(57)【要約】本発明は、自身の野生型に対して遺伝子改変されており、かつ蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む細胞に関し、ここで蛍光タンパク質の発現は、細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に依存する。加えて本発明は、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌を増加させている細胞を識別するための方法、タンパク質の組み換え体生成のために最適化された培地組成を識別するための方法、タンパク質の組み換え体生成のために最適化された培養条件を識別するための方法、細菌細胞の膜を損傷する特性を有することによる抗菌活性を特徴とする化合物を識別するため、あるいは遺伝学的に異なる細菌細胞、または異なる生理的状態もしくは異なる増殖相における遺伝学的に同一の細胞の集団に対するこうした化合物の効果を分析するための方法、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の最適化された分泌を伴う、自身の野生型に対して遺伝子改変された細胞を産生するための方法、この方法によって得られる細胞、タンパク質を生成するための方法、および混合物を調製するための方法に関する。【選択図】図１
2018509939.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自身の野生型に対して遺伝子改変されており、かつ蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む細胞であって、前記蛍光タンパク質の発現は、細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に依存する、細胞。
【請求項２】
前記蛍光タンパク質をコードする前記遺伝子配列は少なくとも１つの異種プロモーターの制御下にあり、前記異種プロモーターは、野生型の細胞において、前記野生型の細胞における発現が細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に依存する遺伝子の発現を制御する、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記細胞はコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、またはマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｋｔｅｒｉｕｍ）属の細胞である、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
前記プロモーターはｃｇ０７０６プロモーター、ｃｇ０９９６プロモーター、ｃｇ０９９８プロモーター、ｃｇ１３２５プロモーター、ｈｔｒＡプロモーター、ｌｉａＩプロモーター、ｍｐｒＡプロモーター、またはｐｅｐＤプロモーターからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５】
前記蛍光タンパク質をコードする前記遺伝子配列はｃｇ０９９６プロモーターおよびｃｇ０９９８プロモーターの組み合わせの制御下にあり、ここでｃｇ０９９６プロモーターはｃｇ０９９８プロモーターの上流に位置する、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
細胞懸濁物における、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌増加を特徴とする細胞を識別するための方法であって、次の方法ステップ、
α１）請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞を含む細胞懸濁物を提供するステップと、
α２）細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に関して異なる細胞を含む細胞懸濁物を得るために前記細胞の遺伝子改変を行うステップと、
α３）細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌を増加させている、前記細胞懸濁物中の個々の細胞を識別するステップと
を含む、方法。
【請求項７】
次の方法ステップ、
α４）前記識別された細胞を前記細胞懸濁物から分離するステップ
をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記分離するステップはフローサイトメトリによって行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細胞懸濁物における、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の高分泌を特徴とする細胞を識別するため、または細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の高分泌を特徴とする細胞を含む細胞懸濁物を識別するための方法であって、次の方法ステップ、
β１）
−  請求項１から５のいずれか一項に記載の複数の細胞を含む細胞懸濁物であって、前記細胞懸濁物中の前記複数の細胞は、細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に関して互いに異なる、細胞懸濁物、
または
−  複数の細胞懸濁物であって、各細胞懸濁物は請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞を含み、前記複数の細胞懸濁物は、前記細胞によって細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に関して互いに異なる、複数の細胞懸濁物
