(57)【要約】  腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染した単球、単球由来細胞またはマクロファージが、がんなどの疾患の治療におけるこのような感染細胞の使用と一緒に開示される。【選択図】図１
2018509181.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染したｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ単球、単球由来細胞またはマクロファージ。
【請求項２】
細胞が、外因性磁性材料を含有する、請求項１に記載のｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ単球、単球由来細胞またはマクロファージ。
【請求項３】
腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染した単球、単球由来細胞またはマクロファージの集団を含む調製物。
【請求項４】
単球、単球由来細胞またはマクロファージが、外因性磁性材料を含有する、請求項３に記載の調製物。
【請求項５】
医学的処置の方法において使用するための、請求項３または４に記載の調製物。
【請求項６】
腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染した単球、単球由来細胞またはマクロファージを調製する方法であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで単球、単球由来細胞またはマクロファージを、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスと接触させる、ことを含む、前記方法。
【請求項７】
単球、単球由来細胞またはマクロファージを、磁性材料と接触させる、ことをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染した単球、単球由来細胞またはマクロファージの集団を含む調製物を生成する方法であって、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染した単球、単球由来細胞またはマクロファージの集団を提供し、そして、前記細胞の集団を含む調製物を処方する、ことを含む、前記方法。
【請求項９】
前記集団中の単球、単球由来細胞またはマクロファージが、外因性磁性材料を含有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
疾患の治療の方法において使用するための、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染し、所望により、外因性磁性材料を含有する単球、単球由来細胞またはマクロファージ。
【請求項１１】
疾患の治療において使用するための医薬の製造における、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染し、所望により、外因性磁性材料を含有する単球、単球由来細胞またはマクロファージの使用。
【請求項１２】
疾患の治療の方法において使用するための、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染した単球、単球由来細胞またはマクロファージの集団を含む調製物であって、単球、単球由来細胞またはマクロファージが、外因性磁性材料を含有し、方法が、対象に調製物を投与し、そして、投与された調製物の細胞を対象の身体中の所望の位置に向かわせるために、対象に磁場を適用する、ことを含む、前記調製物。
【請求項１３】
疾患の治療の方法において使用するための医薬の製造における、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染した単球、単球由来細胞またはマクロファージの集団の使用であって、単球、単球由来細胞またはマクロファージが、外因性磁性材料を含有し、方法が、対象に医薬を投与し、そして、投与された医薬の細胞を、対象の身体中の所望の位置に向かわせるために、対象に磁場を適用する、ことを含む、前記使用。
【請求項１４】
疾患ががんである、請求項１０に記載の疾患の治療の方法において使用するための単球、単球由来細胞またはマクロファージ、請求項１２に記載の疾患の治療の方法において使用するための調製物、あるいは、請求項１１または１３に記載の使用。
【請求項１５】
治療を必要とする対象において疾患を治療する方法であって、前記対象に、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染した単球、単球由来細胞またはマクロファージの集団を含む調製物を投与し、そして、それによって前記疾患を治療する、ことを含む、前記方法。
【請求項１６】
前記集団中の単球、単球由来細胞またはマクロファージが、外因性磁性材料を含有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
投与された調製物の細胞を対象の身体中の所望の位置に向かわせるために、対象に磁場を適用する、ことをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
疾患ががんである、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
所定量の腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスおよび所定量の磁性材料を含むパーツのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染した単球、単球由来細胞またはマクロファージ、およびがんなどの疾患の治療におけるこのような感染細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、高い死亡率、それに伴う経済的および社会的負担ならびにがんを克服した人が直面する心理学的問題のために世界中で最大の関心事の１つである。
治療に対する耐性は、一般に、腫瘍塊が、従来療法、すなわち、化学療法または放射線療法によって到達されない、または影響を受けない区域を示す場合に獲得される。これらの領域は、腫瘍容積の中心に位置し、一般に、高度に低酸素な環境を特徴とし、これは、酸素供給が細胞および間質の適当な呼吸には不十分であることを意味する（Ｓｈａｎｎｏｎ，Ａ．Ｍ．、Ｄ．Ｊ．Ｂｏｕｃｈｉｅｒ−Ｈａｙｅｓ、Ｃ．Ｍ．ＣｏｎｄｒｏｎおよびＤ．Ｔｏｏｍｅｙ、２００３  Ｔｕｍｏｕｒ  ｈｙｐｏｘｉａ，ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２９：２９７〜３０７）。腫瘍における細胞複製の速度が、血管形成のものを圧倒するために、固形腫瘍の不変の特徴である低酸素条件が発生する：したがって、酸素の連続的な要求が細胞性酸素センサーによって検出され、これが、血管新生出芽を刺激することによってその必要性に対応する。次に、血管新生は、がん塊内の不適切な分布を有する構造的に無秩序な血管の生成につながる（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｍ．Ｓｌｅｖｉｎ編．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ、Ｂｅｒｌｉｎ中、Ｋａｎｄｅｌ，Ｊ．Ｊ．、Ｄ．Ｊ．ＹａｍａｓｈｉｒｏおよびＪ．Ｋｉｔａｊｅｗｓｋｉ、２０１１  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｔｕｍｏｕｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ、８１〜９３頁）：これは、腫瘍の塊中の酸素の不適切な拡散および灌流につながる機能障害性微小脈管構造の発達を引き起こす（Ｖａｕｐｅｌ，Ｐ．、Ｏ．ＴｈｅｗｓおよびＭ．Ｈｏｅｃｋｅｌ、２００１  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ  −  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｈｙｐｏｘｉａ  ａｎｄ  ａｎｅｍｉａ．Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １８：２４３〜２５９）。最終的に、これは、低酸素をさらに増大するフィードバックループを作製する。
【０００３】
がんの低酸素区域の重要な特色は、がん発生の極めて早期段階から腫瘍塊中に浸潤する免疫細胞の著しい存在である（Ｄｉ  Ｃａｒｏ、Ｇ．、Ｆ．Ｍａｒｃｈｅｓｉ、Ｌ．ＬａｇｈｉおよびＦ．Ｇｒｉｚｚｉ、２０１３  Ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ：  ｐｌａｓｔｉｃ  ｐｌａｙｅｒｓ  ａｌｏｎｇ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７：１０８８〜１０９５）。最も研究された細胞種の中に、腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）がある。ＴＡＭは、固形腫瘍の低酸素中心区域中に多数で動員され、蓄積するマクロファージの集団である（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｌ、Ｃ．Ｓｃｏｔｔｏｎ、Ｒ．ＮｅｇｕｓおよびＦ．Ｂａｌｋｗｉｌｌ、１９９９  Ｈｙｐｏｘｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２９：２２８０〜２２８７；Ｌｅｗｉｓ，Ｊ．Ｓ．、Ｒ．Ｊ．Ｌａｎｄｅｒｓ、Ｊ．Ｃ．Ｅ．Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ、Ａ．Ｌ．ＨａｒｒｉｓおよびＣ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ、２０００  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｓ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｐｏｏｒｌｙ  ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ  ａｒｅａｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １９２：１５０〜１５８；Ｇｏｌｌａｐｕｄｉ，Ｋ．、Ｃ．Ｇａｌｅｔ、Ｔ．Ｇｒｏｇａｎ、Ｈ．Ｚｈａｎｇ、Ｊ．Ｗ．Ｓａｉｄら、２０１３  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，ｈｉｇｈ  ｇｒａｄｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ，ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ａｆｔｅｒ  ｒａｄｉｃａｌ  ｐｒｏｓｔａｔｅｃｔｏｍｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３：５２３〜５２９）。ＴＡＭは、サイトカイン、増殖因子およびホルモンなどの微小環境シグナルに応じて活性化された特定の表現型を特徴とし（Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｆ．Ｏ．、Ｓ．Ｇｏｒｄｏｎ、Ｍ．ＬｏｃａｔｉおよびＡ．Ｍａｎｔｏｖａｎｉ、２００６  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｔｏ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：  Ｎｅｗ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７７：７３０３〜７３１１）、Ｍ２マクロファージと呼ばれることが多い。その対応物、Ｍ１極性化マクロファージは、炎症性分子に応じて活性化され、高い抗腫瘍および免疫刺激機能を特徴とするが、Ｍ２に偏ったマクロファージは、顕著な腫瘍増殖促進（ｐｒｏ−ｔｕｍｏｒ）活性を発現し、炎症性プロセスを抑制し、マトリックスリモデリング、浸潤、血管新生および生存を促進する（Ｓｉｃａ、Ａ．、Ｔ．Ｓｃｈｉｏｐｐａ、Ａ．ＭａｎｔｏｖａｎｉおよびＰ．Ａｌｌａｖｅｎ��、２００６  Ｔｕｍｏｕｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｒｅ  ａ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｍ２  ｐｏｌａｒｉｓｅｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ：  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ４２：７１７〜７２７）。
【０００４】
ＴＡＭは、腫瘍細胞から連続的に放出される走化性サイトカインによって血液循環から補充されることがわかっている；例えば、ＭＣＰ−１、ＶＥＧＦおよびＣＳＦ−１発現は、多数のヒト腫瘍においてＴＡＭ蓄積と正の相関があるとわかった（Ｇｒａｖｅｓ，Ｄ．Ｔ．、Ｒ．Ｂａｒｎｈｉｌｌ、Ｔ．ＧａｌａｎｏｐｏｕｌｏｓおよびＨ．Ｎ．Ａｎｔｏｎｉａｄｅｓ、１９９２  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＯＦ  ＭＯＮＯＣＹＴＥ  ＣＨＥＭＯＴＡＣＴＩＣ  ＰＲＯＴＥＩＮ−  ＩＮ  ＨＵＭＡＮ−ＭＥＬＡＮＯＭＡ  ＩＮＶＩＶＯ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １４０：９〜１４；Ｋａｃｉｎｓｋｉ，Ｂ．Ｍ．、１９９５  ＣＳＦ−１  ＡＮＤ  ＩＴＳ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ＩＮ  ＯＶＡＲＩＡＮ，ＥＮＤＯＭＥＴＲＩＡＬ  ＡＮＤ  ＢＲＥＡＳＴ−ＣＡＮＣＥＲ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２７：７９〜８５。Ａｒｅｎｂｅｒｇ，Ｄ．Ａ．、Ｍ．Ｐ．Ｋｅａｎｅ、Ｂ．ＤｉＧｉｏｖｉｎｅ、Ｓ．Ｌ．Ｋｕｎｋｅｌ、Ｓ．Ｒ．Ｂ．Ｓｔｒｏｍら、２０００  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ：  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＣＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ４９：６３〜７０；Ｌｅｗｉｓ，Ｊ．Ｓ．、Ｒ．Ｊ．Ｌａｎｄｅｒｓ、Ｊ．Ｃ．Ｅ．Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ、Ａ．Ｌ．ＨａｒｒｉｓおよびＣ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ、２０００  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｓ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｐｏｏｒｌｙ  ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ  ａｒｅａｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １９２：１５０〜１５８）。しかし、腫瘍の低酸素領域へのその特異的蓄積は、いくつかの特色：壊死細胞の顕著な存在（Ｌｅｗｉｓ，Ｊ．、Ｒ．Ｊ．Ｌａｎｄｅｒｓ、Ｒ．Ｄ．Ｌｅｅｋ、Ｋ．Ｃｏｒｋｅ、Ａ．Ｌ．Ｈａｒｒｉｓら、１９９７  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｙｐｏｘｉａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １８２：Ａ１〜Ａ１）およびＭＣＰ−１（Ｌｉ，Ｘ．、Ｈ．Ｋｉｍｕｒａ、Ｋ．Ｈｉｒｏｔａ、Ｈ．ＳｕｇｉｍｏｔｏおよびＨ．Ｙｏｓｈｉｄａ、２００５  Ｈｙｐｏｘｉａ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ａｎｄ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｒｅｎａｌ  ｔｕｂｕｌａｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３３５：１０２６〜１０３４）、ＶＥＧＦ（Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．Ｆ．、Ｂ．Ｂｅｒｓｅ、Ｒ．Ｗ．Ｊａｃｋｍａｎ、Ｋ．Ｔｏｇｎａｚｚｉ、Ａ．Ｊ．Ｇｕｉｄｉら、１９９５年ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＯＦ  ＶＡＳＣＵＬＡＲ−ＰＥＲＭＥＡＢＩＬＩＴＹＦＡＣＴＯＲ  （ＶＡＳＣＵＬＡＲ  ＥＮＤＯＴＨＥＬＩ��Ｌ  ＧＲＯＷＴＨ−ＦＡＣＴＯＲ）  ＡＮＤ  ＩＴＳ  ＲＥＣＥＰＴＯＲＳ  ＩＮ  ＢＲＥＡＳＴ−ＣＡＮＣＥＲ．Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２６：８６〜９１）およびエンドセリン（Ｇｒｉｍｓｈａｗ，Ｍ．Ｊ．、Ｓ．ＮａｙｌｏｒおよびＦ．Ｒ．Ｂａｌｋｗｉｌｌ、２００２  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−２  ｉｓ  ａ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １：１２７３〜１２８１）などのいくつかの化学誘引物質の放出、によって助長される。ＴＡＭは、低酸素区域中に蓄えられると、増殖因子、ＭＭＰおよびＣＸＣＬなどのいくつかの因子の生成および放出の増大によって酸素が枯渇した状態に応じ、これは、順に、血管新生、細胞成長、浸潤能力および転移に影響を及ぼし、このようにして、ＴＡＭは、最終的に腫瘍進行を促進する（Ｓｉｃａ，Ａ．、Ｔ．Ｓｃｈｉｏｐｐａ、Ａ．ＭａｎｔｏｖａｎｉおよびＰ．Ａｌｌａｖｅｎａ、２００６  Ｔｕｍｏｕｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｒｅ  ａ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｍ２  ｐｏｌａｒｉｓｅｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ：  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ４２：７１７〜７２７）。
【０００５】
腫瘍におけるＴＡＭの浸潤は、がん進行の誘発におけるそれらの極めて重要な役割を考え、固形がんの大部分において予後不良と関連付けられている：肺がん（Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｊ．Ｗ．、Ｙ．Ｃ．Ｌｉｎ、Ｐ．Ｌ．Ｙａｏ、Ａ．Ｙｕａｎ、Ｈ．Ｙ．Ｃｈｅｎら、２００５  Ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ：  Ｔｈｅ  ｄｏｕｂｌｅ−ｅｄｇｅｄ  ｓｗｏｒｄ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２３：９５３〜９６４）、口腔扁平上皮癌（Ｈｅ，Ｋ．−Ｆ．、Ｌ．Ｚｈａｎｇ、Ｃ．−Ｆ．Ｈｕａｎｇ、Ｓ．−Ｒ．Ｍａ、Ｙ．−Ｆ．Ｗａｎｇら、２０１４  ＣＤ１６３＋  Ｔｕｍｏｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｏｒ  Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｏｒａｌ  Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＢｉｏＭｅｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ２０１４：８３８６３２）、甲状腺乳頭癌（ＫＩＭら２０１３）、乳頭状腎細胞癌（Ｂｅｈｎｅｓ，Ｃ．Ｌ．、Ｆ．Ｂｒｅｍｍｅｒ、Ｂ．Ｈｅｍｍｅｒｌｅｉｎ、Ａ．Ｓｔｒａｕｓｓ、Ｐ．Ｓｔｒｏｂｅｌら、２０１４  Ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｒｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈｉｖ  ４６４：１９１〜１９６）、乳がん（Ｍｕｋｈｔａｒ，Ｒ．Ａ．、Ａ．Ｐ．Ｍｏｏｒｅ、Ｖ．Ｊ．Ｔａｎｄｏｎ、Ｏ．Ｎｓｅｙｏ、Ｐ．Ｔｗｏｍｅｙら、２０１２  Ｅｌｅｖａｔｅｄ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｃｅｎｔｌｙ  Ｍｉｇｒａｔｅｄ  Ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  Ｃｏｎｆｅｒ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅｎｅｓｓ  ａｎｄ  Ｗｏｒｓｅ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｉｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １９：３９７９〜３９８６；Ｔａｎｇ，Ｘ．Ｑ．、２０１３  Ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３３２：３〜１０）、卵巣がん（Ｌａｎ，Ｃ  Ｙ．、Ｘ．Ｈｕａｎｇ、Ｓ．Ｘ．Ｌｉｎ、Ｈ．Ｑ．Ｈｕａｎｇ、Ｑ．Ｃ．Ｃａｉら、２０１３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍ２−Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｏｒ  Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  １２：２５９〜２６７）および膵臓がん（Ｋｕｒａｈａｒａ，Ｈ．、Ｓ．Ｔａｋａｏ、Ｔ．Ｋｕｗａｈａｔａ、Ｔ．Ｎａｇａｉ、Ｑ．Ｄｉｎｇら、２０１２  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  Ｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １９：２２６４〜２２７１）。
【０００６】
腫瘍溶解性ウイルス療法は、がん細胞を選択的に感染させ死滅させる溶解性ウイルスの使用に関係する。いくつかの腫瘍溶解性ウイルスは、それらががん細胞の複製に対して精巧な選択を示すので有望な療法であり、腫瘍におけるその自己制限性増殖は、より少ない毒性副作用しかもたらさない。いくつかの腫瘍溶解性ウイルスは、臨床において高い有望性を示している（Ｂｅｌｌ，Ｊ．、Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ｖｉｒｕｓｅｓ：  Ａｎ  Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｈｏｒｉｚｏｎ？  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１０；１８（２）：２３３〜２３４）。
【０００７】
マクロファージは、疾患の部位への天然のホーミング能力を有すると知られており、遺伝子療法のための細胞媒体として提案されている（Ｂｕｒｋｅら、Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ：  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔａｒｇｅｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第７２巻、第３号、４１７〜４２８頁）。
【０００８】
ＷＯ２００７／１１３５７２には、磁性材料を含む単球由来細胞、例えば、マクロファージが記載されている。この細胞は、治療剤を、対象中の罹患材料に標的化するための媒体として有用であると記載されており、ここでは、治療剤は、好ましくは、遺伝子であり得（すなわち、罹患材料の治療への遺伝子療法アプローチ）、治療を必要とする対象は、罹患材料における細胞の局在を補助するために磁場に曝露される。関連研究は、ＭｕｔｈａｎａらＡ  ｎｏｖｅｌ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００８年）  １５、９０２〜９１０に開示されている。
【０００９】
Ｍｕｔｈａｎａら、（Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｔｕｍｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；７１（５）２０１１年３月１日）には、マクロファージが、低酸素によって調節されるＥ１Ａ／Ｂ構築物およびＥ１Ａ依存性腫瘍溶解性アデノウイルスを用いて形質導入され、Ｅ１Ａ発現を制御するために、その増殖も、前立腺特異的プロモーターエレメントを使用して前立腺腫瘍細胞に制限される、前立腺腫瘍の治療へのアプローチが記載されている。これらの実験では、マクロファージは、低酸素環境中に局在した際にのみ複製するよう誘導されたアデノウイルスの「サイレント担体」として使用された。アデノウイルスの複製の誘導は、マクロファージの死滅をもたらさなかった。Ｍｕｔｈａｎａら、（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎ  Ｏｎｃｏｌｏｙｔｉｃ  Ｖｉｒｕｓ  Ａｂｏｌｉｓｈｅｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ａｆｔｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｒ  Ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；７３（２）２０１３年１月１５日）では、著者らは、ドセタキセルまたは放射線療法の投与後の効果を調べるために同一アデノウイルスアプローチを使用する実験を記載する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染した単球、単球由来細胞またはマクロファージに関する。感染単球、単球由来細胞またはマクロファージは、疾患の治療、特に、がんの治療の方法において有用であると開示される。好ましい治療は、低酸素である組織もしくはがんまたは低酸素である組織もしくはがんの一部の治療を含み得る。好ましい治療は、深部組織、臓器中に、または身体のコア中に局在する組織またはがんの治療を含み得る。
【００１１】
感染細胞は、罹患組織に自己標的化し、それによって、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスを、そうでなければ、治療薬を用いて浸透することが極めて困難である組織の低酸素領域を含む罹患組織に直接送達する、特殊化されたベクターに相当する。細胞は、単にベクターとして作用するわけではない。腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス感染は、単球または単球由来細胞の死滅につながり、これは、ウイルス複製および細胞溶解によって引き起こされ得る。したがって、罹患組織中に存在しながらの細胞死滅は、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスの放出および腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスによって感染され、溶解され得る罹患細胞、例えば、腫瘍細胞への直接送達につながる。
【００１２】
さらに、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスは、低酸素組織における免疫応答の増強を開始し、それによって疾患に対する免疫応答、例えば、抗腫瘍免疫応答を促進する。
いくつかの実施形態では、単球、単球由来細胞またはマクロファージはまた、外因性磁性材料を含有し得る。これらの実施形態では、治療の方法は、単球、単球由来細胞またはマクロファージを、治療が必要とされる対象の身体中の所望の位置に向かわせるための対象への磁場の適用を含み得る。
【００１３】
本発明の一態様では、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染したｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ単球、単球由来細胞またはマクロファージが提供される。
いくつかの実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ単球、単球由来細胞またはマクロファージはまた、外因性磁性材料を含有し得る。
【００１４】
本発明の一態様では、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染した単球、単球由来細胞またはマクロファージの集団を含む調製物が提供される。
一実施形態では、単球、単球由来細胞またはマクロファージはまた、外因性磁性材料を含有する。
【００１５】
本発明の一態様では、医学的処置、例えば、がんの治療の方法において使用するための調製物が提供される。
本発明の別の態様では、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染した単球、単球由来細胞またはマクロファージを調製する方法が提供され、この方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで単球、単球由来細胞またはマクロファージを、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスと接触させることを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、方法は、単球、単球由来細胞またはマクロファージを、磁性材料と接触させることをさらに含む。
本発明の別の態様では、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染した単球、単球由来細胞またはマクロファージの集団を含む調製物を生成する方法が提供され、この方法は、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染した単球、単球由来細胞またはマクロファージの集団を提供し、そして、前記細胞の集団を含む調製物を処方する、ことを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、前記集団中の単球、単球由来細胞またはマクロファージは、外因性磁性材料を含有する。
