(57)【要約】本開示は、カルニチンおよび／またはその誘導体、脂肪酸、ステロイド、ならびにそれらの組み合わせを含む、骨格筋幹細胞または骨格筋前駆細胞から筋線維または筋管を調製するための組成物を記載する。好ましい態様は、0.1 mM L-カルニチン、0.2 mM 9-シス-リノール酸、および10 mMジヒドロテストステロンを含む。また、線維芽細胞成長因子アゴニスト、Notchシグナル伝達アゴニスト、核酸、およびそれらの組み合わせを含む、骨格筋幹細胞または骨格筋前駆細胞の拡大を誘導するための組成物も開示する。好ましい態様は、20 ng/ml塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、50μg/ml Delta様リガンド1（DLL1）、10 mMヒポキサンチン、および1.6 mMチミジンを含む。2018506290.tif 000003
2018506290.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルニチンおよび／またはその誘導体、脂肪酸、ならびにステロイドを含む、骨格筋幹細胞または骨格筋前駆細胞から筋線維または筋管を調製するための組成物。
【請求項２】
骨格筋前駆細胞が筋芽細胞である、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
骨格筋幹細胞が筋衛星細胞である、請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
筋芽細胞が、胚性幹（ES）細胞、人工多能性幹（IPS）細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、または多分化能幹細胞に由来する、請求項2に記載の組成物。
【請求項５】
筋芽細胞が、ヒト胚性幹細胞におけるPax7 mRNA発現と比較して高いレベルのPax7 mRNAを発現する、請求項4に記載の組成物。
【請求項６】
筋芽細胞が初代筋芽細胞である、請求項2に記載の組成物。
【請求項７】
骨格筋幹細胞または骨格筋前駆細胞が哺乳動物に由来する、請求項1〜6に記載の組成物。
【請求項８】
骨格筋幹細胞または骨格筋前駆細胞が、ヒト、げっ歯類、または霊長類に由来する、請求項7に記載の組成物。
【請求項９】
カルニチンまたはその誘導体がL-カルニチンまたはアシルカルニチンである、請求項1に記載の組成物。
【請求項１０】
アシルカルニチンが、O-アセチル-カルニチン、O-プロピオニル-カルニチン、またはO-ブタノイル-カルニチンである、請求項9に記載の組成物。
【請求項１１】
脂肪酸が不飽和脂肪酸である、請求項1に記載の組成物。
【請求項１２】
脂肪酸がオメガ3脂肪酸またはオメガ6脂肪酸である、請求項11に記載の組成物。
【請求項１３】
脂肪酸が、リノール酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リノレン酸、および前述の脂肪酸の誘導体からなる群より選択される、請求項12に記載の組成物。
【請求項１４】
リノール酸が、9-シス-リノール酸、12-シス-リノール酸、シス-9-オクタデカジエン酸、およびシス-12-オクタデカジエン酸からなる群より選択される、請求項13に記載の組成物。
【請求項１５】
ステロイドが性ステロイドである、請求項1に記載の組成物。
【請求項１６】
性ステロイドが、アンドロゲンおよびエストロゲンからなる群より選択される、請求項15に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ステロイドが、テストステロン、エストラジオール、またはそれらの誘導体である、請求項16に記載の組成物。
【請求項１８】
L-カルニチン、リノール酸、およびテストステロンを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
約0.1 mMの濃度のL-カルニチン、約0.2 mMの濃度のリノール酸、および約10 mMの濃度のテストステロンを含む、請求項18に記載の組成物。
【請求項２０】
線維芽細胞成長因子シグナル伝達アゴニスト、Notchシグナル伝達アゴニスト、および核酸を含む、骨格筋幹細胞または骨格筋前駆細胞の拡大を誘導するための組成物。
【請求項２１】
骨格筋前駆細胞が筋芽細胞である、請求項20に記載の組成物。
【請求項２２】
骨格筋幹細胞が筋衛星細胞である、請求項20に記載の組成物。
【請求項２３】
筋芽細胞が、胚性幹（ES）細胞、人工多能性幹（IPS）細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、または多分化能幹細胞に由来する、請求項21に記載の組成物。
【請求項２４】
筋芽細胞が、ヒト胚性幹細胞におけるPax7 mRNA発現と比較して高いレベルのPax7 mRNAを発現する、請求項22に記載の組成物。
【請求項２５】
筋芽細胞が初代筋芽細胞である、請求項21に記載の組成物。
【請求項２６】
骨格筋幹細胞または骨格筋前駆細胞が哺乳動物に由来する、請求項20〜25に記載の組成物。
【請求項２７】
骨格筋幹細胞または骨格筋前駆細胞が、ヒト、げっ歯類、または霊長類に由来する、請求項26に記載の組成物。
【請求項２８】
線維芽細胞成長因子シグナル伝達アゴニストが線維芽細胞成長因子（FGF）である、請求項20に記載の組成物。
【請求項２９】
線維芽細胞成長因子シグナル伝達アゴニストが、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、およびFGF23からなる群より選択される、請求項28に記載の組成物。
【請求項３０】
線維芽細胞成長因子シグナル伝達受容体アゴニストがFGF2（塩基性線維芽細胞成長因子；bFGF）（bFGF）またはその誘導体である、請求項29に記載の組成物。
【請求項３１】
Notchシグナル伝達アゴニストが、Delta様リガンド（DLL）、Jagged/Serrateリガンド、またはそれらの誘導体である、請求項20に記載の組成物。
【請求項３２】
Delta様リガンド（DLL）が、Delta様1（DLL1）、Delta様3（DLL3）、およびDelta様4（DLL4）からなる群より選択される、請求項31に記載の組成物。
【請求項３３】
Jagged/Serrateリガンドが、Jagged 1（JAG1）、Jagged 2（JAG2）、およびSerrateからなる群より選択される、請求項31に記載の組成物。
【請求項３４】
前記核酸が、ヒポキサンチン、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、イノシン、キサンチン、および前述の窒素塩基の誘導体からなる群より選択される窒素塩基に由来する、請求項20に記載の組成物。
【請求項３５】
塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、Delta様リガンド1（DLL1）、ヒポキサンチン、およびチミンを含む、請求項20〜34のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
約20 ng/mlの濃度の塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、約50μg/mlの濃度のDelta様リガンド1（DLL1）、約10 mMの濃度のヒポキサンチン、および約1.6 mMの濃度のチミンを含む、請求項35に記載の組成物。
【請求項３７】
骨格筋幹細胞または骨格筋前駆細胞を請求項1〜19に記載の組成物と接触させる工程を含む、筋線維または筋管を調製するための方法。
【請求項３８】
骨格筋幹細胞または骨格筋前駆細胞を請求項20〜36に記載の組成物と接触させる工程を含む、骨格筋前駆細胞の拡大を誘導するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2015年2月25日に出願されたシンガポール特許仮出願第10201501387X号の優先権の恩典を主張し、その内容はこれにより、すべての目的でその全体が参照により組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、細胞生物学、分子生物学、および生物工学の分野に関連する。特に、本発明は、骨格筋前駆細胞を細胞培養において分化させること、培養すること、および拡大することに関連する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
