(57)【要約】望ましくない細胞の存在によって特徴づけられる状態を治療するための標的化Ｔ細胞結合剤は、（ａ）望ましくない細胞を標的とすることができる標的化部分、（ｂ）第２のＴ細胞結合ドメインと結合した場合にＴ細胞結合活性になることができる第１のＴ細胞結合ドメイン（ここでは、第２のＴ細胞結合ドメインは薬剤の一部ではない）、（ｃ）少なくとも１つの不活性結合パートナーであって、その不活性結合パートナーが除去されない限り第１のＴ細胞結合ドメインが第２のＴ細胞結合ドメインに結合しないように、第１のＴ細胞結合ドメインに結合することができる、不活性結合パートナー、及び（ｄ）第１のＴ細胞結合ドメインと不活性結合パートナーを分離する、少なくとも１つの切断部位（ここでは、切断部位は、（ｉ）望ましくない細胞が発現する酵素によって切断される、（ｉｉ）望ましくない細胞の内部でｐＨ感受性切断反応を介して切断される、（ｉｉｉ）補体依存的切断反応によって切断される）を含む。【選択図】図１
2018538262.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
望ましくない細胞の存在によって特徴づけられる状態を治療するための二成分系であって、
ａ．標的化Ｔ細胞結合剤を含む第１の成分であって、前記標的化Ｔ細胞結合剤は、
ｉ．前記望ましくない細胞を標的とすることができる第１の標的化部分、
ｉｉ．第２のＴ細胞結合ドメインと結合した場合にＴ細胞結合活性になることができる第１のＴ細胞結合ドメイン（ここでは、前記第２のＴ細胞結合ドメインは前記第１の成分の一部ではない）、
ｉｉｉ．前記第１のＴ細胞結合ドメインに対する第１の不活性結合パートナーであって、前記不活性結合パートナーが除去されない限り前記第１のＴ細胞結合ドメインが前記第２のＴ細胞結合ドメインに結合しないように前記第１のＴ細胞結合ドメインに結合する、前記不活性結合パートナー、
ｉｖ．前記第１のＴ細胞結合ドメインと前記第１の不活性結合パートナーを分離する切断部位（ここでは、前記切断部位は、
（１）前記望ましくない細胞が発現する酵素によって切断される、
（２）前記望ましくない細胞の内部でｐＨ感受性切断反応を介して切断される、
（３）補体依存的切断反応によって切断される、または
（４）前記薬剤中の標的化部分と同じもしくは異なる標的化部分によって前記望ましくない細胞に共存するプロテアーゼによって切断される）
を含む、前記第１の成分、
ｂ．前記第１のＴ細胞結合ドメインと結合した場合にＴ細胞結合活性になることができる第２のＴ細胞結合ドメインを含む第２の成分、を含み、ここでは、前記第１及び第２のＴ細胞結合ドメインが、どちらも不活性結合パートナーに結合していない場合に結合することができる、前記二成分系。
【請求項２】
前記第２の成分が前記望ましくない細胞を標的とすることができる第２の標的化部分をさらに含む、請求項２に記載の二成分系。
【請求項３】
前記第２の成分が、前記第２のＴ細胞結合ドメインに対する第２の不活性結合パートナーであって、前記不活性結合パートナーが除去されない限り前記第２のＴ細胞結合ドメインが前記第１のＴ細胞結合ドメインに結合しないように前記第２のＴ細胞結合ドメインに結合する、前記不活性結合パートナー、及び
ａ．前記第２のＴ細胞結合ドメインと前記第２の不活性結合パートナーを分離する切断部位（ここでは、前記切断部位は、
ｉ．前記望ましくない細胞が発現する酵素によって切断される、
ｉｉ．前記望ましくない細胞の内部でｐＨ感受性切断反応を介して切断される、
ｉｉｉ．補体依存的切断反応によって切断される、または
ｉｖ．前記薬剤中の前記標的化部分と同じもしくは異なる標的化部分によって前記望ましくない細胞に共存するプロテアーゼによって切断される）
をさらに含み、
ここでは、前記切断部位の切断が前記不活性結合パートナーの喪失及び前記二成分系の前記第１のＴ細胞結合ドメインとの相互補完を引き起こす、請求項２に記載の二成分系。
【請求項４】
前記第１及び前記第２の標的化部分が異なる、請求項３に記載の二成分系。
【請求項５】
前記第１及び第２の切断部位が異なる、請求項３に記載の二成分系。
【請求項６】
少なくとも１つの切断部位がプロテアーゼ切断部位である、請求項３に記載の二成分系。
【請求項７】
前記望ましくない細胞が発現する少なくとも１つの酵素がプロテアーゼである、請求項６に記載の二成分系。
【請求項８】
少なくとも１つの不活性結合パートナーが前記Ｔ細胞結合ドメインと特異的に結合する、請求項３に記載の二成分系。
【請求項９】
少なくとも１つの不活性結合パートナーがＶＨまたはＶＬドメインである、請求項８に記載の二成分系。
【請求項１０】
ａ．前記Ｔ細胞結合ドメインがＶＨドメインである場合は、前記不活性結合パートナーがＶＬドメインであり、
ｂ．前記Ｔ細胞結合ドメインがＶＬドメインである場合は、前記不活性結合パートナーがＶＨドメインである、
請求項９に記載の二成分系。
【請求項１１】
少なくとも１つの標的化部分が抗体またはその機能的断片である、請求項３に記載の二成分系。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの不活性結合パートナーが、少なくとも１つの切断部位が切断されると解離することができ、解離後に、前記２つのＴ細胞結合ドメインが互いに結合することができ、Ｔ細胞結合活性を示すことができる、請求項３に記載の二成分系。
【請求項１３】
一方のＴ細胞結合ドメインがＶＨドメインであり、他方のＴ細胞結合ドメインがＶＬドメインである、請求項１２に記載の二成分系。
【請求項１４】
第１の標的化Ｔ細胞結合剤を含む、望ましくない細胞の存在によって特徴づけられる状態を治療するための二成分系で使用するための成分であって、前記第１の標的化Ｔ細胞結合剤は、
ａ．前記望ましくない細胞を標的とすることができる標的化部分、
ｂ．第２のＴ細胞結合ドメインと結合した場合にＴ細胞結合活性になることができる第１のＴ細胞結合ドメイン（ここでは、前記第２のＴ細胞結合ドメインは前記第１の標的化Ｔ細胞結合剤の一部ではない）、
ｃ．前記第１のＴ細胞結合ドメインに対する不活性結合パートナーであって、前記不活性結合パートナーが除去されない限り前記第１のＴ細胞結合ドメインが前記第２のＴ細胞結合ドメインに結合しないように第１のＴ細胞結合ドメインに結合する、前記不活性結合パートナー、
ｄ．前記第１のＴ細胞結合ドメインと前記不活性結合パートナーを分離する切断部位（ここでは、前記切断部位は、
ｉ．前記望ましくない細胞が発現する酵素によって切断される、
ｉｉ．前記望ましくない細胞の内部でｐＨ感受性切断反応を介して切断される、
ｉｉｉ．補体依存的切断反応によって切断される、または
ｉｖ．前記薬剤中の前記標的化部分と同じもしくは異なる標的化部分によって前記望ましくない細胞に共存するプロテアーゼによって切断される）
を含み、
ここでは、前記切断部位の切断が前記不活性結合パートナーの喪失を引き起こし、前記薬剤の一部ではない前記第２のＴ細胞結合ドメインとの相互補完を可能にする、
前記成分。
【請求項１５】
請求項１に記載の前記二成分系の前記第１及び第２の成分をコードする１組の核酸分子。
【請求項１６】
請求項１４に記載の二成分系で使用するための前記成分をコードする核酸分子。
【請求項１７】
患者におけるがんの治療方法であって、請求項１に記載の二成分系を前記患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項１８】
患者におけるがんの治療方法であって、請求項３に記載の二成分系を前記患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項１９】
前記がんが、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がん、黒色腫、肺がん、前立腺がん、精巣がん、甲状腺がん、脳のがん、食道がん、胃がん、膵臓がん、結腸直腸がん、肝臓がん、白血病、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、リンパ増殖性障害、骨髄異形成障害、骨髄増殖性疾患または前がん性疾患のうちのいずれか１つである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
患者の免疫応答を望ましくない細胞に対して標的化する方法であって、請求項３に記載の二成分系を前記患者に投与することを含む、前記。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、望ましくない細胞の存在によって特徴づけられる状態を治療するための標的化Ｔ細胞結合剤に関する。特に、本出願は、望ましくない細胞、例えばがんまたは他の疾患を引き起こす細胞の存在によって特徴づけられる状態を治療するのに使用することができる薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
望ましくない細胞の存在によって引き起こされるがん及び他の疾患は、多大な人命の喪失、苦痛及び経済的影響をもたらす。がんの標的化に対する免疫療法的ストラテジーは、ずっと橋渡し臨床研究の活発な分野である。
【０００３】
免疫療法のために様々な他のアプローチが探究されているが、これらの以前のアプローチの多くは、特定の望ましくない細胞に対して十分な特異性を欠く。例えば、標的細胞上の異なる抗原に結合するｓｃＦｖ部分、補完的デミボディとの対形成を可能にするＦｃドメイン及び相補デミボディ上の別の結合パートナーとの結合を形成することができる結合パートナーをそれぞれが有するデミボディが設計されている。ＷＯ２００７／０６２４６６。しかし、これらのデミボディは、必ずしもがん細胞に特異的とは限らず、同じ抗原を発現する他の細胞と結合し、その細胞上で活性を有する可能性がある。第１の抗原及び機能ドメインの第１の断片に結合する標的化部分を有する第１のポリペプチドを、第２抗原に結合する標的化部分及び機能ドメインの第１の断片に相補的な機能ドメインの第２の断片を有する第２のポリペプチドとともに提供する、ＷＯ２０１３／１０４８０４も参照されたい。同様に、このアプローチは、必ずしもがん細胞に特異的とは限らず、同じ抗原を発現する他の細胞と結合し、その細胞上で活性を有する可能性がある。
【０００４】
以前のアプローチでいくつかの肯定的な試験データが示されているが、臨床的に有効な治療的ストラテジーは、疾患、例えばがんを罹患する個体において強い免疫応答を誘発することができなければならない。さらに、有効な療法は、非常に特異的であるべきであり、体内の他の細胞型に望ましくない副作用を引き起こしてはならない。したがって、再指向性免疫療法のこの分野におけるさらなる発展が必要とされる。
【発明の概要】
【０００５】
説明に従って、本発明者らは、望ましくない細胞の存在によって特徴づけられる状態を治療するための標的化Ｔ細胞結合剤を記載する。この薬剤は、（ａ）望ましくない細胞を標的とすることができる標的化部分、（ｂ）第２のＴ細胞結合ドメインと結合した場合に活性になることができる第１のＴ細胞結合ドメイン（ここでは、第２のＴ細胞結合ドメインは薬剤の一部ではない）、（ｃ）少なくとも１つの不活性結合パートナーであって、その不活性結合パートナーがが除去されない限り第１のＴ細胞結合ドメインが第２のＴ細胞結合ドメインに結合しないように第１のＴ細胞結合ドメインと結合することができる、不活性結合パートナー、（ｄ）第１のＴ細胞結合ドメインと不活性結合パートナーを分離する、少なくとも１つの切断部位を含む。
【０００６】
一実施形態では、望ましくない細胞の存在によって特徴づけられる状態を治療するための二成分系が包含され、二成分系は、
ａ．標的化Ｔ細胞結合剤を含む第１の成分であって、標的化Ｔ細胞結合剤は、
ｉ．望ましくない細胞を標的とすることができる第１の標的化部分、
ｉｉ．第２のＴ細胞結合ドメインと結合した場合にＴ細胞結合活性になることができる第１のＴ細胞結合ドメイン（ここでは、第２のＴ細胞結合ドメインが第１の成分の一部ではない）、
ｉｉｉ．第１の不活性結合パートナーであって、その不活性結合パートナーが除去されない限り第１のＴ細胞結合ドメインが第２のＴ細胞結合ドメインに結合しないように第１のＴ細胞結合ドメインに結合する第１のＴ細胞結合ドメインに対する、不活性結合パートナー、
ｉｖ．第１のＴ細胞結合ドメインと第１の不活性結合パートナーを分離する切断部位（ここでは、切断部位は、
（１）望ましくない細胞が発現する酵素によって切断される、
（２）望ましくない細胞の内部でｐＨ感受性切断反応を介して切断される、
（３）補体依存的切断反応によって切断される、または
（４）薬剤中の標的化部分と同じもしくは異なる標的化部分によって望ましくない細胞に共存するプロテアーゼによって切断される）
を含む、第１の成分、
ｂ．第１のＴ細胞結合ドメインと結合した場合にＴ細胞結合活性になることができる第２のＴ細胞結合ドメインを含む第２の成分
を含み、ここでは、第１及び第２のＴ細胞結合ドメインが、どちらも不活性結合パートナーに結合していない場合に結合することができる。
【０００７】
別の実施形態では、二成分系の第２の成分は、望ましくない細胞を標的とすることができる第２の標的化部分をさらに含む。
【０００８】
別の実施形態では、二成分系の第２の成分は、第２のＴ細胞結合ドメインに対する第２の不活性結合パートナーであって、不活性結合パートナーが除去されない限り第２のＴ細胞結合ドメインが第１のＴ細胞結合ドメインに結合しないように第２のＴ細胞結合ドメインに結合する、不活性結合パートナー及び
ａ．第２のＴ細胞結合ドメインと第２の不活性結合パートナーを分離する切断部位（ここでは、切断部位は、
ｉ．望ましくない細胞が発現する酵素によって切断される、
ｉｉ．望ましくない細胞の内部でｐＨ感受性切断反応を介して切断される、
ｉｉｉ．補体依存的切断反応によって切断される、または
ｉｖ．薬剤中の標的化部分と同じもしくは異なる標的化部分によって望ましくない細胞に共存するプロテアーゼによって切断される）
をさらに含み、
ここでは、切断部位の切断が不活性結合パートナーの喪失及び二成分系の第１のＴ細胞結合ドメインとの相互補完を引き起こす。
【０００９】
いくつかの実施形態では、二成分系の第１及び第２の標的化部分は同じである。
【００１０】
いくつかの実施形態では、二成分系の第１及び第２の標的化部分は異なる。
【００１１】
いくつかの実施形態では、第１及び第２の切断部位は同じである。
