(57)【要約】  本発明は、Ｔ細胞活性化ＩｇＶ領域抑制因子（ＶＩＳＴＡ）に結合する新規な抗体およびフラグメント、ならびにＶＩＳＴＡを検出する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物のＴ細胞活性化ＩｇＶ領域抑制因子（ＶＩＳＴＡ）タンパク質に結合する抗原結合領域を含む単離抗体、またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体が、
ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む抗体ＶＨドメイン；
ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号３５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号３６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含む抗体ＶＬドメイン；
ｃ）非ヒト抗体重鎖定常領域；ならびに
ｄ）非ヒト抗体軽鎖定常領域
を含む単離抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記抗体ＶＨドメインは配列番号６４を含む請求項１に記載の単離抗体、または抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記抗体ＶＬドメインは配列番号４５を含む請求項１または２に記載の単離抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記非ヒト抗体重鎖定常領域は、マウス抗体重鎖定常領域である請求項１、２または３に記載の単離抗体、または抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記マウス抗体重鎖定常領域は、マウスＩｇＧ１重鎖定常領域である請求項４に記載の単離抗体、または抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記マウスＩｇＧ１重鎖定常領域は、配列番号７６の重鎖定常領域を含む請求項５に記載の単離抗体、または抗原結合フラグメント。
【請求項７】
前記マウス抗体重鎖定常領域は、マウスＩｇＧ２ａ重鎖定常領域である請求項４に記載の単離抗体、または抗原結合フラグメント。
【請求項８】
前記非ヒト抗体軽鎖定常領域は、マウス抗体軽鎖定常領域である請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離抗体、または抗原結合フラグメント。
【請求項９】
前記マウス抗体軽鎖定常領域は、マウスＩｇＧ１軽鎖定常領域である請求項８に記載の単離抗体、または抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
前記マウスＩｇＧ１軽鎖定常領域は、配列番号７７の軽鎖定常領域を含む請求項９に記載の単離抗体、または抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
前記マウス抗体軽鎖定常領域は、マウスＩｇＧ２ａ軽鎖定常領域である請求項８に記載の単離抗体、または抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
前記哺乳動物ＶＩＳＴＡタンパク質は、ヒトＶＩＳＴＡタンパク質である請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離抗体、または抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４６のエピトープに結合する請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離抗体、または抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
前記抗体は、全抗体である請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離抗体、または抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
哺乳動物のＴ細胞活性化ＩｇＶ領域抑制因子（ＶＩＳＴＡ）タンパク質に結合する抗原結合領域を含む単離抗体、またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体は、配列番号７６を含む抗体重鎖、および配列番号７７を含む抗体軽鎖を含む単離抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
請求項１または１５に記載の抗体、または抗原結合フラグメントを含む組成物。
【請求項１７】
試料中の哺乳動物ＶＩＳＴＡタンパク質を検出する方法であって、前記試料を請求項１または１５に記載の抗体、または抗原結合フラグメントと、前記抗体、または抗原結合フラグメントが前記試料中のＶＩＳＴＡタンパク質に結合する条件下で接触させる工程と、前記試料中のＶＩＳＴＡタンパク質に結合した前記抗体、または抗原結合フラグメントを検出する工程を含む方法。
【請求項１８】
前記試料は細胞を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料は組織を含む請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料は、免疫細胞もしくは間質細胞、またはそれらの組み合わせを含む請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記免疫細胞はミエロイド細胞、単球またはＴ細胞である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料は癌細胞を含む請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記癌細胞は、肺癌細胞、前立腺癌細胞、急性骨髄性白血病急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、メラノーマ細胞、卵巣癌細胞および結腸癌細胞からなる群から選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体、または抗原結合フラグメントは、検出可能な標識を含む請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色アッセイを含む請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
フローサイトメトリーアッセイを含む請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年６月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／１８４，１０８号および２０１５年７月１日に出願された同第６２／１８７，６５９号の優先権および利益を主張するものである。上記出願の教示は全て参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイル中の材料の参照による組み込み
本明細書とともに提出された次のＡＳＣＩＩテキストファイル：２０１６年６月２２日に作成された、８７ＫＢのサイズを有するファイル名０１４８１１４２０１７ＳＥＱＵＥＮＣＥＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔに含まれる配列表は参照により本願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
腫瘍微少環境における癌細胞または免疫細胞によるネガティブ免疫チェックポイントレギュレーターの発現は、腫瘍に対する宿主免疫応答を抑制する。癌と効果的に戦うには、宿主免疫応答の腫瘍媒介抑制をブロックすることが望ましい。したがって、抗腫瘍免疫応答を抑制する腫瘍微少環境におけるネガティブ免疫チェックポイントレギュレーターを阻害する新しい有効な治療薬が要望されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、一実施形態において、哺乳動物のＴ細胞活性化ＩｇＶ領域抑制因子（ＶＩＳＴＡ）タンパク質に結合する抗原結合領域を含む単離抗体（例えば、キメラ抗体）、またはその抗原結合フラグメントを提供する。抗体は、配列番号３１のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む抗体ＶＨドメインを含む。抗体は、さらに、配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号３５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号３６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含む抗体ＶＬドメインを含む。さらに、抗体は、非ヒト抗体重鎖定常領域および非ヒト抗体軽鎖定常領域を含む。
【０００５】
一実施形態において、抗体ＶＨドメインは、配列番号６４を含む。他の実施形態において、抗体ＶＬドメインは、配列番号４５を含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、抗体は、マウス非ヒト抗体重鎖定常領域である非ヒト抗体重鎖定常領域を含む。ある特定の実施形態では、マウス非ヒト抗体重鎖定常領域は、マウスＩｇＧ１重鎖定常領域である。ある特定の実施形態では、マウスＩｇＧ１重鎖定常領域は、配列番号７６の重鎖定常領域を含む。他の一実施形態において、マウス抗体重鎖定常領域は、マウスＩｇＧ２ａ重鎖定常領域である。
【０００７】
他の実施形態において、抗体は、マウス抗体軽鎖定常領域である非ヒト抗体軽鎖定常領域を含む。ある特定の実施形態では、マウス抗体軽鎖定常領域は、マウスＩｇＧ１軽鎖定常領域である。ある特定の実施形態では、マウスＩｇＧ１軽鎖定常領域は、配列番号７７の軽鎖定常領域を含む。他の一実施形態において、マウス抗体軽鎖定常領域は、マウスＩｇＧ２ａ軽鎖定常領域である。
【０００８】
ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、ヒトＶＩＳＴＡタンパク質に結合する。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、以下に示すアミノ酸配列を有するヒトＶＩＳＴＡタンパク質に存在するエピトープに結合する。
【化１】
2018530514.tif 000002
【０００９】
１つの実施形態では、抗体、または抗原結合フラグメントは全抗体である。
【００１０】
他の一実施形態では、本発明は、配列番号７７を含む抗体重鎖を含むおよび配列番号６８の抗体軽鎖を含む単離抗体、または、その抗原結合フラグメントを提供する。
【００１１】
さらに他の実施形態では、本発明は、本発明の抗体、または抗原結合フラグメントを含む組成物を提供する。
【００１２】
さらなる実施形態では、本発明は、試料中の哺乳動物ＶＩＳＴＡタンパク質を検出する方法を提供する。本発明は、試料を本発明の抗体または抗原結合フラグメントと、抗体または抗原結合フラグメントが試料中のＶＩＳＴＡタンパク質に結合する条件下で接触させる工程と、試料中のＶＩＳＴＡタンパク質に結合した抗体または抗原結合フラグメントを検出する工程を含む。
【００１３】
１つの実施形態では、試料は細胞である。特に、細胞としては、免疫細胞（例えば、ミエロイド細胞）、間質細胞（例えば、線維芽細胞、内皮細胞）、および／あるいは癌（例えば、悪性）細胞、例えば、肺癌細胞、前立腺癌細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、メラノーマ細胞、卵巣癌細胞もしくは結腸癌細胞、またはこれらの組み合わせが挙げられる。ある特定の実施形態では、試料は、組織または体液を含む。
【００１４】
１つの実施形態では、本方法に使用される抗体または抗原結合フラグメントは、検出可能な標識を含む。
【００１５】
ある特定の実施形態では、本方法は、免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色アッセイを含む。他の一実施形態において、本方法は、フローサイトメトリーアッセイを含む。
【００１６】
本発明は、生物材料中のＶＩＳＴＡタンパク質を検出するための改良された試薬および方法を提供する。そのような試薬および方法は、典型的には、増強された感受性および／または選択性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＴＦ１  ＡＭＬ細胞のＶＩＳＴＡ発現を示すグラフ。ＴＦ−１ＡＭＬ細胞株におけるフローサイトメトリーによるＶＩＳＴＡタンパク質の発現を示す。
【図２】ヒトミエロイドおよびリンパ球サブセットを特定するための染色およびゲーティング戦略を示すグラフ。
【図３】一人の健常ドナーのヒトミエロイドおよびリンパ球サブセットのＶＩＳＴＡ発現を示すグラフ。
【図４】多くの健常ドナーのヒトミエロイドおよびリンパ球サブセットのＶＩＳＴＡ発現を示すグラフ。
【図５】ヒト単球およびマクロファージのＶＩＳＴＡ発現を特定するための染色およびゲーティング戦略を示すグラフ。
【図６】ヒト単球およびマクロファージのＶＩＳＴＡ発現を示すグラフ。
【図７】ヒトＴおよびＮＫ細胞サブセットのＶＩＳＴＡ発現を特定するための染色およびゲーティング戦略を示すグラフ。
【図８】一人の健常ドナーのヒトＴおよびＮＫ細胞サブセットのＶＩＳＴＡ発現を示すグラフ。
【図９】多くの健常ドナーのヒトＴおよびＮＫ細胞サブセットのＶＩＳＴＡ発現を示すグラフ。
【図１０】ヒト樹状細胞サブセットのＶＩＳＴＡ発現を特定するための染色およびゲーティング戦略を示すグラフ。
【図１１】一人の健常ドナーのヒト樹状細胞サブセットおよび好塩基球のＶＩＳＴＡ発現を示すグラフ。
【図１２】多くの健常ドナーのヒト樹状細胞サブセットおよび好塩基球のＶＩＳＴＡ発現を示すグラフ。
【図１３】健康なヒトの抹消血液細胞のＶＩＳＴＡ発現の分析。マルチカラーフローサイトメトリー分析による健康なヒトの抹消血液細胞のＶＩＳＴＡ発現のプロファイル：異なる２個体からの全血試料について、単球ＳＳＣｌｏ、ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ１４ｈｉＣＤ１６−ｖｅＣＤ３３＋ｖｅＨＬＡ−ＤＲ＋ｖｅＣＤ１９−ｖｅ）（図１３Ａ）、好中球（ＳＳＣｈｉＣＤ１７７＋ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ１４ｌｏＣＤ１６＋ｖｅＣＤ３３＋ｖｅＨＬＡ−ＤＲ−ｖｅＣＤ１９−ｖｅ）（図１３Ｂ）のＶＩＳＴＡ発現を分析した。ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ｖｅＣＤ４＋ｖｅ）（図１３Ｃ）、およびＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ｖｅＣＤ８＋ｖｅ）（図１３Ｄ）の分析のために、フィコール勾配を使用して抹消血液単核球を単離した。
【図１４】肺癌患者および対照健常ドナーの末梢血液細胞のＶＩＳＴＡ発現の分析。マルチカラーフローサイトメトリー分析による肺癌患者の抹消血液細胞のＶＩＳＴＡ発現のプロファイル：一個体の代表的なＦＡＣＳプロット（図１４Ａ）を示す。抹消血液単核球をフィコールにより単離し、単球（ＣＤ１４＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋ＨＬＡＤＲ＋ＣＤ１５−）（図１４Ｂ）およびミエロイド由来サプレッサー細胞（ＣＤ１４−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３−ＨＬＡＤＲ−ＣＤ１５＋ＣＤ１６＋）（図１４Ｃ）のＶＩＳＴＡ発現を分析した。
【図１５】マルチカラーフローサイトメトリー分析による結腸癌患者の抹消血液細胞のＶＩＳＴＡ発現のプロファイル：一個体の代表的なＦＡＣＳプロット（図１５Ａ）を示す。抹消血液単核球をフィコールにより単離し、単球（ＣＤ１４＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋ＨＬＡＤＲ＋ＣＤ１５−）（図１５Ｂ）およびミエロイド由来サプレッサー細胞（ＣＤ１４−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３−ＨＬＡＤＲ−ＣＤ１５＋ＣＤ１６＋）（図１５Ｃ）のＶＩＳＴＡ発現を分析した。
【図１６】マルチカラーフローサイトメトリー分析によるカニクイザルの抹消血液細胞のＶＩＳＴＡ発現のプロファイル：異なる４匹のサルからの全血試料について、単球（ＳＳＣｌｏＣＤ１１ｂｈｉＣＤ１４ｈｉＨＬＡ−ＤＲｈｉＣＤ１６−ｖｅＣＤ１９−ｖｅ（図１６Ａ）および好中球ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ１４ｌｏＨＬＡ−ＤＲ−ｖｅＣＤ１６−ｖｅＣＤ１９−ｖｅ（図１６Ｂ）のＶＩＳＴＡ発現を分析した。ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＴＣＲα／β＋ｖｅＣＤ４＋ｖｅ）（図１６Ｃ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（ＴＣＲα／β＋ｖｅＣＤ８＋ｖｅ）（図１６Ｄ）の分析のために、フィコール勾配を使用して、３匹のサルから抹消血液単核球を単離した。
【図１７】ヘム細胞株におけるＶＩＳＴＡ  ＲＮＡの絶対発現値を示すグラフ。
【図１８】マウスＡ２０細胞にＧＦＰまたはＶＩＳＴＡを形質移入した。それらをｏｖａペプチドおよびＤＯ１１．１０Ｔ細胞とともにインキュベートした。インキュベーション開始の２４時間後にＴ細胞によるＣＤ２５発現を測定した。Ａ２０−ｈｕＶＩＳＴＡ細胞はＴ細胞によるＣＤ２５発現を抑制するが、この読み出しはＶＳＴＢ９５．とともにインキュベートすることにより大きく回復する。
【図１９】ヒトＶＩＳＴＡ  ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフ。
【図２０】ヒトＶＩＳＴＡを発現する細胞に結合する抗ＶＩＳＴＡ抗体を示すヒトＶＩＳＴＡ  ＦＡＣＳの結果。
【図２１】６種の抗ＶＩＳＴＡ抗体候補の混合リンパ球反応物における希釈（３０μｇ／ｍｌ〜０．０μｇ／ｍｌ）の研究。
【図２２】６種の抗ＶＩＳＴＡ抗体候補のＳＥＢアッセイ（個々のＣＰＭ値およびＩＦＮ−ｇ濃度）における希釈（３０μｇ／ｍｌ〜０．０μｇ／ｍｌ）の研究。
【図２３】Ｐｒｏｔｅｏｎ  ＳＰＲチップにコーティングした抗ＶＩＳＴＡ抗体ＶＳＴＢ８５、および同チップ上を走らせた表示コンペティター（表１６に記載したコンペティター）によるＶＩＳＴＡタンパク質を用いたセンサーグラムプロット。
【図２４】ＭＢ４９マウス膀胱腫瘍モデルの実験計画
【図２５】雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＭＢ４９腫瘍増殖。グラフは、抗マウスＶＩＳＴＡ抗体（図２５Ｂ）または対照ＩｇＧ（図２５Ａ）で処理した個々のマウスの腫瘍増殖を示す。
【図２６】ヒトＶＩＳＴＡのアミノ酸配列（配列番号４６）。
【図２７】ＶＩＳＴＡオルソログの多重配列アラインメント。
【図２８】ＨＤＸにより測定された、ＶＳＴＢ５０およびＶＳＴＢ６０抗体（上）またはＶＳＴＢ９５およびＶＳＴＢ１１２抗体（下）が結合したヒトＶＩＳＴＡの領域
【図２９】ＶＳＴＢ１１２が結合したＶＩＳＴＡエピトープ。（上）標識された鎖を有するＶＩＳＴＡをイラストで示す。複合体中のＶＳＴＢ１１２の５Å以内の少なくとも１つの原子を有する残基は青色に着色されている。青色および橙色の球体は鎖の切断を示し、青緑色および似鳥色の球体はそれぞれ、ＶＩＳＴＡ構造のＮ末端およびＣ末端を示す。（下）構造決定に使用したＶＩＳＴＡコンストラクトの配列。配列の下の丸は、ＶＳＴＢ１１２との主鎖接触部のみを構成する残基を示すために使用され、三角は側鎖接触部を示し、四角は、ＰＩＳＡによる計算で、側鎖接触部が水素結合または塩架橋相互作用をもたらしていることを示す。形状は、所与の残基により接触している最大原子数を有するＣＤＲを示すために図５９に定義するＣＤＲ色で着色してある。二次構造要素は、ＭＯＥプログラムにおいて定義されるように、黄色の矢印はβ鎖を示し、赤色の長方形はα鎖を示す。
【図３０】ＶＳＴＢ１１２パラトープ。（上）ＶＩＳＴＡ抗原をイラストで示し、ＶＩＳＴＡの５オングストローム以内のＶＳＴＢ１１２の表面を、下の配列で特定したＣＤＲ同一性を指定するために使用した色で示している。ＣＤＲに隣接する接触フレームワーク残基には、ＶＳＴＢ１１２Ｆｖ領域の対応するＣＤＲ（下）配列と同様の着色を付している。背景色を付した部分は、キャバット定義によるＣＤＲを示している。配列の下の丸は、ＶＩＳＴＡとの主鎖接触部のみを構成する残基を示すために使用され、三角は側鎖接触部を示し、四角は、ＰＩＳＡによる計算で、側鎖接触部が水素結合または塩架橋相互作用をもたらしていることを示す。
【図３１】結晶学的、かつ水素重水素交換（ＨＤＸ）により同定されたエピトープ領域の比較。構造決定に使用したＶＩＳＴＡコンストラクトの配列。配列の下の丸は、ＶＳＴＢ１１２との主鎖接触部のみを構成する残基を示すために使用され、三角は側鎖接触部を示し、四角は、ＰＩＳＡによる計算で、側鎖接触部が水素結合または塩架橋相互作用をもたらしていることを示す。
【図３２】全ＰＢＭＣ中のＣＤ１４＋単球のＶＳＴＢ１７４（ＶＳＴＢ１１２由来）による活性化。実験の各部分で、細胞をＰＢＳ、ＩｇＧ１対照抗体、またはＶＳＴＢ１７４（１、０．１もしくは０．０１ｕｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。左のパネルはＣＤ８０  ＭＦＩを示し、右のパネルはＨＬＡ−ＤＲ  ＭＦＩを示す（代表的な結果が得られた２つの試験ドナーを示す）。
【図３３】Ｋ５６２−ＶＩＳＴＡ細胞に対するＶＳＴＢ１７４のＡＤＣＣ活性を示すグラフ。
【図３４】Ｋ５６２−ＶＩＳＴＡ細胞に対するＶＳＴＢ１７４のＡＤＣＰ活性を示すグラフ。表記した両抗体は同じＦａｂを有するが、ＶＳＴＢ１７４はＩｇＧ１Ｆｃを有し、ＶＳＴＢ１４０はＦｃサイレントＩｇＧ２を有する。
【図３５】ＶＳＴＢ１７４、ＶＳＴＢ１４９またはＶＳＴＢ１４０ｍＡｂにより仲介されたＫ５６２−ＶＩＳＴＡに対する食作用を示すグラフ。各ｍＡｂを０．０００８μｇ／ｍｌ〜０．５６μｇ／ｍｌの範囲で７種の３．３倍用量（ｈａｌｆ  ｌｏｇ  ｄｏｓｅ）で試験した。
【図３６】ＶＳＴＢ１７４、ＶＳＴＢ１４９またはＶＳＴＢ１４０ｍＡｂにより仲介されたミエローマ細胞株Ｋ５６２細胞に対する食作用を示すグラフ。各ｍＡｂを０．０００８μｇ／ｍｌ〜０．５６μｇ／ｍｌの範囲で７種の３．３倍用量（ｈａｌｆ  ｌｏｇ  ｄｏｓｅ）で試験した。
【図３７】雌のＶＩＳＴＡ−ＫＩマウスにおけるＶＳＴＢ１２３（１、５、７．５および１０ｍｇ／ｋｇ）のＭＢ４９腫瘍効果を評価する研究。移植６日後の投与開始時の腫瘍容積は、約５０ｍｍ３であった。ＶＳＴＢ１２３はマウスＦｃ骨格に接合されたＶＳＴＢ１１２Ｆａｂであり、ＶＩＳＴＡ−ＫＩマウス中のヒトＶＩＳＴＡに結合する。
【図３８】グラフは、ＶＩＳＴＡを高／中レベルで発現するＣＤ１４＋細胞が、肺癌試料中１３／１３で、ならびに患者の遠位肺癌組織および抹消血液中に見出されることを示している。
【図３９】ＧＧ８による肺癌のＶＩＳＴＡのＩＨＣ染色。
【図４０】図４０は結合率対抗体濃度のグラフである。
【図４１】ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した肺癌試料中のＶＳＴＢ１７５（図４１Ａ〜４１Ｃ）または陰性対照血清（図４１Ｄ）によるＶＩＳＴＡ染色の代表的像。図４１Ａ：小細胞肺癌；図４１Ｂ：小細胞肺癌；図４１Ｃ：扁平上皮肺癌；図４１Ｄ：小細胞肺癌。
【図４２】ヒト扁桃腺におけるＶＩＳＴＡ（ＶＳＴＢ１７５）染色。ＶＩＳＴＡ（ＶＳＴＢ１７５）抗体でブロック染色された扁桃腺組織の２領域を示す（左および右のパネル）。
【図４３】ヒト肺癌組織におけるＶＩＳＴＡ（ＶＳＴＢ１７５）染色。３組織試料の代表的な領域が２０倍の倍率で示されており、コホート研究で観察されたＶＩＳＴＡ染色を示す。
【図４４】細胞株、ＶＩＳＴＡ−Ｋ５６２．ＶＩＳＴＡ−Ｋ５６２細胞中で抗体ＶＳＴＢ１７５は頻繁な強い染色を示した。４０倍の倍率。
【図４５】細胞株、ラージ。陰性対照ラージ細胞においてＶＳＴＢ１７５抗体は陰性であった。４０倍の倍率。
【図４６】肺呼吸上皮（左のパネル）、肺胞（右のパネル）．この正常な肺の試料は、４３歳の女性から手術時に得た。抗体ＶＳＴＢ１７５は、血管内白血球（殆どが好中球）中で染色を示し、呼吸上皮内の上皮内好中球では稀である。上皮自体および残りの細胞タイプ、例えば、マクロファージは陰性であった。４０倍の倍率。
【図４７】リンパ節。この正常なリンパ節の試料は、３７歳の男性から得た。抗体ＶＳＴＢ１７５は、洞のリンパ節組織で陰性であった。４０倍の倍率。
【図４８】胎盤絨毛。この正常な胎盤の試料は、２０歳の女性から手術時に得た。抗体ＶＳＴＢ１７５は、トロホブラストにおいて膜染色を示した。４０倍の倍率。
【図４９】脾臓。この正常な脾臓の試料は、アルツハイマー病の７３歳の女性からオートプシーで得た。抗体ＶＳＴＢ１７５は赤脾髄中の単核球、好中球および類洞内皮細胞で限局性染色を示した。白脾髄リンパ球はほぼ陰性であった。４０倍の倍率。
【図５０】扁桃腺。この正常な扁桃腺の試料は、１１歳の女性から得た。抗体ＶＳＴＢ１７５は、表面扁平上皮関連単球で限定的染色を示したが、殆どのリンパ球では陰性であった。４０倍の倍率。
【図５１】結腸、上皮性悪性腫瘍。この結腸の試料は、５７歳の女性から手術時に得た。悪性細胞および炎症細胞（好中球）を含むこの試料では抗体ＶＳＴＢ１７５は陰性であった。４０倍の倍率。
【図５２】メラノーマ。このメラノーマの試料は、５４歳の女性から手術時に得た。抗体ＶＳＴＢ１７５は良性のマクロファージでは限定的染色を示したが、悪性細胞では陰性であった。４０倍の倍率。
【図５３】卵巣、上皮性悪性腫瘍。この卵巣の試料は、５３歳の女性から得た。抗体ＶＳＴＢ１７５は、単核球および多型核好中球をいずれも含む血管内白血球では限定的染色を示した。悪性細胞は陰性で、散在炎症細胞は殆ど特定されなかった。４０倍の倍率。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の実施形態例を以下に記載する。
【００１９】
