(57)【要約】  複数の遺伝子の制御された発現のための誘導性発現カセットは、２つのＤＮＡ配列間に挿入された両方向性プロモーターのＤＮＡ配列を含むものである。目的遺伝子をコードしている２つのＤＮＡ配列での宿主細胞のトランスフェクションにより、一方のＤＮＡ配列の構成的発現および他方のＤＮＡ配列の発現の操作がもたらされる。また、別の両方向性プロモーターとマーカーおよび調節性発現産物をコードしている２つのＤＮＡ配列とを含む調節ＤＮＡカセットも開示する。どちらのカセットも、眠れる森の美女トランスポゾンなどの非ウイルスベクターまたはウイルスベクターに組み込まれ得、宿主細胞において複数の遺伝子の制御された発現を誘導することができる。また、上記の各ベクター型のパッケージを含むキットも開示し、宿主細胞の形質転換方法も開示する。
2018508223.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）第１のポリヌクレオチド配列；
（ｉｉ）第２のポリヌクレオチド配列；および
（ｉｉｉ）前記第１のポリヌクレオチド配列と前記第２のポリヌクレオチド配列とに作動可能に連結されたアルファ−ヘルペスウイルス（α−ＨＳＶ）由来の前初期（ＩＥ）プロモーターを含む両方向性プロモーター
を含むポリヌクレオチド配列を含むものであるＤＮＡ発現カセットであって、前記ＩＥプロモーターは、前記第１および第２のポリヌクレオチド配列のそれぞれ構成的発現産物および制御性発現産物としての発現を増進させ、前記両方向性プロモーターがさらに：（ａ）ＨＳＶ  ＶＰ１６タンパク質が結合すると前記第１のポリヌクレオチド配列の発現を基底レベルより上に高める発現エンハンサードメイン、および（ｂ）前記ＩＥプロモーターと前記第２のポリヌクレオチド配列との間に作動可能に連結された２つのテトラサイクリン応答エレメントを含む、
ＤＮＡ発現カセット。
【請求項２】
前記第１のポリヌクレオチド配列と前記第２のポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも一方が制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含む、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項３】
前記第１のポリヌクレオチド配列および前記第２のポリヌクレオチド配列の各々が制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含む、請求項２に記載の発現カセット。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチド配列の各々が複数の制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含む、請求項３に記載の発現カセット。
【請求項５】
複数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位が、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｐＥＩ、ＭｆｅＩ、ＭｌｕＩ、ＮｃｏＩ、ＰｍｅＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩからなる群より選択される酵素の２つ以上の部位を含む、請求項４に記載の発現カセット。
【請求項６】
さらに、前記第１のポリヌクレオチド配列および前記第２のポリヌクレオチド配列の各々の前記両方向性プロモーターに遠位のポリヌクレオチド配列末端に作動可能に連結された、トランスポザーゼによって認識されるトランスポゾン挿入配列を含む、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項７】
前記第１および第２のポリヌクレオチド配列が第１および第２の選ばれた発現産物をコードしている、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項８】
前記第１および第２のポリヌクレオチド配列が、蛍光性、生物発光性（ｂｉｏｌｕｍｉｎｕｔｅｓｅｓｃｅｎｔ）および薬物耐性タンパク質からなる群のうちの１種類以上から選択されるタンパク質をコードしている、請求項７に記載の発現カセット。
【請求項９】
請求項６に記載の発現カセットを含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項７に記載の発現カセットを含む発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１に記載の発現カセットを染色体ＤＮＡ内に含む細胞。
【請求項１２】
請求項９に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項１３】
請求項１０に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項１４】
哺乳動物細胞である、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
（ｉ）テトラサイクリンリプレッサータンパク質をコードしている調節ポリヌクレオチド配列；
（ｉｉ）抗菌剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードしている選択マーカーポリヌクレオチド配列；および
（ｉｉｉ）該２つのポリヌクレオチド配列間に作動可能に連結された配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；
（ｉｖ）バイシストロニックプロモーターであって、前記調節ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、前記調節ポリヌクレオチド配列と選択マーカーポリヌクレオチド配列の両方の発現を増進させる、前記バイシストロニックプロモーター；ならびに
（ｖ）前記調節ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されていない該バイシストロニックプロモーターの末端に作動可能に連結されたトランスポザーゼ結合部位および該選択マーカーポリヌクレオチド配列の末端に作動可能に連結された別のトランスポザーゼ結合部位
を含むポリヌクレオチド配列を含むものである調節カセット。
【請求項１６】
前記テトラサイクリンリプレッサータンパク質がテトラサイクリン応答エレメントに結合し、前記選択マーカーがピューロマイシンに対する耐性を付与するものである、請求項１５に記載の調節カセット。
【請求項１７】
前記バイシストロニックプロモーターが、ＣＭＶ前初期エンハンサーとニワトリβ−アクチン遺伝子の第１エキソンおよび第１イントロンとを含むキメラＣＡＧプロモーターである、請求項１６に記載の調節カセット。
【請求項１８】
請求項１７に記載の調節カセットを含む調節ベクター。
【請求項１９】
（ｉ）請求項９に記載の発現ベクターのパッケージ；と
（ｉｉ）
（ａ）テトラサイクリン応答エレメントに結合するテトラサイクリンリプレッサータンパク質をコードしている調節ポリヌクレオチド配列；
（ｂ）ピューロマイシン耐性を付与するタンパク質をコードしている選択マーカーポリヌクレオチド配列；および
（ｃ）該２つのポリヌクレオチド配列間に作動可能に連結された配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；ならびに
（ｄ）前記調節ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたバイシストロニックプロモーターであって、ＣＭＶ前初期エンハンサーとニワトリβ−アクチン遺伝子の第１エキソンおよび第１イントロンとを含むものであり、前記調節ポリヌクレオチド配列と選択マーカーポリヌクレオチド配列の両方の発現を増進させる、前記バイシストロニックプロモーター
を含むポリヌクレオチド配列を含む調節ベクターのパッケージと
を含む容器を備えたキット。
【請求項２０】
さらに、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒクラスのトランスポゾンをコードしている（ａ）ＲＮＡまたは（ｂ）ベクターのパッケージを含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒクラスのトランスポゾンが眠れる森の美女トランスポゾンである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
さらに使用のための書面の説明書を含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２３】
（ｉ）請求項１０に記載の発現ベクターのパッケージ；と
（ｉｉ）
（ａ）テトラサイクリン応答エレメントに結合するテトラサイクリンリプレッサータンパク質をコードしている調節ポリヌクレオチド配列；
（ｂ）ピューロマイシン耐性を付与するタンパク質をコードしている選択マーカーポリヌクレオチド配列；および
（ｃ）該２つのポリヌクレオチド配列間に作動可能に連結された配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；ならびに
（ｄ）前記調節ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたバイシストロニックプロモーターであって、ＣＭＶ前初期エンハンサーとニワトリβ−アクチン遺伝子の第１エキソンおよび第１イントロンとを含むものであり、前記調節ポリヌクレオチド配列と選択マーカーポリヌクレオチド配列の両方の発現を増進させる、前記バイシストロニックプロモーター
を含むポリヌクレオチド配列を含む調節ベクターのパッケージと
を含む容器を備えたキット。
【請求項２４】
さらに、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒクラスのトランスポゾンをコードしている（ａ）ＲＮＡまたは（ｂ）ベクターのパッケージを含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒクラスのトランスポゾンが眠れる森の美女トランスポゾンである、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
さらに使用のための書面の説明書を含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２７】
（ｉ）宿主細胞を請求項１９に記載のキットのベクターに加えてＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒクラスのトランスポゾンをコードしている（ａ）ＲＮＡまたは（ｂ）ベクターでトランスフェクトする工程；ならびに
（ｉｉ）該宿主細胞を、第１および第２のポリヌクレオチド配列と前記トランスポゾンとの発現が誘導されるのに充分な条件下で維持して増殖させる工程
を含む、宿主細胞内において複数の遺伝子の発現を誘導する方法。
【請求項２８】
前記Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒクラスのトランスポゾンが眠れる森の美女トランスポゾンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
トランスフェクション薬剤が、約１当量のＤＮＡ発現カセット含有ポリヌクレオチドに対して約２当量の調節カセットポリヌクレオチドおよびトランスポゾンコードＲＮＡまたはベクターの比率で使用される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
トランスフェクション薬剤が３から４×１０５個の宿主細胞に対して約２０００ナノグラム（ｎｇ）の総量で使用される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
トランスポゾンコードＲＮＡまたはベクターが約５００ｎｇで使用される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
調節カセットポリヌクレオチドとＤＮＡ発現カセット含有ポリヌクレオチドが約１：１から約６２５：１の重量比で使用される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
調節カセットポリヌクレオチドとＤＮＡ発現カセット含有ポリヌクレオチドが約２５：１から約１２５：１の重量比で使用される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
トランスフェクション薬剤の各々でのトランスフェクションが一緒に行なわれる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
トランスフェクトされた細胞を回収するさらなる工程を含む、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に分子生物学の分野に関するものであり、より詳しくは、宿主細胞内への目的の複数の遺伝子の導入および該遺伝子の制御された協調発現に関する。特に、本発明は、少なくとも１つの遺伝子が構成的に発現され、少なくとも１つの他の遺伝子の発現が独立して抑制または誘導され得るという複数の遺伝子の同時発現に関する。また、本開示により、かかる方法に有用なヌクレオチド構築物ならびに標的細胞集団への該遺伝子の導入のための構築物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現を過剰発現またはノックダウンのいずれかによって操作できることは、目的遺伝子の生物学的機能の研究に必要である。しかしながら、現在使用されている発現系は、主に３つの要因：ｉ）弱いか、または不均一な遺伝子発現；ｉｉ）制御が不充分な遺伝子発現；ならびにｉｉｉ）安定な組込みの効率および永続的な発現の効率の低さのため、有用性が限定的となる場合があり得る。特定の遺伝子産物は、それが存在するか否かのみならず、その量がほぼどの細胞過程にも影響を及ぼし得るため、これらの要因は重大な制限となる。幸い、遺伝子量効果は、化学薬品または因子を培養培地中または動物内に導入したときの遺伝子発現の「オフ」または「オン」を維持するために開発されたストラテジーを用いて研究することができる。最もよく知られた遺伝子調節系は、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）依存性転写（非特許文献１）の原理に基づいたものであり、２つの成分：（ｉ）アクチベーターまたはリプレッサータンパク質（これは、Ｔｅｔまたはドキシサイクリン（Ｄｏｘ）の添加によってモジュレートされ得る）と、（ｉｉ）このアクチベーターまたはリプレッサーの結合に依存性であるプロモーターからなる。
【０００３】
Ｔｅｔ調節型の系は、遺伝子の活性における規定された可逆的変化を許容する能力を有する。しかしながら、最適な機能遂行には、アクチベーターまたはリプレッサーがある一定の細胞内濃度で存在していること、およびプロモーターと目的遺伝子とが、プロモーター機能に干渉しないゲノム領域内に挿入されていることが必要とされる。後者の点は、Ｔｅｔ調節型のヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期（ＩＥ）プロモーターが、組込み部位付近に存在しているゲノムエンハンサー配列による活性化を受け易く、制御が「リーク性（ｌｅａｋｙ）」であるかまたは不充分である転写（非特許文献１）がもたらされたことを示す研究によって強調される。
【０００４】
同様に、アクチベーターが転写を増強させる能力もまた、ゲノム組込み部位に影響された（非特許文献１）。追跡試験により、Ｔｅｔ応答性ｈＣＭＶプロモーターが非誘導状態では本質的に活性を示さないが誘導されると高レベルの転写を示すゲノム部位の存在が、明らかになった。しかしながら、これらの部位は、安定的にトランスフェクトされた細胞についての累積組込み事象の約５から１５％のみを構成しているにすぎなかった（非特許文献２）。このような報告を総合すると、誘導性発現系についての基底プロモーター活性には明白な差異があることが示された。
【０００５】
このような初期の研究では、遺伝子送達は、誘導性発現カセットをプラスミド内にクローニングし、これを細胞にトランスフェクトすることによって行なわれた。第２の構成的プロモーターによる選択可能遺伝子産物（この場合は、薬物耐性遺伝子）の共発現により、安定的にトランスフェクトされた細胞集団の増殖が可能であった。
【０００６】
現在でもなお頻繁に使用されているが、この細胞株作製方法は、染色体へのランダムな非相同組込みに依存するものであるため、非常に非効率的である。または、幾つかの非ウイルス性の系は、カットアンドペースト機構による組込みおよび長期遺伝子発現の能力を有する；このようなことは、眠れる森の美女（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ）トランスポゾンにより可能である（非特許文献３）。
【０００７】
ヘルペスウイルス科は、ヒトを含む動物において疾患を引き起こすＤＮＡウイルスの大型の科である。また、この科の構成員はヘルペスウイルスとしても知られている。
【０００８】
ヘルペスウイルス科は潜伏感染または溶菌感染を引き起こし得る。単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）および−２（ＨＳＶ−２）、水痘・帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ならびにエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）は、ヘルペスウイルス科の中でも、ヒトに感染する構成員である。これらのウイルスの中でも、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２およびＶＺＶはさらにアルファ−ヘルペスウイルスとして分類されるが、ＣＭＶはベータ−ヘルペスウイルス亜科であり、ＥＢＶはガンマ−ヘルペスウイルス亜科である。
【０００９】
アルファ−ヘルペスウイルス亜科の構成員は、極めて短い増殖周期（数時間）、宿主細胞の即座の破壊および多種多様な宿主組織内での複製能を特徴とする。このウイルスは、特徴的には感覚神経節において潜伏感染を確立させる。
【００１０】
アルファ−ヘルペスウイルスの構成員としては、限定されないが、豚の仮性狂犬病ウイルス、馬のウマ（ｅｑｕｉｄ）ヘルペスウイルス１、３、４、８および９、牛のウシヘルペスウイルス１および５、猫のネコ（ｆｅｌｉｄ）ヘルペスウイルス１、犬のイヌヘルペスウイルス、マレック病ウイルス（ニワトリ）、霊長類のオナガザルヘルペスウイルス２ならびに霊長類のサル水痘ウイルスが挙げられる。すべてのアルファヘルペスウイルスには機能的類似性が存在するが、これらのウイルスは何千万年も前に分かれたため、ＨＳＶ−１／ＨＳＶ−２ウイルスとその他の２８種類のアルファヘルペスウイルス（後述）との間のヌクレオチドドリフトがあまりに大きく、ヌクレオチドレベルの配列アラインメントではわからない。ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２およびＶＺＶを含む３０種類の既知のアルファ−ヘルペスウイルスの完全な一覧は：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＧｅｎｏｍｅｓＧｒｏｕｐ．ｃｇｉ？ｔａｘｉｄ＝１０２９３において知得され得る。