【００１２】
いくつかの実施形態では、第１及び第２の切断部位は異なる。
【００１３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの切断部位はプロテアーゼ切断部位である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの切断部位は、望ましくない細胞の外部で切断され得る。
【００１４】
二成分系のいくつかの実施形態では、望ましくない細胞が発現する少なくとも１つの酵素はプロテアーゼである。
【００１５】
二成分系のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの不活性結合パートナーがＴ細胞結合ドメインと特異的に結合する。
【００１６】
二成分系のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの不活性結合パートナーはＶＨまたはＶＬドメインである。
【００１７】
二成分系のいくつかの実施形態では、Ｔ細胞結合ドメインはＶＨドメインであり、不活性結合パートナーはＶＬドメインであり、Ｔ細胞結合ドメインがＶＬドメインである場合、不活性結合パートナーはＶＨドメインである。
【００１８】
二成分系のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的化部分は抗体またはその機能的断片である。二成分系のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの不活性結合パートナーは、少なくとも１つの切断部位がいったん切断されたならば解離することができ、解離後に、２つのＴ細胞結合ドメインは互いに結合することができ、Ｔ細胞結合活性を示すことができる。
【００１９】
二成分系のいくつかの実施形態では、１組の核酸分子が二成分系の第１及び第２の成分をコードする。二成分系のいくつかの実施形態では、核酸分子は二成分系で使用するための成分をコードする。
【００２０】
二成分系のいくつかの実施形態では、一方のＴ細胞結合ドメインはＶＨドメインであり、他方のＴ細胞結合ドメインはＶＬドメインである。
【００２１】
別の実施形態では、第１の標的化Ｔ細胞結合剤を含む望ましくない細胞の存在によって特徴づけられる状態を治療するための二成分系で使用するための成分は、
ａ．望ましくない細胞を標的とすることができる標的化部分、
ｂ．第２のＴ細胞結合ドメインと結合した場合にＴ細胞結合活性になることができる第１のＴ細胞結合ドメイン（ここでは、第２のＴ細胞結合ドメインは第１の標的化Ｔ細胞結合剤の一部ではない）、
ｃ．第１のＴ細胞結合ドメインに対する不活性結合パートナーであって、その不活性結合パートナーが除去されない限り第１のＴ細胞結合ドメインが第２のＴ細胞結合ドメインに結合しないように第１のＴ細胞結合ドメインに結合する、不活性結合パートナー、
ｄ．第１のＴ細胞結合ドメインと不活性結合パートナーを分離する切断部位（ここでは、切断部位は、
ｉ．望ましくない細胞が発現する酵素によって切断される、
ｉｉ．望ましくない細胞の内部でｐＨ感受性切断反応を介して切断される、
ｉｉｉ．補体依存的切断反応によって切断される、または
薬剤中の標的化部分と同じもしくは異なる標的化部分によって望ましくない細胞に共存するプロテアーゼによって切断される）を含み、ここでは、切断部位の切断が不活性結合パートナーの喪失を引き起こし、薬剤の一部ではない第２のＴ細胞結合ドメインにとの相互補完を可能にする。
【００２２】
いくつかの実施形態では、患者に二成分系を投与することを含む、望ましくない細胞の存在によって特徴づけられる患者における疾患の治療方法が包含される。いくつかの実施形態では、二成分系を投与することを含む、望ましくない細胞に対する患者の免疫応答の標的化方法が包含される。いくつかの実施形態では、これらの望ましくない細胞はがん細胞である。いくつかの実施形態では、がんは、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がん、黒色腫、肺がん、前立腺がん、精巣がん、甲状腺がん、脳のがん、食道がん、胃がん、膵臓がん、結腸直腸がん、肝臓がん、白血病、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、リンパ増殖性障害、骨髄異形成障害、骨髄増殖性疾患または前がん性疾患のうちのいずれか１つである。
【００２３】
さらなる目的及び利点は、以下の説明に部分的に記載され、部分的に説明から明白であり、または実施によって学ぶことができる。目的及び利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘される要素及び組み合わせによって、実現及び達成される。
【００２４】
前述の概要及び以下の詳細な説明の両方とも例示的かつ説明的なものにすぎず、特許請求の範囲を制限しないことを理解されたい。
【００２５】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、１つの（いくつかの）実施形態（複数可）を図示し、説明とともに、本明細書に記載の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】第１の成分が、不活性結合パートナーを有する不活性状態の標的化Ｔ細胞結合剤である、二成分系の第１の成分の一実施形態を示す図である。
【図２】切断可能なリンカーが切断され、不活性結合パートナーが放出されて、活性実体を生成するプロセスを示す図である。
【図３】二成分系の１対の補完的な成分から不活性結合パートナーが放出された後の活性な標的化Ｔ細胞結合剤の生成を図示する図である。
【図４】図４Ａ〜Ｃは、標的細胞に結合している二成分系の相補成分の対の段階的プロセスの切断（Ａ）、不活性結合パートナーを結合しているリンカーの切断（Ａ及びＢ）及びＴ細胞の能力がある活性部分を生成するための結合を図示する図である。
【図５】図５Ａ〜Ｂは、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色によるコンストラクトの評価を示す図である。
【図６】がん細胞を様々な個々のコンストラクト及び組み合わせで処理した場合の、Ｔ細胞応答の代理としてのＩＦＮγの発現を示す図である。６２４５は陽性対照として働き、６２４８と６２４９の組み合わせが有益な結果を示す。
【図７】がん細胞を様々な個々のコンストラクト及び組み合わせで処理した場合の、Ｔ細胞応答の代理としてのＩＦＮγの発現を示す図である。６２４５を陽性対照として用い、６２４８と６２４９の組み合わせが有益な結果を示す。
【図８】がん細胞を様々な濃度のコンストラクトで処理した場合の、Ｔ細胞応答の代理としてのＩＦＮγの発現を示す図である。６２４５を陽性対照として用い、６２４８と６２４９の組み合わせが有益な結果を示す。
【図９】図９Ａ〜Ｂは、がん細胞を対照または様々な濃度のコンストラクトで処理した場合のＴ細胞応答の代理としてのＩＦＮγの発現を示す図である。６２４５を陽性対照として用い、６２４８と６２４９の組み合わせが有益な結果を示す。ＰＨＡも、非特異的なＴ細胞活性化の陽性対照として働いた。
【図１０】がん細胞を対照または様々な濃度のコンストラクトで処理した場合の、Ｔ細胞応答の代理としてのＩＦＮγの発現を示す図である。抗ＣＤＥ３  ｓｃＦｖに対するＶＨまたはＶＬのみを有するコンストラクトで非常に低レベルであるが、陽性対照ならびに二重特異性コンストラクト（９３３２及び９３３３の両方）はより高レベルの活性を示した。
【図１１】二成分系の相補的コンストラクトの化学量論的評価を示す図である。
【図１２】ＭＣＦ−７がん細胞を対照または様々な濃度のコンストラクトで処理した場合の、Ｔ細胞応答の代理としてのＩＦＮγの発現を示す図である。
【図１３】がん細胞を対照またはＥｐＣＡＭを標的とする様々な濃度のコンストラクトで処理した場合の、Ｔ細胞応答の代理としてのＩＦＮγの発現を示す図である。
【図１４】がん細胞を対照、または二重パラトピックＥＧＦＲエピトープを標的とするかＥｐＣＡＭとＥＧＦＲの組み合わせを標的とする様々な濃度のコンストラクトで処理した場合の、Ｔ細胞応答の代理としてのＩＦＮγの発現を示す図である。
【図１５】プロテアーゼ切断部位を含むコンストラクトまたはプロテアーゼ切断部位を含まないコンストラクトに対するプロテアーゼ阻害剤の影響を示す図である。
【図１６】ＶＨＨ標的化部分を有するコンストラクトを、ｓｃＦｖ部分を有するコンストラクトと首尾よく対形成させることによって、異なる種類の標的化部分を使用することができることを示す図である。
【図１７】コンストラクト６２４８及び６２４９に対する模式的な配列を示し、様々なリンカーを枠で囲み、プロテアーゼ切断部位を太字及び下線で示す。Ｈｉｓタグも太字である。
【００２７】
配列の説明
表１Ａ及び１Ｂは、本明細書で言及するある特定の配列のリストを提供する。
【００２８】
【表１Ａ−１】
2018538262.tif 000003
【００２９】
【表１Ａ−２】
2018538262.tif 000004
【００３０】
【表１Ａ−３】
2018538262.tif 000005
【００３１】
【表１Ａ−４】
2018538262.tif 000006
【００３２】
【表１Ａ−５】
2018538262.tif 000007
【００３３】
【表１Ａ−６】
2018538262.tif 000008
【００３４】
【表１Ｂ−１】
2018538262.tif 000009
【００３５】
【表１Ｂ−２】
2018538262.tif 000010
【００３６】
【表１Ｂ−３】
2018538262.tif 000011
【００３７】
【表１Ｂ−４】
2018538262.tif 000012
【００３８】
【表１Ｂ−５】
2018538262.tif 000013
【００３９】
【表１Ｂ−６】
2018538262.tif 000014
【発明を実施するための形態】
【００４０】
Ｉ．少なくとも１つの標的化Ｔ細胞結合剤を含む二成分系
様々な標的化Ｔ細胞結合剤が異なる実施形態で記載され、いくつかの実施形態では第１の成分及び第２の成分を含む二成分系の一部として記載される。しかし、実施形態のそれぞれにおいて、標的化部分を使用して、望ましくない細胞の領域に標的化Ｔ細胞結合剤を送達し、それによって、治療効果が局所的に送達されることを可能にすることができる。標的化Ｔ細胞結合剤は、第２のＴ細胞結合ドメインに結合した場合に活性になることができる第１のＴ細胞結合ドメインも含むが、第２のＴ細胞結合ドメインは標的化Ｔ細胞結合剤の一部ではない。言い換えれば、標的化Ｔ細胞結合剤の一部ではない第２のＴ細胞結合ドメインがなければ、第１のＴ細胞結合ドメインはＴ細胞結合活性になることができない。標的化Ｔ細胞結合剤は、第１のＴ細胞結合ドメインに結合することができ、それが第２のＴ細胞結合ドメインへ結合することを妨げることができる、不活性結合パートナーも含む。言い換えれば、不活性結合パートナーは、不活性結合パートナーが除去されない限り第１のＴ細胞結合ドメインが第２のＴ細胞結合ドメインに結合しないように、第１のＴ細胞結合ドメインに結合する。結合しないことによって、本出願は非特異的結合または低レベルの結合（例えば、≦１％、≦５％、≦１０％）を除外しない。この概念は、Ｔ細胞標的結合に不十分な新規のＶＨ／ＶＬ相互補完をともなう機能不足のうちの１つである。タンパク質分解性切断は、不活性なＶＨまたはＶＬ基を遊離させ、これによって、細胞表面での活性なＶＨとＶＬの対の再対形成の機会を与えることが可能になる。さらに、標的化Ｔ細胞結合剤は、第１のＴ細胞結合ドメインと不活性結合パートナーを分離する切断部位を含む。標的化Ｔ細胞結合剤が望ましくない細胞の微小環境に存在する場合に、切断部位が切断される。
【００４１】
いくつかの実施形態では、第２のＴ細胞結合ドメインは第２の標的化Ｔ細胞結合剤の一部である。したがって、いくつかの実施形態では、キットまたは組成物は、１つは第１のＴ細胞結合ドメインを有しもう１つは第２のＴ細胞結合ドメインを有する、２つの標的化Ｔ細胞結合剤を含むことができる。そのようなキットまたは組成物では、不活性結合パートナーは、各薬剤の切断部位がいったん切断されると解離することができ、解離後に、２つのＴ細胞結合ドメインは互いに結合することができ、活性を示すことができる。
【００４２】
２つの標的化Ｔ細胞結合剤を有するいくつかの実施形態では、二成分系は、ＶＨドメインであってよい１つのＴ細胞結合ドメイン及びＶＬドメインであってよいもう１つのＴ細胞結合ドメインを含む。２つの標的化Ｔ細胞結合剤を有する実施形態では、第１の成分及び第２の成分中の標的化部分は、同じでもよく、または異なっていてもよい。
【００４３】
２つの標的化Ｔ細胞結合剤を有する実施形態では、第１の成分及び第２の成分中の切断部位は同じでもよく、または異なっていてもよい。
【００４４】
図１は、（ａ）標的と結合するＶＨドメイン及びＶＬドメインを含むｓｃＦｖ標的化ドメインであって、ＶＨ及びＶＬドメインが可撓性リンカーによって結合している、ｓｃＦｖ標的化ドメイン、（ｂ）不活性なＶＨドメインに結合するＶＬドメインを含む不活性なＴ細胞結合ドメインであって、ＶＨ及びＶＬドメインが、切断部位を有する可撓性リンカーによって結合している、Ｔ細胞結合ドメイン、ならびに（ｃ）標的化ドメインと不活性なＴ細胞結合ドメインを結合する可撓性リンカーを含む、標的化Ｔ細胞結合剤コンストラクトの一実施形態を示す。
【００４５】
いくつかの実施形態では、図２は、切断可能なリンカーが切断され、不活性結合パートナーが放出されて、不活性結合パートナーを有さない実体を生成するプロセスを示す。この実体は、Ｔ細胞結合ドメイン中のＶＬドメインがそのままでは活性でないので、依然として不活性である。
【００４６】
いくつかの実施形態では、図３は、１対の相補的な標的化Ｔ細胞結合剤から不活性結合パートナーが放出された後の、活性な標的化Ｔ細胞結合剤の生成を図示する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、図４Ａ〜Ｃは、標的細胞に結合している標的化Ｔ細胞結合剤の段階的プロセスの切断（４Ａ）、不活性結合パートナーの切断（４Ａ及び４Ｂ）ならびに活性な標的化Ｔ細胞結合剤を生成するための結合（４Ｃ）を図示する。
【００４８】
