(57)【要約】  本発明は、鏡像異性的に純粋なα−イオノンを製造する方法に関する。さらに、本発明は、リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）をコードする配列を含む核酸、リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）、α−イオノン生合成の構成要素をコードするプラスミド、ならびに酵素ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）、リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）、およびカロテノイド酸化開裂酵素（ＣＣＤ１）をコードする異種性ヌクレオチド配列を含有する微生物に関する。さらに、本発明は、高純度のε−カロテンを製造する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の酵素をコードする異種性ヌクレオチド配列を含む微生物を培養することを含む、鏡像異性的に純粋なα−イオノンを製造する方法：
ａ．ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、
ｂ．イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ｉｐｉ）、
ｃ．フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、
ｄ．フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）、
ｅ．リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）、および
ｆ．カロテノイド酸化開裂酵素（ＣＣＤ１）。
【請求項２】
前記ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼがゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼｃｒｔＥまたはゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼｉｄｓＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が、配列番号１９による配列と少なくとも８０％配列同一性を有し、かつ前記配列番号１９による配列から位置４０３、４０４、および４４５の少なくとも１つにおいて逸脱している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が、以下の変異または変異組合せ：ＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、ＥＣｍｕｔ３．３（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、およびＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）の１つを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記カロテノイド酸化開裂酵素（ＣＣＤ１）がシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）またはウスキモクセイ（Osmanthus fragrans）由来のカロテノイド酸化開裂酵素（ＣＣＤ１）である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素が１つまたは複数のプラスミド上にコードされている、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記１つまたは複数のプラスミドが前記微生物において個々の構造として存在し、または前記微生物のゲノムへ組み込まれている、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
コードされた酵素が共発現する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物が、配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミドを含有する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物が、配列番号２１、２４、３７、３８、３９、４０、４１、または４２による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミドを含有する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物が、配列番号４３または４４による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミドを含有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物が、配列番号４５、４６、または４７による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミドを含有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記微生物が、配列番号３３による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミド、および配列番号３７による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミドを含有し、あるいは
前記微生物が、配列番号３３による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミド、および配列番号４１による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミドを含有し、あるいは
前記微生物が、配列番号４４による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミド、および配列番号４５による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミドを含有する、
請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
リコペンからε−カロテンへの変換を触媒するリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）をコードする配列を含むことを特徴とする核酸であって、コードされたリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が、配列番号２６による配列を有する参照リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）より高いε−カロテン収量をもたらす、核酸。
【請求項１５】
前記コードされたリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が、配列番号１９による配列と少なくとも８０％配列同一性を有する配列を有する、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】
前記コードされたリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）の配列が、配列番号１９による配列から位置４０３、４０４、および４４５の少なくとも１つにおいて逸脱している、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
前記コードされたリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が、以下の変異または変異組合せ：ＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、ＥＣｍｕｔ３．３（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、およびＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）の１つを含む、請求項１５または１６に記載の核酸。
【請求項１８】
前記コードされたリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が、以下の変異または変異組合せ：ＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、ＥＣｍｕｔ３．３（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、およびＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）の１つを有する、配列番号１９による配列からなる、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１９】
請求項１４から１８のいずれか一項に記載の核酸によりコードされるリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）。
【請求項２０】
以下の酵素：
ａ．ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、
ｂ．イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、
ｃ．フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、および
ｄ．フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）
をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするプラスミドであって、前記プラスミドによりコードされるリコペン生合成経路の異種性発現が、ｐＡＣ−ＢＥＴＡｉｐｉ−ΔｃｒｔＹプラスミドによりコードされるリコペン生合成経路の異種性発現と比較してリコペン収量の増加をもたらす、プラスミド。
【請求項２１】
参照配列と少なくとも８０％配列同一性を有する配列を含み、前記参照配列が配列番号１１による配列である、請求項２０に記載のプラスミド。
【請求項２２】
請求項１４から１８のいずれか一項に記載の核酸配列をさらに含む、請求項２０または２１に記載のプラスミド。
【請求項２３】
参照配列と少なくとも８０％配列同一性を有する配列を含み、前記参照配列が配列番号１８による配列である、請求項２０から２２のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項２４】
参照配列と少なくとも８０％配列同一性を有する配列を含む、プラスミドであって、前記参照配列が配列番号２９による配列であり、前記プラスミドによりコードされるリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が、以下の変異または変異組合せ：ＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、ＥＣｍｕｔ３．３（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、およびＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）の１つを有する、請求項２０から２３のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項２５】
配列番号３１、３２、３３、３４、３５、または３６による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有する、請求項２０から２４のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項２６】
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）またはウスキモクセイ（Osmanthus fragrans）由来のカロテノイド酸化開裂酵素（ＣＣＤ１）をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２０から２５のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項２７】
配列番号４３または４４による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有する、請求項２０から２６のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項２８】
以下の酵素をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、プラスミド：
ａ．１−デスオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）、および
ｂ．イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ（ＣｗＩＰＩ）。
【請求項２９】
配列番号４５による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有する、請求項２８に記載のプラスミド。
【請求項３０】
以下の酵素をコードする異種性ヌクレオチド配列を含有する微生物を培養することを含む、リコペンから高純度のε−カロテンを製造する方法：
ａ．ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、
ｂ．イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ｉｐｉ）、
ｃ．フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、
ｄ．フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）、および
ｅ．リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）。
【請求項３１】
前記ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼがゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼｃｒｔＥまたはゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼｉｄｓＡである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が、配列番号１９による配列と少なくとも８０％配列同一性を有し、かつ前記配列番号１９による配列から位置４０３、４０４、および４４５の少なくとも１つにおいて逸脱している、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が、以下の変異または変異組合せ：ＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、ＥＣｍｕｔ３．３（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、およびＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）の１つを含む、請求項３０から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記酵素が１つまたは複数のプラスミド上にコードされている、請求項３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記１つまたは複数のプラスミドが前記微生物において個々の構造として存在し、または前記微生物のゲノムへ組み込まれている、請求項３０から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
コードされた酵素が共発現する、請求項３０から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記微生物が、配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミドを含有する、請求項３０から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記微生物が、配列番号４５、４６、または４７による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミドを含有する、請求項３０から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１から１３または３０から３８のいずれか一項に記載の方法において培養される前記微生物による微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鏡像異性的に純粋なα−イオノンを製造する方法に関する。さらに、本発明は、リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）をコードする配列を含む核酸、α−イオノン生合成の構成要素をコードするプラスミド、および酵素ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）、およびリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）、またはゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）、リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）、およびカロテノイド酸化開裂酵素（carotenoid-cleavage-dioxygenase）（ＣＣＤ１）をコードする異種性ヌクレオチド配列を含有する微生物に関する。追加として、本発明は、高純度のε−カロテンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現今、香料は、洗剤およびクリーニング剤などの多くの製品だけでなく、多数の美容皮膚身体ケア製品、脱臭剤、および香水にも用いられている。これらの香料は、十分な量で、かつ手頃な価格で製造されなければならないだけでなく、高純度の形で入手できなければならない。後者は、望ましくない副作用を防ぐためだけでなく、香料混合物の調合に関して最大限の自由を与えるためにも必要でもある。
【０００３】
イオノンは、カロテノイドの転換を通して多くの植物において産生される、テルペンに属する一群の遍在性天然産物である。イオノンは、香水産業において香料として大量に用いられている。その物質群は、イオノン環構造における二重結合の位置が異なる、個々の物質α−、β−、およびγ−イオノンを含む。α−イオノンとγ−イオノンの両方について、２つの鏡像異性体：（Ｒ）−α−イオノンおよび（Ｓ）−α−イオノン、または（Ｒ）−γ−イオノンおよび（Ｓ）−γ−イオノンが存在する（図１）。全ての個々の物質は、香りが異なる。特に、鏡像異性体についても同じことが言える。この点において、（Ｓ）−α−イオノンの香りは、シーダー様／ラズベリー様と記載されるが、対応する（Ｒ）−鏡像異性体は、フルーティな花咲くスミレの香りをもつ。これらの特徴により、（Ｒ）−α−イオノンは、香水産業にとって特に関心が高い。
【０００４】
天然源において、イオノンは常に、異なる組成の混合物として存在する。最も一般的な代表物は、α−イオノンおよびβ−イオノンであり、β−イオノンは主要な産物であり、α−イオノンは、追加の成分としてより少ない量で存在する。γ−イオノンは、少数の植物によってのみ産生される。したがって、個々の物質を天然から純粋な形で得るために、かつそれらを産業利用のために供給するために、骨が折れ、かつ費用のかかる濃縮および精製ステップが必要である。このことは、産業的に関連性が高いが、非常にまれな（Ｒ）−α−イオノンについて特に言える。
【０００５】
植物において、イオノンの形成は、以下の多段階の合成経路を通して生じる：最初、線状カロテノイドリコペンが産生され、続いて、それが、種々のリコペンシクラーゼの活性を通して、種々のさらなる単環式または二環式カロテノイドに変換される（図２Ａ）。主要な産物は、ほとんどの場合、β−カロテンである。その後、イオノン形成は、さらなる段階において、生成されたカロテノイドのカロテナーゼ酵素（それはまた、カロテノイド酸化開裂酵素（ＣＣＤ）とも呼ばれる）による酸化的開裂を通して生じる（図２Ａ）。
【０００６】
植物において、種々のカロテンのカロテナーゼ（ＣＣＤ）による変換は、α−イオノンの形成をもたらす（図２Ａ）。たいていの場合、α−カロテンが変換され、それが、α−イオノンとβ−イオノンの混合物をもたらす。対照的に、α−イオノンの排他的形成は、ε−カロテンまたはその前駆体δ−カロテンのＣＣＤ触媒性開裂により生じる。δ−カロテンおよびε−カロテンが、たいていの植物において産生されず、または微量でしか産生されないため、この経路は、α−イオノンの生じた総量にほとんど寄与しない。
【０００７】
α−イオノンはまた、化学合成することができる。α−イオノンおよびβ−イオノンをシトラールから合成する方法はすでに開発され、１８９３年に特許取得されている。この化学合成されたα−イオノンは、ラセミ混合物として存在し、それゆえに、異なる香りを有する鏡像異性体を含有する。したがって、香水産業にとっての有用性は制限される。最近になって、（Ｓ）−α−イオノン（Bovolenta et al., 2004）または（Ｒ）−α−イオノン（Soorukram und Knochel, 2004）についての鏡像異性選択的合成方法が記載されている。そのように生成された（Ｒ）−α−イオノンの鏡像異性的純度は９７％である。したがって、（Ｓ）−鏡像異性体のかなりの量がまだ含有されている。収率は６１％である。
