(57)【要約】  本開示の側面は、炎症性大腸疾患の診断および処置のために有用な遺伝子操作された生物に関する。
2018501797.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む組換えプロバイオティック細胞：
以下を含むセンサーサーキット：
（ａ）入力シグナルに応答する制御タンパク質をコードする核酸と作動可能に連結された第一のプロモーター；
（ｂ）制御タンパク質に応答し、かつ、第一の出力タンパク質をコードする核酸と作動可能に連結された第二のプロモーターであって、制御タンパク質によって結合される場合に、第二のプロモーターの活性が変えられる、前記プロモーター；
（ｃ）第三のプロモーターと作動可能に連結された出力分子であって、該出力分子または第三のプロモーターは、制御配列の第一のセットに隣接しており、該制御配列の第一のセットは、第一の出力タンパク質と作用しあって、第三のプロモーターから出力分子の連結を外す、前記出力分子；
（ｄ）制御タンパク質に応答し、かつ、第二の出力タンパク質をコードする核酸と作動可能に連結された第四のプロモーターであって、該制御タンパク質によって結合される場合に、第四のプロモーターの活性が変えられる、前記プロモーター；および、任意には、
（ｅ）プロモーター制御配列の第二のセットに隣接している第二の出力分子であって、制御配列の第二のセットは、第二の出力タンパク質と作用しあって、第二の出力分子を第五のプロモーターと作動可能に連結する、前記出力分子。
【請求項２】
（ａ）のプロモーターが、構成的に活性なプロモーターである、請求項１に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項３】
制御タンパク質が、ｏｘｙＲ、ＮｏｒＲ、およびＮｓｒＲからなる群から選択される、請求項１または２に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項４】
入力シグナルが、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項５】
入力シグナルが、一酸化窒素（ＮＯ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項６】
入力シグナルが、炎症性サイトカイン、任意にはＩＬ−６、ＩＬ−１８、またはＴＮＦαである、請求項１または２に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項７】
プロモーター（ｂ）および／または（ｄ）のプロモーターが、修飾されていない同様のプロモーターと比較して、（ｂ）および／または（ｄ）のプロモーターに関する転写因子またはＲＮＡポリメラーゼの結合親和性を変える修飾を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項８】
修飾が、核酸の突然変異である、請求項７に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項９】
（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、ベクター上にある、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項１０】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）が、ベクター上にある、請求項９に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項１１】
（ａ）および（ｂ）が、単一のベクター上にある、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項１２】
（ａ）、（ｂ）、および（ｄ）が、単一のベクター上にある、請求項１１に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項１３】
（ｃ）および／または（ｅ）が、細菌人工染色体（ＢＡＣ）上にある、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項１４】
（ｂ）および／または（ｄ）が、第一の出力タンパク質の生成を制御し、かつ、第二のプロモーターと第一の出力タンパク質をコードする核酸の間に位置される配列要素を更に含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項１５】
配列要素が、出力タンパク質の転写または翻訳を制御する、請求項１４に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項１６】
配列要素が、リボゾーム結合部位である、請求項１４または１５に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項１７】
配列要素が、修飾されていない同様のリボゾーム結合部位と比較して、修飾されたリボゾーム結合部位に関するリボゾームの結合親和性を変える修飾を含む、修飾されたリボゾーム結合部位である、請求項１６に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項１８】
（ｂ）および／または（ｄ）のプロモーターが、修飾されていない同様のプロモーターと比較して、ｏｘｙＲ、ｎｉｒ、ｈｃｐ、ｎｒｆＡ、ｎａｓＤ、ｙｔｆＥ、ｙｅａＲ、ｎｎｒＳ、およびｎｏｒＶからなる群から選択される（ｂ）のプロモーターに関する転写因子またはＲＮＡポリメラーゼの結合親和性を変える修飾を含む、ｏｘｙＲ、ｏｘｙＳｐ、ｋａｔＧｐ、ｎｉｒ、ｈｃｐ、ｎｒｆＡ、ｎａｓＤ、ｙｔｆＥ、ｙｅａＲ、ｎｎｒＳ、およびｎｏｒＶからなる群から選択されるプロモーターである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項１９】
（ｂ）および／または（ｄ）のプロモーターが、天然に存在するプロモーターである、ｏｘｙＲ、ｏｘｙＳｐ、ｋａｔＧｐ、ｎｉｒ、ｈｃｐ、ｎｒｆＡ、ｎａｓＤ、ｙｔｆＥ、ｙｅａＲ、ｎｎｒＳ、およびｎｏｒＶからなる群から選択されるプロモーターである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項２０】
（ｂ）の第一の出力タンパク質が、リコンビナーゼであり、かつ、（ｃ）の制御配列の第一のセットが、リコンビナーゼ認識部位である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項２１】
（ｄ）の第二の出力タンパク質が、リコンビナーゼであり、かつ、（ｅ）の制御配列の第二のセットが、リコンビナーゼ認識部位である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項２２】
第一の出力分子および／または第二の出力分子が、検出可能である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項２３】
第一の出力分子および／または第二の出力分子が、ＰＣＲ、ＤＮＡ塩基配列決定、または顕微鏡、任意には蛍光顕微鏡によって検出可能である、請求項２２に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項２４】
第一の出力分子および／または第二の出力分子が、治療的分子である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項２５】
第一の出力分子および第二の出力分子が、同じ分子である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項２６】
治療的分子が、抗炎症性分子である、請求項２４に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項２７】
抗炎症性分子が、サイトカイン、任意にはＩＬ−１０である、請求項２６に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項２８】
抗炎症性分子が、フェルロイル−ＣｏＡをクルクミンに変換するクルクミノイドシンターゼ（ＣＵＳ）である、請求項２６に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項２９】
細胞が、細菌細胞または真菌細胞である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項３０】
細菌細胞が、大腸菌細胞、任意にはE. coli Nissle 1917細胞である、請求項２９に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項３１】
真菌細胞が酵母菌、任意にはSaccharomyces boulardii細胞である、請求項２９に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項３２】
それを必要とする対象において、炎症性大腸疾患を処置する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のプロバイオティック細胞を投与することを含む、前記方法。
【請求項３３】
炎症性大腸疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
センサーサーキットが、生物学的アナログシグナル処理サーキットである、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
入力シグナルが、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
入力シグナルが、一酸化窒素（ＮＯ）である、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
入力分子が、炎症性サイトカイン、任意にはＩＬ−６、ＩＬ−１８、またはＴＮＦαである、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
出力分子が検出可能である、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
出力分子がＰＣＲ、ＤＮＡ塩基配列決定、または顕微鏡、任意には蛍光顕微鏡によって検出可能である、請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
出力分子が、治療的分子である、請求項３２〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
治療的分子が，抗炎症性分子である，請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
抗炎症性分子が、サイトカイン、任意にはＩＬ−１０である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
抗炎症性分子が、フェルロイル−ＣｏＡをクルクミンに変換するクルクミノイドシンターゼ（ＣＵＳ）である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
センサーサーキットが、第二の出力分子を更に含む、請求項３２〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
第二の出力分子が、第一の出力分子と同じである、請求項３２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
対象における炎症性大腸疾患を診断する方法であって、以下を含む前記方法：
（ａ）対象に請求項１〜１６のいずれか一項に記載のプロバイオティック細胞を投与すること；
（ｂ）（ａ）の対象から生体試料を得ること；
（ｃ）該生体試料中の少なくとも一つの出力分子の発現を検出すること；
および
（ｄ）炎症性大腸疾患を有するとして対象を診断すること。
【請求項４７】
プロバイオティック細胞が、腸管にコロニーを形成する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
対象が哺乳動物である、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項４９】
対象が、ヒトである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
生体試料が、糞便試料である、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
出力分子の発現が、in vitroで検出される、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
炎症性大腸疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
（ｅ）ＩＢＤの処置に有用な剤を対象に投与することを更に含む、請求項４６〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
以下を含む組換えプロバイオティック細胞：
以下を含むセンサーサーキット：
（ａ）入力シグナルに応答する制御タンパク質をコードする核酸と作動可能に連結された第一のプロモーター；および
（ｂ）制御タンパク質に応答し、かつ、第一の出力タンパク質をコードする核酸と作動可能に連結された第二のプロモーターであって、制御タンパク質によって結合される場合に、第二のプロモーターの活性が変えられる、前記プロモーター。
【請求項５５】
（ａ）のプロモーターが構成的に活性なプロモーターである、請求項１に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項５６】
制御タンパク質がｏｘｙＲ、ＮｏｒＲ、およびＮｓｒＲからなる群から選択される、請求項５４または５５に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項５７】
入力シグナルが、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項５８】
