(57)【要約】  本発明は、抗癌ワクチン組合せ物に関する。特に、本発明は、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１発現阻害剤をウイルス抗原関連ワクチンと組み合わせた、組み合わせ医薬に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体をＨＰＶ抗原関連ワクチンと組み合わせた、組み合わせ医薬。
【請求項２】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体の量は、約５ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬまでの範囲であり、前記ＨＰＶ抗原関連ワクチンの量は、約１×１０４ＣＦＵ／用量から約１×１０１２ＣＦＵ／用量までの範囲である、請求項１に記載の組み合わせ医薬。
【請求項３】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ又はＭＥＤＩ４７３６であり、前記抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ又はペムブロリズマブである、請求項１に記載の組み合わせ医薬。
【請求項４】
前記ＨＰＶ抗原関連ワクチンは、ＬＬＯ−Ｅ６融合タンパク質又はＬＬＯ−Ｅ６−Ｅ７融合タンパク質を有する運搬体である、請求項１に記載の組み合わせ医薬。
【請求項５】
前記ＬＬＯ−Ｅ６融合タンパク質又はＬＬＯ−Ｅ６−Ｅ７融合タンパク質を有する運搬体は、ＬＬＯ−Ｅ６融合タンパク質又はＬＬＯ−Ｅ６−Ｅ７融合タンパク質を発現するプラスミドを有するリステリアである、請求項４に記載の組み合わせ医薬。
【請求項６】
前記リステリアは、リステリア・モノサイトゲネスである、請求項５に記載の組み合わせ医薬。
【請求項７】
第二の抗癌剤を更に含む、請求項１に記載の組み合わせ医薬。
【請求項８】
ＨＰＶ関連腫瘍に罹患している被験体における腫瘍増殖、浸潤、及び／又は転移を治療及び／又は予防する方法であって、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体と、ＨＰＶ抗原関連ワクチンとを投与することを含む、方法。
【請求項９】
前記ＨＰＶ関連腫瘍は、肺腫瘍、子宮頚部腫瘍、膣腫瘍、外陰腫瘍、陰茎腫瘍、肛門腫瘍、直腸腫瘍、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮癌腫（ＨＮＳＣＣ）、及び中咽頭腫瘍である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記肺腫瘍は、非小細胞肺癌である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＨＰＶ関連腫瘍は、ＨＰＶ感染による肺腫瘍又は子宮頚部腫瘍である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨＰＶ関連腫瘍は、ＰＤ−Ｌ１陽性肺腫瘍である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ又はＭＥＤＩ４７３６であり、前記抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ又はペムブロリズマブである、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＨＰＶ抗原関連ワクチンは、ＬＬＯ−Ｅ６融合タンパク質、ＬＬＯ−Ｅ６−Ｅ７融合タンパク質を有する運搬体、又はＡＤＸＳ−ＨＰＶである、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体の投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇまでの範囲である、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＨＰＶ抗原関連ワクチンの投与量は、約１×１０４ＣＦＵ／用量から約１×１０１２ＣＦＵ／用量までの範囲である、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体とＨＰＶ抗原関連ワクチンとは、同時に、並行して、別々に、又は連続的に投与する、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
被験体におけるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１癌免疫療法を改善する方法であって、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体をＨＰＶ抗原関連ワクチンと組み合わせて投与することを含む、方法。
【請求項１９】
癌の予後を改善する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体とＨＰＶ抗原関連ワクチンとは、同時に、並行して、別々に、又は連続的に投与する、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌ワクチン組合せ物に関する。特に、本発明は、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１発現阻害剤をウイルス抗原関連ワクチンと組み合わせた、組み合わせ医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
プログラム細胞死−１（ＰＤ−１）は、Ｔ細胞活性化に阻害シグナルを与える共刺激分子である。プログラム細胞死リガンド−１（ＰＤ−Ｌ１）は、その受容体であるＰＤ−１に結合して、腫瘍微小環境を作り出すことによりヒトＴ細胞応答の阻害因子として作用する。これはまた、腫瘍免疫監視により腫瘍進行をもたらす。ＰＤ−Ｌ１タンパク質は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む様々なヒトの癌において豊富に発現される。ＰＤ−Ｌ１陽性肺腫瘍は、ＰＤ−Ｌ１陰性肺腫瘍と比較して遥かに少ない腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）数を示し、それは、腫瘍細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現が、ＮＳＣＬＣにおける抗腫瘍免疫応答の負の調節の一因となり得ることを示唆している。さらに、ＰＤ−Ｌ１の高発現は、腫瘍浸潤樹状細胞の成熟を抑制することにより、予後不良及び腫瘍免疫逃避の一因となり得る。
【０００３】
ＮＳＣＬＣにおける予後不良は、癌の転移を駆動する主要なプロセスである上皮間葉転換（ＥＭＴ）と関連している。ＥＭＴは、ＮＳＣＬＣにおける炎症性腫瘍微小環境と深く関連しているとともに、ＰＤ−Ｌ１等の多数の標的となり得る免疫チェックポイント分子の上昇と共存する免疫活性化とも深く関連している。ＥＭＴ表現型を表すＣＤ４陽性Ｆｏｘｐ３陽性制御性Ｔ細胞による腫瘍浸潤の増加とも更なる関連性が見られる。したがって、そのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１という主軸は、腫瘍進行、ＥＭＴ、及びＮＳＣＬＣにおける予後不良に重大な役割を担う。
【０００４】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６／１８型感染は、肺癌の発症と関連している。ＨＰＶ１６／１８型のＥ６癌タンパク質は、ＩＬ−１０、ＴＩＭＰ−３、パキシリン、及びＦＯＸＭ１の発現を減衰させることにより腫瘍増殖及び腫瘍浸潤を促進する。これらの分子のＥ６の媒介により誘導される腫瘍浸潤は、ＥＭＴを引き金として発生する。したがって、本発明者らは、Ｅ６癌タンパク質が、ＰＤ−Ｌ１発現を誘導することで、それが腫瘍浸潤を誘導し、かつＮＳＣＬＣにおける予後不良をもたらすこととなるかもしれないと推測した。
【０００５】
特許文献１は、悪性血液疾患の治療方法であって、それを必要とする被験体に治療的有効量のＰＤ１のリガンドを投与する工程を含み、上記ＰＤ１のリガンドは、ＰＤ−Ｌ１又はそのＰＤ１に結合する断片、ＰＤ−Ｌ２又はそのＰＤ１に結合する断片、及び抗ＰＤ１抗体又はそのＰＤ１に結合するフラグメントからなる群から選択され、かつ上記悪性血液疾患は、Ｂ細胞由来の慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞由来の小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、多発性骨髄腫、急性Ｂ細胞白血病、及びマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される、治療方法に関する。特許文献２は、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）と相互作用することで、ＰＤ−Ｌ１と、Ｔ細胞に発現されるプログラム細胞死１（ＰＤ１）受容体との相互作用を阻害し、こうしてＰＤ−Ｌ１に媒介される免疫抑制を最小化する可溶性ＣＤ８０タンパク質を提供する。また、腫瘍浸潤Ｔ細胞は、ＰＤ−Ｌ１等の免疫抑制経路を、腫瘍細胞において傍分泌的に上方調節することが判明した。具体的には、Vamsidhar Velchetiらは、ＰＤ−Ｌ１発現が腫瘍浸潤リンパ球と有意に関連があることを指摘しており、かつ非小細胞肺癌患者に対する研究によって、より多くのＰＤ−Ｌ１タンパク質及びｍＲＮＡの発現が、増大した局所リンパ球浸潤、及びより長期の生存と関連があることが裏付けられた（非特許文献１）。
【０００６】
抗体に媒介されたＰＤ−Ｌ１の遮断は、ＮＳＣＬＣ患者において持続的な腫瘍退縮及び長期の疾患安定化を惹起し得る。予備データは、ＮＳＣＬＣ患者の小サブセットにおいてＨＰＶ１６／１８型のＥ６癌タンパク質とＰＤ−Ｌ１発現との間に正の相関を示した。癌タンパク質ワクチンであるＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチンは、ＴＣ−１動物モデルにおいて腫瘍増殖を抑制する（非特許文献２、非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１１０１７７０８８号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１３０１４９３０５号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Vamsidhar Velcheti et al., Programmed Death Ligand-1 Expression in Non-small Cell Lung Cancer, Laboratory Investigation (2014) 94, 107-116
【非特許文献２】Peng X, Hussain SF, Paterson Y. The ability of two Listeria monocytogenes vaccines targeting human papillomavirus-16 E7 to induce an antitumor response correlates with myeloid dendritic cell function. Journal of immunology 2004; 172:6030-8