【０００８】
持続可能かつ環境に優しいイオノン製造として、特に組換え微生物の使用を含む、発酵による製造システムが好ましい。
【０００９】
一般的に、組換えδ−カロテンおよびε−カロテン産生微生物は、α−イオノンの製造に適している。しかしながら、効率的α−イオノン製造のための出発材料としてのδ−カロテンの使用は、出発分子あたり１分子のみのイオノンがこの単環式基質から得ることができるだけであるため、賢明ではない。ε−カロテンを用いる生合成は、出発分子ε−カロテンあたりのα−イオノンの収量が倍増され得るため、好ましい。
【００１０】
実績のあるイオノン合成に関して今まで記載された組換え系は、ほとんど、種々のＣＣＤ１酵素の生化学的特徴付けから生じた。その自然過程は、組換え細菌株において試験されるべきＣＣＤ１酵素を追加として挿入することにより模倣され、その細菌株において、この挿入の前に、種々のカロテノイドについての合成遺伝子が実行されている（Misawa et al., 1990, Cunningham et al., 1996）。そうすることで、ＣＣＤ１酵素が基質の幅広いスペクトルを有すること、およびそれらが、基質を異なる優先度で変換することが示されている。好ましくは、ＣＣＤ１酵素は、リコペン、β−カロテン、またはゼアキサンチンを供給する株において試験された。
【００１１】
カロテノイドは、テトラテルペンのクラスに属する遍在性の親油性色素である。たいていのカロテノイドは、形式的には、非環式リコペンに由来し得、末端基の環化、水素付加、もしくは脱水素を通して、または酸素の導入を通して、形成される。
【００１２】
カロテノイド合成の出発材料は、イソプレン誘導体イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）および対応する異性体ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）であり、それらは、宿主生物体に依存して、いわゆる非メバロン酸経路（ＭＥＰ経路）および／またはいわゆるメバロン酸経路（ＭＶＡ経路）を介して産生される。植物において、両方の合成経路は活性である。複数のＩＰＰおよびＤＭＡＰＰ分子のカップリングを通して、最初、重要な中間体ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）が形成される。２個のＧＧＰＰユニットの縮合により、最初のテトラテルペン化合物、フィトエンが形成される。その後、その無色のフィトエンは、繰り返される不飽和化および異性化を通して、必須の中間体である赤色リコペンへ変換され、そのリコペンから、異なる環化反応を通して、カロテノイドα−カロテン、β−カロテン、δ−カロテン、およびε−カロテンが形成される。概略は、図２Ａに描かれている。
【００１３】
カロテノイド生合成経路は、植物についてだけでなく、種々の微生物（細菌および酵母）についても同定されており、対応する遺伝子または遺伝子クラスターが単離されている。早くも１９８６年には、対応する細菌遺伝子カスケードが、Ｐｅｒｒｙおよび共同研究者らにより、大腸菌（E. coli）における発現のために、エルウィニア・ヘルビコーラ（Erwinia herbicola）からクローニングされた（Perry et al, 1986）。エルウィニア・ウレドボーラ（Erwinia uredovora）由来の類似の発現カセットが、１９９０年に初めて記載された（Misawa et al., 1990）。その後、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍおよび共同研究者らが、大腸菌（E. coli）におけるカロテノイドの合成のための組換え微生物系を記載し、それは、上記で言及された既知のエルウィニア（Erwinia）種、Ｅ．ヘルビコーラ（E. herbicola）およびＥ．ウレドボーラ（E. uredovora）の生合成遺伝子を用いた（Cunningham et al., 1996）。
【００１４】
それ以来、多くの研究グループが、相補性実験を通してカロテノイド生合成の個々の細菌または植物酵素の機能を調べるための基盤としてＰｅｒｒｙら（１９８６）により記載されたプラスミドを用いている（Cunningham et al., 1994, 1996）。その際、常に、最初のプロモーター、ターミネーター、および最初のリボソーム結合部位（シャイン・ダルガノ配列；ＳＤ）を含む個々の遺伝子間の移行を有するＥ．ヘルビコーラ（E. herbicola）由来の最初のカセットが用いられた。
【００１５】
最近、大腸菌（E. coli）において発現するカロテノイド合成のための追加の遺伝子クラスターが報告された。クロノバクター・サカザキ（Cronobacter sakazakii）の遺伝子の異種性発現は、コロニーの黄色呈色をもたらす。個々の遺伝子は、ｉｄｉ、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、およびｃｒｔＺと同定されている（Zhang et al., 2014）。これらは、標的ベクターｐＷＳＫ２９において、最適化ＳＤ配列との異なる組合せでクローニングされている。
【００１６】
今まで、種々のクラスターが同定されて、異種性に発現している。しかしながら、刊行物は、カロテンの収量を最適化することを報告していない。
【００１７】
いくつかの必須の酵素が、リコペンからのε−カロテンの合成、およびカロテノイドからのイオノンの放出に関与し、それらは以下に記載されている。
【００１８】
リコペン−ε−シクラーゼは、リコペン分子の末端におけるα−イオノン環構造の形成を触媒し、その場合、最初、単環式δ−カロテンが中間体として生成され、それが、その後、いくつかのリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）を通して、第２のα−イオノン環の形成下でε−カロテンへ変換される。したがって、リコペン−ε−シクラーゼの以下の２つのクラスを区別することができる：その１つのクラスは、単環を生じさせることができるのみで、したがって、δ−カロテンを排他的に合成する。シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のε−シクラーゼ、および、今まで調査され、かつ記載されている植物ＥＣ酵素の絶対多数は、このクラスに属する。第２のＥＣクラスがまた、同じ分子（または単環式中間体）において第２の環を生じさせることができ、したがって、ε−カロテンを生成することができる。レタス（Lactuca sativa）（サラダ）のＥＣ酵素はこのクラスに属する。それは、主にε−カロテンを生成する。
【００１９】
トウモロコシ（Zea mays）（コーン）およびナツザキフクジュソウ（Adonis aestivalis）の記載されたＥＣ酵素は、等量のδ−カロテンとε−カロテンの混合物を合成する（Bai et al., 2009；Cunningham und Gantt, 2001）。
【００２０】
ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＧａｎｔｔ（２００１）は、単一アミノ酸の交換が酵素反応の生成物の変化をもたらすことを示すことができた。サラダ（レタス（Lactuca sativa））の酵素について、位置４５７におけるヒスチジンのロイシンとの交換が、単環式生成物の形成をもたらすが、シロイヌナズナ（A. thaliana）（Ｌ４４８Ｈ）のＥＣ酵素における対応する位置での相補的変異は、二環式生成物をもたらし、すなわち、ε−カロテンの形成が好まれる。この研究はまた、シロイヌナズナ（Arabidopsis）の酵素におけるサラダＥＣ由来のヘキサペプチド配列の導入を示し、その導入は、この酵素において４個のアミノ酸の交換（Ａ４４７Ｆ／Ｌ４４８Ｈ／Ｑ４５１Ｌ／Ｆ４５２Ｍ）をもたらす。この変異型酵素は、主要生成物として二環式ε−カロテンを合成した。
【００２１】
より最近の研究はまた、コーンのＥＣについて、１つの位置におけるアミノ酸配列の変化（Ｌ４６１Ｈ）が、二環式ε−カロテンの割合を８０％へ増加させることを示している。しかしながら、位置５０２におけるアラニンのセリンへの変異は、単環式δ−カロテンの割合の増加をもたらす（Bai et al., 2009）。
【００２２】
カロテナーゼは、線状中央分子構造の周辺における単環式および二環式カロテノイドを開裂することができる植物酵素である。その反応は、Ｏ２消費の下で起こる。その反応機構により、その酵素はまた、カロテノイド酸化開裂酵素、ＣＣＤとも呼ばれる。それぞれのＣＣＤ酵素は、基質分子がどの位置で開裂されるかを決定する  −  これは基本的な酵素特性である。カロテン基質を位置９，１０の間および９’，１０’の間で開裂することができるＣＣＤ酵素のみが、イオノンを放出することができる。
【００２３】
シロイヌナズナ（A. thaliana）のカロテノイド酸化開裂酵素１（ＡｔＣＣＤ１）は、広範囲の線状および環状カロテノイド基質を受け入れ、コーンおよびトマトのそれの相同体も同様であり、α−カロテンおよびβ−カロテンに加えてリコペンを開裂することができる（Vogel et al., 2008）。その著者らはまた、コーンＣＣＤ１についてζ−カロテンの開裂を示している。ウスキモクセイ（Osmanthus fragrans）のＣＣＤ１（ＯｆＣＣＤ１）について、それが、インビトロでα−カロテンおよびβ−カロテンを変換し、その際、β−イオノンおよびα−イオノンを生成することが示されている（Baldermann et al., 2010）。ニンジン（Daucus carota）のＣＣＤは、より高い基質特異性を有し、リコペンもフィトエンもＧＧＰＰも変換することができないが、ゼアキサンチン、β−カロテン、およびδ−カロテンを変換することができる（Yahyaa et al., 2013）。
【００２４】
上で記載されているように、α−イオノン、特に（Ｒ）−α−イオノンは、香水産業にとって重要な原材料である。天然源からの単離または化学合成を用いてα−イオノンを製造する現在利用可能な方法は、この重要な原材料の、不十分な量および純度での、不十分な入手のみを提供する。さらに、環境に優しく、かつ持続可能な製造を背景に、古典的化学合成の代替方法が望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
したがって、本発明の課題は、α−イオノン、特に（Ｒ）−α−イオノンを、環境に優しく、かつ持続可能な方法を用いて、十分な量および純度で製造することである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
上記で述べられた課題は、以下の酵素：ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）、リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）、およびカロテノイド酸化開裂酵素（ＣＣＤ１）をコードする異種性ヌクレオチド配列を含有する微生物を培養することを含む、鏡像異性的に純粋なα−イオノンを製造する方法の提供により解決される。
【００２７】
上記で述べられた課題はまた、リコペンからε−カロテンへの変換を触媒するリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）をコードする配列を含む核酸であって、前記リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が、配列番号２６による配列を有する参照リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）より高いε−カロテン収量をもたらす、核酸の提供によって解決される。さらに、その課題は、その核酸によってコードされるリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）自体の提供によって解決される。
【００２８】
さらに、提供されるプラスミドは、その課題の解決に寄与し、プラスミドは、酵素ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、およびフィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とし、プラスミドによりコードされるリコペン生合成経路の異種性発現が、プラスミドｐＡＣＢＥＴＡｉｐｉ−ΔｃｒｔＹ（配列番号２８）によりコードされるリコペン生合成経路の異種性発現と比較して、より高いリコペン収量をもたらす。
【００２９】
さらに、本発明により提供される微生物は、その課題の解決に寄与し、微生物は、以下の酵素：ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）、およびリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）、またはゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）、リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）、およびカロテノイド酸化開裂酵素（ＣＣＤ１）をコードする異種性ヌクレオチド配列を含む。
【００３０】
本発明により提供される高純度のε−カロテンを製造する方法はまた、その課題の解決に寄与し、方法は、以下の酵素：ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）、およびリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）をコードする異種性ヌクレオチド配列を含む微生物の培養を含む。
【００３１】
最後に、提供されるプラスミドもまた、その課題の解決に寄与し、プラスミドは、以下の酵素：１−デスオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）およびイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ（ＣｗＩＰＩ）をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする。
【００３２】
本発明による核酸、リコペン−ε−シクラーゼ、プラスミド、微生物、および方法は、最先端のものと比較して明らかに向上した収量でのリコペンの効率的な発酵による製造、加えて、最先端のものと比較してε−カロテンの明らかに向上した収量でのε−カロテンの効率的な発酵による製造を可能にする。リコペンおよびε−カロテンのどちらも、α−イオノンの産生における中間体である。
【００３３】
本発明は、とりわけ、α−イオノン生合成の２つの中間体、リコペンおよびε−カロテンの、最先端と比較して向上した製造により特徴付けられる（図２Ｂ）。本発明のこの態様は、α−イオノン、特に（Ｒ）−α−イオノンの、環境に優しく、かつ持続可能な方法を用いての十分な量および純度での製造にかなり寄与する。
【００３４】
最先端と比較しての本発明のさらなる利点は、（Ｒ）−α−イオノンの、鏡像異性的に純粋な形で、十分な量および純度での提供である。
【００３５】
さらに、本発明の発酵による方法は、最先端の伝統的な化学合成方法より環境に優しく、かつより持続可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１Ａはα−イオノンの（Ｒ）−および（Ｓ）−鏡像異性体の構造を含むイオノン構造を示す図である。図１Ｂは、カロテン開裂を通してのＣＣＤ触媒によるイオノン形成の反応スキームを示す図である。開裂される二重結合の位置が、番号付けされている。ＣＣＤ＝カロテノイド酸化開裂酵素。
【図２】図２Ａは、植物におけるイオノン合成経路を示す図である。カロテノイド合成の出発材料は、イソプレン誘導体イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）およびそれの異性体ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）であり、それらは、植物において、いわゆる非メバロン酸経路（ＭＥＰ経路）および／またはいわゆるメバロン酸経路（ＭＶＡ経路）を介して産生される。最初、複数のＩＰＰおよびＤＭＡＰＰ分子のカップリングを通して、重要な中間体ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）が形成される。その後、２個のＧＧＰＰユニットの縮合を通して、最初のテトラテルペン化合物、フィトエンが生成される。植物は、フィトエンをリコペンへ変換するために４つの異なる酵素を必要とするが、本発明の合成経路によれば、細菌酵素ｃｒｔＩのみが必要とされる（図２Ｂ）。天然の植物系において、リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）とリコペン−β−シクラーゼ（ＢＣ）の両方が包含される。したがって、α−、β−、およびε−カロテンの混合物が生じ、ε−カロテンは、少数の植物において、非常に少量でのみ、検出されている。β−カロテンは、主要な産物である。α−カロテンはほとんど少量で産生される。カロテノイドのイオノンへの開裂は、酵素ＣＣＤ１とＣＣＤ４、またはＣＣＤ１とＣＣＤ７の組合せにより２段階で起こる。本基質分布により、主にβ−イオノンが生成される。追加としての少量での本α−カロテンは、等量でα−イオノンおよびβ−イオノンに開裂される。したがって、α−イオノンは常に、主に産生されるβ−イオノンと比較して、追加物として少量で存在する。必要とされる酵素の名前はイタリック体で表され、対応する反応矢印に割り当てられている。ＩＰＩ：イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ；ＧＧＰＰＳ：ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ；ＰＳＹ：フィトエンシンターゼ；ＰＤＳ：フィトエンデサチュラーゼ；Ｚ−ＩＳＯ：ζ−カロテンイソメラーゼ；ＺＤＳ：ζ−カロテンデサチュラーゼ；ｃｒｔＩＳＯ：シス−リコペンイソメラーゼ；ＥＣ：リコペン−ε−シクラーゼ；ＢＣ：リコペン−β−シクラーゼ；ＣＣＤ１：カロテノイド酸化開裂酵素１（細胞質型）；ＣＣＤ４：カロテノイド酸化開裂酵素４（色素体型）；ＣＣＤ７：カロテノイド酸化開裂酵素７（色素体型）。  図２Ｂは、本発明によるイオノン合成経路の例を示す図である。β−シクラーゼ活性を阻止し、かつ変異型リコペン−ε−シクラーゼを用いることにより、排他的に、ε−カロテンが生成される（σ−カロテン中間体は、たとえあったとしても、微量のみ検出することができる）。１つの酵素だけが開裂に必要とされ、純粋なα−イオノンが生成される。用いられる酵素の名前はイタリック体で表され、対応する反応矢印に割り当てられている。ｄｘｓ：デスオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ；ＩＰＩ：イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ；ＣｗＩＰＩ：オンウコン（温鬱金）（Curcuma wenyujin）由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ；ｉｄｓＡ：ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ；ｃｒｔＩ：フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ；ｃｒｔＢ：フィトエンシンターゼ；ＥＣｍｕｔ：本発明による変異型リコペン−ε−シクラーゼ；ＣＣＤ１：カロテノイド酸化開裂酵素（ＡｔＣＣＤ１またはＯｆＣＣＤ１）。微生物宿主において実行される合成経路の宿主の基礎代謝との接続が示されている。
【図３】プラスミドマップｐＧＴ１０３６（「Ｌｙｃ合成」プラスミド、発現プラスミド）を示す図である。示されたタンパク質のコード配列は、矢印として描かれている。制御ＤＮＡ配列はボックスとして描かれている。固有の制限酵素部位の位置が示されている。標示された遺伝子エレメントの正確な位置およびそれらの機能は表に列挙されている。
【図４】プラスミドマップｐＧＴ１０６６（「ｅＣａｒｏ合成」プラスミド、発現プラスミド）を示す図である。示されたタンパク質のコード配列は、矢印として描かれている。制御ＤＮＡ配列はボックスとして描かれている。固有の制限酵素部位の位置が示されている。標示された遺伝子エレメントの正確な位置およびそれらの機能は表に列挙されている。
【図５】ＡｔＥＣｍｕｔ３の相同性比較および点変異の位置を示す図である。シロイヌナズナ（A. thaliana）のリコペン−ε−シクラーゼについてのデータベースタンパク質配列の、本発明による配列ＡｔＥＣ−ｄｅｌおよびＡｔＥＣｍｕｔ３、ならびにサラダ（ＬｓＥＣ）およびコーン（ＺｍＥＣ）の相同性酵素との比較。野生型酵素ＡｔＥＣにおいて検出された葉緑体ターゲティングシグナル（Ｎ末端４４個のアミノ酸）は下線が引かれている。ＡｔＥＣ−ｄｅｌは、シロイヌナズナ（A. thaliana）からクローニングされ、かつＮ末端において４４個のアミノ酸分、短縮されているタンパク質バリアントであり、本発明の作製された変異体（ＡｔＥＣｍｕｔ）についての共通の基盤である。変異した位置４０３、４０４、および４４５が示されている（ボックス）。完全長野生型ＡｔＥＣ−タンパク質についての対応する位置は丸括弧に入れて加えられている。サラダまたはコーンの酵素について記載されている変異の位置が示されている。
