(57)【要約】  本発明は、糖尿病網膜症の治療及び／又は予防のためのペプチドを開示する。本発明のペプチドは、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）結合配列及び／又はＥ３ユビキチンリガーゼｓｅｖｅｎ  ｉｎ  ａｂｓｅｎｔｉａ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １（Ｓｉａｈ１）結合配列並びにインターナリゼーション配列を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）結合配列及び／又はＥ３ユビキチンリガーゼｓｅｖｅｎ  ｉｎ  ａｂｓｅｎｔｉａ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １（Ｓｉａｈ１）結合配列並びにインターナリゼーション配列を含むペプチド。
【請求項２】
Ｎ末端から順にインターナリゼーションペプチド並びにＧＡＰＤＨ結合配列及び／又はＳｉａｈ１結合配列を含む、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
インターナリゼーション配列が、陽イオン性インターナリゼーション配列、好ましくは配列番号３を含む配列である、請求項１又は２記載のペプチド。
【請求項４】
ＧＡＰＤＨ結合配列及びインターナリゼーション配列を含む、請求項１〜３記載のペプチド。
【請求項５】
Ｓｉａｈ１結合配列及びインターナリゼーション配列を含む、請求項１〜３記載のペプチド。
【請求項６】
ＧＡＰＤＨ結合配列が、配列番号１を含む、請求項１〜４記載のペプチド。
【請求項７】
Ｓｉａｈ１結合配列が、配列番号２を含む、請求項１〜３又は５記載のペプチド。
【請求項８】
ペプチドのＮ末端がアセチル化されている、請求項１〜７記載のペプチド。
【請求項９】
ペプチドのＣ末端がアミド化されている、請求項１〜８記載のペプチド。
【請求項１０】
糖尿病網膜症の治療又は予防における使用のための、請求項１〜９記載のペプチド。
【請求項１１】
糖尿病網膜症の治療又は予防のための医薬の調製のための、請求項１〜１０記載のペプチドの使用。
【請求項１２】
請求項１〜９記載のペプチドを含む医薬製剤。
【請求項１３】
請求項１〜９記載のペプチドの有効量を対象に投与することを含む、糖尿病網膜症の治療又は予防のための方法。
【請求項１４】
請求項１〜９記載のペプチドをコードする核酸配列を含むベクター。
【請求項１５】
請求項１４記載のベクターを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）及び／又はＥ３ユビキチンリガーゼｓｅｖｅｎ  ｉｎ  ａｂｓｅｎｔｉａ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １（Ｓｉａｈ１）に結合するペプチド並びに糖尿病網膜症の治療又は予防におけるその使用に関する。
【０００２】
背景
糖尿病網膜症（ＤＲ）は、世界中における失明の主原因であり、その有病率は増加している。ＤＲのための現行の治療法は、疾患の後期だけに対処しており、侵襲性であり、有効性が限られている。網膜周皮細胞の死滅は、ＤＲの初期の病理学的特徴である。これは、糖尿病患者及びＤＲの動物モデルにおいて観察されているが、周皮細胞の死滅の原因は未知のままである。最近、眼組織からグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）とＥ３ユビキチンリガーゼｓｅｖｅｎ  ｉｎ  ａｂｓｅｎｔｉａ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １（Ｓｉａｈ１）との間の相互作用によって開始される新規なアポトーシス促進経路が特定された。
【０００３】
本発明によって解決されるべき問題は、糖尿病網膜症の治療又は予防のための新しい治療用ペプチドを提供することであった。
【０００４】
概要
本発明は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）結合配列及び／又はＥ３ユビキチンリガーゼｓｅｖｅｎ  ｉｎ  ａｂｓｅｎｔｉａ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １（Ｓｉａｈ１）結合配列並びにインターナリゼーション配列を含むペプチドを提供する。
【０００５】
特定の実施態様では、本発明のペプチドは、Ｎ末端から順にインターナリゼーションペプチド並びにＧＡＰＤＨ結合配列及び／又はＳｉａｈ１結合配列を含む。
【０００６】
本発明の特定の実施態様では、インターナリゼーション配列は、陽イオン性インターナリゼーション配列、好ましくは配列番号３を含む配列である。
