(57)【要約】２０種の天然アミノ酸のすべてをタンパク質中に組込む能力を損なうことなく、非天然アミノ酸などの非天然部分を組込み可能な、ｔＲＮＡに対する一揃い（補完物）およびタンパク質翻訳系が提供される。これは、少なくとも２種の異なるｔＲＮＡアンチコドンによって通常デコードされるアミノ酸のｔＲＮＡアンチコドンの１種を、非天然部分に再割り当てすることによって達成され、少なくとも１つのコドンは、再割り当てされたアンチコドンによって一意的に認識され得、同一コドンボックスに由来する少なくとも１つの別のコドンは、再割り当てされたアンチコドンによって認識され得ない。したがって、翻訳のためのｍＲＮＡは、再割り当てされたｔＲＮＡアンチコドンに対応する１種または複数の特定のコドンを含むように操作され、その結果、非天然部分が、翻訳されたタンパク質中に選択された位置に組み込まれる。
2018509172.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの非天然部分を含むタンパク質の翻訳に適した一揃いのｔＲＮＡを製造する方法であって、
前記方法は、天然アミノ酸のアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡを、非天然部分に再割り当てされた同一アンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡと置換するステップを含み、前記一揃いのｔＲＮＡは、前記非天然部分に再割り当てされている前記アンチコドンに対応するコドンを含むＲＮＡの翻訳を促進するように作動可能であり、それによって、翻訳されたタンパク質は、２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてを含み得る、方法。
【請求項２】
（ｉ）天然アミノ酸を含むタンパク質の翻訳に適した一揃いのｔＲＮＡから、１種または複数のｔＲＮＡを枯渇させるステップと、（ｉｉ）枯渇された一揃いのｔＲＮＡを、非天然部分にそれぞれ再割り当てされ、前記非天然部分とそれぞれカップリングされる１種または複数のｔＲＮＡを用いて再構成するステップとのうち１つまたは複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｉ）において、天然アミノ酸の実質的にすべてのｔＲＮＡが、前記一揃いのｔＲＮＡから枯渇される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｉ）において、天然アミノ酸の１種または複数のｔＲＮＡが、前記一揃いのｔＲＮＡから選択的に枯渇される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｉｉ）で、再構成ｔＲＮＡが、合成ｔＲＮＡ、天然ｔＲＮＡまたはそれらの混合物を含む、請求項２、請求項３または請求項４に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの非天然部分を含むタンパク質の翻訳に適した一揃いのｔＲＮＡを含む組成物であって、
前記一揃いは、非天然部分に再割り当てされた天然アミノ酸のアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡを含み、前記一揃いのｔＲＮＡは、前記非天然部分に再割り当てされている前記アンチコドンに対応するコドンを含むＲＮＡの翻訳を促進するように作動可能であり、それによって、翻訳されたタンパク質は、２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてを含み得る、組成物。
【請求項７】
少なくとも１つの非天然部分を含むタンパク質の翻訳に適した翻訳系を製造する方法であって、
前記方法は、非天然部分に再割り当てされている天然アミノ酸のアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡを含む一揃いのｔＲＮＡを製造すること、および前記非天然部分に再割り当てされている前記アンチコドンに対応するコドンを含む転写可能なＲＮＡを製造することを含み、ｍＲＮＡは、２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてを含み得る翻訳されたタンパク質を製造するように転写され得る、方法。
【請求項８】
少なくとも１つの非天然部分を含むタンパク質の翻訳に適した翻訳系であって、
前記系は、非天然部分に再割り当てされている天然アミノ酸のアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡを含む一揃いのｔＲＮＡ、および非天然部分に再割り当てされている前記アンチコドンに対応するコドンを含む翻訳可能なｍＲＮＡを含み、前記ｍＲＮＡは、２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてを含み得る翻訳されたタンパク質を製造するように転写され得る、翻訳系。
【請求項９】
少なくとも１つの非天然部分を含む組換えタンパク質を製造する方法であって、
前記方法は、非天然部分に再割り当てされている天然アミノ酸のアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡを含む一揃いのｔＲＮＡ中の、非天然部分に再割り当てされているｔＲＮＡのアンチコドンに対応するコドンを含むｍＲＮＡを翻訳するステップを含み、翻訳されたタンパク質は、２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてを含み得る、方法。
【請求項１０】
前記再割り当てされたアンチコドンが、通常、天然アミノ酸のものである、複数の異なるアンチコドンのうちの１種である、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物、方法または系。
【請求項１１】
アミノアシルｔＲＮＡが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成される、前記請求項のいずれかに記載の組成物、方法または系。
【請求項１２】
前記ｔＲＮＡが、ＲＮＡシンセターゼを使用して製造される、請求項１１に記載の組成物、方法または系。
【請求項１３】
前記ｔＲＮＡが、ＲＮＡシンセターゼを使用してアミノアシル化される、請求項１２に記載の組成物、方法または系。
【請求項１４】
前記ＲＮＡシンセターゼが、ピロリジンｔＲＮＡシンターゼ媒介性アミノアシル化に適したＰｙｌＲＳまたはその変異体；メタノコッカス・ヤンナスキイ（Methanococcus jannaschii）チロシルトランスファーＲＮＡシンセターゼ（Ｍｊ  ＴｙｒＲＳ）またはその変異体；フレキシザイム；およびシステイニルｔＲＮＡシンセターゼから選択される、請求項１３に記載の組成物、方法または系。
【請求項１５】
前記再割り当てされたアンチコドンを含む前記ｔＲＮＡが、突然変異体システインｔＲＮＡである、請求項１４に記載の組成物、方法または系。
【請求項１６】
前記アミノアシルｔＲＮＡが、システイニルｔＲＮＡシンターゼを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成される、請求項１５に記載の組成物、方法または系。
【請求項１７】
前記突然変異体システインｔＲＮＡが、内因性システイニルｔＲＮＡシンセターゼによって再担持され得ない、請求項１６に記載の組成物、方法または系。
【請求項１８】
前記再割り当てされたアンチコドンが、４倍または６倍に縮重しているアンチコドンである、前記請求項のいずれかに記載の方法、組成物または系。
【請求項１９】
前記再割り当てされたアンチコドンが、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、ＬｅｕまたはＳｅｒのアンチコドンである、前記請求項のいずれかに記載の方法、組成物または系。
【請求項２０】
前記一揃いのｔＲＮＡが、それぞれの非天然部分に再割り当てされた、それぞれの天然アミノ酸を通常コードする、２種以上の異なるアンチコドンを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法、組成物または系。
【請求項２１】
前記一揃いのｔＲＮＡが、天然アミノ酸のものではないアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡを含み、前記アンチコドンが、非天然部分に再割り当てされている、前記請求項のいずれかに記載の方法、組成物または系。
【請求項２２】
前記非天然部分に再割り当てされている前記アンチコドンが、アンバーサプレッサーアンチコドンである、請求項２１に記載の方法、組成物または系。
【請求項２３】
請求項９から２２のいずれか一項に記載の方法によって製造される組換えタンパク質。
【請求項２４】
ペグ化、小分子のコンジュゲーション、標識、固定化、分子間および／もしくは分子内架橋もしくはその他の相互作用、高次構造の形成ならびに／または１種もしくは複数の触媒活性を促進する１種または複数の同一または異なる非天然部分を含む、請求項２３に記載の組換えタンパク質。
【請求項２５】
分子内共有結合可能である、前記同一または異なる非天然部分の２種以上を含む、請求項２３に記載の組換えタンパク質。
【請求項２６】
大環状タンパク質である請求項２３、請求項２４または請求項２５に記載の組換えタンパク質。
【請求項２７】
請求項２３から２６のいずれか一項に記載の複数の組換えタンパク質を含む、タンパク質ライブラリー。
【請求項２８】
請求項２３から２６のいずれか一項に記載の組換えタンパク質をコードする、または請求項２７に記載のタンパク質ライブラリー中の前記複数の組換えタンパク質のうちの少なくとも１種をコードするｍＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、タンパク質工学に関する。より詳しくは、本発明は、１種または複数の非天然部分（例えば、非天然アミノ酸）ならびに２０種（２０）すべての天然アミノ酸のうちいずれかを含む組換えタンパク質を製造することに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
タンパク質は、すべての生物において中心的な機能的成分である。それらは、このようなタンパク質の構造単位を形成する２０種（２０）の、遺伝的にコードされる「天然（natural）」アミノ酸の遺伝的に決定される配列を使用する天然生合成経路によって形成される。今日まで、タンパク質構造、機能および多様性の理解における進歩は、天然アミノ酸を含むタンパク質を製造する相対的単純性を前提として、天然構造、機能および多様性に主として焦点を当ててきた。ヒトゲノムは、約３０，０００種の異なるタンパク質をコードするが、天然アミノ酸以外（例えば、非天然アミノ酸、天然アミノ酸の化学的誘導体、化学的反応性部分など）の構造的部分を含むタンパク質が作製され得る場合には、潜在的にさらにより膨大な多様性がある。これらの「非天然（non-natural）」タンパク質は、合成タンパク質ライブラリー、医薬品、生物学的製剤（例えば、抗体、ペプチドホルモン、免疫調節物質）などのタンパク質ベースの生理活性物質、天然に生じるタンパク質には見られない前例のない構造および活性を有する検出試薬または診断試薬を作製するために使用され得る。しかし、このような「非天然」タンパク質の組換え製造は、困難な課題であると証明されている。
【０００３】
一般に、組換え「非天然」タンパク質を製造するためのアプローチは、タンパク質鎖延長の各ステップのために特定の天然アミノ酸を提供するオルソゴナルｔＲＮＡの正常な機能を破壊することによってタンパク質翻訳を操作することに頼ってきた（特に、細胞不含発現系において）。オルソゴナルｔＲＮＡを、非天然アミノ酸を用いて酵素的または化学的にアミノアシル化することが可能である。酵素的アミノアシル化には、オルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（ａａＲＳ）を利用できることが必要である。通常、複数ラウンドの指向進化が、非天然アミノ酸をその基質として受け入れることができるオルソゴナルｔＲＮＡ／ａａＲＳ対を作製するために必要とされる。これらのアプローチを使用して数百種の非天然アミノ酸がタンパク質中に組み込まれたが、それらの大部分は、その「親の」ａａＲＳの特異性によって規定される狭い構造カテゴリーに分類される。
【０００４】
この概念からの注目すべき逸脱は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで非天然アミノ酸をｔＲＮＡに担持できる進化したｔＲＮＡアシル化リボザイム（フレキシザイム）の使用である。これは、ｔＲＮＡの３’末端との一過性の複合体の形成によって達成され、これでは、末端リボースの３’−ＯＨが、非天然アミノ酸の活性化されたカルボキシル炭素での求核攻撃に携わる。
【０００５】
化学的アシル化ｔＲＮＡのためのプロトコールも開発された。これは、天然（native）アミノ酸とは全く別個のものであり、そのために、ａａＲＳ経路によって担持することが困難である化学的官能基の組込みを可能にする。いくつかの合成経路が開発されたが、それらは、通常、低収率であり、広く使用されていない。
【０００６】
その他のアプローチは、オルソゴナルアンチコドンを有するｔＲＮＡに、非天然アミノ酸をコードすることを割り当てることによる、タンパク質翻訳中の非天然アミノ酸の組込みに焦点を当ててきた。これはまた、翻訳されたｍＲＮＡが、非天然アミノ酸が組み込まれるべき位置に、対応する「再割り当てされた」コドンを含むことを必要とする。オルソゴナルコドンの作製のために最もよく使用されるアプローチは、「ナンセンスサプレッション」であり、これは、遺伝暗号中の３種の停止コドン：アンバー、オパールおよびオーカーコドンを利用する。いくつかの生物では、停止コドンは、リードスルーされ得、セレノシステインのＵＧＡコドンおよびピロリジンのＵＡＧコドンなどの非天然アミノ酸をコードし得る。この系の主な不利点は、終結因子（release factor）がオルソゴナルサプレッサーｔＲＮＡと競合することに起因するタンパク質発現収率の固有の低減（inherent reduction）である。
【０００７】
別のアプローチは、「フレームシフトサプレッション」である。伸長したアンチコドンループを含有する天然フレームシフトサプレッサーｔＲＮＡは、ＵＡＧＮおよびＡＣＣＮなどの４塩基コドンとして読むことができ、＋１フレームシフトをサプレッションできる。しかし、４塩基コドンによって非天然アミノ酸をコードすることは、ナンセンスサプレッションの使用よりもはるかに効率の悪いアプローチであり、それによって、標的タンパク質の収率は、トリプレットとしてクアドラプレットコドンを誤って読み取ることによって大幅に低下する。アミノ酸組込みのためのより最近の戦略は、遺伝暗号からの特定のアミノ酸の排除（Ｐｈｅなど）であり、それによって、非天然アミノ酸に割り当てることができる「フリー」コドンが生成する。しかし、これは、アミノ酸ボキャブラリーの低減につながる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
要旨
本発明は、天然アミノ酸を組換えタンパク質中に組み込む能力を損なうことなく、１つまたは複数の非天然部分を含む組換えタンパク質の製造を可能にするために、ｔＲＮＡアンチコドンが、天然アミノ酸から、非天然アミノ酸などの非天然部分に「再割り当て」され得る方法を広く提供する。
【０００９】
第１の態様では、本発明は、少なくとも１つの非天然部分を含むタンパク質の翻訳に適した一揃いのｔＲＮＡ（ｔＲＮＡの補完物（a complement of tRNA））を製造する方法を提供し、前記方法は、天然アミノ酸のアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡを、非天然部分に再割り当てされた同一アンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡと置換するステップを含み、一揃いのｔＲＮＡは、非天然部分に再割り当てされているアンチコドンに対応するコドンを含むＲＮＡの翻訳を促進するように作動可能であり、それによって、翻訳されたタンパク質は、２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてを含み得る。
【００１０】
再割り当てされるアンチコドンは、同一天然アミノ酸の複数の異なるアンチコドンのうちの１種であることが適している。
【００１１】
第２の態様では、本発明は、少なくとも１つの非天然部分を含むタンパク質の翻訳に適した一揃いのｔＲＮＡを含む組成物を提供し、前記一揃いは、天然アミノ酸のアンチコドンから再割り当てされた非天然部分のアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡを含み、一揃いのｔＲＮＡは、非天然部分に再割り当てされているアンチコドンに対応するコドンを含むＲＮＡの翻訳を促進するように作動可能であり、それによって、翻訳されたタンパク質は、２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてを含み得る。
【００１２】
再割り当てされるアンチコドンは、同一天然アミノ酸の複数の異なるアンチコドンのうちの１種であることが適している。
【００１３】
第３の態様では、本発明は、少なくとも１つの非天然部分を含むタンパク質の翻訳に適した翻訳系を製造する方法を提供し、前記方法は、非天然部分に再割り当てされている天然アミノ酸のアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡを含む一揃いのｔＲＮＡを製造すること、および非天然部分に再割り当てされているアンチコドンに対応するコドンを含む転写可能なＲＮＡを製造することを含み、ｍＲＮＡは、２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてを含み得る翻訳されたタンパク質を製造するように転写され得る。
【００１４】
第４の態様では、本発明は、少なくとも１つの非天然部分を含むタンパク質の翻訳に適した翻訳系を提供し、前記系は、非天然部分に再割り当てされている天然アミノ酸のアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡを含む一揃いのｔＲＮＡ、および非天然部分に再割り当てされているアンチコドンに対応するコドンを含む翻訳可能なｍＲＮＡを含み、ｍＲＮＡは２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてを含み得る翻訳されたタンパク質を製造するように転写され得る。
【００１５】
第５の態様では、本発明は、少なくとも１つの非天然部分を含む組換えタンパク質を製造する方法を提供し、前記方法は、非天然部分に再割り当てされている天然アミノ酸のアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡを含む一揃いのｔＲＮＡ中の、非天然部分に再割り当てされているｔＲＮＡのアンチコドンに対応するコドンを含むｍＲＮＡを翻訳するステップを含み、翻訳されたタンパク質は、２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてを含み得る。
【００１６】
上記態様のいずれかに従う方法、組成物または系によれば、再割り当てされるアンチコドンは、４倍または６倍に縮重していることが適している。
【００１７】
上記態様のいずれかに従う方法、組成物または系によれば、再割り当てされるアンチコドンは、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、ＬｅｕまたはＳｅｒのアンチコドンであることが適している。
【００１８】
上記態様のいずれかに従う方法、組成物または系の特定の実施形態では、翻訳されたタンパク質は、１つまたは複数の同一または異なる非天然部分を含み得る。
【００１９】
第６の態様では、本発明は、第５の態様の方法によって製造される組換えタンパク質を提供する。
【００２０】
単離されたタンパク質は、ペグ化、小分子のコンジュゲーション、標識、固定化、分子間および／もしくは分子内架橋もしくはその他の相互作用、高次構造の形成ならびに／または１種もしくは複数の触媒活性を促進する１つまたは複数の同一または異なる非天然部分を含み得るが、それらに限定されないということが認められよう。
【００２１】
一実施形態では、組換えタンパク質は、分子内共有結合を可能にする２以上の同一または異なる非天然部分を含む。特定の実施形態では、組換えタンパク質は、大環状タンパク質である。
【００２２】
第６の態様の組換えタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子も提供される。
【００２３】
不定冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、単数形不定冠詞として、またはそうではなく、不定冠詞が指す１つ超のもしくは単一対象を超えるものを排除すると読み取られてはならないということが認められよう。例えば、「１つの（ａ）」タンパク質は、１つのタンパク質、１つもしくは複数のタンパク質または複数のタンパク質を含む。
【００２４】
本明細書において使用される場合、文脈が別のものを必要としない限り、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、述べられた整数または整数の群を含むことを意味するが、任意のその他の整数または整数の群を排除することを意味しないと理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】４８種のｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成されたｔ７ｔＲＮＡ種の変性ＰＡＧＥ解析を示す図である。ｔ７ｔＲＮＡは、それぞれの一文字アミノ酸コード（大文字）および５’−３’アンチコドントリプレット（小文字）によって示されている。多形ｔＲＮＡ変異体は、それぞれの数値的指標によって示される。ＨＨＲｚ含有ＲＮＡ前駆体の自己切断によって、ＩｌｅおよびＴｒｐのｔＲＮＡ（ＩｇａｕおよびＷｃｃａ）を作製した。対応するｔＲＮＡバンドの上および下のアスタリスクは、それぞれ前駆体および切り出されたＨＨＲｚを示す。イニシエーターおよびエロンゲーターｔＲＮＡ（Ｍｅｔ）は、それぞれ「ｉ」および「ｅ」が前につけられている。
【図２】親和性クランプペプチドバイオセンサーの原理および較正を示す図である。（Ａ）実験手順の模式図。上部のＲＮＡ配列は、ＲＧＳ−ペプチドおよびその誘導体、ＲＧＳ１およびＲＧＳ２のコーディングフレームを表し、後者は、「インスレーター」コドン（緑色）とそれに続く試験コドントリプレット（ＸＸＸ、赤色）を含む。一定の８アミノ酸Ｃ末端および可変Ｎ末端を含有する得られたペプチドは、自己抑制されたＴＶＭＶプロテアーゼからなるバイオセンサーと結合し、ＰＤＺおよびＦＮ３ドメインが親和性クランプを形成する。ペプチド結合は、親和性クランプのコンホメーション変化をもたらし、これは、順に、ＴＶＭＶの活性部位からの阻害ペプチドを除去し、プロテアーゼ活性化およびその後のクエンチされたリポーター基質の切断につながる。ＱおよびＦは、それぞれ、蛍光クエンチャーおよびフルオロフォア基を示す。（Ｂ）熱変性された大腸菌（E. coli）抽出物中の種々の濃度の合成ペプチドをアッセイすることによって得られたＲＧＳ−ペプチドの較正曲線。初速度をペプチド濃度に対してプロットし、３連の実験の平均データを回帰係数（Ｒ２）を使用して適合させた。
【図３】ｔＲＮＡが枯渇した大腸菌（E. coli）溶解物におけるｅＧＦＰおよびＲＧＳ−ペプチドの細胞不含翻訳を示す図である。（Ａ）天然ｔＲＮＡ依存性ｅＧＦＰ発現。（Ｂ）枯渇した溶解物におけるＲＧＳペプチド翻訳を媒介する、ｔ７ｔＲＮＡ混合物に由来する個々のｔ７ｔＲＮＡを控えることによって評価される各コドンの天然ｔＲＮＡの枯渇効率の解析。個々に排除されたｔ７ｔＲＮＡに対応するコドン／アンチコドン対は、対応するバーの下に位置している。エロンゲーターｔ７ｔＲＮＡは、０．８μＭの最終濃度まで補給し、イニシエーターｔ７ｔＲＮＡｉＭｅｔは、１．６μＭとし、天然ｔＲＮＡ混合物は、１μｇ／μｌの最終濃度とした。
【図４】ｔ７ｔＲＮＡデコード表を示す図である。青色で影が付けられたＳｅｒ、ＡｒｇおよびＬｅｕは、そのうち２種のコドン（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）が、スプリットコドンファミリーボックスに属し、その他の４種が、アンスプリットコドンファミリーボックスに属する、混合コドンファミリーボックスによってコードされる１９。４および２倍縮重アミノ酸は、それぞれ、緑色および灰色で影が付けられている。天然ｔＲＮＡおよびｔ７ｔＲＮＡは、そのそれぞれのアンチコドン（Ｎ３４Ｎ３５Ｎ３６）によって示されている。天然ｔＲＮＡアンチコドン中のＡ／Ｕ／Ｇ／Ｃ以外の文字は、修飾されたヌクレオシドを示す５５。天然およびｔ７ｔＲＮＡデコードパターンは、それぞれ、コドン列の左および右側からの矢印線によって示される。アンチコドンまたは別の部分のいずれかにおける修飾が、アミノアシル化にとって必須であるＬｙｓ、ＧｌｕおよびＩｌｅに特異的なｔＲＮＡのアンチコドンは、桃色で強調されている。ｔＲＮＡＬｙｓ（ＵＵＵ）に基づいてＵ３４からＣ３４へのアンチコドン置換を有するＬｙｓ  ｔ７ｔＲＮＡは、赤色で強調されている。ｔ７ｔＲＮＡとそれぞれのコドンを結ぶ矢印線は、ペプチドバイオセンサーアッセイにおいて試験されたｔＲＮＡ／コドン組合せを示す。点線の灰色および黒色連続矢印線は、それぞれ＜１０％または≧１０％コドンデコード効率に対応する。黒色矢印線の傍らの関連する数字は、図１１に記載されるような解析されたコドンに向けられるｔ７ｔＲＮＡの算出されたデコード効率を示す。Ｎ３４修飾は、「Ｖ」−ウリジン５−オキシ酢酸、「［」−５−メチル−アミノメチルウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、「＄」−５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、「Ｓ」−５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、「）」−５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、「Ｂ」−２’−Ｏ−メチルシチジン（Ｃｍ）、「Ｍ」−Ｎ４−アセチルシチジン（ａｃ４Ｃ）、「］」−２−ライシジン（ｋ２Ｃ）、「Ｉ」−イノシン、「Ｑ」−キューオシンおよび「Ｑ＊」−グルタミル−キューオシンを含む５５。
【図５】Ｉｌｅ、ＧｌｕおよびＡｓｎの精製天然ｔＲＮＡの解析を示す図である。（Ａ）ＳＹＢＲグリーンで染色された変性ＰＡＧＥでの精製ｔＲＮＡの解析。（Ｂ〜Ｄ）ペプチド発現アッセイによって解析された、精製天然ｔＲＮＡＧｌｕ（Ｂ）、ｔＲＮＡＡｓｎ（Ｃ）およびｔＲＮＡＩｌｅ（ＧＡＵ）（Ｄ）の活性。アッセイにおける天然ｔＲＮＡの最終濃度は、１．６μＭとした。
【図６】半合成ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系におけるｓＧＦＰ発現を示す図である。（Ａ）半合成ｔＲＮＡ一揃いまたは種々の濃度の天然ｔＲＮＡ混合物を用いてプログラムされたｔＲＮＡが枯渇した溶解物において種々のコドン組成の３種のｓＧＦＰ  ＯＲＦのＤＮＡ鋳型を発現させた。（Ｂ）示されたｔ７ｔＲＮＡを欠く半合成ｔＲＮＡ混合物を補給した、ｔＲＮＡが枯渇した溶解物におけるｓＧＦＰ＿Ｔ２鋳型の発現。対応するコドンがｔＲＮＡの下に示されており、これにより、ｙはＵまたはＣを表し、ｒは、ＡまたはＧを表す。
