖するという能力を有する。例えば、ＥＳ細胞は、細胞および細胞分化を制御する遺伝子に関する研究において有用である。ＥＳ細胞の多能性は、遺伝子操作や選択との組み合わせることにより、トランスジェニックマウス、キメラマウス、およびノックアウトマウスの生成を介してインビボでの遺伝子分析研究に使用することができる。
【００６６】
マウスＥＳ細胞の作製方法はよく知られている。ある方法では、１２９株のマウスの着床前胚盤胞をマウス抗血清で処理して栄養外胚葉を除去し、胎仔ウシ血清を含有する培地中で、化学的に不活性化したマウス胚線維芽細胞のフィーダー細胞層上で培養する。発生する未分化ＥＳ細胞のコロニーを、ウシ胎児血清の存在下、マウス胚線維芽細胞フィーダー層上で継代培養して、ＥＳ細胞の集団を作製する。いくつかの方法において、マウスＥＳ細胞は、血清含有培地（スミス、２０００）にサイトカイン白血病阻害因子（ＬＩＦ）を添加することによって、フィーダー層の非存在下で増殖させることができる。他の方法では、マウスＥＳ細胞を、骨形成タンパク質およびＬＩＦ存在下、無血清培地中で増殖させることができる（インら、２００３）。
【００６７】
ヒトＥＳ細胞は、既に報告されている方法の通り（トムソンおよびマーシェル、１９９８；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、２０００）、精子と卵細胞の融合、核移植、病原性、またはクロマチンのリプログラミングとその後のリプログラミングされたクロマチンの原形質膜への取り込みによって産生される接合体または胚盤胞期の哺乳類胚から産生または誘導することができる。一つの方法では、ヒト胚盤胞を抗ヒト血清に曝露し、栄養外胚葉細胞を溶解して内部細胞塊から除去し、これをマウス胚線維芽細胞フィーダー層上で培養する。さらに、内部細胞塊に由来する細胞の塊を化学的にまたは機械的に解離させ、再播種し、未分化形態を有するコロニーをマイクロピペットによって選択し、解離させ、そして再播種する（米国特許第６，８３３，２６９号）。いくつかの方法では、ＥＳ細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子存在下、線維芽細胞のフィーダー層上で培養することにより、血清を用いずに増殖させることができる（アミットら、２０００）。他の方法では、ヒトＥＳ細胞は、線維芽細胞増殖因子（シュウら、２００１）を含有する「馴化」培地の存在下で、マトリゲル（商標）またはラミニンなどのタンパク質性マトリックス上で細胞を培養することによってフィーダー細胞層なしで増殖させることができる。
【００６８】
ＥＳ細胞はまた、既に報告されている方法に従って、アカゲザルおよびマーモセットを含む他の生物から（例えば、トムソンおよびマーシェル、１９９８；トムソンら、１９９５；トムソンおよびオドリコ、２０００）、さらには、樹立されたマウスおよびヒト細胞株から誘導することもできる。例えば、樹立ヒトＥＳ細胞株としては、ＭＡＯＩ、ＭＡ０９、ＡＣＴ−４、ＨＩ、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４およびＡＣＴ３０が挙げられる。さらなる例として、樹立されたマウスＥＳ細胞系としては、マウス系統１２９胚の内部細胞塊から樹立されたＣＧＲ８細胞系があり、ＣＧＲ８細胞の培養物は、ＬＩＦが存在すれば、フィーダー層なしで増殖させることができる。
【００６９】
ＥＳ幹細胞は、転写因子Ｏｃｔ４、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、段階特異的胚抗原ＳＳＥＡ−１、段階特異的胚抗原ＳＳＥＡ−３、段階特異的胚抗原ＳＳＥＡ−４、転写因子ＮＡＮＯＧ、腫瘍拒絶抗原１−６０（ＴＲＡ−１−６０）、腫瘍拒絶抗原１−８１（ＴＲＡ−１−８１）、ＳＯＸ２、またはＲＥＸ１などのタンパク質マーカーによって検出することができる。
【００７０】
Ｂ．人工多能性幹細胞
多分化能の誘導は最初、多能性に関連している転写因子の導入による体細胞のリプログラミングによって、２００６年にはマウス細胞を用いて（Ｙａｍａｎａｋａら、２００６）、そして２００７年にはヒト細胞を用いて（ユーら、２００７、タカハシら、２００７）達成された。多分化能性幹細胞は、未分化状態で維持することができ、ほとんどあらゆる細胞型に分化することができる。ｉＰＳＣを使用することで、ＥＳ細胞の大規模な臨床使用に関連する倫理的および実践的問題の大部分が回避でき、ｉＰＳＣ由来自己移植を有する患者は、移植片拒絶反応を予防するための生涯にわたる免疫抑制治療を必要としない可能性がある。
【００７１】
生殖細胞を除き、いずれの細胞もｉＰＳＣの出発材料として使用することができる。例えば、そのような細胞型は、ケラチノサイト、線維芽細胞、造血細胞、間葉細胞、肝臓細胞、または胃細胞であり得る。Ｔ細胞はまた、リプログラミングのための体細胞の供給源として使用され得る（米国特許第８，７４１，６４８号）。細胞分化の程度または細胞が採取される動物の年齢に制限はない。未分化の前駆細胞（体細胞幹細胞を含む）および最終的に分化した成熟細胞も、本明細書中に開示される方法においては、体細胞の供給源として使用され得る。一態様では、体細胞はそれ自体が、ヒトＲＰＥ細胞などのＲＰＥ細胞である。ＲＰＥ細胞は、成体または胎児のＲＰＥ細胞であり得る。ヒトＥＳ細胞を特殊化された細胞型に分化させ、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１を含むヒトＥＳ細胞マーカーを発現させることが知られている条件下でｉＰＳＣを増殖させることができる。
【００７２】
当業者に知られている方法を用いて、体細胞を、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を産生するようにリプログラミングすることができる。当業者は、人工多能性幹細胞を容易に産生することができる（例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる、公開米国特許出願第２００９０２４６８７５号、同第２０１０／０２１００１４号、同第２０１２０２７６６３６号；米国特許第８，０５８，０６５号；同第８，１２９，１８７号；同第８，２７８，６２０号；ＰＣＴ公報国際公開第２００７／０６９６６６号Ａ１、および米国特許第８，２６８，６２０号を参照のこと）。一般に核リプログラミング因子は、体細胞から多能性幹細胞を産生するために使用される。いくつかの態様では、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８のうちの少なくとも３つ、または少なくとも４つが利用される。他の態様では、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４が利用される。
【００７３】
細胞は、一般に、体細胞からｉＰＳＣを誘導することができる１つまたは複数の因子またはこれらの物質をコードしている核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）である核リプログラミング物質で処理される。核リプログラミング物質は、一般に少なくともＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４およびＳｏｘ２またはこれらの分子をコードする核酸を含む。ｐ５３の機能的阻害剤、Ｌ−ｍｙｃもしくはＬ−ｍｙｃをコードする核酸、Ｌｉｎ２８もしくはＬｉｎ２８ｂ、またはＬｉｎ２８もしくはＬｉｎ２８ｂをコードする核酸を、さらなる核リプログラミング物質として利用することもできる。Ｎａｎｏｇも、核リプログラミングに利用できる。米国特許出願第２０１２０１９６３６０号に開示されているように、ｉＰＳＣの生産に用いられるリプログラミング因子の例としては、（１）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ（Ｓｏｘ２はＳｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７またはＳｏｘ１８で置き換え可能。Ｋｌｆ４はＫｌｆ１、Ｋｌｆ２またはＫｌｆ５で置き換え可能）；（２）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ラージＴ抗原（ＳＶ４０ＬＴ）；（３）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６Ｅ６；（４）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６Ｅ７；（５）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７；（６）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、Ｂｍｉｌ；（７）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８；（８）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、ＳＶ４０ＬＴ；（９）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ；（１０）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、ＳＶ４０ＬＴ；（１１）Ｏｃｔ３／４、Ｅｓｒｒｂ、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ（ＥｓｒｒｂはＥｓｒｒｇで置き換えられる）；（１２）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２；（１３）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ；（１４）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＨＰＶＩ６Ｅ６；（１５）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６Ｅ７；（１６）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７；（１７）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、Ｂｍｉｌ；（１８）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８（１９）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、ＳＶ４０ＬＴ；（２０）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ；（２１）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＳＶ４０ＬＴ；または（２２）Ｏｃｔ３／４、Ｅｓｒｒｂ、Ｓｏｘ２（ＥｓｒｒｂはＥｓｒｒｇで置き換え可能）、が挙げられる。非限定的な例としては、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃを利用できる。他の態様では、Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２が利用される。例えば、参照することにより本明細書に組み入れられる米国特許第７，６８２，８２８号を参照のこと。これらの因子には、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４およびＳｏｘ２が含まれるがこれらには限定されない。他の例では、これらの因子には、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４およびＭｙｃが含まれるがこれらには限定されない。いくつかの非限定的な例においては、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−ＭｙｃおよびＳｏｘ２が利用される。他の非限定的な例においては、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびＳａｌ４が利用される。Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、またはｃ−Ｍｙｃのような因子は、リプログラミング効率を向上させることができ、いくつかの異なる発現ベクターから発現させることができる。例えば、ＥＢＶエレメントを用いたシステムのような組み込みベクターを使用することができる（米国特許第８，５４６，１４０号）。更なる局面では、タンパク質形質導入によって、リプログラミングタンパク質を体細胞に直接導入することができる。リプログラミングはさらに、細胞を、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）阻害剤、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）レセプター阻害剤もしくはシグナル伝達阻害剤、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ｐ５３阻害剤、ＮＦ−κＢ阻害剤、またはそれらの組み合わせと接触させる工程を含み得る。これらの制御因子は、低分子、阻害性ヌクレオチド、発現カセット、またはタンパク質因子を含み得る。実質的に、いかなるｉＰＳ細胞または細胞株をも使用できると予想される。
【００７４】
これら核リプログラミング物質のマウスおよびヒトｃＤＮＡ配列は、参照することにより本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０６９６６６号に記載されたＮＣＢＩアクセッション番号を参照することによって入手可能である。１つまたは複数のリプログラミング物質、またはこれらリプログラミング物質をコードする核酸を導入する方法は、当該分野で知られており、例えば、公開された米国特許出願第２０１２／０１９６３６０号および米国特許第８，０７１，３６９号に開示されており、これらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる。
【００７５】
誘導したｉＰＳＣは、多能性を維持するのに十分な培地中で培養することができる。ｉＰＳＣは、米国特許第７，４４２，５４８号および米国特許出願公開第２００３／０２１１６０３号に記載されているように、多能性幹細胞を、より具体的には胚性幹細胞を培養するために開発された様々な培地および技術と共に使用され得る。マウス細胞の場合、分化抑制因子である白血病抑制因子（ＬＩＦ）を通常の培地に添加して培養する。ヒト細胞の場合、ＬＩＦの代わりに塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を添加することが望ましい。当業者に知られているように、ｉＰＳＣを培養および維持するための他の方法を使用することもできる。
【００７６】
