(57)【要約】  本発明は、芳香族ヘキサノールの製造および該芳香族ヘキサノールを含む組成物に関する。特に本明細書において、ヘキセノールの製造方法であって、以下：ａ）多価不飽和脂肪酸のヒドロペルオキシドを改変されたヒドロペルオキシドリアーゼと接触させて、ヘキセナールを形成するステップと、ｂ）ヒドリド供与体、ケトレダクターゼおよび補因子の存在下に前記ヘキセナールを還元してヘキセノールを形成するステップとを含む方法において、前記接触ステップと前記還元ステップとを、パン酵母の実質的な非存在下にほぼ同時に行う方法が提供される。
2018506973.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコールの製造方法であって、以下：
ａ）多価不飽和脂肪酸のヒドロペルオキシドをヒドロペルオキシドリアーゼと接触させて、アルデヒドを形成するステップと、
ｂ）ヒドリド供与体、ケトレダクターゼおよび補因子の存在下に前記アルデヒドを還元してアルコールを形成するステップと
を含む方法において、前記接触ステップと前記還元ステップとをほぼ同時に行う方法。
【請求項２】
以下：
ａ）多価不飽和脂肪酸の１３−ヒドロペルオキシドから選択される多価不飽和脂肪酸のヒドロペルオキシドを、１３−ヒドロペルオキシドリアーゼから選択される改変されたヒドロペルオキシドリアーゼと接触させて、ヘキセナールを形成するステップと、
ｂ）ヒドリド供与体、ケトレダクターゼおよび補因子の存在下に前記ヘキセナールを還元するステップと
を含む方法であって、前記接触ステップと前記還元ステップとをほぼ同時に行う、請求項１記載の方法。
【請求項３】
以下：
ａ）多価不飽和脂肪酸の１３−ヒドロペルオキシドから選択される多価不飽和脂肪酸のヒドロペルオキシドを、１３−ヒドロペルオキシドリアーゼから選択される改変されたヒドロペルオキシドリアーゼと接触させて、ｎ−ヘキサナールを形成するステップと、
ｂ）ヒドリド供与体、ケトレダクターゼおよび補因子の存在下に前記ヘキサナールを還元するステップと
を含む方法であって、前記接触ステップと前記還元ステップとをほぼ同時に行う、請求項１記載の方法。
【請求項４】
以下：
ａ）多価不飽和脂肪酸の１３−ヒドロペルオキシドを、改変された１３−ヒドロペルオキシドリアーゼと接触させて、（Ｚ）−３−ヘキセナールを形成するステップと、
（ｂ）第２級アルコール、ケトレダクターゼおよび補因子の存在下に前記（Ｚ）−３−ヘキセナールを還元して、（Ｚ）−３−ヘキセノールを形成するステップと
を含む方法であって、前記接触ステップと前記還元ステップとをほぼ同時に行う、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記１３−ヒドロペルオキシドが、リノール酸の１３−ヒドロペルオキシドおよびα−リノレン酸の１３−ヒドロペルオキシドからなる群から選択される、請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
以下：
ａ）多価不飽和脂肪酸の９−ヒドロペルオキシドから選択される多価不飽和脂肪酸のヒドロペルオキシドを、９−ヒドロペルオキシドリアーゼから選択される改変されたヒドロペルオキシドリアーゼと接触させて、ノネナールおよびノナジエナールからなる群から選択されるアルデヒドを形成するステップと、
ｂ）ヒドリド供与体、ケトレダクターゼおよび補因子の存在下に前記アルデヒドを還元するステップと
を含む方法であって、前記接触ステップと前記還元ステップとをほぼ同時に行う、請求項１記載の方法。
【請求項７】
以下：
ａ）多価不飽和脂肪酸の９−ヒドロペルオキシドから選択される多価不飽和脂肪酸のヒドロペルオキシドを、９−ヒドロペルオキシドリアーゼから選択される改変されたヒドロペルオキシドリアーゼと接触させて、（Ｚ）−３−ノネナールおよび（Ｚ，Ｚ）−３，６−ノナジエナールからなる群から選択されるアルデヒドを形成するステップと、
ｂ）ヒドリド供与体、ケトレダクターゼおよび補因子の存在下に前記アルデヒドを還元するステップと
を含む方法であって、前記接触ステップと前記還元ステップとをほぼ同時に行う、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記９−ヒドロペルオキシドが、リノール酸の９−ヒドロペルオキシドおよびα−リノレン酸の９−ヒドロペルオキシドからなる群から選択される、請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
前記接触ステップおよび前記還元ステップを、パン酵母の実質的な非存在下に行う、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
