(57)【要約】  エチレンジアミン二コハク酸、酸化剤、水および場合によりクエン酸を含む水性反応混合物が、酸化セリウムナノ粒子の安定な分散液を反応混合物中に直接形成するための温度条件と共に提供される、生体適合性材料のナノ粒子を製造する方法が記載されている。酸化セリウム、エチレンジアミン二コハク酸、および任意でクエン酸を含む生体適合性ナノ粒子が記載されている。カタラーゼ様酵素活性の増加は、クエン酸およびエチレンジアミン二コハク酸で調製された酸化セリウムナノ粒子によって実証される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ粒子の分散液を製造する方法であって、
a. ３価セリウムイオン、エチレンジアミン二コハク酸、酸化剤および水を含む反応混合物を形成する工程; および
b. 反応混合物中に酸化セリウムナノ粒子の分散液を形成する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記反応混合物がクエン酸をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
反応混合物を約0℃-約100℃の範囲の温度に加熱または冷却することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記酸化剤が過酸化水素を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記酸化セリウムナノ粒子が実質的に非凝集性である、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記酸化セリウムナノ粒子が、約30ナノメートル未満の流体力学的直径によって特徴付けられる、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記酸化セリウムナノ粒子が、約5ナノメートル未満の流体力学的直径によって特徴付けられる、請求項2に記載の方法。
【請求項８】
酸化セリウムナノ粒子とエチレンジアミン二コハク酸とを含む医薬組成物。
【請求項９】
請求項1に記載の方法によって製造された酸化セリウムナノ粒子を含む医薬組成物。
【請求項１０】
酸化ストレス関連疾患または酸化ストレス関連事象を予防するために患者を予防的に処置するための、請求項9に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１１】
酸化ストレス関連疾患または酸化ストレス関連事象を予防するために患者を予防的に処置する方法であって、有効量の酸化セリウムナノ粒子およびエチレンジアミン二コハク酸を含む医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項１２】
酸化ストレス関連疾患または酸化ストレス関連事象を予防するために患者を予防的に処置するための有効量の酸化セリウムナノ粒子およびエチレンジアミン二コハク酸を含む医薬組成物の使用。
【請求項１３】
患者の酸化ストレス関連疾患または酸化ストレス関連事象の症状を治療する方法であって、有効量の酸化セリウムナノ粒子およびエチレンジアミン二コハク酸を含む医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項１４】
患者における酸化ストレス関連疾患または酸化ストレス関連事象の症状を治療するための有効量の酸化セリウムナノ粒子およびエチレンジアミン二コハク酸を含む医薬組成物の使用。
【請求項１５】
請求項1に記載の方法によって製造された酸化セリウムナノ粒子の分散体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この特許出願は、2015年1月20日に出願された、カタラーゼ様活性を有するEDDSでキレート化されたナノセリア、米国仮特許出願第62/125,381号に対する優先権を主張し、その開示は、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、一般に、ナノサイエンスおよびナノ医学の分野における改良に関する。特に、本発明は、生体適合性材料を含むナノ粒子、およびカタラーゼ様活性を有するナノ粒子等のナノ粒子を調製する方法に関する。本発明はまた、例えば、カタラーゼ様活性を持つナノ粒子を投与することにより、過酸化水素の排除を触媒するため、または疾患を予防または治療するためより具体的には、過酸化水素に起因する酸化ストレスの影響を低減するためにそのナノ粒子の使用ことに関連する。
【背景技術】
【０００３】
酸化ストレスは、多くのヒト疾患、特に神経変性疾患の病因において重要な役割を果たす。したがって、特定のフリーラジカル種を減少させることができる抗酸化剤での治療は、組織損傷を防止し、生存および神経学的転帰の両方を改善し得る。過酸化水素は、多くの重要な細胞プロセスの副生成物である。しかし、それはまた、生理学的環境におけるフリーラジカルの既知の発生源または前駆体でもある。カタラーゼは、過酸化水素を水と酸素への分解を触媒することにより、過酸化水素の過剰蓄積を防止する天然に存在する酸化防止酵素（レドックスタンパク質）である。細胞酵素カタラーゼを模倣する活性（すなわち、カタラーゼ様活性）を有する抗酸化剤は、虚血性脳卒中などの様々な酸化ストレスに関連する疾患および事象の進行を遅らせる可能性がある。
【０００４】
ナノ医薬品におけるナノセリアの使用の起源は、Rzigalinski(Nanoparticles and Cell Longevity, Technology in Cancer Research & Treatment 4(6), 651-659 (2005))によって記載されているように、培養中の脳細胞への超微粒酸化セリウム粒子の応用が大幅に増加した細胞生存性にみることが出来る、BaileyおよびRzigalinskiの精密な研究に突き当たる。より詳細には、インビトロでのラット脳細胞培養物は、Rzigalinski(Rzigalinski et al. in U.S. Patent 7,534,453, filed Sept. 4, 2003)によって開示されているように、逆ミセルマイクロエマルジョン技術によって合成された2-10ナノメートル（nm）サイズの酸化セリウムナノ粒子で処理した場合、約3-4倍長く生存することが示された。