本発明の別の態様では、疾患の治療の方法において使用するための、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染し、所望により、外因性磁性材料を含有する単球、単球由来細胞またはマクロファージが提供される。
【００１８】
治療の方法は、所望により、単球、単球由来細胞またはマクロファージを、対象に投与し、そして、外因性磁性材料を含有する細胞を対象の身体中の所望の位置に向かわせるために、対象に磁場を適用する、ことを含み得る。
【００１９】
本発明の別の態様では、疾患の治療において使用するための医薬の製造における、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染し、所望により、外因性磁性材料を含有する単球、単球由来細胞またはマクロファージの使用が提供される。治療は、対象に単球、単球由来細胞またはマクロファージを投与し、そして、外因性磁性材料を含有する細胞を対象の身体中の所望の位置に向かわせるために、対象に磁場を適用する、ことを所望により含み得る。
【００２０】
本発明の別の態様では、疾患の治療の方法において使用するための、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染した単球、単球由来細胞またはマクロファージの集団を含む調製物が提供され、この単球、単球由来細胞またはマクロファージは、外因性磁性材料を含有し、この方法は、対象に調製物を投与し、そして、投与された調製物の細胞を対象の身体中の所望の位置に向かわせるために、対象に磁場を適用する、ことを含む。
【００２１】
本発明の別の態様では、疾患の治療の方法において使用するための医薬の製造における、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染した単球、単球由来細胞またはマクロファージの集団の使用が提供され、この単球、単球由来細胞またはマクロファージは、外因性磁性材料を含有し、この方法は、対象に医薬を投与し、そして、投与された医薬の細胞を、対象の身体中の所望の位置に向かわせるために、対象に磁場を適用する、ことを含む。
【００２２】
本発明の別の態様では、治療を必要とする対象において疾患を治療する方法が提供され、この方法は、前記対象に、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染した単球、単球由来細胞またはマクロファージの集団を含む調製物を投与し、そして、それによって前記疾患を治療する、ことを含む。所望により、前記集団中の単球、単球由来細胞またはマクロファージは、外因性磁性材料を含有し得、この方法は、所望により、投与された調製物の細胞を対象の身体中の所望の位置に向かわせるために、対象に磁場を適用する、ことをさらに含み得る。
【００２３】
対象への腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染した細胞の投与は、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスへの感染から所定の時間内に実施され得、および／または投与された細胞は、本明細書に記載されるように、既定のパーセンテージ範囲の死滅した、または瀕死の（例えば、溶解した）細胞を含有するように選択され得る。時間および／または細胞の選択は、細胞が、治療を必要としている組織に局在された場合に、細胞死を起こしつつある（例えば、感染した腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスによる溶解を起こしつつある）ことを確実にするようなものであり得る。
【００２４】
本発明の別の態様では、パーツのキットが提供され、このキットは、所定量の腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスおよび所定量の磁性材料を含む。キットは、単球、単球由来細胞またはマクロファージの、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスによる感染について、および／または単球、単球由来細胞またはマクロファージに磁性材料を負荷することについての取扱説明書とともに提供され得る。このような取扱説明書は、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養の条件下で前記感染および／または負荷を実施するためのものであり得る。
【００２５】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスのゲノム中のＩＣＰ３４．５遺伝子のすべてのコピーが、ＩＣＰ３４．５遺伝子が、機能的ＩＣＰ３４．５遺伝子産物を発現不可能であるように改変される。そのようなものとして、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスは、ＩＣＰ３４．５ヌル変異株であり得る。
【００２６】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスのゲノム中のＩＣＰ３４．５遺伝子の一方または両方が、ＩＣＰ３４．５遺伝子が、機能的ＩＣＰ３４．５遺伝子産物を発現不可能であるように改変されている。
【００２７】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１  １７株の変異株である。好ましい実施形態では、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ１７１６（ＥＣＡＣＣ受託番号Ｖ９２０１２８０３）である。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１  １７株の変異株、変異株１７１６である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、治療されるべき疾患は、がん、例えば、腫瘍である。治療は、細胞が磁性的に向けられる所望の位置であり得る、がんの低酸素領域の治療であり得る。そのようなものとして、治療の方法は、がんのその他の正常酸素圧領域と一緒の、またはがんの正常酸素圧領域の治療とは独立した、がんの低酸素領域の治療を含み得る。治療の方法はまた、対象における抗腫瘍応答の誘導を含み得る。治療の方法はまた、投与された、外因性磁性材料を含有する細胞を、がんの低酸素領域に向けるために、対象に磁場を適用する、ことを含み得る。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明者らの発見は、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスが、感染から９６時間後に単球由来細胞を死滅させることができることを示す。腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスは、一般に、増殖中の細胞に向けて高度に選択的な溶解活性を有すると知られており、原理上、健常細胞を害することのない全身または非局所投与および腫瘍細胞の自己標的化による腫瘍治療を可能にする。これは、例示的な安全プロファイルを提供する。
【００３０】
本発明者らは、単球由来細胞の感染後に、感染細胞においてウイルスは検出されないが、長期培養では、ウイルスの存在が再確立されることを観察した（図１）。これは、細胞の増殖性感染、すなわち、ウイルス後代による複製および細胞溶解を含むことと一致するが、本発明は、このような理論に束縛されない。腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスによる感染が、単球由来細胞の細胞死につながるという発見は、感染単球または単球由来細胞が、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスを、腫瘍の低酸素区域を含む罹患組織に送達するために使用され得、その後、細胞が死滅するときに、直接、罹患組織へのウイルスの放出を可能にすることを意味する。
【００３１】
本発明者らはまた、単球由来細胞における腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス複製およびその後の単球由来細胞の細胞死（例えば、溶解）は、低酸素条件において実際に多いことを見出した。これは、単球由来細胞の死滅は、低酸素腫瘍環境において起こり（明らかに優先的に）、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスを、そうでなければ、接近することが困難である腫瘍の低酸素部分へ直接放出することを示す。
【００３２】
したがって、著しい数の単球または単球由来細胞が、標的組織または腫瘍中に存在する場合に、死滅およびウイルス放出を起こすことを確実にするために、対象への感染細胞の投与は、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスの感染から所定の時間内に実施され得、および／または投与された細胞は、既定のパーセンテージ範囲の瀕死のまたは死滅した（例えば、溶解した）細胞を含有するように選択され得る。
【００３３】
本発明者らはまた、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染した、外因性磁性材料が負荷された単球または単球由来細胞が、磁気共鳴標的化によって血流から深部組織標的（原発性および続発性（転移性）腫瘍を含む）に導かれ得ることを示した。例として、これは、磁気共鳴（例えば、ＭＲＩ、ＭＲＴ）システム内でパルス磁場勾配を使用し得る。したがって、例えば、血液への全身投与は、直接、罹患組織への腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス武装した細胞の正確な非侵襲的な方向と相まって、実現される。
【００３４】
このアプローチは、例えば、肺、脳、肝臓または脊髄におけるように、組織または腫瘍が、外科的に除去することが困難であるか、または不可能である場合に特に適用される。さらに、がん患者中の１つまたは複数の転移病巣への細胞の標的化は、独立した位置への細胞の各投与を標的とするそれぞれの独立した磁気共鳴セッションと相まった、細胞の段階的投与を使用して可能である。
【００３５】
腫瘍に対する腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）の直接作用に加えて、自然免疫エフェクター、適応抗ウイルス免疫応答および適応抗腫瘍免疫応答（例えば、Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈら、Ｏｎｏｃｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓｅｓ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２００８年１０月；８（１０）：１５８１〜１５８８）による抗腫瘍応答の有効性の確立において宿主免疫応答が重要な役割を果たすという証拠がますます増えている。
【００３６】
いくつかの研究が、ｏＨＳＶは、抗腫瘍免疫応答を誘導可能であると示してきた。これは、同一動物におけるｏＨＳＶで治療された病変における、および未治療病変における腫瘍成長低減、無傷の免疫応答を必要とするｏＨＳＶの有効性、抗腫瘍サイトカイン応答の誘導、腫瘍免疫機能不全の逆転および腫瘍抗原提示の促進として現れ得る。抗腫瘍免疫応答の誘導は、転移の確立を低減し得、またはその排除に寄与し得、また腫瘍の再発から保護し得る。
【００３７】
例えば、Ｂｅｎｅｎｃｉａら、（（２００８）  Ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｖｅｒｓｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．７、１１９４〜１２０５）では、治療病変および未治療病変における成長低減が報告された。ＭｉｌｌｅｒおよびＦｒａｓｅｒ（（２００３）  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆｏｒ  ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｎｅｕｒｏａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ＨＳＶ−１  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ａｎ  ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｍｏｄｅｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．７（６）：７４１〜７４７）では、ＨＳＶ１７６の有効性は、腫瘍特異的増殖性Ｔ細胞応答によって媒介される無傷の免疫応答を必要とした。
【００３８】
本発明者らは、ここで、正常酸素圧条件に対して、低酸素条件では、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスは、炎症促進性サイトカインおよび転写因子（例えば、ＩＬ−８、ＩＬ−１およびＮＦＫＢ）のインデューサであることを示した。これらの発見は、低酸素条件における腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスの炎症応答特性の増大を示唆し、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスが、低酸素においてより大きなウイルスの潜在力を獲得することを示唆し、低酸素であり接近することが困難である腫瘍の中心区域を標的化するために、単球または単球由来細胞によるウイルス送達を使用する理論的根拠をさらに支持する。
【００３９】
腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス
腫瘍溶解性ウイルスは、好ましくは、優先的なまたは選択的な方法でがん細胞を溶解する（腫瘍退縮）ウイルスである。非分裂細胞を上回って分裂中の細胞において選択的に複製するウイルスは、腫瘍溶解性であることが多い。腫瘍溶解性ウイルスは、当技術分野で周知であり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ第１８巻  第２号２０１０年２月２３３〜２３４頁に概説されている。
【００４０】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノムは、長い（Ｌ）および短い（Ｓ）と呼ばれる、２つの共有結合によって連結されたセグメントを含む。各セグメントは、逆方向末端反復配列の対によってフランキングされた独特の配列を含有する。長い反復配列（ＲＬまたはＲＬ）および短い反復配列（ＲＳまたはＲｓ）は、別個である。
【００４１】
ＨＳＶ  ＩＣＰ３４．５（γ３４．５とも呼ばれる）遺伝子は、広範に研究されており、ＨＳＶ−１  Ｆ株およびｓｙｎ１７＋株において、ならびにＨＳＶ−２  ＨＧ５２株において配列決定されている。ＩＣＰ３４．５遺伝子の１つのコピーは、ＲＬ反復領域の各々内に局在する。ＩＣＰ３４．５遺伝子の一方または両方のコピーを不活性化する突然変異体は、神経毒性を欠く、すなわち、非病原性／非神経毒性である（非神経毒性は、高力価のウイルス（およそ１０６のプラーク形成単位（ｐｆｕ））を、致死的脳炎を引き起こさずに動物または患者に導入し、その結果、動物、例えば、マウスまたはヒト患者における５０％致死量が、およそ≧１０６ｐｆｕの範囲にあるような能力によって定義される）、また、腫瘍溶解性であると知られている。
【００４２】
好ましい腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）は、複製能力のあるウイルスであり、少なくとも、標的腫瘍／がん細胞において複製能力がある。
本発明において使用され得る腫瘍溶解性ＨＳＶとして、γ３４．５（ＩＣＰ３４．５とも呼ばれる）遺伝子の一方または両方が改変されており（例えば、欠失、挿入、付加または置換であり得る突然変異によって）、その結果、それぞれの遺伝子が機能的ＩＣＰ３４．５タンパク質を発現不可能である、例えば、それをコードできないＨＳＶが挙げられる。好ましくは、本発明によるＨＳＶでは、改変されたＨＳＶが、機能的ＩＣＰ３４．５タンパク質を発現可能ではない、例えば、生成可能ではないように、γ３４．５遺伝子の両コピーが改変される。
【００４３】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルスゲノム中に存在するＩＣＰ３４．５遺伝子のすべてのコピー（通常、２つのコピーが存在する）が破壊され、その結果、単純ヘルペスウイルスが、機能的ＩＣＰ３４．５遺伝子産物を生成不可能である、ＩＣＰ３４．５ヌル変異株であり得る。その他の実施形態では、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスは、少なくとも１種の発現可能なＩＣＰ３４．５遺伝子を欠く場合がある。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、一方の発現可能なＩＣＰ３４．５遺伝子のみを欠く場合がある。その他の実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、発現可能なＩＣＰ３４．５遺伝子の両方を欠く場合がある。さらにその他の実施形態では、単純ヘルペスウイルス中に存在する各ＩＣＰ３４．５遺伝子が、発現可能ではない場合がある。発現可能なＩＣＰ３４．５遺伝子がないことは、例えば、ＩＣＰ３４．５遺伝子の発現が、機能的ＩＣＰ３４．５遺伝子産物をもたらさないことを意味する。
【００４４】
腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスは、ＨＳＶの任意の実験室株または臨床分離株（非実験室株（ｎｏｎ−ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｓｔｒａｉｎ））を含め、任意のＨＳＶに由来し得る。いくつかの好ましい実施形態では、ＨＳＶは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２の変異株である。あるいは、ＨＳＶは、ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２との型間組換え株であってもよい。変異株は、実験室株である、ＨＳＶ−１  １７株、ＨＳＶ−１  Ｆ株またはＨＳＶ−２  ＨＧ５２株のうちの１つであり得る。変異株は、非実験室株であるＪＳ−１株であり得る。好ましくは、変異株は、ＨＳＶ−１  １７株の変異株である。単純ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１  １７株の１７１６変異株、ＨＳＶ−１  Ｆ株のＲ３６１６変異株、ＨＳＶ−１  Ｆ株のＧ２０７変異株、ＨＳＶ−１のＮＶ１０２０変異株、またはそれらのさらなる変異株であって、ＨＳＶゲノムが付加的変異および／もしくは１つもしくは複数の異種ヌクレオチド配列を有する変異株のうちの１つであり得る。付加的変異としては、ウイルスの病原性またはその複製能力に影響を及ぼし得る不能化変異（ｄｉｓａｂｌｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を挙げることができる。例えば、突然変異は、ＩＣＰ６、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７のうちの任意の１つまたは複数において行われ得る。好ましくは、これらの遺伝子の一方（適切な場合には、所望により、遺伝子の両方のコピーでもよい）における突然変異は、ＨＳＶがもつ対応する機能性ポリペプチドを発現不能であること（またはその能力の低下）につながる。例として、ＨＳＶゲノムの付加的変異は、ヌクレオチドの付加、欠失、挿入または置換により遂行し得る。
【００４５】
いくつかの腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスは、当技術分野で公知である。例として、ＨＳＶ１７１６、Ｒ３６１６（例えば、Ｃｈｏｕ  ＆  Ｒｏｉｚｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第８９巻、３２６６〜３２７０頁、１９９２年４月を参照のこと）、Ｇ２０７（Ｔｏｄａら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：２１７７〜２１８５、１９９５年１０月１０日）、ＮＶ１０２０（Ｇｅｅｖａｒｇｈｅｓｅら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１０年９月；２１（９）：１１１９〜２８）、ＲＥ６（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １３１、１７１〜１７９（１９８３））およびＯｎｃｏｖｅｘ（商標）（Ｓｉｍｐｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６；６６：（９）４８３５〜４８４２、２００６年５月１日；Ｌｉｕら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００３）：１０、２９２〜３０３）、ｄｌｓｐｔｋ、ｈｒＲ３、Ｒ４００９、ＭＧＨ−１、ＭＧＨ−２、Ｇ４７Δ、Ｍｙｂ３４．５、ＤＦ３γ３４．５、ＨＦ１０、ＮＶ１０４２、ＲＡＭＢＯ、ｒＱＮｅｓｔｉｎ３４．５、Ｒ５１１１、Ｒ−ＬＭ１１３、ＣＥＡＩＣＰ４、ＣＥＡγ３４．５、ＤＦ３γ３４．５、ＫｅＭ３４．５（Ｍａｎｓｅｒｖｉｇｉら、Ｔｈｅ  Ｏｐｅｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２０１０；４：１２３〜１５６）、ｒＲｐ４５０、Ｍ０３２（Ｃａｍｐａｄｅｌｌｉ−Ｆｉｕｍｅら、Ｒｅｖ  Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ  ２０１１；２１：２１３〜２２６）、Ｂａｃｏ１（Ｆｕら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２０１１；１２９（６）：１５０３〜１０）およびＭ０３２およびＣ１３４（Ｃａｓｓａｄｙら、Ｔｈｅ  Ｏｐｅｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２０１０；４：１０３〜１０８）が挙げられる。
【００４６】
いくつかの好ましい実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１  １７株１７１６変異株（ＨＳＶ１７１６）である。ＨＳＶ１７１６は、腫瘍溶解性、非神経毒性ＨＳＶであり、ＥＰ  ０５７１４１０、ＷＯ９２／１３９４３、Ｂｒｏｗｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９４）、７５、２３６７〜２３７７）およびＭａｃＬｅａｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）、７２、６３１〜６３９）に記載されている。ＨＳＶ１７１６は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブタペスト条約の条項（本明細書において、「ブタペスト条約」と呼ばれる）に従って、１９９２年１月２８日に、受託番号Ｖ９２０１２８０３の下、英国ＳＰ４  ０ＪＧ  ウィルトシャー州  ソールズベリー  ポートンダウン、欧州動物培養収集機関（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、ワクチン研究製造研究所（Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、公衆衛生臨床検査サービス（Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）に寄託された。
【００４７】
いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、両ＩＣＰ３４．５遺伝子が、例えば、ＩＣＰ３４．５遺伝子の突然変異（例えば、挿入、欠失、付加、置換）によって、機能的遺伝子産物を発現しないように改変されたが、そうでなければ、野生型親ウイルスＨＳＶ−１  １７＋株のゲノムと似ているまたは実質的に似ているＨＳＶ−１  １７株の変異株である。すなわち、ウイルスは、ＨＳＶ−１  １７＋株のＩＣＰ３４．５遺伝子の両コピーを不活性化するように突然変異されたゲノムを有するが、その他のタンパク質コード配列を挿入または欠失／改変するようには変更されないＨＳＶ１７１６の変異体であり得る。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本発明による腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスのゲノムは、ウイルスにとって異種である（すなわち、通常、野生型ウイルスには見られない）ポリペプチドの少なくとも１つのコピーをコードする核酸を含有し、その結果、ポリペプチドが核酸から発現され得るようにさらに改変され得る。そのようなものとして、腫瘍溶解性ウイルスはまた、ポリペプチドが発現され得る発現ベクターであり得る。このようなウイルスの例は、ＷＯ２００５／０４９８４６およびＷＯ２００５／０４９８４５に記載されている。
【００４９】
ポリペプチドの発現を達成するために、ポリペプチドをコードする核酸は、好ましくは、調節配列、例えば、ポリペプチドをコードする核酸の転写を達成可能であるプロモーターと作動可能に連結される。ヌクレオチド配列と作動可能に連結される調節配列（例えば、プロモーター）は、調節配列が、ヌクレオチド配列の産物の発現を達成および／または制御し得るように、その配列に隣接してまたは近接して位置付けられ得る。したがって、ヌクレオチド配列のコードされた産物は、その調節配列から発現可能であり得る。
【００５０】
いくつかの好ましい実施形態では、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスは、ウイルスにとって異種であるポリペプチド（またはその他の核酸によってコードされる産物）の少なくとも１つのコピーをコードする核酸を含有するように改変されない。すなわち、ウイルスは、それから異種ポリペプチドまたはその他の核酸によってコードされる産物が発現され得る発現ベクターではない。このようなｏＨＳＶは、遺伝子療法の方法において適していない、または有用ではなく、それらが用いられる医学的処置の方法は、所望により、遺伝子療法を含まないものであり得る。
単球、単球由来細胞またはマクロファージ
単球は、骨髄によって産生される白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）（白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ））の１種である。それらは、通常、血液中最初の循環後に、組織中に移動し、そこで、マクロファージまたは樹状細胞に分化する。単球およびそのマクロファージおよび樹状細胞後代は、食作用、抗原提示およびサイトカイン産生に関与する。
【００５１】
食作用は、物質（例えば、微生物性物質または粒状物質またはいくつかの場合には栄養分の）の細胞への取り込み（摂取）と、それに続く、細胞内での物質の消化および／または破壊を含む。食作用は、エンドサイトーシスの特殊化された形態である。食作用のプロセスは、普通、細胞中にインターナライズされる膜結合小胞（ファゴソーム）において物質を貪食することを含む。次いで、ファゴソームは、リソソームと融合して、ファゴリソソームを形成し得、ここで、物質の消化が起こり得る。自然免疫系における単球およびその後代の役割を考慮して、食作用は、病原体および細胞片の除去において主要な役割を果たす。
【００５２】
単球または単球由来細胞は、末梢血またはその他の組織から単離され得る（例えば、ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａら（Ａ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ．Ｍｅｍ  Ｉｎｓｔ  Ｏｓｗａｌｄｏ  Ｃｒｕｚ，Ｒｉｏ  ｄｅ  Ｊａｎｅｉｒｏ、第９５巻（２）：２２１〜２２３、２０００年３月／４月）；Ｅｌｋｏｒｄら（Ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００５年２月；１１４（２）：２０４〜２１２）；Ｒｅｐｎｉｋら（Ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂｕｆｆｙ  ｃｏａｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ第２７８巻、１〜２号、２００３年７月、２８３〜２９２頁）；Ｚｈａｎｇら（Ｔｈｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８３：１４．１．１〜１４．１．１４．２００８年）；Ｊｏｈｎ  Ｑ．ＤａｖｉｅｓおよびＳｉａｍｏｎ  Ｇｏｒｄｏｎ（Ｔｈｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｂａｓｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ第２９０巻、２００５年、１０５〜１１６頁）を参照のこと。
【００５３】
マクロファージは、身体中に広く分布している単核ファゴサイトであり、ここで、それらは、自然および適応免疫応答に関与する。マクロファージの生理学は、それらがある組織環境およびそれらが曝露される局所刺激に応じて変わり得る。そのようなものとして、種々の組織特異的マクロファージの範囲が同定され得る、例えば、脂肪組織由来の脂肪組織マクロファージ、血液または骨髄由来の単球、肝臓由来のクッパー細胞。マクロファージは、分泌性細胞であり、サイトカインおよびケモカインの分泌によって免疫応答を促進および調節し得る。ヒトマクロファージは、ＣＤ１４、ＣＤ４０、Ｃｄ１１ｂおよびＣＤ６４などのタンパク質のその特異的発現を考慮して、フローサイトメトリーによって単離され得る。マクロファージは、その他の哺乳動物、例えば、マウスまたはその他のげっ歯類から同様の技術によって単離され得る。単球およびマクロファージの概説については、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１１、（２０１１年）を参照のこと。
【００５４】
マクロファージなどの単球およびその後代は、しばしば、制限された腫瘍血管新生のために、哺乳動物および実験的腫瘍の顕著な特色である低酸素組織（低酸素圧を有する組織）に引き付けられる。単球は、腫瘍中に連続的に補充され、そこで、それらは蓄積し、腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）に分化する。ＴＡＭは、固形悪性腫瘍および血液学的（ｈａｅｍｏｔｏｌｏｇｉｃａｌ）悪性腫瘍において豊富であり、進行、転移および療法に対する耐性と関連付けられている（Ｃｏｏｋ  ａｎｄ  Ｈａｇｅｍａｎｎ．Ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．第１２巻、４号、２０１３年８月、５９５〜６０１頁）。研究は、マクロファージは、広範囲の有糸分裂促進性、浸潤促進性（ｐｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ）、血管新生促進性および転移促進性遺伝子を活性化する低酸素誘導性転写因子を上方制御することによって腫瘍において見出される低酸素のレベルに応答することを示した（ＬｅｗｉｓおよびＭｕｒｄｏｃｈ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｈｙｐｏｘｉａ，Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２００５年９月；１６７（３）：６２７〜６３５）。