【図６−１】ＡｔＥＣｍｕｔ産物プロファイルの定量的ＨＰＬＣ分析を示す図である。リコペン−ε−シクラーゼの異なって得られた変異体（ＥＣｍｕｔ）についてのリコペン、δ−カロテン、およびε−カロテンの収量の測定。対応する発現ベクターを、大腸菌（E. coli）ＴＯＰ１０細胞に導入し、生じた株を、ＨＰＬＣによる合成されたカロテノイドに関して分析した。細胞を、ｄＹＴ培地（＋クロラムフェニコールおよびアンピシリン）中、２８℃で２４時間、培養した。生成されたカロテノイドをアセトンで定量的に抽出し、ＨＰＬＣ溶媒へ移した。決定されたピーク面積の絶対値は、種々の株の等しい細胞数について示されている。ほとんど全ての株は、リコペンをほとんど完全に変換した；δ−カロテンは、ほんの少数の株によってさえも、完全に変換されたわけではなかった。たいていの株は、鏡像異性的に純粋なα−イオノンへの変換のための出発材料である、ε−カロテンの効率的産生を示す。バリアントＥＣｍｕｔ１は、文献（Cunningham & Gantt, 2001）に以前、記載された変異体に対応し、参照としての役割を果たす。変異体ＥＣｍｕｔ  ９、１０、１１、１２、１６、２１、３．２、３．３、３．８、および３．１６は、産物量および産物純度に関して参照より有意に良い。
【図６−２】ＡｔＥＣｍｕｔ産物プロファイルの定量的ＨＰＬＣ分析を示す図である（図６−１の続き）。
【図７】プラスミドｐＧＴ１０６９およびｐＧＴ１０７０（ＡｔＣＣＤ１およびＯｆＣＣＤ１についての発現プラスミド）のプラスミドマップを示す図である。標示されたタンパク質のコード配列は、矢印として描かれている。制御ＤＮＡ配列はボックスとして描かれている。標示されたエレメントの正確な位置は両方の表に列挙されている。
【図８−１】α−イオノン産生の検出を示す図である。ＨＰＬＣクロマトグラムおよびＬＣ−ＭＳスペクトルが描かれている。酵素ｃｒｔＥ、ＩＰＩ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ＥＣｍｕｔ３、ＡｔＣＣＤ１を有するマルチトランスジェニック大腸菌（E. coli）株を、振盪しながら、ＬＢ培地中、２８℃で２４時間、インキュベートし、ＡｔＣＣＤ１酵素の発現を、アラビノースの添加により、４時間、誘導した（最終濃度：０．１％（ｗ／ｖ））。細胞の溶解後、生じたε−カロテン分解産物を、ジエチルエーテルで抽出し、その後、ＨＰＬＣにより分析した。加えられたイオノン参照物質および得られたジエチルエーテル抽出物についてのクロマトグラムが描かれている（点線：β−イオノン参照、破線：α−イオノン参照；実線：抽出物のクロマトグラム）。同じように、生成されたジエチルエーテル抽出物を、ＬＣ−ＭＳにより質量分光学的に測定した。１９２．９というα−イオノンに対応する質量が明確に検出された。
【図８−２】α−イオノン産生の検出を示す図である（図８−１の続き）。
【図９】プラスミドマップｐＧＴ１５１８（「ｅＣａｒｏ合成」プラスミド、発現プラスミド）を示す図である。このプラスミドは、ｐＴｅｔ−ｍ１プロモーターの調節下での本発明によるリコペン生合成経路（ｉｄｓＡ、ＩＰＩ、ｃｒｔＩ、およびｃｒｔＢ）、およびａＰ１２プロモーターの調節下での変異組合せを有するリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）ＥＣｍｕｔ  ３．３をコードする。標示されたタンパク質のコード配列は、矢印として描かれている。制御ＤＮＡ配列はボックスとして描かれている。固有の制限酵素部位の位置が示されている。標示された遺伝子エレメントの正確な位置およびそれらの機能は表に列挙されている。
【図１０】プラスミドマップｐＧＴ１５４３（「ｅＣａｒｏ合成」プラスミド、発現プラスミド）を示す図である。このプラスミドは、ａＰ４０プロモーターの調節下での本発明によるリコペン生合成経路（ｉｄｓＡ、ＩＰＩ、ｃｒｔＩ、およびｃｒｔＢ）、およびａＰ１２プロモーターの調節下での変異組合せを有するリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）ＥＣｍｕｔ  ３．３をコードする。標示されたタンパク質のコード配列は、矢印として描かれている。制御ＤＮＡ配列はボックスとして描かれている。固有の制限酵素部位の位置が示されている。標示された遺伝子エレメントの正確な位置およびそれらの機能は表に列挙されている。
【図１１】プラスミドマップｐＧＴ１４５４（「ｅＣａｒｏ開裂」プラスミド、発現プラスミド）を示す図である。このプラスミドは、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来のカロテノイド酸化開裂酵素（ＣＣＤ１）（ＡｔＣＣＤ１）をコードする。標示されたタンパク質のコード配列は、矢印として描かれている。制御ＤＮＡ配列はボックスとして描かれている。固有の制限酵素部位の位置が示されている。標示された遺伝子エレメントの正確な位置およびそれらの機能は表に列挙されている。
【図１２】プラスミドマップｐＧＴ１５７５（「イオノン合成」プラスミド、発現プラスミド）を示す図である。このプラスミドは、ｐＴｅｔ−ｍ１プロモーターの調節下での本発明によるリコペン生合成経路（ｉｄｓＡ、ＩＰＩ、ｃｒｔＩ、およびｃｒｔＢ）、および変異組合せを有するリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）ＥＣｍｕｔ  ３．３、加えて、ウスキモクセイ（Osmanthus fragrans）のカロテノイド酸化開裂酵素（ＣＣＤ１）（ＯｆＣＣＤＩ）（どちらもａＰ１２プロモーターの調節下）をコードする。標示されたタンパク質のコード配列は、矢印として描かれている。制御ＤＮＡ配列はボックスとして描かれている。固有の制限酵素部位の位置が示されている。標示された遺伝子エレメントの正確な位置およびそれらの機能は表に列挙されている。
【図１３】プラスミドマップｐＧＴ１５３４（「ＭＥＰ経路」プラスミド、発現プラスミド）を示す図である。このプラスミドは、ａＰ１５プロモーターの調節下での本発明による１−デスオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）、およびｐＴｅｔ−ｍ１プロモーターの調節下での、本発明による、オンウコン（温鬱金）（Curcuma wenyujin）由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＣｗＩＰＩ）のコドン最適化バリアントである、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＣｗＩＰＩ−ｃｏ２）をコードする。標示されたタンパク質のコード配列は、矢印として描かれている。制御ＤＮＡ配列はボックスとして描かれている。固有の制限酵素部位の位置が示されている。標示された遺伝子エレメントの正確な位置およびそれらの機能は表に列挙されている。
【図１４】表は、本発明によるプラスミド、すなわち、「Ｌｙｃ合成」プラスミド、「ｅＣａｒｏ合成」プラスミド、「ｅＣａｒｏ開裂」プラスミド「イオノン合成」プラスミド、および「ＭＥＰ経路」プラスミドの選択を示す。表は、ポリシストロニックか、またはモノシストロニックかのいずれかで構築されている、本発明によるプラスミドのそれぞれの発現カセットを示す。ａＰ５、ａＰ１２、ａＰ１５、ａＰ３２、ａＰ４０、およびａＰ４７．２は、本発明による構成的プロモーターの名前である。ｐＴｅｔ：大腸菌（E. coli）プラスミドｐＢＲ３３２のテトラサイクリンプロモーター。ｐＬａｃ：Ｌａｃプロモーター；ゲノム大腸菌（E. coli）Ｌａｃオペロンのプロモーター領域。ｐＢＡＤ：アラビノース誘導性プロモーター；ゲノム大腸菌（E. coli）アラビノースオペロンのプロモーター領域。ｐＸｙｌ：キシロース誘導性プロモーター；ポリシストロニックなオペロンｘｙｌＡ／ｘｙｌＢおよびｘｙｌＦ／ｘｙｌＧ／ｘｙｌＨ／ｘｙｌＲを調節する双方向性プロモーター領域（シス−制御配列）からなる大腸菌（E. coli）キシロースオペロンの制御配列（それの活性は、ｘｙｌＦＧＨＲオペロンのｘｙｌＲ遺伝子産物を通して制御される）。ｐＴｅｔ−ｍ１：ＬＹＣオペロンのプロモーターにおける１２ｂｐ欠失；プロモーター活性は、２．８倍、向上している。ｐＸｙｌ０：合成キシロース誘導性プロモーター；（ｘｙｌＦ−、ｘｙｌＧ−、およびｘｙｌＨ遺伝子配列の欠失を用いることによる）ｘｙｌＲ遺伝子のシス−制御配列との直接的カップリングから生じる；基本的構築物；誘導性：２５×；相対的発現強度（最大）：参照プロモーター（ｐＬａｃ）の２．５％。ｐＸｙｌ１：標的遺伝子の効率的翻訳のためのｐＸｙｌ０の最適化リボソーム結合部位（シャイン・ダルガノ配列）との組合せ；ｐＸｙｌ１プロモーターはｐＸｙｌ０より３〜４倍、活性が高い（ｐＬａｃ活性の最大で１０％）。ｐＸｙｌ２：ｐＸｙｌ１に基づいて、下流指向性プロモーターエレメントの−１０領域（ＲＮＡポリメラーゼの結合部位）の配列が改変された；プロモーターはｐＸｙｌ０より３〜４倍、活性が高い（ｐＬａｃ活性の最大で３６％）。
【図１５】本発明によるプロモーターを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、本明細書における具体的に述べられた製造物および方法に限定されないが、当業者が、本明細書に記載された利点を達成するのを可能にする、一般的な技術的教示を提供する。用いられた専門用語は、本明細書に記載された一般的な技術的教示をいかなる形であれ限定するものではなく、単に、特定の実施形態を記載するという役割を果たすのみである。
【００３８】
用いられるＥＣ分類番号（ＥＣ番号）は、それらが触媒する反応に従って酵素を分類する。これらのＥＣ番号は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＵＩＢＭＢ）によって発行され、インターネット上で当業者により検索され得る。
【００３９】
本明細書で用いられる「受託番号」（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号  −  ＧｅｎＢａｎｋ）は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の明確な特徴付けに役立ち、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブページから入手される。
【００４０】
本明細書で用いられる場合、用語「ＡｔＥＣ」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＬ８５１０２．１を有するシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）を記載する。
【００４１】
本明細書で用いられる場合、用語「ＬｓＥＣ」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＫ０７４３４．１を有するレタス（Lactuca sativa）リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）を記載する。
【００４２】
本明細書で用いられる場合、用語「ＺｍＥＣ」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＵ９３２６２．１を有するトウモロコシ（Zea mays）リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）を記載する。
【００４３】
本明細書で用いられる場合、用語「リコペン」は、当業者に知られている線状カロテノイドを記載し、名前「リコピン」および「ロイコピン（leukopin）」または「オールトランスリコペン」としても当業者に知られている。これらの用語は交換可能に用いることができる。
【００４４】
本明細書で用いられる場合、用語「リコペン生合成経路」は、酵素ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、およびフィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）の組合せを記載する。
【００４５】
本明細書で用いられる場合、用語「ＡｔＥＣｍｕｔ」は、本発明によるシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）リコペン−ε−シクラーゼの変異体を記載し、その用語は、タンパク質全体、または特定の変異のみを指し得、その特定の変異は、その用語に数字として付与される（例えば、ＡｔＥＣｍｕｔ３）。その用語の意味は、それぞれの文脈から明確に当業者に理解される。用語「ＡｔＥＣｍｕｔ」は、用語「ＥＣｍｕｔ」と同等に本明細書で用いられる。
【００４６】
本明細書で用いられる場合、用語「収量」は、決定された培養体積（微生物の液体培養物）に基づいた産生された材料の量、もしくは決定された培養体積からのその単離された乾燥物質の量、または異なる参照値に基づいた産生された材料の量を記載する。本明細書で用いられる場合、用語「量」は、材料の物質の量、または異なる測定値（その値が、材料の物質の量に直接的に依存する。例えば、ＨＰＬＣ吸収クロマトグラムのピーク面積）を記載する。
【００４７】
本明細書で用いられる場合、用語「配列同一性」は、パーセントで示される、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の一致を記載し、その２つの配列間の同一の位置の数に依存し、最適な配列アラインメントを達成するために導入されることを必要とするギャップの数および長さが考慮される。本明細書で用いられる場合、配列同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Altschul et al., 1990）に従って決定される。当業者に知られているように、配列同一性は、単にＮＣＢＩウェブページ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）上でヌクレオチド配列（ｂｌａｓｔｎ）またはアミノ酸配列（ｂｌａｓｔｐ）についてＢＬＡＳＴアルゴリズムに従って決定することができる。
【００４８】
本明細書で用いられる場合、用語「ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ」は、ファルネシル二リン酸とイソペンテニル二リン酸のゲラニルゲラニル二リン酸への縮合を触媒するＥＣ番号ＥＣ  ２．５．１．２９を有する酵素を記載する。好ましい実施形態は、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼｃｒｔＥおよびｉｄｓＡである。
【００４９】
本明細書で用いられる場合、用語「１−デスオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）」は、ピルビン酸とグリセリンアルデヒド−３−リン酸の１−デスオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）への縮合を触媒する、ＥＣ番号ＥＣ  ２．２．１．７を有する酵素を記載する。
【００５０】
本明細書で用いられる場合、用語「イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）」は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）のジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）への再編成、または逆反応を触媒する、ＥＣ番号ＥＣ  ５．３．３．２を有する酵素を記載する。酵素ＣｗＩＰＩまたはコドン最適化バリアントＣｗＩＰＩ−ｃｏ２もまた、ＥＣ番号ＥＣ  ５．３．３．２による酵素活性を有するイソペンテニル二リン酸イソメラーゼである。
【００５１】
本明細書で用いられる場合、用語「フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）」は、フィトエンのオールトランスリコペンへの不飽和化（酸化）を触媒する、ＥＣ番号ＥＣ  １．３．９９．３１を有する酵素を記載する。
【００５２】
本明細書で用いられる場合、用語「フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）」は、２分子のゲラニルゲラニル二リン酸のフィトエンへの縮合を触媒する、ＥＣ番号ＥＣ  ２．５．１．３２を有する酵素を記載する。
【００５３】
リコペン−ε−シクラーゼ
本発明の態様は、リコペン−ε−シクラーゼをコードする核酸に関する。本発明によるその核酸は、リコペンからε−カロテンへの変換を触媒するリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）をコードする配列を含むことを特徴とし、リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が、配列番号２６による配列を有する参照リコペン−ε−シクラーゼ（ＡｔＥＣｍｕｔ１）より高いε−カロテン収量をもたらす。
【００５４】
それに先行する、または続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による核酸の好ましい実施形態において、リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）は、より高いε−カロテン収量をもたらし、リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）は微生物において発現する。リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）のリコペン収量を参照リコペン−ε−シクラーゼと比較することができるように、両方のシクラーゼは、同じ微生物において同じ条件下で発現する。リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）および参照リコペン−ε−シクラーゼの微生物における発現のために、リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）または参照リコペン−ε−シクラーゼをコードするプラスミドが、形質転換を用いて微生物へ導入され得る。
【００５５】
それに先行する、または続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による核酸の好ましい実施形態において、コードされるリコペン−ε−シクラーゼは、配列番号１９（ＡｔＥＣ−ｄｅｌ）による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性をもつ配列を有する。
【００５６】
配列番号１９（ＡｔＥＣ−ｄｅｌ）は、野生型配列の（Ｎ末端メチオニンを含まない）Ｎ末端の４４個のアミノ酸が除去されているシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のリコペン−ε−シクラーゼの配列を定義する。このＮ末端ペプチドは、植物において、新しく合成されたタンパク質の葉緑体への運搬に影響する葉緑体インポートシグナル（輸送ペプチド）である。種々のリコペン−ε−シクラーゼバリアントの本発明による変異のアミノ酸の位置は、シロイヌナズナ（A. thaliana）のリコペン−ε−シクラーゼのこのＮ末端切り詰め型（配列番号１９）に対して示される。それゆえに、シロイヌナズナ（A. thaliana）のリコペン−ε−シクラーゼの野生型配列における対応する位置は、４４個の位置分、シフトされる。したがって、切り詰め型（配列番号１９）における位置４０３は、野生型配列（ＡＡＬ８５１０２．１）における位置４４７に対応し、位置４０４は位置４４８に対応し、位置４４５は位置４８９に対応する。
【００５７】
それに先行する、または続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による核酸のさらなる実施形態において、コードされたリコペン−ε−シクラーゼの配列は、配列番号１９（ＡｔＥＣ−ｄｅｌ）による配列とは位置４０３、４０４、および４４５の少なくとも１つにおいて異なる。
【００５８】
それに先行する、または続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による核酸の実施形態において、コードされたリコペン−ε−シクラーゼは、以下の変異または変異組合せの１つを含む：ＥＣｍｕｔ２（Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３（Ｌ４０４Ｈ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１０（Ａ４０３Ｃ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１２（Ｌ４０４Ｔ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ４（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｈ）、ＥＣｍｕｔ５（Ａ４０３Ｆ／Ｌ４０４Ｗ）、ＥＣｍｕｔ６（Ａ４０３Ｇ／Ｌ４０４Ｇ）、ＥＣｍｕｔ７（Ａ４０３Ｋ／Ｌ４０４Ｄ）、ＥＣｍｕｔ８（Ａ４０３Ｗ／Ｌ４０４Ｒ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、ＥＣｍｕｔ１１（Ａ４０３Ｆ／Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１３（Ａ４０３Ｉ／Ｌ４０４Ｔ）、ＥＣｍｕｔ１４（Ａ４０３Ｔ／Ｌ４０４Ｒ）、ＥＣｍｕｔ１５（Ａ４０３Ｆ／Ｌ４０４Ｒ）、ＥＣｍｕｔ１６（Ａ４０３Ｗ／Ｌ４０４Ｇ）、ＥＣｍｕｔ１７（Ａ４０３Ｃ／Ａ４０４Ｃ）、ＥＣｍｕｔ１８（Ａ４０３Ｌ／Ｌ４０４Ｖ）、ＥＣｍｕｔ１９（Ａ４０３Ｋ／Ｌ４０４Ｒ）、ＥＣｍｕｔ２０（Ａ４０３Ｙ／Ｌ４０４Ｋ）、ＥＣｍｕｔ２１（Ａ４０３Ｑ／Ｌ４０４Ｋ）、ＥＣｍｕｔ２２（Ａ４０３Ｇ／Ｌ４０４Ｑ）、ＥＣｍｕｔ３．１（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｈ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．３（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．４（Ａ４０３Ｗ／Ｌ４０４Ｒ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．５（Ａ４０３Ｍ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．６（Ａ４０３Ｎ／Ｌ４０４Ｔ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．７（Ａ４０３Ｎ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．８（Ａ４０３Ｈ／Ｌ４０４Ｓ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．９（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ｇ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１１（Ａ４０３Ｋ／Ｌ４０４Ｇ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１３（Ａ４０３Ｒ／Ｌ４０４Ｓ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１４（Ａ４０３Ｇ／Ｌ４０４Ｒ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１５（Ａ４０３Ｆ／Ｌ４０４Ｖ／Ａ４４５Ｓ）、およびＥＣｍｕｔ３．１６（Ａ４０３Ｇ／Ｌ４０４Ｇ／Ａ４４５Ｓ）。
