(57)【要約】  本開示は、異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結された２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列を含む改変組換えレトロウイルスを提供する。本開示は、このようなベクターを発現するかまたは含む細胞およびベクター、ならびに疾患および障害の処置でこのような改変ベクターを用いる方法にさらに関する。【選択図】図３
2018526007.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え複製コンピテントレトロウイルスであって、
レトロウイルスＧＡＧタンパク質；
レトロウイルスＰＯＬタンパク質；
レトロウイルスエンベロープ；
レトロウイルスポリヌクレオチドであって、前記レトロウイルスポリヌクレオチド配列の３’末端に長末端反復（ＬＴＲ）配列、前記レトロウイルスポリヌクレオチドの５’末端に、哺乳動物細胞での発現に適するプロモーター配列、ｇａｇ核酸ドメイン、ｐｏｌ核酸ドメインおよびｅｎｖ核酸ドメインを含むレトロウイルスポリヌクレオチド；
異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結された２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列を含むカセットであって、３’ＬＴＲの５’側に位置し、および前記レトロウイルスエンベロープをコードする前記ｅｎｖ核酸ドメインに作動可能に連結され、前記ｅｎｖ核酸ドメインの３’側に位置するカセット；および
標的細胞での逆転写、パッケージングおよび組込みに必要なシス作用性配列、を含む、組換え複製コンピテントレトロウイルス。
【請求項２】
前記エンベロープは、両種性、多種指向性、異種指向性、１０Ａ１、ＧＡＬＶ、ヒヒ内在性ウイルス、ＲＤ１１４、ラブドウイルス、アルファウイルス、麻疹またはインフルエンザウイルスエンベロープの内の１つから選択される、請求項１に記載の組換え複製コンピテントレトロウイルス。
【請求項３】
前記レトロウイルスポリヌクレオチド配列は、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢＥＶ）、ブタ内在性ウイルス（ＰＥＲＶ）、ネコ由来レトロウイルスＲＤ１１４、リスザルレトロウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＲＶ）、およびトリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ）、またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）からなる群より選択されるウイルスから操作される、請求項１に記載のレトロウイルス。
【請求項４】
前記レトロウイルスは、ガンマレトロウイルスである、請求項１に記載のレトロウイルス。
【請求項５】
前記標的細胞は、哺乳動物細胞である、請求項１に記載のレトロウイルス。
【請求項６】
前記２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列は、配列番号１の配列を含むペプチドをコードする、請求項１に記載のレトロウイルス。
【請求項７】
前記２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列は、配列番号５５〜１２５のいずれか１つのペプチドをコードする、請求項１に記載のレトロウイルス。
【請求項８】
前記２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列は、配列番号８〜１９のいずれか１つに示す配列を含む、請求項１に記載のレトロウイルス。
【請求項９】
前記異種ポリヌクレオチドは、５００ｂｐを超える、請求項１〜８のいずれか１項に記載のレトロウイルス。
【請求項１０】
前記異種ポリヌクレオチドは、少なくとも２つのコード配列を含む、請求項１に記載のレトロウイルス。
【請求項１１】
カセットの下流に２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列を含む第２のカセットをさらに含む、請求項１に記載のレトロウイルス。
【請求項１２】
前記カセットの下流に第２のカセットをさらに含み、前記第２のカセットは、第２の異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結された、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）またはミニプロモーターまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターを含む、請求項１に記載のレトロウイルス。
【請求項１３】
組換え複製コンピテントレトロウイルスであって、
レトロウイルスＧＡＧタンパク質；
レトロウイルスＰＯＬタンパク質；
レトロウイルスエンベロープ；
レトロウイルスポリヌクレオチドであって、前記レトロウイルスポリヌクレオチド配列の３’末端に長末端反復（ＬＴＲ）配列、前記レトロウイルスポリヌクレオチドの５’末端に、哺乳動物細胞での発現に適するプロモーター配列、ｇａｇ核酸ドメイン、ｐｏｌ核酸ドメインおよびｅｎｖ核酸ドメインを含むレトロウイルスポリヌクレオチド；
第２の異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結された２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列を含む少なくとも１つの２Ａカセットに作動可能に連結された第１の異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結された制御ドメインを含むカセットであって、前記カセットは前記３’ＬＴＲの５’側、および前記レトロウイルスエンベロープをコードするｅｎｖ核酸ドメインの３’側に位置し、前記２Ａカセットは第１の異種ポリヌクレオチドの下流にあり、第１の異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているカセット；および
標的細胞での逆転写、パッケージングおよび組込みに必要なシス作用性配列、を含む、組換え複製コンピテントレトロウイルス。
【請求項１４】
前記エンベロープは、両種性、多種指向性、異種指向性、１０Ａ１、ＧＡＬＶ、ヒヒ内在性ウイルス、ＲＤ１１４、ラブドウイルス、アルファウイルス、麻疹またはインフルエンザウイルスエンベロープの内の１つから選択される、請求項１３に記載のレトロウイルス。
【請求項１５】
前記レトロウイルスポリヌクレオチド配列は、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢＥＶ）、ブタ内在性ウイルス（ＰＥＲＶ）、ネコ由来レトロウイルスＲＤ１１４、リスザルレトロウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＲＶ）、およびトリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ）、またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）からなる群より選択されるウイルスに由来する、請求項１３に記載のレトロウイルス。
【請求項１６】
前記レトロウイルスは、ガンマレトロウイルスである、請求項１３に記載のレトロウイルス。
【請求項１７】
前記標的細胞は、哺乳動物細胞である、請求項１３に記載のレトロウイルス。
【請求項１８】
前記２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列は、配列番号１の配列を含むペプチドをコードする、請求項１３に記載のレトロウイルス。
【請求項１９】
前記２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列は、図１または２に示すペプチドをコードする、請求項１３に記載のレトロウイルス。
【請求項２０】
前記２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列は、配列番号８〜１９のいずれか１つに示す配列を含む、請求項１３に記載のレトロウイルス。
【請求項２１】
前記標的細胞は、肺癌細胞、結腸直腸癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞、尿路癌細胞、子宮癌細胞、脳癌細胞、頭頚部癌細胞、膵臓癌細胞、黒色腫細胞、胃癌および卵巣癌細胞からなる群から選択される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のレトロウイルス。
【請求項２２】
前記プロモーター配列は、増殖調節遺伝子に関連する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のレトロウイルス。
【請求項２３】
前記プロモーター配列は、組織特異的プロモーター配列を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のレトロウイルス。
【請求項２４】
前記組織特異的プロモーター配列は、少なくとも１つのアンドロゲン応答エレメント（ＡＲＥ）を含む、請求項２３に記載のレトロウイルス。
【請求項２５】
前記プロモーターは、配列番号２のヌクレオチド１位からヌクレオチド約５８２位までに示す配列を有するＣＭＶプロモーターを含み、１つまたは複数の核酸塩基に対する改変を含んでもよく、転写を誘導し開始できる、請求項１または１３に記載のレトロウイルス。
【請求項２６】
前記プロモーターは、ＣＭＶ−Ｒ−Ｕ５ドメインポリヌクレオチドを含む、請求項１または１３に記載のレトロウイルス。
【請求項２７】
前記ＣＭＶ−Ｒ−Ｕ５ドメインは、ＭＬＶ  Ｒ−Ｕ５領域に連結されたヒトサイトメガロウイルス由来の即時型初期プロモーターを含む、請求項２６に記載のレトロウイルス。
【請求項２８】
前記ＣＭＶ−Ｒ−Ｕ５ドメインポリヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド約１位からヌクレオチド約１２０２位までに示される配列、または配列番号２のヌクレオチド１位からヌクレオチド約１２０２位までに示される配列に少なくとも９５％同一である配列を含み、前記ポリヌクレオチドは、作動可能にそれに連結された核酸分子の転写を促進する、請求項２７に記載のレトロウイルス。
【請求項２９】
前記ｇａｇポリヌクレオチドは、ガンマレトロウイルスに由来する、請求項１または１３に記載のレトロウイルス。
【請求項３０】
前記ｇａｇ核酸ドメインは、配列番号２のヌクレオチド番号約１２０３からヌクレオチド約２８１９までの配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９８％、９９％もしくは９９．８％の同一性を有する配列を含む、請求項２９に記載のレトロウイルス。
【請求項３１】
前記ポリヌクレオチドのｐｏｌドメインは、ガンマレトロウイルスに由来する、請求項１または１３に記載のレトロウイルス。
【請求項３２】
前記ｐｏｌドメインは、配列番号２のヌクレオチド番号約２８２０からヌクレオチド約６３５８までの配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９８％、９９％もしくは９９．９％の同一性を有する配列を含む、請求項３１に記載のレトロウイルス。
【請求項３３】
前記ｅｎｖドメインは、配列番号２のヌクレオチド番号約６３５９からヌクレオチド約８３２３までの配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９８％、９９％もしくは９９．８％の同一性を有する配列を含む、請求項１または１３に記載のレトロウイルス。
【請求項３４】
前記３’ＬＴＲは、ガンマレトロウイルスに由来する、請求項１または１３に記載のレトロウイルス。
【請求項３５】
前記３’ＬＴＲは、Ｕ３−Ｒ−Ｕ５ドメインを含む、請求項３４に記載のレトロウイルス。
【請求項３６】
前記３’ＬＴＲは、配列番号２のヌクレオチド約９１１１位から約１１６５４位までに示される配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９８％または９９．５％同一である配列を含む、請求項３５に記載のレトロウイルス。
【請求項３７】
前記異種核酸配列は、生体応答調節因子または免疫賦活サイトカインをコードする、請求項１または１３に記載のレトロウイルス。
【請求項３８】
前記免疫賦活サイトカインは、インターロイキン１〜３８、インターフェロン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群から選択される、請求項３７に記載のレトロウイルス。
【請求項３９】
前記免疫賦活サイトカインは、インターフェロンガンマである、請求項３７に記載のレトロウイルス。
【請求項４０】
前記異種核酸は、無毒性プロドラッグを毒性薬物に変換するポリペプチドをコードする、請求項１または１３に記載のレトロウイルス。
【請求項４１】
無毒性プロドラッグを毒性薬物に変換する前記ポリペプチドは、チミジンキナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）またはシトシンデアミナーゼである、請求項４０に記載のレトロウイルス。
【請求項４２】
前記異種核酸配列は、レセプタードメイン、抗体、または抗体断片をコードする、請求項１または１３に記載のレトロウイルス。
【請求項４３】
前記第２のカセットは、阻害性ポリヌクレオチドを含む、請求項１２に記載のレトロウイルス。
【請求項４４】
前記阻害性ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡ配列を含む、請求項４３に記載のレトロウイルス。
【請求項４５】
請求項１または１３に記載のレトロウイルスを産生するための組換えレトロウイルスポリヌクレオチドゲノム。
【請求項４６】
ＧＳＧリンカーコード配列を含むかまたは含まない２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列とインフレームのＭＬＶ４０７０Ａエンベロープタンパク質遺伝子、および前記２Ａペプチドまたは２Ａ様コード配列とインフレームの第２の遺伝子を含む、請求項４５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４７】
ＧＳＧリンカーコード配列を含むかまたは含まない２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列とインフレームのＭＬＶ１０Ａ１エンベロープタンパク質遺伝子、および前記２Ａペプチドまたは２Ａ様コード配列とインフレームの第２の遺伝子を含む、請求項４５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４８】
ＧＳＧリンカーコード配列を含むかまたは含まない２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列とインフレームのＸＭＲＶエンベロープタンパク質遺伝子、および前記２Ａペプチドまたは２Ａ様コード配列とインフレームの第２の遺伝子を含む、請求項４５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４９】
ＧＳＧリンカーコード配列を含むかまたは含まない２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列とインフレームのｎｏｎ−Ｆｒｉｅｎｄ  ＭＬＶエンベロープタンパク質遺伝子、および前記２Ａペプチドまたは２Ａ様コード配列とインフレームの第２の遺伝子を含む、請求項４５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５０】
前記異種は、分泌、膜、細胞質、核、または細胞内コンパートメント特異的タンパク質である、請求項４５〜４９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５１】
前記レトロウイルスおよび／または前記異種ポリヌクレオチドは、ヒトＡＰＯＢＥＣ高頻度変異を受けやすいトリプトファンコドンを除去するように改変されている、請求項１に記載の組換え複製コンピテントレトロウイルス。
【請求項５２】
前記レトロウイルスおよび／または前記第１および／または第２の異種ポリヌクレオチドは、ヒトＡＰＯＢＥＣ高頻度変異を受けやすいトリプトファンコドンを除去するように改変されている、請求項１３に記載の組換え複製コンピテントレトロウイルス。
【請求項５３】
前記異種ポリヌクレオチドは、シトシンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項５２に記載の組換え複製コンピテントレトロウイルス。
【請求項５４】
シトシンデアミナーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、配列番号２９のポリペプチドをコードし、Ｘは、トリプトファン以外の任意のアミノ酸である、請求項５３に記載の組換え複製コンピテントレトロウイルス。
【請求項５５】
レトロウイルスポリヌクレオチド中のＡＰＯＢＥＣ高頻度変異を受けやすいコドンを非感受性コドンに改変することにより、ヒトＡＰＯＢＥＣによる不活性化に対し抵抗性である組換え複製コンピテントレトロウイルス。
【請求項５６】
ＡＰＯＢＥＣ高頻度変異を受けやすいコドンは、トリプトファンアミノ酸をコードする、請求項５５に記載の組換え複製コンピテントレトロウイルス。
【請求項５７】
前記ｅｎｖ遺伝子の下流に、ＩＲＥＳカセット、プロモーターカセット、および／または２Ａペプチドカセットを含む、請求項５５または５６に記載の組換え複製コンピテントレトロウイルス。
【請求項５８】
細胞増殖性障害を処置する方法であって、前記異種ポリヌクレオチドが発現されるような条件下で、前記対象を請求項１または１３に記載のレトロウイルスと接触させることを含み、前記異種ポリヌクレオチドは、プロドラッグを細胞傷害性薬物に変換するタンパク質をコードする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年９月４日出願の米国特許仮出願第６２／２１４，８８４号に対する優先権を主張する。この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表への参照
本出願は、電子書式による配列リストと共に出願されている。配列リストは、２０１６年９月１日に作製され、２４５，７０３バイト（２３９ｋｂ）の大きさのＳｅｑｕｅｎｃｅ−Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称のファイルとして提供されている。配列リストの電子データ中の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
技術分野
本開示は、複製コンピテントレトロウイルスベクターに関する。本開示は、細胞中の異種核酸の送達および発現のためのこのような複製コンピテントレトロウイルスベクターの使用にさらに関する。
【背景技術】
【０００４】
細胞および対象へ遺伝子および異種核酸を送達する有効な方法は、科学の発展ならびに疾患および障害の実現可能な治療法のための研究者の目標であった。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、レトロウイルスＧＡＧタンパク質；レトロウイルスＰＯＬタンパク質；レトロウイルスエンベロープ；レトロウイルスポリヌクレオチドであって、該レトロウイルスポリヌクレオチド配列の３’末端に長末端反復（ＬＴＲ）配列、該レトロウイルスポリヌクレオチドの５’末端に、哺乳動物細胞での発現に適するプロモーター配列、ｇａｇ核酸ドメイン、ｐｏｌ核酸ドメインおよびｅｎｖ核酸ドメインを含むレトロウイルスポリヌクレオチド；異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結された２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列を含むカセットであって、３’ＬＴＲの５’側に位置し、およびレトロウイルスエンベロープをコードするｅｎｖ核酸ドメインに作動可能に連結され、該ｅｎｖ核酸ドメインの３’側に位置するカセット；ならびに標的細胞での逆転写、パッケージングおよび組込みのために必要なシス作用性配列、を含む、組換え複製コンピテントレトロウイルスを提供する。一実施形態では、エンベロープは、両種性、多種指向性、異種指向性、１０Ａ１、ＧＡＬＶ、ヒヒ内在性ウイルス、ＲＤ１１４、ラブドウイルス、アルファウイルス、麻疹またはインフルエンザウイルスエンベロープから選択される。別の実施形態では、レトロウイルスポリヌクレオチド配列は、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢＥＶ）、ブタ内在性ウイルス（ＰＥＲＶ）、ネコ由来レトロウイルスＲＤ１１４、リスザルレトロウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＲＶ）、およびトリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ）、またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）からなる群より選択されるウイルスに由来する。さらに別の実施形態では、レトロウイルスは、ガンマレトロウイルスである。別の実施形態では、標的細胞は哺乳動物細胞である。さらに別の実施形態では、２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列は、配列番号１の配列を含むペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列は、配列番号５５〜１２５のいずれか１つで示されるペプチドをコードする。別の実施形態では、２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列は、配列番号８〜１９で示される配列を含む。前述の実施形態のいずれかのさらに別の実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、＞５００ｂｐ、＞１０００ｂｐ、＞１１００ｂｐ、＞１２００ｂｐ、＞１３００ｂｐ、＞１４００ｂｐまたは＞１５００ｂｐの長さである。別の実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも２つのコード配列を含む。さらに別の実施形態では、レトロウイルスは、カセットの下流に２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列を含む第２のカセットをさらに含む。さらに別の実施形態では、レトロウイルスは、カセットの下流に第２のカセットをさらに含み、該第２のカセットは、第２の異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結された、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）またはミニプロモーターまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターを含む。
【０００６】
本開示はまた、レトロウイルスＧＡＧタンパク質；レトロウイルスＰＯＬタンパク質；レトロウイルスエンベロープ；レトロウイルスポリヌクレオチドであって、該レトロウイルスポリヌクレオチド配列の３’末端に長末端反復（ＬＴＲ）配列、該レトロウイルスポリヌクレオチドの５’末端に、哺乳動物細胞での発現に適するプロモーター配列、ｇａｇ核酸ドメイン、ｐｏｌ核酸ドメインおよびｅｎｖ核酸ドメインを含むレトロウイルスポリヌクレオチド；第２の異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結された２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列を含む少なくとも１つの２Ａカセットに作動可能に連結された第１の異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結された制御ドメインを含むカセットであって、該カセットは３’ＬＴＲの５’側、およびレトロウイルスエンベロープをコードするｅｎｖ核酸ドメインの３’側に位置し、および２Ａカセットは第１の異種ポリヌクレオチドの下流にあり、該異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているカセット；ならびに標的細胞での逆転写、パッケージングおよび組込みのために必要なシス作用性配列、を含む、組換え複製コンピテントレトロウイルスを提供する。一実施形態では、エンベロープは、両種性、多種指向性、異種指向性、１０Ａ１、ＧＡＬＶ、ヒヒ内在性ウイルス、ＲＤ１１４、ラブドウイルス、アルファウイルス、麻疹またはインフルエンザウイルスエンベロープの内の１種から選択される。別の実施形態では、レトロウイルスポリヌクレオチド配列は、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢＥＶ）、ブタ内在性ウイルス（ＰＥＲＶ）、ネコ由来レトロウイルスＲＤ１１４、リスザルレトロウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＲＶ）、およびトリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ）、またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）からなる群より選択されるウイルスに由来する。さらに別の実施形態では、レトロウイルスは、ガンマレトロウイルスである。さらに別の実施形態では、標的細胞は哺乳動物細胞である。別の実施形態では、２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列は、配列番号１の配列を含むペプチドをコードする。別の実施形態では、２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列は、配列番号５５〜１２５のいずれか１つで示されるペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列は、配列番号８〜１９のいずれか１つで示される配列を含む。前述の実施形態のいずれかでは、標的細胞は、肺癌細胞、結腸直腸癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞、尿路癌細胞、子宮癌細胞、脳癌細胞、頭頚部癌細胞、膵臓癌細胞、黒色腫細胞、胃癌および卵巣癌細胞からなる群から選択される。前述の実施形態のさらにいずれかでは、プロモーター配列は、増殖調節遺伝子と関連する。前述の実施形態のいずれかのまたさらなる実施形態では、プロモーター配列は、組織特異的プロモーター配列を含む。さらなる実施形態では、組織特異的プロモーター配列は、少なくとも１つのアンドロゲン応答エレメント（ＡＲＥ）を含む。前述のいずれかのさらなる一実施形態では、プロモーターは、配列番号２で示されるヌクレオチド１位からヌクレオチド約５８２位までの配列を有するＣＭＶプロモーターを含み、１つまたは複数の核酸塩基の改変を含むことができ、これは転写を誘導し開始できる。前述のいずれかのさらなる実施形態では、プロモーターはＣＭＶ−Ｒ−Ｕ５ドメインポリヌクレオチドを含む。さらに実施形態では、ＣＭＶ−Ｒ−Ｕ５ドメインは、ＭＬＶ  Ｒ−Ｕ５領域に連結されたヒトサイトメガロウイルス由来の即時型初期プロモーターを含む。またさらなる実施形態では、ＣＭＶ−Ｒ−Ｕ５ドメインポリヌクレオチドは、配列番号２で示されるヌクレオチド約１位からヌクレオチド約１２０２位までの配列、または配列番号２で示されるヌクレオチド１位からヌクレオチド約１２０２位までの配列に少なくとも９５％同一である配列を含み、該ポリヌクレオチドは、作動可能にそれに連結された核酸分子の転写を促進する。前述のいずれかのさらなる実施形態では、ｇａｇポリヌクレオチドは、ガンマレトロウイルス由来である。さらなる実施形態では、ｇａｇ核酸ドメインは、配列番号２のヌクレオチド番号約１２０３からからヌクレオチド約２８１９までの配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９８％、９９％または９９．８％の同一性を有する配列を含む。前述のいずれかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチドのｐｏｌドメインは、ガンマレトロウイルス由来である。さらなる実施形態では、ｐｏｌドメインは、配列番号２のヌクレオチド番号約２８２０からからヌクレオチド約６３５８までの配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９８％、９９％または９９．９％の同一性を有する配列を含む。前述のいずれかのさらなる実施形態では、ｅｎｖドメインは、配列番号の２のヌクレオチド番号約６３５９からからヌクレオチド約８３２３までの配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９８％、９９％または９９．８％の同一性を有する配列を含む。前述のいずれかのさらなる実施形態では、３’ＬＴＲは、ガンマレトロウイルス由来である。さらなる実施形態では、３’ＬＴＲはＵ３−Ｒ−Ｕ５ドメインを含む。またさらなる実施形態では、３’ＬＴＲは、配列番号２に示すヌクレオチド約９１１１位から約１１６５４位までの配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９８％または９９．５％同一である配列を含む。前述のいずれかのさらなる実施形態では、異種核酸配列は、生物学的応答調節物質または免疫賦活サイトカインをコードする。さらなる実施形態では、免疫賦活サイトカインは、インターロイキン１〜３８、インターフェロン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群から選択される。さらなる実施形態では、免疫賦活サイトカインはインターフェロンガンマである。前述のいずれかのさらなる実施形態では、異種核酸は、無毒性プロドラッグを毒性薬物に変換するポリペプチドをコードする。さらなる実施形態では、無毒性プロドラッグを毒性薬物に変換するポリペプチドは、チミジンキナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）またはシトシンデアミナーゼである。前述のいずれかのさらなる実施形態では、異種核酸配列は、レセプタードメイン、抗体、また���抗体断片をコードする。一実施形態では、第２のカセットは阻害性ポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、阻害性ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡ配列を含む。
【０００７】
本開示は、上記いずれかの実施形態で記載のように、レトロウイルスを産生するための組換えレトロウイルスポリヌクレオチドゲノムも提供する。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、ＧＳＧリンカーコード配列を含むかまたは含まない２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列とインフレームのＭＬＶ４０７０Ａエンベロープタンパク質遺伝子および２Ａペプチドまたは２Ａ様コード配列とインフレームの第２の遺伝子を含む。別の実施形態では、該ポリヌクレオチドは、ＧＳＧリンカーコード配列を含むかまたは含まない２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列とインフレームのＭＬＶ１０Ａ１エンベロープタンパク質遺伝子、および２Ａペプチドまたは２Ａ様コード配列とインフレームの第２の遺伝子を含む。別の実施形態では、該ポリヌクレオチドは、ＧＳＧリンカーコード配列を含むかまたは含まない２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列とインフレームのＸＭＲＶエンベロープタンパク質遺伝子、および２Ａペプチドまたは２Ａ様コード配列とインフレームの第２の遺伝子を含む。別の実施形態では、該ポリヌクレオチドは、ＧＳＧリンカーコード配列を含むかまたは含まない２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列とインフレームのｎｏｎ−Ｆｒｉｅｎｄ  ＭＬＶエンベロープタンパク質遺伝子、および２Ａペプチドまたは２Ａ様コード配列とインフレームの第２の遺伝子を含む。前述のいずれかの別の実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、分泌、膜、細胞質、核、または細胞内コンパートメント特異的タンパク質である。
【０００８】
いずれかの前述の実施形態では、組換えレトロウイルスおよび／または異種ポリヌクレオチドは、ヒトＡＰＯＢＥＣ高頻度変異を受けやすいトリプトファンコドンを除去するように改変されている。一実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、シトシンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。さらなる実施形態では、シトシンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２９のポリペプチドをコードし、Ｘは、トリプトファン以外の任意のアミノ酸である。
【０００９】
本開示はまた、レトロウイルスポリヌクレオチド中のＡＰＯＢＥＣ高頻度変異を受けやすいコドンを非感受性コドンに改変することにより、ヒトＡＰＯＢＥＣによる不活性化に対し抵抗性がある組換え複製コンピテントレトロウイルスを提供する。一実施形態では、ＡＰＯＢＥＣ高頻度変異を受けやすいコドンは、トリプトファンアミノ酸をコードする。さらに別の実施形態では、組換えレトロウイルスは、ｅｎｖ遺伝子の下流に、ＩＲＥＳカセット、プロモーターカセット、および／または２Ａペプチドカセットを含む。
【００１０】
本開示はまた、細胞増殖性障害を処置する方法を提供し、該方法は、いずれかの前述の実施形態で記載のように、異種ポリヌクレオチドが発現されるような条件下で、対象をレトロウイルスと接触させることを含み、異種ポリヌクレオチドは、プロドラッグを細胞傷害性薬物に変換するタンパク質をコードする。
【００１１】
本開示の１つまたは複数の実施形態の詳細は、添付図面および下記の説明で示される。他の特徴、目的および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）、馬鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ  ｖｉｒｕｓ（Ｔ２Ａ）およびブタテスコウイルス−１（Ｐ２Ａ）（配列番号５５〜５８）の２Ａ領域のアミノ酸配列の配列アラインメントを示す。