【非特許文献３】Gunn GR, Zubair A, Peters C, Pan ZK, Wu TC, Paterson Y. Two Listeria monocytogenes vaccine vectors that express different molecular forms of human papilloma virus-16 (HPV-16) E7 induce qualitatively different T cell immunity that correlates with their ability to induce regression of established tumors immortalized by HPV-16. Journal of immunology 2001; 167:6471-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、免疫療法において有効な薬剤を更に開発することが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体をＨＰＶ抗原関連ワクチンと組み合わせた、組み合わせ医薬を提供する。
【００１１】
幾つかの実施の形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ又はＭＥＤＩ４７３６である。幾つかの実施の形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ又はペムブロリズマブである。幾つかの実施の形態では、ＨＰＶ抗原関連ワクチンは、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６融合タンパク質を有する運搬体である。リステリアの種は、リステリア・モノサイトゲネスであることが好ましい。
【００１２】
本発明はまた、ウイルス関連腫瘍に罹患している被験体における腫瘍増殖、浸潤、及び／又は転移を治療及び／又は予防する方法であって、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体と、ＨＰＶ抗原関連ワクチンとを投与することを含む、方法を提供する。
【００１３】
本発明はまた、被験体におけるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１癌免疫療法を改善する方法であって、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体をＨＰＶ抗原関連ワクチンと組み合わせて投与することを含む、方法を提供する。
【００１４】
幾つかの実施の形態においては、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体の投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇまでの範囲である。幾つかの実施の形態においては、ＨＰＶ抗原関連ワクチンの投与量は、約１×１０４ＣＦＵ／用量から約１×１０１２ＣＦＵ／用量までの範囲である。
【００１５】
幾つかの実施の形態においては、ＨＰＶ関連癌は、肺癌、子宮頚癌、膣癌、外陰癌、陰茎癌、肛門癌、直腸癌、及び中咽頭癌である。一実施の形態においては、ＨＰＶ関連癌は、ＨＰＶ感染による肺癌又は子宮頚癌である。一実施の形態においては、ＨＰＶ関連癌は、ＰＤ−Ｌ１陽性肺腫瘍である。好ましくは、肺癌は、非小細胞肺癌である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＮＳＣＬＣ患者由来の腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１発現についての代表的な免疫染色結果を示す図である。
【図２Ａ−２Ｃ】ＮＳＣＬＣ患者におけるＨＰＶ１６型／１８型のＥ６発現、ＰＤ−Ｌ１発現、及び両者の発現を組み合わせた、全生存期間（ＯＳ）及び無再発生存期間（ＲＦＳ）に対する影響を評価するためのカプラン・マイヤー生存分析を示す図である。
【図３Ａ−３Ｂ−２】ＨＰＶ１６型のＥ６に媒介されるＰＤ−Ｌ１発現が、コロニー形成能及び軟寒天増殖能の要因となり得ることを示す図である。図３Ａは、４８時間かけて、ＴＬ−１細胞及びＳｉＨａ細胞を、Ｅ６のｓｈＲＮＡ又はＥ７のｓｈＲＮＡでトランスフェクションさせ、ＴＬ−４細胞及びＣ３３Ａ細胞を、Ｅ６を発現するプラスミドでトランスフェクションさせた。ウェスタンブロッティング分析を実施することで、ＴＬ−１細胞及びＴＬ−４細胞におけるＥ６、Ｅ７、及びＰＤ−Ｌ１の発現を評価した。図３Ｂ−１及び図３Ｂ−２は、４８時間かけて、ＴＬ−１細胞及びＳｉＨａ細胞を、Ｅ６のｓｈＲＮＡ及びＰＤ−Ｌ１を発現するプラスミドでトランスフェクションさせ、ＴＬ−４細胞及びＣ３３Ａ細胞を、Ｅ６を発現するプラスミド及びＰＤ−Ｌ１のｓｈＲＮＡでトランスフェクションさせた。コロニー形成能は、７日後に評価した。軟寒天増殖能は、１４日後に測定した。
【図４Ａ−４Ｂ】Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチン＋抗ＰＤ−Ｌ１のモノクローナル抗体の組合せ物が、ヌードマウスにおける皮下腫瘍増殖のより強力な抑制をもたらしたことを示す図である。ヌードマウスには、Ｅ６及びＥ７の癌タンパク質を発現するＨＰＶ１６型が感染したＴＬ−１細胞を皮下注射した。７日後に、それらのマウスを、腹腔注射によって、抗ＰＤ−Ｌ１のモノクローナル抗体（２５μｇ／マウス）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６（Ｅ６）ワクチン（５×１０６ＣＦＵ／マウス）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（Ｅ７）ワクチン（５×１０６ＣＦＵ／マウス）、又は、抗体と一方若しくは両方のワクチンとの組合せ物で処置した。７個の群における代表的な腫瘍量が例証されている（図４Ａ）。各群のヌードマウスにおける腫瘍容積は、０日目から７０日目まで７日間隔で測定した（図４Ｂ）。平均±標準誤差値（ｃｍ３）は、各群における５匹のヌードマウスの腫瘍容積から計算された。
【図５Ａ−５Ｂ】ヌードマウスにおいてＴＬ−１細胞及びＳｉＨａ細胞によって誘導された転移性肺腫瘍結節が、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体＋Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチンの組み合わせ療法によって効果的に抑制されたことを示す図である。ヌードマウスには、ＨＰＶ１６型が感染したＴＬ−１細胞（図５Ａ）又はＳｉＨａ細胞（図５Ｂ）を静脈内注射した。１４日後に、それらのマウスを、腹腔注射によって、抗ＰＤ−Ｌ１のモノクローナル抗体（２５μｇ／マウス）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６（Ｅ６）ワクチン（５×１０６ＣＦＵ／マウス）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（Ｅ７）ワクチン（５×１０６ＣＦＵ／マウス）、又は、抗体とワクチンとの組合せ物で処置した。マウスの各群からの肺腫瘍結節についての代表的なＨ＆Ｅ染色が示されている。マウスの各群における肺腫瘍結節の数も示されている。データは、平均±標準偏差を表す。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定によって統計的に測定された。＊Ｐ＜０．０５（コントロールとの比較）、＊＊Ｐ＜０．００１（コントロールとの比較）、＃Ｐ＜０．０５（抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体＋Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチンとの比較）。
【図６】ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６（Ｅ６）ワクチン、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（Ｅ７）ワクチン、ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体＋Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチン、及びＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体＋Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチンの組合せ物の、ＴＬ−１細胞又はＳｉＨａ細胞を注射したマウスの生存に対する影響を評価するためのカプラン・マイヤー分析を示す図である。実験最終日は、７７日目であった。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書で定義される用語は、本発明の関連分野における当業者によって通常理解される意味を有する。数量を特定していない単数形（"a", "an", and "the"）の語は、単独のものだけを指すものとは解釈されず、説明のために具体例が使用され得る総合的な集合を含む。本明細書の専門用語は、本発明の具体的な実施形態を記載するために使用されるが、特許請求の範囲で概説される場合を除き、それらの専門用語の使用は、本発明の範囲を定めるものではない。例えば、用語「細胞（a cell）」には、細胞の混合物を含めて、複数の細胞が含まれる。
【００１８】
本明細書で使用される場合に、用語「腫瘍」及び「癌」は互換的に使用され、それらは、制御不能な、通常は迅速な細胞増殖から生ずる生理学的機能を持たない組織の悪性新生物を指す。
【００１９】
本明細書で使用される場合に、「癌細胞」又は「腫瘍細胞」とは、癌細胞、前癌細胞、又はｉｎ  ｖｉｖｏで、ｅｘ  ｖｉｖｏで、そして組織培養でのいずれかにおいて形質転換された細胞であって、新しい遺伝物質の取り込みを必ずしも伴わない自発的な又は誘導された表現型変化を有する細胞を指す。形質転換は、形質転換ウイルスによる感染及び新しいゲノム核酸の導入、又は外来性核酸の取り込みから生じ得るが、形質転換は、自発的に生ずることもあり、又は発癌物質への曝露により、内在性遺伝子が変異することで生ずることもある。形質転換／癌は、例えば、ヌードマウス等の適切な動物宿主における、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、及びｅｘ  ｖｉｖｏでの、形態学的変化、細胞の不死化、異常な増殖の制御、病巣形成、増殖、悪性度、腫瘍特異的マーカーレベル、浸潤性、腫瘍増殖又は腫瘍抑制によって実証される。
【００２０】