いくつかの代替実施形態では、第２のＴ細胞結合ドメインは標的化部分に結合していなくてもよく、ならびに／または切断部位及び不活性結合パートナーを含んでいなくてもよい。ある場合には、第２のＴ細胞結合ドメインは、標的化部分（同じ標的化部分または異なる標的化部分のいずれか）にコンジュゲートまたは連結していてもよいが、そのような一実施形態では、このドメインは不活性結合パートナーにコンジュゲートまたは連結していないであろう。そのような一実施形態では、第１のＴ細胞結合ドメインのみが不活性結合パートナーに結合している。別の実施形態では、第２のＴ細胞結合ドメインは、それぞれ本明細書に記載の、標的化部分、切断部位及び不活性結合パートナーを含むこともできる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、第１の成分のＮ末端からＣ末端の構造配置はＩＢＶＬ−Ｌ１−ＴＣＥＶＨ−Ｌ２−ＴＶＬ−Ｌ３−ＴＶＨを含む。いくつかの実施形態では、第２の成分のＮ末端からＣ末端の構造配置はＴＣＥＶＬ−Ｌ２−ＴＶＨ−Ｌ３−ＴＶＬを含む。いくつかの実施形態では、第２の成分のＮ末端からＣ末端の構造配置はＩＢＶＨ−Ｌ１−ＴＣＥＶＬ−Ｌ２−ＴＢＶＨ−Ｌ３−ＴＢＶＬを含む。これらの実施形態のそれぞれでは、ＩＢは不活性結合パートナーを表し、ＩＢＶＬはＶＬ不活性結合パートナーであり、一方、ＩＢＶＨはＶＨインサート結合ドメインである。ＴＣＥはＴ細胞結合を表し、ＴＣＥＶＬはＴ細胞結合ドメインのＶＬ部分であり、ＴＣＥＶＨはＴ細胞結合ドメインのＶＨ部分である。ＴＢは標的結合ドメインを表し、ＴＢＶＨは標的結合ドメインのＶＨ部分であり、ＴＢＶＬは標的結合ドメインのＶＬ部分である。Ｌ１はプロテアーゼ切断部位を有するリンカーであり、一方でＬ２及びＬ３は、随意に、Ｌ１と同じプロテアーゼによって随意に切断不可能なリンカーである。
【００５０】
Ａ．標的化部分
標的化部分は、望ましくない細胞の局所的環境に薬剤を送達することによって標的化Ｔ細胞結合剤中で機能し、これによって、局所的治療ストラテジーが可能になる。ある特定の実施形態では、標的化部分は、望ましくない細胞に特異的に結合することによって、望ましくない細胞を標的にする。ある場合には、標的化部分は、不活性結合パートナーが第１のＴ細胞結合ドメインへ結合している間でさえ、望ましくない細胞と特異的に結合する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、第１の標的化部分は、随意にリンカーによって、第１のＴ細胞結合ドメインに結合しており、別のコンストラクトの一部として、第２の標的化部分は、随意にリンカーによって、第２のＴ細胞結合ドメインに結合している。このようにして、Ｔ細胞結合ドメインの各相補的部分は、別々の標的化部分によって望ましくない細胞に送達される。いくつかの実施形態では、標的化部分は同じ種類のものであり、いくつかの実施形態では、標的化部分は異なる。標的化部分が異なる種類のものである場合、これらは、望ましくない細胞の同じ標的タンパク質上のいずれかの異なるエピトープ（重複または非重複のいずれか）を標的にすることができるか、異なる標的タンパク質を標的にすることができる。標的化部分が異なるタンパク質を標的にする状況では、望ましくない細胞は、２種の標的化部分のそれぞれに対応する抗原を発現し、これは、本アプローチにさらなる特異性を与える。
【００５２】
ある特定の実施形態では、標的化部分は抗体またはその機能的部分である。機能的部分は、望ましくない細胞上の標的に対してその結合活性を保持する任意の抗体断片、例えばｓｃＦｖもしくはＶＨＨ、または他の機能的断片、例えば、軽鎖の欠けた免疫グロブリン、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、抗体断片、ダイアボディ、ｓｃＡＢ、単一ドメイン重鎖抗体、単一ドメイン軽鎖抗体、Ｆｄ、ＣＤＲ領域もしくは抗原もしくはエピトープと結合することができる、抗体の任意の部分もしくはペプチド配列を意味する。特に「全長抗体」と言及しない限り、本出願が抗体を指す場合は、これは、その機能的部分への言及を本質的に含む。
【００５３】
ある特定の抗体標的（括弧内に望ましくない細胞型の例を示す）としては、以下を挙げることができる：Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ（上皮悪性腫瘍）；ＣＤ２２（Ｂ細胞、自己免疫性または悪性）；ＥｐＣＡＭ（ＣＤ３２６）（上皮悪性腫瘍）；ＥＧＦＲ（上皮悪性腫瘍）；ＰＭＳＡ（前立腺癌）；ＣＤ３０（Ｂ細胞悪性腫瘍）；ＣＤ２０（Ｂ細胞、自己免疫性、アレルギー性または悪性）；ＣＤ３３（骨髄性悪性腫瘍）；膜ｌｇＥ（アレルギー性Ｂ細胞）；ｌｇＥ受容体（ＣＤ２３）（アレルギー性疾患における肥満細胞またはＢ細胞）、ＣＤ８０（Ｂ細胞、自己免疫性、アレルギー性または悪性）；ＣＤ８６（Ｂ細胞、自己免疫性、アレルギー性または悪性）；ＣＤ２（Ｔ細胞またはＮＫ細胞リンパ腫）；ＣＡ１２５（卵巣癌を含めた複数のがん）；炭酸脱水酵素ＩＸ（腎細胞癌を含めた複数のがん）；ＣＤ７０（Ｂ細胞、自己免疫性、アレルギー性または悪性）；ＣＤ７４（Ｂ細胞、自己免疫性、アレルギー性または悪性）；ＣＤ５６（Ｔ細胞またはＮＫ細胞リンパ腫）；ＣＤ４０（Ｂ細胞、自己免疫性、アレルギー性または悪性）；ＣＤ１９（Ｂ細胞、自己免疫性、アレルギー性または悪性）；ｃ−ｍｅｔ／ＨＧＦＲ（消化管及び肝臓の悪性腫瘍）；ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（卵巣及び結腸直腸の癌腫を含めた複数の悪性腫瘍）；ＤＲＳ（卵巣及び結腸直腸の癌腫を含めた複数の悪性腫瘍）；ＰＤ−１（Ｂ細胞、自己免疫性、アレルギー性または悪性）；ＰＤ１Ｌ（上皮腺癌を含めた複数の悪性腫瘍）；ＩＧＦ−１Ｒ（上皮腺癌を含めた、たいていの悪性腫瘍）；ＶＥＧＦ−Ｒ２（上皮腺癌を含めた悪性腫瘍の大部分と関係がある脈管系）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）（前立腺腺癌）；ＭＵＣ１（上皮悪性腫瘍）；ＣａｎＡｇ（腫瘍、例えば結腸及び膵臓の癌腫）；メソテリン（中皮腫ならびに卵巣及び膵臓の腺癌を含めた多くの腫瘍）；Ｐ−カドヘリン（乳腺癌を含めた上皮悪性腫瘍）；ミオスタチン（ＧＤＦ８）（肉腫ならびに卵巣及び膵臓の腺癌を含めた多くの腫瘍）；Ｃｒｉｐｔｏ（ＴＤＧＦ１）（結腸、乳房、肺、卵巣及び膵臓のがんを含めた上皮悪性腫瘍）；ＡＣＶＲＬ１／ＡＬＫ１（白血病及びリンパ腫を含めた複数の悪性腫瘍）；ＭＵＣ５ＡＣ（乳腺癌を含めた上皮悪性腫瘍）；ＣＥＡＣＡＭ（乳腺癌を含めた上皮悪性腫瘍）；ＣＤ１３７（Ｂ細胞またはＴ細胞、自己免疫性、アレルギー性または悪性）；ＣＸＣＲ４（Ｂ細胞またはＴ細胞、自己免疫性、アレルギー性または悪性）；ニューロピリン１（肺がんを含めた上皮悪性腫瘍）；グリピカン（肝臓、脳及び乳房のがんを含めた複数のがん）；ＨＥＲ３／ＥＧＦＲ（上皮悪性腫瘍）；ＰＤＧＦＲａ（上皮悪性腫瘍）；ＥｐｈＡ２（神経芽腫、黒色腫、乳がん及び小細胞肺癌を含めた複数のがん）；ＣＤ３８（骨髄腫）；ＣＤ１３８（骨髄腫）；α４−インテグリン（ＡＭＬ、骨髄腫、ＣＬＬ及びほとんどのリンパ腫）。
【００５４】
ある特定の形態では、抗体としては、抗上皮増殖因子受容体抗体、例えばセツキシマブ、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＣＤ２０抗体、例えばリツキシマブ、抗ＣＤ２２抗体、例えばイノツズマブ、Ｇ５４４またはＢＵ５９、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ３３抗体、例えばｈｐ６７．６またはゲムツズマブ、抗ＭＵＣ１抗体、例えばＧＰ１．４及びＳＭ３、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ７４抗体、抗Ｐ−カドヘリン抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗ＣＤ１３８抗体、抗Ｅ−カドヘリン抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗ＦＧＦＲ３抗体ならびに抗α４−インテグリン抗体、例えばナタリズマブが挙げられる。
【００５５】
表２Ａは、がんの種類、可能な標的化部分及びこれらのがんの種類によって発現されるプロテアーゼの非限定例を提供する。二成分系を調製するために、がんを列１から特定することができ、（所望の場合）１つまたは２つの標的を標的化部分について選択することができ、（所望の場合）同様に１つまたは２つのプロテアーゼをがんの種類について選択することができる。本出願の他のセクションで、１つ対２つの標的化部分及び１つ対２つのプロテアーゼ切断部位を使用する場合を論じる。
【００５６】
【表２Ａ−１】
2018538262.tif 000015
【００５７】
【表２Ａ−２】
2018538262.tif 000016
【００５８】
例えば、第１及び第２の成分中の標的化部分が異なる場合、表２Ｂは、特定のがんの種類と組み合わせて使用するための、潜在的な標的化部分の非限定的リストを提供する。二成分系では、第１の成分のための標的化部分は存在することとなり、第２の成分のための第２の標的化部分は随意に存在し得る。第１の成分のみが標的化部分を有する場合、または第１及び第２の成分が同じ標的化部分を有する場合は、列３にがんのタイプが列挙される場合、表の列１または列２に列挙される標的化部分のいずれかを使用することができる。
【００５９】
【表２Ｂ−１】
2018538262.tif 000017
【００６０】
【表２Ｂ−２】
2018538262.tif 000018
【００６１】
いくつかの実施形態では、標的化部分は抗体ではないが、別の種類の標的化部分である。例えば、標的化部分は望ましくない細胞で発現していることが知られているタンパク質に対する結合パートナーでもよい。そのような発現レベルは過剰発現を含む。例えば、以下の結合パートナーは、望ましくない細胞上の以下の標的に結合することができる。
【００６２】
【表３】
2018538262.tif 000019
【００６３】
結合パートナーは、表３に列挙される結合パートナーのために全長または野生型配列を含む必要はない。必要とされることは、結合パートナーが望ましくない細胞上の標的に結合することだけであり、したがって、当技術分野で周知であるトランケート形態、類似体、変異体及び誘導体を含むことができる。
【００６４】
さらに、いくつかの実施形態では、結合パートナーは、望ましくない細胞で発現していることが知られているタンパク質に結合することができるアプタマーでもよい。望ましくない細胞、例えばがん細胞に結合するアプタマーは周知であり、その設計方法は既知である。
【００６５】
細胞ベースのＳＥＬＥＸシステムを使用して、ランダムな候補ライブラリーから標的細胞特異的アプタマーのパネルを選択することができる。ｓｓＤＮＡプールを結合緩衝液に溶解し、変性させ、次いで標的細胞とインキュベートすることができる。洗浄後、結合ＤＮＡを加熱によって溶出し、次いで、（必要に応じて）陰性細胞とインキュベートし、遠心分離し、上清を取り出すことができる。ビオチン標識プライマーを用いて、この上清をＰＣＲによって増幅することができる。ストレプトアビジンコーティングビーズを使用して、選択されたセンスｓｓＤＮＡをアンチセンスビオチン標識鎖から分離させることができる。親和性を増大させるために、洗浄時間、緩衝液量及び洗浄数を増やすことによって洗浄強度を増大させることができる。所望の選択ラウンド後に、選択されたｓｓＤＮＡプールをＰＣＲ増幅し、Ｅ．ｃｏｌｉにクローニングし、配列決定することができる。Ｓｈａｎｇｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｔａｍｅｒｓ  ｅｖｏｌｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｕｄｙ，ＰＮＡＳ  １０３（３２：１１８３８−１１８４３（２００６）、Ｌｙｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｐｔａｍｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ，Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ  ６（９）：１４４０−１４５２（２０１６）を参照されたい。Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ  Ａｐｔａｍｅｒ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６（６）：ｅ２０２２９（２０１１）も参照されたい。これらの参考文献におけるアプタマーの設計に関する特定のアプローチ及びがん細胞に結合する特定のアプタマーは、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
例えば、アプタマーは配列番号９４〜１６４を含むことができる。いくつかの実施形態では、アプタマーは配列番号９５を含むことができる。これらのアプタマーはＥＧＦＲに向けられ、望ましくない細胞に提示される標的に結合することができるアプタマーの代表としてのみ提供される。Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｅｈｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ  ４（９）：９３１−９４４（２０１４）に記載されているような、望ましくない細胞上の他の標的に対する他のアプタマーは、同様に本明細書の記載の一部であり、参照により組み込まれる。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本明細書で使用するためのアプタマーは、ナノモル濃度からピコモル濃度の範囲（例えば、１ピコモル濃度から５００ナノモル濃度または１ピコモル濃度から１００ナノモル濃度）のＫｄで、望ましくない細胞上の標的に結合する。
【００６８】
Ｂ．Ｔ細胞結合ドメイン
