(57)【要約】本発明は、実質的に全てのＦｃドメインがＣ末端リジンを有するＦｃ含有タンパク質を含む組成物を提供する。該組成物を産生するための宿主細胞、該宿主細胞及び組成物の作製方法、ならびにその使用方法がさらに提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃ含有タンパク質の発現のための宿主細胞であって、カルボキシペプチダーゼＤ（ＣｐＤ）遺伝子不活性化を伴わない野生型ＣｐＤ遺伝子を含む宿主細胞と比較して、少なくとも６０％低減したＣｐＤ発現レベルを有する、前記宿主細胞。
【請求項２】
前記宿主細胞が、真核細胞である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
前記宿主細胞が、哺乳類細胞である、請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項４】
前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項５】
前記Ｆｃ含有タンパク質が抗体である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
前記Ｆｃ含有タンパク質がＦｃ含有融合タンパク質である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記宿主細胞における前記ＣｐＤ遺伝子が不活性化される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記ＣｐＤ遺伝子が、ｓｉＲＮＡによって不活性化される、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
前記ＣｐＤ遺伝子が、ｓｈＲＮＡによって不活性化される、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
前記ＣｐＤ遺伝子が、遺伝子欠失によって不活性化される、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
前記ＣｐＤ遺伝子が、遺伝子付加または置換によって不活性化される、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
前記ＣｐＤ遺伝子が、クラスタ化された規則的に離間した短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系を使用して不活性化される、請求項１１または１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記ＣｐＤ遺伝子が、転写活性化因子様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系を使用して不活性化される、請求項１１または１２に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
前記ＣｐＤ遺伝子が、亜鉛フィンガヌクレアーゼ（ＺＦＮ）系を使用して不活性化される、請求項１１または１２に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記ＣｐＤ遺伝子が、メガヌクレアーゼ系を使用して不活性化される、請求項１１または１２に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
前記Ｆｃ含有タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の宿主細胞を含む、細胞培養系。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の宿主細胞の産生方法であって、前記宿主細胞における前記ＣｐＤ遺伝子を不活性化し、それにより、前記宿主細胞を産生することを含む、前記方法。
【請求項２０】
前記ＣｐＤ遺伝子が、ｓｉＲＮＡ系を使用して不活性化される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣｐＤ遺伝子が、ｓｈＲＮＡ系を使用して不活性化される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＣｐＤ遺伝子が、遺伝子欠失によって不活性化される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＣｐＤ遺伝子が、遺伝子付加または置換によって不活性化される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣｐＤ遺伝子が、ＣＲＩＳＰＲ系を使用して不活性化される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣｐＤ遺伝子が、ＴＡＬＥＮ系を使用して不活性化される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＣｐＤ遺伝子が、ＺＦＮ系を使用して不活性化される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＣｐＤ遺伝子が、メガヌクレアーゼ系を使用して不活性化される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２８】
Ｆｃ含有タンパク質の作製方法であって、
ａ）請求項１〜１７のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養することと、
ｂ）前記宿主細胞によって発現された前記Ｆｃ含有タンパク質を得ることと、を含む、前記方法。
【請求項２９】
複数のＦｃ含有タンパク質を含む組成物であって、前記組成物における実質的に全てのＦｃ含有タンパク質が、各Ｆｃドメイン上にＣ末端リジンを有する、前記組成物。
【請求項３０】
前記組成物の実質的に全てのＦｃ含有タンパク質が、同じアミノ酸配列を有する、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記複数のＦｃ含有タンパク質が、荷電状態において実質的に均質である、請求項２９または３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記Ｆｃ含有タンパク質が、Ｆｃ含有融合タンパク質である、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記Ｆｃ含有タンパク質が抗体である、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記抗体がヒト抗体である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３６】
前記抗体が２本の重鎖を含み、各重鎖がＣ末端リジンを含む、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記Ｆｃ含有タンパク質が、薬物にコンジュゲートされる、請求項３２〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記組成物における前記Ｆｃ含有タンパク質が、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、請求項３２〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記組成物における前記Ｆｃ含有タンパク質が、ＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含む、請求項３２〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記組成物における前記Ｆｃ含有タンパク質が、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む、請求項３２〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記組成物が、薬学的組成物である、請求項２９〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記薬学的組成物が、減菌された薬学的組成物である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記組成物が、細胞培養培地である、請求項２９〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４４】
前記組成物が、細胞溶解液である、請求項２９〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４５】
前記組成物が、タンパク質精製カラムからの溶出物である、請求項２９〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４６】
治療を必要とする個体における疾患の治療方法であって、請求項４１または４２に記載の組成物を前記個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項４７】
前記組成物が、非経口投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記組成物が、静脈内または皮下投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記組成物が、局在投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記組成物が、局所投与される、請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年９月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／２２２，１８７号の利益を主張し、該開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：コンピュータ可読形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１４６３９２０３２６４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録日：２０１６年８月１８日、サイズ：５ＫＢ）。
【０００３】
本発明は、実質的に全てのＦｃ含有タンパク質が各Ｆｃドメイン上にＣ末端リジンを有する、Ｆｃ含有タンパク質を含む組成物に関する。本発明はさらに、該組成物を産生するための宿主細胞、該宿主細胞及び組成物の作製方法、ならびにその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
治療用Ｆｃドメイン含有タンパク質、例えば、モノクローナル抗体及びＦｃ含有融合タンパク質は、癌、自己免疫疾患、及び感染などの疾患の治療に重要な薬物となっており、現在最も急速に成長しているクラスの治療薬の代表である。例えば、Ｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０，２０１０を参照されたい。臨床的に、ポリペプチド系治療薬は、それらの高度な標的特異性及び免疫応答に関与する能力により、強力な活性を示している。例えば、Ｓｉｄｈｕ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２５，２００７を参照されたい。しかしながら、均質なポリペプチド系治療薬の商業的産生は、ポリペプチドが多くの修飾、例えば、異なるジスルフィド対合、脱アミド化、酸化、Ｎ末端グルタミン環化、及び異なるグリカン構造を経るため、困難である。例えば、Ｃａｒｓｏｎ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３，２００５を参照されたい。さらに、ポリペプチド修飾の存在及び構造一貫性は、産生条件に非常に敏感である。生物学的に活性なポリペプチドを有する免疫グロブリンＦｃドメインの包含は、長期治療活性及び少ない投薬頻度を可能にする、増加した血漿半減期を含む、生物学的に活性な薬剤に有益な生物学的及び薬理学的性質を提供する。Ｃｚａｊｋｏｗｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，４，２０１２を参照されたい。しかしながら、Ｆｃドメインの存在は、Ｆｃ含有タンパク質生成物の不均一性、例えば、各Ｆｃドメインにわたって比較したときのＣ末端リジンの存在の変動の潜在性をさらに増加させる。
【０００５】
Ｆｃ含有タンパク質などの生物製剤の産生に関する業界標準は、全ての臨床及び商業用バッチにわたって生成物の一貫性を示すことが必要とされる。ポリペプチド生成物の比較可能性試験（Ｃｏｍｐａｒａｂｉｌｉｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ）は、産生パラメータの変更、例えば、第Ｉ相から第ＩＩＩ相の産生最適化の間に生じる変更、商業規模、及び商業化後の改変後の一貫性を確実にするために行われなければならない。産生パラメータの変更には、細胞培養プロセスパラメータ、細胞培養培地、宿主細胞、精製、貯蔵、及び製剤の変更が含まれるが、これらに限定されない。さらに、複数場所での産生に関して、全ての産生施設にわたって生成物の一貫性を確実にすることが必要である。ＦｃドメインＣ末端リジンの存在などのポリペプチド属性のレベルにおける変動及び不均一性は、産生プロセス制御の欠如の指標であるとみなされる。Ｃｈｉｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２，２００４及びＫｏｚｌｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ，９７，２００６を参照されたい。細胞株及び製造プロセス、例えば、培養条件に対するそれらの感受性の相違は、最終生成物の特性に影響を及ぼす。例えば、モノクローナル抗体（２本の重鎖からなる）の産生中のＦｃドメインＣ末端リジンプロセシング、すなわち、切断は、０、１、または２つのＦｃドメインＣ末端リジン残基を保有する抗体アイソフォームの混合物をもたらす。大規模なＦｃドメインＣ末端リジンプロセシングは抗体の産生において観察される場合があり、０または１つのＦｃドメインＣ末端リジンを保有する総抗体集団の割合が大きくなる。Ｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，１００，２００８を参照されたい。したがって、ＦｃドメインＣ末端リジンの存在の不均一性は、治療用Ｆｃ含有タンパク質の産生に固有の課題を提示する。
【０００６】
Ｆｃ含有タンパク質の産生中に生じるＦｃドメインＣ末端リジンの存在の不均一性を減少させるために、大規模な細胞培養条件の最適化が検証されている。例えば、抗体ＦｃドメインＣ末端リジンの存在に対する、亜鉛などの重金属の細胞培地濃度、アミノ酸の細胞培地濃度、ｐＨ、及び温度の制御の作用が、米国特許出願第２０１３０２８０２７４号に記載されている。しかしながら、米国特許出願第２０１３０２８０２７４号に示されるように、細胞培養パラメータの最適化は、ＦｃドメインＣ末端リジンの存在の不均一性を排除しない。
【０００７】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４アイソタイプ免疫グロブリンのＦｃドメインは、各ＦｃドメインのＣ末端に保存された塩基性アミノ酸リジンを含有する。これらの免疫グロブリンアイソタイプのＦｃドメインＣ末端リジンの存在の不均一性は、細胞培養産生中の内因性カルボキシペプチダーゼ（複数可）によるタンパク質分解に起因すると考えられる。Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ，７０５，１９９５及びＬｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，１０９，２０１２を参照されたい。カルボキシペプチダーゼは、タンパク質及びペプチドのＣ末端からアミノ酸を加水分解により切断する酵素である。大半の哺乳類種に見出されるカルボキシペプチダーゼの１３の既知のメンバーが存在する。Ｒｅｚｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ，５８，２００１を参照されたい。異なるカルボキシペプチダーゼタンパク質及びそれらの活性が一般的に使用される産生宿主細胞であるＣＨＯ細胞において検出されているが、どのカルボキシペプチダーゼ（複数可）がＦｃドメインＣ末端リジンの除去に関与するかは不明である。Ｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，１００，２００８を参照されたい。ＣｐＢ及びＣｐＭを含む１つ以上のカルボキシペプチダーゼがＦｃドメインＣ末端リジンプロセシングに関与し得ることが以前に推測されている。Ｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，１００，２００８、Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ，７０５，１９９５、及びＬｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，１０９，２０１２を参照されたい。
【０００８】
本明細書に言及される全ての刊行物、特許、特許出願、及び公開特許出願の開示は、本明細書において参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００９】
本明細書において、Ｆｃ含有タンパク質の発現のための宿主細胞が提供され、この宿主細胞は、ＣｐＤ遺伝子不活性化を伴わない野生型ＣｐＤ遺伝子を含む宿主細胞と比較して、少なくとも６０％低減したカルボキシペプチダーゼＤ（ＣｐＤ）発現レベルを有する。
【００１０】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【００１１】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。
【００１２】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、Ｆｃ含有融合タンパク質である。
【００１３】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、宿主細胞におけるＣｐＤ遺伝子は不活性化される。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子は、ｓｉＲＮＡによって不活性化される。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子は、ｓｈＲＮＡによって不活性化される。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子は、遺伝子欠失によって不活性化される。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子は、遺伝子付加または置換よって不活性化される。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子は、クラスタ化された規則的に離間した短い回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ，ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ，ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）系を使用して不活性化される。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子は、転写活性化因子様エフェクタヌクレアーゼ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）（ＴＡＬＥＮ）系を使用して不活性化される。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子は、亜鉛フィンガヌクレアーゼ（ＺＦＮ）系を使用して不活性化される。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子は、メガヌクレアーゼ系を使用して不活性化される。
【００１４】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｆｃ含有タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを含む。
【００１５】
本明細書において上記の実施形態のいずれかの宿主細胞を含む細胞培養系が提供される。
【００１６】
本明細書において宿主細胞の産生方法が提供され、本方法は、宿主細胞におけるＣｐＤ遺伝子を不活性化し、それにより、上記の実施形態のいずれかの宿主細胞を産生することを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ｓｉＲＮＡ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ｓｈＲＮＡ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、遺伝子欠失によってＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、遺伝子付加または置換によってＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ＣＲＩＳＰＲ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ＴＡＬＥＮ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ＺＦＮ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、メガヌクレアーゼ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。
【００１８】
本明細書において、ａ）宿主細胞を培養することと、ｂ）宿主細胞によって発現されたＦｃ含有タンパク質を得ることと、を含む、Ｆｃ含有タンパク質の作製方法が提供される。
【００１９】
本明細書において複数のＦｃ含有タンパク質を含む組成物が提供され、組成物における実質的に全てのＦｃ含有タンパク質は、各Ｆｃドメイン上にＣ末端リジンを有する。いくつかの実施形態では、組成物の実質的に全てのＦｃ含有タンパク質は、同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、複数のＦｃ含有タンパク質は、荷電状態において実質的に均質である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質はＦｃ含有融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は２本の重鎖を含み、各重鎖はＣ末端リジンを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、薬物にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、組成物におけるＦｃ含有タンパク質は、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、組成物におけるＦｃ含有タンパク質は、ＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、組成物におけるＦｃ含有タンパク質は、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む。
【００２０】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、複数のＦｃ含有タンパク質を含む組成物は、薬学的組成物である。いくつかの実施形態では、複数のＦｃ含有タンパク質を含む薬学的組成物は、減菌された薬学的組成物である。
【００２１】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、複数のＦｃ含有タンパク質を含む組成物は、細胞培養培地である。
【００２２】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、複数のＦｃ含有タンパク質を含む組成物は、細胞溶解液である。
【００２３】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、複数のＦｃ含有タンパク質を含む組成物は、タンパク質精製カラムからの溶出物である。
【００２４】
本明細書において、上記の実施形態に記載される薬学的組成物または減菌された薬学的組成物を個体に投与することを含む、治療を必要とする個体における疾患の治療方法も提供される。いくつかの実施形態では、治療を必要とする個体における疾患の治療方法は、組成物を非経口投与することを含む。いくつかの実施形態では、治療を必要とする個体における疾患の治療方法は、組成物を静脈内または皮下投与することを含む。いくつかの実施形態では、治療を必要とする個体における疾患の治療方法は、組成物を局在投与することを含む。いくつかの実施形態では、治療を必要とする個体における疾患の治療方法は、組成物を局所投与することを含む。
【００２５】
本発明のこれら及び他の態様及び利点は、後の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲から明らかとなろう。本明細書に記載される種々の実施形態の性質うちの１つ、いくつか、または全てを組み合わせて、本発明の他の実施形態を形成し得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図Ａ〜１Ｂは、細胞系における内因性カルボキシペプチダーゼのｑＰＣＲ  ｍＲＮＡ分析を示す。各誤差棒は、１標準偏差を表す。図１Ａは、ＤＰ１２及びＣＨＯＫ１宿主細胞におけるカルボキシペプチダーゼＢ（ＣｐＢ）、カルボキシペプチダーゼＥ（ＣｐＥ）、カルボキシペプチダーゼＭ（ＣｐＭ）、カルボキシペプチダーゼＮ１（ＣｐＮ１）、及びカルボキシペプチダーゼＤ（ＣｐＤ）ｍＲＮＡの相対発現レベルを示す。各カルボキシペプチダーゼのｍＲＮＡの発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子β−２−ミクログロブリン（ｂ２ｍ）に正規化された。白い棒はＤＰ１２宿主からの測定を表し、黒い棒はＣＨＯＫ１宿主からの測定を表す。図１Ｂは、抗体発現細胞系におけるカルボキシペプチダーゼのｍＲＮＡ相対発現レベルを示す。各カルボキシペプチダーゼのｍＲＮＡの発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子ｂ２ｍに正規化された。白い棒は抗体発現細胞系Ａからの測定を表し、黒い棒は抗体発現細胞系Ｂからの測定を表す。