本明細書で使用される場合に、用語「医薬品に許容可能な担体」とは、あらゆる標準的な医薬品用担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水溶液、水、及びエマルジョン、例えば水中油型エマルジョン又は油中水型エマルジョン、並びに様々な種類の湿潤剤を含むことを指す。組成物はまた、安定化剤及び保存剤並びに前述の担体のいずれかを含んでもよいが、ただし、それらは、付加的にｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に許容可能であるものとする。担体、安定化剤、及び補助剤の例については、Martin REMINGTON'S PHARM. SCI., 18th Ed., Mack Publ. Co., Easton, Pa. (1995)、及び「医師用卓上参考書（PHYSICIAN'S DESK REFERENCE）」, 58th ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (2004)を参照のこと。
【００２１】
本明細書で使用される場合に、用語「被験体」は、本明細書では、哺乳動物等の動物を含むものと定義され、これに限定されるものではないが、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス等が挙げられる。具体的な実施形態においては、被験体はヒトである。用語「被験体」及び「患者」は、本明細書においては、例えばヒト等の哺乳動物被験体に関して互換的に使用される。
【００２２】
本明細書で使用される場合に、用語「治療する」、「治療している」、及び「治療」とは、疾患若しくは障害の、又は該疾患若しくは障害と関連する１つ以上の症状の根絶又は改善を指す。特定の実施形態においては、該用語は、１種以上の予防剤又は治療剤を、該疾患又は障害を伴う被験体に投与することによりもたらされる、そのような疾患又は障害の拡大又は悪化を最小限にすることを指す。幾つかの実施形態においては、該用語は、本明細書に示される化合物又は抗体又は投与形を、１種以上の追加の活性剤と一緒に、又はそれらを用いずに、特定の疾患の診断又はその症状の発現の後に投与することを指す。
【００２３】
本明細書で使用される場合に、用語「抗体」は、インタクトな分子だけでなく、抗原結合部位を含むそれらのフラグメントの両者を含むことが意図される。これらに限定されるものではないが、インタクトな抗体のＦｃフラグメントを欠いたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメント、並びに二重特異性抗体が含まれる。
【００２４】
本明細書で使用される場合に、用語「予防する」、「予防している」、及び「予防」とは、疾患若しくは障害の、又はそれらの１種以上の症状の発現、再発、又は拡大の予防を指す。特定の実施形態においては、該用語は、１種以上の他の追加の活性剤と一緒に、又はそれらを用いずに、症状の発現の前に、特に本明細書に示される疾患又は障害の危険性のある患者に、本明細書に示される化合物若しくは抗体若しくは投与形で処置すること、又は該化合物若しくは抗体若しくは投与形を投与することを指す。該用語は、特定の疾患の症状の抑制又は軽減を含む。これに関して、用語「予防」は、用語「予防的処置」と互換的に使用することができる。
【００２５】
本明細書で使用される場合に、用語「再燃した」とは、治療後に癌が寛解した被験体にて癌細胞がぶり返した状況を指す。
【００２６】
本明細書で使用される場合に、用語「難治性」又は「耐性」とは、被験体が、集中的な治療後でさえも、体内に残留癌細胞を有する状況を指す。
【００２７】
本明細書で使用される場合に、用語「薬剤耐性」とは、疾患が１種以上の薬剤の処置に対して応答しない状態を指す。薬剤耐性は、疾患が１種以上の薬剤に一切応答しなかったことを意味する自然耐性であってもよく、又は以前に応答した１種以上の薬剤に対して疾患が応答しなくなることを意味する獲得耐性であってもよい。
【００２８】
本明細書で使用される場合に、用語「抗癌剤」又は「癌治療剤」は、抗増殖剤及び化学療法剤を含むことが意図される。
【００２９】
本明細書で使用される場合に、用語「同時投与」及び「と組み合わせて」には、２種以上の治療剤を、特段の記載が無い限りは特定の時間制限の範囲無くして、同時に、並行して、別々に、又は連続的に投与することが含まれる。一実施形態においては、複数の治療剤が、同じ組成物又は単位投与形の中にある。その他の実施形態においては、複数の治療剤が、別個の組成物又は単位投与形の中にある。
【００３０】
本明細書で使用される場合に、用語「別々」での治療的使用とは、少なくとも２種の有効成分を、同時に又はほぼ同時に異なる経路によって投与することを指す。
【００３１】
本明細書で使用される場合に、用語「連続的」な治療的使用とは、少なくとも２種の有効成分を異なる時間に投与し、その際、投与形路が同一又は異なることを指す。より具体的には、連続的な使用とは、複数の有効成分のうち１種を投与してから、その他の１種以上の投与を開始する全体の投与を指す。したがって、複数の有効成分のうち１種を数分間、数時間、又は数日間にわたって投与してから、その他の１種以上の有効成分を投与することが可能である。
【００３２】
本明細書で使用される場合に、用語「同時」での治療的使用は、少なくとも２種の有効成分を、同時に又はほぼ同時に同じ経路によって投与することを指す。
【００３３】
一態様においては、本発明は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体をＨＰＶ抗原関連ワクチンと組み合わせた、組み合わせ医薬を提供する。一実施形態においては、上記組合せ物は、約５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体と、約１×１０４ＣＦＵ／用量〜約１×１０１２ＣＦＵ／用量のＨＰＶ抗原関連ワクチンとを含む。
【００３４】
幾つかの実施形態においては、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体は、上記組合せ物中に、約５ｍｇ〜約４５ｍｇ、約５ｍｇ〜約４０ｍｇ、約５ｍｇ〜約３５ｍｇ、約５ｍｇ〜約３０ｍｇ、約１０ｍｇ〜約４５ｍｇ、約１０ｍｇ〜約４０ｍｇ、約１０ｍｇ〜約３５ｍｇ、約１０ｍｇ〜約３０ｍｇ、約１５ｍｇ〜約４５ｍｇ、約１５ｍｇ〜約４０ｍｇ、約１５ｍｇ〜約３５ｍｇ、約１５ｍｇ〜約３０ｍｇ、約２０ｍｇ〜約４５ｍｇ、約２０ｍｇ〜約４０ｍｇ、約２０ｍｇ〜約３５ｍｇ、又は約２０ｍｇ〜約３０ｍｇの量で存在する。
【００３５】
幾つかの実施形態においては、ＨＰＶ抗原関連ワクチンは、上記組合せ物中に、約１×１０５ＣＦＵ／用量〜約１×１０１２ＣＦＵ／用量、約１×１０６ＣＦＵ／用量〜約１×１０１２ＣＦＵ／用量、約１×１０７ＣＦＵ／用量〜約１×１０１２ＣＦＵ／用量、約１×１０８ＣＦＵ／用量〜約１×１０１２ＣＦＵ／用量、約１×１０６ＣＦＵ／用量〜約１×１０１１ＣＦＵ／用量、約１×１０６ＣＦＵ／用量〜約１×１０１０ＣＦＵ／用量、約１×１０７ＣＦＵ／用量〜約１×１０１１ＣＦＵ／用量、約１×１０７ＣＦＵ／用量〜約１×１０１０ＣＦＵ／用量、約１×１０８ＣＦＵ／用量〜約１×１０１１ＣＦＵ／用量、又は約１×１０８ＣＦＵ／用量〜約１×１０１０ＣＦＵ／用量の量で存在する。
【００３６】
もう一つの態様においては、本発明は、ＨＰＶ関連腫瘍に罹患している被験体における腫瘍増殖、浸潤、及び／又は転移を治療及び／又は予防する方法であって、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体と、ＨＰＶ抗原関連ワクチンとを投与することを含む、方法を提供する。一実施形態においては、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体と、ＨＰＶ抗原関連ワクチンとは、同時に、並行して、別々に、又は連続的に投与されてよい。一実施形態においては、腫瘍は、ＨＰＶ関連腫瘍である。
【００３７】
もう一つの実施形態においては、本発明は、被験体におけるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１癌免疫療法を改善する方法であって、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体をＨＰＶ抗原関連ワクチンと組み合わせて投与することを含む、方法を提供する。一実施形態においては、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体と、ＨＰＶ抗原関連ワクチンとは、同時に、並行して、別々に、又は連続的に投与されてよい。
【００３８】
一実施形態においては、上記方法は、癌の予後を改善することができる。
【００３９】
幾つかの実施形態においては、ＨＰＶ関連腫瘍は、肺腫瘍、子宮頚部腫瘍、膣腫瘍、外陰腫瘍、陰茎腫瘍、肛門腫瘍、直腸腫瘍、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮癌腫（ＨＮＳＣＣ）、及び中咽頭腫瘍である。一実施形態においては、ＨＰＶ関連腫瘍は、ＨＰＶ感染による肺腫瘍又は子宮頚部腫瘍である。一実施形態においては、ＨＰＶ関連腫瘍は、ＰＤ−Ｌ１陽性肺腫瘍である。好ましくは、肺癌は、非小細胞肺腫瘍である。
【００４０】
一実施形態においては、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ又はＭＥＤＩ４７３６である。一実施形態においては、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ又はペムブロリズマブである。
【００４１】
一実施形態においては、ＨＰＶ抗原関連ワクチンは、治療用ＨＰＶ抗原関連ワクチンである。一実施形態においては、ＨＰＶ抗原関連ワクチンは、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６融合タンパク質を有する運搬体である。好ましくは、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６融合タンパク質を有する運搬体は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６融合タンパク質を発現するプラスミドを有するリステリアである。好ましくは、リステリアの種は、リステリア・モノサイトゲネスである。
【００４２】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６融合タンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列は、以下の通りである。
【００４３】
【表１】
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【００４４】
【表２】
2018530570.tif 000004
【００４５】
一実施形態においては、被験体は、再燃した被験体又は難治性被験体である。一実施形態においては、被験体は、哺乳動物である。好ましくは、該被験体は、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、又はマウスである。
【００４６】