【０００７】
特定の実施態様では、本発明のペプチドは、ＧＡＰＤＨ結合配列及びインターナリゼーション配列を含む。
【０００８】
特定の実施態様では、本発明のペプチドは、Ｓｉａｈ１結合配列及びインターナリゼーション配列を含む。
【０００９】
本発明の特定の実施態様では、ＧＡＰＤＨ結合配列は配列番号１を含む。
【００１０】
本発明の特定の実施態様では、Ｓｉａｈ１結合配列は配列番号２を含む。
【００１１】
本発明の特定の実施態様では、ペプチドのＮ末端はアセチル化されている。
【００１２】
本発明の特定の実施態様では、ペプチドのＣ末端はアミド化されている。
【００１３】
本発明は、また、治療活性物質としての使用のための、特に糖尿病網膜症の処置における使用のための、上記ペプチドに関する。
【００１４】
本発明は、また、上記ペプチド及び治療上不活性な担体を含む医薬組成物に関する。
【００１５】
本発明は、上記ペプチドをコードする核酸配列を含むベクターを提供する。
【００１６】
本発明は、上記ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】高グルコースはＳｉａｈ１総タンパク質のアップレギュレーションを引き起こす。高グルコース（２５mM Ｄ−グルコース）で４８時間処理されたｈＲＰは、正常グルコース（５mM）又はＬ−グルコース（２５mM）（浸透圧対照）のいずれかで処理された細胞と比較して、増加したＳｉａｈ１総タンパク質レベルを有する（Ａ）（図１Ａ）。３つの独立した実験の定量を図１Ｂに示す。
【図２】高グルコースは、ＧＡＰＤＨとＳｉａｈ１との間の結合増加をもたらす。細胞を正常グルコース（５mM）、Ｌ−グルコース（２５mM）又は高グルコース（２５mM）で４８時間処理した。高グルコースで処理されたｈＲＰは、正常グルコース又はＬ−グルコースのいずれかで処置された細胞と比較して高レベルのＳｉａｈ１結合ＧＡＰＤＨを有する（図２Ａ）。１０μM Ｓｉａｈ１ ｓｉＲＮＡ（Ｃ）又は１μM ＧＡＰＤＨ／Ｓｉａｈ１ブロッキングＴＡＴ−ＦＬＡＧペプチド（図２Ｅ）のいずれかを用いたＧＡＰＤＨ／Ｓｉａｈ１経路の阻害は、高グルコースが誘導するＧＡＰＤＨ／Ｓｉａｈ１結合を阻害する。３つの独立した実験の定量を図２Ｂ、２Ｄ、及び２Ｆに示す。
【図３】高グルコースはＧＡＰＤＨの核移行を引き起こす。ＧＡＰＤＨの核レベルは、高グルコース（２５mM）で４８時間処理されたｈＲＰにおいて、正常グルコース（５mM）又はＬ−グルコース（２５mM）で処理された細胞と比較して有意に増加する（図３Ａ）。Ｓｉａｈ１ ｓｉＲＮＡを用いた処理は、高グルコースが誘導するＧＡＰＤＨの核移行を阻害する（図３Ｃ）。ＴＡＴ−ＦＬＡＧペプチドを使用してＧＡＰＤＨ／Ｓｉａｈ１結合部位を阻害することによっても、ＧＡＰＤＨの移行を阻止することができる（図３Ｅ）。３つの独立した実験の定量を図３Ｂ、３Ｄ、及び３Ｆに示す。
【図４】ＧＡＰＤＨの核移行の免疫細胞化学分析。ＨＲＰを、（４Ａ）一次なしの対照、（４Ｂ）正常グルコース（５mM）、（４Ｃ）Ｌ−グルコース（２５mM）、対照ペプチド又はＧＡＰＤＨペプチドの不在下の（４Ｄ）高グルコース（２５mM）、（４Ｅ）対照ペプチド存在下の高グルコース、及び（４Ｆ）ＧＡＰＤＨペプチド存在下の高グルコースで処理した。ＧＡＰＤＨを赤色で示し、一方でＤＡＰＩ染色細胞核を青色で示す。
【図５】ＧＡＰＤＨ／Ｓｉａｈ１シグナル伝達経路の阻害は高グルコースが誘導するｈＲＰアポトーシスをブロッキングする。細胞を正常グルコース（５mM）、Ｌ−グルコース（２５mM）又は高グルコース（２５mM）で４８時間処理した。カスパーゼ−３酵素活性及びアネキシンＶレベルをアポトーシスマーカーとして測定した。高グルコースは、正常グルコース又はＬ−グルコースと比較して、カスパーゼ−３酵素活性（図５Ａ）及びアネキシンＶレベル（図Ｂ）の両方を有意にアップレギュレーションした。高グルコースが誘導するカスパーゼ−３酵素活性の誘導は、Ｓｉａｈ１に対するｓｉＲＮＡ（図５Ｃ）及びＧＡＰＤＨ／Ｓｉａｈ１ブロッキングペプチドで有意に阻害される（図５Ｄ）。
【図６】高グルコースが誘導するヒト網膜周皮細胞のアポトーシスにおけるアポトーシス促進経路ＧＡＰＤＨ／Ｓｉａｈ１の提唱されたモデル。高グルコースなどの細胞ストレスは、一酸化窒素合成（ＮＯＳ）活性に増加を引き起こす。ＮＯＳ活性におけるこの増加は、サイトゾル一酸化窒素（ＮＯ）の上昇を招き、それがＧＡＰＤＨのＳ−ニトロシル化を引き起こす。ニトロシル化ＧＡＰＤＨはＳｉａｈ１と結合し、この複合体を安定化し、それが核に移行するのを促進する。核内に入った後、Ｓｉａｈ１は標的タンパク質を分解させ、かつ／又はＧＡＰＤＨは他の非解糖機能を果たし、細胞不安定性を、そして最終的に細胞死を招く。