【図２−１】異なるクラスのウイルス（配列番号５９〜１２５）中に存在する２Ａペプチド配列の配列アラインメントを示す。
【図２−２】図２−１の続きである。
【図３】ｐＡＣ３−（ｘ）２Ａ−ＧＦＰｍおよびｐＡＣ３−（ｘ）２Ａ−ｙＣＤ２のベクターセットのクローニングスキームを示す。黒色のボックスは、ギブソンアセンブリークローニングで使用される重複配列を表す；（ｘ）は、ウマ鼻炎Ａ（Ｅ）、口蹄疫ウイルス（Ｆ）、ブタテスコウイルス−１（Ｐ）またはＴｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ  ｖｉｒｕｓ（Ｔ）由来の２Ａペプチドを表す。
【図４】Ｕ８７−ＭＧ細胞中の一時的トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から産生されたＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍベクターおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍベクターの複製動力学を示す。
【図５】Ｕ８７−ＭＧ細胞中のＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍベクターの、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として示した、ＧＦＰ発現レベルを示す。示したパーセンテージは、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰのＭＦＩに対する値である。
【図６】Ｕ８７−ＭＧ細胞中のＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍベクターのベクター安定性を示す。
【図７】最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から産生されたＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍベクターの力価を示す。示した力価値は、２つの独立した実験由来のものである。
【図８】最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞中で産生され、続けて、その後に未処理Ｕ８７−ＭＧ細胞中での感染サイクルに供されたＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍベクターの複製動力学を示す。
【図９】第２の感染サイクル由来の最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞のＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍベクター中のＧＦＰｍ発現のＭＦＩを示す。示したパーセンテージは、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰのＭＦＩに対する値である。
【図１０】ＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍ感染Ｕ８７−ＭＧ細胞由来の細胞ライセートの抗ＧＦＰ免疫ブロットを示す。約１２０ｋＤａの位置に検出されたタンパク質バンドは、ウイルスエンベロープ−ＧＦＰｍ融合ポリタンパク質を表す。約２７ｋＤａの位置に検出されたタンパク質バンドは、Ｅｎｖ−ＧＦＰｍ融合ポリタンパク質から分離した未変性ＧＦＰまたは２Ａ−ＧＦＰｍタンパク質を表す。
【図１１】ＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍ感染Ｕ８７−ＭＧ細胞由来の細胞ライセートの抗ｇｐ７０免疫ブロットを示す。約１２０ｋＤａの位置に検出されたタンパク質バンドは、ウイルスエンベロープ−ＧＦＰｍ融合ポリタンパク質を表す。約７５ｋＤａの位置に検出されたタンパク質バンドは、融合ポリタンパク質から分離したＰｒ８５／ｇｐ７０ウイルスエンベロープタンパク質を表す。
【図１２】それぞれ、抗ｇｐ７０および抗ＴＭ抗体により検出された、ｇｐ７０およびｐ１５Ｅサブユニットを含む、適切にプロセッシングされたバイロン結合ウイルスエンベロープタンパク質の免疫ブロットを示す。抗ｐ１５Ｅ抗体は、プリカーサーＴＭサブユニットｐ１５ＥおよびＲ−ペプチド切断ＴＭサブユニットｐ１２Ｅの両方を検出する。
【図１３】最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から産生された、ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２、ＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２ベクターの力価を示す。
【図１４】ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２、ＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２感染Ｕ８７−ＭＧ細胞由来の細胞ライセートの抗ｙＣＤ２免疫ブロットを示す。約１１０ｋＤａの位置に検出されたタンパク質バンドは、ウイルスエンベロープ−ＧＦＰｍ融合ポリタンパク質を表す。約１５ｋＤａの位置に検出されたタンパク質バンドは、Ｅｎｖ−ｙＣＤ２融合ポリタンパク質から分離したｙＣＤ２または２Ａ−ｙＣＤ２タンパク質を表す。
【図１５】ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２、ＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２感染Ｕ８７−ＭＧ細胞由来の細胞ライセートの抗ｇｐ７０免疫ブロットを示す。約１１０ｋＤａの位置に検出されたタンパク質バンドは、ウイルスエンベロープ−ｙＣＤ２融合ポリタンパク質を表す。約７５ｋＤａの位置に検出されたタンパク質バンドは、融合ポリタンパク質から分離したＰｒ８５／ｇｐ７０ウイルスエンベロープタンパク質を表す。
【図１６】Ｕ８７−ＭＧ細胞中のＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２ベクターの、感染の１６サイクルにわたる長期ベクター安定性を示す。ｐＤＮＡは、ポジティブコントロールとして含めた、ｐＡＣ３−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびｐＡＣ３−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２、ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２のプラスミドＤＮＡである。
【図１７】それぞれ、抗ｇｐ７０および抗ＴＭ抗体により検出された、ｇｐ７０およびｐ１５Ｅサブユニットを含む、適切にプロセッシングされたバイロン結合ウイルスエンベロープタンパク質の免疫ブロットを示す。抗ｐ１５Ｅ抗体は、プリカーサーＴＭサブユニットｐ１５ＥおよびＲ−ペプチド切断ＴＭサブユニットｐ１２Ｅの両方を検出する。
【図１８】ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ、ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２感染Ｕ８７−ＭＧ細胞の５−ＦＣ処理７日目の５−ＦＣ媒介死滅を示す。細胞生存パーセントは、非５−ＦＣ処理であるがＲＲＶ−感染している細胞に対する計算値である。未処理Ｕ８７−ＭＧ細胞を、５−ＦＣの非５ＦＵ媒介細胞傷害性効果の濃度を決定するために、対照として含めた。
【図１９】ビリオンアセンブリおよび成熟中のＭＬＶウイルスエンベロープタンパク質プロセッシングを示す。通常、未変性のＭＬＶエンベロープタンパク質のプロセッシングは、前駆体タンパク質Ｐｒ８５のｇｐ７０（ＳＵ）とｐ１５Ｅ（ＴＭ）サブユニットへの切断を伴い、これは感染宿主細胞中で起こる。Ｐｒ８５の切断には、宿主細胞からの出芽中に、ウイルスエンベロープタンパク質のバイロン中への効率的取り込みが必要である。ビリオンは、宿主細胞膜から分離する際に、ビリオンは、感染性になるために成熟プロセスを経る。ＭＬＶビリオン成熟の１つのプロセスには、エンベロープタンパク質のＴＭサブユニットのＣ末端に位置するＲ−ペプチドの、ウイルスプロテアーゼによる除去が含まれる。２Ａペプチドは、Ｒ−ペプチドのＣ末端に対しインフレームで発現し、Ｒペプチドの長さを、２Ａペプチドの配列に応じて、１６アミノ酸から少なくとも３２アミノ酸に増やす。Ｒ−ペプチドの長さは、２Ａペプチド配列の付加により増加するが、２Ａペプチドは、同時に、Ｒペプチドの切断により取り除かれ、機能性エンベロープタンパク質を生ずる。
【図２０Ａ】最大感染Ｔｕ−２４４９細胞中の、ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２、ＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２の、ｙＣＤ２タンパク質発現を示す。
【図２０Ｂ】最大感染Ｔｕ−２４４９細胞中の、ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２、ＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２の、５−ＦＣ感受性を示す。
【図２１】ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２＋５−ＦＣで処理した腫瘍の腫瘍増殖遅延を、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２＋５−ＦＣで処理したものと比較して示す。
【図２２Ａ】ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＭＣＳＦ一時的トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来細胞ライセートの抗ｙＣＤ２免疫ブロットを示す。約１１０ｋＤａの位置に検出されたタンパク質バンドは、ウイルスエンベロープ−ＧＦＰｍ融合ポリタンパク質を表す。約１５ｋＤａの位置に検出されたタンパク質バンドは、融合ポリタンパク質から分離したｙＣＤ２または２Ａ−ｙＣＤ２タンパク質を表す。
【図２２Ｂ】ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＭＣＳＦに一時的トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来培地に分泌されたＧＭＣＳＦ。
【図２３】最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から産生された、ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯベクターの力価を示す。
【図２４】ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯ感染Ｕ８７−ＭＧ細胞由来の細胞ライセートの抗ＨＳＶ−ｔｋ免疫ブロットを示す。
【図２５】Ｕ８７−ＭＧ細胞中のＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯベクターの、１６感染サイクルにわたるベクター安定性を示す。ｐＡＣ３−Ｐ２Ａ−ＴＫＯプラスミドＤＮＡは、ポジティブコントロールとして使用している。
【図２６Ａ】異なる投与量のＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯ感染Ｕ８７−ＭＧ細胞のＧＣＶ感受性を示す。
【図２６Ｂ】異なる投与量のＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯ感染Ｕ８７−ＭＧ細胞のＧＣＶ感受性を示す。
【図２７Ａ】一時的トランスフェクト２９３Ｔ細胞中の、ＰＤＬ１ｓｃＦｖおよびＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃタンパク質発現およびＥｎｖ−ｓｃＦｖおよびＥｎｖ−ｓｃＦｖＦｃポリタンパク質の分離効率を示す。（Ａ）ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖ、ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃ、ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖ−タグ、ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃ−タグに一時的トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのｓｃＦｖ−タグ（約３０ｋＤａ）およびｓｃＦｖＦｃ−タグ（約５５ｋＤａ）タンパク質発現。
【図２７Ｂ】一時的トランスフェクト２９３Ｔ細胞中の、ＰＤＬ１ｓｃＦｖおよびＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃタンパク質発現およびＥｎｖ−ｓｃＦｖおよびＥｎｖ−ｓｃＦｖＦｃポリタンパク質の分離効率を示す。（Ｂ）一時的トランスフェクト２９３Ｔ細胞由来の細胞ライセートの抗２Ａ免疫ブロット。約１１０ｋＤａを超える位置に検出されたタンパク質バンドは、Ｅｎｖ−ｓｃＦｖおよびＥｎｖ−ｓｃＦｖＦｃ融合ポリタンパク質を表す。約８５ｋＤａの位置に検出されたタンパク質バンドは、融合ポリタンパク質から分離したＰｒ８５ウイルスエンベロープタンパク質を表し、約１５ｋＤａに検出されたタンパク質バンドは、Ｐｒ８５ウイルスエンベロープタンパク質からプロセッシングされたｐ１５Ｅ−２Ａタンパク質を表す。
【図２８】血液および腫瘍から抽出した２０人の患者からのＲＲＶ（Ｔｏｃａ５１１、Ｔｏｃａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）点変異のメタアナリシスを示す。クオリティフィルターを通した、少なくとも１％の検出頻度の全ての点変異を、各サンプルについて集計し、それぞれの可能な対での点変異の合計を計算し、相対的頻度に変換した。このプロットは、次記の試料タイプによりグループ化した、異なる点変異の相対的頻度を示す：血液＝患者由来の血液試料、腫瘍＝Ｔｏｃａ５１１のＩＶ投与後の切除腫瘍、ｒｅ＿ｔｕｍｏｒ＝初期切除の時点でＴｏｃａ５１１により処置した患者由来の再切除腫瘍。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別の指示がない限り、複数の参照対象を含む。したがって、例えば、「ａ  ｃｅｌｌ」への言及は、複数のこのような細胞を含み、「ｔｈｅ  ｖｅｃｔｏｒ」への言及は、１つまたは複数のベクター（ｖｅｃｔｏｒ）への言及を含む、等々。
【００１４】
さらに、「または」の使用は、特に明記しない限り「および／または」を意味する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は同義であり、限定することを意図しているものではない。
【００１５】
様々な実施形態の説明が用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用する場合、当業者なら、いくつかの特定の例では、ある実施形態を、言語「から本質的になる」または「からなる」を使って代わりに記載できることがわかるはずであることをさらに理解されたい。
【００１６】
特に断らなければ、本明細書で用いるすべての技術および科学用語は、本開示が属する分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものに類似または同等の方法および材料を開示されている方法および組成物の実施に際し用いることができるが、例示的な方法、装置および材料を本明細書で記載する。
【００１７】
ベクター、プロモーターの使用および多くの他の関連する話題を含む、本明細書で有用な分子生物学的技術を記載する一般教科書には、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １５２，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）（”Ｂｅｒｇｅｒ”）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９（”Ｓａｍｂｒｏｏｋ”）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  １９９９）（”Ａｕｓｕｂｅｌ”）；およびＳ．Ｃａｒｓｏｎ，Ｈ．Ｂ．Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｄ．Ｓ．Ｗｉｔｈｅｒｏｗ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａ  Ｃｌａｓｓｒｏｏｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（２０１２）が含まれる。例えば本開示の相同核酸の生成のために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカーゼ増幅および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介技術（例えば、ＮＡＳＢＡ）を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅方法を当業者に指導するのに十分なプロトコルの例は、Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ，ａｓ  ｗｅｌｌ  ａｓ  ｉｎ  Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６８３，２０２；Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）（”Ｉｎｎｉｓ”）；Ａｒｎｈｅｉｍ  ＆  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（Ｏｃｔ．１，１９９０）Ｃ＆ＥＮ  ３６−４７；Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３：８１−９４；Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４；Ｌｏｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ  ３５：１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２９１−２９４；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｅ  ４：５６０；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ  ８９：１１７；およびＳｏｏｋｎａｎａ���  ａｎｄ  Ｍａｌｅｋ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５６３−５６４、に見られる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増幅された核酸をクローニングするための改善された方法は、Ｗａｌｌａｃｅら、米国特許第５，４２６，０３９号に記載されている。ＰＣＲによって、大きな核酸を増幅するための改善された方法は、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：６８４−６８５、およびその中の引用文献にまとめられており、そこでは、最高４０ｋｂのＰＣＲアンプリコンが生成される。当業者は、逆転写酵素およびポリメラーゼを用いて、本質的にいかなるＲＮＡも、制限消化、ＰＣＲ増幅および配列決定に適する二本鎖ＤＮＡに変換できることを理解するであろう。例えば、すべて前述のＡｕｓｕｂｅｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒを参照されたい。
【００１８】
本文全体で考察される刊行物は、単に本発明の出願日に先行してそれらが開示されているという理由でここに示されている。本明細書のいずれも、先行開示のために本発明者らがこのような開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されてはならない。
【００１９】
本開示は、細胞または対象への遺伝子またはタンパク質の送達に有用な方法および組成物を提供する。そのような方法および組成物を使って、癌および他の細胞増殖性疾患および障害を含む、対象の種々の疾患および障害を処置することができる。本開示は、細胞への遺伝子送達のための複製コンピテントレトロウイルスベクターを提供する。
【００２０】
用語の「ベクター」、「ベクター構築物」および「発現ベクター」は、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進するために、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）を宿主細胞に導入できるビークルを意味する。ベクターは通常、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み、ベクター中に、タンパク質をコードする外来性ＤＮＡが、制限酵素技術により挿入される。ベクターの一般的な型は「プラスミド」であり、それは一般に、追加の（外来の）ＤＮＡを容易に受け入れることができ、好適な宿主細胞に容易に導入できる二本鎖ＤＮＡの自立型分子である。プラスミドおよび真菌のベクターを含む多数のベクターが、様々な真核生物および原核生物の宿主での複製および／または発現について記載されている。非限定的例には、本明細書で開示もしくは引用されるか、または別の方法で関連技術分野の技術者に公知の、ｐＫＫプラスミド（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、ｐＵＣプラスミド、ｐＥＴプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ｐＲＳＥＴもしくはｐＲＥＰプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、またはｐＭＡＬプラスミド（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）、および多くの適切な宿主細胞が含まれる。組換えクローニングベクターは、多くの場合、クローニングまたは発現のための１つまたは複数の複製系、宿主中での選択のための１つまたは複数のマーカー、例えば抗生物質耐性、および１つまたは複数の発現カセットを含む。
【００２１】
組換え複製コンピテントレトロウイルスベクターまたはレトロウイルス複製ベクター（ＲＲＶ）は、レトロウイルス科ファミリーのウイルスのメンバーによるベクターを意味する。レトロウイルスの構造体は、以降でより完全に記載されているように、明確に特徴づけられる。このようなベクターは、組み換え遺伝子技術を使って操作して、異種の遺伝子または配列を挿入することにより、親ウイルスを非天然ＲＲＶとなるように改変できる。このような改変は、発現される遺伝子を、宿主細胞にインビトロまたはインビボで送達可能とする属性をベクターに付与することができる。
【００２２】
レトロウイルスは様々な方法で分類されてきたが、この１０年で命名法は標準化された（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＩＣＴＶｄｂ／ＩＣＴＶｄＢ／のワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）上のＩＣＴＶｄＢ−汎用ウイルスデータベース、ｖ４、およびテキストブック「レトロウイルス」Ｃｏｆｆｉｎ、ＨｕｇｈｓおよびＶａｒｍｕｓ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７年を参照のこと。この開示は参照により本明細書に組み込まれる）。一実施形態では、複製コンピテントレトロウイルスベクターは、オルトレトロウイルスまたはより典型的にはガンマレトロウイルスのベクターを含み得る。
【００２３】
レトロウイルスは、それらが遺伝物質を複製する方法により定義される。複製の際、ＲＮＡはＤＮＡに変換される。細胞の感染の後、逆転写として知られる分子過程により、ウイルス粒子中に保持されているＲＮＡの２つの分子からＤＮＡの二本鎖分子が生成される。ＤＮＡ形態はプロウイルスとして宿主細胞ゲノムに共有結合的に組み込まれ、そこから、細胞性因子および／またはウイルス因子を使用して、ウイルスＲＮＡが発現される。発現されたウイルスＲＮＡは粒子にパッケージングされ、感染性のビリオンとして放出される。
【００２４】
レトロウイルス粒子は、２個の同一のＲＮＡ分子で構成される。各野生型ゲノムは、プラスセンス一本鎖ＲＮＡ分子を有し、それは、５’末端でキャッピングされ、３’末端でポリアデニル化されている。二倍体のウイルス粒子は、ｇａｇタンパク質の「コア」構造内でｇａｇタンパク質、ウイルス酵素（ｐｏｌ遺伝子産物）および宿主ｔＲＮＡ分子と複合体を形成した２つのＲＮＡ鎖を含む。このキャプシドを囲んで保護するのは、宿主細胞膜に由来し、ウイルスエンベロープ（ｅｎｖ）タンパク質を含む、脂質二重層である。ｅｎｖタンパク質はウイルスの細胞受容体に結合し、その粒子は、通常は受容体依存性エンドサイトーシスおよび／または膜融合を介して宿主細胞に入る。
【００２５】
ウイルス粒子を標的細胞中に放出した後、外側のエンベロープが脱殻され、ウイルスＲＮＡは逆転写によって、ＤＮＡに複製される。これは、ｐｏｌ領域によって、コードされた逆転写酵素により触媒され、ビリオンにパッケージングされている宿主細胞ｔＲＮＡを、ＤＮＡ合成のためのプライマーとして用いる。このようにして、ＲＮＡゲノムは、より複雑なＤＮＡゲノムに変換される。
【００２６】
逆転写により生成される二本鎖直鎖ＤＮＡは、核内で環化する必要があっても、またはそうでなくてもよい。この段階で、プロウイルスはいずれかの末端に、長末端反復配列（ＬＴＲ）として知られる２つの同一の反復配列を有する。２つのＬＴＲ配列の末端は、組込みを触媒するｐｏｌ産物−インテグラーゼタンパク質−により認識される部位を生成し、その結果プロウイルスは、ＬＴＲの末端から２塩基対（ｂｐ）が、常に宿主ＤＮＡに結合する。細胞配列の重複は、両ＬＴＲの末端で見られ、転移遺伝因子の組込みパターンを想起させる。レトロウイルスは、それらのＤＮＡを宿主ＤＮＡの多くの部位で組み込むことができるが、異なるレトロウイルスは異なる組込み部位選択性を有する。ＨＩＶ−１およびサル免疫不全ウイルスＤＮＡは、発現遺伝子中に選択的に組み込まれ、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ＤＮＡは転写開始部位（ＴＳＳ）近傍に選択的に組み込まれ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）およびヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）ＤＮＡはほぼランダムに組み込まれ、遺伝子毎にわずかな選択脂向性がある（Ｄｅｒｓｅ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８１：６７３１−６７４１；Ｌｅｗｉｎｓｋｉ  ＭＫ，ｅｔ  ａｌ．（２００６），ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ２：ｅ６０１）。  
【００２７】
組み込まれたウイルスＤＮＡの転写、ＲＮＡスプライシングおよび翻訳は、宿主細胞タンパク質により媒介される。様々にスプライスされた転写物が生成される。ヒトレトロウイルスの場合、遺伝子発現を調節するために、ＨＩＶ−１／２およびＨＴＬＶ−Ｉ／ＩＩウイルスタンパク質も用いられる。細胞性因子およびウイルス因子間の相互作用は、ウイルス潜伏期およびウイルス遺伝子が発現される一時的配列の制御下に置かれる要因である。
【００２８】
レトロウイルスは、水平および垂直に伝播できる。レトロウイルスの効率的な感染伝播は、ウイルスエンベロープタンパク質を特異的に認識する受容体の標的細胞上での発現を必要とするが、ウイルスは、低い効率の受容体非依存性の非特異的侵入経路を使用してもよい。通常、受容体マスキングまたは下方制御のために、ウイルス感染は細胞当たり単一またはわずかなウイルスゲノムコピーしか生じず、これが重感染に対する耐性に繋がる（“Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ”，ＪＭ  Ｃｏｆｆｉｎ，ＳＨ  Ｈｕｇｈｅｓ，＆  ＨＥ  Ｖａｒｍｕｓ  １９９７  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ；Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ２８：８０２，１９７８、中の第３章、１０４頁）。組織培養での状況を操作することにより、ある程度の複数感染を得ることができるが、これは通常、５コピー未満／二倍体ゲノムである。さらに、標的細胞種は、ウイルスが結合および侵入した後の複製サイクルのすべての段階をサポートすることができなければならない。ウイルスゲノムが宿主の生殖細胞系に組み込まれるとき、垂直感染が起こる。その後プロウイルスは、それが細胞の遺伝子であるかのように、代々引き継がれる。したがって、しばしば潜在性のままであるが、宿主が適当な作用因子に曝露されると活性化され得る、内因性プロウイルスが確立される。
【００２９】
用語「レンチウイルス」は、逆転写酵素を含むウイルスの属を表す、その従来の意味で用いられる。レンチウイルスには、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１型および２型（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）ならびにサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含む「免疫不全ウイルス」が含まれる。
【００３０】
歴史的に腫瘍ウイルスは、ウイルス成熟中に電子顕微鏡下で観察される粒子形態に基づいて、Ａ群、Ｂ群、Ｃ群およびＤ群にさらに細分類されている。Ａ型粒子は、感染細胞の細胞質で認められるＢ型およびＤ型ウイルスの未熟粒子を表す。これらの粒子は、感染性ではない。Ｂ型粒子は、細胞質内Ａ型粒子を包み込むことによって、原形質膜から成熟ビリオンとして出芽する。膜において、それらは７５ｎｍの環状コアを有し、そこから長い糖タンパク質スパイクが突き出る。出芽後に、Ｂ型粒子は、偏在する高電子密度のコアを含む。プロトタイプＢ型ウイルスは、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）である。Ｃ型ウイルスに感染した細胞では、いかなる細胞質内粒子も観察することができない。代わりに、成熟粒子は、三日月形の「Ｃ」形の凝縮物を介して細胞表面から直接に出芽し、それは次にそれ自体が閉じ、原形質膜によって、包まれる。エンベロープ糖タンパク質スパイクは、均一に高電子密度のコアと一緒に見ることができる。出芽は、表面原形質膜から、または直接に細胞内液胞中へと発生し得る。Ｃ型ウイルスは最も一般的に研究されており、多くのトリおよびマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）を含む。ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）ならびにヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型およびＩＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ／ＩＩ）は、細胞表面からのそれらの出芽形態のために、同様にＣ型粒子として分類される。しかし、それらは正六角形の形態も有し、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）などのプロトタイプＣ型ウイルスよりも複雑なゲノム構造を有する。Ｄ型粒子は、それらが感染細胞の細胞質中で、細胞表面から出芽する環状構造を示すが、ビリオンが短い表面糖タンパク質スパイクを組み込むという点で、Ｂ型粒子に似ている。高電子密度コアも、粒子の中に偏在する。メーゾンファイザーサルウイルス（ＭＰＭＶ）は、プロトタイプＤ型ウイルスである。
【００３１】
組換え複製コンピテントレトロウイルスを治療に使用する多くの状況では、組換え複製コンピテントレトロウイルスによりコードされる導入遺伝子の高レベルの発現があるのが有利である。例えば、シトシンデアミナーゼ遺伝子などの遺伝子を活性化するプロドラッグでは、プロドラッグ５−ＦＣから５−ＦＵへの変換の効率がより高くなるように、細胞中でＣＤタンパク質のより高レベルの発現があるのが有利である。同様に、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの高レベルの発現は、標的遺伝子発現のより効率的な抑制に繋がる。また、サイトカインまたは単鎖抗体（ｓｃＡｂ）に関しては、通常、サイトカインまたはｓｃＡｂの高レベルの発現が有利である。さらに、ベクターのコピーで、ベクターまたは導入遺伝子を不活化するもしくはそれらの活性を損なういくつかの変異がある場合には、標的細胞中にベクターの複数のコピーを有するのが有利である。理由は、これにより無傷の導入遺伝子を効率的に発現する高い確率が得られるためである。
【００３２】
上記のように、組み込まれたＤＮＡ中間体は、プロウイルスと呼ばれる。以前の遺伝子治療または遺伝子送達系は、適当なヘルパーウイルスの存在下で、または汚染性ヘルパーウイルスの同時生成なしにキャプシド形成を可能にする適当な配列を含む細胞系で、プロウイルスの転写および感染性ウイルスへのアセンブリーを必要とする方法およびレトロウイルスを用いる。下記のように、キャプシド形成のための配列がゲノムで提供され、したがって遺伝子送達または治療のための複製コンピテントレトロウイルスベクターを提供するので、本開示の組換えレトロウイルスの生成のためにはヘルパーウイルスを必要としない。
【００３３】