標的化Ｔ細胞結合剤は、単独でＴ細胞結合することができない第１のＴ細胞結合ドメインを含む。代わりに、標的化Ｔ細胞結合剤の一部ではない第２のＴ細胞結合ドメインに結合した場合に、第１のＴ細胞結合ドメインは活性になることができる。したがって、第１及び第２のＴ細胞結合ドメインは、単独でＴ細胞結合活性を有さないが、互いと対形成したときにその活性を有する、任意の２つの部分でもよい。言い換えれば、第１及び第２のＴ細胞結合ドメインは、機能的に活性なタンパク質の相補的な２分体である。
【００６９】
二成分系で２つのＴ細胞結合ドメインが一緒に結合すると、これらがＴ細胞を活性化するので、これらはＴ細胞表面のＣＤ３抗原及び／またはＴ−細胞受容体に結合することができる。ＣＤ３はすべてのＴ細胞に存在し、γ、δ、ε、ζ及びηと呼ばれるサブユニットから成る。ＣＤ３の細胞質尾部は、ＴＣＲ受容体複合体の他の成分の非存在化でＴ細胞活性化に必要なシグナルを伝達するのに十分である。通常は、Ｔ細胞の細胞傷害性の活性化は、最初に、別の細胞に位置した、それ自体が異質抗原に結合した主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）タンパク質とのＴＣＲの結合に依存する。通常の状況では、この初期のＴＣＲ−ＭＨＣ結合が起こった場合のみ、Ｔ細胞のクローン性増殖及び最終的にＴ細胞の細胞傷害性に関与するＣＤ３依存的シグナルカスケードが続いて起こり得る。しかし、本実施形態のいくつかでは、二成分系がＣＤ３及び／またはＴＣＲに結合する場合、独立したＴＣＲ−ＭＨＣの非存在化における細胞障害性Ｔ細胞の活性化が、免疫シナプス形成を模倣する、ＣＤ３及び／またはＴＣＲ分子の架橋によって起こり得る。これは、クローン的に独立した様式で、すなわち、Ｔ細胞によって運ばれる特定のＴＣＲクローンから独立した方式で、Ｔ細胞が細胞傷害性的に活性化され得ることを意味する。これによって、ある種のクローン的に同一の特定のＴ細胞のみではなく、Ｔ細胞コンパートメント全体の活性化が可能になる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、第１のＴ細胞結合ドメインはＶＨドメインであり、第２のＴ細胞結合ドメインはＶＬドメインである。他の実施形態では、第１のＴ細胞結合ドメインはＶＬドメインであり、第２のＴ細胞結合ドメインはＶＨドメインである。そのような実施形態では、一緒に対形成する場合、第１及び第２のＴ細胞結合ドメインはｓｃＦｖを含むことができる。
【００７１】
第１及び第２のＴ細胞結合ドメインが１対のＶＨ及びＶＬドメインである場合、ＶＨ及びＶＬドメインは、Ｔ細胞の表面で発現する抗原、例えばＣＤ３またはＴＣＲに対して特異的でもよい。抗原がＣＤ３である場合、１つの潜在的なＴ細胞結合ドメインはムロモナブに由来してもよい。
【００７２】
Ｃ．不活性結合パートナー
標的化Ｔ細胞結合剤は、第１のＴ細胞結合ドメインに結合することができ、ある特定の状態が生じない限り、それが第２のＴ細胞結合ドメインへ結合することを妨げることができる、少なくとも１つの不活性結合パートナーも含む。第１のＴ細胞結合ドメインが少なくとも１つの不活性結合パートナーに結合している場合、これはＴ細胞結合活性を有さない。言い換えれば、少なくとも１つの不活性結合パートナーは、第１のＴ細胞結合ドメインがその相補的な対（第２のＴ細胞結合ドメイン）と結合することを阻止し、２つのドメインが一緒に結合してＴ細胞結合活性を有することを妨げることによって、第１のＴ細胞結合ドメインの機能を失わせる。言い換えれば、不活性結合パートナーは、不活性結合パートナーが除去されない限り第１のＴ細胞結合ドメインが第２のＴ細胞結合ドメインに結合しないように、第１のＴ細胞結合ドメインに結合する。結合しないことによって、本出願は、非特異的結合または低レベルの結合（例えば、≦１％、≦５％、≦１０％）を除外しない。
【００７３】
いくつかの実施形態では、不活性結合パートナーは、Ｔ細胞結合ドメインに特異的に結合する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの不活性結合パートナーはＶＨまたはＶＬドメインである。いくつかの実施形態では、標的化Ｔ細胞結合剤中のＴ細胞結合ドメインがＶＨドメインである場合、不活性結合パートナーはＶＬドメインでもよく、第１のＴ細胞結合ドメインがＶＬドメインである場合、不活性結合パートナーはＶＨドメインでもよい。
【００７５】
第１の成分が標的化部分及びＶＬ  Ｔ細胞結合ドメイン及びＶＨ不活性結合パートナーを含む場合、いくつかの実施形態では、ＶＨ不活性結合パートナーは、ＶＬ  Ｔ細胞結合ドメインの、第２の成分中のそのパートナーＶＨ  Ｔ細胞結合ドメインに対する平衡解離定数より大きい、ＶＬ  Ｔ細胞結合ドメインへの結合に対する平衡解離定数を有する。いくつかの実施形態では、前の文は、ＶＨがＶＬに取り換えられた場合も同様に当てはまり、逆もまた同じである。
【００７６】
実施例の実験的証拠に基づくと、コンストラクト中にＴ細胞結合ドメインの誤った対形成パートナーとして不活性結合パートナーを使用することは、より安定で製造しやすいコンストラクトをもたらすと考えられる。
【００７７】
Ｄ．切断部位
概説すると、切断部位は、（ｉ）望ましくない細胞が発現する酵素によって切断されてもよく、（ｉｉ）望ましくない細胞の内部でｐＨ感受性切断反応を介して切断されてもよく、（ｉｉｉ）補体依存的切断反応によって切断されてもよく、または（ｉｖ）薬剤中の標的化部分と同じもしくは異なる標的化部分によって望ましくない細胞に共存するプロテアーゼによって切断されてもよい。いくつかの実施形態では、切断部位はプロテアーゼ切断部位である。
【００７８】
切断部位は、第１のＴ細胞結合ドメインから不活性結合パートナーを放出するように機能する。切断部位は、望ましくない細胞の微小環境において第１のＴ細胞結合ドメインのＴ細胞エピトープから不活性結合パートナーを放出するように、様々な方法で機能することができる。切断は、用いられるストラテジーに応じて、望ましくない細胞の内部または望ましくない細胞の外部で起こり得る。切断が望ましくない細胞の外部で起こる場合は、Ｔ細胞結合ドメインは、最初に細胞中に内部移行すること及び古典的な抗原プロセシング経路に関わることなく、提示され得る。
【００７９】
ある特定の実施形態では、少なくとも１つの切断部位が、望ましくない細胞が発現する酵素によって切断され得る。例えば、がん細胞は、ある特定の酵素、例えばプロテアーゼを発現することが知られており、標的化Ｔ細胞結合剤の切断部位を切断するために、これらを本ストラテジーで用いることができる。非限定例として、例えば、カテプシンＢは中でもＦＲ、ＦＫ、ＶＡ及びＶＲを切断し、カテプシンＤはＰＲＳＦＦＲＬＧＫ（配列番号４５）を切断し、ＡＤＡＭ２８はＫＰＡＫＦＦＲＬ（配列番号１）、ＤＰＡＫＦＦＲＬ（配列番号２）、ＫＰＭＫＦＦＲＬ（配列番号３）及びＬＰＡＫＦＦＲＬ（配列番号４）を切断し、ＭＭＰ２はＡＩＰＶＳＬＲ（配列番号４６）、ＳＬＰＬＧＬＷＡＰＮＦＮ（配列番号４７）、ＨＰＶＧＬＬＡＲ（配列番号４８）、ＧＰＬＧＶＲＧＫ（配列番号４９）及びＧＰＬＧＬＷＡＱ（配列番号５０）を切断する。表１Ａまたは２Ａに列挙される他の切断部位も用いることができる。がんと関係があるプロテアーゼ切断部位及びプロテアーゼは当技術分野で周知である。Ｏｎｃｏｍｉｎｅ（ｗｗｗ．Ｏｎｃｏｍｉｎｅ．ｏｒｇ）は、オンラインのがん遺伝子発現データベースであるので、本発明の薬剤が、がんを治療するためのものである場合、当業者は、所与のがんのタイプを治療するのに適している特定のプロテアーゼ切断部位（または２つのプロテアーゼ切断部位）を特定するために、Ｏｎｃｏｍｉｎｅデータベースを検索することができる。別のデータベースとしては、欧州バイオインフォマティクス研究所（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ）、特に、（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｇｘａ）が挙げられる。プロテアーゼデータベースとしては、ＰＭＡＰ（ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ．ｏｒｇ）、ＥｘＰＡＳｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｕｔｔｅｒ（ｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｅｐｔｉｄｅｃｕｔｔｅｒ）及びＰＭＡＰ．Ｃｕｔ  ＤＢ（ｃｕｔｄｂ．ｂｕｒｎｈａｍ．ｏｒｇ）が挙げられる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの切断部位が、望ましくない細胞の内部でｐＨ感受性切断反応を介して切断され得る。標的化Ｔ細胞結合剤が細胞中に内部移行する場合は、切断反応は、細胞の内部で起こり得、望ましくない細胞の外部の微小環境と細胞の内部の間のｐＨの変化によって引き起こされ得る。具体的には、いくつかのがんの種類は、がん細胞の内部に酸性環境を有することが知られている。そのようなアプローチは、内部の望ましくない細胞型が、特に糖衣などの細胞外微小環境と特徴的に異なるｐＨを有する場合に、用いることができる。ｐＨ切断はリゾチーム中のすべての細胞で起こり得るので、ｐＨ感受性切断部位を使用する場合の標的化薬剤の選択は、必要に応じて、より高い特異性を必要とし得る。例えば、ｐＨ感受性切断部位が使用される場合、がん細胞のみに、または非常に好ましくはがん細胞に結合する標的化薬剤が所望され得る（例えば、肺がん治療のための、メソテリンに結合する抗体など）。
【００８１】
ある特定の実施形態では、少なくとも１つの切断部位が補体依存的切断反応によって切断され得る。標的化Ｔ細胞結合剤が望ましくない細胞に結合すると、患者の補体カスケードが誘発され得る。そのような場合、補体プロテアーゼに感受性の切断部位を使用して、第１のＴ細胞結合ドメインから不活性結合パートナーを切断するために、補体カスケードを使用することもできる。例えば、Ｃ１ｒ及びＣ１ｓならびにＣ３転換酵素（Ｃ４Ｂ，２ａ及びＣ３ｂ，Ｂｂ）はセリンプロテアーゼである。Ｃ３／Ｃ５及びＣ５も補体プロテアーゼである。補体カスケードにも含まれ、Ｃ４ｂ２ｂへのＣ４及びＣ２の切断（Ｃ３転換酵素）に関与する、セリンプロテアーゼであるマンノース関連結合タンパク質（Ｍａｎｎｏｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（ＭＡＳＰ）も使用することもできる。例えば、限定はされないが、Ｃ１ｓはＹＬＧＲＳＹＫＶ及びＭＱＬＧＲＸを切断する。ＭＡＳＰ２は、ＳＬＧＲＫＩＱＩを切断すると考えられている。補体成分Ｃ２ａ及び補体因子Ｂｂは、ＧＬＡＲＳＮＬＤＥを切断すると考えられている。
【００８２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの切断部位が、標的化Ｔ細胞結合剤中の標的化部分と同じまたは異なる標的化部分によって望ましくない細胞に共存するプロテアーゼによって、切断され得る。例えば、プロテアーゼを望ましくない細胞の微小環境の位置に送達する標的化薬剤にプロテアーゼをコンジュゲートすることによって、任意のプロテアーゼを望ましくない細胞の微小環境に同時に向けることができる。標的化薬剤は、本明細書に記載のいかなる標的化薬剤でもよい。ペプチドリンカーまたは化学リンカーを介してプロテアーゼを標的化薬剤に付けることができ、標的化薬剤に結合した場合に十分な酵素活性を維持することができる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、第１の成分と第２の成分の両方が不活性結合パートナーと誤って対形成している。いくつかの実施形態では、第１の成分及び第２の成分のプロテアーゼ切断部位は同じである。他の実施形態では、第１の成分及び第２の成分のプロテアーゼ切断部位は、同じプロテアーゼに対する異なる切断部位である。他の実施形態では、第１の成分及び第２の成分のプロテアーゼ切断部位は、異なるプロテアーゼに対する切断部位である。２つの異なるプロテアーゼを用いるいくつかの実施形態では、望ましくない細胞が両方のプロテアーゼを発現する。
【００８４】
いくつかの実施形態において、第１の成分では、未切断状態の不活性結合パートナーは、ＶＬまたはＶＨ  Ｔ細胞結合ドメインの、それぞれそのパートナーＶＨまたはＶＬ、すなわち第２の成分中のＴ細胞結合ドメインへの特異的結合に干渉する。いくつかの実施形態では、未切断状態の不活性結合パートナーは、ＶＬまたはＶＨ  Ｔ細胞結合ドメインの、それぞれそのパートナーＶＨまたはＶＬ、すなわち未切断状態の第２の成分中のＴ細胞結合ドメインに対する解離定数（Ｋｄ）が、ＶＬまたはＶＨ  Ｔ細胞結合ドメインの、それぞれそのパートナーＶＨまたはＶＬ、すなわち切断状態の第２の成分中のＴ細胞結合ドメインに対するＫｄより少なくとも１００倍大きいように、ＶＬまたはＶＨ  Ｔ細胞結合ドメインの、それぞれそのパートナーＶＨまたはＶＬ、すなわち第２の成分中のＴ細胞結合ドメインへの結合を阻害する。
【００８５】
Ｅ．リンカー
切断部位に加えて、標的化Ｔ細胞結合剤の別々の部分を一緒に結合させるために、リンカーを随意に使用することができる。リンカーには、これらの部分を一緒に結合させる任意の化学的部分が含まれる。いくつかの実施形態では、リンカーは可撓性リンカーでもよい。リンカーとしては、ペプチド、ポリマー、ヌクレオチド、核酸、多糖及び脂質有機化学種（例えばポリエチレングリコール）が挙げられる。いくつかの実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。ペプチドリンカーは、約２〜１００、１０〜５０または１５〜３０アミノ酸長でもよい。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも１０、少なくとも１５または少なくとも２０アミノ酸長でもよく、８０以下、９０以下または１００以下のアミノ酸長でもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、単一または反復のＧＧＧＧＳ（配列番号８５）、ＧＧＧＳ（配列番号８６）、ＧＳ（配列番号８７）、ＧＳＧＧＳ（配列番号８８）、ＧＧＳＧ（配列番号８９）、ＧＧＳＧＧ（配列番号９０）、ＧＳＧＳＧ（配列番号９１）、ＧＳＧＧＧ（配列番号９２）、ＧＧＧＳＧ（配列番号９３）及び／またはＧＳＳＳＧ（配列番号９４）配列（複数可）を有するペプチドリンカーである。
【００８６】
