(57)【要約】  ヒトＣＤ３３に特異的に結合する結合タンパク質、とりわけ、ヒトＣＤ３３とヒトＣＤ３に特異的に結合する二重特異性結合タンパク質が本明細書で提供される。さらに、ＣＤ３３とＣＤ３に結合する二重特異性タンデム二重特異性抗体と、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などのＣＤ３３＋癌、疾患、および疾病の免疫療法のためのその使用が本明細書に記載される。【選択図】図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞移植を受けた患者における急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の処置のための方法であって、
該方法は、
ヒトＣＤ３３とヒトＣＤ３に結合する治療上有効な量のタンパク質を投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
移植は同種異型である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
移植は自家性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
患者は移植前処置を受けない、請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
患者へ移植前処置を施す工程をさらに含む、請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
移植前処置は骨髄破壊性である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
移植前処置は非骨髄破壊性である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
タンパク質は移植前処置の後に投与される、請求項５−７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
患者は完全寛解している、請求項１−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
患者は微小残存病変を有する、請求項１−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
患者は化学療法または放射線療法に失敗したことがある、請求項１−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
患者は誘導型化学療法に失敗したことがある、請求項１−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
患者は、強化または維持（寛解後）の化学療法に失敗したことがある、請求項１−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ＡＭＬは再発性である、請求項１−１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ＡＭＬは難治性である、請求項１−１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ＡＭＬはリスクが高く、寛解期にある、請求項１−１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
タンパク質は造血幹細胞移植直後に投与される、請求項１−１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
タンパク質は造血幹細胞移植の３日後に投与される、請求項１−１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
タンパク質は造血幹細胞移植の７日後に投与される、請求項１−１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
タンパク質は造血幹細胞移植の２週間後に投与される、請求項１−１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
タンパク質は造血幹細胞移植の４週間後に投与される、請求項１−１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
タンパク質は４週、８週、３か月、４か月、６か月、８か月、１０か月、１２か月、１８か月、および２４か月からなる群から選択された期間、投与される、請求項１−２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
タンパク質は、ドナーリンパ球とともに、同種異型設定において進行時に投与される、請求項１−２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
タンパク質は、ドナーリンパ球を用いずに、同種異型設定において進行時に投与される、請求項１−２のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
タンパク質はヒトＣＤ３３とヒトＣＤ３に特異的な重鎖と軽鎖のドメインを含む、請求項１−２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
タンパク質は抗体または抗体の誘導体である、請求項１−２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
タンパク質はＦａｂ、Ｆａｂ’、あるいはＦ（ａｂ’）２のフラグメントを含む、請求項１−２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
タンパク質は、単鎖Ｆｖ、タンデム単鎖Ｆｖ、二重特異性のＴ細胞エンゲージャー、二重親和性再標的化抗体、二重特異性抗体、あるいは二重特異性のタンデム二重特異性抗体である、請求項１−２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
タンパク質は二重特異性のタンデム二重特異性抗体である、請求項１−２５のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
タンデム二重特異性抗体は、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを含み、各ポリペプチドは次々に結合した少なくとも４つの可変鎖ドメインを有し、ここで、各ポリペプチドは、
（ｉ）ヒトＣＤ３３に特異的な可変重鎖（ＶＨ）ドメイン；
（ｉｉ）ヒトＣＤ３３に特異的な可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン；
（ｉｉｉ）ヒトＣＤ３に特異的なＶＨドメイン、および、
（ｉｖ）ヒトＣＤ３に特異的なＶＬドメイン、
を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
各ポリペプチドでは、４つの可変鎖ドメインは：
ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３３）−Ｌ３−ＶＨ（ＣＤ３）；
ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３３）−Ｌ３−ＶＬ（ＣＤ３）；
ＶＬ（ＣＤ３３）−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ３−ＶＨ（ＣＤ３３）；あるいは、
ＶＨ（ＣＤ３３）−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ３−ＶＬ（ＣＤ３３）
の順序でペプチドリンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３によって次々に結合される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ヒトＣＤ３３に特異的なＶＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１−２７からなる群から選択された配列からなるＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８−３４からなる群から選択された配列からなるＣＤＲ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５−４１からなる群の配列からなるＣＤＲ３を含む、請求項２９−３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
ヒトＣＤ３３に特異的なＶＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２−４８からなる群から選択された配列からなるＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９−５５からなる群から選択された配列からなるＣＤＲ２、および、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６−６３からなる群から選択された配列からなるＣＤＲ３を含む、請求項２９−３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
ヒトＣＤ３３に特異的なＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、２８および３５；
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、２９および３６；
（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、３０および３７；
（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、３１および３８；
（ｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、３２および３９；
（ｖｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、３３および４０；ならびに、
（ｖｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、３４および４１
からなる群から選択された配列である、請求項３１−３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
ＣＤ３３に特異的なＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４９および５６；
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、５０および５７；
（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、５０および５８；
（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、５０および５９；
（ｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、５０および６０；
（ｖｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４、５１および６１；
（ｖｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５、５２および６２；
（ｖｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、５３および６３；
（ｉｘ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７、５４、および６３；ならびに、
（ｘ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、５５および６３
からなる群から選択された配列である、請求項２９−３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
ＣＤ３３に特異的なＶＬおよびＶＨのドメインは、
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１；
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２；
（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３；
（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４；
（ｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５；
（ｖｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６；
（ｖｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７；
（ｖｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８；
（ｉｘ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９；および、
（ｘ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０
からなる群から選択された配列である、請求項２９−３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
ヒトＣＤ３に特異的なＶＨドメインは、ＳＴＹＡＭＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）のＣＤＲ１配列、ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）のＣＤＲ２配列、およびＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）あるいはＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＹＦＡＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）のＣＤＲ３配列を含む、請求項２９−３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
ヒトＣＤ３に特異的なＶＬドメインは、ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０）のＣＤＲ１配列、ＧＴＮＫＲＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）のＣＤＲ２配列、およびＡＬＷＹＳＮＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２）のＣＤＲ３配列を含む、請求項２９−３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
ＣＤ３に特異的なＶＬおよびＶＨのドメインは、
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８；
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９；
（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０；および、
（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１
からなる群から選択された配列である、請求項２７−３６のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
各ポリペプチドは、
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、１２、６５および６９；
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、１３、６５および６９；
（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、１４、６５および６９；
（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１５、６５および６９；
（ｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、１１、６４および６８；
（ｖｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、１２、６４および６８；
（ｖｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、１２、６６および７０；
（ｖｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、１４、６６および７０；
（ｉｘ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１５、６６および７０；
（ｘ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、１３、６４および６８；
（ｘｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、１３、６７および７１；
（ｘｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、１４、６４および６８；
（ｘｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１５、６４および６８；
（ｘｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、１７、６４および６８；
（ｘｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、１６、６４および６８；
（ｘｖｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、１６、６７および７１；
（ｘｖｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、１８、６４および６８；
（ｘｖｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１９、６４および６８；
（ｘｉｘ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１９、６７および７１；ならびに、
（ｘｘ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、２０、６４および６８
からなる群から選択された４つの可変鎖ドメインを含む、請求項２９−３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
リンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３は約１２以下のアミノ酸残基からなる、請求項２９−４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
リンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３はそれぞれ、ＧＧＳＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５）、ＧＧＳＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６）、あるいはＧＧＳＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）から独立して選択される、請求項２９−４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
タンデム二重特異性抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８−１２１からなる群から選択された配列を含む、請求項２９−４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）、０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９）、０３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００）、０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１）、０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２）、０６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）、０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４）、０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５）、０９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６）、１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７）、１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８）、１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９）、１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０）、１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１）、１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２）、１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３）、１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）、１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５）、１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６）、２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７）、２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）、２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９）、２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）、あるいは２４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１）である、請求項２９−４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
タンデム二重特異性抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３−１４６からなる群から選択された配列を含む、請求項２９−４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３）、０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４）、０３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５）、０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６）、０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７）、０６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８）、０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９）、０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０）、０９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１）、１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２）、１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３）、１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４）、１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５）、１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６）、１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７）、１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８）、１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９）、１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０）、１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１）、２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２）、２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３）、２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４４）、２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）あるいは２４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）である、請求項２９−４２および４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
該方法は、シタラビン、アザシチジン、デシタビン、アントラサイクリン、フルダラビン、クロファラビン、クラドリビン、ネララビン、メトトレキサート、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、メルファラン、イブルチニブ、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、アプレミラスト、エピポドフィロトキシン、アントラセンジオン、抗ＣＤ２０薬剤、あるいはこれらの組み合わせを投与する工程をさらに含む、請求項１−４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
ＡＭＬは、再発性遺伝的異常を備えたＡＭＬ、骨髄形成異常関連の変化を備えたＡＭＬ、治療関連の骨髄性の新生物、骨髄性肉腫、ダウン症候群と関連する骨髄増殖、芽細胞の形質細胞様樹状細胞新生物、あるいはさもなければ分類されないＡＭＬである、請求項１−４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
ＡＭＬは、ＡＭＬ−Ｍ０、ＡＭＬ−Ｍ１、ＡＭＬ−Ｍ２、ＡＭＬ−Ｍ３、ＡＭＬ−Ｍ４、ＡＭＬ−Ｍ５、ＡＭＬ−Ｍ６、あるいはＡＭＬ−Ｍ７である、請求項１−４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
骨髄破壊性の移植前処置を受けた後に、同種異型の造血幹細胞移植を受けた患者において、タンパク質を投与する工程は、タンパク質による治療に対する全体的な反応率の改善をもたらす、請求項１−４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
非骨髄破壊性の移植前処置を受けた後に、同種異型の造血幹細胞移植を受けた患者において、タンパク質を投与する工程は、タンパク質による治療に対する全体的な反応率の改善をもたらす、請求項１−４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
ヒトＣＤ３３およびヒトＣＤ３に特異的な二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体であって、二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３−１４６から選択された配列を含む、二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項５３】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体は、タンデム二重特異性抗体０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３）、０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４）、０３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５）、０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６）、０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７）、０６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８）、０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９）、０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０）、０９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１）、１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２）、１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３）、１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４）、１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５）、１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６）、１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７）、１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８）、１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９）、１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０）、１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１）、２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２）、２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３）、２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４４）、２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）あるいは２４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）である、請求項５２に記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項５４】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体は、ＨＬ−６０、ＫＧ−１およびＵ−９３７から選択されたＣＤ３３＋腫瘍細胞上のＣＤ３３との５０ｎＭ以下の結合ＫＤを有する、請求項５３に記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項５５】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体は、ＣＤ３３＋ＨＬ−６０腫瘍細胞上のＣＤ３３に１５ｎＭ以下の結合ＫＤを有する、請求項５４に記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項５６】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体は、ヒトＣＤ３３の６２ＤＱＥＶＱＥＥＴＱ７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３のアミノ酸残基６２−７０）内にあるヒトＣＤ３３のエピトープに特異的に結合する、請求項５５に記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項５７】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３）である、請求項５２−５６のいずれかに記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項５８】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４）である、請求項５２−５６のいずれかに記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項５９】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