(57)【要約】  在来ハプロタイプ内の外因性対立遺伝子の存在を判定する方法およびキットが提供される。家畜ゲノム中への外来対立遺伝子の導入は、特定の所望の形質を導入する能力を提供してきた。本開示は、標的遺伝子座の、ハプロタイプにとって外来の外因性対立遺伝子の存在を同定し、かつハプロタイプ在来の特異的マーカーを同定する方法を提供する。在来マーカーが側面に位置する、標的遺伝子座の外因性遺伝子の同定は、外因性遺伝子が分子工学によって存在することを示す。逆に、在来マーカーが部分的にしか側面に位置しない外因性遺伝子の存在は、対立遺伝子が有性育種に起因して存在することを示す。
2018529377.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
在来ハプロタイプ中の外因性対立遺伝子を同定するための、家畜動物を試験するキットを製造するプロセスであって：
ｉ）前記外因性対立遺伝子を潜在的に含む在来ハプロタイプを同定する工程と；
ｉｉ）前記外因性対立遺伝子を同定する工程と；
ｉｉｉ）前記ハプロタイプに特異的な２つ以上のプローブを調製する工程と
を含むプロセス。
【請求項２】
ハプロタイプを同定する工程は、前記ハプロタイプ中の前記家畜在来のマーカーの存在を検出する工程を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
外因性対立遺伝子を同定する工程は、前記ハプロタイプ内の外来対立遺伝子の存在を同定する工程を含む、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記外因性対立遺伝子は、非減数分裂遺伝子移入によって導入される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
所望の前記ハプロタイプは、２つ以上のマーカーによって判定される、請求項１、２、または４に記載のプロセス。
【請求項６】
前記２つ以上のマーカーは、前記外因性対立遺伝子の両側に存在する、請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】
前記２つ以上のマーカーは、前記対立遺伝子の２Ｍｂ以内に見出される、請求項６に記載のプロセス。
【請求項８】
前記２つ以上のマーカーは、前記対立遺伝子の１Ｍｂ以内に見出される、請求項７に記載のプロセス。
【請求項９】
家畜在来のマーカーの存在を検出する工程は、各マーカーに特異的なプローブを含む、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記マーカーは、ウシ（Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ）から選択され：第２０染色体−３９０４７５０１、第２０染色体−３９０６７１６４、第２０染色体−３９１０７８７２、第２０染色体−３９１１８０６３、第２０染色体−３９１２６０５５、第２０染色体−３９１３６５５８、第２０染色体−３９１７９４９８、第２０染色体−３９１７９５２７、第２０染色体−３９２３５８５９、第２０染色体−３９３４３４００、第２０染色体−３９３４３５３４、第５染色体−ＵＭＤ３＿６２５９１３１１、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３０５１６１２、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３０５２６３１、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３０８８９７３、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３０９１５７８、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３１０７２９３、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３１５０４００、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３１９８６６４、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３２０９３９６、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３２２８１０６、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３４８６１３３を含む、請求項３に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記プローブは、ＰＣＲ、アレイベースのアッセイ、ハイレゾリューションメルティング（ＨＲＭ）分析、フラグメント分析、Ｓａｎｇｅｒフラグメント分析、増幅フラグメント長多型（ＡＦＬＰ）分析、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、または一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析に用いられる、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記マーカーは、前記ハプロタイプの配列特異的領域である、請求項５に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記外因性対立遺伝子は、前記在来対立遺伝子とは異なる系統、品種、または種に由来する、請求項３に記載のプロセス。
【請求項１４】
外因性対立遺伝子を同定する工程は、前記外因性対立遺伝子に特異的なプローブを用いる工程を含む、請求項３に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記プローブは、ＰＣＲ、アレイベースのアッセイ、ハイレゾリューションメルティング（ＨＲＭ）分析、フラグメント分析、Ｓａｎｇｅｒフラグメント分析、増幅フラグメント長多型（ＡＦＬＰ）分析、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、または一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析に用いられる、請求項９または１４に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記外因性対立遺伝子は、前記家畜の在来対立遺伝子にとって外来の少なくとも１つの塩基を含む、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１７】
家畜動物中の外因性の標的対立遺伝子の存在を同定する方法であって：
ｉ）前記家畜動物中の在来ハプロタイプを同定する工程と；
ｉｉ）前記ハプロタイプにとって外因性の対立遺伝子を同定する工程と；
ｉｉｉ）前記ハプロタイプ内の前記外因性対立遺伝子の存在を判定する工程と
を含む方法。
【請求項１８】
所望のハプロタイプを同定する工程は、前記ハプロタイプ内の前記家畜在来のマーカーの存在を検出する工程を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ハプロタイプ中の外因性対立遺伝子を同定する工程は、前記ハプロタイプ内の外来対立遺伝子の存在を同定する工程を含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記外因性対立遺伝子は、非減数分裂遺伝子移入によって導入される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ハプロタイプは、２つ以上のマーカーによって同定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記２つ以上のマーカーは、前記外因性対立遺伝子の両側に存在する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記２つ以上のマーカーは、各マーカーに特異的なプローブを用いて同定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記２つ以上のマーカーは、前記対立遺伝子の２ＭＢ以内に見出される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記２つ以上のマーカーは、前記対立遺伝子の１ＭＢ以内に見出される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記マーカーは、ウシ（Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ）から選択され：第２０染色体−３９０４７５０１、第２０染色体−３９０６７１６４、第２０染色体−３９１０７８７２、第２０染色体−３９１１８０６３、第２０染色体−３９１２６０５５、第２０染色体−３９１３６５５８、第２０染色体−３９１７９４９８、第２０染色体−３９１７９５２７、第２０染色体−３９２３５８５９、第２０染色体−３９３４３４００、第２０染色体−３９３４３５３４、第５染色体−ＵＭＤ３＿６２５９１３１１、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３０５１６１２、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３０５２６３１、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３０８８９７３、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３０９１５７８、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３１０７２９３、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３１５０４００、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３１９８６６４、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３２０９３９６、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３２２８１０６、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３４８６１３３を含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２７】
家畜在来のマーカーの存在を検出する工程は、各マーカーに特異的なプローブを含む、請求項１９または２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記プローブは、ＰＣＲ、アレイベースのアッセイ、ハイレゾリューションメルティング（ＨＲＭ）分析、フラグメント分析、Ｓａｎｇｅｒフラグメント分析、増幅フラグメント長多型（ＡＦＬＰ）分析、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、または一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析に用いられ得る、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記マーカーは、前記ハプロタイプの配列特異的領域である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記外因性対立遺伝子は、前記家畜とは異なる系統、品種、または種に由来する、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項３１】
外因性対立遺伝子を同定する工程は、前記外因性対立遺伝子に特異的なプローブを用いる工程を含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項３２】
前記プローブは、ＰＣＲ、アレイベースのアッセイ、ハイレゾリューションメルティング（ＨＲＭ）分析、フラグメント分析、Ｓａｎｇｅｒフラグメント分析、増幅フラグメント長多型（ＡＦＬＰ）分析、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、または一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析に用いられる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記外因性対立遺伝子は、前記家畜の在来対立遺伝子にとって外来の少なくとも１つの塩基を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項３４】
非減数分裂遺伝子移入を用いてハプロタイプ中に導入された外因性対立遺伝子の存在を判定するためのキットであって：
ｉ）動物にとって外来の対立遺伝子に特異的なプローブと、
ｉｉ）前記動物のハプロタイプに特異的な２つ以上のプローブと
を備えるキット。
【請求項３５】
使用説明書をさらに含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
反応混合物を保持するコンテナをさらに含む、請求項３４または３５に記載のキット。
【請求項３７】
試薬をさらに含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記プローブは：ＰＣＲ、アレイベースのアッセイ、ハイレゾリューションメルティング（ＨＲＭ）分析、フラグメント分析、Ｓａｎｇｅｒフラグメント分析、増幅フラグメント長多型（ＡＦＬＰ）分析、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、または一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析に用いられる、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記プローブは：第２０染色体−３９０４７５０１、第２０染色体−３９０６７１６４、第２０染色体−３９１０７８７２、第２０染色体−３９１１８０６３、第２０染色体−３９１２６０５５、第２０染色体−３９１３６５５８、第２０染色体−３９１７９４９８、第２０染色体−３９１７９５２７、第２０染色体−３９２３５８５９、第２０染色体−３９３４３４００、第２０染色体−３９３４３５３４、第５染色体−ＵＭＤ３＿６２５９１３１１、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３０５１６１２、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３０５２６３１、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３０８８９７３、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３０９１５７８、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３１０７２９３、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３１５０４００、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３１９８６６４、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３２０９３９６、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３２２８１０６、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３４８６１３３を含むマーカーに特異的である、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
ウシ（Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ）の第５染色体−ＵＭＤ３＿６３１５０４００のあたりに、または第２０染色体−３９１３６５５８のあたりに修飾を含むインビトロ動物細胞。
【請求項４１】
ウシ（Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ）の第２０染色体−３９１３６５５８遺伝子座あたりに修飾を含むスリック表現型を有する、遺伝的に修飾された動物を作出する方法。
【請求項４２】
所望のハプロタイプ中の外来対立遺伝子の存在を検出するための、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載のキットの使用。
【請求項４３】
所望のハプロタイプ中の外来対立遺伝子の存在を検出するための、請求項１７〜３３のいずれか一項に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１５年９月１日出願の米国仮特許出願第６２／２１２，８４０号明細書および２０１６年４月１３日出願の米国仮特許出願第６２／３２１，９４２号明細書の優先権を主張する。これらの出願は双方とも、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、所望のハプロタイプ中に挿入された標的対立遺伝子の検出方法および検出キットに関する。
【背景技術】
【０００３】
家畜および他の動物が、文明化の始まりから人によって家畜化されてきた。人が動物を家畜化した理由として、食物、衣類、防御、疾患に対する耐性、および交流が挙げられる。所望の形質を有する、または不所望の、もしくは危険な形質を欠く特定の家畜品種が開発されてきた。例えば、ウシは、肉の生産、革の品質、従順さ、そして攻撃性すら（闘牛を考える）挙げられる多く理由のために、育種されてきた。同様に、ウマは、特定の用途に所望される、サイズおよび体力（荷馬）、速度（サラブレッド）、スタミナおよび耐暑性（アラブ馬）、ならびに一般的な基質、速度、および頑健さ（クォーター馬）が挙げられる種々の形質を有するように、育種されてきた。同様に、他の全ての家畜動物は、ある程度まで「近交」されて、所望の形質が親もしくは祖先から得られ、または不所望の形質が除外されてきた。どの場合にも、動物の有性生殖は、両親由来の多くの形質が後代に伝えられるような親遺伝子の混合を必要とする。
【０００４】
動物の育種法は全て、当然、有性生殖を必要とする。有性生殖において、雄の生殖腺および雌の生殖腺の二倍体の配偶子形成細胞は、それぞれがその母親および父親由来の染色体の単一セットを引き継いでいるが（他の全ての細胞がそうである）、減数第一分裂において減数および分裂を経験する。減数第一分裂中に、染色体は複製され（４ｎ）、相同染色体間の乗換えが起こって、各染色体内で遺伝情報の新しいセットが生じ得る。減数第一分裂の後に、細胞分裂の二期（ｔｗｏ  ｐｈａｓｅｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ）が続いて、４つの半数体配偶子が生じ、それぞれが特有のセットの遺伝情報を引き継いでいる。遺伝的組換えが、新しい遺伝子配列または遺伝子の組合せをもたらすので、多様性が増大する。