【００５５】
本発明は、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染可能である、所望により、磁性材料が負荷されている細胞を生成するために、例えば、食作用によって外因性磁性材料を取り込み可能である、マクロファージまたは樹状細胞などの単球または単球由来細胞に関係している。細胞は、非ヒト、好ましくは、哺乳動物、例えば、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたはその他のげっ歯類（げっ歯類目中の任意の動物に由来する細胞を含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、非ヒト霊長類であり得る、またはヒト細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、マクロファージ、例えば、ヒトまたは哺乳動物マクロファージであることが好ましい。
【００５６】
単球または単球由来細胞は、例えば、上記のような末梢血の試料からの単離によって治療されるべき対象から単離され得る、または得られ得る。あるいは、ドナー対象、例えば、別の哺乳動物またはヒト（好ましくは、同一種の）から単離され得る、または得られ得る。ドナー単球は、免疫適合性についてスクリーニングされ得る。単球または単球由来細胞は、単球または単球由来細胞ではない細胞を実質的に含まない培養物または調製物を提供するように、その他の細胞種から単離され得る。所望により、適した支持体または支持細胞は、培養物または調製物中に存在し得る。
【００５７】
単離細胞は、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染し得る、また磁性材料が負荷され得る場合に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され得る。
単球または単球由来細胞の感染は、単純ヘルペスウイルスが細胞に入ることを可能にする条件下で、それに適した十分な時間、細胞を、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスと接触させることを指す。このような感染は、好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養の条件下で実施され得る。ヒトおよび哺乳動物細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染のための技術は、当業者に公知である、例えば、ＳｚａｎｔｏらＰｅｒｉｓｔｅｎｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＢＨＫ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅｓ  １  ａｎｄ  ２  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉ−ｈｅｒｐｅｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ａｃｔａ  Ｖｉｒｏｌ．１９７６年２月；２０（１）；４０〜７）；ＣｏｎｎｅｒらＨｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｓｔｒａｉｎ  ＨＳＶ１７１６  ｇｒｏｗｎ  ｉｎ  ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ  ｈａｓ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｔｒｏｐｉｓｍ  ｆｏｒ  ｎｏｎ−ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ＨＳＶ１７１６  ｇｒｏｗｎ  ｉｎ  ｖｅｒａ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２００５年８月；７９（１５）：９９７０〜８１を参照のこと。
【００５８】
マクロファージのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養のための技術もまた、当業者に公知である、例えば、Ｊｏｈｎ  Ｑ．ＤａｖｉｅｓおよびＳｉａｍｏｎ  Ｇｏｒｄｏｎ（Ｔｈｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｂａｓｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ第２９０巻、２００５年、１０５〜１１６頁）を参照のこと。
【００５９】
したがって、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染した単球、単球由来細胞またはマクロファージを調製する方法は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養の適した条件下で、単球、単球由来細胞またはマクロファージの増殖性感染を可能にするのに十分な時間、単球、単球由来細胞またはマクロファージのうち１種または複数（所望により、集団）を、一定量の腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスと接触させることを含み得る。
【００６０】
所望により、細胞は、ウイルスが細胞死を誘導できる条件下で培養物中に維持され得る。理論に束縛されることは望まないが、本発明者らは、単球、単球由来細胞またはマクロファージの感染後、腫瘍溶解性単純ヘルペスは、複製を起こし、ウイルス後代は、その後細胞を溶解し、細胞死を引き起こすと考える。そのようなものとして、培養条件および期間は、無傷の（ｉｎｔａｃｔ）および死滅した、例えば、溶解した、単球、単球由来細胞またはマクロファージの混合物を有する培養物を生成するのに適したものであり得る。
【００６１】
細胞は、０．５〜１００の範囲の、所望により、０．５〜５、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１〜３０、５〜３０、５〜５０または３０〜５０のうち１種の範囲の感染多重度（ＭＯＩ）を実現するようにウイルスと接触され得る。
【００６２】
所望により、細胞は、感染から所定の時間内に対象に投与され得る。これは、標的組織または腫瘍において細胞の死滅（例えば、溶解）が起こることを確実にし、標的組織におけるウイルスの散在および広がりを可能にするためであり得る。そのようなものとして、細胞の投与は、感染の１時間、２時間、３時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、３日、４日、５日、６日または７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日または１４日内であり得る。
【００６３】
単球または単球由来細胞への磁性材料の負荷もまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件下で実施され得、このステップは、細胞の腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスへの感染に先立って、それと一緒に、またはその後に実施されてもよい。単球または単球由来細胞に磁性材料を負荷するための技術は、例えば、ＫａｉｍらＭＲ  ｉｍａｇａｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｕｌｔｒａｓｍａｌｌ  ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｅｎｔｉｃ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｓｏｆｔ−ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２００２年１２月；２２５（３）：８０８〜１４に、およびＭｕｔｈａｎａらＡ  ｎｏｖｅｌ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００８年）１５、９０２〜９１０）に記載される。細胞を、約２０〜３００μｇ／ｍｌの粒子の濃度または約５０〜１５０μｇ／ｍｌ、７５〜１２５μｇ／ｍｌ、９０〜１１０μｇ／ｍｌまたは約１００μｇ／ｍｌのうち１種を有する磁性粒子の懸濁液と接触させることによって、細胞に、磁性材料が負荷され得る。
【００６４】
したがって、単球、単球由来細胞またはマクロファージを調製する方法は、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスによる感染に加えて、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養の適した条件下で、例えば、食作用による、磁性材料の単球、単球由来細胞またはマクロファージへの取り込みを可能にするのに十分な時間、細胞を一定量の磁性材料と接触させる、ことを含み得る。
【００６５】
感染および／または磁性材料の取り込み後、細胞は、望まれる限り、さらに培養され、集められ、単離され、精製または分離され、適した調製物に処方され得る。
本明細書に記載される単球、単球由来細胞またはマクロファージは、調製物、例えば、臨床使用のための医薬組成物または医薬品として処方する（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｎｇ）ことができ、このような処方物（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）では、薬学的に許容される担体、希釈剤またはアジュバントと組み合わせることができる。調製物を処方または生成する方法は、選択された細胞を、薬学的に許容される担体、アジュバント、希釈剤またはバッファーと混合することを含み得る。
【００６６】
調製物は、単球、単球由来細胞またはマクロファージの集団を含み得、これは、調製物が、共通の特徴、例えば、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染した単球、単球由来細胞またはマクロファージを有し、所望により、外因性磁性材料を含有する、複数の前記細胞で構成されていることを意味する。調製物は、本明細書に記載されるような任意の形態をとり得る。純粋に例として、調製物は、細胞の集団を、薬学的に許容される担体、アジュバント、希釈剤またはバッファーと一緒に含む医薬組成物または医薬であり得る。
【００６７】
例として、調製物は、注射またはカテーテルによる送達を含み得る、非経口、全身、腔内、静脈内、動脈内または腫瘍内投与経路用に処方することができる。適した処方物は、滅菌または等張性培地中に細胞を含み得る。医薬品および医薬組成物は、例えば、液体、溶液、懸濁液もしくはエマルジョンとして注射に適した流体形態で処方することができる、または例えば、それからの細胞の放出速度を制御することができる、対象の身体における移植に適したデポーもしくはリザーバーとして処方することができる。デポー処方物は、ゲル剤、ペースト剤、ボーラス剤またはカプセル剤を含み得る。調製物は、適した容器またはパッケージング中で提供してもよい。流体処方物は、ヒトまたは動物身体の選択された領域への、注射によるまたはカテーテルを介した投与用に処方することができる。
【００６８】
本明細書において、用語「薬学的に許容される」とは、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー応答またはその他の問題または合併症を伴わない、合理的な利益／リスク比と釣り合った、問題の対象（例えば、ヒト）の組織との接触における使用に適している化合物、成分、材料、組成物、剤形などに関係する。各担体、アジュバント、賦形剤などはまた、処方物のその他の成分と適合しているという意味で「許容され」なければならない。適した担体、アジュバント、賦形剤などは、標準的製薬学教本、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９９０年；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第２版、１９９４に見出すことができる。
【００６９】
細胞の集団は、共通の特徴を有する複数の細胞、例えば、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染し、所望により、外因性磁性材料を含有する単球、単球由来細胞またはマクロファージを指す。いくつかの実施形態では、集団は、およそ数百個またはそれ以上の、所与の種類の、すなわち、単球、単球由来細胞またはマクロファージを含有する。集団は、所与の種類の数千個の細胞もしくはそれ以上またはおよそ１×１０４個、１×１０５個、１×１０６個、１×１０７個もしくはそれ以上の程度のいくつかの細胞を有し得る。集団は、細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中に存在し得る、またはそれから単離され得る、または細胞の調製物中に、例えば、医薬組成物もしくは医薬中に存在し得る。
【００７０】
細胞の集団は、所与の種類である、培養物または調製物中のすべての細胞または実質的にすべての細胞、すなわち、単球、単球由来細胞またはマクロファージである、培養物または調製物中のすべての細胞または実質的にすべての細胞を指し得る。いくつかの実施形態では、細胞の調製物または培養物は、所望により、集団の一部と考えられない場合があるその他の種類の細胞、例えば、支持細胞または線維芽細胞を含有し得る。いくつかの実施形態では、細胞の集団では、細胞の少なくとも８０％が、単球、単球由来細胞またはマクロファージであることが好ましい。いくつかの実施形態では、このパーセンテージは、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％のうち１つであり得る。
【００７１】
好ましくは、細胞の集団では、集団中の単球、単球由来細胞またはマクロファージの少なくとも８０％または８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％のうち１つが、ｏＨＳＶに感染し、所望により、外因性磁性材料も含有する。いくつかの好ましい実施形態では、集団中の単球、単球由来細胞またはマクロファージの実質的にすべて、例えば、９５％またはそれ以上が、ｏＨＳＶに感染し、所望により、外因性磁性材料も含有する。
【００７２】
細胞の集団では、ｏＨＳＶに感染している、単球、単球由来細胞またはマクロファージの一部は、細胞死を起こした（例えば、ｏＨＳＶによって溶解された）可能性がある。瀕死の細胞または死滅した（例えば、溶解した）細胞は、ｏＨＳＶに感染している、単球、単球由来細胞もしくはマクロファージの、または単球、単球由来細胞もしくはマクロファージの集団の１〜５０％を占め得る。いくつかの実施形態では、この範囲は、０．５％〜５％、１〜５％、１〜１０％、１〜２０％、１０〜２０％、１０〜３０％、２０〜４０％または３０〜５０％のうちの１つであり得る。これは、対象への投与の時点での集団中の瀕死のまたは死滅した（例えば、溶解した）細胞のパーセンテージであり得る。
【００７３】
いくつかの好ましい実施形態では、単球、単球由来細胞またはマクロファージは、細胞にとって異種であるポリペプチド（またはその他の核酸によってコードされる産物）の少なくとも１つのコピーをコードする核酸を含有するように改変されない。すなわち、細胞は、異種ポリペプチドまたはその他の核酸によってコードされる産物を発現するように改変されない。このような細胞は、遺伝子療法の方法において適していない、または有用ではなく、それらが用いられる医学的処置の方法は、所望により、遺伝子療法（すなわち、医学的方法または治療が、異種ポリペプチドまたはその他の核酸によってコードされる産物の発現に頼る）を含まないものであり得る。
【００７４】
所望により、本明細書において別の場所に記載されるように、単球、単球由来細胞またはマクロファージが感染するｏＨＳＶはまた、ウイルスにとって異種であるポリペプチド（またはその他の核酸によってコードされる産物）をコードする核酸を含有するように改変されないものであり得、そのようなものとして、また、遺伝子療法の方法において適していない、または有用ではなく、それらが用いられる医学的処置の方法は、所望により、遺伝子療法を含まないものであり得る。
【００７５】
投与は、好ましくは、「治療有効量」であり、これは、個体に利益を示すのに十分である。投与される実際量ならびに投与の速度および時間経過は、治療されている疾患の性質および重症度に応じて変わってこよう。
【００７６】
治療薬の処方指示（ｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）、例えば、投与量等についての決定は、総合診療医および他の医師の責任の範囲内であり、典型的には、治療する障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、および専門家に公知の他の因子を考慮する。先述の技術およびプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓに見出すことができる。
【００７７】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスの複製または増殖は、低酸素環境に応答しない。すなわち、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスは、低酸素環境に対して応答性になるように、野生型ウイルスに対して、または親の腫瘍溶解性ウイルス（例えば、ＨＳＶ１７１６）に対して改変（またはさらに改変）されない。例えば、ウイルス複製および／または遺伝子発現は、感染細胞または周囲組織において低酸素に応答性である（例えば、活性化または抑制される）、１つまたは複数の調節エレメント、例えば、プロモーター（単数または複数）の制御下にない。
【００７８】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスは、腫瘍組織を含む特定の組織型において、複製または増殖するように、野生型ウイルスに対して、または親の腫瘍溶解性ウイルス（例えば、ＨＳＶ１７１６）に対して改変（またはさらに改変）されない。例えば、ウイルス複製および／または遺伝子発現は、特定の組織中の位置に応答する（例えば、活性化または抑制される）、１種または複数の調節エレメント、例えば、プロモーター（単数または複数）の制御下にない。例えば、ウイルス複製および／または遺伝子発現は、１種または複数の組織特異的または腫瘍特異的プロモーター（またはその他の調節エレメント）の制御下に置かれない。
単球、単球由来細胞またはマクロファージの感染は、別個の細胞の集団の形成を誘導する
腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染したマクロファージの遺伝子発現解析は、感染後、細胞が、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＣＸＣＬ−１などのいくつかの炎症性サイトカイン、ＩＬ−１０、ＣＸＣＬ−６などのいくつかの抗炎症性サイトカインならびにＮＦκＢ、ＶＥＧＦ−ＡおよびＴＧＦ−βなどその他の因子を含む、特定の因子の発現の変化を起こすことを示す。
【００７９】
そのようなものとして、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスによる感染は、特定の遺伝子／タンパク質の別個の発現のパターンを有する単球、単球由来細胞またはマクロファージであることを特徴とする別個の細胞の集団の形成につながる。細胞は、さらに、培養または処方の条件、すなわち、正常酸素圧（約１８〜２２％のｐＯ２）または低酸素（５％未満のｐＯ２、好ましくは、０．１〜３％のｐＯ２）を特徴とし得る。細胞は、所望により、単離された、または精製された、細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ調製物として提供でき、それぞれの正常酸素圧または低酸素条件下で、培養物中に、または処方物中に維持された細胞であり得る。
【００８０】
いくつかの実施形態では、同一種の非感染細胞と比較して、炎症性サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＣＸＣＬ−１のうち１種または複数の発現が上方制御され得る。このような上方制御は、好ましくは、細胞が低酸素条件（例えば、約０．１％  ｐＯ２）にある場合に起こり得る。ＩＬ−８および／またはＩＬ−１の上方制御は、少なくとも２倍、所望により、３倍または５倍であり得る。ＮＦκＢまたはＴＧＦ−βまたはＣＸＣＬ６発現の上方制御もまた、低酸素条件下で観察され得る。ＮＦκＢおよびその他の因子の上方制御は、１型Ｔ細胞応答（Ｔｈ１および／またはＴｃ１）の誘導と一致し得、これは、がんの治療にとって望ましく、ウイルス粒子が細胞から放出される時に対象において開始される抗ウイルスＴｈ１型免疫応答に対して付加的であり得る。
【００８１】
いくつかの実施形態では、同一種の非感染細胞と比較して、ＩＬ−８、ＩＬ−１、ＮＦκＢ、ＩＬ−１０およびＶＥＧＦＡのうち１種または複数の発現は、上方制御され得る。このような上方制御は、好ましくは、細胞が低酸素条件にある場合に起こり得る（例えば、５％未満のｐＯ２、好ましくは、０．１〜３％のｐＯ２）。このような上方制御は、少なくとも２倍、所望により、３倍または５倍またはそれ以上であり得る。
【００８２】
いくつかの実施形態では、同一種の非感染細胞と比較して、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０、ＣＸＣＬ−６のうち１種または複数の発現は下方制御され得る。このような下方制御は、細胞が正常酸素圧条件にある場合に起こり得る。
【００８３】
いくつかの実施形態では、正常酸素圧条件下では、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１およびＶＥＧＦＡのうち１種または複数は、上方制御され得、ＮＦκＢ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＣＸＣＬ６およびＣＸＣＬ１のうち１種または複数は下方制御され得る。
【００８４】
いくつかの実施形態では、低酸素条件下で、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＮＦκＢ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＶＥＧＦＡ、ＣＸＣＬ６およびＣＸＣＬ１のうち１種または複数は上方制御され得る。
【００８５】
遺伝子／タンパク質の上方制御または過剰発現は、所与の種類の細胞または組織について、通常、予測されるものよりも大きいレベルでのマーカーの発現を含む。そのようなものとして、上方制御は、同一種のウイルスに感染した細胞および非感染細胞間の発現のレベルを比較することによって決定され得る。
【００８６】
発現のレベルは、絶対比較について定量化され得る、または相対比較が行われてもよい。発現は、遺伝子発現を測定することによって、例えば、ｍＲＮＡレベルの測定によって、またはタンパク質発現を測定することによって決定され得る。
【００８７】
いくつかの実施形態では、試験試料における発現のレベルが、対照試料におけるものの少なくとも１．１倍である場合に、上方制御が存在すると考えられる。いくつかの実施形態では、発現のレベルは、対照試料におけるものの少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２．０、少なくとも２．１、少なくとも２．２、少なくとも２．３、少なくとも２．４、少なくとも２．５、少なくとも２．６、少なくとも２．７、少なくとも２．８、少なくとも２．９、少なくとも３．０、少なくとも３．５、少なくとも４．０、少なくとも５．０、少なくとも６．０、少なくとも７．０、少なくとも８．０、少なくとも９．０または少なくとも１０．０倍のうち１つから選択され得る。
【００８８】
下方制御は、対応する方法で決定され得る、例えば、いくつかの実施形態では、試験試料における発現のレベルが、対照試料におけるものの０．９倍未満である場合に、下方制御が存在すると考えられ得る。いくつかの実施形態では、発現のレベルは、対照試料におけるものの０．８倍未満、０．７倍未満、０．６倍未満、０．５倍未満、０．４倍未満、０．３倍未満、０．２倍未満または０．１倍未満のうち１つから選択され得る。
【００８９】
したがって、感染細胞は、細胞が、対象の身体において免疫応答、好ましくは、抗腫瘍応答を促進する既定の因子またはサイトカインのその発現および／または分泌によって治療効果を提供する、養子免疫療法の方法（例えば、Ｄａｒｃｙら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１４、２７：４６〜５２に、およびＡｎｄｒｅｅｓｅｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ第６４巻、１９９８年１０月、４１９〜４２６頁に記載されるような）において有用であり得る、別個の、同定可能な細胞の集団に相当する。細胞集団のこの作用は、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスを罹患組織に輸送し、組織においてそれを放出し、別個のウイルス媒介性抗腫瘍応答につながるその能力に対して付加的である。
【００９０】
したがって、本発明の一態様では、対象から血液または組織試料を得て、前記血液または組織試料から単球、単球由来細胞またはマクロファージを分離し、前記細胞に腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスを感染させ、前記感染細胞を含む調製物を処方し、そして、前記調製物を前記対象に投与する、ことを含む方法が提供される。この方法は、養子免疫療法の方法の一部であり得る。
【００９１】
磁性材料
磁性材料は、磁性的に感受性のある材料、磁化可能な材料または磁場によって操作（例えば、移動）および／もしくは配置され得る材料を含み得る。磁性材料は、非磁性であるが、磁場による操作もしくは配置に対して感受性のある場合もある、または磁性（例えば、磁力線の供給源）である場合もある。そのようなものとして、磁性材料は、固有に磁性であり得るか、または磁場において反応する、例えば、移動するものであり得る。
【００９２】
好ましい実施形態では、磁性材料は、磁性的に感受性のある粒子であるか、または流体、例えば、強磁性流体と呼ばれることが多い、磁性的に感受性のある粒子が、懸濁液中にある流体である。
【００９３】
磁性的に感受性のある粒子として、磁性的に感受性のある粒子、磁化可能な粒子または磁場によって操作（例えば、移動）および／もしくは配置され得る粒子を挙げることができる。磁性的に感受性のある粒子は、非磁性であるが、磁場による操作もしくは配置に対して感受性のある場合もある、または磁性（例えば、磁力線の供給源）である場合もある。
【００９４】
典型的には、粒子は、細胞に対して損傷を引き起こさずに、試薬を細胞中に送達するのに適した大きさものである。一態様では、粒子は、１μｍから１０ｎｍの間、例えば、２００ｎｍから２０ｎｍの間または５ｎｍから５０ｎｍの間など、１０μｍから５ｎｍの間の平均の大きさを有する。別の態様では、磁性的に感受性のある粒子は、球状ビーズであり得、少なくとも約０．０５μｍ、少なくとも約１μｍ、少なくとも約２．５μｍおよび典型的には、約２０μｍ未満の直径を有し得、または約５〜５０ｎｍ、１０〜４０ｎｍ、２０〜３０ｎｍまたは約２５ｎｍの直径を有し得る。
【００９５】
理論に制限されることは望まないが、より大きな粒子は、単球、単球由来細胞またはマクロファージへの改善された取り込みを与えると考えられる。例えば、マグネタイト粒子＞３０ｎｍは、式ｔ＝μＢ  ｓｉｎθ（式中、ｔはトルクであり、マイクロは磁気モーメントであり、Ｂは磁束密度であり、θは、適用された場と粒子の磁化ベクトルの間の角度である）によって示されるような、振動磁場におけるトルクを経験する。例えば、トルクの正確な量は、粒子の形状によって影響を受ける。このトルクによって誘導される粒子の移動は、粒子を細胞の表面中に、それを越えて「引きずること（ｄｒａｇ）」と考えられ、エンドサイトーシス機序による粒子の取り込みを誘導する。正常な細胞プロセスによる粒子の取り込みは、細胞への機械的損傷がないこと（例えば、微粒子銃法またはエレクトロポレーションと比較されるような）、したがって、粒子送達後の細胞生存率を改善することを意味する。
【００９６】
磁性的に感受性のある粒子は、例えば、その各々が全体として参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２００５０１４７９６３号または同２００５０１００９３０号または米国特許第５，３４８，８７６号に記載される磁性的に感受性のある粒子または市販のビーズ、例えば、商標名ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）および／またはＭＹＯＮＥ（商標）の下、Ｄｙｎａｌ  ＡＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ）によって生成されるものであり得る。特に、磁性的に感受性のある粒子に連結された抗体は、その各々が全体として参照により組み込まれる、例えば、米国特許出願番号第２００５０１４９１６９号、同２００５０１４８０９６号、同２００５０１４２５４９号、同２００５００７４７４８号、同２００５０１４８０９６号、同２００５０１０６６５２号および同２００５０１００９３０号ならびに米国特許第５，３４８，８７６号に記載されている。
【００９７】
一態様では、粒子は、元素鉄、クロム、マンガン、コバルト、ニッケルまたは化合物および／またはそれらの組合せ（例えば、マンガンおよびコバルトフェライト）などの、常磁性、超常磁性、強磁性および／または反強磁性材料を含む。粒子は、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）粒子であり得る。例えば、適した化合物として、酸化鉄、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、磁赤鉄鉱（γＦｅ２Ｏ３）、グレイジャイト（Ｆｅ３Ｓ４）および二酸化クロム（ＣｒＯ２）などの鉄塩が挙げられる。
【００９８】
粒子は、ポリマー中、例えば、ポリマーマトリックスの孔中に包埋される磁性材料を含み得る。あるいは、粒子は、生体適合性コーティング、例えば、シリカまたはデキストラン、ポリビニルアルコールもしくはポリエチレンイミンなどのポリマーによって囲まれた磁性コアを含み得る。
【００９９】