体０３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５）である、請求項５２−５６のいずれかに記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項６０】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６）である、請求項５２−５６のいずれかに記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項６１】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７）である、請求項５２−５６のいずれかに記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項６２】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体０６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８）である、請求項５２−５６のいずれかに記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項６３】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９）である、請求項５２−５６のいずれかに記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項６４】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０）である、請求項５２−５６のいずれかに記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項６５】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体０９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１）である、請求項５２−５６のいずれかに記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項６６】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２）である、請求項５２−５６のいずれかに記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項６７】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３）である、請求項５２−５６のいずれかに記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項６８】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４）である、請求項５２−５６のいずれかに記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項６９】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５）である、請求項５２−５６のいずれかに記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項７０】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６）である、請求項５２−５６のいずれかに記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項７１】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７）である、請求項５２−５６のいずれかに記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項７２】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８）である、請求項５２−５６のいずれかに記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項７３】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９）である、請求項５２−５６のいずれかに記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項７４】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０）である、請求項５２−５６のいずれかに記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項７５】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１）である、請求項５２−５６のいずれかに記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項７６】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２）である、請求項５２−５６のいずれかに記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項７７】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３）である、請求項５２−５６のいずれかに記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項７８】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４４）である、請求項５２−５６のいずれかに記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項７９】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）である、請求項５２−５６のいずれかに記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【請求項８０】
二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体２４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）である、請求項５２−５６のいずれかに記載の二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（相互参照）
本出願は、２０１５年５月２９日に出願された米国仮特許出願６２／１６８，６４１号と、２０１５年１２月１１日に出願された米国仮特許出願６２／２６６，４３８号の利益を主張し、両文献は参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含んでいる。２０１６年５月２５日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、４５３７５＿７０５＿６０１＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔと命名され、２５０，１７３バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は大人と子どもの急性白血病である。ＣＤ３３はＡＭＬの骨髄芽球のほとんどで発現される。ＣＤ３３は一般に、報告書によっては、初期の多系列の骨髄系前駆細胞に限定され、正常な造血多能性幹細胞には存在しない。
【発明の概要】
【０００４】
ヒトＣＤ３３と特異的に結合する結合タンパク質、およびヒトＣＤ３３とヒトＣＤ３に特異的に結合する二重特異性の結合タンパク質が本明細書で提供される。さらに、例えばタンデム二重特異性抗体などの多くの二重特異性のＣＤ３３／ＣＤ３結合タンパク質を生成するための抗ＣＤ３３可変ドメインと抗ＣＤ３可変ドメインが本明細書で提供される。さらに、ＣＤ３３とＣＤ３に結合する二重特異性タンデム二重特異性抗体と、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）と他の血液系悪性腫瘍、障害あるいは疾病の免疫療法ためのその使用が本明細書で提供される。
【０００５】
特に、カニクイザルとヒトの両方のＣＤ３３との結合を呈する結合タンパク質が提供される。これらのＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体が、低いＥ：Ｔ細胞比率でＣＤ３３＋ＡＭＬ細胞を効率的に溶解するように、健康なドナーからのポリクローナルＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＡＭＬ患者からの自己由来のＴ細胞と同様に再指向することができることが実施例で実証されている。ＣＤ３３＋標的細胞とＴ細胞の両方の存在に依存するこのプロセスでは、再指向されたＴ細胞は、ＣＤ２５とＣＤ６９の誘発によって示されるように活性化され、刺激されて増殖する。これらのタンデム二重特異性抗体の抗ＡＭＬ効果は、Ｅ：Ｔ細胞比率と同様に、使用された抗体の濃度に依存することが示されている。タンデム二重特異性抗体は四価であり、ＣＤ３３のための２つの結合部位とＣＤ３のための２つの結合部位を有する。本明細書に記載されるＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体の特別な特徴は、それらが、各抗原（すなわちＣＤ３３とＣＤ３）への結合力を与える二価結合の結果として、有力かつ効率的なアポプトーシスを促進するということである。
【０００６】
まとめると、本明細書に記載される提供されたＣＤ３３／ＣＤ３結合タンパク質、とりわけ、特定のタンデム二重特異性抗体は、インビトロでＣＤ３３＋白血病細胞と原発性ＡＭＬ細胞の有力な細胞崩壊を引き起こす。タンデム二重特異性抗体の抗体フォーマットの二重特異性のＣＤ３３／ＣＤ３結合タンパク質の例は、細胞株、原発性ＡＭＬ細胞、およびＡＭＬ細胞株と患者由来の原発性ＡＭＬ細胞を有するインビボモデルにおいて、インビボで細胞崩壊の活性を実証する。これはストリンジェントなＡＭＬ  ＰＤＸモデルにおいて特に注目に値する高いインビボ活性を示す。さらに、タンデム二重特異性抗体の抗体フォーマットの二重特異性のＣＤ３３／ＣＤ３結合タンパク質の例は、新しく診断された、再発した、および難治性の患者を含む、ＡＭＬのすべての段階で患者からのサンプル中で細胞崩壊の活性をエクスビボで実証する。
【０００７】
さらに、本明細書に記載されるこれらのＣＤ３３／ＣＤ３結合タンパク質は、約４時間以内にＣＤ３３発現細胞の有意な溶解を達成することができる。ＣＤ３３／ＣＤ３結合タンパク質は、これに応じて低いエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比率での高い細胞毒性と同様に、細胞表面上の低いＣＤ３３密度でも高い細胞毒性を示す。加えて、本明細書に記載されるＣＤ３３／ＣＤ３結合タンパク質は、ヒトタンパク質への有力なＣＤ３３とＣＤ３の結合親和性を呈するだけではなく、例えば、５−０．２の間のヒト：カニクイザルのＫＤ比率で、それぞれのカニクイザル・タンパク質との優れた交叉感受性を示す。さらに、本明細書に記載されたＣＤ３３／ＣＤ３結合タンパク質は、ＣＤ３３＋標的細胞がない状態で、これらの分子の安全性プロファイルの本質的な要素であるサイトカイン放出の有意な誘発を示さない。さらに、本明細書に記載されるＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体は、８−２４時間の近似範囲の半減期を有する分子のクラスに属し、このことは都合のよい投薬を可能にするはずである。
【０００８】
１つの態様において、ヒトＣＤ３３のエピトープに特異的に結合するＣＤ３３結合タンパク質が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、結合タンパク質は重鎖可変ドメインと、ヒトに由来する軽鎖可変ドメインを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３３結合タンパク質は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインを含む少なくとも１つの結合部位を有し、ここで、軽鎖可変ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１−２７からなる群から選択された配列からなるＣＤＲ１と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８−３４かなる群から選択された配列からなるＣＤＲ２と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５−４１からなる群の配列からなるＣＤＲ３を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３３結合タンパク質は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインを含む少なくとも１つの結合部位を有し、ここで、重鎖可変ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２−４８からなる群から選択された配列からなるＣＤＲ１と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９−５５かなる群から選択された配列からなるＣＤＲ２と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６−６３からなる群の配列から選択されたＣＤＲ３を含む。
【００１１】
ある例では、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、２８および３５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、２９および３６；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、３０および３７；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、３１および３８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、３２および３９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、３３および４０；ならびに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、３４および４１からなる群から選択される。
【００１２】
ある例では、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４９および５６；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、５０および５７；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、５０および５８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、５０および５９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、５０および６０；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４、５１および６１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５、５２および６２；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、５３および６３；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７、５４と６３；ならびに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、５５および６３からなる群から選択される。
【００１３】
ある例では、可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインのヒトＣＤ３３結合部位は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９；および、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０からなる群から選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３３エピトープは、ヒトＣＤ３３のうちのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３の６２ＤＱＥＶＱＥＥＴＱ７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４）アミノ酸残基６２−７０内にある。
【００１５】
上記の実施形態のいずれかにおいて、ＣＤ３３結合タンパク質は少なくとも１つのさらなる機能ドメインを含む。いくつかの例では、機能ドメインはエフェクター細胞へ結合するエフェクタードメインである。ある例では、エフェクタードメインは、ヒトＣＤ３の抗原結合部位を形成する、少なくとも１つの抗体可変重鎖ドメインと少なくとも１つの可変軽鎖ドメインを含むＣＤ３結合部位である。
【００１６】
ある例では、ＣＤ３結合部位は、ＳＴＹＡＭＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）のＣＤＲ１配列、ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）のＣＤＲ２配列、およびＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）のＣＤＲ３配列を含む、重鎖可変ドメインを含む。他の例では、ＣＤ３結合部位は、ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０）のＣＤＲ１配列、ＧＴＮＫＲＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）のＣＤＲ２配列、およびＡＬＷＹＳＮＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２）のＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
【００１７】
ある例では、ＣＤ３結合部位は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４の重鎖可変ドメインと、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８の可変軽鎖ドメイン；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５の重鎖可変ドメインとＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９の可変軽鎖ドメイン；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６の重鎖可変ドメインとＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０の可変軽鎖ドメイン；あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７の重鎖可変ドメインとＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１の可変軽鎖ドメインを含む。
【００１８】
上記の実施形態のうちのどの中でも、ＣＤ３３結合タンパク質は二量体のタンパク質である。上記の実施形態のいずれかにおいて、ＣＤ３３結合タンパク質は多機能である。
【００１９】
ある例では、多機能のＣＤ３３結合タンパク質はＣＤ３３とＣＤ３について二重特異性を有し、結合特異性は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、１２、６５および６９：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、１３、６５および６９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、１４、６５および６９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１５、６５および６９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、１１、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、１２、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、１２、６６および７０；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、１４、６６および７０；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１５、６６および７０；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、１３、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、１３、６７および７１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、１４、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１５、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、１７、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、１６、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、１６、６７および７１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、１８、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１９、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１９、６７および７１；ならびに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、２０、６４および６８からなる群から選択されたＣＤ３３とＣＤ３のための重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインによって提供される。
【００２０】
別の態様において、ヒトＣＤ３とヒトＣＤ３３に特異的な二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、タンデム二重特異性抗体は第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを含み、各ポリペプチドは次々に結合した少なくとも４つの可変鎖ドメインを有し、各ポリペプチドはヒトＣＤ３３に特異的な可変重鎖ドメイン；ヒトＣＤ３３に特異的な可変軽鎖ドメイン；ヒトＣＤ３に特異的な可変重鎖ドメイン、およびヒトＣＤ３に特異的な可変軽鎖ドメインを含み、各ポリペプチドでは、４つの可変鎖ドメインは、ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３３）−Ｌ３−ＶＨ（ＣＤ３）；ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３３）−Ｌ３−ＶＬ（ＣＤ３）；ＶＬ（ＣＤ３３）−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ３−ＶＨ（ＣＤ３３）；または、ＶＨ（ＣＤ３３）−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ３−ＶＬ（ＣＤ３３）の順に、ペプチドリンカーＬ１、Ｌ２、およびＬ３によって次々に結合される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ３３に特異的なＶＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１−２７からなる群から選択された配列からなるＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８−３４からなる群から選択された配列からなるＣＤＲ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５−４１からなる群の配列からなるＣＤＲ３を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ３３に特異的なＶＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２−４８からなる群から選択された配列からなるＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９−５５からなる群から選択された配列からなるＣＤＲ２、および、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６−６３からなる群から選択された配列からなるＣＤＲ３を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ３３に特異的なＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、２８および３５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、２９および３６；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、３０および３７；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、３１および３８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、３２および３９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、３３および４０；ならびに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、３４および４１からなる群から選択された配列である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ３３に特異的なＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４９および５６；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、５０および５７；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、５０および５８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、５０および５９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、５０および６０；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４、５１および６１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５、５２および６２；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、５３および６３；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７、５４と６３；ならびに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、５５および６３からなる群から選択された配列である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３３に特異的なＶＬとＶＨのドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９；および、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０からなる群から選択された配列である。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ３に特異的なＶＨドメインは、ＳＴＹＡＭＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）のＣＤＲ１配列、ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）のＣＤＲ２配列、およびＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）あるいはＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＹＦＡＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）のＣＤＲ３配列を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ３に特異的なＶＬドメインは、ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０）のＣＤＲ１配列、ＧＴＮＫＲＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）のＣＤＲ２配列、およびＡＬＷＹＳＮＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２）のＣＤＲ３配列を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３に特異的なＶＬとＶＨのドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０；および、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１からなる群から選択された配列である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、各ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、１２、６５および６９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、１３、６５および６９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、１４、６５および６９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１５、６５および６９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、１１、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、１２、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、１２、６６および７０；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、１４、６６および７０；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１５、６６および７０；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、１３、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、１３、６７および７１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、１４、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１５、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、１７、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、１６、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、１６、６７および７１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、１８、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１９、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１９、６７および７１；ならびに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、２０、６４および６８からなる群から選択された４つの可変鎖ドメインを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、リンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３は、約１２以下のアミノ酸残基からなる。ある例では、リンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３はそれぞれ独立して、ＧＧＳＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５）、ＧＧＳＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６）、あるいはＧＧＳＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）である。他の例では、リンカーＬ１とＬ３は、ＧＧＳＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５）であり、リンカーＬ２は、ＧＧＳＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６）あるいはＧＧＳＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）である。