【図７】ＰＵＲＥ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系における、およびｔＲＮＡが枯渇したＳ３０溶解物におけるｓＧＦＰ＿Ｔ１の発現を示す図である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳実験は、ｔＲＮＡ（丸）を用いずに、天然ｔＲＮＡ（四角）を用いて、または半合成ｔＲＮＡ（三角）を用いて実施した。
【図８】４８種の大腸菌（E. coli）ｔＲＮＡ種のｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成のためのＤＮＡ鋳型の構築を示す図である。（Ａ）Ｇ、ＵまたはＣから出発するｔＲＮＡのＤＮＡ鋳型；（Ｂ）ＡまたはＵから出発するｔＲＮＡのＤＮＡ鋳型。これらのＤＮＡ鋳型は、転写後に前駆体から自己切断し、ｔＲＮＡを放出するＨＨＲｚ−コード配列を含有する。ボックスは、ＨＨＲｚ−コード配列を示し、ボックス中の矢印は、リボザイム切断部位を示す；（Ｃ）ａ１〜ｄ１２の表で定義される４８種の大腸菌（E. coli）ｔＲＮＡ種の概要。図１のようなｔＲＮＡ記号表示およびそのそれぞれの遺伝子コピー数、第１の塩基および大きさが示されている。
【図９】親和性クランプアッセイにおけるＲＧＳ−ペプチド誘導体ＧＧＲＧＳおよびＤＤＲＧＳの較正曲線を示す図である。ここでは、ＴＶＭＶ基質脱クエンチ（de-quenching）の初速度がペプチドの濃度に対してプロットされており、線形方程式にフィッティングされている。
【図１０】種々のコドンが前に置かれたＲＧＳ鋳型からのペプチド発現レベルを示す図である。コドンは、（Ａ）ＡＵＧイニシエーターコドンのすぐ下流または（Ｂ）ＡＵＧに続く２つの連続ＧＡＵコドンの下流に配置した。前に置かれているコドンは、それぞれのバーの下に示されている。
【図１１】天然ｔＲＮＡ枯渇効率およびｔ７ｔＲＮＡデコード活性の算出を示す図である。１種または２種の試験コドンを有する２つのコーディングフレームを使用した。ＲＧＳペプチドの８アミノ酸に対応するコドンについては、その同義の変異体をペプチドコーディングフレーム内で試験した（灰色で示されている）。２コドン鋳型において、ＲＧＳコーディングフレーム中の同一２コドン変異体に加えて、ＧＡＵ対に続く２連続試験コドンを使用した。ＲＧＳペプチド配列中に生じないその他の１２アミノ酸については、１種または２種の試験コドンを、連続ＧＡＵコドンの対のすぐ下流に配置した。赤色の「ｘｘｘ」は、試験コドンを示す。種々のｔＲＮＡ／コドン組合せを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳反応を、ｔＲＮＡが枯渇した溶解物において実施した。大腸菌（E. coli）天然ｔＲＮＡ（１μｇ／μｌ最終濃度）でプライムした反応は、陽性対照として働いた（Σ天然ｔＲＮＡ）。個々のｔＲＮＡを欠く不完全ｔ７ｔＲＮＡ混合物（Σｔ７（−１）ｔＲＮＡミックス）でプライムした反応を使用して、ボックス中に提示された式を使用して所与の試験コドンの天然ｔＲＮＡ（複数可）の枯渇効率を評価した。完全（Σｔ７ｔＲＮＡミックス）および不完全ｔ７ｔＲＮＡ混合物でプライムした反応間の相違を使用して、試験コドン特異的ｔ７ｔＲＮＡの相対活性を評価し、ならびにアンスプリットまたはスプリットコドンファミリーボックス内のすべての可能性あるコグネートまたは非コグネート交差認識事象を示した。１−および２−コドン鋳型については、細胞不含翻訳反応中の試験コドン特異的ｔ７ｔＲＮＡの濃度は、それぞれ、両方について、１．６または６．４μＭのいずれかであった。２０種すべての基準アミノ酸のコドン／ｔＲＮＡ組合せの全スペクトルをアッセイし、親和性クランプアッセイによってペプチド収率を決定した。示されない限り、各反応は２連で実施した。
【図１２】Ｓｅｒ、ＡｒｇおよびＬｅｕのｔ７ｔＲＮＡ活性の評価を示す図である。Ａ：１．６μＭ  ｔＲＮＡ濃度の１−コドン鋳型（上部）または１．６μＭ（中央）および６．４μＭ（下部）ｔＲＮＡ濃度の２−コドン鋳型を使用して、６種のＳｅｒコドンに向けた４種のｔ７ｔＲＮＡＳｅｒアイソアクセプターのデコード効率を試験した。Ｂ：Ｓｅｒ、ＡｒｇおよびＬｅｕコドンのほとんどに向けた平均ｔ７ｔＲＮＡデコード効率を、１．６μＭまたは６．４μＭのｔ７ｔＲＮＡの１−および２−コドン鋳型によって提供される相対活性の平均値として算出した。その天然アイソアクセプターが不完全に枯渇され、したがって、１−コドン鋳型実験ではシグナルがマスクされた、アスタリスクで印がつけられたコドン（ＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡおよびＣＵＧ）は除外とした。したがって、これら４種のコドンに向けられたｔ７ｔＲＮＡ機能性は、２−コドン鋳型を使用して試験し、その相対デコード活性は、それぞれのｔ７ｔＲＮＡの１．６および６．４μＭでの活性の平均値として算出した。
【図１３】４倍縮重アミノ酸（Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、ＡｌａおよびＧｌｙ）のｔ７ｔＲＮＡデコード効率の評価を示す図である。対応する２−コドン鋳型は、翻訳に失敗したので、１−コドン鋳型反応に基づいてＰｒｏ  ｔ７ｔＲＮＡアイソアクセプターのコドンリーディング活性を算出した。その天然アイソアクセプターが部分的にのみ枯渇したアスタリスクで印をつけたその他のコドンの平均デコード活性は、２−コドン鋳型のみを用いて測定した活性に基づいて算出した。
【図１４】１、２および３倍縮重アミノ酸のコドンのｔ７ｔＲＮＡデコード効率の解析を示す図である。各コドンの最良の性能のｔ７ｔＲＮＡアイソアクセプター（記号表示については図８を参照のこと）ならびにその相対活性が示されている。ｔ７ｔＲＮＡ相対活性は、図１３におけるように算出した。
【図１５】異なるオリゴヌクレオチドマトリックスで単離された天然ｔＲＮＡＧｌｕのＰＡＧＥ解析を示す図である。天然ｔＲＮＡＧｌｕアイソアクセプターを、２種のバッファー系（ＴＭＡ＋またはＮａ＋を含有する）を使用して、それぞれ、オリゴＤＮＡ１−Ｇｌｕ−アミンおよびオリゴＤＮＡ１−Ｇｌｕ−ビオチンを用いて機能付与されたＮＨＳ−およびストレプトアビジン−樹脂によって精製した１１。溶出画分（Ｅ１およびＥ２）を、純度について８％変性ＰＡＧＥで評価した。１０樹脂容積の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファーを用いて室温で、２６０ｎｍでの溶出液の吸光度が、０．０１  Ａ２６０ユニット／ｍｌ未満に低下するまで洗浄することによって、結合していないｔＲＮＡを除去した。６８℃の３樹脂容積の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用いて、標的ｔＲＮＡを２回溶出した。
【図１６】ＲＮＡアプタマー（キッシングループ）クロマトグラフィーを使用する、総ｔＲＮＡ混合物からの特定のｔＲＮＡの枯渇を示す図である。（Ａ）キッシングループ：ｔＲＮＡ複合体形成の塩基対形成機序の模式図（Ｂ）特定のｔＲＮＡについて枯渇したｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系の調製のためのフローチャート。Ｃ：ｔＲＮＡ再構築後のＧＦＰ−合成の測定。
【図１７】ＡＲＳリコイリング（recoiling）手順を示す図である。
【図１８】ｔＲＮＡ枯渇でのＡＲＳリコイリング手順の結果を示す図である。
【図１９】Ａ：グラフトされたＧＣＵ−またはＣＣＵ−アンチコドン（Ｃｙｓ−ｔＲＮＡ（Ｃｙｓ）ｇｃｕ／ｃｃｕ）を有するシステイニル化またはセレモシステイニル化（selemocycteinylated）ｔＲＮＡＣｙｓ（Ｓｅｃｙｓ）を示す図である。Ｂ：すべてのｔＲＮＡが枯渇した溶解物およびｔ７ｔＲＮＡ（Ａｒｇ）ｃｃｕを欠く半合成ｔＲＮＡ一揃いの両方から再構成され、単一ＡＧＧ−コドンを有するｅＧＦＰ−コーディング鋳型を用いてプライムされた翻訳反応における、Ｃｙｓ−ｔＲＮＡ（Ｃｙｓ）ｃｃｕによる単一ＡＧＧ−コドンの有効なサプレッション。Ｃ：ＫＬを使用して内因性ｔＲＮＡ（Ｓｅｒ）ＧＣＵから直接枯渇された溶解物を用いる翻訳反応における２つの連続ＡＧＣ−コドンの有効なサプレッション。Ｄ：グラフトされたＣＵＡアンチコドンを有するｔＲＮＡＣｙｓを翻訳前にセレノシステイニル化することによる、ｅＧＦＰ−コーディングＯＲＦ中のアンバーコドンの有効なサプレッション（位置１５３）（Ｂと同様の反応条件）。Ｅ：ボディパイＦＬヨードアセトアミドを用いるＳｅｃｙｓ−ｔＲＮＡＣｙｓ（ＣＣＵ−アンチコドン）コンジュゲーション生成物の精製。
【図２０】非天然アミノ酸の組込みによる大環状ペプチド設計を示す図である。（Ａ）ｔＲＮＡ  Ａｒｇ（ＣＣＵ）を欠く再構成された無細胞系におけるボディパイ−ｔＲＮＡ−Ｃｙｓを使用するＥＧＦＰの位置１０８でのＡＧＧコドンの再割り当て。（Ｂ）ＥＧＦＰの位置４でのＡＧＣコドンの再割り当て。左パネルは、大腸菌（E. coli）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳反応から精製されたＥＧＦＰを用いてロードされたＳＤＳ−ＰＡＧＥのスキャンである。レーン１は、非修飾無細胞系を表し、レーン２および３は、ＧＣＵｔＲＮＡが、シクロオクテンリジン（ＣＯＣ）が担持されたＰｙｒ  ＧＣＵｔＲＮＡと置換されている反応を表す。ＣＯＣを、精製に先立ってＡｔｔｏ４８８−テトラジンで標識した。（Ｃ）１つまたは２つの再割り当てされたＳｅｒ（ＡＧＣ）またはアンバー（ＴＡＧ）コドンを有するＥＧＦＰの発現収率を示す図である。（Ｄ）テトラジン連結反応。（Ｅ）２つのシクロオクテン含有アミノ酸を連結可能な二機能性テトラジン誘導体の構造。（Ｆ）三機能性テトラジン誘導体。（Ｇ）ジテトラジン（ＤＴ）と架橋しているＣＯＣ含有ＥＧＦＰタンパク質（Ｂ）を発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。ゲルに未沸騰サンプルをロードし、ＥＧＦＰ蛍光についてスキャンした。（Ｈ）コドン再割り当ておよび銅によって触媒されるクリック反応を使用する大環状ポリペプチド形成の例。
【図２１】示されるように３種のｔＲＮＡ混合物を用いてプログラムされた、６つすべて（６）または１つのみのアルギニンコドンのいずれかがＡＧＧに変更された（それぞれ、図で６ＡＧＧまたは１ＡＧＧ）、２種のＧＦＰ−コーディング鋳型の翻訳効率を示す図である。総ｔＲＮＡおよび枯渇したｔＲＮＡは、それぞれｔＲＮＡｃｃｕ／ｕｃｕ枯渇の前後の総自家製単離ｔＲＮＡ混合物を示す。第３の混合物は、５μＭの最終濃度まで添加された合成ｔ７ｔＲＮＡｃｃｕを含有する。
【図２２】種々のｎｎＡＡ／ｏ−ｔＲＮＡ／ａａＲＳ組合せを用いる大腸菌（E. coli）細胞不含翻訳系におけるアンバーコドンサプレッション効率の比較分析を示す図である。Ａ：ここで使用されるｎｎＡＡの構造。Ｂ〜Ｄ：Ａ＿１５１Ｘ鋳型のサプレッションアンバーサプレッション。サプレッション効率は、そのＯＲＦ内に停止コドンを有さない野生型ｅＧＦＰ蛍光野生型ｅＧＦＰのパーセンテージの蛍光に対する割合として定義される。Ｂ：３種のＰｙｌＲＳ変異体による４種のｎｎＡＡの組込み。ＰｙｌＴｃｕａ、ＰｙｌＲＳ変異体およびｎｎＡＡの最終濃度は、それぞれ２０μＭ、２０μＭおよび１ｍＭとした。Ｃ：４種のＭｊＹ  ｔＲＮＡ変異体によるＡｚＦ組込み。ＭｊＹ１、ＭｊＹ２、ＭｊＹ３およびＭｊＹ４は、元の刊行物３５、３７中のｔＲＮＡ  ｐＡｚＰｈｅ１、ｐＡｚＰｈｅ２、ｐＡｚＰｈｅ３およびｔＲＮＡｏｐｔ  ＣＵＡに対応している。ＭｊＹｔＲＮＡ変異体、ＡｚＦＲＳおよびＡｚＦの最終濃度は、それぞれ、１０μＭ、１０μＭおよび１ｍＭとする。Ｄ：ＭｊＹ２／ＡｚＦＲＳ／ＡｚＦおよびＰｙｌＴ／ＰｙｌＲＳＡＦ／ＰｒＫのアンバーコドンサプレッション効率に対するｏ−ｔＲＮＡおよびｏ−ａａＲＳ濃度の効果。Ｅ：２つのオルソゴナル系におけるｎｎＡＡ組込み効率に対するコドン状況の効果。ＭｊＹ２およびＡｚＦＲＳの濃度は、両方について１０μＭとし、ＰｙｌＴおよびＰｙｌＲＳは、それぞれ、２０および３０μＭで使用した。Ａ＿１Ｘ、Ａ＿１５１Ｘ、Ｂ＿１ＸおよびＢ＿１５１Ｘと名付けられた４種の鋳型を解析に使用した（配列はＳＩに示されている）。ＡおよびＢは、異なるコドンバイアスを有する鋳型骨格を示し、これでは、Ａにおけるコドンボキャブラリーは、ｅＧＦＰに対して最適化され、一方でＢでは、それは、各アミノ酸種類をデコードするために独特のコドンを主に利用して単純化されている。数値は、ＯＲＦ配列中のアンバーコドンの位置を示す。個々の反応における相対活性は、ＥｃｔＲＮＡＴｙｒ（ｃｕａ）をサプレッサーとして使用する場合に得られる間に提供される蛍光強度のパーセントとして示されている。
【図２３】４種のＧＦＰ  ＯＲＦにおけるＡｚＦへのＡＧＧ再割り当てを示す図である。ＧＦＰタンパク質を、ＭｊＹサプレッション系（ＭｊＹ２／ＡｚＦＲＳ）を添加した、および添加しないＡＧＧコドンをデコードするｔＲＮＡ種が枯渇した無細胞系において発現させた。ＭｊＹ２、ＡｚＦＲＳ、ＡｚＦの最終濃度は、それぞれ１０μＭ、１０μＭおよび１ｍＭとした。ＭｊＹ２中のアンチコドンは、ＡＧＧコドンをＡｚＦに再割り当てするためにＣＣＵに変更した。
【図２４】ＡＧＧおよびＵＡＧサプレッションのためのＢＰＦＬ−ｔＲＮＡの合成を示す図である。（Ａ）：ＢＰＦＬがコンジュゲートされたｔＲＮＡのＨＰＬＣ精製。ＣＵＡまたはＣＣＵアンチコドンを有するｔＲＮＡＣｙｓに、ＣｙｓＲＳによってＣｙｓを担持し、ＢＰ−ＦＬ上のヨードアセトアミド基と反応させた。２５４ｎｍでの吸光度測定は、リボ核酸を検出し、一方、ＢＰ−ＦＬ検出のためには４９０ｎｍチャネルを使用した。（Ｂ〜Ｃ）：蛍光スキャニングによる標識されたタンパク質収率および１２％  ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロッティングによる総タンパク質収率の解析。ＢＰ−ＦＬ組込みは、サンプルの沸騰によってＧＦＰ蛍光をクエンチし排除した後に、ゲルで検出した。総タンパク質は、抗ＧＦＰ抗体を使用してウエスタンブロッティングによって検出した。各バンドの強度を、１に設定された最もかすかなバンドの強度によってスケーリングし、ＩｍａｇＪによって算出した。（Ｂ）１つのＡＧＧコドンを有するｓＧＦＰ＿Ｔ２鋳型は、正常溶解物または示されたｔＲＮＡ混合物を補給したｔＲＮＡが枯渇した溶解物中にＢｉｏｄｉｐｙ担持されたｔＲＮＡｃｃｕを添加して、または添加せずに、発現された。（Ｃ）アンバーまたはＡＧＧコドンサプレッションによって媒介されるＢＰ−ＦＬ組込みの比較。ＡＧＧサプレッションの翻訳反応は、それぞれ、１番目または１５１番目のＧＦＰ  ＯＲＦに単一ＡＧＧを有する鋳型によってプログラムされ、ＡＧＧサプレッサーを欠き、ＢＰＦＬ−ｔＲＮＡｃｃｕサプレッサーを有するか、または有さないｔＲＮＡが枯渇した溶解物および総ｔＲＮＡ混合物から再構成されている。同様の反応が、アンバーサプレッションのために、ただし、総ｔＲＮＡ混合物、単一アンバーコドンおよびＢＰＦＬ−ｔＲＮＡｃｕａサプレッサーを有する鋳型を用いて実施されている。
【図２５】ｓｍＦＲＥＴベースのコンホメーション変化解析のためのＣａＭの部位特異的二重標識された標識を示す図である。（Ａ）単一および二重標識されたＣａＭの蛍光スキャニングスキャン。二重標識されたＣａＭタンパク質を、ｔＲＮＡが枯渇した溶解物およびＡＧＧサプレッサーを欠く総ｔＲＮＡ混合物から再構成される細胞不含翻訳系において調製した。それぞれ１番目および１４９番目の位置にＵＡＧおよびＡＧＧコドンをリコードするために、２つのサプレッション系、ＭｊＹ２（ｃｕａ）／ＡｚＦＲＳ／ＡｚＦおよびＢＰＦＬ−ｃｙｓ−ｔＲＮＡｃｃｕを補給した。次いで、タンパク質中に組み込まれたＡｚＦを、銅不含クリック化学によってＤＩＢＯ−ＴＡＭＲＡと反応させた。単一標識されたＣａＭタンパク質は、同一方法であるが、１つのサプレッション系のみを使用して調製し、その他のｏ−コドンは、ｔＲＮＡＴｙｒｃｕａまたはｔＲＮＡＡｒｇｃｃｕのいずれかによってデコードされた。単一および二重標識されたＣａＭをロードしたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、示されるように２つのチャネルを使用してスキャンした。（Ｂ）４８８ｎｍで励起された単一標識された、および二重標識されたＣａＭの蛍光発光スペクトル。ＴＡＭＲＡ標識されたタンパク質の濃度を、その発光蛍光が、５４３ｎｍで励起された場合に二重標識されたタンパク質のものと同一であることを確実にするように調整した。（Ｃ）：Ｃａ２＋不含（ＰＤＢ：１ＣＦＣ）およびＣａ２＋結合型（ＰＤＢ：４ＣＬＮ）の構造表示。緑色および赤色の点は、それぞれ、１番目および１４９番目の位置にＣａＭ  ＯＲＦ中に導入されたＢＰ−ＦＬおよびＴＡＭＲＡを示す。（Ｄ〜Ｅ）異なる条件下で二重標識されたＣａＭの記録されたｓｍＦＲＥＴヒストグラム。（Ｄ）：Ｃａ２＋を含まない、（Ｅ）：２ｍＭ  Ｃａ２＋、（Ｆ）：１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌバッファー中。実線は、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェアを使用するデータへのガウスフィットを表す。各ピークは、個々のコンホメーションを示す。
【図２６】ｐＯＰＩＮＥ＿ＣａＭ鋳型のベクターマップを示す図である。
【図２７】ｔ７ｔＲＮＡｃｃｕを補給した、または補給していない枯渇した市販のｔＲＮＡ混合物の翻訳性能を示す図である。図中に示される、すべてのまたはただ１つのＡＧＧコドン、６つのＡＧＧまたは１つのＡＧＧのいずれかを有する２種のＧＦＰコーディング鋳型を、３種のｔＲＮＡ混合物を用いてプログラムされた翻訳反応において試験した。総ｔＲＮＡおよび枯渇したｔＲＮＡは、ｔＲＮＡｃｃｕ／ｕｃｕ枯渇の前後の市販のｔＲＮＡ混合物を示す。第３の混合物は、最終濃度を５μＭにするｔ７ｔＲＮＡｃｃｕを含有する。
【図２８】４種のこれまでに報告されたＭｊＹｔＲＮＡ種のアラインメントを示す図である。ＭｊＹ１、ＭｊＹ２、ＭｊＹ３およびＭｊＹ４は、元の刊行物４において、ｐＡｚＰｈｅ１、ｐＡｚＰｈｅ２、ｐＡｚＰｈｅ３３およびｔＲＮＡｏｐｔ  ＣＵＡと名付けられたｔＲＮＡに対応している。元の論文において報告された配列とは異なり、ＭｊＹ２＿ｔＲＮＡ中のＮ６３〜Ｎ６７は、ここでは、「ＣＡＴＣＧＴ」の代わりに「ＣＡＴＣＧ」である（末端の「Ｔ」は、元の論文では間違っていると思われる）。
【図２９】そのそれぞれの活性基を用いるフレキシザイムによって予め担持された５種のｎｎＡＡの組込み効率を示す図である。Ａ：Ｌ−プロパルギルグリシン４−クロロベンジルチオエステル（Ｐｒａ−ＣＢＴ）、Ｌ−アジドリジン４−クロロベンジルチオエステル（Ｌｙｓ（Ｎ３）−ＣＢＴ）、Ｌ−アジドホモアラニン４−クロロベンジルチオエステル（Ａｈａ−ＣＢＴ）、Ｎε−ビオチニル−Ｌ−リジン３，５−ジニトロベンジルエステル（Ｌｙｓ（ビオチン）−ＤＢＮ）およびＬ−アジドフェニルアラニン−シアノメチルエステル（ＡｚＦ−ＣＭＥ）を含む、フレキシザイムによるｔＲＮＡアシル化の５種の活性化された酸性基質の構造。ｎｎＡＡは黒色で示され、そのそれぞれの活性基は赤色で示されている。Ｂ：無細胞翻訳系においてＡ＿１５１Ｘ鋳型を使用することによって試験された、５種のｎｎＡＡが予め担持されたｔＲＮＡのアンバーサプレッション効率。１０、２０または３０μＭの最終ｔＲＮＡ濃度で、予め担持されたｔＲＮＡを使用して、翻訳反応をプライムした。フレキシザイム反応時間および予め担持されたｎｎＡＡ−ｔＲＮＡの最終濃度が示された。ここで試験された５種のｎｎＡＡの間で、ＡｚＦは、最高の翻訳活性を実証した。これは、その他のｎｎＡＡと比較して、フレキシザイムが、ｏ−ｔＲＮＡにＡｚＦを極めて良好に担持可能であり、この予め担持されたＡｚＦ−ｔＲＮＡは、ＥＦ−Ｔｕおよびリボソームによって十分に許容されることを示唆した。
【図３０】大腸菌（E. coli）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系における２種のサプレッション系、ＭｊＹ２／ＡｚＦＲＳ／ＡｚＦおよびＰｙｌＴ／ＰｙｌＲＳＡＦ／ＰｒＫのオルソゴナル性を示す図である。ｎｎＡＡ−基質、ｏ−ｔＲＮＡまたは酵素のいずれかを欠く反応を使用して、鋳型Ａ＿１５１Ｘ中のアンバーコドンでの非特異的サプレッションのレベルを評価した。ＭｊＹ２およびＡｚＦＲＳの濃度は、両方について１０μＭとし、ＰｙｌＴおよびＰｙｌＲＳをそれぞれ２０および４０μＭで使用した。
【図３１−１】（Ａ）鋳型Ａ＿１５１Ｘ中のＴＡＧコドンを、ＡｚＦに再割り当てしたことを示す図である。ｎｎＡＡ組込み部位を含有する同定されたペプチドのＭＳ／ＭＳ解析が示されている。（Ｂ）鋳型Ａ＿１５１Ｒ中のＡＧＧコドンを、ＡｚＦに再割り当てしたことを示す図である。ｎｎＡＡ組込み部位を含有する同定されたペプチドのＭＳ／ＭＳ解析が示されている。（Ｃ）鋳型Ａ＿１Ｒ中のＡＧＧコドンを、ＡｚＦに再割り当てしたことを示す図である。ｎｎＡＡ組込み部位を含有する同定されたペプチドのＭＳ／ＭＳ解析が示されている。
【図３１−２】（Ａ）鋳型Ａ＿１５１Ｘ中のＴＡＧコドンを、ＡｚＦに再割り当てしたことを示す図である。ｎｎＡＡ組込み部位を含有する同定されたペプチドのＭＳ／ＭＳ解析が示されている。（Ｂ）鋳型Ａ＿１５１Ｒ中のＡＧＧコドンを、ＡｚＦに再割り当てしたことを示す図である。ｎｎＡＡ組込み部位を含有する同定されたペプチドのＭＳ／ＭＳ解析が示されている。（Ｃ）鋳型Ａ＿１Ｒ中のＡＧＧコドンを、ＡｚＦに再割り当てしたことを示す図である。ｎｎＡＡ組込み部位を含有する同定されたペプチドのＭＳ／ＭＳ解析が示されている。
【図３２】ＢＰＦＬ−ｔＲＮＡＣｙｓ（ＣＣＵ）の構造を示す図である。
【図３３】ｔＲＮＡ、アミノ酸および延長因子の３次複合体を示す図である。種々のアミノ酸が担持されたｔＲＮＡＴｒｐの構造は、延長因子ＥＦ−Ｔｕと３次複合体を形成した。Ａ：Ｔｒｐ−ｔＲＮＡ−ＥＦＴｕ、Ｂ：ＢＰＦＬ−ｃｙｓ−ｔＲＮＡ−ＥＦＴｕ。
【図３４】ＡＧＧ翻訳を支援するｔＲＮＡＣｙｓｃｃｕの能力を示す図である。無細胞翻訳反応を、ＡＧＧ−アイソアクセプターを欠く半合成ｔＲＮＡ混合物を補給した、ｔＲＮＡが枯渇した溶解物において実施した。１つのＡＧＧコドンを有するｓＧＦＰ＿Ｔ２鋳型を、示されるようにＣＣＵアンチコドンを有するｔＲＮＡ種を添加して、または添加せずに発現させた。ｔＲＮＡＡｒｇｃｃｕは、合成ｗｔ  ＡＧＧ  ｔＲＮＡアイソアクセプターであり、陽性対照として働く。
【図３５】そのｔ７ｔＲＮＡ対応物：ｔ７ｔＲＮＡｃｃｕ（ａ０５）およびｔ７ｔＲＮＡｇｃｕ（ｃ１１）を補給した、または補給しない天然ＡＧＣ−およびＡＧＧ−コドンｔＲＮＡサプレッサー（Σ−ａ５／６，−ｃ１１）について枯渇した、０．２５および０．５μｇ／μｌで使用された市販のｔＲＮＡ混合物の翻訳性能を示す図である。両方ともＡＧＧのいずれをも欠く、位置４または４，５の１つのみの独特の（ｅＧＦＰ  ｘ１ＡＧＣ）または２つの連続する（consequtive）（ｘ２ＡＧＣ）ＡＧＣコドンのいずれかを有する２種のＧＦＰ−コーディング鋳型ならびに独特のＡＧＣ（位置４）およびＡＧＧ（位置１５１）コドン（ｅＧＦＰ  ｘ１ＡＧＣ／ｘ１ＡＧＧ）の両方を有する１つの鋳型を、サプレッション実験において使用した。各鋳型について、所望のＡＧＣ−およびＡＧＧ−コドンの天然アイソアクセプターを欠く総ｔＲＮＡ混合物または両方について補給されたｔ７ｔＲＮＡ類似体を含有する同一混合物のいずれかを用いて翻訳反応をプログラムした。使用されたＯＲＦの模式図が各グラフの下に示されている。
【図３６】ダブルセンスコドン標識のための実験ワークフローを示す図である。ＣａＭ天然ＯＲＦは、黒色で示されており、プレシジョン（precision）プロテアーゼ切断部位は、青色の丸によって示されており、一方、親和性クランプ（clam）結合ペプチド性（petidic）タグは、褐色の六角形として示されている。ｘ１およびｘ２は、それぞれ、ＣａＭの１番目または１番目および２番目の位置の単一または二重連続ＡＧＣ−コドンを示す。小文字（low case）は、ＳｅｒおよびＡｒｇコドンの残りについてバイアスを示す。
【図３７】ＣａＭの部位特異的二重標識を示す図である。単一および二重標識ＣａＭの蛍光スキャニング。二重標識ＣａＭタンパク質を、ｔＲＮＡが枯渇した溶解物ならびにＡＧＧ／ＡＧＡおよびＡＧＣ−コドンの両方についてサプレッサーを欠く総ｔＲＮＡ混合物から再構成される細胞不含翻訳系において調製した。それぞれ１番目および１５１番目の位置のＡＧＣおよびＡＧＧコドンをデコードするために、２種のサプレッション系、ＭｊＹ２（ｇｃｕ）／ＡｚＦＲＳ／ＡｚＦおよびＢＰＦＬ−ｃｙｓ−ｔＲＮＡｃｃｕを補給した。ＡｚＦを有するタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに直接ロードするか、または銅不含株によって促進される環化付加によるＤＩＢＯ−ＴＡＭＲＡとのその後のコンジュゲーションに付した。１５１位置の独特のＡＧＧに加えて、位置１または１，２の、１つ（ｘ１ＡＧＣ）または２つの（ｘ２）連続する（consequitive）ＡＧＣ−コドンを有する２種のＣａＭ−コーディングＯＲＦを使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、２つのチャネルを使用し、２つの示された波長でスキャンした。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
詳細な説明
本発明は、タンパク質中に２０種（２０）すべての天然アミノ酸を組み込む能力を損なうことなく、翻訳されたタンパク質中への、非天然部分（例えば、非天然アミノ酸）の組込みを可能にするタンパク質翻訳系を提供する。これは、通常、少なくとも２種（２）の異なるｔＲＮＡアンチコドンによってデコードされるアミノ酸のｔＲＮＡアンチコドンの１種を、非天然部分に再割り当てすることによって達成され、ここで、少なくとも１つのコドンは、再割り当てされたアンチコドンによって一意的に認識され得、少なくとも１つの別のコドン（すなわち、同一コドンボックス由来の）は、再割り当てされたアンチコドンによって認識され得ない。したがって、翻訳のためのｍＲＮＡは、再割り当てされたｔＲＮＡアンチコドン（複数可）に対応する１種または複数の特定のコドンを含むよう操作され、その結果、非天然部分は、適当なまたは所望の位置で翻訳されたタンパク質中に組み込まれる。
【００２７】
一態様では、本発明は、少なくとも１つの非天然部分を含むタンパク質の翻訳に適した一揃いのｔＲＮＡを製造する方法を提供し、前記方法は、天然アミノ酸のアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡを、非天然部分に再割り当てされた同一アンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡと置換するステップを含み、一揃いのｔＲＮＡは、非天然部分に再割り当てされたアンチコドンに対応するコドンを含むＲＮＡの翻訳を促進するように作動可能であり、それによって、翻訳されたタンパク質は、２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてを含み得る。
