(57)【要約】  本明細書に示されていのは、新生物を検出すること、およびより詳細には、前がん状態の腫瘍および悪性腫瘍（例えば胃がん）を検出するための方法、組成物、および関連する使用（これらに限らない）に関する技術である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト患者からの試料を特徴づけるため方法であって、
ａ）ヒト患者の試料からＤＮＡを得ること；
ｂ）表１、２、４または７に基づくＤＭＲ１〜２７４からなる群から選択されるメチル化可変領域（ＤＭＲ）における塩基を含んでいるＤＮＡメチル化マーカーのメチル化状態を評価すること；
ｃ）１つ以上のＤＮＡメチル化マーカーの、評価された上記メチル化状態を、胃の新生物を有していないヒト患者にとっての当該１つ以上のＤＮＡメチル化マーカーの、メチル化レベルの基準と比較することを含んでいる、方法。
【請求項２】
上記試料が、糞便試料、組織試料、胃組織試料、血漿試料、または尿試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記試料が胃組織試料であり、上記ＤＭＲが、ＤＭＲ番号２５３、２５１、２５４、２５５、２５６、２４９、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２５０、２６３、１、２６４、２６５、１９６、２６６、１１８、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、４６、２７３、２５２および２３７から選択される；または
上記試料が血漿試料であり、上記ＤＭＲが、ＤＭＲ番号２５３、２３７、２５２、２６１、２５１、１９６、２５０、２６５、２５６、２４９および２７４から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
複数のＤＮＡメチル化マーカーを評価することを含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
２〜１１のＤＮＡメチル化マーカーを評価することを含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
１２〜１０７のＤＮＡメチル化マーカーを評価することを含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記試料における上記１つ以上のＤＮＡメチル化マーカーの上記メチル化状態を評価することが、１つの塩基のメチル化状態を決定することを含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
上記試料における上記１つ以上のＤＮＡメチル化マーカーの上記メチル化状態を評価することが、複数の塩基におけるメチル化の程度を決定することを含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
フォワードストランドのメチル化状態を評価すること、またはリバースストランドのメチル化状態を評価することを含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
上記ＤＮＡメチル化マーカーが１００塩基以下の領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
上記ＤＮＡメチル化マーカーが５００塩基以下の領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
上記ＤＮＡメチル化マーカーが１０００塩基以下の領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
上記ＤＮＡメチル化マーカーが５０００塩基以下の領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
上記ＤＮＡメチル化マーカーが１塩基である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
上記ＤＮＡメチル化マーカーが、高いＣｐＧ密集度のプロモータにある、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
上記評価することは、メチル化特異的なポリメラーゼ連鎖反応、核酸配列決定、質量分析、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量に基づく分離、またはターゲットキャプチャーを用いることを含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
上記評価することが、メチル化特異的なオリゴヌクレオチドの使用を含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
上記試料が組織試料であり、上記メチル化特異的なオリゴヌクレオチドが、配列番号１〜７０からなる群から選択される；または
上記試料が、血漿試料であり、上記メチル化特異的なオリゴヌクレオチドが、配列番号７１〜１０９からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＡＲＨＧＥＦ４、ＥＬＭＯ１、ＡＢＣＢ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＳＦＭＢＴ２、ＣＤ１Ｄ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＺＮＦ５６９およびＣ１３ＯＲＦ１８からなる群から選択されるアノテーションを有している染色体領域が、上記ＤＮＡメチル化マーカーを含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ＤＭＲが、表４に基づいており、ＤＭＲ番号４９、４３、１９６、６６、１、２３７、２４９、２５０、２５１および２５２からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ＥＬＭＯ１、ＡＲＨＧＥＦ４、ＥＭＸ１、ＳＰ９、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＢＭＰ３、ＫＣＮＡ３、ＤＭＲＴＡ２、ＫＣＮＫ１２、ＣＤ１Ｄ、ＰＲＫＣＢ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＺＮＦ５６８、ＡＢＣＢ１、ＥＬＯＶＬ２、ＰＫＩＡ、ＳＦＭＢＴ２  （８９３）、ＰＣＢＰ３、ＭＡＴＫ、ＧＲＮ２Ｄ、ＮＤＲＧ４、ＤＬＸ４、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ、ＦＧＦ１４、ＺＮＦ１３２、ＣＨＳＴ２（７８９０）、ＦＬＩ１、ｃ１３ｏｒｆ１８およびＺＮＦ５６９からなる群から選択されるアノテーションを有している染色体領域が、上記ＤＮＡメチル化マーカーを含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
上記ＤＭＲが、表２に基づいており、ＤＭＲ番号２５３、２５１、２５４、２５５、２５６、２４９、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２５０、２６３、１、２６４、２６５、１９６、２６６、１１８、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、４６、２７３、２５２および２３７からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ｏｒｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡ１からなる群から選択されるアノテーションを有している染色体領域が、上記ＤＮＡメチル化マーカーを含んでおり、上記試料が血漿試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
上記ＤＭＲが、表４および７に基づいており、２５３、２３７、２５２、２６１、２５１、１９６、２５０、２６５、２５６、２４９および２７４からなる群から選択され、上記試料が血漿試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
ヒト患者から得られた試料を特徴づける方法であって、
ａ）表１、２、４および７に基づくＤＭＲ１〜２４７からなる群から選択されるＤＮＡにおける塩基を含んでいる試料におけるＤＮＡメチル化マーカーのメチル化状態を決定すること；
ｂ）ＤＮＡメチル化マーカーのメチル化状態を、胃がんを有していないヒト対象からの正常コントロール試料からのＤＮＡメチル化マーカーのメチル化状態と比較すること
ｃ）上記ヒト患者および正常コントロール試料のメチル化状態における差異の信頼区間および／またはｐ値を決定すること
を含んでいる、方法。
【請求項２６】
上記信頼区間が、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％または９９．９９％であり、上記ｐ値が、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１または０．０００１である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ヒト対象から得られた試料を特徴づけるための方法であって、
ＤＭＲを含んでいる核酸を、バイスルファイト試薬と反応させて、バイスルファイト反応済の核酸を生成すること；上記バイスルファイト反応済の核酸を配列決定して、上記バイスルファイト反応済の核酸のヌクレオチド配列を規定すること；上記バイスルファイト反応済の核酸の上記ヌクレオチド配列を、胃がんを有していない対象からのＤＭＲを含んでいる核酸のヌクレオチド配列と比較して、２つの配列における差異を同定することを含んでいる、方法。
【請求項２８】
ヒト対象から得られた試料を特徴づけるためのシステムであって、
試料のメチル化状態を決定するように構成されている分析コンポーネント、
上記試料の上記メチル化状態を、データベースに記録されているコントロール試料メチル化状態または基準試料メチル化状態と比較するように構成されているソフトウェアコンポーネント、ならびに
メチル化状態の組み合わせに基づく単一の値を決定するように、および胃がんと関連するメチル化状態をユーザに注意喚起するように構成されている警告コンポーネントを備えている、システム。
【請求項２９】
上記試料が、ＤＭＲを含んでいる核酸を含んでいる、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３０】
核酸を単離するためのコンポーネントをさらに備えている、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３１】
試料を回収するためのコンポーネントをさらに備えている、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３２】
上記試料が、糞便試料、組織試料、胃部組織試料、血漿試料または尿試料である、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３３】
上記データベースが、ＤＭＲを含んでいる核酸配列を含んでいる、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３４】
上記データベースが、胃がんを有していない対象からの核酸配列を含んでいる、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３５】
対象から得られた試料における新生物についてスクリーニングする方法であって、
１）対象から得られた試料におけるマーカーのメチル化状態を評価すること；ならびに
２）上記マーカーのメチル化状態が、新生物を有していない対象において評価された上記マーカーのメチル化状態と異なるときに、新生物を有していると上記対象をみなすことを含んでおり、
上記マーカーが、表１、２、４または７に基づくＤＭＲ１〜２７４からなる群から選択されるメチル化可変領域（ＤＭＲ）における塩基を含んでいる
方法。
【請求項３６】
上記新生物が、胃部の新生物である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
上記新生物が、胃がんである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
上記新生物が、前がん状態である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
複数のマーカーを評価することを含んでいる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
２〜１１のマーカーを評価することを含んでいる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
１２〜１０７のマーカーを評価することを含んでいる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
上記試料における上記マーカーの上記メチル化状態を評価することが、１塩基のメチル化状態を決定することを含んでいる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
上記試料における上記マーカーの上記メチル化状態を評価することが、複数の塩基におけるメチル化状態の程度を決定する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
上記マーカー上記メチル化状態が、上記マーカーの通常のメチル化状態に対して、増大したメチル化または減少したメチル化を含んでいる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
上記マーカーの上記メチル化状態が、上記マーカーの通常のメチル化状態に対して、上記マーカーの、異なるパターンのメチル化状態を含んでいる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
フォワードストランドのメチル化状態を評価すること、またはリバースストランドのメチル化状態を評価することを含んでいる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４７】
上記マーカーが１００塩基以下の領域である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４８】
上記マーカーが５００塩基以下の領域である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４９】
上記マーカーが１０００塩基以下の領域である、請求項３５に記載の方法。
【請求項５０】
上記マーカーが５０００塩基以下の領域である、請求項３５に記載の方法。
【請求項５１】
上記マーカーが１塩基である、請求項３５に記載の方法。
【請求項５２】
上記マーカーが高いＣｐＧ密集度のプロモータにある、請求項３５に記載の方法。
【請求項５３】
上記試料が、糞便試料、組織試料、胃部組織試料、血漿試料または尿試料である、請求項３５に記載の方法。
【請求項５４】
上記評価することが、メチル化特異的なポリメラーゼ連鎖反応、核酸配列決定、質量分析、メチル化特異定なヌクレアーゼ、質量に基づく分離、またはターゲットキャプチャーを用いることを含んでいる、請求項３５に記載の方法。
【請求項５５】
上記評価することが、メチル化特異的なオリゴヌクレオチドの使用を含んでいる、請求項３５に記載の方法。
【請求項５６】
配列番号１〜１０９からなる群から選択される配列を含んでいる、
オリゴヌクレオチド。
【請求項５７】
ＡＲＨＧＥＦ４、ＥＬＭＯ１、ＡＢＣＢ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＳＦＭＢＴ２、ＣＤ１Ｄ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＺＮＦ５６９およびＣ１３ＯＲＦ１８からなる群から選択されるアノテーションを有している染色体領域が、上記マーカーを含んでいる、請求項３５に記載の方法。
【請求項５８】
上記ＤＭＲが、表４に基づいており、ＤＭＲ番号４９、４３、１９６、６６、１、２３７、２４９、２５０、２５１および２５２からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項５９】
ＥＬＭＯ１、ＡＲＨＧＥＦ４、ＥＭＸ１、ＳＰ９、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＢＭＰ３、ＫＣＮＡ３、ＤＭＲＴＡ２、ＫＣＮＫ１２、ＣＤ１Ｄ、ＰＲＫＣＢ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＺＮＦ５６８、ＡＢＣＢ１、ＥＬＯＶＬ２、ＰＫＩＡ、ＳＦＭＢＴ２（８９３）、ＰＣＢＰ３、ＭＡＴＫ、ＧＲＮ２Ｄ、ＮＤＲＧ４、ＤＬＸ４、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ、ＦＧＦ１４、ＺＮＦ１３２、ＣＨＳＴ２  （７８９０）、ＦＬＩ１、ｃ１３ｏｒｆ１８およびＺＮＦ５６９からなる群から選択されるアノテーションを有している染色体領域が、上記マーカーを含んでいる、請求項３５に記載の方法。
【請求項６０】
上記ＤＭＲが、表２に基づいており、ＤＭＲ番号２５３、２５１、２５４、２５５、２５６、２４９、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２５０、２６３、１、２６４、２６５、１９６、２６６、１１８、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、４６、２７３、２５２および２３７からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項６１】
ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ｏｒｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡ１からなる群から選択されるアノテーションを有している染色体領域が、上記マーカーを含んでいる、請求項３５に記載の方法。
【請求項６２】
上記ＤＭＲが、表１、２、４または７に基づいており、ＤＭＲ番号２５３、２３７、２５２、２６１、２５１、１９６、２５０、２６５、２５６、２４９および２７４からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項６３】
２つのマーカーのメチル化状態を決定することを含んでいる、請求項３５に記載の方法。
【請求項６４】
表１、２、４または７の横列に示されているマーカーの対のメチル化状態を決定することを含んでいる、請求項３５に記載の方法。
【請求項６５】
１）バイスルファイト試薬；
２）表１、２、４および７に基づくＤＭＲ１〜２７４からなる群から選択されるＤＭＲからの配列を含んでおり、かつがんを有していない対象と関連付けられているメチル化状態を有しているコントロール核酸を備えている、キット。
【請求項６６】
バイスルファイト試薬および請求項５６に記載のオリゴヌクレオチドを備えているキット。
【請求項６７】
対象から試料を得るための試料コレクタ；当該試料から核酸を単離するための試薬；および請求項５６に記載のオリゴヌクレオチドを備えている、キット。
【請求項６８】
上記試料が、糞便試料、組織試料、胃部組織試料、血漿試料または尿試料である、請求項６５に記載のキット。
【請求項６９】
ＤＭＲを含んでいる核酸、およびバイスルファイト試薬を含んでいる、
組成物。
【請求項７０】
ＤＭＲを含んでいる核酸、および請求項５６に記載のオリゴヌクレオチドを含んでいる、組成物。
【請求項７１】
ＤＭＲを含んでいる核酸、およびメチル化感受性制限酵素を含んでいる、組成物。
【請求項７２】
ＤＭＲを含んでいる核酸、およびポリメラーゼを含んでいる、組成物。
【請求項７３】
対象から得られた試料における胃の新生物についてスクリーニングするための方法であって、
ａ）表１、２、４および７に基づくＤＭＲ１〜２７４からなる群から選択されるＤＭＲにおける塩基を含んでいる上記試料におけるマーカーのメチル化状態を決定すること；
ｂ）上記対象試料からの上記マーカーの上記メチル化状態を、胃がんを有していない対象からの正常コントロール試料からのマーカーのメチル化状態と比較すること；
ｃ）上記対象試料および正常コントロール試料のメチル化状態における差異の信頼区間および／またはｐ値を決定することを含んでいる、
方法。
【請求項７４】
上記信頼区間が、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％または９９．９９％であり、上記ｐ値が、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１または０．０００１である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７５】
対象から得られた試料における胃の新生物についてスクリーニングするための方法であって、
ＤＭＲを含んでいる核酸を、バイスルファイト試薬と反応させて、バイスルファイト反応済の核酸を生成すること；上記バイスルファイト反応済の核酸を配列決定して、上記バイスルファイト反応済の核酸のヌクレオチド配列を規定すること；上記バイスルファイト反応済の核酸の上記ヌクレオチド配列を、胃がんを有していない対象からのＤＭＲを含んでいる核酸のヌクレオチド配列と比較して、２つの配列における差異を同定すること；差異があるときに、胃の新生物を有していると上記対象をみなすことを含んでいる、方法。
【請求項７６】
対象から得られた試料における胃の新生物についてスクリーニングするためのシステムであって、
試料のメチル化状態を決定するように構成されている分析コンポーネント、
上記試料の上記メチル化状態を、データベースに記録されているコントロール試料メチル化状態または基準試料メチル化状態と比較するように構成されている、ソフトウェアコンポーネント、ならびに
メチル化状態の組み合わせに基づいて単一の値を決定するためおよび胃がんと関連するメチル化状態をユーザに注意喚起するように構成されている警告コンポーネントを備えている、システム。
【請求項７７】
上記試料が、ＤＭＲを含んでいる核酸を含んでいる、請求項７６に記載のシステム。
【請求項７８】
核酸を単離するためのコンポーネントをさらに備えている、請求項７６に記載のシステム。
【請求項７９】
試料を回収するためのコンポーネントをさらに備えている、請求項７６に記載のシステム。
【請求項８０】
糞便試料、胃部組織試料および／または血漿試料を回収するためのコンポーネントをさらに備えている、請求項７６に記載のシステム。
【請求項８１】
上記データベースが、ＤＭＲを含んでいる核酸配列を含んでいる、請求項７６に記載のシステム。
【請求項８２】
上記データベースが、胃がんを有していない対象からの核酸配列を含んでいる、請求項７６に記載のシステム。
【請求項８３】
それぞれの核酸がＤＭＲを含んでいる、単離された核酸の組。
【請求項８４】
それぞれの核酸が、胃がんを有していない対象からの配列を有している、請求項８３に記載の核酸の組。
【請求項８５】
請求項８５または８６に記載の核酸の上記組、ならびに核酸の当該組と関連付けられている複数の核酸配列のデータベースを備えている、システム。
【請求項８６】
バイスルファイト試薬をさらに備えている、請求項８５に記載のシステム。
【請求項８７】
核酸配列のシークエンサをさらに備えている、請求項８５に記載のシステム。
【請求項８８】
生物学的試料を特徴づけるための方法であって、
（ａ）ヒト個体の生物学的試料におけるＥＬＭＯ１、ＡＲＨＧＥＦ４、ＥＭＸ１、ＳＰ９、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＢＭＰ３、ＫＣＮＡ３、ＤＭＲＴＡ２、ＫＣＮＫ１２、ＣＤ１Ｄ、ＰＲＫＣＢ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＺＮＦ５６８、ＡＢＣＢ１、ＥＬＯＶＬ２、ＰＫＩＡ、ＳＦＭＢＴ２  （８９３）、ＰＣＢＰ３、ＭＡＴＫ、ＧＲＮ２Ｄ、ＮＤＲＧ４、ＤＬＸ４、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ、ＦＧＦ１４、ＺＮＦ１３２、ＣＨＳＴ２  （７８９０）、ＦＬＩ１、ｃ１３ｏｒｆ１８およびＺＮＦ５６９から選択される２つ以上の遺伝子についてＣｐＧ部位のメチル化レベルを、
上記生物学的試料におけるゲノムＤＮＡを、バイスルファイトを用いて処理すること、
上記選択された上記２つ以上の遺伝子に対するプライマーの以下の組：
配列番号２１および２２からなる、ＥＬＭＯ１に対するプライマーの組、
配列番号２３および２４からなる、ＡＲＨＧＥＦ４に対するプライマーの組、
配列番号２５および２６からなる、ＥＭＸ１に対するプライマーの組、
配列番号２７および２８からなる、ＳＰ９に対するプライマーの組、
配列番号２９および３０からなる、ＣＬＥＣ１１Ａに対するプライマーの組、
配列番号１３および１４からなる、ＳＴ８ＳＩＡ１に対するプライマーの組、
配列番号３１および３２からなる、ＢＭＰ３に対するプライマーの組、
配列番号３３および３４からなる、ＫＣＮＡ３に対するプライマーの組、
配列番号３５および３６からなる、ＤＭＲＴＡ２に対するプライマーの組、
配列番号３７および３８からなる、ＫＣＮＫ１２に対するプライマーの組、
配列番号３９および４０からなる、ＣＤ１Ｄに対するプライマーの組、
配列番号４１および４２からなる、ＰＲＫＣＢに対するプライマーの組、
配列番号４３および４４からなる、ＣＹＰ２６Ｃ１に対するプライマーの組、
配列番号４５および４６からなる、ＺＮＦ５６８に対するプライマーの組、
配列番号９および１０からなる、ＡＢＣＢ１に対するプライマーの組、
配列番号４７および４８からなる、ＥＬＯＶＬ２に対するプライマーの組、
配列番号４９および５０からなる、ＰＫＩＡに対するプライマーの組、
配列番号５および６からなる、ＳＦＭＢＴ２（８９３）に対するプライマーの組、
配列番号５１および５２からなる、ＰＣＢＰ３に対するプライマーの組、
配列番号５３および５４からなる、ＭＡＴＫに対するプライマーの組、
配列番号５５および５６からなる、ＧＲＮ２Ｄに対するプライマーの組、
配列番号５７および５８からなる、ＮＤＲＧ４に対するプライマーの組、
配列番号５９および６０からなる、ＤＬＸ４に対するプライマーの組、
配列番号６１および６２からなる、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃに対するプライマーの組、
配列番号６３および６４からなる、ＦＧＦ１４に対するプライマーの組、
配列番号６５および６６からなる、ＺＮＦ１３２に対するプライマーの組、
配列番号６７および６８からなる、ＣＨＳＴ２（７８９０）に対するプライマーの組、
配列番号６９および７０からなる、ＦＬＩ１に対するプライマーの組、
配列番号１９および２０からなる、ｃ１３ｏｒｆ１８に対するプライマーの組、
配列番号１１および１２からなる、ＺＮＦ５６９に対するプライマーの組、
を用いて、上記バイスルファイト処理済のゲノムＤＮＡを増幅すること、および
メチル化特異的ＰＣＲ、定量的なメチル化特異的ＰＣＲ、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析、定量的なバイスルファイトパイロシークエンシングまたはバイスルファイトゲノムシークエンシングＰＣＲによって上記ＣｐＧ部位の上記メチル化レベルを決定すること
によって、測定すること；
（ｂ）上記メチル化レベルを、胃がんなしのコントロール試料における、遺伝子の対応する組のメチル化レベルと比較すること；ならびに
（ｃ）上記２つ以上の遺伝子において測定された上記メチル化レベルが、それぞれの上記コントロール試料において測定された上記メチル化レベルより高いときに、上記個体が胃がんを有していることを、決定することを含んでいる、
方法。
【請求項８９】
上記生物学的試料が糞便試料または組織試料である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
上記組織が胃部組織である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
上記ＣｐＧ部位がコード領域または制御領域に存在する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９２】
２つ以上の遺伝子についての上記メチル化レベル  ＣｐＧ部位を、上記測定することが、上記ＣｐＧ部位のメチル化スコアを決定すること、および上記ＣｐＧ部位のメチル化頻度を決定することからなる群から選択される決定を含んでいる、請求項８８に記載の方法。
【請求項９３】
血漿試料を特徴づけるための方法であって、
（ａ）ヒト個体の血漿試料におけるＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ｏｒｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡ１から選択される２つ以上の遺伝子についてＣｐＧ部位のメチル化レベルを、
上記生物学的試料におけるゲノムＤＮＡを、バイスルファイトを用いて処理すること、
上記選択された２つ以上の遺伝子に対するプライマーの以下の組：
配列番号８０および８１からなる、ＥＬＭＯ１に対するプライマーの対、
配列番号８６および８７からなる、ＺＮＦ５６９に対するプライマーの対、
配列番号７４および７５からなる、Ｃ１３ｏｒｆ１８に対するプライマーの対、
配列番号９８および９９からなる、ＣＤ１Ｄに対するプライマーの対、
配列番号９５および９６からなる、ＡＲＨＧＥＦ４に対するプライマーの対、
配列番号８３および８４からなる、ＳＦＭＢＴ２に対するプライマーの対、
配列番号９２および９３からなる、ＰＰＰ２５ＲＣに対するプライマーの対、
配列番号１０４および１０５からなる、ＣＹＰ２６Ｃ１に対するプライマーの対、
配列番号７１および７２からなる、ＰＫＩＡに対するプライマーの対、
配列番号７７および７８からなる、ＣＬＥＣ１１Ａに対するプライマーの対、
配列番号１０７および１０８からなる、ＬＲＲＣ４に対するプライマーの対、
配列番号１０１および１０２からなる、ＳＴ８ＳＩＡ１に対するプライマーの対
を用いて、上記バイスルファイト処理済のゲノムＤＮＡを増幅すること、および
メチル化特異的ＰＣＲ、定量的なメチル化特異的ＰＣＲ、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析、定量的なバイスルファイトパイロシークエンシングまたはバイスルファイトゲノムシークエンシングＰＣＲによって上記ＣｐＧ部位の上記メチル化レベルを決定すること
によって測定すること；
（ｂ）上記メチル化レベルを、胃がんなしのコントロール試料における、遺伝子の対応する組のメチル化レベルと比較すること；ならびに
（ｃ）上記２つ以上の遺伝子において測定された上記メチル化レベルが、それぞれの上記コントロール試料において測定された上記メチル化レベルより高いときに、上記個体が胃がんを有していることを、決定することを含んでいる、方法。
【請求項９４】
上記ＣｐＧ部位がコード領域または制御領域に存在する、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
２つ以上の遺伝子についての上記メチル化レベル  ＣｐＧ部位を、上記測定することが、上記ＣｐＧ部位のメチル化スコアを決定すること、および上記ＣｐＧ部位のメチル化頻度を決定することからなる群から選択される決定を含んでいる、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