【００１１】
また、これらの亜科の構成員は、ＩＣＰ０と称されるタンパク質およびこのタンパク質のプロモーターを共有している。ＤＮＡ配列は同一でないが、類似したＩＣＰ０プロモーターは同様の活性を有し、両方向性である。
【００１２】
アルファ−ヘルペスウイルスのほとんどはＩＣＰ０様タンパク質をコードしており、このタンパク質は、Ｅ３ユビキチンリガーゼとしての機能を果たし、ウイルス再活性化の主要調節因子の役割を果たす。ＤＮＡ配列は同一でないが類似しているＩＣＰ０プロモーターは、同様の活性を有し、ＨＳＶ−１／ＨＳＶ−２  ＩＣＰ０プロモーターと同様、両方向性であり得る。
【００１３】
ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のゲノムは２つの同一の長反復領域を有しており、該長反復領域の各コピーにＩＣＰ０プロモーターが含まれている。例えば、ＨＳＶ−１株ＫＯＳ（ＧｅｎＢａｎｋ登録ＪＱ６７３４８０）はＩＣＰ０プロモーターを１，２９２から３，０６６までの塩基位置と１２３，１７５から１２４，９４９までの塩基位置に有している。また、ＨＳＶ−２株ＨＧ５２（ＧｅｎＢａｎｋ登録ＮＣ  ００１７９８．２）もＩＣＰ０プロモーターを、１，７５６から２６７３までの塩基位置と１２４，６４８から１２５，５６５までの塩基位置に有している。同様に、ＶＺＶは、ＩＥ６３と称されるＩＣＰ０様タンパク質をコードしている。ＶＺＶ（ＧｅｎＢａｎｋ登録ＮＣ  ００１３４８．１）のＩＥ６３プロモーターも同様に使用され得る。
【００１４】
眠れる森の美女（ＳＢ）トランスポザーゼは、遺伝的積み荷を含有しているＳＢトランスポゾンが同じ（シス）または別個（トランス）のプラスミドにて供給される触媒性トランスポザーゼとともに共送達されると、染色体への組込みおよび安定な遺伝子発現を媒介する。発現されると、トランスポザーゼは、トランスポゾンの５’末端および３’末端の直接反復（ＤＲ）配列に結合し、ドナープラスミドから介在遺伝子エレメントを除去し、該配列を細胞内のゲノム内のＴＡ−ジヌクレオチド標的部位に正確に挿入する（非特許文献４）。最も活性な型のトランスポザーゼを使用すると、組込み型ウイルスベクターと比較して、安定な遺伝子導入効率が遜色ない（非特許文献５）。
【００１５】
市販の誘導性発現系では前述の制限が生じていたため、目的遺伝子の誘導性制御とマーカー遺伝子の構成的発現とをもたらすことができる単一のプロモーターが使用された系を開発することが重要であった。この系をＳＢトランスポゾンと組み合わせることにより、安定な細胞株を速やかに作出および同定できることが予測された。この目標を念頭に置き、複数の遺伝子の協調的な発現を増進させる能力を有する両方向性調節性エレメントに関心が集まった（非特許文献６，７，８）。
【００１６】
研究者らにより、２つの遺伝子の発現を指令するＴｅｔ応答性エレメントを組み込んだ合成の両方向性プロモーターが構築された（非特許文献８，９）。しかしながら、このような合成プロモーターは、該プロモーターの片側に制御を限定することができず、構築のためには大きなクローニング労力が必要とされた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９２）Ｔｉｇｈｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，８９，５５４７−５５５１．
【非特許文献２】Ｂａｒｏｎ，Ｕ．ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．（２０００）Ｔｅｔ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ−ｂａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ：  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ａｄｖａｎｃｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３２７，４０１−４２１．
【非特許文献３】Ｉｖｉｃｓ，Ｚ．Ｎ．，Ｈａｃｋｅｔｔ，Ｐ．Ｂ．，Ｐｌａｓｔｅｒｋ，Ｒ．Ｈ．ａｎｄ  Ｉｚｓｖａｋ，Ｚ．（１９９７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ，ａ  Ｔｃ１−ｌｉｋｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｆｉｓｈ，ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ，９１，５０１−５１０．
【非特許文献４】Ｖｉｇｄａｌ，Ｔ．Ｊ．，Ｋａｕｆｍａｎ，Ｃ．Ｄ．，Ｉｚｓｖａｋ，Ｚ．，Ｖｏｙｔａｓ，Ｄ．Ｆ．ａｎｄ  Ｉｖｉｃｓ，Ｚ．Ｎ．（２００２）Ｃｏｍｍｏｎ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｉｔｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ  Ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３２３，４４１−４５２．
【非特許文献５】Ｍａｔｅｓ，Ｌ．，Ｃｈｕａｈ，Ｍ．Ｋ．，Ｂｅｌａｙ，Ｅ．，Ｊｅｒｃｈｏｗ，Ｂ．，Ｍａｎｏｊ，Ｎ．，Ａｃｏｓｔａ−Ｓａｎｃｈｅｚ，Ａ．，Ｇｒｚｅｌａ，Ｄ．Ｐ．，Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ａ．，Ｂｅｃｋｅｒ，Ｋ．，Ｍａｔｒａｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｒｏｂｕｓｔ  ｓｔａｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，４１，７５３−７６１．
【非特許文献６】Ａｍｅｎｄｏｌａ，Ｍ．，Ｖｅｎｎｅｒｉ，Ｍ．Ａ．，Ｂｉｆｆｉ，Ａ．，Ｖｉｇｎａ，Ｅ．ａｎｄ  Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｌ．（２００５）Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｄｕａｌ−ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２３，１０８−１１６．
【非特許文献７】Ａｎｄｒｉａｎａｋｉ，Ａ．，Ｓｉａｐａｔｉ，Ｅ．Ｋ．，Ｈｉｒａｔａ，Ｒ．Ｋ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．ａｎｄ  Ｖａｓｓｉｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．（２０１０）Ｄｕａｌ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｆｏａｍｙ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１７，３８０−３８８．
【非特許文献８】Ｂａｒｏｎ，Ｕ．，Ｆｒｅｕｎｄｌｉｅｂ，Ｓ．，Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９５）Ｃｏ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｂｙ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  ｖｉａ  ａ  ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３，３６０５−３６０６．
【非特許文献９】Ｌｏｅｗ，Ｒ．，Ｖｉｇｎａ，Ｅ．，Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ，Ｄ．，Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｌ．ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．（２００６）Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｔｅｔ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｕｎｉｔｓ  ｆｏｒ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｄ．，２，１０７−１１８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本明細書において以下に開示し、論考する本発明のアプローチは、天然に存在している両方向性プロモーターの機能にＴｅｔ／Ｄｏｘ調節およびトランスポゾン遺伝子送達を組み合せて、無（またはバックグラウンドレベル）から高値までの範囲に及ぶ劇的な遺伝子発現幅を有する細胞株の迅速な開発を可能にする新規な系を作出することである。このため、アルファヘルペスウイルス科（ｖｉｒｉａｅ）のうちの１種類、例えばＨＳＶ−１のゲノム由来の両方向性前初期（ＩＥ）プロモーターをクローニングした。このプロモーターは、このアクチベータータンパク質が存在している場合に遺伝子発現を基底レベルより大きく誘導するために利用され得る、天然の６つのＶＰ１６−応答エレメントを含むものであった。ＨＳＶ−１  ＩＥプロモーターは、２つのテトラサイクリン応答エレメント（２ｘＯｐ）を片側（５’末端）に導入することにより修飾されて、Ｄｏｘ調節遺伝子発現によってさらなるレベルの制御をもたらした。実例として、２つのレポーター遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および切断型形態の低親和性ヒト神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）（Ｇｅｎｂａｎｋ登録ＮＭ  ００２５０７．３）（１０）をそれぞれ、ＩＥプロモーターの５’末端および３’末端にライゲート（作動可能に連結）し、得られたカセットをＳＢトランスポゾン内に挿入した。
【００１９】
本発明の系と市販の誘導系（Ｔ−ＲＥｘＴＭ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）との間で、Ｔｅｔリプレッサータンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ登録ＡＢ４３４４７１．１）を安定的に発現する細胞株において、発現を比較した。この研究により、市販の系が有する厳密に調節された細胞株を生じる能力は限定的である（＜１５％の効率）ことが明らかになった。または、両方向性のＩＥ系を用いて得た細胞株のほとんどは、基底状態において、低値から検出不可能までのＧＦＰ発現を有するものであった。Ｄｏｘの添加により、ＧＦＰ発現の均一な増大がもたらされ、バックグラウンドより平均でほぼ１０倍上になり、このレベルは、ＤｏｘおよびＶＰ１６処理後では、ベースラインレベルよりほぼ１００倍上までの範囲まで有意に高くなった。
【００２０】
さらなる向上には、Ｔｅｔリプレッサータンパク質およびピューロマイシン耐性遺伝子産物をコードしているバイシストロニック転写物の高レベル発現を付与する第２のトランスポゾンの開発を含めた。この改良により、実例としてインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質の調節された広範な発現を伴う細胞株を速やかにもたらす能力が実証された。この系の特有の特徴は、現在使用されている方法の主な制限に対処し、哺乳動物モデルにおいて遺伝子投与の効果を調べるための優れたストラテジーをもたらすものである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明では、１つの遺伝子が構成的に発現されそして第２の遺伝子の発現が制御される新しい細胞株を作出するために、別個にまたは一緒に使用され得るポリヌクレオチド配列カセットが想定される。従って、本発明の一態様では、（ｉ）第１のポリヌクレオチド配列；（ｉｉ）第２のポリヌクレオチド配列；および（ｉｉｉ）第１のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列とに作動可能に連結された、アルファ−ヘルペスウイルス由来の前初期（ＩＥ）プロモーターを含む両方向性プロモーターを含む、ポリヌクレオチド配列を含むものであるＤＮＡ発現カセットが、想定される。ＩＥプロモーターは、第１および第２のポリヌクレオチド配列の、それぞれ構成的発現産物および制御性発現産物としての発現を付与する。両方向性プロモーターはさらに、（ａ）ＨＳＶ  ＶＰ１６タンパク質が結合すると第１のポリヌクレオチド配列の発現を基底レベルより上に高める発現エンハンサードメイン、および（ｂ）ＩＥプロモーターと第２のポリヌクレオチド配列との間に作動可能に連結された２つのテトラサイクリン応答エレメントを含むものである。
【００２２】
一実施形態では、第１のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも一方が、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含む。別の実施形態では、第１のポリヌクレオチド配列および第２のポリヌクレオチド配列の各々が制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含む。また別の実施形態では、該ポリヌクレオチド配列の各々が、複数の制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含む。なおさらなる一実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチド配列が、第１および第２の選ばれた遺伝子発現産物をコードしている。実例としての第１および第２のポリヌクレオチド配列は、蛍光性であるか、生物発光性であるか、または薬物耐性をもたらすタンパク質をコードしている。
【００２３】
想定される発現カセットは、さらに、第１のポリヌクレオチド配列および第２のポリヌクレオチド配列の各々の両方向性プロモーターに遠位のポリヌクレオチド配列末端に作動可能に連結された、トランスポザーゼによって認識されるトランスポゾン挿入配列を、含むものであり得る。また、上記に論考した発現カセット構築物のいずれかを含む発現ベクターも想定される。前述の発現カセットを染色体ＤＮＡ内に含む細胞もまた想定される。
【００２４】
本発明の想定される第２の態様は、（ｉ）テトラサイクリンリプレッサータンパク質をコードしている調節ポリヌクレオチド配列；（ｉｉ）抗菌剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードしている選択マーカーポリヌクレオチド配列；および（ｉｉｉ）該２つのポリヌクレオチド配列間に作動可能に連結された配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；（ｉｖ）これらの一群の配列の発現を付与するプロモーター；ならびに（ｖ）調節ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されていない該プロモーターの末端に作動可能に連結されたトランスポザーゼ結合部位および選択マーカーポリヌクレオチド配列の末端に作動可能に連結された別のトランスポザーゼ結合部位を含むポリヌクレオチド配列を含むものであるＤＮＡ調節カセットである。該プロモーターは、調節ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、調節ポリヌクレオチド配列と選択マーカーポリヌクレオチド配列の両方の発現を増進させる。
【００２５】
好ましい一実施形態では、テトラサイクリンリプレッサータンパク質が、テトラサイクリン応答エレメントに結合し、選択マーカーが、ピューロマイシンに対する耐性を付与する。別の実施形態では、該プロモーターが、ＣＭＶ前初期エンハンサーとニワトリβ−アクチン遺伝子の第１エキソンおよび第１イントロンとを含むキメラＣＡＧプロモーターである。
【００２６】
上記のＤＮＡ調節カセットを含む調節ベクターもまた想定される。
【００２７】
少なくとも２種類の別々にパッケージングされた成分を内包する容器を備えた、宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションに有用なキットもまた想定される。別々にパッケージングされた該成分のうちの１種類は、上記に規定したＤＮＡ発現カセットを含む発現ベクターのパッケージである。この場合も、該ＤＮＡ発現カセットは、（ｉ）第１のポリヌクレオチド配列；（ｉｉ）第２のポリヌクレオチド配列；および（ｉｉｉ）第１のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列とに作動可能に連結された、アルファヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ−１）由来の前初期（ＩＥ）プロモーターを含む両方向性プロモーターを含むポリヌクレオチド配列を含むものである。両方向性プロモーターはさらに、（ａ）ＨＳＶ  ＶＰ１６タンパク質が結合すると第１のポリヌクレオチド配列の発現を基底レベルより上に高める発現エンハンサードメイン、および（ｂ）ＩＥプロモーターと第２のポリヌクレオチド配列との間に作動可能に連結された２つのテトラサイクリン応答エレメントを含むものである。該ベクターは好ましくは、第１のポリヌクレオチド配列および第２のポリヌクレオチド配列の各々の両方向性プロモーターに遠位のポリヌクレオチド配列末端に作動可能に連結された、トランスポザーゼによって認識されるトランスポゾン挿入配列を、含むものである。
【００２８】
別々にパッケージングされた該成分の第２のものは、（ａ）テトラサイクリン応答エレメントに結合するテトラサイクリンリプレッサータンパク質をコードしている調節ポリヌクレオチド配列；（ｂ）ピューロマイシンに対する耐性を付与するタンパク質をコードしている選択マーカーポリヌクレオチド配列；（ｃ）該２つのポリヌクレオチド配列間に作動可能に連結された配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；（ｄ）調節ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター；ならびに（ｅ）調節ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されていない該プロモーターの末端に作動可能に連結されたトランスポザーゼ結合部位および選択マーカーポリヌクレオチド配列の末端に作動可能に連結された別のトランスポザーゼ結合部位を含むポリヌクレオチド配列を含む上記に規定した調節ベクターのパッケージである。該プロモーターは好ましくは、ＣＭＶ前初期エンハンサーとニワトリβ−アクチン遺伝子の第１エキソンおよび第１イントロンとを含み、上記調節ポリヌクレオチド配列と選択マーカーポリヌクレオチド配列の両方の発現を増進させる、キメラＣＡＧプロモーターである。
