(57)【要約】  本発明は、Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの水性抽出（この抽出物中においてジャスミン花頭の浸軟が行われる）の後に得られる、Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａとジャスミン花頭との相乗作用的抽出物に関し、Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの乾燥重量と花頭の乾燥重量の比は、４０／６０〜９５／５である。本発明は、前記相乗作用的抽出物を得るための方法、および前記抽出物を活性な作用物質として含む化粧品組成物にも関する。最後に、本発明は、成体の皮膚幹細胞（ＳＫＰ）の「幹」の特徴の維持を支持することによって、老化の徴候に対抗するためおよび皮膚の弾性を改善するための、前記組成物の美容的使用に関する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
藻類Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａとＪａｓｍｉｎｕｍ属の植物の花頭との相乗作用的抽出物であって、前記抽出物は、ｉ）藻類Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの水性抽出物を調製する工程、続いて、ｉｉ）Ｊａｓｍｉｎｕｍ属の植物の花頭を前記水性抽出物中で浸軟する工程を含む方法によって入手可能であり、該藻類の乾燥重量と該花頭の乾燥重量との重量比は、４０／６０〜９５／５であり、該藻類と該花頭の両方が、該相乗作用的抽出物を調製するための原材料として使用される、相乗作用的抽出物。
【請求項２】
前記藻類の乾燥重量と前記花頭の乾燥重量との重量比が、８／１〜１０／１であることを特徴とする、請求項１において特許請求された抽出物。
【請求項３】
前記Ｊａｓｍｉｎｕｍ属の植物が、Ｊａｓｍｉｎｕｍ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ、Ｊａｓｍｉｎｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ、Ｊａｓｍｉｎｕｍ  ｏｄｏｒａｔｉｓｓｉｍｕｍ、Ｊａｓｍｉｎｕｍ  ｓａｍｂａｃ、Ｊａｓｍｉｎｕｍ  ａｕｒｉｃｕｌａｔｕｍ、Ｊａｓｍｉｎｕｍ  ｆｌｅｘｉｌｅ、好ましくは、Ｊａｓｍｉｎｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ種から選択されることを特徴とする、前述の請求項のうちの１項に記載の抽出物。
【請求項４】
前記花頭が、乾燥した花頭全体であることを特徴とする、前述の請求項のうちの１項に記載の抽出物。
【請求項５】
工程ｉ）において、前記Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの水性抽出物が、カルボヒドラーゼおよびエンドプロテアーゼを用いる酵素加水分解、次いで、濾過および／または遠心分離によって得られることを特徴とする、前述の請求項のうちの１項に記載の抽出物。
【請求項６】
前記カルボヒドラーゼが、キシラナーゼ、好ましくは、前記藻類の乾燥重量の２〜６ｗｔ％、好ましくは、４％の濃度で使用されるキシラナーゼであること、および前記エンドプロテアーゼが、該藻類の乾燥重量の１〜３重量％、好ましくは、２重量％の濃度で使用されるブロメラインであることを特徴とする、請求項５において特許請求された抽出物。
【請求項７】
２６．８〜３０．８ｇ／ｋｇの乾物含有量、１．３〜２．３ｇ／ｋｇのタンパク質含有量および２５．３〜２９．３ｇ／ｋｇの糖類含有量を有することを特徴とする、前述の請求項のうちの１項に記載の抽出物。
【請求項８】
工程ｉｉ）の終わりに、水、グリセロール、エタノール、プロパンジオール、ブチレン  グリコール、ジプロピレングリコール、エトキシル化もしくはプロポキシル化ジグリコール、環状ポリオールまたはこれらの溶媒の任意の混合物から選択される１種以上の生理的に許容され得る溶媒に希釈されることを特徴とする、請求項７において特許請求された抽出物。
【請求項９】
請求項１〜８のうちの１項において特許請求されたＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａとＪａｓｍｉｎｕｍ属の植物の花頭との相乗作用的抽出物を得る方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）ある量の乾燥され細かく粉砕されたＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａ藻類を、１０／１〜５０／１、好ましくは、２０／１〜４０／１という水とＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａとの重量比で水に溶解する工程、
ｂ）Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの該水溶液を、３〜６、好ましくは、４〜５．５、さらにより好ましくは、４〜４．５のｐＨにおいて、４０〜８０℃、好ましくは、５０〜６０℃、さらにより好ましくは、５５℃の温度において、少なくとも１時間、好ましくは、２時間にわたってカルボヒドラーゼおよび／またはエンドプロテアーゼで加水分解する工程；
ｃ）必要に応じて濾過助剤の添加および遠心分離を行った後、Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの水性抽出物を得る工程；
ｄ）Ｊａｓｍｉｎｕｍ属の植物の乾燥した花頭を、少なくとも２時間かつ長くとも４時間にわたって、外界温度において、工程ｃ）において得られたＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの水性抽出物中で浸軟する工程であって；該藻類の乾燥重量と該花頭の乾燥重量との重量比は、４０／６０〜９５／５である、工程、
ｅ）工程ｄ）におけるように得られた浸軟生成物を濾過して、Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａおよびＪａｓｍｉｎｕｍ属の植物の花頭の抽出物を回収し、それを少なくとも２時間かつ最大２４時間、好ましくは、１２時間または一晩にわたって、４０〜９０℃、好ましくは、８０℃の温度で加熱して、該カルボヒドラーゼおよびエンドプロテアーゼ酵素を不活性化する工程；および
ｆ）それを必要に応じて濾過によって精製して、Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａとＪａｓｍｉｎｕｍ属の植物の花頭との相乗作用的抽出物を得る工程
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のうちの１項において特許請求されたまたは請求項９に記載の方法によって得られる、Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａとＪａｓｍｉｎｕｍ属の植物の花頭との相乗作用的抽出物を生理的に許容され得る溶媒中に含む、化粧品組成物。
【請求項１１】
Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａとＪａｓｍｉｎｕｍ属の植物の花頭との前記相乗作用的抽出物を、前記組成物の総重量の０．０００１％〜２０％乾燥重量の濃度、好ましくは、該組成物の総重量の０．０５％〜５％乾燥重量の濃度で含むことを特徴とする、請求項１０において特許請求された組成物。
【請求項１２】
ビタミンＡ、レチノイン酸、レチノール、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＨ、ビタミンＫ、ビタミンＰＰ、コエンザイムＱ１０、メタロプロテイナーゼ阻害剤、アミノ酸、カルニチン、カルノシン、タウリン、天然または合成ペプチド、植物ペプチド抽出物、酵母抽出物、Ａｒｔｅｍｉａ  ｓａｌｉｎａの抽出物、合成または天然起源のフィトステロール、サリチル酸、オリゴ糖、多糖、アミノ糖、ポリフェノール、フラボノイド、脂質、リン脂質、動物起源の油、植物油、エトキシ化植物油、ＵＶスクリーンおよび日焼け止めから選択される少なくとも１つのさらなる活性な作用物質をさらに含むことを特徴とする、請求項１０または１１のうちの１項において特許請求された組成物。
【請求項１３】
成体の皮膚幹細胞（ＳＫＰ）の「幹」の特徴の維持を支持することによって、皮膚老化の徴候に対抗するための、請求項１〜８のうちの１項において特許請求されたＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａとＪａｓｍｉｎｕｍ属の植物の花頭との相乗作用的抽出物または請求項１０〜１２のうちの１項において特許請求された組成物の美容的使用。
【請求項１４】
皮膚の弾性、柔軟性および／または硬度を改善するための、請求項１３において特許請求された使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧品の分野、特に、真皮レベルでの作用による皮膚のケアに関する。本発明は、より詳細には、Ｊａｓｍｉｎｕｍ属の植物（ジャスミンとも呼ばれる）と紅藻Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａとの相乗作用的抽出物、前記抽出物を得る方法、前記抽出物を含む組成物、ならびに皮膚の老化の徴候に対抗するため、特に、皮膚の弾性、柔軟性および硬度を改善するためのその美容的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
老化は、長い時間にわたって身体の構造および機能を変化させる一連のプロセス、特に生理学的プロセスに対応する。老化は、２つのタイプ、すなわち、一方は内因性の老化および他方は外因性の老化に区別される。内因性の老化は、遺伝因子、疲労の状態、ストレス、妊娠中などのホルモンの変化などにおいて生じる生化学変化に起因する。外因性の老化は、生涯を通じて身体が曝される環境要因（例えば、汚染、太陽光、疾患など）に部分的に起因する。外因性の老化は、様々な手段によって身体のすべての細胞に影響し、様々な方法で顕れる、ゆっくりとした進行性のプロセスである。例えば、皮膚のレベルでは、後者の出現は、様々なタイプの内的または外的攻撃によって変化し、そしてしわおよび線（ｌｉｎｅｓ）、色素過剰または色素脱失の斑、皮膚の乾燥またはさらには脱水、表皮の薄厚化、弾力繊維症、しみおよびそばかすの発生が見られるようになる。
【０００３】
皮膚は、主に３つの細胞層：表皮、真皮および皮下組織で構成されている被覆器官である。表皮は、皮膚の表面を構成しており、真皮表皮接合部と呼ばれる様々なタンパク質のマトリックスによって真皮につなぎ留められている。
【０００４】
表皮は、表皮の基底膜に位置する表皮の幹細胞によって再生されるケラチノサイトと呼ばれる細胞のいくつかの層からなる。
【０００５】
真皮は、皮膚の支持組織であり、主に、線維芽細胞、エラスチン線維およびコラーゲン線維（真皮線維の７０％）からなり、それらは、プロテオグリカンという間質細胞外マトリックスに包まれている。コラーゲン線維およびエラスチン線維は、線維芽細胞において合成される。最初はプロエラスチンの形態であるトロポエラスチン線維の新合成は、これらの線維を細胞外空間に分泌する線維芽細胞の活性に関係するプロセスである。成熟した後、フィブリリンと会合したエラスチンは、真皮に弾性特性を与える弾性線維の主成分となる。さらに、線維芽細胞は、結合組織を再生することおよび受傷後の皮膚の修復に寄与することが可能である。ゆえに、皮膚レベルにおいて多くの機能に関与する線維芽細胞は、皮膚の健康の維持および良好な状態の維持に不可欠である。
【０００６】