生物学的試料を特徴づけるための方法であって、
ヒトの生物学的試料（当該生物学的試料が当該ヒト個体からの組織試料である）におけるＥＬＭＯ１、ＡＲＨＧＥＦ４、ＥＭＸ１、ＳＰ９、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＢＭＰ３、ＫＣＮＡ３、ＤＭＲＴＡ２、ＫＣＮＫ１２、ＣＤ１Ｄ、ＰＲＫＣＢ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＺＮＦ５６８、ＡＢＣＢ１、ＥＬＯＶＬ２、ＰＫＩＡ、ＳＦＭＢＴ２  （８９３）、ＰＣＢＰ３、ＭＡＴＫ、ＧＲＮ２Ｄ、ＮＤＲＧ４、ＤＬＸ４、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ、ＦＧＦ１４、ＺＮＦ１３２、ＣＨＳＴ２  （７８９０）、ＦＬＩ１、ｃ１３ｏｒｆ１８およびＺＮＦ５６９、または
ヒト個体の生物学的試料（当該生物学的試料が当該ヒト個体からの血漿試料である）におけるＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ｏｒｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡ１
いずれかから選択される２つ以上の遺伝子についてのＣｐＧ部位のメチル化レベルを、
上記生物学的試料におけるゲノムＤＮＡを、バイスルファイトを用いて処理すること；
上記選択された２つ以上の遺伝子に対するプライマーの組を用いて、上記バイスルファイト処理済のゲノムＤＮＡを増幅すること；および
メチル化特異的ＰＣＲ、定量的なメチル化特異的ＰＣＲ、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析、定量的なバイスルファイトパイロシークエンシングまたはバイスルファイトゲノムシークエンシングＰＣＲによって、上記ＣｐＧ部位の上記メチル化レベルを決定することによって、測定することを含んでいる、方法。
【請求項９７】
上記メチル化レベルを、胃がんなしのコントロール試料における遺伝子の対応する組のメチル化レベルと比較すること；ならびに
上記２つ以上の遺伝子において測定された上記メチル化レベルが、それぞれの上記コントロール試料において測定された上記メチル化レベルより高いときに、上記個体が胃がんを有していることを、決定することをさらに含んでいる、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
上記選択された２つ以上の遺伝子に対するプライマーの以下の対：
配列番号２１および２２からなる、ＥＬＭＯ１に対するプライマーの対、
配列番号２３および２４からなる、ＡＲＨＧＥＦ４に対するプライマーの対、
配列番号２５および２６からなる、ＥＭＸ１に対するプライマーの対、
配列番号２７および２８からなる、ＳＰ９に対するプライマーの対、
配列番号２９および３０からなる、ＣＬＥＣ１１Ａに対するプライマーの対、
配列番号１３および１４からなる、ＳＴ８ＳＩＡ１に対するプライマーの対、
配列番号３１および３２からなる、ＢＭＰ３に対するプライマーの対、
配列番号３３および３４からなる、ＫＣＮＡ３に対するプライマーの対、
配列番号３５および３６からなる、ＤＭＲＴＡ２に対するプライマーの対、
配列番号３７および３８からなる、ＫＣＮＫ１２に対するプライマーの対、
配列番号３９および４０からなる、ＣＤ１Ｄに対するプライマーの対、
配列番号４１および４２からなる、ＰＲＫＣＢに対するプライマーの対、
配列番号４３および４４からなる、ＣＹＰ２６Ｃ１に対するプライマーの対、
配列番号４５および４６からなる、ＺＮＦ５６８に対するプライマーの対、
配列番号９および１０からなる、ＡＢＣＢ１に対するプライマーの対、
配列番号４７および４８からなる、ＥＬＯＶＬ２に対するプライマーの対、
配列番号４９および５０からなる、ＰＫＩＡに対するプライマーの対、
配列番号５および６からなる、ＳＦＭＢＴ２（８９３）に対するプライマーの対、
配列番号５１および５２からなる、ＰＣＢＰ３に対するプライマーの対、
配列番号５３および５４からなる、ＭＡＴＫに対するプライマーの対、
配列番号５５および５６からなる、ＧＲＮ２Ｄに対するプライマーの対、
配列番号５７および５８からなる、ＮＤＲＧ４に対するプライマーの対、
配列番号５９および６０からなる、ＤＬＸ４に対するプライマーの対、
配列番号６１および６２からなる、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃに対するプライマーの対、
配列番号６３および６４からなる、ＦＧＦ１４に対するプライマーの対、
配列番号６５および６６からなる、ＺＮＦ１３２に対するプライマーの対、
配列番号６７および６８からなる、ＣＨＳＴ２  （７８９０）に対するプライマーの対、
配列番号６９および７０からなる、ＦＬＩ１に対するプライマーの対、
配列番号１９および２０からなる、ｃ１３ｏｒｆ１８に対するプライマーの対、
配列番号１１および１２からなる、ＺＮＦ５６９に対するプライマーの対
は、上記生物学的試料が組織試料である場合に使用される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
上記選択された２つ以上の遺伝子に対するプライマーの以下の組：
配列番号８０および８１からなる、ＥＬＭＯ１に対するプライマーの対、
配列番号８６および８７からなる、ＺＮＦ５６９に対するプライマーの対、
配列番号７４および７５からなる、Ｃ１３ｏｒｆ１８に対するプライマーの対、
配列番号９８および９９からなる、ＣＤ１Ｄに対するプライマーの対、
配列番号９５および９６からなる、ＡＲＨＧＥＦ４に対するプライマーの対、
配列番号８３および８４からなる、ＳＦＭＢＴ２に対するプライマーの対、
配列番号９２および９３からなる、ＰＰＰ２５ＲＣに対するプライマーの対、
配列番号１０４および１０５からなる、ＣＹＰ２６Ｃ１に対するプライマーの対、
配列番号７１および７２からなる、ＰＫＩＡに対するプライマーの対、
配列番号７７および７８からなる、ＣＬＥＣ１１Ａに対するプライマーの対、
配列番号１０７および１０８からなる、ＬＲＲＣ４に対するプライマーの対、
配列番号１０１および１０２からなる、ＳＴ８ＳＩＡ１に対するプライマーの対
は、上記生物学的試料が組織試料であると場合に使用される、請求項９６に記載の方法。
【請求項１００】
上記組織試料が胃部組織試料である、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０１】
上記ＣｐＧ部位がコード領域または制御領域に存在する、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０２】
２つ以上の遺伝子について上記メチル化レベル  ＣｐＧ部位を上記測定することが、上記ＣｐＧ部位のメチル化スコアを決定すること、および上記ＣｐＧ部位のメチル化頻度を決定することからなる群から選択される決定を含んでいる、請求項９６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本願は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国仮出願第６２／２１２，２２１号の利益に対する優先権、および当該利益を主張する。
【０００２】
新生物を検出することに関連する技術（特に（しかし、これらに限らない）、前がん状態および悪性の新生物（例えば胃がん）を検出するための、方法、組成物および関連する使用）が、本明細書に示されている。
【背景技術】
【０００３】
胃がんは、世界中でがんに関する死亡の、３番目に一般的な原因であり（例えば、World Health Organization. Cancer: Fact Sheet No 297. WHOを参照）、ほとんどの患者が進行した疾患を示しているので、西洋諸国において治療困難であり続けている。米国では、胃部の悪性腫瘍は、現在、１５番目に多いがんである（例えば、Surveillance, Epidemiology, and End Results Program. SEER Stat FactSheets: Stomach Cancer. National Cancer Instituteを参照）。ほとんどの先進国において、しかし、胃がんの率は、過去の半世紀より劇的に減少している。
【０００４】
胃がんの減少は、冷凍の広範な使用に、部分的に起因している。冷凍は、いくつかの有効作用：新鮮な果実および野菜の増大した消費；食品防腐剤として使用されている塩の、低下した摂取；および未凍結の肉製品の腐敗から生じる発がん性化合物による、食品の低下した汚染を有している。塩および塩漬け食品は、胃粘膜を損ない得、炎症、ならびにＤＮＡ合成および細胞増殖の、関連する増加を導く。胃がんの率の低下におそらく寄与している他の要因としては、向上した衛生および抗生物質の使用、ならびに一部の国における増加した検診の結果である、Helicobacter pyloriの慢性的な感染のより低い率が挙げられる（例えば、GlobalCancer Facts & Figures, 3rd ed. American Cancer Societyを参照）。
【０００５】
しかし、胃がんは、ほとんどの患者が進行した疾患を示しているので、西洋諸国において治療困難であり続けている。最も好ましい条件にあり、治癒的な外科切除を受けている患者でさえ、再発性の疾患のためにしばしば死亡する。
【０００６】
しがたって、胃がんの早期検出のための改良された方法および手法が、必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
メチル化されているＤＮＡは、ほとんどの腫瘍型の組織におけるバイオマーカーの有力な一群として研究されている。多くの例において、ＤＮＡメチル転位酵素は、遺伝子発現のエピジェネティックな制御として、シトシン−リン酸−グアニン（ＣｐＧ）アイランド部位においてＤＮＡにメチル基を付加する。生物学的に興味深い機序において、腫瘍抑制遺伝子のプロモータ領域における後天的なメチル化現象は、発現を止めさせ、したがって、発がんに寄与すると考えられている。ＤＮＡメチル化は、ＲＮＡまたはタンパク質発現より、化学的および生物学的に安定な診断ツールであり得る（Laird (2010) “Principles and challenges of genome-wide DNAmethylation analysis” Nat Rev Genet 11: 191-203）。さらに、散発性の結腸がんのような他のがんにおいて、メチル化マーカーは、優れた特性をもたらし、個々のＤＮＡ変異より、広く有益かつ高感度である（Zou et al (2007) “Highly methylated genes in colorectal neoplasia:implications for screening” Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 16: 2686-96）。
【０００８】
ＣｐＧアイランドの分析は、動物モデルおよびヒト細胞株に使用されるとき、重要な知見をもたらしている。例えば、Zhangらは、同じＣｐＧアイランドの異なる部分からのアンプリコンが、メチル化の異なるレベルを有していることを発見した（Zhang et al. (2009) “DNA methylation analysis of chromosome 21 genepromoters at single base pair and single allele resolution” PLoS Genet 5:e1000438）。さらに、メチル化レベルは、高メチル化配列および非メチル化配列の間において２つのモードに割り当てられ、さらに、ＤＮＡメチル転位酵素活性の二元的な切替え様パターンをさらに支持している（Zhang et al. (2009) “DNA methylation analysis of chromosome 21 genepromoters at single base pair and single allele resolution” PLoS Genet 5:e1000438）。マウス組織のインビボ分析および細胞株のインビトロ分析は、わずか約０．３％の高いＣｐＧ密集度のプロモータが（ＨＣＰ、３００塩基対の領域内に＞７％のＣｐＧ配列を有していると規定されている）メチル化されており、低いＣｐＧ密集度の部位（３００塩基対の領域内に＜５％のＣｐＧ配列を有していると規定されている）が、動的な組織特異的な様式において頻繁にメチル化されていることを証明した（Meissner et al. (2008) “Genome-scale DNA methylation maps ofpluripotent and differentiated cells” Nature 454: 766-70）。ＨＣＰは、遍在性の構成遺伝子および発生遺伝子のためのプロモータを含んでいる。なかでも、＞５０％においてメチル化されているＨＣＰ部位は、いくつかの確立されたマーカー（例えば、Wnt 2, NDRG2、SFRP2およびBMP3）であった（Meissner et al. (2008)“Genome-scale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells”Nature 454: 766-70）。
【０００９】
総計として、胃腸管系のがんは、任意の他の器官系のがんより高い死亡数を占めている。上部ＧＩがんによる米国における年間死亡数は、結腸直腸がんのおよそ５００００に比べて、９００００を超えている。胃のアデノカルチノーマは、世界中で第２に多い、がんの死亡原因である（つまり、年に１００万人の死者）。それは、太平洋岸のアジア、ロシアおよび一部のラテンアメリカにおいて最も一般的である。ほとんど患者が、進行した疾患を示しているので、予後が不良（５年生存率＜５〜１５％）である。
【００１０】
胃がんの基礎をなすゲノム機序は、複雑であり、完全には理解されていない。Helicobacter pylori感染に基づく慢性的な胃炎は、環境的なばくろとともに、病因に寄与している。染色体上の不安定性およびマイクロサテライトの不安定性が、胃がんおよびエピジェネティックな変化と関連付けられている。ＣｐＧメチレータの表現型はまた、症例のうち２４〜４７％と説明されている。共通して認められる変異としては、いん弟子ｐ５３、ＡＰＣ、βカテニン、およびｋ−ｒａｓが挙げられるが、これらは、自然界では、相対的に低頻度かつ異質である。
【００１１】
胃がんは、消化の流れのなかに細胞およびＤＮＡを流し、最終的に糞便に分泌される。高感度アッセイは、摘出された腫瘍が同じ配列を含んでいると分かっている胃がん患者の適合する糞便において変異ＤＮＡを検出するために、これまで使用されている。しかし、変異マーカーによるいくつかの制限は、それらの検出の根本的な不均一性および扱いにくい処理に関し、典型的に、複数の遺伝子にまたがるそれぞれの変異部位を、高感度を実現するために別々にアッセイされなければならない。
【００１２】
シトシン−リン酸−グアニン（ＣｐＧ）アイランド部位におけるＤＮＡのエピジェネティックなメチル化は、ほとんどの腫瘍型の組織におけるバイオマーカーの有力な一群として研究されている。生物学的に興味深い機序において、腫瘍抑制遺伝子のプロモータ領域における後天的なメチル化現象は、発現を止めさせ、発がんに寄与する。ＤＮＡメチル化は、ＲＮＡまたはタンパク質発現より、化学的および生物学的に安定な診断ツールであり得る。さらに、散発性の結腸がんのような他のがんにおいて、異常なメチル化マーカーは、個々のＤＮＡ変異より、広く有益かつ高感度であり、優れた特性をもたらす。
【００１３】
いくつかの方法が、新規なメチル化マーカーの探索に利用可能である。ＣｐＧメチル化の照会に基づくマイクロアレイが、適当な、高速大量処理アプローチであるが、この戦略は、主に証明されている所望の腫瘍抑制プロモータの、知られている領域に向いている。ＤＮＡメチル化の幅広いゲノム分析のための代替的な方法が、この１０年において開発されている。３つの基本的なアプローチがある。第１は、特定のメチル化された部位を認識する制限酵素によるＤＮＡの消化（続く、制限酵素認識部位に限定されたメチル化データをもたらす、または評価ステップ（例えば、メチル化特異的ＰＣＲ；ＭＳＰ）においてＤＮＡを増幅するためにプライマーが使用される、いくつかの分析手法）を使用する。第２のアプローチは、メチル化シトシンまたは他のメチル化特異的結合ドメインに対する抗体を用いて、ゲノムＤＮＡのメチル化されている画分を濃縮（続いて、基準ゲノムに対して当該断片を位置づけるためのマイクロアレイ分析または配列決定）する。このアプローチは、上記断片ないのすべてのメチル化された部位の単一ヌクレオチドの解像能を示さない。第３のアプローチは、すべての非メチル化チロシンをウラシルに変換するためのバイスルファイト処理に始まり、アダプターリガンドへの結合後におけるすべての断片の制限酵素処理および完全な配列決定に続く。制限酵素の選択が、ＣｐＧ密集領域について上記断片を濃縮し、分析中に多数の遺伝子位置を決定し得る重複配列の数を減らし得る。この後者のアプローチ（低発現量バイスルファイトシークエンシング（reduced representation bisulfite sequencing）（ＲＲＢＳ）と呼ばれている）が、知られているが、胃がんを研究するために、いまのところ使用されていない。
【００１４】
ＲＲＢＳは、すべてのＣｐＧアイランドのうち８０〜９０％および腫瘍抑制プロモータの大部分の、中程度〜高いリードカバレッジにおける、単一ヌクレオチド解像度のＣｐＧメチル化状態データを生じる。がん患者−コントロールの研究において、
これらのリードの分析は、メチル化可変領域（ＤＭＲ）の同定を結果としてもたらす。すい臓がん試料の、これまでのＲＲＢＳ分析において、数百のＤＭＲが発見され、その多くが、発がんに決して関連しておらず、アノテーションがなかった。独立した組織試料に対するさらなる検証試験は、その性能の点で１００％感度および特異性のマーカーＣｐＧを確認した。
【００１５】
高度に識別可能なマーカーの臨床アプローチは、大きな影響を有し得る。例えば、隔たった媒体（糞便または血液のような）におけるそのようなマーカーのアッセイは、胃の新生物の検出用の、スクリーニングを正確にすること、または診断ツールを導き得る。
【００１６】
本技術のための実施形態を開発する中で実施された実験は、胃がん試料から同様に生成された１２３の新規なＤＮＡメチル化マーカーを指摘し、説明している。がんとともに、正常な胃部組織、正常な結腸組織、および正常な白血球ＤＮＡが、配列決定された。マーカーを、最も堅牢な候補物を同定し、最適化するために多くの試料集団について確認した。さらなる実験は、胃がんを検出するための１０の最適なマーカーを同定した（ＡＲＨＧＥＦ４、ＥＬＭＯ１、ＡＢＣＢ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＳＦＭＢＴ２、ＣＤ１Ｄ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＺＮＦ５６９およびＣ１３ＯＲＦ１８；実施例２、ならびに表４、５および６を参照）。さらなる実験は、胃がんを検出するための３０の最適なマーカーを同定した（ＥＬＭＯ１、ＡＲＨＧＥＦ４、ＥＭＸ１、ＳＰ９、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＢＭＰ３、ＫＣＮＡ３、ＤＭＲＴＡ２、ＫＣＮＫ１２、ＣＤ１Ｄ、ＰＲＫＣＢ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＺＮＦ５６８、ＡＢＣＢ１、ＥＬＯＶＬ２、ＰＫＩＡ、ＳＦＭＢＴ２  （８９３）、ＰＣＢＰ３、ＭＡＴＫ、ＧＲＮ２Ｄ、ＮＤＲＧ４、ＤＬＸ４、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ、ＦＧＦ１４、ＺＮＦ１３２、ＣＨＳＴ２  （７８９０）、ＦＬＩ１、ｃ１３ｏｒｆ１８またはＺＮＦ５６９；実施例１、ならびに表１、２および３を参照）。さらなる実験は、胃がんを検出するための１２の最適なマーカーを同定した（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ｏｒｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡ１；実施例３、ならびに表７および８を参照）。
【００１７】
したがって、本明細書には、対象から取られた試料（例えば、糞便試料；胃部組織試料；血漿試料）から検出されるときに、高いシグナルノイズ比および低いバックグラウンドレベルをもたらす胃がんスクリーニングマーカーのための技術が、示されている。マーカーを、胃がんを有している対象の胃部組織または血漿からのＤＮＡマーカーのメチル化状態を、コントロール対象（例えば、正常な胃部組織、正常な結腸上皮、正常な血漿および正常な白血球由来のＤＮＡ；実施例１、２および３、ならびに表１〜８を参照）（例えば、血漿組織；実施例３を参照）からの同じＤＮＡマーカーのメチル化状態と比較することによって、患者−コントロール試験において同定した。
【００１８】
本明細書に説明されているように、上記技術は、胃がん全体にとっての高い識別をともなう、多くのメチル化マーカーおよびその部分集合（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のマーカーの集合）をもたらす。実験は、胃がんのスクリーニングまたは診断を目的として高い特性を示すための高いシグナルノイズ比および低いバックグラウンドレベルを示すマーカーを同定するために、候補物マーカーに対する選択フィルタを使用した。
【００１９】
いくつかの実施形態において、上記技術は、本明細書において同定されている、生物学的試料（例えば、胃部組織、血漿試料）におけるマーカーのうち１つ以上のの存在およびメチル化状態を評価することに関する。これらのマーカーは、本明細書（例えば、表１、２、４および／または７）に述べられているようなメチル化可変領域（ＤＭＲ）の１つ以上を含んでいる。メチル化状態は、上記技術の実施形態において評価される。したがって、本明細書に示されている上記技術は、遺伝子のメチル化状態が測定される方法には、限定されない。例えば、いくつかの実施形態において、メチル化状態は、ゲノムスキャニング法によって測定される。例えば、１つの方法は、制限目標ゲノムスキャニング（Kawai et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14: 7421-7427）をともない、他の例は、メチル化感受性の任意開始ＰＣＲ（Gonzalgo et al. (1997) Cancer Res. 57: 594-599）をともなう。いくつかの実施形態において、特定のＣｐＧにおけるメチル化パターンの変化は、メチル化感受性制限酵素を用いたゲノムＤＮＡの消化（続く所望の領域のサザン分析）（消化−サザン法）によってモニターされる。いくつかの実施形態において、メチル化パターンの変化を分析することは、メチル化感受性制限酵素を用いたゲノムＤＮＡの消化をＰＣＲ増幅前にともなう、ＰＣＲに基づくプロセスをともなう（Singer-Sam et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18: 687）。さらに、メチル化分析の開始点としてＤＮＡのバイスルファイト処理を利用する他の技術が、報告されている。これらとしては、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）（Herman et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9821-9826）およびバイスルファイト変換されたＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物の制限酵素消化（Sadri and Hornsby (1996) Nucl. Acids Res. 24: 5058-5059;およびXiong and Laird (1997) Nucl. Acids Res. 25: 2532-2534）が挙げられる。遺伝子変異の検出用のＰＣＲ手法（Kuppuswamy et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1143-1147）、およびアレル特異的な発現の定量化用のＰＣＲ手法（Szabo and Mann (1995) Genes Dev. 9: 3097-3108;およびSinger-Sam et al. (1992) PCR Methods Appl. 1: 160-163）が、開発されている。そのような手法は、内部プライマー（ＰＣＲ生成されたテンプレートにアニールし、定量される単一ヌクレオチドに接する５’を終端処理する）を使用している。米国特許第7,037,650号に記載の“quantitative Ms-SNuPE assay”を用いる方法が、いくつかの実施形態に使用される。
【００２０】
メチル化状態を評価するとき、メチル化状態は、特定の部位を含んでいる試料におけるＤＮＡの総集団に対する、特定の部位において（例えば、単一ヌクレオチド、特定の領域または遺伝子座、より長い所望の配列（例えば、〜１００ｂｐ、２００ｂｐ、５００ｂｐ、１０００ｂｐ以上のＤＮＡの部分配列））メチル化されているＤＮＡの個々のストランドの部分またはパーセンテージとしてしばしば表される。以前は、非メチル化核酸の量を、標準物質を用いたＰＣＲによって決定している。それから、既知の量のＤＮＡを、バイスルファイト処理し、生じたメチル化特異的な配列を、リアルタイムＰＣＲまたは他の指数関数的な増幅（例えば、QuARTSアッセイ（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第8,361,720号；米国特許出願公開第2012/0122088号；および米国特許出願公開第2012/0122106号によって示されているような））を用いて決定する。
【００２１】
例えば、いくつかの実施形態において、方法は、外部標準を用いることによって非メチル化標的のための標準曲線を生成することを含んでいる。標準曲線は、す少なくとも２点から構成されており、既知の定量的標準に対する非メチル化ＤＮＡについての実時間のＣｔ値に関する。それから、メチル化標的のための第２標準曲線を、少なくとも２点および外部標準から構成する。この第２の標準曲線は、既知の定量的標準に対するメチル化ＤＮＡについてのＣｔに関する。次に、試験試料Ｃｔ値を、メチル化集団および非メチル化集団について決定し、ＤＮＡのゲノム当量を、最初の２ステップによって生成された標準曲線から算出する。所望の部位におけるメチル化のパーセンテージを、集団におけるＤＮＡの総量に対する、メチル化ＤＮＡの量（例えば、（メチル化ＤＮＡの数）／（メチル化ＤＮＡの数＋非メチル化ＤＮＡの数）×１００）から算出する。
【００２２】
本明細書には、また、上記方法を実施するための組成物およびキットが示されている。例えば、いくつかの実施形態において、１つ以上のマーカーに特異的な試薬（例えば、プライマー、プローブ）が、単独または集合（例えば、複数のマーカーを増幅するためのプライマー対の集合）として備えられている。また、検出アッセイを実施するためのさらなる試薬（例えば、QuARTS、ＰＣＲ、配列決定、バイスルファイト、または他のアッセイを実施するための酵素、緩衝液、陽性コントロールおよび陰性コントロール）が、備えられている。また、上記試薬を含んでいる反応混合物が、備えられている。さらに、反応混合物を完成するために、互いおよび／または試験試料に加えられ得る複数の試薬を含んでいる、マスター混合試薬セットが示されている。
【００２３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の技術は、本明細書に記載の方法によってもたらされるような、一連の算術演算または論理演算を実施するために設計されているプログラム可能な機械と関連する。例えば、上記技術のいくつかの実施形態は、コンピュータソフトウェアおよび／またはコンピュータハードウェアと関連づけられている（例えば、において実施される）。一側面において、上記技術は、メモリの形態、算術演算および論理演算を実施するための要素、ならびにデータを読み取り、扱い、補完するための一連の指示（例えば、本明細書に示されているような方法）を実行するための処理要素（例えば、マイクロプロセッサ）を備えているコンピュータに関する。いくつかの実施形態において、マイクロプロセッサは、メチル化状態（例えば、１つ以上のＤＭＲ（例えば、表１、２、４および７に示されているようなＤＭＲ１〜２７４）の）を決定し；メチル化状態（例えば、１つ以上のＤＭＲ（例えば、表１、２、４および７に示されているようなＤＭＲ１〜２７４）の）を比較し；標準曲線を生成し；Ｃｔ値を決定し；メチル化（例えば、１つ以上のＤＭＲ（例えば、表１、２、４および７に示されているようなＤＭＲ１〜２７４）の）の部分、頻度またはパーセンテージを算出し；ＣｐＧアイランドを同定し；アッセイまたはマーカーの特異性および／または感度を決定し；ＲＯＣｋｙｏｋｕｓｅｎｎ  および関連するＡＵＣを算出し；配列分析（すべて本明細書に説明されている、または当該分野において知られている）のためのシステムの一部である。
【００２４】
いくつかの実施形態において、マイクロプロセッサまたはコンピュータは、がんの部位を予測するためのアルゴリズムにおいてメチル化状態データを使用する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ソフトウェア要素またはハードウェア要素は、複数のアッセイの結果を受け取り、当該結果に基づいてがんリスクを示すユーザに報告するための単一の数値結果を決定する（例えば、多数のＤＭＲのメチル化状態（例えば、表１、２、４および７に示されているような）を決定する）。関連する実施形態は、多数のアッセイの結果（例えば、多数のマーカー（例えば、多数のＤＭＲ（例えば、表１、２、４および７）に示されているような）のメチル化状態を決定すること）の数学的な結合（例えば、加重結合、線形結合）に基づいて、リスク因子を算出する。いくつかの実施形態において、ＤＭＲのメチル化状態は、一次元を規定しており、多次元空間における値を有し得、多数のＤＭＲのメチル化状態によって規定される座標が、がんリスクに関する結果（例えば、ユーザに報告するための）である。
【００２６】
いくつかの実施形態は、記録媒体およびメモリ要素を含んでいる。メモリ要素（例えば、揮発性メモリおよび／または不揮発性メモリ）は、指示（例えば、本明細書に記載のような処理の一実施形態）および／またはデータ（例えば、加工物（例えば、メチル化測定、配列決定、およびそれらと関連付けられている統計的記述））の保存における用途がある。また、いくつかの実施形態は、ＣＰＵ、グラフィックカードおよびユーザインターフェイス（例えば、出力装置（例えば、ディスプレイ）および入力装置（例えば、キーボード）を含んでいる）の１つ以上を備えているシステムに関する。
【００２７】
上記技術と関連するプログラム可能な機械は、従来の現存する技術および開発中またはこれから開発される技術（例えば、量子コンピュータ、化学コンピュータ、光学コンピュータ、スピントロニクスに基づくコンピュータなど）を備えている。
【００２８】
いくつかの実施形態において、上記技術は、データ送信のために、有線伝送媒体（例えば、金属ケーブル、光学繊維）または無線伝送媒体を備えている。例えば、いくつかの実施形態は、ネットワーク（例えば、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）、特殊ネットワーク、インターネットなど）の全体へのデータ送信に関する。いくつかの実施形態において、プログラム可能な機械は、クライアント／サーバ関係を有している。