【００２９】
上述のような想定されるキットは、好ましくは、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒクラストランスポザーゼをコードしている（ａ）インビトロ転写されたＲＮＡまたは（ｂ）ベクターである、別個の第３のパッケージもまた含むものである。Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒクラストランスポザーゼは、好ましくは眠れる森の美女トランスポザーゼである。また、想定されるキットは好ましくは、使用のための書面の説明書を含むものである。
【００３０】
宿主細胞内において複数の遺伝子の発現を誘導する方法もまた想定される。該方法は、（ｉ）前述の２パッケージキットのベクターに加えてＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒクラストランスポザーゼをコードしている（ａ）インビトロ転写されたＲＮＡまたは（ｂ）ベクターにより、宿主細胞をトランスフェクトする工程；ならびに（ｉｉ）第１および第２のポリヌクレオチド配列と上記トランスポゾンとの発現が誘導されるのに充分な条件下で、該宿主細胞を維持して増殖させる工程を含むものである。また、２つ目に記載したキットの３つのベクターを使用してもよい。これまでの場合のように、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒクラスのトランスポゾンおよびトランスポザーゼは、眠れる森の美女トランスポゾンおよびトランスポザーゼである。
【００３１】
想定される発現誘導方法によれば、トランスフェクション薬剤は、約１当量のＤＮＡ発現カセット含有ポリヌクレオチドに対して約２当量の調節カセットポリヌクレオチドおよびトランスポザーゼコードＲＮＡまたはベクターの比率で使用される。別の実施形態では、トランスフェクション薬剤は３から４×１０５個の宿主細胞に対して約２０００ナノグラム（ｎｇ）の総量で使用される。このように使用される場合、トランスポザーゼコードＲＮＡまたはベクターが約５００ｎｇで使用され、その他の２種類のベクターが残りの約１５００ｎｇを構成し、この２種類のベクターは少なくともほぼ等量で使用される。好ましくは、調節カセットポリヌクレオチドとＤＮＡ発現カセット含有ポリヌクレオチドは、重量基準で約１：１から約６２５：１の重量比で使用される。より好ましくは、２種類のベクターは約２５：１から約１２５：１の重量比で使用される。
【００３２】
宿主細胞のトランスフェクションは、各トランスフェクション薬剤を一緒に用いて行なわれ得る。または、トランスフェクションは、１種類のベクターの後にその他の２種類、または２種類のベクターの後に１種類によって段階的に行なわれ得る。好ましい実施では、トランスフェクトされた細胞は、調製後に回収される。
【発明の効果】
【００３３】
本発明は、幾つかの有益性および利点を有する。
【００３４】
有益性の１つは、２種類の遺伝子産物が確実に発現され得る新しい細胞株の比較的容易な作製がもたらされることである。
【００３５】
本発明の利点の１つは、遺伝子産物のうちの１種類の発現は構成的であるが、第２の発現は制御性であることである。
【００３６】
本発明の別の有益性は、所望の遺伝子産物を発現する安定な哺乳動物細胞株を作製するために使用され得ることである。
【００３７】
本発明の別の利点は、その使用により、発現されると細胞に対して毒性であるが未発現遺伝子としては無毒性であるタンパク質またはポリペプチドをコードしている遺伝子を有する安定な細胞株の構築が可能になることである。
【００３８】
本発明のさらなる有益性は、研究者の要望に応じて毒性のタンパク質またはペプチドの発現のオンとオフの切換えができることである。
【００３９】
本発明のなおさらなる有益性および利点は、以下の開示内容から当業者に自明となろう。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１Ａ】図１Ａは、６つのＶＰ１６−応答エレメント（ＶＲＥ）がＩＣＰ０遺伝子の転写開始部位（ＴＡＴＡボックス）の上流の約６５０塩基対（ｂｐ）のＤＮＡ範囲に存在している野生型単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）のＩＣＰ０プロモーターの模式図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＶＰ１６結合部位を４つの無関連の制限部位と置き換える部位特異的変異誘発によってＶＲＥ−１、−２、−３および−４が改変されるように変異させた変異型ウイルスＨＳＶ−１  ＶＲＥ１−−４−におけるＩＣＰ０プロモーターの模式図である。ＨＳＶ−１  ＶＲＥ１−−４−のＩＣＰ０プロモーター内に存在する変異の詳細な配列を配列番号：１１に示し、対応する野生型配列を配列番号：１２に示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ベロ細胞に５プラーク形成単位（ｐｆｕ）／細胞にて接種した１２時間後のＩＣＰ０  ｍＲＮＡの蓄積のノーザンブロット解析の写真である。左から右に、模擬（非感染［ＵＩ］細胞）；野生型ＨＳＶ−１株ＫＯＳ；ＨＳＶ−１  ＶＲＥ１−−４−；およびＲＰ４と称するＨＳＶ−１  ＶＰ１６−変異型。
【図１Ｄ】図１Ｄは、図１Ｃに示したノーザンブロットの結果のデンシトメトリー解析を示すグラフである。ＩＣＰ０タンパク質の蓄積は、ベロ細胞に５ｐｆｕ／細胞の野生型ＨＳＶ−１株ＫＯＳまたはＨＳＶ−１  ＶＲＥ１−−４−を接種した１２時間後に測定し、ＩＣＰ０特異的モノクローナル抗体１１０６０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧでの免疫蛍光染色によって可視化した。
【図１Ｅ】図１Ｅは、免疫蛍光性染色細胞の定量的フローサイトメトリー解析を示すグラフである（ｎ＝３／群）。
【図２Ａ】図２Ａは、真核生物細胞内にトランスフェクションされると眠れる森の美女トランスポザーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録ＪＱ６９２１６９．１）（ひし形）を一過性で発現するプラスミドｐＰＧＫ−ＳＢの模式図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、フランキングした眠れる森の美女（ＳＢ）結合部位を含む、実例としてのプラスミドｐＩＴＲ−ＧＦＰ［Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  １０（３）：ｅ０１２２２５３（２０１５）においてＧ−ＩＥ−Ｎと称されている］の模式図であり、これは、トランスポザーゼ（ひし形）が該部位の左側部位と右側部位に結合し、真核生物細胞において宿主細胞の染色体内へのＳＢ部位間の積み荷ＤＮＡの導入をもたらし得るＤＮＡ鎖交換反応を媒介することを、可能にする。ｐＩＴＲ−ＧＦＰの積み荷は内部ＨＳＶ−１  ＩＣＰ０プロモーターであり、これは、Ｔｅｔリプレッサータンパク質（丸）が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩがＴＡＴＡボックス（Ｔｅｔオペレーターに挟まれた右矢印）の下流の転写開始部位にアクセスするのを立体的に妨害する、２つのＴｅｔオペレーター（四角）を含むように遺伝子改変されている。この遺伝子改変された「ＩＣＰ０，Ｔｅｔ調節型（Ｔｅｔ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）」（ＩＴＲ）プロモーターは両方向性であり、遺伝子発現をその左側からおよび右側から駆動する。左側では、ＩＴＲプロモーターは、細胞表面上にみられる切断型神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）を構成的に発現させ、目的のＩＴＲ−標的遺伝子を含む任意の安定な細胞株のフローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）分取を可能にする。右側では、ＩＴＲプロモーターは、任意の標的遺伝子、例えば、図示した実例としての緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーターの低レベルの基底発現をもたらす。過剰のＴｅｔリプレッサータンパク質（丸）の存在下では、標的遺伝子の基底発現を無視できるレベルまで低減させることが可能である。
【図２Ｃ】図２ＣはプラスミドｐＴｅｔ−Ｐｕｒｏの模式図であり、これは、トランスポザーゼ（ひし形）が該部位間の積み荷ＤＮＡを宿主細胞の染色体内に導入させることを可能にする、フランキングした眠れる森の美女（ＳＢ）結合部位を含んでいる。ｐＴｅｔ−Ｐｕｒｏの積み荷は、バイシストロニックメッセージの発現を（配列内リボソーム進入部位［ＩＲＥＳ］によって）（Ｇｅｎｂａｎｋ登録ＤＱ５２０２９１．１）駆動する強力なＣＡＧＳプロモーターを含んでおり、これは、（１）上流のＴｅｔリプレッサータンパク質（図２ＢのＩＴＲプロモーター内のＴｅｔオペレーターに対して作用する丸）と、（２）タンパク質翻訳阻害薬のピューロマイシンを不活性化させる下流のピューロマイシン耐性因子との、両方の発現を駆動する。ＣＡＧＳ−Ｔｅｔ−Ｐｕｒｏ発現カセットが染色体内に組み込まれた安定な細胞株は、ピューロマイシンを不活性化させるピューロマイシン選択マーカーを発現するので、従って、このような細胞は、ピューロマイシンの存在下で増殖することが可能である。対照的に、ｐＴｅｔ−Ｐｕｒｏ遺伝子カセットがない細胞は、強力なタンパク質翻訳阻害薬であるピューロマイシンで処理すると、急速に細胞分裂が止まる。
【図３Ａ】図３Ａは、図２Ａ−２Ｃに示した３つのプラスミドでの一過的トランスフェクション後の所望の安定なＮＧＦＲｈｉ細胞の純集団を単離するための時系列であり、Ｔｅｔ−Ｐｕｒｏ遺伝子発現カセットが安定的に組み込まれた細胞株のピューロマイシン選択のストリンジェンシーの漸増；およびＩＴＲプロモーターの左側からのＮＧＦＲ（図２Ｂに示す）の高レベル発現に基づく、ＩＴＲ−ＧＦＰ＋細胞の純集団の最終的なＦＡＣＳ選択による。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａに概要を示したピューロマイシン選択スキーム下での９０％までのＮＧＦＲ＋  ＩＴＲ−ＧＦＰ細胞の富化を経時的に示すグラフである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、フローサイトメトリー解析による計数を示すグラフであり、ＮＧＦＲｈｉ細胞（最も高いＮＧＦＲレベルを発現する細胞の１０％に及ぶ群によって示される）のＦＡＣＳ単離時のＩＴＲ−ＧＦＰ細胞におけるＮＧＦＲの不均一な発現を示している。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＮＧＦＲｈｉ細胞のＦＡＣＳ単離後のフローサイトメトリー解析を示す棒グラフであり、得られた細胞の９９．９％がＮＧＦＲ＋であることを示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、記載の細胞（ｃａｌｌｓ）の蛍光顕微鏡使用での観察結果を確認するウエスタンブロット解析の写真である；得られたＩＴＲ−ＧＦＰ細胞集団はＧＦＰ標的遺伝子を、ドキシサイクリン（Ｔｅｔリプレッサーを不活性化させる）による調節およびＶＰ１６による調節のどちらをも受ける様式で、発現する。また、この解析は、このプロトコル下で作製した休止ＮＧＦＲｈｉ  ＩＴＲ−ＧＦＰ細胞においてＧＦＰ基底発現の非常に明白なリークがみられることも示す。これらの細胞は、標的遺伝子のオンまたはオフを随意に切り換えることができる完全に調節可能な遺伝子発現系という所望の目標を満たしていない。この第１の型のベロベースのＩＴＲ−ＧＦＰ細胞は、オフに切り換えることができなかった。
【図４】図４は、安定な細胞株を作製するためにトランスフェクションにおいてｐＴｅｔ−Ｐｕｒｏリプレッサーの量を一定に維持する（７５０ｎｇ）とともに、ｐＩＴＲ−ＧＦＰプラスミドを、最低濃度（６ｎｇ）で１コピーのｐＩＴＲ−ＧＦＰあたり１２５コピーのｐＴｅｔ−Ｐｕｒｏがみられるまで希釈した（７５０、１５０、３０または６ｎｇで、約１：１、２５：１、５：１または１２５：１コピーの比が得られる）ときの結果を示すグラフである。４つのすべてのベロベースの安定な細胞株（ＩＴＲ−ＧＦＰ１：１；ＩＴＲ−ＧＦＰ５：１；ＩＴＲ−ＧＦＰ２５：１；およびＩＴＲ−ＧＦＰ１２５：１）における、基底ＧＦＰ蛍光対誘導型ＧＦＰ蛍光のフローサイトメトリー定量は、同じ定性的結論を支持する。ＧＦＰ発現は、蛍光顕微鏡使用により、さまざまな比率のｐＴｅｔ−Ｐｕｒｏ：ｐＩＴＲ−ＧＦＰプラスミドを用いて作製した安定なＩＴＲ−ＧＦＰ細胞株において示された（図示せず）。１：１の比では、ＴｅｔリプレッサーがＩＴＲプロモーターの右側（図２Ｂ）でサイレントになろうとする休止状態において、ＧＦＰ標的遺伝子の有意なリークが明白にみられる。対照的に、Ｔｅｔリプレッサー対ＩＴＲ−ＧＦＰが２５：１である比では、ＧＦＰレポータータンパク質のリークは無視できるレベルまで低下する。それにもかかわらず、ＩＴＲ−ＧＦＰ２５：１細胞は、１μＭのドキシサイクリンで処理すると容易に検出可能なＧＦＰを発現し、これらの細胞を、１μＭのドキシサイクリンおよび１０ｐｆｕ／細胞のＶＰ１６発現アデノウイルスベクターで処理すると、高レベルのＧＦＰ発現が観察される。
【図５Ａ】図５Ａは、ベロベースの安定な細胞株ＩＴＲ−ＧＦＰ１：１（図５Ａ）およびＩＴＲ−ＧＦＰ６２５：１（図５Ｂ）を用いた、図４におけるのと同様の基底ＧＦＰ蛍光対誘導型ＧＦＰ蛍光のフローサイトメトリー定量を示し、これを、親ベロ細胞（左側の黒）をピューロマイシン選択ＩＴＲ−ＧＦＰ細胞（右側）と比較するさらなる解析に供した。これらの結果は、少なくともＧＦＰレポーター遺伝子の場合、この遺伝系は、目的の標的遺伝子が、Ｔｅｔリプレッサーを不活性化するために１μＭのドキシサイクリンが使用される（Ｄｏｘのみ）のでない限り高度に抑制された状態（Ｄｏｘなし，ＶＰ１６なし）に維持され得る安定な細胞株の効率的な構築を可能にするという結論を明白に支持しており、遺伝子発現は、図１および図２Ｂに模式的に示したベクターのＩＣＰ０プロモーター内のＶＲＥに作用するＶＰ１６発現アデノウイルスベクターを用いて（Ｄｏｘ＋ＶＰ１６）さらに誘導され得ることを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ベロベースの安定な細胞株ＩＴＲ−ＧＦＰ１：１（図５Ａ）およびＩＴＲ−ＧＦＰ６２５：１（図５Ｂ）を用いた、図４におけるのと同様の基底ＧＦＰ蛍光対誘導型ＧＦＰ蛍光のフローサイトメトリー定量を示し、これを、親ベロ細胞（左側の黒）をピューロマイシン選択ＩＴＲ−ＧＦＰ細胞（右側）と比較するさらなる解析に供した。これらの結果は、少なくともＧＦＰレポーター遺伝子の場合、この遺伝系は、目的の標的遺伝子が、Ｔｅｔリプレッサーを不活性化するために１μＭのドキシサイクリンが使用される（Ｄｏｘのみ）のでない限り高度に抑制された状態（Ｄｏｘなし，ＶＰ１６なし）に維持され得る安定な細胞株の効率的な構築を可能にするという結論を明白に支持しており、遺伝子発現は、図１および図２Ｂに模式的に示したベクターのＩＣＰ０プロモーター内のＶＲＥに作用するＶＰ１６発現アデノウイルスベクターを用いて（Ｄｏｘ＋ＶＰ１６）さらに誘導され得ることを示す。
【図６Ａ】図６Ａは、フランキングした眠れる森の美女（ＳＢ）結合部位を含むプラスミドｐＩＴＲ−ＩＣＰ０の模式図であり、これは、トランスポザーゼ（ひし形）が左側と右側の該部位に結合し、該部位間の積み荷ＤＮＡを宿主細胞の染色体内に導入させることを可能にする。ｐＩＴＲ−ＩＣＰ０の積み荷は両方向性の遺伝子改変された「ＩＣＰ０，Ｔｅｔ調節型」（ＩＴＲ）プロモーターであり、これは、該プロモーターの左側から切断型神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）を構成的に発現させ、所望の安定なＩＴＲ−ＩＣＰ０細胞株のＦＡＣＳ分取を可能にする。右側では、ＩＴＲプロモーターは、Ｔｅｔ−Ｐｕｒｏ遺伝子発現カセット（図２Ｃ）によってもたらされる過剰のＴｅｔリプレッサータンパク質によって抑制され得る野生型ＩＣＰ０標的遺伝子の発現を制御する。
【図６Ｂ】図６Ｂは、処理後２４時間目のウエスタンブロット解析の写真であり、免疫蛍光顕微鏡使用（図示せず）により、処理後７２時間において、ＩＴＲ−ＩＣＰ０１２５：１細胞が休止抑制状態において発現しているＩＣＰ０タンパク質は検出不可能なレベルであることが確認される。ＩＴＲ−ＩＣＰ０１２５：１におけるＩＴＲプロモーターの抑制状態は１０ｐｆｕ／細胞のＶＰ１６発現アデノウイルスベクターによって逆転され得ないが、１μＭのドキシサイクリン単独で充分にＩＣＰ０タンパク質の合成が抑制解除される（図６Ｂ）。１μＭのドキシサイクリンとＶＰ１６との組合せにより、ＩＣＰ０の過剰発現が誘導され、これは細胞に対して非常に毒性である。
【図７Ａ】図７Ａは、１μＭのドキシサイクリンありまたはなしで処理したベロ細胞またはＩＴＲ−ＩＣＰ０１２５：１細胞への接種後の野生型ＨＳＶ−１の相対的複製効率を示す。各細胞処理群の４連の同型培養物に０．１ｐｆｕ／細胞の野生型ＨＳＶ−１を接種し、培養物を６、１２、２４および３６時間目に回収し、新たな感染性ウイルスの蓄積効率を時間の関数として測定した（ｎ＝３／処理／時間点）。図７Ａに示された結果は、野生型ＨＳＶ−１（ＩＣＰ０＋）が、ＩＣＰ０標的遺伝子がドキシサイクリンによって抑制解除されているか否かに関係なく、ベロ細胞（白丸）またはＩＴＲ−ＩＣＰ０１２５：１（黒四角）細胞において同等の効率で複製されることを示す。図７Ｂは、１μＭのドキシサイクリンでの処理あり（黒丸）またはなし（黒四角）のベロ細胞（白丸）またはＩＴＲ−ＩＣＰ０１２５：１細胞への接種後のＨＳＶ−１  ０−ＧＦＰ（ＩＣＰ０−変異型ウイルス）の相対的複製効率を示すグラフである。各細胞処理群の４連の同型培養物に０．１ｐｆｕ／細胞のＨＳＶ−１  ０−ＧＦＰを接種し、培養物を６、１２、２４および３６時間目に回収し、新たな感染性ウイルスの蓄積効率を時間の関数として測定した（ｎ＝３／処理／時間点）。結果は、ＨＳＶ−１  ０−ＧＦＰ（ＩＣＰ０−ヌル）ウイルスが、ＩＣＰ０標的遺伝子がＴｅｔリプレッサーによって優性的に抑制されたベロ細胞または非処理ＩＴＲ−ＩＣＰ０１２５：１細胞において等しく不充分に複製されることを示す（図６Ａおよび７Ｂ）。対照的に、１μＭのドキシサイクリンを用いてＩＴＲ−ＩＣＰ０１２５：１細胞におけるＩＣＰ０タンパク質の合成を抑制解除した場合、ＨＳＶ−１  ０−ＧＦＰ（ＩＣＰ０−ヌル）ウイルスの複製効率が約２００倍増大する。