本発明は、Ｔ細胞活性化免疫グロブリンＶ領域抑制因子（ＶＩＳＴＡ）（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＪＮ６０２１８４）（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、２０１１）と名付けられた新規な免疫グロブリンファミリーリガンドに対する抗体に関する。ＶＩＳＴＡはＰＤ−Ｌ１に対し相同性を有するが、造血系に限定される特有の発現パターンを示す。特に、ＶＩＳＴＡはＣＤ１１ｂｈｉｇｈミエロイド細胞の構成的に、かつ多く発現し、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞では低レベルで発現する。ヒトホモログは、マウスＶＩＳＴＡと略８５％の相同性を有し、類似の発現パターンを持つ（Ｌｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７４：１９２４、２０１４）。抗原提示細胞（ＡＰＣ）で発現したＶＩＳＴＡは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖、およびＰＤ−１と無関係の類似の受容体によるサイトカイン産生を抑制する。受動的ＥＡＥ（実験的自己免疫性脳脊髄炎）疾患モデルにおいては、ＶＩＳＴＡ特異的モノクローナル抗体は、Ｔ細胞依存免疫応答を増強し、病気を悪化させた。腫瘍細胞におけるＶＩＳＴＡの過剰発現は、腫瘍を持った宿主における防御抗腫瘍免疫を低下させた。ヒトＶＩＳＴＡに関する研究によって、ヒトＴ細胞に対するその抑制機能が確認された（Ｌｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７４：１９２４、２０１４）。Ｆｌｉｅｓらによる研究もまた、ＶＩＳＴＡ  （ＰＤ−１Ｈと称する）が強力な免疫抑制分子であることを確認した（Ｆｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＶＩＳＴＡは、米国特許出願公開第２０１３０１７７５５７  Ａ１号明細書、ならびに米国特許第７，９１９，５８５号明細書および同第８，２３６，３０４号明細書にさらに詳細に記載されており、それらすべて参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２０】
本明細書の実施例１２に記載するように、マウス腫瘍モデルにおけるＶＩＳＴＡ特異的モノクローナル抗体による処理により、腫瘍免疫微少環境の抑制性を逆転させ、防御抗腫瘍免疫を増強させ、それ故、ＶＩＳＴＡモノクローナル抗体の癌免疫療法の新しい治療法としての可能性を示すことがわかった。
【００２１】
本発明の抗体およびフラグメント
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ならびに、限定はされないが、酵素的開裂、ペプチド合成または組み換え技術などの知られた技術で得られる、それらのフラグメント、領域または誘導体を含むものとする。本発明の抗ＶＩＳＴＡ抗体は、免疫応答を調節、制御または増強するＶＩＳＴＡの一部に結合することができる。いくつかの実施形態では、抗体は本明細書に記載の１種以上の抗ＶＩＳＴＡ抗体を競合的に阻害する。２つ以上の抗体が同じ標的への結合を競合するか否かを決定する方法は、当該技術分野で知られている。例えば、１つの抗体が他の抗体の標的への結合をブロックするか否かを決定するために、競合結合アッセイを使用することができる。一般に、競合結合アッセイは、固体基質または細胞に結合した精製標的抗原（例えば、ＰＤ−１）、標識されていない試験結合分子、および標識された参照結合分子の使用を含む。競合阻害は、固体基質または細胞に結合した標識量を、試験結合分子の存在下に測定することによって測定される。通常、試験結合分子は過剰に含まれる。一般に、競合結合分子が過剰に存在すると、共通抗原に対する参照結合分子の特異的結合が、少なくとも５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％またはそれ以上阻害される。いくつかの実施形態では、競合阻害は、競合阻害ＥＬＩＳＡアッセイによって測定される。
【００２２】
ポリクローナル抗体は、抗原で免疫性が付与された動物の血清に由来する異種の抗体分子の集団である。モノクローナル抗体は、抗原に特異的な抗体の実質的に同種の集団を含み、その集団は実質的に類似のエピトープ結合部位を含む。モノクローナル抗体は、当業者に知られた方法で得ることができる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７  （１９７５）；米国特許第４，３７６，１１０号明細書；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．，（１９８７、１９９２）；およびＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２、１９９３）を参照されたい。これらの全ての内容は参照によって本明細書にその全体が組み込まれる。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤおよびそれらのサブクラスを含む免疫グロブリンクラスに分類され得る。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、インビトロ、インサイチューまたはインビボで培養することができる。
【００２３】
本発明はまた、消化フラグメント、その特定の部分および変異体、例えば、抗体類似体、あるいは抗体またはその特定フラクメントもしくは部分の構造および／または機能が類似する抗体部分、例えば、一本鎖抗体およびそのフラグメントを包含する。機能的フラグメントとしては、哺乳動物のＶＩＳＴＡタンパク質に結合する抗原結合フラグメントが挙げられる。例えば、ＶＩＳＴＡまたはその一部に結合することができる抗体フラグメント、例えば、限定はされないが、Ｆａｂ（例えば、パパイン消化による）、Ｆａｂ’（例えば、ペプシン消化および部分還元による）、およびＦ（ａｂ’）２（例えば、ペプシン消化による）、ｆａｃｂ（例えば、プラスミン消化による）、ｐＦｃ’（例えば、ペプシンまたはプラスミン消化による）、Ｆｄ（例えば、ペプシン消化、部分還元および再集合による）、ＦｖまたはｓｃＦｖ（例えば、分子生物学的技術による）フラグメントは、本発明に包含される（例えば、Ｃｏｌｌｉｇａｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、上記）を参照）。本発明の抗体フラグメントとしてはまた、Ａａｒｏｎ  Ｌ．Ｎｅｌｓｏｎ、ｍＡｂｓ２：１、７７−８３（Ｊａｎｕａｒｙ／Ｆｅｂｒｕａｒｙ２０１０）において論じられ、説明されているものが含まれる。
【００２４】
そのようなフラグメントは、例えば、当該技術分野で知られ、かつ／または本明細書に記載される、酵素的開裂、合成または組み換え技術によって生成することができる。抗体はまた、種々の欠失型において、１つ以上の終止コドンが天然の終止部位の上流に導入されている抗体遺伝子を用いて生成することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２重鎖部分をコードする組み合わせ遺伝子を、ＣＨ１ドメインおよび／または重鎖のヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように設計することができる。抗体の種々の部分は、従来技術により化学的に結合することができ、または遺伝子工学手法を用いて隣接タンパク質として作成することができる。
【００２５】
１つの実施形態では、免疫グロブリン鎖、またはその一部（例えば、可変領域、ＣＤＲ）は、本明細書に記載の対応する可変配列鎖のアミノ酸配列に対し、約７０〜１００％の同一性（例えば、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００またはその任意の範囲もしくは値）を有する。好ましくは、７０〜１００％のアミノ酸同一性（例えば、８５、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００またはその任意の範囲もしくは値）は、当該技術分野で知られているように、好適なコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。
【００２６】
重鎖および軽鎖の可変領域の配列は本明細書に示される。
【００２７】
本発明の抗体、またはその特定の変異体は、本発明の抗体の任意の数の隣接するアミノ酸残基を含むことができ、その数は、抗ＴＮＦ抗体の隣接残基数の１０〜１００％からなる整数の群から選択される。任意選択により、この隣接アミノ酸残基の部分配列は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０もしくはそれ以上のアミノ酸長、またはその任意の範囲もしくは値である。さらに、そのような部分配列の数は、１〜２０からなる群から選択される整数、例えば、少なくとも２、３、４または５であり得る。
【００２８】
当業者が認識しているように、本発明は、本発明の少なくとも１種の生物学的に活性な抗体を含む。生物学的に活性な抗体は、天然（非合成）の、内因性の、または関連する既知の抗体の少なくとも２０％、３０％または４０％、好ましくは、少なくとも５０％、６０％または７０％、最も好ましくは、少なくとも８０％、９０％、または９５％〜１００％の比活性を有する。酵素活性および基質特異性の分析および定量的測定の方法は、当業者によく知られている。
【００２９】
実質的な類似性は、天然（非合成）の、内因性の、または関連する既知の抗体の少なくとも８５％（例えば、少なくとも９５％）の同一性と、少なくとも８５％（例えば、少なくとも９５％）の活性を有する化合物を指す。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、タンパク質の実質的に全ての部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク、ＣＬ、ＣＨドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ヒンジ、（ＶＬ、ＶＨ））が、僅かな配列の変化もしくは変異を含む、ヒトにおいて実質的に非免疫原性である抗体を指す。同様に、霊長目（サル、ヒヒ、チンパンジーなど）、齧歯動物（マウス、ラットなど）、およびその他の哺乳動物を指定した抗体は、そのような種、亜属、属、亜科、科の特異抗体を示す。さらに、キメラ抗体は、上記の任意の組み合わせを含むことができる。そのような変化もしくは変異は、非改変抗体に比べて、ヒトまたは他の種の免疫原性を維持または低減するものであってよく、またそれが好ましい。したがって、ヒト抗体は、キメラもしくはヒト化抗体と異なっている。ヒト抗体は、機能的に再配列されたヒト免疫グロブリン（例えば、重鎖および／または軽鎖）遺伝子を発現することができる非ヒト動物細胞、または原核細胞もしくは真核細胞によって産生することができると言える。さらに、ヒト抗体が一本鎖抗体の場合、天然ヒト抗体にはないリンカーペプチドを含むことができる。例えば、Ｆｖは、２〜約８個のグリシンまたは他のアミノ酸残基などのリンカーペプチドを含むことができ、それは、重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域に結合する。そのようなリンカーペプチドは、ヒト起源であると考えられる。
【００３１】
モノクローナル、好ましくは、少なくとも２種の抗原に結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である二重特異性、異種特異性、ヘテロ共役性、または類似の抗体もまた、使用することができる。この場合、結合特異性の１つは少なくとも１つのＶＩＳＴＡタンパク質に対するものであり、他は、他の任意の抗原に対するものである。二重特異性抗体の生成方法は当該技術分野で知られている。二重特異性抗体の組み換え生成は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づいて行うことができるが、ここで、２本の重鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７（１９８３））。国際公開第９３／０８８２９号パンフレット、米国特許第６，２１０，６６８号明細書、同第６，１９３，９６７号明細書、同第６，１３２，９９２号明細書、同第６，１０６，８３３号明細書、同第６，０６０，２８５号明細書、同第６，０３７，４５３号明細書、同第６，０１０，９０２号明細書、同第５，９８９，５３０号明細書、同第５，９５９，０８４号明細書、同第５，９５９，０８３号明細書、同第５，９３２，４４８号明細書、同第５，８３３，９８５号明細書、同第５，８２１，３３３号明細書、同第５，８０７，７０６号明細書、同第５，６４３，７５９号明細書、同第５，６０１，８１９号明細書、同第５，５８２，９９６号明細書、同第５，４９６，５４９号明細書、同第４，６７６，９８０号明細書、国際公開第９１／００３６０号パンフレット国際公開第９２／００３７３号パンフレット、欧州特許第０３０８９号明細書、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５（１９９１）、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１２１：２１０（１９８６）もまた参照されたい。これらはそれぞれ参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３２】
一実施形態では、発明は、ＶＩＳＴＡおよび第２の標的タンパク質（例えば、免疫チェックポイントタンパク質）を標的とする二重特異性抗体に関する。二重特異性抗体の例としては、ＶＩＳＴＡおよびＰＤ−Ｌ１を標的とする二重特異性抗体、ならびに、ＶＩＳＴＡおよびＰＤ−Ｌ２を標的とする二重特異性抗体が挙げられる。
【００３３】
ヒトＶＩＳＴＡタンパク質またはそのフラグメントに特異的なヒト抗体は、ＶＩＳＴＡタンパク質またはその一部（合成ペプチドなどの合成分子を含む）などの適切な免疫原性抗原に対して作ることができる。
【００３４】
他の特異的または一般的な哺乳動物抗体を同様に作ることができる。免疫原性抗原の調製およびモノクローナル抗体の生成は、任意の好適な手法を用いて行うことができる。
【００３５】
例えば、ハイブリドーマは、好適な不死の細胞株（例えば、限定はされないが、Ｓｐ２／０、Ｓｐ２／０−ＡＧ１４、ＮＳＯ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＡＥ−１、Ｌ．５、＞２４３、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２ＳＡ３、Ｓｐ２ＭＡＩ、Ｓｐ２ＳＳ１、Ｓｐ２ＳＡ５、Ｕ９３７、ＭＬＡ１４４、ＡＣＴ  ＩＶ、ＭＯＬＴ４、ＤＡ−１、ＪＵＲＫＡＴ、ＷＥＨＩ、Ｋ−５６２、ＣＯＳ、ＲＡＪＩ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＬ−６０、ＭＬＡ１４４、ＮＡＭＡＩＷＡ、ＮＥＵＲＯ  ２Ａなどのミエローマ細胞株、もしくは異種ミエローマ、それらの融合産物、またはそれらから誘導される細胞もしくは融合細胞、あるいは当該技術分野で知られている他の好適な任意の細胞株、例えば、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇを参照）、を抗体産生細胞と融合させることによって生成することができる。抗体産生細胞としては、単離もしくはクローン化された脾臓、末梢血、リンパ、扁桃腺もしくは他の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）、あるいは重鎖もしくは軽鎖、定常もしくは可変、またはフレームワークもしくは相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を発現する他の細胞を挙げることができる。そのような抗体産生細胞は、組み換えまたは内因性細胞であってよく、また、原核または真核生物（例えば、齧歯動物、ウマ、ヒツジ、ヤギ、雌ヒツジ、霊長目などの哺乳動物）の細胞であってよい。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（上記）、およびＣｏｌｌｉｇａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（上記），ｃｈａｐｔｅｒ２を参照されたい。これらは参照によって本明細書にその全体が組み込まれる。
【００３６】
抗体産生細胞はまた、目的の抗原で免疫したヒトもしくは他の好適な動物の、末梢血、または、好ましくは脾臓もしくはリンパ節から得ることができる。他の好適な宿主細胞もまた、本発明の抗体、特定のフラグメントまたはその変異体をコードする異種または内因性核酸を発現させるために使用することができる。融合細胞（ハイブリドーマ）または組み換え細胞は選択培養条件または他の好適な知られた方法で単離することができ、また限界希釈法もしくは細胞選択、または他の知られた方法によってクローン化することができる。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞は、好適なアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ））によって選択することができる。
【００３７】
必要特異性を有する抗体を産生もしくは単離する他の好適な方法、例えば、限定はされないが、ペプチドもしくはタンパク質ライブラリー（例えば、限定はされないが、バクテリオファージ、リボソーム、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなどのディスプレイライブラリー；例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ、ＵＫ；ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｅｉｄ／Ｐｌａｎｅｇｇ、ＤＥ；Ｂｉｏｖａｔｉｏｎ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ、ＵＫ；Ｂｉｏｉｎｖｅｎｔ、Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ；Ｄｙａｘ  Ｃｏｒｐ．、Ｅｎｚｏｎ、Ａｆｆｙｍａｘ／Ｂｉｏｓｉｔｅ；Ｘｏｍａ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、Ｃａｌｉｆ．；Ｉｘｓｙｓ．から入手可能。例えば、ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号明細書、ＰＣＴ／ＧＢ９２／０１７５５号明細書、ＰＣＴ／ＧＢ９２／００２２４０号明細書、ＰＣＴ／ＧＢ９２／００８８３号明細書、ＰＣＴ／ＧＢ９３／００６０５号明細書、ＰＣＴ／ＧＢ９４／０１４２２号明細書、ＰＣＴ／ＧＢ９４／０２６６２号明細書、ＰＣＴ／ＧＢ９７／０１８３５号明細書、国際公開第９０／１４４４３号パンフレット；国際公開第９０／１４４２４号パンフレット；国際公開第９０／１４４３０号パンフレット、ＰＣＴ／Ｕ５９４／１２３４号明細書、国際公開第９２／１８６１９号パンフレット、国際公開第９６／０７７５４号パンフレット、欧州特許第６１４９８９号明細書、国際公開第９５／１６０２７号パンフレット、国際公開第８８／０６６３０号パンフレット、国際公開第９０／３８０９号パンフレット、米国特許第４，７０４，６９２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０２９８９号明細書、国際公開第８９／０６２８３号パンフレット、欧州特許第３７１９９８号明細書、欧州特許第５５０４００号明細書、欧州特許第２２９０４６号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０７１４９号明細書を参照）、または、確率的に生成されたペプチドもしくはタンパク質―米国特許第５，７２３，３２３号明細書、同第５，７６３，１９２号明細書、同第５，８１４，４７６号明細書、同第５，８１７，４８３号明細書、同第５，８２４，５１４号明細書、同第５，９７６，８６２号明細書、国際公開第８６／０５８０３号パンフレット、欧州特許第５９０６８９号明細書；各文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）から組み換え抗体を選択する方法；あるいは、当該技術分野で知られているように、かつ／または本明細書に記載されているように、一連のヒト抗体を産生することができる遺伝子組み換え動物の免疫付与を利用する方法（例えば、ＳＣＩＤマウス、Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：９０１−９０７（１９９７）；Ｓａｎｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：９５−１１８（１９９６）；Ｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．９３：１５４−１６１（１９９８）；各文献、ならびに関連特許および関連出願は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）を使用することができる。そのような手法としては、限定はされないが、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ��．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：４９３７−４９４２（Ｍａｙ１９９７）；Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：１４１３０−１４１３５（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ１９９８））；単一細胞抗体産生技術（米国特許第５，６２７，０５２号明細書、Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：８８７−８９２（１９８７）；Ｂａｂｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：７８４３−７８４８（１９９６））；ゲル微小液滴（ｇｅｌ  ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔ）およびフローサイトメトリー（Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：３３３−３３７（１９９０）；Ｏｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．；Ｇｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．１８２：１５５−１６３（１９９５）；Ｋｅｎｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：７８７−７９０（１９９５））；Ｂ細胞選択（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｓ１９：１２５−１３４（１９９４）；Ｊｏｎａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｖｏｌ．５，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８８））が挙げられる。
【００３８】
非ヒトまたはヒト抗体を改変またはヒト化する方法もまた使用することができ、当該技術分野でよく知られている。一般に、ヒト化または改変抗体は、非ヒト源、例えば、限定はされないが、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長目または他の哺乳動物に由来するアミノ酸残基を１個以上有する。これらのヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と呼ばれ、それらは、通常、既知のヒトの配列の「インポート」可変、定常または他の領域から取り込まれる。知られているヒトＩｇ配列は、例えばｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；  ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌに開示されており、それぞれ参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３９】
このようにインポートされた配列は、免疫原性の低減、または、当該技術分野で知られているような結合、アフィニティ、親和性、特異性、半減期もしくはその他の好適な特性を低下、増強もしくは改変するために使用することができる。一般に、非ヒトもしくはヒトＣＤＲ配列の一部または全部は維持されるが、フレームワークおよび／または定常領域の非ヒト配列の一部または全部がヒトまたは他のアミノ酸で置換される。抗体はまた、任意選択により、当業者に知られている三次元免疫グロブリンモデルを用いて、抗原に対する高いアフィニティを、他の好ましい生物学的特性を保持してヒト化され得る。選択した候補免疫グロブリン配列の推定三次元配座構造を説明し表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を調べることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンの抗原結合能力に影響するが残基の分析が可能となる。このようにして、フレームワーク（ＦＲ）残基を、標的抗原に対するアフィニティの増大などの所望の抗体特性が得られるように、コンセンサスおよびインポート配列から選択し、組み合わせすることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原との結合に影響する直接的、かつ大きく関与している。本発明の抗体のヒト化または改変は、知られた方法、例えば、限定はされないが、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ  （Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２  （１９８６）；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３  （１９８８）；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４  （１９８８）），  Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６  （１９９３）；  Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１  （１９８７），  Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５  （１９９２）；  Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３  （１９９３）、米国特許第５，７２３，３２３号明細書、同第５，９７６８６２号明細書、同第５，８２４５１４号明細書、同第５，８１７４８３号明細書、同第５，８１４４７６号明細書、同第５，７６３，１９２号明細書、同第５，７２３，３２３号明細書、同第５，７６６，８８６号明細書、同第５，７１４，３５２号明細書、同第６，２０４，０２３号明細書、同第６，１８０，３７０号明細書、同第５，６９３，７６２号明細書、同第５，５３０，１０１号明細書、同第５，５８５，０８９号明細書、同第５，２２５，５３９号明細書、同第４，８１６，５６７号明細書に記載された方法により行うことができる。これらはそれぞれ、本明細書に引用された文献とともに、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４０】