一実施形態においては、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体の投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇまでの範囲である。好ましくは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体の量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、又は約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇである。
【００４７】
一実施形態においては、ＨＰＶ抗原関連ワクチンの投与量は、約１×１０４ＣＦＵ／用量〜約１×１０１２ＣＦＵ／用量、約１×１０５ＣＦＵ／用量〜約１×１０１２ＣＦＵ／用量、約１×１０６ＣＦＵ／用量〜約１×１０１２ＣＦＵ／用量、約１×１０７ＣＦＵ／用量〜約１×１０１２ＣＦＵ／用量、約１×１０８ＣＦＵ／用量〜約１×１０１２ＣＦＵ／用量、約１×１０６ＣＦＵ／用量〜約１×１０１１ＣＦＵ／用量、約１×１０６ＣＦＵ／用量〜約１×１０１０ＣＦＵ／用量、約１×１０７ＣＦＵ／用量〜約１×１０１１ＣＦＵ／用量、約１×１０７ＣＦＵ／用量〜約１×１０１０ＣＦＵ／用量、約１×１０８ＣＦＵ／用量〜約１×１０１１ＣＦＵ／用量、又は約１×１０８ＣＦＵ／用量〜約１×１０１０ＣＦＵ／用量の量で存在する。
【００４８】
本発明の組み合わせ医薬は、１種以上の医薬品に許容可能な担体、賦形剤、並びに製剤に導入して、移送性、送達性、許容性等の改善をもたらすその他の作用物質（本明細書では、総称して「医薬品に許容可能な担体又は希釈剤」と呼ぶ）を更に含んでよい。数多くの適切な製剤は、あらゆる薬剤師に知られる処方集（Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa.）に見出すことができる。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、脂質（カチオン性又はアニオン性）含有ベシクル、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油エマルジョン及び油中水エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、並びにカーボワックスを含有する半固体混合物が含まれる（Powellら著の「非経口製剤用賦形剤の概論（Compendium of excipients for parenteral formulations）」 PDA, 1998, J Pharm Sci Technol 52:238-311も参照こと）。
【００４９】
したがって、経口投与、舌上投与、舌下投与、口腔投与、及び口腔外投与のために設計された組合せ物／組成物は、当該技術分野でよく知られた手段によって、例えば不活性希釈剤又は可食性担体を用いて、過度な実験なくして作製することができる。上記組成物は、ゼラチンカプセル中に封入されてよく、又は錠剤へと圧縮されてよい。経口治療的投与のために、本発明の医薬組成物は、賦形剤と一緒に導入することができ、かつ錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハース、チューイングガム等の形で使用することができる。
【００５０】
錠剤、丸薬、カプセル、トローチ等はまた、結合剤、レシピエント（recipients）、崩壊剤、滑沢剤、甘味料及び着香料を含有していてもよい。結合剤の幾つかの例としては、微結晶セルロース、トラガカントゴム（gum tragacanth）又はゼラチンが挙げられる。賦形剤の例としてはスターチ又はラクトースが挙げられる。崩壊剤の幾つかの例としては、アルギン酸、コーンスターチ等が挙げられる。滑沢剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム又はステアリン酸カリウムが挙げられる。流動化剤の例はコロイド状二酸化ケイ素である。甘味料の幾つかの例としては、スクロース、サッカリン等が挙げられる。着香料の例としては、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香料等が挙げられる。
【００５１】
好ましくは、本発明の組合せ物／組成物は、患者に対して、非経口的に、例えば静脈内注射、筋内注射、くも膜下注射、又は皮下注射によって、鼻内投与、膣内投与、直腸投与、舌上投与、舌下投与、口腔投与、口腔内投与、及び経皮投与によって投与される。非経口投与は、本発明の組成物を溶液又は懸濁液に組み込むことによって達成することができる。かかる溶液又は懸濁液はまた、注射用の水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶剤等の滅菌希釈剤を含んでいてもよい。非経口製剤はまた、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン等の抗菌剤、例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、及びＥＤＴＡ等のキレート化剤を含んでいてもよい。アセテート、シトレート又はホスフェート等の緩衝液、及び塩化ナトリウム又はデキストロース等の等張化剤を添加してもよい。非経口調剤は、アンプル、使い捨てシリンジ、又はガラス若しくはプラスチック製の複数回バイアル（multiple dose vials）に封入することができる。
【００５２】
直腸投与は、組み合わせ医薬／組成物を直腸又は大腸に投与することを含む。これは、坐薬又は浣腸を用いて実現することができる。坐薬製剤は当該技術分野で既知の方法によって容易に作製することができる。例えば、坐薬製剤は、グリセリンを約１２０℃に加熱し、ペクチン組成物をグリセリンに溶解させ、加熱したグリセリンを混合した後、精製水を添加してもよく、この熱い混合物を坐薬の流し型に流し込むことによって調製することができる。
【００５３】
経皮投与は、皮膚を介する組成物の経皮吸収を含む。経皮製剤としては、パッチ、軟膏、クリーム、ゲル、膏薬等が挙げられる。
【００５４】
本発明の一実施形態は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体をＨＰＶ抗原関連ワクチンと組み合わせた組合せ物が、ＨＰＶ感染による肺癌細胞及び子宮頚癌細胞によって誘導される腫瘍増殖及び転移の抑制のための効果的な処置であり得ることを示している。
【実施例】
【００５５】
材料及び方法
以下の実施例で使用されるＬｍ−ＬＬＯ、ＬＬＯ−Ｅ６及びＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７については、Peng X, Hussain SF, Paterson Y.著の「ヒトパピローマウイルス−１６のＥ７を標的とする２種のリステリア・モノサイトゲネスワクチンが抗腫瘍応答を誘導する能力は、骨髄性樹状細胞機能と相関する（The ability of two Listeria monocytogenes vaccines targeting human papillomavirus-16 E7 to induce an antitumor response correlates with myeloid dendritic cell function.）」 Journal of immunology 2004; 172:6030-8、及びGunn GR, Zubair A, Peters C, Pan ZK, Wu TC, Paterson Y.著の「異なる分子形のヒトパピローマウイルス−１６（ＨＰＶ−１６）のＥ７を発現する２種のリステリア・モノサイトゲネスワクチン運搬体は、定性的に異なるＴ細胞免疫を誘導し、そのＴ細胞免疫は、それらがＨＰＶ−１６によって不死化された定着腫瘍の退縮を誘導する能力と相関する（Two Listeria monocytogenes vaccine vectors that express different molecular forms of human papilloma virus-16 (HPV-16) E7 induce qualitatively different T cell immunity that correlates with their ability to induce regression of established tumors immortalized by HPV-16.）」 Journal of immunology 2001; 167:6471-9が参照される。以下の実施例で使用される抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、BioLegend社のカタログ番号３２９７１６、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１１１４９１６８の抗体である。
【００５６】
研究被験体
肺腫瘍検体は、台中栄民総医院（Taichung Veterans General Hospital）（台湾、台中市）の胸部外科で１９９８年から２００４年の間に原発ＮＳＣＬＣの外科的切除を受けた１２２人の患者から収集した。患者には書面によるインフォームド・コンセントの提出を依頼し、その研究は、治験審査委員会によって承認された（ＴＭＵＨ番号２０１３０１０５１）。各々の収集された検体の腫瘍型及び病期を、世界保健機構の分類システムに従って組織学的に調べた。癌の再燃データを、チャートレビューから得て、胸部外科医が確認した。臨床パラメーター並びに全生存期間及び無再発生存期間のデータは、チャートレビュー及び台湾癌登録センター（Taiwan Cancer Registry）（中華民国行政院衛生署）から収集した。
【００５７】
細胞系統
ＴＬ−１細胞及びＴＬ−４細胞は、Y.-W. Cheng博士（台湾台北市の台北医学大学の癌生物学及び創薬の大学院研究所（Graduate Institute of Cancer Biology and Drug Discovery））により寄贈された（１０）。ＳｉＨａ細胞及びＣ３３Ａ細胞は、食品工業発展研究所（台湾、新竹市）の生物資源保存及び研究センター（Bioresource Collection and Research Center）から取得した。ＴＬ−１癌細胞系統、ＴＬ−４癌細胞系統、及びＣ３３Ａ癌細胞系統は、ＲＰＭＩ−１６４０培地（HyClone社、ユタ州、ローガン）中で維持した。ＳｉＨａ癌細胞系統は、ＤＭＥＭ培地（HyClone社、ユタ州、ローガン）中で維持した。その培地は、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）が補われた１０％仔ウシ血清（ＦＢＳ）を含有していた。上記細胞は、供給業者の説明書に従って培養した。蘇生させたら（Once resuscitated）、該細胞系統を、細胞形態モニタリング、増殖曲線分析、イソ酵素学及び核型分類による種の鑑定、ショートタンデムリピートのプロファイリング分析による同一性鑑定、並びにコンタミネーション確認によって慣例的に認証した（６ヶ月に１回、該細胞は、２０１２年１２月に最終試験が行われた）。
【００５８】
免疫組織化学分析