【００２９】
いくつかの実施形態において、データは、コンピュータ読み取り可能な記録媒体（例えば、ハードディスク、フラッシュメモリ、光学媒体、フロッピーディスクなど）に記録される。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本明細書に示されている技術は、本明細書に記載されているような方法を実施するために協働して動作する複数のプログラム可能な装置と関連付けられているえ。例えば、いくつかの実施形態において、複数のコンピュータ（例えば、ネットワークに接続されている）は、（例えば、従来のネットワークインターフェイス（例えば、イーサネット(登録商標)、光学繊維）または無線通信技術）によって接続されている完全なコンピュータ（オンボードＣＰＵ、記憶装置、電源、ネットワークインターフェースなどを有している）に依る、クラスター演算またはグリッド演算またはいくつかの他のコンピュータ構築物の実施において）データを収集し、処理するために同時に動作し得る。
【００３１】
例えば、いくつかの実施形態は、コンピュータ読み取り可能な媒体を含んでいるコンピュータを提供する。当該実施形態は、プロセッサに連結されているランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）を含んでいる。当該プロセッサは、メモリーに保存されているコンピュータ実行可能なプログラム指示を実行する。そのようなプロセッサは、マイクロプロセッサ、ＡＳＩＣ、状態機械または他のプロセッサを包含し得、任意の多くのコンピュータプロセッサ（例えば、Intel Corporation of Santa Clara, California and MotorolaCorporation of Schaumburg, Illinoisが提供しているプロセッサ）であり得る。そのようなプロセッサは、
当該プロセッサによって実行されているときに、当該プロセッサに本明細書に記載のステップを実施させる指示を保存している媒体（例えば、コンピュータ読み取り可能な媒体）を含んでいるか、または当該媒体と接続され得る。
【００３２】
コンピュータ読み取り可能な媒体の実施形態としては、コンピュータ読み取り可能な指示をプロセッサに与えることの可能な、電子、光学、磁気または他の、記憶装置または伝送装置が挙げられるが、これらに限定されない。好適な媒体の他の例としては、フロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、磁気ディスク、メモリチップ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＡＳＩＣ、設定済のプロセッサ、すべての光学媒体、すべての磁気テープまたはコンピュータが指示を読み取り可能な任意の他の磁気媒体が挙げられるが、これらに限定されない。また、コンピュータ読み取り可能な種々の他の形態（ルータ、個人ネットワークもしくは公衆通信回線、または無線もしくは有線の他の伝送装置もしくは伝送路が挙げられる）は、コンピュータに指示を送信し得るか、または伝える得る。指示は、任意の好適なコンピュータプログラム言語（例えば、Ｃ，Ｃ＋＋、Ｃ＃、Visual Basic、Java(登録商標)、Python、PerlおよびJavaScript(登録商標)が挙げられる）に基づくコードを包含し得る。
【００３３】
コンピュータは、いくつかの実施形態において、ネットワークに接続されている。また、コンピュータは、多くの外部装置または内部装置（例えば、マウス、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、キーボード、ディスプレイ、または他の入力装置もしくは出力装置）を備え得る。コンピュータの例は、個人用コンピュータ、デジタルアシスタント、個人用
デジタルアシスタント、形態電話機、移動式電話機、スマートフォン、携帯用小型無線呼出し機、デジタルタブレット、ラップトップコンピュータ、インターネット機器、および他のプロセッサに基づく装置である。一般的に、上記技術の複数の側面に関連するコンピュータは、本明細書に示されている上記技術を含んでいる１つ以上のプログラムをサポート可能な任意のオペレーティングシステム（例えば、Microsoft Windows、Linux(登録商標)、UNIX(登録商標)、Mac OS Xなど）によって動作する、任意の種類のプロセッサに基づくプラットフォームであり得る。いくつかの実施形態は、他のアプリケーションプログラム（例えば、複数のアプリケーション）を実行する個人用コンピュータを包含している。当該複数のアプリケーションは、メモリに格納され得、これらとしては、例えば、ワードプロセシングアプリケーション、表計算アプリケーション、電子メールアプリケーション、簡易メッセージアプリケーション、プレゼンテーションアプリケーション、インターネットブラウザアプリケーション、カレンダ／オーガナイザアプリケーション、およびクライアント装置によって実行可能な任意の他のアプリケーションが挙げられる。
【００３４】
上記技術と関連付けられているように本明細書に記載されている、そのようなすべてのコンポーネント、コンピュータ、およびシステムは、論理または仮想であり得る。
【００３５】
したがって、本明細書には、対象から得られた試料における新生物についてスクリーニングする方法に関する技術が示されている。当該方法は、対象から得られた試料（例えば、胃部組織）（例えば、血漿試料）におけるマーカーのメチル化状態を評価すること；上記マーカーの上記メチル化状態が新生物を有していない対象において評価されたマーカーのメチル化状態と異なるとき、上記対象が新生物を有していると同定することを含んでいる。ここで、上記マーカーは、表１、２、４および／または７に示されているようなＤＭＲ１〜２７４からなる群から選択されるメチル化可変領域（ＤＭＲ）における塩基を含んでいる。上記技術は、胃がんを同定すること、および識別することに関する。いくつかの実施形態において、上記新生物は胃の新生物（例えば、胃がん）である。いくつかの実施形態は、複数のマーカーを評価することを含んでいる（例えば、２〜１１〜１００または２００または２７４のマーカーを評価することを含んでいる）方法を提供する。
【００３６】
上記技術は、評価されるメチル化状態には限定されない。いくつかの実施形態において、試料におけるマーカーのメチル化状態を評価することは、１塩基のメチル化状態を定量することを包含している。いくつかの実施形態において、、試料におけるマーカーのメチル化状態を定量することは、複数の塩基におけるメチル化の程度を決定することを包含している。さらに、いくつかの実施形態において、マーカーのメチル化状態は、マーカーの正常なメチル化状態に対して増大した、マーカーのメチル化状態を包含している。いくつかの実施形態において、マーカーのメチル化状態は、マーカーの正常なメチル化状態に対して低下した、マーカーのメチル化状態を包含している。いくつかの実施形態において、マーカーのメチル化状態は、マーカーの正常なメチル化状態と異なる、マーカーのメチル化のパターンを包含している。
【００３７】
さらに、いくつかの実施形態において、マーカーは、１００未満の塩基の領域である、５００未満の塩基の領域である、１０００未満の塩基の領域である、５０００未満の塩基の領域である、またはいくつかの実施形態において、マーカーは１塩基である。いくつかの実施形態において、マーカーは高いＣｐＧ密集度のプロモータにある。
【００３８】
上記技術は、試料の種類には限定されない。例えば、いくつかの実施形態において、資料は、糞便試料、組織試料（例えば、胃部組織試料）、血液試料（例えば、血漿、血清、全血）、排泄物、または尿試料である。
【００３９】
さらに、上記技術は、メチル化状態を決定するために使用される方法には限定されない。いくつかの実施形態において、定量することは、メチル化特異的ポリメーラゼ連鎖反応、核酸配列決定、質量分析、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量に基づく分離、またはターゲットキャプチャーを用いることを包含している。いくつかの実施形態において、定量することは、メチル化特異的なオリゴヌクレオチドの使用を包含している。いくつかの実施形態において、上記技術は、メチル化状態を決定するために、平行した大規模の配列決定（例えば、次世代シークエンシング）（例えば、合成ごとの配列決定、実時間（例えば、単分子）配列決定、ビーズ乳濁配列決定、ナノ細孔配列決定など）を利用する。
【００４０】
上記技術は、ＤＭＲを検出するための試薬を提供し、例えば、いくつかの実施形態において、配列番号１〜１０９によって示される配列を含んでいるオリゴヌクレオチドの集合が、提供される。いくつかの実施形態において、ＤＭＲにおける塩基を有している染色体領域に対して相補的な配列を含んでいるオリゴヌクレオチドが、提供される。
【００４１】
上記技術は、マーカーの種々のパネルを提供し、例えば、いくつかの実施形態において、マーカーは、当該マーカーを含んでいるＡＲＨＧＥＦ４、ＥＬＭＯ１、ＡＢＣＢ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＳＦＭＢＴ２、ＣＤ１Ｄ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＺＮＦ５６９またはＣ１３ＯＲＦ１８であるアノテーションを有している染色体領域を含んでいる。さらに、実施形態は、ＤＭＲ番号４９、４３、１９６、６６、１、２３７、２４９、２５０、２５１または２５２である表４に基づくＤＭＲを分析する方法を提供する。いくつかの実施形態は、マーカーのメチル化状態を決定することを提供し、ここで、染色体領域が、マーカー（表２を参照）を含んでいるＥＬＭＯ１、ＡＲＨＧＥＦ４、ＥＭＸ１、ＳＰ９、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＢＭＰ３、ＫＣＮＡ３、ＤＭＲＴＡ２、ＫＣＮＫ１２、ＣＤ１Ｄ、ＰＲＫＣＢ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＺＮＦ５６８、ＡＢＣＢ１、ＥＬＯＶＬ２、ＰＫＩＡ、ＳＦＭＢＴ２  （８９３）、ＰＣＢＰ３、ＭＡＴＫ、ＧＲＮ２Ｄ、ＮＤＲＧ４、ＤＬＸ４、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ、ＦＧＦ１４、ＺＮＦ１３２、ＣＨＳＴ２  （７８９０）、ＦＬＩ１、ｃ１３ｏｒｆ１８またはＺＮＦ５６９であるアノテーションを有している。さらに、実施形態は、ＤＭＲ番号２５３、２５１、２５４、２５５、２５６、２４９、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２５０、２６３、１、２６４、２６５、１９６、２６６、１１８、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、４６、２７３、２５２または２３７である、表２に基づくＤＭＲを分析する方法を提供する。さらに、試料が血漿試料であるそのような実施形態において、ＤＭＲ番号２５３、２５１、２５４、２５５、２５６、２４９、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２５０、２６３、１、２６４、２６５、１９６、２６６、１１８、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、４６、２７３、２５２または２３７である、表１、２、４および７に基づくＤＭＲを分析する方法。いくつかの実施形態において、上記方法は、２つのマーカー（例えば、表１、２、４または７に示されているマーカーの対）のメチル化状態を決定することを含んでいる。
【００４２】
キットの実施形態（例えば、バイスルファイト試薬；およびＤＭＲ１〜２７４（表１、２、４または７に基づく）からなる群から選択されるＤＭＲに基づく配列を含んでおり、かつがんを有していない対象と関連付けられているメチル化状態を有しているコントロール核酸を含んでいるキット）が提供される。いくつかの実施形態において、キットは、バイスルファイト試薬および本明細書に記載されているようなオリゴヌクレオチドを含んでいる。いくつかの実施形態において、キットは、バイスルファイト試薬；およびＤＭＲ１〜２７４（表１、２、４または７に基づく）からなる群から選択されるＤＭＲに基づく配列を含んでおり、かつがんを有していない対象と関連付けられているメチル化状態を有しているコントロール核酸を含んでいる。いくつかのキットの実施形態は、対象から試料（例えば、糞便試料、胃部組織試料、血漿試料）を回収するための試料回収器；試料から核酸を単離するための試薬；および本明細書に記載のようなオリゴヌクレオチドを含んでいる。
【００４３】
上記技術は、組成物（例えば、反応混合物）の実施形態に関する。いくつかの実施形態において、ＤＭＲを含んでいる核酸、およびバイスルファイト試薬を含んでいる組成物が、提供される。いくつかの実施形態は、ＤＭＲを含んでいる核酸、および本明細書に記載のようなオリゴヌクレオチドを含んでいる組成物を提供する。いくつかの実施形態は、ＤＭＲを含んでいる核酸、およびメチル化感受性制限酵素を含んでいる組成物を提供する。いくつかの実施形態は、ＤＭＲを含んでいる核酸、およびポリメーラゼを含んでいる組成物を提供する。
【００４４】
対象から得られた試料（例えば、胃部組織試料、血漿試料、糞便試料）における新生物をスクリーニングするための、関連するさらなる方法の実施形態が、提供される。当該方法は、ＤＭＲ１〜２７４（表１、２、４または７）の１つ以上であるＤＭＲにおける塩基を含んでいる試料におけるマーカーのメチル化状態を決定すること；対象試料からのマーカーのメチル化状態を、がんを有していない対象からの正常なコントロール試料からのマーカーのメチル化状態を比較すること；ならびに対象試料および正常なコントロール試料のメチル化状態における差異の信頼区間および／またはｐ値を決定することを含んでいる。いくつかの実施形態において、信頼区間は、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％または９９．９９％であり、ｐ値は、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１または０００１である。方法のいくつかの実施形態は、ＤＭＲを含んでいる核酸を、バイスルファイト試薬と反応させて、バイスルファイト反応済の核酸を生成するステップ；バイスルファイト反応済の核酸を配列決定して、バイスルファイト反応済の核酸のヌクレオチドを配列を示すステップ；バイスルファイト反応済の核酸のヌクレオチド配列を、がんを有していない対象からのＤＭＲを含んでいる核酸のヌクレオチド配列比較して、２つの配列における差異を同定するステップ；および差異があるとき、対象が新生物を有していると同定するステップを含んでいる。
【００４５】
対象から得られた試料における新生物についてスクリーニングするためのシステムが、上記ぎ術によって提供される。システムの例示的な実施形態としては、例えば、対象から得られた試料（例えば、胃部組織試料、血漿試料、糞便試料）における新生物についてスクリーニングするためのシステムが挙げられる。当該システムは、試料のメチル化状態を決定するように構成されている分析コンポーネント、試料のメチル化状態を、データベースに記録されているコントロール試料のメチル化状態または基準試料のメチル化状態と比較するためのソフトウェアコンポーネント、ならびにがんと関連するメチ化状態をユーザに注意喚起するように構成されている注意喚起コンポーネントを含んでいる。注意喚起は、いくつかの実施形態において、多数のアッセイからの結果（例えば、多数のマーカー（例えば、表１、２、または７に示されているような）のメチル化状態を決定すること）を受け取るソフトウェア、および多数の結果に基づいて報告するための値または結果を演算することによって、決定される。いくつかの実施形態は、ユーザ（例えば、内科医、看護師、臨床医など）に報告するための値もしくは結果および／または注意喚起を演算することにおける使用のための、本明細書に示されている各ＤＭＲと関連付けられている加重変数のデータベースを提供する。いくつかの実施形態において、多数のアッセイからのすべての結果が記録され、いくつかの実施形態において、１つ以上の結果が、多数のアッセイに基づく１つ以上の結果（対象におけるがんリスクを表わす）の複合に基づくスコア、値または結果を示すために、使用される。
【００４６】
システムのいくつかの実施形態において、試料は、ＤＭＲを含んでいる核酸を含んでいる。いくつかの実施形態において、システムは、核酸を単離するためのコンポーネント、試料を回収するためのコンポーネント（例えば、糞便試料を回収するためのコンポーネント）をさらに含んでいる。いくつかの実施形態において、システムは、ＤＭＲを含んでいる核酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、データベースは、がんを有していない対象からの核酸配列を含んでいる。また、核酸（例えば、各核酸がＤＭＲを有している複数の核酸の集合）が、提供される。いくつかの実施形態において、眼を有していない対象からの配列を各核酸が有している、複数の核酸の集合。関連するシステムの実施形態は、記載のような複数の核酸の集合および当該複数の核酸の集合と関連付けられている複数の核酸配列のデータベースを含んでいる。いくつかの実施形態は、バイスルファイト試薬をさらに含んでいる。いくつかの実施形態は、核酸シークエンサーをさらに含んでいる。
【００４７】
一部の実施形態において、ヒト患者からの試料（例えば、胃部組織試料、血漿試料、糞便試料）を特徴づけるための方法が、提供される。例えば、いくつかの実施形態において、そのような実施形態は、ヒト患者の試料からＤＮＡを得ること；表１、２または７に基づくＤＭＲ１〜２７４からなる群から選択されるメチル化可変領域（ＤＭＲ）における塩基を含んでいるＤＮＡメチル化マーカーのメチル化状態を評価すること；ならびに１つ以上のＤＮＡメチル化マーカーの、評価されたメチル化状態を、胃の新生物を有していないヒト患者についての１つ以上のＤＮＡメチル化マーカーに対するメチル化レベル基準と比較することを含んでいる。
【００４８】
そのような方法は、ヒト患者からの試料の特定の種類には限定されない。いくつかの実施形態において、試料は胃部組織試料である。いくつかの実施形態において、試料は血漿試料である。いくつかの実施形態において、試料は、糞便試料、組織試料、胃部組織試料、血液試料または尿試料である。
【００４９】
いくつかの実施形態において、そのような方法は、複数のＤＮＡメチル化マーカーを評価することを含んでいる。いくつかの実施形態において、そのような方法は、１２〜１０７のＤＮＡメチル化マーカーを評価することを含んでいる。いくつかの実施形態において、そのような方法は、１塩基のメチル化状態を評価することを含んでいる、試料における１つ以上のＤＮＡメチル化マーカーのメチル化状態を評価することを含んでいる。いくつかの実施形態において、そのような方法は、複数の塩基におけるメチル化状態の程度を決定することを含んでいる、試料における１つ以上のＤＮＡメチル化マーカーのメチル化状態を評価することを含んでいる。いくつかの実施形態において、そのような方法は、フォワードストランドのメチル化状態を評価すること、またはリバースストランドのメチル化状態を評価することを含んでいる。
【００５０】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡメチル化マーカーは、１００未満の塩基の領域である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡメチル化マーカーは５００未満の塩基の領域である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡメチル化マーカーは１０００未満の塩基の領域である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡメチル化マーカーは、１００００未満の塩基の領域である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡメチル化マーカーは１塩基である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡメチル化マーカーは高いＣｐＧ密集度のプロモータである。
【００５１】
いくつかの実施形態において、評価することは、メチル化特異的なポリメーラゼ連鎖反応、核酸配列決定、質量分析、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量に基づく分離、またはターゲットキャプチャーを用いることを含んでいる。
【００５２】
いくつかの実施形態において、評価することは、メチル化特異的オリゴヌクレオチドの使用を含んでいる、いくつかの実施形態において、メチル化特異気的オリゴヌクレオチドは配列番号１〜１０９からなる群から選択される。
【００５３】
いくつかの実施形態において、ＡＲＨＧＥＦ４、ＥＬＭＯ１、ＡＢＣＢ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＳＦＭＢＴ２、ＣＤ１Ｄ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＺＮＦ５６９およびＣ１３ＯＲＦ１８からなる群から選択されるアノテーションを有している染色体領域は、メチル化マーカーを含んでいる。いくつかの実施形態において、ＤＭＲは、表４に基づいており、ＤＭＲ番号４９、４３、１９６、６６、１、２３７、２４９、２５０、２５１および２５２からなる群から選択される。
【００５４】
いくつかの実施形態において、ＥＬＭＯ１、ＡＲＨＧＥＦ４、ＥＭＸ１、ＳＰ９、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＢＭＰ３、ＫＣＮＡ３、ＤＭＲＴＡ２、ＫＣＮＫ１２、ＣＤ１Ｄ、ＰＲＫＣＢ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＺＮＦ５６８、ＡＢＣＢ１、ＥＬＯＶＬ２、ＰＫＩＡ、ＳＦＭＢＴ２  （８９３）、ＰＣＢＰ３、ＭＡＴＫ、ＧＲＮ２Ｄ、ＮＤＲＧ４、ＤＬＸ４、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ、ＦＧＦ１４、ＺＮＦ１３２、ＣＨＳＴ２  （７８９０）、ＦＬＩ１、ｃ１３ｏｒｆ１８およびＺＮＦ５６９からなる群から選択されるアノテーションを有している染色体領域は、ＤＮＡメチル化マーカーを含んでいる。
【００５５】
いくつかの実施形態において、ＤＭＲは、表２に基づいており、ＤＭＲ番号２５３、２５１、２５４、２５５、２５６、２４９、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２５０、２６３、１、２６４、２６５、１９６、２６６、１１８、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、４６、２７３、２５２および２３７からなる群から選択される。
【００５６】
得られた試料が血漿試料であるいくつかの実施形態において、マーカーは、マーカーを含んでいるＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ｏｒｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡ１であるアノテーションを有している染色体領域を含んでいる。
【００５７】
いくつかの実施形態において、ＤＭＲは、表１、２、４または７に基づいており、２５３、２３７、２５２、２６１、２５１、１９６、２５０、２６５、２５６、２４９および２７４からなる群から選択される。
【００５８】
いくつかの実施形態において、そのような方法は、２つのＤＮＡメチル化マーカーのメチル化状態を決定することを含んでいる。いくつかの実施形態において、そのような方法は、表１、２、４または７に示されているＤＮＡメチル化マーカーの対のメチル化状態を決定することを含んでいる。
【００５９】
一部の実施形態において、上記技術は、ヒト患者から得られた試料を特徴づけるための方法を提供する。いくつかの実施形態において、そのような方法は、表１、２、４および７に基づくＤＭＲ１〜２７４からなる群から選択されるＤＭＲにおける塩基を含んでいる試料におけるＤＮＡメチル化マーカーのメチル化状態を決定すること；患者試料からのＤＮＡメチル化マーカーのメチル化状態を、がんを有していないヒト対象からの正常なコントロール試料からのＤＮＡメチル化マーカーのメチル化状態と比較すること；ならびにヒト患者および正常なコントロール試料のメチル化状態における差異の信頼区域およびｐ値を決定することを含んでいる。いくつかの実施形態において、信頼区間は、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％または９９．９９％であり、ｐ値は、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１または０．０００１である。
【００６０】
一部の実施形態において、上記技術は、ヒト対象から得られた試料（例えば、胃部組織試料、血漿試料、糞便試料）を特徴づけるための方法を提供する。当該方法は、ＤＭＲを含んでいる核酸を、バイスルファイト試薬と反応させて、バイスルファイト反応済の核酸を生成させること；バイスルファイト反応済の核酸を配列決定して、バイスルファイト反応済の核酸のヌクレオチド配列を提示すること；バイスルファイト反応済の核酸のヌクレオチド配列を、胃がんを有していない対象からのＤＭＲを含んでいる核酸のヌクレオチド配列と比較することを含んでいる。
【００６１】
一部の実施形態において、上記技術は、ヒト対象から得られた試料（例えば、胃部組織試料、血漿試料、糞便試料）を特徴づけるためのシステムを提供する。当該システムは、試料のメチル化状態を決定するように構成されている分析コンポーネント、試料のメチル化状態を、データベースに記録されているコントロール試料メチル化状態または基準試料メチル化状態と比較するように構成されているソフトウェアコンポーネント、ならびにメチル化状態の組み合わせに基づいて単一の値を決定し、胃がんと関連するメチル化状態をユーザに注意喚起するように構成されている注意喚起コンポーネントを含んでいる。いくつかの実施形態において、試料はＤＭＲを含んでいる核酸を含んでいる。
【００６２】
いくつかの実施形態において、そのようなシステムは、核酸を分離するためのコンポーネントをさらに含んでいる。いくつかの実施形態において、そのようなシステムは、試料を回収するためのコンポーネントをさらに含んでいる。
【００６３】
いくつかの実施形態において、試料は、糞便試料、組織試料、胃部組織試料、血液試料または尿試料である。
【００６４】
いくつかの実施形態において、データベースは、ＤＭＲを含んでいる核酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、データベースは、胃がんを有していない対象からの核酸配列を含んでいる。
【００６５】
さらなる実施形態は、本明細書に含まれている教示に基づいて、関連する分野の当業者にとって明らかである。
【００６６】
本技術のこれらおよび他の特徴、側面および利点は、以下の図を参照してよりよく理解される。
【００６７】
図面は、必ずしも尺度を表していないし、図面における対象物は、互い対する関係において縮尺されていないことが、理解される。図面は、本明細書に開示されている装置、システム、組成物、および方法の種々の実施形態を明確にし、理解させることを目的としている描写である。いかなる場合でも、同じ参照番号が、同じか、または類似の部分を説明する複数の図面の全体を通して使用されている。さらに、図面は、本教示の範囲を限定することをまったく目的としていない。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ＥＬＭＯ１が、実施例２に記載されているように、胃がんに対する高い識別を示したことを、示している。
【図２】QuARTs（定量的アレル特異的リアルタイムターゲットシグナル増幅）アッセイによる、メチル化されたＤＮＡの特徴の検出に使用されるＦＲＥＴカセットについてのオリゴヌクレオチド配列を示す。各ＦＲＥＴ配列は、３つの別のアッセイにおいて、ともに多重化され得るフルオロフォアおよびクエンチャーを含んでいる。
【図３】個々のマーカー曲線と比較して、３つのマーカーパネル（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９およびｃ１３ｏｒｆ１８）の、血漿における性能を強調表示している受信者動作特性曲線を示す。１００％特異性において、パネルは、８６％の感度において胃がんを検出した。
【図４Ａ】正常な粘膜からステージ４の胃がんまでの進行を説明している、血漿におけるメチル化されているＥＬＭＯ１の、ステージにしたがったログスケールの絶対ストランドカウントを示す。定量的なマーカーレベルは、ＧＣステージとともに増加した。
【図４Ｂ】３つのマーカーパネル（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９およびｃ１３ｏｒｆ１８）のステージにしたがった、血漿における胃がんの感度を証明している棒グラフ（１００％特異性）を示す。
【図５Ａ】１２の胃がんマーカー（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ｏｒｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡ１；ＥＬＭＯ１は２回、実施され、２回目はバイプレックス形式（biplex format））の性能を示す。７４の血漿試料における、９０％特異性（Ａ）、９５％特異性（Ｂ）および１００％特異性（Ｃ）、マトリクス形式。マーカーを、縦に並べ、試料を横に並べた。試料を、左側に正常、右側にがんを整列させた。陽性ヒットは、明るい灰色であり、ミスは濃いグレーである。ここで、最上の性能のマーカー（ＥＬＭＯ１）は、９０％特異性において最初に記載されており、残りのパネルは１００％特異性である。このプロットは、マーカーが組み合わせの様式において評価されることを可能にする。
【図５Ｂ】１２の胃がんマーカー（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ｏｒｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡ１；ＥＬＭＯ１は２回、実施され、２回目はバイプレックス形式（biplex format））の性能を示す。７４の血漿試料における、９０％特異性（Ａ）、９５％特異性（Ｂ）および１００％特異性（Ｃ）、マトリクス形式。マーカーを、縦に並べ、試料を横に並べた。試料を、左側に正常、右側にがんを整列させた。陽性ヒットは、明るい灰色であり、ミスは濃いグレーである。ここで、最上の性能のマーカー（ＥＬＭＯ１）は、９０％特異性において最初に記載されており、残りのパネルは１００％特異性である。このプロットは、マーカーが組み合わせの様式において評価されることを可能にする。