抗ＶＩＳＴＡ抗体はまた、任意選択により、本明細書に記載され、かつ／または当該技術分野で知られているように、一連のヒト抗体を産生することができる遺伝子組み換え動物、（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、非ヒト霊長目など）を免疫することによって生成することができる。ヒト抗ＶＩＳＴＡ抗体を産生する細胞は、好適な方法、例えば、本明細書に記載の方法で、そのような動物から単離し、不死化することができる。
【００４１】
ヒト抗原に結合する一連のヒト抗体を産生することができる遺伝子組み換え動物は、知られた方法（例えば、限定はされないが、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．に対し発行された米国特許第５，７７０，４２８号明細書、同第５，５６９，８２５号明細書、同第５，５４５，８０６号明細書、同第５，６２５，１２６号明細書、同第５，６２５，８２５号明細書、同第５，６３３，４２５号明細書、同第５，６６１，０１６号明細書および同第５，７８９，６５０号明細書；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９８／５０４３３号パンフレット、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９８／２４８８４号パンフレット、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９７／１３８５２号パンフレット、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９６／３４０９６号パンフレット、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．欧州特許第０４６３１５１Ｂ１号明細書、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．欧州特許出願公開第０７１０７１９Ａ１、Ｓｕｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，５４５，８０７号明細書、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９０／０４０３６号パンフレット、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．欧州特許第０４３８４７４Ｂ１号明細書、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．欧州特許出願公開第０８１４２５９Ａ２号明細書、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔａｌ．英国特許出願公開第２２７２４４０Ａ号明細書、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６（４）５７９−５９１（１９９４）、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ７：１３−２１（１９９４）、Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１５：１４６−１５６（１９９７）、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０（２３）：６２８７−６２９５（１９９２）、Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０（８）３７２０−３７２４（１９９３）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３（１）：６５−９３（１９９５）、ならびにＦｉｓｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４（７）：８４５−８５１（１９９６）、これらはそれぞれ参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）で生産することができる。一般にこれらのマウスは、機能的に再配列されるか、または機能的再配列を受けることができる少なくとも１つのヒト免疫グロブリン座からのＤＮＡを含む少なくとも１つの導入遺伝子を含む。そのようなマウスにおける内因性免疫グロブリン座は、内因性遺伝子によってコードされる抗体を産生する動物の能力を除くために、破壊または欠失させることができる。
【００４２】
類似のタンパク質またはフラグメントに特異的に結合する抗体のスクリーニングは、ペプチドディスプレイライブラリーを用いて都合良く行うことができる。この方法は、所望の機能または構造を有する個々のメンバーを膨大な数のペプチドからスクリーニングすることを伴う。ペプチドディスプレイライブラリーの抗体スクリーニングは、当該技術分野でよく知られている。ディスプレイされるペプチド配列は３〜５０００個以上のアミノ酸長、多くの場合５〜１００個のアミノ酸長、さらに多くの場合８〜２５個のアミノ酸長であり得る。ペプチドライブラリーを生成するための直接化学合成法に加えて、いくつかの組み換えＤＮＡ法が報告されている。１つのタイプは、バクテリオファージまたは細胞表面のペプチド配列のディスプレイを含む。各バクテリオファージまたは細胞は、特定のディスプレイされたペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む。そのような方法は、国際公開第９１／１７２７１号パンフレット、同第９１／１８９８０号パンフレット、同第９１／１９８１８号パンフレットおよび同第９３／０８２７８に記載されている。ペプチドライブラリーを生成する他のシステムは、インビトロ化学合成法および組み換え法の両方の態様を有する。国際公開第９２／０５２５８号パンフレット、同第９２／１４８４３号パンフレットおよび同第９６／１９２５６号パンフレットを参照されたい。また、米国特許第５，６５８，７５４号明細書および同第６４３，７６８号明細書も参照されたい。ペプチドディスプレイライブラリー、ベクターおよびスクリーニングキットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）およびＣａｍｂｒｉｄｇｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ、ＵＫ）などの供給者から商業的に入手可能である。例えば、Ｄｙａｘに譲渡された米国特許第４，７０４，６９２号明細書、同第４，９３９，６６６号明細書、同第４，９４６，７７８号明細書、同第５，２６０，２０３号明細書、同第５，４５５，０３０号明細書、同第５，５１８，８８９号明細書、同第５，５３４，６２１号明細書、同第５，６５６，７３０号明細書、同第５，７６３，７３３号明細書、同第５，７６７，２６０号明細書、同第５，８５６，４５６；５，２２３，４０９号明細書、同第５，４０３，４８４号明細書、同第５，５７１，６９８号明細書、同第５，８３７，５００号明細書、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに譲渡された同第５，４２７，９０８号明細書、同第５，５８０，７１７号明細書、同第；５，８８５，７９３号明細書、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈに譲渡された同第５，７５０，３７３号明細書、同第５，６１８，９２０号明細書、同第５，５９５，８９８号明細書、同第５，５７６，１９５号明細書、同第５，６９８，４３５号明細書、同第５，６９３，４９３号明細書および同第５，６９８，４１７号明細書を参照されたい。
【００４３】
本発明の抗体はまた、乳中にそのような抗体を生成するヤギ、雌ウシ、雌ヒツジなどの遺伝子組み換え動物を提供する核酸をコードする少なくとも１つの抗ＶＩＳＴＡ抗体を用いて調製することができる。そのような動物は知られた方法で提供することができる。例えば、限定はされないが、米国特許第５，８２７，６９０号明細書、同第５，８４９，９９２号明細書、同第４，８７３，３１６号明細書、同第５，８４９，９９２号明細書、同第５，９９４，６１６号明細書、同第５，５６５，３６２号明細書、同第５，３０４，４８９号明細書などを参照されたい。それらはそれぞれ参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４４】
本発明の抗ＶＩＳＴＡ抗体はまた、遺伝子組み換え植物を用い、知られた方法にしたがって生成することができる。例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：９９−１０８（Ｏｃｔｏｂｅｒ、１９９９）、Ｃｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４０：９５−１１８（１９９９）およびそれらに引用された文献；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：５２２−７（１９９５）；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０９：３４１−６（１９９５）；Ｗｈｉｔｅｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２２：９４０−９４４（１９９４）；およびそれらに引用された文献もまた参照されたい。上記各文献は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４５】
本発明の抗体はヒトＶＩＳＴＡと広範なアフィニティ（ＫＤ）で結合することができる。好ましい実施形態では、本発明の少なくとも１つのヒトモノクローナル抗体は、任意選択により、ヒトＶＩＳＴＡに抗アフィニティで結合することができる。例えば、ヒトモノクローナル抗体は、ヒトＶＩＳＴＡに約１０−７以下、例えば、限定はされないが、０．１〜９．９（または、その中の任意の範囲もしくは値）×１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２、１０−１３またはその中の任意の範囲もしくは値のＫＤで結合することができる。いくつかの実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、ヒトＶＩＳＴＡに、少なくとも１×１０−７リットル／モル、例えば、少なくとも１×１０−８リットル／モル、例えば、少なくとも１×１０−９リットル／モルリットル／モルのアフィニティで結合することができる。
【００４６】
抗体の抗原に対するアフィニティまたは親和性は、任意の好適な方法を用いて実験的に決定することができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ、ｅｔ  ａｌ．，”Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”，Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）；Ｋｕｂｙ、Ｊａｎｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；および本明細書に記載の方法を参照されたい）。特定の抗体抗原相互作用のアフィニティ測定値は、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）の下で測定した場合には変わり得る。したがって、アフィニティおよび他の抗原結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋａ、Ｋｄ）の測定は、抗体および抗原液の標準液と標準緩衝液とで行うことが好ましい。
【００４７】
核酸分子
本明細書に示された情報、例えば、少なくとも１つの特定のフラグメントの少なくとも７０〜１００％の連続したアミノ酸をコードする核酸配列、その変異体もしくはコンセンサス配列、またはそれらの配列の少なくとも１つを含む寄託されたベクターを使用して、配列番号１、２および３の重鎖可変ＣＤＲ領域の全てと、配列番号４、５および６の軽鎖可変ＣＤＲ領域の全てを含む少なくとも１つの抗ＶＩＳＴＡ抗体をコードする本発明の核酸分子を、本明細書に記載の方法、または当該技術分野で知られた方法に依り得ることができる。
【００４８】
本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態、例えば、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡもしくは他の形態、またはＤＮＡの形態、例えば、限定はされないが、クローニングによって得られた、もしくは合成により生成されたｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。ＤＮＡは、三本鎖、二本鎖もしくは一本鎖、またはこれらの組み合わせであり得る。ＤＮＡもしくはＲＮＡの少なくとも１本の鎖の一部は、センス鎖としても知られるコード鎖、またはアンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であり得る。
【００４９】
本発明の単離核酸分子としては、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、例えば、限定はされないが、少なくとも１本の重鎖もしくは軽鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３などの、少なくとも１つのＣＤＲの少なくとも１つの特定部分を含む核酸分子；抗ＶＩＳＴＡ抗体またはフラグメント、例えば、可変領域を含むフラグメントのコード配列を含む含む核酸分子；ならびに、上記のものと異なるが、遺伝子コードの退化のために、本明細書に記載され、かつ／または当該技術分野で知られる少なくとも１つの抗ＶＩＳＴＡ抗体をなおコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を挙げることができる。そのような、本発明の特異的抗ＶＩＳＴＡ抗体をコードする、退化した核酸変異体の生成は、当業者であれば日常的な仕事であろう。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、ｅｔ  ａｌ．（上記）を参照されたい。そのような核酸変異体は本発明に含まれる。
【００５０】
本明細書に記載のように、抗ＶＩＳＴＡ抗体をコードする核酸を含む本発明の核酸分子としては、限定はされないが、抗体フラグメントのアミノ酸配列をコードするもの、全抗体またはその一部をコードする配列；抗体、フラグメントもしくは一部をコードする配列、および追加の配列、例えば、前記追加のコード配列の有無にかかわらず、少なくとも１つのシグナルリーダーまたは融合ペプチド、例えば、追加の非コード配列（例えば、限定はされないが、非コード５’および３’配列、例えば、転写、ｍＲＮＡプロセッシング、例えば、スプライシング、およびポリアデニル化シグナル（例えば、ｍＲＮＡのリボソーム結合および安定性）に役割を持つ転写された非翻訳配列）と共に含まれる少なくとも１つのイントロン；
追加のアミノ酸、例えば追加の機能を付与するアミノ酸をコードする追加のコード配列を挙げることができる。したがって、抗体をコードする配列はマーカー配列、例えば、抗体フラグメントまたは一部を含む融合抗体の精製を促進するペプチドをコードする配列に融合することができる。
【００５１】
本発明の抗体、フラグメントおよび領域の定常（Ｃ）領域をコードするヒト遺伝子は、知られた方法によって、ヒト胎児肝ライブラリーから取り出すことができる。ヒトＣ領域遺伝子は、ヒト細胞、例えば、ヒト免疫グロブリンを発現し産生する細胞から取り出すことができる。ヒトＣＨ領域は、ヒトＨ鎖、例えばγ、μ、α、δもしくはεおよびそれらのサブタイプ、例えば、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３およびＧ４の知られたクラスまたはアイソタイプから取り出すことができる。Ｈ鎖アイソタイプは、抗体の様々なエフェクター機能を担っているため、ＣＨ領域の選択は、所望のエフェクター機能、例えば、補体結合、または抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）活性によって導かれるであろう。
【００５２】
組成物
本明細書に開示の医薬組成物は、標準的手順にしたがって調製され、治療、例えば、軽減、予防もしくは除去のため、または、治療する病態の進行の遅延もしくは半減のために選択される用量で投与される（例えば、ヒト治療用の各種薬剤の投与方法の一般的な説明のためのＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡおよびＧｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．を参照（これらの内容は参照によって本明細書に組み込まれる））。開示の抗体および薬剤を含む組成物は、制御もしくは持続放出型送達システム（例えば、カプセル、生分解性マトリックス）によって送達することができる。本開示化合物の組成物の投与に好適な薬物送達のための遅延放出型送達システムは、例えば、米国特許第５，９９０，０９２号明細書、同第５，０３９，６６０号明細書、同第４，４５２，７７５号明細書および同第３，８５４，４８０に記載されており、それらの全教示は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５３】
本発明の抗ＶＩＳＴＡ抗体および／またはフラグメントから医薬組成物を調製するために、医薬的に許容される担体は、固体または液体であり得る。固形製剤としては、粉剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、座薬および顆粒剤が挙げられる。例えば、本発明の化合物は、送達時に再構成する粉末の形態であり得る。固体担体は、希釈剤、香味剤、可溶化剤、潤滑剤、懸濁化剤、結合剤、防腐剤、錠剤崩壊剤またはカプセル化材としても機能し得る１種以上の物質であり得る。粉剤では、担体は、微粉化した有効成分との混合物を形成する微粉化した固体である。
【００５４】
粉剤および錠剤は、約１〜約７０パーセントの活性成分を含有することが好ましい。好適な担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融ワックス、ココアバターなどである。錠剤、粉剤、カシェ剤、トローチ剤、速く溶けるストリップ剤、カプセル剤および丸剤は、経口投与に好適な有効成分を含有する固形の剤形として使用することができる。
【００５５】
液体製剤としては、溶液、懸濁液、停留かん腸およびエマルション、例えば、水溶液または水性プロピレングリコール溶液が挙げられる。注射剤では、液体製剤を水性プロピレングリコール溶液中に溶液で配合することができる。
【００５６】
医薬組成物は単位剤形とすることができる。そのような剤形では、組成物を適正量の有効成分を含有する単位用量に小分けする。単位剤形はパッケージ製剤とすることができ、パッケージは単位用量の分離量を含有する。投与量は患者の必要性、治療する病態の重症度、化合物および使用する投与経路によって変わり得る。特定の状況に適した投与量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
【００５７】
また、医薬組成物には、必要に応じて、他の混合可能な薬剤、例えば、医薬品、治療薬または予防薬を含有させることができる。治療薬または予防薬としては、限定はされないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣剤、合成薬、無機分子および有機分子が挙げられる。そのような薬剤の分類例としては、限定はされないが、細胞毒素、血管新生阻害薬、免疫調節薬、免疫療法薬、および、痛みの軽減、または１種以上の治療薬の有害作用を相殺するために使用される薬剤（例えば、グルココルチコイドの高カルシウム血作用を軽減するために使用されるビスホスフォネート）が挙げられる。
【００５８】
血管新生阻害薬、本発明に記載の組成物および方法での使用に適した薬剤および療法としては、限定はされないが、アンジオスタチン（プラスミノゲンフラグメント）；血管新生阻害アンチトロンビンＩＩＩ；ａｎｇｉｏｚｙｍｅが挙げられる。ビスホスフォネートとしては、限定はされないが、アレンドロネート、クロドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、パミドロネート、リセドロネート、チルドロネートおよびゾレドロネートが挙げられる。
【００５９】
本明細書に記載の組成物および方法での使用に好適な免疫調節剤および免疫調節療法としては、限定はされないが、抗Ｔ細胞受容体、例えば、抗ＣＤ３抗体（例えば、Ｎｕｖｉｏｎ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ）、ＯＫＴ３（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）または抗ＣＤ２０抗体Ｒｉｔｕｘａｎ（ＩＤＥＣ））、抗ＣＤ５２抗体（例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ  １Ｈ（Ｉｌｅｘ））、抗ＣＤ１１ａ抗体（例えば、Ｘａｎｅｌｉｍ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））；抗サイトカインまたは抗サイトカイン受容体抗体およびアンタゴニスト、例えば、抗ＩＬ−２受容体抗体（Ｚｅｎａｐａｘ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ））、抗ＩＬ−６受容体抗体（例えば、ＭＲＡ（Ｃｈｕｇａｉ））、および抗ＩＬ−１２抗体（ＣＮＴＯ１２７５（Ｊａｎｓｓｅｎ））、抗ＴＮＦアルファ抗体（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（Ｊａｎｓｓｅｎ））またはＴＮＦ受容体アンタゴニスト（Ｅｎｂｒｅｌ（Ｉｍｍｕｎｅｘ））、抗ＩＬ−６抗体（ＢＥ８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ）およびシルツキシマブ（ＣＮＴＯ３２（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ））、ならびに、腫瘍関連抗原に免疫特異的に結合する抗体（例えば、トラスツズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））が挙げられる。
【００６０】
本明細書に記載の組成物および方法での使用に好適な免疫療法薬としては、限定はされないが、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４）、ニボルマブ（抗ＰＤ−１）、ペンブロリズマブ（抗ＰＤ−１）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗ＬＡＧ−３抗体が挙げられる。
【００６１】
組成物は、治療有効量の抗体またはフラグメントを含む単位剤形の形態で作成されることが好ましい。単剤剤形の例には、錠剤およびカプセル剤がある。治療目的のためには、錠剤およびカプセル剤は、有効成分に加えて、結合剤などの従来の担体、例えば、アカシアガム、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ソルビトールまたはトラガント；充填剤、例えば、リン酸カルシウム、グリシン、ラクトース、トウモロコシデンプン、ソルビトールまたはスクロース；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、エチレングリコール、シリカまたはタルク；崩壊剤、例えば、ジャガイモデンプン、香味剤もしくは着色剤、または許容される湿潤剤を含有することができる。一般に水性もしくは油状溶液、懸濁液、エマルション、シロップ剤またはエリキシル剤の形態の経口液体製剤は、懸濁化剤、乳化剤、非水剤、保存料、着色剤および香味剤などの従来の添加剤を含有することができる。液体製剤の添加剤の例としては、アカシア、アーモンド油、エチルアルコール、分画ココナッツ油、ゼラチン、グルコースシロップ、グリセリン、食用硬化油脂、レシチン、メチルセルロース、メチルもしくはプロピルパラヒドロキシベンゾエート、プロピレングリコール、ソルビトールまたはソルビン酸が挙げられる。
【００６２】
本明細書に記載の化合物および組成物の作製方法および使用方法に関する他の一般的な詳細は、当該技術分野でよく知られている。例えば、米国特許第７，８２０，１６９号明細書を参照されたい。その内容はその全体が組み込まれる。
【００６３】
治療方法
当業者、例えば臨床医は、個人に投与するための、特定の抗体、フラグメントおよび組成物の好適な用量および投与経路を、選択した薬剤、医薬製剤および投与経路、患者の各種因子および他の検討事項を考慮して決定することができる。用量は、引き起こされる、または生じる有害な副作用が最小、またはゼロになるものであることが好ましい。標準的な多剤投与処方では、薬剤は、患者が受ける治療において、あらかじめ決定された、または最適な血漿濃度を維持するように設計された処方計画にしたがって投与され得る。抗体、フラグメントおよび組成物は適切な用量範囲または治療有効量、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ、７．０ｍｇ／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ、９．０ｍｇ／ｋｇ、１０．０ｍｇ／ｋｇ、１１．０ｍｇ／ｋｇ、１２．０ｍｇ／ｋｇ、１３．０ｍｇ／ｋｇ、１４．０ｍｇ／ｋｇ、１５．０ｍｇ／ｋｇ、１６．０ｍｇ／ｋｇ、１７．０ｍｇ／ｋｇ、１８．０ｍｇ／ｋｇ、１９．０ｍｇ／ｋｇ、２０．０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇで添加することができる。１つの実施形態では、投与する組成物、抗体またはフラグメントは、１回の投与当たり０．１〜１５ｍｇ／ｋｇである。