【０００５】
続いて、Rzigalinski(Rzigalinski et al. in WO 2007/002662)によって、これらの特定のナノセリア粒子に関する多くの問題が開示された。逆ミセルマイクロエマルション技術によって製造されたナノセリアは、(1)報告された2-10ナノメートル（nm）の範囲内で粒子サイズが十分に制御されず、バッチ間の変動性が高かった; (2)逆ミセル合成方法で最終生成物に使用される、ドキュセートナトリウムまたは（AOT）としても知られているナトリウムビス（エチルヘキシル）スルホスクシネートなどの界面活性剤の残存は、毒性応答を引き起こした; (3)これらのナノ粒子が生物学的媒体中に置かれたときに界面活性剤残存の量が凝集の原因となる量を制御することができず、結果として有効性および送達性が低下する; および(4)セリウムの原子価状態（+ 3 / + 4）の経時的な不安定性等に苦しんでいた。
【０００６】
代わりに、Rzigalinski et al（WO2007/002662）には、少なくとも3つの市販のソースから得られた高温技術によって合成されたナノセリアの生物学的有効性が記載されている。酸化セリウムナノ粒子のこれらの代替的なソースは、バッチ間での活性の優れた再現性を提供することが報告されている。さらに、ソースにかかわらず、サイズが小さく、粒度分布が狭く、凝集速度が低い酸化セリウム粒子が最も有利であることが報告されている。
【０００７】
それら発明者（Rzigalinski et al.）はデリバリーのために、ナノ粒子が非凝集形態において有利であることを報告している。これを達成するために、約10重量％のナノセリアのストック溶液を超高純度水または超高純度水で調製した生理食塩水で超音波処理することでできたと報告した。しかしながら、超音波処理されたナノセリア（高温技術によって合成され、市販のソースから得られる）の水性分散液が非常に不安定であり、迅速に（すなわち数分以内に）沈降し、これらソースに由来するナノセリアの水性分散液の投与において実質的な変動性を引き起こすことを確認した。また、これらの超音波処理されたナノセリア（例えば、Sigma-Aldrichから得られる）水性分散液をマウスに投与すると、肝臓および腎臓にセリアが急速に沈着し、動物の健康が急速に低下することも観察された。
【０００８】
酸化セリウム含有ナノ粒子は、当該技術分野において知られている様々な技術によって調製することができるが、粒子は、典型的に、望ましくない凝集を防ぐために安定剤を必要とする。Masui et al., J. Mater. Sci. Lett. 21, 489-491 (2002)にて以前に使用した生体適合性ナノケア安定剤に関して、安定剤としてクエン酸塩緩衝剤を使用するセリアナノ粒子の安定な水性分散液を直接生成する二段階水熱方法が記載されている。しかし、この方法は時間と設備の両方を要し、閉鎖型反応器で2つの別々の24時間の反応ステップを必要とする。
【０００９】
DiFrancesco et al.（PCT/US2007/077545, METHOD OF PREPARING CERIUM DIOXIDE NANOPARTICLES, 2007/09/04）は、例えば、乳酸、酒石酸、グルコン酸および2-ヒドロキシブタン酸等の生体適合性α-ヒドロキシカルボン酸安定剤の存在下、高度に酸性の条件下（pH <4.5）での過酸化水素による３価のセリウムイオンの酸化について記載している。具体的には、安定剤乳酸および乳酸とエチレンジアミン四酢酸（EDTA）との安定剤の組み合わせが、高酸性反応条件下で3-8nmの範囲の平均粒子サイズのナノセリア粒子の安定な分散液を直接生産することが実施例に示されている。
【００１０】
一般的にアサインされた米国特許第9,034,392は、クエン酸（CA）およびエチレンジアミン四酢酸（EDTA）の存在下における過酸化水素による酸化セリウムの酸化を記載しており、CAとEDTAのモル比は約0.1-約3.0の範囲であり、それにより、安定化された酸化セリウムナノ粒子の水性分散液は、ナノ粒子の単離なしに、反応混合物中に直接形成される。この範囲のモル量でCAおよびEDTAの組み合わせで安定化された酸化セリウムナノ粒子は、虚血性脳卒中のex vivoマウス脳スライスモデルにおける酸化的ストレスに起因する細胞死を相乗的に減少させることが示されている。
【００１１】
一般的にアサインされた米国特許出願2014/0322333はクエン酸と、ニトリロ三酢酸（NTA）、エチレングリコール四酢酸（EGTA）およびジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）からなる群から選択されるキレート剤の存在下での過酸化水素による３価のセリウムイオンの酸化を記載しており、安定化された酸化セリウムナノ粒子の水性分散液は、ナノ粒子を単離することなく、反応混合物中に直接形成される。これらの安定化された酸化セリウムナノ粒子は、虚血性脳卒中のex vivoマウス脳スライスモデルにおける酸化ストレスに起因する細胞死を減少させることが示されている。
【００１２】
上述のように、生体適合性に安定化された酸化セリウムナノ粒子の水性分散液を調製するための様々な方法が報告されている。増加したカタラーゼ様活性を有する酸化防止剤は、過酸化水素の過剰蓄積に起因する組織損傷をより迅速に減少させ、および/または対応する薬物用量の減少を可能にし、それにより患者への薬物コストおよび/または薬物副作用を減少させる。したがって、安定化された酸化セリウムナノ粒子の水性分散液中のカタラーゼ様活性の増大が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の第1の態様において、３価のセリウムイオン、エチレンジアミン二コハク酸、酸化剤、水を含み、そして任意でさらにクエン酸を含む反応混合物を構成し: 任意で反応混合物を加熱または冷却し; そして、それにより、反応混合物中に、ナノ粒子を単離することなく、酸化セリウムナノ粒子の分散液を形成する、を含むナノ粒子の分散液を製造する方法が提供される。