【００３１】
いくつかの実施形態において、二重特異性タンデム二重特異性抗体は、Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグと一緒に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８−１２１からなる群から選択された配列を含む。他の実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体は、タンデム二重特異性抗体０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）、０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９）、０３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００）、０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１）、０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２）、０６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）、０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４）、０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５）、０９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６）、１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７）、１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８）、１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９）、１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０）、１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１）、１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２）、１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３）、１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）、１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５）、１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６）、２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７）、２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）、２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９）、２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）、あるいは２４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１）である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３−１４６からなる群から選択された配列を含む。他の実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体は、タンデム二重特異性抗体０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３）、０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４）、０３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５）、０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６）、０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７）、０６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８）、０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９）、０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０）、０９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１）、１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２）、１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３）、１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４）、１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５）、１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６）、１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７）、１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８）、１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９）、１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０）、１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１）、２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２）、２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３）、２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４４）、２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）あるいは２４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）である。いくつかの実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３）である。いくつかの実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４）である。いくつかの実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体０３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５）である。いくつかの実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６）である。いくつかの実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７）である。いくつかの実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体０６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８）である。いくつかの実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９）である。いくつかの実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０）である。いくつかの実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体０９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１）である。いくつかの実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２）である。いくつかの実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３）である。いくつかの実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４）である。いくつかの実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５）である。いくつかの実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６）である。いくつかの実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７）である。いくつかの実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８）である。いくつかの実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９）である。いくつかの実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０）である。いくつかの実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１）である。いくつかの実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２）である。いくつかの実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３）である。いくつかの実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４４）である。いくつかの実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）である。いくつかの実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体２４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）である。
【００３３】
いくつかの実施形態では、二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体は、ＨＬ−６０、ＫＧ−１およびＵ−９３７から選択されたＣＤ３３＋腫瘍細胞上のＣＤ３３との５０ｎＭ以下の結合ＫＤを有する。いくつかの実施形態では、二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体は、ＨＬ−６０、ＫＧ−１およびＵ−９３７から選択されたＣＤ３３＋腫瘍細胞上のＣＤ３３との１０ｎＭ以下の結合ＫＤを有する。いくつかの実施形態では、二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体は、ＣＤ３３＋ＨＬ−６０腫瘍細胞上のＣＤ３３との１５ｎＭ以下の結合ＫＤを有する。
【００３４】
いくつかの実施形態において、二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体は、ヒトＣＤ３３の６２ＤＱＥＶＱＥＥＴＱ７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３のアミノ酸残基６２−７０）内にあるヒトＣＤ３３のエピトープに特異的に結合する。
【００３５】
別の態様では、上記の実施形態のいずれかのＣＤ３３結合タンパク質あるいは二重特異性タンデム二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドが本明細書で提供される。別の態様では、記載されたポリヌクレオチドを含むベクターが本明細書で提供される。別の態様では、記載されたベクターで形質転換した宿主細胞が本明細書で提供される。
【００３６】
また別の態様では、上記の実施形態のいずれかのＣＤ３３結合タンパク質あるいは二重特異性タンデム二重特異性抗体と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物が本明細書で提供される。
【００３７】
また別の態様において、上記の実施形態のいずれかのＣＤ３３結合タンパク質あるいは二重特異性タンデム二重特異性抗体を産生する方法が本明細書で提供され、該方法は、上記の実施形態のいずれかのＣＤ３３結合タンパク質あるいは二重特異性タンデム二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド、あるいは記載されたポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞へ導入する工程と、ＣＤ３３結合タンパク質あるいは二重特異性タンデム二重特異性抗体が発現される条件下で宿主細胞を培養する工程と、発現されたＣＤ３３結合タンパク質あるいは二重特異性タンデム二重特異性抗体を精製する工程とを含む。
【００３８】
さらに、ＣＤ３３＋癌に苦しむ個体へ上記の実施形態のいずれかの二重特異性タンデム二重特異性抗体を投与する工程を含む、ＣＤ３３＋癌の処置のための方法も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３＋癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ前駆細胞リンパ芽球性白血病、骨髄性肉腫、多発性骨髄腫、急性のリンパ腫、急性のリンパ芽球性リンパ腫、あるいは慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３＋癌は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３＋癌は多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３＋癌は急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）である。
【００３９】
さらに、ＡＭＬに苦しむ個体へ上記の実施形態のいずれかの二重特異性タンデム二重特異性抗体を投与する工程を含む、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の処置のための方法も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＡＭＬは、再発性遺伝的異常を備えたＡＭＬ、骨髄形成異常関連の変化を備えたＡＭＬ、治療関連の骨髄性の新生物、骨髄性肉腫、ダウン症候群と関連する骨髄増殖、芽細胞の形質細胞様樹状細胞新生物、あるいは他の点では分類されないＡＭＬである。いくつかの実施形態では、ＡＭＬは、ＡＭＬ−Ｍ０、ＡＭＬ−Ｍ１、ＡＭＬ−Ｍ２、ＡＭＬ−Ｍ３、ＡＭＬ−Ｍ４、ＡＭＬ−Ｍ５、ＡＭＬ−Ｍ６、あるいはＡＭＬ−Ｍ７である。さらなる実施形態では、ＡＭＬは新しく診断されるか、再発するか、あるいは難治性である。
【００４０】
さらに、ＭＤＳに苦しむ個体へ上記の実施形態のいずれかの二重特異性タンデム二重特異性抗体を投与する工程を含む、骨髄性の形成異常症候群（ＭＤＳ）の処置のための方法も本明細書で提供される。
【００４１】
さらに、ＭＰＤに苦しむ個体へ上記の実施形態のいずれかの二重特異性タンデム二重特異性抗体を投与する工程を含む、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）の処置のための方法も本明細書で提供される。
【００４２】
さらに、ＣＭＭＬに苦しむ個体へ上記の実施形態のいずれかの二重特異性タンデム二重特異性抗体を投与する工程を含む、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）の処置のための方法も本明細書で提供される。
【００４３】
さらに、免疫抑制に苦しむ個体へ上記の実施形態のいずれかの二重特異性タンデム二重特異性抗体を投与する工程を含む、骨髄由来の抑制細胞（ＭＤＳＣ）による免疫抑制の処置のための方法も本明細書で提供される。
【００４４】
処置のための上記方法において、特定の実施例では、該方法はさらに、シタラビン、アザシチジン、デシタビン、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン、イダルビシン、ドキソルビシンなど）、アムサクリン、フルダラビン、クロファラビン、クラドリビン、ネララビン、メトトレキサート、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、メルファラン、イブルチニブ、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、アプレミラスト、エピポドフィロトキシン（例えばエトポシド、テニポシドなど）、アントラセンジオン（例えばミトキサントロン、ピクサントロン、ロソキサントロン、ピロキサントロン、アメタントロンなど）、抗ＣＤ２０薬剤（例えばリツキシマブ、オクレリズマブ、オファツムマブなど）あるいはそれらの組み合わせを投与する工程をさらに含む。
【００４５】
造血幹細胞移植を受けた患者における急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の処置のための方法が本明細書で提供され、該方法は、ヒトＣＤ３３とヒトＣＤ３に結合する治療上有効な量のタンパク質を投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、該方法が提供され、移植は同種異型である。いくつかの実施形態において、該方法が提供され、移植は自家性である。いくつかの実施形態において、該方法が提供され、患者は移植前処置を受けない。いくつかの実施形態において、該方法が提供され、該方法は、患者へ移植前処置を施す工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、該方法が提供され、移植前処置は骨髄破壊性である。いくつかの実施形態において、該方法が提供され、移植前処置は非骨髄破壊性である。
【００４６】
上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、タンパク質は移植前処置の後に投与される。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、患者は完全寛解している。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、患者は微小残存病変を有する。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、患者は化学療法または放射線に失敗したことがある。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、患者は誘導型化学療法に失敗したことがある。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、患者は、強化化学療法または維持（寛解後）化学療法に失敗したことがある。
【００４７】
上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、ＡＭＬは再発性である。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、ＡＭＬは難治性である。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、ＡＭＬはリスクが高く、寛解期にある。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、タンパク質は造血幹細胞移植直後に投与される。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、タンパク質は造血幹細胞移植の３日後に投与される。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、タンパク質は造血幹細胞移植の７日後に投与される。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、タンパク質は造血幹細胞移植の２週間後に投与される。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、タンパク質は造血幹細胞移植の４週間後に投与される。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、タンパク質は４週、８週、３か月、４か月、６か月、８か月、１０か月、１２か月、１８か月、および２４か月からなる群から選択された期間、投与される。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、タンパク質は、ドナーリンパ球と共に、同種異型設定において進行時に投与される。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、タンパク質は、ドナーリンパ球を用いずに同種異型設定において進行時に投与される。
【００４８】
上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、タンパク質はヒトＣＤ３３とヒトＣＤ３に特異的な重鎖と軽鎖のドメインを含む。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、タンパク質は抗体または抗体の誘導体である。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、タンパク質はＦａｂ、Ｆａｂ’、あるいはＦ（ａｂ’）２のフラグメントを含む。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、タンパク質は、単鎖Ｆｖ、タンデム単鎖Ｆｖ、二重特異性のＴ細胞エンゲージャー、二重親和性再標的化抗体、二重特異性抗体、あるいは二重特異性タンデム二重特異性抗体である。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、タンパク質は二重特異性タンデム二重特異性抗体である。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、タンデム二重特異性抗体は、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを含み、各ポリペプチドは次々に結合した少なくとも４つの可変鎖ドメインを有し、ここで、各ポリペプチドはヒトＣＤ３３に特異的な可変重鎖（ＶＨ）ドメイン；ヒトＣＤ３３に特異的な可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン；ヒトＣＤ３に特異的なＶＨドメイン、および、ヒトＣＤ３に特異的なＶＬドメインを含む。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、各ポリペプチドでは、４つの可変鎖ドメインは、：ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３３）−Ｌ３−ＶＨ（ＣＤ３）；ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３３）−Ｌ３−ＶＬ（ＣＤ３）；ＶＬ（ＣＤ３３）−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ３−ＶＨ（ＣＤ３３）；あるいは  ＶＨ（ＣＤ３３）−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ３−ＶＬ（ＣＤ３３）の順序でペプチドリンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３によって次々に結合される。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、ヒトＣＤ３３に特異的なＶＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１−２７からなる群から選択された配列からなるＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８−３４からなる群から選択された配列からなるＣＤＲ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５−４１からなる群の配列からなるＣＤＲ３を含む。
【００４９】
上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、ヒトＣＤ３３に特異的なＶＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２−４８からなる群から選択された配列からなるＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９−５５からなる群から選択された配列からなるＣＤＲ２、および、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６−６３からなる群から選択された配列からなるＣＤＲ３を含む。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、ヒトＣＤ３３に特異的なＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、２８および３５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、２９および３６；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、３０および３７；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、３１および３８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、３２および３９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、３３および４０；ならびに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、３４および４１からなる群から選択された配列である。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、ＣＤ３３に特異的なＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、４９および５６；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、５０および５７；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、５０および５８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、５０および５９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、５０および６０；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４、５１および６１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５、５２および６２；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、５３および６３；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７、５４、および６３；ならびに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、５５および６３からなる群から選択された配列である。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、ＣＤ３３に特異的なＶＬおよびＶＨのドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９；および、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０からなる群から選択された配列である。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、ヒトＣＤ３に特異的なＶＨドメインは、ＳＴＹＡＭＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）のＣＤＲ１配列、ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）のＣＤＲ２配列、およびＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）あるいはＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＹＦＡＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）のＣＤＲ３配列を含む。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、ヒトＣＤ３に特異的なＶＬドメインは、ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０）のＣＤＲ１配列、ＧＴＮＫＲＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）のＣＤＲ２配列、およびＡＬＷＹＳＮＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２）のＣＤＲ３配列を含む。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、ＣＤ３に特異的なＶＬおよびＶＨのドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０；および、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１からなる群から選択された配列である。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、各ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、１２、６５および６９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、１３、６５および６９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、１４、６５および６９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１５、６５および６９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、１１、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、１２、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、１２、６６および７０；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、１４、６６および７０；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１５、６６および７０；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、１３、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、１３、６７および７１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、１４、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１５、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、１７、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、１６、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、１６、６７および７１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、１８、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１９、６４および６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１９、６７および７１；ならびに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、２０、６４および６８からなる群から選択された４つの可変鎖ドメインを含む。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、リンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３は約１２以下のアミノ酸残基からなる。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、リンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３はそれぞれ、ＧＧＳＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５）、ＧＧＳＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６）、あるいはＧＧＳＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）から独立して選択される。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、タンデム二重特異性抗体は、Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグと一緒に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８−１２１からなる群から選択された配列を有する。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）、０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９）、０３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００）、０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１）、０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２）、０６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）、０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４）、０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５）、０９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６）、１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７）、１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８）、１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９）、１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０）、１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１）、１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２）、１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３）、１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）、１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５）、１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６）、２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７）、２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）、２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９）、２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）、あるいは２４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ��１２１）である。