【００６４】
抗体またはフラグメントは、１日に、１回、少なくとも１回、２回、少なくとも２回、３回、または少なくとも３回投与することができる。抗体またはフラグメントは、１週間に、１回、少なくとも１回、２回、少なくとも２回、３回、少なくとも３回、４回、少なくとも４回、５回、少なくとも５回、６回、または少なくとも６回投与することができる。抗体またはフラグメントは、１カ月に１回、１カ月に少なくとも１回、１カ月に２回、１カ月に少なくとも２回、１カ月に３回、または１カ月に少なくとも３回投与することができる。抗体または抗体フラグメントは、１年に１回、１年に少なくとも１回、１年に２回、１年に少なくとも２回、１年に３回、１年に少なくとも３回、１年に４回、１年に少なくとも４回、１年に５回、１年に少なくとも５回、１年に６回、または１年に少なくとも６回投与することができる。
【００６５】
抗ＶＩＳＴＡ抗体、フラグメントおよび組成物は、例えば、非経口または経口で、例えば、静脈内に、皮下に、経口で、直腸に、筋肉内に、腹腔内に、粘膜に、髄腔内に、鼻腔内に、または局所的に投与することができる。当業者は、以下の剤形が、有効成分として、本発明の化合物、または本発明の化合物に対応する薬学的に許容される塩を含み得ることを認識していよう。いくつかの実施形態では、これらの剤形が、有効成分として、化合物、または化合物に対応する薬学的に許容される塩を含み得る。
【００６６】
本発明の抗ＶＩＳＴＡ抗体を、併用療法（例えば、互いに、または１種以上の他の治療薬と）の一部として投与することができる。本発明の化合物は、１種以上の他の治療薬の前、後、または同時に投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明の化合物および他の治療薬は、個別の製剤として、または混合した製剤として、同時に（例えば、一斉に）同時投与することができる。あるいは、薬剤は、個別の組成物として、熟練した臨床医によって決定される適切な時間枠（例えば、療法における医薬効果が重なって現れるのに十分な時間）内で、連続的に投与することができる。本発明の化合物または１種以上の他の治療薬は、単回投与または多数回投与で、順に、所望の治療効果を達成するのに好適なスケジュールで、投与することができる。
【００６７】
本発明はまた、細胞、組織、臓器、動物または患者の少なくとも１つの悪性疾患の調節または治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の化合物および組成物は、癌の治療または予防に使用される。癌には、任意の臓器系または体系の任意の悪性または良性の腫瘍が含まれ得る。例としては、限定はされないが、以下のものが挙げられる：乳癌、消化器／消化管癌、内分泌癌、神経内分泌癌、眼癌、泌尿生殖器癌、胚細胞癌、婦人科癌、頭頸部癌、血液癌、筋骨格癌、神経癌、呼吸器／胸部癌、膀胱癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、子宮内膜、腎臓癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌、精巣癌、食道癌、前立腺癌、脳腫瘍、子宮頸癌、卵巣癌および甲状腺癌が挙げられる。他の癌としては、白血病、メラノーマおよびリンパ腫、ならびに本明細書に記載の癌を挙げることができる。いくつかの実施形態では、固形腫瘍に骨髄細胞および／またはＴ細胞が浸潤する。いくつかの実施形態では、癌は、白血病、リンパ腫、骨髄異形成症候群および／または骨髄腫である。いくつかの実施形態では、リンパ性白血病または骨髄性白血病などの任意の種類またはタイプの白血病、例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞白血病、Ｔ細胞前リンパ性白血病、大型顆粒リンパ球白血病、または成人Ｔ細胞白血病であり得る。いくつかの実施形態では、リンパ腫は、組織球性リンパ腫、濾胞性｛ろほうせい｝リンパ腫またはホジキンリンパ腫であり、いくつかの実施形態では、癌は、多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、癌は、固形腫瘍、例えば、メラノーマまたは膀胱癌である。ある特定の実施形態では、癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などの肺癌である。
【００６８】
本発明はまた、細胞、組織、臓器、動物または患者の少なくとも１つの悪性疾患、例えば、限定はされないが、白血病、急性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞またはＦＡＢ  ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、形成、カポジ肉腫、大腸癌、膵臓癌、上咽頭癌、悪性組織球増殖症、悪性の腫瘍随伴性症候群／高カルシウム血症、固形腫瘍、腺癌、肉腫、悪性メラノーマ、血管腫、転移疾患、癌関連骨吸収、癌関連骨痛などの少なくとも１つを調節または治療する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、固形腫瘍に骨髄細胞および／またはＴ細胞が浸潤する。ある特定の実施形態では、固形腫瘍は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などの肺癌である。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物および療法は、ワクチン（ウイルスベクターワクチン、細菌ワクチン、細胞ワクチン、ＤＮＡワクチン、ＲＮＡワクチン、ペプチドまたはタンパク質ワクチンなど）と同時投与される。そのようなワクチンは、当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｓｃｈｌｏｍ、“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  Ｍｏｖｉｎｇ  Ｆｏｒｗａｒｄ、”Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ；１０４：５９９−６１３（２０１２）を参照されたい。その内容はその全体が組み込まれる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物および療法は、化学療法、ホルモン療法および生物学的療法用薬剤、ならびに／またはビスホスフォネートと同時投与される。いくつかの実施形態では、化学療法用薬剤としては、次の１種以上が挙げられる：カルボプラチン（パラプラチン）、シスプラチン（プラチノール、プラチノール−ＡＱ）、シクロヒスファミド（シトキサン、ネオサール）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エトポシド（ベプシド）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビン（ジェムザール）、イリノテカン（カンプトサール）、パクリタキセル（タキソール）、トポテカン（ハイカムチン）、ビンクリスチン（オンコビン、ビンカサールＰＦＳ）、ビンブラスチン（ベルバン）。
【００７１】
他の実施形態では、本明細書に記載の抗ＶＩＳＴＡ化合物および療法は、１種以上の免疫チェックポイント抗体、例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、トレメリムマブ、イピリムマブ、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＴＩＭ−３抗体、抗ＬＡＧ−３ｖ、抗ＯＸ４０抗体および抗ＧＩＴＲ抗体などと同時投与される。
【００７２】
他の一実施形態では、本明細書に記載の抗ＶＩＳＴＡ化合物および療法は、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）小分子阻害剤とともに同時投与される。
【００７３】
本発明の抗ＶＩＳＴＡ化合物および組成物は、癌を予防（癌の再発防止を含む）または治療（例えば、癌またはその１種以上の症状の管理または改善）するために、それを必要としている対象に投与することができる。癌またはその１種以上の症状の予防、治療、管理または改善に有用であると知られているか、または使用されてきたか、もしくは現在使用されている薬剤または療法（例えば、化学療法、放射線療法、イマチニブ、ソラフェニブおよびベムラフェニブなどの標的療法、ホルモン療法、および／または生物学的療法もしくは免疫療法）は、本明細書に記載の本発明の化合物または組成物と併用することができる。抗癌剤としては、限定はされないが、以下のものが挙げられる：５−フルオロウラシル；アシビシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ビカルタミド；硫酸ブレオマイシン；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼルシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デキソマプラチン；デザグアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジクオン；ドセタキセル；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；ドロロキシフェンシトラート；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン；塩酸エフロルニチン；エンロプラチン；エンプロマート；エピプロピジン；塩酸エピルビシン；エルブロゾール；塩酸エソルビシン；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸ナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルロシタビン；ホスキドン；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；ヒドロキシウレア；塩酸イダルビシン；イホスファミド；イルモフォシン；インターロイキンＩｌ（組換えインターロイキンＩＩ、すなわちｒｌＬ２を含む）、インターフェロンアルファ−２ａ；インターフェロンアルファ−２ｂ；インターフェロンアルファ−ｍ；インターフェロンアルファ−ｎ３；インターフェロンベータ−Ｉａ；インターフェロンガンマ−Ｉｂ；イプロプラチン；塩酸イリノテカン；ランレオチドアセテート；レトロゾール；リュープロリドアセテート；塩酸リアロゾール；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン；マソプロコール；塩酸メクロレタミン；メゲストロールアセテート；メレンゲストロールアセテート；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；マイトマイシン；ミトスペル；ミトタン；塩酸ミトキサントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール；オルマプラチン；パクリタキセル；ペグアスパルガーゼ；ポルフロマイシン（ｐｏｒｆｒｏｍｙｃｉｎ）；プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；ピューロマイシン；ログレチミド；塩酸サフィンゴール；セムスチン；シムトラゼン；スパルフォセートナトリウム；スパルソマイシン；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌール；タリソマイシン；テガフール；塩酸テロキサントロン；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；硫酸ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン；硫酸ビングリシナート；硫酸ビンロイロシン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン；硫酸ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；塩酸ゾルビシン。標的療法としては、限定はされないが、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブ、ソラフェニブおよびベムラフェニブ）が挙げられる。本発明はまた、ｘ線、ガンマ線および癌細胞を破壊する他の線源の使用を含む放射線療法と組み合わせた本発明の抗ＶＩＳＴＡ化合物の投与を包含する。癌治療は当該技術分野で知られており、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（５７ｔｈ  ｅｄ．、２００３）などの文献に記載されている。
【００７４】
本明細書に記載の抗ＶＩＳＴＡ抗体はまた、例えば、慢性感染症、とりわけＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＨＳＶなどの治療に有用である。
【００７５】
ＶＩＳＴＡタンパク質の検出
本明細書に記載の発明の抗体および抗原結合フラグメントは、一般に、例えば、試料（例えば、生物材料）中のＶＩＳＴＡタンパク質の検出に有用である。本発明の抗体は、当該技術分野で知られている多くのタンパク質検出アッセイ、例えば、免疫学的方法および免疫化学的方法、例えば、限定はされないが、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ分析）、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、例えば、化学発光法、、放射免疫測定法、免疫ブロット法（例えば、ウエスタンブロット）、免疫組織化学的検査法（ＩＨＣ）、免疫沈降法、および他の抗体に基づく定量法（例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズに基づくアッセイ）を適用可能である。他の好適な方法としては、例えば、質量分析法が挙げられる。
【００７６】
本発明のＶＩＳＴＡ検出法は、一般に、試料（例えば、細胞試料）を、本明細書に記載の、本発明のＶＩＳＴＡ抗体または抗原結合フラグメントと、抗体または抗原結合フラグメントが試料中のＶＩＳＴＡタンパク質に結合する条件下で接触させることを含む。本発明の抗体または抗原結合フラグメントの試料中のＶＩＳＴＡタンパク質への結合に好適な条件は、当業者であれば容易に決定することができ、当該技術分野で知られている様々な条件を含む。例えば、そのような条件としては、本明細書の実施例２７に記載のものが挙げられる。
【００７７】
例えば、ＶＩＳＴＡに対する抗体は、試料中のＶＩＳＴＡの存在レベルおよび／または発現レベルを、例えば、免疫組織化学的検査法（ＩＨＣ）により測定するために使用することができる。特に、ＩＨＣは、インサイチューで、試料または組織標本中の標的を検出する方法を提供する（Ｍｏｋｒｙ  １９９６、ＡＣＴＡ  ＭＥＤＩＣＡ  ３９：１２９を参照）。ＩＨＣでは、試料の細胞の全体的な完全性は保持され、は保持され、したがって、目的の標的の存在および位置を検出することができる。
【００７８】
ＩＨＣ染色手順は、組織のカットおよびトリミング、固定、脱水、パラフィン浸潤、薄い切片の切り出し、スライドグラスへの搭載、ベーキング、脱パラフィン、再水和、抗原回復、ブロッキング工程、一次抗体の適用、洗浄、二次抗体−酵素接合体の適用、洗浄、ポリマーに接合させ、酵素と結合させた三次抗体の接合体の適用、色素原基質の適用、洗浄、対比染色、カバーガラスの適用および顕微鏡検査などの手順を含み得る。洗浄工程は、好適な緩衝液または溶媒、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、蒸留水で行うことができる。洗浄用緩衝液は、任意選択により、洗剤、例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０またはＮＰ−４０を含有してもよい。
【００７９】
１つの実施形態では、ＩＨＣ試料をホリマリンで固定し、パラフィンに包埋し、染色およびその後の光学顕微鏡による検査のために切片に切り分ける。今日のＩＨＣ法では、直接標識または二次抗体に基づく標識もしくはハプテンに基づく標識を使用する。知られたＩＨＣシステムの例としては、例えば、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）、Ｐｏｗｅｒｖｉｓｉｏｎ（登録商標）（Ｉｍｍｕｎｏｖｉｓｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｄａｌｅ、Ａｒｉｚ．）、ＮＢＡ（登録商標）キット（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ヒストファイン（登録商標）（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ  Ｃｏｒｐ、東京、日本）が挙げられる。
【００８０】
ＶＩＳＴＡタンパク質は、様々なタイプの試料、例えば、限定はされないが、組織試料、生体液試料（例えば、哺乳動物の血漿、血清、リンパ液、全血、脊髄、羊膜または他の動物由来の液）、細胞（例えば、腫瘍細胞、免疫細胞）試料などで検出することができる。試料としては、例えば、（ａ）固定されていない新鮮組織および／または細胞を含む標本；（ｂ）固定包埋された組織標本、例えば、保存材料；ならびに（ｃ）凍結した組織または細胞が挙げられる。したがって、試料は、新鮮であるか、あるいは、液体溶液、急速冷凍もしくは凍結乾燥、スライドまたは他の支持材上に塗布、または乾燥、包埋もしくは固定して保存され得る。
【００８１】
いくつかの実施形態では、組織または細胞試料は固定または包埋される。例えば、細胞および組織を再生可能で生きているような方法で保存するために、固定液が使用される。固定液はまた、細胞および組織を安定化し、それにより、プロセッシングおよび染色の厳しさからそれらを保護する。例えば、組織のブロック、切片、塗抹を含む試料を固定液に浸漬、または塗布物の場合には乾燥させる。
【００８２】
組織試料を固定し包埋する方法は、例えば、アルコール固定、およびホルマリン固定、その後のパラフィン包埋（ＦＥＰＥ）など、多くの方法が知られている。任意の好適な固定剤を使用することができる。例としては、エタノール、酢酸、ピクリン酸、２−プロパノール、３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド二水和物、アセトイン（モノマーの混合物）およびダイマー、アクロレイン、クロトンアルデヒド（ｃｉｓ＋ｔｒａｎｓ）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサール、重クロム酸カリウム、過マンガン酸カリウム、四酸化オスミウム、パラホルムアルデヒド、塩化第二水銀、２，４−ジイソシアン酸トリレン、トリクロロ酢酸、タングステン酸が挙げられる。他の例としては、ホルマリン（水性ホルムアルデヒド）ａｎｄ中性緩衝ホルマリン、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミダート、ベンゾキノン、オスミン酸および四酸化オスミウムが挙げられる。新鮮な生検標本、細胞標品（例えば、タッチ標本（ｔｏｕｃｈ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）および血液塗抹）、凍結切片およびＩＨＣ分析用組織は、有機溶媒、例えば、エタノール、酢酸、メタノールおよび／またはアセトンに固定することができる。
【００８３】
試料を採取するために、患者から試料を採取する任意の方法、例えば、採血、脊椎穿刺、組織スミアもしくはスクレープ、または組織生検を使用することができる。したがって、試料は、生検標本（例えば、腫瘍、ポリープ、腫瘤（固形細胞））、吸引物、塗抹または血液試料であり得る。試料は、腫瘍（例えば、癌性増殖）および／または腫瘍細胞を有するか、あるいは、腫瘍および／または腫瘍細胞を有する疑いのある組織であり得る。例えば、腫瘍生検は、直視下生検、標的領域から全（切除生検）または部分（切開生検）腫瘤を除去する手順で得ることができる。あるいは、腫瘍試料は、経皮的生検、針用器具を用い、小切開または穿刺を行って（画像装置の助けの有無にかかわらず）、個々の細胞もしくは細胞塊（例えば、微細針吸引（ＦＮＡ））、または組織のコアもしくはフラグメントを得る手順で得ることができる。
【００８４】
試料は、細胞学的に（例えば、塗抹））、組織学的に（例えば、凍結もしくはパラフィン切片）または他の任意の好適な方法（例えば、分子診断法）により検査することができる。腫瘍試料はまた、個体組織由来の培養ヒト細胞からインビトロで採集することによっても得ることができる。腫瘍細胞は、必要に応じて、分析前に、急速凍結、または管理された凍結レジームなどの、分析可能な条件で試料のタンパク質および／または核酸を保存する好適な貯蔵手段によって貯蔵することができる。必要に応じて、凍結は、抗凍結剤、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、またはプロパンジオール−スクロースの存在下に行うことができる。腫瘍細胞は、必要に応じて、貯蔵前または貯蔵後に、分析目的のためにプールすることができる。
【００８５】
本発明の抗体は、標識、例えば、生物試料中の抗体、および抗体（例えば、ＶＩＳＴＡ）によって結合したタンパク質の検出を可能にする検出標識を含むことができる。検出標識は特に診断用途に好適である。例えば、ＶＩＳＴＡ抗体は、放射性同位体（ラジオアイソトープ）、で標識することができ、それは、当業者により、γカウンター、シンチレーションカウンターを用いて、またはオートラジオグラフィーもしくは他の好適な手段によって検出することができる。本発明の目的のために有用な同位体としては、限定はされないが、３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、３６Ｃｌ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅおよび７５Ｓｅが挙げられる。
【００８６】
本発明の抗体はまた、蛍光化合物（例えば、色素）で標識することができる。蛍光標識された抗体を適当な波長の光に曝露すると、その存在を化合物の蛍光によって検出することができる。最も一般的に使用されている蛍光標識は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンである。本発明の抗体はまた、１５２Ｅｕ、または他のランタニド系などの蛍光を発する金属を用いて標識することができる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、テトラアザシクロドデカン四酢酸（ＤＯＴＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート基によって抗体分子に結合することができる。
【００８７】
本発明の抗体はまた化学発光化合物に結合することができる。有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
【００８８】
同様に、生物発光化合物を、本発明の抗体の標識のために使用することができる。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応効率を増大させる生物系で見出された化学発酵のタイプである。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって測定される。抗体を標識する目的のために有用な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【００８９】
標識された抗体の検出は、検出可能な標識が放射性放出体の場合には、例えば、シンチレーションカウンターで、あるいは、標識が蛍光体である場合には、例えば、蛍光光度計で行うことができる。酵素標識の場合、検出は、酵素の基質を使用する比色法によって行うことができる。検出はまた、基質の酵素反応の範囲を、同様に調製した標準と目視で比較することにより行うことができる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、試料中のＶＩＳＴＡタンパク質の適切な量もまた決定される。例えば、試料からの標識の強度を、知られた標準または対照試料の強度と比較することができる。試料中の検出可能な標的（例えば、ＶＩＳＴＡタンパク質）の量を推定することは、例えば、様々な診断検査で有用であり、推定値は疑われる病気または疾患の治療計画を立てるために使用することができる。いくつかの市販の濃度測定ソフトウエアプログラムおよび関連機器、例えば、Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃから入手できるものが、試料中の染色した標的の強度を定量するために利用可能である。
【００９１】
本発明の抗ＶＩＳＴＡ抗体を選択するための各種特性および配列情報を本明細書中の表１Ａ、１Ｂおよび２に示す。
【００９２】
【表１】
2018530514.tif 000003
【００９３】
【表２】
2018530514.tif 000004
【００９４】
【表３】
2018530514.tif 000005
【００９５】
【表４】
2018530514.tif 000006
【００９６】
【表５】
2018530514.tif 000007
【００９７】
【表６】
2018530514.tif 000008
【実施例】
【００９８】
実施例１：ヒト造血細胞におけるＶＩＳＴＡ発現の分析
方法：ＶＩＳＴＡ発現用新鮮ヒトＰＢＭＣの調製および染色
いくつかのドナーから新鮮単離したＰＢＭＣ（末梢血単核球）におけるＶＩＳＴＡ発現を試験した。染色に抗ヒトＶＩＳＴＡビオチン（ＧＡ−１）を使用した（５μｇ／ｍｌ）。マウスＩｇＧ１、Ｋビオチン（クローンＭＯＰＣ−２１、５μｇ／ｍｌ）をアイソタイプ対照として使用した。
【００９９】
ドナー材料
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｏｒｐ．（Ｃｏｌｍａｒ、ＰＡ）から血液試料を得、同じ日に採取し、分析した。ヘパリン硫酸を含む全血１０ｍｌを分析のために送った。
【０１００】
試料の調製