【００１４】
本発明の第2の態様において、エチレンジアミン二コハク酸の存在下で調製され、任意でクエン酸の存在下でさらに調製される酸化セリウムナノ粒子が提供される。
【００１５】
本発明の第3の態様において、エチレンジアミン二コハク酸の存在下で調製された酸化セリウムナノ粒子を含み、任意でさらにクエン酸の存在下で調製される、酸化ストレス関連事象または疾患および特に、多発性硬化症または筋萎縮性側索硬化症などの中枢神経系疾患の予防および/または治療のための医薬組成物が提供される。
【００１６】
本発明の第4の態様において、酸化ストレス関連事象または酸化ストレス関連疾患、特に多発性硬化症または筋萎縮性側索硬化症などの中枢神経系疾患の予防（すなわち、予防的処置）のための方法であって、エチレンジアミン二コハク酸の存在下で調製され、任意でクエン酸の存在下でさらに調製された酸化セリウムナノ粒子; または酸化セリウム、エチレンジアミン二コハク酸を含み、任意でクエン酸をさらに含むナノ粒子の有効量を、事象または疾患の発症に先立って投与することを含む、方法が提供される。
【００１７】
本発明の第6の態様において、特に虚血性脳卒中などの酸化ストレスに関連した事象、または酸化ストレスに関連した疾患、および特に特に多発性硬化症または筋萎縮性側索硬化症などの中枢神経系疾患を治療する方法であって、事象または疾患の発症後に、有効量のエチレンジアミン二コハク酸の存在下で調製され、任意でクエン酸の存在下でされに調製された酸化セリウムナノ粒子、または、酸化セリウム、エチレンジアミン二コハク酸および任意でクエン酸をさらに含むナノ粒子を投与する方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
特に示されていない、または記載されていない要素は、当然のことながら、当業者に周知の様々な形態を取ることができる。本発明は請求項によって定義される。
【００１９】
この出願において、用語「ナノ粒子」は、100nm未満の平均直径を有する粒子を含む。この開示目的のために、特に明記しない限り、ナノ粒子の直径は、Scherrer方程式を用いた粉末X線回折（XRD）スペクトルのピーク幅分析によって推定することができるその平均結晶学的粒子径を指す。あるいは、幾何学的粒径は、透過電子顕微鏡写真（TEM）の分析によって推定することができる。あるいは、分子吸着物および付随する粒子の溶媒和シェルを含む流体力学的直径は、動的光散乱技術によって決定することができる。さらに、1-10nmの範囲の幾何学的サイズを有する実質的に単分散のナノ粒子サイズ分布のために、XRDは散乱中心のサイズの直接的な尺度である非常に低い角度の散乱ピークを示すことができる。
【００２０】
この出願において、「実質的に凝集していない」と記載された粒子は、Scherrer法を用いたXRDによって決定された結晶子直径の2倍に等しい、またはそれ以下の流体力学的直径を有する。
【００２１】
この開示において、周期律表の元素を指す用語「金属」は、1-2, 5-10, 14-18, 33-36, 52-54, 85および86の原子番号以外のすべての元素を含む。
【００２２】
「遷移金属」という用語は、それぞれ周期表の周期4,5,6に含まれる、原子番号21-30、39-48、57および72-80の30の化学元素を含むと理解される。
【００２３】
「希土類金属」という用語は、原子番号58-71の14種のランタニド元素、および原子番号90-103の14のアクチノイド化学元素を含むと理解される。
【００２４】
用語「アルカリ金属」は、原子番号3,11,19,37,55および87の周期律表の第1族を形成する6つの化学元素を包含するものと理解される。
【００２５】
用語「アルカリ土類金属」は、原子番号4,12,20,38,56および88の周期律表の第2族を構成する6つの化学元素を包含するものと理解される。
【００２６】
化学用語「エチレンジアミンジコハク酸」は、エチレンジアミン-N、N'-ジコハク酸、N、N'-エチレンジアミン二コハク酸、L-エチレンジアミン二コハク酸、N、N'-エチレンジアスパラギン酸、2- [2-（1,2-ジカルボキシエチルアミノ）エチルアミノ]ブタン二酸（IUPAC名）、CAS番号20846-91-7、分子式C10H16N2O8および略語EDDSおよびEDSSなどの化学名で代替的に知られている。EDDSの構造に2つのキラル中心があり、[R,R']-EDDSおよび[S,S']-EDDSの2つのエナンチオマー異性体、および1つのメソ異性体[R,S]-EDDSを生じる。[S,S']-EDDSは、Enviomet C265およびNatriquest E30の商品名で市販されており、生分解性であることが知られている。
【００２７】
化学用語「エチレンジアミンジコハク酸」はまた、その任意の塩を包含するものと理解され、例えばエチレンジアミン二コハク酸と塩基、例えば水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムのようなアルカリ金属水酸化物との反応生成物を含むものである。斯くて、エチレンジアミン二コハク酸中の酸性プロトンの1つまたはそれ以上が、例えばアルカリ金属カチオンまたはアルカリ土類金属カチオンなどの別のカチオンで置換される。したがって、エチレンジアミン二コハク酸のモノ、ジ、トリおよびテトラアルカリ金属塩が形成され得る。例えば、[S,S']-エチレンジアミン-N、N'-ジコハク酸三ナトリウム塩の水溶液は、Sigma-Aldrich（カタログ番号92698）から市販されている。
【００２８】
化学用語「クエン酸」は、例えば、クエン酸アニオンの金属カチオン塩のような塩を含むと理解される。斯くて、クエン酸中の1つまたはそれ以上の酸性プロトンは、例えば、アルカリ金属カチオンまたはアルカリ土類金属カチオンなどの別のカチオンによって置換される。
【００２９】
