(57)【要約】シュレム管の内皮内層の濾過能力を回復させることにより緑内障を治療するための組成物及び方法が提供される。より具体的には、眼圧を低下させる方法が開示され、このような治療を必要とする対象に対して治療的有効量の組成物が投与される。種々の実施形態において、該組成物は、アスコルビン酸に複合体化されたチロシンまたはＬ−ＤＯＰＡ、酵素、酵素をコードする核酸、または小柱網細胞を含み得る。【選択図】図１Ａ
2018506519.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼圧を低下させる方法であって、そのような治療を必要とする対象に対して、治療的有効量のアスコルビン酸複合体を投与することを含み、前記アスコルビン酸複合体は、チロシンもしくはＬ−ＤＯＰＡまたはその誘導体に結合されたアスコルビン酸またはその誘導体を含む、前記方法。
【請求項２】
眼圧を低下させる方法であって、そのような治療を必要とする対象に対して、アスコルビン酸をチロシンもしくはその誘導体、またはＬ−ＤＯＰＡもしくはその誘導体に複合体化するための酵素活性を増加させる組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記組成物はキナーゼ活性を備えた酵素または酵素的に活性なその断片である、前記方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、前記組成物はエステラーゼ活性を備えた酵素または酵素的に活性なその断片である、前記方法。
【請求項５】
請求項２に記載の方法であって、前記組成物は酵素または酵素的に活性なその断片をコードする核酸である、前記方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、投与することは更に、持続放出性インプラントを前眼房または前部硝子体に配置するために、外科手術または注入を介して移植することを含む、前記方法。
【請求項７】
眼圧を低下させることにおいて使用するための医薬組成物であって、チロシンもしくはＬ−ＤＯＰＡまたはその誘導体に複合体化されたアスコルビン酸と、医薬的に許容可能な担体とを含み、前記医薬組成物は眼内送達のために構成される、前記組成物。
【請求項８】
眼圧を低下させることにおいて使用するための医薬組成物であって、アスコルビン酸のチロシンもしくはＬ−ＤＯＰＡまたはその誘導体への複合体化を触媒できる酵素または酵素的に活性な断片と、医薬的に許容可能な担体とを含み、前記医薬組成物は眼内送達のために構成される、前記組成物。
【請求項９】
眼圧を低下させることにおいて使用するための医薬組成物であって、アスコルビン酸複合体の膜貫通タンパク質への連結を触媒できる酵素または酵素的に活性な断片と、医薬的に許容可能な担体とを含み、前記医薬組成物は眼内送達のために構成され、また前記複合体はチロシンもしくはＬ−ＤＯＰＡまたはその誘導体に結合されたアスコルビン酸またはその誘導体を含む、前記組成物。
【請求項１０】
眼圧を低下させることにおいて使用するための医薬組成物であって、アスコルビン酸のチロシンもしくはＬ−ＤＯＰＡまたはその誘導体への複合体化を触媒できる酵素または酵素的に活性な断片をコードする核酸と、医薬的に許容可能な担体とを含み、前記医薬組成物は遺伝子治療のために構成される、前記組成物。
【請求項１１】
眼圧を低下させることにおいて使用するための医薬組成物であって、アスコルビン酸複合体の膜貫通タンパク質への連結を触媒できる酵素または酵素的に活性な断片をコードする核酸と、医薬的に許容可能な担体とを含み、前記医薬組成物は眼内送達のために構成され、前記複合体はチロシンもしくはＬ−ＤＯＰＡまたはその誘導体に結合されたアスコルビン酸またはその誘導体を含む、前記組成物。
【請求項１２】
眼圧を低下させる方法であって、そのような治療を必要とする対象に対して、小柱網細胞を眼の前眼房に投与することを含む、前記方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記小柱網細胞はフリーの溶液中において投与される、前記方法。
【請求項１４】
眼圧を低下させる方法であって、そのような治療を必要とする対象に対して、小柱網細胞を眼の小柱網上に投与することを含む、前記方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記小柱網細胞は、直接的な可視化の下で投与されることを含む、前記方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、前記小柱網細胞は、間接的な可視化の下で投与されることを含む、前記方法。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、前記小柱網細胞は、懸濁培養、細胞もしくは器官培養由来の培養された細胞である、前記方法。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法であって、前記小柱網細胞は、遺伝的または後天的な欠陥を矯正するために、投与に先立ってインビトロで遺伝子的に改変される、前記方法。
【請求項１９】
眼圧を低下させることにおいて使用するための医薬組成物であって、医薬的に許容可能な担体中の小柱網細胞を含み、前記組成物は眼内送達または小柱網の或る領域への送達のために構成される、前記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示の態様は、一般に、緑内障を治療するための方法及び組成物に関する。より具体的には、この緑内障の治療は、眼の小柱網の濾過能力を回復させることを含み得る。
【背景技術】
【０００２】
緑内障は、眼圧の上昇を特徴とする失明の主要な原因であり、治療しなければ視神経の破壊を招く可能性がある。房水と呼ばれる透明な流体が毛様体によって絶えず形成され、後眼房に分泌される。この流体はレンズ上を通り前眼房に入る。房水は、２つの経路のうちの１つを通して、生成されるのとほぼ同じ速度で眼の前眼房を通過する。流体の約１０％が毛様体の筋線維の間を浸透し、流体の約９０％は小柱網及びシュレム管と呼ばれるフィルター状組織塊を通る「小管路」を介して除去され、次いで強膜静脈ネットワークに導入される。
【０００３】
開放角及び閉塞角緑内障並びにステロイド誘発性緑内障を含む多くの異なる形態の緑内障が存在する。緑内障の最も一般的な形態は解放角であり、これは、小柱網を通る流出経路における増加した抵抗に起因する。流出経路が遮断されまたは不十分になるメカニズムは殆ど理解されていないが、その結果は眼圧の上昇をもたらし、これは視神経内の軸索を圧迫して、神経への血管供給を傷つける可能性がある。時間の経過と共に、これは部分的または完全な失明をもたらす可能性がある。小柱網は物理的には閉塞されていないが、もはや前眼房と強膜排液静脈との間で流体を効率的に輸送しない。
【０００４】
緑内障の現在の治療は、内科的、外科的、またはその両方である。緑内障の治療のための薬物には、毛様体の筋線維の間の流体浸透を増加させるプロスタグランジン類縁体、及び点眼薬として投与されて虹彩の筋線維を引き締めることにより眼の瞳孔の収縮を引き起こして、房水が眼を離れる速度を増大させる縮瞳薬が含まれる。エピネフリン点眼薬もまた眼圧を低下させることに成功しているが、重大な副作用を有する。他の薬物、例えば、点眼薬としてのβ−アドレナリン作動性ブロッキング剤、または液体の生成を減少させる丸薬としての炭酸脱水酵素阻害剤が用いられる。
【０００５】
外科的解決策には、小柱網に沿った複数のスポットにレーザーを適用することが含まれ、これは細胞外物質を変化させて流出を増強させると考えられる。当初は約８０％がこの治療に反応していたが、残念ながら５０％が５年以内に圧力が増大している。他の解決策では、小柱網の透過性を増大させ、またはシュレム管の幅を広げることを試みている。もう１つの外科的処置は小柱網切除術であり、ここでは結膜に切開を入れて、強膜に房水が流れるための孔を形成する。これは、レーザーを用いて、または開放処置によって行うことができる。両方のルート共に、感染及び眼に対する傷害を含むリスクを有する。いずれのルートでも、しばしば時間の経過とともに穴が閉まり、結果的に圧力が上昇する。小柱網を横切るシャントまたはドレーンとしての移植のような、強膜またはシュレム管へと排液する種々の器具が提案されている。或いは、幾つかの治療は、シュレム管をライニングしている内皮細胞の間の孔を標的にしている。