磁性的に感受性のある粒子は、試薬を含み得る。試薬は、共有結合または非共有結合（例えば、水素結合、静電相互作用、イオン結合、親油性相互作用またはファンデルワールス力）によって粒子と会合され（コンジュゲートされ）得る。一態様では、試薬および粒子は、例えば、試薬を反応性側鎖、例えば、タンパク質性試薬のチロシン残基に連結するためのベンジジンまたは炭水化物基と連結するための過ヨウ素酸を有する粒子に曝露することによって、共有結合によって連結される。別の態様では、粒子は、結合活性を有する分子（例えば、アビジン）と連結され得、試薬は、前記結合分子（例えば、ビオチン）のリガンドと連結され得る。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで粒子および試薬が容易にコンジュゲートされることを可能にする。さらなる態様において、粒子は、ポリマーマトリックスなどのマトリックス中に吸収された試薬を含み得る。
【０１００】
磁性材料は、好ましくは、単球、単球由来細胞またはマクロファージに対して外因性である、すなわち、単球、単球由来細胞またはマクロファージの外側を起源とし、所望により、単球、単球由来細胞またはマクロファージ中に通常存在する材料ではない。
磁場の適用
単球、単球由来細胞またはマクロファージに外因性磁性材料が負荷される実施形態では、対象への単球、単球由来細胞またはマクロファージの投与後に、投与された細胞を、対象の身体中の所望の位置に、例えば、腫瘍に向かわせるために対象に磁場が提供され得る。それによって、細胞は、勾配を有する磁場中にある場合に磁性材料に対して発揮される力である磁力に付される。磁力は、磁性材料を磁場の供給源に向けて動かし得る。磁力はまた、粒子にトルクを経験させ得る。いくつかの構成では、磁力は、粒子を、磁場の供給源から離れて動かし得る。これは、粒子が、磁性的に遮断され、回転できない場合に起こり得る。
【０１０１】
本明細書において、磁石の、または磁石アレイの「力場」は、磁性材料が磁力を経験する、磁石または磁石アレイの周囲の空間の容量を説明する。
磁場は、磁場（ｍａｇｎｅｔ  ｆｉｅｌｄ）供給源、典型的には、磁石または磁石のアレイによって提供され得る。磁石は、電磁石であり得る。選択される磁石の種類および大きさ／力は、適用に応じて異なる。例えば、細胞が身体の表面近くの腫瘍に局所的に投与される場合、例えば、原発性黒色腫の場合には、細胞を、例えば、組織または血管を通って、腫瘍の部位へ向かわせるように適した磁力を適用するのに、手持ち式磁石が十分であり得る。その他の場合には、例えば、腫瘍が身体内のより深くに位置する場合および／または投与が腫瘍に対して非局所的である、例えば、全身投与の場合には、対象は、電磁石のものまたは磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、核磁気共鳴画像法（ＮＭＲＩ）または磁気共鳴トポグラフィー（ＭＲＴ）装置によって提供されるものなどの、可変のまたは周期的に振動する、好ましくは、制御可能な磁場中に置かれ得る。
【０１０２】
いくつかの好ましい実施形態では、本発明に従う方法および使用は、磁性材料が負荷された単球、単球由来細胞またはマクロファージを、皮膚の近くに位置しない選択された組織または腫瘍に、すなわち、深部組織または臓器に向けることまたは標的化することを含む。深部組織または臓器は、皮膚の表面から少なくとも４ｃｍまたは５ｃｍまたはそれ以上離れている（治療されるべき組織または腫瘍の領域の中心から皮膚の表面までの最短距離として測定される）ものであり得る。組織または腫瘍は、対象の身体のコア（すなわち、脚および腕を含まない身体の部分）にあり得る。組織または腫瘍は、頭部、頸部、胸部、腹部または骨盤にあり得る。組織または腫瘍は、副腎、副腎髄質、肛門、虫垂、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、盲腸、中枢神経系（脳を含むまたは脳を含まない）小脳、子宮頸部、結腸、十二指腸、子宮内膜、胆嚢、食道、心臓、回腸、腸、空腸、腎臓（複数可）、涙腺（ｌａｃｒｉｍａｌ  ｇｌａｄ）、喉頭、肝臓、肺（複数可）、リンパ、リンパ節、縦隔、腸間膜、子宮筋、上咽頭、腹膜網（ｏｍｅｎｔｕｍｅ）、卵巣、膵臓、耳下腺、末梢神経系、腹膜、胸膜、前立腺、直腸、唾液腺、Ｓ字結腸、小腸、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺または子宮などの主要な臓器の１種であり得る、または主要な臓器の１種中にあり得る。単球、単球由来細胞またはマクロファージは、低酸素である組織または腫瘍の領域に向けられ得るまたは標的化され得る。
【０１０３】
治療を達成するために、対象は、磁性材料が負荷された細胞を投与され得、磁場内に配置され得る。次いで、磁場は、必要に応じて、細胞が投与された組織の構造、例えば、血液脈管構造を考慮して、細胞内に含有される磁性材料に磁力を適用し、磁性材料（および細胞）を、対象の身体中の所望の位置に向けるように、対象に対して、および／または細胞に対して変更され得る、またはそうでなければ、操作され得る。
【０１０４】
磁性材料が負荷された細胞およびその他の薬剤を、身体内の標的部位に磁性的に導くおよび／または局在化するための装置および技術（マグネトフェクションと呼ばれることもある）は、当業者に公知であり、例として、Ｍｕｔｈａｎａら、（Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００８）１５、９０２〜９１０）；ＰｏｌｙａｋおよびＦｒｉｅｄｍａｎ、（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２００９年１月、第６巻、第１号：５３〜７０頁）；Ｐｌａｎｋら、（Ｍａｇｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｔｅｎ  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ−  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．第６３巻、第１４〜１５号、２０１１年１１月、１３００〜１３３１頁）；およびＬｉら、（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１２年４月；３（４）：３６５〜３７０）に記載されている。
【０１０５】
好ましい実施形態では、対象の身体への磁場の適用は、非侵襲性であり、非外科的である。磁場供給源は、通常、対象の身体の外側にあり、好ましい実施形態では、対象の身体と物理的に接触しない。
がん
がんは、任意の望まれない細胞増殖（または望まれない細胞増殖によって示す任意の疾患）、新生物もしくは腫瘍または望まれない細胞増殖、新生物もしくは腫瘍へのリスクの増大もしくは素因であり得る。がんは、良性または悪性であり得、原発性または続発性（転移性）であり得る。新生物または腫瘍は、細胞の任意の異常な成長または増殖であり得、任意の組織中に位置し得る。組織の例として、副腎、副腎髄質、肛門、虫垂、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、盲腸、中枢神経系（脳を含むまたは含まない）小脳、子宮頸部、結腸、十二指腸、子宮内膜、上皮細胞（例えば、腎上皮）、胆嚢、食道、グリア細胞、心臓、回腸、空腸、腎臓、涙腺、喉頭、肝臓、肺、リンパ、リンパ節、リンパ芽球、上顎骨、縦隔、腸間膜、子宮筋、上咽頭、腹膜網、口腔、卵巣、膵臓、耳下腺、末梢神経系、腹膜、胸膜、前立腺、唾液腺、Ｓ字結腸、皮膚、小腸、柔組織、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、舌、扁桃腺、気管、子宮、外陰部、白血球が挙げられる。
【０１０６】
治療されるべき腫瘍は、神経系または非神経系腫瘍であり得る。神経系腫瘍は、中枢または末梢神経系のいずれかを起源とし得る、例えば、神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、神経線維腫、上衣腫、シュワン腫、神経線維肉腫、星状細胞腫および乏突起神経膠腫である。非神経系がん／腫瘍は、任意のその他の非神経系組織を起源とし得、例として、黒色腫、中皮腫、リンパ腫、骨髄腫、白血病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、皮膚性Ｔ−細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、肝細胞腫、類表皮癌、前立腺癌、乳がん、肺がん、結腸がん、卵巣がん、膵臓がん、胸腺癌、ＮＳＣＬＣ、血液学的がんおよび肉腫が挙げられる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍であり得る。
低酸素（Ｈｙｐｏｘｉａ）
いくつかの実施形態では、組織またはがんは、低酸素環境を有するものであり得、治療は、周囲の正常酸素圧細胞と一緒に、またはそれらから独立して、その環境内の細胞に向けられ得る。
【０１０８】
生理学的正常酸素圧は、組織間で、動物間でおよび個体間で変わる。組織または臓器は、例えば、血管新生のパターンに応じて可変測定値を有し得る。一般に、健常な哺乳動物の内部組織および臓器は、典型的には、２０ｍｍＨｇ［約２．６２％酸素］より大きい酸素の平均分圧を有する（例えば、脳では約＞３５ｍｍＨｇ、腸組織では＞５０ｍｍＨｇ、肝臓では＞３５ｍｍＨｇ、筋肉では＞２５ｍｍＨｇ）。
【０１０９】
生存対象において生理学的正常酸素圧および低酸素を測定するための技術は、参照により本明細書に組み込まれるＣａｒｒｅａｕら（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．第１５巻、第６号、２０１１年１２３９〜１２５３頁）に記載されている。これらとして、非侵襲性および侵襲性技術が挙げられる。非侵襲性技術は、所望により、ニトロイミダゾール（例えば、アゾマイシン）などの低酸素マーカーと併用した、陽電子放射型断層撮影（ＰＥＴ）、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ、例えば、１９Ｆ−ＭＲＩ、血液酸素依存性ＭＲＩまたはダイナミック造影ＭＲＩ）、近赤外分光法（ＮＩＲＳ）および電子常磁体共鳴分光分析（ＥＰＲ）などの画像診断技術を含む。その他の技術として、ポーラログラフィーセンサーの使用（酸素圧を測定するための至適基準と考えられることが多い）、塩化ルテニウムなどのｐＯ２感受性蛍光色素と併用した光ファイバーベースのセンサーおよび質量分析が挙げられる。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、治療の方法は、対象中の組織において正常酸素圧および／または低酸素の状態を測定または決定すること、例えば、酸素分圧の測定および腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスに感染した単球、単球由来細胞またはマクロファージを用いる治療のために、対象および／または対象中の組織もしくは組織の部分を選択することを含み得る。細胞が、外因性磁性材料を含有し、正常酸素圧／低酸素の状態の決定が、磁気共鳴法を使用して行われる実施形態では、正常酸素圧／低酸素の状態の決定および選択された組織または組織の一部に、細胞を向けることの両方が、所望により、同時に実施され得る。
【０１１１】
低酸素は、腫瘍において起こることがわかっている。対応する血管新生または血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）を伴わない腫瘍の急速な成長は、酸素濃度が、正常な（正常酸素圧）健常組織においてよりも低い腫瘍の領域につながる。そのようなものとして、低酸素微小環境が発生し、腫瘍細胞の代謝は、低酸素環境に適応するようになり得る。腫瘍低酸素は、各々、参照により本明細書において組み込まれる、Ｋｉｚａｋａ−Ｋｏｎｄｏｈら、（Ｔｕｍｏｒ  ｈｙｐｏｘｉａ：  Ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  ２００３年１２月、第９４巻、第１２号、１０２１〜１０２８）ならびにＨｏｃｋｅｌおよびＶａｕｐｅｌ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ第９３巻、第４号、２００１年２月２１日、２６６〜２７６頁）に概説されている。
【０１１２】
腫瘍低酸素は、固形腫瘍ではよく起こる。多数の固形腫瘍は、臨床的大きさ、ステージ、グレードまたは組織学によって予測できない低Ｏ２分圧の区域を含有する。
いくつかの実施形態では、低酸素は、約２０ｍｍＨｇ未満、約１５ｍｍＨｇ未満、約１４ｍｍＨｇ未満、約１３ｍｍＨｇ未満、約１２ｍｍＨｇ未満、約１１ｍｍＨｇ未満、約１０ｍｍＨｇ未満、約９ｍｍＨｇ未満、約８ｍｍＨｇ未満、約７ｍｍＨｇ未満、約６ｍｍＨｇ未満、約５ｍｍＨｇ未満、約４ｍｍＨｇ未満、約３ｍｍＨｇ未満、約２ｍｍＨｇ未満またはｎ約１ｍｍＨｇ未満のうち１つの酸素の分圧によって定義される。いくつかの実施形態では、低酸素は、０．０１〜１５ｍｍＨｇ、５〜１５ｍｍＨｇ、０．０１〜１０ｍｍＨｇ、３〜１０ｍｍＨｇ、５〜１０ｍｍＨｇ、７〜１０ｍｍＨｇ、８〜１０ｍｍＨｇ、８〜１１ｍｍＨｇまたは７〜１２ｍｍＨｇの範囲の酸素の分圧を有する組織として定義され得る。いくつかの実施形態では、低酸素は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ｍｍＨｇのうち１つの酸素の分圧を有する組織として定義され得る。［注記：１ｍｍＨｇ＝１３３．３２２Ｐａ；１％酸素＝１．０１３ｋＰａまたは約７．６４ｍｍＨｇ］
細胞代謝は、低酸素条件において適応され得るので、低酸素はまた、１種または複数のマーカーの発現を測定することによって決定され得る。
【０１１３】
このようなマーカーとして、転写因子、例えば、ＮＦκＢまたは低酸素誘導性因子（ＨＩＦ）ファミリーのうち１種、例えば、アイソフォームＨＩＦ−１α、ＨＩＦ−２αが挙げられる。ＨＩＦ−１は、２つのサブユニット、ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−１βを有する。ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２αは、低酸素の発生の数分内に誘導される。ＨＩＦ−１αは、主に、低酸素に対する急性応答であり、ＨＩＦ−１αレベルは、長期の低酸素では低減する傾向がある。ＨＩＦ−２αレベルは、低酸素の時間とともに増大し続ける傾向がある。ＨＩＦ−１αの誘導は、通常、ＨＩＦ−２αの誘導に必要であるよりも低いｐＯ２（＜５％［Ｃａｒｒｅａｕら］）を必要とする。そのようなものとして、いくつかの実施形態では、低酸素は、ＮＦκＢ、ＨＩＦ−１αまたはＨＩＦ−２αの発現の上方制御を測定することによって決定され得、その測定値が、生理学的正常酸素圧にあると考えられる対応する組織と比較され得る。
【０１１４】
マーカーの別のグループとして、低酸素によって調節されるマイクロＲＮＡ（ＨＲＭ）があり、これには、低酸素細胞において上方制御され得るｍｉＲ−２１、２３ａ、２３ｂ、２４、２６ａ、２６ｂ、２７ａ、３０ｂ、９３、１０３、１０６ａ、１０７、１２５ｂ、１８１ａ、１８１ｂ、１９２、１９５、２１０および２１３が挙げられる。ｍｉＲ−１５ｂ、１６、１９ａ、２０ａ、２０ｂ、２９ｂ、３０ｂ、３０ｅ−５ｐ、１０１、１４１、１２２ａ、１８６、１９７、３２０などのいくつかのマイクロＲＮＡは、低酸素細胞において下方制御され得る。そのようなものとして、いくつかの実施形態では、低酸素は、低酸素によって調節されるマイクロＲＮＡのうち１種または複数の上方制御または下方制御を測定することによって決定され得る。測定は、生理学的に正常酸素圧にあると考えられる組織と比較され得る。
【０１１５】
低酸素は、腫瘍低酸素の場合には、腫瘍増殖および低酸素環境への適応を促進し得るプロテオーム変化を誘導し得る。このような適応は、解糖酵素、グルコーストランスポーター（例えば、ＧＬＵＴ１およびＧＬＵＴ３）、血管新生分子、生存および増殖因子（例えば、ＶＥＧＦ）、アンギオゲニン、ＰＤＧＦ−βまたはＴＧＦ−βの転写を刺激することによって栄養欠乏に適応することを含み得る。
【０１１６】
対象
治療されるべき対象は、任意の動物またはヒトであり得る。対象は、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトである。対象は、非ヒト哺乳動物であり得るが、より好ましくは、ヒトである。対象は、男性または女性であり得る。対象は、患者であり得る。対象は、がんを有すると診断されていた場合もあり、がんを有すると疑われる場合もある。
【０１１７】
キット
本発明のいくつかの態様では、パーツのキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、所定の量の腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス、例えば、所定のウイルス用量または数／量／濃度のウイルス粒子を有する少なくとも１つの容器を有し得る。腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスは、細胞の感染に適しているように処方することができる。キットは、所定の量の磁性材料を有する少なくとも１つの容器をさらに含み得る。
【０１１８】
キットは、単球、単球由来細胞もしくはマクロファージの腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスによる感染のための、および／または単球、単球由来細胞もしくはマクロファージへの磁性材料の負荷のための取扱説明書と一緒に提供され得る。このような取扱説明書は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養の条件下で前記感染および／または負荷をｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施するためのものであり得る。
【０１１９】
本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施され得、生成物が存在し得る。用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、実験室条件において、または培養において材料、生物学的物質、細胞および／または組織を用いる実験を包含するように意図されるが、用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、無傷の多細胞生物を用いる実験および手順を包含するように意図される。「Ｅｘ  ｖｉｖｏ」とは、生物の外側、例えば、生物から採取された組織（例えば、全臓器）または細胞上であり得るヒトまたは動物の身体の外側に存在するまたはそこで起こる何かを指す。
【０１２０】
本発明は、記載された態様および好ましい特色の組合せを、このような組合せが明確に許容されないまたは明らかに避けられる場合を除いて、含む。
本明細書において使用される節見出しは、単に構造化された目的のためのものであって、記載される主題を制限すると解釈されてはならない。
【０１２１】
本発明の態様および実施形態を、例として、添付の図面を参照して、ここで、例示する。さらなる態様および実施形態は、当業者に明らかとなろう。本教示において言及されたすべての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２２】
本発明の原理を例証する実施形態および実験については、添付の図面を参照しながら論考する。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】４ｐｆｕ／細胞ＨＳＶ１７１６を用いる感染および正常酸素圧または低酸素における培養後、種々の時点でのヒトマクロファージの滴定を示す図表である。およそ３００，０００の一次ヒトマクロファージに１，１８０，０００ｐｆｕのＨＳＶ１７１６を感染させ、感染後種々の時点で試料を集め、ベロ細胞でＨＳＶ１７１６を滴定した。総滴定可能ウイルスを時間に対してグラフ化し、点線は、投入したウイルスの量を表す。
【図２】種々の投入ｍｏｉのＨＳＶ１７１６を用いる正常酸素圧感染の７２時間後にヒトマクロファージから得た排出量（総ｐｆｕ）を示す図表である。およそ３００，０００の一次ヒトマクロファージに、ｍｏｉ４０、４、０．４および０．０４でＨＳＶ１７１６を感染させ、感染後７２時間で試料を集め、ベロ細胞でＨＳＶ１７１６を滴定した。
【図３ａ】ＭＯＩ０（対照）（Ａ）および５（Ｂ）での感染から７２時間後のＬＮＣａＰ細胞集団の代表的密度プロットである。ＢＬ３−Ａ検出器（Ｘ軸）は、ＰＩの尺度であり、ＢＬ１−Ａ検出器（Ｙ軸）は、ＧＦＰの尺度である。各ドットは細胞を表す。象限Ｒ４は、ＨＳＶ１７１６に感染していない生存集団を示す（ＰＩ−／ＧＦＰ−）；象限Ｒ３およびＲ５は、死滅細胞の量を表す（ＰＩ＋）；Ｒ２は、ＨＳＶ１７１６に感染した生存細胞を示す（ＰＩ−／ＧＦＰ＋）。対照（Ａ）では、細胞集団は、主にＲ４に分布するが、ＭＯＩ５（Ｂ）細胞は、プロットの右側（Ｒ３＋Ｒ５）および上側（Ｒ２）に向けて移動し、細胞死および一定のパーセンテージのＨＳＶ１７１６に感染した生存細胞の存在の増大をそれぞれ示す。プロットは、Ａｔｔｕｎｅ細胞数測定ソフトウェアから得られた。
【図３ｂ】ＭＯＩ０（対照）（Ａ）および５（Ｂ）での感染から７２時間後のＬＮＣａＰ細胞集団の代表的密度プロットである。ＢＬ３−Ａ検出器（Ｘ軸）は、ＰＩの尺度であり、ＢＬ１−Ａ検出器（Ｙ軸）は、ＧＦＰの尺度である。各ドットは細胞を表す。象限Ｒ４は、ＨＳＶ１７１６に感染していない生存集団を示す（ＰＩ−／ＧＦＰ−）；象限Ｒ３およびＲ５は、死滅細胞の量を表す（ＰＩ＋）；Ｒ２は、ＨＳＶ１７１６に感染した生存細胞を示す（ＰＩ−／ＧＦＰ＋）。対照（Ａ）では、細胞集団は、主にＲ４に分布するが、ＭＯＩ５（Ｂ）細胞は、プロットの右側（Ｒ３＋Ｒ５）および上側（Ｒ２）に向けて移動し、細胞死および一定のパーセンテージのＨＳＶ１７１６に感染した生存細胞の存在の増大をそれぞれ示す。プロットは、Ａｔｔｕｎｅ細胞数測定ソフトウェアから得られた。
【図４ａ】ＨＳＶ１７１６が、ＬＮＣａＰ細胞腫瘍退縮を誘導することを示す図である。（Ａ）Ｘ軸は、ＭＯＩを示し、Ｙ軸は、ＨＳＶ１７１６を取り込んだ生存細胞のパーセンテージを示す。ＭＯＩ０．５および５の両方で正常酸素圧条件（各データ点の左側のバー；低酸素＝各データ点の右側のバー）において統計的有意性が観察された。（Ｂ）Ｘ軸は、ＭＯＩを示し、Ｙ軸で細胞死のパーセンテージが報告されている。細胞死は、正常酸素圧および低酸素条件の両方においてＭＯＩ５で統計的に有意である（正常酸素圧＝各データ点の左側のバー；低酸素＝各データ点の右側のバー）。注目すべきは、データは、ｎ＝４反復の平均±ＳＥＭであり、多重比較のための二元配置Ａｎｏｖａ試験を使用することによって測定される、ｐ値＜０．０５である。
【図４ｂ】ＨＳＶ１７１６が、ＬＮＣａＰ細胞腫瘍退縮を誘導することを示す図である。（Ａ）Ｘ軸は、ＭＯＩを示し、Ｙ軸は、ＨＳＶ１７１６を取り込んだ生存細胞のパーセンテージを示す。ＭＯＩ０．５および５の両方で正常酸素圧条件（各データ点の左側のバー；低酸素＝各データ点の右側のバー）において統計的有意性が観察された。（Ｂ）Ｘ軸は、ＭＯＩを示し、Ｙ軸で細胞死のパーセンテージが報告されている。細胞死は、正常酸素圧および低酸素条件の両方においてＭＯＩ５で統計的に有意である（正常酸素圧＝各データ点の左側のバー；低酸素＝各データ点の右側のバー）。注目すべきは、データは、ｎ＝４反復の平均±ＳＥＭであり、多重比較のための二元配置Ａｎｏｖａ試験を使用することによって測定される、ｐ値＜０．０５である。
【図５ａ】ＭＯＩ０（対照）（Ａ）および５（Ｂ）での感染から７２時間後のＰＣ３細胞集団の代表的密度プロットである。ＢＬ３−Ａ検出器（Ｘ軸）は、ＰＩの尺度であり、ＢＬ１−Ａ検出器（Ｙ軸）は、ＧＦＰの尺度である。各ドットは細胞を表す。象限Ｒ４は、ＨＳＶ１７１６に感染していない生存集団を示す（ＰＩ−／ＧＦＰ−）；象限Ｒ３およびＲ５は、死滅細胞の量を表す（ＰＩ＋）；Ｒ２は、ＨＳＶ１７１６に感染した生存細胞を示す（ＰＩ−／ＧＦＰ＋）。細胞集団が、生存細胞（Ｒ４に分布される事象）によってほとんど構成される対照（Ａ）と比較して、ＭＯＩ５（Ｂ）では、一貫した割合の細胞が、プロットの右側（死滅細胞）および上側に向けて移動した（Ｒ２：感染した生存細胞）。プロットは、Ａｔｔｕｎｅ細胞数測定ソフトウェアから得られた。
【図５ｂ】ＭＯＩ０（対照）（Ａ）および５（Ｂ）での感染から７２時間後のＰＣ３細胞集団の代表的密度プロットである。ＢＬ３−Ａ検出器（Ｘ軸）は、ＰＩの尺度であり、ＢＬ１−Ａ検出器（Ｙ軸）は、ＧＦＰの尺度である。各ドットは細胞を表す。象限Ｒ４は、ＨＳＶ１７１６に感染していない生存集団を示す（ＰＩ−／ＧＦＰ−）；象限Ｒ３およびＲ５は、死滅細胞の量を表す（ＰＩ＋）；Ｒ２は、ＨＳＶ１７１６に感染した生存細胞を示す（ＰＩ−／ＧＦＰ＋）。細胞集団が、生存細胞（Ｒ４に分布される事象）によってほとんど構成される対照（Ａ）と比較して、ＭＯＩ５（Ｂ）では、一貫した割合の細胞が、プロットの右側（死滅細胞）および上側に向けて移動した（Ｒ２：感染した生存細胞）。プロットは、Ａｔｔｕｎｅ細胞数測定ソフトウェアから得られた。
【図６ａ】ＨＳＶ１７１６が、ＰＣ３に対して細胞傷害性効果を有することを示す図である。（Ａ）Ｘ軸は、ＭＯＩを示し、Ｙ軸、ＨＳＶ１７１６を取り込んだ生存細胞のパーセンテージを示す。ＭＯＩ０．５および５の両方で正常酸素圧条件（各データ点の左側のバー；低酸素＝各データ点の右側のバー）において統計的有意性が観察された。（Ｂ）Ｘ軸は、ＭＯＩを示し、Ｙ軸は、細胞死のパーセンテージを示す。細胞死は、正常酸素圧および低酸素条件の両方においてＭＯＩ０．５およびＭＯＩ５で統計的に有意である（正常酸素圧＝各データ点の左側のバー；低酸素＝各データ点の右側のバー）。結果は、４（Ａ）および８（Ｂ）反復の平均±ＳＥＭであり、多重比較のための二元配置Ａｎｏｖａ試験を使用することによって測定される、ｐ値＜０．０５である。
【図６ｂ】ＨＳＶ１７１６が、ＰＣ３に対して細胞傷害性効果を有することを示す図である。（Ａ）Ｘ軸は、ＭＯＩを示し、Ｙ軸、ＨＳＶ１７１６を取り込んだ生存細胞のパーセンテージを示す。ＭＯＩ０．５および５の両方で正常酸素圧条件（各データ点の左側のバー；低酸素＝各データ点の右側のバー）において統計的有意性が観察された。（Ｂ）Ｘ軸は、ＭＯＩを示し、Ｙ軸は、細胞死のパーセンテージを示す。細胞死は、正常酸素圧および低酸素条件の両方においてＭＯＩ０．５およびＭＯＩ５で統計的に有意である（正常酸素圧＝各データ点の左側のバー；低酸素＝各データ点の右側のバー）。結果は、４（Ａ）および８（Ｂ）反復の平均±ＳＥＭであり、多重比較のための二元配置Ａｎｏｖａ試験を使用することによって測定される、ｐ値＜０．０５である。
【図７ａ】ＭＯＩ０（対照）（Ａ）および５（Ｂ）での感染から１２０時間後のＴ４７Ｄ細胞集団の代表的密度プロットである。ＢＬ３−Ａ検出器（Ｘ軸）は、ＰＩの尺度であり、ＢＬ１−Ａ検出器（Ｙ軸）は、ＧＦＰの尺度である。各ドットは細胞を表す。象限Ｒ４は、ＨＳＶ１７１６に感染していない生存集団を示す（ＰＩ−／ＧＦＰ−）；象限Ｒ３およびＲ５は、死滅細胞の量を表す（ＰＩ＋）；Ｒ２は、ＨＳＶ１７１６に感染した生存細胞を示す（ＰＩ−／ＧＦＰ＋）。生存細胞集団（Ａ、対照）は、感染から１２０時間後にプロットの右側に向かって移動し（Ｂ、ＭＯＩ５）、これは、死滅細胞の存在を示す。Ｒ２象限に顕著な割合の細胞も観察された（感染生存細胞）。プロットは、Ａｔｔｕｎｅ細胞数測定ソフトウェアから得られた。
【図７ｂ】ＭＯＩ０（対照）（Ａ）および５（Ｂ）での感染から１２０時間後のＴ４７Ｄ細胞集団の代表的密度プロットである。ＢＬ３−Ａ検出器（Ｘ軸）は、ＰＩの尺度であり、ＢＬ１−Ａ検出器（Ｙ軸）は、ＧＦＰの尺度である。各ドットは細胞を表す。象限Ｒ４は、ＨＳＶ１７１６に感染していない生存集団を示す（ＰＩ−／ＧＦＰ−）；象限Ｒ３およびＲ５は、死滅細胞の量を表す（ＰＩ＋）；Ｒ２は、ＨＳＶ１７１６に感染した生存細胞を示す（ＰＩ−／ＧＦＰ＋）。生存細胞集団（Ａ、対照）は、感染から１２０時間後にプロットの右側に向かって移動し（Ｂ、ＭＯＩ５）、これは、死滅細胞の存在を示す。Ｒ２象限に顕著な割合の細胞も観察された（感染生存細胞）。プロットは、Ａｔｔｕｎｅ細胞数測定ソフトウェアから得られた。
【図８ａ】ＨＳＶ１７１６感染が、Ｔ４７Ｄ細胞死を誘導することを示す図である。（Ａ）Ｘ軸は、ＭＯＩを示し、Ｙ軸は、ＨＳＶ１７１６を取り込んだ生存細胞のパーセンテージを示す。ＭＯＩ０．５および５の両方で正常酸素圧および低酸素条件において（正常酸素圧＝各データ点の左側のバー；低酸素＝各データ点の右側のバー）統計的有意性が観察された。（Ｂ）Ｘ軸は、ＭＯＩを示し、Ｙ軸は、死滅細胞のパーセンテージを示す。細胞死は、正常酸素圧および低酸素条件の両方においてＭＯＩ５で統計的に有意である。結果は、ｎ＝３（Ａ）およびｎ＝５（Ｂ）の独立実験の平均±ＳＥＭであり、多重比較のための二元配置Ａｎｏｖａ試験を使用することによって測定される、ｐ値＜０．０５である。
【図８ｂ】ＨＳＶ１７１６感染が、Ｔ４７Ｄ細胞死を誘導することを示す図である。（Ａ）Ｘ軸は、ＭＯＩを示し、Ｙ軸は、ＨＳＶ１７１６を取り込んだ生存細胞のパーセンテージを示す。ＭＯＩ０．５および５の両方で正常酸素圧および低酸素条件において（正常酸素圧＝各データ点の左側のバー；低酸素＝各データ点の右側のバー）統計的有意性が観察された。（Ｂ）Ｘ軸は、ＭＯＩを示し、Ｙ軸は、死滅細胞のパーセンテージを示す。細胞死は、正常酸素圧および低酸素条件の両方においてＭＯＩ５で統計的に有意である。結果は、ｎ＝３（Ａ）およびｎ＝５（Ｂ）の独立実験の平均±ＳＥＭであり、多重比較のための二元配置Ａｎｏｖａ試験を使用することによって測定される、ｐ値＜０．０５である。
【図９ａ】ＭＯＩ０（対照）（Ａ）、５（Ｂ）および（Ｃ）での感染から９６時間後のＭＤＭ細胞集団の代表的密度プロットである。ＢＬ３−Ａ検出器（Ｘ軸）は、ＰＩの尺度であり、ＢＬ１−Ａ検出器（Ｙ軸）は、ＧＦＰの尺度である。各ドットは細胞を表す。象限Ｒ４は、ＨＳＶ１７１６に感染していない生存集団を示す（ＰＩ−／ＧＦＰ−）；象限Ｒ３およびＲ５は、死滅細胞の量を表す（ＰＩ＋）。細胞集団が、生存細胞によってほとんど構成される対照（Ａ）と比較して、ＭＯＩ５（Ｂ）では、グラフの右側へ向かう変換が観察され（Ｒ３、Ｒ５）、これは、死滅細胞のパーセンテージの増大を示す。ＭＯＩ５０（Ｃ）では、細胞死のわずかな増大が検出されるが、ＭＯＩ５と５０の間で相当な差はない。プロットは、Ａｔｔｕｎｅ細胞数測定ソフトウェアから得られた。
【図９ｂ】ＭＯＩ０（対照）（Ａ）、５（Ｂ）および（Ｃ）での感染から９６時間後のＭＤＭ細胞集団の代表的密度プロットである。ＢＬ３−Ａ検出器（Ｘ軸）は、ＰＩの尺度であり、ＢＬ１−Ａ検出器（Ｙ軸）は、ＧＦＰの尺度である。各ドットは細胞を表す。象限Ｒ４は、ＨＳＶ１７１６に感染していない生存集団を示す（ＰＩ−／ＧＦＰ−）；象限Ｒ３およびＲ５は、死滅細胞の量を表す（ＰＩ＋）。細胞集団が、生存細胞によってほとんど構成される対照（Ａ）と比較して、ＭＯＩ５（Ｂ）では、グラフの右側へ向かう変換が観察され（Ｒ３、Ｒ５）、これは、死滅細胞のパーセンテージの増大を示す。ＭＯＩ５０（Ｃ）では、細胞死のわずかな増大が検出されるが、ＭＯＩ５と５０の間で相当な差はない。プロットは、Ａｔｔｕｎｅ細胞数測定ソフトウェアから得られた。
