(57)【要約】本発明は、ＧＲＣＳバクテリオファージ、と同様に人工関節感染症を治療するための方法及び組成物に関する。特に、本発明は人工関節感染症に由来するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対して特異的なバクテリオファージを提供する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓが関与する人工関節感染症の治療方法であって、ＧＲＣＳバクテリオファージまたはＧＲＣＳバクテリオファージ遺伝子１８５０５６１４によってコードされるマイナー尾部タンパク質もしくはその機能的誘導体を有するポドウイルス科バクテリオファージを人工関節の感染領域及び／または表面に投与することを含む、前記治療方法。
【請求項２】
前記機能的誘導体が、ＧＲＣＳバクテリオファージ遺伝子１８５０５６１４によってコードされる前記マイナー尾部タンパク質との少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マイナー尾部タンパク質または前記その機能的誘導体がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのにおける表面決定基を認識する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記人工関節感染症が１以上の追加の微生物株を含む混合感染症である上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記追加の微生物株がグラム陽性またはグラム陰性である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記追加の微生物株が、コアグラーゼ陰性のブドウ球菌、連鎖球菌、腸球菌、嫌気性細菌及びグラム陰性の桿菌から選択される請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記バクテリオファージがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを除去する上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記人工関節感染症がバイオフィルムを特徴とする上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記バクテリオファージがバイオフィルム分解酵素をコードする核酸を含む上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記バイオフィルム分解酵素がディスパーシンＢである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記バクテリオファージが少なくとも１つの抗菌ポリペプチドをコードする核酸を含む上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗菌ポリペプチドが約１２〜約５０のアミノ酸を有する抗菌ペプチドである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗菌ペプチドが、アニオン性ペプチド、線状カチオン性α−らせんペプチド、プロリン、アルギニン、フェニルアラニン、グリシンもしくはトリプトファンが豊富なカチオン性ペプチド、またはシステインとジスルフィド結合とを含有するアニオン性及びカチオン性のペプチドから選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗菌ペプチドが、インドリシジン、セクロピンＰ１、デルマセプチン、ポネリシンＷ１、ポネリシンＷ３、ポネリシンＷ４、ポネリシンＷ５、ポネリシンＷ６、マキシミンＨ５、ダームシジン、アンドロピン、モリシン、セロトトキシン、メリチン、メガイニン、ボンビニン、ブレビニン、エスクレンチン、ブフォリン、ＣＡＰ１８、ＬＬ３７、アバシン、プロフェニン、プロテグリン、タキプレシン、デフェンシン、ドロソマイシン、アピデシン、オンコシンまたはそれらの変異体から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗菌ペプチドが、感染した細菌から分泌される請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗菌ポリペプチドが、グラム陽性の細菌またはグラム陰性の細菌に対して活性がある溶菌酵素である請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗菌ポリペプチドが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、コアグラーゼ陰性のブドウ球菌、連鎖球菌、腸球菌、嫌気性細菌及びグラム陰性の桿菌の１以上に対して活性がある溶菌酵素である請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶菌酵素が、ＬｙｓＫ、エンドリシン、リゾチーム、リゾスタフィンまたはそれらの機能的誘導体から選択される請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記バクテリオファージが、抗生剤耐性遺伝子及び／または細胞生存修復遺伝子を阻害する少なくとも１つの作用物質をコードする核酸を含む上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記バクテリオファージが、ＳＯＳ応答遺伝子及び／または細菌防御遺伝子の少なくとも１つのリプレッサをコードする核酸を含む上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ＳＯＳ応答遺伝子の前記リプレッサがｌｅｘＡまたはその機能的誘導体である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記その機能的誘導体がｌｅｘＡ３である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細菌防御遺伝子の前記リプレッサがｓｏｘＲである請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記バクテリオファージが、細菌細胞の抗菌剤に対する感受性を高める少なくとも１つの作用物質をコードする核酸を含む上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記作用物質が細菌細胞への抗菌剤の侵入を増やす請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
細菌細胞への抗菌剤の前記侵入を増やす前記作用物質がポリンである請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
さらに抗生剤または抗菌剤の全身性投与を含む上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
ＧＲＣＳバクテリオファージ遺伝子１８５０５６１４によってコードされるようなマイナー尾部タンパク質またはその機能的誘導体を含む操作されたバクテリオファージであって、
前記マイナー尾部タンパク質または前記その機能的誘導体が人工関節感染症に関連するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにおける表面決定基を認識する、前記バクテリオファージ。
【請求項２９】
前記バクテリオファージが、バイオフィルム分解酵素をコードする核酸を含むように操作される請求項２８に記載のバクテリオファージ。
【請求項３０】
前記バイオフィルム分解酵素がディスパーシンＢである請求項２９に記載のバクテリオファージ。
【請求項３１】
前記バクテリオファージが、少なくとも１つの抗菌ポリペプチドをコードする核酸を含むように操作される請求項２８〜３０のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項３２】
前記抗菌ポリペプチドが約１２〜約５０のアミノ酸を有する抗菌ペプチドである請求項３１に記載のバクテリオファージ。
【請求項３３】
前記抗菌ペプチドが、アニオン性ペプチド、線状カチオン性α−らせんペプチド、プロリン、アルギニン、フェニルアラニン、グリシンもしくはトリプトファンが豊富なカチオン性ペプチド、またはシステインとジスルフィド結合とを含有するアニオン性及びカチオン性のペプチドから選択される請求項３２に記載のバクテリオファージ。
【請求項３４】
前記抗菌ペプチドが、インドリシジン、セクロピンＰ１、デルマセプチン、ポネリシンＷ１、ポネリシンＷ３、ポネリシンＷ４、ポネリシンＷ５、ポネリシンＷ６、マキシミンＨ５、ダームシジン、アンドロピン、モリシン、セロトトキシン、メリチン、メガイニン、ボンビニン、ブレビニン、エスクレンチン、ブフォリン、ＣＡＰ１８、ＬＬ３７、アバシン、プロフェニン、プロテグリン、タキプレシン、デフェンシン、ドロソマイシン、アピデシン、オンコシンまたはそれらの変異体から選択される請求項３３に記載のバクテリオファージ。
【請求項３５】
前記抗菌ペプチドが、感染した細菌から分泌される請求項３２〜３４のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項３６】
前記抗菌ポリペプチドが、グラム陽性の細菌またはグラム陰性の細菌に対して活性がある溶菌酵素である請求項３１に記載のバクテリオファージ。
【請求項３７】
前記抗菌ポリペプチドが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、コアグラーゼ陰性のブドウ球菌、連鎖球菌、腸球菌、嫌気性細菌及びグラム陰性の桿菌の１以上に対して活性がある溶菌酵素である請求項３１に記載のバクテリオファージ。
【請求項３８】
前記溶菌酵素が、ＬｙｓＫ、エンドリシン、リゾチーム、リゾスタフィンまたはそれらの機能的誘導体から選択される請求項３５または３６に記載のバクテリオファージ。
【請求項３９】
前記バクテリオファージが、抗生剤耐性遺伝子及び／または細胞生存修復遺伝子を阻害する少なくとも１つの作用物質をコードする核酸を含むように操作される請求項２８〜３８のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項４０】
前記バクテリオファージが、ＳＯＳ応答遺伝子及び／または細菌防御遺伝子の少なくとも１つのリプレッサをコードする核酸を含むように操作される請求項２８〜３９のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項４１】
ＳＯＳ応答遺伝子の前記リプレッサがｌｅｘＡまたはその機能的誘導体である請求項４０に記載のバクテリオファージ。
【請求項４２】
前記その機能的誘導体がｌｅｘＡ３である請求項４１に記載のバクテリオファージ。
【請求項４３】
細菌防御遺伝子の前記リプレッサがｓｏｘＲである請求項４０〜４２のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項４４】
前記バクテリオファージが、細菌細胞の抗菌剤に対する感受性を高める少なくとも１つの作用物質をコードする核酸を含むように操作される請求項２８〜４３のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項４５】