【０００６】
しかしながら、開放角緑内障を安全に、持続的に、効果的に治療する方法が未だ必要とされている。現在の内科的及び外科的処置の選択肢は、しばしば時間と共にその効力を失う。更に、外科的治療は眼への感染または傷害の危険性を伴い、また現在の内科的な解決策は、しばしば視力、眼の構造に対して重大な副作用をもたらし、または全身性の副作用をもたらす。房水流出システムの根底にある病理に対処し、非緑内障の眼に見られるような排液の戻りを生じさせる緑内障治療の必要性もまた存在する。この眼科用途に使用するためにｅｘ  ｖｉｖｏで薬物を試験するための改良されたモデルの必要性も存在する。
【発明の概要】
【０００７】
緑内障の治療のための方法及び組成物が提供される。この開示は、眼圧の調節のための潜在的メカニズムを提供する、眼組織におけるアスコルビン酸複合体の発見に基づく。
【０００８】
眼圧を低下させる方法が開示される。該方法は、そのような治療を必要とする対象に対して、治療的有効量のアスコルビン酸複合体を投与することを含む。
【０００９】
一実施形態において、アスコルビン酸複合体は、チロシンまたはその誘導体に結合されたアスコルビン酸またはその誘導体を含む。他の実施形態において、アスコルビン酸複合体は、Ｌ−ＤＯＰＡまたはその誘導体に結合されたアスコルビン酸またはその誘導体を含む。
【００１０】
一実施形態において、眼圧を低下させる方法は、そのような治療を必要とする対象に対して、治療的有効量の組成物を投与することを含み、該組成物はアスコルビン酸をチロシンもしくはその誘導体、またはＬ−ＤＯＰＡもしくはその誘導体に複合体化する酵素活性を増加させるものである。該組成物は、キナーゼ活性を含む酵素または酵素的に活性なその断片であり得る。他の実施形態において、該組成物は、エステラーゼ活性を含む酵素またはその酵素的に活性な断片であり得る。幾つかの実施形態において、該組成物は、酵素またはその酵素的に活性な断片をコードする核酸である。
【００１１】
眼圧を低下させるために使用するための医薬組成物もまた開示される。該組成物は、チロシンもしくはＬ−ＤＯＰＡまたはその誘導体に複合体化されたアスコルビン酸と、医薬的に許容可能な担体とを含有し、該組成物は眼内送達のために構成される
【００１２】
変形例において、眼圧を低下させるための当該医薬組成物は、チロシンもしくはＬ−ＤＯＰＡまたはその誘導体へのアスコルビン酸の複合体化を触媒できる酵素またはその酵素的に活性な断片と、医薬的に許容可能な担体とを含有し、該組成物は眼内送達用に構成される。
【００１３】
別の変形例では、眼圧を低下させることにおいて使用するための当該医薬組成物は、アスコルビン酸複合体と膜貫通タンパク質との連結を触媒できる酵素またはその酵素的に活性な断片、及び医薬的に許容可能な担体を含み、ここでの前記組成物は眼内送達用に構成され、また前記複合体はチロシンもしくはＬ−ＤＯＰＡまたはその誘導体に結合されたアスコルビン酸またはその誘導体を含む。
【００１４】
別の変形例において、眼圧を低下させることにおいて使用するための当該医薬組成物は、アスコルビン酸のチロシンもしくはＬ−ＤＯＰＡまたはその誘導体への複合体化を触媒できる酵素またはその酵素的に活性な断片をコードする核酸、及び医薬的に許容可能な担体を含み、当該医薬組成物は遺伝子治療のために構成される。
【００１５】
別の変形形態において、眼圧を低下させるための当該医薬組成物は、アスコルビン酸複合体の膜貫通タンパク質への連結を触媒できる酵素またはその酵素的に活性な断片をコードする核酸、及び医薬的に許容可能な担体を含み、ここでの前記医薬組成物は眼内送達のために構成され、また前記複合体はチロシンもしくはＬ−ＤＯＰＡまたはその誘導体に結合されたアスコルビン酸またはその誘導体を含む。
【００１６】
眼圧を低下させる別の方法も開示される。この方法は、そのような治療を必要とする対象に対して、小柱網細胞を眼の前眼房に投与することを含む。
【００１７】
一実施形態において、前記小柱網細胞はフリーの溶液中で投与され得る。
【００１８】
眼圧を低下させる別の方法も開示される。該方法は、そのような治療を必要とする対象に対して、小柱網細胞を眼の小柱網に投与することを含む。
【００１９】
一実施形態において、前記小柱網細胞は、直接的な可視化の下で投与され得る。別の実施形態において、前記小柱網細胞は、間接的な可視化の下で投与され得る。幾つかの実施形態においては、前記小柱網細胞は、懸濁培養、細胞培養または器官培養由来の培養細胞であり得る。幾つかの実施形態においては、遺伝的または後天的な欠陥を矯正するために、小柱網細胞を投与前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝子改変し得る。
【００２０】
眼圧を低下させるために使用される組成物もまた開示される。この組成物は医薬的に許容可能な担体中の小柱網細胞を含んでおり、該組成物は眼内送達のため、または小柱網の或る領域への送達のために構成される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】眼の前方部分の断面図である。
【図１Ｂ】眼の虹彩角膜角の断面図である
【図２】Ａは小柱網及びシュレム管の概略図である。Ｂはシュレム管の傍シュレム管内層における内皮細胞の膜の概略図である。Ｃはシュレム管の傍シュレム管内層における内皮細胞の膜の概略図である。
【図３】チロシン及びＬ−ＤＯＰＡについて、提案されたアスコルビン酸複合体の構造の図解である。
【図４】３３９．１０／１７６．１ｕの小柱網試料抽出物Ｌ／ＭＳ／ＭＳを示すグラフである。
【図５】３５５．０９／１７６．１ｕの小柱網試料抽出物Ｌ／ＭＳ／ＭＳを示すグラフである。
【図６】小柱網試料抽出物ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
解剖学
緑内障は、眼の前眼房４０（図１Ａ）から房水静脈７０（図１Ａ）へ、次いで強膜静脈排液系への房水の無秩序な排液から生じる眼房内の圧力上昇により定義される。排液の正確なメカニズムは殆ど理解されていない。しかしながら、正常な眼では、眼圧が比較的一定に保たれるように、該プロセスはエネルギーに依存せず自己調節的であることが知られている。眼の前眼房からの流出速度は、一般に、眼３０の後房における房水の生成速度と一致する。
【００２３】
正常な眼（図１Ａ及び１Ｂ）では、房水が小柱網５４を通ってシュレム管５６に流れ、それにより強膜７２の静脈系６０に入る。小柱網５４及びシュレム管５６は、虹彩４６と強膜７２の間の接合部に位置する。角膜５０、レンズ３５、及び瞳孔４４も可視化される。小柱網は構造が楔形であり、眼の全周に亘って走り、三次元の篩構造を形成する。小柱網は、小柱網細胞と呼ばれる細胞の単層に整列されたコラーゲンビームから形成されており、これはコラーゲンビームの間の空間を満たす細胞外物質を産生する。小柱網を通過した後、水性物質はシュレム管５６の内皮細胞を横切る。このように、小柱網細胞及びシュレム管内皮細胞は、眼の主要な流出経路の細胞を含んでいると考えられている。小柱網は、角膜内皮と毛様体表面の間に吊り下げられており、小柱と称される薄く、平坦で、枝分かれした絡み合う帯の一連の平行な層を備えている。小柱網の内側部分（虹彩根及び毛様体７４に最も近い）はブドウ膜網と称される一方、外側部分（シュレム管に最も近い）は、角強膜または傍シュレム管網と呼ばれる。ブドウ膜網目小柱は、直径約４μｍであり、コラーゲンコアを囲む細胞の単一層からなり、相互に連結された層状に配置されている。これらの小柱の間の空間は不規則であり、約２５μｍ〜約７５μｍの範囲のサイズである。角膜強膜網の小柱は、厚さ約３μｍ、長さ約２０μｍ以下の幅広く平坦な内皮シートに似ている。これらの小柱間の空間は、ブドウ膜網におけるよりも小さく、且つより複雑である。薄片がシュレム管に近づくにつれて、小柱間の間隔は約２μｍに減少する。小柱網を通る房水流出に対する抵抗は、主に傍シュレム管網（ＪＣＭ）に存在することが報告されている。この部位には２つの細胞型、即ち、小柱網細胞、並びにシュレム管内壁の内皮細胞が見出される。内科的及び外科的な両方の治療は、小柱網の透過性を増加させ、新たな流出経路を創出し、またはシュレム菅を広げることによって眼圧を低下させようと試みてきた。しかしながら、これらは傍シュレム管網が流出に対する抵抗の主要な原因であることに適切に対処していない。
