(57)【要約】  本発明は、例えば、感染性疾患を含む急性及び慢性感染症を処置するための、細菌の同定及び抗菌剤感受性試験のための組成物、方法、及びキットを提供する。本発明は、乳腺炎を引き起こす細菌の同定において特に有用であり、乳腺炎の適切な処置の特定を容易にするための抗生物質感受性試験にとって特に有用である。
2018507712.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト又は非ヒト動物から得た生物試料について抗菌剤感受性試験を実施する方法であって、ヒト又は非ヒト動物が、感染症を引き起こす1つ又は複数の細菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有する可能性があり、方法が、
(i)ヒト又は非ヒト動物から得た生物試料、並びに増殖培地、抗菌剤、呈色pH指示薬、及び安定化剤を含む感受性培地を含む反応混合物を提供する工程と、
(ii)試料を感受性培地と混合した場合の色の変化を観察することによって、抗菌剤に対する試料中の1つ又は複数の細菌の感受性を決定する工程と
を含み、pH指示薬が、安定化剤が存在しなければ、感染症を引き起こす1つ又は複数の細菌の増殖を阻害するほど十分な量で、反応混合物中に存在する、方法。
【請求項２】
細菌が、グラム陽性菌である場合、安定化剤が、乳汁由来タンパク質又は乳汁由来タンパク質抽出物を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
乳汁由来タンパク質又は乳汁由来タンパク質抽出物が、α-カゼイン、β-カゼイン(A1、A2、A3、B、C、D、E、及びF変種の1つ又は複数を含む)、カゼインナトリウム(例えば、α-カゼイン、β-カゼイン、及びκ-カゼインを含む)、κ-カゼイン、β-ラクトグロブリン、乳清タンパク質、ラクトアルブミン、ラクトフェリン、乳汁又は粉乳、及びそれらの組合せからなる群から選択される1つ又は複数を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
細菌がグラム陰性菌である場合、安定化剤が炭水化物を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
炭水化物が、デキストロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、及びスクロースからなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
方法が、試料中のグラム陽性菌及び/又はグラム陰性菌を同定する工程を含み、安定化剤が乳汁である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
生物試料が、乳汁、子宮からの液体試料、全血試料、血漿、血清、卵胞液試料、精液試料、脳脊髄液、唾液、喀痰、尿、胸膜滲出液、間質液、滑液、リンパ、及び涙液からなる群から選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
生物試料が乳汁である場合、反応混合物が安定化剤を含む必要はない、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
呈色pH指示薬が、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル、及びブロモチモールブルーからなる群から選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
呈色pH指示薬がフェノールレッドである、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
フェノールレッドが、反応混合物の0.0035〜0.30%で存在する、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
感受性培地が、トリプティックソイブロス、ミューラーヒントンブロスからなる群から選択される1つ又は複数の増殖培地を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
感染症が乳腺炎又は子宮筋層炎である、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
乳腺炎又は子宮筋層炎が、ウシ乳腺炎又はウシ子宮筋層炎であり、ウシ乳腺炎又はウシ子宮筋層炎を引き起こす細菌が、連鎖球菌(Streptococcus)、ブドウ球菌(Staphylococcus)、及びグラム陰性菌からなる属の1つ又は複数から選択される、請求項10に記載の方法。
【請求項１５】
ヒト又は非ヒト動物試料中のD群連鎖球菌の存在を同定する方法であって、ヒト又は非ヒト動物が、D群連鎖球菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有する可能性があり、方法が、
(i)ヒト又は非ヒト動物から得た生物試料、並びにエスクリン、クエン酸第二鉄、及び安定化剤を含む同定培地を含む反応混合物を提供する工程と、
(ii)D群連鎖球菌が試料中に存在するか否かを同定する工程と
を含み、エスクリン及びクエン酸第二鉄が、安定化剤が存在しなければD群連鎖球菌の増殖を阻害するほど十分な量で反応混合物中に存在し、
試料中のD群連鎖球菌の同定が、反応混合物の黒色化によって確認され、
試料中のD群連鎖球菌の同定が、ヒト又は非ヒト動物が、D群連鎖球菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有することを示している、
方法。
【請求項１６】
ヒト又は非ヒト動物におけるコアグラーゼ陽性ブドウ球菌を同定する方法であって、ヒト又は非ヒト動物が、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有する可能性があり、方法が、
(i)ヒト又は非ヒト動物から得た生物試料、並びに亜テルル酸塩及び安定化剤を含む同定培地を含む反応混合物を提供する工程と、
(ii)コアグラーゼ陽性ブドウ球菌が試料中に存在するか否かを同定する工程と
を含み、亜テルル酸塩が、安定化剤が存在しなければコアグラーゼ陽性ブドウ球菌の増殖を阻害するほど十分な量で反応混合物中に存在し、
試料中のコアグラーゼ陽性ブドウ球菌の同定が、反応混合物中の黒色沈殿の出現によって確認され、
試料中のコアグラーゼ陽性ブドウ球菌の同定が、ヒト又は非ヒト動物が、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有することを示している、
方法。
【請求項１７】
ヒト又は非ヒト動物におけるコアグラーゼ陰性ブドウ球菌を同定する方法であって、ヒト又は非ヒト動物が、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有し、方法が、
(i)請求項16に記載の方法に従って、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌が、試料中に存在しないことを確立する工程と、
(ii)同じヒト又は非ヒト動物から得た生物試料、並びに高塩濃度、炭水化物源、及び呈色pH指示薬を含む同定培地を含む反応混合物を提供する工程と、
(iii)コアグラーゼ陰性ブドウ球菌が試料中に存在するか否かを同定する工程と
を含み、pH指示薬が、安定化剤が存在しなければコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の増殖を阻害するほど十分な量で反応混合物中に存在し、
反応混合物中の炭水化物源が、グルコース、フルクトース、マルトース、スクロース、グリセロール、ガラクトース、マンノース、及びラクトースからなる群の1つ又は複数から選択され、
コアグラーゼ陰性ブドウ球菌の同定が、pHの変化によって引き起こされる第2の反応混合物における色の変化によって確認され、
試料中のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の同定が、ヒト又は非ヒト動物が、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有することを示している、
方法。
【請求項１８】
ヒト又は非ヒト動物において乳腺炎を引き起こす1つ又は複数の細菌を同定する方法であって、
(i)ヒト又は非ヒト動物から得た乳汁試料、並びに同定培地を含む反応混合物を提供する工程と、
(ii)反応混合物が安定化剤を必要としないという改変を加えて、請求項15から17のいずれか一項に従い、乳腺炎を引き起こす1つ又は複数の細菌が乳汁試料中に存在するか否かを同定する工程と
を含む方法。
【請求項１９】
抗菌剤感受性試験の前、抗菌剤感受性試験と並行して、又は抗菌剤感受性試験の後に、細菌同定工程を更に含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
細菌同定工程が、請求項15から18に記載の方法の任意の1つ又は複数を含む、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
(i)ヒト若しくは非ヒト動物において感染症を引き起こす1つ若しくは複数の細菌を同定するため、及び/又は
(ii)ヒト若しくは非ヒト動物において感染症を引き起こす細菌に関して抗菌剤感受性試験を実施するため
の試験キットであって、使用説明書と共に、請求項1から20のいずれか一項に従いヒト又は非ヒト動物からの試験試料に関して細菌同定及び/又は抗菌剤感受性試験を実施するための試薬を含む試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、感染性疾患を含む急性及び慢性感染症を処置するための、細菌の同定及び抗菌剤感受性試験に関する。本発明は、乳腺炎を引き起こす細菌の同定において特に有用であり、乳腺炎の適切な処置の特定を容易にするための抗生物質感受性試験にとって特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
過去数十年の間に、臨床微生物学の分野並びに感染性疾患の処置及び管理は著しく進歩している。しかし、生命を脅かす衰弱性の全身及び局所細菌感染症はなおもヒト及び動物のヘルスケアの両方にとって主要な問題である。その上、多剤耐性生物の出現は、ヒトの及び獣医学におけるヘルスケアの実施が直面する難題を増加させている。
【０００３】
不適切又は不適当に処置された微生物感染症は、多剤耐性細菌株の発生の主な原因であり、これは多くの院内感染症及び農場を発生源とする感染症を引き起こす。薬物耐性、特に抗生物質耐性はしばしば、感染症を処置するために使用される抗生物質が、不適切に選択されている場合、感染因子を有効に撲滅しないように処方されている場合、又は不良な患者のコンプライアンス不良若しくは農作業の結果として起こる。更に、無効な又は不要な抗生物質の処方により、存在するいかなる感染性細菌も衰えることなく複製し続け、その結果しばしば、それがなければ不要であった入院を含む、費用が高く侵襲性の高い処置を必要とする生命を脅かす合併症が起こる。したがって、可能性がある感染因子の正確且つ迅速な診断は、患者のケアの改善、ヘルスケア費用の低減、及び抗菌剤の有効性の保持にとって重要である。
【０００４】
ヒト又は動物の感染症は、病原体の中でもとりわけ、細菌によって引き起こされうる。抗生物質を含む抗菌剤は、感染症と闘う手段として、細菌集団を死滅させる又はその増殖を阻害する試みで用いられる。疾患を引き起こす細菌の候補リスト並びに一般的又は重要な細菌に対する抗菌剤の第1及び第2選択は、例えば、「Pharmacology」、Rang & Dale 1987, Churchchill Livingstone社に記載されている。ヒト及び獣医学で使用される典型的な抗菌剤は、抗生物質を含む。例えば、ベンジルペニシリン(又はペニシリンG)は、連鎖球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumococci)、髄膜炎菌(menigococci)、淋菌(gonococci)、及び非ペニシリダーゼ産生ブドウ球菌(staphylococci)によって引き起こされる感染症に関して選択される薬物である。ベータ-ラクタマーゼ産生ブドウ球菌の場合、中でもクロキサシリンの使用が推奨される。一方、ベンジルペニシリンはしばしば、例えば大腸菌(Escherichia coli)等の大腸菌群細菌等のグラム陰性菌に対してほぼ無効である。広域スペクトルの抗生物質はしばしば、大腸菌群細菌に対して活性である。典型的な広域スペクトルの抗生物質は、アンピシリン、アモキシシリン、又はセフォタキシム若しくはセフチオフル等のセファロスポリン類である。
【０００５】
一般的に使用される抗生物質は、中でもアミノグリコシド類、カルバペネム類及びモノバクタム類、セファロスポリン類、クロラムフェニコール、リンコサミド類、マクロライド類、プレウロムチリン類、糖ペプチド、ポリペプチド、ペニシリン類、ポリミキシン類、キノロン類、スルホンアミド類、並びにテトラサイクリン類として分類されうる。
【０００６】
他のタイプの抗菌剤には、例えば、他にも多くのものがあるが、ナイシン、銀、又は消毒剤が含まれる。
【０００７】
興味深いことに、世界で投与されている抗菌剤の大部分は、ヒト患者に投与されておらず、むしろ食糧生産目的でウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、及び魚を含む動物に投与される。抗生物質は、他にも理由はあるが、中でも、感染動物の疾患を処置するために、これらの動物に投与される。
【０００８】
食糧生産時の大量の抗菌剤の使用、並びに動物及びヒトの排泄物、及び農地からの流出水を通しての環境への抗菌剤の意図されない広範囲の放出は、公衆衛生上の帰結を有し、これはヒトの食物媒介性疾患に関連する人畜共通の耐性菌として最も明白に認められる。更に、質的及び量的に未知の重要なのは、動物起源の細菌からヒト病原体への耐性遺伝子の伝播の可能性である。
【０００９】
感染した患者の迅速な抗菌剤処置によって、治療の成功か、長期の不能か又は更に死亡かの差を生じうる。残念なことに、抗菌剤の使用及び誤使用により、耐性微生物の容赦ない拡大が促進され、従来の処置レジメンによる有効性が失われる。実際に、抗生物質耐性及び多剤耐性菌又は「スーパーバグ」の進化は、世界保健機構によって、ヒト集団の長期の生存に対する有意な脅威であると特定されている。
【００１０】
抗菌剤による処置は典型的には、感染又は疾患の検出後速やかに開始される。処置の選択は通常、ヒト及び動物(例えば、耳、喉、乳房、又は子宮等)における特異的細菌感染症に関する専門施設の抗菌剤推奨の第1選択又は第2選択に基づく。
【００１１】
感染症又は感染性疾患を引き起こす細菌が処置前に同定されれば、処置にとって適切な抗菌剤を投与のために選択することができ、有利であろう。しかし、細菌のタイプを知ることは適切な抗菌剤処置を選択するために必ずしも十分ではない。例えば、ブドウ球菌の場合、非ペニシリナーゼ産生ブドウ球菌であれば、ベンジルペニシリンが第1選択薬である。しかし、このタイプの情報は通常、処置前はわかっておらず、選択的及び/又は識別的細菌濃縮試験を行った後なら必ずわかるわけでもない。
【００１２】
理想的には、抗菌剤処置レジメンの選択を助けるのみならず、適切な用量の選択も助ける抗菌剤感受性試験を、処置前に実施することが望ましいであろう。しかし、試験は、確立された研究所において数日間の応答時間で実施しなければならないことから、このアプローチにはいくつかの制限がある。その間、感染症は、無処置のままであるか、又は感染症と闘う試みで(例えば)広域スペクトルの抗菌剤によって処置される。この実践によって抗生物質が過剰に使用され、その結果多くの細菌種において薬物耐性(例えば、抗生物質耐性)の発生に至ったことは驚くべきことではない。
【００１３】
乳腺炎
乳腺炎は、哺乳動物の乳腺の炎症疾患である。獣医学において、最も重要且つ最も頻繁に見られる乳腺炎は、ウシ動物、特に乳牛の乳腺炎である。
【００１４】
泌乳牛群は、典型的には牛乳生産のために飼育される。24時間の間に最大2〜3回搾乳するという慣習により、ウシ乳腺は感染症に罹りやすくなる。加えて、自動搾乳作業で、ウシからウシへと移動する機械装置が関与することは、感染症が1頭の動物から他の動物へと容易に伝播されうることを意味する。
【００１５】
乳腺は、細菌病原体に対して多数の天然の防御機構を有する。しかし、これらの防御機構は、高レベルの細菌負荷によって、不良な動物飼育を通して、又は泌乳サイクルにおける特定の時間での生理的変化を通して圧倒されうる。例えば、乾乳期及び出産前後の期間は、乳腺炎の比較的高い発生率に関連する。
【００１６】
乳腺炎は、多くの異なる種のグラム陽性菌及びグラム陰性菌によって引き起こされうる。ウシ乳腺炎に最も一般的に関係するそれらの細菌種は、2つのカテゴリに入る。第1のカテゴリは、黄色ブドウ球菌及びアガラクチア菌(Streptococcus agalactiae)等の宿主病原体を含む。これらの細菌は、乳房の皮膚上又は乳房自体の中に生息しており、群れの中の他のウシへの感染源である。第2のカテゴリは、ストレプトコッカス・ウベリス(Streptococcus uberis)及び大腸菌等の環境病原体を含む。これらの病原体は、酪農牛が置かれる環境に見出され、したがって感染症に対して一定のリスクを呈する。
【００１７】
上記のように特徴付けられた細菌によって引き起こされる乳腺炎は、臨床疾患又は臨床下疾患のいずれかとして出現しうる。
【００１８】
臨床的乳腺炎は、目に見える異常な乳汁(例えば、色、フィブリン塊)を生じる、感染症に対する炎症応答である。炎症の程度が増加すると、乳房の変化(腫脹、熱、疼痛、発赤)もまた明らかとなりうる。局所兆候のみを含む臨床症例は軽度又は中等度と呼ばれる。炎症応答が全身の関与を含む場合(発熱、食欲不振、ショック)、症例は重度と呼ばれる。重度の臨床症例の場合にしばしば見られるように、発症が非常に急速である場合、重度の乳腺炎の急性症例と呼ばれる。より重度に罹患したウシは、罹患部で分泌がより漿液性になる傾向がある。とはいえ、臨床的乳腺炎ではより軽度の症状が最も典型的である。
【００１９】
臨床下乳腺炎は、局所炎症又は全身の関与の明らかな兆候がない感染症の存在である。異常な乳汁又は乳房の炎症の一過性のエピソードが現れうるが、これらの感染症は、大抵の場合無症候性であり、感染症が少なくとも2カ月間持続する場合は、慢性と呼ばれる。一度確立されると、これらの感染症の多くは、全泌乳期間、又はウシの一生の間持続する。検出は、乳汁の体細胞数(SCC)検査(主に好中球)によって最もよく行われる。
【００２０】
乳腺炎は、様々な処置選択肢が利用可能であるにもかかわらず、依然として酪農業における経済的損失の主な原因である。現在、ウシの乳腺炎(乳房の炎症)を処置する、及び子宮筋層炎(子宮の炎症)を処置する主な方法は、抗生物質治療である。
【００２１】
第1選択及び第2選択抗菌剤に関する推奨は、しばしば政府機関又は専門の疾患研究施設により与えられる。ウシ乳腺炎は、グラム陽性菌及びグラム陰性菌によって引き起こされうる。最も一般的で重要な細菌は、ストレプトコッカス・ウベリス、黄色ブドウ球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、アガラクチア菌、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ(Streptococcus dysagalactiae)、及び大腸菌である。乳腺炎の乳汁は、健康なウシの乳汁と比較してその粘稠性が変化している。乳腺炎の乳汁は、凝塊を有し、テクスチャは、水っぽく薄いか又は濃厚でありうる。乳腺炎の乳汁の色は、黄色から茶色がかった色として記述されうる。
【００２２】
加えて、通常、乳腺炎の乳汁は、高い体細胞数を有し、これは、健康なウシの乳汁とは異なり、1ミリリットルあたり最大で数百万個となりうる。
【００２３】
ウシ乳腺炎に関する多数の細菌検査キットが市販されており、農場での感染症を引き起こす細菌のタイプを同定するために使用することができる。例えば、「The Overnighter」(国際公開第2007/032691号)は、微生物増殖装置及び容器を記述している。増殖培地は寒天培地(ゲルタイプ)に基づき、細菌の同定は、比色測定の変化によって示される。細菌の同定は、24〜48時間内に得られる。
【００２４】
国際公開第1999/18439号及び国際公開第2011/139263号は、生菌数迅速測定フィルムに基づく好気性及び大腸菌/大腸菌群の計数検査を記述している。好気性生菌数迅速測定フィルムは、乳汁試料に見出される全ての好気性菌を検出するが、大腸菌/大腸菌群フィルムは、グラム陰性菌の増殖のみを支持する。乳腺炎感染症がグラム陽性菌又はグラム陰性菌によって引き起こされるかを決定した後、感染症を治癒させるために処置の決定を行うことができる。
【００２５】
農場での乳腺炎検査であるCHECK-UP乳腺炎診断ツール、Farm Medix、http://www.farmmedix.com/は、ストレプトコッカス・ウベリス、黄色ブドウ球菌、ブドウ球菌種、及び大腸菌を同定するための4つのゾーンを含む寒天プレートである。検出時間は、15〜24時間である。
【００２６】
しかし、これらの試験のいずれも抗菌剤感受性試験を提供しない。
【００２７】
ウシ乳腺炎は、感染症の典型的な一例に過ぎない。乳腺炎はまた、ヒト又は他の乳汁産生動物にも起こりうる。子宮筋層炎は、他の多くの細菌感染症の中の別の典型的な感染症である。これらの細菌感染症の処置は、しばしば細菌のタイプ又は抗菌剤感受性がわからず、そのために感染症を処置するために不適切な抗菌剤が選択され、その結果別の抗菌剤処置が与えられることとなりうることが問題である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２８】
【特許文献１】国際公開第2007/032691号
【特許文献２】国際公開第1999/18439号
【特許文献３】国際公開第2011/139263号
【非特許文献】
【００２９】
【非特許文献１】「Pharmacology」、Rang & Dale 1987、Churchchill Livingstone社
【非特許文献２】CHECK-UP乳腺炎診断ツール、農場での乳腺炎検査、Farm Medix、http://www.farmmedix.com/
【非特許文献３】http://ansci.illinois.edu/static/ansc438/Milkcompsynth/milkcomp_table.html
【非特許文献４】Wattsら(2008)  Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals; Approved Standard  第3版、28(8) Clinical and Laboratory Standards Institute社、Wayne、Pennsylvania、USA
【非特許文献５】Parisi (1985) Microbiological Reviews 49(2):126-139
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