本開示のレトロウイルスゲノムおよびプロウイルスＤＮＡは、少なくとも３個の遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを有し、これらの遺伝子には、１または２個の長末端反復配列（ＬＴＲ）が隣接し得、またはプロウイルスでは、ｐｓｉなどのシス作用性配列を含む２個の長末端反復配列（ＬＴＲ）が隣接する。ｇａｇ遺伝子は、内部構造（マトリックス、キャプシドおよびヌクレオキャプシド）タンパク質をコードし；ｐｏｌ遺伝子は、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、プロテアーゼおよびインテグラーゼをコードし；ｅｎｖ遺伝子は、ウイルスエンベロープの糖タンパク質をコードする。５’および／または３’のＬＴＲは、ビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニル化を促進する役目を果たす。ＬＴＲは、ウイルス複製に必要な他のすべてのシス作用性配列を含む。レンチウイルスは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｎｅｆおよびｖｐｘを含む追加の遺伝子を有する（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２および／またはＳＩＶにおいて、）。
【００３４】
ゲノムの逆転写に必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）、および粒子へのウイルスＲＮＡの効率的なキャプシド形成のために必要な配列（Ｐｓｉ部位）が、５’ＬＴＲに隣接する。キャプシド形成（または感染性ビリオンへのレトロウイルスＲＮＡのパッケージング）のために必要な配列がウイルスゲノムから欠落している場合、その結果は、ゲノムウイルスＲＮＡのキャプシド形成を妨げるシス欠損である。この型の改変ベクターは、以前の遺伝子送達系（すなわち、ビリオンのキャプシド形成のために必要とされるエレメントを欠く系）で、非複製性であるがパッケージジング可能なＲＮＡゲノムをパッケージングするウイルスタンパク質を輸送中に提供する「ヘルパー」エレメントとして一般的に用いられてきたものである。
【００３５】
用語「発現する」および「発現」は、遺伝子またはＤＮＡ配列内の情報を顕在化することを可能にするかまたはそうさせること、例えば、対応する遺伝子またはＤＮＡ配列の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することにより、または抑制性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）の場合には、ＲＮＡｉ分子を、プロセッシングされて、標的遺伝子の発現を抑制できるように転写することによりタンパク質を産生することを意味する。
【００３６】
ＤＮＡ配列は細胞内で、またはそれにより発現され、タンパク質などの「発現産物」を形成する。発現産物自体、例えば、得られたタンパク質が、細胞によって、「発現される」と言ってもよい。例えば、それが外来もしくは天然のプロモーターの制御下において、外来宿主細胞で、または外来プロモーターの制御下において、天然宿主細胞で発現または生成される場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組換えにより発現される。
【００３７】
前述のように、いくつかの事例では、用語の「発現」は、抑制性ＲＮＡ分子（ＲＮＡｉ）の産生を含む。このような分子の発現は、細胞の翻訳機構を必要としないが、むしろ、細胞の機構を利用して、宿主細胞の遺伝子発現を改変する。いくつかの実施形態では、本開示の組換えウイルスベクターは、コード配列（例えば、タンパク質）を発現する、ＲＮＡｉ分子を発現する、またはコード配列の発現（例えば、タンパク質の発現）およびＲＮＡｉ分子の発現の両方を行うように改変できる。
【００３８】
通常、組換え複製ウイルスベクターは、「カセット」を含むように改変され、これは通常、効果的な発現を可能とするエレメント（例えば、プロモーター、ＩＲＥＳまたは異種の配列転写および翻訳を可能とするリードスルーエレメント）に作動可能に連結された、発現されるべき異種遺伝子または配列を含む。
【００３９】
導入遺伝子（例えば、発現される異種配列）は、長端末反復（ＬＴＲ）、エンベロープの下流およびスプライス受容体の後の挿入物、ウイルスｇａｇまたはｐｏｌタンパク質との融合物、エンベロープコード配列下流の内部ＩＲＥＳ配列または小さい内部プロモーター中を含む多くの位置でレトロウイルスゲノム中に挿入できる。導入遺伝子のＬＴＲ中への挿入および余分のスプライス受容体の導入は、ベクターゲノムの急速な不安定化に繋がったが、ＩＲＥＳおよびその他の方法は、より有望であった。導入遺伝子の発現および構成は、潜在性スプライス受容体の除去および導入遺伝子配列のヒト化などの重要な配列の適切な変化により、少なくとも部分的には、影響を受ける可能性がある（米国特許第８，７２２，８６７号を参照されたい。この開示は参照により本明細書に組み込まれる）。導入遺伝子の大きさもまた、ベクターの安定性に影響を与え得る。例えば、特定のベクターでは、導入遺伝子の大きさが増すに伴い、ウイルスは不安定になり、少なくとも一部の異種遺伝子または配列を急速に除去する。この制限は、ＩＲＥＳ（通常約６００ｂｐ、例えば、米国特許第８，７２２，８６７号を参照）または小さいプロモーター（通常約２５０〜３００ｂｐ、例えば、国際公開第２０１４／０６６７００号を参照。この特許公開は参照により本明細書に組み込まれる）などの配列を可能とする発現を含むことが必要で、場合により、例えば、ＭＬＶ中の９００〜１２００ｂｐの異種遺伝子または配列インサートのみを残すことにより、悪化する。したがって、より多くの導入遺伝子の選択肢を含むように、利用可能な導入遺伝子寸法を最大化できれば極めて有用であろう。
【００４０】
ヒト細胞中で効率的に複製するレトロウイルスのいくつかの例には、両種性、多種指向性、異種指向性および１０Ａ１系のマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ならびにテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、ヒヒ内在性ウイルスおよびネコウイルスＲＤ１１４が挙げられる。同様に、両種性偽型ＲＲＶなどの非同種志向性エンベロープ遺伝子を含むように改変されている同種志向性系のＭＬＶも同様に、処理される種々の種および細胞型中で効率的に複製できる。しかし、レトロウイルスエンベロープは、ラブドウイルス、アルファウイルス、麻疹またはインフルエンザウイルスエンベロープなどの非レトロウイルスエンベロープにより置換することもできる。
【００４１】
ピコルナウイルスおよび脳心筋炎ウイルスを含むいくつかのウイルスは、それらのゲノム中に２Ａまたは２Ａ様ペプチドをコードし、単一ＯＲＦから複数のタンパク質発現を媒介する。２Ａペプチドは通常、配列中の約１６〜１８アミノ酸であり、コンセンサスモチーフ（Ｄ［Ｖ／Ｉ］ＥＸＮＰＧＰ（配列番号１）、Ｘは任意のアミノ酸）を共有する。２Ａペプチドが人工のマルチシストロニックｍＲＮＡ中のＯＲＦ間にコードされる場合、それは、リボソームを、翻訳ポリペプチド中の２ＡペプチドのＣ末端で停止させて、それにより、それぞれのＯＲＦに由来するポリペプチドの分離を生ずる（Ｄｏｒｏｎｉｎａら，２００８年）。分離ポイントは、２ＡのＣ末端にあり、ＯＲＦ下流の第１のアミノ酸はプロリンである（例えば、図１を参照）。２Ａペプチドの独自の特徴が、単一のマルチシストロニックなｍＲＮＡ構成から複数タンパク質発現用の分子ツールとしてのその利用をもたらした。
【００４２】
２Ａペプチドは、口蹄疫ウイルスおよび馬鼻炎Ａウイルスなどのピコルナウイルス科ウイルスファミリーのウイルスゲノム、ならびにブタテスコウイルス−１およびＴｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ  ｖｉｒｕｓなどの他のウイルス中に存在する（図１）。２Ａペプチドは、天然の属性でほぼ１００％の「分離」効率を有し、多くの場合、非天然の配列中に導入される場合、より低い「分離」効率を有する。異なる種類のウイルスで認められる他の２Ａ様配列はまた、非天然配列中で約８５％の「分離」効率を達成することが示された（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７年）。導入遺伝子を発現するために、本開示の方法および組成物で使用できる多数の２Ａ様配列が存在する（図２）。
【００４３】
２Ａ配列は約２０年にわたり存在が知られていたが、非天然の設定でのそれらの機能する能力は、疑問視されてきた。特に、２Ａ配列は、前にある翻訳されたタンパク質のＣ末端上に約１７〜２２個の余分のアミノ酸を残し、下流タンパク質のＮ−末端上にプロリンを付加し、その結果、前にあるタンパク質が機能する能力に影響を及ぼす可能性がある。タンパク質が、多くのウイルスエンベロープタンパク質の場合におけるように（Ｔ．Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ．２０１２）、内質およびゴルジ装置中で、および／またはビリオンの成熟中に翻訳後修飾を必要とする場合、前にあるタンパク質が機能不全になるさらなるリスクが存在する。
【００４４】
図１９は、エンベロープタンパク質のＣ末端に２Ａペプチドを有するＭＬＶエンベロープタンパク質のプロセッシングを示す。通常、未変性のＭＬＶエンベロープタンパク質のプロセッシングは、前駆体タンパク質Ｐｒ８５のｇｐ７０（ＳＵ）とｐ１５Ｅ（ＴＭ）サブユニットへの切断を伴い、これは感染宿主細胞中で起こる。Ｐｒ８５の切断には、宿主細胞からの出芽中に、ウイルスエンベロープタンパク質のバイロン中への効率的取り込みが必要である。宿主細胞膜から分離する際に、ビリオンは、感染性になるように成熟プロセスを経る。ＭＬＶビリオン成熟の１つのプロセスには、エンベロープタンパク質のＴＭサブユニットのＣ末端に位置するＲ−ペプチドの、ウイルスプロテアーゼによる除去が含まれる。図１９に示すシナリオでは、２Ａペプチドは、最後のアミノ酸残基のプロリン（Ｐｒｏ）以外は、Ｒ−ペプチドの下流で発現し、Ｒペプチドの長さを、２Ａペプチドの配列に応じて、１６アミノ酸から少なくとも３２アミノ酸に増やす。Ｒ−ペプチドの長さは、理論的には、２Ａペプチド配列の付加により延長されるが、２Ａペプチドは、同時に、Ｒペプチドの切断により取り除かれ、機能性エンベロープタンパク質を生ずる。
【００４５】
したがって、エンベロープ配列が非機能性であるかまたは弱まっている場合は、ウイルスベクターは有用ではない可能性がある。特定の２Ａ配列（ブタテスコウイルス−１由来、「Ｐ２Ａ」）をマウスのみに感染する特定のエンベロープ（同種志向性）を有するレトロウイルス構築物中で用いる試みがなされた（Ｓ．Ｓｔａｖｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  １０（５）：ｅ１００４１４５，２０１４；およびＥ．Ｐ．Ｂｒｏｗｎｅ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８９：１５５−６４，２０１５）。しかし、これらのウイルスはヒト細胞に感染せず、一般的なタンパク質プロセッシング問題が解決されるという期待はない。さらに、このように構築されたウイルスは、治療効果を達成するのではなく、インビボでウイルス複製を促進する遺伝子を発現するように設計された。
【００４６】
本開示は、例えばシトシンデアミナーゼもしくはその変異体、ｍｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ、サイトカイン、抗原結合ドメイン、またはコード配列の組み合わせなどをコードする、細胞または対象に送達できる異種ポリヌクレオチドを含む複製コンピテントウイルスベクターを提供する。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、麻疹ベクター、ヘルペスベクター、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含む）、ラブドウイルスベクター、例えば水疱性口内炎ウイルスベクター、レオウイルスベクター、セネカバレーウイルスベクター、ポックスウイルスベクター（動物ポックスもしくはワクシニア由来のベクターを含む）、パルボウイルスベクター（ＡＡＶベクターを含む）、アルファウイルスベクター、または当業者に既知である他のウイルスベクターであってもよい（例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｅｄ．Ｂｏｒｏ  Ｄｒｏｐｕｌｉｃ  ａｎｄ  Ｂａｒｒｉｅ  Ｃａｒｔｅｒ，Ｗｉｌｅｙ，２００８，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ．；Ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｅｄ．Ｔｈｅｏｄｏｒｅ  Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９；Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｅｄ．Ｎａｎｃｙ  Ｓｍｙｔｈ  Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００およびＧｅｎｅ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，３ｒｄ．ｅｄ．，ｅｄ．Ｎａｎｃｙ  Ｓｍｙｔｈ  Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎｅ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，２００８、も参照されたい）。
【００４７】
後述のように、本開示のＲＲＶは、ＭＬＶ、ＭｏＭＬＶ、ＧＡＬＶ、ＦＥＬＶなどから誘導する（すなわち、親ヌクレオチド配列はこれらから得られる）ことができ、異種ヌクレオチド配列に結合した２Ａペプチドまたは２Ａ様ペプチドを含むように改変される（本明細書においては、「２Ａペプチドカセット」と呼ぶこともある）。
【００４８】
本開示のＲＲＶは、それらの安定性および／または発現を変えるように操作できる。例えば、発現の変化は、不活化変異または減毒化変異が腫瘍組織中で継続的に反復されるのに伴い、複製レトロウイルスのベクター中でそれらが蓄積する頻度に起因して発生し得る。研究では、最も高頻度のイベントの１つは、ＧからＡへの変異（逆転写ステップの第１の複製ステップからのマイナス鎖一本鎖ＤＮＡにおけるＣからＴへの特徴的なＡｐｏＢｅｃ媒介変異に対応する）であることが示されている。これは、ＲＲＶタンパク質のアミノ酸組成の変化を生じ、ＴＧＧ（トリプトファン）から停止コドン（ＴＡＧまたはＴＧＡ）への壊滅的な変化を引き起こし得る。一実施形態では、この不活化変化は、類似の化学的または構造的特性を有するフェニルアラニンまたはチロシンなどの、この可能性のない、他のアミノ酸の置換コドンにより回避される。
【００４９】
したがって、２Ａペプチドカセットに加えて、ＲＲＶは、宿主細胞中の構築物の発現および／または安定性を向上させる複数の追加の変異を含めることができる。このような変異には、トリプトファンコドンを、ＧＡＧ、ＰＯＬおよび／またはＥＮＶドメインの生物活性を維持する許容可能なコドンに変えるＧＡＧ、ＰＯＬおよび／またはＥＮＶコード配列中の１つまたは複数のコドンの改変を含めることができる。トリプトファンのコドンはＵＧＧ（ＤＮＡではＴＧＧ）であることは、当該技術分野において既知である。さらに、「停止コドン」はＵＡＡ、ＵＡＧまたはＵＧＡ（ＤＮＡではＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）であることは、当該技術分野において既知である。トリプトファンコドン中の単一点変異は、非天然停止コドンを生ずる（例えば、ＵＧＧ−＞ＵＡＧまたはＵＧＧ−＞ＵＧＡ）。ヒトＡＰＯＢＥＣ３ＧＦ（ｈＡ３Ｇ／Ｆ）は、Ｇ−＞Ａ高頻度変異によりレトロウイルスの複製を抑制することも知られている（Ｎｅｏｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｔ．ＡＩＤＳ  Ｓｏｃ．，１６（１）：１８４７２，Ｆｅｂ．２５，２０１３）。さらに、後述のように、長期発現およびウイルス性安定性は、コード配列中のトリプトファンコドンの使用を避けることにより改善でき、それにより、ｈＡ３Ｇ／Ｆによる高頻度変異に起因する非天然停止コドンの組み込みを回避できる。例えば、一実施形態では、ＭＬＶ由来核酸配列は、ＧＡＧ、ＰＯＬおよびＥＮＶコードドメイン（例えば、ｇａｇ核酸ドメインは配列番号２のヌクレオチド番号約１２０３〜ヌクレオチド約２８１９を含み、ｐｏｌドメインは配列番号２のヌクレオチド番号約２８２０〜ヌクレオチド約６３５８の配列を含み、およびｅｎｖドメインは配列番号２のヌクレオチド番号約６３５９〜ヌクレオチド約８３２３の配列を含む）を含む。表１（ヌクレオチド番号は配列番号２を基準としている）に特定された、トリプトファンコドン中にあるヌクレオチドを含むコドンを改変することにより、ｈＡ３Ｇ／Ｆ抵抗性ＲＲＶが提供される。
【表１】
2018526007.tif 000003
【００５０】
したがって、本開示の一実施形態では、トリプトファンのコドンの１つまたは複数の変異を含む組換え複製コンピテントレトロウイルスが提供され、変異は、コドンをトリプトファン以外のアミノ酸のコドンに変え、生体適合性であるコドン（すなわち、ベクターの機能を破壊しないコドン）を提供する。このベクターは、「ＡｐｏＢｅｃ不活性化抵抗性」である。組換えＡｐｏＢｅｃ不活性化抵抗性ベクターは、ＩＲＥＳカセット、プロモーターカセット、および／または２Ａペプチドカセットを含み得る。本明細書で使用される場合、ＩＲＥＳカセットは、目的の生物学的活性な分子をコードする異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結された配列内リボソーム進入部位を含む（例えば、米国特許第８，８２９，１７３号を参照されたい。この特許は参照により本明細書に組み込まれる）。本明細書で使用される場合、プロモーターカセットは、目的の生物学的活性な分子をコードする下流の異種ポリヌクレオチドの転写を開始する制御ドメインを含む（例えば、米国特許第８，８２９，１７３号および米国特許公開第２０１５／０２７３０２９Ａ１号を参照されたい。これらの特許は本明細書に組み込まれる）。プロモーターは組織特異的プロモーター、ｐｏｌＩＩＩプロモーターまたはミニプロモーターであってもよい。２Ａペプチドカセットは、本明細書の別のところで記載されている。
【００５１】
一実施形態では、ウイルスベクターは、細胞分裂中の哺乳動物細胞のみに感染することができる複製コンピテントレトロウイルスベクターであってもよい。一実施形態では、複製コンピテントレトロウイルスベクターは、レトロウイルスエンベロープのすぐ下流にあり、それに作動可能に連結され、また、発現される異種核酸配列のすぐ上流にある２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様配列を含む。特定の実施形態では、ベクターは、ＩＲＥＳカセットまたはｐｏｌＩＩＩ（またはミニプロモーター）カセットをさらに含むことができる。異種ポリヌクレオチドは、例えば、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ、サイトカイン、受容体、抗体などをコードできる。ｐｏｌＩＩＩプロモーターまたはミニプロモーターが含まれる場合には、ベクターはｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはその他のＲＮＡｉ配列をさらに発現できる。
【００５２】
別の実施形態では、本開示は、ＥＮＶ−２Ａ−異種遺伝子カセットを提供する。このカセットは、両種性、多種指向性、異種指向性、１０Ａ１、ＧＡＬＶ、ヒヒ内在性ウイルス、ＲＤ１１４、ラブドウイルス、アルファウイルス、麻疹およびインフルエンザウイルスエンベロープの内の１つから選択されるエンベロープを含むことができる。２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列は、エンベロープコード配列のＣ末端に作動可能に連結された、図１または２に示した配列のいずれかであってもよい。別の実施形態では、２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列は、ＧＳＧリンカー配列（例えば、ｇｇａａｇｃｇｇａ（配列番号３））を介して結合される。異種遺伝子は、２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様配列のＣ末端に作動可能に連結される。異種遺伝子は、標的細胞に送達され、発現される任意の目的の遺伝子であってもよい。一実施形態では、異種遺伝子は、５００〜１５００ｂｐの長さまたはそれらの間の任意の数値（例えば、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐなど）の長さを含む。別の実施形態では、異種遺伝子は、１５００ｂｐを超える長さを含む。別の実施形態では、カセットは、２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様配列で分離された２つの異種遺伝子を含む。さらに別の実施形態では、カセットは、ｅｎｖのＣ末端と、異種遺伝子のＮ−末端との間で作動可能に連結された２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様配列を含むことができ、異種遺伝子の後に、第２の異種配列に連結されたＩＲＥＳまたはプロモーターを含む第２のカセットが続く。
【００５３】
本開示は、改変レトロウイルスベクターを提供する。改変レトロウイルスベクターは、レトロウイルス科ファミリーのメンバーから誘導でき、ＥＮＶ−２Ａ−導入遺伝子カセットを含むように改変できる。前述のように、レトロウイルス科ファミリーは、３つの群：ヒト泡沫状ウイルス（ＨＦＶ）などのスプーマウイルス（または泡沫状ウイルス）；レンチウイルス、ならびにヒツジのビスナウイルス；およびオンコウイルスからなる（この群内のすべてのウイルスが発癌性とは限らない）。
【００５４】
一実施形態では、本開示は、非分裂細胞、分裂細胞または細胞増殖性障害を有する細胞に感染できる、組換えレトロウイルスを提供する。本開示の組換え複製コンピテントレトロウイルスは、ウイルスＥＮＶ配列のすぐ下流（例えば、１〜５０ヌクレオチドの間（１〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０またはそれらの間の任意の整数））の、２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列の後ろに、ビリオン内に封入されたウイルスＧＡＧ、ウイルスＰＯＬ、ウイルスＥＮＶ、異種ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００５５】
語句の「非分裂性」細胞は、有糸分裂を経ない細胞を指す。非分裂細胞は、その細胞が活発に分裂していない限り、細胞周期中の任意の時点（例えば、Ｇ０／Ｇ１、Ｇ１／Ｓ、Ｇ２／Ｍ）でブロックし得る。ｅｘ  ｖｉｖｏ感染のために、分裂細胞は、照射、アフィディコリン処理、血清飢餓および接触阻害を含む、当業者により用いられる標準技術によって、細胞分裂をブロックするように処理できる。しかし、多くの細胞がすでに停止しているので（例えば、幹細胞）、ｅｘ  ｖｉｖｏ感染はしばしば細胞をブロックすることなく実施されることを理解されたい。例えば、組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することができる。既存の体内の非分裂細胞の例には、ニューロン、筋肉、肝臓、皮膚、心臓、肺および骨髄の細胞、およびそれらの誘導体が含まれる。分裂細胞のために、オンコレトロウイルスベクターを用いることができる。
【００５６】
「分裂」細胞は、活発な有糸分裂または減数分裂をしている細胞を意味する。このような分裂細胞には、幹細胞、皮膚細胞（例えば、線維芽細胞およびケラチノサイト）、配偶子、および当技術分野で既知の他の分裂細胞が含まれる。特に興味があり、用語の分裂細胞に包含されるものは、新生物細胞などの細胞増殖性障害を有する細胞である。用語の「細胞増殖性障害」は、異常な数の細胞分裂を特徴とする状態を指す。この状態は、肥大性（組織の中で細胞集団の異常増殖をもたらす細胞の継続的増殖）および発育不全（組織中の細胞の不足もしくは欠乏）細胞増殖の両方、または体の領域への細胞の過剰の流入もしくは移動を含むことができる。細胞集団は必ずしも形質転換細胞、腫瘍形成細胞または悪性細胞であるわけではなく、正常細胞も含むことができる。細胞増殖性障害には、結合組織の異常増殖に関連する障害、例えば強皮症、関節炎および肝硬変を含む様々な線維症状態が含まれる。細胞増殖性障害には、頭頸部癌などの腫瘍性疾患が含まれる。頭頸部癌には、例えば、口、食道、咽喉、喉頭、甲状腺、舌、唇、唾液腺、鼻、副鼻腔、鼻咽頭の癌腫、上鼻腔および副鼻腔腫瘍、感覚神経芽腫、扁平上皮細胞癌、悪性黒色腫、副鼻腔未分化癌腫（ＳＮＵＣ）、脳（多形神経膠芽腫などの神経膠芽腫を含む）または血液の新生物が含まれるであろう。頸部リンパ節、喉頭前リンパ節、食道傍リンパ節および顎下リンパ節を含む局所リンパ節の癌腫も含まれる（Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ｅｄｓ．，Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．，１３ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐｌ８５０−１８５３，１９９４）。他の癌型には、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌、尿路癌、子宮癌リンパ腫、口腔癌、膵臓癌、白血病、黒色腫、胃癌、皮膚癌および卵巣癌が含まれるが、これらに限定されない。細胞増殖性疾患には、関節リウマチ（Ｏ’Ｄｅｌｌ  ＮＥＪＭ  ３５０：２５９１  ２００４）および多くの場合免疫系の不適切な細胞増殖を特徴とする、他の自己免疫障害（Ｍａｃｋａｙ  ｅｔ  ａｌ  ＮＥＪＭ  ３４５：３４０  ２００１）も含まれる。
【００５７】
異種核酸配列は、２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様配列をコードする配列に作動可能に連結される。本明細書で使用される場合、用語の「異種」核酸配列または導入遺伝子は、（ｉ）野生型レトロウイルスに通常は存在しない配列、（ｉｉ）外来種に由来する配列、または（ｉｉｉ）同じ種に由来する場合、それが、その原形からかなり改変されてもよいことを意味する。あるいは、細胞で通常発現されない未改変の核酸配列は、異種核酸配列である。
【００５８】
本開示のレトロウイルスベクターの使用目的に応じて、任意の数の異種ポリヌクレオチドまたは核酸配列をレトロウイルスベクターに挿入してもよい。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験のために、抗生物質耐性および蛍光分子（例えば、ＧＦＰ）または発光性分子を含む、通常用いられるマーカー遺伝子またはリポーター遺伝子を用い得る。任意の目的のポリペプチド配列をコードする追加のポリヌクレオチド配列を、本開示のベクターに挿入してもよい。
【００５９】
異種核酸配列のｉｎ  ｖｉｖｏ送達を目指す場合、治療および非治療配列の両方を用い得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＥＮＶ−２Ａ−導入遺伝子カセットを、ｐｏｌＩＩＩ−ＲＮＡｉカセットまたはＩＲＥＳカセットの前に配置できる。例えば、ミニプロモーターまたはｐｏｌＩＩＩカセットが使われる場合、カセットは、細胞増殖性障害またはその他の遺伝子関連疾患または障害に関連する特定の遺伝子に向けられるｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどを含む異種配列を含むことができる。他の実施形態では、２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様配列またはＩＲＥＳの下流の異種遺伝子は、自殺遺伝子（例えば、改変されたまたは未改変の、ＨＳＶ−ｔｋまたはＰＮＰまたはシトシンデアミナーゼ活性を有するポリペプチド）、増殖因子または治療タンパク質（例えば、第ＩＸ因子、ＩＬ２など）であり得る。本開示に適用できる他の治療タンパク質は、当技術分野で容易に特定される。
【００６０】
一実施形態では、ベクター中の異種ポリヌクレオチドは、ヒト細胞での発現のために最適化されたシトシンデアミナーゼまたはチミジンキナーゼを含む。さらなる実施形態では、シトシンデアミナーゼは、ヒトコドン最適化された配列を含み、野生型シトシンデアミナーゼと比較してシトシンデアミナーゼの安定性（例えば、分解の低減または熱安定性の増加）を高める変異を含み、および／またはトリプトファンコドンを非トリプトファンをコードするコドンに変える変異を含む。さらに別の実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、ＵＰＲＴまたはＯＰＲＴ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたシトシンデアミナーゼ活性を有するポリペプチド（ヒトコドン最適化されたかまたは最適化されておらず、変異を起こしたかまたは変異を起こしていない）を含む融合構築物をコードする。
【００６１】
前述のように、ヒトＡＰＯＢＥＣ３ｇは、ウイルスベクター配列中でＧ−＞Ａに変換する高頻度変異を生じる。したがって、２Ａペプチドカセットに含まれる異種ポリヌクレオチド中のトリプトファンコドンは、ｈＡＰＯＢＥ３による停止コドンへの変換を受けやすい。このような変異を回避するために、トリプトファンコドンは、他のアミノ酸の生物学的に許容可能なコドンで置換できる。例えば、一実施形態では、本開示の２Ａカセットは、シトシンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができ、該ポリヌクレオチドは、下記配列を含む。
【化１】
2018526007.tif 000004
この配列は、２つのトリプトファンコドン（太字／下線）を含む。本開示の一実施形態では、これらのコドンは独立に、Ｄ、Ｍ、Ｔ、Ｅ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｆ、Ｙ、Ａ、Ｋ、Ｈ、Ｐ、Ｒ、Ｖ、Ｌ、Ｇ、ＩおよびＣからなる群より選択されるアミノ酸を与えるコドンに変えられる。得られたポリペプチドは、下記配列を含む。
【化２】
2018526007.tif 000005
この場合、ポリペプチドはシトシンデアミナーゼ活性を含み、Ｘは、トリプトファン以外の任意のアミノ酸である。一実施形態では、配列番号２９中のＸは、Ｆ、Ｄ、Ｍ、Ｌ、ＳまたはＲからなる群よりそれぞれ独立に選択される。
【００６２】
別の実施形態では、複製コンピテントレトロウイルスベクターは、シトシンデアミナーゼ（本明細書に記載のもの）を含むポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むことができ、さらに、ウイルスプロモーターからの一次転写産物の一部として、または細胞型もしくは組織特異的であり得るプロモーターに連結されたｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子を含む、ポリヌクレオチドを含んでもよい。またさらなる実施形態では、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡはｐｏｌＩＩＩプロモーターの後ろに配置されてもよい。
【００６３】
ＭｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、低分子、ノンコーディングＲＮＡである。それらは、コード遺伝子もしくは非コード遺伝子のイントロン、非コード遺伝子のエクソン、または遺伝子間領域内に位置する。ｍｉＲＮＡコード配列は、一次前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる前駆体ポリヌクレオチドを生成するＲＮＡポリメラーゼＩＩにより転写される。核内のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡはリボヌクレアーゼＤｒｏｓｈａによりプロセッシングされ、短いヘアピン構造を形成するｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）を生成する。その後、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡはＥｘｐｏｒｔｉｎ  ５を介して細胞質に輸送され、Ｄｉｃｅｒと呼ばれる別のリボヌクレアーゼによって、さらにプロセッシングされ、活性のある成熟ｍｉＲＮＡを生成する。
【００６４】
成熟ｍｉＲＮＡは、長さが約２１ヌクレオチドである。それは、標的遺伝子のｍＲＮＡの３’非翻訳領域に結合し、タンパク質翻訳の抑制またはｍＲＮＡの分解によって、タンパク質発現を抑制することによって、機能を発揮する。ｍｉＲＮＡは、発生、細胞増殖、分化および癌進行を含む生物学的プロセスに関与する。ｍｉＲＮＡプロファイリングの研究は、一部のｍｉＲＮＡ発現が組織特異的であるか、または特定の組織で濃縮されることを示す。例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１８１およびｍｉＲ−２２３の発現は、ヒトおよびマウス造血組織で濃縮されることが証明されている（Ｂａｓｋｅｒｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５年  ＲＮＡ  １１，２４１−２４７；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４年  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３，８３−８６）。
【００６５】
一部のｍｉＲＮＡは、いくつかの腫瘍で発現上昇（発癌性ｍｉＲＮＡ）または発現低下（リプレッサー）することが観察されている（Ｓｐｉｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９年  Ｃｅｌｌ  １３７，５８６ｅ１）。例えば、ｍｉＲ−２１は、神経膠芽腫、乳房、肺、前立腺、結腸、胃、食道および子宮頸の癌、子宮平滑筋肉腫、ＤＬＢＣＬ、頭頸部癌で過剰発現する。対照的に、ｌｅｔ−７のメンバーは、神経膠芽腫、肺、乳房、胃、卵巣、前立腺、および結腸の癌で発現低下していることが報告されている。癌でのｍｉＲＮＡ発現の恒常性の再確立は、癌進行を阻害または逆転させるのに不可欠な機構である。
【００６６】