【００２８】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つの非天然部分を含むタンパク質の翻訳に適した一揃いのｔＲＮＡを含む組成物を提供し、前記一揃いは、天然アミノ酸のアンチコドンから再割り当てされた非天然部分のアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡを含み、一揃いのｔＲＮＡは、非天然部分に再割り当てされたアンチコドンに対応するコドンを含むＲＮＡの翻訳を促進するように作動可能であり、それによって、翻訳されたタンパク質は、２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてを含み得る。
【００２９】
本明細書において全般的に使用される場合、タンパク質は、天然Ｌ−アミノ酸および／または非天然アミノ酸などの非天然部分であり得る２つ（２）以上の共有結合によって連結された部分を含むポリマーである。通常、ペプチドは、５０（５０）を超えない連続部分を含むタンパク質である。通常、ポリペプチドは、５０（５０）超の連続部分を含むタンパク質である。
【００３０】
本明細書において使用される場合、「天然アミノ酸」は、生物のゲノムによって遺伝子によってコードされ得るＬ−アミノ酸である。通常、天然アミノ酸は、速度定数の生理学的範囲でペプチジルトランスフェラーゼ中心で反応する。好ましくは、天然アミノ酸は、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グリシン、リジン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、ヒスチジン、メチオニン、セリン、トレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンまたはこれらの天然アミノ酸のいずれかのアンチコドンを有するｔＲＮＡによって翻訳されたタンパク質中に通常組み込み可能なこれらの誘導体からなる群から選択される。誘導体は、翻訳後修飾されたアミノ酸（例えば、セレノシステイン）などの天然に生じる誘導体であり得る。
【００３１】
本明細書において使用される場合、「非天然部分」は、上記で定義されるような天然アミノ酸ではないという条件で、リボソーム媒介性鎖延長によってＲＮＡ鋳型から翻訳可能なタンパク質への組込みが可能な任意の分子であり得る。全般的に、このような非天然部分は、非天然アミノ酸、天然アミノ酸の天然もしくは合成化学誘導体および／または分子内共有結合を形成可能な部分などの化学的反応性部分を含み得る。いくつかの実施形態では、上記の条件の対象、非天然アミノ酸は、ペプチド結合形成可能であるアミン（−ＮＨ２）およびカルボン酸（−ＣＯＯＨ）を有する任意の有機化合物であり得る。非天然部分の限定されない例として、Ｄ−アミノ酸、セレノシステイン、ピロリジン、Ｎ−ホルミルメチオニン、α−アミノ−ｎ−酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、アロイソロイシン、ｔ−ロイシン、α−アミノ−ｎ−ヘプタン酸、ピペコリン酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、α，γ−ジアミノ酪酸、オルニチン、アロスレオニン、ホモシステイン、ホモセリン、β−アラニン、β−アミノ−ｎ−酪酸、β−アミノイソ酪酸、γ−アミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、イソバリン、サルコシン、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−プロピルグリシン、Ｎ−イソプロピルグリシン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−エチルアラニン、Ｎ−メチルβ−アラニン、Ｎ−エチルβ−アラニンが挙げられる。
【００３２】
分子内共有結合の形成に適し得る化学部分は、ホモ縮合を起こす２つの同一反応性基の組込み、二官能性反応性基による縮合を起こす２つの同一反応性基の組込みまたはヘテロ縮合を起こす２つの異なる反応性基の組込みを促進する任意のものであり得る。限定されない例として、ＮＨＳ−エステル、マレイミド（maleimidies）、ハロアセチルなどの部分によって修飾された、アミノ酸側鎖または末端アミンもしくはカルボン酸が挙げられるが、それらに限定されない。アミノ酸およびタンパク質の化学修飾のより詳細な考察については、Chapters 14 and 15 Of Current Protocols in Protein Science Eds. Coligan et al (2001-2012)も参照され得る。
【００３３】
本明細書において全般的に使用される場合、「ｔＲＮＡ」は、天然（native）および合成ｔＲＮＡ分子を含む、トランスファーＲＮＡまたはアイソアクセプターＲＮＡ分子である。通常、ｔＲＮＡ分子は、一次構造から形成される、４つまたは５つの二本鎖ステムおよび３つまたは４つの一本鎖ループをもたらす内部塩基対形成の領域を有する、約６０〜９３ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。５’および３’末端は、内部で塩基対形成された「アクセプターステム」の末端に位置している。３’末端は、ヌクレオチド配列ＣＣＡを含み、末端「Ａ」ヌクレオチドは、アミノ酸特異的アミノアシルｔＲＮＡシンターゼによるアミノアシル化の部位である。アミノ酸特異的アンチコドンは、ループＩＩ中に位置する。
【００３４】
本明細書において使用される場合、「アンチコドン」は、天然アミノ酸をコードするか、または翻訳ターミネーター（ＵＡＡ、ＵＧＡ、ＵＡＧ）として働くｍＲＮＡまたはそのＤＮＡ前駆体中のコドンに対応するｔＲＮＡ分子のヌクレオチド配列である。多くの場合には、アンチコドンは、アンチコドンが対応する（Ｓｅｒ、Ａｌａおよびいくつかの場合には、Ｌｅｕを除く）翻訳可能なｍＲＮＡコドンによってコードされる正しいアミノ酸を用いる、適当なアミノアシルｔＲＮＡシンターゼによるｔＲＮＡのアミノアシル化を促進する。これに関連して、アンチコドンは、対応する５’−３’ｍＲＮＡコドン配列と、少なくとも第１および第２の位置でワトソン−クリック塩基対を形成する、３’−５’トリヌクレオチド配列であり得る。遺伝暗号は、縮重しているので、所与のアミノ酸のコドンボックスをデコードする１つ超のｔＲＮＡがあり得る。同一アミノ酸をデコードし、異なるアンチコドンを含むこのようなｔＲＮＡは、「アイソアクセプター」として定義される。ＭｅｔおよびＴｒｐをコードするコドンを除いてすべてのコドンの場合には、アンチコドンおよびｍＲＮＡコドンの間の塩基対形成の特異性は、最初の２つのヌクレオチド（すなわち、アンチコドンでは３’−５’に、ｍＲＮＡコドンでは５’−３’に読み取る）によって規定され、その結果、同一アンチコドンは、２種以上の縮重ｍＲＮＡコドンに対応し得る。Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、ＰｈｅおよびＴｙｒの単一ｔＲＮＡ−アイソアクセプターの各々は、２種の異なるｍＲＮＡコドン（すなわち、「２倍縮重」）に対応する。Ｉｌｅは、２つのアイソアクセプターを有し、そのうち１つは、単一ｍＲＮＡコドンに対応する（すなわち「３倍縮重」）。ＲＮＡ鋳型中のそれぞれのコドンに対応するＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、ＴｈｒおよびＶａｌの２つのアイソアクセプターがある（すなわち、「４倍縮重」）。Ａｒｇ、ＬｅｕおよびＳｅｒについては、それぞれのコドンに対応する４または５つのアイソアクセプターがある（すなわち「６倍縮重」）。
【００３５】
本明細書において開示される組成物は、天然アミノ酸から非天然部分に再割り当てされたアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡを含むことが適している。これに関連して「再割り当てされた（reassigned）」とは、アンチコドンがもはや、そのオルソゴナル天然アミノ酸をコードするＲＮＡまたはＤＮＡコドンに対応しないことを意味する。これを達成するために、組成物を使用して翻訳可能な任意のＲＮＡはまた、合成されたタンパク質中に非天然部分を組み込むように意図される位置に対応するコドンを含む。重複性コドン（redundant codon）に対応するアンチコドンを利用することによって、組成物は、翻訳されたタンパク質中に２０種（２０）すべての天然アミノ酸を含む能力を損なうことなく、非天然部分を組込み可能である。
【００３６】
原則として、本発明による再割り当てされたアンチコドンは、天然アミノ酸をコードする重複性ＲＮＡコドンに対応する任意のものであり得、ここで、再割り当てされたコドンは、同一アミノ酸の複数の異なるコドンのうち１種である。所与のアミノ酸の重複性コドンの中に、再割り当てされたアンチコドンに独特に対応する少なくとも１つのＲＮＡコドンおよび再割り当てされたアンチコドンに対応しない少なくとも１つのＲＮＡコドンがあることが適している。当業者によって理解されるように、遺伝暗号は、それによってトリプトファンおよびメチオニン以外のすべての天然アミノ酸が、１つ超のコドンによってコードされる縮重を提供する。本発明の好ましい目的は、タンパク質への非天然部分の組込みにもかかわらず、２０種（２０）すべての非天然アミノ酸を組み込む能力が保持されるタンパク質翻訳系を提供することである。したがって、再割り当てされたアンチコドンは、上記のように４倍に縮重または６倍に縮重していることが好ましい。これは、「再割り当てされていない」アンチコドンが、タンパク質翻訳中に天然アミノ酸を組み込むことにおいてその通常の役割を果たすことを可能にする。特に好ましい形態では、アンチコドンは、Ｌｅｕ、ＡｒｇまたはＳｅｒのものである。
【００３７】
任意の特定のアミノ酸の潜在的に再割り当て可能なアンチコドンの各プールまたは一揃い内に、再割り当てに適当なアンチコドンの選択に当てはまるルールまたは判定基準があり得ることも、実施例から認められるであろう。これらとして、塩基対形成における「ゆらぎ」の効果、ｔＲＮＡアンチコドンおよびｍＲＮＡコドンの間の交差認識の可能性ならびに／または再割り当てされたアンチコドンを含む合成ｔＲＮＡ分子の調製の適合性を挙げることができる。これらの因子のより詳細な検討は、実施例において提供される。
【００３８】
一実施形態では、組成物を製造する方法は、（ｉ）天然アミノ酸を含むタンパク質の翻訳に適した一揃いのｔＲＮＡから、１種または複数のｔＲＮＡを枯渇させる（depleting）ステップと、（ｉｉ）枯渇された一揃いのｔＲＮＡを、非天然部分にそれぞれ再割り当てされ、非天然部分とそれぞれカップリングされる１種または複数のｔＲＮＡを用いて再構成するステップとを含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、（ｉ）における一揃いのｔＲＮＡは、細胞不含翻訳系中に存在する。
【００４０】
ステップ（ｉ）の一実施形態では、天然アミノ酸の実質的にすべてのｔＲＮＡが、一揃いのｔＲＮＡから枯渇される。特定の実施形態では、枯渇は、ｔＲＮＡをエタノールアミンセファロースと結合させることによる。
【００４１】
ステップ（ｉ）の別の実施形態では、一揃いのｔＲＮＡから天然アミノ酸の１種または複数のｔＲＮＡが選択的に枯渇される。一実施形態では、選択的枯渇は、１種または複数のｔＲＮＡを、それぞれの特異的なｔＲＮＡ枯渇物質と選択的に結合させることによる。このような物質は、天然または合成タンパク質、ＤＮＡ、ＰＮＡなどであり得る。
【００４２】
一実施形態では、ｔＲＮＡ枯渇物質は、ＲＮＡアプタマーである。各ＲＮＡアプタマーは、特定のｔＲＮＡと特異的高親和性複合体を形成することが適している。一実施形態では、ＲＮＡアプタマーは、標的ｔＲＮＡのアンチコドン含有ヌクレオチド配列との結合によって高親和性複合体を形成するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは、「キッシングループ（kissing loop）」ＲＮＡと呼ばれることがある。
【００４３】
さらに別の実施形態では、ｔＲＮＡ枯渇物質は、それぞれのｔＲＮＡに特異的なヌクレオチド配列を有する、１種または複数の一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む。この実施形態は、特定のｔＲＮＡの枯渇にとって特に有用である。
【００４４】
ステップ（ｉｉ）の一実施形態では、再構成ｔＲＮＡ（reconstituting tRNA）は、合成ｔＲＮＡ、天然ｔＲＮＡまたはそれらの混合物（本明細書において「半合成ｔＲＮＡ一揃い（半合成ｔＲＮＡ補完物（semi-synthetic tRNA complement））」と呼ばれる）を含み得る。合成ｔＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼ媒介合成を含めた、当技術分野で公知の任意の化学的または酵素的方法によって作製できる。限定されない例として、ＳＰ６、ＳＰ３およびＴ７媒介性合成が挙げられるが、それらに限定されない。以下に、より詳細に記載されるように、アスパラギン、グルタミン酸およびイソロイシンの合成ｔＲＮＡは、実質的に非機能性である。したがって、再構成目的で、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＩｌｅのｔＲＮＡは、天然ｔＲＮＡであることが適しているが、操作されたｔＲＮＡ突然変異体によって置換されてもよい。
【００４５】
いくつかの実施形態では、上記のように「キッシングループ」ＲＮＡなどのＲＮＡアプタマーとの選択的結合後に、特異的ｔＲＮＡを得、再構成のために使用できる。
【００４６】
非天然部分は、当技術分野で公知の任意の方法によって、再構成ｔＲＮＡ上にカップリング、担持またはロードされ得る。これらとして、化学的アミノアシル化（aminocylation）または酵素的アミノアシル化の使用を挙げることができる。酵素的アミノアシル化の限定されない例として、ピロリジンｔＲＮＡシンターゼ媒介性アミノアシル化において使用されるＰｙｌＲＳまたはその変異体（variant）、メタノコッカス・ヤンナスキイ（Methanococcus jannaschii）チロシルトランスファーＲＮＡシンセターゼ（Ｍｊ  ＴｙｒＲＳ）またはその変異体などの天然、修飾されたアミノアシルｔＲＮＡシンターゼの使用、フレキシザイム媒介性アミノアシル化および／またはシステイニルｔＲＮＡシンターゼによるアミノアシル化が挙げられる。
【００４７】
システイニルｔＲＮＡシンターゼによる非天然部分を用いるｔＲＮＡのアミノアシル化に関連する実施形態では、好ましい実施形態は、非天然部分に再割り当てされたアンチコドンを有する合成ｔＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ担持を提供する。野生型システインｔＲＮＡアンチコドンの突然変異は、システインｔＲＮＡに対するシステイニルｔＲＮＡシンセターゼの親和性を低減するが、高濃度の反応物が、親和性の低減を補償する場合には、システイニルｔＲＮＡシンセターゼのアミノアシル化活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで実質的に低減または阻害しない。システインｔＲＮＡアンチコドン突然変異体は、通常低レベルのシステイニルｔＲＮＡシンセターゼおよび競合する内因性システインｔＲＮＡの存在のために、ｉｎ  ｖｉｖｏで（例えば、細胞不含翻訳系において）システインを用いてアミノアシル化され得ない。したがって、一揃いのｔＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで非天然部分に再割り当てされたアンチコドンを有する合成ｔＲＮＡを担持することおよびｔＲＮＡ一揃いをこの合成ｔＲＮＡまたは各々異なる非天然部分を含む複数の異なるｔＲＮＡを用いて再構成することによって製造できる。上記のものから認められるように、本明細書において開示される組成物は、組換えタンパク質製造のための方法または系において使用するのに適し得る。
【００４８】
したがって、本発明の一態様は、少なくとも１つの非天然部分を含むタンパク質の翻訳に適した翻訳系を製造する方法を提供し、前記方法は、非天然部分に再割り当てされている天然アミノ酸のアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡを含む一揃いのｔＲＮＡを製造することおよび非天然部分に再割り当てされているアンチコドンに対応するコドンを含む転写可能なＲＮＡを製造することを含み、ｍＲＮＡは、２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてを含み得る翻訳されたタンパク質を製造するように転写され得る。
【００４９】
本発明の別の態様は、少なくとも１つの非天然部分を含むタンパク質の翻訳に適した翻訳系を提供し、前記系は、非天然部分に再割り当てされている天然アミノ酸のアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡを含む一揃いのｔＲＮＡおよび非天然部分に再割り当てされているアンチコドンに対応するコドンを含む翻訳可能なｍＲＮＡを含み、ｍＲＮＡは、２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてを含み得る翻訳されたタンパク質を製造するように転写され得る。
【００５０】
本発明のさらなる態様は、少なくとも１つの非天然部分を含む組換えタンパク質を製造する方法を提供し、前記方法は、非天然部分に再割り当てされている天然アミノ酸のアンチコドンを含む少なくとも１つのｔＲＮＡを含む一揃いのｔＲＮＡ中の、非天然部分に再割り当てされているｔＲＮＡのアンチコドンに対応するコドンを含むｍＲＮＡを翻訳するステップを含み、翻訳されたタンパク質は、２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてを含み得る。
【００５１】
これらの態様の系および方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでタンパク質翻訳を実施するため、またはそうでなければ、無細胞もしくは細胞不含翻訳系であることが適している。限定されない例として、麦芽、昆虫、ＨｅＬａ溶解物、ウサギ網状赤血球溶解物、大腸菌（E. coli）およびリーシュマニア（Leishmania）ベースの系が挙げられる。
【００５２】
上記のものから理解されるように、本発明は、遺伝暗号の１つまたは複数の重複性コドンを、非天然部分をコードするように再割り当てすることを少なくとも部分的に前提としている。したがって、本発明は、天然アミノ酸から非天然部分に再割り当てされているそれぞれのｔＲＮＡのアンチコドンに選択的に対応する１つまたは複数のコドンを含む、翻訳可能なＲＮＡが製造され得る方法を提供する。
【００５３】
本発明の特定の利点は、翻訳可能なｍＲＮＡが、１つまたは複数の非天然部分に加えて、２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてのコドンを含み得、それによって、翻訳されたタンパク質は、１つまたは複数の非天然部分に加えて２０種（２０）の天然アミノ酸のいずれかまたはすべてを含み得ることである。
【００５４】
したがって、本発明の一態様は、本明細書において開示される方法によって製造される組換えタンパク質を提供する。
【００５５】
本明細書において開示される組換えタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子も提供される。
【００５６】
単離されたタンパク質は、ペグ化、小分子のコンジュゲーション、標識、タギング、固定化、分子間および／もしくは分子内架橋もしくはその他の相互作用、高次構造の形成および／または１つもしくは複数の触媒活性などのさらなる誘導体化を促進する１つまたは複数の同一または異なる非天然部分を含み得るが、それらに限定されないことは認められよう。
【００５７】
特定の実施形態では、翻訳されたタンパク質は、１つまたは複数の分子内共有結合の形成を促進する１つまたは複数の非天然部分を含み得る。特定の実施形態では、組換えタンパク質は、大環状タンパク質である。
【００５８】
例として、環状ポリペプチドは、天然に見られる構造的フォールディングクラスの一部またはすべてからの代表物を含有するフォーカスドペプチドライブラリーを設計するための生物情報科学的方法において有用であり得る。
【００５９】
環化可能なアミノ酸を含むタンパク質の製造における複数の再割り当てされたコドンの利用能は、大環状ペプチドのライブラリーの構築を促進し得る。共有分子内結合を形成するために、以下のアプローチを使用してもよい：ａ）ホモ縮合を起こす２つの同一反応性基の組込み、ｂ）２つの同一反応性基の組込みおよび二官能性反応性基によるそれらの縮合ならびにｃ）ヘテロ縮合を起こす２つの異なる反応性基の組込み。本明細書に記載されるように、ｔＲＮＡアンチコドンの再割り当ては、これらのアプローチを試験するための系を提供する。ＳｅｒおよびＡｒｇコドンならびにＣ末端親和性クランプタグを保持する合成１０マーペプチドをコードする試験ｍＲＮＡを構築する限定されない例は、実施例により詳細に記載される。
【００６０】
本明細書において開示される本発明は、必要に応じて天然アミノ酸の組込みを可能にしながら、天然アミノ酸以外の部分を、標的化されたまたは選択された位置中に組み込む、任意のタンパク質もしくはペプチドまたは複数の異なるタンパク質およびペプチドを含むライブラリーの製造に適用可能であり得るということが認められよう。
【００６１】
本発明が十分に理解され、実用的効果をもたらし得るように、以下の限定されない実施例が参照される。
【実施例】
【００６２】
実施例１
半合成タンパク質翻訳系の開発
材料および方法
ペプチドバイオセンサー（親和性クランプ）アッセイ
種々の配列、ＲＧＳＩＤＴＷＶ、ＧＧＲＧＳＩＤＴＷＶ、ＤＤＲＧＳＩＤＴＷＶのリポーターペプチドおよび蛍光的にクエンチされたＴＶＭＶ基質ペプチド（５−アミノ−２−ニトロ安息香酸−ＥＴＶＲＦＱＳＫ−７−メトキシクマリン−４−イル）を、Ｍｉｍｏｔｏｐｅによって合成した。自己抑制されるプロテアーゼおよび親和性クランプ（ペプチドバイオセンサー）の融合物を、Ｎｉ２＋−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＴＣＥＰ、および１０％グリセロールバッファー（ｐＨ８．０）中で保存した。
【００６３】
通常、親和性クランプアッセイを、１．３μＭのペプチドバイオセンサーおよび３００μＭのＴＶＭＶ基質ペプチドを補給した、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴおよび０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）のバッファーＡ中で実施した。ＲＧＳペプチドをバッファー中の溶液として、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳においてのいずれかで使用し、サンプルを３３０ｎｍで励起し、Ｓｙｎｅｒｇｙプレートリーダーを使用して４０５ｎｍでの蛍光変化を１時間記録することによって反応進行をモニタリングした。較正プロットを作製して、基質切断の初速度（Ｖｍａｘ）および対照ペプチド既知濃度の間の関係を確立した。サンプルは３連でアッセイした。
【００６４】
細胞不含翻訳反応においてＲＧＳペプチドおよびその誘導体を定量するために、連関する転写−翻訳のために配合され、×２プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を補給したＳ３０大腸菌（E. coli）細胞抽出物を、所望のペプチドをコードするＤＮＡ鋳型を用いてプライムし、３２℃で１時間インキュベートした。翻訳後、反応混合物にＮａＣｌを１Ｍの最終濃度まで添加し、続いて、６５℃で１０分間インキュベートして、そうでなければ、基質ペプチドについてＴＶＭＶプロテアーゼと競合する内因性プロテアーゼを不活性化した。１００００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上記のような親和性クランプアッセイのために１０μｌの上清を使用した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳反応において、ＤＮＡ鋳型を欠く細胞不含翻訳反応中に種々の量の合成ペプチドを補給することによって較正プロットを得た。
【００６５】
ｔＲＮＡが枯渇した溶解物の調製
２７に記載されるように、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＧＯＬＤからｓ３０大腸菌（E. coli）抽出物を調製し、ｔＲＮＡ枯渇手順の前に、−８００で１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ８．２）、１４ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、０．６ｍＭ  ＫＯＡｃおよび０．５ｍＭ  ＤＴＴバッファー中で凍結して保存した。ｔＲＮＡ枯渇のために、２．５ｍｌのｓ３０抽出物を、２５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．１ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２）および１２０ｍＭ  ＫＯＡｃのバッファーＢを用いて平衡化したＮＡＰ−２５カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で再緩衝した。再緩衝後、溶解物を、これまでの手順２８に従って調製した、０．８〜１．２ｍｌの定着されたエタノールアミン−セファロースマトリックスとともに、オービタルシェーカー上で４０℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、上清を集め、１ｍｌの、１８０ｍＭ  ＫＯＡｃを含有するバッファーＢを用いてマトリックスを洗浄した。フロースルーを、前のステップから得た上清と組み合わせて、ｔＲＮＡが枯渇した溶解物を得、スナップ凍結し、−８００で保存した。
【００６６】
３０ｎＭ  ＤＮＡ鋳型および１０ｍＭ最終濃度のＭｇ（ＯＡｃ）２を使用して標準プロトコール２７に従って、Ｓ３０溶解物において、細胞不含翻訳反応を３２０で実施した。ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）Δ（ａａ、ｔＲＮＡ）キット（Ｅ６８４０Ｓ）は、ＮＥＢから購入し、製造業者の指示に従って使用した。
【００６７】
ペプチドおよびｓＧＦＰ発現のためのｔＤＮＡおよびプラスミドの構築
ｔＲＮＡのコード配列は、ゲノムｔＲＮＡデータベース（ＧｔＲＮＡｄｂ）２９から入手した。ＤＮＡ鋳型（ｔＤＮＡ）は、３ステップＰＣＲによって合成した（図８）。
【００６８】
ペプチドおよびｓＧＦＰをコードするすべてのＤＮＡ鋳型は、ｐＯＰＩＮＥ−ｅＧＦＰプラスミド（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＦ３７２３９７．１）をベースとして構築した。ペプチドをコードするＤＮＡ鋳型を構築するために、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限部位オーバーハングを有する２種の相補的オリゴヌクレオチドを使用して、所望のペプチドのＯＲＦを組み立てた。オリゴヌクレオチドの濃度を１００μＭに調整し、水に１：１モル比で混合し、続いて、９５℃で５分間加熱し、次いで、アニーリングのために室温にゆっくりと冷却した。ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩによってｐＯＰＩＮＥ−ｅＧＦＰプラスミドベクターを消化し、アニーリングしたオリゴヌクレオチドと組み合わせ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用してライゲーションした。陽性クローンをＳａｎｇｅｒシーケンシング（ＡＧＲＦ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ）によって確認した。