免疫組織化学分析を行って、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現を評価した。ホルマリン固定されてパラフィンに包埋された検体を、３μｍの切片に切断し、ガラス上にマウントして３７℃で一晩乾燥させた。次いで、すべての切片を、キシレン中で脱パラフィンし、アルコールに通して再水和させ、リン酸緩衝生理食塩水中で洗浄した。この緩衝液は、すべての後続の洗浄に使用した。慣用のストレプトアビジンペルオキシダーゼ法（ＬＳＡＢ  Ｋｉｔ  Ｋ６７５、DAKO社、カリフォルニア州、カーピンテリア）に従って、切片を、マイクロ波オーブン内にてクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で５分間にわたり２回加熱し、その後に室温で６０分間にわたりインキュベートした。シグナルを、３，３’−ジアミノベンジジンで５分間にわたり顕色させ、それらの切片を、ヘマトキシリンで対比染色した。ネガティブコントロールは、一次抗体を省くことによって得た。シグナルの強度を、独立して３人の観察者によって評価した。
【００５９】
プラスミド構築、トランスフェクション、及び安定なクローンの選択
ＨＰＶ  １６型のＥ６のｃＤＮＡプラスミド及びＨＰＶ  １６型のＥ６の小ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡは、以前に記載されている。ＰＤ−Ｌ１のｃＤＮＡプラスミドは、Addgene社（Addgene Company社、マサチューセッツ州、ケンブリッジ）から購入した。ＰＤ−Ｌ１のｓｈＲＮＡは、台湾中央研究院（台湾、台北市）の国立ＲＮＡｉコア施設（National RNAi Core Facility）から入手した。ｓｈＲＮＡのターゲット配列は、補足的な表２に示されている。スクランブル配列を有し、空ベクター発現を伴う非特異的ｓｈＲＮＡを、それぞれノックダウン実験及び異所性発現実験におけるコントロールとして使用した。トランスフェクション手順及び安定なクローン選択手順は、以前に記載されている。
【００６０】
足場非依存性の軟寒天コロニー形成
足場非依存性増殖を、細胞が軟寒天プレート上にコロニーを形成する能力としてアッセイした。６ウェルプレート中の底部の寒天は、１０％仔ウシ血清及び０．５％アガロースを含有する増殖培地からなっていた。全体で３００個の細胞を、１０％仔ウシ血清及び０．４％アガロースを含有する増殖培地中で再懸濁し、底部の寒天の上に載せた。それらの細胞を、５％ＣＯ２中で加湿されたインキュベーター内にて３７℃で増殖させた。培養１４日後にコロニーを可視化して顕微鏡で定量し、１００μｍより大きい直径のコロニーを数えた。
【００６１】
皮下動物モデル
６週齢〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス及びＣ５７Ｂｌ／６マウスを、国立実験動物センター（National Laboratory Animal Center）（台湾、台北市）から購入した。マウスは、ＮＬＡＣの動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルの下に管理した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６（Ｅ６）ワクチン及びＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（Ｅ７）ワクチンを、５×１０６ＣＦＵ／マウスの用量で腹腔内注射した。BioLegend社（カリフォルニア州、サンディエゴ）から入手した抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体を、２５μｇ／マウスの用量で静脈内注射した。その実験は、コントロール群と比較した場合の、種々の処置によって誘導された腫瘍増殖の変化を調べることが目的であった。簡潔には、マウスに、０日目に１匹のマウス当たり５０００００個のＴＬ−１細胞を右脇腹に皮下的に移植した。７日目（腫瘍サイズが、直径で約３ｍｍ〜４ｍｍ）に、それらのマウスに、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６又はＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を腹腔内注射し、及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体を静脈内注射した。マウスを、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体で、腫瘍移植後の１４日目、２１日目、及び２８日目に更に３回処置した。コントロール群のマウスは、ＴＬ−１細胞又はＳｉＨａ細胞を注射しただけであった。腫瘍を、３日〜４日毎にデジタルノギスを用いて計測し、腫瘍容積を、式Ｖ＝（Ｗ２×Ｌ）／２（式中、Ｖは、容積であり、Ｌは、長さ（長径）であり、かつＷは、幅（短径）である）を使用して計算した。フローチャートは、補足的な図１に示されている。
【００６２】
経尾静脈転移性肺腫瘍動物モデル
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６（Ｅ６）ワクチン及びＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（Ｅ７）ワクチンを、５×１０６ＣＦＵ／マウスの用量で腹腔内注射した。抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体を、２５μｇ／マウスの用量で静脈内注射した。その実験は、種々の処置によって誘導された腫瘍増殖及び生存における変化を調べることが目的であった。簡潔には、マウスに、０日目に１匹のマウス当たり１０００００個のＴＬ−１細胞又はＳｉＨａ細胞を尾静脈注射によって注射した。１４日目に、それらのマウスに、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチン若しくはＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチンを腹腔内注射し、及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体を静脈内注射した。マウスを、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体で、腫瘍細胞注射後の２１日目、２８日目、３５日目に更に３回処置した。マウスには、死ぬまで通常の食餌を与え続けた。
【００６３】
統計分析
すべての統計分析は、ＳＰＳＳ統計ソフトウェアプログラム（バージョン１７．０、SPSS, Inc.社、イリノイ州、シカゴ）を使用して、以前に記載された通りに実施した（１８、１９）。統計的検定において分散の両側分析を行い、Ｐ値＜０．０５０を統計学的に有意とみなした。
【００６４】
実施例１  腫瘍における抗ＰＤ−Ｌ１抗体の治療的実験及び／又は該抗体とＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチンとを組み合わせた治療的実験
１．  Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチンの形成
Ｅ６腫瘍抗原研究で使用されるリステリア菌株は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６（エピソーム性発現系におけるｈｌｙ−Ｅ６融合遺伝子）、Ｌｍ−Ｅ６（リステリアのゲノム中に組み込まれた単コピーＥ６遺伝子カセット）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（エピソーム性発現系におけるｈｌｙ−ＮＰ融合遺伝子）、及びＬｍ−Ｇａｇ（染色体中に組み込まれた単コピーＨＩＶ−１  Ｇａｇ遺伝子カセット）である。ＤＰ−Ｌ２０２８としても知られるＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（Chen CJ, Hsu LS, Lin LS, Lin SH, Chen MK, Wang HK, Hsu JD, Lee H, Yeh KT (2012)「クルッペル様因子４の核発現の喪失は、口腔癌患者における予後不良と関連している（Loss of nuclear expression of Kruppel-like factor 4 is associated with poor prognosis in patients with oral cancer.）」 Human Pathology, 43, 1119-1125）、及びＺＹ−１８としても知られるＬｍ−Ｇａｇ（Wang YC, Sung WW, Wu TC, Wang L, Chien WP, Cheng YW, Chen CY, Shieh SH and Lee H* (2012).「インターロイキン−１０ハプロタイプは、切除された非小細胞肺癌における生存及び再燃を予測し得る（Interleukin-10 haplotype may predict survival and relapse in resected non-small cell lung cancer.）」 PLOS ONE, 7, 7, e39525)は、以前に記載されている。Ｅ６は、ＰＣＲによってプライマー５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣ−３’（配列番号６）（ＸｈｏＩ部位に下線が引かれている）及び５’−ＧＧＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡ−３’（配列番号７）（ＳｐｅＩ部位に下線が引かれている）を使用して増殖させ、ｐＣＲ２．１（Invitrogen社、カリフォルニア州、サンディエゴ）中にライゲーションした。Ｅ６を、ｐＣＲ２．１からＸｈｏＩ及びＳｐｅＩによる二重消化によって切り出し、ｐＧＧ−５５中にライゲーションした。発現系ｐＧＧ−５５は、ｐＤＰ−２０２８を手本にしている（Chen CJ, Hsu LS, Lin LS, Lin SH, Chen MK, Wang HK, Hsu JD, Lee H, Yeh KT (2012).「クルッペル様因子４の核発現の喪失は、口腔癌患者における予後不良と関連している（Loss of nuclear expression of Kruppel-like factor 4 is associated with poor prognosis in patients with oral cancer.）」 Human Pathology, 43, 1119-1125）。ｈｌｙ−Ｅ６融合遺伝子及びｐｒｆＡを、ｐＡＭ４０１という多コピーのシャトルプラスミド中にクローニングすることで、ｐＧＧ−５５が作製される。ｈｌｙプロモーターは、ＸｈｏＩ部位によってＥ６遺伝子に結合されているｈｌｙ遺伝子産物のＬＬＯの最初の４４１アミノ酸の発現を駆動する。そこで得られるのは、転写されてＬＬＯ−Ｅ６として分泌されるｈｌｙ−Ｅ６融合遺伝子である。ＬＬＯの溶血性Ｃ末端を欠失させることによって、該融合タンパク質中の溶血活性は取り除かれた。多能性転写因子のｐｒｆＡもｐＧＧ−５５中に含まれている。