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、抗体発現細胞系Ａ（白い棒）及び抗体発現細胞系Ｂ（黒い棒）においてカルボキシペプチダーゼ特異的ｓｉＲＮＡ構築物でトランスフェクトされた後のカルボキシペプチダーゼｍＲＮＡ発現のレベルを示す。各誤差棒は、１標準偏差を表す。図２Ａは、抗体発現細胞系Ａ及び抗体発現細胞系ＢにおけるＣｐＤ  ｍＲＮＡの発現レベルを示す。灰色の棒は、細胞系Ａ及び細胞系Ｂ両方のスクランブル構築物トランスフェクション後の細胞系におけるＣｐＤ  ｍＲＮＡレベルを表し、白い棒は、ＣｐＤｉ構築物トランスフェクション後の細胞系ＡにおけるＣｐＤ  ｍＲＮＡレベルを表し、黒い棒は、ＣｐＤｉ構築物トランスフェクション後の細胞系ＢにおけるＣｐＤ  ｍＲＮＡを表す。各細胞系におけるＣｐＤ  ｍＲＮＡの発現レベルは、スクランブル構築物でトランスフェクトされた後のそれぞれの細胞系におけるＣｐＤの発現レベルと比較された。図２Ｂは、抗体発現細胞系Ａ及び抗体発現細胞系ＢにおけるＣｐＮ  ｍＲＮＡの相対発現レベルを示す。灰色の棒は、スクランブル構築物トランスフェクション後の細胞系におけるｍＲＮＡレベルを表し、白い棒は、ＣｐＮｉ構築物トランスフェクション後の細胞系ＡにおけるｍＲＮＡレベルを表し、黒い棒は、ＣｐＮｉ構築物トランスフェクション後の細胞系ＢにおけるｍＲＮＡレベルを表す。各細胞系におけるＣｐＮ  ｍＲＮＡの発現レベルは、スクランブル構築物でトランスフェクトされた後のそれぞれの細胞系におけるＣｐＮの発現レベルと比較された。
【図３】抗体発現細胞系Ａ（黒い棒）及び抗体発現細胞系Ｂ（灰色の棒）においてカルボキシペプチダーゼ特異的ｓｉＲＮＡ構築物でトランスフェクトされた後の発現された抗体のＣ末端リジンレベルを示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、野生型（ＷＴ）及びノックアウト（ＫＯ）ＣｐＤ対立遺伝子の概略図を示す。図４Ａは、野生型ＣｐＤ対立遺伝子の概略図を示す。２つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列（ｇＲＮＡ１及びｇＲＮＡ２）が、ＣＲＩＳＰＲを介した遺伝子ノックアウトのために、それぞれ、ＣＨＯ  ＣｐＤ遺伝子のエキソン２及びエキソン２１を標的とするために使用された。２つのｇＲＮＡ間の距離は約４６ｋｂである。ＣＲＩＳＰＲにより除去されることを目的としたＷＴ  ＣｐＤ配列を検出するために使用された順方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは、それぞれ、ＷＴ．Ｆ及びＷＴ．Ｒとして表される。図４Ｂは、ＫＯ  ＣｐＤ対立遺伝子の概略図を示す。ＫＯ  ＣｐＤ対立遺伝子を検出するために使用された順方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは、それぞれ、ＫＯ．Ｆ及びＫＯ．Ｒとして表される。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、抗体発現細胞系Ｂからの２つのＣｐＤノックアウトクローンにおけるＣｐＤ発現レベルを示す。図５Ａは、２つのＣｐＤ  ＫＯクローン及び２つのＣｐＤ  ＷＴクローンのＣｐＤ  ＲＮＡ発現レベルを示す。図５Ｂは、２つのＣｐＤ  ＫＯクローン及び２つのＣｐＤ  ＷＴクローンのウエスタンブロット分析を示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、抗体産生細胞系Ｂの２つのＣｐＤ  ＫＯクローン及び２つのＣｐＤ  ＷＴクローンの流加振盪フラスコ評価データを示す。各棒は、２回の繰り返しからの平均を表す。各誤差棒は、１標準偏差を表す。図６Ａは、１４日目の発現された抗体の力価を示す。図６Ｂは、ピコグラム（ｐｇ）／細胞／日単位の特定生産性（Ｑｐ）を示す。図６Ｃは、１４日の培養後、１リットル当たりの１億個単位での細胞・日の集積生菌数を示す。
【図７】抗体産生細胞系Ｂの２つのＣｐＤ  ＫＯクローン及び２つのＣｐＤ  ＷＴクローンのＣ末端リジンレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本出願は、タンパク質の単一Ｃ末端アミノ酸を加水分解する亜鉛結合酵素であるカルボキシペプチダーゼＤ（ＣｐＤ）がＦｃドメインＣ末端リジンプロセシング（すなわち、切断）に関与する唯一のカルボキシペプチダーゼであるという驚くべき所見に基づく。具体的には、質量分析を使用して、我々は、ＦｃドメインＣ末端リジン切断がＣｐＤノックアウト細胞において完全に消失されたことを示し、したがって、ＣｐＤがＣＨＯ細胞において抗体ＦｃドメインＣ末端リジンを切断する唯一の内因性カルボキシペプチダーゼであることを示す。
【００２８】
したがって、本出願は、低減されたＣｐＤ発現レベルを有する宿主細胞を使用することによる、各Ｆｃドメイン上にＣ末端リジンを有するＦｃ含有タンパク質の産生方法を提供する。かかる方法によって産生された生成物は、ＦｃドメインＣ末端リジンの存在において１００％の均質性をもたらすことができる。かかる方法は、ＦｃドメインＣ末端リジンの存在の状態に対する産生条件の変更の作用を考慮する必要性を排除し、したがって、Ｆｃ含有タンパク質の製造プロセスを非常に容易にする。例えば、Ｆｃ含有タンパク質のかかる産生方法を使用することにより、複数の産生バッチにわたって比較したとき（例えば、複数の臨床用及び商業用バッチの比較）、ＦｃドメインＣ末端リジンの存在の変動を最小にするために細胞培養条件を最適化する必要性を排除する。加えて、例えば、Ｆｃ含有タンパク質のかかる産生方法を使用することにより、ＦｃドメインＣ末端リジンの存在の変動を最小にすることと、Ｆｃ含有タンパク質の他の特性の変動及び状態（例えば、Ｆｃ含有タンパク質の力価及び翻訳後修飾の存在）とのバランスをとるために、細胞培養条件を最適化する必要性を排除する。さらに、Ｆｃ含有タンパク質のかかる産生方法は一般的に、Ｆｃ含有タンパク質の後の分析を容易にする。例えば、Ｆｃ含有タンパク質のかかる産生方法を使用することにより、不均一なＦｃドメインＣ末端リジンの存在を伴う複数のＦｃ含有タンパク質の電荷変異型をアッセイするための追加ステップ（例えば、全てのＦｃドメインＣ末端リジンを除去するためにＣｐＢとインキュベートすることを伴うステップなど）を組み込む必要性を排除する。
【００２９】
さらに、ＦｃドメインＣ末端リジンを保持することにより、Ｆｃ含有タンパク質産生中のＦｃドメインＣ末端アミノ酸の後の改変が阻害される場合がある。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３免疫グロブリンの保存されたＦｃドメインＣ末端アミノ酸配列は、プロリン−グリシン−リジンである。ＦｃドメインＣ末端リジンの切断は、末端グリシンを生成し、ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３においてグリシン残基を除去し、プロリンにアミド部分を付加する２ステップアミド化反応を触媒することを可能にする（この酵素の活性は、培養培地中の銅濃度にも依存する）。ＦｃドメインＣ末端プロリンのアミド化及びその程度は、Ｆｃ含有タンパク質の集団内で電荷変異型をさらに生成し得る。
【００３０】
したがって、本出願は、一態様では、Ｆｃ含有タンパク質の発現のための宿主細胞を提供し、この宿主細胞は、低減されたカルボキシペプチダーゼＤ（ＣｐＤ）発現レベルを有する。本出願は、別の態様では、宿主細胞を含む細胞培養系を提供する。本出願は、また別の態様では、宿主細胞の産生方法を提供し、本方法は、宿主細胞におけるＣｐＤ遺伝子を不活性化し、それにより、宿主細胞を産生することを含む。本出願は、また別の態様では、宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって発現されたＦｃ含有タンパク質を得ることと、を含む、Ｆｃ含有タンパク質の作製方法を提供する。本出願は、また別の態様では、複数のＦｃ含有タンパク質を含む組成物を提供し、組成物における実質的に全てのＦｃ含有タンパク質は、各Ｆｃドメイン上にＣ末端リジンを有する。本出願は、また別の態様では、個体に組成物を投与することを含む、治療を必要とする個体における疾患の治療方法を提供し、この組成物は、各Ｆｃドメイン上にＣ末端リジンを有する複数のＦｃ含有タンパク質を含む薬学的組成物である。
【００３１】
定義
本明細書で使用されるとき、「Ｆｃドメイン」は、免疫グロブリン重鎖またはそのＣ末端断片のＦｃ領域を指す。本用語は、野生型Ｆｃドメイン及び変異型Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃドメインは、Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端に及ぶ（アミノ酸の番号は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載される、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う）。いくつかの実施形態では、本用語は、免疫グロブリン重鎖及び１つ以上の定常領域のＣ末端断片を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧに関して、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンドメインのＣＨ２及びＣＨ３、ならびにＣＨ１とＣＨ２との間にヒンジを含み得る。
【００３２】
本明細書で使用されるとき、「Ｆｃ含有タンパク質」は、Ｆｃドメインを含むタンパク質（例えば、抗体またはＦｃ含有融合タンパク質）を指す。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、１つ以上のタンパク質サブユニットを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、１つ以上のポリペプチドを含む。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、「Ｆｃ含有融合タンパク質」は、少なくとも１つの他の異種タンパク質ユニットまたはポリペプチドに融合されたＦｃドメインを含むタンパク質を指す。
【００３４】
本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、単一のポリペプチド鎖を指す。
【００３５】
本明細書で使用される「重鎖」という用語は、免疫グロブリン重鎖を指す。
【００３６】
「抗体」という用語は、本明細書で最も広義に使用され、それらがＦｃドメインを含む限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含むが、これらに限定されない、種々の抗体構造を包含する。
【００３７】
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の源または種に由来し、一方で重鎖及び／または軽鎖の残りが異なる源または種に由来する抗体を指す。
【００３８】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。
【００３９】
「ヒト化」抗体は、非ヒト超可変領域（ＨＶＲ）由来のアミノ酸残基及びヒトフレームワーク（ＦＲ）由来のアミノ酸残基を含む、キメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、そのＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、そのＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
【００４０】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、同一であり、かつ／または同じエピトープに結合するが、例えば、天然に存在する変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に発生する可能な変異型抗体を除き、かかる変異型は、一般的、少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体の集団から得られるときの抗体の特徴を示しており、いかなる特定の方法による抗体の産生を必要とするものとしても解釈されない。
【００４１】
本明細書で使用されるとき、「イムノアドヘシン」という用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクタ機能とを組み合わせた分子を指す。構造的に、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を有するアミノ酸配列（このアミノ酸配列は、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（すなわち、抗体の定常領域と比較して「異種」である））と、免疫グロブリン定常ドメイン配列（例えば、ＩｇＧのＣＨ２及び／またはＣＨ３配列）との融合を含む。例示的なアドヘシン配列としては、目的とするタンパク質に結合する受容体またはリガンドの一部分を含む連続したアミノ酸配列が挙げられる。アドヘシン配列は、目的とするタンパク質に結合するが、受容体またはリガンド配列ではない配列（例えば、ペプチボディにおけるアドヘシン配列）でもあり得る。かかるポリペプチド配列は、ファージディスプレイ技法及び高スループット選別方法を含む種々の方法によって選択または特定され得る。イムノアドヘシン中の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、「宿主細胞」は、タンパク質またはポリペプチド産物を産生することができる細胞を指す。例えば、宿主細胞は、Ｆｃ含有タンパク質を産生する。
【００４３】
「個体」という用語は、哺乳動物を指し、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、齧歯類、または霊長類を含むが、これらに限定されない。
【００４４】
本明細書で使用されるとき、「治療」または「治療する」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的に関して、有益なまたは所望の臨床結果には、以下のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない：疾患に起因する１つ以上の症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の安定化（例えば、疾患の悪化の阻止もしくは遅延）、疾患の蔓延（例えば、転移）の阻止もしくは遅延、疾患の再発の阻止もしくは遅延、疾患の進行の遅延もしくは緩徐、疾患状態の回復、疾患の寛解（部分的もしくは完全）の提供、疾患の治療に必要とされる１つ以上の他の薬物の用量の減少、疾患の進行の遅延、生活の質の増加、及び／または生存の延長。本発明の方法は、治療のそれらの態様のうちの任意の１つ以上を企図する。
【００４５】
「治療有効量」は、少なくとも特定の障害の測定可能な改善をもたらすために必要な最小限の濃度である。治療有効量は、本明細書において、患者の病状、年齢、性別、及び体重、ならびに個体において所望の応答を引き起こすための抗体の能力などの因子によって変動し得る。治療有効量は、抗体の任意の毒性または有害な作用よりも治療的に有益な作用が上回ることでもある。「予防有効量」は、必要な投与量及び投与期間にて、所望の予防的結果を達成するのに有効な量を指す。典型的であって必ずしもそうではないが、疾患の早期段階前または早期段階で予防用量が対象において使用されるため、予防有効量は、治療有効量よりも少なくてもよい。
【００４６】
本明細書に記載される本発明の態様及び実施形態が、態様及び実施形態「からなる」ならびに／または「から本質的になる」を含むことが理解される。
【００４７】
本明細書において「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする変動を含む（かつ記述する）。例えば、「約Ｘ」について言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。
【００４８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ（１つの）」、「ｏｒ（または）」、及び「ｔｈｅ（その）」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。
【００４９】
宿主細胞
本出願は、Ｆｃ含有タンパク質の発現のための宿主細胞を提供し、この宿主細胞は、低減されたカルボキシペプチダーゼＤ（ＣｐＤ）発現レベルを有する。
【００５０】
宿主細胞の中でも用いられるのは、酵母または高等真核細胞などの真核細胞である。高等真核細胞には、昆虫細胞及び哺乳類起源の確立された細胞株が含まれる。
【００５１】
好適な哺乳類宿主細胞の例としては、サル腎臓細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）のＣＯＳ−７株（Ｇｌｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２３，１９８１）、Ｌ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または無血清培地中で成長するＶｅｇｇｉｅ  ＣＨＯ及び関連細胞株などのそれらの誘導体（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２８，１９９８）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１０）細胞系、ならびにＭｃＭａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１０，１９９１により記載されるアフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶＩ  （ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）に由来するＣＶＩ／ＥＢＮＡ細胞株、２９３、２９３  ＥＢＮＡ、もしくはＭＳＲ  ２９３などのヒト胚性腎臓細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換された霊長類細胞株、正常な二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養に由来する細胞株、一次外植体、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫ、またはＪｕｒｋａｔ細胞が挙げられる。任意に、例えば、ＨｅｐＧ２／３Ｂ、ＫＢ、ＮＩＨ  ３Ｔ３、またはＳ４９などの哺乳類細胞株が宿主細胞として使用され得る。
【００５２】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。ＣＨＯ細胞は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２９，２０１１を参照されたい。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＤＰ１２宿主細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＤＵＸＢ−１１由来ＤＨＦＲ欠損ＤＰ１２宿主細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯＫ１宿主細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＤＨＦＲ陽性ＣＨＯＫ１宿主細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯＫ１Ｍ宿主細胞である。
【００５３】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、マウス宿主細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｓｐ２／０宿主細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＮＳ０宿主細胞である。
【００５４】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ハイブリドーマである。いくつかの実施形態では、ハイブリドーマは、抗体産生細胞であり、この抗体産生細胞は、抗原で宿主を免疫化した後に宿主から回収される。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞は、骨髄腫細胞と融合される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、マウス骨髄腫由来細胞株である。
【００５５】
あるいは、宿主細胞は、酵母などの下等真核生物であり得る。好適な酵母には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ株、Ｃａｎｄｉｄａ、または異種ポリペプチドを発現することができる任意の酵母株が含まれる。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、「低減されたＣｐＤ発現レベル」は、ＣｐＤ遺伝子不活性化を伴わない野生型ＣｐＤ遺伝子を含む宿主細胞と比較して、少なくとも６０％低減したＣｐＤ発現レベルを指す。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、不活性化前の宿主細胞と比較して、少なくとも６０％低減したＣｐＤ発現レベルを有する。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ発現レベルは、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％低減される。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ発現レベルは、少なくとも９５％低減される。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ発現レベルは、１００％低減される。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ発現レベルは、約６０％〜１００％、約７０％〜１００％、約８０％〜１００％、約９０％〜１００％、または約９５％〜１００％低減される。
【００５７】
いくつかの実施形態では、宿主細胞におけるＣｐＤ遺伝子は不活性化され、このＣｐＤ発現レベルの低減はＤＮＡレベルに基づく。いくつかの実施形態では、宿主細胞におけるＣｐＤ遺伝子は不活性化され、このＣｐＤ発現レベルの低減はＲＮＡレベルに基づく。いくつかの実施形態では、宿主細胞におけるＣｐＤ遺伝子は不活性化され、このＣｐＤ発現レベルの低減はポリペプチドレベルに基づく。
【００５８】
いくつかの実施形態では、宿主細胞におけるＣｐＤ遺伝子は不活性化され、低減された発現レベルは、遺伝子不活性化後のＣｐＤ発現レベルに基づく。いくつかの実施形態では、宿主細胞におけるＣｐＤ遺伝子は不活性化され、低減されたＣｐＤ発現レベルはＤＮＡレベルに基づく。いくつかの実施形態では、宿主細胞におけるＣｐＤ遺伝子は不活性化され、低減された発現レベルはＲＮＡレベルに基づく。いくつかの実施形態では、宿主細胞におけるＣｐＤ遺伝子は不活性化され、低減された発現レベルはポリペプチドレベルに基づく。
【００５９】
いくつかの実施形態では、宿主細胞におけるＣｐＤ遺伝子は不活性化され、このＣｐＤ発現レベルは少なくとも６０％低減される。いくつかの実施形態では、宿主細胞におけるＣｐＤ遺伝子は不活性化され、このＣｐＤ発現レベルは少なくとも９０％低減される。いくつかの実施形態では、宿主細胞におけるＣｐＤ遺伝子は不活性化され、このＣｐＤ発現レベルは少なくとも９５％低減される。いくつかの実施形態では、宿主細胞におけるＣｐＤ遺伝子は不活性化され、このＣｐＤ発現レベルは１００％低減される。
【００６０】
いくつかの実施形態では、宿主細胞におけるＣｐＤ遺伝子は不活性化される。本明細書で使用されるとき、「不活性化」は、遺伝子の翻訳または潜在的な後の翻訳（すなわち、タンパク質の発現）の阻害を指す。不活性化は、転写、翻訳、及びタンパク質発現を含むが、これらに限定されない遺伝子発現の任意の段階またはプロセスで生じ得、不活性化は、ＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）、及びポリペプチドを含むが、これらに限定されない任意の遺伝子または遺伝子生成物に影響を及ぼし得る。
【００６１】
宿主細胞におけるＣｐＤ遺伝子を不活性化するための方法及び技法としては、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ；ショートヘアピンＲＮＡとも称される）、クラスタ化された規則的に離間した短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）、転写活性化因子様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、相同組換え、非相同末端結合、及びメガヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｏ’Ｋｅｅｆｅ，Ｍａｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３，２０１３、Ｄｏｅｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３２，２０１４、Ｇａｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３１，２０１４、及びＳｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１１，２０１１を参照されたい。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）系によって不活性化される。ＣｐＤ遺伝子不活性化に好適なｓｉＲＮＡ配列の特定方法は、当該技術分野において周知である。例えば、ＣｐＤ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを開発及び特定するために一般的に考慮することには、ａ）好ましくは、長さが２１〜２３ヌクレオチド（後に必要に応じて配列長さの低減が続く）である配列を最初に探すこと、ｂ）開始コドン及び終止コドンの５０〜１００塩基対内の領域を避けること、ｃ）イントロン領域を避けること、ｄ）４つ以上の塩基の伸長、例えば、ＡＡＡＡを避けること、ｅ）３０％未満または６０％を超えるＧＣ含有量の領域を避けること、ｆ）リピート及び複雑度が低い配列を避けること、ｇ）単一ヌクレオチド多型部位を避けること、ならびにｈ）他の標的外遺伝子の配列に相補的である配列を避けることが含まれる。例えば、Ｒｕｌｅｓ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｏｎｌｉｎｅ，Ｍａｙ  ２９，２００４及びＲｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２，２００４を参照されたい。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ系は、長さが約１０〜２００ヌクレオチド、または長さが約１０〜１００ヌクレオチド、または長さが約１５〜１００ヌクレオチド、または長さが約１０〜６０ヌクレオチド、または長さが約１５〜６０ヌクレオチド、または長さが約１０〜５０ヌクレオチド、または長さが約１５〜５０ヌクレオチド、または長さが約１０〜３０ヌクレオチド、または長さが約１５〜３０ヌクレオチドであるｓｉＲＮＡヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列は、長さがおよそ１０〜２５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列は、長さがおよそ１５〜２５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列は、長さが少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、または少なくとも約２５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ系は、ＣｐＤ  ｍＲＮＡ分子の領域に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相補的であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ系は、ＣｐＤ  ｐｒｏ−ｍＲＮＡ分子の領域に対して少なくとも少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相補的であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ系は、２本鎖ＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ系は、１本鎖ＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書の実施形態のいずれかに記載されるｓｉＲＮＡ系を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書の実施形態のいずれかに記載される活性ｓｉＲＮＡ分子内に処理されるｐｒｏ−ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＣｐＤ  ｍＲＮＡ分子の領域に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相補的であるｓｉＲＮＡヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書の実施形態のいずれかに記載されるｓｉＲＮＡ分子をコードする発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書の実施形態のいずれかに記載されるｐｒｏ−ｓｉＲＮＡ分子をコードする発現ベクターを含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ系は、送達ベクターを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、送達ベクターを含む。いくつかの実施形態では、送達ベクターは、ｐｒｏ−ｓｉＲＮＡ及び／またはｓｉＲＮＡ分子を含む。