特定の態様では、未定義の条件を使用することができる。例えば、幹細胞を未分化状態に維持するために、線維芽細胞フィーダー細胞または線維芽細胞フィーダー細胞に曝露された培地上で多能性細胞を培養することができる。いくつかの態様において、細胞は、フィーダー細胞として、細胞分裂を終了させるために放射線または抗生物質で処理されたマウス胚線維芽細胞の共存下で培養される。あるいは多能性細胞は、ＴＥＳＲ（商標）培地（ルドウィグら、２００６ａ；ルドウィグら、２００６ｂ）またはＥ８（商標）培地（Ｃｈｅｎら、２０１１）などの定義されたフィーダー非依存性培養系を使用することで、本質的に未分化な状態で培養および維持され得る。
【００７７】
いくつかの態様において、ｉＰＳＣは、プロモーターおよび第１のマーカーをコードする核酸配列に機能的に連結されたチロシナーゼエンハンサーを含むなどのようにして、外因性核酸を発現するように改変することができる。チロシナーゼ遺伝子は、例えば、２０１３年１月１日付けでジェンバンク（登録商標）に登録されている、アクセッション番号２２１７３から利用可能である。この配列は、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスの第７染色体の５２８６９７１−５２９１６９１（逆向き）に位置している。ＲＰＥ細胞内で発現させるには４７２１塩基対の配列で十分である（参照することにより本明細書に組み込まれるＭｕｒｉｓｉｅｒら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３０３：８３８−８４７、２００７を参照のこと）。この構築物は、網膜色素上皮細胞において発現する。他のエンハンサーを利用することもできる。他のＲＰＥ特異的エンハンサーとしては、Ｄ−ＭＩＴＦ、ＤＣＴ、ＴＹＲＰ１、ＲＰＥ６５、ＶＭＤ２、ＭＥＲＴＫ、ＭＹＲＩＰおよびＲＡＢ２７Ａが挙げられる。好適なプロモーターとしては、チロシナーゼプロモーターなどの網膜色素上皮細胞において発現する任意のプロモーターが挙げられるが、これらには限定されない。この構築物には、翻訳開始のためのリボソーム結合部位（内部リボソーム結合配列）、および転写／翻訳ターミネーターなどの他のエレメントも含めることができる。一般に、構築物を細胞に導入することが有利である。安定な形質導入に適したベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびセンダイウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
プラスミドは、制御された状態で高いコピー数を達成すること、バクテリア内でプラスミドが不安定性を示す潜在的原因を回避すること、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞での使用に適合するプラスミドを選抜するための手段を提供することなど、多くの目的を考慮して設計されている。ヒト細胞で使用するためのプラスミドの二大要件に特に注意が払われている。第一の要件は、大腸菌での維持および発酵に適しており、大量のＤＮＡを生産および精製することができる、ということである。第二の要件は、それらが安全であり、ヒト患者および動物における使用に適していることである。第１の要件には、バクテリア発酵中に比較的容易に選択および安定に維持できる高コピー数プラスミドであることが必要となる。第２の要件には、選択可能なマーカーおよび他のコード配列などの要素に注意する必要がある。いくつかの態様においてマーカーをコードするプラスミドは、（１）高コピー数複製起点、（２）カナマイシンによる抗生物質選択のためのｎｅｏ遺伝子など（これには限定されないが）の選択マーカー、（３）チロシナーゼエンハンサーなどの転写終結配列、および（４）種々の核酸カセット取り込みのためのマルチクローニング部位；ならびに（５）チロシナーゼプロモーターに作動可能に連結されたマーカーをコードする核酸配列、から構成される。タンパク質をコードする核酸を誘導するための多数のプラスミドベクターが存在し、当該分野で知られている。これらには、参照することにより本明細書に組み入れられる、米国特許第６，１０３，４７０号；米国特許第７，５９８，３６４号；米国特許第７，９８９，４２５号；および米国特許第６，４１６，９９８号に開示されているベクターが含まれるがこれらには限定されない。
【００７９】
ウイルス遺伝子送達系は、ＲＮＡ系またはＤＮＡ系のウイルスベクターであり得る。エピソーム遺伝子送達系は、プラスミド、ＥＢＶ（エプスタイン・バーウイルス、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）を基礎とするエピソームベクター、酵母を基礎とするベクター、アデノウイルスを基礎とするベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）を基礎とするエピソームベクター、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）を基礎とするベクター、またはレンチウイルスベクターであり得る。
【００８０】
マーカーには、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼまたはホタル／ウミシイタケルシフェラーゼまたはナノルック（ｎａｎｏｌｕｃ））、または他のタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。マーカーは、タンパク質（分泌された、細胞表面タンパク質もしくは内部タンパク質を含む；細胞によって合成されるかもしくは取り込まれるタンパク質）、核酸（例えば、ｍＲＮＡ、または酵素的に活性な核酸分子）または多糖類であってもよい。目的の細胞型のマーカーに特異的な、抗体、レクチン、プローブまたは核酸増幅反応によって検出可能な任意のこのような細胞成分の決定因子が含まれる。マーカーはまた、遺伝子産物の機能に依存する生化学的アッセイまたは酵素アッセイまたは生物学的応答によって同定することができる。これらのマーカーをコードする核酸配列は、チロシナーゼエンハンサーに作動可能に連結することができる。さらに、幹細胞からのＲＰＥ分化もしくはＲＰＥの機能、または生理学、または病理に影響し得る遺伝子など、他の遺伝子も含まれ得る。したがって、いくつかの態様では、ＭＩＴＦ、ＰＡＸ６、ＴＦＥＣ、ＯＴＸ２、ＬＨＸ２、ＶＭＤ２、ＣＦＴＲ、ＲＰＥ６５、ＭＦＲＰ、ＣＴＲＰ５、ＣＦＨ、Ｃ３、Ｃ２Ｂ、ＡＰＯＥ、ＡＰＯＢ、ｍＴＯＲ、ＦＯＸＯ、ＡＭＰＫ、ＳＩＲＴ１−６、ＨＴＲＰ１、ＡＢＣＡ４、ＴＩＭＰ３、ＶＥＧＦＡ、ＣＦＩ、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＡＰＰ、ＣＤ４６、ＢＡＣＥ１、ＥＬＯＬＶ４、ＡＤＡＭ１０、ＣＤ５５、ＣＤ５９およびＡＲＭＳ２のうちの１つ以上をコードする核酸が含まれる。
【００８１】
１．ＭＨＣハプロタイプ一致
同種異系臓器移植の免疫拒絶反応の主な原因は主要組織適合性複合体である。組織適合性複合体には、３つの主要なＭＨＣクラスＩハプロタイプ（Ａ、Ｂ、およびＣ）および３つの主要なＭＨＣクラスＩＩハプロタイプ（ＤＲ、ＤＰおよびＤＱ）がある。ＨＬＡ遺伝子座は第６染色体上に４Ｍｂにわたって分布しており、高度な多型を示す。この領域内のＨＬＡ遺伝子をハプロタイプ化する能力は、自己免疫疾患および感染性疾患に関連し、さらにドナーとレシピエントの間のＨＬＡハプロタイプの適合性が移植の臨床転帰に影響を与えるため、臨床上、非常に重要である。ＭＨＣクラスＩに対応するＨＬＡは、細胞の内側からペプチドを提示し、ＭＨＣクラスＩＩに対応するＨＬＡは、細胞の外側からＴリンパ球まで抗原を提示する。移植片と宿主との間のＭＨＣハプロタイプの不適合性は、移植片に対する免疫応答を誘発し、その拒絶につながる。したがって、拒絶反応を防ぐために患者を免疫抑制剤で治療する場合がある。ＨＬＡ適合性幹細胞株は、免疫拒絶反応のリスクを克服し得る。
【００８２】
ＨＬＡが移植において重要であるため、ＨＬＡ遺伝子座は、通常、好ましいドナー−レシピエント対を同定するため、血清学的におよびＰＣＲによって分類される。ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ抗原の血清学的検出は、精製されたＴリンパ球またはＢリンパ球を用いた補体媒介性リンパ球毒性試験を用いて行うことができる。この手順は主に、ＨＬＡ−ＡとＨＬＡ−Ｂの遺伝子座を一致させるために使用される。分子に基づく組織型決定は、血清学的検査よりも正確である場合が多い。ＰＣＲ産物を一連のオリゴヌクレオチドプローブに対して試験するＳＳＯＰ（配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ）法などの低分解能分子法を用いてＨＬＡ抗原を同定することができ、現在、これらの方法は、ＨＬＡクラスＩＩの分類に関する主要な方法になっている。ＰＣＲ増幅のために対立遺伝子特異的プライマーを利用するＳＳＰ（配列特異的プライマー）法などの高分解能技術は、特定のＭＨＣ対立遺伝子を同定することができる。
【００８３】
ドナー細胞がＨＬＡホモ接合体である場合、すなわち、各抗原提示タンパク質について同一の対立遺伝子を含む場合、ドナーとレシピエントとの間のＭＨＣ適合性は有意に高まる。ほとんどの個体はＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ遺伝子に関してヘテロ接合であるが、特定の個体はこれらの遺伝子についてホモ接合である。これらのホモ接合体個体はスーパードナーとして働き、それらの細胞から生成された移植片は、そのハプロタイプについてホモ接合体またはヘテロ接合体である全ての個体に移植することができる。さらに、ホモ接合性ドナー細胞が、集団において高頻度で見出されるハプロタイプを有する場合、これらの細胞は、多数の個体の移植療法に適用され得る。
【００８４】
したがって、ｉＰＳＣは、治療される対象の体細胞から、または患者と同じまたは実質的に同じＨＬＡ型を有する別の対象の体細胞から産生することができる。一例では、ドナーの主要ＨＬＡ（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲの３つの主要座位）は、レシピエントの主要ＨＬＡと同一である。別の例では、体細胞ドナーはスーパードナーであり得、したがって、ＭＨＣホモ接合スーパードナー由来のｉＰＳＣを用いてＲＰＥ細胞を産生することができる。したがって、スーパードナーに由来するｉＰＳＣは、そのハプロタイプについてホモ接合性またはヘテロ接合性のいずれかである対象に移植され得る。例えば、ｉＰＳＣは、ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂのような２つのＨＬＡ対立遺伝子でホモ接合であり得る。このように、スーパードナーから生成されたｉＰＳＣは、多数の潜在的なレシピエントに「適合する」可能性のあるＲＰＥ細胞を産生するために、本明細書に開示される方法において使用され得る。
【００８５】
２．エピソームベクター
特定の局面において、リプログラミング因子は、１つ以上の外因性エピソーム性遺伝子エレメントに含まれる発現カセットから発現される（参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１０／０００３７５７号参照）。したがって、ｉＰＳＣは、レトロウイルスまたはレンチウイルスのベクターエレメントなどの外因性遺伝子エレメントを本質的に含まなくてもよい。これらのｉＰＳＣは、外来性のベクターまたはウイルス要素を本質的に含まないｉＰＳＣを作製するためにエピソーム的に複製することができるベクターである染色体外複製ベクター（すなわち、エピソームベクター）の使用によって調製される（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５４６，１４０号；ユーら、２００９）。アデノウイルス、シミアン空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）またはウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）、または出芽酵母ＡＲＳ（自律複製配列）含有プラスミドのような多くのＤＮＡウイルスは、哺乳動物細胞では染色体外的にまたはエピソーム的に複製する。これらのエピソームプラスミドは、ベクターの組み込みに関連するこれらの欠点を本質的に含まない（ボードら、２００１）。例えば、既に定義したように、リンパ球萎縮性側索ヘルペスウイルスまたはＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ）は、染色体外で複製し、リプログラミング遺伝子を体細胞に送達するのを助ける場合がある。有用なＥＢＶエレメントには、ＯｒｉＰおよびＥＢＮＡ−１、またはそれらの変異体もしくは機能的均等物がある。エピソームベクターのさらなる利点は、外因性要素が細胞に導入された後に時間とともに失われ、これらの要素を本質的に含まない自己持続性ｉＰＳＣに至ることである。
【００８６】
他の染色体外ベクターには、他のリンパ増殖性ヘルペスウイルスを基礎とするベクターが含まれる。リンパ増殖性ヘルペスウイルスは、リンパ芽球（例えば、ヒトＢリンパ芽球）において複製し、その自然のライフサイクルの一貫でプラスミドとなるヘルペスウイルスである。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、「リンパ増殖性（ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ）」ヘルペスウイルスではない。例示的なリンパ栄養性ヘルペスウイルスには、ＥＢＶ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、ヘルペスウィルスサイミリ（ＨＳ）およびマレック病ウィルス（ＭＤＶ）が含まれるが、これらには限定されない。酵母ＡＲＳ、アデノウイルス、ＳＶ４０、またはＢＰＶのような、他の、エピソームに基づくベクターの供給源も考えられる。
【００８７】
Ｃ．体細胞核移植
多能性幹細胞は、体細胞核移植法によって調製することができる。体細胞核移植は、紡錘体を含まない卵母細胞へのドナー核の移動を伴う。一方法では、アカゲザルの皮膚線維芽細胞由来のドナー線維芽細胞核を、電気融合によって紡錘体を含まない成熟中期ＩＩ型アカゲザル眼細胞の細胞質に導入する（ビルンら、２００７）。融合した卵母細胞をイオノマイシンに曝露することにより活性化し、次いで胚盤胞期までインキュベートする。その後、選択された胚盤胞の内部細胞塊を培養して、胚性幹細胞株を産生する。胚性幹細胞株は正常なＥＳ細胞の形態を示し、様々なＥＳ細胞マーカーを発現し、インビトロでもインビボでも、複数の細胞型に分化する。
【００８８】
ＩＩＩ．網膜色素上皮細胞
ＲＰＥ細胞は、本明細書中に開示される方法において産生される。光を直接感じる網膜の細胞は光受容細胞である。光受容体は、網膜の外側部分の感光性ニューロンであり、桿体細胞また錐体細胞のいずれかであり得る。光受容体細胞は、光伝達の過程においてレンズによって集束された入射光エネルギーを電気信号に変換し、その電気信号が視神経を介して脳に送られる。脊椎動物には、錐体細胞および桿体細胞を含む２種類の視細胞がある。錐体細胞は、細かいディテール、中央とカラーの視覚を検出するように適応され、明るい光条件でうまく機能する。桿体細胞は、周辺視野および暗所視を担う。錐体細胞および桿体細胞からの神経信号は、網膜の他のニューロンによる処理を受ける。
【００８９】