【図７】ＧＡＰＤＨペプチド（ペプチド１）で処理されたｒｍｃ−１細胞（２４時間）におけるＧＡＰＤＨの核蓄積。高グルコースが誘導するＧＡＰＤＨの核蓄積は、ＧＡＰＤＨペプチド（ペプチド１）で処理後に減少する。正常グルコース（５mM）又は高グルコース（２５mM）及び５μg/mL又は１０μg/mL ＧＡＰＤＨペプチドと共に正常グルコース（５mM）又は高グルコース（２５mM）で２４時間処理されたｒｍｃ−１細胞に対してトリパンブルー染色を行い、ＧＡＰＤＨの核蓄積が陽性又は陰性の細胞のいずれかであるかを計数して、ＧＡＰＤＨの核蓄積が陽性の細胞のパーセンテージを計算した。
【図８】ＧＡＰＤＨペプチド（ペプチド１）で処理されたｒｍｃ−１細胞におけるＧＡＰＤＨの核蓄積（２４時間）。高グルコースが誘導するＧＡＰＤＨの核蓄積は、ペプチド１で処理後に減少する。正常グルコース（５mM）又は高グルコース（２５mM）で、及び５μg/mL ペプチド１又はスクランブルペプチド１と共に正常グルコース（５mM）又は高（２５mM）グルコースで２４時間処置されたミュラー細胞に対して免疫蛍光染色を行った。ＧＡＰＤＨ一次抗体で免疫染色した。蛍光顕微鏡観察を行い、ＧＡＰＤＨの核蓄積が陽性又は陰性の細胞のいずれかであるかを計数して、ＧＡＰＤＨの核蓄積が陽性細胞のパーセンテージ±ＳＤＥＶを計算した（ｎ＝３；ｎｓ＝有意でない）。
【図９】ＧＡＰＤＨペプチド（ペプチド１）で処理されたｒｍｃ−１細胞における細胞死（９６時間）。ＧＡＰＤＨペプチドで処理後に、高グルコースが誘導する細胞死は減少する。正常グルコース（５mM）又は高グルコース（２５mM）で、及び２．５又は５μg/mL ＧＡＰＤＨペプチド（ペプチド１）と共に正常グルコース（５mM）又は高グルコース（２５mM）で９６時間処理されたｒｍｃ−１細胞に関してトリパンブルー染色を行い、生存細胞及び死細胞の両方を計数して、細胞死のパーセンテージを計算した。
【図１０】ペプチド１で処理されたミュラー細胞における細胞死（９６時間）。高グルコースが誘導する細胞死は、ペプチド１で処理後に減少する。正常（５mM）グルコース又は高（２５mM）グルコース及び５μg/mL ペプチド１又はスクランブルペプチド１と共に正常（５mM）グルコース又は高（２５mM）グルコースで９６時間処理されたミュラー細胞に関してトリパンブルー染色を行い、生存細胞及び死細胞の両方を計数して、細胞死±ＳＤＥＶの平均のパーセンテージを計算した。（ｎ＝３；＊＝ｐ＜０．５）。
【図１１】Ｓｉａｈ−１はＧＡＰＤＨペプチドと結合する。ＧＡＰＤＨペプチド（ペプチド１）のＦＬＡＧ配列の免疫沈降を行って、ＧＡＰＤＨペプチド（ペプチド１）が、正常（５mM）グルコース又は高（２５mM）グルコース及び１μg/mL ＧＡＰＤＨペプチド（ペプチド１）と共に正常（５mM）グルコース又は高（２５mM）グルコースで２４時間処理されたｒｍｃ−１細胞において実際にＳｉａｈ−１結合性であるかどうかを分析した。ＧＡＰＤＨペプチド（ペプチド１）のプルダウンを行い、Ｓｉａｈ−１に対して探索し、高血糖処理後にｒＭＣにおけるペプチド１とＳｉａｈ−１との結合を実証した。
【図１２】ＴＡＴ−ＦＬＡＧペプチドの特定。図１２Ａ：ヒト網膜周皮細胞（Ｈｒｐ）における抗ＦＬＡＧ染色（赤色）の免疫細胞化学分析。左上のパネルは、ペプチド処理なしに対照培地中で培養されたｈＲＰを示す。この条件は、バックグラウンドＦＬＡＧ蛍光の尺度として役立つ。全部で４つのパネルをＤＡＰＩで青色に染色する。図１２Ｂ：抗ＦＬＡＧの免疫沈降ウエスタンブロット。ＦＬＡＧ−ＢＡＰ融合タンパク質を陽性対照として使用して、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体の機能的完全性を確認した。図１２Ｃ：対応するペプチドで処理されたｈＲＰの細胞生存性アッセイ法。陽性対照として７０％メタノールで細胞を３０分間処理した。
【図１３】Ｓｉａｈ１のノックダウン（ＫＤ）効率。Ｓｉａｈ１の発現（図１３Ａ）及びタンパク質レベル（図１３Ｂ）は、Ｓｉａｈ１に対する１０μM ｓｉＲＮＡオリゴマーで有意に減少する。発現レベルをＲＴ−ＰＣＲによって測定し、タンパク質レベルをウエスタンブロット解析により測定する。
【図１４】高グルコースは、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）活性（図１４Ａ）及びＳ−ニトロシル化（図１４Ｂ）における増加を引き起こす。ＨＲＰを低グルコース（５mM）、２５mM Ｌ−又はＤ−グルコースで４８時間処理した。図１４Ａ：Calbiochem製ＮＯＳ比色キットを使用してＮＯＳ活性を測定した。グラフは、総亜硝酸塩（ＮＯ２−）レベル及び総硝酸塩（ＮＯ３−）レベルを表す。図１４Ｂ：Ｓ−ニトロシル化タンパク質のウエスタンブロット解析。Pierce  Ｓ−ニトロシル化ウエスタンブロットキットを使用すると、iodoTMTzero試薬で標識するためにＳ−ニトロソシステインがアスコルビン酸塩で選択的に還元される。ＴＭＴ標識タンパク質のウエスタンブロット検出のために抗ＴＭＴ抗体を使用した。アスコルビン酸塩で処理されなかった試料は、陰性対照として役立つ。