【００５９】
それに先行する、または続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による核酸の好ましい実施形態において、コードされたリコペン−ε−シクラーゼは、以下の変異または変異組合せの１つを含む：ＥＣｍｕｔ１６（Ａ４０３Ｗ／Ｌ４０４Ｇ）、ＥＣｍｕｔ３．１２（Ｌ４０４Ｔ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．３（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．５（Ａ４０３Ｍ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．８（Ａ４０３Ｈ／Ｌ４０４Ｓ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．９（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ｇ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１６（Ａ４０３Ｇ／Ｌ４０４Ｇ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、およびＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）。
【００６０】
それに先行する、または続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による核酸の特に好ましい実施形態において、コードされたリコペン−ε−シクラーゼは、以下の変異または変異組合せの１つを含む：ＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、およびＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）。
【００６１】
それに先行する、または続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による核酸のさらなる特に好ましい実施形態において、コードされたリコペン−ε−シクラーゼは、配列番号１９による配列からなり、かつ上記で言及された変異または変異組合せの１つを有する。この関連において特に好ましいのは、ＥＣｍｕｔ１６（Ａ４０３Ｗ／Ｌ４０４Ｇ）、ＥＣｍｕｔ３．１２（Ｌ４０４Ｔ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．３（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．５（Ａ４０３Ｍ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．８（Ａ４０３Ｈ／Ｌ４０４Ｓ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．９（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ｇ／Ａ４４５Ｓ）、およびＥＣｍｕｔ３．１６（Ａ４０３Ｇ／Ｌ４０４Ｇ／Ａ４４５Ｓ）からなる群から選択される変異組合せを有する実施形態であり、特に好ましいのは、ＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、およびＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）からなる群から選択される変異または変異組合せを有する実施形態である。
【００６２】
本発明のさらなる態様は、リコペン−ε−シクラーゼ自体に関する。
【００６３】
本発明によるリコペン−ε−シクラーゼは、上記の核酸の１つによりコードされることを特徴とする。
【００６４】
それに先行する、または続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による核酸の特に好ましい実施形態において、コードされたリコペン−ε−シクラーゼは、配列番号１９による配列からなり、かつ本発明による変異または変異組合せの１つを有する。この関連において特に好ましいのは、ＥＣｍｕｔ１６（Ａ４０３Ｗ／Ｌ４０４Ｇ）、ＥＣｍｕｔ３．１２（Ｌ４０４Ｔ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．３（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．５（Ａ４０３Ｍ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．８（Ａ４０３Ｈ／Ｌ４０４Ｓ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．９（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ｇ／Ａ４４５Ｓ）、およびＥＣｍｕｔ３．１６（Ａ４０３Ｇ／Ｌ４０４Ｇ／Ａ４４５Ｓ）からなる群から選択される変異組合せを有する実施形態であり、特に好ましいのは、ＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、およびＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）からなる群から選択される変異または変異組合せを有する実施形態である。
【００６５】
プラスミド
本発明の一部はまた、リコペン、ε−カロテン、および／またはα−イオノン生合成の本発明の構成要素をコードするヌクレオチド配列を含む種々のプラスミドである。本発明によるこれらのプラスミドの特に好ましい実施形態は図１４に列挙されている。
【００６６】
本発明の一部は、リコペン生合成の本発明による構成要素、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、およびフィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドである（「Ｌｙｃ合成」プラスミド）。本発明の一部はさらに、ε−カロテン生合成の本発明による構成要素、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）、およびリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドである（「ｅＣａｒｏ合成」プラスミド）。さらに、本発明の一部は、ε−カロテンをα−イオノンへ開裂するための本発明による構成要素、カロテノイド酸化開裂酵素（ＣＣＤ１）をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドである（「ｅＣａｒｏ開裂」プラスミド）。本発明の一部はまた、α−イオノン生合成の本発明による構成要素、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）、リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）、およびカロテノイド酸化開裂酵素（ＣＣＤ１）をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドである（「イオノン合成」プラスミド）。同様に、本発明の一部は、非メバロン酸経路（ＭＥＰ経路）をリコペン、ε−カロテン、および／またはα−イオノン生合成に結びつけるための本発明による構成要素、すなわち、１−デスオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドである（「ＭＥＰ経路」プラスミド）。
【００６７】
それに先行する、または続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明によるプラスミドの好ましい実施形態において、プラスミドによりコードされるリコペン生合成経路（ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、およびフィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ））の異種性発現は、微生物、好ましくは細菌においてリコペン収量の増加をもたらす。好ましい細菌は大腸菌（E. coli）である。この関連において特に好ましいのは、大腸菌（E. coli）株、ＸＬ１−ｂｌｕｅ、ＴＯＰ１０、ＸＬ１０  ｂｌｕｅ、ＤＨ５−ａｌｐｈａ、ＪＭ１０９、Ｃ４１、ＢＬ２１ｇｏｌｄ（ＤＥ３）、およびＷ３１１０である。特に、本発明による微生物は、大腸菌（E. coli）株ＴＯＰ１０であり得る。特に好ましいのは、大腸菌（E. coli）株ＢＬ２１ｇｏｌｄ（ＤＥ３）である。
【００６８】
それに先行する、または続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明によるプラスミドの好ましい実施形態において、酵素ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、およびフィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）は、エルウィニア・ヘルビコーラ（Erwinia herbicola）の対応する酵素である。
【００６９】
それに先行する、または続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明によるプラスミドの好ましい実施形態において、そのプラスミドによりコードされる酵素は、誘導性プロモーターの調節下にある。特に好ましいのは、誘導性プロモーターｐＴｅｔ、ｐＢＡＤ、ｐＬａｃ、およびｐＸｙｌであり、それらはまた、実施例１０および図１５においてより詳細に記載されている。特に好ましいのは、誘導性プロモーターｐＴｅｔ−ｍ１、ｐＸｙｌ０、ｐＸｙｌ１、およびｐＸｙｌ２である（実施例１０および図１５）。
【００７０】
それに先行する、または続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明によるプラスミドの好ましい実施形態において、そのプラスミドによりコードされる酵素は、構成的プロモーターの調節下にある。特に好ましいのは、本発明による構成的プロモーターａＰ５、ａＰ１２、ａＰ１５、ａＰ３２、およびａＰ４７．２である（実施例１０および図１５）。
【００７１】
「Ｌｙｃ合成」プラスミド
本発明による「Ｌｙｃ合成」プラスミドは、以下の酵素：ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、およびフィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とし、そのプラスミドによりコードされるリコペン生合成経路の異種性発現が、プラスミドｐＡＣ−ＢＥＴＡｉｐｉ−ΔｃｒｔＹ（配列番号２８）によりコードされるリコペン生合成経路の異種性発現と比較して、リコペン収量の増加をもたらす。
【００７２】
それに先行する、または続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明によるプラスミドのさらなる実施形態において、そのプラスミドは、参照配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性をもつ配列を有する配列を含み、または好ましくは、この配列からなる。
【００７３】
それに先行する、または続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明によるプラスミドのさらなる実施形態において、参照配列は、配列番号２８による配列であり、参照配列は、配列番号２８（ｐＡＣ−ＢＥＴＡｉｐｉ−ΔｃｒｔＹ）による配列に対して塩基９８４〜１３９４および３４３２〜４１９８の欠失を有する。
【００７４】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明によるプラスミドのさらなる実施形態において、参照配列は、配列番号２８（ｐＡＣ−ＢＥＴＡｉｐｉ−ΔｃｒｔＹ）による配列に対して、塩基９８４〜１３９４、３４３２〜４１９８、および６６０５〜７２４２の欠失を有する。
【００７５】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明によるプラスミドの好ましい実施形態において、参照配列は配列番号１１（ｐＧＴ１０３６）による配列である。特に、本発明によるプラスミドの配列は、配列番号１１による配列と同一である配列を含み得る。特に好ましい実施形態において、プラスミドは、配列番号１１による配列と同一である配列からなる。
【００７６】
「ｅＣａｒｏ合成」プラスミド
本発明による「ｅＣａｒｏ合成」プラスミドは、以下の酵素：ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）、およびリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とし、そのプラスミドによりコードされるリコペン生合成経路の異種性発現が、プラスミドｐＡＣ−ＢＥＴＡＩＰＩ−ΔｃｒｔＹ（配列番号２８）によりコードされるリコペン生合成経路の異種性発現と比較して、リコペン収量の増加をもたらす。
【００７７】
本発明による「ｅＣａｒｏ合成」プラスミドは、特に、本発明による「Ｌｙｃ合成」プラスミドおよび本発明によるリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）の全ての実施形態も含む。
【００７８】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による「ｅＣａｒｏ合成」プラスミドの好ましい実施形態において、（「Ｌｙｃ合成」プラスミドの節において特徴付けられた）参照配列は、配列番号１８（ｐＧＴ１０６６＊、ｐＧＴ１０６６に対応するが、ＡｔＥＣ−ｄｅｌ−酵素のアミノ酸位置４０３、４０４、および４４５をコードするコドンのヌクレオチドについて、ａ、ｔ、ｃ、またはｇに対応するｎを有する）による配列である。特に、本発明によるプラスミドの配列はまた、配列番号１８による配列と同一である配列を含み得る。特に好ましい実施形態において、そのプラスミドは、配列番号１８による配列と同一である配列からなる。
【００７９】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による「ｅＣａｒｏ合成」プラスミドの特に好ましい実施形態において、参照配列は、配列番号２９（ｐＧＴ１０６６−ＡｔＥＣ−ｄｅｌ）による配列であり、そのプラスミドによりコードされるリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）は、以下の変異または変異組合せの１つを含み、または有する：ＥＣｍｕｔ２（Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３（Ｌ４０４Ｈ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１０（Ａ４０３Ｃ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１２（Ｌ４０４Ｔ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ４（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｈ）、ＥＣｍｕｔ５（Ａ４０３Ｆ／Ｌ４０４Ｗ）、ＥＣｍｕｔ６（Ａ４０３Ｇ／Ｌ４０４Ｇ）、ＥＣｍｕｔ７（Ａ４０３Ｋ／Ｌ４０４Ｄ）、ＥＣｍｕｔ８（Ａ４０３Ｗ／Ｌ４０４Ｒ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、ＥＣｍｕｔ１１（Ａ４０３Ｆ／Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１３（Ａ４０３Ｉ／Ｌ４０４Ｔ）、ＥＣｍｕｔ１４（Ａ４０３Ｔ／Ｌ４０４Ｒ）、ＥＣｍｕｔ１５（Ａ４０３Ｆ／Ｌ４０４Ｒ）、ＥＣｍｕｔ１６（Ａ４０３Ｗ／Ｌ４０４Ｇ）、ＥＣｍｕｔ１７（Ａ４０３Ｃ／Ａ４０４Ｃ）、ＥＣｍｕｔ１８（Ａ４０３Ｌ／Ｌ４０４Ｖ）、ＥＣｍｕｔ１９（Ａ４０３Ｋ／Ｌ４０４Ｒ）、ＥＣｍｕｔ２０（Ａ４０３Ｙ／Ｌ４０４Ｋ）、ＥＣｍｕｔ２１（Ａ４０３Ｑ／Ｌ４０４Ｋ）、ＥＣｍｕｔ２２（Ａ４０３Ｇ／Ｌ４０４Ｑ）、ＥＣｍｕｔ３．１（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｈ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．３（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．４（Ａ４０３Ｗ／Ｌ４０４Ｒ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．５（Ａ４０３Ｍ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．６（Ａ４０３Ｎ／Ｌ４０４Ｔ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．７（Ａ４０３Ｎ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．８（Ａ４０３Ｈ／Ｌ４０４Ｓ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．９（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ｇ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１１（Ａ４０３Ｋ／Ｌ４０４Ｇ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１３（Ａ４０３Ｒ／Ｌ４０４Ｓ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１４（Ａ４０３Ｇ／Ｌ４０４Ｒ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１５（Ａ４０３Ｆ／Ｌ４０４Ｖ／Ａ４４５Ｓ）、およびＥＣｍｕｔ３．１６（Ａ４０３Ｇ／Ｌ４０４Ｇ／Ａ４４５Ｓ）。特に好ましい変異組合せは、ＥＣｍｕｔ１６（Ａ４０３Ｗ／Ｌ４０４Ｇ）、ＥＣｍｕｔ３．１２（Ｌ４０４Ｔ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．３（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．５（Ａ４０３Ｍ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．８（Ａ４０３Ｈ／Ｌ４０４Ｓ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．９（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ｇ／Ａ４４５Ｓ）、およびＥＣｍｕｔ３．１６（Ａ４０３Ｇ／Ｌ４０４Ｇ／Ａ４４５Ｓ）である。特に好ましいのは、変異または変異組合せＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、およびＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）である。
【００８０】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による「ｅＣａｒｏ合成」プラスミドの特に好ましい実施形態において、プラスミドは、配列番号２９（ｐＧＴ１０６６−ＡｔＥＣ−ｄｅｌ）による配列からなり、そのプラスミドによりコードされるリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）は、以下の変異または変異組合せ：ＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、ＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）、およびＥＣｍｕｔ３．３（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）の１つを有する。
【００８１】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による「ｅＣａｒｏ合成」プラスミドの特に好ましい実施形態において、プラスミドは、配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有する。
【００８２】
「ｅＣａｒｏ開裂」プラスミド
本発明による「ｅＣａｒｏ開裂」プラスミドは、酵素カロテノイド酸化開裂酵素（ＣＣＤ１）をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする。