いくつかの実施形態では、リンカーはマレイミド（ＭＰＡ）またはＳＭＣＣリンカーである。
【００８７】
Ｆ．製造方法
本明細書に記載の標的化Ｔ細胞結合剤は、遺伝子工学技法を使用して製造することができる。具体的には、適切な宿主で核酸を発現させて、標的化Ｔ細胞結合剤を生成することができる。例えば、その成分部分のすべて及びリンカーを含む標的化Ｔ細胞結合剤をコードする核酸配列を含むベクターを調製することができ、そのベクターを使用して、適切な宿主細胞を形質転換することができる。
【００８８】
宿主の性質及び宿主への核酸の導入方式ならびにエピソームの維持または組込みが所望されるかどうかに応じて、様々な調節エレメントをベクター中で使用することもできる。
【００８９】
マレイミドまたはＳＭＣＣリンカーを使用するなどの化学的結合技法を用いることもできる。
【００９０】
結合パートナーがアプタマーである場合は、アプタマーをタンパク質、すなわちＴ細胞結合ドメインにコンジュゲートする方法を当業者なら理解するであろう。チオール結合または他の標準的なコンジュゲーション化学を使用してアプタマーをコンジュゲートすることができる。マレイミド、スクシンイミドまたはＳＨ基をアプタマーに付けて、Ｔ細胞結合ドメインにそれを結合させることができる。
【００９１】
ＩＩ．医薬組成物
医薬組成物として標的化Ｔ細胞結合剤を用いることができる。したがって、標的化Ｔ細胞結合剤は、医薬的に許容可能な担体とともに調製することができる。非経口投与が所望される場合、例えば、無菌の発熱物質を含有しない注射用水または無菌の発熱物質を含有しない生理食塩水中に標的化Ｔ細胞結合剤を提供することができる。あるいは、無菌の液状担体を加えて再懸濁するための凍結乾燥形態で、標的化Ｔ細胞結合剤を提供することができる。
【００９２】
ＩＩＩ．治療方法
Ａ．望ましくない細胞の低減、免疫応答の標的化及びがん治療
本明細書に記載の標的化Ｔ細胞結合剤は、各成分が上記の様々な実施形態で詳細に記載されたように、少なくとも１つの標的化Ｔ細胞結合剤及び第２の成分を含む二成分系を患者に投与することを含む、望ましくない細胞の存在によって特徴づけられる患者における疾患の治療方法で使用することができる。さらに、本明細書に記載の薬剤は、患者に二成分系を投与することを含む、患者の自分自身の免疫応答を望ましくない細胞に対して標的化する方法で使用することもできる。
【００９３】
患者に投与する薬剤の量は、問題になっている状態を治療するのに有効な量を提供するように、患者の医師が選択することができる。二成分系の第１の成分及び第２の成分は、同じ製剤で、または患者において活性であるために十分に近い期間内で２つの異なる製剤で投与することができる。
【００９４】
治療を受ける患者はヒトでもよい。患者は霊長類または任意の哺乳動物でもよい。あるいは、患者は動物、例えば、飼育動物（例えば、イヌもしくはネコ）、実験動物（例えば、実験用のげっ歯類、例えば、マウス、ラットもしくはウサギ）または農業上重要な動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジもしくはヤギ）でもよい。
【００９５】
望ましくない細胞を特徴とする状態としては、がんを挙げることができる。がんは、固形悪性腫瘍でもよく、または非固形悪性腫瘍でもよい。がんは、リンパ腫ではない固形腫瘍でもよい。がんは、任意のがん、例えば、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がん、黒色腫、肺がん、前立腺がん、精巣がん、甲状腺がん、脳のがん、食道がん、胃がん、膵臓がん、結腸直腸がん、肝臓がん、白血病、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、リンパ増殖性障害、骨髄異形成障害、骨髄増殖性疾患及び前がん性疾患でもよい。
【００９６】
二成分系は、単独で、または手術、放射線照射もしくは従来の化学療法を含めた他の療形態法と併せて投与することができる。
【実施例】
【００９７】
実施例１．コンストラクトの調製
本実施例で、対照及び実験用の両方の様々なコンストラクトを調製し使用した。
【００９８】
Ａ．単鎖ｓｃＦｖ二重特異性コンストラクト
陽性対照として扱うために、単鎖ｓｃＦｖコンストラクトを本用途で使用した。コンストラクト６２４５（配列番号１６５）を、抗ＥＰＣＡＭ  ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ３Ｅ  ｓｃＦｖを含む二重特異性抗体として調製した。このコンストラクトは、不活性結合パートナーとのいかなる誤った対形成も含まず、活性な標的化部分及びＴ細胞結合部分の両方を有する。
【００９９】
Ｂ．標的化ｓｃＦｖを使用する予め切断された二成分系コンストラクト
コンストラクト６２４６（配列番号１６６）及び６２４７（配列番号１６７）は、二成分系における補完的な予め切断されたコンストラクトである。予め切断されたによって、本説明は、機能的標的化部分及び非対形成のＴ細胞結合部分（すなわち、不活性結合パートナーに誤って対形成していないもの及びさらに、機能的なＴ細胞結合複合体を形成するように、その正しいパートナーとまだ対形成していないもの）を有するコンストラクトを指す。両方のコンストラクトは抗ＥＰＣＡＭ  ｓｃＦｖを含む。コンストラクト６２４６は抗ＣＤ３Ｅ  ＶＨドメインを含むが、コンストラクト６２４７は抗ＣＤ３Ｅ  ＶＬドメインを含む。いずれのコンストラクトも誤った対形成パートナーとして不活性結合パートナーを含まない。
【０１００】
Ｃ．標的化ｓｃＦｖ及び不活性結合パートナーに誤って対形成したＴ細胞結合ドメインならびに不活性結合パートナーを放出するためのプロテアーゼ切断部位を使用する二成分系コンストラクト
コンストラクト６２４８（配列番号１６８）及び６２４９（配列番号１６９）は二成分系における相補的コンストラクトである。両方のコンストラクトは抗ＥＰＣＡＭ  ｓｃＦｖを含む。コンストラクト６２４８は、ＭＭＰ２切断部位（ＡＩＰＶＳＬＲ（配列番号４６））を有する２５ｍｅｒリンカーを介してガンテネルマブ由来の不活性結合パートナーＶＬドメインに連結した抗ＣＤ３Ｅ  ＶＨドメインを含む。コンストラクト６２４９は、ＭＭＰ２切断部位（ＡＩＰＶＳＬＲ（配列番号４６））を有する２５ｍｅｒリンカーを介してクローンアルファ−ＭＵＣ１−１抗体由来の不活性結合パートナーＶＨドメインに連結した抗ＣＤ３Ｅ  ＶＬドメインを含む。
【０１０１】
Ｄ．標的化部分及び不活性結合パートナーと誤って対形成したＴ細胞結合ドメインを有し、不活性結合パートナーを放出するためのプロテアーゼ切断部位を有さない、二成分系コンストラクト
コンストラクト９３２７（配列番号１７０）及び９３２８（配列番号１７１）は、ｓｃＦｖ標的化ドメインを使用する二成分系コンストラクトである。しかし、これらは、誤った対形成部分として働く不活性結合パートナーを放出するためのプロテアーゼ切断部位を有さない。両方のコンストラクトは、ＥｐＣＡＭを発現する望ましくない細胞に対してコンストラクトを標的化するために、抗ＥＰＣＡＭ  ｓｃＦｖを含む。コンストラクト９３２７は、実施例で使用するプロテアーゼに対応するプロテアーゼ切断部位を有さない２５ｍｅｒリンカーによってガンテネルマブ由来の不活性結合パートナーＶＬドメインに連結した抗ＣＤ３Ｅ  ＶＨドメインを含む。コンストラクト９３２８は、実施例で使用するプロテアーゼに対応するプロテアーゼ切断部位を有さない２５ｍｅｒリンカーによってクローンアルファ−ＭＵＣ１−１抗体由来の不活性結合パートナーＶＨドメインに連結した抗ＣＤ３Ｅ  ＶＬドメインを含む。
これらのコンストラクトは実施例で使用するプロテアーゼに対応するプロテアーゼ切断部位を有さないので、不活性結合パートナーは、コンストラクトに結合したたままであり、二成分系の相補的であろう２つの成分が一緒になって活性な抗ＣＤ３Ｅ  ｓｃＦｖを生成するのを防ぐ。
【０１０２】
Ｅ．異なる標的化部分を提供するコンストラクト
コンストラクト９３２９（配列番号１７２）及び９３３０（配列番号１７３）は、異なる標的化部分を提供する。これらのコンストラクトは、１つのコンストラクトががん細胞上の第１の抗原を標的にし、第２のコンストラクトが同じがん細胞上の第２の抗原を標的にする二成分系で使用することを目的とした。ｓｃＦｖ及びＶＨＨ標的化部分の相対的な大きさが類似しているので、これらのコンストラクトは、抗ＣＤ３Ｅ  ＶＬドメインを有する対形成可能なコンストラクトと「うまく組み合わせる（ｍｉｘ−ａｎｄ−ｍａｔｃｈ）」ことを目的とした。
【０１０３】
コンストラクト９３２９は、抗グリピカン−３ＶＨＨ配列を含む。これは、ＭＭＰ２切断部位（ＡＩＰＶＳＬＲ（配列番号４６））を含む２５ｍｅｒリンカーによってガンテネルマブ由来の不活性結合パートナーＶＬドメインに結合している抗ＣＤ３Ｅ  ＶＨドメインも含む。
【０１０４】
コンストラクト９３３０は、インダツキシマブ由来の抗ＳＤＣ１  ｓｃＦｖを標的化部分として含む。これは、ＭＭＰ２切断部位（ＡＩＰＶＳＬＲ（配列番号４６））を含む２５ｍｅｒリンカーによってガンテネルマブ由来の不活性結合パートナーＶＬドメインに結合している抗ＣＤ３Ｅ  ＶＨドメインも含む。
【０１０５】
Ｆ．ＶＨＨ／ｓｃＦｖ二重特異性コンストラクト
コンストラクト９３３２（配列番号１７４）及び９３３３（配列番号１７５）は両方とも、抗ＥＧＦＲ  ＶＨＨ部分及び抗ＣＤ３Ｅ  ｓｃＦｖ部分を含む、ＶＨＨ／ｓｃＦｖ二重特異性コンストラクトである。これらの２つのコンストラクトは、いかなるインサート結合ドメインも含まない。
【０１０６】
Ｇ．標的化ＶＨＨドメイン、不活性結合パートナーに誤って対形成したＴ細胞結合ドメインを使用し、不活性結合パートナーを放出するためのプロテアーゼ切断部位を含む、二成分系コンストラクト
コンストラクト９３３４（配列番号１７６）及び９３３５（配列番号１７７）は、標的化ＶＨＨドメインを使用する相補的な二成分系コンストラクトである。両方のコンストラクトは、ＥＧＦＲを発現する望ましくない細胞への標的化のために、抗ＥＧＦＲ  ＶＨＨドメインを含む。コンストラクト９３３４は、ＭＭＰ２切断部位（ＡＩＰＶＳＬＲ（配列番号４６））を有する２５ｍｅｒリンカーによってガンテネルマブ由来の不活性結合パートナーＶＬドメインに連結した抗ＣＤ３Ｅ  ＶＨドメインを含む。ＭＭＰ２切断部位（ＡＩＰＶＳＬＲ（配列番号４６））を有する２５ｍｅｒリンカーによってクローンアルファ−ＭＵＣ１−１抗体由来の不活性結合パートナーＶＨドメインに連結した抗ＣＤ３Ｅ  ＶＨドメインを含む、コンストラクト９３３５を調製した。
【０１０７】
したがって、概要として、コンストラクトは表４に提供される通りであり、さらなる詳細及び配列は上で表１Ｂに提供し、ＩＢＤは不活性結合パートナーを表す。
【０１０８】
【表４】
2018538262.tif 000020
【０１０９】
Ｈ．すべてのコンストラクトの調製及び保管
コンストラクトをＤＮＡ２．０（Ｎｅｗａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって生成し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させた。下流の精製を補助するために、一本鎖オリゴヌクレオチドをＣ末端のヘキサヒスチジンタグで特定の配列をカバーするよう設計した。オリゴヌクレオチドを化学合成し、次いで、配列の特徴に応じて様々な独自のプロトコールを使用してアセンブルした。ある場合には、鋳型非依存的ＰＣＲを使用した。ある場合には、標準的な制限酵素消化及び連結酵素媒介性アセンブリーを使用することによって、短い配列をアセンブルして、長い配列を生成した。次いで、アセンブルしたオリゴヌクレオチドを標準的なＥ．ｃｏｌｉプラスミドにクローニングし、ＡＢＩハードウェアでの自動サンガー配列決定によって、完全な二本鎖配列を検証した。１５０ｍｌスケールの、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への一過的なトランスフェクションによって、コンストラクトを発現させ、アフィニティークロマトグラフィーを使用して抗体断片を精製した。
【０１１０】
実験を開始する前に、コンストラクトを氷上で解凍し、無菌条件下で低タンパク質結合チューブに分取した。必要になるまで分取物を−８０℃で保管した。使用直前に分取物を氷上で解凍した。分取物は、最大５回の凍結融解サイクルに使用した。
【０１１１】
実施例２．コンストラクト製造の評価
Ａ．図５Ａ：ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色によるコンストラクトの評価
抗体の分取物を氷上で解凍し、２５ｍＭトリスｐＨ７．４中に希釈して、２．０ｍｇ／ｍｌの終濃度にした。コンストラクトが既にこれよりも希釈されていた場合は、希釈ステップを省略した。適切な量の６×ゲル試料緩衝液（０．５ＭトリスｐＨ６．８、１２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、２５％（ｖ／ｖ）グリセロール、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２００ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミド）を各試料に加え、次いで、これを１０分間９０℃に加熱した。
【０１１２】
４〜２０％のプレキャストグラジエントゲルに１０μｇの各コンストラクトを泳動した。泳動した後、染色緩衝液（１０％（ｖ／ｖ）酢酸、５０％（ｖ／ｖ）メタノール及び４０％（ｖ／ｖ）ｄＨ２Ｏ）中でゲルを３０分間固定し、次いで、これをクマシーブルーＲ−２５０（染色緩衝液中に０．２５％）中で２時間染色し、続いて、必要に応じて緩衝液をいくつか変化させた染色緩衝液中で２〜３時間脱染色した。記録化するまで、７％（ｖ／ｖ）酢酸中にゲルを保管した。
【０１１３】
図５Ａに結果を示す。これは、タンパク質が作られ、その配列によって予測された正しい分子量とともに、非常に高い純度を有することを示す。
【０１１４】
Ｂ．図５Ｂ
図５Ｂでは、さらなるコンストラクトを評価した。図５Ａに使用した方法を５Ｂに使用した。
【０１１５】
コンストラクト６２４５（対形成を必要としない二重特異性コンストラクト）、６２４８及び６２４８（不活性結合パートナー及びＭＭＰ２切断部位を有する対形成可能なコンストラクト）を適切に生成した。コンストラクト６２４６及び６２４７（不活性結合パートナー非含有）を低収量で生成し、これは、不安定であると考えられる。ＶＨ／ＶＬ対形成が断片の安定性に重要であると思われる。