請求項３記載の方法により製造された（Ｚ）−３−ヘキセノールを含む組成物であって、約１２０００ｍｇ／Ｌ以上の量の（Ｚ）−３−ヘキセノールを含むとともにさらに、ｎ−ヘキサナール、（Ｚ）−３−ヘキセナール、（Ｅ）−２−ヘキセナール、（Ｅ）−２−ヘキセノールおよびｎ−ヘキサノールの全量を約１７０ｍｇ／Ｌ以下から約４００ｍｇ／Ｌまで有する組成物において、前記ｎ−ヘキサナール、（Ｚ）−３−ヘキセナール、（Ｅ）−２−ヘキセナール、（Ｅ）−２−ヘキセノールおよびｎ−ヘキサノールが処理後に除去されていない組成物。
【請求項１１】
（Ｚ）−３−ヘキセノールと、ｎ−ヘキサナール、（Ｚ）−３−ヘキセナール、（Ｅ）−２−ヘキセナール、（Ｅ）−２−ヘキセノールおよびｎ−ヘキサノールの全量との質量比が、約３０：１から少なくとも約７１：１までの範囲である、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
（Ｚ）−３−ヘキセノールを含む請求項１０記載の組成物であって、約１２０００ｍｇ／Ｌ以上の量の（Ｚ）−３−ヘキセノールを含むとともにさらに、反応中に生成されたｎ−ヘキサナール、（Ｚ）−３−ヘキセナール、（Ｅ）−２−ヘキセナール、（Ｅ）−２−ヘキセノールおよびｎ−ヘキサノールの全量約４００ｍｇ／Ｌ以下を有する組成物において、前記ｎ−ヘキサナール、（Ｚ）−３−ヘキセナール、（Ｅ）−２−ヘキセナール、（Ｅ）−２−ヘキセノールおよびｎ−ヘキサノールが処理後に除去されていない組成物。
【請求項１３】
請求項６記載の方法により製造された（Ｚ，Ｚ）−３，６−ノナジエノールを含む組成物であって、（Ｚ，Ｚ）−３，６−ノナジエノールを約０．７４ｇ／ｌ以上の量で、より具体的には約１．８ｇ／ｌ以上の量で、さらにより具体的には約２ｇ／ｌ以上の量で、さらにより具体的には４ｇ／ｌ以上の量で含む組成物において、該組成物が、約１ｇ／ｌ以下の、より具体的には約０．２ｇ／ｌ以下の、さらにより具体的には約０．１６ｇ／ｌ以下の（Ｚ）−３−ノネノールを含みうる組成物。一実施形態において、前記組成物は（Ｚ）−３−ノネノールを含まない。
【請求項１４】
（Ｚ，Ｚ）−３，６−ノナジエノールと（Ｚ）−３−ノネノールとの比が、約４．６３：１から約２５：１までの範囲である、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１から８までのいずれか１項記載の方法から得ることができる生成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本分野は、フレーバーおよびフレグランスの製造方法である。
【０００２】
背景
香料およびフレーバーの産業における有用な化合物であって、酵素反応により行われうるヒドロペルオキシド開裂を伴うもののうち、いわゆる「グリーンノート」としては、例えばｎ−ヘキサナール、ｎ−ヘキサノール、（Ｅ）−２−ヘキセナール、（Ｅ）−２−ヘキセン−１−オール、（Ｚ）−３−ヘキセン−１−オール（ピポールとしても知られる）および（Ｚ）−３−ヘキセン−１−アールが挙げられ、これらは、フレッシュグリーン特性を付与すべく、フレグランスおよびフレーバー、特に果実フレーバーにおいて広く用いられている。また、グリーンノートは果実アロマにとって必須であり、アロマ産業において広範に用いられている。天然グリーンノートの需要は、例えばミント（メンタ・アルベンシス（Ｍｅｎｔｈａ  ａｒｖｅｎｓｉｓ））油などの伝統的な供給源からのその供給を上回るほど高まっている。このことが、こうした材料を得る代替的な自然な方法の発見に向けた研究努力の動機付けとなった。
【０００３】
グリーンノート化合物の合成は、遊離（多価不飽和）脂肪酸、例えばリノール（９−（Ｚ），１２−（Ｚ）−オクタデカジエン）酸およびα−リノレン（９−（Ｚ），１２−（Ｚ），１５−（Ｚ）−オクタデカトリエン）酸から出発する。実際には、細胞の損傷後に脂肪分解酵素によってこれらの酸が細胞膜から放出される。特異的な１３−リポキシゲナーゼ（１３−ＬＯＸ）の作用により脂肪酸１３−ヒドロペルオキシドが形成され、続いてこの脂肪酸１３−ヒドロペルオキシドが特異的な１３−ヒドロペルオキシドリアーゼ（１３−ＨＰＬ）により開裂されることで、Ｃ６アルデヒド部分とＣ１２ω−オキソ酸部分とが形成される。続いて、このアルデヒドを熱異性化しかつ／またはデヒドロゲナーゼ酵素により還元することで、例えばアルコールおよびエステルといった他のＣ６生成物（すなわちグリーンノート）を生成することができる（Ｈａｔａｎａｋａ  Ａ．（１９９３）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１２０１−１２１８；Ｈａｔａｎａｋａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄｓ  ４４：４３１−３６１）。