骨格筋損傷および悪液質などの種々の筋肉疾患のため、ならびに再生医療における用途のための、細胞療法としての筋形成性幹細胞の使用が、数十年間試みられているが、中程度の成功しかしていない。例えば、人工多能性幹細胞（iPSC）由来の筋細胞は、同種異系間移植を可能にするため、骨格筋を再生する幹細胞療法にとって有望な候補である。このように、治療中に必要とされる大量のこれらの筋細胞の利用を可能とするための、筋芽細胞を細胞培養において拡大するためおよび分化させるための安全かつ良好な耐容性を示す方法および／または組成物について、まだ対処されていない必要性がある。
【発明の概要】
【０００４】
概要
1つの局面において、本発明は、カルニチンまたはその誘導体、脂肪酸、ステロイド、およびそれらの組み合わせを含む、骨格筋幹細胞または骨格筋前駆細胞から筋線維または筋管を調製するための組成物に言及する。
【０００５】
別の局面において、本発明は、線維芽細胞成長因子シグナル伝達アゴニスト、Notchシグナル伝達アゴニスト、核酸、およびそれらの組み合わせを含む、骨格筋幹細胞または骨格筋前駆細胞の拡大を誘導するための組成物に言及する。
【０００６】
また別の例において、本発明は、骨格筋幹細胞または骨格筋前駆細胞を、本明細書に記載する組成物と接触させる工程を含む、筋線維または筋管を調製するための方法に言及する。
【０００７】
さらなる例において、本発明は、骨格筋幹細胞または骨格筋前駆細胞を、本明細書に記載する組成物と接触させる工程を含む、骨格筋前駆細胞の拡大を誘導するための方法に言及する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
本発明は、非限定的な実施例および添付の図面とともに考慮すると、詳細な説明に関してより良好に理解されるであろう。
【０００９】
【図１】処理していない対照群と比較した、20 ng/ml塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、3μM CHIR99021、2.5μg/ml Delta様タンパク質1（DLL1）、およびbFGF/CHIR/DLL1の組み合わせで処理した人工多能性幹細胞由来筋芽細胞における、PAX7 mRNA発現のレベルの比較を示す棒グラフである。この図に示すデータは、上述の化合物での細胞の処理が、細胞のPAX7発現の増加を結果としてもたらすことを例証し、それにより、PAX7は筋芽細胞の同一性および増殖を維持するマスター転写因子であることが公知であるため、筋芽細胞機能が促進されていることを示す。
【図２】筋形成を起こしているヒト人工多能性幹細胞に対して行った、液体クロマトグラフィー-質量分析（LC-MS）ベースの細胞内メタボロミクスの結果を図示するヒートマップである。bFGF/CHIR/DLL1を用いた薬物処理を伴う胚様体（EB）は、PAX7＋筋芽細胞が濃縮され、薬物処理を伴わないEBに対して、サイクリックAMP（cAMP）、デオキシヌクレオチド（dNTP）、ヌクレオチド（NTP）、およびビタミンB12などの特定の代謝産物のより高いレベルを示す。
【図３】処理していない対照群と比較した、メタボロミクスの知見に関連した70種の異なる小分子でのスクリーニング後の人工多能性幹細胞由来筋芽細胞における、OCT3/4、NCAM、AFP、およびPAX7 mRNA発現のレベルを示すヒートマップである。この図に示すデータは、フォルスコリン、グルタミン、ヒポキサンチンおよびチミジン（HT）補給剤、ならびにビタミンB12などの化合物での細胞の処理が、細胞におけるPAX7および神経筋マーカーNCAMを増加できることを例証し、それにより、多能性マーカーOCT3/4または内胚葉マーカーAFPの増加を伴わない筋芽細胞機能の増大を示す。
【図４】DMEM培地に溶解した、bFGF/CHIR/DLL1、ならびにフォルスコリン、グルタミン、ヒポキサンチンおよびチミジン（HT）補給剤、ならびにビタミンB12の複合カクテルへの曝露を伴うかまたは伴わない、初代成体ヒト骨格筋（hSkM）、ヒト胚性幹細胞（hES）、またはヒト人工多能性幹細胞（hiPS）に由来する筋芽細胞における、集団倍加速度または増殖速度の比較を示す線グラフである。この図に示すデータは、上述のカクテルでの細胞の処理が、DMEM（20％ FBS）培地に曝露したいずれかの筋芽細胞と比較して、少なくとも212倍の（4000倍を上回る）集団倍加または増殖の劇的な増大を結果としてもたらすことを例証する。
【図５】DMEM培地に溶解した、bFGF/CHIR/DLL1、ならびにフォルスコリン、グルタミン、ヒポキサンチンおよびチミジン（HT）補給剤、ならびにビタミンB12の複合カクテルへの曝露を伴うかまたは伴わない、成体ヒト骨格筋（hSkM）、ヒト胚性幹細胞（hES）、またはヒト人工多能性幹細胞（hiPS）に由来する筋芽細胞における、PAX7、MYF5、MYOD1、MYOG、MYHC mRNA発現のレベルを示す棒グラフである。継代6および継代1の両方の細胞を、カクテルにおける継代1のiPS由来筋芽細胞に対して比較した。この図に示すデータは、上述のカクテルでの細胞の処理が、継代6までに経時的に、筋芽細胞マーカーであるPAX7およびMYF5の増加、ならびに分化した筋細胞のマーカーであるMYOG、MYHCの減少を結果としてもたらすことを例証し、それにより、カクテルが、筋芽細胞増殖を促進し、筋芽細胞の筋細胞への分化を阻止することを示す。対照的に、DMEM（20％ FBS）培地は、1継代以内に劇的に、筋芽細胞マーカーであるPAX7およびMYF5を減少させ、かつ分化した筋細胞のマーカーであるMYOD1、MYOG、MYHCを増加させて、それにより、正規のDMEM培地が筋芽細胞分化を促進することを示す。
【図６】ビヒクルで処理した（BSA 0.1％）対照群と比較した、様々な濃度の塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、Delta様タンパク質1（DLL1）、Delta様タンパク質4（DLL4）、Jaggedタンパク質1（JAG1）、Jaggedタンパク質2（JAG2）、HT（ヒポキサンチンおよびチミジン）補給剤、HTおよびDLL1の組み合わせ、ならびに、HT、DLL1、およびbFGFの組み合わせで処理した人工多能性幹細胞由来筋芽細胞における、PAX7 mRNA発現のレベルの比較を示す棒グラフである。この図に示すデータは、HT 1x（ヒポキサンチン10 mMおよびチミジン1.6 mM）、DLL1 50μg/ml、およびbFGF 20 ng/mlの組み合わせでの細胞の処理が、PAX7発現を増加させ（約100倍）、そのために筋芽細胞増殖を増加させるのに最適であることを例証する。
【図７】ビヒクルで処理した（BSA 0.1％）対照群と比較した、様々な濃度の塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、Delta様タンパク質1（DLL1）、Delta様タンパク質4（DLL4）、Jaggedタンパク質1（JAG1）、Jaggedタンパク質2（JAG2）、ヒポキサンチンおよびチミジン（HT）補給剤、HTおよびDLL1の組み合わせ、ならびに、HT、DLL1、およびbFGFの組み合わせで処理した筋芽細胞の、増殖速度の比較を示す棒グラフである。この図に示すデータは、HT 1x（ヒポキサンチン10 mMおよびチミジン1.6 mM）、DLL1 50μg/ml、およびbFGF 20 ng/mlの組み合わせでの細胞の処理が、筋芽細胞の細胞増殖を増加させる（約4000倍）のに最適であることを例証する。
【図８】筋形成を起こしているヒト人工多能性幹細胞に対して行った、液体クロマトグラフィー-質量分析（LC-MS）ベースの細胞内メタボロミクスの結果を図示するヒートマップである。bFGF/CHIR/DLL1を用いた薬物処理を伴う単層は、分化した筋管が濃縮され、薬物処理を伴わない単層に対して、カルニチン、脂肪酸アシル-CoA、アセチル-CoA、およびステロールなどの特定の代謝産物のより高いレベルを示す。
【図９】処理していない対照群と比較した、メタボロミクスの知見に関連した70種の異なる小分子でのスクリーニング後の人工多能性幹細胞由来筋管における、MYOG、MYHC、MYH3、MYH8、MYH7、MYH2、MYH1発現のレベルを示すヒートマップである。この図に示すデータは、カルニチン、リノール酸、フルバスタチン、テストステロンなどのいくつかの化合物での細胞の処理が、分化した筋細胞のマーカーであるMYOG、MYHC、MYH3、MYH8、および成体筋管マーカーであるMYH7、MYH2、MYH1の発現を増加させうることを例証し、それにより、筋芽細胞の筋管への分化の効率の増大を示す。