血液を滅菌ＰＢＳにより１：１に希釈した。希釈した臍帯血２２ｍｌを、５０ｍｌコニカルチューブ内の滅菌Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  カタログ番号１７−１４４００３）上に注ぎ、層を形成した。チューブを１８００ｒｐｍで２０分間、室温で遠心分離機にかけた。遠心分離後、１ｍｌピペットを用いて界面の単核球を採取し、２本の５０ｍｌコニカルチューブに入れた。滅菌ＰＢＳを各チューブに加えて、体積を５０ｍｌとし、細胞を３００ｇで、１０分間、４℃で遠心分離機にかけた。上清を捨てた。細胞を５０ｍｌの滅菌ＰＢＳ中に再懸濁し、チューブを３００ｇで１０分間、４℃で回転させた。上清を捨てた。細胞をまとめ、計数前に、５０ｍｌの滅菌ＰＢＳ中に再懸濁した。
【０１０１】
染色プロトコル：５×１０７個のＰＢＭＣを含有する凍結バイアルを、補償制御のために使用し、かつ染色用対照として使用した。
【０１０２】
以下の試薬および／または消耗品を使用した。
【０１０３】
０．２％ＥＤＴＡを補充したＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＳＡ）（カタログ番号５５４６５７）；リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ  カタログ番号１４１９０）；９６ウエルポリプロピレン丸底プレート（ＢＤ＃３０７７）；１．２ｍｌプリプロピレンクラスターチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃４４５１）；ＩｍｍｕｎｏＮｅｘｔ製のビオチン化抗ＶＩＳＴＡクローンＧＡ−１  Ｌｏｔ番号０８０６１２Ｂ（５μｇ／ｍｌで使用）；ビオチン化ｍＩｇＧ１、Ｋアイソタイプ対照（クローンＭＯＰＣ−２１）；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号４００１０４、ロット番号Ｂ１１６６４９（５μｇ／ｍｌで使用）；抗ヒト抗体（下の染色表を参照）；近赤外吸収ライブ・デッド色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｌ１０１１９）；およびＳＴＰ−ＡＰＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  カタログ番号５５４０６７、ロット番号０４２５１）（ＦＡＣＳ緩衝液で１：２００に希釈して使用）、ＳＴＰ−ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号４０５２０３、ロット番号Ｂ１３９６８８）（ＦＡＣＳ緩衝液で１：２００に希釈して使用））、ＳＴＰ−ＰＥＣｙ７（アイソタイプ対照試料臭いて非特異的結合を示す）、ＳＴＰ−Ｑ６０５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｑ１０１０１ＭＰ、ロット番号５３４４９Ａ）（ＦＡＣＳ緩衝液で１：２００に希釈して使用）を含むトレプトアビジン試薬。
【０１０４】
細胞表面染色プロトコル
染色前に、１×１０６個の細胞を９６ウエル丸底プレートに移し、１５０μｌのＰＢＳで洗浄した。その後、プレートを、１３００ｒｐｍ、４℃で、３分間、遠心分離機にかけた。
【０１０５】
その後、細胞をＰＢＳで再度洗浄し、上記のように遠心分離機にかけた。
【０１０６】
その後、０．２５μｌの近赤外吸収ライブ・デッド色素を含有する５０μｌのＰＢＳ中で染色を行った。室温で、１０分後、ウエルを１５０μｌのＦＡＣｓ染色緩衝液で洗浄し、１３００ｒｐｍ、４℃で、３分間、遠心分離機にかけた。上清を捨てた。
【０１０７】
ヒト血清を１：１００で含む５０μｌのＦＡＣＳ染色緩衝液で細胞をブロックした。プレートを４℃で、１５分間インキュベートした。その後、ウエルを１５０μｌのＦＡＣｓ染色緩衝液で洗浄し、１３００ｒｐｍ、４℃で、３分間、遠心分離機にかけた。上清を捨てた。
【０１０８】
その後、表面染色のために、以下の抗体を含有するカクテルを各ウエルに加えた。カクテルを下の表３〜６に記載する。各カクテルは対象の集団に応じて、他とは別に使用される。
【０１０９】
【表７】
2018530514.tif 000009
【０１１０】
【表８】
2018530514.tif 000010
【０１１１】
【表９】
2018530514.tif 000011
【０１１２】
【表１０】
2018530514.tif 000012
【０１１３】
表面染色後、細胞をＦＡＣＳ染色緩衝液で２回、前述のようにして洗浄し、１３００ｒｐｍ、４℃で、５分間、遠心分離機にかけた。試料を、蛍光標識された適切なストレプトアビジンを含む５０μｌのＦＡＣＳ染色緩衝液中に再懸濁した。試料を４℃で３０分間インキュベートした。細胞を１５０μｌのＦＡＣＳ染色緩衝液で洗浄し、１３００ｒｐｍ、４℃で、５分間、遠心分離機にかけた。この洗浄工程を繰返した後、試料を２５０μｌのＦＡＣＳ染色緩衝液中に再懸濁した。同日、試料をＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＴＭセルアナライザー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。
【０１１４】
データ解析
特定の表現型個体群をゲーティングするために、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖｅｒｓｉｏｎ９ソフトウエアを用いて、フローサイトメトリーデータを再分析した。異なる細胞サブセットにおけるＶＩＳＴＡ発現を比較するために、幾何平均の一覧を使用した。抗ＶＩＳＴＡ処理試料の平均値からアイソタイプ対照の値を減算することによって、各個体群をバックグラウンドで正規化した。グラフをプリズムで作成し、スチューデントのｔ検定（２種の試料のみを比較する場合）、またはボンフェローニのポスト検定を含む一元配置ＡＮＯＶＡを使用して統計処理を行った。
【０１１５】
結果：
ヒトミエロイドおよびリンパ球サブセットにおけるＶＩＳＴＡの発現：
図２Ａ〜２Ｅ、３Ａ〜３Ｇ、４、５Ａ〜５Ｂおよび６Ａ〜６Ｃに示すように、ＣＤ１４＋単球におけるＶＩＳＴＡ発現は、他の全ての個体群と大きく異なっていた（ｐ＜０．００１）。他の個体群間では大きな違いは認められなかった。末梢血では、単球が最も高レベルでＶＩＳＴＡを発現し、ＣＤ１４＋ＣＤ１６−サブセットがＣＤ１４ｌｏＣＤ１６＋細胞よりはるかに高い発現を示した。一方、ＡＰＣは中程度のＶＩＳＴＡ発現を示し、リンパ球サブセットは低い発現レベルを示した。
【０１１６】
ヒトＴサブセットおよびＮＫサブセットにおけるＶＩＳＴＡの発現：
図７Ａ〜７Ｅ、８Ａ〜８Ｇおよび９に示すように、ＮＫサブセットを含むＣＤ５６ｌｏ細胞はＣＤ５６ＨｉＮＫ細胞よりはるかに高いＶＩＳＴＡ発現レベルを示した。Ｔ細胞サブセットのうち、ＣＤ８＋記憶細胞は最も高い発現レベルを示したが、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞よりさほど高くはなかった。
【０１１７】
ヒト樹状細胞サブセットにおけるＶＩＳＴＡの発現：
図１０Ａ〜１０Ｄ、１１Ａ〜１１Ｃおよび１２に示すように、ＶＩＳＴＡ発現に大きな違いは認められず、ＤＣおよび好塩基球は低いＶＩＳＴＡ発現を示し、形質細胞用樹状細胞（ｐＤＣ）は一般にそれらと比較して高かったが顕著なほどではなかった。
【０１１８】
結論：これらの結果は、各種の免疫細胞サブセッにおけるＶＩＳＴＡ発現を示し、ＶＩＳＴＡは単球で最も高く発現し、種々のＴ細胞サブセットおよびＮＫ細胞ではいくらか発現し、Ｂ細胞では殆ど発現しない。
【０１１９】
実施例２：末梢血細胞におけるＶＩＳＴＡ発現
方法：
全血の染色：新鮮な単離全血（１００μｌ）を下記に示した抗体カクテルで、４℃で３０分間インキュベーションすることによって染色した。赤血球（ＲＢＣ）を溶解緩衝液で溶解し、残りの細胞を染色緩衝液で１回洗浄した。細胞を２００μｌの染色緩衝液に再懸濁した。ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメーターを用いてデータを集め、ＦｌｏｗＪｏ解析ソフトウエアを用いて解析した。
【０１２０】
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の染色：末梢血単核球をフィコール勾配を用いて全血から単離した。新しく単離した１×１０６ＰＢＭＣを１００μｌの染色緩衝液中で抗体カクテルにより染色した。試料を４℃で３０分間インキュベートし、その後、染色緩衝液で１回洗浄した。細胞を１００μｌの染色緩衝液に再懸濁した。ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてデータを集め、ＦｌｏｗＪｏ解析ソフトウエアを用いて解析した。
【０１２１】
使用した抗体は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１７７、ＣＤ１６、ＣＤ１５、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＨＬＡＤＲ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１２７、ＣＤ６９、およびＦＯＸＰ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）であった。ＡＰＣ−結合マウス抗ヒトＶＩＳＴＡ（クローンＧＧ８）をＩｍｍｕＮｅｘｔ（Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ）により作製した。
【０１２２】
結論：
健常ヒト末梢血細胞におけるＶＩＳＴＡの発現
全血および末梢血単核球のＶＩＳＴＡ発現をマルチカラーフローサイトメトリーを用いて解析した。図１５Ａおよび１５Ｂに示すように、最も高いＶＩＳＴＡ発現は、単核球で検出され、続いて、好中球で検出された。図１３Ｃおよび１３Ｄに示すように、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＶＩＳＴＡ発現は低レベルであった。
【０１２３】
癌患者の末梢血細胞におけるＶＩＳＴＡの発現
図１４Ａ〜Ｃに示すように、肺癌患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を解析した。図１４Ａは、ＣＤ１４＋単球およびＣＤ１５＋ミエロイド由来の抑制性細胞（ＭＤＳＣ）の解析を示す代表的なフロープロットである。結果は、表現型の上では、ＣＤ１５＋ｃ細胞が好中球由来のＭＤＳＣであることを示唆している。さらに、これらの細胞は健常者の血液試料には存在しない。図１４Ｂは、健常者と癌患者由来の単球におけるＶＩＳＴＡ発現の代表的なヒストグラムであり、健常対照に比較して癌患者のＶＩＳＴＡ発現レベルが高いことを示唆している。同様に、図１４Ｃに示すように、癌患者のＭＤＳＣでは、高レベルのＶＩＳＴＡが認められた。
【０１２４】
図１５Ａは、結腸癌患者の血液に好中球由来のＭＤＳＣが存在することを示す代表的なＦＡＣＳプロットである。図１５Ｂおよび１５Ｃは、健常なドナーの血液試料に比べて癌患者の単球におけるＶＩＳＴＡ発現がより高いことを示す代表的なヒストグラムである。
【０１２５】
カニクイザルの末梢血細胞におけるＶＩＳＴＡの発現
図１６Ａおよび１６Ｂに示すように、サルの全血のフローサイトメトリー解析はヒト細胞に似たＶＩＳＴＡ発現パターンを示した。単球および好中球はいずれも、ＣＤ４＋（図１６Ｃ）およびＣＤ８＋（図１６Ｄ）Ｔ細胞に比べて最高レベルでＶＩＳＴＡを発現した。
【０１２６】
実施例３：ヘム悪性細胞株におけるＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルでのＶＩＳＴＡ発現
ＶＩＳＴＡはヘム悪性腫瘍で発現するため、抗ＶＩＳＴＡ抗体は悪性細胞を破壊の標的とし、また、ＶＩＳＴＡをブロックして、抗腫瘍免疫反応を促進する可能性がある。
【０１２７】
データは約１４０ヘム悪性細胞株（解析においては、いくつかの細胞種は繰り返される）のＲＮＡｓｅｑを含む。データを図１７に示す。
【０１２８】
ＲＮＡｓｅｑ値をＦＰＫＭ（マップされたフラグメント１００万本当たりのエクソン１キロベース当たりのフラグメント数）値で示す。
【０１２９】
実質的に、これは、遺伝子のエクソン領域内の全リードが計数され、遺伝子長と試料当たりの全リード数により正規化されていることを意味する（試料間の差を説明するため）。カットオフ値は１で、１超はＶＩＳＴＡ発現（ＲＮＡレベルで）が陽性であり、１未満はＶＩＳＴＡ発現が陰性である。
【０１３０】
結果は、多くの細胞株がＲＮＡレベルで陽性であることを示した（急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病）。ＶＩＳＴＡは正常なミエロイド細胞で高発現し、その機能は抗腫瘍免疫応答などの免疫応答を低下させると考えられることから、このことが予期され得る。
【０１３１】
実施例４：ＶＩＳＴＡに対するモノクローナル抗体の生成
ファージパニング
２４のファージパニング実験を行い、Ｃｙｎｏ  ＶＩＳＴＡ−Ｈｉｓに対するファージの反応性を向上させた。カニクイザルＶＩＳＴＡタンパク質は、ヒトＶＩＳＴＡタンパク質より良好なビオチン結合を示すため、これらの実験にはそのカニクイザルＶＩＳＴＡタンパク質を使用した。ファージ実験の成功を決定するために、それぞれのパニングラウンドからのファージプールをビオチン化ｃｙｎｏ  ＶＩＳＴＡ−Ｈｉｓでコーティングしたニュートラアビジンプレートに加え、ＨＲＰ−結合抗Ｍ１３抗体で検出した。ファージ選択ラウンドで個々のコロニーを採取し、９６ウエルプレート中でＦａｂタンパク質を産生させた。発現したＦａｂ上清をビオチン化ｃｙｎｏ  ＶＩＳＴＡ−Ｈｉｓへの結合について分析した。これには２００より多くがヒットした。
【０１３２】
ＦａｂプレートのＶＨおよびＶＬ領域を増幅し、ＤＮＡ配列決定を行い、ＦＡＳＴＡファイルとしてエクスポートした。変質されＭＡＢとして試験されるべきクローンを採取する場合に、クローンは配列多様性ならびに翻訳語修飾の危険性が限られていること、および疎水性残基がなるべく少ないことを基準に選択された。
【０１３３】
ファージクローンからのＶＨおよびＶＬを哺乳動物のＩｇＧ１／ｋａｐｐａ発現ベクターにサブクローン化し、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ親和性樹脂により、抗体を精製した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ測定を使用した定量ＥＬＩＳＡによりファージＭＡＢの濃度を決定した。抗体パネルは高レベルで発現した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、発現した各抗体変異体の完全性が示された。
【０１３４】
ＶＬ多様性を有するファージベクターへクローニングするための、パニングの最終ラウンドから得られたポリクローナル抗体混合物のＶＨドメインを増幅することによって、ファージ抗体をインライン成熟させた。これにより、濃縮されたＶＨプールが得られ、これはＶＬの多様性が加わった試料となった。ファージは、ＶＩＳＴＡ  ＥＣＤ  Ｈｉｓタンパク質への非常に高アフィニティの結合を同定しようとする期待を伴った、１〜２ラウンドの厳しいパニングにより採取された。モノクローナルＦａｂのＥＬＩＳＡを行い、成熟が成功したことを決定した。ＥＬＩＳＡおよび発現データを、元のもののパニング実験から１００％に設定された参照クローンに対して正規化し、ｃｙｎｏ  ＶＩＳＴＡ抗原への結合シグナルが参照クローンより強いアフィニティ成熟クローンが同定された。このプロセスは、低濃度の抗原（１ｎＭ）でスクリーニングすると、２００％までの結合を示す数種のクローンを生み出し、最も高いアフィニティを有するクローンは、ＭＡＢとしてその配列が決定され生産された。
【０１３５】
ハイブリドーマの生成
ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌマウスの１グループは、完全フロイントアジュバント中で乳化したＨｕ  ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ組み換えタンパク質（Ｓｉｎｏ）５０μｇの腹腔内（ＩＰ）注射を１回受け、２週後、不完全フロイントアジュバント中で乳化したＨｕ  ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ組み換えタンパク質５０μｇのＩＰ注射を１回受けた。２週後、マウスは、不完全フロイントアジュバント中で乳化したｃｙｎｏ  ＶＩＳＴＡ−Ｆｃ組み換えタンパク質５０μｇのＩＰ注射を１回受けた。全てのマウスは、尾の基部にＰＢＳ中２５μｇのヒトおよび同２５μｇのｃｙｎｏ  ＶＩＳＴＡの最終注射を受け、５日後、融合のために脾臓を回収した。
【０１３６】
別の群のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌマウスは、完全フロイントアジュバント中で乳化したＨｕ  ＶＩＳＴＡ−Ｈｉｓ組み換えタンパク質５０μｇのＩＰ注射を１回受けた。２週間後、マウスは、不完全フロイントアジュバント中で乳化したＨｕ  ＶＩＳＴＡ−Ｈｉｓ組み換えタンパク質５０μｇのＩＰ注射を１回受けた。２週間後、マウスは、不完全フロイントアジュバント中で乳化したＣｙｎｏ  ＶＩＳＴＡ−Ｈｉｓ組み換えタンパク質５０μｇのＩＰ注射を１回受けた。２週間後、全てのマウスは、ＰＢＳ中２５μｇのＨｕ  ＶＩＳＴＡ−Ｈｉｓおよび同２５μｇのＣｙｎｏ  ＶＩＳＴＡ−Ｈｉｓの最終注射を受け、３日後、融合のために脾臓を回収した。
【０１３７】
融合の日に、マウスをＣＯ２窒息により安楽死させ、脾臓を取り出し、１０ｍＬの冷リン酸緩衝食塩水に入れた。小さい乳棒を用いて、細かい網目のスクリーンを通して脾臓をすり潰し、室温でＰＢＳにより濯いで、脾臓細胞の単一細胞懸濁液を調製した。細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、ＲＢＣ溶解に供した。簡潔に記せば、脾臓ごとに細胞を３ｍＬのＲＢＣ溶解バッファ（Ｓｉｇｍａ＃Ｒ７７５７）に再懸濁させ、氷上に５分間置いた。再度、細胞をＰＢＳにより室温で１回洗浄し、磁気ソートのために標識した。製造業者の指示書により、細胞には、抗マウスＴｈｙ１．２、抗マウスＣＤ１１ｂおよび抗マウスＩｇＭ磁気ビーズ（それぞれＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ＃１３０−０４９−１０１、１３０−０４９−６０１および１３０−０４７−３０１）で標識し、その後、Ｍｉｄｉ  ＭＡＣＳを用いてＭＳカラムによりソートした。陰性の細胞画分（陽性の細胞画分は廃棄した）をＦＯ細胞と融合させた。１：１の比のマウス骨髄細胞対生脾臓細胞で融合を行った。簡潔に記せば、脾臓および骨髄細胞を一緒に混合して、ペレット化し、５０ｍＬのＰＢＳ中で１回洗浄した。１０ｅ８個の脾臓細胞当たり１ｍＬのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液（２ｇ  ＰＥＧ、分子量４０００、２ｍＬ  ＤＭＥＭ、０．４ｍＬ  ＤＭＳＯ）を用いて、ペレットを３７℃で３０秒間再懸濁させた。次いで、細胞／融合混合物を緩やかに撹拌しながら３７℃の水浴に約６０秒間浸漬した。３７℃のＤＭＥＭを１分間かけて徐々に添加し、融合反応を停止させた。融合した細胞を室温で５分間静置し、次いで１５０Ｇで５分間遠心分離した。その後、ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ０２６２）を含むＭｅｄｉｕｍ  Ｅ−ＨＡＴ（Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号０３８０５）に細胞を再懸濁させ、９６ウエル平底ポリスチレン組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３９９７）に播種した。
【０１３８】
捕捉ＥＩＡを使用して、ｃｙｎｏ  ＶＩＳＴＡ特異的抗体についてハイブリドーマ上清をスクリーニングした。簡潔に記せば、プレート（Ｎｕｎｃ−Ｍａｘｉｓｏｒｐ＃４４６６１２）は、少なくとも６０分間、コーティングバッファ（Ｔｈｅｒｍｏ２８３８２）中のヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ＃１１５−００６−０７１）で４μｇ／ｍｌの濃度でコーティングした。プレートを、ＰＢＳ中２００μｌ／ウェルの０．４％（重量／体積）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）により、室温で３０分間ブロッキングした。プレートを１回洗浄し、５０μｌ／ウェルのハイブリドーマ上清を加え、室温で少なくとも３０分間インキュベートした。プレートを１回洗浄し、５０μｌ／ウェルの０．１μｇ／ｍＬのｃｙｎｏ  ＶＩＳＴＡ−ｈｕＩｇを加え、室温で３０分間インキュベートした。プレートを１回洗浄し、０．４％ＢＳＡ／ＰＢＳ中１：４０，０００のストレプトアビジンＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ０１６−０３０−０８４）をプレートに加え、室温で３０分間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、続いて１００μｌ／ウェルＴＭＢ  Ｔｕｒｂｏ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ３４０２２）を使用して、室温で約１０分間インキュベートして、発色させた。２５μｌ／ウェルの４Ｎ硫酸を使用して反応を停止させ、自動プレート分光計を使用して４５０ｎｍで吸光度を測定した。限界希釈法により、一次ヒットのうち１５個をサブクローニングのために選択し、一次スクリーニングと同じ形式でスクリーニングした。
【０１３９】
全てのｃｙｎｏ  ＶＩＳＴＡ反応性ハイブリドーマ細胞株を、ヒトＶＩＳＴＡ−Ｉｇを使用して交差スクリーニングし、交差反応性を評価した。簡潔に記せば、プレート（Ｎｕｎｃ−Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ＃４４６６１２）を、０．１Ｍ炭酸−重炭酸ナトリウムバッファ、ｐＨ９．４（Ｐｉｅｒｃｅ  ２８３８２  ＢｕｐＨＴＭ）中４μｇ／ｍＬのヤギ抗ｍｓ  Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ＃１１５−００６−０７１）により、４℃で終夜コーティングした。洗浄せずに、ウェルを、２００μｌのブロック液（ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中０．４％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）（重量／体積））により、４℃で終夜ブロッキングした。ブロック溶液を除去した後、希釈していないハイブリドーマ上清を、コーティングしたプレート上、室温で３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ）（重量／体積））で１回洗浄し、その後Ｈｕ  ＶＩＳＴＡ−Ｉｇをブロック液中で１００ｎｇ／ｍｌに希釈して３０分間インキュベートした。プレートを、１回洗浄し、ブロック液中１：１０，０００に希釈したヤギ抗ヒトＦｃ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ＃１０９−０３６−０９８）により、室温で３０分間プローブ処理した。プレートを再度洗浄し、続いて１００μｌ／ウェルのＴＭＢ  Ｔｕｒｂｏ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ３４０２２）を使用して、室温で約１０分間インキュベートして発色させた。２５μｌ／ウェルの４Ｎ硫酸を使用して反応を停止させ、自動プレート分光計を使用して４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１４０】
ヒトおよびカニクイザルの両方のＶＩＳＴＡに反応性を有することを示したハイブリドーマは、クローニングされたＶ領域抗体配列を有した。ハイブリドーマ細胞を調製し、その後ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ｃｅｌｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて逆転写（ＲＴ）反応を行った。簡潔に記せば、培養培地を廃棄し、プレートを氷上に置き、２００μｌの冷ＰＢＳに再懸濁させた。４０μｌをＭｉｃｒｏＡｍｐ高速９６ウェル反応ＰＣＲプレートに移し、プレートを冷金属プレートベース上に置き、プラスチックフィルムで密封して、７００ｒｐｍで３分間回転させた。ＰＢＳを廃棄し、各ウェルに１０μｌ再懸濁バッファおよび１μｌの溶解促進剤を加えた。プレートを密封し、７５℃で１０分間インキュベートして、−８０℃で保存した。
【０１４１】
ＲＴ反応のために、各ウェルは５μｌの水、１．６μｌの１０×ＤＮａｓｅバッファ、１．２μｌの５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２μｌのＯｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（５０ｍＭ）および１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘを含んだ。プレートを７０℃で５分間インキュベートし、続いて氷上で２分間インキュベートし、その後以下の試薬を各ウェルに加えた：６μｌの５×ＲＴバッファ、１μｌのＲＮａｓｅＯＵＴＴＭ（４０Ｕ／μｌ）、１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩＩ  ＲＴ（２００Ｕ／μｌ）および１μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ。プレートに封をし、５０℃に予備加熱したサーマルサイクラー上に置き、５０℃で５０分間インキュベートし、その後不活性化させた（８５℃で５分間のインキュベーション）。反応物を氷上で冷やし、一本鎖ｃＤＮＡを、次に使用するまで−８０℃で保存した。
【０１４２】
Ｖ領域増幅のために、２０μｌのＰＣＲ反応を設定した。各ウェルは、１６．２μｌの水、２．０μｌの１０×ＰＣＲ反応バッファ、０．８μｌのＭｇＳＯ４（５０ｍＭ）、０．４μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．１５μｌの１００ｕＭフォワードプライマー混合物、０．０５μｌの１００ｕＭリバースプライマー、０．２μｌのＨｉＦｉ  Ｔａｇ酵素を含んだ。上記のように調製したｃＤＮＡ（２μｌ／ウェル）をＰＣＲ内容混合物に移し、プレートに封をして、増幅反応を行った：ＶＨに対してプログラムは、（ｉ）９４℃で１分間、（ｉｉ）９４℃で１５秒間、（ｉｉｉ）５５℃で３０秒間、（ｉｖ）６８℃で１分間とした。工程（ｉｉ〜ｉｖ）を合計３５サイクル繰り返し、その後、６８℃で３分の最後の伸長を続けた。ＶＬに対してプログラムは、（ｉ）９４℃で１分間、（ｉｉ）９４℃で１５秒間、（ｉｉｉ）５５℃で３０秒間、（ｉｖ）６５℃で３０秒間、（ｖ）６８℃で１分間とした。工程（ｉｉ〜ｖ）を合計３５サイクル繰り返し、その後６８℃で３分の最後の伸長を続けた。