【０１１６】
したがって、不活性結合パートナーと誤って対形成したコンストラクトは、より安定で製造しやすいと考えられる。
【０１１７】
Ｃ．収量
図５Ｂで評価したコンストラクトの収量は以下の通りである。
【０１１８】
【表５】
2018538262.tif 000021
【０１１９】
実施例３．腫瘍細胞株と混合し様々なコンストラクトで処理したＴ細胞におけるＩＦＮγ発現の評価
二成分系の相補的コンストラクトがＴ細胞応答を誘発する能力を試験するために、単一コンストラクト及び混合コンストラクトの調製物をこれらのＩＦＮγの発現について試験した。
【０１２０】
一般的なＩＦＮγのアッセイの背景：インビトロでのサイトカインマーカーの発現、例えばＩＦＮγの発現は、Ｔ細胞応答に対して予想値を有することが知られているので、インビボの結果を予測する。Ｇｈａｎｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ｊ８（３）：６２８−３１（２００１）に記載されているように、サイトカインフローサイトメトリー（ＣＦＣ）によって測定した、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮγの発現は、細胞傷害性Ｔリンパ球の応答の代替マーカーである（Ｇｈａｎｅｋａｒ、６２８頁）。先行研究によって、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγの発現とＣＴＬエフェクター細胞の活性の間に強い相関があることが示された。（Ｇｈａｎｅｋａｒ、６３０頁）。先行研究によって、ＩＦＮγの発現に関するデータの使用によって、臨床環境におけるＣＤ８＋Ｔ細胞応答の評価のより高い精度が可能になることが示される（同上、６３１頁）。これは、本明細書のサイトカイン発現アッセイがインビボ及び臨床応答に対する予想値を有することが知られていたことを示す。ＩＦＮγの発現を評価する複数の方法が存在するので、本明細書の方法はＧｈａｎｅｋａｒの正確な方法ステップに従わないが、Ｇｈａｎｅｋａｒは、ＩＦＮγの発現がＴ細胞活性の代理であることを示す。
【０１２１】
Ｔ細胞株の培養：細胞障害性Ｔ細胞をＩＦＮγアッセイで使用し、４．０ｍＭのＬ−グルタミン、１％のペニシリン及びストレプトマイシン、１０％の熱失活したＦＢＳ、１％の熱失活したヒト血清（プールしたＡＢ血清、ＴＣＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）ならびに１，０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。細胞を１〜２×１０６細胞／ｍｌの密度で維持し、４８時間毎に培地の４分の３を交換することによって、養分を与えた。これは、１０μｇのＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限されたウイルスペプチドＮＬＶＰＭＶＡＴＶをＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋提供者由来の１０００万個の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に加えることによって、最初に生成した。４．０ｍＭのＬ−グルタミン、１％のペニシリン及びストレプトマイシン、１０％の熱失活したＦＢＳならびに１％の熱失活したヒト血清（プールしたＡＢ血清、ＴＣＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で４日間細胞を培養してから、１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含むように培地を変えた。Ｔ細胞は主にＣＤ８＋Ｔ細胞であり、少量のＣＤ４＋Ｔ細胞も含んでいた。
【０１２２】
腫瘍細胞株の培養：以下の細胞株を使用した：ＳＷ６２０、ＭＣＦ−７、ＳＮＵ３９８及びＵ２６６。１０％の熱失活したＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で培養したＳＮＵ３９８及びＵ２６６細胞を除いて、１０％のＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を含むＤＭＥＭ中で細胞を培養した。ＳＷ６２０細胞はヒト結腸がん転移部に由来する。ＭＣＦ−７細胞はヒト乳がん転移性部位（胸水）に由来する。ＳＮＵ３９８細胞は、１９９０年のヒト未分化肝細胞癌患者に由来する。Ｕ２６６細胞はＩｇＥを分泌するヒト男性多発性骨髄腫患者に由来する。
【０１２３】
ＩＦＮγ生成へのコンストラクトの影響：接着細胞株を９６ウェルプレート（ウェルあたり１００，０００細胞）に少なくとも１６時間プレーティングした。非付着細胞（ウェルあたり１００，０００細胞）を、４００×ｇで５分間培養物を遠心分離し、Ｔ細胞培地に細胞を再懸濁することにより、実験の当日にプレーティングした。Ｔ細胞培地中のウェルあたり２０，０００個のＴ細胞を加えた。コンストラクトをＴ細胞培地中で作製し、培養物に加えた。コンストラクトの混合物を使用した場合は、これらを前もって混合してから、培養物に加えた。培養物の最終量はウェルあたり２００μｌであった。培養物を３７℃、５％ＣＯ２及び１００％相対湿度で２４時間インキュベートした。培養物を４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引し、別のプレートに入れた。ＩＦＮγについて解析するまで、上清を−２０℃で保管した。
【０１２４】
ＩＦＮγのＥＬＩＳＡ：組織培養上清中のＩＦＮγレベルを、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅａｄｙ−Ｓｅｔ−Ｇｏ  ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号８８−７３１６−８８）またはＢｉｏＬｅｇｅｎｄヒトＩＦＮγＥＬＩＳＡマックスキット（カタログ番号４３０１０６）のいずれかを使用して、製造者の指示書の通りにアッセイした。
【０１２５】
Ａ．図６
様々な単一コンストラクト及び混合コンストラクトについて、ＩＦＮγを評価した。指示されている場合を除いて、上記に提供されるＩＦＮγの生成及びＥＬＩＳＡアッセイのプロトコールを使用した。１０％のＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を含むＤＭＥＭ中で、ＳＷ６２０細胞を培養した。実験の前日に、細胞を９６ウェルプレート（ウェルあたり１００，０００細胞）にプレーティングした。実験の当日に、培地を吸引し廃棄した。Ｔ細胞培地中のウェルあたり２０，０００個のＴ細胞を加えた。コンストラクト（１μｇ／ｍｌの終濃度）をＴ細胞培地中で作製し、培養物に加えた。対照は、ＰＨＡ−Ｍ（終濃度１０μｇ／ｍｌ）、ＳＷ６２０細胞＋Ｔ細胞（添加なし）及びＳＷ６２０細胞（Ｔ細胞または他の添加なし）であった。各条件を３連で実施した。培養物の最終量はウェルあたり２００μｌであった。培養物を３７℃、５％ＣＯ２及び１００％相対湿度で２４時間インキュベートした。培養物を４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引し、別のプレートに入れた。ＩＦＮγについて解析するまで、上清を−２０℃で保管した。
【０１２６】
様々な単一コンストラクト及び混合コンストラクトについて、ＩＦＮγを評価した。コンストラクト６４２５（ＥｐＣＡＭ及びＣＤ３Ｅに対する二重特異性ｓｃＦｖ）を陽性対照として扱って、単一コンストラクを評価した。ＳＷ６２０がん細胞をともなうＴ細胞、ＳＷ６２０がん細胞単独及びＴ細胞のＩＦＮγ発現能力を示すためにフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で非特異的に刺激したＴ細胞中で、ベースラインのＩＦＮγを評価した。
【０１２７】
ＳＷ６２０腫瘍細胞では、１μｇ／ｍｌの終濃度でコンストラクトを使用した。培養物を４時間インキュベートし、ＩＦＮγについて上清をアッセイした。３連の平均±標準偏差を示す。様々な単一コンストラクト及び混合コンストラクトについて、ＩＦＮγを評価した。培養物を４時間インキュベートし、ＩＦＮγについて上清をアッセイした。３連の平均±標準偏差を示す。１μｇ／ｍｌの終濃度でコンストラクトを使用した。培養物を２４時間インキュベートし、ＩＦＮγについて上清をアッセイした。３連の平均±標準偏差を示す。
【０１２８】
コンストラクト６２４５は、標的化抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖと抗ＣＤ３Ｅ  ｓｃＦｖの両方を有するので、陽性対照として働く。したがって、これはＴ細胞結合（ＴＣＥ）活性に対形成を必要としない二重特異性コンストラクトである。
【０１２９】
コンストラクト６２４８及び６２４９（ＭＭＰ２切断部位を有するリンカーによってそれぞれ抗ＣＤ３Ｅ  Ｔ細胞結合ＶＬまたはＶＨから分離されている不活性結合パートナーをそれぞれ有する、二成分系の対）は、一緒に対形成した場合に、単独で投与された場合よりも多くのＩＦＮγ発現を示した。６２４６と６２４７の組み合わせ（不活性結合パートナーへの任意の誤った対形成またはそれらが結合するのに必要とされるプロテアーゼ切断部位を有さない二成分系の対）は、６２４８と６２４９の組み合わせよりもはるかに低い応答をもたらし、これは、それぞれ各コンストラクトにおいて非対形成の抗ＣＤ３Ｅ  ＶＨ及びＶＬドメインを安定化すると考えられている不活性結合パートナーによって、６２４６及び６２４７が製造中に保護されないためである可能性が高い。したがって、不活性結合パートナーを有する誤って対形成したコンストラクトは、非対形成の抗ＣＤ３Ｅ  ＶＨまたはＶＬドメインを有する前切断されたコンストラクトよりも安定で製造しやすいことが考えられる。
【０１３０】
Ｂ．図７
様々な単一コンストラクト及び混合コンストラクトについて、ＩＦＮγを価した。１０％のＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を含むＤＭＥＭ中で、ＳＷ６２０細胞を培養した。実験の前日に、細胞を９６ウェルプレート（ウェルあたり１００，０００細胞）にプレーティングした。実験の当日に、培地を吸引し廃棄した。Ｔ細胞培地中のウェルあたり２０，０００個のＴ細胞を加えた。コンストラクト（１μｇ／ｍｌの終濃度）をＴ細胞培地中で作製し、培養物に加えた。コンストラクトの混合物を使用した場合は、これらを前もって混合してから培養物に加えた（コンストラクトの終濃度はコンストラクトあたり１μｇ／ｍｌであった）。対照は、ＰＨＡ−Ｍ（終濃度１０μｇ／ｍｌ）、ＳＷ６２０細胞＋Ｔ細胞（添加なし）及びＳＷ６２０細胞（Ｔ細胞または他の添加なし）であった。各条件を３連で実施した。培養物の最終量はウェルあたり２００μｌであった。培養物を３７℃、５％ＣＯ２及び１００％相対湿度で２４時間インキュベートした。培養物を４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引し、別のプレートに入れた。ＩＦＮγについて解析するまで、上清を−２０℃で保管した。３連の平均±標準偏差を示す。
【０１３１】
コンストラクト６２４５は、標的化抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖと抗ＣＤ３Ｅ  ｓｃＦｖの両方を有するので、陽性対照として働く。したがって、これはＴ細胞結合（ＴＣＥ）活性に対形成を必要としない二重特異性コンストラクトである。
【０１３２】
コンストラクト６２４８及び６２４９（ＭＭＰ２切断部位を有するリンカーによってそれぞれ抗ＣＤ３Ｅ  Ｔ細胞結合ＶＬまたはＶＨから分離されている不活性結合パートナーをそれぞれ有する二成分系の対）は、一緒に対形成した場合、単独で投与された場合よりも多くのＩＦＮγ発現を示した。６２４６と６２４７の組み合わせ（任意の結合ドメインまたはそれらが結合するのに必要とされるプロテアーゼ切断部位を有さない二成分系の対）は、６２４８と６２４９の組み合わせよりもはるかに低い応答をもたらし、これは、それぞれ各コンストラクトにおいて非対形成の抗ＣＤ３Ｅ  ＶＨ及びＶＬドメインを安定化すると考えられている不活性結合パートナーによって、６２４６及び６２４７が製造中に保護されないためである可能性が高い。したがって、不活性結合パートナーを有する誤って対形成したコンストラクトは、非対形成の抗ＣＤ３Ｅ  ＶＨまたはＶＬドメインを有するコンストラクトよりも安定で製造しやすいことが考えられる。
【０１３３】
図８
１０％のＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を含むＤＭＥＭ中で、ＳＷ６２０細胞を培養した。実験の前日に、細胞を９６ウェルプレート（ウェルあたり１００，０００細胞）にプレーティングした。実験の当日に、培地を吸引し廃棄した。Ｔ細胞培地中のウェルあたり２０，０００個のＴ細胞を加えた。コンストラクト（１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌの範囲の終濃度）をＴ細胞培地中で作製し、培養物に加えた。コンストラクトの混合物を使用した場合は、これらを前もって混合してから培養物に加えた（コンストラクトあたり１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌの範囲のコンストラクトの終濃度）。対照は、ＳＷ６２０細胞＋Ｔ細胞（添加なし）及びＳＷ６２０細胞（Ｔ細胞または他の添加なし）であった。各条件を３連で実施した。培養物の最終量はウェルあたり２００μｌであった。培養物を３７℃、５％ＣＯ２及び１００％相対湿度で２４時間インキュベートした。培養物を４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引し、別のプレートに入れた。ＩＦＮγについて解析するまで、上清を−２０℃で保管した。３連の平均±標準偏差を図８に示した。
【０１３４】