皮膚構造の再生の活性、または例えばＵＶ照射もしくは創傷によって損傷したときの皮膚構造の修復の活性は、特に包皮および毛嚢などの組織に位置する、成体の皮膚幹細胞（皮膚由来前駆体またはＳＫＰ）の存在を暗示する（Ｔｏｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ２３：７２７−７３７）。ＳＫＰ細胞は、線維芽細胞の再生を保証しているという点で、皮膚細胞の主要な前駆細胞である。ＳＫＰ細胞は、特に皮膚創傷の修復に関与する。
【０００７】
ＳＫＰ細胞は、幹細胞全般に特有の特徴を有する；それらは、自己複製および分化のかなりの能力を有し（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１２３：８５３−６０）、一連の分子マーカー、例えば：
−ネスチン＋：発生中の多くの細胞および特に神経堤の細胞によって発現される中間径フィラメントタンパク質（この発現は、一過性であり、成人期になっても続くものではない）、
−ＯＣＴ４＋（八量体結合転写因子４）：未分化胚性幹細胞の自己複製に関与する多分化能マーカー、
−ＳＯＸ２＋（性決定領域Ｙ−ボックス２）：未分化胚性幹細胞の自己複製の維持に不可欠な転写因子
を発現している細胞として定義される。
【０００８】
皮膚老化に対抗することができる活性な作用物質を特定するための研究によって、様々な有効性の数多くの活性な作用物質が販売されるようになった。しかしながら、より効果的に皮膚老化の出現を遅らせることまたは皮膚老化の徴候に対抗することができる新しい化合物を特定する必要がまだある。本発明が解決することを目的としているより詳細な問題は、線維芽細胞によって産生される構成タンパク質の大部分である細胞外マトリックスのレベルで生じる皮膚老化の主な徴候に対抗することができる新規の活性な作用物質を特定することである。
【０００９】
藻類は、化粧品の用途で広く使用されている。藻類の潜在能力として、老化の予防ならびにヒトの皮膚の外観および保護の改善が知られている。藻類の抽出物を使用することにより、良好な水和レベルを維持しつつ、皮膚および毛髪の栄養が改善し得る。
【００１０】
微細藻類のある特定の種が、スキンケア用に販売されている。例えば、ＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａおよびＣｈｌｏｒｅｌｌａの抽出物は、アンチエイジングクリーム、刺激を抑える製品およびリフレッシュケア製品または再生ケア製品において周知である。
【００１１】
さらに、藻類のＰａｌｍａｒｉａ属の種、特にＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａ種は、スキンケアにおいて有効であると知られている。この藻類Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａは、ＤｕｌｃｅまたはＤｕｌｓｅとも呼ばれている。この海藻は、ミネラル、特に、フッ化物、リン、カリウム、ビタミン、タンパク質および多糖類（キシラン）が豊富である。仏国特許出願公開第２８２６５７５号明細書には、Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａから抽出されたキシランの美容的使用、より詳細には、角質層の水和を増加させるための美容的使用だけでなく、フィブロネクチンの合成および線維芽細胞の増殖による皮膚および毛髪の再生も記載されている。
【００１２】
ジャスミンの花、特に、Ｊａｓｍｉｎｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ種の水性抽出物は、抗酸化特性を有するフラボノイド類の公知の起源である。ジャスミンの精油は、アロマテラピー（抗酸化剤）および皮膚科学（防腐性および抗炎症性の特性）において使用されている。
【００１３】
しかしながら、一方でＪａｓｍｉｎｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅの抽出物および他方でＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの抽出物の公知の使用において、これらの２つの抽出物が、互いに独立して、または互いと組み合わさって、ｉ）コラーゲンの遺伝子発現および／もしくはタンパク質発現を増加させる特性、ならびに／またはｉｉ）皮膚幹細胞の幹の特徴を増大させる特性を有することは示唆されていない。
【００１４】
現代の化粧品の傾向は、しわ取り剤またはアンチエイジング剤としての効果だけでなく、いくつかの特性を合わせ持つがゆえに、より広い範囲の老化徴候の改善も提供する、天然起源の有効な製品を開発することである。
【００１５】
ここで、本発明者らは、Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａおよびＪａｓｍｉｎｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅから得られる新しい抽出物が、皮膚幹細胞に対して相乗効果を有するという点において、スキンケアにとってかなり興味深いことを実証した。この抽出物は、実際に、皮膚幹細胞の貯蔵量を増加させることおよびそれらの機能を改善することを可能にし、真皮の結合組織の構造を保存し、修復することすら可能にする。この抽出物は、弾性測定（ｂａｌｌｉｓｔｏｍｅｔｒｙ）試験において実証されたように、皮膚の機械的特性、特に弾性を改善することが可能であり、ゆえに、皮膚老化のある特定の徴候に対抗することが可能である。
【００１６】
驚いたことに、本発明者らは、本発明に従って使用されるＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａとジャスミン花頭との相乗作用的抽出物が、特に以下の利点を提供することを発見した：
−その相乗作用的抽出物は、皮膚細胞において、皮膚幹細胞（ＳＫＰ）の「幹」の特徴に関連する生化学的マーカー、特にネスチン＋、ＯＣＴ４＋、ＳＯＸ２＋の量を増加させ；
−その相乗作用的抽出物は、皮膚の弾性、皮膚の柔軟性および／または皮膚の硬度を高め、
−その相乗作用的抽出物は、皮膚の再生を増加させ；
−その相乗作用的抽出物は、皮膚細胞外マトリックスのタンパク質、例えば、コラーゲン、特にコラーゲンＩ、ＩＩＩまたはＶ；プロコラーゲン、特にプロコラーゲンＩ、ＩＩＩまたはＶ；およびトロポエラスチンの合成を増加させ；
−その結果、その相乗作用的抽出物は、皮膚老化に関連する皮膚の徴候に対抗することが可能である。
【００１７】
「皮膚幹細胞の幹の特徴」は、ＳＫＰ細胞またはＳＫＰ様細胞の表現型に関連する生化学的マーカーの発現プロファイル、特に、ネスチン＋、ＯＣＴ４＋、ＳＯＸ２＋の発現を意味する。
【００１８】
本発明および本発明がもたらす利点は、説明を読むとより良く理解されるだろう。
【発明の概要】
【００１９】
本発明は、藻類Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの水性加水分解物中でＪａｓｍｉｎｕｍ属の植物の少なくとも一部を浸軟することによって得られる、その植物の抽出物に関する。その藻類の乾燥重量と植物の乾燥重量との重量比は、好ましくは、４０／６０〜９５／５であり、その藻類と植物は両方とも、抽出物を調製するための原材料として使用される。この抽出物は、藻類Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの水性加水分解物と、Ｊａｓｍｉｎｕｍ属の植物の少なくとも一部を水で浸軟することによって得られるその植物の抽出物との混合物で得られる生物学的特性と同一の生物学的特性を有しないという独自の特徴を有する。
【００２０】
本発明は、第１に、藻類Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａとＪａｓｍｉｎｕｍ属の植物の少なくとも一部との相乗作用的抽出物に関し、前記抽出物は、ｉ）藻類Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの水性抽出物を調製する工程、続いて、ｉｉ）Ｊａｓｍｉｎｕｍ属の植物の少なくとも一部を前記水性抽出物中で浸軟する工程を含む方法によって入手可能であり、その藻類の乾燥重量と植物の一部の乾燥重量との重量比は、４０／６０〜９５／５であり、その藻類と植物の一部の両方が、相乗作用的抽出物を調製するための原材料として使用される。
【００２１】
１つの実施形態において、相乗作用的抽出物は、この方法によって得られる。
【００２２】
本発明において、パーセンテージは、別段述べられない限り、重量／重量で表現される。
【００２３】
説明の残りの部分において、用語「ジャスミン」と「Ｊａｓｍｉｎｕｍ属の植物」とは、区別なく使用される。
【００２４】
用語「抽出物」は、通常、それ自体はこれまでに自然界に存在していない、天然の植物原材料から得られる単離された物質を表す。
【００２５】
本説明において、藻類または植物への言及は、必要に応じて乾燥され（ストーブ乾燥または凍結乾燥などの任意の公知の方法によって）、必要に応じて粉砕によって粉末またはフレークに小さくされた、収穫された植物材料を意味する。
【００２６】
本発明に係る「相乗作用的抽出物」は、単独でインキュベートされたＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの参照抽出物、単独でインキュベートされたジャスミンの参照抽出物およびそれらの混合物と比べて、遺伝子発現の直接もしくは間接的な調節または他の生物学的プロセス（例えば、タンパク質の安定化またはメッセンジャーＲＮＡ転写物の安定化）によってタンパク質合成を増加させることによってネスチン＋、ＯＣＴ４＋、ＳＯＸ２＋の発現を増加させることができる、Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａおよびジャスミン、好ましくは、Ｊａｓｍｉｎｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅの花頭の水性抽出物を含むかまたはそれからなる抽出物を意味する。Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの参照抽出物は、例えば、上に記載された相乗作用的抽出物を調製するための方法の工程ｉ）を同一の調製条件で行うことによって、得ることができる。ジャスミンの参照抽出物は、例えば、工程ｉ）の終わりに得られたＰａｌｍａｒｉａの水性抽出物を同じ重量の水で置き換えることによって、上に記載された相乗作用的抽出物を調製するための方法の工程ｉｉ）を同一の調製条件で行うことによって、得ることができる。本説明全体を通じて、特性の増大は、抽出物の一定の乾物重量において評価される。
【００２７】
特に、本発明に係る相乗作用的抽出物は、単独でインキュベートされたＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの参照抽出物、単独でインキュベートされたジャスミンの参照抽出物および必要に応じてそれらの混合物と比べて、皮膚幹細胞の幹の特徴を少なくとも２倍増加させることができる、Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａおよびジャスミン花頭の水性抽出物を含むかまたはそれからなる抽出物である。
【００２８】
特に、相乗作用的抽出物は、単独でインキュベートされたＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの参照抽出物および単独でインキュベートされたジャスミンの参照抽出物と比べて、
−線維芽細胞によって発現されるＳＯＸ２＋のメッセンジャーＲＮＡの量を少なくとも８倍増加させること、および／または
−線維芽細胞によって発現されるネスチン＋のメッセンジャーＲＮＡの量を少なくとも２倍増加させること、および／または