本出願人は、特に乳腺炎及び子宮筋層炎等の感染症を引き起こすことがわかっている細菌に関して、細菌を同定する新規アプローチを開発した。更に、本出願人は、意外にもヒト及び非ヒト動物から得た生物試料に直接実施することができる比色測定法に基づく抗菌剤感受性試験に対する新しいアプローチを開発した。このアプローチは、処置の選択肢を知らせる目的で、抗菌剤に対する(例えば)細菌の感受性に関する「リアルタイム」の情報を提供する。これらの特徴及び他の利点は、以下の説明から明らかとなるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
本明細書において記述され、特許請求される本発明は、本発明の概要において記載又は記述又は参照されるものを含むがこれらに限定されない、多くの属性及び実施形態を有する。全てを包括することは意図されず、本明細書において記述及び特許請求される本発明は、単に例示目的のために含められ、制限のためではない、本発明の概要において特定された特徴若しくは実施形態に限定されない、又は特徴若しくは実施形態によって限定されない。
【００３２】
本発明の一態様において、ヒト又は非ヒト動物から得た生物試料について抗菌剤感受性試験を実施する方法であって、ヒト又は非ヒト動物が、感染症を引き起こす1つ又は複数の細菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有する可能性があり、方法が、
(i)ヒト又は非ヒト動物から得た生物試料、並びに増殖培地、抗菌剤、呈色pH指示薬及び安定化剤を含む感受性培地を含む反応混合物を提供する工程と、
(ii)試料を感受性培地に添加した場合の色の変化を観察することによって、抗菌剤に対する試料中の1つ又は複数の細菌の感受性を決定する工程と
を含み、pH指示薬が、安定化剤が存在しなければ、感染症を引き起こす1つ又は複数の細菌の増殖を阻害するほど十分な量で、反応混合物中に存在する、
方法が提供される。
【００３３】
本発明の別の態様において、ヒト又は非ヒト動物から得た乳汁を含む生物試料について抗菌剤感受性試験を実施する方法であって、ヒト又は非ヒト動物が、感染症を引き起こす1つ又は複数の細菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有する可能性があり、方法が、
(i)ヒト又は非ヒト動物から得た生物試料、並びに抗菌剤及び呈色pH指示薬を含む感受性培地を含む反応混合物を提供する工程と、
(ii)試料を感受性培地に添加した場合の色の変化を観察することによって、抗菌剤に対する試料中の1つ又は複数の細菌の感受性を決定する工程と
を含み、pH指示薬が、安定化剤が存在しなければ、感染症を引き起こす1つ又は複数の細菌の増殖を阻害するほど十分な量で、反応混合物中に存在する、
方法が提供される。
【００３４】
本発明のなお別の態様において、ヒト又は非ヒト動物においてD群連鎖球菌を同定する方法であって、ヒト又は非ヒト動物が、D群連鎖球菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有する可能性があり、方法が、
(i)ヒト又は非ヒト動物から得た生物試料、並びにエスクリン、クエン酸第二鉄、及び安定化剤を含む同定培地を含む反応混合物を提供する工程と、
(ii)D群連鎖球菌が試料中に存在するか否かを同定する工程と
を含み、エスクリン及びクエン酸第二鉄が、安定化剤が存在しなければD群連鎖球菌の増殖を阻害するほど十分な量で、反応混合物中に存在し、
試料中のD群連鎖球菌の同定が、反応混合物の黒色化によって確認され、
試料中のD群連鎖球菌の同定が、ヒト又は非ヒト動物がD群連鎖球菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有することを示している、
方法が提供される。
【００３５】
本発明の別の態様において、ヒト又は非ヒト動物においてD群連鎖球菌を同定する方法であって、ヒト又は非ヒト動物が、D群連鎖球菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有する可能性があり、方法が、
(i)ヒト又は非ヒト動物から得た乳汁含有生物試料、並びにエスクリン及びクエン酸第二鉄を含む同定培地を含む反応混合物を提供する工程と、
(ii)D群連鎖球菌が試料中に存在するか否かを同定する工程と
を含み、エスクリン及びクエン酸第二鉄が、乳汁試料中に安定化剤が存在しなければD群連鎖球菌の増殖を阻害するほど十分な量で、反応混合物中に存在し、
試料中のD群連鎖球菌の同定が反応混合物の黒色化によって確認され、
試料中のD群連鎖球菌の同定が、ヒト又は非ヒト動物がD群連鎖球菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有することを示している、
方法が提供される。
【００３６】
本発明の更なる態様において、ヒト又は非ヒト動物においてコアグラーゼ陽性ブドウ球菌を同定する方法であって、ヒト又は非ヒト動物が、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有する可能性があり、方法が
(i)ヒト又は非ヒト動物から得た生物試料、並びに亜テルル酸塩及び安定化剤を含む同定培地を含む反応混合物を提供する工程と、
(ii)コアグラーゼ陽性ブドウ球菌が試料中に存在するか否かを同定する工程と
を含み、亜テルル酸塩が、安定化剤が存在しなければコアグラーゼ陽性ブドウ球菌の増殖を阻害するほど十分な量で、反応混合物中に存在し、
試料中のコアグラーゼ陽性ブドウ球菌の同定が反応混合物における黒色沈殿の出現によって確認され、
試料中のコアグラーゼ陽性ブドウ球菌の同定が、ヒト又は非ヒト動物がコアグラーゼ陽性ブドウ球菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有することを示している、
方法が提供される。
【００３７】
本発明のなお更なる態様において、ヒト又は非ヒト動物においてコアグラーゼ陰性ブドウ球菌を同定する方法であって、ヒト又は非ヒト動物が、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有し、方法が
(i)本明細書において記述される方法に従って、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌が試料中に存在しないことを確立する工程と、
(ii)同じヒト又は非ヒト動物から得た生物試料、並びに高い塩濃度、炭水化物源、及び呈色pH指示薬を含む同定培地を含む反応混合物を提供する工程と、
(iii)コアグラーゼ陰性ブドウ球菌が試料中に存在するか否かを同定する工程と
を含み、pH指示薬が、安定化剤が存在しなければコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の増殖を阻害するほど十分な量で、反応混合物中に存在し、
第2の反応混合物中の炭水化物源が、グルコース、フルクトース、マルトース、スクロース、グリセロール、ガラクトース、マンノース及びラクトースからなる群の1つ又は複数から選択され、
コアグラーゼ陰性ブドウ球菌の同定が、pHの変化によって引き起こされる反応混合物中の色の変化によって確認され、
試料中のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の同定が、ヒト又は非ヒト動物がコアグラーゼ陰性ブドウ球菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有することを示している、
方法が提供される。
【００３８】
本発明のなお別の態様において、ヒト又は非ヒト動物において乳腺炎を引き起こす1つ又は複数の細菌を同定する方法であって、
(i)ヒト又は非ヒト動物から得た乳汁試料、並びに同定培地を含む反応混合物を提供する工程と、
(ii)反応混合物が安定化剤を必要としないという改変を加えて、本明細書において記述される方法のいずれかに従い、乳腺炎を引き起こす1つ又は複数の細菌が乳汁試料中に存在するか否かを同定する工程と
を含む方法が提供される。
【００３９】
本発明のなお更なる態様において、
(i)ヒト若しくは非ヒト動物における感染症を引き起こす1つ若しくは複数の細菌を同定するため、及び/又は
(ii)ヒト若しくは非ヒト動物における感染症を引き起こす細菌に関する抗菌剤感受性試験を実施するため
の試験キットであって、
使用説明書と共に、本明細書において記述される任意の方法に従いヒト又は非ヒト動物からの試験試料について細菌同定及び/又は抗菌剤感受性試験を実施するための試薬を含む試験キットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】多様なカナマイシンレベルに曝露した黄色ブドウ球菌の増殖阻害を時間の関数として示す図である。対照(黒塗りの四角)、0.5μg/mLカナマイシン(丸)、1.0μg/mLカナマイシン(プラス記号)、2.0μmg/mLカナマイシン(白四角)、4.0μg/mLカナマイシン(クロス)、及び8μg/mLカナマイシン(三角)。
【図２】本発明の方法に従う黄色ブドウ球菌及びコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の細菌同定/識別を示す図である。
【図３】本発明の方法に従う黒色沈殿の出現による黄色ブドウ球菌の視覚的同定を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
一般的定義
特にそれ以外であると定義している場合を除き、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、当業者(例えば、微生物学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、及び生化学の当業者)によって一般的に理解される意味と同じ意味を有すると解釈すべきである。
【００４２】
本明細書において開示される数字の範囲に対する言及(例えば、1〜10)はまた、その範囲内の全ての関連する数字に対する言及(例えば、1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9、及び10)を組み込み、同様にその範囲内の有理数の任意の範囲(例えば、2〜8、1.5〜5.5、及び3.1〜4.7)を含むと意図され、したがって、本明細書において明示的に開示される全ての範囲の部分範囲が明示的に開示される。これらは、具体的に意図されるものの例に過ぎず、列挙された最小値と最大値の間の数値の起こりうる全ての組合せが、本出願において同様に明示的に述べられていると考えるべきである。
【００４３】
用語「及び/又は」、例えば「X及び/又はY」は、「X及びY」又は「X又はY」のいずれかを意味すると解釈され、両方の意味又はいずれかの意味に関する明白な根拠を提供すると解釈される。
【００４４】
本明細書を通して、用語「含む(comprise)」、又は「含む(comprises)」若しくは「含むこと(comprising)」等のその変化形は、記載の要素、整数、若しくは工程、又は要素、整数、若しくは工程の群を含むことを暗示するが、任意の他の要素、整数、若しくは工程、又は要素、整数、若しくは工程の群を除外しないと理解される。
【００４５】
本明細書を通して、特にそれ以外であると述べている場合を除き、又は文脈がそれ以外であることを必要としている場合を除き、単数の工程、物質の組成物、工程の群、又は物質の組成物の群に対する言及は、それらの工程、物質の組成物、工程の群、又は物質の組成物の群の1つ及び複数(すなわち、1つ又は複数)を包含すると解釈すべきである。
【００４６】
選択的定義
用語「微生物」は、本明細書において、例えば細菌、酵母、真菌、ウイルス等を含む任意の真核又は原核細胞微生物を記述するために使用される。
【００４７】
用語「感染症」は、本明細書において、その後に組織損傷を生じ、多様な細胞又は毒性機構を通して明白な疾患へと進行しうる、体の一部又は組織における病原性微生物による侵入及び複製を記述するために使用される。
【００４８】
用語「ブドウ球菌」は、本明細書において、1つのブドウ球菌又はブドウ球菌の集団を意味するために使用される。
【００４９】
用語「D群連鎖球菌」は、本明細書において、1つのD群連鎖球菌又はD群連鎖球菌の集団を意味するために使用される。D群連鎖球菌の例には、ストレプトコッカス・ウベリス、ウシ連鎖球菌(Streptococcus bovis)、及びストレプトコッカス・エクイヌス(Streptococcus equinis)が含まれるがこれらに限定されない。
【００５０】
用語「複数のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌」又は「コアグラーゼ陰性ブドウ球菌」は、本明細書において、フィブリノゲンのフィブリンへの変換を可能にするタンパク質酵素コアグラーゼを有しないブドウ球菌を記述するために使用される。コアグラーゼ陰性ブドウ球菌の例には、スタフィロコッカス・クロモゲネス(Staphylococcus chromogenes)、スタフィロコッカス・シミュランス(Staphylococcus simulans)、スタフィロコッカス・キシローサス(Staphylococcus xylosus)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヒカス(Staphylococcus hyicus)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus hemolyticus)、スタフィロコッカス・アルレッタ(Staphylococcus arlettae)、黄色ブドウ球菌d、スタフィロコッカス・ガリナルム(Staphylococcus gallinarum)、スタフィロコッカス・レンタス(Staphylococcus lentus)、スタフィロコッカス・シュードインターメディウス(Staphylococcus pseudintermedius)、スタフィロコッカス・サプロフィチクス(Staphylococcus saprophyticus)、スタフィロコッカス・ワルネリ/パスツーリ(Staphylococcus warneri/pasteuri)、黄色ブドウ球菌(いくつかの株はコアグラーゼ陰性である)が含まれるがこれらに限定されない。
【００５１】
用語「複数のコアグラーゼ陽性ブドウ球菌」又は「コアグラーゼ陽性黄色ブドウ球菌」は、本明細書において、フィブリノゲンのフィブリンへの変換を可能にするタンパク質酵素コアグラーゼを有するブドウ球菌を記述するために使用される。コアグラーゼ陽性ブドウ球菌の例には、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・デルフィニ(Staphylococcus delphini)、スタフィロコッカス・ヒカス、スタフィロコッカス・インターメディウス(Staphylococcus intermedius)、スタフィロコッカス・ルトラエ(Staphylococcus lutrae)、スタフィロコッカス・シュードインターメディウス、及びスタフィロコッカス・シュライフェリ亜種(Staphylococcus schleiferi subsp)が含まれるがこれらに限定されない。
【００５２】
用語「大腸菌群細菌」は、本明細書において、ラクトースを発酵させ、酸及び気体を産生するグラム陰性棹菌を記述するために使用される。
【００５３】
用語「指示薬」又は「指示薬組成物」は、本明細書において、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、ブロモクレゾールグリーン、メチルレッド、メチルパープル、アゾリトミン、ニュートラルレッド、ナフトールフタレイン、クレゾールレッド、クレゾールフタレイン、フェノールフタレイン、2,4-ジニトロフェノール、エリスロシン二ナトリウム塩、ベンゾパープリン4B、N,N-ジメチル-p-(m-トリルアゾ)アニリン、p-ジメチルアミノアゾベンゼン、4,4'-ビス(2-アミノ-1-ナフチルアゾ)-2,2'-スチルベンジスルホン酸、テトラブロモフェノールフタレインエチルエステルカリウム塩、ブロモフェノールブルー、コンゴーレッド、メチルオレンジ、エチルオレンジ、4-(4-ジメチルアミノ-1-ナフチルアゾ)-3-メトキシベンゼンスルホン酸、レサズリン、4-フェニルアゾ-1-ナフチルアミン、エチルレッド2-(p-ジメチルアミノフェニルアゾ)ピリジン、4-(p-エトキシフェニルアゾ)-m-フェニレン-ジアミン一塩酸塩、レゾルシンブルー、アリザリンレッドS、プロピルレッド、クロロフェノールレッド、p-ニトロフェノール、アリザリン2-(2,4-ジニトロフェニルアゾ)1-ナフトール-3,6-ジスルホン酸二ナトリウム塩、6,8-ジニトロ-2,4-(1H)キナゾリンジオン、ブリリアントイエロー、m-ニトロフェノール、ターメリック(クルクミン)、メタクレゾールパープル、4,4'-ビス(4-アミノ-1-ナフチルアゾ)-2,2'-スチルベンジスルホン酸、チモールブルー、p-ナフトールベンゼイン、フェノールフタレイン、o-クレゾールフタレイン、エチルビス(2,4-ジメチルフェニル)エタノエートの1つ又は複数を含むがこれらに限定されない特異的化合物又は分子を記述するために使用される。誤解を避けるために、用語指示薬は、pH指示薬を含む。
【００５４】
用語「対象」は、本明細書において、ヒト及び非ヒト哺乳動物を記述するために使用される。非ヒト動物の例には、ウシ、ヒツジ、シカ、ウマ、ブタ、ニワトリ、魚、イヌ、ネコ、マウス、ラット、霊長類(ゴリラ、アカゲザル、及びチンパンジーを含む)、ポッサム、及び他の家畜化された又は動物園の動物が含まれるがこれらに限定されない。このように、本明細書において記述されるアッセイ、方法、及びキットは、ヒト及び非ヒト動物の両方、特に、限定されないが、ヒト、霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカ、アルパカ、ラマ、水牛を含む農場動物、ネコ、イヌ、及びウマを含むコンパニオン動物及び/又は純血種の動物、に対する適用を有する。更に、対象は、好ましくは生きている生物であるが、本明細書において記述される本発明は、同様に死後分析に使用してもよい。
【００５５】
用語「試料」又は「生物試料」は、本明細書において、対象から採取した又は対象に由来する任意の試料を意味するために使用される。そのような試料は、対象から得てもよく、又は対象に提供されることが意図される生物材料から得てもよい。例えば、試料は、ヒト又は非ヒト動物に由来しうる、評価すべき血液又は乳汁から得てもよい。通常の健康な対象及び/又は感染性微生物のレベルを理解するために有用である健康な対象等の、任意の対象から採取した又は任意の対象に由来する試料が含まれる。好ましい試料は、体液試料である。本明細書において使用される用語「体液試料」は、例えば、目的の対象の診断、予後、分類、又は評価の目的のために得た体液試料を指す。特定の実施形態において、そのような試料は、感染症の重症度を決定する目的のために得てもよい。試料は、1つ又は複数の微生物が検出されうる当技術分野で公知の任意の試料でありうる。例えば、全血試料、血漿、血清、乳汁、卵胞液試料、精液試料、脳脊髄液、子宮からの液体試料、唾液、喀痰、尿、胸膜滲出液、間質液、滑液、リンパ、涙液等の任意の体液が含まれるが、全血試料、血漿、血清、及び乳汁が本発明において使用するために特に適している。加えて、当業者は、特定の体液試料が、分画又は精製技法の後に、例えば全血の血清又は血漿成分への分離後により容易に分析されることを理解するであろう。
【００５６】
用語「試験紙」は、本明細書において、本発明のアッセイ及び方法が実施されうる、任意の形状の試験プレート、ウェル、バイアル、又は容器を意味するために使用される。例えば、細菌の同定及び/又は抗菌剤感受性試験は、本明細書において記述されるように、同時、個別、又は連続的に実行される。
【００５７】
用語「定性的感受性」試験は、本明細書において、微生物又は細胞標本が特定の抗菌製品に対して感受性であるか又は耐性であるかを一般的に示す試験結果を生じる装置及び方法を記述するために使用される。関係する方法に応じて、抗菌製品の1つ又は2つの濃度のみを通常利用する。感受性又は耐性の程度は、定性的感受性試験では報告されない。
【００５８】
用語「定量的感受性試験」は、本明細書において、微生物の増殖を阻害するために十分である抗菌製品の濃度に関するデータを提供する試験結果を生じる試験装置及び方法を記述するために使用される。典型的には、微生物標本に関して、抗菌製品の治療的濃度範囲にわたる、抗菌製品の多数の異なる希釈液を利用する。用語最小発育阻止濃度(MIC)は、しばしば、微生物の定量的感受性試験によって提供される結果を指すために使用され、微生物の増殖阻害を生じる抗菌製品の最小濃度として定義される。
【００５９】
用語「抗菌剤」は、本明細書において、例えば細菌、酵母、真菌、ウイルス、寄生虫等を含む微生物を死滅させる又は微生物の増殖を阻害する薬剤を記述するために使用される。微生物又は微生物集団の増殖を阻害する抗菌剤は、微生物抑制性(例えば、細菌の増殖を阻害する抗細菌剤の場合の静菌性)と呼ばれる。同様にして、微生物又は微生物の集団を死滅させる抗菌剤は、殺微生物性（例えば、最近を死滅させる抗細菌剤の場合の殺微生物性）と呼ばれる。適した抗菌剤の例を以下に記載する。
【００６０】
本明細書において使用される用語「処置する」及び「処置」は、治療的処置と予防的又は防止的手段の両方を意味する。
【００６１】
詳細な説明
本発明は、ヒト及び非ヒト動物において感染症又は感染性疾患を引き起こすことが知られている細菌の同定に関する。本発明はまた、感染症を引き起こす細菌及びその特異的株にどの抗生物質が感受性であるかを決定するための抗生物質感受性試験にも関する。
【００６２】
1.細菌の同定
感染症又は感染性疾患を引き起こす細菌の同定により、適切な抗菌剤が治療のために選択されうるように処置の決定が誘導されれば有利であろう。すなわち、ヒト又は非ヒト動物から得た生物試料中の感染症又は感染性疾患を引き起こす細菌の同定は、その後の治療の処置選択肢を知らせるために使用されうる。感染症又は感染性疾患を引き起こす細菌の同定はまた、感染性疾患の発生に関連する及び/又は定義された地理的パラメータ内での細菌の流行の地図を作成するために使用されうる。更に、例えば乳腺炎及び子宮筋層炎等の特定の疾患状態に関連する感染症又は感染性疾患を引き起こす細菌の同定に関する情報は、特定の感染性疾患に関連する歴史的及び季節的変化並びに地理的発生をモニタリングするために有用な情報データベースを構築するために使用されうる。
【００６３】
本出願人は、連鎖球菌及びブドウ球菌の同定を含むがこれらに限定されない生物試料中の細菌の同定に対する新規アプローチを発見した。
【００６４】
意外にも、本出願人は、連鎖球菌、特に(例えば)ストレプトコッカス・ウベリスを含むD群連鎖球菌が、エスクリン、クエン酸第二鉄、及び安定化剤を含む同定培地中で濃縮することによって、ヒト又は非ヒト動物から得た生物試料中で同定されうることを発見した。例えばストレプトコッカス・ウベリスを含むD群連鎖球菌は、エスクリンをエスクレチン及びデキストロースに加水分解する。エスクレチンは、クエン酸第二鉄と反応して培養培地の黒色化を生じ、それによってD群連鎖球菌に独自の検出可能な変化をもたらす。(例えば)乳汁等の安定化剤の存在は、細菌の増殖に対するエスクリン及びクエン酸第二鉄の阻害活性を抑制するために使用される((例えば)標準的な濃縮培地を使用してこれらの分析物の阻害効果を証明する、実施例2のTable 2a(表6)〜Table 4e(表14)を参照されたい)。このことは、本発明に従う方法において、D群連鎖球菌の同定を増強するために、エスクリン及びクエン酸第二鉄の増加濃度を使用してもよいことを意味する。これは、感染症を引き起こす微生物に関連するバックグラウンド色が存在する臨床試料について使用する場合には特に重要である。この点を以下に更に詳細に考察する。