【０００４】
グアバは、この合成経路において使用するための凍結安定性の１３−ＨＰＬの優れた供給源であることが特定されている。グアバ１３−ＨＰＬをグリーンノートの工業的な製造方法において使用することが記載されている（米国特許第５４６４７６１号明細書（ＵＳ  ５４６４７６１））。この方法では、調製したての大豆粉を１３−ＬＯＸの供給源として使用して、リノール酸またはα−リノレン酸（それぞれヒマワリ油およびアマニ油より得たもの）から、必要な１３−ヒドロペルオキシドの溶液が製造される。次いで、この溶液を、１３−ＨＰＬの供給源としての完全なグアバ（シジウム・グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ））果実の調製したてのピュレと混合する。次いで、アルデヒド生成物を蒸留により単離する。対応するアルコールが必要とされる場合には、このヒドロペルオキシド溶液に新鮮なパン酵母を加えてから、これをグアバピュレと混合する。この酵母は活性アルコールデヒドロゲナーゼ酵素を含んでおり、１３−ＨＰＬによりアルデヒドが形成されると、この酵素によってアルデヒドが還元して、対応するアルコールが形成される。
【０００５】
発明の概要
本明細書において、アルコールの製造方法であって、以下：
ａ）多価不飽和脂肪酸のヒドロペルオキシドをヒドロペルオキシドリアーゼと接触させて、アルデヒドを形成するステップと、
ｂ）ヒドリド供与体、ケトレダクターゼおよび補因子の存在下に前記アルデヒドを還元してアルコールを形成するステップと
を含む方法において、前記接触ステップと前記還元ステップとをほぼ同時に行う方法が提供される。
【０００６】
本明細書においてさらに、（Ｚ）−３−ヘキセノールを含む組成物であって、約１２０００ｍｇ／Ｌ以上の量の（Ｚ）−３−ヘキセノールを含むとともにさらに、反応中に生成されたｎ−ヘキサナール、（Ｚ）−３−ヘキセナール、（Ｅ）−２−ヘキセナール、（Ｅ）−２−ヘキセノールおよびｎ−ヘキサノールの全量約４００ｍｇ／Ｌ以下を有する組成物において、前記ｎ−ヘキサナール、（Ｚ）−３−ヘキセナール、（Ｅ）−２−ヘキセナール、（Ｅ）−２−ヘキセノールおよびｎ−ヘキサノールが処理後に除去されていない組成物が提供される。
【０００７】
本明細書においてさらに、（Ｚ，Ｚ）−３，６−ノナジエノールを含む組成物であって、（Ｚ，Ｚ）−３，６−ノナジエノールを約０．７４ｇ／ｌ以上の量で、より具体的には約１．８ｇ／ｌ以上の量で、さらにより具体的には約２ｇ／ｌ以上の量で含む組成物において、該組成物が、約１ｇ／ｌ以下の、より具体的には約０．２ｇ／ｌ以下の、さらにより具体的には約０．１６ｇ／ｌ以下の（Ｚ）−３−ノネノールを含みうる組成物が提供される。一実施形態において、前記組成物は（Ｚ）−３−ノネノールを含まない。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、改変された１３−ＨＰＬ（変異体ＧＣ７）およびケトレダクターゼＡＤＨ００５を用いて、開裂と還元とを逐次的に行ったもの（Ａ）と、開裂と還元とを並行して行ったもの（Ｂ）との比較を示す。実験（Ａ）では、ｔ＝０分でケトレダクターゼ、イソプロパノールおよび補因子を加える前に、開裂反応がすでに５分間進行していたことに留意されたい。グラフ中で以下の符号が適用される：（Ｚ）−３−ヘキセノール（ダイヤ）、（Ｅ）−２−ヘキセノール（正方形）、（Ｚ）−３−ヘキセナール（三角形）、（Ｅ）−２−ヘキセナール（水平な線）。
【図２】図２は、改変された１３−ＨＰＬ変異体ＧＣ７およびケトレダクターゼＩＥＰｏｘ５８を用いて開裂と還元とを並行して行うことを示す。グラフ中で以下の符号が適用される：（Ｚ）−３−ヘキセノール（ダイヤ）、（Ｅ）−２−ヘキセノール（正方形）、（Ｚ）−３−ヘキセナール（三角形）、（Ｅ）−２−ヘキセナール（水平な線）およびｎ−ヘキサノール（星）。
【図３】図３は、単離された（Ｚ）−３−ヘキセノールのガスクロマトグラムを示す。
【０００９】
詳細な説明
一実施形態において、本明細書で提供される多価不飽和脂肪酸のヒドロペルオキシドは、多価不飽和酸の９−ヒドロペルオキシドおよび多価不飽和脂肪酸の１３−ヒドロペルオキシドから選択される。
【００１０】
一実施形態において、アルデヒドは、Ｃ６アルデヒドである。
【００１１】
一実施形態において、Ｃ６アルデヒドはヘキサナールであり、特にｎ−ヘキサナールである。
【００１２】
一実施形態において、Ｃ６アルデヒドは、ｎ−ヘキサナール、（Ｅ）−２−ヘキセナールおよび（Ｚ）−３−ヘキセナールからなる群から選択され、特に（Ｚ）−３−ヘキセナールである。