【００６９】
ｓＧＦＰ＿Ｔ１、ｓＧＦＰ＿Ｔ２およびｓＧＦＰ＿Ｔ３として示される種々のコドンバイアスを有するｓＧＦＰ  ＯＲＦをコードする断片を、ＩＤＴによってＧ−ｂｌｏｃｋとして合成し、標準Ｇｉｂｓｏｎクローニング手順に従ってｐＯＰＩＮＥベースのプラスミド中にクローニングした。
【００７０】
ｔ７ｔＲＮＡ合成および精製
標準ランオフｔ７転写反応を、４０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、１８ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、２ｍＭ  スペルミジン、４０ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５μＭ  ＤＮＡ鋳型を含有する５ｍＭ  各ｒＮＴＰ、１０μｇ／ｍｌ  Ｔ７ポリメラーゼおよび０．２５Ｕ／ｍｌ  酵母無機ピロホスファターゼ中で３２０で２時間実施した。ｔＲＮＡＨｉｓの合成のために、転写反応物に、まず、５ｍＭの各ｒＡＴＰ／ｒＣＴＰ／ｒＵＴＰおよび６．８ｍＭ  ｒＧＭＰを５分間補給し、続いて、１．７ｍＭ  ｒＧＴＰを添加し、２時間インキュベートした。ｔＲＮＡＨｉｓのＤＮＡ鋳型は、ｔＲＮＡ中の−１位置に対応するさらなるＧを含有していた。転写後、反応物をバッファーＣ（１２５ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ５．２、０．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ）で５倍に希釈した。ｔＲＮＡ転写物を、エタノールアミン−セファロースマトリックスを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。１ｍｌの転写反応のために、０．２ｍｌの定着されたマトリックスを使用した。４０でスラリーを１時間インキュベートした後、結合したｔＲＮＡを有するマトリックスを、２００ｍＭ  ＮａＯＡｃを含有するバッファーＣを用いて十分に洗浄した。ｔ７ｔＲＮＡをマトリックスから、２Ｍ  ＮａＯＡｃを含有するバッファーＣ中に溶出した。ｔＲＮＡをエタノール沈殿させ、ペレットを１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．５ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．０）を含有するｔＲＮＡバッファーに溶解した。
【００７１】
半合成ｔＲＮＡ混合物によるｓＧＦＰ発現
ｓＧＦＰをコードする可変同義コドン組成を有する３種のＯＲＦを商業的に合成し、ｐＯＰＩＮＥプラスミド中にクローニングした。鋳型１（Ｔ１）は、Ｌｅｕをコードする５種の異なる同義コドン、Ｖａｌの４種ならびにＰｒｏ、Ａｒｇ、ＳｅｒおよびＴｈｒの３種を含めた、最大コドン変動を有していた（表４）。鋳型２（Ｔ２）を、Ｓｅｒ、ＡｒｇおよびＬｅｕをコードするために使用される２種のみの同義コドンならびにＶａｌ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、ＡｌａおよびＧｌｙをコードするために使用される１種のコドンを用いて最大コドンバイアスを送達するように設計した（表５）。鋳型３（Ｔ３）は、中程度のコドン多様性を特徴とし、ＳｅｒおよびＡｒｇの２種のコドンならびにＴ１におけるように、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、ＡｌａおよびＧｌｙのいくつかのコドンを有していた（表６）。半合成ｔＲＮＡ混合物中の個々のｔＲＮＡの割合は、１０回を超えて生じるコドンおよび最小に枯渇した天然ｔＲＮＡに対応するコドンを除いて、ｓＧＦＰ  ＯＲＦ配列中のそのコドン存在量に対して大まかに比例していた。半合成混合物中のこれらのｔ７ｔＲＮＡは、表４〜６に示されるそのコドン使用に対して低減した割合でとられた。半合成ｔＲＮＡ一揃いを用いる翻訳反応においてＴ１〜３に対応するｓＧＦＰの製造を４８５ｎｍ励起および５２８ｎｍ発光波長で３時間、蛍光プレートリーダーでモニタリングした。
【００７２】
結果
タンパク質翻訳を支持可能な合成大腸菌（E. coli）ｔＲＮＡ一揃いを構築するために、本発明者らは、ｔ７プロモーターと、続いて、対応するｔＲＮＡコード配列を有する４８種のＤＮＡ鋳型でｉｎ  ｖｉｔｒｏランオフ転写２９、３０を実施した（図８）。
【００７３】
ｔ７ｔＲＮＡ転写物は、ｔＲＮＡＩｌｅ（ＧＡＵ）およびｔＲＮＡＴｒｐ（ＣＣＡ）を除いて、すべてのｔＲＮＡについて十分な量で得られた（図１）。これらのｔＲＮＡをコードする配列は、初期転写相において高い失敗率を引き起こす可能性が高いアデノシンから始まる。これら２種のｔＲＮＡについては、強力な転写開始部位が前に置かれたハンマーヘッド型リボザイム（ＨＨＲｚ）コード配列をｔＲＮＡコード配列の上流に導入して、効率的な転写と、それに続くＨＨＲｚ媒介性自己切除を確実にした（図８）３１。変性ＰＡＧＥ解析は、ＲＮＡ前駆体の９０％超が切断されて、所望のｔＲＮＡが得られることを示した（図１）。ｔＲＮＡＬｅｕ（ＣＡＡ）およびｔＲＮＡＴｙｒなどのいくつかのｔＲＮＡはさらなる微量のバンドを含有するが、本発明者らは、すべての場合において予測される大きさの主要な種を得た。
【００７４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏペプチド発現アッセイ
次いで、本発明者らは、ｔ７ｔＲＮＡのデコード効率を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成アッセイを考案しようとした。本発明者らは、限定されたコドンのセットを使用する短いオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に対応するリポーターペプチドは、その合成にｔＲＮＡの完全セットを必要とするＧＦＰまたはルシフェラーゼなどの伝統的なリポータータンパク質を上回って有利であると推測した。
【００７５】
多重定量的均一ペプチド発現アッセイを確立するために、本発明者らは、本発明者らのグループによって最近開発されたペプチドバイオセンサーを利用した３２。それは、「親和性クランプ」として知られる３３人工的に操作されたペプチド結合ドメインおよび自己抑制されたタバコ葉脈斑紋ウイルス（tobacco vein mottling virus）（ＴＶＭＶ）プロテアーゼからなる。８アミノ酸リガンドペプチドＲＧＳＩＤＴＷＶ（ＲＧＳペプチド）のバイオセンサーとの結合が、コンホメーション変化を引き起こし、プロテアーゼ活性化をもたらし、これが、クエンチされた蛍光ＴＶＭＶ基質ペプチドの切断によって検出される（図２Ａ）。本発明者らは、このアッセイを使用して、５０ｎＭほどの少ないペプチドが検出され得ることを実証した。ＴＶＭＶ基質切断の初速度（Ｖｍａｘ）およびＲＧＳペプチドの絶対濃度の間の関係は、５０〜４００ｎＭの範囲で線形であるとわかった（図２Ｂ）。さらに、アッセイは、大腸菌（E. coli）無細胞系において実施され得るが、これには、内因性タンパク質分解活性を軽減するためにプロテアーゼ阻害剤のカクテルが必要である。
【００７６】
ＲＧＳペプチドの親和性クランプとの結合は、遊離Ｃ末端３４、３５に応じて非常に変わるが、ＲＧＳペプチドのＮ末端にさらなるアミノ酸を導入することは、クランプ対ペプチド結合に影響を及ぼすと予測されない３３。本発明者らは、本発明者らのアッセイにおいて、２種のＮ末端が伸長された合成ペプチド、ＧＧ  ＲＧＳＩＤＴＷＶおよびＤＤ  ＲＧＳＩＤＴＷＶを試験することによってこれを確認し（図９）、３種のペプチドすべての較正曲線は、良好な直線性を示し、Ｒ２＞０．９９であった（図２Ｂおよび図９）。本発明者らは、本発明者らの発現アッセイは、無細胞系におけるＲＧＳ由来ペプチドの発現を定量するように良好に適合され、したがって、種々のアイソアクセプター／コドン対のデコード効率を試験するために使用され得ると結論付けた。翻訳開始に対するイニシエーターＡＵＧコドンのすぐ下流のコドンの影響を低減するために、イニシエーターおよび試験コドンの間に２つのＧＡＵコドンを挿入して、ＲＧＳ２鋳型を得た（図２Ａ）。対照実験は、このような鋳型が、ＲＧＳペプチドコード配列の上流の試験コドンに関わらず、一貫したペプチド発現レベルを媒介することを実証した（図１０）。
【００７７】
ｔＲＮＡが枯渇した大腸菌（E. coli）細胞不含翻訳系の特性決定
ｔＲＮＡが枯渇した大腸菌（E. coli）Ｓ３０細胞抽出物を得るために、本発明者らは、先に公開されたクロマトグラフィー的ｔＲＮＡ枯渇プロトコール２８を改変した。この手順では、タンパク質合成のために必要とされるその他の成分は、フロースルー中のままでありながら、内因性ｔＲＮＡは、エタノールアミン−セファロースマトリックスと結合する。翻訳効率を保持しながら、最適ｔＲＮＡ枯渇を得るために、本発明者らは、カリウム／マグネシウム濃度ならびにマトリックス対溶解物の比を最適化した。総天然ｔＲＮＡ混合物を添加した、または添加しない枯渇した溶解物におけるｅＧＦＰ発現を比較することによって、ｔＲＮＡ枯渇の程度を評価した。図３Ａに見ることができるように、天然ｔＲＮＡの非存在下では、ｅＧＦＰは製造されなかったが、総天然ｔＲＮＡ混合物の添加は、親の溶解物レベルの６０％に翻訳を回復させた。ｔＲＮＡが枯渇した溶解物では、おそらくは再添加されたｔＲＮＡのアミノアシル化に必要な時間を反映して、およそ１０分の時間のずれが観察された。
【００７８】
ｅＧＦＰと同様に、短いＲＧＳ１鋳型の翻訳（図２Ａ）も、ｔＲＮＡ依存性であった。天然ｔＲＮＡおよび９種のコドン特異的ｔ７ｔＲＮＡ種の混合物（表１）の両方とも、同様のレベルに翻訳を回復させた（示されていないデータ）。
【００７９】
合成ｔＲＮＡは、ＲＧＳ１鋳型の翻訳を支持できたという観察結果は、ｔＲＮＡＩｌｅが、効率的なアミノアシル化のために転写後修飾を必要とする２１ことを考慮すると幾分か驚くべきものであった。ゆえに、本発明者らは、混合物から個々のｔ７ｔＲＮＡを省き、得られた反応混合物における翻訳活性を測定した対照実験を実施した。図３Ｂに表されるように、ＡＵＧ（ｉＭｅｔ）、ＣＧＧ（Ａｒｇ）またはＵＣＣ（Ｓｅｒ）コドンの個々のｔ７ｔＲＮＡが、ｔ７ｔＲＮＡ混合物から独立に控えられた場合に、ペプチド発現は大幅に減少した。しかし、ＧＧＣ（Ｇｌｙ）、ＡＵＣ（Ｉｌｅ）、ＧＡＣ（Ａｓｐ）、ＡＣＣ（Ｔｈｒ）またはＵＧＧ（Ｔｒｐ）のｔ７ｔＲＮＡが排除された場合には、おそらくは、溶解物中の天然ｔＲＮＡ残遺物のために、幾分かの残存する発現が観察された。ＣＧＧ（Ａｒｇ）およびＵＣＣ（Ｓｅｒ）のｔＲＮＡの枯渇効率は、７５〜９０％であり、これらのコドンは、枯渇された溶解物中に残存するそれぞれの天然ｔＲＮＡアイソアクセプターが無視できる量であるため（選択されたｔＲＮＡが添加されない場合にペプチドが製造されなかった場合に、ｔＲＮＡ枯渇効率は、１００％と定義される）３６、再割り当てにより適していることを示した。これらのコドンの両方とも、２つのコドンファミリーから構成される混合コドンボックスに属し、これが、それらを、再割り当ての特に有望な候補にする（以下を参照のこと）。
【００８０】
ｔ７ｔＲＮＡ機能性および特異性の系統的解析
開発したアッセイは、ｔ７ｔＲＮＡの全集合体を系統的に試験するためのプラットフォームを提供した（図２Ａ）。しかし、最初の実験は、枯渇された溶解物中のいくつかのアイソアクセプターの残存する量を示した。これらは、大腸菌（E. coli）中で豊富であるｔＲＮＡを表し、これは、個々のｔＲＮＡの枯渇効率とその存在量の間の関係を示す（表２）１０、３６。内因性ｔＲＮＡの不完全な枯渇は、そのｔ７ｔＲＮＡ対応物からのシグナルをマスクすることによって機能性試験を複雑にする可能性がある。しかし、本発明者らは、特定のｔＲＮＡの２つの連続コドンを、鋳型中に含めることが、ペプチド翻訳効率に対するその枯渇の悪影響を大幅に増強することを観察した。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの少ない存在量のｔＲＮＡについてこれまでに記載された３７、低減されたｔＲＮＡ濃度での翻訳速度論の変化を反映する可能性が高い。したがって、本発明者らは、２つの連続標的コドンを有するリポーターペプチドＯＲＦを使用して、不完全に枯渇されたアイソアクセプターを有するコドンを再スクリーニングした。デコード効率は、１−および２−コドン鋳型の平均値として算出した（図１１）。６１種のコドンをデコードするｔ７ｔＲＮＡの能力は、図４および図１２〜１４にまとめられている。
【００８１】
アッセイ結果を解釈する場合に考慮する１つの重要な態様は、ｔ７ｔＲＮＡが溶解物中で修飾を受け得る程度である。例えば、粗大腸菌（E. coli）溶解物は、合成ｔＲＮＡ中のプソイドウリジンの形成を媒介すると報告された３８。このような修飾は、イソメラーゼ活性のみを必要とし、本発明者らの系中に存在する可能性がある低分子量基質または補助因子を必要としない３９。しかし、Ｎ３４およびＮ３７での修飾は、リレー鎖を有する最大２０種の酵素ならびに複数の基質および補助因子に関わる１９。したがって、このような修飾は、系の大幅な最適化を行わずに粗溶解物中の合成ｔＲＮＡ上に現れる可能性は低い。本発明者らは、報告において後にこの問題に実験的に取り組んでいる（以下を参照のこと）。
【００８２】
スプリットコドンファミリーボックス
Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、ＡｓｐおよびＣｙｓなどのＵおよびＣで終わるスプリットコドンファミリーのデコードは、第１のアンチコドン位置にＧまたはその修飾形態（Ｑ）を有するｔＲＮＡによって実施される。ＡおよびＧで終わるコドンは、修飾されたウリウリジン（ＬｙｓおよびＧｌｕ）を使用して、または第１のアンチコドン位置にＣを有する（Ａｒｇ、ＬｅｕおよびＧｌｎ）（図４の青色および灰色で影が付けられたアミノ酸）アイソアクセプターを添加することによってデコードされる。前者の場合には、ウリジンは、ＡおよびＧで終わるコドンのみに認識を限定する種々のアミノメチル誘導体で修飾され４０、ＵおよびＣが、両Ｌｅｕアイソアクセプターの第１のアンチコドン位置にある場合には、リボース２’−Ｏ−メチル化によってさらに支持される。
【００８３】
その天然対応物と比較して、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、ＡｓｐおよびＣｙｓのｔ７ｔＲＮＡは、ワトソン−クリック幾何学を有する（「コグネート−ＷＣ」とさらに呼ばれる）（Ｃで終わる）そのコグネート（Ｃで終わる）コドンおよびゆらぎ（Ｕで終わる）コドンの両方のデコードにおいて効率的であった（５０〜７０％）。ｔ７ｔＲＮＡＴｙｒ（ＧＵＡ）は、ＵＡＣを約５０％の効率で、ＵＡＵを３０％未満でデコードした。さらなるＧ−１Ｃ７３塩基対を特徴とするｔ７ｔＲＮＡＨｉｓ（ＧＵＧ）は、そのコグネート−ＷＣ  ＣＡＣおよびゆらぎＣＡＵコドンの効率的なデコードを実証した。Ｇ−１を欠くｔ７ｔＲＮＡは、おそらくは、アミノアシル化ステップの失敗のために４１ペプチド翻訳の回復において機能的ではなかった（示されていないデータ）。
【００８４】
ｔ７ｔＲＮＡＳｅｒ（ＧＣＵ）は、ＡＧＣおよびＡＧＵコドンの両方を、それぞれ１２３および７５％の効率で認識した。ＬｅｕおよびＡｒｇについて、２種のｔＲＮＡアイソアクセプターは、各スプリットコドンボックスをデコードすることに関与しており、本発明者らのアッセイでは、ＵＡＡおよびＣＡＡアンチコドンを有する両Ｌｅｕ  ｔ７ｔＲＮＡが、伝統的なＷＣ−塩基対形成によってそのコグネートコドンのみを認識した。これは、非修飾ウリジンによるこれまでに報告された制限された認識様式４２と一致するが、それぞれ３６および８８％の効率であった。ＵＣＵおよびＣＣＵアンチコドンを有するＡｒｇのｔ７ｔＲＮＡは、それぞれ、３４０および２０２％の効率で、そのコグネートＷＣコドンを厳密に認識することにおいて同様の挙動を実証した。これらのｔ７ｔＲＮＡの、より高い見かけの活性は、天然ｔＲＮＡ混合物中のこれらのアイソアクセプターの少ない存在量３６を反映した可能性がある。リボソーム結合アッセイ４３から得られたこれまでの観察結果と一致して、ｔ７ｔＲＮＡＧｌｎ（ＵＵＧ）は、そのコグネートＷＣ  ＣＡＡコドンをデコードできなかった。ｔ７ｔＲＮＡＧｌｎ（ＣＵＧ）はまた、ＣＡＡコドンをデコードできなかったが、そのコグネートＷＣ  ＣＵＧコドンを、４０％の効率でデコードできた。
【００８５】
Ｇｌｕ（ＵＵＣ）、Ｉｌｅ（ＧＡＵ）、Ａｓｎ（ＧＵＵ）およびＬｙｓ（ＵＵＵ）のｔ７ｔＲＮＡは、そのコグネートＷＣおよびゆらぎコドンの両方を含む鋳型からのペプチド翻訳を持続するのに失敗した。ＧｌｕおよびＩｌｅ  ｔ７ｔＲＮＡのアンチコドンループ内の修飾がないことが、そのアミノアシル化を妨げ、ペプチド翻訳においてそれらを不活性にすることがこれまでに示されており４４、４５、Ｈｒｚの助けを借りて、または借りずに調製されたｔ７ｔＲＮＡＡｓｎ（ＧＵＵ）は、リポーターペプチド合成において不十分なしか性能しか示さなかった。両方ともｔＲＮＡＡｓｎに由来する、グラフトされたアンチコドンおよびデスクリミネーター塩基を有するキメラｔ７ｔＲＮＡＬｙｓは、Ａｓｎを用いてＡｓｎＲＳによってアミノアシル化され得るが４６、それでも本発明者らのアッセイにおいてペプチド発現を支持するのに失敗した（示されていないデータ）。この関連で、非修飾Ｕ３４を有するｔＲＮＡＬｙｓは、アンチコドンループにおける構造秩序の潜在的な喪失ならびに３つの連続する最小に重複するＡ−Ｕ塩基面によって形成されるコドン−アンチコドン二本鎖内の不十分なスタッキングのために、そのコドンのいずれかのデコードに失敗することがこれまでに報告された４７、４８。本発明者らの系では、ｔ７ｔＲＮＡＬｙｓの第１のアンチコドン位置においてＵをＣに突然変異させることは、ＡＡＧコドンに対するそのデコード活性を十分に回復させた。この効果は、アンチコドンループおよびコドン−アンチコドンヘリックス両方内のシチジンによって提供されるより強力なスタッキングに、ならびにリジルａａＲＳに対するより高度な親和性４９に起因する可能性があり得る。
【００８６】
Ｔｒｐ（ＣＣＡ）およびＭｅｔ（ＣＡＵ）のｔ７ｔＲＮＡは、そのコグネートＷＣコドンを、それぞれ、４６％および６１％の効率でデコードした。
【００８７】
アンスプリットコドンファミリーボックス
細菌では、８種のアンスプリットコドンファミリーボックスをデコードするために、Ａｒｇだけは除いて、第１のアンチコドンにＧ、Ｕ、および／またはＣを有する２種または３種のアイソアクセプターの標準サブセットが使用される。ここで、Ｇで終わる同義コドン（図４で青色および緑色で影を付けた）のデコードをもっぱら媒介するためのＣ−およびＵ−を有するＧ３４対ならびにＣ３４。ペプチド合成アッセイでは、第１のアンチコドン位置にＧまたはＣを有するすべてのｔ７ｔＲＮＡアイソアクセプターは、４０〜１６０％の効率でのそのコグネートＷＣコドンの特異的認識を実証した（図４）。ｔＲＮＡＧｌｙ（ＵＣＣ）を除くすべての天然ｔＲＮＡアイソアクセプターでは、Ｕ３４は、ヌクレオシド糖パッカー幾何学を部分的に変更することによって、Ｖａｌ、ＰｒｏおよびＡｌａについて、Ａで終わるそのコグネートＷＣ５０を超えて、Ｇ、ＵおよびＣで終わるコドンに認識を広げる５’−オキシ酢酸修飾を保持する５１、５２。
【００８８】
さらに、おそらく修飾を欠くｔ７ｔＲＮＡＬｅｕ（ＵＡＧ）およびｔ７ｔＲＮＡＳｅｒ（ＵＧＡ）は、Ａで終わるコドンに対して強い優先傾向を示し、より小さい程度でＵで終わるコドンに対して優先傾向を示すが、ＧおよびＣで終わるコドンを認識できない２４。１．６μＭの２つの連続ＵＣＵコドンをデコードするｔＲＮＡＳｅｒ（ＵＧＡ）の相対効率は、約１０％であったが、アイソアクセプター濃度の６．４μＭへの増大は、約７０％のデコード効率をもたらした（図１２Ａ）。ｔＲＮＡ本体（アンチコドンループを含む）中にいくつかの転写後修飾がないことが、ａａＲＳに対する親和性の低減もしくは高率のコドン−アンチコドン相互作用の解離のいずれか、および／またはｔＲＮＡ適応につながること５３を考えると、この知見は容易に正当化され得る。これらの効果の両方とも、少なくとも部分的に、ｔＲＮＡ濃度の増大によって補償され得る。
【００８９】
驚くべきことに、非修飾Ｕ３４を有する可能性が最も高い、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、ＴｈｒおよびＡｌａのｔ７ｔＲＮＡは、その天然対応物と同様のコドン読み取りパターンを示した−すなわち、これらのｔ７ｔＲＮＡは、そのコグネートＷＣ  Ａで終わるコドンを効率的にデコードするだけでなく、より少ない程度で、ＵおよびＣで終わるコドンもデコードする５４。Ｇで終わるコドンのデコードは、ＶａｌおよびＡｌａの強力なＵ３４−Ｇ３媒介性認識を特徴とし、これは、Ｃ３４を有するバックアップアイソアクセプターを欠く。これは、コグネートＷＣアイソアクセプターによって媒介される可能性がある、ＰｒｏおよびＴｈｒの非効率的なＵ３４−Ｇ３媒介性認識と対照をなす（図４）。
【００９０】
天然ｔＲＮＡＧｌｙ（ＵＣＣ）は、スプリットコドンボックスをデコードするｔＲＮＡの特徴である、Ｕ３４（上記参照のこと）にアミノメチル修飾を保持するという点で５０、第１のアンチコドン位置にＵを有するアンスプリットボックスをデコードするその他のｔＲＮＡとは異なる。ｔ７ｔＲＮＡＧｌｙ（ＵＣＣ）は、後者のコグネートＷＣデコードのＣ３４アイソアクセプターの存在にもかかわらず、ＣおよびＧで終わるコドンを有効にデコードするので上記の相関の例外である。
【００９１】
上記のように、細菌におけるアンスプリットファミリーボックスからの４種のＡｒｇコドンのデコードは、２種のアイソアクセプターに頼るので通常ではなく、その一方は、真核生物ではより一般的なイノシン修飾を保持する。この修飾は、それぞれ、ゆらぎおよびＷＣ幾何学を有する塩基対形成によってＡ、ＵおよびＣで終わるコドンのデコードを可能にする。ｔ７ｔＲＮＡ（ＡＣＧ）の非修飾アンチコドンステム−ループは、そのコグネートＷＣコドンＣＧＵに対してほとんど同一の親和性を示したが、そのゆらぎＣＧＣおよびＣＧＡコドンとの結合では非効率的であった５６。本発明者らの研究では、ｔ７ｔＲＮＡＡｒｇ（ＡＣＧ）は、Ｕで終わるコドンを効率的にデコードできただけでなく、Ｃ、Ａで終わるコドンおよび少ない程度にＧで終わるコドンもデコードできた。
【００９２】
これまでに記載された実験は、１７種のアミノ酸について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、合成ｔＲＮＡが、その天然対応物に機能的に取って代わることができたことを実証する。すべての試験されたｔ７ｔＲＮＡについて、異なるアミノ酸をコードする同一ファミリーに由来するコドンについて（図４、ＳｅｒおよびＡｒｇ、ＬｅｕおよびＰｈｅ、ＨｉｓおよびＧｌｎ、ＡｓｎおよびＬｙｓ）またはＳｅｒ、ＡｒｇおよびＬｅｕなどの同一の混合されたコドンボックスを有する異なるファミリーに属する同義コドンについて、交差認識が観察されなかったことが重要である。アンスプリットコドンボックスと合わされたスプリットコドンファミリーを用いて、これら３種のアミノ酸を解析することは、前者および後者が重複しないデコードパターンを有し、潜在的に再割り当て可能なコドンを表すので特に興味深い。
【００９３】
大腸菌（E. coli）天然ｔＲＮＡ混合物からのＧｌｕ、ＡｓｎおよびＩｌｅの天然ｔＲＮＡの単離
本発明者らの結果は、アミノ酸の大部分は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたｔＲＮＡを使用することによってタンパク質中に組み込まれ得ることを実証した。２０種すべての基準アミノ酸を含有するタンパク質の翻訳を支持可能なｔＲＮＡ混合物を再構成するために、本発明者らは、Ｇｌｕ、ＡｓｎおよびＩｌｅのコドンを効率的にデコードする必要があった。この目的で、本発明者らは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションクロマトグラフィー５７、５８によって天然ｔＲＮＡ混合物から、これらのアミノ酸に特異的な天然ｔＲＮＡを精製することを決定した。本発明者らは、いくつかの固定化戦略を試験し、３’−アミノ化オリゴヌクレオチドを、ＮＨＳ−セファロースとカップリングすることによって最良の結果を得た（図１５）。Ｇｌｕ、ＡｓｎおよびＩｌｅの３種の特異的ｔＲＮＡのすべてが、標的ｔＲＮＡのＤ−ループおよびアンチコドンループと相補的であるオリゴヌクレオチドを用いる選択的ハイブリダイゼーションによって、天然ｔＲＮＡ混合物から良好な純度で成功裏に得られた（表３）。ｔＲＮＡは、熱変性によってマトリックスから溶出され、変性ＰＡＧＥ解析によって＞９０％純度のものであると示された（図５Ａ）。
【００９４】
Ｇｌｕ（ＳＵＣ）、Ａｓｎ（ＱＵＵ）およびＩｌｅ（ＧＡＵ）の精製された天然ｔＲＮＡの機能性を、そのコグネートＷＣまたはゆらぎコドンを有する鋳型を使用して上記のように試験した。連続ＧＡＡまたはＧＡＧコドンを有する２種の鋳型を使用して、図５Ｂに示されるように、両コドンを効率的にデコードできる、精製されたｔＲＮＡＧｌｕ（ＳＵＣ）の機能性を試験した。同様に、精製された天然ｔＲＮＡＡｓｎ（ＱＵＣ）は、ＡＡＵまたはＡＡＣコドンのいずれかを有する鋳型の翻訳を回復させた。精製された天然ｔＲＮＡＩｌｅ（ＧＡＵ）は、おそらくは変性または修飾されたアイソアクセプター変異体下での同時単離後の非効率的再折りたたみのために、ＡＵＵコドンを４０％の効率でのみデコードできた。
【００９５】
半合成タンパク質翻訳系
本発明者らは、２０種の基準アミノ酸の各々の少なくとも１種の精製された機能的ｔＲＮＡを得た。この単純化されたｔＲＮＡ一揃いが、全長タンパク質の合成を支持できるか否かを試験するために、本発明者らは、可変コドン組成を有するスーパーフォールダー（superfolder）ＧＦＰ（ｓＧＦＰ）５９をコードする３種のＤＮＡ鋳型を合成した。これらの鋳型は、ＣＣＵ（Ｐｒｏ）、ＵＡＵ（Ｔｙｒ）、ＣＡＡ（Ｇｌｎ）およびＡＡＡ（Ｌｙｓ）などの合成ｔＲＮＡによって非効率的にデコードされるコドンを除外するように設計した（表４〜６）。種々の半合成ｔＲＮＡ混合物を補給したｔＲＮＡが枯渇した溶解物において鋳型を発現させ（表４〜６）、これは、天然ｔＲＮＡ混合物に匹敵する効率で３種の鋳型すべての翻訳を支持した（図６Ａ）。
【００９６】