【００６５】
例示的なＣｐＤ  ｓｉＲＮＡ標的配列が表１に列挙される。
表１．例示的なＣｐＤ  ｓｉＲＮＡ標的配列ｓｉＲＮＡ。
2018529341.tif 000002
【００６６】
いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子は、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ；ショートヘアピンＲＮＡとも称される）系によって不活性化される。ｓｈＲＮＡ系による遺伝子不活性化は、当該技術分野において周知である。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡ系は、長さが約１０〜２００ヌクレオチド、または長さが約１０〜１００ヌクレオチド、または長さが約１５〜１００ヌクレオチド、または長さが約１０〜６０ヌクレオチド、または長さが約１５〜６０ヌクレオチド、または長さが約１０〜５０ヌクレオチド、または長さが約１５〜５０ヌクレオチド、または長さが約１０〜３０ヌクレオチド、または長さが約１５〜３０ヌクレオチドであるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡヌクレオチド配列は、長さがおよそ１０〜２５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡヌクレオチド配列は、長さがおよそ１５〜２５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡヌクレオチド配列は、長さが少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、または少なくとも約２５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡ系は、ＣｐＤ  ｍＲＮＡ分子の領域に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相補的であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡ系は、ＣｐＤ  ｐｒｏ−ｍＲＮＡ分子の領域に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相補的であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡ系は、２本鎖ＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡ系は、１本鎖ＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書の実施形態のいずれかに記載されるｓｈＲＮＡ系を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書の実施形態のいずれかに記載される活性ｓｈＲＮＡヌクレオチド配列内に処理されるｐｒｅ−ｓｈＲＮＡヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｐｒｏ−ｓｈＲＮＡ分子はＤＮＡから構成される。いくつかの実施形態では、ｐｒｏ−ｓｈＲＮＡ分子はＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＣｐＤ  ｍＲＮＡ分子の領域に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相補的であるｓｈＲＮＡヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書の実施形態のいずれかに記載されるｓｈＲＮＡ分子をコードする発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書の実施形態のいずれかに記載されるｐｒｏ−ｓｈＲＮＡ分子をコードする発現ベクターを含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡ系は、送達ベクターを含む。いくつかの実施形態では、宿主は、送達ベクターを含む。いくつかの実施形態では、送達ベクターは、ｐｒｏ−ｓｈＲＮＡ及び／またはｓｈＲＮＡ分子を含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子は、遺伝子欠失によって不活性化される。本明細書で使用されるとき、「遺伝子欠失」は、遺伝子から、またはそれに近接してＤＮＡ配列の少なくとも一部を除去することを指す。いくつかの実施形態では、遺伝子欠失を受ける配列は、遺伝子のエキソン配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子欠失を受ける配列は、遺伝子のプロモータ配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子欠失を受ける配列は、遺伝子の隣接配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子配列の一部が遺伝子から除去される。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子配列の一部がＣｐＤ遺伝子から、またはそれに近接して除去される。いくつかの実施形態では、完全な遺伝子配列が染色体から除去される。いくつかの実施形態では、完全なＣｐＤ配列が染色体から除去される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書の実施形態のいずれかに記載される遺伝子欠失を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＣｐＤ遺伝子に遺伝子欠失を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＣｐＤ遺伝子に近接して遺伝子欠失を含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子は、遺伝子付加または置換よって不活性化される。本明細書で使用されるとき、「遺伝子付加」または「遺伝子置換」は、１つ以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド塩基対の挿入または置換を含む、遺伝子配列の改変を指す。いくつかの実施形態では、遺伝子のイントロン配列が改変される。いくつかの実施形態では、遺伝子のエキソン配列が改変される。いくつかの実施形態では、遺伝子のプロモータ配列が改変される。いくつかの実施形態では、遺伝子の隣接配列が改変される。いくつかの実施形態では、１つのヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対が遺伝子配列に付加される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの連続したヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対が遺伝子配列に付加される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書の実施形態のいずれかに記載される遺伝子付加または置換を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＣｐＤ遺伝子に遺伝子付加または置換を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子は遺伝子欠失によって不活性化され、遺伝子配列における少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対の欠失は、非機能性遺伝子生成物をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子は遺伝子欠失によって不活性化され、遺伝子配列に対する少なくとも１つのヌクレオチドの欠失は、元の遺伝子生成物の機能または活性をもはや有しない遺伝子生成物をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子は遺伝子欠失によって不活性化され、遺伝子配列に対する少なくとも１つのヌクレオチドの欠失は、機能不全遺伝子生成物をもたらす。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子は遺伝子付加または置換によって不活性化され、少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対のＣｐＤ遺伝子配列への付加またはその置換は、非機能性遺伝子生成物をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子は遺伝子不活性化によって不活性化され、ＣｐＤ遺伝子配列に対する少なくとも１つのヌクレオチドの組み込みまたは置換は、元の遺伝子生成物の機能または活性をもはや有しない遺伝子生成物をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子は遺伝子付加または置換によって不活性化され、少なくとも１つのヌクレオチドのＣｐＤ遺伝子配列への組み込みまたはその置換は、機能不全遺伝子生成物をもたらす。
【００７２】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、非機能性ＣｐＤ遺伝子生成物を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、元のＣｐＤ遺伝子生成物の機能または活性を有しないＣｐＤ遺伝子生成物を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、機能不全ＣｐＤ遺伝子生成物を含む。
【００７３】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、不活性化されたＣｐＤ遺伝子を含み、この不活性化されたＣｐＤ遺伝子は、完全長かつ機能性ＣｐＤ遺伝子生成物（例えば、完全長ＣｐＤポリペプチド配列）を発現しない。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、不活性化されたＣｐＤ遺伝子を含み、この不活性化されたＣｐＤ遺伝子は、内因性ＣｐＤ遺伝子生成物配列を発現しない。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、不活性化されたＣｐＤ遺伝子を含み、この不活性化されたＣｐＤ遺伝子は、変異型ＣｐＤ遺伝子生成物を発現する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、変異型ＣｐＤ遺伝子生成物を含む。
【００７４】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、送達ベクターを含む。いくつかの実施形態では、送達ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、送達ベクターは、レンチウイルスである。いくつかの実施形態では、送達ベクターは、アデノウイルスである。いくつかの実施形態において、ベクターは、プロモータを含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、安定したノックダウン宿主細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、安定したＣｐＤノックダウン細胞株である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、一過性のノックダウン細胞株である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、一過性のＣｐＤノックダウン細胞系である。
【００７６】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＣｐＤ以外の不活性化された遺伝子をさらに含む。
【００７７】
一般的に、宿主細胞は、所望のＦｃ含有タンパク質をコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターで形質転換される。加えて、本出願の宿主細胞は、ブランク宿主細胞であってもよい。本明細書で使用されるとき、「ブランク宿主」は、Ｆｃ含有タンパク質をコードする発現ベクターを含有しない細胞を指す。いくつかの実施形態では、ブランク宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態では、ブランク宿主細胞は、マウス細胞である。
【００７８】
また、本明細書に記載されるＦｃ含有タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞が本出願によって提供される。本発明によって提供される核酸分子は、１本鎖及び２本鎖両方の形態のＤＮＡ及びＲＮＡ、ならびに対応する相補配列を含む。ＤＮＡには、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成されたＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせが含まれる。本発明の核酸分子は、完全長遺伝子またはｃＤＮＡ分子、ならびにそれらの断片の組み合わせを含む。本明細書に提供される核酸は、好ましくは、ヒト源に由来する。
【００７９】
本明細書の別の箇所に記述されるように、「単離された」核酸は、天然に生じる源から単離された核酸の場合、核酸が単離された生物のゲノムに存在する隣接遺伝子配列から単離された核酸である。例えば、ＰＣＲ生成物、ｃＤＮＡ分子、またはオリゴヌクレオチドなどのテンプレートから酵素的に、または化学的に合成された核酸の場合、かかるプロセスから得られた核酸は単離された核酸であることを理解されたい。単離された核酸分子は、別個の断片の形態の、またはより大きい核酸構築物の構成成分としての核酸分子を指す。
【００８０】
ある特定の実施形態では、核酸は、汚染内因性物質を実質的に含まない。核酸分子は、好ましくは、実質的に純粋な形態で、かつ標準的な生化学方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に概説されるものなど）によりその構成成分であるヌクレオチド配列の特定、操作、及び回収を可能にする量及び濃度で少なくとも一度単離されたＤＮＡまたはＲＮＡに由来している。かかる配列は、好ましくは、真核遺伝子に典型的に存在する内部非翻訳配列またはイントランによって中断されていないオープンリーディングフレームの形態で提供及び／または構築される。非翻訳ＤＮＡの配列は、それがコード領域の操作または発現に干渉しないオープンリーディングフレームから５’または３’に存在し得る。
【００８１】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｆｃ含有タンパク質を発現することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｆｃ含有タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｆｃ含有タンパク質を分泌することができる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＣｐＤ遺伝子不活性化前の宿主細胞と類似する出力速度でＦｃ含有タンパク質を発現することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＣｐＤ遺伝子不活性化前の宿主細胞と同じ出力速度でＦｃ含有タンパク質を発現することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＣｐＤ遺伝子不活性化前の宿主細胞の約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の出力速度でＦｃ含有タンパク質を発現することができる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、遺伝子修飾をさらに含む。遺伝子修飾を介してＦｃ含有タンパク質を産生する目的のための宿主細胞の最適化は、当該技術分野において周知であり、例えば、グリコシル化パターン、統合方法のためのベクター選択性質、及びＦｃ含有タンパク質の産生のための操作に望ましいであろう任意の他の細胞性質を付与すると考えられるものを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、標的遺伝子修飾である。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ノックアウト遺伝子修飾である。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ノックイン遺伝子修飾である。
【００８４】
Ｆｃ含有タンパク質
本出願は、Ｆｃ含有タンパク質を提供し、Ｆｃ含有タンパク質の各ＦｃドメインはＣ末端リジンを有する。
【００８５】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、１つ以上のＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、２つのＦｃドメインを含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、重鎖を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、少なくとも１本の重鎖を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、１本以上の重鎖を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、２本の重鎖を含む。
【００８７】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質はＦｃドメインを含み、このＦｃドメインはＣ末端リジンを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、少なくとも１つのＦｃドメインを含み、各ＦｃドメインはＣ末端リジンを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、１つ以上のＦｃドメインを含み、各ＦｃドメインはＣ末端リジンを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、２つのＦｃドメインを含み、各ＦｃドメインはＣ末端リジンを含む。
【００８８】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は重鎖を含み、この重鎖はＣ末端リジンを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、少なくとも１本の重鎖を含み、各重鎖はＣ末端リジンを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は１本以上の重鎖を含み、各重鎖はＣ末端リジンを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は２本の重鎖を含み、各重鎖はＣ末端リジンを含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、多量体タンパク質である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は多重特異性抗体である。
【００９１】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質はＦｃ含有融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有融合タンパク質は、１つ以上のＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有融合タンパク質は、１つ以上のＦｃドメインを含み、各々Ｃ末端リジンを含む。
【００９２】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有融合タンパク質のＦｃドメインは、Ｆｃ含有融合タンパク質の血漿半減期を延長する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有融合タンパク質のＦｃドメインは、Ｆｃ含有融合タンパク質の生物学的活性を延長する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有融合タンパク質のＦｃドメインは、Ｆｃ含有融合タンパク質の腎クリアランスの速度を減少させる。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有融合タンパク質のＦｃドメインは、Ｆｃ含有融合タンパク質の溶解度を増加させる。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有融合タンパク質のＦｃドメインは、Ｆｃ含有融合タンパク質の安定度を増加させる。
【００９３】
Ｆｃ含有融合タンパク質は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｃｚａｊｋｏｗｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，４，２０１２を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有融合タンパク質はイムノアドヘシンである。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有融合タンパク質は、サイトカイン−Ｆｃ融合タンパク質である。
【００９４】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、薬剤にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、薬剤の少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の分子にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、薬剤の約２〜１０個、約４〜１０個、約６〜１０個、または約８〜１０個の分子にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は薬剤にコンジュゲートされ、この薬剤はＦｃ含有タンパク質のＦｃドメインにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、薬剤は、治療薬である。いくつかの実施形態では、治療薬は、小分子治療薬である。いくつかの実施形態では、治療薬は、化学療法薬である。いくつかの実施形態では、薬剤は、検出剤である。いくつかの実施形態では、検出剤は、放射標識である。いくつかの実施形態では、検出剤は、蛍光標識である。いくつかの実施形態では、検出剤は、免疫標識である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、コンパニオン診断薬である。
【００９５】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、Ｃ末端リジンを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、１つ以上のＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、１つ以上のＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含み、各ＦｃドメインはＣ末端リジンを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、ＩｇＧ１重鎖を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、Ｃ末端リジンを含むＩｇＧ１重鎖を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、１本以上のＩｇＧ１重鎖を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、１本以上のＩｇＧ１重鎖を含み、各重鎖はＣ末端リジンを含む。