【００６５】
明快にするために、用語「濃縮する」は、検出及び同定の目的のために試料中の細菌数を増加させる当技術分野で公知の任意の技術を意味すると意図される。これには、濃縮のみならず、培養並びに陽性又は陰性増殖選択技術が含まれる。
【００６６】
したがって、本発明の一態様において、ヒト又は非ヒト動物においてD群連鎖球菌を同定する方法であって、ヒト又は非ヒト動物が、D群連鎖球菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有する可能性があり、方法が、
(i)ヒト又は非ヒト動物から得た生物試料、並びにエスクリン、クエン酸第二鉄、及び安定化剤を含む同定培地を含む反応混合物を提供する工程と、
(ii)D群連鎖球菌が試料中に存在するか否かを同定する工程と
を含み、エスクリン及びクエン酸第二鉄が、安定化剤が存在しなければD群連鎖球菌の増殖を阻害するほど十分な量で、反応混合物中に存在し、
試料中のD群連鎖球菌の同定が、反応混合物の黒色化によって確認され、
試料中のD群連鎖球菌の同定が、ヒト又は非ヒト動物がD群連鎖球菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有することを示している、
方法が提供される。
【００６７】
一例において、安定化剤は、乳汁由来タンパク質又は乳汁由来タンパク質抽出物を含む。乳汁由来タンパク質又は乳汁由来タンパク質抽出物の例には、α-カゼイン、β-カゼイン(A1、A2、A3、B、C、D、E、及びF変種の1つ又は複数を含む)、カゼインナトリウム(例えば、α-カゼイン、β-カゼイン、及びκ-カゼインを含む)、κ-カゼイン、β-ラクトグロブリン、乳清タンパク質、ラクトアルブミン、ラクトフェリン、及び乳汁又は粉乳、並びにそれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。
【００６８】
乳タンパク質及び抽出物は、以下に記述されるものを含むがこれらに限定されない任意の遺伝子起源に由来しうる:
http://ansci.illinois.edu/static/ansc438/Milkcompsynth/milkcomp_table.html
【００６９】
カゼインナトリウムは、Sigma Chemicals社(カタログ番号C8654)から得てもよい。
【００７０】
一例において、D群連鎖球菌は、ストレプトコッカス・ウベリス、ウシ連鎖球菌、及びストレプトコッカス・エクイヌスからなる群から選択される。
【００７１】
本発明の第1の態様に従うなお別の例において、同定培地は更に、濃縮、増殖、及び選択培地からなる群の1つ又は複数から選択される成分を含む。用語「濃縮」、「増殖」、及び「選択」は、関連技術分野の当業者に周知であろう。更に、本発明の方法において使用するための適した濃縮、増殖、及び選択培地の例もまた、関連技術分野の当業者に公知であろう。更に、濃縮、増殖、及び選択培地の非限定的な例を、以下の実施例に記述する。
【００７２】
本発明の第1の態様に従う別の例において、試料を同定培地と合わせる工程は、試料中に1つ又は複数の細菌が存在するか否かを同定するために十分な時間の期間、細菌を濃縮することを更に含む。
【００７３】
なお別の例において、細菌を濃縮する工程は、25℃〜45℃で6〜48時間培養することを含む。誤解を避けるために及び単なる例として、25〜45℃での培養は、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、又は45℃での培養を含む。同様に、誤解を避けるために及び単なる例として、6〜48時間の培養は、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、又は48時間の培養を含む。
【００７４】
同定培地は、同定の目的のために試料中に存在する細菌を濃縮するために十分な、任意の濃縮、増殖、及び/又は選択培地を含みうる。少なくとも、同定培地は、目的の細菌を同定する目的のために細菌の増殖及び選択を支持しなければならない。細菌増殖の増殖を支持するために十分な濃縮培地の例を実施例1に列挙する。しかし、例として非限定的な例には、濃縮される細菌に応じて、トリプティックソイブロス、ミューラーヒントンブロス、マッコンキーブロス、マンニット食塩ブロス、エスクリンアザイドブロス、ジオリッティカントーニブロスが含まれる。当業者は、本発明が、液体濃縮培地及び関連する培養技術に限定されないこと、及び必要であれば又は望ましければ他の培養培地及び技術、例えば、所望の濃縮、増殖、及び/又は選択培地を含む寒天ゲル上で試料を培養することを使用してもよいことを理解するであろう。
【００７５】
本発明の第1の態様に従う一例において、D群連鎖球菌を同定するための同定培地は、トリプティックソイブロスを含む。
【００７６】
細菌増殖を支持する同定培地に加えて、同定培地は、目的の細菌の同定を容易にするために少なくとも1つの選択培地を更に含む。D群連鎖球菌を選択するために、選択培地は、エスクリン、クエン酸第二鉄、及び安定化剤を含む。エスクリン及びクエン酸第二鉄は、増殖を支持する安定化剤が存在しなければ細菌の増殖を通常阻害する量で選択培地中に存在する。
【００７７】
クエン酸第二鉄と合わせたエスクリンは、D群連鎖球菌を同定するための選択培地として使用される。エスクリン及びクエン酸第二鉄は、化合物濃度が増加すると試料中の細菌の増殖を阻害しうることから、典型的には低濃度で使用される。実施例1及びTable 5(表15)、実施例3を参照されたい。典型的には、10mLのエスクリンブロスと混合した最大100μLの試料をエスクリン寒天上に広げる。これは、約1:100の体積比である。この体積比又は類似の体積比は、陽性反応(培養培地の黒色化)を可視化するという利点を有し、専門の研究所において実施可能である。素人に実現可能な方法を提供するためには、体積比1:10〜10:1が適用可能性がより高い。実施例3、Table 6(表16)は、典型的に使用される0.1%のエスクリン濃度及び0.05%のクエン酸第二鉄濃度によって得られる、乳汁中のストレプトコッカス・ウベリスの比色測定検出が弱いことを示している。この問題は、臨床試料のバックグラウンド色に関連する。本出願人は意外にも、より高濃度のエスクリン及びクエン酸第二鉄が、安定化剤、(例えば)乳汁由来タンパク質又は乳汁由来タンパク質抽出物の存在下でD群連鎖球菌の増殖を阻害しないこと、並びに試験試料中のD群連鎖球菌の存在が肉眼で簡単に同定されうること(陽性反応=培養培地の黒色化の形成)を見出した。
【００７８】
したがって、本発明の第1の態様に従う一例において、同定培地は、0.1%〜2.0%エスクリン、特に0.50%エスクリンを更に含む。0.1〜2.0%エスクリンは、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、及び2.0%エスクリンを含むがこれらに限定されず、(例えば)0.25%エスクリンを含む、その間のありとあらゆる値を含む。
【００７９】
関連する一例において、同定培地は、0.05%〜1.0%クエン酸第二鉄、特に0.25%クエン酸第二鉄を含む。0.05%〜1.0%クエン酸第二鉄は、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、及び1.0%クエン酸第二鉄を含むがこれらに限定されず、(例えば)0.125%クエン酸第二鉄を含むその間のありとあらゆる値を含む。クエン酸第二鉄は、クエン酸鉄アンモニウム並びに他の遊離型又は塩型を含むがこれらに限定されない、様々な形態で存在してもよいことは当業者に公知であろう。
【００８０】
更に関連する一例において、同定培地は、0.50%エスクリンと0.25%クエン酸第二鉄とを含み、生物試料を同定培地と合わせる工程は、37℃で16〜24時間の期間、細菌を培養することを含む。
【００８１】
本発明のこの態様に従って、生物試料は、乳汁、子宮からの液体試料、全血試料、血漿、血清、卵胞液試料、精液試料、脳脊髄液、唾液、喀痰、尿、胸膜滲出液、間質液、滑液、リンパ、及び涙液からなる群から選択されうる。
【００８２】
更に、生物試料が乳汁(例えば、ヒト又はウシ動物等の非ヒト動物由来)である場合、反応混合物に安定化剤は必要ない。
【００８３】
したがって、本発明の別の態様において、ヒト又は非ヒト動物においてD群連鎖球菌を同定する方法であって、ヒト又は非ヒト動物がD群連鎖球菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有する可能性があり、方法が、
(i)ヒト又は非ヒト動物から得た乳汁含有生物試料、並びにエスクリン及びクエン酸第二鉄を含む同定培地を含む反応混合物を提供する工程と、
(ii)D群連鎖球菌が試料中に存在するか否かを同定する工程と
を含み、エスクリン及びクエン酸第二鉄が、乳汁試料中に安定化剤が存在しなければD群連鎖球菌の増殖を阻害するほど十分な量で、反応混合物中に存在し、
試料中のD群連鎖球菌の同定が、反応混合物の黒色化によって確認され、
試料中のD群連鎖球菌の同定が、ヒト又は非ヒト動物がD群連鎖球菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有することを示している、
方法が提供される。
【００８４】
連鎖球菌はグラム陽性菌であることから、同定培地は、1つ又は複数のグラム陰性抗菌剤、例えばグラム陰性菌に対する抗生物質を更に含みうる。重要なことに、グラム陰性菌に対する抗菌剤の存在は、グラム陽性連鎖球菌の濃縮に影響を及ぼさない。グラム陰性菌に対する抗菌剤を含めることは、同定の目的に関してD群連鎖球菌の濃縮を容易にするであろう。
【００８５】
したがって、なお別の関連する例において、D群連鎖球菌を同定するための同定培地は、グラム陰性菌に対する抗菌剤を更に含む。
【００８６】
グラム陰性抗生物質の例は、アズトレオナムを含むがこれらに限定されないモノバクタム類を含む。
【００８７】
コアグラーゼ陽性及びコアグラーゼ陰性ブドウ球菌を、特異的に同定及び/又は識別することがしばしば望ましい。感染を引き起こすブドウ球菌のタイプがわかっていることは、処置の決定に影響を及ぼしうる。
【００８８】
意外にも、本出願人は、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌及びコアグラーゼ陰性ブドウ球菌を同定し識別する新規アプローチも開発した。
【００８９】
第一に、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌(例えば、黄色ブドウ球菌)は、亜テルル酸塩を含む同定培地中で濃縮することによって、ヒト又は非ヒト動物から得た生物試料中で同定されうる。本出願人は意外にも、亜テルル酸塩がコアグラーゼ陰性菌の増殖を選択的に阻害することを発見した。
【００９０】
第二に、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌の濃縮が検出されない場合、高レベルの塩(例えば、塩化ナトリウム)、選択的炭水化物源、及びpH指示薬を含む同定培地中で濃縮することによって、同じ生物試料のコアグラーゼ陰性菌の同定を並行して行ってもよい。高い塩濃度のみが、コアグラーゼ陽性及びコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の増殖を支持する。亜テルル酸塩濃縮培地に黒色沈殿物が存在しないこと、及び所望の炭水化物源と合わせた高い塩を含む同定培地中で細菌が増殖することにより、pHの変化を通して調べるコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の間接的な同定が可能となる。すなわち、所望の炭水化物源の存在下では、コアグラーゼ陰性菌は、炭水化物を酸性化産物に変換して、それによってpHの変化が起こり、これを測定することができる。これを図2に示す。
【００９１】
したがって、本発明の更なる態様において、ヒト又は非ヒト動物においてコアグラーゼ陽性ブドウ球菌を同定する方法であって、ヒト又は非ヒト動物が、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有する可能性があり、方法が、
(i)ヒト又は非ヒト動物から得た生物試料、並びに亜テルル酸塩及び安定化剤を含む同定培地を含む反応混合物を提供する工程と、
(ii)コアグラーゼ陽性ブドウ球菌が試料中に存在するか否かを同定する工程と
を含み、亜テルル酸塩が、安定化剤が存在しなければコアグラーゼ陽性ブドウ球菌の増殖を阻害するほど十分な量で、反応混合物中に存在し、
試料中のコアグラーゼ陽性ブドウ球菌の同定が、反応混合物における黒色沈殿物の出現によって確認され、
試料中のコアグラーゼ陽性ブドウ球菌の同定が、ヒト又は非ヒト動物が、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有することを示している、
方法が提供される。
【００９２】
本発明のこの態様に従う一例において、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌は黄色ブドウ球菌である。
【００９３】
本発明のこの態様に従う別の例において、同定培地は、1%亜テルル酸塩溶液の0.5%〜30%を含み、特に1%亜テルル酸塩溶液の10%〜22%を含む。関連する一例において、亜テルル酸塩は、亜テルル酸カリウムである。
【００９４】
関連する一例において、同定培地は、1%亜テルル酸カリウム溶液の10%を含み、生物試料と同定培地とを含む反応混合物を提供する工程は、25〜45℃で7〜48時間の期間、細菌を培養することを含む。
【００９５】
本発明のこの態様に従う方法がヒト又は非ヒト動物から得た生物試料中でコアグラーゼ陽性ブドウ球菌を同定できない場合、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌の存在に関して間接的に決定するために、試料を更に調べてもよい。
【００９６】
したがって、本発明のなお更なる態様において、ヒト又は非ヒト動物におけるコアグラーゼ陰性ブドウ球菌を同定する方法であって、ヒト又は非ヒト動物がコアグラーゼ陰性ブドウ球菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有し、方法が、
(i)本明細書において記述される方法に従って、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌が試料中に存在しないことを確立する工程と、
(ii)同じヒト又は非ヒト動物から得た生物試料、並びに高い塩濃度、炭水化物源、及び呈色pH指示薬を含む同定培地を含む反応混合物を提供する工程と、
(iii)コアグラーゼ陰性ブドウ球菌が試料中に存在するか否かを同定する工程と
を含み、pH指示薬が、安定化剤が存在しなければコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の増殖を阻害するほど十分な量で、反応混合物中に存在し、
反応混合物中の炭水化物源が、グルコース、フルクトース、マルトース、スクロース、グリセロール、ガラクトース、マンノース及びラクトースからなる群の1つ又は複数から選択され、
コアグラーゼ陰性ブドウ球菌の同定が、pHの変化によって引き起こされる反応混合物の色の変化によって確認され、
試料中のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の同定が、ヒト又は非ヒト動物が、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有することを示している、
方法が提供される。
【００９７】
一例において、高い塩濃度は≧7.5%(w/v)の塩化ナトリウムを含む。或いは、高い塩濃度は、関連技術分野の当業者に公知であるように、≧7.5%(w/v)の塩化カリウム又は他の塩を含む。
【００９８】
炭水化物源は、グルコース、フルクトース、マルトース、スクロース、グリセロール、ガラクトース、マンノース及びラクトースからなる群から選択される。重要なことに、炭水化物源は、マンニトール、トレハロース、ラムノース、キシロース、又はアラビノースを含まない。
【００９９】
更に関連する一例において、pH指示薬は、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル、及びブロモチモールブルーからなる群から選択される。なお更なる例において、pH指示薬は、フェノールレッドであり、細菌の増殖に起因する培地の酸性化は、赤から黄への色の変化を引き起こす。
【０１００】
なお更なる例において、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌は、スタフィロコッカス・クロモゲネス、スタフィロコッカス・シミュランス、スタフィロコッカス・キシローサス、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・ヘモリチカス、スタフィロコッカス・アルレッタ、スタフィロコッカス・ガリナルム、スタフィロコッカス・レンタス、スタフィロコッカス・サプロフィチクス、スタフィロコッカス・ワルネリ/パスツーリ、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス(Staphylococcus lugdunensis)、スタフィロコッカス・シュライフェリ、及びスタフィロコッカス・カプラエ(Staphylococcus caprae)からなる群から選択される。一例において、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌は、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス、スタフィロコッカス・シュライフェリ、及びスタフィロコッカス・カプラエ群から選択される。
【０１０１】
一例において、安定化剤は、乳汁由来タンパク質又は乳汁由来タンパク質抽出物を含む。乳汁由来タンパク質又は乳汁由来タンパク質抽出物の例には、α-カゼイン、β-カゼイン(A1、A2、A3、B、C、D、E、及びF変種の1つ又は複数を含む)、カゼインナトリウム(例えば、α-カゼイン、β-カゼイン、及びκ-カゼインを含む)、κ-カゼイン、β-ラクトグロブリン、乳清タンパク質、ラクトアルブミン、ラクトフェリン、及び乳汁又は粉乳、並びにそれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。
【０１０２】
本発明の方法に従う更なる例において、生物試料は、乳汁、尿、血清、血漿、喀痰、及び便からなる群から選択される。
【０１０３】
重要なことに、本発明に従う方法は、例えばヒト及び非ヒト動物において乳腺炎又は子宮筋層炎を引き起こす細菌の同定において特に有用である。特に、本発明の方法は、ウシ動物、例えば乳牛において乳腺炎を引き起こす細菌の同定において有用である。
【０１０４】
したがって、本発明のなお別の態様において、ヒト又は非ヒト動物において乳腺炎を引き起こす1つ又は複数の細菌を同定する方法であって、
(i)ヒト又は非ヒト動物から得た乳汁試料、並びに同定培地を含む反応混合物を提供する工程と、
(ii)反応混合物が安定化剤を必要としないという改変を加えて、本明細書において記述される任意の方法に従い、乳腺炎を引き起こす1つ又は複数の細菌が乳汁試料中に存在するか否かを同定する工程と
を含む方法が提供される。
【０１０５】
関連する一例において、本発明のこの態様に従う方法は、例えば大腸菌群細菌を含む、他の乳腺炎を引き起こす細菌を同定する工程を更に含む。乳腺炎を引き起こす大腸菌群細菌の例は大腸菌である。
【０１０６】
したがって、なお更に関連する一例において、乳汁を含むがこれらに限定されない生物試料中に大腸菌群細菌が存在するか否かを決定することが望ましい場合、同定培地は、ウシ胆汁とpH指示薬とを含み、試料中の大腸菌群細菌の同定は、試料を同定培地と合わせた場合の赤から黄への色の変化によって確認される。
【０１０７】
関連する一例において、同定培地は、ウシ胆汁源としてマッコンキーブロスを含む。
【０１０８】
更に関連する一例において、呈色pH指示薬は、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル、及びブロモチモールブルーからなる群から選択される。
【０１０９】
なお更なる例において、乳腺炎を引き起こす細菌は、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス・ウベリス、アガラクチア菌、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ、大腸菌、及びスタフィロコッカス・クロモゲネス、スタフィロコッカス・シミュランス、スタフィロコッカス・キシローサス、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・ヒカス、スタフィロコッカス・ヘモリチカス、スタフィロコッカス・アルレッタ、黄色ブドウ球菌d、スタフィロコッカス・ガリナルム、スタフィロコッカス・レンタス、スタフィロコッカス・シュードインターメディウス、スタフィロコッカス・サプロフィチクス、スタフィロコッカス・ワルネリ/パスツーリを含むコアグラーゼ陰性ブドウ球菌、コリネバクテリウム・ボビス(Corynebacterium bovis)、エンテロコッカス・フェカーリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Entercoccis faecium)、アエロコッカス・ビリダンス(Aerococcus viridans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、ノカルジア種(Nocardia species)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxttoca)、アルカノバクテリウム・ピオゲネス(Arcanobacterium pyogenes)、バチルス種(Bacillus species)、及びプロテウス種(Proteus SPP)からなる群から選択される。
【０１１０】
乳腺炎に関して、本発明の第1、第3、及び第4の態様に従う方法は、感染症を引き起こす細菌を同定するために子宮から得た液体試料を使用して行ってもよい。
【０１１１】
ヒト又は非ヒト動物の感染症は、1つ超の細菌種によって引き起こされる可能性がある。したがって、本発明の方法は、異なるレベルで感染症の性質を調べるために同じ試料について並行して行ってもよい。例えば、本明細書において記述される同定方法は、感染症を引き起こす細菌の同時、個別、又は連続的同定が調べられうるように並行して試験紙で行ってもよい。乳腺炎に関連する非限定的な例に関しては実施例4を参照されたい。