リステリアのｐｒｆＡ陰性菌株ＸＦＬ−７（ペンシルバニア大学のHao Shen博士からの寄贈）をｐＧＧ−５５で形質転換させることによって、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるプラスミドの保有が選択される。ｈｌｙプロモーター及び遺伝子断片を、プライマー５’−ＧＧＧ  ＧＧＣ  ＴＡＧ  ＣＣＣ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＧＡＴ  ＴＡＧ  ＴＡＴ  ＡＴＴ  Ｃ−３’（配列番号８）（ＮｈｅＩ部位に下線が引かれている）及び５’−ＣＴＣ  ＣＣＴ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＣＡＴ  ＡＡＴ  ＴＴＡ  ＣＴＴ  ＣＡＴ  Ｃ−３’（配列番号９）（ＸｈｏＩ部位に下線が引かれている）を使用し��作製した。ｐｒｆＡ遺伝子を、プライマー５’−ＧＡＣ  ＴＡＣ  ＡＡＧ  ＧＡＣ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＣＧＡ  ＣＡＡ  ＧＴＧ  ＡＴＡ  ＡＣＣ  ＣＧＧ  ＧＡＴ  ＣＴＡ  ＡＡＴ  ＡＡＡ  ＴＣＣ  ＧＴＴ  Ｔ−３’（配列番号１０）（ＸｂａＩ部位に下線が引かれている）及び５’−ＣＣＣ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＡＧ  ＣＴＣ  ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＧＴＧ  ＡＡＧ−３’（配列番号１１）（ＳａｌＩ部位に下線が引かれている）を使用してＰＣＲ増幅させた。Ｌｍ−Ｅ６は、Ｅ６の発現及び分泌を駆動するｈｌｙプロモーター及びシグナル配列を有する発現カセットを、Ｌ．モノサイトゲネスのゲノムのｏｒｆＺドメイン中に導入することによって作製した。Ｅ６を、ＰＣＲによってプライマー５’−ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＡＴＡ  ＣＡＣ  ＣＴＡ  Ｃ−３’（配列番号１２）（ＢａｍＨＩ部位に下線が引かれている）及び５’−ＧＣＴ  ＣＴＡ  ＧＡＴ  ＴＡＴ  ＧＧＴ  ＴＴＣ  ＴＧＡ  Ｇ−３’（配列番号１３）（ＸｂａＩ部位に下線が引かれている）を使用して増幅させた。次いでＥ６を、ｐＺＹ−２１シャトルベクター中にライゲーションした。得られたプラスミドｐＺＹ−２１−Ｅ６は、Ｌ．モノサイトゲネスのゲノムのｏｒｆＸ、Ｙ、Ｚドメインに相当する１．６ｋｂの配列の中央に挿入された以前に記載された発現カセットを含む発現系である。Ｌ．モノサイトゲネス菌株１０４０３Ｓを、ｐＺＹ−２１−Ｅ６で形質転換させた。ホモロジードメインは、Ｅ６遺伝子カセットをｏｒｆＺドメイン中に相同組換えにより挿入することを可能にする。クローンを、Ｅ６遺伝子カセットのｏｒｆＺドメイン中への組み込みについてスクリーニングした。細菌を、クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）を有する（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６及びＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰ）又は有さない（Ｌｍ−Ｅ６及びＺＹ−１８）脳心臓浸出物培地中で増殖させた。細菌を、アリコートにおいて−８０℃で凍結させた。
【００６５】
２．  Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチンの、定着腫瘍増殖に対する効果
６週齢〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス及びＣ５７Ｂｌ／６マウスを、国立実験動物センター（台湾、台北市）から購入した。マウスは、ＮＬＡＣの動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルの下に管理した。ＴＬ１細胞は、Cheng YW博士により寄贈された。ヒトパピローマウイルス株１６型（ＨＰＶ１６型）早期タンパク質６及び７（Ｅ６及びＥ７）並びに活性化ｒａｓ癌遺伝子を原発Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肺上皮細胞に同時トランスフェクションさせることによって得られたＴＣ−１細胞を、ＡＴＣＣ（バージニア州、マナサス）から入手し、細胞を、１０％ＦＢＳ、ペニシリン及びストレプトマイシン（それぞれ１００Ｕ／ｍｌ）並びにＬ−グルタミン（２ｍＭ）を補ったＲＰＭＩ  １６４０中で３７℃、５％のＣＯ２で増殖させた。ヒトパピローマウイルス−１６型（ＨＰＶ−１６型）のＥ６及びＥ７を有する又は有さないリステリアワクチン運搬体（Ｌｍ−ＬＬＯ、ＬＬＯ−Ｅ６及びＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７）は、Advaxis Inc.社によって供給された。Ｌｍ−ＬＬＯ、ＬＬＯ−Ｅ６及びＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を、５×１０６ＣＦＵ／マウスの用量で腹腔内注射した。抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体及び抗ＰＤ−１モノクローナル抗体を、CureTech社（イスラエル）から入手し、該抗体を、５０μｇ／マウスの用量で静脈内注射した。フローサイトメトリーのために使用されるすべての蛍光標識された抗体及び適切なアイソタイプコントロールは、BD Biosciences社（カリフォルニア州、サンノゼ）から購入した。腫瘍増殖及び生存を分析することを目的とする治療的実験は、以前に記載されたように実施した。簡潔には、０日目に、右脇腹において皮下的に１匹のマウス当たり５０００００個の細胞で、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにＴＣ−１細胞を移植し、かつＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにＴＬ−１細胞を移植した。８日目（腫瘍サイズが、直径で約３ｍｍ〜４ｍｍ）に、適切な群からの動物（１群当たり５匹のマウス）に、Ｌｍ−ＬＬＯ又はＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ６又はＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を腹腔内注射すると共に、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体を静脈内注射するか、又は該抗体を注射しなかった。腫瘍移植後の１５日目に、ワクチンとモノクローナル抗体でマウスをもう一度処置した。別の群のマウスは、未処置のままにした。腫瘍を、３日〜４日毎にデジタルノギスを用いて計測し、腫瘍容積を、式Ｖ＝（Ｗ２×Ｌ）／２（式中、Ｖは、容積であり、Ｌは、長さ（長径）であり、かつＷは、幅（短径）である）を使用して計算した。
【００６６】
実施例２  転移性腫瘍における抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体若しくは抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の治療的実験、及び／又は該抗体とＬｍ−ＬＬＯワクチン若しくはＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチン若しくはＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチンとを組み合わせた治療的実験
１．  ＴＣ−１に誘導された転移性肺腫瘍形成における、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（BioLegend社のカタログ番号３２９７１６、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１１１４９１６８）若しくは抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の治療的実験、及び／又は該抗体とＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチン若しくはＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチンとを組み合わせた治療的実験
６週齢〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス及びＣ５７Ｂｌ／６マウスを、国立実験動物センター（台湾、台北市）から購入した。マウスは、ＮＬＡＣの動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルの下に管理した。ヒトパピローマウイルス−１６型（ＨＰＶ−１６型）のＥ６及びＥ７を有する又は有さないリステリアワクチン運搬体（Ｌｍ−ＬＬＯ、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６及びＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７）は、Advaxis Inc.社によって供給された。Ｌｍ−ＬＬＯ、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６及びＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を、５×１０６ＣＦＵ／マウスの用量で腹腔内注射した。抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体及び抗ＰＤ−１モノクローナル抗体を、BioLegend社から入手し（カタログ番号３２９７１６、３２９９２６）、それらの抗体を、それぞれ０．１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注射した。フローサイトメトリーのために使用されるすべての蛍光標識された抗体及び適切なアイソタイプコントロールは、BD Biosciences社（カリフォルニア州、サンノゼ）から購入した。腫瘍増殖及び生存を分析することを目的とする治療的実験は、以前に記載されたように（参考文献）実施した。簡潔には、マウスに、０日目に１匹のマウス当たり５０００００個のＴＣ−１細胞を右脇腹に皮下的に移植した。８日目（腫瘍サイズが、直径で約３ｍｍ〜４ｍｍ）に、適切な群からの動物（１群当たり５匹のマウス）に、Ｌｍ−ＬＬＯ又はＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ６又はＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を腹腔内注射すると共に、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体を静脈内注射するか、又は該抗体を注射しなかった。腫瘍移植後の１５日目に、Ｌｍ−ＬＬＯワクチン又はＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチン又はＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチンと、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体とで、マウスをもう一度処置した。別の群のマウスは、未処置のままにした。腫瘍を、３日〜４日毎にデジタルノギスを用いて計測し、腫瘍容積を、式Ｖ＝（Ｗ２×Ｌ）／２（式中、Ｖは、容積であり、Ｌは、長さ（長径）であり、かつＷは、幅（短径）である）を使用して計算した。Ｌｍ−ＬＬＯ、ＬＬＯ−Ｅ６又はＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体と組み合わせた群においては、腫瘍容積はほとんどが１００％減少する一方で、抗ＰＤ−Ｌ１単独の群においては、腫瘍容積は約１０％減少した。