コンストラクト６２４５は陽性対照として働き、対形成したコンストラクト６２４８及び６２４９を評価した。対照コンストラクトと対形成した二成分系の両方ともＩＦＮγの発現を示した。これは、不活性なＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれコンストラクト６２４８及び６２４９から切断されていること、ならびにＴ細胞に結合することができる完全な抗ＣＤ３Ｅ  ｓｃＦｖを生成するようにこれらの２つのコンストラクトが対形成していることを示す。
【０１３５】
二成分系（６２４８及び６２４９）は二重特異性の６２４５コンストラクトよりも弱い効力を有するが、依然として許容可能な範囲にあり、副作用の回避の面で投薬の利点を実際に与え得る。
【０１３６】
Ｄ．図９Ａ〜Ｂ
１０％のＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を含むＤＭＥＭ中で、ＳＷ６２０細胞を培養した。実験の前日に、細胞を９６ウェルプレート（ウェルあたり１００，０００細胞）にプレーティングした。実験の当日に、培地を吸引し廃棄した。Ｔ細胞培地中のウェルあたり２０，０００個のＴ細胞を加えた。コンストラクト（１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌの範囲の終濃度）をＴ細胞培地中で作製し、培養物に加えた。コンストラクトの混合物を使用した場合は、これらを前もって混合してから培養物に加えた（コンストラクトあたり１０ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの範囲のコンストラクトの終濃度）。対照は、ＰＨＡ−Ｍ（終濃度１０μｇ／ｍｌ）、ＳＷ６２０細胞＋Ｔ細胞（添加なし）及びＳＷ６２０細胞（Ｔ細胞または他の添加なし）であった。各条件を３連で実施した。培養物の最終量はウェルあたり２００μｌであった。培養物を３７℃、５％ＣＯ２及び１００％相対湿度で２４時間インキュベートした。培養物を４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引し、別のプレートに入れた。ＩＦＮγについて解析するまで、上清を−２００℃で保管した。３連の平均±標準偏差を図９Ａ〜Ｂに示した。
【０１３７】
対照コンストラクトと対形成した二成分系の両方ともＩＦＮγの発現を示した。これは、不活性なＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれコンストラクト６２４８及び６２４９から切断されていること、ならびにＴ細胞に結合することができる完全な抗ＣＤ３Ｅ  ｓｃＦｖを生成するようにこれらの２つのコンストラクトが対形成していることを示す。
【０１３８】
二成分系（６２４８及び６２４９）は二重特異性の６２４５コンストラクトよりも弱い効力を有するが、依然として許容可能な範囲にあり、副作用の回避の面で投薬の利点を実際に与え得る。
【０１３９】
Ｅ．図１０
１０％のＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を含むＤＭＥＭ中で、ＳＷ６２０細胞を培養した。実験の前日に、細胞を９６ウェルプレート（ウェルあたり１００，０００細胞）にプレーティングした。実験の当日に、培地を吸引し廃棄した。Ｔ細胞培地中のウェルあたり２０，０００個のＴ細胞を加えた。コンストラクト（１μｇ／ｍｌの終濃度）をＴ細胞培地中で作製し、培養物に加えた。コンストラクトの混合物を使用した場合は、これらを前もって混合してから培養物に加えた（コンストラクトの終濃度はコンストラクトあたり１μｇ／ｍｌであった）。対照は、ＰＨＡ−Ｍ（終濃度１０μｇ／ｍｌ）、ＳＷ６２０細胞＋Ｔ細胞（添加なし）及びＳＷ６２０細胞（Ｔ細胞または他の添加なし）であった。各条件を３連で実施した。培養物の最終量はウェルあたり２００μｌであった。培養物を３７℃、５％ＣＯ２及び１００％相対湿度で２４時間インキュベートした。培養物を４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引し、別のプレートに入れた。ＩＦＮγについて解析するまで、上清を−２０℃で保管した。図１０は、３連の平均±標準偏差を提供する。
【０１４０】
図１０は、抗ＣＤ３Ｅ  ｓｃＦｖに対するＶＨまたはＶＬしか有さないコンストラクトに対ついて非常に低レベルのＩＦＮγの発現を示すが、完全なｓｃＦｖを有する陽性の二重特異性コンストラクト（９３３２及び９３３３）は、より高いＩＦＮγの発現レベルを示した。
【０１４１】
Ｆ．二成分系の相補的コンストラクトの化学量論的評価（図１１）
図１１に示すように、二成分系の相補的コンストラクト（６２４８及び６２４９）を様々な比率で一緒加えた。
【０１４２】
１０％のＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を含むＤＭＥＭ中で、ＳＷ６２０細胞を培養した。実験の前日に、細胞を９６ウェルプレート（ウェルあたり１００，０００細胞）にプレーティングした。実験の当日に、培地を吸引し廃棄した。Ｔ細胞培地中のウェルあたり２０，０００個のＴ細胞を加えた。コンストラクトをＴ細胞培地中に特定の比率で前もって混合し、培養物に加えた（コンストラクトの終濃度は全体で１μｇ／ｍｌであった）。２つの成分６２４８及び６２４９（一方はＣＤ３活性化部分のＶＨドメインを含み（６２４９）、他方はＣＤ３活性化部分のＶＬドメインを含む（６２４８））を１００：０、９０：１０、７５：２５、５０：５０、２５：７５、１０：９０及び０：１００の比率で前もって混合した。２つの成分の混合物を１００，０００個の望ましくない腫瘍細胞及び２０，０００個のＴ細胞に加えた。対照は、ＰＨＡ−Ｍ（終濃度１０μｇ／ｍｌ）、ＳＷ６２０細胞＋Ｔ細胞（添加なし）及びＳＷ６２０細胞（Ｔ細胞または他の添加なし）であった。各条件を３連で実施した。培養物の最終量はウェルあたり２００μｌであった。培養物を３７℃、５％ＣＯ２及び１００％相対湿度で２４時間インキュベートした。培養物を４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引し、別のプレートに入れた。ＩＦＮγについて解析するまで、上清を−２０℃で保管した。
【０１４３】
図１１の結果は、２つの成分の比が平衡に達するにつれて、Ｔ細胞の活性化が増大することを示す。ＣＤ３活性化部分のＶＨドメインを含む成分（６２４９）またはＣＤ３活性化部分のＶＬドメインを含む他の成分（６２４８）のいずれか過剰量である場合、Ｔ細胞の活性化は低下し、これは、活性化がＣＤ３活性化部分のＶＨ及びＶＬの両方が一緒になることに依存しているのからである。したがって、ＩＦＮγの発現レベルは、提供されるすべてまたはほとんどすべてのコンストラクトが１つのタイプまたは他のタイプのものであった場合に、非常に低かった。最高のＩＦＮγ発現レベルは、等量の２つの相補的コンストラクトのそれぞれが提供された場合のシナリオに対応する。これは、ＩＦＮγの発現が二成分系の２つのコンストラクトから一緒に来る抗ＣＤ３Ｅ  ｓｃＦｖの２つの２分体によって引き起こされることを示す、さらなる証拠を提供する。
【０１４４】
Ｇ．ＭＣＦ−７細胞の使用（図１２）
図１２は、ＭＣＦ−７腫瘍細胞株で行われた実験を示す。１０％のＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を含むＤＭＥＭ中で、ＭＣＦ−７細胞を培養した。実験の前日に、細胞を９６ウェルプレート（ウェルあたり１００，０００細胞）にプレーティングした。実験の当日に、培地を吸引し廃棄した。Ｔ細胞培地中のウェルあたり２０，０００個のＴ細胞を加えた。コンストラクト（１μｇ／ｍｌの終濃度）をＴ細胞培地中で作製し、培養物に加えた。対照は、ＰＨＡ−Ｍ（終濃度１０μｇ／ｍｌ）、ＭＣＦ−７細胞＋Ｔ細胞（添加なし）及びＭＣＦ−７細胞（Ｔ細胞または他の添加なし）であった。各条件を３連で実施した。培養物の最終量はウェルあたり２００μｌであった。培養物を３７℃、５％ＣＯ２及び１００％相対湿度で２４時間インキュベートした。培養物を４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引し、別のプレートに入れた。ＩＦＮγについて解析するまで、上清を−２０℃で保管した。
【０１４５】
使用した他の細胞株と同様の結果が得られた。図１２では、陽性対照コンストラクト６２４５、９３３２及び９３３３（それぞれ完全な抗ＣＤ３Ｅ  ｓｃＦｖを有する）は、抗ＣＤ３Ｅ抗体からのＶＨまたはＶＬドメインのみを含む単一成分のどれよりもはるかに高いＩＦＮγ発現レベルを示した。図１２は、ＭＣＦ−７細胞単独またはＰＨＡで非特異的に刺激したＴ細胞に対するベースラインのＩＦＮγ発現レベルも提供する。
【０１４６】
Ｈ．図１３〜１４
１０％のＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を含むＤＭＥＭ中で、ＳＷ６２０細胞を培養した。実験の前日に、細胞を９６ウェルプレート（ウェルあたり１００，０００細胞）にプレーティングした。実験の当日に、培地を吸引し廃棄した。Ｔ細胞培地中のウェルあたり２０，０００個のＴ細胞を加えた。コンストラクト（１μｇ／ｍｌの終濃度）をＴ細胞培地中で作製し、培養物に加えた。コンストラクトの混合物を使用した場合は、これらを前もって混合してから培養物に加えた（コンストラクトの終濃度はコンストラクトあたり１μｇ／ｍｌであった）。対照は、ＰＨＡ−Ｍ（終濃度１０μｇ／ｍｌ）、ＳＷ６２０細胞＋Ｔ細胞（添加なし）及びＳＷ６２０細胞（Ｔ細胞または他の添加なし）であった。各条件を３連で実施した。培養物の最終量はウェルあたり２００μｌであった。培養物を３７℃、５％ＣＯ２及び１００％相対湿度で２４時間インキュベートした。培養物を４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引し、別のプレートに入れた。ＩＦＮγについて解析するまで、上清を−２０℃で保管した。
【０１４７】
図１３では、データは、６２４８及び６２４９の二成分系は、これらのコンストラクトがＭＭＰ２切断部位で切断され得る不活性結合パートナーならびに対形成可能な抗ＣＤ３Ｅ可変ドメイン（１つは６２４８のＶＨ及び１つは６２４９のＶＬ）を有するので、期待されたように機能することを示す。コンストラクト９３２７及び９３２８は、これらのコンストラクトのいずれも不活性結合パートナーと抗ＣＤ３Ｅ可変ドメインの間に切断部位を有さないので、強いＩＦＮγシグナルを生成しない。
【０１４８】
コンストラクト９３２７及び６２４８は、これらは両方とも抗ＣＤ３Ｅ抗体に対するＶＨドメインを有し、機能的な抗ＣＤ３Ｅ  ｓｃＦｖを作製することができず、さらに９３２７は切断部位を有さないので、いかなる活性も示さない。９３２７及び６２４９は、９３２７は切断部位を有さず、６２４９は切断部位を有するが、いくらかの低レベルの自発的な切断が生じる場合に２つが一緒に抗ＣＤ３Ｅ  ｓｃＦｖを作製することができるので、非常に低レベルの活性を示す。
【０１４９】
図１４では、コンストラクト９３３４及び９３３５の対形成（ＥＧＦＲ上の異なるエピトープに対する標的化抗体ｓｃＦｖを用いる、ＥＦＧＲ標的化に対する二重パラトピックアプローチを提供する）は、ＩＦＮγシグナルを生成しなかった。ＥＧＦＲ上のいずれのエピトープも遠く離れすぎていて、２つの抗ＣＤ３Ｅ可変ドメインが互いに到達することができないこと、またはエピトープが近すぎて、抗体側での結合に立体障害をもたらすことが考えられる。しかし、二重パラトピックの組み合わせを試験することは非常に合理的である。本アプローチの組み合わせのために、ＥＧＦＲに対する別の抗体を同定し、試験することができる。
【０１５０】
図１４は、同じがん細胞で発現している２つの異なるタンパク質の標的化も示す。コンストラクト６２４８はＥｐＣＡＭと結合し、ＥＧＦＲに結合する９３３５と首尾よく対形成する。コンストラクト６２４９もＥｐＣＡＭと結合し、９３３４と首尾よく対形成する。これは、がん細胞の様々な分子を標的にできることを確証し、本明細書に記載の二成分系のいくつかの実施形態に対して特異性のさらに別の層を提供する。これは、成分９３３５及び９３３４が他の状況で働くというさらなる証拠も提供し、さらに、上で述べたそれらの互いの組み合わせにおいて、これらの成分が互いに近すぎたまたは遠すぎたことを示唆する。
【０１５１】
９３３４と６２４９の組み合わせは、この図において有用な情報提供し、コンストラクト９３３４がＥＧＦＲを標的にし、９２４９がＥｐＣＡＭを標的にするので、二重標的化を達成することができることを示す。
【０１５２】
９３３４及び６２４８の組み合わせは、両方のコンストラクトが抗ＣＤ３Ｅ抗体からのＶＨを含み、いずれのコンストラクトもその抗体からのＶＬを含まないので、活性を有するとは期待されなかった。
【０１５３】
Ｉ．図１５
１０％のＦＢＳ、２ｍＭグルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を含むＲＰＭＩ１６４０中で、ＳＮＵ３９８細胞を培養した。実験の前日に、細胞を９６ウェルプレート（ウェルあたり１００，０００細胞）にプレーティングした。実験の当日に、培地を吸引し廃棄した。Ｔ細胞培地中のウェルあたり２０，０００個のＴ細胞を加えた。コンストラクト（１μｇ／ｍｌの終濃度）をＴ細胞培地中で作製し、培養物に加えた。コンストラクトの混合物を使用した場合は、これらを前もって混合してから培養物に加えた（コンストラクトの終濃度はコンストラクトあたり１μｇ／ｍｌであった）。対照は、ＰＨＡ−Ｍ（終濃度１０μｇ／ｍｌ）、ＳＮＵ３９８細胞＋Ｔ細胞（添加なし）及びＳＮＵ３９８細胞（Ｔ細胞または他の添加なし）であった。各条件を３連で実施した。培養物の最終量はウェルあたり２００μｌであった。培養物を３７℃、５％ＣＯ２及び１００％相対湿度で２４時間インキュベートした。培養物を４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引し、別のプレートに入れた。ＩＦＮγについて解析するまで、上清を−２０℃で保管した。
【０１５４】
図１５は、プロテアーゼ阻害剤の添加が、プロテアーゼ切断部位を有する二成分系（コンストラクト６２４８及び６２４９）のＩＦＮγの発現を低減することを示す。プロテアーゼ阻害剤は、切断及び対形成が活性に必要とされないので、６２４５二重特異性コンストラクトに影響しない。
【０１５５】
Ｊ．図１６