【図１５】ヒト網膜周皮細胞（ＨＲＰ）、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ｈＲＭＥＣ）及びヒト皮膚線維芽細胞（Ｈｄｆ）におけるＧＡＰＤＨ／Ｓｉａｈ１複合体。ｈＲＰ（上）、ｈＲＭＥＣ（中）及びｈＤＦ（下）におけるＮＧ２染色（赤色）の免疫細胞化学。図１５Ａ：ＤＡＰＩで青色に染色された核。図１５Ｂ：Ｓｉａｈ１のウエスタンブロット解析。図１５Ｃ：ＧＡＰＤＨ核画分及び図１５Ｄ：高グルコースで４８時間処理されたｈＤＦのカスパーゼ−３酵素活性の活性アッセイ法。高グルコース（４８時間）は、ｈＤＦ又はｈＲＭＥＣにおいてＧＡＰＤＨの核移行又は細胞死を引き起こさない。
【００１８】
発明の実施態様の詳細な説明
用語「ＧＡＰＤＨ」は、本明細書において、任意の動物、例えばヒトを含む哺乳動物種由来の未変性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼポリペプチド及びＧＡＰＤＨ異種を表すために使用される。ヒトＧＡＰＤＨポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００１９】
用語「Ｓｉａｈ１」は、本明細書において、任意の動物、例えばヒトを含む哺乳動物種由来の未変性Ｅ３ユビキチンリガーゼｓｅｖｅｎ  ｉｎ  ａｂｓｅｎｔｉａ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １ポリペプチド及びＳｉａｈ１異種を表すために使用される。ヒトＳｉａｈ１ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号５に示す。
【００２０】
用語「ＧＡＰＤＨ結合配列」は、本明細書において、ＧＡＰＤＨポリペプチドに結合し、そのことによって、ＧＡＰＤＨポリペプチドとＳｉａｈ１ポリペプチドとの相互作用を妨害及び／又はブロッキングするペプチド配列を表すために使用される。
【００２１】
用語「Ｓｉａｈ１結合配列」は、本明細書において、Ｓｉａｈ１ポリペプチドに結合し、そのことによって、Ｓｉａｈ１ポリペプチドとＧＡＰＤＨポリペプチドとの相互作用を妨害及び／又はブロッキングするペプチド配列を表すために使用される。
【００２２】
用語「インターナリゼーション配列」は、本明細書において、そのようなインターナリゼーション配列を含むペプチドの細胞取り込みをもたらすペプチド配列を表すために使用される。
【００２３】
本明細書に使用される用語「ペプチド配列」は、最大５０アミノ酸長のアミノ酸配列を表す。
【００２４】
本明細書に使用される用語「アミノ酸」は、カルボキシル基に対してａ位に位置するアミノ部分を有する有機分子を意味する。アミノ酸の例には、アルギニン、グリシン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリンが含まれる。採用されるアミノ酸は、それぞれの場合に任意でＬ−型である。
【００２５】
本明細書に使用される用語「ベクター」は、それが連結される別の核酸を増やすことができる核酸分子を表す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター及び導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある特定のベクターは、作動的に連結された核酸の発現を指令することができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
【００２６】
用語「発現カセット」は、標的細胞における特有の核酸配列の転写を許す一連の特定の核酸エレメントを含む、組換え又は合成的に生成されたポリヌクレオチドを表す。組換え発現カセットを、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ、ウイルス、又は核酸フラグメントに組み入れることができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、数ある配列の中で、転写されるべき核酸配列及びプロモーターを含む。
【００２７】