【００５０】
上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、タンデム二重特異性抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３−１４６からなる群から選択された配列を有する。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、タンデム二重特異性抗体はタンデム二重特異性抗体０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３）、０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４）、０３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５）、０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６）、０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７）、０６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８）、０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９）、０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０）、０９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１）、１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２）、１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３）、１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４）、１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５）、１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６）、１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７）、１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８）、１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９）、１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０）、１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１）、２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２）、２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３）、２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４４）、２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）あるいは２４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）である。
【００５１】
上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、該方法は、シタラビン、アザシチジン、デシタビン、アントラサイクリン、フルダラビン、クロファラビン、クラドリビン、ネララビン、メトトレキサート、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、メルファラン、イブルチニブ、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、アプレミラスト、エピポドフィロトキシン、アントラセンジオン、抗ＣＤ２０薬剤、あるいはこれらの組み合わせを投与する工程を含む。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、ＡＭＬは、再発性遺伝的異常を備えたＡＭＬ、骨髄形成異常関連の変化を備えたＡＭＬ、治療関連の骨髄性の新生物、骨髄性肉腫、ダウン症候群と関連する骨髄性の増殖、芽細胞の形質細胞様樹状細胞新生物、あるいはさもなければ分類されないＡＭＬである。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、ＡＭＬは、ＡＭＬ−Ｍ０、ＡＭＬ−Ｍ１、ＡＭＬ−Ｍ２、ＡＭＬ−Ｍ３、ＡＭＬ−Ｍ４、ＡＭＬ−Ｍ５、ＡＭＬ−Ｍ６、あるいはＡＭＬ−Ｍ７である。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、骨髄破壊性の移植前処置を受けた後に、同種異型の造血幹細胞移植を受けた患者において、タンパク質を投与する工程は、タンパク質による治療に対する全体的な反応率の改善をもたらす。上記の実施形態のいずれかにおいて、該方法が提供され、非骨髄破壊性の移植前処置を受けた後に、同種異型の造血幹細胞移植を受けた患者において、タンパク質を投与する工程は、タンパク質による治療に対する全体的な反応率の改善をもたらす。
【００５２】
＜参照による組み込み＞
本明細書で言及される公開物、特許、および特許出願はすべて、あたかも個々の公開物、特許あるいは特許出願がそれぞれ参照により組み込まれるように具体的かつ個々に指示されるかのような同じ程度、参照により本明細書に組込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
本発明の新規な特徴はとりわけ添付の請求項で説明される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が用いられる実施形態を説明する以下の詳細な説明と、以下の添付図面とを引用することによって得られるであろう。
【図１】遺伝子組織化とＣＤ３／ＣＤ３３タンデム二重特異性抗体（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））のドメイン順序の概略図である。タンデム二重特異性抗体は、単鎖ペプチドリンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３によって接続された４つの可変ドメインから構成された単一のポリペプチドとして発現される。発現後、２つのモノマーポリペプチドは、ヘッドトゥーテールで（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）非共有的に会合して、機能的なホモ二量体のタンデム二重特異性抗体分子を形成する。Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３：リンカー；ＶＨ：重鎖可変ドメイン；ＶＬ：軽鎖可変ドメイン。
【図２】ＣＤ３結合タンデム二重特異性抗体とその作用機序。タンデム二重特異性抗体は、ＣＤ３に結合することによって細胞毒性Ｔ細胞に結合することができる四価の二重特異性のタンパク質である。タンデム二重特異性抗体は、４つの結合ドメインのうちの２つを有するＣＤ３３＋腫瘍細胞と、他の２つの結合ドメインを有するＣＤ３と結合する。このＴ細胞／標的細胞結合（架橋）事象はＴ細胞の活性化を促進し、ＡＤＣＣによる腫瘍細胞のその後の破壊を促進する。
【図３】ＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体のドメイン順の変異体。タンデム二重特異性抗体をコードする遺伝子配列内の可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）のドメイン順序の変動は、分子の内部または外部に位置するＣＤ３３とＣＤ３の特異性を備えた抗体の産生を可能にする。ドメイン特異性と、５’−末端および３’−末端と同様に、シグナル配列（ｓｓ）とリンカー（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）とアフィニティータグ（Ｈｉｓ）の位置が指示されている。
【図４】正に濃縮された健康なドナーＴ細胞ｖｓ負に選択された健康なドナーＴ細胞の比較。ＫＧ−１ａ細胞は、示されるように１：１あるいは３：１のＥ：Ｔ細胞比率で、１０の選択されたタンデム二重特異性抗体の１つの１０ｐＭ（およそ１ｎｇ／ｍＬ）と２５ｐＭ（およそ２．５ｎｇ／ｍＬ）と、負に選択された健康なドナーＴ細胞あるいは正に選択された健康なドナーＴ細胞のいずれかとでインキュベートされた。４８時間後、細胞数を決定し、細胞毒性をＤＡＰＩ染色で評価した。結果は、複製のウェルで行われた３つの独立した実験からの死細胞（上部パネル）の割合と特定の細胞毒性（下部パネル）の割合の平均±ＳＥＭとして示される。
【図５】分析戦略。１つの健康なドナーＴ細胞アリコートと１つの代表的なＡＭＬ細胞株（ＨＬ−６０）と原発性ＡＭＬ標本（ＡＭＰ００２）からの分散とヒストグラムのプロットであり、それぞれはタンデム二重特異性抗体により誘発された細胞毒性を決定するために追求された戦略を例証する。ＦＳＣ、前方散乱；ＳＳＣ、側面散乱。
【図６】ＣＤ３３＋ＡＭＬ細胞株における細胞毒性アッセイのスクリーニング。親のＨＬ−６０（Ａ、Ｂ）とＫＧ−１ａ（Ｃ、Ｄ）細胞を、示されるように、１：１（Ａ、Ｃ）あるいは５：１（Ｂ、Ｄ）のいずれかのＥ：Ｔ細胞比率において、２２のＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体分子の１つの１０ｐＭ（およそ１ｎｇ／ｍＬ）と２５ｐＭ（およそ２．５ｎｇ／ｍＬ）、あるいは非結合対照タンデム二重特異性抗体（００）と健康なドナーＴ細胞でインキュベートした。４８時間後、細胞数を決定し、細胞毒性をＤＡＰＩ染色で評価して、薬物に特異的な細胞毒性を定量化した。結果は、複製のウェルで行われた３つの独立した実験からのＤＡＰＩ＋細胞の割合の平均±ＳＥＭとして示される。細胞毒性が特定の細胞毒性の割合として発現されたとき、質的に同様の結果が得られた。
【図７】研究用の原発性ＡＭＬ標本の選択。原発性ヒトＡＭＬ標本の合計から冷凍されたアリコートを得て、分析に用いた。解凍後のＡＭＬ芽細胞の割合はＣＤ４５／側方散乱特性に基づいたフローサイトメトリーによって決定された。標本の生存率を、解凍時と４８時間後に、生細胞／死細胞マーカーとしてＤＡＰＩを使用するフローサイトメトリーにより、サイトカインを含有する液体培養（タンデム二重特異性抗体分子あるいは健康なドナーＴ細胞の添加なく）で測定した。解凍後と４８時間の生存率の結果がすべての標本について描かれており、これは＞５８％のＡＭＬ芽細胞であった。正方形：サイトカインを含有する液体培養での解凍時＞５０％、４８時間後＞５０％の生存率を示した、最終分析に含まれる原発性ＡＭＬ標本。
【図８】原発性ＡＭＬ標本におけるタンデム二重特異性抗体により誘発された細胞毒性。原発性ＡＭＬ標本を、示されるように、１：３（Ｂ）あるいは１：１（Ｃ）のいずれかのＥ：Ｔ細胞比率で、健康なドナーＴ細胞を添加せずに（Ａ）、あるいは健康なドナーＴ細胞を用いて、９つのタンデム二重特異性抗体分子のうちの１つの２．５ｐＭ（およそ２５０ｐｇ／ｍＬ）、１０ｐＭ（およそ１ｎｇ／ｍＬ）、および２５ｐＭ（およそ２．５ｎｇ／ｍＬ）でインキュベートした。４８時間後、細胞数を決定し、細胞毒性をＤＡＰＩ染色で評価して、薬物に特異的な細胞毒性を定量化した。結果は、複製のウェルで行われた実験からの特定の細胞毒性の割合の平均±ＳＥＭとして示される。
【図９】ヒトＣＤ３３（ａａ１８−２５９）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３）の細胞外ドメインのアミノ酸配列；
【図１０】アミノ酸配列（Ａ）Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグを備えたタンデム二重特異性抗体１の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）；（Ｂ）Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグを備えたタンデム二重特異性抗体２の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９）（Ｃ）Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグを備えたタンデム二重特異性抗体３の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００）；（Ｄ）Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグを備えたタンデム二重特異性抗体４の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１）；（Ｅ）Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグを備えたタンデム二重特異性抗体５の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２）；（Ｆ）Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグを備えたタンデム二重特異性抗体６の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）；（Ｇ）Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグを備えたタンデム二重特異性抗体７の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４）；（Ｈ）Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグを備えたタンデム二重特異性抗体８の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５）；（Ｉ）Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグを備えたタンデム二重特異性抗体９の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６）；（Ｊ）Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグを備えたタンデム二重特異性抗体１０の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７）；（Ｋ）Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグを備えたタンデム二重特異性抗体１１の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８）；（Ｌ）Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグを備えたタンデム二重特異性抗体１２の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９）；（Ｍ）Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグを備えたタンデム二重特異性抗体１３の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０）；（Ｎ）Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグを備えたタンデム二重特異性抗体１４の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１）；（Ｏ）Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグを備えたタンデム二重特異性抗体１５の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２）；（Ｐ）Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグを備えたタンデム二重特異性抗体１６の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３）；（Ｑ）Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグを備えたタンデム二重特異性抗体１７の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）；（Ｒ）Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグを備えたタンデム二重特異性抗体１８の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５）；（Ｓ）Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグを備えたタンデム二重特異性抗体１９の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６）；（Ｔ）Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグを備えたタンデム二重特異性抗体２０の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７）；（Ｕ）Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグを備えたタンデム二重特異性抗体２１の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）；（Ｖ）Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグを備えたタンデム二重特異性抗体２２の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９）；（Ｗ）Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグを備えたタンデム二重特異性抗体２３の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）；および、（Ｘ）Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグを備えたタンデム二重特異性抗体２４の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１）。強調された配列はリンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３を表す。
【図１１】アミノ酸配列（Ａ）タンデム二重特異性抗体１の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３）；（Ｂ）タンデム二重特異性抗体２の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４）；（Ｃ）タンデム二重特異性抗体３の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５）；（Ｄ）タンデム二重特異性抗体４の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６）；（Ｅ）タンデム二重特異性抗体５の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７）；（Ｆ）タンデム二重特異性抗体６の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８）；（Ｇ）タンデム二重特異性抗体７の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９）；（Ｈ）タンデム二重特異性抗体８の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０）；（Ｉ）タンデム二重特異性抗体９の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１）；（Ｊ）タンデム二重特異性抗体１０の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２）；（Ｋ）タンデム二重特異性抗体１１の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３）；（Ｌ）タンデム二重特異性抗体１２の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４）；（Ｍ）タンデム二重特異性抗体１３の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５）；（Ｎ）タンデム二重特異性抗体１４の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６）；（Ｏ）タンデム二重特異性抗体１５の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７）；（Ｐ）タンデム二重特異性抗体１６の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８）；（Ｑ）タンデム二重特異性抗体１７の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９）；（Ｒ）タンデム二重特異性抗体１８の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０）；（Ｓ）タンデム二重特異性抗体１９の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１）；（Ｔ）タンデム二重特異性抗体２０の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２）；（Ｕ）タンデム二重特異性抗体２１の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３）；（Ｖ）タンデム二重特異性抗体２２の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４４）；（Ｗ）タンデム二重特異性抗体２３の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）。および、（Ｘ）タンデム二重特異性抗体２４の完全な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）。強調された配列はリンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３を表す。
【図１２】ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス中のＨＬ−６０細胞の成長に対するタンデム二重特異性抗体１６と１２の効果。免疫不全のＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの８つの実験群は、０日目に４ｘ１０６  ＨＬ−６０細胞の懸濁液を用いる皮下注射によって異種移植された。注入の前に、ＨＬ−６０細胞は健康なドナーからの３ｘ１０６精製Ｔ細胞と混合された。腫瘍細胞とＴ細胞を移植された実験群の動物はすべて、指示されたような３つの異なる投与量レベル（０．１μｇ、１μｇ、および１０μｇ）で、ビヒクル（対照）、タンデム二重特異性抗体１６あるいは１２のいずれかを、０、１、２、３、および４日目に静脈内ボーラスで受け取った。エフェクター細胞とビヒクル処置のない１つの群は追加の陰性対照として役立った。
【図１３】ＡＭＬ異種移植片モデル中のタンデム二重特異性抗体１６の抗腫瘍活性。ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスは致死量以下に照射され（２Ｇｙ）、４ｘ１０６  ＨＬ−６０細胞で皮下に播種された。９日目に、動物は抗アシアロＧＭ１ウサギＡｂの１回のボーラス注入を受けた。腫瘍が１０日目に５０−１５０ｍｍ３（平均７３±１１ｍｍ３）の間の量に達すると、１０匹の動物を３つの処置群に割り当てた。第２群と第３群（ｎ＝８）に、１．５ｘ１０７拡張化および活性化ヒトＴ細胞を腹腔内に注入した。１３日目から２１日目まで、（ｑｄｘｄ９）匹の動物は、外側の尾静脈（第１の群と第２の群）にタンデム二重特異性抗体１６（第３群）あるいはビヒクルのいずれかを受け取った。
【図１４】５μｇ（０．２５ｍｇ／ｋｇ）あるいは５０μｇ（２．５ｍｇ／ｋｇ）のＣＤ３３／ＣＤ３のタンデム二重特異性抗体１２と１６を用いる処置後３８日目の、ＮＳＧマウスの骨髄（ＢＭ）と脾臓中のヒトＡＭＬ芽細胞の相対量（Ａ）と絶対数（Ｂ）。
【図１５】ＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体１６を媒介とした標的細胞溶解の動力学。１ｘ１０４のカルセイン標識したＨＬ−６０標的細胞は、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、あるいは５時間のあいだ、タンデム二重特異性抗体１６の段階希釈の存在下で、あるいは抗体（ｗ／ｏ）のない状態で、２５：１のＥ：Ｔ比率でエフェクター細胞として初代ヒトＴ細胞でインキュベートされた。各時間点では、溶解された標的細胞から放出された蛍光性のカルセインは、計算された特定の溶解に用いられた。３つの複製の平均とＳＤがプロットされる。
【図１６】ＣＤ３３／ＣＤ３のためにタンデム二重特異性抗体１６に関するＥＣ５０と特定の溶解値の動力学。ＥＣ５０値（黒い実線円）とタンデム二重特異性抗体１６を媒介とした標的細胞溶解（開いた四角）は、非線形回帰／Ｓ字形の用量反応によって指示されたインキュベーション時間でカルセイン放出細胞毒性アッセイにおいて測定され、プロットされた。
【図１７】新しく診断され、再発した、および難治性のＡＭＬの患者のサンプル中の細胞毒性活性。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
第１の態様によれば、少なくともＣＤ３３、好ましくはヒトＣＤ３３について特異性を有する結合タンパク質が本明細書で記載される。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は、ヒトとカニクイザルのＣＤ３３について特異性を有し、つまり、交差反応性である。いくつかの実施形態において、これらの交差反応性の結合タンパク質は、同様の親和性をもってヒトとカニクイザルのＣＤ３３に結合する。
【００５５】
ＣＤ３３は、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の芽細胞などの骨髄性細胞上で発現される。ヒトＣＤ３３などのＣＤ３３に特異的な抗体ドメインの単離については、抗体ライブラリがスクリーニングされることがある。例えば、ＩｇＭファージディスプレイライブラリーは、例えば、ヒトＣＤ３３（図９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３）の細胞外ドメインのアミノ酸１−２４３を含む、組み換えＣＤ３３−Ｆｃ融合タンパク質を使用することにより、スクリーニング可能である。
【００５６】
いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインを含む、少なくとも１つのＣＤ３３結合部位を有する。軽鎖可変ドメインは、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、重鎖可変ドメインは重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、これらの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）は、表１に示されるヒトＣＤＲ配列から選択される（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１−４１）。ある例では、軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１−２７から選択される。ある例では、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８−３４から選択される。ある例では、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５−４１から選択される。
【００５７】
いくつかの実施形態において、これらの重鎖ＣＤＲ（重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）は、表２に示されるヒトＣＤＲ配列から選択される（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２−６３）。ある例では、重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２−４８から選択される。ある例では、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９−５５から選択される。ある例では、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６−６３から選択される。
【００５８】
いくつかの実施形態において、いくつかの実施形態において、軽鎖と重鎖のＣＤＲは、それぞれの可変ドメインの周囲のフレームワーク配列を伴わずに選択され、これらは、他の免疫グロブリンあるいはコンセンサスフレームワーク領域からのフレームワーク配列を含み、随意に、他の適切なフレームワーク配列によりさらに変異させられ、および／または該適切なフレームワーク配列と取り替えられる。したがって、いくつかの実施形態では、軽鎖可変ドメインを含むＣＤ３３結合タンパク質が本明細書で提供され、軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８であり、および、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は軽鎖可変ドメインを含み、軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は軽鎖可変ドメインを含み、軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は軽鎖可変ドメインを含み、軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は軽鎖可変ドメインを含み、軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は軽鎖可変ドメインを含み、軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は軽鎖可変ドメインを含み、軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１である。