【図５Ｃ】１２の胃がんマーカー（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ｏｒｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡ１；ＥＬＭＯ１は２回、実施され、２回目はバイプレックス形式（biplex format））の性能を示す。７４の血漿試料における、９０％特異性（Ａ）、９５％特異性（Ｂ）および１００％特異性（Ｃ）、マトリクス形式。マーカーを、縦に並べ、試料を横に並べた。試料を、左側に正常、右側にがんを整列させた。陽性ヒットは、明るい灰色であり、ミスは濃いグレーである。ここで、最上の性能のマーカー（ＥＬＭＯ１）は、９０％特異性において最初に記載されており、残りのパネルは１００％特異性である。このプロットは、マーカーが組み合わせの様式において評価されることを可能にする。
【図６】７４の血漿試料における３つの胃がんマーカー（最初のパネル）の、１００％特異性の、性能を示している。マーカーを縦に並べ、試料を横に並べている。がんを、ステージにしたがって整列している。陽性ヒットは、明るい灰色であり、ミスは濃いグレーである（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９およびｃ１３ｏｒｆ１８）。
【図７Ａ】血漿における１２の胃がんマーカー（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ｏｒｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡ１；ＥＬＭＯ１は２回、実施され、２回目はバイプレックス形式）のボックスプロット（線形のスケール）を示す。コントロール試料（Ｎ＝３８）を左に、胃がん症例（Ｎ＝３６）を右に記載している。縦軸は、βアクチンストランドに対して標準化されたメチル化の％である。
【図７Ｂ】血漿における１２の胃がんマーカー（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ｏｒｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡ１；ＥＬＭＯ１は２回、実施され、２回目はバイプレックス形式）のボックスプロット（線形のスケール）を示す。コントロール試料（Ｎ＝３８）を左に、胃がん症例（Ｎ＝３６）を右に記載している。縦軸は、βアクチンストランドに対して標準化されたメチル化の％である。
【図７Ｃ】血漿における１２の胃がんマーカー（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ｏｒｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡ１；ＥＬＭＯ１は２回、実施され、２回目はバイプレックス形式）のボックスプロット（線形のスケール）を示す。コントロール試料（Ｎ＝３８）を左に、胃がん症例（Ｎ＝３６）を右に記載している。縦軸は、βアクチンストランドに対して標準化されたメチル化の％である。
【図７Ｄ】血漿における１２の胃がんマーカー（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ｏｒｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡ１；ＥＬＭＯ１は２回、実施され、２回目はバイプレックス形式）のボックスプロット（線形のスケール）を示す。コントロール試料（Ｎ＝３８）を左に、胃がん症例（Ｎ＝３６）を右に記載している。縦軸は、βアクチンストランドに対して標準化されたメチル化の％である。
【図７Ｅ】血漿における１２の胃がんマーカー（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ｏｒｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡ１；ＥＬＭＯ１は２回、実施され、２回目はバイプレックス形式）のボックスプロット（線形のスケール）を示す。コントロール試料（Ｎ＝３８）を左に、胃がん症例（Ｎ＝３６）を右に記載している。縦軸は、βアクチンストランドに対して標準化されたメチル化の％である。
【図７Ｆ】血漿における１２の胃がんマーカー（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ｏｒｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡ１；ＥＬＭＯ１は２回、実施され、２回目はバイプレックス形式）のボックスプロット（線形のスケール）を示す。コントロール試料（Ｎ＝３８）を左に、胃がん症例（Ｎ＝３６）を右に記載している。縦軸は、βアクチンストランドに対して標準化されたメチル化の％である。
【図７Ｇ】血漿における１２の胃がんマーカー（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ｏｒｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡ１；ＥＬＭＯ１は２回、実施され、２回目はバイプレックス形式）のボックスプロット（線形のスケール）を示す。コントロール試料（Ｎ＝３８）を左に、胃がん症例（Ｎ＝３６）を右に記載している。縦軸は、βアクチンストランドに対して標準化されたメチル化の％である。
【図７Ｈ】血漿における１２の胃がんマーカー（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ｏｒｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡ１；ＥＬＭＯ１は２回、実施され、２回目はバイプレックス形式）のボックスプロット（線形のスケール）を示す。コントロール試料（Ｎ＝３８）を左に、胃がん症例（Ｎ＝３６）を右に記載している。縦軸は、βアクチンストランドに対して標準化されたメチル化の％である。
【図７Ｉ】血漿における１２の胃がんマーカー（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ｏｒｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡ１；ＥＬＭＯ１は２回、実施され、２回目はバイプレックス形式）のボックスプロット（線形のスケール）を示す。コントロール試料（Ｎ＝３８）を左に、胃がん症例（Ｎ＝３６）を右に記載している。縦軸は、βアクチンストランドに対して標準化されたメチル化の％である。
【図７Ｊ】血漿における１２の胃がんマーカー（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ｏｒｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡ１；ＥＬＭＯ１は２回、実施され、２回目はバイプレックス形式）のボックスプロット（線形のスケール）を示す。コントロール試料（Ｎ＝３８）を左に、胃がん症例（Ｎ＝３６）を右に記載している。縦軸は、βアクチンストランドに対して標準化されたメチル化の％である。
【図７Ｋ】血漿における１２の胃がんマーカー（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ｏｒｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡ１；ＥＬＭＯ１は２回、実施され、２回目はバイプレックス形式）のボックスプロット（線形のスケール）を示す。コントロール試料（Ｎ＝３８）を左に、胃がん症例（Ｎ＝３６）を右に記載している。縦軸は、βアクチンストランドに対して標準化されたメチル化の％である。
【図７Ｌ】血漿における１２の胃がんマーカー（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ｏｒｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡ１；ＥＬＭＯ１は２回、実施され、２回目はバイプレックス形式）のボックスプロット（線形のスケール）を示す。コントロール試料（Ｎ＝３８）を左に、胃がん症例（Ｎ＝３６）を右に記載している。縦軸は、βアクチンストランドに対して標準化されたメチル化の％である。
【図７Ｍ】血漿における１２の胃がんマーカー（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ｏｒｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡ１；ＥＬＭＯ１は２回、実施され、２回目はバイプレックス形式）のボックスプロット（線形のスケール）を示す。コントロール試料（Ｎ＝３８）を左に、胃がん症例（Ｎ＝３６）を右に記載している。縦軸は、βアクチンストランドに対して標準化されたメチル化の％である。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
本明細書に示されているのは、腫瘍形成を検出すること、およびより詳細には、前がん状態の腫瘍および悪性腫瘍（例えば胃がん）を検出するための方法、組成物、および関連する使用（これらに限らない）に関する技術である。本技術が本明細書に記載されるように、使用されるセクションの見出しは、系統だてる目的のみのためのものであり、いかなる方法でも主題を限定するものと解釈されるべきではない。
【００７０】
種々の実施形態の当該詳細な説明において、説明の目的のために、多数の特定の詳細は、開示された実施形態の完全な理解を提供するために、説明される。これらの種々の実施形態は、これらの特定の詳細があろうがなかろうが実施され得ることを、当業者は正しく理解し得る。他の例において、構造および装置は、ブロック図形式で示される。さらに、当業者は、各種方法が提示されかつ実行される特定の順序は実例であると容易に正しく理解でき、この順序を変更でき、変更後もなお本明細書において開示される種々の実施形態の精神および範囲の内であることが企図される。
【００７１】
限定されないが、特許、特許出願、物品、本、論文、およびインターネットウェブページを含む本願に引用される全ての文献および同様の素材は、任意の目的のために本明細書に参照として明確に組入れられる。他の方法で定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本明細書に記載される種々の実施形態が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を持つ。組入れられた参照における用語の定義が本教示において与えられる定義と異なることが明白であるとき、本教示において与えられる定義が支配する。
【００７２】
〔定義〕
本発明の理解を促進するために、多数の用語および語句を、以下に定義する。追加の定義は、詳細な説明中に説明する。
【００７３】
明細書および特許請求の範囲中、文脈が明確に他の意味を指示しない限り、以下の用語は本明細書に明白に関連した意味を持つ。本明細書において使用されるフレーズ「１つの実施形態において」は、そうであり得るけれども、必ずしも同一の実施形態を指さない。さらに、本明細書において使用されるフレーズ「他の実施形態」は、そうであり得るけれども、必ずしも異なる実施形態を指さない。したがって、以下に記載されるように、本発明の種々の実施形態は、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、容易に組み合わせられ得る。
【００７４】
さらに、本明細書に使用される際、用語「または」は、文脈が明らかにそうではないと規定しない限り、包括的な「または」の機能語であり、用語「および／または」と同義である。用語「基づく」は、文脈が明らかにそうではないと規定しない限り、排他的ではなく、記載されていない追加の要素に基づいているものを考慮に入れる。さらに、明細書中、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の意味は、複数表示も含む。「ｉｎ」の意味は、「ｉｎ」および「ｏｎ」を含む。
【００７５】
本明細書に使用される際、「核酸」または「核酸分子」は、一般的にリボ核酸またはデオキシリボ核酸を指し、修飾されていないまたは修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。「核酸」は、限定されず、一本鎖および二本鎖の核酸を含む。本明細書に使用される際、用語「核酸」も上述のように１つ以上の修飾された塩基を含むＤＮＡを含む。したがって、安定性のためまたは他の理由のために修飾されたバックボーンを有するＤＮＡは「核酸」である。本明細書に使用される際、用語「核酸」は、ウイルスおよび細胞（例えば単一細胞および複雑型細胞を含む）のＤＮＡ特質の化学的形態だけでなく、化学的に、酵素的に、または代謝的に修飾された核酸の形態といったものを包含する。
【００７６】
用語「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド」または「核酸」は、２つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを有する分子を指し、好ましくは３つ以上であり、通常は１０より多い。正確なサイズは、多数の要因に依存し得り、結果としてオリゴヌクレオチドの最終的な機能または使用に依存する。
【００７７】
オリゴヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、またはそれらの組み合わせを含む任意のものにおいて作製され得る。ＤＮＡの典型的なデオキシリボヌクレオチドは、チミン、アデニン、シトシン、およびグアニンである。ＲＮＡの典型的なリボヌクレオチドは、ウラシル、アデニン、シトシン、およびグアニンである。
【００７８】
本明細書に使用される際、核酸の「遺伝子座」または「領域」は、例えば、染色体上の遺伝子、単一のヌクレオチド、ＣｐＧアイランド等、核酸のサブ領域を指す。
【００７９】
用語「相補的」および「相補性」は、塩基対形成規則によって関連付けられるヌクレオチド（例えば、１ヌクレオチド）またはポリヌクレオチド（例えば、連続したヌクレオチド）を指す。例えば、配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は、配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’」に対して相補的である。相補性は、一部の核酸塩基のみが塩基対形成規則に従って適合する、「部分的」なものであってもよい。あるいは、核酸間に、「完全」または「全体的」相補性が存在してもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリッド形成の効率および強度に影響を与える。これは、増幅反応および核酸間の結合に依存する検出方法において、特に重要である。
【００８０】
用語「遺伝子」は、ＲＮＡ、ポリペプチド、またはその前駆体の生成に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を指す。機能的なポリペプチドは、ポリペプチドの所望の活性または機能的特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル変換等）が保持される限り、完全長コード配列またはコード配列の任意の部分によって、コードすることができる。用語「部分」は、遺伝子に関して使用される際、その遺伝子の断片を指す。断片とは、サイズに関して、数個のヌクレオチドから、完全な遺伝子マイナス１ヌクレオチドの範囲までをとりうる。したがって、「遺伝子の少なくとも一つの部分を含むヌクレオチド」は、当該遺伝子の複数の断片を含んでいてもよく、または完全な当該遺伝子を含んでいてもよい。
【００８１】
用語「遺伝子」はまた、構造遺伝子のコード領域、ならびに５’および３’の両末端における当該コード領域に隣接する配列、例えば、いずれかの末端で約１ｋｂの距離にわたりコード領域に隣接して位置する配列を包含し、この場合当該遺伝子は完全長ｍＲＮＡの長さに対応する（例えば、コード配列、調節配列、構造配列および他の配列を含む）。コード領域の５’に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳（non-translated）配列または５’非翻訳（untranslated）配列と称される。コード領域の３’または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳（non-translated）配列または３’非翻訳（non-translated）配列と称される。用語「遺伝子」は、ｃＤＮＡおよび遺伝子のゲノム形態の両方を包含する。いくつかの生物（例えば、真核生物）において、遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と称される、非コード配列により分断されるコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントであり、イントロンは、エンハンサーのような調節要素を含み得る。イントロンは、核または一次転写物から除去または「スプライシング除去」され、イントロンは、したがって、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物には存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳の際に、発生期のポリペプチドにおいてアミノ酸の配列または順序を特定するように機能する。
【００８２】
イントロンを含有することに加えて、遺伝子のゲノム形態はまた、ＲＮＡ転写物上に存在する配列の５’末端および３’末端の両方に位置する配列を含んでもよい。これらの配列は、「フランキング」配列または領域と称される（これらのフランキング配列は、ｍＲＮＡ転写物上に存在する非翻訳配列に対して５’または３’に位置する）。５’フランキング領域は、遺伝子の転写を制御するか、またはそれに影響を及ぼす、プロモーターおよびエンハンサー等の調節配列を含み得る。３’フランキング領域は、転写終結、転写後の切断、およびポリアデニル化を指示する配列を含み得る。
【００８３】
用語「野生型」は、遺伝子に関して構成される際、天然に存在する源から単離された遺伝子の特徴を有する、遺伝子を指す。用語「野生型」は、遺伝子産物に関して構成される際、天然に存在する源から単離された遺伝子産物の特徴を有する、遺伝子産物を指す。用語「天然に存在する」は、対象に用いる際、天然に見られることができる対象である事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）に存在し、天然の源から単離でき、実験室で人の手によって意図的に修飾されていないポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然に存在している。野生型の遺伝子は、しばしば、集団中に最も高頻度で観察される遺伝子または対立遺伝子であり、したがって、その遺伝子の無作為に設計された「正常」または「野生型」形態である。対照的に、用語「修飾された」または「変異体」は、遺伝子または遺伝子産物に関して構成される際、それぞれ、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較した際、配列および／または機能的特性に修飾（例えば、変化した特性）を示す、遺伝子または遺伝子産物を指す。天然に存在する突然変異体は、単離可能であり、これらは、それらが野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に変化した特性を有するという事実によって、識別されるということを留意されたい。
【００８４】
用語「対立遺伝子」は、遺伝子の変種を指し、変種は、限定されないが、変異形および変異体、多形遺伝子座、ならびに単一のヌクレオチド多形遺伝子座、フレームシフト、ならびにスプライス変異を含む。対立遺伝子は、集団中に天然に存在し得り、または任意の集団の特定の個体の寿命の間起こり得る。
【００８５】
したがって、用語「変異形」および「変異体」は、ヌクレオチド配列に関して使用される際、１つ以上のヌクレオチドで、他の、通常関連する、ヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を指す。「変種」は、２つの異なるヌクレオチド配列間の違いであり、典型的には、配列の一つは参照配列である。
【００８６】
「増幅」は、鋳型特異性が関与する特別な核酸複製である。これは、非特異的鋳型複製（例えば、鋳型依存的であるが特異的な鋳型には依存しない複製）と対照的である。鋳型特異性はここでは、複製の忠実性（例えば、適当なヌクレオチド配列の合成）およびヌクレオチド（リボ−またはデオキシリボ−）特異性とは区別される。鋳型特異性は、「標的」特異性に関して頻繁に説明される。標的配列は、他の核酸から選別されることが求められるという意味での「標的」である。増幅技術は、この選別のために主にデザインされる。
【００８７】
核酸の増幅は、一般的に、典型的に少量のポリヌクレオチド（例えば、単一のポリヌクレオチド分子、ポリヌクレオチド分子の１０〜１００コピー、厳密に同一であってもそうでなくてもよい、）から開始する、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一部分の複数のコピーの生成を指し、増幅産物またはアンプリコンは、一般的に検出可能である。ポリヌクレオチドの増幅は、種々の化学的および酵素的プロセスを包含する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ、例えば、米国特許第５，４９４，８１０号を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の際の、標的または鋳型ＤＮＡ分子の１つまたは少数のコピーからの複数のＤＮＡコピーの生成は、増幅の形態である。さらなる増幅の種類には、限定されないが、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（例えば、米国特許第５，６３９，６１１号を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、アセンブリＰＣＲ（例えば、米国特許第５，９６５，４０８号を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ヘリカーゼ依存性増幅（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，６６２，５９４号を参照されたい）、ホットスタートＰＣＲ（例えば、米国特許第５，７７３，２５８号および同第５，３３８，６７１号を参照されたく、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、配列間特異的ＰＣＲ、逆ＰＣＲ（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＴｒｉｇｌｉａ，ｅｔ  ａｌｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：８１８６を参照されたい）、ライゲーション媒介性ＰＣＲ（例えば、Ｇｕｉｌｆｏｙｌｅ，Ｒ．ｅｔ  ａｌｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：１８５４−１８５８（１９９７）、米国特許第５，５０８，１６９号を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、メチル化特異的ＰＣＲ（例えば、Ｈｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）ＰＮＡＳ  ９３（１３）９８２１−９８２６を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ミニプライマーＰＣＲ、多重ライゲーション依存性プローブ増幅（例えば、Ｓｃｈｏｕｔｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０（１２）：ｅ５７を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、多重ＰＣＲ（例えば、Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６（２３）１１１４１−１１１５６、Ｂａｌｌａｂｉｏ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８４（６）５７１−５７３、Ｈａｙｄｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００８）ＢＭＣ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９：８０を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ネスト化ＰＣＲ、重複伸長ＰＣＲ（例えば、Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６（１５）７３５１−７３６７を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、���アルタイムＰＣＲ（例えば、Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｅｔ  ａｌｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：４１３−４１７、Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１０２６−１０３０を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、逆転写ＰＣＲ（例えば、Ｂｕｓｔｉｎ，Ｓ．Ａ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２５：１６９−１９３を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、固相ＰＣＲ、熱非対称インターレースＰＣＲ、およびタッチダウンＰＣＲ（例えば、Ｄｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）１９（１４）４００８、Ｒｏｕｘ，Ｋ．（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １６（５）８１２−８１４、Ｈｅｃｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０（３）４７８−４８５を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）が含まれる。ポリヌクレオチド増幅はまた、デジタルＰＣＲを使用して達成することができる（例えば、Ｋａｌｉｎｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２５；１９９９−２００４，（１９９７）、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９６；９２３６−４１，（１９９９）、国際特許出願公開第０５０２３０９１Ａ２号、米国特許出願公開第２００７０２０２５２５号を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００８８】
用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、クローニングまたは精製なしで、ゲノムＤＮＡの混合物中の標的配列のセグメントの濃度を増加させるための方法を記載する、Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓの米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，９６５，１８８号の方法を指す。標的配列を増幅させるためのこのプロセスは、非常に過剰な２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、所望される標的配列を含有するＤＮＡ混合物に導入し、続いてＤＮＡポリメラーゼの存在下で正確な順序の熱サイクル処理を行うことから構成される。２つのプライマーは、二本鎖の標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。増幅をもたらすために、混合物を変性させ、次いで、プライマーを標的分子内のそれらの相補的配列とアニーリングさせる。アニーリング後、プライマーを、新しい相補鎖の組を形成するように、ポリメラーゼで伸長させる。変性、プライマーのアニーリング、およびポリメラーゼ伸長のステップを、何度も反復して（すなわち、変性、アニーリング、および伸長が、１つの「サイクル」を構成し、多数の「サイクル」が存在し得る）、高濃度の所望の標的配列の増幅セグメントを得ることができる。所望の標的配列の増幅セグメントの長さは、互いに対するプライマーの相対的位置によって決定され、したがって、この長さは、制御可能なパラメータである。プロセスの反復する態様のため、この方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）と称される。所望される標的配列の増幅セグメントが、混合物における優勢配列（濃度に関して）となるため、それらは、「ＰＣＲにより増幅された」と称され、「ＰＣＲ産物」および「アンプリコン」である。
【００８９】
鋳型特異性は、ほとんどの増幅技術において、酵素の選択により実現される。増幅酵素は、それらが使用される条件下で、核酸の異種混合物中の核酸の特異的配列のみをプロセッシングする酵素である。例えば、Ｑ−ベータレプリカーゼの場合、ＭＤＶ−１  ＲＮＡは、このレプリカーゼの特異的鋳型である（Ｋａｃｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ６９：３０３８［１９７２］)。他の核酸は、この増幅酵素によっては複製されない。同様にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの場合、この増幅酵素は、それ自身のプロモーターに対しストリンジェントな特異性を有する（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２２８：２２７［１９７０］）。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの場合、この酵素は、２つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを連結せず、ここでこのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質とこの鋳型との間にライゲーション接合点でミスマッチが存在する（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０）。最後に、熱安定性の鋳型依存的ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＴａｑおよびＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ）は、それらの高温で機能する能力に関して、結合した配列に高い特異性を発揮し、その結果プライマーにより定義されることがわかっており、高温によって、標的配列とのプライマーハイブリダイゼーションには好ましいが、非標的配列とはハイブリダイズしない、熱力学的条件が生じる（Ｈ．  Ａ．  Ｅｒｌｉｃｈ（ｅｄ．），  ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ［１９８９］）。
【００９０】
