(57)【要約】  本発明は、ＦＧＦ２１シグナル伝達経路に対する長時間作用性アゴニストを用いてそれを必要とする患者を処置する方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、過剰な胆汁酸に関連する障害または疾患を処置するための、ＦＧＦ２１シグナル伝達経路を刺激する分子、例えば、長時間作用性ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはアゴニスト抗体の使用に関する。本発明はさらに、胆汁酸関連障害の処置に適したＦＧＦ２１シグナル伝達経路の長時間作用性アゴニストの医薬製剤及び投与に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦ２１シグナル伝達経路の延長された半減期のアゴニストを用いて
過剰の胆汁酸を有する患者を処置する方法。
【請求項２】
前記アゴニストが、Ｆｃリンカー及びＦＧＦ２１を含むＦＧＦ２１融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＦＧＦ２１が、リジン９８のアルギニンへ、及びプロリン１７１のグリシンへの配列番号１の位置における点突然変異をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＦＧＦ２１がアルギニン１８０のグルタミン酸への点突然変異をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アゴニストが５時間を超える半減期を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記アゴニストの投与の際に、胆汁酸が前処置レベルと比較して統計的に有意な量、低下する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記アゴニストの投与時に、胆汁酸産生のＣＹＰ７Ａ１バイオマーカーが、処置前レベルに対して統計的に有意な量、低下する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記処置すべき状態が、進行性家族性肝内胆汁うっ滞２型及び３型（それぞれＢＳＥＰ及びＭＤＲ３突然変異；これらは肝臓から胆汁酸及びリン脂質を送出するポンプである）、妊娠性肝内胆汁うっ滞（ＩＣＰ）、薬物誘発胆汁うっ滞、避妊誘導胆汁うっ滞、原発性胆汁性肝硬変（自己免疫）、原発性硬化性胆管炎（自己免疫）、原因不明胆道線維症／肝硬変、全非経口栄養（ＴＰＮ）誘発胆汁うっ滞、肝移植後の胆管傷害、敗血症関連胆汁うっ滞、進行性硬化性胆管炎、特発性成人期胆管消失、東南アジア胆管炎及び原発性肝結石症に関連する胆管症から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
過剰の胆汁酸を有する患者の処置に使用するための、ＦＧＦ２１シグナル伝達経路の延長された半減期のアゴニスト。
【請求項１０】
前記アゴニストが、Ｆｃリンカー及びＦＧＦ２１を含むＦＧＦ２１融合タンパク質である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記ＦＧＦ２１が、リジン９８のアルギニンへ及びプロリン１７１のグリシンへの配列番号１の位置における点突然変異をさらに含む、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記ＦＧＦ２１が、アルギニン１８０のグルタミン酸への点突然変異をさらに含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記アゴニストが５時間を超える半減期を有する、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
前記アゴニストの投与時に、胆汁酸が処置前レベルに対して統計的に有意な量、低下する、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
前記アゴニストの投与時に、胆汁酸産生のＣＹＰ７Ａ１バイオマーカーが、処置前レベルに対して統計的に有意な量、低下する、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記処置すべき状態が、進行性家族性肝内胆汁うっ滞タイプ２及び３（それぞれＢＳＥＰ及びＭＤＲ３突然変異；これらは肝臓から胆汁酸及びリン脂質を送出するポンプである）、妊娠性肝内胆汁うっ滞（ＩＣＰ）、薬物誘発胆汁うっ滞、避妊誘導胆汁うっ滞、原発性胆汁性肝硬変（自己免疫）、原発性硬化性胆管炎（自己免疫）、原因不明胆道線維症／肝硬変、全非経口栄養（ＴＰＮ）誘発胆汁うっ滞、肝移植後の胆管傷害、敗血症関連胆汁うっ滞、進行性硬化性胆管炎、特発性成人期胆管消失、東南アジア胆管炎及び原発性肝結石症に関連する胆管症から選択される、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１５年１０月１日に出願された米国仮出願第６２／２３６，０５０号の利益を主張する。
【０００２】
（電子提出したテキストファイルの説明）
本明細書に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列リストのコンピュータ可読フォーマットコピー（ファイル名：Ａ−１９４３−ＷＯ−ＰＣＴ−ＳｅｑＬｉｓｔ０９３０１６＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０１６年９月２０日、ファイルサイズ１７キロバイト）。
【０００３】
本発明は、ＦＧＦ２１シグナル伝達経路に対する長時間作用性アゴニストを用いて、それを必要とする患者を処置する方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、過剰な胆汁酸に関連する障害または疾患を処置するための、ＦＧＦ２１シグナル伝達経路を刺激する分子例えば、長時間作用性ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはアゴニスト抗体、の使用に関する。本発明はさらに、胆汁酸関連障害の処置に適したＦＧＦ２１シグナル伝達経路の長時間作用性アゴニストの医薬製剤及び投与に関する。
【背景技術】
【０００４】
線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）は、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１及びＦＧＦ２３を含む線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のサブファミリーに属する分泌ポリペプチドである（Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｔｒｅｎｄ  Ｇｅｎｅｔ．２０：５６３−６９）。ＦＧＦ２１は、ヘパリン非依存性であり、グルコース、脂質及びエネルギー代謝の調節におけるホルモンとして機能する点で、非定型ＦＧＦである。
【０００５】
ＦＧＦ２１は、肝臓及び膵臓で高度に発現され、かつ主に肝臓で発現されるＦＧＦファミリーの唯一のメンバーである。ＦＧＦ２１を過剰発現するトランスジェニックマウスは、成長速度が遅く、血漿グルコース及びトリグリセリドレベルが低く、年齢関連２型糖尿病、膵島肥厚及び肥満がないという代謝表現型を示す。げっ歯類及び霊長類モデルにおける組換えＦＧＦ２１タンパク質の薬理学的投与は、血漿グルコースのレベルの正常化、トリグリセリド及びコレステロールレベルの低下、ならびに耐糖能及びインスリン感受性の改善をもたらす。さらに、ＦＧＦ２１は、エネルギー消費、身体活動及び代謝速度を増大させることによって体重及び体脂肪を減少させる。実験的研究では、２型糖尿病、肥満、脂質異常症、及びヒトにおける他の代謝状態または障害の処置のためのＦＧＦ２１の薬理学的投与のための支持が得られる。
【０００６】
ＦＧＦ２１は、肝臓由来の内分泌ホルモンであり、脂肪細胞におけるグルコース取り込み及び脂質ホメオスタシスをその受容体の活性化を通じて刺激する。興味深いことに、正準のＦＧＦ受容体に加えて、ＦＧＦ２１受容体はまた、必須の補因子としてβ−Ｋｌｏｔｈｏに関連する膜を含む。ＦＧＦ２１受容体の活性化は、様々な代謝パラメータに対して複数の効果をもたらす。
【０００７】
哺乳動物では、ＦＧＦは、一連の４つのＦＧＦ受容体であるＦＧＦＲ１〜４を介してその作用を媒介し、今度はＦＧＦＲ１−４が、複数のスプライシング改変体、例えば、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ及びＦＧＦＲ４で発現される。各ＦＧＦ受容体は、ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）、ＲＡＦ１、ＡＫＴ１及びＳＴＡＴを含む下流のシグナル伝達経路につながる、リガンド結合の際に活性化される細胞内チロシンキナーゼドメインを含む。（Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２２：３７〜４４）。いくつかの報告では、ＦＧＦＲ１−３の「ｃ」レポータースプライス改変体は、β−Ｋｌｏｔｈｏに対する特異的親和性を示し、ＦＧＦ２１に対する内在性受容体として作用し得ることが示唆された（Ｋｕｒｏｓｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：２６６８７−２６６９５）；Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、（２００７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４：７４３２−７４３７）；Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２１５：１−７）。β−Ｋｌｏｔｈｏ及びＦＧＦＲ４の両方を豊富に発現する肝臓では、ＦＧＦ２１は、ＦＧＦ２１のβ−Ｋｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ４複合体への強力な結合にもかかわらず、ＭＡＰＫのリン酸化を誘導しない。３Ｔ３−Ｌ１細胞及び白色脂肪組織では、ＦＧＦＲ１ははるかに豊富な受容体であり、従って、この組織におけるＦＧＦ２１の主要な機能的受容体は、β−Ｋｌｏｔｈｏ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体である可能性が最も高い。
【０００８】
胆汁酸合成はまた、肝臓で起こり、食事後の脂肪酸吸収に必要であるが、肝臓で過剰に保持されると破壊的性質を有する可能性がある。成人慢性胆汁うっ滞の最も一般的な原因は、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）及び原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）である。ＰＢＣは、肝臓中の中小の大きさの胆管の慢性的な免疫媒介性破壊によって引き起こされる。ＰＳＣは、自己免疫傷害、有害な胆道損傷、感染性誘因及び血管傷害に起因する肝臓内または肝外の大胆管の破壊によって特徴付けられる。ＰＳＣ及びＰＢＣの罹患率は、それぞれ１０万人あたり約０．６〜４０人、１０万人あたり０．２〜１４人である。成人の慢性胆汁うっ滞性肝疾患の他の病因としては、薬物誘発性胆管炎及び胆汁うっ滞、避妊誘導性胆汁うっ滞、妊娠性肝内胆汁うっ滞、腸管障害関連肝臓病、免疫グロブリンＧ４関連胆管炎、サルコイドーシス、リンパ腫及び特発性成人期胆管消失（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ａｄｕｌｔｈｏｏｄ  ｄｕｃｔｏｐｅｎｉａ）、移植肝臓の拒絶による胆管損傷、移植片対宿主病、長期非経口栄養、原因不明胆道線維症／肝硬変、敗血症関連胆汁うっ滞が挙げられる。慢性胆汁うっ滞はまた、胆石、腫瘍または嚢胞からの胆管の機械的閉塞によって誘導され得る。このタイプの胆汁うっ滞は、閉塞性胆汁うっ滞として知られており、遺伝的代謝異常及び後天性の代謝異常によって引き起こされる代謝性胆汁うっ滞とは識別される。
【０００９】
胆汁うっ滞性肝疾患の管理のための選択肢は限られている。現在、ＰＳＣについてＦＤＡが承認した薬物は存在しない。ＰＢＣ及びその他の胆汁うっ滞性肝疾患の限られたグループに関しては、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）が唯一のＦＤＡ承認薬である。ＵＤＣＡは、クマの主要な胆汁酸及びヒトの副次的な二次胆汁酸として見出される親水性天然胆汁酸である。ＵＤＣＡの作用機序は、有毒な疎水性胆汁酸を置換し、胆汁酸プールをより親水性にすることである。したがって、ＵＤＣＡは置換療法であり治癒ではない。さらに、全ての患者がＵＤＣＡ治療に反応するわけではなく、肝臓移植は、これらの後期段階の患者の最終的な解決策である。かくして、必要とする患者において胆汁酸を減少させる効果的な処置の必要性が存在する。
【００１０】
本明細書には、胆汁酸の合成及び蓄積を減少させることが示されている、あるクラスのＦＧＦ２１経路刺激分子の最初の記述が示される。このクラスのＦＧＦ２１分子の代表的な例としては、半減期の延長のために操作されたＦＧＦ２１分子、及びβ−ＫｌｏｔｈｏによるＦＧＦ２１のシグナル伝達経路をアゴナイズする抗体が挙げられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｔｒｅｎｄ  Ｇｅｎｅｔ．２０：５６３−６９
【非特許文献２】Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２２：３７〜４４
【非特許文献３】Ｋｕｒｏｓｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：２６６８７−２６６９５）
【非特許文献４】Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、（２００７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４：７４３２−７４３７）
【非特許文献５】Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２１５：１−７
【発明の概要】
【００１２】
本開示は、胆汁酸生成に関連する障害または疾患を治療するための方法を提供する。より具体的には、胆汁酸レベルを低下させるためのＦＧＦ２１経路活性化分子の使用が、本明細書で開示される。さらにより具体的には、ＦＧＦ２１経路を通じてシグナル伝達し、それにより胆汁酸を減少させる、ＦＧＦ２１よりも長い半減期を有する分子が提供される。
【００１３】
ＦＧＦ２１シグナル伝達経路の活性化が、胆汁酸産生に関する両方のバイオマーカーを減少させ、様々な生物学的位置における胆汁酸の量を減少させたという驚くべき結果に加えて、本発明者らは、この効果が、主として、ＦＧＦ２１に対して半減期が延長された結合タンパク質で見られることを発見した。本発明の方法及び使用における実施のための半減期延長分子の特定の非限定的な例としては、抗体Ｆｃドメインに融合されたＦＧＦ２１、及び／またはタンパク質分解から防御するための点突然変異を有するＦＧＦ２１、及び／またはβ−Ｋｌｏｔｈｏを利用するＦＧＦ２１シグナル伝達経路を活性化もしくはアゴナイズする、血清半減期を延長するドメイン及び抗体に融合された凝集体が挙げられる。
【００１４】
したがって、特定の実施形態において、本発明は、胆汁酸レベルを低下させるための延長された半減期のＦＧＦ２１分子の使用に関する。他の実施形態において、本発明は、ＦＧＦ２１シグナル伝達経路を活性化して胆汁酸レベルを低下させる抗体の使用に関する。さらに他の実施形態では、本発明は、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ８Ｂ１、ＣＹＰ２７Ａ１、ＣＹＰ７Ｂ１及び７α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（Ｃ４）などの胆汁酸産生に関連するバイオマーカーの減少に関する。他の実施形態では、本発明は、過剰な胆汁酸蓄積によって引き起こされる肝臓への損傷を低減または修復するための延長された半減期のＦＧＦ２１分子の使用に関する。
【００１５】
胆汁酸レベルの低下が望まれる典型的な適応症としては、進行性の家族性肝内胆汁うっ滞タイプ２及び３（それぞれＢＳＥＰ及びＭＤＲ３突然変異；これらは肝臓から胆汁酸及びリン脂質を送出するポンプである）、妊娠性肝内胆汁うっ滞（ＩＣＰ）、薬物誘発胆汁うっ滞、避妊誘導胆汁うっ滞、原発性胆汁性肝硬変（自己免疫）、原発性硬化性胆管炎（自己免疫）、原因不明胆道線維症／肝硬変、全非経口栄養（ＴＰＮ）誘発胆汁うっ滞、肝移植後の胆管傷害、敗血症関連胆汁うっ滞、進行性硬化性胆管炎、特発性成人期胆管消失、東南アジア胆管炎（ｏｒｉｅｎｔａｌ  ｃｈｏｌａｎｇｉｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）及び原発性肝結石症に関連する胆管症が挙げられる。
【００１６】
ＦＧＦ２１シグナル伝達経路のアゴニストとしては、操作されたＦＧＦ２１及びアゴニスト抗体を含む様々な様式が挙げられる。当業者は、ＦＧＦ２１を超えて延長される半減期を有し、同じシグナル伝達経路を活性化することができる他の結合タンパク質も本発明の範囲内にあることを理解するであろう。
【００１７】
成熟した分泌されたヒトＦＧＦ２１配列の例は以下のとおりである：
ＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＬＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＬＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＰＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＳＭＶＧＰＳＱＧＲＳＰＳＹＡＳ（配列番号１）。したがって、本開示は、（ａ）少なくとも１つのアミノ酸置換であって、（ｉ）１９位でグルタミン、イソロイシンまたはリジン残基であるか；（ｉｉ）２０位置で、ヒスチジン、ロイシンまたはフェニルアラニン残基であるか；（ｉｉｉ）２１位でイソロイシン、フェニルアラニン、チロシンまたはバリン残基であるか；（ｉｖ）２２位でイソロイシン、フェニルアラニン、またはバリン残基であるか；（ｖ）１５０位でアラニンまたはアルギニン残基であるか；（ｖｉ）１５１位でアラニンまたはバリン残基であるか；（ｖｉｉ）１５２位でヒスチジン、ロイシン、フェニルアラニンまたはバリン残基であるか；（ｖｉｉｉ）１７０位でアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、プロリンまたはセリン残基であるか；（ｉｘ）１７１位でアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、セリン、トレオニン、トリプトファンまたはチロシン残基であるか；（ｘ）１７２位でロイシンまたはトレオニン残基であるか；あるいは（ｘｉ）１７３位でアルギニンまたはグルタミン酸残基である少なくとも１つのアミノ酸置換；ならびに（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸置換であって、（ｉ）２６位でアルギニン、グルタミン酸またはリシン残基であるか；（ｉｉ）４５位でアルギニン、グルタミン酸、グルタミン、リジンまたはトレオニン残基であるか；（ｉｉｉ）５２位でトレオニン残基であるか；（ｉｖ）５８位でシステイン、グルタミン酸、グリシン、またはセリン残基であるか；（ｖ）６０位でアラニン、アルギニン、グルタミン酸またはリシン残基であるか；（ｖｉ）７８位でアラニン、アルギニン、システインまたはヒスチジン残基であるか；（ｖｉｉ）８６位でシステインまたはトレオニン残基であるか；（ｖｉｉｉ）８８位でアラニン、アルギニン、グルタミン酸、リジンまたはセリン残基であるか；（ｉｘ）９８位でアルギニン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、リジンまたはトレオニン残基であるか；（ｘ）９９位でアルギニン、アスパラギン酸、システイン、またはグルタミン酸残基であるか；（ｘｉ）１１１位でリジンまたはトレオニン残基であるか；（ｘｉｉ）１２９位でアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンまたはリジン残基であるか；あるいは（ｘｉｉｉ）１３４位でアルギニン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジンまたはチロシン残基である少なくとも１つのアミノ酸置換；ならびにそれらの組み合わせ、を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む胆汁酸関連障害を処置するために適切な単離されたポリペプチドを提供する。一実施形態では、位置９８の残基はアルギニンであり、位置１７１の残基はプロリンであり、別の実施形態では、このポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでもよく、ただしここで（ａ）（ｉ）〜（ｘｉ）及び（ｂ）（ｉ）〜（ｘｉｉｉ）の少なくとも１つのアミノ酸置換はそれ以上改変されない。
【００１８】
本開示はさらに、少なくとも１つのアミノ酸置換であって：（ａ）１９位でグルタミン、リジンまたはイソロイシン残基であるか；（ｂ）２０位でヒスチジン、ロイシンまたはフェニルアラニン残基であるか；（ｃ）２１位でイソロイシン、フェニルアラニン、チロシンまたはバリン残基であるか；（ｄ）２２位でイソロイシン、フェニルアラニン、またはバリン残基であるか；（ｅ）１５０位でアラニンまたはアルギニン残基であるか；（ｆ）１５１位でアラニンまたはバリン残基であるか；（ｇ）１５２位でヒスチジン、ロイシン、フェニルアラニン、またはバリン残基であるか；（ｈ）１７０位でアラニン、アスパラギン酸、システイン、またはプロリン残基であるか；（ｉ）１７１位でアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、セリン、トレオニン、トリプトファンまたはチロシン残基であるか；（ｊ）１７２位でロイシン残基であるか；または（ｋ）１７３位でアルギニンまたはグルタミン酸残基である少なくとも１つのアミノ酸置換；及びそれらの組み合わせを有する配列番号１のアミノ酸配列を含む胆汁酸関連障害を処置するのに適した単離されたポリペプチドを提供する。一実施形態では、１７１位の残基はプロリンであり、別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列であって、（ａ）〜（ｋ）の少なくとも１つのアミノ酸置換はそれ以上改変されていないアミノ酸配列を含んでもよい。
【００１９】
本開示は、さらに、少なくとも１つのアミノ酸置換であって、（ａ）２６位でアルギニン、グルタミン酸、またはリシン残基であるか、（ｂ）４５位でアルギニン、グルタミン酸、グルタミン、リジンまたはトレオニン残基であるか；（ｃ）５２位でトレオニン残基であるか；（ｄ）５８位でグルタミン酸、グリシン、またはセリン残基であるか；（ｅ）６０位でアラニン、アルギニン、グルタミン酸またはリジン残基であるか；（ｆ）７８位でアラニン、アルギニンまたはヒスチジン残基であるか；（ｇ）８８位でアラニン残基であるか；（ｈ）９８位でアルギニン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、またはトレオニン残基であるか；（ｉ）９９位でアルギニン、アスパラギン酸、システインまたはグルタミン酸残基であるか；（ｊ）１１１位でリジンまたはトレオニン残基であるか；（ｋ）１２９位でアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンまたはリジン残基であるか；あるいは（ｌ）１３４位でアルギニン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、またはチロシン残基である少なくとも１つのアミノ酸置換；及びそれらの組み合わせを有する配列番号１のアミノ酸配列を含む胆汁酸関連障害を治療するのに適した単離されたポリペプチドを提供する。一実施形態では、９８位の残基はアルギニンであり、別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列であって、ただしここで（ａ）〜（ｌ）の少なくとも１つのアミノ酸置換はそれ以上改変されないアミノ酸配列を含んでもよい。
【００２０】
様々な実施形態において、胆汁酸関連障害を処置するのに適し、本明細書に開示されるポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸置換であって、（ａ）１７９位でフェニルアラニン、プロリン、アラニン、セリンまたはグリシンであるか；（ｂ）１８０位でグルタミン酸、グリシン、プロリンまたはセリンであるか；あるいは（ｃ）１８１位でリジン、グリシン、トレオニン、アラニン、ロイシンまたはプロリンである少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでもよく、かつさらにポリペプチドのＣ末端に融合された１〜１０個のアミノ酸残基を含んでもよく、任意のアミノ酸、例えば、グリシン、プロリン及びそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上の残基であってもよい。
【００２１】
種々の実施形態において、本明細書に開示される胆汁酸関連障害を治療するのに適したポリペプチドは、（ａ）哺乳動物において血糖値を低下し得る８個以下のアミノ酸残基のアミノ末端切断；（ｂ）ポリペプチドが哺乳動物の血糖値を低下し得る１２個以下のアミノ酸残基のカルボキシル末端切断；または（ｃ）哺乳動物の血糖値を低下し得る、８アミノ酸残基以下のアミノ末端切断及び１２アミノ酸残基以下のカルボキシル末端切断、を含んでもよい。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される胆汁酸関連障害を治療するのに適したポリペプチドは、ＰＥＧなどの１つ以上のポリマーに共有結合され得る。他の実施形態では、本発明のポリペプチドは、必要に応じてＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５）などのリンカーを介して、異種アミノ酸配列に融合されてもよい。本明細書中に開示される融合ポリペプチドはまた、多量体を形成し得る。
【００２３】
本開示はまた、本明細書中に開示されるポリペプチド及び薬学的に許容される製剤を含む、胆汁酸関連障害を処置するのに適した医薬組成物を提供する。そのような医薬組成物は、代謝障害を処置するための方法において使用されてもよく、この方法は、それを必要とするヒト患者に本発明の医薬組成物を投与することを包含する。治療できる代謝障害としては、糖尿病及び肥満が挙げられる。
【００２４】
本開示は、さらに、以下を含み得る胆汁酸関連障害の処置に適した単離された融合タンパク質を提供する：（ａ）ＩｇＧ定常ドメイン；（ｂ）ＩｇＧ定常ドメインに融合したリンカー配列；（ｃ）リンカー配列に融合され、配列番号１のアミノ酸配列を含むＦＧＦ２１変異体であって、ここで９８位でアルギニン残基がロイシン残基を置換し、１７１位でグリシン残基がプロリン残基を置換している、配列番号１のアミノ酸配列を含むＦＧＦ２１変異体。一実施形態では、リンカー配列は、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５）を含んでもよく、別の実施形態では、ＩｇＧ定常ドメインは、配列番号１１を含んでもよい。別の実施形態では、リンカー配列は、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５）を含み、ＩｇＧ定常ドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、リンカーのＮ末端は、ＩｇＧ定常ドメインのＣ末端に融合され、ＦＧＦ２１変異体のＮ末端が、リンカーのＣ末端に結合されている。開示された融合タンパク質は、多量体を形成し得る。
【００２５】
融合タンパク質の様々な実施形態において、ＦＧＦ２１の構成要素は、少なくとも１つのアミノ酸置換であって：（ａ）１７９位でフェニルアラニン、プロリン、アラニン、セリンまたはグリシンであるか；（ｂ）１８０位でグルタミン酸、グリシン、プロリンまたはセリンであるか；あるいは（ｃ）１８１位でリジン、グリシン、トレオニン、アラニン、ロイシンまたはプロリンであり、さらにＦＧＦ２１変異体のＣ末端に融合した１〜１０個のアミノ酸残基及び１〜１０個のアミノ酸残基を含んでもよく、かつ任意のアミノ酸、例えば、グリシン、プロリン及びそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上の残基であり得る、少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでもよい。
【００２６】
特定の非限定的な実施形態では、アミノ酸位置Ｌ９８のＲへ及びＰ１７１のＧへというＦＧＦ２１配列内の点突然変異が作製される。他の実施形態では、点突然変異は、アミノ酸位置Ｌ９８からＲ、Ｐ１７１からＧ、及びＡ１８０からＥというアミノ酸位置で、配列のＦＧＦ２１部分で作成される。したがって、これらの改変体は、タンパク質半減期延長技術の代表例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン、デキストラン、またはＦｃ領域のような半減期延長部分に融合されてもよい。
【００２７】
融合タンパク質のさらに他の実施形態では、ＦＧＦ２１構成要素は、以下を含んでもよい：（ａ）哺乳動物においてポリペプチドが血糖値を低下し得る、８個以下のアミノ酸残基のアミノ末端切断；（ｂ）ポリペプチドが哺乳動物の血糖値を低下し得る、１２個以下のアミノ酸残基のカルボキシル末端切断；または（ｃ）ポリペプチドが哺乳動物の血糖値を低下し得る、８アミノ酸残基以下のアミノ末端切断及び１２アミノ酸残基以下のカルボキシル末端切断。別の実施形態では、融合タンパク質のＦＧＦ２１構成要素は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるが、アルギニン及びグリシン残基はそれ以上改変されていないアミノ酸配列を含んでもよい。
【００２８】
ＦＧＦ２１シグナル伝達経路を活性化し、例えば抗体を含むさらなる結合部分が企図される。
【００２９】
本開示はまた、本明細書中に開示される融合タンパク質及び薬学的に許容される製剤を含む胆汁酸関連障害の処置に適した医薬組成物も提供する。そのような医薬組成物は、代謝障害を処置するための方法において使用することができ、その方法は、それを必要とするヒト患者に本発明の医薬組成物を投与することを包含する。処置され得る代謝障害としては、糖尿病及び肥満が挙げられる。
【００３０】
また、本明細書に開示されるポリペプチドをコードする単離された核酸分子、ならびにそのような核酸分子を含むベクター及びそのような核酸分子を含む宿主細胞も提供される。
【００３１】
本発明の特定の実施形態は、特定の実施形態及び特許請求の範囲の以下のさらに詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１Ａ〜図１Ｅ：ＣＹＰ７Ａ１発現に対するＦＧＦ２１の急性効果。マウスにＦＧＦ２１の単回用量を注射した。組織を採取し、全ＲＮＡについて抽出し、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて遺伝子発現を分析した。Ａ：注入３時間後に、自由に給餌するかまたは絶食（３時間または１２時間）したＤＩＯマウスから採取した組織。Ｂ：血漿ｒｈＦＧＦ２１濃度と比較した、ＣＹＰ７Ａ１発現に対するＦＧＦ２１効果の時間経過評価。Ｃ−Ｅ：雄性のＤＩＯ、Ｃ５７ＢＬ６Ｊ及びｏｂ／ｏｂマウスを、示された用量でＦＧＦ２１で処理して、ＣＹＰ７Ａ１発現に対する処置効果を決定した。全てのデータは平均±ＳＥＭに相当する。１群あたりＮ＝４〜５匹のマウス。
【図２】図２Ａ〜図２Ｃ：ＣＹＰ７Ａ１発現及び他の胆汁酸代謝遺伝子に対するＦＧＦ２１の急性効果。肝胆汁酸合成（Ａ）、胆汁酸及びステロール輸送（Ｂ）、ならびに回腸胆汁酸再吸収（Ｃ）に関与する遺伝子の発現解析。各バーは、ｎ＝５マウスからのプールされたサンプルの重複分析を表す。さらに、ＣＹＰ７Ａ１を個々のマウスから分析し、平均±ＳＥＭ（１群あたりｎ＝５）として表した。
【図３−１】図３Ａ−１−３Ａ−６：Ｃ５７ＢＬ６マウスの胆汁酸レベルに対する慢性ｒｈＦＧＦ２１及びアナログ投与の効果。組織を、胆汁酸分析のために３時間の絶食後及び注射後の終結時に採集した。３日の総糞便は、０−３日から及び６−９日からの処置期間中に収集した。Ａ：肝臓、小腸、胆嚢及び総胆汁プールサイズ及び胆汁の容積及び濃度における全胆汁酸レベル由来のデータ。Ｂ：第０−３日及び第６−９日の結腸及び糞便中の全胆汁酸レベル。さらに、糞便コレステロール及び遊離脂肪酸を、第６〜９日目の便サンプルから測定した。全てのデータは平均±ＳＥＭを表す。Ｎ＝１群あたり７〜８匹のマウス。
【図３−２】図３Ｂ−１−３Ｂ−４：Ｃ５７ＢＬ６マウスの胆汁酸レベルに対する慢性ｒｈＦＧＦ２１及びアナログ投与の効果。組織を、胆汁酸分析のために３時間の絶食後及び注射後の終結時に採集した。３日の総糞便は、０−３日から及び６−９日からの処置期間中に収集した。Ａ：肝臓、小腸、胆嚢及び総胆汁プールサイズ及び胆汁の容積及び濃度における全胆汁酸レベル由来のデータ。Ｂ：第０−３日及び第６−９日の結腸及び糞便中の全胆汁酸レベル。さらに、糞便コレステロール及び遊離脂肪酸を、第６〜９日目の便サンプルから測定した。全てのデータは平均±ＳＥＭを表す。Ｎ＝１群あたり７〜８匹のマウス。
【図４】図４Ａ〜図４Ｂ：肥満カニクイザルにおける血漿総胆汁酸及びＣ４レベルに対する慢性長時間作用性ＦＧＦ２１アナログ投薬の効果。用量漸増研究は、Ｖｅｈｉｃｌｅ、ＡＭＧ  ８７５（配列番号４）、またはＡＭＧ  ８７６（配列番号３）を毎週投与したサルで行った。サルを０．３ｍｇ／ｋｇで３週間処置し、続いて１ｍｇ／ｋｇの用量で３週間、３ｍｇ／ｋｇでさらに３週間処置した。一晩絶食させたサルからの血漿サンプルを、血漿総胆汁酸及びＣ４レベルについて分析した。全てのデータは平均±ＳＥＭを表す。１群あたりＮ＝１０〜１４匹のサル。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
ＦＧＦ２１シグナル伝達経路を活性化する胆汁酸関連障害を処置するのに適した結合剤は、本明細書に開示する方法を用いて調製してもよい。場合により、抗体またはその一部を野生型ＦＧＦ２１配列のＮ末端またはＣ末端に融合させることにより、半減期を延長してもよい。タンパク質にアミノ酸置換を導入することにより、野生型ＦＧＦ２１タンパク質の半減期をさらに延長するか、または凝集を減少させることも可能である。そのような改変タンパク質は、本明細書では変異体またはＦＧＦ２１変異体と呼ばれ、本発明の実施形態を形成する。さらなるＦＧＦ２１経路活性化ポリペプチドとしては、アゴニスト抗体が挙げられる。
【００３４】
（１．一般的な定義）
「単離された核酸分子」という用語は、本発明の核酸分子であって、（１）全核酸が原細胞から単離される時にそれが天然に一緒に見出される、タンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質のうち少なくとも約５０％から分離されているか、（２）「単離された核酸分子」が天然に連結されているポリヌクレオチドの全部にも一部にも連結されていないか、（３）天然には連結されていないポリヌクレオチドに作動可能に連結されているか、または（４）より大きなポリヌクレオチド配列の一部として天然には存在しない、核酸分子を指す。好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、ポリペプチドの産生またはその治療的、診断的、予防的もしくは研究的な用途におけるその使用を妨害する、その天然の環境において見出される、他の混入する核酸分子または他の汚染物質を実質的に含まない。
【００３５】
実施例を含む本明細書中で使用される組換え核酸法は、一般的にＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．及びＷｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９４）に示されるものである。
【００３６】
「ベクター」という用語は、コード情報を宿主細胞に移入するために使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミドまたはウイルス）を指すために使用される。
【００３７】
「発現ベクター」という用語は、宿主細胞の形質転換に適しており、挿入された異種核酸配列の発現を指示及び／または制御する核酸配列を含むベクターを指す。発現には、限定するものではないが、転写、翻訳、及びＲＮＡスプライシング（イントロンが存在する場合）などのプロセスが含まれる。
【００３８】
「作動可能に連結された」という用語は、本明細書では、そのように記載された隣接配列がそれらの通常の機能を果たすように構成または組み立てられた、隣接配列の配列を指すために使用される。したがって、コード配列に作動可能に連結された隣接配列は、コード配列の複製、転写及び／または翻訳を達成し得る場合がある。例えば、コード配列は、プロモーターがそのコード配列の転写を指示し得る場合、プロモーターに作動可能に連結される。隣接配列は、それが正しく機能する限り、コード配列と連続している必要はない。したがって、例えば、介在する未翻訳だが転写された配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、プロモーター配列は、コード配列に「作動可能に連結された」とみなされ得る。
【００３９】