入力シグナルが、一酸化窒素（ＮＯ）である、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項５９】
入力シグナルが、炎症性サイトカイン、任意にはＩＬ−６、ＩＬ−１８、またはＴＮＦαである、請求項５４または５５に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項６０】
プロモーター（ｂ）のプロモーターが、修飾されていない同様のプロモーターと比較して、（ｂ）のプロモーターに関する転写因子のまたはＲＮＡポリメラーゼの結合親和性を変える修飾を含む、請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項６１】
修飾が、核酸の突然変異である、請求項６０に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項６２】
（ａ）および（ｂ）が、ベクター上にある、請求項５４〜６１のいずれか一項に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項６３】
（ａ）および（ｂ）が、単一のベクター上にある、請求項５４〜６２のいずれか一項に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項６４】
（ｂ）が、第一の出力タンパク質の生成を制御し、かつ、第二のプロモーターと第一の出力タンパク質をコードする核酸との間に位置される配列要素を更に含む、請求項５４〜６３のいずれか一項に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項６５】
配列要素が、出力タンパク質の転写または翻訳を制御する、請求項６４に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項６６】
配列要素が、リボゾーム結合部位である、請求項６４または６５に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項６７】
配列要素が、修飾されていない同様のリボゾーム結合部位と比較して、修飾されたリボゾーム結合部位に関するリボゾームの結合親和性を変える修飾を含む、修飾されたリボゾーム結合部位である、請求項６６に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項６８】
（ｂ）のプロモーターが、修飾されていない同様のプロモーターと比較して、ｏｘｙＲ、ｎｉｒ、ｈｃｐ、ｎｒｆＡ、ｎａｓＤ、ｙｔｆＥ、ｙｅａＲ、ｎｎｒＳ、およびｎｏｒＶからなる群から選択される（ｂ）のプロモーターに関する転写因子またはＲＮＡポリメラーゼの結合親和性を変える修飾を含む、ｏｘｙＲ、ｏｘｙＳｐ、ｋａｔＧｐ、ｎｉｒ、ｈｃｐ、ｎｒｆＡ、ｎａｓＤ、ｙｔｆＥ、ｙｅａＲ、ｎｎｒＳ、およびｎｏｒＶからなる群から選択されるプロモーターである、 請求項５４〜６７のいずれか一項に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項６９】
（ｂ）のプロモーターが、天然に存在するプロモーターである、ｏｘｙＲ、ｏｘｙＳｐ、ｋａｔＧｐ、ｎｉｒ、ｈｃｐ、ｎｒｆＡ、ｎａｓＤ、ｙｔｆＥ、ｙｅａＲ、ｎｎｒＳ、およびｎｏｒＶからなる群から選択されるプロモーターである、請求項５４〜６８のいずれか一項に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項７０】
第一の出力分子が、治療的分子である、請求項５４〜６９のいずれか一項に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項７１】
治療的分子が、抗炎症性分子である、請求項７０に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項７２】
抗炎症性分子が、サイトカイン、任意にはＩＬ−１０である、請求項７１に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項７３】
抗炎症性分子が、フェルロイル−ＣｏＡをクルクミンに変換するクルクミノイドシンターゼ（ＣＵＳ）である、請求項７１に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項７４】
４−クマラート：ＣｏＡリガーゼおよびアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼをコードする核酸を更に含む請求項７１に記載の組み換え型のプロバイオティック細胞であって、該核酸が、任意には１または２以上のベクターである、前記プロバイオティック細胞。
【請求項７５】
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼをコードする核酸が、ＡｃｃＢｃおよびＤｔｓＲ１である、請求項７４に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項７６】
４−クマラート：ＣｏＡリガーゼおよびアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼをコードする核酸が、構成プロモーターと作動可能に連結された、請求項７４または７５に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項７７】
細胞が、細菌細胞または真菌細胞である、請求項５４〜７６のいずれか一項に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項７８】
細菌細胞が、大腸菌細胞、任意にはE. coli Nissle 1917細胞である、請求項７７に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項７９】
真菌細胞が酵母菌、任意にはSaccharomyces boulardii細胞である、請求項７７に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項８０】
それを必要とする対象において、炎症性大腸疾患を処置する方法であって、それを必要とする対象に、請求項５４〜７９のいずれか一項に記載のプロバイオティック細胞を投与することを含む、前記方法。
【請求項８１】
炎症性大腸疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
以下を含む組換え細胞：
以下を含むセンサーサーキット：
（ａ）入力シグナルに応答する制御タンパク質をコードする核酸と作動可能に連結された第一のプロモーター；
（ｂ）制御タンパク質に応答し、かつ、第一の出力タンパク質をコードする核酸と作動可能に連結された第二のプロモーターであって、第二のプロモーターが、ｎｉｒ、ｈｃｐ、ｎｒｆＡ、ｎａｓＤ、ｙｔｆＥ、ｙｅａＲ、ｎｎｒＳ、またはｎｏｒＶプロモーターであり、かつ、制御タンパク質によって結合される場合に、第二のプロモーターの活性が変えられる、前記プロモーター；および
（ｃ）プロモーター制御配列の第一のセットに隣接している出力分子であって、制御配列の第一のセットが、第一の出力タンパク質と作用しあって、出力分子を第三のプロモーターと作動可能に連結する、前記出力分子。
【請求項８３】
更に以下を含む請求項８２に記載の組換え細胞：
（ｄ）制御タンパク質に応答し、かつ、第二の出力タンパク質をコードする核酸と作動可能に連結された第四のプロモーターであって、該制御タンパク質によって結合される場合に、第四のプロモーターの活性が変えられる、前記プロモーター。
【請求項８４】
更に以下を含む請求項８３に記載の組換え細胞：
（ｅ）プロモーター制御配列の第二のセットに隣接している第二の出力分子であって、制御配列の第二のセットは、第二の出力タンパク質と作用しあって、第二の出力分子を第五のプロモーターと作動可能に連結する、前記出力分子。
【請求項８５】
制御タンパク質が、ＮｓｒＲである、請求項８２に記載の組換え細胞。
【請求項８６】
制御タンパク質が、ＮｏｒＲである、請求項８２に記載の組換え細胞。
【請求項８７】
入力シグナルが、一酸化窒素（ＮＯ）である、請求項８２に記載の組換え細胞。
【請求項８８】
入力シグナルが、炎症性サイトカイン、任意にはＩＬ−６、ＩＬ−１８、またはＴＮＦαである、請求項８２に記載の組換え細胞。
【請求項８９】
（ａ）の第一のプロモーターが、構成的に活性なプロモーターである、請求項８２に記載の組換え細胞。
【請求項９０】
プロモーター（ｂ）の第二のプロモーターが、修飾されていない同様のプロモーターと比較して、（ｂ）の第二のプロモーターに関する転写因子のまたはＲＮＡポリメラーゼの結合親和性を変える修飾を含む、請求項８２に記載の組換え細胞。
【請求項９１】
修飾が、核酸の突然変異である、請求項９０に記載の組換え細胞。
【請求項９２】
（ａ）および（ｂ）が、単一のベクター上にある、請求項８２に記載の組換え細胞。
【請求項９３】
（ｂ）が、第一の出力タンパク質の生成を制御し、かつ、第二のプロモーターと第一の出力タンパク質をコードする核酸との間に位置される配列要素を更に含む、請求項８２に記載の組換え細胞。
【請求項９４】
配列要素が、出力タンパク質の転写または翻訳を制御する、請求項９３に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【請求項９５】
配列要素が、リボゾーム結合部位である、請求項９３または９４に記載の組換え細胞。
【請求項９６】
配列要素が、修飾されていない同様のリボゾーム結合部位と比較して、修飾されたリボゾーム結合部位に関するリボゾームの結合親和性を変える修飾を含む、修飾されたリボゾーム結合部位である、請求項９４に記載の組換え細胞。
【請求項９７】
（ｂ）の第一の出力タンパク質が、リコンビナーゼであり、かつ、（ｃ）の制御配列の第一のセットが、リコンビナーゼ認識部位を含む、請求項８２に記載の組換え細胞。
【請求項９８】
第一の出力タンパク質が、検出可能である、請求項８２に記載の組換え細胞。
【請求項９９】
第一の出力タンパク質が、ＰＣＲ、ＤＮＡ塩基配列決定、または顕微鏡、任意には蛍光顕微鏡によって検出可能である、請求項９８に記載の組換え細胞。
【請求項１００】
（ｃ）の出力分子が、治療的分子である、請求項８２に記載の組換え細胞。
【請求項１０１】
治療的分子が、抗炎症性分子である、請求項１００に記載の組換え細胞。
【請求項１０２】
抗炎症性分子が、サイトカインである、請求項１０１に記載の組換え細胞。
【請求項１０３】
サイトカインが、ＩＬ−１０である、請求項１０２に記載の組換え細胞。
【請求項１０４】
抗炎症性分子が、クルクミノイドシンターゼ（ＣＵＳ）である、請求項１０１に記載の組換え細胞。
【請求項１０５】
細胞が、細菌細胞または真菌細胞である、請求項８２に記載の組換え細胞。
【請求項１０６】
細胞が、大腸菌細胞である、請求項１０５に記載の組換え細胞。
【請求項１０７】
細胞が、Saccharomyces boulardii細胞である、請求項１０５に記載の組換え細胞。
【請求項１０８】
組換え細胞が、組換えプロバイオティック細胞である、請求項８２に記載の組換え細胞。
【請求項１０９】
炎症性大腸疾患の処置を必要とする対象において炎症性大腸疾患を処置する方法であって、炎症性大腸疾患を有する対象に、請求項８２に記載の細胞を投与することを含む、前記方法。
【請求項１１０】
炎症性大腸疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項１０９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、特許法§１１９（ｅ）の下で、２０１４年１２月２２日に出願の米国仮出願番号第６２／０９５４１５号の利益を主張し、それは全体として本願明細書に参照として組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究
本発明は、国防脅威削減局によって付与されたＨＤＴＲＡ１−１４−１−０００７および海軍研究事務所によって付与された認可番号００１４−１１−１−０７２５の下の支援によりなされた。政府は、本発明の一定の権利を有する。
【０００３】
分野
本開示のいくつかの側面は、生合成工学の分野に関する。本開示のいくつかの側面は、炎症性大腸疾患の診断および処置のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
炎症性大腸疾患（ＩＢＤ）は、クローン病および潰瘍性大腸炎を包含する慢性炎症性疾患である。現在まで、ＩＢＤの原因はわかっておらず、治療法はない。さらに、最近のＩＢＤ療法は、免疫不全などの重篤な副作用につながり得る抗炎症剤の、高容量の総合的な服用を含む。非侵襲的な形で初期の疾患の再燃を検出することは難しく、したがって、症状が重篤になる前に、患者の疾患を処置することを困難にする。このように、動物モデルでのＩＢＤの検討を改善し、疾患の再燃の早期検出を可能にし、そして抗炎症療法の標的化された送達を達成するために、新しい技術は必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
概要
いくつかの側面において、本開示は、センサーサーキットを含む組換えプロバイオティック細胞に関し、以下を含む：（ａ）入力シグナルに応答する制御タンパク質をコードする核酸と、作動可能に連結された第一のプロモーター；（ｂ）制御タンパク質に応答し、および第一の出力タンパク質をコードする核酸と、作動可能に連結された第二のプロモーターであって、制御タンパク質によって結合される場合に、第二のプロモーターの活性が変えられる、前記プロモーター；（ｃ）第三のプロモーターと作動可能に連結された出力分子であって、該出力分子または第三のプロモーターは、制御配列の第一のセットに隣接しており、該制御配列の第一のセットは、第一の出力タンパク質と作用しあって、第三のプロモーターから出力分子の連結を外す、前記出力分子；（ｄ）制御タンパク質に応答し、かつ、第二の出力タンパク質をコードする核酸と作動可能に連結された第四のプロモーター、ここで、該制御タンパク質によって結合される場合に、第四のプロモーターの活性が変えられる；および、任意に、（ｅ）制御配列の第二のセットに隣接している第二の出力分子であって、ここで制御配列の第二のセットは、第二の出力タンパク質と作用しあって、第二の出力分子を第五のプロモーターと作動可能に連結する、前記出力分子。