本明細書に使用される際、用語「核酸検出アッセイ」は、目的の核酸のヌクレオチド組成を決定する任意の方法を指す。核酸検出アッセイには、限定されないが、ＤＮＡ配列決定法、プローブハイブリッド形成法、構造特異的切断アッセイ（例えば、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．）が含まれ、例えば、米国特許第５，８４６，７１７号、同第５，９８５，５５７号、同第５，９９４，０６９号、同第６，００１，５６７号、同第６，０９０，５４３号、および同第６，８７２，８１６号、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２９２（１９９９）、Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，９７：８２７２（２０００）、および米国特許出願公開第２００９／０２５３１４２号に記載され、これらのそれぞれは、全ての目的に関して参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、酵素不適合切断法（例えば、Ｖａｒｉａｇｅｎｉｃｓ、米国特許第６，１１０，６８４号、同第５，９５８，６９２号、同第５，８５１，７７０号、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、ポリメラーゼ連鎖反応、分枝ハイブリッド形成法（例えば、Ｃｈｉｒｏｎ、米国特許第５，８４９，４８１号、同第５，７１０，２６４号、同第５，１２４，２４６号、および同第５，６２４，８０２号、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、ローリングサークル複製（例えば、米国特許第６，２１０，８８４号、同第６，１８３，９６０号、および同第６，２３５，５０２号、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、ＮＡＳＢＡ（例えば、米国特許第５，４０９，８１８号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、分子指標技術（例えば、米国特許第６，１５０，０９７号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、Ｅセンサー技術（Ｍｏｔｏｒｏｌａ、米国特許第６，２４８，２２９号、同第６，２２１，５８３号、同第６，０１３，１７０号、および同第６，０６３，５７３号、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、サイクリングプローブ技術（例えば、米国特許第５，４０３，７１１号、同第５，０１１，７６９号、および同第５，６６０，９８８号、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇシグナル増幅法（例えば、米国特許第６，１２１，００１号、同第６，１１０，６７７号、同第５，９１４，２３０号、同第５，８８２，８６７号、および同第５，７９２，６１４号、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、リガーゼ連鎖反応（例えば、Ｂａｒｎａｙ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８，１８９−９３（１９９１））、ならびにサンドイッチハイブリッド形成法（例えば、米国特許第５，２８８，６０９号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）が含まれる。
【００９１】
用語「増幅可能な核酸」は、任意の増幅法により増幅することができる核酸に関して使用される。「増幅可能な核酸」は、通常「試料鋳型」を含むことが企図される。
【００９２】
用語「試料鋳型」は、「標的」(以下に定義する)の存在について分析される試料を起源とする核酸を指す。対照的に「バックグラウンド鋳型」は、試料中に存在するかまたは存在しない、試料鋳型以外の核酸に関して使用される。バックグラウンド鋳型は最も頻繁には、不注意による。これは、キャリーオーバーの結果であるか、または試料から精製除去されることが求められた核酸夾雑物の存在に起因し得る。例えば検出されるべきもの以外の生物由来の核酸は、被験試料中にバックグラウンドとして存在することがある。
【００９３】
用語「プライマー」は、精製された制限分解物にあるように、天然に存在するか、または合成で生成されたかにかかわらず、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘発される条件下に（例えば、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼ等の誘発剤の存在下、好適な温度およびｐＨで）置かれる場合、その開始点として機能することが可能な、オリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、好ましくは、最大の増幅効率のため一本鎖であるが、代替として、二本鎖であってもよい。二本鎖である場合、プライマーは、伸長産物の調製に使用される前に、最初にその鎖を分離するために処理される。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘発剤の存在下で、伸長産物の合成を開始するのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマー源、および使用する方法を含む、多数の因子に依存することになる。
【００９４】
用語「プローブ」は、対象となる別のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることが可能である、精製された制限消化産物中に天然に、または合成、組換え、もしくはＰＣＲ増幅によって作製されたオリゴヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド配列）を指す。プローブは、一本鎖または二本鎖であってよい。プローブは、特定の遺伝子配列（例えば、「捕捉配列」）の検出、同定、および単離に有用である。本発明で使用されるプローブは、いくつかの実施形態において、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡに加え、酵素に基づく組織化学アッセイ）、蛍光、放射性、および発光システムを含むがこれらに限定されない、任意の検出システムで検出可能となるように「レポーター分子」により標識されることが企図される。本発明が特定の検出システムまたは標識物に限定されることは意図されていない。
【００９５】
本明細書に使用される際、「メチル化」は、シトシンのＣ５またはＮ４位のシトシンのメチル化、アデニン、または他の型の核酸のＮ６位のメチル化を指す。典型的なインビトロでのＤＮＡ増幅方法は、増幅鋳型のメチル化パターンを保たないので、インビトロで増幅されたＤＮＡは、通常メチル化されない。しかしながら、「メチル化されていないＤＮＡ」または「メチルされたＤＮＡ」はまた、それぞれ、もともとの鋳型がメチル化されていないまたはメチル化された増幅されたＤＮＡを指す。
【００９６】
したがって、本明細書に使用される際、「メチル化されたヌクレオチド」または「メチル化されたヌクレオチド塩基」は、ヌクレオチド塩基上のメチル残基の存在を指し、メチル残基は、認識される典型的なヌクレオチド塩基に存在しない。例えば、シトシンは、そのピリミジン環上にメチル残基を含まないが、５−メチルシトシンは、そのピリミジン環の５位にメチル残基を含む。したがって、シトシンは、メチル化されたヌクレオチドではなく、５−メチルシトシンは、メチル化されたヌクレオチドである。他の例において、チミンは、そのピリミジン環の５位にメチル残基を含むが、本明細書における意図では、チミンは典型的なＤＮＡのヌクレオチド塩基であるので、ＤＮＡに存在する際、チミンはメチル化されたヌクレオチドを考慮されない。
【００９７】
本明細書に使用される際、「メチル化された核酸分子」は、１つ以上のメチル化されたヌクレオチドを含む核酸分子を指す。
【００９８】
本明細書に使用される際、核酸分子の「メチル化状態（state）」、「メチル化プロファイル」および「メチル化状態（status）」は、核酸分子中の１つ以上のメチル化されたヌクレオチド塩基の欠如の存在を指す。例えば、メチル化されたシトシンを含む核酸分子は、メチル化されたと考えられる（例えば、核酸分子のメチル化状態（state）はメチル化されている）。任意のメチル化されたヌクレオチドを含まない核酸分子は、メチル化されていないと考えられる。
【００９９】
特定の核酸配列のメチル化状態（state）は（例えば、本明細書で記載される際、遺伝子マーカーまたはＤＮＡ領域）、配列中の全ての塩基のメチル化状態を示すことができ、または配列内の塩基の（例えば、１つ以上のシトシンの）一部分のメチル化状態を示すことができ、またはメチル化が存在する配列内の位置する正確な情報を与えられていてもいなくても、配列内の局所的なメチル化密度に関する情報を示すことができる。
【０１００】
核酸分子中のヌクレオチド遺伝子座のメチル化状態は、核酸分子中の特定の遺伝子座のメチル化されたヌクレオチドの存在または欠如を指す。例えば、核酸分子中の７番目のヌクレオチドに存在するヌクレオチドが５−メチルシトシンであるとき、核酸分子の７番目のヌクレオチドのシトシンのメチル化状態は、メチル化されている。同様に、核酸分子中の７番目のヌクレオチドに存在するヌクレオチドがシトシンである（５−メチルシトシンではない）とき、核酸分子の７番目のヌクレオチドのシトシンのメチル化状態は、メチル化されていない。
【０１０１】
メチル化状態（status）は、任意に「メチル化値」によって表されるまたは示すことができる（例えば、メチル化頻度、分率、比、割合等を表す）メチル化値は、例えば、メチル化依存的制限酵素で以下の制限消化を与えたそのままの核酸量を定量することにより、または重亜硫酸塩反応後の増幅プロファイルの比較により、または重亜硫酸塩で処理されたおよび処理されていない核酸の配列の比較により、生み出すことができる。したがって、値、例えばメチル化値は、メチル化状態（status）を表し、それゆえ、遺伝子座の多数のコピーにわたってメチル化状態（status）の量の指標として使用することができる。これは、試料中の配列のメチル化状態（status）を閾値または参照値と比較することが望ましいときに、特に使用される。
【０１０２】
本明細書に使用される際、「メチル化頻度」または「メチル化割合（％）」は、分子または遺伝子座がメチル化されていない実例の数と比較した分子または遺伝子座がメチル化された実例の数を指す。
【０１０３】
したがって、メチル化状態（state）は、核酸（例えば、ゲノム配列）のメチル化の状態（state）を表す。さらに、メチル化状態（state）は、メチル化に関連する特定のゲノム遺伝子座の核酸断片の特性を指す。上記特性は、限定されないが、このＤＮＡ配列内の任意のシトシン（Ｃ）残基がメチル化されているかどうか、メチル化されたＣ残基の位置、核酸の任意の特定領域中のメチル化されたＣの頻度または割合、およびメチル化要因における対立遺伝子の差異、例えば、対立遺伝子の起源の差異を含む。用語「メチル化状態（state）」、「メチル化プロファイル」、および「メチル化状態（status）」はまた、相対濃度、絶対濃度、または生体試料中の核酸の任意の特定領域中のメチル化されたＣもしくはメチル化されていないＣのパターンを指す。例えば、核酸配列内のシトシン（Ｃ）配列がメチル化されている場合、それは「高メチル化された」または「増加したメチル化」を有するとして称され得るが、一方ＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基がメチル化されていない場合、「低メチル化された」または「減少したメチル化」を有するとして称され得る。同様に、他の核酸配列（例えば、異なる領域または異なる個体等）と比較したときに、核酸配列内のシトシン（Ｃ）残基がメチル化されている場合、他の核酸配列と比較して、その配列は、高メチル化された、または増加したメチル化を有すると考えられる。また、他の核酸配列（例えば、異なる領域または異なる個体等）と比較したときに、ＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基がメチル化されていない場合、他の核酸配列と比較して、その配列は、低メチル化された、または減少したメチル化を有すると考えられる。さらに、用語「メチル化パターン」は、本明細書に使用される際、核酸の配列に対してメチル化されたおよびメチル化されていないヌクレオチドの集合部位を指す。２つの核酸は、同一のまたは同様のメチル化頻度またはメチル化割合を有していてもよいが、メチル化されたおよびメチル化されていないヌクレオチドの位置が異なるものの、領域中、メチル化されたおよびメチル化されていないヌクレオチドの数が同一または同様であるとき、異なるメチル化パターンを有していてもよい。配列は、メチル化の範囲（他のものと比較して増加したまたは減少したメチル化を有するもの）、頻度、またはパターンが異なるとき、「異なってメチル化された」または「メチル化において差異」を有するまたは「異なるメチル化状態（state）」を有するとして称される。用語「異なるメチル化」は、がん陰性試料中の核酸メチル化のパターンのレベルまたはパターンと比較したときの、がん陽性試料中の核酸メチル化のパターンのレベルまたはパターンの差異を指す。それはまた、手術後にがんが再発した患者と再発していない患者との間のレベルまたはパターンの差異と称され得る。異なるメチル化およびＤＮＡメチル化の特定のレベルまたはパターンは、予知および予測生体マーカーであり、例えば、かつて正確な区分または予測特性が明確にされてきた。
【０１０４】
メチル化状態（state）頻度は、複数の個体からなる群または単一の個体由来の試料を表すために使用することができる。例えば、５０％のメチル化状態（state）頻度を有するヌクレオチド遺伝子座は、実例の５０％においてメチル化されており、実例の５０％においてメチル化されていない。上記頻度は、例えば、個体の群または核酸の集合においてヌクレオチド遺伝子座または核酸領域がメチル化されている程度を表すために使用することができる。したがって、第１の群または核酸分子のプール中のメチル化が第２の群または核酸分子のプール中のメチル化と異なるとき、第１の群またはプールのメチル化状態（state）頻度は、第２の群またはプールのメチル化状態（state）頻度と異なり得る。上記頻度はまた、例えば、ヌクレオチド遺伝子座または核酸領域が単一の個体においてメチル化されている程度を表すために使用することができる。例えば、上記頻度は、組織試料由来の細胞の集団がヌクレオチド遺伝子座または核酸領域でメチル化されたまたはメチル化されていない程度を表すために使用することができる。
【０１０５】
本明細書に使用される際、「ヌクレオチド遺伝子座」は、核酸分子中のヌクレオチドの位置を指す。メチル化されたヌクレオチドのヌクレオチド遺伝子座は、核酸分子中のメチル化されたヌクレオチドの位置を指す。
【０１０６】
典型的に、ヒトＤＮＡのメチル化は、隣接するグアニンおよびシトシンを含んで
ジヌクレオチド配列上で起こり、シトシンは、グアニンの５’に位置する（ＣｐＧジヌクレオチド配列とも称する）。ＣｐＧジヌクレオチド内のほとんどのシトシンは、ヒトゲノムにおいてメチル化されるが、いくつかは、ＣｐＧアイランドとして知られる、特定のＣｐＧジヌクレオチドリッチゲノム領域においてメチル化されないままである（例えば、Ａｎｔｅｑｕｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６２：５０３−５１４を参照されたい）。
【０１０７】
本明細書に使用される際、「ＣｐＧアイランド」は、全ゲノムＤＮＡと比較してＣｐＧジヌクレオチドの増加した数を包含するゲノムＤＮＡのＧ：Ｃリッチ領域を指す。ＣｐＧアイランドは、長さが少なくとも１００、２００、またはそれ以上の塩基対であってもよく、領域のＧ：Ｃ含有量は、少なくとも５０％であり、予測頻度に対する観測ＣｐＧ頻度の比は、０．６であり、いくつかの実例において、ＣｐＧアイランドは、長さは少なくとも５００塩基対であってもよく、領域のＧ：Ｃ含有量は少なくとも５５％であり）、予測頻度に対する観測ＣｐＧ頻度の比は、０．６５である。予測頻度に対する観測ＣｐＧ頻度の比は、Ｇａｒｄｉｎｅｒ−Ｇａｒｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：  ２６1−２８１に規定される方法により計算することができる。例えば、予測頻度に対する観測ＣｐＧ頻度は、式Ｒ＝（Ａ×Ｂ）／（Ｃ×Ｄ）により計算することができ、Ｒは予測頻度に対する観測ＣｐＧ頻度の比であり、Ａは分析される配列中のＣｐＧジヌクレオチド数であり、分析される配列中の全ヌクレオチド数であり、Ｃは分析される配列中の全Ｃヌクレオチド数であり、Ｄは分析される配列中の全Ｇヌクレオチド数である。メチル化状態（state）は、典型的には、ＣｐＧアイランドにおいて、例えばプロモーター領域で決定される。ヒトゲノム中の他の配列がＣｐＡおよびＣｐＴのようにＤＮＡメチル化されやすいけれども、評価され得る（Ｒａｍｓａｈｏｙｅ（２０００）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７：５２３７−５２４２；Ｓａｌｍｏｎ  ａｎｄ  Ｋａｙｅ（１９７０）Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．  ２０４：３４０−３５１；Ｇｒａｆｓｔｒｏｍ（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：２８２７−２８４２；Ｎｙｃｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：４３５３−４３６７；Ｗｏｏｄｃｏｃｋ（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １４５：８８８−８９４を参照されたい）。
【０１０８】
本明細書に使用される際、核酸分子のメチル化状態（state）と相関して核酸分子のヌクレオチドを修飾する試薬、またはメチル化特異的試薬は、核酸分子のメチル化状態（state）を反映する方法で核酸分子のヌクレオチド配列を変えることができる化合物または組成物または他の薬剤を指す。上記試薬で核酸分子を処理する方法は、核酸分子を試薬と接触させ、必要な場合はさらなるステップと組み合わせて、所望のヌクレオチド配列の変化を成し遂げることを含む。核酸分子のヌクレオチド配列における上記変化は、それぞれのメチル化されたヌクレオチドが異なるヌクレオチドに修飾されている核酸分子をもたらし得る。核酸ヌクレオチド配列における上記変化は、それぞれのメチル化されていないヌクレオチドが異なるヌクレオチドに修飾されている核酸分子をもたらし得る。核酸ヌクレオチド配列における上記変化は、メチル化されていない選択されたヌクレオチドそれぞれ（例えば、それぞれのメチル化されていないシトシン）が異なるヌクレオチドに修飾されている核酸分子をもたらし得る。核酸ヌクレオチド配列を変えるための上記試薬の使用は、メチル化されたヌクレオチドであるそれぞれのヌクレオチド（例えば、それぞれのメチル化されたシトシン）が異なるヌクレオチドに修飾されている核酸分子をもたらし得る。本明細書に使用される際、選択されたヌクレオチドを修飾する試薬の使用は、他の３つのヌクレオチドを修飾せずに、１つのヌクレオチドを修飾する試薬のような、核酸分子中に典型的に存在する４つのヌクレオチド（ＤＮＡの場合Ｃ、Ｇ、Ｔ、およびＡ、ならびにＲＮＡの場合Ｃ、Ｇ、Ｕ、およびＡ）の１つのヌクレオチドを修飾する試薬を指す。一つの典型的な実施例において、上記試薬は、メチル化されていない選択されたヌクレオチドを修飾することで、異なるヌクレオチドを生じる。他の典型的な実施例において、上記試薬は、メチル化されていないシトシンヌクレオチドを脱アミノ化し得る。典型的な試薬は重亜硫酸塩である。
【０１０９】
本明細書に使用される際、用語「重亜硫酸塩試薬」は、いくつかの実施形態において、例えば、ＣｐＧジヌクレオチド配列において、メチル化されたシチジンとメチル化されていないシチジンとを区別するための、重亜硫酸塩、二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、またはそれらの組み合わせを含む試薬を指す。
【０１１０】
用語「メチル化アッセイ」は、核酸の配列内の１つ以上のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態（state）を決定するためのアッセイを指す。
【０１１１】
用語「ＭＳ  ＡＰ−ＰＣＲ」（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ−Ｐｒｉｍｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、最もＣｐＧジヌクレオチドを含みやすい領域を合わせるためのＣＧリッチプライマーを使用するゲノムの全体的なスキャンを考慮した技術分野で認識されている技術を指し、Ｇｏｎｚａｌｇｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５７：５９４−５９９に記述されている。
【０１１２】
用語「ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」は、Ｅａｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５９：２３０２−２３０６に記述されている技術分野で認識されている蛍光に基づくリアルタイムＰＣＲ技術を指す。
【０１１３】
用語「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）」は、アッセイを指す。
核酸試料のメチル化特異的選択的増幅を可能にする増幅プライマー間のＣｐＧ位置をカバーする、または当該プライマーによってカバーされるメチル化特異的ブロッキングプローブ（本明細書ではブロッカーとしても称される）のアッセイを指す。
【０１１４】
用語「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」アッセイは、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイは、増幅プライマー間のＣｐＧ位置をカバーするメチル化特異的ブロッキングプローブを組み合わせた、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイの変種である、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイを指す。
【０１１５】
用語「Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ」（メチル化感受性１本差ヌクレオチドプライマー伸長）は、Ｇｏｎｚａｌｇｏ  ＆  Ｊｏｎｅｓ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：２５２９−２５３１に記述されている技術分野で認識されているアッセイを指す。
【０１１６】
用語「ＭＳＰ」（メチル化特異的ＰＣＲ）は、Ｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：９８２１−９８２６およびＵ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．５，７８６，１４６に記述されている技術分野で認識されているメチル化アッセイを指す。
【０１１７】
用語「ＣＯＢＲＡ」（組み合わせ重硫酸塩制限分析）は、Ｘｉｏｎｇ  ＆  Ｌａｉｒｄ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：２５３２−２５３４に記述されている技術分野で認識されているメチル化アッセイを指す。
【０１１８】
用語「ＭＣＡ」（メチル化されたＣｐＧアイランド増幅）は、Ｔｏｙｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５９：  ２３０７−１２、およびＷＯ  ００／２６４０１Ａ１に記述されているメチル化アッセイを指す。
【０１１９】
本明細書に使用される際、「選択されたヌクレオチド」は、核酸分子中に典型的に存在する４つのヌクレオチド（ＤＮＡの場合Ｃ、Ｇ、Ｔ、およびＡ、ならびにＲＮＡの場合Ｃ、Ｇ、Ｕ、およびＡ）の１つのヌクレオチドを指し、典型的に存在するヌクレオチドのメチル化された誘導体を含み得り（例えば、Ｃが選択されたヌクレオチドであるとき、メチル化されたおよびメチル化されていないＣの両方は、選択されたヌクレオチドの意味に含まれる）、メチル化された選択されたヌクレオチドは、特に、メチル化された典型的に存在するヌクレオチドを指し、メチル化されていない選択されたヌクレオチドは、特に、メチル化されていない典型的に存在するヌクレオチドを指す。
【０１２０】
用語「メチル化特異的制限酵素」または「メチル化選択的制限酵素」は、酵素を指す。
その認識部位のメチル化状態（state）に依存的な核酸を選択的に消化する。認識部位がメチル化されていないまたはヘミメチル化されている場合に特異的に切断する制限酵素の場合、認識部位がメチル化された場合に切断は行われないまたは有意に減少された効果で行われ得る。認識部位がメチル化されている場合に特異的に切断する制限酵素の場合、認識部位がメチル化されていない場合に切断は行われないまたは有意に減少された効果で行われ得る。好ましくは、メチル化特異的制限酵素、ＣＧジヌクレオチドを含む認識配列（実例の場合ＣＧＣＧまたはＣＣＣＧＧＧのような認識配列）である。さらに好ましいいくつかの実施形態は、上記ジヌクレオチド中のシトシンが炭素原子Ｃ５でメチル化される場合に切断しない制限酵素である。
【０１２１】
本明細書に使用される際、「異なるヌクレオチド」は、選択されたヌクレオチドと化学的に異なるヌクレオチドを指し、典型的には異なるヌクレオチドが、選択されたヌクレオチドとは異なるワトソン−クリック塩基対形成特性を有し、選択されたヌクレオチドと相補的である典型的に存在するヌクレオチドは、異なるヌクレオチドと相補的である典型的に存在するヌクレオチドと同一ではない。例えば、Ｃが選択されたヌクレオチドであるとき、ＵまたはＴは異なるヌクレオチドであってよく、ＣのＧに対する相補性およびＵまたはＴのＡに対する相補性により例示される。本明細書に使用される際、選択されたヌクレオチドに相補的な、または異なるヌクレオチドに相補的なヌクレオチドは、高厳格状態下、４つの典型的に存在するヌクレオチドの３つとの相補的なヌクレオチドの塩基ペアリング（paring）よりも高い親和性を有する選択されたヌクレオチドまたは異なるヌクレオチドとの塩基対を形成するヌクレオチドを指す。相補性の一例は、ＤＮＡ（例えば、Ａ−ＴおよびＣ−Ｇ）およびＲＮＡ（例えば、Ａ−ＵおよびＣ−Ｇ）におけるワトソン−クリック塩基対形成である。したがって、例えば、高厳格状態下、Ｇは、Ｇ、Ａ、またはＴと塩基対を形成するよりも、Ｃとより高い親和性で塩基対を形成するため、Ｃが選択ヌクレオチドであるとき、Ｇは選択されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドである。
【０１２２】
本明細書に使用される際、所定のマーカーの「感度」は、新生物の試料および新生物でない試料の区別をする閾値より上のＤＮＡメチル化値を報告する試料の割合を指す。いくつかの実施形態において、陽性は、閾値より上のＤＮＡメチル化値（例えば、疾患に関連する範囲）を報告する組織で確認された新生物として定義され、偽陰性は、閾値より下のＤＮＡメチル化値（例えば、非疾患に関連する範囲）を報告する組織で確認された新生物として定義される。感度の値は、それゆえ、既知の疾患試料から得られた所定のマーカーのＤＮＡメチル化測定値が測定値に関連する疾患の範囲内であり得る確率を反映する。本明細書で定義されるように、算出された感度の値の臨床的な関連性は、症状のある被検体に用いるとき、所定のマーカーが臨床症状の存在を検出し得る確率の推定を表す。
【０１２３】
本明細書に使用される際、所定のマーカーの「特異性」は、新生物の試料および新生物でない試料の区別をする閾値より下のＤＮＡメチル化値を報告する新生物でない試料の割合を指す。いくつかの実施形態において、陰性は、閾値より下のＤＮＡメチル化値（例えば、非疾患に関連する範囲）を報告する組織で確認された新生物でない試料として定義され、偽陽性は、閾値より上のＤＮＡメチル化値（例えば、疾患に関連する範囲）を報告する組織で確認された新生物でない試料として定義される。特異性の値は、それゆえ、既知の非疾患試料から得られた所定のマーカーのＤＮＡメチル化測定値が測定値に関連する非疾患の範囲内であり得る確率を反映する。本明細書で定義されるように、算出された特異性の値の臨床的な関連性は、症状のない患者に用いるとき、所定のマーカーが臨床症状がないことを検出し得る確率の推定を表す。
【０１２４】
用語「ＡＵＣ」は、本明細書に使用される際、「曲線の下の領域（areaunder a curve）」の略語である。特に、ＡＵＣは、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の下の領域を指す。ＲＯＣ曲線は、診断テストの異なる可能なカットポイントの偽陽性率に対する真陽性率のプロットである。ＲＯＣ曲線は、選択されたカットポイントに依存する感度と特異性との間のトレードオフを示す（感度における任意の増加は、特異性における減少により付随され得る）。ＲＯＣ曲線の下の領域（ＡＵＣ）は、診断テストの精度の基準である（より大きい領域であるほどよりよい；最高は１；ランダムテストは０．５の領域を有する対角線に横たわるＲＯＣ曲線を有し得る；参照：Ｊ．  Ｐ．  Ｅｇａｎ．（１９７５）Ｓｉｇｎａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ＲＯＣ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【０１２５】
本明細書に使用される際、用語「新生物」は、「組織の異常な塊、度を超えた成長、正常な組織の成長と調和していない」を指す。例えば、「Ｔｈｅ  Ｓｐｒｅａｄ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｏｄｙ」，  Ｌｏｎｄｏｎ，  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  ＆  Ｃｏ，  １９５２を参照されたい。
【０１２６】
本明細書に使用される際、用語「腺腫」は、腺起源の良性腫瘍を指す。これらの成長は良性であるが、時間とともに、悪性に進化する可能性がある。
【０１２７】
用語「がん発生前の」または「新生物発生前の」およびそれらの同義語は、悪性の形質転換を受けている任意の細胞増殖疾患を指す。
【０１２８】
新生物、腺腫、がん等の「部位」とは、新生物、腺腫、がん等が位置する被検体の身体における、組織、器官、細胞型、解剖学的構造上の領域、身体の一部等である。
【０１２９】
本明細書に使用される際、「診断」テスト方法は、被検体が所定の疾患または症状に感染する可能性を決定し、疾患または症状のある被検体が治療に反応する可能性を決定し、疾患または症状のある被検体の予測を決定し（またはおそれがある進行または退行）、疾患または症状のある被検体の治療の効果を決定する、被検体の疾患状態（state）または症状の検出または同定を含む。例えば、診断は、存在または新生物に感染している被検体の可能性またはそのような被検体が化合物（例えば、医薬、例えば薬物）に好適に反応する可能性または他の治療の検出に用いることができる。