ｓＧＦＰ発現が、半合成ｔＲＮＡの補給の直接的結果であったことを確実にするために、および個々のｔＲＮＡの機能を再確認するために、本発明者らは、個々のｔＲＮＡを欠くｔＲＮＡ混合物を配合した。次いで、本発明者らは、これらの混合物の、ｔＲＮＡが枯渇した無細胞系においてｓＧＦＰ鋳型の合成を支持する能力を解析し、数倍から桁違いの範囲の翻訳の低減を観察した（図６Ｂ）。ＵＣＧ（Ｓｅｒ）、ＣＧＧおよびＡＧＧ（Ａｒｇ）、ＵＵＧ（Ｌｅｕ）、ＧＧＡ（Ｇｌｙ）、ＣＣＡ（Ｐｒｏ）、ＡＣＡ（Ｔｈｒ）、ＧＵＧ（Ｖａｌ）、ＡＡＧ（Ｌｙｓ）およびＵＵＣ（Ｐｈｅ）をコードするｔ７ｔＲＮＡを含む、ペプチド発現アッセイによって得られた結果と同様に、半合成ｔＲＮＡ混合物は、ｓＧＦＰ発現を回復させ、したがって、対応するｔ７ｔＲＮＡの機能性が再確認された。しかし、ＲＧＳペプチド発現プロフィールとは対照的に、ＣＵＡおよびＡＧＣコドンの天然ｔＲＮＡの残存量は、ｓＧＦＰ発現に十分であるとわかった。リポーターペプチドのＯＲＦ配列中に１種のみのＣＵＡまたはＡＧＣコドンが存在する場合には、混合物中のｔ７ｔＲＮＡ（ＵＡＧ）およびｔ７ｔＲＮＡ（ＧＣＵ）の存在は、ペプチド発現をそれぞれ、９２および７２％に回復させた（表２）。この不一致は、おそらくはｓＧＦＰと比較して、より高濃度のペプチド転写物ならびにより高いペプチド翻訳のターンオーバー速度を反映していた。前者の場合には、延長中の複合体の数は、おそらくは、溶解物中に残存する天然ｔＲＮＡの数を凌ぎ、後者の場合には、同一ｔＲＮＡが同一ポリソームユニット中でトンネルされ得た３７、６０。
【００９７】
ＯＲＦ中にただ１種のコドンが存在していた場合には、ｓＧＦＰ発現は、枯渇された溶解物中の対応する天然ｔＲＮＡの残存量に対してより感受性であると思われた。ＣＵＡおよびＡＧＣコドンについてとは異なり、ＯＲＦあたりただ１種のＡＧＧコドンを有するｓＧＦＰの発現レベルは、ＡＧＧのｔ７ｔＲＮＡが排除された場合に約９０％低下した。これは、天然ｔＲＮＡの枯渇をさらに最適化しない場合でも、ＡＧＧを、再割り当てにとって最も有望なコドンにする。
【００９８】
全長タンパク質が、本発明者らの無細胞系において発現され得るという観察結果は、タンパク質翻訳におけるｔＲＮＡ修飾の役割を調べるように本発明者らを促した。上記で論じたように、本発明者らの系においてｔＲＮＡの大部分が合成されたものであるが、それらは、翻訳的に活性な溶解物において部分的編集または修飾を起こす可能性があり得た。
【００９９】
ｔ７ｔＲＮＡの機能性に対するこのような推定上の修飾の効果を試験するために、本発明者らは、推定上、ｔＲＮＡプロセシングおよび修飾活性を欠く、再構成されたＰＵＲＥ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系を使用して上記の実験を反復した。本発明者らは、半合成ｔＲＮＡが、タンパク質発現を持続することを見出したが、本発明者らは、半合成ｔＲＮＡを補給したＰＵＲＥ系の相対翻訳効率が、天然ｔＲＮＡ一揃いと比較して、６０％でしかないことを観察した。これは、天然および合成ｔＲＮＡ一揃いは両方とも、枯渇された溶解物においてほとんど同等に良好な性能を示したという本発明者らの観察結果とは対照的である。一方では、これは、非修飾合成ｔ７ｔＲＮＡが、タンパク質合成を持続できたことを示す。他方では、観察された効率の低減は、Ｓ３０抽出物中の少なくともいくつかのｔ７ｔＲＮＡのさらなる転写後プロセシングを反映し得るが、ＰＵＲＥ系においてはそうではない。この問題に対処することは、最終的に、ＰＵＲＥ系において個々のｔ７ｔＲＮＡの機能性を試験することを必要とする。これは、驚くほど高レベルの夾雑天然ｔＲＮＡのために容易ではない（図７）。
【０１００】
考察
この研究において、本発明者らは、内因性ｔＲＮＡが枯渇したｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系を使用する、個々のｔＲＮＡ機能の系統的解析のためのアプローチを確立した。これは、ｔＲＮＡが枯渇した大腸菌（E. coli）細胞不含翻訳系においてリポーターペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を定量するための非放射性アッセイを開発することによって達成された。本発明者らは、枯渇された溶解物が親の溶解物の活性の６０％超を保持することを実証した。枯渇された溶解物中の残存するｔＲＮＡプールは、ｅＧＦＰおよびＲＧＳペプチド発現を持続できないが、本発明者らは、天然ｔＲＮＡのサブセットは十分に枯渇されないことを見出した。開発されたペプチドバイオセンサーアッセイによって、そのコドンに対するｔＲＮＡアイソアクセプターの枯渇レベルを推定することが可能となり、個々のｔＲＮＡの枯渇効率とその存在量の間の相関を示した。個々のｔＲＮＡを欠くｔ７ｔＲＮＡ混合物を用いてプライムされた、十分に組換えられた大腸菌（E. coli）ＰＵＲＥ系において、ＲＧＳ１ペプチド発現も観察されたことが重要である（示されていないデータ）。さらに、外因性ｔＲＮＡを用いずに組み立てられたＰＵＲＥ系は、全長ＧＦＰの発現を支持でき（図７）、全範囲の夾雑ｔＲＮＡの存在を示す。これは、残存するｔＲＮＡは、翻訳機構１６のａａＲＳまたはその他の成分と共精製する可能性が最も高いことを示唆する。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系からの効率的なｔＲＮＡ枯渇は、課題のままである。
【０１０１】
内因性ｔＲＮＡバックグラウンド活性からｔ７ｔＲＮＡの活性を区別するために、本発明者らは、２つの同一連続試験コドンが、特定のｔＲＮＡの枯渇に対するアッセイを大幅に増感させたという観察結果を利用した。これによって、本発明者らのｔＲＮＡが枯渇した溶解物において、４８種すべての大腸菌（E. coli）ｔＲＮＡ種の合成版の機能性を解析することが可能になった。
【０１０２】
本発明者らの結果は、合成ｔＲＮＡのほとんどは、タンパク質／ペプチド翻訳の支持において効率的であったということを実証する（図４〜７）。さらに、２倍または４倍縮重アミノ酸に対応するｔ７ｔＲＮＡのほとんどが、高いまたは中程度の効率でそのコグネートＷＣコドン、および中程度または低い効率でそのゆらぎコドンをデコードした（図４）。対照的に、Ａｓｎ、Ｇｌｎ（ＣＡＡ）、Ｉｌｅ（ＡＵＣ）、ＧｌｕおよびＬｙｓのｔ７ｔＲＮＡは、親和性クランプアッセイにおいて非機能的であるとわかった。
【０１０３】
本発明者らは、粗翻訳系において、合成ｔＲＮＡの部分的編集および修飾を除外できなかったが、複数の酵素の活性を必要とするＮ３４およびＮ３７修飾が効率的に生じる可能性は低いと思われる。この考えは、Ｉｌｅ、ＧｌｕおよびＬｙｓの合成は、合成ｔＲＮＡによって支持され得なかったという観察結果によって支持され、修飾ヌクレオチドが、そのコグネートａａＲＳの重要な分子認識特徴として働いた２１ことを示すこれまでの研究と一致する。アンチコドンループの外側の修飾を欠くｔＲＮＡＬｙｓ（ＵＵＵ）は、１４０倍低い効率でアミノアシル化を受ける６２が、第１のアンチコドン位置におけるＵのＣへの変換は、ＡＡＧコドンに対するその活性を回復させたということが以前に報告された。Ｌｙｓ（ＵＵＵ）に加えて、Ａｒｇ（ＵＣＵ）、Ａｌａ（ＵＧＣ）、Ｃｙｓ（ＧＣＡ）、Ｇｌｕ（ＵＵＣ）およびＧｌｎ（ＵＵＧ）などの、いくつかのｔ７ｔＲＮＡ転写物またはその対応するアンチコドンステム−ループも、リボソーム媒介性コドン結合アッセイにおいて成功しなかった５０。Ｇｌｕ（ＵＵＣ）およびＧｌｎ（ＵＵＧ）を例外として、３種の残存するｔ７ｔＲＮＡは、親和性クランプアッセイにおいて翻訳的に活性であった。特に、ｔ７ｔＲＮＡＡｒｇ（ＵＣＵ）は、総天然ｔＲＮＡ混合物において過少に示されると推定されるその相同体と比較して３倍高い活性を実証した（図４）。全般的に、図４に表されるコドン−アンチコドン相互作用マトリックスは、天然およびアンチコドンループ内に修飾を欠く可能性が最も高いｔ７ｔＲＮＡの間の高度に同様のコドン認識パターンを示す。例えば、ｔ７ｔＲＮＡの第１のアンチコドン位置のＵ３４は、そのコグネートＡおよびＧだけでなく、第３のコドン位置のＵおよびＣもデコードし、Ｓｅｒ、ＬｅｕおよびＧｌｙの天然ｔＲＮＡ中のｃｍｏ５Ｕのものと同様の読み取りパターンを有し、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、ＴｈｒおよびＡｌａのｔＲＮＡにおいて同一パターンを有する。構造的および動態学的データから、コドン−アンチコドンヘリックスの固有の安定性は、リボソームによって感知されるその適切な幾何学６３、５６、５７よりも重要ではないと思われる。これらの研究は、したがって、コドン−アンチコドン二本鎖およびリボソームの間の正味の親和性が、デコードセンターの周囲の３０Ｓ閉鎖を促進し、それによって、ｔＲＮＡ適応を促進し、ペプチド結合形成につながる５４下流ステップの引き金を引くことを暗示する。現在の研究では、Ｕ３４−Ｎ３相互作用の高度にモザイクのパターンおよびスプリットコドンボックス中に非コグネート交差認識がないことは、ｔＲＮＡ本体における高次前後関係性−潜在的に、正確な生産的なデコードのさらなるチェックポイント５６、５７という考えを支持する。
【０１０４】
ここで示されるデコード優先性は、特定のアミノ酸の同義コドンから「オルソゴナル」対「天然」コドン対を同定するための貴重な導きとなる。このような対は、Ａｒｇ、ＳｅｒおよびＬｅｕならびにＰｒｏ、ＴｈｒおよびＧｌｙなどの、６倍縮重アミノ酸の異なるファミリーのコドンから、または高いゆらぎ制限を有するアンスプリットコドンファミリーボックスに由来するコドンから作製され得る（表７）。この研究は、天然ｔＲＮＡがほとんど完全に枯渇されたＡＧＧ−コドンは、すべてのその他のコドンよりも再割り当てすることが容易である可能性があることを示唆する。
【０１０５】
本発明者らは、ここで、合成ｔＲＮＡによって、Ｉｌｅ、ＧｌｕおよびＡｓｎを除くすべてのアミノ酸がデコードされ得ることならびにこれら３種のアミノ酸の天然ｔＲＮＡが機能的形態で均一性に精製されることを示した。本発明者らは、合成ｔＲＮＡおよび３種の特定の天然ｔＲＮＡを用いて再構成されたｔＲＮＡ一揃いは、ｓＧＦＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成を天然ｔＲＮＡ混合物を用いて達成される匹敵するレベルまで支持し得ることを実証した。全ｔＲＮＡ枯渇は課題のままであるが、ＰＵＲＥ系を使用する本発明者らの結果は、夾雑ｔＲＮＡプールの起源の手がかりを提供する。
【０１０６】
半合成ｔＲＮＡ一揃いと組み合わせた改善されたｔＲＮＡ枯渇プロトコールは、ペプチドおよびタンパク質中のセンスコドンを再割り当てすること、それによって、合成生物学者およびタンパク質エンジニアのツールボックスを大幅に拡大することを可能にするであろう。さらに、ＰＵＲＥ系と組み合わせた開発されたペプチド発現アッセイは、その機能性に対する個々のｔＲＮＡ修飾の影響が精査されることを可能にする。これは、順に、このような修飾が最小細胞を構築する取り組みにおいて維持される必要がある程度に関する長年にわたる問に答えるはずである６４。最後に、提示されたアプローチは、大腸菌（E. coli）に限定されず、真核細胞不含発現系に移され得る。
【０１０７】
さらなる支持情報
４８種のｔ７ｔＲＮＡ転写物の調製
本発明者らは、３ステップＰＣＲを使用して、ｔＲＮＡ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための２種のＤＮＡ鋳型を調製した。第１の種類は、Ｇ、ＵおよびＣから出発するｔＲＮＡ種の、２つのフォワード（Ｔ７、Ｆ）および３つのリバースオリゴヌクレオチド（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３）によって組み立て（図８Ａ）、他方の種類は、ＡおよびＵから出発するｔＲＮＡ種の３種のフォワード（Ｔ７、Ｆ１、Ｆ２）および３種のリバースオリゴヌクレオチドから組み立てて、自己プロセシングハンマーヘッド型リボザイム（ＨＨＲｚ）融合構築物を作製した（図Ｓ１Ｂ）２。Ｆ１プライマーは、Ｔ７プロモーターと、それに続く、転写失敗率を低減するためのＧＧＧＡＧＡ配列、標的ｔＲＮＡの５’部分と相補的である４〜１０塩基およびＨＨＲｚコード配列の断片を含有していた。Ｆ２は、ＨＨＲｚコード配列と、それに続く、ｔＲＮＡの５’部分と相補的であるセグメントを含有する。３ステップＰＣＲ後に、産物を、エタノール沈殿によって精製し、材料および方法に記載されるようにＴ７転写の鋳型として使用して、所望のｔＲＮＡを得た。
【０１０８】
ｔ７ｔＲＮＡ転写物の３’および５’の同一性
作製された合成ｔＲＮＡは、生理的３’−ヒドロキシル基を含有すると予想される。調製法に応じて、５’−は、５’−一リン酸、５’−三リン酸または５’−ヒドロキシル基を有し得る。非生理的５’−三リン酸は、ａａＲＳおよびその他の翻訳機構６７、６８によって許容され得るか、または例えば、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ６９などの内因性ホスファターゼ活性によって粗溶解物中で一リン酸にプロセシングされ得る。転写物の５’−リボザイム媒介性プロセシングが使用された場合には、切断産物は、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｓｐのｔＲＮＡ転写物のアミノアシル化効率に影響を及ぼさないと報告されている６６５’−ヒドロキシルを含有する。「ＣＡＴ」アンチコドンを有する４８種のｔＲＮＡ遺伝子のうち５種が、ゲノムｔＲＮＡデータベースにおいてＭｅｔに割り当てられるが６、それらのうち３種のみが実際にＭｅｔをコードする（イニシエーターＭｅｔコドンの２種およびエロンゲーターＭｅｔコドンの１種）が、残りの２種は、Ｍｏｄｏｍｉｃｓデータベース７１に由来する配列に従ってＩｌｅをコードする。
【０１０９】
効率的ペプチド発現のためのＲＧＳ鋳型の最適化
ＲＧＳペプチド配列中に存在しないコドンのｔ７ｔＲＮＡ種の機能性を試験するために、試験コドンを、ＲＧＳペプチド配列と開始コドンの間に最初に挿入した。しかし、イニシエーターＡＵＧの近くに挿入されるコドンは、翻訳開始に影響を及ぼし得７２、それによって、結果の解釈を複雑にした。したがって、本発明者らは、下流コドン挿入の効果を最小化するために、出発コドンの後ろに１つまたは２つの不変「インスレーター」コドンを挿入することを決定した。このために、本発明者らは、ＴｈｒのＡＣＣ、ＩｌｅのＡＵＣ、ＧｌｙのＧＧＣ、ＡｓｐのＧＡＵなどの変動するＧ／Ｃ含量の４種の異なるコドンを試験し、これらのコドンのうち１種または２種を、ＡＵＧ出発コドンとペプチドコーディングフレームの間に入れた。それらの中で、２つの連続ＧＡＵコドンを有する鋳型は、親和性クランプアッセイによって証明されるような最良の翻訳効率を示し、一方で、その他の鋳型に由来するシグナルは低いかまたはなかった（図１０Ａ）。本発明者らは、ペプチド末端Ａｓｐが、正味の陰性電荷をペプチドに付与することによって、リボソーム出口トンネルからのペプチド放出を促進すると推測した７３。本発明者らは、２つの不変ＧＡＵコドンの後ろに可変コドンを有するいくつかのＤＮＡ鋳型を構築し、これらは、使用されるコドンにかかわらず、親和性クランプアッセイにおいてすべて十分な性能を示した（図１０Ｂ）。したがって、本発明者らは、すべてのその他のコドンを試験するためにこの親鋳型を使用した。
【０１１０】
天然ｔＲＮＡ精製戦略の最適化
固定化されたオリゴヌクレオチドマトリックスの調製
オリゴＤＮＡの固定化のためのよく使用される戦略は、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用７４に基づいている。しかし、この頑強かつ柔軟なアプローチは、ｔＲＮＡ溶出のために使用される変性条件下でのマトリックス不安定性のために本発明者らの目的のために最適以下であった。したがって、本発明者らは、アミン−ＮＨＳおよびチオール−ヨードアセトアミドコンジュゲーションに基づく固定化化学を試験した。
【０１１１】
ＩＤＴによって、３’−アミン、３’−ビオチンまたは３’−チオール基を有するオリゴＤＮＡを合成した。３’−チオールを有するオリゴＤＮＡは、固定化の前に還元を必要とし、これは、固定化プロトコールに複雑性を付加した。それぞれ、１１２、１５０および５５ｎｍｏｌｅでアミン、ビオチンおよびチオールを用いて機能付与されたオリゴＤＮＡを固定化して、１ｍｌのそれぞれの定着された樹脂を得た。高コスト、複雑なプロトコールおよび低いコンジュゲーション効率のために、ヨードアセチル樹脂を用いるチオール反応による固定化は中止された。アミン／ＮＨＳコンジュゲーション反応のＮ−ヒドロキシスクシンイミド副生成物は、２６０ｎｍで高い吸光度を有し、結合していないオリゴＤＮＡの定量化に強力に影響を及ぼしたので、反応上清の非変性ＰＡＧＥによって、コンジュゲーション程度の尺度としての結合している対結合していないオリゴＤＮＡの割合を決定した。
【０１１２】
ｔＲＮＡ精製
テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡ−Ｃｌ）は、ｔＲＮＡ−オリゴＤＮＡハイブリッドの形成を増強し得る７５と報告された。したがって、０．９Ｍ  ＮａＣｌを含有する標準ハイブリダイゼーションバッファーに加えて、本発明者らはまた、０．９Ｍ  ＴＭＡ−Ｃｌを含有するバッファーを試験した。１００μｇの総天然ｔＲＮＡ混合物から、１ｎｍｏｌｅの固定化されたオリゴＤＮＡに対応する、アミンがコンジュゲートしているマトリックスでおよそ２．２５μｇのｔＲＮＡＧｌｕが精製され、ビオチンによってオリゴＤＮＡが固定化されたストレプトアビジンマトリックスからの収率は、およそ３倍低かった。後者の場合には、溶出されたｔＲＮＡは、わずかな高温で同時溶出された、ｔＲＮＡのフロントの下のゲルで移動するオリゴＤＮＡを含有していた（図１５においてアスタリスクで印をつけられた）。したがって、天然ｔＲＮＡの所望のサブセットを精製するためにＮＨＳ−マトリックスを使用した。材料および方法の対応する節に記載されるように洗浄ステップを最適化することによって、報告された方法１１に基づいて最終精製プロトコールをさらに改善した。ｔＲＮＡＡｓｐを除く必要なサブセットからすべての天然ｔＲＮＡが、良好な収率および高純度で得られた（図６）。
【０１１３】
実施例２
キッシングループを使用するｔＲＮＡの選択的枯渇
キッシングループ（ＫＬ）は、ヌクレオチド対の面間の共通の積層カラムによって安定化される準連続二重らせんの形成によって、高親和性（５〜５０ｎＭ）でＧＣＵ  Ｓｅｒアイソアクセプターと結合する（図１６Ａ）。大腸菌（E. coli）Ｓ３０溶解物は、エタノールアミンセファロースでのクロマトグラフィーによって総ｔＲＮＡから大幅に枯渇され得る。枯渇後に、溶解物は、市販の総ｔＲＮＡ画分によって補給された場合に、その親の翻訳効率の約６０％の翻訳効率を保持する（図１６Ｂ）。
【０１１４】
ＫＬが固定化されたマトリックスは、粗溶解物からの直接的な、または総ｔＲＮＡ混合物からアイソアクセプターを取り出すことと、それに続く、すべてのｔＲＮＡが枯渇した溶解物を用いるその再構成による間接的な、特定のｔＲＮＡ−アイソアクセプター枯渇のために使用され得る（図（Ｂ））。いずれかの方法を使用して調製された反応におけるＧＦＰ合成は、コドンバイアスがかかった、２つの連続ＡＧＣコドンを有する鋳型での約１００％の休止を実証する（図１６Ｃ）。このために、リンカー（小文字）を有する「キッシングループ」コード配列（大文字）ＧＧＴＡＧＴＧＡＧＧＴＡＧＴＴＡＧＣＡＧＡＴＡＣＣＴＣＡＣＴＡＣＣａａｃａｃａｃａｃａｃａａｃａｃａｃａｃａｃａａｃａｃａｃａａｇｃｔを、ＨｉｎｄＩＩＩ部位が３’にフランキングされたＴ７プロモーターの下流にクローニングし、続いて、ＨｉｎｄＩＩＩ消化されたプラスミドからランオフＴ７−転写した。ＫＬが固定化されたマトリックスを得るために、ＫＬ−ＲＮＡを過ヨウ化ナトリウムによって酸化し、ＰＭＩＤ：１４６５２０７５に従ってアジピン酸ジヒドラジド−アガロースビーズとコンジュゲートした（Ｓｉｇｍａ：Ａ０８０２−５０ＭＬ）。第１のアプローチでは、約２０〜２５ｎｍｏｌのＫＬを含有する１ｇのマトリックスの２つのバッチを、５ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、２５ｍＭ  ＨｅｐｅｓＫＯＨ（ｐＨ７．６）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて緩衝された２．５ｍｌの粗溶解物とともに、室温で３０分間反復してインキュベートし、続いて、Ｐ−１０ゲル濾過カラムでバッファー交換した。第２のアプローチでは、１２５ｍｇのＫＬ−ビーズを５μｌの３０ｍｇ／ｍｌ総大腸菌（E. coli）ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ：１０１０９５４１００１）を含有する２００μｌの反応容量中、同一条件で反復してインキュベートし、エタノールによるｔＲＮＡの沈殿を続けた。
【０１１５】
ｔＲＮＡ（Ｓｅｒ）ＧＣＵアイソアクセプター枯渇が高いが不完全であることがわかり−一部の小さいｔＲＮＡ画分が、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＡＲＳアーゼ）またはＥＦ−Ｔｕのいずれかとの複合体の一部であり、したがって、ＫＬ−トラップを逃れると思われる。本発明者らは、「ＡＲＳアーゼリコイリング」手順（図１７、下のパネルを参照のこと）に取り掛かることによって良好な枯渇を達成しようとした。このアプローチでは、翻訳溶解物は、上記で記載されるが、ａ）標的ＡＧＣ（枯渇されているアイソアクセプターによってデコードされる）を除くコドンバイアスがかかった鋳型中のすべてのＳｅｒコドンのデコードに関与する過剰のカウンターアイソアクセプター（ｔＲＮＡ（Ｓｅｒ）ｇｇａ）（１５μＭ）、ｂ）ＡＴＰ（２０ｍＭ）およびセリン（５ｍＭ）などの、セリル−アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（synthetise）（ＳｅｒＲＳ）の過剰のその他の２種の基質ならびにｃ）Ａａ−ｔＲＮＡのＥＦ−Ｔｕとの複合体を解離するための１ｍＭ  ＧＤＰの存在下で、２３ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２、５ｍＭの各ＫＯＡｃおよびＫＣｌをさらに含有する反応混合物中で、ＫＬが固定化された樹脂とともにインキュベートされる。過剰のＳｅｒＲＳ基質は、酵素のターンオーバー速度論を加速させ、有効なアイソアクセプター置換につながり、これでは、対象のアイソアクセプター、ｔＲＮＡ（Ｓｅｒ）ＧＣＵが放出され、ＫＬトラップにとって利用可能になる。ＡＧＣ標的コドンを含まない（４，５ｔｃｇ「−」、４，５ｔｃｃ「−」）、２連続ＡＧＣコドンを含む（４，５ａｇｃ）または種々の位置に単一の標的コドンを含む（残りすべて）Ｓｅｒコドンバイアスがかかった鋳型を翻訳しながら（図１８、上のパネル）、「ＡＲＳアーゼリコイリング」手順を受けた溶解物（図１３、３番目および４番目のパネル：緑色および紫色のバー）は、「リコイリング」が行われなかった対照と比較して、より高いｔＲＮＡ枯渇程度を示す（図１３、青色および赤色のバー）。
【０１１６】
実施例３
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアミノアシル化
ｕＡＡの部位選択的組込みを実施するために、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔＲＮＡアミノアシル化のための３つのプロトコールを最初に確立した。最初のものは、突然変異ｔＲＮＡ（Ｃｙｓ）の、ＣｙｓＲＳ媒介性ｉｎ  ｖｉｔｒｏアミノアシル化のためのプロトコールに基づいている。反応性チオール基は、広範囲のマレイミドによって、またはヨードアセトアミドによって活性化される試薬を用いるアシル化ｔＲＮＡ（Ｃｙｓ）の迅速な誘導体化を可能にする。ＥＧＦＰの独特のＡＧＧコドン中へのボディパイ−Ｃｙｓの組込みは、この経路によって得られた。本発明者らはまた、ピロリジンＣＵＡｔＲＮＡのピロリジンＲＳ（ＰｙｌＲＳ）によって媒介されるアシル化およびフレキシザイムによって媒介されるｔＲＮＡアミノアシル化を確立した。本発明者らは、トランス−シクロオクテン（Ｌｙｓ−ＣＯＣ）によって誘導体化されているＬｙｓ  ε−アミノを、大腸菌（E. coli）無細胞系において再割り当てされたＳｅｒ  ＡＧＣコドン中に組み込むことができることを実証した。本発明者らが、センスコドン中へのＣＯＣの組込みが、アンバーサプレッションと比較して、タンパク質発現収率に対してかなり小さい影響しか及ぼさないことを観察したことが重要である。
【０１１７】
実施例４
システイニルｔＲＮＡシンターゼ媒介性アミノアシル化
システイニルｔＲＮＡシンセターゼ（ＣｙｓＲＳ）は、ｔＲＮＡのアンチコドントリプレット（Ｃｙｓ）と接触領域を有する。突然変異されたｔＲＮＡに対する酵素の親和性は低減されるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで高基質濃度で高いアミノアシル化率を依然として支持し得るが、本発明者らは、このような突然変異ｔＲＮＡは、内因性ＣｙｓＲＳの不十分な濃度ならびに野生型ｔＲＮＡ（Ｃｙｓ）の高い競合活性のために翻訳反応の過程で効率的な再アシル化を受けることができないことを見出した。これは、ｕＡＡのみが成長するポリペプチド鎖中に組み込まれることを確実にする。
【０１１８】
対応するＡｒｇ−ＡＧＧまたはＳｅｒ−ＡＧＣコドンをマッチさせるために、ｗｔ  ｔ７ｔＲＮＡＣｙｓ  ＧＣＡのアンチコドンをＣＣＵまたはＧＣＵのいずれかに変更した（図１９Ａを参照のこと）。ＣＵＡアンチコドンを有するアンバーコドンサプレッサーｔ７ｔＲＮＡＣｙｓを使用して、ｅＧＦＰ−ＯＲＦでプライムされた翻訳反応における蛍光収率をモニタリングすることによってアミノアシル化状態を最適化し、これでは、位置１５３のアスパラギン酸コドンがアンバー停止コドンに変換された。５０ｍＭ  ＨｅｐｅｓＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１ｍＭシステインまたは２ｍＭセレノシステイン（Ｓｅｃｙｓ）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭの各ＫＯＡｃおよびＫＣｌ、４ｍＭ  ＡＴＰ、２２．５μＭ  ｔＲＮＡ、１０μＭ  ＣｙｓＲＳ、２０％  ＤＭＳＯ、２５ｍＭ  ＤＴＴ、５μＭ  ＺｎＣｌ２、０．００５μ／μｌの酵母無機ピロホスファターゼおよび５０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含有する反応物中でのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組換えＣｙｓＲＳによって、両ｔ７ｔＲＮＡにシステインを担持した。反応に先立って、４０ｍＭ  Ｓｅｃｉｓ、５０ｍＭ  ＨｅｐｅｓＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１Ｍ  ＤＴＴを含有する溶液中で、３７℃で３０分間、Ｓｅｃｙｓをセレノシスチン（Ｓｅｃｉｓ）から還元し、ｐＨを１００ｍＭ  ＫＯＨ最終によって７．５にした。フェノール抽出によってシステイニル化またはセレノシステイニル化ｔＲＮＡ（Ｃｙｓ（Ｓｅｃｙｓ）−ｔＲＮＡ）を精製し、エタノールによって沈殿させ、５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（Ｓｅｃｙｓ−ｔＲＮＡのためにｐＨ８．５または７．２）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、７５％  ＤＭＳＯ、８０μＭ  Ｃｙｓ（Ｓｅｃｙｓ）−ｔＲＮＡおよび１ｍＭのヨードアセトアミドまたはマレイミド誘導体を含有する反応物中で対象のヨードアセトアミド−（マレイミド−）化合物とコンジュゲートするか、または対照反応におけるシステインのＡＧＧ（Ａｒｇ）およびＡＧＣ（Ｓｅｒ）コドンのリコードのために直接使用した（図１９Ａを参照のこと）。コンジュゲーション反応における、システインと比較したセレノシステイン残基のより低いｐＫαおよび還元の可能性の両方のために、本発明者らは、数倍規模で高い収率のＢＰＦＬ−ｔＲＮＡコンジュゲーション産物を得ることができ、ＢＰＦＬ−Ｓｅ−ｔＲＮＡコンジュゲートに変換されているアミノアシル化のために用いられた元のｔＲＮＡ材料の平均２５％をもたらした。