この出願において、「結晶性」という用語は、少なくとも1つのX線または電子回折ピーク（結晶構造に帰属しない非常に低い角度のXRDピークを除く）を示す材料を表すと理解され、ここでピーク強度は、バックグラウンド散乱（ベースラインノイズ）よりも明らかに大きい。用語「半結晶質」または「部分結晶質」は、長距離秩序の欠如のために低いピーク強度の広いX線または電子回折ピークのみを示す材料を表すと理解される。「非晶質」という用語は、X線または電子回折ピーク（結晶構造に帰属できない非常に低い角度のXRDピークを除く）を示さない材料を表すと理解される。
【００３０】
この出願では、種々のセリウム含有材料は、「セリア」相、「酸化セリウム」相又は「二酸化セリウム」相として名目上記載されている。これらの材料中に存在する実際の酸化アニオンは、酸化物アニオンまたは水酸化物アニオン、または水和酸化物相（例えば、オキシ水酸化物）のような混合物を含み得ることが、化学技術分野の当業者に理解されるであろう。さらに、組成物は多価カチオンの固溶体から構成され、非化学量論的固体と呼ばれることが知られている。したがって、複数の酸化状態の金属カチオンからなるバルク酸化物相では、存在する酸化性アニオンの総量は、存在する金属カチオンの種々の酸化状態の特定量、例えば、電荷中性が維持されるようにする、３価セリウムイオン（Ce3+）および４価セリックイオン(Ce4+)によって決定されることが理解される。金属二酸化物として名目上記載されている非化学量論相については、これは化学式MO2-Δにおいて具体化され、ここでΔ（デルタ）の値は変化し得る。
【００３１】
酸化セリウムについて、CeO2-Δ、Δ（デルタ）の値は、典型的には、0.0〜0.5の範囲であり、前者は酸化セリウム（IV）、CeO2、後者は酸化セリウム（III）、CeO1.5（あるいはCeO3と表される）を示す。特定の理論に拘束されることなく、Δの値は、セリウム（IV）酸化物（CeO2）に対して存在する酸素空孔の量として解釈することができる。存在する各酸素二アニオン空孔について、電荷中性を保つために2つのテルルイオン（Ce3+）が存在する。
【００３２】
この出願において、「二酸化セリウム」という用語は、酸化セリウム（IV）（CeO2）を表すと理解される。
【００３３】
この出願において、「セリア」という用語は、４価セリックイオン（すなわち、Ce4+またはセリウム（IV）イオン）を含む酸化セリウムと記載され、化学式によって記載されたある非化学量論的物質の範囲を包含すると理解され、ここでΔ（デルタ）の値は、0.0-0.5未満の範囲である。
【００３４】
この出願では、用語「ナノセリア粒子」および「セリアナノ粒子」は同じ意味を有し、互換的に使用される。
【００３５】
本発明の一態様によれば、３価セリウムイオン、エチレンジアミン二コハク酸、酸化剤および水を含む反応混合物を形成すること、および、その後、反応混合物中にセリアナノ粒子の分散液を形成することを含む方法が提供される。
【００３６】
本発明の他の態様によれば、３価セリウムイオン、クエン酸、エチレンジアミン二コハク酸、酸化剤および水を含む反応混合物を形成すること、および、その後、反応混合物中にセリアナノ粒子の分散液を形成することを含む方法が提供される。
【００３７】
特定の実施形態では、ナノ粒子の分散は、ナノ粒子の単離なしに、反応混合物中に直接形成される。
【００３８】
特定の実施形態では、反応混合物は約0℃-約100℃の範囲の温度に加熱または冷却される。特定の実施形態では、反応混合物は、20℃より高い、または20℃未満または同じ温度に加熱または冷却される。様々な実施形態において、反応混合物は、約30℃、約40℃、約50℃、約60℃、約70℃、約80℃または約90℃より高い温度に加熱または冷却される。
【００３９】
上昇した反応温度を使用する実施形態において、高温での時間の持続時間は、例えば数分から数時間まで広く変化し得る。特定の実施形態では、約40℃-約100℃の範囲の反応温度が、約10分-約4時間の時間範囲にわたって維持される。
【００４０】
特定の実施形態において、形成されたナノ粒子は、反応混合物の加熱によって脱水、脱ヒドロキシル化または脱プロトン化される。
【００４１】
特定の実施形態において、形成されたナノ粒子の結晶化度は、反応混合物の加熱によって高められる。
【００４２】
様々な実施形態において、反応混合物中の３価セリウムイオンのソースは、例えば、硝酸セリウム（III）、酢酸セリウム（III）またはそれらの水和塩のような３価セリウムイオンの水溶性塩である。
【００４３】
様々な実施形態において、形成された反応混合物またはナノ粒子は、セリウムイオン以外の少量の金属イオン、例えば遷移金属イオン、セリウム以外の希土類金属イオン、アルカリ土類金属イオンまたはアルカリ金属イオンを含む。特定の実施形態において、セリウムイオン以外の金属イオンは、２価鉄イオンまたは３価鉄イオンなどの鉄イオンである。他の特定の実施形態では、金属イオンは白金、パラジウム、ニッケルまたは銅イオンである。
【００４４】
様々な実施形態において、酸化剤は、酸素分子（または空気の周囲雰囲気）よりも酸化性の化合物を含む。特定の実施形態では、酸化剤は、標準水素電極に対して-0.13ボルトより大きい水性半電池還元電位を有する。特定の実施形態において、酸化剤は、アルカリ金属または過塩素酸アンモニウム、塩素酸塩、次亜塩素酸塩または過硫酸塩; オゾン、過酸化水素（H2O2）またはtert-ブチルヒドロペルオキシドなどの過酸化物;またはそれらの組み合わせを含む。
【００４５】
様々な実施形態において、使用される酸化剤の量は、存在する酸化可能な金属イオンの総量に対して大きく変化する。特定の実施形態において、存在する酸化剤のモル量は、酸化可能な金属イオンの総モル量に等しいかそれより大きい。特定の実施形態において、過酸化水素のような2電子酸化剤は、例えば、苛性ソーダイオンまたは第一鉄イオン等の酸化可能な金属イオンの全モル濃度の少なくとも半分の濃度で存在する。
【００４６】
様々な実施形態において、酸化剤は、反応混合物に単独で、または1つまたはそれ以上の他の反応物と共に添加される。
【００４７】
特定の実施形態において、酸素分子を反応混合物に通す。
【００４８】
様々な実施形態において、反応混合物のpHは、酸または塩基を4.5を超える、5.0を超える、6.0を超える、7.0を超える、8.0を超える、9.0を超える、10.0を超えるまたは11.0を超える値に添加することによって調製される。
【００４９】
