(57)【要約】ジャガイモ栽培品種Ｘ１７が開示される。本発明は、Ｘ１７の塊茎、種子、植物体、その一部、Ｘ１７から作製された食品製品、およびＸ１７をそれ自体とまたは別のジャガイモ品種と交配することによって生じる植物体を得るための方法に関する。本発明は、遺伝子材料内に１つまたは複数の導入遺伝子を含有するジャガイモ植物体を得る方法、ならびにそれらの方法によって得たトランスジェニック植物体および植物体の一部にも関する。本発明は、Ｘ１７に由来するジャガイモ栽培品種または栽培品種および植物体の一部の育種、Ｘ１７に由来する他のジャガイモ栽培品種、系統または植物体の一部を生じるための方法、ならびにそれら方法の使用に由来するジャガイモ植物体、品種、およびその一部にも関する。本発明はさらに、Ｘ１７を別のジャガイモ栽培品種と交配することによって生じるハイブリッドジャガイモの塊茎、種子、植物体およびその一部に関する。
2018529364.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
代表的な試料がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２２４８の下で寄託されている、ジャガイモ栽培品種Ｘ１７のジャガイモの塊茎または塊茎の一部。
【請求項２】
請求項１に記載の塊茎または塊茎の一部を成長させることによって生じたジャガイモ植物体またはその一部。
【請求項３】
請求項２に記載の植物体の生理的特性および形態学的特性の全てを有するジャガイモ植物体であって、内在性アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子および内在性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復と、それに加えて、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子およびジキナーゼＲ１遺伝子の内在性ジャガイモプロモーターの逆方向反復とを含有する、栽培品種Ｘ１７に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入断片領域を含み、ジャガイモ疫病抵抗性遺伝子Ｒｐｉ−ｖｎｔ１と、内在性液胞インベルターゼ遺伝子ＶＩｎｖの発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復とを含有する、Ｘ１７に存在するｐＳＩＭ１６７８の挿入断片領域をさらに含む、ジャガイモ植物体。
【請求項４】
請求項２に記載の植物体から生じた細胞の組織培養物であって、前記組織培養物の前記細胞が、葉、花粉、胚、子葉（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）、胚軸、分裂組織細胞、根、根端、雌ずい、葯、花、茎および塊茎からなる群から選択される植物体の一部から生じ、前記組織培養された細胞が、内在性アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子および内在性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復と、それに加えて、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子およびジキナーゼＲ１遺伝子の内在性ジャガイモプロモーターの逆方向反復とを含有する、栽培品種Ｘ１７に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入断片領域を含み、ジャガイモ疫病抵抗性遺伝子Ｒｐｉ−ｖｎｔ１と、内在性液胞インベルターゼ遺伝子ＶＩｎｖの発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復とを含有する、Ｘ１７に存在するｐＳＩＭ１６７８の挿入断片領域をさらに含む、組織培養物。
【請求項５】
請求項４に記載の組織培養物から再生されたジャガイモ植物体であって、ジャガイモ栽培品種Ｘ１７の生理的特性および形態学的特性の全てを有する、ジャガイモ植物体。
【請求項６】
請求項１に記載のジャガイモの塊茎または塊茎の一部を成長させることによって生じたジャガイモの種子であって、内在性アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子および内在性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復と、それに加えて、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子およびジキナーゼＲ１遺伝子の内在性ジャガイモプロモーターの逆方向反復とを含有する、栽培品種Ｘ１７に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入断片領域を含み、ジャガイモ疫病抵抗性遺伝子Ｒｐｉ−ｖｎｔ１と、内在性液胞インベルターゼ遺伝子ＶＩｎｖの発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復とを含有する、Ｘ１７に存在するｐＳＩＭ１６７８の挿入断片領域をさらに含む、ジャガイモの種子。
【請求項７】
請求項６に記載の種子を成長させることによって生じたジャガイモ植物体またはその一部。
【請求項８】
請求項７に記載のジャガイモ植物体の組織培養物から再生されたジャガイモ植物体であって、内在性アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子および内在性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復と、それに加えて、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子およびジキナーゼＲ１遺伝子の内在性ジャガイモプロモーターの逆方向反復とを含有する、栽培品種Ｘ１７に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入断片領域を含み、ジャガイモ疫病抵抗性遺伝子Ｒｐｉ−ｖｎｔ１と、内在性液胞インベルターゼ遺伝子ＶＩｎｖの発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復とを含有する、Ｘ１７に存在するｐＳＩＭ１６７８の挿入断片領域をさらに含む、再生されたジャガイモ植物体。
【請求項９】
ジャガイモの種子を生じさせるための方法であって、２種のジャガイモ植物体を交配するステップと、得られたジャガイモの種子を収穫するステップとを含み、少なくとも一方のジャガイモ植物体が請求項２に記載のジャガイモ植物体である、方法。
【請求項１０】
ジャガイモの種子を生じさせるための方法であって、２種のジャガイモ植物体を交配するステップと、得られたジャガイモの種子を収穫するステップとを含み、少なくとも一方のジャガイモ植物体が請求項７に記載のジャガイモ植物体である、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法によって生じたジャガイモの種子であって、内在性アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子および内在性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復と、それに加えて、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子およびジキナーゼＲ１遺伝子の内在性ジャガイモプロモーターの逆方向反復とを含有する、栽培品種Ｘ１７に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入断片領域を含み、ジャガイモ疫病抵抗性遺伝子Ｒｐｉ−ｖｎｔ１と、内在性液胞インベルターゼ遺伝子ＶＩｎｖの発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復とを含有する、Ｘ１７に存在するｐＳＩＭ１６７８の挿入断片領域をさらに含む、ジャガイモの種子。
【請求項１２】
請求項１１に記載のジャガイモの種子を成長させることによって生じたジャガイモ植物体またはその一部。
【請求項１３】
請求項１２に記載の植物から生じたジャガイモの種子であって、内在性アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子および内在性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復と、それに加えて、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子およびジキナーゼＲ１遺伝子の内在性ジャガイモプロモーターの逆方向反復とを含有する、栽培品種Ｘ１７に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入断片領域を含み、ジャガイモ疫病抵抗性遺伝子Ｒｐｉ−ｖｎｔ１と、内在性液胞インベルターゼ遺伝子ＶＩｎｖの発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復とを含有する、Ｘ１７に存在するｐＳＩＭ１６７８の挿入断片領域をさらに含む、ジャガイモの種子。
【請求項１４】
前記ジャガイモ植物体の一方がジャガイモ栽培品種Ｘ１７であり、第２のジャガイモ植物体がトランスジェニックである、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
ジャガイモの種子を生じさせる方法であって、２種のジャガイモ植物体を交配するステップと、得られたジャガイモの種子を収穫するステップとを含み、前記ジャガイモ植物体の一方が請求項７に記載のジャガイモ植物体であり、第２のジャガイモ植物体がトランスジェニックである、方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法によって生じた種子を成長させることによって生じたジャガイモ植物体またはその一部であって、内在性アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子および内在性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復と、それに加えて、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子およびジキナーゼＲ１遺伝子の内在性ジャガイモプロモーターの逆方向反復とを含有する、栽培品種Ｘ１７に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入断片領域を含み、ジャガイモ疫病抵抗性遺伝子Ｒｐｉ−ｖｎｔ１と、内在性液胞インベルターゼ遺伝子ＶＩｎｖの発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復とを含有する、Ｘ１７に存在するｐＳＩＭ１６７８の挿入断片領域をさらに含む、ジャガイモ植物体またはその一部。
【請求項１７】
ジャガイモ栽培品種Ｘ１７に所望の形質を導入する方法であって、
（ａ）塊茎の代表的な試料がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２２４８の下で寄託されているＸ１７植物体を、所望の形質を含む別のジャガイモ栽培品種の植物と交配して後代植物体を生じさせるステップであり、前記所望の形質が、雄性不稔性、除草剤抵抗性、昆虫抵抗性、脂肪酸代謝の改変、炭水化物代謝の改変、および細菌による病害、真菌による病害、またはウイルスによる病害に対する抵抗性からなる群から選択されるステップと、
（ｂ）前記所望の形質を有する１つまたは複数の後代植物体を選択するステップと、
（ｃ）選択された後代植物体をＸ１７植物体と戻し交配して戻し交配後代植物体を生じさせるステップと、
（ｄ）前記所望の形質を有する戻し交配後代植物体を選択するステップと、
（ｅ）ステップ（ｃ）および（ｄ）を２回またはそれよりも多く連続して繰り返して、前記所望の形質を含む選択された第３またはその後の戻し交配後代植物体を生じさせるステップと
を含む方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法によって生じたジャガイモ植物体であって、所望の形質を有し、内在性アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子および内在性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復と、それに加えて、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子およびジキナーゼＲ１遺伝子の内在性ジャガイモプロモーターの逆方向反復とを含有する、栽培品種Ｘ１７に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入断片領域を含み、ジャガイモ疫病抵抗性遺伝子Ｒｐｉ−ｖｎｔ１と、内在性液胞インベルターゼ遺伝子ＶＩｎｖの発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復とを含有する、Ｘ１７に存在するｐＳＩＭ１６７８の挿入断片領域をさらに含む、ジャガイモ植物体。
【請求項１９】
前記所望の形質が除草剤抵抗性であり、前記抵抗性が、イミダゾリノン、スルホニル尿素、グリホサート、グルホシネート、Ｌ−ホスフィノトリシン、トリアジンおよびベンゾニトリルからなる群から選択される除草剤に対して付与される、請求項１８に記載のジャガイモ植物体。
【請求項２０】
前記所望の形質が昆虫抵抗性であり、前記昆虫抵抗性が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ内毒素をコードする導入遺伝子によって付与される、請求項１８に記載のジャガイモ植物体。
【請求項２１】
前記所望の形質が脂肪酸代謝の改変または炭水化物代謝の改変であり、前記所望の形質が、フルクトシルトランスフェラーゼ、レバンスクラーゼ、α−アミラーゼ、インベルターゼおよびデンプン分枝酵素からなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸またはステアリル−ＡＣＰデサチュラーゼのアンチセンスをコードするＤＮＡによって付与される、請求項１８に記載のジャガイモ植物体。
【請求項２２】