【０００５】
しかしながら、何千年とまではいかないが何百年にわたって注意深く育種されてきた家畜動物においては、多様性の増大は所望されない。所望されるのは、動物が、形質（これについて育種されてきた）を示し、かつ維持していることである。例えば、ウシは世界中で、８００を超える品種が存在する。一部のウシは、特定の気候に適合するように育種されている。しかしながら、ほとんど多数は、乳生産および／もしくは牛肉生産が挙げられる特定の農業目的、または役用目的で育種されている。例えば、ヘレフォード種は主に肉のために育種されている一方、ホルスタイン種は主に酪農動物であり、そしてシンメンタール種牛は、肉目的かつ酪農目的で育種されている。さらに、そのような品種はまた、非計測形質、例えば気質および生殖能力が予測可能である。ウマ、ヒツジ、ブタ等が挙げられるほとんどの家畜動物が、信頼でき、かつ所望されるとみなされる特定の形質を同様に発現すること、そして不所望の形質、例えば攻撃性、または不所望の疾患に対する感受性を除外していることは勿論である。
【０００６】
有益な形質を動物中に導入したいという願望の中で、家畜は、特に所望される形質を単一品種に含めるように、何千年にもわたって育種されてきた。通常、動物の品種は、その種の他の動物から識別される同質の（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）外観（表現型）、同質の挙動、および／または他の特性を有し、かつ選抜育種に由来する、家畜動物の特定の群である。選抜育種は、所望の形質を有する個体を、他の個体と、雌雄の別によって交配して、所望の形質について、そして全体としての品種の形質について「正しい状態（ｔｒｕｅ）」を育種することを必要とする。所望の品種および所望の形質を、その品種において開発する動物育種は、長年にわたって培われた、近親交雑、同系繁殖、および他殖を要する科学である。しかしながら、家畜の所望の品種を開発するのに必要な多くの世代の間に、品種の実際の遺伝的多様性は、その実際の数は非常に多いかもしれないけれども、非常に低下してしまった。結果的に、有効な集団サイズ（Ｎｅ）は、特定のあらゆる品種について、極端に小さくなった。例えば、Ｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（特許文献１。その全体が本明細書に組み込まれる）は、ウシの中で、ホルスタイン−フリージアン種のＮｅが５０から１００；ブラウンスイス種で約４６、ホルスタイン種で４９、そしてレッド・デーニッシュ種で４７であると推定されると見積もっている。ヒツジの中で、ドーセット−ランブイエ−フィンシープ交雑種について、３５であった。ブタは、Ｎｅが僅かに高く、Ｈａｒｍｅｇｎｉｅｓ種について＜２００；デュロック／ラージホワイト種について８５、そしてラージホワイト種について３００と推定されている。ニワトリも同様に、小さなＮｅを示し、例えばＬａｙｅｒｓ品種について、９１から１２３であると推定されている。この低い遺伝的多様性は、各品種の物理的特性が十分に認識されていること、そして、広く用いられている品種において不所望の特性が生じる可能性が極端に低く、一般に、自然突然変異の発生に限られていることを意味する。
【０００７】
結果的に、種々の家畜品種中に新しい形質を導入する能力は限られており、時間を浪費するものである。例えば、所望の家畜品種中への新しい形質の導入は、品種の特性全てを有するだけでなく、所望の形質を含む動物であると同時に、異系交雑（ｏｕｔ  ｂｒｅｅｄ）親由来の他の全ての形質を除去している動物に到達するには、所望の形質を有する動物を、所望の品種の高品質の雌と交雑させること、交雑した、所望の形質を有する所望の品種の、表現型的に許容可能な後代を選択すること、そして有望な後代を、所望の品種の更なる雄または雌と戻し交雑することを必要とする。結果的に、価値がある品種中に新しい形質を導入するには、導入種の他の全ての特性を欠き、かつ、価値がある品種の他の全ての品質について正しい状態を育種した動物中に、形質を安定して導入するには、多くの育種世代が費やされる。
【０００８】
価値がある動物の育種は、単一形質を安定して導入するための多くの世代の選抜育種を、そして、他の全ての特性において、品種の十分に認識された形質と一致する動物を提供するための後代の戻し交雑を、必要とする。したがって、所望の形質を家畜動物中に導入するための、そして当該動物を、発現し得る新規の形質が有性生殖の結果であるか、所望の家畜品種の遺伝子型内の特定の遺伝子によって引き継がれる特定の形質の定方向導入の結果であるかを判定するために試験するための、より容易な方法が必要とされている。
【０００９】
近年、遺伝子修飾および動物クローニングの新しい技術により、例えば遺伝子編集によって動物ゲノム中に特定の遺伝子または対立遺伝子を導入することができるようになった（例えば、Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．の特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、および特許文献６参照。これらの出願はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。これらの技術は、価値がある動物品種のゲノム中への新規の形質の直接導入を可能にし、これによれば、有害な、または不所望の形質を当該品種に加えるリスクもないし、動物の一世代未満の範囲内で行うことができる。
【００１０】
現在、価値がある家畜品種は、品種レジストリまたは血統台帳に登録されており、これらは、動物の各血統を一覧にしており、多くの世代について追跡することができる。この書面にしたレジストリにより、動物育種家は、価値があり、かつ多産な雌株および雄株を同定することができ、そして不所望の動物との育種を同定かつ回避することができるようになった。しかしながら、新しい形質を伴う既知の品種の動物の提示については、動物育種家は、既知の品種との計画的交雑、または未知の動物、もしくは不所望の動物との予期しない有性出現（ｓｅｘｕａｌ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ）等によって、新しい形質が導入された方法を同定する必要がある。ゆえに、家畜の特定の品種において、新しい形質のソースの同定を補助することとなる技術および／または方法を同定することが有益であろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１４／０２２０５７５号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１４／０３３８０７号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１４／０２０１８５７号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１４／００４１０６６号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１３／０１１７８７０号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１３／００９０５２２号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本開示は、家畜動物の標的遺伝子座に、外来の、または外因性の対立遺伝子（遺伝子）を導入する一方、宿主動物の在来ゲノムを維持する、遺伝的操作の産物である動物を同定する方法およびキットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
したがって、例示的な一実施形態において、本開示は、標的遺伝子座に挿入された外因性対立遺伝子を有し、かつ標的遺伝子座を含有する在来ハプロタイプ内に遺伝的マーカーを有する動物を同定する方法を提供する。種々の実施形態において、本開示はさらに、サザンハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、アレイベースのアッセイ、ハイレゾリューションメルティング（ＨＲＭ）分析、フラグメント分析、Ｓａｎｇｅｒフラグメント分析、増幅フラグメント長多型（ＡＦＬＰ）分析、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、または一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析を用いて外因性対立遺伝子を同定する工程を含む。種々の例示的な実施形態において、在来マーカーを同定する工程は、サザンハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、アレイベースのアッセイ、ハイレゾリューションメルティング（ＨＲＭ）分析、フラグメント分析、Ｓａｎｇｅｒフラグメント分析、増幅フラグメント長多型（ＡＦＬＰ）分析、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、または一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析を用いる工程を含む。種々の例示的な実施形態において、マーカーは、標的遺伝子座の５００ｂｐ以内にある。他の種々の例示的な実施形態において、少なくとも５つのマーカーが存在する。他の例示的な実施形態において、少なくとも４つのマーカー、３つのマーカー、または２つのマーカーが存在する。他の例示的な実施形態において、マーカーの少なくとも２つが、標的遺伝子座の側面に位置する。これらの例示的な実施形態において、在来ハプロタイプ内の標的遺伝子座での外因性対立遺伝子の存在を検出することによって、別の動物との育種に起因する外因性対立遺伝子の存在は除外され得る一方、在来ハプロタイプ内の標的遺伝子座での外因性対立遺伝子の存在は、遺伝的修飾に由来する動物を同定する際に、決め手となる。
【００１４】
さらに別の例示的な実施形態において、本開示は、動物が有性育種の産物であるか、遺伝的修飾の産物であるかを判定するキットを提供する。この例示的な実施形態において、キットは、知られているハプロタイプ用の２つ以上のプローブおよび／またはプライマーを含む。また、この例示的な実施形態において、キットはまた、ハプロタイプにとって外来の、標的遺伝子座に位置決めされた対立遺伝子用の１つまたは複数のプローブまたはプライマーを含む。種々の例示的な実施形態において、キットはまた、使用説明書が付属する。さらに他の例示的な実施形態において、キットはさらに、コンテナ内に含有される。さらに他の実施形態において、キットはさらに、動物が有性育種の産物であるか遺伝的修飾の産物であるかを判定するのに必要とされる試薬、アンプル、または試験管が付属する。種々の例示的な実施形態において、キットは、メーリングラベルを備える。
【００１５】
本開示のこれらの、そして他の特徴および利点は、後に続く記載および添付の特許請求の範囲において示され、またはより完全に明らかとなろう。特徴および利点は、特に添付の特許請求の範囲において指摘される機器および組合せによって実現され得、かつ得られ得る。さらに、本開示の特徴および利点は、本明細書中で開示される方法および技術の実行によって学ぶことができ、または下記の記載から明らとなろう。
【００１６】
以下の図を参照して、本開示に従う組成物および方法の種々の例示的な実施形態を、詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＰｏｌｌｅｄのＴＡＬＥＮ介在性遺伝子移入。（Ａ）Ｐｃ対立遺伝子をホルスタイン（ＨＯＲＮＥＤ）細胞中に遺伝子移入するための戦略。Ｐｃ対立遺伝子は、１０ｂｐの欠失（不図示）がある２１２ｂｐのタンデムリピート（赤色の矢印）である。ＴＡＬＥＮは、ＨＯＲＮＥＤ対立遺伝子（緑色の垂直の矢印）を特異的に標的とするように開発されており、これは、Ｐｃ  ＨＤＲプラスミドを用いて、相同組換えによって修復され得る。Ｂに、用いたプライマーセットを表す。（Ｂ）Ｐｃのホモ接合性またはヘテロ接合性の遺伝子移入がなされたコロニーの代表画像。数字によって示す３つのプライマーセットを、候補コロニーの陽性分類に用いた：セット１、Ｆ１＋Ｒ１；セット２、Ｆ２＋Ｒ２；およびセット３、Ｆ１＋Ｐ（Ｐｃ特異的）。ポジティブコントロール鋳型（Ｐ、プライマーＦ１とＲ１の間の、配列を確認したＰｃ  １，７４８ｂｐの挿入を含有するプラスミド鋳型；Ｈ、ホルスタイン雄牛のゲノムＤＮＡ）を用いて生じたアンプリコンを示す。ＰＣＲ産物の識別を、Ｆ１＋Ｒ１アンプリコンの配列決定によって確認した。
【図２】減数分裂期組換え中の乗換えを示す概略図である。
【図３】組換え、自然突然変異、または非減数分裂遺伝子移入によって導入された対立遺伝子の遺伝的同定を示す概略図。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本開示は、外来対立遺伝子または外生対立遺伝子を標的遺伝子座に導入する一方、宿主動物の在来ゲノムを維持する遺伝子操作の産物である動物を同定する方法およびキットを提供する。
【００１９】
別途定義されない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で具体的に言及した全ての刊行物および特許は、全ての目的（本開示と共に用いられ得る刊行物において報告される化学物質、機器、統計分析、および方法論の記載および開示が挙げられる）について、参照によって組み込まれる。本明細書中の全ての引用文献は、当該技術のレベルを示すのに必要とされるであろう。本明細書中で、先行発明の長所によって、本開示がそのような開示に先行する資格がないとの承認として解釈されるべきものは、何もない。
【００２０】
本明細書中で、そして添付の特許請求の範囲において用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、複数の引用を含む点に留意が必要である。同様に、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」、および「少なくとも１つ」は、本明細書中で互換的に用いられ得る。また、用語「含む」、「挙げられる」、「特徴とする」、および「有する」は、互換的に用いられ得る点にも留意が必要である。
【００２１】
本明細書中で用いられる「相加的遺伝効果」は、親から後代に伝えられ得る個々の平均遺伝子効果を意味する。
【００２２】
本明細書中で用いられる「対立遺伝子」は、遺伝子の代替の形態を指す。これはまた、ＤＮＡ配列の変形物として考えることもできる。例えば、動物が、特定の遺伝子についてＢｂの遺伝子型を有するならば、Ｂおよびｂの双方が対立遺伝子である。
【００２３】
「ＤＮＡマーカー」は、物理的特性との関連について試験することができる特定のＤＮＡ変形物を指す。
【００２４】
「遺伝子型」は、動物の遺伝的構成を指す。
【００２５】
「遺伝子型分析（ＤＮＡマーカー試験）」は、特定の遺伝子検査について、動物が引き継いでいる特定の対立遺伝子を判定するために動物が試験されるプロセスを指す。
【００２６】
「単純な形質」は、単一遺伝子によって引き継がれる形質、例えば、毛色および有角の状態、ならびにいくつかの疾患を指す。
【００２７】
「複雑な形質」は、多数の遺伝子によって支配される形質、例えば生殖、成長、および死（ｃａｒｃａｓｓ）を指す。
【００２８】
「複雑な対立遺伝子」とは、コーディング領域が、その中に複数の突然変異を有するものである。これにより、所定の突然変異の効果を判定することがより困難となる。なぜなら、研究者は、対立遺伝子内のどの突然変異が効果をもたらしているかを確信することができないからである。
【００２９】
「コピー数変動」（ＣＮＶ）（構造的変動形態）とは、ＤＮＡの１つまたは複数の区分のコピー数の変動が異常な、または特定の遺伝子については正常な細胞をもたらす、ゲノムのＤＮＡの改変である。ＣＮＶは、ゲノム領域の大きさに比較的対応しており、特定の染色体上で欠失し（正常な数よりも少なくなる）、または複製される（正常な数よりも多くなる）。例えば、通常、Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄの順で区分を有する染色体は、その代わりとして、ゲノムの全体を通して、複数のコピーが出現する核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の区分Ａ−Ｂ−Ｃ−「反復エレメント」パターンを有する場合がある。反復ＤＮＡは、その迅速な再結合動態のため、最初に検出された。
【００３０】
「量的変異」の変動は、離散的な単位またはカテゴリではなく、連続的な単位またはカテゴリ（例えば、ヒトの身長）を基に評価される。連続変異参照。特定の特性についての広範な表現型の存在は、明白な質的差異によってではなく、程度によって異なる。
【００３１】
「ホモ接合」は、単一の遺伝子について、同じ対立遺伝子の２つのコピー、例えばＢＢを有することを指す。
【００３２】
「ヘテロ接合」は、単一の遺伝子について、対立遺伝子の異なるコピー、例えばＢｂを有することを指す。
【００３３】
「遺伝子座」は、染色体上でのメーカーまたは遺伝子の特定の位置を指す。
【００３４】
「センチモルガン（Ｃｍ）」は、遺伝的連鎖を測定するための組換え頻度の単位である。これは、染色体位置（遺伝子座またはマーカーとも呼ぶ）間の距離と定義され、一世代において発生する染色体乗換えの予想される平均数は、０．０１である。染色体に沿った距離の推測もしばしば用いられている。しかしながら、それは正しい状態の物理的距離でない。
【００３５】
「染色体乗換え」（「乗換え」）は、個体によって継承される、その母親由来の相同染色体と父親由来の相同染色体との間での、遺伝的材料の交換である。各個体は、二倍体セット（２つの相同染色体、例えば２ｎ）を有する（その母親および父親から１つずつ継承されたものである）。減数第一分裂中に、染色体は複製され（４ｎ）、母親および父親から受け取った染色体の相同領域間の乗換えが起こって、各染色体内で遺伝情報の新しいセットが生じ得る。減数第一分裂の後に、細胞分裂の二期が続いて、４つの半数体配偶子が生じ、それぞれが特有のセットの遺伝情報を引き継いでいる。遺伝的組換えが、新しい遺伝子配列または遺伝子の組合せをもたらすので、多様性が増大する。乗換えは通常、相同染色体上の相同領域が断たれて、その後他の染色体に再結合する場合に、起こる。
【００３６】
「マーカーアシスト選択（ＭＡＳ）」は、管理決定をする際の補助にＤＮＡマーカー情報を用いるプロセスを指す。
【００３７】
「マーカーパネル」は、特定の形質と関連している２つ以上のＤＮＡマーカーの組合せである。
【００３８】
「非相加的遺伝効果」は、優性およびエピスタシス等の作用を指す。共優性は、同じ遺伝子座の対立遺伝子の相互作用である一方、エピスタシスは、異なる遺伝子座の対立遺伝子の相互作用である。
【００３９】