様々な実施形態において、ナノ粒子は、生物学的組織または生物学的媒体を処理するために使用され、約6.5-約8.0、または約7.0-約7.4の範囲の生理学的pH条件に調製される。
【００５０】
特定の実施形態において、反応混合物は適切な生理学的条件内のpHに調製される。他の実施形態において、セリアナノ粒子の最終生成物の分散は、適切な生理学的条件内のpHに調製される。
【００５１】
様々な実施形態において、反応混合物はバッチ反応器、連続反応器またはコロイドミル中で形成される。連続反応器の特定の実施形態では、連続攪拌槽反応器またはプラグフロー反応器が使用される。
【００５２】
特定の実施形態では、当該分野で公知の様々な混合装置が、反応混合物の内容物を撹拌、混合、せん断または攪拌するために使用される。様々な実施形態では、攪拌棒、マリンブレードプロペラ、ピッチブレードタービンまたはフラットブレードタービンを含むミキサーが使用される。特定の実施形態では、コロイドミルまたはSilverson（登録商標）高せん断ミキサーが用いられる。特定の実施形態では、反応混合物をスクリーンを通過させる高せん断ミキサーが使用され、孔はサイズがミリメートルから数ミリメートルの小片まで変化する。特定の実施形態において、反応体の1つまたはそれ以上が、水性反応混合物の表面の下に導入される。特定の実施形態において、反応物質は、混合装置に近接して水性反応混合物の表面の下に導入される。
【００５３】
様々な実施形態において、形成されたナノ粒子は、非晶質、半結晶質または結晶質である。結晶性ナノ粒子は、別法として、単一粒子クリスタリットとして、または個々のクリスタリットとして記述することができる。特定の実施形態において、形成されたナノ粒子は、酸化セリウム結晶構造によって特徴付けられる。特定の実施形態では、形成されるナノ粒子は、立方晶蛍石結晶構造によって特徴付けられる。
【００５４】
様々な実施形態において、形成されるナノ粒子は、100nm未満、80nm未満、60nm未満、40nm未満、20nm未満、10nm未満、5.0nm未満または2.0nm未満の流体力学的直径を有する。
【００５５】
本発明の特定の実施形態では、セリウムおよびエチレンジアミン二コハク酸を含むナノ粒子が提供される。
【００５６】
本発明の特定の実施形態では、セリウム、クエン酸およびエチレンジアミン二コハク酸を含むナノ粒子が提供される。
【００５７】
特定の実施形態では、４価セリウムイオンおよびエチレンジアミン二コハク酸を含むナノ粒子が提供される。
【００５８】
特定の実施形態では、４価セリウムイオン、クエン酸およびエチレンジアミン二コハク酸を含むナノ粒子が提供される。
【００５９】
特定の実施形態では、セリアおよびエチレンジアミン二コハク酸を含むナノ粒子が提供される。
【００６０】
特定の実施形態では、セリア、クエン酸およびエチレンジアミン二コハク酸を含むナノ粒子が提供される。
【００６１】
特定の実施形態では、エチレンジアミン二コハク酸および酸化セリウム、水酸化セリウムまたはオキシ水酸化セリウムを含むナノ粒子が提供される。
【００６２】
特定の実施形態では、クエン酸、エチレンジアミン二コハク酸および酸化セリウム、水酸化セリウムまたはオキシ水酸化セリウムを含むナノ粒子が提供される。
【００６３】
様々な実施形態において、ナノ粒子のゼータ電位はpH、クエン酸含有量、エチレンジアミン二コハク酸含有量のナノ粒子分散液、またはそれらの組み合わせを調製することによって、改変される。
【００６４】
特定の実施形態では、形成されたナノ粒子分散液を洗浄して過剰のイオンまたは副生塩を除去する。  様々な実施形態において、イオン導電率が約15ミリジーメンス/センチメートル（mS/cm）未満、10mS/cm未満、5mS/cm未満、3mS/cm未満に低下するようにナノ粒子分散液を洗浄する。特定の実施形態において、形成されたナノ粒子分散液は、例えば透析またはダイアフィルトレーションなどにより、ナノ粒子の単離をせずに洗浄され、安定なナノ粒子分散液が維持される。
【００６５】
特定の実施形態では、形成されたナノ粒子分散液を濃縮して過剰の溶媒または過剰の水を除去する。特定の実施形態において、ナノ粒子分散液はダイアフィルトレーションまたは遠心分離によって濃縮される。
【００６６】
様々な実施形態において、分散液中のナノ粒子の濃度は約0.05モルより、0.5モルより、2.0モルより大きい（所定の分散液中に約35％の固形分）。
【００６７】
特定の実施形態では、ナノ粒子のサイズ分布は実質的に単一モードである。様々な実施形態において、ナノ粒子サイズ分布は、約30％未満、約25％未満、約20％未満、約15％未満、約10％未満、約5％未満の変動係数（COV）を有し、ここでCOVは、標準偏差を平均で割ったものとして定義される。
【００６８】
本発明の一実施形態として、一般的にアサインされた米国特許出願公開第8,679,344号に開示された方法によって水性ナノ粒子分散液をより極性の低い溶媒組成物にシフトさせる溶媒の方法が用いられる。特定の実施形態では、ナノ粒子分散液は、有機希釈剤の添加と共にダイアフィルトレーションカラムに通される。特定の実施形態では、有機希釈剤は、例えば、1つまたはそれ以上のアルコールまたはグリコールエーテルなどの界面活性剤を含む。
【００６９】
いずれの理論にも縛られることなく、炎症および酸化ストレスに関連する事象および疾患（例えば、反応性酸素種（ROS）媒介性疾患）の予防および/または治療のための生体適合性に安定化されたナノセリアの提案された使用は、酸化セリウムがフリーラジカルの触媒掃去剤として機能し得るという確信に部分的に基づいている。Ce3+およびCe4+価電子状態の混合物中におけるセリウムの存在および容易な相互互換は、酸化セリウムがフリーラジカルを害が低い種に触媒的または自動再生的に還元および/または酸化させることを可能にする。酸化還元反応は、組織損傷性フリーラジカルを中和する酸化セリウムナノ粒子の表面上で起こり得る。例えば、スーパーオキシドアニオン（O2-）を分子状酸素に酸化し、ペルオキシナイトライトアニオン（ONOO-）を生理学的に良性の種に酸化し、ヒドロキシルラジカル（・OH）を水酸化物アニオンに還元することが望ましいと考えられている。これは、例えば酸化ストレスに関連する疾患および事象を治療するために現在利用可能な犠牲的な抗酸化剤と比較して、大幅に減少した投薬レジメンを可能にする。