【００２４】
毛様体７４による房水産生に関与する細胞プロセスについての現在の知識レベルとは対照的に、房水流出速度を決定する小柱網５４内の細胞機構は殆ど知られていない。ピノサイトーシス小胞が、傍シュレム管網及びシュレム管内壁において観察されている。これら小胞の機能は未知のままであるが、幾人かの研究者は、該網目構造を通る房水の大部分の流れは細胞間空間を通る流れによっては説明できないこと、及びこれら小胞が流出調節において中心的な役割を果たすことを示唆している。傍シュレム管網及びシュレム管内層の細胞膜におけるイオンチャネルの調節により、流出を管理することが提案されている。しかしながら、異なる機構である浸透圧駆動がＪＣＭを通る房水の流出の調節を担うことが提案されている。この浸透圧駆動は自己調節性であり、眼圧の変化が対応する流出速度の変化をもたらし、比較的一定の圧力が維持されるように調節している。
【００２５】
実験
房水中のＬ−アスコルビン酸のレベル（１．０６ｍｍｏｌ／ｌ；Ａｒｓｈｉｎｏｆｆ  Ｓ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ”，ｃｈａｐｔｅｒ  ４．２０．２［Ｍｏｓｂｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ．により１９９９年に発行され、その全体を参照により本明細書に援用する］）は、血液循環中に存在するもの（２０〜７０μｍｏｌ／ｌ、Ｇｅｉｇｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔａｂｌｅｓ，ｖｏｌ．３，ｐａｇｅ１３２，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  １９８５，［Ｃｉｂａ  Ｇｅｉｇｙにより発行され、その全体を参照により本明細書に援用する］）よりも約２０倍高い（Ｂｒｕｂａｋｅｒ  Ｒ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．“Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ”，Ｊｕｎｅ  ２０００，ｖｏＬ  ４１，Ｎｏ．７，ｐｐ．１６８１、その全体を参照により本明細書に援用する）。網膜の場合、眼内のＬ−アスコルビン酸レベルは、実際には血液循環中に存在するレベルよりも１００倍高い。
【００２６】
緑内障の眼におけるアスコルビン酸レベルを調べる研究（Ｐｅｉ−ｆｅｉ  Ｌｅｅ，ＭＤ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｈｕｍｏｒ  Ａｓｃｏｒｂａｔｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｐｅｎ−Ａｎｇｌｅ  Ｇｌａｕｃｏｍａ，”Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１９７７；９５（２）：３０８−３１０、その全体を参照により本明細書に援用する）、及び緑内障を予防する上での食物抗酸化剤の使用を評価する研究（Ｊａｅ  Ｈ．Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  Ｉｎｔａｋｅ  ａｎｄ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｏｐｅｎ−Ａｎｇｌｅ  Ｇｌａｕｃｏｍａ：Ａ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ，”Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．（２００３）１５８（４）：３３７−３４６、その全体を参照により本明細書に援用する）は、アスコルビン酸レベルが緑内障の眼で予測可能に低下するようには見えず、また抗酸化剤の使用が緑内障を予防しないことを示している。アスコルビン酸サプリメントの使用に向けられた治療法が提案されており、抗酸化特性が低下した眼圧の維持に役割を果たし得ると理論化している（ＵＳ２００６／０００４０８９、その全体を参照により本明細書に援用する）。
【００２７】
しかしながら、眼におけるＬ−アスコルビン酸レベルの上昇について満足のいく説明はなく、また眼の正常な機能を維持する上で果たす役割についての説明もない。
【００２８】
非緑内障ドナーから単離された小柱網組織試料中において、アスコルビン酸複合体の存在を確認するための実験を設計した。アスコルビン酸複合体の提案された検出の代案として、６−Ｏ−パルミトイル−Ｌ−アスコルビン酸を使用して、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）及び液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）の技術が開発された。次いで、提供された眼組織がＭＳ分析のために調製された。試料は、前駆体イオンスキャン技術により、機械的エステル連結されたアスコルビン酸塩構造についてスクリーニングされた。眼組織切片におけるこれらの分子の可能な発見のためのスクリーニング手順を提供するために、標準分子を研究して、逆相ＨＰＬＣ分離からの中性損失ＭＳ／ＭＳ検出による検出を最適化した。これらの中性損失検出実験は、アスコルビン酸糖について１７６．１ｕの損失にセンタリングされた。１７６．１ｕの数字は、図３に示すように、チロシン２０６及びＬ−ＤＯＰＡ２０８のアスコルビン酸複合体２０４についての、提案された構造を調べることによって決定された。アスコルビン酸２００は、化学式Ｃ６Ｈ８Ｏ６を有し、正確な質量は１７６．０３であり、分子量は１７６．１２である。正確な質量３３９．１０及び分子量３３９．３０をもった式Ｃ１５Ｈ１７ＮＯ８を有するアスコルビン酸複合体のアスコルビン酸複合体断片化（図４）が起こり、式Ｃ９Ｈ１０ＮＯ２＋を有し且つ正確な質量が１６４．０７のチロシン基、及び式Ｃ６Ｈ７Ｏ６を有し且つ正確な質量が１７５．０２のアスコルビン酸分子が残されることが提案された。或いは、３５５．０９の正確な質量及び３５５．３０の分子量を有する式Ｃ１５Ｈ１７ＮＯ９を備えたアスコルビン酸複合体のアスコルビン酸複合体断片化（図５）が起こり、式Ｃ９Ｈ１０ＮＯ３＋及び１８０．０７の正確な質量を有するＬ−ＤＯＰＡ基、及び式Ｃ６Ｈ７Ｏ６な及び正確な質量１７５．０２を有するアスコルビン酸分子が残されることが提案された。
【００２９】
強膜縁を有する角膜組織を組織培養培地中に保存し、最初の抽出が行われるまで２〜８℃で冷蔵した。試料を以下のようにして抽出した。即ち、組織を平衡塩類溶液で濯ぎ、小柱網を微細手術器具及び解剖顕微鏡を用いて剥がした。組織を１３×１００ｍｍガラス試験管に移した。眼組織をガラス撹拌棒の端で粉砕した。組織は非常に線維性であり、破壊に抵抗性であることが認められた。１．０ｍＬのＨＰＬＣ等級のメタノールを組織に加え、混合した。次いで、混合物を３７℃の水浴中で１時間超音波処理した。次に、１．０ｍＬのＨＰＬＣ等級のクロロホルムを添加し、高い設定で２分間混合した。次いで、該混合物を２５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次に、底部層を清浄な１３×１００ｍｍガラス試験管に移した。上層を１．０ｍＬのＨＰＬＣ等級の追加のクロロホルムで再抽出した。該混合物を前述のように遠心分離し、得られた下層を最初の下層と合わせた。クロロホルムを蒸発乾固させ、得られた物質を１００μＬのＨＰＬＣ移動相Ｂで再構成した。