癌で発現低下しているｍｉＲＮＡは、抗癌剤として有用である可能性がある。例には、ｍｉｒ−１２８−１、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−１２４およびｍｉＲ−１３７が挙げられる（Ｅｓｑｕｅｌａ−Ｋｅｒｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８年  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ７，７５９−７６４；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８年  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５，３９０３−３９０８；Ｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９年  Ｃｅｌｌ  １３７，１００５−１０１７；Ｓｉｌｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８年  ＢＭＣ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：１４  １−１７）。ｍｉＲ−１２８発現は、中枢神経系で高められることが報告され、神経膠芽腫では発現低下していることが観察されている（Ｓｅｍｐｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４年  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：Ｒ１３．５−１１；Ｇｏｄｌｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８年  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：（２２）９１２５−９１３０）。ｍｉＲ−１２８は、２個の異なる遺伝子、ｍｉＲ−１２８−１およびｍｉＲ−１２８−２によりコードされる。両方とも、同一の成熟配列にプロセッシングされる。Ｂｍｉ−１およびＥ２Ｆ３ａは、ｍｉＲ−１２８の直接の標的であることが報告されている（Ｇｏｄｌｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８年  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：（２２）９１２５−９１３０；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９年  Ｊ．Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ８７：４３−５１）。さらに、Ｂｍｉ−１発現は、神経膠腫、マントル細胞リンパ腫、非小細胞肺癌Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、乳癌、結腸直腸癌および前立腺癌を含め、様々なヒトの癌で発現上昇していることが観察されている。さらに、ニューロン幹細胞ならびに神経膠腫中の「幹様」細胞集団を含む、多様な組織からの幹細胞の自己複製のためにＢｍｉ−１が必要とされることが証明されている。
【００６７】
本明細書で使用される場合、用語の「ＲＮＡ干渉」（ＲＮＡｉ）は、短干渉核酸（ｓｉＲＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ））により媒介される配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを意味する。用語の「ＲＮＡ干渉を媒介できる因子」は、ｓｉＲＮＡ、ならびに細胞中で転写されるとｓｉＲＮＡをコードする、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターを意味する。用語ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡは、配列特異的なＲＮＡ干渉を媒介できる任意の核酸分子、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短干渉オリゴヌクレオチド、短干渉核酸、短干渉改変オリゴヌクレオチド、化学改変ｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）、その他を包含することを意味する。
【００６８】
ヘアピン二本鎖のステム長の好適設計範囲には、２０〜３０ヌクレオチド、３０〜５０ヌクレオチド、５０〜１００ヌクレオチド、１００〜１５０ヌクレオチド、１５０〜２００ヌクレオチド、２００〜３００ヌクレオチド、３００〜４００ヌクレオチド、４００〜５００ヌクレオチド、５００〜６００ヌクレオチドおよび６００〜７００ヌクレオチドのステム長が含まれる。ヘアピン二本鎖のループ長の好適設計範囲には、４〜２５ヌクレオチド、２５〜５０ヌクレオチド、または、ヘアピン二本鎖のそのステム長がかなりのものである場合それを超えるループ長が含まれる。特定の文脈では、２１ヌクレオチドよりも長い二本鎖領域を有するヘアピン構造は、ループの配列および長さに関係なく、有効なｓｉＲＮＡ誘導性のサイレンシングを促進できる。
【００６９】
さらに別のまたはさらなる実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、インターロイキン、インターフェロンγなどのサイトカインを含むことができる。本開示のレトロウイルスベクターから発現させることのできるサイトカインには、限定されないが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、１Ｌ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５，ＩＬ−３６、ＩＬ−３７、ＩＬ−３８、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α、ＴＮＦ−αの溶解性形態、リンフォトキシン−α（ＬＴ−α、別名ＴＮＦ−β）、ＬＴ−β（複合ヘテロトリマーＬＴ−α２−βで見出される）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開第９６／１４３２８号）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開第９７／３３８９９号）、エンドカイン−α（国際公開第９８／０７８８０号）、ＯＰＧ、およびニュートロカイン−α（国際公開第９８／１８９２１号）、ＯＸ４０および神経成長因子（ＮＧＦ）、ならびにＦａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０および４−ＩＢＢの溶解性形態、ＴＲ２（国際公開第９６／３４０９５号）、ＤＲ３（国際公開第９７／３３９０４号）、ＤＲ４（国際公開第９８／３２８５６号）、ＴＲ５（国際公開第９８／３０６９３号）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開第９８／５６８９２号）、ＴＲ１０（国際公開第９８／５４２０２号）、３１２Ｃ２（国際公開第９８／０６８４２号）、およびＴＲ１２、ならびにＣＤ１５４、ＣＤ７０およびＣＤ１５３の溶解性形態が含まれる。いくつかの実施形態では、特に細胞系からのタンパク質産生のために、血管形成タンパク質が有用なことがある。このような血管新生因子には、限定されないが、神経膠腫由来増殖因子（ＧＤＧＦ）、血小板由来増殖因子Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）、血小板由来増殖因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、胎盤増殖因子２（ＰＩＧＦ−２）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）、血管内皮増殖因子２（ＶＥＧＦ−２）、血管内皮増殖因子Ｂ（ＶＥＧＦ−３）、血管内皮増殖因子Ｂ−１８６（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）、血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）、血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）および血管内皮増殖因子Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）が含まれる。線維芽細胞増殖因子は、本開示のベクターにより送達し得、その例には、限定されないが、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４およびＦＧＦ−１５が含まれる。造血成長因子は、本開示のベクターを用いて送達することができ、このような成長因子には、限定されないが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（サルグラモスチム）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（フィルグラスチム）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１）エリスロポイエチン（エポエチンアルファ）、幹細胞因子（ＳＣＦ、ｃ−ｋｉｔリガンド、造血幹細胞因子）、巨核球コロニー刺激因子、ＰＩＸＹ３２１（ＧＭＣＳＦ／ＩＬ−３）融合タンパク質などが含まれる。
【００７０】
用語の「調節核酸配列」は、プロモーター配列／領域、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、エンハンサーなどを総称し、それらが協働して、レシピエント細胞でコード配列の複製、転写および翻訳を提供する。選択されるコード配列の複製、転写および翻訳が適切な宿主細胞において可能である場合には、必ずしもこれらの制御配列のすべてが存在する必要性があるわけではない。当業者は、公開データベースおよび資料から調節核酸配列を容易に同定できる。さらに、当業者は、例えばｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、使用目的に適用できる調節配列を特定できる。
【００７１】
用語の「プロモーター領域」は本明細書で通常の意味で用いられ、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域を指し、そこで、調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼに結合して下流（３’方向）へのコード配列の転写を開始できる遺伝子に由来する。調節配列は、目的の遺伝子配列と同種または異種であってもよい。例えば、ウイルスまたは哺乳動物のプロモーターを含む、広範囲のプロモーターを利用できる。
【００７２】
「２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様配列」は、配列番号１のコンセンサス配列、配列番号１のコンセンサス配列を含む図１および２のいずれかの配列に９７％同一である配列を有するペプチドを意味する。２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様配列を「コードする」配列は、例えば、配列番号１のコンセンサス配列を有する２Ａペプチドまたはペプチド様配列をコードするポリヌクレオチド配列である。一実施形態では、コード配列は、ＥＮＶと異種配列との間に作動可能に連結および配置され、それにより、配列が転写されると、単一転写物（例えば、ポリｍＲＮＡ）として転写され、転写物が翻訳される場合、２つのポリペプチドが産生する（例えば、ＥＮＶおよび異種ポリペプチド）。
【００７３】
内部リボソーム侵入部位（「ＩＲＥＳ」）は、通常はＩＲＥＳに対して３’側のコード配列の翻訳の際、リボソームの侵入または保持を促進する核酸セグメントを意味する。一部の実施形態では、ＩＲＥＳはスプライス受容／供与部位を含むことができるが、好ましいＩＲＥＳはスプライス受容／供与部位を欠く。通常、メッセンジャーＲＮＡへのリボソームの侵入は、すべての真核生物ｍＲＮＡの５’末端に位置するキャップを介して起こる。しかし、この普遍的規則の例外がある。一部のウイルスｍＲＮＡでのキャップの非存在は、これらのＲＮＡの内部部位でのリボソームの侵入を許す、代替構造の存在を示唆する。今まで、それらの機能のためにＩＲＥＳと命名されたこれらの構造のいくつかが、特にポリオウイルス（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８年，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８，１１０３−１１１２）およびＥＭＣＶウイルス（脳心筋炎ウイルス（Ｊａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２，２６３６−２６４３  １９８８；Ｂ．Ｔ．Ｂａｒａｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０５：４７３３−８，２００８）などのピコルナウイルスのものなどの、キャップのないウイルスｍＲＮＡの５’非コード領域で特定されている。本開示は、複製コンピテントレトロウイルスベクターとの関連でのＩＲＥＳの使用を提供する。
【００７４】
異種核酸配列は、通常、ウイルスＬＴＲプロモーター−エンハンサーエレメントまたは内部プロモーターの制御下にあり、レトロウイルスＬＴＲの中に保持されたエレメントは、この場合でも宿主細胞ゲノムへのベクターの効率的な組込みをもたらすことができる。したがって、本開示の組換えレトロウイルスベクター、目的の配列、遺伝子および／または遺伝子断片は、いくつかの部位に、および異なる調節配列の下で挿入できる。例えば、挿入部位は、ウイルスエンハンサー／プロモーターに近位の部位（すなわち、５’ＬＴＲ駆動遺伝子座）であり得る。
【００７５】
一実施形態では、本開示のレトロウイルスゲノムは、目的の／異種ポリヌクレオチドの挿入のために、２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列の下流のクローニング部位を含む２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列を含む。一実施形態では、２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列は、レトロウイルスベクターのｅｎｖ遺伝子の３’側であるが、目的の異種ポリヌクレオチドの５’側に位置する。したがって、目的のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドは、２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列に作動可能に連結される。
【００７６】
別の実施形態では、ターゲッティングポリヌクレオチド配列は、本開示の組換えレトロウイルスベクターの一部として含まれる。ターゲッティングポリヌクレオチド配列は、ターゲッティングリガンド（例えば、ヘレグリンなどのペプチドホルモン、単鎖抗体、受容体もしくは受容体のリガンド）、組織特異的もしくは細胞型特異的調節エレメント（例えば、組織特異的もしくは細胞型特異的プロモーターもしくはエンハンサー）、またはターゲッティングリガンドおよび組織特異的／細胞型特異的調節エレメントの組合せである。好ましくは、ターゲッティングリガンドはレトロウイルスのｅｎｖタンパク質に作動可能に連結され、キメラレトロウイルスｅｎｖタンパク質を形成する。ウイルスＧＡＧ、ウイルスＰＯＬおよびウイルスＥＮＶタンパク質は、任意の適するレトロウイルスに由来し得る（例えば、ＭＬＶまたはレンチウイルス由来する）。別の実施形態では、ウイルスＥＮＶタンパク質は、非レトロウイルス由来である（例えば、ＣＭＶまたはＶＳＶ）。
【００７７】
一実施形態では、本開示の組換えレトロウイルスは、レトロウイルスベクターの組換えゲノムが、標的の非分裂細胞、標的の分裂細胞、または細胞増殖性障害を有する標的細胞に送達されるように、ウイルスが特定の細胞型（例えば、平滑筋細胞、肝細胞、腎細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、間葉性幹細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、上皮細胞、腸の細胞、乳腺細胞、新生物細胞、グリオーマ細胞、ニューロン細胞および当技術分野で既知である他のもの）を標的にするように遺伝子改変される。
【００７８】
一実施形態では、レトロウイルスベクターは、細胞の外表面に分子を有する細胞に結合することによって、細胞を標的にする。レトロウイルスを標的にするこの方法は、レトロウイルス表面のターゲッティングリガンドと相互作用する受容体または結合分子を有する細胞または組織をウイルスの標的にするのに役立つように、レトロウイルスの外被上でのターゲッティングリガンドの発現を利用する。ウイルスが細胞に感染した後、ウイルスは細胞内にその核酸を注入し、レトロウイルス遺伝物質は宿主細胞ゲノムと一体化できる。
【００７９】
本開示のウイルスベクターに目的の異種ポリヌクレオチドを、例えば特定の標的細胞上の受容体のリガンドをコードする別の遺伝子と一緒に挿入することにより、この段階でベクターは標的特異的である。ウイルスベクターは、例えば糖、糖脂質またはタンパク質を結合させることによって、標的特異的にすることができる。ターゲッティングは、ウイルスベクターを標的にする抗体を用いて達成できる。当業者は、目的の核酸配列を含むウイルスベクターの標的特異的送達を可能にするためにウイルスエンベロープに結合させることができるウイルスゲノムまたはタンパク質に挿入できる、特異的ポリヌクレオチド配列を知っているか、または容易に確認できる。
【００８０】
したがって、本開示は、一実施形態では、ターゲッティングポリペプチドに作動可能に連結されたレトロウイルスＥＮＶタンパク質を含む、キメラｅｎｖタンパク質を含む。ターゲッティングポリペプチドは、細胞特異的受容体分子、細胞特異的受容体のリガンド、細胞特異的抗原エピトープに対する抗体もしくは抗体断片、または標的細胞と結合もしくは相互作用できる、当技術分野で容易に特定される他の任意のリガンドであり得る。ターゲッティングポリペプチドまたは分子の例には、リンカーとしてビオチン−ストレプトアビジンを用いる二価抗体（Ｅｔｉｅｎｎｅ−Ｊｕｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌ．，７３，３２５１−３２５５（１９９２）；Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６，９０７９−９０８３（１９８９））、そのエンベロープにハプテンに対する単鎖抗体可変領域をコードする配列を含む組換えウイルス（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２１，１０８１−１０８５（１９９３））、レトロウイルスエンベロープへのペプチドホルモンリガンドのクローニング（Ｋａｓａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６，１３７３−１３７６（１９９４））、キメラＥＰＯ／ｅｎｖ構築物（Ｋａｓａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４年）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体を発現するＨｅＬａ細胞の特異的感染をもたらす、同種指向性ＭＬＶエンベロープのＬＤＬ受容体に対する単鎖抗体（Ｓｏｍｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９２，７５７０−７５７４（１９９５））が含まれ、同様に、ＡＬＶの宿主域はインテグリンリガンドの組込みによって、変化させることができ、これで、ラット神経膠芽腫細胞に特異的に感染するためにウイルスが種を交雑することが可能になり（Ｖａｌｓｅｓｉａ−Ｗｉｔｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，４６０９−４６１９（１９９４））、またＤｏｒｎｂｅｒｇおよび共同研究者（Ｃｈｕ  ａｎｄ  Ｄｏｒｎｂｕｒｇ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６９，２６５９−２６６３（１９９５）；Ｍ．Ｅｎｇｅｌｓｔａｄｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８，１２０２−１２０６（２００１））は、腫瘍マーカーに対する単鎖抗体を含むエンベロープを用いて、脾臓壊死ウイルス（ＳＮＶ）、トリレトロウイルスの組織特異的ターゲッティングを報告している。
【００８１】
本開示は、標的細胞に感染できる組換えレトロウイルスを生成する方法を提供し、該方法は、好適な宿主細胞を、次記のもの：すなわち、ウイルスｇａｇ、ウイルスｐｏｌおよびウイルスｅｎｖをコードするポリヌクレオチド配列、ｅｎｖと異種ポリヌクレオチドとの間に作動可能に連結された２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列を含むベクターで、トランスフェクトすること、および組換えウイルスを回収することを含む。
【００８２】
本開示のレトロウイルスおよび方法は、ビリオンを増殖および産生するために、ヘルパーウイルスまたは追加の核酸配列もしくはタンパク質を必要としない、複製コンピテントレトロウイルスを提供する。例えば、本開示のレトロウイルスの核酸配列は、上記のようにそれぞれ基特異的抗原および逆転写酵素（ならびに、成熟および逆転写のために必要なインテグラーゼおよびプロテアーゼ酵素）をコードする。ウイルスのｇａｇおよびｐｏｌは、レンチウイルス、例えばＨＩＶまたは腫瘍ウイルスまたはガンマレトロウイルス、例えば、ＭｏＭＬＶから誘導できる。さらに、本開示のレトロウイルスの核酸ゲノムは、ウイルスエンベロープ（ＥＮＶ）タンパク質をコードする配列を含む。ｅｎｖ遺伝子は、任意のレトロウイルスから誘導できる。ｅｎｖは、ヒトおよび他の種の細胞の形質導入を可能にする両種性エンベロープタンパク質であってもよく、または、マウスおよびラットの細胞だけを形質導入できる同種指向性エンベロープタンパク質であってもよい。さらに、エンベロープタンパク質と、特定の細胞型の受容体へのターゲッティングのための抗体または特定のリガンドとの結合によって、組換えウイルスを標的にすることが望ましいことがある。上記のように、レトロウイルスベクターは、例えば糖脂質またはタンパク質を挿入することによって、標的特異的にすることができる。ターゲッティングは、特定の細胞型（例えば、特定の組織で見られる細胞型または癌細胞型）の上の抗原をレトロウイルスベクターの標的にするための抗体を用いて達成されることが多い。当業者は、過度な実験をすることなく、特異的標的へのレトロウイルスベクターの送達を達成する特異的方法を知るか、または容易に確認できる。一実施形態では、ｅｎｖ遺伝子は、レトロウイルス以外に由来する（例えば、ＣＭＶまたはＶＳＶ）。レトロウイルス由来のｅｎｖ遺伝子の例には、限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられる。他のｅｎｖ遺伝子、例えば水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）（プロテインＧ）、サイトメガロウイルスエンベロープ（ＣＭＶ）またはインフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）を用いることもできる。
【００８３】
一実施形態では、レトロウイルスゲノムは、オンコレトロウイルス、より具体的には、哺乳動物のオンコレトロウイルスに由来する。さらなる実施形態では、レトロウイルスゲノムは、ガンマレトロウイルス、より具体的には、哺乳動物のガンマレトロウイルスに由来する。「由来する」は、親ポリヌクレオチド配列が野生型オンコウイルスであり、これが、天然配列の挿入または除去により改変されていることを意味する（例えば、２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列ならびにポリペプチドおよび必要に応じて１つまたは複数のＩＲＥＳ、または別の異種ポリヌクレオチドに連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターもしくは目的の阻害核酸をそれぞれコードする異種ポリヌクレオチドの挿入）。
【００８４】
別の実施形態では、本開示は、調節配列を用いて標的を定めた、レトロウイルスベクターを提供する。特定の細胞集団の遺伝子配列の発現を標的にするために、細胞特異的または組織特異的調節配列（例えば、プロモーター）を利用できる。本開示に適する哺乳動物およびウイルスのプロモーターは、本明細書の他のところで記載される。したがって、一実施形態では、本開示は、レトロウイルスゲノムの５’末端に組織特異的プロモーターエレメントを有するレトロウイルスを提供する。通常は、組織特異的調節エレメント／配列は、例えば新生細胞に対する細胞特異的または組織特異的プロモーターおよびエンハンサー（例えば、腫瘍細胞特異的エンハンサーおよびプロモーター）ならびに誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリン）を含む、レトロウイルスゲノムのＬＴＲのＵ３領域にある。
【００８５】
本開示の転写制御配列は、超抗原、サイトカインまたはケモカインをコードする遺伝子に生来関連している、天然の転写制御配列を含むこともできる。
【００８６】
状況次第では、発現を調節することが望ましいことがある。例えば、目的の発現レベルに応じて、異なる活性強度を有する異なるウイルスプロモーターを利用してもよい。哺乳動物細胞では、強い転写活性を提供するために、ＣＭＶ即時型初期プロモーターがしばしば用いられる。導入遺伝子のより低い発現レベルが所望の場合、より非力であるＣＭＶプロモーターの改変バージョンも用いられている。造血細胞で導入遺伝子の発現が所望の場合、ＭＬＶまたはＭＭＴＶ由来のＬＴＲなどのレトロウイルスプロモーターを用いることができる。用いることができる他のウイルスプロモーターには、ＳＶ４０、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２  ＬＴＲ、アデノウイルスプロモーター、例えばＥ１Ａ、Ｅ２ＡまたはＭＬＰ領域由来のもの、ＡＡＶ  ＬＴＲ、カリフラワーモザイクウイルス、ＨＳＶ−ＴＫおよびトリ肉腫ウイルスが挙げられる。
【００８７】
同様に、非標的組織に対する潜在毒性または望ましくない影響を低減させるように、特定の組織または細胞で転写を達成するために組織特異的または組織選択的プロモーターを用いることができる。例えば、前立腺での遺伝子発現を標的にするために、ＰＳＡ、プロバシン、前立腺酸性フォスファターゼまたは前立腺特異的腺性カリクレイン（ｈＫ２）などのプロモーターを用いることができる。乳清アクセサリータンパク質（ＷＡＰ）を、乳房組織発現のために用いることができる（Ａｎｄｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８４：１２９９−１３０３，１９８７）。用いることができる他のプロモーター／調節ドメインを、下記に示す。
【００８８】
「組織特異的調節エレメント」は、一組織で遺伝子の転写を進行させることができるが、他の組織型ではほとんど「サイレント」のままである調節エレメント（例えば、プロモーター）である。しかし、組織特異的プロモーターは、それらがサイレントであると予測される組織で、検出可能な量の「バックグラウンド」または「基底」活性を有し得ることは理解されよう。プロモーターが標的組織で選択的に活性化される程度は、選択比（標的組織での活性／対照組織での活性）で表すことができる。この点に関しては、本開示の実施で有用な組織特異的プロモーターは、通常、約５よりも大きな選択比を有する。好ましくは、選択比は、約１５よりも大きい。
【００８９】
特定の適応症では、本開示の組換え複製コンピテントレトロウイルス（ＲＲＶ）を投与した後、特定の時間に転写を活性化することが望ましいことがある。このことは、ホルモンまたはサイトカインで調節可能であるプロモーターで実行し得る。例えば、特定のステロイドが産生されるかまたは送られる場合、適用が生殖腺組織である治療適用では、アンドロゲンまたはエストロゲンにより調節されるプロモーターの使用が有利であり得る。ホルモンにより調節可能であるこのようなプロモーターには、ＭＭＴＶ、ＭＴ−１、エクジソンおよびルビスコが含まれる。甲状腺、下垂体および副腎ホルモンに応答性であるものなどの、ホルモンにより調節される他のプロモーターを用い得る。用いられる可能性のあるサイトカインおよび炎症性タンパク質に応答性のプロモーターには、ＫおよびＴキニノーゲン（Ｋａｇｅｙａｍａら、１９８７年）、ｃ−ｆｏｓ、ＴＮＦ−α、Ｃ反応性タンパク質（Ａｒｃｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８年）、ハプトグロビン（Ｏｌｉｖｉｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７年）、血清アミロイドＡ２、Ｃ／ＥＢＰα、ＩＬ−１、ＩＬ−６（Ｐｏｌｉ  ａｎｄ  Ｃｏｒｔｅｓｅ，１９８９年）、補体Ｃ３（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０年）、ＩＬ−８、α−１酸性糖タンパク（Ｐｒｏｗｓｅ  ａｎｄ  Ｂａｕｍａｎｎ，１９８８）、α−１アンチトリプシン、リポタンパク質リパーゼ（Ｚｅｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８年）、アンギオテンシノーゲン（Ｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０年）、フィブリノーゲン、ｃ−ｊｕｎ（ホルボールエステル、ＴＮＦ−α、ＵＶ照射、レチノイン酸および過酸化水素によって、誘導可能）、コラゲナーゼ（ホルボールエステルおよびレチノイン酸により誘導される）、メタロチオネイン（重金属およびグルココルチコイド）、ストロメライシン（ホルボールエステル、インターロイキン１およびＥＧＦによって、誘導可能）、α−２マクログロブリンならびにα−１抗キモトリプシンが含まれる。腫瘍細胞で遺伝子発現を調節するために、オステオカルシン、低酸素応答性エレメント（ＨＲＥ）、ＭＡＧＥ−４、ＣＥＡ、アルファフェトプロテイン、ＧＲＰ７８／ＢｉＰおよびチロシナーゼなどの腫瘍特異的プロモーターを用いてもよい。
【００９０】
さらに、このプロモーターリストは網羅的または限定的とみなすべきではなく、当業者は、本明細書で開示されるプロモーターおよび方法と共に用い得る他のプロモーターのこともわかるであろう。
【表２】
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【００９１】
特定のプロモーターは、単一の組織型に活性が制限されないとはいえ、それらが一群の組織で活性であり、別の群では活性がより低いかまたはサイレントであり得るという点で選択性を示すことができることがさらに理解されよう。このようなプロモーターも「組織特異的」と言われ、本開示での使用が企図される。例えば、様々な中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンで活性であるプロモーターは、脳のいくつかの異なる領域のいずれかに影響を及ぼし得る脳卒中による損傷からの保護において、治療的に有用な場合がある。したがって、本開示で用いられる組織特異的調節エレメントは、異種タンパク質の調節への適用可能性に加えて、本レトロウイルスベクターでのターゲッティングポリヌクレオチド配列としての適用可能性を有する。
【００９２】
さらに別の実施形態では、本開示は、組換えレトロウイルス由来構築物を含むプラスミドを提供する。プラスミドは、ＨＴ１０８０、ＮＩＨ  ３Ｔ３または他の組織培養細胞などの標的細胞または細胞培養に直接導入できる。生じた細胞は、培地にレトロウイルスベクターを放出する。
【００９３】
本開示は、ポリヌクレオチド構築物を提供し、該ポリヌクレオチド構築物は、５’側から３’側へ：転写の開始に有用なプロモーターまたは調節領域；ｐｓｉパッケージングシグナル；ｇａｇコード核酸配列、ｐｏｌコード核酸配列；ｅｎｖコード核酸配列；２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列；マーカー、治療または診断ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド；任意のＩＲＥＳまたはｐｏｌＩＩＩカセット；およびＬＴＲ核酸配列、を含む。前述のように、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ核酸ドメインは、ＡｐｏＢｅｃ３により停止コドンに変換されるトリプトファンコドンを除去するように改変できる。特定のその他の実施形態では、ベクターは、異種ポリヌクレオチドの下流で、３’ＬＴＲの上流に、ｐｏｌＩＩＩカセットまたはＩＲＥＳカセットをさらに含んでもよい。本明細書の他の場所で記載のように、および以下の通りに、本開示のポリヌクレオチド構築物（例えば、組換え複製コンピテントレトロウイルスポリヌクレオチド）の様々なセグメントが、ある程度は目的の宿主細胞、発現のタイミングまたは量、および異種ポリヌクレオチドに応じて改変される。本開示の複製コンピテントレトロウイルス構築物は、当業者が個々に改変し得るいくつかのドメインに分割できる。
【００９４】