前記作用物質が細菌細胞への抗菌剤の侵入を増やす請求項４４に記載のバクテリオファージ。
【請求項４６】
細菌細胞への抗菌剤の侵入を増やす前記作用物質がポリンである請求項４５に記載のバクテリオファージ。
【請求項４７】
前記バクテリオファージが、マーカーをコードする核酸を含むように操作される請求項２８〜４６のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項４８】
前記マーカーが発光タンパク質または蛍光タンパク質である請求項４７に記載のバクテリオファージ。
【請求項４９】
前記マーカーがルシフェラーゼである請求項４７に記載のバクテリオファージ。
【請求項５０】
前記マーカーが緑色蛍光タンパク質である請求項４７に記載のバクテリオファージ。
【請求項５１】
前記マーカーがさらに親和性タグを含む請求項４７〜５０のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項５２】
前記親和性タグがＨＩＳタグである請求項５１に記載のバクテリオファージ。
【請求項５３】
本明細書に記載されているようなバクテリオファージと薬学上許容できるキャリアとを含む医薬組成物。
【請求項５４】
前記医薬組成物が、前記人工関節感染症に関連するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを除去する請求項５３に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
前記医薬組成物が、前記人工関節感染症に関連するバイオフィルムを除去する請求項５３または５４に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
人工関節感染症を有する対象に由来する試料にてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの存在または非存在を判定する方法であって、
ＧＲＣＳバクテリオファージ遺伝子１８５０５６１４によってコードされるようなマイナー尾部タンパク質またはその機能的誘導体を含み、検出可能なマーカーをコードするバクテリオファージに前記試料を曝露することと、
前記試料をアッセイして前記マーカーの発現を検出することとを含む、前記方法。
【請求項５７】
前記機能的誘導体が、ＧＲＣＳバクテリオファージ遺伝子１８５０５６１４によってコードされるマイナー尾部タンパク質との少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記マイナー尾部タンパク質または前記その機能的誘導体がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにおける表面決定基を認識する請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記マーカーが発光タンパク質または蛍光タンパク質である請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記マーカーがルシフェラーゼである請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記マーカーが緑色蛍光タンパク質である請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記マーカーが、増幅される及び／または定量されるバクテリオファージ内に含有される核酸配列である請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
ＧＲＣＳファージの製造方法であって、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞では複製できない細菌人工染色体（ＢＡＣ）にてＧＲＣＳゲノムを抱く前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞から任意で１以上の遺伝子挿入物を有するＧＲＣＳファージを回収することを含む、前記製造方法。
【請求項６４】
前記ＢＡＣがＥ．ｃｏｌｉにて複製し、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞に形質転換される請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＧＲＣＳファージがＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙによって構築される請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
さらに、患者への投与のために前記ＧＲＣＳファージを製剤化することを含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
請求項６３に記載の方法によって製造されるＧＲＣＳファージ。
【請求項６８】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞にてＧＲＣＳファージを製造するのに好適なＧＲＣＳファージゲノムを含む細菌人工染色体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる２０１６年５月３１日に出願された米国仮特許出願番号６２／３４３，２０９及び２０１５年７月２３日に出願された米国仮特許出願番号６２／１９６，０１５に対して優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、人工関節感染症を含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（ブドウ球菌）感染症の治療のための方法及び組成物に関する。詳しくは、本発明は、人工関節感染症におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）に対する高い感染力を持つバクテリオファージを提供する。
【背景技術】
【０００３】
たとえば、完全人工股関節及び完全人工膝関節を持つものを含む、数百万人の人工関節患者が存在する。高齢化する人口及び肥満の増え続ける広がりのために、人工関節手術の数は毎年増えると予想される。２０２０年までに２５０万人が毎年手術を受け、人工関節を挿入するまたは既存の人工関節を置換すると推定される。
【０００４】
人工関節感染症（ＰＪＩ）は人工関節手術の深刻な合併症である。ＰＪＩの発生率は、初回股関節及び膝関節の置換については約１〜２．５％であり、再置換手術については約２．１〜５．８％である。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは人工股関節及び膝関節の形成術での感染症の２０〜４０％の原因であり、複数回の手術、人工関節の置換、長期の抗生剤療法、及び可能性として、関節固定術、または感染した四肢の切断を結果として生じる。急性ＰＪＩの選択された患者では、創面切除、抗生剤療法及び人工埋没材保持（ＤＡＩＲ）が有効である。しかしながら、ＤＡＩＲは、選択基準を満たさない患者及び慢性ＰＪＩの患者には適当ではない。ＤＡＩＲについて不適当である症例及び慢性の症例では、バイオフィルムの存在はとりわけ、有効な抗生剤療法を妨げる障害であることが多いので、患者は、人工関節の大幅な見直し、または１段階もしくは２段階の置換を受け、こうして関節を置換することによってバイオフィルムを取り除く。これは患者がその状態を治療するために複数回の手術に耐えるように仕向ける。効果なく治療されたまたは治療されないＰＪＩは結果的に、長期の機能的ハンディキャップ、切断のリスク、及び死さえ生じる。
【０００５】
従って、特に有効な抗生剤療法を可能にするバイオフィルムの除去及び人工関節置換の代替として人工埋没材の保持に関して、慢性ＰＪＩ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓから生じるＰＪＩを含む人工関節感染症の有効な治療に対するニーズが残ったままである。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、人工関節感染症（ＰＪＩ）における特にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対する高い感染力を持つバクテリオファージを提供する。本明細書で実証されているように、ＧＲＣＳバクテリオファージは他の臨床所見に由来する単離体に比べてＰＪＩに由来する臨床単離体に対して高い感染力を有する。この結果はバクテリオファージ遺伝子１８５０５６１４（推定上のマイナー尾部タンパク質）の存在に少なくともある程度起因し得る。
【０００７】
従って、態様の１つでは、本発明は、感染領域にＧＲＣＳバクテリオファージを投与することによって、またはＧＲＣＳバクテリオファージ遺伝子１８５０５６１４によりコードされるマイナー尾部タンパク質もしくはその機能的誘導体を含むバクテリオファージを投与することによってＰＪＩを治療する方法を提供する。機能的誘導体は、ＧＲＣＳバクテリオファージ遺伝子１８５０５６１４によってコードされるマイナー尾部タンパク質に対し少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。マイナー尾部タンパク質またはその機能的誘導体は人工関節感染症（ＰＪＩ）に由来するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにおける表面決定基を認識してもよい。バクテリオファージはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの除去を促進することができ、一部の実施形態では、バクテリオファージは感染症における他の微生物作用物質のクリアランスを促進するように、及び／またはＰＪＩに関連するバイオフィルムのクリアランスを促進するように操作することができる。例となるバクテリオファージを操作する戦略には、感染部位での抗菌ペプチドの発現、感染部位でのバイオフィルム分散剤の発現、及び／または感染部位での抗生剤の薬効を高める１以上の遺伝子の発現が挙げられる。
【０００８】
別の態様では、本発明は操作されたＧＲＣＳバクテリオファージまたはＧＲＣＳバクテリオファージ遺伝子１８５０５６１４によってコードされるマイナー尾部タンパク質もしくはその機能的誘導体を有するバクテリオファージを提供する。バクテリオファージは、感染部位に存在してもよいスペクトルの広い微生物病原体のクリアランスを促進する酵素またはポリペプチド、たとえば、抗菌ペプチド（ＡＭＰ）または溶菌酵素をコードする遺伝物質を含むように操作されてもよい。実施形態では、バクテリオファージは、感染した細菌によって機能的に発現され、任意で分泌されるバイオフィルム分解酵素をコードするように操作される。さらなる実施形態では、バクテリオファージは、たとえば、抗生剤耐性遺伝子の阻害剤または細胞生存修復遺伝子の阻害剤のような、細菌細胞の抗菌剤への感受性を高める少なくとも１つの遺伝子の感染部位での機能的な発現をコードするように操作される。バクテリオファージは、ＰＪＩへの適用に好適な薬学上許容できる組成物として提供されてもよい。
【０００９】