【０１１２】
本発明に従う細菌同定方法の一例において、感染症は乳腺炎であり、感染症を引き起こす細菌は、D群連鎖球菌である。関連する一例において、D群連鎖球菌には、ストレプトコッカス・ウベリスが含まれるがこれらに限定されない。
【０１１３】
本発明に従う細菌同定法の別の例において、感染症は乳腺炎であり、感染症を引き起こす細菌はブドウ球菌である。関連する一例において、ブドウ球菌には、黄色ブドウ球菌及びコアグラーゼ陰性ブドウ球菌が含まれるがこれらに限定されない。
【０１１４】
本発明に従う細菌同定法のなお別の例において、感染症は乳腺炎であり、感染症を引き起こす細菌はD群連鎖球菌及び大腸菌又はグラム陰性菌である。関連する一例において、D群連鎖球菌には、ストレプトコッカス・ウベリスが含まれるがこれらに限定されない。
【０１１５】
本発明に従う細菌同定法の更なる例において、感染症は乳腺炎であり、感染症を引き起こす細菌は、ブドウ球菌及び大腸菌又はグラム陰性菌である。関連する一例において、ブドウ球菌には、黄色ブドウ球菌及びコアグラーゼ陰性ブドウ球菌が含まれるがこれらに限定されない。
【０１１６】
本発明に従う細菌同定法のなお更なる例において、感染症は乳腺炎であり、感染症を引き起こす細菌は、D群連鎖球菌、ブドウ球菌、及び大腸菌又はグラム陰性菌である。関連する一例において、D群連鎖球菌には、ストレプトコッカス・ウベリスが含まれるがこれらに限定されない。更に関連する一例において、ブドウ球菌には、黄色ブドウ球菌及びコアグラーゼ陰性ブドウ球菌が含まれるがこれらに限定されない。
【０１１７】
先に定義したように、本発明に従う試験紙は、本発明のアッセイ及び方法を実施するために十分な、任意の形状のプレート、ウェル、バイアル、又は容器を含む。これは、細菌を同定する目的並びに抗菌剤感受性試験の実施のためのものを含む(以下を参照されたい)。
【０１１８】
本発明に従う特定の例において、試験紙は、試験ウェルを含む作製済みのプレート(例えば、96ウェルマイクロアレイプレート)、又は(例えば)1×10、1×8、1×6、1×4、2×3、2×5、3×3、3×4、3×8、4×8、4×12等の異なる形状で作製済みの試験ウェルを含む。他の例において、試験ウェル、バイアル、又は容器は、本発明に従う細菌同定培地を予め充填されている。これによって、試料中の細菌の濃縮及びその後の同定の目的のために、試験紙及び/又は試験ウェルに生物試料を直接添加することができる。
【０１１９】
公知の細菌同定試験試薬もまた、試験される生物試料中の細菌を同定する目的で、個別の試験ウェル、バイアル、又は容器内に含めてもよい。例えば、試料中のグラム陽性及びグラム陰性菌の同定を単に確立するために、試験ウェル、バイアル、又は容器に、トリプティックソイブロス及びフェノールレッドを充填してもよい。
【０１２０】
2.抗菌剤感受性試験
その後の処置に適切な抗菌剤を選択する目的で、感染症又は感染性疾患を引き起こす細菌の同一性に関する情報がわかっていることは有利でありうるが、ヒト又は非ヒト動物から得た試料中に存在する細菌のタイプに関する情報は必ずしも十分ではない。例えば、感染症を引き起こす細菌の特定の株が、同じ細菌を死滅させる又は増殖を阻害することが予めわかっている従来の抗菌剤(例えば、抗生物質)に対する薬物耐性を発生している可能性がある。更に、特定の細菌株は、特定の抗菌剤又は抗菌剤のクラスに対してより感受性が高くなりうる。したがって、感染症を引き起こす細菌が特定の抗菌剤による処置に対してどの程度感受性があるかを理解する試みにおいて、リアルタイムの抗生物質感受性試験を実施することが有利であろう。この情報はまた、情報のデータベースを構築する目的で感染性疾患に関連する歴史的、季節的、及び地理的発生に対する有効な処置を記録するために使用されうる。その上、定量的感受性試験を行うことによって、例えば連続希釈分析を通して、感染したヒト又は非ヒト動物のその後の処置の用量最適化に関する情報を引き出すことができる。
【０１２１】
抗菌剤感受性試験の概念は公知であるが(例えば、Wattsら(2008)  Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals; Approved Standard  第3版、28(8) Clinical and Laboratory Standards Institute社、Wayne、Pennsylvania、USAを参照されたい)、既存の技術に関連する限界がある。例えば、従来の研究所での検査は時間がかかり(すなわち、最大数日)、試験前に細菌の単離及びその後の培養を伴う。これは、それぞれの試験が細菌の特定の接種量を必要とするためである。このことは、多くの抗菌剤が分裂中の細菌に対してのみ有効である(例えば、ペニシリン)という理由で、細菌培養物を指数増殖期まで増殖させなければならないことを意味している。従来の研究所での検査は時間がかかるのみならず、細菌培養、単離、及び全般的微生物学の専門技術を必要とする。その間に、患者は、処置されることなく結果を待つか、又は細菌感染症に関する特定の知識なしに処置される。いずれの状況においても、薬物耐性に関連する問題に寄与することは言うまでもなく、患者にとってマイナスであり、生命を脅かす結果すら起こりうる。
【０１２２】
ヒト又は非ヒト動物から得た生物試料に直接、抗菌剤感受性試験を実施することが望ましいであろう。このアプローチは、容易に検出可能で素人が使用することができる液体培養での比色測定試験に基づきうる。しかし、臨床細菌試料の使用にしばしば関連する問題は、感染症によるバックグラウンド色である。乳腺炎の場合、例えばこの色は、感染症の重症度に応じて、黄から茶として記述されうる。同様に、尿を含む生物試料は、微量の血液を含有することがあり、このことは臨床試料が赤のバックグラウンド色を有しうることを意味する。便試料は黄色、茶色でありうるか、又は更に血液を含有しうる。そのようなバックグラウンド色は、比色測定試験の読み取りを困難にしうる。
【０１２３】
更に、感染症に関連する試料のあらゆるバックグラウンド色を隠すのに十分な濃度の呈色指示薬を使用することには限界がある。例えば、実施例2のTable 2a(表6)〜Table 2c(表8)は、一般的に使用される呈色指示薬であるフェノールレッドの細菌増殖に及ぼす阻害効果を証明している。すなわち、試料に関連する任意のバックグラウンド色を隠すためには、フェノールレッドは、細菌増殖を実際に阻害する濃度で添加される必要があり、それによって濃縮も阻害される。結果は、比色技術を抗菌剤感受性試験に適用する場合、抗菌剤の可能性がある有効性に関する有用な情報はあったとしてもごくわずかである。したがって、比色法による検出は難しく、しばしば選択的又は識別的濃縮培地の適用前に細菌を単離する必要がある。この問題を克服する1つのアプローチは、バックグラウンド色を低減させるために、及び/又は阻害効果を除去するために、臨床試料を例えば100倍、1000倍、又は10000倍希釈することである。しかし、これらの希釈は、感受性試験の感度を損なうことから、しばしば望ましくない。或いは、所望の時点でいくつかの試料を採取した後、細菌細胞計数のために寒天ゲル上にプレーティングする。しかし、この技法は更により時間がかかり、素人が行うには難しい。
【０１２４】
本出願人は意外にも、細菌増殖に対する呈色pH指示薬の阻害効果を、1つ又は複数の安定化剤を使用して有効に抑制することができることを発見し、このことは、(例えば)フェノールレッド等のpH指示薬の増加濃度を、細菌同定アッセイのみならず、抗菌剤感受性試験においても使用してもよいことを意味する。呈色指示薬の増加濃度を使用する利点は、臨床試料を使用して比色測定試験を行うことができ、それによって(i)事前単離技術を行う必要性、及び(ii)試験される試料の感染症によって引き起こされるバックグラウンド色の混入に関連する起こり得る問題を回避することができることを意味する。
【０１２５】
そのため、本発明は、比色測定変化に基づく増殖阻害アッセイを使用して行われうる、細菌の抗生物質感受性試験を提供する。更になお、本発明は、適切な処置を選択する目的で抗生物質感受性試験を行う場合に素人が使用することができる方法及びキットを都合よく提供する。
【０１２６】
したがって、本発明の一態様において、ヒト又は非ヒト動物から得た生物試料に関して抗菌剤感受性試験を行うための方法であって、ヒト又は非ヒト動物が、感染症を引き起こす1つ又は複数の細菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有する可能性があり、方法が、
(i)ヒト又は非ヒト動物から得た生物試料、並びに増殖培地、抗菌剤、呈色pH指示薬、及び安定化剤を含む感受性培地を含む反応混合物を提供する工程と、
(ii)試料を感受性培地に添加した場合の色の変化を観察することによって、抗菌剤に対する試料中の1つ又は複数の細菌の感受性を決定する工程と
を含み、pH指示薬が、安定化剤が存在しなければ、感染症を引き起こす1つ又は複数の細菌の増殖を阻害するほど十分な量で、反応混合物中に存在する、方法が提供される。
【０１２７】
本発明のこの態様に従う一例において、細菌がグラム陽性菌である場合、安定化剤は、乳汁由来タンパク質又は乳汁由来タンパク質抽出物を含む。乳汁由来タンパク質又は乳汁由来タンパク質抽出物の例には、α-カゼイン、β-カゼイン(A1、A2、A3、B、C、D、E、及びF変種の1つ又は複数を含む)、カゼインナトリウム(例えば、α-カゼイン、β-カゼイン、及びκ-カゼインを含む)、κ-カゼイン、β-ラクトグロブリン、乳清タンパク質、ラクトアルブミン、ラクトフェリン、及び乳汁又は粉乳、並びにそれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。
【０１２８】
本発明のこの態様に従う別の例において、細菌がグラム陰性菌である場合、安定化剤は、炭水化物を含む。本発明のこの態様に従う炭水化物の例には、デキストロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、及びスクロースが含まれるがこれらに限定されない。
【０１２９】
重要なことに、選択培地は2つの機能を果たさなければならない。すなわち(i)細菌濃縮の目的のために細菌増殖を支持すること、及び(ii)抗菌剤の存在下で増殖阻害に対する細菌の感受性を同定するために十分な成分を含むことである。
【０１３０】
本発明の一例において、呈色pH指示薬は、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、ブロモクレゾールグリーン、メチルレッド、メチルパープル、アゾリトミン、ニュートラルレッド、ナフトールフタレイン、クレゾールレッド、クレゾールフタレイン、フェノールフタレイン、2,4-ジニトロフェノール、エリスロシン二ナトリウム塩、ベンゾパープリン4B、N,N-ジメチル-p-(m-トリルアゾ)アニリン、p-ジメチルアミノアゾベンゼン、4,4'-ビス(2-アミノ-1-ナフチルアゾ)-2,2'-スチルベンジスルホン酸、テトラブロモフェノールフタレインエチルエステルカリウム塩、ブロモフェノールブルー、コンゴーレッド、メチルオレンジ、エチルオレンジ、4-(4-ジメチルアミノ-1-ナフチルアゾ)-3-メトキシベンゼンスルホン酸、レサズリン、4-フェニルアゾ-1-ナフチルアミン、エチルレッド2-(p-ジメチルアミノフェニルアゾ)ピリジン、4-(p-エトキシフェニルアゾ)-m-フェニレン-ジアミン一塩酸塩、レゾルシンブルー、アリザリンレッドS、プロピルレッド、クロロフェノールレッド、p-ニトロフェノール、アリザリン2-(2,4-ジニトロフェニルアゾ)1-ナフトール-3,6-ジスルホン酸二ナトリウム塩、6,8-ジニトロ-2,4-(1H)キナゾリンジオン、ブリリアントイエロー、m-ニトロフェノール、ターメリック(クルクミン)、メタクレゾールパープル、4,4'-ビス(4-アミノ-1-ナフチルアゾ)-2,2'-スチルベンジスルホン酸、チモールブルー、p-ナフトールベンゼイン、フェノールフタレイン、o-クレゾールフタレイン、エチルビス(2,4-ジメチルフェニル)エタノエートからなる群から選択される。
【０１３１】
関連する一例において、呈色pH指示薬は、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル、及びブロモチモールブルーからなる群から選択される。
【０１３２】
本発明の更に関連する一例において、呈色pH指示薬は、フェノールレッドである。
【０１３３】
なお別の例において、フェノールレッドは、0.0035%〜0.30%、0.005〜0.1%、及び0.01〜0.1%で添加される。特に、フェノールレッドは、0.0125%〜0.03%の濃度で添加される。0.0035〜0.30%の濃度では、フェノールレッドの色は、試験される試料に関連するあらゆるバックグラウンド色を隠すのに十分である。
【０１３４】
更に、本発明は、試験される試料を添加する直前に、反応混合物のpHを所望のpHに調節するために十分なpH調節剤(すなわち、酸及び塩基)の使用を企図する。例えば、開始pHは7.2であることが望ましく、反応混合物が7.0である場合、pHを7.2にするために(例えば)水酸化ナトリウムの添加を行ってもよい。これらのタイプのpH調節剤による改変は、当業者に公知であろう。
【０１３５】
既に考察したように、安定化剤の目的は、細菌増殖に及ぼす呈色pH指示薬の阻害効果を抑制するためである。グラム陽性菌に対する抗菌剤感受性を試験する場合の適した安定化剤の例は、乳汁由来タンパク質又は乳汁由来タンパク質抽出物、(例えば)α-カゼイン、β-カゼイン(A1、A2、A3、B、C、D、E、及びF変種の1つ又は複数を含む)、カゼインナトリウム(例えば、α-カゼイン、β-カゼイン、及びκ-カゼインを含む)、κ-カゼイン、β-ラクトグロブリン、乳清タンパク質、ラクトアルブミン、ラクトフェリン、及び乳汁又は粉乳、並びにそれらの組合せである。グラム陰性菌に対する抗菌剤感受性を試験する場合の適した安定化剤の例は、炭水化物、(例えば)デキストロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、及びスクロースである。(例えば)増加濃度のフェノールレッドの増殖阻害効果の抑制に及ぼす安定化剤の効果は、Table 2a(表6)〜Table 2c(表8)と比較した場合、Table 4a(表10)〜Table 4d(表13)に記載の結果から明らかである。
【０１３６】
加えて、どれがその後の処置における有効量でありうるかを決定するために、異なる濃度の抗菌剤、又は抗菌剤の組合せの有効性を試験することが望ましいであろう。
【０１３７】
したがって、本発明の第6の態様に従う一例において、生物試料を、抗菌剤を含む感受性培地と合わせる工程は、定量的感受性試験を含む。定量的感受性試験は、本明細書において具体的に定義され、例えば試験される抗菌剤の連続希釈液を使用して、又は試験される抗菌剤の予め選択された濃度を使用することによって行われうる。本発明に従う定量的感受性試験の例を実施例6に提供する。
【０１３８】
本発明の第6の態様に従う特定の例において、抗菌剤は、抗生物質又は抗生物質の組合せである。
【０１３９】
関連する一例において、抗生物質又は抗生物質の組合せは、ペニシリン類、セファロスポリン類、マクロライド類、リンコサミド類、フロルフェニコール、キノリン類、モノバクタム類、テトラサイクリン類、アミノグリコシド類、スルホンアミド類、ポリミキシン類、及び糖ペプチドからなる群から選択される。
【０１４０】
本発明の第6の態様に従う他の例において、生物試料を感受性培地と合わせる工程は、25〜45℃で7〜48時間の期間細菌を培養することを含む。
【０１４１】
本発明に従う抗菌剤感受性方法は、24時間未満、実施されるが、12時間未満、及び7時間未満の期間が望ましい。同定に要する時間は最終的に、試験される臨床又は生物試料中の細菌接種量に依存するが、時間の関数として細菌増殖の阻害を示す図1も参照されたい。これらのデータは、7時間未満での感受性の読み取りが、誤解を招く情報を提供しうることを示しており、したがって抗菌剤感受性を経時的に評価することが重要である。
【０１４２】
本発明の他の例において、抗菌剤感受性試験は、乳腺炎又は子宮筋層炎を処置する目的のために抗生物質に対する細菌の感受性を決定するために使用される。このことは、乳腺炎又は子宮筋層炎による感染症が疑われるヒト又は非ヒト動物からの乳汁試料を得ることと、本発明の方法に従う抗生物質感受性試験を実施することとを伴う。ヒト又は非ヒト動物から得た乳汁試料について「リアルタイム」抗生物質感受性試験を実施することによって、他の任意の抗菌剤に加えて、特定の抗生物質又は抗生物質の組合せに対する、感染症を引き起こす細菌の感受性が得られうる。このアプローチはまた、抗生物質が細菌同定分析のみに基づいて選択されている場合、薬物耐性細菌によって生じる可能性がある問題を排除する。したがって、ヒト又は非ヒト動物に関する処置の転帰が成功する可能性は増加する。
【０１４３】
ヒト又は非ヒト動物から得た試料を使用する抗菌剤感受性試験によって与えられた利点にもかかわらず、例えば、乳腺炎又は子宮筋層炎の試験において、抗菌剤感受性試験と並行して、感染症を引き起こす細菌の同一性を決定することも有用でありうる。したがって、本発明はまた、細菌の同定と抗生物質感受性試験を行うための二重の方法及び試験キットも企図する。本発明に従う細菌同定と感受性試験との組合せの例を提供する実施例7を参照されたい。
【０１４４】
本明細書において記述されるように、安定化剤の目的は、呈色pH指示薬の阻害効果を抑制することである。本発明に従う安定化剤の例は、乳汁である。したがって、試験される試料が乳汁である場合、例えば乳腺炎又は子宮筋層炎に関連する感受性試験の場合、安定化剤を含める必要はない。
【０１４５】
したがって、本発明の別の態様において、ヒト又は非ヒト動物から得た乳汁を含む生物試料に関して抗菌剤感受性試験を実施する方法であって、ヒト又は非ヒト動物が、感染症を引き起こす1つ又は複数の細菌に感染している、又はそれによる感染のリスクを有する可能性があり、方法が、
(i)ヒト又は非ヒト動物から得た生物試料、並びに抗菌剤及び呈色pH指示薬を含む感受性培地を含む反応混合物を提供する工程と、
(ii)試料を感受性培地に添加した場合の色の変化を観察することによって、抗菌剤に対する試料中の1つ又は複数の細菌の感受性を決定する工程と
を含み、pH指示薬が、安定化剤が存在しなければ、感染症を引き起こす1つ又は複数の細菌の増殖を阻害するほど十分な量で存在する、
方法が提供される。
【０１４６】
関連する一例において、乳腺炎に感染していることが疑われるヒト又は非ヒト動物から得た試料に関する抗菌剤感受性試験に関して選択される抗生物質は、アモキシシリン、アンピシリン、ベンジルペニシリン又はペニシリンG、カルベニシリン、クラブラン酸塩、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペネタメート、フェノキシメチルペニシリン又はペニシリンV、スルバクタム、タゾバクタム、セフラセトリル、セファレキシン、セファロチン、セファピリン、セフロキシム、セフチオフル、セフキノム、エリスロマイシン、オレアンドマイシン、タイロシン、クリンダマイシン、リンコマイシン、ピルリマイシン、フロルフェニコール、ダノフロキサシン、ジフロキサシン、エンロフロキサシン、イバフロキサシン、マルボフロキサシン、オルビフロキサシン、サラフロキサシン、シプロフロキサシン、アズトレオナム、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、ジヒドロストレプトマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、スルファジアジン、スルファメトキサゾール、スルファドキシン、及びバンコマイシンからなる群から選択される抗生物質を含む。
【０１４７】
本発明に従う感受性試験の基本的な方法は、陰性増殖対照ウェル又は容器、陽性増殖対照ウェル又は容器、及び試験ウェル又は試験容器による試験パネルを利用して、抗菌製品の予め選択された濃度による増殖阻害に対する微生物の感受性を試験することを伴う。用語「ウェル」又は「容器」は、用語「容器」が、試験分析物を保持するための任意の適切な構造に対する一般用語であると理解して、本明細書において互換的に使用される。本発明に従う方法は、マルチウェルパネル又はマルチウェルプレートの使用に依存せず、個別の個々の容器を使用することができる。パネル又はプレートアプローチは、インキュベータ内外の取り扱いを単純にするために、及び当業者に周知の他の理由により好ましい。
【０１４８】
感受性試験が本発明に従ってどのように実施されうるかの例を、以下の実施例2及び6に記述する。微生物培養の適した培地には、当技術分野で公知の培養物は他にもあるが、中でも、トリプティックソイブロス、ミューラーヒントンブロス、マッコンキーブロス、及びエスクリンブロスが含まれる。本発明に従う微生物培養のための一般的な濃縮培地の例を、実施例1に記載する。
【０１４９】
選択された増殖培地の濃度は、感受性試験業界において現在使用されている標準的な濃度範囲内でありうる。
【０１５０】
短期間から中期間での輸送及び保存に耐えるために適切な貯蔵寿命を有する分析物を含む、すぐに使用できる抗菌剤感受性及び/又は細菌同定試験キットを提供することもまた望ましい。いくつかの抗菌剤、(例えば)ペニシリン又はセファロスポリン抗生物質は、室温で保存すると時間と共に水性培地中で分解する。薬物の分解が保存時に起これば、試験時の実際の薬物濃度が不明となり、不正確な情報、(例えば)偽陰性試験結果をもたらす可能性がある。
【０１５１】
抗生物質の場合に特に有用である、この制限を回避する1つのアプローチは、抗生物質を含む乾燥又は凍結乾燥抗菌剤を提供することである。別のアプローチは、抗生物質を含む抗菌剤を凍結することである。
【０１５２】
末端のユーザーに、簡便なすぐに使用できる抗菌剤感受性試験を提供するためには、抗菌剤は、保存の間、化学的に安定でなければならない。これは、選択される抗菌剤(例えば、抗生物質)が、感受性培地と共に試験キットに含まれフリーザーで保存される場合、又は選択される薬物が乾燥若しくは凍結乾燥される場合に達成することができる。例えば、所望の抗菌剤を含む感受性培地を、所望の濃度で試験キットのウェルに添加し、次いで75℃で30分間乾燥させてもよい。選択された抗生物質を含む感受性培地は、ここでウェル又は容器の内部で乾燥薄膜として提供され、これを室温で長期間(例えば数カ月又は数年)保存することができる。所望の時点で、試料採取装置に、例えば一定量の臨床試料を充填することができる。次いで、抗生物質を含む感受性培地を含む薄膜は、感受性培地を添加すると復元される。
【０１５３】
所望の抗菌剤を含む感受性培地を、所望の濃度で試験キットのウェルに添加し、次いで凍結乾燥してもよい(試料を大気圧で-20℃に凍結し、次いで圧力を(例えば)-20℃で0.001barに24時間低減させ、次いで温度を25℃に上昇させ、24時間保持し、次いで圧力を大気圧に増加させる)。選択される抗生物質を含む感受性培地は、ここでウェル又は容器の内部で粉末ケークとして提供され、これを室温で長期間(例えば、数カ月又は数年)保存することができる。所望の時点で、試料採取装置に、例えば一定量の臨床試料を充填することができる。次いで、抗生物質を含む感受性培地を含む粉末ケークは、臨床試料を粉末ケークと合わせると直ちに復元される。