網膜色素上皮は、血流と網膜との間の障壁として機能し、視覚機能の維持において光受容体と密接に相互作用している。網膜色素上皮は、網膜に到達する光エネルギーを吸収するメラニンの顆粒が密集している六角形の細胞の単一層からなる。この特殊なＲＰＥ細胞の主な機能には、血液から光受容体へのグルコース、レチノール、脂肪酸などの栄養素の輸送；水、代謝産物、およびイオンの網膜下腔から血液への輸送；光の吸収および光酸化に対する保護；オール−トランス−レチノールの１１−シス−レチナールへの再異性化；光受容細胞膜の食作用；および網膜の構造的完全性のために必須な因子の分泌が含まれる。
【００９０】
網膜色素上皮は、細胞性レチナールアルデヒド結合タンパク質（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｔｉｎａｌｄｅｈｙｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＲＡＬＢＰ）、ＲＰＥ６５、ベスト卵黄様黄斑ジストロフィー遺伝子（ＶＭＤ２）、および色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）などのマーカーを発現する。網膜色素上皮の機能不全は、網膜色素上皮剥離、形成異常、萎縮、網膜症、色素性網膜炎、黄斑ジストロフィー、または変性などの多くの視覚の変化条件と関連している。
【００９１】
網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞は、色素沈着、上皮の形態および頂端−基底極性に基づいて特徴づけることができる。分化したＲＰＥ細胞は、それらの石畳状の形態や色素の初期の外観によって視覚的に認識することができる。さらに、分化したＲＰＥ細胞は、単層全体にわたる経上皮抵抗性／ＴＥＲおよびトランス上皮電位／ＴＥＰを有し（ＴＥＲ＞１００オーム／ｃｍ2；ＴＥＰ＞２ｍＶ）、頂端側から基底側に液体およびＣＯ2を輸送し、サイトカインの極性分泌を制御する。
【００９２】
ＲＰＥ細胞は、免疫細胞化学、ウェスタンブロット分析、フローサイトメトリー、および酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの方法論の使用によって検出されるマーカーとして機能し得るいくつかのタンパク質を発現する。例えば、ＲＰＥ特異的マーカーには、細胞性レチナールアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）、微小眼症関連転写因子（ＭＩＴＦ）、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＹＲＰ−１）、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）、プレメラノソームタンパク質（ＰＭＥＬ１７）、ベストロフィン１（ＢＥＳＴ１）、およびｃ−ｍｅｒ癌原遺伝子チロシンキナーゼ（ＭＥＲＴＫ）が含まれ得る。ＲＰＥ細胞は、胚性幹細胞マーカーＯｃｔ−４、ｎａｎｏｇまたはＲｅｘ−２を（検出可能なレベルで）発現しない。具体的には、これらの遺伝子の発現は、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価した場合、ＥＳ細胞またはｉＰＳＣ細胞よりもＲＰＥ細胞においては約１００分の１から１０００分の１と低い。
【００９３】
ＲＰＥ細胞マーカーは、例えば、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット分析、または公的に入手可能な配列データ（ジェンバンク（登録商標））を用いる標準的な増幅方法において用いられる配列特異的プライマーを用いるドットブロットハイブリダイゼーション分析によって、ｍＲＮＡレベルで検出することができる。タンパク質またはｍＲＮＡレベルで検出された組織特異的マーカーの発現レベルが少なくともまたは約２、３、４、５、６、７、８または９倍である場合に、そのマーカーに関して陽性とみなされる。より具体的には、未分化多能性幹細胞または他の無関係な細胞型などの対照細胞のものよりも組織特異的マーカーの発現レベルが１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍以上高い場合に、そのマーカーに関して陽性とみなされる。
【００９４】
ＲＰＥ細胞の機能不全、傷害および喪失は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、ベスト病を含む遺伝性黄斑変性症および色素性網膜炎などの、多くの眼科疾患および障害の原因である。このような疾患を治療する方法の１つとして、ＲＰＥ細胞をそのような治療を必要とする人々の網膜に移植することが考えられる。そのような移植によるＲＰＥ細胞の補充によって、疾患の進行を遅延もしくは停止させ、または網膜の劣化を反転させ、網膜機能の改善およびそのような状態に起因する失明を防ぐことができると推測される。しかしながら、ヒトドナーおよび胚からＲＰＥ細胞を直接得ることは困難である。
【００９５】
Ａ．ＰＳＣ胚様体からのＲＰＥ細胞の誘導
よく知られているリプログラミング因子を用いてリプログラミングされたｉＰＳＣは、ＲＰＥ細胞を含む神経系統の眼細胞を生じさせる可能性をもつ（ヒラミら、２００９）。その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第２０１４／１２１０７７号では、ｉＰＳＣから産生された胚様体（ＥＢ）を浮遊培養系でＷｎｔおよびＮｏｄａｌアンタゴニストで処理して、網膜前駆細胞のマーカーの発現を誘導する方法が開示されている。この公報では、ｉＰＳＣのＥＢをＲＰＥ細胞が濃縮された培養物に分化させるプロセスを通じて、ｉＰＳＣからＲＰＥ細胞を誘導する方法が開示されている。例えば、ｒｈｏ関連コイルドコイルキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を添加し、２つのＷＮＴ経路阻害剤およびＮｏｄａｌ経路阻害剤を含む第１の培地で培養することで、ｉＰＳＣから胚様体（ＥＢ）を産生する。さらにこのＥＢを、マトリゲル（商標）でコーティングした組織培養系において、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含まないが、Ｎｏｄａｌ経路阻害剤、約２０ｎｇ〜約９０ｎｇのＮｏｇｇｉｎ、約１〜約５％のノックアウト血清代替品を含む第２の培地中で分化しているＲＰＥ細胞を形成させる。分化しているＲＰＥ細胞を、ＡＣＴＩＶＩＮおよびＷＮＴ３ａを含む第３の培地で培養する。次いで、ＲＰＥ細胞を約５％の胎児血清、基準ＷＮＴ阻害剤、非基準ＷＮＴ阻害剤、およびソニックヘッジホッグ（Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）およびＦＧＦ経路の阻害剤を含むＲＰＥ培地で培養してヒトＲＰＥ細胞を産生させる。
【００９６】
分化した細胞を産生するためにＥＢを使用することにはいくつかの欠点がある。例えば、ＥＢの生産は、効率が変化するため、一貫性がなく、再現性のないプロセスであることが挙げられる。ｉＰＳＣまたはＥＳ細胞から産生されるＥＢのサイズおよび形状は均質ではなく、ＥＢＳの産生には律速遠心分離処理が伴われる。本開示では、ＥＢを使用せずに、臨床、研究または治療用途に必要とされるｉＰＳＣまたはＥＳ由来細胞の大規模生産を可能にする方法を提供する。
【００９７】
Ｂ．実質的に単一なＰＳＣ細胞からのＲＰＥ細胞の誘導
いくつかの態様では、ヒトｉＰＳＣのような多能性幹細胞（ＰＳＣ）の本質的に単一の細胞懸濁液からＲＰＥ細胞を産生するための方法が提供される。いくつかの態様において、ＰＳＣは、いかなる細胞凝集をも防止するために、コンフルエントに達しない程度に培養される。特定の局面において、ＰＳＣは、例えばトリプシン（ＴＲＹＰＳＩＮ）（商標）またはトライプル（ＴＲＹＰＬＥ）（商標）のような細胞解離酵素とインキュベーションすることで解離される。ＰＳＣはまた、ピペット操作によって本質的に単一の細胞懸濁液に解離させることができる。さらに、単個細胞への解離後に、細胞を培養容器に付着させずに、ＰＳＣの生存率を上げるために、ブレビスタチン（例えば、約２．５μＭ）を培地に添加することができる。ブレビスタチンの代わりにＲＯＣＫ阻害剤を使用して、単個細胞に解離した後のＰＳＣ生存率を向上させることができる。
【００９８】
ＲＰＥ細胞を単一のＰＳＣ細胞から効率的に分化させるには、入力密度を正確に測定しておくことで、ＲＰＥの分化効率を高めることができる。したがって、一般的に、ＰＳＣの単個細胞懸濁液を播種する前に計数する。例えば、ＰＳＣの単個細胞懸濁液は、血球計またはビセル（ＶＩＣＥＬＬ）（登録商標）またはＴＣ２０のような自動細胞カウンターによって計数される。細胞は、約１０，０００〜約５００，０００細胞／ｍＬ、約５０，０００〜約２００，０００細胞／ｍＬ、または約７５，０００〜約１５０，０００細胞／ｍＬの細胞密度に希釈することができる。非限定的な例では、ＰＳＣの単個細胞懸濁液を、エッセンシャル８（Ｅ８（商標））培地などの完全に定義された培地を用い、約１００，０００細胞／ｍＬの密度に希釈する。
【００９９】
濃度が分かっている、ＰＳＣの単個細胞懸濁液が得られれば、通常、細胞を、フラスコ、６ウェル、２４ウェル、または９６ウェルプレートなどの組織培養プレートなどの適切な培養容器に播種する。細胞を培養するために使用される培養容器としては、その中で幹細胞を培養することができるものであれば、フラスコ、組織培養用フラスコ、シャーレ、組織培養用皿、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレイ、セルスタック（ＣＥＬＬＳＴＡＣＫ、登録商標）チャンバー、培養バッグ、ローラーボトルなどが挙げられる。細胞は、培養の必要に応じて、少なくとも約０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０ｍｌ、１００ｍｌ、１５０ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌの４００ｍｌ、４５０ｍｌ、５００ｍｌ、５５０ｍｌ、６００ｍｌ、８００ｍｌ、１０００ｍｌ、１５００ｍｌ、またはそこから導出可能な任意の範囲の容量で培養することができる。特定の態様では、培養容器は、細胞が増殖することができるように生物学的に活性な環境を支持する任意のエクスビボのデバイスまたはシステムを意味するバイオリアクターであってもよい。バイオリアクターは、少なくともまたは約２、４、５、６、８、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００リットル、１、２、４、６、８、１０、１５立方メートル、またはそこから導出可能な任意の範囲の容量を有することができる。
【０１００】
特定の局面において、ｉＰＳＣなどのＰＳＣは、効率的な分化に適切な細胞密度で播種される。細胞は一般的に、約５，０００〜約４０，０００細胞／ｃｍ2のような約１，０００〜約７５，０００細胞／ｃｍ2の細胞密度で播種される。６ウェルプレートでは、ウェルあたり約５０，０００〜約４００，０００細胞の細胞密度で細胞を播種することができる。例示的な方法では、１ウェル当たり約２００００細胞など、細胞を１ウェル当たり約１００，０００、約１５０，００、約２００，０００、約２５０，０００、約３００，０００または約３５０，０００個の細胞密度で播種する。
【０１０１】
ＰＳＣ（ｉＰＳＣなど）は、一般に、細胞生存性を維持しながら細胞接着を促進するために、１つまたは複数の細胞接着タンパク質によるコーティングが施された培養プレート上で培養される。例えば、好ましい細胞接着性タンパク質としては、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲンおよび／またはフィブロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質が挙げられ、これらは、多能性細胞を増殖させるための固体支持層を提供する手段として培養表面をコーティングするために使用され得る。「細胞外マトリックス」という用語は当該技術分野において認識されている用語であり、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン、トロンボスポンジン、エラスチン、ゼラチン、コラーゲン、フィブリリン、メロシン、アンコリン、コンドロネクチン、結合タンパク質、骨シアロタンパク質、オステオカルシン、オステオポンチン、エピネクチン、ヒアルロネクチン、ウンデュリン、エピリグリン、およびカリンのうちの１種以上を含む。例示的な方法においてＰＳＣは、ビトロネクチンまたはフィブロネクチンでコーティングされた培養プレート上で増殖される。いくつかの態様では、細胞接着性タンパク質はヒトタンパク質である。
【０１０２】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質は、天然由来のものであってもよく、ヒトもしくは動物の組織から精製されたものであってもよく、または、ＥＣＭタンパク質は、遺伝子操作された組み換えタンパク質であってももしくは天然の系で合成された物であってもよい。ＥＣＭタンパク質は、全タンパク質であってもよく、天然または改変されたペプチド断片の形態であってもよい。細胞培養のためのマトリックスとして使用できるＥＣＭタンパク質の例としては、ラミニン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチンおよびビトロネクチンが挙げられる。いくつかの態様において、マトリックス組成物は、合成されたフィブロネクチンまたは組換えフィブロネクチンのペプチドフラグメントを含む。いくつかの態様では、マトリックス組成物は異種成分を含まない。例えば、ヒト細胞を培養するための異種成分不含有マトリックスでは、ヒト由来のマトリックス成分を使用することができ、ヒト以外の動物成分は除外することができる。
【０１０３】
いくつかの局面において、マトリックス組成物中の全タンパク質濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬであり得る。いくつかの好ましい態様では、マトリックス組成物中の全タンパク質濃度は、約１μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬである。より好ましい態様では、マトリックス組成物中の総タンパク質濃度は、約５μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬである。
【０１０４】
ＲＰＥ細胞またはＰＳＣなどの細胞は、特定の細胞集団それぞれの増殖を支持するために必要な栄養素とともに培養することができる。細胞は一般的に、炭素源、窒素源およびｐＨを維持するための緩衝液を含む増殖培地中で培養される。培地はまた、脂肪酸または脂質、アミノ酸（非必須アミノ酸など）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化物質、ピルビン酸、緩衝剤および無機塩を含み得る。例示的な増殖培地は、幹細胞の増殖率を高める、非必須アミノ酸およびビタミンなどの様々な栄養素を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはエッセンシャル（ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ）８（Ｅ８）（登録商標）培地などの最小必須培地を含む。最小必須培地の例には、最小必須培地（ＭＥＭ）アルファ培地、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０培地、１９９培地およびＦ１２培地が含まれるが、これらには限定されない。さらに、最小必須培地には、ウマ、子牛またはウシ胎仔血清などの添加物を補充することができる。あるいは、培地は血清を含まないものであってもよい。他の例において、増殖培地は、培養中の幹細胞のような未分化細胞を増殖および維持するために最適化された無血清製剤である「ノックアウト血清代替物」を含み得る。ノックアウト（ＫＮＯＣＫＯＵＴ）（登録商標）血清代替品は、例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００２／００７６７４７号に開示されている。ＰＳＣを、完全に定義されたフィーダーフリーの培地中で培養することが好ましい。