【図７Ｂ】図７Ｂは、１μＭのドキシサイクリンありまたはなしで処理したベロ細胞またはＩＴＲ−ＩＣＰ０１２５：１細胞への接種後の野生型ＨＳＶ−１の相対的複製効率を示す。各細胞処理群の４連の同型培養物に０．１ｐｆｕ／細胞の野生型ＨＳＶ−１を接種し、培養物を６、１２、２４および３６時間目に回収し、新たな感染性ウイルスの蓄積効率を時間の関数として測定した（ｎ＝３／処理／時間点）。図７Ａに示された結果は、野生型ＨＳＶ−１（ＩＣＰ０＋）が、ＩＣＰ０標的遺伝子がドキシサイクリンによって抑制解除されているか否かに関係なく、ベロ細胞（白丸）またはＩＴＲ−ＩＣＰ０１２５：１（黒四角）細胞において同等の効率で複製されることを示す。図７Ｂは、ベロ細胞（白丸）または１μＭのドキシサイクリンでの処理あり（黒丸）またはなし（黒四角）のＩＴＲ−ＩＣＰ０１２５：１細胞への接種後のＨＳＶ−１  ０−ＧＦＰ（ＩＣＰ０−変異型ウイルス）の相対的複製効率を示すグラフである。各細胞処理群の４連の同型培養物に０．１ｐｆｕ／細胞のＨＳＶ−１  ０−ＧＦＰを接種し、培養物を６、１２、２４および３６時間目に回収し、新たな感染性ウイルスの蓄積効率を時間の関数として測定した（ｎ＝３／処理／時間点）。結果は、ＨＳＶ−１  ０−ＧＦＰ（ＩＣＰ０−ヌル）ウイルスが、ＩＣＰ０標的遺伝子がＴｅｔリプレッサーによって優性的に抑制されたベロ細胞または非処理ＩＴＲ−ＩＣＰ０１２５：１細胞において等しく、あまり複製されないことを示す（図６Ａおよび７Ｂ）。対照的に、１μＭのドキシサイクリンを用いてＩＴＲ−ＩＣＰ０１２５：１細胞におけるＩＣＰ０タンパク質の合成を抑制解除した場合、ＨＳＶ−１  ０−ＧＦＰ（ＩＣＰ０−ヌル）ウイルスの複製効率が約２００倍増大する。
【図８Ａ】図８Ａは、フランキングした眠れる森の美女（ＳＢ）結合部位を含むプラスミドｐＩＴＲ−ＯＢＰの模式図であり、これは、トランスポザーゼ（ひし形）を左側と右側の該部位に結合させ、そして該部位間の積み荷ＤＮＡを宿主細胞の染色体内に導入させることを可能にする。ｐＩＴＲ−ＯＢＰの積み荷は両方向性の遺伝子改変された「ＩＣＰ０，Ｔｅｔ調節型」（ＩＴＲ）プロモーターであり、これは、該プロモーターの左側から切断型神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）を構成的に発現させ、所望の安定なＩＴＲ−ＯＢＰ細胞株のＦＡＣＳ分取を可能にする。右側では、Ｔｅｔ−Ｐｕｒｏ遺伝子発現カセットによってもたらされる過剰のＴｅｔリプレッサータンパク質によって発現が抑制され得る起点結合タンパク質（ＯＢＰ）標的遺伝子の発現を、ＩＴＲプロモーターが制御する（図２Ｃおよび８Ａ）。
【図８Ｂ】図８Ｂは、処理後２４時間目のウエスタンブロット解析の写真であり、ＩＴＲ−ＯＢＰ−１２５：１細胞が休止状態において発現するＯＢＰタンパク質は検出不可能なレベルであることが確認される。ＩＴＲ−ＯＢＰ１２５：１におけるＩＴＲプロモーターの抑制状態は１０ｐｆｕ／細胞のＶＰ１６発現アデノウイルスベクターで逆転され得ないが、１μＭのドキシサイクリン単独で充分にＯＢＰタンパク質の合成が抑制解除される。１μＭのドキシサイクリンとＶＰ１６との組合せにより、ＯＢＰの過剰発現が誘導される。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ベロ細胞（白丸）または１μＭのドキシサイクリンでの処理あり（黒丸）またはなし（黒四角）のＩＴＲ−ＯＢＰ１２５：１細胞への接種後のＨＳＶ−１  ｈｒ９４（ＯＢＰ−変異型ウイルス）の相対的複製効率を示す。各細胞処理群の４連の同型培養物に０．１ｐｆｕ／細胞のＨＳＶ−１を３６時間接種し、新たな感染性ウイルスの蓄積効率を時間の関数として測定した（ｎ＝３／処理／時間点）。結果は、ＨＳＶ−１  ｈｒ９４（ＯＢＰ−ヌル）ウイルスは、ベロ細胞内では全く複製されず；ＯＢＰ標的遺伝子がＴｅｔリプレッサーによって抑制されている非処理ＩＴＲ−ＯＢＰ１２５：１細胞では非常に限定的に複製され（図８Ａ）；一方、ＨＳＶ−１  ｈｒ９４（ＯＢＰ−ヌル）ウイルスは、１μＭのドキシサイクリンを用いて図８ＢにおいてＯＢＰタンパク質の合成を抑制解除した場合、ＩＴＲ−ＯＢＰ−１２５細胞において２７０倍大きく効率的に複製されることを示す。
【図９】図９は、４μＭのドキシサイクリンの非存在下（Ｄｏｘなし）および存在下（Ｄｏｘ）で培養した、市販のテトラサイクリン誘導性発現系を使用して「オフ／オン」表現型を示すクローン細胞における、ＧＦＰの発現を示すフローサイトメトリーのヒストグラムを示す。クローンは、４つの表現型：誘導性でないクローン（非誘導）、充分に抑制状態でないクローン（リーク性）、一部のみ誘導状態のクローン（不均一）、または最適に抑制され誘導状態とみなされるクローン（最適）のうちの１つを示した。各カテゴリーのクローンのパーセンテージを示す（ｎ＝２１細胞株）。
【図１０Ａ】図１０Ａは、テトラサイクリン誘導性カセットのトランスポゾン媒介性送達に供され、４μＭのドキシサイクリン非存在下（Ｄｏｘなし）または存在下（Ｄｏｘ）で培養した細胞株における、ＧＦＰの発現を示すフローサイトメトリーのヒストグラムを示す。非誘導、リーク性、不均一または最適であるクローンの代表的な例を、表示した各群のクローンのパーセンテージとともに示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、抑制（Ｄｏｘなし）状態および抑制解除（＋Ｄｏｘ）状態でのＧＦＰ蛍光強度を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、抑制解除（＋Ｄｏｘ）の場合のＧＦＰ蛍光強度の増大倍数を示す。ＧＦＰ蛍光および増大倍数のグラフ表示は１９個のクローン株から計算し、平均＋ｓ．ｅ．ｍ．として報告した。
【図１１】図１１は、フローサイトメトリーにより作成した代表的なドットプロットを示し、順方向および逆方向でのＧ−Ｃ−ＮプロモーターのＮＧＦＲおよびＧＦＰの発現を示す。各型をヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ−２９３Ｔ）細胞にコトランスフェクトし、ピューロマイシン耐性細胞クローンを作出した（ｎ＝５／方向）。
【図１２Ａ】図１２Ａは、６つのＶＰ１６−応答エレメント（ＶＲＥ）がＩＣＰ０遺伝子の転写開始部位（ＴＡＴＡボックス）の上流の約６５０塩基対（ｂｐ）のＤＮＡ範囲に存在している野生型単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）ＩＣＰ０プロモーターの模式図である。ＨＳＶ−１  ＩＥ配列を眠れる森の美女トランスポゾンプラスミド内のＧＦＰのコード配列と切断型神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）のコード配列との間に挿入し、Ｇ−ＩＥ−Ｎ（上記のようにＩＴＲ−ＧＦＰとも称する）を作出した。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、Ｇ−ＩＥ−Ｎプロモーターでトランスフェクトした細胞における誘導前（ＶＰ１６なし）および誘導後（ＶＰ１６）の、フローサイトメトリーで測定したときのＧＦＰおよびＮＧＦＲの平均蛍光強度を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ＶＰ１６誘導後のＧＦＰおよびＮＧＦＲの蛍光強度の増大倍数を示す。ＧＦＰ蛍光および増大倍数のグラフ表示は３つの細胞株から計算し、平均＋ｓｅｍとして報告した。
【図１３Ａ】図１３Ａは、２ｘＯｐ配列を、転写開始部位の近傍でＴＡＴＡ部位付近の範囲内（Ｇ−ＩＥ−Ｎ（ＴＲＴＡＴＡ））または第１イントロン内（Ｇ−ＩＥ−Ｎ（ＴＲイントロン））において、野生型ＩＥプロモーター（Ｇ−ＩＥ−Ｎ）内に導入した位置を示す模式図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、表示した構築物（Ｇ−ＩＥ−Ｎ、Ｇ−ＩＥ−Ｎ（ＴＲＴＡＴＡ）および（Ｇ−ＩＥ−Ｎ（ＴＲイントロン））の各々について作製した代表的なクローンのドットプロットを示し、各構築物のＮＧＦＲおよびＧＦＰのレベルを示す。プロモーターの転写活性を、ナイーブＨＥＫ−２３９Ｔ細胞のクローン集団におけるＮＧＦＲおよびＧＦＰの発現のフローサイトメトリー解析によってモニタリングした。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、各ベクターにつき５個のクローンについて計算し、平均＋ｓｅｍとして報告したＧＦＰおよびＮＧＦＲについての平均蛍光強度の値のグラフ表示を示す。＊Ｐ＝０．０００６（スチューデントのＴ検定を使用，Ｇ−ＩＥ−Ｎと比較した場合）。
【図１４】図１４は、ＴＡＴＡ部位付近に導入されたテトラサイクリン−リプレッサー標的配列のタンデムコピー（２ｘＯｐ）を有するＨＳＶ−ＩＥプロモーターをコードしているＳＢトランスポゾンベクター（Ｇ−ＩＥ−Ｎ（ＴＲＴＡＴＡ））でトランスフェクトしたクローンのドットプロットを示し、抑制状態、−、および誘導状態でのＧＦＰおよびＮＧＦＲの共発現を、フローサイトメトリーによって示す。代表的な細胞株をドキシサイクリンの非存在下（抑制状態）、ドキシサイクリンの存在下（抑制解除状態）、またはＶＰ１６の発現をコードしているアデノウイルスベクター粒子（ｍ．ｏ．ｉ．＝３）でドキシサイクリン処理細胞を形質導入した場合（誘導状態）で培養した。
【図１５】図１５は、２つの細胞株から調製した全細胞ライセートのウエスタンブロットの写真を示し、細胞株は、Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン遺伝子の誘導性発現をコードしている（ＨＡ−ＩＥ−Ｎ）か、またはテトラサイクリン−リプレッサー（ＴｅｔＲ）とピューロマイシン耐性遺伝子（Ｐｕｒｏ）とのバイシストロニック発現をコードしている、眠れる森の美女トランスポゾンを、ＳＢトランスポザーゼ（ＰＧＫ−ＳＢ１１）と共にＨｅＬａ細胞にコトランスフェクトし、調節されたＨＡレベルを有する細胞株を作出し、次いで、ドキシサイクリンの非存在下（抑制状態，Ｒ）、４μＭのドキシサイクリンの存在下（抑制解除状態，ＤＲ）またはドキシサイクリン処理細胞をＶＰ１６の発現をコードしているアデノウイルスベクター粒子（ｍ．ｏ．ｉ．＝３）で形質導入した場合（誘導状態，ＩＮ）において、培養した。細胞膜をＨＡまたはＧＡＰＤＨ（これはローディングコントロールとして使用した）に対する抗体と反応させた。分子量（ｋＤａｌ）を示す。
【図１６】図１６は、ドキシサイクリンおよびＶＰ１６を用いて、修飾ＨＳＶ  ＩＥ両方向性プロモーターにより得られた、遺伝子発現レベルの制御された動的変化の図表を示す。トランスポゾン遺伝子導入は、ｉ）テトラサイクリンリプレッサータンパク質（黒丸）の安定な発現およびｉｉ）誘導性ＩＥ両方向性プロモーターによって制御される目的遺伝子（ＧＯＩ）の誘導性発現と組み合わせたＮＧＦＲの構成的発現を同時に有する細胞株を作出するために使用される。抑制状態では、Ｔｅｔリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）は標的配列（２ｘＯｐ）に結合し、ＧＯＩの転写を阻害する（オフ）。ＴｅｔＲは、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）が添加されると阻害され、転写が活性化される（抑制解除状態，オン）。ＩＥプロモーターの転写活性およびＧＯＩの発現は、抑制解除された細胞でのみ、ＶＰ１６トランスアクチベーターが発現されるとさらに増強され得る（誘導状態）。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
論考
本明細書において例示するアルファ−ヘルペスウイルスの天然に存在している両方向性ＩＰＣ０プロモーターであるＨＳＶ−１由来のプロモーターを、リプレッサーエレメントとアクチベーターエレメントの両方の組合せを用いて遺伝子発現の厳密に制御された動的変化が得られるように修飾した（図２Ｂ）。このプロモーターにより下流側での構成的遺伝子発現が付与される。このとき、安定的にトランスフェクトされた細胞が蛍光顕微鏡使用またはフローサイトメトリーを用いて簡便に同定されるように、実例としてＮＧＦＲ遺伝子を使用した。
【００４２】
高度に調節可能な遺伝子発現はプロモーターの上流側で行なわれ、遺伝子発現は、抑制状態であって「オフ」もしくは非常に低レベルのいずれかであるか、テトラサイクリンファミリーの薬物の存在下で抑制解除状態もしくは「オン」であるか、または該薬物およびＶＰ１６の存在下で誘導された状態である（図２Ｂ）。誘導状態の立体配置では、抑制状態と比較した場合、タンパク質レベルにおいて約１００倍の増大がもたらされる。
【００４３】
この系を例示的な眠れる森の美女トランスポゾンなどのトランスポゾン内に組み込むと、特に、リプレッサータンパク質に、薬物選択可能マーカーに連結させたＴｅｔリプレッサータンパク質の発現をコードしている第２のトランスポゾンを供給した場合に、上記の基準を満たす細胞株の非常に効率的な開発が可能になった。この結果は、ドキシサイクリン感受性抑制解除とＶＰ１６媒介性配列特異的誘導との組合せによって、遺伝子発現が本質的に「オフ」であるレベルから一様に「オン」へと厳密で一様に制御されることが可能である安定な細胞株を作出するために、哺乳動物細胞内に容易に送達され得る新規な両方向性プロモーターである。
【００４４】
協調的遺伝子発現は、遺伝子導入用途のために所望される形質であり、この場合、目的遺伝子は、陽性改変細胞の富化／選択を容易にするためのマーカー、即ち、薬物選択可能遺伝子、改変された細胞を標的して除去することを可能にする細胞傷害性遺伝子またはノックダウン遺伝子を指向するｓｈＲＮＡ配列と、共発現され得る。単一のベクターを用いて目的遺伝子とレポーターとの両方の発現を行なわせるために、幾つかのストラテジーが使用されている。
【００４５】
このようなストラテジーとしては、デュアルプロモーター（この場合、１つのプロモーターが目的遺伝子の発現を付与し、第２のプロモーターがレポーター遺伝子の発現を駆動する（２０））；遺伝子融合（この場合、目的遺伝子とレポーターを物理的に連結させる（２１））；または種々のリードスルー手法、例えば、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）［（２２）において概説される］および口蹄疫ウイルス２Ａペプチドもしくは誘導体［（２３）において概説される］が挙げられる。しかしながら、各ストラテジーは、それらの有用性を限定的にする幾つかの制限に悩むものである（６，２０，２４−２７）。
【００４６】
両方向性プロモーターの使用は、両方向性プロモーターが前述の系でみられる制限の多くに悩まされないため、デュアル遺伝子発現のより良い代替法として支持されてきた。ほとんどの研究者らは、単一のベクターから２つの独立した遺伝子の協調発現を行なわせる試みにおいて、合成の両方向性プロモーターを使用していた。例えば、Ａｍｅｎｄｉｏｌａおよび共同研究者らは、最小ＣＭＶプロモーターを、ヒトＰＧＫプロモーター断片およびユビキチンＣプロモーター断片と、反対方向でレンチウイルスベクター内にて融合させ、レポーター遺伝子の協調発現を実証した（６）。両方の遺伝子の協調的発現は行なわれたが、遺伝子発現は固定された量のままであり、プロモーターの選択および細胞または組織に特異的な環境に依存性のようであった（６）。また、ヒトゲノムＤＮＡに由来する内在性の両方向性プロモーターもまた、デュアル遺伝子発現を指令するために使用された（７）が、同様になんら動的な発現範囲はみられなかった。
【００４７】
両方向性プロモーターは、自然界では一般的であり、ヒトタンパク質コード遺伝子のおよそ１０％を構成していると推定されている（（２８）において概説される）。このようなプロモーターは多くの場合、調節された遺伝子同士（多くの場合、同じ生物学的経路、例えばＤＮＡ修復に関与している）の協調的発現を付与する（２９）。数名の著者らにより、両方向性活性は多くのプロモーターの共通の特色であり得ることが提唱されている［（３０）において概説される］。
【００４８】
バイオインフォマティクスアプローチにより一方向性プロモーターと両方向性プロモーターとのゲノム構造の違いが確認されており（２８，３０）、これにより、所与のプロモーターが両方向性機能を有するものであるかどうかの予測が可能になり得る。注目すべきことには、両方向性プロモーターは多くの場合、一方向性プロモーターよりも高いＧＣ（＞６０％）含量を示す。
【００４９】
ＨＳＶ  ＩＥプロモーターおよびＣＭＶ  ＩＥプロモーターはどちらもヘルペスウイルス科（ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｆａｍｉｌｙ）（ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ））の構成員であるが、２つのうち、アルファ−ヘルペスウイルス由来のＨＳＶ  ＩＥプロモーターのみが両方向性活性の能力を有する。興味深いことに、ＨＳＶ  ＩＥプロモーターは６８％のＧＣ含量を有するが、完全長ＣＭＶプロモーターは４７．７％のＧＣ含量を有し、切断型の（市販の）ＣＭＶプロモーターは４８．４％のＧＣ含量を有する。ＣＭＶはベータ−ヘルペスウイルス科の構成員である。
【００５０】
さらに、ＣｐＧアイランド検索（３１，３２）により、ＨＳＶ  ＩＥプロモーターについて幅広いＣｐＧアイランド構造が明らかになったが、ＣＭＶプロモーターについては見いだされなかった。これにより、ヒトとウイルスとでは同様のゲノム編成の両方向性プロモーターが存在することが示唆される。
【００５１】
外来性遺伝子の発現の誘導性制御は、多くの場合、目的遺伝子の定量的および／または時間的レベルの微調整を可能にするために望ましい。ほとんどの場合に、テトラサイクリンリプレッサーの成分が、その単純性、使用し易さおよび速やかな遺伝子誘導ゆえに、誘導性ベクター系において使用される。しかしながら、Ｔｅｔ調節型の系は「リーク性」ものであり得、即ち、誘導因子がない場合であってもいくらかの遺伝子発現レベルを許容し得る（図１Ｂおよび３Ｃ参照）（１，１６）。さらに、Ｔｅｔ調節型のベクターは典型的には、通常、最大レベルでのみ遺伝子発現の「オン」または「オフ」状態を可能にする。
【００５２】
個々のポリヌクレオチドカセット配列、該配列を含むベクターおよびカセットの系は、現在利用可能な誘導性ベクターと比べて幾つかの鍵となる特色を有する。第１に、厳密に調節された様式での遺伝子発現が可能となるように、２つのＴｅｔ応答エレメントを内在性ＨＳＶ両方向性プロモーター内に組み込んでいる。Ｄｏｘの添加後の遺伝子発現は、一様にバックグラウンドより平均でほぼ１０倍上であり、おそらくハウスキーピング遺伝子の範囲内である。
【００５３】
第２に、ＨＳＶ両方向性プロモーターの使用は、その天然に存在しているＶＰ１６応答エレメントにより、第２度（ｓｅｃｏｎｄ  ｄｅｇｒｅｅ）（ｄｏｘ抑制解除よりも約１０倍上）の遺伝子発現をもたらし、最終タンパク質レベルをさらに調節する。
【００５４】
第３に、ＨＳＶプロモーターの両方向性の性質により、細胞をＤｏｘまたはＤｏｘおよびＶＰ１６で処理した場合、第２の遺伝子の発現が影響を受けないことが可能になる。これは、第２の遺伝子がレポーター遺伝子（ここでは、ＮＧＦＲ）である（この場合、遺伝子導入の正確な評価のため、および抑制状態または「オフ」表現型を有する細胞を容易に選択するために一貫性のある発現が必要である）場合に好都合である。
【００５５】
得られたデータは、ＮＧＦＲと目的遺伝子とが同じ細胞内で共発現されることを示しており、それによって、目的遺伝子の発現のインジケータとしてのレポーター遺伝子の妥当性が確認される。
【００５６】