【０１５４】
したがって、本発明の一例において、選択された抗菌剤を含む選択培地は、試験される試料の添加前に試験ウェル又は容器中にフリーズドライ型又は凍結乾燥型として存在する。このアプローチにより、抗生物質は、試験前に長期間の貯蔵寿命(数カ月超)の間、活性を保持することができる。
【０１５５】
非限定的な例により、0.0125%フェノールレッドを含有するトリプティックソイブロス等の一般的な濃縮培地が、フリーズドライ後に比較的緩い粉末/ケークを形成し、これは容易に復元することができることが見出された。この場合、この培地20μlをフリーズドライし、次いでストレプトコッカス・ウベリス10^6cfu/mlを含有する乳汁の既定量を、復元のために添加した。フリーズドライした濃縮培地は、数分以内に復元され、バイアルを1又は2回タッピングすると、肉眼で見て均質な混合物が得られた。次いでこの試料を約16時間インキュベートした。ストレプトコッカス・ウベリス菌が増殖すると、濃縮培地は黄色になった。
【０１５６】
既に定義したように、本発明に従う試験紙は、本発明のアッセイ及び方法を実施するために十分な、任意の形状のプレート、ウェル、バイアル、又は容器を含む。これは、細菌を同定する目的並びに抗菌剤感受性試験(以下を参照されたい)の実施を含む。
【０１５７】
本発明に従う特定の例において、試験紙は、試験ウェルを含む作製済みのプレート(例えば、96ウェルマイクロアレイプレート)、又は(例えば)1×10、1×8、1×6、1×4、2×3、2×5、3×3、3×4、3×8、4×8、4×12等の異なる形状で作製済みの試験ウェルを含む。他の例において、試験ウェル、バイアル、又は容器は、本発明に従う細菌同定培地を予め充填されている。これによって、試料中の細菌の濃縮及びその後の同定の目的のために、試験紙及び/又は試験ウェルに生物試料を直接添加することができる。
【０１５８】
3.抗菌剤
既に定義したように、用語「抗菌剤」は、例えば細菌、酵母、真菌、ウイルス、寄生虫等を含む微生物を死滅させる、又は増殖を阻害する薬剤を意味すると意図される。
【０１５９】
抗菌剤の例には、抗生物質、抗ウイルス剤、銀含有組成物、天然の抗菌剤、(例えば)アロエベラ、クランベリー、グレープフルーツ皮、緑茶、タラゴン等を含む植物からの抽出物が含まれるがこれらに限定されない。
【０１６０】
更に、適した抗生物質のクラスの例には、ペニシリン類、セファロスポリン類、マクロライド類、リンコサミド類、フロルフェニコール、キノロン類、モノバクタム類、テトラサイクリン類、アミノグリコシド類、スルホンアミド類、ポリミキシン類、及び糖ペプチドが含まれるがこれらに限定されない。これらのクラスに含まれる特異的抗生物質の例を以下に記載する。
【０１６１】
アモキシシリン、アンピシリン、アジオシリン、ベンジルペニシリン/ペニシリンG、カルベニシリン、クラブラン酸塩、クロキサシリン、シクラシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、ヘタシリン、メシリナム、メチシリン、メズロシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペネタメート、フェノキシメチルペニシリン/ペニシリンV、ピペラシリン、スルバクタム、チカルシリン、タゾバクタムが挙げられるがこれらに限定されない、ペニシリン類。
【０１６２】
セファセトリル、セファドロキシル、セファレキシン、セファログリシン、セファロニウム、セファロリジン、セファロチン、セファピリン、セファトリジン、セファザフル、セファゼドン、セファゾリン、セフラジン、セフロキサジン、セフテゾール、セファクロル、セフォニシド、セフプロジル、セフロキシム、セフゾナム、セフメタゾール、セフォテタン、セフォキシチン、セフカペン、セフダロキシム、セフジニル、セフジトレン、セフェタメト、セフィキシム、セフメノキシム、セフォジジム、セフォタキシム、セフォベシン、セフピミゾール、セフポドキシム、セフテラム、セフタメレ(ceftamere)、セフチブテン、セフチオフル、セフチオレン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフクリジン、セフェピム、セフルプレナム、セフォセリス、セフォゾプラン、セフピロム、セフキノム、セフトビプロル、セフタロリン、セフトロザンが挙げられるがこれらに限定されない、セファロスポリン類。
【０１６３】
アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、テリスロマイシン、カルボマイシンA、ジョサマイシン、キタサマイシン、ミデカマイシン/ミデカマイシン酢酸塩、オレアンドマイシン、ソリスロマイシン、スピラマイシン、トロレアンドマイシン、タイロシン、ロキシスロマイシンが挙げられるがこれらに限定されない、マクロライド類。
【０１６４】
クリンダマイシン、リンコマイシン、ピルリマイシンが挙げられるがこれらに限定されない、リンコサミド類。
【０１６５】
ダノフロキサシン、ジフロキサシン、エンロフロキサシン、イバフロキサシン、マルボフロキサシン、オルビフロキサシン、サラフロキサシン、シプロフロキサシンが挙げられるがこれらに限定されない、キノロン類。
【０１６６】
アズトレオナムが挙げられるがこれらに限定されない、モノバクタム類。
【０１６７】
ドキシサイクリン、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン、デメクロサイクリン、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、ペニメピサイクリン、ロリテトラサイクリン、テトラサイクリンが挙げられるがこれらに限定されない、テトラサイクリン類。
【０１６８】
ジヒドロストレプトマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンが挙げられるがこれらに限定されない、アミノグリコシド類。
【０１６９】
スルファジアジン、スルファメトキサゾール、スルファドキシンが挙げられるがこれらに限定されない、スルホンアミド類。
【０１７０】
ポリミキシンB、コリスチンが挙げられるがこれらに限定されない、ポリミキシン類。
【０１７１】
バンコマイシン、テイコプラニン、アボパルシンが挙げられるがこれらに限定されない、糖ペプチド。
【０１７２】
カルバペネム、クロラムフェニコール、プロイロムチリン、ポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない、他の抗生物質。
【０１７３】
本発明の方法及びキットに従って、抗生物質は、遊離型又は様々な塩型で使用される。例えば、ベンジルペニシリンは、カリウム、ナトリウム、又はプロカイン塩として使用してもよく、クロキサシリンは、ナトリウム又はベンザチン塩として使用してもよく、セフチオフルは、酸性塩、塩酸塩又はナトリウム塩として使用してもよく、セファピリンは、ナトリウム又はベンザチン塩として使用してもよく、セファゾリンは遊離型又はナトリウム塩として使用してもよく、オキシテトラサイクリンは塩酸塩として使用してもよく、ネオマイシンは三硫酸塩として使用してもよく、セファレキシンは一水和物として使用してもよく、及びジヒドロストレプトマイシンは硫酸塩として使用してもよい。(例えば)感受性試験又はその後の処置レジメンにおいて、例えば乳腺炎の処置において使用される抗生物質に応じて、当業者は、使用すべき抗生物質の適当な形態(すなわち、遊離型又は特定の塩)を承知しているであろう。
【０１７４】
本発明に従う一例において、乳腺炎の乳汁試料に関する感受性試験に使用される抗生物質には、プロカイン塩としてのベンジルペニシリン、塩酸塩としてのオキシテトラサイクリン、一水和物としてのセファレキシン、三硫酸塩としてのネオマイシン、硫酸塩としてのジヒドロストレプトマイシン、遊離型のアズトレオナム、塩酸塩としてのセフチオフル、及びナトリウム塩としてのクロキサシリンが含まれるがこれらに限定されない。更に、本発明の方法において使用するための抗生物質の組合せも想定される。例には、ナトリウム塩としてのクロキサシリンと組み合わせたプロカイン塩としてのベンジルペニシリン、並びに三硫酸塩としてのネオマイシンと組み合わせた塩酸塩としてのオキシテトラサイクリンが含まれるがこれらに限定されない。
【０１７５】
4.試験キット/製品
本発明はまた、本発明に従って、細菌同定及び抗菌剤感受性試験を行うための試験分析物を含むキット及び試験キットも企図する。
【０１７６】
したがって、本発明は、
(i)ヒト若しくは非ヒト動物において感染症を引き起こす1つ若しくは複数の細菌を同定するため、及び/又は
(ii)ヒト若しくは非ヒト動物において感染症を引き起こす細菌に関する抗菌剤感受性試験を実施するため
の試験キットであって、使用説明書と共に、本明細書において記述される任意の方法に従いヒト又は非ヒト動物からの試験試料に関して細菌同定及び/又は抗菌剤感受性試験を実施するための試薬を含む試験キットを提供する。
【０１７７】
試験キットは、抗菌剤感受性試験及び/又は細菌同定を行うための、液体又はフリーズドライ型の試薬を含有しうる。しかし、フリーズドライされていて使用直前に溶液に急速に再懸濁されうる試薬が好ましい。これは、製品の貯蔵寿命を増強する。加えて、フリーズドライされた試薬及び培地は、過剰な水分/水含有量を除去するために、親水性コロイド状シリカ等の除湿剤を更に含んでもよい。この場合も、除湿剤を含めることにより、本発明に従う試験キットの貯蔵寿命は更に増強される。
【０１７８】
典型的なフリーズドライ又は凍結乾燥方法論は以下の工程を含む:
【０１７９】
工程1:固化
(i)好ましい試料容器に液体培養培地を充填する
(ii)培地を充填した試料容器を、すなわち大気圧下の-40℃で凍結する(これはフリーズドライ装置内又は個別のフリーザー内で行うことができる)-この工程を固化(工程1)と呼ぶ。
(iii)凍結培地を含む試料容器をフリーズドライ装置に移す
【０１８０】
工程2:昇華乾燥(一次乾燥)
・  圧力を、典型的には100Pa未満に低下させる
・  温度-40℃で開始し、温度を連続的に、0.06℃/分の勾配ですなわち-10℃まで上昇させ、次いで-10℃の温度をすなわち8時間保持する
【０１８１】
工程3:脱着乾燥(二次乾燥)
・  圧力を、典型的には100Pa未満に低下させる
・  温度すなわち-10℃で開始し、温度を連続的に、1.5℃/分の勾配ですなわち40℃まで上昇させ、次いで40℃の温度をすなわち6時間保持する
【０１８２】
工程4:密封(任意選択)
・  フリーズドライした培地を保護するためにゴム製の蓋を低圧下で試料容器に押しつける
【０１８３】
工程5:圧を大気圧に増加させて、試料を取り出す
【０１８４】
本発明に従う特定の例において、フリーズドライ/凍結乾燥同定培地及び/又は感受性試験培地(個別のチューブ)を含む試験紙を、上記の方法論に従って調製してもよい。次いで、試験紙を使用場所(例えば、農場)に輸送し、生物試料(例えば、乳汁)を添加して、表現型スクリーニングのために反応混合物を作製してもよい。
【０１８５】
本明細書の教示に従って、当業者は、試験紙が、適用の性質、並びに(i)同定される可能性がある及び/又は(ii)抗菌剤に対する感受性に関してスクリーニングされる細菌、に応じて異なる試薬(同定/感受性培地)を含むことを認識するであろう。
【０１８６】
例えば、単なる例に過ぎないが、抗生物質感受性試験紙は、フリーズドライされた増殖培地(例えば、トリプティックソイブロス)、抗生物質(例えば、ベンジルペニシリンの連続希釈液)、pH指示薬(例えば、フェノールレッド)、及び任意選択で安定化剤(例えば、1つ又は複数のカゼイン)を含有するように包装されている。次いで、試験紙をアルミニウムポーチ、又はプラスチックポーチ、又は真空下及び/若しくはシリカゲルの小袋(除湿剤)を含有するプラスチックポーチに密封し、所望の試験場所に輸送する。試験試料(例えば、生物試料、上記を参照されたい)を感受性培地に添加して再懸濁すると、本明細書において記述される方法に従う反応混合物がもたらされる。
【実施例】
【０１８７】
(実施例1)
材料及び方法
1.細菌培養のための一般的な濃縮培地
トリプティックソイブロス(pH約7.3)(%w/v)
トリプトン(カゼインの膵臓消化物)         1.7%
ソイトン(ダイズ粕の膵臓消化物)           0.3%
グルコース(=デキストロース)              0.25%
塩化ナトリウム                          0.5%
リン酸水素二カリウム                    0.25%
水                                      97.0%
【０１８８】
マッコンキーブロス(pH約7.3)(%w/v)
ゼラチンの酵素消化物                    2.0%
ラクトース                              1.0%
ウシ胆汁                                0.5%
ブロモクレゾールパープル                0.001%
水                                      96.499%
【０１８９】
エスクリン寒天培地(%w/v)
寒天                                    1.5%
カゼインの膵臓消化物                    1.3%
NaCl                                   0.5%
酵母エキス                              0.5%
心筋、注入液からの固体                  0.2%
エスクリン                              0.1%
クエン酸第二鉄                          0.05%
水                                      95.85%
【０１９０】
エスクリンアザイドブロス(pH約7.2)(%w/v)
動物組織のペプシン消化物                2.0%
酵母エキス                              0.5%
胆汁酸塩                                1.0%
クエン酸ナトリウム                      0.1%
エスクリン                              0.1%
クエン酸鉄アンモニウム                  0.05%
アジ化ナトリウム                        0.025%
水                                      96.225%
【０１９１】
マンニット食塩寒天培地(%w/v)
寒天                                    1.5%
カゼインの酵素消化物                    0.5%
動物組織の酵素消化物                    0.5%
牛肉エキス                              0.1%
D-マンニトール                          1.0%
塩化ナトリウム                          7.5%
フェノールレッド                        0.0025%
水                                      88.8975%
【０１９２】
マンニット食塩ブロス(pH約7.3)(%w/v)
マンニトール                            0.25%
塩化ナトリウム                          10%
ダイズペプトン                          0.3%
カゼインペプトン                        1.275%
ゼラチンペプトン                        0.425%
フェノールレッド                        0.0025%
リン酸水素二カリウム                    0.25%
水                                      87.4975%
【０１９３】
ベアードパーカー寒天培地(%w/v)
トリプトン                              1%
牛肉エキス                              0.5%
酵母エキス                              0.1%
グリシン                                1.2%
ピルビン酸ナトリウム                    1.0%
塩化リチウム                            0.5%
寒天                                    1.5%
水                                      94.2%
+50mL卵黄亜テルル酸塩乳剤/L
【０１９４】
ジオリッティカントーニブロス基礎培地(%w/v)pH約6.9
トリプトン                              1%
牛肉エキス                              0.5%
酵母エキス                              0.5%
D-マンニトール                          2%
塩化ナトリウム                          0.5%
塩化リチウム                            0.5%
グリシン                                0.12%
ピルビン酸ナトリウム                    0.3%
水                                      94.58%
19mLのジオリッティカントーニブロス基礎培地中に、1.05mL(約5.24%)の1%亜テルル酸塩溶液を添加、又は食肉の試験の場合には0.105mL(約0.55%)を添加
【０１９５】
ミューラーヒントンブロス(%w/v)
カゼインの酸加水分解物                  1.75%
牛肉エキス                              0.3%
デンプン                                0.15%
水                                      97.9%
【０１９６】
2.細菌試料
細菌試料1:
トリプティックソイブロス中の大腸菌/cfu/mL
a)約10^8; b)約10^7; c)約10^6; d)約10^5; e)約10^4; f)約10^3; g)約10^2
【０１９７】
細菌試料2:
トリプティックソイブロス中の黄色ブドウ球菌/cfu/mL
a)約10^8; b)約10^7; c)約10^6; d)約10^5; e)約10^4; f)約10^3; g)約10^2
【０１９８】
細菌試料3:
トリプティックソイブロス中のストレプトコッカス・ウベリス/cfu/mL
a)約10^8; b)約10^7; c)約10^6; d)約10^5; e)約10^4; f)約10^3; g)約10^2
【０１９９】
細菌試料4:
全脂加工乳中の大腸菌/cfu/mL
a)約10^8; b)約10^7; c)約10^6; d)約10^5; e)約10^4; f)約10^3; g)約10^2
【０２００】
細菌試料5:
全脂加工乳中の黄色ブドウ球菌/cfu/mL
a)約10^8; b)約10^7; c)約10^6; d)約10^5; e)約10^4; f)約10^3; g)約10^2; h)約10^6.5
【０２０１】
細菌試料6:
全脂加工乳中のストレプトコッカス・ウベリス/cfu/mL
a)約10^8; b)約10^7; c)約10^6; d)約10^5; e)約10^4; f)約10^3; g)約10^2
【０２０２】
細菌試料7:
全脂加工乳中の表皮ブドウ球菌(コアグラーゼ陰性)/cfu/mL
a)約10^8; b)約10^7; c)約10^6; d)約10^5; e)約10^4; f)約10^3; g)約10^2; h)約10^6.5
【０２０３】
細菌試料8(%v/v)(細菌なし)
全脂加工乳                              100%
【０２０４】
細菌試料9:
全脂加工乳中のアガラクチア菌/cfu/mL
a)約10^6; b)約10^3;
【０２０５】
細菌試料10:
尿中の大腸菌/cfu/mL
a)10^7; b)10^5; c)10^3
【０２０６】
細菌試料11:
尿中のストレプトコッカス・ウベリス/cfu/mL
a)10^7; b)10^5; c)10^3
【０２０７】
細菌試料12:
トリプティックソイブロス中の表皮ブドウ球菌/cfu/mL
a)10^7; b)10^5
【０２０８】
3.ウシ乳腺炎由来の臨床細菌試料
試料ID:1〜8は、ニュージーランド南島の農場から得た。
【０２０９】
4.組成物
組成物1:(%w/v)
マッコンキーブロス原液                  9.9875%
フェノールレッド                        0.0125%
【０２１０】
【表１】
2018507712.tif 000003
【０２１１】
組成物3(%w/v)
トリプティックソイブロス                99.96%
ブロモクレゾールパープル                0.04%
【０２１２】
【表２】
2018507712.tif 000004
【０２１３】
組成物5(%v/v)
ジオリッティカントーニブロス            98.77%
1%w/v亜テルル酸カリウム溶液            1.23%
【０２１４】
組成物6(%v/v)
ジオリッティカントーニブロス            98.0%
1%w/v亜テルル酸カリウム溶液            2.0%
【０２１５】
組成物7(%v/v)
ジオリッティカントーニブロス            83.33%
1%w/v亜テルル酸カリウム溶液            16.67%
【０２１６】
組成物8(%v/v)
ジオリッティカントーニブロス            88.89%
1%w/v亜テルル酸カリウム溶液            11.11%
【０２１７】
組成物9(%v/v)
マンニット食塩ブロス                    98.77%
1%w/v亜テルル酸カリウム溶液            1.23%
【０２１８】
組成物10(%v/v)
マンニット食塩ブロス                    93.02%
0.1%w/v亜テルル酸カリウム溶液          6.98%
【０２１９】
組成物11(%v/v)
マンニット食塩ブロス                    100%
【０２２０】
組成物12(%v/v)
マンニット食塩ブロス                    49.385%
蒸留水                                  49.385%
1%w/v亜テルル酸カリウム溶液            1.23%