「ヌクレオチド」は、４つの塩基化学物質：アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）の１つが挙げられる、ＤＮＡの構成成分を指す。
【００４０】
「表現型」は、測定され得る動物の外観を指す。表現型は、動物の遺伝的構成および環境によって影響される。
【００４１】
「単ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）」は、ＤＮＡ配列における単一のヌクレオチド変化である。
【００４２】
「半数体遺伝子型」または「ハプロタイプ」は、減数分裂中に、かなりの割合の配偶子中に共分離するように連鎖されている、対立遺伝子、遺伝子座、またはＤＮＡの多型の組合せを指す。ハプロタイプの対立遺伝子は、連鎖不平衡（ＬＤ）にあってもよい。
【００４３】
「連鎖不平衡（ＬＤ）」は、対立遺伝子が、それらの個々の対立遺伝子頻度に基づいて、独立して、ランダムにサンプリングされた場合に予想されるのと異なる、異なる遺伝子座の対立遺伝子の無作為でない関連、すなわち、異なる遺伝子座の対立遺伝子間の統計学的関連の存在である。異なる遺伝子座の対立遺伝子間に連鎖不平衡がないならば、連鎖平衡にあると言われる。
【００４４】
用語「制限酵素断片長多型」または「ＲＦＬＰ」は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの、１つまたは複数のエンドヌクレアーゼ酵素による制限消化によって生産される様々なＤＮＡフラグメント長のいずれか１つを指し、フラグメント長は、集団中の個体間で異なる。
【００４５】
「遺伝子移入」は、「移入交雑」としても知られており、ある種からの、別の種の遺伝子プール中への、その親種の１つとの種間雑種の繰返し戻し交雑による、遺伝子または対立遺伝子の移動（遺伝子流動）である。意図的な遺伝子移入は、プロセスが長期である；これは、戻し交雑が起こるよりも先に、多くの雑種世代を必要とする場合がある。
【００４６】
「非減数分裂遺伝子移入」は、二倍体（非配偶子）細胞中への遺伝子または対立遺伝子の導入による遺伝子移入である。非減数分裂遺伝子移入は、有性生殖に依存せず、かつ戻し交雑を必要とせず、そして重要なことに、一世代において実行される。非減数分裂遺伝子移入において、対立遺伝子は、相同組換えを介してハプロタイプ中に導入される。対立遺伝子は、ゲノムから、編集されるべき既存の対立遺伝子の部位に導入されてもよいし、対立遺伝子は、他の所望の部位に導入されてもよい。
【００４７】
「転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）」は、ＴＡＬエフェクタＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることによって作り出される人工制限酵素である。
【００４８】
本明細書中で用いられる「インデル」は、生物におけるＤＮＡの修飾を指す「挿入」または「欠失」の短縮形である。
【００４９】
本明細書中で用いられる「遺伝的マーカー」は、染色体上の位置が既知である、遺伝子／対立遺伝子または既知のＤＮＡ配列を指す。マーカーは、あらゆる遺伝的マーカーであってよく、例えば、１つまたは複数の対立遺伝子、ハプロタイプ、ハプログループ、遺伝子座、量的形質遺伝子座、またはＤＮＡ多型［制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、増幅フラグメント長多型（ＡＦＬＰ）、単核多型（ＳＮＰ）、インデル、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、マイクロサテライト、およびミニサテライト］がある。好都合には、マーカーは、ＳＮＰまたはＳＴＲ、例えばマイクロサテライト、より好ましくはＳＮＰである。好ましくは、各染色体セグメント内のマーカーは、連鎖不平衡にある。
【００５０】
本明細書中で用いられる用語「宿主動物」は、動物の認識された種または品種の本来の遺伝的相補体を有する動物を意味する。
【００５１】
本明細書中で用いられる「在来ハプロタイプ」または「在来ゲノム」は、宿主動物中に存在しない遺伝子または対立遺伝子のレシピエントであるために選択された動物の特定の種または品種の天然のＤＮＡを意味する。
【００５２】
本明細書中で用いられる用語「遺伝的修飾」は、バイオテクノロジーを用いた生物ゲノムの直接的操作を指す。
【００５３】
本明細書中で用いられる用語「標的遺伝子座」は、染色体上の既知の対立遺伝子の特定の位置を意味する。
【００５４】
本明細書中で用いられる用語「量的形質」は、離散的カテゴリに当てはまる形質を指す。量的形質は、連続する広範な変異、例えば、特定の品種が与えることができる乳量、または尾部の長さとして出現する。概して、遺伝子群が大きいほど、量的形質を支配する。
【００５５】
本明細書中で用いられる用語「質的形質」は、異なるカテゴリに分類される形質を指すのに用いられる。これらのカテゴリは、特定のいかなる順序も有していない。一般に、質的形質は単一遺伝子的であり、これは、形質が単一遺伝子によって影響されることを意味する。質的形質の例として、例えば、血液型および花色が挙げられる。
【００５６】
本明細書中で用いられる用語「量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）」は、表現型（量的形質）の変異と相関するＤＮＡの区分（遺伝子座）である。
【００５７】
本明細書中で用いられる用語「クローニング」は、無性生殖による、遺伝的に同一の生物の生産を意味する。
【００５８】
「体細胞核移植」（「ＳＣＮＴ」）は、体細胞および卵細胞から生存可能胚をクローニングする一戦略である。当該技術は、除核卵母細胞（卵細胞）を取り出すこと、そして体細胞からドナー核を移植することからなる。
【００５９】
本明細書中で用いられる「オーソロガス」は、進化的に近縁の種内の遺伝子と類似した機能を有する遺伝子を指す。オーソログの同定は、遺伝子の機能予測に有用である。家畜の場合、オーソロガス遺伝子は、動物界の全体を通じて見出され、他の哺乳類において見出されるオーソロガス遺伝子は、トランスジェニック置換に特に有用であり得る。これは特に、同じ種、品種、または系統の動物に当てはまる。ここで、種は、有性生殖を介して、生殖能のある後代を産むことができるほど近縁な２頭の動物と定義され；品種は、動物を、同じ種の他の動物から定義する同質の表現型、同質の挙動、および他の特性を有する家畜動物の特定の群と定義され；そして系統は、血統の連続的系列と定義される；生物、集団、細胞、または遺伝子の一続きが、祖先／後代関係によって繋がれる。例えば、家畜化されたウシは、２つの異なった系統のものであり、双方とも古代のオーロクスから生じている。一系統は、中東におけるオーロクスの家畜化に由来する一方、第２の異なる系統は、インド亜大陸でのオーロクスの家畜化に由来する。
【００６０】
「遺伝子型分析」または「遺伝子検査」は一般に、注目する１つまたは複数のマーカー、例えばＳＮＰを、試験されることになる個体由来のサンプルにおいて検出すること、そして、対象のハプロタイプを判定するために、得られた結果を分析することを指す。本明細書中の開示から明らかなように、注目する１つまたは複数のマーカーを、これに直接的に、または間接的に結合される異なる配列の核酸から本質的になる、またはこれを有する固体支持体を含む高スループット系であって、異なる配列の各核酸が、現在の集団を代表する、祖先または創始者に由来する多型遺伝的マーカーを含み、より好ましくは、前記高スループット系が、現在の集団のゲノムを代表するのに十分なマーカーを含む、高スループット系を用いて検出することが、例示的な一実施形態である。遺伝子型分析用の好ましいサンプルは、核酸、例えば、ＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ、好ましくはゲノムＤＮＡを含む。家畜動物の品種は、その遺伝的マーカーを評価することによって、容易に確立され得る。
【００６１】
家畜は、遺伝子型分析されて、種々の遺伝的マーカーが同定され得る。遺伝子型分析は、生物学的アッセイを用いて個体のＤＮＡ配列を判定することによって、そしてそれを、別の個体の配列、または参照配列と比較することによって、個体の遺伝的構成（遺伝子型）の差異を判定するプロセスを指す用語である。遺伝的マーカーは、既知のＤＮＡ配列であり、染色体上の位置が既知である；これは、育種を通して絶えず継承されるので、血統または系統進化（ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ）を通してトレースされ得る。遺伝的マーカーは、複数の塩基または単ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を既知の位置に含む配列であってよい。家畜動物の品種は、その遺伝的マーカーを評価することによって、容易に確立され得る。多くのマーカーが知られており、注目する形質にマーカーを相関させようと、または今後の育種のために、もしくは予想される価値のために、動物の遺伝的価値を確立しようと試みる、多くの異なる測定技術が存在する。
【００６２】
動物の遺伝子検査は、極端に小さな組織サンプルを用いて実行され得、例えば、試験されることになる動物の尾部から単離された毛包が用いられ得る。容易に入手可能なサンプルの他の例として、例えば、皮膚もしくは体液、またはその抽出物もしくはその画分が挙げられる。例えば、容易に入手可能な体液として、例えば、全血、唾液、精液、または尿が挙げられる。例示的な全血画分が、バフィーコート画分、Ｃｏｈｎのエタノール分画によって得られる画分ＩＩ＋ＩＩＩ（Ｅ．Ｊ．Ｃｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６８：４５９（１９４６））、Ｃｏｈｎのエタノール分画によって得られる画分ＩＩ（Ｅ．Ｊ．Ｃｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６８：４５９（１９４６））、アルブミン画分、免疫グロブリン含有画分、およびそれらの混合物からなる群から選択される。好ましくは、動物由来のサンプルは、例えば、外科手術によって、またはシリンジもしくは綿棒を用いて、動物の対象から以前に単離されたもの、またはそれに由来したものである。
【００６３】
別の実施形態において、サンプルは、例えば本明細書中で先に記載される組織または臓器に由来する細胞もしくは細胞抽出物またはそれらの混合物を含んでよい。臓器、組織、または細胞に由来する核酸調製物もまた、特に有用である。
【００６４】
サンプルは、組織学的分析用の固体マトリックス上で、または代わりに、適切な溶液、例えば抽出バッファもしくは懸濁バッファ中で調製され得、本開示は明らかに、このように調製された生物溶液の試験に及ぶ。しかしながら、例示的な一実施形態において、本開示の高スループット系は、溶液中でサンプルを用いて使用される。
【００６５】
本開示に従う例示的な他の実施形態において、遺伝的操作によって生産されたと考えられる動物が試験されて、当該動物によって示される形質が、有性の育種に起因するか、または、形質が、遺伝的操作に起因して存在し、かつ当該動物がその後、例えばＳＣＮＴによって、クローニングされたかを判定することができる。
【００６６】
したがって、当業者は、表現型形質または遺伝子型形質の起源を判定するためのプローブおよび／またはプライマーを設計することができる。当業者は、適切なプローブまたはプライマー、すなわち標的遺伝子座のマーカーまたは外来対立遺伝子を特異的に検出することができるプローブまたはプライマーが、マーカーまたは対立遺伝子を含む、試験されることになる個体由来のゲノムＤＮＡ中のゲノム領域に特異的にハイブリダイズすることとなると認識している。本明細書中で用いられる「選択的にハイブリダイズする」は、バックグラウンドを大幅に超えるレベルで標的ポリヌクレオチドがプローブにハイブリダイズすることが見出される条件下で、プローブとして用いられるポリヌクレオチドが用いられることを意味する。バックグラウンドのハイブリダイゼーションが、例えば、スクリーニングされることになるゲノムＤＮＡ中に存在する他のポリヌクレオチドにより出現する虞がある。この場合、バックグラウンドは、プローブと非特異的ＤＮＡとの相互作用によって生じるシグナルのレベルを意味する。このレベルは、標的ＤＮＡにより観察される特異的相互作用の強度の１０倍未満、好ましくは１００倍未満である。相互作用の強度は、例えば、プローブを放射性同位元素、例えば３２Ｐで識別することによって、測定される。
【００６７】
当業者に知られているように、プローブまたはプライマーは、核酸を含み、一般に最大約１００〜３００ヌクレオチド長、一部の実施形態において約５０〜１００ヌクレオチド長、または約８〜１００もしくは８〜５０ヌクレオチド長の合成オリゴヌクレオチドからなってよい。例えば、１つまたは複数のＳＮＰの検出用のロックド核酸（ＬＮＡ）またはタンパク質−核酸（ＰＮＡ）のプローブまたは分子ビーコンは、一般に、少なくとも８〜１２ヌクレオチド長である。最大数キロベース長のより長い核酸フラグメントが用いられてもよく、これは例えば、１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼで剪断または消化されたゲノムＤＮＡに由来する。これ以外にも、プローブ／プライマーは、ＲＮＡを含んでよい。しかしながら、当業者であれば直ちに、明示的に定められた境界間の全ての範囲および値が意図され、以下のいずれかが上限または下限として利用可能であることを理解するであろう：例えば、１０、５０、１００、１２０、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０から、最大少なくとも１０００ヌクレオチド。
【００６８】
本開示に用いられる例示的なプローブまたはプライマーは、本明細書中に記載される高スループット系と適合すると考えられる。例示的なプローブおよびプライマーは、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはタンパク質−核酸（ＰＮＡ）のプローブまたは分子ビーコンを含むこととなり、これらは好ましくは、固体相に結合されている。例えば、固体支持体に結合されたＬＮＡまたはＰＮＡのプローブが用いられ、当該プローブは、それぞれＳＮＰを含み、そして、試験されることになる個体が属する種のゲノムにまたがるのに十分なプローブが、固体支持体に結合されている。
【００６９】
プローブまたはプライマーの数は、スクリーニングされることになる遺伝子座またはＱＴＬの数に応じて、そしてゲノム全体のスクリーニングの場合、スクリーニングされることになるゲノムのサイズに応じて変わることとなる。そのようなパラメータの決定は、当業者によって容易に、過度に実験することなく決定される。
【００７０】
プローブまたはプライマーの特異性もまた、遺伝子型分析に使用されるハイブリダイゼーション反応または増幅反応の形式によって決まり得る。
【００７１】
本開示の方法に用いられる特定のあらゆるプローブまたはプライマーの配列は、スクリーニングされることになる遺伝子座もしくはＱＴＬ、またはそれらの組合せによって決まることとなる。この点で、本開示は一般に、あらゆる遺伝子座もしくはＱＴＬの遺伝子型分析に、または任意の数のＱＴＬもしくは遺伝子座の同時遺伝子型分析もしくは連続遺伝子型分析（ゲノム全体の遺伝子型分析を含む）に用いられ得る。この普遍性は取り除かれることもないし、特定の遺伝子座もしくはＱＴＬ、またはそれらの組合せにまで下げて読まれる（ｒｅａｄ  ｄｏｗｎ  ｔｏ）こともない。プローブ／プライマー配列の決定は、当業者によって容易に、過度に実験することなく決定される
【００７２】
プローブおよび／またはプライマーを設計する標準的な方法が使用され、例えば、Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（Ｅｄｓ）（Ｉｎ：ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＮＹ，１９９５）によって記載されるものがある。種々のアッセイに最適なプローブおよび／またはプライマーを設計するソフトウェアパッケージも公開されており、例えば、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡから入手可能なＰｒｉｍｅｒ  ３がある。プローブおよび／またはプライマーは好ましくは、ヘアピン、セルフプライミングを、またはプライマーダイマーを（例えば、検出アッセイで用いられる別のプローブまたはプライマーと）形成しないものを決定するように評価される。さらに、プローブまたはプライマー（またはその配列）は好ましくは、これが標的核酸から変性する温度（すなわち、プローブまたはプライマーの融解温度またはＴｍ）を判定するために評価される。Ｔｍを判定する方法は、当該技術において知られており、例えば、Ｓａｎｔａ  Ｌｕｃｉａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１４６０−１４６５，１９９５またはＢｒｅｓｓｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：３７４６−３７５０，１９８６に記載されている。
【００７３】
ＬＮＡまたはＰＮＡのプローブまたは分子ビーコンについて、一部の例示的な実施形態において、プローブまたは分子ビーコンは、少なくとも約８〜１２ヌクレオチド長であり、より好ましくは、ＳＮＰが、プローブのおおよそ中心に位置を定められることによって、選択的なハイブリダイゼーションおよび正確な検出が容易になる。
【００７４】
対立遺伝子特異的なＰＣＲアッセイまたはリガーゼ鎖反応アッセイを用いて、１つまたは複数のＳＮＰを検出するために、プローブ／プライマーは一般に、３’末端のヌクレオチドがＳＮＰの部位にハイブリダイズするように設計される。３’末端のヌクレオチドは、ＳＮＰの部位に存在することが知られているヌクレオチドのいずれかに相補的であってよい。相補的ヌクレオチドが、プローブ／プライマー、そして多型部位の双方に出現する場合、プローブまたはプライマーの３’末端は、注目するマーカーに完全にハイブリダイズして、例えば、ＰＣＲ増幅または別の核酸へのライゲーションが容易になる。したがって、標的核酸に完全にハイブリダイズするプローブまたはプライマーは、アッセイにおいて陽性結果をもたらす。
【００７５】
プライマー伸長反応について、プローブ／プライマーは一般に、注目する特定のヌクレオチド、例えばＳＮＰに隣接する領域に特異的にハイブリダイズするように設計される。ソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴを用いて、いずれかの核酸に対するプローブまたはプライマーの相同性の程度を判定することによって、プローブまたはプライマーの特異的ハイブリダイゼーションが推定され得る一方、プローブまたはプライマーの特異性は一般に、当該技術において知られている方法を用いて、実験に基づいて決定される。
【００７６】