【０１１９】
ＣＣＵ−アンチコドン（ｃｙｓ−ｔＲＮＡ（Ｃｙｓ）ｃｃｕ）を有するシステイニル化またはセレノシステイニル化ｔ７ｔＲＮＡは、すべてのｔＲＮＡが枯渇した溶解物およびｔ７ｔＲＮＡ（Ａｒｇ）ｃｃｕを欠く半合成ｔＲＮＡ一揃いの両方から再構成され、単一ＡＧＧコドンまたはＴＡＧ−コドンを有するｅＧＦＰコーディング鋳型でプライムされた翻訳反応において、濃度依存的にｅＧＦＰ生合成を維持すると示された（図１９Ｂ、Ｄを参照のこと）。非アミノアシル化ｔＲＮＡＣｙｓｃｃｕの添加（図１９Ｂ）は、１０μＭのｔＲＮＡＣｙｓｃｃｕが使用された場合には、ｅＧＦＰ翻訳を維持できず、任意のＡＧＧ−コドンサプレッサーを欠く陰性対照反応におけるバックグラウンド翻訳（Ｂでの「半合成ｔＲＮＡ−１」）と比較して、わずかな効果しか引き起こさなかった。後者は、変更されたアンチコドンを有する翻訳前にアミノアシル化されたｔＲＮＡＣｙｓは、簡単なオルソゴナル系を表すことを示唆する。
【０１２０】
グラフトされたＧＣＵ−アンチコドンを有するシステイニル化ｔＲＮＡＣｙｓ（Ｃｙｓ−ｔＲＮＡ（Ｃｙｓ）ｇｃｕ−図１９Ａ、Ｃを参照のこと）は、ＫＬを使用する内因性ｔＲＮＡ（Ｓｅｒ）ＧＣＵから直接的に枯渇された溶解物を用いる翻訳反応において２つの連続ＡＧＣコドンを有効にサプレッションすると示された（図１９Ｃ）。
【０１２１】
実施例５
大環状タンパク質設計および試験
この計画の一態様は、分子内結合を有するペプチドを作製することであるので、本発明者らは、ホモ−およびヘテロ−縮合を可能にするいくつかのｕＡＡを試験する。１つのアプローチの概要が、図２０に提供されている。最も簡単な場合には、本発明者らは、セレノ−システイン（Ｓｅ−Ｃｙｓ）を使用し、これは、生理的条件下で本質的に不可逆性のジセレニウム結合を自発的に形成する。利用可能な証拠は、それがＣｙｓＲＳによってｔＲＮＡ（Ｃｙｓ）に担持され得ることを示唆する。本発明者らは、１つまたは複数のコドンへのＳｅ−Ｃｙｓの効率を試験し、質量分析およびエンドペプチダーゼ保護アッセイを使用して自発的環化の産物を解析する。次いで、本発明者らは、開発された系の、互いにオルソゴナルの反応性基の対を組み込む能力を解析する。
【０１２２】
本発明者らは、ＳｅｒおよびＡｒｇコドンならびにＣ末端親和性クランプタグを保持する合成１０マーペプチドをコードする試験ｍＲＮＡを構築する。最初に、２つのＡＧＣコドンがｍＲＮＡ配列中に含まれる。構築物は、Ｓｅ−Ｃｙｓが担持されたＣＵＡｔＲＮＡまたはアジドおよびアルキンもしくはより反応性のトランス−シクロ−オクテンを保持するアミノ酸を含有する無細胞系において発現される。
【０１２３】
Ｓｅ−Ｃｙｓを含有するペプチドは、自発的に環化すると予想され、反応の程度は、質量分析によって決定される。アジドおよびアルキン修飾されたアミノ酸の場合には、クリック反応および内部結合の形成を誘導するように、翻訳混合物中に触媒Ｃｕ（Ｉ）が添加される。シクロオクテンの場合には、機能付与されたアミノ酸環化は、２つのカップリングされたテトラジン基を特徴とする試薬の添加によって達成される（図２０Ｅ）。本発明者らは、市販の試薬からジテトラジンを合成し、それがシクロオクテン−Ｌｙｓを含有するＥＧＦＰ分子を架橋し得ることを実証した（図２０Ｇ）。続いて、テトラジン基によって機能付与された芳香族スキャフォールドを特徴とする、より強固な変異体が合成される。最初の実験は、２つのテトラジン基のみを含有する試薬を用いて実施されるが、３つの基を有するその後のスキャフォールドは開発される（図２０Ｆ）。このような試薬は、複数の架橋を提供し、高度に制約された大環状構造をもたらす。対照実験では、再割り当てされたコドンを欠く遺伝子が翻訳され、同一条件に付される。得られた産物は、親和性精製され、天然形態で、またはトリプシン消化後のいずれかで、新規分子間結合を同定するためにＬＣ−ＭＳによって解析される。
【０１２４】
本発明者らは、ＬｙｓまたはＣｙｓが担持された、このような基を保持する再割り当てされたｔＲＮＡのライブラリーを作製する。具体的に言えば、本発明者らは、アジドおよびアルキン修飾されたアミノ酸ならびにトランスシクロオクテンおよびテトラジンを用いて修飾されたアミノ酸に焦点を当てる。前者のグループは、Ｃｕ（Ｉ）の存在下で共有結合１，４−位置異性体を形成し、一方で、後者の対は、自発的に反応して、複素環を形成する。上記の基に選択的にコンジュゲートされ得るフルオロフォアおよびアフィニティー試薬の大きなパネルは、市販されており、効率および方法の選択性を評価するために使用される。
【０１２５】
実施例６
大環状ペプチドおよびペプチドライブラリーの構築および選択
本明細書において開示される技術は、大環状ペプチドの構築および選択のための基盤を築く。本発明者らの大環状化アプローチを選択系と統合するために、本発明者らは、ＣＩＳディスプレイなどのＲＮＡまたはＤＮＡディスプレイを利用する。ＣＩＳディスプレイは、ＤＮＡ結合性タンパク質、ＲｅｐＡが、そのコードするＤＮＡに結合し返す能力を生かす。この系は、１０１３を上回る有効なライブラリーの大きさを支持し、本発明者らの目的に理想的に適している大腸菌（E. coli）無細胞系を利用する。あるいは、これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで組み立てられたウイルスまたはファージを用いて実施され得る。
【０１２６】
本発明者らは、大環状結合物質の選択のための２つのＣＩＳディスプレイと適合するライブラリーを作製する。本発明者らの最初の１０マーのライブラリーは、高親和性タンパク質：タンパク質界面の形成を媒介すると知られているチロシンと織り交ぜられた利用可能な再割り当てされたコドンを含有する。第２のライブラリーは、選択された、すべてのクラスのタンパク質フォールディングを網羅する５０００種に相当するようにコンピュータによって設計される。コドン使用は、そのライブラリーにおける再割り当てされたコドンの出現を最大にするように最適化される。本発明者らの最初の標的として、本発明者らは、ＭＡＰキナーゼ経路の標的化可能な成分としてこれまでに同定されているシトロンキナーゼのＣＮＨドメインを選択する。種々のコドン再割り当てによって環化されたライブラリーは、組換えＣＮＨドメインで選択され、選択手順の結果は、次世代シーケンシングを使用して比較される。次いで、ペプチドは、線形で合成され、環化され、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎおよび単一分子同時相互作用解析（single-molecule coincidence interaction analyses）において使用される。結局、アプローチは、１０８種の変異体での天然Ｐｈｙｌｏｍｅｒライブラリーで試験され、ライブラリーの性能は、未処置の、および選択されたライブラリーのシーケンシングによって比較される。
【０１２７】
提案されるプログラムは、大環状ペプチドの高度に多様なライブラリーを構築し、解析するための新規アプローチを提供する。それは、新規ライブラリーを作製することを必要とせずに、得られたペプチドの大きな構造的翻訳後多様化を可能にする。このアプローチは、高度に強力な生物活性化合物の作製のための新規プラットフォームをもたらす可能性が高い。また、チームの科学者にバイオオルソゴナル化学および多様性ベースの活性化合物開発の使用における訓練を提供する。
【０１２８】
【表１】
2018509172.tif 000003
【０１２９】
【表２】
2018509172.tif 000004
【０１３０】
【表３】
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【０１３１】
【表４】
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【０１３２】
【表５】
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【０１３３】
【表６】
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【０１３４】
【表７】
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【０１３５】
参考文献
【化１】
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【０１３６】
実施例７
センスコドンおよびアンバーサプレッサーコドンによる二重タンパク質標識
材料および方法
材料
非天然アミノ酸、ＢＣＮ（ビシクロ［６．１．０］ノニン−リジン）、ＴＣＯ＊（トランス−シクロオクタ−２−エン−Ｌ−リジン）、ＴＣＯ（トランス−シクロオクテン−リジン）、ＰｒＫ（Ｎ−プロパルギル−リジン）を、Ｓｉｒｉｕｓ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＳｉＣｈｅｍ  ＧｍｂＨから購入した。ＡｚＦ（ｐ−アジドフェニルアラニン）を、ＳｙｎＣｈｅｍから購入した。ＴＡＭＲＡ  ＤＩＢＯアルキンを、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄから購入した。ボディパイ（登録商標）ＦＬヨードアセトアミドは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）製であった。エタノールアミン−セファロースは、エポキシ活性化セファロース６Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でエタノールアミンをカップリングすることによって調製した。エポキシ活性化セファロース６Ｂを、水（１グラムのマトリックスあたり約２００ｍｌ）によって十分に洗浄して、添加物を除去し、次いで、１Ｍエタノールアミンとともに室温で穏やかに撹拌しながら一晩インキュベートした。ｐＨが７に近づくまで水による別の洗浄を実施した。得られたエタノールアミン−セファロースマトリックスを、２ｍＭ  ＮａＮ３を有するバッファーＡ（１００ｍＭ  ＫＯＡｃ、２５ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）、０．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中の２０％スラリーとして保存し、８ｇマトリックスが、１００ｍｌの２０％スラリーをもたらす。
【０１３７】
オルソゴナルｔＲＮＡシンセターゼのクローニングおよび精製
ＡｚＦＲＳのタンパク質配列は、先に記載されたような３９突然変異７に由来する。ＰｙｌＲＳ変異体、ＭｂＢＣＮＲＳ、ＭｂＴＣＯＲＳ３６およびＭｍＰｙｌＲＳＡＦ１９、２９のタンパク質配列は、それぞれの論文から入手した。Ｎ末端に６Ｈｉｓ−タグを含有するこれらのタンパク質の、コドン最適化されたＯＲＦをコードするｇＢｌｏｃｋを、ＩＤＴによって合成し、ＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ二重消化されたｐＯＰＩＮＥプラスミド中にサブクローニングした。消化されたプラスミドおよび所望のタンパク質遺伝子の組み立ては、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢ）によって達成した。シーケンシングによって正しい構築物が同定された。Ｒｏｓｅｔｔａ細胞において２０℃で一晩、０．５ｍＭのイソプロピル（isfopropyl）−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いてタンパク質発現を誘導した。標準バッファーを使用するＮｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーと、それに続く、ＰＢＳバッファー中のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのゲル濾過によってＡｚＦＲＳを精製した。ＭｂＢＣＮＲＳおよびＭｂＴＣＯＲＳを、改変結合バッファー（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５％グリセロール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  Ｔｗｅｅｎ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２０ｍＭイミダゾール）および溶出バッファー（結合バッファーおよび０．５Ｍイミダゾール）を使用するＮｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。タンパク質を、ゲル濾過によってさらに精製し、４０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０Ｍｍ  ＭｇＣｌ２、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロール、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ中、−８０℃で保存した。
【０１３８】
ｔ７ｔＲＮＡ合成
ＭｊＹ１、ＭｊＹ２およびＭｊＹ３  ｔＲＮＡは、以前の刊行物３７においてＡｚＦ組込みについて同定された最良の３種のヒットであるが、６つの突然変異を有するＭｊＹ４  ｔＲＮＡは、後の報告３８に記載された。これら４種のｔＲＮＡの配列アラインメントが、ＳＩ（図２７）に示されている。最適化されたＰｙｌＴ  ｔＲＮＡは、Ｕ２５Ｃ突然変異体である３８。ｔＲＮＡＴｙｒ  ｃｕａの配列は、「ＧＵＣ」が「ＣＵＡ」アンチコドンに置き換わっていることを除けば、野生型ｔＲＮＡＴｙｒの配列と同様である。上記のｔＲＮＡ種すべてのｔ７転写物を、先に記載されたように調製した２４。基本的に、正常またはトランスザイム（transzyme）構築物を含む各ＤＮＡ鋳型を、３ステップＰＣＲを使用して５または６オリゴ（表８）から組み立てた。次いで、ＰＣＲ産物をエタノール沈殿によって精製し、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによるランオフ転写のために使用した。転写されたｔＲＮＡをエタノールアミン−セファロースマトリックスを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。具体的には、２ｍｌの転写反応物を、１０倍ストックを使用してバッファーＡ条件に調整した。転写反応容量と同容量の２０％マトリックスを添加し、４℃で一晩インキュベートした。マトリックスを１０ｍｌのバッファーＡを用いて４回洗浄した後、ｔＲＮＡを２ｍｌのバッファーＢ、２Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）、０．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．５ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２を用いて２回溶出し、次いで、エタノールによって沈殿させた。
【０１３９】
総ｔＲＮＡ調製
総ｔＲＮＡ混合物を、改変Ｚｕｂａｙ法５９によって大腸菌（E. coli）（Ｇｏｌｄ）株から単離した。手短には、総ｔＲＮＡを一晩培養物から抽出した。細胞ペレット（２０ｇ）を、４０ｍｌの１０ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４バッファーに再懸濁した。次いで、ヌクレオシド酸を、３４．４ｍｌの液状フェノールによって、低温室で２時間激しく撹拌しながら抽出した。１０ｍｌの液状フェノールを添加することによって抽出を再度反復した。次いで、１８，０００ｇで３０分間の遠心分離によって水相を集めた。０．０５容量の４Ｍ酢酸カリウムおよび２容量の１００％エタノールを用いて、−２０℃で一晩、ＲＮＡを沈殿させた。５，０００ｇで１０分の遠心分離によって沈殿物を集め、２０ｍｌの１Ｍ冷ＮａＣｌに再懸濁した。低温室で１時間激しく撹拌することによって、沈殿物を分散させた。上清を集め、１Ｍ  ＮａＣｌを用いて抽出を反復した。２回のＮａＣｌ抽出から得た上清を合わせ、２容積のエタノールの添加によって沈殿させた。２回反復した後、粗ｔＲＮＡ画分を水に溶解した。
【０１４０】
総ｔＲＮＡ混合物における特定のｔＲＮＡの枯渇
記載されるように２４総混合物からＤＮＡ−ハイブリダイゼーションクロマトグラフィーによって特定のｔＲＮＡ種を枯渇させた。アクセプターステムのアンチコドンループと相補的であるＤＮＡオリゴを設計し、ＩＤＴ製の３’−アミン基を用いて合成した（表８）。これらのＤＮＡオリゴを、１００μｌ樹脂あたり１００μｌの１５０μＭオリゴを用いて、製造業者のプロトコールに従ってＮＨＳ−活性化セファロース（ＧＥ）上に固定化した。２００μｌの５μｇ／μｌの未分画ｔＲＮＡ混合物を、同容量の２×ハイブリダイゼーションバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１．８Ｍ  ＮａＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ）と混合し、次いで、マトリックス上のオリゴを用いるハイブリダイゼーションに付した。各標的ｔＲＮＡについて、１２５μｌの、オリゴＤＮＡが固定化された定着した樹脂を使用した。ｔＲＮＡ混合物の懸濁液およびマトリックスを、６５℃で１０分間熱変性させた。サンプルをゆっくりと室温に冷却した後、ハイブリダイズしていないｔＲＮＡを、４００μｌよりわずかに少なく遠心分離によって集めた。次いで、４０μｌの１×ハイブリダイゼーションバッファーを使用して、マトリックスを洗浄し、最後のステップから集められたｔＲＮＡと組み合わせた。すべての結合していないｔＲＮＡを、エタノール沈殿のために一緒に合わせ、水に溶解した。
【０１４１】
ｔＲＮＡアミノアシル化およびフルオロフォアコンジュゲーション
ＣＣＵまたはＣＵＡアンチコドンを有する合成システインｔＲＮＡを、上記のようにｔ７転写によって調製した。組換えシステイニルｔＲＮＡシンセターゼ（synthease）（ＣｙｓＲＳ、ＳＩ）によって、これらのｔＲＮＡ変異体にシステイン（Ｃｙｓ）またはセレノシステイン（Ｓｅｃｙｓ）を担持させた。最初に、５０ｍＭ  Ｃｙｓを、５０ｍＭ  ＴＣＥＰとともに３７℃で１５分間プレインキュベートして、それを十分に還元した形態に変換し、その後、アミノアシル化反応を行った。Ｓｅｃｙｓを、４０ｍＭ  Ｓｅｃｉｓ、５０ｍＭ  ＨｅｐｅｓＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１Ｍ  ＤＴＴを含有する溶液中で、セレノシスチン（Ｓｅｃｉｓ）から３７℃で３０分還元させ、ｐＨを１００ｍＭ  ＫＯＨ最終によって７．５にした。その間に（Meatime）、ｔＲＮＡを７８℃で変性させ、５ｍＭ  Ｍｇ２＋の存在下、その最大活性を維持するように室温でゆっくりと、５０μＭ濃度で再フォールディングさせた。次いで、アミノアシル化反応を、１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ  ＣｙｓまたはＳｅｃｙｓ、２ｍＭ  ＴＣＥＰまたは２５ｍＭ  ＤＴＴ（Ｓｅｃｙｓのため）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＫＯＡｃ、０．１ｍＭ  ＣＴＰ、４ｍＭ  ＡＴＰ、２２．５μＭ  ｔ７ｔＲＮＡＣｙｓ変異体、１０μＭ  ＣｙｓＲＳ、２０％ＤＭＳＯ、５μＭ  ＺｎＣｌ２、０．００５μ／μｌの酵母無機ピロホスファターゼおよび５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ中、３７℃で１時間実施した。
【０１４２】
アミノアシル化後、反応ミックスを、エタノールアミン−セファロース精製と、それに続く、フェノール抽出（残存するフェノールは、１Ｖのクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を用いる２回のその後の抽出によって除去した）およびエタノール沈殿のために１×バッファーＡに４倍希釈した。ボディパイ（登録商標）ＦＬヨードアセトアミド（ＢＰＦＬ−ＩＡ）を用いるコンジュゲーション反応を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｓｅｃｙｓ−ｔＲＮＡのためにｐＨ８．５または７．２）、８０μＭ  Ｃｙｓ−ｔＲＮＡ、７５％  ＤＭＳＯ、１ｍＭ  ＢＰＦＬ−ＩＡおよび１００ｍＭ  ＮａＣｌ中で実施した。コンジュゲートされた産物（ＢＰＦＬ−ｔＲＮＡ）をエタノールによって沈殿させ、最小容量のｔＲＮＡバッファー（０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ５．０）に溶解した。次いで、サンプルを１×ＨＰＬＣバッファー（０．１Ｍ  ＴＥＡＡ、１％  ＡＣＮ）に調整し、続いて、以下のバッファーを使用するＰＯＲＯＳ（登録商標）Ｒ１  １０μｍカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でのＨＰＬＣによって精製した：バッファーＣは、０．１Ｍ  ＴＥＡＡ、１％  ＡＣＮであり；バッファーＤは、０．１Ｍ  ＴＥＡＡ、９０％  ＡＣＮであり、１〜２０％直線勾配を用いる９分の実施期間。ＨＰＬＣ精製後、ＢＰＦＬ−ｔＲＮＡ画分をエタノールによって沈殿させ、ｔＲＮＡバッファーに再懸濁し、−８０℃で保存した。
【０１４３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質翻訳アッセイ
ｔＲＮＡが枯渇した溶解物を、エタノールアミン−セファロースアフィニティークロマトグラフィーによって記載されるように２４調製する。２つのＧＦＰ  ＯＲＦを有するＤＮＡ鋳型：ｅＧＦＰ（鋳型Ａ）のための最適化されたコドン組成物の一方およびｓＧＦＰ（鋳型Ｂ）のための単純化されたコドン組成物のもう一方を使用した。ＩＤＴによってｇＢｌｏｃｋとして全遺伝子断片を合成して６つのＡｒｇコドンすべてをＡＧＧに同時に変更すること、または適切なプライマーを用いるＰＣＲを使用して、突然変異を同一位置に３未満のヌクレオチド導入することのいずれかによって、アンバーまたはＡＧＧ−コドンへ突然変異を導入した。得られた断片を、標準Ｇｉｂｓｏｎアセンブリークローニング手順（ＮＥＢ）に従って、ｐＬＴＥまたはｐＯＰＩＮＥベースのプラスミド中にクローニングした。Ｍｉｄｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって所望の突然変異を有する正しいプラスミドを精製して、無細胞タンパク質翻訳のための良好な品質を確実にした。ここで使用したすべてのオープンリーディングフレームの配列情報は、ＳＩに提供されている。
【０１４４】
ＧＦＰ製造のために細胞不含翻訳反応を、１０ｍＭ濃度の最適化されたＭｇ２＋を用いて標準プロトコール６０に従って実施した。標準Ｓ３０溶解物のものと同一の０．３５容量の枯渇した溶解物を、反応において使用した。その他の化合物を補給することが各実験について注記された。ＧＦＰ製造を、４８５ｎｍの励起および５２８ｎｍの発光波長の蛍光プレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ）で、３０℃で３〜５時間モニタリングした。
【０１４５】
タンパク質標識
細胞不含翻訳反応におけるＡｚＦおよびＢＰ−ＦＬを有するＣａＭの発現。それぞれ、ＣａＭ  ＯＲＦの位置１および１４９に位置するＴＡＧおよびＡＧＧコドンを有するｐＯＰＩＮＥ−ＣａＭ鋳型（図２７；ＳＩ）を、３５％（ｖ／ｖ）の枯渇した溶解物、０．５μｇ／μｌの枯渇したｔＲＮＡ混合物、１０μＭ  ＭｊＹ２ｔＲＮＡ、１０μＭ  ＡｚＦＲＳ、１ｍＭ  ＡｚＦ；１０μＭ  ＢＰ−ｔＲＮＡＣｙｓｃｃｕを含有する細胞不含反応物中に補給した。反応を、３２℃で４時間実施した。２００μｌの細胞不含反応物を、６００ｍｌのＰＢＳバッファーに対して、１２〜１４ｋＤａのカットオフ透析チューブ中で３時間、２回透析して、翻訳反応物中のＡｚＦを取り除いた。透析後、反応容量を２５０μｌに増大した。反応物に１６μｌの１ｍＭ  ＤＩＢＯ−ＴＡＭＲＡを添加して、６０μＭの最終濃度にした。標識反応を、室温で３時間実施した。
【０１４６】
親和性クランプマトリックスでの標識されたＣａＭの精製：反応混合物を５０００ｒｐｍで２分間回転させた後に、標識サンプルに、２０μｌの５０％親和性クランプマトリックス（ＳＩを参照のこと）を添加した。マトリックスをサンプルとともに室温で３０分間インキュベートした。マトリックスを、１．５ｍｌ  ＰＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎ（０．１％）バッファーを用いて、次いで、７．５ｍｌのＰＢＳを、最後に３．２ｍｌの切断バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ）を用いて洗浄した。続いて、マトリックスに４０μｌのプレシジョンプロテアーゼ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を添加し、１６℃で一晩インキュベートした。２×７５μｌの切断バッファーを用いてタンパク質を溶出した。
【０１４７】
２つの別個の反応を実施して、単一の標識されたＣａＭタンパク質を調製した。ＣａＭ−ＢＰＦＬを発現させるために、天然ＡＧＧ  ｔＲＮＡ種を欠く細胞不含翻訳系に、ＢＰＦＬが担持されたｔＲＮＡｃｃｕを補給して、ＡＧＧコドンをデコードし、一方で、ＵＡＧコドンをＴｙｒにデコードするために１０μＭ  ｔＲＮＡＴｙｒｃｕａを添加した。ＣａＭ−ＴＡＭＲＡを得るために、ＡｚＦを、第１の位置のＵＡＧコドン中にＭｊＹ２およびＡｚＦＲＳを用いるアンバーサプレッションによってタンパク質配列中に組み込み、一方で、ＡＧＧコドンをＡｒｇにデコードするために５μＭ合成ｔＲＮＡＡｒｇｃｃｕを補給した。次いで、ＡｚＦを、上記のように、銅不含クリック化学によってＤＩＢＯ−ＴＡＭＲＡによって修飾した。
【０１４８】
ｓｍＦＲＥＴ実験
ｓｍＦＲＥＴ実験を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴにおいて約１００ｐＭの二重標識されたＣａＭ濃度を用いて実施した。２ｍＭ  Ｃａ２＋または１０ｍＭ  ＥＤＴＡの非存在下および存在下のいずれかで、ｓｍＦＲＥＴ実験において記録を行った。自家製のシリコンプレート（ＳＹＬＧＡＲＤ（登録商標））上にロードされ、７０×８０ｍｍカバーグラスによって保持している２０μｌサンプルを各実験のために使用した。ｓｍＦＲＥＴ測定を、Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ４０×１．２ＮＡ水浸対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ）を使用して、ＣｏｎｆｏＣｏｒ３モジュールを備えたＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７１０顕微鏡で室温で実施した。ＢＰ−ＦＬ蛍光を、４８８ｎｍレーザーによって励起した。発光光は、ピンホールを通過し、５６５ｎｍダイクロイックミラーを使用してドナーおよびアクセプター構成要素に分けられ、ドナーおよびアクセプターシグナルをそれぞれ、５０５〜５４０および５８０〜６１０ｎｍバンドパスフィルターによってさらにフィルターに通した。
【０１４９】