【０１４３】
フォワードプライマーを予め混合し、そうした混合物とリバースプライマーを３：１の比で使用した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で検証した。促進剤（Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＣ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ、カタログ番号６３９６５０、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を加えることにより、注入クローニングのための反応物を調製した。５μｌのＰＣＲ反応物をＰＣＲプレートに移し、続いて２μｌの促進剤／ウエルを移した。プレートに封をし、サーマルサイクラー（３７℃で１５分および８０℃で１５分）中でインキュベートした。Ｅｓｐ３Ｉ消化により目的のベクター（ｖＤＲ２４３またはｖＤＲ３０１）を調製した（３０μｌの反応において、１．５μｇのベクターは３μｌのＴａｎｇｏバッファ、２ｌのＥｓｐ３Ｉおよび水中で、３７℃で２時間かけて消化した）。
【０１４４】
注入クローニングのために、２μｌの促進剤で処理したＰＣＲ産物を１００ｎｇのＥｓｐ３Ｉ消化ベクターおよび２μｌの５Ｘ注入酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と混合した。注入反応は、９６ウエルＰＣＲプレート形式で行った。ＰＣＲマシン上でプレートを５０℃で１５分間インキュベートし、Ｓｔｅｌｌａコンポーネント細胞を、振盪することなく４２℃で４０秒間ヒートショックにより形質転換し、選択抗生物質を有するＬＢ寒天プレート上に撒き、３７℃で終夜インキュベートした。翌日、コロニーを、ＬＢ／カーベニシリン培地を含む９６ウエルの深底ウエルプレートに採取し、３７℃で終夜増殖させた。等容量の３０％重量／体積グリセロールと混合した終夜培養物から凍結ストックを作製した。配列決定プライマーＳＰＦ００５２を使用してＶ領域を配列決定した。配列を解析して、ハイブリドーマｖＨおよびｖＬ当たり１つの陽性ウエルを選択し、新しいプレートに再配置して、アンピシリンを有する富化培地中で終夜増殖させた。次いで、９６ウエルプレート中、小規模トランスフェクションのためにクローンをミニプレップＤＮＡ調製した。
【０１４５】
重鎖および軽鎖の両方について４８個の選択されたマウスハイブリドーマ配列は、インターナルソフトウェアプログラムを使用して適合させたヒトフレームワークであった。マウスｖＨまたはｖＬのそれぞれ１つについて１つのヒトフレームワークを選択した。逆翻訳によりＶ領域ＤＮＡ配列を得た。ＨＦＡアミノ酸配列に対応する合成ＤＮＡ領域は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）に注文した。予め切断したｖＤＲ１４９およびｖＤＲ１５７、ヒトＩｇＧ１およびヒトκそれぞれにクローニングした。Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｎｄｏ−ｆｒｅｅ  Ｍａｘｉ−ｐｒｅｐキットを使用してＤＮＡを調製した。Ｅｘｐｉ２９３（１００ｍｌ）培養物を使用してこの抗体パネルを発現させた。
【０１４６】
実施例５：インビトロにおけるヒトＶＩＳＴＡ−ＩＧ  Ｔ細胞抑制アッセイのためのプロトコル
マウスＡ２０細胞に、ＧＦＰまたはヒトＶＩＳＴＡのいずれかを安定にトランスフェクトした。それらをｏｖａペプチドおよびＤＯ１１．１０  Ｔ細胞とインキュベートした。インキュベーションの開始から２４時間後、Ｔ細胞によるＣＤ２５の発現を測定した。Ａ２０−ｈｕＶＩＳＴＡ細胞は、Ｔ細胞によるＣＤ２５発現を抑制するが、この読み出しは、ＶＳＴＢ９５とのインキュベーションにより有意に修復される（図１８）。
【０１４７】
実施例６：抗ＶＩＳＴＡ抗体のヒトフレームワーク領域の適合
重鎖および軽鎖の両方のマウスハイブリドーマ配列は、インターナルソフトウェアプログラムを使用してＣＤＲ移植（Ｊｏｎｅｓ、ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５（１９８６）により適合されたヒトフレームワークであった。このプログラムは、Ｋａｂａｔの定義（Ｗｕ、Ｔ．Ｔ．＆  Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．（１９７０）．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、１３２、２１１−５０）に従ってＶ領域配列の相補性決定領域（ＣＤＲ）を表し、Ｂｌａｓｔを使用してフレームワーク領域とヒト生殖細胞系遺伝子を比較する。マウスフレームワークに対して最も高い配列同一性を有するヒト生殖細胞系を、ヒトフレームワーク適合（ＨＦＡ）のためのアクセプター遺伝子として選択した。いくつかの場合において、ヒトフレームワークが良好に発現された以前の実験に基づいて、密接に関連のあるヒト生殖細胞系遺伝子を代わりに選択した。マウスｖＨまたはｖＬのＶ領域のそれぞれについて選択されたヒトフレームワークについてのＤＮＡ配列を逆翻訳により得た。ＨＦＡアミノ酸配列に対応する合成ＤＮＡ領域は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）に注文した。ヒトＩｇＧ１およびヒトκのそれぞれへのクローニングを行った。
【０１４８】
実施例７：抗ＶＩＳＴＡ抗体構築物
細胞株開発用分子のためのプラスミドおよび配列情報：ＶＳＴＢ１１２可変領域およびＩｇＧ１κ定常領域（ＶＳＴＢ１７４、定常領域中のアロタイプ変化のために新しい番号）、ＩｇＧ２σ定常領域（ＶＳＴＢ１４０）またはＩｇＧ１プロテアーゼ耐性定常領域（ＶＳＴＢ１４９）を有する抗ＶＩＳＴＡ抗体のためにプラスミド構築物を作製した。
【０１４９】
Ｌｏｎｚａベクター
ｐＥＥ６．４およびｐＥＥ１２．４チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）発現ベクター系（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＰＬＣ）は、哺乳動物発現細胞株における治療用ｍＡｂ作製のための一次発現系としてＢｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＢＲ）およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ＆  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＰＤＭＳ）で確立された。各ベクターは、重鎖（ＨＣ）または軽鎖（ＬＣ）の発現を駆動するためのヒトサイトメガロウイルス（ｈｕＣＭＶ−ＭＩＥ）プロモーターを含み、アンピシリン耐性遺伝子を含む。ｐＥＥ１２．４ベクターはまた、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）酵素をコードする遺伝子を含む。グルタミンシンターゼ活性を必要とする増殖条件は、発現ベクターを維持するために、細胞に選択的な圧力を加える（ＧＳ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｅｒｓｉｏｎ４．０）。一遺伝子ベクターとして、ｐＥＥ６．４を使用してＨＣ遺伝子をクローニングし、ｐＥＥ１２．４を使用してＬＣ遺伝子をクローニングした。これらの２つのＬｏｎｚａ一遺伝子ベクターからＬｏｎｚａ二重遺伝子プラスミドが作製される。
【０１５０】
選択ＶＩＳＴ  ＡｍＡｂの重鎖可変領域のアミノ酸配列
【０１５１】
＞ＶＳＴＢ１１２重鎖（配列番号３７）
【化２】
2018530514.tif 000013
【０１５２】
＞ＶＳＴＢ５０重鎖（配列番号３８）
【化３】
2018530514.tif 000014
【０１５３】
＞ＶＳＴＢ５３重鎖（配列番号３９）
【化４】
2018530514.tif 000015
【０１５４】
＞ＶＳＴＢ９５重鎖（配列番号４０）
【化５】
2018530514.tif 000016
【０１５５】
＞ＶＳＴＢ１１６重鎖（配列番号６４）
【化６】
2018530514.tif 000017
【０１５６】
選択ＶＩＳＴ  ＡｍＡｂの軽鎖可変領域のアミノ酸配列
【０１５７】
＞ＶＳＴＢ５０軽鎖（配列番号４１）
【化７】
2018530514.tif 000018
【０１５８】
＞ＶＳＴＢ５３軽鎖（配列番号４２）
【化８】
2018530514.tif 000019
【０１５９】
＞ＶＳＴＢ９５軽鎖（配列番号４３）
【化９】
2018530514.tif 000020
【０１６０】
＞ＶＳＴＢ１１２軽鎖（配列番号４４）
【化１０】
2018530514.tif 000021
【０１６１】
＞ＶＳＴＢ１１６軽鎖（配列番号４５）
【化１１】
2018530514.tif 000022
【０１６２】
実施例８：抗ＶＩＳＴＡ抗体のＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳスクリーニング
これらの実験は、産生された抗体のヒトまたはカニクイザルＶＩＳＴＡタンパク質に対する結合能をＥＬＩＳＡにおいて測定するため、および、ＦＡＣＳスクリーニングにより、その抗体の、ヒトまたはカニクイザルＶＩＳＴＡタンパク質を発現するＫ５６２細胞（ヒト骨髄性白血病細胞株）の表面のＶＩＳＴＡタンパク質に対する結合能を測定するために行われた。
【０１６３】
方法：
ＥＬＩＳＡ手順概要：プレートを、終夜、４℃で、１μｇ／ｍｌ  ＳＢ０３６１（ヒト）またはＳＢ０３６１（ｃｙｎｏ（カニクイザル））タンパク質をコーティングした。それらはそれぞれの種からのＶＩＳＴＡの細胞外ドメインである。抗体を出発濃度として１μｇ／ｍｌに希釈し、計４種の濃度に１：４の段階希釈を行い、室温室温（ＲＴ）で２時間インキュベートした。マウス抗ヒトＩｇＧ１−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を検出のために使用し、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄は全て、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）を用いて行った。
【０１６４】
ＦＡＣＳ手順概要：２×１０５Ｋ５６２−Ｇ８（ヒト）またはＫ５６２−Ｃ７（ｃｙｎｏ）細胞を、５μｇ／ｍｌの各試験抗体で染色し、４℃で３０分間インキュベートした。ヤギ抗ヒトＩｇＧ１−ＰＥ（フィコエリスリン）抗体を、二次検出抗体として５μｇ／ｍｌで使用した。細胞をＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａにかけ、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアを用いて（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｇ、ＯＲ）生きた集団のＭＦＩ（平均蛍光強度）で解析した。
【０１６５】
データ解析／結果：各抗体について、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ解析の両方で、抗体が確実に結合したか否かに関する主観的スコア（イエス／ノー）を、４アッセイのそれぞれで示した。ｓ抗体がいずれかのアッセイで結合に対し「ノー」という結果を示したなら、それがネガティブであることを確認することを繰り返した。結果を、下の表７と、図１９Ａ〜１９Ｆおよび２０Ａ〜２０Ｆに示す。
【０１６６】
【表１１】
2018530514.tif 000023
【０１６７】
実施例９：混合リンパ球反応（ＭＬＲ）およびブドウ球菌腸毒素Ｂ（ＳＥＢ）活性化アッセイを使用した抗ヒトＶＩＳＴＡ抗体のスクリーニング結果
この試験の目的は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイおよびブドウ球菌腸毒素Ｂ活性化（ＳＥＢ）アッセイにおいて細胞性免疫応答を高める多機能的αＶＩＳＴＡ抗体の同定を支援するデータを示すことであった。
【０１６８】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）は、同種異系Ｔ細胞応答を駆動するのにミスマッチなＭＨＣクラスＩおよびＩＩに依存する標準的な免疫学的アッセイである。末梢血単核細胞を２つのミスマッチの個体から単離して、一緒にインキュベートし、これらのミスマッチの結果として増殖およびサイトカイン産生が起こる。
【０１６９】
材料と方法：
５００ｍｌのＲＰＭＩと５０ｍｌのヒトＡＢ血清、５ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍｌ）、５ｍｌのＬ−グルタミン（１００ｘ）および１０ｍｌのＨＥＰＥＳ（１Ｍ）を合わせて１０％ＡＢ培地を調製した。培地は１４日を超えない日数保存した。０．２ｍｌのチミジンストック（１ｍＣｉ／ｍｌ）を９．８ｍｌのＲＰＭＩで希釈して、１ｍＣｉの力価のチミジンを調製した。
【０１７０】
可溶性ＶＩＳＴＡ抗体を１０％ＡＢ血清培地中で２０μｇ／ｍｌに希釈した。１００μｌの適切な抗体溶液を９６ウエルＵ底プレート（Ｆａｌｃｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ＃３５３０７７または同等物）の適切なウエルに加えた。種々の細胞集団を添加した後、最終濃度は１０μｇ／ｍｌであった。
【０１７１】
白血球の単離：ドナーは少なくとも１８歳であり、一般に健常で、局所的な集団から無作為的に選択された。単離チューブから５０ｍｌ円錐チューブにドナーの血液を移した。２５ｍｌの血液当たり、１５ｍｌのフィコール１０７７を、血液と混合しないように注意して下に入れた。室温で、細胞を１２５０Ｇで２５分間中断せずに遠心分離した。フィコールおよび血清の界面で白血球を単離し、細胞を４０ｍｌのハンクスバランス塩溶液（ＨＢＳＳ）に加えて希釈した。細胞を、４℃で１０分間、４５３Ｇ（１５００ｒｐｍ）で遠心分離した。細胞を５０ｍｌのＨＢＳＳに再懸濁させ、５００μｌの別のチューブに移して計数した。
【０１７２】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）９６ウエルプレートの設定：分析する試料の数に基づいて、アッセイに必要な「刺激細胞」および「応答細胞」の適切な数を決定した。９６ウエルＵ底プレートの１ウエル当たり刺激集団は０．５×１０５細胞／ウエルで播種し、応答集団は１．０×１０５細胞／ウエルで播種する。全ての条件は３回実施しなければならない。適切な数の「刺激細胞」を新しい円錐にピペッティングし、前述のように遠心分離した。細胞を１０ｍｌに再懸濁し、４０００ｒａｄで照射した。細胞を前述のように遠心分離し、１０％ＡＢ血清培地中１×１０６／ｍｌの濃度で再懸濁させ、５０μｌを適切なウエルに加えた。必要な数の応答細胞を単離し、前述のように遠心分離し、１０％ＡＢ血清培地中２×１０６／ｍｌの濃度で再懸濁させ、５０μｌを適切なウエルに加えた。細胞を３７℃で５日間、５％ＣＯ２中でインキュベートした。５日目に、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）産生の分析のために、３０μｌの上清を除去した。５日目に、２５μｌの４０μＣｉ／ｍｌの力価のチミジン溶液をそれぞれのウエルに添加し、３７℃および５％ＣＯ２で８時間インキュベートした。製造業者の指示書により、細胞を９６ウエルマイクロシンチレーションプレートに移した。製造業者に指示書により、マイクロシンチレーション計数器を使用して計数した。ＩＦＮ−γ濃度は、製造業者のプロトコルを使用して、ＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号８８−７３１６−８８）により決定した。
【０１７３】
データ解析：未処理のウエルについて１分当たりの平均カウント数（ＣＰＭ）またはＩＦＮ−γの濃度を計算した。各試験群の平均ＣＰＭまたはＩＦＮ−γを計算した。データセットをＬｏｇ１０変換した。それぞれの化合物について１２ＭＬＲ倍のスコアを使用して、それぞれの化合物の１２試験群のセットについての平均を計算した。１２試験の平均スコア＝Σ［（ｌｏｇ１０（試験化合物についての３回の平均ＣＰＭ））−（ｌｏｇ１０（未処理について３回の平均ＣＰＭ））］／１２
【０１７４】
許容基準：アッセイを行う前に、全ての試験試薬および適切な対照をエンドトキシンについて試験し、それらは＜０．１ＥＵ／ｍｇのレベルを有した。応答細胞は単独では、平均で７００ＣＰＭ未満のＣＰＭカウントを有し、単独でインキュベートしたときに、細胞が休眠状態にあったことが示された。ＭＬＲ群についてのＣＰＭは、単独でインキュベートした応答細胞のＣＰＭよりも少なくとも２倍高く、反応が起こったことおよびドナーがミスマッチであったことが示された。全てのＭＬＲアッセイは、ヒトＩｇＧ１陰性対照タンパク質を含んだ。ヒトＩｇＧ１陰性対照の結果は、スチューデントｔ検定の使用に基づいて、未処理試料とは統計的に異ならなかった。
【０１７５】
ＭＬＲにおける抗ＶＩＳＴＡ抗体のスクリーニング：全ての化合物の最初のスクリーニング。抗ＶＩＳＴＡ抗体を用いたＭＬＲを行う前に、抗体が、ＦＡＣＳ分析により細胞結合ＶＩＳＴＡおよびＥＬＩＳＡによりＶＩＳＴＡタンパク質の両方に結合することを確認した。抗体Ｓ２６（ＶＳＴＢ７７）、Ｓ３０（ＶＳＴＢ８６）、Ｓ３１（ＶＳＴＢ８８）、Ｓ３２（ＶＳＴＢ９０）およびＳ３９（ＶＳＴＢ７４）は、この最初のスクリーニングに失敗したが、アッセイにおいて依然試験中である。最初のスクリーニングの目的で、全ての抗体は、増殖を伴うＭＬＲ中１０μｇ／ｍｌで試験し、ＩＦＮ−γは測定されたパラメータであった（図２１Ａ〜２１Ｄおよび２２Ａ〜２２Ｂ）。
【０１７６】
６個の誘導抗体の選択。最初のスクリーニングから、さらなる分析のために６個の候補ＶＳＴＢ１１２（Ｓ２）、ＶＳＴＢ１１６（Ｓ５）、ＶＳＴＢ９５（Ｓ１６）、ＶＳＴＢ５０（Ｓ４１）、ＶＳＴＢ５３（Ｓ４３）およびＶＳＴＢ６０（Ｓ４７）を選択した。
【０１７７】
ＭＬＲにおける上部の６個の候補の希釈試験：プロトコルの調整。プロトコルは、抗体を以下の濃度：３０、１０、３、１、０．３、０．１、０．０３、０．０１および０μｇ／ｍｌの濃度に希釈するように調整して、前述のものと同じである。
【０１７８】
ＩＣ５０値の決定：元の（Ｒａｗ）ＣＰＭ数およびＩＦＮ−γ濃度を使用して、それぞれの抗体についてのＩＣ５０を決定した。ＩＣ５０の計算は、プログラム「ＥＺ−Ｒ  ｓｔａｔｓ」を使用して決定した。６個の個々の応答体を使用してＩＣ５０値を決定した。誘導候補の用量力価を有するＭＬＲにおける個々のＣＰＭ数およびＩＦＮ−γ濃度。
【０１７９】
【表１２】
2018530514.tif 000024
【０１８０】
結論：最初のスクリーニングは、複数のＶＩＳＴＡ特異的抗体はＭＬＲ細胞性免疫応答を高め得ることを示した。次いで、有効性および変動に基づいて抗体をランク付けし、これらの結果に基づいてＶＳＴＢ１１２、ＶＳＴＢ１１６、ＶＳＴＢ９５、ＶＳＴＢ５０、ＶＳＴＢ５３およびＶＳＴＢ６０を選択して、用量−力価実験を評価した。ＶＳＴＢ６０は、用量−力価実験において、他の５つの抗体よりも弱い応答を誘導した。
【０１８１】
ブドウ球菌エンドトキシンＢ（ＳＥＢ）活性化アッセイ：ＳＥＢは、特異的なＶβ＋  Ｔ細胞の活性化を誘導する細菌性の超抗原である。末梢血単核細胞を単離して、培養中でＳＥＢ抗原とインキュベートすると、強いサイトカイン産生が誘導される。このアッセイは、５個の誘導候補に対して行った。このアッセイは、５個の誘導候補に対して行った。
【０１８２】
１０％ＡＢ培地の調製、１ｍＣｉ力価チミジンの調製、可溶性ＶＩＳＴＡ抗体の調製、および白血球細胞の単離は全てＭＬＲにおいて上述の通りに行った。
【０１８３】
ＳＥＢ９６ウエルプレート設定：分析対象の試料の数に基づいて、アッセイに必要な応答細胞の適切な数を決定した。９６ウエルＵ底プレート１ウエル当たり２．０ｘ１０５細胞で応答集団を播種する。全ての条件は３回行わなければならなかった。上述のように細胞を遠心分離し、１０％ＡＢ血清培地中４ｘ１０６／ｍｌの濃度で再懸濁し、適切なウエルに５０μｌを添加した。ＳＥＢ抗原を含む５０μｌの１０％ＡＢ血清培地を４０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。記載される実験において、ＳＥＢは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（カタログ番号Ｓ０８１２）。ウエル中の最終濃度は１０ｎｇ／ｍｌであった。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベートした。３日目に、ＩＦＮ−γ産生の分析のために３０μｌの上清を除去した。２５μｌの１ｍＣｉ／ｍｌ力価チミジン溶液をそれぞれのウエルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２で８時間インキュベートした。製造業者の指示書により、細胞を９６ウエルマイクロシンチレーションプレーに移した。マイクロシンチレーション計測器を使用して、製造業者の指示書により計測を行った。ＩＦＮ−γ濃度は、製造業者の指示書を用いてＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号８８−７３１６−８８）により決定した。
【０１８４】
プロトコル：データ分析。全ての濃度で、それぞれの抗体について１分あたりの平均数（ＣＰＭ）またはＩＦＮ−γ濃度を計算した。許容基準は上述の通りに行った。記載の通りにＩＣ５０値の決定を行った。誘導候補の用量力価を有するＳＥＢアッセイにおける個々のＣＰＭ数およびＩＦＮ−γ濃度。
【０１８５】
【表１３】
2018530514.tif 000025
【０１８６】
結論：ＳＥＢアッセイにおいて、ＶＩＳＴＡ特異的抗体は、用量依存的な様式でサイトカイン産生および増殖を高めた。ＳＥＢ試験由来のＩＣ５０値は一般に、ＭＬＲ希釈試験の結果と同様であった。
【０１８７】
実施例１０：エピトープ結合アッセイ
方法：ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６系（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、エピトープ結合（ｂｉｎｎｉｎｇ）を行った。アミン共役化学（ＢｉｏＲａｄ、カタログ番号１７６−２４１０）についての製造業者の指示書を使用して、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＧＬＣチップ（ＢｉｏＲａｄ，  Ｃａｔ＃１７６−５０１１）を二組の６個のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）でコーティングした。
【０１８８】
過剰（２５０ｎＭ終濃度）な競合ｍＡｂを、ヒトＶＩＳＴＡ（２５ｎＭ終濃度）と、室温で４時間予備インキュベートして、コーティングｍＡｂのパネルでコーティングしたチップ上で同時に６個を、４分の結合時間で走らせ、５分間解離させた。それぞれの施行の後、１００ｍＭリン酸でチップを再生させた。
【０１８９】
データ分析は、リガンドによる全てのセンサーグラムのグループ分け、およびＸおよびＹ軸整列および人為的影響の除去を自動で行う整列ウィザードの適用を含んだ。次いでデータにスポット間補正を適用した。
【０１９０】
非競合ｍＡｂは、Ａ１シグナル（ヒトＶＩＳＴＡのみに結合）と同じかまたはそれより大きい結合シグナルを有するものとして規定された。
【０１９１】
競合ｍＡｂは、Ａ１シグナル（すなわち、ヒトＶＩＳＴＡのみに結合）よりはるかに小さい結合シグナルを有するものとして規定された。
【０１９２】
結果：図２３に示される例示センサーグラムにおいて、ＶＳＴＢ８５抗体をＰｒｏｔｅｏｎ  ＳＰＲチップにコーティングし、指定される競合剤を用いて予備インキュベートされたＶＩＳＴＡタンパク質を、チップ上で走らせた。ＶＩＳＴＡ／ＶＳＴＢ５０複合体を走らせる場合に陽性の反応が見られたので、ＶＳＴＢ５０は非競合性抗体の例である。ＶＩＳＴＡと複合体化されたＧＧ８、ＶＳＴＢ４９およびＶＳＴＢ５１は、チップ上にコーティングされたＶＳＴＢ８５に結合せず、そのためＶＩＳＴＡ上のＶＳＴＢ８５と同じ結合部位に対して競合すると分類された。
【０１９３】
【表１４】
2018530514.tif 000026
【０１９４】
【表１５】
2018530514.tif 000027
【０１９５】
実施例１１：ＰＲＯＴＥＯＮ親和性決定
抗ＩｇＧ  Ｆｃコーティング表面を使用して、ＰｒｏｔｅＯｎチップ上で抗体を捕捉した。０．３９ｎＭ〜１００ｎＭの範囲のＶＩＳＴＡタンパク質の濃度でのヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＶＩＳＴＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の結合について、抗体を試験した。抗原を、抗体コーティングチップに４分間結合／会合（ｂｉｎｄ／ａｓｓｏｃｉａｔｅ）させ、その後、解離を３０分間モニタリングした。１００ｍＭリン酸の１８秒間の２回の処理でチップを再生させた。全ての実験は２５℃で行い、データを１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに適合させた。
【０１９６】
実施例１２：ＭＢ４９マウス膀胱腫瘍モデルにおける抗ＶＩＳＴＡ処理の効果
方法：
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにＭＢ４９腫瘍細胞を注射した。腫瘍が確立されたところで、抗ＶＩＳＴＡ処理を開始した。次いで腫瘍増殖を１週間に３回モニタリングした。腫瘍が任意の寸法で１５ｍｍに達したところでＩＡＣＵＣ規則に従ってマウスを安楽死させた。
【０１９７】
それぞれの実験について、ＭＢ４９細胞の凍結バイアルを解凍して、１０％血清およびペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質を加えたＲＰＭＩ  １６４０（＋Ｌ−Ｇｌｕｔ）中で増殖させた。培養の３日後、ＳｔｅｍＰｒｏ  Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して細胞を回収し、５ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度でＲＰＭＩに再懸濁してマウス１匹当たり５０μｌを注射した。
【０１９８】
６〜８週齢の雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを国立癌研究所から購入した。到着した際に、マウスを１日間順化させ、次いで右わき腹の毛を剃り、尾に入れ墨をした。次いで３〜５日後にマウスに注射した。