−線維芽細胞によって発現されるＯＣＴ４＋のメッセンジャーＲＮＡの量を少なくとも６倍増加させること
が可能であり得る。
【００２９】
用語「相乗作用的抽出物」、「Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａとジャスミン花頭との相乗作用的抽出物」または「活性な作用物質」は、本説明全体を通じて同じ意味を有する代替物として使用される。
【００３０】
Ｊａｓｍｉｎｕｍ属の植物の一部は、根、茎、葉、花または種子であり得る。好ましくは、前記一部は、花を含む。「花頭」は、必要に応じて茎を伴う花を含む、植物の一部を意味する。１つの実施形態において、花頭は、花および数センチメートルの茎を含む。
【００３１】
本発明に係る抽出物は、好ましくは、Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの水性抽出（この抽出物中においてジャスミン花頭の浸軟が行われる）の後に得られ、この藻類の乾燥重量と花頭の乾燥重量との重量比は、５０／５０〜９０／１０、例えば、６０／４０〜７０／３０または８０／２０〜９０／１０（両端値を含む）である。１つの実施形態において、重量比は、９０／１０に等しい。
【００３２】
抽出物の調製は、ＤｕｌｃｅまたはＤｕｌｓｅとも呼ばれるＰａｌｍａｒｉａｃｅａｅ科の紅藻類の種であるＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの水性抽出物の調製から開始し得る。それは、数世紀にわたって、繊維の重要な起源であった。この藻類は、ミネラル、特に、フッ化物、リン、カリウム、ミネラル、ビタミン、タンパク質および多糖類（キシラン）が豊富である。
【００３３】
本発明に従って使用されるＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの水性抽出物は、例えば、１０／１〜５０／１という水とＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａ（藻類の乾燥重量で表現される）との重量比を含むＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの水溶液を、ｐＨ３〜６、４０〜８０℃の温度において、少なくとも１時間、好ましくは２時間にわたってカルボヒドラーゼおよび／またはエンドプロテアーゼで酵素加水分解することによって得ることができる。
【００３４】
藻類Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａは、収穫後に好都合に乾燥され、細かく粉砕される。
【００３５】
水とＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａとの重量比は、好ましくは、１５／１〜３０／１、さらにより好ましくは、２０／１〜２５／１である。
【００３６】
ｐＨは、好ましくは、例えば、塩酸（ＨＣｌ）を添加することによって、３〜６、好ましくは、４〜５．５、さらにより好ましくは、４〜４．５に調整される。
【００３７】
加水分解温度は、好ましくは、４０℃〜８０℃、好ましくは、５０〜６０℃であり、さらにより好ましくは、５５℃である。
【００３８】
加水分解された植物抽出物を使用することにより、化粧品および皮膚用化粧品に多くの利点がもたらされる。活性な化合物を放出することに加えて、加水分解および精製は、化粧品においてアレルギー反応を引き起こさないより安定した、より容易に標準化される混合物を得ることを可能にする。
【００３９】
都合のよいことに、制御された加水分解によって、Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａ種の藻類に含まれる糖類を入手することが可能になる。本発明に係る抽出物は、Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａおよびジャスミン由来の目的の化合物を多く含む、ジャスミンおよびＰａｌｍａｒｉａの水性抽出物である。
【００４０】
制御された酵素加水分解は、好ましくは、カルボヒドラーゼとしてキシラナーゼおよびエンドプロテアーゼとしてブロメラインを用いて行われる。これらの酵素は、加水分解の収率および程度を最適化することが可能である。
【００４１】
キシラナーゼは、二重置換機構を介したキシランへのβ−１，４−グルコシド（ｇｌｕｃｏｓｉｄｉｃｓ）の加水分解を触媒するグリコシル加水分解酵素群の酵素である。キシランの加水分解によって、キシロースが放出される。
【００４２】
好ましくは、本発明に係る方法において使用されるエンドプロテアーゼは、ブロメラーゼとも呼ばれるブロメラインである。それは、パイナップルの新鮮な茎および根から抽出されるタンパク分解性酵素である。それは、システインの側鎖の硫酸化された基を標的にする、タンパク分解作用を有する酵素の混合物である。
【００４３】
キシラナーゼは、反応混合物に添加される藻類の乾燥重量に対して、好ましくは、２〜６％、さらにより好ましくは、４％の量で使用され、ブロメラインは、好ましくは、１〜３％、さらにより好ましくは、２％の量で使用される。
【００４４】
そのようにして得られたＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの水性抽出物は、次に、遠心分離に続く濾過などの当業者に公知の方法によって、固体残渣から分離される。
【００４５】
この最初に濾過された水性抽出物こそが、例えば、ジャスミン花頭に対する浸軟液として働く。
【００４６】
浸軟は、規定の時間にわたって固体を液体中に放置することにより、その固体から可溶性化合物を抽出することからなるプロセスである。
【００４７】
好ましくは、浸軟は、少なくとも２時間かつ最長４時間にわたって、外界温度、例えば、１８〜３５℃の温度で行われる。
【００４８】
Ｊａｓｍｉｎｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅまたはホワイトジャスミン（または一般的なジャスミン）は、香りの強いたくさんの花を夏の間ずっとつける、落葉性から半永存性（ｓｅｍｉ−ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ）の葉を有するＯｌｅａｃｅａｅ科の蔓性の低木である。
【００４９】
ジャスミン花頭（植物の一部としての花を含み、数センチメートルの茎を伴う）は、好ましくは、Ｊａｓｍｉｎｕｍ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ、Ｊａｓｍｉｎｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ、Ｊａｓｍｉｎｕｍ  ｏｄｏｒａｔｉｓｓｉｍｕｍ、Ｊａｓｍｉｎｕｍ  ｓａｍｂａｃ、Ｊａｓｍｉｎｕｍ  ａｕｒｉｃｕｌａｔｕｍ、Ｊａｓｍｉｎｕｍ  ｆｌｅｘｉｌｅ種のうちの１つ、好ましくは、Ｊａｓｍｉｎｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅの花頭から選択される。ジャスミンは、好ましくは、Ｊａｓｍｉｎｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ種に属する。
【００５０】
ジャスミン花頭は、好都合に、全体が使用され、乾燥され、Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの水性抽出物中で浸軟するために放置される。
【００５１】
濾過後の、そのようにして得られたＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａとジャスミン花頭との相乗作用的抽出物は、２６．８〜３０．８ｇ／ｋｇの乾物含有量、１．３〜２．３ｇ／ｋｇのタンパク質濃度および２５．３〜２９．３ｇ／ｋｇの糖類（主としてキシロース）濃度を有する。
【００５２】
次いで、その抽出物は、１種以上の生理的に許容され得る溶媒（例えば、水、グリセロール、エタノール、プロパンジオール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシル化もしくはプロポキシル化ジグリコール、環状ポリオールまたはこれらの溶媒の任意の混合物）に希釈され得る。好ましくは、その抽出物は、水およびキシリトールに希釈されて、キシリトールが３０ｗｔ％の最終的な抽出物をもたらす。次いで、本発明に係る相乗作用的抽出物は、２８０〜３２０ｇ／ｋｇの乾物濃度、８〜１２ｇ／ｋｇの糖類濃度およびｐＨ４〜５を特徴とする。
【００５３】
本発明は、第２に、Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａとジャスミン花頭との相乗作用的抽出物を得る方法に関し、その方法は、以下の工程を含む：
−ある量のＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａを、１０／１〜５０／１という水とＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａ（乾燥重量）との重量比で水に溶解する工程；
−Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの水溶液を４０〜８０℃の温度においてカルボヒドラーゼおよびエンドプロテアーゼで加水分解する工程；
−ジャスミン花頭を、先に得られたＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの水性抽出物中で浸軟する工程（ここで、その藻類の乾燥重量と花頭の乾燥重量との重量比は、４０／６０〜９５／５である）；
−浸軟され得られた生成物を濾過し、次いで、２〜２４時間にわたって、４０〜９０℃の温度で加熱することにより、カルボヒドラーゼおよびエンドプロテアーゼ酵素を不活性化する工程。
【００５４】
特定の実施形態によると、本発明に係るＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａとジャスミン花頭との相乗作用的抽出物を得るための方法は、以下の工程を含む：
ａ）乾燥され、フレークの形態に細かく粉砕された、ある量のＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａを、１０／１〜５０／１、好ましくは、２０／１〜４０／１という水とＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａとの重量比で水に溶解する工程、
ｂ）Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの水溶液をカルボヒドラーゼおよびエンドプロテアーゼで加水分解する工程であって、好ましくは、キシラナーゼおよびブロメラインを用いて、３〜６、好ましくは、４〜５．５、さらにより好ましくは、４〜４．５のｐＨ、４０〜８０℃、好ましくは、５０〜６０℃、さらにより好ましくは、５５℃の温度で、少なくとも１時間、好ましくは、２時間にわたって行われる工程；
ｃ）必要に応じて濾過助剤の添加および遠心分離を行った後、Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの水性抽出物を得る工程；
ｄ）乾燥されたジャスミン花頭を、少なくとも２時間かつ長くとも４時間にわたって、外界温度において、工程ｃ）で得られたＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの水性抽出物中で浸軟する工程（ここで、その藻類の乾燥重量と花頭の乾燥重量との重量比は、４０／６０〜９５／５であり、好ましくは、その藻類の乾燥重量と花頭の乾燥重量との重量比は、９０／１０に等しい）；