この系は、操作に利用可能な細胞の範囲を拡張するためのウイルスベクターを作出するために使用される技術に適合可能である。このような一群の特徴は、現在使用されている方法の主な制限に対処し、任意の哺乳動物モデルにおいて遺伝子投与の効果を調べるための優れたストラテジーをもたらす。
【００５７】
より具体的には、本発明では、１つの遺伝子が構成的に発現され、第２の遺伝子の発現が制御される新しい細胞株を作出するために、別個にまたは一緒に使用され得るポリヌクレオチド配列カセットが想定される。従って、本発明の一態様では、（ｉ）第１のポリヌクレオチド配列；（ｉｉ）第２のポリヌクレオチド配列；および（ｉｉｉ）第１のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列とに作動可能に連結された、アルファヘルペスウイルス、例えばＨＳＶ−１由来の前初期（ＩＥ）プロモーターを含む両方向性プロモーターを含むポリヌクレオチド配列を含むものであるＤＮＡ発現カセットが、想定される。ＩＥプロモーターは、第１および第２のポリヌクレオチド配列のそれぞれ構成的発現産物および制御性発現産物としての発現を付与する。両方向性プロモーターはさらに、（ａ）ＨＳＶ  ＶＰ１６タンパク質が結合すると第１のポリヌクレオチド配列の発現を基底レベルより上に高める発現エンハンサードメイン、および（ｂ）ＩＥプロモーターと第２のポリヌクレオチド配列との間に作動可能に連結された２つのテトラサイクリン応答エレメントを含むものである。
【００５８】
一実施形態では、第１のポリヌクレオチド配列および第２のポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも一方が制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含む。別の実施形態では、第１のポリヌクレオチド配列および第２のポリヌクレオチド配列の各々が制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含む。また別の実施形態では、該ポリヌクレオチド配列の各々が複数の制限エンドヌクレアーゼの認識部位、即ちマルチプルクローニングサイトを含む。
【００５９】
マルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）は、ポリリンカーとも称され、多く（約２０個まで）の制限部位を含む短いＤＮＡセグメントであり（改変されたプラスミドの標準的な特色）、当該技術分野でよく知られている。ＭＣＳ内の制限部位は典型的には特有であり、所与のプラスミド内に１つしか存在しない。ＭＣＳは、分子クローニングまたはサブクローニングを伴う手順の際に一般的に使用される。バイオテクノロジー、バイオエンジニアリングおよび分子遺伝学において極めて有用であり、ＭＣＳにより、当業者は、１つのＤＮＡセグメントまたは幾つかのＤＮＡセグメントを、ＭＣＳの領域内に挿入することが可能である。
【００６０】
実例としての制限エンドヌクレアーゼ認識部位としては、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｐＥＩ、ＭｆｅＩ、ＭｌｕＩ、ＮｃｏＩ、ＰｍｅＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩからなる群より選択される酵素の１つ以上の部位が挙げられる。好ましくは、２つ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位が存在する。商業的状況において販売されている製品として想定されるＤＮＡ発現カセットでは、典型的には、制限エンドヌクレアーゼの認識部位が第１のポリヌクレオチド配列および第２のポリヌクレオチド配列の少なくとも一方として使用される。
【００６１】
なおさらなる一実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチド配列が、第１および第２の選ばれた発現産物をコードしている。実例としての第１のポリヌクレオチド配列は、蛍光性であるか、生物発光性であるか、もしくは薬物耐性をもたらすタンパク質、またはなんらかの他のマーカータンパク質もしくはマーカーポリペプチドであるタンパク質をコードしており、これらは、配列のトランスフェクションが成功裡であったことを示すために使用され得る。このようなマーカータンパク質またはポリペプチドは、好ましくは、構成的に発現される様式で挿入される。
【００６２】
第２の発現産物のポリペプチドまたはタンパク質は、多くの場合、生物学的に活性であり、制御性発現産物として発現されるものである。かかるポリペプチドまたはタンパク質の実例は、構成的に発現されると細胞に対して毒性であるもの、例えばインターフェロン−γ、または別の様式で重要なもの、例えば、タウタンパク質、β−アミロイド、プログラム細胞死１受容体（ＰＤ−１）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質−４）サイトカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦであり得る。
【００６３】
想定される発現カセットは、さらに、第１のポリヌクレオチド配列および第２のポリヌクレオチド配列の各々の両方向性プロモーターに遠位のポリヌクレオチド配列末端に作動可能に連結された、トランスポザーゼによって認識されるトランスポゾン挿入配列を、含むものであり得る。また、上記に論考した発現カセット構築物のいずれかを含む発現ベクターも想定される。前述の発現カセットを染色体ＤＮＡ内に含む細胞もまた想定される。
【００６４】
また、調節ＤＮＡカセットも想定される。このカセットは、（ｉ）テトラサイクリンリプレッサータンパク質をコードしている調節ポリヌクレオチド配列；（ｉｉ）抗菌剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードしている選択マーカーポリヌクレオチド配列；および（ｉｉｉ）該２つのポリヌクレオチド配列間に作動可能に連結された配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；（ｉｖ）プロモーター；ならびに（ｖ）調節ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されていないバイシストロニックプロモーターの末端に作動可能に連結されたトランスポザーゼ結合部位および選択マーカーポリヌクレオチド配列の末端に作動可能に連結された別のトランスポザーゼ結合部位を含むポリヌクレオチド配列を、含むものである。この構造を、図２Ｃに模式的に示す。
【００６５】
このプロモーターは、発現カセットに関して論考した両方向性プロモーターとは異なるものであり、調節ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結され、調節ポリヌクレオチド配列と選択マーカーポリヌクレオチド配列との両方の発現を増進させる。
【００６６】
好ましくは、選択マーカーは、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、カナマイシン、ブラストサイジン、トリクロサンおよびフレオマイシンＤ１などの抗菌剤に対する耐性を付与するものである。当業者には、改変細胞において同じ抗生物質に対する第２のマーカーの使用の回避は理解されるであろうが、幸い、選択を行なうための薬物およびマーカー遺伝子は、幾つか存在する。
【００６７】
調節カセットのテトラサイクリンリプレッサータンパク質は、テトラサイクリン応答エレメントに結合する。調節カセットのバイシストロニックプロモーターは、好ましくは、ＣＭＶ前初期エンハンサーとニワトリβ−アクチン遺伝子の第１エキソンおよび第１イントロン（本明細書において以下に論考）とを含むキメラＣＡＧプロモーターである。
【００６８】
ベクター
本発明のさらなる一態様は、本明細書において先に規定した核酸またはポリヌクレオチドを含むベクター、例えば発現ベクター、クローニングベクターまたはレポーターベクターである。ベクターは、外来遺伝物質を別の細胞に運ぶための媒体として使用されるＤＮＡ分子であり、この細胞において、該遺伝物質は、複製および／または発現され得る。ベクターの主要な４つの型はプラスミド、ウイルスベクター、コスミドおよび人工染色体である。
【００６９】
このようなベクターは、当該技術分野でよく知られている。多くのこのようなベクターが市販されており、当該技術分野で同様によく知られた組換え手法、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（第２版  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）などのマニュアルに示された方法に従って作製され、使用され得る。例えば、Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  １０（３）：ｅ０１２２２５３（２０１５）；Ｃｈａｌｆｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３：８０２−８０５（１９９４）および米国特許第９，２７３，３２６号を参照のこと。
【００７０】
従って、本発明の別の態様では、ベクターの一部として存在する前述のＤＮＡカセットが想定される。本発明のベクターの実施形態の一態様では、ＤＮＡ配列の少なくとも１つがマルチプルクローニングサイトで構成された前述のＤＮＡ発現カセットに作動可能に連結されたベクターが想定される。好ましくは、両方のＤＮＡ配列が、マルチプルクローニングサイトである。この型のベクターは、自分で選んだタンパク質またはポリペプチド配列を挿入する他者に販売され得る、商業的環境において特に有用である。また、該発現カセットに作動可能に連結されたベクターは、タンパク質またはポリペプチドをコードしている該発現カセットのＤＮＡ配列の一方を有するものであっても両方を有するものであってもよい。
【００７１】
また、前述の調節ＤＮＡカセットは、好ましくは、ベクター内に存在することにより、そのＤＮＡが宿主細胞内に取り込まれて、該ＤＮＡ発現カセットの発現を調節し得る。
【００７２】
トランスポゾン
転移因子（ＴＥ）は、可動遺伝子エレメントの幾つかの型のうちの１つを表す。ＴＥは、コピーアンドペースト（クラスＩ  ＴＥ）またはカットアンドペースト（クラスＩＩ  ＴＥ）のいずれかで示され得るその転移機構に従って、２つのクラスのうちの１つに割り当てられる。クラスＩＩ  ＴＥはクラスＩ  ＴＥよりもはるかに一般性が低い。
【００７３】
クラスＩＩ  ＴＥは、ヒトゲノム内において転移因子の２％未満を構成している。クラスＩＩ  ＴＥのカットアンドペースト転移機構はＲＮＡ中間体を含まない。転移は幾つかのトランスポザーゼ酵素によって行なわれる。
【００７４】
一部のトランスポザーゼは、ＤＮＡ内の任意の標的部位に非特異的に結合するが、他の一部のものは、特定のＤＮＡ配列標的部位にのみ結合する。標的部位では、トランスポザーゼにより、一本鎖の５’もしくは３’ＤＮＡ突出端または５’もしくは３’ＤＮＡ付着末端をもたらす互い違いの切断部が作製される。また、この互い違いの切断部によりＤＮＡ型トランスポゾンも切り出され、これが新しい標的部位内にライゲートされ、即ち挿入される。次いで、ＤＮＡポリメラーゼがギャップを埋め込み、ＤＮＡリガーゼが糖鎖−リン酸骨格をふさぐ。従って、標的部位が複製される。
【００７５】
ＤＮＡ型トランスポゾンは、遺伝子エレメントを、標的ＤＮＡ内に作製された互い違いの切断部の埋め込みによって作出された短い直列反復配列およびそれに続く一連の逆向き反復配列によって同定され得る部位に、挿入する。カットアンドペーストＴＥは細胞周期のＳ期の間に複製されて、遺伝子の複製をもたらし得る。
【００７６】
マリナー（ｍａｒｉｎｅｒ）様因子は、ヒトおよび他の種にみられる別の著名なクラスのトランスポゾンである。ｍａｒｉｎｅｒトランスポゾンは、最初にショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）において見出され、多くの種において水平伝播される能力で知られている。ヒトゲノム内には推定１４０００コピーのｍａｒｉｎｅｒが存在し、２６０万塩基対を構成している。
【００７７】
より最近では、眠れる森の美女（ＳＢ）トランスポゾンが転移因子として使用されている。このトランスポゾンは、サケのゲノムＤＮＡから得られた絶滅した（ｅｘｔｉｎｃｔ）トランスポザーゼ配列から再構築された。これは、一部の魚類のゲノムにみられるＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒクラスのトランスポゾンの構成員である。魚類にみられるトランスポザーゼ遺伝子は１０００万年以上の間、不活性であった。多くの不活性な魚類トランスポザーゼの配列を使用し、祖先型（および機能性）のトランスポザーゼの推定配列が設計および構築された。
【００７８】
ＳＢトランスポザーゼは、直列反復配列に結合するアミノ末端ＤＮＡ認識結合ドメイン、核局在配列、およびカットアンドペースト反応（転移反応）を触媒するドメインを有する、ポリペプチドである。ＤＮＡ認識ドメインは、２つの対になるボックス配列を有し、該配列はＤＮＡに結合し得るものであり、一部の転写因子にみられる種々のモチーフと関連している。この触媒性ドメインは、多くのトランスポザーゼおよびリコンビナーゼ酵素にみられるホールマークアミノ酸を有する。
【００７９】
ＳＢトランスポゾンは、組換え遺伝子を宿主細胞および生物体に導入するための非ウイルスベクターとして開発されたものであり、これにより、ウイルスに対する細胞の防御機構の誘発が回避される。遺伝的積み荷は発現カセット（遺伝子および該遺伝子の発現を所望のレベルに調節する能力を授与する関連エレメント）であり得る。ＳＢトランスポゾンは、プラスミドよりもさらに容易かつ効率的に宿主細胞内に組み込まれる。
【００８０】
ＳＢトランスポゾンの具体的な実施形態は、例えば、米国特許出願公開第２０１５／００７２０６４号に記載されており、これには、導入遺伝子をゲノム内に組み込むための好適なベクターとしてのＳＢトランスポゾンが記載されている。
【００８１】
本発明のまた別の態様は、トランスポザーゼ結合部位コード配列を、先に論考したＤＮＡ発現カセットおよび先に論考したＤＮＡ調節カセットのいずれかの末端に含めることである。このような結合部位の使用により、トランスポゾンおよびトランスポザーゼ結合部位間に組み込まれたＤＮＡ配列が宿主細胞のＤＮＡ配列（染色体）内に配置されることが可能になる。また、先に論考したベクターは、トランスポザーゼ結合部位コード配列を該カセット配列の両末端に含むものである。本明細書における以下の論考は、カセットおよびベクターの構築におけるこのようなエレメントの使用の実例を示し、トランセクション（ｔｒａｎｓｅｃｔｉｏｎ）のためのベクターの使用を含む。
【００８２】
トランスポザーゼ結合部位コード配列を含むベクターのトランスフェクションに同様に使用されるのは、適切なトランスポザーゼ酵素をコードしているベクターである。眠れる森の美女（ＳＢ）トランスポゾンが好ましいトランスポゾンであり、この使用を本明細書において以下に実例を示す。
【００８３】
本発明のさらなる一態様は、上記に規定した少なくとも１種類の核酸、ポリヌクレオチドカセットまたはベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を含む。該核酸またはポリヌクレオチド（またはベクター）は、宿主細胞の染色体外にとどまるものであってもよく、または例えば相同または非相同組換えによって、宿主細胞のゲノム内に挿入状態になるものであってもよい。
【００８４】
宿主細胞は、遺伝子操作され得、好ましくは増殖し得る任意の細胞であり得る。細胞は、真核生物のものであっても原核生物のものであってもよい。細胞は哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、真菌、細菌細胞など、またはキメラ細胞であり得る。細胞の典型的な例としては、細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、デイノコッカス属種（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）など）ならびに哺乳動物細胞、例えば、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞、ベロ（アフリカミドリザル腎臓）細胞およびＨｅＬａ子宮頸癌細胞が挙げられる。本発明は、なんら特定の細胞の型に限定されず、共通一般知識に従って、あらゆる種類の細胞に適用され得ることは理解されよう。形質転換は、それ自体は当該技術分野で既知の手法、例えば、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿などを用いて行なわれ得る。
【００８５】
想定されるトランスポザーゼは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡの形態であり得る。特定の状況では、ＲＮＡ型のトランスポザーゼが好ましい。
【００８６】
本発明のなおさらなる一実施形態は、宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションに有用なキットである。一態様では、想定されるキットは、（ｉ）ＤＮＡ配列の少なくとも１つがマルチプルクローニングサイトを含むものである（好ましくは、両方のＤＮＡ配列がこのような部位を含む）ＤＮＡ発現カセットを含む発現ベクターのパッケージと；（ｉｉ）（ａ）テトラサイクリン応答エレメントに結合するテトラサイクリンリプレッサータンパク質をコードしている調節ポリヌクレオチド配列；（ｂ）ピューロマイシンに対する耐性を付与するタンパク質をコードしている選択マーカーポリヌクレオチド配列；（ｃ）該２つのポリヌクレオチド配列間に作動可能に連結された配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；ならびに（ｄ）上記調節ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド配列を含む調節ベクターのパッケージとを含む容器を備えたものである。該プロモーターは、ＣＭＶ前初期エンハンサーとニワトリβ−アクチン遺伝子の第１エキソンおよび第１イントロンとを含むものであり、調節ポリヌクレオチド配列と選択マーカーポリヌクレオチド配列の両方の発現を増進させる。
【００８７】
ベクター含有パッケージは、ＤＮＡ配列が減損または外部原因による汚染なく、数ヶ月間保持され得る任意の入れ物を含み得る。実例としてのパッケージは、ガラス、ポリプロピレン、ポリカーボネート、またはプラスチック（例えば、ポリエチレンもしくはポリプロピレン）で被覆されたアルミニウムなどの金属箔で作製されたものであり得る。キットはさらに、好ましくは、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒクラストランスポザーゼをコードしている（ａ）ＲＮＡまたは（ｂ）ＤＮＡベクターのパッケージを含むものである。該Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒクラスのトランスポゾンは、好ましくは眠れる森の美女トランスポザーゼである。想定されるキットはさらに、使用のための書面の説明書を含むものである。