例えば、プロモーターは、配列番号２のヌクレオチド１位からヌクレオチド約５８２位までに記載の配列を有するＣＭＶプロモーターを含むことができ、また、改変されたプロモーターが転写を誘導および開始できる限りにおいて、１つまたは複数の（例えば、２〜５、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０、５０〜１００個またはそれを超える）核酸塩基に改変を含み得る。一実施形態では、プロモーターまたは調節領域は、ＣＭＶ−Ｒ−Ｕ５ドメインポリヌクレオチドを含む。ＣＭＶ−Ｒ−Ｕ５ドメインは、ＭＬＶ  Ｒ−Ｕ５領域に連結されたヒトサイトメガロウイルス由来の即時型初期プロモーターを含む。一実施形態では、ＣＭＶ−Ｒ−Ｕ５ドメインポリヌクレオチドは、配列番号２で示されるヌクレオチド約１位からヌクレオチド約１２０２位までの配列、または配列番号２で示される配列に少なくとも９５％同一である配列を含み、該ポリヌクレオチドは、作動可能にそれに連結された核酸分子の転写を促進する。ポリヌクレオチドのｇａｇドメインは、任意数のレトロウイルスに由来してもよいが、通常は、オンコレトロウイルス、より具体的には、ＭＬＶなどの哺乳動物のオンコレトロウイルスに由来する。一実施形態では、ｇａｇドメインは、配列番号２のヌクレオチド番号約１２０３位からヌクレオチド約２８１９位までの配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９８％、９９％もしくは９９．８％（小数点以下一桁に丸めた）の同一性を有する配列を含む。ポリヌクレオチドのｐｏｌドメインは、任意数のレトロウイルスに由来してもよいが、通常は、オンコレトロウイルス、より具体的にはＭＬＶなどの哺乳動物のオンコレトロウイルスに由来する。一実施形態では、ｐｏｌドメインは、配列番号２のヌクレオチド番号約２８２０位からヌクレオチド約６３５８位までの配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９８％、９９％もしくは９９．９％（小数点以下一桁に丸めた）の同一性を有する配列を含む。ポリヌクレオチドのｅｎｖドメインは、任意数のレトロウイルスに由来してもよいが、通常は、オンコレトロウイルスまたはガンマレトロウイルス、より具体的には、哺乳動物のオンコレトロウイルスまたはＭＬＶなどのガンマレトロウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、ｅｎｖコードドメインは、両種性ｅｎｖドメインを含む。一実施形態では、ｅｎｖドメインは、配列番号２のヌクレオチド番号約６３５９位からヌクレオチド約８３２３位までの配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９８％、９９％もしくは９９．８％（小数点以下一桁に丸めた）の同一性を有する配列を含む。２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様カセットは、ｅｎｖドメインの後ろに（例えば、ヌクレオチド約８３２４の位置に）挿入され、２Ａまたは２Ａ様ペプチドのＣ末端に連結された異種ポリヌクレオチドの末端まで続く。異種ドメインには、ポリプリンに富むドメインが続いてもよくまたはＩＲＥＳカセットまたはｐｏｌＩＩＩカセットが続いてもよい。３’ＬＴＲは、任意数のレトロウイルス、通常はオンコレトロウイルス、好ましくは哺乳動物のＭＬＶなどのオンコレトロウイルスから誘導できる。一実施形態では、３’ＬＴＲは、Ｕ３−Ｒ−Ｕ５ドメインを含む。さらに���の実施形態では、ＬＴＲは、配列番号２のヌクレオチド約９１１１位から約１１６５４位までに示す配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９８％または９９．５％（小数点以下一桁に四捨五入）同一である配列を含む。
【００９５】
本開示はまた、組換えレトロウイルスベクターを提供し、該組換えレトロウイルスベクターは、５’側から３’側に、ＣＭＶ−Ｒ−Ｕ５、ヒトサイトメガロウイルス由来最初期プロモーターのＭＬＶ  Ｒ−Ｕ５領域への融合体；ＰＢＳ、逆転写酵素用のプライマー結合部位；５’スプライス部位；ψパッケージングシグナル；ｇａｇ、ＭＬＶ群特異的抗原のためのＯＲＦ；ｐｏｌ、ＭＬＶポリメラーゼポリタンパク質のためのＯＲＦ；３’スプライス部位；４０７０Ａｅｎｖ、ＭＬＶ系４０７０Ａのエンベロープタンパク質のためのＯＲＦ；２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様配列；トリプトファンコドンへの改変（上述のように）を含有または非含有の改変シトシンデアミナーゼ（熱安定化およびコドン最適化）；ＰＰＴ、ポリプリントラクト；およびＵ３−Ｒ−Ｕ５、ＭＬＶ長末端反復配列、を含む。
【００９６】
本開示は、以下に示す配列を含むレトロウイルスベクターも提供する。
【００９７】
レトロウイルスベクターは、いくつかの細胞増殖性疾患および障害を含む広範囲の疾患および障害を処置するために用いることができる（例えば、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，４０５，７１２号および第４，６５０，７６４号；Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５−１２８１；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：９２６−９３２，Ｒ．Ｃｒｙｓｔａｌ，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４０４−４１０、また、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｔｈｅｏｄｏｒｅ  Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９９．ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−５２８−５；Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｅｄ．Ｂｏｒｏ  Ｄｒｏｐｕｌｉｃ  ａｎｄ  Ｂａｒｒｉｅ  Ｃａｒｔｅｒ，Ｗｉｌｅｙ，２００８，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ．；Ｇｅｎｅ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ｅｄ．Ｎａｎｃｙ  Ｓｍｙｔｈ  Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ＦＬ  ２００８、も参照されたい）。
【００９８】
本開示は、細胞増殖性障害の処置のための遺伝子治療も提供する。そのような療法は、増殖性障害を有する対象の細胞への、適切な治療ポリヌクレオチド（例えば、アンチセンス、リボザイム、自殺遺伝子、ｓｉＲＮＡ）の導入により、その治療効果を達成するであろう。ポリヌクレオチド構築物の送達は、特にそれがＭＬＶに基づく場合、分裂細胞に感染できる本開示の組換えレトロウイルスベクターを用いて達成できる。
【００９９】
さらに、本明細書に記載の治療法（例えば、遺伝子治療または遺伝子送達法）は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで実施できる。遺伝子治療の前に、例えば外科的にまたは放射線によって、腫瘍の大部分を除去することが好ましい場合がある。いくつかの態様では、レトロウイルス療法の前または後に、手術、化学療法または放射線療法を実施してもよい。
【０１００】
したがって、本開示は、非分裂細胞、分裂細胞または新生細胞に感染できる、組換えレトロウイルスを提供し、該組換えレトロウイルスは、ウイルスＧＡＧ；ウイルスＰＯＬ；ウイルスＥＮＶ；２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列に作動可能に連結された異種核酸；ならびにパッケージング、逆転写および組込みのために必要なシス作用性核酸配列を含む。組換えレトロウイルスは、ＨＩＶなどのレンチウイルスであってもよく、またはオンコウイルスであってもよい。組換えレトロウイルスを生成する方法に関して上に記載のように、本開示の組換えレトロウイルスは、ＶＰＲ、ＶＩＦ、ＮＥＦ、ＶＰＸ、ＴＡＴ、ＲＥＶおよびＶＰＵタンパク質の内の少なくとも１つをさらに含んでもよい。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、これらの遺伝子／タンパク質産物の１つまたは複数が、生成される組換えレトロウイルス（例えば、ＮＥＦ）のウイルス力価の増加に重要であるか、またはビリオンの感染およびパッケージングに必要であり得ると考えられている。
【０１０１】
本開示は、特定の核酸（例えば、異種配列）の発現を提供するために、標的細胞への核酸移入の方法も提供する。したがって、別の実施形態では、本開示は、標的細胞での異種核酸の導入および発現方法を提供し、該方法は、標的細胞を本開示の組換えウイルスに感染させ、標的細胞中で異種核酸を発現させることを含み、該異種核酸は、ｅｎｖドメインの下流にあり、２Ａまたは２Ａ様ペプチドに作動可能に連結された組換えウイルスベクターに組み込まれる。上記のように、標的細胞は、それらがレトロウイルスによる感染が可能である限り、当業者により認識される分裂細胞型、非分裂細胞型、新生細胞型、不死化細胞型、改変細胞型および他の細胞型を含む、任意の細胞型であってもよい。
【０１０２】
生物学的応答調節物質（例えば、サイトカイン）をコードする核酸を細胞または対象に導入することが望ましいことがある。このカテゴリーには、「インターロイキン」として分類されるいくつかのサイトカインをコードする核酸を含む、免疫賦活剤が含まれる。これらには、例えば、インターロイキン１〜３８、ならびに本明細書のほかの場所で記載される他の応答調節剤および因子が含まれる。必ずしも同じ機構によって、機能するわけではないが、インターフェロン、特にガンマインターフェロン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）もこのカテゴリーに含まれる。他のポリペプチドには、例えば血管新生因子および抗血管新生因子が含まれる。酵素欠乏症または免疫欠乏を処置するために、このような核酸を骨髄細胞またはマクロファージに送達することが望ましいことがある。増殖因子、毒性ペプチド、リガンド、受容体または他の生理的に重要なタンパク質をコードする核酸を、特定の標的細胞に導入することもできる。前述の生物学的応答調節物質のいずれかは、２Ａまたは２Ａ様ペプチドの下流にあり、それに動作可能に連結された、本開示のＲＲＶに組み込まれる。
【０１０３】
本開示は、薬剤特異的ターゲッティングおよび効果を促進する異種ポリヌクレオチドの送達のために用いることができる。例えば、ＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーＨＥＲ２は、薬剤トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）の結合の標的である。トラスツズマブは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の媒介物質である。活性は、免疫組織化学により、１＋および非発現細胞よりも、２＋および３＋レベルの過剰発現のＨＥＲ２発現細胞を優先的に標的にする（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ処方情報、Ｃｒｏｍｍｅｌｉｎ  ２００２年）。低ＨＥＲ２腫瘍におけるＨＥＲ２または末端切断ＨＥＲ２（細胞外および膜貫通ドメインだけを発現する）を発現するベクターの導入によるＨＥＲ２の発現の増強は、ＡＤＣＣの最適な誘発を促進し、臨床使用で観察されるハーセプチン抵抗性の急速な進展を克服し得る。これらの例では、異種遺伝子はＨＥＲ２をコードすることになろう。
【０１０４】
別の例では、ＣＤ２０は、薬剤リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）の結合の標的である。リツキシマブは、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）およびＡＤＣＣの媒介物質である。フローサイトメトリーによるより高い平均蛍光強度を有する細胞は、リツキシマブに対する増強された感受性を示す（ｖａｎ  Ｍｅｅｒｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６；１２（１３）：４０２７−４０３５，２００６年）。低ＣＤ２０のＢ細胞におけるＣＤ２０を発現するベクターの導入によるＣＤ２０の発現の増強は、ＡＤＣＣの最適な誘発を促進し得る。この例では、異種遺伝子はＣＤ２０をコードする。
【０１０５】
本開示は、癌および新生物などの細胞増殖性障害を処置するための方法を提供し、該方法は、本開示のＲＲＶベクターの投与に続いて、化学療法剤または抗癌剤で処置することを含む。一態様では、化学療法剤または抗癌剤の投与より前に、ＲＲＶの感染および複製を可能にする一定時間、ＲＲＶベクターが対象に投与される。対象は次に、癌細胞の増殖を減少させるか、それらを死滅させるための一定時間および投薬量で、化学療法剤または抗癌剤で処置される。一態様では、化学療法剤または抗癌剤による処置が、癌／腫瘍を減少させるが死滅させない場合（例えば、部分寛解または一時的寛解）、次に、ＲＲＶ由来の細胞傷害遺伝子（例えば、シトシンデアミナーゼ）を発現する細胞で毒性治療薬に変換される非毒性治療薬（例えば、５−ＦＣ）で対象を処置し得る。
【０１０６】
このような方法を用いて、本開示のＲＲＶベクターは腫瘍細胞の複製過程の間に拡散され、その後、このような細胞は抗癌剤または化学療法剤による処理によって、死滅させることができ、また、本明細書に記載のＲＲＶ処理プロセスを用いてさらなる死滅を起こすことができる。
【０１０７】
本開示のさらに別の実施形態では、異種遺伝子は、標的抗原（例えば、癌抗原）のコード配列を含むことができる。この実施形態では、細胞増殖性障害を含む細胞を、標的抗原をコードする異種ポリヌクレオチドを含むＲＲＶに感染させて、標的抗原の発現（例えば、癌抗原の過剰発現）を提供する。標的抗原と特異的に相互作用するターゲッティング同族部分を含む抗癌剤が、次に対象に投与される。ターゲッティング同族部分は、細胞傷害剤に作動可能に連結されてもよく、またはそれ自身が抗癌剤であってもよい。したがって、ターゲッティング抗原コード配列を含むＲＲＶに感染する癌細胞は、癌細胞上での標的の発現を増加させ、細胞傷害剤ターゲッティングの効率／効力の増加をもたらす。
【０１０８】
さらに別の実施形態では、本開示のＲＲＶは、同族抗原またはリガンドと特異的に相互作用する結合ドメイン（例えば、抗体、抗体断片、抗体ドメインまたは受容体リガンド）を含むコード配列を含むことができる。次に、癌細胞または新生細胞などの細胞増殖性障害を含む対象の細胞に感染させるために、結合ドメインのコード配列を含むＲＲＶを用いることができる。その後、感染細胞は、結合ドメインまたは抗体を発現する。細胞傷害剤に作動可能に連結されているか、またはそれ自体細胞傷害性である抗原または同族を、次に対象に投与できる。次に、細胞傷害性同族は、結合ドメインを発現する感染細胞を選択的に死滅させる。あるいは、結合ドメイン自体が抗癌剤であり得る。
【０１０９】
本開示は、細胞増殖性障害を有する対象を処置する方法を提供する。対象は任意の哺乳動物とすることができ、好ましくはヒトである。対象を、本開示の組換え複製コンピテントレトロウイルスベクターと接触させる。接触させることは、ｉｎ  ｖｉｖｏであってもまたはｅｘ  ｖｉｖｏであってもよい。本開示のレトロウイルスベクターを投与する方法は当技術分野で既知であり、例えば、全身投与、局所投与、腹腔内投与、筋内投与、頭蓋内、脳脊髄、ならびに腫瘍または細胞増殖性障害の部位への直接投与が含まれる。他の投与経路は、当技術分野で既知である。
【０１１０】
したがって、本開示は、細胞増殖性障害を処置するために様々な有用医薬組成物を含む。本開示による医薬組成物は、本開示による細胞増殖性障害の処置または調節に有用な異種ポリヌクレオチド配列を含むレトロウイルスベクターを、キャリア、賦形剤および添加剤または補助剤を用いて対象への投与に適する形にすることにより調製される。多くの場合に用いられるキャリアまたは補助剤には、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトールおよび他の糖、タルク、ミルクタンパク質、ゼラチン、デンプン、ビタミン、セルロースおよびその誘導体、動植物油、ポリエチレングリコールならびに溶媒、例えば無菌水、アルコール、グリセロールおよび多価アルコールが含まれる。静脈内ビークルには、液体および栄養素補液が含まれる。保存剤には、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスが含まれる。例えば、その内容は参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ  ｅｄ．Ｅａｓｔｏｎ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１４０５−１４１２，１４６１−１４８７（１９７５）ａｎｄ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  ＸＩＶ．，１４ｔｈ  ｅｄ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９７５）、に記載されているように、他の薬学的に許容されるキャリアには、塩、保存剤、緩衝剤などを含む水溶液、非毒性賦形剤が含まれる。医薬組成物の様々な成分のｐＨおよび正確な濃度は、当技術分野で常用される技術により調節される。Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（７ｔｈ  ｅｄ．）を参照されたい。
【０１１１】
他の実施形態では、本開示の複製コンピテントレトロウイルスベクタートランスフェクト宿主細胞が提供される。宿主細胞には、真核細胞、例えば酵母細胞、昆虫細胞または動物細胞が含まれる。宿主細胞には、細菌細胞などの原核細胞も含まれる。
【０１１２】
本明細書で提供されるベクター（例えば複製コンピテントレトロウイルスベクター）で形質導入されている（形質転換またはトランスフェクトされている）操作された宿主細胞も提供される。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選択するか、またはコードポリヌクレオチドを増幅するために適宜改変された、従来の栄養培地で培養できる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に用いられたものであり、それらは、当業者に、および本明細書の引用文献、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒ、ならびに、例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，３ｒｄ  ｅｄ．（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびその中の引用文献で明らかである。  
【０１１３】
適切な発現宿主の例には、大腸菌、枯草菌、ストレプトマイセスおよびネズミチフス菌などの細菌細胞；出芽酵母、ピキアパストリス、およびアカパンカビなどの真菌細胞；ショウジョウバエおよびヨトウガなどの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３ｂｒ、Ｂｏｗｅｓメラノーマなどの哺乳動物細胞；または植物細胞または外植片、などが挙げられる。通常は、ヒト細胞または細胞系が用いられるが、配列決定、増幅およびクローニングのために、本開示のベクターおよびポリヌクレオチドを非ヒト宿主細胞にクローニングすることが望ましい場合がある。
【０１１４】
以下の実施例は、本開示を例示するためのものであり、限定するものではない。そのような実施例は使用し得るものを代表するが、当業者に既知の他の手順を代わりに利用してもよい。
【０１１５】
実施例
実施例１：ＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ、ＲＲＶ−２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ｙＣＤ２の設計。
ＲＲＶ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＦＰは、両種性エンベロープ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子の下流に脳心筋炎ウイルス配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）−導入遺伝子カセット（Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ，２０１２年）を有する、モロニーＭＬＶベースのＲＲＶである。ＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰ（別名ｐＡＣ３−２Ａ−ＧＦＰ）およびＲＲＶ−２Ａ−ｙＣＤ２（ｐＡＣ３−２Ａ−ｙＣＤ２）ベクターは、ＲＲＶ−ＧＦＰおよびＲＲＶ−ｙＣＤ２ベースであるが、ＩＲＥＳ領域は種々の異なる、両種性エンベロープタンパク質および導入遺伝子（ＧＦＰまたはｙＣＤ２）とインフレームにある２Ａペプチドで置換されている。ＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰおよびＲＲＶ−ｙＣＤ２ベクターのクローニングスキームの概要は、図３に示されている。２個のＤＮＡフラグメントおよびＢｓｔＢＩおよびＮｏｔＩ部位で消化したｐＡＣ３−ｅｍｄバックボーンを含むギブソンアセンブリークローニングキット（ＮＥＢ）を使って、ｐＡＣ３−Ｔ２Ａ−ＧＦＰ構築物を最初に生成した。最初に、５’から３’の順に、両種性ｅｎｖの３’末端、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ  ｖｉｒｕｓ由来の２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）、およびＧＦＰの５’の配列を含む、１対のセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成し（ＩＤＴ）、ハイブリッド形成してＤＮＡフラグメント２Ａ−Ｇを生成した。ギブソンアセンブリー中の第２のＤＮＡフラグメントは、ＦＰフラグメントである（図３）。ＦＰフラグメントは次のプライマーを使ってＰＣＲにより生成した。ＧＦＰ−Ｆ−Ｇｉｂ（５’−ＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣ−３’）およびＧＦＰ−Ｒ−Ｇｉｂ（５’−ＴＡＡＡＡＴＣＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣ−３’）
【０１１６】
２Ａ−Ｇフラグメントでは、５’は、ｐＡＣ３バックボーンの両種性ｅｎｖ中のＢｓｔＢＩ部位と重複する配列を含み、３’は、ＦＰ  ＤＮＡフラグメントの５’と重複する配列を含む。さらに、ＡｓｃＩ制限酵素部位は、第２の導入遺伝子、ＧＦＰの開始コドンのすぐ上流にあるＴ２Ａの３’−末端の位置に配置された。ＡｓｃＩ部位の包含は、その後のＴ２Ａペプチドのその他の２Ａペプチドによる置換のためである。追加のヌクレオチドＴの後にＡｓｃＩ部位が来る状態でのＡｓｃＩ制限酵素部位の包含は、Ｔ２Ａペプチドの最後のプロリン残基に対する追加の３個のアミノ酸（グリシン−アラニン−プロリン）Ｃ末端を生じた。同時翻訳プロセス中に、Ｔ２Ａペプチドにより媒介されるエンベロープタンパク質からのＧＦＰタンパク質の分離は、ＧＦＰのＮ−末端での追加の４個のアミノ酸：Ｐ、Ｇ、Ａ、およびＰを生じた。ＦＰフラグメントでは、ＦＰフラグメントの５’末端は、２Ａ−Ｇフラグメントの３’末端と２４個のヌクレオチドだけ重複する配列を含み、ＦＰフラグメントの３’末端は、ｐＡＣ３−ＧＦＰバックボーンのＮｏｔＩ部位までの５’−末端と２６個のヌクレオチドだけ重複する。ギブソンアセンブリークローニングから得られたプラスミドＤＮＡは、ｐＡＣ３−Ｔ２Ａ−ＧＦＰと名付けた（図３）。
【０１１７】
他の３つのよく使われる、ブタテスコウイルス−１（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）および馬鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）由来で、２種の異なる配置の、２Ａペプチドを含む追加のＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰベクターをその後合成した（ＩＤＴ）。それぞれのＤＮＡフラグメントは、両種性ｅｎｖ遺伝子の３’ならびにＢｓｔＢＩおよびＡｓｃＩ部位のｐＡＣ３−Ｔ２Ａ−ＧＦＰバックボーンのＴ２Ａの代わりに指定２Ａペプチドを含む。得られたプラスミドＤＮＡは、ｐＡＣ３−Ｐ２Ａ−ＧＦＰ、ｐＡＣ３−Ｆ２Ａ−ＧＦＰ、ｐＡＣ３−Ｅ２Ａ−ＧＦＰ、ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＦＰ、ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＦＰ、ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｆ２Ａ−ＧＦＰ、およびｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｅ２Ａ−ＧＦＰと命名される。
【０１１８】
記載されたＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰプラスミドＤＮＡ（ｐＡＣ３−Ｅ２Ａ−ＧＦＰ、ｐＡＣ３−Ｆ２Ａ−ＧＦＰ、ｐＡＣ３−Ｐ２Ａ−ＧＦＰ、ｐＡＣ３−Ｔ２Ａ−ＧＦＰ、ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｅ２Ａ−ＧＦＰ、ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｆ２Ａ−ＧＦＰ、ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＦＰ、およびｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＦＰ）は全てＧＦＰの３’−末端に停止コドン変異を含んでいたことが後で明らかになった。ＦＰ  ＰＣＲフラグメントを生成する際に、ＧＦＰ−Ｒ−Ｇｉｂプライマー（５’−ＴＡＡＡＡＴＣＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣ−３’（配列番号４））中に変異を導入した。ＰＣＲに由来するＧＦＰ中の停止コドン変異は、停止コドンに達する前に追加の１１アミノ酸（Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｄ−Ｋ−Ｉ−Ｋ−Ｄ−Ｆ−Ｉ（配列番号５））に対するＧＦＰ  ＯＲＦの読み飛ばしを生じた。プラスミドＤＮＡを次のように再命名した：ｐＡＣ３−Ｅ２Ａ−ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３−Ｆ２Ａ−ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３−Ｐ２Ａ−ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３−Ｔ２Ａ−ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｅ２Ａ−ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｆ２Ａ−ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＦＰｍ、およびｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＦＰｍ。以後、次の２つの命名法は同義として用いられる：ｐＡＣ３−Ｅ２Ａ−ＧＦＰ／ｐＡＣ３−Ｅ２Ａ−ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３−Ｆ２Ａ−ＧＦＰ／ｐＡＣ３−Ｆ２Ａ−ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３−Ｐ２Ａ−ＧＦＰ／ｐＡＣ３−Ｐ２Ａ−ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３−Ｔ２Ａ−ＧＦＰ／ｐＡＣ３−Ｔ２Ａ−ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｅ２Ａ−ＧＦＰ／ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｅ２Ａ−ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｆ２Ａ−ＧＦＰ／ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｆ２Ａ−ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＦＰ／ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＦＰｍ、およびｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＦＰ／ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＦＰｍ。
【０１１９】
ＲＲＶ−２Ａ−ｙＣＤ２ベクターの等価セットは、ｐＡＣ３−Ｐ２Ａ−ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３−Ｔ２Ａ−ＧＦＰｍおよびｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＦＰｍプラスミドＤＮＡのそれぞれの２ＡペプチドバージョンのＧＦＰｍ読み枠をｙＣＤ２  ＯＲＦで置換することにより生成した（図３）。ＡｓｃＩ−ｙＣＤ２−ＮｏｔＩ  ＰＣＲフラグメントを、次のプライマーを使ってｐＡＣ３−ｙＣＤ２プラスミドＤＮＡから生成した：ＡｓｃＩ−ｙＣＤ２−Ｆ（５’−ＧＡＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣＴＡＴＧＧＴＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＡＴＧＧＣ−３’（配列番号６）および３−３７（５’−ＣＣＣＣＴＴＴＴＴＣＴＧＧＡＧＡＣＴＡＡＡＴＡＡ−３’（配列番号７）。ＰＣＲ産物およびそれぞれの４つのｐＡＣ３−２Ａ−ＧＦＰｍプラスミドＤＮＡを、ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩで制限酵素消化し、ＡｓｃＩ−ｙＣＤ２−ＮｏｔＩ消化ＰＣＲ産物をＧＦＰｍの代わりにサブクローニングしてｐＡＣ３−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２、ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２、ｐＡＣ３−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２、およびｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２を生成した（表３）。
【表３】
2018526007.tif 000007
【０１２０】
実施例２：２９３Ｔ細胞から産生したＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍベクターは感染性であり、ＧＦＰタンパク質を発現する。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの１８〜２０時間前に、１０ｃｍプレート当たり２ｅ６細胞で播種した。次の日、ｐＡＣ３−２Ａ−ＧＦＰｍおよびｐＡＣ３−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍプラスミドを使って、細胞播種２０時間後に、リン酸カルシウム法を使って、２０μｇのプラスミドＤＮＡの一時的トランスフェクションを行った。トランスフェクションの１８時間後、細胞をＤＭＥＭ完全培地で３回洗浄し、新しい完全培地でインキュベートした。トランスフェクションの約４２時間後にウイルス上清を収集し、０．４５μｍのシリンジフィルターを通して濾過した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一時的トランスフェクションからのＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰのウイルス力価を、前述のようにして（Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２年）測定した。簡単に説明すると、ベクターの単一サイクル感染により、ＰＣ３細胞に対しベクター調製物の力価を測定した。単一サイクル感染は、感染の２４時間後のアジドチミジン処理、およびそれに続く、感染の４８時間後にウイルスベクターＤＮＡに特異的な標的細胞ゲノムＤＮＡの定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行い（ＭＬＶ  ＬＴＲプライマーセット；５−ＭＬＶ−Ｕ３−Ｒ（５’−ＡＧＣＣＣＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＡＣＴＣ−３’（配列番号２０））、３−ＭＬＶ−Ｐｓｉ（５’−ＴＣＴＣＣＣＧＡＴＣＣＣＧＧＡＣＧＡ−３’（配列番号２１））、およびプローブ（５’−ＦＡＭ−ＣＣＣＣＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＣＣＣＣＣＧＣＴＧＡＣＧ−ＢＨＱ１−３’（配列番号２２））、細胞ゲノム当たりのウイルス性ＤＮＡコピー数を定量することにより保証された。ミリリットル当たりの形質導入単位（ＴＵ）（ＴＵ／ｍＬ）で報告されるウイルス力価を、２ｘ１０７コピー〜２ｘ１０１コピーの範囲のプラスミドＤＮＡの検量線および既知の量のゲノムＤＮＡ入力、細胞数、および反応混合物当たりのウイルスストックの希釈から導出される閾値サイクル（ＣＴ）値を計算することにより決定した。表４は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から産生されたＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍの力価がＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰの力価と同等であることを示す。
【表４】
2018526007.tif 000008
【０１２１】
次に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から産生したＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍウイルスを使って、０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）でＵ８７−ＭＧに感染させた。初期感染では、Ｕ８７−ＭＧ細胞を６ウエルプレートに１ｘ１０５細胞で播種した。細胞を新しい６ウエルプレートのウエルに各継代で１：４の希釈で継代培養し、各試料からの残りの細胞を採取し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使って、ＧＦＰｍ発現細胞のパーセントおよびＧＦＰｍ平均蛍光強度を測定することによりウイルス拡散を評価した。それぞれの継代のＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージをプロットした。ＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰウイルスが最大感染力（約９５％またはそれを超えるＧＦＰ陽性細胞）に達するまでアッセイを継続した。図４は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から産生されたＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍが感染性であることを示す。遅れを示すＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ＧＦＰｍ、ＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｆ２Ａ−ＧＦＰｍを除いて、ＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍの間のウイルス拡散速度は、感染Ｕ８７−ＭＧ細胞中のＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰに類似であった。それにもかかわらず、それらは、１８日以内に最大感染力に達した。ＧＦＰｍ発現レベルはまた、ＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍベクターの間で変動したが、全てが、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から発現したレベルの約２０〜５０％であった（図５）。