ｅ）工程ｄ）においてそのようにして得られた浸軟された生成物を濾過することにより、Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａおよびジャスミン花頭の抽出物を回収する工程であって、少なくとも２時間かつ最長２４時間、好ましくは、１２時間または一晩にわたって、４０〜９０℃、好ましくは、８０℃の温度において、加熱することにより、カルボヒドラーゼおよびエンドプロテアーゼ酵素を不活性化する工程；および
ｆ）それを必要に応じて濾過によって精製することにより、Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａとジャスミン花頭との相乗作用的抽出物を得る工程。
【００５５】
工程ｄ）において、ジャスミン花頭は、必ずしも、グリコールまたはより一般的にはアルコール、例えば、メタノールを含む媒質中で浸軟されず；水のみに基づく液体媒質の使用が好ましい。さらに、その花をＰａｌｍａｒｉａの水性抽出物中で浸軟する工程は、その花からフェノール化合物および炭水化物を抽出するための従来技術において時折認められる酵素加水分解の工程を必ずしも含むわけではない。酵素加水分解は、ジャスミンの花を添加する前のＰａｌｍａｒｉａの水性抽出物に対して行われる。
【００５６】
工程ｂ）およびｅ）の後、得られる溶液は、濁っていることがある。遠心分離および濾過の工程を行うことにより、懸濁された固体残渣が除去される。Ｃｅｌａｔｏｍ（登録商標）などの濾過助剤をその混合物に添加してもよく、次いで、濾過工程を行うことにより、固体が液相から分離され、固体が廃棄される。次いで、数回の連続的な濾過工程が、多孔度を低下させたフィルターにおいて行われ得る。回収された濾液は、多糖類が豊富なＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの抽出物となる。
【００５７】
Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの酵素加水分解、および残留酵素の不活性化後のＰａｌｍａｒｉａの抽出物中でのジャスミン花頭の浸軟に由来する濾液は、本発明に係る活性な相乗作用的抽出物の第１の形態、または第１の濾液となる。この段階において、第１の濾液は、例えば、２６．８〜３０．８ｇ／ｋｇの乾物濃度、１．３〜２．３ｇ／ｋｇのタンパク質化合物含有量および２５．３〜２９．３ｇ／ｋｇの糖含有量を有する。
【００５８】
次いで、この第１の活性な濾液は、１種以上の生理的に許容され得る溶媒（例えば、水、グリセロール、エタノール、プロパンジオール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシル化もしくはプロポキシル化ジグリコール、環状ポリオールまたはこれらの溶媒の任意の混合物）で希釈され得る。好ましい実施形態では、第１の活性な濾液は、３０％のキシリトールを含む第２の濾液または最終的な抽出物が得られるように、溶媒混合物で希釈される。また、本発明に係る相乗作用的抽出物は、０．５％安息香酸ナトリウムを用いて、夾雑物から保護され得る。
【００５９】
次いで、溶媒に希釈された第２の濾液は、滅菌条件下で濾過され、低温、好ましくは、６５℃において一晩、完全な滅菌のために低温殺菌され得る。
【００６０】
この実施形態に従って、本発明に係る相乗作用的抽出物を構成する最終的な濾液が得られる。本発明に従って得られた相乗作用的抽出物は、その物理化学的特徴および化合物の含有量を測定するための、当業者に知られている従来の手法によって、定性的および定量的に解析され得る。
【００６１】
好ましくは、第１の活性な濾液が、３０％のキシリトールを含んでいるとき、本発明に係る相乗作用的抽出物は、２８０〜３２０ｇ／ｋｇの乾物濃度、８〜１２ｇ／ｋｇの糖類濃度およびｐＨ４〜５を特徴とする。
【００６２】
本発明は、第３に、生理的に許容され得る媒質中に、本発明に係る相乗作用的抽出物を、組成物の総重量の０．０００１％〜２０％の乾燥重量濃度、好ましくは、組成物の総重量の０．０５％〜５％の乾燥重量濃度で含む、皮膚老化の徴候に対抗するための組成物に関する。
【００６３】
「生理的に許容され得る」は、本発明に係る相乗作用的抽出物または前記作用物質を含む組成物が、毒性または不耐の反応を引き起こさずに、皮膚または粘膜との接触に適していることを意味する。
【００６４】
本発明に係る相乗作用的抽出物は、美容的担体または薬学的担体（例えば、リポソームまたは化粧品の分野において使用される他の任意のマイクロカプセル）に被包され得るかもしくは含められ得るか、または粉末の形態の有機ポリマー上もしくは無機物支持体（例えば、タルクおよびベントナイト）上に吸着され得る。
【００６５】
これらの組成物は、特に、水性、水性−アルコール性または油性の溶液；水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョンまたは多重エマルジョンの形態であり得；それらは、皮膚、粘膜、口唇および／または付属器への適用に適した、クリーム、懸濁液または粉末の形態でもあり得る。これらの組成物は、ほぼ流動性であり得、クリーム、ローション、ミルク、セラム、軟膏、ゲル、ペーストまたはフォームの外観を有する。それらは、固体の形態（例えば、スティック）であってもよいし、エアロゾルの形態で皮膚に適用されてもよい。それらは、スキンケア製品および／またはスキンメーキャップ製品として使用され得る。
【００６６】
これらの組成物はさらに、想定される応用分野において通常使用される任意の添加物ならびにそれらの製剤化に必要な助剤（例えば、溶媒、共溶媒（エタノール、グリセロール、ベンジルアルコール）、増粘剤、希釈剤、抗酸化剤、染料、日焼け止め（ｓｕｎ  ｆｉｌｔｅｒｓ）、セルフタンニング剤、色素、充填剤、保存剤、香料、臭気吸収剤（ｏｄｏｒ  ａｂｓｏｒｂｅｒｓ）、美容的または薬学的活性成分、精油、ビタミン、必須脂肪酸、界面活性剤、微量元素、フィルム形成ポリマー、化学的または無機物フィルター、水和剤または温泉水、ポリマー（例えば、多糖類またはポリペプチド、メチルセルロース型のセルロース誘導体もしくはヒドロキシプロピルセルロース、または合成ポリマー、ポロキサマー、カルボマー、シロキサン、ＰＶＡもしくはＰＶＰ））を含む。
【００６７】
すべての場合において、当業者は、これらの添加物ならびにそれらの割合が、本発明に係る組成物の必要とされる有益な特性に悪影響を及ぼさないように選択されることに注意する。これらの添加物は、例えば、組成物の総重量の０．０１〜２０％に対応し得る。本発明の組成物が、エマルジョンであるとき、油相は、組成物の総重量に対して５〜８０ｗｔ％、好ましくは、５〜５０ｗｔ％であり得る。組成物において使用される乳化剤および共乳化剤は、対象の分野において従来使用されているものから選択される。例えば、それらは、組成物の総重量に対して０．３〜３０ｗｔ％の割合で使用され得る。
【００６８】
本発明に従って使用可能な組成物は、任意の好適な経路、特に経口または外用によって適用され得、組成物の処方は、当業者によって適合される。
【００６９】
好都合にも、本発明に係る組成物は、局所的適用に適した形態である。ゆえに、これらの組成物は、生理的に許容され得る媒質、すなわち皮膚および付属器と適合性であって、すべての化粧品の形態に含まれる媒質を含まなければならない。
【００７０】
好都合にも、本発明を実行するために使用可能な組成物は、本発明に係る活性な作用物質の他に、本発明の効果と類似および／または相補的な美容的効果を有する少なくとも１つの他の活性な作用物質を含んでもよい。本発明によると、この活性な作用物質は、「さらなる活性な作用物質」と定義される。
【００７１】
例えば、さらなる活性な作用物質は、アンチエイジング剤、安定剤、美白剤（ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、水和剤、脱水剤、微小循環を支持するもの、医薬品、ピーリング剤、細胞外マトリックスを刺激する剥離剤、エネルギー代謝活性化剤、抗菌剤、抗真菌剤、鎮静剤、抗フリーラジカル剤、抗ＵＶ剤、抗にきび剤、抗炎症剤、麻酔剤、温感を提供するもの、清涼感を提供するもの、および減量剤から選択され得る。
【００７２】
これらのさらなる作用物質は、以下を含む群から選択され得る：
−ビタミンＡ、特に、レチノイン酸、レチノール、プロピオン酸レチノール、パルミチン酸レチノール、
−ビタミンＢ３、より詳細には、ニコチンアミド、ニコチン酸トコフェロール、
−ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、パンテノール、
−ビタミンＣ、特に、アスコルビン酸、アスコルビルグルコシド、テトラパルミチン酸アスコルビル、リン酸アスコルビルマグネシウムおよびリン酸アスコルビルナトリウム、
−ビタミンＥ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、ＰＰ、コエンザイムＱ１０、
−メタロプロテイナーゼ阻害剤またはＴＩＭＰ活性化剤、
−ＤＨＥＡ、その前駆体および誘導体、
−アミノ酸、例えば、アルギニン、オルニチン、ヒドロキシプロリン、ジパルミチン酸ヒドロキシプロリン、パルミトイルグリシン、ヒドロキシリジン、メチオニンおよびその誘導体、Ｎ−アシルアミノ酸化合物、
−天然ペプチドまたは合成ペプチド（ジ−、トリ−、テトラ−、ペンタ−およびヘキサペプチド、ならびにそれらの親油性誘導体、異性体、および他の種、例えば、金属イオン（例えば、銅、亜鉛、マンガン、マグネシウムなど）との複合体を含む）、例えば、ＭＡＴＲＩＸＹＬ（登録商標）、ＡＲＧＩＲＥＬＩＮＥ（登録商標）、ＣＯＬＬＡＸＹＬＴＭ、ＰＥＰＴＩＤＥ  ＶＩＮＣＩ  ０２ＴＭ、ＣＨＲＯＮＯＧＥＮＴＭ、ＬＡＭＩＮＩＸＹＬ  ＩＳＴＭ、ＰＥＰＴＩＤＥ  Ｑ１０ＴＭという名称で商業的に知られているペプチド、ＡＴＰｅｐｔｉｄｅＴＭという名称で販売されている配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＮＨ２の合成ペプチド、ＳＩＲＰｅｐｔｉｄｅＴＭという名称で販売されている配列Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎの合成ペプチド、
−植物ペプチド抽出物、例えば、ダイズ、スペルトコムギ、ブドウ、ナタネ、アマ、イネ、トウモロコシまたはエンドウマメの抽出物、
−酵母抽出物、Ａｒｔｅｍｉａ  ｓａｌｉｎａの抽出物、
−デヒドロ酢酸（ＤＨＡ）、
−合成または天然起源のフィトステロール、
−サリチル酸およびその誘導体、アルファ−およびベータ−ヒドロキシ酸、シラノール、
−アミノ糖、グルコサミン、Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、マンノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、
−ポリフェノール、イソフラボン、フラボノイドの抽出物、例えば、ブドウの抽出物、マツの抽出物、オリーブの抽出物、
−脂質（例えば、セラミドまたはリン脂質）、動物起源の油（例えば、スクアレンまたはスクアラン）；植物油（例えば、甘扁桃油、コプラ油、ひまし油、ホホバ油、オリーブ油、菜種油、落花生油、ヒマワリ油、麦芽油、トウモロコシ胚芽油、ダイズ油、綿実油、アルファルファ油、ケシ油、カボチャ油、月見草油、キビ油、オオムギ油、ライムギ油、ベニバナ油、トケイソウ油、ヘーゼルナッツ油、パーム油、杏仁油、アボカド油、キンセンカ油）；エトキシ化植物油、シアバター、
−ＵＶスクリーンおよび日焼け止め。
【００７３】
本発明の別の態様は、特に、ＳＫＰ成体皮膚幹細胞の「幹」の特徴の維持を支持することによって、皮膚の老化の徴候に対抗するための、本発明に係るＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａとジャスミン花頭との相乗作用的抽出物の美容的使用に関する。