【００７０】
特定の実施形態において、投与されたナノセリア粒子は、細胞膜を介して細胞に取り込まれ、細胞質またはミトコンドリアおよび核などの様々な細胞小器官に存在する。他の実施形態では、ナノセリア粒子は、血管内または間質の空間に存在すし、そこで過酸化水素の蓄積を減少させることによって、またはフリーラジカルを除去すること、または自己免疫応答を低下させることによって、酸化的ストレスおよび炎症を減少させる。特定の実施形態において、血液脳関門（BBB）または血液脳脊髄液関門（BCFB）または血液眼球関門（BOB）の破壊から生じる中枢神経系の免疫系侵襲は、ナノセリア粒子によって調節される。
【００７１】
他の実施形態では、ナノセリア粒子は、哺乳類の血液脳関門を通過することができる粒子である。様々な実施形態において、ナノセリア粒子は、哺乳類の血液脳関門を渡り、約100nm未満、約50nm未満、約20nm未満、約10nm未満、約5nm未満のサイズの凝集物（aggregates）または凝集物（agglomerates）として脳実質組織に存在する。様々な実施形態において、ナノセリア粒子は、哺乳類の血液脳関門を渡り、約30nm未満、約5nm未満、約4nm未満、約3nm未満、約2nm未満のサイズの独立した非凝集ナノ粒子として脳実質組織に存在する。
【００７２】
特定の実施形態において、医薬組成物は、ナノセリアなどのセリウム含有ナノ粒子、およびエチレンジアミン二コハク酸、またはエチレンジアミン二コハク酸の存在下で調製されたナノセリアのようなセリウム含有ナノ粒子である。
【００７３】
特定の実施形態において、医薬組成物は、ナノセリア、クエン酸、およびエチレンジアミン二コハク酸などのセリウム含有ナノ粒子を含み、またはクエン酸およびエチレンジアミン二コハク酸の存在下で調製されたナノセリアのようなセリウム含有ナノ粒子である。
【００７４】
様々な実施形態において、ナノセリアなどのセリウム含有ナノ粒子およびエチレンジアミン二コハク酸を含む; またはエチレンジアミン二コハク酸の存在下で製造されたナノセリアなどのセリウム含有ナノ粒子を含む医薬組成物; はヒトまたは非ヒト対照、例えば限定されないが、イヌ科、ネコ科、ウシ属、ウマ科、ヒツジ科、ブタ科またはげっ歯類を含む他の哺乳動物に投与される。
【００７５】
様々な実施形態において、ナノセリア、クエン酸およびエチレンジアミン二コハク酸などのセリウム含有ナノ粒子を含む医薬組成物; またはクエン酸およびエチレンジアミン二コハク酸の存在下で調製されたナノセリアなどのセリウム含有ナノ粒子; はヒトまたは限定されないが、イヌ科、ネコ科、ウシ属、ウマ科、ヒツジ科、ブタ科またはげっ歯類を含む他の哺乳動物に投与される。
【００７６】
他の実施形態において、投与対象は、鳥類、昆虫類、爬虫類、両生類、または任意のコンパニオンもしくは農業動物のような動物である。あるいは、投与対象は、細菌、酵母、カビ、真菌または別の単細胞生物であってもよい。投与の対象は、植物であってもよい。
【００７７】
他の特定の実施形態において、疾患または細胞病状を予防（すなわち、予防的に処置）する方法であって、例えばナノセリアおよびエチレンジアミン二コハク酸を含むセリウム含有ナノ粒子（任意で更にクエン酸を含む）、または例えばエチレンジアミン二コハク酸の存在下で調製され、および任意でさらにクエン酸の存在下で調製されたナノセリア等のセリウム含有ナノ粒子の有効量を事象、疾患、細胞病理の発症に先立って投与することを含む。
【００７８】
他の特定の実施形態において、酸化的ストレスに関連する事象、疾患または細胞病態を治療する方法は、事象、疾患または細胞病態の発症後に任意でさらにクエン酸を含むナノケアおよびエチレンジアミン二コハク酸等のセリウム含有ナノ粒子、または例えばエチレンジアミン二コハク酸の存在下で調製されたナノセリアおよび任意でさらにクエン酸の存在下で調製されたセリウム含有ナノ粒子の有効量投与方法。
【００７９】
様々な実施形態において、本発明のナノセリアなどのセリウム含有ナノ粒子は、注入、点滴または移植等の局所的、経腸的または非経口的な方法によって被験体にin vivoで投与される。より詳細には、耳の（耳）、口腔、結膜、皮膚、歯、電気浸透、子宮頸管内の、血液透析、浸潤、間質性、腹腔内、羊水内、動脈内、胆道内、気管支内、気管内、心臓内、脳内、胸腔内、腔内、腔内、脳内、嚢内、腔内、角膜内-歯、冠動脈内、海綿体内、皮内、鼻内、管内、十二指腸内、内腔内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、口腔内、病巣内、腔内、腔内、髄内、髄膜内、筋肉内、眼内、腹腔内、心膜内、腹腔内、胸膜内、静脈内、肺内、髄内、脊髄内、滑膜、脈管内、胸骨内、髄腔内、胸腔内、管腔内、腫瘍内、中耳内、子宮内、血管内、静脈内、急速静注、静脈内注入、脳室内、膀胱内、硝子体内、洗浄法、喉頭、鼻、鼻腔胃、密封療法、目、口腔、中咽頭、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器（吸入）、眼球後、軟部組織、くも膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮性、経乳、経粘膜、経胎盤、経気管、経気管支、尿管、尿道、膣および他のまたは割り当てられていない経路のいずれかによって本発明のナノセリア粒子を投与することが特に期待される。
【００８０】