【００６７】
２．  マウス樹状細胞の単離、精製、及びＰＤ−Ｌ１発現の分析
マウスの樹状細胞（ＤＣ）を、以前に本発明者らが記載したように骨髄から単離及び精製した。ヒト樹状細胞を得るために、単球を健康な成人血液ドナー（米国国立衛生研究所、血液バンク）から単離した。簡潔には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（Amersham Biosciences社）を使用して勾配遠心分離により単離し、該細胞を、洗浄後に３７℃で２時間にわたり組織培養プレートに付着させた。非付着性細胞を洗浄により除去し、付着性単球を、プレートにおいて３７℃、５％ＣＯ２でＲＰＭＩ  １６４０、２ｍＭのＬ−グルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０％の仔ウシ血清、１０ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノールからなる完全ＲＰＭＩ  １６４０中で培養した。細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）及びＩＬ−４（５００Ｕ／ｍｌ）の存在下で４日間にわたり培養することで、未成熟樹状細胞となった。ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を、３日目に新たな培地と一緒に再び加えた。培養物における樹状細胞の生存率を、トリパンブルー排除プロトコルを使用して評価した。トリパンブルー陰性細胞を、生きているとみなした。単球からの樹状細胞を４日間〜５日間にわたり培養した後に、樹状細胞を回収し、６ウェルプレートに移した（１×１０６個の細胞／ｍｌ）。種々の濃度のＬｍ−ＬＬＯ又はＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ６又はＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を、樹状細胞培養物（０ＣＦＵ／ｍｌ、１０７ＣＦＵ／ｍｌ、１０８ＣＦＵ／ｍｌ、及び１０９ＣＦＵ／ｍｌ）に１時間にわたり加え、それに引き続き、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を加えることで、リステリアを死滅させ、４８時間にわたり培養した。樹状細胞を、適切な蛍光標識された抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＰＥ抗マウスＰＤ−Ｌ１及びＦＩＴＣ抗ヒトＰＤ−Ｌ１）で染色した。アイソタイプ適合されたモノクローナル抗体を、ネガティブコントロールとして使用した。染色された細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒサイトメーター及びＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（BD Biosciences社）を使用して分析した。
【００６８】
３．  末梢及び腫瘍における、抗原特異的細胞性免疫応答、制御性Ｔ細胞、ＭＤＳＣの分析
ＥＬＩＳＰＯＴを使用して、製造業者（BD Biosciences社、カリフォルニア州、サンノゼ）によって提案される通りに、処置されたマウス及びコントロールマウスからのＥ６又はＥ７で再刺激された（１０μｇ／ｍｌ）脾細胞培養物におけるＩＦＮγ産生を検出した。ＣＴＬ  Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔアナライザー（Cellular Technology Ltd.社、オハイオ州、シェーカーハイツ）を使用して、スポットを分析した。無関係のペプチド（ｈｇｐ  １００２５−３３−ＫＶＰＲＮＱＤＷＬ−Celtek Bioscience社、テネシー州、ナッシュビル）で再刺激された脾細胞からのスポットの数を、Ｅ７で再刺激された培養物のものから差し引いた。腫瘍試料を、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳディソシエーター及び固形腫瘍の均質化プロトコルを使用して、製造業者（Miltenyi Biotec社、カリフォルニア州、オーバーン）によって提案される通りに処理した。腫瘍浸潤性ＣＤ８陽性ＣＤ４陽性Ｆｏｘｐ３陽性細胞（制御性Ｔ細胞）及びＣＤ１１ｂ陽性Ｇｒ−１陽性細胞（ＭＤＳＣ）の数を、ＣＤ４５陽性造血細胞集団内でフローサイトメトリーアッセイを使用して以前に本発明者らが記載したように分析した。制御性Ｔ細胞及びＭＤＳＣのレベルも、腫瘍を保有する処置されたマウス及びコントロールマウスの脾臓において同じフローサイトメトリーアッセイを使用して評価した。
【００６９】
実施例３  Ｅ６及びＰＤ−Ｌ１の発現は、肺腫瘍において正の相関があり、ＮＳＣＬＣ患者において予後不良と関連している
本発明者らは、ＮＳＣＬＣ患者から１２２人の手術で切除された肺腫瘍を収集して、Ｅ６発現が、ＰＤ−Ｌ１発現と関連し得るかどうかを調べた。Ｅ６発現に関するデータは、以前の研究から得られた。免疫組織化学分析により、Ｅ６陽性肺腫瘍は、より高い頻度の陽性ＰＤ−Ｌ１発現を示すことが指摘された（６６．７％対４７．９％、Ｐ＝０．０３９、図１）。ＰＤ−Ｌ１発現は、年齢、性別、喫煙状況、及び病期等の臨床的パラメーターとは関連していなかったが、その発現は、腫瘍組織学と関連しており、陽性ＰＤ−Ｌ１が、扁平上皮細胞癌におけるよりも腺癌でより頻繁に発現されることが指摘された（６３．８％対４５．３％、Ｐ＝０．０４２）。
【００７０】
Ｅ６発現及びＰＤ−Ｌ１発現の単独及び組み合わせと、全生存期間（ＯＳ）及び無再発生存期間（ＲＦＳ）との間に考えられる関連を、ＮＳＣＬＣ患者において調査した。カプラン・マイヤー分析により、陽性ＰＤ−Ｌ１腫瘍患者においては、陰性ＰＤ−Ｌ１腫瘍患者におけるよりも短い全生存期間及び無再発生存期間が観察されることが裏付けられた（全生存期間の場合にＰ＝０．００１、無再発生存期間の場合にＰ＝０．００３、図２Ｂ）が、Ｅ６癌タンパク質は、この研究集団において予後値を示さなかった（図２Ａ）。しかしながら、ＰＤ−Ｌ１発現及びＥ６発現の組み合わせは、全生存期間について予後値を有したが、無再発生存期間については有さなかった（全生存期間の場合にＰ＝０．０１７、無再発生存期間の場合にＰ＝０．１２１、図２Ｃ）。Ｃｏｘ回帰分析により、陽性ＰＤ−Ｌ１腫瘍患者が、陰性ＰＤ−Ｌ１腫瘍患者と比べてより短い全生存期間及び無再発生存期間を有することが更に確認された（全生存期間の場合に、ハザード比（ＨＲ）１．６９、９５％信頼区間１．０６〜２．６７、Ｐ＝０．０２６；無再発生存期間の場合に、ハザード比１．５５、９５％信頼区間０．９７〜２．４８、Ｐ＝０．０４５、表１）。陽性ＰＤ−Ｌ１腫瘍患者においては、陰性ＰＤ−Ｌ１腫瘍患者におけるよりも、５年生存率が低かった（全生存期間の場合に１０．０％対２７．３％、無再発生存期間の場合に８．６％対１３．３％、表１）。しかしながら、Ｅ６癌タンパク質は、この研究集団において予後値を示さなかった。興味深いことに、ＰＤ−Ｌ１陽性／Ｅ６陽性の組み合わせ及びＰＤ−Ｌ１陽性／Ｅ６陰性の組み合わせは、ＰＤ−Ｌ１陰性／Ｅ６陰性の組み合わせを参照として使用した場合に、全生存期間及び無再発生存期間について予後値を示した（表１）。全生存期間及び無再発生存期間についての最も低い５年生存率は、その他の３つの組み合わせと比較した場合に、ＰＤ−Ｌ１陽性／Ｅ６陽性の組み合わせを有する患者において観察された（全生存期間の場合に６．４％、無再発生存期間の場合に５．７％、表１）。これらの結果は、ＰＤ−Ｌ１発現を、ＨＰＶ感染によるＮＳＣＬＣにおける転帰不良の独立した予測因子として使用することができることを示唆している。
【００７１】
【表３】
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【００７２】
実施例４  Ｅ６癌タンパク質は、ＰＤ−Ｌ１発現を増大させ、ＨＰＶ感染による肺癌細胞におけるコロニー形成及び軟寒天増殖を促進する
本発明者らは、Ｅ６癌タンパク質発現が、ＰＤ−Ｌ１発現を増大させ、ＨＰＶ感染による肺癌細胞におけるコロニー形成及び軟寒天増殖を促進し得る可能性を調査した。ＨＰＶ１６型陽性ＴＬ−１細胞を、Ｅ６又はＥ７の小ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡでのトランスフェクションのために、そしてＥ６又はＥ７の発現ベクターでトランスフェクションされたＨＰＶ１６型陰性ＴＬ−４細胞との比較のために収集した。この比較は、Ｅ６癌タンパク質が、肺癌細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現の要因となるが、Ｅ７癌タンパク質は、その要因とならないかどうかを検証するものである（図３Ａ）。ウェスタンブロッティングにより、Ｅ６及びＥ７のタンパク質発現が、Ｅ６又はＥ７の操作によって予想通りに減少及び増大したことが指摘された（図３Ａ）。興味深いことに、ＰＤ−Ｌ１発現は、ＴＬ−１細胞におけるＥ６ノックダウンによって顕著に減少したが、それは、ＴＬ−４細胞におけるＥ６過剰発現によって増大した（図３Ａ）。ＰＤ−Ｌ１発現は、Ｅ７の操作では両方の細胞型において不変であった（図３Ａ）。ＨＰＶ１６型陽性及びＨＰＶ１６型陰性の子宮頚部ＳｉＨａ細胞及びＣ３３Ａ細胞を同じ処置に供したものには同様の応答が見られた（図３Ａ）。これらの結果は、Ｅ６癌タンパク質が、ＨＰＶ感染による肺癌細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現の要因となり得るが、Ｅ７癌タンパク質は、その要因となり得ないことを示唆している。
【００７３】
次に本発明者らは、ＰＤ−Ｌ１発現のＥ６による操作が、肺癌細胞におけるコロニー形成及び軟寒天増殖についての能力を減衰させ得るかどうかを調査した。寒天プレートにおける代表的なコロニー増殖及び軟寒天プレートにおける軟寒天増殖コロニーが、図２Ｂ（上方のパネル）に示されている。コロニー形成及び軟寒天増殖の能力は、ＴＬ−１細胞におけるＥ６ノックダウンによって顕著に減少されたが、両方の能力は、ＴＬ−４細胞におけるＥ６過剰発現によって有意に増大された（図３Ｂ）。しかしながら、Ｅ６癌タンパク質によるコロニー形成能及び軟寒天増殖能の増大は、ＴＬ−４細胞におけるＰＤ−Ｌ１ノックダウンによってほぼ完全に回復された（図３Ｂ）。ＳｉＨａ子宮頚癌細胞及びＣ３３Ａ子宮頚癌細胞を同じ処置に供したものにおいて同様の所見が観察された（図３Ｂ）。これらの結果は、Ｅ６に媒介されるＰＤ−Ｌ１発現が、ＨＰＶ感染による肺癌細胞におけるコロニー形成及び軟寒天増殖の要因となり得ることを明らかに示している。