種々の実施形態では、バクテリオファージは、その発現が感染し易い細菌の検出に役立つであろう１以上のマーカーをコードするように操作されてもよい。これらの態様では、本発明はさらに、バクテリオファージに試料を曝露する工程と、試料をアッセイしてマーカー発現の存在または非存在を検出する工程とを含む、人工関節感染症を有する対象に由来する試料にて感染し易いＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの存在または非存在を検出する方法を提供する。
【００１０】
他の態様では、本発明は、ＧＲＣＳゲノムを抱く細菌人工染色体で形質転換したＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞からＧＲＣＳファージを作る方法を提供する。驚くべきことに、ＧＲＣＳファージに由来するゲノムｄｓＤＮＡはファージの末端タンパク質の非存在下で複製することができ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞へのＤＮＡの形質転換の際にファージを増殖させることができるＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）でのゲノムの複製を可能にする。この方法で製造されたファージはＰＪＩを含むが、これらに限定されないＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓが関与する感染症を治療するのに有用である。
【００１１】
本発明の他の態様及び実施形態は以下の詳細な説明から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】３つのバクテリオファージＧＲＣＳ、Ｐ６８及び４４ＡＨＪＤのゲノム配列の比較を示す図である。矢印は推定上のマイナー尾部タンパク質をコードするＧＲＣＳ遺伝子１８５０５６１４を示す。
【図２】図２Ａ及び図２Ｂは、人工関節感染症に由来するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するポドウイルス科バクテリオファージの平板効率（ＥＯＰ）を示す図である。溶菌効率は、完全な透明化を示す４、全体的に透明であるが、透明ゾーンでかすかな濁りがあることを示す３、実質的に濁っていることを示す２、わずかな個々のプラークを示す１、及び全く透明ではないことを示す０のスコアで視覚的にスコア化した。
【図３】他の臨床単離体に由来するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するポドウイルス科バクテリオファージの平板効率（ＥＯＰ）を示す図である。溶菌効率は、完全な透明化を示す４、全体的に透明であるが、透明ゾーンでわずかに濁りがあることを示す３、実質的に濁っていることを示す２、わずかな個々のプラークを示す１、及び全く透明ではないことを示す０のスコアで視覚的にスコア化した。
【図４】人工関節感染症に由来するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの菌叢における重層アッセイでのポドウイルス科バクテリオファージの平板効率（ＥＯＰ）を示す図である。
【図５】（Ａ）配列で高度に関連する３つの他のポドウイルス科のファージと比べたＧＲＣＳのメジャー尾部タンパク質の間のドットマトリクス相同性を示す図であり、及び（Ｂ）マイナー尾部タンパク質についての同じ比較である。
【図６】ＧＲＣＳゲノムの構築及び細菌人工染色体（ＢＡＣ）への導入を説明する図である。そのとき、構築物はＥ．ｃｏｌｉで増幅され、その後ＧＲＣＳ宿主株に形質転換されてもよい。
【図７】ＧＲＣＳ／ＢＡＣがＧＲＣＳファージ粒子を作ることを実証する図である。
【図８】ＧＲＣＳ／ＢＡＣへの遺伝子挿入（ＧＦＰ）を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
人工関節感染症（ＰＪＩ）はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ及び／または他の微生物株の存在を特徴とすることが多い。これらの微生物は、疼痛、炎症、及び他の症状を生じる多数の酵素及び毒素を分泌する。さらにその上、これらの微生物はバイオフィルムを生成し、それは、宿主の免疫系や抗生剤からその生物を保護するので、人工関節感染症を治療するのが特に難しくなっている。ＰＪＩの病因は複雑であるけれども、Ｓ．ａｕｒｅｕｓによる感染症は、細菌の伝染力の強い性質と迅速なバイオフィルムの形成のために特に難しい。
【００１４】
本発明は、人工関節感染症における特にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対する高い感染力を持つバクテリオファージを提供する。本明細書で実証されているように、ＧＲＣＳバクテリオファージは、ＰＪＩに由来する臨床単離体にわたって高い感染力を有するが、他の臨床所見に由来する単離体にわたってはそれを有さず、その成績はゲノム解析に基づいたバクテリオファージ遺伝子１８５０５６１４（推定上のマイナー尾部タンパク質）の存在に少なくともある程度起因し得る。
【００１５】
態様の１つでは、本発明は、ＧＲＣＳバクテリオファージまたはＧＲＣＳバクテリオファージ遺伝子１８５０５６１４によってコードされるマイナー尾部タンパク質を有するバクテリオファージを感染領域に投与することを含む、人工関節感染症を治療する方法を提供する。種々の実施形態では、バクテリオファージはポドウイルス科のバクテリオファージである。実施形態では、バクテリオファージはポドウイルス科のＧＲＣＳバクテリオファージである。種々の実施形態では、バクテリオファージは本明細書に記載されているような操作されたバクテリオファージである。
【００１６】
天然の宿主としてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを有する多数のバクテリオファージが単離されている。一般に、Ｘｉａ  ａｎｄ  Ｗｏｌｚ，Ｐｈａｇｅｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｈｏｓｔ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，２１：５９３−６０１（２０１４）を参照のこと。ＧＲＣＳバクテリオファージはインドにおける処理場で回収された生下水から単離されたが、その完全なゲノム配列は既知である。Ｓｗｉｆｔ  ａｎｄ  Ｎｅｌｓｏｎ，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｐｈａｇｅ  ＧＲＣＳ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎｎｏｕｎｃ  Ｖｏｌ．２，Ｉｓｓｕｅ，２（２０１４）。ＧＲＣＳはポドウイルス科に分類される溶菌性ファージである。ポドウイルス科のファージは非常に短い非収縮性の尾部を特徴とする。ポドウイルス科のウイルスはエンベロープを持たず、２０面体で頭部／尾部構造を持つ。
【００１７】
種々の実施形態では、バクテリオファージはＧＲＣＳバクテリオファージ遺伝子１８５０５６１４を含み、それは、ＰＪＩから単離されたＳ．ａｕｒｅｕｓに対して高い感染性比率を少なくともある程度提供すると考えられている。遺伝子１８５０５６１４は配列番号１のヌクレオチド配列を含む。発現について最適化すること、及び／またはＳ．ａｕｒｅｕｓのＰＪＩ臨床単離体の高い感染性比率を提供する高い及び／または類似する能力を持つ変異体タンパク質をコードすることを含む、遺伝子１８５０５６１４の種々の変異体を作り出すことができる。一部の実施形態では、バクテリオファージは、マイナー尾部タンパク質（または以下に記載されているようなその誘導体）をコードし、且つ少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または約９９％の配列番号１との同一性を有してもよいヌクレオチド配列を含む。
【００１８】
種々の実施形態では、バクテリオファージは、たとえば、ＧＲＣＳバクテリオファージ遺伝子１８５０５６１４によってコードされるようなマイナー尾部タンパク質をコードする遺伝物質を含む。一部の実施形態では、マイナー尾部タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、バクテリオファージは、ＧＲＣＳバクテリオファージ遺伝子１８５０５６１４によってコードされるマイナー尾部タンパク質の機能的誘導体を含む。理論によって束縛されることを望まないで、ＧＲＣＳバクテリオファージ遺伝子１８５０５６１４によってコードされるマイナー尾部タンパク質またはその機能的誘導体は人工関節感染症に関連するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにおける表面決定基を認識すると考えられている。
【００１９】
種々の実施形態では、ＧＲＣＳバクテリオファージ遺伝子１８５０５６１４によってコードされるマイナー尾部タンパク質の機能的誘導体は、配列番号２と少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有する。機能的誘導体は、ＰＪＩに由来するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ単離体及び／または他の臨床所見に由来する単離体にわたる遺伝子を含むファージの感染力のスペクトルをアッセイすることによって決定することができる。
【００２０】
種々の実施形態では、バクテリオファージは、ＧＲＣＳバクテリオファージ遺伝子１８５０５６１４によってコードされるマイナー尾部タンパク質に比べて１以上のアミノ酸変異を有するタンパク質を含んでもよい。たとえば、マイナー尾部タンパク質は、ＧＲＣＳバクテリオファージ遺伝子１８５０５６１４によってコードされるマイナー尾部タンパク質に比べて１〜約２０、または１〜約１５、または１〜約１０のアミノ酸変異を有してもよい。一部の実施形態では、１以上のアミノ酸変異は独立して置換、挿入、欠失及び切り詰めから選択されてもよい。一部の実施形態では、アミノ酸変異はアミノ酸の置換及び／または切り詰めである。
【００２１】
種々の実施形態では、バクテリオファージは、標的細菌によって発現されると、感染を一掃するための有効性を高める１以上の追加の酵素またはポリペプチドをコードするように操作される。種々の実施形態では、バクテリオファージは、バイオフィルム分解酵素をコードする核酸を含むように操作されるので、感染した細菌によってその酵素が発現され、任意で分泌される。バイオフィルムは、たとえば、宿主防御、抗生剤及び殺菌剤のような種々の環境攻撃から細菌を保護するために細菌のような微生物によって分泌されるポリマー構造体である。バイオフィルムは結合相、成熟相及び分散相を含む調節された生活環を有する。たとえば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓはフィブリン及びフィブリノーゲンを含む多数の宿主血漿タンパク質に対する受容体を発現しているので、Ｓｔａｐｈバイオフィルムにおける当初の結合には一般にタンパク質／タンパク質の相互作用がある程度介在する。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのバイオフィルムは、細胞外ポリマー物質を形成する３つのクラスの分子；ポリ−β−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ）と、フェノール可溶性モジュリン、ＳｔａｐｈプロテインＡ等を含むタンパク質と同様に細菌起源及び宿主起源双方の細胞外ＤＮＡで構成される。さらに、Ｓ．ａｕｒｅｕｓとＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのバイオフィルムの間には差異がある。たとえば、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのＲＰ６２ＡバイオフィルムはＤｓｐＢ酵素によって分解され、プロテイナーゼＫまたはウシＤＮＡ分解酵素Ｉによって分解されないのに対してＳ．ａｕｒｅｕｓのバイオフィルムはＤｓｐＢには感受性ではないが、プロテイナーゼＫ及びＤＮＡ分解酵素Ｉによって分解される。