本開示において有用なプローブおよび／またはプライマーを生産／合成する方法が、当該技術において知られている。例えば、オリゴヌクレオチド合成が、Ｇａｉｔ（Ｅｄ）（Ｉｎ：Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４）に記載されており；ＬＮＡ合成が、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．，１：３４２３，１９９７；Ｓｉｎｇｈ  ａｎｄ  Ｗｅｎｇｅｌ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２４７，１９９８に記載されており；そしてＰＮＡ合成が、例えば、Ｅｇｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：１８９５，１９９２；Ｅｇｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６，１９９３；およびＯｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：５３３２，１９９３に記載されている。
【００７７】
サンプル中の特定のマーカーの存在を検出する多数の方法が、当該技術において知られている。
【００７８】
例示的な一実施形態において、個体由来のサンプル中のマーカーに選択的にハイブリダイズするプローブまたはプライマーを、中程度のストリンジェンシー条件下で、好ましくは高ストリンジェンシー条件下で用いて、前記マーカーは検出される。プローブまたはプライマーが、適切なリポーター分子、例えば、化学発光標識、蛍光標識、放射性標識、酵素、ハプテン、または特有のオリゴヌクレオチド配列その他で検出可能に標識されているならば、リポーター分子の結合を判定することによって、ハイブリダイゼーションは直接検出され得る。これ以外にも、増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または類似した形式を実行して、増幅された核酸を検出することによって、ハイブリダイズされたプローブまたはプライマーが検出され得る。好ましくは、プローブまたはプライマーは、例えば本開示の高スループット系において、固体支持体に結合されている。
【００７９】
ハイブリダイゼーションに用いられることになるストリンジェンシーのレベルを定義する目的で、低ストリンジェンシーは、本明細書中で、２〜６×ＳＳＣバッファ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中で２８℃にて実行されるハイブリダイゼーション工程および／もしくは洗浄工程、または等価の条件と定義される。中程度のストリンジェンシーは、本明細書中で、０．２〜２×ＳＳＣバッファ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中で、４５℃〜６５℃の範囲内の温度にて実行されるハイブリダイゼーション工程および／もしくは洗浄工程、または等価の条件と定義される。高ストリンジェンシーは、本明細書中で、０．１×ＳＳＣバッファ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、もしくはより低い塩濃度中で、低くとも６５℃の温度にて実行されるハイブリダイゼーション工程および／もしくは洗浄工程、または等価の条件と定義される。ストリンジェンシーの特定のレベルへの本明細書中での言及は、当業者に知られているＳＳＣ以外の洗浄溶液／ハイブリダイゼーション溶液を用いる等価の条件を包含する。
【００８０】
通常、ストリンジェンシーは、ＳＳＣバッファの濃度を引き下げ、かつ／またはＳＤＳの濃度を引き上げ、かつ／またはハイブリダイゼーションおよび／もしくは洗浄の温度を上げることによって、増大する。当業者であれば、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄の条件が、サンプルＤＮＡを支持するために用いられるハイブリダイゼーションマトリックスの性質、または用いられるハイブリダイゼーションプローブのタイプに応じて変わり得ることを知っているであろう。
【００８１】
次第に高くなるストリンジェンシー条件が使用されてもよく、そこではストリンジェンシーは、より低いストリンジェンシー条件からより高いストリンジェンシー条件まで段階的に上昇する。例示的な段階的ストリンジェンシー条件は、以下の通りである：約室温での２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（ハイブリダイゼーション条件）；約室温での０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（低ストリンジェンシー条件）；約４２℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（中程度のストリンジェンシー条件）；そして約６８℃での０．１×ＳＳＣ（高ストリンジェンシー条件）。洗浄は、これらの条件の１つのみ、例えば高ストリンジェンシー条件のみを用いて実行されてもよいし、それぞれの条件が用いられてもよく、例えば、先で一覧にされた順序で、それぞれ１０〜１５分間、一覧にされた工程のいずれかまたは全てが繰り返される。しかしながら、先で言及されるように、最適な条件は、包含される特定のハイブリダイゼーション反応に応じて変わることとなり、実験に基づいて決定され得る。
【００８２】
例えば、数ある中で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅、リガーゼ連鎖反応、サイクリングプローブ技術、またはＤＮＡマイクロアレイチップ等の方法を用いて、ゲノムの領域（ハプロタイプ）、またはその発現産物の配列の修飾、例えば挿入（例えば、標的遺伝子座での外来対立遺伝子の導入）、欠失、転換、または転移が検出される。
【００８３】
ＰＣＲ法が、当該技術において知られており、例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ（ｅｄ．）ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（ｅｄ）（Ｉｎ：ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＮＹ，１９９５）に記載されている。通常、ＰＣＲについて、少なくとも約１５ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長を含む２つの非相補的核酸プライマー分子が、核酸鋳型分子の異なる鎖にハイブリダイズされて、鋳型の特定の核酸分子コピーが、酵素によって増幅される。ＰＣＲ産物は、電気泳動、および核酸に結合する検出可能なマーカーによる検出を用いて、検出され得る。これ以外にも、オリゴヌクレオチドの１つまたは複数が、検出可能なマーカー（例えば、フルオロフォア）で標識されて、例えばｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡ）を用いて、増幅産物が検出される。明らかに、本開示はまた、ＰＣＲ、例えばＴａｑｍａｎアッセイの量的形態を包含する。
【００８４】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、および制限酵素を利用して、標的配列を増幅する。オリゴヌクレオチドが、標的核酸にハイブリダイズされて、ポリメラーゼが用いられて、この領域のコピーが生産される。次に、コピーされた核酸および標的核酸の二重鎖が、コピーされた核酸の始まりの配列を特異的に認識するエンドヌクレアーゼにより、ニックを入れられる。ＤＮＡポリメラーゼが、ニックを入れられたＤＮＡを認識して、標的領域の別のコピーを生産すると同時に、以前に生じた核酸を置換する。ＳＤＡの利点は、等温形式で起こることによって、高スループット自動化分析を容易にすることである。
【００８５】
リガーゼ連鎖反応（例えば、ＥＰ３２０，３０８号明細書および米国特許第４，８８３，７５０号明細書に記載されている）は、互いに隣接するようにして標的核酸に結合する少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを用いる。次に、リガーゼ酵素が用いられて、オリゴヌクレオチドを連結する。次に、サーマルサイクリングを用いて、連結されたオリゴヌクレオチドが、更なるオリゴヌクレオチドの標的になる。次に、例えば、電気泳動またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いて、連結されたフラグメントが検出される。代わりに、または、加えて、プローブの１つまたは複数が、検出可能なマーカーで標識されることによって、迅速な検出が促進される。
【００８６】
サイクリングプローブ技術は、標的配列にハイブリダイズすることができるＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡを含むキメラ合成プローブを用いる。標的配列へのハイブリダイゼーション直後に、形成されたＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖が、ＲＮａｓｅ  Ｈの標的となることによって、プローブが切断される。次に、例えば、電気泳動またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いて、切断されたプローブが検出される。
【００８７】
ＳＮＰを検出する更なる方法が、当該技術において知られており、例えば、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８：７６９−７７６，１９９８（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）にレビューされている。
【００８８】
例えば、ＤＮＡをエンドヌクレアーゼで消化して、例えばサザンブロッティング（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ（Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＩＳＢＮ  ０４７  １５０３３８，１９８７）（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００１）（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されている）を用いて、注目するフラグメントを検出することによって、制限酵素の認識配列である配列を導入または変更するＳＮＰが検出される。これ以外にも、先で記載される核酸増幅法が、ＳＮＰを包囲する領域を増幅するために用いられる。次に、増幅産物が、エンドヌクレアーゼとインキュベートされて、生じたあらゆるフラグメントが、例えば、電気泳動、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、またはＰＣＲによって検出される。
【００８９】
ジデオキシチェーンターミネーション法またはマクサム−ギルバート法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄ．，ＣＳＨＰ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９）；Ｚｙｓｋｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，１９８８）（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）参照）を用いて、本開示の多型配列の直接的分析が達成され得る。例えば、１つまたは複数のマーカーを含むゲノムＤＮＡの領域が、増幅反応、例えばＰＣＲを用いて増幅され、そして増幅産物の精製後、増幅核酸が、配列決定反応に用いられて、注目するＳＮＰの部位の一方または双方の対立遺伝子の配列が判定される。
【００９０】
これ以外にも、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）を用いて、１つまたは複数のＳＮＰが検出される。ＳＳＣＰは、核酸における二次構造の形成および当該二次構造の配列依存的性質によっている。この分析の一形態において、増幅法、例えば先で記載される方法が、ＳＮＰを含む核酸を増幅するために用いられる。次に、例えば、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動、質量分析、または液体クロマトグラフィ（例えば、ＨＰＬＣまたはｄＨＰＬＣ）を用いて、増幅された核酸が変性、冷却、かつ分析される。異なる配列を含む領域は、異なる二次構造を形成し、そして結果として、例えば、ゲルおよび／または荷電場中を、異なる速度で移動する。明らかに、迅速なマーカー検出を容易にするために、検出可能マーカーが、ＳＳＣＰ分析に有用なプローブ／プライマー中に組み込まれてよい。
【００９１】
これ以外にも、例えば、質量分析またはキャピラリ電気泳動を用いて、あらゆるヌクレオチド変化が検出され得る。例えば、試験サンプル由来の、ＳＮＰを含むＤＮＡ領域の増幅産物が、ＳＮＰの部位にて知られている遺伝子型を有する個体由来の増幅産物と混合される。産物は変性して、再アニールが可能になる。ＳＮＰの位置にて異なるヌクレオチドを含むサンプルは、コントロールサンプル由来の核酸分子に完全にアニールせず、これによって、完全にアニールした核酸と比較して、核酸の電荷および／または構造が変わることとなる。このような誤った塩基対形成が、例えば質量分析を用いて、検出可能である。
【００９２】
対立遺伝子特異的ＰＣＲ（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７：３８９−３９８，１９９７に記載されている）（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）もまた、ＳＮＰの一方または他方の対立遺伝子の存在を判定するのに有用である。注目するＳＮＰの特定の形態（すなわち対立遺伝子）に、最も３’末端の（ｍｏｓｔ  ３’）塩基がハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが、設計される。ＰＣＲ反応の間、オリゴヌクレオチドの３’端は、検出されるＳＮＰの特定の形態を含まない標的配列に、ハイブリダイズしない。したがって、ＰＣＲ産物がほとんど、または全く生産されず、このことは、オリゴヌクレオチド中に存在する塩基以外の塩基が、サンプル中のＳＮＰの部位に存在することを示している。次に、例えば、ゲル電気泳動もしくはキャピラリ電気泳動、または質量分析を用いて、ＰＣＲ産物が検出される。
【００９３】
プライマー伸長方法（例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ（ｅｄ．）ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（ｅｄ）（Ｉｎ：ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＮＹ，１９９５に記載されている）もまた、ＳＮＰの検出に有用である。ＳＮＰに隣接する核酸領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが用いられる。このオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ、およびＳＮＰの部位に出現する、考えられる塩基のいずれかに対応する遊離ヌクレオチド二リン酸（ｆｒｅｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）によるプライマー伸長プロトコルに用いられる。好ましくは、ヌクレオチド二リン酸は、検出可能なマーカー（例えばフルオロフォア）で標識される。プライマー伸長の後、結合していない標識ヌクレオチド二リン酸が、例えば、サイズ排除クロマトグラフィもしくは電気泳動を用いて、除去されて、または、例えばアルカリホスファターゼを用いて、加水分解されて、オリゴヌクレオチド中への標識ヌクレオチドの組込みが検出され、これは、当該塩基が、ＳＮＰの部位に存在することを示している。代わりに、または加えて、本明細書中で例示されるように、質量分析（例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を用いて、プライマー伸長産物が検出される。
【００９４】
本開示は、プライマー伸長分析、例えばミニシーケンス（Ｓｙ  Ｖａｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ９：３４１−３４２，１９９５）（その全体が参照によって組み込まれる）の高スループット形態におよび、そこでは、プローブもしくはプライマー、または複数のプローブもしくはプライマーが、固体支持体（例えばガラススライド）上に固定されて、核酸を含むサンプルが、プローブまたはプライマーと接触して、プライマー伸長反応が実行されて、遊離ヌクレオチド塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔがそれぞれ、異なる検出可能マーカーで標識されて、各プローブおよび／または各プライマーに結合される検出可能マーカーを判定することによって、１つまたは複数のＳＮＰの有無が判定される。
【００９５】
蛍光標識されたロックド核酸（ＬＮＡ）分子または蛍光標識されたタンパク質−核酸（ＰＮＡ）分子が、ＳＮＰの検出に有用である（Ｓｉｍｅｏｎｏｖ  ａｎｄ  Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０（１７）：１−５，２００２に記載されている）。ＬＮＡ分子およびＰＮＡ分子は、核酸、特にＤＮＡに、高い親和性で結合する。ＬＮＡまたはＰＮＡのプローブに結合されるフルオロフォア（特に、ローダミンまたはヘキサクロロフルオレセイン）が、標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーション直後に、標的核酸にハイブリダイズしなかったプローブと比較して、顕著に高いレベルで蛍光を発する。しかしながら、蛍光のレベル増大は、ヌクレオチドのミスマッチが１つ生じた場合ですら、同じレベルに増強されない。したがって、サンプル中で検出される蛍光の程度は、例えばＳＮＰの存在下で、ＬＮＡまたはＰＮＡのプローブと標的核酸とのミスマッチの存在を示す。好ましくは、例えば、先で記載される増幅方法を用いて以前に増幅された核酸の単一塩基変化を検出するのに、蛍光標識ＬＮＡまたはＰＮＡ技術が用いられる。
【００９６】
当業者にとって明らかであるように、ＬＮＡまたはＰＮＡによる検出技術は、Ｄｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ，４５：１８９８−１９０５，１９９９（その全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ＬＮＡまたはＰＮＡのプローブを固体支持体に固定する、１つまたは複数のマーカーの高スループット検出に適用可能である。
【００９７】