【００５９】
さらにいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインを含むＣＤ３３結合タンパク質が本明細書で提供され、重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は重鎖可変ドメインを含み、重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は重鎖可変ドメインを含み、重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は重鎖可変ドメインを含み、重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は重鎖可変ドメインを含み、重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は重鎖可変ドメインを含み、重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は重鎖可変ドメインを含み、重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は重鎖可変ドメインを含み、重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は重鎖可変ドメインを含み、重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は重鎖可変ドメインを含み、重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３である。
【００６０】
さらなる実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は、表３に示されるアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−１０から選択された可変軽鎖ドメインを含む。さらなる実施形態では、ＣＤ３３結合タンパク質は、表４に示されるアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１−２０から選択された可変重鎖ドメインを含む。またさらなる実施形態では、ＣＤ３３結合タンパク質は、表３に示されるアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−１０から選択された可変軽鎖ドメインと、表４に示されるアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１−２０から選択された可変重鎖ドメインとを含む。
【００６１】
用語「結合タンパク質」は、抗原結合特性、つまり、抗原結合部位を含む免疫グロブリンポリペプチド、あるいはそのフラグメントを備えた免疫グロブリン誘導体を指す。結合タンパク質は、抗体またはそのフラグメントの可変ドメインを含む。各抗原結合ドメインは、抗体（つまり、免疫グロブリン）可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、同じエピトープへ結合する抗体可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）とによって形成されるが、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）は３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）は３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるいくつかの実施形態に係る結合タンパク質は、免疫グロブリン定常ドメインが欠けている。いくつかの例では、抗原結合部位を形成する可変軽鎖および可変重鎖のドメインは、例えば、ペプチドリンカーによって、互いに共有結合しており、あるいは他の例では、可変軽鎖および可変重鎖のドメインは、抗原結合部位を形成するために互いに非共有的に会合する。用語「結合タンパク質」は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、単鎖Ｆｖ、タンデム単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）２、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））、二重親和性再標的化抗体（ＤＡＲＴ（商標））、二重特異性抗体、およびタンデム二重特異性抗体（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））を含む、抗体フラグメントあるいは抗体誘導体も指す。さらに、ある例では、結合タンパク質は多価性であり、つまり、ＣＤ３３のための２つ、３つ、あるいはそれ以上の結合部位を有する。
【００６２】
【表１】
2018516248.tif 000003
【００６３】
【表２】
2018516248.tif 000004
【００６４】
【表３】
2018516248.tif 000005
【００６５】
【表４】
2018516248.tif 000006
【００６６】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３３に特異性を与える結合タンパク質は、表３および表４に示される、ヒトＣＤ３３結合部位を形成する、可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインの以下の組み合わせの１つから選択される。限定しない例は、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、（ｖｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、（ｖｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、（ｉｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、および（ｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む。
【００６７】
本明細書にはまた、ＣＤ３３に対する特異性を有するだけでなく、少なくとも１つのさらに機能的なドメインも有する、結合タンパク質が記載される。さらなる実施形態では、少なくとも１つのさらに機能的なドメインは、エフェクタードメインである。「エフェクタードメイン」は、エフェクター細胞に特異的な抗体の結合部位を含み、これは、細胞毒性、食作用、抗原提示、サイトカイン放出を刺激するかまたは引き起こすことができる。例えば、そのようなエフェクター細胞は、限定されないが、Ｔ細胞である。特に、エフェクタードメインは、Ｔ細胞上の抗原、例えば、ヒトＣＤ３などに対する抗原結合部位を形成する、少なくとも１つの抗体可変重鎖ドメインおよび少なくとも１つの可変軽鎖ドメインを含む。
【００６８】
したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤ３３結合タンパク質は多機能性である。本明細書に使用されるような用語、多機能性は、結合タンパク質が２つ以上の異なる生物学的機能示すことを意味する。例えば、異なる生物学的機能は、異なる抗原に対する異なる特異性である。特定の例では、多機能性ＣＤ３３結合タンパク質は、多特異性である、つまり、ＣＤ３３および１つ以上のさらなる抗原に対する結合特異性を有している。特定の例では、結合タンパク質は、ＣＤ３３およびＣＤ３に対する特異性を有する二重特異性である。そのような二重特異性結合タンパク質は、例えば、クラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭの二重特異性モノクローナル抗体、二重特異性抗体、単鎖二重特異性抗体（ｓｃＤｂ）、タンデム単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）２、例えばＢｉ特異的Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））、二重親和性再標的化抗体（ＤＡＲＴ（商標））、タンデム二重特異性抗体（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、およびフレキシボディ（ｆｌｅｘｉｂｏｄｉｅｓ）を含む。
【００６９】
特定の実施形態では、二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合部位は、ヒトＣＤ３、およびいくつかの例では、カニクイザルＣＤ３に対する特異性を有する。そのような結合部位の例は、表５に示される配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−６７）からのＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、および表６に示される配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８−７１）からのＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、ポリペプチドである。特定の例では、ＣＤ３結合部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４の可変重鎖ドメインとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８の可変軽鎖ドメインの組み合わせである。特定の例では、ＣＤ３結合部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５の可変重鎖ドメインとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９の可変軽鎖ドメインの組み合わせである。特定の例では、ＣＤ３結合部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６の可変重鎖ドメインとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０の可変軽鎖ドメインの組み合わせである。特定の例では、ＣＤ３結合部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７の可変重鎖ドメインとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１の可変軽鎖ドメインの組み合わせである。
【００７０】
【表５】
2018516248.tif 000007
【００７１】
【表６】
2018516248.tif 000008
【００７２】
さらなる実施形態では、二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合部位は、ＳＴＹＡＭＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２）のＣＤＲ１配列を含む可変重鎖ドメインを有する。さらなる実施形態では、二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合部位は、ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３）のＣＤＲ２配列を含む可変重鎖ドメインを有する。さらなる実施形態では、二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合部位は、ＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４）のＣＤＲ３配列を含む可変重鎖ドメインを有する。さらなる実施形態では、二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合部位は、ＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＹＦＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５）のＣＤＲ３配列を含む可変重鎖ドメインを有する。またさらなる実施形態では、ＣＤ３結合部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２−７４の、それぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む可変重鎖ドメインを有する。またさらなる実施形態では、ＣＤ３結合部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２、７３および７５の、それぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む可変重鎖ドメインを有する。
【００７３】
さらなる実施形態では、二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合部位は、ＮＴＹＡＭＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）、ＮＴＹＡＭＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）およびＮＫＹＡＭＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）から成る群から選択されるＣＤＲ１配列を含む、可変重鎖ドメインを有する。さらなる実施形態では、二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合部位は、ＲＩＲＮＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）、ＲＩＲＮＫＹＮＮＹＡＴＥＹＡＤＳＶＫＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０）、ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＥＹＡＡＳＶＫＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）、ＲＩＲＮＫＹＮＮＹＡＴＥＹＡＡＳＶＫＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）、ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３）およびＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＥＹＡＤＳＶＫＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４）から成る群から選択されるＣＤＲ２配列を含む、可変重鎖ドメインを有する。さらなる実施形態では、二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合部位は、ＨＧＮＦＧＤＳＹＶＳＷＦＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５）、ＨＧＮＦＧＮＴＹＶＳＷＦＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６）、ＨＧＮＦＧＣＳＹＶＳＷＦＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７）、ＨＧＮＦＧＮＳＹＩＳＹＷＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８）およびＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＦＦＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）から成る群から選択されるＣＤＲ３配列を含む、可変重鎖ドメインを有する。
【００７４】
またさらなる実施形態では、ＣＤ３結合部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６、７３および７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６、７９および７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６、８０および７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６、８１および７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６、８２および７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６、８３および７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２、８３および７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２、８３および８５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６、８３および８６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７、８３および７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２、８３および８７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８、７３および８８、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８、８４および８９の、それぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む可変重鎖ドメインを有する。
【００７５】
さらなる実施形態では、二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合部位は、ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０）のＣＤＲ１配列を含む可変軽鎖ドメインを有する。さらなる実施形態では、二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合部位は、ＧＴＮＫＲＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１）のＣＤＲ２配列を含む可変軽鎖ドメインを有する。さらなる実施形態では、二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合部位は、ＡＬＷＹＳＮＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２）のＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖ドメインを有する。またさらなる実施形態では、ＣＤ３結合部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０−９２の、それぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤ２およびＣＤ３の配列を含む可変軽鎖ドメインを有する。
【００７６】
特定の例では、ＣＤ３結合部位は、ＣＤ３に対する高親和性を有している。代替的に、他の例では、重鎖ドメインに加えて軽鎖ドメイン、あるいは随意に、可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインからのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、例えば、ＵＣＨＴ１、ムロモナブ−ＣＤ３（ＯＫＴ３）、オテリキシズマブ（ＴＲＸ４）、テプリズマブ（ＭＧＡ０３１）、ビジリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ）などの、他のＣＤ３抗体に由来する。
【００７７】
別の態様において、本明細書には、ヒト化したまたは完全にヒトである、つまり、ヒト起源であるＣＤ３３結合タンパク質に加えて二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質が記載される。
【００７８】
いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３の結合タンパク質は、ＣＤ３３およびＣＤ３に対する可変軽鎖ドメインおよび重鎖ドメインによってＣＤ３３およびＣＤ３の特異性を提供する以下の組み合わせの１つを有する：限定されないが、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、１２、６５および６９、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、６５および６９、（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、６５および６９、（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１５、６５および６９、（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、１１、６４および６８、（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、１２、６４および６８、（ｖｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、１２、６６および７０、（ｖｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、６６および７０、（ｉｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１５、６６および７０、（ｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、６４および６８、（ｘｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、６７および７１、（ｘｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、６４および６８、（ｘｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１５、６４および６８、（ｘｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１７、６４および６８、（ｘｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１６、６４および６８、（ｘｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１６、６７および７１、（ｘｖｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１８、６４および６８、（ｘｖｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１９、６４および６８；（ｘｉｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１９、６７および７１、および（ｘｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、２０、６４および６８。
【００７９】
＜ＣＤＲ配列および重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインの保存変異体＞
代替的な実施形態では、重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインは、本明細書に記載されるＣＤＲ配列の免疫学的に活性な同族体または変異体を組み込む。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤ３３またはＣＤ３に結合する重鎖ドメインまたは軽鎖ドメインにおけるＣＤＲ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１−６３または７２−９２に描写されたアミノ酸配列と同一ではないが、それに類似している。特定の例では、ＣＤＲ変異体配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１−６３または７２−９０の配列と比較して、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％の配列同一性を有し、免疫学的に活性である。
【００８０】
さらなる例では、ＣＤＲ変異体配列は、１、２、３、４、または５の保存されたアミノ酸置換基を組み込む。保存的置換基は、与えられたアミノ酸を類似した特性を持つ別のアミノ酸と置換するアミノ酸置換基を含み、さらに、脂肪族アミノ酸の中のアラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンの交換；ヒドロキシル残基のセリンおよびトレオニンの交換、酸性残基のアスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩の交換、アミド残基のアスパラギンおよびグルタミンの間の置換、塩基性残基のリジンおよびアルギニンの交換、および芳香族残基の中のフェニルアラニンおよびチロシンの交換、を含む。
【００８１】
またさらなる例では、ＣＤＲ変異体配列は、安定性、プロテアーゼに対する耐性および／またはＣＤ３３またはＣＤ３に対する結合親和性の増加などの、ＣＤＲの特性を増強する置換基を組み込む。
【００８２】
他の例では、ＣＤＲ変異体配列は、重要でない残基または重要でない領域における残基を変更するために修正される。重要でないアミノ酸は、親和性成熟、ＣＤＲウォーキング、部位特異的変異誘発、結晶化、核磁気共鳴、光親和性標識、またはアラニン−系統的変異導入法などの、既知の方法によって特定することができる。
【００８３】
さらなる代替的な実施形態では、ＣＤ３３およびＣＤ３の結合タンパク質は、本明細書に提供される重鎖ドメイン配列および軽鎖ドメイン配列の免疫学的に活性な同族体または変異体である、重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインを含む。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤ３３およびＣＤ３の結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２０または６４−７１に描写されたアミノ酸配列と同一ではないが、それに類似している重鎖ドメイン配列または軽鎖ドメイン配列を含む。特定の例では、変異体の重鎖ドメイン配列または軽鎖ドメイン配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２０または６４−７１の配列と比較して、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％の配列同一性を有し、免疫学的に活性である。
【００８４】
さらなる例では、変異体の重鎖ドメイン配列または軽鎖ドメイン配列は、１、２、３、４、または５の保存されたアミノ酸置換基を組み込む。保存的置換基は、与えられたアミノ酸を類似した特性を持つ別のアミノ酸と置換するアミノ酸置換基を含み、さらに、脂肪族アミノ酸の中のアラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンの交換；ヒドロキシル残基のセリンおよびトレオニンの交換、酸性残基のアスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩の交換、アミド残基のアスパラギンおよびグルタミンの間の置換、塩基性残基のリジンおよびアルギニンの交換、および芳香族残基の中のフェニルアラニンおよびチロシンの交換、を含む。
【００８５】
またさらなる例では、変異体の重鎖ドメイン配列または軽鎖ドメイン配列は、安定性、プロテアーゼに対する耐性および／またはＣＤ３３またはＣＤ３に対する結合親和性の増加などの、ＣＤＲの特性を増強する置換基を組み込む。
【００８６】
他の例では、変異体の重鎖ドメイン配列または軽鎖ドメイン配列は、重要でない残基または重要でない領域における残基を変更するために修正される。重要でないアミノ酸は、親和性成熟、ＣＤＲウォーキング、部位特異的変異誘発、結晶化、核磁気共鳴、光親和性標識、またはアラニン−系統的変異導入法などの、既知の方法によって特定することができる。
【００８７】
＜ＣＤ３３およびＣＤ３の二重特異性およびタンデム二重特異性抗体＞
別の態様では、ＣＤ３３結合タンパク質または二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質は、二量体である、つまり、ＣＤ３３およびＣＤ３に対する抗原結合部位を有する２つのポリペプチドを含む。
【００８８】
また別の態様において本明細書には、タンデム二重特異性抗体（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））のフォーマットでの二量体および二重特異性のＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質が提供される。そのようなタンデム二重特異性抗体は、単一の遺伝子構築物において４つの抗体可変結合ドメイン（２つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および２つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ））を結合することによって構築され（図１）、ホモ二量体化が可能になる。
そのようなタンデム二重特異性抗体では、リンカー長さは、可変ドメインの分子内対合を防ぐような長さであり、それによって、分子は、単鎖二重特異性抗体を形成するためにそれ自体で折り畳まって戻る（ｆｏｌｄ ｂａｃｋ ｕｐｏｎ ｉｔｓｅｌｆ）ことができず、むしろ別の鎖の相補ドメインと対になることを強いられる。そのドメインはまた、対応するＶＨおよびＶＬのドメインが、この二量体化の間に対になるように配される。単一の遺伝子構築物からの発現後に、２つの同一のポリペプチド鎖が、ヘッドトゥーテールで折り畳まり、およそ１０５ｋＤａの機能的な非共有結合のホモ二量体を形成する（図１）。分子間の共有結合の欠如にもかかわらず、ホモ二量体は、一旦形成されると高度に安定しており、無傷のままであり、単量体形態に戻らない。
【００８９】
タンデム二重特異性抗体は、従来のモノクローナル抗体および他のより小さな二重特異性分子よりも利点を提供する多くの特性を有している。タンデム二重特異性抗体は、抗体可変ドメインのみを含有し、それ故、Ｆｃ部分と会合され得る副作用または非特異的相互作用を欠くことが熟考される。例えば、Ｆｃドメインに結合することができるＦｃ受容体は、白血球（例えば、好塩基球、Ｂ細胞、好酸球、ナチュラルキラー細胞、好中球など）またはクッパー細胞などの、多数の細胞型上で見られる。タンデム二重特異性抗体が、ＣＤ３３およびＣＤ３の各々に対する二価結合を可能にするために、その結合力はＩｇＧの結合力と同じである。タンデム二重特異性抗体のサイズは、およそ１０５ｋＤａであり、ＩｇＧのサイズより小さく、これは腫瘍浸潤の増強を可能にし得る。しかしながら、このサイズは、初回通過クリアランスに対する腎閾値を十分に上回っており、抗体結合ドメインまたは非抗体スキャフォールドに基づいて、より小さな二重特異性フォーマットと比較して、薬物動態学的利点を提供する。さらに、タンデム二重特異性抗体は、この薬物動態学的特性および結合力特性に基づいて、ＢｉＴＥまたはＤＡＲＴの分子などの他の二重特異性結合タンパク質よりも利点があり、結果としてより長い内因性の半減期および急速な細胞毒性をもたらす。タンデム二重特異性抗体は、宿主細胞、例えば、哺乳動物のＣＨＯ細胞中でよく発現される。強固な上流および下流の製造プロセスが、タンデム二重特異性抗体のために利用可能であることが熟考される。
【００９０】
本明細書に記載されるＣＤ３３およびＣＤ３の二重特異性タンデム二重特異性抗体は、細胞傷害性Ｔ細胞を動員することによってＣＤ３３＋腫瘍細胞の特異的な標的化を可能にするように設計されている。これは、単独の抗原に向けられたおよび細胞傷害性Ｔ細胞を直接動員することができない、全長抗体と比較して、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）を改善する。対照的に、これらの細胞上で特異的に発現されたＣＤ３分子を結合することによって、タンデム二重特異性抗体は、非常に特異的な方法でＣＤ３３＋腫瘍細胞を細胞傷害性Ｔ細胞と架橋することができ、それによって、そのような分子の細胞毒性の可能性が著しく増加する。この機構は図２に概説される。タンデム二重特異性抗体は、強い、特異的且つ効率的なＡＤＣＣを示す。Ｔ細胞が腫瘍増殖を制御する役割を果たすことができることが報告されている。例えば、大腸腫瘍における細胞傷害性Ｔ細胞に加えてＮＨＬ患者からのリンパ節の存在が、より優れた臨床転帰と相関することが示された。さらに、Ｔ細胞応答を誘発するように設計された治療の可能性が、メラノーマワクチンの他に、Ｔ細胞活性化の負の制御因子である、ＣＴＬＡ−４に対する抗体に関しても実証された。本明細書に記載されるタンデム二重特異性抗体は、表面に発現されたＣＤ３に結合することによって細胞傷害性Ｔ細胞に結合し、それによってＴ細胞受容体の一部が形成される。特定の腫瘍細胞の表面上で発現されたＣＤ３およびＣＤ３３へのこのタンデム二重特異性抗体の同時結合は、Ｔ細胞活性化を引き起こし、腫瘍細胞の続く溶解を媒介する（図２）。
【００９１】