【００７４】
本発明は、哺乳動物、特に人間に関する。
【００７５】
「皮膚老化の徴候」は、内因性および外因性の老化、例えば、しわおよび線、枯れた外観、硬度低下、やせ細り、弾性および／または緊張の喪失、くすみ、ならびにつやの喪失に起因する皮膚および付属器の外観の任意の変化だけでなく、必ずしも外観の変化に反映されない皮膚の任意の内的変化、例えば、紫外線（ＵＶ）などの外的因子によって引き起こされる皮膚内部の任意の分解も意味する。本発明に係る活性な作用物質またはそれを含む組成物は、特に、皮膚の弾性、柔軟性および硬度の喪失に対抗することを可能にする。
【００７６】
「皮膚老化の徴候に対抗する」は、その出現を遅延させること、視覚的出現を減少させること、視覚的外観を改善すること、またはそのような徴候を補正することを意味する。特に、「老化の徴候に対抗する」は、皮膚の機械的特性の改善、特に、その硬度、柔軟性および／または弾性の増大を意味する。
【００７７】
したがって、本発明はさらに、皮膚の弾性を改善するための、Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａとジャスミン花頭との相乗作用的抽出物の美容的使用に関する。
【００７８】
本発明はさらに、皮膚の弾性特性を改善するための、Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａとジャスミン花頭との相乗作用的抽出物の美容的使用に関する。
【００７９】
本発明に係る用語「皮膚」には、無毛皮膚、ならびに身体表面上に存在するケラチン性付属器のすべて、特に、毛、睫毛、眉、爪および毛髪が含まれる。
【００８０】
皮膚の永久的な再生だけでなく、ＵＶ照射または創傷などによる損傷後のそれらの修復もまた、皮膚に皮膚幹細胞またはＳＫＰと呼ばれる体性幹細胞が存在することを暗示する。この幹細胞の貯蔵量は、老化するにつれておよび外因子の攻撃的な作用の下で減少して、皮膚の再生能力が低下し、皮膚の老化の徴候の出現に寄与する。
【００８１】
「外部の攻撃因子」という表現は、環境中の攻撃因子を意味する。一例として、汚染、紫外線または刺激性の性質の製品（例えば、界面活性剤、保存剤または香料）などの因子が挙げられ得る。汚染とは、例えば、ディーゼル粒子、オゾンまたは重金属に起因する、「外側の」汚染と、特に、塗料用溶剤、接着剤または壁紙からの放出（例えば、トルエン、スチレン、キシレンまたはベンズアルデヒド）またはたばこの煙に起因し得る「内側の」汚染の両方を意味する。大気の乾燥も、皮膚乾燥の重大な原因である。
【００８２】
ここで、本発明者らは、驚いたことに、本発明に係る活性な作用物質が、ＳＫＰ細胞を保護し、それらの活性を強化することを見出した。実際に、本発明に係る抽出物は、Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの抽出物のみまたはジャスミン花頭の水性抽出物のみによる処理後に観察される活性化よりもはるかに大きい、皮膚幹細胞の「幹」の特徴に特徴的なマーカーを相乗作用的に増加させることができる。
【００８３】
したがって、相乗作用的抽出物は、太陽または乾燥した環境への曝露によって加速されるかもしれない老化によって引き起こされる皮膚の損傷を予防または修復するために化粧品組成物において活性な作用物質として使用され得る。
【００８４】
したがって、本発明の１つの態様は、皮膚の硬度、皮膚の弾性、皮膚の柔軟性および皮膚の再生速度からなる群より選択される、人間の健康な皮膚の領域の状態の少なくとも１つを改善するための、ジャスミン花頭をＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの水性抽出物中で浸軟することによって得られる前記花頭の抽出物の美容的使用に関する。
【００８５】
本発明の意味において、「美容的使用」は、治療的な使用を目的としない使用を意味する。この使用の文脈において、抽出物は、人間の健康な皮膚の一部に適用される。健康な皮膚の領域は、皮膚科医によって容易に特徴づけられ得、その皮膚科医は、いかなる疾患、いかなる皮膚障害（乾癬、湿疹またはざ瘡）またはいかなる創傷も検出しない。
【００８６】
老化している間、コラーゲン量は全体的に減少し、皮膚の硬度が失われる。この現象は、皮膚が寒冷またはＵＶ照射などの外部の攻撃因子に曝されると、促進され得る。
【００８７】
皮膚老化は、互いに無関係な生物学的原因を有する様々な徴候によって顕れることから、特定の老化の徴候を減少させるために特定の標的に対して作用する活性成分を提案することによって、皮膚の老化に対抗することが可能である。
【００８８】
これらの徴候としては、硬度低下、こわばりの増大および弾性の喪失が挙げられる。皮膚の機械的特性の劣化は、主に、皮膚の細胞外マトリックスにおけるコラーゲン量の減少に起因する。この減少は、それ自体が、互いに無関係な様々な原因に起因し、それらの原因としては、酵素によるコラーゲン分子の分解、これらの同じ分子の糖化、および線維芽細胞によるコラーゲン産生の減少が挙げられる。
【００８９】
化粧品組成物に組み込まれる、当業者に公知のアンチエイジング効果を有する生物学的活性成分は、コラーゲンの分解に関わるコラゲナーゼの活性を阻害する。コラーゲンの糖化の機構を阻害する他の活性成分も、美容的ケア製品において提案されている。これらの活性成分およびこれらの化粧品組成物は、コラーゲン線維の分解および破壊を遅らせる。そのような製品は、新しく合成される皮膚タンパク質の量を増加させることまたは細胞の再生速度を高めることはできない。
【００９０】
ゆえに、皮膚老化の徴候に対抗するためにより有効な生物学的活性成分を提案する必要がまだある。本発明の目的は、長い時間にわたって皮膚におけるコラーゲンの量を安定させるだけでなく、コラーゲンの遺伝子発現および／またはタンパク質発現を高めることも可能であり、その結果として、皮膚の機械的特性、例えば、柔軟性および弾性を改善することが可能である、植物起源の新しい抽出物を提供することである。
【００９１】
その態様の１つによると、本発明は、皮膚の柔軟性のレベル、弾性のレベルおよび／または細胞の再生速度を高めることによって皮膚の老化に対抗するための、上に記載された抽出物または上に記載された方法によって調製される抽出物の使用に関する。
【００９２】
本発明の抽出物によってもたらされる皮膚の柔軟性および弾性の増大は、コラーゲン、トロポエラスチンおよびプロコラーゲンから選択される、真皮の細胞外マトリックスの少なくとも１つのタンパク質の発現の増加と関係し得る。真皮におけるタンパク質の発現の増加は、前記タンパク質の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の増加に対応し得る。特定の実施形態において、皮膚の硬度および弾性の増大は、コラーゲンおよびエラスチンの合成の同時の増加、例えば、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、プロコラーゲンＩ、プロコラーゲンＩＩＩおよびトロポエラスチンの合成の同時の増加によって引き起こされる。
【００９３】
皮膚の細胞再生の増加は、皮膚幹細胞数の増加、および／または相乗作用的抽出物の適用前は劣化していた皮膚の結合組織の構造の修復を可能にするその機能の改善を反映し得る。特定の場合において、本発明は、線維芽細胞によって発現されるマーカーであるネスチン＋、ＯＣＴ４＋およびＳＯＸ２＋のうちの少なくとも１つの発現を増加させることによって皮膚幹細胞の幹の特徴を回復させることまたは増強することを目標としている。
【００９４】
本発明は、より詳細には、皮膚の硬度、柔軟性および／または弾性を高めることによって皮膚の老化に対抗するための、ジャスミン花頭をＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの水性抽出物中で浸軟することによって得られる前記花頭の抽出物の美容的使用に関する。硬度、柔軟性および／または弾性の増大は、真皮における線維芽細胞によるタンパク質合成を増加させることによって誘導され得る。
【００９５】
本発明は、特に皮膚幹細胞（ＳＫＰ）の幹の特徴を高めることおよび／または皮膚における皮膚幹細胞の量を増加させることによって真皮の細胞再生を高めるための、ジャスミン花頭をＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの水性抽出物中で浸軟することによって得られる前記花頭の抽出物の美容的使用にも関する。
【００９６】
本発明は、真皮の少なくとも１つのタンパク質の発現を増加させるための、上に記載された抽出物の好都合にも局所的経路による美容的使用にも関する。真皮におけるタンパク質発現の増加は、前記タンパク質の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の増加に対応し得る。このタンパク質は、例えば、コラーゲン、トロポエラスチンおよびプロコラーゲンから選択される。コラーゲンは、好ましくは、コラーゲンＩまたはコラーゲンＩＩＩである。プロコラーゲンは、好ましくは、プロコラーゲンＩまたはプロコラーゲンＩＩＩである。特定の実施形態において、本発明は、プロコラーゲンＩのタンパク質発現、コラーゲンＩＩＩのタンパク質発現およびトロポエラスチンのタンパク質発現を同時に増加させるための、上記抽出物の使用に関する。
【００９７】
真皮のコラーゲンの発現の増加は、本発明に係る抽出物の非存在下において測定されたコラーゲンのタンパク質発現レベルと比べて少なくとも１５％のコラーゲンのタンパク質発現レベルの増加であり得る。この増加は、好ましくは、成体ドナーの線維芽細胞から得られた線維芽細胞およびＳＫＰまたはＳＫＰ様型の皮膚幹細胞を含む真皮等価物において、その真皮等価物の重量の０．０１％程度の重量のある量の乾燥した抽出物を用いて測定される。例えば、それは、例えば落射蛍光顕微鏡での観察による検出を用いる免疫標識法による、実施例５に記載されているようなプロトコルに従って測定される、真皮等価物における少なくとも１５％のトロポエラスチンのタンパク質発現レベルの増加と必要に応じて組み合される、例えば落射蛍光顕微鏡での観察による検出を用いる免疫標識法による、実施例３に記載されているようなプロトコルに従って測定される、真皮等価物における少なくとも２０％のプロコラーゲンＩおよびコラーゲンＩＩＩのタンパク質発現レベルの増加である。
【００９８】
柔軟性および／または弾性の増大は、それぞれ本発明に係る抽出物の適用前に測定された皮膚サンプルの柔軟性または弾性のレベルと比べたときの、少なくとも１５％の増大であり得る。柔軟性および弾性の増大は、培養液の重量の０．０１ｗｔ％程度の乾燥重量に等価なある量の抽出物を用いて、線維芽細胞およびＳＫＰまたはＳＫＰ様型の皮膚幹細胞を含む真皮等価物において、バリストメーター（ｂａｌｌｉｓｔｏｍｅｔｅｒ）を使用して測定され得る。
【００９９】
弾性測定の方法は、所定の高さから皮膚サンプル上に落としたボールの振動を追跡することからなる。放たれたボールの侵入の深さ（押込みと呼ばれる）は、皮膚の剛性およびその結果として柔軟性を測定することを可能にする。実際に、ボールの侵入が深いほど、皮膚の剛性は低い。弾性は、振動ピークの全頂点を結んだ曲線の傾き（アルファと呼ばれる）を計算することによって評価される。皮膚が弾性であるほど、ボールはより弾み、傾きは小さい。
【０１００】
剛性の低下としても表現され得る柔軟性の増大は、例えば、特に実施例６のプロトコルに従って、線維芽細胞およびＳＫＰまたはＳＫＰ様型の皮膚幹細胞を含む真皮等価物に対して弾性測定方法を用いて、本発明に係る抽出物の適用前に測定された押込みと比べたときの、少なくとも１５％の押込みの減少である。
【０１０１】
弾性の増大は、例えば、特に実施例６のプロトコルに従って、線維芽細胞およびＳＫＰまたはＳＫＰ様型の皮膚幹細胞を含む真皮等価物に対して弾性測定方法を用いて、本発明に係る抽出物の適用前に測定された傾きアルファと比べたときの、傾きアルファの少なくとも１５％の増加である。