【図１０】対照のダルベッコ改変イーグル培地（DMEM；2％ウマ血清）培地またはCLFT（カルニチン、リノール酸、フルバスタチン、テストステロン）を補給した培地への8週間の曝露後の、人工多能性幹細胞由来の筋管の形態および分化効率を示す顕微鏡写真のペアである。この図に示すデータは、CLFT培地への曝露時の、厚い多核筋管の形成の増大を例証する。
【図１１】対照のダルベッコ改変イーグル培地（DMEM；2％ウマ血清）培地またはCLFT（カルニチン、リノール酸、フルバスタチン、テストステロン）培地への3日間の曝露後の、初代ヒト骨格筋（hSkM）筋芽細胞由来の筋管の形態および分化効率を示す顕微鏡写真のペアである。この図に示すデータは、CLFT培地への曝露時の、厚い多核筋管の形成の増大を例証する。
【図１２】初代成体ヒト骨格筋（hSkM）に由来する筋管における、MYOG、MYHC、MYH3、MYH8、MYH7、MYH2、MYH1 mRNA発現のレベルを示す棒グラフである。この図に示すデータは、CLFT培地での細胞の処理が、分化した成体筋管のマーカーであるMYOG、MYHC、MYH3、MYH8、MYH7、MYH2、MYH1の増加を結果としてもたらすことを例証し、それにより、CLFT培地が初代hSkM筋芽細胞の成体筋管への分化を増強することを示す。
【図１３】ビヒクルで処理した（DMSO 0.5％）対照群と比較した、様々な濃度のカルニチン、O-アセチル-カルニチン、9-シス-リノール酸、12-シス-リノール酸、シス-9-オクタデカジエン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リノレン酸、テストステロン、エストラジオール、9-シス-リノール酸（L）およびテストステロン（T）の組み合わせ、ならびに、カルニチン（C）、9-シス-リノール酸（L）、およびテストステロン（T）の組み合わせで処理した人工多能性幹細胞由来筋管における、成体遅筋MHC（MYH7）および成体速筋MHC（MYH2）のmRNA発現のレベルの比較を示す棒グラフである。この図に示すデータは、CLTの組み合わせでの細胞の処理が、成体遅筋MHC（MYH7）および成体速筋MHC（MYH2）の両方の発現を増加させるのに最適であり、そのために成体筋管の分化を増大させるのに最適であることを例証する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
定義
本明細書において使用する際、「筋形成」という用語は、特に胚発生中の、筋肉組織の生成および形成を指す。筋形成の過程中に、成熟した筋細胞が、筋芽細胞の分化および成熟を通して形成される。
【００１１】
本明細書において使用する際、「筋芽細胞」という用語は、成熟した収縮細胞がそれに由来する、胚性（前駆型）筋肉細胞を指す。一般に筋細胞として公知であるこれらの成熟した収縮細胞は、骨格筋細胞、心筋細胞、および平滑筋細胞であり、そのすべてが種々の特性を有する、3種の筋肉細胞のうちの1種を形成する。心筋および骨格筋の縞のある細胞は、概して、筋肉線維と呼ばれる。心臓筋細胞（すなわち心筋細胞）は、心臓の室を形成する筋肉線維であり、単一の中心核を有する。骨格筋線維（融合した骨格筋細胞で作られている）は、身体を支持して動かす手助けをし、周辺核を有する傾向がある。平滑筋細胞は、不随意運動、例えば、食道および胃における蠕動収縮を制御する。
【００１２】
本明細書において使用する際、「筋管」という用語は、筋芽細胞の多核線維への融合を通して概して形成される筋肉線維を指す。
【００１３】
本明細書において使用する際、「hES」または「ヒト胚性幹細胞」という用語は、ヒト胚の未分化内部塊細胞に由来する幹細胞を指す。胚性幹細胞は多能性であり、それは、それらが外胚葉、内胚葉、および中胚葉の3種の一次胚葉すべての誘導体に成長（すなわち分化）できることを意味する。換言すると、ヒト胚性幹細胞は、それらがそのように指定される限り、成体ヒト身体の200種より多い異なる細胞タイプの各々に発生することができる。胚性幹細胞は、多能性および無期限に複製する能力という他とは異なる2種の特性によって区別される。多能性は、胚性幹細胞を、成体において見出される成体幹細胞から区別する。このように、胚性幹細胞は、身体におけるすべての細胞タイプを生成することができるが、成体幹細胞は、多分化能を有し、限定された数の細胞タイプのみを生じることができる。追加的に、胚性幹細胞は、定義された条件下で、無期限に自分自身を増やす能力を有する。これにより、胚性幹細胞は、無限の数の自分自身を、継続的な研究または臨床用途のために生じることができるため、研究および再生医療の両方にとって有用なツールとして使用することが可能になる。胚性幹細胞療法は、それらの可塑性、および自己複製の潜在的に無限の能力のために、損傷または疾患後の再生医療および組織置換について提唱されている。多能性幹細胞により潜在的に処置することができる疾患には、複数の血液および免疫系に関連する遺伝性疾患、がん、および障害；若年性糖尿病；パーキンソン病；盲目および脊髄損傷が含まれるが、それらに限定されるわけではない。胚性幹細胞の他の可能性のある用途には、ヒト初期発生の調査、遺伝性疾患の研究、および毒物学の試験用のインビトロ系としての用途が含まれる。
【００１４】
本明細書において使用する際、培養における細胞に関する「初代」という用語は、対象から直接培養されて細胞培養にある細胞を指す。腫瘍に由来するいくつかの初代細胞を除いて、大抵の初代細胞培養は、限定された寿命を有する。初代細胞とは反対に、樹立された細胞株または不死化された細胞株は、ランダム変異、またはテロメラーゼ遺伝子の人工的発現などの故意の改変のいずれかを通して獲得された、無期限に増殖する能力を有する。
【００１５】
本発明の詳細な説明
筋肉組織工学は、機能的に欠損した筋肉を再生するための重要な方法の1つである。骨格筋などであるがそれに限定されるわけではない筋肉は、生物において多数の様々な機能を果たす、非常に複雑なかつ不均質な組織である。筋形成としても公知である、筋肉を生成する過程は、いくつかの別個の段階に分けることができる。胚の筋形成中に、中胚葉由来の構造が、身体の最初の筋肉線維を生成し、その後の波において、これらの最初の鋳型線維に沿って、追加の線維が生成される。細胞培養において筋芽細胞の拡大および分化を模倣する試みは、困難を伴うことが当技術分野において公知であり、例えば、細胞生存および拡大に必要とされる添加物および構成要素のために細胞培養において細胞がその固有の分化潜在能力を失わずに、筋芽細胞をエクスビボで拡大することは、公知の問題である。したがって、筋芽細胞の拡大、およびそれらのその後の分化のための方法または組成物についての必要性に、本開示において対処する。
【００１６】
初代ヒト筋芽細胞（骨格筋前駆細胞）および筋形成分化を起こしているヒト胚性幹細胞／人工多能性幹細胞由来の胚様体の両方に対するメタボロミクスおよび代謝産物／薬物スクリーニング戦略を用いて、ヒト胚性幹細胞／人工多能性幹細胞由来の筋芽細胞および初代ヒト筋芽細胞の両方がヒト筋肉再生のために筋線維に効率的に分化するように、誘導することができる分子の組み合わせを特定した。したがって、1つの例において、本明細書に記載する筋芽細胞は、ヒト胚性幹細胞におけるPax7 mRNA発現と比較して高いレベルのPax7 mRNAを発現する。
【００１７】
上記に概要を述べたアプローチに基づいて、細胞培養における前記細胞の拡大をさらに可能にすることができる分子のさらなる組み合わせを見出した。特許請求する組成物は、ヒト胚性幹細胞／人工多能性幹細胞由来のPax7＋筋芽細胞および初代ヒト筋芽細胞の両方の大規模拡大を誘導するのに安全でありかつ良好な耐容性を示し、それにより、患者の筋肉再生を改善および処置する能力を生じさせる。
【００１８】
ヒト筋芽細胞対ヒト筋管のメタボロミクス解析、および筋芽細胞に対する代謝産物／薬物スクリーニングに基づいて、ヒト筋芽細胞の筋管への効率的な分化のための組成物を見出した。対照的に、以前に試されたことがある大抵の他の代謝産物および薬物は、エクスビボで前記細胞の分化を増強することができなかった。本明細書に記載する組成物を、ヒト胚性幹細胞／人工多能性幹細胞由来の筋芽細胞および初代ヒト筋芽細胞の両方に対して試験し、それにより、筋管分化のための現在の標準的処理と比較して10倍よりも高い効率を筋管分化において結果としてもたらした。このように、1つの例において、本開示は、カルニチンまたはその誘導体、脂肪酸、ステロイド、およびそれらの組み合わせを含む、骨格筋幹細胞または骨格筋前駆細胞から筋線維または筋管を調製するための組成物を記載する。
【００１９】