【０１９９】
腫瘍注射（皮内）：マウスの毛を剃った脇腹に、５０μｌのＭＢ４９細胞懸濁物（約２５０，０００細胞）を皮内（ｉ．ｄ．）注射した。
【０２００】
腫瘍増殖のモニタリング：最初に広い寸法（Ｌ）次いで最初の測定に対して９０°の角度（Ｗ）を横切る電気毛細管を使用して、腫瘍増殖を測定した。腫瘍容積を次のようにして得た：
体積＝（Ｌ２＊Ｗ２）／２
【０２０１】
腫瘍の直径が約５ｍｍ（約６０ｍｍ３体積）に達したところで腫瘍が確立されたとみなした。確立されたところで治療を開始した。腫瘍増殖は、治療経過の間、実験を終了するまで１週間に３回測定した。
【０２０２】
抗ＶＩＳＴＡ治療：キメラ化１３Ｆ３−ｍＩｇＧ２ａモノクローナル抗体を１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射した。注射スケジュールは、４週間にわたり毎週３回行った。
【０２０３】
マウスの安楽死：ＩＡＣＵＣ要件に従い、腫瘍が最も長い寸法で１５ｍｍに達した際に動物を安楽死させた。
【０２０４】
有効性の分析：データ管理のためにエクセルおよびグラフ化のためにＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用してマウス腫瘍体積を分析した。Ｒ統計学的コンピューターソフトウェアについてマクロを使用して統計学的分析を行った。
【０２０５】
実験設計を図２４に示す。
【０２０６】
結果：
雌マウスにおけるＣｈ１３Ｆ３−ｍＩｇＧ２ａ治療により、７０％の動物で完全な腫瘍の拒絶（ＣＲ）および３０％（ｎ＝７）で部分寛解（ＰＲ）が誘導された（表１３および図２５Ｂ）。対照的に、全ての対照ｍＩｇＧ２ａ処理マウスは、腫瘍の進行性の増殖を示した（６／６）（図２５Ａ）。これらのデータは、抗ＶＩＳＴＡ処理が腫瘍増殖に大きな効果を有し得ることを示す。
【０２０７】
【表１６】
2018530514.tif 000028
【０２０８】
Ｗａｎｇら、２０１１、上述（その内容は全体において本明細書に援用される）から適用されたヒトＶＩＳＴＡ配列を図２６および２７に示す。
【０２０９】
実施例１３：水素／重水素（Ｈ／Ｄ）交換試験を使用した抗ＶＩＳＴＡ抗体のエピトープマッピング
ヒトＶＩＳＴＡ上のＶＳＴＢ５０、６０、９５および１１２についてのエピトープを同定するために、対応するＦａｂを使用して、溶液（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）水素／重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）を行った。Ｈ／Ｄ交換について、Ｆａｂ摂動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）を分析するために使用した手順は、いくつかの変更を有して前述のもの（Ｈａｍｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｏｌ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：１７１−１８２，  ２００３；Ｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５：８４８８−８４９８，  ２００６）と同様であった。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｆａｂ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｃａｔ＃  ４４９８５）を使用して、パパイン消化およびプロテインＡ捕捉によりＩｇＧからＦａｂを調製した。ヒトＶＩＳＴＡタンパク質配列は、６個のＮ結合グリコシル化部位を含む。配列カバー率を向上させるために、ＰＮＧアーゼＦによりタンパク質を脱グリコシル化した。脱グリコシル化ＶＩＳＴＡタンパク質を、重水素化水溶液中で所定の時間インキュベートして、交換可能水素原子に重水素取り込みを生じた。重水素化ＶＩＳＴＡタンパク質を、４℃で３０秒、２分、１０分および６０分の間、４６μＬの酸化重水素（Ｄ２Ｏ）中ＶＳＴＢ５０、ＶＳＴＢ６０、ＶＳＴＢ９５またはＶＳＴＢ１１２のＦａｂのいずれかと複合体化した。低ｐＨにより交換反応をクエンチし、ペプシンでタンパク質を消化した。同定されたペプチドでの重水素レベルを、ＬＣ−ＭＳの質量シフトからモニタリングした。参照対照として、Ｆａｂ分子と複合体化しないこと以外は、ＶＩＳＴＡタンパク質を同様に処理した。Ｆａｂに結合した領域は、交換から比較的保護され、そのため参照ＶＩＳＴＡタンパク質よりも多くの重水素の画分を含む部位であると推測された。タンパク質の約９４％を、特定の領域にマッピングし得た。
【０２１０】
ＶＩＳＴＡとＶＳＴＢ５０／ＶＳＴＢ６０、およびＶＳＴＢ９５／ＶＳＴＢ１１２の溶液ＨＤＸ−ＭＳ摂動マップを図２８の上および下のそれぞれに示す。２つのエピトープ群を同定した。抗ＶＩＳＴＡ  ＶＳＴＢ５０はＶＳＴＢ６０と同じエピトープを認識し、ＶＳＴＢ９５は、ＶＩＳＴＡ上でＶＳＴＢ１１２とは別のエピトープに結合する。抗ＶＩＳＴＡ  ＶＳＴＢ５０および６０は、断片１０３ＮＬＴＬＬＤＳＧＬ１１１（配列番号：６２）および１３６ＶＱＴＧＫＤＡＰＳＮＣ１４６（配列番号：６３）を含む同じエピトープを共有する（図２８、上）。抗ＶＩＳＴＡ  ＶＳＴＢ９５および１１２は、断片２７ＰＶＤＫＧＨＤＶＴＦ３６（配列番号：７４）および５４ＲＲＰＩＲＤＬＴＦＱＤＬ６５（配列番号：６５）を含む同様のエピトープを標的すると思われる（図２８、下）。残基３９〜５２および１１８〜１３４を含むＶＳＴＢ９５および１１２による弱い摂動を示す２つの他の断片がある。しかしながら、減少のレベルは、差動マップにおける以前の領域（２７〜３６および５４〜６５）ほど強くはない。ＶＳＴＢ９５および１１２による強い摂動を示す１つのペプチド１００ＴＭＲ１０２がＶＩＳＴＡ表面の他の面に位置するが、これはエピトープ領域２７〜３６および５４〜６５とは離れている。この摂動はアロステリック効果のためであり得る。これらのＨＤＸ−ＭＳの結果は、抗ＶＩＳＴＡ抗体についてのペプチドレベルでのエピトープを提供する。これら２つのエピトープ群についてエピトープ領域の重複はなかった。これらの結果は、互いに競合しない以前の競合結合（ｂｉｎｎｉｎｇ）データと一致する。
【０２１１】
実施例１４：タンパク質結晶学によるヒトＶＩＳＴＡ  ＥＣＤ：ＶＳＴＢ１１２  Ｆａｂ複合体の構造決定
ＶＩＳＴＡ構造を決定して、ＶＩＳＴＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と誘導抗体ＶＳＴＢ１１２のＦａｂ断片の間の相互作用を規定するエピトープおよびパラトープを示す努力において、複合体を結晶化し、１．８５Åの解像度まで構造を決定した。Ｔ抗体ＶＳＴＢ１１２のＦａｂ断片と複合体化したヒトＶＩＳＴＡのＥＣＤの構造は、ＶＩＳＴＡ  ＥＣＤ自身の構造を決定し、この相互作用のためのエピトープ／パラトープの両方を規定するための努力において決定された。該構造は、ＶＩＳＴＡが、ＩｇＶ折りたたみにＴＣＲ  Ｖα鎖と同様の鎖トポロジーを適用することを明らかにする。βサンドイッチの背面および前面のＢ鎖とＦ鎖を架橋する規範的なジスルフィド結合に加えて、該構造により、ＥＣＤが、２つのさらなるジスルフィド結合を有し、その１つがＣＣ’ループを前面シートにつなぎ、第２のものがＡ’鎖とＧ’鎖の間にあることが明らかになる。ＶＩＳＴＡ分子間に結晶接触が存在するが、それらは小さなものであり、この構造に基づくＶＩＳＴＡ  ＥＣＤの二量体についての証明はない。ＶＳＴＢ１１２エピトープは、ＶＩＳＴＡ  ＢＣ、ＣＣ’およびＦＧループと最も近い前面βシート（Ｃ’ＣＦＧ）の残基と共に、これらのループの一部を含むことが示される。パラトープは、接触を最小にするＣＤＲ  Ｌ３との重鎖相互作用に対して大きく偏る。
【０２１２】
ＶＩＳＴＡ：ＶＳＴＢ１１２相互作用を規定するエピトープ／パラトープ
ＶＳＴＢ１１２  Ｆａｂは、ＶＩＳＴＡ  ＥＣＤへの結合の際に１０２４．３Å２の表面積が埋まり、重鎖表面の埋没はこの合計の７１５．３Å２となる。ＶＩＳＴＡとＶＳＴＢ１１２軽鎖の間に７個の水素結合および４個の塩の架橋相互作用が形成され、ＶＩＳＴＡとＶＳＴＢ１１２重鎖の間に１０個の水素と２個の塩の架橋相互作用が形成される。ＶＳＴＢ１１２は、ＦＧループの近位の末端で前面シート鎖Ｃ’、Ｃ、ＦおよびＧ中の残基、ならびにＢＣ、ＦＧおよびＣＣ’ループ中の残基を認識する（図２９および３０）。ＣＣ’ループとの相互作用は、さらなる軽鎖相互作用を作製するＦＧループ中の残基Ｅ１２５およびＲ１２７のみを有するＦａｂ軽鎖との接触のほとんどの原因となる。ＶＩＳＴＡ  ＦＧループに対応する残基１１９〜１２７は、ＶＳＴＢ１１２との結合時に埋まる合計１０３４．８Å２の表面積の３８％になる。顕著に、このループは高度に極性であり、以下の配列−ＩＲＨＨＨＳＥＨＲ−（配列番号：７５）で構成される。さらに、ＶＳＴＢ１１２  ＣＤＲ  Ｈ３中のＷ１０３は、ＶＩＳＴＡの主鎖の残基Ｈ１２２およびＨ１２３を正確に包み、ＶＩＳＴＡ  Ｈ１２１は、ＣＤＲ  Ｈ２中のＦ５５の芳香族環との相互作用上の端を形成する。
【０２１３】
結晶学およびＨＤＸにより同定したエピトープ領域の比較を図３１に示す。
【０２１４】
実施例１５：抗ＶＩＳＴＡ抗体によるＴ細胞および単球の活性化
抗ＶＩＳＴＡ抗体の機能的効果を２つのインビトロアッセイ、混合白血球反応（ＭＬＲ）およびＳＥＢ（スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）エンテロトキシンＢ）で評価した。両アッセイは、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン誘導を一次読み出しとして測定するが、これらの効果は異なるメカニズムによる。ＭＬＲにおいて、異なる２人のヒトドナーからの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を一緒にインキュベートし、１人のドナーからのＴ細胞と他方のドナーの樹状細胞間の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の不適合は、Ｔ細胞の増殖よインターフェロン（ＩＦＮγ）産生をもたらす。ＳＥＢアッセイでは、単一ドナーからのＰＢＭＣを細菌性超抗原とともにインキュベートする。これは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面のＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩタンパク質をＴ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合させ、Ｔ細胞の活性化、増殖、およびサイトカイン分泌を引き起こす。両アッセイにおいて、ＶＳＴＢ１７４の親分子であるＶＳＴＢ１１２は、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生の用量依存的誘導を示し、候補の中で最も強力であった（図２１Ａ〜２１Ｄ、Ｔ表１２）。
【０２１５】
【表１７】
2018530514.tif 000029
【０２１６】
単球活性化アッセイ
表１２に示したアッセイデータは、ＶＳＴＢ１７４の親分子であるＶＳＴＢ１１２で生成された。ＶＳＴＢ１７４の活性をより理解するために、単球活性化アッセイを行った。結果は、全ＰＢＭＣと共にＶＳＴＢ１７４をインキュベートすると、ＣＤ１４＋単球上の活性化マーカ（ＣＤ８０およびＨＬＡ−ＤＲ）の上方制御を誘導し、ＶＩＳＴＡを高発現すると知られている免疫細胞サブセットに結合する抗体の効果を示すことを示した（図３２）。他の問題は、全ＰＢＭＣにおける単球活性化に対する作用が、ＶＩＳＴＡに結合し、ＩｇＧ１  Ｆｃを有する抗体によって促進されるか否かである。抗体ＶＳＴＢ１０３およびＶＳＴＢ６３は、ＶＳＴＢ１１２およびＶＳＴＢ１１１と同様、ＶＩＳＴＡに高アフィニティ（それぞれ、ＫＤ６．３６Ｅ−１０および８．３０Ｅ−１０ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）で結合し、かつＶＩＳＴＡタンパク質を発現する細胞に結合する。ＶＳＴＢ１０３はＶＳＴＢ１１２と同じエピトープ・ビンにあり、一方、ＶＳＴＢ６３は異なるエピトープ・ビンにあり、抗体はいずれも単球活性化を促進しない。総合すると、これらの結果は、ＶＳＴＢ１７４がＴ細胞活性化／増殖に影響を及ぼし得るメカニズムは、ＮＫ細胞によって促進される単球活性化によるものであることを示している。
【０２１７】
培地の調製
５００ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０（Ｃｏｒｎｉｎｇ、１０−０４０−ＣＶ）を５０ｍｌのヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｉｎｃ、ロット番号３Ｃ０４０５）、５ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ、１７−６０２Ｅ）１０，０００Ｕ／ｍｌ、５ｍｌのＬ−グルタミンｇｌｕｔａｍｉｎｅ（１００×）（Ｇｉｂｃｏ、２５０３０−０８１）および１０ｍｌのＨＥＰＥＳ（１Ｍ）（Ｆｉｓｈｅｒ  ＢＰ２９９−１００、ロット番号−１）と混合した。培地を４℃で、１４日以内の間、保存した。
【０２１８】
可溶性ＶＩＳＴＡおよび対照抗体の調製
抗体を１０％ＡＢ血清中で２×所望の濃度に希釈した：ＶＳＴＢ１７４：ｌｏｔ  ＶＳＴＢ１７４．００３
【０２１９】
９６ウエルＵ底プレート（Ｆａｌｃｏｎ、３５３０７７）の適切なウエルに１００μｌの適切な抗体溶液を加えた。種々の細胞集団を１００μｌに加え、各抗体の最終濃度を１、０．１または０．０１ｇ／ｍｌとした。ＩｇＧ１対照抗体ＣＮＴＯ３９３０（Ｌｏｔ６４０５、ＥＮＤＯ＜０．１ＥＵ／ｍｇ）を最終濃度１μｇ／ｍｌで加えた。
【０２２０】
ＰＢＭＣを単離した。
【０２２１】
ドナーは、少なくとも１８歳で、概ね健康であり、地域個体群からランダムに選択した。
【０２２２】
ドナーの血液を、単離チューブから５０ｍｌコニカルチューブに移した。
【０２２３】
１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ１０７７（ＳＩＧＭＡ、１０７７１）を、血液と混合しないように注意しながら、下に位置させた。これは血液２５ｍｌ当たりであった。
【０２２４】
細胞を室温、１２５０ｇで、２５分間、ブレーキをかけずに遠心分離した。
【０２２５】
Ｆｉｃｏｌｌと血清の相間の白血球を単離し、４０ｍｌのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中に希釈させた。
【０２２６】
細胞を４℃、４５３ｇ（１５００ｒｐｍ）で、１０分間、遠心分離した。
【０２２７】
細胞を５０ｍｌのＨＢＳＳの再懸濁し、個別のエッペンドルフ型チューブに５００μｌを移すことによってカウントした。
【０２２８】
さらに、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ製のＰａｎ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ単離セットを製造会社の使用説明書（カタログ番号１３０−０９６−５３７）どおりに使用して、いくつかの処理群における陰性選択によってＣＤ１４＋細胞を単離した。
【０２２９】
インビトロ培養手順
必要とする適切な数の細胞を、解析すべき試料数に基づき、アッセイのために決定した。応答個体群を２．０×１０５ｃ細胞／９６ウエルＵ底プレートに播種した。ＣＤ１４負の選択個体群では、０．５×１０５個の細胞を播種した。すべての条件を３回行った。
【０２３０】
細胞を上記のように遠心分離し、全ＰＢＭＣ個体群では、１０％ＡＢ血清培地中に、２×１０６／ｍｌの濃度に、ＣＤ１４負の選択個体群では、０．５×１０６／ｍｌの濃度に再懸濁し、試験抗体１００μｌを適切なウエルに加え、各ウエルの全体積を２００μｌとした。
【０２３１】
細胞を３７℃および５％ＣＯ２で、１、２、または３日間インキュベートした。
【０２３２】
抗体染色およびフローサイトメトリー
９６ウエルＵ底プレートを４５３ｇで５分間遠心分離にかけ、上清を除去した。
【０２３３】
細胞を２００μｌのＰＢＳで洗浄し、工程５．５．１．と同様にして遠心分離機にかけた。
【０２３４】
上清を捨て、以下の抗体を含有する５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁した：
・ＣＤ１４−ＡＰＣ（クローン  ＨＣＤ１４）１：２５０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  カタログ番号３２５６０８）
・ＨＬＡ−ＤＲ−ＰＥ  Ｃｙ７（クローン  Ｌ２４３）１：２５０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  カタログ番号３０７６１６）
・ＣＤ８０−ＰＥ（クローン  ２Ｄ１０）１：２５０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  カタログ番号３０５２０８）
・Ｈｕ  ＦｃＲ結合阻害剤（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号１４−９１６１−７３）
【０２３５】
暗所の濡れた氷で２０分間インキュベートした。
【０２３６】
１５０μｌのＰＢＳを加え、工程５．５．１．と同様にして遠心分離機にかけた。
【０２３７】
１５０ｌのＰＢＳ緩衝液を添加し、ＦＡＣＳにより解析した。
【０２３８】
試料をＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  １０−パラメータフローサイトメーターにかけ、ＦｌｏｗＪｏ９．７．５を用いて、ＣＤ１４＋個体群上のＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８０の発現を解析した。幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）、一連の数の中央傾向を決める統計値を、処理を比較する定義統計として使用した。
【０２３９】
統計解析
全ての統計をＰｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄ，ｖｅｒｓｉｏｎ６で行った。多重性に対するテューキーの補正を含むＯｎｅ−Ｗａｙ  ＡＮＯＶＡを使用して、各タイムポイントで、グループ間の一対比較を行った。全ての検定および比較で、０．０５未満のＰ値は、有意であると見なした。全てのグラフ及び表で、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【０２４０】
実施例１６：抗ＶＩＳＴＡ抗体のＡＤＣＣおよびＡＤＣＰ活性
ＶＳＴＢ１７４はＩｇＧ１Ｆｃを有し、それは抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、および抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）活性を与え得る。両タイプのアッセイを行い、ＶＳＴＢ１７４は、Ｋ５６２−ＶＩＳＴＡ細胞を溶解または貪食する（図３３−３４）が、Ｋ５６２ミエローマ細胞株親細胞はしないことがわかった（データは示さず）。ＶＩＳＴＡの阻害作用を調節するＶＳＴＢ１７４の作用のさらなるメカニズムは、ＶＩＳＴＡを高レベルで発現する細胞の溶解または呑食であり、したがって、局所微少環境からそれらを除去する。
【０２４１】
実施例１７：さらなる抗ＶＩＳＴＡ抗体のＡＤＣＰ活性
抗ヒトＶＩＳＴＡ  ｍＡｂ（ＶＳＴＢ１７３およびＶＳＴＢ１７４）によりＶＩＡＴＡを異所的に発現する細胞のマクロファージ媒介食作用増強の研究に、インビトロ食作用アッセイを使用した。これらのｍＡｂを異なるＦｃ骨格（ＩｇＧ１  ＷＴ（野生型）、ＩｇＧ１  ＰＲ（プロテアーゼ耐性）およびＩｇＧ２σ）にクローニングし、食作用の増強に関し異なる活性を持つ可能性があると仮定した。ＩｇＧ１およびＩｇＧ１  ＰＲ骨格は、Ｆｃ受容体に結合することができ、ＡＤＣＰを引き起こす可能性があるが、ＩｇＧ２σは、Ｆｃ受容体に結合せず、ＡＤＣＰを媒介しない。
【０２４２】
ＡＤＣＰアッセイにおいてＫ５６２親細胞およびＫ５６２−ＶＩＳＴＡ標的細胞を用いて抗ＶＩＳＴＡ抗体を試験した。図３５〜３６に示すように、ＶＳＴＢ１７４、ＶＳＴＢ１４９、ＶＳＴＢ１７３およびＶＳＴＢ１４５は、Ｋ５６２−ＶＩＳＴＡ細胞のｈＭａ食作用を増強した。Ｆｃ受容体に結合しなかったＩｇＧ２σ  Ｆｃを有するＶＩＳＴＡ抗体、ＶＳＴＢ１４０またはＶＳＴＢ１３２、予想どおり食作用を増強しなかった。ＩｇＧ１Ｆｃを有するＶＩＳＴＡ  ｍＡｂ、ＶＳＴＢ１７４およびＶＳＴＢ１７３は、ＩｇＧ１ＰＲ  Ｆｃを有するＶＳＴＢ１４９およびＶＳＴＢ１４５より、より強い食作用を示した（ＥＣ５０値を示す表１３および１４を参照）。
【０２４３】
【表１８】
2018530514.tif 000030
【０２４４】
【表１９】
2018530514.tif 000031
【０２４５】
ＶＳＴＢ１７４およびＶＳＴＢ１７３は、最大濃度でもＫ５６２親細胞の食作用に対する増強は弱く（図３５〜３６）、これはＫ５６２細胞によるＶＩＳＴＡの発現が低いためであり得る。他の抗ＶＩＳＴＡ抗体はＫ５６２細胞の食作用を増強させなかった。
【０２４６】
Ｋ５６２−ＶＩＳＴＡ食作用アッセイにおいて、陰性対照抗体をそれぞれ２種類の濃度で試験したが、食作用は全く誘導されなかった。この結果は、抗ＶＩＳＴＡ抗体によって媒介される食作用が特異的で、Ｋ５６２−ＶＩＳＴＡ細胞によるＶＩＳＴＡ抗原の発現によるものであることを示している。
【０２４７】
実施例１８：さらなる抗ＶＩＳＴＡ抗体のＡＤＣＰ活性
ＡＤＣＣを誘導するそれらの能力を試験するために、以下の３種のヒト抗ＶＩＳＴＡ抗体を試験した：
ＶＳＴＢ１７４（ＩｇＧ１）
ＶＳＴＢ１４９（ＩｇＧ１  ＰＲ）
ＶＳＴＢ１７４．ＬＦ（ＩｇＧ１  ＬＦ（低フコース））。
【０２４８】
各抗体について、同じプレートで、６種の異なる濃度を、２回の個別の実験で、全６個のデータポインドで各３回試験した。
【０２４９】
ＶＳＴＢ１７４、ＶＳＴＢ１４９、およびＶＳＴＢ１７４．ＬＦはそれぞれ１０、１、０．１および０．０１μｇ／ｍＬ、で測定可能なＡＤＣＣ活性を示したが、０．００１μｇ／ｍＬでは、ＬＦ抗体のみが測定可能なＡＤＣＣ活性を示し、０．０００１μｇ／ｍＬでは抗体はいずれもＡＤＣＣを示さなかった。これらの各抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ１変異Ｆｃを有しており、この結果が予想される。ＬＦ抗体曲線のＥＣ５０値（０．００２２９３μｇ／ｍＬ）が標準のＩｇＧ１抗体曲線（０．０２３８１μｇ／ｍＬ）に比べて小さいこと明らかなように、ＬＦ抗体は、ＡＤＣＣ効力の増大を示した。ＩｇＧ１ＰＲ抗体曲線は、標準のＩｇＧ１曲線（０．０１８４６μｇ／ｍＬ）に類似したＥＣ５０値を有した。
【０２５０】
【表２０】
2018530514.tif 000032
【０２５１】
ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ１  ＰＲおよびヒトＩｇＧ１  ＬＦ抗体は全て、１０、１、０．１および０．０１μｇ／ｍＬ抗体濃度で、測定可能なＡＤＣＣ媒介性傷害を示したが、ＬＦ抗体のみが０．００１μｇ／ｍＬ抗体濃度で傷害を示した。０．０００１μｇ／ｍＬ抗体濃度では、抗ＶＩＳＴＡ抗体はいずれも傷害を示さなかった。
【０２５２】
ＥＣ５０値から明らかなように、ＬＦ抗体は、標準のＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ１ＰＲ抗体の約１０倍を超えるＡＤＣＣ傷害効果を示した。
【０２５３】
実施例１９：ＶＳＴＢ１７４のヒトおよびカニクイザルＶＩＳＴＡに対するアフィニティ
ヒトおよびカニクイザルＶＩＳＴＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対するＶＳＴＢ１７４のアフィニティを、ＰｒｏｔｅＯｎ装置を用いる表面｛ひょうめん｝プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法によって測定した。ＶＳＴＢ１７４は各タンパク質に対して非常に類似したＫＤ値を示した（ヒトＶＩＳＴＡ  ＥＣＤで１．５６Ｅ−１０  ＭおよびカニクイザルＶＩＳＴＡで８．６６Ｅ−１１  Ｍ）。
【０２５４】
実施例２０：マウス腫瘍モデルにおいて、ＶＩＳＴＡ抗体は有効性を示す
マウス種、試薬および腫瘍モデル
【０２５５】
インビボ試験では、Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドと戻し交配したヒトＶＩＳＴＡノックイン（ＶＩＳＴＡ−ＫＩ）マウスを使用した。
【０２５６】
抗ヒトＶＩＳＴＡ抗体を作製して、マウスＦｃ  ＩｇＧ２ａに移植したＶＳＴＢ１７４可変領域（ＶＳＴＢ１２３）を使用したＶＩＳＴＡ−ＫＩマウスにおける試験が可能になった。
【０２５７】
ＶＩＳＴＡ  ＫＩマウスにおいて、ＭＢ４９膀胱癌を評価した。
抗ＶＩＳＴＡ抗体療法が野生型マウスにおいて腫瘍増殖を抑制することを示す公開された試験（Ｌｅ  Ｍｅｒｃｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）に加えて、異なる投与スケジュールを使用したｗｔマウス、およびＶＳＴＢ１２３で治療したＶＩＳＴＡ−ＫＩマウスにおいて、代理母ハムスター抗体による抗腫瘍の有効性が示された。
【０２５８】
ＶＩＳＴＡ−ＫＩマウスのＭＢ４９腫瘍モデルにおけるインビボ有効性試験
雌ＶＩＳＴＡ−ＫＩマウスにおいてＭＢ４９有効性試験を行い、１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲のいくつかの用量でＶＳＴＢ１２３を試験した。０日目に、マウスに２５０，０００個のＭＢ４９腫瘍細胞を皮内注射した。
６日目に、図３７に示すように投与を開始した（１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照ｍＩｇＧ２ａまたは示した用量のＶＳＴＢ１２３のいずれか；１０匹のマウス／群）。
【０２５９】
図３７に示すように、ＶＳＴＢ１２３は、低用量に対して高用量でより有効であった。１０ｍｇ／ｋｇおよび７．５ｍｇ／ｋｇの用量は同等であったが、５または１ｍｇ／ｋｇで投与したマウスで腫瘍はより速く増殖した。
【０２６０】
実施例２１：抗ＶＩＳＴＡ抗体を用いたヒト腫瘍におけるＶＩＳＴＡ発現の検出
図１は、ＡＭＬ腫瘍細胞株によるＶＩＳＴＡ発現を示し、これと、図１７のＲＮＡ  ｓｅｑ発現データは、ＡＭＬ細胞によりＶＩＳＴＡが発現されるという考え、および抗ＶＩＳＴＡ薬物が、免疫調節または抗体媒介性傷害に対し、これらの細胞を直接標的にすることにより効果的であるという考えを支持する。