【００８８】
また、本発明は、上記に規定した少なくとも１種類の核酸、ポリヌクレオチドまたはベクターでトランスフェクトされた組換え細胞に関する。好ましくは、宿主細胞は、発現ＤＮＡカセット配列を含むベクターにより、および調節ＤＮＡカセット配列を含むベクターとによってもまた、トランスフェクトされる。最も好ましくは、組換え細胞は、該２つのベクターのカセットのＤＮＡ配列の宿主細胞ゲノム内への組込みを可能にするトランスポザーゼによってもまた、トランスフェクトされる。
【００８９】
宿主細胞内において複数の遺伝子の発現を誘導する方法もまた、想定される。該方法は、（ｉ）宿主細胞を前述のキットのベクターに加えてＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒクラストランスポザーゼをコードしている（ａ）ＲＮＡまたは（ｂ）ベクターでトランスフェクトする工程；ならびに（ｉｉ）該宿主細胞を、第１および第２のポリヌクレオチド配列と該トランスポザーゼとの発現が誘導されるのに充分な条件下で維持して増殖させる工程を、含む。Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒクラスのトランスポゾンおよびトランスポザーゼは、好ましくは眠れる森の美女トランスポゾンおよびトランスポザーゼ（ｔｒａｓｎｓｐｏｓａｓｅ）である。
【００９０】
想定される方法の実施において、該トランスフェクション薬剤は、約１当量のＤＮＡ発現カセット含有ポリヌクレオチドに対して約２当量の調節カセットポリヌクレオチドおよびトランスポゾンコードＲＮＡまたはベクターの比率で使用される。重量の観点からは、該トランスフェクション薬剤は、３から４×１０５個の宿主細胞に対して約２０００ナノグラム（ｎｇ）の総量で使用される。好ましくは、トランスポゾンコードＲＮＡまたはベクターは約５００ｎｇで使用される。
【００９１】
また、調節カセットポリヌクレオチドおよびＤＮＡ発現カセット含有ポリヌクレオチドは、約１：１から約６２５：１の重量比で使用されることが好ましい。より好ましくは、調節カセットポリヌクレオチドおよびＤＮＡ発現カセット含有ポリヌクレオチドは、約２５：１から約１２５：１の重量比で使用される。
【００９２】
また、該トランスフェクション薬剤の各々でのトランスフェクションが、一緒に行なわれることが好ましい。また、該方法は好ましくは、トランスフェクトされた細胞を回収するさらなる工程をも含むものである。
【００９３】
結果
安定な遺伝子送達後のテトラサイクリン誘導性発現系の制限
市販の誘導性ベクター（Ｔ−ＲＥｘ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の有効性を、Ｄｏｘによる抑制解除に応答した遺伝子発現の制御について試験した。ヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ−２９３Ｔ）をトランスフェクトし、共発現させたブラストサイジン耐性遺伝子に対する耐性について選択することにより、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）の安定な発現を有する細胞株を作出した。
【００９４】
このＴｅｔＲ発現株を、続いて、Ｔｅｔ調節型のｈＣＭＶプロモーター（ＴＲＰ  ２ｘＯＰと称する）の制御下のＧＦＰコードベクターでトランスフェクトした。細胞を、共発現させたハイグロマイシン遺伝子に対する耐性について選択し、２１個の充分に単離されたクローンを拡大培養し、Ｄｏｘの非存在下または存在下で培養した場合のＧＦＰ発現についてフローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡使用によって調べた。
【００９５】
プロモーター機能を、最適な機能遂行の指標であるとみなされる２つの基準：（ｉ）抑制（Ｄｏｘなし）：＞６０％の細胞集団がＧＦＰ陰性であり、平均蛍光強度（ＭＦＩ）は＜５０（細胞を蛍光顕微鏡で可視化した場合、この蛍光レベルは検出限界より下であるため閾値として選択される）である、および（ｉｉ）活性化（＋Ｄｏｘ）：＞８０％の細胞集団がＧＦＰ陽性であり、平均１０倍のＭＦＩの増大を示す、を用いて評価した。この基準に基づき、生じた細胞株を４つのカテゴリー：（ｉ）非誘導：Ｄｏｘの添加後のＭＦＩの増大なし；（ｉｉ）リーク性：初期ＭＦＩ（Ｄｏｘなし）＞５０；（ｉｉｉ）不均一：Ｄｏｘの添加後、＜５０％の細胞集団がＧＦＰの発現の１０倍の増大を示す；（ｉｖ）最適：初期ＭＦＩ（Ｄｏｘなし）＜５０（この場合、活性化（＋Ｄｏｘ）ＭＦＩは初期レベルの＞１０倍であり、細胞集団のほとんど（少なくとも８０％）において観察される）に割り当てることができた。この結果を以下の表Ｉに表形式にする。
【００９６】
【表１】
2018508223.tif 000003
市販のＴｅｔ−Ｏｎベクター系およびランダム組込みを用いて得た細胞株の表現型。ＭＦＩ：平均蛍光強度。Ｄｏｘなし、＋Ｄｏｘおよび誘導倍数の値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。
【００９７】
この基準を使用すると、クローンの過半数（２１個のうち１２個）は、リーク性ＧＦＰ発現を示し、このため、Ｄｏｘの非存在下であっても、ＧＦＰは、フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡使用によって容易に検出可能なレベルで発現された（図９）。残りの９個のクローンは非誘導群、不均一群または最適群に等しく分かれた（図９）。ＤｏｘなしおよびＤｏｘありでのＧＦＰ発現のＭＦＩ、誘導倍数、Ｄｏｘ処理によって誘導された細胞のパーセント。
【００９８】
前述の細胞株は、プラスミドトランスフェクションおよびその後の共発現ハイグロマイシンマーカーについての選択によって作出した。この方法は、宿主細胞ゲノムにおけるランダムな非相同組換えを必要とするが、これは非効率的かつ不正確であり、そしてゲノム上の位置的効果の影響を受ける（１５）。トランスポゾン媒介性遺伝子導入により、このような制限の多くが対処され得、最適なＤｏｘ抑制／抑制解除の基準を満たすクローン（即ち、基底状態では低い／検出不可能なＧＦＰ発現を示すがＤｏｘ処理後はロバストなＧＦＰ発現を示すクローン）の数を増大させ得ることが想定された。
【００９９】
この目的のため、Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）ベクター由来のＴｅｔ調節型プロモーター−ＧＦＰ−ポリＡカセットをＳＢトランスポゾン内に導入し、ＴｅｔＲ発現細胞を、このベクター、ピューロマイシン耐性遺伝子の発現をコードしている第２のトランスポゾン、およびＳＢトランスポザーゼをコードしているベクター（ＳＢ１１；図１０Ａ−１０Ｃ）でコトランスフェクトし、ピューロマイシンに対する耐性について選択した。
【０１００】
１９個のクローンを単離し、再度、Ｄｏｘの非存在下および存在下でのＧＦＰ発現についてスクリーニングした。しかしながら、ＳＢトランスポゾンを用いた誘導性発現系の送達は、最適なＤｏｘ調節ＧＦＰ発現の達成において、単純なプラスミドトランスフェクションより良くはないことが示された（図１０Ａおよび以下の表ＩＩ）。
【０１０１】
【表２】
2018508223.tif 000004
市販のＴｅｔ−Ｏｎベクター系および眠れる森の美女トランスポゾン媒介性組込みを用いて得た細胞株の表現型。ＭＦＩ：平均蛍光強度。Ｄｏｘなし、＋Ｄｏｘおよび誘導倍数の値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。
【０１０２】
抑制状態および抑制解除状態のすべての細胞株の平均ＧＦＰ蛍光の定量（Ｄｏｘなし：３６１±１４４に対してＤｏｘ：１１３４±２３１、平均＋ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝１９）により、およそ１７倍のＧＦＰレベルの増大が示された。この結果は、このＤｏｘ応答性ベクター系は遺伝子発現の調節を行うことができること；しかしながら、「最適」条件を満たす厳密に調節された細胞株が得られる頻度はかなり低いことを示す。従って、このような少数の均一な細胞株が同定されるためには、一方向性Ｔｅｔ調節型発現カセットのレトロウイルス送達で報告されたように、相当なスクリーニングおよび選択が必要とされる（１６）。このため、安定な細胞株において厳密に調節された遺伝子発現が高頻度で得られる尤度が大きく増大し得る新規な誘導系の開発が模索された。
【０１０３】
ＣＭＶプロモーターは強力だが両方向性活性に欠ける
一方において目的遺伝子の制御された発現および他方においてマーカー遺伝子の構成的発現を可能にして安定なトランスフェクト体の陽性選択を可能にするために、両方向性プロモーターとテトラサイクリン制御エレメントとを兼ね備えた系を開発することが重要であった。Ｔ−ＲＥｘベクターに使用されているＣＭＶプロモーターは、完全長のＣＭＶ  ＩＥエレメント由来の７２８ｂｐのコア配列からなる（１３）。このコア領域から延在する配列のバイオインフォマティクス解析により、転写開始部位としての機能を果たし得る幾つかの古典的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ＴＡＴＡボックスおよび非古典的ＴＡＴＡボックスが同定された。
【０１０４】
この解析に基づいて、完全長のＣＭＶ  ＩＥプロモーターが両方向性活性を有するかどうかを調べることが所望された。これを試験するため、ＨｅＬａ細胞において強力なプロモーター活性を有することが示された領域であるＣＭＶ  ＩＥ領域Ｉ（１３）のエキソン１および第１イントロンをコードしているＣＭＶゲノム由来の２，０８１ｂｐのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片をクローニングした。この断片の埋め込みおよび平滑末端のライゲーションにより、ＣＭＶプロモーターが上流のＧＦＰカセットと下流のＮＧＦＲカセットとの間に配置されたＳＢトランスポゾン（Ｇ−Ｃ−Ｎと称する）を作出した。
【０１０５】
ナイーブＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、各向きにおけるＧ−Ｃ−Ｎトランスポゾンで、前述の３プラスミド法を用いて独立してトランスフェクトし、ピューロマイシン耐性クローンを選択した。得られた細胞株のフローサイトメトリー解析により、完全長ＣＭＶ  ＩＥプロモーターについて、＋末端のみしかＧＦＰ発現をもたらす能力を有さない（−末端：０．５±０．３％の細胞がＧＦＰ＋、ＭＦＩ：４．７±０．３に対して＋末端：９９．６±０．２％の細胞がＧＦＰ＋、ＭＦＩ：２４５９±６０７、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝５／群）、一方向性活性が示された。この厳密な一方向性活性は、細胞株をＮＧＦＲに対する抗体と反応させ、この表面マーカーのＧＦＰとの共発現をフローサイトメトリーによって解析した場合に確認された（図１１）。従って、該２つのマーカーにより、本発明者らがＧＦＰとＮＧＦＲの両方を発現する細胞を同定できなかったことによって実証されるように、ＣＭＶ  ＩＥプロモーターは一方向でしか転写活性を示さないことが確認された。
【０１０６】
ＨＳＶ−１前初期（ＩＥ）両方向性プロモーターの特性評価
ＨＳＶ−１ゲノムには、前初期（ＩＥ）遺伝子ＩＣＰ０およびロング−ショートジャンクションスパニング（ｌｏｎｇ−ｓｈｏｒｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｓｐａｎｎｉｎｇ）転写物（Ｌ／ＳＴ）の発現を指令する両方向性プロモーターが含まれている（１７，１８）。また、このプロモーターには、遺伝子発現をさらに増強するために使用され得るトランスアクチベータータンパク質のための６つのＶＰ１６応答エレメント（ＶＲＥ）が含まれている。完全長のＣＭＶ  ＩＥプロモーターを、Ｇ−Ｃ−Ｎトランスポゾン内において、６つのＶＲＥを含む１７２４ｂｐのＨＳＶ−１ゲノムＤＮＡと、ＧＦＰが５’（ＩＣＰ０）末端に、およびＮＧＦＲが３’（Ｌ／ＳＴ）末端に配置されるように置き換え、Ｇ−ＩＥ−Ｎを作出した（図１２Ａ）。
【０１０７】
このプロモーターが、ＨＳＶ−１ゲノムから取り出された場合に両方向性機能を有することを確認するため、Ｇ−ＩＥ−Ｎトランスポゾンを、ピューロマイシンをコードするトランスポゾンおよびトランスポザーゼ発現ベクターと組合せて、ナイーブＨＥＫ−２９３Ｔ細胞内にトランスフェクトさせた。明瞭なコロニーとして増殖した細胞をＧＦＰの発現について可視化すると、すべてのコロニー（およそ１００個）がいくらかの発現レベルを示した。３つのクローンを拡大培養し、ＧＦＰおよびＮＧＦＲの発現について免疫蛍光およびフローサイトメトリーにより、直接（ＧＦＰ）またはＮＧＦＲに対する抗体と反応させる場合のいずれかで評価した。
【０１０８】
免疫蛍光により、細胞はＮＧＦＲを細胞表面上に、そしてＧＦＰを細胞質内に示すことが明らかになった（図１２Ｂ）。フローサイトメトリーにより、ＧＦＰおよびＮＧＦＲの発現の一様な基底レベルが示された（図１２Ｃ）。この場合、細胞は、２色ドットプロットにおいて対角線に沿って分布する傾向を示し、この２つの遺伝子の協調的発現が示された。さらに、ＶＰ１６トランスアクチベーターの発現により、ＧＦＰの発現が１０倍より大きく増強された（ＭＦＩ：ＶＰ１６なしで１８５±２７に対してＶＰ１６ありで１，９７３±２１３；平均＋ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３）。しかしながら、同様のＶＰ１６依存性の増大はＮＧＦＲについては検出されず、この場合、発現レベルは概ね不変のままであった（ＭＦＩ：ＶＰ１６なしで７４０±６０に対してＶＰ１６ありで９０５±１３；１．３倍の増大；平均＋ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３）。従って、該２つのマーカーにより、ＨＳＶ  ＩＥプロモーターは、ＨＳＶ−１ゲノムから取り出され、哺乳動物細胞の染色体内に安定的に組み込まれた場合、協調的な両方向性活性を示すことが確認された。また、顕微鏡写真は、ＮＧＦＲについての免疫蛍光染色およびＧＦＰについての直接蛍光を提供し、マージ画像により、この２種類のタンパク質の共発現が示された（図示せず）。
【０１０９】
３０，０００プラーク形成単位（ｐｆｕ）のＩＣＰ０−変異型ウイルスであるＨＳＶ−１  ０−ＧＦＰのプラーク形成の効率を、単層の親ベロ細胞；確立されたベロ由来のＩＣＰ０補足（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）細胞株であるＬ７細胞；Ｔｅｔリプレッサーの優性効果に起因して検出可能なＩＣＰ０生物学的活性をほとんど示さないかもしくは全く示さない非処理ＩＴＲ−ＩＣＰ０１２５：１細胞、または１μＭのドキシサイクリン（これは、ＴｅｔオペレーターへのＴｅｔリプレッサーの結合を破壊する）で処理したＩＴＲ−ＩＣＰ０１２５：１細胞の上にプレーティングした場合で調べた。ウイルスの吸着および進入を４５分間行なわせた後、すべての細胞単層に、０．５％のメチルセルロースを含有しかつ１μＭのドキシサイクリンを含有するかまたは含有しない培養培地を、重層した。ウイルス感染培養物をすべて７２時間にわたりインキュベートし、そして残りの細胞単層は固定して、０．５％のクリスタルバイオレット色素を含有している２０％メタノールで染色した。ベロ細胞および非処理ＩＴＲ−ＩＣＰ０１２５：１細胞の場合、３０，０００ｐｆｕのＨＳＶ−１  ＩＣＰ０−変異型ウイルスの約１％がプラーク形成を開始させ、従って、数百個のプラーク（白い穴）が細胞単層内に形成された。対照的に、ＩＣＰ０の生物学的活性がＩＣＰ０補足Ｌ７細胞およびドキシサイクリン処理ＩＴＲ−ＩＣＰ０１２５：１細胞から伝えられた場合、３０，０００ｐｆｕのＨＳＶ−１  ＩＣＰ０−変異型ウイルス接種材料の本質的に１００％がプラーク形成を開始させ、従って、接種後７２時間までに約３０，０００個のプラークが完全に融合して一緒になったため、各細胞単層を完全に破壊した。
【０１１０】
転写をトランス活性化タンパク質の結合に依存性にするためのＨＳＶ両方向性プロモーターの修飾
ＧＦＰおよびＮＧＦＲの発現の解析により、ＨＳＶ  ＩＥプロモーターはその３’末端から構成的遺伝子発現を示し、その５’末端からＶＰ１６誘導性遺伝子発現を可能にすることが明らかになった（図１２Ｂ，１２Ｃ）。ＨＳＶ  ＩＥ両方向性プロモーターによるさらなる制御レベルをもたらすため、ＶＰ１６誘導性５’末端を、Ｔｅｔオペレーター配列の２つのタンデムコピー（２ｘＯｐ）を含むように修飾した。Ｔｅｔオペレーター配列の配置は基底プロモーター活性に影響を及ぼし得るため、２ｘＯｐ配列を５’末端のＴＡＴＡボックス付近（Ｇ−ＩＥ−Ｎ（ＴＲＴＡＴＡ）（配列番号：９）またはＧＦＰのすぐ上流に位置する非コードイントロン内（Ｇ−ＩＥ−Ｎ（ＴＲイントロン）；図１３Ａ）のいずれかに含む型のＩＥプロモーターを作出した。プラスミドＧ−ＩＥ−Ｎの一部としてのＨＳＶ−１  ＩＥプロモーターは、２つの遺伝子の協調的で構成的な発現をもたらし、該発現はＶＰ１６によって誘導され、ＧＦＰ発現の数倍の誘導性増大をもたらした（図１２Ａ−１２Ｂ）。また、顕微鏡写真は、ＮＧＦＲについての免疫蛍光染色とＧＦＰについての直接蛍光を提供し、マージ画像により、この２種類のタンパク質の共発現が示された（図示せず）。
【０１１１】
テトラサイクリン−リプレッサー標的配列の２つのタンデムコピーであるテトラサイクリンオペレーター配列（２ｘＯｐ）の位置は、ＨＳＶ１−ＩＥプロモーターの基底転写活性に影響を及ぼした（図１３Ｂ−１３Ｃ）。第１イントロン内に導入した場合、ＧＦＰの発現は低減した（図１３Ｃ）。Ｇ−ＩＥ−Ｎ（ＴＲＴＡＴＡ）プロモーターを使用すると、トランスフェクトされた細胞の５０％において最適な結果が得られた。このデータを以下の表ＩＩＩに示す。
【０１１２】
【表３】
2018508223.tif 000005
誘導性ＨＳＶ１−ＩＥ両方向性プロモーターおよび眠れる森の美女トランスポゾン媒介性組込みを用いて得た細胞株の表現型。ＭＦＩ：平均蛍光強度。Ｄｏｘなし（Ｎｏ  ｏｘ）、＋Ｄｏｘおよび誘導倍数の値は平均±ｓ．ｅ．である。
【０１１３】
ピューロマイシン耐性細胞株を、ナイーブＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を親Ｇ−ＩＥ−Ｎトランスポゾンおよび２ｘＯｐ配列を含む型で、この３プラスミド送達法を用いてトランスフェクトすることにより作出した。各組合せにより生じたクローンを、フローサイトメトリーによりＧＦＰおよびＮＧＦＲの発現についてスクリーニングした。図１３Ｂおよび１３Ｃは、該プロモーターの５’末端の２ｘＯｐ配列の位置はＮＧＦＲの発現に対して効果を有さなかった（ＭＦＩ：８７０±８７（Ｇ−ＩＥ−Ｎ）、１１４７±３２３（ＴＲＴＡＴＡ）、８２３±１１１（ＴＲイントロン）、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、各々についてｎ＝５）が、イントロン内に配置した場合、ＧＦＰ発現は有意に低減された（ＧＦＰ  ＭＦＩ：２３３±４１（Ｇ−ＩＥ−Ｎ）、１６１±６５（ＴＲＴＡＴＡ）、１６±４（ＴＲイントロン）、平均＋ｓ．ｅ．ｍ．、各々についてｎ＝５）ことを示す。従って、２ｘＯｐ配列の配置は好ましくは、ＨＳＶ  ＩＥ両方向性プロモーター内のＴＡＴＡボックス付近の５’末端である。