を提供するステップと、
β２）前記細胞懸濁物中の複数の異なる細胞、または複数の異なる前記細胞懸濁物を培養するステップと、
β３）細胞膜を通過してサイトゾル外空間へタンパク質を高分泌している、前記細胞懸濁物中の個々の細胞を識別するか、または細胞膜を通過してサイトゾル外空間へタンパク質を高分泌している細胞を含む個々の細胞懸濁物を識別するステップと
を含む、方法。
【請求項１０】
タンパク質の組み換え体生成のために最適化された培地組成を識別するための方法であって、次の方法ステップ、
γ１）培地の組成に関して互いに異なる複数の培地を提供するステップと、
γ２）前記異なる培地において、請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞を培養することによって複数の細胞懸濁物を得るステップであって、前記細胞懸濁物の前記細胞は、前記培地の組成の相違のために、細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の分泌量に関して互いに異なる、ステップと、
γ３）細胞膜を通過してサイトゾル外空間へタンパク質を高分泌している細胞を含む細胞懸濁物を識別するステップと
を含む、方法。
【請求項１１】
タンパク質の組み換え体生成のために最適化された培養条件を識別するための方法であって、次の方法ステップ、
δ１）請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞を含む複数の細胞懸濁物を提供するステップと、
δ２）これらの細胞懸濁物中の前記細胞を異なる培養条件下で培養することによって、異なる前記細胞懸濁物中の前記細胞が、前記培養条件の相違のために、細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に関して互いに異なるようにするステップと、
δ３）細胞膜を通過してサイトゾル外空間へタンパク質を高分泌している細胞を含む細胞懸濁物を識別するステップと
を含む、方法。
【請求項１２】
細菌細胞の膜を損傷する特性を有することによる抗菌活性を特徴とする化合物を識別するため、あるいは遺伝学的に異なる細菌細胞、または異なる生理的状態もしくは異なる増殖相における遺伝学的に同一の細胞の集団に対するこうした化合物の効果を分析するための方法であって、次の方法ステップ、
ε１）請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞を含む細胞懸濁物を提供するステップと、
ε２）前記化合物の存在下で前記懸濁物中の前記細胞を培養するステップと、
ε３）細胞内蛍光活性の検出によって、前記化合物の前記抗菌活性および濃度依存性の抗菌活性を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項１３】
細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の最適化された分泌を伴う、自身の野生型に対して遺伝子改変された細胞を産生するための方法であって、次の方法ステップ、
Ｉ）請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞を含む細胞懸濁物を提供するステップと、
ＩＩ）細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に関して異なる前記細胞を含む細胞懸濁物を得るために前記細胞の遺伝子改変を行うステップと、
ＩＩＩ）細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌を増加させている、前記細胞懸濁物中の個々の細胞を識別するステップと、
ＩＶ）前記識別された細胞を前記細胞懸濁物から分離するステップと、
Ｖ）識別および分離された前記細胞における、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌増加の原因となった、遺伝子改変された遺伝子Ｇ１からＧｎまたは突然変異Ｍ１からＭｍを識別するステップと、
ＶＩ）前記遺伝子Ｇ１からＧｎの少なくとも１つおよび／または前記突然変異Ｍ１からＭｍの少なくとも１つを含むゲノムを有する、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の最適化された分泌を伴う、自身の野生型に対して遺伝子改変された細胞を産生するステップと
を含む、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法によって得られる細胞。
【請求項１５】
タンパク質を生成するための方法であって、次の方法ステップ、
（ａ）請求項１３に記載の方法によって、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の最適化された分泌を伴う、自身の野生型に対して遺伝子改変された細胞を産生するステップと、
（ｂ）栄養素を含む培地において、前記細胞が前記栄養素からタンパク質を生成する条件下で、前記細胞を培養するステップと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自身の野生型に対して遺伝子改変された細胞、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌増加を特徴とする細胞を識別するための方法、タンパク質の組み換え体生成のために最適化された培地組成を識別するための方法、タンパク質の組み換え体生成のために最適化された培養条件を識別するための方法、細菌細胞の膜を損傷する特性を有することによる抗菌活性を特徴とする化合物を識別するため、または遺伝学的に異なる細菌細胞の集団に対するこうした化合物の効果を分析するための方法、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の最適化された分泌を伴う、自身の野生型に対して遺伝子改変された細胞を産生するための方法、この方法によって得られる細胞、タンパク質を生成するための方法、および混合物を調製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、経済学的に大きな関心を集めている。たとえば酵素は、さまざまな化合物の化学的合成、特に界面活性剤、またはヒトもしくは動物の食物におけるエナンチオ選択的合成における生体触媒として用いられる。その他のタンパク質、たとえば抗体、ホルモン、および免疫修飾物質などは、医薬組成物に見出され得る。