【００８３】
本発明による「ｅＣａｒｏ開裂」プラスミドの好ましい実施形態において、カロテノイド酸化開裂酵素（ＣＣＤ１）は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）またはウスキモクセイ（Osmanthus fragrans）のカロテノイド酸化開裂酵素３０（ＣＣＤ１）である。
【００８４】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による「ｅＣａｒｏ開裂」プラスミドの好ましい実施形態において、プラスミドは、配列番号２１、２４、３７、３８、３９、４０、４１、または４２による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有する。特に好ましいのは、配列番号３７および４１による配列である。
【００８５】
「イオノン合成」プラスミド
本発明による「イオノン合成」プラスミドは、以下の酵素：ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）、リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）、およびカロテノイド酸化開裂酵素（ＣＣＤ１）をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とし、そのプラスミドによりコードされるリコペン生合成経路の異種性発現が、プラスミドｐＡＣ−ＢＥＴＡＩＰＩ−ΔｃｒｔＹ（配列番号２８）によりコードされるリコペン生合成経路の異種性発現と比較して、リコペン収量の増加をもたらす。
【００８６】
本発明による「イオノン合成」プラスミドはまた、特に、本発明による「Ｌｙｃ合成」プラスミド、本発明によるリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）、および本発明による「ｅＣａｒｏ合成」プラスミドの全ての実施形態を含む。
【００８７】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による「イオノン合成」プラスミドの好ましい実施形態において、プラスミドは、配列番号４３または４４による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有し、配列番号４４による配列が特に好ましい。特に好ましいのは、配列番号４４による配列を有するプラスミドである。
【００８８】
「ＭＥＰ経路」プラスミド
本発明による「ＭＥＰ経路」プラスミドは、以下の酵素：１−デスオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする。
【００８９】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による「ＭＥＰ経路」プラスミドの好ましい実施形態において、プラスミドは、オンウコン（温鬱金）（Curcuma wenyujin）のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＣｗＩＰＩ）をコードするヌクレオチド配列を含む。特に好ましいのは、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼのコドン最適化合成遺伝子配列（ＣｗＩＰＩ−ｃｏ２）である。イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＣｗＩＰＩ）は、正確な意味において、リコペン−ε−カロテンおよび／またはα−イオノン生合成のＭＥＰ経路への連結に必要なわけではない。それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による「ＭＥＰ経路」プラスミドの特に好ましい実施形態において、「ＭＥＰ経路」プラスミドは、配列番号４５、４６、または４７による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有し、配列番号４５による配列が特に好ましい。特に好ましいのは、配列番号４５による配列を有するプラスミドである。
【００９０】
発現カセット
本発明のさらなる態様は、本発明による発現カセットに関し、当業者は、それを、図、特に図３、４、７、および９〜１４、加えて、配列プロトコールから理解することができる。本発明による発現カセットは、それが本発明による微生物のゲノムに組み込まれている形で、存在することができる。発現カセットは、当業者に知られている方法、特に相同組換えを用いて、微生物のゲノムへ組み込むことができる。好ましい実施形態において、本発明による発現カセットは、大腸菌（E. coli）株、特にＸＬ１−ｂｌｕｅ、ＴＯＰ１０、ＸＬ１０  ｂｌｕｅ、ＤＨ５−α、ＪＭ１０９、Ｃ４１、ＢＬ２１ｇｏｌｄ（ＤＥ３）、およびＷ３１１０に存在することができる。特に、本発明による微生物は、大腸菌（E. coli）株ＴＯＰ１０であり得る。特に好ましいのは、大腸菌（E. coli）株ＢＬ２１ｇｏｌｄ（ＤＥ３）である。
【００９１】
本発明による発現カセットは、特に、図１４に列挙されているような発現カセットを含む。
【００９２】
特に、好ましくは大腸菌（E. coli）などの微生物のゲノムに存在する、本発明による発現カセットは、図１４による発現カセットと少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有する発現カセットを含む。
【００９３】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による発現カセットの好ましい実施形態において、本発明による発現カセットによりコードされる酵素は、構成的プロモーターの調節下にある。本発明による特に好ましい構成的プロモーターは、ａＰ５、ａＰ１２、ａＰ１５、ａＰ３２、およびａＰ４７．２である。
【００９４】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による発現カセットの好ましい実施形態において、発現カセットによりコードされる酵素は、誘導性プロモーターの調節下にある。特に好ましいのは、誘導性プロモーターｐＴｅｔ、ｐＢＡＤ、ｐＬａｃ、およびｐＸｙｌであり、それらはまた、実施例１０において詳細に記載されている。特に好ましいのは、誘導性プロモーターｐＴｅｔ−ｍ１、ｐＸｙｌ０、ｐＸｙｌ１、およびｐＸｙｌ２である（実施例１０）。
【００９５】
微生物
本発明による微生物は、以下の酵素：ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）、およびリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）、またはゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）、リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）、およびカロテノイド酸化開裂酵素（ＣＣＤ１）をコードする異種性ヌクレオチド配列を含有することを特徴とする。
【００９６】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による微生物の好ましい実施形態において、酵素は、１つまたは複数のプラスミド上にコードされる。本発明による微生物の特に好ましい実施形態は、本発明による１つまたは複数のプラスミドを含有する。特に好ましいのは、「Ｌｙｃ合成」プラスミド、「ｅＣａｒｏ合成」プラスミド、「ｅＣａｒｏ開裂」プラスミド、「イオノン合成」プラスミド、および「ＭＥＰ経路」プラスミドである。
【００９７】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による微生物の好ましい実施形態において、酵素ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、およびフィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）は、エルウィニア・ヘルビコーラ（Erwinia herbicola）の対応する酵素である。
【００９８】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による微生物の好ましい実施形態において、プラスミドは、微生物において個々の構造として存在し、または微生物のゲノムへ組み込まれている。
【００９９】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による微生物のさらに好ましい実施形態において、カロテノイド酸化開裂酵素（ＣＣＤ１）の発現は、誘導性プロモーターの転写調節下にある。それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、さらなる好ましい実施形態において、誘導性プロモーターは、アラビノース誘導性プロモーターｐＢＡＤである。さらに、特に好ましいのは、構成的および／または誘導性プロモーターｐＸＹＬ１、ｐＸＹＬ２、ａＰ５、およびａＰ１５である。
【０１００】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による微生物のさらなる好ましい実施形態において、微生物は、リコペン−ε−シクラーゼをコードする、本発明による核酸を含有する。
【０１０１】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による微生物のさらなる好ましい実施形態において、カロテノイド酸化開裂酵素（ＣＣＤ１）は、ε−カロテンの９，１０−二重結合および９’，１０’−二重結合を酸化的に開裂する。
【０１０２】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による微生物の特に好ましい実施形態において、微生物は、配列番号２９（ｐＧＴ１０６６−ＡｔＥＣ−ｄｅｌ）による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有する配列を含み、またはそれからなる、本発明による「ｅＣａｒｏ合成」プラスミドを含有し、そのプラスミドによりコードされるリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が、以下の変異または変異組合せ：ＥＣｍｕｔ１６（Ａ４０３Ｗ／Ｌ４０４Ｇ）、ＥＣｍｕｔ３．１２（Ｌ４０４Ｔ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．３（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．５（Ａ４０３Ｍ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．８（Ａ４０３Ｈ／Ｌ４０４Ｓ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．９（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ｇ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１６（Ａ４０３Ｇ／Ｌ４０４Ｇ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、およびＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）の１つを有する。特に好ましいのは、変異または変異組合せＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、およびＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）である。
【０１０３】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による微生物の特に好ましい実施形態において、微生物は、配列番号２９による配列からなる、本発明による「ｅＣａｒｏ合成」プラスミドを含有し、そのプラスミドによりコードされるリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が、以下の変異または変異組合せ：ＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、およびＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）の１つを有する。
【０１０４】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による微生物の特に好ましい実施形態において、微生物は大腸菌（E. coli）株である。この関連において特に好ましいのは、大腸菌（E. coli）株ＸＬ１−ｂｌｕｅ、ＴＯＰ１０、ＸＬ１０  ｂｌｕｅ、ＤＨ５−α、ＪＭ１０９、Ｃ４１、ＢＬ２１ｇｏｌｄ（ＤＥ３）、およびＷ３１１０である。特に、本発明による微生物は、大腸菌（E. coli）株ＴＯＰ１０であり得る。特に好ましいのは、大腸菌（E. coli）株ＢＬ２１ｇｏｌｄ（ＤＥ３）である。
【０１０５】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による微生物の特に好ましい実施形態において、微生物は、本発明による「ｅＣａｒｏ合成」プラスミド、および配列番号２１（ｐＧＴ１０６９）による、または配列番号２４（ｐＧＴ１０７０）による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有する配列を有する「ｅＣａｒｏ開裂」プラスミドを含有する。微生物の特に好ましい実施形態は、本発明による「ｅＣａｒｏ合成」プラスミド、および配列番号２１（ｐＧＴ１０６９）による、または配列番号２４（ｐＧＴ１０７０）による配列を有する「ｅＣａｒｏ開裂」プラスミドを含有し、本発明による「ｅＣａｒｏ合成」プラスミドが好ましくは、配列番号２９（ｐＧＴ１０６６−ＡｔＥＣ−ｄｅｌ）による配列からなり、そのプラスミドによりコードされるリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が以下の変異または変異組合せ：ＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、およびＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）の１つを有する。
【０１０６】
本発明による微生物のさらなる特に好ましい実施形態において、微生物は、高純度のε−カロテンを製造する本発明による方法において、または鏡像異性的に純粋なα−イオノンを製造する本発明による方法において、培養される微生物に対応する。
【０１０７】
高純度のε−カロテンを製造する方法
本発明によるリコペンから高純度のε−カロテンを製造する方法は、以下の酵素：ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）、およびリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）をコードする異種性ヌクレオチド配列を含有する微生物を培養することを含む。
【０１０８】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明によるリコペンから高純度のε−カロテンを製造する方法の特に好ましい実施形態において、本発明による微生物が培養される。
【０１０９】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明によるリコペンから高純度のε−カロテンを製造する方法の好ましい実施形態において、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼは、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼｃｒｔＥまたはゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼｉｄｓＡである。
【０１１０】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明によるリコペンから高純度のε−カロテンを製造する方法の好ましい実施形態において、リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）は、本発明によるリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）である。この関連において特に好ましいのは、リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が配列番号１９による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有し、かつそれが、配列番号１９による配列から位置４０３、４０４、および４４５の少なくとも１つにおいて逸脱している、実施形態である。特に好ましいのは、本発明によるリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が以下の変異：ＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、ＥＣｍｕｔ３．３（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、およびＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）の１つを含む、実施形態である。
【０１１１】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明によるリコペンから高純度のε−カロテンを製造する方法の好ましい実施形態において、酵素は、１つまたは複数のプラスミド上にコードされている。これらのプラスミドは、微生物において個々の構造として存在し得、または微生物のゲノムへ組み込まれ得る。これらの酵素は共発現することができる。
【０１１２】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明によるリコペンから高純度のε−カロテンを製造する方法の好ましい実施形態において、微生物は、配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミドを含有する。
【０１１３】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明によるリコペンから高純度のε−カロテンを製造する方法の好ましい実施形態において、微生物は、配列番号４５、４６、または４７による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミドを含有する。
【０１１４】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明によるリコペンから高純度のε−カロテンを製造する方法の特に好ましい実施形態において、配列番号２９（ｐＧＴ１０６６−ＡｔＥＣ−ｄｅｌ）による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有する配列を含み、またはそれからなる本発明による「ｅＣａｒｏ合成」プラスミドを含有し、そのプラスミドによりコードされるリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が、以下の変異または変異組合せの１つを含み、または有する、本発明による微生物が培養される：ＥＣｍｕｔ２（Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３（Ｌ４０４Ｈ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１０（Ａ４０３Ｃ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１２（Ｌ４０４Ｔ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ４（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｈ）、ＥＣｍｕｔ５（Ａ４０３Ｆ／Ｌ４０４Ｗ）、ＥＣｍｕｔ６（Ａ４０３Ｇ／Ｌ４０４Ｇ）、ＥＣｍｕｔ７（Ａ４０３Ｋ／Ｌ４０４Ｄ）、ＥＣｍｕｔ８（Ａ４０３Ｗ／Ｌ４０４Ｒ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、ＥＣｍｕｔ１１（Ａ４０３Ｆ／Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１３（Ａ４０３Ｉ／Ｌ４０４Ｔ）、ＥＣｍｕｔ１４（Ａ４０３Ｔ／Ｌ４０４Ｒ）、ＥＣｍｕｔ１５（Ａ４０３Ｆ／Ｌ４０４Ｒ）、ＥＣｍｕｔ１６（Ａ４０３Ｗ／Ｌ４０４Ｇ）、ＥＣｍｕｔ１７（Ａ４０３Ｃ／Ａ４０４Ｃ）、ＥＣｍｕｔ１８（Ａ４０３Ｌ／Ｌ４０４Ｖ）、ＥＣｍｕｔ１９（Ａ４０３Ｋ／Ｌ４０４Ｒ）、ＥＣｍｕｔ２０（Ａ４０３Ｙ／Ｌ４０４Ｋ）、ＥＣｍｕｔ２１（Ａ４０３Ｑ／Ｌ４０４Ｋ）、ＥＣｍｕｔ２２（Ａ４０３Ｇ／Ｌ４０４Ｑ）、ＥＣｍｕｔ３．１（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｈ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．３（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．４（Ａ４０３Ｗ／Ｌ４０４Ｒ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．５（Ａ４０３Ｍ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．６（Ａ４０３Ｎ／Ｌ４０４Ｔ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．７（Ａ４０３Ｎ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．８（Ａ４０３Ｈ／Ｌ４０４Ｓ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．９（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ｇ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１１（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１３（Ａ４０３Ｒ／Ｌ４０４Ｓ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１４（Ａ４０３Ｇ／Ｌ４０４Ｒ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１５（Ａ４０３Ｆ／Ｌ４０４Ｖ／Ａ４４５Ｓ）、およびＥＣｍｕｔ３．１６（Ａ４０３Ｇ／Ｌ４０４Ｇ／Ａ４４５Ｓ）。特に好ましいのは、変異および変異組合せＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、およびＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）である。