【００２２】
バイオフィルムにおける細菌は抗生剤療法に耐性であることができる。耐性は、一部のバイオフィルムの細菌の代謝上の休止に加えてバイオフィルムにて抗生剤が有意な濃度を達成できないことによる可能性がある。従って、バイオフィルムに関連した感染、特に非生物表面における感染は標準の抗生剤療法で治療するのは難しい。
【００２３】
バイオフィルムは人工関節を含むどんな表面に見いだされてもよい。バイオフィルム分解酵素は、バイオフィルムの形成を阻害することによってバイオフィルムマトリクスポリマーを分解し、樹立されたバイオフィルムのコロニーを取り外し、バイオフィルム形成細胞を抗菌剤による殺傷に対して感受性にする。
【００２４】
バイオフィルムを壊すのに有用な例となる酵素には、ディスパーシンＢ、アルギン酸リアーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、ディスアグレガターゼ酵素、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、多糖デポリメラーゼ、タンパク分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ＤＮＡ分解酵素Ｉ、またはリアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、バイオフィルム分解酵素には、たとえば、セルラーゼのグリコシルヒドロキシラーゼファミリー（たとえば、セルラーゼＡとも呼ばれる酵素のグリコシルヒドロキシラーゼ５ファミリー）のようなセルラーゼ、ポリグルコサミン（ＰＧＡ）デポリメラーゼ、及びコロン酸デポリメラーゼ（たとえば、１，４−Ｌ−フコダイスヒドロラーゼ）、脱重合化アルギナーゼ、及びＤＮＡ分解酵素Ｉが挙げられる。追加のバイオフィルム分解酵素は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、たとえば、米国特許第８，１５３，１１９号に記載されている。実施形態では、バクテリオファージは、β−１，６−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを加水分解する酵素であるディスパーシンＢをコードする核酸を含むように操作される。ディスパーシンＢ遺伝子の例は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、たとえば、米国特許第８，１５３，１１９号に記載されている。実施形態では、ディスパーシンＢ遺伝子は、たとえば、配列番号３で示されるようなＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ（アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス）に由来するディスパーシンＢのヌクレオチド配列を含み、及び／または配列番号４のアミノ酸配列またはその機能的な変異体を含む。
【００２５】
種々の実施形態では、ディスパーシンＢ酵素の機能的な変異体は、配列番号４と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有する。機能的な変異体はβ−１，６−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの加水分解についてアッセイすることによって判定することができる。種々の実施形態では、ディスパーシンＢは配列番号４に比べて１以上のアミノ酸変異を有してもよい。たとえば、ディスパーシンＢは配列番号４に比べて１〜約２０、または１〜約１５、または１〜約１０のアミノ酸変異を有してもよい。一部の実施形態では、１以上のアミノ酸変異は独立して置換、挿入、欠失及び切り詰めから選択されてもよい。
【００２６】
種々の実施形態では、バクテリオファージは、少なくとも１つの抗菌ポリペプチドをコードする核酸を含むように操作されるので、宿主細菌によってその抗菌ポリペプチドが発現され、任意で分泌される。一部の実施形態では、抗菌ポリペプチドは抗菌ペプチドである。抗菌ペプチドは宿主防御ペプチドとも呼ばれ、先天性免疫応答の一部として細菌、真菌、昆虫、カエル類、及び哺乳類にまで及ぶ種によって産生される。一部の実施形態では、抗菌ペプチドは約１０〜約６０のアミノ酸、または約１２〜約５０のアミノ酸を含む。
【００２７】
一部の実施形態では、抗菌ペプチドには、たとえば、アルギニンまたはリジンによって提供される２以上の正に荷電した残基と、大きな比率（たとえば、５０％を超える）疎水性残基とが含まれてもよい。一部の実施形態では、抗菌ペプチドの二次構造は、たとえば、α−らせん、β−鎖（たとえば、２以上のジスルフィド結合の存在による）、β−ヘアピンまたはループ（たとえば、単一のジスルフィド結合及び／またはペプチド鎖の環化の存在による）であってもよく、且つ伸長されてもよい。
【００２８】
実施形態では、抗菌ペプチドはアニオン性ペプチド、たとえば、グルタミン酸及びアスパラギン酸が豊富なペプチドであってもよい。別の実施形態では、抗菌ペプチドは、たとえば、システインを欠いている線状のカチオン性α−らせんペプチドであってもよい。さらなる実施形態では、抗菌ペプチドは、特定のアミノ酸を濃縮したカチオン性ペプチドであってもよい。たとえば、抗菌ペプチドは、プロリン、アルギニン、フェニルアラニン、グリシンまたはトリプトファンが豊富であってもよい。別の実施形態では、抗菌ペプチドは、少なくとも１つのシステインとジスルフィド結合とを含有するアニオン性及びカチオン性のペプチドであってもよい。たとえば、抗菌ペプチドは約１〜約３のジスルフィド結合を含んでもよい。例となる抗菌ペプチドには、インドリシジン、セクロピンＰ１、デルマセプチン、ポネリシンＷ１、ポネリシンＷ３、ポネリシンＷ４、ポネリシンＷ５、ポネリシンＷ６、マキシミンＨ５、ダームシジン、アンドロピン、モリシン、セロトトキシン、メリチン、メガイニン、ボンビニン、ブレビニン、エスクレンチン、ブフォリン、ＣＡＰ１８、ＬＬ３７、アバシン、プロフェニン、プロテグリン、タキプレシン、デフェンシン、ドロソマイシン、アピデシン、オンコシンまたはそれらの変異体が挙げられるが、これらに限定されない。追加の抗菌ペプチドには、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号２０１５／００５０７１７に記載されたものが挙げられる。
【００２９】
一部の実施形態では、操作されたバクテリオファージはアピデシン及び／またはオンコシンから選択される抗菌ペプチドをコードする。アピデシン（アピデシン型ペプチド）は一連の小型のプロリンが豊富な（Ｐｒｏリッチ）１８〜２０残基のペプチドであり、昆虫によって天然に産生される。構造的に、アピデシンは、２つの領域である、一般的な抗菌能に関与する保存された（定常の）領域と、抗菌スペクトルに関与する可変領域とから成る。小型の、遺伝子がコードし、且つ修飾されていないアピデシンは、特定の抗菌メカニズムによって多数のグラム陰性の細菌に対して優先的に活性がある。
【００３０】
一部の実施形態では、抗菌ポリペプチドは、たとえば、エンドリシン、リゾチーム、リゾスタフィンまたはそれらの機能的誘導体のような溶菌酵素である。これらの酵素は、５０から数百のアミノ酸のサイズに及び、種間及び種内の殺菌の戦いにおいてバクテリオファージ及び細菌によって優勢に使用される。実施形態では、酵素はグラム陽性及び／またはグラム陰性の細菌の溶菌を誘導する。たとえば、酵素はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、コアグラーゼ陰性のブドウ球菌、連鎖球菌、腸球菌、嫌気性細菌及びグラム陰性の桿菌の１以上を効果的に溶菌してもよい。例となる酵素には、ＬｙｓＫ、リゾチーム、リソスタフィンまたはそれらの機能的断片が挙げられるが、これらに限定されない。実施形態では、ＬｙｓＫの機能的断片は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号２０１５／００５０７１７にて開示されたようなＣＨＡＰ１６５である。追加の酵素は、たとえば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号２０１５／００５０７１７に記載されている。
【００３１】
一部の実施形態では、バクテリオファージは、抗菌ペプチドと溶菌酵素との間でのキメラまたは融合体をコードする核酸を含むように操作される。特定の実施形態では、融合タンパク質またはキメラタンパク質はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ及び／または他のグラム陽性及びグラム陰性の細菌の溶菌を誘導してもよい。実施形態では、融合タンパク質またはキメラタンパク質は外膜を持つグラム陰性の細菌に対して特に活性がある。実施形態では、融合タンパク質またはキメラタンパク質は外膜を欠いているＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓと同様に近接するグラム陰性の細菌の溶菌を誘導する。抗菌ペプチドと溶菌酵素との間での例となるキメラタンパク質または融合タンパク質は、たとえば、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，０９６，３６５号及び同第８，８４６，８６５号、ならびにＢｒｉｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１５），Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１０（３）：３７７−９０、Ｂｒｉｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１４），Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，５８（７）：３７７４−８４、Ｂｒｉｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１４），Ｍ．Ｂｉｏ，５（４）：ｅ０１３７９−１４、及びＬｕｋａｃｉｋ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１２），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０９（２５）：９８５７−６２に記載されている。
【００３２】