【０１０５】
したがって一般的には、単個細胞ＰＳＣを完全に定義された培地に播種し、培養する。特定の局面では、播種してから約１８〜２４時間後に培地を吸引し、新鮮な培地、例えばＥ８（商標）培地を培養物に添加する。特定の局面では、単個細胞ＰＳＣを、プレーティング後約１、２または３日間、完全に定義された培地中で培養する。単個細胞ＰＳＣを、分化プロセスを進める前に完全に定義された培地中で約２日間培養することが好ましい。
【０１０６】
いくつかの態様では、培地に、任意の血清代替品を含めてもよいし、含めなくてもよい。血清代替品としては、アルブミン（脂質リッチアルブミン、組換えアルブミン、植物デンプン、デキストランおよびタンパク質加水分解物などのアルブミン代替物）、トランスフェリン（または他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール、またはそれらの均等物が挙げられる。血清代替品は、例えば、国際公開第９８／３０６７９号に開示されている方法によって調製することができる。あるいは、より簡単に、市販されている任意の材料を使用することもできる。市販されている材料には、ノックアウト（ＫＮＯＣＫＯＵＴ）（登録商標）血清置換（ＫＳＲ）、化学的に定義された脂質濃縮物（ギブコ）およびグルタマックス（ＧＬＵＴＡＭＡＸ）（登録商標）（ギブコ）が含まれる。
【０１０７】
他の培養条件も適宜、決定することができる。例えば、培養温度は約３０〜４０℃、例えば、少なくともまたは約３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９℃とすることができるが、特にこれらに限定されない。一態様では、細胞を３７℃で培養する。ＣＯ2濃度は、約１〜１０％、例えば約２〜５％、またはその中で導出可能な任意の範囲とすることができる。酸素分圧は、少なくとも、最大、もしくはおよそ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０％またはそれに由来する任意の範囲にすることができる。
【０１０８】
ａ．分化培地
網膜誘導培地
単個細胞ＰＳＣが培養プレートに付着した後、細胞を網膜誘導培地で培養して、網膜系統細胞への分化プロセスを開始させることが好ましい。網膜誘導培地（ＲＩＭ）は、ＷＮＴ経路阻害剤を含み、ＰＳＣの網膜系統細胞への分化をもたらし得る。ＲＩＭは、ＴＧＦβ経路阻害剤およびＢＭＰ経路阻害剤をさらに含む。１つの典型的なＲＩＭ培地の組成を表３に示す。
【０１０９】
ＲＩＭは、約１：１の比でＤＭＥＭおよびＦ１２を含む場合がある。例示的な方法では、ＲＩＭは、ＷＮＴ経路阻害剤（例えばＣＫＩ−７）、ＢＭＰ経路阻害剤（例えばＬＤＮ１９３１８９）およびＴＧＦβ経路阻害剤（例えばＳＢ４３１５４２）を含む。例えば、ＲＩＭは、約５ｎＭ〜約５０ｎＭ（例えば約１０ｎＭ）のＬＤＮ１９３１８９、約０．１μＭ〜約５μＭ（例えば約０．５μＭ）のＣＫＩ−７、および約０．５μＭ〜約１０μＭ（例えば約１μＭ）のＳＢ４３１５４２を含む。さらにＲＩＭは、約１％〜約５％のノックアウト血清代替品、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ピルビン酸ナトリウム、Ｎ−２サプリメント、Ｂ−２７サプリメント、アスコルビン酸、およびインスリン成長因子１（ＩＧＦ１）を含む場合がある。好ましくは、ＩＧＦ１は動物を含まないＩＧＦ１（ＡＦ−ＩＧＦ１）であり、ＲＩＭに約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬ（例えば約１ｎｇ／ｍＬ）の濃度で含まれる。培地は毎日吸引され、新鮮なＲＩＭに交換される。細胞は、網膜系統細胞を産生するために、ＲＩＭ中で約１〜約５日間、例えば約１、２、３、４または５日間、例えば約２日間培養される。
【０１１０】
網膜分化培地
次いで、網膜系統細胞を、さらなる分化のために網膜分化培地（ＲＤＭ）中で培養することができる。ＲＤＭは、ＷＮＴ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＴＧＦβ経路阻害剤およびＭＥＫ阻害剤を含む。一態様では、ＲＤＭは、ＷＮＴ経路阻害剤（例えばＣＫＩ−７）、ＢＭＰ経路阻害剤（例えばＬＤＮ１９３１８９）、ＴＧＦβ経路阻害剤（例えばＳＢ４３１５４２）、およびＭＥＫ阻害剤（例えばＰＤ０３２５９０１）を含む。あるいは、ＲＤＭは、ＷＮＴ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＴＧＦβ経路阻害剤およびｂＦＧＦ阻害剤を含むことができる。一般に、Ｗｎｔ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤およびＴＧＦβ経路阻害剤の濃度は、ＲＩＭと比較してＲＤＭにおいては約９〜約１１倍（例えば約１０倍）高い。例示的な方法において、ＲＤＭは、約５０ｎＭ〜約２００ｎＭ（例えば約１００ｎＭ）のＬＤＮ１９３１８９、約１μＭ〜約１０μＭ（例えば約５μＭ）のＣＫＩ−７、約１μＭ〜約５０μＭ（例えば約１０μＭ）のＳＢ４３１５４２、および約０．１μＭ〜約１０μＭ（例えば約１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭまたは９μＭ）のＰＤ０３２５９０１を含む。例示的なＲＤＭ培地の１つを表３に示す。
【０１１１】
一般的に、ＲＤＭは、約１：１の比のＤＭＥＭとＦ１２、ノックアウト血清代替品（約１％〜約５％、例えば約１．５％）、ＭＥＭ  ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、Ｎ−２サプリメント、Ｂ−２７サプリメント、アスコルビン酸およびＩＧＦ１（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬ、例えば約１０ｎｇ／ｍＬ）を含む。特定の方法では、毎日、培地を吸引した後細胞に新鮮なＲＤＭを与えるということを培養前日から行う。一般的に、細胞をＲＤＭ中で約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６日間（例えば約７日間）培養し、分化した網膜細胞を誘導する。
【０１１２】
網膜培地
次に、分化した網膜細胞を網膜培地（ＲＭ）中で培養することによりさらに分化させることができる。網膜培地はアクチビンＡを含み、さらにニコチンアミドを含む場合がある。ＲＭは、アクチビンＡ約５０〜約２００ｎｇ／ｍＬ（例えば約１００ｎｇ／ｍＬ）、ニコチンアミド約１ｍＭ〜約５０ｍＭ（例えば約１０ｍＭ）を含むこと場合がある。あるいは、ＲＭは、ＧＤＦ１などのその他のＴＧＦ−β活性化因子、および／またはＷＡＹ−３１６６０６、ＩＱ１、ＱＳ１１、ＳＢ−２１６７６３、ＢＩＯ（６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）または２−アミノ−４−［３，４−（メチレンジオキシ）ベンジル−アミノ］−６−（３−メトキシフェニル）ピリミジンのようなＷＮＴ経路活性化因子を含む場合がある。あるいは、ＲＭは、ＷＮＴ３ａをさらに含むこと場合がある。例示的なＲＭ培地の１つを表３に示す。
【０１１３】
ＲＭは、約１：１の比のＤＭＥＭとＦ１２、約１％〜約５％（例えば約１．５％）のノックアウト血清代替品、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ピルビン酸ナトリウム、Ｎ−２サプリメント、Ｂ−２７サプリメント、およびアスコルビン酸を含む場合がある。培地は、室温ＲＭで毎日交換することができる。細胞は一般に、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７日間、例えば約１０日間、ＲＭ中で培養されて分化ＲＰＥ細胞を誘導する。
【０１１４】
ＲＰＥ成熟培地
ＲＰＥ細胞のさらなる分化のために、細胞を、ＲＰＥ成熟培地（ＲＰＥ−ＭＭ）中で培養することが好ましい。例示的なＲＰＥ−ＭＭ培地を表３に示す。ＲＰＥ−成熟培地は、約１００μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬ（例えば約２５０μｇ／ｍＬ）のタウリン、約１０μｇ／Ｌ〜約３０μｇ／Ｌ（例えば約２０μｇ／Ｌ）のヒドロコルチゾンおよび約０．００１μｇ／Ｌ〜約０．１μｇ／Ｌ（例えば約０．０１３μｇ／Ｌ）のトリヨードチロニンを含む。さらに、ＲＰＥ−ＭＭは、ＭＥＭアルファ、Ｎ−２サプリメント、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、およびピルビン酸ナトリウム、およびウシ胎仔血清（約０．５％〜約１０％、例えば約１％〜約５％）を含む場合がある。培地は、室温のＲＰＥ−ＭＭで１日おきに交換してもよい。一般的に細胞を、ＲＰＥ−ＭＭ中で約５〜約１０日間、例えば約５日間培養する。その後、細胞解離酵素などで細胞を解離させ、再播種し、さらに培養期間を延長して、約５〜約３０日間（例えば約１５〜２０日間）培養し、ＲＰＥ細胞にさらに分化させることができる。さらなる態様では、ＲＰＥ−ＭＭはＷＮＴ経路阻害剤を含まない。ＲＰＥ細胞は、この段階で凍結保存することができる。
【０１１５】
ｂ．ＲＰＥ細胞の成熟
次いで、ＲＰＥ細胞をＲＰＥ−ＭＭ中で継続して培養し、細胞を成熟させることができる。いくつかの態様では、ＲＰＥ細胞は、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、または１０ｃｍプレートなどのウェルで増殖させる。ＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ培地中で約４〜約１０週間、例えば約６〜８週間、例えば６、７または８週間維持することができる。ＲＰＥ細胞の継続的な成熟のための例示的な方法では、トライプル（ＴＲＹＰＬＥ）（登録商標）のような細胞解離酵素で細胞を解離させ、スナップウェル（ＳＮＡＰＷＥＬＬ）（商標）デザインなどの特殊で分解可能な足場アセンブリに再播種し、ＰＤ０３２５９０１のようなＭＥＫ阻害剤を含むＲＰＥ−ＭＭ中で約１〜２週間、培養することができる。あるいは、ＲＰＥ−ＭＭは、ＭＥＫ阻害剤の代わりにｂＦＧＦ阻害剤を含む場合がある。分解性足場上でＲＰＥ細胞を培養するための方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１４／１２１０７７に教示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。簡潔に述べると、この方法の主な構成用品は、コーニング（ＣＯＲＮＩＮＧ）（登録商標）コスター（ＣＯＳＴＡＲ）（登録商標）スナップウェル（商標）プレート、バイオイナートＯリング、および生分解性足場である。スナップウェル（商標）プレートは、生分解性足場のための構造およびプラットフォームを提供する。先端側および基底側を形成する微孔性膜は、足場の支持体を提供するだけでなく、細胞の分極層をそれぞれの側面から単離するために理想的である。膜を引き剥がすスナップウェル（登録商標）インサートの能力により、インサートの支持リングを足場用アンカーとして使用することが可能になる。得られた、分化していて、極性があり、コンフルエントな単層の機能性ＲＰＥ細胞は、この段階で（例えば、異種成分不含有ＣＳ１０培地を使って）凍結保存することができる。
【０１１６】
いくつかの態様において、成熟ＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ成熟を促進する追加の化学物質または小分子と一緒にＲＰＥ−ＭＭ中で連続的に培養することによって、インタクトな（完全な）ＲＰＥ組織として機能する機能性ＲＰＥ細胞の単層に、さらに発達させることができる。例えば、これらの小分子としては、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）またはアフィディコリンなどの一次繊毛誘導物質がある。ＰＧＥ２は、約２５μＭ〜約２５０μＭ、例えば約５０μＭ〜約１００μＭの濃度で培地に添加することができる。あるいは、ＲＰＥ−ＭＭは、カノニカルＷＮＴ経路阻害剤を含むことができる。例示的なカノニカルＷＮＴ経路阻害剤は、Ｎ−（６−メチル−２−ベンゾチアゾリル）−２−［（３，４，６，７−テトラヒドロ−４−オキソ−３−フェニルチエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）チオ］−アセトアミド（ＩＷＰ２）または４−（１，３，３ａ、４，７，７ａ−ヘキサヒドロ−１，３−ジオキソ−４，７−メタノ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）−Ｎ−８−キノリニル−ベンズアミド（エンド−ＩＷＲ１）である。細胞は、成熟し機能的なＲＰＥ細胞単層を得るために、追加の期間、例えばさらに約１週間〜約５週間、例えば約２〜４週間程度、この培地で培養することができる。従って、ここで開示している方法は、多能性細胞の単個細胞懸濁液から大規模で一貫して複製することができる、臨床用途のための成熟ＲＰＥ細胞を提供するものである。
【０１１７】
ｃ．ＲＰＥ細胞の凍結保存
本明細書に開示された方法によって生成された網膜色素上皮細胞は、凍結保存することができる（例えば、参照することにより本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第２０１２／１４９４８４号Ａ２参照）。細胞は基質の有無にかかわらず凍結保存することができる。いくつかの態様では、保存温度は、約−５０℃〜約−６０℃、約−６０℃〜約−７０℃、約−７０℃〜約−８０℃、約−８０℃約−９０℃、約−９０℃〜約−１００℃、およびそれらの重複範囲を含む。いくつかの態様において、低温は、凍結保存細胞の保存（例えば、維持）のために使用される。いくつかの態様では、液体窒素（または他の同様の液体冷却剤）を用いて細胞を保存する。さらなる態様では、細胞を約６時間より長く保存する。さらなる態様では、細胞は約７２時間保存される。いくつかの態様において、細胞は、４８時間〜約１週間保存される。さらに他の態様では、細胞は、約１、２、３、４、５、６、７または８週間保存される。さらなる態様において、細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヶ月間保存される。細胞は、より長い時間保存することもできる。細胞は、別々にまたは本明細書中に開示される任意の基質のような基質上に凍結保存することができる。
【０１１８】