【００３０】
次いで、試料をＬＣ／＋ＮＬ１７６．１ｕスキャン（図６）によって分析した。陽イオンは、アスコルビン酸に特徴的なＮＬ１５８ｕイオンへと断片化しなかった。陰イオンは、アスコルビン酸の特徴的なＮＬ１５７ｕイオンへと断片化しなかった。
【００３１】
陽イオン３５８．４ｕ及び３７４．４ｕについて計算されたリガンド分子量は、それぞれ１９９．１ｕ及び２１５．１ｕであった。これらの分子量値は約１６ｕ離れており、これはＯＨ基の構造における相違を示唆している。
【００３２】
陽イオン３５８．４ｕ及び３７４．４ｕは、陽イオン３４０．４ｕ及び３５６．４ｕから約１８ｕ離れていた。陽イオン３４０．４ｕ及び３５６．４ｕは、それぞれ１８１．２ｕ及び１９６．３ｕの分子量を有していた。これは、Ｈ２Ｏ基の損失または（ＮＨ４）＋基の損失を示唆する。
【００３３】
負イオン３３７．３ｕ及び３６９ｕの計算されたリガンド分子量は、それぞれ１８０．４ｕ及び２１２．４ｕであった。これらの分子量値は３２ｕ離れており、２（ＯＨ）基の構造における相違を示唆している。
【００３４】
これらのデータ観察から、陽イオン３４０．４ｕの分子量は３３９．４ｕであると決定された。従って、リガンドの分子量は、陽イオン３４０．４ｕの分子量３３９．４ｕから、アスコルビン酸のＮＬ１５８ｕイオンを差し引くことによって計算され、１８１．４ｕのリガンド分子量が得られた。
【００３５】
陽イオン３５６．４ｕの分子量は３５５．４ｕであった。陽イオン３５６．４ｕの分子量３５５．４ｕからＮＬ１５８ｕのアスコルビン酸イオンを差し引くことにより、リガンド分子量１９７．４ｕが生じた。
【００３６】
陰イオン３３７．３ｕの分子量は３３８．３ｕであった。陰イオン３３７．３ｕの分子量３３８．３ｕからアスコルビン酸のＮＬ１５８ｕイオンを差し引くことにより、１８０．３ｕのリガンド分子量が得られた。
【００３７】
陰イオン３６９．０ｕの分子量は３７０．０ｕであった。３６９．０ｕイオンの３７０．０ｕ分子量から、アスコルビン酸のＮＬ１５８ｕイオンを差し引くことにより、２１２．０ｕのリガンド分子量が得られた。
【００３８】
提案されたアスコルビン酸複合体、並びにチロシン及びＬ−ＤＯＰＡの断片をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ下でアッセイして、３４０．４ｕ及び３５６．４ｕの断片化をモニターすることによりリガンドのアイデンティティを確証した。
【００３９】
提案されたメカニズム
この実験は、眼組織試料中のチロシンまたはＬ−ＤＯＰＡの成分としてのアスコルベートの存在を示す。いずれかの理論に束縛されることを望むものではないが、アスコルビン酸またはその誘導体もしくは塩と会合したチロシンまたはＬ−ＤＯＰＡが、正常眼組織、特にシュレム管３６６の内皮層３２４及び／または小柱網細胞中に存在し、浸透圧駆動の一部としてＪＣＭ細胞の膜を通る房水の排液を調節することにより、正常眼圧の維持において或る役割を果たしている可能性がある。図２Ａに見られるように、小柱網３２０は、単一層の内皮細胞３２４によってシュレム管３６６から分離される。房水が内皮層を通過すると、それはシュレム管の中に排液され、次いで橋状血管３７０によって強膜静脈系の中に排液される。図２Ｂにおいて、内皮細胞の細胞膜３４０は、親油性領域３４２及び親水性領域３４４を伴って見える。図２Ｃは、シュレム管３６６と対面する矢印によって示される房水の方向と共に、内皮細胞膜３８０を示している。内皮層３６０の細胞膜における提案された構造は、細胞膜３４０を架橋し、且つ該膜を横切って房水を輸送するように働くミセル３６６の配列として示されている。対向する膜を横切った後、房水はシュレム管内に放出される。
【００４０】
アスコルビン酸またはアスコルビン酸誘導体の頭部を含むチロシン分子またはＬ−ＤＯＰＡ分子は、ＪＣＭの特殊化された細胞によって産生され、細胞膜に輸送され、そこで膜貫通タンパク質に結合することが提案されている。或いは、アスコルビン酸またはアスコルビン酸誘導体の頭部は、タンパク質に既に組み込まれているチロシンまたはＬ−ＤＯＰＡのような、アミノ酸の−ＯＨ基または他の官能基に結合されてもよい。膜貫通型シリンダーは、水及び溶質輸送のための親水性の内部が形成されるように、十分なタンパク質分子で形成され得る。眼圧が低い場合、アスコルビン酸の頭部は互いに結合を形成し、眼圧が上昇すると共に細胞浸透圧が低下し、細胞容積が増加し、細胞膜を伸張させる。これにより、結合部位で水分子がますます効果的に競合し、水がチャネルを通過することが可能になる。周囲の水性流体からの圧力増加はまた、細胞膜を歪ませる際の機械的役割を果たし、それによって極性部分の間の結合の解離と、その結果として水分子への浸透性に寄与する。機械的な力はまた、ＪＣＭ及びシュレム管の内壁において観察されたピノサイトーシス小胞形成を開始し得る。増加した流れに応答して眼圧が低下するにつれ、極性部分間の結合は水分子との結合よりもますます有利になり、流れは平衡に達するまで減少する。この平衡は、房水の生成速度のような種々の因子に基づいて変化し得るが、望ましい圧力を維持するように自己調節されるであろう。
【００４１】
細胞膜に広がる上記複合体は、眼の前眼房からシュレム管内への水の輸送のための自己調節浸透圧駆動を生じさせことができる。圧力が均衡すると、アスコルビン酸部分は一般的に相互に結合し、房水からの水分子は、親水性頭部の間を定常状態速度で比較的ゆっくりと移動する。しかしながら、圧力の僅かな増加または減少でさえ、新しい平衡流速の確立を引き起こす可能性がある。
【００４２】
開放角緑内障は、上記浸透圧駆動の障害と共に生じる可能性がある。緑内障患者の眼組織には比較的正常な濃度のアスコルビン酸が存在することが見出されているので、アスコルビン酸の吸収、輸送及び摂取は、障害の原因であることはなさそうであり、更に、孤立した眼圧上昇よりも、むしろビタミンＣ欠乏に関連する全身性の問題を引き起こすことが予想される。幾人かの患者では、アスコルビン酸とチロシンまたはＬ−ＤＯＰＡとの正常な複合体化の失敗は、酵素欠損、酵素活性の低下、または他の障害によって生じる可能性がある。これらの酵素は、眼またはＪＣＭの細胞に特異的であってよく、または他の場所に存在してよく、その場合、患者は、緑内障に加えて他の症状を有する可能性があり、治療的分子はこれらの症状も同様に治療し得る。幾人かの患者において、他の病変はまた、浸透圧駆動を細胞膜内で組み立てられない結果を生じる可能性がある。
【００４３】
治療法
本明細書中に開示される分子は、治療的有効量で提供されれば、疾患及び状態、特に開放角緑内障の治療を達成する医薬品として使用され得る。本明細書で使用する「治療する」、「治療すること」または「治療」の用語は、予防的及び／または治療の目的で分子または医薬組成物を対象に投与することを意味し、（ｉ）疾患の素因を有する可能性があるが、それを有すると未だ診断されていない対象において当該疾患が生じるのを予防すること；（ｉｉ）疾患を抑制すること、即ちその発症を阻止すること；または（ｉｉｉ）疾患を緩和すること、即ち疾患の退行を生じさせることを含む。
【００４４】
本明細書で使用する「対象」は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、非ヒト霊長類または鳥類、例えばニワトリ、並びに任意の他の脊椎動物または無脊椎動物を意味する。「哺乳動物」の用語は、通常の生物学的意味で使用される。従って、特定的には、サル（チンパンジー、類人猿、サル）及びヒトを含む霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、げっ歯類、ラット、マウス、モルモット等が含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