【００９６】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、ＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、Ｃ末端リジンを含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、１つ以上のＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、１つ以上のＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含み、各ＦｃドメインはＣ末端リジンを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、ＩｇＧ２重鎖を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、Ｃ末端リジンを含むＩｇＧ２重鎖を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、１本以上のＩｇＧ２重鎖を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、１本以上のＩｇＧ２重鎖を含み、各重鎖はＣ末端リジンを含む。
【００９７】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、Ｃ末端リジンを含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、１つ以上のＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、１つ以上のＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含み、各ＦｃドメインはＣ末端リジンを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、ＩｇＧ４重鎖を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、Ｃ末端リジンを含むＩｇＧ４重鎖を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、１本以上のＩｇＧ４重鎖を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、１本以上のＩｇＧ４重鎖を含み、各重鎖はＣ末端リジンを含む。
【００９８】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、翻訳後修飾を含む。いくつかの実施形態では、翻訳後修飾は、非酵素的にもたらされる。いくつかの実施形態では、翻訳後修飾は、酵素的にもたらされる。いくつかの実施形態では、翻訳後修飾は、ジスルフィド対合、脱アミド化、酸化、Ｎ末端グルタミン環化、及びグリコシル化からなる群から選択される。
【００９９】
複数のＦｃ含有タンパク質を含む組成物
本出願は、別の態様では、複数のＦｃ含有タンパク質を含む組成物を提供し、この複数のＦｃ含有タンパク質の実質的に全てのＦｃ含有タンパク質は、各Ｆｃドメイン上にＣ末端リジンを有する。
【０１００】
本明細書で使用されるとき、「実質的に全て」という用語は、少なくとも約９０％を指し、これには、例えば、９５％または１００％を含む。したがって、例えば、本組成物は、複数のＦｃ含有タンパク質を含み、この複数のＦｃ含有タンパク質の少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＦｃ含有タンパク質が、各Ｆｃドメイン上にＣ末端リジンを有する。いくつかの実施形態では、本組成物は、複数のＦｃ含有タンパク質を含み、この複数のＦｃ含有タンパク質の１００％のＦｃ含有タンパク質が、各Ｆｃドメイン上にＣ末端リジンを有する。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、本組成物は、複数のＦｃ含有タンパク質を含み、この複数のＦｃ含有タンパク質の約９０％〜１００％のＦｃ含有タンパク質が、各Ｆｃドメイン上にＣ末端リジンを有する。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本組成物は、複数のＦｃ含有タンパク質を含み、この複数のＦｃ含有タンパク質の１００％のＦｃ含有タンパク質が、各Ｆｃドメイン上にＣ末端リジンを有する。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本組成物は、複数のＦｃ含有タンパク質を含み、この複数のＦｃ含有タンパク質の実質的に全てのＦｃ含有タンパク質が、同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本組成物は、複数のＦｃ含有タンパク質を含み、この複数のＦｃ含有タンパク質の実質的に全てのＦｃ含有タンパク質が、同じＦｃドメインアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本組成物は、複数のＦｃ含有タンパク質を含み、この複数のＦｃ含有タンパク質の実質的に全てのＦｃ含有タンパク質が、同じ重鎖アミノ酸配列を有する。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本組成物は、複数のＦｃ含有タンパク質を含み、この複数のＦｃ含有タンパク質の少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のＦｃ含有タンパク質が、同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本組成物は、複数のＦｃ含有タンパク質を含み、この複数のＦｃ含有タンパク質の少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のＦｃ含有タンパク質が、同じＦｃドメインアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本組成物は、複数のＦｃ含有タンパク質を含み、この複数のＦｃ含有タンパク質の少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のＦｃ含有タンパク質が、同じ重鎖アミノ酸配列を有する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本組成物は、複数のＦｃ含有タンパク質を含み、この複数のＦｃ含有タンパク質の少なくとも約９０％〜１００％のＦｃ含有タンパク質が、同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本組成物は、複数のＦｃ含有タンパク質を含み、この複数のＦｃ含有タンパク質の少なくとも約９０％〜１００％のＦｃ含有タンパク質が、同じＦｃドメインアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本組成物は、複数のＦｃ含有タンパク質を含み、この複数のＦｃ含有タンパク質の少なくとも約９０％〜１００％のＦｃ含有タンパク質が、同じ重鎖アミノ酸配列を有する。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本組成物は、複数のＦｃ含有タンパク質を含み、この複数のＦｃ含有タンパク質の１００％のＦｃ含有タンパク質が、同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本組成物は、複数のＦｃ含有タンパク質を含み、この複数のＦｃ含有タンパク質の１００％のＦｃ含有タンパク質が、同じＦｃドメインアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本組成物は、複数のＦｃ含有タンパク質を含み、この複数のＦｃ含有タンパク質の１００％のＦｃ含有タンパク質が、同じ重鎖アミノ酸配列を有する。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本組成物は、複数のＦｃ含有タンパク質を含み、この複数のＦｃ含有タンパク質は、荷電状態において実質的に均質である。本明細書で使用されるとき、「荷電状態において実質的に均質」は、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の複数のＦｃ含有タンパク質が同じ電荷を有することを指す。Ｆｃ含有タンパク質の電荷（例えば、表面電荷及び正味電荷）は、該Ｆｃ含有タンパク質の分子組成に高度に依存することは十分に理解されよう。いくつかの実施形態では、本組成物は、荷電状態が実質的に均質である複数のＦｃ含有タンパク質を含み、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の複数のＦｃ含有タンパク質が、同じ表面電荷を有する。いくつかの実施形態では、本組成物は、荷電状態が実質的に均質である複数のＦｃ含有タンパク質を含み、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の複数のＦｃ含有タンパク質が、同じ正味電荷を有する。いくつかの実施形態では、本組成物は、荷電状態が実質的に均質である複数のＦｃ含有タンパク質を含み、複数のＦｃ含有タンパク質の各Ｆｃ含有タンパク質は、複数のＦｃ含有タンパク質の各々にわたって比較したとき、アミノ酸配列の位置におけるアミノ酸残基上に同じ電荷（例えば、−１、０、＋１）を有する。いくつかの実施形態では、本組成物は、荷電状態が実質的に均質である複数のＦｃ含有タンパク質を含み、複数のＦｃ含有タンパク質の各Ｆｃ含有タンパク質は、同じ表面電荷を有する。いくつかの実施形態では、本組成物は、荷電状態が実質的に均質である複数のＦｃ含有タンパク質を含み、複数のＦｃ含有タンパク質の各Ｆｃ含有タンパク質は、同じ正味電荷を有する。いくつかの実施形態では、本組成物は、荷電状態が実質的に均質である複数のＦｃ含有タンパク質を含み、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の複数のＦｃ含有タンパク質が、同じｐＩを有する。いくつかの実施形態では、電荷は、Ｆｃ含有タンパク質（例えば、アミノ酸残基）に関連する。いくつかの実施形態では、電荷は、Ｆｃ含有タンパク質の翻訳後修飾に関連する。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本組成物は、薬学的組成物である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、貯蔵のための形態である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、生成物輸送のための形態である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、凍結される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、凍結乾燥される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、再構成される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、投与組成物である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、それを必要とする個体に投与するための形態である。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、減菌された薬学的組成物である。減菌された薬学的組成物は、当業者に既知である医薬グレードの減菌基準（例えば、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ７９７、１０７２、及び１２１１；Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ＆Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎｓ  Ｃｏｄｅ  ４１２７．７；１６  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  １７５１，２１  Ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  ２１、またはかかる規制に対するｅｘ−Ｕ．Ｓ．対応物）に従い配合または製造される。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、薬学的製剤は、安定した製剤である。本明細書で使用されるとき、「安定した」製剤は、含まれるＦｃタンパク質が貯蔵中に物理的及び化学的安定性及び完全性を本質的に保持するものである。タンパク質安定性を測定するための種々の分析技法が当該技術分野で利用可能であり、例えば、Ｊｏｎｅｓ，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ，１０，１９９３において考察されている。安定性は、選択された温度にて選択された期間評価することができる。例えば、貯蔵中の凝集の程度は、タンパク質安定性の指標として使用され得る。よって、「安定した」製剤は、Ｆｃ含有タンパク質の約１０％未満、好ましくは約５％未満が製剤中に凝集物として存在するものであってよい。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、薬学的製剤は、再構成された製剤である。本明細書で使用されるとき、「再構成された」製剤は、Ｆｃ含有タンパク質が全体にわたって分散されるように、希釈剤中に凍結乾燥したＦｃ含有タンパク質製剤を溶解することにより調製されたものである。再構成された製剤は、それを必要とする個体に投与するのに適している（例えば、静脈内または皮下投与）。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、等張製剤である。本明細書で使用されるとき、「等張」製剤は、ヒト血液と本質的に同じ浸透圧を有するものである。等張製剤は、一般的に、約２５０〜３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有する。「低張」という用語は、ヒト血液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する製剤を説明する。同様に、「高張」という用語は、ヒト血液の浸透圧よりも高い浸透圧を有する製剤を説明するために使用される。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、特定のｐＨである。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約５〜７、約５〜６、または約５〜５．５のｐＨである。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約５．３のｐＨである。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約５．４のｐＨである。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、ｐＨ調整される。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される担体」は、活性成分以外の薬学的組成物中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝液、賦形剤、安定剤、または保存剤が含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容される担体は、一般的に、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、これには、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質などの介在性薬物分散剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、酢酸ナトリウム、スクロース、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０）、コハク酸ナトリウム、ヒスチジン、ＨＣｌ、及び塩化ナトリウムからなる群から選択される。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容される酸をさらに含む。本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される酸」は、それらが製剤化される濃度及び様式において非毒性である無機及び有機酸を含む。例えば、好適な無機酸としては、塩化水素酸、過塩素酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、スルホン酸、スルフィン酸、スルファニル酸、リン酸、炭酸等が挙げられる。好適な有機酸としては、直鎖及び分岐鎖アルキル、芳香族、環状、脂環式、アリール脂肪族、複素環式、飽和、不飽和のモノ、ジ、及びトリカルボン酸（例えばギ酸、酢酸、２−ヒドロキシ酢酸、トリフルオロ酢酸、フェニル酢酸、トリメチル酢酸、ｔ−ブチル酢酸、アントラニル酸、プロパン酸、２−ヒドロキシプロパン酸、２−オキソプロパン酸、プロパン二酸、シクロペンタンプロピオン酸、シクロペンタンプロピオン酸、３−フェニルプロピオン酸、ブタン酸、ブタン二酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、２−アセトキシ−安息香酸、アスコルビン酸、桂皮酸、ラウリル硫酸、ステアリン酸、ムコン酸、マンデル酸、コハク酸、エンボン酸、フマル酸、リンゴ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、マロン酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、グリコール酸、グリコン酸、グルコン酸、ピルビン酸、グリオキサル酸、シュウ酸、メシル酸、コハク酸、サリチル酸、フタル酸、パルモ酸、パルメイン酸、チオシアン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、カンファスルホン酸、４−メチルビシクロ［２，２，２］−オクト−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプトン酸、４，４’−メチレンビス−３−（ヒドロキシ−２−エン−１−カルボン酸）、ヒドロキシナフトエ酸を含む）が挙げられる。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容される塩基をさらに含む。本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される塩基」は、それらが製剤化される濃度及び様式において非毒性である無機及び有機塩基を含む。例えば、好適な塩基としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウムなどの無機塩基形成性金属から形成されるもの、Ｎ−メチルグルカミン、モルホリン、ピペリジン、及び有機非毒性塩基（第一級、第二級、及び第三級アミン、置換アミン、環状アミン、及び塩基性イオン交換樹脂、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジエチルアミノエタノール、トリメタミン、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ポリアミン樹脂などを含む）を含む。特に好ましい有機非毒性塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメタミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン、及びカフェインである。
【０１１７】
本発明で使用することができるさらなる薬学的に許容される酸及び塩基としては、アミノ酸、例えば、ヒスチジン、グリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、及びアスパラギンに由来するものが挙げられる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容される緩衝液または塩、例えば、上記の酸及び塩基の酸及び塩基付加塩の両方に由来するものをさらに含む。具体的な緩衝液及び／または塩としては、ヒスチジン、コハク酸塩、及び酢酸塩が挙げられる。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容される糖をさらに含む。本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される糖」は、Ｆｃ含有タンパク質と混合した場合に、貯蔵の際のＦｃ含有タンパク質の化学的及び／または物理的不安定性を著しく妨げるかまたは低減する分子である。製剤を凍結乾燥させ、次いで再構成することを意図する場合、「薬学的に許容される糖類」は、「凍結乾燥保護剤」としても知られ得る。例示的な糖類及びそれらの対応する糖アルコールとしては、グルタミン酸一ナトリウムまたはヒスチジンなどのアミノ酸；ベタインなどのメチルアミン；硫酸マグネシウムなどのリオトロピックな塩；三価またはそれより高い分子量の糖アルコールなどのポリオール、例えばグリセリン、デキストラン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）；及びそれら組み合わせが挙げられる。さらなる例示的な凍結乾燥保護剤としては、グリセリン及びゼラチン、ならびに糖類のメリビオース、メレジトース、ラフィノース、マンノトリオース、及びスタキオースが挙げられる。還元糖類の例としては、グルコース、マルトース、ラクトース、マルツロース、イソ−マルツロース、及びラクツロースが挙げられる。非還元糖類の例としては、糖アルコール及び他の直鎖多価アルコールから選択されるポリヒドロキシ化合物の非還元グリコシドが挙げられる。好ましい糖アルコールは、モノグリコシド、特にラクトース、マルトース、ラクツロース、及びマルツロースなどの二糖類の還元により得られるそれらの化合物である。グリコシド側基は、グルコシドまたはガラクトシドのいずれかであり得る。糖アルコールのさらなる例は、グルシトール、マルチトール、ラクチトール、及びイソ−マルツロースである。好ましい薬学的に許容される糖類は、非還元糖類のトレハロースまたはスクロースである。薬学的に許容される糖類は、タンパク質がその物理的及び化学的な安定性及び完全性を貯蔵中（例えば再構成及び貯蔵の後）に本質的に保持することを意味する「保護量」（例えば凍結乾燥前）で製剤に添加される。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容される保存剤をさらに含む。本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される保存剤」は、細菌の活性を低減するために本明細書の製剤に添加することができる化合物である。可能性のある保存剤の例としては、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム（アルキル基が長鎖化合物であるアルキルベンジルジメチル塩化アンモニウムの混合物）、及び塩化ベンゼトニウムが挙げられるが、これらに限定されない。他の型の保存剤としては、芳香族アルコール、例えば、フェノール、ブチル、及びベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールが挙げられる。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、複数のＦｃ含有タンパク質を含む組成物は、細胞培養培地であり、実質的に全てのＦｃ含有タンパク質が、各Ｆｃドメイン上にＣ末端リジンを有する。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、栄養培地である。栄養培地は、宿主細胞の成長に必要な全ての要素を含有する。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、最小培地である。最小培地は、例えば、一般的にアミノ酸を含まない、宿主細胞の成長が可能な最小栄養素を含有する。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、選択培地である。選択培地は、選択生物の成長を阻害する薬剤を含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、細胞の支持及び／または成長のための細胞培養培地栄養素をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地栄養素は、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、炭水化物、金属及び鉱物、例えば、カルシウム、マグネシウム、鉄；微量金属、例えば、リン酸及び硫酸；緩衝液；ｐＨ指示薬、例えば、フェノールレッド、ブロモ−クレゾールパープル；ならびに抗菌剤から選択される。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、宿主細胞をさらに含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、実質的に宿主細胞を含まない。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、本組成物は、細胞溶解液である。いくつかの実施形態では、細胞溶解液は、複数のＦｃ含有タンパク質及び宿主細胞構成成分を含む。いくつかの実施形態では、細胞溶解液は、遠心分離された細胞溶解液である。いくつかの実施形態では、細胞溶解液は、細胞溶解液の沈殿した部分及び細胞溶解液の上清部分を含む。いくつかの実施形態では、細胞溶解液は、細胞溶解液のペレット化された部分及び細胞溶解液の上清部分を含む。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、本組成物は、タンパク質精製カラムから溶出される。本明細書で使用されるとき、「溶出液」は、タンパク質精製カラムを通過する任意の流体を指す。いくつかの実施形態では、溶出液は、フロースルー流体から単離される流体を含む。いくつかの実施形態では、溶出液は、洗浄流体から単離される流体を含む。いくつかの実施形態では、溶出液は、１つ以上の洗浄流体から単離される流体を含む。いくつかの実施形態では、溶出液は、洗浄流体から単離される流体を含む。
【０１２６】
Ｆｃ含有タンパク質を濃縮するためのタンパク質精製カラムは、当該技術分野において既知である。以下は、タンパク質精製カラムの例示的な種類である：免疫親和性、プロテインＡ、プロテインＧ、イオン交換、逆相、カチオン交換、強カチオン交換、アニオン交換、疎水性、混合様式、ヒドロキシルアパタイト、及びゲル濾過。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、本組成物は、Ｆｃ含有タンパク質のライブラリを含み、複数のＦｃ含有タンパク質のうちの少なくとも２つのＦｃ含有タンパク質は異なる。いくつかの実施形態では、ライブラリは、異なる抗原に結合する少なくとも２つのＦｃ含有タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ライブラリは、異なるエピトープに結合する少なくとも２つのＦｃ含有タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、異なるＦｃ含有タンパク質は、異なる容器に収容される。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも２、３、４、５、１０、３０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２５００、５０００、７５００、１００００、２５０００、５００００、７５０００、１０００００、２５００００、５０００００、７５００００、１００００００、２５０００００、５００００００、７５０００００、１０００００００、または１０００００００を超える異なるＦｃ含有タンパク質を含むライブラリを提供する。