【００１３】
一実施形態において、アルデヒドは、ノネナールおよびノナジエナールからなる群から選択される。
【００１４】
一実施形態において、アルデヒドは、（Ｚ）−３−ノネナールおよび（Ｚ，Ｚ）−３，６−ノナジエナールからなる群から選択される。
【００１５】
さらに他の実施形態において、アルコールは、ｎ−ヘキサノール、（Ｅ）−２−ヘキセノールおよび（Ｚ）−３−ヘキセノールからなる群から選択されるＣ６アルコールであり、特に（Ｚ）−３−ヘキセノールである。
【００１６】
さらに他の実施形態において、アルコールは、Ｃ９アルコールである。
【００１７】
さらに他の実施形態において、アルコールは、（Ｚ）−３−ノネノールおよび（Ｚ，Ｚ）−３，６−ノナジエノールからなる群から選択されるＣ９アルコールであり、特に（Ｚ，Ｚ）−３，６−ノナジエノールである。
【００１８】
一実施形態において、（Ｚ）−３−ヘキセノールと、ｎ−ヘキサナール、（Ｚ）−３−ヘキセナール、（Ｅ）−２−ヘキセナール、（Ｅ）−２−ヘキセノールおよびｎ−ヘキサノールの全量との質量比は、約３０：１から少なくとも約７１：１までの範囲であり、より具体的には約３０：１から約７１：１までの範囲である。一実施形態において、（Ｚ，Ｚ）−３，６−ノナジエノールと（Ｚ）−３−ノネノールとの比は、約４．６３：１から約２５：１までの範囲である。
【００１９】
一実施形態において、ヒドリド供与体は、第２級アルコール、第１級アルコール、アルカンジオールおよびヒドロキシ酸またはそのエステルの１つからなる群から選択される化合物のヒドリドを供与する化合物である。
【００２０】
一実施形態において、第２級アルコールは、イソプロパノール、イソアミルアルコール、グリセロール、イソブタノール、ブタン−２−オール、プロピレングリコール、フェンコール、ボルネオール、メントール、カルベオール、メチル−ｐ−トリルカルビノール、８−シメノール、オクト−１−エン−３−オール、ペンタン−２−オール、ペンタン−３−オール、４−メチル−２−ペンタノール、ヘキサン−２−オール、ヘプタン−２−オール、オクタン−２−オール、ノナン−２−オール、デカン−２−オール、ウンデカン−２−オールからなる群から選択される。特定の一実施形態において、ヒドリド供与体はイソプロパノールである。
【００２１】
一実施形態において、ヒドリド供与体は、ブタン−１，４−ジオール、ブタン−２，３−ジオールおよびエチレングリコールからなる群から選択されるアルカンジオールである。
【００２２】
他の実施形態において、ヒドリド供与体は、特に乳酸カルシウム、乳酸エチル、乳酸プロピルおよび乳酸ブチルからなる群から選択されるヒドロキシ酸エステルである。
【００２３】
一実施形態において、ヒドロペルオキシドリアーゼは、例えば米国特許第８５０１４５２号明細書（ＵＳ  ８５０１４５２（Ｂ２））に記載の改変された１３−ｈｐｌ遺伝子を有する組換え発現プラスミドを保有する改変された生物において生成された改変されたリアーゼ（特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）生物、変異体ＧＣ７）であり、ここに本明細書の一部を構成するものとして該明細書の内容全体を援用する。
【００２４】
一実施形態において、ヒドロペルオキシドリアーゼは、改変された９−ヒドロペルオキシドリアーゼ遺伝子を有する組換え発現プラスミドを保有する改変された生物により生成された改変されたリアーゼであり、このリアーゼを用いてＣ９アルデヒドを生成し、そしてこのアルデヒドを還元した後に、Ｃ９アルコール、特に（基質としてリノール酸の９−ヒドロペルオキシド（９−ＨＰＯＤ）を用いた場合には）（Ｚ）−３−ノネノールが生成され、また（基質としてα−リノレン酸の９−ヒドロペルオキシド（９−ＨＰＯＴ）を用いた場合には）（Ｚ，Ｚ）−３，６−ノナジエノールが生成される。これらのアルコールから、対応する酢酸エステルまたは他のエステルを生成することができる。特にリアーゼは、例えば米国特許出願公開第２００２０９８５７０号明細書（ＵＳ  ２００２０９８５７０（Ａ１））に記載の９−ヒドロペルオキシドリアーゼ遺伝子を保有する生物から生成され、ここに本明細書の一部を構成するものとして該明細書の内容全体を援用する。
【００２５】
ヒドロペルオキシドリアーゼは、好ましいことにヒドリド供与体の存在下で安定である。例えばアルコールによって酵素が不安定になる場合が多いことが知られているため、これは驚くべきことである。本発明者らは、特定のヒドリド供与体の存在下で前記ヒドロペルオキシドリアーゼが安定であり、この特定のヒドリド供与体によって、ヒドロペルオキシドの開裂とアルデヒドの還元とを並行して行うことができることを見出した。
【００２６】