本明細書において使用する際、「カルニチン」という用語は、身体のほぼすべての細胞において見出される、アミノ酸に由来する化合物を指す。カルニチンは、したがって、L-カルニチン、アセチル-L-カルニチン、およびプロピオニル-L-カルニチンを含むがそれらに限定されるわけではない、複数の化合物に対する総称である。したがって、1つの例において、カルニチンまたはその誘導体は、L-カルニチンまたはアシルカルニチンである。また別の例において、アシルカルニチンは、O-アセチル-カルニチン、O-プロピオニル-カルニチン、またはO-ブタノイル-カルニチンである。さらなる例において、カルニチンはL-カルニチンである。
【００２０】
1つの例において、組成物中に存在するカルニチンは、10μM〜1 mMの間、5μM〜0.1 mMの間、0.5 mM〜1 mMの間、少なくとも50μM、少なくとも100μM、少なくとも250μM、少なくとも500μM、約20μM、約70μM、約80μM、約90μM、約95μM、約100μM、約120μM、約180μM、約200μM、約500μM、約800μM、または約1000μMであるがそれらに限定されるわけではない濃度である。1つの例において、組成物中に存在するカルニチンは、少なくとも0.1 mMの濃度である。別の例において、組成物中に存在するカルニチンは、約0.1 mMの濃度である。また別の例において、組成物中に存在するカルニチンは、約100μMの濃度である。
【００２１】
本明細書において使用する際、「脂肪酸」という用語は、約4個〜約28個の炭素原子を含みうる、脂肪族尾部を有する飽和モノカルボン酸または不飽和モノカルボン酸を指す。このように、1つの例において、脂肪酸は不飽和脂肪酸である。本明細書に記載する脂肪酸は、一般式CnH2n+1COOH（式中、nは正の整数である）を有する飽和モノカルボン酸でありうる。1つの例において、nは、約4〜約28でありうる。脂肪酸の脂肪族尾部は、ヒドロキシル官能基を含まなくてもよい。脂肪酸は、脂肪、ワックス、およびエッセンシャルオイルにおいてエステルの形態で、または、脂肪および脂肪油においてグリセリドの形態で、天然に存在しうる。脂肪酸の例は、オレイン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ルーメン酸、バクセン酸、ミリソレイン（myrisoleic）酸、パルミトレイン酸、α-リノール酸を含みうるが、それらに限定されるわけではない。それはまた、任意の他の通常の脂肪酸、その誘導体、およびそれらの組み合わせも含みうる。1つの例において、脂肪酸は、オメガ3脂肪酸またはオメガ6脂肪酸である。別の例において、脂肪酸は、リノール酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リノレン酸、およびそれらの誘導体であることができるが、それらに限定されるわけではない。また別の例において、リノール酸は、9-シス-リノール酸、12-シス-リノール酸、シス-9-オクタデカジエン酸、およびシス-12-オクタデカジエン酸であることができるが、それらに限定されるわけではない。さらなる例において、リノール酸は9-シス-リノール酸である。
【００２２】
1つの例において、組成物中に存在する脂肪酸は、0.01 mM〜3 mMの間、0.02〜0.5 mMの間、0.4 mM〜1.8 mMの間、少なくとも0.05 mM、少なくとも0.1 mM、少なくとも0.15 mM、約0.1 mM、約0.18 mM、約0.2 mM、約0.5 mM、約1 mM、約1.5 mM、約1.7 mM、または約2 mMであるがそれらに限定されるわけではない濃度である。1つの例において、脂肪酸は、少なくとも0.1 mMの濃度で組成物中に存在する。別の例において、脂肪酸は、約0.2 mMの濃度で組成物中に存在する。
【００２３】
本明細書において使用する際、「ステロイド」という用語は、特定の立体配置に整列された4個の環を有する有機化合物を指す。ステロイドコア構造は、3個の6員シクロヘキサン環および1個の5員シクロペンタン環である4個の「融合された」環において結合した、17個の炭素原子から構成されている。ステロイドは、この4環コアに付着した官能基、および環の酸化状態によって変動する。すべてのステロイドは、ステロールであるラノステロール（動物、真菌）またはシクロアルテノール（植物）から細胞中で製造される。ラノステロールおよびシクロアルテノールは、トリテルペンスクアレンの環化に由来する。ヒトにおいて、性ホルモンなどのステロイドホルモンには、エストロゲン、プロゲステロン、アンドロゲン、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、アルドステロン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、コルチゾール、カルシトリオール、カルシジオール、ならびにそれらの誘導体および類似体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。本明細書において使用するステロイドという用語は、天然ステロイドおよび合成ステロイドの両方、ならびにそれらの誘導体および類似体を包含する。このように、1つの例において、ステロイドは性ステロイドである。別の例において、性ステロイドは、アンドロゲンまたはエストロゲンのいずれかである。また別の例において、ステロイドは、テストステロン、エストラジオール、またはそれらの誘導体である。さらなる例において、ステロイドはジヒドロテストステロンである。
【００２４】
1つの例において、組成物中に存在するステロイドは、0.5 nM〜150 nMの間、1 nM〜100 nMの間、50 nM〜75 nMの間、少なくとも0.8 nM、少なくとも1.6 nM、少なくとも8 nM、約3 nM、約5 nM、約10 nM、約11 nM、約15 nM、約20 nM、約40 nM、約60 nM、または約80 nMであるがそれらに限定されるわけではない濃度である。1つの例において、ステロイドは、少なくとも10 nMの濃度で組成物中に存在する。1つの例において、ステロイドは、約10 nMの濃度で存在する。
【００２５】
本明細書に記載する組成物は、さらなる任意の構成要素のスタチンを含んでもよい。本明細書において使用する際、HMG-CoA還元酵素阻害剤としても公知である「スタチン」という用語は、コレステロールの産生において中心的な役割を果たす酵素であるHMG-CoA還元酵素を阻害する、コレステロールを低下させる化合物および／または分子のクラスを指す。高いコレステロールレベルは、心臓血管疾患（CVD）と関連している。スタチンはまた、肝臓における低密度リポタンパク質（LDL）結合受容体の産生を促進し、血漿中に循環しているLDLのレベルの通常著しい減少、および高密度リポタンパク質（HDL）のレベルのささやかな増加を結果としてもたらすことも公知である。スタチンの例は、フルバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、ピタバスタチン、セリバスタチン、メバスタチン、およびそれらの誘導体を含むことができるがそれらに限定されるわけではない、1型スタチンまたは2型スタチンであるが、それらに限定されるわけではない。1つの例において、スタチンは、1型スタチンまたは2型スタチンである。別の例において、スタチンは、フルバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、アトルバスタチン、およびそれらの誘導体であるが、それらに限定されるわけではない。
【００２６】
本明細書において使用する際、「前駆細胞」という用語は、幹細胞に類似して、特定のタイプの細胞に分化する能力を有するが、すでに幹細胞よりも特異的であり（すなわち、真の幹細胞よりも分化の道をさらに下っており）、その「標的」細胞に分化するように推進されている、生物学的細胞を指す。前駆細胞はまた、少能性または単能性であるとも説明されうる。幹細胞と前駆細胞との間の最も重要な差は、幹細胞が無期限に複製できるのに対して、前駆細胞は限定された回数しか分裂できないことである。ヒトにおいて見出される前駆体の例は、例えば、筋肉において見出される衛星細胞、表皮の基底細胞内に見出される骨髄間質細胞、膵臓前駆細胞、血管芽細胞または内皮前駆細胞、および芽細胞であるが、それらに限定されるわけではない。したがって、1つの例において、骨格筋前駆細胞は筋衛星細胞である。別の例において、骨格筋幹細胞は筋芽細胞である。
【００２７】