ドナーおよびアクセプターシグナルを、各実験において３０秒、１ｍｓビンタイムを用いて２０反復の間、同時に記録した。３実験から得たデータを一緒に合わせて、解析に十分な事象を得た。ドナー発光の、遊離ＴＡＭＲＡ色素のアクセプターチャネルへの漏出を、２０μＭフルオロフォア濃度を用いる別個の実験で推定し、ＦＲＥＴ解析前のシグナルを補正するために１４％として算出した。バックグラウンドノイズをフィルターで除去するために、ドナーおよびアクセプターシグナルの合計について閾値を２０カウントに設定した。ＦＲＥＴ効率を、［強度（アクセプター）−ドナーチャネルからの漏出］／総強度（強度（アクセプター）＋強度（ドナー））として算出し、ヒストグラムとしてプロットした。ガウス関数を使用して、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ  Ｃｏｒｐ．）によるデータをフィッティングした。
【０１５０】
結果
ｎｎＡＡ組込みのための「ＡＧＧ」ブランクコドンを作製すること
本発明者らは、大腸菌（E. coli）溶解物からのＡＧＧコドンの天然アルギニンアイソアクセプターのほとんど完全な枯渇を最近実証した２４。本発明者らは、この溶解物が、単一ＡＧＧ−コドンを含有するｓｆＧＦＰ  ＯＲＦの翻訳を支持できないが、一方で、合成ｔＲＮＡｃｃｕの添加がその翻訳を回復させたことを実証した。この元のアプローチの主な欠点は、個々のｔＲＮＡ種からの半合成ｔＲＮＡ混合物を配合するための必要条件である。したがって、本発明者らは、標的ｔＲＮＡが、ＤＮＡ−ハイブリダイゼーションクロマトグラフィーによって総天然ｔＲＮＡ混合物から選択的に枯渇される代替アプローチ２５を試験することを決定した。
【０１５１】
このために、総ｔＲＮＡをＢＬ２１（Ｇｏｌｄ）大腸菌（E. coli）株から単離するか、または商業的に得た。ｔＲＮＡｃｃｕ／ｕｃｕのヌクレオチドと相補的であるＤＮＡオリゴヌクレオチドを、総ｔＲＮＡ混合物からのそのクロマトグラフィー的枯渇のために使用した。ｔＲＮＡｃｃｕ／ｕｃｕ枯渇の前後のｔＲＮＡ混合物の翻訳効率を、１つまたは６つのＡＧＧコドンを有するＧＦＰ鋳型の翻訳を支持する能力によって試験した（図２１および図２７）。前者の場合には、ＡＧＧをデコードするアイソアクセプターが枯渇した総ｔＲＮＡ混合物中のアルギニンコドンの残りは、１ＡＧＧ鋳型について観察される無視できるほどのバックグラウンド翻訳しかもたらさないか、または６ＡＧＧ鋳型については検出可能な翻訳がなかった（図２１および図２７）。反応物に、ｔ７ｔＲＮＡｃｃｕを補給することは、枯渇の前に総ｔＲＮＡ混合物によって提供された翻訳に匹敵するレベルに翻訳を回復させた。本発明者らは、ｔＲＮＡ枯渇効率を、１−（ＲＦＵ（枯渇したｔＲＮＡ）／ＲＦＵ（枯渇したｔＲＮＡ＋ｔ７ｔＲＮＡｃｃｕ））として定義した。この評価判定基準を使用して、組織内で製造されたｔＲＮＡ混合物の枯渇効率は、８９％〜９４％の範囲であり、他方、商業的に購入されたｔＲＮＡ混合物については、それぞれ、６２％〜８８％の範囲であり、これらは１ＡＧＧ−および６ＡＧＧ−鋳型に基づいて算出された。組織内で製造されたｔＲＮＡ混合物を、その後のすべての実験のために使用した。
【０１５２】
ｎｎＡＡ組込みのためのｏ−ｔＲＮＡ／ａａＲＳ対の効率の比較
ＡＧＧコドンが再割り当てのために遊離されたことを実証した後に、本発明者らは、最良のｔＲＮＡ担持系ならびにＡＧＧ再割り当ておよび二重タンパク質標識に適したｎｎＡＡを同定しようとした。したがって、本発明者らは、最良ｔＲＮＡ担持系ならびに二重タンパク質標識目的で、ＡＧＧ再割り当てとの今後の組合せに適したｎｎＡＡを見出すために、利用可能なｏ−ｔＲＮＡ／ａａＲＳ対の能力を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳反応サプレッションにおいてアンバーコドンをサプレッションに基づいて試験することを決定した。逆電子要請ディールス−アルダー環化付加として知られる、ひずんだアルケン／アルキンおよびテトラジンの間の最近開発されたバイオオルソゴナル反応は、この反応のより早い版よりも数桁速い速度定数を示す２６。バイオオルソゴナル反応物のうち１種、テトラジンは、発色団クエンチャーであり、その誘導体化されたボディパイプローブは、タンパク質とのコンジュゲーション後に１０００倍を超えるターンオン蛍光を示し２７、これは、未反応の色素のその後の除去を、従来の色素よりもはるかに容易にし、厳しいものではなくする。したがって、ひずんだアルケン／アルキンの遺伝子組み込みは、テトラジンフルオロフォアを用いる迅速な選択的な「ターンオン」タンパク質標識を達成する理想的な戦略となろう。ＰｙｌＲＳの活性部位の可塑性は、タンパク質への、ひずんだアルキンおよびアルケン、ＢＣＮ、ＴＣＯまたはＴＣＯ＊のいずれかを含む、多数のｎｎＡＡの組込みを可能にした１９、２８〜３５（図２２Ａ）。いくつかの独特な突然変異を特徴とする３種の進化したＰｙｌＲＳ変異体ＢＣＮＲＳ３６、ＴＣＯＲＳ３６およびＰｙｌＲＳＡＦ１９は、ｉｎ  ｖｉｖｏでこれらのｎｎＡＡの組込みを媒介すると報告されている。本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系においていくつかの基質に対する、これらの酵素の効率を比較しようとした。
【０１５３】
本発明者らは、ＰｙｌＲＳ変異体の組換え形態を、そのアンチコドンステム（ＰｙｌＴ）１４にＵ２５Ｃ突然変異およびｎｎＡＡ−基質ＢＣＮ、ＴＣＯまたはＴＣＯ＊を有する進化したｏ−ｔＲＮＡの存在下で、１５１位置にアンバー−コドン（Ａ＿１５１Ｘ、ＳＩ）を含有する鋳型からのｅＧＦＰ合成のｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成を支持するその能力について試験した。ｗｔ  ＭｂＰｙｌＲＳ３０によって、ｔＲＮＡに対し受け入れられ、担持されると知られているアジドカップリングのためにも使用される別のｎｎＡＡであるＰｒＫ（図２２Ａ）およびＯＲＦは、ＣＧＮコドンファミリーボックスに属し、ＭｍＰｙｌＲＳ５も試験した。ＢＣＮ、ＴＣＯおよびＴＣＯ＊によるＵＡＧサプレッションの効率が極めて低かったことは驚くべきことであった（図２２Ｂ）。これらの大きな脂肪族アルキンまたはアルケンのいずれも、３種のＰｙｌＲＳ突然変異体のいずれかによって、５％を上回る効率で組み込まれることができなかった。ＢＣＮＲＳは、最高のサプレッション効率を示し、ＢＣＮおよびＴＣＯ＊は、３％および２％であった。ＰｙｌＲＳＡＦは、ＴＣＯと組み合わせて、３％の最良のサプレッション効率を実証した。驚くべきことに、ＢＣＮＲＳおよびＴＣＯＲＳは、本質的にＰｒＫを組み込むことができなかったが、ＰｙｌＲＳＡＦは、嵩高いシクロ脂肪族基のために設計されたその拡大されたアミノ酸結合ポケットにも関わらずそれを１３％の効率で担持し、以前の報告２９が確認された。後者は、包括的研究３５において報告された種々の基質に対する、操作されたＰｙｌＲＳ変異体の混乱状態を確認する。
【０１５４】
Ｍ．ヤンナスキイ（M. jannaschii）由来のＴｙｒＲＳは、１つまたは複数の部位にテトラジン誘導体を含む２、１３、２２、さまざまなベンジル側鎖類似体の組込みを媒介するように操作された酵素を担持する、別の広く使用されるオルソゴナルｔＲＮＡである。ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（ＡｚＦ、図２２Ａ）およびＭｊＴｙｒＲＳ−ＡｚＦＲＳ３９のそれぞれの操作された版を、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアンバー−コドンサプレッションのための成功した適用の報告に基づいて選択した。試験された基質の中で、ＡｚＦは、フレキシザイム（ｅＦｘ）担持系と組み合わせて使用した場合に、最良のアンバー−コドン組込み効率を示した（図２９）。これは、高アシル化率だけでなく、アシル化チロシン類似体のＥＦ−Ｔｕとの適合性も間接的に示唆する。ｎｎＡＡ組込みにおける律速段階としての後者の重要性も理解されることが多い。
【０１５５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ選択キャンペーンにおいてＡｚＦＲＳのために、いくつかの最適化されたｏ−ｔＲＮＡが進化し、したがって、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのその活性を比較することを決めた。本発明者らは、８１％の最高効率でＡｚＦ組込みを支持するＭｊＹ２を見出した（図２２Ｃ）。ＭｊＹ２はＭｊＹ４よりもわずかに良好に、それぞれ、ＭｊＹ１およびＭｊＹ３よりも１．８および４．６倍効率的な性能を示した。ＭｊＹ１は、選択実験３７において最良の性能を示したが、本発明者らのアッセイにおいては、ＭｊＹ２と比較して、効率的ではなかった。
【０１５６】
個々の特性決定後に、本発明者らは、ＭｊＹ２／ＡｚＦＲＳ／ＡｚＦおよびＰｙｌＴ／ＰｙｌＲＳＡＦ／ＰｒＫを系統的に比較した。第１に、ｏ−ｔＲＮＡおよびａａＲＳを翻訳反応において滴定して、１５１位置にアンバーコドンを有する鋳型（Ａ＿１５１Ｘ）からのｅＧＦＰ発現収率に対するそれらの濃度の効果を決定した。ｔＲＮＡ濃度が、２０μＭで一定に維持される場合には、ＧＦＰ収率は、最大１０μＭまでＡｚＦＲＳ濃度につれて、増大し、一方、ＰｙｌＲＳについては、３０μＭでさえ飽和しなかった（図２２Ｄ）。ＡｚＦＲＳまたはＰｙｌＲＳの濃度が、それぞれ、２０μＭおよび３０μＭで一定に維持された場合には、タンパク質収率は５〜１０μＭのＭｊＹ２  ｔＲＮＡまたは２０μＭのＰｙｌＴ  ｔＲＮＡでプラトーに達し、両方の高濃度で減少した（図２３Ａ）。半最大タンパク質収率を支持するｏ−ｔＲＮＡ濃度は、ＭｊＹ２ｔＲＮＡおよびＰｙｌＴについて、それぞれ１．５μＭおよび８μＭであった。ＭｊＹ系の最大収率は、２０μＭのＭｊＹ２  ｔＲＮＡおよび１０μＭのＡｚＦＲＳを用いた場合に８５７０ＲＦＵに達し、一方で、ＰｙｌＲＳＡＦおよびＰｙｌＴの両方の３０μＭは、ＭｊＴｙｒＲＳ系を用いて達成されたレベルの４３％にしかＧＦＰ翻訳を支持できなかった。
【０１５７】
アンバー−コドンでのサプレッション効率が状況依存であるので、種々の位置に位置する単一ＴＡＧコドンを有する３種のさらなるＧＦＰをコードするＯＲＦを設計し、２つのサプレッション系間のＧＦＰ収率を比較した（図２２Ｄ）。ｎｎＡＡ−基質、ｏ−ｔＲＮＡまたは酵素のいずれかを欠く反応を使用して、非特異的サプレッションのレベルを評価した（図３０；ＳＩ）。効率的なアンバーコドンサプレッションのために知られている、グラフトされたＣＵＡアンチコドンを有する、大腸菌（E. coli）Ｔ７によって転写されたチロシンｔＲＮＡ（ＥｃｔＲＮＡＴｙｒ（ｃｕａ））を、陽性対照として使用した。ｏ−系によって提供された相対活性は、陽性対照における蛍光のパーセンテージとして算出した（図２３Ｅ）。
【０１５８】
図２２Ｅに示されるように、ＭｊＹ系は、鋳型状況に関わらず、ＴＡＧコドンサプレッションにおいてＰｙｌＴ系よりも一貫して性能が優れていた。鋳型サブセットＡについて、両系における相対サプレッション効率は、近位のＴＡＧコドン（位置１）について、一貫してより高いことが見出された。驚くべきことに、Ｂサブセットについて、位置の優先性は逆転し、ＰｙｌＲＳのｏ−系においてはサプレッションを全く示さなかった近位のアンバーコドンよりも、遠位（位置１５１）を好んだ（図２３Ｂ）。全体的に、ＰｙｌＲＳと比較してＭｊＹ  ｏ−系の平均活性は、１．２〜３倍高く（いくつかの場合におけるＰｙｌＲＳ系の失敗を考慮に入れずに）、はるかに状況依存性ではなかった（図２２Ｅ）。
【０１５９】
ＡｚＦにＡＧＧコドンを再割り当てすること
本発明者らのこれまでの解析知見は、ｏ−系を担持するオルソゴナルＭｊＹ  ｔＲＮＡが、アンバーコドンで高レベルのＡｚＦ組込みを媒介することを示した実証する（indicateddemonstrate）。ＭｊＴｙｒＲＳがないことは、主要なアンチコドン結合ドメインを欠き、これは、アンチコドントリプレットは、効率的なｔＲＮＡ認識にとって必須ではないことを示す（suggested indicating）４０。しかし、第１のアンチコドン位置（アンバーサプレッサー）においてＧをＣに変換することまたは３種のアンチコドンヌクレオチドすべてを突然変異させること（ＡＴＧサプレッサー）は、アミノアシル化効率において、それぞれ、およそ１００および９００倍の喪失を引き起こす、もたらすと報告された４０。Ｍｊ  ｏ−ｔＲＮＡに基づいて構築されたアンバーアンバーサプレッサーが、極めて効率的な高サプレッションを与えたので、本発明者らは、アンチコドンをＣＣＵに変更し、それによって、それをＡＧＧコドンにターゲティングし、一方で、それがおそらくは担持反応におけるかなり高いｏ−ｔＲＮＡ／酵素濃度の必要条件を作製し得ることによって、そのアンチコドンを変更して、その対応するＡＧＧコドンサプレッサーを調べることを決めた。
【０１６０】
本発明者らは、ＡＧＧコドンのアイソアクセプターを欠く溶解物を、ＭｊＹ２（ｃｃｕ）／ＡｚＦＲＳおよびＡｚＦと組み合わせることによって、ＡＧＧコドンをＡｚＦに再割り当てする可能性を評価しようとした。本発明者らは、ＡＧＧコドンをＡｚＦに再割り当てする可能性を評価しようとした。このために、本発明者らは、コドンバイアスがかかった鋳型サブセットＡおよびＢ両方（ＳＩ）において単一アンバーコドンをＡＧＧに変換し、一方で、状況効果を同時にモニタリングするためにＯＲＦ中の残存するアルギニンは、ＣＧＮファミリーコドンファミリーによってコードされた（配列情報については図２３およびＳＩ）。Ａ＿１５１Ｒ、Ａ＿１Ｒ、Ｂ＿１５１Ｒ、Ｂ＿１Ｒの天然ＡＧＧアイソアクセプターの枯渇程度は、それぞれ、７５％、８０％、９３％および８４％であるとわかった（方程式１）。ＭｊＹ２（ｃｃｕ）／ＡｚＦＲＳを有する反応物の１５１Ｒおよび１Ｒ補給は、Ａサブセットについて蛍光の４．２および５．２倍の増大をもたらし、Ｂサブセットについては１８．４および７．２倍の増大をもたらした。これは、すべての場合において８０％超のＧＦＰタンパク質がＡｚＦを用いて修飾されたことを示した。翻訳産物の質量分析解析は、タンパク質のほとんどが、ＡＧＧによって規定された位置に組み込まれたＡｚＦを有し、極めて無視できるほど微量の画分が、この部位にＡｒｇを有することを実証した（図３２Ｂ〜Ｃ）。驚くべきことに、ＧＵＡ＝＞ＣＣＵ変換が、すべての位置でｗｔとは異なるアンチコドンをもたらし、水素結合が失なわれる可能性が高くなるにも関わらず、ＵをＣ３５４１に変更すると、ＡＧＧサプレッサーはここで、そのアンバーサプレッサー対応物としての高いサプレッション活性を維持した。
【０１６１】
ボディパイ−ＦＬ  ｎｎＡＡ誘導体の遺伝子コード化
ＭｊＹ  ｏ−系による、ＡＧＧのＡｚＦへの成功した再割り当ては、本発明者らに、ｎｎＡＡの２部位組込みに使用される可能性があり得るＵＡＧと組み合わされ得る第２のオルソゴナルコドンを提供した。しかし、ＡｚＦに対して化学的にオルソゴナルである第２のｎｎＡＡの選択は、ひずんだアルキンおよびアルケンの低い組込み効率ならびに代替クリック化学タグのようなＰｒＫとＡｚＦの間の交差反応性のために問題のあるものである。したがって、本発明者らは、蛍光ｎｎＡＡの直接組込みおよびさらなるコンジュゲーションのためのクリック化学に適合するｎｎＡＡ−タグの両方を、ＦＲＥＴ形成フルオロフォアと組み合わせる新規戦略を試験することを選択した。１つのみの翻訳後コンジュゲーション／精製誘導体化ステップを有することを示唆するこのような「偽性ワンポット（pseudo-one-pot）」標識アプローチは、全体を大幅に単純化し、すべてのこれまでに公開された二重標識手順より大幅に簡単である。
【０１６２】
その大きさのために、フルオロフォアフルオロフォアを有するアミノ酸類似体は、ａａＲＳによってアミノアシル化されることが困難であり得、低い効率を有し、大きさ制限のために共翻訳的に共翻訳的使用ができなくなる。したがって、蛍光アミノ酸を用いて予め担持された、予め担持されたｔＲＮＡの共翻訳的補給は、必要であり、代替アプローチを提供する。ｔＲＮＡにｎｎＡＡを予め担持させるためにいくつかの戦略が開発された。１つは、化学的に調製されたアミノアシル化ジヌクレオチドを、３’−ＣＡジヌクレオチドを欠く末端切断型ｔＲＮＡに連結することを含む４２。複数ステッププロトコールを含むこの方法は、技術的に課題があるものである。代替アプローチでは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｎｎＡＡをｔＲＮＡに担持させるために、フレキシザイム、ｔＲＮＡアシル化リボザイムが開発された４３。原理では、このアプローチは、簡単であるが、複数ステップの化学合成に頼るものであり、担持効率は異なるｎｎＡＡに対して大きく変わり、大量の蛍光色素を必要とする複数ステップ化学合成として高価であり、色素の嵩高性は、立体障害を引き起こし、反応性基の正しい配向を妨げる可能性があり得る。別のアプローチは、システイン４４のスルフヒドリル基またはリジン残基のε−アミノ基などの反応性アミノ酸側鎖を介した酵素的アミノアシル化ｔＲＮＡとの官能基カップリングを含む４５。本発明者らは、その修飾が、最短の脂肪族スペーサーをもたらし、ならびにその対応するシステイニル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＣｙｓＲＳ）中に編集ドメインがない４６、４７ので、コンジュゲーションタグとしてシステイン残基を使用することを選択した。
【０１６３】
幅広い市販のスルフヒドリル反応性蛍光化合物から、本発明者らは、最小のボディパイ  ＦＬフルオロフォア（ＢＰＦＬ）ヨードアセトアミドを使用することを選択した。ＥＦ−Ｔｕまたはその操作された形態によるエステル化ｎｎＡＡの不適当な適応は、かなりの頻度で、三次複合体形成またはリボソームでのｎｎＡＡ−ｔＲＮＡの解離のレベルのいずれかで、その効率的な組込みに障壁をもたらし４８、熱力学的代償仮説は、生産的組込みのためにｔＲＮＡ本体およびエステル化アミノ酸の間の適合性を求める４９。したがって、本発明者らは、許容される（acceptiable）リンカーの長さおよびフルオロフォアの大きさを確立するために、ＥＦ−Ｔｕ構造のコンピュータによる解析を実施した。例えば、８マースペーサーを介してｔＲＮＡ（Ｌｙｓ）アミノ−エステル骨格と結合している市販のＢＰＦＬは、タンパク質標識において視覚的に十分な性能を示したが、そうではない同一のＢＰＦＬ−ピロリル類似体のＥＦ−Ｔｕに対する親和性は、ｗｔ  Ｌｙｓ−ｔＲＮＡ（Ｌｙｓ）のものよりも３０倍低かった４８。１７マーのスペーサーを介して結合しているビオチンの組込みの効率は、ＥＦ−Ｔｕと堅く結合するｔＲＮＡ（Ａｌａ）本体と交換することによって救済され得た５０。環の大きさおよびスペーサーの長さが、エステル化ｎｎＡＡのＥＦ−Ｔｕとの結合にどのように影響を及ぼすかを予測することは上記から困難と思われたので、本発明者らは、ＥＦ−Ｔｕの、５マーのスペーサーが、ＢＰＦＬ環をアミノ−エステル骨格から離すＢＰＦＬ／システイニル−ｔＲＮＡコンジュゲートを収容する能力を大まかに推定しようとした（図３２、ＳＩ）。これと一致して、本発明者らは、ＢＰＦＬを、Ｔｒｐの代わりに既知構造５１中に手作業で適合させ、スペーサーの長さを同様に５マーに調整した（図３３、ＳＩ）。得られたモデルでは、ＢＰＦＬは、大きな立体的な衝突を伴わずに、Ｔｒｐとはわずかに異なる配向でポケットを占めており、さらに、スペーサー伸長のための幾分かの余地を保持すると思われた。モデルから、ＢＰＦＬ−システイン誘導体は、ＥＦＴｕによって収容され、したがって、少なくともある程度は、幾分か負の遊離結合エネルギーに寄与する可能性が最も高いと思われるが、このエネルギーは、Ｃｙｓ自体または親和性によるその分布が極めて広い５２、５３芳香族アミノ酸残基に対して相対的にランク付けすることは極めて困難である。したがって、ＢＰＦＬとのコンジュゲーションのために、本発明者らは、ｗｔ  Ｔ−ステムおよび弱いから中程度のＣｙｓの結合を補償する、使用されるアルゴリズムに応じて、中程度から相互に密接したまで広がる、ＥＦＴｕに対するｔＲＮＡ（Ｃｙｓ）の天然親和性を維持することを選択した。
【０１６４】
ＣＵＡまたはＣＣＵアンチコドンのいずれかを有するｔ７ｔＲＮＡ（Ｃｙｓ）変異体をアミノアシル化し、ＢＰＦＬとコンジュゲートし、ＢＰＦＬ−ｃｙｓ−ｔＲＮＡを得、次いで、コンジュゲーション産物をＨＰＬＣによって精製し、約１５〜２０％の最終収率であった（図２４Ａ）。次いで、本発明者らは、精製ＢＰ−ｃｙｓ−ｔＲＮＡｃｃｕを、ＡＧＧ反応のためのアイソアクセプターを欠く無細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳混合物中に、ｓＧＦＰ＿Ｔ２鋳型を使用するＡＧＧサプレッションによる共翻訳的単一部位タンパク質標識のためのそれぞれのアイソアクセプターを欠く半合成ｔ７ｔＲＮＡ混合物とともに補給した、導入した２４。反応物を、単一ＡＧＧコドンを有するｅＧＦＰ鋳型によってプライムし、標識されたタンパク質対枯渇されていない「親」溶解物および異なるｔＲＮＡ混合物によってプログラムされたｔＲＮＡが枯渇した溶解物の両方で生成された総タンパク質の収率（図２４Ｂ）を比較した。標識されたタンパク質の収率は、１．４倍増大し、相対標識効率は、ｗｔ溶解物と比較して、ｔＲＮＡで再構成された系において１０倍高かった（図２４Ｂ、ＢＰ−ｔＲＮＡを用いるレーン３および４）。ＢＰＦＬ−ｔＲＮＡは、天然ｔＲＮＡプール中では少ない存在量であるが天然ＡＧＧ−アイソアクセプターの存在のために、正常溶解物においてＡＧＧコドンをデコードすることについて、天然ｔＲＮＡとあまり都合よく競合しない５４。ＡＧＧアイソアクセプターを欠く半合成ｔ７ｔＲＮＡ一揃いを有する無細胞系では、ｓＧＦＰはほとんど製造されなかった（ＢＰ−ｔＲＮＡを有さない、図２４Ｂ、レーン３）。ｓＧＦＰの発現は、ＢＰＦＬ−Ｃｙｓ−ｔＲＮＡｃｃｕの添加の際に回復され得、これは、実質的にすべての発現されたポリペプチドが、ＢＰ−フルオロフォアを組み込んだことを示す。本発明者らは、ＢＰ−ＦＬ担持されたｔＲＮＡは、延長因子およびリボソームの両方を含む宿主翻訳機構と適合すると結論付けた。翻訳中にｎｎＡＡから放出されたＣｙｓ−ｔＲＮＡｃｃｕは、システインを用いて無視できるほどの共翻訳的再担持を起こした（図３４、ＳＩ）。ＣｙｓＲＳは、ＣｙｓＲＳ認識によるｔＲＮＡ認識における重要な同一性要素であるように、アンチコドン（特に、Ｇ３５Ｃ３６）に頼るので、系のオルソゴナル性は、おそらくは、相対的に低濃度の内因性ＣｙｓＲＳおよび内因性（endogeneousendogenous）ｗｔ  ｔＲＮＡ（Ｃｙｓ）との好ましくない競合をもたらすことを必然的に伴うＡＧＧ−サプレッサーの高度に還元されたｋｃａｔ／Ｋｍによるものである。
【０１６５】
本発明者らは、アンバーアンバーおよびＡＧＧコドン媒介性ＢＰ−ＦＬ組込みを、４種の鋳型、ＧＦＰ  ＯＲＦの１番目および１５１番目の位置に単一のアンバーまたはＡＧＧコドンのいずれかを有する、Ｂ＿１Ｘ（１５１Ｘ）およびＢ＿１Ｒ（１５１Ｒ）を使用することによって効率的に比較した（詳細な考察については、図２４Ｃ、ＳＩ）。ｔＲＮＡが枯渇した溶解物およびＡＧＧアイソアクセプターを欠く総ｔＲＮＡ混合物から再構成された翻訳反応物に、精製ＢＰＦＬ−ｃｙｓ−ｔＲＮＡサプレッサーを補給し、そのそれぞれの鋳型を用いてプライムした。ＡＧＧサプレッションは、１．８および４倍の一貫して高いＢＰ−ＦＬ組込み、アンバーサプレッションよりも、それぞれ、１番目および１５１番目の位置で１．８および４倍をもたらした。これは、アンバーコドンで媒介される翻訳終結の終結因子のものと比較して、ＡＧＧコドンの天然ｔＲＮＡアイソアクセプターからの少ない競合を示す。本発明者らは、ＢＰ−ＦＬが担持されたｔＲＮＡは、ＡＧＧに、本発明者らがここで試験したコドン状況においてより適合すると結論付けた。
【０１６６】
ＡＧＧおよびアンバーコドン再割り当ての組合せによる二重タンパク質標識
導入に記載されるように、ＦＲＥＴ形成性色素対を用いる部位特異的二重タンパク質標識の現在の戦略は、タンパク質配列中に遺伝的に組み込まれる、２種のバイオオルソゴナル基を導入することと、それに続く、ＦＲＥＴ形成性フルオロフォアを送達する別の基との２種のそれぞれのコンジュゲーション反応に頼っている７、１９。これらのｎｎＡＡおよびフルオロフォアにおいて官能基の反応性を注意深く制御することが必要であることが、このアプローチを技術的に課題があるものにする。ＢＰ−ＦＬは、共翻訳的にタンパク質配列中に組み込まれ得るので、第２の遺伝子によってコードされるｎｎＡＡの選択に多くではないものの少しの制限はあるが、第２のフルオロフォアの導入は、より簡単なものになろう。本発明者らは、それぞれ、アンバーおよびＡＧＧコドン再割り当てによって１番目および１４９番目の位置に導入された、バイオオルソゴナル反応性基（ＡｚＦ）およびフルオロフォアを有するアミノ酸（ＢＰＦＬ−Ｃｙｓ）を用いて、カルモジュリン（ＣａＭ）、細胞機能のレギュレータータンパク質を合成することによって、このアプローチを試験した。次いで、ＢＰＦＬと対を形成する、ＦＲＥＴ形成性色素を形成するＴＡＭＲＡを、銅不含クリック化学によってタンパク質中に直接導入した。この反応は、純粋なタンパク質上、または細胞不含反応状況のいずれかで処理実施され得、タンパク質凝集または銅によって触媒されるアジド−アルキンヒュスゲン環化付加（ＣｕＡＡＣ）において必要とされる金属触媒によって引き起こされる酸化の副作用を避けることができる。蛍光ゲルスキャニングは、２種のＦＲＥＴプローブのＣａＭタンパク質中への確認された成功した導入を実証する（図２５Ａ、第１のレーン）。
【０１６７】
二重標識されたＣａＭの４８８ｎｍでの励起は、蛍光発光スペクトルにおいて２つの別個のピークを示した（図２５Ｂ）。５１２ｎｍのピークは、ＢＰ−ＦＬの発光に対応するのに対し、５７５ｎｍでのその他のピークは、ＴＡＭＲＡの発光を反映する。対照的に、ＢＰ−ＦＬまたはＴＡＭＲＡで単一標識されたＣａＭタンパク質は、４８８ｎｍで励起された場合に、その蛍光発光スペクトルにおいて５７５ｎｍで少ない発光を示す。ＴＡＭＲＡで単一標識されたＣａＭタンパク質単一標識されたＣａＭタンパク質の濃度を予め調整して、その最大発光蛍光を５４３ｎｍ（アクセプター励起波長）で励起された場合の二重標識タンパク質のものと等しくなるようにした。両サンプルを４８８ｎｍで励起した場合、二重標識されたタンパク質の５７５ｎｍでの発光蛍光は、ＴＡＭＲＡ単一標識タンパク質のものよりもかなり高かった。これは、二重標識されたＣａＭにおけるドナーフルオロフォアＢＰ−ＦＬからアクセプターフルオロフォアＴＡＭＲＡへのエネルギー移動を示し、成功した二重標識が確認される。
【０１６８】
タンパク質コンホメーション変化解析におけるｓｍＦＲＥＴの適用を実証するために、本発明者らは、二重標識ＣａＭタンパク質を、Ｃａ２＋およびＥＤＴＡを用いて滴定する（図２５Ｄ〜Ｆ）。二重標識ＣａＭを、Ｃａ２＋を有さないバッファー条件で無細胞翻訳から精製した。そのｓｍＦＲＥＴヒストグラムは、２つのピークを示し、一方は、０．２を中心に集まり、もう一方は、０．５５を中心に集まっている。それらは、精製サンプル中の２種のコンホメーションに相当し、本発明者らは、一方は、Ｃａ２＋不含にあり、もう一方は、Ｃａ２＋結合型にあると推測する。細胞不含で発現されたＣａＭは、おそらくは微量のカルシウムが夾雑しており、サンプル中の一部のＣａＭタンパク質のコンホメーション変化を引き起こした。サンプルに２ｍＭ  Ｃａ２＋を添加した後、第２のピークは消失し、第１のピークとともに出現した。これによって、およそ０．２の第１のピークは、カルシウム結合型であることが確認された。サンプルにＥＤＴＡを添加した場合には、第１のピークは、明らかに低減し、これは、幾分かのＣａ２＋がＣａＭタンパク質から取り除かれたことを示した。このデータは、ＣａＭの１番目および１４９番目の位置の２つのフルオロフォアが、Ｃａ２＋結合型よりもＣａ２＋不含形態では近接している（高いＦＲＥＴ効率）（図２５Ｃ）という構造情報と一致する。