植物商品を作製する方法であって、請求項２に記載の植物またはその一部を得るステップと、前記植物体またはその植物体の一部から前記植物商品を作製するステップとを含み、前記植物商品が、生ホールポテト、フレンチフライ、ポテトチップ、乾燥ジャガイモ材料、ジャガイモフレークおよびジャガイモ顆粒からなる群から選択される、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法によって作製された植物商品であって、内在性アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子および内在性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復と、それに加えて、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子およびジキナーゼＲ１遺伝子の内在性ジャガイモプロモーターの逆方向反復とを含有する、栽培品種Ｘ１７に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入断片領域を含み、ジャガイモ疫病抵抗性遺伝子Ｒｐｉ−ｖｎｔ１と、内在性液胞インベルターゼ遺伝子ＶＩｎｖの発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復とを含有する、Ｘ１７に存在するｐＳＩＭ１６７８の挿入断片領域をさらに含む、植物商品。
【請求項２４】
請求項１に記載のジャガイモの塊茎から作られた食品製品。
【請求項２５】
スライスされたジャガイモの塊茎食品製品である、請求項１に記載のジャガイモの塊茎から作られた食品製品。
【請求項２６】
フレンチフライまたはチップである、請求項１に記載のジャガイモの塊茎から作られた食品製品。
【請求項２７】
請求項１に記載のジャガイモの塊茎から得られた、加熱加工された塊茎製品。
【請求項２８】
請求項１に記載のジャガイモの塊茎から得られた、加熱加工された塊茎製品であって、フレンチフライ、チップ、およびベークドポテトからなる群から選択される、加熱加工された塊茎製品。
【請求項２９】
請求項１に記載のジャガイモの塊茎から得られた、加熱加工された塊茎製品であって、フレンチフライ、チップ、およびベークドポテトからなる群から選択され、栽培品種Ｘ１７に存在するｐＳＩＭ１２７８およびｐＳＩＭ１６７８の挿入断片領域を含まない対照ジャガイモ植物体から得られる対照の加熱加工された塊茎製品のアクリルアミドの濃度よりも少なくとも５０％低い、６０％低い、７０％低い、８０％低い、８５％低い、またはそれを超えて低いアクリルアミドの濃度を有する、加熱加工された塊茎製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年１０月８日に出願された米国仮出願番号第６２／２３９，０６０号および２０１５年１１月１８日に出願された米国仮出願番号第６２／２５６，９４２号に基づく優先権の利益を主張しており、これら仮出願の各々の全体の内容は、すべての目的のためにそれらの全体が参考として本明細書によって援用される。
【０００２】
分野
本開示は、Ｘ１７と名付けられた新規のジャガイモ栽培品種、ならびにそのジャガイモ変種により生じる塊茎、植物体、植物体の一部、組織培養物、および種子に関する。本開示は、さらに、フレンチフライ、ポテトチップ、乾燥ジャガイモ材料、ジャガイモフレーク、およびジャガイモ顆粒などの、ジャガイモ栽培品種Ｘ１７から作製された食品製品に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ジャガイモは、世界で４番目に最も重要な食用作物であり、群を抜いて最も重要な野菜である。ジャガイモは現在、米国のほぼ全ての州で商業的に育てられている。年間のジャガイモ生産は米国では１８００万トン、世界的には３億トンを超える。ジャガイモの人気は、主にその多用性および栄養価に由来する。ジャガイモは、生で、凍結または乾燥させて使用することもでき、穀粉、デンプンまたはアルコールに加工することもできる。ジャガイモは、複合炭水化物を含有し、カルシウム、ナイアシンおよびビタミンＣが豊富である。
【０００４】
食品産業におけるジャガイモの品質は、以下の２つの重大な因子の影響を受ける：（１）ジャガイモは、揚げたときまたは焼いたときに急速に酸化されて発がん性生成物であるアクリルアミドを形成する非必須遊離アミノ酸であるアスパラギンを大量に含有すること、および（２）ジャガイモは、打撲を受けたジャガイモの損傷した色素体からポリフェノールオキシダーゼが漏出したときに起こる望ましくない事象である、酵素による褐変および変色を高度に受けやすいこと。細胞質では、この酵素によりフェノールが酸化され、次いでこれが急速に重合して濃い色素が生じる。塊茎は、リン酸化されたデンプンを大量に含有し、その一部は貯蔵中に分解されてグルコースおよびフルクトースが生じる。１２０℃を超える温度で加熱すると、これらの還元糖がアミノ酸と反応してアクリルアミドを含めたメイラード生成物を形成する。２種の酵素、水ジキナーゼ（ｗａｔｅｒ  ｄｉｋｉｎａｓｅ）Ｒ１およびホスホリラーゼ−Ｌ（Ｒ１およびＰｈＬ）がデンプンリン酸化に関与する。褐変はまた、デンプンのグルコースおよびフルクトースへの部分分解の結果として、非酵素的にも誘発される。
【０００５】
多くのジャガイモ栽培品種は、真菌様卵菌病原体Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓによって引き起こされる壊滅的な病害である疫病にかかりやすい。ジャガイモの疫病は、急速に拡大し、壊死性になる可能性がある葉および茎の黒色／褐色病変によって同定される。Ｐ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓが宿主作物において急速に成長し、生殖すると、重症の疫病伝染病が発生する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
開示の要旨
したがって、毒性化合物のレベルが低下し、病害に対する抵抗性が増大しているが、未知または外来核酸は使用されていないジャガイモ品種を開発する必要がある。本開示は、この必要性を満たす。
【０００７】
前述の関連技術の例およびそれに関連する限定は、例示的なものであり、排他的なものではないものとする。関連技術の他の限定は、本明細書を読めば当業者には明らかになろう。
【０００８】
したがって、当技術分野において、アクリルアミド含有量が少なく、打撲黒斑耐性が増大しており、還元糖が減少しており、かつ、疫病に対する抵抗性が増大している塊茎を生じるジャガイモ植物体変種が必要とされている。
【０００９】
以下の実施形態およびその態様は、例示的なものであり、範囲を限定するものではないものとする、システム、ツールおよび方法と併せて記載されている。種々の実施形態では、上記の問題の１つまたは複数が低減または排除されており、一方、他の実施形態は、他の改善を対象とする。
【００１０】
この目的のために、本発明は、ジャガイモ植物体ゲノムに対してネイティブであり、外来ＤＮＡ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＤＮＡ、ウイルスマーカーまたはベクター骨格配列を含有しない核酸配列で形質転換された新規のジャガイモ変種Ｘ１７を提供する。もっと正確に言えば、ジャガイモ変種Ｘ１７のゲノムに挿入されるＤＮＡは、打撲黒斑の発現、アスパラギンの蓄積および老化により甘くなることに関与する遺伝子をサイレンシングする、ジャガイモに対してネイティブであるまたはジャガイモ有性生殖適合性植物である野生ジャガイモに対してネイティブである非コードポリヌクレオチドである。
【００１１】
したがって、一実施形態では、本開示は、アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子（ｆＡｓｎ１）の断片およびポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の３’−非翻訳配列をアンチセンス方向に含むＤＮＡセグメントを２コピー含有する第１のサイレンシングカセットと、ジャガイモホスホリラーゼ−Ｌ（ｐＰｈＬ）遺伝子の断片およびジャガイモＲ１遺伝子の断片をアンチセンス方向に含むＤＮＡセグメントを２コピー含有する第２のサイレンシングカセットとを含む、ｐＳＩＭ１２７８と称される植物ベクターを提供する。ｐＳＩＭ１２７８ベクターは、植物の形質転換の前の植物ＤＮＡの維持を支持し、植物細胞の形質転換の際に植物細胞に移入されない、９，５１２ｂｐの骨格領域と、形質転換の際に植物細胞のゲノムに安定に組み込まれるネイティブなＤＮＡを含む、１０，１４８ｂｐのＤＮＡ挿入断片領域とを含む。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、Ｒｐｉ−ｖｎｔ１発現カセットと、植物液胞インベルターゼ遺伝子ＶＩｎｖに対するサイレンシングカセットとを含む、ｐＳＩＭ１６７８と称される第２の植物ベクターを提供する。Ｒｐｉ−ｖｎｔ１遺伝子カセットは、広範な疫病に対する抵抗性を付与する、そのネイティブなプロモーター配列およびターミネーター配列によって調節されるＶＮＴ１タンパク質コード領域からなり、一方、サイレンシングカセットは、対向する植物プロモーター、ｐＧｂｓｓおよびｐＡｇｐで挟まれた、ジャガイモＶＩｎｖ遺伝子由来の配列の逆方向反復からなる。ｐＳＩＭ１６７８ベクターは、植物の形質転換の前の植物ＤＮＡの維持を支持し、植物細胞の形質転換の際に植物細胞に移入されない、９，５１２ｂｐの骨格領域と、形質転換の際に植物細胞のゲノムに安定に組み込まれるネイティブなＤＮＡを含む、９，０９０ｂｐのＤＮＡ挿入断片領域とを含む。
【００１３】
異なる実施形態では、本発明は、本発明の植物ベクターの一方または両方で形質転換された植物細胞を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、本発明のベクターで形質転換された１つまたは複数の細胞を含むジャガイモ植物体変種を提供する。本発明の一態様では、ジャガイモ植物体変種は、ベクターｐＳＩＭ１２７８の２つのサイレンシングカセットのうちの少なくとも一方を発現し、かつ、ベクターｐＳＩＭ１６７８のサイレンシングカセットを発現し、これらのサイレンシングカセットの発現により、当該植物体の塊茎におけるアスパラギンシンテターゼ−１遺伝子、ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子および液胞インベルターゼ遺伝子の下方制御がもたらされる。本発明の好ましい態様では、少なくとも１つのサイレンシングカセットを発現するジャガイモ植物体変種の塊茎は、同じ変種の形質転換されていない植物体の塊茎には存在しない２つまたはそれよりも多い望ましい形質を示す。本発明の最も好ましい態様では、２つまたはそれよりも多い望ましい形質は、アスパラギンの低蓄積、打撲黒斑の減少、熱により誘導されるアクリルアミド形成の減少および貯蔵中の還元糖の蓄積の減少からなる群から選択される。
【００１４】
本発明の異なる態様では、ジャガイモ植物体変種は、植物ＤＮＡベクターｐＳＩＭ１２７８の両方のサイレンシングカセットを発現し、かつ、ベクターｐＳＩＭ１６７８のサイレンシングカセットを発現し、サイレンシングカセットの発現により、ジャガイモ植物体変種の塊茎におけるアスパラギンシンテターゼ−１遺伝子、ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子、ジキナーゼＲ１遺伝子および液胞インベルターゼ遺伝子の下方制御がもたらされる。本発明の好ましい態様では、植物ＤＮＡベクターｐＳＩＭ１２７８の２つのサイレンシングカセットを発現し、かつ、ベクターｐＳＩＭ１６７８のサイレンシングカセットを発現するジャガイモ植物体変種の塊茎は、同じ変種の形質転換されていない植物体の塊茎には存在しない２つまたはそれよりも多い望ましい形質を示す。好ましい実施形態では、２つまたはそれよりも多い望ましい形質は、アスパラギンの低蓄積、打撲黒斑の減少、貯蔵中の還元糖の蓄積の減少および熱により誘導されるアクリルアミド形成の減少からなる群から選択される。本発明の一態様では、植物ＤＮＡベクターｐＳＩＭ１２７８の２つのサイレンシングカセットおよび植物ＤＮＡベクターｐＳＩＭ１６７８のサイレンシングカセットを発現するジャガイモ植物体変種は、Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔ  Ｘ１７変種である。
【００１５】
本発明の別の態様では、本発明のジャガイモ植物体変種Ｘ１７は、植物ＤＮＡベクターｐＳＩＭ１６７８の疫病抵抗性遺伝子（Ｒｐｉ−ｖｎｔ１）を発現する。本発明の別の態様では、本発明のジャガイモ植物体変種Ｘ１７は、疫病感染に対する抵抗性が増大している。
【００１６】
したがって、本発明によると、Ｘ１７と名付けられた、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  Ｌ．の属および種の新しいジャガイモ栽培品種が提供される。したがって、この発明は、ジャガイモ栽培品種Ｘ１７、ジャガイモ栽培品種Ｘ１７の塊茎、ジャガイモ栽培品種Ｘ１７の植物体、ジャガイモ栽培品種Ｘ１７の種子、ジャガイモ栽培品種Ｘ１７から作製された食品製品、およびジャガイモ栽培品種Ｘ１７の自殖によってまたはジャガイモ栽培品種Ｘ１７と別のジャガイモ栽培品種との交配によって生じるジャガイモ植物体を生じさせるための方法、およびジャガイモ栽培品種Ｘ１７の変異誘発または形質転換によるバリアントの創出に関する。
【００１７】
したがって、栽培変種Ｘ１７を使用する、自殖、戻し交配、ハイブリッド作製、個体群への交配などの方法はいずれも本発明の実施形態である。ジャガイモ栽培変種Ｘ１７が少なくとも一方の親として使用されて生じた植物体は全てこの発明の範囲内に入る。有利に、当該ジャガイモ栽培変種を他の異なるジャガイモ植物体との交配に使用して、優れた特性を有する第１世代（Ｆ１）ジャガイモハイブリッド塊茎、種子および植物体を生じさせることができる。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、単一のまたは多数の遺伝子変換されたジャガイモ栽培品種Ｘ１７の植物体を提供する。一実施形態では、移入される遺伝子（単数または複数）は、優性対立遺伝子（単数または複数）であっても劣性対立遺伝子（単数または複数）であってもよい。一部の実施形態では、移入される遺伝子（単数または複数）により、除草剤抵抗性、昆虫抵抗性、細菌、真菌、またはウイルスによる病害に対する抵抗性、雄性稔性、雄性不稔性、栄養品質の増強、デンプンおよび他の炭水化物の濃度の均一性および上昇、打撲を受ける傾向の減少、ならびにデンプンが糖に変換される速度の低下などの形質が付与される。遺伝子（単数または複数）は、天然に存在するジャガイモ遺伝子であってもよく、遺伝子工学の技法、戻し交配または変異によって導入された導入遺伝子であってもよい。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、ジャガイモ栽培品種Ｘ１７の組織培養物に使用するための再生可能な細胞を提供する。一実施形態では、組織培養物は、前述のジャガイモ植物体の全ての生理的特性および形態学的特性を有する植物を再生することができ、かつ、前述のジャガイモ植物体と実質的に同じ遺伝子型を有する植物を再生することができるものである。一部の実施形態では、そのような組織培養物中の再生可能な細胞は、胚、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、雌ずい、子葉（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）、胚軸、根、根端、花、種子、葉柄、塊茎、芽または茎である。さらに、本発明は、本発明の組織培養物から再生されたジャガイモ植物体を提供する。