いくつかの態様では、追加して低温保護剤を使用することができる。例えば、細胞は、ＤＭ８０、ヒトまたはウシ血清アルブミンなどの血清アルブミンなどの１つまたは複数の凍結保護物質を含む凍結保存溶液中で凍結保存することができる。特定の態様では、溶液は、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％％、または約１０％ＤＭＳＯを含む。他の態様では、溶液は、約１％〜約３％、約２％〜約４％、約３％〜約５％、約４％〜約６％、約５％〜約７％、約６％〜〜約８％、約７％〜約９％、または約８％〜約１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはアルブミンを含む。特定の態様では、溶液は２．５％ＤＭＳＯを含む。別の特定の態様では、溶液は１０％ＤＭＳＯを含む。
【０１１９】
細胞は、例えば凍結保存中に約１℃／分の速度で冷却することができる。いくつかの態様では、凍結保存温度は約−８０℃〜約−１８０℃、または約−１２５℃〜約−１４０℃である。いくつかの態様では、細胞を１℃／分の速度で４℃まで冷却してから凍結させる。凍結保存された細胞は、液体窒素の蒸気相に移して解凍し、使用することができる。いくつかの態様では、例えば、細胞が約−８０℃に達したら、それらを液体窒素貯蔵領域に移す。凍結保存は、速度制御された冷凍庫を使用して行うこともできる。凍結保存された細胞は、例えば、約２５℃〜約４０℃の温度で、典型的には約３７℃の温度で解凍され得る。
【０１２０】
ｄ．阻害剤
ＷＮＴ経路阻害剤
ＷＮＴは、細胞間相互作用を調節する高度に保存された分泌シグナル伝達分子のファミリーであり、ショウジョウバエセグメントの極性遺伝子であるウィングレス（ｗｉｎｇｌｅｓｓ）に関連している。ヒトのＷＮＴファミリーの遺伝子は、３８〜４３ｋＤａのシステインに富んだ糖タンパク質をコードする。ＷＮＴタンパク質は、疎水性シグナル配列、保存されたアスパラギン結合オリゴ糖コンセンサス配列（例えば、Ｓｈｉｍｉｚｕら、細胞の成長と分化（Ｃｅｌｌ    Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ）８：１３４９−１３５８（１９９７）を参照のこと）および２２個の保存されたシステイン残基を有する。ＷＮＴタンパク質は、細胞質ベータカテニンの安定化を促進する能力のために、転写活性化因子として作用し、アポトーシスを阻害することができる。特定のＷＮＴタンパク質の過剰発現は、ある種の癌に関連することが示されている。
【０１２１】
本明細書においてＷＮＴ阻害剤とは、基本的に、ＷＮＴ阻害剤を意味する。したがって、ＷＮＴ阻害剤は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ９Ａ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１１およびＷｎｔ１６を含むＷＮＴファミリータンパク質メンバーの任意の阻害剤のことを言う。本方法の特定の態様では、分化培地中のＷＮＴ阻害剤に関する。当分野で知られている好適なＷＮＴ阻害剤の例としては、Ｎ−（２−アミノエチル）−５−クロロイソキノリン−８−スルホンアミド二塩酸塩（ＣＫＩ−７）、Ｎ−（６−メチル−２−ベンゾチアゾリル）−２−［（３，４，６，７−テトラヒドロ−４−オキソ−３−フェニルチエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）チオ］−アセトアミド（ＩＷＰ２）、Ｎ−（６−メチル−２−ベンゾチアゾリル）−２−［（３，４，６，７−テトラヒドロ−３−（２−メトキシフェニル）−４−オキソチエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）チオ］−アセトアミド（ＩＷＰ４）、２−フェノキシ安息香酸−［（５−メチル−２−フラニル）メチレン］ヒドラジド（ＰＮＵ７４６５４）、２，４−ジアミノ−キナゾリン、ケルセチン、３，５，７，８−テトラヒドロ−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４Ｈ−チオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４−オン（ＸＡＶ９３９），２，５−ジクロロ−Ｎ−（２−メチル−４−ニトロフェニル）ベンゼンスルホンアミド（ＦＨ５３５）、Ｎ−［４−［２−エチル−４−（３−メチルフェニル）−５−チアゾリル］−２−ピリジニル］ベンズアミド（ＴＡＫ７１５）、ジクコフ（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ）関連タンパク質１（ＤＫＫ１）、および分泌フィズルド（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）関連タンパク質（ＳＦＲＰ１）が挙げられる。さらに、ＷＮＴの阻害剤は、ＷＮＴに対する抗体、ＷＮＴのドミナントネガティブ変異体、およびＷＮＴ  ｓｉＲＮＡ、ならびにＷＮＴの発現を抑制するアンチセンス核酸を含み得る。ＲＮＡ媒介性干渉（ＲＮＡｉ）を用いてＷＮＴを阻害することもできる。
【０１２２】
ＢＭＰ経路阻害剤
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）スーパーファミリーに属する多機能性成長因子である。ＢＭＰは、身体全体の構造を調整するのに重要な一群の形態形成シグナルを構成すると考えられている。ＢＭＰシグナルの重要な生理機能は、病理過程における調節不全なＢＭＰシグナル伝達に関する多数の役割という形で顕れる。
【０１２３】
ＢＭＰ経路阻害剤は、一般に、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤全般のことを言うか、またはＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０もしくはＢＭＰ１５に特異的な阻害剤を含み得る。例示的なＢＭＰ阻害剤には、４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリン塩酸塩（ＬＤＮ１９３１８９）、６−［４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル］−３−（４−ピリジニル）−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン二塩酸塩（ドルソモルフィン）、４−［６−（４−（１−メチルエトキシ）フェニル］ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル］−キノリン（ＤＭＨ１）、４−［６−［４−［２−（４−モルホリニル）エトキシ］フェニル］ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル］キノリン（ＤＭＨ−２）、および５−［６−（４−メトキシフェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル］キノリン（ＭＬ３４７）が挙げられる。
【０１２４】
ＴＧＦβ経路阻害剤
トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）は、ほとんどの細胞において増殖、細胞分化および他の機能を制御する分泌タンパク質であり、免疫、癌、気管支喘息、肺線維症、心疾患、糖尿病、および多発性硬化症において機能する一種のサイトカインである。ＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３と呼ばれる少なくとも３つのイソ型で存在する。ＴＧＦ−βファミリーは、インヒビン、アクチビン、抗ミュラー管ホルモン、骨形成タンパク質、デカペンタプレジックおよびＶｇ−１を含むトランスフォーミング増殖因子ベータスーパーファミリーとして知られるタンパク質のスーパーファミリーの一部である。
【０１２５】
ＴＧＦβ経路阻害剤には一般に、ＴＧＦβシグナル伝達の任意の阻害剤が含まれ得る。例えば、ＴＧＦβ経路阻害剤は、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド（ＳＢ４３１５４２）、６−［２−（１，１−ジメチルエチル）−５−（６−メチル−２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］キノキサリン（ＳＢ５２５３３４）、２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−tert−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩水和物（ＳＢ−５０５１２４）、４−（５−ベンゾール［１，３］ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−ｌＨ−イミダゾール−２−イル）−ベンズアミド水和物、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド水和物、左右決定因子（レフティ）、３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド（Ａ８３−０１）、４−［４−（２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−６−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド（Ｄ４４７６）、４−［４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２−ピリジニル］−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−ベンズアミド（ＧＷ７８８３８８）、４−［３−（２−ピリジニル））−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−キノリン（ＬＹ３６４８４７）、４−［２−フルオロ−５−［３−（６−メチル−２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−１−エタノール（Ｒ２６８７１２）または２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン（ＲｅｐＳｏｘ）がある。
【０１２６】
ＭＥＫ阻害剤
ＭＥＫ阻害剤は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ酵素ＭＥＫ１またはＭＥＫ２を阻害する化学物質または薬物であり、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路に影響を及ぼすために使用することができる。例えば、ＭＥＫ阻害剤としては、Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）、Ｎ−［３−［３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨードアニリノ）−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１−イル］フェニル］アセトアミド（ＧＳＫ１１２０２１２）、６−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−７−フルオロ−Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）−３−メチルベンズイミダゾール−５−カルボキサミド（ＭＥＫ１６２）、Ｎ−［３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨードアニリノ）−６−メトキシフェニル］−１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）シクロプロパン−１−スルホンアミド（ＲＤＥＡ１１９）および６−（４−ブロモ−２−クロロアニリノ）−７−フルオロ−Ｎ−（−２−ヒドロキシエトキシ）−３−メチルベンズイミダゾール−５−カルボキサミド（ＡＺＤ６２４４）が挙げられる。
【０１２７】
ｂＦＧＦ阻害剤
塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ２またはＦＧＦ−βとしても知られる）は線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーである。ｂＦＧＦは、基底膜および血管の内皮細胞外マトリックスに存在する。さらにｂＦＧＦは、細胞が未分化状態のままである必要があるヒトＥＳＣ培地の共通成分である。
【０１２８】
ｂＦＧＦ阻害剤は、一般に、ｂＦＧＦの阻害剤を意味する。ｂＦＧＦ阻害剤には、例えば、Ｎ−［２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ−６−（３，５−ジメトキシフェニル）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−Ｎ’−（１，１−ジメチルエチル）尿素（ＰＤ１７３０７４）、２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン（ＰＤ９８０５９）、１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−［６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］尿素（ＰＤ１６１５７０）、６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−［［４−［２−（ジエチルアミノ）エトキシ］フェニル］アミノ］−８−メチル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン二塩酸塩水和物（ＰＤ１６６２８５）、Ｎ−［２−アミノ−６−（３，５−ジメトキシフェニル）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−Ｎ’−（１，１−ジメチルエチル）−尿素（ＰＤ１６６８６６）およびＭＫ−２２０６が含まれるが、これらには限定されない。
【０１２９】
ＩＶ．網膜色素上皮細胞の使用
特定の局面では、多くの重要な研究、開発、および商業目的のために使用することができるＲＰＥまたはＲＰＥに富んだ細胞集団を産生する方法を提供する。
【０１３０】
いくつかの局面では、本明細書中に開示される方法から、少なくとも約９０％（例えば、少なくとももしくは約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％またはそこから導出される任意の範囲）のＲＰＥ細胞で構成される少なくとももしくは約１０6、１０7、１０8、５ｘ１０8、１０9、１０10（またはそこから導出される任意の範囲）の数の細胞集団が生じる。
【０１３１】
特定の局面では、本方法のための出発細胞は、少なくともまたは約１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、１０12、１０13個の細胞またはそこから導出される任意の範囲の数の細胞の使用を含み得る。出発細胞集団は、少なくともまたは約１０、１０1、１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8細胞／ｍｌの密度、またはそこから導出される任意の範囲の密度で播種され得る。