「宿主細胞」という用語は、形質転換された細胞、または核酸配列で形質転換された後に目的の選択された遺伝子を発現することができる細胞を指して使用される。この用語は、選択された遺伝子が存在する限り、子孫が元の親と形態学的にまたは遺伝的構成が同一であるか否かにかかわらず、親細胞の子孫を包含する。
【００４０】
「単離されたポリペプチド」という用語は、本発明のポリペプチドであって、（１）原細胞から単離されたときに天然に一緒に見出されるポリヌクレオチド、脂質、炭水化物または他の物質の少なくとも約５０パーセントから分離されているか、（２）「単離されたポリペプチド」が天然に結合しているポリペプチドの全てまたは一部に（共有結合または非共有結合的に）結合していないか、（３）天然には連結されていないポリヌクレオチドに作動可能に連結されている（共有結合的相互作用または非共有結合的相互作用）か、または（４）天然には存在しない、本発明のポリペプチドを指す。好ましくは、単離されたポリペプチドは、その治療、診断、予防または研究の使用を妨害する、その自然環境において見出される他の混入ポリペプチドまたは他の汚染物質を実質的に含まない。
【００４１】
核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などのような生物学的物質に関連して使用される場合、「天然に存在する」という用語は、天然に見出され、ヒトによって操作されていない物質を指す。同様に、本明細書で使用される「天然に存在しない」とは、天然には見出されないか、またはヒトによって構造的に改変もしくは合成された物質を指す。ヌクレオチドに関連して用いる場合、「天然に存在する」という用語は、塩基アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）を指す。アミノ酸に関して用いる場合、「天然に存在する」という用語は、２０のアミノ酸、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、及びチロシン（Ｙ）を指す。
【００４２】
「ＦＧＦ２１ポリペプチド」という用語は、ヒトにおいて発現される天然に存在する野生型ポリペプチドを指す。本開示の目的に関して、「ＦＧＦ２１ポリペプチド」という用語は、任意の全長ＦＧＦ２１ポリペプチド、例えば、２０８アミノ酸残基からなり、かつ配列番号１３のヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号１２；任意の成熟型のポリペプチド、例えば、配列番号１であって、１８１個のアミノ酸残基からなり、配列番号２のヌクレオチド配列によってコードされ（ここで全長ＦＧＦ２１ポリペプチドのアミノ末端の２７個のアミノ酸残基（すなわち、シグナルペプチドを構成する）は除去されている）ポリペプチド、及びそれらの改変体を指して交換可能に用いられ得る。
【００４３】
「ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体」及び「ＦＧＦ２１変異体」という用語は、天然に存在するＦＧＦ２１アミノ酸配列が改変されたＦＧＦ２１ポリペプチド改変体を指す。このような改変としては、限定するものではないが、天然に存在しないアミノ酸アナログによる置換及び切断を含む１つ以上のアミノ酸置換が挙げられる。従って、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体としては、限定するものではないが、本明細書に記載のような、部位特異的ＦＧＦ２１変異体、切断型ＦＧＦ２１ポリペプチド、タンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体、凝集低減ＦＧＦ２１変異体、ＦＧＦ２１組合せ変異体、及びＦＧＦ２１融合タンパク質が挙げられる。本発明のＦＧＦ２１変異体の特定の切断及びアミノ酸置換を同定する目的で、切断または変異されたアミノ酸残基のナンバリングは、成熟１８１−残基ＦＧＦ２１ポリペプチドのナンバリングに対応する。
【００４４】
本発明の他の実施形態では、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるが、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体に望ましい特性を付与する特異的残基例えば、タンパク質分解耐性、延長した半減期または凝集減少特性、及びそれらの組み合わせが、それ以上改変されていない、アミノ酸配列を含む。言い換えれば、タンパク質分解耐性、凝集低減または他の特性を付与するために改変されたＦＧＦ２１変異体配列中の残基を除いて、ＦＧＦ２１変異体配列中の全ての他のアミノ酸残基の約１５％が改変されてもよい。例えば、ＦＧＦ２１変異体Ｑ１７３Ｅ中では、１７３位のグルタミンを置換した、グルタミン酸残基以外の全てのアミノ酸残基の最大１５％までを改変してもよかった。さらに他の実施形態では、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約９０パーセント、または約９５、９６、９７、９８、または９９パーセント同一であるが、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体のタンパク質分解耐性または凝集低減特性を付与する特異的残基は、それ以上改変されていない、アミノ酸配列を含む。そのようなＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの少なくとも１つの活性を保有する。
【００４５】
本発明はまた、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるが、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体に所望の特性、例えば、タンパク質分解耐性、半減期の延長または凝集低下特性、及びそれらの組み合わせを付与する特異的残基がさらに改変されていないアミノ酸配列を含むＦＧＦ２１ポリペプチド変異体をコードする核酸分子も包含する。言い換えれば、タンパク質分解耐性、凝集低減または他の特性を付与するために改変されているＦＧＦ２１変異体配列中の残基をコードするヌクレオチドを除いて、ＦＧＦ２１変異体配列中の全ての他のヌクレオチドのうち約１５％が、改変されてもよい。例えば、ＦＧＦ２１変異体Ｑ１７３Ｅでは、１７３位のグルタミンを置換したグルタミン酸残基をコードするヌクレオチド以外の全ヌクレオチドのうち最大１５％までを改変してもよかった。本発明はさらに、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％または約９５、９６、９７、９８もしくは９９％同一であるが、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体のタンパク質分解耐性または凝集低減特性を付与する特異的残基がそれ以上改変されていないアミノ酸配列を含むＦＧＦ２１ポリペプチド変異体をコードする核酸分子を包含する。そのようなＦＧＦ２１変異体は、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの少なくとも１つの活性を保有する。
【００４６】
本発明はまた、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも約８５％同一であるヌクレオチド配列であって、コードされたＦＧＦ２１ポリペプチド変異体のタンパク質分解耐性、凝集減少または他の特性を付与するアミノ酸配列をコードするヌクレオチドがそれ以上改変されていないヌクレオチド配列を含む核酸分子も包含する。言い換えれば、タンパク質分解耐性、凝集低減または他の特性を付与するために改変されているＦＧＦ２１変異体配列中の残基を除いて、ＦＧＦ２１変異体配列中の全ての他のアミノ酸残基のうち約１５％が、改変されてもよい。例えば、ＦＧＦ２１変異体Ｑ１７３Ｅでは、１７３位のグルタミンを置換したグルタミン酸残基以外の全アミノ酸残基のうち最大１５％までを改変してもよかった。本発明はさらに、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％または約９５、９６、９７、９８もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列であって、ただしコードされたＦＧＦ２１ポリペプチド変異体のタンパク質分解耐性または凝集低減特性を付与するアミノ酸残基をコードするヌクレオチドがそれ以上改変されていないヌクレオチドを含む核酸分子を包含する。そのような核酸分子は、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの少なくとも１つの活性を保有するＦＧＦ２１変異体ポリペプチドをコードする。
【００４７】
「生物学的に活性なＦＧＦ２１ポリペプチド変異体」という用語は、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体に導入された改変のタイプまたは数にかかわらず、血糖、インスリン、トリグリセリドまたはコレステロールを低下させ；体重を減らし；及び耐糖能、エネルギー消費またはインスリン感受性を改善する能力などの、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの活性を保有する本明細書に記載の任意のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体を指す。野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドと比較して幾分低下したレベルのＦＧＦ２１活性を保有するＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、それにもかかわらず、生物学的に活性なＦＧＦ２１ポリペプチド変異体であるとみなすことができる。
【００４８】
「有効量」及び「治療上有効な量」という用語はそれぞれ、血糖、インスリン、トリグリセリド、もしくはコレステロールレベルを低下するか；体重を減らすか；またはグルコース耐性、エネルギー消費、もしくはインスリン感受性を改善する能力のような、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの１つ以上の生物学的活性の観察可能なレベルを支持するために使用されるＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の量をいう。
【００４９】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という用語は、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の送達を達成または増強するのに適した１つ以上の製剤物質を指す。
【００５０】
「抗原」という用語は、抗体に結合することが可能で、さらにその抗原のエピトープに結合することができる抗体を産生するために動物で使用され得る、分子または分子の一部を指す。抗原は、１つ以上のエピトープを有してもよい。
【００５１】
「天然Ｆｃ」という用語は、抗体全体の消化から得られるか、または単量体型でももしくは、多量体型のいずれにもかかわらず、他の手段によって産生され、ヒンジ領域を含み得る、非抗原結合フラグメントの配列を含む分子または配列を指す。天然のＦｃの最初の免疫グロブリン源は、好ましくはヒト起源のものであり、いずれの免疫グロブリンであってもよいが、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が好ましい。天然Ｆｃ分子は、共有結合（すなわち、ジスルフィド結合）及び非共有結合によって、二量体型に連結されてもまたは多量体型に連結されてもよい単量体ポリペプチドから構成される。天然のＦｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１及びＩｇＧＡ２）に依存して１〜４の範囲である。天然Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化から生じるジスルフィド結合二量体である（Ｅｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：４０７１−９を参照のこと）。本明細書で使用される「天然Ｆｃ」という用語は、単量体、二量体、及び多量体型の総称である。Ｆｃポリペプチド配列の例は、配列番号１１に示されている。
【００５２】
「Ｆｃ改変体」という用語は、天然Ｆｃから改変されているが、依然としてサルベージ受容体ＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）の結合部位を含む、分子または配列を指す。国際公開番号ＷＯ９７／３４６３１号及びＷＯ９６／３２４７８号は、例示的なＦｃ改変体ならびにサルベージ受容体との相互作用を記載しており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。したがって、「Ｆｃ変異体」という用語は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化されている分子または配列を包含し得る。さらに、天然Ｆｃは、本発明のＦＧＦ２１変異体の融合分子に必要でない構造的特徴または生物学的活性を提供するので、除去することができる領域を含む。したがって、「Ｆｃ改変体」という用語は、１つ以上の天然のＦｃ部位もしくは残基を欠くか、または１つ以上のＦｃ部位もしくは残基が改変されており、（１）ジスルフィド結合形成（２）選択された宿主細胞との不適合性、（３）選択された宿主細胞における発現時のＮ末端異種性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、または（７）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響するか、またはそれに関与する分子または配列を包含する。
【００５３】
「Ｆｃドメイン」という用語は、上記で定義した天然のＦｃ及びＦｃの改変体及び配列を包含する。Ｆｃ改変体及び天然Ｆｃ分子と同様に、「Ｆｃドメイン」という用語は、抗体全体から消化されるか、または他の手段によって産生されるかに関わらず、単量体または多量体形態の分子を包含する。本発明のいくつかの実施形態において、Ｆｃドメインは、例えば、ＦｃドメインとＦＧＦ２１配列との間の共有結合を介して、ＦＧＦ２１またはＦＧＦ２１変異体（切断型のＦＧＦ２１またはＦＧＦ２１変異体を含む）に融合されてもよい。そのような融合タンパク質は、Ｆｃドメインの会合を介して多量体を形成し得、これらの融合タンパク質及びその多量体の両方とも本発明の一態様である。
【００５４】
（２．部位特異的ＦＧＦ２１変異体）
「部位特異的ＦＧＦ２１変異体」または「置換ＦＧＦ２１変異体」という用語は、天然に存在するＦＧＦ２１ポリペプチド配列のアミノ酸配列、例えば、配列番号１及び１４、ならびにそれらの改変体とは異なるアミノ酸配列を有するＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを指す。部位特異的ＦＧＦ２１変異体は、保存的または非保存的のいずれかのアミノ酸置換を導入し、天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸をＦＧＦ２１ポリペプチドの特定の位置に使用することによって生成してもよい。
【００５５】
「保存的アミノ酸置換」とは、天然のアミノ酸残基（すなわち、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列の所与の位置に見出される残基）の非天然残基（すなわち、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列の所与の位置に見いだされない残基）による置換であって、その位置のアミノ酸残基の極性または電荷にほとんどまたは全く影響がない置換である。保存的アミノ酸置換はまた、生物学的系における合成よりもむしろ化学的ペプチド合成によって典型的には組み込まれる非天然のアミノ酸残基を包含する。これらには、ペプチド模倣物、及び他の逆位または反転型のアミノ酸部分が挙げられる。
【００５６】
天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて以下のクラスに分類され得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００５７】
保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを同じクラスの別のメンバーと交換することを包含し得る。非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを包含し得る。
【００５８】
所望のアミノ酸置換（保存的であろうと非保存的であろうと）は、そのような置換が望まれる時点で当業者によって決定され得る。アミノ酸置換の例示的な（ただし限定はされない）列挙を表１に示す。
【表１】
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【００５９】
（３．切断型ＦＧＦ２１ポリペプチド）
本発明の１つの実施形態は、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドの切断形に関する。本発明のこの実施形態は、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドの非切断型に類似し、場合によってはそれより優れた活性を提供し得る切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドを同定する努力から生じた。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、「切断型ＦＧＦ２１ポリペプチド」という用語は、ＦＧＦ２１ポリペプチドであって、アミノ酸残基がＦＧＦ２１ポリペプチドのアミノ末端（またはＮ末端）末端から除去されているか、アミノ酸残基が、ＦＧＦ２１ポリペプチドのカルボキシル末端（またはＣ末端）から除去されているか、またはアミノ酸残基が、ＦＧＦ２１ポリペプチドのアミノ末端及びカルボキシル末端の両方から除去されているポリペプチドを指す。
【００６１】
Ｎ末端が切断されたＦＧＦ２１ポリペプチド及びＣ末端が切断されたＦＧＦ２１ポリペプチドの活性は、インビトロＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイを用いてアッセイすることができる。
【００６２】
本発明の切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドの活性は、ｏｂ／ｏｂマウスのようなインビボアッセイにおいて評価することもできる。一般に、切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドのインビボ活性を評価するために、切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドを試験動物に腹腔内投与してもよい。所望のインキュベーション期間（例えば、１時間以上）の後、血液サンプルを採取し、血糖値を測定してもよい。