【００２０】
さらなる実施形態では、本発明は、ジャガイモ植物体品種Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔ  Ｘ１７の塊茎から作られた食品製品を提供する。食品製品は、加熱加工された製品であることが好ましい。食品製品は、生ホールポテト、フレンチフライ、ポテトチップ、乾燥ジャガイモ材料、ジャガイモフレーク、またはジャガイモ顆粒であることがなおより好ましい。
【００２１】
上記の例示的な態様および実施形態に加えて、以下の説明を考察することにより、さらなる態様および実施形態が明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクターを示す。左側のベクター骨格領域は、１０，１４９ｂｐの位置で始まり、１９，６６０ｂｐの位置で終わる、９，５１２ｂｐの長さである。骨格ＤＮＡは、主に、植物の形質転換の前のＤＮＡ挿入断片の維持の支持をもたらす細菌ＤＮＡからなる。隣接境界配列を含めたＤＮＡ挿入断片領域（右側）は、１０，１４８ｂｐの長さである（１ｂｐから１０，１４８ｂｐまで）。ＤＮＡ挿入断片は、形質転換の際にジャガイモゲノムに安定に組み込まれた。
【００２３】
【図２】図２は、ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクターに挿入したＤＮＡ挿入断片内のサイレンシングカセットの略図を提供する。各サイレンシングカセットは、スペーサーによって分離された、２コピーの２つの遺伝子断片を含有する。２コピーの、標的化された４つの遺伝子、すなわち、Ａｓｎ−１、Ｐｐｏ−５、ＰｈｌおよびＲ１の断片を含むＤＮＡセグメントを、Ｐｒｏで示される、主に塊茎において活性である２つの収束プロモーターの間に逆方向反復として挿入した。結果として得られる、サイレンシングカセットを含有する植物体は、塊茎において、意図された標的遺伝子を動的にかつ勢いよくサイレンシングする、ＲＮＡ分子の多様かつポリアデニル化されていないアレイを生じる。収束転写（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）により、衝突転写（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）がもたらされるので、ＲＮＡ分子のサイズは、一般に、使用した２つのプロモーター間の距離よりも小さかった。
【００２４】
【図３】図３は、本発明のｐＳＩＭ１６７８形質転換ベクターを示す。左側のベクター骨格領域は、９，０９１ｂｐの位置で始まり、１８，６０２ｂｐの位置で終わる、９，５１２ｂｐの長さである。骨格ＤＮＡは、主に植物の形質転換の前のＤＮＡ挿入断片の維持の支持をもたらす細菌ＤＮＡからなる。隣接境界配列を含めたＤＮＡ挿入断片領域（右側）は、９，０９０ｂｐの長さである（１ｂｐから９，０９０ｂｐまで）。ＤＮＡ挿入断片は、ネイティブなＤＤＡのみからなり、形質転換の際にジャガイモゲノムに安定に組み込まれた。
【００２５】
【図４】図４は、ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクターに挿入したＤＮＡ挿入断片内のサイレンシングカセット（上の構築物）およびｐＳＩＭ１６７８形質転換ベクターに挿入したＤＮＡ挿入断片内のサイレンシングカセット（下の構築物）の略図である。
【００２６】
【図５】図５は、表１および表２に記載のＤＮＡ配列を利用する、プラスミドｐＳＩＭ１２７８を構築するためのプロセスを例示する。出発ベクター、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１は、最終的なｐＳＩＭ１２７８骨格における複製起点を含有する。
【００２７】
【図６】図６は、ｐＳＩＭ１２７８におけるＴ−ＤＮＡ発現カセットの構築を例示する。融合ＰＣＲを使用して、エレメント１Ａ（ｐＡｇｐ−第１のコピー）、１Ｂ（ｐＡｇｐ−第２のコピー）、２（Ａｓｎ１、Ｐｐｏ５）、３（Ｐｐｏ５、Ａｓｎ１）、４（ｐＧｂｓｓ−第１のコピー）および７（スペーサー１、Ｐｐｏ５、Ａｓｎ１）を増幅した。エレメント５（ＰｈＬ、Ｒ１）および６（スペーサー２、Ｒ１、ＰｈＬ、ｐＧｂｓｓ）は、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）により、ジャガイモゲノム由来の配列に基づいて合成された。エレメント８、９、および１０は、図に示されている構成要素をライゲーションすることによって作出した。最後に、３つの断片、１０、１１および６を所望の発現カセットにまたがるように創出した。これらの３つの断片をライゲーションし、図５に示されているＫｐｎＩ−ＳａｃＩ制限部位に挿入してｐＳＩＭ１２７８を作出した。
【００２８】
【図７】図７は、表３および表４に記載のＤＮＡ配列を利用する、プラスミドｐＳＩＭ１６７８を構築するためのプロセスを例示する。出発ベクター、ｐＳＩＭ１２７８は、最終的なｐＳＩＭ１６７８骨格を含有する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
詳細な説明
定義
以下の説明および表では、いくつもの用語が使用されている。そのような用語に与えられる範囲を含め、本明細書および特許請求の範囲の明瞭かつ一貫した理解をもたらすために以下の定義を提供する。
【００３０】
用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つまたは複数のその実体を指す。例えば、「１つの（ａ）プライマー」とは、１つまたは複数のプライマーまたは少なくとも１つのプライマーを指す。そのように、用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つまたは複数の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」および「少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」は、本明細書では互換的に使用される。さらに、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」による「１つの要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」への言及は、文脈により、その要素がただ１つのみ存在することが明らかに必要とされている場合を除き、その要素が１つ超存在する可能性を除去するものではない。
【００３１】
対立遺伝子。「対立遺伝子」は、１つの形質または特性に関する遺伝子の１つまたは複数の代替形態のいずれかである。二倍体の細胞または生物では、所与の遺伝子の２つの対立遺伝子は、相同染色体の対上の対応する遺伝子座を占有する。
【００３２】
アミノ酸配列。本明細書で使用される場合、植物から単離された、植物に対してネイティブな、もしくは植物において天然に存在する、または、合成により作製されたものであるが内在性対応物の核酸配列を含む、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質およびその断片を包含する。
【００３３】
人工的に操作された（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｅｄ）。本明細書で使用される場合、「人工的に操作された（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｅｄ）」は、操作されていない天然に存在する対応物と比較して異なる生物学的、生化学的、形態学的、または生理的表現型および／または遺伝子型を有する植物体または植物細胞が生じるように、植物体または植物細胞を、手によって、または機械的手段もしくは組換え手段によって、例えば、遺伝子工学技法によって、移動させる、配置する、操作する（ｏｐｅｒａｔｅ）または制御することを意味する。
【００３４】
無性繁殖。配偶子の融合を伴わない、葉挿し、茎挿し、根挿し、塊茎芽、匍匐枝、単一の植物細胞プロトプラスト、カルスなどから植物全体を作出することによって後代を生じさせること。
【００３５】
骨格。バイナリーベクターの、移入が意図されたＤＮＡ挿入断片配列以外の核酸配列。
【００３６】
戻し交配。「戻し交配」は、育種家が、雑種後代をまた親の一方と交配すること、例えば、第１世代雑種Ｆ１とＦ１雑種の親遺伝子型の一方との交配を繰り返すプロセスである。
【００３７】
細菌による輪腐病。細菌による輪腐病は、細菌Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ  ｓｓｐ．によって引き起こされる病害である。細菌による輪腐病の名称は、塊茎内の維管束輪の特徴的な崩壊に由来する。この輪が多くの場合クリーム色がかった黄色〜薄茶色のチーズのような腐敗として現れる。ジャガイモの外表面に関しては、重度な病害にかかっている塊茎では、わずかにへこみ、乾燥し、ひびの入った面が示される可能性がある。感染した塊茎の維管束組織における細菌による輪腐病の症状は、上記のものよりは明白ではない可能性があり、裂けた散発的に現れる黒い線として、または連続した黄色がかった変色としてのみ現れる。
【００３８】
打撲黒斑。打撲を受けた塊茎組織に見出される黒斑は、細胞が傷害を受けた後に生成され、組織に褐色、灰色または黒色の外観を生じさせるメラニンと称される色素の結果である。メラニンは、細胞損傷の結果としてフェノール基質と適切な酵素が互いと接触すると形成される。損傷は、細胞の破壊である必要はない。しかし、通常、組織が強い衝撃を受けた場合、基質と酵素の混合は必ず起こるはずである。黒斑は、主に導管輪（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｉｎｇ）の真下の髄周囲組織（ｐｅｒｉｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｔｉｓｓｕｅ）において起こるが、皮質組織の一部を含むほど大きい場合がある。
【００３９】
境界様配列。「境界様」配列は、改変しようとする選択された植物種から、または改変しようとする植物種に対して有性生殖適合性の植物から単離され、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの境界配列と同様に機能する。すなわち、本発明の境界様配列は、それが連結したポリヌクレオチドの組み込みを促進し、容易にするものである。本発明のＤＮＡ挿入断片は、境界様配列を含有することが好ましい。ＤＮＡ挿入断片の境界様配列は、５〜１００ｂｐの長さ、１０〜８０ｂｐの長さ、１５〜７５ｂｐの長さ、１５〜６０ｂｐの長さ、１５〜５０ｂｐの長さ、１５〜４０ｂｐの長さ、１５〜３０ｂｐの長さ、１６〜３０ｂｐの長さ、２０〜３０ｂｐの長さ、２１〜３０ｂｐの長さ、２２〜３０ｂｐの長さ、２３〜３０ｂｐの長さ、２４〜３０ｂｐの長さ、２５〜３０ｂｐの長さ、または２６〜３０ｂｐの長さの間である。ＤＮＡ挿入断片の左境界配列および右境界配列は、改変しようとする植物のゲノムから単離されたものであるか、かつ／または、改変しようとする植物のゲノムに対してネイティブなものである。ＤＮＡ挿入断片の境界様配列は、任意の公知のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のＴ−ＤＮＡの境界配列とは、ヌクレオチド配列が同一でない。したがって、ＤＮＡ挿入断片の境界様配列は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓなどのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種由来のＴ−ＤＮＡの境界配列とは異なるヌクレオチドを１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれ超有し得る。すなわち、ＤＮＡ挿入断片の境界、または本発明の境界様配列は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓなどのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種由来のＴ−ＤＮＡの境界配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％または少なくとも５０％の配列同一性を有するが、１００％の配列同一性は有さない。本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ挿入断片の境界」および「ＤＮＡ挿入断片の境界様」という説明的用語は、交換可能である。境界様配列は、植物のゲノムから単離することができ、ヌクレオチド配列を別のヌクレオチド配列に組み込むことが可能な効率が変化するように改変するかまたは変異させることができる。他のポリヌクレオチド配列を本発明の境界様配列に付加するまたは組み入れることができる。したがって、ＤＮＡ挿入断片の左境界またはＤＮＡ挿入断片の右境界は、５’多重クローニング部位および３’多重クローニング部位、または追加的な制限部位を有するように改変することができる。ＤＮＡ挿入断片の境界配列は、付随的なベクターに由来する骨格ＤＮＡが植物のゲノムに組み込まれない可能性が増大するように改変することができる。
【００４０】
から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）。ある特定の要素「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」組成物は、それらの要素、ならびに、本発明の組成物の基本的かつ新規の特性に実質的に影響を及ぼさない要素の包含に限定される。したがって、組成物が本発明の基本的かつ新規の特性に影響を及ぼさない、すなわち、選択された植物種にも選択された植物種に対して有性生殖適合性の植物にも由来するものではない外来ＤＮＡを含有しない限りは、その組成物は、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という言葉で特徴付けられる本発明の組成物の構成成分とみなすことができる。
【００４１】