様々な実施形態において、酸化ストレスに関連する事象および/または予防および/または治療のために特に予期される疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、運動失調、フリードライヒ運動失調症、自閉症、強迫性障害、注意欠陥多動障害、偏頭痛、虚血性脳卒中、外傷性脳損傷、癌、炎症、自己免疫異常、ループス、多発性硬化症（MS）、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、狭窄、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、メタボリックシンドローム、内皮機能不全、血管痙攣、糖尿病、老化、慢性疲労、冠動脈心疾患、心筋線維症、心筋梗塞、高血圧、狭心症、プリズメタル狭心症、虚血、血管形成、低酸素症、カシャン病、グルコース-6-リン酸脱水素酵素欠損症、ソラマメ症、虚血性再灌流傷害、リウマチおよび骨関節炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（例えば、肺気腫および気管支炎）、アレルギー、急性呼吸窮迫症候群、慢性腎臓病、腎移植、腎炎、電離放射線損傷、日焼け、皮膚炎、メラノーマ、乾癬、黄斑変性症、網膜変性症および白内障形成が挙げられるが、これに限定されない。
【００８１】
様々な実施形態において、予防および/または治療のために特に予期されている酸化的ストレスに関連する細胞病態としては、ミトコンドリア機能不全、リソソームおよびプロテアソーム機能不全、核酸の酸化（例えばRNAおよびDNA）、チロシンニトロ化、リン酸化媒介シグナル伝達カスケードの喪失、アポトーシスの開始、脂質過酸化および膜脂質環境の破壊が挙げられるが、これら限定されない。
【００８２】
他の実施形態において、本発明のナノセリアなどのセリウム含有ナノ粒子は、カニューレ、カテーテルまたはステントのような医療器具または人工器官の表面上または表面に保持され、これにより、例えば、短期間または長期間のいずれかで、局所的にまたは全身的に炎症を減少させる。
【００８３】
様々な実施形態において、本発明のナノセリアなどのセリウム含有ナノ粒子は、懸濁液、ゲル、錠剤、腸溶錠剤、積載リポソーム、粉末、座薬、不溶性、トローチ剤、クリーム、ローション、軟膏または吸入剤を含むがこれに限定されず、当技術分野で公知の任意の適切な形態で送達される。
【００８４】
様々な実施形態において、本発明のナノセリアのようなセリウム含有ナノ粒子は、他の薬学的に許容される物質、例えば限定されないが、水、塩、緩衝液、リン酸緩衝食塩水（PBS）、砂糖、ヒトまたはウシの血清アルブミン、脂質、薬物、着色剤、香味料、結合剤、ガム質、界面活性剤、フィラーまたは当該分野で公知の任意の賦形剤等と組み合わされる。
【００８５】
特定の実施形態において、本発明のナノセリアなどのセリウム含有ナノ粒子を含むビヒクルは、投与前に滅菌される。
【００８６】
他の実施形態では、細胞または細胞培養物を、ナノセリアなどのセリウム含有ナノ粒子または本発明の粒子と接触させる。接触は、in vitroまたはex vivo方法によって細胞または細胞培養物を曝すことによって実施することができ、後者の方法は、例えば、細胞または細胞群がもともと得られた被験体などの、被験体に処置細胞または細胞群を再導入することを含む方法である。様々な実施形態では細胞は本質的に原核生物または真核生物である。特定の実施形態において、処理された細胞は、限定されないが、抗原、抗体およびワクチンなどの生物製剤として一般に知られている製薬産業で使用されるタンパク質の生産に使用される。他の実施形態では、処理された細胞は発酵方法で使用される。
【００８７】
最終用途の代替案では、本発明のナノセリア粒子は、例えば半導体デバイス、セラミックおよび光学素子に使用される基板を研磨するための化学機械的研磨剤の成分として使用される。特定の実施形態において、本発明のナノセリア粒子は、磁場の印加時に粘度または他の流体特性が変化する磁性流体に混合される。これらの磁性流体の典型的な最終用途のいくつかには、米国特許5,525,249に記載されているようなショックアブソーバ、クラッチ、熱伝達装置および作動モジュールが含まれる。特定の実施形態では、本発明のナノセリア粒子を、例えば、米国特許第6,955,589に記載されているようなレンズ研磨操作において使用される磁気レオロジー仕上げ（MRF）流体中の研磨剤として使用することが特に予期されている。特定の実施形態において、約20重量％の本発明のナノセリア粒子を含有する分散液をMRF流体中に混合する。本発明のナノセリアのような超微細研磨剤をMRF流体に添加するいくつかの目標は、物質除去速度の増加、物理的欠陥の少ない表面平滑性の増加、化学的安定性の改善（例えば、磁性粒子の酸化の減少）、およびMRF流体の物理的安定性の改善（例えば、沈殿の減少）などである。
【００８８】
本発明の特定の実施形態において、(1)セリウムおよびエチレンジアミン二コハク酸を含む、またはエチレンジアミン二コハク酸の存在下で調製され、任意でクエン酸の存在下でさらに調製されたナノ粒子; および(2)生物学的に活性な薬剤を含む、コンジュゲートが提供される。特定の実施形態において、生物学的に活性な薬剤は、例えばプラスミドデオキシリボ核酸、small interfering ribonucleic acid (siRNA)、micro ribonucleic acid (miRNA)およびアプタマー/リボスイッチのような核酸材料を含む。特定の実施形態では、上記のコンジュゲートを細胞トランスフェクション剤として使用する。
【００８９】
（実施例）
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【００９０】
ナノ粒子の散乱とサイズ評価
純粋な溶媒の試料からの散乱量と比較して、赤色レーザーペン光により照射されたときに分散体によって示されるティンデル散乱の程度を評価することによって、粒子分散の簡単な定性的特徴付けを行った。
【００９１】
ナノ粒子分散液の粒子サイズの定量的評価は、多くの技術によって行うことができる。
【００９２】
石英キュベットを備えたBrookhaven 90Plus粒子サイズアナライザー（Brookhaven Instruments Corp.、Holtzville、New York、U.S.A.）を使用して、動的光散乱（DLS）測定値を得た。典型的には、細菌汚染物質を除去するために、測定前に試料を0.2ミクロンのシリンジフィルターで濾過した。レポートされるDLSサイズは、対数正規化加重パラメータである。これらの流体力学的粒子サイズは、DLS技術が粒子の溶媒和球面を構成する吸着されたイオンまたは分子からの寄与を含むため、通常、他の技術によって得られるサイズよりも大きい。
【００９３】