【０１０２】
皮膚の細胞再生の増大は、培養液の重量の０．０１ｗｔ％程度の乾燥重量に等価な量で使用される、本発明の抽出物の適用前および適用後のインビトロで培養された線維芽細胞によって発現されたＳＯＸ２、ネスチンおよび／またはＯＣＴ４のｍＲＮＡ量を比較することによる、定量的ＰＣＲの方法によって測定される、線維芽細胞におけるマーカーであるネスチン、ＯＣＴ４およびＳＯＸ２のうちの少なくとも１つの発現の増加であり得る。線維芽細胞におけるＳＯＸ２、ネスチンおよびＯＣＴ４のｍＲＮＡの発現の増加は、好ましくは、それぞれ少なくとも２５０％、少なくとも１００％および少なくとも２５０％である。
【０１０３】
本発明は、皮膚の硬度、柔軟性および／もしくは弾性を高めるためまたは皮膚の再生速度を高めるために、上に記載されたような相乗作用的抽出物を被験体の健康な皮膚上に適用する工程からなる美容的ケア方法にも関する。
【０１０４】
美容的ケアのこれらの方法およびこれらの使用に特有の実施形態も、上記の説明に由来する。
【０１０５】
本発明の他の利点および特徴は、以下に与えられる例証的な非限定的な実施例を読むと、より詳細に理解され得る。
【０１０６】
すべての図面において、グラフ表示のために使用された数値は、３つの測定値の平均値である。エラーバーは、平均標準偏差に基づく計算値であるＲＱｍｉｎおよびＲＱｍａｘに対応する：＊＊＊：極めて有意；＊＊：非常に有意、＊：有意（ダネットの検定において）。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】線維芽細胞に種々の抽出物を適用した後のＳＯＸ２、ネスチンおよびＯＣＴ４のｍＲＮＡのｑＰＣＲ。グラフ表示に使用された数値は、３つの測定値の平均値である。エラーバーは、平均標準偏差に基づく計算値であるＲＱｍｉｎおよびＲＱｍａｘに対応する：＊＊＊：極めて有意；＊＊：非常に有意、＊：有意（ダネットの検定において）。
【０１０８】
【図２】ＳＫＰ細胞を含む真皮等価物に、実施例１に記載の１％の相乗作用的抽出物を適用した後の、細胞外マトリックスのタンパク質（プロコラーゲンＩおよびコラーゲンＩＩＩ）の発現。グラフ表示に使用された数値は、３つの測定値の平均値である。エラーバーは、平均標準偏差に基づく計算値であるＲＱｍｉｎおよびＲＱｍａｘに対応する：＊＊＊：極めて有意；＊＊：非常に有意、＊：有意（ダネットの検定において）。
【０１０９】
【図３】ＳＫＰ様細胞を含む真皮等価物に、実施例１に記載の１％の相乗作用的抽出物を適用した後の、コラーゲンＩＩＩの発現。（平均値＋／−ＳＥＭ；ｎ＝６、１条件あたり３つの真皮および真皮等価物１つあたり２枚の写真）。＊：スチューデントの「ｔ」検定−片側仮説において有意。
【０１１０】
【図４】実施例１に記載の１％の相乗作用的抽出物を適用した後の、ＳＫＰ様細胞を含む真皮等価物の収縮の測定。（平均値＋／−ＳＥＭ；ｎ＝３つの真皮等価物）。＊＊：スチューデントの「ｔ」検定−片側仮説において非常に有意。
【０１１１】
【図５】実施例１に記載の１％の相乗作用的抽出物を適用した後の、ＳＫＰ様細胞を含む真皮等価物におけるトロポエラスチン線維の合成の測定。（平均値＋／−ＳＥＭ；ｎ＝１０〜１２、真皮等価物１つあたり３〜４枚の写真）。＊：スチューデントの「ｔ」検定−片側仮説において有意。
【０１１２】
【図６】実施例１に記載の１％の相乗作用的抽出物を適用した後の、ＳＫＰ様細胞を含む真皮等価物の剛性および弾性の測定。（平均値＋／−ＳＥＭ；ｎ＝１５、真皮等価物１つあたり５つの測定値）。＊：スチューデントの「ｔ」検定−片側仮説において有意。
【０１１３】
【図７】実施例１の相乗作用的抽出物によるマーカーＳＯＸ２およびネスチンの活性化の前および後の光学顕微鏡による観察の写真（倍率＊４０）。
【０１１４】
以下の実施例に示される結果のすべてが、スチューデントまたはダネットの検定によると統計学的に有意である（ｐ＜０．０５）。
【実施例】
【０１１５】
実施例１：Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａとジャスミン花頭との相乗作用的抽出物の調製
【０１１６】
１８０ｇの、フレークの形態のＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａを４ｋｇの水に溶解し、ｐＨをＨＣｌで４．５〜５．５の値に調整する。
【０１１７】
Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａから糖類を抽出するために、加水分解酵素およびプロテアーゼを用いて、加水分解を行う。このために、７．２ｇのキシラナーゼおよび３．６ｇのブロメラインを反応混合物に添加する。次いで、その反応混合物を５５℃で２時間加熱する。
【０１１８】
濾過工程により、固体残渣を廃棄することおよび炭水化物が豊富な濾液だけを維持することができる。このために、１０ｇ／ｋｇのＣＥＬＡＴＯＭ（登録商標）（濾過助剤）を添加し、溶液を４０００ｒｅｖ／分で１０分間遠心する。遠心分離の後、残留固体を除去し、次いで、濾液をセルロースフィルターでの濾過によって様々な程度に清澄化する。
【０１１９】
第２の工程では、２０ｇのＪａｓｍｉｎｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅの花を、得られた約３．６ｋｇの濾液に添加し、浸軟を外界温度で２時間行う。
【０１２０】
１０ｇ／ｋｇのＣＥＬＡＴＯＭ（登録商標）を混合物に添加し、濾過によって濾液から固体を分離する。
【０１２１】
次いで、濾液（Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの酵素加水分解およびジャスミン花頭の浸軟に由来する）を８０℃で一晩加熱して、残留酵素を不活性化する。
【０１２２】
次いで、その溶液を、フィルターの多孔度を低下させながら、濾過により精製して、明るい琥珀色の透明な溶液を得る。
【０１２３】
得られた相乗作用的抽出物は、２８．８±２．０ｇ／ｋｇの乾物、１．８±０．５ｇ／ｋｇのタンパク質含有量および２７．３±２．０ｇ／ｋｇの糖類含有量によって特徴づけられる。
【０１２４】
次いで、その溶液を水で希釈し、滅菌条件において濾過し、次いで、低温で（６５℃で一晩）低温殺菌して、滅菌を完了させる。
【０１２５】
活性な相乗作用的抽出物に対応する最終産物は、１０±３．０ｇ／ｋｇの乾物、８〜１２ｇ／ｋｇの糖類含有量およびｐＨ４〜５によって特徴づけられる淡黄色の透明な溶液である。
【０１２６】
実施例２：Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの参照抽出物およびジャスミン花頭の参照抽出物と比較する、実施例１に従って得られた相乗作用的抽出物を適用した後のＳＯＸ２、ネスチンおよびＯＣＴ４のｍＲＮＡの評価
【０１２７】
この研究の目的は、ジャスミンの参照抽出物、Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの参照抽出物および実施例１に従って得られた相乗作用的抽出物で処理された後の細胞によって発現されるＳＯＸ２、ネスチンおよびＯＣＴ４のｍＲＮＡ量を比較することである。
【０１２８】
ＳＯＸ２、ネスチンまたはＯＣＴ４のｍＲＮＡレベルを、定量的ＰＣＲ（ｑ−ＰＣＲ）によって評価した。
【０１２９】
ジャスミン花頭のみに由来する抽出物およびＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａのみに由来する抽出物も、生物学的有効性の比較試験を行う目的で調製した。
【０１３０】
参照抽出物および相乗作用的抽出物は、同じ条件（水１ｋｇあたり同じレベルの乾燥植物材料、同じｐＨ、同じ濾過および清澄化の条件）において調製することに注意した。
【０１３１】
ジャスミンの参照抽出物の調製：
２０ｇのＪａｓｍｉｎｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅの乾燥した花頭を１ｋｇの水に入れ、撹拌しながら外界温度で２時間浸軟する。次いで、固体残渣を廃棄し、抽出物を清澄化するために、多孔度を低下させた（２０〜５０μｍから０．３〜０．５μｍまで）フィルターを用いる連続的な濾過を行う。
【０１３２】
得られた抽出物は、５±０．５ｇ／ｋｇの乾物を特徴とする。次に、その抽出物を、３±０．５ｇ／ｋｇの乾物という最終濃度に水で希釈した。ｐＨを４に調整する。次いで、滅菌を完了させるために、抽出物を０．２μｍフィルターでの滅菌濾過に供し、低温殺菌のために６５℃で一晩放置する。
【０１３３】
Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの参照抽出物の調製：
５０ｇのフレークの形態のＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａを１ｋｇの水に溶解する。反応混合物に添加した２ｇのキシラナーゼおよび１ｇのブロメラインを用いて、加水分解を行う。次いで、反応混合物を５５℃で２時間加熱する。濾過工程により、固体残渣を廃棄することおよび炭水化物が豊富な濾液だけを維持することができる。このために、１０ｇ／ｋｇのＣｅｌａｔｏｍ（登録商標）（遠心分離助剤）を添加し、溶液を４０００ｒｅｖ／分で１０分間遠心した。遠心分離の後、残留固体を廃棄し、次いで、上清を、７〜２０μｍまで多孔度を低下させたフィルターによる濾過によって清澄化し、８０℃で一晩維持する。翌日、抽出物を、０．３〜０．５μｍまで多孔度を低下させたフィルターで再度濾過する。得られた抽出物は、３０±２ｇ／ｋｇの乾物を特徴とする。次いで、抽出物を水で希釈して、２０±２ｇ／ｋｇの乾物を得る。次いで、ｐＨを４〜４．５に調整する。
【０１３４】
次いで、抽出物を０．２μｍフィルターでの滅菌濾過に供し、低温殺菌のために６５℃で一晩放置して、滅菌を完了させる。
【０１３５】
ｍＲＮＡを評価するためのプロトコル：正常なヒト線維芽細胞を、先に調製され、培養液（）で１％ｖｏｌ／ｖｏｌに希釈された様々な抽出物で処理する。並行して、線維芽細胞の培養物を処理せずに放置して、無処理コントロールとする。５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃において培養を行う。
【０１３６】
このインキュベーションの終わりに、全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ，７４１０４）を用いて抽出し、ＲＮＡｓｅの阻害剤を含むＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，４３６８８１４）を用いて逆転写する。Ｓｔｅｐ  Ｏｎｅ  Ｐｌｕｓサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、定量的ＰＣＲを行う。標的であるＳＯＸ２、ネスチンおよびＯＣＴ４のプライマーおよびプローブ、ならびに内在性コントロール１８Ｓのプライマーおよびプローブは、Ｔａｑｍａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、１８Ｓに対してＨｓ９９９９９９０１＿ｓ１；ＳＯＸ２に対してＨｓ０１０５３０４９＿ｓ１、ネスチンに対してＨｓ００７０７１２０＿ｓ１およびＯＣＴ４に対してＨｓ００９９９６３２＿ｇ１）から入手し、滅菌水およびマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で希釈する。
【０１３７】
結果：
結果は、図１に示されているように、無処理コントロールと比べて、１％のＰａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの参照抽出物で処理された線維芽細胞において、ＳＯＸ２、ネスチンおよびＯＣＴ４のｍＲＮＡ発現のそれぞれ２９％、２６％および３４％という統計学的に有意な増加を示す。