１０％のＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を含むＤＭＥＭ中で、ＳＷ６２０細胞を培養した。実験の前日に、細胞を９６ウェルプレート（ウェルあたり１００，０００細胞）にプレーティングした。実験の当日に、培地を吸引し廃棄した。Ｔ細胞培地中のウェルあたり２０，０００個のＴ細胞を加えた。コンストラクト（１μｇ／ｍｌの終濃度）をＴ細胞培地中で作製し、培養物に加えた。コンストラクトの混合物を使用した場合は、これらを前もって混合してから培養物に加えた（コンストラクトの終濃度はコンストラクトあたり１μｇ／ｍｌであった）。対照は、ＰＨＡ−Ｍ（終濃度１０μｇ／ｍｌ）、ＳＷ６２０細胞＋Ｔ細胞（添加なし）及びＳＷ６２０細胞（Ｔ細胞または他の添加なし）であった。各条件を３連で実施した。培養物の最終量はウェルあたり２００μｌであった。培養物を３７℃、５％ＣＯ２及び１００％相対湿度で２４時間インキュベートした。培養物を４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引し、別のプレートに入れた。ＩＦＮγについて解析するまで、上清を−２０℃で保管した。
【０１５６】
９３３５と６２４８の機能的組み合わせは、様々な種類の抗体断片をそれぞれ第１の成分及び第２の成分に組み合わせることができることを示す。９３３５は標的化部分として抗ＥＧＦＲ  ＶＨＨを用い、６２４８は標的化部分として抗ＥＰＣＡＭ  ｓｃＦｖを用いる。
【０１５７】
実施例４．二成分系を使用する、Ｂ細胞リンパ腫のインビボ標的化
第１の成分及び第２の成分を含む二成分系をリンパ腫を有する患者に投与する。第１の成分は、標的化部分としてリツキシマブまたは抗ＣＤ２２抗体を、Ｔ細胞結合ドメインとしてＣＤ３に結合する抗体由来のＶＨドメインを、不活性結合パートナーとしてＶＬドメインを、及びＡＤＡＭ２８切断部位ＫＰＡＫＦＦＲＬを含む。第２の成分も、標的化部分としてリツキシマブまたは抗ＣＤ２２抗体を、Ｔ細胞結合ドメインとしてＣＤ３に結合する抗体由来の相補的なＶＬドメインを、不活性結合パートナーとしてＶＨを、及びＡＤＡＭ２８切断部位ＫＰＡＫＦＦＲＬを含む。第１の成分のＴ細胞結合ドメインとしてのＣＤ３に結合する抗体由来のＶＨドメイン及び第２の成分のＴ細胞結合ドメインとしてのＣＤ３に結合する抗体由来のＶＬドメインは、不活性結合パートナーに結合していない場合に互いに結合することができ、Ｔ細胞に結合する活性を有することができる。
【０１５８】
健常及び悪性のすべてのＢ細胞を標的にする薬剤を患者に注入する。悪性細胞に結合すると、薬剤はプロテアーゼと接触し、それによって、プロテアーゼ認識ドメインの切断により第１及び第２のＴ細胞結合ドメインの両方から不活性結合パートナーが放出される。
【０１５９】
今や活性化された二成分系複合体に結合している悪性のＢ細胞は、第１と第２のＴ細胞結合ドメインの複合体の存在及び活性により、Ｔ細胞による細胞溶解のために宿主免疫系を誘引する。
【０１６０】
実施例５．二成分系の特定の実施形態
系Ａ〜Ｅから選択される二成分系を表３に従って調製し、がんを有する患者に投与する。項目が随意として記載されている場合、表の行は、その項目を有するまたは有さない二成分系の両方を記載する。
【０１６１】
【表６−１】
2018538262.tif 000022
【０１６２】
【表６−２】
2018538262.tif 000023
【０１６３】
【表６−３】
2018538262.tif 000024
【０１６４】
【表６−４】
2018538262.tif 000025
【０１６５】
実施例６．実施形態
以下の番号付けした条項は本明細書に記載の実施形態を提供するが、ここに列挙する実施形態は限定的ではない。
【０１６６】
条項１．望ましくない細胞の存在によって特徴づけられる状態を治療するための二成分系であって、
ａ．標的化Ｔ細胞結合剤を含む第１の成分であって、前記標的化Ｔ細胞結合剤は、
ｉ．前記望ましくない細胞を標的とすることができる第１の標的化部分、
ｉｉ．第２のＴ細胞結合ドメインと結合した場合にＴ細胞結合活性になることができる第１のＴ細胞結合ドメイン（ここでは、前記第２のＴ細胞結合ドメインは前記第１の成分の一部ではない）、
ｉｉｉ．前記第１のＴ細胞結合ドメインに対する第１の不活性結合パートナーであって、不活性結合パートナーが除去されない限り前記第１のＴ細胞結合ドメインが前記第２のＴ細胞結合ドメインに結合しないように前記第１のＴ細胞結合ドメインに結合する、前記不活性結合パートナー、及び
ｉｖ．前記第１のＴ細胞結合ドメインと前記第１の不活性結合パートナーを分離する切断部位（ここでは、前記切断部位は、
（１）前記望ましくない細胞が発現する酵素によって切断される、
（２）前記望ましくない細胞の内部でｐＨ感受性切断反応を介して切断される、
（３）補体依存的切断反応によって切断される、または
（４）前記薬剤中の前記標的化部分と同じもしくは異なる標的化部分によって前記望ましくない細胞に共存するプロテアーゼによって切断される）
を含む、第１の成分、
ｂ．前記第１のＴ細胞結合ドメインと結合した場合にＴ細胞結合活性になることができる第２のＴ細胞結合ドメインを含む、第２の成分
を含み、
ここでは、前記第１及び第２のＴ細胞結合ドメインが、どちらも不活性結合パートナーに結合していない場合に結合することができる、前記二成分系。
【０１６７】
条項２．前記第２の成分が前記望ましくない細胞を標的とすることができる第２の標的化部分をさらに含む、条項１に記載の二成分系。
【０１６８】
条項３．前記第２の成分が、前記第２のＴ細胞結合ドメインに対する第２の不活性結合パートナーであって、前記不活性結合パートナーが除去されない限り前記第２のＴ細胞結合ドメインが前記第１のＴ細胞結合ドメインに結合しないように前記第２のＴ細胞結合ドメインに結合する、前記不活性結合パートナー、及び
ａ．前記第２のＴ細胞結合ドメインと前記第２の不活性結合パートナーを分離する切断部位（ここでは、前記切断部位は、
ｉ．前記望ましくない細胞が発現する酵素によって切断される、
ｉｉ．前記望ましくない細胞の内部でｐＨ感受性切断反応を介して切断される、
ｉｉｉ．補体依存的切断反応によって切断される、または
ｉｖ．前記薬剤中の前記標的化部分と同じもしくは異なる標的化部分によって前記望ましくない細胞に共存するプロテアーゼによって切断される）
をさらに含み、
ここでは、前記切断部位の切断が前記不活性結合パートナーの喪失及び前記二成分系の前記第１のＴ細胞結合ドメインとの相互補完を引き起こす、
条項１または２に記載の二成分系。
【０１６９】
条項４．前記第１及び前記第２の標的化部分が同じである、条項１〜３のいずれか１項に記載の二成分系。
【０１７０】
条項５．前記第１及び前記第２の標的化部分が異なる、条項１〜３のいずれか１項に記載の二成分系。
【０１７１】
条項６．前記第１及び第２の切断部位が同じである、条項１〜５のいずれか１項に記載の二成分系。
【０１７２】
条項７．前記第１及び第２の切断部位が異なる、条項１〜５のいずれか１項に記載の二成分系。
【０１７３】
条項８．少なくとも１つの切断部位がプロテアーゼ切断部位である、条項１〜７のいずれか１項に記載の二成分系。
【０１７４】
条項９．少なくとも１つの切断部位が前記望ましくない細胞の外部で切断され得る、条項１〜８のいずれか１項に記載の二成分系。
【０１７５】
条項１０．前記望ましくない細胞が発現する少なくとも１つの酵素がプロテアーゼである、条項１〜９のいずれか１項に記載の二成分系。
【０１７６】
条項１１．少なくとも１つの不活性結合パートナーが前記Ｔ細胞結合ドメインと特異的に結合する、条項１〜１０のいずれか１項に記載の二成分系。
【０１７７】
条項１２．少なくとも１つの不活性結合パートナーがＶＨまたはＶＬドメインである、条項１〜１１のいずれか１項に記載の二成分系。
【０１７８】
条項１３．ａ．前記Ｔ細胞結合ドメインがＶＨドメインである場合は、前記不活性結合パートナーがＶＬドメインであり、
ｂ．前記Ｔ細胞結合ドメインがＶＬドメインである場合は、前記不活性結合パートナーがＶＨドメインである、
条項１〜１２のいずれか１項に記載の二成分系。
【０１７９】
条項１４．少なくとも１つの標的化部分が抗体またはその機能的断片である、条項１〜１３のいずれか１項に記載の二成分系。
【０１８０】
条項１５．前記少なくとも１つの不活性結合パートナーが、少なくとも１つの切断部位が切断されると解離することができ、解離後に、前記２つのＴ細胞結合ドメインが互いに結合することができ、Ｔ細胞結合活性を示すことができる、条項１〜１４のいずれか１項に記載の二成分系。
【０１８１】
条項１６．一方のＴ細胞結合ドメインがＶＨドメインであり、他方のＴ細胞結合ドメインがＶＬドメインである、条項１〜１５に記載の二成分系。
【０１８２】
条項１７．第１の標的化Ｔ細胞結合剤を含む望ましくない細胞の存在によって特徴づけられる状態を治療するための二成分系で使用するための成分であって、前記第１の標的化Ｔ細胞結合剤は、
ａ．望ましくない細胞を標的とすることができる標的化部分、
ｂ．第２のＴ細胞結合ドメインと結合した場合にＴ細胞結合活性になることができる第１のＴ細胞結合ドメイン（ここでは、前記第２のＴ細胞結合ドメインは前記第１の標的化Ｔ細胞結合剤の一部ではない）、
ｃ．前記第１のＴ細胞結合ドメインに対する不活性結合パートナーであって、前記不活性結合パートナーが除去されない限り前記第１のＴ細胞結合ドメインが前記第２のＴ細胞結合ドメインに結合しないように前記第１のＴ細胞結合ドメインに結合する、前記不活性結合パートナー、
ｄ．前記第１のＴ細胞結合ドメインと前記不活性結合パートナーを分離する切断部位（ここでは、前記切断部位は、
ｉ．前記望ましくない細胞が発現する酵素によって切断される、
ｉｉ．前記望ましくない細胞の内部でｐＨ感受性切断反応を介して切断される、
ｉｉｉ．補体依存的切断反応によって切断される、または
ｉｖ．前記薬剤中の前記標的化部分と同じもしくは異なる標的化部分によって前記望ましくない細胞に共存するプロテアーゼによって切断される）
を含み、
ここでは、前記切断部位の切断が前記不活性結合パートナーの喪失を引き起こし、前記薬剤の一部ではない前記第２のＴ細胞結合ドメインとの相互補完を可能にする、
前記成分。
【０１８３】
条項１８．前記切断部位がプロテアーゼ切断部位である、条項１７に記載の二成分系で使用するための成分。
【０１８４】
条項１９．前記切断部位が前記望ましくない細胞の外部で切断され得る、条項１７〜１８のいずれか１項に記載の二成分系で使用するための成分。
【０１８５】
条項２０．前記望ましくない細胞が発現する前記酵素がプロテアーゼである、条項１７〜１９のいずれか１項に記載の二成分系で使用するための成分。
【０１８６】
条項２１．少なくとも１つの不活性結合パートナーが前記Ｔ細胞結合ドメインと特異的に結合する、条項１７〜２０のいずれか１項に記載の二成分系で使用するための成分。
【０１８７】
条項２２．前記不活性結合パートナーがＶＨまたはＶＬドメインである、条項１７〜２１のいずれか１項に記載の二成分系で使用するための成分。
【０１８８】
条項２３．
ａ．前記Ｔ細胞結合ドメインがＶＨドメインである場合は、前記不活性結合パートナーがＶＬドメインであり、
ｂ．前記Ｔ細胞結合ドメインがＶＬドメインである場合は、前記不活性結合パートナーがＶＨドメインである、
条項１７〜２２のいずれか１項に記載の二成分系で使用するための成分。
【０１８９】
条項２４．前記標的化部分が抗体またはその機能的断片である、条項１７〜２３のいずれか１項に記載の二成分系で使用するための成分。
【０１９０】
条項２５．条項１〜１６のいずれか１項に記載の２成分系の前記第１及び第２の成分をコードする１組の核酸分子。
【０１９１】
条項２６．条項１７〜２４のいずれか１項に記載の二成分系で使用するための前記成分をコードする核酸分子。
【０１９２】
条項２７．望ましくない細胞の存在によって特徴づけられる患者における疾患の治療方法であって、条項１〜１６のいずれか１項に記載の二成分系を前記患者に投与することを含む、前記方法。
【０１９３】
条項２８．望ましくない細胞に対する患者の免疫応答の標的化方法であって、条項１〜１６のいずれか１項に記載の二成分系を前記患者に投与することを含む、前記方法。
【０１９４】
条項２９．前記望ましくない細胞ががん細胞である、条項２７〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【０１９５】
条項３０．前記がんが、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がん、黒色腫、肺がん、前立腺がん、精巣がん、甲状腺がん、脳のがん、食道がん、胃がん、膵臓がん、結腸直腸がん、肝臓がん、白血病、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、リンパ増殖性障害、骨髄異形成障害、骨髄増殖性疾患または前がん性疾患のうちのいずれか１つである、条項２９に記載の方法。
【０１９６】
均等物
前述の明細書は、当業者が実施形態を実施できるようにするのに十分であると考えられる。前述の説明及び実施例はある特定の実施形態を詳述し、本発明者らが企図する最良の形態を記載する。しかし、いかに詳細に前述の事項が本文中に現れようとも、実施形態は多くの方法で実施することができ、添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物に従って解釈されるべきであることが理解されるであろう。
【０１９７】
本明細書で使用する場合、約という用語は、明確に示されたかどうかを問わず、例えば、整数、分数及びパーセンテージを含めた数値を指す。約という用語は、一般に、記載される値と均等である（例えば、同じ機能または結果を有する）と当業者が考えると思われる数値の範囲（例えば、記載される範囲の＋／−５〜１０％）を指す。少なくとも及び約などの用語が数値または範囲のリストに先行する場合、これらの用語は、そのリストに提供される値または範囲のすべてを修飾する。ある場合には、約という用語は、最も近い有効数字に四捨五入される数値を含んでもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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