種々の実施形態では、バクテリオファージは、たとえば、抗生剤耐性遺伝子または細胞生存修復遺伝子の発現及び／または機能を阻害することによって抗生剤の作用を強化する作用物質をコードする核酸を含むように操作される。これらの実施形態に従って標的とする例となる抗生剤耐性遺伝子はβ−ラクタム（たとえば、メチシリン）またはバンコマイシンに対する耐性を付与するものである。
【００３３】
例となる細胞生存修復遺伝子には、ｒｅｃＡ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＣ、ｓｐｏＴまたはｒｅｌＡのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓオルソログが挙げられる。追加の標的は、たとえば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号２０１０／０３２２９０３にて開示されている。これらの遺伝子の発現または機能が、たとえば、アンチセンスポリヌクレオチドの発現、または標的とされる宿主にて機能的である二本鎖ＲＮＡもしくは他の遺伝子のサイレンシング法によって標的とされてもよい。
【００３４】
種々の実施形態では、バクテリオファージは、ＳＯＳ応答遺伝子及び／または非ＳＯＳ経路の細菌防御遺伝子を抑制する少なくとも１つの遺伝子をコードする核酸を含むように操作される。細菌におけるＳＯＳ応答は、誘導性のＤＮＡ修復システムであり、それによって細菌は増えたＤＮＡの損傷を乗り切るのが可能になる。一部の実施形態では、リプレッサはｌｅｘＡのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓオルソログまたはｌｅｘＡ３のようなその修飾型である。一部の実施形態では、遺伝子はｍａｒＲＡＢ、ａｒｃＡＢ及びｌｅｘＯのようなＳＯＳ応答遺伝子を抑制する。追加のリプレッサは、たとえば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号２０１０／０３２２９０３にて開示されている。一部の実施形態では、非ＳＯＳ経路の遺伝子のリプレッサは、ｓｏｘＲ、ｍａｒＲ、ａｒｃ、ｆｕｒ、ｃｒｐ、ｉｃｄＡ、ｃｒａＡ、もしくはｏｍｐＡ、またはそれらの修飾型の１以上である。非ＳＯＳ細菌防御遺伝子は、細菌または微生物を細胞死から保護する、たとえば、抗菌剤によって殺傷されるまたは増殖抑制されるのを防御するのに役立つ、細菌または微生物によって発現される遺伝子を指す。
【００３５】
種々の実施形態では、バクテリオファージは、抗菌剤に対する細菌の感受性を高める作用物質をコードする核酸を含むように操作される。一実施形態では、作用物質は抗菌剤の細菌細胞への侵入を増やす。抗菌剤の細菌細胞への侵入を増やす例となる作用物質には、ポリンまたはポリン様タンパク質、たとえば、ＯｍｐＦ、βバレルポリン、または外膜ポリン（ＯＭＰ）の機能的スーパーファミリーの他のメンバーをコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、作用物質は、細菌細胞にて鉄／イオウのクラスターを増やし、及び／または細菌にて酸化ストレスもしくはヒドロキシルラジカルを増やす。鉄／イオウのクラスターを増やす感受性作用物質の例には、Ｆｅｎｔｏｎ反応を調節して（すなわち、増やすまたは減らす）ヒドロキシルラジカルを形成する作用物質が挙げられる。細菌細胞にて鉄／イオウのクラスターを増やす作用物質の例には、ＩｓｃＡ、ＩｓｃＲ、ＩｓｃＳ及びＩｓｃＵのタンパク質またはホモログをコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。鉄の取り込み及び利用を増やす作用物質の例には、ＥｎｔＣ、ＥｘｂＢ、ＥｘｂＤ、Ｆｅｃｌ、ＦｅｃＲ、ＦｅｐＢ、ＦｅｐＣ、Ｆｅｓ、ＦｈｕＡ、ＦｈｕＢ、ＦｈｕＣ、ＦｈｕＦ、ＮｒｄＨ、Ｎｒｄｌ、ＳｏｄＡ及びＴｏｎＢのタンパク質またはホモログをコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。細菌の抗菌剤に対する感受性を高めてもよい追加の作用物質は、たとえば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号２０１０／０３２２９０３にて開示されている。
【００３６】
種々の実施形態では、バクテリオファージは検出可能なマーカーをコードする核酸を含むように操作される。実施形態では、マーカーは、たとえば、発光タンパク質または蛍光タンパク質のように検出可能なマーカーである。例となるマーカーには、たとえば、ルシフェラーゼ、修飾されたルシフェラーゼタンパク質、青色／ＵＶ蛍光タンパク質（たとえば、ＴａｇＢＦＰ、アズライト、ＥＢＦＰ２、ｍＫａｌａｍａ１、シリウス、サファイア、及びＴ−サファイア）、シアン蛍光タンパク質（たとえば、ＥＣＦＰ、セルリアン、ＳＣＦＰ３Ａ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、単量体緑石−シアン、ＴａｇＣＦＰ、及びｍＴＦＰ１）、緑色蛍光タンパク質（たとえば、ＥＧＦＰ、エメラルド、スーパーフォルダーＧＦＰ、単量体Ａｚａｍｉ緑色、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、及びｍワサビ）、黄色蛍光タンパク質（たとえば、ＥＹＦＰ、シトリン、ヴィーナス、ＳＹＦＰ２、及びＴａｇＹＦＰ）、橙色蛍光タンパク質（たとえば、単量体クサビラ−橙色、ｍＫＯＫ、ｍＫＯ２、ｍ橙色、及びｍ橙色２）、赤色蛍光タンパク質（たとえば、ｍラズベリー、ｍチェリー、ｍストロベリー、ｍタンジェリン、ｔｄトマト、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ｍＡｐｐｌｅ、及びｍＲｕｂｙ）、遠赤色蛍光タンパク質（たとえば、ｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、及びＮｉｒＦＰ）、近−ＩＲ蛍光タンパク質（たとえば、ＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦＰ１．４、及びｉＲＦＰ）、長ストローク−シフトタンパク質（たとえば、ｍＫｅｉｍａ赤、ＬＳＳ−ｍＫａｔｅ１、及びＬＳＳ−ｍＫａｔｅ２）、光活性化できる蛍光タンパク質（たとえば、ＰＡ−ＧＦＰ、ＰＡｍチェリーｌ、及びＰＡＴａｇＲＦＰ）、光変換できる蛍光タンパク質（たとえば、Ｋａｅｄｅ（緑色）、Ｋａｅｄｅ（赤色）、ＫｉｋＧＲ１（緑色）、ＫｉｋＧＲ１（赤色）、ＰＳ−ＣＦＰ２、ＰＳ−ＣＦＰ２、ｍＥｏｓ２（緑色）、ｍＥｏｓ２（赤色）、ＰＳｍ橙色、及びＰＳｍ橙色）、ならびに光交換できる蛍光タンパク質（たとえば、Ｄｒｏｎｐａ）が挙げられる。
【００３７】
一部の実施形態では、検出可能なマーカーはタグを含む。タグはマーカーの検出または製造のために使用されてもよい。一部の実施形態では、タグはマーカーを精製する及び／または濃縮するのに使用される親和性タグである。一部の実施形態では、タグは６×Ｈｉｓタグである。一部の実施形態では、タグは、検出に先立って試料で作製されるマーカーを精製する及び／または濃縮するのに使用される、及び／またはマーカーを検出するのに使用される抗体によって特異的に認識されるエピトープである。一部の実施形態では、検出可能なマーカーは、特定のマーカーをコードする遺伝子の存在を検出するまたはそれを定量するために増幅されてもよい（たとえば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって）独特の核酸配列を含んでもよい。従って、バクテリオファージ内に含有される任意の核酸配列をＰＣＲに基づく検出または定量（たとえば、ＲＴ−ＰＣＲ）に使用してもよい。
【００３８】
種々の実施形態では、バクテリオファージは、本明細書で開示されている遺伝子（たとえば、バイオフィルム分解酵素、抗菌ポリペプチド、抗生剤耐性遺伝子及び／または細胞生存修復遺伝子を阻害する作用物質、細菌細胞の抗菌剤への感受性を高める作用物質、及びマーカーをコードする核酸）の発現を指図するように操作可能に連結されるプロモータ配列を含む。一部の実施形態では、プロモータは核酸に操作可能に連結される。一部の実施形態では、プロモータはバクテリオファージのプロモータまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのプロモータである。使用されてもよい他のプロモータは、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、たとえば、米国特許公開番号２０１０／０３２２９０３及びｐａｒｔｓｒｅｇｉｓｔｒｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｐａｒｔｓｄｂ／ｐｇｒｏｕｐ．ｃｇｉ？ｐｇｒｏｕｐ＝ｏｔｈｅｒ＿ｒｅｇｕｌａｔｏｒ＆ｓｈｏｗ＝１にて開示されている。
【００３９】
種々の実施形態では、バクテリオファージは、たとえば、バイオフィルム分解酵素及び抗菌ポリペプチドのような作用物質を発現している核酸を感染した宿主細菌細胞に送達する。実施形態では、バクテリオファージ感染の溶菌サイクルの間に宿主細菌が溶解されると作用物質は宿主細菌細胞から放出される。別の実施形態では、たとえば、分泌経路を介して作用物質は宿主細菌から分泌される。そのような実施形態では、バクテリオファージが感染した宿主細菌細胞から発現される作用物質は、たとえば、分泌シグナル配列のようなシグナルペプチドを含有してもよい。そのような分泌シグナル配列によって、細菌からのその分泌のための作用物質の細菌細胞の原形質膜への細胞内輸送が可能になる。例となる分泌シグナル配列は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、たとえば、米国特許公開番号２０１５／００５０７１７にて開示されている。
【００４０】
態様の１つでは、本発明は、本発明の１以上のバクテリオファージを含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明の医薬組成物はさらに、感染の部位への適用に好適な薬学上許容できる賦形剤またはキャリアを含んでもよい。
【００４１】
本発明は、人工関節の感染領域及び／または表面に本明細書で開示されているような本発明のバクテリオファージ及び／または医薬組成物を投与することを含む、人工関節感染症を治療する方法を提供する。一部の実施形態では、バクテリオファージ及び／または医薬組成物は人工関節感染症に関与する微生物（たとえば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の増殖を効果的に阻害し、及び／またはそれを殺傷する（または細胞の生存率を低下させる）。一部の実施形態では、バクテリオファージ及び／または医薬組成物は、人工関節感染症に関与する微生物（たとえば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）によって作られた細菌バイオフィルムを除去することまたは減らすことにおいて有効である。
【００４２】
一部の実施形態では、本発明の方法はバクテリオファージの近傍の微生物の増殖を阻害する、及び／またはそれを殺傷する（または細胞の生存率を低下させる）。一部の実施形態では、本発明の方法はバクテリオファージの近傍の細菌バイオフィルムを除去する、または減らす。理論によって束縛されることを望まないで、作用物質は感染した宿主微生物細胞から近傍に放出されると考えられている。従って、本発明の方法は、これらの微生物が本発明のバクテリオファージに感染していなくても、または感染することに抵抗性であっても、人工関節感染症に関与する微生物を標的にすることができる。