【０１６９】
考察
本発明者らは、大腸菌（E. coli）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系においてＡｒｇ  ＡＧＧセンスコドンを、ｕＡＡに再割り当てするための新規戦略をここで記載する。それを達成するために、本発明者らは、最近開発された、内因性ｔＲＮＡ２４が枯渇した大腸菌（E. coli）翻訳系を利用した。本発明者らは、ＤＮＡ−ハイブリダイゼーションクロマトグラフィーによって総ｔＲＮＡ混合物から選択されたｔＲＮＡを除去するための新規手順をここで開発した。半合成ｔＲＮＡ一揃いを使用する、これまでに報告された再構成アプローチとは異なり、開発されたｔＲＮＡ枯渇法は、簡単であり効率的である。本発明者らは、ＡＧＧコドンの天然アイソアクセプターのほとんど完全な枯渇を達成し、再割り当てに適したものにできた。ｔＲＮＡｃｃｕ補給しない場合は、６つのＡＧＧコドンを有するＧＦＰ鋳型を使用してタンパク質翻訳は観察されなかったが、１つのＡＧＧコドン鋳型を含有する鋳型で最小のＧＦＰ発現のみが観察された。合成ｔＲＮＡｃｃｕを添加すると、ＧＦＰタンパク質発現は、野生型の系のものに匹敵するレベルに増大した。これによって、センスコドン再割り当て戦略が検証され、潜在的な多数の新規オルソゴナルコドンの作製のための道を開く。
【０１７０】
細胞不含翻訳系の開放性が、その成分の濃度および同一性に対する直接制御を可能にする。本発明者らは、この特徴を利用して、ＰｙｌおよびＭｊＴｙｒ系を含むいくつかのオルソゴナルｔＲＮＡ／ａａＲＳ系を、ｎｎＡＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳されたタンパク質への組込みを支持するその能力において比較した。本発明者らは、いくつかの報告されたＰｙｌＲＳ変異体を、ＢＣＮ、ＴＣＯ、ＴＣＯ＊およびＰｒＫを含むｎｎＡＡの組込みを媒介するその能力によって評価した。本発明者らは、その高い反応性およびバイオオルソゴナル２６のために、最初の３種の非天然アミノ酸に特に興味を持った。驚くべきことに、それらのうち、試験されたＰｙｌＲＳ変異体の良好な基質であると思われたものはなかった。これらの結果は、ＭＳ解析によってこれらのｎｎＡＡの効率的な組込みが確認されたＵＡＧサプレッションでのｉｎ  ｖｉｖｏデータとの予期しない不一致を示した１９、３６。対照的に、ＰｙｌＲＳＡＦは、相対的に高い効率で、ＰｒＫを有するＵＡＧコドンを効率的にデコードでき、銅で触媒されるクリック化学によってさらに修飾され得る。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏ選択によって進化したアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼは、特に大きな脂肪族アルキンまたはアルケンにとって最適ではない可能性があることを示す。ＰｙｌＲＳ変異体は、一般に、高度の基質誘導性ドメイン間動力学再編成を有する多重基質酵素である。したがって、基質結合ポケットの突然変異誘発は、他方では、数百倍のアミノアシル化動力学の全体的な低減をもたらす可能性を必然的に伴う３５。本発明者らは、精製ステップの間に、これらのＰｙｌＲＳベースの酵素の沈殿を観察した。マグネシウム、高濃度塩およびグリセロールが、可溶化形態でのこれらのタンパク質の維持をある程度まで補助し得るものの、バッファー条件におけるこれらのＰｙｌＲＳ変異体の不安定性が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ適用にとっての余分な障壁を引き起こす。これは、ｎｎＡＡ組込みのために大腸菌（E. coli）において、ＰｙｌＲＳは不十分に発現され、ミスフォールディングの傾向があり、コドン使用および発現条件の最適化を必要としたことを示唆した、いくつかのｉｎ  ｖｉｖｏデータと一致する１４。
【０１７１】
ＭｊＹ１は、ｉｎ  ｖｉｖｏで最も効率的であるとスクリーニングされ同定され３７、ＭｊＹ４（ｔＲＮＡＯｐｔＣＵＡ）は、最も最近の研究において使用されたが３８、ＭｊＴｙｒ系を解析するなかで本発明者らは、ＭｊＹ２は、ＡｚＦ官能基のコーディングにおいて最も効率的であると見出した。進化圧力が、アミノ酸側鎖を種々のｔＲＮＡ本体と組み合わせることによって、天然系では、すべてのａａ−ｔＲＮＡが、延長因子（ＥＦ−Ｔｕ）に対して類似の親和性を示す４９、５５ことを保証する。したがって、最良のｎｎＡＡ組込み効率を達成するために、選択された標的ｎｎＡＡと協力して働き、ＥＦ−Ｔｕに対して最適親和性を達成するように、野生型ｏ−ｔＲＮＡ配列を最適化することが望ましい。
【０１７２】
さらに、本発明者らは、２種のオルソゴナル翻訳系、ＭｊＹ２／ＡｚＦＲＳ／ＡｚＦおよびＰｙｌＴ／ＰｙｌＲＳＡＦ／ＰｒＫの最良の組合せによって、デコード効率に対するアンバーコドン状況を比較した。ＭｊＴｙｒ系は、本発明者らがここで試験した４種のコドン状況のすべてにおいて、一貫してＰｙｌ系よりも良好な性能を示した。ＭｊＴｙｒ系の相対効率は、ＵＡＧコドンのデコードにおいて５５％〜９７％の範囲であった。対照的に、ＰｙｌＴ／ＰｙｌＲＳ／ＰｒＫのサプレッション効率は変化し、いくつかの場合には、ＧＦＰ翻訳を媒介できなかった。これらの結果は、ＯＲＦのいくつかの位置は、その他のものよりも容易にサプレッションされる５６、５７というこれまでの知見と一致し、高度に効率的なｏ−ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対が使用される場合には、状況効果は、低減されることを示す。
【０１７３】
異種ｔＲＮＡ／ａａＲＳ／ｎｎＡＡの高度オルソゴナル性は、コドン再割り当ての特異性および忠実度を決定する重要な問題である。本発明者らの結果は、Ｐｙｌサプレッション系のオルソゴナル性は、大腸菌（E. coli）ではＭｊＹ系のものよりも高い（図３０）ことを実証したが、これは、後者の場合には、本発明者らが、ＡｚＦの非存在下で基準芳香族アミノ酸、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐの組込みを観察したからである。しかし、翻訳系のＡｚＦを補給した後、基準アミノ酸の誤組込みは無視できるほどになり（図３１）、これは、特定のｎｎＡＡに対して最適化されたＭｊＴｙｒＲＳは、その他の基質を許容するには低い効率を有していたということを示唆する。広い基質特異性は、同様の構造を有するｎｎＡＡの組込みにとって利点を有するが、１種超のｎｎＡＡが組み込まれる必要がある場合には誤組込みを増大もする。各成熟ｔＲＮＡおよびそのコグネートａａＲＳの割合は、翻訳忠実度および効率を確実にするように進化的にバランスがとられている。
【０１７４】
本発明者らは、ＭｊＹサプレッション系が、アンバーサプレッションに限定されず、本発明者らが新規に開発した、ＡＧＧ天然アイソアクセプターを欠く無細胞系と組み合わせた場合に、ＡｚＦへのＡＧＧ再割り当てにも良好に適合することを実証した。ＭｊＴｙｒＲＳのｔＲＮＡアンチコドントリプレットに対するＭｊＴｙｒＲＳの低感受性によって、その他のセンスコドンへの再割り当てのためのその将来の使用が可能となる。ＡｚＦに加えて、ＡＧＧコドンが、ＢＰ−ＦＬフルオロフォアに直接再割り当てされ得、これは、予め担持されたＢＰＦＬ−Ｃｙｓ−ｔＲＮＡｃｃｕを使用することによって、標識手順を大幅に簡単にするであろう。放出されたｔＲＮＡｃｃｕは、変更されたアンチコドンのためにＣｙｓＲＳの不十分な基質であり、システインを用いた場合に起きる共翻訳的再担持は無視できるほどであった。これは、系の忠実度を維持した、維持する。エステル化ＢＰＦＬ−Ｃｙｓを伴う状況のｔＲＮＡ本体を、配列との相互作用についてさらに最適化して、ＥＦ−Ｔｕによってより良好に受け入れられるようにそのエステル化ＢＰＦＬ−Ｃｙｓとの適合性を増強することが、デコード効率を増大するであろう。
【０１７５】
本発明者らは、上記の観察結果を利用して、２種のＦＲＥＴ形成性プローブを用いて標識された部位選択的タンパク質（複数可）を構築するための新規アプローチを開発した。２種の標識反応の選択性のバランスをとることに関連する困難を避けるために、本発明者らは、２種の標識反応の選択性のバランスをとることに関連する困難を避けるために、１種のフルオロフォアをタンパク質配列中に共翻訳的に組み込むことを決定した。本発明者らは、それぞれ、アンバーおよびＡＧＧコドンを再割り当てするために、最も効率的なＭｊＴｙｒサプレッション系を、ＢＰＦＬが予め担持されたｔＲＮＡと組み合わせた。続いて銅不含クリック化学を行い、アジド基を用いる反応を介して銅不含クリック化学によってＴＡＭＲＡ色素をタンパク質配列中にさらに導入し、数分内に達成した。この戦略を使用することによって、本発明者らは、ＢＰ−ＦＬおよびＴＡＭＲＡをカルモジュリンタンパク質中に部位特異的に導入した。単一分子ＦＲＥＴ解析は、カルシウムとのカルシウム結合の際に、そのコンホメーションの劇的な変化を示し、これによって、効率的な部位選択的色素組込みが確認された。開発されたアプローチは、多数のオルソゴナルコドンおよび可変性の官能基を用いるその修飾の作製を可能にする可能性がある。さらに、このアプローチは、真核細胞無細胞系に直接移され得る。これは、本発明者らのアプローチを、原核生物翻訳機構については比較的に容易に製造されるが、真核細胞系に移された場合には、ほとんど管理できない複雑性を持ち込んでしまうＰＵＲＥ系などの完全に再構成されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系の使用に基づく方法とは異なるものとする。しかし、本発明者らの最近の解析は、大腸菌（E. coli）無細胞系が、ヒト細胞質タンパク質のうち１０％しか非凝集形態で発現できないが、一方で、真核細胞系は、かなり良好な性能を示したことを実証した５８。したがって、本発明者らのアプローチを真核細胞系に移すことは、現在はこの方法に不十分にしか到達できない、複合なマルチドメイン真核細胞タンパク質およびタンパク質複合体のｓｍＦＲＥＴ解析を可能にするであろう。
【０１７６】
補足情報（ＳＩ）
タンパク質をコードするヌクレオチド配列
（１）鋳型Ａ（ＫＪ５４１６６７．１のＧｅｎＢａｎｋ番号を有し、ｐＬＴＥベクターをベースとするｅＧＦＰ鋳型）
【化２】
2018509172.tif 000015
【０１７７】
鋳型Ａは、ＳＩＴＳタンパク質、ｅＧＦＰ構築物およびｍｙｃタグをＮからＣ末端に含有する。鋳型Ａは、以下の誘導体を調製するための親鋳型として使用される：
（ａ）６つのＡＧＧコドンを有するＧＦＰ（この構築物中の６つのＡｒｇコドンすべてが、ＡＧＧに変更される）；
（ｂ）Ａ＿１Ｘ：ｅＧＦＰ構築物のＮ末端にＴＡＧコドンを導入した（第１の赤色コドン）
（ｃ）Ａ＿１５１Ｘ：ｅＧＦＰ構築物の１５１番目の位置で、ＴＡＴ（Ｔｙｒコドン）をＴＡＧコドンに変更した（第２の赤色コドン）
（ｄ）Ａ＿１Ｒ：ｅＧＦＰ構築物のＮ末端にＡＧＧコドンを導入した（第１の赤色コドン）
（ｅ）Ａ＿１５１Ｒ：ｅＧＦＰ構築物の１５１番目の位置で、ＴＡＴ（Ｔｙｒコドン）をＡＧＧコドンに変更した（第２の赤色コドン）
【０１７８】
（２）鋳型Ｂ（ｓＧＦＰ鋳型、ｐＯＰＩＮＥベクターをベースとし、ＥＦ３７２３９７．１）のＧｅｎＢａｎｋ番号を有する）
【化３】
2018509172.tif 000016
【０１７９】
鋳型Ｂは、ｍｙｃタグ、ｓＧＦＰ構築物、プレシジョン切断部位およびＲＧＳペプチドタグをＮからＣ末端に含有する。鋳型Ｂは、以下の誘導体を調製するための親鋳型として使用される：
（ａ）Ｂ＿１Ｘ：ｓＧＦＰ構築物のＮ末端にＴＡＧコドンを導入した（第１の赤色コドン）
（ｂ）Ｂ＿１５１Ｘ：ｓＧＦＰ構築物の１５１番目の位置で、ＴＡＴ（Ｔｙｒコドン）をＴＡＧコドンに変更した（第２の赤色コドン）
（ｃ）ｂ＿１Ｒ：ｓＧＦＰ構築物のＮ末端にＡＧＧコドンを導入した（第１の赤色コドン）
（ｄ）Ｂ＿１５１Ｒ：ｓＧＦＰ構築物の１５１番目の位置で、ＴＡＴ（Ｔｙｒコドン）をＡＧＧコドンに変更した（第２の赤色コドン）
【０１８０】
（３）ｓＧＦＰ＿Ｔ２
【化４】
2018509172.tif 000017
【０１８１】
鋳型ｓＧＦＰ＿Ｔ２１は、ｓＧＦＰタンパク質のオープンリーディングフレームのみを含有する。このタンパク質中のアルギニンは、１０８位置でＡＧＧコドンによってコードされ（赤色で示されている）、それらの残りは、ＣＧＧコドンによってコードされる。
【０１８２】
（４）ＣａＭ
【化５】
2018509172.tif 000018
【０１８３】
ＣａＭ鋳型は、ベクターマップにおいて示されるように、ｍｙｃタグ、ＣａＭタンパク質、プレシジョン切断部位およびＲＧＳペプチドタグをＮからＣ末端に含有する。
【０１８４】
材料および方法
組換えシステイニル−ｔＲＮＡシンセターゼ製造：ＣｙｓＲＳの遺伝子断片を、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）株でコロニーＰＣＲによって増幅し、Ｃ末端Ｈｉｓ−タグとともにｐＥＴ２８ベクター中にクローニングし、標準アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ細胞において２０℃で一晩、０．５ｍＭのイソプロピル（isfopropyl）−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いてタンパク質発現を誘導した。標準バッファーを使用するＮｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーと、それに続く、バッファー：５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＤＴＴ中のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのゲル濾過によってＣｙｓＲＳを精製した。
【０１８５】
親和性クランプマトリックス調製：Ｃ末端Ｃｙｓを、親和性クランプタンパク質（ｐｄｚ−フィブロネクチン融合タンパク質、ＰＤＢ：３ＣＨ８＿Ａ）の配列中に添加した。Ｃ末端Ｃｙｓを有する精製タンパク質を、製造業者のプロトコールを使用して、ヨードアセチルゲル（ＵｌｔｒａＬｉｎｋ（登録商標））上に固定化した。
【０１８６】
アンバーサプレッションのためのフレキシザイムによるｔＲＮＡ担持：アシル化反応を、以前に記載の通りに実施した６２。１容量の２５０μＭ  ｏ−ｔＲＮＡを、同容量の５０μＭ  Ｆｘ（２５０μＭ）および３容量の水と混合した。次いで、混合物を、１２００ｒｐｍで一定撹拌しながら９５℃で５分間加熱し、室温にゆっくりと冷却した。１容量の０．５Ｍ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）および２容量の３Ｍ  ＭｇＣｌ２を添加した後、混合物を氷上に２分間置き、続いて、２ＶのｎｎＡＡ基質（１００ｍＭ）（１００％  ＤＭＳＯまたは１００％  ＡＣＮ中）を添加した。反応物を撹拌しながら１０℃で所与の期間（２．５、５または１０時間）インキュベートした。フレキシザイムアシル化反応を停止し、翻訳反応物をプライムするために使用した。
【０１８７】
ＭＳ解析：修飾されたタンパク質を、ナノトラップマトリックスで精製し、次いで、１ｘＳＤＳ  ＰＡＧＥローディングバッファーを用いて溶出した。ゲルを流した後、所望のバンドを切り出し、トリプシンを用いて消化した。次いで、得られたペプチドをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって解析した。
【０１８８】
結果および考察
市販のｔＲＮＡ混合物は、１ＡＧＧ  ｓＧＦＰ鋳型の翻訳の支持において本明細書において製造されたものよりも約２倍低い効率を実証したが、飽和濃度での６ＡＧＧコドンを有するｅＧＦＰ鋳型の翻訳の支持に対して３倍高い活性を示した（図２１および図２７）。これは、市販の混合物中の、天然のまれなＡＧＧ−コドンアイソアクセプターのより高い割合を示す。枯渇した組織内で製造されたｔＲＮＡ混合物へのｔ７ｔＲＮＡｃｃｕの添加は、元の総ｔＲＮＡ混合物と比較して翻訳活性の５倍の増大をもたらした（図２１）。これによって、細胞培養の適当な齢で、ＡＧＧコドンをデコードするための少ない存在量のｔＲＮＡ種の画分は、コドン再割り当て目的に好都合にバイアスがかかっているという本発明者らの推測が確認された。
【０１８９】
翻訳忠実度を確実にするために、外因性ｔＲＮＡ／ａａＲＳ対は、内因性ｔＲＮＡ／ａａＲＳ対に対してオルソゴナルであるべきである。本発明者らは、大腸菌（E. coli）無細胞翻訳系においてＭｊＹ２／ＡｚＦＲＳ／ＡｚＦおよびＰｙｌＴ／ＰｙｌＲＳＡＦ／ＰｒＫの翻訳忠実度を評価した。ｏ−ｔＲＮＡ／ａａＲＳ／ｎｎＡＡの種々の組合せを補給することによって、鋳型Ａ＿１５１Ｘを無細胞反応において翻訳させた。ＭｊＴｙｒ系について、ｔＲＮＡまたはａａＲＳのいずれかを除外すると、タンパク質は翻訳されなかった。しかし、反応物からＡｚＦが除外された場合には、タンパク質のおよそ１０％が製造された。それは、ＡｚＦＲＳが、アンバーサプレッションのためにＭｊＹ２ｔＲＮＡに基準アミノ酸を担持できたことを示す。本発明者らはまた、ＡｚＦＲＳの濃度が増大するにつれ、ＭｊｔＲＮＡに基準アミノ酸を担持する能力が増大する（示されていないデータ）ことを見出した。この問題を調べるために、ＡｚＦを伴わずに、およびＡｚＦを伴って製造されたタンパク質を、ナノトラップマトリックスでのアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。対応するバンドを切り出し、トリプシンを使用して消化した。次いで、得られたペプチドを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して解析して、所望の位置のアミノ酸の同一性を評価した。ＡｚＦを補給しないＧＦＰ生成物のＭＳスペクトル解析は、いくつかの芳香族アミノ酸、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐが、ＴＡＧコドンで組み込まれたことを示した（示されていないデータ）。ＧＦＰ１５１ＡｚＦサンプルでは、野生型ペプチドは、無視できるほどであり、タンパク質の８０％超がＡｚＦを含有していた（図３２Ａ）。ＡｚＦ組込みはまた、ＤＩＢＯ−ＴＡＭＲＡによるＴＡＭＲＡ組込みを追跡することによって確認できた。
【０１９０】
ＰｙｌＴ／ＰｙｌＲＳＡＦ対のオルソゴナル性は、ＭｊＹ２／ＡｚＦＲＳ対より良好である。ｎｎＡＡ、ＰｙｌＴまたはＰｙｌＲＳのいずれかを除外すると、検出可能な蛍光は観察されなかった。しかし、反応物にＭｊＹ２  ｔＲＮＡを補給した場合には、タンパク質収率は、わずかに増大し、これは、ＭｊＹｔＲＮＡが、Ｐｒｋを有するＰｙｌＲＳによって誤アシル化され得ることを示した。各成熟ｔＲＮＡおよびそのコグネートａａＲＳの割合は、翻訳忠実度および効率を確実にするように進化的にバランスがとられている。したがって、２１番目および２２番目のｏ−ｔＲＮＡ／ａａＲＳ対が、翻訳系に導入される場合には、交差認識を避けるために注意しなくてはならない。
【０１９１】
本発明者らは、１番目および１５１番目ＧＦＰ  ＯＲＦに単一のＡＧＧまたは単一のアンバーコドンのいずれかを有する４種の鋳型を使用することによって、アンバーおよびＡＧＧコドン媒介性ＢＰ−ＦＬ組込み効率を比較した（図２５Ｃ）。１ＴＡＧでのＢＰ−ＦＬ標識されたタンパク質の収率は、１５１ＴＡＧのものの３．７倍であったが、１ＡＧＧでは、１５１ＡＧＧのものの１．２倍であった。アンバーおよびＡＧＧコドンの両方について、１番目位置でのサプレッション効率は、１５１番目の位置よりも一貫して高い。相対総タンパク質収率は、ウエスタンブロットでのバンド強度によって表された。本発明者らが、１５１ＴＡＧサプレッションの全長タンパク質（図２５Ｃ、レーン３、抗ＧＦＰ）は、直接的にＢＰ−ＦＬ組込みによるものであると推定すると、ＢＰ−ＦＬ／抗ＧＦＰのバンド強度割合（上のバンド）は、１００％標識効率と考えられるべきである。１ＡＧＧサプレッションの蛍光／総タンパク質割合（図２５Ｃ、レーン２）は、１５１ＴＡＧのものよりも明らかに高く、これは、１００％を超える標識効率を示し、可能ではない。したがって、いくつかの非特異的組込みが、１５１ＴＡＧサプレッションの全長バンド中にあった。それは、ＢＰ−ＦＬを有する生成物だけからなるのでなく、その他の何らかの非蛍光アミノ酸を伴う。最高の可能性は、Ｃｙｓであり、これは、ＢＰＦＬ−ｔＲＮＡサプレッサーに由来する、タンパク質翻訳の後期段階で放出されたｔＲＮＡＣｙｓｃｕａによってタンパク質中に組み込まれた。この非特異的組込みは、１ＴＡＧの蛍光／総タンパク質割合（３．７／１＝３．７）は、１５１ＴＡＧのもの（１／（１＋１．１）＝０．４８）よりもおよそ８倍高いので、状況依存的である。したがって、全長／（全長および末端切断）の割合に由来するＴＡＧ標識効率からＡＧＧ標識効率を推定することは簡単ではない。しかし、１ＴＡＧ：１ＡＧＧ：１５１ＴＡＧ：１ＡＧＧの標識効率は、ここで、４：７：１：４である。ＡＧＧサプレッションは、アンバーサプレッションよりも一貫して高いＢＰ−ＦＬ組込み、それぞれ、１番目および１５１番目の位置で１．８および４倍をもたらした。これは、アンバーコドンでの終結のための終結因子のものと比較して、ＡＧＧコドンの天然ｔＲＮＡアイソアクセプターからの少ない競合を示す。本発明者らは、ＢＰ−ＦＬが担持されたｔＲＮＡは、本発明者らがここで試験した状況においてＡＧＧコドンにより適合すると結論付けた。
【０１９２】
【表８】
2018509172.tif 000019
【０１９３】
参考文献
【化６】
2018509172.tif 000020
2018509172.tif 000021
2018509172.tif 000022
2018509172.tif 000023
【０１９４】
実施例８
２つのセンスコドンによる二重タンパク質標識
ＡＧＧおよびＡＧＣ天然ｔＲＮＡサプレッサーの総ｔＲＮＡ混合物の特定の枯渇
アンチコドンループ特異的ｔＲＮＡアプタマーに基づく特定のｔＲＮＡ枯渇（実施例２の通り）と、それに続く、ｔＲＮＡ特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドに基づく特定のｔＲＮＡ枯渇（実施例７「総ｔＲＮＡ混合物中の特定のｔＲＮＡ枯渇」の通り）のための両手順を組み合わせて、本発明者らは、セリンｔＲＮＡ  ＧＣＵ−アイソアクセプター（ｃ１１）について、およびアルギニンＣＣＵ／ＵＣＵ両アイソアクセプター（ａ０５／０６）について高度に枯渇した総ｔＲＮＡ混合物を作製した。サプレッション実験では、両ｔＲＮＡが高度に枯渇されると示された（図３５）。
【０１９５】
２種のセンスコドンによる二重タンパク質標識
異なるコドンバイアスを有するそれぞれの鋳型でプライムされた細胞不含翻訳反応における、ＡＧＣおよびＡＧＧコドンによる、ＡｚＦおよびＢＰ−ＦＬの、ＣａＭおよびｅＧＦＰへの部位特異的組込み：ＣａＭ  ＯＲＦのそれぞれ位置１（１および２）および１５１に位置する、単一または二重ＡＧＣおよび単一ＡＧＧコドンを有するｐＯＰＩＮＥ−ＣａＭ鋳型（図３６）を、１００ｎｇ／μｌで、３５％（ｖ／ｖ）枯渇した溶解物、０．５μｇ／μｌの枯渇したｔＲＮＡ混合物、１２．５μＭ  ＭｊＹ２ｔＲＮＡｇｃｕ、１０μＭ  ＡｚＦＲＳ、１ｍＭ  ＡｚＦ；１６μＭ  ＢＰ−ｔＲＮＡＣｙｓｃｃｕを含有する細胞不含反応物中に補給した。反応を２８℃で３時間実施した。２００μｌの細胞不含反応物から得た翻訳された産物を、親和性クランプ樹脂ビーズ上に固定化させた（実施例７を参照のこと）。固定化された翻訳産物を有する樹脂を、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．２５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００バッファーを用いて洗浄して、翻訳反応物から遊離ＡｚＦを除去し、続いて、２つの元の反応容積のＰＢＳ中に１ｍＭ最終濃度までＤＩＢＯ−ＴＡＭＲＡを添加した。室温で１時間コンジュゲーションした後、ビーズを洗浄して、コンジュゲートしていないＴＡＭＲＡ色素を除去し、１０μｌの翻訳反応物から得られたタンパク質に対応するビーズのアリコートを、９５℃で加熱した×２  ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを用いて溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した（図３７）。
【０１９６】
本明細書を通じて、目的は、いずれか１つの実施形態または特徴の特定の収集物に本発明を限定することなく、本発明の好ましい実施形態を記載することである。本発明から逸脱することなく、記載され、例示される実施形態に種々の変更および改変を行うことができる。
【０１９７】
本明細書において参照される、各特許および科学文献の開示内容、コンピュータプログラムならびにアルゴリズムは、参照によりその全体が組み込まれる。
【図１】
2018509172.tif 000024
【図２】
2018509172.tif 000025
【図３】
2018509172.tif 000026
【図４】
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【図５】
2018509172.tif 000028
【図６】
2018509172.tif 000029
【図７】
2018509172.tif 000030
【図８】
2018509172.tif 000031
【図９】
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【図１０】
2018509172.tif 000033
【図１１】
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【図１２】
2018509172.tif 000035
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2018509172.tif 000038
【図１６】
2018509172.tif 000039
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2018509172.tif 000044
【図２２】
2018509172.tif 000045
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１−１】
2018509172.tif 000054
【図３１−２】
2018509172.tif 000055
【図３２】
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【図３３】
2018509172.tif 000057
【図３４】
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【図３５】
2018509172.tif 000059
【図３６】
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【図３７】
2018509172.tif 000061
【国際調査報告】
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2018509172.tif 000063
2018509172.tif 000064
2018509172.tif 000065
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