【０２２１】
組成物13(%v/v)
マンニット食塩ブロス                    50%
蒸留水                                  50%
【０２２２】
組成物14(%w/v)
マンニット食塩ブロス                    98.75%
ラクトース                              1.25%
【０２２３】
組成物15(%w/v)
トリプティックソイブロス                96.362%
フェノールレッド                        0.025%
1%w/v亜テルル酸カリウム溶液            3.614%
【０２２４】
組成物16(%w/v)
トリプティックソイブロス                96.374%
フェノールレッド                        0.0125%
1%w/v亜テルル酸カリウム溶液            3.614%
【０２２５】
組成物17(%w/v)
トリプティックソイブロス                93.0%
フェノールレッド                        0.023%
1%w/v亜テルル酸カリウム溶液            6.977%
【０２２６】
組成物18(%w/v)
トリプティックソイブロス                99.625%
エスクリン                              0.25%
クエン酸鉄アンモニウム                  0.125%
【０２２７】
組成物19(%w/v)
マッコンキーブロス                      99.975
フェノールレッド                        0.025%
【０２２８】
組成物20(%v/v)
ジオリッティカントーニブロス基礎培地    93.82%
1%w/v亜テルル酸カリウム溶液            6.18%
【０２２９】
組成物21(%v/v)
マンニット食塩ブロス                    75.0%
0.1%w/v亜テルル酸カリウム溶液           6.56%
10%w/v塩化リチウム溶液                 6.25%
10%w/vグリシン溶液                     1.5%
蒸留水                                  10.69%
【０２３０】
組成物22(%w/v)
トリプティックソイブロス                99.625%
エスクリン                              0.5%
クエン酸鉄アンモニウム                  0.25%
【０２３１】
組成物23(%w/v)
マッコンキーブロス                      98.98%
フェノールレッド                        0.02%
クロキサシリンナトリウム                1.0%
【０２３２】
組成物24(%w/v)
トリプティックソイブロス                99.98%
フェノールレッド                        0.02%
【０２３３】
組成物25(%w/v)
トリプティックソイブロス                98.56%
エスクリン                              0.22%
クエン酸鉄アンモニウム                  0.11%
1%w/vゲンタマイシン                    1.11%
【０２３４】
組成物26(%w/v)
ミューラーヒントンブロス                99.9875%
フェノールレッド                        0.0125%
【０２３５】
組成物27(%w/v)
トリプティックソイブロス                99.2375%
エスクリン                              0.5%
クエン酸鉄アンモニウム                  0.25%
フェノールレッド                        0.0125%
【０２３６】
【表３】
2018507712.tif 000005
【０２３７】
組成物29〜54はTable 90(表104)に記載されている。
【０２３８】
【表４】
2018507712.tif 000006
【０２３９】
(実施例2)
抗生物質感受性試験
1.試験の開発に基づく予備実験及び評価
本実施例において、以下の略語を使用する:McC=マッコンキーブロス;TSB=トリプティックソイブロス。
【０２４０】
フェノールレッドを添加したマッコンキーブロス(大腸菌群細菌の濃縮培地)中の大腸菌を含むグラム陰性菌;マッコンキーブロスは、乳汁及び水中の大腸菌群細菌を検出するために使用される。
【０２４１】
マッコンキーブロスの処方g/L
ゼラチンの酵素消化物                    20g
ラクトース                              10g
ウシ胆汁                                5g
ブロモクレゾールパープル                0.01g
【０２４２】
大腸菌を含むグラム陰性菌が過剰量のフェノールレッドを添加したマッコンキーブロス中で増殖すれば、予想されるように、色は当初の赤から細菌の増殖により黄に変化する。重要なことに、黄色は、最大48時間残る。以下のTable 1(表5)を参照されたい。
【０２４３】
Table 2a(表6)は、抗生物質感受性試験にとって必要な一般的な濃縮培地中で増殖する大腸菌を示す。結果は、フェノールレッド濃度が増加すると、赤の強度が増加して、反応色である黄が増加する(データは示していない)ことを証明している。単純にするために、本明細書において記述される結果は、単純に赤又は黄で示す。しかし、色の変化に関連する動力学を測定することができる。後述を参照されたい。
【０２４４】
予想されるように、大腸菌は一般的な濃縮培地中で増殖する場合、赤から黄への色の変化が起こる。しかし、色の変化は安定ではなく、約11.5時間後には黄からオレンジ/赤へと劣化する。T=0及びT=24での赤の色合いに何らかの識別可能な差が存在しうるが、これは望ましくない。更に、多くの呈色pH指示薬の細菌増殖阻害効果を考慮すると、そのような理由のためにより多くの(例えば)フェノールレッドを試験に単純に添加することもまた望ましくない。これを、黄色ブドウ球菌及びストレプトコッカス・ウベリスの増殖をフェノールレッドの増加濃度の関数として調べたTable 2b(表7)及びTable 2c(表8)に例証する。
【０２４５】
重要なことに、比色測定試験の成功は、試料採取期間を通して残っている安定な色の変化に依存する。細菌同定及び/又は抗生物質感受性試験の場合、約24時間の試料採取期間が望ましい。
【０２４６】
本発明は、呈色pH指示薬の可能性がある阻害効果を抑制する1つ又は複数の安定化剤を含めることを通して、これらの制限を克服する。そのため、呈色pH指示薬(例えば、フェノールレッド)の増加濃度を試験に使用し、それによって細菌増殖に関連する色の変化の安定性を得てもよい。本発明に従う安定化剤の例は乳汁である。
【０２４７】
2.抗生物質感受性試験
本実施例において、細菌感染症を処置するための抗菌剤の選択の決定を支持するために、感受性がある抗菌剤の早期且つ容易な同定を可能にする液体培養培地を使用する。液体培地はまた、臨床試料に存在するグラム陽性及び/又はグラム陰性菌等の細菌の検出を可能にし、及び/又は色の変化の動力学分析から接種量の推定を可能にする。この液体培養培地の基礎は、汎用液体濃縮培地、例えばトリプティックソイブロス(ダイズ-カゼイン消化物培地)であるが、ミューラーヒントンブロスでもありうる。このTSB培地は、フェノールレッド及び/又はブロモクレゾールパープル等のpH指示薬の過剰濃度と乳汁とを有する。次いでそのような培養培地を、生乳、尿、便、血液、喀痰、又は他のタイプの綿棒採取試料等の、ヒト又は動物からの臨床試料と混合する。臨床試料が乳汁試料である場合、追加の乳汁は必要ではない。比色測定分析を、肉眼で、又は光学リーダー、例えばCCDカメラチップ若しくは光ダイオードによって実施することができる。
【０２４８】
以下の表において、試験した試料中の細菌のおおよその接種量を示す。例えば、10^6、10^7、及び10^8。当業者は、10^8の接種量が概算であり、非限定的な例として7.6×10^7又は8.4×10^8を表しうることを認識するであろう。
【０２４９】
【表５】
2018507712.tif 000007
【０２５０】
【表６】
2018507712.tif 000008
【０２５１】
【表７】
2018507712.tif 000009
【０２５２】
【表８】
2018507712.tif 000010
【０２５３】
【表９】
2018507712.tif 000011
【０２５４】
【表１０】
2018507712.tif 000012
【０２５５】
【表１１】
2018507712.tif 000013
【０２５６】
【表１２】
2018507712.tif 000014
【０２５７】
【表１３】
2018507712.tif 000015
【０２５８】
【表１４】
2018507712.tif 000016
【０２５９】
色の変化が起こる場合、これは徐々に起こり、これをモニタリングすることができる。色の変化の開始点は、接種量に依存する。このため、動力学による色の変化の曲線を経時的に決定し、推定される初回接種量を計算することができる。
【０２６０】
安定化剤の存在下では、フェノールレッドを、安定化剤としての乳汁又は粉乳と組み合わせて35μg/ml〜3000μg/ml、50μg/ml〜1000μg/ml、特に100μg/ml〜500μg/mlの濃度で含めてもよい。
【０２６１】
以下に概要する抗生物質感受性試験の例に従って、試験を(臨床)試料を使用して最大24時間実施した。
【０２６２】
以下の実施例に含まれる安定化剤は、加工乳(暗青色の上部)であり、したがって、白色を有した。
【０２６３】
Table 3(表9)は、80μlのMcC/20μlの乳汁中の大腸菌を示す;接種量はcfu/ml乳汁を指す。予想されるように、Table 3(表9)の結果はTable 1(表5)の結果と一致する。
【０２６４】
Table 4a(表10)は、80μlのTSB/20μlの乳汁中の大腸菌を示す;接種量はcfu/ml乳汁を指す。意外にも、Table 4a(表10)の結果は、色の変化にフェノールレッド濃度が実質的に影響を及ぼさないことを示す(7時間及び接種量10^3cfu/mlを除く)。色の変化は、11.5時間から23.5時間の間で一定のままであり、これは、フェノールレッドが過剰量であったにもかかわらず、重要な期間である。これは、Table 2a(表6)のデータと比較すると予想外であり、フェノールレッドの増加濃度の阻害効果の抑制における乳汁の安定化効果を示す。
【０２６５】
意外にも、Table 4b(表11)の結果は、23.5時間で異なるフェノールレッド濃度の存在下で黄色ブドウ球菌が阻害されなかったことを示している。これより前の時点では、0.25mg/ml及びそれ超のフェノールレッド濃度のいくつかの例は、色の反応のわずかな遅れを示す。この場合も、これらの結果は、Table 2b(表7)のデータと比較すると予想外である。
【０２６６】
同様に、Table 4c(表12)は、ストレプトコッカス・ウベリスの増殖が、異なるフェノールレッド濃度とは無関係であることを示している。この場合も、これらの結果は、Table 2c(表8)のデータと比較すると予想外である。
【０２６７】
Table 4d(表13)に示されるように、コアグラーゼ陰性菌である表皮ブドウ球菌についても同じ結果が得られる。
【０２６８】
Table 4e(表14)に示されるように、過剰濃度のブロモクレゾールパープルは、調べた全ての接種量に対してストレプトコッカス・ウベリスの増殖を阻害しない。興味深いことに、マッコンキーブロス等の典型的な濃縮培地中のブロモクレゾールパープルの典型的な濃度は約40倍低い次数である。
【０２６９】
まとめると、意外にもこれらのデータは、呈色pH指示薬の増加濃度を使用して観察された増殖阻害効果が、安定化剤、例えば乳汁の存在下で抑制されうることを示している。したがって、呈色pH指示薬の増加濃度は、1つ又は複数の抗菌剤に対する細菌の感受性を評価する目的のために強力な比色測定試験を提供するために使用されうる。
【０２７０】
(実施例3)
臨床試料中のD群連鎖球菌の同定
エスクリン寒天培地又はエスクリンブロス又は他の典型的なエスクリン含有培養培地は、エスクリンを単独で又はクエン酸第二鉄との組合せで含有する。この培地は、それらのエスクリンの加水分解能に基づく細菌の培養及び識別のために使用することができる。本発明に従うエスクリン寒天培地又はブロスの例としての組成物には:
【０２７１】
エスクリン寒天培地
1リットルあたりの組成:
寒天                                    15.0g
カゼインの膵臓消化物                    13.0g
NaCl                                    5.0g
酵母エキス                               5.0g
心筋、注入液からの固体                   2.0g
エスクリン                               1.0g
クエン酸第二鉄                           0.5g
【０２７２】
エスクリンアザイドブロス
1リットルあたりの組成:
動物組織のペプシン消化物                20.0g
酵母エキス                              5.0g
胆汁酸塩                                10.0g
クエン酸ナトリウム                      1.0g
エスクリン                              1.0g
クエン酸鉄アンモニウム                  0.5g
アジ化ナトリウム                        0.25g
最終pH(25℃で)7.2±0.2
【０２７３】
D群連鎖球菌、例えばストレプトコッカス・ウベリスは、エスクリンをエスクレチン及びデキストロースへと加水分解し、これはクエン酸第二鉄と反応して培養培地の茶/黒色化を生じる。濃縮培地に存在する典型的なエスクリン濃度は、クエン酸第二鉄に関して0.1%及び0.05%である。本実施例の文脈において、クエン酸第二鉄は、ここではクエン酸鉄アンモニウムを意味するが、他の形態を使用してもよい。
【０２７４】
しかし、より高濃度のエスクリン及び/又はクエン酸第二鉄は、細菌増殖の阻害を引き起こしうる。この点を例証するために、D群連鎖球菌、特にストレプトコッカス・ウベリスを、(i)0.1%エスクリン及び0.05%クエン酸第二鉄、(ii)1.0%エスクリン及び0.5%クエン酸第二鉄、(iii)2.0%エスクリン及び1.0%クエン酸第二鉄、並びに(iv)5.0%エスクリン及び2.5%クエン酸第二鉄の存在下、トリプティックソイブロス中で増殖させた。簡単に説明すると、ストレプトコッカス・ウベリスをトリプティックソイブロス(TSB)中に分散させ、増殖させ、次いでTable 5(表15)に示すように20μlの希釈液を、エスクリン及びクエン酸第二鉄濃度を含有する100μlのTSBと混合した(約10^6及び約10^4cfu/mlの接種量で)。最初のストレプトコッカス・ウベリスのエスクリン/クエン酸第二鉄培地の色は透明な黄であった。約16時間及び約48時間後に色をチェックした。結果をTable 5(表15)に要約する。
【０２７５】
【表１５】
2018507712.tif 000017
【０２７６】
これらのデータは、ストレプトコッカス・ウベリス増殖の阻害が、TSBを含む濃縮培地中で0.1%エスクリン及び0.05%クエン酸第二鉄、並びに1.0%エスクリン及び0.5%クエン酸第二鉄であることを示している。
【０２７７】
しかし、臨床試料は、感染症(例えば、D群連鎖球菌による感染)によって引き起こされる強いバックグラウンド色を呈しうることから、臨床試料について同じアプローチを使用することには限界がある。言い換えれば、エスクリン及びクエン酸第二鉄の存在下でのD群連鎖球菌によって産生される黒/茶の沈殿物の検出は、臨床試料に関連するバックグラウンド色によって隠されうる。
【０２７８】
Table 5(表15)に示される結果に基づくと、これらの分析物の増殖阻害効果により、沈殿物の検出を増加させるために、試料中のエスクリン(すなわち、>1.0%)及びクエン酸第二鉄(すなわち、>0.5%)の濃度を単に増加させることは可能ではない。
【０２７９】
意外にも、本出願人は、安定化剤(例えば、乳汁)を含めることが、著しく増加した濃度のエスクリン及びクエン酸第二鉄の増殖阻害効果を抑制することができることを発見した。
【０２８０】
例として、今回に限り、乳腺炎に感染していることが疑われるウシ動物から得た臨床乳汁試料を使用して、上記と同じ実験を実施した。
【０２８１】
「白」であるように見えた臨床乳汁試料に関しても、本出願人らは、ストレプトコッカス・ウベリスを乳汁試料にスパイクすることによって有用な結果を得る試みにもかかわらず(データは示していない)、低濃度のエスクリン及びクエン酸第二鉄(すなわち、0.1%エスクリン及び0.05%クエン酸第二鉄)を含むTSBを使用して得た同じ結果と比較すると、呈色反応が弱いことを観察した。
【０２８２】
しかし、本出願人らは、増加量のエスクリン及びクエン酸第二鉄を、乳汁由来臨床試料に使用できることを発見した。例えば、少なくとも2%エスクリン及び1%クエン酸第二鉄の濃度では、ストレプトコッカス・ウベリスの増殖は阻害されない。培養培地の黒色化の形成(上記の化学の記述を参照されたい)を参照することによって、これらのデータをTable 6(表16)に示す。これらのデータをTSBの存在下で実施した類似の実験(Table 5(表15))と対比させる。
【０２８３】
したがって、本出願人は、乳汁の成分が、エスクリン及びクエン酸第二鉄の増殖阻害特性を抑制し、それによって、D群連鎖球菌の存在下で培養培地の黒色化の形成を安定化させることを意外にも発見した。したがって、D群連鎖球菌の同定は、たとえ臨床試料がそれに関連する有意なバックグラウンド色を有する場合であっても可能である。
【０２８４】
上記の実験において、試験される臨床試料は、乳腺炎に感染していることが疑われるウシ動物から得た乳汁であったことに注目されたい。非乳汁の臨床試料を試験する場合、本発明に従って使用される高濃度のエスクリン及びクエン酸第二鉄の増殖阻害効果を抑制するためには、安定化剤(例えば、液体又は粉末型の乳汁)を含めることが必要であろう。
【０２８５】
【表１６】
2018507712.tif 000018
【０２８６】
本出願人らは、0.5%エスクリン及び0.25%クエン酸第二鉄を含有するTSBと、同様に100μg/ml濃度のアズトレオナム(大腸菌等の多くのグラム陰性菌に対して活性を有する抗生物質)を含有するストレプトコッカス・ウベリスをスパイクした80μlの乳汁試料、並びに/又は0.5mg/mlフェノールレッドとの組合せにより、容易に検出可能な色の変化が得られることを更に発見した。フェノールレッド又はアズトレオナムによるストレプトコッカス・ウベリスの阻害は検出されなかった。
【０２８７】
(実施例4)
臨床試料におけるブドウ球菌の同定(識別及び選択性)
コアグラーゼ陽性菌とコアグラーゼ陰性ブドウ球菌とを識別することがしばしば望ましい。ブドウ球菌のコアグラーゼのタイプを知っていることは、処置の決定に影響を及ぼしうる。
【０２８８】
従来、コアグラーゼ陽性菌と陰性ブドウ球菌との識別は、細胞外ブドウ球菌コアグラーゼを検出する試験管でのコアグラーゼ試験、又は細菌細胞表面に存在するクランピング因子(結合したコアグラーゼ)を検出するスライドガラスでのコアグラーゼ試験によって行われてきた。
【０２８９】
或いは、BBL(商標)Staphyloslide(商標)ラテックス試験は、黄色ブドウ球菌に通常存在するクランピング因子及び/又はプロテインAを保有するブドウ球菌を、これらの特性を保有しないブドウ球菌と識別するためのラテックススライドガラス凝集試験である。
【０２９０】
BBL(商標)Staphyloslide(商標)ラテックス試験は、ヒトフィブリノゲン及びIgGをコーティングしたブルーラテックス粒子からなる。ラテックス試薬を、クランピング因子又はプロテインAが存在するブドウ球菌のコロニーと混合すると、架橋が形成されて、ラテックス粒子の目に見える凝集が起こる。そのような凝集は特に黄色ブドウ球菌で起こる。クランピング因子又はプロテインAのいずれも存在しない場合、凝集は起こらず、結果は陰性と見なされる。ブドウ球菌の最も頻繁なコアグラーゼ及びプロテインA陰性単離体は、表皮ブドウ球菌である。
【０２９１】
これらのコアグラーゼ試験(スライドガラス、試験管及びラテックス粒子)は、寒天プレート上での試料の培養を必要とする。
【０２９２】
マンニット食塩ブロス(MSB;実施例1の例を参照されたい)は、推定病原性のブドウ球菌を単離するための選択培地である。他の細菌のほとんどが塩化ナトリウムの高濃度によって阻害される。
【０２９３】
MSBは、増殖にとって必須の窒素、ビタミン、ミネラル、及びアミノ酸を提供するペプトンを含む。MSBはその名前から示唆されるように、炭水化物エネルギー源であるマンニトールも含む。塩化ナトリウムは、輸送及び浸透圧バランスにとって必須の電解質を供給する。細菌によるマンニトールの分解により、酸性化産物を生じ、これをpH指示薬の存在下で検出することができる。フェノールレッドの場合、酸性化産物の産生は、赤から黄への色の変化を引き起こす。これは、35±2℃で18〜24時間実施した以下の増殖阻害アッセイによって48時間後に証明される。
【０２９４】
【表１７】
2018507712.tif 000019
【０２９５】
表皮ブドウ球菌は、グルコース、フルクトース、マルトース、スクロース、及びグリセロールから好気的に酸を産生し、株の70〜90%がガラクトース、マンノース、及びラクトースから好気的に酸を産生することが公知である。マンニトール、トレハロース、ラムノース、キシロース、又はアラビノースからは酸は産生されない(Parisi (1985) Microbiological Reviews 49(2):126-139)。
【０２９６】
同様に、マンニット食塩培地が、ブドウ球菌を選択的に増殖させるために使用することができ、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌)と、表皮ブドウ球菌等のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌(CNS)とを識別するために使用することができることも公知である。問題は、乳汁がラクトース(平均で4〜5%)を含有するウシ乳腺炎の場合であり、したがってCNSも同様に、MSBにおいて酸を産生することができ、黄への色の変化が起こる。このため、乳汁試料に関しては、マンニット食塩培地ではコアグラーゼ陽性ブドウ球菌と陰性ブドウ球菌の識別ができない。