【００４３】
種々の実施形態では、人工関節感染症にはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓが関与する。一部の実施形態では、人工関節感染症は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓと１以上の追加の微生物の種及び／または株を含む混合感染である。実施形態では、追加の微生物株はグラム陽性またはグラム陰性である。別の実施形態では、追加の微生物株は、コアグラーゼ陰性のブドウ球菌、連鎖球菌、腸球菌、嫌気性細菌及びグラム陰性の桿菌から選択される。実施形態では、追加の微生物株はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓである。
【００４４】
種々の実施形態では、本発明のバクテリオファージまたは医薬組成物は、それを必要とする対象に追加の治療剤との併用で投与されてもよい。実施形態では、追加の治療剤は抗生剤または抗菌剤であり、それは局所にまたは全身性に投与される。実施形態では、追加の治療剤は抗生剤または抗菌剤であり、それは全身性に投与される。種々の実施形態では、追加の治療剤との併用での本発明のバクテリオファージまたは医薬組成物の投与は相乗効果を生じる。
【００４５】
本発明での使用に好適な抗生剤には、アミノグリコシド、カルバペネム、セファロスポリン、セフェム、糖ペプチド、フルオロキノロン／キノロン、オキサゾリジノン、ペニシリン、ストレプトグラミン、スルホンアミド、リファマイシン及び／またはテトラサイクリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
他の態様では、本発明は人工関節感染症を有する対象に由来する試料における感染し易いＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの存在または非存在を判定する方法を提供する。方法には、ＧＲＣＳバクテリオファージに、またはＧＲＣＳバクテリオファージ遺伝子１８５０５６１４によってコードされるマイナー尾部タンパク質もしくはその機能的誘導体を含むバクテリオファージに試料を曝露することが含まれる。実施形態では、バクテリオファージは検出可能なマーカーをコードし、宿主細菌によって発現される核酸を含む。試料における感染し易いＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの存在または非存在を示すマーカーの存在または非存在を検出するために試料をその後アッセイする。試料が感染し易い細菌について検査で陽性と出た場合、患者は本明細書に記載されているバクテリオファージで治療される。
【００４７】
種々の実施形態では、マーカーは、たとえば、化学発光タンパク質または蛍光タンパク質のような検出可能なマーカーである。例となるマーカーには、たとえば、ルシフェラーゼ、修飾されたルシフェラーゼタンパク質、青色／ＵＶ蛍光タンパク質（たとえば、ＴａｇＢＦＰ、アズライト、ＥＢＦＰ２、ｍＫａｌａｍａ１、シリウス、サファイア、及びＴ−サファイア）、シアン蛍光タンパク質（たとえば、ＥＣＦＰ、セルリアン、ＳＣＦＰ３Ａ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、単量体緑石−シアン、ＴａｇＣＦＰ、及びｍＴＦＰ１）、緑色蛍光タンパク質（たとえば、ＥＧＦＰ、エメラルド、スーパーフォルダーＧＦＰ、単量体Ａｚａｍｉ緑色、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、及びｍワサビ）、黄色蛍光タンパク質（たとえば、ＥＹＦＰ、シトリン、ヴィーナス、ＳＹＦＰ２、及びＴａｇＹＦＰ）、橙色蛍光タンパク質（たとえば、単量体クサビラ−橙色、ｍＫＯＫ、ｍＫＯ２、ｍ橙色、及びｍ橙色２）、赤色蛍光タンパク質（たとえば、ｍラズベリー、ｍチェリー、ｍストロベリー、ｍタンジェリン、ｔｄトマト、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ｍＡｐｐｌｅ、及びｍＲｕｂｙ）、遠赤色蛍光タンパク質（たとえば、ｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、及びＮｉｒＦＰ）、近−ＩＲ蛍光タンパク質（たとえば、ＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦＰ１．４、及びｉＲＦＰ）、長ストローク−シフトタンパク質（たとえば、ｍＫｅｉｍａ赤、ＬＳＳ−ｍＫａｔｅ１、及びＬＳＳ−ｍＫａｔｅ２）、光活性化できる蛍光タンパク質（たとえば、ＰＡ−ＧＦＰ、ＰＡｍチェリーｌ、及びＰＡＴａｇＲＦＰ）、光変換できる蛍光タンパク質（たとえば、Ｋａｅｄｅ（緑色）、Ｋａｅｄｅ（赤色）、ＫｉｋＧＲ１（緑色）、ＫｉｋＧＲ１（赤色）、ＰＳ−ＣＦＰ２、ＰＳ−ＣＦＰ２、ｍＥｏｓ２（緑色）、ｍＥｏｓ２（赤色）、ＰＳｍ橙色、及びＰＳｍ橙色）、及び光交換できる蛍光タンパク質（たとえば、Ｄｒｏｎｐａ）が挙げられる。これらのマーカーの検出方法は当該技術で既知であり、たとえば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号２０１５０００４５９５ｍにて開示されている。
【００４８】
一部の実施形態では、検出可能なマーカーはタグを含む。一部の実施形態では、タグは６×Ｈｉｓタグである。一部の実施形態では、タグは、検出に先立って試料で作製されるマーカーを精製する及び／または濃縮するのに使用される、及び／またはマーカーを検出するのに使用される抗体によって特異的に認識されるエピトープである。一部の実施形態では、検出可能なマーカーは、特定のマーカーをコードする遺伝子の存在を検出するまたはそれを定量するために増幅されてもよい（たとえば、ポリメラーゼ鎖反応によって）独特の核酸配列を含んでもよい。バクテリオファージ内に含有される任意の核酸配列をＰＣＲに基づく検出または定量（たとえば、ＲＴ−ＰＣＲ）に使用してもよい。
【００４９】
他の態様では、本発明は、ＧＲＣＳゲノムを抱く細菌人工染色体（ＢＡＣ）で形質転換したＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ宿主細菌からＧＲＣＳファージを作る方法を提供する。この方法で産出されるファージは、ＰＪＩを含むが、これらに限定されないＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓが関与する感染症を治療するのに有用である。この方法で産出されるファージは、記載されているような１以上の遺伝子挿入物、または本明細書に記載されている他の修飾を含有することができる。そのようなファージは、たとえば、浸透圧安定剤によって安定化することができる。浸透圧安定剤には限定しないで、たとえば、スクロース、トレハロース、ソルビトール、ポリエチレングリコール（たとえば、２０００〜１０，０００の間のＭＷ）及びスペルミンのような糖類及びポリマーが挙げられる。一部の実施形態では、安定化されたファージは凍結乾燥される。
【００５０】
Ｅ．ｃｏｌｉにて複製可能なＢＡＣベクターは周知である。たとえば、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙを用いて好適なＢＡＣベクターにてＧＲＣＳゲノムを構築した後、ファージゲノムを含有するＢＡＣベクターを形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉから精製し、ファージの産出のためにＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ宿主細菌に導入する。多数のファージがＤＮＡ複製を開始するのに必要とされる末端タンパク質を含有する一方で、ＧＲＣＳはファージＤＮＡに関連するそのようなタンパク質を含有してもよいが、そのタンパク質はＤＮＡ複製になくても済むことが発見され、Ｅ．ｃｏｌｉで複製できるＤＮＡ構築物で形質転換したＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ宿主細菌からのファージの好都合な産出を可能にする。
【実施例】
【００５１】
実施例１：ポドウイルス科バクテリオファージゲノム配列の解析
Ｇｅｎｅｉｏｕｓバージョン６．１．４を用いて４つのポドウイルス科バクテリオファージＧＲＣＳ、ＳＡＰ−２、４４ＡＨＪＤ及びＰ６８のゲノム配列を比較した。これらのファージにわたるゲノム配列の比較は高いレベルの相同性を説明し、互いの近縁性の高い程度を示した。しかしながら、ゲノム解析はまた、単一のＯＲＦ、すなわち、ＧＲＣＳ遺伝子１８５０５６１４（約１０，０００〜１１，５００）において有意な配列多様性も示した。ＳＡＰ−２（切り詰められた）、Ｐ６８（相同性の欠如）及び４４ＡＨＪＤ（オープンリーディングフレームを失った）に比べて、ＧＲＣＳ遺伝子１８５０５６１４は推定上のマイナー尾部タンパク質をコードする（図１を参照）。
【００５２】
実施例２：人工関節感染症（ＰＪＩ）から単離されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのバクテリオファージ感染効率の解析
１４の非人工埋没材株（複数の供給源）及び２７のＰＪＩの単離体に由来するＳ．ａｕｒｅｕｓによる希釈寒天重層アッセイを用いて、３種の高度に関連する伝染力の高いポドウイルス科ファージのプラーク形成効率を測定した。溶菌効率は、４（完全な透明化）から０（プラーク形成がない）までの尺度にて視覚的にスコア化した（Ｋｕｔｔｅｒ，Ｅ．（２００９），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５０１：１４１−１４９）。
【００５３】
ファージの増殖
１０ｍＭのＭｇＳＯ４で補完したトリプシンダイズブロス（ＴＳＢＭ）におけるその同族宿主にて各ファージを増殖させた。液体ＴＳＢＭにて相当するファージによって各指定された宿主に植菌し、各培養物からの細菌の視覚的一掃によって示されるように溶菌が達成されるまで３７℃でインキュベートすることによってファージ溶解物を調製した。次いで溶解物を４５μｍのフィルターを介して濾過し、溶解物３ｍｌ当たり５０μｌのクロロホルムで処理し、将来に使用のために４℃でガラス製バイアルにて保存した。
【００５４】
軟寒天の重層によるファージの数え上げ
各宿主Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株の一晩培養物１００μｌを３ｍｌのＴＳＢＭ＋０．７５％寒天に加えることによって一連の軟寒天プレートを調製し、丸型ペトリ皿にて固形ＴＳＢＭ培地（１．５％寒天）上に重層した。各ファージ溶解物の１０倍希釈を同時に調製し、各希釈の１００μｌ容量を固形ＴＳＢＭ培地への添加の直前に上記３ｍｌのＴＳＢＭ＋０．７５％寒天に加えた。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、プラークの数を目視で定量した。次いで、形成されたプラークの数及び溶解物植菌の希釈係数に基づいて、ｍｌ当たりのプラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍｌ）を算出した。