それ故、さらなる態様では、多特異性のタンデム二重特異性抗体が存在する。いくつかの実施形態では、多特異性タンデム二重特異性抗体は、２、３またはそれ以上の異なるエピトープに対する特異性を有し、ここで２つ以上のエピトープは、同じまたは異なる抗原標的であり得る。特定の実施形態では、多特異性のタンデム二重特異性抗体は、二重特異性且つ四価である、つまり、４つの抗原結合部位を含む。そのような二重特異性タンデム二重特異性抗体は、少なくとも１つの抗原結合部位で、ヒトＣＤ３およびヒトＣＤ３３に結合し、特定の例では、タンデム二重特異性抗体は、２つの抗原結合部位でヒトＣＤ３に結合し、２つの他の抗原結合部位でヒトＣＤ３３に結合する、つまり、タンデム二重特異性抗体は、二価で各抗原に結合する。
【００９２】
いくつかの実施形態では、二重特異性の抗原結合タンデム二重特異性抗体は、ヒトＣＤ３３およびヒトＣＤ３に特異的であり、ここで、前記タンデム二重特異性抗体は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、各ポリペプチドは、次々に結合された少なくとも４つの可変鎖ドメインを有し、ここで各ポリペプチドは以下を含む：
（ｉ）ヒトＣＤ３３に特異的な可変重鎖（ＶＨ）ドメイン；
（ｉｉ）ヒトＣＤ３３に特異的な可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン；
（ｉｉｉ）ヒトＣＤ３に特異的なＶＨドメイン、および（ｉｖ）ヒトＣＤ３に特異的なＶＬドメイン。
【００９３】
特定の実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体は、ヒトＣＤ３３の６２ＤＱＥＶＱＥＥＴＱ７０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３のアミノ酸残基６２−７０）内にあるヒトＣＤ３３のエピトープに特異的に結合する。特定の例では、そのようなタンデム二重特異性抗体は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、各ポリペプチドは、次々に結合された少なくとも４つの可変鎖ドメインを有し、ここで、各ポリペプチドは以下を含む：
（ｉ）ヒトＣＤ３３の６２ＤＱＥＶＱＥＥＴＱ７０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３のアミノ酸残基６２−７０）内にあるヒトＣＤ３３のエピトープに特異的な可変重鎖ドメイン；
（ｉｉ）ヒトＣＤ３３の６２ＤＱＥＶＱＥＥＴＱ７０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３のアミノ酸残基６２−７０）内にあるヒトＣＤ３３のエピトープに特異的な可変軽鎖ドメイン；
（ｉｉｉ）ヒトＣＤ３に特異的な可変重鎖ドメイン、および
（ｉｖ）ヒトＣＤ３に特異的な可変軽鎖ドメイン。
【００９４】
他の実施形態において、本明細書には、ＣＤ３３＋細胞上のＣＤ３３に対する１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下のＫＤの親和性を有している、ＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体が記載されている。ＣＤ３３＋細胞は、例えば、ＨＬ−６０またはＫＧ−１などの腫瘍細胞から選択され得る。
【００９５】
さらなる実施形態では、本明細書に記載されるＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体は、１０ｎＭ、５ｎＭ以下、または２ｎＭ以下のＫＤを有して、ＣＤ３に結合し、特定の例では、ＣＤ３＋細胞、特にＴ細胞上でＣＤ３のイプシロン鎖に結合する。
【００９６】
いくつかの実施形態では、二重特異性タンデム二重特異性抗体の各ポリペプチドは、４つの可変鎖ドメインの以下の組み合わせの１つを含む：（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、１２、６５および６９、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、６５および６９、（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、６５および６９、（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１５、６５および６９、（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、１１、６４および６８、（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、１２、６４および６８、（ｖｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、１２、６６および７０、（ｖｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、６６および７０、（ｉｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１５、６６および７０、（ｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、６４および６８、（ｘｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、６７および７１、（ｘｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、６４および６８、（ｘｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１５、６４および６８、（ｘｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１７、６４および６８、（ｘｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１６、６４および６８、（ｘｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１６、６７および７１、（ｘｖｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１８、６４および６８、（ｘｖｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１９、６４および６８；（ｘｉｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１９、６７および７１、および（ｘｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、２０、６４および６８。
【００９７】
本明細書で使用されるように、「二量体」は２つのポリペプチドの複合体を指す。特定の実施形態では、２つのポリペプチドは、互いに非共有結合され、特に、２つのポリペプチド間に共有結合がないことを条件とする。特定の例では、２つのポリペプチドは、二量体の安定化を助けるために形成されるジスルフィド結合などの共有結合性会合を有する。特定の実施形態では、二量体は、ホモ二量体である、つまり、２つの同一のポリペプチドを含む。用語「ポリペプチド」は、アミド結合によって結合されたアミノ酸残基のポリマーを指す。ポリペプチドは、特定の例において、分枝されていない単鎖融合タンパク質である。ポリペプチドにおいて、可変抗体ドメインは次々に結合される。ポリペプチドは、他の例において、可変ドメインＮ末端および／またはＣ末端残基に加えて、連続するアミノ酸残基を有し得る。例えば、そのような連続するアミノ酸残基は、いくつかの例ではＣ末端で、Ｔａｇ配列を含み得、これは、ポリペプチドの精製および検出のために有用であると熟考される。
【００９８】
一態様では、二重特異性タンデム二重特異性抗体の各ポリペプチドは、４つの可変ドメイン、ＣＤ３結合タンパク質の可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖も（ＶＨ）の他に、ＣＤ３３結合タンパク質の可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）も含む。特定の実施形態では、４つの可変ドメインは、ペプチドリンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３によって結合され、いくつかの例では、以下のようにＮ末端からＣ末端に配される：
ドメインの順序：
（１）ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３３）−Ｌ３−ＶＨ（ＣＤ３）；または、
（２）ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３３）−Ｌ３−ＶＬ（ＣＤ３）；または、
（３）ＶＬ（ＣＤ３３）−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ３−ＶＨ（ＣＤ３３）；または、
（４）ＶＨ（ＣＤ３３）−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ３−ＶＬ（ＣＤ３３）。
【００９９】
リンカーの長さは、報告された試験に従って抗原結合タンデム二重特異性抗体の柔軟性に影響を与える。したがって、いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３の長さは、１つのポリペプチドのドメインが、別のポリペプチドのドメインと分子間で会合し、二量体抗原結合タンデム二重特異性抗体を形成することができるような長さである。特定の実施形態では、そのようなリンカーは、「短い」、つまり、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のアミノ酸残基から成る。したがって、特定の例では、リンカーは、約１２以下のアミノ酸残基から成る。０のアミノ酸残基の場合には、リンカーはペプチド結合である。そのような短いリンカーは、異なるポリペプチドの抗体可変軽鎖ドメインと抗体可変重鎖ドメインとの間で正しい抗原結合部位に結合し、それらを形成することによって、２つのポリペプチドの分子間の二量体化を支持する。リンカーを約１２以下のアミノ酸残基に短縮することによって、一般に、同じポリペプチド鎖の隣接ドメインが互いに分子内で相互作用することが防がれる。いくつかの実施形態では、これらのリンカーは、約３から約１０、例えば、４、５または６の連続するアミノ酸残基から成る。
【０１００】
リンカーのアミノ酸組成に関して、２つのポリペプチドの二量体化に干渉しないペプチドが選択される。例えば、グリシンおよびセリンの残基を含むリンカーは、一般にプロテアーゼ耐性を提供する。リンカーのアミノ酸配列は、例えば、抗原結合ポリペプチド二量体の抗原結合および生産収率を改善するファージディスプレイ方法によって、最適化することができる。いくつかの実施形態におけるタンデム二重特異性抗体に適したペプチドリンカーの例は、ＧＧＳＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５）、ＧＧＳＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６）、またはＧＧＳＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）である。
【０１０１】
本明細書に記載されるようなタンデム二重特異性抗体の限定しない例は、表７に従う、抗ＣＤ３３ ＶＬおよびＶＨドメイン、抗ＣＤ３ ＶＬおよびＶＨドメイン、ドメインの順序、およびリンカーを有する、タンデム二重特異性抗体である。
【０１０２】
【表７】
2018516248.tif 000009
【０１０３】
【表８】
2018516248.tif 000010
【０１０４】
いくつかの実施形態では、タンデム二重特異性抗体は、Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグに結合される。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグを有するタンデム二重特異性抗体は、図１０Ａから１０Ｘに示されるように、タンデム二重特異性抗体 ０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８）、０２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９）、０３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００）、０４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１）、０５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２）、０６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３）、０７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４）、０８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５）、０９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６）、１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７）、１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８）、１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）、１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０）、１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１）、１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２）、１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３）、１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４）、１８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５）、１９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６）、２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７）、２１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８）、２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９）、２３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０）、または２４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１）である。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、タンデム二重特異性抗体は、図１１Ａから１１Ｘに示されるように、タンデム二重特異性抗体 ０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３）、０２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４）、０３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５）、０４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６）、０５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７）、０６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２８）、０７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２９）、０８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０）、０９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１）、１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３２）、１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３）、１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４）、１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５）、１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６）、１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７）、１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８）、１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９）、１８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０）、１９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１）、２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２）、２１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３）、２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４）、２３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５）、または２４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６）である。
【０１０６】
本明細書に記載されるＣＤ３３結合タンパク質およびＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性結合タンパク質（例えばＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性タンデム二重特異性抗体）は、いくつかの実施形態において、抗原結合タンデム二重特異性抗体を形成するために、別の同一のポリペプチドと会合するタンデム二重特異性抗体のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することによって生成される。それ故、別の態様は、本明細書に記載されるような抗原結合タンデム二重特異性抗体のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えばＤＮＡまたはＲＮＡである。
【０１０７】
ポリヌクレオチドは、ペプチドリンカーによって分離された、または他の実施形態では、ペプチド結合によって直接結合された、少なくとも４つの抗体可変ドメインをコードする遺伝子を、適切なプロモーター、および随意に適切な転写ターミネーターに作動可能に結合された単一の遺伝子構築物へと組み合わせ、それを細菌または例えばＣＨＯ細胞などの他の適切な発現系において発現させるなどの、既知の方法によって構築される。利用されるベクター系および宿主に依存して、構成的および誘導性のプロモーターを含む、任意数の適切な転写および翻訳要素が使用されてもよい。プロモーターは、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドの発現を促進するために選択される。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、さらなる実施形態を表わす、ベクター、好ましくは発現ベクターへと挿入される。この組換えベクターは、既知の方法に従って構築され得る。
【０１０９】
記載された抗原結合タンデム二重特異性抗体のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するおよび発現するために、様々な発現ベクター／宿主系が利用され得る。
【０１１０】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のための発現ベクターの例は、哺乳動物細胞における発現のためのｐＳＫＫ（Ｌｅ Ｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． （２００４） ２８５（１）：１１１−２７）またはｐｃＤＮＡ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【０１１１】
したがって、本明細書に記載されるような抗原結合タンデム二重特異性抗体は、いくつかの実施形態において、上に記載されるようなポリペプチドをコードするベクターを宿主細胞へと導入し、ポリペプチド鎖が、発現され、単離され得、随意にさらに精製される条件下で前記宿主細胞を培養することによって生成される。
【０１１２】
他の態様では、本明細書に記載されるＣＤ３３結合タンパク質またはＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性結合タンパク質（例えばＣＤ３３／ＣＤ３の二重特異性タンデム二重特異性抗体）は、修飾を有する。典型的な修飾は、限定されないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、薬物抱合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、フォルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化（ａｒｇｉｎｙｌａｔｉｏｎ）などの、タンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介性の付加、およびユビキチン化を含む。さらなる実施形態では、ＣＤ３３結合タンパク質またはＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性結合タンパク質は、リーダーまたは分泌の配列、あるいはポリペプチドの精製のための配列などの、追加のアミノ酸で修飾される。
【０１１３】
他の態様において、本明細書には、ＣＤ３３結合タンパク質、抗原結合タンデム二重特異性抗体、抗原結合タンデム二重特異性抗体のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターまたはこのベクターによって形質転換された宿主細胞、および少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物が提供される。用語「薬学的に許容可能な担体」は、限定されないが、成分の生物活性の有効性に干渉しないおよび投与される患者に対して毒性ではない担体を含む。適切な薬学的担体の例は、当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝食塩水溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌液などを含む。そのような担体は、従来の方法によって製剤することができ、適切な用量で被験体に投与することができる。好ましくは、組成物は滅菌される。これらの組成物はまた、防腐剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含有し得る。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤の包含によって確かなものとされ得る。
【０１１４】
ＣＤ３３およびＣＤ３に対する高親和性の結合を有する二重特異性ＣＤ３３／ＣＤ３結合タンパク質は、多くの一次ＡＭＬ標本中で高度に活性であり、これは、これらの分子が、最小のＣＤ３３発現の場合においても、細胞遺伝学的疾患／分子病のスペクトル全体にわたって、ヒトＡＭＬに対して活性であり得ることを示唆している。留意すべきこととして、薬物特異的な細胞毒性も、残余の自己由来Ｔ細胞が存在において観察され、抑制された量の健康なドナーＴ細胞の追加によって有意に増大される（実施例６を参照）。
【０１１５】
ＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性結合タンパク質は、特定のタンデム二重特異性抗体において、インビトロでＣＤ３３＋白血病細胞の強力な細胞溶解を誘発することができる。データは、ＣＤ３３およびＣＤ３の両方への高親和性の結合が、二重特異性タンパク質誘発性のＴ細胞活性化および抗ＡＭＬ効能を最大限にすることを示す。本明細書に記載されるタンデム二重特異性抗体などの、高親和性ＣＤ３３／ＣＤ３に向けられた二重特異性結合タンパク質は、インビトロで一次ＡＭＬにおいて細胞溶解活性を示す。したがって、これらの二重特異性結合タンパク質およびタンデム二重特異性抗体は、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）または他の血液系悪性腫瘍（例えば、骨髄異形成症候群、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、または骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）の処置に対する治療手段に適している。
【０１１６】
それ故、本明細書には、本明細書で上に記載されるような抗原結合タンデム二重特異性抗体が、ＣＤ３３＋癌（例えば急性骨髄白血病（ＡＭＬ））、疾患または疾病の処置のために、被験体、例えば患者に有効量で投与される方法が提供される。ＣＤ３３＋癌は、限定されないが、急性骨髄白血病、前駆Ｂ細胞リンパ芽球性白血病を含む急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）などの急性白血病、骨髄性肉腫、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性リンパ腫などの急性リンパ腫、慢性骨髄単球性白血病などを含む。ＣＤ３３＋疾患および疾病は、特定の癌および慢性炎症において骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）に起因する免疫抑制の状態または環境を含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような抗原結合タンデム二重特異性抗体は、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）の処置のために投与される。特定の実施形態では、本明細書に記載されるような抗原結合タンデム二重特異性抗体は、急性骨髄白血病のサブタイプの処置のために投与される。
【０１１８】
ＦＡＢ分類系は、ＡＭＬを８つのサブタイプに分割する：ＡＭＬ−Ｍ０（最小に分化された）、ＡＭＬ−Ｍ１（成熟なし）、ＡＭＬ−Ｍ２（顆粒球成熟を有する）、ＡＭＬ−Ｍ３（前骨髄球性白血病または急性前骨髄球性白血病）、ＡＭＬ−４（急性骨髄単球性白血病）、ＡＭＬ−Ｍ５（急性の単芽球性白血病または単球性白血病）、ＡＭＬ−Ｍ６（急性赤白血病）、およびＡＭＬ−Ｍ７（急性巨核芽球性白血病）。特定の例では、本明細書に記載されるような抗原結合タンデム二重特異性抗体は、ＡＭＬ−Ｍ０、ＡＭＬ−Ｍ１、ＡＭＬ−Ｍ２、ＡＭＬ−Ｍ３、ＡＭＬ−Ｍ４、ＡＭＬ−Ｍ５、ＡＭＬ−Ｍ６、またはＡＭＬ−Ｍ７の処置のために投与される。
【０１１９】
ＷＨＯ ＡＭＬ分類表は、以下のサブタイプに従ってＡＭＬを組織化する：再発性遺伝的異常を有するＡＭＬ、脊髄形成異常関連の変化、治療関連の骨髄性新生物、骨髄性肉腫、ダウン症候群に関連する骨髄増殖、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物を有するＡＭＬ、およびそうでなければ分類されないＡＭＬ。特定の他の例では、再発性遺伝的異常を有するＡＭＬ、脊髄形成異常関連の変化、治療関連の骨髄性新生物、骨髄性肉腫、ダウン症候群に関連する骨髄増殖、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物を有するＡＭＬ、またはそうでなければ分類されないＡＭＬの処置のために投与される。
【０１２０】
他のいくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような抗原結合タンデム二重特異性抗体は、新たに診断された、再発性または難治性のＡＭＬの処置のために投与される。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質、例えば抗原結合タンデム二重特異性抗体は、再発性または難治性のＡＭＬの処置のために、造血幹細胞移植（ＨＣＴ）を受けた患者に投与される。ＨＣＴを受けた患者は、ＡＭＬの処置のためにＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質に適用可能な特異的な患者集団である。ＨＣＴを受けたことで、患者は、リンパ球を含む自身の免疫系を再確立し、それによって、ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞により有効に結合し、腫瘍細胞を死滅させることができることが熟考される。
【０１２２】
多くのまたはほとんどの場合に、ＨＣＴを受ける患者は、化学療法または放射線療法などのＡＭＬの処置のための以前の治療に失敗し、寛解にある。いくつかの実施形態では、ＨＣＴを受ける患者は、初回化学療法または放射線療法に失敗した。いくつかの実施形態では、ＨＣＴを受ける患者は、単回化学療法または放射線療法に失敗した。ＨＣＴを受ける何人かのＡＭＬ患者は、初回完全寛解（ＣＲ１）にある。いくつかの実施形態では、ＨＣＴを受けるＡＭＬ患者は、第２回完全寛解（ＣＲ２）にある再発性ＡＭＬ患者である。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、造血幹細胞移植は同種である（ａｌｌｏ−ＨＣＴ）。Ａｌｌｏ−ＨＣＴでは、幹細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の一致した患者以外のドナーから生じる。一致したドナーは、患者に関連し得るかまたは関連し得ない。いくつかの場合では、１つの抗原が一致しない部分的に一致したドナーは、ａｌｌｏ−ＨＣＴに使用することができる。ドナーからの細胞の共通ソースは、骨髄および末梢血の幹細胞を含む。ＨＬＡの一致したまたは部分的に一致した関連するまたは関連しないドナーが利用可能でないこれらの患者のために、代替的なドナー源が使用されてもよい。典型的な代替のドナーのオプションは、臍帯移植またはハプロタイプ一致の移植を含む。ａｌｌｏ−ＨＣＴの利点は、腫瘍のない移植片および免疫媒介性の移植片対白血病効果の使用を含む。ドナー免疫細胞は、身体へと注入されるときに、残りの白血病細胞を異質であるものとして認識し、それらを攻撃し得る。ａｌｌｏ−ＨＣＴの欠点は、一致したまたは部分的に一致したドナーに加えて移植片対宿主病も発見することの困難性を含み、ここで、ドナーの細胞によって確立された免疫系は、患者自身の組織を異質であるものとして認識し、それらを攻撃する。
【０１２４】
他のいくつかの実施形態では、造血幹細胞移植は自己由来である（ａｕｔｏ−ＨＣＴ）。自己由来のＨＣＴは、患者からの造血幹細胞の、一般にアフェレーシスによる抽出および採取した細胞の冷凍庫中の保存を必要とする。その後、患者は、部分的または完全な骨髄除去または言いかえれば新しい血液細胞を成長させるための患者の骨髄機能の破壊を犠牲にして、患者の悪性細胞集団を根絶することを意図して、放射線療法とともにまたはそれなしで高用量化学療法によって処置される。その後、患者自身の保存された幹細胞は、血流へと注入され、ここで、それらは、破壊された組織を交換し、患者の正常な血液細胞産生を再開する。免疫機能の回復が急速であるため、自己由来の移植は、処置の免疫無防備の期間（ｐｏｒｔｉｏｎ）の間の感染のリスクがより少ないという利点を有する。また、急性または慢性の移植片対宿主病である、患者が拒絶を経験する発生率は、ドナーおよびレシピエントが同じ個体であるため非常にまれである。
【０１２５】
さらなる実施形態では、患者はＨＣＴ前に移植前処置を受ける。いくつかの実施形態では、ＨＣＴ前の移植前処置は、移植を保証する且つ著しい毒性を有さないために十分な免疫抑制を提供することができる。移植前処置は、骨髄破壊性または非骨髄破壊性であり、強度軽減移植前（ＲＩＣ）処置としても知られている。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、移植前処置は骨髄破壊性である。骨髄破壊性の移植前処置は、ＡＭＬ細胞を含む、骨髄中の細胞を切除し、全身照射（ＴＢＩ）、シクロホスファミドの投与、ブスルファンの投与、またはそれらの組み合わせによって通常実行される。典型的なシクロホスファミドは、エンドキサン、シトキサン、ネオサール（ｎｅｏｓａｒ）、プロシトックス（ｐｒｏｃｙｔｏｘ）、レビミュン（ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ）、およびシクロブラスチン（ｃｙｃｌｏｂｌａｓｔｉｎ）を含む。いくつかの実施形態では、移植前処置は非骨髄破壊性である、即ち、強度軽減移植前（ＲＩＣ）である。ＲＩＣ処置は、骨髄破壊性の治療より少ない化学療法および／または放射線の用量を含む。したがって、ＲＩＣ処置は、すべての骨髄細胞を根絶はしないより軽い処置であると考えられ、骨髄破壊性の移植前処置を受けることができない高齢者などの患者において使用することができる。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される、ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質、例えば抗原結合タンデム二重特異性抗体は、骨髄破壊性の移植前処置の後にａｕｔｏ−ＨＣＴを受けたＡＭＬ患者に投与される。いくつかの実施形態では、抗原結合タンデム二重特異性抗体は、骨髄破壊性の移植前処置の後にａｌｌｏ−ＨＣＴを受けたＡＭＬ患者に投与される。いくつかの実施形態では、骨髄破壊性の移植前処置の後にａｌｌｏ−ＨＣＴを受ける患者は、完全寛解（ＣＲ）にあり、ａｌｌｏ−ＨＣＴ後に本明細書に記載されるようなＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質を投与することによって、再発性または難治性のＡＭＬの発生確率が低下する。いくつかの実施形態では、骨髄破壊性の移植前処置の後にａｌｌｏ−ＨＣＴを受ける患者は、ＣＲにあるが、微小残存病変（ＭＲＤ）を有し、ａｌｌｏ−ＨＣＴ後に本明細書に記載されるようなＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質を投与することによって、再発性または難治性のＡＭＬの発生確率が低下する。いくつかの実施形態では、骨髄破壊性の移植前処置の後にａｌｌｏ−ＨＣＴを受ける患者は、ＭＲＤを有し、ａｌｌｏ−ＨＣＴ後に本明細書に記載されるようなＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質を投与することによって、再発性または難治性のＡＭＬの発生確率が低下する。