【００６３】
（ａ．Ｎ末端切断）
本発明のいくつかの実施形態では、Ｎ末端切断は、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドのＮ末端から１、２、３、４、５、６、７または８アミノ酸残基を含む。９アミノ酸残基未満のＮ末端切断を有する切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドは、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドの個体における血糖値低下能を保持する。したがって、特定の実施形態では、本発明は、１、２、３、４、５、６、７または８アミノ酸残基のＮ末端切断を有する成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の切断型を包含する。
【００６４】
（ｂ．Ｃ末端切断）
本発明のいくつかの実施形態では、Ｃ末端切断は、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドのＣ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２アミノ酸残基を含む。１３アミノ酸残基未満のＣ末端切断を有する切断型ＦＧＦ２１ポリペプチドは、インビトロＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイにおいて野生型ＦＧＦ２１の効力の少なくとも５０％の効力を示し、これによって、これらのＦＧＦ２１変異体は、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドが個体の血糖値を低下させる能力を保持することが示される。したがって、特定の実施形態では、本発明は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のアミノ酸残基のＣ末端切断を有する成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の切断型を包含する。
【００６５】
（４．タンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体）
成熟ＦＧＦ２１は、インビボの分解を受けていることが判明し、これは最終的にタンパク質分解攻撃から生じると決定された。成熟ＦＧＦ２１のインビボでの分解は、有効な半減期をより短くし、分子の治療能力に有害な影響を及ぼし得ることが判明した。したがって、タンパク質分解に対して耐性を示すＦＧＦ２１変異体を同定するための指向性研究を行った。この検討の結果、特にタンパク質分解に感受性であると判定された成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドの部位には、４〜５、２０〜２１、１５１〜１５２及び１７１〜１７２位のアミノ酸残基の間のペプチド結合が含まれる。
【００６６】
タンパク質の活性に許容されない程度に影響を与えずに、観察されたタンパク質分解効果を排除する特定の置換を同定するために、広範であるが集中的かつ指向性の研究を行った。表８及び１１は、調製及び試験された変異体のいくつかを強調している。全てのＦＧＦ２１変異体が理想的なプロファイルを示したわけではない；一部の変異体はタンパク質分解耐性を付与したが、損なわれたＦＧＦ２１活性を犠牲にしていた。他の変異は、ＦＧＦ２１活性を保持したが、タンパク質分解耐性を付与しなかった。例えば、ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｇを含むいくつかの変異体は、野生型ＦＧＦ２１と同様のレベルの活性を保持すると同時に、またタンパク質分解に対する耐性も示した。
【００６７】
所望のタンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体を同定するための１つの選択基準は、ＦＧＦ２１変異体の活性が、野生型ＦＧＦ２１の活性と本質的に同じであるか、またはそれより大きいことであった。したがって、本発明の別の実施形態は、タンパク質分解に耐性であり、野生型ＦＧＦ２１と本質的に同じであるかまたはそれよりも大きい活性を依然として保持するＦＧＦ２１変異体に関する。場合によっては、あまり望ましくないが、タンパク質分解に対して耐性であるが幾分低下した活性を示すＦＧＦ２１変異体は、本発明の別の実施形態を形成する。場合によっては、ある程度のタンパク質分解を維持することが望ましい場合があり、その結果、ある程度のタンパク質分解が起こることを可能にするＦＧＦ２１変異体も、本発明の別の実施形態を構成する。
【００６８】
本発明の全てのＦＧＦ２１変異体と同様に、本発明のタンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体は、本明細書に記載のように調製してもよい。当業者であれば、例えば、標準的な分子生物学技術に精通している者は、本発明のタンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体を作製して使用するために、本開示と併せてその知識を用い得る。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために、標準的な技術を使用してもよい。例えば、任意の目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（上記）を参照のこと。酵素反応及び精製技術は、当該分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載されているように、製造者の仕様書に従って実施することができる。特定の定義が与えられていない限り、本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、ならびに医学的及び製薬化学と関連して利用される命名法ならびに実験手順及び技術は、当該技術分野において周知で一般的に使用されているものである。標準的な技術を、化学合成；化学分析；薬学的調製物、製剤及び送達；ならびに患者の処置に使用してもよい。
【００６９】
本発明のタンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体は、タンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体にさらなる特性を付与し得る、別の実体に融合してもよい。本発明の一実施形態では、タンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体を、ＩｇＧ  Ｆｃ配列、例えば配列番号１１に融合してもよい。このような融合は、公知の分子生物学的方法及び／または本明細書で提供される指針を用いて達成することができる。このような融合ポリペプチドの利点、ならびにこのような融合ポリペプチドを作製するための方法は公知であり、本明細書においてさらに詳細に考察される。
【００７０】
（５．凝集を減少させるＦＧＦ２１変異体）
野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの１つの特性は、その凝集傾向である。約５ｍｇ／ｍＬを超える濃度では、凝集速度は室温で高い。本明細書に示され、記載されるように、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの凝集速度は、濃度及び温度の両方に依存する。
【００７１】
凝集は、治療用製剤の場合など、これらの濃度で野生型ＦＧＦ２１を用いて作業する場合、課題であることが判明する可能性がある。従って、ＦＧＦ２１凝集の減少を示すＦＧＦ２１変異体を同定するために、指向性の研究を行った。次いで、得られたＦＧＦ２１変異体を、種々の濃度で凝集する傾向について試験した。
【００７２】
広範であるが集中的かつ指向性の研究を行って野生型ＦＧＦ２１の観察された凝集効果を排除または減少させ、タンパク質の活性に容認できない程度の影響を及ぼさない特定の置換を同定した。
【００７３】
所望の凝集減少ＦＧＦ２１変異体を同定するための１つの選択基準は、ＦＧＦ２１変異体の活性が野生型ＦＧＦ２１の活性と本質的に類似しているか、またはそれよりも大きいことであった。したがって、本発明の別の実施形態は、野生型ＦＧＦ２１と同様であるか、またはそれより大きいＦＧＦ２１活性を依然として保持しながら、減少した凝集特性を有するＦＧＦ２１変異体に関する。場合によっては、あまり望ましくないが、低下した凝集特性を有するが幾分低下したＦＧＦ２１活性を示すＦＧＦ２１変異体は、本発明の別の実施形態を形成する。場合によっては、ある程度の凝集を維持することが望ましい場合があり、その結果、ある程度の凝集を生じさせるＦＧＦ２１変異体も本発明の別の実施形態を形成する。
【００７４】
本発明の全てのＦＧＦ２１変異体と同様に、本発明の凝集低減ＦＧＦ２１変異体は、本明細書に記載されるように調製してもよい。標準的な分子生物学技術に精通している当業者は、本発明の凝集低減ＦＧＦ２１変異体を作製及び使用するために、本開示と併せてその知識を使用し得る。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために、標準的な技術を使用してもよい。例えば、任意の目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（上記）を参照のこと。酵素反応及び精製技術は、当業界で一般的に行われているように、または本明細書に記載されているように、製造者の仕様書に従って実施してもよい。特定の定義が与えられていない限り、本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、及び医学的及び製薬化学と関連して利用される命名法、ならびに実験手順及び技術は、当該技術分野において周知であり、かつ一般的に使用されている。標準的な技術を化学合成；化学分析；製薬学的調製物、処方物及び送達；ならびに患者の処置に使用してもよい。
【００７５】
本発明の凝集低減ＦＧＦ２１変異体は、凝集低減ＦＧＦ２１変異体にさらなる特性を付与し得る別の実体に融合してもよい。本発明の一実施形態では、凝集減少ＦＧＦ２１変異体をＩｇＧ  Ｆｃ配列、例えば配列番号１１に融合してもよい。このような融合は、公知の分子生物学的方法及び／または本明細書で提供される指針を用いて達成し得る。そのような融合ポリペプチドの利益、ならびにそのような融合ポリペプチドを作製するための方法は、本明細書においてより詳細に考察される。
【００７６】
（６．ＦＧＦ２１融合タンパク質）
本明細書で使用される場合、「ＦＧＦ２１融合ポリペプチド」または「ＦＧＦ２１融合タンパク質」という用語は、本明細書に記載される任意のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体のＮ末端またはＣ末端での１つ以上のアミノ酸残基（異種タンパク質またはペプチドなど）の融合を指す。
【００７７】
異種ペプチド及びポリペプチドとしては、限定するものではないが、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の検出及び／または単離を可能にするエピトープ；膜貫通受容体タンパク質またはその一部、例えば細胞外ドメインまたは膜貫通ドメイン及び細胞内ドメイン；膜貫通受容体タンパク質に結合するリガンドまたはその一部；触媒的に活性な酵素またはその一部；ロイシンジッパードメインのようなオリゴマー化を促進するポリペプチドまたはペプチド；免疫グロブリン定常領域のような安定性を増大させるポリペプチドまたはペプチド；機能的もしくは非機能的抗体、またはその重鎖もしくは軽鎖；及び本発明のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体とは異なる、治療活性などの活性を有するポリペプチドが挙げられる。また本発明には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に融合したＦＧＦ２１変異体も包含される。
【００７８】
胆汁酸関連障害の処置に適した長時間作用性ＦＧＦ２１融合タンパク質は、異種配列を、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合させることによって作製してもよい。本明細書に記載されるように、異種配列は、アミノ酸配列または非アミノ酸含有ポリマーであってもよい。異種配列は、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体に直接融合されてもよく、またはリンカーもしくはアダプター分子を介して融合されてもよい。リンカーまたはアダプター分子は、１つ以上のアミノ酸残基（または−マー）、例えば１、２、３、４、５、６、７、８または９残基（または−マー）、好ましくは１０〜５０アミノ酸残基（または−マー）、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０残基（または−マー）、より好ましくは１５〜３５アミノ酸残基（または−マー）であってもよい。リンカーまたはアダプター分子はまた、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼまたは融合部分の分離を可能にするプロテアーゼのための切断部位で設計され得る。
【００７９】
（ａ．Ｆｃ融合体）
本発明の一実施形態において、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の１つ以上のドメインに融合される。抗体は、機能的に独立した２つの部分、抗原に結合する「Ｆａｂ」として公知の可変ドメイン、ならびに補体活性化及び食細胞による攻撃のようなエフェクター機能に関与する「Ｆｃ」として公知の定常ドメインを含む。Ｆｃは、長い血清半減期を有するが、Ｆａｂは短命である（Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５〜３１）。治療用タンパク質と一緒に結合すると、Ｆｃドメインは、より長い半減期を提供し得るか、またはＦｃ受容体結合、プロテインＡ結合、補体固定、及びおそらくさらには胎盤伝達のような機能を組み込み得る（Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。
【００８０】
インビボでの薬物動態解析により、ヒトＦＧＦ２１は、迅速なクリアランス及びインビボでの分解に起因して、マウスにおいて約１時間という短い半減期を有することが示された。したがって、ＦＧＦ２１の半減期を延長するために、Ｆｃ配列をＦＧＦ２１ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合させた。野性型ＦＧＦ２１に対するＦｃ領域の融合、特に、野性型ＦＧＦ２１のＮ末端に融合されたＦｃは、予想どおり半減期を延長しなかったが、これは、インビボでのＦＧＦ２１のタンパク質分解の研究、及びこのような分解に耐性であったＦＧＦ２１変異体の同定につながった。このような変異体は、野生型ＦＧＦ２１よりも長い半減期を示す。これら及び他のＦＧＦ２１融合タンパク質は、本発明の実施形態を形成する。
【００８１】
本開示全体を通して、Ｆｃ−ＦＧＦ２１は、Ｆｃ配列がＦＧＦ２１のＮ末端に融合されている融合タンパク質を指す。同様に、本開示を通して、ＦＧＦ２１−Ｆｃは、Ｆｃ配列がＦＧＦ２１のＣ末端に融合されている融合タンパク質を指す。
【００８２】
得られたＦＧＦ２１融合タンパク質は、例えば、プロテインＡアフィニティーカラムの使用によって精製してもよい。Ｆｃ領域に融合されたペプチド及びタンパク質は、融合されていない対応物よりもインビボで実質的に大きな半減期を示すことが見出されている。また、Ｆｃ領域への融合によって、融合ポリペプチドの二量化／多量化が可能になる。Ｆｃ領域は、天然に存在するＦｃ領域であってもよいし、または治療の質、循環時間、または凝集の減少などの特定の質を改善するように改変されてもよい。
【００８３】
抗体の「Ｆｃ」ドメインとの融合によるタンパク質治療剤の有用な改変は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ００／０２４７８２号に詳細に考察されている。この文書は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン、デキストランまたはＦｃ領域のような「ビヒクル」への結合について考察している。
【００８４】
（ｂ．融合タンパク質リンカー）
本発明の融合タンパク質を形成する場合、リンカーを用いることができるが、その必要はない。存在する場合、リンカーの化学構造は、それが主にスペーサーとして働くので、重要ではない場合もある。リンカーは、ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸で構成されてもよい。本発明のいくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチド結合によって連結された１〜２０個のアミノ酸から構成され、このアミノ酸は２０個の天然に存在するアミノ酸から選択される。種々の実施形態において、１〜２０個のアミノ酸が、グリシン、セリン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及びリジンといったアミノ酸から選択される。いくつかの実施形態において、リンカーは、グリシン及びアラニンのような、立体的に妨げられていない大部分のアミノ酸から構成される。いくつかの実施形態において、リンカーは、ポリグリシン（例えば、（Ｇｌｙ）４及び（Ｇｌｙ）５）、ポリアラニン、グリシン及びアラニンの組み合わせ（例えば、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ））、またはグリシン及びセリン（例えば、ポリ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ））である。他の適当なリンカーとしては、（Ｇｌｙ）５−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ（配列番号５）、（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ（配列番号６）、（Ｇｌｙ）３−Ｌｙｓ−（Ｇｌｙ）４（配列番号７）、（Ｇｌｙ）３−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）２（配列番号８）、（Ｇｌｙ）３−Ｃｙｓ−（Ｇｌｙ）４（配列番号９）、及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１０）が挙げられる。１５アミノ酸残基のリンカーが特定のＦＧＦ２１融合タンパク質に対して特に良好に働くことが見出されているが、本発明は、当業者によって決定される適切な長さまたは組成のリンカーを企図する。