同様に、サンプル中で、または増幅された産物中で、ＳＮＰを直接検出するのに、分子ビーコンが有用である（例えばＭｈｌａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｌｍｂｅｒｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：４６３−４７１，２００１参照）（その全体が本明細書に組み込まれる）。分子ビーコンは、ステム−ループ構造を有する一本鎖核酸分子である。ループ構造は、注目するＳＮＰを包囲する領域に相補的である。ステム構造は、プローブの両側上の、互いに相補的な２本の「アーム」をアニールすることによって、形成される（ループ）。蛍光部分が、一方のアームに結合される。そして、他方のアームに結合した標的配列に分子ビーコンが結合されない場合に、クエンチ部分が、検出可能なあらゆる蛍光を抑制する。ループ領域の、その標的核酸への結合直後に、アームは分離されて、蛍光が検出可能である。しかしながら、塩基ミスマッチが１つでもあれば、サンプル中で検出される蛍光レベルは顕著に変更される。したがって、ＳＮＰの部位での特定の塩基の有無は、検出される蛍光レベルによって判定される。
【００９８】
本開示はまた、遺伝的マーカー、例えばユニーク配列、ＳＮＰ、または外来対立遺伝子を検出する他の方法、例えば、マイクロアレイ（例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘから市販されており、または、例えば、米国特許第６，４６８，７４３号明細書（その全体が本明細書に組み込まれる）もしくはＨａｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４：４４１，１９９６に記載されている）（その全体が本明細書に組み込まれる）、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ａｓｓａｙｓ（例えばＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されており、そしてＬｉｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，９：３４１−３４２，１９９５に記載されている）（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）、固相ミニシーケンス（Ｓｙｖａｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１３：１００８−１０１７，１９９２に記載されている）（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）、ＦＲＥＴによるミニシーケンス（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｋｗｏｋ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３４７−３５３，１９９７に記載されている）（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）、またはパイロミニシーケンス（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，８（８）：７６９−７７６，１９９８にレビューされている）（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を包含する。
【００９９】
多型またはマーカーが、ＲＮＡをコードする核酸の領域内に存在する場合において、前記多型または前記マーカーは、ＲＴ−ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、またはＴＭＡ（転写媒介性増幅）等の方法を用いて検出される。
【０１００】
ＲＴ−ＰＣＲ法は、当該技術において知られており、例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ（ｅｄ．）ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ  （ｅｄ）（Ｉｎ：  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＮＹ，１９９５（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１０１】
ＴＭＡ法または自家持続配列複製（３ＳＲ）法は、標的配列、ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ  Ｈ、および逆転写酵素の側面に位置する２つ以上のオリゴヌクレオチドを用いる。一オリゴヌクレオチド（ＲＮＡポリメラーゼ結合部位も含む）が、標的配列を含むＲＮＡ分子にハイブリダイズして、逆転写酵素が、この領域のｃＤＮＡコピーを生産する。ＲＮａｓｅ  Ｈが、ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体中のＲＮＡを消化するのに用いられ、そして第２のオリゴヌクレオチドが、ｃＤＮＡのコピーを生産するのに用いる。次に、ＲＮＡポリメラーゼが、ｃＤＮＡのＲＮＡコピーを生産するのに用いられ、そして当該プロセスが繰り返される。
【０１０２】
ＮＡＳＢＡ系は、３つの酵素（逆転写酵素、ＲＮａｓｅ  Ｈ、およびＲＮＡポリメラーゼ）の、標的ｍＲＮＡ配列を選択的に増幅する同時活性によっている。標的配列にハイブリダイズし、かつ５’末端にＲＮＡポリメラーゼ結合部位を含むオリゴヌクレオチドを用いた逆転写によって、ｍＲＮＡ鋳型がｃＤＮＡに転写される。鋳型ＲＮＡは、ＲＮａｓｅ  Ｈで消化され、そして二本鎖ＤＮＡが合成される。次に、ＲＮＡポリメラーゼが、ｃＤＮＡの複数のＲＮＡコピーを生産し、そして当該プロセスが繰り返される。
【０１０３】
マーカーへのハイブリダイゼーションおよび／またはマーカーの増幅が、例えば、電気泳動および／または質量分析を用いて、検出可能である。この点に関して、増幅反応に用いられるプローブ／プライマーの１つもしくは複数、および／またはヌクレオチドの１つもしくは複数が、マーカーの迅速な検出を容易にするために、検出可能マーカー、例えば、蛍光標識（例えば、Ｃｙ５またはＣｙ３）または放射性同位体（例えば３２Ｐ）で標識されてよい。
【０１０４】
これ以外にも、核酸の増幅は、例えば、米国特許第６，１７４，６７０号明細書に記載されるような、融解曲線分析法を用いて、継続的に監視され得る。そのような方法は、生体サンプル中の選択的スプライスフォームのレベルを判定するのに適している。
【０１０５】
本開示の方法は、ゲノム全体の配列決定法または「ミクロシーケンス」法を用いて、ＳＮＰでのヌクレオチドの存在を同定することができる。個体のゲノム全体の配列決定により、単回分析で全てのＳＮＰ遺伝子型が同定される。ミクロシーケンス法は、「所定の」部位の単一ヌクレオチドのみの同一性を判定する。そのような方法は、標的ポリヌクレオチドにおける多型の存在および同一性を判定するのに、特に有用である。そのようなミクロシーケンス法、およびＳＮＰ遺伝子座でのヌクレオチドの存在を判定する他の方法が、Ｂｏｙｃｅ−Ｊａｃｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ．、米国特許第６，２９４，３３６号（参照によって本明細書に組み込まれる）で考察されている。
【０１０６】
ミクロシーケンス法として、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（国際公開第９２／１５７１２号パンフレット（参照によって本明細書に組み込まれる））によって開示されるＧｅｎｅｔｉｃ  Ｂｉｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ法が挙げられる。ＤＮＡ中の多型部位をアッセイするための更なるプライマー誘導ヌクレオチド組込み手順もまた記載されている（Ｋｏｍｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：７７７９−７７８４，１９８９；Ｓｏｋｏｌｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：３６７１（１９９０）；Ｓｙｖａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８：６８４−６９２，１９９０；Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：１１４３−１１４７，１９９１；Ｐｒｅｚａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１：１５９−１６４，１９９２；Ｕｇｏｚｚｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＧＡＴＡ  ９：１０７−１１２，１９９２；Ｎｙｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：１７１−１７５，１９９３；Ｗａｌｌａｃｅ，国際公開第８９／１０４１４号パンフレット；Ｍｕｎｄｙ，米国特許第４，６５６，１２７号明細書；Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＲ第２，６５０，８４０号明細書；国際公開第９１／０２０８７号パンフレット）。配列を分析するためにゲル電気泳動を使用する際に直面する困難に対して、ミクロシーケンスの代替方法、例えば、Ｍａｃｅｖｉｃｚ、米国特許第５，００２，８６７号明細書（参照によって本明細書に組み込まれる）が開発された。Ｂｏｙｃｅ−Ｊａｃｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第６，２９４，３３６号明細書は、ポリヌクレオチド標的に選択的に結合するプライマーを、ＳＮＰが、当該標的に選択的に結合される最も３’末端のヌクレオチドである部位にて利用することによって、核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の配列を判定する固相配列決定法を提供している。Ｏｌｉｐｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｐｐｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｕｎｅ  ２００２は、ＳＮＰのヌクレオチドの存在を判定するための、ＢｅａｄＡｒｒａｙ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの使用を記載している。これ以外にも、ＳＮＰのヌクレオチドの存在は、ＤＮＡ  ＭａｓｓＡｒｒａｙ系（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を用いて判定され得、当該系は、ＳｐｅｃｔｒｏＣｈｉｐｓ（商標）、マイクロフルイディクス、ナノ分配、生化学、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（飛行時間型質量分析のマトリックスアシストレーザー離脱イオン化時間）を組み合わせるものである。
【０１０７】
特に有用な方法として、高スループット形式に、マルチプレックス形式に、または双方に容易に適応可能なものが挙げられる。マーカー、とりわけＳＮＰを分析するための高スループット系として、例えば、プラットフォーム、例えば、ＵＨＴ  ＳＮＰ−ＩＴ（商標）プラットフォーム（Ｏｒｃｈｉｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ）、ＭａｓｓＡｒｒａｙ（商標）系（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）、一体化ＳＮＰ遺伝子型分析系（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）、ＴａｑＭａｎ（商標）（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）、ローリングサークル増幅、蛍光偏光（とりわけ本明細書において先で記載されたもの）が挙げられ得る。一般に、ＳＮＰ−ＩＴ（商標）は、３工程のプライマー伸長反応である。第１の工程において、標的ポリヌクレオチドが、捕捉プライマーへのハイブリダイゼーションによって、サンプルから単離され、これにより第１のレベルの特異性が実現される。第２の工程において、捕捉プライマーが、標的ＳＮＰ部位にて終端するヌクレオチド三リン酸から伸長され、これにより第２のレベルの特異性が実現される。第３の工程において、以下が挙げられる、種々の知られている形式を用いて、伸長されたヌクレオチド三リン酸が検出され得る：直接蛍光、間接蛍光、間接比色アッセイ、質量分析、蛍光偏光、その他。反応は、ＳＮＰｓｔｒｅａｍ（商標）機器（Ｏｒｃｈｉｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）を用いて、３８４ウェル形式で、自動化形式で処理され得る。
【０１０８】
遺伝子型選択のための高スループット系
本開示はまた、有効集団サイズが小さい集団での遺伝子型選択のための高スループット系を提供する。一部の実施形態において、当該系は、固体支持体を含み、当該固体支持体は、これに直接的に、または間接的に結合される異なる配列の核酸から本質的になり、または同核酸を有する。異なる配列の各核酸は、現在の集団を代表する、祖先または創始者に由来する多型遺伝的マーカーを含む。
【０１０９】
例示的な高スループット系は、ハイブリダイゼーション媒体、例えば、マイクロフルイディックデバイスまたは同質のアッセイ媒体である。マイクロチャンネルを有する固体支持体が挙げられる多数のマイクロフルイディックデバイスが知られている（例えば、米国特許第５，３０４，４８７号明細書；米国特許第５，１１０，７４５号明細書；米国特許第５，６８１，４８４号明細書；および米国特許第５，５９３，８３８号明細書参照）。例示的な一実施形態において、高スループット系は、ＳＮＰを含む配列からそれぞれなる１０，０００〜１００，０００オリゴヌクレオチドを含むＳＮＰチップを備える。これらのハイブリダイゼーション媒体はそれぞれ、形質と関連したマーカーの有無を判定するのに適している。
【０１１０】
核酸は典型的に、固体支持体に直接的に、または間接的に付着したオリゴヌクレオチドである。したがって、オリゴヌクレオチドは、例えば対象の核酸におけるＳＮＰの有無による、問題のマーカーのヌクレオチドの存在によって影響を受けることになる、固体支持体に結合された一連のオリゴヌクレオチドのあるオリゴヌクレオチドへの、試験されることになる対象由来の核酸のハイブリダイゼーションによって、形質と関連したマーカーのヌクレオチドの存在を判定するのに用いられる。したがって、各マーカーのゲノム位置に、またはその近くに結合するオリゴヌクレオチドが選択され得る。そのようなオリゴヌクレオチドとして、試験されることになる、対象から得られた鋳型核酸中に存在する特定の多型マーカーの増幅を支持することができるフォワードオリゴヌクレオチドおよびリバースオリゴヌクレオチドが挙げられ得る。代わりに、または加えて、オリゴヌクレオチドは、マーカーの近くにハイブリダイズすることによって、同定の目的で、マーカーへの伸長を支持する伸長プライマー配列を含んでよい。適切な検出方法が、例えば、本明細書中に記載される遺伝子型分析法において、オリゴヌクレオチドの結合またはタギングを検出するであろう。
【０１１１】
ＤＮＡ分子の固定化アレイを生産する技術が、当該技術において記載されている。通常、ほとんどの方法は、例えば、固体基質上の種々の離散的位置にて配列の種々の並べ換え（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）を構築するためのマスキング技術を用いる、一本鎖核酸分子アレイを合成する方法を記載している。米国特許第５，８３７，８３２号明細書（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）（この出願の内容は参照によって本明細書に組み込まれる）は、非常に大規模の統合技術に基づいて、シリコン基質に固定されたＤＮＡアレイを生産する改良法を記載している。特に、米国特許第５，８３７，８３２号明細書（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）は、固定化ＤＮＡアレイを生産するために用いられる基質上の、空間的に定義された位置にて、プローブの特定のセットを合成する、「タイリング」と呼ばれる戦略を記載している。米国特許第５，８３７，８３２号明細書（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）はまた、より初期の技術（これも用いられ得る）についての参照を提供している。
【０１１２】
ＤＮＡは、基質の表面上にてインサイチュで合成されてよい。しかしながら、例えば、ピンまたは圧電素子を備えたロボットデバイスを用いて、ＤＮＡが基質上に直接プリントされてもよい。一般に、支持体上への標的の直接的なインサイチュ合成によって、または代わりに、予め調製された標的の外因的な堆積によって、マイクロアレイが段階を追って生産される。一般に、フォトリソグラフィ、機械マイクロスポッティング、およびインクジェット技術が、マイクロアレイを生産するために使用される。
【０１１３】
フォトリソグラフィにおいて、感光性保護基で修飾したガラスウエハが、例えばＤＮＡ合成のために、フォトマスクを通して光を当てることによって、選択的に活性化される。脱保護およびカップリングのサイクルの繰返しにより、高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイの調製が可能となる（例えば、１９９８年４月２８日発行の米国特許第５，７４４，３０５号明細書参照）（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１１４】
マイクロスポッティングは、予め製造した少量の標的物質を固体表面上にプリントすることによって、自動化マイクロアレイ生産を可能にする堆積技術を包含する。プリンティング基質と送達機構、例えばピンまたはキャピラリとの直接的な表面接触によって、プリンティングが達成される。ロボット制御系および多重プリントヘッドにより、自動化マイクロアレイの製造が可能となる。
【０１１５】
インクジェット技術は、ミニチュアノズルから固体表面に生化学的物質を輸送するために、圧電形態および他の推進形態を利用する。圧電気を用いて、電流を圧電性結晶に通すことで、これが広がってサンプルを放出するように広がることによって、標的サンプルが放出される。圧電推進技術は、コンティニュアスデバイスおよびドロップオンデマンドデバイスを含む。圧電インクジェットに加えて、熱が用いられて、流滴が、バブルジェットヘッドまたは熱インクジェットヘッドを用いて形成かつ推進されてよい；しかしながら、そのような熱インクジェットは典型的に、生体サンプルにとって多くの場合ストレスとなる熱に起因して、生物学的材料の輸送に不適である。インクジェット技術の使用の例として、米国特許第５，６５８，８０２号明細書（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）が挙げられる。
【０１１６】