本開示は、筋芽細胞の、例えば筋管への分化のための組成物の使用に言及する。1つの例において、本明細書に記載する組成物は、カルニチン、脂肪酸、およびステロイドを含む。別の例において、本明細書に記載する組成物は、L-カルニチン、脂肪酸、およびステロイドを含む。別の例において、組成物は、カルニチン、リノール酸、およびステロイドを含む。また別の例において、本明細書に記載する組成物は、カルニチン、脂肪酸、およびテストステロンを含む。さらなる例において、組成物は、L-カルニチン、脂肪酸、およびテストステロンを含む。別の例において、本明細書に記載する組成物は、カルニチン、リノール酸、およびテストステロンを含む。さらなる例において、本明細書に記載する組成物は、L-カルニチン、リノール酸、およびテストステロンを含む。また別の例において、本明細書に記載する組成物は、約0.1 mMの濃度のL-カルニチン、約0.2 mMの濃度のリノール酸、および約10 nMの濃度のテストステロンを含む。
【００２８】
分化潜在能力を有する細胞の別の供給源は、例えば、人工多能性幹細胞である。本明細書において使用する際、「人工多能性幹細胞」という用語は、成体細胞から直接生成することができる多能性幹細胞のタイプを指す。これらの多能性幹細胞は、無期限に増えることができる上、ニューロン、心臓、膵臓、および肝臓の細胞などであるがそれらに限定されるわけではない、身体における種々の他の細胞タイプを生じさせることができるため、これらの多能性細胞は、傷害または疾患により失われた細胞を置き換えるために使用することができる、細胞の単一供給源に相当する。人工多能性幹細胞は、成体組織に直接由来することができるため、多能性幹細胞をそこから単離することができる胚の必要性を回避するだけではなく、患者に合致した様式で作製することもでき、これは、各個体が、移植片または外来組織に付随する免疫拒絶のリスクなしに、自分自身の多能性幹細胞株を有しうることを意味する。このように、1つの例において、筋芽細胞は、胚性幹（ES）細胞、人工多能性幹（IPS）細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、または多分化能幹細胞に由来する。別の例において、筋芽細胞は初代筋芽細胞である。また別の例において、骨格筋幹細胞または骨格筋前駆細胞は、哺乳動物に由来する。別の例において、骨格筋幹細胞または骨格筋前駆細胞は、ヒト、げっ歯類、または霊長類に由来する。
【００２９】
さらにまた、ヒト筋芽細胞のメタボロミクス解析および筋芽細胞に対する代謝産物／薬物スクリーニングに基づいて、ヒト筋芽細胞の大規模拡大のための方法および組成物が見出された。線維芽細胞成長因子（FGF）およびWntシグナル伝達が胚の筋形成において重要な役割を果たすことは、以前に示唆されていた。これに基づいて、本開示は、Notchアゴニスト（DLL1）を伴う線維芽細胞成長因子（塩基性線維芽細胞成長因子；bFGF）およびWntシグナル伝達アゴニスト（CHIR99201）を、代謝の知見に基づく他の構成要素、例えば、フォルスコリン（cAMPアゴニスト）、グルタミン、ヒポキサンチン、チミジン、およびコバラミンと組み合わせる。対照的に、以前に試験されたことがある大抵の他の代謝産物および薬物は、培養において筋芽細胞を拡大することができなかった。本明細書において特許請求する組成物を、ヒト胚性幹細胞／人工多能性幹細胞由来の筋芽細胞およびヒト初代筋芽細胞の両方に対して試し、試験して、細胞培養における4000倍の拡大を結果としてもたらした。本明細書に記載するさらなる組成物は、例えば、ハイスループット薬物スクリーニング、疾患モデリング、および筋芽細胞移植における使用のために、ヒト胚性幹細胞由来のPax7＋筋芽細胞および人工多能性幹細胞由来のPax7＋筋芽細胞の両方の大規模拡大を可能にし、かつ誘導する。このように、1つの例において、本開示は、線維芽細胞成長因子シグナル伝達アゴニスト、Notchシグナル伝達アゴニスト、核酸、およびそれらの組み合わせを含む、骨格筋幹細胞または骨格筋前駆細胞の拡大を誘導するための組成物を記載する。
【００３０】
本明細書において使用する際、「線維芽細胞成長因子」という用語は、そのメンバーが、血管形成、創傷治癒、胚発生、および種々の内分泌シグナル伝達経路に関与することが公知であるが、それらに限定されるわけではない、成長因子のファミリーを指す。線維芽細胞成長因子（FGF）は、通常、ヘパリン結合タンパク質であり、細胞表面会合ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用し、その相互作用は、線維芽細胞成長因子のシグナル伝達にとって必須であることが示されている。線維芽細胞成長因子は、多種多様の細胞および組織の増殖および分化の過程において鍵となる役者であることが公知である。本明細書において使用する際、「アゴニスト」という用語は、受容体に結合し、生物学的応答を生じるように受容体を活性化する（化学的、合成、または天然起源の）分子を指す。アゴニストが作用を引き起こすのに対して、アンタゴニストはアゴニストの作用を遮断する。インバースアゴニストは、アゴニストのものと反対の作用を引き起こす。したがって、「線維芽細胞成長因子アゴニスト」とは、線維芽細胞成長因子と同じ受容体に結合し、同じ生物学的反応を誘発する分子を指す。このように、1つの例において、線維芽細胞成長因子シグナル伝達アゴニストは、線維芽細胞成長因子（FGF）である。別の例において、線維芽細胞成長因子シグナル伝達アゴニストは、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、およびFGF23であることができるが、それらに限定されるわけではない。また別の例において、線維芽細胞成長因子シグナル伝達受容体アゴニストは、FGF2（塩基性線維芽細胞成長因子；bFGF）またはその誘導体である。さらなる例において、線維芽細胞成長因子シグナル伝達受容体アゴニストは、FGF2（塩基性線維芽細胞成長因子；bFGF）である。
【００３１】
1つの例において、組成物中に存在する線維芽細胞成長因子アゴニストは、1 ng/ml〜250 ng/mlの間、100 ng/ml〜200 ng/mlの間、15 ng/ml〜35 ng/mlの間、少なくとも5 ng/ml、少なくとも18 ng/ml、少なくとも25 ng/ml、少なくとも45 ng/ml、約2 ng/ml、約10 ng/ml、約18 ng/ml、約23 ng/ml、約35 ng/ml、約50 ng/ml、または約150 ng/mlであるがそれらに限定されるわけではない濃度である。1つの例において、線維芽細胞成長因子アゴニストは、少なくとも20 ng/mlの濃度で組成物中に存在する。別の例において、線維芽細胞成長因子アゴニストは、約20 ng/mlの濃度で組成物中に存在する。
【００３２】
本明細書において使用する際、「Notchシグナル伝達アゴニスト」という用語は、Notchシグナル伝達経路に対してアゴニストとして作用する分子を指す。Notchシグナル伝達は、発生中の細胞運命の決定を調節し、成体組織の恒常性を維持する、多細胞生物において進化的に保存されている経路である。Notch経路は、接触分泌細胞シグナル伝達を媒介し、そこでは、シグナルを送る細胞および受け取る細胞の両方が、リガンド-受容体クローストークを通して影響を受け、それにより、ニューロン、心臓、免疫、および内分泌の発生における数々の細胞運命の決定が調節される。Notch受容体は、通常、機能的細胞外（NECD）ドメイン、膜貫通（TM）ドメイン、および細胞内（NICD）ドメインから構成される一回膜貫通タンパク質であるが、それに限定されるわけではない。Notch受容体は、Deltexにより調節され、NUMBにより阻害される様式で、リガンド結合を介して活性化される。哺乳動物のシグナルを送る細胞において、Delta様ファミリーのメンバー（DLL1、DLL3、DLL4）およびJaggedファミリーのメンバー（JAG1、JAG2）は、Notchシグナル伝達受容体に対する結合リガンドの例として働く。このように、1つの例において、Notchシグナル伝達アゴニストは、Delta様リガンド（DLL）、Jagged/Serrateリガンド、またはそれらの誘導体である。別の例において、Delta様リガンド（DLL）は、Delta様1（DLL1）、Delta様3（DLL3）、およびDelta様4（DLL4）からなる群より選択される。また別の例において、Delta様リガンド（DLL）はDelta様1である。また別の例において、Jagged/Serrateリガンドは、Jagged 1（JAG1）、Jagged 2（JAG2）、およびSerrateからなる群より選択される。
【００３３】