本明細書に使用される「発現」は、核酸がｍＲＮＡに転写される過程及び／又は転写されたｍＲＮＡ（転写物とも呼ばれる）が続いてペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳される過程を表す。転写物及びコードされるポリペプチドは、個別に又はまとめて遺伝子産物と呼ばれる。核酸がゲノムＤＮＡから得られる場合、真核細胞における発現は、対応するｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【００２８】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、そして外因性核酸が導入された細胞を、そのような細胞の子孫を含めて表す。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、形質転換細胞は、初代形質転換細胞及び継代回数に関係なくそれから得られた子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸内容物が完全に同一でない場合があり、変異を含む場合がある。本来形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物学的活性を有する変異型子孫が、本明細書に含まれる。
【００２９】
「組換えペプチド」は、組換え操作された宿主細胞によって産生されるペプチドである。それは、任意で単離又は精製されている。
【００３０】
本発明のペプチドは、当技術分野において周知の方法によって組換え又は合成的に製造することができる。
【００３１】
医薬組成物及び投与
別の実施態様は、本発明のペプチド及び治療上不活性な担体、希釈剤又は賦形剤を含有する医薬組成物又は医薬、並びにそのような組成物及び医薬を調製するために本発明のペプチドを使用する方法を提供する。一例では、本発明のペプチドは、外界温度及び適切なｐＨ及び所望の純度で、生理学的に許容される担体、すなわち採用される投薬量及び濃度でレシピエントに無毒の担体と共に混合してガレノス投与形態にすることによって製剤化され得る。製剤のｐＨは、主に特定の使用及び化合物の濃度に依存するが、好ましくは約３〜約８のどこかの範囲である。一例では、本発明のペプチドは、ｐＨ５の酢酸塩緩衝液中に製剤化される。別の実施態様では、本発明のペプチドは無菌である。本発明のペプチドは、例えば、固形又は無定形組成物として、凍結乾燥製剤として、又は水溶液として保存され得る。
【００３２】
組成物は、優良製造規則に一致する方法で製剤化、調剤、及び投与される。これに関連する考慮要因には、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳類、個別の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与計画、及び医師に公知の他の要因が含まれる。投与されるべき本発明のペプチドの「有効量」は、そのような考慮事項によって左右され、治療効果を示すために必要な最小量である。例えば、そのような量は、正常細胞又は全体としての哺乳動物に有毒な量未満であり得る。
【００３３】
実施例
実施例１：高グルコースはヒト網膜周皮細胞（ｈＲＰ）におけるＳｉａｈ１タンパク質レベルを増加させる
ＨＲＰを正常グルコース（５mM Ｄ−グルコース）、浸透圧対照（２５mM Ｌ−グルコース）又は高グルコース（２５mM Ｄ−グルコース）で４８時間処理した。Ｓｉａｈ１総タンパク質は、浸透圧対照で処理された培養物と比較して、高グルコースで処理された培養物では２倍に増加した（ｐ＝０．０１３６）。浸透圧対照処理細胞と正常グルコース処理細胞との間に有意差はなかった（図１Ａ）。３つの独立したウエスタンブロットの定量を図１Ｂに示す。
【００３４】
実施例２：高グルコースはｈＲＰにおけるＧＡＰＤＨとＳｉａｈ１との間の結合を増加させる
ＨＲＰを正常グルコース（５mM）、高グルコース（２５mM）又はＬ−グルコース（２５mM）で４８時間処理した。プルダウンアッセイ法を行ったが、それは、以下のように説明される：抗Ｓｉａｈ１を用いた免疫沈降（ＩＰ）に続く、抗ＧＡＰＤＨを用いた免疫複合体のウエスタンブロット（ＷＢ）解析により、浸透圧対照を用いて処理された細胞と比較して、高グルコースで処理された細胞におけるＧＡＰＤＨ／Ｓｉａｈ１結合の１．５倍の増加が明らかとなった（ｐ＝０．０２９２）（図２Ａ）。３つの独立したウエスタンブロットの定量を図２Ｂに示す。
【００３５】
実施例３：Ｓｉａｈ１ノックダウン及び部位特異的ブロッキングペプチドは高グルコースが誘導するＧＡＰＤＨ／Ｓｉａｈ１結合を軽減する