【０００６】
いくつかの実施形態において、（ａ）のプロモーターは、構成的に活性なプロモーターである。いくつかの実施形態において、制御タンパク質は、ｏｘｙＲ、ＮｏｒＲ、およびＮｓｒＲからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、入力シグナルは、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である。いくつかの実施形態において、入力シグナルは、一酸化窒素（ＮＯ）である。いくつかの実施形態において、入力シグナルは、炎症性サイトカイン、任意にはＩＬ−６、ＩＬ−１８、またはＴＮＦαである。いくつかの実施形態において、入力分子は、好中球によって産生される分子、例えばカルプロテクチンまたはラクトフェリンである。いくつかの実施形態において、入力シグナルは、血液である。
【０００７】
いくつかの実施形態において、プロモーター（ｂ）および／または（ｄ）のプロモーターは、修飾されていない同様のプロモーターと比較して、（ｂ）および／または（ｄ）のプロモーターに関する転写因子のまたはＲＮＡポリメラーゼの結合親和性を変える修飾を含む。いくつかの実施形態において、修飾は、核酸突然変異である。いくつかの実施形態において、上記の（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は、ベクター上にある。いくつかの実施形態において、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）は、ベクター上にある。いくつかの実施形態において、（ａ）および（ｂ）は、単一のベクター上にある。いくつかの実施形態において、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は、単一のベクター上にある。いくつかの実施形態において、（ｃ）および／または（ｅ）は、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）上にある。
【０００８】
いくつかの実施形態において、（ｂ）および／または（ｄ）は、第一の出力タンパク質の生成を制御し、かつ、第二のプロモーターと第一の出力タンパク質をコードする核酸との間に位置される配列要素を更に含む。いくつかの実施形態において、配列要素は、出力タンパク質の転写または翻訳を制御する。いくつかの実施形態において、配列要素は、リボゾーム結合部位である。いくつかの実施形態において、配列要素は、修飾されていない同様のリボゾーム結合部位と比較して、修飾されたリボゾーム結合部位に関するリボゾームの結合親和性を変える修飾を含む、修飾されたリボゾーム結合部位である。
【０００９】
いくつかの実施形態において、（ｂ）および／または（ｄ）のプロモーターは、同様の修飾されていないプロモーターと比較して、ｏｘｙＲ、ｋａｔＧｐ、ｏｘｙＳｐ、ａｈｐＳｐ、ＨｅｍＨｐ、ａｈｐＣｐ２、ｄｓｂＧｐ、ｕｏｆｐ、ｄｐｓｐ、ｇｒｘＡｐ、ｙｂｊＣｐ、ｈｃｐｐ、ｙｃｈＦｐ、ｓｕｆＡｐ、ｆｌｕｐ、ｍｎｔＨｐ、ｔｒｘＣｐ、ｇｏｒｐ、ｙｈｊＡｐ、ｏｘｙＲｐ、ｇｎｔＰｐ、ｕｘｕＡｐ、ｆｈｕＦｐ、ｋａｔＧｐ、ｎｉｒ、ｈｃｐ、ｎｒｆＡ、ｎａｓＤ、ｙｔｆＥ、ｙｅａＲ、ｎｎｒＳ、およびｎｏｒＶからなる群から選択される（ｂ）のプロモーターに関する転写因子またはＲＮＡのポリメラーゼの結合親和性を変える修飾を含む、ｏｘｙＲ、ｋａｔＧｐ、ｏｘｙＳｐ、ａｈｐＳｐ、ＨｅｍＨｐ、ａｈｐＣｐ２、ｄｓｂＧｐ、ｕｏｆｐ、ｄｐｓｐ、ｇｒｘＡｐ、ｙｂｊＣｐ、ｈｃｐｐ、ｙｃｈＦｐ、ｓｕｆＡｐ、ｆｌｕｐ、ｍｎｔＨｐ、ｔｒｘＣｐ、ｇｏｒｐ、ｙｈｊＡｐ、ｏｘｙＲｐ、ｇｎｔＰｐ、ｕｘｕＡｐ、ｆｈｕＦｐ、ｋａｔＧｐ、ｎｉｒ、ｈｃｐ、ｎｒｆＡ、ｎａｓＤ、ｙｔｆＥ、ｙｅａＲ、ｎｎｒＳ、およびｎｏｒＶからなる群から選択されるプロモーターである。いくつかの実施形態において、（ｂ）および／または（ｄ）のプロモーターは、天然に存在するプロモーターである、ｏｘｙＲ、ｋａｔＧｐ、ｏｘｙＳｐ、ａｈｐＳｐ、ＨｅｍＨｐ、ａｈｐＣｐ２、ｄｓｂＧｐ、ｕｏｆｐ、ｄｐｓｐ、ｇｒｘＡｐ、ｙｂｊＣｐ、ｈｃｐｐ、ｙｃｈＦｐ、ｓｕｆＡｐ、ｆｌｕｐ、ｍｎｔＨｐ、ｔｒｘＣｐ、ｇｏｒｐ、ｙｈｊＡｐ、ｏｘｙＲｐ、ｇｎｔＰｐ、ｕｘｕＡｐ、ｆｈｕＦｐ、ｋａｔＧｐ、ｎｉｒ、ｈｃｐ、ｎｒｆＡ、ｎａｓＤ、ｙｔｆＥ、ｙｅａＲ、ｎｎｒＳ、およびｎｏｒＶからなる群から選択されるプロモーターである。
【００１０】
いくつかの実施形態において、（ｂ）の第一の出力タンパク質は、リコンビナーゼであり、かつ、（ｃ）の制御配列の第一のセットは、リコンビナーゼ認識部位である。いくつかの実施形態において、（ｄ）の第二の出力タンパク質は、リコンビナーゼであり、かつ、（ｅ）の制御配列の第二のセットは、リコンビナーゼ認識部位である。いくつかの実施形態において、第一の出力分子または第二の出力分子は、検出可能である。いくつかの実施形態において、第一の出力分子および/または第二の出力分子は、ＰＣＲ、ＤＮＡ塩基配列決定、または顕微鏡、任意には蛍光顕微鏡によって検出可能である。
【００１１】
いくつかの実施形態において、第一の出力分子および/または第二の出力分子は、治療的分子である。いくつかの実施形態において、第一の出力分子または第二の出力分子は、同じ分子である。いくつかの実施形態において、治療的分子は、抗炎症性分子である。いくつかの実施形態において、抗炎症性分子は、サイトカイン、任意にはＩＬ−１０である。いくつかの実施形態において、抗炎症性分子は、クルクミンである。
【００１２】
いくつかの実施形態において、細胞は、細菌細胞または真菌細胞である。いくつかの実施形態において、細菌細胞は、大腸菌細胞、任意にはE. coli Nissle 1917細胞である。いくつかの実施形態において、真菌細胞は、酵母菌、任意にはSaccharomyces boulardii細胞である。
【００１３】
いくつかの側面において、本開示は、対象において、その必要に応じて炎症性大腸疾患を処置する方法であって、対象に、その必要に応じて本明細書中に記載のプロバイオティック細胞を投与することを含む、前記方法に関する。
【００１４】
本方法のいくつかの実施形態において、炎症性大腸疾患は、クローン病または潰瘍性大腸炎である。
【００１５】
本方法のいくつかの実施形態において、センサーサーキットは、生物学的アナログシグナル処理サーキットである。本方法のいくつかの実施形態において、入力シグナルは、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である。本方法のいくつかの実施形態において、入力シグナルは、一酸化窒素（ＮＯ）である。本方法のいくつかの実施形態において、入力分子は、炎症性サイトカイン、任意にはＩＬ−６、ＩＬ−１８、またはＴＮＦαである。いくつかの実施形態において、入力分子は、好中球によって産生される分子、例えばカルプロテクチンまたはラクトフェリンである。いくつかの実施形態において、入力シグナルは、血液である。
【００１６】
本方法のいくつかの実施形態において、第一および/または第二の出力分子は、検出可能である。本方法のいくつかの実施形態において、第一のおよび/または第二の出力分子は、ＰＣＲ、ＤＮＡ塩基配列決定、または顕微鏡、任意には蛍光顕微鏡によって検出可能である。本方法の中でいくつかの実施形態において、出力分子は、比色観察を介して検出可能である。
【００１７】
本方法のいくつかの実施形態において、第一および/または第二の出力分子は、治療的分子である。本方法のいくつかの実施形態において、治療的分子は、抗炎症性分子である。本方法のいくつかの実施形態において、抗炎症性分子は、サイトカイン、任意にはＩＬ−１０である。本方法のいくつかの実施形態において、抗炎症性分子は、クルクミンである。本方法のいくつかの実施形態において、抗炎症性分子は、抗体または抗体フラグメントである。本方法のいくつかの実施形態において、センサーサーキットは、第二の出力分子を更に含む。本方法のいくつかの実施形態において、第二の出力分子は、第一の出力分子と同じである。
【００１８】
いくつかの側面において、本開示は、対象における炎症性大腸疾患を診断する方法であって、以下を含む前記方法に関する：（ａ）対象に、本願明細書に記載のプロバイオティック細胞を投与すること；（ｂ）（ａ）の対象から生体試料を得ること；（ｃ）該生体試料中の少なくとも一つの出力分子の発現を検出すること；および、（ｄ）炎症性大腸疾患を有するとして対象を診断すること。
【００１９】
本方法のいくつかの実施形態において、プロバイオティック細胞は、腸管にコロニーを作る。本方法のいくつかの実施形態において、対象は、哺乳動物である。本方法のいくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。本方法のいくつかの実施形態において、生体試料は、糞便試料である。方法の中でいくつかの実施形態において、出力分子の発現は、in vitroで検出される。本方法のいくつかの実施形態において、炎症性大腸疾患は、クローン病または潰瘍性大腸炎である。いくつかの実施形態において、本方法は、ＩＢＤの処置に有用な剤を対象に投与することを更に含む。
【００２０】
別の側面において、以下を含むセンサーサーキットを含む組換えプロバイオティック細胞が提供される（ａ）入力シグナルに応答する制御タンパク質をコードする核酸と、作動可能に連結された第一のプロモーター；および（ｂ）制御タンパク質に応答し、かつ、第一の出力タンパク質をコードする核酸と作動可能に連結された第二のプロモーターであって、制御タンパク質によって結合される場合に、第二のプロモーターの活性が変えられる、前記プロモーター。いくつかの実施形態において、第一のプロモーターは、構成的に活性なプロモーターである。
【００２１】
いくつかの実施形態において、制御タンパク質は、ｏｘｙＲ、ＮｏｒＲ、およびＮｓｒＲからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、入力シグナルは、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である。いくつかの実施形態において、入力シグナルは、一酸化窒素（ＮＯ）である。いくつかの実施形態において、入力シグナルは、炎症性サイトカイン、任意にはＩＬ−６、ＩＬ−１８、またはＴＮＦαである。
【００２２】
いくつかの実施形態において、第２のプロモーターは、修飾されていない同様のプロモーターと比較して、第二のプロモーターに関する転写因子のまたはＲＮＡポリメラーゼの結合親和性を変える修飾を含む。いくつかの実施形態において、修飾は、核酸突然変異である。
【００２３】
いくつかの実施形態において、（ａ）および（ｂ）は、ベクター上に、いくつかの実施形態において、単一のベクター上にある。
【００２４】
いくつかの実施形態において、（ｂ）は、第一の出力タンパク質の生成を制御し、かつ、第二のプロモーターと第一の出力タンパク質をコードする核酸との間に位置される配列要素を更に含む。いくつかの実施形態において、配列要素は、出力タンパク質の転写または翻訳を制御する。いくつかの実施形態において、配列要素は、リボゾーム結合部位である。いくつかの実施形態において、配列要素は、修飾されていない同様のリボゾーム結合部位と比較して、修飾されたリボゾーム結合部位に関するリボゾームの結合親和性を変える修飾を含む、修飾されたリボゾーム結合部位である。
【００２５】
いくつかの実施形態において、（ｂ）のプロモーターは、修飾されていない同様のプロモーターと比較して、ｏｘｙＲ、ｎｉｒ、ｈｃｐ、ｎｒｆＡ、ｎａｓＤ、ｙｔｆＥ、ｙｅａＲ、ｎｎｒＳ、およびｎｏｒＶからなる群から選択される（ｂ）のプロモーターに関する転写因子またはＲＮＡポリメラーゼの結合親和性を変える修飾を含む、ｏｘｙＲ、ｏｘｙＳｐ、ｋａｔＧｐ、ｎｉｒ、ｈｃｐ、ｎｒｆＡ、ｎａｓＤ、ｙｔｆＥ、ｙｅａＲ、ｎｎｒＳ、およびｎｏｒＶからなる群から選択されるプロモーターである。いくつかの実施形態において、（ｂ）のプロモーターは、天然に存在するプロモーターであるｏｘｙＲ、ｏｘｙＳｐ、ｋａｔＧｐ、ｎｉｒ、ｈｃｐ、ｎｒｆＡ、ｎａｓＤ、ｙｔｆＥ、ｙｅａＲ、ｎｎｒＳ、およびｎｏｒＶからなる群から選択されるプロモーターである。
【００２６】
いくつかの実施形態において、第一の出力分子は、治療的分子である。いくつかの実施形態において、治療的分子は、抗炎症性分子である。いくつかの実施形態において、抗炎症性分子は、サイトカイン、任意にはＩＬ−１０である。
【００２７】
いくつかの実施形態において、抗炎症性分子は、フェルロイル−ＣｏＡをクルクミンに変換するクルクミノイドシンターゼ（ＣＵＳ）である。いくつかの実施形態において、組み換えプロバイオティック細胞は、任意には１または２以上のベクター上にある、４−クマラート：ＣｏＡリガーゼおよびアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼをコードする核酸を更に含む。いくつかの実施形態において、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼをコードする核酸は、ＡｃｃＢｃおよびＤｔｓＲ１である。いくつかの実施形態において、４−クマラート：ＣｏＡリガーゼおよびアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼをコードする核酸は、構成プロモーターと作動可能に連結される。
【００２８】
いくつかの実施形態において、細胞は、細菌細胞または真菌細胞である。いくつかの実施形態において、細菌細胞は、大腸菌細胞、任意にはE. coli Nissle 1917細胞である。他の実施形態において、真菌細胞は、酵母菌、任意にはSaccharomyces boulardii細胞である。
【００２９】
別の側面において、その必要に応じて、対象において、炎症性大腸疾患を処置する方法は、提供される。本方法は、その必要に応じて、対象において、以下を含むセンサーサーキットを含む、前述のプロバイオティック細胞を投与することを含む（ａ）入力シグナルに応答する制御タンパク質をコードする核酸と、作動可能に連結された第一のプロモーター；および（ｂ）制御タンパク質に応答し、および第一の出力タンパク質をコードする核酸と、作動可能に連結された第二のプロモーターであって、制御タンパク質によって結合される場合に、第二のプロモーターの活性が変えられる、前記プロモーター。いくつかの実施形態において、炎症性大腸疾患は、クローン病または潰瘍性大腸炎である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