【０１１５】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明によるリコペンから高純度のε−カロテンを製造する方法の特に好ましい実施形態において、配列番号２９（ｐＧＴ１０６６−ＡｔＥＣ−ｄｅｌ）による配列からなる本発明による「ｅＣａｒｏ合成」プラスミドを含有し、そのプラスミドによりコードされるリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が、以下の変異または変異組合せの１つを有する、本発明による微生物が培養される：ＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、ＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）、およびＥＣｍｕｔ３．３（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）。
【０１１６】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明によるリコペンから高純度のε−カロテンを製造する方法の特に好ましい実施形態において、本発明による微生物は大腸菌（E. coli）である。この関連において特に好ましいのは、大腸菌（E. coli）株ＸＬ１−ｂｌｕｅ、ＴＯＰ１０、ＸＬ１０  ｂｌｕｅ、ＤＨ５−α、ＪＭ１０９、Ｃ４１、ＢＬ２１ｇｏｌｄ（ＤＥ３）、およびＷ３１１０である。特に、微生物は、大腸菌（E. coli）株ＴＯＰ１０であり得る。特に好ましいのは、大腸菌（E. coli）株ＢＬ２１ｇｏｌｄ（ＤＥ３）である。
【０１１７】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明によるリコペンから高純度のε−カロテンを製造する方法の特に好ましい実施形態において、本発明による微生物は、酵素１−デスオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）をコードする異種性ヌクレオチド配列を含有する。
【０１１８】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明によるリコペンから高純度のε−カロテンを製造する方法の特に好ましい実施形態において、微生物は、酵素イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＣｗＩＰＩ）をコードする異種性ヌクレオチド配列を含有する。
【０１１９】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、リコペンから高純度のε−カロテンを製造する方法の特に好ましい実施形態において、微生物は、配列番号４５、４６、または４７による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミドを含有し、配列番号４５による配列が特に好ましい。特に、好ましいのは、配列番号４５による配列を有するプラスミドである。
【０１２０】
鏡像異性的に純粋なα−イオノンを製造する方法
本発明による鏡像異性的に純粋なα−イオノンを製造する方法は、以下の酵素：ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）、リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）、およびカロテノイド酸化開裂酵素（ＣＣＤ１）をコードする異種性ヌクレオチド配列を含有する微生物の培養を含む。
【０１２１】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による鏡像異性的に純粋なα−イオノンを製造する方法の好ましい実施形態において、本発明による微生物が培養される。
【０１２２】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による鏡像異性的に純粋なα−イオノンを製造する方法の好ましい実施形態において、（Ｒ）−α−イオノンが製造される。
【０１２３】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による鏡像異性的に純粋なα−イオノンを製造する方法の好ましい実施形態において、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼは、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼｃｒｔＥまたはゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼｉｄｓＡである。
【０１２４】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による鏡像異性的に純粋なα−イオノンを製造する方法の好ましい実施形態において、リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）は、本発明によるリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）である。この関連において特に好ましいのは、リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が配列番号１９による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有し、かつ配列番号１９による配列から位置４０３、４０４、および４４５の少なくとも１つにおいて逸脱している、実施形態である。特に好ましいのは、本発明によるリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が以下の変異または変異組合せ：ＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、ＥＣｍｕｔ３．３（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、およびＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）の１つを含む、実施形態である。
【０１２５】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による鏡像異性的に純粋なα−イオノンを製造する方法の好ましい実施形態において、カロテノイド酸化開裂酵素（ＣＣＤ１）は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）またはウスキモクセイ（Osmanthus fragrans）のカロテノイド酸化開裂酵素（ＣＣＤ１）である。
【０１２６】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による鏡像異性的に純粋なα−イオノンを製造する方法の好ましい実施形態において、酵素は、１つまたは複数のプラスミドによりコードされている。これらのプラスミドは、微生物において個々の構造として存在し得、または微生物のゲノムへ組み込まれ得る。これらの酵素は共発現することができる。
【０１２７】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による鏡像異性的に純粋なα−イオノン、好ましくは（Ｒ）−α−イオノンを製造する方法の特に好ましい実施形態において、本発明による「ｅＣａｒｏ合成」プラスミドおよび「ｅＣａｒｏ開裂」プラスミドを含有する微生物が培養され、本発明による「ｅＣａｒｏ合成」プラスミドが、配列番号２９（ｐＧＴ１０６６−ＡｔＥＣ−ｄｅｌ）による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有する配列を含み、またはそれからなり、そのプラスミドによりコードされるリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が、以下の変異または変異組合せの１つを含み、または有する：ＥＣｍｕｔ２（Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３（Ｌ４０４Ｈ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１０（Ａ４０３Ｃ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１２（Ｌ４０４Ｔ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ４（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｈ）、ＥＣｍｕｔ５（Ａ４０３Ｆ／Ｌ４０４Ｗ）、ＥＣｍｕｔ６（Ａ４０３Ｇ／Ｌ４０４Ｇ）、ＥＣｍｕｔ７（Ａ４０３Ｋ／Ｌ４０４Ｄ）、ＥＣｍｕｔ８（Ａ４０３Ｗ／Ｌ４０４Ｒ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、ＥＣｍｕｔ１１（Ａ４０３Ｆ／Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１３（Ａ４０３Ｉ／Ｌ４０４Ｔ）、ＥＣｍｕｔ１４（Ａ４０３Ｔ／Ｌ４０４Ｒ）、ＥＣｍｕｔ１５（Ａ４０３Ｆ／Ｌ４０４Ｒ）、ＥＣｍｕｔ１６（Ａ４０３Ｗ／Ｌ４０４Ｇ）、ＥＣｍｕｔ１７（Ａ４０３Ｃ／Ａ４０４Ｃ）、ＥＣｍｕｔ１８（Ａ４０３Ｌ／Ｌ４０４Ｖ）、ＥＣｍｕｔ１９（Ａ４０３Ｋ／Ｌ４０４Ｒ）、ＥＣｍｕｔ２０（Ａ４０３Ｙ／Ｌ４０４Ｋ）、ＥＣｍｕｔ２１（Ａ４０３Ｑ／Ｌ４０４Ｋ）、ＥＣｍｕｔ２２（Ａ４０３Ｇ／Ｌ４０４Ｑ）、ＥＣｍｕｔ３．１（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｈ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．３（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．４（Ａ４０３Ｗ／Ｌ４０４Ｒ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．５（Ａ４０３Ｍ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．６（Ａ４０３Ｎ／Ｌ４０４Ｔ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．７（Ａ４０３Ｎ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．８（Ａ４０３Ｈ／Ｌ４０４Ｓ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．９（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ｇ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１１（Ａ４０３Ｋ／Ｌ４０４Ｇ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１３（Ａ４０３Ｒ／Ｌ４０４Ｓ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１４（Ａ４０３Ｇ／Ｌ４０４Ｒ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１５（Ａ４０３Ｆ／Ｌ４０４Ｖ／Ａ４４５Ｓ）、およびＥＣｍｕｔ３．１６（Ａ４０３Ｇ／Ｌ４０４Ｇ／Ａ４４５Ｓ）。特に好ましいのは、変異または変異組合せＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、およびＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）である。「ｅＣａｒｏ開裂」プラスミドは、好ましくは、配列番号２１（ｐＧＴ１０６９）による配列または配列番号２４（ｐＧＴ１０７０）による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミドである。特に好ましいのは、配列番号２１（ｐＧＴ１０６９）による配列または配列番号２４（ｐＧＴ１０７０）による配列と同一である配列を有するさらなるプラスミドである。
【０１２８】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による鏡像異性的に純粋なα−イオノン、好ましくは（Ｒ）−α−イオノンを製造する方法の特に好ましい実施形態において、本発明による「ｅＣａｒｏ合成」プラスミドおよび「ｅＣａｒｏ開裂」プラスミドを含有する本発明による微生物が培養され、その「ｅＣａｒｏ合成」プラスミドが、配列番号２９（ｐＧＴ１０６６−ＡｔＥＣ−ｄｅｌ）による配列からなり、そのプラスミドによりコードされるリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が、以下の変異または変異組合せ：ＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、ＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）、およびＥＣｍｕｔ３．３（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）の１つを有する。
【０１２９】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による鏡像異性的に純粋なα−イオノン、好ましくは（Ｒ）−α−イオノンを製造する方法の特に好ましい実施形態において、「ｅＣａｒｏ開裂」プラスミドは、配列番号２１（ｐＧＴ１０６９）による配列または配列番号２４（ｐＧＴ１０７０）による配列からなる。
【０１３０】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による鏡像異性的に純粋なα−イオノン、好ましくは（Ｒ）−α−イオノンを製造する方法の特に好ましい実施形態において、「ｅＣａｒｏ合成」プラスミドおよび「ｅＣａｒｏ開裂」プラスミドを含有する本発明による微生物が培養され、その「ｅＣａｒｏ開裂」プラスミドは、配列番号２１（ｐＧＴ１０６６−ＡｔＥＣ−ｄｅｌ）による配列または配列番号２４（ｐＧＴ１０７０）による配列からなり、かつ本発明による「ｅＣａｒｏ合成」プラスミドが、配列番号２９（ｐＧＴ１０６６−ＡｔＥＣ−ｄｅｌ）による配列からなり、本発明によるプラスミドによりコードされるリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が、以下の変異または変異組合せ：ＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、ＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）、およびＥＣｍｕｔ３．３（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）の１つを有する。
【０１３１】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による鏡像異性的に純粋なα−イオノンを製造する方法の特に好ましい実施形態において、微生物は、配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミドを含有する。
【０１３２】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による鏡像異性的に純粋なα−イオノンを製造する方法の好ましい実施形態において、微生物は、配列番号２１、２４、３７、３８、３９、４０、４１、または４２による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミドを含有する。
【０１３３】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による鏡像異性的に純粋なα−イオノンを製造する方法の好ましい実施形態において、微生物は、配列番号４３または４４による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミドを含有する。
【０１３４】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による鏡像異性的に純粋なα−イオノンを製造する方法の好ましい実施形態において、微生物は、配列番号４５、４６、または４７による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミドを含有する。
【０１３５】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による鏡像異性的に純粋なα−イオノンを製造する方法の好ましい実施形態において、微生物は、配列番号３３による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミド、および配列番号３７による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミドを含有する。同等に好ましい実施形態において、微生物は、配列番号３３による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミド、および配列番号４１による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミドを含有する。さらなる特に好ましい実施形態において、微生物は、配列番号４４による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミド、および配列番号４５による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミドを含有する。
【０１３６】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による鏡像異性的に純粋なα−イオノンを製造する方法の特に好ましい実施形態において、微生物は、配列番号３３による配列を有するプラスミドおよび配列番号３７による配列を有するプラスミド、または配列番号３３による配列を有するプラスミドおよび配列番号４１による配列を有するプラスミド、または配列番号４４による配列を有するプラスミドおよび配列番号４５による配列を有するプラスミドを含有する。
【０１３７】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による鏡像異性的に純粋なα−イオノンを製造する方法の特に好ましい実施形態において、微生物は大腸菌（E. coli）株である。この関連において特に好ましいのは、大腸菌（E. coli）株ＸＬ１−ｂｌｕｅ、ＴＯＰ１０、ＸＬ１０  ｂｌｕｅ、ＤＨ５−α、ＪＭ１０９、Ｃ４１、ＢＬ２１ｇｏｌｄ（ＤＥ３）、およびＷ３１１０である。特に、本発明による微生物は、大腸菌（E. coli）株ＴＯＰ１０であり得る。特に好ましいのは、大腸菌（E. coli）株ＢＬ２１ｇｏｌｄ（ＤＥ３）である。
【０１３８】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による鏡像異性的に純粋なα−イオノンを製造する方法の特に好ましい実施形態において、微生物は、酵素１−デスオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）をコードする異種性ヌクレオチド配列を含有する。
【０１３９】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による鏡像異性的に純粋なα−イオノンを製造する方法の特に好ましい実施形態において、微生物は、酵素イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＣｗＩＰＩ）をコードする異種性ヌクレオチド配列を含有する。
【０１４０】
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明による鏡像異性的に純粋なα−イオノンを製造する方法の特に好ましい実施形態において、微生物は、配列番号４５、４６、または４７による配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一性を有するプラスミドを含有し、配列番号４５による配列が特に好ましい。特に、好ましいのは、配列番号４５による配列を有するプラスミドである。
【０１４１】
本発明のさらなる実施形態