子葉（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）。「子葉（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）」は、子葉（ｓｅｅｄ  ｌｅａｆ）の一種である。子葉（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）は、種子の養分貯蔵組織を含有する。
【００４２】
縮重プライマー。用語「縮重プライマー」は、類似しているが厳密な相同ではない配列とハイブリダイズした際の塩基ミスマッチに適応させることができる十分なヌクレオチド変動を含有するオリゴヌクレオチドである。
【００４３】
双子葉植物（双子葉類）。胚に子葉（ｓｅｅｄ  ｌｅａｆ）または子葉（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）を２つ有する顕花植物。双子葉類の例としては、これだけに限定されないが、タバコ、トマト、ジャガイモ、サツマイモ、キャッサバ、アルファルファおよびダイズを含めたマメ科植物、ニンジン、イチゴ、レタス、オーク、カエデ、クルミ、バラ、ミント、カボチャ、ヒナギク、およびサボテンが挙げられる。
【００４４】
ＤＮＡ挿入断片。本発明によれば、植物のゲノムに挿入されるＤＮＡ挿入断片は、その植物に対してネイティブなポリヌクレオチド配列を含むか、またはその植物に対してネイティブな遺伝子エレメントを有する。一実施例では、例えば、本発明のジャガイモ品種Ｘ１７のｐＳＩＭ１２７８由来のＤＮＡ挿入断片は、ジャガイモもしくは野生ジャガイモ、ジャガイモ有性生殖適合性の植物体に対してネイティブであり、形質転換の際に植物細胞のゲノムに安定に組み込まれ、打撲黒斑の発現、アスパラギンの蓄積、および老化により甘くなることに関与する遺伝子をサイレンシングする、非コードポリヌクレオチドである。ＤＮＡ挿入断片は、２つの発現カセットを含み、ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクターと称される形質転換ベクターに挿入されることが好ましい。第１のカセットは、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（Ａｇｐ）遺伝子のＡｇｐプロモーターと顆粒結合合成酵素（Ｇｂｓｓ）遺伝子のＧｂｓｓプロモーターの間に逆方向反復として配置された、アスパラギンシンテターゼ−１（Ａｓｎ１）遺伝子とポリフェノールオキシダーゼ−５（Ｐｐｏ５）遺伝子の両方の断片を含む。これらのプロモーターは、主に塊茎において活性である。第２のカセットの機能は、デンプン関連遺伝子ジキナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）およびホスホリラーゼ−Ｌ（ＰｈＬ）遺伝子のプロモーターをサイレンシングすることである。このカセットは、第１のカセットと同じＡｇｐプロモーターおよびＧｂｓｓプロモーターに作動可能に連結した、デンプン関連遺伝子ジキナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）およびホスホリラーゼ−Ｌ（ＰｈＬ）遺伝子のプロモーターの断片で構成される。第２のＤＮＡ挿入断片は、Ｒｐｉ−ｖｎｔ１発現カセットと、植物液胞インベルターゼ遺伝子ＶＩｎｖに対するサイレンシングカセットとを含む、ｐＳＩＭ１６７８と称される形質転換ベクターによってもたらされる。Ｒｐｉ−ｖｎｔ１遺伝子カセットは、広範な疫病に対する抵抗性を付与する、そのネイティブなプロモーター配列およびターミネーター配列によって調節されるＶＮＴ１タンパク質コード領域からなり、一方、サイレンシングカセットは、対向する植物プロモーター、ｐＧｂｓｓおよびｐＡｇｐで挟まれた、ジャガイモＶＩｎｖ遺伝子由来の配列の逆方向反復からなる。これらの発現カセットは、外来ＤＮＡを含有せず、選択された植物種または選択された植物種に対して有性生殖適合性の植物のいずれかのみに由来するＤＮＡからなる。
【００４５】
胚。胚は、成熟した種子中に含有される未成熟の植物体である。
【００４６】
外来。核酸に関して、「外来」は、その核酸が、非植物生物に由来する、または形質転換しようとする植物体と同じ種ではない植物体に由来する、または、形質転換しようとする植物体と交配できない植物体に由来しない、または標的植物体の種に属さないことを意味する。本発明によると、外来ＤＮＡまたはＲＮＡは、真菌、細菌、ウイルス、哺乳動物、魚類または鳥類の遺伝子構造には天然に存在するが、形質転換しようとする植物体には天然に存在しない核酸を表す。したがって、外来核酸は、例えば、形質転換された植物によって自然に産生されないポリペプチドをコードする核酸である。外来核酸は、タンパク質産物をコードする必要はない。本発明によると、所望の遺伝子内植物（ｉｎｔｒａｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔ）は、そのゲノム内にいかなる外来核酸も組み込まれていない植物である。
【００４７】
遺伝子。本明細書で使用される場合、「遺伝子」は、コード領域を指し、その領域の５’側または３’側のヌクレオチド配列を含まない。機能的な遺伝子は、プロモーターまたはターミネーターに作動可能に連結したコード領域である。遺伝子は、異なる種に由来するか同じ種に由来するかにかかわらず、種のゲノムに、形質転換または種々の育種方法を使用して導入することができる。
【００４８】
遺伝子変換された（変換）。遺伝子変換された（変換）植物は、戻し交配技法によって、遺伝子工学によって、または変異によって、ある品種の所望の形態学的特性および生理的特性の基本的に全てを、当該品種に移入される１つまたは複数の遺伝子に加えて回復させる、戻し交配と称される植物育種技法によって開発された植物を指す。１つまたは複数の遺伝子座も移入することができる。
【００４９】
遺伝子再構成。遺伝物質の新しい組織化が導入される、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて自然に起こり得る遺伝子エレメントの再会合を指す。例えば、異なる染色体の遺伝子座にあるポリヌクレオチドの一緒になったスプライシングが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて植物発生および有性組換えのどちらの間にも自然に起こり得る。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける非天然遺伝子改変技法による遺伝子エレメントの組換えは、同じくｉｎ  ｖｉｖｏにおける有性組換えを通じて起こり得る組換え事象と類似している。
【００５０】
ジャガイモシストセンチュウ。一般にジャガイモシストセンチュウとして公知のＧｌｏｂｏｄｅｒａ  ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓは、ジャガイモ植物体の根および塊茎に影響を及ぼす、植物に寄生する線形動物である。症状としては、不十分な植物生長、しおれ、水ストレスおよび養分欠乏が挙げられる。
【００５１】
胚軸。胚軸は、子葉（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）と根の間の胚または実生の部分である。したがって、胚軸は、苗条と根の間の移行部とみなすことができる。
【００５２】
インフレーム。ヌクレオチドトリプレット（コドン）が植物細胞において所望の組換えタンパク質の新生アミノ酸配列に翻訳される。具体的には、本発明は、第１の核酸が読み枠内で第２の核酸と連結しており、第１のヌクレオチド配列は遺伝子であり、第２のヌクレオチドはプロモーターまたは同様の調節エレメントであることを意図している。
【００５３】
組み込む。選択された植物種に由来する、または選択された植物と同じ種由来の植物に由来する、または選択された植物種に対して有性生殖適合性の植物に由来する核酸配列を、選択された植物種の細胞のゲノムに挿入することを指す。「組み込み」とは、ネイティブな遺伝子エレメントのみを植物細胞ゲノムに組み入れることを指す。例えば相同組換えによってネイティブな遺伝子エレメントを組み込むために、本発明では、ネイティブでないＤＮＡを、そのようなプロセスにおけるステップとして「使用」することができる。したがって、本発明では、特定のＤＮＡ分子の「使用」と特定のＤＮＡ分子の植物細胞ゲノムへの「組み込み」は区別される。
【００５４】
導入。本明細書で使用される場合、感染、トランスフェクション、形質転換または形質導入を含めた方法によって核酸配列を細胞に挿入することを指す。
【００５５】
単離された。「単離された」は、その通常のネイティブな環境から物理的に分離された任意の核酸または化合物を指す。単離された材料は、例えば溶媒、緩衝液、イオン、または他の構成成分を含有する適切な溶液中で維持することができ、精製された形態であっても精製されていない形態であってもよい。
【００５６】
疫病。ジャガイモ植物体の葉、茎、果実、および塊茎に感染し、それらを破壊し得る、卵菌Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓによって引き起こされる、「ジャガイモの疫病」としても公知のジャガイモの病害。
【００５７】
リーダー。遺伝子の前にある（または遺伝子に対して５’側にある）、転写されるが翻訳はされない配列。
【００５８】
遺伝子座。遺伝子座は、例えば、雄性不稔性、除草剤耐性、昆虫抵抗性、病害抵抗性、蝋様デンプン、脂肪酸代謝の改変、フィチン酸代謝の改変、炭水化物代謝の改変、およびタンパク質代謝の改変などの、１つまたは複数の形質を付与するものである。形質は、例えば、戻し交配、自然変異もしくは誘導された変異によって品種のゲノムに導入された天然に存在する遺伝子、または遺伝子形質転換技法によって導入された導入遺伝子により、付与され得る。遺伝子座は、単一の染色体上の位置に組み込まれた１つまたは複数の対立遺伝子を含み得る。
【００５９】
市場性のある収量。市場性のある収量は、直径２インチから４インチの間である、収穫される全ての塊茎の重量である。市場性のある収量は、ｃｗｔ（ハンドレッドウェイト）単位で測定され、ｃｗｔ＝１００ポンドである。
【００６０】
単子葉植物（単子葉類（ｍｏｎｏｃｏｔ））。胚に子葉（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）または子葉（ｓｅｅｄ  ｌｅａｆ）を１つ有する顕花植物である。単子葉類の例としては、これだけに限定されないが、芝草、トウモロコシ、イネ、エンバク、コムギ、オオムギ、モロコシ、ラン、アヤメ、ユリ、タマネギ、およびヤシが挙げられる。
【００６１】
ネイティブ。「ネイティブ」な遺伝子エレメントとは、形質転換しようとする植物のゲノムに天然に存在する、それを起源とする、またはそれに属する核酸を指す。したがって、形質転換しようとする植物体もしくは植物種のゲノムから単離されたか、または、形質転換しようとする植物種に対して有性生殖適合性または交配可能である植物体もしくは種から単離された核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡ分子はいずれも、その植物種に対して「ネイティブ」である、すなわち、その植物種に固有である。言い換えれば、ネイティブな遺伝子エレメントとは、古典的な植物育種を通じて植物を改善するために植物育種家が利用可能な全ての遺伝物質を表す。本発明によると、ネイティブな核酸の任意のバリアントも「ネイティブ」とみなされる。この点において、「ネイティブ」な核酸は、植物またはその有性生殖適合性の種から単離し、得られるバリアントが、植物から単離された改変されていないネイティブな核酸と、ヌクレオチド配列が、９９％またはそれ超、９８％またはそれ超、９７％またはそれ超、９６％またはそれ超、９５％またはそれ超、９４％またはそれ超、９３％またはそれ超、９２％またはそれ超、９１％またはそれ超、９０％またはそれ超、８９％またはそれ超、８８％またはそれ超、８７％またはそれ超、８６％またはそれ超、８５％またはそれ超、８４％またはそれ超、８３％またはそれ超、８２％またはそれ超、８１％またはそれ超、８０％またはそれ超、７９％またはそれ超、７８％またはそれ超、７７％またはそれ超、７６％またはそれ超、７５％またはそれ超、７４％またはそれ超、７３％またはそれ超、７２％またはそれ超、７１％またはそれ超、７０％またはそれ超、６９％またはそれ超、６８％またはそれ超、６７％またはそれ超、６６％またはそれ超、６５％またはそれ超、６４％またはそれ超、６３％またはそれ超、６２％またはそれ超、６１％またはそれ超、または６０％またはそれ超、同様になるように、改変するかまたは変異させることもできる。ネイティブな核酸バリアントは、ヌクレオチド配列が、約６０％未満、約５５％未満、または約５０％未満、同様であってもよい。植物から単離された「ネイティブ」な核酸は、その核酸から転写および翻訳される天然に存在するタンパク質産物のバリアントをコードしてもよい。したがって、ネイティブな核酸は、核酸を単離した植物において発現される改変されていないネイティブなタンパク質と、アミノ酸配列が、９９％またはそれ超、９８％またはそれ超、９７％またはそれ超、９６％またはそれ超、９５％またはそれ超、９４％またはそれ超、９３％またはそれ超、９２％またはそれ超、９１％またはそれ超、９０％またはそれ超、８９％またはそれ超、８８％またはそれ超、８７％またはそれ超、８６％またはそれ超、８５％またはそれ超、８４％またはそれ超、８３％またはそれ超、８２％またはそれ超、８１％またはそれ超、８０％またはそれ超、７９％またはそれ超、７８％またはそれ超、７７％またはそれ超、７６％またはそれ超、７５％またはそれ超、７４％またはそれ超、７３％またはそれ超、７２％またはそれ超、７１％またはそれ超、７０％またはそれ超、６９％またはそれ超、６８％またはそれ超、６７％またはそれ超、６６％またはそれ超、６５％またはそれ超、６４％またはそれ超、６３％またはそれ超、６２％またはそれ超、６１％またはそれ超、または６０％またはそれ超、同様であるタンパク質をコードしてもよい。
【００６２】
ネイティブな遺伝子エレメント。「ネイティブな遺伝子エレメント」は、本発明に従って選択された植物種のゲノムに組み入れ、組み込むことができる。ネイティブな遺伝子エレメントは、選択された植物種に属する植物体または選択された植物種に対して有性生殖適合性の植物体から単離される。例えば、栽培されたジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）に組み入れられるネイティブなＤＮＡは、任意の遺伝子型のＳ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍまたはＳ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍに対して有性生殖適合性の任意の遺伝子型の野生ジャガイモ種（例えば、Ｓ．ｄｅｍｉｓｓｕｍ）に由来するものであってよい。
【００６３】