【０１２８】
特定の前臨床試験は、より強度な移植前処置が、結果として急性移植片対宿主病の進行を支持する炎症促進性サイトカイン環境につながることを示した。典型的な強度移植前処置は、非常に高用量のＴＢＩ処置を含む。いくつかの実施形態では、強度移植前処置の後にａｌｌｏ−ＨＣＴを受けたＡＭＬ患者に本明細書に記載されるＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質を投与することは、結果として炎症促進性サイトカイン環境にはつながらず、急性移植片対宿主病の発生確率を低下させる。
【０１２９】
さらなる実施形態では、ＣＤ３３およびＣＤ３の結合タンパク質、例えば抗原結合タンデム二重特異性抗体は、ＲＩＣ処置の後にａｕｔｏ−ＨＣＴを受けたＡＭＬ患者に投与される。いくつかの実施形態では、抗原結合タンデム二重特異性抗体は、ＲＩＣ処置の後にａｌｌｏ−ＨＣＴを受けたＡＭＬ患者に投与される。典型的な強度が最小の移植前処置は、ＴＢＩと組み合わせてフルダラビンを投与することを含む。いくつかの実施形態では、フルダラビンは、２ＧｙのＴＢＩとともに、３日間、３０ｍｇ／ｍ２／日の用量で投与される。いくつかの試験は、非骨髄破壊性またはＲＩＣの移植前処置が、２年での３４％から５０％の全生存率、ｎｏｎは再発する、２年での２２％から３４％の非再発死亡率（ＮＲＭ）、３３％から３５％の急性移植片対宿主病率、および４１％から５３％の慢性移植片対宿主病率に関係することを報告した。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなＣＤ３３およびＣＤ３の結合タンパク質は、ＲＩＣ移植前処置の後にａｌｌｏ−ＨＣＴを受けたＡＭＬ患者に投与される。いくつかの実施形態では、ＲＩＣ移植前処置の後にａｌｌｏ−ＨＣＴを受けたＡＭＬ患者に本明細書に記載されるような抗原結合タンデム二重特異性抗体を投与することによって、結果として、全生存率の改善、ＮＲＭ率の低下、および／または急性または慢性の移植片対宿主病の発生率の低下につながる。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質は、ＲＩＣ処置の後にａｌｌｏ−ＨＣＴを受けたＡＭＬ患者に投与される。いくつかの実施形態では、ＲＩＣ処置後にａｌｌｏ−ＨＣＴを受ける患者は、完全寛解（ＣＲ）にあり、ａｌｌｏ−ＨＣＴ後に本明細書に記載されるようなＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質を投与することによって、再発性または難治性のＡＭＬの発生確率が低下する。いくつかの実施形態では、ＲＩＣ処置後にａｌｌｏ−ＨＣＴを受ける患者は、ＣＲにあるが、微小残存病変（ＭＲＤ）を有し、ａｌｌｏ−ＨＣＴ後に本明細書に記載されるような抗原結合タンデム二重特異性抗体を投与することによって、再発性または難治性のＡＭＬの発生確率が低下する。いくつかの実施形態では、ＲＩＣ処置後にａｌｌｏ−ＨＣＴを受ける患者は、ＭＲＤを有し、ａｌｌｏ−ＨＣＴ後に本明細書に記載されるような抗原結合タンデム二重特異性抗体を投与することによって、再発性または難治性のＡＭＬの発生確率が低下する。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなＣＤ３３およびＣＤ３の結合タンパク質は、ＡＭＬ進行中に、ドナーのリンパ球とともに、ａｌｌｏ−ＨＣＴを受けた患者に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような抗原結合タンデム二重特異性抗体は、ＡＭＬ進行中に、ドナーのリンパ球なしで、ａｌｌｏ−ＨＣＴを受けた患者に投与される。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、ｌｌｏ−ＨＣＴ後に本明細書に記載されるようなＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質を投与されたＡＭＬ患者における全奏効率は、事前のａｌｌｏ−ＨＣＴなしで本明細書に記載されるようなＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質を投与されたＡＭＬ患者における全奏効率より高い。いくつかの実施形態では、骨髄破壊性または強度軽減の移植前処置の後にａｌｌｏ−ＨＣＴを受けるＡＭＬ患者は、本明細書に記載されるようなＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質の結合のための機能的なＴ細胞を有し、機能的なＴ細胞が存在下で記載されるようなＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質を投与することによって、結果としてＡＭＬの処置の成功率が改善される。
【０１３３】
さらなる実施形態では、本明細書に記載されるような抗原結合タンデム二重特異性抗体は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）または脊髄増殖性疾患（ＭＰＤ）などの前白血病の血液疾患の処置のために投与される。特定の例では、本明細書に記載されるような抗原結合タンデム二重特異性抗体は、ＭＤＳの処置のために投与される。特定の例では、本明細書に記載されるような抗原結合タンデム二重特異性抗体は、ＭＰＤの処置のために投与される。
【０１３４】
他の実施形態では、本明細書に記載されるような抗原結合タンデム二重特異性抗体は、多発性骨髄腫の処置のために投与される。さらなる実施形態では、本明細書に記載されるような抗原結合タンデム二重特異性抗体は、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）の処置のために投与される。
【０１３５】
他の実施形態では、本明細書に記載されるような抗原結合タンデム二重特異性抗体は、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の阻害または除去のために投与される。ＭＤＳＣは、特定の単離された病変組織においてＣＤ３３を高度に過剰発現し、強い免疫抑制活性を有する。特定のヒト癌（非ＣＤ３３＋に加えてＣＤ３３＋も）では、ＭＤＳＣは、増殖し、腫瘍特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞応答を抑制するおよびＴｒｅｇ細胞を誘発するように活性化されて、腫瘍または癌が微小環境中よく成長することを可能にする。慢性炎症では、ＭＤＳＣは、伝えられるところによると、Ｔ細胞免疫機能を抑制するために、増殖されて、炎症部位で見つけられる。他の実施形態では、本明細書に記載されるような抗原結合タンデム二重特異性抗体は、ＭＤＳＣに関連する疾病を処置するために投与される。さらに他の実施形態では、本明細書に記載されるような抗原結合タンデム二重特異性抗体は、免疫抑制を処置するために投与される。さらに他の実施形態では、本明細書に記載されるような抗原結合タンデム二重特異性抗体は、ＭＤＳＣによって抑制された炎症を処置するために投与される。さらに他の実施形態では、本明細書に記載されるような抗原結合タンデム二重特異性抗体は、ＭＤＳＣによって引き起こされた低下した免疫反応を処置するために投与される。さらに他の実施形態では、本明細書に記載されるような抗原結合タンデム二重特異性抗体は、ＭＤＳＣによって促進される、癌の血管新生、腫瘍侵入または転移を処置するために投与される。さらに他の実施形態では、本明細書に記載されるような抗原結合タンデム二重特異性抗体は、ＭＤＳＣによって増強されるか、増大されるか、悪化されるか、または増加される癌または腫瘍を処置するために投与される。
【０１３６】
本明細書に記載される抗原結合のタンデム二重特異性抗体は、薬物として使用のために熟考される。投与は、異なる方法、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、または皮内の投与により達成される。幾つかの実施形態において、投与経路は、治療の種類、および医薬組成物に含まれる化合物の種類に依存する。投与レジメンは、主治医および他の臨床学的因子により決定される。１人の患者のための投与量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、性別、投与される特定の化合物、投与の時間と経路、治療の種類、健康状態、および同時に投与される他の薬物を含む多くの要因に依存する。「有効な量」は、疾患の経過と重症度に影響を及ぼし、それによりそのような病状の減少または寛解を引き起こすのに十分な量の活性成分を指す。ＡＭＬの処置および／または予防に有用な「有効な量」は、既知の方法を使用して決定され得る。
【０１３７】
更なる実施形態において、本明細書に記載される抗原結合のタンデム二重特異性抗体は、ＣＤ３３＋の癌、疾患、または疾病に対する標準的治療と組み合わせて投与される。標準的治療は、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、放射線、手術、遺伝子治療などを含む。特定の例において、本明細書に記載される抗原結合のタンデム二重特異性抗体は、標準のＡＭＬ治療と組み合わせて投与される。特定の例において、本明細書に記載される抗原結合のタンデム二重特異性抗体は、シタラビン、アザシチジン、デシタビン、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン、イダルビシン、ドキソルビシンなど）、アムサクリン、フルダラビン、クロファラビン、クラドリビン、ネララビン、メトトレキサート、ボルテゾミブ、カーフィルゾミブ、メルファラン、イブルチニブ、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、アプレミラスト、エピポドフィロトキシン（例えばエトポシド、テニポシドなど）、アントラセンジオン（例えばミトキサントロン、ピクサントロン、ロソキサントロン、ピロクサントロン、アメタントロンなど）、抗ＣＤ２０薬剤（例えばリツキシマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ）、或いはそれらの組み合わせと組み合わせて、投与される。特定の例において、本明細書に記載される抗原結合のタンデム二重特異性抗体は、シタラビン（ａｒａ−Ｃ）と組み合わせて投与される。特定の例において、本明細書に記載される抗原結合のタンデム二重特異性抗体は、アザシチジンと組み合わせて投与される。特定の例において、本明細書に記載される抗原結合のタンデム二重特異性抗体は、デシタビンと組み合わせて投与される。更なる例において、本明細書に記載される抗原結合のタンデム二重特異性抗体は、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン、イダルビシン、ドキソルビシンなど）と組み合わせて投与される。他の例において、本明細書に記載される抗原結合のタンデム二重特異性抗体は、チェックポイント阻害剤（例えばＰＤ−１阻害剤、ＣＴＬＡ−４阻害剤など）と組み合わせて投与される。また他の例において、本明細書に記載される抗原結合のタンデム二重特異性抗体は、エピポドフィロトキシン（例えばエトポシド、テニポシドなど）と組み合わせて投与される。また他の例において、本明細書に記載される抗原結合のタンデム二重特異性抗体は、アントラセンジオン（例えばミトキサントロン、ピクサントロン、ロソキサントロン、ピロクサントロン、アメタントロンなど）と組み合わせて投与される。
【０１３８】
以下の実施例は、本発明の範囲を制限することなく、記載された実施形態を更に示すものである。
【０１３９】
＜実施例１＞
単鎖Ｆｖ抗体をコードするＤＮＡ発現構築物のクローン化
Ｅ．  ｃｏｌｉの抗ＣＤ３３単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体の細菌発現のために、全ての分子のＤＮＡコード配列を、細菌発現ベクターにクローン化した。周辺質への抗体分泌および精製をそれぞれ促進するために、Ｎ末端シグナルペプチドおよびＣ末端ヘキサ−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグのコード配列を含むように全ての発現構築物を設計した。全ての抗ＣＤ３３  ｓｃＦｖクローンからのＶＬおよびＶＨ−ドメインのアミノ酸配列を、表３と表４に示す。
【０１４０】
Ｅ．ｃｏｌｉの組換え型抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ抗体の発現
組換え型ｓｃＦｖ抗体を、Ｅ．ｃｏｌｉ周辺質において可溶性の分泌タンパク質として発現させた。第１の工程において、アンピシリンで補われた小さな培地に、形質転換した細菌を播種させ、２８℃で１６時間インキュベートした。その後、アンピシリンで補われた第２の培地を加えることにより光学密度を調整し、光学密度が６００ｎｍで０．６〜０．８の範囲に到達するまで２８℃でもう１回インキュベートした。５０μＭのＩＰＴＧの追加、および、１６時間までの２１−２８℃および２００ｒｐｍでの培養物のインキュベーションを介して、タンパク質発現を誘発させた。インキュベーション後、細胞を小球にし（３０分、４℃、７５００ｒｐｍ）、更に処理するまで−２０℃で保存した。
【０１４１】
抗ＣＤ３３単鎖Ｆｖ抗体の精製
緩衝液中で細胞ペレットを再懸濁することによる細菌細胞培養物の遠心分離、および優しく撹拌しながらの室温で３０分間のインキュベーションの後、組換え型ｓｃＦｖをＥ．ｃｏｌｉ周辺質から抽出した。細胞をペレット状にし、組換え型タンパク質を含む上清を維持した。上清をプールし、超音波処理により均質化する前に、この手順をもう１回繰り返した。ホモジネートを希釈し、低濃度のイミダゾールで補い、予め包装済みの固定された金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に詰めた。ベースラインが到達するまでカラムを洗浄し、その後結合された境界タンパク質をイミダゾール緩衝液で溶出した。抗体含有画分をプールし、その後、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製した。最終的に、タンパク質溶出液を限外濾過により濃縮し、保存緩衝液に対して透析した。低ｐＨでの処置後（３７℃で２０−２４時間、ｐＨ３．０でのインキュベーション）、Ｔｒｉｓを使用してサンプルを中和させた。精製されたタンパク質を、使用するまで−８０℃でアリコートとして保存した。
【０１４２】
実施例２
タンデム二重特異性抗体（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））をコードするＤＮＡ発現構築物のクローン化
ＣＨＯ細胞中の二重特異性タンデム二重特異性抗体の発現のために、全ての分子のコード配列を、哺乳動物発現ベクターシステムへとクローン化した。実施例１の抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖドメインを使用して、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖドメインと組み合わせてＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体を構築し、ドメインは表７と図３に示されるように組み立てられる。簡潔に、ペプチドリンカー（ＶＨ−リンカーＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨ）により分離された抗ＣＤ３３  ＶＨおよびＶＬのドメインをコードする遺伝子配列を合成し、サブクローン化した。結果として生じる構築物を消化し、リンカー配列内に位置するＢａｍ ＨＩ制限部位を利用して別個のＶＨおよびＶＬのコード配列を生成した。その後、これらＶＨおよびＶＬのフラグメントを、抗ＣＤ３（ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨ）のＶＨおよびＶＬのドメインをコードするＤＮＡフラグメントでライゲートして、最終構築物を得た。ＣＤ３３／ＣＤ３のタンデム二重特異性抗体のドメイン順序変異体１〜３を、図３に示す。周辺質への抗体分泌および精製をそれぞれ促進するために、Ｎ末端シグナルペプチドおよびＣ末端ヘキサヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグのコード配列を含むように全ての発現構築物を設計した。
【０１４３】
安定してトランスフェクトされたＣＨＯ細胞におけるタンデム二重特異性抗体の発現
ＣＨＯ細胞発現系（Ｆｌｐ−Ｉｎ（登録商標）， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣＨＯ−Ｋ１チャイニーズハムスター卵巣細胞の誘導体（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−６１）（Ｋａｏ ａｎｄ Ｐｕｃｋ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９６８； ６０（４）：１２７５−８１）を使用した。Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより提供される標準の細胞培養プロトコルに従って、付着細胞を二次培養した。
【０１４４】
懸濁液中の成長に対する適応のために、細胞を組織培養フラスコから引き離し、無血清培地に配した。懸濁液に適応した細胞を、１０％のＤＭＳＯを含む培地に凍結保存した。
【０１４５】
分泌されたタンデム二重特異性抗体を安定して発現させる、組換え型ＣＨＯ細胞株を、懸濁液に適応した細胞のトランスフェクションにより生成した。抗菌性のヒグロマイシンＢでの選択中、生細胞密度を週に２回測定し、細胞を遠心分離し、０．１×１０６生細胞／ｍＬの最大密度で新鮮な選択培地の中で再懸濁した。タンデム二重特異性抗体を安定して発現させる細胞プールを選択の２−３週後に回収し、その時点で細胞は振盪フラスコの標準培地に移される。組換え型分泌タンパク質の発現を、タンパク質のゲル電気泳動またはフローサイトメトリーの実行により確認した。安定した細胞プールを、ＤＭＳＯ含有培地に凍結保存した。
【０１４６】
タンデム二重特異性抗体を、細胞培養上清への分泌により安定してトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株の１０日間の流加回分培養において生成した。典型的に＞７５％の培養物の生存率で、細胞培養上清を１０日後に採取した。サンプルを一日おきに生成培養物から集め、細胞密度と生存率を評価した。採取の当日、更なる使用の前に、細胞培養上清を遠心分離と真空濾過により取り除いた。
【０１４７】
細胞培養上清におけるタンパク質発現の力価および生成物の保全性をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１４８】
タンデム二重特異性抗体の精製
タンデム二重特異性抗体から２工程の手順でＣＨＯ細胞培養上清を精製した。Ｈｉｓ６のタグを付けた構築物を、第１工程でＮｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗクロマトグラフィーにさらし、第２工程でＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００の上で分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）にさらした。溶出されたタンデム二重特異性抗体を、それらのホモ二量体（タンデム二重特異性抗体）内容物に関して特徴化し、ホモ二量体内容物が９０％以上であった場合にプールした。最終的に、プールされたサンプルを緩衝液交換し、限外濾過により濃縮することで＞１ｍｇ／ｍＬの典型的な濃度とした。最終サンプルの純度および均質性（典型的に＞９０％）を、還元条件および非還元条件下でのＳＤＳ  ＰＡＧＥ、次いで抗Ｈｉｓ−タグ抗体を使用する免疫ブロット法、同様に分析ＳＥＣ、それぞれによって評価した。精製されたタンパク質を、使用するまで−８０℃でアリコートとして保存した。
【０１４９】
ＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体のポリペプチドを、表７と図３に示す。タンデム二重特異性抗体はそれぞれ、２つの同一のポリペプチドから成る（図１）。外部リンカーＬ１とＬ３の両方は、６つのアミノ酸ＧＧＳＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５）で構成され、一方で中央ペプチドリンカー２は長さが異なり（４−６のアミノ酸）、配列ＧＧＳＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６）、ＧＧＳＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）、またはＧＧＳＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５）それぞれを有している。
【０１５０】
一連の抗ＣＤ３３可変ドメインおよび抗ＣＤ３可変ドメインを使用して、大きなタンデム二重特異性抗体分子を生成し、これは、トランスフェクトされた細胞株において安定して生成されるとともに、体温で、同様に凍結／解凍のサイクルの繰返しの後に安定性を維持した。更なる開発および前臨床の毒性研究を促進するために、ヒトおよびカニクイザル両方のＣＤ３３への結合を示したタンデム二重特異性抗体分子の選択に重点を置いた。完全なアミノ酸配列の例を、図１０Ｌ、１０Ｎ、および１０Ｐそれぞれにおいて、タンデム二重特異性抗体１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）、１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１）、および１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３）の単鎖について示す。この例において、可変ドメインの順序、および構造に関するそれらのリンカーは、次のとおりである：ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３３）−Ｌ３−ＶＨ（ＣＤ３）。Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジン（６×Ｈｉｓ）−タグを、精製中に切断する。上述のタンデム二重特異性抗体の完全なアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンタグの除去後、図１１Ｌ、１１Ｎ、および１１Ｐそれぞれに示されるように、タンデム二重特異性抗体１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４）、タンデム二重特異性抗体１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６）、およびタンデム二重特異性抗体１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８）である。
【０１５１】
実施例３
フローサイトメトリーによる抗体親和性の判定
ＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体の１００μＬの段階希釈により、細胞をインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した後、細胞を、氷の上で４５分間、同じ緩衝液の中で、１０μｇ／ｍＬのマウスモノクローナル抗Ｈｉｓ抗体０．１ｍＬでインキュベートした。２回目の洗浄サイクルの後、細胞を、以前と同じ条件下で１５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体０．１ｍＬでインキュベートした。対照として、細胞を、抗Ｈｉｓ ＩｇＧ、その後、抗ＣＤ３３タンデム二重特異性抗体が無いＦＩＴＣ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体でインキュベートした。その後、細胞を再び洗浄し、死細胞を除外するために２μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有する０．２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁した。１×１０４の生細胞の蛍光を、ＭＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｋｒｅｆｅｌｄ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ ＦＣ５００  ＭＰＬフローサイトメーター、または、Ｉｎｃｙｔｅソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーターを用いて測定した。細胞サンプルの平均蛍光強度を、ＣＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｋｒｅｆｅｌｄ， Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＩｎｃｙｔｅソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して計算した。第二・第三の試薬単独で染色した細胞の蛍光強度値を控除した後、この値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ ６．００ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ， ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ）の１サイト結合（双曲線）の方程式でのＫＤ値の計算に使用した。
【０１５２】
タンデム二重特異性抗体を、ヒトＣＤ３＋とＣＤ３３＋細胞およびカニクイザルＣＤ３＋とＣＤ３３＋細胞に対するそれらの結合親和性について試験した。選択されたタンデム二重特異性抗体の典型的な結合データを表８に要約する：
【０１５３】
【表９】
2018516248.tif 000011
【０１５４】
＃ＫＤ比率カニクイザルＣＤ３３／ヒトＣＤ３３を、カニクイザルＣＤ３３およびヒトＣＤ３３をそれぞれ発現させるＣＨＯ細胞上で測定されたＫＤ値に基づいて計算した。
【０１５５】
【数１】
2018516248.tif 000012
比率ｈｕ ＣＤ３／ｈｕ ＣＤ３３を、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ｈｕ ＣＤ３）上で測定されたＫＤ値、および、３つのヒトＣＤ３３＋腫瘍細胞株（ＨＬ−６０、ＫＧ−１、Ｕ９３７）の平均ＫＤに基づいて計算した。
【０１５６】
ＣＤ３結合親和性と交差反応性を、ＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｄｒ． Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ， ＤＫＦＺ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇにより提供される；ヒト急性Ｔ細胞白血病）およびカニクイザルＣＤ３＋ＨＳＣ−Ｆ細胞株（ＪＣＲＢ， ｃａｔ．：ＪＣＲＢ１１６４）に対する滴定およびフローサイトメトリー実験において評価した。ＣＤ３３結合と交差反応性を、ヒトＣＤ３３＋腫瘍細胞株：ＨＬ−６０（ＤＳＭＺ， ｃａｔ．：ＡＣＣ ３、ヒトＢ前駆細胞白血病）、Ｕ−９３７（ＤＳＭＺ， ｃａｔ．：ＡＣＣ５；ヒト細網肉腫）、およびＫＧ−１（ＤＳＭＺ， ｃａｔ．：ＡＣＣ１４；急性骨髄性白血病）の上で評価した。交差反応性のＫＤ比率を、組換え型ヒト抗原または組換え型カニクイザル抗原を発現させるＣＨＯ細胞株上で判定されたＫＤ値を使用して、計算した。
【０１５７】
タンデム二重特異性抗体は、１ｎＭより下の試験された腫瘍細胞株の大半の上でのヒトＣＤ３３＋に対する比較的高い親和性を示した。ヒトＣＤ３に対する親和性は、２ｎＭ以下であると判定された。
【０１５８】
実施例４
細胞毒性アッセイ
細胞毒性アッセイのために、標準条件下で培養された標的細胞を採取し、洗浄し、ＰＫＨ６７ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｋｅｒ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔに提供される希釈剤Ｃの中で、２×１０７細胞／ｍＬの密度に再懸濁した。その後、細胞懸濁液を、等量の２倍濃縮したＰＫＨ６７標識溶液と混合し、ＲＴで２−５分間インキュベートした。等量のＦＣＳを加えて１分間インキュベートすることにより、染色反応を実行した。完全なＲＰＭＩ培地で標識化標的細胞を洗浄した後、細胞を計数し、完全なＲＰＭＩ培地において２×１０５細胞／ｍＬの密度に再懸濁した。その後、２×１０４の標的細胞を、２００μＬ／ウェルの総量で、マイクロタイタープレートの個々のウェルにおける示されたタンデム二重特異性抗体の濃度の増大の存在下、５：１のＥ：Ｔ比率でエフェクター細胞として豊富なヒトＴ細胞と共に播種した。抗体が無い状態での自発的な細胞死、およびＴ細胞による標的の死滅を、各プレート上で少なくとも３回の複製について測定した。遠心分離後、アッセイプレートを、５％のＣＯ２を含む湿気のある大気において３７℃で、示された期間にわたりインキュベートした。インキュベーションの後、培養物をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、次いで、２μｇ／ｍＬのＰＩで補われた１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液の中で再懸濁した。標的生細胞の絶対量を、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ ＦＣ５００ ＭＰＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ＰＫＨ６７でのポジティブグリーン染色およびＰＩのネガティブ染色により測定した。測定された残る標的生細胞に基づき、特定の細胞溶解のパーセンテージを、以下の式に従い計算した：［１−（生きた標的（サンプル）の数／生きた標的（自発性）の数）］×１００％。Ｓ字状の用量応答曲線とＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用して非線形回帰／４つのパラメータのロジスティックフィットにより計算した。与えられた抗体濃度について得られた溶解値を使用して、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて４つのパラメータのロジスティックフィット分析によりＳ字状の用量応答曲線を計算した。
【０１５９】
ＥＣ５０値を、５：１の比率でエフェクター細胞として豊富なヒトＴ細胞を含むＣＤ３３＋Ｕ−９３７（ＤＳＭＺ， ｃａｔ．：ＡＣＣ５；ヒト細網肉腫）標的細胞上での２０−２４時間のアッセイにおいて測定した。幾つかのタンデム二重特異性抗体も、ＣＤ３３＋ＫＧ−１（ＤＳＭＺ， ｃａｔ．：ＡＣＣ１４；急性骨髄性白血病）とＨＬ−６０標的細胞上での細胞毒性分析において試験した。具体的に、ＨＬ−６０細胞を、ＣＤ３３（任意のＭＦＩ［平均±ＳＥＭ］：３，１３３±２１５；ｎ＝３）の比較的高度な細胞表面発現を持つＡＭＬのモデルとして選択し、ＫＧ−１ａを、ＣＤ３３発現が非常に制限されているＡＭＬのモデル（任意のＭＦＩ：２７７±１１；ｎ＝３）として選択した。選択されたタンデム二重特異性抗体の典型的な細胞毒性データを表９に要約する。ＨＬ−６０細胞株の付加的な細胞毒性データは、表８の最後のカラムにて見出される。
【０１６０】
【表１０】
2018516248.tif 000013
【０１６１】
２０−２４時間インキュベートされた、示された標的細胞株の上で、５：１のＥ：Ｔ比率で、にエフェクター細胞としての一次ヒトＴ細胞でのＦＡＣＳベースの細胞毒性分析において、ＥＣ５０値を測定した。タンデム二重特異性抗体をそれぞれ、少なくとも２つの独立した実験において各腫瘍細胞株に対し試験した。平均値を提示する。
【０１６２】
実施例５
４８時間でのヒトＣＤ３３＋ＡＭＬ細胞株における更なる細胞毒性スクリーニング実験
上述のように、有意な細胞毒性は早ければ２４時間で検出されるが、より高レベルの毒性は４８時間で検出され得る。次のアッセイのために、４８時間の時点を選択した。タンデム二重特異性抗体で誘発された細胞毒性に対するＴ細胞選択の影響を試験した。これを達成するために、健康なボランティアドナーから未刺激のＰＢＭＣを得て、ＣＤ３＋細胞を、ＣＤ３マイクロビーズの使用による単純な「正の豊富化」、並びに、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、およびＣＤ２３５ａに対する抗体のマイクロビーズカクテルによるより複雑な「負の選択」の両方によって、分離した。図４に表されるように、タンデム二重特異性抗体で誘発された細胞毒性は、正に選択されたＴ細胞よりも、負に選択された健康なドナーＴ細胞の方が大きかった。しかし、個々のタンデム二重特異性抗体の相対的な細胞毒性活性は、Ｔ細胞選択の方法により影響を受けなかった。それ故、後のアッセイを、正に豊富な健康なドナーＴ細胞で実行した。
【０１６３】
ＦＨＣＲＣ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄにより承認された研究プロトコル下でのＦｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＦＨＣＲＣ）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｃｏｒｅ（Ｃｏｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ）による白血球アフェレーシスを介して、健康な成人ボランティアから未刺激の単核細胞を集めた。Ｔ細胞を、ＣＤ３マイクロビーズ（「正の豊富化」）またはＰａｎ Ｔ細胞細胞分離キット（「負の選択」；共にＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ａｕｂｕｒｎ， ＣＡから）の何れかを介した磁気細胞分類により豊富化して、アリコート中で凍結し、液体窒素中で保存した。解凍した細胞アリコートを、製造業者の指示に従い３μＭのＣｅｌｌＶｕｅ Ｂｕｒｇｕｎｄｙ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）で標識化する。精製したＰＢＭＣを、様々な濃度のタンデム二重特異性抗体分子の存在下で培養した。