本明細書中で使用するとき、「治療的有効量」、「医薬的有効量」または「有効量」の用語は、それを必要としている哺乳動物に投与されたときに、（上記で定義したような）治療を行うのに十分である分子の量（必要な用量及び期間において）を言う。「治療的有効量」を構成する量は、投与される分子、状態または疾患及びその重症度、並びに治療される哺乳動物、その体重、年齢等に依存して変化するが、現代の知識及び本開示に関する当業者は日常的に決定できるであろう。
【００４６】
分子及び他のアスコルビン酸誘導体
幾つかの実施形態において、緑内障に罹患している個体は、アスコルビン酸複合体からなる治療的有効量の治療的分子を投与することによって治療され、前記複合体は親水性または両親媒性部分に複合体化されたアスコルビン酸またはその誘導体を含む。幾つかの実施形態において、前記親水性または両親媒性部分は、チロシンもしくはＬ−ＤＯＰＡ、またはその誘導体を含む。別の実施形態において、緑内障に罹患している個体は治療的有効量の治療的分子を投与することによって治療でき、該分子はアスコルビン酸もしくはアスコルビン酸誘導体の前記親水性または両親媒性部分に対する親和性を増強するように構成できる。幾つかの実施形態において、前記親水性または両親媒性部分は、チロシンまたはその類似体を含む。幾つかの実施形態において、前記親水性または両親媒性部分は、Ｌ−ＤＯＰＡまたはその類似体を含む。アスコルベートは、その形態に関して限定されず、任意の既知のアスコルベートまたはアスコルベート誘導体を使用することができる。例えば、アスコルベート、アスコルビン酸、またはその医薬的に許容可能な塩、水和物、及び溶媒和物は、チロシンまたはＬ−ＤＯＰＡ基に連結され、治療的有効量で患者に送達され得る。水素結合できる単一または複数の部位を有する他の極性分子もまた、アスコルビン酸基の代用となり得る。以下に、チロシンまたはＬ−ＤＯＰＡに複合体化されたアスコルビン酸を含む可能なアスコルビン酸複合体を開示するが、ここでのＲ部分はチロシン（Ｒ＝−Ｈ）またはＬ−ＤＯＰＡ（Ｒ＝−ＯＨ）を表す。下記には、チロシンまたはＬ−ＤＯＰＡに複合体化されたアスコルビン酸の可能な置換パターンもまた開示される。Ｒ部分の例には、−Ｈ、−ＨＣＯ、−Ｈ３ＣＣＯ、−（ＣＨ３）２ＨＣＣＯ、及び−（ＣＨ３）３ＣＣＯが含まれるが、これらに限定されない。Ｘ部分の例には、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、及び−ＯＲ１が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に開示されたアスコルビン酸複合体の合成的変異体もまた作製され得る。
【化１】
2018506519.tif 000003
2018506519.tif 000004
【００４７】
「溶媒和物」とは、溶媒と、ここに開示された分子またはその塩との相互作用により形成される分子を言う；適切な溶媒和物は、水和物を含む医薬的に許容可能な溶媒和物である。
【００４８】
「医薬的に許容可能な塩（製薬上許容される塩）」の用語は、分子の生物学的有効性及び性質を保持し、且つ生物学的にまたは他の点において医薬品に使用するために望ましくないものではない塩を言う。多くの場合、本明細書に開示される分子は、アミノ基及び／またはカルボキシル基、またはそれに類似した基の存在により、酸性及び／または塩基性塩を形成することができる。医薬的に許容可能な酸付加塩は、無機酸及び有機酸を用いて形成できる。塩を誘導し得る無機酸には、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等が含まれる。塩を誘導し得る有機酸には、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸等が含まれる。医薬的に許容可能な塩基付加塩は、無機塩基及び有機塩基を用いて形成できる。塩を誘導し得る無機塩基としては、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム等が含まれ、特に好ましいのはアンモニウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩である。塩を誘導し得る有機塩基には、例えば、第一級、第二級及び第三級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、塩基性イオン交換樹脂等、特に、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、及びエタノールアミンが含まれる。１９８７年９月１１日に公開されたＪｏｈｎｓｔｏｎらのＷＯ８７／０５２９７（その全体を参照により本明細書に援用する）に記載されているように、そのような多くの塩が当該分野で知られている。
【００４９】
酵素
他の実施形態において、リガンドに複合体化されたアスコルビン酸またはその医薬的に許容可能な誘導体を含む分子を形成する酵素活性を備えた酵素は、眼への取り込みのための治療的有効量で投与される。他の実施形態において、アスコルビン酸またはその医薬的に許容可能な誘導体をリガンドに複合体化する酵素活性を有する酵素は、眼への取り込みのための治療的有効量で投与される。幾つかの実施形態では、リガンドに複合体化されたアスコルビン酸またはその誘導体を含むアスコルビン酸複合体を、膜貫通細孔の構成の一部として膜貫通タンパク質に連結する酵素活性を有する酵素が、眼への取り込みのための治療的有効量で投与される。幾つかの実施形態において、前記リガンドはチロシンまたはその類似体であり得る。幾つかの実施形態において、前記リガンドは、Ｌ−ＤＯＰＡまたはその類似体であり得る。幾つかの実施形態において、前記酵素は、アスコルビン酸をリン酸化できるキナーゼであり得る。例えば、ホスホリパーゼＤは、その全体を参照により本明細書に援用するＬｉｐｉｄｓ  ２６：３９０−９４（１９９１）においてＮａｇａｏらにより記載されているように、６−ホスファチジル−Ｌ−アスコルビン酸を合成するために使用することができる。ストレプトマイセス・リディカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｙｄｉｃｕｓ）由来のホスホリパーゼＤは、入手し得るか、またはこの酵素は実験室で合成することができ、これらは両者共に当該技術において既知の方法により達成できる。アスコルビン酸をリン酸化するのに有効な他の酵素は、合成または単離されて、治療的有効量で対象に投与され得る。
【００５０】
幾つかの実施形態において、前記酵素はエステラーゼであってよい。幾つかの実施形態において、該エステラーゼは、ブレード、ニードル、アプリケータ、または送達系を角膜に通すことによって、前房内に投与できる。他の実施形態において、前記エステラーゼは小柱網上に直接適用することができる。非限定的な例として、前記小柱網は、ゴニオスコピーによる直接観察下で、ペースト状侵食性担体の中に含めることができる。前記酵素は、ニワトリのようなトランスジェニック対象から入手し得る。_トランスジェニック対象を使用することに向けられた治療が提案され、米国食品医薬品局によって承認されている（例えば、Ｋａｎｕｍａ［セベリパーゼアルファ］、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ＮｅｗｓＥｖｅｎｔｓ／Ｎｅｗｓｒｏｏｍ／ＰｒｅｓｓＡｎｎｏｕｎｃｅｍｅｎｔｓ／ｕｃｍ４７６０１３．ｈｔｍ、その全体を参照により本明細書に援用する）。
【００５１】
勿論、エステラーゼ以外の他の酵素が関与している可能性もある。本開示は特定の酵素に限定されない。小柱網細胞及びシュレム管内皮細胞における特定の酵素欠損が同定され、この酵素欠損は眼の水流出経路に関連するので、これら酵素もまた本開示の範囲内において潜在的治療標的となるであろう。例えば、該酵素分類には、ホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、トランスフェラーゼ、リボソーム及び非リボソームシンテターゼ、並びに縮合反応を触媒する他の酵素（例えばアミド及びエステル形成縮合酵素）等が含まれ得る。