【０１２２】
実施例３：ＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍベクターはＵ８７−ＭＧ細胞中で安定である。
ＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍ感染Ｕ８７−ＭＧ細胞での低下したＧＦＰ発現は、ウイルスゲノム中のＧＦＰ遺伝子の欠失が原因ではないことを確実にするために、２Ａ−ＧＦＰｍ領域の完全性を、プロウイルスＤＮＡの３’ｅｎｖおよび３’ＵＴＲ領域プライマーセットを使って、エンドポイントＰＣＲにより評価した。Ｕ８７−ＭＧ細胞の最大感染力時に、続けて、細胞を培養し、Ｔ７５フラスコ中で培養飽和密度に達した時点で、培地を新しい培地と置換し、その後、ウイルス含有上清を収集して、培地交換後１８〜２４時間で０．４５μＭの濾過を行った。収集した細胞上清を分取し、イムノブロッティングおよび再感染実験に使用するまで、−８０℃で保存した。同時に、細胞を、１／１０をゲノムＤＮＡの単離用として、９／１０を合計細胞ライセートの単離用として、２つに分割した。ゲノムＤＮＡを、４００μLの１ｘＰＢＳに再懸濁することにより細胞ペレットから抽出し、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｘｗｅｌｌ  １６  Ｃｅｌｌ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使って単離した。その後、１００ナノグラムのゲノムＤＮＡをＰＣＲ用のテンプレートとして、次のプライマーセットと共に使用する：ＩＲＥＳ−Ｆ（５’−ＣＴＧＡＴＣＴＴＡＣＴＣＴＴＴＧＧＡＣＣＴＴＧ−３’（配列番号２３））およびＩＲＥＳ−Ｒ（５’−ＣＣＣＣＴＴＴＴＴＣＴＧＧＡＧＡＣＴＡＡＡＴＡＡ−３’（配列番号２４））。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分析した。データは、ＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍベクターのプロウイルスＤＮＡ中の２Ａ−ＧＦＰｍおよびＧＳＧ−ＧＦＰｍ領域は、ウイルス複製の時間経過中、Ｕ８７−ＭＧ細胞中で安定であることを示す（図６）。
【０１２３】
実施例４：最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から産生されたＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍは、その後の感染サイクルで感染性のまま存続する。
長期感染力は、ＲＲＶによりもたらされる治療効果を持続するために多くの重要な基準の内の１つであるので、最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から産生したＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍの感染力を、未処理Ｕ８７−ＭＧ細胞中で追加の感染サイクルを実施することにより評価した。最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から集めたウイルス上清を、記載されているように、最初に力価を測定し、その後、未処理Ｕ８７−ＭＧ細胞に０．０１のＭＯＩで再感染させた。図７は、最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から得た力価は、一時的トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から得た力価と類似であり、ＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍベクターならびにＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクター間で同等であることを示す。
【０１２４】
ＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍのウイルス拡散を、記載されているように、各細胞継代でモニターした。一時的トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から産生したウイルス上清を使った第１の感染サイクルで観察されたウイルス拡散速度と対照的に、図８は、全てのベクターがＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰと同等の速度で拡散することを示す。しかし、この感染サイクルにおけるＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍ感染Ｕ８７−ＭＧ細胞からのＧＦＰ発現レベルは、以前に観察したように、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ細胞による発現の２０％〜５０％にとどまった（図９）。
【０１２５】
実施例５：ＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍベクターのウイルスエンベロープおよびＧＦＰｍタンパク質は、感染Ｕ８７−ＭＧ細胞中で異なる効率でプロセッシングされる。
ＧＦＰｍ発現、ＧＦＰｍのウイルスエンベロープタンパク質からの分離効率、およびウイルスエンベロープタンパク質の適切なプロセッシングを評価するために、感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から細胞ライセートを生成した。最大感染力のＵ８７−ＭＧ細胞、集密的細胞単層を１ｘＰＢＳで１回洗浄し、ＴｒｐＺｅａｎ（Ｓｉｇｍａ）により解離させ、完全ＤＭＥＭに再懸濁し、再度１ｘＰＢＳで洗浄後、２００μＬのＲＩＰＡリシスバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で３０分間氷上で細胞溶解した。１４，０００ｒｐｍ、４℃で１５分の遠心分離によりライセートの壊死細胞片を除去し、上清を収集し、新しいチューブに移した。次に、細胞ライセートのタンパク質濃度を、ＢＣＡ沈殿アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使ってアッセイし、２０μｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。タンパク質を４〜１２％ＸＴトリスＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＢｉｏＲａｄ）上、２００ボルトで４５分間分離した。その後、タンパク質を、ｉＢｌｏｔドライブロッティングシステムを使って、２０ボルトで７分間、ＰＶＤＦ膜（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上に移した。膜の、エンベロープタンパク質のｇｐ７０サブユニットおよびＧＦＰｍの発現を、抗ｇｐ７０（ラット抗ｇｐ７０、クローン８３Ａ２５；１：５００希釈）および抗ＧＦＰ（ウサギ抗ＧＦＰ；１：１０００希釈）を使ってアッセイした。タンパク質発現を、対応する西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体を使って検出した。結果は、約１２０ｋＤａの位置の高分子量ｅｎｖ−２Ａ−ＧＦＰｍ融合タンパク質により示されるように、抗ＧＦＰ抗体を用いて、ＲＲＶ−Ｆ２Ａ−ＧＦＰｍ、ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ＧＦＰｍ、およびＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ＧＦＰｍ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｆ２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｆ２Ａ−ＧＦＰｍがウイルスエンベロープタンパク質から非効率的に分離されたことを示す（図１０）。対照的に、ウイルスエンベロープタンパク質からのＧＦＰｍの分離は、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰからの分離に比べて、ＲＲＶ−Ｅ２Ａ−ＧＦＰｍ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＦＰｍベクターに対し比較的効率的であった（図１０）。同時に、感染Ｕ８７−ＭＧ中のウイルスエンベロープタンパク質のプロセッシングを、抗ｇｐ７０抗体を使って調査した。結果は、プリカーサー（Ｐｒ８５）またはプロセッシング形態（ｇｐ７０）でエンベロープウイルスが、ＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍベクターの全てで検出されたことを示し（図１１）、抗ＧＦＰ免疫ブロットで認められるように、ＧＦＰｍからのウイルスエンベロープタンパク質の分離を示唆する。さらに、抗ｇｐ７０ブロットで観察された分離効率は、抗ＧＦＰ免疫ブロットで観察されたものとある程度一致する。融合ポリタンパク質、Ｅｎｖ−ＧＦＰｍのタンパク質発現は、ＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍベクター間で変動するが、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ＧＦＰｍは、抗ＧＦＰおよび抗ｇｐ７０両方の免疫ブロットにおいて、ウイルスエンベロープ−ＧＦＰｍ融合ポリタンパク質が検出されないこ��により示されるように、最も効率的に分離するように見える。
【０１２６】
実施例６：適切にプロセッシングされたウイルスエンベロープタンパク質の組み込みのレベルは、ウイルスエンベロープとＧＦＰｍタンパク質との間の分離効率と関連する。
最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞由来のＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍからのウイルス上清を、２０％ショ糖勾配により１４０００ｒｐｍ、４℃で３０分間ペレット化し、続けて、５％の２−メルカプトエタノールを含む２０μＬの１ｘＬａｅｍｍｌｉバッファー中に再懸濁し、４〜２０％トリスグリシンゲル（ＢｉｏＲａｄ）を用いたＳＤＳ  ＰＡＧＥに供した。電気泳動およびタンパク質転写を記載されているように行った。適切にプロセッシングされたバイロン結合ウイルスエンベロープタンパク質発現を、抗ｇｐ７０（ラット産生抗ｇｐ７０、クローン８３Ａ２５；１：５００希釈）および抗ｐ１５Ｅ（マウス産生抗ＴＭ、クローン３７２；１：２５０希釈）を用いて調査した。タンパク質発現を、対応する西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体を使って検出した。データは、ＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍの適切にプロセッシングされたエンベロープタンパク質、ｇｐ７０およびｐ１２Ｅ／ｐ１５Ｅは、ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ＧＦＰｍベクターを除いて、ビリオン中のＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰのレベルと同等のレベルで検出されたことを示す（図１２）。予想通り、最低レベルのビリオン結合エンベロープタンパク質を示したＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ＧＦＰｍは、細胞ライセート中で最高レベルの融合ポリタンパク質を発現した。発表されたデータと一致して、このデータは、プロセッシングされていないエンベロープタンパク質前駆体タンパク質Ｐｒ８５またはこの場合、ウイルスエンベロープ−ＧＦＰｍ融合ポリタンパク質は、ビリオン中に組み込まれないという表現を支持する。さらに、最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から生成された力価により示されるように、「融合性」ｐ１２Ｅに繋がる２Ａペプチドを有するＲペプチドの切断もまた、ビリオン成熟中に感染性ウイルス粒子を生成するのに十分であるように見える（図７）。感染中の膜融合におけるｐ１５Ｅ／ｐ１２Ｅ比率の性質とその役割は、明らかではない。全体として、このデータは、ウイルスエンベロープタンパク質組み込みのレベルは、標的細胞で測定された力価値とは相関しないことを示唆する。予想外のベクター間、特に、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＦＰｍおよびＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ＧＦＰｍベクター間の力価値の差異の欠如は、一連のエンベロープ発現レベルが、ＲＲＶ粒子に対し、これらの細胞の力価に影響を与えることなく許容できることを示唆する。
【０１２７】
実施例７：２９３Ｔ細胞から産生したＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２ベクターは感染性であり、ｙＣＤ２タンパク質を発現する。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの１８〜２０時間前に、１０ｃｍプレート当たり２ｅ６細胞で播種した。次の日、ｐＡＣ３−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２、ｐＡＣ３−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２、ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２、ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２プラスミドを使って、細胞播種２０時間後に、リン酸カルシウム法を使って、２０μｇのプラスミドＤＮＡの一時的トランスフェクションを行った。トランスフェクションの１８時間後、細胞をＤＭＥＭ完全培地で３回洗浄し、新しい完全培地でインキュベートした。トランスフェクションの約４２時間後にウイルス上清を収集し、０．４５μｍのシリンジフィルターを通して濾過した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一時的トランスフェクションからのＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２、ＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２のウイルス力価を、前述のようにして（Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２年）測定した。簡単に説明すると、ベクターの単一サイクル感染により、ＰＣ３細胞に対しベクター調製物の力価を測定した。単一サイクル感染は、感染の２４時間後のアジドチミジン処理、およびそれに続く、感染の４８時間後にウイルスベクターＤＮＡに特異的な標的細胞ゲノムＤＮＡの定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行い（ＭＬＶ  ＬＴＲプライマーセット；５−ＭＬＶ−Ｕ３−Ｒ（５’−ＡＧＣＣＣＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＡＣＴＣ−３’（配列番号２０））、３−ＭＬＶ−Ｐｓｉ（５’−ＴＣＴＣＣＣＧＡＴＣＣＣＧＧＡＣＧＡ−３’（配列番号２１））、およびプローブ（５’−ＦＡＭ−ＣＣＣＣＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＣＣＣＣＣＧＣＴＧＡＣＧ−ＢＨＱ１−３’（配列番号２２））、細胞ゲノム当たりのウイルス性ＤＮＡコピー数を定量することにより保証された。ミリリットル当たりの形質導入単位（ＴＵ）（ＴＵ／ｍＬ）で報告されるウイルス力価を、２ｘ１０７コピー〜２ｘ１０１コピーの範囲のプラスミドＤＮＡの検量線および既知の量のゲノムＤＮＡ入力、細胞数、および反応混合物当たりのウイルスストックの希釈から導出される閾値サイクル（ＣＴ）値を計算することにより決定した。表５は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から産生したＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２、ＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２、およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２の力価がＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２の力価と同等であることを示す。
【０１２８】
【表５】
2018526007.tif 000009
【０１２９】
さらに、最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から集めたウイルス上清を、記載されているように力価を測定し、それらが感染性を持続することを確実にした。力価用に使用したプライマーセットは、５−ＭＬＶ−Ｕ３−Ｒ、３−ＭＬＶ−Ｐｓｉプライマーおよびプローブを含むプライマーセットと類似のプライミング効率を有する。感染Ｕ８７−ＭＧ細胞からのＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２、ＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２ベクターの力価測定に使用されるプライマーセットは：Ｅｎｖ２に対して：５’−ＡＣＣＣＴＣＡＡＣＣＴＣＣＣＣＴＡＣＡＡＧＴ−３’（配列番号２５），Ｅｎｖ２逆方向：５’−ＧＴＴＡＡＧＣＧＣＣＴＧＡＴＡＧＧＣＴＣ−３’（配列番号２６）およびプローブ５’−ＦＡＭ−ＣＣＣＣＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＣＣＣＣＣＧＣＴＧＡＣＧ−ＢＨＱ１−３’（配列番号２７）である。図１３は、最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から得た力価は、一時的トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から得た力価と類似であり、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２ベクター間で同等であることを示す。
【０１３０】
実施例８：感染Ｕ８７−ＭＧ細胞中の、ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２ベクターのウイルスエンベロープおよびｙＣＤ２タンパク質は、異なる効率でプロセッシングされる。
ｙＣＤ２発現、ｙＣＤ２タンパク質のウイルスエンベロープタンパク質からの分離効率、およびウイルスエンベロープタンパク質の適切なプロセッシングを評価するために、感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から細胞ライセートを生成した。最大感染力のＵ８７−ＭＧ細胞、集密的細胞単層を１ｘＰＢＳで１回洗浄し、ＴｒｐＺｅａｎ（Ｓｉｇｍａ）により解離させ、完全ＤＭＥＭに再懸濁し、再度１ｘＰＢＳで洗浄後、２００μＬのＲＩＰＡリシスバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で３０分間氷上で細胞溶解した。１４，０００ｒｐｍ、４℃で１５分の遠心分離によりライセートの壊死細胞片を除去し、上清を収集し、新しいチューブに移した。次に、細胞ライセートのタンパク質濃度を、ＢＣＡ沈殿アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使ってアッセイし、２０μｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。タンパク質を４〜１２％ＸＴトリスＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＢｉｏＲａｄ）上、２００ボルトで４５分間分離した。その後、タンパク質を、ｉＢｌｏｔドライブロッティングシステムを使って、２０ボルトで７分間、ＰＶＤＦ膜（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上に移した。膜の、エンベロープタンパク質のｇｐ７０サブユニットおよびｙＣＤ２の発現を、抗ｇｐ７０（ラット抗ｇｐ７０、クローン８３Ａ２５；１：５００希釈）および抗ｙＣＤ２（マウス抗ｙＣＤ２；１：１０００希釈）を使ってアッセイした。タンパク質発現を、対応する西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体を使って検出した。結果は、約１１０ｋＤａの位置の高分子量ｅｎｖ−２Ａ−ｙＣＤ２融合タンパク質により示されるように、抗ｙＣＤ２抗体を用いて、ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２がウイルスエンベロープタンパク質から非効率的に分離されたことを示す（図１４）。対照的に、ウイルスエンベロープタンパク質からのｙＣＤ２タンパク質の分離は、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２からの分離に比べて、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２に対し比較的効率的であった（図１４）。同時に、感染Ｕ８７−ＭＧ中のウイルスエンベロープタンパク質のプロセッシングを、抗ｇｐ７０抗体を使って調査した。結果は、プリカーサー（Ｐｒ８５）またはプロセッシング形態（ｇｐ７０）のエンベロープウイルスは、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２ベクター中で容易に検出可能であるが、ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２ベクター中ではそのレベルは遥かに低いことを示した（図１５）。さらに、Ｐｒ８５／ｇｐ７０ウイルスエンベロープタンパク質のレベルは、抗ｙＣＤ２免疫ブロットで観察されたものとある程度一致する。しかし、ＲＲＶ−２Ａ−ＧＦＰｍまたはＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ＧＦＰｍベクターとは異なり、ウイルスエンベロープ−ｙＣＤ２融合ポリタンパク質は、抗ｇｐ７０抗体または抗２Ａ抗体（カタログ番号ＡＢＳ３１、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使って検出できなかった。４つのベクター中で、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２ベクターは、抗ｙＣＤ２免疫ブロットでウイルスエンベロープ−ｙＣＤ２融合ポリタンパク質が検出されないことにより示されるように、最も効率的な融合ポリタンパク質の分離を示した。全体として、データは、ＧＳＧ−Ｐ２ＡおよびＧＳＧ−Ｔ２Ａ構成は、ＲＲＶエンベロープタンパク質読み枠との関連では、最も効率的なポリタンパク質分離を生ずることを示唆する。
【０１３１】
実施例９：ＲＲＶ−Ｇ２Ｇ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２はＵ８７−ＭＧ細胞中で長期安定性を有する。
連続感染を実施し、Ｕ８７−ＭＧ細胞中のＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２の長期ベクター安定性を評価した。最初に、６ウエルプレートに播種した約１０５の未処理のＵ８７−ＭＧ細胞を０．１のＭＯＩでウイルスベクターに感染させ、１週間培養し、１感染サイクルを完了した。完全感染細胞由来の２ｍｌの内の１００μＬのウイルス上清を使って、１０５の未処理細胞に感染させ、１６サイクルまで反復した。ゲノムＤＮＡを、４００μLの１ｘＰＢＳに再懸濁することにより小ペレットから抽出し、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｘｗｅｌｌ  １６  Ｃｅｌｌ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使って単離した。その後、１００ナノグラムのゲノムＤＮＡをＰＣＲ用のテンプレートとして、導入遺伝子カセット全体をカバーする次のプライマー対と共に使用する：ＩＲＥＳ−Ｆ（５’−ＣＴＧＡＴＣＴＴＡＣＴＣＴＴＴＧＧＡＣＣＴＴＧ−３’（配列番号２３））およびＩＲＥＳ−Ｒ（５’−ＣＣＣＣＴＴＴＴＴＣＴＧＧＡＧＡＣＴＡＡＡＴＡＡ−３’（配列番号２４））。感染細胞由来の組み込まれたプロウイルスのＰＣＲ増幅により、２Ａ−ｙＣＤ２領域のベクター安定性を評価する。予測ＰＣＲ産物サイズは約０．７３ｋｂである。０．７３ｋｂよりも小さい何らかのバンドが現れることは、２Ａ−ｙＣＤ２領域中の欠失を示す。図１６Ａは、以前に報告したように、ＲＲＶ−ｙＣＤ２中のＩＲＥＳ−ｙＣＤ２（１．２ｋｂ）領域は１６感染サイクルまで安定である（Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２年）ことを示す。同様に、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２の両方の２Ａ−ｙＣＤ２領域はまた、１６感染サイクルまで安定性が継続する。しかし、１３感染サイクルから現れた欠失（０．４ｋｂ）からわかるように、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２中の２Ａ−ｙＣＤ２領域は、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２よりもわずかに安定性が低いが、全１６サイクルを通して安定性が継続する（図１６Ｂおよび１６Ｃ）。
【０１３２】
実施例１０：適切にプロセッシングされたウイルスエンベロープタンパク質の組み込みは、ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２ベクターに感染したＵ８７−ＭＧ細胞中のウイルスエンベロープとｙＣＤ２タンパク質との間の分離効率と関連する。
ＲＲＶ−２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−２Ａ−ｙＣＤ２最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から産生したウイルス上清を、２０％ショ糖勾配により１４０００ｒｐｍ、４℃で３０分間ペレット化し、続けて、５％の２−メルカプトエタノールを含む２０μＬの１ｘＬａｅｍｍｌｉバッファー中に再懸濁し、４〜２０％トリスグリシンゲル（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＣＡ）を用いたＳＤＳ  ＰＡＧＥに供した。電気泳動およびタンパク質転写を記載のように行った。適切にプロセッシングされたビリオンウイルスエンベロープタンパク質発現および成熟を、抗ｇｐ７０（ラット産生抗ｇｐ７０、クローン８３Ａ２５；１：５００希釈）および抗ｐ１５Ｅ（マウス産生抗ＴＭ、クローン３７２；１：２５０希釈）を用いてアッセイした。タンパク質発現を、対応する西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体を使って検出した。データは、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２の適切にプロセッシングされたエンベロープタンパク質、ｇｐ７０は、ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２を除いて、ビリオン中のＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２のレベルと同等のレベルで検出されたことを示す（図１７）。
【０１３３】
重要なのは、このデータは、適切にプロセッシングされたウイルスエンベロープタンパク質組み込みのレベルが、力価値とは相関しないことを示唆していることである。
【０１３４】
実施例１１：ｙＣＤ２タンパク質発現レベルは、ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２感染Ｕ８７−ＭＧ細胞で変動するが、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２感染Ｕ８７−ＭＧ細胞と同等の５−ＦＣ感受性を示した。
ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２の免疫ブロットは、ウイルスエンベロープタンパク質から分離されたタンパク質としてまたは融合ポリタンパク質として発現したｙＣＤ２タンパク質の量が感染Ｕ８７−ＭＧ細胞中で変動することを示したので、それらの５−ＦＣ感受性を、ＬＤ５０実験を実施することにより測定した。ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２ベクター最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞を使って、ＭＴＳアッセイによりそれらの５−ＦＣ  ＬＤ５０を測定した。それぞれの感染または非感染Ｕ８７−ＭＧ細胞系に対し、１ｘ１０３細胞／ウエル／１００μＬの培地で、９６ウエルプレートに３回繰り返して播種した。細胞を、０．００００１ｍＭ〜１ｍＭの範囲の１：１０系列希釈により５−ＦＣ（カタログ番号Ｆ７１２９、Ｓｉｇｍａ）で処理した。５−ＦＣ処理をしないものは、対照として含めなかった。播種１日後、５−ＦＣを加えた後、完全培地＋５−ＦＣを２日毎に補充した。未処理Ｕ８７−ＭＧ細胞を、５−ＦＣの非５−ＦＵ媒介細胞傷害性効果を決定するために、対照として含めた。７日間のインキュベーション時間にわたり細胞をモニターし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、細胞死を２日毎に測定した。ＭＴＳの添加後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００（Ｔｅｃａｎ）プレートリーダーを用いて、ＭＴＳインキュベーションの６０分後に、４９０ｎｍでのＯＤ値を取得した。各試料の３回の繰り返しからの平均ＯＤ値を、未処理であるがＲＲＶ感染している細胞に対する、細胞生存のパーセンテージに変換した。その後、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｍを使って、パーセンテージ値を５−ＦＣ濃度に対しｌｏｇスケールでプロットして、ＬＤ５０グラフを生成した。ＬＤ５０値を、取得データポイントの非線形４パラメーターフィットを使ってソフトウェアにより計算した。データは、「分離」ｙＣＤ２タンパク質のレベルは、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２感染Ｕ８７−ＭＧ細胞で、ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２感染Ｕ８７−ＭＧ細胞より高く、ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２感染Ｕ８７−ＭＧ細胞で観察されたウイルスエンベロープウイルスエンベロープ−ｙＣＤ２融合ポリタンパク質は、５−ＦＣの５−ＦＵ変換して、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２に類似のＬＣ５０濃度で細胞傷害性効果を得る点で酵素的に活性であることを示す（図１８）。
【０１３５】
実施例１２：ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２感染Ｔｕ２４４９細胞は、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２と同等の５−ＦＣ感受性を示した。
ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２による最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞を使って、記載されているように、ＭＴＳアッセイにより、その５−ＦＣ  ＬＤ５０を測定した。ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２を対照として含めた。０．００００１ｍＭ〜１ｍＭの範囲の１：１０系列希釈した５−ＦＣ（カタログ番号Ｆ７１２９、Ｓｉｇｍａ）による処理を使用した。５−ＦＣ処理をしないものは、対照として含めなかった。播種１日後、５−ＦＣを加えた後、完全培地＋５−ＦＣを２日毎に補充した。未処理Ｕ８７−ＭＧ細胞を、５−ＦＣの非５−ＦＵ媒介細胞傷害性効果を決定するために、対照として含めた。７日間のインキュベーション時間にわたり細胞をモニターし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、細胞死を２日毎に測定した。ＭＴＳの添加後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００（Ｔｅｃａｎ）プレートリーダーを用いて、ＭＴＳインキュベーションの６０分後に、４９０ｎｍでのＯＤ値を取得した。各試料の３回の繰り返しからの平均ＯＤ値を、未処理あるがＲＲＶ感染している細胞に対する、細胞生存のパーセンテージに変換した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｍを使って、パーセンテージ値を５−ＦＣ濃度に対しｌｏｇスケールでプロットして、ＬＤ５０グラフを生成した。ＬＤ５０値を、取得データポイントの非線形４パラメーターフィットを使ってソフトウェアにより計算した。データは、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２感染Ｔｕ−２４４９細胞により発現したｙＣＤ２タンパク質（図２０Ａ）は、５−ＦＣの５−ＦＵ変換して、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２に類似のＬＣ５０濃度で細胞傷害性効果を得る点で酵素的に活性であることを示す（図２０Ｂ）。