【０１３２】
本明細書に開示された方法によって産生されたＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ細胞について当技術分野で現在知られている任意の方法および用途に使用することができる。例えば、ＲＰＥ細胞上の化合物の薬理学的特性または毒物学的特性をアッセイすることを含む、化合物を評価する方法を提供することができる。ＲＰＥ細胞に対する効果について化合物を評価する方法であって、ａ）本明細書で提供されるＲＰＥ細胞を化合物と接触させること；およびｂ）ＲＰＥ細胞に対する化合物の効果をアッセイすることを含む方法も提供され得る。
【０１３３】
Ａ．試験化合物のスクリーニング
ＲＰＥ細胞を商業的に利用して、そのような細胞およびその多様な後代細胞の特性に影響を及ぼす因子（溶媒、低分子薬、ペプチド、オリゴヌクレオチドなど）または環境条件（培養条件または操作など）をスクリーニングすることができる。試験化合物は例えば、化合物、低分子、ポリペプチド、成長因子、サイトカイン、または他の生物学的薬剤であり得る。
【０１３４】
一態様では、方法には、ＲＰＥ細胞を試験薬剤と接触させること、および試験薬剤が集団内のＲＰＥ細胞の活性または機能を調節するか否かを決定することが含まれる。いくつかの用途では、ＲＰＥ細胞の増殖を調節するか、またはＲＰＥ細胞の分化を変化させる薬剤を同定するためにスクリーニングアッセイが使用される。スクリーニングアッセイは、インビトロでまたはインビボで行うことができる。眼用薬剤またはＲＰＥ薬剤をスクリーニングおよび同定するための方法には、ハイスループットスクリーニングに適したものが含まれる。例えば、治療分子として使用できる可能性のある分子を同定するために、ＲＰＥ細胞を、培養皿、フラスコ、ローラーボトルまたはプレート（例えば、一枚のマルチウェルディッシュ、もしくは８、１６、３２、６４、９６、３８４および１５３６ウェルのマルチウエルプレートまたはディッシュ）上に、必要に応じて決められた位置に、配置または設置することができる。スクリーニングすることができるライブラリーには、例えば、低分子ライブラリー、ｓｉＲＮＡライブラリー、およびアデノウイルストランスフェクションベクターライブラリーが含まれる。
【０１３５】
他のスクリーニング系の用途は、網膜組織の維持または修復に対する医薬化合物の効果について試験するものに関連する。このようなスクリーニングは、化合物が細胞に対して薬理学的効果を有するように設計されているかまたは他の所で効果を有するように設計されている化合物が、この組織型の細胞に対して意図しない副作用を有する可能性があるため、実施される場合がある。
【０１３６】
Ｂ．治療および移植
他の態様ではまた、網膜変性または重大な損傷など、それを必要とする任意の状態における眼組織の維持および修復を強化するためのＲＰＥ細胞の使用を提供することができる。
【０１３７】
治療剤投与のための細胞組成物の適合性を決定するために、細胞を最初に適切な動物モデルで試験することができる。一局面では、ＲＰＥ細胞は、生存し、インビボでその表現型を維持するそれらの能力について評価される。細胞組成物は、免疫不全動物（例えば、ヌードマウス、または化学的または放射線照射によって免疫不全にされた動物）に投与される。組織をある期間の成長させた後に回収し、多能性幹細胞由来細胞が依然として存在するかどうかについて評価する。
【０１３８】
ＲＰＥ細胞組成物の適合性を試験するには、多くの動物種が利用可能である。例えば、ロイヤルカレッジオブサージオン（Ｒｏｙａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  ＳｕｒｇｅｏＮ’ｓ、ＲＣＳ）ラットは、網膜ジストロフィーのモデルとしてよく知られている（Ｌｕｎｄら、２００６）。さらに、ＲＰＥ細胞の適合性および生存率は、ＮＯＧマウスのような免疫不全動物のマトリゲルへの移植（例えば、皮下または網膜下）によって決定することができる（カネムラら、２０１４）。
【０１３９】
本明細書に記載のヒトＲＰＥ細胞、またはこれらの細胞を含む医薬組成物は、それを必要とする患者の状態を治療するための薬剤の製造に使用することができる。ＲＰＥ細胞は、予め凍結保存しておくことができる。特定の局面では、開示されたＲＰＥ細胞はｉＰＳＣ由来であり、したがって、眼疾患を有する患者に「個別化医療（ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」を提供するために使用することができる。いくつかの態様では、患者から得た体細胞を、疾患を引き起こす突然変異を修正するために遺伝子操作し、ＲＰＥに分化させ、ＲＰＥ組織を形成するように操作することができる。このＲＰＥ組織を用いて、同じ患者の内因性の変性ＲＰＥを置換することができる。あるいは、健康なドナーまたはＨＬＡホモ接合体「スーパードナー」から生成されたｉＰＳＣを使用することもできる。ＲＰＥ細胞にインビトロで、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）ベータ、および／またはレチノイン酸などの特定の因子を処理して、インビボの抗炎症および免疫抑制環境を生じさせることができる。
【０１４０】
様々な眼の状態は、本明細書に開示される方法を用いて得られたＲＰＥ細胞を導入することによって治療または予防され得る。このような状態には、網膜疾患または、一般的に、網膜機能不全または分解、網膜傷害、および／または網膜色素上皮の喪失に関連する障害が含まれる。治療できる状態には、シュタルガルト黄斑ジストロフィー、色素性網膜炎、黄斑変性症（加齢性黄斑変性症など）、緑内障および糖尿病性網膜症などの網膜の変性疾患が含まれるが、これらには限定されない。その他状態には、リーバー先天性黒内障、遺伝性または後天性の黄斑変性症、ベスト病、網膜剥離、脳回転状萎縮症、全脈絡膜萎縮、パターンジストロフィー（ｐａｔｔｅｒｎ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ＲＰＥのその他のジストロフィー、および、光線、レーザー、炎症性、感染性、放射線性、新血管性または外傷性の損傷うちのいずれか１つによって引き起こされる損傷によるＲＰＥおよび網膜損傷が挙げられる。特定の態様では、ＲＰＥ細胞を含む組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、網膜変性によって特徴付けられる状態を治療または予防するための方法を提供する。このような方法は、これらの状態のうちの１つ以上を有する対象を選択すること、およびその状態を治療する、および／または症状を改善するのに十分な治療有効量のＲＰＥ細胞を投与することを含む場合がある。ＲＰＥ細胞は様々な形態で移植することができる。例えば、ＲＰＥ細胞を、細胞懸濁液の形態で標的部位に導入することができる。あるいは、生体分解性ポリマーのようなマトリックス、細胞外マトリックスもしくは基材上に単層として接着させること、または前記を組み合わせてもよい。ＲＰＥ細胞はまた、光受容体などの他の網膜細胞と一緒に移植（同時移植）することもできる。いくつかの態様では、ＲＰＥ細胞は、治療される対象由来のｉＰＳＣから産生され、したがって、自己由来である。他の態様において、ＲＰＥ細胞は、ＭＨＣ適合ドナーから産生される。
【０１４１】
いくつかの態様において、ＲＰＥ細胞は、再生医療を受けるのに適した対象に対する自己ＲＰＥ移植片のために使用することができる。ＲＰＥ細胞は、光受容体などの他の網膜細胞と組み合わせて移植することができる。開示する方法によって産生されたＲＰＥ細胞は、当技術分野でよく知られている様々な技術によって移植することができる。例えば、ＲＰＥ移植を行う方法は、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９６２，０２７号および米国特許第６，０４５，７９１号に記載されている。一態様によれば、移植は、膵臓硝子体切除術を行い、続いて網膜下領域に小さな網膜開口部を介して、または直接注入によって細胞を送達することによって行われる。ＲＰＥ細胞は、細胞懸濁液の形態で標的部位に導入され、細胞外マトリックスのようなマトリックス上に付着され得るか、または生分解性ポリマーなどの基材上に提供され得る。ＲＰＥ細胞はまた、光受容体を有する網膜細胞のような他の細胞と共に移植（同時移植）することもできる。従って、本明細書で開示する方法によって得られたＲＰＥ細胞を含む組成物が提供される。いくつかの態様では、これらＲＰＥ細胞は、プロモーターに作動可能に連結されたチロシナーゼエンハンサーおよびマーカーをコードする核酸を含む。他の態様では、ＲＰＥ細胞は、第２のマーカーをコードする核酸に作動可能に連結された第２の構成的プロモーターも含む。
【０１４２】
本明細書に開示された方法によって製造されたＲＰＥ細胞の医薬組成物。これらの組成物は、少なくとも約１×１０3個のＲＰＥ細胞、約１×１０4個のＲＰＥ細胞、約１×１０5個のＲＰＥ細胞、約１×１０6個のＲＰＥ細胞、約１×１０7個のＲＰＥ細胞、約１×１０8個のＲＰＥ細胞、または１×１０9個のＲＰＥ細胞を含んでいる可能性がある。特定の態様において、組成物は、本明細書に開示される方法によって産生される分化ＲＰＥ細胞を含有する、実質的に精製された（非ＲＰＥ細胞に関して）調製物である。ポリマー担体などの足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）、および／または細胞外マトリックス、および本明細書中に開示される方法によって産生される有効量のＲＰＥ細胞を含む組成物も提供される。例えば、細胞は単層の細胞として提供される。マトリックス材料は、一般的に生理学的に許容され、生体内での使用に適したものである。例えば、生理学的に許容される材料には、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）、架橋または非架橋アルギン酸、親水性コロイド、発泡体、コラーゲンゲル、コラーゲンスポンジ、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）メッシュ、フリースおよび生体接着剤などの吸収性および／または非吸収性の固体マトリックス材料が挙げられる。
【０１４３】
好適なポリマー担体にはまた、合成溶液または天然ポリマー、ならびにポリマー溶液から形成された多孔質メッシュまたはスポンジがある。マトリックスは、例えば、ポリマーメッシュまたはスポンジ、または高分子ヒドロゲルである。使用することができる天然ポリマーには、コラーゲン、アルブミン、およびフィブリンなどのタンパク質；ならびにアルギン酸やヒアルロン酸ポリマーなどの多糖類が挙げられる。合成ポリマーには、生分解性ポリマーと非生分解性ポリマーの両方が含まれる。生分解性ポリマーには、例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）およびポリ乳酸−グリコール酸（ＰＧＬＡ）、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼンおよびそれらの組み合わせなどのヒドロキシ酸のポリマーが含まれる。非生分解性ポリマーとしては、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、エチレンビニルアセテート、およびポリビニルアルコールが挙げられる。
【０１４４】
可鍛性のイオン的にまたは共有結合的に架橋されたヒドロゲルを形成することができるポリマーを使用することができる。ヒドロゲルは、共有結合、イオン結合または水素結合を介して有機ポリマー（天然または合成）が架橋されて水分子を捕捉してゲルを形成する三次元開格子構造を形成するときに形成される物質である。ヒドロゲルを形成するために使用することができる材料の例には、イオン性に架橋されたアルギン酸、ポリホスファジン、およびポリアクリレートなどの多糖類、またはプルロニックス（ＰＬＵＲＯＮ１ＣＳ）（登録商標）もしくはテトロニクス（ＴＥＴＲＯＮ１ＣＳ）（登録商標）などのブロックコポリマー、温度またはＨのそれぞれによって架橋されるポリエチレンオキシド−ポリプロピレンブロックコポリマーがある。他の材料としては、フィブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドン、ヒアルロン酸およびコラーゲンなどのポリマーが挙げられる。
【０１４５】
医薬組成物は、網膜組織の疾患または異常を改善するためのＲＰＥ細胞機能の再構成のような、所望の目的のために、取り扱い説明書と共に、必要に応じて適切な容器に包装することができる。いくつかの態様では、開示された方法によって産生されたＲＰＥ細胞を、ＲＰＥを形成するように操作し、それを必要とする対象の変性ＲＰＥを置換するために使用することができる。
【０１４６】
Ｃ．商業用、治療用および研究目的のための流通
いくつかの態様では試薬システムが提供され、この試薬システムは、製造、分配または使用中にいつでも存在するＲＰＥに富んだ細胞集団を含む細胞のセットまたは組み合わせを含む。細胞セットは、本明細書に記載の細胞集団と、未分化多能性幹細胞または他の分化した細胞型との任意の組み合わせを含み、これらは同じゲノムを有していることも多い。各細胞型は、まとめてまたはそれぞれ別々の容器中に、ビジネス関係を共有する同じ組織または異なる組織の制御下で、同じ施設内でまたは異なる場所で、同じ時刻または異なる時刻に、包装することができる。
【０１４７】
医薬組成物は、必要に応じて、所望の目的（例えば、眼組織の疾患または損傷を改善するためのＲＰＥ細胞機能の再構成など）に関する取り扱い説明書と共に適切な容器に包装することができる。
【０１４８】
Ｖ．キット
いくつかの態様では、例えば、ＲＰＥ細胞を産生するための１つまたは複数の培地および成分を含む可能性のあるキットが提供される。試薬システムは、必要に応じて、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかで包装してもよい。キットの容器手段は、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段を含み、その中に構成要素を配置、好ましくは適切に分注する。キット中に２つ以上の構成要素が含まれる場合、キットは一般に第２、第３または他の追加の容器を含み、その中に追加の構成要素を別々に配置することができる。また、バイアルには、成分を様々に組み合わせて入れてもよい。キットの成分は、乾燥粉末として提供することもできる。試薬および／または成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は、適切な溶媒の添加によって再構成され得る。溶媒は、別の容器手段に提供されてもよいことが想定される。キットはまた、典型的には、商業的な販売のために、キット成分を厳重に梱包するための手段も含む。そのような容器は、所望のバイアルが保持される注入またはブロー成形プラスチック容器を含み得る。キットには、印刷形式またはデジタル形式などの電子形式の取り扱い説明書も含まれている場合がある。
【実施例】
【０１４９】
ＶＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含まれる。当業者には、以下の実施例に開示される技術が本発明の実施において良好に機能するように発明者によって発見された技術を表し、従って、その実施のための好ましい様式を構成すると考えることができると理解される。しかし、当業者であれば、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された特定の態様において多くの変更がなされ得、同様のまたは類似の結果が得られることを認識できる。
【０１５０】
実施例１−出発多能性幹細胞集団の調製
ＲＰＥ細胞の出発集団は、ＥＳ細胞およびｉＰＳＣのような多能性幹細胞に由来し得る。例示的な方法では、ＲＰＥ細胞は、参照することにより本明細書に組み入れられる、米国特許第８，５４６，１４０号、同第８，７４１，６４８号、同第８，６９１，５７４号、公開米国特許出願第２００９０２４６８７５号、公開米国特許第８，２７８，１０４号、同第９，００５，９６７号、米国特許第８，０５８，０６５号、同第８，１２９，１８７号、国際公開第２００７／０６９６６６号Ａ１、米国特許第８，１８３，０３８号および同第８，２６８，６２０号などの当該分野で公知の方法によって体細胞からリプログラミングされたヒトｉＰＳＣに由来したものである。例えば、多能性幹細胞を、核プログラミング因子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４を用いて、体細胞から産生した。別の例示的な方法では、核プログラミング因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｌ−ＭｙｃおよびＳＶ４０ラージＴ抗原を用いて、体細胞から多能性幹細胞を産生した。
【０１５１】
ｉＰＳＣを、ビトロネクチンでコーティングしたプレートに入れたエッセンシャル８（登録商標）（Ｅ８ＴＭ）培地のような完全に定義された培地中で、マウスまたはヒトフィーダー層なしで増殖させた。ビトロネクチンをカルシウムまたはマグネシウムを含まないＤＰＢＳで２００倍に希釈し、培養プレートをこのビトロネクチンでコーティングし、室温で約１時間インキュベートした。不健全なおよび／または分化した細胞を予防するために、ｉＰＳＣを、それらがコンフルエントに達する前で、それ以上増殖することが許されない時点で分割した（図１Ａ）。
【０１５２】
ＲＰＥ細胞を誘導するために、ｉＰＳＣを単個細胞の懸濁液として解離させて、凝集体または胚様体を除去した。単個細胞懸濁液を得るために、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、トライプル（ＴＲＹＰＬＥ）（登録商標）などの細胞解離酵素中、３７℃で約１０分間インキュベートした。次いで、細胞を、血清学的ピペットを用いたピペッティングにより分離させ、細胞懸濁液をコニカルチューブに集めた。穏やかにピペッティングすることでは細胞が分離しなかった場合、培養物をより長く、例えば２〜３分間インキュベートした。全ての細胞を回収するために、培養容器を室温Ｅ８（商標）培地で洗浄し、次いで培地を、細胞懸濁液を含むチューブに入れた。さらに、単個細胞に解離させた後のＰＳＣ細胞の生存率が、細胞が培養容器に付着しなくても、高くなるように、ブレビスタチン（例えば、２．５μＭ）をＥ８（登録商標）培地に加えた。細胞を回収するために、それらを４００ｘｇで約５分間遠心分離し、上清を吸引し、細胞を適切な容量のＥ８（商標）培地に再懸濁した。
【０１５３】
単個細胞にしたｉＰＳＣからＲＰＥ細胞を効率的に分化させるために、単個細胞ｉＰＳＣの入力密度をビセル（ＶＩＣＥＬＬ）（商標）のような自動細胞カウンターで正確に計数し、室温のＥ８（商標）で約１×１０5細胞／ｍＬの細胞懸濁液になるように希釈した。ｉＰＳＣの単個細胞懸濁液が既知の細胞密度で得られたら、細胞をビトロネクチンで被覆した６ウェルプレートのような適切な培養容器に播種した。細胞をウェル当たり約２００，０００細胞の細胞密度で播種し、３７℃の加湿インキュベーターに入れた。約１８〜２４時間後、培地を吸引し、新鮮なＥ８（商標）培地を培養物に添加した。プレートに適切な状態で接着させるために、細胞を播種後約２日間、Ｅ８（商標）培地で培養した。
【０１５４】
実施例２−ｉＰＳＣのＲＰＥ細胞への分化
適切な細胞密度で播種した単個細胞ｉＰＳＣを実施例１のように約２日間培養したら、ＲＰＥ細胞を誘導するための様々な分化培地で培養した。３日目に、Ｅ８（商標）培地を吸引し、室温の網膜誘導培地（ＲＩＭ）（例えば、表３）を加えた。簡単に説明すると、ＲＩＭは、約１：１の比のＤＭＥＭおよびＦ１２、ノックアウト血清代替品、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ピルビン酸ナトリウム、Ｎ−２サプリメント、Ｂ−２７サプリメントおよびアスコルビン酸を含むものである。さらに、ＲＩＭには、ＷＮＴ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＴＧＦβ経路阻害剤およびインスリン成長因子１（ＩＧＦ１）を含めた。毎日培地を吸引し、新鮮なＲＩＭを細胞に添加した。細胞を約２〜４日間ＲＩＭ中で培養した。
【０１５５】
次いで、細胞を網膜分化培地（ＲＤＭ）中で約７〜１４日間培養した。簡単に説明すると、ＲＤＭ（表２）は、約１：１の比のＤＭＥＭおよびＦ１２、ノックアウト血清代替品、ＭＥＭ  ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、Ｎ−２サプリメント、Ｂ−２７サプリメントおよびアスコルビン酸を含むものとした。さらに、ＲＤＭには、ＷＮＴ経路阻害剤（例えばＣＫＩ−７）、ＢＭＰ経路阻害剤（例えばＬＤＮ１９３１８９）、ＴＧＦβ経路阻害剤（例えばＳＢ４３１５４２）およびＭＥＫ阻害剤（例えばＰＤ３２５９０１）を含めた。Ｗｎｔ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤およびＴＧＦβ経路阻害剤の濃度は、ＲＤＭでは、ＲＩＭよりも１０倍高かった。毎日培地を吸引し、室温ＲＤＭを細胞に加え、分化した網膜細胞を産生した。
【０１５６】
ＲＰＥ細胞を誘導するために、細胞を次に網膜培地（ＲＭ）中で７〜１０日間培養した。ＲＭは、約１：１の比のＤＭＥＭおよびＦ１２、ノックアウト血清代替品、ＭＥＭ  ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、Ｎ−２サプリメント、Ｂ−２７サプリメントおよびアスコルビン酸を含むものとした。さらにＲＭには、ニコチンアミドおよびアクチビンＡを含めた。培地を室温ＲＭで毎日交換してＲＰＥ細胞を得た。
【０１５７】
ＲＰＥ細胞の成熟のために、細胞をＲＰＥ成熟培地（ＲＰＥ−ＭＭ）中で５〜１０日間培養した。ＲＰＥ−ＭＭ（表２）は、ＭＥＭアルファ、ウシ胎児血清、Ｎ−２サプリメント、ＭＥＭ  ＮＥＡＡおよびピルビン酸ナトリウムを含むものとした。さらに、ＲＰＥ−ＭＭには、タウリン、ヒドロコルチゾンおよび３，３’、５−トリヨード−Ｌ−チロニンを含めた（図１Ｃ）。培地を室温のＲＰＥ−ＭＭで１日おきに交換した。次いで細胞を細胞解離酵素中で解離させ、ビトロネクチンでコーティングしたプレートに再び播種した。誘導されたＰＲＥ細胞はこの段階で、異種成分不含有ＣＳ１０培地に入れて凍結保存することができる。ＲＰＥの成熟を継続するために、播種した細胞はさらに約１５日間培養する。
【０１５８】
実施例３−ＲＰＥ細胞の成熟
実施例２で産生したＲＰＥ細胞を継続して成熟させるために、トライプル（商標）のような細胞解離酵素で細胞を解離させ、ＭＥＫ阻害剤、例えばＰＤ３２５９０１を添加したＲＰＥ−ＭＭ中で１〜２週間、特殊なスナップウェル（ＳＮＡＰＷＥＬＬ）（商標）デザインの分解性足場アセンブリに再播種した。これにより、異種成分不含有ＣＳ１０培地を使ってこの段階で凍結保存することができる、分化し、極性化し、コンフルエントな機能性ＲＰＥ細胞の単層が得られた（図１Ｄ）。
【０１５９】
成熟ＲＰＥ細胞は、ＰＧＥ２またはアフィディコリンなどの初代繊毛誘導物質のような低分子を添加したＲＰＥ−ＭＭ中で継続して培養することによって、インタクトなＲＰＥ組織として機能する機能的ＲＰＥ細胞の単層にさらに発達した。理論に束縛されるものではないが、これらの一次繊毛誘導物質は、カノニカルＷＮＴ経路を抑制し、細胞内で細胞周期からの離脱を誘発し、ＲＰＥ単層において頂端−基底分極を誘導する。あるいは、ＲＰＥ成熟を促進するためにＲＰＥ細胞において細胞周期からの離脱を誘導するＩＷＰ２およびエンド−ＩＷＲ１などのカノニカルＷＮＴ経路阻害剤によってＲＰＥ成熟を誘導することができる。成熟し機能的なＲＰＥ細胞単層を得るために、細胞をこの培地でさらに２〜３週間培養した。したがって、現在開示の方法は、臨床用途のために大規模に一貫して複製することができる多能性細胞由来の成熟ＲＰＥ細胞を提供するものである。
【０１６０】
実施例４−ＲＰＥ細胞の凍結保存
実施例２の分化したＲＰＥ細胞を凍結保存するために、培地を吸引し、細胞をダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）で２回洗浄した。次いで、細胞を細胞解離酵素と共にインキュベートし、細胞懸濁液をピペットでコニカルチューブに移した。細胞を遠心分離し、上清を吸引し、細胞を室温のＲＰＥ−ＭＭに再懸濁した。次いで、細胞懸濁液をステリフリップ（ＳＴＥＲＩＦＬＩＰ）（登録商標）細胞ストレーナーで濾過し、細胞を計数した。その後、細胞を遠心分離し、冷やしておいたクライオストア（ＣｒｙｏＳｔｏｒ）（登録商標）ＣＳ１０に、適切な密度（例えば、１×１０7細胞／ｍＬ）で再懸濁した。細胞懸濁液を予め標識しておいたクライオバイアルに分配し、冷凍容器に入れ、−８０℃の冷凍庫に１２〜２４時間移した。次いでバイアルを液体窒素に移して貯蔵した。
【０１６１】
実施例５−混入非ＲＰＥ細胞のＭＡＣＳ枯渇およびＣＤ２４、ＣＤ５６および／またはＣＤ９０枯渇によるＲＰＥ出発細胞集団の濃縮
実施例２または３で得られたＲＰＥ細胞の集団は、残存する汚染性非ＲＰＥ細胞ならびに未成熟ＲＰＥ細胞（まとめて「汚染細胞」と呼ぶ）を含む場合があり、その両方を分離および除去して成熟ＲＰＥに富んだ細胞集団を得ることができる。混入細胞は、例えば、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ（登録商標））、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、または単細胞選別などの様々な方法論によって培養物から除去することができる。それらの表面抗原によって種々の細胞集団を分離することができることが当該分野で知られているＭＡＣＳ（登録商標）方法論を用いて、より成熟した目的のＲＰＥ細胞から、汚染細胞を分離した。
【０１６２】
ＲＰＥ細胞の出発集団に混入している汚染細胞は、目的の成熟ＲＰＥ細胞から汚染細胞を分離するために使用することができる特異的細胞表面マーカーを有する。例えば、ＣＤ２４、ＣＤ５６、および／またはＣＤ９０は、多能性幹細胞および他の神経細胞型（但し、これらに限定されない）上で発現される細胞表面抗原である。ＣＤ２４は、多能性幹細胞、いくつかのＢリンパ球および分化する神経芽細胞の表面に発現する糖タンパク質である。ＣＤ５６または神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）は、ニューロンおよびナチュラルキラー細胞の表面に発現する糖タンパク質である。ＣＤ９０またはＴｈｙ−１は、様々な幹細胞ならびにニューロンの表面に発現するマーカーである。ＣＤ２４、ＣＤ５６および／またはＣＤ９０の発現は、幹細胞が、ＲＰＥ細胞を含む多くの成熟細胞型に分化する過程で失われる。したがって、ＣＤ２４、ＣＤ５６および／またはＣＤ９０に対して陽性の細胞を除去することで、残留汚染細胞を枯渇させることができる。
【０１６３】
分離技術を実施するためには、ＲＰＥ細胞の出発集団を、実施される選別（例えば、ＭＡＣＳ）のために単個細胞懸濁液に解離させることが望ましい。既に凍結保存されている細胞であれば、細胞を解凍し、再播種する必要がある。接着培養に含まれる細胞から単個細胞懸濁液を得るために、細胞を洗浄し（例えば、ＤＰＢＳ）、細胞解離酵素を添加した（例えばトライプル（登録商標））。細胞を３７℃で約５分間インキュベートした後、容器を静かに軽くたたいてニューロンクラスターを剥がした。細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、細胞解離酵素を加えた（例えばトライプル（登録商標））。細胞を３７℃で約３０分間インキュベートした後、細胞懸濁液をＲＰＥ−ＭＭ播種（Ｐｌａｔｉｎｇ）培地に集め、４００ｘｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットをＲＰＥ−ＭＭ播種培地に再懸濁し、細胞懸濁液を細胞ストレーナー（例えば、２０μＭのスリットスリップ細胞ストレーナー）で濾過して、残りの細胞クラスターを解離させた。生存細胞について細胞懸濁液を計数し（例えば、ビセル計数器を用いて）、細胞濃度を見た。計数した細胞懸濁液は、選別またはフローサイトメトリー純度アッセイに使用できる単個細胞懸濁液を提供するものとなった。
【０１６４】
ＲＰＥ細胞の出発集団から汚染細胞を除去するために、ＭＡＣＳを使用して、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ５６陽性細胞、および／またはＣＤ９０陽性細胞を枯渇させた。ＲＰＥ細胞の出発集団由来の細胞を単個細胞懸濁液に解離させた後、細胞をＭＡＣＳ緩衝液に、例えば１×１０7細胞／ｍＬで再懸濁させた。ＭＡＣＳ緩衝液の例を表３に示す。次に、細胞を抗ＣＤ２４抗体、抗ＣＤ５６抗体および／または抗ＣＤ９０抗体（それぞれ１：５００に希釈）で染色し、４℃で２０分間インキュベートし、抗体を細胞上の抗原に結合させた。使用する抗体は、二次抗体に結合する標識（例えば、ＦＩＴＣ）で標識しておく必要がある。インキュベートした後、２０ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液を添加し、細胞を４００ｘｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを２０ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、激しく混合し、４００×ｇで５分間遠心分離して、未結合抗体を除去した。細胞ペレットをＭＡＣＳ緩衝液に（例えば、１．１１×１０8細胞／ｍＬで）再懸濁し、希釈した（１：１０）二次抗体（例えば、抗ＦＩＴＣ）でコーティングしたマイクロビーズを加え、細胞を４℃で２０分間インキュベートした。インキュベートした後、細胞をＭＡＣＳ緩衝液で洗浄して未結合のマイクロビーズを除去し、１．２５×１０8個以下の細胞を５００μＬのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。細胞懸濁液を強磁場に置いたＬＤカラムに移すと、マイクロビーズに付着したＣＤ２４、ＣＤ５６、および／またはＣＤ９０抗原を発現している細胞はカラムに残った。ＬＤカラムをＭＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。ＣＤ２４、ＣＤ５６および／またはＣＤ９０抗原を発現していない非標識細胞を溶出して集めた。さらなる特徴解析および培養のために、採取した非標識細胞懸濁液を遠心分離し（４００ｘｇで５分間）、ＲＰＥ−ＭＭ播種培地で再播種し、細胞懸濁液の一定量をフローサイトメトリー純度アッセイに使用した。このようにして、ＭＡＣＳ細胞の選別により、ＣＤ２４、ＣＤ５６および／またはＣＤ９０に対して陽性の細胞を枯渇させたＲＰＥに富んだ細胞集団が得られた。この方法の使用は、実施例２に詳述された方法から生じる出発集団には限定されず、他の方法（例えば、これらに限定されるものではないが、米国特許出願第１２／５２３，４４４号および同第１４／４０５，７３０号に記載の方法）によって産生されたＲＰＥ細胞集団から汚染細胞を除去するためにも利用され得る。