複数の核酸が、典型的に、固体基質の離散的領域上に、または同離散的領域内に固定される。基質は、基質内での固定を可能にするために多孔性であり、または表面固定を可能にするために、実質的に非多孔性である。
【０１１７】
固体基質は、ポリペプチドが直接的にでも間接的にでも結合することができるあらゆる材料から製造され得る。適切な固体基質の例として、平坦なガラス、シリコンウエハ、マイカ、セラミックス、ならびに、ポリスチレンおよびポリメタクリレートが挙げられるプラスチック等の有機ポリマーが挙げられる。半透膜、例えばニトロセルロース膜またはナイロン膜を用いることも可能であり、これらは広く入手可能である。半透膜は、よりロバストな固体表面、例えばガラス上に載せられる。表面は、場合によっては、金属、例えば金、白金、または他の遷移金属の層でコーティングされてもよい。
【０１１８】
好ましくは、固体基質は、一般に、表面が硬質または半硬質の材料である。一部の実施形態において、基質の少なくとも一表面が、実質的に平坦であろう。一方で、一部の実施形態において、合成領域を物理的に分離して、異なるポリマーが、例えば、領域が起立し、または溝がエッチングされていることが所望される。また、一実施形態において、固体基質は、１０，０００から４０，０００ｃｍ−２の密度を与える、典型的に５０から１００μｍの離散的領域におけるＤＮＡ配列の高密度利用に適している。
【０１１９】
固体基質は、好都合には、区分に分割される。これは、フォトエッチング等の技術よって、または疎水性インク、例えばＴｅｆｌｏｎベースのインク（Ｃｅｌ−ｌｉｎｅ，ＵＳＡ）の塗布によって、達成される。
【０１２０】
異なるアレイ部材がそれぞれ位置決めされている離散的位置が、好都合なあらゆる形状を有してよく、例えば、環形状、矩形状、楕円形状、くさび形状その他がある。
【０１２１】
基質への核酸の付着は、一般に核酸が結合する分子の層を介して、共有結合であっても非共有結合であってもよい。例えば、核酸プローブ／プライマーが、ビオチンで標識され、かつ基質が、アビジンおよび／またはストレプトアビジンでコーティングされてよい。ビオチン化されたプローブ／プライマーを用いる好都合な特徴は、固体基質へのカップリング効率が容易に判定されることである。
【０１２２】
例えばガラスの場合、固体基質とプローブ／プライマーとの間に化学界面が提供されてよい。適切な化学界面の例として、ヘキサエチレングリコール、ポリリシンが挙げられる。例えば、ポリリシンは、標準的な手順を用いて、親和性リガンドを導入するように化学的に修飾され得る。
【０１２３】
プローブ／プライマーを固体基質の表面に付着させる他の方法として、例えば、国際公開第９８／４９５５７号パンフレット（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載される、当該技術において知られているカップリング剤の使用が挙げられる。
【０１２４】
本開示の高スループット系は、一ＳＮＰまたは一連のＳＮＰのヌクレオチドの存在を判定するように設計される。当該系は、ゲノム全体の高密度ＳＮＰマップ全体のヌクレオチドの存在を判定することができる。
【０１２５】
マーカー、とりわけＳＮＰを分析する高スループット系として、例えば、プラットフォーム、例えば、ＵＨＴ  ＳＮＰ−ＩＴプラットフォーム（Ｏｒｃｈｉｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ）、ＭａｓｓＡｒｒａｙ（商標）系（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）、一体化ＳＮＰ遺伝子型分析系（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）、ＴａｑＭａｎ（商標）（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）が挙げられ得る。例示的な核酸アレイは、国際公開第９５／１１９９５号パンフレット（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されるタイプのものであり、国際公開第９５／１１９９５号パンフレット（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）はまた、予め特徴付けられた多型の変異体形態の検出に最適化されたサブアレイを記載している。そのようなサブアレイは、第１の参照配列の対立遺伝子変異体である第２の参照配列に相補的であるように設計されたプローブを含有する。第２のグループ（または更なるグループ）の包含は、プローブの長さと同程度の短い距離の範囲内で複数の突然変異（例えば、９〜２１塩基の範囲内で２つ以上の突然変異）が出現することが予想される、一次参照配列の短いサブ配列を分析するのに特に有用であり得る。より好ましくは、高スループット系は、ＳＮＰマイクロアレイを備え、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘから入手可能な、または、例えば、米国特許第６，４６８，７４３号明細書（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）もしくはＨａｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４：４４１，１９９６（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されるものがある。
【０１２６】
ＤＮＡアレイは典型的に、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラまたは共焦点撮像系によって、同時に読まれる。これ以外にも、ＤＮＡアレイは、検出のために、ｘ−ｙ方向に動くことができる適切な装置、例えばプレートリーダ内に入れられてよい。このように、各離散的位置についての特性の変化は、各離散的エレメントを順番に、検出手段に沿って配置するようなアレイのコンピュータ制御移動によって、自動的に測定される。
【０１２７】
検出手段は、光学的に、または電気的に、ライブラリアレイ内の各位置を調べることができる。適切な検出手段の例として、ＣＣＤカメラまたは共焦点撮像系が挙げられる。
【０１２８】
当該系はさらに、一連のオリゴヌクレオチドの、一連のＳＮＰへの結合を検出するための検出機構を備えてよい。そのような検出機構は、当該技術において知られている。
【０１２９】
本開示の高スループット系は、試薬、典型的には液体を、固体支持体に塗布するのに用いられ得る試薬ハンドリング機構を備えてよい。
【０１３０】
高スループット系はまた、固体支持体および検出機構を動かすのに有効な機構を備えてもよい。
【０１３１】
近年、ハプロタイプ中への外来対立遺伝子の効率的な非減数分裂遺伝子移入を実現するために、カスタムヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を用いた、遺伝的修飾動物を作出する方法が同定された。そのような修飾は、遺伝子または対立遺伝子の特定の配列構造、およびこれをその染色体上で包囲する配列を同定することによって、なされ得る。分子生物学、遺伝子配列決定、および動物クローニングの急速な進歩に起因して、離散的遺伝子を同定し、かつその機能を、他の種の知られている遺伝子との相同性によって同定または仮定する能力は、科学者に、動物本来の遺伝物質を修飾しようと企てるだけでなく、他の動物、例えば、異なる品種、系統、株、または種から、宿主種の在来の遺伝子または対立遺伝子の部位であり得る同定された遺伝子座中に相同遺伝子（すなわち外因性遺伝子）を挿入する能力を提供してきた。さらに、そのような挿入または遺伝子移入の利点は、宿主動物のドナーから不必要な遺伝子を加えることなく形質を付与するように、家畜育種、交雑育種、および戻し交雑の従来の方法による代わりに、一世代で種または品種に特定の形質が付与され得ることである。例えば、米国特許出願公開第２０１２／０２２２１４３号明細書（その全体が全ての目的について本明細書に組み込まれる）は、安定して発現される表現型をもたらすために家畜ゲノム中に所望の形質を導入するのに非減数分裂遺伝子移入を用いる方法を記載している。
【０１３２】
正確な遺伝子編集を用いて、動物のゲノム中の標的対立遺伝子、より具体的には宿主動物認識ハプロタイプ内の標的対立遺伝子が、挿入または欠失により所望される通りに編集され得る。例えば、家畜のあらゆる品種に特定の他の遺伝子、対立遺伝子、または表現型形質を変更することなく、新しい形質を発現するために、効率的な非減数分裂遺伝子移入が、単一塩基を変えるのに用いられてもよいし、単一対立遺伝子または複合対立遺伝子を同相で（ｉｎ  ｐｈａｓｅ）挿入するのに用いられてもよい。
【０１３３】
そのような例において、特定の家畜動物が、その認識された表現型に対して、外来である一部の形質を示す（または欠く）かを、そして当該形質の存在（またはその欠如）が、正確な遺伝子編集の結果であるか、ランダムな突然変異の、またはそのような形質を付与する別の動物との有性交雑育種の結果であるかを同定することが、必須となり得る。そのような場合、家畜化された動物の、知られているハプロタイプ内の外来対立遺伝子または外因性対立遺伝子の存在が、同定され得る。当業者であれば、ハプロタイプ内に含有される、知られているＤＮＡ配列（またはマーカー）が同定され得るならば、そして外来ＤＮＡが標的遺伝子座の当該ハプロタイプ中に導入されたならば、ハプロタイプ内の在来対立遺伝子の部位（例えば標的遺伝子座）に挿入されたＤＮＡの存在により動物を同定することが可能であろうと理解するであろう。
【０１３４】
互いに密に近接する、染色体上の対立遺伝子は、独立して分離しないような顕著な連鎖不平衡を示す。むしろ、互いに５００塩基以内にある対立遺伝子は、それらの対立遺伝子を示す動物が、有性生殖の産物である場合ですら、一緒に分離する可能性が高い。さらに、当業者は、染色体上の対立遺伝子同士が近いほど、共分離することとなる可能性が高いと認識する。したがって、標的遺伝子座に５００塩基よりも近い対立遺伝子および／またはＳＮＰもまた、ハプロタイプマーカーとして用いられ得、一部の場合において、２００塩基、１００塩基、または５０塩基以内の対立遺伝子が同定されることとなる。
【０１３５】
技術の進歩により、動物の全ゲノムを配列決定する能力が提供されてきた。例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｇｒａｍは、ウシ、ブタ、ニワトリ、ヒツジ、ウマが挙げられる家畜、および水産養殖で用いられる生物のゲノム配列決定を統合することを目標としている（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｎｉｍａｌｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／参照）。一部の場合において、所望の品種を得ようと家畜が数百年という育種および交雑育種に曝されてきたため、そのような品種の遺伝的多様性は、限られている。例えば、Ｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許出願公開第２０１４／０２２０５７５号明細書）（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）は、人気の家畜品種の有効な集団サイズ（Ｎｅ）が、数および地理的分布が大きなものと比較した場合に、極端に小さいと推定している。例えば、ウシの中で、ホルスタイン−フリージアン種のＮｅは５０から１００；ブラウンスイス種で約４６、ホルスタイン種で４９、そしてレッド・デーニッシュ種で４７であると推定されている。ヒツジにおいて、ドーセット−ランブイエ−フィンシープ交雑種のＮｅは３５である。ブタは、Ｎｅが僅かに高く、Ｈａｒｍｅｇｎｉｅｓ種について＜２００；デュロック／ラージホワイト種について８５、そしてラージホワイト種について３００と推定されている。ニワトリも同様に、小さなＮｅを示し、例えばＬａｙｅｒｓ品種について、９１から１２３であると推定されている。
【０１３６】
結果的に、育種の見地から、そして経済的見地から、動物にとって外来の表現型形質のソースが、天然の突然変異から生じているのか、有性生殖から生じているのか、または形質が、クローニングされた動物中に導入された外来対立遺伝子から生じているのかを同定することが重要である。先で考察されたように、形質、例えば無角（ＰＯＬＬＥＤ）が、ウシの有角品種中に、例えば、有角品種（ホルスタイン）と無角品種（アンガス）の交雑および戻し交雑に続いて、無角後代の、ホルスタインとの戻し交雑を介して導入されて、従来通り許容可能な（例えば主観的表現型の）無角ホルスタインに到達したならば、多くの世代を必要とする他に、その交雑の遺伝子型の結果は、無角対立遺伝子と連鎖不平衡にある無角ゲノムの部分（発現されるか否かに拘らない）を含むこととなる。アンガスゲノムのそのような部分を導入することは、ホルスタイン品種に有益でない虞があり、そして同様に、他の形質または特性を変える虞がある。さらに、ホルスタインハプロタイプにおける、無角対立遺伝子に連鎖するアンガス対立遺伝子の存在は、有性交雑による無角遺伝子の導入によることが決定的であろう。逆に、無角遺伝子が、遺伝的操作によってハプロタイプ中に導入されること（すなわち、非減数分裂遺伝子移入）に起因してハプロタイプ中に存在するならば、宿主品種（ホルスタイン）の在来ハプロタイプは、導入されたアンガスの対立遺伝子またはヌクレオチドを除いて、同じままである。
【０１３７】
この点で、特定の遺伝子編集の使用、例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）を導入するためのＴＡＬＥＮの使用は、置き換えられ、または中断されることになる在来ヌクレオチド配列についての情報を必要とする一方、上流配列または下流配列は無関係である。しかしながら、本発明者らによって認識されるように、導入された（外因性）ＤＮＡについて、宿主ハプロタイプに在来であるマーカーを、正確な挿入部位と共に同定することによって、外来対立遺伝子が分子的に宿主動物中に導入されたかどうか、または非在来対立遺伝子がランダムな突然変異によって、もしくは有性生殖によって動物において現れたかどうかを判定することが可能である。図３参照。この情報は、動物の所有者、動物の育種家、およびそのような動物の消費者に、導入された外因性対立遺伝子を除いて、動物が、その宿主／親と遺伝的に同じままであることを知る安心感を提供する。
【０１３８】
したがって、例示的な一実施形態において、本開示は、外来の対立遺伝子または表現型を発現する宿主動物が、自発的突然変異の結果であるか、選抜育種の結果であるか、遺伝的修飾の結果であるかを同定する方法を含む。したがって、本実施形態において、当該方法は、ハプロタイプ内の特定の、定義された遺伝子座での、知られている外因性対立遺伝子の存在を同定することを含む。当該方法はさらに、ハプロタイプ在来の２つ以上のマーカーを同定することを含む。一部の例示的な実施形態において、マーカーは、染色体上の標的遺伝子座の側面に位置する。他の実施形態において、マーカーは、染色体上の標的遺伝子座の同じ側面にある。もちろん、当業者であれば、２つを超えるハプロタイプマーカーがあってもよいと理解するであろう。例えば、３つ、４つ、または５つのハプロタイプマーカーがあってもよい。マーカーは、染色体上の標的遺伝子座の側面に位置してもよいし、マーカーは全て、染色体上の標的遺伝子座の同じ側面にあってもよい。
【０１３９】
先で一般的に記載されるデバイスおよび化合物の種々の例示的な実施形態、および本開示に従う方法が、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されよう。これらは、実例として提供されるものであり、本開示をいかなる形態でも限定することが意図されるものではない。
【実施例】
【０１４０】
実施例１
家畜における有効な非減数分裂対立遺伝子移入
一部のウシ肉用種は、天然で無角であり（例えばアンガス）、これはＰＯＬＬＥＤと呼ばれる優性形質である（２７）。無角を付与する２つの対立遺伝子変異体が、第１染色体上で同定された（２８）。有角の乳用品種中へのＰＯＬＬＥＤ形質の減数分裂遺伝子移入が、従来の異種交配によって達成され得るが、結果として生じた動物の遺伝的利点は、正味の利点（すなわち乳生産）について選択されなかった（下位の）対立遺伝子の、集団中への混合のために、より低く評価されよう。発明者らは、Ｐｃと呼ばれるＣｅｌｔｉｃ  ＰＯＬＬＥＤ対立遺伝子（１０ｂｐを置き換える２１２ｂｐの重複）の、有角の乳用雄牛に由来する線維芽細胞中への非減数分裂遺伝子移入に着手した。アンガス品種由来のＰｃ対立遺伝子を含む１，５９４ｂｐフラグメントを含有するプラスミドＨＤＲ鋳型を構築した（図１Ａ）。ＴＡＬＥＮを設計し、これが、ＨＯＲＮＥＤ対立遺伝子を切断することができるが、Ｐｃ対立遺伝子を無影響のままにすることができるようにした。また、ｍＲＮＡとして送達されるＴＡＬＥＮの一対が、プラスミドＤＮＡと類似した活性を有することを見出した後（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１３  Ｏｃｔ  ８；１１０（４１）：１６５２６−３１）、出願人らは、ＴＡＬＥＮ発現プラスミドの考えられるゲノム統合を排除するために、ＴＡＬＥＮをｍＲＮＡとして送達することを選択した。２２６のコロニーのうちの５つ（２％）が、各ＰＣＲ試験をパスし、Ｐｃの遺伝子移入を確認することが示された（図１Ｂ）。
【０１４１】
Ｐｃ  ＨＤＲ鋳型。Ｃｅｌｔｉｃ  ＰＯＬＬＥＤ対立遺伝子を包含する１，７８４ｂｐフラグメントを、アンガスゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し（Ｆ１：５’−ＧＧＧＣＡＡＧＴＴＧＣＴＣＡＧＣＴＧＴＴＴＴＴＧ（配列番号１）；Ｒ１−５’−ＴＣＣＧＣＡＴＧＧＴＴＴＡＧＣＡＧＧＡＴＴＣＡ（配列番号２））、ＰＣＲ  ２．１ベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中にＴＯＰＯクローニングした。このプラスミドを、分析プライマーセットについて、そして１，５９２ｂｐ  ＨＤＲ鋳型の起源について、以下のプライマー（１５９４Ｆ１：５’−ＴＣＧＡＡＣＣＴＧＧＧＴＣＴＴＣＴＧＣＡＴＴＧ（配列番号３）；Ｒ１：５’−ＴＣＣＧＣＡＴＧＧＴＴＴＡＧＣＡＧＧＡＴＴＣＡ（配列番号４））によるＰＣＲによって、ポジティブコントロール鋳型として用いて、先の通りＴＯＰＯクローニングした。各プラスミドの配列を、使用前に確認した。トランスフェクショングレードのプラスミドを、Ｆａｓｔ−Ｉｏｎ  ＭＩＤＩ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｅｎｄｏ−Ｆｒｅｅキット（ＩＢＩ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて調製して、５μｇまたは１０μｇを、２μｇのＨＰ１．３  ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡと共にトランスフェクションした。
【０１４２】
実施例２
組織培養およびトランスフェクション