【００８５】
本明細書に記載のリンカーは例示的であり、はるかに長く、他の残基を含むリンカーも本発明によって企図される。非ペプチドリンカーもまた、本発明によって企図される。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ここで、ｓ＝２〜２０）のようなアルキルリンカーを使用してもよい。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６）、低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、またはフェニルを含むがこれらに限定されない任意の非立体障害基によってさらに置換され得る。例示的な非ペプチドリンカーは、ポリエチレングリコールリンカーであり、ここでリンカーは１００〜５０００ｋＤ、例えば１００〜５００ｋＤの分子量を有する。
【００８６】
（７．化学的に改変されたＦＧＦ２１変異体）
本明細書に記載のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の化学的に改変された形態（本明細書に記載のＦＧＦ２１の切断形を含む）は、本明細書に記載の開示があれば、当業者により調製され得る。そのような化学的に改変されたＦＧＦ２１変異体は、化学的に改変されたＦＧＦ２１変異体が、ＦＧＦ２１変異体に天然に結合した分子の型または位置のいずれかにおいて、未改変ＦＧＦ２１変異体と異なるように変更される。化学的に改変されたＦＧＦ２１変異体は、１つ以上の天然に結合した化学基の欠失によって形成された分子を含んでもよい。
【００８７】
一実施形態では、本発明のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、１つ以上のポリマーの共有結合によって改変されてもよい。例えば、選択されたポリマーは、生理学的環境などの水性環境において、それに結合するタンパク質が沈殿しないように、典型的には水溶性である。適切なポリマーの範囲には、ポリマーの混合物が含まれる。好ましくは、最終製品調製物の処置的使用のために、ポリマーは薬学的に許容されるであろう。本発明のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体にコンジュゲートした非水溶性ポリマーも、本発明の一態様を形成する。
【００８８】
例示的なポリマーはそれぞれ、任意の分子量であってもよく、分枝状であってもまたは非分枝状であってもよい。ポリマーはそれぞれ、典型的には、約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａの平均分子量を有する（「約」という用語は、水溶性ポリマーの調製において、いくつかの分子は、記載された分子量よりも多く、そしてある程度少ないことを示す）。各ポリマーの平均分子量は、好ましくは約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、より好ましくは約１２ｋＤａ〜約４０ｋＤａ、最も好ましくは約２０ｋＤａ〜約３５ｋＤａである。
【００８９】
適切な水溶性ポリマーまたはその混合物としては、限定するものではないが、Ｎ結合またはＯ結合の炭水化物、糖、リン酸塩、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（タンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態が含まれ、例としては、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）、アルコキシ−、またはアリールオキシ−ポリエチレングリコール）、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン（例えば、約６ｋＤの低分子量デキストランなど）、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、及びポリビニルアルコールが挙げられる。また、共有結合したＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異多量体を調製するために使用することができる二官能性架橋分子も、本発明に包含される。ポリシアル酸に共有結合したＦＧＦ２１変異体も本発明に包含される。
【００９０】
本発明のいくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１変異体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコールを含むが、これに限定されない１つ以上の水溶性ポリマーを含むように、共有結合的にまたは化学的に改変される。例えば、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号；及び同第４，１７９，３３７号を参照のこと。本発明のいくつかの実施形態において、ＦＧＦ２１変異体は、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、別の炭水化物系ポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、またはこのようなポリマーの混合物を含むが、これらに限定されない１つ以上のポリマーを含む。
【００９１】
本発明のいくつかの実施形態において、胆汁酸関連障害の処置に適したＦＧＦ２１変異体は、ＰＥＧサブユニットで共有結合的に改変される。いくつかの実施形態において、１つ以上の水溶性ポリマーは、ＦＧＦ２１変異体の１つ以上の特異的位置（例えば、Ｎ末端）に結合される。いくつかの実施形態において、１つ以上の水溶性ポリマーは、ＦＧＦ２１変異体の１つ以上の側鎖にランダムに結合される。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、ＦＧＦ２１変異体の治療能力を改善するために使用される。このような特定の方法は、例えば、任意の目的のため参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１３３，４２６号に考察される。
【００９２】
ポリマーがＰＥＧである本発明の実施形態では、ＰＥＧ基は任意の都合のよい分子量であってもよく、そして直鎖状であっても、または分枝状であってもよい。ＰＥＧ基の平均分子量は、好ましくは約２ｋＤ〜約１００ｋＤａ、より好ましくは約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、例えば１０、２０、３０、４０または５０ｋＤａの範囲である。ＰＥＧ基は一般には、ＦＧＦ２１変異体上の反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、またはエステル基）へのＰＥＧ部分上の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオールまたはエステル基）を通じた、アシル化または還元的アルキル化を介してＦＧＦ２１変異体に結合される。
【００９３】
本発明のＦＧＦ２１変異体を含むポリペプチドのＰＥＧ化は、当該分野で公知のＰＥＧ化反応のいずれかを用いて特異的に行うことができる。そのような反応は、例えば、以下の文献に記載されている：Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２、Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３：４−１０；欧州特許第０  １５４  ３１６号及び同第０  ４０１  ３８４号；及び米国特許第４，１７９，３３７号。例えば、ＰＥＧ化は、本明細書に記載の反応性ポリエチレングリコール分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して行ってもよい。アシル化反応のためには、選択されたポリマーは、単一の反応性エステル基を有すべきである。還元的アルキル化のために、選択されたポリマーは単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。反応性アルデヒドは、例えば、水安定性であるポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそのモノＣ１−Ｃ１０アルコキシもしくはアリールオキシ誘導体である（例えば、米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。
【００９４】
本発明のいくつかの実施形態では、ＰＥＧ基のポリペプチドへの結合のための有用なストラテジーは、それぞれが相互に反応性である特殊な機能性をお互いが保有するペプチド及びＰＥＧ部分を、溶液中でコンジュゲート連結の形成と通じて組み合わせることを包含する。ペプチドは、従来の固相合成により容易に調製することができる。ペプチドは、特定の部位に適切な官能基で「予備活性化」されている。前駆体を精製し、ＰＥＧ部分と反応する前に十分に特徴付ける。ＰＥＧとのペプチドのライゲーションは、通常、水相中で起こり、逆相分析ＨＰＬＣによって容易にモニターすることができる。ＰＥＧ化ペプチドは、分取ＨＰＬＣにより容易に精製し得、分析用ＨＰＬＣ、アミノ酸分析及びレーザー脱離質量分析によって特徴付けてもよい。
【００９５】
多糖ポリマーは、タンパク質改変のために使用することができる別のタイプの水溶性ポリマーである。したがって、多糖ポリマーに融合した本発明のＦＧＦ２１変異体は、本発明の実施形態を構成する。デキストランは、アルファ１−６結合によって主に連結されたグルコースの個々のサブユニットからなる多糖ポリマーである。デキストラン自体は、多くの分子量範囲で利用可能であり、約１ｋＤ〜約７０ｋＤの分子量で容易に利用可能である。デキストランは、ビヒクルとしてそれ自体で、または別のビヒクル（例えば、Ｆｃ）と組み合わせて使用するのに適した水溶性ポリマーである。例えば、国際公開ＷＯ９６／１１９５３を参照のこと。処置用または診断用の免疫グロブリンにコンジュゲートしたデキストランの使用が報告されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる欧州特許公開第０  ３１５  ４５６号を参照のこと。本発明はまた、約１ｋＤ〜約２０ｋＤのデキストランの使用も包含する。
【００９６】
一般に、タンパク質を活性化ポリマー分子と反応させるために使用される任意の適切な条件下で、化学修飾を実施してもよい。化学的に修飾されたポリペプチドを調製する方法は、一般に、以下のステップを包含する：（ａ）ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体が１つ以上のポリマー分子に結合される条件下で、ポリペプチドを、活性化されたポリマー分子（例えば、ポリマー分子の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と反応させるステップ、ならびに（ｂ）反応生成物を得るステップ。最適な反応条件は、公知のパラメータ及び所望の結果に基づいて決定される。例えば、タンパク質に対するポリマー分子の比が大きいほど、結合したポリマー分子のパーセンテージは大きくなる。本発明の一実施形態では、化学的に改変されたＦＧＦ２１変異体は、アミノ末端に単一のポリマー分子部分を有してもよい（例えば、米国特許第５，２３４，７８４号を参照のこと）。
【００９７】
本発明の別の実施形態において、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、ビオチンに化学的にカップリングされ得る。次いで、ビオチン／ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体をアビジンに結合させて、４価のアビジン／ビオチン／ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体を得る。ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体はまた、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）に共有結合させてもよく、得られたコンジュゲートを抗ＤＮＰまたは抗ＴＮＰ−ＩｇＭで沈殿させて１０価のデカマーコンジュゲートを形成してもよい。
【００９８】
一般に、本発明の化学的に改変されたＦＧＦ２１変異体の投与によって緩和または調節され得る状態としては、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体について本明細書に記載される状態が挙げられる。しかしながら、本明細書中に開示される化学的に改変されたＦＧＦ２１変異体は、未改変ＦＧＦ２１変異体と比較して、追加の活性、増強もしくは低下された生物学的活性または他の特性、例えば半減期の延長もしくは低下を有してもよい。
【００９９】
（８．処置用組成物及びその投与）
胆汁酸関連障害の処置に適したＦＧＦ２１経路活性化分子を含む治療用組成物は、本発明の範囲内であり、特に企図されている。そのような医薬組成物は、投与様式に適合するように選択された薬学的にまたは生理学的に許容される製剤との混合物として、処置有効量のポリペプチドを含んでもよい。
【０１００】
許容される製剤材料は、好ましくは、使用される投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性である。
【０１０１】
医薬組成物は、組成物の例えば、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解速度もしくは放出速度、吸着または浸透を改変、維持または保存するための製剤材料を含んでもよい。適切な製剤材料としては、限定するものではないが、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン）、抗菌剤、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）、緩衝液（例えば、ホウ酸塩、炭酸水素塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸）、増量剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）、キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、ベータ−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン）、充填剤、単糖類、二糖類及び他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）、着色剤、香料及び希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（ナトリウムなど）、防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、懸濁化剤、界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサポール）、安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）、張度増強剤（例えば、アルカリ金属ハロゲン化物−好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム−またはマンニトールソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤及び／または医薬アジュバントが挙げられる（例えば、任意の目的のために参照によって本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ  Ｅｄ．、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）及びその後の版を参照のこと）。
【０１０２】
最適な薬学的組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形態、及び所望の投薬量（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、（上記）を参照のこと）に応じて、当業者によって決定される。そのような組成物は、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の物理的状態、安定性、インビボ放出の速度、及びインビボのクリアランスの速度に影響し得る。
【０１０３】
医薬組成物中の第１のビヒクルまたは担体は、性質上、水性でも非水性でもよい。例えば、注射用の適切なビヒクルまたは担体は、水、生理食塩水、または人工脳脊髄液であってもよく、場合によっては非経口投与のための組成物中に共通な他の材料を補充してもよい。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合した生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。他の例示的な薬学的組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含み、ソルビトールまたは適切な代替物をさらに含んでもよい。本発明の１つの実施形態において、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態の任意の製剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記）と混合することによって、貯蔵のために調整してもよい。さらに、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体生成物は、スクロースなどの適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として処方してもよい。
【０１０４】
医薬組成物は、非経口送達のために選択され得る。そのような薬学的に許容される組成物の調製は、当技術分野の技術の範囲内である。
【０１０５】
製剤成分は、投与部位に許容される濃度で存在する。例えば、緩衝液を用いて、組成物を生理学的ｐＨまたはわずかに低いｐＨ、典型的には約５〜約８のｐＨ範囲に維持する。
【０１０６】