【０２９７】
或いは、ベアードパーカー寒天培地(例としての処方に関しては実施例1を参照されたい)が食物中の黄色ブドウ球菌の検出及び列挙のために使用される。培地の選択性は、塩化リチウム及び1%亜テルル酸カリウムによるものであり、ブドウ球菌以外の生物の増殖を抑制する。コアグラーゼ陽性ブドウ球菌の識別は、亜テルル酸カリウムと卵黄乳剤に基づく。レシチナーゼを含有するブドウ球菌は、卵黄を分解して、コロニー周囲に透明域を形成する。不透明な沈殿域はリパーゼ活性により形成されうる。亜テルル酸カリウムの低減は、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌の特徴であり、コロニーの黒色化を引き起こす。寒天は固化剤である。
【０２９８】
ベアードパーカー寒天培地は、溶液中に約1%亜テルル酸塩を含有する。予想される増殖の転帰は以下のとおりである:
【０２９９】
【表１８】
2018507712.tif 000020
【０３００】
これらのデータは、ベアードパーカー寒天培地を使用することによるコアグラーゼ陽性ブドウ球菌とコアグラーゼ陰性ブドウ球菌との識別が信頼できないことを証明している。
【０３０１】
或いは、ジオリッティカントーニブロス基礎培地が、単離技法の際に食物からの黄色ブドウ球菌の濃縮のために使用される。塩化リチウムは、グラム陰性桿菌を阻害する。グリシンと組み合わせた亜テルル酸カリウムは、ブドウ球菌以外のグラム陽性菌を阻害する。
【０３０２】
1.05ml又は食肉製品を試験する場合には0.105mlの1%亜テルル酸塩溶液を、19mlのジオリッティカントーニブロス基礎培地(GC)に添加する。次いで、典型的には1g又は1mlの試料を19mlのジオリッティカントーニ/亜テルル酸塩ブロスに添加する。これにより、GC中の亜テルル酸塩溶液濃度は典型的には5%〜0.5%となる。試料濃度はジオリッティカントーニブロス中で約5%である。
【０３０３】
【表１９】
2018507712.tif 000021
【０３０４】
予想される結果
試験管を培地の黒色化(陽性反応)又は黒色化なし(陰性反応)に関して読み取る。黒色化が起こる場合、黄色ブドウ球菌の単離を確認するためにベアードパーカー寒天培地で副次培養する。
【０３０５】
表皮ブドウ球菌がジオリッティ/カントーニ/亜テルル酸塩ブロスにおいてどのように挙動するか指標はない。これはベアードパーカー寒天培地での副次培養が推奨されていることから、ベアードパーカーブロスと差がないと予想すべきである。
【０３０６】
これらの上記の培地のいずれも、ブドウ球菌に関して単独で、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌と陰性ブドウ球菌と(黄色ブドウ球菌対CNS)の迅速且つ容易な識別を行うための所望の溶液とはならない。
【０３０７】
1%亜テルル酸カリウム溶液は通常、
・  ベアードパーカー培地に約1%で添加され
・  ジオリッティカントーニでは0.5%〜5%の範囲である。
【０３０８】
ブドウ球菌実験の定義:
黒は、バイアル/ウェルの底に蓄積した黒色沈殿を意味する。
SA:黄色ブドウ球菌(コアグラーゼ陽性);SE:表皮ブドウ球菌(コアグラーゼ陰性)
示していない限り、1%亜テルル酸塩溶液
【０３０９】
【表２０】
2018507712.tif 000022
【０３１０】
【表２１】
2018507712.tif 000023
【０３１１】
Table 7(表20)の結果は、コアグラーゼ陽性及び陰性ブドウ球菌がインキュベーション後に黒色沈殿を形成することを証明する。これは当技術分野での知識を考慮すると予想外ではない。
【０３１２】
Table 8(表21)の結果は、亜テルル酸塩溶液濃度を増加させる(1%又は10%)効果を示す。ジオリッティカントーニ(GC)ブロス及び細菌試料を50/50で混合した。10%亜テルル酸塩溶液でさえもコアグラーゼ陰性ブドウ球菌(SE)の培地の黒色化を抑制することはできなかった。
【０３１３】
典型的には、GC培地は食品に適用され、コアグラーゼ陽性菌と陰性菌とを区別するために臨床試料にこの培地を適用することは、当然なことではない。
【０３１４】
上記の知識にもかかわらず、亜テルル酸塩を使用して、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌とコアグラーゼ陰性ブドウ球菌とを識別できることが意外にも見出された。
【０３１５】
接種量が10^7cfu/mlを超えない場合、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌)とコアグラーゼ陰性ブドウ球菌(表皮ブドウ球菌)とを識別することができる3つの培地が同定された。黄色ブドウ球菌の濃縮が達成され、同時に表皮ブドウ球菌が抑制された:
1.ジオリッティカントーニ+亜テルル酸塩溶液+細菌試料(80μl+10μl+20μl)
2.マンニット食塩ブロス+亜テルル酸塩溶液+細菌試料(80μl+1μl+20μl)
3.トリプティックソイブロス+過剰量のフェノールレッド+3〜6μlの亜テルル酸塩溶液
色の変化を伴う表皮ブドウ球菌の濃縮は、以下により達成された
4.マンニット食塩ブロス+細菌乳汁試料(80μl+20μl)、原則的に表皮ブドウ球菌が酸を産生することができるラクトース等の任意の炭水化物源
新規組合せ(2バイアル/ウェル)
-  1+4;
-  2+4;
-  3+4;
【０３１６】
特異的実施例
ジオリッティカントーニ亜テルル酸塩ブロス
意外にも、ジオリッティカントーニブロス、亜テルル酸塩溶液、及び細菌試料を8:1:2の割合で混合すると、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌とコアグラーゼ陰性ブドウ球菌との識別が可能であることが見出された(細菌試料中の接種量が10^7cfu/mlに等しい又はそれ未満の場合)(Table 9(表22)及びTable 10(表23))。このため、そのような又は類似の培地によって、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌(例えば、黄色ブドウ球菌)を同定することができ、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌(CNS)を抑制する。臨床細菌試料は通常10^8cfu/ml未満を含有する。
【０３１７】
黒色化が起これば、黒色沈殿の量は時間と共に徐々に増加して、顕著な黒色沈殿の開始時間は接種量及び較正(経時的な黒色沈殿の発生)に依存して、臨床試料中の初回接種量の推定が可能となる。
【０３１８】
【表２２】
2018507712.tif 000024
【０３１９】
【表２３】
2018507712.tif 000025
【０３２０】
マンニット食塩/亜テルル酸塩ブロス
【０３２１】
【表２４】
2018507712.tif 000026
【０３２２】
【表２５】
2018507712.tif 000027
【０３２３】
【表２６】
2018507712.tif 000028
【０３２４】
【表２７】
2018507712.tif 000029
【０３２５】
意外にも、MSB又はMSB/H2O混合物中の約1μlの亜テルル酸塩であっても、接種量が10^8〜10^6cfu/ml又はそれ未満の量であれば、少なくとも24時間の期間で表皮ブドウ球菌の濃縮を抑制することが見出された。亜テルル酸塩が存在しない場合、表皮ブドウ球菌の濃縮が起こり、このため色が変化する(ラクトースが乳汁中に存在する)(対照)。黄色ブドウ球菌は1%亜テルル酸塩溶液の存在下で濃縮され、黒色沈殿を形成した。これはコアグラーゼ陽性ブドウ球菌を同定する新規方法である。
【０３２６】
0.6μlの亜テルル酸塩溶液でも、妥当な結果が得られるが、ボーダーラインぎりぎりである。約1μl亜テルル酸塩溶液が好ましい。ラクトースを含有する乳汁、又は純粋なラクトース、又は表皮ブドウ球菌に酸を産生させる他の炭水化物源が存在する場合、色の変化を伴う濃縮が起こる。これは本発明者にとって望ましい。その結果、特許請求の範囲はまた、ウェル1が少なくともMSB/亜テルル酸塩溶液と細菌試料とを含有し、ウェル2がMSB/乳汁及び/又はラクトース及び/又はコアグラーゼ陰性ブドウ球菌に酸を産生させる他の炭水化物源と、細菌試料とを含有する、ウェルの組合せも含むべきである。このウェルの組合せによって、臨床試料のコアグラーゼ陽性又は陰性の同定が可能となる。初回接種量の推定も同様に可能である。同じ原理をGCの章で記述する。
【０３２７】
トリプティックソイブロス/フェノールレッド/亜テルル酸塩ブロス
【０３２８】
【表２８】
2018507712.tif 000030
【０３２９】
【表２９】
2018507712.tif 000031
【０３３０】
【表３０】
2018507712.tif 000032
【０３３１】
意外にも、3μl又は6μlの亜テルル酸塩溶液と組み合わせた、TSBと過剰量のフェノールレッド、例えば0.125mg/ml又はそれ超の組合せが、最大48時間の培養時間で表皮ブドウ球菌(CNS)の濃縮を抑制することができるが、同時に黄色ブドウ球菌を濃縮し、それによって色の変化を伴う黒色沈殿を生じることが見出された。初回接種量の推定も同様に可能である。
【０３３２】
(実施例5)
細菌の同定
Table 18(表31)及びTable 19(表32)の略語:
GC10%T
80μlのジオリッティカントーニ基礎ブロス+10μlの亜テルル酸塩溶液+20μlの乳汁中の細菌
MSB
80μlのマンニット食塩ブロス+20μlの乳汁中の細菌
TSB/Fer/FerCit
0.25%エスクリン及び0.125%クエン酸鉄アンモニウムを含有する80μlのトリプティックソイブロス+20μlの乳汁中の細菌
McC/PR0.25mg/ml
0.025%フェノールレッドを含有する80μlのマッコンキーブロス(原液)+20μlの乳汁中の細菌
TSB/PR0.25mg/ml
0.025%フェノールレッドを含有する80μlのトリプティックソイブロス+20μlの乳汁中の細菌
TSB/PR0.125mg/ml
0.0125%フェノールレッドを含有する80μlのトリプティックソイブロス+20μlの乳汁中の細菌
TSB/PR0.05mg/ml
0.005%フェノールレッドを含有する80μlのトリプティックソイブロス+20μlの乳汁中の細菌
黒/白
黒色沈殿及び白色培地
黒/黄
黒色沈殿及び黄色培地
灰/ピンク
灰色沈殿及びピンク色培地
【０３３３】
乳汁中の細菌は10^4cfu/ml及び10^6cfu/mlであった。Table 18(表31)及びTable 19(表32)は、t=0時間及びt=24時間のインキュベーションでの各ウェルの色を示す。GC10%Tは、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌)の選択的及び識別的培地である。両方の細菌濃度で黄色ブドウ球菌のみが黒色沈殿を示した。GC10%T中では他の全ての細菌(表皮ブドウ球菌、大腸菌、及びストレプトコッカス・ウベリス)が、黒色沈殿を有しなかった。MSBは、ブドウ球菌に関する選択培地である。黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌の培地はいずれもt=24時間で黄への色の変化を示した。大腸菌及びストレプトコッカス・ウベリスの培地はピンク色のままであった。細菌の1つが臨床試料に存在する場合、GC10%TとMSBとの組合せによって、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌とコアグラーゼ陰性ブドウ球菌とを区別することができる。GC10%Tが黒色沈殿を有しない白色で、MSBが黄色である場合、臨床試料はコアグラーゼ陰性ブドウ球菌を含有する。GC10%Tが黒色沈殿を有し、MSBが黄色である場合、臨床試料はコアグラーゼ陽性ブドウ球菌を含有する。TSB/Esc/FerCitは、ストレプトコッカス・ウベリスが属するD群連鎖球菌の選択培地である。ストレプトコッカス・ウベリスのみがこの培地を24時間後に黒色にした。調べた他の全ての細菌(黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、大腸菌)は、t=24時間でD群連鎖球菌培地の色を変化させなかった。McC/PR0.25mg/mlは、大腸菌群細菌の選択培地である。大腸菌のみがt=24時間で培地の色を変化させた。調べた他の全ての細菌(黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、ストレプトコッカス・ウベリス)は、t=24時間で大腸菌群濃縮培地の色を変化させなかった。汎用濃縮培地TSB/PR0.25mg/ml、TSB/PR0.125mg/ml、及びTSB/PF0.05mg/mlは、調べた4つ全ての細菌に関してt=24時間で色を変化させた。
【０３３４】
汎用、選択、及び識別培地のこの組合せによって、D群連鎖球菌、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌及びコアグラーゼ陰性ブドウ球菌、並びに大腸菌群細菌、並びに任意の他の細菌(特定していない)の同定が可能である。
【０３３５】
【表３１】
2018507712.tif 000033
【０３３６】
【表３２】
2018507712.tif 000034
【０３３７】
Table 20(表33)の略語:
GC5.25%T
80μlのジオリッティカントーニ基礎ブロス+5.25μlの亜テルル酸塩溶液+20μlの乳汁中の細菌
MSB2-0.5%T
60μlのMSB+5.25μlの亜テルル酸塩溶液(0.1%)+5μlのLiCl+1.2μlのグリシン+8.55μlのH2O+20μlの乳汁中の細菌
TSB/Fer/FerCit2
0.5%エスクリン及び0.25%クエン酸鉄アンモニウムを含有する80μlのトリプティックソイブロス+20μlの乳汁中の細菌
McCCLXPR0.2mg/ml
0.02%フェノールレッド及びナトリウム塩としての1%クロキサシリンを含有する80μlのマッコンキーブロス(原液)+20μlの乳汁中の細菌
TSB/PR0.2mg/ml
0.02%フェノールレッドを含有する80μlのトリプティックソイブロス+20μlの乳汁中の細菌
【０３３８】
アガラクチア菌(B群連鎖球菌)のインキュベーションは、24時間のインキュベーション後に、調べた選択又は識別濃縮培地(GC5.25%T、MSB2-0.5%T、TSB/Esc/FerCit2/McCCLXPR 0.2mg/ml)の色を変化させない。汎用濃縮培地(TSB/PR0.2mg/ml)のみが24時間のインキュベーション後に黄に変化した。
【０３３９】
【表３３】
2018507712.tif 000035
【０３４０】
(実施例6)
細菌の同定と抗菌剤感受性試験の組合せ
臨床ウシ乳腺炎乳汁試料をニュージーランド南島の獣医師の診療所から収集した。試料をフリーザー中で数カ月間保存し、凍結状態で試験施設に輸送した。本実施例において、用語「臨床」は、乳牛が乳房の感染症の臨床症状を有したこと、例えばウシが、他にも典型的な症状はあるが、中でも異常な凝固乳、腫脹した乳房を示したことを意味する。試験は、24ウェル(3×8ウェル)を含むマイクロウェルプレートで実施した。
【０３４１】
1.プレート構成番号1
各ウェルに関する濃縮培地の液体量をTable 21(表34)に記載する。加えて、臨床乳腺炎試料20μlを実験用ピペットで各ウェルに添加した。
【０３４２】
【表３４】
2018507712.tif 000036
【０３４３】
【表３５】
2018507712.tif 000037
【０３４４】
【表３６】
2018507712.tif 000038
【０３４５】
【表３７】
2018507712.tif 000039
【０３４６】
【表３８】
2018507712.tif 000040
【０３４７】
【表３９】
2018507712.tif 000041
【０３４８】
【表４０】
2018507712.tif 000042
【０３４９】
略語
1.80μl GC+10μl Tell:80μlのジオリッティカントーニ基礎ブロス+10μlの亜テルル酸塩溶液  (1%);
2.80μl TSB/Esc/Fer Cit:0.25%エスクリン及び0.125%クエン酸鉄アンモニウムを含有する80μlのトリプティックソイブロス;
3.80μl TSB/Esc/Fer Cit+10μl Genta:0.25%エスクリン及び0.125%クエン酸鉄アンモニウムを含有する80μlのトリプティックソイブロス+10μlの10mg/mlゲンタマイシン溶液;
4.80μl McC/PR25:0.0125%フェノールレッドを含有する80μlのマッコンキーブロス(原液);並びに
5.80μl TSB/PR25:0.0125%フェノールレッドを含有する80μlのトリプティックソイブロス。
【０３５０】
細菌の同定
縦列A〜C及び横列1及び2を細菌同定のために使用した。A1:コアグラーゼ陽性ブドウ球菌;A2:ブドウ球菌;B1:D群連鎖球菌;B2:D群連鎖球菌;C2:汎用濃縮培地(グラム陽性及びグラム陰性菌);C2:大腸菌群細菌。
【０３５１】
抗菌剤感受性試験
縦列A3〜A8:カリウム塩としてのベンジルペニシリンの連続希釈液。縦列B3〜B8:塩酸塩としてのセフチオフルの連続希釈液。縦列C3〜C8:ナトリウム塩としてのクロキサシリンの連続希釈液。抗生物質濃度を遊離型として4μg/ml〜0.05μg/mlの範囲で記載する。
【０３５２】
物質の最小発育阻止濃度(MIC)は、本明細書において2つのウェル(薬物濃度1での1つのウェルは赤のままであるが、薬物濃度2で他のウェルは黄であり、薬物濃度1が薬物濃度2より高い)の間で色の変化が起こる濃度として定義され、この場合MICは薬物濃度1の値である。
【０３５３】
Table 21(表34)は、マイクロウェルのプレート構成番号1を示す;薬物:カリウム塩としてのベンジルペニシリン;ナトリウム塩としてのクロキサシリン;塩酸塩としてのセフチオフル;各ウェル中の薬物濃度(A3〜C8)は、80μlの組成物+10μlの薬物溶液+20μlの臨床乳腺炎乳汁試料に基づき、μg/mlでの記載の薬物濃度に等しい;臨床ウシ乳腺炎乳汁試料20μlを各ウェルに添加した(A1〜C8)。
【０３５４】
Table 22(表35)は、試料ID 1、2、3、4(参照)に関する、インキュベーション前(t=0時間)の各ウェルに臨床乳腺炎試料を添加後の各ウェルにおける濃縮培地の色を示す。
【０３５５】
Table 23(表36)は、37℃で22時間インキュベーション後の試料ID1の各濃縮培地の色を示す。ウェルB1及びB2における濃縮培地は黒に変化して、C1は黄に変化した。ウェルA1、A2、C2では色は変化しない。このため、この臨床試料は、D群連鎖球菌を含有する。抗菌剤感受性試験は、ベンジルペニシリンに関して0.1μg/ml、セフチオフル及びクロキサシリンに関して0.5μg/mlのMICを示す。
【０３５６】
Table 24(表37)は、37℃で22時間インキュベーション後の試料ID2の各濃縮培地の色を示す。ウェルB1における濃縮培地は黒に変化し、C1は黄に変化した。ウェルA1、A2、B2、C2では色は変化しない。このため、この臨床試料は、D群連鎖球菌を含有する。抗菌剤感受性試験は、ベンジルペニシリンに関して>4μg/ml、セフチオフルに関して1μg/ml、及びクロキサシリンに関して0.5μg/mlのMICを示す。Table 25(表38)は、37℃で48時間インキュベーション後の試料ID2の各濃縮培地の色を示す。ウェルB2は黒色のままであったが、ウェルA1は黒色沈殿を有し、A2は黄に変化した。このため、この臨床試料は、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌を有する。ベンジルペニシリンが少なくとも4μg/mlまでの薬物濃度で感受性がないことから、ブドウ球菌はベータ-ラクタマーゼ産生ブドウ球菌である可能性がある。
【０３５７】
Table 26(表39)は、37℃で22時間インキュベーション後の試料ID3の各濃縮培地の色を示す。ウェルC1及びC2における濃縮培地は黄に変化した。ウェルA1、A2、B1、B2では色は変化しない。このため、この臨床試料は、大腸菌群細菌を含有する。抗菌剤感受性試験は、ベンジルペニシリン及びクロキサシリンに関して>4μg/ml、セフチオフルに関して1μg/mlのMICを示す。
【０３５８】
Table 27(表40)は、37℃で22時間インキュベーション後の試料ID4の各濃縮培地の色を示す。ウェルA1における濃縮培地は黒色沈殿を有し、A2、C1は黄に変化した。ウェルB1、B2、C2では色は変化しない。このため、この臨床試料は、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌を含有する。抗菌剤感受性試験は、ベンジルペニシリンに関して>4μg/ml、セフチオフルに関して1μg/ml、及びクロキサシリンに関して0.5μg/mlのMICを示す。ベンジルペニシリンが少なくとも4μg/mlまでの薬物濃度で感受性がないことから、ブドウ球菌はベータ-ラクタマーゼ産生ブドウ球菌である可能性がある。
【０３５９】
2.プレート構成番号2
各ウェルの濃縮培地の液体量をTable 28(表41)に記載する。加えて、各ウェルにトランスファーピペットで平均約35mgである臨床試料1滴を加えた。これは、臨床乳腺炎試料の添加前後でのウェルプレートを秤量することにより決定した。次いで、この質量を24に分けた。
【０３６０】
略語
1.80μl GC+10μl Tell:80μlのジオリッティカントーニ基礎ブロス+10μlの亜テルル酸塩溶液(1%);
2.80μl TSB/Esc/Fer Cit:0.25%エスクリン及び0.125%クエン酸鉄アンモニウムを含有する80μlのトリプティックソイブロス;
3.80μl TSB/Esc/Fer Cit+10μl Genta: 0.25%エスクリン及び0.125%クエン酸鉄アンモニウムを含有する80μlのトリプティックソイブロス+10μlの10mg/mlゲンタマイシン溶液;
4.80μl McC/PR25:0.0125%フェノールレッドを含有する80μlのマッコンキーブロス(原液);並びに
5.80μl TSB/PR25:0.0125%フェノールレッドを含有する80μlのトリプティックソイブロス。
【０３６１】
【表４１】
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【０３６２】
【表４２】
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【０３６３】
【表４３】
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【０３６４】
【表４４】
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【０３６５】
【表４５】
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【０３６６】
【表４６】
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【０３６７】
【表４７】
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【０３６８】