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明の以下のさらなる実施形態が記載される。
【０１４２】
実施形態１：リコペンからε−カロテンへの変換を触媒するリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）をコードする配列を含むことを特徴とする核酸であって、コードされたリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が、配列番号２６による配列を有する参照リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）と比較してより高いε−カロテン収量をもたらす、核酸。
【０１４３】
実施形態２：コードされたリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が、配列番号１９による配列と少なくとも８０％配列同一性を有する配列を有する、実施形態１に記載の核酸。
【０１４４】
実施形態３：コードされたリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）の配列が、配列番号１９による配列の位置４０３、４０４、および４４５の少なくとも１つにおいて逸脱している、実施形態２に記載の核酸。
【０１４５】
実施形態４：コードされたリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が以下の変異または変異組合せ：ＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、ＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）、およびＥＣｍｕｔ３．３（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）の１つを含む、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の核酸。
【０１４６】
実施形態５：コードされたリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が、以下の変異または変異組合せ：ＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、ＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）、およびＥＣｍｕｔ３．３（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）の１つを有する、配列番号１９による配列からなる、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の核酸。
【０１４７】
実施形態６：実施形態１〜５のいずれか１つに記載の核酸によりコードされるリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）。
【０１４８】
実施形態７：以下の酵素：
ａ．ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、
ｂ．イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、
ｃ．フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、および
ｄ．フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）
をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするプラスミドであって、そのプラスミドによりコードされるリコペン生合成経路の異種性発現が、プラスミドｐＡＣ−ＢＥＴＡＩＰＩ−ΔｃｒｔＹ（配列番号２８）によりコードされるリコペン生合成経路の異種性発現と比較してリコペン収量の増加をもたらす、プラスミド。
【０１４９】
実施形態８：参照配列と少なくとも８０％配列同一性を有する配列を含み、参照配列が配列番号２８による配列であり、参照配列が、配列番号２８による配列に対して、塩基９８４〜１３９４および３４３２〜４１９８の欠失を有する、実施形態７に記載のプラスミド。
【０１５０】
実施形態９：配列番号２８による配列に対する参照配列が、塩基９８４〜１３９４、３４３２〜４１９８、および６６０５〜７２４２の欠失を有する、実施形態８に記載のプラスミド。
【０１５１】
実施形態１０：参照配列と少なくとも８０％配列同一性を有する配列を含み、参照配列が配列番号１１による配列である、実施形態７に記載のプラスミド。
【０１５２】
実施形態１１：実施形態１〜５のいずれか１つに記載の核酸配列をさらに含む、実施形態７〜１０のいずれか１つに記載のプラスミド。
【０１５３】
実施形態１２：参照配列と少なくとも８０％配列同一性を有する配列を含み、参照配列が配列番号１８による配列である、実施形態７に記載のプラスミド。
【０１５４】
実施形態１３：参照配列と少なくとも８０％配列同一性を有する配列を含み、参照配列が配列番号２９による配列である、実施形態７に記載のプラスミドであって、そのプラスミドによりコードされるリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）が、以下の変異または変異組合せ：ＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、ＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）、およびＥＣｍｕｔ３．３（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）の１つを有する、プラスミド。
【０１５５】
実施形態１４：以下の酵素をコードする異種性ヌクレオチド配列を含有することを特徴とする微生物：
ａ．ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）、およびリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）、または
ｂ．ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）、リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）、およびカロテノイド酸化開裂酵素（ＣＣＤ１）。
【０１５６】
実施形態１５：酵素が１つまたは複数のプラスミド上にコードされている、実施形態１４に記載の微生物。
【０１５７】
実施形態１６：１つまたは複数のプラスミドが、微生物において個々の構造として存在し、または微生物のゲノムへ組み込まれている、実施形態１４または１５に記載の微生物。
【０１５８】
実施形態１７：コードされた酵素が共発現する、実施形態１４〜１６のいずれか１つに記載の微生物。
【０１５９】
実施形態１８：カロテノイド酸化開裂酵素（ＣＤＤ１）の発現が、誘導性プロモーターの転写調節下、好ましくはアラビノース誘導性プロモーターｐＢＡＤの調節下にある、実施形態１４〜１７のいずれか１つに記載の微生物。
【０１６０】
実施形態１９：実施形態１〜５のいずれか１つに記載の核酸を含有する、実施形態１４〜１８のいずれか１つに記載の微生物。
【０１６１】
実施形態２０：実施形態７〜１３のいずれか１つに記載のプラスミドを含有する、実施形態１４〜１９のいずれか１つに記載の微生物。
【０１６２】
実施形態２１：カロテノイド酸化開裂酵素（ＣＤＤ１）が、ε−カロテンの９，１０−二重結合および９’，１０’−二重結合を酸化的に開裂する、実施形態１４〜２０のいずれか１つに記載の微生物。
【０１６３】
実施形態２２：プラスミドｐＧＴ１０６９（配列番号２１）またはｐＧＴ１０７０（配列番号２４）を含有する、実施形態１４〜２１のいずれか１つに記載の微生物。
【０１６４】
実施形態２３：以下の酵素をコードする異種性ヌクレオチド配列を含有する微生物が培養されることを特徴とする、リコペンから高純度のε−カロテンを製造する方法：
ａ．ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、
ｂ．イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、
ｃ．フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、
ｄ．フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）、および
ｅ．リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）。
【０１６５】
実施形態２４：培養される微生物が、実施形態１４〜２２のいずれか１つに記載の微生物である、実施形態２３に記載の方法。
【０１６６】
実施形態２５：以下の酵素をコードする異種性ヌクレオチド配列を含有する微生物が培養されることを特徴とする、鏡像異性的に純粋なα−イオノンを製造する方法：
ａ．ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、
ｂ．イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、
ｃ．フィトエンデサチュラーゼ／デヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、
ｄ．フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）、
ｅ．リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）、および
ｆ．カロテノイド酸化開裂酵素（ＣＣＤ１）。
【０１６７】
実施形態２６：培養される微生物が、実施形態１４〜２２のいずれか１つに記載の微生物である、実施形態２５に記載の方法。
実施例
【実施例１】
【０１６８】
発現プラスミドの最適化
発現ベクターを最適化するための出発材料は、Ｅ．ヘルビコーラ（E. herbicola）のカロテノイド遺伝子（ｃｒｔＥ、ＩＰＩ、ｃｒｔＢ、および２０  ｃｒｔＩ）を有するプラスミドｐＡＣ−ＢＥＴＡｉｐｉ（Cunningham et al., 2007）であった。とりわけ、プラスミドｐＡＣ−ＢＥＴＡｉｐｉを、当業者に知られた分子生物学標準方法（Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989 (Nolan C, Ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）を用いてプラスミドｐＧＴ１０３６（配列番号１１）を作製するために以下のように改変した：欠失９８４〜１３９４、欠失３４３２〜５３５６、および欠失７７６１〜２５  ８３９９。生じたプラスミドｐＧＴ１０３６のプラスミドマップは、図３Ａに描かれており、図３Ｂは、ｐＧＴ１０３６の完全な核酸配列を記載する。
【０１６９】
リコペン収量の分析を、ε−カロテン収量について実施例６において記載された分析と類似して行った。簡単に述べれば、細菌カロテノイド抽出物のＨＰＬＣ分析を、３ポンプシステムおよびダイオードアレイ検出器を有するＨＰ−シリーズＩＩ  １０９０液体クロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｏｂｌｉｎｇｅｎ）を用いて行った。分解について、Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ１８分離カラム（３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｏｂｌｉｎｇｅｎ）を４０℃のカラム温度で用いた。カロテノイドの分離は、最初、２分間にわたって、アセトニトリル（ＡｃＮ）中２０％酢酸エチル（ＥｔＡｃ）での均一濃度で、続いて、ＡｃＮ中２０％ＥｔＡｃ〜ＡｃＮ中５０％ＥｔＡｃの勾配で１０分間、その後、ＡｃＮ中５０％ＥｔＡｃでの均一濃度で３分間、１分間あたり１ｍｌの流速で行われた。分析を、ＬＣ用ＨＰ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎバージョンＡ．０５．０２を用いて行い、リコペンについて４５０ｎｍの波長で実施した。ＨＰＬＣ条件は以下の通りであった：カラム  −  Ｚｏｒｂａｘ  Ｃ１８  ３，５μｍ  １５０−４．６（Ａｇｉｌｅｎｔ）、カラム温度  −  ４０℃、溶媒Ａ  −  アセトニトリル、溶媒Ｂ  −  酢酸エチル、流速  −  １ｍｌ／分、および勾配  −  ２０％  Ｂでの均一濃度で２分間、５０％  Ｂまで１０分間、５０％  Ｂでの均一濃度で３分間。
【０１７０】
分析／検出を、吸収測定を用いて実施した。リコペンを４５０ｎｍの波長で検出した。
【０１７１】
リコペンの量の決定について、クロマトグラムにおける対応するピークの面積を計算する。それは、物質の量と正比例する。参照曲線の作成について、純粋な参照物質の増加する量がこの様式で決定される。この参照曲線を用いることにより、物質の所定の（ｇでの）量をピーク面積から計算することができる。
【０１７２】
上記のプラスミドｐＡＣ−ＢＥＴＡｉｐｉへの変化は、リコペン収量の有意な増加をもたらす。参照プラスミドｐＡＣ−ＢＥＴＡｉｐｉ−ΔｃｒｔＹと比較して、プラスミドｐＧＴ１０３６は、リコペン収量が４．２倍、増加している。
【実施例２】
【０１７３】
人工ターミネーター配列ａＴｅｒｍ５のクローニング
発現プラスミドｐＧＪ２７２０（Jach et al. 2006）から出発して、１０ｂｐ逆方向反復に隣接される１８ｂｐのランダム配列からなる短いＤＮＡ配列を、レポーター遺伝子ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）の３’末端に導入した。以下のプライマーを、ＰＣＲ反応に用いた（Ｎ＝ランダムヌクレオチド）：
配列番号１：ＮＮＮＮＮＮＮＮＡＡＣＧＧＧＡＴＴＴＴＴＴＧＣＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧＡＡＣＴＡＴＡＴＣＣ
配列番号２：ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＡＣＧＧＧＣＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧ
【０１７４】
ＰＣＲ反応物（５０μｌ最終体積）は、再蒸留水（bidest water）溶存成分として以下を含有した：５ｎｇ  ｐＧＪ２７２０プラスミド（鋳型）、プライマーＰ２７５０およびＰ２７５１のそれぞれ２０ｐｍｏｌ、ヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのそれぞれ１０ｎｍｏｌ、ならびに５μｌ  Ｑ５−Ｐｕｆｆｅｒ（１０×）。以下のプログラムを用いた：９８℃で２分間、その後、それぞれ、９８℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、および７２℃で９０秒間での３０サイクル、続いて７２℃で５分間。
【０１７５】
１０ユニットの制限酵素ＤｐｎＩの添加後、ＰＣＲ反応を、３７℃で１時間、インキュベートした。その後、製造会社の使用説明書に従って、生じたＰＣＲ産物を、カラムにおいて精製した（ＰＣＲ精製キット；Ｍａｓｃｈｅｒｙ  ａｎｄ  Ｎａｇｅｌ）。ＰＣＲ産物の５’末端のリン酸化について、溶出液（５０μｌ）を、２μｌ  １０ｍＭ  ＡＴＰおよび１μｌポリヌクレオチドキナーゼと混合し、３７℃で１５分間、その後、６５℃で２０分間、インキュベートした。その後、この調製物の５μｌを、標準ライゲーション反応液へ加えた（Ｓａｍｂｒｏｏｋら；最終体積２０μｌ）。その後、ライゲーション産物を、標準形質転換方法を用いて大腸菌（E. coli）細胞へ導入した。その後、生じたクローンの報告された遺伝子発現の分析により、機能性ターミネーター配列の同定を実施した。機能性クローンのコレクションを調製し、対応するプラスミドＤＮＡを単離し、対応するターミネーターの配列をＤＮＡシーケンシングによって同定した。
【実施例３】
【０１７６】
シロイヌナズナ（A. thaliana）のリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）のクローニング
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）遺伝子Ａｔ５ｇ５７０３０によりコードされるリコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）のインシリコ分析を行い、それにより、そのタンパク質配列の（Ｎ末端メチオニンを除く）最初の４４個のアミノ酸が葉緑体局在化シグナル（輸送ペプチド）を構成することが示された。そのゲノム遺伝子配列は複数のイントロンを含有し、それゆえに、その酵素の微生物発現に適切ではないため、ＰＣＲを用いて、シロイヌナズナ（A. thaliana）ｃＤＮＡからの成熟タンパク質の決定されたコード領域（ＡｔＥＣ−ｄｅｌ、配列番号１９）を増幅した。その後、それを発現プラスミドｐＧＪ２７２０においてサブクローニングし、生じたＤＮＡ配列を検証した。
【実施例４】
【０１７７】
リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）変異
分子生物学標準手順を用いて、リコペン−ε−シクラーゼ（ＥＣ）発現カセットを作製した。Ｌａｃプロモーター（ｐＬａｃ）、ＡｔＥＣ−ｄｅｌ（配列番号１９）をコードする配列、およびターミネーターａＴｅｒｍ５（実施例２参照）からなる作製されたＥＣ発現カセットを、ＰＣＲ反応を用いて増幅し、作製されたプラスミドｐＧＴ１０３６（図３Ａ、配列番号１１）へ導入した。図４は、例示的に、ＥＣｍｕｔ３についての遺伝子を含有する発現プラスミド（ｐＧＴ１０６６、配列番号１７）についてのプラスミドマップおよびヌクレオチド配列を示す。以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、標的変異（Ｌ４０４Ｈ、Ａ４４５Ｓ、Ｌ４０４Ｈ／Ａ４４５Ｓ、Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｈ）またはランダム変異を、ＡｔＥＣ−ｄｅｌ−アミノ酸配列の位置４０３／４０４および／または４４５へＰＣＲ反応を用いて導入した（図５参照）。
配列番号３：ＧＴＣＴＴＧＣＡＣＡＣＡＴＡＧＴＴＣＡＡＴＴＣＧ
配列番号４：ＣＴＡＴＧＴＧＴＧＣＡＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＧＣＴＣＴＣＴＧ
配列番号５：ＣＴＣＴＴＴＴＣＴＴＴＡＴＡＣＡＴＧＴＴＣＧＴＣＡＴＴＴＣＡＣＣ
配列番号６：ＧＴＡＴＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＡＣＧＡＧＡＴＣＴＣＣＴＧ
配列番号７：ＧＴＣＴＴＴＣＡＣＡＣＡＴＡＧＴＴＣＡＡＴＴＣＧＡＴＡＣＣＧ
配列番号８：ＣＴＡＴＧＴＧＴＧＡＡＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＧＣＴＣ
配列番号９：ＧＣＡＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＴＧＧＴＣＴＴＮＮＫＮＮＫＡＴＡＧＴＴＣＡＡＴＴＣＧＡＴＡＣＣＧＡＡＧＧＣ
配列番号１０：ＣＣＡＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＧＣＴＣＴＣＴＧ
【０１７８】
ＰＣＲ反応物（５０μｌ最終体積）は、再蒸留水溶存成分として以下を含有する：５ｎｇ  ｐＧＪ２７２０プラスミド（ｔｅｍｐｌａｔｅ）、プライマー組合せ（配列番号３／配列番号４、配列番号５／配列番号６、配列番号７／配列番号８、または配列番号９／配列番号１０）の１つのそれぞれ２０ｐｍｏｌ、ヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのそれぞれ１０ｐｍｏｌ、および５μｌ  Ｑ５バッファー（１０×）。以下のプログラムを用いた：９８℃で２分間、その後、それぞれ、９８℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で４分間での３０サイクル、最後に７２℃で５分間。１０ユニットの制限酵素ＤｐｎＩの添加後、ＰＣＲ反応を、３７℃で１時間、インキュベートした。その後、製造会社の使用説明書に従って、生じたＰＣＲ産物を、カラムにより精製した（ＰＣＲ精製キット；Ｍａｓｃｈｅｒｙ  ａｎｄ  Ｎａｇｅｌ）。ＰＣＲ産物について、ＬＩＣ反応（ライゲーション非依存性クローニング）を行い、その反応産物を、標準方法を用いて大腸菌（E. coli）ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。
【０１７９】
ＡｔＥＣ−ｄｅｌ−ランダム変異体のスクリーニングを、固体培地（ＬＢ＋クロラムフェニコール）上に形質転換体をプレーティングし、２８℃で２４時間、インキュベートし、その後、ε−カロテノイド含有量による最も強い黄色呈色を有するコロニーから選択することにより実施した。生じた変異の決定について、選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡシーケンシングを用いて分析した。
【０１８０】
以下の変異体が、それらの強い黄色呈色に基づいて選択された：
単一変異体：
ＥＣｍｕｔ２（Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ９（Ｌ４０４Ｓ）
二重変異体：
ＥＣｍｕｔ４（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｈ）、ＥＣｍｕｔ５（Ａ４０３Ｆ／Ｌ４０４Ｗ）、ＥＣｍｕｔ６（Ａ４０３Ｇ／Ｌ４０４Ｇ）、