あるいは、X線回折（XRD）スペクトルのピーク幅分析による粒度推定は、Scherrer法を用いて行われる。XRD測定のための試料調製は、以下のようにして行われる; 液体試料を軽く混合し、テルフォンボートに入れ、加熱ランプの下で数時間（ほぼ乾燥するまで）乾燥させ、その後、得られた濃縮液をゼロバックグラウンド石英ディスク上に置き、加熱ランプの下で乾燥させ、乾燥窒素雰囲気下で、室温または約80℃のオーブンで4時間乾燥した。次いで、コーティングされたディスクを、窒素ガス乾燥セルアタッチメントを使用してXRDによって分析した。XRDスペクトルは、銅回転陽極、銅Kα放射線に同調した回折ビームグラファイトモノクロメーターおよびシンチレーション検出器を備えたRigaku D2000回折計で記録した。
【００９４】
あるいは、ナノ粒子のサイズは、粒子の透過電子顕微鏡（TEM）画像の直接分析によって決定することができた。
【００９５】
カタラーゼ活性試験
過酸化水素の除去を触媒するセリウム含有ナノ粒子の水性分散液の能力は、Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA, USAから購入したAmplex（登録商標）Red Catalase Assay Kit（A22180）を用いて測定した。カタラーゼ様活性を、60μM濃度の試料を1時間インキュベートして測定し、各試料を3回試験し、結果を平均した。カタラーゼ単位活性は、過酸化水素標準曲線に基づいて計算した。
【実施例１】
【００９６】
クエン酸とEDTAを用いたナノケアの調製
室温で0.8Lのビーカーに蒸留水500g、硝酸セリウム6水和物10g、クエン酸2.4gおよびエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩（EDTA）4.3gを添加し、混合および溶解した。次いで、溶液のpHが8.5になるまで濃水酸化アンモニウム（28-30％）を加えた。反応混合物を80℃に加熱した。続いて過酸化水素（50％）4.8mlを加え、反応を80℃で約1時間保持し、透明な黄色/オレンジ色の懸濁液を得た。懸濁液を室温に冷却し、次いでダイアフィルトレーションにより洗浄して過剰の塩を除去して約10mS / cm未満のイオン伝導度にした。最終生成物分散液のpHは約7.2であった。
【００９７】
反応混合物に添加されたセリウムイオン/クエン酸/ EDTAのモル比は、それぞれ1.0 / 0.5 / 0.5であった。
【００９８】
最終生成物の分散物は、低強度のレーザービームで照射したときにチンダル（Tyndall）の散乱度が高く、試験で十分に分散したコロイド粒子を示す、クリアライトオレンジ色の液体であった。動的光散乱による粒径分析は、3.1nmの流体力学的直径を示した。最終反応生成物の分散液は、数ヶ月にわたって安定である（すなわち、良好に分散している）ことが観察された。粉末XRD分析による相同定は、CeO2と同形の相の存在を示した（PDF＃34-394）。Scherrer法を用いた（220）粉末XRDピーク幅の分析から、ナノセリア粒子の平均結晶子サイズは2.4ナノメートルであると決定された。
【実施例２】
【００９９】
EDDSを用いたナノケアの調製
実施例1で使用したものと、クエン酸の添加を省略およびエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩（EDTA）の代わりにエチレンジアミン二コハク酸三ナトリウム塩（EDDS）の35％溶液23.5gを添加したことを除いて、同様の水性反応手順を繰り返した。この方法で、等モル量のセリウムイオンおよびEDDSが添加された。
【０１００】
最終生産物の分散液は、低強度のレーザービームで照らされたときに高度なチンダル散乱を示した大部分がクリア、ダークレッド/オレンジ色の液体であった。動的光散乱による粒子サイズ分析は、29.5nmの流体力学的直径を示し、多分散性は0.145であった。
【実施例３】
【０１０１】
クエン酸およびEDDSを含むナノケアの調製
実施例1で使用したものと、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩（EDTA）の代わりに等モルのエチレンジアミン二コハク酸三ナトリウム塩（EDDS）を用いたことを除き、同様の水性反応手順を繰り返した。
【０１０２】
セリウムイオン、クエン酸およびEDDSのモル比はそれぞれ1.0 / 0.5 / 0.5であった。
【０１０３】
最終反応生成物は、低強度のレーザービームで照射したときにチンダル（Tyndall）の散乱度が高く、試験で十分に分散したコロイド粒子を示す、クリアライトオレンジ色の液体であった。動的光散乱による粒径分析は、2.7nmの流体力学的直径を示し、0.147の多分散性を示した。
【０１０４】
最終反応生成物の分散液は、少なくとも18ヶ月間安定（すなわち、良好に分散）していることが観察された。
【０１０５】
粉末XRD分析による相同定は、CeO2と同形の相の存在を示した（PDF＃34-394）。Scherrer法を用いた（220）粉末XRDピーク幅の分析から、ナノセリア粒子の平均結晶子サイズは2.1ナノメートルであると決定された。
【０１０６】
上記カタラーゼ活性試験を用いて、実施例1-3で調製したナノ粒子生成物分散液のそれぞれについて、カタラーゼ様活性を評価した。結果を以下の表に示す。
【０１０７】
【表１】
2018508568.tif 000002
【０１０８】
上記の表に示された結果の検討は、EDDSで調製されたナノ粒子分散液の両方が実質的なカタラーゼ様活性を有することを示している。特に、クエン酸およびEDDSを用いて実施例3で調製したナノ粒子分散液は、カタラーゼ様活性が最も高かった。
【０１０９】
本発明を様々な特定の実施形態を参照して説明してきたが、記載された本発明の概念の真意および範囲内で多くの変更を行うことができることを解される。したがって、本発明は、記載された実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲の文言によって定義される全範囲を有することを意味する。
【国際調査報告】
2018508568.tif 000003
2018508568.tif 000004