天然に存在する核酸。天然に存在する核酸は、選択された植物種のゲノム内に見出され、ＤＮＡ分子であってもＲＮＡ分子であってもよい。植物種のゲノム内に通常存在する制限部位の配列は、ベクターまたはオリゴヌクレオチドなどの外因性ＤＮＡ分子に、その制限部位がそのゲノムから物理的に単離されていないにもかかわらず、工学的に操作して入れることができる。したがって、本発明では、制限酵素認識配列などのヌクレオチド配列を、その配列が選択された植物種のゲノムまたは形質転換しようとする選択された植物種に対して有性生殖適合性の植物体において天然に存在する限りは、合成により創出することが可能になる。
【００６４】
作動可能に連結した。２つまたはそれ超の分子を、植物細胞においてそれらが組み合わさって適正に機能するように組み合わせること。例えば、プロモーターにより構造遺伝子の転写が制御される場合、そのプロモーターは、構造遺伝子に作動可能に連結している。
【００６５】
植物。本明細書で使用される場合、用語「植物」は、これだけに限定されないが、被子植物および裸子植物、例えば、ジャガイモ、トマト、タバコ、アルファルファ、レタス、ニンジン、イチゴ、サトウダイコン、キャッサバ、サツマイモ、ダイズ、トウモロコシ、芝草、コムギ、イネ、オオムギ、モロコシ、エンバク、オーク、ユーカリ、クルミ、およびヤシなどを含む。したがって、植物は、単子葉類であっても双子葉類であってもよい。単語「植物」は、本明細書で使用される場合、有性生殖によって生じたか無性生殖によって生じたかにかかわらず、植物細胞、種子、植物後代、むかご、および、これらのいずれかの後裔、例えば、挿し木または種子なども包含する。植物細胞は、懸濁培養物、カルス、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉、種子および小胞子を含む。植物は、成熟度が種々の段階であってよく、液体または固体培養物中で生育させることもでき、鉢、温室または圃場において土壌または適切な培地で生育させることもできる。植物における導入されたリーダー、トレーラーまたは遺伝子配列の発現は一過性であっても恒久的であってもよい。「選択された植物種」は、これだけに限定されないが、これらの「植物」の任意の１つの種であってよい。
【００６６】
植物体の一部。本明細書で使用される場合、用語「植物体の一部」（またはジャガイモ植物体、またはその一部）は、これだけに限定されないが、プロトプラスト、葉、茎、根、根端、葯、雌ずい、種子、胚、花粉、胚珠、子葉（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）、胚軸、花、塊茎、芽、組織、葉柄、細胞、分裂組織細胞などを含む。
【００６７】
植物種。少なくともいくらかの有性生殖適合性を示す、種々の公式に名付けられた植物種に属する植物の群。
【００６８】
植物の形質転換および細胞培養。植物細胞を遺伝子改変し、維持、さらなる生育、および／またはさらなる発達のために適切な植物培養培地に移すプロセスを広範に指す。
【００６９】
的確な育種。選択された植物種から、または選択された植物と同じ種の別の植物から、または選択された植物種に対して有性生殖適合性の種から単離されたネイティブな遺伝子および調節エレメントなどの核酸を、個々の植物細胞に安定に導入し、その後、これらの遺伝子改変された植物細胞を植物全体に再生させることによって植物を改善することを指す。未知または外来の核酸は植物のゲノムに恒久的には組み入れられないので、本発明の技術では、従来の植物育種によっても利用可能である同じ遺伝物質を使用する。
【００７０】
後代。本明細書で使用される場合、２つのジャガイモ植物体であって、少なくとも１つの植物体はジャガイモ栽培品種Ｘ１７を含む、植物体の交配から生じたＦ１ジャガイモ植物体を含み、後代は、これだけに限定されないが、その後の、反復親系統とのＦ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９、およびＸ１７世代の交配をさらに含む。
【００７１】
定量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）。定量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）とは、通常は継続的に分布する、数値で表すことが可能な形質をいくらかの程度まで制御する遺伝子座を指す。
【００７２】
組換え。本明細書で使用される場合、遺伝子をクローニングすることができ、ＤＮＡについて配列決定することができ、タンパク質産物を産生させることができる種々の技術を広範に説明する。本明細書で使用される場合、この用語はまた、植物宿主系の細胞に遺伝子を移入した後に産生されたタンパク質も説明する。
【００７３】
再生。再生は、組織培養物からの植物の発達を指す。
【００７４】
調節配列。植物系における目的の遺伝子の転写または結果として得られるＲＮＡの翻訳を増大させ、かつ／または最大にするために発現ベクターに含めることができる、当業者には標準であり公知の配列を指す。それらとしては、これだけに限定されないが、プロモーター、ペプチド移出シグナル配列、イントロン、ポリアデニル化、および転写終結部位が挙げられる。植物における発現レベルが上昇するように核酸構築物を改変する方法も当技術分野で公知である（例えば、Ｒｏｇｅｒｓら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６０巻、３７３１〜３８頁、１９８５年；Ｃｏｒｎｅｊｏら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２３巻：５６７：８１、１９９３年を参照されたい）。タンパク質の転写の速度に影響を及ぼすための植物系の工学的操作では、正または負に作用する配列、エンハンサーおよびサイレンサーなどの調節配列、ならびにクロマチン構造を含めた、当技術分野で公知の様々な因子が影響を及ぼし得る。本発明は、目的のタンパク質を発現させるために植物を工学的操作するのに利用することができる、これらの因子の少なくとも１つを提供する。本発明の調節配列は、ネイティブな遺伝子エレメントである、すなわち、選択された改変しようとする植物種から単離されたものである。
【００７５】
選択マーカー。「選択マーカー」は、一般には、抗生物質、除草剤または毒性化合物に対するある種の抵抗性を付与するタンパク質をコードする遺伝子であり、形質転換事象を同定するために使用される。選択マーカーの例としては、ストレプトマイシン抵抗性をコードするストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｓｐｔ）遺伝子、マンノース−６−リン酸をフルクトース−６リン酸に変換するホスホマンノースイソメラーゼ（ｐｍｉ）遺伝子；カナマイシンおよびジェネテシン抵抗性をコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシンに対する抵抗性をコードするハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔまたはａｐｈｉｖ）遺伝子、スルホニル尿素型除草剤に対する抵抗性をコードするアセト乳酸合成酵素（ａｌｓ）遺伝子、ホスフィノトリシンまたはバスタ（ｂａｓｔａ）などの、グルタミン合成酵素の作用が阻害されるように作用する除草剤に対する抵抗性をコードする遺伝子（例えば、ｂａｒ遺伝子）、または当技術分野で公知の他の同様の遺伝子が挙げられる。
【００７６】
センス抑制。トランスジェニック植物において、内在性遺伝子の発現を、その遺伝子の全部または一部の１つまたは複数の追加的なコピーを発現させることによって低減させること。
【００７７】
比重。本明細書で使用される場合、「比重」は、密度の表現であり、ジャガイモ品質の尺度である。塊茎の比重およびデンプン含有量および乾物または総固形物の百分率の間には高い相関がある。比重が高いほど、加工製品の回収率が高くなり、かつ、品質がより良好になる。
【００７８】
Ｔ−ＤＮＡ様。「Ｔ−ＤＮＡ様」配列は、選択された植物種から、または選択された植物種に対して有性生殖適合性の植物から単離された核酸であり、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種Ｔ−ＤＮＡと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％であるが１００％ではない配列同一性を共有する。Ｔ−ＤＮＡ様配列は、それぞれが、ヌクレオチド配列を別のポリヌクレオチドに組み込むことが可能な１つまたは複数の境界または境界様配列を含有してよい。
【００７９】
総収量。総収量は、収穫された塊茎全ての総重量を指す。
【００８０】
トレーラー。遺伝子の後に続く（または遺伝子の３’側にある）、転写されるが翻訳はされない配列。
【００８１】
転写されるＤＮＡ。前述のプロモーターの作用により、単一のｍＲＮＡとして転写される、遺伝子と、その遺伝子に付随する非翻訳リーダー配列およびトレーラー配列の両方を含むＤＮＡ。
【００８２】
植物細胞の形質転換。ＤＮＡが植物細胞のゲノムに安定に組み込まれるプロセス。「安定に」とは、細胞ゲノムにおける、および細胞ゲノムによるポリヌクレオチドの恒久的な、または一過性ではない保持および／または発現を指す。したがって、安定に組み込まれたポリヌクレオチドは、形質転換された細胞ゲノム内の定着物（ｆｉｘｔｕｒｅ）であり、細胞または得られた形質転換された植物の連続的な後代を通じて複製および繁殖させることができるポリヌクレオチドである。形質転換は、当技術分野で周知の種々の方法を使用して、天然の条件下で行うこともでき、人工的な条件下で行うこともできる。形質転換は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換プロトコール、ウイルス感染、ウィスカー、電気穿孔、熱ショック、リポフェクション、ポリエチレングリコール処理、微量注入、および微粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）を含めた、原核生物または真核生物宿主細胞に核酸配列を挿入するための任意の公知の方法に依拠するものであってよい。
【００８３】
導入遺伝子。タンパク質コード領域を含む、宿主ゲノムに挿入される遺伝子。本発明に関しては、導入遺伝子を含むエレメントが宿主ゲノムから単離される。
【００８４】
トランスジェニック植物。少なくとも１つの導入遺伝子を含有する、遺伝子改変された植物。
【００８５】
バリアント。本明細書で使用される場合、「バリアント」は、特定の遺伝子またはタンパク質の標準または所与のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列から逸脱したヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を意味するものと理解される。用語「アイソフォーム」、「アイソタイプ」および「類似体」も、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の「バリアント」形態を指す。１つまたは複数のアミノ酸の付加、除去もしくは置換、またはヌクレオチド配列の変化により変更されたアミノ酸配列は、「バリアント」配列とみなすことができる。バリアントは、置換アミノ酸が同様の構造的または化学的性質を有する「保存的」変化、例えば、ロイシンのイソロイシンでの置き換えを有してよい。バリアントは、「非保存的」変化、例えば、グリシンのトリプトファンでの置き換えを有してよい。類似の軽微な変動は、アミノ酸の欠失または挿入、またはその両方を含んでもよい。どのアミノ酸残基を置換する、挿入する、または欠失させることができるかの決定の手引きは、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ
Ｓｕｉｔｅ（ＩｎｆｏｒＭａｘ、ＭＤ）ソフトウェアなどの、当技術分野で周知のコンピュータプログラムを使用して見出すことができる。
【００８６】
つるの成熟度。つるの成熟度は、植物の、炭水化物の利用および光合成を続ける能力を指す。つるの成熟度は、１〜５のスケールにスコア化され、ここで、１＝枯れたつるであり、５＝まだ開花する緑色のつるである。
【００８７】
ジャガイモは、四倍体であり、高度にヘテロ接合性であり、かつ近交弱勢に対して感受性であるので、ジャガイモ植物体のゲノムへの望ましい形質の挿入には特定の難しさがある。したがって、従来の育種を使用すると、加工中のアクリルアミドの生成が少なく、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−（３−ケト−１，２−ブタンジオール）−３’−ニトロチラミン（Ｗａｎｇら、Ａｒｃｈ  Ｔｏｘｉｃｏｌ、７０巻：１０〜５頁、１９９５年）、５−ヒドロキシメチル−２−フルフラール（Ｊａｎｚｏｗｓｋｉら、Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｏｘｉｃｏｌ、３８巻：８０１〜９頁、２０００年）、および変異原性を有する他のメイラード反応生成物（Ｓｈｉｂａｍｏｔｏ、Ｐｒｏｇ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ、３０４巻：３５９〜７６頁、１９８９年）を含めた有害なメイラード反応生成物が少ないトランスジェニックジャガイモ植物体を効率的に開発することが非常に難しい。
【００８８】
加工の変化、デキストロースの低減、ならびにアスパラギナーゼ、クエン酸塩、および競合アミノ酸などの添加物を通じてアクリルアミドを低減するためのいくつかの方法が試験されており、研究が進行中である。ジャガイモ産業全体を通して加工の変化を実行するために必要な資本支出は、数百万ドルかかる。支出に加えて、これらの加工の変化には、アスパラギナーゼまたはクエン酸塩などの添加物に付随する潜在的に負のフレーバーを含めた重大な欠点がある。一般には、フライ製造者は、フレンチフライの加工中、所望の黄金色を発生させるためにデキストロースを添加するが、デキストロースはまた、メイラード反応によるアクリルアミドの形成も増加させる。ただ単に加工からデキストロースを取り除くことによってアクリルアミドの有意な減少が起こるが、そうすると、特徴的な黄金色をいくつかの他のやり方（例えば、アナトーのような着色料を添加することによってなど）で発生させなければならない。代替の着色料を使用することにより、これらの褐色化反応によって発生する典型的なフレーバーが存在しなくなる。アスパラギンのような反応物を減少させるために添加物を使用することに伴う別の難題は、凍結貯蔵中に水分移行が起こり、その結果、アスパラギンが表面に戻ってアクリルアミドが増加することである。最後に、ジャガイモが打撲を受けた後に起こる黒変が、フレンチフライおよびチップの加工における品質および回収率に影響を及ぼす。損傷し、打撲を受けたジャガイモは、不要な部分を切り取らなければならないか、または加工前に拒絶され、その結果、品質の問題または経済的損失が生じる。