ＥＣｍｕｔ７（Ａ４０３Ｋ／Ｌ４０４Ｄ）、ＥＣｍｕｔ８（Ａ４０３Ｗ／Ｌ４０４Ｒ）、ＥＣｍｕｔ１０（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｔ）、ＥＣｍｕｔ１１（Ａ４０３Ｆ／Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｓ）、ＥＣｍｕｔ１３（Ａ４０３Ｉ／Ｌ４０４Ｔ）、ＥＣｍｕｔ１４（Ａ４０３Ｔ／Ｌ４０４Ｒ）、ＥＣｍｕｔ１５（Ａ４０３Ｆ／Ｌ４０４Ｒ）、ＥＣｍｕｔ１６（Ａ４０３Ｗ／Ｌ４０４Ｇ）、
ＥＣｍｕｔ１７（Ａ４０３Ｃ／Ａ４０４Ｃ）、ＥＣｍｕｔ１８（Ａ４０３Ｌ／Ｌ４０４Ｖ）、ＥＣｍｕｔ１９（Ａ４０３Ｋ／Ｌ４０４Ｒ）、ＥＣｍｕｔ２０（Ａ４０３Ｙ／Ｌ４０４Ｋ）、ＥＣｍｕｔ２１（Ａ４０３Ｑ／Ｌ４０４Ｋ）、ＥＣｍｕｔ２２（Ａ４０３Ｇ／Ｌ４０４Ｑ）
三重変異体：
ＥＣｍｕｔ３．１（Ａ４０３Ｓ／Ｌ４０４Ｈ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．２（Ａ４０３Ｃ／Ｌ４０４Ｃ／Ａ４４５Ｓ）、
ＥＣｍｕｔ３．３（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．４（Ａ４０３Ｗ／Ｌ４０４Ｒ／Ａ４４５Ｓ）、
ＥＣｍｕｔ３．５（Ａ４０３Ｍ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．６（Ａ４０３Ｎ／Ｌ４０４Ｔ／Ａ４４５Ｓ）、
ＥＣｍｕｔ３．７（Ａ４０３Ｎ／Ｌ４０４Ａ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．８（Ａ４０３Ｈ／Ｌ４０４Ｓ／Ａ４４５Ｓ）、
ＥＣｍｕｔ３．９（Ａ４０３Ｅ／Ｌ４０４Ｇ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１１（Ａ４０３Ｋ／Ｌ４０４Ｇ／Ａ４４５Ｓ）、
ＥＣｍｕｔ３．１３（Ａ４０３Ｒ／Ｌ４０４Ｓ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１４（Ａ４０３Ｇ／Ｌ４０４Ｒ／Ａ４４５Ｓ）、
ＥＣｍｕｔ３．１５（Ａ４０３Ｆ／Ｌ４０４Ｖ／Ａ４４５Ｓ）、ＥＣｍｕｔ３．１６（Ａ４０３Ｇ／Ｌ４０４Ｇ／Ａ４４５Ｓ）。
【実施例５】
【０１８１】
宿主細胞の形質転換
全ての発現プラスミドを、形質転換を用いて、大腸菌（E. coli）ＴＯＰ１０細胞へ導入した。宿主細胞の形質転換を、標準方法（Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989 (Nolan C, Ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）に従って、行った。
【実施例６】
【０１８２】
ε−カロテンの検出
組換え株を、それらの合成されたカロテノイドに関して、ＨＰＬＣを用いて、分析した。
【０１８３】
ｃｒｔＥ、ＩＰＩ、ｃｒｔＩ、およびｃｒｔＢに加えて、種々のリコペン−ε−シクラーゼ変異体（ＥＣｍｕｔ）の１つについての核酸を含有する種々の発現プラスミドで大腸菌（E. coli）株を形質転換することにより、組換え株を作製した。
【０１８４】
組換え株の培養を、ｄＹＴ培地（＋クロラムフェニコールおよびアンピシリン）中、２８℃で２４時間、実施した。その後、細胞を、遠心分離（１０分間、４，０００ｇ）を用いてペレット化し、培地上清を除去し、形成されたカロテノイドを、アセトンを用いて、細胞ペレットから定量的に抽出した。その抽出物を、減圧下で蒸発乾固し、生じたカロテノイドペレットを、同体積のアセトニトリル（１ｍｌ）中に溶解し、ＨＰＬＣ分析のために直接、用いた。
【０１８５】
細菌カロテノイド抽出物のＨＰＬＣ分析を、３ポンプシステムおよびダイオードアレイ検出器を有するＨＰシリーズＩＩ  １０９０液体クロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｏｂｌｉｎｇｅｎ）を用いることにより実施した。分離について、Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ１８分離カラム（３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｏｂｌｉｎｇｅｎ）を４０℃のカラム温度で用いた。カロテノイドの分離は、最初、２分間にわたって、アセトニトリル（ＡｃＮ）中２０％酢酸エチル（ＥｔＡｃ）での均一濃度で、続いて、ＡｃＮ中２０％ＥｔＡｃからＡｃＮ中５０％ＥｔＡｃへの勾配で１０分間、その後、ＡｃＮ中５０％ＥｔＡｃでの均一濃度で３分間、１分間あたり１ｍｌの流速で実施した。
【０１８６】
分析を、ＬＣ用ＨＰ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎバージョンＡ．０５．０２を用いて行い、α−、β−、δ−、およびε−カロテンについて４５０ｎｍの波長で実施した。
【０１８７】
ＨＰＬＣ分析により、ＥＣｍｕｔ５を除いて、全ての作製された変異体は、出発材料リコペンを本質的に完全に変換し、主要産物としてε−カロテンを産生したことが示された（表１、図６Ａおよび６Ｂ）。バリアントＥＣｍｕｔ１は、文献にすでに記載されている変異体（ＡｔＥＣ−Ｌ４４８Ｈ；Cunningham & Gantt, 2001）に対応し、参照としての役割を果たした。
【０１８８】
変異体ＥＣｍｕｔ９、−１０、−１１、−１２、−１６、−２１、−３．２、−３．３、−３．５、−３．８、−３．９、−３．１２、および−３．１６は、産物純度および産物の量に関して参照より有意に良い。ＥＣ変異体により合成されたε−カロテンの、細胞の総カロテノイド含有量と比較しての割合は、９７．７％〜１００％であり（表１参照）、一方、参照（ＥＣｍｕｔ１）について、９４．３％（このように、発表された参照値（９２％；Cunningham et al., 2001）よりわずかに上である）の割合が決定された。
【０１８９】
最良の変異体（ＥＣｍｕｔ９、−１０、−３．２、−３．３、−３．５、−３．８、−３．９、−３．１２）は、９９．３％〜１００％のε−カロテン含有量を生じた。示された変異体についてのε−カロテン対それの前駆体δ−カロテンの比は、１４７：１〜４９２：１内にあり、したがって、今まで発表された最良の量比（１０：１から４９：１までの範囲である（表１およびCunningham et al., 2001、Bai et al. 2009参照））より３〜１０倍、高い。ＥＣｍｕｔ３．５について、δ−カロテン量は検出閾値より下であり、その結果、その総変換により、本明細書では商は決定することができず、またはそれは無限に大きい。
【０１９０】
驚くべきことに、分析により、形成されたε−カロテンの純度だけでなく、産物の量も、用いられたＥＣ変異体に依存することが示された（表１、図６Ａおよび６Ｂ）。
【０１９１】
【表１】
2018526027.tif 000002
【０１９２】
最初の２つの列は、酵素または酵素変異体、および対応するアミノ酸交換を示す。文献データとのより良い比較のために、本発明によるＥＣｍｕｔ酵素の変異は、完全長酵素により示されている。野生型シロイヌナズナ（A. thaliana）酵素リコペン−ε−シクラーゼ（ＡｔＥＣ）の位置４４７、４４８、および４８９は、本発明による変異体ＡｔＥＣ−ｄｅｌ（配列番号１９）の位置４０３、４０４、および４４５に対応する（図５参照）。Ｌｙｃ、ａ−Ｃａｒｏ、ｇ−Ｃａｒｏ、ｄ−Ｃａｒｏ、ｅ−Ｃａｒｏについてのパーセントでの記載されたカロテノイド収量は、言及されたカロテノイドの総量と比較したそれぞれのカロテノイドのパーセント割合を表す。記載されたｅ−カロテン収量は、参照変異体ＥＣｍｕｔ１（Ｌ４４８Ｈ）の形成されたε−カロテンの量と本発明によるそれぞれのＥＣ変異体の形成されたε−カロテンの量とのパーセントで表された比率を示し、参照値（ＥＣｍｕｔ１（Ｌ４４８Ｈ））は１００％として固定された。
【０１９３】
Ｌｙｃ＝リコペン、ａ−Ｃａｒｏ＝α−カロテン、ｇ−Ｃａｒｏ＝γ−カロテン、ｄ−Ｃａｒｏ＝δ−カロテン、ｅ−Ｃａｒｏ＝ε−カロテン；Ａｔ＝シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、Ｌｓ＝レタス（Latuca sativa）、Ｚｍ＝トウモロコシ（Zea mays）、ＥＣ＝リコペン−ε−シクラーゼ。
【実施例７】
【０１９４】
α−イオノンを得るための方法
振盪フラスコ培養におけるα−イオノンの製造について、最初、本発明による発現プラスミド（例えば、ＥＣｍｕｔ３をコードするｐＧＴ１０６６およびＣＣＤ１発現プラスミドｐＧＴ１０６９またはｐＧＴ１０７０）を一緒に、標準形質転換プロトコールを用いて大腸菌（E. coli）ＴＯＰ１０へ導入し、その後、ＬＢ培地を含む寒天プレート上で選択条件（クロラムフェニコール（２５ｍｇ／Ｌ）およびアンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）での選択）下、培養した（２８〜３０℃で２４時間のインキュベーション）。基質ε−カロテンの産生について、液体培地（ｄＹＴ＋クロラムフェニコール（２５ｍｇ／Ｌ）およびアンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ））に、得られたプレートからの単一コロニーを接種し、その培養物を、振盪（２００ｒｐｍ）下、２８〜３０℃で２４時間、培養した。その後、カロテノイド酸化開裂酵素（ＣＣＤ）の発現、および形成されたε−カロテンからα−イオノンへの変換を、誘導培地（ｄＹＴ＋０．５％アラビノース＋クロラムフェニコール（２５ｍｇ／Ｌ）およびアンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ））の添加によって開始した。最初の体積の１／５を加えた。その後、その培養物を、２８℃でさらに４時間、インキュベートした。形成されたα−イオノンの抽出について、細菌細胞を、遠心分離（１０分間；５０００ｒｐｍ）により分離し、続いて、溶解させ、その可溶化液をジエチルエーテルと共に振盪した。
【実施例８】
【０１９５】
α−イオノンの検出
産生されたε−カロテンを定量的に変換し、そのことは、すでに、細胞の変色に基づいて巨視的に目に見えた。形成されたα−イオノンの抽出について、実施例７にすでに記載されているように、細菌細胞を、遠心分離（１０分間；５０００ｇ）により分離し、続いて、溶解させ、その可溶化液をジエチルエーテルと共に振盪した。生じた調製物を、ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳにより分析した（図８）。細菌カロテノイド抽出物のＨＰＬＣ分析を、３ポンプシステムおよびダイオードアレイ検出器を有するＨＰシリーズＩＩ  １０９０液体クロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｏｂｌｉｎｇｅｎ）を用いて行った。分離について、Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ１８分離カラム（３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｏｂｌｉｎｇｅｎ）を４０℃のカラム温度で用いた。カロテノイドの分離は、最初、２分間、アセトニトリル（ＡｃＮ）中２０％酢酸エチル（ＥｔＡｃ）での均一濃度で、続いて、ＡｃＮ中２０％ＥｔＡｃ〜ＡｃＮ中５０％ＥｔＡｃの勾配で１０分間、その後、ＡｃＮ中５０％ＥｔＡｃでの均一濃度で３分間、１分間あたり１ｍｌの流速で行われた。分析を、ＬＣ用ＨＰ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎバージョンＡ．０５．０２を用いて行い、α−、β−、δ−、およびε−カロテンについて４５０ｎｍの波長、ならびにα−およびβ−イオノンについて２８０ｎｍで行った。
【実施例９】
【０１９６】
鏡像異性体分布の分析
発酵的に製造されたα−イオノンの鏡像異性体分布／純度に関する分析をＧＣ−質量分析法により行った。調製について、ジエチルエーテル抽出物（実施例８参照）を蒸発乾固して、ジエチルエーテルを除去し、得られた乾燥物質をアセトニトリル中に溶解した。その後、この試料を、希釈せずにＧＣ−質量分析法に用いた。
【０１９７】
鏡像異性体分布の決定
この目的を達成するために、鏡像異性体選択ガスクロマトグラフィ／質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）を以下のように行った：質量スペクトルを、質量分析計Ｓａｔｕｒｎ  ２０００（Ｖａｒｉａｎ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）に連結されたガスクロマトグラフＶａｒｉａｎ  ３８００（Ｖａｒｉａｎ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）で作成した。α−イオノンの鏡像異性体分布の決定について、質量スペクトルを、７０ｅＶのイオン化エネルギーでのＣＩ様式において記録した。以下のキャピラリーカラムを用いた：ＢＧＢ１７４、３０ｍ×０．２５ｍｍ内径（ＩＤ）、０．２５μｍフィルム厚さ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ。ＧＣ／ＭＳについての以下の条件を用いた：
・試料注入：カラム上、４０℃、１μｌ注入体積
・キャリアガス：ヘリウム、流速３５ｃｍ／秒
・質量分析計：イオントラップＳａｔｕｒｎ  ２０００−２０００  Ｒ、Ｖａｒｉａｎ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ
・温度プログラム：７０℃で０分間、１分あたり４℃の増加、２２０℃で５分間である、温度勾配７０〜２２０℃。
【０１９８】
β−イオノン含有量の決定
この目的を達成するために、半定量的ガスクロマトグラフィ／質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）を、質量分析計Ｓａｔｕｒｎ  ２０００（Ｖａｒｉａｎ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）に連結されたガスクロマトグラフＶａｒｉａｎ  ３８００（Ｖａｒｉａｎ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）を用いて実施した。β−イオノン質量スペクトルの半定量的決定について、７０ｅＶのイオン化エネルギーでのＥＩ様式で記録された。以下のキャピラリーカラムを用いた：ＦＦＡＰ、３０ｍ×０．２５ｍｍ内径（ＩＤ）、０．２５μｍフィルム厚さ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ。
【０１９９】
ＧＣ／ＭＳについての条件は以下の通りであった：
・試料注入：カラム上、４０℃、１μｌ注入体積
・キャリアガス：ヘリウム、流速３５ｃｍ／秒
・質量分析計：イオントラップＳａｔｕｒｎ  ２０００−２０００  Ｒ、Ｖａｒｉａｎ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ
・温度プログラム：４０℃で１分間、１分あたり６０℃の増加、２４０℃で５分間である、温度勾配４０〜２４０℃。
【０２００】
結果：
α−イオノン試料について、１００％［Ｒ］０％［Ｓ］の鏡像異性体分布が決定された。その試料は、鏡像異性的に純粋な（Ｒ）−α−イオノンを含有する。
【０２０１】
β−イオノンの含有量は、検出閾値より下であった（＜２μｇ／ｌ）。その試料は純粋なα−イオノンを含有する。
【実施例１０】
【０２０２】
プロモーター
プロモーターの選択で、中間体（リコペン、ε−カロテン）および最終産物（α−イオノン）の合成は、微調整することができる。この目的を達成するために、誘導性または構成的プロモーターを用いることができる。多数の遊離プラスミドを有する微生物の構築、または微生物ゲノムにおける１つの発現カセット、それぞれの組込みに依存して、異なるプロモーター強度が望ましい。
【０２０３】
先行技術のプロモーター：
・ｐＴｅｔ：大腸菌（E. coli）プラスミドｐＢＲ３３２（）由来のテトラサイクリンプロモーター、構成的
・ｐＬａｃ：Ｌａｃプロモーター、ゲノム大腸菌（E. coli）Ｌａｃ−オペロンのプロモーター領域
・ｐＢＡＤ：アラビノース誘導性プロモーター；ゲノム大腸菌（E. coli）アラビノース−オペロンのプロモーター領域
・ｐＸｙｌプロモーター：キシロース誘導性プロモーター；ポリシストロニックオペロンｘｙｌＡ／ｘｙｌＢおよびｘｙｌＦ／ｘｙｌＧ／ｘｙｌＨ／ｘｙｌＲを調節する双方向性プロモーター領域（シス−制御配列）からなる、大腸菌（E. coli）キシロース−オペロン由来の制御配列、それの活性は、ｘｙｌＦＧＨＲオペロンのｘｙｌＲ遺伝子産物を通して制御される
【０２０４】
本発明による誘導性プロモーター：
・ｐＴｅｔ−ｍ１：Ｌｙｃオペロンの前のプロモーターにおける１２ｂｐ−欠失、プロモーター活性は２．８倍、増加している
・ｐＸｙｌ０：合成キシロース誘導性プロモーター。（ｘｙｌＦ−、ｘｙｌＧ−、およびｘｙｌＨ−遺伝子配列の欠失を用いることによる）ｘｙｌＲ遺伝子のシス−制御配列との直接的カップリングにより作製される。基本的構築物。誘導能：２５×；相対的発現強度（最大）：参照プロモーター（ｐＬａｃ）の２．５％
・ｐＸｙｌ１：標的遺伝子の効率的翻訳のためのｐＸｙｌ０の最適化リボソーム結合部位（シャイン・ダルガノ配列）との組合せ。プロモーターは、ｐＸｙｌ０より３〜４倍、活性が高い（ｐＬａｃ活性の最大１０％）。
・ｐＸｙｌ２：ｐＸｙｌ１に基づいて、下流指向性プロモーターエレメントの−１０領域（ＲＮＡポリメラーゼの結合部位）の配列が改変された。プロモーターは、ｐＸｙｌ０より３〜４倍、活性が高い（ｐＬａｃ活性の最大３６％）。
【０２０５】
本発明による構成的プロモーター：
用いられたプロモーターは、ＰＣＲに基づいたアプローチによって作製された構成的発現プロモーターのコレクションに由来した。プロモーターを含まないＲＦＰレポーター構築物（ｐＧＪ２７２０ｄｅｌ）は、この関連において鋳型としての機能を果たした。逆ＰＣＲアプローチを用いて、全プラスミド配列は、プルーフリーディングポリメラーゼで増幅され、そのＤＮＡ断片は、オリゴヌクレオチドプライマーに含有される追加の配列によって伸長される。プライマー１（−１０プライマー）は、レポーター遺伝子の前のリボソーム結合部位の領域における鋳型ＤＮＡと結合する。それの伸長は、９個のランダム塩基、続いて、配列ＴＡＴＡＡＴおよび６個の追加のランダム塩基からなる。プライマー２は、プライマー１の結合部位の前に直接、（逆配向で）結合する。プライマー２伸長（−３５プライマー）は、９個のランダム塩基、続いて、配列ＴＧＴＣＡＡおよび６個のさらなるランダム塩基からなる。プライマー１および２は６０℃のアニーリング温度を有する。プライマーを、酵素ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で製造会社の使用説明書に従ってリン酸化し、その後、以下のＰＣＲプログラムで、鋳型の増幅に用いた：９８℃で２分間、続いて９８℃で４５秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で２分間の３０サイクル。生じたＰＣＲ断片を、アガロースゲル上で電気泳動的に分離させ、ＤＮＡバンドをゲルから単離した（ＰＣＲおよびゲル抽出キット、Ｍａｃｈｅｒｙ  ＆  Ｎａｇｅｌ）。酵素Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて、単離されたＤＮＡ断片の自己ライゲーションを実施した。ライゲーション生成物を、標準形質転換方法を用いて大腸菌（E. coli）ＸＬ１細胞へ形質転換し、組換え細胞を選択培地上で培養した。生じた機能性プロモーターの選択を、ＲＦＰレポーター遺伝子発現（赤色呈色）に基づいて、最大に誘導されたｐＬａｃプロモーターの調節下でＲＦＰレポーター遺伝子を発現する対応する微生物と比較して、巨視的に行った。種々の発現レベルを有するクローンを選択し、プラスミドＤＮＡを単離し、それぞれ得られたプロモーター配列を、ＤＮＡシーケンシングにより同定した。命名は、クローン選択によるスキームａＰｘｘに従って行った。プロモーター番号は発現強度と相関しない。
・ａＰ１２：活性：（誘導された）ｐＬａｃプロモーターの３５％
・ａＰ１５：活性：（誘導された）ｐＬａｃプロモーターの３９％
・ｐＰ３２：活性：（誘導された）ｐＬａｃプロモーターの５１％
・ａＰ４７．２：活性：（誘導された）ｐＬａｃプロモーターの１８０％
【実施例１１】
【０２０６】
カロテノイド収量
カロテノイド産生性大腸菌（E. coli）株を、液体ｄＹＴ培地中、２８℃で１８〜４８時間、培養する。生じた培養物の細胞密度（＝ＯＤ６００）を、光度計において６００ｎｍでの吸収を測定することにより決定する。必要に応じて、培養物を、０．１〜０．８の範囲に吸光度値を示すようにｄＹＴ培地で適切に希釈する（通常１：１０）。結果に基づいて、培養物を、ＯＤ６００／ｍｌ＝４に調整する（新鮮な培地での希釈）。これらの培養物の１ｍＬからの細胞を、遠心分離（１分間、１３，０００ｒｐｍ）によりペレット化し、上清を移す。ペレットがまだカロテノイドを含有する（呈色がまだ目に見える）場合には、抽出を繰り返し、抽出物の上清を混ぜ合わせる。抽出物のカロテノイド濃度を、吸収スペクトルを記録し、４７４ｎｍ（リコペン）または４４２ｎｍ（ｅ−カロテン）における測定された吸光度を特定の吸光係数（リコペン：３４５０（Ｌ／ｇ・ｃｍ）；ｅ−カロテン：２９００（Ｌ／ｇ・ｃｍ））に基づいて変換することにより測光的に（ｇ／Ｌで）決定する。抽出された細胞質量の乾燥重量を、測定された細胞密度から以下の実験的に決定された式を用いて計算する：ＴＧｗ（ｇ／Ｌ）＝０．３５×ＯＤ６００。カロテノイド合成能力の評価について、バイオマスあたりのカロテノイド量（ｍｇカロテノイド／ｇ  ＴＧｗ）を決定する。
【０２０７】
【表２】
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【０２０８】
【表３】
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参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月24日(2018.4.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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