【０１３８】
ジャスミンのみの抽出物を用いたとき、刺激は観察されなかった。
【０１３９】
線維芽細胞を、実施例１に従って得られた１％の相乗作用的抽出物で処理した場合、結果は、増加が、無処理コントロールと比べて、それぞれＳＯＸ２のｍＲＮＡ発現が２９６％、ネスチンのｍＲＮＡ発現が１２３％およびＯＣＴ４のｍＲＮＡ発現が２８５％という増加で、Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａの抽出物で先に観察された増加よりもかなり大きいことを示す。
【０１４０】
結論：
実施例１に従って得られた相乗作用的抽出物で前処理された線維芽細胞では、無処理コントロール細胞、ジャスミンの参照抽出物および藻類の参照抽出物と比べて、ＳＯＸ２、ネスチンおよびＯＣＴ４のより高いｍＲＮＡレベルが観察される。実施例１に従って得られた相乗作用的抽出物は、皮膚細胞の「幹」の特徴に特徴的なマーカーの相乗作用的な増加をもたらす。
【０１４１】
実施例３：ヒト線維芽細胞およびＳＫＰ細胞を含む真皮等価物におけるプロコラーゲンＩおよびコラーゲンＩＩＩの発現に対する、実施例１に従って得られた相乗作用的抽出物の活性化作用の実証
【０１４２】
この研究の目的は、以下の細胞外マトリックスタンパク質：プロコラーゲンＩおよびコラーゲンＩＩＩの発現に対する、実施例１に従って得られた相乗作用的抽出物の作用を明らかにすることである。
【０１４３】
このために、重合ウシコラーゲンＩ、ヒト線維芽細胞およびＳＫＰ幹細胞からなる再構成された真皮等価物から開始して、特異的な標識を行った。
【０１４４】
免疫標識プロトコル：ヒト線維芽細胞を成体ドナーの皮膚外植片から取り出した。この実験において使用されたＳＫＰ細胞は、包皮から得た。培養中のＳＫＰ細胞を、培養液で１／１００希釈された（すなわち１％ｖｏｌ／ｖｏｌの）実施例１に記載の抽出物で７日間、１日に２回、前処理した。実施例１において得られた抽出物は、約１０ｇ／ｋｇの乾燥重量を有するので、その抽出物は、培養液の重量の約０．０１ｗｔ％で試験される。このモデルでは、抽出物の直接的な作用を確かめるために、真皮等価物に組み込む前の幹細胞を抽出物で刺激する。ＳＫＰ細胞の無処理コントロールとするために、並行して、ＳＫＰ細胞の培養物を処理せずに維持する。５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃において培養を行う。
【０１４５】
球状体（ｓｐｈｅｒｅｓ）の形態で培養されたＳＫＰ細胞と、ＳＫＰ細胞の１球状体に対して１００００個の線維芽細胞という各割合で培養液に懸濁された線維芽細胞とを添加した、Ｉ型ウシコラーゲンの溶液を混合することによって、真皮等価物を調製した。その混合物を慎重に均質化し、６ウェルプレートのウェルに分配する。コラーゲンＩの重合を行って、真皮等価物を形成させる。その真皮等価物を、その混合物の体積に対して１％の濃度の、実施例１に従って得られた相乗作用的抽出物で５日間、１日に２回処理し、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃において維持する。
【０１４６】
サンプルを１０％パラホルムアルデヒドで固定し、一連のエタノール浴およびキシレン浴（Ｓｈａｎｄｏｎ）の後、パラフィンに包埋する。
【０１４７】
４μｍの厚さの切片に対して免疫標識を行う。
【０１４８】
プロコラーゲンＩの場合、組織を、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６（Ｓｉｇｍａ）中の６００Ｗにおけるマイクロ波アンマスキングに供した後、ペプシン０．２５％で酵素処理する（３７℃で１５分；Ｚｙｍｅｄ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
【０１４９】
コラーゲンＩＩＩの免疫標識のための組織切片の処理の場合は、６００Ｗでマイクロ波アンマスキングを行った後、０．５％トリプシンで酵素処理する（３７℃で１５分、Ｚｙｍｅｄ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
【０１５０】
３０分間の飽和の後、切片を、プロコラーゲンＩに特異的なラットモノクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、コラーゲンＩＩＩに特異的なウサギポリクローナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）および次いで蛍光色素に結合された抗ラット二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または蛍光色素に結合された抗ウサギ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下においてインキュベートする。次いで、真皮等価物の切片を、落射蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ８０ｉ顕微鏡）を用いて調べる。
【０１５１】
１条件あたり３枚の写真を、Ｖｏｌｏｃｉｔｙ画像解析ソフトウェア（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ）で定量的に解析する。
【０１５２】
ＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳ）を用いて統計解析を行う。
【０１５３】
結果：
結果は、図２に示されているように、ＳＫＰ細胞を含まない無処理コントロールと比べて、ＳＫＰ細胞を含む無処理の真皮等価物において、コラーゲンＩおよびコラーゲンＩＩＩの新しく合成されたタンパク質の発現の１８％および２３％という有意な増加を示した。
【０１５４】
実施例１に従って得られた１％の相乗作用的抽出物で、ＳＫＰ細胞を含む真皮等価物のサンプルを処理することにより、ＳＫＰ細胞を含む無処理コントロールと比べて、プロコラーゲンＩおよびコラーゲンＩＩＩがそれぞれ２５％および２９％増加した。
【０１５５】
結論：
ＳＫＰ皮膚幹細胞を含む真皮等価物における、実施例１に従って得られた１％の相乗作用的抽出物の適用は、プロコラーゲンＩおよびコラーゲンＩＩＩの発現を刺激する。
【０１５６】
実施例４：ヒト線維芽細胞およびＳＫＰ様細胞を含む真皮等価物における皮膚の収縮およびコラーゲンＩＩＩの発現に対する、実施例１に従って得られた相乗作用的抽出物の活性化作用の実証
【０１５７】
Ｗｅｎｚｅｌら（Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ．１：５１６−５２６，２０１２）およびＨｉｌｌら（Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１２，Ｖｏｌ．７，Ｉｓｓｕｅ  １１，ｅ５０７４２）は、寒冷ストレスをインビトロで成体ドナー線維芽細胞に適用した後に、ＳＫＰ様細胞が単離できることを実証した。
【０１５８】
この研究の目的は、同じドナーから得られた線維芽細胞およびＳＫＰ様細胞を含むコラーゲンの真皮等価物における、真皮等価物の収縮およびコラーゲンＩＩＩの発現に対する実施例１に従って得られた相乗作用的抽出物の作用を明らかにすることである。
【０１５９】
真皮等価物の収縮は、コラーゲンミクロフィブリルに結合し、それらを１つの同じ方向に向け、細胞外マトリックスの密度を高める、線維芽細胞の収縮活性に関連するプロセスである。直径は、数日後に安定する。細胞外マトリックスの特定のタンパク質の合成をモニターするために、再構成された真皮等価物から開始して、免疫標識を行った。
【０１６０】
プロトコル：ヒト線維芽細胞を成体ドナーの皮膚外植片から取り出した。ＳＫＰ様細胞を作製するために、培養中のこれらの線維芽細胞の一部を寒冷ストレス（４℃、一晩）に供した。そのようにして得られたＳＫＰ細胞と同じ特徴を有する細胞を、本明細書中では「ＳＫＰ様」と呼ぶ。この実験において使用されたＳＫＰ様細胞を、培養液で１／１００希釈された（すなわち１％ｖｏｌ／ｖｏｌの）、実施例１に従って得られた相乗作用的抽出物で６日間、１日に２回処理する。並行して、無処理ＳＫＰ様コントロールとするために、ＳＫＰ様培養物を処理せずに維持する。５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃において培養を行う。
【０１６１】
真皮等価物を、多細胞性球状体の形態で培養されたＳＫＰ様細胞を添加したＩ型ウシコラーゲンの混合物を用いて調製した。そのＳＫＰ様細胞および線維芽細胞は、１つの球状体に対して１００００個の線維芽細胞という割合で含めた。コラーゲンＩ／細胞のマトリックス混合物を６ウェルプレートのウェルに分配する。重合したら、真皮等価物を培地中で浮遊培養する。真皮等価物を、実施例１に従って得られた１％の濃度の相乗作用的抽出物で５日間、１日に２回処理し、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃において維持する。実施例１からの抽出物は、約１０ｇ／ｋｇの乾燥重量を有するので、その抽出物は、培養液の重量の約０．０１ｗｔ％で試験される。
【０１６２】
毎日、１条件あたり３つの真皮等価物に対して、培養物を写真撮影し、次いで画像解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ｊ）を用いて定量することによって、真皮等価物の直径の減少に反映される皮膚収縮をモニターする。
【０１６３】
培養の完了時に、組織を１０％パラホルムアルデヒドで固定し、一連のエタノール浴およびキシレン浴（Ｓｈａｎｄｏｎ）の後、パラフィンに包埋する。
【０１６４】
４μｍの厚さの切片に対して免疫標識を行った。
【０１６５】
コラーゲンＩＩＩの場合、切片をマイクロ波アンマスキングにかけた後、トリプシン０．５％で酵素処理した（３７℃で１５分；Ｚｙｍｅｄ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。３０分間の飽和の後、切片を、コラーゲンＩＩＩに特異的なウサギポリクローナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）および次いで蛍光色素に結合された抗ウサギ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下においてインキュベートする。次いで、真皮等価物の切片を、落射蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ８０ｉ顕微鏡）を用いて調べる。
【０１６６】
１条件あたり３枚の写真を、Ｖｏｌｏｃｉｔｙ画像解析ソフトウェア（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ）で解析する。
【０１６７】
ＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳ）を用いて統計解析を行う。
【０１６８】
結果：結果は、図３に示されているように、ＳＫＰ様細胞を含む無処理コントロールと比べて、実施例１に従って得られた１％の相乗作用的抽出物で処理された真皮等価物において、コラーゲンＩＩＩのタンパク質発現の２９％という有意な増加を示した。
【０１６９】
真皮等価物の直径の解析から、図４に示されているように、ＳＫＰ様細胞を含む無処理コントロールと比べて、実施例１に従って得られた相乗作用的抽出物での４日間の処理の後、真皮等価物の収縮性の非常に有意な増加が示された。
【０１７０】
結論：成体ドナーの線維芽細胞から得られた皮膚「幹」細胞（ＳＫＰ様細胞）を含む真皮等価物における、実施例１に従って得られた１％の相乗作用的抽出物の適用は、その組織の収縮性を改善し、コラーゲンＩＩＩの発現を刺激する。