【００８９】
本発明の「ネイティブな技術」戦略は、ジャガイモの農業特性および栄養価を改善するというジャガイモ産業の必要性に、打撲黒斑に関与するポリフェノールオキシダーゼ−５（ＰＰＯ−５）の発現、アクリルアミド形成における前駆物質であるアスパラギンの蓄積に関与するアスパラギンシンテターゼ−１（Ａｓｎ−１）の発現を低減させること、スクロースをグルコースおよびフルクトースに変換する酵素液胞インベルターゼの発現、ならびに／または通常はアスパラギンなどのアミノ酸と反応し、アクリルアミドを含めた毒性メイラード生成物を形成する還元糖の蓄積に関連する酵素であるホスホリラーゼ−Ｌおよびキナーゼ−Ｒ１の発現を低減させることによって対処するものである。塊茎におけるこれらの遺伝子の部分的なまたは完全なサイレンシングにより、アクリルアミドが生成する潜在性が低下する。本発明のネイティブな技術の使用により、ジャガイモを、ジャガイモ植物体またはジャガイモ植物体に対して有性生殖適合性である植物体から得られた、非コード調節領域を含む遺伝子材料である「ネイティブな」遺伝子材料のみを用いて形質転換することにより、いかなる外来遺伝子材料も植物のゲノムに組み込むことなく望ましい形質を組み入れることが可能になる。望ましい形質としては、衝撃に誘導される打撲黒斑に対する高い耐性、アクリルアミドを含めた毒性メイラード生成物の蓄積の減少を結果として伴う、アクリルアミド前駆物質アスパラギンの形成の減少および還元糖の蓄積の減少、品質の改善、ならびに食品の色の制御が挙げられる。これらの望ましい形質を既存のジャガイモ品種に組み入れることは従来育種によっては実現不可能であり、これは、ジャガイモが四倍体であり、高度にヘテロ接合性であり、かつ近交弱勢に対して感受性であることが理由である。
【００９０】
本発明において使用する非コードジャガイモ植物体ＤＮＡ挿入断片配列は、ジャガイモ植物体ゲノムに対してネイティブであり、いかなるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＤＮＡも含有しない。ＤＮＡ挿入断片のうちの１つは、２つの発現カセットを含み、ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクターと称される形質転換ベクターに挿入されることが好ましい。第１のカセットは、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（Ａｇｐ）遺伝子のＡｇｐプロモーターと顆粒結合合成酵素（Ｇｂｓｓ）遺伝子のＧｂｓｓプロモーターの間に逆方向反復として配置された、アスパラギンシンテターゼ−１（Ａｓｎ１）遺伝子とポリフェノールオキシダーゼ−５（Ｐｐｏ５）遺伝子の両方の断片を含む。これらのプロモーターは、主に塊茎において活性である。第２のカセットの機能は、デンプン関連遺伝子ジキナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）およびホスホリラーゼ−Ｌ（ＰｈＬ）遺伝子のプロモーターをサイレンシングすることである。このカセットは、第１のカセットと同じＡｇｐプロモーターおよびＧｂｓｓプロモーターに作動可能に連結した、デンプン関連遺伝子ジキナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）およびホスホリラーゼ−Ｌ（ＰｈＬ）遺伝子のプロモーターの断片で構成される。これらの発現カセットは外来ＤＮＡを含有せず、選択された植物種または選択された植物種に対して有性生殖適合性の植物に由来するＤＮＡのみからなる。第２のＤＮＡ挿入断片は、Ｒｐｉ−ｖｎｔ１発現カセットおよび植物液胞インベルターゼ遺伝子、ＶＩｎｖに対するサイレンシングカセットを含む、ｐＳＩＭ１６７８と称される形質転換ベクターによってもたらされる。Ｒｐｉ−ｖｎｔ１遺伝子カセットは、疫病に対する広範な抵抗性を付与する、そのネイティブなプロモーター配列およびターミネーター配列によって調節されるＶＮＴ１タンパク質コード領域からなり、一方、サイレンシングカセットは、対向する植物プロモーター、ｐＧｂｓｓおよびｐＡｇｐで挟まれた、ジャガイモＶＩｎｖ遺伝子由来の配列の逆方向反復からなる。第１のカセットの機能は、疫病に対する抵抗性を付与することであり、一方、第２のカセットの機能は、液胞インベルターゼ遺伝子をサイレンシングし、それにより、グルコースおよびフルクトースを減少させることである。
【００９１】
本発明において使用する商業的に有益なジャガイモ植物体変種は、Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔである。Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔは、Ｘ１７の親変種である。この完全な季節変種は、１９９１年に公開された。Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔは、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋよりも、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍによる立ち枯れ病、ＸウイルスおよびＹウイルス、葉巻病ならびに網状壊死、ならびにＦｕｓａｒｉｕｍによる乾腐病に対する抵抗性が高い。Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔは、空胴病に対する抵抗性が高い。植物体は、大きく、立性〜開帳性である。茎は、厚く、緑色であり、たくさんの日光の下では薄茶色がかった〜薄紫色になる。葉は、大きく、広く、中程度に緑色である。花は、豊富であり、生育可能な花粉を生じる。芽は、緑色で基部および小花柄が赤みがかった紫色であり、短い軟毛の量は中程度である。花冠は、中程度の大きさであり、赤紫色であり、葯は鮮やかな黄色である。Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔは、長く、わずかに平らであり、フレンチフライへのベーキングおよび加工によく適した、品質が良好で比重の高い塊茎を高収量で生成する。塊茎は、そうか病および打撲黒斑にかかりやすい。Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔは、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋよりも早く成熟し、中期貯蔵用変種であるとみなされる。この変種は稔性であり、主に北西部において、特にフレンチフライの生産用として育てられている。
【００９２】
本発明は、形質転換ベクターｐＳＩＭ１２７８で形質転換し、その後、第２の形質転換ベクターｐＳＩＭ１６７８で形質転換し、マーカーではなくポリメラーゼ連鎖反応を使用して同定し、繁殖に成功した、有意な市場価値のあるジャガイモ変種、すなわち、Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔを提供する。本発明のジャガイモ植物体変種Ｘ１７の塊茎から作られた食品製品も提供される。ジャガイモ栽培品種Ｘ１７は、以下のＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（ＯＥＣＤ）の独特の植物変種識別子を有する。
【００９３】
ネイティブなＤＮＡを用いた標的化遺伝子サイレンシングにより、ジャガイモ植物体変種Ｘ１７の塊茎における標的化遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルが低下する。ジャガイモ栽培品種Ｘ１７は、塊茎における還元糖のレベルを多数の機構によって低下させる発現カセットを含有する。ｐＳＩＭ１２７８を用いた形質転換を通じて、デンプン関連遺伝子（Ｒ１）およびホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子（ＰｈＬ）のプロモーターに対するサイレンシングカセットが導入され、一方、ｐＳＩＭ１６７８を用いた形質転換により、インベルターゼ遺伝子に対するサイレンシングカセットが導入された（ＶＩｎｖ；Yeら、２０１０年）。まとめると、これらの形質は、デンプンおよびスクロースの還元糖（グルコースおよびフルクトース）への変換を遅くすることによって機能する。
【００９４】
したがって、本発明のジャガイモ植物体変種Ｘ１７の塊茎には、揚げたときまたは焼いたときのアクリルアミド形成の低減に関連する、遊離のアミドアミノ酸アスパラギンおよびグルタミンの比率の低下を含めた、高度に望ましい形質が組み入れられる。具体的には、本発明のジャガイモ変種Ｘ１７は、遊離のアスパラギン含有量が２分の１〜４分の１よりも大きく減少すること、打撲黒斑に伴う変色が低減すること、および、疫病に対する抵抗性が増大することを特徴とする。さらに、本発明のジャガイモ変種Ｘ１７は、貯蔵中の、デンプンの還元糖グルコースおよびフルクトースへの分解の遅延を示す。デンプンから糖への変換を損なうことにより、さらに、老化により甘くなることおよびアクリルアミド形成が低減され、熱により誘導される褐変が限定される。
【００９５】
したがって、本発明のジャガイモ変種Ｘ１７は、加熱加工の際にその塊茎で生成されるアクリルアミドが有意に少なく、いかなる潜在的に有害な外来遺伝子も保有しないので、ジャガイモ産業および食品市場において非常に価値がある。
【実施例】
【００９６】
本発明では、新しい遺伝子内ジャガイモ植物体変種を開発するために、ネイティブな技術を使用して、選択されたジャガイモ植物体変種のゲノムにネイティブな非コードＤＮＡを組み込む。方法は、形質同定、ベクターの設計、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへのベクターの組み入れ、レシピエントジャガイモ変種の選択、植物の形質転換、オープンリーディングフレームが存在しないことの証明、および新しいジャガイモ植物体変種がネイティブなＤＮＡのみを含有することの確認を含む。本発明のジャガイモ栽培品種Ｘ１７は、アクリルアミドを形成する能力が低く、スクロースの量が少なく、かつ、打撲黒斑に対する抵抗性が形質転換されていない対応物よりも高い。さらに、本発明のジャガイモ栽培品種Ｘ１７は、疫病に対する抵抗性が増大している。
【００９７】
（実施例１）
ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクター骨格
プラスミドｐＳＩＭ１２７８は、ジャガイモを形質転換するために使用される、１９．７ｋｂのバイナリー形質転換ベクターである。この実施例では、遺伝子エレメントの供給源、骨格およびＴ−ＤＮＡ配列のクローニングステップ、ならびにプラスミド内のエレメントの順序を示す。
【００９８】
プラスミド骨格（図１および表１）は、２つのよく特徴付けられた細菌の複製起点を含有する。ｐＶＳ１（ｐＶＳ１  ＳｔａおよびＲｅｐ）はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにおけるプラスミドの維持を可能にし、ｐＢＲ３２２（ｐＢＲ３２２  ｂｏｍおよびｏｒｉ）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおけるプラスミドの維持を可能にするものである。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＤＮＡオーバードライブ配列により、ＲＢにおける切断が増強され、そしてＥ．ｃｏｌｉ  ｎｐｔＩＩ遺伝子は、細菌性カナマイシン選択マーカーである。骨格は、Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔジャガイモポリユビキチン（Ｕｂｉ７）プロモーターとＲａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔジャガイモポリユビキチン（Ｕｂｉ３）ターミネーターで挟まれたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍイソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子を含む発現カセットを含有する。ｉｐｔカセットは、宿主植物へのプラスミド骨格ＤＮＡの組み込みに対する選択に使用するためのスクリーニング可能な表現型である。形質転換された植物組織において存在する場合、ｉｐｔの過剰発現により植物ホルモンであるサイトカイニンが過剰産生され、その結果、生育が妨げられる表現型を有し、葉が異常であり、根付くことができない植物が生じる。
【００９９】
骨格部分は植物細胞に移入されない。骨格の種々のエレメントを表１に記載する。
【表１−１】
2018529364.tif 000003
【表１−２】
2018529364.tif 000004
【表１−３】
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【表１−４】
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【０１００】
（実施例２）
ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクターＴ−ＤＮＡ
ｐＳＩＭ１２７８に使用する、隣接境界配列を含めたｐＳＩＭ１２７８  ＤＮＡ挿入断片領域は、長さが１ｂｐから１０，１４８ｂｐまでの１０，１４８ｂｐである。ｐＳＩＭ１２７８  ＤＮＡ挿入断片は、ネイティブなＤＮＡのみからなり、ジャガイモゲノム内に安定に組み込まれる。ｐＳＩＭ１２７８  ＤＮＡ挿入断片またはその機能性部分は、ベクターｐＳＩＭ１２７８の、本発明のジャガイモ植物体品種に組み込まれる唯一の遺伝物質である。
【０１０１】
ｐＳＩＭ１２７８  ＤＮＡ挿入断片は、図１（ベクター骨格領域と共に）、図２、および以下の表２に記載されている。ＬＢ配列およびＲＢ配列（各２５ｂｐ）を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来のＴ−ＤＮＡの境界と類似し、同様に機能するように、合成により設計した。ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＡＹ５６６５５５を、境界領域についてのＤＮＡの供給源が明白になるように修正した。遺伝子エレメント５および１０と記載されているＡＳＮ１は、Ｃｈａｗｌａら、２０１２年ではＳｔＡｓｔ１と称されている。
【０１０２】
プラスミドｐＳＩＭ１２７８  Ｔ−ＤＮＡは、２つの発現カセットを含有する：
【０１０３】