【０１２９】
バッチ
本出願は、本明細書の実施形態に記載される組成物のいずれかの大規模なバッチ（例えば、製造規模での商業用バッチ（複数可））を提供する。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、バッチは、少なくとも約５ｇ、１０ｇ、５０ｇ、１００ｇ、２００ｇ、３００ｇ、４００ｇ、５００ｇ、６００ｇ、７００ｇ、８００ｇ、９００ｇ、１，０００ｇ、１，５００ｇ、２，０００ｇ、２，５００ｇ、３，０００ｇ、３，５００ｇ、４，０００ｇ、４，５００ｇ、または５，０００ｇの複数のＦｃ含有タンパク質を含み、この複数のＦｃ含有タンパク質の各Ｆｃ含有タンパク質は、各Ｆｃドメイン上にＣ末端リジンを有する。いくつかの実施形態では、バッチは、少なくとも約５〜５，０００ｇ、５０〜４，０００ｇ、または約１００〜１，０００ｇの複数のＦｃ含有タンパク質を含み、この複数のＦｃ含有タンパク質の各Ｆｃ含有タンパク質は、各Ｆｃドメイン上にＣ末端リジンを有する。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、バッチは、薬物貯蔵のための形態である。いくつかの実施形態では、バッチは、生成物輸送のための形態である。いくつかの実施形態では、バッチは、それを必要とする個体に投与するための形態である。いくつかの実施形態では、バッチは凍結乾燥される。いくつかの実施形態では、バッチは、薬剤にコンジュゲートされない。いくつかの実施形態では、バッチは、薬剤にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、バッチは、製剤構成成分をさらに含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、バッチは、細胞培養培地である。いくつかの実施形態では、バッチは、細胞溶解液である。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、バッチまたはその一部は、容器中に存在する。いくつかの実施形態では、バッチまたはその一部は、バイアル中に存在する。いくつかの実施形態では、バッチまたはその一部は、複数のバイアル中に存在する。いくつかの実施形態では、バッチまたはその一部は、シリンジ中に存在する。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、バッチまたはその一部は、複数のバイアル中に存在し、各バイアルは、複数のＦｃ含有タンパク質を含み、各Ｆｃ含有タンパク質は、各Ｆｃドメイン上にＣ末端リジンを有する。いくつかの実施形態では、バッチまたはその一部は、複数のバイアル中に存在し、各バイアルは、複数のＦｃ含有タンパク質を含み、各バイアル中の少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の複数のＦｃ含有タンパク質が、各Ｆｃドメイン上にＣ末端リジンを有する。いくつかの実施形態では、バッチまたはその一部は、複数のバイアル中に存在し、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のバイアルは、各Ｆｃドメイン上にＣ末端リジンを含む、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の複数のＦｃ含有タンパク質を含む。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、バッチは、単位投与量に分配される。本明細書で使用されるとき、「単位投与量」は、単回単位用量として投与することを意図したＦｃ含有タンパク質の量である。いくつかの実施形態では、単回単位用量は、約１〜約５００ｍｇのＦｃ含有タンパク質である。いくつかの実施形態では、単位投与量は、容器にパッケージされる。いくつかの実施形態では、単位投与量は、バイアルにパッケージされる。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、商業用バッチのサイズは、臨床用バッチのサイズの約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍を超えない。本明細書で使用されるとき、「商業用バッチ」は、商業用産生及び／または配給の目的のために完了された１回以上の産生運転中に産生されたＦｃ含有タンパク質の量を指す。本明細書で使用されるとき、「臨床用バッチ」は、臨床試験の目的のために完了された１回以上の産生運転中に産生されたＦｃ含有タンパク質の量を指す。いくつかの実施形態では、商業用バッチのサイズは、臨床用バッチのサイズの１０倍を超えない。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、容器は、本明細書に記載される商業用バッチのアリコートを含み、この商業用バッチは、Ｆｃ含有タンパク質を含む組成物を含み、Ｆｃ含有タンパク質の各ドメインは、Ｃ末端リジンを有する。いくつかの実施形態では、バイアルは、本明細書に記載される商業用バッチのアリコートを含み、この商業用バッチは、Ｆｃ含有タンパク質を含む組成物を含み、Ｆｃ含有タンパク質の各ドメインは、Ｃ末端リジンを有する。いくつかの実施形態では、シリンジは、本明細書に記載される商業用バッチのアリコートを含み、この商業用バッチは、Ｆｃ含有タンパク質を含む組成物を含み、Ｆｃ含有タンパク質の各ドメインは、Ｃ末端リジンを有する。
【０１３８】
細胞培養系
本発明は、本明細書の実施形態に記載される任意の宿主細胞を含む細胞培養系を提供する。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、細胞培養系は、Ｆｃ含有タンパク質の産生のための環境で宿主細胞を維持する。いくつかの実施形態では、細胞培養系は、成長のための環境で宿主細胞を維持する。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、細胞培養系は、種培養物を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養系は、接種培養物を含む。いくつかの実施形態では、接種培養は、一次接種培養物である。いくつかの実施形態では、接種培養は、二次接種物である。いくつかの実施形態では、細胞培養系は、産生培養物を含む。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、細胞培養系は、特定の環境で宿主細胞を維持するための機構を含む。いくつかの実施形態では、特定の環境は、特定の温度である。いくつかの実施形態では、特定の温度は、約１５℃〜約４５℃である。いくつかの実施形態では、特定の温度は、約３０℃である。いくつかの実施形態では、特定の環境は、特定のｐＨである。いくつかの実施形態では、特定の環境は、特定の溶解された酸素濃度である。いくつかの実施形態では、特定の環境は、特定の栄養素レベルである。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、細胞培養物は、培養培地をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞培養系は、種培養物を含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、接種培養物である。いくつかの実施形態では、接種培養培地は、一次接種培養培地である。いくつかの実施形態では、接種培養培地は、二次接種培地である。いくつかの実施形態では、培養培地は、産生培養培地である。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、培養系は、本明細書の実施形態に記載されるＦｃ含有タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、培養系は、本明細書の実施形態に記載される複数のＦｃ含有タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、培養系は、本明細書の実施形態に記載されるＦｃ含有タンパク質を含む組成物を含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、培養系は、Ｆｃ含有タンパク質を含み、Ｆｃ含有タンパク質の各ＦｃドメインはＣ末端リジンを有する。いくつかの実施形態では、培養系は、複数のＦｃ含有タンパク質を含み、この複数のＦｃ含有タンパク質の各Ｆｃ含有タンパク質は、Ｃ末端リジンＦｃドメインを有する。いくつかの実施形態では、培養系は、複数のＦｃ含有タンパク質を含む組成物を含み、この複数のＦｃ含有タンパク質の各Ｆｃ含有タンパク質は、各Ｆｃドメイン上にＣ末端リジンを有する。
【０１４５】
ＣｐＤ発現レベルが低減した宿主細胞の産生方法
本出願は、本明細書の実施形態に記載される任意の宿主細胞の産生方法を提供し、本方法は、宿主細胞のＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。
【０１４６】
一般的に、宿主細胞の産生方法は、宿主細胞のＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞が低減したＣｐＤ発現レベルを有する宿主細胞の産生方法は、ｓｉＲＮＡ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、長さが約１０〜２００ヌクレオチド、または長さが約１０〜１００ヌクレオチド、または長さが約１５〜１００ヌクレオチド、または長さが約１０〜６０ヌクレオチド、または長さが約１５〜６０ヌクレオチド、または長さが約１０〜５０ヌクレオチド、または長さが約１５〜５０ヌクレオチド、または長さが約１０〜３０ヌクレオチド、または長さが約１５〜３０ヌクレオチドであるｓｉＲＮＡヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、長さがおよそ１０〜２５ヌクレオチドであるｓｉＲＮＡヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、長さがおよそ１５〜２５ヌクレオチドであるｓｉＲＮＡヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、長さが少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、または少なくとも約２５ヌクレオチドであるｓｉＲＮＡヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ＣｐＤ  ｍＲＮＡ分子の領域に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相補的であるヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ＣｐＤ  ｐｒｏ−ｍＲＮＡ分子の領域に対して少なくとも少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相補的であるｓｉＲＮＡヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、２本鎖ＲＮＡ分子を含むｓｉＲＮＡ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、１本鎖ＲＮＡ分子を含むｓｉＲＮＡ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。例示的なＣｐＤ  ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列は表１に列挙される。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ｓｉＲＮＡ系を宿主細胞に送達することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ｓｉＲＮＡ系を宿主細胞に送達することを含み、ｓｉＲＮＡ系は、ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、電気穿孔を使用してｓｉＲＮＡ系を宿主細胞に送達することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、トランスフェクション技法を使用してｓｉＲＮＡ系を宿主細胞に送達することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ウイルスを使用してｓｉＲＮＡ系を宿主細胞に送達することを含む。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、宿主細胞が低減したＣｐＤ発現レベルを有する宿主細胞の産生方法は、宿主細胞におけるＣｐＤ遺伝子不活性化レベルを決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルの決定は、ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列を宿主細胞に送達する前にＣｐＤ発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルの決定は、ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列を宿主細胞に送達した後にＣｐＤ発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ発現レベルは、ＲＮＡレベルで決定される。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルの決定方法は、ＰＣＲを使用してＣｐＤ発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ発現レベルは、タンパク質レベルで決定される。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルの決定方法は、免疫組織化学を使用してＣｐＤ発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルの決定方法は、ウエスタンブロットを使用してＣｐＤ発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルの決定方法は、フローサイトメトリーを使用してＣｐＤ発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルは、ｓｉＲＮＡの送達後のＣｐＤ発現レベルを対照値と比較することにより決定される。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルは、ｓｉＲＮＡの送達後のＣｐＤ発現レベルを野生型値と比較することにより決定される。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルは、ｓｉＲＮＡの送達後のＣｐＤ発現レベルを、ＣｐＤ  ｓｉＲＮＡの送達前のＣｐＤ発現レベルと比較することにより決定される。
【０１４９】
ＲＮＡレベルでのＣｐＤレベルを決定するための例示的なプライマー及びプローブを表２に提供する。
表２．ＣｐＤのＲＮＡ発現レベルを決定するための例示的なヌクレオチド配列。
2018529341.tif 000003
【０１５０】
いくつかの実施形態では、宿主細胞が低減したＣｐＤ発現レベルを有する宿主細胞の産生方法は、ｓｈＲＮＡ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、長さが約１０〜２００ヌクレオチド、または長さが約１０〜１００ヌクレオチド、または長さが約１５〜１００ヌクレオチド、または長さが約１０〜６０ヌクレオチド、または長さが約１５〜６０ヌクレオチド、または長さが約１０〜５０ヌクレオチド、または長さが約１５〜５０ヌクレオチド、または長さが約１０〜３０ヌクレオチド、または長さが約１５〜３０ヌクレオチドであるｓｈＲＮＡヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、長さがおよそ１０〜２５ヌクレオチドであるｓｈＲＮＡヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、長さがおよそ１５〜２５ヌクレオチドであるｓｈＲＮＡヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、長さが少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、または少なくとも約２５ヌクレオチドであるｓｈＲＮＡヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ＣｐＤ  ｍＲＮＡ分子の領域に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相補的であるヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ＣｐＤ  ｐｒｏ−ｍＲＮＡ分子の領域に対して少なくとも少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相補的であるｓｈＲＮＡヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、２本鎖ＲＮＡ分子を含むｓｈＲＮＡ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、１本鎖ＲＮＡ分子を含むｓｈＲＮＡ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。例示的なＣｐＤ  ｓｈＲＮＡヌクレオチド配列は表１に列挙される。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ｓｈＲＮＡ系を宿主細胞に送達することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ｓｈＲＮＡ系を宿主細胞に送達することを含み、ｓｈＲＮＡ系は、ｓｈＲＮＡヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、電気穿孔を使用してｓｈＲＮＡ系を宿主細胞に送達することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、トランスフェクション技法を使用してｓｈＲＮＡ系を宿主細胞に送達することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ウイルスを使用してｓｈＲＮＡ系を宿主細胞に送達することを含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、宿主細胞が低減したＣｐＤ発現レベルを有する宿主細胞の産生方法は、宿主細胞におけるＣｐＤ遺伝子不活性化レベルを決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルの決定は、ｓｈＲＮＡヌクレオチド配列を宿主細胞に送達する前にＣｐＤ発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルの決定は、ｓｈＲＮＡヌクレオチド配列を宿主細胞に送達した後にＣｐＤ発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ発現レベルは、ＲＮＡレベルで決定される。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルの決定方法は、ＰＣＲを使用してＣｐＤ発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ発現レベルは、タンパク質レベルで決定される。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルの決定方法は、免疫組織化学を使用してＣｐＤ発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルの決定方法は、ウエスタンブロットを使用してＣｐＤ発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルの決定方法は、フローサイトメトリーを使用してＣｐＤ発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルは、ｓｈＲＮＡの送達後のＣｐＤ発現レベルを対照値と比較することにより決定される。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルは、ｓｈＲＮＡの送達後のＣｐＤ発現レベルを野生型値と比較することにより決定される。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルは、ｓｈＲＮＡの送達後のＣｐＤ発現レベルを、ＣｐＤ  ｓｈＲＮＡの送達前のＣｐＤ発現レベルと比較することにより決定される。
【０１５３】
ＲＮＡレベルでのＣｐＤレベルを決定するための例示的なプライマー及びプローブを表２に提供する。
【０１５４】
遺伝子欠失または遺伝子付加もしくは置換による宿主細胞の産生方法が本出願においてさらに提供される。例えば、方法は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、及びメガヌクレアーゼ系の使用を含むが、これらに限定されない。
【０１５５】
一般的に、ＣＲＩＳＰＲ系は、Ｃａｓ９などのカスパーゼンタンパク質、及び目的とする配列に相補的である、ガイド配列とも称されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ配列を含む。カスパーゼ及びＲＮＡ配列は、宿主細胞のＤＮＡ配列を特定する複合体を形成し、その後、カスパーゼのヌクレアーゼ活性はＤＮＡ鎖の切断を可能にする。カスパーゼアイソタイプは、１本鎖ＤＮＡまたは２本鎖ＤＮＡヌクレアーゼ活性を有する。ＣＲＩＳＰＲ系に使用されるガイドＲＮＡ配列の設計及びガイドＲＮＡ配列の数は、遺伝子の特定の伸長の除去及び／またはＤＮＡ配列の付加を可能にする。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、宿主細胞が低減したＣｐＤ発現レベルを有する宿主細胞の産生方法は、ＣＲＩＳＰＲ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、コードベクターを含むＣＲＩＳＰＲ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ遺伝子を含むコードベクターを含むＣＲＩＳＰＲ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ＣＡＳ遺伝子を含むコードベクターを含むＣＲＩＳＰＲ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ＣＡＳ９遺伝子を含むコードベクターを含むＣＲＩＳＰＲ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ＣＡＳ９遺伝子をコードするコードベクターを含むＣＲＩＳＰＲ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、Ｃａｓタンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、Ｃａｓ９タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用することができるＲＮＡ分子をコードするコードベクターを含むＣＲＩＳＰＲ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）単位を含むＲＮＡ分子をコードするコードベクターを含むＣＲＩＳＰＲ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含み、ｇＲＮＡ単位は、ＣｐＤ遺伝子配列の一部に相補的であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ｇＲＮＡ単位を含むＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含み、ｇＲＮＡ単位は、ＣｐＤ遺伝子配列の一部に相補的であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）単位を含むＲＮＡ分子をコードするコードベクターを含むＣＲＩＳＰＲ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ｔｒａｃｒＲＮＡ単位を含むＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ｇＲＮＡ単位及びｔｒａｃｒＲＮＡ単位を含むＲＮＡ分子をコードするコードベクターを含むＣＲＩＳＰＲ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含み、ｇＲＮＡ単位は、遺伝子配列の一部に相補的であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ｇＲＮＡ単位及びｔｒａｃｒＲＮＡ単位を含むＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含み、ｇＲＮＡ単位は、ＣｐＤ遺伝子配列の一部に相補的であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ａ）ｇＲＮＡ単位を含む第１のＲＮＡ分子であって、ｇＲＮＡ単位がＣｐＤ遺伝子配列の一部に相補的である第１のヌクレオチド配列を含む、第１のＲＮＡ分子、及びｂ）ｇＲＮＡ単位を含む第２のＲＮＡ分子であって、ｇＲＮＡ単位がＣｐＤ遺伝子配列の一部に相補的である第２のヌクレオチド配列を含む、第２のＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列は異なる。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列に相補的であるＣｐＤ遺伝子の一部の領域とは異なる位置にあるＣｐＤ遺伝子配列の一部に相補的である。
【０１５７】
ｇＲＮＡ配列に含まれる例示的なＣｐＤ標的配列は表３に列挙される。
表３．ｇＲＮＡに含まれる例示的なＣｐＤ標的配列。
2018529341.tif 000004
【０１５８】
いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ＣＲＩＳＰＲ系を宿主細胞に送達することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、送達ベクターを使用してＣＲＩＳＰＲ系を含むベクターを送達することを含む。いくつかの実施形態では、送達ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、送達ベクターは、レンチウイルスである。いくつかの実施形態では、送達ベクターは、アデノウイルスである。いくつかの実施形態において、ベクターは、プロモータを含む。
【０１５９】