非経口投与が企図される場合、本発明で使用するための治療用組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に所望のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体を含む、発熱物質を含まない非経口的に許容される水溶液の形態であってもよい。非経口注射のための特に適切なビヒクルは、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体が適切に保存された滅菌等張液として製剤化される、滅菌蒸留水である。さらに別の調製物は、所望の分子と、その後に、デポ注射により送達され得る生成物の制御放出または徐放性をもたらす、注射可能なマイクロスフェア、生体腐食性粒子、高分子化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸など）、ビーズまたはリポソームのような薬剤との製剤を含んでもよい。またヒアルロン酸も使用してもよく、これは循環における持続期間を促進する効果を有し得る。所望の分子の導入のための他の適切な手段としては、移植可能な薬物送達デバイスが挙げられる。
【０１０７】
持続的送達製剤または制御送達製剤中のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体を含む製剤を含む、さらなる医薬組成物は、当業者に明らかであろう。リポソーム担体、生体侵食性微小粒子または多孔性ビーズ及びデポ注射などの様々な他の持続的または制御された送達手段を製剤化する技術もまた、当業者には公知である（例えば、国際公開番号ＷＯ９３／１５７２２（医薬組成物の送達のための多孔性ポリマーマイクロ粒子の徐放性を記載、ならびにＷｉｓｃｈｋｅ＆Ｓｃｈｗｅｎｄｅｍａｎ、２００８、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．３６４：２９８−３２７、及びＦｒｅｉｂｅｒｇ＆Ｚｈｕ、２００４、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２８２：１−１８（ミクロスフェア／微粒子の調製及び使用について論じている）を参照のこと）。
【０１０８】
徐放性調製物のさらなる例としては、成形品の形態の半透性ポリマーマトリックス、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルが挙げられる。持続放出マトリックスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号及び欧州特許第００５８４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７〜５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７及びＬａｎｇｅｒ，１９８２、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，前掲）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第０  １３３  ９８８号）が挙げられる。徐放性組成物はまた、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製することができるリポソームを含んでもよい。例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８−９２；及び欧州特許第００３６６７６号、同第００８８０４６号及び同０１４３９４９号を参照のこと。
【０１０９】
インビボ投与に使用される医薬組成物は、典型的には無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜による濾過によって達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前または後のいずれで行ってもよい。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥型で保存しても、または溶液中に保存してもよい。さらに、非経口組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針で穿孔可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルに入れられる。
【０１１０】
一旦、医薬組成物が処方されると、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体として、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアルに保存することができる。そのような製剤は、すぐ使用できる形態で、または投与前に再構成する必要がある形態（例えば、凍結乾燥）のいずれで保存されてもよい。
【０１１１】
特定の実施形態では、本発明は、単回用量投与単位を作製するためのキットに関する。キットはそれぞれ、乾燥タンパク質を有する第１の容器と水性製剤を有する第２の容器の両方を備え得る。また、本発明の範囲内には、単一及び複数のチャンバーを備えたプレフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジ及びリオシリンジ）を備えるキットが含まれる。
【０１１２】
治療上使用される医薬組成物の有効量は、例えば、処置の状況及び目的に依存する。したがって、当業者は、処置のための適切な投与量レベルが、部分的に、送達される分子、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体が使用される適応症、投与経路、ならびに患者の大きさ（体重、体表面、または臓器の大きさ）及び状態（年齢及び一般的な健康状態）に依存することを理解する。したがって、臨床医は、最適な治療効果を得るために用量を力価測定し、投与経路を変更してもよい。典型的な投薬量は、上述の因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上までの範囲であり得る。他の実施形態では、投与量は、０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ；または１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ；または５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、３５μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、４５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、５５μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、６５μｇ／ｋｇ、７０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、最大約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。さらに他の実施形態では、投与量は、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、５５０μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、６５０μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、８５０μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、９５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、１０００μｇ／ｋｇ、２０００μｇ／ｋｇ、３０００μｇ／ｋｇ、４０００μｇ／ｋｇ、５０００μｇ／ｋｇ、６０００μｇ／ｋｇ、７０００μｇ／ｋｇ、８０００μｇ／ｋｇ、９０００μｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇであってもよい。
【０１１３】
投薬の頻度は、胆汁酸関連の疾患または障害を処置するために使用される製剤中の治療剤の薬物動態パラメータに依存する。典型的には、臨床医は、所望の効果を達成する投与量に達するまで組成物を投与する。したがって、組成物は、単回用量として、２回以上の用量（同じ量の所望の分子を含んでもよいし、または含まなくてもよい）として経時的に、または移植デバイスもしくはカテーテルによる連続注入として投与されてもよい。適切な投薬量の更なる改良は、当業者によって日常的に行われ、彼らによって日常的に行われる課題の範囲内である。適切な投与量は、適切な投与量応答データの使用によって確認することができる。
【０１１４】
医薬組成物の投与経路は、例えば、静脈内、腹腔内、大脳内（脳実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内または病巣内経路による；持続放出系（注入されてもよい）による；または植え込みデバイスによる、注入によって、公知の方法に従う。必要に応じて、この組成物は、ボーラス注射によって、もしくは注入によって連続的に、または移植デバイスによって投与されてもよい。
【０１１５】
代替的または追加的に、組成物は、所望の分子が吸収またはカプセル化された膜、スポンジ、または他の適切な材料の移植を介して局所的に投与されてもよい。移植デバイスが使用される場合、デバイスは、任意の適切な組織または器官に移植されてもよく、所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラス、または連続投与を介して行われてもよい。
【０１１６】
（９．ＦＧＦ２１の処置的使用）
ＦＧＦ２１シグナル伝達タンパク質は、限定されるものではないが、胆汁酸レベルの低下が望まれる障害または状態を含む多くの疾患、障害または状態を処置、診断、改善または予防するために使用してもよく、これには、進行性家族性肝内胆汁うっ滞２型及び３型（それぞれＢＳＥＰ及びＭＤＲ３突然変異；これらは肝臓から胆汁酸及びリン脂質を送出するポンプである）、妊娠性肝内胆汁うっ滞（ＩＣＰ）、薬物誘発胆汁うっ滞、避妊誘導胆汁うっ滞、原発性胆汁性肝硬変（自己免疫）、原発性硬化性胆管炎（自己免疫）、原因不明胆道線維症／肝硬変、全非経口栄養（ＴＰＮ）誘発胆汁うっ滞、肝移植後の胆管傷害、敗血症関連胆汁うっ滞、進行性硬化性胆管炎、特発性成人期胆管消失、東南アジア胆管炎及び原発性肝結石症に関連する胆管症が挙げられる。
【０１１７】
これらの疾患または障害は、本明細書中に記載されるような長時間作用性ＦＧＦ２１アゴニストを、それを必要とする患者に治療有効量の量で投与することによって処置され得る。投与は、ＩＶ注射、腹腔内注射、液体剤形の筋肉内注射または凍結乾燥などの本明細書に記載のように行ってもよい。ほとんどの状況において、所望の投薬量は、本明細書に記載されているように臨床医によって決定され、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの治療上有効な用量を表し得る。ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの治療上有効な用量は、とりわけ、投与計画、投与される抗原の単位用量、核酸分子またはポリペプチドが他の治療剤と組み合わせて投与されるか否か、レシピエントの免疫状態及び健康状態に依存することは当業者には明らかであろう。
【０１１８】
本明細書で使用される「治療上有効な用量」という用語は、研究者、医師、または他の臨床家が求めている組織系、動物またはヒトにおける生物学的応答または医学的応答を誘発するＦＧＦ２１経路アクチベーターの量であって、処置されている疾患または障害の症状の緩和を包含する量を意味する。
【０１１９】
（１０．抗体）
ＦＧＦ２１シグナル伝達経路を活性化する抗体及び抗体フラグメントが企図され、本発明の範囲内である。この抗体は、ポリクローナル、例としては、単一特異的ポリクローナル；モノクローナル（ＭＡｂ）；組換え体；キメラ；ヒト化、例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）−グラフト化；ヒト；一本鎖；及び／または二重特異性；ならびにフラグメント；改変体；またはその化学的に改変された分子であってもよい。抗体フラグメントには、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド上のエピトープに特異的に結合する抗体の部分が含まれる。そのようなフラグメントの例としては、全長抗体の酵素的切断によって生成されるＦａｂ及びＦ（ａｂ’）フラグメントが挙げられる。他の結合フラグメントとしては、抗体可変領域をコードする核酸配列を含む組換えプラスミドの発現のような、組換えＤＮＡ技術によって生成されるフラグメントが挙げられる。
【０１２０】
ＦＧＦ２１シグナル伝達経路を模倣するか、アゴナイズするか、または活性化するモノクローナル抗体は、培養中の連続細胞系による抗体分子の産生を提供する任意の方法を用いて産生され得る。モノクローナル抗体を調製するための適切な方法の例としては、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−９７及びヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ、１９８４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８７）が挙げられる。ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドと反応性のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株も本発明により提供される。
【０１２１】
本発明のモノクローナル抗体は、治療剤としての使用のために改変されてもよい。一実施形態では、モノクローナル抗体は、重（Ｈ）及び／または軽（Ｌ）鎖の一部が、特定の種に由来する抗体における対応する配列と同一もしくは相同であるかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属するが、その鎖の残りが別の種に由来する抗体または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体である。所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体のフラグメントも含まれる。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１〜５５を参照のこと。
【０１２２】
別の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、米国特許第５，５８５，０８９号及び第５，６９３，７６２号を参照のこと。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、例えば、当該分野で記載の方法（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−３６を参照のこと）を用いて、ヒト抗体の対応する領域げっ歯類相補性決定領域の少なくとも一部を置換することによって行ってもよい。
【０１２３】
また、本発明には、本発明のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドに結合するヒト抗体も包含される。内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を使用して、そのような抗体は、必要に応じて担体とコンジュゲートされた、ＦＧＦ２１変異体抗原（すなわち、少なくとも６個の連続したアミノ酸を有する）による免疫で産生される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：２５５１〜５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−５８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３を参照のこと。１つの方法では、そのようなトランスジェニック動物は、その中の重及び軽免疫グロブリン鎖をコードする内在性遺伝子座を不能化し、ヒト重鎖及び軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座をそのゲノムに挿入することによって産生される。部分的に改変された動物、すなわち完全な補体よりも少ない改変体を交配させて、所望の免疫系の改変を全て有する動物を得る。免疫原を投与した場合、これらのトランスジェニック動物は、これらの抗原に対して免疫特異的である可変領域を含む、ヒト（例えば、ネズミではなく）のアミノ酸配列を有する抗体を産生する。例えば、国際公開番号ＷＯ９６／３３７３５号及び国際公開番号ＷＯ９４／０２６０２号を参照のこと。さらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、国際公開番号ＷＯ９１／１０７４１及びＷＯ９０／０４０３６に、ならびに欧州特許第０  ５４６  ０７３号に記載されている。ヒト抗体はまた、宿主細胞における組換えＤＮＡの発現によって産生されてもよく、または本明細書中に記載されるようなハイブリドーマ細胞における発現によって産生されてもよい。
【０１２４】
別の実施形態では、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーから産生され得る（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２２２：５８１を参照のこと）。これらのプロセスは、糸状バクテリオファージの表面上の抗体レパートリーのディスプレイによる免疫選択、及び選択された抗原へのそれらの結合によるファージの引き続く選択を模倣する。そのような技術の１つは、国際公開第ＷＯ  ９９／１０４９４号に記載されており、そのようなアプローチを用いる、ＭＰＬ及びｍｓｋ受容体に対する高親和性及び機能的アゴニスト抗体の単離が記載されている。
【０１２５】
キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、及びヒト化抗体は、典型的には、組換え方法によって産生される。抗体をコードする核酸を、宿主細胞に導入し、本明細書に記載の材料及び手順を用いて発現させる。一実施形態では、抗体は、哺乳動物宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞において産生される。モノクローナル（例えば、ヒト）抗体は、宿主細胞における組換えＤＮＡの発現によって産生されても、または本明細書に記載のハイブリドーマ細胞における発現によって産生されてもよい。
【０１２６】
本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイなどの任意の公知のアッセイ方法（例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ｓｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７）を参照のこと）において、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの検出及び定量のために用いてもよい。抗体は、使用されるアッセイ方法に適切な親和性でＦＧＦ２１変異体ポリペプチドに結合する。