1つの例において、組成物中に存在するNotchシグナル伝達アゴニストは、0.1μg/ml〜80μg/mlの間、5μg/ml〜20μg/mlの間、15〜60μg/mlの間、40〜78μg/mlの間、少なくとも1μg/ml、少なくとも10μg/ml、少なくとも20μg/ml、少なくとも30μg/ml、少なくとも40μg/ml、少なくとも50μg/ml、少なくとも60μg/ml、約8μg/ml、約18μg/ml、約26μg/ml、約35μg/ml、約45μg/ml、約48μg/ml、約50μg/ml、約55μg/ml、約64μg/ml、または約75μg/mlであるがそれらに限定されるわけではない濃度である。1つの例において、Notchシグナル伝達アゴニストは、少なくとも45μg/mlの濃度で組成物中に存在する。1つの例において、Notchシグナル伝達アゴニストは、約50μg/mlの濃度で組成物中に存在する。
【００３４】
本明細書において使用される際、「核酸」という用語は、生命のすべての公知の形態にとって必須の生体ポリマー、または生体高分子を指す。DNA（デオキシリボ核酸）およびRNA（リボ核酸）を含むがそれらに限定されるわけではない核酸は、ヌクレオチドとして公知のモノマーから作られる。生物学的核酸の基本的な構成要素はヌクレオチドであり、その各々は、ペントース糖（リボースまたはデオキシリボース）、リン酸基、および核酸塩基を含有する。糖がデオキシリボースである場合、ポリマーはDNA（デオキシリボ核酸）である。糖がリボースである場合、ポリマーはRNA（リボ核酸）である。3種の構成要素がすべて組み合わされた時に、それらは核酸を形成する。ヌクレオチドはまた、リン酸ヌクレオチドとしても公知である。本明細書において使用する際、「核酸塩基」という用語は、デオキシリボ核酸（DNA）およびリボ核酸（RNA）の基本的な構成単位であるヌクレオシド内の、糖に連結して見出される、窒素を含有する生物学的化合物（窒素塩基）を指す。それらは遺伝学において単純に塩基と呼ばれることが多く、塩基対を形成し、互いに積み重なるその能力が、DNAおよびRNAのらせん構造に直接つながる。このように、1つの例において、核酸は、ヒポキサンチン、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、イノシン、キサンチン、前述の窒素塩基の誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される窒素塩基に由来する。別の例において、本明細書に記載する組成物は、少なくとも1種、少なくとも2種、1種、2種、3種、4種、またはそれより多い核酸を含む。また別の例において、組成物は2種の核酸を含む。
【００３５】
1つの例において、組成物中に存在する核酸は、0.1 mM〜15 mMの間、1.4 mM〜5 mMの間、1 mM〜10 mMの間、5 mM〜7.5 mMの間、少なくとも0.8 mM、少なくとも1.6 mM、約1.1 mM、約1.5 mM、約2 mM、約4 mM、少なくとも8 mM、約1.2 mM、約2.8 mM、約3 mM、約6 mM、約10 mM、約11 mM、または約12 mMであるがそれらに限定されるわけではない濃度である。1つの例において、核酸は、少なくとも1.6 mMの濃度で組成物中に存在する。別の例において、核酸は、少なくとも10 mMの濃度で組成物中に存在する。また別の例において、核酸は、約1.6 mMの濃度で存在する。さらなる例において、核酸は、約10 mMの濃度で存在する。また別の例において、組成物は2種の核酸を含み、1種の核酸は1 mMの濃度で存在し、もう1種の核酸は0.16 mMの濃度で存在する。別の例において、1種の核酸は10 mMの濃度で存在し、もう1種の核酸は1.6 mMの濃度で存在する。さらなる例において、1種の核酸は100 mMの濃度で存在し、もう1種の核酸は16 mMの濃度で存在する。
【００３６】
本開示は、例えば、筋芽細胞の拡大のための組成物の使用に言及する。1つの例において、本明細書に記載する組成物は、線維芽細胞成長因子、Notchシグナル伝達アゴニスト、および少なくとも1種の核酸を含む。別の例において、本明細書に記載する組成物は、線維芽細胞成長因子、Notchシグナル伝達アゴニスト、および少なくとも2種の核酸を含む。また別の例において、本明細書に記載する組成物は、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、Notchシグナル伝達アゴニスト、および少なくとも2種の核酸を含む。別の例において、本明細書に記載する組成物は、線維芽細胞成長因子、Delta様リガンド1（DLL1）、および少なくとも2種の核酸を含む。別の例において、本明細書に記載する組成物は、線維芽細胞成長因子、Notchシグナル伝達アゴニスト、および少なくとも2種の核酸を含み、該2種の核酸は、ヒポキサンチンおよびチミンである。また別の例において、本明細書に記載する組成物は、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、Notchシグナル伝達アゴニスト、および少なくとも2種の核酸を含み、該2種の核酸は、ヒポキサンチンおよびチミンである。別の例において、本明細書に記載する組成物は、線維芽細胞成長因子、Delta様リガンド1（DLL1）、および少なくとも2種の核酸を含み、該2種の核酸は、ヒポキサンチンおよびチミンである。別の例において、本明細書に記載する組成物は、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、Delta様リガンド1（DLL1）、および少なくとも2種の核酸を含み、該2種の核酸は、ヒポキサンチンおよびチミンである。
【００３７】
1つの例において、本明細書に記載する組成物には、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）が約20 ng/mlの濃度で存在し、Delta様リガンド1（DLL1）が約50μg/mlの濃度で存在し、少なくとも2種の核酸、ヒポキサンチンおよびチミンが、それぞれ、約10 mMおよび1.6 mMの濃度で存在する。
【００３８】
本明細書に記載する組成物は、任意で、Wntシグナル伝達アゴニスト、アデニリルシクラーゼ、ビタミン、および塩のうちの、1つまたは複数の構成要素を含んでもよい。
【００３９】
本明細書において使用する際、「Wntシグナル伝達アゴニスト」という用語は、Wntシグナル伝達経路に対してアゴニストとして作用する分子を指す。Wntシグナル伝達経路は、概して、細胞表面受容体を通して細胞中にシグナルを渡すタンパク質で作られている、シグナル伝達経路の群として公知である。古典的Wnt経路、非古典的平面内細胞極性経路、および非古典的Wnt／カルシウム経路の、3種のWntシグナル伝達経路が公知である。3種の経路のすべては、Wntタンパク質リガンドのFrizzledファミリー受容体への結合によって活性化され、この受容体は、細胞内側のタンパク質dishevelledに生物学的シグナルを渡す。古典的Wnt経路は、遺伝子転写の調節につながる。非古典的平面内細胞極性経路は、細胞の形状を担う細胞骨格を調節する。非古典的Wnt／カルシウム経路は、細胞内側のカルシウムを調節する。Wntシグナル伝達経路は、近傍の細胞-細胞コミュニケーション（傍分泌）または同一細胞コミュニケーション（自己分泌）のいずれかを使用する。これらのシグナル伝達経路は、動物において進化的に高度に保存されていることが当技術分野において公知であり、これは、これらの経路が異なる動物種にわたって類似していることを意味する。Wntシグナル伝達はまた、発癌および胚発生において役割を果たすことも公知である。Wntシグナル伝達アゴニストの例は、6-[[2-[[4-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(5-メチル-1H-イミダゾール-2-イル)-2ピリミジニル]アミノ]エチル]アミノ]-3-ピリジンカルボニトリル（CHIR99021）、リチウム塩、6-ブロモインジルビン-3'-オキシム（BIO）、N2-(2-(4-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(1H-イミダゾール-1-イル)ピリミジン-2-イルアミノ)エチル)-5-ニトロピリジン-2,6-ジアミン（CHIR98014）、N-(4-メトキシベンジル)-N'-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)ウレア（ARA014418）、(4Z)-4-(2-アミノ-4-オキソ-1H-イミダゾール-5-イリデン)-2-ブロモ-1,5,6,7-テトラヒドロピロロ[2,3-c]アゼピン-8-オン（ヒメニアルジシン）、2-(2-クロロフェニル)-5,7-ジヒドロキシ-8-[(3S,4R)-3-ヒドロキシ-1-メチル-4-ピペリジニル]-4-クロメノン（フラボピリドール）、7-ブチル-6-(4-メトキシフェニル)-[5H]ピロロ[2,3-b]ピラジン（アロイシン）、3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン（SB216763）、3-((3-クロロ-4-ヒドロキシフェニル)アミノ)-4-(2-ニトロフェニル)-(1H)-ピロール-2,5-ジオン（SB415286）、9-ブロモ-7,12-ジヒドロ-インドロ-[3,2-d]-[1]ベンゾアゼピン-6(5H)-オン（ケンパウロン）、およびそれらの誘導体であることができるが、それらに限定されるわけではない。