図面の簡単な説明
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、炎症の感知および処置のために操作されたプロバイオティックスの概観を提供する。図１Ａは、プロバイオティック細胞（例えば大腸菌）が腸を通過して、炎症部位（四角および「Ｘ」）に遭遇することを示す。図１Ｂは、炎症マーカー（点）の存在および濃度を感知し、記憶するために操作されたプロバイオティック細胞の設計を示し、したがって、炎症の早期発見を可能にする（明るい陰影のついた細胞、右）。図１Ｃは、抗炎症性分子（円）を構成的に合成するプロバイオティック細胞の設計を示す。図１Ｄは、炎症（四角、Ｘ）を感知することができ、抗炎症療薬（円）を局所的に分泌することによって応答することができる、プロバイオティック細胞を介する、ＩＢＤのための標的化された治療の設計を示す。
【００３１】
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、ＤＮＡリコンビナーゼに基づいて統合された記憶を有する操作された炎症−センシングサーキットのための概略図を示す。図２Ａは、三つの異なるＤＮＡリコンビナーゼ（Ｒｅｃ．１、２、３）の発現が、Ｈ２Ｏ２およびＮＯなどの炎症性分子の種々のレベルで誘発されることを説明する概略図を示す。図２Ｂは、発現において、図２Ａにおいて示された各ＤＮＡリコンビナーゼ（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３）が、独立した出力ＤＮＡ塩基配列を反転させ、このように、反転されたＤＮＡ塩基配列の中に含まれる別々の出力遺伝子（それぞれ出力１、出力２、出力３）の永続的な発現をもたらすことを示す。これらの出力遺伝子は、検出可能なリポーター、ならびに治療タンパク質または小分子生合成遺伝子を含むことができる。これらの出力モジュールの状況は、ＤＮＡ塩基配列決定およびＰＣＲを介して読み出されることもできる。出力モジュールは、顕微鏡または比色観察を介して読み出されてもよい。図２Ｃは、炎症マーカーに対する、操作されたプロバイオティック細胞の応答の概略図を示す。複数の出力遺伝子は、起こった炎症のレベルに応じて発現される。例えば、閾値１と閾値２の間にある炎症レベルは、出力１（左の曲線）を誘発するだけであろうが、閾値３より上の炎症レベルは、出力１、出力２（中間の曲線）、および出力３（右の曲線）の出力を誘発するだろう。このように、プロバイオティック細菌によって起こる炎症状態の永続的な読み出しは、ＤＮＡにおいて記録されることができる。
【００３２】
【図３】図３は、Ｈ２Ｏ２レベルを検出するためのＧＦＰを発現する３つの異なるバイオ感知サーキットが、３つの異なるリボゾーム結合部位（００３３、００３１、００２９）と組み合わされる２つの異なるプロモーター（ｏｘｙＳｐおよびｋａｔＧｐ）を用いて大腸菌において構築されたことを示す。結果として生じるサーキットの設計は、Ｈ２Ｏ２レベルを感知するための、異なる閾値および感度を有する２つの異なる入出力伝達機能を表す。
【００３３】
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、大腸菌におけるクルクミン生成を示す。図４Ａは、フェルラ酸からのクルクミンの生成が、４つの異種酵素の発現を要求することを示す。図４Ｂは、炎症を誘発し得るクルクミン生成のための遺伝子サーキットを示す。炎症−センシングサーキットによってクルクミンの統制された生成を可能にするために、最後の変換ステップ（フェルロイル−ＣｏＡからクルクミンへ）のために必要とされるクルクミノイドシンターゼ（ＣＵＳ）酵素の発現は、制御下で、炎症センサー、例えば図２Ａ〜２Ｃに記載されたそれらによって配置される。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
詳細な説明
いくつかの側面において、本開示は、炎症の非侵襲性センサーおよび炎症性大腸疾患（ＩＢＤ）を治療するための局所的な抗炎症化合物のプロデューサーとしてのプロバイオティック細菌の使用に関する。これらのプロバイオティックスは、それらが腸を通過するにつれてＩＢＤを診断し処置するために、経口で使用されることができる。さらにその上、操作されたプロバイオティックスは、大便から回収され、それらが腸を移動する間遭遇した状態に関する情報を回収するために、調査されることができる。
【００３５】
したがって、いくつかの側面において、本開示は、センサーサーキットを含む組換えプロバイオティック細胞に関し、以下を含む：（ａ）入力シグナルに応答する制御タンパク質をコードする核酸と、作動可能に連結された第一のプロモーター；（ｂ）制御タンパク質に応答し、および第一の出力タンパク質をコードする核酸と、作動可能に連結された第二のプロモーターであって、制御タンパク質によって結合される場合に、第二のプロモーターの活性が変えられる、前記プロモーター；（ｃ）第三のプロモーターと作動可能に連結された出力分子であって、該出力分子または第三のプロモーターは、制御配列の第一のセットに隣接しており、該制御配列の第一のセットは、第一の出力タンパク質と作用しあって、第三のプロモーターから出力分子の連結を外す、前記出力分子；（ｄ）制御タンパク質に応答し、および第二の出力タンパク質をコードする核酸と作動可能に連結された第四のプロモーターであって、ここで、該制御タンパク質によって結合される場合に、第四のプロモーターの活性が変えられる、前記プロモーター；および、任意に、（ｅ）制御配列の第二のセットに隣接している第二の出力分子であって、ここで制御配列の第二のセットは、第二の出力タンパク質と作用しあって、第二の出力分子を第五のプロモーターと作動可能に連結する、前記出力分子。
【００３６】
プロバイオティック細胞
センサーサーキットを含むプロバイオティック細胞が、本願明細書中に提供される。本明細書において使用されるように、用語「プロバイオティック」は、適切な量で投与される場合、それらが投与された宿主に健康利益を授ける生きた微生物を指す。例えば、E. coli Nissle 1917細菌は、第一次世界大戦中にうまく細菌性赤痢の激増を処置するために用いられた。プロバイオティック生物の例は、細菌（Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus reuteri ATCC 55730, Bifidobacterium longum, Bacillus coagulans, および Escherichia coli Nissle 1917（ＥｃＮ））および真菌（例えばSaccharomyces cerevisiae、Saccharomyces boulardii、Saccharomyces pastoriamus、Saccharomyces batanus）を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態において、本開示のプロバイオティック細胞は、嫌気性細菌細胞（例えば、増殖のための酸素を要求しない）である。嫌気性細菌細胞は、通気性嫌気性細胞（例えば、Escherichia coliおよび Lactobacillus sp.等）を含む。いくつかの実施形態において、センサーサーキットを含むプロバイオティック細胞は、大腸菌細胞である。いくつかの実施形態において、大腸菌細胞は、E. coli Nissle 1917（ＥｃＮ）である。いくつかの実施形態において、本開示のプロバイオティック細胞は、酵母細胞である。いくつかの実施形態において、酵母細胞は、Saccharomyces boulardii細胞である。
【００３８】
本明細書中で使用されるように、用語「組換え細胞」は、細胞中に天然に存在しない核酸を含ませるために遺伝的組換えで操作された細胞を指す。組換え細胞は、外因性核酸または天然に生じない核酸（例えば、本開示のセンサーサーキット）を含む。いくつかの実施形態において、組換え細胞は、独立に核酸を複製する外因性成分（例えば、エピソームベクター上に存在するアナログシグナル処理サーキットの成分）を含む。いくつかの実施形態において、組換え細胞は、外部のまたは外因性の核酸を細胞に導入することによって形成される。このように、サーキットを細胞に導入する方法は、本願明細書中に提供される。核酸は、通常の方法、例えば、エレクトロポレーション（例えば、Heiser W.C. Transcription Factor Protocols: Methods in Molecular Biology（商標） 2000; 130: 117-134参照）、化学物質（例えば、カルシウムホスファートまたは脂質）のトランスフェクション（Lewis W.H., et al., Somatic Cell Genet. 1980 May; 6(3): 333-47; Chen C., et al., Mol Cell Biol. 1987 August; 7(8): 2745-2752参照）、遺伝子組換えプラスミドを含む細菌プロトプラストとの融合（例えば、Schaffner W. Proc Natl Acad Sci USA. 1980 Apr; 77(4): 2163-7参照）、トランスダクション、コンジュゲーション、または細胞の核への精製されたＤＮＡの直接的なマイクロインジェクション（例えば、Capecchi M.R. Cell. 1980 Nov; 22(2 Pt 2): 479-88参照）等によって、細胞に導入されてもよい。
【００３９】
いくつかの実施形態において、細胞は、関連する内因性のタンパク質を過剰発現させるために修飾される（例えば、その発現レベルを上昇させるために関連するタンパク質をコードする内因性遺伝子の近くのプロモーターまたは他の制御要素を導入または修飾することを介して）。いくつかの実施形態において、細胞は、突然変異誘発によって修飾される。いくつかの実施形態において、細胞は、関連する遺伝子の変異を形成するために、該細胞へ操作された核酸を導入することにより修飾される（例えば、挿入または相同組換えを介して）。いくつかの実施形態において、細胞は、遺伝子欠失を含む。
【００４０】
本開示のアナログシグナル処理サーキットは、一過性に発現されてもよいし安定して発現されてもよい。「一過性の細胞発現」とは、細胞の核ゲノムに統合されない核酸の、細胞による発現を指す。これに対して、「安定な細胞発現」は、細胞およびその娘細胞の核ゲノム中に残る核酸の、細胞による発現を指す。典型的に、細胞は、安定な細胞発現を達成するために、細胞中の安定な発現が意図されるマーカー遺伝子および外因性核酸（例えば、アナログシグナル処理サーキットまたはその成分）によってコトランスフェクションされる。該マーカー遺伝子は、該細胞にいくつかの選択できる利益（例えば、毒素、抗生物質、または他の因子に対する抵抗性）を与える。ほとんどのトランスフェクトされた細胞は、偶然に、それらのゲノムへ外因性核酸を統合させなかった。その後、毒素が、例えば、細胞培養液に加えられる場合、それらのゲノムに統合された毒素抵抗性マーカー遺伝子を有するそれらのわずかな細胞だけが、他の細胞が死滅する一方で、増殖することが可能である。しばらくの間この選択圧を適用した後に、安定なトランスフェクションを有する細胞だけが残って、更に培養されることができる。本開示に従い用いられるマーカー遺伝子および選択剤の例は、メトトレキサートのジヒドロ葉酸レダクターゼ、メチオニンスルフォキシミンのグルタミンシンテターゼ、ハイグロマイシンのハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシンのピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ、およびジェネテシン（Ｇ４１８としても知られる）を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。他のマーカー遺伝子／選択剤は、本願明細書中で考察される。
【００４１】
生物学的センサーサーキット
いくつかの側面において、本開示は、センサーサーキットを含む組換えプロバイオティック細胞に関する。本明細書中で使用されるように、「センサーサーキット」は、生体シグナル、例えば炎症マーカーを検出するために用いられる遺伝子サーキットを指す。生体シグナルは動的な濃度勾配においてしばしば存在し、いくつかの場合において、入力シグナルの勾配を１つのまたは複数の分子の目立たない発現に変換することが（例えばアナログのデジタル論理への適用を介して）、望まれる。それゆえ、いくつかの実施形態において、該センサーサーキットは、生物学的アナログシグナル処理サーキットである。生物学的アナログシグナル処理サーキットの更なる記載に関して、標題Analog to Digital Computations in Biological Systemsで同日に出願され、その全体が本明細書中に参照として組み込まれている、米国のシリアルＮｏ.６２／０９５３１８（代理人事件記録簿番号Ｍ０６５６．７０３４７ＵＳ００）を参照されたい。
【００４２】
本開示のアナログシグナル処理サーキットは、入力シグナルに応答し、出力分子をコードする核酸と作動可能に連結されたプロモーターを含む。「プロモーター」は、残りの核酸の転写の開始および速度が制御される核酸の統制領域である。プロモーターは、制御タンパク質および分子、例えば転写因子が結合するサブ領域を、含んでもよい。本開示のプロモーターは、構成的な、誘導可能な、活性化可能な、抑制可能な、組織特異的な、または、それらのいずれかの組合せであってもよい。プロモーターは、発現を引き起こすか、またはそれが制御する核酸の転写を引き起こす。その核酸の転写開始および／または発現を統制する（「引き起こす」）ためにそれが制御する核酸との関係で、それが機能する正しい位置及び方向にある場合に、プロモーターは「作動可能に連結される」と考えられる。
【００４３】