一般的に、ＴＡＬＥＮ系は、１つ以上の制限ヌクレアーゼと、ＤＮＡ配列の認識及び後続の２本鎖ＤＮＡ切断を可能にする２つ以上のタンパク質複合体と、を含む。ＴＡＬＥＮ系のタンパク質複合体は、各々が特定のヌクレオチドを認識するいくつかの転写活性化因子様エフェクタ（ＴＡＬＥ）、及び制限ヌクレアーゼのドメインを含む。一般的に、ＴＡＬＥＮ系は、各々がＴＡＬＥ及び制限ヌクレアーゼのドメインを含む２つのタンパク質複合体が、制限ヌクレアーゼの２つのドメイン（各タンパク質複合体から１つずつ）が活性ヌクレアーゼを形成し、特定のＤＮＡ配列を切断することを可能にする様式でＤＮＡ配列に個々に結合するように設計される。ＴＡＬＥＮ系において切断されるタンパク質複合体及び配列の数の設計は、遺伝子の特定の伸長の除去及び／またはＤＮＡ配列の付加を可能にする。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、宿主細胞が低減したＣｐＤ発現レベルを有する宿主細胞の産生方法は、ＴＡＬＥＮ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、第１のＴＡＬＥＮ単位を含むＴＡＬＥＮ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、第１のＴＡＬＥＮ単位は、第１のＴＡＬＥＮ結合単位を含む。いくつかの実施形態では、第１のＴＡＬＥＮ結合単位は、少なくとも１つの転写活性化因子様エフェクタ（ＴＡＬＥ）及び第１のヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のＴＡＬＥＮ結合単位は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のＴＡＬＥ及び第１のヌクレアーゼドメインを含み、このＴＡＬＥは一緒に連結され、連結されたＴＡＬＥは、ＣｐＤヌクレオチド配列の一部を認識する。いくつかの実施形態では、第１のＴＡＬＥＮ結合単位は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のＴＡＬＥ及び第１のヌクレアーゼドメインを含み、このＴＡＬＥは一緒に連結され、連結されたＴＡＬＥは、ＣｐＤヌクレオチド配列の一部を認識し、連結されたＴＡＬＥは、第１のヌクレアーゼドメインにさらに連結される。いくつかの実施形態では、第１のＴＡＬＥＮ単位は、第２のＴＡＬＥＮ結合単位を含む。いくつかの実施形態では、第２のＴＡＬＥＮ結合単位は、少なくとも１つの転写活性化因子様エフェクタ（ＴＡＬＥ）及び第２のヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２のＴＡＬＥＮ結合単位は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のＴＡＬＥ及び第２のヌクレアーゼドメインを含み、このＴＡＬＥは一緒に連結され、連結されたＴＡＬＥは、ＣｐＤヌクレオチド配列の一部を認識する。いくつかの実施形態では、第２のＴＡＬＥＮ結合単位は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のＴＡＬＥ及び第２のヌクレアーゼドメインを含み、このＴＡＬＥは一緒に連結され、連結されたＴＡＬＥは、ＣｐＤヌクレオチド配列の一部を認識し、連結されたＴＡＬＥは、第２のヌクレアーゼドメインにさらに連結される。いくつかの実施形態では、第１のＴＡＬＥＮ結合単位及び第２のＴＡＬＥＮ結合単位は、ＣｐＤ遺伝子の異なる配列に結合する。いくつかの実施形態では、第１のヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態では、第１のヌクレアーゼドメインは、制限エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態では、第１のヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１のドメインである。いくつかの実施形態では、第２のヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態では、第２のヌクレアーゼドメインは、制限エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態では、第２のヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１のドメインである。いくつかの実施形態では、第１のヌクレアーゼドメイン及び第２のヌクレアーゼドメインは、活性制限エンドヌクレアーゼを含むように会合する。いくつかの実施形態では、第１のヌクレアーゼドメイン及び第２のヌクレアーゼドメインは、活性Ｆｏｋ１酵素を含むように会合する。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、第２のＴＡＬＥＮ単位をさらに含むＴＡＬＥＮ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、第２のＴＡＬＥＮ単位は、第３のＴＡＬＥＮ結合単位を含む。いくつかの実施形態では、第３のＴＡＬＥＮ結合単位は、少なくとも１つの転写活性化因子様エフェクタ（ＴＡＬＥ）及び第３のヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、第３のＴＡＬＥＮ結合単位は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のＴＡＬＥ及び第３のヌクレアーゼドメインを含み、このＴＡＬＥは一緒に連結され、連結されたＴＡＬＥは、ＣｐＤヌクレオチド配列の一部を認識する。いくつかの実施形態では、第３のＴＡＬＥＮ結合単位は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のＴＡＬＥ及び第３のヌクレアーゼドメインを含み、このＴＡＬＥは一緒に連結され、連結されたＴＡＬＥは、ＣｐＤヌクレオチド配列の一部を認識し、連結されたＴＡＬＥは、第３のヌクレアーゼドメインにさらに連結される。いくつかの実施形態では、第２のＴＡＬＥＮ単位は、第４のＴＡＬＥＮ結合単位をさらに含む。いくつかの実施形態では、第４のＴＡＬＥＮ結合単位は、少なくとも１つの転写活性化因子様エフェクタ（ＴＡＬＥ）及び第４のヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、第４のＴＡＬＥＮ結合単位は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のＴＡＬＥ及び第４のヌクレアーゼドメインを含み、このＴＡＬＥは一緒に連結され、連結されたＴＡＬＥは、ＣｐＤヌクレオチド配列の一部を認識する。いくつかの実施形態では、第４のＴＡＬＥＮ結合単位は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のＴＡＬＥ及び第４のヌクレアーゼドメインを含み、このＴＡＬＥは一緒に連結され、連結されたＴＡＬＥは、ＣｐＤヌクレオチド配列の一部を認識し、連結されたＴＡＬＥは、第４のヌクレアーゼドメインにさらに連結される。いくつかの実施形態では、第３のＴＡＬＥＮ結合単位及び第４のＴＡＬＥＮ結合単位は、ＣｐＤ遺伝子の異なる配列に結合する。いくつかの実施形態では、第３のヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態では、第３のヌクレアーゼドメインは、制限エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態では、第３のヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１のドメインである。いくつかの実施形態では、第４のヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態では、第４のヌクレアーゼドメインは、制限エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態では、第４のヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１のドメインである。いくつかの実施形態では、第３のヌクレアーゼドメイン及び第４のヌクレアーゼドメインは、活性制限エンドヌクレアーゼを含むように会合する。いくつかの実施形態では、第３のヌクレアーゼドメイン及び第４のヌクレアーゼドメインは、活性Ｆｏｋ１酵素を含むように会合する。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、宿主細胞が低減したＣｐＤ発現レベルを有する宿主細胞の産生方法は、ＴＡＬＥＮ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含み、このＴＡＬＥＮ系は、第１のＴＡＬＥＮ単位、及びＣｐＤ遺伝子配列の異なる重複しない部分に結合する第２のＴＡＬＥＮ単位を含む。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、宿主細胞が低減したＣｐＤ発現レベルを有する宿主細胞の産生方法は、ＴＡＬＥＮ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含み、このＴＡＬＥＮ系は、第１のＴＡＬＥＮ単位をコードするコードベクターを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞が低減したＣｐＤ発現レベルを有する宿主細胞の産生方法は、ＴＡＬＥＮ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含み、このＴＡＬＥＮ系は、第１のＴＡＬＥＮ単位をコードするコードベクターを含み、このＴＡＬＥＮ系は、第２のＴＡＬＥＮ単位をコードするコードベクターを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞が低減したＣｐＤ発現レベルを有する宿主細胞の産生方法は、ＴＡＬＥＮ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含み、このＴＡＬＥＮ系は、第１のＴＡＬＥＮ単位をコードするコードベクターを含み、ＴＡＬＥＮ系は、第１のＴＡＬＥＮ単位及び第２のＴＡＬＥＮ単位をコードするコードベクターを含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、宿主細胞が低減したＣｐＤ発現レベルを有する宿主細胞の産生方法は、ＴＡＬＥＮ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含み、このＴＡＬＥＮ系は、第１のＴＡＬＥＮ単位を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞が低減したＣｐＤ発現レベルを有する宿主細胞の産生方法は、ＴＡＬＥＮ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含み、このＴＡＬＥＮ系は、第２のＴＡＬＥＮ単位を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞が低減したＣｐＤ発現レベルを有する宿主細胞の産生方法は、ＴＡＬＥＮ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含み、このＴＡＬＥＮ系は、第１のＴＡＬＥＮ単位及び第２のＴＡＬＥＮ単位を含む。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、第１のＴＡＬＥＮ結合単位は、連結されたＴＡＬＥ群を含み、このＴＡＬＥ群は、ヌクレオチド配列を認識する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣｐＤ遺伝子の一部を含む配列である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣｐＤ遺伝子プロモータの一部を含む配列である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣｐＤ遺伝子に隣接する配列の一部を含む配列である。いくつかの実施形態では、配列は、ＣｐＤ遺伝子の一部に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相同である。いくつかの実施形態では、配列は、ＣｐＤ遺伝子プロモータの一部に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相同である。いくつかの実施形態では、配列は、ＣｐＤ遺伝子に隣接する配列の一部に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相同である。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ＴＡＬＥＮ系を宿主細胞に送達することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、送達ベクターを使用してＴＡＬＥＮ系を含むベクターを送達することを含む。いくつかの実施形態では、送達ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、送達ベクターは、レンチウイルスである。いくつかの実施形態では、送達ベクターは、アデノウイルスである。
【０１６７】
一般的に、ＺＦＮ系は、１つ以上の制限ヌクレアーゼと、ＤＮＡ配列の認識及び後続の２本鎖ＤＮＡ切断を可能にする２つ以上のタンパク質複合体と、を含む。ＺＦＮ系のタンパク質複合体は、各々が特定のヌクレオチドコドンを認識するいくつかの亜鉛フィンガ、及び制限ヌクレアーゼのドメインを含む。一般的に、ＺＦＮ系は、各々が亜鉛フィンガ及び制限ヌクレアーゼのドメインを含む２つのタンパク質複合体が、制限ヌクレアーゼの２つのドメイン（各タンパク質複合体から１つずつ）が活性ヌクレアーゼを形成し、特定のＤＮＡ配列を切断することを可能にする様式でＤＮＡ配列に個々に結合するように設計される。ＺＦＮ系において切断されるタンパク質複合体及び配列の数の設計は、遺伝子の特定の伸長の除去及び／またはＤＮＡ配列の付加を可能にする。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、宿主細胞が低減したＣｐＤ発現レベルを有する宿主細胞の産生方法は、ＺＦＮ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、第１のＺＦＮ単位を含むＺＦＮ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、第１のＺＦＮ単位は、第１のＺＦＮ結合単位を含む。いくつかの実施形態では、第１のＺＦＮ結合単位は、少なくとも１つの亜鉛フィンガ及び第１のヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のＺＦＮ結合単位は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の亜鉛フィンガ及び第１のヌクレアーゼドメインを含み、この亜鉛フィンガは一緒に連結され、連結された亜鉛フィンガは、ＣｐＤヌクレオチド配列の一部を認識する。いくつかの実施形態では、第１のＺＦＮ結合単位は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の亜鉛フィンガ及び第１のヌクレアーゼドメインを含み、この亜鉛フィンガは一緒に連結され、連結された亜鉛フィンガは、ＣｐＤヌクレオチド配列の一部を認識し、連結された亜鉛フィンガは、第１のヌクレアーゼドメインにさらに連結される。いくつかの実施形態では、第１のＺＦＮ単位は、第２のＺＦＮ結合単位をさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のＺＦＮ結合単位は、少なくとも１つの亜鉛フィンガ及び第２のヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２のＺＦＮ結合単位は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の亜鉛フィンガ及び第２のヌクレアーゼドメインを含み、この亜鉛フィンガは一緒に連結され、連結された亜鉛フィンガは、ＣｐＤヌクレオチド配列の一部を認識する。いくつかの実施形態では、第２のＺＦＮ結合単位は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の亜鉛フィンガ及び第２のヌクレアーゼドメインを含み、この亜鉛フィンガは一緒に連結され、連結された亜鉛フィンガは、ＣｐＤヌクレオチド配列の一部を認識し、連結された亜鉛フィンガは、第２のヌクレアーゼドメインにさらに連結される。いくつかの実施形態では、第１のＺＦＮ結合単位及び第２のＺＦＮ結合単位は、ＣｐＤ遺伝子の異なる配列に結合する。いくつかの実施形態では、第１のヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態では、第１のヌクレアーゼドメインは、制限エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態では、第１のヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１のドメインである。いくつかの実施形態では、第２のヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態では、第２のヌクレアーゼドメインは、制限エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態では、第２のヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１のドメインである。いくつかの実施形態では、第１のヌクレアーゼドメイン及び第２のヌクレアーゼドメインは、活性制限エンドヌクレアーゼを含むように会合する。いくつかの実施形態では、第１のヌクレアーゼドメイン及び第２のヌクレアーゼドメインは、活性Ｆｏｋ１酵素を含むように会合する。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、第２のＺＦＮ単位をさらに含むＺＦＮ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、第２のＺＦＮ単位は、第３のＺＦＮ結合単位を含む。いくつかの実施形態では、第３のＺＦＮ結合単位は、少なくとも１つの亜鉛フィンガ及び第３のヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、第３のＺＦＮ結合単位は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の亜鉛フィンガ及び第３のヌクレアーゼドメインを含み、この亜鉛フィンガは一緒に連結され、連結された亜鉛フィンガは、ＣｐＤヌクレオチド配列の一部を認識する。いくつかの実施形態では、第３のＺＦＮ結合単位は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の亜鉛フィンガ及び第３のヌクレアーゼドメインを含み、この亜鉛フィンガは一緒に連結され、連結された亜鉛フィンガは、ＣｐＤヌクレオチド配列の一部を認識し、連結された亜鉛フィンガは、第３のヌクレアーゼドメインにさらに連結される。いくつかの実施形態では、第２のＺＦＮ単位は、第４のＺＦＮ結合単位をさらに含む。いくつかの実施形態では、第４のＺＦＮ結合単位は、少なくとも１つの亜鉛フィンガ及び第４のヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、第４のＺＦＮ結合単位は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の亜鉛フィンガ及び第４のヌクレアーゼドメインを含み、この亜鉛フィンガは一緒に連結され、連結された亜鉛フィンガは、ＣｐＤヌクレオチド配列の一部を認識する。いくつかの実施形態では、第４のＺＦＮ結合単位は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の亜鉛フィンガ及び第４のヌクレアーゼドメインを含み、この亜鉛フィンガは一緒に連結され、連結された亜鉛フィンガは、ＣｐＤヌクレオチド配列の一部を認識し、連結された亜鉛フィンガは、第４のヌクレアーゼドメインにさらに連結される。いくつかの実施形態では、第３のＺＦＮ結合単位及び第４のＺＦＮ結合単位は、ＣｐＤ遺伝子の異なる配列に結合する。いくつかの実施形態では、第３のヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態では、第３のヌクレアーゼドメインは、制限エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態では、第３のヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１のドメインである。いくつかの実施形態では、第４のヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態では、第４のヌクレアーゼドメインは、制限エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態では、第４のヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１のドメインである。いくつかの実施形態では、第３のヌクレアーゼドメイン及び第４のヌクレアーゼドメインは、活性制限エンドヌクレアーゼを含むように会合する。いくつかの実施形態では、第３のヌクレアーゼドメイン及び第４のヌクレアーゼドメインは、活性Ｆｏｋ１酵素を含むように会合する。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、宿主細胞が低減したＣｐＤ発現レベルを有する宿主細胞の産生方法は、ＺＦＮ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含み、このＺＦＮ系は、第１のＺＦＮ単位、及びＣｐＤ遺伝子遺伝子配列の異なる重複しない部分に結合する第２のＴＡＬＥＮ単位を含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、宿主細胞が低減したＣｐＤ発現レベルを有する宿主細胞の産生方法は、ＺＦＮ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含み、このＺＦＮ系は、第１のＺＦＮ単位をコードするコードベクターを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞が低減したＣｐＤ発現レベルを有する宿主細胞の産生方法は、ＺＦＮ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含み、このＺＦＮ系は、第１のＺＦＮ単位をコードするコードベクターを含み、このＺＦＮ系は、第２のＺＦＮ単位をコードするコードベクターを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞が低減したＣｐＤ発現レベルを有する宿主細胞の産生方法は、ＺＦＮ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含み、このＺＦＮ系は、第１のＺＦＮ単位をコードするコードベクターを含み、ＺＦＮ系は、第１のＺＦＮ単位及び第２のＺＦＮ単位をコードするコードベクターを含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、宿主細胞が低減したＣｐＤ発現レベルを有する宿主細胞の産生方法は、ＺＦＮ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含み、このＺＦＮ系は、第１のＺＦＮ単位を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞が低減したＣｐＤ発現レベルを有する宿主細胞の産生方法は、ＺＦＮ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含み、このＺＦＮ系は、第２のＺＦＮ単位を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞が低減したＣｐＤ発現レベルを有する宿主細胞の産生方法は、ＺＦＮ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含み、このＺＦＮ系は、第１のＺＦＮ単位及び第２のＺＦＮ単位を含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、第１のＺＦＮ結合単位は、連結された亜鉛フィンガ群を含み、この亜鉛フィンガ群は、ヌクレオチド配列を認識する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣｐＤ遺伝子の一部を含む配列である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣｐＤ遺伝子プロモータの一部を含む配列である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣｐＤ遺伝子に隣接する配列の一部を含む配列である。いくつかの実施形態では、配列は、ＣｐＤ遺伝子の一部に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相同である。いくつかの実施形態では、配列は、ＣｐＤ遺伝子プロモータの一部に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相同である。いくつかの実施形態では、配列は、ＣｐＤ遺伝子に隣接する配列の一部に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相同である。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ＺＦＮ系を宿主細胞に送達することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、送達ベクターを使用してＺＦＮ系を含むベクターを送達することを含む。いくつかの実施形態では、送達ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、送達ベクターは、レンチウイルスである。いくつかの実施形態では、送達ベクターは、アデノウイルスである。
【０１７５】