【０１２７】
診断適用では、特定の実施形態において、抗体を検出可能な部分で標識してもよい。検出可能部分は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に産生することができる任意のものであってもよい。例えば、検出可能部分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、または６７Ｇａなどの放射性同位体；蛍光もしくは化学発光化合物、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリン；または酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｂａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１８４：１３８−６３）であってもよい。
【０１２８】
競合的結合アッセイは、限定された量の抗ＦＧＦ２１変異体抗体と結合するための試験サンプル分析物（例えば、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド）と競合する標識された標準（例えば、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、またはその免疫学的反応性部分）の能力に依拠する。試験サンプル中のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの量は、抗体に結合するようになる標準の量に反比例する。結合される標準の量の決定を容易にするために、抗体は、典型的には、競合の前または後に不溶化して、その結果、抗体に結合している標準及び分析物を、結合していない標準及び分析物から都合よく分離してもよい。
【０１２９】
サンドイッチアッセイは、典型的には、検出及び／または定量すべきタンパク質の異なる免疫原性部分またはエピトープにそれぞれ結合し得る２つの抗体の使用を包含する。サンドイッチアッセイにおいて、試験サンプル分析物は、典型的には、固体支持体上に固定された第１の抗体によって結合され、その後、第２の抗体が分析物に結合し、それによって、不溶性の３部分複合体が形成される。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照のこと。第二の抗体はそれ自体が、検出可能な部分で標識されてもよいし（直接サンドイッチアッセイ）、または検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定されてもよい（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、ある種類のサンドイッチアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）であり、この場合、検出可能な部分は酵素である。
【０１３０】
本発明の抗体は、インビボの画像化にも有用である。検出可能な部分で標識された抗体を動物に、好ましくはその血流に投与し、そして宿主中の標識された抗体の存在及び位置をアッセイしてもよい。抗体は、核磁気共鳴、放射線学、または当技術分野で公知の他の検出手段のいずれかによって、動物において検出可能である任意の部分で標識し得る。
【０１３１】
本発明のポリペプチドは、治療剤として使用してもよい。これらの治療剤は、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの生物学的活性の少なくとも１つをそれぞれ増強するかまたは低下させるという点で、一般にアゴニストまたはアンタゴニストである。一実施形態では、本発明のアンタゴニスト抗体は、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドに特異的に結合し得、インビボまたはインビトロでＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの機能的活性を阻害または排除し得る抗体またはその結合フラグメントである。
【実施例】
【０１３２】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態及びその様々な用途を例示するものである。これらは、説明の目的でのみ記載されており、決して本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１３３】
（ＧＦ２１発現構築物の調製）
成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドをコードする核酸配列は、成熟ＦＧＦ２１配列の５’末端及び３’末端に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって得られた。表２は、成熟ＦＧＦ２１配列を増幅するために使用されたプライマーを列挙する。
【表２】
2018529729.tif 000003
【０１３４】
ＦＧＦ２１発現構築物を調製するために使用されるプライマーは、適切な発現ベクター（例えば、ｐＥＴ３０（Ｎｏｖａｇｅｎ／ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）またはｐＡＭＧ３３（Ａｍｇｅｎ；Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ））への配列の指向性クローニングのための制限エンドヌクレアーゼ部位を組み込んだ。発現ベクターｐＡＭＧ３３は、低コピー数Ｒ−１００複製起点、改変ｌａｃプロモーター、及びカナマイシン耐性遺伝子を含む。発現ベクターｐＥＴ３０は、ｐＢＲ３２２由来の複製起点、誘導性Ｔ７プロモーター、及びカナマイシン耐性遺伝子を含む。ｐＡＭＧ３３からの発現がより高いことが見出されたが、ｐＥＴ３０はより信頼性の高いクローニングベクターであることが判明した。したがって、本出願に記載されている構築物の大部分は、最初にｐＥＴ３０中で生成され、次いで効力についてスクリーニングされた。次いで、選択された配列をさらに増幅するためにｐＡＭＧ３３に移した。
【０１３５】
ＦＧＦ２１配列を、４０．６５μＬのｄＨ２Ｏ、５μＬのＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ反応緩衝液（１０×）、１．２５μＬのｄＮＴＰ混合物（４０ｍＭ〜４×１０ｍＭ）、０．１μＬのテンプレート（１００ｎｇ／ｍＬ）、１μＬのプライマー１（１０μＭ）、１μＬのＰｒｉｍｅｒ２（１０μＭ）、及び１μＬのＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ融合ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を含む反応混合物中で増幅した。増幅反応は、９５℃で２分間加熱：続いて、９５℃で２０秒間、６０℃で２０秒間（サイクルあたり１℃を引いたもの）、及び７２℃で１５秒（所望の生成物１キロベースあたり）を１０サイクル；続いて９４℃で２０秒、５５℃で２０秒、及び７２℃で１５秒（所望の生成物の１キロベースあたり）を２０サイクル；続いて７２℃で３分間行った。増幅産物を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ、ＤｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、適切なベクターに連結し；次いでコンピテント細胞に形質転換した。
【０１３６】
（細菌からのＦＧＦ２１タンパク質の精製）
以下の実施例では、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド、切断型ＦＧＦ２１ポリペプチド、ＦＧＦ２１変異体、及びＦＧＦ２１融合タンパク質を含む様々なＦＧＦ２１タンパク質を細菌発現系で発現させた。以下に記載する発現後、ＦＧＦ２１タンパク質は、他に指示がない限り、本実施例に記載されるように精製した。
【０１３７】
細菌封入体由来の野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド、切断型ＦＧＦ２１ポリペプチド、及びＦＧＦ２１変異体を精製するために、二重洗浄封入体（ＤＷＩＢ）を、塩酸グアニジン及びＤＴＴをｐＨ８．５のトリス緩衝液中に含む可溶化緩衝液に可溶化し、次いで、室温で１時間混合し、可溶化混合物を、尿素、アルギニン、システイン、及び塩酸シスタミンを含むリフォールド緩衝液にｐＨ９．５で添加し、次いで２５℃で２４時間混合した（例えば、Ｃｌａｒｋｅ、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：１５７−６３；Ｍａｎｎａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９７：１５２３−３４；Ｒｕｄｏｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、「Ｆｏｌｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）５７−９９；及びＩｓｈｉｂａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．４２：１−６を参照のこと）。
【０１３８】
可溶化及びリフォールディング後、混合物を０．４５ミクロンのフィルターで濾過した。次いで、リフォールディングプールを、２０ｐｓｉの膜貫通圧力（ＴＭＰ）で１０ｋＤ分子量カットオフＰａｌｌ  Ｏｍｅｇａカセットで約１０倍に濃縮し、３カラム容積の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０を用いて、２０ｐｓｉのＴＭＰで透析濾過した。
【０１３９】
清澄化されたサンプルを、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ樹脂を用いた陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーに供した。２０ｍＭトリス中の０〜２５０ｍＭ  ＮａＣｌの直線塩勾配を、ｐＨ８．０で５℃で行った。ピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、プールした。
【０１４０】
次いで、ＡＥＸ溶出液プールを、フェニルセファロースＨＰ樹脂を用いて、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に供した。ｐＨ  ８．０かつ周囲温度で、０．７Ｍ〜０Ｍ硫酸アンモニウムの減少する直線勾配を用いて、タンパク質を溶出した。ピーク画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０、Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０−８５）、プールした。
【０１４１】
ＨＩＣプールを、１０ｋＤの分子量カットオフＰａｌｌ  Ｏｍｅｇａ  ０．２ｍ２カセットを用いて、２０ｐｓｉのＴＭＰで７ｍｇ／ｍＬに濃縮した。濃縮物を５カラム容積の１０ｍＭのＫＰＯ４、５％ソルビトール、ｐＨ  ８．０を用いて、２０ｐｓｉのＴＭＰで透析濾過し、回収した濃縮物を５ｍｇ／ｍＬに希釈した。最後に、その溶液を、Ｐａｌｌ  ｍｉｎｉ−Ｋｌｅｅｎｐａｃの０．２μＭのＰｏｓｉｄｙｎｅ膜を通して濾過した。
【０１４２】
細菌封入体由来のＦＧＦ２１融合タンパク質及びＦＧＦ２１融合変異体タンパク質を精製するために、塩酸グアニジン及びＤＴＴをｐＨ８．５のトリス緩衝液中に含む可溶化緩衝液に、二重洗浄封入体（ＤＷＩＢ）を可溶化し、次いで室温で１時間混合し、可溶化混合物を、尿素、アルギニン、システイン、及び塩酸シスタミンを含有するリフォールディング緩衝液にｐＨ９．５で添加し、次いで５℃で２４時間混合した（例えば、Ｃｌａｒｋｅ、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：１５７−６３；Ｍａｎｎａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９７：１５２３−３４；Ｒｕｄｏｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、「Ｆｏｌｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）５７−９９；及びＩｓｈｉｂａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．４２：１−６を参照のこと）。
【０１４３】
可溶化及びリフォールディング後、混合物を、１０ｋＤ透析チュービングを用いて、５倍容積の２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０に対して透析した。透析したリフォールディングのｐＨを５０％酢酸を用いて５．０に調整し、次いで４Ｋで３０分間遠心分離して清澄化した。
【０１４４】
次いで、清澄化されたサンプルを、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ樹脂を用いた陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーに供した。２０ｍＭトリス中の０〜２５０ｍＭのＮａＣｌの直線の塩勾配を、ｐＨ８．０で５℃で行った。ピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０、Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０−８５）により分析し、プールした。
【０１４５】
次いで、ＡＥＸ溶出液プールを、フェニルセファロースＨＰ樹脂を用いて疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に供した。周囲温度で、ｐＨ  ８．０の０．６Ｍ〜０Ｍの硫酸アンモニウムの減少する直線勾配を用いて、タンパク質を溶出した。ピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、プールした。
【０１４６】
ＨＩＣ工程の後、プールを次に６０容積の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２．２％スクロース、３．３％ソルビトール、ｐＨ  ８．５で透析した。透析したプールを、ジャンボセップ（ｊｕｍｂｏｓｅｐ）を用いて５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。最後に、溶液をＰａｌｌ  ｍｉｎｉ−Ｋｌｅｅｎｐａｃ  ０．２μＭ  Ｐｏｓｉｄｙｎｅ膜で濾過した。
【０１４７】
（ＦＧＦ２１タンパク質分解耐性変異体）
適切なＦＧＦ２１変異体を、主要なタンパク質分解活性の部位である野生型ＦＧＦ２１配列の位置を実験的に決定することによって同定し、特定のアミノ酸置換をこれらの部位に導入した。アミノ酸置換は、他の種とのＦＧＦ２１配列保存及び他のアミノ酸残基との生化学的保存に基づいていた。野生型ＦＧＦ２１タンパク質に導入されたか、または導入され得るアミノ酸置換の列挙を表３に示すが、表３は例示的なものに過ぎず、他の置換を行ってもよい。表３に示す位置の数は、１８１個のアミノ酸残基からなる成熟ＦＧＦ２１タンパク質の残基位置に対応する。
【表３】
2018529729.tif 000004
【０１４８】
（プロテアーゼ耐性ＦＧＦ２１変異体及び融合タンパク質の調製及び発現）
ＦＧＦ２１変異体をコードする構築物を、以下に記載の野生型ＦＧＦ２１発現ベクターのＰＣＲ増幅によって調製した。これらの実験の目的は、タンパク質分解に耐性であり、より長い半減期を示すＦＧＦ２１変異体を生成することであった。
【表４】
2018529729.tif 000005
2018529729.tif 000006
2018529729.tif 000007
【０１４９】
ＦＧＦ２１変異体構築物は、突然変異されるコドン（または複数のコドン）の上流及び下流領域に相同な配列を有するプライマーを用いて調製した。このような増幅反応で使用されるプライマーはまた、増幅された産物、すなわち所望の変異体を現在有する全ベクターの再環状化を可能にするために、約１５ヌクレオチドのオーバーラッピング配列を提供した。
【０１５０】
本質的にＰＣＲ条件を用いてＦＧＦ２１変異体構築物を調製した。増幅産物を制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩで消化し、次いで、コンピテント細胞に形質転換した。得られたクローンを配列決定して、ポリメラーゼ生成誤差の欠如を確認した。Ｆｃ−ＦＧＦ２１及びＦＧＦ２１−Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書に記載されるように生成した。
【０１５１】
ＦＧＦ２１変異体は、コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）またはＢＬ２１  Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）細胞を特定の変異体をコードする構築物で形質転換することによって発現させた。形質転換体を、４０μｇ／ｍＬのカナマイシンを補充したＴＢ培地中で限定された通気で一晩増殖させ、翌朝通気させ、短い回復期間の後に０．４ｍＭのＩＰＴＧ中で誘導した。誘導の１８〜２０時間後にＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを遠心分離により採取した。
【０１５２】
ＦＧＦ２１変異体も予測された免疫原性について分析した。タンパク質に対する免疫応答は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ結合部位における抗原プロセシング及び提示によって増強される。この相互作用は、タンパク質を認識する抗体の成熟におけるＴ細胞の助けに必要とされる。ＭＨＣクラスＩＩ分子の結合部位が特徴付けられているので、一連の共通のヒト対立遺伝子に結合することができる特異的配列をタンパク質が有するか否かを予測することが可能である。線形アミノ酸ペプチド配列が免疫寛容を破壊する可能性を有するか否かを決定するために、文献参照及びＭＨＣクラスＩＩ結晶構造に基づいてコンピューターアルゴリズムが作成されている。ＴＥＰＩＴＯＰＥコンピュータープログラムを用いて、特にＦＧＦ２１変異体の点突然変異が大多数のヒトにおいて抗原特異的Ｔ細胞を増大させるか否かを決定した。各ＦＧＦ２１変異体の線状タンパク質配列の分析に基づいて、いずれの変異体も免疫原性を増強するとは予測されなかった。
【０１５３】
（Ｆｃ−ＦＧＦ２１融合組換え変異体の調製及び発現）