【００４０】
本明細書において使用する際、「アデニリルシクラーゼ」という用語は、本質的にすべての細胞において鍵となる調節的役割を有する酵素を指す。それは、最も多元性の公知の酵素であり、6種の別個のクラス、すなわちクラスI〜VIが記述されており、すべてが同じ反応を触媒するが、公知の配列相同性または構造相同性を伴わない無関係の遺伝子ファミリーを提示する。アデニリルシクラーゼの最もよく知られたクラスは、クラスIIIつまりAC-IIIである。AC-IIIは、真核生物に広く存在し、多くのヒト組織において重要な役割を有する。アデニリルシクラーゼのすべてのクラスは、アデノシン三リン酸（ATP）の3',5'-サイクリックAMP（cAMP）およびピロリン酸への変換を触媒する。マグネシウムイオンが、概して必要とされ、酵素機構に密接に関与しているように見られる。アデニリルシクラーゼによって産生されたcAMPは、次いで、特定のcAMP結合タンパク質である、転写因子、酵素（例えば、cAMP依存性キナーゼ）、またはイオン輸送体のいずれかを介して調節性シグナルとして働く。このように、1つの例において、アデニリルシクラーゼシグナル伝達アゴニストは、ラブダンジテルペン、および好ましくは、フォルスコリンまたはその誘導体である。別の例において、アデニリルシクラーゼシグナル伝達アゴニストは、cAMPの非加水分解性類似体、イソプロテノール（isoprotenol）、血管作用性腸ペプチド、カルシウムイオノフォア、膜脱分極作用物質、cAMP刺激性マクロファージ由来因子、マクロファージ活性化作用物質、ホスホジエステラーゼ阻害剤、下垂体アデニラートシクラーゼ活性化ペプチド（PACAP）、コレラ毒素、プロスタグランジン化合物、β2-アドレナリン受容体アゴニスト、およびそれらの誘導体であることができるが、それらに限定されるわけではない。
【００４１】
本明細書において使用する際、「ビタミン」という用語は、生物が限定された量で必要とする有機化合物および生命維持に必要な栄養素を指す。生物が、その化合物を十分量、合成することができず、食餌を通して取得しなければならない場合に、その有機化学化合物（または関連する化合物のセット）をビタミンと呼ぶ。このように、「ビタミン」という用語は、環境および特定の生物に条件的である。例えば、アスコルビン酸（ビタミンCの1つの形態）は、ヒトにとってビタミンであるが、大抵の他の動物生物にとってビタミンではない。通例により、「ビタミン」という用語は、食餌性ミネラル、必須脂肪酸、または必須アミノ酸などの他の必須栄養素（ビタミンよりも多い量で必要とされる）も、健康を促進し、生物の健康を維持するために必要とされることはそれほど多くない、多数の他の栄養素も含まない。13種のビタミンが、現在のところ一般に認識されている。これらは、ビタミンA、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB3、ビタミンB5、ビタミンB6、ビタミンB7、ビタミンB9、ビタミンB12、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE、およびビタミンKである。ビタミンは、概して、それらの生物学的活性および化学的活性によって分類され、それらの構造によっては分類されない。このように、各「ビタミン」は、特定のビタミンと関連する生物学的活性をすべてが示す、複数のビタマー（vitamer）化合物を指す。例えば、一連の化学物質を、化合物レチナール、レチノール、および4種の公知のカロテノイドを含む「ビタミンA」などの、アルファベットで表記するビタミン「総称記述」名の下でグループ化する。定義によるビタミンは、身体中でビタミンの活性型に変換可能であり、同様に、時には互いに相互変換可能である。ビタミンは、多様な生化学機能を有する。ビタミンDなどのいくつかは、ミネラル代謝の調節物質、または細胞および組織の成長および分化の調節物質として、ホルモン様機能を有する（ビタミンAのいくつかの形態など）。他のビタミンは、抗酸化剤として機能する（例えば、ビタミンEおよび時にはビタミンC）。最も数が多いビタミンであるビタミンB群は、主に、酵素補因子（補酵素）または同一物の前駆型として機能し、補酵素は、酵素を、代謝における触媒としてのその働きにおいて手助けする。この役割で、ビタミンは、補欠分子団の一部として酵素に緊密に結合している場合がある。例えば、ビオチンは、脂肪酸を作ることに関与する酵素の一部である。ビタミンはまた、分子間で化学基または電子を運ぶように機能する着脱可能な分子である補酵素として、酵素触媒にそれほど緊密でなく結合している場合もある。例えば、葉酸は、細胞においてメチル基、ホルミル基、およびメチレン基を運ぶ場合がある。酵素-基質反応の補助におけるこれらの役割は、ビタミンの最もよく知られた機能であるが、他のビタミン機能も同等に重要である。このように、例において、ビタミンは、ビタミンB群であることができる。別の例において、ビタミンは、ビタミンB12またはコバラミンであることができる。
【００４２】
特許請求する組成物を使用する方法もまた、本明細書に記載する。このように、1つの例において、本開示は、骨格筋幹細胞または骨格筋前駆細胞を、本明細書に記載する組成物と接触させる工程を含む、筋線維または筋管を調製するための方法を記載する。別の例において、本開示は、骨格筋幹細胞または骨格筋前駆細胞を、本明細書に記載する組成物と接触させる工程を含む、骨格筋前駆細胞の拡大を誘導するための方法を記載する。
【００４３】
本明細書に記載する組成物の他の用途は、例えば、すべてのがん、慢性腎臓疾患、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、後天性免疫不全症候群（AIDS）または他の慢性疾患、サルコペニア（加齢に関連した筋肉の消耗）、筋委縮症、筋ジストロフィー、および糖尿病における筋肉の迅速な損失の結果としての、例えば、悪液質の間であるがそれに限定されるわけではない筋肉量の変性に対処することを含む。
【００４４】
本明細書に例証して記載する本発明は、本明細書において具体的に開示されない、任意の1つまたは複数の要素、1つまたは複数の限定の非存在下で、適切に実施されうる。このように、例えば、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含有する（containing）」などの用語は、拡張的にかつ無制限に読まれることになる。追加的に、本明細書において使用される用語および表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、そのような用語および表現の使用において、示されて説明される特徴の任意の同等物またはそれらの一部分を除外する意図はないが、種々の改変は、特許請求される発明の範囲内で可能であることが認識される。このように、本発明は、好ましい態様および任意の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書において開示されている、その中で具体化されている本発明の改変および変動が、当業者によって行使されうること、ならびに、そのような改変および変動は、本発明の範囲内であると考えられることが、理解されるべきである。
【００４５】
本発明は、本明細書において広く、かつ一般的に説明されている。一般的な開示内に入る、より狭い種および亜属のグループ分けの各々もまた、本発明の一部を形成する。これには、除かれた材料が本明細書において具体的に列挙されているか否かにかかわらず、上位概念から任意の内容を除去する但し書きまたは消極的な限定を伴う、発明の一般的な記載が含まれる。
【００４６】
他の態様が、以下の特許請求の範囲内および非限定的な実施例内である。加えて、本発明の特徴および局面がマーカッシュ群の用語で記載される場合、本発明はまた、それによりマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの部分群の用語でも記載されることを、当業者は認識するであろう。