【０１３０】
用語「マーカー」は、本明細書に使用される際、例えば、そのメチル化状態（state）に基づき、がん細胞と正常な細胞とを区別することにより、がんを診断できる基質（例えば、核酸または核酸の領域）を指す。
【０１３１】
用語「単離された」は、「単離されたオリゴヌクレオチド」のように、核酸に関連して使用される場合、同定され、かつその天然の供給源において通常それと会合している少なくとも１つの夾雑核酸から分離された核酸配列を指す。単離された核酸は、それが天然に認められるものとは異なる形または状況で存在する。対照的に、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの単離されない核酸は、天然に存在する状態で認められる。単離されない核酸の例は、隣接遺伝子に近接して宿主細胞染色体上に認められ、特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列などのＲＮＡ配列は、多数のタンパク質をコードする多くの他のｍＲＮＡとの混合物として細胞内に認められる所定のＤＮＡ配列（例えば遺伝子）を含む。しかし特定のタンパク質をコードする単離された核酸は、例として、核酸が天然の細胞のそれとは異なる染色体位置にあるか、またはそうでなければ天然に認められるものとは異なる核酸配列が側方に位置しているような、タンパク質を通常発現する細胞内の核酸を含む。単離された核酸またはオリゴヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖の形で存在することができる。単離された核酸またはオリゴヌクレオチドが、タンパク質またはオリゴヌクレオチドを発現させるために利用される場合、オリゴヌクレオチドは最小のセンス鎖またはコード鎖を含む（すなわちオリゴヌクレオチドは１本鎖である）が、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含んでも良い（すなわちオリゴヌクレオチドは２本鎖であることができる）。単離された核酸は、その天然のまたは典型的な環境から単離された後、他の核酸または分子と組み合わせてもよい。例えば、単離された核酸は、例えば異種間発現に置かれた宿主細胞に存在してもよい。
【０１３２】
用語「精製された」は、天然の環境から除去された、単離された、または分離された核酸またはアミノ酸配列のどちらかの分子を指す。「単離された核酸配列」は、それゆえ、精製された核酸配列であってよい。「実質的に精製された」分子は、それらが天然に関連する他の成分から少なくとも６０％フリーであり、好ましくは少なくとも７５％フリーであり、より好ましくは少なくとも９０％フリーである。本明細書に使用される際、用語「精製された」または「精製する」はまた、試料から夾雑物を除去することを指す。夾雑タンパク質を除去することにより、試料中の対象のポリペプチドまたは核酸の割合が高くなる。他の例において、組み換えポリペプチドは、植物、バクテリア、酵母、または哺乳類の宿主細胞中で発現され、ポリペプチドは、宿主細胞タンパク質の除去により精製され、試料中、組み換えポリペプチドの割合は、それによって高くなる。
【０１３３】
用語所定のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド「を含む組成物」は、所定のポリヌクレオチド配列またはポリペプチドを含む任意の組成物を広く指す。組成物は、塩（例えばＮａＣｌ）、界面活性剤（例えばＳＤＳ）、および他の成分（例えばデンハルト液、乾燥ミルク、サケ精子ＤＮＡ等）を含む水性溶液を含んでいてもよい。
【０１３４】
用語「試料」は、その最も広い意味で使用される。ある意味において、動物細胞または組織を指してもよい。他の意味において、生物学的および環境的試料だけでなく、任意の源から得られた検体または培養物を含むことを意味する。生物学的試料は、植物または動物（ヒトを含む）から得られ、流体、個体、組織、および気体を包含し得る。いくつかの実施形態において、試料は血漿試料である。いくつかの実施形態において、試料は胃の組織試料である。いくつかの実施形態において、試料は便試料である。環境的試料は、表面物質、土壌、水、および産業試料のような環境的物質を含む。これらの例は、本発明に適用可能な試料タイプを制限するものとして解釈されるべきではない。
【０１３５】
本明細書に使用される際、「かけ離れた試料」は、いくつかの文脈において使用される際、試料の細胞、組織、または臓器の源でない部位から間接的に回収された試料を指す。例えば、膵臓を起源とする試料物質が便試料中で評価されるとき（例えば、膵臓から直接的に採取された試料由来でない）、当該試料はかけ離れた試料である。
【０１３６】
本明細書に使用される際、用語「患者」または「被検体」は、技術により与えられた種々のテストを受ける生物を指す。用語「被検体」は、動物を含み、好ましくはヒトを含む哺乳類動物を含む。好ましい実施形態において、被検体は霊長類の動物である。さらにより好ましい実施形態において、被検体はヒトである。
【０１３７】
本明細書に使用される際、用語「キット」とは、材料を送達するための任意の送達システムを指す。反応アッセイの関連において、このような送達システムには、反応試薬（例えば、適切な容器に入ったオリゴヌクレオチド、酵素等）および／または支持材料（例えば、緩衝液、アッセイを行うための説明書類等）の保管、輸送、もしくは１つの位置からもう１つの位置までの送達を可能にする、システムが含まれる。例えば、キットには、関連する反応試薬および／または支持材料を含有する１つ以上の容器（例えば、箱）が含まれる。本明細書に使用される際、用語「細分化キット」は、２つ以上の別個の容器であって、それぞれが、全キット構成要素の一部を含む、２つ以上の別個の容器を含む送達システムを指す。容器は、一緒または別個に、意図される受容者に送達することができる。例えば、第１の容器は、アッセイで使用するための酵素を含み得り、一方で第２の容器は、オリゴヌクレオチドを含む。用語「細分化キット」は、連邦食品衣料品化粧品法（Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｆｏｏｄ，Ｄｒｕｇ，ａｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ａｃｔ）の第５２０条（ｅ）項により規制される、検体特異的試薬（ＡＳＲ）を含むキットを包含するように意図するが、それらに限定されない。実際には、２つ以上の別個の容器であって、それぞれが全キット構成要素の一部分を含む、２つ以上の別個の容器を含むいずれの送達システムも、用語「細分化キット」に含まれる。対照的に、「複合キット」は、反応アッセイの全ての構成要素を単一の容器（例えば、所望される構成要素のそれぞれを収容する単一の容器内）に含む、送達システムを指す。用語「キット」は、細分化および複合両方のキットが含まれる。
【０１３８】
〔本技術の実施形態〕
本明細書に提供されているのは、腫瘍形成の検出に関する技術、ならびに、特に（ただしこれらに限定されない）、前がん状態および胃がんなどの悪性腫瘍を検出するための、方法、組成物、および関連する使用に関する技術である。胃のがん（例えば、胃がん）を有する被験体の腫瘍由来のＤＮＡマーカーのメチル化状態を、コントロールの被験体由来の同一のＤＮＡマーカのメチル化状態と比較することによる症例対照法にてマーカーを同定した（実施例１および２を参照のこと）。
追加実験では、胃がん検出のための１０個の最適なマーカー（ＡＲＨＧＥＦ４、ＥＬＭＯ１、ＡＢＣＢ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＳＦＭＢＴ２、ＣＤ１Ｄ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ＯＲＦ１８；実施例２および表４を参照のこと）を同定した。さらなる追加実験により、胃がん検出のための３０個の任意マーカーを同定した（実施例１および表２を参照のこと）。さらなる追加実験により、血漿試料中の胃のがん（例えば胃がん）検出のための１２個の最適なマーカーを同定した（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３またはｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡＩ；実施例３、表１、２、４および７を参照のこと）。
【０１３９】
マーカーおよび／またはマーカのパネル（例えば、ＡＲＨＧＥＦ４、ＥＬＭＯ１、ＡＢＣＢ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡＩ、ＳＦＭＢＴ２、ＣＤ１Ｄ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＺＮＦ５６９または１３ＯＲＦ１８から選択されるアノテーションを有し、マーカ（表４を参照）を含む染色体領域、を、胃のがん（例えば胃がん）を有する被験体の胃の組織のメチル化状態をコントロールの被験体由来の同一のＤＮＡマーカーのメチル化状態と比較することによる症例対照法にてマーカーを同定した（実施例２を参照のこと）。
【０１４０】
マーカーおよび／またはマーカーのパネル（例えば、ＥＬＭＯ１、ＡＲＨＧＥＦ４、ＥＭＸ１、ＳＰ９、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＢＭＰ３、ＫＣＮＡ３、ＤＭＲＴＡ２、ＬＣＮＫ１２、ＳＤ１Ｄ、ＰＲＬＣＢ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＺＮＦ５６８、ＡＢＣＢ１、ＥＬＯＶＬ２、ＰＫＩＡ、ＳＦＭＢＴ２（８３９）、ＰＣＢＰ３、ＭＡＴＫ、ＧＲＮ２Ｄ、ＮＤＲＧ４、ＤＬＸ４、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ、ＦＧＦ１４、ＺＮＦ１３２、ＣＨＳＴ２（７８９０）、ＦＬ１１、ｃ１３もしくはｆ１８またはＺＮＦ５６９から選択されるアノテーションを有し、マーカーを含んでいる染色体領域（表２を参照のこと）を、
を、胃のがん（例えば胃がん）を有する被験体の胃の組織のメチル化状態をコントロールの被験体由来の同一のＤＮＡマーカーのメチル化状態と比較することによる症例対照法にてマーカーを同定した（実施例１を参照のこと）。
【０１４１】
マーカーおよび／またはマーカーのパネル（例えば、ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３もしくはｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４、ＳＴ８ＳＩＡ１から選択されるアノテーションを有し、マーカーを含んでいる染色体領域（表１、２、４および７を参照のこと）を、ＤＮＡマーカー（胃のがん（例えば胃がん）を有する被験体の胃の血漿由来）のメチル化状態をコントロールの被験体由来の同一のＤＮＡマーカーのメチル化状態と比較することによる症例対照法にてマーカーを同定した（実施例３を参照のこと）。
【０１４２】
さらに、本技術は様々なマーカのパネル、例えば、いくつかの実施形態では、マーカーは、ＡＲＨＧＥＦ４、ＥＬＭＯ１、ＡＢＣＢ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＳＦＭＢＴ２、ＣＤ１Ｄ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＺＮＦ５６９またはＣ１３ＯＲＦ１８であるアノテーションを有し、当該マーカーを含む、染色体領域を含む（表４を参照のこと）。
さらに、実施形態では、ＤＭＲ番号、Ｎｏ．４９、４３、１９６、６６、１、２３７、２４９、２５０、２５１または２５２である、表４のＤＭＲの解析する方法を示している。いくつかの実施形態では、マーカーのメチル化状態の測定であって、染色体領域がＥＬＭＯ１、ＡＲＨＧＥＦ４、ＥＭＸ１、ＳＰ９、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＢＭＰ３、ＫＣＮＡ３、ＤＭＲＴＡ２、ＫＣＮＫ１２、ＣＤ１Ｄ、ＰＲＫＣＢ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＺＮＦ５６８、ＡＢＣＢ１、ＥＬＯＶＬ２、ＰＫＩＡ、ＳＦＭＢＴ２（８９３）、ＰＣＢＰ３、ＭＡＴＫ、ＧＲＮ２Ｄ、ＮＤＲＧ４、ＤＬＸ４、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ、ＦＧＦ１４、ＺＮＦ１３２、ＣＨＳＴ２（７８９０）、ＦＬＩ１、ｃ１３もしくはｆ１８またはＺＮＦ５６９であるアノテーションを有し、当該マーカーを含む、測定を提供する（表２を参照のこと）。さらなる実施形態では、表２由来のＤＭＲ解析の歩具体的な方法は、ＤＭＲ番号が２５３、２５１、２５４、２５５、２５６、２４９、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２５０、２６３、１、２６４、２６５、１９６、２６６、１１８、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、４６、２７３、２５２または２３７である表２のＤＭＲを解析する方法を提供する。いくつかの実施形態では、得られた試料は血漿血漿試料であり、マーカーは、ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３かｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡ１であるアノテーションを有し、当該マーカーを含む染色体領域を含む。さらに、このような実施形態において、試料は血漿血漿試料であり、ＤＭＲ番号２５３、２５１、２５４、２５５、２５６、２４９、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２５０、２６３、１、２６４、２６５、１９６、２６６、１１８、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、４６、２７３、２５２または２３７である表１、２、４および７のＤＭＲを解析する方法である。いくつかの実施形態では、方法は、2つのマーカー（例えば表１、２、４または７の列に示されているマーカーの組）のメチル化状態を測定することを包含する。
【０１４３】
本明細書における開示は、特定の例示された実施形態を言及しているが、これらの実施形態は例示の方法によって示されたものであり限定の方法によって示されたものでないことが理解されるであろう。
【０１４４】
特定の局面において、本技術は、胃のがん（例えば胃がん）などのがんの同定、検出、および／または分類のための組成物および方法を提供する。当該方法は被験体（例えば、便の試料、胃の組織試料、血漿血漿試料）から分離された生物学的試料における少なくとも１つのメチル化マーカーのメチル化状態を検出することを包含しており、マーカーのメチル化状態における変化が、胃のがん（例えば胃がん）の存在、分類または部位の指標となる。特定の実施形態は、疾病の前がんステージの間の早期発見を含む新生細胞増殖性の疾患（例えばがん）腫瘍性細胞の、診断（例えばスクリーニング）に用いられる、メチル化可変領域（ＤＭＲ、例えば、ＤＭＲ１−２７４、表１、２、４および７）を含んでいるマーカーに関する。
【０１４５】
少なくとも１つのマーカー、マーカーの領域、または、本明細書に示され、表１、２、４、または７に列挙されたＤＭＲ（例えば、ＤＭＲ、ＤＭＲ１−２７４）を含んでいるマーカーの塩基のメチル化が分析される実施形態に加え、本技術はまた、がん（特に胃のがん）の検出の有用性を有するＤＭＲを含む、少なくとも１つのマーカー、マーカーの領域、またはマーカーの塩基を含むマーカーのパネルを提供する。
【０１４６】
本技術のいくつかの実施形態は、少なくとも１つのマーカー、マーカーの領域、またはマーカの塩基のＣｐＧメチル化状態の分析に基づいている。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、本技術は、ＤＭＲ（例えば、ＤＭＲ１−２７４、表１、２、４および７を参照のこと）を含んでいる少なくとも１つのマーカー中のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態を測定する１つ以上のメチル化アッセイとの組合せにおける、
重亜硫酸塩法の使用のために提供される。ゲノムのＣｐＧジヌクレオチドは、メチル化または脱メチル化され得る（あるいはそれぞれup- およびdown-メチル化として知られている）。しかし、本発明の方法は、離れた試料（例えば血液、組織排出物または便）のバックグラウンド中の異種の性質（例えば低濃度の腫瘍細胞またはそれ由来の生物学的材料）の生物学的資料の分析に好適である。
【０１４８】
したがって、そのような試料中のＣｐＧの位置のメチル化状態の分析をする場合、特定のＣｐＧの位置におけるメチル化のレベル（例えばパーセント、分画、比率、集団、度合）を検出するための定量的アッセイを使用し得る。
【０１４９】
本技術によれば、ＤＭＲを含んでいるマーカー中のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態の測定は、胃のがんなどのがんの診断および性質の両方に有用性がある。
【０１５０】
〔マーカーの組み合わせ〕
いくつかの実施形態において、本技術は表１（例えば、ＤＭＲ番号１−２４８）、または表４（例えば、ＤＭＲ番号４９、４３、１９６、６６、１、２３７、２４９、２５０、２５１、２５２）、または表２（例えば、ＤＭＲ番号２５３、２５１、２５４、２５５、２５６、２４９、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２５０、２６３、１、２６４、２６５、１９６、２６６、１１８、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、４６、２７３、２５２、２３７）、または表７（ＤＭＲ番号２７４）またはＤＭＲを含むさらなるマーカーを含むマーカーの組合せのメチル化状態を評価することに関する。いくつかの実施形態において、１つ以上のマーカーのメチル化状態を評価することは、特異性を向上させるおよび／または被験体における腫瘍（例えば胃のがん）の想定のためのスクリーニングまたは診断の感度を向上させる。いくつかの実施形態において、マーカまたはマーカーの組合せは、腫瘍の種類同士および／または局在同士を識別する。
【０１５１】
種々のがんがマーカーの種々の組合せによって予測される（例えば、予測の特異性および感度に関する統計学的な技術によって同定される）。本技術は、いくつかの癌の予測的な組み合せおよび実証された組合せを決定する方法を提供する。
【０１５２】
〔メチル化状態（state）の分析方法〕
５−メチルシトシンの存在のために核酸を分析するための最もよく使用される方法は、ＤＮＡ中の５−メチルシトシンの検出のためのＦｒｏｍｍｅｒらによりに記載されている重亜硫酸塩法（Ｆｒｏｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：  １８２７−３１  ｅｘｐｌｉｃｉｔｌｙ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｈｅｒｅｉｎ  ｂｙ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｉｔｓ  ｅｎｔｉｒｅｔｙ  ｆｏｒ  ａｌｌ  ｐｕｒｐｏｓｅｓ）またはその変種に基づいている。５−メチルシトシンを見つけ出す重亜硫酸塩法は、５−メチルシトシンでないシトシンが亜硫酸水素イオン（重亜硫酸塩としても知られる）と反応する観測に基づく。反応は、通常、以下のステップにより行われる。はじめに、シトシンは、スルホン化シトシンを形成するために亜硫酸水素と反応する。次に、スルホン化反応中間体の自発的な脱アミノ化によりスルホン化ウラシルとなる。最終的に、スルホン化ウラシルは、ウラシルを形成するために、アルカリ条件下で脱スルホン化される。ウラシルはアデニンと塩基対を形成し（チミンのようにふるまう）、一方５−メチルシトシンはグアニンと塩基対を形成する（シトシンのようにふるまう）ため、検出は可能である。これは、例えば、重亜硫酸塩遺伝子配列決定（Ｇｒｉｇｇ  Ｇ，  ＆  Ｃｌａｒｋ  Ｓ，  Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ（１９９４）１６：  ４３１−３６；  Ｇｒｉｇｇ  Ｇ，  ＤＮＡ  Ｓｅｑ．  （１９９６）  ６：  １８９−９８）、または例えば米国特許第５，７８６，１４６号に開示されているようなメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）により、メチル化されていないシトシンからメチル化されたシトシンを区別することを可能にする。
【０１５３】
いくつかの従来の技術は、分析するためのＤＮＡをアガロース膜中に囲うことを含む方法に関係し、それにより、ＤＮＡの拡散および復元を防ぎ（重亜硫酸塩は１本鎖ＤＮＡとのみ反応する）、早い透析で沈降および精製ステップに取って代わる（Ｏｌｅｋ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）“Ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｂａｓｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２４：  ５０６４−６）。したがって、方法の有用性および感度を示す、メチル化状態（status）の個々の細胞を分析することが可能である。５−メチルシトシンを検出するための従来の方法の概要は、Ｒｅｉｎ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２６：  ２２５５により与えられる。
【０１５４】
重亜硫酸塩の技術は、典型的に、個々のシトシンの位置を分析するために、重亜硫酸塩処理後の既知の核酸の短い特定のフラグメントを増幅すること、それから配列決定により産物を分析すること（Ｏｌｅｋ  ＆  Ｗａｌｔｅｒ（１９９７）Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  １７：  ２７５−６）、またはプライマー伸長反応（Ｇｏｎｚａｌｇｏ  ＆  Ｊｏｎｅｓ  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：  ２５２９−３１；国際公開公報第９５／００６６９号；米国特許第６，２５１，５９４号）を含む。いくつかの方法は、酵素消化を用いる（Ｘｉｏｎｇ  ＆  Ｌａｉｒｄ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：  ２５３２−４）。ハイブリッド形成による検出はまた、当技術分野において説明されている（Ｏｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開公報第９９／２８４９８号）。さらに、個々の遺伝子に関するメチル化検出のための重亜硫酸塩の技術の使用が説明されている（Ｇｒｉｇｇ  ＆  Ｃｌａｒｋ（１９９４）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  １６：  ４３１−６，；  Ｚｅｓｃｈｎｉｇｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．  ６：  ３８７−９５；  Ｆｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：  ６９５；  Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｇｅｎｅ  １５７：  ２６１−４；国際公開公報第９７４６７０５号；国際公開公報第９５１５３７３号）。
【０１５５】
様々なメチル化分析方法は、当技術分野において知られており、本技術による重亜硫酸塩処理と併用して使用できる。これらの分析により、核酸配列内の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチド（例えばＣｐＧアイランド）のメチル化状態（state）を決定できる。そのような分析は、他の技術の間に、重亜硫酸塩処理された核酸の配列決定、ＰＣＲ（配列特定の増幅のため）、サザンブロット分析、およびメチル化感受性制限酵素の使用を含む。
【０１５６】
例えば、遺伝子配列決定は、メチル化パターンの分析のために簡易化され、５−メチルシトシンは、重亜硫酸塩処理を用いることにより区別する（Ｆｒｏｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：  １８２７−１８３１）。さらに、重亜硫酸塩転換されたＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物の制限酵素消化は、例えば、Ｓａｄｒｉ  ＆  Ｈｏｒｎｓｂｙ（１９９７）Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２４：  ５０５８−５０５９により説明されるように、またはＣＯＢＲＡ（組み合わせ重硫酸塩制限分析）（Ｘｉｏｎｇ  ＆  Ｌａｉｒｄ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：  ２５３２−２５３４）として知られる方法において実施されるように、メチル化状態（state）を査定することにおける使用を見出す。
【０１５７】
ＣＯＢＲＡ（商標）分析は、少量のゲノムＤＮＡ中の特定の遺伝子座でのＤＮＡメチル化レベルを決定するのに有用な定量メチル化分析である（Ｘｉｏｎｇ  ＆  Ｌａｉｒｄ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：２５３２−２５３４，  １９９７）。要するに、制限酵素消化は、重亜硫酸ナトリウム処理されたＤＮＡのＰＣＲ産物中のメチル化依存的な配列の差異を明らかにするために使用される。メチル化依存的な配列の差異は、Ｆｒｏｍｍｅｒら（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１８２７−１８３１，  １９９２）により説明される方法による標準の重亜硫酸塩処理によってゲノムＤＮＡにはじめに導入される。重亜硫酸塩転換されたＤＮＡのＰＣＲ増幅は、それから対象のＣｐＧアイランドのための特定のプライマーを使用して行われ、続いて制限エンドヌクレアーゼ消化、ゲル電気泳動、および特定のラベル化ハイブリッド形成プローブを用いた検出が行われる。もともとのＤＮＡ試料におけるメチル化レベルは、ＤＮＡメチル化レベルの広範なスペクトルを横切る線形定量法における消化されたおよび消化されていないＰＣＲ産物の相対的な量により表される。さらに、この技術は顕微解剖されたパラフィンが組み込まれた組織試料から得られたＤＮＡに確実に適用できる。
【０１５８】
ＣＯＢＲＡ（商標）分析のための典型的な試薬（例えば、典型的なＣＯＢＲＡ（商標）に基づくキットに見られ得るような）は、限定されないが、特定の遺伝子座のためのＰＣＲプライマー（例えば、特定の遺伝子、マーカー、ＤＭＲ、遺伝子の領域、マーカーの領域、重亜硫酸塩処理されたＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランド等）；制限酵素および適切な緩衝液、遺伝子ハイブリット形成オリゴヌクレオチド；コントロールハイブリット形成オリゴヌクレオチド；オリゴヌクレオチドプローブのためのキナーゼラベリングキット；およびラベル化されたヌクレオチドを含んでもよい。さらに、重亜硫酸塩転換試薬は、ＤＮＡ変性緩衝液、スルホン化緩衝液、ＤＮＡ修復試薬、またはキット（例えば、沈降、限外ろ過、アフィニティーカラム）；脱スルホン化緩衝液、およびＤＮＡ修復組成物を含んでいてもよい。
【０１５９】
好ましくは、「ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」（蛍光に基づくリアルタイムＰＣＲ技術）（Ｅａｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５９：２３０２−２３０６，  １９９９）、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ（商標）（メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長）反応（Ｇｏｎｚａｌｇｏ  ＆  Ｊｏｎｅｓ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：２５２９−２５３１，  １９９７）、メチル化特異的ＰＣＲ（「ＭＳＰ」；  Ｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：９８２１−９８２６，  １９９６；  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，７８６，１４６）、およびメチル化されたＣｐＧアイランド増幅（「ＭＣＡ」；  Ｔｏｙｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５９：２３０７−１２，  １９９９）のような分析は、単独または１つ以上のこれらの方法の組み合わせで使用される。
【０１６０】
「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）」分析、技術は、重亜硫酸塩処理されたＤＮＡのメチル化特異的増幅に基づいて、メチル化の差異を査定するための定量方法である。増幅プライマー間のＣｐＧ位置をカバーする、または当該プライマーによってカバーされるメチル化特異的ブロッキングプローブ（「ブロッカー」）によって、核酸試料のメチル化特異的選択的増幅が可能となる。
【０１６１】
用語「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」アッセイは、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイは、増幅プライマー間のＣｐＧ位置をカバーするメチル化特異的ブロッキングプローブを組み合わせた、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイの変種である、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイを指す。ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）アッセイはまた、メチル化特異的増幅プライマーとの組み合わせにおいて使用されてもよい。
【０１６２】
ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）分析のための典型的な試薬（例えば、典型的なＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）に基づくキットに見られ得るような）は、限定されないが、特定の遺伝子座（例えば、特定の遺伝子、マーカー、ＤＭＲ、遺伝子の領域、マーカーの領域、重亜硫酸塩処理されたＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランド、または重亜硫酸塩処理されたＤＮＡ配列またはＣｐＧアイランド等）のためのＰＣＲプライマー；オリゴヌクレオチドブロッキング；最適化されたＰＣＲ緩衝液およびデオキシンクレオチド；およびＴａｑポリメラーゼを含んでいてもよい。
【０１６３】