【０１６４】
薬物で誘発された細胞毒性の定量化のために、細胞を実施例４におけるように、異なるＥ：Ｔの細胞比率で、（５％のＣＯ２および空気の中）３７℃でインキュベートした。２４−７２時間後、細胞数および薬物で誘発された細胞毒性を、生育不能な細胞を検出するためのＤＡＰＩを使用して、ＬＳＲＩＩ血球計算器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により判定し、ＦｌｏｗＪｏで分析した。ＡＭＬ細胞を、前方／側方散乱特性、および、健康なドナーＴ細胞が加えられた実験においてはＣｅｌｌＶｕｅ  Ｂｕｒｇｕｎｄｙの色素に関する陰性により識別した（図５）。薬物で誘発された細胞毒性を次のように提示する：％細胞毒性＝１００×（１−標的生細胞処置した（ｔｒｅａｔｅｄ）／標的生細胞対照（ｃｏｎｔｒｏｌ））。細胞毒性アッセイの結果を、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として提示する。スピアマンのノンパラメトリック相関性を使用して、連続的なサンプル特徴間の相関性を計算した。Ｐ値は全て両側性である。統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して実行した。
【０１６５】
健康なドナーＴ細胞が無い状態で、ＣＤ３３／ＣＤタンデム二重特異性抗体のどちらも、Ｔ細胞の無い状態ではＡＭＬ細胞株に対して顕著な細胞毒性効果を及ぼさず、このことは、それらの細胞毒性効果にＴ細胞の絶対的な必要性を確認した（データは示されず）。Ｔ細胞の存在下で、タンデム二重特異性抗体で誘発された特異的な細胞毒性の範囲は、タンデム二重特異性抗体の濃度、同様にＥ：Ｔ細胞の比率に依存していた。ＣＤ３３／ＣＤ３に向けられたタンデム二重特異性抗体分子と１つの対照のタンデム二重特異性抗体（００）との直接の比較は、ＨＬ−６０細胞（図６Ａ／Ｂと表１０）およびＫＧ−１ａ細胞（図６Ｃ／Ｄと表１０）の両方において抗体で誘発された細胞毒性の相当な差異を示し、結果は、繰り返しの実験において高度に複製可能であった。全体として、タンデム二重特異性抗体で誘発された細胞毒性の程度は、一次ヒトＴ細胞上でのＣＤ３の結合親和性と相関した（２５ｐＭ（およそ２．５ｎｇ／ｍＬ）およびＥ：Ｔ＝５：１：ｒ＝−０．５４２、ｐ＝０．００９でのＫＧ−１ａ細胞における細胞毒性について；２５ｐＭおよびＥ：Ｔ＝５：１：ｒ＝−０．３９１、ｐ＝０．０７でのＨＬ−６０細胞における細胞毒性について）。タンデム二重特異性抗体１２、１４、１６は、ＨＬ−６０とＫＧ−１ａ細胞の両方に対し光度に細胞毒性であった。
【０１６６】
【表１１】
2018516248.tif 000014
【０１６７】
実施例６
一次ヒトＡＭＬ標本におけるタンデム二重特異性抗体の更なる特徴化
これら候補の細胞毒性特性の包括的な特徴化のために、ＡＭＬ患者由来の標本を、研究用にＦＨＣＲＣ標本貯蔵所から得た。
【０１６８】
ＡＭＬを持つ成人患者からの前処置（「診断上の」）末梢血または骨髄の標本からフィコール分離された単核細胞の冷凍アリコートを、ＦＨＣＲＣにある貯蔵所から得た。ＡＭＬを定義するために２００８年のＷＨＯの基準を使用し（Ｖａｒｄｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．； Ｂｌｏｏｄ． ２００９； １１４（５）：９３７−９５１）、および、細胞遺伝学的リスクを割り当てるために洗練された英国医学研究評議会（ＭＲＣ）の基準を使用した（Ｇｒｉｍｗａｌｄｅ ｅｔ ａｌ．； Ｂｌｏｏｄ． ２０１０；１１６（３）：３５４−３６５）。患者は、ＦＨＣＲＣ治験審査委員会により承認されたプロトコルの下での研究目的用の生体標本の収集および使用についてのインフォームドコンセントの文書を提供した。医療保険の相互運用性と説明責任に関する法律の規則に従い、臨床データを匿名化した。解凍後、細胞を、直接標識された抗体を認識するＣＤ３３（クローンＰ６７．６；ＰＥ−Ｃｙ７−共役）、ＣＤ３（クローンＳＫ７；ＰｅｒＣＰ−共役）、ＣＤ３４（クローン８Ｇ１２；ＡＰＣ−共役；全てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ由来）、およびＣＤ４５（クローンＨＩ３０；ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）７８０−共役；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。生育不能な細胞を識別するために、サンプルを４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。少なくとも１０，０００の事象を、Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で獲得し、ＤＡＰＩ細胞をＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ， Ａｓｈｌａｎｄ， ＯＲ）を使用して分析した。
【０１６９】
解凍後、ＣＤ４５／側方散乱特性に基づいてフローサイトメトリーにより判定されるように、標本には＞５８％のＡＭＬ芽細胞があった。標本には、解凍直後に＞５０％の生細胞、およびサイトカイン含有液体培養物において４８時間後に＞５０％の生細胞があった（図７）。患者の中央年齢は５８．１（範囲：２３．９−７６．２）歳であり；細胞遺伝学的な疾病リスクは、２人において良好、１８人において中間、７人において有害であった。ＮＰＭ１、ＦＬＴ３、およびＣＥＢＰＡの突然変異状態に関する情報は不完全であるが、１つのサンプルはＣＥＢＰＡ二重突然変異体であることが分かり、別のサンプルはＮＰＭ１ｐｏｓ／ＦＬＴ３−ＩＴＤｎｅｇであることが分かった。研究された標本における骨髄性芽細胞およびＣＤ３＋Ｔ細胞の中間のパーセンテージは、それぞれ８６．１％（範囲：５８．４−９７．０％）と２．０％（範囲：０−１１．９％）であり、培養物中の４８時間後の中間のサンプル生存率は８０．１％（範囲：５３．６−９３．６％）であった。患者のうち１５人は新しくＡＭＬと診断され、一方で１２人は標本採取の時点で再発性（ｎ＝７）または難治性（ｎ＝５）何れかの疾患を有していた。表１１に要約されるように、新たに診断されたＡＭＬを持つ患者由来の標本の基本特性は、骨髄性芽細胞上でのＣＤ３３発現、自己由来のＴ細胞の量、骨髄性芽細胞の比率、および培養物の生存率に関して、再発性／難治性疾患を持つ患者と同様であった。
【０１７０】
ＡＭＬ標本の培養物へのタンデム二重特異性抗体分子の添加の結果、適度の用量依存性の細胞毒性（図８Ａ）がもたらされ、このことは、活性ＡＭＬを持つ患者由来の標本に含まれる自己由来のＴ細胞が白血病細胞を溶解するように結合され得ることを実証している。健康なドナーＴ細胞の存在下で、個々のタンデム二重特異性抗体の細胞毒性活性は、薬物用量とＥ：Ｔ細胞の比率に厳密に依存していた（図８Ｂ／Ｃ）。しかし、高活性のタンデム二重特異性抗体の高活性は、ＡＭＬ芽細胞上で非常に低いＣＤ３３発現を伴う一部の標本においてさえも観察された。タンデム二重特異性抗体分子の中で、１２が最も活性であると考えられ、その理由として、Ｅ：Ｔ＝１：３およびＥ：Ｔ＝１：１の両方で、低濃度（２．５ｐＭ（およそ２５０ｎｇ／ｍＬ）、およびあまり目立たない程度で１０ｐＭ（およそ１ｎｇ／ｍＬ））で最も高い細胞毒性を有していたためである。
【０１７１】
ＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体を、典型的なＡＭＬ患者の血液サンプルでスクリーニングし、このサンプルは、患者の性別、年齢、疾患ステージ（新たに診断されたもの、再発性のもの、難治性のもの）、ＣＤ３３発現の程度、および細胞発生のリスクに関して変動するものであった（表１１）。著しいことに、多くの検査されたタンデム二重特異性抗体（例えば、０２、０８、０９、１１、１２、１４、１６、１９、２２、および２３）は、図１７に示されるように疾患スペクトラムにわたりほぼ全ての患者サンプルにおいて非常に活性であった。更に、活性の程度と範囲は、新たに診断された患者、再発性の患者、および難治性の患者を含む、ＡＭＬの全てのステージにおいて同様である。
【０１７２】
【表１２】
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【０１７３】
実施例７
異なるレベルのＣＤ３３を発現させる様々な起原の異なるＣＤ３３＋細胞株に対する、ＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体１２およびタンデム二重特異性抗体１６の効力と効果
ＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体の効力と効果は、標的細胞上でＣＤ３３密度に依存するのかどうかを評価するために、様々なヒトＣＤ３３＋腫瘍細胞株、および、組換え型ヒトＣＤ３３を発現するＣＨＯ細胞を、ＱＩＦＩＫＩＴ定量化キットと抗ＣＤ３３  ｍＡｂ  ＷＭ５３を使用して、それらのＣＤ３３発現レベルについて試験した。表１２の結果は、腫瘍細胞株上のＣＤ３３密度が、〜１３００のＳＡＢＣ（標準化された抗体結合能力）と〜４６０００のＳＡＢＣとの間の範囲にあったことを示している。ＣＨＯ−ＣＤ３３細胞上での発現は〜１９７０００のＳＡＢＣであり、これは腫瘍細胞株上のものよりも実質的に高かった。試験したＣＤ３３＋細胞株を全て、ＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体１２とタンデム二重特異性抗体１６の段階希釈の存在下、５：１の標的対エフェクターの比率で、エフェクター細胞としてのヒトＴ細胞での少なくとも３つの独立したＦＡＣＳベースの細胞毒性分析において、標的細胞として使用した。各アッセイにおいて、ＥＣ５０およびタンデム二重特異性抗体を媒介とした溶解値を、非線形回帰により計算した。その結果、１２および１６の効力（ＥＣ５０値）も効果（％溶解）も、標的細胞の表面上のＣＤ３３の密度とは相互に関連しないことが実証される。
【０１７４】
注目すべきことに、少なくとも１２と１６は、１５００未満のＳＡＢＣの非常に低いＣＤ３３密度を持つＳＥＭのような細胞に対しても、それらの細胞毒性活性を示している。
【０１７５】
【表１３】
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【０１７６】
ＣＤ３３＋細胞株上の標準化された抗体結合能力（ＳＡＢＣ）を、ＱＩＦＩＫＩＴおよび抗ＣＤ３３ ｍＡｂ ＷＭ５３を使用して判定した。タンデム二重特異性抗体１２とタンデム二重特異性抗体１６で再指向された標的細胞溶解のＥＣ５０値を、５：１のＥ：Ｔの比率および２０−２４時間のインキュベーションで、エフェクター細胞としてのヒト一次Ｔ細胞でのＦＡＣＳベースの細胞毒性分析において判定し、ＣＤ３３を発現するＣＨＯ細胞でのアッセイを４０−４８時間インキュベートした。少なくとも３つの独立したアッセイの平均およびＳＤを示す。
【０１７７】
実施例８
Ｔ細胞のＴａｎｄＡｂ−活性化、およびＡＭＬ細胞のインビトロでの死滅
ＴａｎｄＡｂを、精製されたヒトＴ細胞およびＶＰＤ−４５０−標識化ヒトＣＤ３３＋白血病細胞株、ＫＧ−１、またはＣＤ３３−ヒトＡＬＬ細胞株、Ｇ２でインキュベートした（Ｅ：Ｔ  ５：１）。フローサイトメトリーを使用して、ＴａｎｄＡｂにより標的細胞溶解を評価した（１０−１５〜１０−８Ｍ；２４時間、３７℃）。
【０１７８】
ヒトＴ細胞でのＴａｎｄＡｂ １２、１６、および１９のインキュベーションにより、ＫＧ−１細胞を効率的に溶解した（それぞれ、ＩＣ５０〜０．０１、０．５、および５ｐＭ）。４０％までのＴ細胞を活性化させ（ＣＤ２５＋）、細胞毒性活性を増加させる。無関係の標的を持つ対照ＴａｎｄＡｂ、００（＞１０−７Ｍ）は、インビトロでＫＧ−１の有意な死滅をもたらさなかった。別々に、１６はＫＧ−１細胞の溶解を誘発し（ＩＣ５０＝５×１０−１２Ｍ）、一方で１×１０−８ＭにはＣＤ３３−Ｇ２細胞に対して効果が無かった。結果は、Ｔ細胞が活性化されるようになり、且つ、ＣＤ３３／ＣＤ３ ＴａｎｄＡｂによりＣＤ３３＋白血病細胞（ＫＧ−１）および一次ＣＤ３３＋ＡＭＬ芽細胞に標的化された時に強力に腫瘍細胞を溶解することを示している。
【０１７９】
実施例９
エピトープのマッピング
ＣＤ３３結合エピトープを識別するために、異なるＣＤ３３結合部分を含むタンデム二重特異性抗体を、ＣＬＩＰＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐｅｐｓｃａｎ）を使用したエピトープのマッピングにさらした。
【０１８０】
ＣＬＩＰＳ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙは、単一ループ、二重ループ、三重ループ、シート状の折り畳み（ｆｏｌｄｓ）、螺旋状の折り畳み、およびそれらの組み合わせへのペプチドの構造化を促進して、標的分子の不連続的なエピトープをマッピングする可能性を提供する。
【０１８１】
７０００を超える独立したペプチドのアレイを合成し、ペプチドに対する各抗体の結合をＥＬＩＳＡで試験した。
【０１８２】
タンデム二重特異性抗体１２、１４、１６、および２２は、ヒトＣＤ３３のドメインのような第１のＩｇにおいてストレッチ６２ＤＱＥＶＱＥＥＴＱ７０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）に結合する。それぞれのアミノ酸ストレッチを、図１０と１１において下線と太線で示す。タンデム二重特異性抗体０１、０２、０４、０６、０８、０９、１３、および２３は、タンデム二重特異性抗体１２、１４、１６、および１２と同じＣＤ３３結合ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と１２、３と１３、５と１５、９と１９）を共有するため、このエピトープにも結合することが、考慮される。
【０１８３】
実施例１０
予防的なインビボの腫瘍モデルにおける用量応答
タンデム二重特異性抗体１２と１６を、ヒトＴ細胞で再構成されたＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの予防的なＨＬ−６０腫瘍異種移植片モデルの異なる用量レベルで比較する。用量応答を達成するために、１０、１、および０．１μｇ（０．５、０．０５、および０．００５ｍｇ／ｋｇ）での３つの用量レベルを選択した。
【０１８４】
免疫不全のＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの８つの実験群に、４×１０６のＨＬ−６０細胞の懸濁液を皮下注射により異種移植した。注射前に細胞を、負の選択を利用してバフィーコート（健康なドナー）から分離された３×１０６のＴ細胞と混合した。Ｔ細胞の潜在的なドナーの可変性を説明するために、実験群の各々を３つのコホートに細分し、各々１つの個体のドナーのみのＴ細胞を受ける。腫瘍細胞とＴ細胞を移植した実験群の動物は全て、０、１、２、３、および４日目に（ｑｄｘｄ５）、示されるような３つの異なる用量レベル（０．１μｇ、１μｇ、および１０μｇ）でビヒクル（対照）、１６、または１２の何れかの静脈内ボーラスを受けた。エフェクター細胞およびビヒクルでの処置が無い１つの群は、追加の対照として役立った。表１３は、群の割当と投薬スケジュールを要約している。
【０１８５】
【表１４】
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【０１８６】
ＨＬ−６０異種移植片モデルにおけるインビボの用量応答研究のための処置群。対照群の動物は全て、確実に腫瘍を発達させ、均質的な腫瘍増殖を示した。Ｔ細胞の存在には、腫瘍増殖に対して影響がなかった。ＨＬ−６０の増殖における差異は、ビヒクルで処置した対照群にＴ細胞がある状態または無い状態では観察されなかった。
【０１８７】
両方の試験アイテムでの処置により、明らかな用量依存性の抗腫瘍効果が明らかとなった（図１２）。実質的な差異は、２つのタンデム二重特異性抗体間では見出されなかった。図１２における平均腫瘍容積のプロットを、処置群の大半が完全であった２９日目に制限した。４５日目まで研究を継続し、腫瘍の無い生存について動物を観察した。１０または１μｇの１６で処置した群において、９匹の動物のうち６匹には、観察期間の終わりに腫瘍が無く、１０μｇの１２を受けた９匹の動物のうち５匹は、４５日目に腫瘍が無くなった。１匹の動物には、１μｇの１２で処置した時に腫瘍が無いままであった。
【０１８８】
対照群の動物は全て、確実に腫瘍を発達させ、均質的な腫瘍増殖を示した。タンデム二重特異性抗体の何れかでの処置は、用量依存性の抗腫瘍効果を明らかにし、実質的な差異は、２９日目まで２つのタンデム二重特異性抗体間では見出されなかった。
【０１８９】
検出可能な差異を、長期の観察（４５日）の後にのみ観察し、その時点で、低用量および対照の群は既に、大きな腫瘍の増殖により終了していた。１６で処置した群には、より多くの腫瘍の無い動物がいた。
【０１９０】
実施例１１
定着腫瘍モデル
１６を利用して予め定着されたＨＬ−６０腫瘍を持つＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの異種移植片モデルを発達させ、概念の証明を実証した。
【０１９１】
簡潔に、メスの免疫不全ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスを亜致死的に照射し（２Ｇｙ）、４×１０６のＨＬ−６０細胞を皮下に播種させた。９日目に、動物は、抗アシアロＧＭ１ウサギ抗体（Ｗａｋｏ， Ｎｅｕｓｓ， Ｇｅｒｍａｎｙ）の単一ボーラス注射を受け、マウスナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を消耗させた。１０日目に、腫瘍が５０−１５０ｍｍ３（平均７３±１１ｍｍ３）の容積に達すると、動物を３つの処置群に割り当てた。群２と３（各々８匹の動物）に、１．５×１０７の活性化ヒトＴ細胞を腹腔内注射した。注射前にＴ細胞を、負の選択を利用してバフィーコート（健康なドナー）から分離した。製造業者の使用書に従い（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｔ細胞活性化／拡張キットによりＴ細胞を拡張且つ活性化させた。潜在的なドナー可変性に対処するために、群２と３を２つのコホートに細分化し、各々、個々のドナーから拡張且つ活性化されたＴ細胞を受ける。コホートはそれぞれ、１つの個々のＴ細胞ドナーのみに由来するＴ細胞を受けた。
【０１９２】
【表１５】
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【０１９３】
１３日目の始めに、群３の動物は１０５ｍｍ３の平均腫瘍容積を示し、且つ、５０μｇのタンデム二重特異性抗体１６（ｑｄｘ９ｄ）を合計９回静脈内投与することで処置した。表１４は群の割当と投与スケジュールを示す。群１と２をビヒクルのみで処置した。体重と腫瘍容積を２７日目まで測定した。
【０１９４】
動物は全て腫瘍を確実に発達させ、このことは６日目に明白であった。ビヒクルで処置した群１と２（ＨＬ−６０）の動物の平均腫瘍容積は、２７日目の研究終了時まで絶えず増大した（図１３）。ＨＬ−６０腫瘍細胞に加えて、一次活性化ヒトＴ細胞を受けた群２の動物において、平均腫瘍容積は、群１（ＨＬ−６０のみ）と比較して、より急速に増大した。
【０１９５】
ヒトＴ細胞の存在下でのタンデム二重特異性抗体１６（５０μｇ／動物；２．５ｍｇ／ｋｇ）による１３日目〜２１日目（ｑｄｘｄ９）の繰り返しの静脈内の処置（群３）は、群１と群２に比べて腫瘍増殖を急速に遅らせた。タンデム二重特異性抗体１６は、ビヒクルで処置した対照群（群２）と比較して、およそ４−５日まで群３における腫瘍増殖を遅らせた。６日目から２７日目までの期間における統計的有意差を、２２日目（ｐ＜０．０５）、２３日目（ｐ＜０．０１）、および２７日目（ｐ＜０．０１）に、群２（ＨＬ−６０、Ｔ細胞、ビヒクル）と群３（ＨＬ−６０、Ｔ細胞、１６）との間で識別した（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法（ｐｏｓｔｔｅｓｔ）を用いた二元配置反復測定分散分析）。統計的有意差は、群１の腫瘍の増殖の異常な遅さにより、群１と群３の間には存在しなかった。
【０１９６】
Ｔ細胞活性に関するドナー可変性は、異なるドナー由来のＴ細胞を受ける群の中のコホート１とコホート２における腫瘍成長を比較した時には、観察されなかった（表１４を参照）。
【０１９７】
実施例１０は、予め定着したＨＬ−６０腫瘍（ＡＭＬ）および腹腔内移植されたヒトＴ細胞を持つＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの異種移植片モデルが、成功裡に発達したことを示している。単回投与レベルでのタンデム二重特異性抗体１６の繰り返しの投与は、それぞれのビヒクルで処置した対照群と比較して、腫瘍増殖の統計的に有意な遅延をもたらした。生成されたデータは、ＣＤ３３／ＣＤ３ ＢｉＴＥ（商標）による同様の研究のために公開された結果に匹敵している（Ａｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１２； Ｌｅｕｋｅｍｉａ， ２０１３， Ａｐｒ；２７（５）：１１０７−１５）。
【０１９８】
実施例１２
ＮＳＧマウスのＡＭＬ ＰＤＸモデルにおけるＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体の効果
ＣＤ３３＋白血病が２−４％のＣＤ３＋Ｔ細胞を含んでいた、ＡＭＬ患者由来の凍結保存細胞を使用して、ＮＳＧマウスにＡＭＬ ＰＤＸモデルを定着させた。照射された（２５０ｃＧｙ）ＮＳＧマウスへの腫瘍細胞の注射の１時間後、ＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体１６または１２を、２つの静脈内投与（５０μｇまたは５μｇ；ｎ＝８マウス／群）の何れかで、２００μＬのボーラスの中で注射した。タンデム二重特異性抗体の追加の注射を、次の４日間毎日行った。マウスの重さを週に１回量り、その後３８日目に屠殺し、フローサイトメトリーによる分析のために末梢血、骨髄、および脾臓を収集した（ｈｕＣＤ３３、ｈｕＣＤ３４、ｈｕＣＤ４５、ｍｕＣＤ４５、ｈｕＣＤ１４、ｈｕＣＤ３、ｈｕＣＤ４、ｈｕＣＤ８、および７ＡＡＤ）。結果を図１４に示す。
【０１９９】
図１４は、未処置のマウスが、３８日後に骨髄および脾臓に相当な量のヒト芽細胞を有していたことを示している。対照的に、タンデム二重特異性抗体１２または１６の静脈内注射を毎日受けたマウスは、骨髄および脾臓において実質的に少ない数のヒトＡＭＬ芽細胞を提示した。ＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体の強力な抗ＡＭＬ効果を、両方の用量レベル（５および５０μｇ／注射）で観察した。
【０２００】
両方のＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体１２および１６について観察された抗ＡＭＬ効果は、同一のマウスモデルにおいてＡＭＬを標的とするＣＤ１２３／ＣＤ３  ＤＡＲＴ（登録商標）抗体の効果よりもはるかに強力であった（Ｈｕｓｓａｉｎｉ ｅｔ ａｌ．：“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＤ１２３ Ｉｎ Ｌｅｕｋｅｍｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｄｕａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅ−Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ （ＤＡＲＴｓ（登録商標）） Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １５， ２０１３； Ｂｌｏｏｄ： １２２ （２１））。骨髄および脾臓において略全てのＡＭＬ芽細胞を排除した、ＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体とは対照的に、Ｈｕｓｓａｉｎｉらは、ＣＤ１２３／ＣＤ３ ＤＡＲＴ（登録商標）が、２．５および０．２５ｍｇ／ｋｇでＰＤＸモデルの骨髄および脾臓におけるＡＭＬ芽細胞の数を５０−１０００だけしか減らしていないを報告しており、且つ、ＣＤ１２３／ＣＤ３ ＤＡＲＴ（商標）が、０．５ｍｇ／ｋｇで、ＰＤＸモデルのみの骨髄および脾臓におけるＡＭＬ芽細胞の数を４０−７８％しか減少させていないと報告している。
【０２０１】
実施例１３
ＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体１６により媒介される標的細胞溶解の迅速な発生
ＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体により媒介される標的細胞溶解のキネティクスを評価するために、異なるインキュベーション時間でのカルセイン放出細胞毒性分析を行った。カルセインで標識化したＣＤ３３＋ＨＬ−６０標的細胞を、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、または５時間にわたり、２５：１のＥ：Ｔの比率で、エフェクター細胞としての一次ヒトＴ細胞の存在下でタンデム二重特異性抗体１６の段階希釈によりインキュベートした。各時点で、溶解された標的細胞から放出されたカルセインを使用し、非線形回帰／Ｓ字状の用量応答を用いてＥＣ５０値、および、タンデム二重特異性抗体１６により媒介された標的細胞溶解を計算した。図１５は、タンデム二重特異性抗体の濃度の飽和時に３０分のインキュベーション後、４０％を超える溶解を伴うタンデム二重特異性抗体により媒介された標的細胞溶解の、予期せぬ迅速な発生を示している。４時間のインキュベーション後、標的細胞溶解は９０％超に到達した。表１５と図１６は、３０分と５時間の間のインキュベーション時間におけるタンデム二重特異性抗体１６について判定されたＥＣ５０および特異的な溶解の値を要約している。その結果は更に、使用されたアッセイ条件下で、最大限の効力（最低のＥＣ５０値）がインキュベーションの２時間後に到達し、インキュベーションの５時間後に標的細胞は略全て溶解したことを実証している。まとめると、これらの結果は、ＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体により媒介される、非常に迅速で、強力で、且つ効果的な標的細胞溶解を実証している。
【０２０２】
【表１６】
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【０２０３】
実施例１４
ＡＭＬ患者へのＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体の投与のための、概念実証の臨床試験プロトコル
これは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の処置として、ＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体１６を研究するための第Ｉ／ＩＩ相臨床試験である。
【０２０４】
研究目的：
【０２０５】
第１：ＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体１６の最大耐用量
【０２０６】
第２：ＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体１６のインビトロでの応答が臨床応答に関連するかどうかを判定すること
【０２０７】
第Ｉ相
【０２０８】
最大耐用量（ＭＴＤ）を、試験の第Ｉ相セクションにおいて判定する。
１．１  最大耐用量（ＭＴＤ）を、試験の第Ｉ相セクションにおいて判定する。
１．２  適格基準を満たす患者を、ＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体１６に対する試験に参加させる。
１．３  目標は、参加者において重度または手に余る副作用無しに、安全に投与され得るＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体１６の最高用量を識別することである。与えられた用量は、以前の研究に登録された参加者の数、および用量にどれくらい十分な耐性があったかに依存する。全ての参加者が同じ用量を受けるとは限らない。
【０２０９】
第ＩＩ相
２．１  次の第ＩＩ相セクションをＭＴＤにおいて処理し、その目標は、ＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体１６による治療が、少なくとも２０％の応答率を結果としてもたらすかどうかを判定することである。
第ＩＩ相の第１の目的−−−ＣＤ３３／ＣＤ３タンデム二重特異性抗体１６の治療により、少なくとも２０％の患者が臨床応答（芽細胞応答、微細な応答、部分応答、または完全応答）を達成したかどうかを判定すること
【０２１０】
適格性：
急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）の患者を除き、ＷＨＯの基準を満たしている、末梢血と骨髄の分析により文書化されたＡＭＬ
一次誘導化学療法に抵抗性のあるＡＭＬを持つ、再発性疾患を持つ、または、６０歳以上の年齢であり、且つ処置する医師に従い年齢、パフォーマンスステータス、および／または有害な危険要因のために標準の細胞毒性治療に適切でない、患者
年齢≧１８歳
カルノフスキーパフォーマンスステータス≧５０％またはＥＣＯＧパフォーマンスステータス０−２
平均余命≧６週
【０２１１】
特定の実施形態が、本明細書に示され且つ記載されている一方で、このような実施形態が、ほんの一例として提供されることは当業者に明白であろう。多数の変形、変化、および置換は、本発明から逸脱することなく、当業者によって現在想到されるものである。本明細書に記載される実施形態の様々な代替案が、本実施形態を実行する際に利用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲およびその同等物の範囲内の方法および構造は、それにより包含されることが、意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
2018516248.tif 000029
【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
2018516248.tif 000031
【図１０Ｄ】
2018516248.tif 000032
【図１０Ｄ−１】
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【図１０Ｅ】
2018516248.tif 000034
【図１０Ｆ】
2018516248.tif 000035
【図１０Ｇ】
2018516248.tif 000036
【図１０Ｈ】
2018516248.tif 000037
【図１０Ｉ】
2018516248.tif 000038
【図１０Ｊ】
2018516248.tif 000039
【図１０Ｋ】
2018516248.tif 000040
【図１０Ｌ】
2018516248.tif 000041
【図１０Ｍ】
2018516248.tif 000042
【図１０Ｎ】
2018516248.tif 000043
【図１０Ｏ】
2018516248.tif 000044
【図１０Ｐ】
2018516248.tif 000045
【図１０Ｑ】
2018516248.tif 000046
【図１０Ｑ−１】
2018516248.tif 000047
【図１０Ｒ】
2018516248.tif 000048
【図１０Ｓ】
2018516248.tif 000049
【図１０Ｔ】
2018516248.tif 000050
【図１０Ｕ】
2018516248.tif 000051
【図１０Ｖ】
2018516248.tif 000052
【図１０Ｗ】
2018516248.tif 000053
【図１０Ｘ】
2018516248.tif 000054
【図１１Ａ】
2018516248.tif 000055
【図１１Ｂ】
2018516248.tif 000056
【図１１Ｃ】
2018516248.tif 000057
【図１１Ｄ】
2018516248.tif 000058
【図１１Ｅ】
2018516248.tif 000059
【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１１Ｊ】
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【図１１Ｋ】
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【図１１Ｌ】
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【図１１Ｍ】
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【図１１Ｎ】
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【図１１Ｏ】
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【図１１Ｐ】
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【図１１Ｑ】
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【図１１Ｒ】
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【図１１Ｓ】
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【図１１Ｔ】
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【図１１Ｕ】
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【図１１Ｖ】
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【図１１Ｗ】
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【図１１Ｘ】
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【図１２】
2018516248.tif 000079
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018516248.tif 000086
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