【実施例】
【００４７】
実験項
筋形成中に発動される胚性シグナル伝達経路を模倣および最適化することによって（図1）、標準DMEM培地（20％ FBS、1％ Pen-Strep）に添加されたWnt/β-カテニンアゴニストCHIR99021（3μM）、FGFアゴニストbFGF（20 ng/ml）、およびNotchアゴニストDLL1（2.5μg/ml）が、45日にわたって筋形成を起こしてPax7+筋芽細胞へ変換するようにヒト胚性幹細胞／人工多能性幹細胞を指定できたことが特定された。この組み合わせは、ヒト胚性幹細胞／人工多能性幹細胞の筋芽細胞への一過性変換を指定することだけができたが、Pax7＋筋芽細胞の大規模拡大を誘導することはできなかった。筋芽細胞拡大に必要な代謝条件を誘発するために、LC-MSメタボロミクスを、薬物処理を伴うかまたは伴わずに、筋芽細胞が濃縮された胚様体（EB）、および分化した筋管の単層と比べて、ヒト人工多能性幹細胞に対して行った（図2）。
【００４８】
ヒト筋芽細胞において代謝産物が特異的に増加していたことが見出され、こうして、ヒト筋芽細胞によって必要とされる代謝フラックスが示された。これらには、サイクリックAMP（cAMP）、ヌクレオチド（dNTPおよびNTP）、ならびにコバラミン（ビタミンB12）の増加が含まれる。
【００４９】
このように、アデニリルシクラーゼアゴニストであるフォルスコリンを、cAMP合成を誘導するために試験し、コバラミンを、これらの化合物がヒト筋芽細胞の拡大を高めるかどうかを見るために投与した。また、すべてがヌクレオチド合成にとって律速であるグルタミン、ヒポキサンチン、およびチミジンが、ヒト筋芽細胞拡大を高められるかどうかも試験した。このバックグラウンドに対して、アミノ酸および脂肪酸を含む様々な他の小分子薬物および代謝物をスクリーニングし、それにより、筋芽細胞拡大に対するそれらの効果を試験した。次いで、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）スクリーニングを、これらの70種の条件に曝露したヒト人工多能性幹細胞由来筋芽細胞に対して、種々の系列マーカー（多能性マーカーOCT3/4、神経筋マーカーNCAM、内胚葉マーカーAFP、筋肉マーカーPax7）について行った（図3）。
【００５０】
結果により、フォルスコリン、コバラミン、グルタミン、ヒポキサンチン、およびチミジンは、各々個別に、ヒト人工多能性幹細胞からのFGF/Wnt/Notch誘導性筋形成中にPax7発現を特異的に増加できたことが示される。これらの結果により、フォルスコリン、コバラミン、グルタミン、ヒポキサンチン、およびチミジンのカクテルは、FGF/Wnt/Notchによる指定後の筋芽細胞拡大を高めることができたことが示される。
【００５１】
この仮説を検証するために、ヒト胚性幹細胞／人工多能性幹細胞由来の筋芽細胞を、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、CHIR99021、DLL1、フォルスコリン、コバラミン、グルタミン、ヒポキサンチン、およびチミジンを補給したDMEM培地（20％ FBS、1％ Pen-Strep）のカクテル中で培養した。本明細書において使用したヒト胚性幹細胞は、WiCell Research Institute Inc（Madison, Wisconsin）により製造販売されているWA01細胞株から継代31まで培養した。人工多能性幹細胞は、当施設で生成したBJ1-iPSC細胞株から継代56まで培養した。ヒト胚性幹細胞／人工多能性幹細胞由来の筋芽細胞を、このカクテル中で少なくとも6継代にわたって拡大することが可能であり、各継代は、6ウェルプレートの各ウェルにおける1:4の比での分割（継代あたり、60,000細胞／ウェルを播種）であった。これは、最初の60,000細胞の212倍を上回る拡大、すなわち4000倍より大きい拡大ということになる（図4）。興味深いことに、同じ処理をヒト初代成体筋芽細胞（hSkM）に対して行った時、ヒト初代成体筋芽細胞の同様の拡大が観察され、記載した組成物／カクテルが、ヒト胚性幹細胞／ヒト人工多能性幹細胞由来の筋芽細胞および初代成体筋芽細胞の両方を拡大できたことが示された（図4）。遺伝子発現プロファイリングにより、これらの筋芽細胞は、培養における6継代後にPax7＋；MYF5＋のままであったことが判明した（図5）。対照的に、DMEM（20％ FBS、1％ Pen-Strep）は、筋芽細胞を拡大することができず、それは、それらがMyoG＋；MyHC＋筋管に迅速に分化したためであった（図4および図5）。
【００５２】
種々の成分の様々な濃度でのさらなる最適化で（図6）、FGF2（20ng/ml）、DLL1（50ug/ml）、およびHT補給剤（ヒポキサンチン10mM、チミジン1.6mM）を含む最適な組成物が達成され、それにより、組成物から他の構成要素が排除された。この最適化された組成物は、さらにより高いレベル、ほぼ100倍の筋芽細胞マーカーPax7を生じる（図6）。それはまた、筋芽細胞数を、4000倍を上回って拡大する（図7）。
【００５３】
筋管分化を増強するために必要な代謝条件を解明するために、液体クロマトグラフィー-質量分析メタボロミクスを、筋形成性薬物処理を伴うかまたは伴わずに、筋芽細胞胚様体（EB）、および分化した細胞の単層と比べて、ヒト人工多能性幹細胞に対して行った（図8）。ヒト筋管において代謝産物が特異的に増加していたことが見出され、こうして、ヒト筋管によって必要とされる代謝フラックスが暗示された。これらの代謝産物には、カルニチン、脂肪酸アシル-CoA、アセチル-CoA、およびステロールの増加が含まれた。
【００５４】
このように、脂肪酸酸化を容易にするためのカルニチン、脂肪酸酸化を激化させるための脂肪酸であるリノレアート、アラキドナート、およびパルミタートを試験した。フルバスタチンなどのステロイド合成のスタチン阻害剤、および、テストステロンまたはプロゲステロンのようなステロイドが、ヒト筋管分化を高められるかどうかも試験した。このバックグラウンドに対して、OxPhos阻害剤およびビタミンを含む様々な他の小分子薬物および代謝産物もまたスクリーニングして、筋管分化に対するそれらの効果を試験した。次いで、qPCRスクリーニングを、これらの70種の条件に曝露したヒト人工多能性幹細胞由来筋芽細胞に対して、種々の筋形成性分化マーカーについて行った（図9）。これらの結果により、カルニチン、O-アセチル-カルニチン、リノレアート、フルバスタチン、およびテストステロンは、各々個別に、ヒト人工多能性幹細胞からの薬物誘導性筋形成中に、MyoD、MyoG、およびMYHC（ミオシン重鎖）発現を特異的に増加できたことが示された。結果によりまた、カルニチン／O-アセチル-カルニチン、リノレアート、フルバスタチン、およびテストステロンのカクテルは、筋管分化を高められたことも示唆された。
【００５５】
この仮説を検証するために、人工多能性幹細胞由来の筋芽細胞を、標準分化培地（DMEM 2％ウマ血清、1％ Pen-Strep；「対照」）、またはそれにカルニチン、リノレアート、フルバスタチン、およびテストステロン（CLFT）のカクテルを補給したもののいずれかで培養した。CLFT組成物は、ヒト胚性幹細胞／人工多能性幹細胞由来の筋芽細胞の筋管への分化を加速および増強することができた（図10）。興味深いことに、同じ処理をヒト初代成体筋芽細胞に対して行った時、ヒト初代成体筋芽細胞の筋管への筋形成性分化の同様の増強が観察され、本発明者らのCLFT補給剤が、胚性幹細胞／人工多能性幹細胞由来の筋芽細胞および初代成体筋芽細胞の両方の分化を増強できたことが示された（図11）。MyoGおよびMyHCなどの種々の筋管マーカーについての遺伝子発現プロファイリングにより、CLFT組成物は、対照培地と比べて、10倍より大きく（＞10倍）、多くの筋形成性分化マーカーを増強できたことが判明した（図12）。
【００５６】
種々のバージョンの脂肪酸の様々な濃度でのさらなる最適化で（図13）、L-カルニチン（0.1mM）、9-シス-リノール酸（CLA；0.2mM）、およびジヒドロテストステロン（DHT；10nM）を含む最適な組成物が確立され、それにより、混合物からフルバスタチンが排除された。この組成物は、さらにより高いレベル、ほぼ100倍の、成体の遅収縮および速収縮ミオシン重鎖マーカー（それぞれMYH7およびMYH2）を生じ、筋芽細胞の筋管への分化が達成されていたことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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