【０２６１】
肺癌においてＶＩＳＴＡ発現を評価するためのデータは、外科的切除による肺腫瘍試料から得た。細胞を解離させ、ＶＩＳＴＡおよび多くの他のマーカーの発現について特徴付けした。結果は、１３／１３肺腫瘍（扁平上皮癌または腺癌）がＣＤ１４＋ＶＩＳＴＡ＋ミエロイド細胞を含むことを示した（図３８）。
【０２６２】
実施例２２：抗ＶＩＳＴＡ抗体を使用した肺腫瘍におけるＶＩＳＴＡ発現の検出
クローンＧＧ８、抗ヒトＶＩＳＴＡマウスＩｇＧ１を使用して、免疫組織化学アッセイを最適化した。このｍＡｂを使用して、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）ＦＦＰＥ腫瘍切片におけるＶＩＳＴＡの染色を調べた。
【０２６３】
ＦＦＰＥ腫瘍切片を、標準的な抗原回復法を用いて処理した後に染色した。ＧＧ８マウス抗ヒトＶＩＳＴＡ抗体は１：５００希釈で使用した。ウサギ抗マウスポリクローナル抗体、その後、抗ウサギポリマーＨＲＰを使用して、ＧＧ８結合を検出した。続いて、ヘマトキシリンでの対比染色を行い、その後、腫瘍切片をスコアリングした。
【０２６４】
肺癌におけるＶＩＳＴＡ発現は、免疫浸潤にほぼ限定され（図３９に示した例）、高レベルのＶＩＳＴＡ陽性細胞は、多くの肺癌試料中に存在した。
【０２６５】
実施例２３：ｖｓｔｂ１７４のＦａｂフラグメントと複合体化されたヒトＶＩＳＴＡの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の構造
ＶＩＳＴＡ抗原変異体を作製して、結晶学のために精製した。組み換えｈｉｓタグ付加ＶＳＴＢ１７４  Ｆａｂを内部発現させて精製した。結晶を作製し、シンクロトロン照射を使用してＶＩＳＴＡ  ＥＣＤ：ＶＳＴＢ１７４  Ｆａｂ複合体についての高解像度データを補正するために使用し、相同性モデリングおよび電子密度分析を併用して、構造決定を解決した（図２９（上））。
【０２６６】
ｘ線結晶学によりＶＩＳＴＡ  ＥＣＤ：ＶＳＴＢ１７４  Ｆａｂ複合体の構造を、１．８５Åの解像度まで決定し、ＶＩＳＴＡ  ＥＣＤの第１の構造を提供し、ＶＳＴＢ１７４エピトープおよびパラトープを示した。ＶＩＳＴＡ  ＥＣＤは、ＩｇＶ折りたたみにＣＴＬＡ−４ＥＣＤと類似のトポロジーを採用するが、βサンドイッチの前面シートから伸長する特有のＧ’鎖を有する。Ａ’およびＧ’は、Ａ’鎖の残基Ｃ１２とＧ’鎖の残基Ｃ１４６の間に形成されるジスルフィド架橋を介してさらに化学的に接続される。３つの分子内ジスルフィド結合につながれる６個のシステインが見られたが、結晶接触に基づけば、二量体化ＶＩＳＴＡの証拠はない。
【０２６７】
ＶＳＴＢ１７４は、ＦＧループの近位の末端上の前面シートの鎖Ｃ’、Ｃ、ＦおよびＧ中の残基、ならびにＢＣ、ＦＧおよびＣＣ’ループ内の残基を認識する。
【０２６８】
実施例２４：ＶＳＴＢ１１６  ＶＨおよびＶＬ領域のマウスＩｇＧ１骨格へのクローニング
ＶＳＴＢ１１６重鎖（配列番号５７）および軽鎖（配列番号５８）可変領域マウスＩｇＧ１骨格にサブクローニングしてＶＳＴＢ１７５を作製した。ＶＳＴＢ１７５重鎖発現プラスミド、ｐＤＲ２３１７０をベクターｖＤＲ０００３６７（マウスＩｇＧ１  Ｂａｌｂ  Ｃ定常領域をコードするｐＵｎｄｅｒベクター）およびｐＤＲ１７５８２由来のＶＳＴＢ１１６可変領域を使用して作製した。ｐＤＲ２３１７０の標準的な合成は、Ｇｅｎｅｗｉｚ  ｗｉｔｈ  ＨｉｎｄＩＩＩ＿ＢａｍＨ１サイトで行い、ベクターｖＤＲ０００３６７（ｐＵｎｄｅｒ＿ｍＧ１  Ｂａｌｂ  Ｃ）にＨｉｎｄＩＩＩ＿ＢａｍＨ１サイトでカスタムクローニングし、最終生成物ｐＤＲ２３１７０を作製した。ＶＳＴＢ１７５軽鎖発現プラスミド、ｐＤＲ２１００３を、アダプター追加したＧｅｎｅＡｒｔで、可変領域の標準的な合成によって作製した。ｖＤＲ０００３７１（マウスカッパ定常領域をコードするｐＵｎｄｅｒベクター）を、Ｅｓｐ３Ｉサイトを用いて直線化した。合成されたＶＳＴＢ１７５軽鎖可変領域配列のフラグメントを、ｖＤＲ０００３７１に融合クローニングして、ｐＤＲ２１００３を作製した。得られた一次転写物の配列を決定し、確認し、大規模のＤＮＡ調製物を形質移入用に調製した。
【０２６９】
【表２１】
2018530514.tif 000033
【０２７０】
実施例２５：ＶＳＴＢ１７５の発現、精製および分析
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎカタログ番号Ａ１４５２７）を、Ｅｘｐｉ２９３発現培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎカタログ番号Ａ１４３５１−０１）で、３７°Ｃ；７％ＣＯ２；１３０ＲＰＭで増殖させた。形質移入の２日前に細胞を７ｅ５細胞／ｍｌで分けた。形質移入時、細胞を計数し、細胞が少なくとも３０ｅ５細胞／ｍｌの濃度で９５％超が生細胞であることを確認した。それぞれ３０−ｍＬの形質移入のために、３０μｇのプラスミドＤＮＡをＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎカタログ番号３１９８５−０７０）中で混合し、総体積１．５ｍＬとした。（１５μｇのｐＡｄｖａｎｔａｇｅ  ＤＮＡおよび１５ｕｇの発現ベクターＤＮＡ（抗体用、これはＨＣ：ＬＣ比が１：３の発現コンストラクト）。８１μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ２９３試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  カタログ番号  Ａ１４５２５）．をその後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地中に希釈して総容量１．５ｍＬとした。希釈したＤＮＡおよびＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ溶液をその後、静かに撹拌し、室温で５分間インキュベートした。希釈ＤＮＡを希釈ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ２９３試薬に添加し、静かに撹拌し、室温で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、混合物を、１２５ｍｌ振盪フラスコに入れた２５．５ｍｌの細胞に加えた。形質移入後直ちに、１５０ｕＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ２９３  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  １および１．５ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ２９３  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ２を各フラスコに加えた（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎカタログ番号Ａ１４５２５）。形質移入の５日後、細胞上清を遠心分離によって採集し、０．２ミクロンフィルタによって清澄化した。
【０２７１】
２つのＶＳＴＢ１７５一過性２９３Ｅｘｐｉトランスフェクション採集物をプールし、１×ＤＰＢＳ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌの緩衝液に加えた。試料をＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒを用いて２〜１０℃で精製した。試料をＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ樹脂（２０ｍＬ、１．６ｃｍＩＤ×１０ｃｍＨ）に捕獲した。固定されていない試料を、１×ＤＰＢＳ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌにより、樹脂から洗い流した。ｍＡｂを０．１ＭＮａ＋酢酸塩、ｐＨ３．５で溶出した。ＯＤ２８０が＞２５ｍＡＵ／２ｍｍのとき、溶出画分（８−ｍＬ）をまとめた。溶出画分を、１画分当たり、２ｍＬの２．５ＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．２で中和し、さらなる処理を行うまで、２〜１０℃で保存した。溶出ピーク画分をＯＤ２８０およびＳＥ−ＨＰＬＣにより分析し、タンパク質濃度および凝集体％を測定した。この分析で多量の凝集体が観察されたため、試料をＳＥＣでポリッシングする必要が生じた。試料を濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（２６／６０カラム、２．５ｍＬ／ｍｉｎ１×ＤＰＢＳ、４−ｍＬフラクション）を用いて、ＳＥＣ分別を行った。試料をＯＤ２８０（タンパク質濃度）、ＬＡＬ（エンドトキシン量）ＳＥ−ＨＰＬＣ（％モノマーｍＡｂ）、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。試料は、ＳＥ−ＨＰＬＣによる分析で９８．２２％がモノマーｍＡｂであった。
【０２７２】
１）アッセイを開始する前に、１０分間、トランスフェクション培地（例えば、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＣＨＯ）中に抗ヒトＦｃバイオセンサーを浸漬する。ＦＩＡ９６ウエルプレートに培地１２０μｌを加える。バイオセンサートレイに９６ウエルプレートを置き、トレー内の培地にチップを置く。２）試料をトランスフェクション培地中に１：１０（または、濃縮試料では１：２５）に希釈する。３）各ニート１２０μｌおよび１：１０希釈試料を第２の９６ウエルブラックＦＩＡプレートに移す。４）機器に既にロードした標準曲線。５）未知の試料を全て加えた後、３種の標準試料（４０，２０および１０μｇ／ｍｌの標準対照抗体）を加える。レファレンスとしてトランスフェクション培地をカラムの残りのウエルに充填する。６）製造会社の使用説明書にしたがって、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔで試料を分析する。
【０２７３】
実施例２６：ＶＳＴＢ１７５分子病理免疫組織化学アッセイの展開
推奨濃度：１０μｇ／ｍｌ；希釈剤：Ｄａｋｏ共通抗体
【０２７４】
使用した回復法：加圧容器中（リトリーバー）で新しく調製したＤａｋｏ低ｐＨ回復溶液に２０分間、１２１℃で、その後、リトリーバで４０分間冷却。取り出し、室温で１５分間冷却。
【０２７５】
検出システム：Ａｎｔｉ  Ｍｏｕｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋システムＤＡＢ（Ｄａｋｏ）。
【０２７６】
装置：Ｂｉｏｇｅｎｅｘ  ｉ６０００
【０２７７】
プロトコル工程：１）４μｍパラフィン切片の脱イオン水による脱パラフィン化。２）抗原回復。３）脱イオン水中により洗浄。４）ペルオキダーゼブロック（３％Ｈ２Ｏ２）１５分。５）少なくとも１５分間の洗浄緩衝液による洗浄。６）タンパク質ブロック（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）室温で６０分間。７）一次抗体６０分。室温にて。８）洗浄緩衝液による洗浄、５回。８）ペルオキダーゼ標識ポリマー抗マウス、３０分。９）洗浄緩衝液による洗浄、５回。１０）５分間、ＤＡＢを稼働。１１）脱イオン水による洗浄、３回。１２）洗浄緩衝液による洗浄、５回。１３）Ｍａｙｅｒｓヘマトキシリンによる５分間の対比染色。１４）水道水による洗浄、およびカバーガラス装着前の溶媒による処理。
【０２７８】
結果を図４１および表１７〜１８に示す。
【０２７９】
【表２２】
2018530514.tif 000034
【０２８０】
【表２３】
2018530514.tif 000035
【０２８１】
実施例２７：肺癌組織におけるＶＳＴＢ１７５抗体クローン
材料および方法
ＶＩＳＴＡ  ＶＳＴＢ１７５抗体およびＮＳＣＬＣ試料：ＶＩＳＴＡ  ＶＳＴＢ１７５抗体の凍結アリコートを、ヒトＮＳＣＬＣ組織試料の最適化のために用意した。９個のホルマリンで固定し、パラフィン包埋した（ＦＥＰＥ）試料を評価用に選択し、スライドグラス上の無染色切片を免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色のために、最適化されたＶＩＳＴＡ（ＶＳＴＢ１７５）ＩＨＣアッセイが特定されたところで用意した。
【０２８２】
ＩＨＣアッセイの最適化：ＶＩＳＴＡ（ＶＳＴＢ１７５）ＩＨＣアッセイの最適化を、扁桃腺および脾臓組織で行った。２通りの抗原検索時間（２０分および４０分）を、抗体希釈範囲（１：５００、１：１０００および１：２０００）でｐＨ６のクエン酸ナトリウムで評価した。扁桃腺および脾臓組織の染色の提示が、有資格の獣医病理学者により評価され、最適アッセイ条件が特定された。最適ＩＨＣアッセイは、ｐＨ６で、４０分間、９０℃（この温度は、研究室が高地にあるため選ばれた）で、クエン酸ナトリウムによる抗原回復、６０分間のＶＩＳＴＡ（ＶＳＴＢ１７５）抗体の１：５００の希釈（開始濃度６．３６ｍｇ／ｍｌ）、およびＤＡＢによる１０分間の展開を使用した。ＩＨＣアッセイは、Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  ＲＸ自動染色装置を用い、以下のプロトコルにしたがって行った：
【０２８３】
詳細なプロトコル（Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  ＲＸまたはＭａｘ自動染色装置を使用）：
１．１回の通常の切片作成プロトコルにつき、スライドを４ミクロンに切断する。スライドを風乾し、その後、６０℃で６０分間ベークする。スライドは一般に、切断の２週間以内に染色に使用する。
２．Ｌｅｉｃａのスライドラックにベークしたスライドを置き、自動染色装置にラックを挿入する。
３．一次抗体Ｌｅｉｃａ抗体希釈液（＃ＡＲ９３５２）で１：５００に希釈する。
【０２８４】
Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  ＲＸ／Ｍａｘ自動染色装置で行われる工程：
１．Ｂｏｎｄ  Ｄｅｗａｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（＃ＡＲ９２２２）を７２℃で３回適用。
２．１００％エタノールを３回適用。
３．Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  Ｗａｓｈ  １×Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（＃ＡＲ９５９０）を３回適用。
４．Ｌｅｉｃａ  ＥＲ  １  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（＃ＡＲ９９６１）は、４０分間９０℃でインキュベートする。
５．Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  Ｗａｓｈ  １×Ｓｏｌｕｔｉｏｎを５回適用。
６．Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｉｅｒｃｅ  ｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（＃３７５８４）は５分間インキュベートする。
７．抗体適用前に洗浄は行わない。
８．抗体希釈液は６０分間インキュベートする。
９．Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  Ｗａｓｈ  １×  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを３回適用。
１０．Ｐｏｓｔ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｌｉｎｋ（Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｒｅｆｉｎｅ  Ｋｉｔ＃ＤＳ９８００）は８分間インキュベートする。
１１．Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  Ｗａｓｈ  １Ｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを２分間、３回適用。
１２．ポリマー（Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｒｅｆｉｎｅ  Ｋｉｔ  ＃ＤＳ９８００）は８分間インキュベートする。
１３．Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  Ｗａｓｈ  １×  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを２分間、２回適用。
１４．ＤＩ水による濯ぎ。
１５．Ｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｂｌｏｃｋ（Ｌｅｉｃａ  ＢＰＲキット）１０分間インキュベートする。
１６．Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  Ｗａｓｈ  １×  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを２回適用。
１７．ＤＩ水による濯ぎ。
１８．ＤＡＢクロマゲン（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）／基質（Ｌｅｉｃａ  ＢＰＲキットｔ）は１０分間インキュベートする。
１９．Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  Ｗａｓｈ  １×  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを３回適用。
２０．ヘマトキシリン対比染色（Ｌｅｉｃａ  ＢＰＲ  Ｋｉｔ）は２分間インキュベートする。
２１．ＤＩ水による洗浄。
２２．Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  Ｗａｓｈ  １×  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを１回適用。
２３．ＤＩ水による濯ぎ。
２４．Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  ＲＸ／Ｍａｘからスライドを取り出す。
脱水およびカバースリップを次のように手で行う：
２３．９５％エタノールを２回交換（各１分）
２４．１００％エタノールを２回交換（各１分）
２５．キシレンを２回交換（各２分）
２６．Ｃｙｔｏｓｅａｌ封入剤でカバースリップする。
【０２８５】
スライドスキャニングおよび注釈：ＩＨＣ染色が終了したなら、スライドグラスをＡｐｅｒｉｏモデルＣＳおよびＸＴスキャナーでデジタル化した。各スライドグラスをデジタル化したなら、注釈を付して染色領域（ＲＯＡ）を特定した。ＲＯＡは、各サンプル内に解析可能な腫瘍組織およびその周囲の間質組織部分を取り込んだ。壊死、大面積の炭粉沈着（炭素顔料）、リンパ濾胞（非腫瘍関連の前から存在するリンパ球集団など）などの望ましくない組織特性を注釈前に分析から除去した。注釈によって特定した各ＲＯＡ、画像解析を行う前に病理学者によって評価され、確認された。
【０２８６】
画像解析：ＶＩＳＴＡ陽性細胞ｓ／ｍｍ２の数を本試験の主要評価項目として、プロジェクト開始前に特定した。腫瘍細胞巣および関連浸潤性炎症細胞を腫瘍組織部分として解析した。間質細胞領域および関連浸潤性炎症細胞を、腫瘍微少環境（ＴＭＥ）組織部分として解析した。結果：
【０２８７】
結果を上記の表１７および１８に示す。
【０２８８】
ＶＩＳＴＡ（ＶＳＴＢ１７５）のためのＩＨＣアッセイの開発：ＩＨＣアッセイ条件のマトリックスを試験して、ＶＩＳＴＡ  ＶＳＴＢ１７５抗体試薬のための最適ＩＨＣアッセイを特定した。表１９に最適化中に評価した条件の概要を示す。図４２は、独立した２染色日のヒト扁桃腺切片（陽性対照組織）の染色を示す。最適アッセイ条件を扁桃腺（陽性対照）および脾臓（陰性対照）組織切片によって特定した。一般に、扁桃腺濾胞では陽性細胞はほとんど特定されなかった。さらに、濾胞の外の上皮下領域ではＶＩＳＴＡ染色は観察されず、読み取ることができなかった。
【０２８９】
【表２４】
2018530514.tif 000036
【０２９０】
最適なアッセイ条件が特定されたところで、９人のヒト肺癌試料をＶＩＳＴＡ（ＶＳＴＢ１７５）ＩＨＣアッセイで染色した。図４３は、試験試料で観察されたＶＩＳＴＡ＋（ＶＳＴＢ１７５）染色の３例を示す。各試験試料の初期の主観評価では、ＶＩＳＴＡ＋細胞は、あっても非常に少なかった。染色は、各試験試料の多数の細胞で観察した。
【０２９１】
ＶＩＳＴＡ解析溶液の開発：誤った陽性細胞を最小化する間、細胞で観察される低レベルのＶＩＳＴＡ染色を得するための最適ゲートを決定するため、感受性ＤＡＢ（すなわちＶＩＳＴＡ）陽性ゲートの範囲を評価した。試料の順位は抗体クローン間でほとんど保存されず、腫瘍組織部分において異なる現象を各抗体が捕えていることを示唆した。これらの発見は、ＶＩＳＴＡ  ＶＳＴＢ１７５クローンの特異性の向上が、腫瘍組織部分における誤った陽性細胞をほとんど見られなくするというという考えと一致していた。最後に、ＶＳＴＢ１７５クローンに基づく試料の順位が、ＶＩＳＴＡ陽性ゲートに依存しておらず、さらに、両ゲートが異なる感受性を持った同じ生物学的情報を測定していることを示した。
【０２９２】
【表２５】
2018530514.tif 000037
【０２９３】
【表２６】
2018530514.tif 000038
【０２９４】
実施例２８：免疫組織化学
方法：
Ｊａｎｓｓｅｎから提供された抗体を用いて抗体滴定実験を行った。免疫組織化学的染色をＶＳＴＢ１７５（キメラ抗体）およびすぐに使用可能なＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（ＢｉｏＧｅｎｅｘカタログ番号ＨＫ１１９−７Ｍ、ＢＧＸ−Ｍｓ−ＩｇＧ１と称する）を用いて行い、シグナルの最小バックグラウンドおよび最大検出をもたらす濃度を確立した。ＬｉｆｅＳｐａｎより供給されたホルマリン固定パラフィン包埋組織上の２種の試験抗体、およびＪａｎｓｓｅｎから供給された陽性（Ｖｉｓｔａ  Ｋ５６２）および陰性（ラージ）対象細胞株を用いて、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌおよび２．５μｇ／ｍｌの連続希釈を行った。アイソタイプ対照抗体は、すぐに使用可能な濃度でのみ使用した。一次抗体として、ＶＳＴＢ１７５およびＢＧＸ−Ｍｓ−ＩｇＧ１抗体を使用し、主要検出システムはベクター抗マウスセカンダリー（ＢＡ−２０００）、およびベクター赤色基質キット（ＳＫ−５１００）を含むベクターＡＢＣ−ＡＰキット（ＡＫ−５０００）で構成した、これは、フクシャ色に着色した堆積物を生成するために使用された。
【０２９５】
組織はまた、組織抗原が保存され、免疫組織化学解析が利用可能であることを確認するため、陽性対照抗体（ＣＤ３１およびビメンチン）で染色した。ＣＤ３１およびビメンチン染色に陽性であった組織のみを、この研究の残りのために選択した。
【０２９６】
陰性対照は、一次抗体を含まない隣接切片で免疫組織化学の全手順を行うことから構成したが、これらのスライドは適切に陰性であった。
【０２９７】
報告した濃度で染色したスライドを、Ｎｉｋｏｎ顕微鏡に接続したＤＶＣ  １３１０Ｃデジタルカメラで撮像した。画像をＡｄｏｂｅ  ＰｈｏｔｏｓｈｏｐによりＴＩＦＦファイルとして保存した。結果を図４４〜５３に示す。
【０２９８】
本明細書中に引用した全ての特許、公開された出願、および文献の教示は、参照によりその全体が組み込まれる。
【０２９９】
本発明を、その実施形態例に関して詳細に説明し記載してきたが、当業者であれば、添付した特許請求の範囲に包含される発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細に様々な変化を加え得ることは理解されよう。
【図１】
2018530514.tif 000039
【図２】
2018530514.tif 000040
【図３】
2018530514.tif 000041
【図４】
2018530514.tif 000042
【図５】
2018530514.tif 000043
【図６】
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【図７】
2018530514.tif 000045
【図８】
2018530514.tif 000046
【図９】
2018530514.tif 000047
【図１０】
2018530514.tif 000048
【図１１】
2018530514.tif 000049
【図１２】
2018530514.tif 000050
【図１３】
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【図１４】
2018530514.tif 000052
【図１５】
2018530514.tif 000053
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
2018530514.tif 000070
【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
2018530514.tif 000075
【図３８】
2018530514.tif 000076
【図３９】
2018530514.tif 000077
【図４０】
2018530514.tif 000078
【図４１】
2018530514.tif 000079
【図４２】
2018530514.tif 000080
【図４３】
2018530514.tif 000081
【図４４】
2018530514.tif 000082
【図４５】
2018530514.tif 000083
【図４６】
2018530514.tif 000084
【図４７】
2018530514.tif 000085
【図４８】
2018530514.tif 000086
【図４９】
2018530514.tif 000087
【図５０】
2018530514.tif 000088
【図５１】
2018530514.tif 000089
【図５２】
2018530514.tif 000090
【図５３】
2018530514.tif 000091
【配列表】
2018530514000001.app
【国際調査報告】
2018530514.tif 000092
2018530514.tif 000093