メチル化感受性制限酵素の使用の影響を受けずに、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）により、ＣｐＧアイランド内のＣｐＧ部位の実質的な任意の基のメチル化状態（status）を査定することができる（Ｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：９８２１−９８２６，  １９９６；  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，７８６，１４６）。要するに、ＤＮＡは、重亜硫酸ナトリウムによって修飾され、メチル化シトシンではなく非メチル化シトシンをウラシルに転換し、産物はメチル化ＤＮＡ対非メチル化ＤＮＡのための特定のプライマーで連続的に増幅される。ＭＳＰは少量のＤＮＡのみを必要とし、所定のＣｐＧアイランド遺伝子座のメチル化対立遺伝子の０．１％の感度を有し、パラフィンが組み込まれた試料から抽出されたＤＮＡ上で行うことができる。ＭＳＰ分析のための典型的な試薬（例えば、典型的なＭＳＰに基づくキットに見られ得るような）は、限定されないが、特定の遺伝子座（例えば、特定の遺伝子、マーカー、ＤＭＲ、遺伝子の領域、マーカーの領域、重亜硫酸塩処理されたＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランド等）のためのメチル化および非メチル化ＰＣＲプライマー；最適化されたＰＣＲ緩衝液およびデオキシヌクレオチド、および特定のプローブを含んでいてもよい。
【０１６４】
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイは、ＰＣＲステップ後のさらなる操作が必要ない、蛍光に基づくリアルタイムＰＣＲ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標））を利用する高スループット定量メチル化アッセイである（Ｅａｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５９：２３０２−２３０６，  １９９９）。要するに、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）工程は、標準的な方法によって、重亜硫酸ナトリウム反応において、メチル化依存的な配列の差異を持つ混合プールに転換される、ゲノムＤＮＡの混合試料から始まる（重亜硫酸塩工程は、非メチル化シトシン残基をウラシルに転換する）。蛍光に基づくＰＣＲは、それから例えば、既知のＣｐＧジヌクレオチドと一部重なり合うＰＣＲプライマーと共に、「偏った」反応において行われる。配列の区別は、増幅工程のレベル及び蛍光検出工程のレベルの両方で生じる。
【０１６５】
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイは、核酸（例えばゲノムＤＮＡ試料）中のメチル化パターンの定量テストとして使用され、配列の区別はプローブのハイブリッド形成のレベルで生じる。定量版において、ＰＣＲ反応は、特定の推定上のメチル化部位と一部重なる蛍光プローブの存在下で、メチル化特異的増幅を与える。ＤＮＡの投入量の偏りのないコントロールは、プライマーもプローブも任意のＣｐＧジヌクレオチドに重ならない反応によって与えられる。また、ゲノムメチル化の定量テストは、既知のメチル化部位をカバーしないコントロールヌクレオチド（例えば、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）およびＭＳＰ技術の蛍光に基づく版）または可能性のあるメチル化部位をカバーするオリゴヌクレオチドであるかのどちらかで偏ったＰＣＲプールを探査することにより成し遂げられる。
【０１６６】
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）工程は、任意の好ましいプローブと共に使用される（例えば「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」プローブ、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）プローブ等）例えば、いくつかの適用において、例えばＭＳＰプライマーおよび／またはＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌブロッカーオリゴヌクレオチドおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと共に、２本鎖ゲノムＤＮＡは重亜硫酸ナトリウムで処理され、ＴａｑＭａｎ（登録商標）を用いたＰＣＲ反応のプローブ２セットのうち１つの対象となる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、蛍光「レポーター」および「クエンチャー」分子で二重にラベル化され、相対的に高いＧＣ成分領域に特異的になるようにデザインされるため、フォアワードまたはリバースプライマーよりもＰＣＲサイクル中、約１０℃高い温度で融解する。これにより、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、ＰＣＲアニーリング／伸長ステップの間、十分にハイブリッド形成されたものを残すことができる。Ｔａｑポリメラーゼは、ＰＣＲの間、新しい鎖を酵素的に合成し、最終的にアニールされたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに達し得る。Ｔａｑポリメラーゼ５´−３´エンドヌクレアーゼ活性は、それからそれを消化することによってＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに置き換えられてもよく、リアルタイム蛍光検出システムを用いてすぐに消光しないシグナルを定量検出するための蛍光レポーター分子を放出する。
【０１６７】
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）分析のための典型的な試薬（例えば、典型的なＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）に基づくキットに見られ得るような）は、限定されないが、特定の遺伝子座のためのＰＣＲプライマー（例えば、特定の遺伝子、マーカー、ＤＭＲ、遺伝子の領域、マーカーの領域、重亜硫酸塩処理されたＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランド等）；ＴａｑＭａｎ（登録商標）またはＬｉｇｈｔｃｙｃｅｒ（登録商標）プローブ；最適化されたＰＣＲ緩衝液およびデオキシヌクレオチド；およびＴａｑポリメラーゼを含んでいてもよい。
【０１６８】
ＱＭ（商標）（定量的メチル化）アッセイは、ゲノムＤＮＡ試料中のメチル化パターンの代替定量テストであり、配列の区別がプローブハイブリッド形成のレベルで生じる。この定量版において、ＰＣＲ反応は、特定の推定上のメチル化部位と一部重なる蛍光プローブの存在下で、偏りのない増幅を与える。ＤＮＡ投入量の偏りのないコントロールは、プライマーもプローブも任意のＣｐＧジヌクレオチドに重ならない反応によって与えられる。また、ゲノムメチル化の定量テストは、既知のメチル化部位をカバーしていないコントロールオリゴヌクレオチド（ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）およびＭＳＰ技術の蛍光ベース版）または可能性のあるメチル化部位をカバーするオリゴヌクレオチドのどちらかと共に、偏ったＰＣＲプールを探査することによって成し遂げられる。
【０１６９】
ＱＭ（商標）工程は、増幅工程において、任意の好適なプローブ（例えば、「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」プローブ、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｅｒ（登録商標）プローブ）を使用できる。例えば、２本鎖ゲノムＤＮＡは、重亜硫酸ナトリウムで処理され、不偏プライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブにさらされる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブがＰＣＲアニーリング／伸長ステップの間、十分にハイブリッド形成したままにすることができる。ＰＣＲの間、Ｔａｑポリメラーゼは新しい鎖を酵素的に合成する際、最終的にアニールされたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに近づき得る。Ｔａｑポリメラーゼ５´−３´エンドヌクレアーゼ活性は、それからそれを消化することによってＴａｑＭａｎ（登録商標）に置き換えられてもよく、リアルタイム蛍光検出システムを用いてすぐに消光しないシグナルを定量検出するための蛍光レポーター分子を放出する。ＱＭ（商標）分析のための典型的な試薬（例えば、典型的なＱＭ（商標）に基づくキットに見られ得るような）は、限定されないが、特定の遺伝子座（例えば、特定の遺伝子、マーカー、ＤＭＲ、遺伝子の領域、マーカーの領域、重亜硫酸塩処理されたＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランド等）のためのＰＣＲプライマー；ＴａｑＭａｎ（登録商標）またはＬｉｇｈｔｃｙｃｅｒ（登録商標）プローブ；最適化されたＰＣＲ緩衝液およびデオキシヌクレオチド；およびＴａｑポリメラーゼを含んでいてもよい。
【０１７０】
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ（商標）技術は、ＤＮＡの重亜硫酸塩処理、続く１本鎖ヌクレオチドプライマー伸長に基づく特定のＣｐＧ部位でのメチル化差異を査定するための定量法である（Ｇｏｎｚａｌｇｏ  ＆  Ｊｏｎｅｓ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：２５２９−２５３１，  １９９７）。要するに、５−メチルシトシンを変化しないまま、ゲノムＤＮＡは、重亜硫酸ナトリウムと反応して非メチル化シトシンをウラシルに転換する。所望の標的配列の増幅は、それから重亜硫酸塩転換されたＤＮＡに特異的なＰＣＲを用いて行われ、結果として生じた産物は単離され、対象のＣｐＧ部位でのメチル化分析のための鋳型として使用される。少量のＤＮＡで分析することができ（例えば、顕微解剖された病理部分）、ＣｐＧ部位でのメチル化状態（status）を決定するための制限酵素の利用を回避する。
【０１７１】
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ（商標）分析のための典型的な試薬（例えば、典型的なＭｓ−ＳＮｕＰＥ（商標）に基づくキットにみられるような）は、限定されないが、特定の遺伝子座（例えば、特定の遺伝子、マーカー、ＤＭＲ、遺伝子の領域、マーカーの領域、重亜硫酸塩処理されたＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランド等）のためのＰＣＲプライマー；最適化されたＰＣＲ緩衝液およびデオキシヌクレオチド；ゲル抽出キット；陽性コントロールプライマー；特定の遺伝子座のためのＭｓ−ＳＮｕＰＥ（商標）プライマー；反応緩衝液（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ反応）；およびラベル化されたヌクレオチドを含んでいてもよい。さらに、重亜硫酸塩転換試薬は、ＤＮＡ変性緩衝液；スルホン化緩衝液；ＤＮＡ修復試薬またはキット（例えば、沈降、限外ろ過、アフィニティーカラム）；脱スルホン化緩衝液、およびＤＮＡ修復組成物を含んでいてもよい。
【０１７２】
還元重亜硫酸塩配列決定（ＲＲＢＳ）は、全ての非メチル化シトシンをウラシルに転換するための核酸の重亜硫酸塩処理を開始し、続いて制限酵素消化を行い（例えば、ＭｓｐＩのようなＣＧ配列を含む部位を認識する酵素によって）、アダプターリガンドに結合した後に断片の配列決定を完了する。制限酵素の選択は、分析の間、複数の遺伝子の位置にマップされ得る重複配列の数を減少し、ＣｐＧ密集領域の断片を豊富化する。そのように、ＲＲＢＳは配列決定のための制限断片の部分を選択することによって（例えば、調製ゲル電気泳動を用いた大きさの選択によって）、核酸試料の複雑さを減らす。全ゲノム重亜硫酸塩配列決定とは対照的に、制限酵素消化によって産出される全ての断片は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのＤＮＡメチル化情報を含む。そのように、ＲＲＢＳは、これらの領域におけるプロモーター、ＣｐＧアイランド、制限酵素切断部位の高い頻度を有する他のゲノムの特徴の試料を豊富化して、１つ以上のゲノム遺伝子座のメチル化状態（state）を査定するためのアッセイを提供する。
【０１７３】
典型的なＲＲＭＳのプロトコルは、ＭｓｐＩのような制限酵素で核酸試料を消化するステップ、突出およびＡ−テーリングを満たすステップ、アダプターを連結するステップ、重亜硫酸塩転換ステップ、およびＰＣＲステップを含む。例えば、（２００５）  “Ｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅｓ  ａｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ”  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７：  １３３−６；  Ｍｅｉｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  “Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３３：  ５８６８−７７等を参照されたい。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、定量的対立遺伝子特異的リアルタイム標的およびシグナル増幅（ＱｕＡＲＴＳ）アッセイは、メチル化状態（state）を評価するために使用される。それぞれのＱｕＡＲＴＳアッセイ中、最初の反応において増幅（反応１）および標的プローブ切断（反応２）；第２の反応においてＦＲＥＴ切断および蛍光シグナル発生（反応３）を含む、３つの反応が連続的に起こる。標的の核酸が特定のプライマーで増幅されるとき、フラップ配列を有する特定の検出プローブは、増幅産物にゆるく結合する。標的の結合部位の特定の侵入オリゴヌクレオチドの存在は、検出プローブとフラップ配列との間を切断することによって、フラップ配列を放出するための切断を引き起こす。フラップ配列は、ＦＲＥＴカセットに相当するヘアピンでない部分に相補的である。したがって、フラップ配列はＦＲＥＴカセット上の侵入オリゴヌクレオチドとして機能し、ＦＲＥＴカセット蛍光色素分子とクエンチャーとの間の切断をもたらし、蛍光シグナルを発生する。切断反応は、標的毎に複数のプローブを切断することができ、したがって、フラップごとに複数の蛍光色素分子を放ち、急激に増加するシグナル増幅を与える。ＱｕＡＲＴＳは、よく異なる色素を有するＦＲＥＴカセットを用いることによって、単一反応において複数の標的を検出することができる。例えば、Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  “Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５６：  Ａ１９９；米国特許出願第１２／９４６，７３７号、第１２／９４６，７４５号、第１２／９４６，７５２号および第６１／５４８，６３９号を参照されたい。
【０１７５】
用語「重亜硫酸塩試薬」とは、重亜硫酸塩、二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、またはそれらの組み合わせを含む試薬を指し、本明細書に開示されているように、メチル化および非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列の間を区別するために役立つ。上記処理の方法は、当該分野で知られている（例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５、本明細書に参照として組入れられる）。重亜硫酸塩処置は、限定されないが、ｎ−アルキレングリコールもしくはジエチレングリコールジメチルエーテル（ＤＭＥ）のような変性溶剤の存在で、またはジオキサンもしくはジオキサン誘導体の存在下で行われることが好ましい。いくつかの実施形態において、変性溶剤は、１％〜３５％（ｖ／ｖ）の濃度で使用される。いくつかの実施形態において、重亜硫酸塩反応は、限定されないが、クロマン誘導体（例えば、６−ヒドロキシー２，５，７，８，−テトラメチルクロム２−カルボン酸塩またはトリヒドロキシ安息香酸およびそれらの誘導体、例えば、没食子酸）のようなスカベンジャーの存在下で行われる（参照：ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５、本明細書に参照として組入れられる）。重亜硫酸塩転換は、好ましくは、３０℃〜７０℃の温度で行われ、反応の間、温度は短時間８０℃より高く上げられる（参照：ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５、本明細書に参照として組入れられる）。重亜硫酸塩処理されたＤＮＡは、好ましくは定量化の前に精製される。これは、限定されないが、限外ろ過（例えば、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（商標）カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）により製造された）によって）のような当該技術分野で知られる任意の手段により行われてもよい。精製は、変更された製造プロトコルにより行われた（例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５を参照されたい、本明細書に参照として組入れられる）。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、処理されたＤＮＡの断片は、本発明によるプライマーオリゴヌクレオチド（例えば、表３および／または５を参照されたい）および増幅酵素のセットを用いて増幅される。いくつかのＤＮＡセグメントの増幅は、１つおよび同一の反応容器において連続的に行うことができる。典型的に、増幅は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行われる。増幅産物は典型的に長さが１００〜２０００塩基対である。
【０１７７】
方法の他の実施形態において、ＤＭＲ（例えば、表１、２、４および７において与えられるようなＤＭＲ１−２７４）を含むマーカー内または当該マーカーに近いＣｇＧ位置のメチル化状態（status）は、メチル化特異的プライマーオリゴヌクレオチドの使用によって検出され得る。この技術（ＭＳＰ）は、米国特許第６，２６５，１７１号Ｈｅｒｍａｎに記載されている。重亜硫酸塩処理されたＤＮＡの増幅のためのメチル化状態（status）特異的プライマーの使用によって、メチル化および非メチル化核酸の間を区別できる。ＭＳＰプライマー対は、重亜硫酸塩処理されたＣｐＧジヌクレオチドにハイブリッド形成する少なくとも１つのプライマーを含む。それゆえ、上記プライマーの配列は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。非メチル化ＤＮＡに特異的なＭＳＰプライマーは、ＣｐＧにおいてＣ位の位置に「Ｔ」を含む。
【０１７８】
増幅によって得られた断片は、直接的にまたは間接的に検出可能なラベルに運ぶことができる。いくつかの実施形態において、ラベルは、質量分光計で検出できる典型的な質量を有する蛍光ラベル、放射性核種、または検出可能な分子断片である。上記ラベルは質量ラベルであり、いくつかの実施形態はラベル化された増幅産物が単一の陽性または陰性のネットチャージを有することを与え、質量分光計において検出性をよりよくすることができる。検出は、例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）またはエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を使用する手段によって行い、視覚化してもよい。
【０１７９】
これらのアッセイ技術に好適なＤＮＡを単離するための方法は、当該技術分野において知られている。特に、いくつかの実施形態は、米国特許出願第１３／４７０，２５１号（「核酸の単離」）（本明細書に参照として組入れられる）に記載されているように核酸の単離を含む。
【０１８０】
〔方法〕
本技術のいくつかの実施形態において、以下の工程を包含する方法が提供される：  １）被験体から得た核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、例えば、便試料、胃の組織、血漿試料などの体液から単離した）をＤＭＲ（例えばＤＭＲ１−２７４、例えば表１、２、４および７に示された）を含む少なくとも１つのマーカー中のメチル化と非メチル化とを区別する少なくとも１つの試薬または一連の試薬と接触させること、
２）腫瘍形成または増殖性疾患の検出（例えば、８０％より多いか同等の感度および８０％より多いもしくは同等の特異性を有する）。
【０１８１】
本技術のいくつかの実施形態において、以下の工程を包含する方法が提供される：
１）被験体から得た核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、例えば、便試料などの体液または胃の組織から単離した）をＡＲＨＧＥＦ４、ＥＬＭＯ１、ＡＢＣＢ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＳＦＭＢＴ２、ＣＤ１Ｄ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＺＮＦ５６９およびＣ１３ＯＲＦ１８からなる群から選択される少なくとも１つのマーカー中のメチル化したＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとを区別する少なくとも１つの試薬または一連の試薬と接触させること、
２）胃のがんの検出（例えば、８０％より多いか同等の感度および８０％より多いか同等の特異性を有する）。
【０１８２】
本技術のいくつかの実施形態において、以下の工程を包含する方法が提供される：
１）被験体から得た核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、例えば、血漿試料から単離した）をＥＬＭＯ１、ＡＲＨＧＥＦ４、ＥＭＸ１、ＳＰ９、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＢＭＰ３、ＫＣＮＡ３、ＤＭＲＴＡ２、ＫＣＮＫ１２、ＣＤ１Ｄ、ＰＲＫＣＢ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＺＮＦ５６８、ＡＢＣＢ１、ＥＬＯＶＬ２、ＰＫＩＡ、ＳＦＭＢＴ２（８９３）、ＰＣＢＰ３、ＭＡＴＫ、ＧＲＮ２Ｄ、ＮＤＲＧ４、ＤＬＸ４、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ、ＦＧＦ１４、ＺＮＦ１３２、ＣＨＳＴ２（７８９０）、ＦＬＩ１、ｃ１３かｆ１８またはＺＮＦ５６９からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択された少なくとも１つのマーカー中のメチル化したＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとを区別する少なくとも１つの試薬または一連の試薬と接触させること、
２）胃のがんの検出（例えば、８０％より多いか同等の感度および８０％より多いもか同等の特異性を有する）。
【０１８３】
本技術のいくつかの実施形態において、以下の工程を包含する方法が提供される：
１）被験体から得た核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、例えば、便試料などの体液または胃の組織から単離した）をＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ｏｒｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４，および  ＳＴ８ＳＩＡ１からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択された少なくとも１つのマーカー中のメチル化したＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとを区別する少なくとも１つの試薬または一連の試薬と接触させること、
２）胃のがんの検出（例えば、８０％より多いか同等の感度および８０％より多いもしくは同等の特異性を有する）。
【０１８４】
好ましくは、上記感度は約７０％〜約１００％、または約８０％〜約９０％、または約８０％〜約８５％である。好ましくは、、特異性は７０％〜約１００％、または約８０％〜約９０％、または約８０％から約８５％である。
【０１８５】
ゲノムＤＮＡは商業的に利用可能なキットの使用を含むいかなる手法によっても単離され得る。
簡潔には、対象の上記ＤＮＡを、細胞膜により被包し、生物学的試料は酵素的、化学的または機械的に破砕し、し、溶解しなければならない。上記ＤＮＡ溶液は、タンパク質および他の汚染物質を、例えば、プロテアーゼＫを用いた消化によって、除去した。続いて上記ゲノムＤＮＡを、上記溶液から溶出した。これは、塩析、有機溶媒抽出、固体相の担体へのＤＮＡの結合を含む様々な手法で行い得る。方法の選択は、時間、費用、ＤＮＡの要求される品質を含む複数の因子に影響されるであろう。腫瘍形成事象または前腫瘍形成事象を含む、全ての種類の臨床試料が本方法に好適に用いられる（例えば、細胞株、組織学的スライド、生検、パラフィン包埋める組織、体液、便、胃の組織、結腸の液、尿、血漿、血清、全血、単離された血液細胞、血液から単離された細胞およびそれら組み合わせ）。
【０１８６】
上記技術は、試料の準備や実験するための核酸の準備に用いる方法に限らない。例えば、いくつか具体的に、直接的遺伝子捕捉、例えば、詳細な米国特許出願６１／４８５３８６や関連している方法を使用して、ＤＮＡは便試料、血液、血漿試料から単離される。
【０１８７】
ゲノムＤＮＡ試料は、ＤＭＲ（例えば、ＤＭＲ１−２７４、例えば、表１、２、４および７に基づく）を含む少なくとも１個のマーカーの中の、メチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとを区別する少なくとも１つのの試薬または１連の試薬で処理する。。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、上記試薬は、ハイブリダイゼーション反応により、５’位における脱メチル化しているシトシン塩基をウラシル、チミン、またはシトシンとは類似でない他の塩基に変える。しかし、いくつか実施形態において、上記試薬はメチル化感受性の制限酵素であり得る。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡ試料は、脱メチル化しているシトシン塩基を反応により、５’位における脱メチル化しているシトシン塩基をウラシル、チミン、もしくはシトシンとは異なる他の塩基に変換する方法で処理される。いくつかの実施形態では、本処理は硫酸水素塩（水素、硫酸、二硫酸塩）でバイトアルカリ加水分解に従い行われる。
【０１９０】
処理した核酸は、標的遺伝子配列（少なくとも１個の遺伝子、ゲノムシーケンス、またはＤＭＲを比較するマーカー由来のヌクレオチド、例えば、ＤＭＲ１−２７４から選択された少なくとも１個のＤＭＲ、例えば、表１、２、４、または７に基づく）のメチル化状態を解析する。解析の上記方法は、例えば、本発明の中でＱｕＡＲＴＳやＭＳＰのリストに含まれている、これらの技術の中で知られている中から選抜している。
【０１９１】
異常なメチル化、さらに詳細には、ＤＭＲを比較するマーカー（ＤＭＲ１−２７４から選択された少なくとも１個のＤＭＲ、例えば、表１、２、４、または７に基づく）の過メチル化は、胃のがんおよびより詳細には、予測される腫瘍部位と関連している。
【０１９２】
本発明は、胃がんに関する試料のいくつかの解析と関連している。例えば、いくつかの実施形態において、上記試料は患者由来の組織もしくは生物学的液体を含んでいる。いくつかの実施形態において、上記試料は分泌物を含む。いくつかの実施形態において、上記試料は、血液、血清、血漿、胃の分泌物、膵液、胃腸管系の生検試料、胃腸管系の生検から顕微解剖された細胞、胃腸管系内腔に捨てられた胃腸管系の細胞または、糞便から回収された胃腸管系の細胞を含んでいる。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。これらの試料は、消化管上部、消化管下部に由来し得るか、または消化管上部および消化管下部の両方からの細胞、組織および／または分泌物を含んでいる。上記試料は、肝臓、胆管、膵臓、胃、結腸、直腸。食道、小腸、虫垂、十二指腸、ポリープ、胆嚢、肛門および／または腹膜からの細胞、分泌物または組織を含むいくつかの実施形態において、上記試料は、細胞液、腹水、尿、排泄物、膵液、内視鏡検査法の間に得らえる液体、血液、粘液、または唾液を含む。いくつかの実施形態において、上記試料は便である。
【０１９３】
そのような試料は、当該分野において知られている（例えば、当業者にとって明らかな）多くの任意の方法によって得られる。例えば、尿試料および糞便試料は容易に入手でき、血液試料、腹水試料、血漿試料または膵液試料は、例えば針およびシリンジを用いることによって、非経口的に入手できる。無細胞または実質的に無細胞の試料は、当該分野において知られている種々の手法（遠心分離およびろ過が挙げられるが、これらに限定されない）に上記試料を供することによって入手できる。非侵襲的な手法が上記試料を入手するために使用されることが、一般的に好ましいが、組織ホモジネート、組織片および生検標本のような試料を入手することも、好ましい。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、上記技術は、患者（例えば、胃のがん（例えば胃がん）の患者、初期段階の胃がんの患者、または胃がんに進み得る患者）を治療するための方法に関し、当該方法は、本明細書に示されているようなＤＭＲのメチル化状態を決定すること、およびメチル化状態を決定した結果に基づいて、患者に処置を施すことを含んでいる。上記処置は、薬学的化合物、ワクチン、外科処置の実施、患者の画像化診断、他の試験の実施の施行であり得る。好ましくは、当該用途は、臨床スクリーニング方法、予後評価の方法、治療の結果を観察する方法、特定の治療処置にほぼ応答する患者を特定するための方法、患者または対象を画像化診断する方法、薬物のスクリーニングまたは開発のための方法にある。
【０１９５】
本技術のいくつかの実施形態において、胃のがん（例えば胃がん）を診断するための方法が提供される。用語「診断すること」および「診断」は、本明細書に使用されるとき、対象が所定の疾患もしくは状態にあるか否か、または将来的に所定の疾患もしくは状態に進行し得るか否かを、当業者が、推定し、さらに決定し得る方法を指す。当業者は、診断の１つ以上の指標（例えば、バイオマーカー（例えば、本明細書に開示されているようなＤＭＲ）、状態の存在、重篤度もしくは非存在を表わすメチル化状態など）に基づいて、診断をしばしば下す。
【０１９６】