入力シグナルが、プロモーターの機能を間接的にまたは直接的に調整する場合、プロモーターは、入力シグナルに「応答する」と考えられる。いくつかの実施形態において、プロモーターが、それが作動可能に連結される核酸の転写を活性化または増加させるように（例えば、一定のパーセンテージまたは程度によって）、入力シグナルはプロモーターを正方向に調整することもできる。いくつかの実施形態において、対照的に、プロモーターが、活性化を阻害され、または、作動可能に連結される核酸の転写を阻害しまたは減少させるように、入力シグナルは、プロモーターを負方向に調整してもよい。プロモーターに結合することにより、または中間シグナルなしにプロモーターに作用することによって、入力シグナルは、プロモーターの機能を直接調整することができる。例えば、ｏｘｙＲタンパク質は、ｏｘｙＲプロモーターの領域へ結合することによって、ｏｘｙＲプロモーターを調整する。このように、ｏｘｙＲタンパク質は、本願明細書中で、ｏｘｙＲプロモーターを直接調整する入力シグナルと考えられる。対照的に、入力シグナルが中間シグナルを介してプロモーターを調整する場合、入力シグナルは間接的にプロモーターの機能を調整すると考えられる。例えば、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）は、ｏｘｙＲタンパク質を調整し（例えば、活性化し）、そして、次に、ｏｘｙＲプロモーターを調整する（例えば、活性化する）。このように、Ｈ２Ｏ２は、本願明細書中で、ｏｘｙＲプロモーターを間接的に調整する入力シグナルと考えられる。
【００４４】
「入力シグナル」は、直接または間接的に、アナログシグナル処理サーキットの成分（例えば、プロモーター）を調整する、細胞中の、または、該細胞にさらされている、いずれかの化学（例えば、小分子）の、または非化学（例えば、光または熱）のシグナルを指す。いくつかの実施形態において、入力シグナルは、プロモーターの機能を調整する（直接的な調整と呼ばれる）生体分子であるか、または生体分子を調整するシグナルであり、その後、それは、プロモーターの機能を調整する（間接的な調整と呼ばれる）。「生体分子」は、生きた細胞中で、例えば、内因性に、または、遺伝子組み換えに基づく発現を介して生成される。Ｈ２Ｏ２および一酸化窒素（ＮＯ）は、ｏｘｙＲプロモーター、および、ｎｉｒ、ｈｃｐ、ｎｒｆＡ、ｎａｓＤ、ｙｔｆＥ、ｙｅａＲ、ｎｎｒＳ、およびｎｏｒＶプロモーターをそれぞれに、そして次に、出力分子の発現を間接的に調整する入力シグナルと考えられる。同様に、それらがｏｘｙＲプロモーター（例えばｏｘｙＲ、ｋａｔＧｐ、ｏｘｙＳｐ、ａｈｐＳｐ、ＨｅｍＨｐ、ａｈｐＣｐ２、ｄｓｂＧｐ、ｕｏｆｐ、ｄｐｓｐ、ｇｒｘＡｐ、ｙｂｊＣｐ、ｈｃｐｐ、ｙｃｈＦｐ、ｓｕｆＡｐ、ｆｌｕｐ、ｍｎｔＨｐ、ｔｒｘＣｐ、ｇｏｒｐ、ｙｈｊＡｐ、ｏｘｙＲｐ、ｇｎｔＰｐ、ｕｘｕＡｐ、ｆｈｕＦｐ、ｋａｔＧｐ）またはｎｉｒ、またはｈｃｐ、またはｎｒｆＡ、またはｎａｓＤ、またはｙｔｆＥ、またはｙｅａＲ、またはｎｎｒＳ、またはｎｏｒＶのそれぞれと結合することにより出力分子の転写を直接的に調整するので、ｏｘｙＲおよびＮｏｒＲまたはＮｓｒＲタンパク質それ自体が、入力シグナルであると考えられる。いくつかの実施形態において、入力シグナルは、入力シグナル（例えば、誘発性プロモーター）に応答するプロモーターからの転写活性を調整する（例えば、誘導するかまたは抑制する）ことに活性であるように、アナログシグナル処理サーキットのプロモーターに接触する細胞または通常外因性状態、化合物、またはタンパク質に対して、内因性でもよい。いくつかの実施形態において、入力シグナルは、細胞において構成的に発現される。いくつかの実施形態において、入力シグナルは、ｏｘｙＲタンパク質である。いくつかの実施形態において、入力シグナルは、ＮｏｒＲまたはＮｓｒＲタンパク質である。
【００４５】
いくつかの側面において、本開示は、炎症マーカー入力シグナルに応答するセンサーサーキットに関する。本明細書に使用されているように、用語「炎症マーカー」は、炎症性免疫応答のいずれかの化学手的または生物学的インジケータにも関する。炎症マーカーの例は、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、Ｈ２Ｏ２、ＮＯ、血液、カルプロテクチン、ラクトフェリン、腸管内腔への好中球浸潤と関連づけられた他の分子を含むが、これに限定されるものではない。特に、炎症性大腸疾患（ＩＢＤ）と関連づけられた炎症マーカーは、入力シグナルとして考察される。本明細書に使用されているように、「炎症性大腸疾患」は、クローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を含む消化管の慢性炎症性障害の種々の群を指す。いくつかの実施形態において、入力シグナルは、Ｈ２Ｏ２である。いくつかの実施形態において、入力シグナルは、ＮＯである。いくつかの実施形態において、入力分子は、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、またはＴＮＦαからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、入力分子は、好中球、例えばカルプロテクチンまたはラクトフェリンによって産生される分子である。いくつかの実施形態において、入力シグナルは、血液である。入力シグナルの組合せは、例えばＨ２Ｏ２、ＮＯ、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、ＴＮＦα、血液、カルプロテクチン、ラクトフェリンからなる群から選択される入力シグナルの２または３以上に応答するセンサーサーキットを含む組換えプロバイオティック細胞も考察される。
【００４６】
いくつかの実施形態において、該センサーサーキットは、出力分子（例えば、リコンビナーゼまたは検出可能なタンパク質）をコードする核酸と、作動可能に連結されるプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、出力プロモーターは、制御タンパク質、例えば、転写因子等に応答する。いくつかの実施形態において、その同じ制御タンパク質のための修飾されていないプロモーターの親和性と比較して、特定の制御タンパク質のためのプロモーターの親和性が変えられる（例えば、減少される）ように、出力プロモーターは、修飾される（例えば、変異される）。あるいは、出力プロモーターは、異なる親和性を有する同じ転写因子を結合させる、天然に生ずるプロモーターである。例えば、ｏｘｙＳｐおよびＫａｔＧｐは、異なる親和性を有するｏｘｙＲタンパク質を結合させる、二つの天然に生じるプロモーターである。
【００４７】
リコンビナーゼは、保存された認識部位を介して核酸と結合することにより、およびＤＮＡ再編成の次の形：統合、切りだし／レゾルーション、および／または反転の少なくとも１つを仲介することにより、部位特異的組換えを仲介する酵素である。リコンビナーゼは、通常、タンパク質のチロシンリコンビナーゼ（ＹＲ）およびセリン・リコンビナーゼ（ＳＲ）の２つのファミリーに分類される。しかしながら、リコンビナーゼは、それらの方向性（すなわち両方向性または一方向性）に従って分類されることもできる。
【００４８】
一方向性リコンビナーゼは、同一でない認識部位と結合し、それゆえ不可逆的な組換えを仲介する。一方向性リコンビナーゼ認識部位の例は、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、ａｔｔＲ、疑似ａｔｔＢ、および疑似ａｔｔＰを含む。いくつかの実施形態において、本願明細書中に記載されるサーキットは、一方向性リコンビナーゼを含む。一方向性リコンビナーゼの例は、ＢｘｂＩ、ＰｈｉＣ３１、ＴＰ９０１、ＨＫ０２２、ＨＰ１、Ｒ４、Ｉｎｔ１、Ｉｎｔ２、Ｉｎｔ３、Ｉｎｔ４、Ｉｎｔ５、Ｉｎｔ６、Ｉｎｔ７、Ｉｎｔ８、Ｉｎｔ９、Ｉｎｔ１０、Ｉｎｔ１１、Ｉｎｔ１２、Ｉｎｔ１３、Ｉｎｔ１４、Ｉｎｔ１５、Ｉｎｔ１６、Ｉｎｔ１７、Ｉｎｔ１８、Ｉｎｔ１９、Ｉｎｔ２０、Ｉｎｔ２１、Ｉｎｔ２２、Ｉｎｔ２３、Ｉｎｔ２４、Ｉｎｔ２５、Ｉｎｔ２６、Ｉｎｔ２７、Ｉｎｔ２８、Ｉｎｔ２９、Ｉｎｔ３０、Ｉｎｔ３１、Ｉｎｔ３２、Ｉｎｔ３３、およびＩｎｔ３４を含むが、これに限定されるものではない。さらに、一方向性リコンビナーゼは、その全体が参照として本明細書に組み込まれるYang et al., Nature Methods, October 2014; 11(12), pp.1261-1266中に開示された方法を使用して、確認されることもできる。
【００４９】
本願明細書中に記載されるサーキットのいくつかの実施例において、サーキットは少なくとも一つの一方向性リコンビナーゼを含み、核酸配列に隣接している認識部位は、少なくとも一つの一方向性リコンビナーゼによって作動可能である。いくつかの実施形態において、サーキットは、２または３以上の一方向性リコンビナーゼを含む。
【００５０】
可逆的である生体シグナル処理サーキットも、本願明細書中で考察される。例えば「リセットスイッチ」の使用、または、活性化された制御タンパク質の活性を反転させる第２のサーキットを介して、可逆的な生体シグナル処理サーキットは、オン／オフされるべき出力分子の発現をゆるす。いくつかの実施形態において、生体シグナル処理サーキットは、少なくとも一つの両方向性リコンビナーゼを含む。双方向性リコンビナーゼは、同一の認識部位と結合し、それゆえ可逆的な組換えを仲介する。両方向性リコンビナーゼの例は、Ｃｒｅ、ＦＬＰ、Ｒ、ＩｎｔＡ、Ｔｎ３レゾルバーゼ、ヒンインベルターゼ、およびジンインベルターゼを含むが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、出力分子は、少なくとも一つの両方向性リコンビナーゼ認識部位と隣接する。いくつかの実施形態において、出力分子に隣接する両方向性リコンビナーゼ認識部位は、同じである。いくつかの実施形態において、出力分子に隣接する両方向性リコンビナーゼ認識部位は、異なる。両方向性リコンビナーゼのための同一の認識部位の非限定的な例は、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＲＳ認識部位を含む。両方向性リコンビナーゼのための同一の認識部位の非限定的な例は、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＲＳ認識部位を含む。両方向のリコンビナーゼが操作されることができるかまたは一方向性リコンビナーゼとしてふるまうために修飾されることができることも、注意されるべきである。例えば、ＣＲＥ等のチロシンリコンビナーゼは、２つの異なるリコンビナーゼ認識部位（例えばｌｏｘ６６およびｌｏｘ７１）と組み合わせて利用されることができる。
【００５１】
いくつかの実施形態において、可逆的な生物学的アナログシグナル処理サーキットは、リセットスイッチを含む。いくつかの実施形態において、リセットスイッチは、リコンビナーゼの作動を変える少なくとも一つのリコンビナーゼ方向性因子（ＲＤＦ）を含む。リコンビナーゼ方向性因子は、従来技術において公知であり、例えば、Bonnet et al. PNAS 109(23), pp. 8884-9, 2012（本願明細書中に参照によってその全体が組み込まれる）中に記載されている。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本願明細書中に記載される生物学的アナログシグナル処理サーキットは、細菌性リコンビナーゼを含む。細菌性リコンビナーゼのＡ非限定的な例は、ＦｉｍＥ、ＦｉｍＢ、ＦｉｍＡ、およびＨｂｉＦを含む。ＨｂｉＦは、Ｆｉｍリコンビナーゼによって反転された組換え部位を反転させるリコンビナーゼである。細菌性リコンビナーゼは、逆方向反復配列を認識し、右側の逆位反復（ＩＲＲ）および左側の逆位反復（ＩＲＬ）と称される。いくつかの実施形態において、細菌性リコンビナーゼを含む生物学的アナログシグナル処理サーキットは、細菌性リコンビナーゼ制御剤を更に含む。細菌性リコンビナーゼ制御要素の非限定的な例は、ＰａｐＢであり、それはＦｉｍＢ活性を阻害する。
【００５３】
本開示のセンサーサーキットおよびそれらの成分は、制御タンパク質のためのプロモーターの親和性が同じ制御タンパク質のための他のプロモーターの親和性と比較して異なるように、プロモーター修飾によって「調節される」ことができる。アナログシグナル処理サーキットの更なる調節は、本願明細書中で考察される。例えば、出力分子または制御タンパク質の転写、翻訳、または分解をさらに制御するために、「制御配列」は、サーキットに含まれてもよい。本願明細書中に提供される制御配列の例は、リボゾーム結合部位、リボスイッチ、リボザイム、ガイドＲＮＡ結合部位、マイクロＲＮＡ結合部位、トーホールドスイッチ、シス再抑制ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ結合部位、プロテアーゼ標的部位、リコンビナーゼ認識部位、および転写ターミネーター部位を含むが、これに限定されるものではない。
【００５４】
いくつかの側面において、本開示は、制御配列を含む生物学的アナログシグナル処理サーキットに関する。いくつかの実施形態において、制御配列は、リコンビナーゼ認識部位である。いくつかの実施形態において、組換え認識部位は、ＢｘｂＩ、ＰｈｉＣ３１、ＴＰ９０１、ＢｘｂＩ、ＰｈｉＣ３１、ＴＰ９０１、ＨＫ０２２、ＨＰ１、Ｒ４、Ｉｎｔ１、Ｉｎｔ２、Ｉｎｔ３、Ｉｎｔ４、Ｉｎｔ５、Ｉｎｔ６、Ｉｎｔ７、Ｉｎｔ８、Ｉｎｔ９、Ｉｎｔ１０、Ｉｎｔ１１、Ｉｎｔ１２、Ｉｎｔ１３、Ｉｎｔ１４、Ｉｎｔ１５、Ｉｎｔ１６、Ｉｎｔ１７、Ｉｎｔ１８、Ｉｎｔ１９、Ｉｎｔ２０、Ｉｎｔ２１、Ｉｎｔ２２、Ｉｎｔ２３、Ｉｎｔ２４、Ｉｎｔ２５、Ｉｎｔ２６、Ｉｎｔ２７、Ｉｎｔ２８、Ｉｎｔ２９、Ｉｎｔ３０、Ｉｎｔ３１、Ｉｎｔ３２、Ｉｎｔ３３、およびＩｎｔ３４からなる群から選択されるリコンビナーゼを認識する。いくつかの実施形態において、生物学的アナログシグナル処理サーキットは、２または３以上の異なる制御配列を含む。いくつかの実施形態において、制御配列は、出力分子の転写および／または翻訳を制御する。いくつかの実施形態において、制御配列は、プロモーターの、出力タンパク質をコードする核酸配列への作動可能な連結を制御する。いくつかの実施形態において、制御配列の第一のセットは、出力分子の転写および／または翻訳を制御し、制御配列の第二のセットは、プロモーターの、出力タンパク質をコードする核酸への、作動可能な連結を制御する。
【００５５】