一実施形態において、ケトレダクターゼは、Ｃｏｄｅｘｉｓ社（カリフォルニア州レッドウッドシティー）の酵素ＡＤＨ００５およびＣａｍｂｒｅｘ−ＩＥＰ社（ドイツ連邦共和国ヴィースバーデン）の酵素ＩＥＰＯｘ５８からなる群から選択される。
【００２７】
一実施形態において、９−ヒドロペルオキシド脂肪酸および１３−ヒドロペルオキシド脂肪酸は、リノール酸およびα−リノレン酸からなる群から選択される。
【００２８】
一実施形態において、補因子は、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨからなる群から選択される。
【００２９】
一実施形態において、補因子再生酵素を、グルコースを補基質とするグルコースデヒドロゲナーゼ、ホルミエートを補基質とするホルミエートデヒドロゲナーゼまたはホスフィットを補基質とするホスフィットデヒドロゲナーゼからなる群から選択することができる。
【００３０】
本明細書で提供される一実施形態は、（Ｚ）−３−ヘキセノールを含む組成物であって、約１２０００ｍｇ／Ｌ以上の量の（Ｚ）−３−ヘキセノールを含むとともにさらに、ｎ−ヘキサナール、（Ｚ）−３−ヘキセナール、（Ｅ）−２−ヘキセナール、（Ｅ）−２−ヘキセノールおよびｎ−ヘキサノールの全量約４００ｍｇ／Ｌ以下、より具体的には約１７０ｍｇ／Ｌ未満を有する組成物において、前記ｎ−ヘキサナール、（Ｚ）−３−ヘキセナール、（Ｅ）−２−ヘキセナール、（Ｅ）−２−ヘキセノールおよびｎ−ヘキサノールが処理後に除去されていない組成物である。提供される他の実施形態において、前記組成物は、（Ｚ）−３−ヘキセノールを約１２０００ｍｇ／Ｌ以上の量で含むとともにさらに、ｎ−ヘキサナール、（Ｚ）−３−ヘキセナール、（Ｅ）−２−ヘキセナール、（Ｅ）−２−ヘキセノールおよびｎ−ヘキサノールの全量を約１７０ｍｇ／Ｌ以下から約４００ｍｇ／Ｌまで有し、その際、前記ｎ−ヘキサナール、（Ｚ）−３−ヘキセナール、（Ｅ）−２−ヘキセナール、（Ｅ）−２−ヘキセノールおよびｎ−ヘキサノールは処理後に除去されていない。
【００３１】
一実施形態において、接触ステップおよび還元ステップは、約０℃から約３０℃までの範囲の温度で、より具体的には約１０℃から約３０℃までの範囲の温度で、約２分間から約４８０分間までの範囲の期間で行われる。特定の一実施形態において、温度は約２０℃であり、約４３０分間の期間にわたる。他の特定の実施形態において、温度はほぼ室温であり、約５時間の期間にわたる。典型的には、接触ステップおよび還元ステップは混合しながら行われる。
【００３２】
本明細書で提供される化合物は、フレーバーおよびフレグランスの産業において現在使用されている酸素含有化合物であり、すなわちそのフルーティーおよびグリーンタイプの感覚刺激特性の結果としての酸素含有化合物である。これらの化合物は天然起源のいくつかのフレーバーおよびフレグランスの構成成分であることが知られており、これらの化合物を調製するための様々な合成方法に関する多くの研究が文献に記載されている。
【００３３】
本方法の利点の１つは、インタクトな生物を必要としない点にある。
【００３４】
実施例
以下の実施例は、例示のみを目的として提供される。
【００３５】
例１
１３−ＨＰＯＴ／Ｄの合成
メカニカルスターラー、温度計、滴下漏斗、ガラスキャップおよび酸素注入口を備えた５ッ口ガラスフラスコに、アマニ油加水分解物（酸化可能な酸約６５％）４４ｇと水道水２４７．５ｇとの混合物を２４０ｒｐｍで撹拌しながら加えた。氷水浴で温度を１８℃に調節した。３０％ＮａＯＨ水溶液１３．２ｇを加えることにより、この反応物のｐＨを調節した。オーバーヘッド気相を純酸素Ｏ２で３回パージした。次いで、ガラスキャップをｐＨ電極と素早く交換した。次いで、可とう性のホースに接続されたフラスコを通じて、粉砕したての大豆粉３８．５ｇを加えた。撹拌速度を１０００〜１２００ｒｐｍに上昇させた。３０％ＮａＯＨ水溶液を滴加して、ｐＨを９．２〜９．４に一定に保持した。温度を１８〜２２℃に保持した。１時間反応させた。０．０１Ｎ  Ｎａ２Ｓ２Ｏ３溶液でのヨウ素滴定により、脂肪酸ヒドロペルオキシド濃度を求めた。脂肪酸ヒドロペルオキシドの品質を、ＨＰＬＣにより制御した。滴定により求めた全脂肪酸ヒドロペルオキシドは、少なくとも８０ｇ／Ｌの１３−ＨＰＯＴ／Ｄ（１３−ヒドロペルオキシトリエン酸／１３−ヒドロペルオキシジエン酸）に達した。
【００３６】
例２
１３−ヒドロペルオキシドリアーゼ（１３−ＨＰＬ）の生成