【００７４】
実施例５  抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体＋Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチンは、ヌードマウスにおけるＴＬ−１細胞によって誘導された皮下腫瘍増殖をほぼ完全に抑制する
抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体は、持続的な腫瘍抑制及び進行したＮＳＣＬＣにおける臨床的利益をもたらし得る（１５）。したがって、ＰＤ−Ｌ１がＨＰＶ感染による肺癌におけるＥ６に媒介されるコロニー形成及び軟寒天増殖の要因となり得るという所見（図２）は、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体＋Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチンの組合せ物が、ヌードマウスにおけるＴＬ−１細胞により誘導された腫瘍増殖に対する優れた抑制効果を有し得ることを示唆した。ヌードマウスを、それぞれ５匹のヌードマウスの７つの群に無作為に分け、それらのマウスにＴＬ−１細胞を注射し、次いで、それらのマウスを、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチン、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチン、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体＋Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチン、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体＋Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチン、又は抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体＋Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６／Ｅ７ワクチンのいずれかで処置した。コントロール群のマウスは、ＴＬ−１細胞で処置しただけであった。各群における代表的な腫瘍量が図４に示されている。ＴＬ−１細胞によって誘導された皮下腫瘍量は、コントロール群と比較して、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体＋Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチン又は抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体＋Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６／Ｅ７ワクチンではほぼ完全に抑制された。しかしながら、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチン群においては、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体群又は抗ＰＤ−Ｌ１＋Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチン群におけるよりも高い抗腫瘍活性が観察された。ＴＬ−１細胞によって誘導された腫瘍は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチン処置によってほぼ不変であった（図４）。これらの結果は、その細胞モデルの所見を裏付けており、ＰＤ−Ｌ１が、ＨＰＶ感染による癌におけるＥ６に媒介される腫瘍増殖及び転移の要因となり得ることが指摘された。
【００７５】
実施例６  ヌードマウスにおけるＴＬ−１細胞により誘導された転移性肺腫瘍結節は、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体＋Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチンの組み合わせ療法によって効果的に抑制される
さらに本発明者らは、経尾静脈動物モデルを用いて、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体＋Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６の組合せ物が、ヌードマウスにおけるＴＬ−１細胞により誘導された転移性肺腫瘍結節形成を抑制し得るかどうかを検証した。実験は、７７日間で中止した。各群におけるＴＬ−１細胞によって誘導された代表的な転移性肺腫瘍結節を、ＳｉＨａ細胞によって誘導されたものと比較した。腫瘍は、Ｈ＆Ｅ染色によって確認した（図５Ａ）。各群の肺腫瘍結節についての代表的な免疫染色結果により、これらの肺腫瘍結節におけるＰＤ−Ｌ１及びＥ６の発現が、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体とＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチンによって、コントロール群と比較して有意に抑制されることが示された。ＴＬ−１細胞によって誘導された転移性肺腫瘍結節の数は、コントロール群と比較して、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体＋Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチンによって最も抑制され、続いて、Ｅ６ワクチン、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体、抗ＰＤ−Ｌ１＋Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチン、及びＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチンによって抑制された（図５Ａ）。同じ処置に供したヌードマウスにおけるＳｉＨａ細胞によって誘導された転移性肺腫瘍結節においては、同様の所見が観察された（図５Ｂ）。
【００７６】
ＴＬ−１細胞が注射されたコントロールマウスの体重は、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチン、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体＋Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチン、及び抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体＋Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチンが注射されたマウスよりも有意に低かったが、それらは、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチン処置を受けたマウスと相違しなかった。同じ処置に供したＳｉＨａ細胞が注射されたマウスの体重に関して同様の観察がなされた。ＴＬ−１細胞又はＳｉＨａ細胞が注射されたヌードマウスの生存日数は、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体＋Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチンの組合せ物によって、コントロール群と比較して有意に延長された（図６）。５匹のマウスのうち３匹は、ＴＬ−１細胞及びＳｉＨａ細胞で処置された抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体＋Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチン群及び抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体＋Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチン群において７７日目で生存していた。最後のマウスは、ＴＬ−１細胞及びＳｉＨａ細胞で処置されたコントロール群において、それぞれ４９日目及び５８日目に死んだ。ＴＬ−１細胞が注射されたヌードマウスの生存日数は、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体＋Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチンの場合に、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体＋Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチン、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチン、又は抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体と比較して有意に延長された（抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体＋Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチンの場合にＰ＝０．００４、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチンの場合にＰ＝０．０３７、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体の場合にＰ＝０．０４３、図６）。これらの結果は、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体＋Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ６ワクチンが、ＨＰＶ感染による肺癌及び子宮頚癌における転移性肺腫瘍結節形成を抑制し、したがってこれらのマウスの生存を延長させるのに最も高い潜在力を有することを示唆している。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ−１】
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【図３Ｂ−２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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