ＨＲＰを、正常グルコース、浸透圧対照又は高グルコースに加えて１０μM 陰性対照ｓｉＲＮＡ、Ｓｉａｈ１に対する１０μM ｓｉＲＮＡ、１μM ＴＡＴ−ＦＬＡＧ対照、１μM ＴＡＴ−ＦＬＡＧ ＧＡＰＤＨペプチド、１μM ＴＡＴ−ＦＬＡＧ Ｓｉａｈ１ペプチド又は１μM ＧＡＰＤＨ＋１μM Ｓｉａｈ１ペプチドで処理した。上記のようにプルダウンアッセイ法を行った。本発明者らのＧＡＰＤＨペプチドを設計して、Ｓｉａｈ１上のＧＡＰＤＨ結合部位をブロッキングし、Ｓｉａｈ１ペプチドを設計して、ＧＡＰＤＨ上のＳｉａｈ１結合部位をブロッキングした（補足の表１）。高グルコースは、ＧＡＰＤＨ／Ｓｉａｈ１の結合を有意に増加させ（ｐ＝０．０３９０）、この結合は、Ｓｉａｈ１ ｓｉＲＮＡによって有意に減少した（ｐ＝０．０４６１）（図２Ｃ、Ｄ）。ＧＡＰＤＨ（ｐ＝０．０１９４）若しくはＳｉａｈ１ペプチド（ｐ＝０．００６６）、又は両方の組合せ（ｐ＝０．０１４６）は、高グルコースが誘導するＧＡＰＤＨ／Ｓｉａｈ１の結合を同様に有意に阻害した（図２Ｅ、Ｆ）。ｈＲＰ核画分においても、高グルコースが誘導するＧＡＰＤＨ／Ｓｉａｈ１の結合が増加し、Ｓｉａｈ１に対するｓｉＲＮＡを用いて細胞を処理することによって核蓄積をブロッキングすることができる（図２Ｇ）。
【００３６】
実施例４：高グルコースはｈＲＰにおけるＧＡＰＤＨの核移行を増加させる。Ｓｉａｈ１ ｓｉＲＮＡ、又はＧＡＰＤＨ／Ｓｉａｈ１特異的ペプチドは高グルコースが誘導するＧＡＰＤＨの核移行をブロッキングする
正常グルコース、浸透圧対照又は高グルコースで４８時間処理後、細胞溶解物を調製し、細胞質画分及び核画分に分離した。次に、各画分を、ＧＡＰＤＨ、ＭＥＫ及びヒストンＨ３のウエスタンブロット解析に供した。ＭＥＫ及びヒストンＨ３を対照抗原として使用して、それぞれ細胞質画分及び核画分の純度を判定した。高グルコース処理は、正常グルコース又は浸透圧対照のどちらと比較しても核ＧＡＰＤＨの有意な蓄積を引き起こした（ｐ＝０．０００５）（図３Ａ、Ｂ）。Ｓｉａｈ１ ｓｉＲＮＡ（１０μM）は、高グルコースが誘導するＧＡＰＤＨの核蓄積を阻害した（ｐ＝０．０４６９）（図３Ｃ、Ｄ）。ＧＡＰＤＨペプチド（ｐ＝０．０１４２）若しくはＳｉａｈ１ペプチド（ｐ＝０．０２２１）又は両方のペプチドの組合せ（ｐ＝０．０１００）は、高グルコースが誘導するＧＡＰＤＨの核移行を有意に阻害した（図３Ｅ、Ｆ）。ＧＡＰＤＨの核移行を、免疫細胞化学分析によってもアッセイし、それは、移行が高グルコースによって誘導され（図４Ｄ）、この誘導が１μM  ＧＡＰＤＨペプチドによって阻害されたことを実証した（図４Ｆ）。
【００３７】
実施例５：高グルコースはＧＡＰＤＨ／Ｓｉａｈ１依存性経路によりヒト網膜周皮細胞のアポトーシスを引き起こす
ＨＲＰを正常グルコース、Ｌ−グルコース又は高グルコースで４８時間〜７２時間処理した。細胞死は、４８時間の高グルコース処理後に明白であり、細胞死は７２時間後に有意に増加する。２５mM Ｄ−グルコースを用いた７２時間の処理の結果、アポトーシスの一般的マーカーであるカスパーゼ−３−酵素活性に３倍の増加が生じた（ｐ＜０．０００１）（図５Ａ）。高グルコース曝露は、アポトーシス特異的細胞死の別の尺度であるアネキシンＶレベルにも有意な増加を引き起こした（ｐ＜０．０００１）（図５Ｂ；）。Ｓｉａｈ１ ｓｉＲＮＡは、この高グルコースが誘導するアポトーシスを有意にブロッキングした（ｐ＝０．０００９）（図５Ｃ）。さらに、ＧＡＰＤＨブロッキングペプチド及びＳｉａｈ１ブロッキングペプチドは、高グルコースが誘導するｈＲＰのアポトーシスを阻害した（図５Ｄ、対照ペプチド  ｐ＝０．００１９、ＧＡＰＤＨペプチド  ｐ＝０．００９０、Ｓｉａｈ１ペプチド  ｐ＝０．００５３）。
【００３８】
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）とＥ３ユビキチンリガーゼｓｅｖｅｎ  ｉｎ  ａｂｓｅｎｔｉａ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １（Ｓｉａｈ１）との間の相互作用によって開始される新規なアポトーシス促進経路が、最近、眼組織において特定された。
【００３９】
本発明の発明者らは、ヒト網膜周皮細胞（ｈＲＰ）のアポトーシスにおけるＧＡＰＤＨ／Ｓｉａｈ１相互作用の関与について調査した。ＨＲＰを５mM 正常グルコース、２５mM Ｌ−又はＤ−グルコース中で４８時間培養した（それぞれ浸透圧対照処理及び高グルコース処理）。Ｓｉａｈ１の発現をダウンレギュレーションするためにＳｉａｈ１ ｓｉＲＮＡを使用した。ＴＡＴ−ＦＬＡＧ ＧＡＰＤＨ及び／又はＳｉａｈ１ペプチドを使用してＧＡＰＤＨとＳｉａｈ１との相互作用をブロッキングした。免疫共沈アッセイ法を行って、ＧＡＰＤＨ及びＳｉａｈ１の結合に及ぼす高グルコースの影響を分析した。アネキシンＶ染色及びカスパーゼ−３酵素活性アッセイ法によってアポトーシスを測定した。高グルコースは、Ｓｉａｈ１総タンパク質レベルを増加させ、ＧＡＰＤＨとＳｉａｈ１との結合を誘導し、ＧＡＰＤＨの核移行をもたらした。本発明者らの知見により、ＧＡＰＤＨ／Ｓｉａｈ１アポトーシス促進複合体の解離は、ＤＲの顕著な特徴と広く見なされる、高グルコースが誘導する周皮細胞のアポトーシスをブロッキングできることが実証される。