ウシＰＯＬＬＥＤ対立遺伝子を、有角雄牛線維芽細胞中に遺伝子移入した。ウシ線維芽細胞を３０℃に維持した。ｍＲＮＡおよびオリゴを混合したバッファ「Ｒ」中に再懸濁させた５００，０００〜６００，０００細胞で各トランスフェクションを構成し、１００μｌチップを用いて、以下のパラメータによってエレクトロポレーションした：入力電圧；１８００Ｖ；パルス幅；２０ｍｓ；およびパルス数；１。典型例として、ＴＡＬＥＮ発現プラスミドの２〜４μｇまたはＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡの１〜２μｇおよび注目する遺伝子に特異的なオリゴの２〜３μＭを、各トランスフェクションに含めた。それらの量からのずれを、ＴＡＬＥＮ実験およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９実験の双方について、図の説明文中に示す。トランスフェクション後、細胞を、６ウェルディッシュの２つの別々のウェル中に６０：４０で分けて、それぞれ３０℃または３７℃にて３日間培養した。３日後、細胞集団は拡大した。編集の安定性を評価するために、少なくとも１０日目まで３７℃にした。
【０１４３】
トランスフェクションの３日後、５０〜２５０細胞を１０ｃｍディッシュ上に播種して、個々のコロニーが直径およそ５ｍｍに達するまで培養した。この時点で、ＰＢＳ中に希釈したＴｒｙｐＬＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１：５（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の６ｍｌを加えて、コロニーを吸引して、２４ウェルディッシュのウェルに移して、同じ条件下で培養した。コンフルエンスに達したコロニーを収集して、低温保存および遺伝子型分析用に分けた。
【０１４４】
実施例３
遺伝子移入の確認
５つのクローンのうち３つが、Ｐｃ遺伝子移入についてホモ接合性であり、当該技術において知られている配列決定法によって確認した。簡潔に、Ｆ１プライマー（上記参照）および「Ｐ」プライマー（５’−ＡＣＧＴＡＣＴＣＴＴＣＡＴＴＴＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣ）（配列番号５）を用いて、１×ＭｙＴａｑ  Ｒｅｄミックス（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を用いた３８サイクル（９５℃、２５ｓ；６２℃、２５ｓ；７２℃、６０ｓ）のＰＣＲによって、Ｐｃ遺伝子移入の検出を実行した。Ｆ２：５’−ＧＴＣＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＴＡＧＴＴＴＴＣＴＴＧＧ（配列番号６）；Ｒ２−５’−ＧＧＣＡＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＴＣＴＴＧＧＧＴＧＴ（配列番号７）を用いて、第２のＰＣＲアッセイを実行した。双方の試験をパスした候補を、側面に位置するＦ１プライマーおよびＲ１プライマーを用いたＰＣＲに続く、ＴＯＰＯクローニングおよび配列決定法によって、分析した。
【０１４５】
実施例４
対立遺伝子移入を確認するハプロタイプマーカーの同定
外因性ＤＮＡの挿入遺伝子座の位置が定義されるので、ハプロタイプの存在を検出するためのマーカーを設計することができる。先で考察したように、遺伝的マーカーは、染色体セグメント内の知られているあらゆるＤＮＡ配列であってよい。連鎖不平衡および非独立遺伝（ｎｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）のため、ハプロタイプ内の対立遺伝子は、乗換えの間、標的遺伝子座からの距離が挙げられる種々の要因に起因して、一緒に分離する（図２）。好ましくは標的遺伝子座から５００ｂｐ以内、より好ましくは標的遺伝子座の２００塩基対以内の、知られている配列を同定することによって、適切なマーカーが同定されるが、一部の実施形態において、染色体に沿って最大８Ｍｂｐに及んでもよい。一部の実施形態において、マーカーは標的の側面に位置する（図３）。当業者であれば、標的遺伝子座の側面に２つのマーカーが位置すれば、ハプロタイプ中の外因性対立遺伝子の存在を同定するのに十分であると理解するであろう。しかしながら、在来ハプロタイプに特有の５つ以上のマーカーを同定することは、本開示の範囲内である。一部の実施形態において、あらゆるハプロタイプに特異的なマーカーのマップが作成され、当該マップは、動物のあらゆる特定の遺伝子座のあらゆる染色体上の特異的マーカーの存在を同定するのに、何時でもアクセスすることができる。適切なマーカーが同定されると、当該マーカーの存在を判定する方法を用いて、例えば特異的プローブによるインサイチュハイブリダイゼーションによって、所望の標的を認識するプローブを製造することもできるし、例えばＰＣＲによって、所望のマーカーを増幅することとなるプライマーを製造することもできる。他の戦略として、外因性対立遺伝子およびいくつかのマーカーを含む染色体の大きなセグメントの配列決定法が挙げられ、これは、適切な染色体セグメント内の、設計されるように挿入される外因性ＤＮＡの存在を確認する。この場合、プライマーは、ハプロタイプ中の標的遺伝子座の側面に位置するように設計されていてよい。例えば、一分子リアルタイムシーケンス（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、１ランあたり１０，０００から１５，０００ｂｐを読むことができる一方、チェインターミネーションシーケンス（Ｓａｎｇｅｒ）は、約４００ｂｐから９００ｂｐを読むことができる。そのような距離は、例えば、ウシ（Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ）の第１染色体上の遺伝子座にて定義される有角ハプロタイプの適切な範囲内の２１２ｂｐのＰＯＬＬＥＤ対立遺伝子の正確な挿入を確認するのに適し得る。
【０１４６】
実施例５
スリック表現型の遺伝子移入を確認するハプロタイプマーカーの同定
「ＳＬＩＣＫ」は、セネポル、Ｃａｒｏｒａ、クリオロ、Ｌｉｍｏｎｅｒｏ、およびＲｏｍｏｓｉｎｕａｎｏが挙げられる、新世界のウシにおいて見出される突然変異である。用語「ＳＬＩＣＫ」は、ウシの短い、艶がある毛皮に言及するために作られたものである。また、この表現型として、毛の密度（より少ない）、毛幹構造型、汗腺密度、平均正常体温、および温度調節効率の差異が挙げられる。ＳＬＩＣＫ表現型のウシは、熱帯環境において体温調節する非常に高い能力を示して、結果的に高温の環境においてかなり小さなストレスしか経験しない。
【０１４７】
「ＳＬＩＣＫ」突然変異は、ウシゲノムの第２０染色体にマッピングされており、この表現型の基礎となる突然変異が、プロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）の遺伝子に存する。当該遺伝子は、５８１アミノ酸のポリペプチドをコードし得る９つのエキソンを有する。セネポルウシにおける以前の研究により、当該表現型は、エキソン１０における単一塩基の欠失から生じ（エキソン１はなく、認識されるエキソンは２〜１０である）、これが、早期終止コドン（ｐ．Ｌｅｕ４６２）および受容体からの末端１２０アミノ酸の喪失を導入することが示された。当該表現型は、本明細書中でＳＬＩＣＫ１と呼ぶ。セネポルウシは極端に暑熱耐性であり、暑熱耐性についてのこの優性形質の利点を提供するために、他の多くのウシ品種と交雑されてきた。
【０１４８】
今では、ＳＬＩＣＫ表現型もたらす対立遺伝子の１つまたは複数を他のウシ中へ、有性交雑なしで導入することが可能である（例えば、Ｆａｈｒｅｎｋｒｕｇ  ｅｔ  ａｌ．の米国仮特許出願第６２／２２１，４４４号明細書参照）。したがって、ＳＬＩＣＫ表現型を示す動物が、有性育種ではなく遺伝的修飾の産物であることを同定することができることが重要である。これは、いくつかの理由のためである。第一に、ほとんどのウシ品種が、十分に特徴付けられており、そして予測される有効集団サイズが５０（ホルスタイン／フリーシアン）から１１４（Ｂｒａｕｎｖｉｅｈ）の近交系であるためである。そのような動物の価値は、特性、例えば、サイズ、肉生産、乳生産、ウシが産むことができる仔牛の数、疾患に対する耐性その他が周知であることである。したがって、動物の経済的価値は、その品種の特性にマッチする動物の能力に基づく。第二に、動物が遺伝子移入によって形質を示すかがわかることによって、動物の遺伝歴を追跡かつ確認することができるためである。
【０１４９】
表１は以下で、ＳＬＩＣＫ遺伝子座の周辺でのＳＮＰのマーカー分析を示す。示されるように、マーカー１〜５は、第２０染色体上のＳＬＩＣＫ遺伝子座の上流にあり、マーカー６〜１０はＳＬＩＣＫ遺伝子座の下流にある。「ＳＮＰ対立遺伝子」のラベルが付いた行は、マーカー（ＳＮＰ）がセネポルウシで自然に見出される染色体の遺伝子座である。「他の対立遺伝子」のラベルが付いた行は、有毛のウシの間でマイナー対立遺伝子頻度がより高いヌクレオチド残基であり、典型的に、ＳＬＩＣＫに連鎖する、またはＳＬＩＣＫを含有しないハプロタイプにおいては、見出されない。ＭＡＦは、遺伝子型を特定したＤＮＡの実験セット内での、ＷＴと比較した各ＳＮＰの頻度である。最後の列は、１０個のフランキングマーカーにおいてＳＮＰ対立遺伝子を有し、かつスリック突然変異を有していない可能性が、約８×１０−５であることを示している。しかしながら、本研究用の動物のサンプリングは、クリオロの遺伝的基礎である、ＳＬＩＣＫ突然変異の在来ソースによって影響を受けた動物に由来するウシＤＮＡサンプルに向けて、非常に偏っていた点に留意する必要がある。したがって、各マーカーの頻度は、これらのマーカーのあらゆる包括的な／ランダムな分布において見られ得る頻度よりも、かなり優勢である。非セネポル動物が、いずれの連鎖マーカーも有することなく第２０染色体−３９１３６５５８にて欠失を示す可能性は、８×１０−５であり、この値は、非常に影響を受けたクリオロ集団のサンプリングに起因して、より可能性が高い方に歪んでいる。表１で注目されるように、確認領域の全長は、３９，０４７，５０１から３９，３４３，５３４までの２９６，０３３ｂｐである。
【０１５０】
【表１】
2018529377.tif 000003
【０１５１】
表２は、表１のマーカーによって同定される主要なハプロタイプを同定している。
【０１５２】
【表２】
2018529377.tif 000004
【０１５３】
ゆえに、信頼性が高いマーカーの同定は、標的配列のソース（例えばＳＬＩＣＫ）の同定に向けた工程である。ＳＬＩＣＫの場合、シトシン塩基が欠失したあらゆるハプロタイプで、ＳＬＩＣＫハプロタイプの全対立遺伝子を共有しないものは同定されなかった。したがって、任意の集団由来の動物が、シトシンを欠失し、かつ同定した他の１０個のマーカーを有しない可能性は、あり得ないくらいに非常に低い。
【０１５４】
実施例６
ホルスタインウシにおけるＨＨ１用ハプロタイプマーカーの同定
第５染色体上のＨＨ１ハプロタイプは、ホルスタインウシにおける受胎率の低下およびホモ接合体の不足と関連している。ＡＰＡＦ１中のナンセンス突然変異（ＡＰＡＦ１  ｐ．Ｑ５７９Ｘ）を、予測される創始者（Ｃｈｉｅｆ）、およびその３子孫の全ゲノムリシーケンスを用いて、ＨＨ１内で同定した。この突然変異は、タンパク質−タンパク質相互作用に重要なＷＤ４０ドメインを含有する、コードされたＡＰＡＦ１タンパク質の６７０アミノ酸（５３．７）パーセントをトランケートする（ｔｒｕｎｃａｔｅ）と予測される。２４６，７７３頭のホルスタインの市販の遺伝子型分析により、突然変異について、５，２９９のＡＰＡＦ１ヘテロ接合体および０のホモ接合体を明らかにした。以前に記載される通り（ＶａｎＲａｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１ａ；Ｓｏｎｓｔｅｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、ｆｉｎｄｈａｐ．ｆ９０を用いて、２０１１年現在、５４，００１個のＳＮＰ遺伝子型を有する７８，４６５頭の動物の血統内で、ＣｈｉｅｆのＨＨ１ソースハプロタイプの全てではなく一部と定義される組換えハプロタイプを検出した。推定の突然変異を含有する７．１Ｍｂｐに及ぶ７５マーカーソースハプロタイプの全コピーは、Ｃｈｉｅｆまで、そして、他の目立たない祖先までトレースすると考えられた。ソースハプロタイプの一部のみについてホモ接合性である組換えハプロタイプを有する、生きている動物は、致死突然変異を含有しないとして、ハプロタイプのその部分を除外することができる。全ての組換えハプロタイプを処理した後、除外されない領域を、Ｓｏｎｓｔｅｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）によって記載されるように、突然変異の重要領域と定義した。
【０１５５】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｏｖｉｎｅＳＮＰ５０  ＢｅａｄＣｈｉｐｓ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）由来の４３，３８５個のＳＮＰについて遺伝子型を特定した７８，４６５頭の動物において、Ｗｉｇｇａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）の編集およびｆｉｎｄｈａｐ．ｆ９０（ＶａｎＲａｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１ａ）バージョン２からの標準的なアウトプットを用いて、組換え事象を検出した。これらは、最初に、６００マーカー、次に２００マーカー長のハプロタイプを、そして最後に≦７５マーカーのアウトプットハプロタイプを調査した。当該プログラムは、遺伝子型をハプロタイプに同期させて（ｐｈａｓｅ）、遺伝子型を特定した各親の母性ハプロタイプと父性ハプロタイプとの間の組換え点を検出する。組換えハプロタイプは、ソースハプロタイプの一部および非ソースハプロタイプの一部を含有する。乗換えが出現した場合に、子孫の表現型状態はわかり得ない。血統内で、後代を親ハプロタイプと直接比較することによって、乗換えを遺伝子型から検出した。各乗換えについて、第１の親ハプロタイプに由来したことが知られている最後のマーカー、および第２の親ハプロタイプに由来したことが知られている第１のマーカーは、アウトプットである。親ハプロタイプがその領域で同一であり、一部の遺伝子型がコール（ｃａｌｌ）されず、または両親がヘテロ接合性であり、かつ対立遺伝子が、未知の乗換え位置に至るように同期され得ないならば、ギャップがそれら２つのマーカー間に残存し得る。極めて少ない雌親（ｄａｍ）しか遺伝子型分析されていないので、母性祖先で起こっている乗換えは多くの場合、検出されていない（Ｓｏｎｓｔｅｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０１５６】
ソースハプロタイプの一区分がホモ接合性である領域を、原因となるＨＨ１突然変異を保有するという考慮から除外した。例えば、生きている動物が一方の親から本来のＨＨ１ハプロタイプを、そしてＨＨ１ハプロタイプの残る２０マーカーを他方の親から受け取ったならば、それらの２０マーカーを含有する領域は、ジャージー種ハプロタイプ１についてＳｏｎｓｔｅｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）において正確に記載されるように、考慮から除外した。
【０１５７】
Ｃｈｉｅｆ、およびその後代のうち２頭、Ｉｖａｎｈｏｅ  ＣｈｉｅｆおよびＶａｌｉａｎｔのゲノムを、合成化学による配列決定法を用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で配列決定した。ライブラリを、精液ストローから精製したゲノムＤＮＡの５μｇから調製して、データを、メーカーによって提供される標準的な配列決定プロトコルを用いて生じさせた。４５４  Ｔｉｔａｎｉｕｍ技術を用いるＭａｒｋ（１２×）およびＣｈｉｅｆ（６×）の以前の配列決定結果もまた用いた（Ｌａｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０１５８】
ＳＮＰおよび遺伝子の検出
ＢＴＡ５の疑惑領域におけるＳＮＰを、ＦｒｅｅＢａｙｅｓ（Ｇａｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｈ，２０１２）を用いて同定した。推定のＳＮＰが、以下の基準内に適合するならば、これを受け入れた：少なくとも２回のリードによる４×最小リード範囲を、各向き（フォワード、リバース）にアラインして、最小対立遺伝子配列決定品質が、≧２０である。当該領域におけるＳＮＰのリストを得て直ぐに、変異体の機能的注釈付けを、ＡＮＮＯＶＡＲ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）を用いて実行した。ＡＮＮＯＶＡＲプログラムは、ウシゲノム内の遺伝子位置または遺伝子間位置によって、ＳＮＰをカテゴリ化した。当該プログラムは、注釈を付けられた遺伝子のイントロンおよびエキソン、５’ＵＴＲ領域および３’ＵＴＲ領域、ならびに遺伝子位置の上流および下流内に位置決めされたＳＮＰを報告する。ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＬｉｆｔＯｖｅｒ）によって作成されたプログラムＬｉｆｔＯｖｅｒを用いて、ＳＮＰおよび遺伝子位置に関する全座標を、Ｂｔａｕ４．０からＵＭＤ３．１のゲノムアセンブリに変換して、ハプロタイプおよび遺伝子型のデータセットと整合させた。
【０１５９】
以前に構築された（Ｗｉｇｇａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）５４，００１個のＳＮＰについて遺伝子型を特定した３３，４１５頭のホルスタインの大データベースを問い合わせることによって、動物を確認のために選択した。遺伝子型インピュテーションおよびハプロタイプ頻度は、３３，４１５頭の全動物を含んだが、更なる確認のために選択した７５８頭のサンプルは、Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｄａｉｒｙ  ＤＮＡ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ由来であり、これは、北アメリカでほとんど全ての後代試験済み雄牛由来のＤＮＡを含有する。ハプロタイプの同定は、ＢＴＡ５上の７．１ＭｂｐのＨＨ１含有インターバルと指定した７５個のＳＮＰマーカーに基づいた（ＵＭＤ３．１座標は５８，６３８，７０２から６５，７４３，９２０；ＶａｎＲａｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１ｂ）。更なるクエリを実行して、当該インターバルにおいて特有のヘテロ接合性ハプロタイプの組合せを有する非キャリアの多様なセットを選択した。
【０１６０】