改変された１３−ｈｐｌ遺伝子＊を有する組換え発現プラスミドを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞の一晩培養物０．５ｍＬを、アンピシリン１００ｍｇ／ｍＬとチアミン２ｍｇ／Ｌとを含むＬＢ培地１００ｍＬの入ったフラスコに加えた。この培養物を、光学密度ＯＤ６００が０．４５に達するまで１８０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で成長させた。次いで、５−アミノレブリン酸を加えて最終濃度を１ｍＭとした。３０分以内に温度を２５℃に下げた。この培養物を、光学密度ＯＤ６００＝０．６で０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘導し、１８時間振とうしながら２５℃で放置した。その後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞を遠心分離し、ｐＨ７．６の１００ｍＭリン酸緩衝液中に再懸濁させてＯＤ６００を１０としてから、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社（ドイツ連邦共和国ゲッティンゲン）のＬａｂｓｏｎｉｃ  Ｐを用いて音波処理を行った。
【００３７】
＊例えば米国特許第８５０１４５２号明細書（ＵＳ  ８５０１４５２（Ｂ２））に記載の変異体ＧＣ７。
【００３８】
例３
逐次的に行われる、１３−ＨＰＯＴ／Ｄの開裂および（Ｚ）−３−ヘキセナールの還元
改変された１３−ＨＰＬ変異体ＧＣ＃７を生成する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の溶解細胞を用いて、粗製１３−ＨＰＯＴ／Ｄの開裂を行った。１０ｍＬのバイアルに、次のものを加えた：８０ｇ／Ｌ超の１３−ＨＰＯＴ／Ｄ  １．８ｍＬおよび１３−ＨＰＬを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の溶解細胞（ＯＤ６００＝１０に相当する細胞懸濁液）０．２ｍＬ。５分後に、イソプロパノール４００μＬと、ＮＡＤＰ（５０ｍＭ）２５μＬと、Ｃｏｄｅｘｉｓ社（カリフォルニア州レッドウッドシティー）の酵素ＡＤＨ００５（７７５Ｕ／ｍＬ）１２０μＬと、を撹拌しながら加えた。この反応物から２分後、５分後、１０分後、２０分後、４０分後、６０分後に試料１００μＬを採取し、直ちに水９００μＬで希釈した。ガスクロマトグラフィーにより分析を行うために、内部標準物質としての１ｇ／Ｌのｎ−オクタノールを含む等体積の酢酸エチルを用いて抽出を行った。水素炎イオン化型検出器とＤＢ−ＷＡＸカラム（Ｌ＝３０ｍ、ＩＤ＝０．２５ｍｍ、コーティング＝０．２５μｍ）とを備えたガスクロマトグラフを、以下の温度プログラムで使用した：８０℃（２分間）、１６０℃（４℃／分）、２３０℃（３０℃／分）、２３０℃（６分間）。１：５０の分割比を用い、ヘリウム流量は１．４ｍＬ／分であった。１時間後に、この反応ブロスは、（Ｚ）−３−ヘキセノール７．２ｇ／Ｌ、（Ｚ）−３−ヘキセナール０．４２ｇ／Ｌ、（Ｅ）−２−ヘキセノール０．１７ｇ／Ｌおよび（Ｅ）−２−ヘキセナール０．０２ｇ／Ｌを含んでいた。この反応のキネティクスを図１Ａに示す。図１Ａに示すように、ケトレダクターゼおよび補因子ＮＡＤＰは、反応条件下に十分に安定したままであった。
【００３９】
例４
ａ）並行して行われる、１３−ＨＰＯＴ／Ｄの開裂および（Ｚ）−３−ヘキセナールの還元
１０ｍＬのバイアルに、次のものを加えた：８０ｇ／Ｌの１３−ＨＰＯＴ／Ｄ  １８００μＬ、１Ｍ  ＭｇＳＯ４  ４μＬ、５０ｍＭ  ＮＡＤＰ  ２５μＬ、イソプロパノール４００μＬ、Ｃｏｄｅｘｉｓ社（カリフォルニア州レッドウッドシティー）のケトレダクターゼＡＤＨ００５（７７５Ｕ／ｍＬ）１２０μＬおよび１３−ＨＰＬ（変異体ＧＣ＃７）を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解物（ＯＤ６００＝１０に相当する細胞懸濁液）２５０μＬ。この反応物を室温で撹拌した。この反応物から試料１００μＬを所定の時点で１時間採取し、これをＨ２Ｏ  ９００μＬで希釈し、酢酸エチル１ｍＬで抽出してから、前例に記載の通りにガスクロマトグラフィーにより分析した。ｎ−オクタノールを内部標準物質として使用した。１時間後に、この反応ブロスは、（Ｚ）−３−ヘキセノール７．５ｇ／Ｌ、（Ｅ）−２−ヘキセノール０．０４ｇ／Ｌを含んでいた。アルデヒドは検出されなかった。この反応のキネティクスを図１Ｂに示す。
【００４０】
ｂ）並行して行われる、１３−ＨＰＯＴ／Ｄの開裂および（Ｚ）−３−ヘキセナールの還元