調節は、プロモーターと、それが作動可能に連結されている核酸との間に置かれるリボゾーム結合部位（ＲＢ）を修飾する（例えば、突然変異させる）ことによって、達成されてもよい。いくつかの実施形態において、本願明細書において記載される生物学的サーキットは、異なる転写効率を有するＲＢを含む。いくつかの実施形態において、ＲＢＳは、天然に生じるＲＢＳである。いくつかの実施形態において、ＲＢＳは、修飾されたＲＢＳである。いくつかの実施形態において、修飾されたＲＢＳは、少なくとも一つの修飾の結果として、同じＲＢＳの天然型（修飾されていない）のバージョンと比較して、異なる転写効率を有する。
【００５６】
調節はまた、プロモーターのためのＲＮＡポリメラーゼの親和性、すなわちプロモーターの強度を変えることによって達成されることができる。例えば、１または２以上の突然変異は、プロモーターの−１０領域においてなされる。プロモーターの強度（すなわちリコンビナーゼの転写速度）を変えることによって、デジタルスイッチは、異なる濃度で得られる（入力、例えばＨ２Ｏ２に関して）。
【００５７】
アナログシグナル処理サーキットの調節は、例えば、サーキットの特別な成分の核酸の発現レベルを統制することによって、達成されてもよい。核酸（例えば、低い、中間の、および／または、高いコピープラスミドおよび／または構成的に活性なプロモーターを使用すること）のコピー数を統制することによって、この制御は、例えば、達成されることができる。
【００５８】
いくつかの実施例において、本願明細書に提供されるように、２または３以上の調節機構を組み合わせることによって、本開示のアナログシグナル処理サーキットの「調節可能性」が達成されることが理解されるべきである。例えば、いくつかの実施形態において、アナログシグナル処理サーキットは、少なくとも一つの修飾されたプロモーター（制御タンパク質に関する減少されまたは増加された親和性を有する）およびリボゾーム結合部位（ＲＢＳ）を含む。いくつかの実施形態において、アナログシグナル処理サーキットは、修飾されたプロモーターおよび少なくとも一つの修飾されたリボゾーム結合部位を含む。いくつかの実施形態において、アナログシグナル処理サーキットは、修飾されたリボゾーム結合部位および制御配列を含む。他の構成は、本願明細書中で考察される。
【００５９】
本開示のセンサーサーキットは、いくつかの実施形態において、出力分子の形において応答を出す。「出力分子」は、入力シグナルの統制下での（例えば、応答して生成される）いずれの検出可能な分子にも関連する。例えば、図２に示されるように、出力１、出力２、および出力３は、炎症マーカーによるリコンビナーゼ遺伝子（Ｒｅｃ．１、Ｒｅｃ．２およびＲｅｃ．３）の発現を引き起こすプロモーターの活性化に応答して生成される出力分子である。出力分子の発現レベルは、いくつかの実施形態において、特定の制御タンパク質のためのプロモーターの親和性に依存する。例えば、制御タンパク質に関する減少された親和性を有する修飾されたプロモーターの統制下の出力タンパク質の発現レベルは、修飾されていないプロモーターの統制下の出力分子の発現レベルより少なくてもよい。同様に、制御タンパク質に関する減少された親和性を有する修飾されたプロモーターの統制下の出力タンパク質の発現レベルは、同じ制御タンパク質に関する親和性においてより一層の減少を有する修飾されたプロモーターの統制下の出力分子の発現レベルより少なくてもよい。
【００６０】
出力分子の例は、タンパク質および核酸を含むが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、出力分子は、検出可能である。検出可能な出力分子は、ＤＮＡ記憶の形成に有用である。例えば、入力シグナルは、リコンビナーゼの発現を活性化させることができ、それはＤＮＡの特定の伸展を不可逆的に反転させ、すなわち、リポーターアッセイ（例えば、蛍光タンパク質、比色分析、ルシフェラーゼ）、ＤＮＡ塩基配列決定、および／またはＰＣＲに基づく反応を介して読み出されることができる イベントの安定な記憶をつくりだす。
【００６１】
複数の出力分子を含む成るセンサーも、考察される。いくつかの実施形態において、センサーサーキットは、２つの出力タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、第一の出力分子および/または第二の出力分子は、治療的分子である。いくつかの実施形態において、第一の出力分子または第二の出力分子は、同じ分子である。いくつかの実施形態において、治療的分子は、抗炎症性分子である。いくつかの実施形態において、抗炎症性分子は、サイトカイン、任意にはＩＬ−１０である。いくつかの実施形態において、抗炎症性分子は、クルクミンである。いくつかの実施形態において、抗炎症性分子は、抗体または抗体フラグメントである。本願明細書中で考察される治療的分子の他の非限定的な例は、抗体、単一可変ドメイン、ｓｃＦｖ−フラグメント、５−アミノサリチラート、コルチコステロイド、免疫抑制剤、抗生物質、および、炎症性の経路を標的とするＲＮＡｉ分子またはガイドＲＮＡ分子、インターロイキンまたはコミュニケーション分子自体（例えばＴＮＦ−αまたはＩＬ−１６）、ならびにコミュニケーション分子レセプタ／シグナル処理経路に対する抗体／抗体フラグメントを含む。加えて、抗炎症経路をオンにする抗炎症アゴニスト。
【００６２】
生物学的センサーサーキットの成分（例えば、プロモーター、リボゾーム結合部位、および／または出力分子）は、ベクター上にあり得る。いくつかの実施形態において、プロモーターは、同じベクター（例えば、プラスミド）上にある。いくつかの実施形態において、プロモーターは、異なるベクター（例えば、別々のプラスミド上の各々）上にある。いくつかの実施形態において、プロモーターは、同じベクターの高いコピープラスミド、中間のコピープラスミド、または低いコピープラスミド上にあり得る。いくつかの実施形態において、生物学的アナログシグナル処理サーキットの出力分子は、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）にあり得る。いくつかの実施形態において、センサーサーキットは、生物のゲノムに統合される。
【００６３】
ＩＢＤを診断し、処置する方法
本開示は、センサーサーキットを含むプロバイオティックスが、それらが腸を通過するにつれてＩＢＤを診断し、処置するために経口で消費されることができるという驚くべき発見に基づく。さらにその上、操作されたプロバイオティックスは、大便から回収され、それらが腸を移動する間遭遇した状態に関する情報を回収するために、調査されることができる。したがって、本開示は、方法を提供するそれらの必要に応じて、対象において炎症性大腸疾患を診断しおよび／または処置する。いくつかの実施形態において、炎症性大腸疾患は、クローン病である。いくつかの実施形態において、炎症性大腸疾患は、潰瘍性大腸炎である。
【００６４】
いくつかの側面において、本開示は、対象において、その必要に応じて炎症性大腸疾患を処置する方法であって、対象に、その必要に応じて本明細書中に記載のセンサーサーキットを含むプロバイオティック細胞を投与することを含む前記方法に関する。当業者に公知のいかなる手段によっても、本開示の医薬品組成物を投与することは、達成され得る。投与経路は、経口、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、皮下、眼、膣、および直腸を含むが、これに限定されるものではない。
【００６５】
いくつかの実施形態において、プロバイオティック細胞は、経口で投与される。経口投与のために、細胞を、当分野で周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって、該化合物は、容易に調製されることができる。そのような担体は、本発明の化合物が、治療される患者による経口摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方されることを可能にする。いくつかの実施形態において、プロバイオティック細胞は、プロバイオティック製剤の部分として、任意には食品の成分として投与される。
【００６６】
本明細書中で使用されるように、用語「それを必要とする対象」は、炎症性大腸疾患に伴う、または有すると疑われる兆候または症状を有するいかなる動物をも指す。いくつかの実施形態において、該対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、該対象は、ヒト、ヒト以外の霊長動物、ウマ、ブタ、イヌ、またはネコの対象である。
【００６７】
本方法のいくつかの実施形態において、センサーサーキットは、生物学的アナログシグナル処理サーキットである。本方法のいくつかの実施形態において、入力シグナルは、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である。本方法のいくつかの実施形態において、入力シグナルは、一酸化窒素（ＮＯ）である。本方法のいくつかの実施形態において、入力分子は、炎症性サイトカイン、任意にはＩＬ−６、ＩＬ−１８、またはＴＮＦαである。いくつかの実施形態において、入力分子は、好中球、例えばカルプロテクチンまたはラクトフェリンによって産生される分子である。いくつかの実施形態において、入力シグナルは、血液である。本方法いくつかの実施形態において、第一および/または第二の出力分子は、検出可能である。
【００６８】
本方法のいくつかの実施形態において、第一のおよび/または第二の出力分子は、ＰＣＲ、ＤＮＡ塩基配列決定、比色観察、または顕微鏡、任意には蛍光顕微鏡によって検出可能である。
【００６９】
本方法のいくつかの実施形態において、第一および/または第二の出力分子は、治療的分子である。本方法のいくつかの実施形態において、治療的分子は、抗炎症性分子である。本方法のいくつかの実施形態において、抗炎症性分子は、サイトカイン、任意にはＩＬ−１０である。本方法のいくつかの実施形態において、抗炎症性分子は、クルクミンである。本方法のいくつかの実施形態において、抗炎症性分子は、抗体または抗体フラグメントである。本方法のいくつかの実施形態において、センサーサーキットは、第二の出力分子を更に含む。本方法のいくつかの実施形態において、第二の出力分子は、第一の出力分子と同じである。
【００７０】
本開示のいくつかの側面は、対象における炎症性大腸疾患を診断する方法であって、以下を含む前記方法に関する：（ａ）対象に、本願明細書に記載のプロバイオティック細胞を投与すること；（ｂ）（ａ）の対象から生体試料を得ること；（ｃ）該生体試料中の少なくとも一つの出力分子の発現を検出すること；および、（ｄ）炎症性大腸疾患または炎症性大腸疾患の再燃を有するとして、対象を診断すること。
【００７１】
本方法のいくつかの実施形態において、プロバイオティック細胞は、腸管にコロニーを作る。本方法のいくつかの実施形態において、対象は、哺乳動物である。本方法のいくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。
【００７２】
本明細書中で使用されるように、用語「生体試料」は、炎症マーカーが同定されることができる対象から得られる検体を意味する。生体試料の例は、組織、血液、唾液、尿、および糞便試料を含むが、これに限定されるものではない。
【００７３】
本方法のいくつかの実施形態において、生体試料は、糞便試料である。方法の中でいくつかの実施形態において、出力分子の発現は、in vitroで検出される。本方法のいくつかの実施形態において、炎症性大腸疾患は、クローン病または潰瘍性大腸炎である。いくつかの実施形態において、本方法は、ＩＢＤの処置に有用な剤を対象に投与することを更に含む。
【００７４】
本開示は、以下の番号をつけられた段落によって包含される側面も提示する：
１．以下を含む組換えプロバイオティック細胞：以下を含むセンサーサーキット：（ａ）入力シグナルに応答する制御タンパク質をコードする核酸と、作動可能に連結された第一のプロモーター；（ｂ）制御タンパク質に応答し、かつ、第一の出力タンパク質をコードする核酸と、作動可能に連結された第二のプロモーターであって、制御タンパク質によって結合される場合に、第二のプロモーターの活性が変えられる、前記プロモーター；（ｃ）第三のプロモーターと作動可能に連結された出力分子であって、該出力分子または第三のプロモーターは、制御配列の第一のセットに隣接しており、該制御配列の第一のセットは、第一の出力タンパク質と作用しあって、第三のプロモーターから出力分子の連結を外す、前記出力分子；（ｄ）制御タンパク質に応答し、かつ、第二の出力タンパク質をコードする核酸と作動可能に連結された第四のプロモーター、ここで、該制御タンパク質によって結合される場合に、第四のプロモーターの活性が変えられる；および、任意に、（ｅ）制御配列の第二のセットに隣接している第二の出力分子であって、ここで制御配列の第二のセットは、第二の出力タンパク質と作用しあって、第二の出力分子を第五のプロモーターと作動可能に連結する、前記出力分子。
２．（ａ）のプロモーターが構成的に活性なプロモーターである、段落１に記載の組換えプロバイオティック細胞。
３．制御タンパク質がｏｘｙＲ、ＮｏｒＲ、およびＮｓｒＲからなる群から選択される、段落１または２に記載の組換えプロバイオティック細胞。
４．入力シグナルが、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である、段落１〜３のいずれか一に記載の組換えプロバイオティック細胞。
５．入力シグナルが、一酸化窒素（ＮＯ）である、段落１〜３のいずれか一に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【００７５】
６．入力シグナルが、炎症性サイトカイン、任意にＩＬ−６、ＩＬ−１８、またはＴＮＦαである、段落１または２に記載の組換えプロバイオティック細胞。
７．プロモーター（ｂ）および／または（ｄ）のプロモーターが、修飾されていない同様のプロモーターと比較して、（ｂ）および／または（ｄ）のプロモーターに関する転写因子のまたはＲＮＡポリメラーゼの結合親和性を変える修飾を含む、段落１〜６のいずれか一に記載の組換えプロバイオティック細胞。
８．修飾が、核酸の突然変異である、段落７に記載の組換えプロバイオティック細胞。
９．（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、ベクトル上にある、段落１〜８のいずれか一に記載の組換えプロバイオティック細胞。