【００４０】
方法
ＨＲＰ処理：ヒト網膜周皮細胞（ｈＲＰ）の初代培養物（Cell Systems; Kirk-land, WA）を、接着因子（Cell Signaling; Danvers, MA）をコーティングした組織培養フラスコ中に蒔いた。１０％ ＦＢＳ及び細胞成長補助栄養を補充した、抗生物質（Lonza; Basel）を含む正常グルコースのダルベッコ変法イーグル培地（５．５mM ＤＭＥＭ １×, Life Technologies; Carlsbad, CA）中でＨＲＰを成長させ培養した。全ての培養物を３７℃、５％ ＣＯ２及び相対湿度９５％（酸素２０．９％）でインキュベートした。全ての実験に継代５〜７回を使用した。ＨＲＰの同一性をニューロングリア２（ＮＧ２）（EMD Millipore; Temecula, CA）の免疫反応によって確認した。正常Ｄ−グルコース（５．５mM）、高Ｄ−グルコース（２５mM Sigma; St. Louis,MO）又は浸透圧対照として役立ったＬ−グルコース（２５mM Acros Organics; Geel, Belgium）を含有する１０％ ＦＢＳ培地で集密度８０％のｈＲＰを処理した。ＴＡＴ−ＦＬＡＧペプチド処理について、１μM 対照ペプチド、１μM ＧＡＰＤＨペプチド及び／又は１μM Ｓｉａｈ１ペプチドをハンクス平衡塩溶液（Life Technologies; Carlsbad, CA）に添加した。ＧＡＰＤＨペプチドは、Ｓｉａｈ１上のＧＡＰＤＨ結合部位を競合的にブロッキングし、Ｓｉａｈ１ペプチドは、ＧＡＰＤＨ上のＳｉａｈ１ペプチドを競合的にブロッキングする。ペプチド溶液を３７℃で３０分間インキュベートしてから各ウェルに添加した。細胞を各ペプチド溶液と共に２時間インキュベートしてから実験処理を加えた。ペプチドを組み合わせて使用した場合、各ペプチドについてそれぞれの元の濃度を使用した。各ＴＡＴ−ペプチドのＮ−末端をアセチル化し、Ｃ−末端をアミド化する。これらの改変は、適正な細胞進入を確実にし、細胞内に入った後の分解を阻止する。ＦＬＡＧタグペプチド配列は、これらのペプチドの検出及び定量を可能にする（図１２）。
【００４１】
ＨＲＰのトランスフェクション：ｓｉＲＮＡのトランスフェクションのために、ｈＲＰを６ウェル皿内で培養し、処理の３０分前に各ウェルに新鮮培地１mlを添加した。各ウェルについて、１０μM ｓｉＲＮＡオリゴマー（陰性対照ｓｉＲＮＡ又はＳｉａｈ１に対するｓｉＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ配列の識別表示ｓｃ−３７４９５Ａ、Ｂ及びＣ、Santa Cruz; Dallas,TX）、Targefect Solution A（Targetingsystems; El Cajon, CA）９μl、及びVirofect（Targetingsystems）１８μlを別々のチューブ内のOptimem（Life Technologies）２５０μlに添加し、各試薬の添加の合間に転倒混和した。混合した試薬を３７℃で２５分間インキュベートしてから培養ｈＲＰに添加した。細胞をトランスフェクション試薬と共に１２時間インキュベートしてから洗浄し、新鮮培地で処理した。実験処理は、トランスフェクションの２４時間後に開始した。本発明者らのｓｉＲＮＡ実験のノックダウン効率及び他の品質管理局面を図１３に示す。
【００４２】
核分画及びウエスタンブロット解析：必要に応じてＨＲＰを処理した。TrypLE Express（Life Technologies）を使用して細胞を回収し、放射免疫沈降アッセイ用（ＲＩＰＡ）緩衝液（Qiagen; Limburg, Netherlands）を使用して細胞を溶解させた。ＮＥ−ＰＥＲ核及び細胞質抽出試薬（Thermo Scientific; Nashville, TN）を使用して溶解物をサイトゾル画分と核画分に分離した。総タンパク質濃度のために試料を平衡化し、１０％ ＳＤＳ／ＰＡＧＥに供し、iBlotシステム（Life Technologies）を使用してゲルをニトロセルロース膜に移動させた。