【０１３６】
実施例１３：ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２処理の皮下、同系神経膠腫マウスは、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２と同等の腫瘍増殖の遅延を示した。
同系細胞系Ｔｕ−２４４９を、Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウス中の同所性脳腫瘍モデル（Ｏｓｔｅｒｔａｇら，２０１２年）として使用した。Ｔｕ−２４４９細胞の亜系統（Ｔｕ−２４４９ＳＱ）を皮下腫瘍モデリング用に樹立した。９８％の未処理Ｔｕ−２４４９ＳＱ細胞および２％のＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２感染Ｔｕ−２４４９ＳＱ細胞の混合物を、インビトロで調製し、皮下腫瘍埋め込みのために、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）中に再懸濁した。９８％の未処理Ｔｕ−２４４９ＳＱ細胞および２％のＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２感染Ｔｕ−２４４９ＳＱ細胞の混合物をポジティブコントロールならびにコンパレータとして含めた。各群のＢ６Ｃ３Ｆ１マウス（群当たりｎ＝１０匹）は、０日目に１ｘ１０６腫瘍細胞の皮下埋め込みを受ける。腫瘍埋め込み後１２日目（この時点で約７５％を超える腫瘍がＲＲＶに感染）に、マウスにＰＢＳまたは５−ＦＣ（５００ｍｇ／ｋｇ体重／単回用量を腹腔内にｂ．ｉ．ｄ．投与）を４５連続日投与し、続けて、薬物なしで２日間、残りの感染細胞からベクターを拡散させる。５日オン、２日オフ薬剤処理サイクルをさらに２回繰り返した。腫瘍体積測定を毎日実施した。結果は、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２またはＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａを有し、５−ＦＣ処理をしないマウスの腫瘍は、増殖を続けることを示す。対照的に、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａを保持し、その後５−ＦＣ処理したマウスの腫瘍は、事前定着腫瘍の腫瘍増殖が遅延し、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２＋５−ＦＣで処理したものと同等である（図２１）。データは、皮下同系神経膠腫マウスモデルにおいて、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２は、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２と同等の治療効力を有することを示唆する。
【０１３７】
実施例１４：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から産生したＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２−ＧＳＧ−ＰＳ２−ＧＭＣＳＦベクターは、ＧＭＣＳＦおよびｙＣＤ２タンパク質を発現し、感染性である。
それぞれ５‘および３’末端に存在するＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位を用いて化学的に合成した（Ｇｅｎｅｗｉｚ）ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＭＣＳＦは、ヒトＧＭＣＳＦ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびｙＣＤ２−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＭＣＳＦカセットの、ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化されたｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２バックボーンへのクローニングにより生成された。得られたＧＭＣＳＦ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびｙＣＤ２−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＭＣＳＦカセットは、カセットのＮ−末端（ＡｓｃＩ制限酵素部位の５’上流）でＧＳＧ−Ｔ２Ａとインフレームである。
【０１３８】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの１８〜２０時間前に、１０ｃｍプレート当たり２ｅ６細胞で播種した。次の日、２０μｇのｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２またはｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＭＣＳＦプラスミドを使って、細胞播種２０時間後に、リン酸カルシウム法を使って、一時的トランスフェクションを行った。トランスフェクションの１８時間後、細胞をＣＭＥＭ培地で３回洗浄し、新しい完全培地でインキュベートした。トランスフェクションの約４２時間後にウイルス上清を収集し、０．４５μｍのシリンジフィルターを通して濾過した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一時的トランスフェクションからのＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２のウイルス力価を、記載されているように測定した。データは、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＭＣＳＦの力価（約２Ｅ６  ＴＵ／ｍＬ）は、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２と同等であることを示す。
【０１３９】
ｙＣＤ２タンパク質発現２を評価するために、ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２またはｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＭＣＳＦの一時的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞から、細胞ライセートを生成した。この実験では、ｐＡＣ３−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２およびｐＡＣ３−ＩＲＥＳ−ＧＭＣＳＦも、対照として含めた。ＧＭＣＳＦ発現に対しては、ＥＬＩＳＡ測定（カタログ番号ＤＧＭ００、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）のために、上清の一時的トランスフェクト２９３Ｔ細胞を集めた。全細胞ライセートに対し、記載されているように、ｙＣＤ２タンパク質発現のアッセイを行った。抗ｙＣＤ２結果は、約１５ｋＤａのバンドにより示されるように、ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２またはｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＭＣＳＦ由来のｙＣＤ２タンパク質は、ＧＭＣＳＦから効率的に分離されることを示す（図２２Ａ）。しかし、両配置における２Ａペプチドにより媒介された、ＧＭＣＳＦ（ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２）から、またはウイルスエンベロープタンパク質（ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＭＣＳＦ）からのｙＣＤ２の分離は、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２からのｙＣＤ２に比較して、ｙＣＤ２のサイズにより示されるように、ＧＭＣＳＦからのｙＣＤ２タンパク質の適切な分離が理由となって、極めて異なっている（図２２Ａ）。対照的に、ウイルス性ｅｎｖからのｙＣＤ２タンパク質分離は、わずかに高い分子量を有し（図２２Ａでは２Ａ−ｙＣＤ２と表記）、図１０および図１４に示すＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＦＰ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＦＰ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２構築物のものと一致する。データは、ＥｎｖからのｙＣＤ２分離は、理論的に予測されるアミノ酸配列で正確には起こらない可能性があることを示唆する。しかし、ｙＣＤ２が別の分泌タンパク質（すなわち、ＧＭＣＳＦ）の下流に配置される場合、適切なｙＣＤ２タンパク質の分離が観察される。しかし、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２から発現された２Ａ−ｙＣＤ２タンパク質の酵素活性は、インビトロおよびインビボの両方で、５−ＦＣ感受性および細胞傷害性効果に影響しないように見えることに留意することは重要である（図２０）。
【０１４０】
ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２構築物中のウイルスエンベロープタンパク質からの、またはｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＭＣＳＦ構築物中のｙＣＤ２からのＧＭＣＳＦタンパク質の分離効率は未確認であるが、ＧＭＣＳＦのＥＬＩＳＡ結果は、分泌ＧＭＣＳＦの量は、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２では約５００ｎｇ／ｍＬであり、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＭＣＳＦでは約７６０ｎｇ／ｍＬであることを示す（図２２Ｂ）。両方のケースで、発現したＧＭＣＳＦの量は、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ＧＭＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）より約２０倍〜３０倍多い。同時に、感染Ｕ８７−ＭＧ中のウイルスエンベロープタンパク質のプロセッシングを、抗ｇｐ７０抗体を使って調査する。結果は、プリカーサー（Ｐｒ８５）またはプロセッシング形態（ｇｐ７０）中で、ウイルスエンベロープタンパク質が容易に検出できることを示す。全体として、データは、Ｅｎｖ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＥｎｖ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＭＣＳＦポリタンパク質配置の両方は、ＧＭＣＳＦおよびｙＣＤ２タンパク質を発現できることを示唆する。
【０１４１】
さらに、最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から集めたウイルス上清を、記載されているように力価を測定し、ウイルスが感染性を持続することを確実にする。データは、最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から得た力価（約３Ｅ６  ＴＵ／ｍＬ）は、一時的トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から得た力価と類似であり、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２と同等であることを示す。
【０１４２】
実施例１５：ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２−Ｐ２Ａ−ＧＭＣＳＦベクターは、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２感染Ｕ８７−ＭＧ細胞と同等の５−ＦＣ感受性を示す。
ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２またはＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＭＣＳＦによる最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞を使って、記載されているように、ＭＴＳアッセイにより、その５−ＦＣ  ＬＤ５０を測定する。ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２を対照として含める。データは、感染Ｕ８７−ＭＧ細胞中で検出された「分離」ｙＣＤ２タンパク質の量は、０．００８ｍＭのＬＤ５０濃度で細胞傷害性効果を達成することができ、これはＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２に類似であることを示す。
【０１４３】
実施例１６：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞および最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から産生したＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−ＲＳＶ−ｙＣＤ２およびベクターは、感染性であり、ＧＭＣＳＦおよびｙＣＤ２タンパク質を発現する。
それぞれ５‘および３’末端に存在するＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位を用いて化学的に合成した（Ｇｅｎｅｗｉｚ）ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−ＲＳＶ−ｙＣＤ２は、ヒトＧＭＣＳＦ−ＲＳＶ−ｙＣＤ２カセットの、ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化されたｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２バックボーンへのクローニングにより生成された。化学的に合成したＧＭＣＳＦ−ＲＳＶ−ｙＣＤ２カセットは、ＧＭＣＳＦ  ＯＲＦの３’末端に停止コドンを含む。
【０１４４】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの１８〜２０時間前に、１０ｃｍプレート当たり２ｅ６細胞で播種する。次の日、２０μｇのｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−ＲＳＶ−ｙＣＤ２プラスミドを使って、細胞播種２０時間後に、リン酸カルシウム法を使って、一時的トランスフェクションを行う。トランスフェクションの１８時間後、細胞をＤＭＥＭ培地で３回洗浄し、新しい完全培地でインキュベートした。トランスフェクションの約４２時間後にウイルス上清を収集し、０．４５μｍのシリンジフィルターを通して濾過した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一時的トランスフェクションからのＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−ＲＳＶ−ｙＣＤ２のウイルス力価を、記載されているように測定した。データは、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−ＲＳＶ−ｙＣＤ２の力価（約２Ｅ６  ＴＵ／ｍＬ）は、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２と同等であることを示す。
【０１４５】
さらに、最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から集めたウイルス上清の力価を測定し、ウイルスが感染性を持続することを確実にする。データは、最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から得た力価（約２Ｅ６  ＴＵ／ｍＬ）は、一時的トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から得た力価と類似であり、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２と同等であることを示す。
【０１４６】
ＧＭＣＳＦおよびｙＣＤ２タンパク質発現を評価するために、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−ＲＳＶ−ｙＣＤ２感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から細胞ライセートを生成する。この実験では、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２およびＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ＧＭＣＳＦを対照として含めた。最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞からの上清を、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によるＧＭＣＳＦのタンパク質発現レベルの測定用に収集する。全細胞ライセートに対し、記載されているように、ｙＣＤ２タンパク質発現のアッセイを行う。抗ｙＣＤ２免疫ブロット結果は、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−ＲＳＶ−ｙＣＤ２感染Ｕ８７−ＭＧ細胞からのｙＣＤ２タンパク質は、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２よりも約２〜３倍少ないレベルで発現することを示す。同時に、感染Ｕ８７−ＭＧ中のウイルスエンベロープタンパク質のプロセッシングを、抗ｇｐ７０抗体を使って調査する。結果は、プリカーサー（Ｐｒ８５）またはプロセッシング形態（ｇｐ７０）中で、ウイルスエンベロープタンパク質が容易に検出できることを示す。予想通り、ウイルスエンベロープ−ＧＭＣＳＦ融合ポリタンパク質は、抗ｇｐ７０抗体を使って細胞ライセート中でも検出される。ウイルスエンベロープタンパク質からのＧＭＣＳＦタンパク質の分離は未確定であるが、ＧＭＣＳＦのＥＬＩＳＡ結果は、分泌ＧＭＣＳＦの量は、約３００ｎｇ／ｍＬであり、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ＧＭＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）より約１０倍大きいことを示す。全体として、データは、ウイルスエンベロープタンパク質−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−ＲＳＶ−ｙＣＤ２ポリタンパク質配置は、ＲＲＶの存在下で、感染性ウイルスに加えて、ＧＭＣＳＦおよびｙＣＤ２タンパク質も同様に産生できることを示唆する。
【０１４７】
実施例１７：ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−ＲＳＶ−ｙＣＤ２ベクターは、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２感染Ｕ８７−ＭＧ細胞と同等の５−ＦＣ感受性を示す。
ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−ＲＳＶ−ｙＣＤ２ベクターによる最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞を使って、記載されているように、ＭＴＳアッセイにより、その５−ＦＣ  ＬＤ５０を測定する。この実験では、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２を対照として含める。データは、感染Ｕ８７−ＭＧ細胞で発現したｙＣＤ２タンパク質の量は、０．０１０ｍＭのＬＤ５０濃度で細胞傷害性効果を達成することができ、これはＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２と同等であることを示す。
【０１４８】
実施例１８：２９３Ｔ細胞および感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から産生したＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２−ＲＳＶ−ＰＤＬ１ｍｉＲ３０ｓｈＲＮＡベクターは、感染性であり、ｙＣＤ２タンパク質を発現する。
ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２−ＲＳＶ−ｍｉＲＰＤＬ１は、それぞれ５‘および３’末端に存在するＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位を用いて化学的に合成した（Ｇｅｎｅｗｉｚ）ヒトｙＣＤ２−ＲＳＶ−ｍｉＲＰＤＬ１カセットの、ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化されたｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２バックボーンへのクローニングにより生成された。化学的に合成したｙＣＤ２−ＲＳＶ−ｍｉＲＰＤＬ１カセットは、ｙＣＤ２  ＯＲＦの末端に停止コドンを含む。
【０１４９】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの１８〜２０時間前に、１０ｃｍプレート当たり２ｅ６細胞で播種する。次の日、２０μｇのｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２−ＲＳＶ−ｍｉＲＰＤＬ１プラスミドを使って、細胞播種２０時間後に、リン酸カルシウム法を使って、一時的トランスフェクションを行う。トランスフェクションの１８時間後、細胞をＤＭＥＭ培地で３回洗浄し、新しい完全培地でインキュベートした。トランスフェクションの約４２時間後にウイルス上清を収集し、０．４５μｍのシリンジフィルターを通して濾過した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一時的トランスフェクションからのＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２−ＲＳＶ−ｍｒＲＰＤＬ１のウイルス力価を、記載されているように測定した。データは、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２−ＲＳＶ−ｍｉＲＰＤＬ１の力価（約２Ｅ６  ＴＵ／ｍＬ）は、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２と同等であることを示す。
【０１５０】
さらに、最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から集めたウイルス上清の力価を測定し、ウイルスが感染性を持続することを確実にする。データは、最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から得た力価（約２Ｅ６  ＴＵ／ｍＬ）は、一時的トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から得た力価と類似であり、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２と同等であることを示す。
【０１５１】
ｙＣＤ２タンパク質の発現およびＰＤＬ１細胞表面発現を測定するために、最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞を採取し、全細胞ライセートに対し、記載されているように、ｙＣＤ２タンパク質発現のアッセイを行う。抗ｙＣＤ２免疫ブロット結果は、抗ｙＣＤ２抗体を使った約１５ｋＤａのバンドにより示されるように、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２−ＲＳＶーｍｉＲＰＤＬ１感染Ｕ８７−ＭＧ細胞からのｙＣＤ２タンパク質は、ウイルスエンベロープタンパク質から効率的に分離することを示す。予想通り、ウイルスエンベロープ−ｙＣＤ２融合ポリタンパク質は、抗ｙＣＤ２および抗ｇｐ７０抗体の両方を使って細胞ライセート中でも検出される。同時に、感染Ｕ８７−ＭＧ中のウイルスエンベロープタンパク質のプロセッシングを、抗ｇｐ７０抗体を使って調査する。結果は、プリカーサー（Ｐｒ８５）またはプロセッシング形態（ｇｐ７０）中で、ウイルスエンベロープタンパク質が容易に検出できることを示す。さらに、抗ｙＣＤ２免疫ブロットで認められるように、融合ポリタンパク質は検出される。
【０１５２】
実施例１９：ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２−ＲＳＶ−ｍｉＲＰＤＬ１感染Ｕ８７−ＭＧ細胞は、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２感染Ｕ８７−ＭＧ細胞と同等の５−ＦＣ感受性を示す。
ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２−ＲＳＶ−ｍｉＲＰＤＬ１ベクターによる最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞を使って、記載されているように、ＭＴＳアッセイにより、その５−ＦＣ  ＬＤ５０を測定する。この実験では、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２を対照として含める。データは、感染Ｕ８７−ＭＧ細胞中で検出された「分離」ｙＣＤ２タンパク質の量は、ＬＤ５０濃度（０．００８ｍＭ）で細胞傷害性効果を達成することができ、これはＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２と同等であることを示す。
【０１５３】
実施例２０：ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２−ＲＳＶ−ｍｉＲＰＤＬ１感染ＭＤＡーＭＢ２３１細胞は、細胞表面上のＰＤ−Ｌ１の強力なノックダウンを示す。
ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２−ＲＳＶ−ｍｉＲＰＤＬ１のＰＤＬ１ノックダウン活性を評価するために、０．１のＭＯＩを使って、ＭＤＡーＭＢ２３１細胞に感染させる。この細胞は、顕著なレベルのＰＤＬ１を発現することが明らかになっている。この実験では、ＲＲＶ−ＲＳＶ−ｍｉＲＰＤＬ１を、ＰＤＬ１ノックダウン活性を評価するためのポジティブコントロールとして含める。感染後の約１４日目に、細胞を採取し、細胞表面染色を行ってＰＤＬ１タンパク質のレベルをＦＡＣＳにより測定する。データは、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２−ＲＳＶ−ｍｉＲＰＤＬ１感染ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞のＰＤＬ１の細胞表面発現が、約７５％低減し、これはＲＲＶ−ＲＳＶ−ｍｉＲＰＤＬ１と同等であることを示す。全体として、データは、ウイルスエンベロープタンパク質−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２−ＲＳＶ−ｍｉＲＰＤＬ１配置は、ＲＲＶの存在下で、感染性ウイルス、ｙＣＤ２タンパク質およびｍｉＲＰＤＬ１を産生できることを示唆する。
【０１５４】
実施例２１：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞および最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から産生したＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯベクターは、感染性であり、ＴＫＯタンパク質を発現する。
ｐＡＣ３−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ｐＡＣ３−Ｔ２Ａ−ＴＫＯおよびｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯをヒトコドン最適化（ＴＫＯ）（国際公開第２０１４／０６６７００号、参照により本明細書に組み込まれる）カセットを有するＳｒ３９−ｔｋ（Ｂｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１：３０２２−３０２６，２００１年；Ｋｏｋｏｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１：２２６７−２２７２，２００２年）のｐＡＣ３−２Ａバックボーンへのクローニングにより生成した。ＴＫＯの配列を、それぞれ５‘および３’末端に存在するＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位を用いて化学的に合成し（Ｇｅｎｅｗｉｚ）、ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化されたｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２またはｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２バックボーンへ挿入した。
【０１５５】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの１８〜２０時間前に、１０ｃｍプレート当たり２ｅ６細胞で播種した。次の日、２０μｇのｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯまたはｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯプラスミドを使って、細胞播種２０時間後に、リン酸カルシウム法を使って、一時的トランスフェクションを行った。トランスフェクションの１８時間後、細胞をＤＭＥＭ培地で３回洗浄し、新しい完全培地でインキュベートした。トランスフェクションの約４２時間後にウイルス上清を収集し、０．４５μｍのシリンジフィルターを通して濾過した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一時的トランスフェクションからのＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯのウイルス力価を、記載されているように測定した。データは、力価は、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２と同等であることを示す（表６）。
【表６】
2018526007.tif 000010
【０１５６】
さらに、最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から集めたウイルス上清を、記載されているように力価を測定し、ウイルスが感染性を持続することを確実にする。データは、最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から得た力価は、一時的トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から得た力価と同等であることを示す（図２３）。
【０１５７】
ＴＫＯタンパク質発現を評価するために、ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯ感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から細胞ライセートを生成した。全細胞ライセートに対し、１：２００で抗ＨＳＶ−ｔｋ抗体（カタログ番号ｓｃ２８０３７、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ）を使ってＴＫＯタンパク質発現をアッセイした。結果は、ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯおよびＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯ感染Ｕ８７−ＭＧ細胞からのＴＫＯタンパク質は、以前にＧＦＰおよびｙＣＤ２導入遺伝子で認められたように、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯより低い効率で分離される（図２４）ことを示す。
【０１５８】
実施例２２：ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯベクターはＵ８７−ＭＧ細胞中で安定である。
最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞中のベクター安定性を評価するために、ゲノムＤＮＡを、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｘｗｅｌｌ  １６  Ｃｅｌｌ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使って細胞から抽出した。その後、１００ナノグラムのゲノムＤＮＡをＰＣＲ用のテンプレートとして、以前に記載されたように、導入遺伝子カセット全体をカバーする次のプライマー対と共に使用する：ＩＲＥＳ−Ｆ（５’−ＣＴＧＡＴＣＴＴＡＣＴＣＴＴＴＧＧＡＣＣＴＴＧ−３’（配列番号２３））およびＩＲＥＳ−Ｒ（５’−ＣＣＣＣＴＴＴＴＴＣＴＧＧＡＧＡＣＴＡＡＡＴＡＡ−３’（配列番号２４））。全てのＲＲＶ−２Ａ−ＴＫＯ構築物に対する予測ＰＣＲ産物は１．４ｋｂである。データは、ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯベクターのプロウイルスＤＮＡ中の２Ａ−ＴＫＯおよびＧＳＧ−２Ａ−ＴＫＯ領域は、ウイルス複製の時間経過中、Ｕ８７−ＭＧ細胞中で安定であることを示す（図２５）。