【００５５】
ファージの宿主域の判定
１０ｍＭの硫酸マグネシウムで補完したトリプシンダイズブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ）（ＴＳＢＭ）にてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの培養物を増殖させた。指示されたＳ．ａｕｒｅｕｓ株の一晩培養物１００μｌを４ｍｌのＴＳＢＭ＋０．７５％寒天に加え、正方格子のペトリ皿にて固形ＴＳＢＭ培地（１．５％寒天）上に重層した。１０８〜１０１０のｍｌ当たりのプラーク形成単位（ｐｆｕ）の出発濃度を伴う各ファージのアリコートを１０倍連続希釈した。各細菌軟寒天の重層上にて各希釈の５μｌ容量でスポットを作った。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、各透明ゾーンでプラーク形成を可能にした。４が完全な透明化を示し、３が全体的に透明ではあるが、透明ゾーンを介したかすかな濁りを示し、２が実質的な濁りを示し、１がわずかな個々のプラークを示し、０が透明化がないことを示すＫｕｔｔｅｒ（Ｋｕｔｔｅｒ，２００９）に従ってゾーンをスコア化した。プレートを写真撮影した。
【００５６】
結果
驚くべきことに、３種のバクテリオファージ（ＧＲＣＳ、Ｐ６８及び４４ＡＨＪＤ）及びその他）の相対的な感染力の比較は、ＰＪＩから単離されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓａｕ）について調べた他のバクテリオファージよりもＧＲＣＳが高い比率の感染力を有することを実証した（図２Ａ及び２Ｂ、図４及び表１）が、他の臨床所見に由来する株に対して比較した場合、そうではなかった（図３）。
【表１】
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【００５７】
調べたポドウイルス科のファージは、マイナー尾部タンパク質をコードする遺伝子を失くしている４４ＡＨＪＤを除いて、非人工埋没材株とは対照的にＰＪＩ由来の単離体でさらに良好なプラーク形成効率を実証した。ＰＪＩ単離体でのこれらのファージで観察されたファージ感染の高い効率は、ＰＪＩから単離された株が、ファージゲノムで唯一有意に多様な配列である、これらポドウイルス科のファージにおけるマイナー尾部タンパク質によっておそらく認識される決定基を発現し得ることを示唆している。従って、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのファージ感染力は、臨床供給源及び／または単離体の微細環境に関連すると思われる決定基の発現及び同族認識にある程度依存してもよい。
【００５８】
結局のところ、これらの結果は、ＰＪＩに由来するＳ．ａｕｒｅｕｓの臨床単離体の多様な集団は、他の臨床所見から単離されたＳ．ａｕｒｅｕｓの他の株に比べて特定のファージ（すなわち、ＧＲＣＳ）がさらに感染し易いことを実証した。ＰＪＩ及び他の臨床所見の双方に由来する単離体に対して関連する及び関連しないバクテリオファージをスクリーニングすることにおいて、１つのバクテリオファージ（ＧＲＣＳ）が他の臨床所見に由来するもの（＜４０％）に比べてＰＪＩに由来する株について程度の大きな感染力（＞７０％）を有することは予期しなかった。理論によって束縛されることを望まないで、この特異性はＧＲＣＳバクテリオファージゲノム内での特定の遺伝子における変異による可能性があるので、高度に関連したバクテリオファージ（４４ＡＨＪＤ及びＰ６８）はこの特定の遺伝子においてのみＧＲＣＳからの有意な配列変異を示し、バクテリオファージゲノム全体での他の遺伝子ではそうではないと考えられている。これらの結果は、ＰＪＩに由来する多数のＳ．ａｕｒｅｕｓ株が他のバクテリオファージにおける同じ機能性タンパク質とは対照的にＧＲＣＳにおける変異体タンパク質によって特異的に認識される特定の表面決定基を提示することを示唆している。そのようなものとして、ＧＲＣＳバクテリオファージは特にＰＪＩの治療のために優先的にＳ．ａｕｒｅｕｓ株に感染する。
【００５９】
ＧＲＣＳファージのＰＪＩ臨床単離体に対する特異性は少なくともある程度、マイナー尾部タンパク質によると考えられている。３つの他のポドウイルス科のファージ（配列で高度に関連する）と比べたＧＲＣＳのメジャー尾部タンパク質との間のドットマトリクス相同性は、タンパク質が４つすべてのファージで本質的に同一である（線が連続する）ことを示している（図５Ａ）。それに対して、図５Ｂで示すように、マイナー尾部タンパク質は様々なレベルを同一性を有する。これらは遺伝子の重複及び欠失の結果である可能性が高い。関連するファージのマイナー尾部タンパク質間の比較は、種の選択性を変えるまたは拡大するようにキメラのマイナー尾部タンパク質を操作するのに有用な領域を特定してもよい。
【００６０】
実施例３：ＧＲＣＳゲノムの細菌人工染色体へのクローニング
末端タンパク質で刺激したＤＮＡファージはそのｄｓＤＮＡゲノムの５’末端に共有結合した小型のタンパク質を有する。末端タンパク質で刺激したＤＮＡの複製は、高度に相同性のＳ．ａｕｒｅｕｓファージであるＰ６８を含むＧＲＣＳに関連するい幾つかのファージで見いだされている。文献には末端タンパク質はこれらのファージゲノムのＤＮＡ複製及びパッケージングに必要であると記載されている。このことは、末端タンパク質がなければ複製やパッケージングが生じないことになるので、ファージの増殖のためのベクターへのインタクトなファージゲノムの挿入を推定上妨げることになる。
【００６１】
他のファージにおける既知の末端タンパク質との比較はＧＲＣＳゲノムにおけるホモログを示さなかった。ＧＲＣＳのＤＮＡポリメラーゼが、これらの他のファージに由来する他のタンパク質で刺激したＤＮＡポリメラーゼにて見いだされる署名アミノ酸を有するということは、ＧＲＣＳがタンパク質で刺激したＤＮＡ複製メカニズムを利用することを示唆している。
【００６２】
以下の観察に基づいて、末端タンパク質はＧＲＣＳにおけるＤＮＡ複製にはなくても済むことを発見した。末端タンパク質を維持するためにプロテイナーゼＫ処理の非存在下で単離された場合、ファージから単離されたＧＲＣＳのＤＮＡの処理は電気泳動の際のアガロースゲルに入らない。このことは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに由来するｐｈｉ２９のような他のファージで見られる挙動に一致し、その際、末端タンパク質の維持はアガロース電気泳動におけるファージゲノムＤＮＡの移動を妨げる。ＤＮＡ単離の間でのプロテイナーゼＫによる処理は末端タンパク質を破壊し、アガロース電気泳動におけるファージゲノムＤＮＡの移動を可能にする。さらに、ＧＲＣＳファージＤＮＡの双方の形態（末端タンパク質がインタクトな、及びタンパク質分解によって末端タンパク質が破壊された）でＳ．ａｕｒｅｕｓのＧＲＣＳ宿主株を直接形質転換した。ＧＲＣＳファージを複製すること、増殖させることは、プロテイナーゼＫで処理したファージゲノムＤＮＡによってのみ得られた。インタクトな末端タンパク質ＤＮＡは十中八九形質転換しなかった。重要なことに、末端タンパク質の非存在下でファージの複製及び増殖を達成する能力は、末端タンパク質がＧＲＣＳファージゲノムＤＮＡのＤＮＡ複製を開始するのになくても済むことを示している。従って、細菌人工染色体（ＢＡＣ）に由来する宿主細胞におけるファージの産出は上手く行くと思われる。
【００６３】
ＧＲＣＳゲノムＤＮＡを宿主細胞の形質導入から単離した。手短には、細菌宿主（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に液体培養にてＧＲＣＳファージを感染させ、溶菌を達成させた（約４〜６時間）。溶菌培養物を遠心分離し、ＰＥＧによる沈殿によってＧＲＣＳファージ粒子を含有する上清を回収し、その後ＣｓＣｌ勾配遠心分離によって精製した。ＳＤＳ及びプロテイナーゼＫ、それに５ｍＭのＥＧＴＡを加えてファージ粒子を破壊することによってファージ粒子からファージＤＮＡを単離した。フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によってＤＮＡを単離した。
【００６４】
ＧＲＣＳゲノムの重複している６ｋｂのセグメントをＰＣＲで増幅し、その後、ＰＣＲ産物を精製した。セグメントは、その隣接領域（Ｖｙｂｉｒａｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｌｙｔｉｃ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｐｈａｇｅｓ：４４ＡＨＪＤ  ａｎｄ  Ｐ６８，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２１９，２７５−２８３（２００３）における配列に基づく）への継ぎ目のないアセンブリのための２０ｂｐの重複するＤＮＡ配列を含有した。
【００６５】
ｐＢｅｌｏＢａｃ１１−ＧＲＣＳの構築は、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを用いたＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ反応によって行った。図６を参照のこと。ｐＢｅｌｏＢａｃ１１ベクター主鎖及びＧＲＣＳゲノムの約６ｋｂの３つのセグメントを含む４つのＰＣＲ断片を製造元の指示書に従って集合させ、続いて反応物でエレクトロコンピテントＤＨ５−αＥ．ｃｏｌｉを形質転換した。２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有し、ｐＢｅｌｏＢａｃ１１ベクター主鎖を選択するＬＢ培地に細胞を播くことによって形質転換体を得た。ＧＲＣＳゲノムの組込みは精製したＧＲＣＳ−ＢＡＣ構築物でのＰＣＲによって確認した。次いでＧＲＣＳ−ＢＡＣ構築物でＳ．ａｕｒｅｕｓのＧＲＣＳ宿主株（図５におけるＴｆＨＦＨ−２９９９４）を形質転換し、４時間のエレクトロポレーションから回収し、次いで回収した形質転換の上清（低速遠心分離の後）を、軟寒天重層法を用いてＳ．ａｕｒｅｕｓ細菌の菌叢に載せた。Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおけるＧＲＣＳ−ＢＡＣ構築物の形質転換は、ＢＡＣがＥ．ｃｏｌｉでのみ複製するので、細菌にてベクター（ＢＡＣ）が複製することなく、寒天重層におけるプラーク形成によって判定されるようにファージの産出を生じた（図７）。ＧＲＣＳゲノムＤＮＡの存在についてＰＣＲによって単離プラークをチェックし、本物のＧＲＣＳファージであることを確認した。
【００６６】
このプラットフォームを用いてＧＲＣＳゲノムへのＧＦＰの挿入を作り出した（図８）。高い浸透圧（たとえば、０．５Ｍのスクロースによる）はこの挿入物を含有するファージを安定化するのに有用だった。
【００６７】
同等物
本発明はその具体的な実施形態と併せて記載されてきたが、それはさらに改変することが可能であり、本出願は、一般に本発明の原理に従って、且つ本発明が関係する当該技術の範囲内で既知のまたは普通の実践の範囲内にあるような、上文で述べられた本質的な特徴に適用されてのよいような、及び添付のクレームの範囲で従うような本開示からのそのような逸脱を含めて、本発明の変異、使用または適応を対象にするように意図される。
【００６８】
参照による組み入れ