一般的に、メガヌクレアーゼ系は、ＤＮＡ配列の認識及び後続の２本鎖ＤＮＡ切断を可能にする１つ以上のメガヌクレアーゼを含む。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、宿主細胞が低減したＣｐＤ発現レベルを有する宿主細胞の産生方法は、メガヌクレアーゼ系を使用してＣｐＤ遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼは、長さが約８〜約３５ヌクレオチド塩基対であるＤＮＡ認識配列を有する。いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼは、長さが約１２〜約３０ヌクレオチド塩基対であるＤＮＡ認識配列を有する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ認識配列は、ＣｐＤ遺伝子の一部を含む配列である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ認識配列は、ＣｐＤ遺伝子プロモータの一部を含む配列である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ認識配列は、ＣｐＤ遺伝子に隣接する配列の一部を含む配列である。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、メガヌクレアーゼ系を宿主細胞に送達することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、送達ベクターを使用してメガヌクレアーゼ系を含むベクターを送達することを含む。いくつかの実施形態では、送達ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、送達ベクターは、レンチウイルスである。いくつかの実施形態では、送達ベクターは、アデノウイルスである。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、宿主細胞が低減したＣｐＤ発現レベルを有する宿主細胞の産生方法は、遺伝子欠失または遺伝子付加もしくは置換など、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルを決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルを決定することを含み、ＣｐＤ遺伝子欠失が検出される。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルを決定することを含み、ＣｐＤ遺伝子付加または置換が検出される。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルを決定することを含み、ＣｐＤ発現レベルが、宿主細胞において遺伝子を不活性化する前に決定される。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルを決定することを含み、ＣｐＤ発現レベルが、ＣＲＩＳＰＲ系を使用して宿主細胞におけるＣｐＤ遺伝子を不活性化した後に決定される。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルを決定することを含み、ＣｐＤ発現レベルが、ＴＡＬＥＮ系を使用して宿主細胞におけるＣｐＤ遺伝子を不活性化した後に決定される。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルを決定することを含み、ＣｐＤ発現レベルが、ＺＦＮ系を使用して宿主細胞におけるＣｐＤ遺伝子を不活性化した後に決定される。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルを決定することを含み、ＣｐＤ発現レベルが、メガヌクレアーゼ系を使用して宿主細胞におけるＣｐＤ遺伝子を不活性化した後に決定される。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、ＣｐＤ発現レベルは、ＤＮＡレベルで決定される。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ発現レベルは、ＲＮＡレベルで決定される。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ＰＣＲを使用してＣｐＤ発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ＰＣＲを使用してＣｐＤ発現レベルを決定することを含み、変異型配列が検出される。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ｑＰＣＲを使用してＣｐＤ発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ｑＰＣＲを使用してＣｐＤ発現レベルを決定することを含む。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、ＣｐＤ発現レベルは、タンパク質レベルで決定される。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、免疫組織化学を使用してＣｐＤ発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、ウエスタンブロットを使用してＣｐＤ発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の産生方法は、フローサイトメトリーを使用してＣｐＤ発現レベルを決定することを含む。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルは、ＣｐＤ遺伝子不活性化後のＣｐＤ発現レベルを対照値と比較することにより決定される。いくつかの実施形態では、ＣｐＤ遺伝子不活性化レベルは、ＣｐＤ遺伝子不活性化後のＣｐＤ発現レベルを、ＣｐＤ遺伝子不活性化前のＣｐＤ発現レベルと比較することにより決定される。
【０１８２】
ＣｐＤ発現を決定することを含む、Ｆｃ含有タンパク質の発現の適切性に関して宿主細胞を評価する方法も提供され、低減されたＣｐＤ発現レベルは適切性の指標である。
【０１８３】
Ｆｃ含有タンパク質の作製方法
本出願は、本明細書の実施形態に記載されるＦｃ含有タンパク質の作製方法を提供する。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質の作製方法は、ａ）宿主細胞を培養することと、ｂ）宿主細胞によって発現されたＦｃ含有タンパク質を得ることと、を含む。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質の作製方法は、ａ）Ｆｃ含有タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換することと、ｂ）宿主細胞を培養することと、ｃ）宿主細胞によって発現されたＦｃ含有タンパク質を得ることと、を含む。
【０１８６】
発現ベクターを使用した宿主細胞の形質転換方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，３９７，２０１０を参照されたい。宿主細胞のトランスフェクト方法には、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈降、電気穿孔、微量注入、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、または他の既知の技法を含むが、これらに限定されない。選択される方法は、部分的に、使用される宿主細胞の種類に応じて決まる。これらの方法及び他の好適な方法は、当業者に周知である。
【０１８７】
本明細書に記載される少なくとも１つのＦｃ含有タンパク質を含むプラスミド、発現ベクター、転写、または発現カセットの形態の発現系及び構築物も提供される。ある特定の実施形態では、本明細書に提供されるプラスミド、発現ベクター、転写、または発現カセットは、少なくとも１つのＦｃ含有タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、宿主細胞に使用される発現ベクターは、プラスミドの維持、ならびに外因性ヌクレオチド配列のクローニング及び発現のための配列を含有する。ある特定の実施形態では、集合的に「隣接配列」とも称されるかかる配列は、典型的には、以下のヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含む：プロモータ、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終止配列、ドナー及びアクセプタースプライス部位を含有する完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるＦｃ含有タンパク質をコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択可能マーカー要素。これらの配列の各々は以下に論じられる。
【０１８９】
隣接配列は、相同（すなわち、宿主細胞と同じ種及び／または株から）、異種（すなわち、宿主細胞種または株以外の種から）、ハイブリッド（すなわち、２つ以上の源からの隣接配列の組み合わせ）、合成、または天然であり得る。そのため、隣接配列源は、任意の真核生物、任意の脊椎もしくは無脊椎生物、または任意の植物であり得るが、但し、隣接配列は、宿主細胞機構において機能的であり、それによって活性化され得ることを条件とする。
【０１９０】
本発明のベクターにおいて有用な隣接配列は、当該技術分野において周知のいくつかの方法のいずれかによって得ることができる。典型的には、本明細書において有用な隣接配列は、マッピング及び／または制限エンドヌクレアーゼ消化により以前に特定されており、したがって、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して、適切な組織源から単離され得る。場合によっては、隣接配列の完全なヌクレオチド配列が既知である場合がある。ここで、隣接配列は、核酸合成またはクローニングに関して本明細書に記載される方法を使用して合成され得る。
【０１９１】
隣接配列の全てまたは一部のみが既知であるかに関わらず、それは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、かつ／またはオリゴヌクレオチド及び／もしくは同じまたは別の種からの隣接配列断片などの好適なプローブでゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得ることができる。隣接配列が不明の場合、隣接配列を含有するＤＮＡの断片が、例えば、コード配列またはさらには別の遺伝子（複数可）を含有し得るＤＮＡのより大きな片から単離され得る。単離は、適切なＤＮＡ断片を産生するための制限エンドヌクレアーゼ消化、続いてアガロースゲル精製Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）、または当業者に既知の他の方法を使用して単離することにより達成される。この目的を達成するための好適な酵素の選択は、当業者には容易に明らかであろう。
【０１９２】
複製起点は、典型的には、商業的に購入された部分発現ベクターであり、起点は、宿主細胞におけるベクターの増幅を補助する。選択したベクターが複製起点部位を含有しない場合、既知の配列に基づいて化学合成され、ベクター内にライゲートされ得る。例えば、種々のウイルス起源（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶもしくはＢＰＶなどのパピローマウイルス）が、哺乳類細胞におけるベクターのクローニングに有用である。一般的に、複製起点構成成分は、哺乳動物発現ベクターに必要とされない（例えば、ＳＶ４０起源は、ウイルス初期プロモータも含有するという理由だけで使用されることが多い）。
【０１９３】
転写終止配列は、典型的には、ポリペプチドコード領域の末端の３’に位置し、転写を終結するように機能する。配列はライブラリから容易にクローニングされるか、またはさらにはベクターの一部として商業的に購入されるが、本明細書に記載されるものなど、核酸合成の方法を使用して容易に合成することもできる。
【０１９４】
選択可能マーカー遺伝子は、選択培養培地中で成長した宿主細胞の生存及び成長に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素への耐性を付与するか、（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補完するか、または（ｃ）複合培地もしくは既知組成培地から利用できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。具体的な選択可能マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。有利に、ネオマイシン耐性遺伝子も真核宿主細胞における選択に使用され得る。
【０１９５】
他の選択可能遺伝子が、発現される遺伝子を増幅するために使用され得る。増幅は、成長または細胞生存に重要なタンパク質の産生に必要とされる遺伝子が組換え細胞の連続した世代の染色体内にタンデムで繰り返されるプロセスである。哺乳類細胞に好適な選択可能マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）及びプロモータのないチルニジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。哺乳類細胞形質転換体が、形質転換体のみがベクターに存在する選択可能遺伝子により生存するように一意的に適合される選択圧下に置かれる。選択圧は、培地中の選択薬剤の濃度が連続的に増加する条件下で形質転換された細胞を培養し、それにより、選択可能遺伝子、及び抗体軽鎖または重鎖などの別の遺伝子をコードするＤＮＡの両方の増幅をもたらすことにより課される。結果として、増加したポリペプチド量が増幅したＤＮＡから合成される。
【０１９６】
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、例えば、コザック配列を特徴とする。この要素は、典型的には、発現されるポリペプチドのプロモータの３’及びコード配列の５’に位置する。ある特定の実施形態では、１つ以上のコード領域が、内部のリボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結され得、単一ＲＮＡ転写物からの２つのオープンリーディングフレームの翻訳を可能にする。
【０１９７】
本発明の発現及びクローニングベクターは、典型的には、宿主生物により認識され、かつポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結されるプロモータを含有する。プロモータは、構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子の開始コドン（一般的に、約１００〜１０００ｂｐ内）の上流（すなわち、５’）に位置する非転写配列である。プロモータは、従来、２つのクラス、すなわち誘導プロモータ及び構成プロモータのうちの１つに分類される。誘導プロモータは、培養条件のある変化、例えば、栄養素の存在もしくは不在、または温度の変化に応答してそれらの制御下でＤＮＡから増加したレベルの転写を開始する。一方、構成プロモータは、それらが作動可能に連結される遺伝子を一律に転写し、すなわち遺伝子発現に対してほとんどまたは全く制御がない。様々な潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモータが周知である。好適なプロモータは、制限酵素消化により源のＤＮＡからプロモータを除去し、所望のプロモータ配列をベクターに挿入することにより、例えば、重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡに作動可能に連結される。
【０１９８】
酵母宿主と共に使用するのに好適なプロモータも当該技術分野において周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモータと共に有利に使用される。哺乳類宿主細胞と共に使用するのに好適なプロモータは周知であり、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるものを含むが、これらに限定されない。他の好適な哺乳類プロモータには、異種哺乳類プロモータ、例えば、熱ショックプロモータ及びアクチンプロモータが含まれる。
【０１９９】
目的のものであり得る追加のプロモータには、ＳＶ４０初期プロモータ（Ｂｅｎｏｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）、ＣＭＶプロモータ（Ｔｈｏｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６５９−６６３）、ラウス肉腫ウイルスの３’の長い末端リピートに含有されるプロモータ（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−１４４５）、メタロチオニン遺伝子からのプロモータ及び調節配列、Ｐｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２、またはｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）が含まれるが、これらに限定されない。組織特異性を呈し、トランスジェニック動物に利用されている以下の動物転写制御領域も目的のものである：膵臓腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４  Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−６４６、Ｏｍｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９、ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）、膵臓β細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−１２２）、リンパ球細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−６５８、Ａｄａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−５３８、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４）、精巣、乳房、リンパ球、及びマスト細胞において活性であるマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−４９５）、肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）、肝臓において活性であるアルファ−フェタタンパク質遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８、Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：５３−５８）、肝臓において活性であるアルファ−１アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）、骨髄細胞において活性であるベータ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−３４０、Ｋｏｌｌｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４）、脳の乏突起膠細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−７１２）、骨格筋において活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−２８６）、及び視床下部において活性である性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−１３７８）。
【０２００】
エンハンサー配列は、ベクターに挿入されて、高等真核生物による本発明の軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡの転写を増加させることができる。エンハンサーは、転写を増加させるようにプロモータに作用する、通常長さが約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用要素である。エンハンサーは、比較的、配向及び位置に依存し、転写単位の５’及び３’の両方の位置で見出される。哺乳類遺伝子から利用可能ないくつかのエンハンサー配列が知られている（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ胎児タンパク質、及びインスリン遺伝子）。しかし、典型的には、ウイルスからのエンハンサーが使用される。当該技術分野において既知であるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモータエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーは、真核プロモータの活性化のための例示的な増強要素である。エンハンサーは、コード配列の５’または３’のいずれかのベクターに位置し得るが、典型的には、プロモータから部位５’に位置する。適切な天然または異種シグナル配列（リーダー配列またはシグナルペプチド）をコードする配列は、抗体の細胞外分泌を促進するために、発現ベクターに組み込まれ得る。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、抗体が産生される宿主細胞の種類に依存し、天然のシグナル配列を異種シグナル配列に置き換えることができる。哺乳類宿主細胞において機能的であるシグナルペプチドの例としては、以下が含まれる：米国特許第４，９６５，１９５号に記載されるインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列、Ｃｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８に記載されるインターロイキン−２受容体のシグナル配列、欧州特許第０３６７  ５６６号に記載されるインターロイキン−４受容体シグナルペプチド、米国特許第４，９６８，６０７に記載されるＩ型インターロイキン−Ｉ受容体シグナルペプチド、欧州特許第０  ４６０  ８４６号に記載されるＩＩ型インターロイキン−Ｉ受容体シグナルペプチド。
【０２０１】
ベクターは、ベクターが宿主細胞ゲノムに統合されるとき、発現を容易にする１つ以上の要素を含有し得る。例としては、ＥＡＳＥ要素（Ａｌｄｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．１９：１４３３−３８）及マトリックス付着領域（ＭＡＲ）が挙げられる。ＭＡＲは、クロマチンの構造機構を媒介し、統合されたベクターを「位置」作用から隔離し得る。したがって、ＭＡＲは、ベクターを使用して安定したトランスフェクタントを創出するときに特に有用である。例えば、米国特許第６，２３９，３２８号、同第７，３２６，５６７号、同第６，１７７，６１２号、同第６，３８８，０６６号、同第６，２４５，９７４号、同第７，２５９，０１０号、同第６，０３７，５２５号、同第７，４２２，８７４号、同第７，１２９，０６２号など、いくつかの天然及び合成ＭＡＲ含有核酸が当該技術分野において既知である。
【０２０２】
本発明により提供される発現ベクターは、市販のベクターなどの開始ベクターから構築され得る。かかるベクターは、所望の隣接配列の全てを含有しても、含有しなくてもよい。本明細書に記載される隣接配列のうちの１つ以上が既にベクターに存在していない場合、それらを個々に得、ベクターにライゲートすることができる。隣接配列の各々を得るために使用される方法は、当業者に周知である。
【０２０３】
ベクターが構築され、Ｆｃ含有タンパク質配列をコードする核酸分子がベクターの適切な部位に挿入された後、完成したベクターは、増幅及び／またはポリペプチド発現のために好適な宿主細胞に挿入され得る。
【０２０４】
Ｆｃ含有タンパク質をコードする核酸を含むベクターの作製方法は、当該技術分野において周知である。例えば、米国特許第７，９２３，２２１号を参照されたい。
【０２０５】
Ｆｃ含有タンパク質、ならびに所望のコード及び制御配列を含む好適なベクターの構築は、標準的なライゲーション技法を用いる。単離されたプラスミドまたはＤＮＡ断片が、所望の形態に切断、調整、及びライゲートされて、必要とされるプラスミドを形成する。用いられる方法は、ＤＮＡ源または意図される宿主に依存しない。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質の作製方法は、宿主細胞に導入するためのポリヌクレオチドの最適な比率を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質の収率を決定するために質量分析が使用され、比率はＦｃ含有タンパク質の収率を最大にするように調節される。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質の収率を決定するために二重抗原ＥＬＩＳＡが使用され、比率はＦｃ含有タンパク質の収率を最大にするように調節される。
【０２０７】
宿主細胞の培養方法は、当業者に周知である。例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ，２，２０１０を参照されたい。本明細書の実施形態の所望のＦｃ含有タンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が、宿主細胞の培養に好適である。加えて、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚ，５８，１９７９、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０２，１９８０、米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５号、または同第５，１２２，４６９号、国際特許出願第ＷＯ９０／０３４３０号もしくは同第ＷＯ８７／００１９５号、または米国特許再発行第３０，９８５号に記載の培地のいずれも、宿主細胞の培養培地として使用され得る。これらの培地のいずれも、必要に応じて、ホルモン及び／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬など）、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物と定義される）、ならびにグルコースまたは同等のエネルギー源で補充され得る。任意の他の必要な補充物もまた、当業者には既知であろう適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に以前に使用されているものであり、当業者には明らかであろう。
【０２０８】
一般的に、Ｆｃ含有タンパク質の産生は、大規模（商業規模）で行われる。商業規模の産生に好適な宿主細胞集団を得るために、当業者は、宿主細胞集団を拡大するための段階的アプローチを使用する有用性を認識するだろう。例えば、プロセスは、宿主細胞集団の増加を可能にするために、シードトレインなどの小規模で所望の宿主細胞を成長させることを伴う。宿主細胞集団をさらに増加させるために、方法は、一般的に、シードトレインを使用して、接種タンクなどのより大きな培養タンクを接種することを伴った。しばしば、接種トレインなどのサイズを増加させる一連の接種タンクが、宿主細胞集団を拡大するために使用される。このプロセスは、産生培養において培養のための好適な宿主細胞集団を提供する。いくつかの実施形態では、産生培養は、１０００Ｌの培養タンクである。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質の作製方法は、バッチ投入方法を使用して宿主細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質の作製方法は、連続投入方法を使用して宿主細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質の作製方法は、バッチ投入方法及び連続投入方法を含む投入方法を使用して宿主細胞を培養することを含む。
【０２１０】