【表４８】
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【０３６９】
細菌の同定
縦列A〜C及び横列1及び2を細菌同定のために使用した。A1:コアグラーゼ陽性ブドウ球菌;A2:ブドウ球菌;B1:D群連鎖球菌;B2:-;C1:汎用濃縮培地(グラム陽性及びグラム陰性菌);C2:大腸菌群細菌。
【０３７０】
抗菌剤感受性試験
縦列A3〜A8:カリウム塩としてのベンジルペニシリンの連続希釈液。薬物濃度は遊離型として4μg/ml〜0.05μg/mlの範囲で示す。縦列B3〜B8:塩酸塩としてのセフチオフルの連続希釈液。薬物濃度は遊離型として4μg/ml〜0.05μg/mlの範囲で示す。縦列C3〜C8:ナトリウム塩としてのクロキサシリンの連続希釈液。薬物濃度は遊離型として4μg/ml〜0.05μg/mlの範囲で示す。
【０３７１】
Table 29(表42)は、試料ID5、6、7、8(参照)のインキュベーション前(t=0時間)の各ウェルに臨床乳腺炎試料を添加後の各ウェルにおける濃縮培地の色を示す。Table 30(表43)は、37℃で23時間インキュベーション後の試料ID5の各濃縮培地の色を示す。ウェルB1における濃縮培地は黒に変化して、C1は黄に変化した。ウェルA1、A2、C2では色は変化しない。このため、この臨床試料は、D群連鎖球菌を含有する。抗菌剤感受性試験は、ベンジルペニシリンに関して<0.05μg/ml、セフチオフル及びクロキサシリンに関して0.5μg/mlのMICを示す。
【０３７２】
Table 31(表44)は、37℃で23時間インキュベーション後の試料ID6の各濃縮培地の色を示す。ウェルC1及びC2における濃縮培地は黄に変化した。ウェルA1、A2、B1では色は変化しない。このため、この臨床試料は大腸菌群細菌を含有する。抗菌剤感受性試験は、ベンジルペニシリン及びクロキサシリンに関して>4μg/ml、セフチオフルに関して2μg/mlのMICを示す。
【０３７３】
Table 32(表45)は、37℃で23時間インキュベーション後の試料ID7の各濃縮培地の色を示す。ウェルA1における濃縮培地は黒色沈殿を有し、A2、C1は黄に変化した。ウェルB1、C2では色は変化しない。このため、この臨床試料は、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌を含有する。抗菌剤感受性試験は、ベンジルペニシリン及びクロキサシリン0.5μg/ml、セフチオフルに関して1μg/mlのMICを示す。
【０３７４】
Table 33(表46)は、37℃で23時間インキュベーション後の試料ID8の各濃縮培地の色を示す。ウェルB1における濃縮培地は黒に変化し、A2、C1は黄に変化した。ウェルA1、C2では色は変化しない。このため、この臨床試料は、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌とD群連鎖球菌とを含有する。抗菌剤感受性試験は、ベンジルペニシリンに関して<0.05μg/ml、セフチオフル及びクロキサシリンに関して0.5μg/mlのMICを示す。
【０３７５】
Table 34(表47)及びTable 35(表48)は、臨床試料ID3及び6に関してt=7時間、t=11時間、及びt=22〜23時間の時点で、37℃でインキュベーション後の各濃縮培地の色の変化を示す。両方の試料が大腸菌群細菌を含有する。各ウェルの参照の色をTable 22(表35)及びTable 29(表42)に示す。
【０３７６】
Table 34(表47)は、試料ID3に関して、7時間及び11時間インキュベーション後に、参照(t=0時間)と比較していかなる濃縮培地の色の変化も起こらないことを示す。22時間のインキュベーションでは、濃縮培地において色の変化が起こった(同様にTable 26(表39)及びその説明を参照されたい)。
【０３７７】
Table 35(表48)は、試料ID6に関して濃縮培地の色の変化が7時間で起こり、7時間と比較して11時間及び23時間で変化しないままであることを示している。Table 34(表47)及びTable 35(表48)の色の変化と比較すると、試料ID6が高い接種量を有し、試料ID3が低い接種量を有したことが示される。ウェルにおける色の連続的な試験、例えば毎時間又は15分毎の試験により、色の変化の開始点を決定することができる。例えば、経時的に濃縮培地において色を示す大腸菌の検量線により、臨床大腸菌試料の接種量を推定することができる。これは、他の任意のグラム陽性又はグラム陰性菌についても同じであろう。
【０３７８】
以下のTable 36(表49、50)〜Table 38(表52)は、本発明に従って実施された抗菌剤感受性試験の更なる例を示す。Table 36(表49、50)は、ミューラーヒントン及びトリプティックソイブロス中でのインキュベーション前及び15〜24時間での黄色ブドウ球菌の抗菌剤感受性試験を示す。Table 37(表51)及びTable 38(表52)は、グラム陰性菌特異的抗生物質であるアズトレオナムを添加した、ストレプトコッカス・ウベリス及び大腸菌の抗菌剤感受性試験を示す。Table 38(表52)〜Table 49(表63)は、抗生物質感受性試験の更なる例を示し、転帰を記述の本発明と共に記載する。
【０３７９】
【表４９】
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【０３８０】
【表５０】
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【０３８１】
【表５１】
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【０３８２】
【表５２】
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【０３８３】
【表５３】
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【０３８４】
【表５４】
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【０３８５】
【表５５】
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【０３８６】
【表５６】
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【０３８７】
【表５７】
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【０３８８】
【表５８】
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【０３８９】
【表５９】
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【０３９０】
【表６０】
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【０３９１】
【表６１Ａ】
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【０３９２】
【表６１Ｂ】
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【０３９３】
【表６２】
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【０３９４】
(実施例7)
安定化剤
本発明は、細菌が、1つ又は複数の安定化剤の存在下で同定培地及び/又はpH指示薬の増殖阻害量を含む増殖培地で培養されうるという意外で予想外の発見に大部分基づいている。同定培地及び/又はpH指示薬の濃度を増加させると、反応混合物における表現型の変化がより容易に且つ信頼できるように観察されうることから、試験の感受性が増加する。
【０３９５】
本発明に従う最初の実験を、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の両方に関して乳汁の存在下で実施した。同定培地及び/又はpH指示薬培地を、そうしなかったならば細菌の増殖を阻害する濃度まで増加させることができることを本出願人は観察した。例えば、Table 49(表63)〜Table 52(表66)の結果(トリプティックソイブロス及びフェノールレッド(増殖阻害濃度)中で培養した黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス・ウベリス、表皮ブドウ球菌、及び大腸菌)を、Table 53(表67)〜Table 56(表70)(粉乳が存在するだけで、それ以外は同じ実験)と比較して参照されたい。結果は、粉乳が対照実験におけるフェノールレッドの増殖阻害効果に対して安定化効果を有したことを証明する(すなわち、Table 49(表63)〜Table 52(表66))。更に、Table 5(表15)、Table 6(表16)、Table 79(表93)〜Table 86(表100)の結果(ストレプトコッカス・ウベリス、表皮ブドウ球菌及び黄色ブドウ球菌)は、そうでなければ増殖を阻害する濃度の同定培地で細菌を培養した場合の乳汁の安定化効果を証明する。
【０３９６】
乳汁(粉乳を含む)の主成分は、カゼインタンパク質及び炭水化物を含む。本出願人は、カゼインナトリウム(α-カゼイン、β-カゼイン、及びκ-カゼインを含む)及びラクトースの存在下で同じ細菌に及ぼすフェノールレッドの増殖阻害効果を試験した。Table 53(表67)〜Table 64(表78)に示すデータは、グラム陽性菌(すなわち、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス・ウベリス、表皮ブドウ球菌)の場合、安定化効果がカゼインタンパク質によって提供されるが、グラム陰性菌(大腸菌)の場合には、安定化効果が炭水化物によって提供されるという予備的な概念実証を提供する。
【０３９７】
本出願人は、観察された増殖阻害効果に及ぼす、異なる乳タンパク質及び乳タンパク質抽出物(例えば、α-カゼイン、β-カゼイン(A1、A2、A3、B、C、D、E、及びF変種の1つ又は複数を含む)、κ-カゼイン、β-ラクトグロブリン、乳清タンパク質、ラクトアルブミン、ラクトフェリン、及び乳汁又は粉乳)、並びに異なる炭水化物(例えば、デキストロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、及びスクロース)の安定化効果を調べようとした。これらのデータをTable 90(表104)(すなわち、組成物)と共に読み取る場合、Table 65(表79)〜Table 86(表100)に示す。これらのデータは、培養される細菌に応じて、グラム陰性菌に対する増殖阻害に対する安定化効果が、デキストロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、及び(程度は少ないが)スクロースによって提供されるが、グラム陽性菌に関する増殖阻害に対する安定化効果は、α-カゼイン、β-カゼイン(A1、A2、A3、B、C、D、E、及びF変種の1つ又は複数を含む)、κ-カゼイン、β-ラクトグロブリン、乳清タンパク質、ラクトアルブミン、ラクトフェリン、及び乳汁又は粉乳によって提供されることを示している。
【０３９８】
(実施例8)
尿試料
Table 87(表101)〜Table 89(表103)に示す結果は、非乳汁試料、すなわち大腸菌及びストレプトコッカス・ウベリスをスパイクした尿における本発明の方法の有効性を証明する。Table 87(表101)、Table 88(表102)は、糖(すなわち、ラクトース及び/又はトレハロース)の存在下で、グラム陰性菌(例えば、大腸菌)が疑似臨床試料中でフェノールレッドの増殖阻害量の存在下で増殖することを示している。更に、Table 89(表103)は、乳タンパク質(すなわち、ウシ乳清、ラクトアルブミン、カゼインナトリウム等)の存在下でグラム陽性菌(例えば、ストレプトコッカス・ウベリス)が、疑似臨床試料中でフェノールレッドの増殖阻害量の存在下で増殖することを示している。
【０３９９】
【表６３】
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【０４００】
【表６４】
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【０４０１】
【表６５】
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【０４０２】
【表６６】
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【０４０３】
【表６７】
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【０４０４】
【表６８】
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【０４０５】
【表６９】
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【０４０６】
【表７０】
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【０４０７】
【表７１】
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【０４０８】
【表７２】
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【０４０９】
【表７３】
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【０４１０】
【表７４】
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【０４１１】
【表７５】
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【０４１２】
【表７６】
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【０４１３】
【表７７】
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【０４１４】
【表７８】
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【０４１５】
【表７９】
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【０４１６】
【表８０】
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【０４１７】
【表８１】
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【０４１８】
【表８２】
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【０４１９】
【表８３】
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【０４２０】
【表８４】
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【０４２１】
【表８５】
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【０４２２】
【表８６】
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【０４２３】
【表８７】
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【０４２４】
【表８８】
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【０４２５】
【表８９】
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【０４２６】
【表９０】
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【０４２７】
【表９１】
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【０４２８】
【表９２】
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【０４２９】
【表９３】
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【０４３０】
【表９４】
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【０４３１】
【表９５】
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【０４３２】
【表９６】
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【０４３３】
【表９７】
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【０４３４】
【表９８】
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【０４３５】
【表９９】
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【０４３６】
【表１００】
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【０４３７】
【表１０１】
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【０４３８】
【表１０２】
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【０４３９】
【表１０３】
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【０４４０】
【表１０４Ａ】
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【０４４１】
【表１０４Ｂ】
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【０４４２】
【表１０４Ｃ】
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【０４４３】
本明細書において参照又は言及した全ての特許、刊行物、科学論文、ウェブサイト、並びに他の文書及び材料は、本発明が関係する当業者のレベルを示しており、それぞれのそのような参照された文書及び材料は、それが、全体が参照により本明細書に個々に組み込まれている又は全体が本明細書に記載されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれている。本出願人は、任意のそのような特許、刊行物、科学論文、ウェブサイト、電子的に利用可能な情報、及び他の参照される材料又は文書からのありとあらゆる材料及び情報を本明細書に物理的に組み込む権利を有する。
【０４４４】
本発明は、例によって説明してきたが、特許請求の範囲で定義される本発明の範囲を逸脱することなく変更及び改変を行ってもよいと認識すべきである。更に、特異的特徴に対して公知の均等物が存在する場合、そのような均等物は、本明細書において具体的に言及されているかのように組み込まれている。本明細書において記述される特異的アッセイ及び方法は、好ましい実施形態の代表であり、例示的であり、本発明の範囲を制限すると意図されない。他の態様及び実施形態が、本明細書を検討することにより当業者に想起され、それらは特許請求の範囲によって定義される本発明の精神に包含される。本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、様々な置換及び改変を本明細書に開示される本発明に行ってもよいことは、容易に当業者に明らかとなるであろう。本明細書において例示的に説明される本発明は、具体的に必須であると開示されていない任意の要素若しくは複数の要素、又は制限若しくは複数の制限がなくとも、適切に実践されうる。このため、例えば、本明細書において説明又は使用されるそれぞれの例において、本発明の実施形態又は例における用語「含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」のいずれも本明細書において他の2つの用語のいずれかと置換してもよい。同様に、用語「含む(comprising)」、「含む(including)」、及び「含有する」等は、拡張的且つ制限なしに読むべきである。本明細書において例示的に説明したアッセイ及び方法は、異なる順序の工程で適切に実践することができ、それらは本明細書又は特許請求の範囲に示した工程の順序に必ずしも限定されない。更に、本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用又は説明されるように、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」は、本文が明らかにそれ以外であることを示していない限り、複数形を含む。どのような状況であっても、本特許は、特異的実施例若しくは実施形態、又は本明細書において具体的に開示された方法に限定されないと解釈されうる。
【０４４５】
用いられている用語及び表現は、説明のためであって制限のためでない用語として使用され、そのような用語及び表現の使用において、示され、説明され、又はその一部である特徴のいかなる均等物も除外しないと意図され、様々な改変が、特許請求される本発明の範囲において可能であると認識される。このため、本発明は、好ましい実施形態及び任意選択の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書において開示される概念の改変及び変更を当業者が行ってもよく、そのような改変及び変更は、本明細書において記述され、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内であると考えられると理解される。
【０４４６】
本発明は、本明細書において広く全般的に説明してきた。全般的開示の中に含まれるより狭い種及びより下位の群のそれぞれも同様に、本発明の一部を形成する。このことは、条件付きの本発明の全般的説明、又は削除された材料が本明細書において具体的に列挙されているか否かによらず、任意の主題をその属から除く負の制限を含む。
【０４４７】
他の実施形態は以下の特許請求の範囲内である。加えて、本発明の特徴又は態様は、マーカッシュ形式で記述されており、当業者は、本発明が同様に、それによってマーカッシュ形式の任意の個々のメンバー又はメンバーのサブグループに関して記述されていることを認識するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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