【図９ｃ】ＭＯＩ０（対照）（Ａ）、５（Ｂ）および（Ｃ）での感染から９６時間後のＭＤＭ細胞集団の代表的密度プロットである。ＢＬ３−Ａ検出器（Ｘ軸）は、ＰＩの尺度であり、ＢＬ１−Ａ検出器（Ｙ軸）は、ＧＦＰの尺度である。各ドットは細胞を表す。象限Ｒ４は、ＨＳＶ１７１６に感染していない生存集団を示す（ＰＩ−／ＧＦＰ−）；象限Ｒ３およびＲ５は、死滅細胞の量を表す（ＰＩ＋）。細胞集団が、生存細胞によってほとんど構成される対照（Ａ）と比較して、ＭＯＩ５（Ｂ）では、グラフの右側へ向かう変換が観察され（Ｒ３、Ｒ５）、これは、死滅細胞のパーセンテージの増大を示す。ＭＯＩ５０（Ｃ）では、細胞死のわずかな増大が検出されるが、ＭＯＩ５と５０の間で相当な差はない。プロットは、Ａｔｔｕｎｅ細胞数測定ソフトウェアから得られた。
【図１０】ＨＳＶ１７１６が、ＭＤＭ細胞死を引き起こすことを示す図である。Ｘ軸は、ＭＯＩを示し、Ｙ軸は、死滅細胞のパーセンテージを示す。細胞死は、正常酸素圧および低酸素条件両方（正常酸素圧＝各データ点の左側のバー；低酸素＝各データ点の右側のバー）においてＭＯＩ５およびＭＯＩ５０で統計的に有意である（ｐ値＜０．００１）。ＭＯＩ５０では、低酸素条件下で細胞死の増大が観察される。結果は、ｎ＝４の独立実験の平均±ＳＥＭである。多重比較のための二元配置Ａｎｏｖａ試験を使用して統計的比較を実施した。
【図１１】表１：マクロファージコンディショニング培地において検出されたＨＳＶ１７１６（ＰＦＵ／ｍｌ）の濃度を示す図である。この表は、ＭＯＩ０、５、５０で感染され、正常酸素圧および低酸素条件下でインキュベートされたＭＤＭから回収された上清中に存在するＨＳＶ１７１６（ＰＦＵ／ｍｌ）の濃度を示す。行は、異なる微小環境（正常酸素圧、低酸素）を示し、；列は、実施されたウイルス感染（対照、ＭＯＩ５、ＭＯＩ５０）を示す。ＭＯＩ５および５０の両方でウイルス粒子が検出され、正常酸素圧および低酸素条件の両方においてＭＯＩ５０でより高い濃度であった。データは、ｎ＝４の独立実験の平均±ＳＥＭである。
【図１２】ＨＳＶ１７１６が、ヒトマクロファージを溶解し、微小環境中に放出されることを示す図である。Ｘ軸は、ＭＤＭが感染したＭＯＩを示し、Ｙ軸は、プレートから回収された上清中に見出されるＨＳＶ１７１６の濃度（ＰＦＵ／ｍｌ）を示す。結果は、低酸素条件下で、ＭＯＩ５０で統計的に有意である（多重比較のための二元配置Ａｎｏｖａ試験を使用することによって決定される、ｐ値＜０．０００１）。データは、ｎ＝４の独立実験の平均±ＳＥＭを示す。正常酸素圧＝各データ点の左側のバー；低酸素＝各データ点の右側のバー。
【図１３】ＭＤＭコンディショニング培地中に含有されるウイルス粒子が、ＬＮＣａＰ細胞死を誘導することを示す図である。Ｘ軸は、それからコンディショニング培地が回収されるマクロファージに感染させるために使用されたＭＯＩを示す。Ｙ軸は、死滅細胞のパーセンテージを示す。細胞死は、正常酸素圧においてＭＯＩ５０で統計的に有意である（ｐ値＜０．０１）。結果は、ｎ＝３の独立実験の平均±ＳＥＭである。統計分析は、多重比較のための二元配置Ａｎｏｖａを使用することによって実施した。正常酸素圧＝各データ点の左側のバー；低酸素＝各データ点の右側のバー。
【図１４】表２：ＨＳＶ１７１６が、ＭＤＭ遺伝子発現レベルの変更を誘導することを示す図である。表２は、正常酸素圧（第２行）および低酸素（第３行）条件の両方におけるＭＯＩ５０でのＨＳＶ１７１６感染から４８時間後の、１０種の目的の遺伝子（第１行において名付けられた）について算出されたＭＤＭ遺伝子発現の倍数変化を示す。各条件下での感染は、２回反復した。下線が引かれた値は、上方制御（値＞１）または下方制御（値＜１）のいずれかの遺伝子発現の関連変更を表示的に表す；すなわち、下線が引かれた値５．１３は、ＭＯＩ５０での感染後に、サイトカインＩＬ−８が低酸素条件において過剰発現され、対照と比較して５倍の増大をもたらすとわかったことを意味する。
【図１５】感染ＭＤＭ（ＭＯＩ５０）でのスフェロイドの浸潤が、スフェロイド細胞死を誘導することを示す図である。グラフは、浸潤から５日後（実験の９日目）にフローサイトメトリーによって検出される細胞死を示す。Ｙ軸は、細胞死（ＰＩ＋）％を示し、Ｘ軸は、ＭＤＭが浸潤前に感染したＭＯＩを示す。対照スフェロイド（対照）および非感染ＭＤＭ（０）での浸潤の間では、生存力に有意差は観察されなかったが、スフェロイドが、ＭＯＩ５０（５０）で感染したＭＤＭで浸潤された場合には、対照および０の両方を用いる後者と比較した場合に、細胞死は統計的に有意であった（５１±５．９２％細胞死）（ｐ値＝それぞれ、０．００９、０．００４）。結果は、ｎ＝３の独立実験の平均±ＳＥＭである。統計分析は、複数のｔ検定を使用して実施した。
【図１６】細胞ベースの療法を、患者中の特定の組織に導くためのＭＲ標的化の可能性ある使用を示す図である。（ａ）概略図：これらの研究のために使用される細胞は、患者血液から単離された単球に由来する。これらの細胞は、「治療用」マクロファージ（例えば、サイトカイン、治療用遺伝子またはウイルス）を産生するように種々の刺激の存在下で培養され、超常磁性酸化鉄粒子（ＳＰＩＯ）が負荷され、その後、同一患者中に再注入されて戻される。（ｂ）概略図：次いで、対象をＭＲＩスキャナーの中心に置き、ここで、線形空間的エンコード磁性勾配を使用して、磁化身体に力を誘導できる。対象の血流中に注射された磁性細胞は、循環し、適用される磁場の影響下で罹患臓器／組織中に標的化される。場マッププロットは、ＭＲＩ勾配コイルによって種々の方向に著しい場勾配が作製され得ることを実証する。得られた磁場（ｄＢ／ｄｙ場）は、磁性細胞を、細胞取り込みの増大のために罹患組織に導くことができる。
【図１７ａ】磁性マクロファージが、ＭＲ標的化を使用して原発性前立腺腫瘍中に導かれたことを示す図であり、（ａ）ＭＲ標的化の画像処理勾配を使用する標的化される領域の模式図である。描かれるように前立腺（濃く影が付けられた四角）の位置を標的化するために、Ａ−Ｙ勾配が、動物中に等しく適用される。次いで、３００万の磁力によって標識されたマクロファージをｉ．ｖ．注射によってマウスに投与し、麻酔されたマウスを、７Ｔ  ＭＲＩスキャナーのアイソセンターに置いた。対象を２群に分けた。群１は、１時間後に撮像した（ＭＲ標的化なし）。群２は、ＭＲＩ標的化を経験した。死後、（ｂ）ＭＲＩ標的化の１時間後のコラゲナーゼ処理された腫瘍のＦＡＣＳ解析によって、および（ｃ）抗ヒトＣＤ６８抗体およびＰｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ（ＳＰＩＯに対する）を用いる、パラフィンワックス包埋された腫瘍切片の組織学的染色によって、ヒトマクロファージ取り込みのレベルの増大が確認された。（ｄ）および（ｅ）に各群の代表的なＲＡＲＥ画像およびＲ２マップが示されている、バー＝２００ｐｍ。
【図１７ｂ】磁性マクロファージが、ＭＲ標的化を使用して原発性前立腺腫瘍中に導かれたことを示す図であり、（ａ）ＭＲ標的化の画像処理勾配を使用する標的化される領域の模式図である。描かれるように前立腺（濃く影が付けられた四角）の位置を標的化するために、Ａ−Ｙ勾配が、動物中に等しく適用される。次いで、３００万の磁力によって標識されたマクロファージをｉ．ｖ．注射によってマウスに投与し、麻酔されたマウスを、７Ｔ  ＭＲＩスキャナーのアイソセンターに置いた。対象を２群に分けた。群１は、１時間後に撮像した（ＭＲ標的化なし）。群２は、ＭＲＩ標的化を経験した。死後、（ｂ）ＭＲＩ標的化の１時間後のコラゲナーゼ処理された腫瘍のＦＡＣＳ解析によって、および（ｃ）抗ヒトＣＤ６８抗体およびＰｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ（ＳＰＩＯに対する）を用いる、パラフィンワックス包埋された腫瘍切片の組織学的染色によって、ヒトマクロファージ取り込みのレベルの増大が確認された。（ｄ）および（ｅ）に各群の代表的なＲＡＲＥ画像およびＲ２マップが示されている、バー＝２００ｐｍ。
【図１７ｃ】磁性マクロファージが、ＭＲ標的化を使用して原発性前立腺腫瘍中に導かれたことを示す図であり、（ａ）ＭＲ標的化の画像処理勾配を使用する標的化される領域の模式図である。描かれるように前立腺（濃く影が付けられた四角）の位置を標的化するために、Ａ−Ｙ勾配が、動物中に等しく適用される。次いで、３００万の磁力によって標識されたマクロファージをｉ．ｖ．注射によってマウスに投与し、麻酔されたマウスを、７Ｔ  ＭＲＩスキャナーのアイソセンターに置いた。対象を２群に分けた。群１は、１時間後に撮像した（ＭＲ標的化なし）。群２は、ＭＲＩ標的化を経験した。死後、（ｂ）ＭＲＩ標的化の１時間後のコラゲナーゼ処理された腫瘍のＦＡＣＳ解析によって、および（ｃ）抗ヒトＣＤ６８抗体およびＰｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ（ＳＰＩＯに対する）を用いる、パラフィンワックス包埋された腫瘍切片の組織学的染色によって、ヒトマクロファージ取り込みのレベルの増大が確認された。（ｄ）および（ｅ）に各群の代表的なＲＡＲＥ画像およびＲ２マップが示されている、バー＝２００ｐｍ。
【図１７ｄ】磁性マクロファージが、ＭＲ標的化を使用して原発性前立腺腫瘍中に導かれたことを示す図であり、（ａ）ＭＲ標的化の画像処理勾配を使用する標的化される領域の模式図である。描かれるように前立腺（濃く影が付けられた四角）の位置を標的化するために、Ａ−Ｙ勾配が、動物中に等しく適用される。次いで、３００万の磁力によって標識されたマクロファージをｉ．ｖ．注射によってマウスに投与し、麻酔されたマウスを、７Ｔ  ＭＲＩスキャナーのアイソセンターに置いた。対象を２群に分けた。群１は、１時間後に撮像した（ＭＲ標的化なし）。群２は、ＭＲＩ標的化を経験した。死後、（ｂ）ＭＲＩ標的化の１時間後のコラゲナーゼ処理された腫瘍のＦＡＣＳ解析によって、および（ｃ）抗ヒトＣＤ６８抗体およびＰｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ（ＳＰＩＯに対する）を用いる、パラフィンワックス包埋された腫瘍切片の組織学的染色によって、ヒトマクロファージ取り込みのレベルの増大が確認された。（ｄ）および（ｅ）に各群の代表的なＲＡＲＥ画像およびＲ２マップが示されている、バー＝２００ｐｍ。
【図１７ｅ】磁性マクロファージが、ＭＲ標的化を使用して原発性前立腺腫瘍中に導かれたことを示す図であり、（ａ）ＭＲ標的化の画像処理勾配を使用する標的化される領域の模式図である。描かれるように前立腺（濃く影が付けられた四角）の位置を標的化するために、Ａ−Ｙ勾配が、動物中に等しく適用される。次いで、３００万の磁力によって標識されたマクロファージをｉ．ｖ．注射によってマウスに投与し、麻酔されたマウスを、７Ｔ  ＭＲＩスキャナーのアイソセンターに置いた。対象を２群に分けた。群１は、１時間後に撮像した（ＭＲ標的化なし）。群２は、ＭＲＩ標的化を経験した。死後、（ｂ）ＭＲＩ標的化の１時間後のコラゲナーゼ処理された腫瘍のＦＡＣＳ解析によって、および（ｃ）抗ヒトＣＤ６８抗体およびＰｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ（ＳＰＩＯに対する）を用いる、パラフィンワックス包埋された腫瘍切片の組織学的染色によって、ヒトマクロファージ取り込みのレベルの増大が確認された。（ｄ）および（ｅ）に各群の代表的なＲＡＲＥ画像およびＲ２マップが示されている、バー＝２００ｐｍ。
【図１８ａ】ＭＲ標的化を使用して磁性マクロファージが肺転移中に導かれたことを示す図である。短パルス磁性勾配を使用して、ＳＰＩＯが負荷されたマクロファージを肺に導いた。（ａ）コラゲナーゼ処理された肺のＦＡＣＳ解析は、ＭＲ標的化を用いないものよりも、ＭＲ標的化を用いて有意に多いヒトＣＤ１４＋マクロファージが肺中に存在することを示した。（ｂ）これは、肺切片におけるヒトＣＤ６８およびＰｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅに対する免疫染色の増大を伴った。（ｃ）ＣＤ３１およびＨ＆Ｅを用いる免疫染色は、磁性マクロファージの肺へのＭＲ標的化送達は、標的化を伴わない送達と比較して、肺脈管構造に対して悪影響を有さないことを示した。ｎ＝３マウス／群である、２回の反復実験の一方から得た代表的なデータが示されている。ＳＥＭが表されている。パネルＡにおけるＭＲ標的化されていない肺と比較した、＊Ｐ＜０．０１。バー＝５０ｐｍ。
【図１８ｂ】ＭＲ標的化を使用して磁性マクロファージが肺転移中に導かれたことを示す図である。短パルス磁性勾配を使用して、ＳＰＩＯが負荷されたマクロファージを肺に導いた。（ａ）コラゲナーゼ処理された肺のＦＡＣＳ解析は、ＭＲ標的化を用いないものよりも、ＭＲ標的化を用いて有意に多いヒトＣＤ１４＋マクロファージが肺中に存在することを示した。（ｂ）これは、肺切片におけるヒトＣＤ６８およびＰｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅに対する免疫染色の増大を伴った。（ｃ）ＣＤ３１およびＨ＆Ｅを用いる免疫染色は、磁性マクロファージの肺へのＭＲ標的化送達は、標的化を伴わない送達と比較して、肺脈管構造に対して悪影響を有さないことを示した。ｎ＝３マウス／群である、２回の反復実験の一方から得た代表的なデータが示されている。ＳＥＭが表されている。パネルＡにおけるＭＲ標的化されていない肺と比較した、＊Ｐ＜０．０１。バー＝５０ｐｍ。
【図１８ｃ】ＭＲ標的化を使用して磁性マクロファージが肺転移中に導かれたことを示す図である。短パルス磁性勾配を使用して、ＳＰＩＯが負荷されたマクロファージを肺に導いた。（ａ）コラゲナーゼ処理された肺のＦＡＣＳ解析は、ＭＲ標的化を用いないものよりも、ＭＲ標的化を用いて有意に多いヒトＣＤ１４＋マクロファージが肺中に存在することを示した。（ｂ）これは、肺切片におけるヒトＣＤ６８およびＰｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅに対する免疫染色の増大を伴った。（ｃ）ＣＤ３１およびＨ＆Ｅを用いる免疫染色は、磁性マクロファージの肺へのＭＲ標的化送達は、標的化を伴わない送達と比較して、肺脈管構造に対して悪影響を有さないことを示した。ｎ＝３マウス／群である、２回の反復実験の一方から得た代表的なデータが示されている。ＳＥＭが表されている。パネルＡにおけるＭＲ標的化されていない肺と比較した、＊Ｐ＜０．０１。バー＝５０ｐｍ。
【図１９ａ】磁性標的化が、ヒト前立腺（ＬＵＣ−ＬＮＣａＰ）腫瘍に対するマクロファージウイルス療法の抗腫瘍効果を増大することを示す図である。腫瘍を有するマウスに、腫瘍溶解性ウイルス、ＨＳＶ１７１６を保持するヒト単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）（ＭＤＭ＋ＯＶ）の単回用量を用いて投与した。これらを３群のマウスに分割した（各々５匹のマウス／群を有する）。１つの群は、前立腺または肺いずれかへのＭＲ標的化を１時間経験し（ＭＤＭ＋ＯＶ＋ＭＲＴ）、別のものは、ＭＲＩスキャナーに曝露したが、ＭＲ標的化はなく（ＭＤＭ＋ＯＶ、ＭＲＴなし）、第３のもの（ＭＤＭ＋ＯＶ）は、ＭＲＩスキャナーに入らなかった。さらなる群のマウスに、１００μｌのＰＢＳ（対照）、１×１０７ｐｆｕのＨＳＶ１７１６の単回用量（ＯＶ）または３百万の未処理のＭＤＭを与えた。マウスをＭＳ画像処理システムを使用して毎週撮像し、２１日後に、腫瘍および肺を取り出し、組織学のために処理した。（ａ）腫瘍視感度は、ＭＲ標的化が、腫瘍成長に対するＯＶ−ＭＤＭの効果を有意に改善したことを示した。（ｂ）種々の治療後の原発性腫瘍の代表的なＩＶＩＳ画像および写真。（ｃ）ＭＲ標的化を有するまたは有さないＭＤＭ＋ＯＶ代表的なＲＡＲＥ画像は、療法の開始および終了での腫瘍の大きさにおいて顕著な差を示す（ｄ）。（ｅ）原発性腫瘍における壊死の存在および（ｆ）ＭＲ標的化を有するまたは有さないＭＤＭ＋ＯＶを与えられているマウスの肺における転移を示すＨ＆Ｅ染色された切片の外観。すべての群から得た対応するデータが示されている（ｅ）。示されるデータは、平均＋／−ＳＥＭである。定量的解析は、組織切片あたり１０の高倍率視野（ＨＰＦ；×２０拡大率）で実施した。ＭＤＭ＋ＯＶ＋ＭＲＴ対ＭＤＭ＋ＯＶ（ＭＲ標的化なし）を用いて比較した統計的有意差、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊Ｐ＜０．０００１、および＾は、ＭＤＭ＋ＯＶ（ＭＲ標的化なし）およびＯＶを含まない群を比較している；バー、２００ｐｍ。
【図１９ｂ】磁性標的化が、ヒト前立腺（ＬＵＣ−ＬＮＣａＰ）腫瘍に対するマクロファージウイルス療法の抗腫瘍効果を増大することを示す図である。腫瘍を有するマウスに、腫瘍溶解性ウイルス、ＨＳＶ１７１６を保持するヒト単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）（ＭＤＭ＋ＯＶ）の単回用量を用いて投与した。これらを３群のマウスに分割した（各々５匹のマウス／群を有する）。１つの群は、前立腺または肺いずれかへのＭＲ標的化を１時間経験し（ＭＤＭ＋ＯＶ＋ＭＲＴ）、別のものは、ＭＲＩスキャナーに曝露したが、ＭＲ標的化はなく（ＭＤＭ＋ＯＶ、ＭＲＴなし）、第３のもの（ＭＤＭ＋ＯＶ）は、ＭＲＩスキャナーに入らなかった。さらなる群のマウスに、１００μｌのＰＢＳ（対照）、１×１０７ｐｆｕのＨＳＶ１７１６の単回用量（ＯＶ）または３百万の未処理のＭＤＭを与えた。マウスをＭＳ画像処理システムを使用して毎週撮像し、２１日後に、腫瘍および肺を取り出し、組織学のために処理した。（ａ）腫瘍視感度は、ＭＲ標的化が、腫瘍成長に対するＯＶ−ＭＤＭの効果を有意に改善したことを示した。（ｂ）種々の治療後の原発性腫瘍の代表的なＩＶＩＳ画像および写真。（ｃ）ＭＲ標的化を有するまたは有さないＭＤＭ＋ＯＶ代表的なＲＡＲＥ画像は、療法の開始および終了での腫瘍の大きさにおいて顕著な差を示す（ｄ）。（ｅ）原発性腫瘍における壊死の存在および（ｆ）ＭＲ標的化を有するまたは有さないＭＤＭ＋ＯＶを与えられているマウスの肺における転移を示すＨ＆Ｅ染色された切片の外観。すべての群から得た対応するデータが示されている（ｅ）。示されるデータは、平均＋／−ＳＥＭである。定量的解析は、組織切片あたり１０の高倍率視野（ＨＰＦ；×２０拡大率）で実施した。ＭＤＭ＋ＯＶ＋ＭＲＴ対ＭＤＭ＋ＯＶ（ＭＲ標的化なし）を用いて比較した統計的有意差、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊Ｐ＜０．０００１、および＾は、ＭＤＭ＋ＯＶ（ＭＲ標的化なし）およびＯＶを含まない群を比較している；バー、２００ｐｍ。
【図１９ｃ】磁性標的化が、ヒト前立腺（ＬＵＣ−ＬＮＣａＰ）腫瘍に対するマクロファージウイルス療法の抗腫瘍効果を増大することを示す図である。腫瘍を有するマウスに、腫瘍溶解性ウイルス、ＨＳＶ１７１６を保持するヒト単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）（ＭＤＭ＋ＯＶ）の単回用量を用いて投与した。これらを３群のマウスに分割した（各々５匹のマウス／群を有する）。１つの群は、前立腺または肺いずれかへのＭＲ標的化を１時間経験し（ＭＤＭ＋ＯＶ＋ＭＲＴ）、別のものは、ＭＲＩスキャナーに曝露したが、ＭＲ標的化はなく（ＭＤＭ＋ＯＶ、ＭＲＴなし）、第３のもの（ＭＤＭ＋ＯＶ）は、ＭＲＩスキャナーに入らなかった。さらなる群のマウスに、１００μｌのＰＢＳ（対照）、１×１０７ｐｆｕのＨＳＶ１７１６の単回用量（ＯＶ）または３百万の未処理のＭＤＭを与えた。マウスをＭＳ画像処理システムを使用して毎週撮像し、２１日後に、腫瘍および肺を取り出し、組織学のために処理した。（ａ）腫瘍視感度は、ＭＲ標的化が、腫瘍成長に対するＯＶ−ＭＤＭの効果を有意に改善したことを示した。（ｂ）種々の治療後の原発性腫瘍の代表的なＩＶＩＳ画像および写真。（ｃ）ＭＲ標的化を有するまたは有さないＭＤＭ＋ＯＶ代表的なＲＡＲＥ画像は、療法の開始および終了での腫瘍の大きさにおいて顕著な差を示す（ｄ）。（ｅ）原発性腫瘍における壊死の存在および（ｆ）ＭＲ標的化を有するまたは有さないＭＤＭ＋ＯＶを与えられているマウスの肺における転移を示すＨ＆Ｅ染色された切片の外観。すべての群から得た対応するデータが示されている（ｅ）。示されるデータは、平均＋／−ＳＥＭである。定量的解析は、組織切片あたり１０の高倍率視野（ＨＰＦ；×２０拡大率）で実施した。ＭＤＭ＋ＯＶ＋ＭＲＴ対ＭＤＭ＋ＯＶ（ＭＲ標的化なし）を用いて比較した統計的有意差、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊Ｐ＜０．０００１、および＾は、ＭＤＭ＋ＯＶ（ＭＲ標的化なし）およびＯＶを含まない群を比較している；バー、２００ｐｍ。
【図１９ｄ】磁性標的化が、ヒト前立腺（ＬＵＣ−ＬＮＣａＰ）腫瘍に対するマクロファージウイルス療法の抗腫瘍効果を増大することを示す図である。腫瘍を有するマウスに、腫瘍溶解性ウイルス、ＨＳＶ１７１６を保持するヒト単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）（ＭＤＭ＋ＯＶ）の単回用量を用いて投与した。これらを３群のマウスに分割した（各々５匹のマウス／群を有する）。１つの群は、前立腺または肺いずれかへのＭＲ標的化を１時間経験し（ＭＤＭ＋ＯＶ＋ＭＲＴ）、別のものは、ＭＲＩスキャナーに曝露したが、ＭＲ標的化はなく（ＭＤＭ＋ＯＶ、ＭＲＴなし）、第３のもの（ＭＤＭ＋ＯＶ）は、ＭＲＩスキャナーに入らなかった。さらなる群のマウスに、１００μｌのＰＢＳ（対照）、１×１０７ｐｆｕのＨＳＶ１７１６の単回用量（ＯＶ）または３百万の未処理のＭＤＭを与えた。マウスをＭＳ画像処理システムを使用して毎週撮像し、２１日後に、腫瘍および肺を取り出し、組織学のために処理した。（ａ）腫瘍視感度は、ＭＲ標的化が、腫瘍成長に対するＯＶ−ＭＤＭの効果を有意に改善したことを示した。（ｂ）種々の治療後の原発性腫瘍の代表的なＩＶＩＳ画像および写真。（ｃ）ＭＲ標的化を有するまたは有さないＭＤＭ＋ＯＶ代表的なＲＡＲＥ画像は、療法の開始および終了での腫瘍の大きさにおいて顕著な差を示す（ｄ）。（ｅ）原発性腫瘍における壊死の存在および（ｆ）ＭＲ標的化を有するまたは有さないＭＤＭ＋ＯＶを与えられているマウスの肺における転移を示すＨ＆Ｅ染色された切片の外観。すべての群から得た対応するデータが示されている（ｅ）。示されるデータは、平均＋／−ＳＥＭである。定量的解析は、組織切片あたり１０の高倍率視野（ＨＰＦ；×２０拡大率）で実施した。ＭＤＭ＋ＯＶ＋ＭＲＴ対ＭＤＭ＋ＯＶ（ＭＲ標的化なし）を用いて比較した統計的有意差、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊Ｐ＜０．０００１、および＾は、ＭＤＭ＋ＯＶ（ＭＲ標的化なし）およびＯＶを含まない群を比較している；バー、２００ｐｍ。
【図１９ｅ】磁性標的化が、ヒト前立腺（ＬＵＣ−ＬＮＣａＰ）腫瘍に対するマクロファージウイルス療法の抗腫瘍効果を増大することを示す図である。腫瘍を有するマウスに、腫瘍溶解性ウイルス、ＨＳＶ１７１６を保持するヒト単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）（ＭＤＭ＋ＯＶ）の単回用量を用いて投与した。これらを３群のマウスに分割した（各々５匹のマウス／群を有する）。１つの群は、前立腺または肺いずれかへのＭＲ標的化を１時間経験し（ＭＤＭ＋ＯＶ＋ＭＲＴ）、別のものは、ＭＲＩスキャナーに曝露したが、ＭＲ標的化はなく（ＭＤＭ＋ＯＶ、ＭＲＴなし）、第３のもの（ＭＤＭ＋ＯＶ）は、ＭＲＩスキャナーに入らなかった。さらなる群のマウスに、１００μｌのＰＢＳ（対照）、１×１０７ｐｆｕのＨＳＶ１７１６の単回用量（ＯＶ）または３百万の未処理のＭＤＭを与えた。マウスをＭＳ画像処理システムを使用して毎週撮像し、２１日後に、腫瘍および肺を取り出し、組織学のために処理した。（ａ）腫瘍視感度は、ＭＲ標的化が、腫瘍成長に対するＯＶ−ＭＤＭの効果を有意に改善したことを示した。（ｂ）種々の治療後の原発性腫瘍の代表的なＩＶＩＳ画像および写真。（ｃ）ＭＲ標的化を有するまたは有さないＭＤＭ＋ＯＶ代表的なＲＡＲＥ画像は、療法の開始および終了での腫瘍の大きさにおいて顕著な差を示す（ｄ）。（ｅ）原発性腫瘍における壊死の存在および（ｆ）ＭＲ標的化を有するまたは有さないＭＤＭ＋ＯＶを与えられているマウスの肺における転移を示すＨ＆Ｅ染色された切片の外観。すべての群から得た対応するデータが示されている（ｅ）。示されるデータは、平均＋／−ＳＥＭである。定量的解析は、組織切片あたり１０の高倍率視野（ＨＰＦ；×２０拡大率）で実施した。ＭＤＭ＋ＯＶ＋ＭＲＴ対ＭＤＭ＋ＯＶ（ＭＲ標的化なし）を用いて比較した統計的有意差、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊Ｐ＜０．０００１、および＾は、ＭＤＭ＋ＯＶ（ＭＲ標的化なし）およびＯＶを含まない群を比較している；バー、２００ｐｍ。
【図１９ｆ】磁性標的化が、ヒト前立腺（ＬＵＣ−ＬＮＣａＰ）腫瘍に対するマクロファージウイルス療法の抗腫瘍効果を増大することを示す図である。腫瘍を有するマウスに、腫瘍溶解性ウイルス、ＨＳＶ１７１６を保持するヒト単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）（ＭＤＭ＋ＯＶ）の単回用量を用いて投与した。これらを３群のマウスに分割した（各々５匹のマウス／群を有する）。１つの群は、前立腺または肺いずれかへのＭＲ標的化を１時間経験し（ＭＤＭ＋ＯＶ＋ＭＲＴ）、別のものは、ＭＲＩスキャナーに曝露したが、ＭＲ標的化はなく（ＭＤＭ＋ＯＶ、ＭＲＴなし）、第３のもの（ＭＤＭ＋ＯＶ）は、ＭＲＩスキャナーに入らなかった。さらなる群のマウスに、１００μｌのＰＢＳ（対照）、１×１０７ｐｆｕのＨＳＶ１７１６の単回用量（ＯＶ）または３百万の未処理のＭＤＭを与えた。マウスをＭＳ画像処理システムを使用して毎週撮像し、２１日後に、腫瘍および肺を取り出し、組織学のために処理した。（ａ）腫瘍視感度は、ＭＲ標的化が、腫瘍成長に対するＯＶ−ＭＤＭの効果を有意に改善したことを示した。（ｂ）種々の治療後の原発性腫瘍の代表的なＩＶＩＳ画像および写真。（ｃ）ＭＲ標的化を有するまたは有さないＭＤＭ＋ＯＶ代表的なＲＡＲＥ画像は、療法の開始および終了での腫瘍の大きさにおいて顕著な差を示す（ｄ）。（ｅ）原発性腫瘍における壊死の存在および（ｆ）ＭＲ標的化を有するまたは有さないＭＤＭ＋ＯＶを与えられているマウスの肺における転移を示すＨ＆Ｅ染色された切片の外観。すべての群から得た対応するデータが示されている（ｅ）。示されるデータは、平均＋／−ＳＥＭである。定量的解析は、組織切片あたり１０の高倍率視野（ＨＰＦ；×２０拡大率）で実施した。ＭＤＭ＋ＯＶ＋ＭＲＴ対ＭＤＭ＋ＯＶ（ＭＲ標的化なし）を用いて比較した統計的有意差、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊Ｐ＜０．０００１、および＾は、ＭＤＭ＋ＯＶ（ＭＲ標的化なし）およびＯＶを含まない群を比較している；バー、２００ｐｍ。
【図２０ａ】新規経内皮遊走（ＴＥＭ）フローアッセイを使用する最初のＭＲＴ検査を示す図である。３Ｄ腫瘍スフェロイドならびに血管内皮層を収容できるフローチャンバーを設計した。したがって、流れる「磁性細胞」は、血管バリアを横切り、その後、３Ｄ腫瘍に入ることを必要とし、これは、血管壁中の内皮細胞を通る細胞の通過をシミュレートする（Ａ：左パネル）。ＴＥＭフローチャンバーを、球状（６ｍｍ直径）均質７Ｔ磁場を有するＭＲＩスキャナーのアイソセンター中に置く。（−ｙ）勾配方向に３００ｍＴ／ｍの強度を有するパルス勾配（最大の５０％）を適用した。得られた不均一磁場（ｄＢ／ｄｙ場）は、磁性粒子を取り込みの増大のために腫瘍スフェロイドに向けて導くことができた（Ａ：右パネル）。（Ｂ）細胞死に対するＳＰＩＯの効果を示すグラフ；ＭＲＴが適用されなかった場合と比較した、ＭＲＩ画像の歪みおよびシグナルの喪失によって取り込みが確認された（Ｃｉ）。リポーターアデノウイルス（ＡｄＣＭＶＧＦＰ）を保持するマクロファージに浸潤された全スフェロイドの対応する蛍光画像が、（Ｃｉｉ）に示される。酵素的に分散されたスフェロイドのフローサイトメトリーは、勾配が適用された場合に（Ｃｉｉｉ＆ｉｖ）、スフェロイドに浸潤する磁性細胞の数（ＣＤ１４＋であったスフェロイド中に存在するすべての細胞の％）は有意に（＊Ｐ＜０．０３）増大することを明らかにした。データは、平均±ＳＥＭであり、６回の反復実験を代表する。ＭＲＴ処理された細胞と比較された、統計的有意差ｐ＝０．０００１。バー＝１００μｍ。
【図２０ｂ】新規経内皮遊走（ＴＥＭ）フローアッセイを使用する最初のＭＲＴ検査を示す図である。３Ｄ腫瘍スフェロイドならびに血管内皮層を収容できるフローチャンバーを設計した。したがって、流れる「磁性細胞」は、血管バリアを横切り、その後、３Ｄ腫瘍に入ることを必要とし、これは、血管壁中の内皮細胞を通る細胞の通過をシミュレートする（Ａ：左パネル）。ＴＥＭフローチャンバーを、球状（６ｍｍ直径）均質７Ｔ磁場を有するＭＲＩスキャナーのアイソセンター中に置く。（−ｙ）勾配方向に３００ｍＴ／ｍの強度を有するパルス勾配（最大の５０％）を適用した。得られた不均一磁場（ｄＢ／ｄｙ場）は、磁性粒子を取り込みの増大のために腫瘍スフェロイドに向けて導くことができた（Ａ：右パネル）。（Ｂ）細胞死に対するＳＰＩＯの効果を示すグラフ；ＭＲＴが適用されなかった場合と比較した、ＭＲＩ画像の歪みおよびシグナルの喪失によって取り込みが確認された（Ｃｉ）。リポーターアデノウイルス（ＡｄＣＭＶＧＦＰ）を保持するマクロファージに浸潤された全スフェロイドの対応する蛍光画像が、（Ｃｉｉ）に示される。酵素的に分散されたスフェロイドのフローサイトメトリーは、勾配が適用された場合に（Ｃｉｉｉ＆ｉｖ）、スフェロイドに浸潤する磁性細胞の数（ＣＤ１４＋であったスフェロイド中に存在するすべての細胞の％）は有意に（＊Ｐ＜０．０３）増大することを明らかにした。データは、平均±ＳＥＭであり、６回の反復実験を代表する。ＭＲＴ処理された細胞と比較された、統計的有意差ｐ＝０．０００１。バー＝１００μｍ。
【図２０ｃ】新規経内皮遊走（ＴＥＭ）フローアッセイを使用する最初のＭＲＴ検査を示す図である。３Ｄ腫瘍スフェロイドならびに血管内皮層を収容できるフローチャンバーを設計した。したがって、流れる「磁性細胞」は、血管バリアを横切り、その後、３Ｄ腫瘍に入ることを必要とし、これは、血管壁中の内皮細胞を通る細胞の通過をシミュレートする（Ａ：左パネル）。ＴＥＭフローチャンバーを、球状（６ｍｍ直径）均質７Ｔ磁場を有するＭＲＩスキャナーのアイソセンター中に置く。（−ｙ）勾配方向に３００ｍＴ／ｍの強度を有するパルス勾配（最大の５０％）を適用した。得られた不均一磁場（ｄＢ／ｄｙ場）は、磁性粒子を取り込みの増大のために腫瘍スフェロイドに向けて導くことができた（Ａ：右パネル）。（Ｂ）細胞死に対するＳＰＩＯの効果を示すグラフ；ＭＲＴが適用されなかった場合と比較した、ＭＲＩ画像の歪みおよびシグナルの喪失によって取り込みが確認された（Ｃｉ）。リポーターアデノウイルス（ＡｄＣＭＶＧＦＰ）を保持するマクロファージに浸潤された全スフェロイドの対応する蛍光画像が、（Ｃｉｉ）に示される。酵素的に分散されたスフェロイドのフローサイトメトリーは、勾配が適用された場合に（Ｃｉｉｉ＆ｉｖ）、スフェロイドに浸潤する磁性細胞の数（ＣＤ１４＋であったスフェロイド中に存在するすべての細胞の％）は有意に（＊Ｐ＜０．０３）増大することを明らかにした。データは、平均±ＳＥＭであり、６回の反復実験を代表する。ＭＲＴ処理された細胞と比較された、統計的有意差ｐ＝０．０００１。バー＝１００μｍ。