１０ｍＬのガラスバイアルに、次のものを加えた：８０ｇ／Ｌの１３−ＨＰＯＴ／Ｄ  ０．９ｍＬ、５．２ｍＭ  ＮＡＤストック溶液１０μＬ、イソプロパノール２００μＬ、Ｃａｍｂｒｅｘ−ＩＥＰ社（ドイツ連邦共和国ヴィースバーデン）のケトレダクターゼＩＥＰＯｘ５８  ２３μＬおよび（ＯＤ６００＝１０の細胞懸濁液から構成される）１３−ＨＰＬ変異体ＧＣ７溶解物２００μＬ。この反応物を、マグネチックバーにより４００ｒｐｍで１０℃で５時間まで撹拌した。内部標準物質としてｎ−オクタノールを使用したＧＣによる分析のために、３倍体積のＭＴＢＥでこの反応物を抽出した。５時間後に、この反応ブロスは、（Ｚ）−３−ヘキセノール１２．３ｇ／Ｌ、（Ｚ）−３−ヘキセナール０．０２ｇ／Ｌ、（Ｅ）−２−ヘキセノール０．０７ｇ／Ｌ、（Ｅ）−２−ヘキセナール０．０１ｇ／Ｌ、１−ヘキサノール０．３ｇ／Ｌを含んでいた。この反応のキネティクスを図２に示す。
【００４１】
例５
（Ｚ）−３−ヘキセノールの調製
１Ｌフラスコに、＞８０ｇ／Ｌの１３−ＨＰＯＴ／Ｄ  ６９２ｍＬ、１Ｍ  ＭｇＳＯ４  １．５ｍＬ、イソプロパノール１５５ｍＬ、２５ｍＭ  ＮＡＤＰ  ２０ｍＬ、Ｃｏｄｅｘｉｓ社（カリフォルニア州レッドウッドシティー）のケトレダクターゼＡＤＨ００５（７７５Ｕ／ｍＬ）４６ｍＬおよび変異体ＧＣ＃７（ＯＤ６００＝７に相当する細胞懸濁液）の改変された１３−ＨＰＬを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の溶解細胞９７ｍＬを加えた。この反応物を、マグネチックスターラーで８００ｒｐｍで室温で４０分間撹拌した。この反応をガスクロマトグラフィーによりモニタリングするため、２分後、５分後、１０分後、２０分後および４０分後にアリコート２００μＬを採取した。次いで、反応物全体をＭＴＢＥで３回抽出した。有機抽出物を水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、孔径０．４５μｍのＰＴＦＥ膜でろ過した後、有機溶媒を蒸発により除去した。次いで、標準的な蒸留装置を用いて７０〜８５℃で真空（１５ｍｂａｒ）下に残留物を蒸留した。単離された（Ｚ）−３−ヘキセノールの純度は９７．８％であり、主要な不純物として１−ヘキサノール１．２％および（Ｅ）−２−ヘキセノール０．６％が含まれていた（図３）。これらの生成物の同定を、ＧＣ−ＭＳおよびＮＭＲによりさらに確認した。
【００４２】
例６
９−ＨＰＯＴ／Ｄの合成
α−リノレン酸の９−ヒドロペルオキシドを、以下の通り調製した：メカニカルスターラー、温度計、滴下漏斗、ガラスキャップおよび酸素注入口および真空排出口を備えた多口ガラスフラスコを使用した。この多口ガラスフラスコに、マッシュしたてのジャガイモ（シャルロット（Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ）またはビンチェ（Ｂｉｎｔｊｅ））３７０ｇを加えた。次に、アマニ油加水分解物３０ｇを、Ｔｗｅｅｎ  ８０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ４７８０）２５０μＬを含む水２５０ｇ、およびＶｉｓｃｏｚｙｍ  Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社）３７０μＬと共に素早く加えた。温度を２０℃〜２２℃に調節し、３０％ＮａＯＨ水溶液を加えることによりｐＨを５．５〜５．７に保持した。この系を酸素で４回パージし、８００ｒｐｍで激しく撹拌し、酸素下に１時間保持した。ビュレットを用いて酸素消費量を測定した。０．０１Ｎ  Ｎａ２Ｓ２Ｏ３を用いたヨウ素滴定により、脂肪酸ヒドロペルオキシド濃度を求めた。全９−ＨＰＯＴ／Ｄ含有量（９−ヒドロペルオキシトリエン酸／９−ヒドロペルオキシジエン酸）が少なくとも３０ｇ／Ｌであることが望ましい。
【００４３】
例７
粗製９−ヒドロペルオキシドリアーゼ（９−ＨＰＬ）の生成
ｍａｌＥの３’末端にインフレームで融合された９−ｈｐｌのコドン改変ＯＲＦ（例えば米国特許第７０３７６９３号明細書（ＵＳ  ７０３７６９３  Ｂ２）参照）を有するｐＭＡＬ−ｃ−２Ｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチューセッツ州イプスウィッチ）に基づく組換え発現プラスミドを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αの細胞の一晩培養液１ｍＬを、アンピシリン１００ｍｇ／ｍＬとチアミン２ｍｇ／Ｌとを含む滅菌ＬＢ培地２００ｍＬの入ったフラスコに加えた。細胞を、光学密度ＯＤ６００が０．５に達するまで３７℃で２２０ｒｐｍで振とうしながら成長させた。次いで、１Ｍ  ５−アミノレブリン酸２００μＬを加えて最終濃度を１ｍＭとした。温度を２５℃に下げ、この培養物を、ＯＤ６００＝０．６で０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘導した。次いで、この培養物を２５℃で１８０ｒｐｍでさらに１６時間成長させた。細胞を４℃で４０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を廃棄し、氷冷したｐＨ７．６の１００ｍＭリン酸緩衝液中に細胞ペレットを懸濁させたところ、ＯＤ６００が４５に達した。リゾチームを２ｍｇ／Ｌで加え、氷上で３０分間インキュベートした後、ＬａｂｓｏｎｉｃＰ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社、ドイツ連邦共和国ゲッティンゲン）を用いた音波処理により細胞を破壊した。