【０１５９】
実施例２３：ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯ感染Ｕ８７−ＭＧ細胞は、ＲＲＶ−Ｓ１−ＴＫＯより優れたＧＣＶ感受性を示した。
ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯによる最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞を使って、ＭＴＳアッセイにより、そのＧＣＶ  ＬＤ５０を測定した。ＲＲＶ−Ｓ１−ＴＫＯ（この内のＴＫＯ発現が合成ミニマルプロモーターにより促進される（国際公開第２０１４／０６６７００号参照、参照により本明細書に組み込まれる））を対照として含めた。ＧＣＶ（カタログ番号３４５７００−５０ＭＧ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）での処理を、０．０００１μＭ〜０．５μＭの範囲の１：２系列希釈により実施した。ＧＣＶ無処理を対照として含めた。ＧＣＶを、播種後１日目に添加し、その後、完全培地＋ＧＣＶを２日毎に補充した。未処理Ｕ８７−ＭＧ細胞を、ＧＣＶの細胞傷害性効果を判定するために、対照として含めた。７日間のインキュベーション時間にわたり細胞をモニターし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、細胞死を２日毎に測定した。ＭＴＳの添加後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００（Ｔｅｃａｎ）プレートリーダーを用いて、ＭＴＳインキュベーションの６０分後に、４９０ｎｍでのＯＤ値を取得した。各試料の３回の繰り返しからの平均ＯＤ値を、未処理であるがＲＲＶ感染している細胞に対する、細胞生存のパーセンテージに変換した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｍを使って、パーセンテージ値をＧＣＶ濃度に対しｌｏｇスケールでプロットして、ＬＤ５０グラフを生成した。ＬＤ５０値を、取得データポイントの非線形４パラメーターフィットを使ってソフトウェアにより計算した。データは、ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯにより発現されたＴＫＯタンパク質は、０．１ミリモル範囲でＧＣＶを細胞傷害性ＧＣＶに変換し、細胞傷害性効果を実現するという点で酵素的に活性であることを示す（図２６）。ＲＲＶ−Ｓ１−ＴＫＯに比べて、ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯは、１２．５〜２０倍高いＧＣＶ感受性を示す。さらに、ＥｎｖーＴＫＯ融合ポリタンパク質からのＴＫＯ分離の差異にも関わらず、ＲＲＶ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯとＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯの間、またはＲＲＶ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯとＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯの間で、ＧＣＶ  ＬＤ５０の有意な差が存在しない。２Ａ−ｙＣＤ２と同様に、データは、細胞中で発現したＴＫＯタンパク質の量は、ＧＣＶを細胞傷害性ＧＣＶに変換するのに十分であることを示唆する。
【０１６０】
実施例２４：ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯ処理の皮下、同系神経膠腫マウスは、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２と同等の腫瘍増殖の遅延を示す。
同系細胞系Ｔｕ−２４４９を、Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウス中の同所性脳腫瘍モデル（Ｏｓｔｅｒｔａｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２年）として使用した。Ｔｏｃａｇｅｎで、Ｔｕ−２４４９細胞の亜系統（Ｔｕ−２４４９ＳＱ）を皮下腫瘍モデル用に樹立した。９８％の未処理Ｔｕ−２４４９ＳＱ細胞および２％のＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯまたはＲＲＶ−Ｓ１−ＴＫＯ感染Ｔｕ−２４４９ＳＱ細胞の混合物を、インビトロで調製し、皮下腫瘍埋め込みのために、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）中に再懸濁した。９８％の未処理Ｔｕ−２４４９ＳＱ細胞および２％のＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２感染Ｔｕ−２４４９ＳＱ細胞の混合物をポジティブコントロールならびにコンパレータとして含めた。各群のＢ６Ｃ３Ｆ１マウス（群当たりｎ＝１０匹）は、０日目に１ｘ１０６腫瘍細胞の皮下埋め込みを受ける。腫瘍埋め込み後１２日目（この時点で約７５％を超える腫瘍がＲＲＶに感染）に、マウスにＰＢＳ、５−ＦＣ（５００ｍｇ／ｋｇ体重／単回用量を腹腔内にｂ．ｉ．ｄ．投与）またはＧＣＶ（５０ｍｇ／ｋｇ体重／単回用量を腹腔内にｂ．ｉ．ｄ．投与）を５連続日投与し、続けて、薬物なしで２日間、残りの感染細胞からベクターを拡散させる。５日オン、２日オフ薬剤処理サイクルをさらに２回繰り返した。腫瘍体積測定を毎日実施した。結果は、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯもしくはＲＲＶ−Ｓ１−ＴＫＯを有し、ＧＣＶ処理をしない、またはＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２を有し、５−ＦＣ処理をしないマウスの腫瘍は、増殖を続けることを示す。対照的に、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯ＋ＧＣＶ処理したマウスの腫瘍は、事前定着腫瘍の腫瘍増殖を遅らせる。さらに、ＲＲＶ−Ｓ１−ＴＫＯ＋ＧＣＶ処理したマウスの腫瘍はまた、腫瘍増殖の遅れを示すが、その程度は、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯ＋ＧＣＶより低く、またより長時間であり、これはおそらく、ＴＫＯ発現の低減によるものであろう。全体として、データは、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯ＋ＧＣＶおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯ＋ＧＣＶの腫瘍増殖の遅れは、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２＋５−ＦＣによる処理と同等であることを示す。データは、皮下同系神経膠腫マウスモデルにおいて、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＴＫＯおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＴＫＯは、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２と同等の治療効力を有することを示唆する。
【０１６１】
実施例２５：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞および最大感染Ｕ８７−ＭＧ細胞から産生したＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃベクターは、感染性であり、ｓｃＦｖおよびｓｃＦｖＦｃタンパク質を発現する。
ｐＡＣ３−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖ、ｐＡＣ３−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖ−タグ、ｐＡＣ３−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃおよびｐＡＣ３−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃ−タグを生成し、ヒトおよびマウスＰＤＬ１に対するブロッキング単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）として機能させた。ＰＤＬ１ｓｃＦｖカセットは、ヒトＩｇＧ１の結晶性断片（Ｆｃ）領域を含有または非含有で設計される。さらに、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖＦｃのＣ末端に組み込まれたＨＡおよびＦｌａｇエピトープタグを有するマッチングカセットも、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖＦｃタンパク質発現の検出のために生成した。それぞれのカセットの配列（ＰＤＬ１ｓｃＦｖ、ＰＤＬ１ｓｃＦｖ−タグ、ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃおよびＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃ−タグ）を、それぞれ５‘および３’末端に存在するＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位を用いて化学的に合成し（Ｇｅｎｅｗｉｚ）、ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化されたｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２バックボーンへ挿入した。
【０１６２】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの１８〜２０時間前に、１０ｃｍプレート当たり２ｅ６細胞で播種した。次の日、２０μｇのｐＡＣ３−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖ、ｐＡＣ３−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖ−タグ、ｐＡＣ３−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃおよびｐＡＣ３−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃ−タグプラスミドを使って、細胞播種２０時間後に、リン酸カルシウム法を使って、一時的トランスフェクションを行った。トランスフェクションの１８時間後、細胞をＤＭＥＭ培地で３回洗浄し、新しい完全培地でインキュベートした。トランスフェクションの約４２時間後にウイルス上清を収集し、０．４５μｍのシリンジフィルターを通して濾過した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一時的トランスフェクションからのＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＭＣＳＦ−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２のウイルス力価を、記載したようにして測定した。データは、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖ−タグ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃ−タグの力価値は、ＲＲＶ−ＩＲＥＳ−ｙＣＤ２と同等であることを示す（表７）。
【０１６３】
【表７】
2018526007.tif 000011
【０１６４】
ｓｃＦｖタンパク質発現を評価するために、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃトランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から細胞ライセートを生成した。全細胞ライセートに対し、１：１，０００で抗Ｆｌａｇおよび抗ＨＡ抗体（カタログ番号１８０４およびカタログ番号Ｈ３６６３、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使ってｓｃＦｖタンパク質発現をアッセイした。結果は、ＧＦＰおよびｙＣＤ２およびＴＫＯ導入遺伝子で以前に認められたように、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖ−タグ、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃ−タグ一時的トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのＰＤＬ１ｓｃＦｖ−タグおよびＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃ−タグタンパク質発現は、Ｅｎｖ−ｓｃＦｖポリタンパク質から分離される（図２７Ａ）ことを示す。
【０１６５】
同時に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のウイルスエンベロープタンパク質のプロセッシングを、抗２Ａ抗体を使って調査した。結果は、２Ａペプチドペプチド配列を含むプリカーサー（Ｐｒ８５）またはプロセッシング形態（ｐ１５Ｅ）でエンベロープウイルスが、全４つのベクターで検出されたことを示し（図２７Ｂ）、抗Ｆｌａｇおよび抗ＨＡ免疫ブロットで認められるように、ｓｃＦｖおよびｓｃＦｖＦｃタンパク質からウイルスエンベロープタンパク質の分離を示唆する。融合ポリタンパク質、Ｅｎｖ−ｓｃＦｖまたはＥｎｖ−ｓｃＦｖＦｃの発現が細胞ライセートで検出されるが、細胞ライセートおよび上清からの免疫ブロットにより示されるように、かなりの量のＰＤＬ１ｓｃＦｖおよびＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃタンパク質が融合ポリタンパク質から分離される。
【０１６６】
同様に、数の多いｓｃＦｖ−タグおよびｓｃＦｖＦｃ−タグタンパク質発現も、抗Ｆｌａｇ抗体による免疫沈殿とそれに続く抗ＨＡによる検出（逆も同様）により、一時的トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの上清中で検出される。さらに、細胞ライセートならびに上清中のｓｃＦｖ−タグおよびｓｃＦｖＦｃ−タグタンパク質発現はまた、最大感染ＭＤＡ−ＭＢ２３１（ヒト乳癌細胞系）およびＣＴ−２６（マウス結腸直腸癌細胞系）細胞からも、一時的トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの場合の約２〜３倍少ないレベルで、検出される。
【０１６７】
実施例２６：ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃは、ＰＨＡ刺激Ｔ細胞活性化を回復し、インビトロでのＰＤＬ１ブロッキング抗体の等価性を示す。
ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖまたはＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃによる腫瘍細胞に対するＰＤＬ１ブロッキングがＰＤＬ１媒介Ｔ細胞抑制を軽減することが可能かどうかを判断するために、我々は、ＰＤＬ１媒介トランス抑制同時培養実験を実施する。ここで、我々は、種々の腫瘍細胞系でのＰＤＬ１発現がＰＨＡ刺激健康なドナーＰＢＭＣの活性を変えることが可能かどうかを、細胞内のＩＦＮγの発現またはＩＦＮγの上清への放出により測定して、評価する。トランス抑制同時培養アッセイにおけるＩＦＮγ前処理の多面的効果の可能性を除去するために、高いＰＤＬ１基底細胞表面発現レベルを有する、ヒト乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を使って培養システムを構築する。このアッセイにおけるＰＤＬ１の関与の必要性を確認するために、抗ＰＤＬ１ブロッキング抗体も含める。ＰＤＬ１＋腫瘍細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ＩＦＮγ＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の増加により示されるように、抗ＰＤＬ１ブロッキング抗体の存在下で、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を抑制できない。同様に、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｓｃＦｖまたはＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｓｃＦｖＦｃ感染ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、等しくＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を回復する。データは、ＰＤＬ１ブロッキングｓｃＦｖによる腫瘍細胞およびリンパ球上のＰＤＬ１：ＰＤ１軸の破壊は、抗ＰＤＬ１ブロッキング抗体と同等の活性を示し、ＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖおよびＲＲＶ−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃからのかなりの免疫学的恩恵を受ける証拠を与えることを示す。
【０１６８】
実施例２７：ＲＲＶ、ＴＯＣＡ−５１１、変異プロファイリング。
種々の腫瘍型は、急速なＲＲＶ複製を様々に支援でき、この変動性が異なる腫瘍のＲＲＶベース治療処置、例えば、ＲＲＶ  Ｔｏｃａ５１１（別名Ｔ５．０００２）および高悪性度の神経膠腫用のプロドラッグＴｏｃａ  ＦＣ処置、に対する感受性を変えることを可能とする（Ｔ．Ｆ．Ｃｌｏｕｇｈｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．，８（３４１）：３４１ｒａ７５，Ｊｕｎｅ  １，２０１６，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｄ９７８４）。この変動性は、各種要因に起因するが、我々の、患者の血液または腫瘍から回収した改変酵母シトシンデアミナーゼをコードするＲＲＶの配列決定データから、関連すると思われるものは、ＡＰＯＢＥＣ機能、特にＡＰＯＢＥＣ３ＢおよびＡＰＯＢＥＣ３Ｂによる改変である（Ｂ．Ｐ．Ｄｏｅｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：８２０１−８２０７，２００５年）。例えば、発現の変化は、不活化変異または減毒化変異が腫瘍組織中で継続的に反復されるのに伴い、複製レトロウイルスのベクター中でそれらが蓄積する頻度から推定される。研究では、最も高頻度のイベントの１つは、ＧからＡへの変異（逆転写ステップの第１の複製ステップからのマイナス鎖一本鎖ＤＮＡに対するＡＰＯＢＥＣ媒介変異の特徴的なＣからＴへの変化に対応する）であることが示されている。これらの変異は、ＲＲＶタンパク質のアミノ酸組成の変化を生じ、例えば、ＴＧＧ（トリプトファン）から停止コドン（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）への壊滅的な変化を引き起こす場合がある。いくつかの腫瘍（特に、膀胱、子宮頸部、肺（腺癌および扁平上皮細胞癌）、頭頸部、および乳癌）では、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ活性が上方制御され、この上方制御が、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ活性と一致する変化を伴う、変異荷重の増加と相関することが示されている（ＭＢ．Ｂｕｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４５：９７７−８３，２０１３年；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｇ．２７０１）。この上方制御の背後にある促進要因は、高次の変異速度は、腫瘍の進展ならびに腫瘍に有利な遺伝子型および表現型の選択に好都合であることが提案されている。一実施形態では、ウイルスの不活化変化は、類似の化学的または構造的特性を有するＡＰＯＢＥＣにより変換されないフェニルアラニンまたはチロシンなどの他のアミノ酸に対するコドンによる置換により回避される。Ｔｏｃａ５１１は、ＭＬＶ由来の、ＩＲＥＳに結合した耐熱性コドン最適化酵母シトシンデアミナーゼをコードするＲＲＶであり、これは、プロドラッグ５−ＦＣの細胞傷害性５−ＦＵへの変換を触媒する。Ｔｏｃａ５１１処置の過程で、Ｔｏｃａ５１１は逆転写でのエラーおよびＡＰＯＢＥＣ媒介シチジンデアミナーゼなどの細胞の抗ウイルス防護機構による変異を受けやすい。ＡＰＯＢＥＣタンパク質は、主としてＴｏｃａ５１１ＲＮＡゲノムの逆転写中に、一本鎖ＤＮＡを標的とし、ＧからＡへの点変異として顕在化する。
【０１６９】
Ｔｏｃａ５１１配列の変異スペクトルは、腫瘍および血液から単離された臨床試料由来のＴｏｃａ５１１のハイスループット配列決定によりプロファイル解析された。ＧからＡへの点変異は、Ｔｏｃａ５１１の最もよくある変異タイプであり、ＡＰＯＢＥＣ活性と一致する（図２８）。これは、ヒト試料由来のガンマレトロウイルスの遺伝子治療変異スペクトルのハイスループット配列決定による最初の特性評価である。ＧからＡ変異の解析は、これらは通常、コード配列中の非同義の変化に繋がることを示す。複数の患者由来の試料中の、シトシンデアミナーゼポリペプチドをコードする遺伝子内で、反復性ＧからＡへの変異を有する２つの位置が存在した（表８）。これらの変異は、トリプトファンをコードするコドンＴＧＧをＴＧＡ、ＴＡＧまたはＴＡＡ停止コドンに変換し、その結果、わずか９個のアミノ酸の後に、ＣＤ翻訳を終わらせる。これらの結果は、トリプトファンコドンは、レトロウイルスの遺伝子治療法の潜在的不活性化源であることを強調する。
【表８】
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【０１７０】
したがって、トリプトファンコドンの、タンパク質の機能と適合するアミノ酸をコードする代替コドンへの変化は、レトロウイルスの遺伝子療法のＡＰＯＢＥＣ媒介不活性化を軽減することができる。
【０１７１】
安定性に対する変異の効果を試験するために、Ｔｏｃａ５１１のゲノム配列（米国特許第８，７２２，８６７号、’８６７特許の配列番号１９、２０および２２を参照、この特許は参照により本明細書に組み込まれる）を、ＡｐｏＢｅｃ高頻度変異を示すコドンを、安定性および機能を保存する代替アミノ酸をコードするコドンへ変える（例えば、トリプトファンのコドンをいくつかの他の許容可能なアミノ酸に変える）ように操作する。シトシンデアミナーゼ活性を有するＴｏｃａ５１１ポリペプチド（配列番号２９参照）は、天然の真菌シトシンデアミナーゼタンパク質と密接に関係し、このようなシトシンデアミナーゼの高分解能構造を利用可能である。したがって、構造的および複数配列アラインメントの組み合わせを利用して、系統的に多様な真菌ＣＤタンパク質から、例えば、ＲＯＳＥＴＴＡ、Ｐｒｏｖｅａｎ、ＰＳＩｐｒｅｄまたは類似のプログラムを用いて、生物学的機能に有害作用を与えない有望なアミノ酸置換を特定することができる。その後、一連の推定アミノ酸置換は、Ｔｏｃａ５１１ゲノムを変え、酵素および生物活性、溶解度、溶液中の熱安定性ならびに細胞培養アッセイおよびマウス腫瘍モデルにおいて、５−ＦＣから５−ＦＵへの変換などの機能を果たす能力、細胞死を開始する能力、および腫瘍に対し免疫反応を活性化して持続的反応を実現する能力を測定することにより試験される。類似の解析をＧＡＧ、ＰＯＬおよびＥＮＶ配列に対して適用して、このような配列からＡｐｏＢｅｃ高頻度変異を受けやすいコドンを除くように改変できる。
【０１７２】
実施例２８：ＡＰＯＢＥＣ抵抗性ｙＣＤウイルスベクターは、ヌードマウスの頭蓋内ヒト異種移植片（Ｔ９８Ｇ）において、治療効果がある。
ＡＰＯＢＥＣを高度に発現しているＴ９８Ｇヒト神経膠腫細胞系を用いた頭蓋内の異種移植片モデルを樹立し、高ＡＰＯＢＥＣ活性条件下、ムードマウス宿主中で、ＲＲＶベクターの拡散および体内分布ならびにＡＰＯＢＥＣ抵抗性ＲＣＲベクター媒介シトシンデアミナーゼ自殺遺伝子治療の治療効力を試験する。
【０１７３】
環境順化後、マウスを９つの処置群（下記群参照）の１つに無作為に割り付ける。０日目に、８つの群は、１ｘ１０５のＴ９８Ｇ細胞／マウスの右線条体への頭蓋内投与を受ける。群９のマウスには腫瘍を埋め込まない。５日目に、製剤バッファーのみ、９ｘ１０５ＴＵ／５μｌのＴ５．０００２（ｙＣＤ発現ＡＰＯＢＥＣ感受性ＲＲＶ；群３）または９ｘ１０５／５μｌ、９ｘ１０４／５μｌ、もしくは９ｘ１０３／５μｌのＡＰＯＢＥＣ抵抗性ＲＣＲベクター（Ｔ５．００２Ａ）をマウスに注射した。無作為化５−ＦＣの５００ｍｇ／ｋｇ／日の注入を、１９日目から開始して単回ＩＰ注射として投与する、または一部の群には５−ＦＣを投与しない（群１、４、８）。中間投与量のベクターを投与した全マウスに５−ＦＣを投与した（すなわち、この用量については対照群と分けない）。５−ＦＣ投与を７日間連続して毎日続け、その後１５日間は処置をしない。薬物と休薬のサイクルを４サイクルまで繰り返す。群８を除いて各群から１０匹のマウスを、生存分析カテゴリーに無作為に割り付ける。所定のスケジュールに従って、残りのマウスを屠殺する。
【表９】
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【０１７４】
静脈内投与を尾静脈への注射により行った。腹腔内投与は、膀胱を避けるように注意をして腹部への注射により行った。頭蓋内注射のために、マウスをイソフルランで麻酔し、平滑なイヤーバーを備えた定位固定装置に配置した。手術部位の準備するために、皮膚を剪毛し、ベタダインを使用して頭皮を処置した。この動物を加温パッド上に置き、無菌条件下でメスを使い、皮膚を貫いて正中切開を行った。切開部位における皮膚の退縮および筋膜の反射は、頭蓋の可視化を可能にさせる。３．５ｍｍの突起を備える蓋を取り付けた３ｍｍの突起を備えるガイドカニューレを、頭蓋内の小さな頭蓋穿孔を通して挿入し、頭蓋に歯科用セメントおよび三つの小さなネジを取り付ける。セメントが固まった後、皮膚を縫合して閉じる。突き出た定位座標は、ＡＰ＝０．５〜１．０ｍｍ、ＭＬ＝１．８〜２．０ｍｍ、ＤＶ＝３．０ｍｍである。動物のコホートの正確な定位座標は、染料を注入しその位置を決定することによるパイロット実験（２〜３匹の動物）で決定される。麻酔回復の間、動物をモニターする。鎮痛剤のブプレノルフィンを、手術の終了前に皮下（ＳＣ）に投与し、その後、３日間まで、約１２時間ごとにブプレノルフィン投与する。動物を毎日モニターする。細胞またはベクターを、ガイドカニューレを通して挿入した３．５ｍｍの突起を備える注射カニューレにより、頭蓋内に注入する。速度を、ハミルトンシリンジおよび柔軟性チューブを取り付けたシリンジポンプを用いて制御する。細胞注入に関しては、細胞１μＬを１分当たり０．２μＬの流速（合計５分）で送達する。ベクター注入に関しては、５μＬのベクターを１分当たり０．３３μＬの流速（合計１５分）で送達する。
【０１７５】
ＡＰＯＢＥＣ抵抗性ベクターをマウスに送達し、脳重量１ｇ当たりの形質転換単位（ＴＵ）として計算した。このような計算を用いて、ヒトを含む他の動物に対する用量変換を計算できる。ＡＰＯＢＥＣ抵抗性ベクターは、効果的用量反応を示すが、ＡＰＯＢＥＣ活性に感受性があるベクターは、効果的な反応を低減させる。同じ実験を、ヒトＡＰＯＢＥＣ３ＧまたはＡＰＯＢＥＣ３Ｂ用の、これらのタンパク質を天然のＵ８７レベルより少なくとも３倍超発現する発現ベクターを使ってトランスフェクトしたＵ８７細胞系を、異種移植モデルに埋め込んで実施する。これらの実験は、ＡＰＯＢＥＣ抵抗性となるように設計された改変コドンウイルスは、Ｕ８７系の複製および／または治療反応の利点を有すると同時に、元のＲＲＶ（すなわち、ＡＰＯＢＥＣ抵抗性のためのコドン改変のないＲＲＶ）よりもＡＰＯＢＥＣレベルが増加していることを示す。
【０１７６】
実施例２９：ＡＰＯＢＥＣ抵抗性ｙＣＤウイルスベクターは、脳癌の同系マウスモデルにおいて、治療効果がある。
同系の動物モデルにおける本開示の方法および組成物を実証する追加実験を実施する。
【０１７７】
同系のＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、安定にトランスフェクトされてマウスＡＰＯＢＥＣ３を産生するＣＴ２６結腸直腸ガン細胞系を用いた頭蓋内埋め込みモデルを確立し、ＡＰＯＢＥＣ抵抗性ＲＲＶベクターの拡散および体内分布ならびにＲＲＶベクター媒介シトシンデアミナーゼ自殺遺伝子治療の治療効力およびその免疫学的な影響を試験する。
【０１７８】
この研究には１２９匹の動物（０匹のオス、１１９匹のメスおよび１０匹の予備動物（１０匹のメス））を含める。環境順化後、マウスを９つの処置群（下記群参照）の１つに無作為に割り付ける。０日目に、８つの群は、１ｘ１０４のＡＰＯＢＥＣ発現ＣＴ２６細胞／マウスの右線条体への頭蓋内投与を受ける。群９のマウスには腫瘍を埋め込まない。４日目に、製剤バッファーのみ、９ｘ１０５ＴＵ／５μｌのＡＰＯＢＥＣにまだ感受性のある対照ベクター（Ｔ５．０００２）または９ｘ１０５／５μｌ、９ｘ１０４／５μｌ、もしくは９ｘ１０３／５μｌのＡＰＯＢＥＣ抵抗性ベクター（Ｔ５．０００２Ａ）をマウスに注射する。ベクターを注射していないマウスまたは、９×１０５／５ｕｌもしくは９×１０３／５ｕｌのベクターを注射したマウスを無作為化し、１３日目に開始して、ＩＰ注射により５−ＦＣ（５００ｍｇ／ｋｇ／ＢＩＤ）を投与するか、または示したように５−ＦＣを投与しない（ＰＢＳ）。中間用量のベクターを投与したマウスに５−ＦＣを投与する（すなわち、この用量については対照群と分けない）。５−ＦＣ投与を７日間連続して毎日続け、その後１０日間は処置をしない。薬物と休薬のサイクルを４サイクルまで繰り返す。群９を除いて各群から１０匹のマウスを、生存分析カテゴリーに無作為に割り付ける。所定のスケジュールに従って、残りのマウスを屠殺する。
【０１７９】
未処置のセンチネルマウスを屠殺予定動物と一緒に収容し、同時点で屠殺し、排出によるベクター伝達を評価する。
【表１０】
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【０１８０】
静脈内投与を尾静脈への注射により行った。腹腔内投与は、膀胱を避けるように注意をして腹部への注射により行った。頭蓋内注射のために、右線条体に埋め込み、３．７ｍｍの突起を備える蓋を取り付けた３．２ｍｍの突起を備えるガイドカニューレを有するマウスを用いる。突き出た定位座標は、ＡＰ＝０．５〜１．０ｍｍ、ＭＬ＝１．８〜２．０ｍｍ、ＤＶ＝３．２ｍｍ（ブレグマから）である。細胞またはベクターを、ガイドカニューレを通して挿入した３．７ｍｍの突起を備える注射カニューレにより、頭蓋内に注入する。速度を、ハミルトンシリンジおよび柔軟性チューブを取り付けたシリンジポンプを用いて制御する。
【０１８１】
細胞注入に関しては、細胞１μＬを１分当たり０．２μＬの流速（合計５分）で送達する。ベクター注射に関しては、ベクター５μＬを１分当たり０．３３μＬの流速（合計１５分）で送達する。
【０１８２】
ベクターをマウスに送達し、脳重量１ｇ当たりの形質転換単位（ＴＵ）として計算した。このような計算を用いて、ヒトを含む他の動物に対する用量変換を計算できる。この研究の結果は、ＡＰＯＢＥＣ抵抗性ウイルスは、腫瘍全体に拡散し、ｙＣＤの完全性を維持し、５ＦＣと組み合わせた腫瘍の処置において、ＡＰＯＢＥＣ感受性ＲＲＶに比べて、より効果的であることを示す。ＡＰＯＢＥＣ抵抗性ＲＲＶはまた、未処理ケージメイトに水平拡散しない。
【０１８３】
上述のように、ＲＲＶは「２Ａカセット」を含む。例えば、配列番号ＡＡは、２Ａカセットを含む一般的構築物を提供する。このカセットは、多くの異なるカセットと置換できる。例えば、次のカセットを調製し、配列番号ＡＡベクターバックボーンに挿入し、配列番号ＡＡ中のカセットを置換できる。
【０１８４】
本明細書で提供する方法および配列を用いて、次のように、多くのベクターを設計した：
ｐＡＣ３−Ｔ２Ａ−ＧＦＰｍ（配列番号４３）
ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ＧＦＰｍ（配列番号４４）
ｐＡＣ３−Ｐ２Ａ−ＧＦＰｍ（配列番号４５）
ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＧＦＰｍ（配列番号４６）
ｐＡＣ３−Ｅ２Ａ−ＧＦＰ（配列番号４７）
ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｅ２Ａ−ＧＦＰｍ（配列番号４８）
ｐＡＣ３−Ｆ２Ａ−ＧＦＰｍ（配列番号４９）
ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｆ２Ａ−ＧＦＰｍ（配列番号５０）
ｐＡＣ３−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２（配列番号５１）
ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ−ｙＣＤ２（配列番号５２）
ｐＡＣ３−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２（配列番号５３）
ｐＡＣ３−ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ｙＣＤ２（配列番号５４）
【０１８５】
本開示の多くの実施形態を記載してきた。しかしながら、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な変更が行われ得ると理解されよう。したがって、他の実施形態は、下記の請求項の範囲内に入る。
【図１】
2018526007.tif 000015
【図２−１】
2018526007.tif 000016
【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
2018526007.tif 000038
【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【配列表】
2018526007000001.app
【国際調査報告】
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