第１のカセット（エレメント４〜１２、表２）は、形質転換されたジャガイモ変種におけるＡｓｎ１およびＰｐｏ５を下方制御するものである。第１のカセットは、２つの同一の４０５ｂｐのＡｓｎ１の断片および２つの同一の１４４ｂｐのＰｐｏ５の断片で構成される。Ａｓｎ１の断片およびＰｐｏ５の断片は、非コード１５７ｂｐ  Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔジャガイモヌクレオチドスペーサーエレメントによって分離された逆方向反復として配置する。Ａｓｎ１断片およびＰｐｏ５断片は、主に塊茎において活性である２つのジャガイモ収束プロモーター；ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（Ａｇｐ）遺伝子のＡｇｐプロモーターと顆粒結合デンプン合成酵素（Ｇｂｓｓ）遺伝子のＧｂｓｓプロモーターとの間に配置する。これらのプロモーターにより、逆方向反復の発現が駆動されて二本鎖ＲＮＡが生成し、Ａｓｎ１およびＰｐｏ５が下方制御される。
【０１０４】
第２のカセット（エレメント１４〜２１、表２）は、形質転換されたジャガイモ品種におけるＰｈＬおよびＲ１を下方制御するものである。第２のカセットは、２つの同一の５０９ｂｐのＰｈＬプロモーター領域（ｐＰｈＬ）の断片および２つの同一の５３２ｂｐのＲ１プロモーター領域（ｐＲ１）の断片で構成される。ｐＰｈＬ断片およびｐＲ１断片は、Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔジャガイモポリユビキチン遺伝子の非コード２５８ｂｐ断片によって分離された逆方向反復として配置する。第１のカセットと同様に、ｐＰｈＬ断片およびｐＲ１断片は、ジャガイモＡｇｐプロモーターとＧｂｓｓプロモーターとの間に配置され、それらによって転写される。
【表２−１】
2018529364.tif 000007
【表２−２】
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【表２−３】
2018529364.tif 000009
【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
2018529364.tif 000012
【０１０５】
したがって、表１および表２から見ることができるように、ｐＳＩＭ１２７８プラスミドは、ジャガイモ植物体を形質転換するために設計されたバイナリーベクターである。ベクター骨格は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの両方における複製のための配列を、ベクター骨格ＤＮＡを有する植物を除去するためのスクリーニング用のｉｐｔマーカーと共に含有する。Ｔ−ＤＮＡ領域は、ＬＢ配列とＲＢ配列で挟まれた２つの発現カセットからなる。宿主植物組織にｐＳＩＭ１２７８ベクターを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを接種すると、ｐＳＩＭ１２７８のＴ−ＤＮＡ領域が宿主ゲノム内に移入される。
【０１０６】
本開示のジャガイモ栽培品種Ｘ１７を創出するために使用した、表２に記載されているＤＮＡ挿入断片は、隣接する遺伝子を活性化せず、ジャガイモ植物体品種の表現型に悪影響を及ぼさない。
【０１０７】
（実施例３）
ｐＳＩＭ１６７８形質転換ベクター骨格
プラスミドｐＳＩＭ１６７８は、ジャガイモを形質転換するために使用される、１８．６ｋｂのバイナリー形質転換ベクターである。この実施例では、遺伝子エレメントの供給源、骨格およびＴ−ＤＮＡ配列のクローニングステップ、ならびにプラスミド内のエレメントの順序を示す。
【０１０８】
プラスミド骨格（図３；表３）は、２つのよく特徴付けられた細菌の複製起点を含有する。ｐＶＳ１（ｐＶＳ１  ＳｔａおよびＲｅｐ）はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにおけるプラスミドの維持を可能にし、ｐＢＲ３２２（ｐＢＲ３２２  ｂｏｍおよびｏｒｉ）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおけるプラスミドの維持を可能にするものである。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＤＮＡオーバードライブ配列により、ＲＢにおける切断が増強され、そしてＥ．ｃｏｌｉ  ｎｐｔＩＩ遺伝子は、細菌性カナマイシン選択マーカーである。骨格は、Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔジャガイモポリユビキチン（Ｕｂｉ７）プロモーターとＲａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔジャガイモポリユビキチン（Ｕｂｉ３）ターミネーターとで挟まれたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍイソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子を含む発現カセットを含有する（ＧａｒｂａｒｉｎｏおよびＢｅｌｋｎａｐ、１９９４年）。ｉｐｔカセットは、宿主植物へのプラスミド骨格ＤＮＡの組み込みに対する選択に使用するためのスクリーニング可能な表現型である。形質転換された植物組織において存在する場合、ｉｐｔの過剰発現により植物ホルモンであるサイトカイニンが過剰産生され、その結果、生育が妨げられる表現型を有し、葉が異常であり、根付くことができない植物が生じる。
【０１０９】
骨格部分は植物細胞に移入されない。骨格の種々のエレメントは、表３に記載されている。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【０１１０】
（実施例４）
ｐＳＩＭ１６７８形質転換ベクターＴ−ＤＮＡ
ｐＳＩＭ１６７８において使用する、隣接境界配列を含めたｐＳＩＭ１６７８  ＤＮＡ挿入断片領域は、９，０９０ｂｐの長さである（１ｂｐから９，０９０ｂｐまで）。ｐＳＩＭ１６７８  ＤＮＡ挿入断片は、ネイティブなＤＮＡのみからなり、ジャガイモゲノム内に安定に組み込まれる。ｐＳＩＭ１６７８  ＤＮＡ挿入断片またはその機能性部分は、本発明のジャガイモ植物体変種に組み込まれるベクターｐＳＩＭ１６７８の唯一の遺伝物質である。
【０１１１】
ｐＳＩＭ１６７８  ＤＮＡ挿入断片は、図３（ベクター骨格領域と共に）、および以下の表４に記載されている。表４では、ＬＢ配列およびＲＢ配列（各２５−ｂｐ）を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来のＴ−ＤＮＡの境界と類似し、同様に機能するように、合成により設計した。ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
ＡＹ５６６５５５を、境界領域についてのＤＮＡの供給源が明白になるように修正した。
【０１１２】
プラスミドｐＳＩＭ１６７８  Ｔ−ＤＮＡは、１−ｂｐから９，０９０−ｂｐまでであり、２つの発現カセットを含有する（図３）：
【０１１３】
第１のカセット（エレメント４〜６、表４）は、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｖｅｎｔｕｒｉｉに由来する２，６２６ｂｐのＲｐｉ−ｖｎｔ１（Ｖｎｔ１）遺伝子を含有する。遺伝子産物ＶＮＴ１は、ジャガイモをＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓによる疫病感染から保護する植物免疫応答に関与するＲ−タンパク質である。この遺伝子は、ネイティブなＶｎｔ１プロモーターｐＶｎｔ１、およびターミネーターｔＶｎｔ１の下で発現する。
【０１１４】
第２のカセット（エレメント８〜１４、表４）は、形質転換されたジャガイモ変種における液胞インベルターゼ（ＶＩｎｖ）の下方制御を結果としてもたらす。第２のカセットは、分離された逆方向反復として配置された２つのＶＩｎｖの断片（エレメント１０および１２、表４）で構成される。ＶＩｎｖ断片は、主に塊茎において活性である２つのジャガイモ収束プロモーター；ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（Ａｇｐ）遺伝子のＡｇｐプロモーターと顆粒結合デンプン合成酵素（Ｇｂｓｓ）遺伝子のＧｂｓｓプロモーターとの間に配置する。これらのプロモーターにより、逆方向反復の発現が駆動されて二本鎖ＲＮＡが生成し、ＶＩｎｖが下方制御される。
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【０１１５】
したがって、表３および表４から見ることができるように、ｐＳＩＭ１６７８プラスミドは、ジャガイモ植物体を形質転換するために設計されたバイナリーベクターである。ベクター骨格は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの両方における複製のための配列を、ベクター骨格ＤＮＡを有する植物を除去するためのスクリーニング用のｉｐｔマーカーと共に含有する。Ｔ−ＤＮＡ領域は、ＬＢ配列とＲＢ配列とで挟まれた２つの発現カセットからなる。宿主植物組織にｐＳＩＭ１６７８ベクターを有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを接種すると、ｐＳＩＭ１６７８のＴ−ＤＮＡ領域が宿主ゲノム内に移入される。
【０１１６】
（実施例５）
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株およびトランスフェクション
Ｃ５８由来のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＡＧＬ１は、強毒性プラスミドｐＴｉＢｏ５４２のトランスファーＤＮＡを正確に欠失させることによって開発された（Ｌａｚｏら、１９９１年）。一般的な組換え遺伝子（ｒｅｃＡ）にトランスポゾンを挿入することにより、ｐＳＩＭ１２７８などの組換えプラスミドベクターが安定化する（図１）。ＡＧＬ１は、カルベニシリンおよびリファンピシンに対する抵抗性を示し、チメンチンを使用する形質転換されたジャガイモ組織から除去される。選択後、植物は、抗生物質およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのどちらも含まず、ジャガイモ由来の発現カセットが植物のゲノム内に挿入されている。
【０１１７】
ストックの植物体を、３％スクロースおよび２ｇ／ｌのゲルライトを含有する、半分の強度のＭ５１６（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）培地（繁殖培地）４０ｍｌを伴うマゼンタボックス（ｍａｇｅｎｔａ  ｂｏｘ）中で維持した。４週齢の植物体から４〜６ｍｍのジャガイモ節間セグメントを切り取り、ｐＳＩＭ１２７８を有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＡＧＬ１株を感染させ、３％スクロースおよび６ｇ／ｌの寒天を含有する組織培養培地（共栽培培地）に移した。２日後、感染外植片を、３％スクロース、６ｇ／ｌの寒天および１５０ｍｇ／ｌのチメンチンを含有するＭ４０４（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）培地に移してＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを除去した（ホルモンを含まない培地）。この方法の詳細は、Ｒｉｃｈａｅｌら（２００８年）に記載されている。
【０１１８】
１カ月後、感染外植片を、いかなる合成ホルモンも欠く新鮮な培地に移し、Ｐｅｒｃｉｖａｌ生育チャンバー中、２４℃、１６時間の光周期の下でインキュベートし、そこで感染外植片の苗条形成を開始させた。多くの苗条がｉｐｔ遺伝子を発現し、サイトカイニン過剰産生表現型を示した。これらの苗条は、さらなる分析については検討されなかった。ＰＣＲ遺伝子型決定により、残りの苗条の約０．３〜１．５％が、Ｐ−ＤＮＡの少なくとも一部を含有するがｉｐｔ遺伝子を欠くことが実証された。したがって、形質転換された植物を選択するためにマーカーは使用しなかった。ｉｐｔに基づく、マーカーを用いない植物の形質転換に関する詳細は、Ｒｉｃｈａｅｌら（２００８年）により公開されている。
【０１１９】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを除去するプロセスは外植片への感染後２日目に開始した。この目的のために、組織を、生きているＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを含まないことが証明されるまで、抗生物質チメンチン（１５０ｍｇ／Ｌ）に供した。証明は、形質転換された事象の茎断片を栄養ブロス−酵母抽出物（ＮＢＹ培地）上、２８℃で２週間インキュベートすることによって得た（２回繰り返した）。９７  ＣＦＲ  Ｐａｒｔ  ３４０に従って、生きているＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを含まない場合にのみ、形質転換された植物を圃場に移し、植えた。
【０１２０】
Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔ  Ｘ１７事象は、異なるプラスミドを用いた２つの別々の形質転換に由来する挿入断片を含有する。第１の挿入断片、プラスミドｐＳＩＭ１２７８は、塊茎における最大４つのジャガイモ遺伝子、Ａｓｎ１、Ｐｐｏ５、Ｒ１、およびＰｈＬをサイレンシングするために設計された逆方向反復からなる２つのカセットを含有する。同様に、第２のプラスミド、ｐＳＩＭ１６７８は、塊茎におけるＶＩｎｖ遺伝子をサイレンシングするための逆方向反復からなるカセットを含有するが、同時に、ネイティブなジャガイモプロモーター下にあるＲｐｉ−ｖｎｔ１遺伝子のコピーも含有する。
【０１２１】
ジャガイモ植物体変種を、組み込まれたＤＮＡ挿入断片配列の構造およびコピー数を決定するため、およびベクター骨格配列が存在しないことを確認するために、ＤＮＡゲルブロット分析によって分析した。
（実施例６）
ベクター骨格ＤＮＡが存在しないことの証明
【０１２２】
多くの商業的なトランスジェニック作物とは異なり、本開示のジャガイモ栽培品種は、ベクター骨格ＤＮＡなどの、形質転換のために使用されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のＤＮＡ配列を含まないことが以下の２つの異なる方法によって確認された：１）第１に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから植物細胞へのイソペンテニルイソメラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子発現カセットを含む骨格ＤＮＡの偶発的移入により、ｉｐｔ遺伝子発現、したがって、サイトカイニン型ホルモンであるイソペンテニルアデノシンの形成が誘発されるので、負の選択が可能なｉｐｔマーカー遺伝子がベクター骨格内に存在するかしないかを決定し、植物体が、プラスミド骨格内の負の選択が可能なイソペンテニルイソメラーゼ（ｉｐｔ）マーカー遺伝子に関連する表現型を有した場合には、それらを廃棄した。２）次いで、第１のスクリーニング方法を通過した形質転換されたジャガイモ植物体に対して、サザンブロットハイブリダイゼーションを使用して骨格ＤＮＡが存在しないことを確認した。