【図２１ａ】磁性マクロファージが、ＭＲＩスキャナー中に生じた磁場を使用して原発性前立腺腫瘍中に導かれたことを示す図である。３００万の磁力によって標識されたマクロファージを、ｉ．ｖ．注射によって投与し、次いで、マウスを、７Ｔ  ＭＲＩスキャナーのアイソセンター中に置いた。対象を２群に分けた。群１は、１時間後に撮像した（ＭＲＴなし）。群２は、ＭＲＴを経験した。ＣＤ３１標識した腫瘍の切片において、視野あたり高倍率視野あたりの血管数を記録した（ａ）。ＭＲＴを使用してマクロファージを組織中に導くことは、ＭＲＴを施されなかったマウスと比較して、腫瘍中の血管数に対して有意な効果を有さなかった（ｐ＝０．５１６５）。腫瘍中へのＭＲＴ後の各群の代表的なＭＲＩ画像は、シグナルの量的低減を示し、これは、両群における横緩和速度の解析によって確認された（ｂ）。群２は、群１を上回る減衰率の増大を示す。ＭＲＩを用いてシグナル差を検討するための推定される最良のエコー時間は、およそ６０ｍｓである−ＭＲＩで導くことは、このエコー時間でシグナルの１０％低減につながる。この著しいシグナル低減は、群２における鉄のレベルの増大の存在を示唆する。腫瘍組織の正常な減衰率もまた比較のために（対照）示される。この実験は、ただし、ＳＰＩＯを有さないマクロファージを使用して反復される（群あたりＮ＝３マウス）。（ｃ）における腫瘍のＭＲＩ画像では極めて小さい歪みが見え、これは、非磁性マクロファージの低い取り込みを示し、これは、コラゲナーゼ処理組織のＦＡＣＳ解析によって確認された（ｄ）。示されたデータは、平均±ＳＥＭである。バー＝２００μｍである。
【図２１ｂ】磁性マクロファージが、ＭＲＩスキャナー中に生じた磁場を使用して原発性前立腺腫瘍中に導かれたことを示す図である。３００万の磁力によって標識されたマクロファージを、ｉ．ｖ．注射によって投与し、次いで、マウスを、７Ｔ  ＭＲＩスキャナーのアイソセンター中に置いた。対象を２群に分けた。群１は、１時間後に撮像した（ＭＲＴなし）。群２は、ＭＲＴを経験した。ＣＤ３１標識した腫瘍の切片において、視野あたり高倍率視野あたりの血管数を記録した（ａ）。ＭＲＴを使用してマクロファージを組織中に導くことは、ＭＲＴを施されなかったマウスと比較して、腫瘍中の血管数に対して有意な効果を有さなかった（ｐ＝０．５１６５）。腫瘍中へのＭＲＴ後の各群の代表的なＭＲＩ画像は、シグナルの量的低減を示し、これは、両群における横緩和速度の解析によって確認された（ｂ）。群２は、群１を上回る減衰率の増大を示す。ＭＲＩを用いてシグナル差を検討するための推定される最良のエコー時間は、およそ６０ｍｓである−ＭＲＩで導くことは、このエコー時間でシグナルの１０％低減につながる。この著しいシグナル低減は、群２における鉄のレベルの増大の存在を示唆する。腫瘍組織の正常な減衰率もまた比較のために（対照）示される。この実験は、ただし、ＳＰＩＯを有さないマクロファージを使用して反復される（群あたりＮ＝３マウス）。（ｃ）における腫瘍のＭＲＩ画像では極めて小さい歪みが見え、これは、非磁性マクロファージの低い取り込みを示し、これは、コラゲナーゼ処理組織のＦＡＣＳ解析によって確認された（ｄ）。示されたデータは、平均±ＳＥＭである。バー＝２００μｍである。
【図２１ｃ】磁性マクロファージが、ＭＲＩスキャナー中に生じた磁場を使用して原発性前立腺腫瘍中に導かれたことを示す図である。３００万の磁力によって標識されたマクロファージを、ｉ．ｖ．注射によって投与し、次いで、マウスを、７Ｔ  ＭＲＩスキャナーのアイソセンター中に置いた。対象を２群に分けた。群１は、１時間後に撮像した（ＭＲＴなし）。群２は、ＭＲＴを経験した。ＣＤ３１標識した腫瘍の切片において、視野あたり高倍率視野あたりの血管数を記録した（ａ）。ＭＲＴを使用してマクロファージを組織中に導くことは、ＭＲＴを施されなかったマウスと比較して、腫瘍中の血管数に対して有意な効果を有さなかった（ｐ＝０．５１６５）。腫瘍中へのＭＲＴ後の各群の代表的なＭＲＩ画像は、シグナルの量的低減を示し、これは、両群における横緩和速度の解析によって確認された（ｂ）。群２は、群１を上回る減衰率の増大を示す。ＭＲＩを用いてシグナル差を検討するための推定される最良のエコー時間は、およそ６０ｍｓである−ＭＲＩで導くことは、このエコー時間でシグナルの１０％低減につながる。この著しいシグナル低減は、群２における鉄のレベルの増大の存在を示唆する。腫瘍組織の正常な減衰率もまた比較のために（対照）示される。この実験は、ただし、ＳＰＩＯを有さないマクロファージを使用して反復される（群あたりＮ＝３マウス）。（ｃ）における腫瘍のＭＲＩ画像では極めて小さい歪みが見え、これは、非磁性マクロファージの低い取り込みを示し、これは、コラゲナーゼ処理組織のＦＡＣＳ解析によって確認された（ｄ）。示されたデータは、平均±ＳＥＭである。バー＝２００μｍである。
【図２１ｄ】磁性マクロファージが、ＭＲＩスキャナー中に生じた磁場を使用して原発性前立腺腫瘍中に導かれたことを示す図である。３００万の磁力によって標識されたマクロファージを、ｉ．ｖ．注射によって投与し、次いで、マウスを、７Ｔ  ＭＲＩスキャナーのアイソセンター中に置いた。対象を２群に分けた。群１は、１時間後に撮像した（ＭＲＴなし）。群２は、ＭＲＴを経験した。ＣＤ３１標識した腫瘍の切片において、視野あたり高倍率視野あたりの血管数を記録した（ａ）。ＭＲＴを使用してマクロファージを組織中に導くことは、ＭＲＴを施されなかったマウスと比較して、腫瘍中の血管数に対して有意な効果を有さなかった（ｐ＝０．５１６５）。腫瘍中へのＭＲＴ後の各群の代表的なＭＲＩ画像は、シグナルの量的低減を示し、これは、両群における横緩和速度の解析によって確認された（ｂ）。群２は、群１を上回る減衰率の増大を示す。ＭＲＩを用いてシグナル差を検討するための推定される最良のエコー時間は、およそ６０ｍｓである−ＭＲＩで導くことは、このエコー時間でシグナルの１０％低減につながる。この著しいシグナル低減は、群２における鉄のレベルの増大の存在を示唆する。腫瘍組織の正常な減衰率もまた比較のために（対照）示される。この実験は、ただし、ＳＰＩＯを有さないマクロファージを使用して反復される（群あたりＮ＝３マウス）。（ｃ）における腫瘍のＭＲＩ画像では極めて小さい歪みが見え、これは、非磁性マクロファージの低い取り込みを示し、これは、コラゲナーゼ処理組織のＦＡＣＳ解析によって確認された（ｄ）。示されたデータは、平均±ＳＥＭである。バー＝２００μｍである。
【図２２】磁性マクロファージが、その他の組織／臓器において極めて少数で検出されたことを示す図である。磁性マクロファージを腫瘍中にＭＲＩで導くことは、その他の組織への極めて少ないマクロファージ局在化をもたらした。これは、死後取り出された組織および臓器のパラフィンワックス包埋された切片の組織学的染色によって決定された。ＭＲＴを施されたまたはＭＲＴを施されない腫瘍を保持するマウスから採取された肝臓および脾臓の代表的な切片が示されている。これらの組織の両方では、抗ＣＤ６８を用いる染色後に、わずかなヒトマクロファージ（＜２％、肝臓＆＜１％脾臓）が検出された。バー＝１００μｍ。
【図２３ａ】磁性マクロファージが、ＭＲＴを使用して肺転移の区域中に導かれたことを示す図である。これは、ＥＰＣＡＭ（ヒト前立腺腫瘍細胞を検出するために）および鉄陽性ヒトマクロファージを検出するためのＰｒｕｓｓｉａｎ  Ｂｌｕｅ（ＰＢ）を用いる、肺組織のワックス包埋された連続切片の組織学的染色によって確認された。代表的な画像は、ＰＢに対して陽性のマクロファージが、ＭＲＩで導いた後のマウスの肺内の転移性沈着物に近接して検出されたことを示す。（ａ）注目すべきは、Ｈ＆Ｅ染色後に鉄が、ＭＲＴによって肺に標的化されたマクロファージとともに目に見えた（ｂ）。バー＝２００μｍおよびバー＝５０μｍ。
【図２３ｂ】磁性マクロファージが、ＭＲＴを使用して肺転移の区域中に導かれたことを示す図である。これは、ＥＰＣＡＭ（ヒト前立腺腫瘍細胞を検出するために）および鉄陽性ヒトマクロファージを検出するためのＰｒｕｓｓｉａｎ  Ｂｌｕｅ（ＰＢ）を用いる、肺組織のワックス包埋された連続切片の組織学的染色によって確認された。代表的な画像は、ＰＢに対して陽性のマクロファージが、ＭＲＩで導いた後のマウスの肺内の転移性沈着物に近接して検出されたことを示す。（ａ）注目すべきは、Ｈ＆Ｅ染色後に鉄が、ＭＲＴによって肺に標的化されたマクロファージとともに目に見えた（ｂ）。バー＝２００μｍおよびバー＝５０μｍ。
【図２４ａ】ＨＳＶ１７１６が、ＬＮＣａＰおよびマクロファージ腫瘍退縮を誘導することを示すグラフである。ＨＳＶ１７１６：ＧＦＰを、正常酸素圧（２０％  Ｏ２）および低酸素（０．５％  Ｏ２）培養条件でインキュベートされたＬＮＣａＰ細胞の培養物に添加した。腫瘍細胞死をヨウ化プロピジウムを使用してフローサイトメトリーによって評価し、非感染細胞を上回って大幅に増大した（ａ）。これは、用量依存性であり、正常酸素圧では、ＭＯＩ５でｐ＜０．０３、ＭＯＩ５０でｐ＜０．００１および低酸素では、ＭＯＩ５でｐ＜０．０１、ＭＯＩ５０でｐ＜０．００１であった。ＭＯＩ５および５０の両方で正常酸素圧および低酸素条件間で統計的有意性は観察されなかった。ＨＳＶ１７１６は、感染の４８時間後のフローサイトメトリーによって評価されるように、ＭＯＩ５および５０でＭＤＭによって効率的に取り込まれる。正常酸素圧培養条件は、低酸素条件（ｂ）と比較して、ＭＯＩ５で（ｐ＜０．０００４）およびＭＯＩ５０（ｐ＜０．００１）で有意により多いＧＦＰ発現マクロファージをもたらしたが、興味深いことに、感染の９６時間後にマクロファージ上清において検出されるＨＳＶ１７１６の濃度（ＰＦＵ／ｍｌ）は、低酸素においてＭＯＩ５および５０の両方で、正常酸素圧条件と比較して高かった。最後に、マクロファージ細胞死は、ＨＳＶ１７１６による感染後に、正常酸素圧および低酸素の両方において同等に感染性であった（ｐ＜０．２）（ｃ、ｄ）。データは、ｎ＝４の独立実験の平均±ＳＥＭである。
【図２４ｂ】ＨＳＶ１７１６が、ＬＮＣａＰおよびマクロファージ腫瘍退縮を誘導することを示すグラフである。ＨＳＶ１７１６：ＧＦＰを、正常酸素圧（２０％  Ｏ２）および低酸素（０．５％  Ｏ２）培養条件でインキュベートされたＬＮＣａＰ細胞の培養物に添加した。腫瘍細胞死をヨウ化プロピジウムを使用してフローサイトメトリーによって評価し、非感染細胞を上回って大幅に増大した（ａ）。これは、用量依存性であり、正常酸素圧では、ＭＯＩ５でｐ＜０．０３、ＭＯＩ５０でｐ＜０．００１および低酸素では、ＭＯＩ５でｐ＜０．０１、ＭＯＩ５０でｐ＜０．００１であった。ＭＯＩ５および５０の両方で正常酸素圧および低酸素条件間で統計的有意性は観察されなかった。ＨＳＶ１７１６は、感染の４８時間後のフローサイトメトリーによって評価されるように、ＭＯＩ５および５０でＭＤＭによって効率的に取り込まれる。正常酸素圧培養条件は、低酸素条件（ｂ）と比較して、ＭＯＩ５で（ｐ＜０．０００４）およびＭＯＩ５０（ｐ＜０．００１）で有意により多いＧＦＰ発現マクロファージをもたらしたが、興味深いことに、感染の９６時間後にマクロファージ上清において検出されるＨＳＶ１７１６の濃度（ＰＦＵ／ｍｌ）は、低酸素においてＭＯＩ５および５０の両方で、正常酸素圧条件と比較して高かった。最後に、マクロファージ細胞死は、ＨＳＶ１７１６による感染後に、正常酸素圧および低酸素の両方において同等に感染性であった（ｐ＜０．２）（ｃ、ｄ）。データは、ｎ＝４の独立実験の平均±ＳＥＭである。
【図２４ｃ】ＨＳＶ１７１６が、ＬＮＣａＰおよびマクロファージ腫瘍退縮を誘導することを示すグラフである。ＨＳＶ１７１６：ＧＦＰを、正常酸素圧（２０％  Ｏ２）および低酸素（０．５％  Ｏ２）培養条件でインキュベートされたＬＮＣａＰ細胞の培養物に添加した。腫瘍細胞死をヨウ化プロピジウムを使用してフローサイトメトリーによって評価し、非感染細胞を上回って大幅に増大した（ａ）。これは、用量依存性であり、正常酸素圧では、ＭＯＩ５でｐ＜０．０３、ＭＯＩ５０でｐ＜０．００１および低酸素では、ＭＯＩ５でｐ＜０．０１、ＭＯＩ５０でｐ＜０．００１であった。ＭＯＩ５および５０の両方で正常酸素圧および低酸素条件間で統計的有意性は観察されなかった。ＨＳＶ１７１６は、感染の４８時間後のフローサイトメトリーによって評価されるように、ＭＯＩ５および５０でＭＤＭによって効率的に取り込まれる。正常酸素圧培養条件は、低酸素条件（ｂ）と比較して、ＭＯＩ５で（ｐ＜０．０００４）およびＭＯＩ５０（ｐ＜０．００１）で有意により多いＧＦＰ発現マクロファージをもたらしたが、興味深いことに、感染の９６時間後にマクロファージ上清において検出されるＨＳＶ１７１６の濃度（ＰＦＵ／ｍｌ）は、低酸素においてＭＯＩ５および５０の両方で、正常酸素圧条件と比較して高かった。最後に、マクロファージ細胞死は、ＨＳＶ１７１６による感染後に、正常酸素圧および低酸素の両方において同等に感染性であった（ｐ＜０．２）（ｃ、ｄ）。データは、ｎ＝４の独立実験の平均±ＳＥＭである。
【図２４ｄ】ＨＳＶ１７１６が、ＬＮＣａＰおよびマクロファージ腫瘍退縮を誘導することを示すグラフである。ＨＳＶ１７１６：ＧＦＰを、正常酸素圧（２０％  Ｏ２）および低酸素（０．５％  Ｏ２）培養条件でインキュベートされたＬＮＣａＰ細胞の培養物に添加した。腫瘍細胞死をヨウ化プロピジウムを使用してフローサイトメトリーによって評価し、非感染細胞を上回って大幅に増大した（ａ）。これは、用量依存性であり、正常酸素圧では、ＭＯＩ５でｐ＜０．０３、ＭＯＩ５０でｐ＜０．００１および低酸素では、ＭＯＩ５でｐ＜０．０１、ＭＯＩ５０でｐ＜０．００１であった。ＭＯＩ５および５０の両方で正常酸素圧および低酸素条件間で統計的有意性は観察されなかった。ＨＳＶ１７１６は、感染の４８時間後のフローサイトメトリーによって評価されるように、ＭＯＩ５および５０でＭＤＭによって効率的に取り込まれる。正常酸素圧培養条件は、低酸素条件（ｂ）と比較して、ＭＯＩ５で（ｐ＜０．０００４）およびＭＯＩ５０（ｐ＜０．００１）で有意により多いＧＦＰ発現マクロファージをもたらしたが、興味深いことに、感染の９６時間後にマクロファージ上清において検出されるＨＳＶ１７１６の濃度（ＰＦＵ／ｍｌ）は、低酸素においてＭＯＩ５および５０の両方で、正常酸素圧条件と比較して高かった。最後に、マクロファージ細胞死は、ＨＳＶ１７１６による感染後に、正常酸素圧および低酸素の両方において同等に感染性であった（ｐ＜０．２）（ｃ、ｄ）。データは、ｎ＝４の独立実験の平均±ＳＥＭである。
【図２５Ａ】ＨＳＶ１７１６が、ヒトマクロファージに感染し、その中で複製し、死滅させることを示す図である。７日目に、ＧＦＰタグの付いたＨＳＶ１７１６に感染したヒト単球由来マクロファージは、細胞死の増大と相関する感染の有意な増大を実証する。図表は、（Ａ）ヒト単球由来マクロファージの感染、（Ｂ）マクロファージ死滅を示す。すべてのデータは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化され、６回の独立実験を実施した（ｎ＝６）。Ｘ軸０＝マクロファージ（ウイルスなし）。
【図２５Ｂ】ＨＳＶ１７１６が、ヒトマクロファージに感染し、その中で複製し、死滅させることを示す図である。７日目に、ＧＦＰタグの付いたＨＳＶ１７１６に感染したヒト単球由来マクロファージは、細胞死の増大と相関する感染の有意な増大を実証する。図表は、（Ａ）ヒト単球由来マクロファージの感染、（Ｂ）マクロファージ死滅を示す。すべてのデータは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化され、６回の独立実験を実施した（ｎ＝６）。Ｘ軸０＝マクロファージ（ウイルスなし）。
【図２６Ａ】ヒトマクロファージ内でのＨＳＶ１７１６複製を示す図である。ウイルスタンパク質の発現の調査は、ウイルス複製に必要な最初期（ＩＣＰＯ）および後期（ｇＢ）遺伝子の両方が、マクロファージにおいて著しい遺伝子発現を実証することを示した。図表は、（Ａ）ＩＣＰＯ発現、（Ｂ）ＩＣＰ８発現、（Ｃ）ｇＢ発現を示す。すべてのデータは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化され、６回の独立実験を実施した（ｎ＝６）。Ｘ軸０＝マクロファージ（ウイルスなし）。
【図２６Ｂ】ヒトマクロファージ内でのＨＳＶ１７１６複製を示す図である。ウイルスタンパク質の発現の調査は、ウイルス複製に必要な最初期（ＩＣＰＯ）および後期（ｇＢ）遺伝子の両方が、マクロファージにおいて著しい遺伝子発現を実証することを示した。図表は、（Ａ）ＩＣＰＯ発現、（Ｂ）ＩＣＰ８発現、（Ｃ）ｇＢ発現を示す。すべてのデータは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化され、６回の独立実験を実施した（ｎ＝６）。Ｘ軸０＝マクロファージ（ウイルスなし）。
【図２６Ｃ】ヒトマクロファージ内でのＨＳＶ１７１６複製を示す図である。ウイルスタンパク質の発現の調査は、ウイルス複製に必要な最初期（ＩＣＰＯ）および後期（ｇＢ）遺伝子の両方が、マクロファージにおいて著しい遺伝子発現を実証することを示した。図表は、（Ａ）ＩＣＰＯ発現、（Ｂ）ＩＣＰ８発現、（Ｃ）ｇＢ発現を示す。すべてのデータは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化され、６回の独立実験を実施した（ｎ＝６）。Ｘ軸０＝マクロファージ（ウイルスなし）。
【図２７Ａ】ヒトマクロファージにおける細胞死の機序を示す図である。ＨＳＶ１７１６は、アポトーシスによって、Ｆａｓ依存性にマクロファージを死滅させ、ＦａｓＬおよびＢｃｌ−２遺伝子発現の両方とも、５のＭＯＩのＨＳＶ１７１６による感染の２４時間後に上方制御される。自食作用に関与する遺伝子（Ａｔｇ５およびＬＣ３Ｂ）の発現は、大幅に変更されなかった。図表は、（Ａ）ＦａｓＬ、（Ｂ）Ｂｃｌ−２、（Ｃ）ＬＣ３Ｂ、（Ｄ）Ａｔｇ５の発現を示す。すべてのデータは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化され、６回の独立実験を実施した（ｎ＝６）。Ｘ軸０＝マクロファージ（ウイルスなし）。
【図２７Ｂ】ヒトマクロファージにおける細胞死の機序を示す図である。ＨＳＶ１７１６は、アポトーシスによって、Ｆａｓ依存性にマクロファージを死滅させ、ＦａｓＬおよびＢｃｌ−２遺伝子発現の両方とも、５のＭＯＩのＨＳＶ１７１６による感染の２４時間後に上方制御される。自食作用に関与する遺伝子（Ａｔｇ５およびＬＣ３Ｂ）の発現は、大幅に変更されなかった。図表は、（Ａ）ＦａｓＬ、（Ｂ）Ｂｃｌ−２、（Ｃ）ＬＣ３Ｂ、（Ｄ）Ａｔｇ５の発現を示す。すべてのデータは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化され、６回の独立実験を実施した（ｎ＝６）。Ｘ軸０＝マクロファージ（ウイルスなし）。
【図２７Ｃ】ヒトマクロファージにおける細胞死の機序を示す図である。ＨＳＶ１７１６は、アポトーシスによって、Ｆａｓ依存性にマクロファージを死滅させ、ＦａｓＬおよびＢｃｌ−２遺伝子発現の両方とも、５のＭＯＩのＨＳＶ１７１６による感染の２４時間後に上方制御される。自食作用に関与する遺伝子（Ａｔｇ５およびＬＣ３Ｂ）の発現は、大幅に変更されなかった。図表は、（Ａ）ＦａｓＬ、（Ｂ）Ｂｃｌ−２、（Ｃ）ＬＣ３Ｂ、（Ｄ）Ａｔｇ５の発現を示す。すべてのデータは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化され、６回の独立実験を実施した（ｎ＝６）。Ｘ軸０＝マクロファージ（ウイルスなし）。
【図２７Ｄ】ヒトマクロファージにおける細胞死の機序を示す図である。ＨＳＶ１７１６は、アポトーシスによって、Ｆａｓ依存性にマクロファージを死滅させ、ＦａｓＬおよびＢｃｌ−２遺伝子発現の両方とも、５のＭＯＩのＨＳＶ１７１６による感染の２４時間後に上方制御される。自食作用に関与する遺伝子（Ａｔｇ５およびＬＣ３Ｂ）の発現は、大幅に変更されなかった。図表は、（Ａ）ＦａｓＬ、（Ｂ）Ｂｃｌ−２、（Ｃ）ＬＣ３Ｂ、（Ｄ）Ａｔｇ５の発現を示す。すべてのデータは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化され、６回の独立実験を実施した（ｎ＝６）。Ｘ軸０＝マクロファージ（ウイルスなし）。
【図２８Ａ】ＨＳＶ１７１６感染が、マクロファージにおいて炎症性表現型を誘導することを示す図である。７日目単球由来マクロファージのＨＳＶ１７１６感染は、感染の２４時間後の炎症の通常のマーカーのｍＲＮＡ発現を大幅に誘導する。図表は、（Ａ）ＩＬ−６、（Ｂ）ＩＬ−８、（Ｃ）ＩＬ−１０、（Ｄ）ＴＮＦα、（Ｅ）ＴＧＦβ、（Ｆ）ＮＦκＢのｍＲＮＡの発現を示す。すべてのデータは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化され、６回の独立実験を実施した（ｎ＝６）。Ｘ軸０＝マクロファージ（ウイルスなし）。
【図２８Ｂ】ＨＳＶ１７１６感染が、マクロファージにおいて炎症性表現型を誘導することを示す図である。７日目単球由来マクロファージのＨＳＶ１７１６感染は、感染の２４時間後の炎症の通常のマーカーのｍＲＮＡ発現を大幅に誘導する。図表は、（Ａ）ＩＬ−６、（Ｂ）ＩＬ−８、（Ｃ）ＩＬ−１０、（Ｄ）ＴＮＦα、（Ｅ）ＴＧＦβ、（Ｆ）ＮＦκＢのｍＲＮＡの発現を示す。すべてのデータは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化され、６回の独立実験を実施した（ｎ＝６）。Ｘ軸０＝マクロファージ（ウイルスなし）。
【図２８Ｃ】ＨＳＶ１７１６感染が、マクロファージにおいて炎症性表現型を誘導することを示す図である。７日目単球由来マクロファージのＨＳＶ１７１６感染は、感染の２４時間後の炎症の通常のマーカーのｍＲＮＡ発現を大幅に誘導する。図表は、（Ａ）ＩＬ−６、（Ｂ）ＩＬ−８、（Ｃ）ＩＬ−１０、（Ｄ）ＴＮＦα、（Ｅ）ＴＧＦβ、（Ｆ）ＮＦκＢのｍＲＮＡの発現を示す。すべてのデータは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化され、６回の独立実験を実施した（ｎ＝６）。Ｘ軸０＝マクロファージ（ウイルスなし）。
【図２８Ｄ】ＨＳＶ１７１６感染が、マクロファージにおいて炎症性表現型を誘導することを示す図である。７日目単球由来マクロファージのＨＳＶ１７１６感染は、感染の２４時間後の炎症の通常のマーカーのｍＲＮＡ発現を大幅に誘導する。図表は、（Ａ）ＩＬ−６、（Ｂ）ＩＬ−８、（Ｃ）ＩＬ−１０、（Ｄ）ＴＮＦα、（Ｅ）ＴＧＦβ、（Ｆ）ＮＦκＢのｍＲＮＡの発現を示す。すべてのデータは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化され、６回の独立実験を実施した（ｎ＝６）。Ｘ軸０＝マクロファージ（ウイルスなし）。
【図２８Ｅ】ＨＳＶ１７１６感染が、マクロファージにおいて炎症性表現型を誘導することを示す図である。７日目単球由来マクロファージのＨＳＶ１７１６感染は、感染の２４時間後の炎症の通常のマーカーのｍＲＮＡ発現を大幅に誘導する。図表は、（Ａ）ＩＬ−６、（Ｂ）ＩＬ−８、（Ｃ）ＩＬ−１０、（Ｄ）ＴＮＦα、（Ｅ）ＴＧＦβ、（Ｆ）ＮＦκＢのｍＲＮＡの発現を示す。すべてのデータは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化され、６回の独立実験を実施した（ｎ＝６）。Ｘ軸０＝マクロファージ（ウイルスなし）。
【図２８Ｆ】ＨＳＶ１７１６感染が、マクロファージにおいて炎症性表現型を誘導することを示す図である。７日目単球由来マクロファージのＨＳＶ１７１６感染は、感染の２４時間後の炎症の通常のマーカーのｍＲＮＡ発現を大幅に誘導する。図表は、（Ａ）ＩＬ−６、（Ｂ）ＩＬ−８、（Ｃ）ＩＬ−１０、（Ｄ）ＴＮＦα、（Ｅ）ＴＧＦβ、（Ｆ）ＮＦκＢのｍＲＮＡの発現を示す。すべてのデータは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化され、６回の独立実験を実施した（ｎ＝６）。Ｘ軸０＝マクロファージ（ウイルスなし）。
【図２９Ａ】ＨＳＶ１７１６感染が、マクロファージにおいて炎症性表現型を誘導することを示す図である。７日目単球由来マクロファージのＨＳＶ１７１６感染は、通常の炎症性Ｍ１マクロファージマーカー（ＮＯＳ２、ＣＸＣＬ１０）のｍＲＮＡ発現を大幅に誘導し、腫瘍由来マクロファージによって発現される通常のＭ２マーカー（ＭＲＣ１）を下方制御する。図表は、（Ａ）Ａｒｇ１、（Ｂ）Ｎｏｓ２、（Ｃ）ＭＲＣ１、（Ｄ）ＶＥＧＦ、（Ｅ）ＣＸＣＬ１０のｍＲＮＡ発現を示す。すべてのデータは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化され、６回の独立実験を実施した（ｎ＝６）。
【図２９Ｂ】ＨＳＶ１７１６感染が、マクロファージにおいて炎症性表現型を誘導することを示す図である。７日目単球由来マクロファージのＨＳＶ１７１６感染は、通常の炎症性Ｍ１マクロファージマーカー（ＮＯＳ２、ＣＸＣＬ１０）のｍＲＮＡ発現を大幅に誘導し、腫瘍由来マクロファージによって発現される通常のＭ２マーカー（ＭＲＣ１）を下方制御する。図表は、（Ａ）Ａｒｇ１、（Ｂ）Ｎｏｓ２、（Ｃ）ＭＲＣ１、（Ｄ）ＶＥＧＦ、（Ｅ）ＣＸＣＬ１０のｍＲＮＡ発現を示す。すべてのデータは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化され、６回の独立実験を実施した（ｎ＝６）。
【図２９Ｃ】ＨＳＶ１７１６感染が、マクロファージにおいて炎症性表現型を誘導することを示す図である。７日目単球由来マクロファージのＨＳＶ１７１６感染は、通常の炎症性Ｍ１マクロファージマーカー（ＮＯＳ２、ＣＸＣＬ１０）のｍＲＮＡ発現を大幅に誘導し、腫瘍由来マクロファージによって発現される通常のＭ２マーカー（ＭＲＣ１）を下方制御する。図表は、（Ａ）Ａｒｇ１、（Ｂ）Ｎｏｓ２、（Ｃ）ＭＲＣ１、（Ｄ）ＶＥＧＦ、（Ｅ）ＣＸＣＬ１０のｍＲＮＡ発現を示す。すべてのデータは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化され、６回の独立実験を実施した（ｎ＝６）。
【図２９Ｄ】ＨＳＶ１７１６感染が、マクロファージにおいて炎症性表現型を誘導することを示す図である。７日目単球由来マクロファージのＨＳＶ１７１６感染は、通常の炎症性Ｍ１マクロファージマーカー（ＮＯＳ２、ＣＸＣＬ１０）のｍＲＮＡ発現を大幅に誘導し、腫瘍由来マクロファージによって発現される通常のＭ２マーカー（ＭＲＣ１）を下方制御する。図表は、（Ａ）Ａｒｇ１、（Ｂ）Ｎｏｓ２、（Ｃ）ＭＲＣ１、（Ｄ）ＶＥＧＦ、（Ｅ）ＣＸＣＬ１０のｍＲＮＡ発現を示す。すべてのデータは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化され、６回の独立実験を実施した（ｎ＝６）。
【図２９Ｅ】ＨＳＶ１７１６感染が、マクロファージにおいて炎症性表現型を誘導することを示す図である。７日目単球由来マクロファージのＨＳＶ１７１６感染は、通常の炎症性Ｍ１マクロファージマーカー（ＮＯＳ２、ＣＸＣＬ１０）のｍＲＮＡ発現を大幅に誘導し、腫瘍由来マクロファージによって発現される通常のＭ２マーカー（ＭＲＣ１）を下方制御する。図表は、（Ａ）Ａｒｇ１、（Ｂ）Ｎｏｓ２、（Ｃ）ＭＲＣ１、（Ｄ）ＶＥＧＦ、（Ｅ）ＣＸＣＬ１０のｍＲＮＡ発現を示す。すべてのデータは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化され、６回の独立実験を実施した（ｎ＝６）。
【図３０】ＨＳＶ１７１６感染が、マクロファージにおいてＰＣＮＡ発現を誘導することを示す図表である。７日目単球由来マクロファージのＨＳＶ１７１６感染は、ＰＣＮＡ発現を誘導する。これは、最終的に区別される非腫瘍細胞においてウイルス複製およびマクロファージ細胞死を誘導するための可能性ある機序である。すべてのデータは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化され、４回の独立実験を実施した（ｎ＝４）。
【０１２４】
［実施例］
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、本発明を実施するための本発明者らが企図する最良の形態の具体的な詳細を含めて、実施例により、以下の付随する説明に記載する。本発明がこれらの具体的な詳細に限定されずに実施され得ることは、当業者には明らかであろう。
【０１２５】
以下に提示される実施例は、腫瘍溶解性ＨＳＶ１７１６（Ｓｅｐｒｅｈｖｉｒ）に感染した腫瘍によってコンディショニングされたマクロファージが、ｉＮＯＳ、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦ−αなどの炎症性因子の発現を特徴とする、古典的な活性化された（Ｍ１）プロファイルを示すことを示す。
【０１２６】
さらに、Ｍ１マクロファージを、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯ）を使用して磁力によって標識し、次いで、すべての磁気共鳴画像処理システム（ＭＲＩ）に固有のパルス磁場勾配を使用して、血流から、原発性および続発性腫瘍を含む深部標的組織に非侵襲性に導くことができる。本発明者らは、この磁気共鳴標的化（ＭＲＴ）アプローチを使用して、細胞ベースの腫瘍溶解性ウイルス療法を送達した。次いで、緩和時間測定法測定値は、標準ＭＲ画像処理を使用して、この療法の有効性をモニタリングできることを示唆する。
【実施例１】
【０１２７】
ＨＳＶ１７１６およびヒト一次マクロファージ
１）最初の研究では、ＨＳＶ１７１６をおよそ４ｐｆｕ／細胞で用いてヒトマクロファージに感染させ、次いで、正常および低酸素条件下で細胞をインキュベートした。試料を、感染（＋１．５時間、＋２４時間、＋４８時間および＋７２時間）後、種々の時点で取り出し、滴定した（図１）。
【０１２８】
１時間内にウイルスの９０％がマクロファージによって吸着され、次いで、正常酸素圧または低酸素のいずれでも２４または４８時間でウイルスは検出可能ではなかった（滴定の検出限界は、１００ｐｆｕ／ｍｌである）。
【０１２９】
７２時間でウイルスは、著しく検出可能であったが、この時間での量は、正常酸素圧対低酸素マクロファージにおいて同様であった。この出現性ウイルスは、いくつかの一時的な不顕性の状態に入った元の投入したものであり得るか、またはマクロファージにおける複製の第１波に相当し得るので、大いに目的のものである。
【０１３０】
２）漸減するＨＳＶ１７１６ｍｏｉ（４０、４、０．４および０．０４）を用いてマクロファージに感染させ、７２時間後にだけ、試料を滴定した。ｍｏｉ４０、４および０．４で感染させたマクロファージからウイルスを検出したが、０．０４ｍｏｉで感染させたものからは検出されなかった（図２）。
【０１３１】
興味深いことに、投入したｐｆｕに対する７２時間後に検出されたウイルスの割合は、図１に示される、２つのその他の７２時間の正常酸素圧／低酸素時点から得たものとおよそ同一および同様であった。
【０１３２】
要約すると、ヒト一次マクロファージは、ＨＳＶ１７１６を吸着する高い能力を有し、４８時間後に培養物中のマクロファージから活性ウイルスを収集できるとわかった。
【実施例２】
【０１３３】
３種の異なるがん細胞株を使用し（ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、Ｔ４７Ｄ）、マクロファージを、ヒト単核細胞から導き；多細胞性スフェロイドを、アガロースコーティングされた培養プレート上で調製し；ＨＳＶ１７１６ＧＦＰを使用して、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーによる、がん細胞による取り込みおよび腫瘍スフェロイドの定量化を可能にし；最後に、ＲＴ−ＰＣＲを実施して、ＨＳＶ１７１６感染後のマクロファージ遺伝子発現の変化を解析した。
【０１３４】
結果は、ＨＳＶ１７１６が、前立腺および乳がん細胞株において細胞死を誘導することおよびＨＳＶ１７１６に感染したマクロファージが、９６時間内に効率的に死滅させられることを示した。さらに、ＨＳＶ１７１６に感染したマクロファージによるスフェロイドの浸潤は、腫瘍スフェロイド細胞死を引き起こす。
【０１３５】
材料および方法
細胞株
ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰおよびＰＣ３およびヒト乳癌細胞株Ｔ４７Ｄは、Ｄｒ  Ｈｅｌｅｎ  Ｂｒｙａｎｔ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｔｈｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ、Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ、ＵＫ）によって提供された。細胞を１０％ウシ胎児血清を補給したＲＰＭＩ中で培養した。
【０１３６】
ヒトＭＤＭの調製
マクロファージを、血小板が枯渇したバフィーコート（Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｒｏｙａｌ  Ｈａｌｌａｍｓｈｉｒｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ、ＵＫ）から単離されたヒト単核細胞から導いた。単核細胞をフィコール勾配遠心分離を使用して血液から分離した（ＢＵＲＫＥ  ２００３）。単離後、単核細胞をＴ７５組織培養フラスコ中に播種し（約７０×１０６個細胞／フラスコ）、２％ＡＢ血清を補給したＩＭＤＭ中で３日間培養した。
【０１３７】
単純ヘルペスウイルス１７１６
ＨＳＶ１７１６は、Ｖｉｒｔｔｕ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｌａｓｇｏｗ、ＵＫ）によって提供された。腫瘍細胞の感染を、０．５および５の感染多重度（ＭＯＩ）、すなわち、感染の際に細胞あたりに添加されるウイルス粒子の数によって実施した。マクロファージ感染のために、５および５０のＭＯＩを使用した。ＧＦＰを用いて標識することによって、ＨＳＶ１７１６の検出（フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡によって測定される）が可能となった。
【０１３８】
一次ＭＤＭの感染
ＭＤＭを、２％ＡＢ血清を補給したＩＭＤＭ中で３日間培養し；３日後、細胞をＰＢＳを用いて洗浄し、培地を１０％  ＦＢＳを補給したＲＰＭＩと交換した。ＭＯＩ５０で細胞に感染させ、一晩インキュベートした（正常酸素圧条件：２０％  ＰＯ２；低酸素条件：０．１％ＰＯ２）。２４時間後、コンディショニング培地を新鮮培地と交換し、さらに７２時間細胞をインキュベートした。感染から９６時間（４日）後、フローサイトメトリーによって細胞生存力を測定した。
【０１３９】
腫瘍スフェロイドへの一次ＭＤＭの浸潤
腫瘍スフェロイドを、ＬＮＣａＰ細胞を使用し、２×１０４個細胞／ウェルを、１００μΙ  ＲＰＭＩ（＋１０％  ＦＢＳ）中で、２％アガロースコーティングされた９６ウェルプレート中に播種することによって調製した。７２時間（３日）後、５×１０３個の感染マクロファージを各ウェルに添加した。さらに５日後に細胞死の解析を実施した；毎日、スフェロイドを、蛍光顕微鏡下で観察して、低酸素コアにおけるＨＳＶ１７１６ＧＦＰの存在を検出した。
【０１４０】
フローサイトメトリー
細胞生存力／死滅およびＧＦＰ発現を、フローサイトメトリーによって測定した。細胞を回収し、ＰＢＳに再懸濁し、ＰＩ（１μΙ／試料）を用いて標識して、細胞死を定量化した。Ａｔｔｕｎｅ  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、各試料中のＰＩ陽性細胞およびＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを解析した。ＢＬ３検出器によってＰＩ（励起波長：４８８ｎｍ；最大発光：６１７ｎｍ）を検出し；ＧＦＰ検出のためにはＢＬ１を使用した（４８８ｎｍで励起および５０９ｎｍで最大発光）。
【０１４１】
ＲＴ−ＰＣＲ
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施して、感染マクロファージにおけるＲＮＡレベルを検出し、ＨＳＶ１７１６が遺伝子発現の変化を引き起こすか否かを決定した。細胞（１．５×１０６個）を、６ウェルプレート中にプレーティングし、ＨＳＶ１７１６をＭＯＩ５０で用いて感染させた。４８時間インキュベートした後（正常酸素圧条件：２０％  ｐＯ２；低酸素条件：０．１％  ｐＯ２）、細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡ抽出を実施した。ＲＮＡからＰｒｉｍｅｒ  ｄｅｓｉｇｎ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｎａｎｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴキットおよびＴ１００  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡを、目的の遺伝子のプライマーとともに３８４ウェルＰＣＲプレートにプレーティングした。ＡＢＩ７９００リアルタイムＰＣＲを使用してＰＣＲを実施した。
【０１４２】
【表１−１】
2018509181.tif 000003
【０１４３】
【表１−２】
2018509181.tif 000004
【０１４４】
統計解析
データは、平均±ＳＥＭとして報告した。統計分析およびグラフィックスは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して実施した。多重比較のための二元配置ＡＮＯＶＡ試験および多重ｔ検定を実施して、得られた実験データを比較した。統計的有意性は、ｐ＝０．０５の値に制限された。
【０１４５】
結果
ＨＳＶ１７１６は、腫瘍細胞死を誘導する
ＬＮＣａＰ細胞株
ＨＳＶ１７１６の前立腺がん細胞に対する腫瘍溶解性潜在力を解析するために、ＬＮＣａＰ細胞を、１２ウェルプレート中に播種し（２×１０４個細胞／ウェル）、ＨＳＶ１７１６をＭＯＩ０（対照）、０．５および５で用いて感染させた。生存細胞によるウイルス取り込みを可視化するために、ＨＳＶ１７１６−ＧＦＰを使用して感染を反復した。プレートを正常酸素圧および低酸素インキュベーター中に維持し、酸素化条件および非酸素化条件の両方においてＨＳＶ１７１６の細胞を死滅させる能力を調べた。２４時間後、コンディショニング培地を新鮮培地と交換した。７２時間後、プレートを回収し、フローサイトメトリーによって細胞を解析した。細胞死をＰｌ（＋）細胞として測定し；生存細胞におけるウイルス取り込みは、ＧＦＰ（＋）／ＰＩ（−）細胞として測定した（図３）。感染から７２時間後、正常酸素圧条件において、ＭＯＩ０．５で５６±６．３５％の細胞において（ｐ＜０．０００１）、およびＭＯＩ５で５３±８．７％の細胞において（ｐ＜０．０００１）ウイルス取り込みが観察されたが、低酸素条件では、レベルはかなり低かった（ＭＯＩ５で６±４．７３％、ｐ＜０．０５）。ＭＯＩ５では、正常酸素圧（３１±７．３２％、ｐ＜０．０１）および低酸素（３８±１．３６％、ｐ＜０．０５）条件の両方において統計的に有意なレベルの細胞死が観察された（図４）。興味深いことに、ウイルス取り込みは、低酸素条件下で高いと思われたが、結果は、ＭＯＩ５で有意なレベルの細胞死を明らかにした（図４）。
ＰＣ３細胞株
ＰＣ３は、高い転移能を有する前立腺がん細胞株であり、ＬＮＣａＰよりも相当により侵襲性である。２×１０４個細胞を１２ウェルプレート中に播種し、ＨＳＶ１７１６をＭＯＩ０、０．５および５で用いて感染させた。細胞を、正常酸素圧および低酸素条件において７２時間インキュベートした。２４時間後、コンディショニング培地を新鮮培地と交換して、細胞によって取り込まれていないウイルス粒子を排除した。７２時間後、フローサイトメトリーによって細胞を解析し、ＰＩ（−）／ＧＦＰ（＋）細胞の量をプロットした（図５）。ウイルス取り込みのパーセンテージは、正常酸素圧条件におけるウイルス粒子によって感染した生存細胞の有意な存在を示し（ＭＯＩ０．５で２０±４．４６％、ＭＯＩ５で１７±４．３７％、ｐ＜０．０５）；細胞死は、正常酸素圧（ＭＯＩ０．５で２３±２．４９％、ｐ＜０．０００１およびＭＯＩ５で７±３．１４％、ｐ＜０．０１）および低酸素条件（ＭＯＩ０．５で２０±１．３４％およびＭＯＩ５で１９±２．６８％、ｐ＜０．０５）の両方で統計的に有意であり、生存細胞によるウイルス取り込みおよび細胞死のパーセンテージは、図表で報告した（図６）。
【０１４６】
Ｔ４７Ｄ細胞株
ＨＳＶ１７１６の、種々の種類の固形腫瘍に対する腫瘍溶解性能力を調べるために、乳癌細胞株、Ｔ４７Ｄの感染の効果を評価付けした。１×１０５個細胞を１２ウェルプレート中に播種し、ＨＳＶ１７１６およびＨＳＶ１７１６−ＧＦＰを、ＭＯＩ０、０．５および５で用いて感染させた。細胞を、正常酸素圧および低酸素条件下で７２時間インキュベートし、フローサイトメトリーによって解析した。いずれの条件においても細胞死の徴候がないことが観察され、ウイルス取り込みは、ＭＯＩ０．５でさえ顕著に高かった（データは示していない）。したがって、１２０時間後に解析を反復して、Ｔ４７Ｄ細胞株が、ＨＳＶ１７１６に対して応答性ではないのか、前立腺癌細胞株よりも感受性が少ないだけのかを検証した。１２０時間後、フローサイトメトリーによって細胞を観察し、ＰＩ（−）／ＧＦＰ（＋）細胞の量をプロットした（図７）。生存細胞によるウイルス取り込みは、ＭＯＩ０．５および５で有意であり、低酸素（ＭＯＩ０．５で２７±５．５２％、ＭＯＩ５で１７±２．１８％、ｐ＜０．００１）よりも正常酸素圧（ＭＯＩ０．５で３８±０．３５％、ＭＯＩ５で４９±０．４９％、ｐ＜０．０００１）において有意に高いレベルであり、細胞死は、正常酸素圧および低酸素条件の両方においてＭＯＩ５で有意であるとわかった（それぞれ、２９±１．３７％および２２±５．８２％、ｐ＜０．０００１）（図８ｂ）。
【０１４７】
ヒトマクロファージに対するＨＳＶ１７１６感染の効果
ＨＳＶ１７１６は、ヒトマクロファージを効率的に死滅させる
マクロファージを、ＨＳＶ１７１６療法のための送達系として使用できるか否かを決定するために、マクロファージ細胞に対するウイルス感染の結果を試験することは基本的なことであった。単離から３日後、ＭＤＭを回収し、カウントし；１×１０６個細胞を６ウェルプレートに播種した。細胞がプラスチックに付着したら、感染を実施した。ＭＯＩ０（対照）、５および５０でＨＳＶ１７１６を添加した。細胞を、正常酸素圧および低酸素条件において９６時間インキュベートした。２４時間後に、培地を新鮮培地と交換し、４日目に、さらなる研究のために各ウェルから上清を集めた。９６時間後、プレートを回収し、フローサイトメトリーによって細胞生存力を解析した。結果は、ＭＯＩ５および５０の両方での細胞の効果的な死滅を示し、正常酸素圧条件（ＭＯＩ５で６３±２．７６％、ＭＯＩ５０で６２±２．４２％、ｐ＜０．０００１）および低酸素条件（ＭＯＩ５で４３±４．９１％、ｐ＜０．００１およびＭＯＩ５０で５７±７．３４％、ｐ＜０．０００１）の両条件下で高いパーセンテージの細胞死を示していた（図９、１０）。
感染マクロファージは、ウイルス粒子を放出する
細胞の半数を超えるものがＨＳＶ１７１６によって死滅させられたので、感染後の相当なウイルス複製および細胞の溶解が、微小環境におけるウイルス粒子の放出につながるはずである。したがって、ＨＳＶ１７１６の、マクロファージを死滅させ、そこで複製する能力を確認するために、感染から９６時間後に各ウェルから上清を集め、解析した。正常酸素圧および低酸素の両条件において、ＭＯＩ０、５および５０で感染した細胞から獲得された培地からなる試料および上清中のウイルス粒子の存在を滴定によって決定した。ＭＯＩ５および５０で感染したＭＤＭの上清においてＨＳＶ１７１６を検出し、高いＭＯＩに対して高い濃度であったが、対照群ではウイルスは観察されなかった（表１（図１１））。興味深いことに、低酸素条件下で感染した細胞から集められた試料は、その正常酸素圧等価物と比較して、２．５倍高い濃度（ＭＯＩ５で）および４倍高い濃度（ＭＯＩ５０で）のＨＳＶ１７１６を示した（図１２）。
【０１４８】
この結果を再確認するために、感染ＭＤＭから収集したコンディショニング培地を用いる腫瘍細胞の感染を実施した。ＬＮＣａＰ細胞を１２ウェルプレート中に播種し（１×１０４個細胞／ウェル）、１ｍｌ  ＲＰＭＩ中の１００μｌのＭＤＭ上清を用いて感染させた。感染から１２０時間後、細胞を回収し、フローサイトメトリーによって解析した。しかし、ＰＩ染色後、滴定研究から予想されたもの（低酸素条件下で、より高い細胞死）とは対照的に、正常酸素圧条件下のＭＤＭから集められたコンディショニング培地を用いて感染した細胞では、細胞死は、ＭＯＩ５０でのみ有意であるとわかった（４０±７．２６％、ｐ＜０．０１）（図８）。
【０１４９】
ＨＳＶ１７１６感染は、マクロファージ遺伝子発現を改変する
ＨＳＶ１７１６による感染が、ＭＤＭ遺伝子発現が変化する方法を調べるために、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して目的のサイトカインおよび増殖因子のｍＲＮＡレベルを定量化した。１．５×１０６個細胞を６ウェルプレートに播種し、ＭＯＩ５０で感染させ、異なる環境による遺伝子発現の可能性ある変更を理解するために、プレートを正常酸素圧および低酸素条件下でインキュベートした。感染の４８時間後、細胞を回収し、感染細胞および対照群からｍＲＮＡを抽出した。次いで、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、目的の遺伝子：炎症性サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＣＸＣＬ１；転写因子ＮＦκＢ、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０およびＣＸＣＬ−６、増殖因子ＶＥＧＦ−ＡおよびＴＧＦ−βのプライマーとともに３８４ウェルプレート中にプレーティングした。構成的に発現されるハウスキーピング遺伝子としてβ−アクチンを選択した。ＲＴ−ＰＣＲを実施した後、各遺伝子のｍＲＮＡレベルを、β−アクチン濃度に対して正規化し、発現の倍数変化を算出した。ＨＳＶ１７１６感染によって引き起こされた遺伝子誘導プロファイルは、２連で得た。各遺伝子について算出された発現の倍数変化を報告した；結果は、ＭＯＩ５０でＨＳＶ１７１６は、炎症性サイトカインのインデューサである（低酸素条件におけるＩＬ−８、ＩＬ−１および炎症性転写因子ＮＦκＢのより高い誘導プロファイル）ことを示唆する。同時に、正常酸素圧においてＮＦκＢおよび抗炎症性ＴＧＦ−βおよびＩＬ−１０の発現は、低減され（低酸素条件下での後者の明らかな誘導にもかかわらず）、一方で、ケモカインＣＸＣＬ−１およびＣＸＣＬ−６について、遺伝子発現の検出可能な変更は観察されなかった。興味深いことに、低酸素条件下で、感染後にＶＥＧＦ−Ａの顕著に高い誘導が観察された（表２（図１４））。
【０１５０】
ＭＤＭによるスフェロイドの浸潤は、腫瘍縮小につながる
ＨＳＶ１７１６の腫瘍への、具体的には、低酸素コアへの送達が、マクロファージの使用によって媒介され得るか否かを調べるために、腫瘍スフェロイドを作製した。スフェロイドの使用は、２Ｄ培養物と比較して、十分に酸素化されたゾーンによって囲まれた、酸素が枯渇した中心区域によって構成されており、したがって、スフェロイドは、３Ｄ腫瘍を模倣するという利点を有する。ＬＮＣａＰ細胞（２％アガロースコーティングされた９６ウェルプレート中に播種された１．５×１０４個細胞）を使用して、１日目に腫瘍スフェロイドを作製した。細胞をプレーティングした３日後に（４日目）、８００μｍ／１ｍｍ直径のスフェロイドが発達した。３日目にＭＤＭを、ＨＳＶ１７１６をＭＯＩ５０で用いて感染させ、２４時間インキュベートし、非感染細胞を対照として使用した。４日目に、細胞を回収し、カウントし、スフェロイドは、５×１０３個ＭＤＭをＭＯＩ０（対照ＭＤＭ）およびＭＯＩ５０（感染ＭＤＭ）によって浸潤された。さらに、対照スフェロイド（非浸潤）を考慮した。プレートをさらに２０時間インキュベートした（９日目まで）。６日目に、ＭＤＭ感染から７２時間後に、スフェロイドの内側のＨＳＶ１７１６（ＧＦＰを用いて標識された）の存在を可視化するために蛍光顕微鏡を使用して写真を撮った。画像は、ＨＳＶ１７１６に感染したＭＤＭの存在を明らかにしたが、ＭＤＭは、低酸素コアを取り囲む生存可能な周縁部に限局されると思われ、スフェロイドの内部区域にはＧＦＰ（＋）細胞は観察されなかった。スフェロイドの中心区域（対照群）は、わずかに壊死していると思われ、予想されるものよりも顕著に暗かった。９日目に、スフェロイドを顕微鏡下でさらに観察し、写真を撮った；スフェロイドの形状および大きさに大きな変更は検出されなかった。浸潤から５日後（９日目）にスフェロイドを回収し、洗浄し、フローサイトメトリーによって細胞生存力を解析したところ、対照群において、および非感染ＭＤＭにより浸潤されたスフェロイドにおいては、大幅な細胞死は観察されなかったが、ＭＯＩ５０で感染したＭＤＭによる浸潤は、５１±５．９２％の細胞の腫瘍退縮を引き起こした（ｐ値＜０．０１）（図１５）。
【０１５１】
考察
発見は、前立腺がん細胞株ＬＮＣａＰおよびＰＣ３ならびに乳がん細胞株Ｔ４７Ｄは、ＨＳＶ１７１６に対して感受性であることを明らかにし、これは、このウイルスを広い範囲の腫瘍を治療するための療法として使用できることを示す。異なる程度にではあるが、前立腺がんおよび乳がん細胞株の両方が、７２時間後に（ＬＮＣａＰ、ＰＣ３）および１２０時間後に（Ｔ４７Ｄ）、ＭＯＩ５でのＨＳＶ１７１６感染に応答性であった；さらに、生存細胞における高レベルのウイルス取り込みの検出は、さらなる細胞傷害性効果が継時的に誘導され得ることを示唆する。細胞死のパーセンテージは、試験されたすべての細胞株について正常酸素圧および低酸素条件において同様であった（２群の間で統計的有意性は観察されなかった）：この結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで低酸素が腫瘍細胞にＨＳＶ１７１６に対する耐性を付与しない付与しないことを示す；したがって、ＨＳＶ１７１６は、治療することが困難ながんの低酸素区域を死滅させるために使用できる可能性がある。興味深いことに、酸素が枯渇した条件下では有意な細胞死が観察されるという事実にもかかわらず、前立腺がんおよび乳がん細胞株の両方について、低酸素におけるウイルス取り込みは、全般的に、正常酸素圧における取り込みよりも低く、ＰＣ３については有意でない。しかし、報告された高レベルの細胞死は、低酸素条件におけるＨＳＶ１７１６に対するより高い感受性を示唆する。
【０１５２】
ヒトマクロファージで実施した研究は、それらはＨＳＶ１７１６に対して感受性であることを示した。ＨＳＶ１７１６の、感染から９６時間後にマクロファージを死滅させる能力は、ＭＤＭを、ＭＤＭによって腫瘍の低酸素区域の内側に輸送され、複製し、ＭＤＭを溶解し、次いで、近くのがん細胞に感染し、死滅させるウイルスの送達系として利用する可能性を暗示するので基本的な重要性を有する。ＭＤＭにおけるＨＳＶ１７１６複製が、微小環境におけるウイルス粒子の放出につながることをさらに実証するために、解析し、ＨＳＶ１７１６の存在を検出することを目的として感染マクロファージから上清を集めた。結果は、予想されるように、ＭＯＩが増大するにつれたウイルス濃度の増大を明らかにし；興味深いことに、低酸素条件下でのウイルス粒子の複製および放出は、正常酸素圧においてよりも３倍高かった。しかし、同一上清を用いてＬＮＣａＰを感染させた場合には、１２０時間後に、細胞死は、ＭＯＩ５０で正常酸素圧においてのみ有意であったが、低酸素条件下またはより低いＭＯＩでは有意な値は観察されなかった。この結果は、上清の滴定後に観察されるウイルス粒子の量は、低酸素ではより高いが、全般的に３×１０３ＰＦＵ／ｍｌよりも高くなく、１００μｌの、３×１０３ＰＦＵ／ｍｌ（またはより少ない、ＭＯＩ５の場合には）のＨＳＶ１７１６を含有する上清を使用して、２×１０４個細胞に感染させたことを考慮すると、このような量は、ウイルスが細胞を死滅させるには十分ではない場合があるという事実によって説明でき；これは、ＬＮＣａＰがＭＯＩ＜０．０５、極めて低いＭＯＩ（ＨＳＶ１７１６を用いて感染を実施する場合に、有意な細胞死がＭＯＩ５でのみ観察されたことを踏まえれば）で感染されたことを意味する。しかし、ＭＤＭコンディショニング培地において検出されたＨＳＶ１７１６のこのような低い値は、ウイルスの放出を暗示し、この発見の重要性は、推定治療アプローチにおいて、ウイルス粒子は、ＭＤＭによって送達され、環境中に放出されると、腫瘍細胞と遭遇し、それらに感染し、一定量のウイルスコピーをさらに増幅しながら複製し、その後、腫瘍中に広く広まることを考慮した場合に明確である。
【０１５３】
ＭＤＭの、ＨＳＶ１７１６を腫瘍に、具体的には、低酸素区域に送達する能力を試験するために、実際の腫瘍の構造を模倣することを目的として多細胞３Ｄスフェロイドを調製した。主目的は、ＭＤＭが、ウイルスを、３Ｄスフェロイドにおいて細胞死が誘導されるために十分に実際に送達するか否かを理解することである。比較的大きな直径のスフェロイド（８００μｍ〜１ｍｍ）によって、顕微鏡下での形状および大きさの可能性ある変更の観察が可能となった。さらに、ＧＦＰ標識されたＨＳＶ１７１６の存在は、スフェロイドの内側での感染ＭＤＭの存在を検出する機会、したがって、ＭＤＭが低酸素コアに実際に到達したか否かを観察する機会を与えた。
【０１５４】
感染ＭＤＭ（ＭＯＩ５０）により浸潤されたスフェロイドにおいて、対照群（ｐ値＝０．００９）および非感染ＭＤＭにより浸潤されたスフェロイド（ｐ値＝０．００４）と比較して有意な細胞死が観察された。
【０１５５】
ＭＤＭ感染から７２時間後（６日目）に、感染ＭＤＭを用いて処理されたスフェロイドにおいてＨＳＶ１７１６ＧＦＰが観察され、酸素化された周縁部と同時局在する弱いｇｆｐ蛍光を有していた。明白な緑色染色がないことは、使用されるＭＤＭの少ない量（各スフェロイドにより、わずか５×１０３個細胞が浸潤された）による可能性がある。しかし、感染ＭＤＭにより浸潤されたスフェロイドが、有意なレベルの細胞死（５１±５．９２％、ｐ値＜０．０１）を示したのでＨＳＶ１７１６の送達は成功し、これは、ＨＳＶ１７１６が、ＭＤＭの内側で複製し、微小環境に広がり、最終的に、腫瘍細胞を死滅させることを示唆した。
【０１５６】
ＨＳＶ１７１６感染がＭＤＭにおける遺伝子発現を改変する方法を理解するために、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。目的の遺伝子をその免疫特性に基づいて選択した、炎症性サイトカインＩＬ−８、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＣＸＣＬ−１、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０、ＣＸＣＬ−６および因子ＮＦκＢ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＴＧＦ−β。ヒト細胞のウイルス感染は、一般に、炎症性サイトカインおよび転写因子の誘導を引き起こすシグナル伝達経路の活性化につながる（Ｍｏｇｅｎｓｅｎ，Ｔ．Ｈ．およびＳ．Ｒ．Ｐａｌｕｄａｎ、２００１  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６５：１３１−＋）。したがって、ＭＤＭ遺伝子発現に対するＭＯＩ５０でのＨＳＶ１７１６感染の効果ならびに正常酸素圧および低酸素条件下で実施された感染間の相違を解析することは興味深いと考えられた。
【０１５７】
ＭＯＩ５０でのＨＳＶ１７１６感染は、４８時間までに炎症性サイトカインの誘導を引き起こし、発現の増大は、低酸素条件下で特に観察されたが、正常酸素圧では、相当の変化は観察されなかった。サイトカインＩＬ−８およびＩＬ−１は、低酸素においてそれぞれ、５倍および７倍上方制御されるとわかった。低酸素条件下で５倍増大した発現はまた、ＮＦκＢについても観察されたが、驚くべきことに、ＮＦκＢは正常酸素圧では５倍下方制御される。この発見は、酸素の不在下でより高い炎症特性を有し得るＨＳＶ１７１６に対するＭＤＭの異なる応答を示唆する。この場合には、これは、ＨＳＶ１７１６が、低酸素においてより大きいウイルス効力を獲得することを示唆し：この結果は、異なる方法によって接近することが困難である腫瘍の標的中心区域への、ＭＤＭによるウイルス送達を使用することの理論的根拠をさらに支持する。
【０１５８】
抗炎症性サイトカインＩＬ−１０および増殖因子ＴＧＦ−βは、正常酸素圧条件においてのみ、ＨＳＶ１７１６感染後に５倍下方制御される。実際、低酸素下では、抗炎症性ＩＬ−１０発現の４倍増大が観察され、これは、おそらくは炎症性効果に対立する。興味深いことに、低酸素条件下で、ＶＥＧＦ−Ａの強力な上方制御があり（２１倍）、これは、幾分かは、ＶＥＧＦ−Ａは、通常、低酸素応答に関与しているという事実による可能性がある。
【０１５９】
要約すれば、この研究は、ＨＳＶ１７１６が、前立腺がんおよび乳がん細胞株において腫瘍細胞死を誘導し、ＭＤＭにおいて複製し、周囲の微小環境中に広がることができることを実証する。さらに、結果は、ＨＳＶ１７１６は、ＭＤＭによって送達された場合に、多細胞３Ｄスフェロイドにおいて細胞死を引き起こし、したがって、腫瘍溶解性ＨＳＶ１７１６の腫瘍への、マクロファージによって媒介される送達は、固形腫瘍を治療するための可能性ある治療アプローチを構成することを示す。これまでに実施された臨床治験によって示されるＨＳＶ１７１６の主要な安全性プロファイルは、ＭＤＭ送達可能療法としてそれを使用する可能性を、がん患者に提供され得る治療の範囲をさらに増大する絶好の機会にする。
実施例２の参考文献
【０１６０】
【表２−１】
2018509181.tif 000005
【０１６１】
【表２−２】
2018509181.tif 000006
【０１６２】
【表２−３】
2018509181.tif 000007
【０１６３】
【表２−４】
2018509181.tif 000008
【実施例３】
【０１６４】
ヒトマクロファージの単離および培養
単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｔ．Ａｌｂａｎｓ、ＵＫ）を使用して血小板が枯渇したバフィーコート（Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ、ＵＫ）から単離し、単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）は先に記載されるように調製した２１、２２。
【０１６５】
内皮細胞培養
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、５μΜ孔ＰＥＴメンブレンを含有するコラーゲンコーティングされた（０．１ｍｇ／ｍｌ、ヒトＩＶ型）メンブレン（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ）上に２４時間播種した。
【０１６６】
ヒト多細胞腫瘍スフェロイド
ヒト前立腺がん細胞株、ＬＮＣａＰを１００μｌの培地中で、２％アガロース（Ｓｉｇｍａ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）コーティングされた９６ウェル組織培養プレートの各ウェル中に播種した（５×１０３）。７〜１０日後、各ウェルは、７００〜８００μｍの平均直径を有する腫瘍スフェロイドを含有していた２１。
【０１６７】
一次マクロファージの感染
３日目にＭＤＭに複製欠損アデノウイルス（ＣＭＶ−ＡｄＶ５−ＧＦＰ（ＣＭＶプロモーターによって駆動される）を感染させた。ウイルス最適化およびＧＦＰ発現レベルは、２１に記載されている。
【０１６８】
マクロファージによる磁性ナノ粒子の細胞性取り込み
ＭＤＭ（ＡｄＣＭＶ−ＧＦＰに感染した）を、１００μｇ／ｍｌのＳＰＩＯ（２５ｎｍ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）とともに一晩培養した。細胞におけるＳＰＩＯ蓄積を、フローサイトメトリーによって予め評価し、Ｍｕｔｈａｎａ，Ｍ．ら  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ（２００８）に記載されるように、光学顕微鏡によって観察されるように、培養ディッシュの側面に置かれた磁石に向けて細胞が引き付けられることによって確認した。マクロファージによるＳＰＩＯ取り込み後の細胞生存力も測定し、ＤＮＡ色素ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を使用して、ＳＰＩＯとともにインキュベートされなかった細胞と比較した。２つの群間に統計的有意差は観察されなかった。ｐ＝０．４（図２０ｃ）Ｎ＝３。
【０１６９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ経内皮フローアッセイ
経内皮遊走（ＴＥＭ）チャンバーを、（図２０ａ）に示されるように組み立てた。ＳＰＩＯが負荷されたＭＤＭ（ＰＢＳ＋２％  ＦＣＳ中の１．５×１０５個細胞／ｍｌ）を、通常の静脈流速（１．１８８５ｍｌ／分）で、１．４Ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２のせん断応力でＨＵＶＥＣ単層上を流れさせた、これは、後毛細管細静脈を通る血流と同等である。ＴＥＭチャンバーを、７テスラ磁石（Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｅｃＡＶＡＮＣＥＩＩ、３１０ｍｍボア、ＭＲＩシステムＢ／Ｃ  ７０／３０）の約５ｍｍ遠位にアイソセンター中に直接配置した。チャンバー中の流れは、−ｚ方向にあった（磁石ボアの中と外）。本発明者らは、Ｒｅｉｇｌｅｒら１３によって記載されるように、パルス勾配２ｍｓオン、７ｍｓオフを使用した。ＳＰＩＯを腫瘍スフェロイドを含有するチャンバー中に導くために、本発明者らは、過熱を避けるためにパルス−ｙ勾配を５０％の強度で（約３００ｍＴ／ｍ）３０分間適用した。ＭＲＴ後、１Ｈボリューム共鳴器（Ｂｒｕｋｅｒ、３００ＭＨｚ、１ｋＷ最大、外径１１８ｍｍ／内径７２ｍｍ）によって、ＭＲ画像（ＦＬＡＳＨおよびＲＡＲＥ）の捕獲が可能となった。
【０１７０】
次いで、ＧＦＰ陽性細胞を検出するために蛍光顕微鏡および酵素的に分散されたスフェロイドを使用するフローサイトメトリーを使用して、ＭＤＭによるスフェロイド浸潤を評価した。ＳＰＩＯが負荷されたマクロファージ内の鉄含量を決定するために、細胞ペレットを７０％硝酸中で７〜１４日間可溶化し、その後解析した。鉄濃度を、Ｖａｒｉａｎ  Ｖｉｓｔａ−Ｍ  ＰＸを使用するＡｔｏｍｉｃ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙによって較正標準鉄溶液（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）に対して定量化した１４。
【０１７１】
同所（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）前立腺異種移植片モデル