上記のように、ＦＧＦ２１の安定性及び可溶性は、特定の切断及びアミノ酸置換の導入によって調整することができる。さらに、ＦＧＦ２１の安定性は、そのような改変ＦＧＦ２１タンパク質をヒト免疫グロブリンＩｇＧ１遺伝子のＦｃ部分と融合させることによってさらに増強することができる。さらに、上記改変の組み合わせを導入することにより、安定性と溶解性の両方が向上したＦＧＦ２１分子を作製し得る。表６に列挙したＦＧＦ２１組合せ変異体をコードする核酸配列を、上記の技術を用いて調製した。
【表５】
2018529729.tif 000008
【０１５４】
（マウスにおけるＣＹＰ７Ａ１発現に対する組換えＦＧＦ２１の急性効果）
コレステロール７α−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ７Ａ１）は、古典経路を介した胆汁酸合成に関与する律速酵素である。ＣＹＰ７Ａ１遺伝子発現の減少は、胆汁酸合成のダウンレギュレーションを示すであろう。単回投与後の異なるマウスモデルにおけるＣＹＰ７Ａ１発現に対する組換えＦＧＦ２１の効果を評価するために、５つの別個の研究を行った。全てのマウスを各試験の開始前に、１２：１２時間の明暗サイクル、ハウジングの湿度及び温度、並びに日常的な取り扱いに順応させた。痩せた雄性Ｃ５７ＢＬ６マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を標準的な齧歯類食餌（２０２０ｘ  Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ）で維持した。食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスに関する研究では、雄性Ｃ５７ＢＬ６マウスを、３週齢でＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）から入手した。肥満は、６０％ｋｃａｌの高脂肪食（Ｄ１２４９２、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ）給餌を開始し、試験開始前に少なくとも１２週間続けることにより、４週齢で誘発された。ＤＩＯマウスは、各研究期間中、高脂肪食で維持した。レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスを、８週齢でＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ストック＃０００６３２）から入手し、グループ飼育し、標準的な齧歯類飼料（８６４０  Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ）で維持した。全ての３つのマウスモデル由来のマウスを、体重に基づいて処置群に階層化した。組換えＦＧＦ２１の単回腹腔内注射（ＩＰ）を、指示された用量で投与した。薬物濃度の測定及び遺伝子発現分析を行うために、注射後の様々な時点で、末端血液及び肝臓サンプルを収集した。
【０１５５】
図１Ａにおいて、この研究は、自由に摂食させるか、または合計３時間または１２時間にわたって絶食させたＤＩＯマウスにおいて、異なる摂食条件下でのＣＹＰ７Ａ１発現に対するＦＧＦ２１の効果を試験した。マウスは、各条件について、終了の３時間前にＦＧＦ２１（３ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）の単回注射を施した。ビヒクル処置マウスにおけるＣＹＰ７Ａ１レベルと比較して、ＦＧＦ２１投与後の３つの全ての条件下でＣＹＰ７Ａ１レベルが低下した。ＣＹＰ７Ａ１レベルは、１２時間絶食マウスでは７２％、自由に摂食させたマウスでは６４％、及び絶食マウスでは３時間で５２％低下した。
【０１５６】
図１Ｂにおいて、ＦＧＦ２１（３ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）の単回注射後のＤＩＯマウスにおいて、ＣＹＰ７Ａ１発現を２４時間の経時変化にわたって測定した。血漿及び肝臓サンプルを、注射後１、３、６、及び２４時間で収集した。各時点について、平均のＣＹＰ７Ａ１発現レベルを、同じマウスからのそれぞれの平均ＦＧＦ２１血漿濃度に対してプロットする。ＦＧＦ２１投与後、ＣＹＰ７Ａ１レベルは、ピークＦＧＦ２１血清濃度と一致して、１時間及び３時間の時点で３４％及び６１％低下した。６時間及び２４時間の時点で、ＣＹＰ７Ａ１発現レベルは、ビヒクル処置群とＦＧＦ２１処置群の間で、血清由来のＦＧＦ２１のクリアランスと一致してほぼ同一であった。ＦＧＦ２１の血清濃度は、６時間の時点では１時間の時点よりも１０分の１であり、かつ２４時間の時点では定量可能なレベルよりも低かった。
ＣＹＰ７Ａ１発現に対するＦＧＦ２１の用量応答効果をＤＩＯマウス（図１Ｃ）、痩せたマウス（図１Ｄ）及びｏｂ／ｏｂマウス（図１Ｅ）で調べた。ＤＩＯマウス及び痩せたＣ５７ＢＬ６マウスは、（０、０．００１、０．０１、０．１、１．０、３．０及び１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）でＦＧＦ２１を投与された。３時間絶食させたマウスからの注射３時間後、終末肝臓サンプルを採取した。ＤＩＯマウスでは、ＦＧＦ２１を１．０ｍｇ／ｋｇで投与したマウスではＣＹＰ７Ａ１の発現が５４％低下し、１０ｍｇ／ｋｇでＦＧＦ２１を投与したマウスでは、６５％という最大ＣＹＰ７Ａ１の低下が達成された。痩せたＣ５７ＢＬ６マウスでは、ＦＧＦ２１（０．００１ｍｇ／ｋｇ）を投与したマウスではＣＹＰ７Ａ１の発現が３３％低下し、ＦＧＦ２１を（１０ｍｇ／ｋｇで）投与したマウスではＣＹＰ７Ａ１の最大４７％の低下が達成された。
【０１５７】
さらに、ＦＧＦ２１を（０、０．１，１及び１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰで）投与したｏｂ／ｏｂマウスにおいて、ＣＹＰ７Ａ１発現を測定した。終末肝臓サンプルは、自由給餌したマウスから注射後４時間で採取した。ＦＧＦ２１を投与したマウスでは、ＣＹＰ７Ａ１発現の減少は５３％〜７４％の範囲であった。
【０１５８】
（ＤＩＯマウスにおける胆汁酸合成、分泌及び再吸収に関与する複数の遺伝子に対する組換えＦＧＦ２１の急性効果）
ＤＩＯマウスにおける胆汁酸合成、排泄、及び腸吸収に関連する遺伝子に対する組換えＦＧＦ２１の効果を評価するための研究を行った。ＤＩＯマウスを、実施例１に記載のように順化させ、体重に基づいて処置群に層別化した。マウスに、０．３、３及び６ｍｇ／ｋｇの組換えＦＧＦ２１の単回注入（ＩＰ）または単回強制経口投与の肝臓Ｘ受容体アゴニスト（ＬＸＲ、Ｔ０９０１３１７、５０ｍｇ／ｋｇ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ＣＡＳ  ２９３７５４−５５−９）を投与した。食物を除去し、肝臓、胆嚢及び回腸サンプルを、遺伝子発現分析のために注射後３時間で収集した。回腸サンプルを、生理食塩水できれいに洗った。全ての組織サンプルを、液体窒素中で急速凍結した。
【０１５９】
図２Ａにおいて、遺伝子発現分析は、胆汁酸合成に関連する遺伝子の肝臓サンプルに対して行った。ＦＧＦ２１の急性投与は、古典的な胆汁酸合成経路の重要な遺伝子であるＣＹＰ７Ａ１及びＣＹＰ８ｂ１の両方の肝臓発現を用量依存的に阻害した。ＦＧＦ２１投与後、ＣＹＰ７Ａ１発現は、４２％（０．３ｍｇ／ｋｇ）、５７％（３ｍｇ／ｋｇ）、及び７５％（６ｍｇ／ｋｇ）低下された。ＣＹＰ８Ｂ１の発現は、７％（０．３ｍｇ／ｋｇ）、１６％（３ｍｇ／ｋｇ）、及び３９％（６ｍｇ／ｋｇ）低下された。代替の胆汁酸合成経路の重要な遺伝子であるＣＹＰ２７Ａ１もまた、最高用量のＦＧＦ２１（６ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスにおいて４５％抑制された。予想どおり、ＣＸＰ７Ａ１発現は、ビヒクルで処置したＤＩＯマウスと比較して、ＬＸＲアゴニスト（Ｔ０９０１３１７）で処置したＤＩＯマウスにおいて４倍増大した。
【０１６０】
図２Ｂにおいて、胆嚢サンプルにおける胆汁酸排泄に関連する遺伝子において遺伝子発現分析を行った。ＦＧＦ２１投与は、ＤＩＯマウスの胆嚢における胆汁酸、リン脂質及びステロール輸送に関与する遺伝子の発現を増大させた。高用量のＦＧＦ２１（３及び６ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）を投与したマウスは、胆汁酸トランスポーターＢＳＥＰの発現を、２００％まで、リン脂質トランスポーターＭＲＰ２の発現を１７７％まで、ならびにステロールトランスポーターＡＢＣＧ５及びＡＢＣＧ８の発現を、それぞれ１１２％及び７５％まで増大させた。これらの４つの遺伝子はまた、ビヒクルで処置したＤＩＯマウスと比較して、ＬＸＲアゴニスト（Ｔ０９０１３１７、ＰＯ）で処置したＤＩＯマウスにおいてもアップレギュレートされた。
【０１６１】
図２Ｃにおいて、遺伝子発現分析は、回腸胆汁酸再吸収に関連する遺伝子において行った。ビヒクルで処置したＤＩＯマウスと比較して、３用量のＦＧＦ２１（０．３、３及び６ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）またはＬＸＲアゴニスト（Ｔ０９０１３１７、ＰＯ）のいずれかを投与したＤＩＯマウスでは、ＯＳＴ□遺伝子発現が低下した。ＯＳＴ□遺伝子発現の最大低下は、ＦＧＦ２１処置マウスにおいて３３％であった。ＡＳＢＴ遺伝子発現は、ＦＧＦ２１処置マウスにおいて用量依存的に減少し、ＦＧＦ２１の６ｍｇ／ｋｇで処置したマウスでは３２％の最大低下が観察された。ＦＧＦ２１（３及び６ｍｇ／ｋｇ）で処置したＤＩＯマウスでは、ＯＳＴ□遺伝子発現の限定的な低下が観察され、最大低下は１６％であった。
【０１６２】
（痩せたＣ５７ＢＬ６マウスにおける胆汁酸レベルに対する組換えＦＧＦ２１及びＡＭＧ  ８７６サロゲートの効果）
１８週齢の痩せたＣ５７ＢＬ６マウスにおける胆汁酸レベルへの影響を評価するために、組換えＦＧＦ２１または組換えＡＭＧ  ８７６サロゲートを複数回注射して、９日間の研究を行った。ＦＧＦ１９もまた比較として含まれていた。痩せたマウスを、標準食餌で維持し、体重に基づいて処置群に階層化した。マウスには、ビヒクル、ｈｒＦＧＦ１９（０．３及び３ｍｇ／ｋｇ）またはｈｒＦＧＦ２１（０．３及び３ｍｇ／ｋｇ）を１日２回、ＩＰ注射によって投与した。長時間作用性ＦＧＦ２１アナログであるＡＭＧ  ８７６サロゲートを、３日ごとに１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇでＩＰ投与した。ＡＭＧ  ８７６サロゲートで処置したマウスには、試験物を投与しなかった場合に生理食塩水注射（ＩＰ）を与え、全ての研究マウスが同じ回数の注射を受けたことを確認した。３日目の総糞便は、０−３日及び６−９日の処置期間中に収集した。９日目の終了時に、マウスに最後の薬物用量を与え、食物なしで新しいケージに入れた。終末組織サンプルを、朝の試験品投与の３時間後に収集した。肝臓を液体窒素中で急速冷凍し、胆嚢を結紮して秤量した。胆嚢に切開を行い、遠心分離後に胆汁を採取した。空の胆嚢を再度秤量し、満杯の胆嚢と空の胆嚢との差を胆汁量として記録した。小腸及び結腸を、内容物をそのままで収集した。組織は、各組織の胆汁酸含量に応じて、組織重量の５〜８倍の体積の７５％エタノール中で個々に抽出した。胆汁酸測定は、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍマウス胆汁酸キット（Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ、カタログ番号８０３７０）を用いて行った。
【０１６３】
図３Ａでは、高用量のＦＧＦ１９及びＦＧＦ２１（３ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスならびに低用量及び高用量（１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）のＡＭＧ  ８７６サロゲートで処置したマウスの肝臓及び小腸において、総胆汁酸の減少が観察された。高用量のＦＧＦ１９（３ｍｇ／ｋｇ）ならびに低用量及び高用量のＡＭＧ  ８７６サロゲートで処置したマウスで、胆嚢中の胆汁酸濃度の減少及び総胆汁酸プールサイズを観察した。ＦＧＦ１９と比較して、天然のＦＧＦ２１は、同じ用量レベルで投与した場合ほど有効ではなかった。しかし、半減期の延長及び効力の改善により、長時間作用性ＦＧＦ２１アナログであるＡＭＧ  ８７６サロゲートは、ＦＧＦ１９と同等またはそれよりもわずかに優れた有効性を達成した。ＡＭＧ  ８７６サロゲートで処置したマウスにおいて、肝臓（６７％）、小腸（７７％）、胆汁（６４％）及び総胆汁酸プールサイズ（７６％）からの総胆汁酸の減少を観察した。空の胆嚢重量は、全ての処置群にわたってマウスにおいてほぼ同一であった。しかし、胆汁容積または胆汁分泌の増大指標である胆汁重量の増大は、ＦＧＦ２１の両方の用量で処置したマウスにおいて見られた。
【０１６４】
図３Ｂでは、結腸及び糞便の総胆汁酸濃度、ならびに糞便脂質を、終末大腸サンプルから、ならびに０−３及び６−９日目に収集した糞便サンプルから測定した。結腸及び糞便中の総胆汁酸濃度は、肝臓、小腸及び全体のプールサイズにおける総胆汁酸のプロファイルと類似していた（図３Ａ）。ＦＧＦ１９（３ｍｇ／ｋｇ）、ＦＧＦ２１（０．３及び３ｍｇ／ｋｇ）及びＡＭＧ  ８７６サロゲート（１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスでは結腸及び糞便中の総胆汁酸濃度の低下が観察された。ビヒクル処置マウスと比較した場合、ＡＭＧ  ８７６サロゲートで処置したマウスでは結腸内の総胆汁酸濃度の７８％の最大低下が観察された。処置開始の最初の３日以内に、糞便の総胆汁酸濃度は、全ての処置群由来のマウスで低下し、ＡＭＧ  ８７６サロゲートで処置したマウスでは、ビヒクルで処置したマウスのレベルと比較して３０％の最大低下が観察された。６−９日目までに、ＦＧＦ１９（０．３ｍｇ／ｋｇ）及びＦＧＦ２１（０．３及び３ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスの糞便の総胆汁酸濃度は、ビヒクル処置したレベルの近くに戻ったが、ＦＧＦ２１（３ｍｇ／ｋｇ）処置マウスは依然としてビヒクル群と比較して有意に低かった。ＦＧＦ１９（３ｍｇ／ｋｇ）及びＡＭＧ  ８７６サロゲート（１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスでは、便の総胆汁酸濃度における０−３日目から６−９日目までのさらなる低下が観察された。糞便の総胆汁酸濃度は、ビヒクルと比較してＡＭＧ  ８７６サロゲート処理マウスで最大５８％低下した。胆汁酸は、腸内腔における脂質の可溶化及び吸収に必要である。予想されるように、腸内腔の胆汁酸の低下は、コレステロール及び脂肪酸の吸収の低下及び糞便排泄の増加をもたらした。糞便のコレステロールレベルは、ＦＧＦ１９及びＦＧＦ２１、ならびにＡＭＧ  ８７６を含む全ての処置群由来のマウスで増大した。高用量ＦＧＦ１９（３ｍｇ／ｋ）ならびに低及び高用量の両方のＡＭＧ  ８７６サロゲート（１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスで、糞便の脂肪酸レベルは増大した。ビヒクル処置マウスと比較した場合、ＡＭＧ  ８７６サロゲートで処置したマウスにおいて、糞便コレステロール（５１％）及び糞便脂肪酸（１０７％）の最大の増大が観察された。
【０１６５】
（カニクイザルにおける血漿胆汁酸及びＣ４レベルに対する組換えＡＭＧ  ８７５及び組換えＡＭＧ  ８７６の効果）
長時間作用性ＦＧＦ２１アナログによる慢性用量漸増研究を、用量漸増プロトコルを用いて、耐糖能異常性カニクイザルにおいて実施した。要するに、１２：１２時間の明暗サイクル、６０％〜８０％の制御された湿度範囲という制御された環境で動物を個別に飼育し、温度を１８℃〜２６℃の範囲に維持した。動物は、食事の間に軽食を１日２回給餌し、飲料水には自由にアクセスできた。研究開始前に全ての実験手順に動物を順応させた。ビヒクル、ＡＭＧ８７５、またはＡＭＧ８７６を、９週連続して皮下注射により毎週投与した。３週間ごとに用量を増量した（最初の３週間は０．３ｍｇ／ｋｇ、続いて次の３週間は１ｍｇ／ｋｇ、及び最後の３週間は３ｍｇ／ｋｇ）。一晩絶食したカニクイザルからの血液サンプルを、投与１４日前、ならびに５、１２、１９、２６、３３、４０、４７、５４、及び６１日目（各週の投与の約１１７時間後）に採取した。研究の薬物−ウオッシュアウト期の間、７０、７７、８４、９１、９８、１０５及び１３３日目に血液サンプルを採取した。全ての絶食サンプルを続いて血漿総胆汁酸について分析した。さらに、投与前−１４日目、及び１９、４０及び６１日目の絶食サンプルを用いて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる胆汁酸合成のためのバイオマーカーである７α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（Ｃ４）レベルを測定した。
【０１６６】
図４では、血漿総胆汁酸レベルを、１０週間のウォッシュアウト期間を含む毎週の血漿収集から測定し、ベースライン値からのパーセント変化としてプロットした。ＡＭＧ  ８７６で処置したサルは、投与の９週間全体にわたって総胆汁酸レベルを低下させ、６９％の最大低下であったことが実証された。ＡＭＧ８７５で処置したサルは、ビヒクルで処置したサルより低い傾向があった。薬物ウォッシュアウトの１週間後、ＡＭＧ  ８７５で処置したサルの総胆汁酸レベルは、ベースラインレベルより５〜７倍近く急激に回復した。ＡＭＧ８７６は、ＡＭＧ８７５よりも優れた薬物動態プロファイルを有し、全胆汁酸レベルに対して３週間の薬剤ウォッシュアウトを行い、ビヒクル処置サルに見られるレベルに戻った。Ｃ４レベルはまた、投薬前（第−１４日）に採取された空腹時血漿サンプル及び試験日（１９、４０、６１及び１３３）における各用量レベルの３回目の注射後に測定された。ＡＭＧ  ８７５及びＡＭＧ  ８７６の両方で処置されたサルは、各用量レベルでＣ４の有意な阻害を示し、ビヒクルで処置したサルと比較して、ＡＭＧ８７５（５７％）及びＡＭＧ  ８７６（６５％）において、最大の低下が観察された。Ｃ４レベルは、１０週間の薬物のウォッシュアウトによりビヒクルで処置されたサルに見られるレベルに戻った。
【０１６７】
本発明を様々な実施形態に関して説明してきたが、当業者には、変形及び変更が思いつくことが理解される。したがって、添付の特許請求の範囲は、特許請求された本発明の範囲内に入るそのような等価な変形全てをカバーすることが意図されている。さらに、本明細書で使用されるセクション見出しは、編成目的のみのためのものであり、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１６８】
この出願に引用されている全ての参考文献は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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