１０．（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）が、ベクター上にある、段落９に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【００７６】
１１．（ａ）および（ｂ）が、単一のベクター上にある、段落１〜１０のいずれか一に記載の組換えプロバイオティック細胞。
１２．（ａ）、（ｂ）、および（ｄ）が、単一のベクター上にある、段落１１に記載の組換えプロバイオティック細胞。
１３．（ｃ）および／または（ｅ）が、細菌人工染色体（ＢＡＣ）上にある、段落１〜１２のいずれか一に記載の組換えプロバイオティック細胞。
１４．（ｂ）および／または（ｄ）が、第一の出力タンパク質の生成を制御し、かつ、第二のプロモーターと第一の出力タンパク質をコードする核酸の間に位置される配列要素を更に含む、段落１〜１３のいずれか一に記載の組換えプロバイオティック細胞。
１５．配列要素が、出力タンパク質の転写または翻訳を制御する、段落１４に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【００７７】
１６．配列要素が、リボゾーム結合部位である、段落１４または１５に記載の組換えプロバイオティック細胞。
１７．配列要素が、修飾されていない同様のリボゾーム結合部位と比較して、修飾されたリボゾーム結合部位に関するリボゾームの結合親和性を変える修飾を含む、修飾されたリボゾーム結合部位である、段落１６に記載の組換えプロバイオティック細胞。
１８．（ｂ）および／または（ｄ）のプロモーターが、修飾されていない同様のプロモーターと比較して、ｏｘｙＲ、ｎｉｒ、ｈｃｐ、ｎｒｆＡ、ｎａｓＤ、ｙｔｆＥ、ｙｅａＲ、ｎｎｒＳ、およびｎｏｒＶからなる群から選択される（ｂ）のプロモーターに関する転写因子またはＲＮＡポリメラーゼの結合親和性を変える修飾を含む、ｏｘｙＲ、ｏｘｙＳｐ、ｋａｔＧｐ、ｎｉｒ、ｈｃｐ、ｎｒｆＡ、ｎａｓＤ、ｙｔｆＥ、ｙｅａＲ、ｎｎｒＳ、およびｎｏｒＶからなる群から選択されるプロモーターである、段落１〜１７のいずれか一に記載の組換えプロバイオティック細胞。
１９．（ｂ）および／または（ｄ）のプロモーターが、天然に存在するプロモーターである、ｏｘｙＲ、ｏｘｙＳｐ、ｋａｔＧｐ、ｎｉｒ、ｈｃｐ、ｎｒｆＡ、ｎａｓＤ、ｙｔｆＥ、ｙｅａＲ、ｎｎｒＳ、およびｎｏｒＶからなる群から選択されるプロモーターである、段落１〜１７のいずれか一に記載の組換えプロバイオティック細胞。
２０．（ｂ）の第一の出力タンパク質が、リコンビナーゼであり、かつ、（ｃ）の制御配列の第一のセットが、リコンビナーゼ認識部位である、段落１〜１９のいずれか一に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【００７８】
２１．（ｄ）の第二の出力タンパク質が、リコンビナーゼであり、かつ、（ｅ）の制御配列の第二のセットが、リコンビナーゼ認識部位である、段落１〜２０のいずれか一に記載の組換えプロバイオティック細胞。
２２．第一の出力分子および/または第２の出力分子が、検出可能である、段落１〜２１のいずれか一に記載の組換えプロバイオティック細胞。
２３．第一の出力分子および／または第二の出力分子が、ＰＣＲ、ＤＮＡ塩基配列決定、または顕微鏡、任意には蛍光顕微鏡によって検出可能である、段落２２に記載の組換えプロバイオティック細胞。
２４．第一の出力分子および／または第２の出力分子が、治療的分子である、段落１〜２３のいずれか一に記載の組換えプロバイオティック細胞。
２５．第一の出力分子および第２の出力分子が、同じ分子である、段落１〜２４のいずれか一に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【００７９】
２６．治療的分子が、抗炎症性分子である、段落２４に記載の組換えプロバイオティック細胞。
２７．抗炎症性分子が、サイトカイン、任意にはＩＬ−１０である、段落２６に記載の組換えプロバイオティック細胞。
２８．抗炎症性分子が、フェルロイル−ＣｏＡをクルクミンに変換するクルクミノイドシンターゼ（ＣＵＳ）である、段落２６に記載の組換えプロバイオティック細胞。
２９．細胞が、細菌細胞または真菌細胞である、段落１〜２８のいずれか一に記載の組換えプロバイオティック細胞。
３０．細菌細胞が、大腸菌細胞、任意にはE. coli Nissle 1917細胞である、段落２９に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【００８０】
３１．真菌細胞が酵母菌、任意にはSaccharomyces boulardii細胞である、段落２９に記載の組換えプロバイオティック細胞。
３２．それを必要とする対象において、炎症性大腸疾患を処置する方法であって、それを必要とする対象に、段落１〜３１のいずれか一に記載のプロバイオティック細胞を投与することを含む、前記方法。
３３．炎症性大腸疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎である、段落３２に記載の方法。
３４．センサーサーキットが、生物学的アナログシグナル処理サーキットである、段落３２または３３に記載の方法。
３５．入力シグナルが、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である、段落３２〜３４のいずれか一に記載の方法。
【００８１】
３６．入力シグナルが、一酸化窒素（ＮＯ）である、段落３２〜３４のいずれか一に記載の方法。
３７．入力分子が、炎症性サイトカイン、任意にはＩＬ−６、ＩＬ−１８、またはＴＮＦαである、段落３２〜３４のいずれか一に記載の方法。
３８．出力分子が検出可能である、段落３２〜３７のいずれか一に記載の方法。
３９．出力分子がＰＣＲ、ＤＮＡ塩基配列決定、または顕微鏡、任意には蛍光顕微鏡によって検出可能である、段落３２〜３８のいずれか一に記載の方法。
４０．出力分子が治療的分子である、段落３２〜３９のいずれか一に記載の方法。
【００８２】
４１．治療的分子が，抗炎症性分子である，段落４０に記載の方法。
４２．抗炎症性分子が、サイトカイン、任意にはＩＬ−１０である、段落４１に記載の方法。
４３．抗炎症性分子が、フェルロイル−ＣｏＡをクルクミンに変換するクルクミノイドシンターゼ（ＣＵＳ）である、段落４１に記載の方法。
４４．センサーサーキットが、第二の出力分子を更に含む、段落３２〜４３のいずれか一項に記載の方法。
４５．第二の出力分子が第一の出力分子と同じである、段落３２〜４４のいずれか一に記載の方法。
【００８３】
４６．対象における炎症性大腸疾患を診断する方法であって、以下を含む前記方法：（ａ）対象に段落１−１６のいずれか一に記載のプロバイオティック細胞を投与すること；（ｂ）（ａ）の対象から生体試料を得ること；（ｃ）該生体試料中の少なくとも一つの出力分子の発現を検出すること；および（ｄ）炎症性大腸疾患を有するとして対象を診断すること。
４７．プロバイオティック細胞が、腸管にコロニーを形成する、段落４６に記載の方法。
４８．対象が哺乳動物である、段落４６または４７に記載の方法。
４９．対象が、ヒトである、段落４８に記載の方法。
５０．生体試料が、糞便試料である、段落４６〜４９のいずれか一に記載の方法。
【００８４】
５１．出力分子の発現が、in vitroで検出される、段落４６〜５０のいずれか一に記載の方法。
５２．炎症性大腸疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎である、段落４６〜５１のいずれか一に記載の方法。
５３．段落４６〜５２のいずれか一に記載の方法であって、（ｅ）ＩＢＤの処置に有用な剤を対象に投与することをさらに含む、前記方法。
５４．以下を含む組換えプロバイオティック細胞：以下を含むセンサーサーキット：（ａ）入力シグナルに応答する制御タンパク質をコードする核酸と、作動可能に連結された第一のプロモーター；および（ｂ）制御タンパク質に応答し、かつ、第一の出力タンパク質をコードする核酸と、作動可能に連結された第二のプロモーターであって、制御タンパク質によって結合される場合に、第二のプロモーターの活性が変えられる、前記プロモーター；
５５．（ａ）のプロモーターが構成的に活性なプロモーターである、段落１に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【００８５】
５６．制御タンパク質がｏｘｙＲ、ＮｏｒＲ、およびＮｓｒＲからなる群から選択される、段落５４または５５に記載の組換えプロバイオティック細胞。
５７．入力シグナルが、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である、段落５４〜５６のいずれか一に記載の組換えプロバイオティック細胞。
５８．入力シグナルが、一酸化窒素（ＮＯ）である、段落５４〜５６のいずれか一に記載の組換えプロバイオティック細胞。
５９．入力シグナルが、炎症性サイトカイン、任意にＩＬ−６、ＩＬ−１８、またはＴＮＦαである、段落５４または５５に記載の組換えプロバイオティック細胞。
６０．プロモーター（ｂ）のプロモーターが、修飾されていない同様のプロモーターと比較して、（ｂ）のプロモーターに関する転写因子のまたはＲＮＡポリメラーゼの結合親和性を変える修飾を含む、段落５４〜５９のいずれか一に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【００８６】
６１．修飾が、核酸の突然変異である、段落６０に記載の組換えプロバイオティック細胞。
６２．（ａ）および（ｂ）が、ベクター上にある、段落５４〜６１のいずれか一に記載の組換えプロバイオティック細胞。
６３．（ａ）および（ｂ）が、単一のベクター上にある、段落５４〜６２のいずれか一に記載の組換えプロバイオティック細胞。
６４．（ｂ）が、第一の出力タンパク質の生成を制御し、かつ、第二のプロモーターと第一の出力タンパク質をコードする核酸との間に位置される配列要素を更に含む、段落５４〜６３のいずれか一に記載の組換えプロバイオティック細胞。
６５．配列要素が、出力タンパク質の転写または翻訳を制御する、段落６４に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【００８７】
６６．配列要素が、リボゾーム結合部位である、段落６４または６５に記載の組換えプロバイオティック細胞。
６７．配列要素が、修飾されていない同様のリボゾーム結合部位と比較して、修飾されたリボゾーム結合部位に関するリボゾームの結合親和性を変える修飾を含む、修飾されたリボゾーム結合部位である、段落６６に記載の組換えプロバイオティック細胞。
６８．（ｂ）のプロモーターが、修飾されていない同様のプロモーターと比較して、ｏｘｙＲ、ｎｉｒ、ｈｃｐ、ｎｒｆＡ、ｎａｓＤ、ｙｔｆＥ、ｙｅａＲ、ｎｎｒＳ、およびｎｏｒＶからなる群から選択される（ｂ）のプロモーターに関する転写因子またはＲＮＡポリメラーゼの結合親和性を変える修飾を含む、ｏｘｙＲ、ｏｘｙＳｐ、ｋａｔＧｐ、ｎｉｒ、ｈｃｐ、ｎｒｆＡ、ｎａｓＤ、ｙｔｆＥ、ｙｅａＲ、ｎｎｒＳ、およびｎｏｒＶからなる群から選択されるプロモーターである、段落５４〜６７のいずれか一に記載の組換えプロバイオティック細胞。
６９．（ｂ）のプロモーターが、天然に存在するプロモーターである、ｏｘｙＲ、ｏｘｙＳｐ、ｋａｔＧｐ、ｎｉｒ、ｈｃｐ、ｎｒｆＡ、ｎａｓＤ、ｙｔｆＥ、ｙｅａＲ、ｎｎｒＳ、およびｎｏｒＶからなる群から選択されるプロモーターである、段落５４〜６８のいずれか一に記載の組換えプロバイオティック細胞。
７０．第一の出力分子が、治療的分子である、段落５４〜６９のいずれか一に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【００８８】
７１．治療的分子が、抗炎症性分子である、段落７０に記載の組換えプロバイオティック細胞。
７２．抗炎症性分子が、サイトカイン、任意にはＩＬ−１０である、段落７１に記載の組換えプロバイオティック細胞。
７３．抗炎症性分子が、フェルロイル−ＣｏＡをクルクミンに変換するクルクミノイドシンターゼ（ＣＵＳ）である、段落７１に記載の組換えプロバイオティック細胞。
７４．４−クマラート：ＣｏＡリガーゼおよびアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼをコードする核酸を更に含む段落７１に記載の組み換え型のプロバイオティック細胞であって、該核酸が、任意には１または２以上のベクターである、前記プロバイオティック細胞。
７５．アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼをコードする核酸が、ＡｃｃＢｃおよびＤｔｓＲ１である、段落７４に記載の組換えプロバイオティック細胞。
【００８９】
７６．４−クマラート：ＣｏＡリガーゼおよびアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼをコードする核酸が、構成プロモーターと作動可能に連結された、段落７４または７５に記載の組換えプロバイオティック細胞。
７７．細胞が、細菌細胞または真菌細胞である、段落５４〜７６のいずれか一に記載の組換えプロバイオティック細胞。
７８．細菌細胞が、大腸菌細胞、任意にはE. coli Nissle 1917細胞である、段落７７に記載の組換えプロバイオティック細胞。
７９．真菌細胞が酵母菌、任意にはSaccharomyces boulardii細胞である、請求項７７に記載の組換えプロバイオティック細胞。
８０．それを必要とする対象において、炎症性大腸疾患を処置する方法であって、それを必要とする対象に、請求項５４〜７９のいずれか一に記載のプロバイオティック細胞を投与することを含む前記方法。
【００９０】
８１．炎症性大腸疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項８０に記載の方法。