【０１２３】
したがって、上記の２つの分析から、Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔ  Ｘ１７事象が、形質転換に使用したいずれのプラスミドに由来する骨格も含有しないことが示された。
（実施例７）
挿入ＤＮＡの安定性
【０１２４】
細菌Ｔ−ＤＮＡは、植物への挿入後に安定であるとは限らない。推定される不安定率（０．５〜５．９×１０−４）は、減数分裂に関連付けられ（Mullerら、１９８７年；Connerら、１９９８年）、これは、ジャガイモは栄養生殖するので、ジャガイモには関係ない。したがって、ＤＮＡ挿入は安定であることが予測される。商業的に植えられるのは塊茎であるので、その後の世代の定義には種子ではなく塊茎を使用した。
【０１２５】
分子アッセイおよび表現型アッセイの両方を使用して遺伝学的安定性を評価した。挿入断片の構造は、３世代のＸ１７ジャガイモ（Ｇ０〜Ｇ３）にわたって単離されたゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を使用して安定であることが示され、一方、表現型安定性は、第２世代の圃場で生育させた塊茎におけるポリフェノールオキシダーゼ活性を測定することによって評価した。この方法では、ジャガイモの切断面にカテコールを塗布した後、ＰＰＯサイレンシングの視覚的証拠が示される。これらの試験は、Ｘ１７における所望の遺伝子変化が多数のクローンサイクルにわたって安定なままであり、同時に形質が維持されることを確実にするために行った。
【０１２６】
ＤＮＡ挿入断片の安定性を、サザンブロットを使用して３つの連続的なクローン世代（Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３）を元の形質転換体（Ｇ０）と比較することによって評価した。安定なＤＮＡ挿入断片は、同じ構造を維持し、したがって、多世代の植物体にわたって同じ消化パターンを生じることが予測される。Ｘ１７事象における挿入断片の安定性を試験するために、ｐＳＩＭ１２７８およびｐＳＩＭ１６７８の両方に由来する挿入断片の領域にハイブリダイズする２種のプローブ（ＧＢＳ１およびＡＧＰ）、ならびにｐＳＩＭ１６７８挿入断片に特異的な２種のプローブ（ＩＮＶおよびＶＮＴ１）を使用して、その消化パターンを比較した。これらのプローブがハイブリダイズするＤＮＡ配列は、ジャガイモゲノム内およびＤＮＡ挿入断片（単数または複数）内に含有されるので、サザンブロットでは内在性バンドおよび挿入断片特異的バンドの両方が予測される。
【０１２７】
全てのゲノムＤＮＡ試料を制限酵素ＥｃｏＲＶで消化し、ＡＧＰまたはＧＢＳ１のいずれかに特異的なプローブとハイブリダイズさせた。ＥｃｏＲＶは、両方の挿入断片の内部を消化して、ｐＳＩＭ１２７８挿入断片において予測サイズ（例えば、２．３ｋｂ）の内側のバンドを伴う独特のバンディングのパターンをもたらすので、これらの試験に選択した。Ｘ１７の全ての試料の間で、バンディングのパターンは、どちらのプローブについても互いに同一であった。Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔ対照に存在する複数のバンドはＸ１７でも見られるが、Ｘ１７は、ｐＳＩＭ１２７８挿入断片およびｐＳＩＭ１６７８挿入断片に対応するバンドも含有する。これらのバンドは、同様に、分析したＸ１７の全ての世代の間で一貫しており、これにより、両方の挿入断片の遺伝学的安定性が示される。
【０１２８】
第２の分析は、ｐＳＩＭ１６７８挿入断片に特異的な２種のプローブを使用して実施した。この分析のために、ゲノムＤＮＡ試料を制限酵素ＸｂａＩで消化し、ＶＮＴ１プローブおよびＩＮＶプローブとハイブリダイズした。ＸｂａＩは、ｐＳＩＭ１６７８を内部で消化し、既知サイズ（例えば、ＩＮＶプローブについては４．６ｋｂ）のバンドを生じるので、これらの試験の制限酵素として選択した。再度、内在性バンドおよび挿入断片特異的バンドの両方が検出され、分析した３世代の間で一貫したバンディングのパターンが伴った。遺伝学的および表現型解析により、ｐＳＩＭ１２７８およびｐＳＩＭ１６７８の両方の形質転換によって生じる挿入が３世代にわたって安定であることが示された。３世代にわたって実証された安定性を考慮すると、安定性は、その後の栄養繁殖のサイクルの間、維持される可能性がある。
（実施例８）
遺伝子サイレンシングの有効性および組織特異性
【０１２９】
サイレンシングの標的とする遺伝子およびプロモーターに由来する配列を含有する逆方向反復配列を導入することによってサイレンシングを実現した。二本鎖ＲＮＡ媒介性サイレンシングに関与するいくつもの並行経路が存在するが、これらの逆方向反復の転写は、ウイルス防御に関与する細胞機構によって処理されると考えられている（Fusaroら、２００６年）。Ｘ１７ジャガイモは、合計５つの異なるジャガイモ遺伝子に由来する配列を含有する３つの独特のカセットを含有する。ｐＳＩＭ１２７８構築物は、２つの遺伝子サイレンシングカセットからなる（図４、上の構築物を参照されたい）。一方のカセットは、２種の遺伝子、アスパラギンシンテターゼ−１（Ａｓｎ１）およびポリフェノールオキシダーゼ−５（Ｐｐｏ５）に由来する配列の逆方向反復を含有する。第２のカセットは、デンプン関連遺伝子、Ｒ１（５３１−ｂｐ）およびホスホリラーゼ−Ｌ（ＰｈＬ）（５０８−ｂｐ）のプロモーターに由来する配列を含む。最終的なカセットを、液胞インベルターゼ（ＶＩｎｖ）遺伝子由来の配列を含有する逆方向反復を含むｐＳＩＭ１６７８構築物によって導入した（図４、下の構築物を参照されたい）。
【０１３０】
３つのサイレンシングカセットは全て、塊茎において、光合成的に活性な組織および根と比較して高度に活性である、ジャガイモのＡｇｐ遺伝子およびＧｂｓｓ遺伝子に由来する同じよく特徴付けられた組織特異的プロモーターによって調節される（Nakataら、１９９４年；Visserら、１９９１年）。したがって、発現および遺伝子サイレンシングは、塊茎において最も有効であり、かつ、大きく限定されると予測された。
【０１３１】
５種の標的遺伝子の全ての発現を、ノーザンブロット分析によって特徴付けて、核カセットからの遺伝子サイレンシングの効果を決定した。そして、以下の表５により示される通り、５遺伝子の全てが塊茎において下方制御されることが示された。
【表５】
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【０１３２】
Ｘ１７事象において、全ての標的化遺伝子の塊茎特異的な下方制御が観察された。他の組織における発現レベルは、葉におけるＡｓｎ１ならびに花におけるＡｓｎ１およびＶＩｎｖがわずかに低下した以外は影響を受けなかった。
（実施例９）
ジャガイモ栽培品種Ｘ１７の特徴付けの概要
【０１３３】
ジャガイモ変種Ｘ１７は、疫病に対する抵抗性を増大させること、打撲黒斑に関与する酵素の発現を低下させること、および、反応物、すなわちアスパラギンおよび還元糖の濃度を低下させることによりアクリルアミドを減少させることによって品質を改善するというジャガイモ産業の必要性に対処するものである。ジャガイモ品種Ｘ１７を、ジャガイモ植物体ゲノムに対してネイティブであり、外来ＤＮＡ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＤＮＡ、ウイルスマーカーまたはベクター骨格配列を含有しない核酸配列で形質転換した。さらに、農学的試験を行って、当該事象が、形質に関連する特性を例外として従来の対照と同様に生育することを確実にした。
【０１３４】
２０１３年および２０１４年に米国の１０カ所において圃場試験を行った。この試験の目的は、Ｘ１７ジャガイモの表現型性能、塊茎、および生態学的相互作用をＲａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔ対照と比較して評価することであった。
【０１３５】
収集された表現型、塊茎、および生態学的相互作用のデータからは、Ｘ１７とＲａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔ対照の間でいかなる意味のある差異も示されなかった。
【０１３６】
表現型特性のいずれについても統計的有意差は検出されず、これにより、Ｘ１７が表現型に関してＲａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔと同等であることが示される。
【０１３７】
塊茎評価の結果から、比重、高糖質、およびフライの色は異なったが、従来のジャガイモにおいてみられる値の範囲内であることが示された。
【０１３８】
これらの差異により、Ｘ１７の塊茎の品質の改善が実証される。
【０１３９】
昆虫、病害、および非生物的ストレッサー、ならびに節足動物発生量についての差異がないことにより、Ｘ１７の生態学的相互作用が従来のジャガイモと同じであるという結論が支持される。
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【０１４０】
表現型性能、塊茎評価、および生態学的相互作用の試験の結果から、Ｘ１７とＲａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔ対照の間に意味のある差異は示されない。表現型特性のいずれに関しても差異は検出されなかった。塊茎評価については、比重、高糖質、およびフライの色は異なったが、従来のジャガイモにおいて見いだされる値の範囲内であった。これらの特性は、環境リスクに関連するものではなく、Ｘ１７の品質は、従来のジャガイモの範囲内に入ることが確認される。これらの差異により、Ｘ１７の塊茎の品質の改善が実証される。昆虫、病害、および非生物的ストレッサーならびに節足動物発生量に関して差異がないことにより、Ｘ１７の生態学的相互作用が従来のジャガイモと異ならないという結論が支持される。
（実施例１０Ａ）
ジャガイモ栽培品種Ｘ１７疫病有効性２０１３実験
【０１４１】
この試験の目的は、ジャガイモ事象Ｘ１７の葉の疫病（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）に対する圃場での有効性を評価することであった。
【０１４２】
２０１３年の間に３カ所で圃場試験を行った。プロットに、疫病のＵＳ−８株、ＵＳ−２２株、および／またはＵＳ−２３株を接種した。葉の感染の程度を、季節を通して評価した。
【０１４３】
Ｘ１７では、それらの形質転換されていない親対照と比較して、疫病への葉の感染の有意な低減が観察され、これにより、試験したＰ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓの株に対する疫病抵抗性形質の有効性が実証される。
（実施例１０Ｂ）
ジャガイモ栽培品種Ｘ１７疫病有効性２０１４実験
【０１４４】
この試験の目的は、ジャガイモ事象Ｘ１７の葉の疫病（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）に対する圃場での有効性を評価することであった。
【０１４５】
２０１４年の間に２カ所で圃場試験を行った。プロットに疫病のＵＳ−２３株を接種した。葉の感染の程度を、季節を通して評価した。
【０１４６】
Ｘ１７では、それらの形質転換されていない親対照と比較して、疫病への葉の感染の有意な低減が観察され、これにより、試験したＰ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓの株に対する疫病抵抗性形質の有効性が実証される。
【０１４７】
参照による組み込み
本明細書において引用されている全ての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公報、および特許出願は、あらゆる目的に関してそれらの全体が参照により組み込まれる。しかし、本明細書において引用されている参考文献、論文、刊行物、特許、特許公報、および特許出願のいずれに対する言及も、それらが有効な先行技術を構成するまたは世界の任意の国における共通の一般知識の一部を形成することの承認またはいかなる形態の示唆でもなく、そのように取られるべきではない。
【０１４８】
上記の説明は、単に例示的な実施形態および実施例を表すものであることが理解されるべきである。読者の利便性のために、上記の説明は、本開示の原理を教示する全ての可能性のある実施形態、実施例のうちの限られた数の代表的な例に焦点を合わせている。説明は、全ての可能性のある変形またはさらには記載されるそれらの変形の組合せを徹底的に列挙しようとはしていない。本開示の特定の部分に関しては代替実施形態が示されていない場合があること、または別の記載されていない代替実施形態が一部に関して利用可能であり得ることは、それらの代替実施形態の権利放棄とみなされるべきではない。それらの記載されていない実施形態の多くは、本開示の原理の適用の差異ではなく、技術および材料の差異を伴うことが当業者には理解されよう。したがって、本開示は、以下の特許請求の範囲に記載されている範囲および等価物未満に限定されるものではない。
参考文献
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【０１４９】
寄託情報
上に開示されており、添付の特許請求の範囲に列挙されているＪ．Ｒ．Ｓｉｍｐｌｏｔ  Ｃｏｍｐａｎｙの独自のジャガイモ栽培品種Ｘ１７の塊茎は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０への寄託がなされた。寄託日は、２０１５年６月１７日であった。５０バイアルの微小塊茎の寄託物を、本出願の出願日の前からＪ．Ｒ．Ｓｉｍｐｌｏｔ  Ｃｏｍｐａｎｙにより維持されている同じ寄託物から取得した。特許が付与された際に全ての制限が決定的に取り除かれ、寄託は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８０１〜１．８０９の要件の全てを満たすものとする。ＡＴＣＣ受託番号はＰＴＡ−１２２２４８である。寄託物は、受託所において、３０年または最後の要求から５年の期間、または特許の権利行使可能期間のいずれか長い方の期間維持され、必要に応じてその期間中に交換される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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