確認試験（Ｐａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）用に設計したＳＮＰ遺伝子型分析パネル（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、精製したＨＨ１インターバル領域内の１２個の推定ＳＮＰについて、２４回の二方向アッセイで構成した。これは、遺伝子境界を当該インターバル内で見出した全てのＳＮＰを含み、そして５つの更なるＳＮＰを、ＡＰＡＦ１ストップ−ゲイン突然変異由来のインターバル領域において、または遠位フランキング領域において、隣接する遺伝子の近くに観察した。２４回のＳＮＰアッセイのうち合計２２回は、機能的であった；１個のＳＮＰ遺伝子座は、単型であった。全ＳＮＰ遺伝子座についてのコール率は、ＵＭＤ３＿６３１０７２９３（９９．３％）およびＵＭＤ３＿６２５９１３１１（９９．９％）以外、１００％であった。各ＳＮＰ遺伝子座についての二方向アッセイの結果を、一致について比較して、１１個のＳＮＰ遺伝子座の全体にわたって、各動物についての単一マーカー遺伝子型スコアに組み込んだ。１１個の有益なＳＮＰのハプロタイプを、ＰＨＡＳＥ  ｖ２．１．１（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）によって判定して、合計２４個の可能性のあるハプロタイプを同定した（表３）。これらのハプロタイプは、ＨＨ１を見出すのに用いた７．１Ｍｂｐに及ぶ７５マーカーウィンドウ（５４，００１個のチップに由来する）によって元々定義したものよりもかなり短く、そしてそれとは異なる。２つの異なるナンバリング系が存在する：１つ目が、７．１Ｍｂｐウィンドウにおける２，０００個を超える異なるハプロタイプについてであり、そして２つ目が、確認用の狭い１１個のＳＮＰのウィンドウにおける２４個のハプロタイプについてである（表３）。
【０１６１】
【表３】
2018529377.tif 000005
【０１６２】
複数のデータセットを様々なマーカーおよび動物（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ，Ｊ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．２０１６  Ａｕｇ；９９（８）：６６９３−７０１）に用いた確認試験の後、ストップ−ゲイン突然変異についての試験を、ＧｅｎｅＳｅｅｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（ＧＧＰ）ＢｅａｄＣｈｉｐ（ＧｅｎｅＳｅｅｋ−Ｎｅｏｇｅｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ；Ｎｅｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，２０１３）に、そして以降のチップに加えて、ルーチンのゲノム予測の一部として、２４６，７７３頭のホルスタインについて、遺伝子型を受け入れた。
【０１６３】
表３に示すように、７番目のマーカー（ＵＭＤ３＿６３１５０４００）にてゼロ対立遺伝子を有し、かつ１１１１００−Ｘ−０１１１ハプロタイプを有するあらゆる動物は、ゲノム編集の結果であるに違いなかろう。さらに、ハプロタイプが７番目のマーカーにてのみランダムな突然変異を有し得たという可能性は、２８億５０００万の１である。これによって、７番目のマーカーにてゼロの存在が、ランダムな存在であり得たというあらゆる可能性が排除される。
【０１６４】
本開示を、先で概説した種々の例示的な実施形態と併せて記載してきた一方、種々の代替物、修飾、変形、改良、および／または実質的な均等物が、知られているか、現在予見し難いかに拘らず、当業者に明らとなり得る。したがって、本開示に従う例示的な実施形態は、前述のように、限定ではなく例証となることが意図される。本開示の精神および範囲から逸脱することなく、種々の変更を加えてもよい。したがって、本開示は、これらの例示的な実施形態の全ての知られている、または後に開発される代替物、修飾、変形、改良、および／または実質的な均等物を包含することが意図される。
【０１６５】
１から４３まで連続して列挙した以下の段落は、本開示の種々の更なる態様を提供する。一実施形態において、第１の段落（１）中で、本開示は、以下を提供する。
【０１６６】
１．在来ハプロタイプ中の外因性対立遺伝子を同定するための、家畜動物を試験するキットを製造するプロセスであって：
外因性対立遺伝子を潜在的に含む在来ハプロタイプを同定する工程と；
外因性対立遺伝子を同定する工程と；
ハプロタイプに特異的な２つ以上のプローブを調製する工程と
を含むプロセス。
【０１６７】
２．ハプロタイプを同定する工程は、ハプロタイプ中の家畜在来のマーカーの存在を検出する工程を含む、段落１のプロセス。
【０１６８】
３．外因性対立遺伝子を同定する工程は、ハプロタイプ内の外来対立遺伝子の存在を同定する工程を含む、段落１および２のプロセス。
【０１６９】
４．外因性対立遺伝子は、非減数分裂遺伝子移入によって導入される、段落１から３のプロセス。
【０１７０】
５．所望のハプロタイプは、２つ以上のマーカーによって判定される、段落１から４のプロセス。
【０１７１】
６．２つ以上のマーカーは、外因性対立遺伝子の両側に存在する、段落１から５のプロセス。
【０１７２】
７．２つ以上のマーカーは、対立遺伝子の２Ｍｂ以内に見出される、段落１から６のプロセス。
【０１７３】
８．２つ以上のマーカーは、対立遺伝子の１Ｍｂ以内に見出される、段落１から７のプロセス。
【０１７４】
９．家畜在来のマーカーの存在を検出する工程は、各マーカーに特異的なプローブを含む、段落１から８のプロセス。
【０１７５】
１０．マーカーは、ウシ（Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ）から選択され：第２０染色体−３９０４７５０１、第２０染色体−３９０６７１６４、第２０染色体−３９１０７８７２、第２０染色体−３９１１８０６３、第２０染色体−３９１２６０５５、第２０染色体−３９１３６５５８、第２０染色体−３９１７９４９８、第２０染色体−３９１７９５２７、第２０染色体−３９２３５８５９、第２０染色体−３９３４３４００、第２０染色体−３９３４３５３４、第５染色体−ＵＭＤ３＿６２５９１３１１、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３０５１６１２、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３０５２６３１、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３０８８９７３、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３０９１５７８、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３１０７２９３、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３１５０４００、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３１９８６６４、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３２０９３９６、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３２２８１０６、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３４８６１３３を含む、段落１から９のプロセス。
【０１７６】
１１．プローブは、ＰＣＲ、アレイベースのアッセイ、ハイレゾリューションメルティング（ＨＲＭ）分析、フラグメント分析、Ｓａｎｇｅｒフラグメント分析、増幅フラグメント長多型（ＡＦＬＰ）分析、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、または一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析に用いられる、段落１から１０のプロセス。
【０１７７】
１２．マーカーは、ハプロタイプの配列特異的領域である、段落１から１１のプロセス。
【０１７８】
１３．外因性対立遺伝子は、家畜とは異なる系統、品種、または種に由来する、段落１から１２のプロセス。
【０１７９】
１４．外因性対立遺伝子を同定する工程は、外因性対立遺伝子に特異的なプローブを用いる工程を含む、段落１から１３のプロセス。
【０１８０】
１５．プローブは、ＰＣＲ、アレイベースのアッセイ、ハイレゾリューションメルティング（ＨＲＭ）分析、フラグメント分析、Ｓａｎｇｅｒフラグメント分析、増幅フラグメント長多型（ＡＦＬＰ）分析、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、または一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析に用いられる、段落１から１４のプロセス。
【０１８１】
１６．外因性対立遺伝子は、家畜の在来対立遺伝子にとって外来の少なくとも１つの塩基を含む、段落１から１５のプロセス。
【０１８２】
１７．家畜動物中の外因性の標的対立遺伝子の存在を同定する方法であって：
ｉ）家畜動物中の在来ハプロタイプを同定する工程と；
ｉｉ）ハプロタイプにとって外因性の対立遺伝子を同定する工程と；
ｉｉｉ）ハプロタイプ中の外因性の対立遺伝子の存在を判定する工程と
を含む方法。
【０１８３】
１８．所望のハプロタイプを同定する工程は、ハプロタイプ中の家畜在来のマーカーの存在を検出する工程を含む、段落１から１７の方法。
【０１８４】
１９．ハプロタイプ中の外因性対立遺伝子を同定する工程は、ハプロタイプ内の外来対立遺伝子の存在を同定する工程を含む、段落１から１８のいずれかの方法。
【０１８５】
２０．外因性対立遺伝子は、非減数分裂遺伝子移入によって導入される、段落１から１９のいずれかの方法。
【０１８６】
２１．ハプロタイプは、２つ以上のマーカーによって同定される、段落１から２０のいずれかの方法。
【０１８７】
２２．２つ以上のマーカーは、外因性対立遺伝子の両側に存在する、段落１から２１のいずれかの方法。
【０１８８】
２３．２つ以上のマーカーは、各マーカーに特異的なプローブを用いて同定される、段落１から２２のいずれかの方法。
【０１８９】
２４．２つ以上のマーカーは、対立遺伝子の２ＭＢ以内に見出される、段落１から２３のいずれかの方法。
【０１９０】
２５．２つ以上のマーカーは、対立遺伝子の１ＭＢ以内に見出される、段落１から２４のいずれかの方法。
【０１９１】
２６．マーカーは、ウシ（Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ）から選択され：第２０染色体−３９０４７５０１、第２０染色体−３９０６７１６４、第２０染色体−３９１０７８７２、第２０染色体−３９１１８０６３、第２０染色体−３９１２６０５５、第２０染色体−３９１３６５５８、第２０染色体−３９１７９４９８、第２０染色体−３９１７９５２７、第２０染色体−３９２３５８５９、第２０染色体−３９３４３４００、第２０染色体−３９３４３５３４、第５染色体−ＵＭＤ３＿６２５９１３１１、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３０５１６１２、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３０５２６３１、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３０８８９７３、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３０９１５７８、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３１０７２９３、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３１５０４００、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３１９８６６４、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３２０９３９６、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３２２８１０６、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３４８６１３３を含む、段落１から２５のいずれかの方法。
【０１９２】
２７．家畜在来のマーカーの存在を検出する工程は、各マーカーに特異的なプローブを含む、段落１から２６のいずれかの方法。
【０１９３】
２８．プローブは、ＰＣＲ、アレイベースのアッセイ、ハイレゾリューションメルティング（ＨＲＭ）分析、フラグメント分析、Ｓａｎｇｅｒフラグメント分析、増幅フラグメント長多型（ＡＦＬＰ）分析、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、または一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析に用いられ得る、段落１から２７のいずれかの方法。
【０１９４】
２９．マーカーは、ハプロタイプの配列特異的領域である、段落１から２８のいずれかの方法。
【０１９５】
３０．外因性対立遺伝子は、家畜とは異なる系統、品種、または種に由来する、段落１から２９のいずれかの方法。
【０１９６】
３１．外因性対立遺伝子を同定する工程は、外因性対立遺伝子に特異的なプローブを用いる工程を含む、段落１から３０のいずれかの方法。
【０１９７】
３２．プローブは、ＰＣＲ、アレイベースのアッセイ、ハイレゾリューションメルティング（ＨＲＭ）分析、フラグメント分析、Ｓａｎｇｅｒフラグメント分析、増幅フラグメント長多型（ＡＦＬＰ）分析、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、または一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析に用いられる、段落１から３１のいずれかの方法。
【０１９８】
３３．外因性対立遺伝子は、家畜の在来対立遺伝子にとって外来の少なくとも１つの塩基を含む、段落１から３２のいずれかの方法。
【０１９９】
３４．非減数分裂遺伝子移入を用いてハプロタイプ中に導入された外因性対立遺伝子の存在を判定するためのキットであって：
動物にとって外来の対立遺伝子に特異的なプローブと、
動物のハプロタイプに特異的な２つ以上のプローブと
を備えるキット。
【０２００】
３５．使用説明書をさらに含む、段落３４のキット。
【０２０１】
３６．反応混合物を保持するコンテナをさらに含む、段落３４および３５のキット。
【０２０２】
３７．試薬をさらに含む、段落３４から３６のキット。
【０２０３】
３８．プローブは：ＰＣＲ、アレイベースのアッセイ、ハイレゾリューションメルティング（ＨＲＭ）分析、フラグメント分析、Ｓａｎｇｅｒフラグメント分析、増幅フラグメント長多型（ＡＦＬＰ）分析、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、または一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析に用いられる、段落３４から３８のキット。
【０２０４】
３９．プローブは：第２０染色体−３９０４７５０１、第２０染色体−３９０６７１６４、第２０染色体−３９１０７８７２、第２０染色体−３９１１８０６３、第２０染色体−３９１２６０５５、第２０染色体−３９１３６５５８、第２０染色体−３９１７９４９８、第２０染色体−３９１７９５２７、第２０染色体−３９２３５８５９、第２０染色体−３９３４３４００、第２０染色体−３９３４３５３４、第５染色体−ＵＭＤ３＿６２５９１３１１、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３０５１６１２、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３０５２６３１、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３０８８９７３、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３０９１５７８、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３１０７２９３、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３１５０４００、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３１９８６６４、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３２０９３９６、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３２２８１０６、第５染色体−ＵＭＤ３＿６３４８６１３３を含むマーカーに特異的である、段落３４から３８のキット。
【０２０５】
４０．ウシ（Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ）の第５染色体−ＵＭＤ３＿６３１５０４００のあたりにて、または第２０染色体−３９１３６５５８のあたりにて編集されたゲノムからなる、遺伝的に修飾された動物。
【０２０６】
４１．ウシ（Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ）の第２０染色体−３９１３６５５８遺伝子座あたりに修飾を含むスリック表現型を有する、遺伝的に修飾された動物を作出する方法。
【０２０７】
４２．ウシ（Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ）の第５染色体−ＵＭＤ３＿６３１５０４００のあたりに、または第２０染色体−３９１３６５５８のあたりに修飾を含む、インビトロ動物細胞。
【０２０８】
４３．所望のハプロタイプ中の外来対立遺伝子の存在を同定するための、先の段落のいずれかの使用。
【０２０９】
本明細書中で示す特許、刊行物、および学術論文は全て、参照によって本明細書に組み込まれる；矛盾する場合には、本明細書が支配する。
【０２１０】
本開示を、先で概説した種々の例示的な実施形態と併せて記載してきた一方、種々の代替物、修飾、変形、改良、および／または実質的な均等物が、知られているか、現在予見し難いかに拘らず、当業者に明らとなり得る。したがって、本開示に従う例示的な実施形態は、前述のように、限定ではなく例証となることが意図される。本開示の精神および範囲から逸脱することなく、種々の変更を加えてもよい。したがって、本開示は、これらの例示的な実施形態の全ての知られている、または後に開発される代替物、修飾、変形、改良、および／または実質的な均等物を包含することが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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