【００４４】
例８
逐次的に行われる、９−ＨＰＯＴ／Ｄの開裂およびアルデヒドの化学的還元
全ペルオキシド３５ｇ／Ｌの９−ＨＰＯＴ／Ｄ  ９００μＬをガラスバイアルに加えた。次いで、磁気撹拌しながら粗製９−ＨＰＬ  １００μＬを加えた。５分後、１０分後、１５分後および２０分後に試料１００μＬを取り出し、これらの試料を室温で１０分間磁気撹拌しながら１０ｇ／ＬのＮａＢＨ４水溶液９００μＬ中で直ちに還元した。還元したこれらの試料を、内部標準物質としての１−オクタノールを含むＭＴＢＥ  ２ｍＬで抽出し、ＤＢ−ＷＡＸカラムを用いてＧＣにより分析した。５分後に、（Ｚ）−３−ノネノール０．２ｇ／Ｌおよび（Ｚ，Ｚ）−３，６−ノナジエノール０．９ｇ／Ｌが検出された（表１）。
【００４５】
【表１】
2018506973.tif 000003
【００４６】
例９
逐次的に行われる、９−ＨＰＯＴ／Ｄの開裂およびアルデヒドの生化学的還元
３５ｇ／Ｌの９−ＨＰＯＴ／Ｄ  １８００μＬをガラスバイアルに加えた。次いで、磁気撹拌しながら粗製９−ＨＰＬ  ２００μＬを加えた。この反応物を、室温で９００ｒｐｍで５分間磁気撹拌したままにした。２つの試料各１００μＬを対照として取り出し、ＮａＢＨ４で還元し、上記の通りに分析した。この反応物の残分に、次のものを直ちに加えた：１０ｍＭ  ＮＡＤＰ水溶液１２０μＬ、Ｈ２Ｏ  １６０μＬ、イソプロパノール７０μＬ、１Ｍ  ＭｇＳＯ４  １１μＬおよびＣｏｄｅｘｉｓ社（カリフォルニア州レッドウッドシティー）のケトレダクターゼＡＤＨ００５（７７５Ｕ／ｍＬ）１００μＬ。強力に磁気撹拌しながら２０％ＮａＯＨ  １２μＬを加えることにより、ｐＨを７に調節した。試料２００μＬを異なる時間間隔で取り出し、１５倍体積のＭＴＢＥで抽出し、内部標準物質として１−オクタノールを用いて上記の通りにＧＣにより分析した。生化学的還元により、（Ｚ）−３−ノネノール０．１３ｇ／Ｌおよび（Ｚ，Ｚ）−３，６−ノナジエノール０．５９ｇ／Ｌが得られ、５分後に遊離アルデヒドは検出されなかった。
【００４７】
例１０
並行して行われる、９−ＨＰＯＴ／Ｄの開裂およびアルデヒドの還元
３５ｇ／Ｌの９−ＨＰＯＴ／Ｄ  １６２０μＬをガラスバイアルに加えた。次いで、１０ｍＭ  ＮＡＤＰ  １２０μＬ、Ｈ２Ｏ  １６０μＬ、イソプロパノール７０μＬ、１Ｍ  ＭｇＳＯ４  １１μＬ、Ｃｏｄｅｘｉｓ社（カリフォルニア州レッドウッドシティー）のケトレダクターゼＡＤＨ００５（７７５Ｕ／ｍＬ）１００μＬ、粗製９−ＨＰＬ（ＯＤ６００＝４５）１８０μＬおよび２０％ＮａＯＨ  １２μＬを、室温で撹拌しながら加えた（最終ｐＨ＝７）。試料２００μＬを異なる時間間隔で取り出し、１５倍体積のＭＴＢＥで抽出し、内部標準物質として１−オクタノールを用いて上記の通りにＧＣにより分析した。生化学的還元により、（Ｚ）−３−ノネノール０．１６ｇ／Ｌおよび（Ｚ，Ｚ）−３，６−ノナジエノール０．６８ｇ／Ｌが得られ、還元時間５分が経過した後に遊離アルデヒドは検出されなかった。
【００４８】
例１１
並行して行われる、９−ＨＰＯＴ／Ｄの開裂およびアルデヒドの還元
３５ｇ／Ｌの９−ＨＰＯＴ／Ｄ  １６２０μＬをガラスバイアルに加えた。次いで、１０ｍＭ  ＮＡＤ  ４０μＬ、Ｈ２Ｏ  １６０μＬ、イソプロパノール７０μＬ、Ｃａｍｂｒｅｘ−ＩＥＰ社（ドイツ連邦共和国ヴィースバーデン）のケトレダクターゼＩＥＰＯｘ５８  ２００μＬ、粗製９−ＨＰＬ（ＯＤ６００＝４５）１８０μＬおよび２０％ＮａＯＨ  １２μＬを、室温で撹拌しながら加えた（最終ｐＨ＝７）。試料２００μＬを異なる時間間隔で取り出し、１５倍体積のＭＴＢＥで抽出し、内部標準物質として１−オクタノールを用いて上記の通りにＧＣにより分析した。生化学的還元により、（Ｚ）−３−ノネノール０．１６ｇ／Ｌおよび（Ｚ，Ｚ）−３，６−ノナジエノール０．７４ｇ／Ｌが得られ、還元時間１５分が経過した後に遊離アルデヒドは検出されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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