【０１１４】
（図１４）において、Ｔｅｔ応答性ＨＳＶ−ＩＥプロモーターは厳密に制御され、広範な遺伝子発現をもたらす。この厳密な制御は、同じ細胞株の蛍光顕微鏡画像においても観察され、示された状態でのＧＦＰ発現を表す（図示せず）。以下の表ＩＶに量的に表示する。
【０１１５】
【表４】
2018508223.tif 000006
遺伝子発現レベルは誘導性ＨＳＶ−ＩＥ両方向性プロモーターを用いて得た。ＭＦＩ：平均蛍光強度。値は、２つの独立した細胞株でｎ＝３回の実験の平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。
【０１１６】
この結果により、２ｘＯｐ配列の配置は好ましくは、目的遺伝子の発現を可能にするためにはＨＳＶ  ＩＥ両方向性プロモーター内のＴＡＴＡボックス付近の５’末端であるか、または同遺伝子の発現を抑制するためにはイントロン内であることが確認される。従って、この系は、毒性であるか、またはこの発現が別の点で所望されない遺伝子産物の発現を制御するために使用され得る。
【０１１７】
誘導性ＨＳＶ  ＩＥ両方向性プロモーターは厳密に調節されており、制御された遺伝子発現を広範なレベルにわたって可能にする
Ｇ−ＩＥ−Ｎ（ＴＲＴＡＴＡ）の転写活性がトランス活性化タンパク質の結合に依存性であるかどうかを調べることが重要であった。この目的のため、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞をこの３プラスミドプロトコルによってトランスフェクトし、ピューロマイシン耐性について選択した。
【０１１８】
このとき、生じたコロニーをＮＧＦＲ抗体と反応させ、免疫蛍光顕微鏡使用によってスクリーニングした。１４個のＮＧＦＲ陽性クローンを、Ｄｏｘの非存在下および存在下でのＧＦＰの発現についてフローサイトメトリーによって評価した。
【０１１９】
ここで、構成的に発現されたＮＧＦＲマーカーの対抗選択により、「望ましい」クローンの同定能が有意に改善され、５０％の細胞株がこの基準を満たしたのに対して、この共発現レポーターがない市販の系の使用では１６％（１９個のうち３個）のみであった。これらの結果は、誘導性ＨＳＶ  ＩＥ両方向性プロモーターが厳密に調節された遺伝子発現を高頻度でもたらし得ることを示す。
【０１２０】
Ｇ−ＩＥ−Ｎ（ＴＲＴＡＴＡ）を用いて作出され、また、「望ましい」基準も満たす２つの細胞株を、抑制特性および誘導特性について、ＤｏｘとＶＰ１６との組合せを用いて試験した。クローンを、抑制（ＤｏｘなしもしくはＤｏｘなし、＋ＶＰ１６）、抑制解除（＋Ｄｏｘ）または誘導（＋Ｄｏｘ、＋ＶＰ１６）し、ＧＦＰ発現について、単独またはＮＧＦＲに対する抗体と反応させた場合のいずれかにおいて、直接蛍光顕微鏡使用またはフローサイトメトリーによって評価した場合、ＧＦＰおよびＮＧＦＲの発現の代表的な例が示された。
【０１２１】
細胞は、Ｄｏｘの非存在下かつＶＰ１６ありまたはなしにおいて、限定的なＧＦＰ発現を示した（抑制された）。Ｄｏｘの添加によりＧＦＰ発現は抑制状態の９倍のレベルまで抑制解除され、一方、ＤｏｘとＶＰ１６との両方の組合せではさらに、ＧＦＰ発現はさらに９倍増大し；ＮＧＦＲレベルはすべての条件で本質的に不変であった。この結果は、ＨＳＶ  ＩＥ両方向性プロモーターの５’末端から広範な遺伝子発現が可能であるとともに、該プロモーターの３’末端から一定レベルのＮＧＦＲ発現が維持されることを示す。
【０１２２】
誘導性両方向性プロモーターが、生物学的に関連性のある遺伝子の発現を効率的に駆動し得ることを確認するため、ＧＦＰをＧ−ＩＥ−Ｎ（ＴＲＴＡＴＡ）内において、Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子をコードしている配列と置き換え、ＨＡ−ＩＥ−Ｎを作出した。ＨＡは、標的細胞へのウイルス進入の媒介に使用されるウイルスエンベロープタンパク質であり、赤血球の凝集を引き起こし、外来性タンパク質の発現における分子タグとして頻繁に使用される。
【０１２３】
この系の有用性を改善するため、Ｃａｇｓプロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋ登録ＪＱ６２７８２７．１）（１９）からＴｅｔＲおよびピューロマイシン耐性のバイシストロニック発現を付与するトランスポゾンを作出し、このベクター、ＨＡ−ＩＥ−ＮおよびＳＢトランスポザーゼでＨｅＬａ細胞をコトランスフェクトした。ピューロマイシン耐性について選択した後、コロニーをＮＧＦＲ抗体と反応させ、免疫蛍光顕微鏡使用によってスクリーニングした。
【０１２４】
２個のＮＧＦＲ陽性クローンを、ＨＡの発現についてウエスタンブロットによって評価し、これにより、ＨＡタンパク質は基底条件下では検出不可能であり；Ｄｏｘ抑制解除によって検出可能になり、ＤｏｘとＶＰ１６との組合せでは有意に富化されることが明らかになった（図１５）。この結果は、この新規なベクターが、構成的に発現される第１の発現産物（ここではＮＧＦＲレポーター）の定常発現ならびに第２の目的遺伝子の誘導性の広範な発現もまた可能にする、単一のプロモーターからのデュアル遺伝子発現を、効率的に駆動することができることを示す（図１６）。さらに、このベクターでは、現在市販されているベクターと比べた場合、高いトランスフェクション効率が得られ、陽性トランスフェクト細胞の速やかな同定が助長される。
【実施例】
【０１２５】
実験手順
ベクターの構築
ＴＲＰ−ＧＦＰプラスミド。ＧＦＰコード配列を、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から、プライマー：ＧＦＰフォワード：５’−ＧＡＴ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＡ  ＧＣＡ  ＡＧＧ  ＧＣＧ−（配列番号：１）およびＧＦＰリバース：５’−ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＴＡ  ＣＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＧＴＣ  Ｃ−３’（配列番号：２）（これらは、ＧＦＰの５’末端および３’末端のＮｃｏＩおよびＸｈｏＩの認識配列（下線部）を含む）を用いてＰＣＲ増幅させた。ＰＣＲ反応は、Ｐｆｕ  Ｔａｑポリメラーゼおよび条件：９８℃で２分の後、９８℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で１分の３５サイクル、最終伸長は７２℃で１０分の後、４℃での停止を用いて行なった。得られた産物をゲル精製し、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化し、同じ酵素で消化したｐＦａｓｔＢａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に挿入し、ｐＦａｓｔＢａｃ−ＧＦＰを作出した。ＧＦＰをコードしているＢａｍＨＩからＸｈｏＩまでの断片を回収し、同様に消化したｐｃＤＮＡ５／ＴＯ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内に挿入した。ライゲーションにより、テトラサイクリン応答型のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下でのＧＦＰ発現をコードするＴＲＰ−ＧＦＰを作出し、シミアンウイルス（ＳＶ）４０プロモーター調節型ブラストサイジン耐性遺伝子の上流に配置した。
【０１２６】
眠れる森の美女トランスポゾンベクターを、Ｔ２末端逆位反復配列を用いて既報（１１）のとおりに構築し、発現がヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターによって調節されるトランスポザーゼ（ＳＢ１１）コードプラスミド（ＰＧＫ−ＳＢ１１と称される（Ｇｅｎｂａｎｋ登録ＡＦ０９０４５３．１）（１２））とともに共送達した。
【０１２７】
ＴＲＰ−ＧＦＰ。テトラサイクリン調節ＧＦＰ発現カセットをＴＲＰ−ＧＦＰからＭｆｅＩでの消化によって切り出し、クレノウＤＮＡポリメラーゼでの突出端の埋め込みの後、ＰｖｕＩＩで消化した（平滑端）。テトラサイクリン応答性ＣＭＶプロモーター、ＧＦＰおよびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルをコードしている得られた１８６９ｂｐの断片を、ＰｍｅＩで消化（平滑端）して仔ウシアルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）を用いて脱リン酸化したトランスポゾンベクターｐＫＴ２／ＳＥ内に挿入した。ライゲーションにより、テトラサイクリン調節型ＧＦＰ発現をコードしているトランスポゾンを作出した。
【０１２８】
Ｇ−ＭＣＳ−Ｎ。ＧＦＰコード配列をＴＲＥ−ＧＦＰから、プライマーであるＧＦＰリンカーフォワード：５’ＡＣＧ  ＣＧＴ  ＴＣＴ  ＣＣＧ  ＧＡＣ  ＴＡＧ  ＡＴＣ  ＴＡＡ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＡＣ  ＴＡＧ  ＴＣＧ ＧＡＴ ＣＣＡ  ＣＣＧ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＧＧＣ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  Ｃ−３’（配列番号：３）およびＧＦＰリンカーリバース：５’−ＧＣＡ  ＴＧＧ  ＡＣＧ  ＡＧＣ  ＴＧＴ  ＡＣＡ  ＡＧＴ  ＡＡＡ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＴＣ  ＴＡＧ  ＡＣＣ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＴＧＡ  ＣＧＴ  ＣＧＣ  ＧＧＧ  ＴＡＡ  ＣＣＡ  ＣＧＧ  ＴＣＧ  ＡＣＡ  Ｔ−３’（配列番号：４）を用いてＰＣＲ増幅させた。ＰＣＲ反応は、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）および条件：９８℃で２分の後、９８℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で１分の３５サイクル、最終伸長は７２℃で１０分の後、４℃での停止を用いて行なった。得られた８３０ｂｐの産物をゲル精製し、Ａ鎖付加し、ｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯ／ＴＡ内に導入してｐＣＲ２．１／ＧＦＰリンカーを作出し、配列を確認した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）。リンカー修飾ＧＦＰ配列をコードしているＳａｃＩからＳａｌＩまでの断片を回収し、ＮＧＦＲに続いてＳＶ４０ポリアデニル化シグナルをコードしているトランスポゾン（同じ酵素で消化した）内にライゲートした。これにより、ＧＦＰとＮＧＦＲとが、ＭｌｕＩ、ＢｓｐＥＩ、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩの特有の制限部位によって隔離されているＧ−ＭＣＳ−Ｎが作出された。
【０１２９】
Ｇ−Ｃ−Ｎ。ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター−エンハンサー（１３）の配列をコードしているｐＧＥＭ−２  プラスミドをＰｓｔＩで消化して２１００ｂｐの断片を切り離し、これを、ＰｓｔＩで消化してＣＩＰで脱リン酸化したＧ−ＭＣＳ−Ｎ内に導入した。ライゲーションにより、センスおよびアンチセンスの両方の向きにＣＭＶプロモーターを有するトランスポゾンベースの発現ベクターを作出し、活性をＧＦＰおよびＮＧＦＲの発現に基づいてモニタリングした。
【０１３０】
Ｇ−ＩＥ−Ｎ。プラスミドｐ０＋ＧＦＰ２４（１４）をＢｇｌＩＩおよびＢｓｐＥＩで消化し、６つのＶＰ１６応答エレメントを含む７３６ｂｐの両方向性プロモーターとＩＣＰ０の非コードイントロン１由来の７６１ｂｐの配列とをコードしている１７２４ｂｐのＨＳＶ−１ゲノムＤＮＡを回収した。この断片を、ＢｇｌＩＩ−ＢｓｐＥＩ消化Ｇ−ＭＣＳ−Ｎ内にクローニングし、Ｇ−ＩＥ−Ｎを作出した。
【０１３１】
テトラサイクリン誘導性型のＧ−ＩＥ−Ｎ。Ｇ−ＩＥ−Ｎ内のＨＳＶ  ＩＥ両方向性プロモーターを、Ｔｅｔオペレーター配列の２つのタンデムコピー（２ｘＯｐまたはＴＲ）がＴＡＴＡボックス付近の該プロモーターの５’（ＩＣＰ０）末端において（Ｇ−ＩＥ−Ｎ（ＴＲＴＡＴＡ））またはＧＦＰのすぐ上流に存在する非コードイントロン内（Ｇ−ＩＥ−Ｎ（ＴＲイントロン））に含まれるように修飾した。これらのベクターを構築するため、アニーリングされた場合に５’−Ｂｓｕ３６Ｉ部位をコードする配列に、１６０ｂｐの配列（該プロモーターまたは非コードイントロンのいずれかに相同）、Ｔｅｔリプレッサータンパク質の２つの結合部位ＧＧ  ＧＡＴ  ＡＧＴ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  ＣＴＣ  ＴＡＧ  ＡＧＧ  ＧＡＴ  ＡＧＴ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  Ｃ（配列番号：５）およびさらなる２８ｂｐが続いた後にＮｈｅＩ部位で終結する、２つの２２７ｂｐのオリゴヌクレオチドを作出した。これらの配列のＢｓｕ３６Ｉ−ＢｇｌＩＩ消化Ｇ−ＩＥ−Ｎ内へのライゲーションにより、２つの型のプロモーターを作出し、これらのテトラサイクリンに対する応答について試験した。
【０１３２】
テトラサイクリン誘導性ＨＡ−ＩＥ−Ｎ。Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質の配列をコードしているｐＣＥＰ４プラスミド（Ｐｕｅｒｕｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４株）（ミネソタ大学のＴｏｍ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈ博士のご厚意によるいただきもの）を、ＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩとで順次消化し、クレノウＤＮＡポリメラーゼで突出端を埋め込み、平滑末端を作出した。得られた１７４１ｂｐの断片を、ＸｂａＩとＢｇｌＩＩとで消化してクレノウＤＮＡポリメラーゼで処理した後にＣＩＰで脱リン酸化した、Ｇ−ＩＥ−Ｎ（ＴＲＴＡＴＡ）（配列番号：９）内に挿入した。ライゲーションにより、ＨＡのテトラサイクリン調節型発現をコードしているトランスポゾン（ＨＡ−ＩＥ−Ｎと称する（配列番号：１０））を作出した。
【０１３３】
テトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）トランスポゾン。ＴｅｔＲコード配列を、ｐｃＤＮＡ６／ＴＲ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から、プライマーであるＴｅｔＲフォワード：５’−ＣＡＡ  ＴＴＧ  ＧＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＧ−３’（配列番号６）およびＴｅｔＲリバース：５’−ＣＡＡ  ＴＴＧ  ＧＴＡ  ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＡＴＡ  ＡＧＣ  ＴＧＣ−３’（配列番号：６）（５’末端および３’末端のＭｆｅＩの認識配列（下線部）が導入されるように設計）を用いてＰＣＲ増幅させた。
【０１３４】
ＰＣＲ反応は、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）および条件：９５℃で１分の後、９５℃で３０秒、６１℃で３０秒、７２℃で１分の３５サイクル、および７２℃で１０分の最終伸長の後、４℃での停止を用いて行なった。得られた７３４ｂｐの産物をゲル精製し、Ａ鎖付加し、ｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯ／ＴＡ内に導入してｐＣＲ２．１／ＴｅｔＲを作出し、配列を確認した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）。ＴｅｔＲコード配列をコードしているＭｆｅＩからＭｆｅＩまでの断片を回収し、ホタルルシフェラーゼのコード配列を除去するためにＥｃｏＲＩで消化した後にＣＩＰで脱リン酸化したトランスポゾン（ｐＫＴ２／Ｃａｇｓ−Ｌｕｃ−ｉｒｅｓ−Ｐｕｒｏをコードする）内に挿入した。ＴｅｔＲとのライゲーションにより、ｐＫＴ２／Ｃａｇｓ−ＴｅｔＲ−ｉｒｅｓ−Ｐｕｒｏ（配列番号８）を作出した。
【０１３５】
ＤＮＡの調製。トランスフェクションに使用したプラスミドはすべて、エンドトキシン非含有Ｍａｘｉ  Ｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調製した。
【０１３６】
細胞培養、トランスフェクションおよび薬物耐性コロニーの選択
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞およびＨｅＬａ子宮頸癌細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。両細胞株を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％のペニシリン−ストレプトマイシンを補填したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、３７℃にて５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気中で培養した。トランスフェクションのため、３から４×１０５個の細胞を６ウェル組織培養皿内に播種し、一晩接着させた。翌日、培地を除去し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）２０００−（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）複合体化ＤＮＡを含有する１ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を細胞に滴下した。３から４時間のインキュベーション後、トランスフェクション培地を新鮮増殖培地と交換した。２日後、生存細胞（トリパンブルー陰性）を、細胞総数が１００，０００個から３００個になるように、ブラストサイジン（１０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシン（１００μｇ／ｍＬ）またはピューロマイシン（０．５μｇ／ｍＬ）のいずれかを補填した増殖培地の入った１００ｍｍの皿の中で１：３に連続希釈した。１２から１４日間の選択後、充分に単離された薬物耐性コロニーを、ホウケイ酸ガラス製クローニングシリンダー（Ｂｅｌｌｃｏ，Ｖｉｎｅｌａｎｄ，ＮＪ）を用いてプレートから取り出し、選択的に拡大培養して、単一細胞由来の細胞株を作製した。