本明細書で参照されている特許及び出版物はすべてその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【００６９】
配列表
ＧＲＣＳバクテリオファージの遺伝子１８５０５６１４（配列番号１）
ａｔｇｇｃｔｇａｔａｇａａｔｃｇｔａａｇａａｇｔｔｔａａｇｇｇｇｔａｔｔｇａｔｔｃａｇｔａｇａｇａａｇｔｔａａａｃｇａｃａａｔｔｔａｇｔａｇａａｇｃａａａｔｇａｃｔｔａａｔｔａｃａａｃｔａａａｇａｃｇａｔａａｃａｔａｔａｔａｔａａｇａｃｇｔｇａｔｇａｇｇａｔｔａｔｔａｔａａｇｔｔａａｃｃｔｔｔａａａｇａｔｇａａｔｔａｔｔａｇａａａａａａｔｔａａｔａｃａａａｃａｃａａａｔｔｃａａｔｔｇａｔａａａａａｔａａａａａｔｇａｔａｔｃｇｃｔａｃａａａｔａａａａａｃａａｔａｔａｔｃｔｃａａａａｔｇｃａａｃａｇａｔａｔｔａｔｔｃａｔａｔｔａａａｇａｇｇａｔａａｔａｔａｃａａｃａａｇａｔａａａａａａａｔｔａａａａａｔｔｔａｔｃｔｇａｔａｃａｃａａｔｃａｇａａｃａｔａｃａａａｔａａａａｔａａａｃａａｔｃａｃｇａｔｇａｃｇｃｔａｔｔｔｔｇｔｔａｔｔａｇａｔｇａｔｇａａａａｔａｃａａａａａａｃａａａｔｔａｇｃａａｔｔｇａａａｃｇａａｔａａａｃａａｇａｔａｔｃａｔｃｇｃｔａｃａａａａｇａａａｃａａｔｃｇｇａｃａａａａｔａａａｃａａａｇｔａｔａｇａａａａｔｔｔａｇｃｔｔｃａａｃｇｇｔｔｔｃａａａｃａａｃａｃａａｔｔｇａａａｃａａｇｔａａａａａａａｔｃｇａａｔｃａａｃｔａａａａｃａｇａａｔｔａａｔａｇａｔａａａａｔｔａａｃａａｔｔｃａａａａａｃａａａｔｇｔａａｔｔｇａｔａｃａｇｇｔｔｇｇｃａａｇａｔａｔａａｃａｔｔａｇａａａｇｔｇｇｔａｔｔａｃｔｇｃａａｇｔｇａｔｔｃａａｇｔｇｇｔｇｇｔｔａｔｃｃｔｔｃｔｃｃｇｃａａｔａｃｃｇｔａｔｔａｔｔａｃａａｔｔａａｔａａｔａｔｔｃｇｔａｃａａｔａｃａａａｔａａｇａｇｇａｇｔａｔｔａａａａｇｇａａｔｔａａｇａａａａａｃｇｇａｇａｔａｔｔａａａｔｔａｇｇｔａｇｔａｔｔａａｔｇｃｔａａｔｔｔａａａａａｃａａｃａｃａｔｃａｃｔａｔａｃａｃａａｔｇｔｇｃｔａｔｔｇａｔａｃａａａａａｔｇａｔａａａｔａｃａａｇａａｔｇｔａｔｔｔａａａｔｔｔｔａａｃａａｃｇａａｔｔａｃａｔｔｔｔｇｔｔａｃａｔｃａｔｃｇｔａｔｃａａｇａｔａｇｔｇａａｔｔａａｃａａａｃｇｇｔｇａｔａａａｃｇｔｔｔｔｇｔａａｔａｇａｔａｃａｃａａａｔｃａｔｔｇａａｔａａ
【００７０】
バクテリオファージＧＲＣＳの推定上のマイナー尾部タンパク質（配列番号２）
ＭＡＤＲＩＶＲＳＬＲＧＩＤＳＶＥＫＬＮＤＮＬＶＥＡＮＤＬＩＴＴＫＤＤＮＩＹＩＲＲＤＥＤＹＹＫＬＴＦＫＤＥＬＬＥＫＩＮＴＮＴＮＳＩＤＫＮＫＮＤＩＡＴＮＫＮＮＩＳＱＮＡＴＤＩＩＨＩＫＥＤＮＩＱＱＤＫＫＩＫＮＬＳＤＴＱＳＥＨＴＮＫＩＮＮＨＤＤＡＩＬＬＬＤＤＥＮＴＫＮＫＬＡＩＥＴＮＫＱＤＩＩＡＴＫＥＴＩＧＱＮＫＱＳＩＥＮＬＡＳＴＶＳＮＮＴＩＥＴＳＫＫＩＥＳＴＫＴＥＬＩＤＫＩＮＮＳＫＴＮＶＩＤＴＧＷＱＤＩＴＬＥＳＧＩＴＡＳＤＳＳＧＧＹＰＳＰＱＹＲＩＩＴＩＮＮＩＲＴＩＱＩＲＧＶＬＫＧＩＫＫＮＧＤＩＫＬＧＳＩＮＡＮＬＫＴＴＨＨＹＴＱＣＡＩＤＴＫＭＩＮＴＲＭＹＬＮＦＮＮＥＬＨＦＶＴＳＳＹＱＤＳＥＬＴＮＧＤＫＲＦＶＩＤＴＱＩＩＥ
【００７１】
ディスパーシンＢ（受入番号ＡＹ２２８５５１）（配列番号３）
１      ａａｔｔｇｔｔｇｃｇ  ｔａａａａｇｇｃａａ  ｔｔｃｃａｔａｔａｔ  ｃｃｇｃａａａａａａ  ｃａａｇｔａｃｃａａ  ｇｃａｇａｃｃｇｇａ
６１    ｔｔａａｔｇｃｔｇｇ  ａｃａｔｃｇｃｃｃｇ  ａｃａｔｔｔｔｔａｔ  ｔｃａｃｃｃｇａｇｇ  ｔｇａｔｔａａａｔｃ  ｃｔｔｔａｔｔｇａｔ
１２１  ａｃｃａｔｃａｇｃｃ  ｔｔｔｃｃｇｇｃｇｇ  ｔａａｔｔｔｔｃｔｇ  ｃａｃｃｔｇｃａｔｔ  ｔｔｔｃｃｇａｃｃａ  ｔｇａａａａｃｔａｔ
１８１  ｇｃｇａｔａｇａａａ  ｇｃｃａｔｔｔａｃｔ  ｔａａｔｃａａｃｇｔ  ｇｃｇｇａａａａｔｇ  ｃｃｇｔｇｃａｇｇｇ  ｃａａａｇａｃｇｇｔ
２４１  ａｔｔｔａｔａｔｔａ  ａｔｃｃｔｔａｔａｃ  ｃｇｇａａａｇｃｃａ  ｔｔｃｔｔｇａｇｔｔ  ａｔｃｇｇｃａａｃｔ  ｔｇａｃｇａｔａｔｃ
３０１  ａａａｇｃｃｔａｔｇ  ｃｔａａｇｇｃａａａ  ａｇｇｃａｔｔｇａｇ  ｔｔｇａｔｔｃｃｃｇ  ａａｃｔｔｇａｃａｇ  ｃｃｃｇａａｔｃａｃ
３６１  ａｔｇａｃｇｇｃｇａ  ｔｃｔｔｔａａａｃｔ  ｇｇｔｇｃａａａａａ  ｇａｃａｇａｇｇｇｇ  ｔｃａａｇｔａｃｃｔ  ｔｃａａｇｇａｔｔａ
４２１  ａａａｔｃａｃｇｃｃ  ａｇｇｔａｇａｔｇａ  ｔｇａａａｔｔｇａｔ  ａｔｔａｃｔａａｔｇ  ｃｔｇａｃａｇｔａｔ  ｔａｃｔｔｔｔａｔｇ
４８１  ｃａａｔｃｔｔｔａａ  ｔｇａｇｔｇａｇｇｔ  ｔａｔｔｇａｔａｔｔ  ｔｔｔｇｇｃｇａｃａ  ｃｇａｇｔｃａｇｃａ  ｔｔｔｔｃａｔａｔｔ
５４１  ｇｇｔｇｇｃｇａｔｇ  ａａｔｔｔｇｇｔｔａ  ｔｔｃｔｇｔｇｇａａ  ａｇｔａａｔｃａｔｇ  ａｇｔｔｔａｔｔａｃ  ｇｔａｔｇｃｃａａｔ
６０１  ａａａｃｔａｔｃｃｔ  ａｃｔｔｔｔｔａｇａ  ｇａａａａａａｇｇｇ  ｔｔｇａａａａｃｃｃ  ｇａａｔｇｔｇｇａａ  ｔｇａｃｇｇａｔｔａ
６６１  ａｔｔａａａａａｔａ  ｃｔｔｔｔｇａｇｃａ  ａａｔｃａａｃｃｃｇ  ａａｔａｔｔｇａａａ  ｔｔａｃｔｔａｔｔｇ  ｇａｇｃｔａｔｇａｔ
７２１  ｇｇｃｇａｔａｃｇｃ  ａｇｇａｃａａａａａ  ｔｇａａｇｃｔｇｃｃ  ｇａｇｃｇｃｃｇｔｇ  ａｔａｔｇｃｇｇｇｔ  ｃａｇｔｔｔｇｃｃｇ
７８１  ｇａｇｔｔｇｃｔｇｇ  ｃｇａａａｇｇｃｔｔ  ｔａｃｔｇｔｃｃｔｇ  ａａｃｔａｔａａｔｔ  ｃｃｔａｔｔａｔｃｔ  ｔｔａｃａｔｔｇｔｔ
８４１  ｃｃｇａａａｇｃｔｔ  ｃａｃｃａａｃｃｔｔ  ｃｔｃｇｃａａｇａｔ  ｇｃｃｇｃｃｔｔｔｇ  ｃｃｇｃｃａａａｇａ  ｔｇｔｔａｔａａａａ
９０１  ａａｔｔｇｇｇａｔｃ  ｔｔｇｇｔｇｔｔｔｇ  ｇｇａｔｇｇａｃｇａ  ａａｃａｃｃａａａａ  ａｃｃｇｃｇｔａｃａ  ａａａｔａｃｔｃａｔ
９６１  ｇａａａｔａｇｃｃｇ  ｇｃｇｃａｇｃａｔｔ  ａｔｃｇａｔｃｔｇｇ  ｇｇａｇａａｇａｔｇ  ｃａａａａｇｃｇｃｔ  ｇａａａｇａｃｇａａ
１０２１  ａｃａａｔｔｃａｇａ  ａａａａｃａｃｇａａ  ａａｇｔｔｔａｔｔｇ  ｇａａｇｃｇｇｔｇａ  ｔｔｃａｔａａｇａｃ  ｇａａｔｇｇｇｇａｔ
１０８１  ｇａｇｔｇａ
【００７２】
ディスパーシンＢ（配列番号４）
ＮＣＣＶＫＧＮＳＩＹＰＱＫＴＳＴＫＱＴＧＬＭＬＤＩＡＲＨＦＹＳＰＥＶＩＫＳＦＩＤＴＩＳＬＳＧＧＮＦＬＨＬＨＦＳＤＨＥＮＹＡＩＥＳＨＬＬＮＱＲＡＥＮＡＶＱＧＫＤＧＩＹＩＮＰＹＴＧＫＰＦＬＳＹＲＱＬＤＤＩＫＡＹＡＫＡＫＧＩＥＬＩＰＥＬＤＳＰＮＨＭＴＡＩＦＫＬＶＱＫＤＲＧＶＫＹＬＱＧＬＫＳＲＱＶＤＤＥＩＤＩＴＮＡＤＳＩＴＦＭＱＳＬＭＳＥＶＩＤＩＦＧＤＴＳＱＨＦＨＩＧＧＤＥＦＧＹＳＶＥＳＮＨＥＦＩＴＹＡＮＫＬＳＹＦＬＥＫＫＧＬＫＴＲＭＷＮＤＧＬＩＫＮＴＦＥＱＩＮＰＮＩＥＩＴＹＷＳＹＤＧＤＴＱＤＫＮＥＡＡＥＲＲＤＭＲＶＳＬＰＥＬＬＡＫＧＦＴＶＬＮＹＮＳＹＹＬＹＩＶＰＫＡＳＰＴＦＳＱＤＡＡＦＡＡＫＤＶＩＫＮＷＤＬＧＶＷＤＧＲＮＴＫＮＲＶＱＮＴＨＥＩＡＧＡＡＬＳＩＷＧＥＤＡＫＡＬＫＤＥＴＩＱＫＮＴＫＳＬＬＥＡＶＩＨＫＴＮＧＤＥ
【００７３】
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【００８９】
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【００９０】
Ｂｌａｎｃｏ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．“Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐｈａｇｅ  ｐｈｉ  ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ  ｍｏｄｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，８９３５−８９４０（１９８９）．
【００９１】
Ｂｌａｎｃｏ，Ｌ  ａｎｄ  Ｓａｌａｓ，Ｍ．“Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈａｇｅ  ｐｈｉ  ２９  ＤＮＡ  ｗｉｔｈ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｐｈｉ  ２９  ＤＮＡ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２，６４０４−６４０８（１９８５）．
【００９２】
Ｉｔｏ，Ｊ．“Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｐｈｉ２９  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ｉｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ５’ｔｅｒｍｉｎｉ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｉ２９  ｇｅｎｏｍｅ．”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２８，８９５−９０４（１９７８）．
【００９３】
Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｂｙ  ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．    ３７，６９８４−６９９０（２００９）．
【００９４】
Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂｙ  ａ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９，５２−５６（２０１０）．
【００９５】
Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｐ  ｔｏ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｈｕｎｄｒｅｄ  ｋｉｌｏｂａｓｅｓ．”Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６，３４３−３４５（２００９）．
【図１】
2018529755.tif 000004
【図２Ａ】
2018529755.tif 000005
【図２Ｂ】
2018529755.tif 000006
【図３】
2018529755.tif 000007
【図４】
2018529755.tif 000008
【図５Ａ】
2018529755.tif 000009
【図５Ｂ】
2018529755.tif 000010
【図６】
2018529755.tif 000011
【図７】
2018529755.tif 000012
【図８】
2018529755.tif 000013
【配列表】
2018529755000001.app
【国際調査報告】
2018529755.tif 000014
2018529755.tif 000015
2018529755.tif 000016
2018529755.tif 000017