【００５２】
遺伝子治療
更に他の実施形態において、治療は遺伝子治療からなり、ここでは１以上の治療剤が治療薬をコードする核酸である。例えば、前記核酸は、タンパク質またはペプチドをコードし得る。該タンパク質またはペプチドは、アスコルビン酸またはその医薬的に許容可能な誘導体をリガンドに複合体化する酵素活性をもった酵素を含むことができる。幾つかの実施形態において、前記タンパク質またはペプチドは、リガンドに複合体化されたアスコルビン酸またはその誘導体を含むアスコルビン酸複合体を、膜貫通細孔の構成の一部として膜貫通タンパク質に連結する酵素活性をもった酵素を含み得る。幾つかの実施形態において、前記リガンドはチロシンまたはその類似体であり得る。幾つかの実施形態において、前記リガンドはＬ−ＤＯＰＡまたはその類似体であり得る。前記タンパク質またはペプチドは、アスコルビン酸をリン酸化するか、またはアスコルビン酸誘導体をリン酸化するか、或いは前記眼に投与された核酸の発現を指令するのに十分な調節要素と動作可能に関連して、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはアスコルベート均等物複合体の産生に寄与する機能的キナーゼ酵素を含むことができる。別の非限定的な例として、前記核酸は、エステラーゼ活性を有するタンパク質またはペプチドをコードすることができ、ここでの機能的エステラーゼ酵素はエステル基を切断して、複合体分子を放出し得るものである。核酸治療剤を含む組成物は、許容可能な希釈剤中の核酸または遺伝子治療ベクターから実質的になることができ、或いは、ポリマーマトリックスのような薬剤放出調節成分であって、核酸または遺伝子治療ベクターがこれと物理的に会合し、例えばそれと混合され、またはその中にカプセル化または埋設された放出調節成分を含むことができる。前記遺伝子治療ベクターは、プラスミド、ウイルス、または他のベクターであり得る。或いは、前記医薬組成物は、治療的な核酸またはポリペプチドを産生する１以上の細胞を含むことができる。好ましくは、このような細胞は治療剤を細胞外空間に分泌する。
【００５３】
或いは、眼は比較的免疫特権的な部位であるので、これは、組織適合検査または免疫抑制なしで、ドナー角膜の成功裏の移植を可能にする。従って、細胞療法は効果的であり得る。この免疫特権状態は、ドナーの小柱網細胞を対象に投与して眼圧を低下させるために使用され得る。幾つかの実施形態において、小柱網細胞はインビトロで、例えば組織培養、懸濁培養、器官培養等において増殖させ得る。他の実施形態において、前記小柱網細胞はアイバンク組織から採取することができる。幾つかの実施形態において、前記小柱網細胞は、異種、同種または自家性であり得る。幾つかの実施形態において、前記小柱網細胞は、フリー溶液で投与することができる。幾つかの実施形態において、前記小柱細胞は、ブレード、ニードル、アプリケータ、または送達系を角膜に通すことによって、前房内に投与することができる。小柱網細胞は眼の前眼房に放出することができ、そこでは水性排液がそれらを小柱網へと運ぶであろう。例えば、下記を参照されたい：Ｙｕｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍｏｎｋｅｙ  ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ  ｍｅｓｈｗｏｒｋ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ：ｇｒｏｗｔｈ，ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ，ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．Ｇｒａｅｆｅｓ  Ａｒｃｈ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．，２２６（３）：２６２−２６８；Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ  ｍｅｓｈｗｏｒｋ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃ  ｃｕｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｎａｎｏｓｃａｌｅ  ｌｅｖｅｌ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ４９（２）：６２９−６３５；Ｇａｓｉｏｒｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００９）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ  ｍｅｓｈｗｏｒｋ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  ８８（４）：６７１−６７５；上記引用参考文献は全て、その全体をその参照により本明細書に援用する。
【００５４】
小柱網細胞を眼の小柱網上に投与して、眼圧を下げることができる。幾つかの実施形態において、小柱網細胞は組織培養で増殖させることができる。幾つかの実施形態において、小柱網細胞は、小柱網上に直接適用できる。幾つかの実施形態において、小柱網細胞は、間接的可視化の下で投与し得る。他の実施形態において、小柱網細胞は、直接的視覚化の下で投与し得る。非限定的な例として、小柱網は、ゴニオスコピーによる直接観察の下で、ペースト状侵食性担体に含めることができる。
【００５５】
幾つかの実施形態において、患者自身の細胞を修復する必要があれば、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼＣａｓ９に基づいて、組織培養培地中で増殖された小柱網細胞における遺伝的または後天的な欠陥を修復するために、ゲノム工学技術が使用され得る。これらは、患者自身の小柱網細胞、または恐らくは患者からの改変細胞であり得る。患者の小柱網細胞は、患者に害を与えることなく、細胞培養のためのストリップとして取り出すことができる。１つの緑内障手術であるトラベクトーム手術はこれに基づいており、罹患率は低い。実際の機能不全の核酸配列を決定するために、小柱網は角膜縁から容易に剥がされ、培養されて、ゲノムはカタログに登録される。例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連のＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼＣａｓ９に基づいて、ゲノム工学技術を用いたターゲッティングのために同定された欠陥核酸配列を用いて、開放角緑内障患者由来の眼に対しても同様のことを行うことができる。次いで、修復された細胞は、先に述べた技術を用いて患者に再導入され得る。ＣＲＩＳＰＲ技術を用いた遺伝子編集の詳細な方法については、例えば下記を参照されたい：Ｄｏｕｄｎａ  ａｎｄ  Ｃｈａｒｐｅｎｔｅｉｒ（２０１４）Ｔｈｅ  ｎｅｗ  ｆｒｏｎｔｉｅｒ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．３４６  ｎｏ．６２１３；Ｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ＤＮＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．３４５  ｎｏ．６２０１  ｐｐ．１１８４−１１８８；Ｓｌａｙｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ５２２７；上記全ての引用参考文献は、その全体をその参照により本明細書に援用する。
【００５６】