８２．以下を含む組換え細胞：以下を含むセンサーサーキット：（ａ）入力シグナルに応答する制御タンパク質をコードする核酸と、作動可能に連結された第一のプロモーター；（ｂ）制御タンパク質に応答し、そして第一の出力タンパク質をコードする核酸と作動可能に連結された第二のプロモーターであって、第二のプロモーターが、ｎｉｒ、ｈｃｐ、ｎｒｆＡ、ｎａｓＤ、ｙｔｆＥ、ｙｅａＲ、ｎｎｒＳ、またはｎｏｒＶプロモーターであり、かつ、制御タンパク質によって結合される場合に、第二のプロモーターの活性が変えられる、前記プロモーター；および（ｃ）プロモーター制御配列の第一のセットが隣接している出力分子であって、制御配列の第一のセットは、第一の出力タンパク質と作用しあって、出力分子を第三のプロモーターと作動可能に連結する、前記出力分子。
８３．更に以下を含む段落８２に記載の組換え細胞：（ｄ）制御タンパク質に応答し、および第二の出力タンパク質をコードする核酸と作動可能に連結された第四のプロモーターであって、ここで、該制御タンパク質によって結合される場合に、第四のプロモーターの活性が変えられる、前記プロモーター。
８４．更に以下を含む段落８３に記載の組換え細胞：（ｅ）制御配列の第二のセットに隣接している第二の出力分子であって、ここで制御配列の第二のセットは、第二の出力タンパク質と作用しあって、第二の出力分子を第五のプロモーターと作動可能に連結する、前記出力分子。
８５．制御タンパク質がＮｓｒＲである、段落８２〜８４のいずれか一に記載の組換え細胞。
【００９１】
８６．制御タンパク質がＮｏｒＲである、段落８２〜８４のいずれか一に記載の組換え細胞。
８７．入力シグナルが、一酸化窒素（ＮＯ）である、段落８２〜８６のいずれか一に記載の組換えプロバイオティック細胞。
８８．入力シグナルが、炎症性サイトカイン、任意にはＩＬ−６、ＩＬ−１８、またはＴＮＦαである、段落８２に記載の組換え細胞。
８９．（ａ）の第一のプロモーターが、構成的に活性なプロモーターである、段落８２〜８８のいずれか一に記載の組換え細胞。
９０．プロモーター（ｂ）の第二のプロモーターが、修飾されていない同様のプロモーターと比較して、（ｂ）の第二のプロモーターに関する転写因子のまたはＲＮＡポリメラーゼの結合親和性を変える修飾を含む、段落８２〜８９のいずれか一に記載の組換え細胞。
【００９２】
９１．修飾が、核酸の突然変異である、段落９０に記載の組換え細胞。
９２．（ａ）および（ｂ）が、単一のベクター上にある、段落８２〜９１のいずれか一に記載の組換え細胞。
９３．（ｂ）が、第一の出力タンパク質の生成を制御し、かつ、第二のプロモーターと第一の出力タンパク質をコードする核酸との間に位置される配列要素を更に含む、段落８２〜９２のいずれか一に記載の組換え細胞。
９４．配列要素が、出力タンパク質の転写または翻訳を制御する、段落９３に記載の組換えプロバイオティック細胞。
９５．配列要素が、リボゾーム結合部位である、段落９３または９４に記載の組換え細胞。
【００９３】
９６．配列要素が、修飾されていない同様のリボゾーム結合部位と比較して、修飾されたリボゾーム結合部位に関するリボゾームの結合親和性を変える修飾を含む、修飾されたリボゾーム結合部位である、段落９４または９５に記載の組換え細胞。
９７．（ｂ）の第一の出力タンパク質が、リコンビナーゼであり、かつ、（ｃ）の制御配列の第一のセットが、リコンビナーゼ認識部位を含む、段落８２〜９６のいずれか一に記載の組換え細胞。
９８．第一の出力タンパク質または第２の出力タンパク質が検出可能である、段落８２に記載の組換え細胞。
９９．第一の出力タンパク質または第２の出力タンパク質が、ＰＣＲ、ＤＮＡ塩基配列決定、または顕微鏡、任意には蛍光顕微鏡によって検出可能である、段落８２〜９８のいずれか一に記載の組換え細胞。
１００．（ｃ）の出力分子が、治療的分子である、段落８２〜９９のいずれか一に記載の組換え細胞。
【００９４】
１０１．治療的分子が、抗炎症性分子である、段落１００に記載の組換え細胞。
１０２．抗炎症性分子が、サイトカインである、段落１０１に記載の組換え細胞。
１０３．サイトカインが、ＩＬ−１０である、段落１０２に記載の組換え細胞。
１０４．抗炎症性分子が、クルクミノイドシンターゼ（ＣＵＳ）である、段落１０１に記載の組換え細胞。
１０５．細胞が、細菌細胞または真菌細胞である、段落８２〜１０４のいずれか一に記載の組換え細胞。
【００９５】
１０６．細胞が、大腸菌細胞である、段落１０５に記載の組換え細胞。
１０７．細胞が、Saccharomyces boulardii細胞である、段落１０５に記載の組換え細胞。
１０８．組換え細胞が、組換え細胞である、段落８２〜１０７に記載の組換え細胞。
１０９．炎症性大腸疾患の処置を必要とする対象において炎症性大腸疾患を処置する方法であって、炎症性大腸疾患を有する対象に段落８２〜１０８のいずれか一に記載の細胞を投与することを含む、前記方法。
１１０．炎症性大腸疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎である、段落１０９に記載の方法。
【実施例】
【００９６】
実施例
はじめに
本開示は、部分的に、炎症に関する生体内のセンサーおよび局所的な治療法としてのプロバイオティック細菌のセットの操作に関する。多くの強力な合成遺伝子サーキットが過去１０年に記載されてきたにもかかわらず、ほとんどヒト疾患の研究および操作に適用されてこなかった。本願明細書中に記載されるプロバイオティック細胞は、健康な環境および疾病環境の双方における炎症を研究するのに有用であり、ＩＢＤの発症、およびＩＢＤ再燃の早期検出のための診断の設計を開始しおよびそれらに貢献するキー分子のタイミングおよび濃度の特定を可能にする。より有効な治療法の開発のために理解することがそれらに必須であっても、ＩＢＤにおける炎症の媒体のin vivoでの正確なプロフィールは、詳細に計画されていなかった。本願明細書中に記載されるように、診断用センサーを含むプロバイオティック細胞は、需要に応じて抗炎症治療法を発現するためにも操作され、したがって、ＩＢＤ治療法のタイミング、用量、および位置についての決定を下すインテリジェント薬剤をもたらす。プロバイオティックスの先行研究は、抗炎症薬剤の構成的生成を利用したが、これらは臨床試験において良好な有効性を示さなかった。
【００９７】
実施例１：炎症のためのプロバイオティックセンサーおよび記憶サーキット
この実施例においては、プロバイオティック細菌、例えばE. coli Nissle 1917は、センサーサーキットを介して、炎症媒体、例えばＨ２Ｏ２およびＮＯの存在および濃度を検出し、記憶するために操作される（図２）。具体的には、プロバイオティック細胞は、複数の独立したサーキットの下で発現され、炎症の異なるレベルによって誘発される直交性リコンビナーゼのセットを含むために操作される。図２に例示されるように、炎症センサーが低い閾値を超える場合に、リコンビナーゼ１の発現は誘導され、炎症センサーが中間の閾値を超える場合に、リコンビナーゼ２の発現は誘導され、そして、炎症センサーが高い閾値を超える場合に、リコンビナーゼ３の発現は誘導される。
【００９８】
発現された場合、これらのリコンビナーゼは、ＤＮＡの特定の伸展を反転させ、すなわち、リポーターアッセイ（例えば、蛍光タンパク質、比色分析、ルシフェラーゼ）、ＤＮＡ塩基配列決定、および／またはＰＣＲに基づく反応を介して読み出されるイベントの安定な記憶をつくりだす（３）。
【００９９】
結果
Ｈ２Ｏ２およびパラコート（スーパーオキサイド発生剤）を検出するための二つの直交性センサーを含んでいる操作された細菌細胞が、操作された。その結果は、操作された細菌が、野生型の哺乳動物免疫細胞と、ＩＢＤに関連する突然変異を有するそれらとを区別することができることを説明している（４）。さらにまた、ＯｘｙＲ転写因子を用いてＨ２Ｏ２の種々の濃度を検出することができる２つの大腸菌株が、産生された。ＯｘｙＲは通常は、還元型にあるが、一旦Ｈ２Ｏ２と反応すれば、それは酸化型に変わり、それは標的とされたプロモーター（例えばａｈｐＣｐ、ｋａｔＧｐ、ｏｘｙＲｐ、ｏｘｙＳｐ）の特定のＤＮＡ制御要素と結合する（７〜９）。
【０１００】
Ｈ２Ｏ２感知のための６つの組合せの設計は、ＧＦＰの発現を統制するために、３つのリボゾーム結合部位（標準生物学的パーツ登録所からのＢＢａ＿００２９、ＢＢａ＿００３１、ＢＢａ＿００３３）を有する２つのプロモーター（ｋａｔＧｐおよびｏｘｙＳｐ）を集めることによってなされ、このように、転写および翻訳の両方を調整した。これらの構築物の３つは、Ｈ２Ｏ２濃度にかかわりなく構成的に高い活性を有した。残りの３つ（図３に示される；ｏｘｙＳｐ＋００３３、ｋａｔＧｐ＋００３１、ｋａｔＧｐ＋００２９）は、Ｈ２Ｏ２（入力）と％ＧＦＰ−陽性細胞（出力）の間に伝達関数の２つの異なった閾値を呈した（図３）。これらの結果は、Ｈ２Ｏ２の異なる感知された濃度が、異なる遺伝子発現プロフィールを誘導する遺伝子サーキットを示し、このように、炎症の種々のレベルの感知を可能にする。
【０１０１】
一酸化窒素センサーの開発
ＮＯ感受性転写因子（例えばＮｏｒＲ（１５）およびＮｓｒＲ（１６））は、プロバイオティック細胞のＮＯセンサーサーキットクラスを操作するために、ｎｉｒ（１６）、ｈｃｐ、ｎｒｆＡ（１８）、ｎａｓＤ（１９）、ｙｔｆＥ（１８、２０）、ｙｅａＲ、ｎｎｒＳ（２０）およびｎｏｒＶ（２１）プロモーターを含む、様々なそれらのそれぞれのプロモーターと組み合わされる。プロモーター機能的なセンサーサーキットを選別するために、ＮｓｒＲおよびＮｏｒＲは、低いコピープラスミド上のＩＰＴＧ−誘発プロモーター（ｐＬｌａｃＯ）の制御下で配置される。ＮＯ感受性プロモーターは、同じプラスミド上の出力分子として、成熟のためのＯ２を要求しない、フラビンが基本とされるリポーター遺伝子（例えばＥｃＦｐＦＢまたはｉＬＯＶ）を統制する（２２）。ＮＯセンサーサーキットは、ＩＰＴＧおよびＮＯを生成する分子（ニトロプルシドナトリウムまたはジエチレントリアミン／一酸化窒素等）の濃度の増加によって誘発することによって、E. coli MG1655-Pro（ゲノムからＬａｃＩを発現する株）へと形質転換される。ＮＯセンシングサーキットは、嫌気的、または、微好気的に機能するために、内因的に設計される。
【０１０２】
実施例２：ＩＢＤの局所的な感知および処置のためのプロバイオティック細菌の設計
炎症に応答して抗炎症化合物を産生し分泌するプロバイオティクスは、ＩＢＤ処置のためのペプチドおよびいくつかの小分子を経口的に導入する困難さへの解決策を提供する。この実施例は、それらが必要な場合、場所、時でのみ抗炎症化合物を放出し、これにより潜在的に現在ＩＢＤ治療に伴う副作用を低減し、臨床症状に先立つＩＢＤ再燃を処置することによって成功率を上げるインテリジェントプロバイオティックスの構成を、記載する。インテリジェント治療法は、それらがタイムリーに正しい部位に到達すること確実にするため、炎症を検出した後に急速に放出されなければならない。
【０１０３】
抗炎症タンパク質および／または抗炎症小分子を発現する炎症センサーサーキットを有する操作されたプロバイオティック細胞は、構成される。有用な出力分子の非限定的な例は、サイトカインＩＬ−１０、抗ＴＮＦα抗体、抗体フラグメント、および小分子クルクミンを含む。センサーサーキットの設計は、プロバイオティック細菌に挿入され、活性酸素種の種々の濃度によって誘発させ、時間応答および結果として生じる抗炎症化合物のタイターを測定することによって、in vitroで検証される。
【０１０４】
大腸菌の突然変異株は、サイトカインおよび抗体の産生のために必要とされる。若干の真核生物のタンパク質は、ジスルフィド結合形成を必要とする；しかしながら、自然に酸化している大腸菌の細胞質中でこれらの分子を正しく折り畳むことは、困難である。それゆえ、還元している細胞質を有するあらかじめ確立した変異大腸菌株（１０）は、大量に、活性抗炎症化合物を発現させるために用いられる。上澄み中への活性治療的分子の分泌を達成するために、治療的タンパク質は、よく理解されているＩ型分泌システム（１１）を使用するシグナル伝達ペプチドと、融合される。分泌されたタンパク質中のジスルフィド結合形成は、還元および非還元タンパク質ゲル電気泳動によって確認される。活性は、上澄みをマクロファージとインキュベートし、続いてマクロファージの特定の膜貫通受容体に関するウェスタンブロット解析により検証される。
【０１０５】
小分子の抗炎症薬のために、クルクミンの発現を統制するセンサーサーキットを有するプロバイオティック細胞は、構成される。クルクミンは、Curcuma longaによって天然に産生される疎水性分子である。潜在的にＮＦκＢの抑制を通して、クルクミンが抗炎症特性を呈することが示された（１２）。クルクミンはヒトにおいて高用量で安全であるが、低い吸収、急速な代謝および／または全身からの除去によって生じる劣った生物学的利用能は、現在有効な治療法としてのとしてのクルクミンにとっての制限要因である（１３）。
【０１０６】
これらの問題を克服するために、in vivo炎症マーカーを感知しクルクミンを発現するため操作されたプロバイオティック細菌は構成された。フェルラ酸（安価なおよび商業的に入手可能な化合物）から、大腸菌におけるクルクミンの生成を可能にするための合成生成経路はすでに記載されている（１４）。フェルラ酸は、ＬＥ４ＣＬ−１（４−クマラート：Lithospermum erythrorhizonからのＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ））によってフェルロイル−ＣｏＡに変換され、次々に、クルクミノイドシンターゼ（ＣＵＳ）によってクルクミンに変換される（図４Ａ）。生合成の最終ステップは、補因子としてのマロニル−ＣｏＡを必要とする。ＡｃｃＢｃおよびＤｔｓＲ１、アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに転換するアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ複合体を形成する二つの酵素も、重要である。炎症−センシングサーキットによってクルクミンの統制された生成を可能にするために、最後の変換ステップ（フェルロイル−ＣｏＡからクルクミンへ）のために必要とされるクルクミノイドシンターゼ（ＣＵＳ）酵素の発現は、炎症センサーによって制御下に配置される。
【０１０７】
【表１−１】
2018501797.tif 000003
【表１−２】
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【表１−３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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