【表１】
2018526032.tif 000002
ＲＰＥ−マーカーに対して陽性である細胞の予備選別の割合は、実施例２のＲＰＥ細胞の出発集団に含まれるＲＰＥ−マーカー陽性細胞の割合を示す。ＣＤ２４陽性細胞とＣＤ５６陽性細胞の両方を枯渇させると、ＣＤ２４陽性細胞のみを枯渇させるよりもＲＰＥ細胞がより濃縮される。ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ５６陽性細胞およびＣＤ９０陽性細胞の全てを枯渇させると、細胞集団中のＲＰＥ細胞の純度は９９％を超えた。
【０１６５】
実施例６−ＲＰＥ濃縮細胞集団の特徴解析のためのフローサイトメトリー純度アッセイ
ＭＡＣＳ選別を実施する前後に、ＢＥＳＴ１、ＣＲＡＬＢＰ、ＴＹＲＰ１、ＰＭＥＬ１７、ＭＡＰ２、ＮＥＳ、およびＭＩＴＦを含む関連マーカーのパネルによるＲＰＥ細胞の特性決定（例えば、予備選別（ｐｒｅ−ｓｏｒｔｉｎｇ）および事後選別（ｐｏｓｔ−ｓｏｒｔｉｎｇ））を行った。フローサイトメトリー純度アッセイを実施して、ＭＡＣＳを利用してＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ５６陽性細胞、および／またはＣＤ９０陽性細胞を除去する前後の各マーカーについて陽性の細胞のパーセンテージの測定値（表１）を得た（図２および３）。
【０１６６】
フローサイトメトリー純度アッセイを実施して、本開示の選別方法によって得られたＲＰＥ細胞のパーセンテージを決定した。ＭＡＣＳアッセイから採取した細胞懸濁液の一定分量（１試料あたり５ｍＬのＦＡＣＳチューブ中２×１０6細胞）を４００×ｇで３分間遠心分離した。細胞ペレットを１ｍＬの染色液（例えば、リブデッド（Ｌｉｖｅ−Ｄｅａｄ）赤色染色液）に再懸濁し、暗所、室温で１５分間インキュベートした。インキュベートした後、２ｍＬの洗浄緩衝液を加え、細胞を４００×ｇで３分間遠心分離して、結合していない染色液を除去した。細胞ペレットを固定緩衝液に再懸濁し、暗所、室温で１５分間インキュベートした。インキュベートした後、２ｍＬの洗浄緩衝液を加え、細胞を４００×ｇで３分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞ペレットを２ｍＬの洗浄緩衝液に再懸濁して１×１０6細胞／ｍＬの懸濁液とし、２００μＬの細胞懸濁液をＦＡＣＳチューブに移した。各チューブに２ｍＬのパーム（ｐｅｒｍ）緩衝液を添加し、細胞を４００×ｇで３分間遠心分離した。ＲＰＥ特異的マーカーの一次抗体をパーム緩衝液で希釈し、希釈した抗体溶液１００μＬを各チューブに加えた。暗所、４℃で一晩インキュベートした後、細胞を２ｍＬのパーム緩衝液で２回洗浄した。二次抗体溶液を各チューブに入れ、細胞を暗所、室温で１〜２時間インキュベートした。インキュベートした後、細胞をパーム緩衝液で２回洗浄し、遠心分離し（４００ｘｇで３分間）、フローサイトメトリー分析用に１００μＬの洗浄緩衝液に再懸濁した。参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許第８，６８２，８１０号およびヘルツェンベルグら、２００６などに記載されている当業者に公知の方法によってフローサイトメトリー分析を実施し、試験したマーカーのそれぞれについて、陽性細胞のパーセンテージを得た（表１）。フローサイトメトリー純度アッセイから、ＣＤ２４、ＣＤ５６および／またはＣＤ９０陽性汚染細胞を枯渇させるＭＡＣＳ選別によって、ＢＥＳＴ１マーカーによって決定される出発細胞集団でのパーセンテージ（７８．６％）と比較して、ＲＰＥ細胞に富んだ集団（９５〜９９％）が得られたことが示された。
【０１６７】
実施例７−ＲＰＥ細胞を分化させるための別の方法
実施例２および３に記載された方法に関して、ｉＰＳＣ播種後２日目から開始する分化プロセスの終了までの間（ＭＡＣＳ後の培養を含む）の特定の時間枠内で、培地中に１μＭの濃度のＰＤ０３２５９０１を含めることにより、結果として生じるＲＰＥ集団の成熟度およびＲＰＥ集団の純度（混入細胞の減少を意味する）が向上する可能性がある。本明細書に記載のＲＰＥプロセスで、ＲＤＭおよびＲＰＥ−ＭＭ（約４２〜５０日目）に１μＭのＰＤ０３２５９０１を含めると、ＲＰＥ集団の純度および成熟度の両方が改善されることが分かっている。
【０１６８】
実施例８−ＲＰＥ細胞を分化させるための別の方法
実施例２および３に記載された方法に関して、ＲＰＥ−ＭＭおよびＲＰＥ−ＭＭプレート培地中のウシ胎仔血清のパーセンテージを５％から０．５〜１％に減少させると、ＲＰＥ集団の純度（混入した汚染細胞の減少を意味する）および結果として生じるＲＰＥ集団の成熟度が向上する可能性がある。
【０１６９】
実施例９−成熟ＲＰＥ細胞の機能性
ＰＧＥ２での処理から産生された成熟ＲＰＥ細胞を分析するために、ＲＰＥ単層の免疫染色を行い、ｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞のＺＯ１染色と透過電子顕微鏡観察により、タイトジャンクションの六角形構造（図４Ａ〜４Ｃ）を確認した（図４Ｄ）。この染色から、ＰＧＥ２で処理したＲＰＥ細胞では、ベータカテニンが減少し、ＲＰＥ６５が増加することが示された。また、ＩＷＰ２＋エンド−ＩＷＲ１またはＩＷＰ２で処理することによっても、ベータカテニンの減少（図５Ａ）およびＲＰＥ６５の増加がもたらされる（図５Ｃ）。ＩＷＰ２＋エンド−ＩＷＲ１の組み合わせは、ＩＷＰ２単独またはエンド−ＩＷＲ１単独と比較してより有効であることが見出された。したがって、ＰＧＥ２、ＩＷＰ２、またはＩＷＰ２＋エンド−ＩＷＲ１で処理することにより、成熟ＲＰＥ細胞が産生される。
【０１７０】
本発明の方法によって生成されたＲＰＥ細胞のバリア機能を測定するために、経上皮電位（ＴＥＰ）により、細胞間の流れを制御するエネルギー駆動型イオンポンプによって生成された単層全体にわたるイオン勾配を測定し、経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）によって、主にタイトジャンクション構造の微細構造を介して傍細胞間空間を介して物質の抵抗を測定する（図７Ａ）。
【０１７１】
また、ＩＷＰ２またはエンド−ＩＷＲ１で処理された成熟ＲＰＥ細胞の機能解析も行った。ＰＧＥ２またはＩＷＰ２＋エンド−ＩＷＲ１で処理したＲＰＥ細胞と未処理ＲＰＥ細胞のＴＥＰおよびＴＥＲ測定値の比較から、処理した成熟ＲＰＥ細胞では機能性が向上していることが示された（図７Ｃ〜７Ｅ）。
【０１７２】
次に、ＲＰＥ−ＭＭ＋ＰＧＥ２培地中のＰＧＥ２濃度を５０μＭから１００μＭに増加させることにより、ＲＰＥ集団の純度（すなわち、汚染細胞の減少）および結果として生じるＲＰＥ集団の成熟度の両方が向上するか否かを試験した。５０μＭおよび１００μＭのＰＧＥ２処理培養物の成熟度および機能性を決定するために、経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）に関するバリア機能を測定して（図７Ｆ）、実施例９で説明するのと同様に、傍細胞間空間を通る物質の抵抗を比較した。ＲＰＥ−ＭＭ＋ＰＧＥ２培地でｉＰＳＣ由来ＲＰＥ培養物を５０μＭまたは１００μＭで処理した後に得られる純粋なＲＰＥ細胞のパーセンテージを測定するために、実施例６で説明したのと同様に、ＲＰＥ特異的マーカーについてフローサイトメトリー純度アッセイを行った（図７Ｇ）。結果から、より高い濃度の一次繊毛誘導因子ＰＧＥ２により、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ分化の過程におけるＲＰＥ集団の純度および成熟度の両方が促進されることが示された。
【０１７３】
実施例１０−ＲＰＥ分化法の再現性
ＲＰＥ分化プロセスの再現性を試験するために、３つのｉＰＳＣ系統からＲＰＥ細胞に分化させる過程を、複数のオペレーターによって行った（図６Ａ）。得られたＲＰＥ細胞の平均純度は、ＲＰＥマーカーであるレチナールアルデヒド結合タンパク質１（Ｃｒａｐｌｂｐ）をフローサイトメトリーで測定することで解析した（表２）。ＲＰＥ分化プロセスは、出発細胞集団が異なっていても、また、オペレーターが異なっていても、再現性が高いことが判明した。さらに、３Ｄ１、ＡＭＤ１Ｂ、ＢＥＳＴ１Ｌ、ＢＥＳＴ３Ａ、ＢＥＳＴ８Ａ、ＡＭＤドナー３ＤおよびＨＬＡ細胞系Ａ（図６Ｂ）を含む異なる出発細胞株からのＲＰＥ分化によっても再現性を確認した。ＨＬＡ細胞系Ａ（２１５２５．１０２）は、ＨＬＡ−Ａ＊０１およびＨＬＡ−Ｂ＊０８をホモ接合したドナーから産生され、米国人口の１１．３８％にとって有益な一致性を提供するｉＰＳＣ系統である。さらに、米国人口の７．６３％にとって有益な一致性を提供し得るＨＬＡ−Ａ＊０３およびＨＬＡ−Ｂ＊０７のホモ接合体であるＨＬＡ細胞系Ｃ（２１５２６．１０１）由来のｉＰＳＣ系統から、このプロセスを用いてＲＰＥを産生することも成功している。前述したＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂがホモ接合であるＨＬＡ細胞系Ａ（２１５２５．１０２）およびＨＬＡ細胞系Ｃ（２１５２６．１０１）は、セルラーダイナミクスインターナショナル社（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ）の所有物である。さらに、１３のドナー由来にするにする２８のｉＰＳＣ細胞系から、１０９回ＲＰＥを分化させ、その精製前および精製後のＣｒａｌｂｐ陽性細胞の割合を測定することにより、再現性をさらに確認した（図６Ｃ〜Ｄ）。ＲＰＥ分化後のＣｒａｌｂｐ陽性細胞の割合は様々であったが、ＭＡＣＳ精製は一貫して９５％以上の純度をもたらし、ほとんどの場合１００％純度に近い結果をもたらした。したがって、ＲＰＥ分化の本方法は、ドナーの遺伝子型が多用であっても、また、異なるオペレーターによって実施される場合であっても、より一貫性と再現性のある結果を提供するという点で、胚様体からＲＰＥ細胞を産生するいかなる方法よりも明らかに有用である。
【表２】
2018526032.tif 000003
【０１７４】
実施例１１−材料および方法
実施例１〜１０で使用した材料を表３に示す。
【表３】
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【０１７５】
フローサイトメトリーの洗浄緩衝液は、２０ｍＬのＦＢＳを１０００ｍＬのＤＰＢＳ（すなわち、カルシウムおよびマグネシウムを含まない）に添加することによって調製した。緩衝液はフィルター滅菌し、４℃で最長４週間保存することができる。
【０１７６】
フローサイトメトリーのパームバッファーは、２０ｍＬのＦＢＳを１０００ｍＬのＤＰＢＳ（すなわち、カルシウムおよびマグネシウムを含まない）に添加することによって調製した。１グラムのサポニンを添加し、よく混合した。緩衝液はフィルター滅菌し、４℃で最長４週間保存することができる。
【０１７７】
フローサイトメトリーのライブデッド赤色染色液は、ＤＰＢＳ（すなわちカルシウムおよびマグネシウムを含まない）でライブデッド染色液を１０００倍に希釈することによって調製した。アッセイされる１×１０6個の細胞につき１ｍＬの染色液を調製した。染色液は使用前に新しく調製した。
【０１７８】
フローサイトメトリーの固定バッファーは、１ｍＬの３６．５％ホルムアルデヒドを８．１ｍＬのＤＰＢＳ（すなわち、カルシウムおよびマグネシウムを含まない）に添加することによって調製した。アッセイされる１×１０6個の細胞につき１ｍＬの染色液を調製した。バッファーは使用前に新しく調製した。
【０１７９】
本明細書に開示され特許請求される方法の全ては、本開示に照らして過度の実験をすることなく準備・実行され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい態様という観点から記載されているが、当業者には、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、これらの方法および工程または記載された方法の工程の順序に変更を適用することができることは明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連する特定の薬剤を、本明細書に記載の薬剤と置き換えて、同じまたは類似の結果を達成することができることは明らかであろう。当業者に明らかなこのような類似の置換および変更はすべて、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載されたものに補足的な例示的な手順または他の詳細を提供する範囲で、参照することにより本明細書に具体的に組み込まれる。
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【図１Ａ】
2018526032.tif 000014
【図１Ｂ】
2018526032.tif 000015
【図１Ｃ】
2018526032.tif 000016
【図１Ｄ】
2018526032.tif 000017
【図２Ａ】
2018526032.tif 000018
【図２Ｂ】
2018526032.tif 000019
【図３Ａ−１】
2018526032.tif 000020
【図３Ａ−２】
2018526032.tif 000021
【図３Ｂ−１】
2018526032.tif 000022
【図３Ｂ−２】
2018526032.tif 000023
【図３Ｃ−１】
2018526032.tif 000024
【図３Ｃ−２】
2018526032.tif 000025
【図４Ａ】
2018526032.tif 000026
【図４Ｂ】
2018526032.tif 000027
【図４Ｃ】
2018526032.tif 000028
【図４Ｄ】
2018526032.tif 000029
【図５Ａ】
2018526032.tif 000030
【図５Ｂ】
2018526032.tif 000031
【図５Ｃ】
2018526032.tif 000032
【図５Ｄ】
2018526032.tif 000033
【図６Ａ】
2018526032.tif 000034
【図６Ｂ】
2018526032.tif 000035
【図６Ｃ−１】
2018526032.tif 000036
【図６Ｃ−２】
2018526032.tif 000037
【図６Ｄ】
2018526032.tif 000038
【図７Ａ】
2018526032.tif 000039
【図７Ｂ】
2018526032.tif 000040
【図７Ｃ】
2018526032.tif 000041
【図７Ｄ】
2018526032.tif 000042
【図７Ｅ】
2018526032.tif 000043
【図７Ｆ】
2018526032.tif 000044
【図７Ｇ】
2018526032.tif 000045
【国際調査報告】
2018526032.tif 000046
2018526032.tif 000047
2018526032.tif 000048