遺伝子治療プロトコルのために使用されてきたウイルスベクターには、レトロウイルス、レンチウイルス、他のＲＮＡウイルス、例えばポリオウイルスまたはシンドビスウイルス、並びにアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、ワクシニア及び他のＤＮＡウイルスが含まれるが、これらに限定されない。複製欠損マウスレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターは、広く利用されている遺伝子導入ベクターである。遺伝子治療の化学的方法には、膜融合のためのリポソームまたは他の小胞のような、融合誘導性脂質小胞の使用による担体媒介性遺伝子導入が含まれる。関心のある核酸を含む担体は、眼または体液または血流に都合よく導入できる。担体は、体内の標的臓器または組織に部位特異的に指向させることができる。例えば、細胞または組織特異的ＤＮＡ担持リポソームを使用することができ、リポソームによって運ばれる外来核酸は、これら特定の細胞によって吸収され得る。遺伝子導入はまた、リポソームではない脂質ベースの分子の使用を伴い得る。例えば、リポフェクチン及びサイトフェクチンは陽イオンを含む脂質ベースの分子であり、これは負に帯電した核酸に結合し、細胞膜を横切って該核酸を輸送できる複合物を形成する。
【００５７】
遺伝子治療の送達はまた、陽イオン性ポリマーを介して達成され得る。特定の陽イオン性ポリマーは、ＤＮＡなどの核酸に自発的に結合してナノ粒子に凝縮する。例えば、天然に存在するタンパク質、ペプチド、またはそれらの誘導体が使用されてきている。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリリジン（ＰＬＬ）などのような合成陽イオン性ポリマーはＤＮＡを凝縮させ、有用な送達媒体である。デンドリマーもまた使用することができる。多くの有用なポリマーは、負に帯電したＤＮＡリン酸とのイオン相互作用を可能にするための帯電可能なアミノ基と、加水分解可能なエステル結合のような分解可能な領域の両方を含んでいる。例としては、ポリ（α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸）、ネットワークポリ（アミノエステル）、及びポリ（β−アミノエステル）が含まれる。これらの錯化剤は、例えばヌクレアーゼ、血清成分などによる分解から核酸を保護し、またより少ない負の表面電荷を生じるが、これは細胞の疎水性膜（例えば、細胞質膜、リソソーム膜、エンドソーム膜、核膜）を通しての通過を容易にする。ある種の錯化剤は、エンドソーム逃避、細胞質輸送、及び核侵入のような細胞内輸送事象を促進し、核酸から解離することができる。
【００５８】
個別治療
幾つかの実施形態において、緑内障の治療は、個々の患者に合わせて調整される。異なる濃度のチロシン、Ｌ−ＤＯＰＡ、アスコルビン酸またはそれぞれの類似体、及びその医薬的に許容可能な誘導体を有する分子の複数の変形例が提供され、ここでの各変形例の投与は眼圧における特徴的な低下、または平衡における特徴的な圧力をもたらす。治療方法は、治療剤の投与前の眼圧の測定、眼圧の所望の低下または目標圧力に基づく分子の選択、及びその分子の投与を含み得る。治療中に眼圧を監視し、所望の圧力、例えば１０〜２０ｍｍＨｇ、または或るときは約１５〜約１８ｍｍＨｇを維持するために、異なる薬剤または異なる薬剤の組合せを選択することができる。そのような異なる薬剤または異なる薬剤の組合せを選択した後、次にそれらを投与することができる。
【００５９】
投与の方法
房水の輸送を増加させる分子またはその前駆体は、分子が眼に入る能力を高めるために改変され得る。その例には、天然の酵素または代謝経路によって房水の輸送を増加させ得る意図された分子に変更可能な、開裂可能なエステル基または他の容易な脱離基、及び分子／化合物の付加が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００６０】
治療的分子を体系的に投与する様々な方法が企図されている。これらには、点眼剤、スプレー、ゲル、軟膏、または他のビヒクルによる眼への局所投与が含まれる。本明細書に開示される活性分子は、任意の適切な手段によって患者の眼に投与されるが、好ましくは、この用途は活性分子の液体またはゲル懸濁液を液滴、スプレーまたはゲルの形態で投与することによる。或いは、活性分子はリポソームを介して眼に適用される。更に、活性分子は、ポンプカテーテルシステムを介して涙液膜に注入することができる。別の実施形態は、連続的または選択的な放出デバイス、例えば限定されないが、Ｏｃｕｓｅｒｔ（商標）システム（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）で使用されるような、膜の中に含まれる治療用分子が含まれる。追加の実施形態として、活性分子は、眼に配置されるコンタクトレンズ内に収容され、担持され、または付着させることができる。本発明の別の実施形態には、スワブまたはスポンジ内に含まれる治療用分子が含まれ、これは眼表面に適用される。本発明の別の実施形態は、眼球表面に適用される液体スプレー内に含められた治療用分子が含まれる。
【００６１】
他の実施形態において、治療用分子は、定期的に行われる眼内注射によって送達される。幾つかの実施形態において、治療用分子は結膜下注射によって、他の例では、眼内（前眼房）、硝子体内または強膜下注射によって投与され得る。治療用分子は、カテーテルまたは移植シャントを介してシュレム管に直接送達されてもよい。活性分子の全身投与の更なる手段には、治療的有効量の治療用分子のゲル、クリームまたは懸濁液形態の直接の術中点眼が含まれる。幾つかの実施形態において、該治療用分子は懸濁液で投与される。幾つかの実施形態において、前記治療用分子は、例えば、最大１年以上の期間に亘って治療的量の分子を放出する生分解性ポリマー内の、前眼房内または前硝子体内に配置するための持続放出インプラント及びマイクロスフェアによって投与され得る。加えて、幾つかの実施形態では、前記治療用分子は移植された薬物送達系によって投与することができ、該送達系は治療的有効量の分子を経時的に放出する。薬物送達系の移植は、外科手術であっても注射によるものであってもよい。幾つかの実施形態において、前記治療用分子は、イオントフォレシスによって送達される。幾つかの実施形態において、前記治療用分子は超音波によって送達される。
【００６２】
治療用分子を含む局所溶液は、眼科分野の当業者が従来の基準を使用して選択できるように、生理学的に適合するビヒクルをも含むことができる。該ビヒクルは既知の眼科用ビヒクルから選択でき、これには生理食塩水、水ポリエーテル（ポリエチレングリコール等）、ポリビニル類（ポリビニルアルコール及びポビドン等）、セルロース誘導体類（メチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、石油誘導体（鉱油、及び白色ワセリン等）、動物性脂肪（ラノリン等）、アクリル酸のポリマー（カルボキシポリメチレンゲル等）、植物性脂肪（ピーナッツ油等）、及び多糖類（デキストラン等）、並びにグリコサミノグリカン（ヒアルロン酸ナトリウム等）、及び塩（塩化ナトリウム及び塩化カリウム等）が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、前記治療用分子を含有する局所溶液のｐＨは、約７〜約１１のｐＨに調節することができる。幾つかの実施形態において、前記ｐＨは、約７、約８、約９、約１０、約１１、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲である。幾つかの実施形態において、局所投与のための治療用分子は、その全体を参照により本明細書に援用するＪａｎ  Ｄ．Ｂｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ５００  Ｄａｌｔｏｎ  ｒｕｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｋｉｎ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  ｄｍｇｓ，”Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０００；９（３）：１６５−９に記載され、またはそれから修飾されるように、約５００ダルトン以下であることができる。