【０１３７】
安定な細胞株の作製
テトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）。ＴｅｔＲタンパク質の安定な発現を有する細胞を、ＨＥＫ−２９３Ｔを１μｇのｐｃＤＮＡ６／ＴＲ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ｐＵＣ複製起点内の１ヶ所を切断するＰｃｉＩでの一晩（約１８時間）の消化によって線状化しておいた）でトランスフェクトすることによって作出した。消化されたＤＮＡを、１００％エタノールで沈殿させ、７０％エタノールで２回洗浄した後、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ溶液中に再懸濁させた。トランスフェクションの２日後、細胞を限界希釈法にて１００ｍｍの組織培養プレート内にプレーティングし、１０μｇ／ｍＬのブラストサイジンで選択した。選択過程において拡大培養した個々のクローンを、５０ｎｇのｐｃＤＮＡ５／ＴＯ−ＧＦＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００を用いて一過的にトランスフェクトし、翌日、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ４１顕微鏡を用いた直接蛍光顕微鏡使用によって目視した。これらの条件下でＧＦＰ発現が抑制されたクローンプールを、本試験に使用した。
【０１３８】
ＴＲＰ−ＧＦＰプラスミド。ＴｅｔＲの安定な発現を有するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、１μｇのＴＲＰ−ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトした。２日後、細胞を、限界希釈法にて１００ｍｍの組織培養プレート内にプレーティングし、１００μｇ／  ｍＬのハイグロマイシンで選択した。充分に単離されたクローンをランダムに選出し、拡大培養した。Ｄｏｘ抑制解除を評価するため、２×１０５個の細胞を６ウェル組織培養皿内に播種し、４μＭのドキシサイクリンの非存在下または存在下で２日間増殖させた後、ＧＦＰ発現について、後述するように、直接蛍光顕微鏡使用またはフローサイトメトリーにより検査した。
【０１３９】
眠れる森の美女トランスポゾン
ＴｅｔＲ発現ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、ヒトホスホグリセリン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｇｙｃｅｒａｔｅ）キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター（５０ｎｇ）の制御下でのピューロマイシン耐性遺伝子の発現をコードしている第２のトランスポゾンと組合せた各々５００ｎｇのトランスポゾンドナープラスミド（ＴＲＰ−ＧＦＰ；Ｇ−Ｃ−Ｎ；Ｇ−ＩＥ−Ｎ；Ｇ−ＩＥ−Ｎ（ＴｅｔＲＴＡＴＡ）またはＧ−ＩＥ−Ｎ（ＴｅｔＲイントロン）と、ＰＧＫ調節ＳＢ１１トランスポザーゼベクター（５００ｎｇ）とでトランスフェクトした。または、ナイーブＨｅＬａ細胞を、ＨＡ−ＩＥ−Ｎトランスポゾン（５００ｎｇ）にて、ＴｅｔＲとピューロマイシン耐性遺伝子とのバイシストロニック発現をコードしている第２のトランスポゾン（ｐＫＴ２／ＣＡＧＳ−ＴｅｔＲ−ｉｒｅｓ−ｐｕｒｏ；５０ｎｇ）およびＳＢ１１トランスポザーゼ（ＰＧＫ−ＳＢ１１；５００ｎｇ）とともにトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞を、限界希釈法で１００ｍｍの組織培養プレート内にプレーティングし、０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンで選択した。１０から１２日間の増殖後に出現した充分に単離されたクローンを、ランダムに選出するか、または免疫蛍光染色および蛍光顕微鏡を用いた目視の後でＮＧＦＲの発現に基づいて選択した。抑制解除／誘導を評価するため、２×１０５個の細胞を６ウェル組織培養皿内に播種し、４μＭのドキシサイクリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の非存在下または存在下で２日間増殖させた後、ＶＰ１６の発現を付与するアデノウイルス粒子により感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）３にて一晩、形質導入した。処理した細胞を、後述するように、蛍光顕微鏡使用、フローサイトメトリーまたはウエスタンイムノブロットにより検査した。
【０１４０】
蛍光検出
単独でまたはＮＧＦＲとの組合せのいずれかでＧＦＰが誘導性発現されるように改変した細胞株を、直接蛍光顕微鏡使用によって可視化するか、またはＮＧＦＲの共発現について免疫蛍光染色によるクローンのスクリーニングによって選択した。表面ＮＧＦＲレベルを検出するため、培養した細胞を、マウス抗ヒトＮＧＦＲ  ｐ７５モノクローナル抗体（ＭＥ２０．４，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４二次抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（各々、１：１０，０００の最終希釈度で）と一晩（約１８時間）反応させた。ＧＦＰまたはＮＧＦＲ陽性細胞を同定し、Ｏｌｙｍｐｕｓ（登録商標）ＤＰ７０デジタルカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ）を取り付けたＯｌｙｍｐｕｓ（登録商標）ＢＸ４１顕微鏡を用いて、同じ露光時間の画像キャプチャーにより写真撮影した。
【０１４１】
フローサイトメトリー
細胞を、トリプシンを用いて回収し、単独で、またはマウス抗ヒトＮＧＦＲ  ｐ７５モノクローナル抗体（ＭＥ２０．４，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４コンジュゲートヤギ抗マウスＨ＋Ｌ  ＩｇＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と反応させた場合の、ＧＦＰの発現について評価した；マウス抗ヒトＩｇＧを、アイソタイプ対照として使用した。各々の蛍光強度の平均（ＭＦＩ）を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＴＭ  ｖ５．２．１ソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて最低１０，０００事象の収集後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により求めた。収集後データの解析は、ＦｌｏｗＪｏ  ｖ１０．０（Ｔｈｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて行なった。値は、平均＋ｓ．ｅ．ｍ．としてプロットされる。
【０１４２】
ウエスタンイムノブロット
細胞を、プレートからトリプシンを用いて取り出し、ＰＢＳで洗浄し、ＨａｌｔＴＭプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補填したＭ−ＰＥＲ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてタンパク質を抽出した。氷上で３０分間のインキュベーション後、試料を遠心分離し（１４，０００ｒｐｍ／３０分間／４℃）、上清みを収集し、タンパク質濃度をＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって求めた。タンパク質（１０μｇ）を２×Ｌａｅｍｍｌｉ試料バッファー（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）中で５分間煮沸し、１０％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル中を電気泳動させ、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標）−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。この膜を、５％のスキムミルクを含む０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）で１から２時間ブロックした。ＨＡをウサギポリクローナル抗体（１：５０００，Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４），Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を用いて検出した。ＴＢＳＴで洗浄後、膜を、室温で１から２時間、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ウサギＨ＋Ｌ  ＩｇＧ（すべてＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）（ＴＢＳＴ中で１：１０００に希釈）とともにインキュベートした。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を、モノクローナル抗ＧＡＰＤＨペルオキシダーゼ抗体（クローンＧＡＰＤＨ  ７１．１，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の１：７５０００希釈物を用いて検出した。膜を、増強化学発光（ＥＣＬ）基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともにインキュベートし、Ｘ線フィルム（ＣＬ−ＸｐｏｓｕｒｅＴＭフィルム，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に感光させ、Ｋｏｎｉｃａ  ＳＲＸ−１０１現像機（Ｋｏｎｉｃａ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ）を用いて現像して、タンパク質を可視化した。
【０１４３】
統計解析
マイクロソフトエクセルソフトウェアパッケージを使用し、記述統計値（平均＋ｓ．ｅ．ｍ．）を求めた。
【０１４４】
本発明の実施形態
本発明の第１の実施形態では、（ｉ）第１のポリヌクレオチド配列；（ｉｉ）第２のポリヌクレオチド配列；および（ｉｉｉ）第１のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列とに作動可能に連結された、アルファ−ヘルペスウイルス（α−ＨＳＶ）由来の前初期（ＩＥ）プロモーターを含む両方向性プロモーターを含む、ポリヌクレオチド配列を含むものであるＤＮＡ発現カセットが想定される。両方向性プロモーターはさらに：（ａ）ＨＳＶ  ＶＰ１６タンパク質が結合すると第１のポリヌクレオチド配列の発現を基底レベルより上に高める発現エンハンサードメイン、および（ｂ）ＩＥプロモーターと第２のポリヌクレオチド配列との間に作動可能に連結された２つのテトラサイクリン応答エレメントを含むものである。
【０１４５】
この第１の実施形態の一態様において、第１のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも一方は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含む。別の態様では、第１のポリヌクレオチド配列および第２のポリヌクレオチド配列の各々が、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含む。また別の態様では、該ポリヌクレオチド配列の各々が、複数の制限エンドヌクレアーゼの認識部位；即ち、マルチプルクローニングサイトを含む。なおさらなる一実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチド配列が、第１および第２の選ばれたタンパク質またはポリペプチド発現産物をコードしている。実例としての第１および第２のポリヌクレオチド配列は、蛍光性であるか、生物発光性であるか、または薬物耐性をもたらすタンパク質またはポリペプチドならびに生物学的に活性であり制御性発現産物として発現される発現産物ポリペプチドまたは発現産物タンパク質を、コードしている。
【０１４６】
想定される発現カセットのいずれかは、さらに、第１のポリヌクレオチド配列および第２のポリヌクレオチド配列の各々の両方向性プロモーターに遠位のポリヌクレオチド配列末端に作動可能に連結された、トランスポザーゼによって認識されるトランスポゾン挿入配列を含むものであり得る。また、上記に論考した発現カセット構築物のいずれかを含む発現ベクターも想定される。上記の任意の発現カセットを染色体ＤＮＡ内に含むトランスフェクトされた宿主細胞もまた想定される。
【０１４７】
調節ＤＮＡカセットは、想定される別の第２の実施形態である。このカセットは、（ｉ）テトラサイクリンリプレッサータンパク質をコードしている調節ポリヌクレオチド配列；（ｉｉ）抗菌剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードしている選択マーカーポリヌクレオチド配列；および（ｉｉｉ）該２つのポリヌクレオチド配列間に作動可能に連結された配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；（ｉｖ）バイシストロニックプロモーター；ならびに（ｖ）調節ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されていない該バイシストロニックプロモーターの末端に作動可能に連結されたトランスポザーゼ結合部位および選択マーカーポリヌクレオチド配列の末端に作動可能に連結された別のトランスポザーゼ結合部位を含む、ポリヌクレオチド配列を含むものである。このバイシストロニックプロモーターは、発現カセットの実施形態に関して論考した両方向性プロモーターとは異なるものであり、調節ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結され、調節ポリヌクレオチド配列と選択マーカーポリヌクレオチド配列の両方との発現を増進させる。
【０１４８】
この実施形態の一態様において、選択マーカーは、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、カナマイシン、ブラストサイジン、トリクロサンおよびフレオマイシンＤ１などの抗菌剤に対する耐性を付与するものである。
【０１４９】
この実施形態の別の態様では、調節カセットのテトラサイクリンリプレッサータンパク質は、テトラサイクリン応答エレメントに結合する。この実施形態の任意の態様において、調節カセットのバイシストロニックプロモーターは、ＣＭＶ前初期エンハンサーとニワトリβ−アクチン遺伝子の第１エキソンおよび第１イントロンとを含むキメラＣＡＧプロモーターである。
【０１５０】
上記に論考した調節カセット構築物のいずれかを含むベクターは、この実施形態のさらなる態様である。上記の任意の調節カセットを染色体ＤＮＡ内に含むトランスフェクトされた宿主細胞もまた想定される。
【０１５１】
（ｉ）上記に論考した発現カセット構築物のいずれかを含むベクターのパッケージ；と（ｉｉ）上記に論考した調節カセット構築物のいずれかを含むベクターのパッケージとを含む容器を備えた、宿主細胞をトランスフェクトするためのキットは、本発明のさらなる一実施形態を構成する。
【０１５２】
この実施形態のさらなる一態様では、想定されるキットは、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒクラスのトランスポゾンをコードしている（ａ）ＲＮＡまたは（ｂ）ベクターのパッケージを含むものである。該Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒクラスのトランスポゾンは、眠れる森の美女トランスポゾンである。
【０１５３】
この実施形態のなおさらなる一態様では、キットは使用のための書面の説明書を含むものである。
【０１５４】
宿主細胞内において複数の遺伝子の発現を誘導する方法は、本発明のまた別の実施形態である。この方法は、（ｉ）宿主細胞を上記に論考した２パッケージキットのベクターに加えてＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒクラスのトランスポゾンをコードしている（ａ）ＲＮＡまたは（ｂ）ベクターでトランスフェクトする工程；ならびに（ｉｉ）該宿主細胞を、第１および第２のポリヌクレオチド配列と該トランスポゾンとの発現が誘導されるのに充分な条件下で維持して増殖させる工程を含むものである。
【０１５５】
この実施形態の一態様において、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒクラスのトランスポゾンは、眠れる森の美女トランスポゾンである。
【０１５６】
方法の実施形態の別の態様では、該トランスフェクション薬剤が、約１当量のＤＮＡ発現カセット含有ポリヌクレオチドに対して約２当量の調節カセットポリヌクレオチドおよびトランスポゾンコードＲＮＡまたはベクターの比率で使用される。
【０１５７】
該方法の実施形態のさらなる一態様では、該トランスフェクション薬剤が、３から４×１０５個の宿主細胞に対して約２０００ナノグラム（ｎｇ）の総量で使用される。この態様のさらなる一態様では、トランスポゾンコードＲＮＡまたはベクターが約５００ｎｇで使用される。
【０１５８】
方法の実施形態のさらなる一態様として、調節カセットポリヌクレオチドとＤＮＡ発現カセット含有ポリヌクレオチドは約１：１から約６２５：１の重量比で使用される。先の態様を精緻化したものとして、調節カセットポリヌクレオチドとＤＮＡ発現カセット含有ポリヌクレオチドは約２５：１から約１２５：１の重量比で使用される。
【０１５９】
方法の実施形態のいずれかの態様で想定されるのは、各トランスフェクション薬剤を用いたトランスフェクションが一緒に行なわれることである。
【０１６０】
この実施形態の上記のいずれかの態様のさらなる一態様は、トランスフェクトされた細胞がさらなる一工程として回収されることである。
【０１６１】
【表５】
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【０１６２】
本明細書において挙げた特許、特許出願および論文は各々、参照により組み込まれる。
【０１６３】
本発明の血清学的アッセイの幾つかの具体的な実施形態を本明細書において記載したが、当業者には、該実施形態に対して、その広い態様内において以下の特許請求の範囲に示される本発明から逸脱することなく変更および修正がなされ得ることが認識されよう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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