これらの研究には、雄のＣＤ１胸腺マウスを使用した（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ、ＵＫ）。１００万個のＬＮＣａＰ：ＬＵＣ細胞（Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ  Ｍａｇｎｕｓ  Ｅｓｓａｎｄ、Ｕｐｐｓａｌａ  Ｓｗｅｄｅｎより寄贈）を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ中で１：１混合し、背外側前立腺中に注射した。腫瘍の大きさは、Ｍｕｔｈａｎａ，Ｍ．らＭａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎ  Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ｖｉｒｕｓ  Ａｂｏｌｉｓｈｅｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ａｆｔｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｒ  Ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，ｄｏｉ：０００８−５４７２．ＣＡＮ−１２−３０５６  ［ｐｉｉ］１０．１１５８／０００８−５４７２．ＣＡＮ−１２−３０５６  （２０１３）に記載されるように、生物発光ＭＳ画像処理を使用し、マウスの毎日の体重を測定する評価によって決定した。移植のおよそ１４日後に、または前立腺への腫瘍細胞の移植後に肺の腫瘍が発生する場合には転移モデルにおいて２１日後に、腫瘍を有するマウスを実験に使用した２１。
【０１７２】
細胞移動を指示するためのＭＲＩスキャナーの使用
３００万の、ＳＰＩＯを有するまたは有さないＭＤＭを、尾静脈を介して、ＰＢＳの１００μｌの容量で投与し（ｎ＝５）、対照群には、１００μｌのＰＢＳ（ｎ＝５）または１００μｌの、３×１０６のＳＰＩＯを有さないマクロファージを含有するＰＢＳを与えた（ｎ＝５）。ＭＤＭ投与の直後に、マウスをガス状イソフランを用いて麻酔し、次いで、磁石と適合する保持カプセル内に確保し、ＭＲ標的化を直ちに実施した。
【０１７３】
マウスを、ｎ＝５の２群に分割した。群１は、ＭＲ標的化を有さない時間を適合させた対照であり、群２は、１時間の、前立腺の腫瘍部位（−ｚ、−ｙ）への粗い導きのために選択された勾配を使用してＭＲ標的化を経験した（上記参照のこと）。肺（＋ｚおよび−ｙ勾配）へ導くために、ｘ勾配がないことが各肺における磁性粒子の均一な分布を確実にするはずである。
【０１７４】
磁力によって標識された細胞の力は、ＳＰＩＯが磁力によって飽和になったか否かに応じて変わる。不飽和である場合には、力は、ＳＰＩＯの磁化率、磁場およびまた磁場勾配に応じて変わる（Ｐａｎｋｈｕｒｓｔ，Ｑ．Ａ．、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｊ．、Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｋ．およびＤｏｂｓｏｎ，Ｊ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ４４３”  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｊ  Ｐｈｙｓ  Ｄ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓ  ３６、Ｒ１６７〜Ｒ１８１、（２００３））。
【０１７５】
しかし、一度ＳＰＩＯが飽和に到達すると、力は、もはや粒子の磁化率に左右されないが、飽和磁化には左右され、そのようなものとして、磁場勾配のみが、細胞に適用される力に影響を及ぼす（Ｒｉｅｇｌｅｒ，Ｊ．らＴａｒｇｅｔｅｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ３１、５３６６−５３７１、（２０１０年））。ＳＰＩＯは、典型的には、１Ｔ未満で十分に磁性飽和に到達し、例えば、Ｒｉｅｇｌｅｒら２０１３において、ＳＰＩＯはおよそ３００ｍＴで飽和になり、したがって、同一磁場勾配、約３００ｍＴ／ｍが使用されるとすれば、ＭＲＴは、臨床ＭＲＩシステムで実現可能である。
【０１７６】
ＭＲＩによって導いた後、腫瘍（前立腺のみ）の高解像度ＲＡＲＥおよびＦＬＡＳＨ画像を撮った。一度、ＭＳＥおよびＭＧＥを使用する完全緩和時間測定法を実施して、横緩和速度を評価した。処置後、動物を屠殺し、腫瘍、腎臓、肝臓、肺および脾臓を含めた組織を、免疫組織化学のためにパラフィンワックス包埋し、固定するか、またはフローサイトメトリーによって解析して、マクロファージ取り込みを決定した。
【０１７７】
内皮細胞培養
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、最大継代８まで実験に使用した。細胞（１５０，０００個）を、５μΜ孔ＰＥＴメンブレンを含有するコラーゲンコーティングされた（０．１ｍｇ／ｍｌ、ヒトＩＶ型）メンブレン（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ）上に２４時間播種した。これは、ＣＤ３１染色によって見られるような（データは示していない）、フィルター上のＨＵＶＥＣのコンフルエント単層をもたらした。
【０１７８】
一次マクロファージの感染
３日目にＭＤＭを、複製欠損アデノウイルス（ＣＭＶ−ＡｄＶ５−ＧＦＰ）を感染させた。Ｅ１Ａ／Ｂが欠失したアデノウイルスベクター、ＣＭＶ−ＡｄＶ５−ＧＦＰ（ＣＭＶプロモーターによって駆動される）を単一プラークから単離し、２９３ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞において増やした。すべてのウイルスを、二重セシウム勾配遠心分離によって精製し、２９３細胞でのプラークアッセイによって滴定し、力価は、プラーク形成単位（ＰＦＵ）／細胞として表した。ウイルス最適化およびマクロファージにおけるＧＦＰ発現レベルは、２１に記載されている。
【０１７９】
フローサイトメトリー解析
単細胞懸濁液は、ＭＤＭ（同時形質導入されたＭＤＭを含む）をトリプシン処理することによって得た。次いで、細胞を、マウス抗ＣＤ１４、１％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ中１：１００とともに４℃で３０分間インキュベートして、非特異的抗体結合を防いだ。あるいは、スフェロイドを、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを使用して消化して、腫瘍細胞を分離し、浸潤したマクロファージおよび細胞死を、フローサイトメーターでの実行の直前に細胞にヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ）を添加することによってフローサイトメトリーによって解析した。
【０１８０】
マクロファージによる磁性ナノ粒子の細胞性取り込み
ナノ粒子細胞性取り込み研究のために、ＭＤＭ（ＡｄＣＭＶ−ＧＦＰに感染した）を、磁性ナノ粒子１００μｇ／ｍｌ  ＳＰＩＯ（２５ｎｍ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）とともに一晩培養した。ＳＰＩＯとともにインキュベートした後の細胞におけるＭＮＰ蓄積を、フローサイトメトリーによって評価し、これは、本発明者によって記載されるように１４、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて細胞生存力を測定することを含んでおり、光学顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＵＫ  Ｌｔｄ）によって観察されるように、培養ディッシュの側面に置かれた磁石に向けて細胞が引き付けられることによって確認した。
【０１８１】
ＨＳＶ１７１６ウイルス療法
治療的研究のために、ＬＮＣａＰまたはマクロファージに、ＨＳＶ１７１６ＧＦＰ（欠失されたＩＣＰ３４．５遺伝子座中にＧＦＰ発現カセットが挿入されたＨＳＶ１７１６変異体）を、５または５０の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。細胞死を、ＰＩ染色を使用して感染の９６時間後にフローサイトメトリーによって評価した。プラーク形成単位を決定するためのベロ細胞での滴定アッセイを使用して、感染マクロファージの清澄化した上清において、ウイルス粒子を検出した。
【０１８２】
マウスに、３００万のＭＤＭ単独またはＭＯＩ５０のＨＳＶ１７１６、１×１０７ｐｆｕ  ＨＳＶ１７１６武装したＭＤＭまたはＰＢＳのいずれかの尾静脈注射を施した（ｎ＝５マウス／群）。注目すべきは、３群のマウスに、ＭＤＭ＋ＯＶを投与し、１つの群は、ＭＲＴを１時間経験し、１つの群は、ＭＲＩスキャナー中に１時間置かれたが、ＭＲＴはなく（ＭＤＭ＋ＯＶ  ＭＲＴなし）、別の群は、ＭＲＩスキャナーに入らなかった（ＭＤＭ＋ＯＶ）。腫瘍の大きさを、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  ｉｍａｇｉｎｇ  （ＩＶＩＳ、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってモニタリングした。腫瘍が、ＵＫ  Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓによって許可された最大容量に到達すると、動物を屠殺させ、屠殺の１時間前に、マウス静脈内にＦＩＴＣ：レクチン（腫瘍脈管構造を検出するために使用される）を注射した。注目すべきは、ＰＢＳおよびＭＤＭのみを与えたマウスを、大きな腫瘍の大きさのために治療後１４日で選別した。２１日目にすべてのその他の腫瘍を取り出した。腫瘍、腎臓、肝臓、肺および脾臓を含めた切除された組織を、組織学的標識研究のために、ＯＣＴまたはパラフィンワックス中に包埋した。
【０１８３】
解析
組織を２つに分け、；一方の部分は、免疫組織学的解析のためにホルマリン固定し、他方は、接着性線維性および脂肪組織を含まないように解体し、コラゲナーゼを用いて処理した。
フローサイトメトリー：細胞生存力を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して決定した。すべてのＦＡＣＳデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を使用するＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で解析した。
【０１８４】
組織学：すべての臓器の５ミクロンの切片を、標的抗原の特異的抗体とともにインキュベートした；脈管構造のために、本発明者らはＣＤ３１（１：１００）（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）を、マクロファージのために、ヒトＣＤ６８（Ｄａｋｏ、Ｅｌｙ、ＵＫ）を１：１００で使用し、アデノウイルスを検出するために、本発明者らは、１：５０のＥ１Ａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＫ）を使用した。ビオチン化二次抗体系を、ストレプトアビジンがコンジュゲートしているＨＲＰとともに使用した。ペルオキシダーゼ活性をジアミノベンジジン（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  ｋｉｔ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）とともに局在化した。腫瘍において鉄を検出するために（細胞密度が高かった場合）、Ｐｅｒｌｓ  Ｐｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅを用いて切片を染色し、コントラストを改善するためにエオシンを用いて対比染色した。肺中のがん細胞を検出するために、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）またはヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いてすべての肺切片を染色した。複数の組織切片ですべての免疫局在性実験を反復し、バックグラウンド染色の決定のためにアイソタイプ適合対照を含んでいた。
【０１８５】
統計解析
データは、平均±ＳＥＭである。スチューデントのｔ検定を使用して、データの統計的有意性を解析した。０．０５未満のＰ値の差は、有意と呼んだ。
【０１８６】
補足方法
マウス手順およびヒト単球単離は、動物（化学的処置）法（Ａｎｉｍａｌｓ  （Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）  Ａｃｔ）１９８６の下、シェフィールド大学倫理委員会および英国ホームオフィス規制（ＵＫ  Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）に従って実施した。
【０１８７】
結果
本発明者らは、腫瘍溶解性ウイルス（ＨＳＶ１７１６）武装した治療用細胞を、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯ）を使用して磁力によって標識し、次いで、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）システム内のパルス磁場勾配を使用して血流から深部標的組織（原発性および二次性腫瘍）中に導くことができることを示す。この技術の使用は、腫瘍への細胞送達の顕著な増大ならびに腫瘍量および転移の有意な低減をもたらした。したがって、本発明者らの研究は、臨床ＭＲＩスキャナーを、このような磁力によって標識された細胞を、身体中へのその注入後に、画像処理するためだけでなく、それらを具体的には、身体内の１つまたは複数の標的部位に導くために使用できることを示す。本発明者らは、マクロファージの腫瘍への送達を増大するための磁気共鳴標的化（ＭＲＴ）の使用を記載する。
【０１８８】
本発明者らは、腫瘍中／腫瘍の周囲に磁場を形成するように、ＭＲＩスキャナーの空間磁場勾配コイルを操作し、それによって、磁力によって標識された細胞をそれに向けて非侵襲性に導くことが可能であることを示す（図１６）。
【０１８９】
本発明者らは、これまでに、このようなＭＲＴを使用して、細胞を画像処理し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管二分岐モデル（人工二分岐を模倣する２Ｄチューブ）において移動させることができることを示した１３。ここで、本発明者らは、マウスにおいてＭＲＴを使用して、磁性マクロファージをｉｎ  ｖｉｖｏで、すなわち、血流から２つの標的臓器、同所性前立腺腫瘍およびその肺転移に「導く」こともできることを示す。本発明者らは、マクロファージを、細胞媒体の一例として使用したが、これは、これらの細胞が、高度に食作用性であり、それらが、その磁石特性を保有しながら、ＳＰＩＯを容易に消費するのを可能にするからである１４、１８、１９。このような骨髄由来細胞は、がん２０−２２、梗塞心筋２３、脊髄損傷２４、脳虚血２５、パーキンソン病２６およびアルツハイマー病２７のような変性性疾患などの疾患のための細胞ベースの療法においてますます使用されている。
【０１９０】
ＭＲＴ技術をｉｎ  ｖｉｖｏに適用する前に、本発明者らは、６００ｍＴ／ｍ勾配コイルセットが取り付けられた前臨床７Ｔ  ＭＲＩシステムは、磁性マクロファージを内皮層を越えて３Ｄヒト腫瘍スフェロイド（ＭＴＳ）中に導くことによってｉｎ  ｖｉｔｒｏでそれらに対して実質的な作動力を生成できることをまず確立した。これを行うために、本発明者らは、ヒトマクロファージが、ヒト血管内皮細胞の層でコーティングされた穿孔処理されたメンブレンの表面を越えて循環し、それによって腫瘍細静脈における流れを模倣する経内皮遊走（ＴＥＭ）フローチャンバーを設計した。ＭＴＳを、メンブレンの下の非接着性チャンバー中で培養した（図２０ａ）。ＧＦＰリポーターアデノウイルス（Ａｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰ）を発現するようにトランスフェクトされたヒトマクロファージは、ＳＰＩＯ（１．１８μｇ／ｍｌ±０．３）１４を負荷され、次いで、チャンバーを高磁場（７Ｔ）前臨床ＭＲＩシステムのアイソセンター中に置いた場合に、メンブレンを越えてＭＴＳ中に導かれた。
【０１９１】
ＭＲＴ実験は、スフェロイドの方向でパルス磁場勾配（２ｍｓオン、７ｍｓオフ、５０％強度  約３００ｍＴ／ｍ１３）を１時間使用し（図２０ａ）、ＭＴＳ部位の周囲で効果的なさらなる磁場消失、Ｂｏｆｆ約＋１．５ｍＴを有していた。対照条件では、試料をスキャナーの磁場に曝露したが、勾配は瞬間適用しなかった。本発明者らは、ＭＲＴを使用して、Ｔ２＊強調シグナル喪失を見出し、これは、ＭＲＴ曝露された試料の対照試料と比較してより高い鉄の濃度を示し（ｎ＝６）（図２０ｃｉ）、ＧＦＰを発現するマクロファージは、ＭＴＳ内に明確に見えた（図２０ｃｉｉ）。フロー解析によって、マクロファージ取り込みがさらに確認され、ＭＲＴを用いない場合（２．９％±１．８）よりも、ＭＲＴを用いた場合に目に見える浸潤性ＣＤ１４＋／ＰＩ−を発現するマクロファージ（２９．７％±２．６）が有意に（Ｐ＝０．０００１）より多かった（図２０ｃｉｉｉ〜ｉｖ）。
【０１９２】
次いで、本発明者らは、ＭＲＩ勾配システムを使用して、磁性マクロファージを腫瘍にｉｎ  ｖｉｖｏで導くことができるか否かを調べた（図１７）。３００万のＳＰＩＯが負荷されたマクロファージを、同所性原発性および転移性（肺）前立腺腫瘍を有するマウスに静脈内投与した。パルス磁場勾配１３を前立腺の方向で１時間適用し（図１７ａ）、スキャナーの静磁場の頂部で効率的な磁場消失、Ｂｏｆｆ約＋７ｍＴを有していた（Ｂ０＝７Ｔ）。対照群は、導く勾配の不在下でスキャナーの静磁場に曝露した（ＭＲＴなし）。
【０１９３】
ＭＲＴは、対照群（７．１７％±０．８）と比較して、原発性前立腺腫瘍におけるＳＰＩＯが負荷されたマクロファージの取り込みを有意に（ｐ＝０．０００１）増大した（４２．２％±２．５）（図１７ｂ）。さらに、ヒトＣＤ６８に対する抗体（汎マクロファージマーカー）を使用して腫瘍の連続切片を標識することおよび鉄についての組織学的染色（Ｐｒｕｓｓｉａｎ  Ｂｌｕｅまたは「ＰＢ」）によって見られるように、これらの細胞は、腫瘍中に存在しており、ＭＲ標的化後に腫瘍脈管構造中に細胞凝集塊の極めてわずかな徴候しかなかった（図１７ｃ）。マクロファージをＭＲＩによって導くことは、腫瘍脈管構造に悪影響を与えず（図２１ａ）、腫瘍のマルチエコーＲＡＲＥ  ＭＲ像では、ＭＲＴおよびＭＲＴなし群の間にわずかな差異を見ることができる（図１７ｄ）。これは、ボクセルあたりの血液プール鉄含量による可能性が最も高い。しかし、ＳＰＩＯが注射されたおよび注射されていない対象間の顕著な差は、Ｔ２強調ロングＴＥ画像において明らかであり、腫瘍内でのシグナル強度の喪失を有し（対照と比較した、ＭＲＴを用いた場合の歪められたＭＲＩ画像）、これは、高濃度の鉄の存在を示す（図１７ｅ）。ｉｎ  ｖｉｖｏでの磁性マクロファージの取り込みの増大を評価しようと努力して、本発明者らは、両群中の腫瘍においてＭＲ横緩和減衰率（Ｒ２）を測定するためにＭＲ緩和時間測定法を使用した。Ｒ２測定値は、ＭＲＴ群について２１．８ｓ−１および対照群について１８．８ｓ−１であった。ＳＰＩＯの存在が全くない腫瘍組織の正常なＲ２減衰率も、比較に含まれる（１０．５ｓ−１）。より高い減衰率は、ＭＲＴ群についての鉄取り込みの増大を示し、これは、死後解析を用いて見られるように、ＭＲＩを用いる取り込みを評価することが可能であることを示唆する。スピンエコーベースのＭＲＩシークエンスを６０ｍｓのＴＥで用いて、Ｒ２値における有意差を使用して、シグナル差を解析するための最良エコー時間を推定し、ここで、ＭＲＴは、時間を適合させた対照を上回るシグナルの１０％低減につながる。
【０１９４】
さらなる対照は、腫瘍を有するマウス：（ｉ）非標識マクロファージおよびＭＲ標的化を有する、および（ｉｉ）非標識マクロファージを有し、ＭＲ標的化を有さないを含んでいた。これらの対照群について、本発明者らは、ＭＲＩ画像処理（図２１ｃ）および酵素的に分散された腫瘍のフローサイトメトリー（図２１ｄ）によって確認されるように腫瘍内に極めてわずかなマクロファージを検出した。注目すべきは、本発明者らは、肝臓（すべての細胞／組織切片の＜２％）、脾臓（＜１％）および腎臓（検出されない）を含めたその他の組織において、ヒトＣＤ６８＋マクロファージを実質的に検出しなかった（図２２）。
【０１９５】
ＭＲＴは、肺、脳、肝臓または脊髄におけるように、腫瘍が、外科的に除去することが困難であるか、または不可能である場合に特に適用される。別個のＭＲＴセッションが、細胞ベースの療法の、がん患者中の１つまたは複数の転移病巣への標的化を可能にできる。第２のｉｎ  ｖｉｖｏ実験では、本発明者らは、本発明者らの腫瘍を有するマウスにおいて、磁性マクロファージを、微小転移を含有する肺中に導いた。３００万のマクロファージの投与後に、ＭＲＴをやはり使用して、磁性マクロファージを、肺に向けて導いた。ＭＲＴを適用しないが、スキャナーの磁場に同一長さの時間曝露したマウスを、時間を適合させた対照として使用した。
【０１９６】
酵素的に分散された肺のフローサイトメトリー解析は、対照群と比較して、ＭＲＴ後に有意に多いヒトＣＤ１４＋マクロファージの存在を示した（それぞれ、１７．７％±４対４．４％±２．６）（図１８ａ）。これはまた、肺の組織学的染色によって確認され、これでは、ＣＤ６８＋ヒトマクロファージが、ＭＲＴ後のマウスの肺内の転移性沈着物中またはそれに近接して検出された（図１８ｂおよび図２３ａ）。これらのマクロファージはまた、Ｐｒｕｓｓｉａｎ  Ｂｌｕｅについて陽性であり（図１８ｃ）、Ｈ＆Ｅ染色後に、その鉄含量も目に見えた（図２３ｂ）。本発明者らは、ＭＲＴを用いるまたは用いないＳＰＩＯ標識されたマクロファージのその取り込み後の肺におけるＣＤ３１＋血管の形態を検査した（図１８ｃ）。さらに、本発明者らは、これらの２群のマウス中の５つの腫瘍の各々中のどの血管も調べ、２群間に差は見られなかった。本発明者らは、内皮細胞破壊の徴候を見ることはできず、ＭＲＩ標的化後の血管の反管腔側中またはその上に血液凝固（例えば、血小板凝集）の何らかの徴候もなかった。肺組織のショートＴ２／Ｔ２＊のために、取り込みの増大のｉｎ  ｖｉｖｏ検証のために高磁場で従来の１Ｈ  ＭＲＩ技術を用いて肺柔組織を画像処理することは可能ではなかった。さらなる技術開発がこれを可能にし得る、例えば、気腔における過分極されたガスの使用を、間接ＭＲシグナル検出法として使用できる２８。それにもかかわらず、種々の臓器または柔組織では、または臨床システムでは、Ｔ２＊画像処理は、一定の場所を有し得る。
【０１９７】
ＭＲＴの治療効果を評価する最終実験では、本発明者らは、治療用腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）ＨＳＶ１７１６を用いて武装されたＳＰＩＯが負荷されたマクロファージを、腫瘍を有するマウスに標的化した。ＨＳＶ１７１６複製は、ＰＣ３前立腺がん細胞によって支持され｛ＣｏｎｎｅｒおよびＢｒａｉｄｗｏｏｄ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１２年７月；１９（７）：４９９〜５０７｝、ここで、本発明者らは、低酸素（０．５％  Ｏ２）および正常酸素圧（２０％  Ｏ２）両条件におけるＬＮＣａＰ細胞における腫瘍退縮を初めて示す（図２４ａ）。ＨＳＶ１７１６は、マクロファージによって容易に取り込まれるが、取り込みは、正常酸素圧培養条件において有意に高く（ＭＯＩ５でｐ＝０．００２およびＭＯＩ５０でｐ＝０．００１）（図２４ｂ）、ウイルス複製は、低酸素において多く、マクロファージ細胞死は、低酸素環境において同等に有効である（図２４ｃ、ｄ）。本発明者らのｉｎ  ｖｉｖｏモデルでは、ＯＶを保持するマクロファージの単回静脈内注射のいずれかを与えた腫瘍を有するマウスを、ＭＲＩスキャナーに対して曝露しなかった（ＭＤＭ＋ＯＶ）、スキャナーにおいて静止であったが、ＭＲＴを用いなかった（ＭＤＭ＋ＯＶ（ＭＲＴなし））、またはスキャナーに曝露し、ＭＲＴを用いた（ＭＤＭ＋ＯＶ＋ＭＲＴ）。比較する目的で、マウスの別個の群に「遊離」ＯＶを投与した。マウスのさらなる対照群に、１００μｌの生理食塩水処置（対照）または３００万のマクロファージ（ＭＤＭ）のいずれかを静脈内に与えた。ＯＶ（１×１０７ｐｆｕ）｛Ｓｏｒｅｎｓｅｎら．、Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ２０１２  ５３：６４７−６５４｝単独は、ＰＢＳまたはＭＤＭのみを与えられたマウスと比較して原発性腫瘍成長を最大７日間有意に（Ｐ＜０．０３）遅延した（図１９ａ）。この効果は、ＨＳＶ１７１６のマクロファージ媒介性送達を用いた場合に有意に延長された（１４日目でｐ＜０．００６および２１日目でｐ＜０．００７）。注目すべきは、ＭＤＭ＋ＯＶおよびＭＤＭ＋ＯＶ（ＭＲＴなし）を与えられたマウスでは差が観察されなかったが、これでは、後者はスキャナーに対して曝露されるが、導かれない。しかし、本発明者のマクロファージ療法のＭＲＴ標的化は、７日目以降からの原発性腫瘍の大きさの低減において優れているだけでなく、これはまた、実験全体について原発性腫瘍再成長を遅延した（図１９ａ）。
【０１９８】
治療の最初の日（０日目）に、および実験の最後に（２１日目）、ＭＲ標的化とともにまたはそれを伴わずにマクロファージＯＶ療法を与えられているマウスの生物発光は、原発性腫瘍のこの顕著な低減を示した（図１９ａ＆ｂ）。これは、ＭＲＩスキャンで視覚的に確認された（図１９ｃ）。さらに、マクロファージによって送達されるＯＶ後にＭＲ標的化を経験している腫瘍は、ＭＲ標的化を経験していないものよりも有意により壊死していた（ｐ＜０．００１）（図１９ｅ）。
【０１９９】
治療の最初の日（０日目）に、および実験の最後に（２１日目）、ＭＲＴとともにまたはそれを伴わずにマクロファージＯＶ療法が与えられているマウスのＭＲ画像は、この原発性腫瘍の顕著な低減を反映する。興味深いことに、ＯＶまたはＯＶを保持するＭＤＭを用いて治療されたマウスから得た腫瘍は、ＰＢＳまたはＭＤＭ単独群と比較して、相当に淡く、少なく血管形成され、これは、微小血管密度（ＭＶＤ）の低減と相関する。マクロファージによって送達されたＯＶ後にＭＲＴを経験しているマウスでは、ＭＲＴの不在下においてよりも、有意に多い壊死（ｐ＜０．００１）が、腫瘍において観察された。
【０２００】
本発明者らは、次いで、これらの療法が肺転移の発生に影響を及ぼす方法を決定した。ＰＢＳまたはＭＤＭ単独を注射されたマウスにおいて、２、３の転移が検出されたが、これは、これらの群における原発性腫瘍は、１４日目までに除去されなければならないからである（その大きさのために）。したがって、これらの対照群における転移を、その他の実験群と比較することは正当ではない。しかし、マウスが、ＯＶを有するマクロファージの送達後にＭＲＴを施された場合には、ＭＲＴが使用されなかった場合と比較して、肺転移の形成は顕著に低減した（図１９ｆ  ０．８±０．３７対３．８±０．９５  ｐ＜０．０２）。
【０２０１】
要約すれば、本発明者らは、ＭＲＩスキャナーを使用して、細胞を身体内の原発性および続発性腫瘍の両方に非侵襲性に導くことができ、治療転帰の著しい改善につながることを示す。さらに、緩和時間測定法測定値は、ＭＲＴ後ＭＲＩを使用して、このアプローチの有効性を評価することができることを示唆する。この研究は、腫瘍への細胞送達に焦点を合わせてきたが、この技術を使用して、任意の細胞（例えば、幹細胞）を、その細胞表面上のタンパク質に対して向けられる、ＳＰＩＯがコンジュゲートしている抗体を使用して「磁化され」得る、非食作用性細胞種を含めた所与の組織に標的化できる。
【０２０２】
細胞の送達を増大するための磁気共鳴画像処理システム内の磁場勾配を利用する磁気共鳴標的化の使用は、深部または表在性組織に理想的に合わされる。臨床解釈の問題は、臨床ＭＲＩシステムで同一標的化力を提供する能力に応じて変わる。３００ｍＴ／ｍの高性能磁場勾配システムを有する臨床スキャナーは、既に使用されており、そのようなものとして、同様の力をもたらす可能性を有する。さらに、本発明者らは、ＭＲＴ後に細胞分布を画像化でき、これは、ＭＲＩシステムを使用するリアルタイム画像誘導標的化の可能性を示す。これらの発見は、療法のための細胞の標的化の改善のための画像処理と併用したＭＲＴの可能性ある価値を支持する。
実施例３の参考文献
【０２０３】
【表３−１】
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【０２０４】
【表３−２】
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【０２０５】
【表３−３】
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【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１７ｄ】
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【図１７ｅ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１８ｃ】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図１９ｃ】
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【図１９ｄ】
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【図１９ｅ】
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【図１９ｆ】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２０ｃ】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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【図２１ｃ】
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【図２１ｄ】
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【図２２】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ】
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【図２４ａ】
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【図２４ｂ】
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【図２４ｃ】
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【図２４ｄ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
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【図２８Ｅ】
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【図２８Ｆ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図２９Ｅ】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018509181.tif 000086
2018509181.tif 000087
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