５％ ミルク（β-アクチン（Thermo Scientific）及びＧＡＰＤＨ（Abcam; Cambridge,UK）のイムノブロット用）又は５％ ＢＳＡ（Ｓｉａｈ１（Santa Cruz）、Ｈ３（Cell Signaling）、ＭＥＫ（Cell Signaling）のイムノブロット用）中で膜をブロッキングし、適切な一次抗体（抗β−アクチン １：３０００、抗ＧＡＰＤＨ １：１０００、抗Ｓｉａｈ１ １：２５０、抗ヒストンＨ３及び抗ＭＥＫ １：７５０）で探索した。次にブロットを、１：２０００に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート型二次抗体（ＧＡＰＤＨ、ＭＥＫ及びヒストンＨ３；抗ウサギ、Ｓｉａｈ１；抗ヤギ、及びβ−アクチン；抗マウス）で標識した。ＭＥＫ及びヒストンＨ３は、細胞質分画対照及び核分画対照として役立った。β−アクチンを使用して総タンパク質濃度を決定した。Pierce ECLウエスタンブロット基質中で膜をインキュベートし、ChemiDoc MP（Bio-Rad; Hercules, CA）を使用して現像した。少なくとも３回の独立した実験を使用してウエスタンブロット定量グラフを作った。ImageJ 1.47vソフトウェアを使用してブロットを定量した。
【００４３】
免疫共沈アッセイ法：必要に応じてＨＲＰを処理し、Pierce IP Lysis Bufferを使用して溶解させた。各試料から等しい量のタンパク質（１０００μg）を抗Ｓｉａｈ１抗体 １０μgと共に４℃で一晩混合した。Pierce Protein A/G Magnetic Beadを予備洗浄し、抗原試料／抗体混合物に室温で１時間添加した。磁気スタンドを用いてビーズを収集し、４×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元試料緩衝液５０μlを使用して１００℃で１０分間溶離させた。次に免疫複合体をウエスタンブロット解析に供した。各溶解物からＳｉａｈ１を完全にプルダウンするための対照としてＳｉａｈ１枯渇試料を役立てた。Ｓｉａｈ１免疫沈降の効率を検証するために独立した品質管理実験を行った（データは示さず）。
【００４４】
免疫細胞化学分析。ＨＲＰをマルチウェルガラススライド上で培養し、細胞をＰＢＳ中０．１％ トリトン−Ｘ１００で３０分間透過処理し、ＰＢＳＴ中１．５％ ＢＳＡで４℃で一晩ブロッキングした。細胞を抗ＧＡＰＤＨ一次抗体（Abcam）と共に４℃で一晩インキュベートした。一次抗体（１：１００）と共にインキュベートした後、細胞を洗浄し、二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。次に細胞をＰＢＳＴ中で洗浄し、４０，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色（Sigma）を適用した。最後に、細胞を洗浄し、トリス緩衝液と共にFluorogel（Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA）を使用して包埋し、蛍光顕微鏡（Olympus AX70; Tokyo, Japan）により観察した。
【００４５】
アポトーシスの測定：全てのアポトーシス測定を、７２時間の適切な処理後に行った。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ染色は、アポトーシスをアッセイするために使用した方法の１つであった。簡潔には、細胞ペレットをアネキシンＶ結合緩衝液（Biolegend; San Diego, CA）中に再懸濁した。アネキシンＶ（Life Techonologies）及び７−ＡＡＤ生存染色液（Biolegend）を各試料に室温で１５分間添加した。Vanderbilt's Flow Cytometry Shared Resource中核研究室で行われたフローサイトメトリー分析を用いて試料を定量した。カスパーゼ−３酵素活性を測定することによってもアポトーシスをアッセイした。EnzChekカスパーゼ−３アッセイキット（Life Technologies）を使用して活性を定量した。７−アミノ−４−メチルクマリン由来基質であるＺ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣと共に試料を１時間インキュベートした。４４０nmでの蛍光の発光を２時間後に測定した。
【００４６】
統計：市販のソフトウェア（GraphPad Prism 6; La Jolla, CA）を用いて、フィッシャーのＬＳＤ事後解析を行うＡＮＯＶＡを使用してデータを解析した。ｐ＜０．０５の値を統計的に有意と見なした。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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