診断とともに、臨床的ながんの予後診断は、診療的ながん予測は、がんの病原性および再発率を決定して、最も有効な治療法を計画することに関する。より正確な診断がなされるか、がんを進行させる見込みのあるリスクが評価され得る場合、適切な治療法、およびいくつかの場合に危険のより少ない治療法が、選択され得る。がんのバイオマーカーの所見（例えば、メチル化状態の測定）は、良好な予後および／またはがん進行の低いリスクがを有している対象（治療を要しないか、わずかな治療を要する）を、がんの進行しやすいか、またはがんの再発しやすい対象（より集中的な処置から利益を得る）と分けるために有益である。
【０１９７】
そのような“診断をすること”または“診断”は、本発明において、さらにがんの進行のリスクを判断すること、または予後を決定することを含んでいる。それは、本発明で報告したバイオマーカーの診断（例えばＤＭＲ）の測定に基づく、適切な治療（もしくは効果的な治療かどうか）を選択すること、または現在の治療の経過観察と、もしかすると治療の変更で、臨床結果（医学的治療をする、またはしない）を予測するためにある。さらに、本開示のいくつかの実施形態において、長期にわたるバイオマーカーの複合的な決定は、診断および／または予後診断を容易にし得る。バイオマーカーの一時的な変化は、臨床結果を予測することができたもので、胃がんの進行を監視し、または直接がんに対して適切な治療の効果を監視することができた。そのようないくつかの実施形態において、例えば、生物学的試料は、長期にわたる効果的な治療の進行の間において、本発明で明らかにした（監視しているもしかすると１つか複数のバイオマーカー）１つか複数のバイオマーカー（例えばＤＭＲ）のメチル化状態の変化を観察し予測することである。
【０１９８】
さらにいくつか具体的に患者の状態をすぐに開示するには、患者においてがんの予防や治療を始めるかもしくは継続するか決定するための方法がある。いくつか具体的に、上記方法は患者からの期間が終わるまでを生物学的試料の系を含む方法で；それぞれ互いの生物学的試料において、本発明で明らかになった少なくとも１つのバイオマーカーはメチル化状態の変化の計測を有している。バイオマーカーのメチル化状態における変化のいくつかは、がんの進行のリスクを予測し、臨床結果を予測し、がんの予防や治療を始めるかもしくは継続するかどうか、また今の治療はがんの効果的な治療であるかどうか、決定することに使用されてきた。例えば、まず初めに治療の開始のために選択され、そして第二に治療の開始後しばらくの間に選択される。メチル化状態は、異なる時に定量し、もしくは定量的に異なる特徴から入手されたそれぞれ互いの試料を計測することができる。異なる試料由来のバイオマーカー水準のメチル化状態の変化は、患者における胃がんのリスク、経過予測、有効的な治療の決定と、もしくは、がんの予測と相互関係を示すことができる。
【０１９９】
具体的にむしろ好まれるのは、本発明の方法や性質は、早期の段階、例えば、病気が表れる前の兆候における病気の治療や診断のためである。いくつか具体的には、本発明の方法や性質は、臨床段階における治療や病気の診断のためである。
【０２００】
さらに具体的に示すと、１つか複数のバイオマーカーの診断や経過予測の多くの決定は、診断や経過予測の決定をするために用いられるマーカーにおける時間の変化を引き起こしてきた。例えば、診断マーカーは初期における、そして再び第二段階における決定をしてきた。いくつか具体的には、初期から第二段階までのマーカーの増加は、特定の型やがんの厳しさ、もしくは経過予測の診断ができる。同様に、初期から第二段階までのマーカーの減少は、特定の型やがんの厳しさ、もしくは経過予測を示すことができる。さらに、１つか複数のマーカーの変化の度合いは、がんの厳しさや将来の不利益な出来事と関連している。熟練した上記の技術を持つ人はこれらを理解するだろうし、確かな具体的な測定の比較は、多数の段階において同様のバイオマーカーの作成ができ、またある段階におけるバイオマーカーや、第二段階における２つ目のバイオマーカーを測定することができ、これらのマーカーの比較は診断に役立つ情報となる。
【０２０１】
本発明で使用された、本表現“診断の決定”は、熟練した技術を持つ人が患者の状態の経過や結果を予測できる方法と関連している。“経過予測”期間は、１００％の正確さを持って状態の経過や結果を予測する能力と関連していない。もしくは、経過や結果はバイオマーカー（例えばＤＭＲ）のメチル化状態に基づき多かれ少なかれ引き起こされると予測できる。その代りに、熟練した上記技能を持つ人は、“経過予測”期間は確かな状態の経過や結果起こる確率は増加することと関連していると理解できるだろう；そしてその経過や結果は、状態に示さないこれらの個人と比較すると、状態に示している患者にさらに起こり得る。例えば、状態（例えば、１つか複数のＤＭＲの標準のメチル化状態を有する）に示さない個人において、結果の見込み（例えば、胃がんに苦しむこと）はとても低いかもしれない。
【０２０２】
具体的には、統計解析は、結果が進行しやすい傾向がある経過予測の指標と関連している。例えば、具体的には、がんではない患者に由来する通常の基準となる試料とは異なるメチル化状態は、がんで苦しむ患者よりも、基準となる試料においてメチル化状態と類似したレベルの患者の方が、統計上優位性のレベルで決定することで示すことができる。付け加えると、基準となるレベル（例えば“通常の”）からメチル化状態の変化は、患者の経過予測に反映することができ、メチル化状態における変化の度合いは反対の結果の重大さに関係している。統計上の優位性は、たいてい、２人か複数人の集団を比較すること、さらに信頼性の差とまたはｐ値の判定により決定されることが多い。例えば、Ｄｏｗｄｙ  ａｎｄ  Ｗｅａｒｄｅｎ、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、  １９８３は、それ全体の参考により具体化されている。現患者の状態の典型的な信頼性の差は、９０％、９５％、９７．５％。９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％であり、全ての典型的なｐ値は０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００１である。
【０２０３】
その他具体的に、本発明において公開したバイオマーカー（例えば、ＤＭＲ）の経過予測や診断のメチル化状態における変化の閾値の度合は、確率することができ、生物学的試料におけるバイオマーカーのメチル化の度合いはメチル化状態の閾値の度合いと容易に比較される。本発明において示されたバイオマーカーのためのメチル化状態における好まれる閾値の変化は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７５％、約１００％、約１５０％である。しかし他の具体化において、“ノモグラム”は、設けることができる。それは、経過観察や診断の指標（バイオマーカーやバイオマーカーの組み合わせ）となるメチル化状態は、一定の結果に向かう性質と直接に関連することによるものである。熟練した本技術を持つ人は、２つの数字の値と関連するそのようなノモグラムの使用について、この測定はマーカー濃度と同様に不確かであることを理解すると共に、精通している。なぜなら、集団の平均ではなく、個々の試料の測定は参照されるからである。
【０２０４】
いくつか具体的に、基準の試料は生物学的試料と同時に解析される。そして、上記生物学的試料から得られた結果は、基準となる試料から得られた結果と比較される。付け加えると、標準的な分布曲線になると予想され、生物学的試料のための上記アッセイの結果は比較される。そのような標準的な分布曲線は、アッセイユニットの機能としてバイオマーカーのメチル化状態を示している。例えば、蛍光ラベルが使用されているときは蛍光シグナルの強度である。多数のドナーから提供され使用した試料は、標準的な分布曲線は通常の組織における１つか複数のバイオマーカーの標準的なメチル化状態を定めている。それは変質形成のドナーや胃がんのドナーから提供された組織において、１つか複数のバイオマーカーの“危険がある”レベルと同様である。上記方法のある具体化は、患者は、上記患者から採取された生物学的試料において、本発明で示した１つか複数のＤＭＲの異常なメチル化状態を示す変質形成を有しているとして確定される。さらに上記方法の他の具体化は、上記患者由来の生物学的試料において、１つか複数のそのようなバイオマーカーの異常なメチル化状態の検出の結果、上記患者はがんであるとみなされる。
【０２０５】
マーカーの上記解析は、１つの試験試料の中で追加マーカーと別々にまたは同時に行われる。例えば、それぞれのマーカーは、試料の効率的な作業のために、さらに大診断ともしくは正確な経過予測をするために、１つの試験を同時に行う。さらに付け加えると、本技術におけるある技能は、同じ患者由来の多数の試料（例えば、時間が連続するとき）の試験の有用性を認識されている。一連の試料のそのような試験は、時間を超えたメチル化マーカーにおける変化と同一であると認められている。メチル化状態の変化は、メチル化状態における変化がないことと同様に、それを含む上記病気の状態についての有益な情報であり、しかしこれに限るものではなく、上記状態の始まりからほぼ同じ時間を確認している。それは、その存在や回復した組織の量、薬剤治療の適応性、様々な治療の有効性、そして将来の状態のリスクを含む患者の結果の確認である。
【０２０６】
バイオマーカーの上記解析は、様々な実際の系において行われる。例えば、マイクロプレートの使用や全自動化は、数多くの試験試料の作業を容易にしてきた。あるいは、１つの試料の型は、素早いやり方で容易に即時の治療と診断のために進化した。例えば、一時的な輸送や緊急処置室の設置である。
【０２０７】
いくつかの具体化にすると、基準のメチル化状態を比較した際、上記患者はまるで胃のがんを有しているように診断される。それは、上記試料において少なくとも１つのバイオマーカーのメチル化状態において、ある程度の差が生じる。逆に、メチル化状態において変化がないときは、生物学的試料の中で同定される。患者は胃のがんを有していないかどうか、がんのリスクをないか、あるいはがんのリスクが低いか確認される。これに関して、上記がんやそのリスクを持つ患者は、おおむねがんでない、またはそのリスクが低い患者と区別することができる。胃がんが進行するリスクのあるこれらの患者は、内視鏡観察を含むさらに集中的で、もしくは通常のクリーニング計画におかれる。一方で、おおむねリスクがないか低い患者は、将来のスクリーニングの時点まで、例えば、現在の技術と一致するようなスクリーニングで、内視鏡検査を避けることができ、それらの患者において胃がんのリスクが現れることを示している。
【０２０８】
すでに言及しているが、現技術の方法の具体的な発展は、１つか複数のバイオマーカーのメチル化状態における変化を検出することは、定性的な測定、もしくは定量的な測定が可能である。患者が、持っているとして、進行のリスク、胃のがん（例えば胃がん）の診断の段階だから、確実な閾値の測定はそのように示している。例えば、前もって決められた基準のメチル化状態から、様々な生物学的試料における１つか複数のバイオマーカーのメチル化状態である。本方法のいくつかの具体化において、基準のメチル化状態は、いくつか検知可能なメチル化状態のバイオマーカーである。本方法のほかの具体化は、生物学的試料と同時に実験した基準試料の場合、前もって決まっている基準のメチル化状態は、基準試料におけるメチル化状態である。本方法のほかの具体化は、前もって決まったメチル化状態は後に基づくかもしくは、標準的な分布曲線により確定される。本方法のほかの具体化において、前もって決まるメチル化は、はっきりした状態か状態の範囲である。上記の前もって決まるメチル化は、本分野のそれら技術にとって明白に容認できる制限の中で、熟練してさらに望まれる特異性など、本方法の具体化における一部分に基づき選択される。
【０２０９】
診断方法と関係する以上に、好まれる患者は脊椎動物の患者である。好まれる脊椎動物は定温であり；好まれる定温の脊椎動物は哺乳類である。好まれる哺乳類は、ほとんどヒトである。本発明で使用している、“患者”はヒトと動物患者両方を含んでいる。したがって、獣医学上の治療法は本発明で示している。そのような現技術は、ヒトのような哺乳類の診断のためだけでなく、絶滅の危機にある貴重な哺乳類、例えばシベリアンタイガーのためにあり；経済的重要性のある、ヒトによる消費のための農場にいるような動物；ともしくは、ペットや動物園で飼育されている動物のように、ヒトにとって社会的な重要性のある動物のためである。そのような動物の例は、これに限るものではないが；ネコやイヌのような肉食性の哺乳類；家畜のブタ、子ブタ、食肉用の雄ブタ、さらに野生の雄ブタを含む；家畜のウシ、雄牛、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、ラクダ、さらにウマのような反芻動物とまたは有蹄動物である。したがって、家畜の上記診断や治療もまた示しており、しかし、これに限るものではなく、家畜化したブタ、反芻動物、有蹄動物、ウマ（競走馬も含む）、さらにこれに匹敵する動物である。ただちに示された患者の状態は、患者における胃のがん（例えば、胃がん）の診断のためのシステムをさらに含んでいる。上記システムは、例えば、生物学的試料を採集された患者における、胃のがんのリスクや胃のがんの診断を選別するために使用されてきた大量生産のキットとして規定している。実例のシステムは、表１、２、４、または７に基づくメチル化状態のＤＭＲを測定する本技術と一致している。
【実施例】
【０２１０】
（実施例１−胃がんの検出用マーカーの同定）
本技術のための実施形態を開発する過程において実施された実験は、胃がんのための１２３のＤＮＡメチル化マーカー（２４８のＤＭＲ（例えば、ＤＭＲ番号１〜２４８；表１）に対応する）を同定した。そのようなＤＮＡメチル化マーカを、患者−コントロールの組織試料セットの、平行した大規模の配列決定をともなった、ＣｐＧアイランドのエンリッチメントによって生成されたデータから同定した。コントロールは、正常な胃部組織、正常な結腸上皮および正常な白血球から得られたＤＮＡを含んでいた。方法は、低発現量バイスルファイトシークエンシング（reduced representation bisulfite sequencing）（ＲＲＢＳ）を利用した。第３のステップは、カバレッジカットオフについてのデータを解析すること、有益でない部位をすべて排除すること、ロジスティック回帰を用いた診断サブグループ間におけるメチル化％を対比すること、近接するメチル化部位の明確なグループ化に基づいて、ＣｐＧ「アイランド」をコンピュータによって作り出すこと、および受信者動作特性分析を含んでいた。第４のステップは、メチル化％データ（個々のＣｐＧおよびコンピュータ内のクラスタの両方）をフィルタにかけて、シグナルノイズ比を最大化し、バックグラウンドのメチル化を最小化し、腫瘍の異質性を明らかにし、かつＲＯＣ性能を重視した。さらに、この分析法は、下流のマーカーアッセイ（メチル化特異的ＰＣＲ、小断片ディープシークエンシングの容易かつ最適な設計ための、確定したＤＮＡ長の全体にわたるＣｐＧホットスポットの同定を確実にした。
【０２１１】
各試料は、約２〜３００万の良質なＣｐＧを生じ、分析およびフィルタリングの後に、高度に識別される１０００未満の個々の部位になった。これらは、特異なメチル化の、１２３の局在領域（一部は３０〜４０ベース、他の一部はキロベースに広がっていた）に集中していた（表１を参照）。すべてのＤＭＲは、０．８以上のＡＵＣを有していた（一部は、コントロールから、患者の完全な識別（１．０のＡＵＣ）を示した）。０．８のＡＵＣ閾値に加えて、同定された胃がんマーカーは、正常な胃粘膜または結腸粘膜の２０倍を超えるメチル化密集度を、腫瘍において示す必要があり、非新生物の胃粘膜または結腸において＜１．０％のメチル化を示す必要があった。
【０２１２】
【表１】
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【０２１３】
【表２】
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【０２１４】
【表３】
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【０２１５】
【表４】
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【０２１６】
【表５】
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【０２１７】
【表６】
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【０２１８】
開示されている１２３のマーカーから、２２が、ＡＵＣおよび倍数変化率（がん  対  正常な胃＋正常な結腸）に基づいて選択され、他のＧＩがん部位（結腸、すい臓、胆管、食道）からの７３の探査マーカーとともに、より大きな組織の検証試験に組み入れられた。これらの異なるコホートにおける試料は、がん、正常の両方、および該当する場合にアデノーマにおいて、１５〜５０サンプルの間であった。検証プラットフォームは、メチル化コントロールの集団によって最適化されているプライマーを用いた、定量的なメチル化特異的ＰＣＲであった。すべてのアッセイを、Roche 480 LightCyclersによって実施した。結果を、ＲＯＣ特性、倍数変化および相補性について分析した。感度によって評価された（がんおよびアデノーマについて）、上位の３０を、表２に示した。表３は、表２に示されているマーカーに対するプライマー情報を示している。これらのうち、１０が、Mayo Koreanとの共同試験におけるさらなる組織検証（実施例２を参照）のために、選択された。
【０２１９】
【表７】
2018526029.tif 000008
【０２２０】
【表８】
2018526029.tif 000009
【０２２１】
【表９】
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【０２２２】
（実施例２−新規なメチル化されるＤＮＡマーカーによる胃がん検出：米国および韓国からの患者コホートにおける組織検証）
本技術のための実施形態を開発する過程において実施された実験は、全体のメチロームシークエンシングによって、新規のメチル化されたＤＮＡを同定し、それから、米国および韓国における患者コホートからの組織において最適な候補物を検証した（表４、５および６を参照）。
【０２２３】
低発現量バイスルファイトシークエンシング（reduced representation bisulfite sequencing）を用いた全体のメチロームを見出す試みの後に、１７のメチル化されるＤＮＡマーカー候補物を、米国および韓国における患者からの胃部組織集合における盲検のために、選択した。顕微解剖された組織からのＤＮＡを、メチル化特異的なポリメラーゼ連鎖反応によって定量し、マーカーレベルを、ベータアクチン（総計のヒトＤＮＡ）によって標準化した。ＧＣ症例は、未処置のアデノカルチノーマと病理学的に確認された、３５人（米国）および５０人（韓国）の患者によって構成されていた。コントロールは、症例と人口統計学的に対応した６５人（米国）および５０人（韓国）の壮健な患者からの、原発性ＧＣから離れた部位において得られた、病理学的に正常な上皮を含んでいた。各マーカーについて、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を、名義ロジスティック回帰から計算した。
【０２２４】
全体として、上位１０のマーカーは、ＡＲＨＧＥＦ４、ＥＬＭＯ１、ＡＢＣＢ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＳＦＭＢＴ２、ＣＤ１Ｄ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＺＮＦ５６９およびＣ１３ＯＲＦ１８を含んでいた（表４を参照）。９５％の特異性において、これらのマーカーのパネルは、米国コホートの１００％および韓国コホートの９４％においてＧＣを検出した。個々のＡＵＣはそれぞれ、米国コホートにおいて０．９２、０．９１、０．８９、０．８８、０．８５、０．８２、０．８２、０．８１、０．７５および０．６６であり、韓国コホートにおいて０．７３、０．９０、０．７８、０．７５、０．８０、０．９４、０．８７、０．７９、０．７５および０．７９であった（表６を参照）。ＥＬＭＯ１のような一部のマーカーは、各患者コホートにおいて同様に高い識別能を示し、ＡＲＨＧＥＦ４のような他のマーカーは、患者コホート全体に通じる、正常コントロール（ＮＬ）による高いバクグラウンドのために、より変動の大きい識別能を示した（図１を参照）。補油５は、補油４に示されている１０のマーカーについてのフォワードプライマーおよびリバースプライマーの情報を示している。
【０２２５】
【表１０】
2018526029.tif 000011
【０２２６】
【表１１】
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【０２２７】
【表１２】
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【０２２８】
（実施例３−血漿における新規なメチル化されるＤＮＡマーカーの評価による胃がんの検出）
この実施例は、胃のアデノカルチノーマ（ＧＣ）検出に対するアプローチとして血漿に基づいて評価するための、実施例ＩおよびＩＩからの選択されたメチル化されるＤＮＡマーカー（ＭＤＭ）候補物の使用を調査した。実際に、この実施例は、血漿において評価された新規なＭＤＭのパネルが、コントロールからＧＣ症例を正確に識別することを、証明している。マーカーレベルは、コントロールにおいて無視でき、症例において上昇し、かつＧＣステージにしたがって徐々に増加することが、示された。
【０２２９】
単一の総合施設から症例組み入れ基準に適合していた、保管所の血漿試料を、試験に含めた。症例は、すべてのステージ、組織学的な型および胃の部位に及ぶ、病理学的に確認されたアデノカルチノーマを有している３７人の患者を含んでいた。症例の血漿試料は、切除、化学療法または放射線の前に回収されている。コントロールとして、年齢および性別の一致する健常な３８人のボランティアからの、保管所の血漿試料を、選択した。ＤＮＡを、２ｍｌの血漿およびバイスルファイト処理から抽出した。それから、選択されたＭＤＭ（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ｏｒｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡ１）（表７はＬＲＣＣ４についてのＤＭＲ情報を示している）を、最適化なしの、定量的アレル特異的リアルタイムターゲットシグナル増幅法（quantitative allele-specific real-time target and signalamplification method）を用いて定量した。これらのマーカーは、臨床上の感度および特異性、胃がん  対  正常胃部組織を比較したときのメチル化シグナルの倍数変化、ならびに血球由来のＤＮＡにおける非常に低いバックグラウンドのメチル化によって評価される、組織における高い性能を証明している。
【０２３０】
血漿における最高の分析能を容易にするために、これらのマーカー（メチル化特異的なＰＣＲアッセイを用いて組織においてあらかじめ調べた）を、QuARTs（quantitative allele-specificreal-time target and signal amplification）アッセイと複合させながら、元のＤＭＲ配列を用いて再設計した。QuARTsアッセイは、ＰＣＲプライマー（表８を参照）、検出プローブ（表８を参照）、および侵入型のオリゴ（Integrated DNA Technologies）、GoTaq DNA ポリメラーゼ（Promega）、Cleavase II（Hologic）、ならびにFAM、HEXおよびQuasar 670色素を含んでいる蛍光共鳴エネルギー移動レポータカセット（FRET）（Biosearch Technologies）を含んでいる。
【０２３１】
図２は、QuARTs（quantitative allele-specificreal-time target and signal amplification）アッセイによる、メチル化されているＤＮＡの特徴の検出に使用されるFRETカセットのためのオリゴヌクレオチド配列を示している。各FRET配列は、３つの別のアッセイにおいて、ともに多重化され得るフルオロフォアおよびクエンチャーを含んでいる。
【０２３２】
基準を、プラスミドコントロールから増やし、切断した配列から導き出した。段階希釈した基準の絶対コピー数を、ポアソンモデリングから得た。
【０２３３】
ＤＮＡを、２ｍＬの保管所の血漿試料から精製し、内部で保有している方法および自動化された計測器を用いてバイスルファイト変換した。処理コントロール遺伝子を、試験期間における標的回収の可変性について補正するために、すべてのサンプルに対して、前もって加えた。
【０２３４】
試料を、１２のプライマーセットを用いて前増幅し、希釈し、QuARTsに供した。後段のためのプラットフォームは、LightCycler 480（Roche）であった。それぞれのマーカーのストランドカウントを、多重反応において含められているβアクチンからのストランドに対して標準化した。
【０２３５】
結果を、相補性を評価するために、ロジスティックに解析し、マトリクス形式においてプロットした。
【０２３６】
図３は、個々のマーカー曲線と比較して、３つのマーカーパネル（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９およびｃ１３ｏｒｆ１８）の、血漿における性能を強調表示している受信者動作特性曲線を示す。１００％特異性において、パネルは、８６％の感度において胃がんを検出した。
【０２３７】
図４Ａは、正常な粘膜からステージ４の胃がんまでの進行を説明している、血漿におけるメチル化されているＥＬＭＯ１の、ステージにしたがったログスケールの絶対ストランドカウントを示す。定量的なマーカーレベルは、ＧＣステージとともに増加した。
【０２３８】
図４Ｂは、３つのマーカーパネル（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９およびｃ１３ｏｒｆ１８）のステージにしたがった、血漿における胃がんの感度を証明している棒グラフ（１００％特異性）を示す。
【０２３９】
実際に、ＥＬＭＯ１は、最も識別するマーカーであり、単独で９４％のＡＵＣ（９５％  ＣＩ  ８９〜９９％）を有していた。１００％特異性において、３つのＭＤＭ（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９およびＣ１３ｏｒｆ１８）のパネルは、８６％（７１〜９５％）の感度においてＧＣを検出した。ＧＣステージにしたがって（図４Ａ）、１００％特異性におけるパネルによる感度は、ステージ１（ｎ＝８）、２（ｎ＝１３）、３（ｎ＝４）、および４（ｎ＝１１）についてそれぞれ、５０％、９２％、１００％および１００％であった（トレンドについてｐ＝０．０１）。定量的なＭＤＭレベルは、ＧＣステージにしたがって直接的に増大した。メチル化されているＥＬＯＭＯ１の分布によって示されているように（図４Ｂ）、血漿ストランドの中央値／コントロールにおける血漿のｍｌは、０．４であり、ＣＧ症例のステージ１、２、３および４におけるストランドカウントはそれぞれ、１６、１１１、１０１および２１３であった（トレンドについてｐ＝０．０１）。年齢も性別もマーカーレベルに影響しなかった。
【０２４０】
図５Ａ、ＢおよびＣは、１２の胃がんマーカー（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ｏｒｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡ１；ＥＬＭＯ１は２回、実施され、２回目はバイプレックス形式（biplex format））の性能を示す。７４の血漿試料における、９０％特異性（Ａ）、９５％特異性（Ｂ）および１００％特異性（Ｃ）、マトリクス形式。マーカーを、縦に並べ、試料を横に並べた。試料を、左側に正常、右側にがんを整列させた。陽性ヒットは、明るい灰色であり、ミスは濃いグレーである。ここで、最上の性能のマーカー（ＥＬＭＯ１）は、９０％特異性において最初に記載されており、残りのパネルは１００％特異性である。このプロットは、マーカーが組み合わせの様式において評価されることを可能にする。
【０２４１】
図６は、７４の血漿試料における３つの胃がんマーカー（最初のパネル）の、１００％特異性の、性能を示している。マーカーを縦に並べ、試料を横に並べている。がんを、ステージにしたがって整列している。陽性ヒットは、明るい灰色であり、ミスは濃いグレーである（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９およびｃ１３ｏｒｆ１８）。
【０２４２】
図７Ａ〜Ｍは、血漿における１２の胃がんマーカー（ＥＬＭＯ１、ＺＮＦ５６９、Ｃ１３ｏｒｆ１８、ＣＤ１Ｄ、ＡＲＨＧＥＦ４、ＳＦＭＢＴ２、ＰＰＰ２５ＲＣ、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＰＫＩＡ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＬＲＲＣ４およびＳＴ８ＳＩＡ１；ＥＬＭＯ１は２回、実施され、２回目はバイプレックス形式）のボックスプロット（線形のスケール）を示す。コントロール試料（Ｎ＝３８）を左に、胃がん症例（Ｎ＝３６）を右に記載している。縦軸は、βアクチンストランドに対して標準化されたメチル化の％である。
【０２４３】
【表１３】
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【０２４４】
【表１４】
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【０２４５】
【表１５】
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【０２４６】
以上の明細書に述べられている公開物および特許は、すべての目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。説明されている組成物、方法およびその技術の使用の、種々の変更および変形は、説明されているような技術の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかである。この技術は例示的な特定の実施形態に関連して説明されているが、請求されているような発明が、このような特定の実施形態まで不当に限定されるべきではないことが理解される。実際に、薬理学、生化学、医学または関連する分野の当業者にとって自明な、本発明を実施するための説明されている形態の種々の変更が、以下の特許請求の範囲内にあると意図されている。
【図１】
2018526029.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図７Ｋ】
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【図７Ｌ】
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【図７Ｍ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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