【０１７１】
実施例５：ヒト線維芽細胞およびＳＫＰ様細胞を含む真皮等価物におけるトロポエラスチン線維の合成に対する、実施例１に従って得られた相乗作用的抽出物の活性化作用の実証
【０１７２】
この研究の目的は、同じドナーから得られた線維芽細胞およびＳＫＰ様細胞を含むコラーゲンの真皮等価物におけるトロポエラスチン線維の合成に対する、実施例１に従って得られた相乗作用的抽出物の作用を明らかにすることである。線維芽細胞から開始してトロポエラスチン線維の合成をモニターするために、再構成された真皮等価物から開始して、免疫標識を行った。
【０１７３】
プロトコル：同じドナーから得られた線維芽細胞およびＳＫＰ様細胞を含むコラーゲンの真皮等価物を、処理以外は実施例５に明記されたものと同じプロトコルに従って調製した。実際には、この実験において使用されたＳＫＰ様細胞を、培養液で１／１００希釈された（すなわち１％ｖｏｌ／ｖｏｌの）、実施例１に従って得られた相乗作用的抽出物で５日間、１日に２回処理する。真皮等価物を、実施例１に従って得られた１％の濃度の相乗作用的抽出物で６日間、１日に２回処理する。実施例１において得られた抽出物は、約１０ｇ／ｋｇの乾燥重量を有するので、抽出物は、培養液の重量の約０．０１ｗｔ％で試験される。
【０１７４】
培養の完了時に、組織を１０％パラホルムアルデヒドで固定し、一連のエタノール浴およびキシレン浴（Ｓｈａｎｄｏｎ）の後、パラフィンに包埋する。
【０１７５】
４μｍの厚さの切片に対して免疫標識を行った。
【０１７６】
切片を、０．５％トリプシンでの酵素処理（３７℃で１５分；Ｚｙｍｅｄ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるアンマスキングにかけた。３０分間の飽和の後、切片を、トロポエラスチンに特異的なウサギポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）、次いで、蛍光色素に結合された抗ウサギ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下においてインキュベートする。次いで、真皮等価物の切片を、落射蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ８０ｉ顕微鏡）を用いて調べる。
【０１７７】
１条件あたり１０〜１２枚の写真を解析する。強い蛍光を有する細胞の数および細胞の総数を数える。
【０１７８】
ＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳ）を用いて統計解析を行う。
【０１７９】
結果：結果は、図５に示されているように、ＳＫＰ様細胞を含む無処理コントロールと比べて、実施例１に従って得られた１％の相乗作用的抽出物で処理された真皮等価物においてトロポエラスチン線維の合成の１９％という有意な増加を示した。
【０１８０】
結論：成体ドナーの線維芽細胞から得られた皮膚「幹」細胞（ＳＫＰ様細胞）を含む真皮等価物における実施例１に従って得られた１％の相乗作用的抽出物の適用は、弾性線維の合成を改善する。
【０１８１】
実施例６：ヒト線維芽細胞およびＳＫＰ様細胞を含む真皮等価物の弾性特性に対する、実施例１に従って得られた相乗作用的抽出物の活性化作用の実証
【０１８２】
この研究の目的は、同じドナーから得られた線維芽細胞およびＳＫＰ様細胞を含むコラーゲンの真皮等価物の弾性特性に対する、実施例１に従って得られた相乗作用的抽出物の作用を明らかにすることである。参照用のバリストメーターＢＬＳ７８０（Ｍｏｎａｄｅｒｍ）は、皮膚の弾性および剛性を測定するための装置である。それには、測定値を自動的にパラメータ表示するソフトウェアが搭載されている。
【０１８３】
プロトコル：同じドナーから得られた線維芽細胞およびＳＫＰ様細胞を含むコラーゲンの真皮等価物を、処理以外は実施例４に明記されたものと同じプロトコルに従って調製した。実際には、この実験において使用されたＳＫＰ様細胞を、培養液で１／１００希釈された（すなわち１％ｖｏｌ／ｖｏｌの）、実施例１に従って得られた相乗作用的抽出物で５日間、１日に２回処理する。真皮等価物を、実施例１に従って得られた１％の濃度の相乗作用的抽出物で１０日間、１日に２回処理する。実施例１において得られた抽出物は、約１０ｇ／ｋｇの乾燥重量を有するので、抽出物は、培養液の重量の約０．０１ｗｔ％で試験される。
【０１８４】
方法：プローブを真皮等価物の上に置く。そのプローブからボールが放たれると、そのボールは、その装置によって予め決められた一定の力で皮膚の表面上に侵入し、弾む。次いで、そのボールはいくつかの振動を起こした後、安定する。放たれたときのボールの侵入深さ（押込みと呼ばれる）によって、皮膚の剛性を測定することができる。実際に、ボールよってもたらされる押込みが深いほど、その組織は軟らかく、ゆえに、より低い剛性を有する。第２の判定基準は、皮膚の弾性の測定を可能にする、ピークの全頂点を結んだ曲線の傾き（アルファと呼ばれる）である。良好な弾性を有する皮膚の場合、ボールはより弾むので、傾きは、より低い値を有する。
【０１８５】
結果：結果は、図６に示されているように、ＳＫＰ様細胞を含む無処理コントロールと比べて、実施例１に従って得られた１％の相乗作用的抽出物で処理された真皮等価物の弾性の１９％という有意な増加を示した。並行して、コントロールと比べて、真皮等価物の剛性の１７％という有意な低下が観察された。
【０１８６】
結論：成体ドナーの線維芽細胞から得られた皮膚「幹」細胞（ＳＫＰ様細胞）を含む真皮等価物における実施例１に従って得られた１％の相乗作用的抽出物の適用は、真皮等価物の弾性特性および柔軟性を改善する。
【０１８７】
実施例７：本発明の相乗作用的抽出物を含む化粧品組成物の例
【０１８８】
Ａ−セラム
【表１】
2018538256.tif 000002
【０１８９】
調製のプロトコル：
【０１９０】
水を主容器に添加する。穏やかに均質化しながら加熱する。
【０１９１】
その水にＰｅｍｕｌｅｎ  ＴＲ−２をゆっくり注ぎ、完全に再水和するまで混合する。温度を７０°〜７５℃で維持する。
【０１９２】
いかなる塊もなくポリマーが完全に混合されたら、混合しながら保存剤を１つずつ添加する。第２の容器において、相Ｂを混合し、７５℃に加熱する。
【０１９３】
相Ｂを、均質化しながら、主容器に添加する。
【０１９４】
６０〜６５℃に冷却し、予め混合しておいた相Ｃを添加する。
【０１９５】
４０〜４５℃に冷却し、相Ｄの成分を１つずつ添加し、各添加の間に混合する。
【０１９６】
撹拌しながら室温（２５℃）まで冷却する。
【０１９７】
Ｂ−ナイトクリーム
【表２】
2018538256.tif 000003
【０１９８】
プロトコル：
【０１９９】
穏やかに均質化しながら、主容器に水を添加する。相Ａの残りの成分を１つずつ添加し、混合しながら７０〜７５℃に加熱する。
【０２００】
第２の容器において、相Ｂの成分を混合し、混合しながら７５℃に加熱する。
【０２０１】
激しく撹拌しながら（１０分）、相Ｂ（７０〜７５℃）を相Ａ（７０〜７５℃）に添加する。冷却し始める。
【０２０２】
６０〜６５℃において、その混合物に相Ｃを振りかける。十分に混合することにより、ポリマーの完全な水和物を得る（必要に応じて混合速度を上げる）。
【０２０３】
相Ｄを予め混合し；上記混合物に添加し、全部を慎重に混合することにより、均一な混合物を得る。その混合物は、より濃厚になる。冷却し続ける。
【０２０４】
ゆっくり撹拌しながら、４０℃に冷却する。相Ｅの成分を１つずつ添加し、各添加の間に十分撹拌する。室温において相Ｆを添加する。よく混合する。２５℃で停止する。
【０２０５】
Ｃ−デトックスクリーム
【表３】
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【０２０６】
プロトコル：
【０２０７】
穏やかに均質化しながら、主容器に水を添加する。Ｖｅｒｓｅｎｅを添加し、完全に溶解するまで混合する。７０〜７５℃に加熱する。
【０２０８】
第２の容器において、相Ｂの成分を混合し、混合しながら７０℃〜７５℃に加熱する。
【０２０９】
７５℃において、１０分間、強い状態で相Ｂを相Ａに添加する。冷却し始める。
【０２１０】
６０〜６５℃に冷却し、相Ｃの成分を１つずつ添加し、各添加の間に混合する。
【０２１１】
４０〜４５℃に冷却し、相Ｄの成分を１つずつ添加し、各添加の間に混合する。
【０２１２】
ゆっくり撹拌しながら、室温まで冷却する。２５℃で停止する。
【０２１３】
実施例８：ＳＫＰ様細胞におけるマーカーＳＯＸ２、ＯＣＴ４およびネスチンのタンパク質発現に対する、実施例１に従って得られた相乗作用的抽出物の活性化作用の実証
【０２１４】
この研究の目的は、幹細胞に特徴的なタンパク質：ＳＯＸ２、ＯＣＴ４およびネスチンの発現に対する、実施例１に従って得られた相乗作用的抽出物の作用を明らかにすることである。
【０２１５】
このために、パラフィンに包埋されたＳＫＰ様細胞のペレットに対して特異的な標識を行った。
【０２１６】
免疫標識プロトコル：ＳＫＰ様細胞を、成体ドナーの皮膚外植片から取り出されたヒト線維芽細胞から単離した。そのＳＫＰ様細胞を、培養液で１／１００希釈された（すなわち１％ｖｏｌ／ｖｏｌの）実施例１に記載の抽出物で２日間、１日に２回、処理した。実施例１において得られた抽出物は、約１０ｇ／ｋｇの乾燥重量を有するので、その抽出物は、培養液の重量の約０．０１ｗｔ％で試験される。５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃において培養を行う。
【０２１７】
培養の終わりに、ＳＫＰ様細胞を細胞ペレットとして調製し、１０％パラホルムアルデヒドで固定し、一連のエタノール浴およびキシレン浴（Ｓｈａｎｄｏｎ）の後、パラフィンに包埋する。
【０２１８】
４μｍの厚さの切片に対して免疫標識を行う。
【０２１９】
上記３つの免疫標識に対して、切片を、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６（Ｓｉｇｍａ）中の６００Ｗにおけるマイクロ波アンマスキングに供する。３０分間の飽和の後、切片を、ネスチンに特異的なマウスモノクローナル抗体（ａｂｃａｍ）、ＯＣＴ４またはＳＯＸ２に特異的なウサギポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）および次いで蛍光色素に結合された抗マウス二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または蛍光色素に結合された抗ウサギ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下においてインキュベートする。次いで、ＳＫＰ様細胞の切片を、落射蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ８０ｉ顕微鏡）を用いて調べる。
【０２２０】
結果：
顕微鏡法による観察（倍率＊４０）は、実施例１に従って得られた相乗作用的抽出物を適用した条件において、無処理と比べて、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４およびネスチン標識の強度の増加を示した。図７は、ＳＯＸ２およびネスチン標識に対して得られた写真を再現している。
【０２２１】
結論：
ＳＫＰ様細胞における、実施例１に従って得られた１％の相乗作用的抽出物の適用は、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４およびネスチン幹細胞マーカーの発現を刺激する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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