【００６３】
上記の局所投与方法に加えて、本発明の治療用分子を全身に投与する種々の方法がある。１つの全身投与方法は、対象が吸入する活性分子を含んだ呼吸可能な粒子のエアロゾル懸濁液を含むことができる。前記治療用分子は肺を介して血流に吸収され、続いて医薬的に有効な量で眼組織に接触する。呼吸に適した粒子は液体または固体であり、吸入の際に口及び喉頭を通過するのに十分な粒度を有する。一般に、サイズが約１〜１０ミクロン、より好ましくは１〜５ミクロンの範囲の粒子が呼吸可能であると考えられる。
【００６４】
対象の眼に活性分子を全身投与するための別の手段は、液体製剤の点眼剤または眼洗浄剤または点鼻薬の形態の液体／液体懸濁液、または対象が吸入する呼吸可能な粒子の鼻スプレーを投与することが含まれるであろう。鼻スプレーまたは点鼻薬もしくは点眼剤を製造するための活性分子の液体医薬組成物は、前記活性分子を、当業者に既知の技術によって、滅菌パイロジェンフリー水または滅菌生理食塩水のような適切なビヒクルと組み合わせることによって調製することができる。
【００６５】
治療用分子を全身投与する他の手段には経口投与が含まれてもよく、ここでの活性分子を含有する医薬組成物は、錠剤、ロゼンジ、水性もしくは油性の懸濁液、分散性粉末もしくは顆粒、エマルジョン、ハードもしくはソフトカプセル、またはシロップもしくはエリキシル剤である。経口使用のための組成物は、医薬組成物の製造のための当該技術で既知の任意の方法に従って調製され、このような組成物は、医薬的に洗練され且つ嗜好性に適合した製剤を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤及び保存剤からなる群から選択される１種以上の物質を含有することができる。錠剤は、錠剤の製造に適した無毒性の医薬的に許容可能な賦形剤との混合物中に、活性成分を含有する。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムのような不活性希釈剤；造粒剤及び崩壊剤、例えばコーンスターチまたはアルギン酸；結合剤、例えばデンプン、ゼラチンまたはアラビアゴム；及び滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクである。錠剤は、コーティングされていないか、または胃腸管における崩壊及び吸収を遅延させるために既知の技術でコーティングされ、それにより長期間に亘る持続的な作用を提供する。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンのような時間遅延材料を使用することができる。経口使用のための製剤は、活性成分が不活性固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合される硬質ゼラチンカプセルとして、または活性成分が水または油媒体、例えばピーナッツ油、流動パラフィンまたはオリーブ油と混合される軟質ゼラチンカプセルとして提示することができる。
【００６６】
対象の眼への治療用分子の全身投与の追加の手段には、治療的有効量の分子が全身吸収及び循環によって眼に到達するように、活性分子の坐剤形態が含まれるであろう。
【実施例】
【００６７】
実施例１−チロシンに連結されたアスコルビン酸を用いた緑内障の治療［予言的］
７５歳の患者は、両眼において２６ｍｍＨｇの眼圧（ＩＯＰ）を示す。これは、平均ＩＯＰ（１６ｍｍＨｇ）を超える４標準偏差（２．５ｍｍＨｇ）を表す。フィルター角度はゴニオスコピーによって検査され、開いていることが分かる。房水静脈が最も顕著である眼の鼻部及び側頭部分の検査は、構造が損なわれていないことを示す。視神経は中程度の損傷のみを示す。この患者は非常に低い目標ＩＯＰをもたないであろうし、またＩＯＰの正常化は治療に対する適切な応答を表すであろう。予想される治療計画は、ビヒクルまたは送達系中に１０ｍｇ以下のアスコルビン酸−チロシン複合体を含む点眼剤の、１日２〜３回の負荷用量である。該治療計画で２週間後、眼圧は低下し、投薬は１日２回に減少される。１ヶ月目に眼圧が正常化されたら、点眼は、治療効果を維持するのに必要な最小限度まで減少させてよい。
【００６８】
実施形態及び方法は、緑内障治療との関連において開示されているが、本明細書で開示される実施形態及び方法は、他の状況でも使用され得ることが、当業者には理解されるであろう。例えば、チロシンまたはＬ−ＤＯＰＡに連結されたアスコルビン酸の投与は、体液流出調節が機能不全である他の疾患を治療するために、治療的量で利用され得る。開示される治療法を利用する体液流出調節の例には、水頭症及び人工腎臓の治療が含まれるが、これに限定されない。
【００６９】
これは或る特定の好ましい実施形態及び実施例の文脈で開示されているが、当業者は、本発明が具体的に開示された実施形態を超えて、本発明の他の代替実施形態及び／または使用、並びにその明らかな変形及び均等物に及ぶことを理解するであろう。加えて、本発明の変形例が示され詳細に説明されているが、当業者には、本発明の範囲内にある他の変形例についても、この開示に基づいて容易に明らかであろう。当該実施形態の特定の特徴及び態様の種々の組合せ、または副組合せを実施することができ、それもやはり本発明の範囲内に入ると企図されている。従って、開示された実施形態の種々の特徴及び態様は、開示された発明の種々の形態を実行するために、互いに組合せ得ること、または互いに置換し得ることが理解されるべきである。従って、本明細書に開示された発明の範囲は、上述した特定の開示された実施形態によって限定されるべきではなく、特許請求の範囲の公正な解読によってのみ決定されるべきである。
【００７０】
本出願においては、別段の記載がない限り、または本開示に照らして当業者が理解するように単数形が唯一の機能的実施形態でない限り、単数形の使用は複数形を含むことができる。従って、例えば、「ａ」は複数を意味することができ、「１つの実施形態」は、その記載が複数の実施形態に適用されることを意味することができる。加えて、本出願において、「及び／または」は、「及び」の包含的な意味、或いは「または」の排他的な意味の両方が、リストでの列挙項目に適用されることを示す。従って、リストにおける列挙は、該リストの項目の全ての可能な組合せを含み、また他の項目から排他的に各項目を含むように解読されるべきである。この用語の追加は、「及び」または「または」用語の単独の使用が、いずれか特別な意味を表すことを意味するものではない。このような用語の意味は、特定の開示を読んだ当業者には明らかであろう。
【００７１】
公開された、及び公開されていない特許出願、特許、教科書、参考文献等（これらに限定されない）を含めて、本明細書で引用されている全ての参考文献は、それらが既に援用されていない範囲において、その全体を参照により本明細書に援用する。援用された文献及び類似の資料の１以上が、定義された用語、用語の使用、記載された技術等（これらに限定されない）を含めて、本明細書に含まれる開示とは異なり、またはこれと矛盾する範囲において、本明細書は、そのような矛盾する如何なる資料についてもこれを破棄し、及び／またはこれに優先することを意図するものである。
【００７２】
本明細書で使用するとき、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（を含む）」の用語は、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（を含む）」、「を含有する」または「を特徴とする」と同義であり、包含的でありまたは制限的ではなく、追加の記載されていない要素または方法工程を排除しないものである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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