Ｆｃ含有タンパク質を得るための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈ  Ｍｅｔｈ，５１，２００２を参照されたい。Ｆｃ含有タンパク質は、細胞内で産生されるか、または培地内に直接分泌され得る。Ｆｃ含有タンパク質が細胞内で産生される場合、最初のステップとして、微粒子残屑（宿主細胞または溶解断片のいずれか）が、例えば、遠心分離または限外濾過により除去される。Ｆｃ含有タンパク質が培地内に分泌される場合、かかる発現系からの上清は一般的に、市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して、まず濃縮される。いくつかの実施形態では、タンパク質分解を阻害するためのプロテアーゼ阻害剤が前述のステップのうちのいずれかに含まれてもよく、二次的な不純物の成長を阻止するための抗生物質が含まれてもよい。
【０２１１】
細胞から調製された組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができ、親和性クロマトグラフィーが好ましい精製技法である。親和性リガンドとしてのタンパク質Ａの適切性は、Ｆｃ含有タンパク質に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。タンパク質Ａは、１、２、または４本の重鎖を含有するヒト免疫グロブリンに基づくＦｃ含有タンパク質を精製するために使用され得る（例えば、Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ，６２，１９８３を参照されたい）。タンパク質Ｇは、全てのマウスアイソタイプ及びヒト３に推奨される（例えば、Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ，５，１９８６を参照されたい）。親和性リガンドが結合するマトリックスは、多くの場合アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。孔制御ガラスまたはポリ（スチレン−ジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定したマトリックスは、アガロースで達成可能なものよりも速い流速、及び短い処理時間を可能にする。タンパク質精製のための他の技法、例えば、イオン交換カラム上での分別、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリン上でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿も、回収されるＦｃ含有タンパク質に応じて利用可能である。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質の精製方法は、フィルタを使用することを含む。いくつかの実施形態では、フィルタは、透析濾過系である。いくつかの実施形態では、フィルタは、限外濾過系である。いくつかの実施形態では、フィルタは、ウイルス濾過系である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質の精製は、一連の濾過ステップを使用することを含む。いくつかの実施形態では、一連の濾過ステップは、以下のうちの少なくとも１つから選択される：透析濾過、限外濾過、及びウイルス濾過。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質の精製方法は、濾過、タンパク質Ａ精製、カチオン交換精製、強カチオン交換精製、アニオン交換精製、逆相精製、及び多様式精製から選択される一連のタンパク質精製技法を使用することを含む。
【０２１４】
Ｃ末端リジンの存在の決定方法も、本出願において提供される。いくつかの実施形態では、Ｃ末端リジンの存在の決定方法は、画像化キャピラリー等電点電気泳動などの等電点電気泳動を使用することを含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端リジンの存在の決定方法は、質量分析を使用することを含む。
【０２１５】
治療方法
本出願は、本明細書の実施形態に記載される薬学的組成物を個体に投与することを含む、治療を必要とする個体における疾患の治療方法を提供する。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、複数のＦｃ含有タンパク質の有効量がそれを必要とする個体に投与され、この複数のＦｃ含有タンパク質の実質的に全てが、各Ｆｃドメイン上にＣ末端リジンを有する。
【０２１７】
本明細書に記載される薬学的組成物は、非経口（静脈内、動脈内、腹腔内、肺内を含む）、経口、吸入、小胞内、筋肉内、気管内、皮下、眼内、クモ膜下腔内、または経皮などの種々の経路を介して投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬学的組成物は、非経口投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬学的組成物は、静脈内投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬学的組成物は、皮下投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬学的組成物は、局在投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬学的組成物は、局所投与され得る。
【０２１８】
本明細書の方法により治療され得る疾患は、Ｆｃ含有タンパク質で治療され得る任意の疾患である。いくつかの実施形態では、疾患は、癌である。いくつかの実施形態では、疾患は、自己免疫疾患である。いくつかの実施形態では、疾患は、感染である。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬学的組成物は、別の投与モダリティまたは治療と併せて使用される。
【０２２０】
当業者は、いくつかの実施形態が本発明の範囲及び趣旨内で可能であることを認識するだろう。本発明は、ここで、以下の非限定的な実施例を参照することにより、より詳細に記載される。以下の実施例は本発明をさらに例示説明するが、当然のことながら、その範囲を制限するものとして決して解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２２１】
実施例１：
カルボキシペプチダーゼＤは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞においてＣ末端リジン切断に関与する
方法：
細胞株Ａは、ＤＵＸＢ−１１系ＤＨＦＲ欠損ＤＰ１２宿主に由来する社内で開発された抗体産生（ＩｇＧ１）細胞株である。Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ，２９，２０１３、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，７７，１９８０を参照されたい。細胞株Ｂは、ＣＨＯＫ１宿主に由来する社内で開発された抗体産生（ＩｇＧ１）細胞株である。Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ，２９，２０１３を参照されたい。１５０ｒｐｍ、３７℃、及び５％ＣＯ２の１２５ｍｌ振盪フラスコ容器中の独自のＤＭＥＭ／Ｆ１２系培地中でＣＨＯ細胞を培養した。３〜４日毎に３×１０５／ｍＬの播種密度で細胞を継代した。
【０２２２】
ＲＮｅａｓｙ  ９６キット（Ｃａｔ＃  ７４１８１，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して全ＲＮＡを単離し、ＤＮａｓｅ消化（Ｃａｔ＃  ７９２５４，ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で処理して、単離したＲＮＡ試料に存在し得るいかなる残存ＤＮＡも除去した。製造元の指示に従い、一般的なｑＲＴ−ＰＣＲマスター混合物（Ｃａｔ＃  ４３０９１６９，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、Ｔａｑｍａｎを行った。異なるカルボキシペプチダーゼの発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子β−２−ミクログロブリン（β２ｍ）に正規化された。
【０２２３】
Ｔａｑｍａｎ分析に使用されたプライマー及びプローブ配列は以下の通りであった：
ＣｐＤ順方向プライマー：ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＣＡＴ  ＴＡＣ  ＡＡＡ  ＴＣＴ  ＴＡＣ  ＣＡ（配列番号１）；
ＣｐＤ逆方向プライマー：ＧＡＧ  ＡＴＴ  ＴＣＧ  ＡＧＧ  ＧＡＣ  ＣＡＡ  ＡＴ（配列番号２）；
ＣｐＤプローブ：ＴＴＧ  ＧＧＡ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＴＡＴ  ＣＧＴ  ＣＡ（配列番号３）；
ＣｐＮ順方向プライマー：ＧＴＧ  ＧＧＡ  ＴＣＡ  ＡＴＣ  ＡＣＧ  ＡＴＧ  ＴＣ（配列番号４）；
ＣｐＮ逆方向プライマー：ＣＣＴ  ＴＧＧ  ＣＡＧ  ＴＧＡ  ＣＡＡ  ＴＧＴ  ＡＡＧ  ＴＡ（配列番号５）；
ＣｐＮプローブ：ＡＣＡ  ＴＧＧ  ＧＧＡ  ＴＴＡ  ＣＴＴ  ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＧＣＴ  Ｇ（配列番号６）；
ＣｐＭ順方向プライマー：ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＧＡＧ  ＡＧＴ  ＡＣＴ  ＡＣＣ  ＴＧＣ  ＴＴＣ  Ｔ（配列番号７）；
ＣｐＭ逆方向プライマー：ＴＣＡ  ＴＧＣ  ＣＣＡ  ＧＧＧ  ＡＣＴ  ＧＴＡ（配列番８）；
ＣｐＭプローブ：ＡＴＴ  ＧＡＴ  ＣＡＣ  ＧＴＡ  ＧＧＡ  ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＣＡＡ  Ａ（配列番号９）；
ＣｐＢ順方向プライマー：ＴＧＡ  ＡＴＧ  ＣＧＣ  ＴＧＧ  ＴＧＡ  ＡＡＧ  Ｇ（配列番号１０）；
ＣｐＢ逆方向プライマー：ＴＣＣ  ＴＧＧ  ＧＣＣ  ＡＴＡ  ＴＧＴ  ＧＴＡ  ＣＴＴ  Ｇ（配列番号１１）；
ＣｐＢプローブ：ＣＧＧ  ＴＣＡ  ＡＧＧ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＣＣＴ  ＣＴＣ  ＴＧＣ  Ａ（配列番号１２）；
ＣｐＥ順方向プライマー：ＴＧＧ  ＣＴＡ  ＣＣＴ  ＧＧＣ  ＡＡＴ  ＡＡＣ  ＡＡ（配列番号１３）；
ＣｐＥ逆方向プライマー：ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＡＡＡ  ＧＴＣ  ＡＡ（配列番号１４）；
ＣｐＥプローブ：ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＣＡＧ  ＴＴＣ  ＣＴＴ  ＴＣＡ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  Ｃ（配列番号１５）；
β−ミクログロブリン順方向プライマー：ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＣＡＧ  ＴＧＧ  ＴＣＴ  ＧＣＴ  ＴＧＧ（配列番号１６）；
β−ミクログロブリン逆方向プライマー：ＴＧＧ  ＣＧＴ  ＧＴＧ  ＴＡＧ  ＡＣＴ  ＴＧＣ  ＡＣＴ  Ｔ（配列番号１７）；
β−ミクログロブリンプローブ：ＴＧＣ  ＣＡＴ  ＣＣＡ  ＧＣＧ  ＴＣＣ  ＣＣＣ  Ａ（配列番号１８）。
【０２２４】
全てのプライマー及びプローブは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で合成及び精製された。
【０２２５】
ウエスタンブロット分析が、ＣＨＯ細胞における相対的カルボキシペプチダーゼＤタンパク質発現レベルを決定するために行われた。細胞質タンパク質であるβ−アクチンを試料充填対照として使用した。細胞ペレットを回収し、１ｘ細胞溶解緩衝液（Ｃａｔ＃  ９８０３，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）に溶解した。溶解された上清の全タンパク質をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｃａｔ＃  １８５６２１０，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で定量化し、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に充填する前に、３分間９５℃で加熱した。エレクトロブロットにより、分離したタンパク質をニトロセルロース膜に移した。次に、移した膜を、ＣｐＤタンパク質発現を検出するためのカルボキシペプチダーゼＤに対するウサギポリクローナル抗体（Ｃａｔ＃  ＳＡＢ２７００４８６，Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、及び等しい試料充填の充填対照としてのβ−アクチンに対するマウス抗体（Ｃａｔ＃  Ａ２２２８，Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と共にインキュベートした。
【０２２６】
低分子干渉ＲＮＡ（ＤＳＩＲ）プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｍｅｄｃｅｎｔｒａｌ．ｃｏｍ）のデザイナーを使用して、ＣｐＤ及びＣｐＮ特異的低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列を設計した：
ＣｐＤ  ｓｉＲＮＡ標的配列：ＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＣＴＡＣＴＡＡ（配列番号１９）；
ＣｐＮ  ｓｉＲＮＡ標的配列：ＧＡＡＴＧＧＴＧＣＴＴＧＡＴＧＡＧＡＡ（配列番号２０）。
【０２２７】
上記のｓｉＲＮＡ配列を合成し、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  ３．１−Ｈ１ベクター（Ｃａｔ＃  ＡＭ５７６６，Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）に個々にクローニングしてｓｉＲＮＡ発現構築物を作製した。一過性のトランスフェクションにおいて、製造元の推奨に従いリポフェクタミン２０００  ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、各構築物を抗体発現細胞株Ａ及び抗体発現細胞株Ｂに導入した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞ペレットを回収して、Ｔａｑｍａｎにより各カルボキシペプチダーゼｍＲＮＡの発現を評価した。加えて、画像化キャピラリー等電点電気泳動（ＩｃＩＥＦ）による電荷変異型生成物品質分析のために、細胞培養液（ＣＣＦ）を回収し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５（３０，０００  ＭＷＣＯ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）により濃縮した。
【０２２８】
フルオロカーボンコーティングされたキャピラリーカートリッジ（１００μｍ×５ｃｍ）を備えるｉＣＥ２８０分析器（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を使用して、電荷変異型分布を評価した。両性電解質溶液は、０．３５％のメチルセルロース（ＭＣ）、１．３４％の３〜１０両性電解質担体、１．３４％の６．７〜７．７両性電解質担体、ｐＩマーカー（ｐＩ  ６．６１及びｐＩ  ９．２２）、ならびに精製水中１０ｍＭのＬ−アルギニン遊離塩基の混合物からなった。陽極液は８０ｍＭリン酸であり、陰極液は１００ｍＭ水酸化ナトリウムであり、両方とも０．１％ＭＣ中である。試料を希釈し、両性電解質溶液と混合し、次に、１５００Ｖの電位を１分間、続いて３０００Ｖの電位を８分間導入することにより電気泳動した。電気泳動した電荷変異型の画像は、キャピラリーを通して電荷結合素子デジタルカメラのレンズに２８０ｎｍの紫外線を通過させることにより得た。重鎖Ｃ末端Ｌｙｓ残基を除去するために、１：１００（ｗ／ｗ）の酵素：基質比で、希釈ステップでカルボキシペプチダーゼＢを各試料に添加し、続いて３７℃で２０分間インキュベートした。
【０２２９】
下の次のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列を、それぞれ、ＣｐＤエキソン２及びエキソン２１上に位置するように設計した：
エキソン２のＣｐＤガイドＲＮＡ１配列（ｇＲＮＡ１）：ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＧＡＧ  ＡＣＴ  ＴＴＣ  ＡＡＡ  ＧＡＣ  ＧＧ（配列番号２１）；
エキソン２１のＣｐＤガイドＲＮＡ２配列（ｇＲＮＡ２）：ＴＣＡ  ＧＴＴ  ＡＧＧ  ＴＧＧ  ＣＴＴ  ＡＧＧ  ＴＴＣ  ＧＧ（配列番号２２）。
【０２３０】
カスパーゼ９（Ｃａｓ９）と共に同時にトランスフェクトされたとき、ｇＲＮＡ配列は、大半の注釈付けされたＣｐＤ遺伝子座を包含する約４６ｋｂの欠失を可能にすると予想される。
【０２３１】
個々のｇＲＮＡをクローニングし、ｐＬＫＯ．５ベクター（Ｃａｔ＃  ＳＨＣ−２０１，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のヒトＵ６プロモータの制御下で転写した。２つのｇＲＮＡ及びＣａｓ９構築物を、等モル比で同時にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、限界希釈により細胞を３８４ウェルプレートに播種した。３週間後、コロニーを選び取り、９６ウェルプレートに移し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりスクリーニングした。ＣｐＤノックアウト（約４６ｋｂ欠失）及び野生型対立遺伝子をスクリーニングするためのＰＣＲプライマーは以下の通りであった：
ＣｐＤノックアウト対立遺伝子の順方向プライマー：ＡＧＴ  ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＧＴＧ  Ｇ（配列番号２３）；
ＣｐＤノックアウト対立遺伝子の逆方向プライマー：ＧＧＡ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＴＣＣ  ＴＴＣ  ＡＧＴ  ＧＡＡ  ＣＡＣ（配列番号２４）；
ＣｐＤ野生型対立遺伝子の順方向プライマー：ＣＣＡ  ＧＴＴ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＴＴＡ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＧＡＧ（配列番号２５）；
ＣｐＤ野生型対立遺伝子の逆方向プライマー：ＡＡＴ  ＧＴＴ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＧＡＣ  ＣＴＴ（配列番号２６）；
【０２３２】
希釈したタンパク質試料（１ｍｇ／ｍＬ）を、１：１の比率で２０ｍｇ／ｍＬのＴＣＥＰ溶液と混合し、６０℃で１０分間インキュベートして抗体を還元し、それを軽鎖と重鎖に解離した。次に、ナノ−チップＬＣ−ＥＳＩ源と結合されたＡｇｉｌｅｎｔ  ６２１０飛行時間質量分析を使用して、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ）により各試料を分析した。簡潔に、約５ｎｇのタンパク質試料を、脱塩のための４０ｎＬのトラップカラム及び４００ｎＬ／分での分離のための４３ｍｍ×７５μｍの寸法の等価分析カラムＺｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ−Ｃ８（５μｍ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を有するカスタムチップ上に注入した。Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｂｓ，５，２０１３を参照されたい。移動相Ａは水中０．１％ギ酸であり、移動相Ｂはアセトニトリル中０．１％ギ酸であった。ＭＳデータが抽出され、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｂ．０４．００を使用してデコンボリューションされた。Ｃ末端リジンの割合を推定するために、Ｃ末端リジンを伴う、または伴わない抗体重鎖に対応するデコンボリューションされた質量の強度が使用された。
【０２３３】
流加産生を、独自の化学既知組成培地において、浸透フラスコ容器で行われ、３、７、及び１０日目にボーラス投入された。３７℃から３５℃への温度変更が３日目に行われた。１４日目の力価は、ＵＶ検出を伴うタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーを使用して決定された。
【０２３４】
結果：
ｑＰＣＲ分析が、各宿主（細胞株Ａ及び細胞株Ｂ）からのＤＵＸＢ−１１系ＤＨＦＲ欠損ＤＰ１２、ＤＨＦＲ陽性ＣＨＯＫ１宿主、ならびに抗体産生細胞株における可能な内因性カルボキシペプチダーゼのｍＲＮＡレベルを測定するために行われた。細胞株ＡはＤＨＦＲ欠損ＤＰ１２宿主に由来し、細胞株ＢはＤＨＦＲ陽性ＣＨＯＫ１宿主に由来した。
【０２３５】
ＣｐＤ、ＣｐＮ、ＣｐＭ、ＣｐＢ、及びＣｐＥの５つのカルボキシペプチダーゼがｑＰＣＲによるｍＲＮＡ発現分析用に選択された。ＣｐＤは、両ＣＨＯ宿主及びそれらのそれぞれの抗体発現株において、最も高いｍＲＮＡレベルを有した（図１Ａ及び図１Ｂ）。ＣｐＤ及びＣｐＮ  ｍＲＮＡレベルは、細胞株Ａ及び細胞株Ｂにおいて、ＣｐＭ、ＣｐＥ、及びＣｐＢのレベルよりも高かった（図１Ｂ）。
【０２３６】
ｓｉＲＮＡ媒介ノックダウン（例えば、Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ，６１，２００９を参照されたい）実験が、２つの最も豊富なカルボキシペプチダーゼ、つまりＣｐＤ及びＣｐＮを有する２つの抗体産生細胞株を使用して行われた。各細胞株は、それぞれ、ＣｐＤ（ＣｐＤｉ構築物）またはＣｐＮ（ＣｐＮｉ構築物）を特異的に標的とするｓｉＲＮＡ構築物で一過的にトランスフェクトされた。スクランブルされたベクター対照構築物も、陰性対照としてトランスフェクトされた。図２Ａに示されるように、ＣｐＤ  ｍＲＮＡレベルは、細胞株Ａにおいて３９％、そして細胞株Ｂにおいて２８％ノックダウンされた。類似する結果がＣｐＮｉ構築物によるＣｐＮ  ｍＲＮＡ阻害に関して観察され、ＣｐＮ  ｍＲＮＡレベルは細胞株Ａにおいて４３％、そして細胞株Ｂにおいて３５％低減された、（図２Ｂ）。
【０２３７】
細胞培養における抗体上に存在するＣ末端リジンの百分率が計算された。細胞培養における抗体上に存在するＣ末端リジンの百分率を計算するために、ＣｐＢ処理を伴う、または伴わないＣｐＤｉ及びＣｐＮｉトランスフェクトされた細胞株からの上清を、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーで精製し、画像化キャピラリー等電点電気泳動（ＩｃＩＥＦ）で分析した。ＣｐＢ処理された試料と未処理の試料との間の差分値は、無傷Ｃ末端リジンを有する抗体の百分率を表す。ＣｐＤ  ｍＲＮＡがおよそ３０〜４０％ノックダウンされたとき、大幅に増加したＣ末端リジンレベルが両細胞株において観察された（図２Ａ及び図３）。最小のＣ末端リジンレベル変化が、スクランブルされたＲＮＡｉ構築物（陰性対照）、またはＣｐＮ  ｍＲＮＡをおよそ４０％までノックダウンしたＣｐＮｉ構築物のいずれかでトランスフェクトされた２つの細胞株において観察された（図２Ｂ及び図３）。これらの結果は、ＣｐＤ  ｍＲＮＡレベルの低減がＣ末端リジンレベルの増加をもたらした一方で、ＣｐＮ  ｍＲＮＡレベルの変化は２つの試験した抗体産生株においてＣ末端リジンに対して作用がないことを示した。
【０２３８】
ＣＲＩＳＰＲ技術を使用したノックアウト実験（例えば、Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，２０１４、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ，２，２０１３を参照されたい）が行われた。ＣＨＯ  ＣｐＤのコード領域配列の大半を含む、ＮＣＢＩデータベースにおける既知のＣＨＯＫ１  ＣｐＤゲノム配列は、およそ５５ｋｂである。図４Ａに図示されるように、２つのガイドＲＮＡ配列は、チャイニーズハムスターＣｐＤ遺伝子のエキソン２及び２１を同時に標的とするように設計され、これは２つのエキソン間の４６ｋｂ配列を削除することを目的とする。２つのｇＲＮＡ構築物及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼ構築物を抗体発現細胞株Ｂに同時にトランスフェクトしたとき、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ｇＲＮＡに相補的である特定のＤＮＡ配列を切断する。この切断は、２本鎖ＤＮＡの破壊、及び標的遺伝子の発現を消失させることができる欠失または挿入による後の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復をもたらす。ｇＲＮＡ配列に隣接し、かつその上流のＰＣＲプライマーを使用して、ＣｐＤノックアウト細胞は、２つのｇＲＮＡ間の介在配列が図４Ｂに図示されるように削除されるとき、およそ６００塩基対のＰＣＲ生成物をもたらすはずである。合計１８０のクローンがＣｐＤ配列の欠失に関してスクリーニングされ、ＰＣＲ生成物のサイズ及び配列分析に基づいて、両ＣｐＤ対立遺伝子が削除された２つのクローンを得、ＣｐＤ  ｍＲＮＡ及びタンパク質発現分析に使用した（データ示さず）。図５Ａに示されるように、ＣｐＤ  ｍＲＮＡは、２つのＣｐＤ  ＫＯクローンにおいて、ｑＰＣＲ分析により検出不可能であった。さらに、抗ＣｐＤ抗体を使用するウエスタンブロット分析は、図５Ｂに示されるように、およそ１８０ｋＤａの分子量を有するタンパク質が２つのＣｐＤ  ＫＯクローンにおいて不在であったが、ＣｐＤ  ＷＴクローンにおいては存在したことを示した。
【０２３９】
ＣｐＤ  ＫＯ及びＷＴクローンを、生産性及び生成物品質特性に関して評価した。２つのＫＯ及び２つのＷＴクローンの間で、明らかな相違は、統合された生細胞数細胞（ＩＶＣＣ）、特定生産性（Ｑｐ）、及び力価において観察されず（図６）、ＣＨＯ細胞におけるＣｐＤ発現の不在が、流加振盪フラスコ産生アッセイにより評価されたとき、細胞生産性及び成長に影響を与えなかったことを示す。重要なことには、Ｃ末端リジンレベルが還元された抗体の質量分析に基づく分析により測定され、およそ４〜６％のＣ末端リジンが２つのＷＴクローンで観察された一方で、１００％のＣ末端リジンが２つのＫＯクローンにおいて存在したことを示す（図７）。したがって、ＣｐＤがＣＨＯ細胞における抗体重鎖のＣ末端リジンの除去に関与する唯一のカルボキシペプチダーゼであることが示された。同じ結果がＩｃＩＥＦアッセイによっても観察された（データ示さず）。他の生成物品質特性及び細胞培養代謝物プロファイルは、ＣｐＤ  ＫＯとＷＴクローンとの間で同等であった（データ示さず）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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