【０００３】
こうしたタンパク質を調製するための好ましい方法は、組み換え微生物を用いた生物工学的生成である。発酵プロセスにおいて、これらの微生物は細胞タンパク質合成によって所望のタンパク質を生成するように培養される。この生合成的生成経路によって、天然タンパク質を直接得ることができ、単純かつ安価な原材料を使用できる。微生物としては、たとえば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、または関連細菌などがその目的のためによく使用される。
【０００４】
生物工学的プロセスにおいてタンパク質を生成し得る効率および対費用効果にとって、生物学的および手順的パラメータは重要である。これらのパラメータは、たとえば宿主微生物、菌株／ベクターの組み合わせ、タンパク質コード遺伝子のコドン使用頻度、細胞壁を通るタンパク質の輸送のために必要なシグナルペプチド（分泌シグナルペプチド）、発現レベル、誘導時間、温度、培地の組成、増殖速度などを含む。
【０００５】
タンパク質生成のための効率的な生物工学的プロセスの開発のためには、これらのパラメータを変動させて最適化する必要がある。しかし問題となるのは、上記パラメータの各々が広範囲に変動可能であるだけでなく、さらに異なるパラメータが互いに影響し合うために、評価する必要のあるパラメータの組み合わせが多数存在し得ることである。当該技術の現状に従うと、最適化したパラメータまたはパラメータの組み合わせの単なる理論的予測はできず、さらに各特定のタンパク質に対して異なるパラメータおよびパラメータの組み合わせが理想的と考えられるため、各生成プロセスに対して多数の異なるパラメータの組み合わせをテストする必要がある。
【０００６】
所望のタンパク質の組み換え体生成に用いることが意図される特定の菌株において異なる特性を生じさせるために、従来の化学的または物理的突然変異誘発ステップが適用され（例、ＭＮＮＧまたはＵＶ）、それらのステップによって菌株のゲノムにランダム突然変異が誘発される（非方向性突然変異誘発）。タンパク質の分泌変更を伴う突然変異体を生成するために、たとえばタンパク質コード遺伝子配列を異なる分泌シグナルペプチドのコード配列と融合させた、タンパク質コード遺伝子のライブラリを生成する。タンパク質分泌に対する異なる培養条件または異なる培地組成の影響を分析するために、これらの異なる条件および／またはこれらの異なる培地において、特定のタンパク質を分泌する菌株が培養される。
【０００７】
所望のタンパク質の生成のための生物学的プロセスの収率、効率または経済性の増加をもたらす遺伝子改変ならびに最適化した培養パラメータおよび培地を探すことは、一般的に「スクリーニング」と呼ばれる。しかし、こうしたスクリーニングプロセスにおける問題点は、複数の遺伝学的に異なる細胞を含む細胞懸濁物、またはさまざまなパラメータが調整された（またはただ１つのパラメータを変更したにもかかわらず他のパラメータも影響を受けた）実験設定において、最終的に観察される所望のタンパク質の生成増加の原因となったのは、どの遺伝子改変またはどのパラメータだったのかを明確に識別することはほぼ不可能であるという事実にみられるはずである。こうした評価のために必要なスクリーニング法は非常に時間がかかって高価であるだけでなく、個々のタンパク質各々に対して高度に特異的であり、よって一般的に適用できない。さらに、所与の実験設定における所望のタンパク質の生成または分泌の量を決定することは、その培地または細胞内のタンパク質の触媒活性の検出によってのみ可能であるため、これらのスクリーニング法は所望のタンパク質に対する実用的なスクリーニングアッセイが利用可能であることに依存している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、特定のタンパク質を分泌する遺伝子改変細胞の検出に関連して起こる不利益を克服するという目的に基づくものであった。
【０００９】
特に本発明は、遺伝子改変後、または培養条件に関するパラメータの変更後、または培地の組成の変更後に、特定のタンパク質の分泌増加を特徴とする変異体を簡単な態様で識別できるような遺伝子改変細胞を提供するという目的に基づくものであり、加えてこれらの細胞を複数の異なる細胞から容易に分離することが可能である。加えて、特定のタンパク質の分泌増加を特徴とする細胞の識別は、所望のタンパク質の性質に依存すべきではなく、発酵プロセスにおいて組み換えによって生成され得るすべてのタンパク質に適用可能であるべきである。
【００１０】
加えて本発明は、複数の遺伝学的に異なる細胞における特定のタンパク質の分泌増加を特徴とする細胞を、簡単、高速かつ対費用効果の高い態様で識別し、複数の遺伝学的に異なる細胞からこれらの細胞を特定的に分離するための方法を提供するという目的に基づくものであった。
【００１１】
加えて本発明は、特定の培養条件下または特定の培地において培養されたときに、異なる培養条件または異なる培地において培養された同じ細胞と比べて特定のタンパク質の分泌が増加することを特徴とする細胞を識別することによって、簡単、高速かつ対費用効果の高い態様で、最適化された培養条件および／または最適化された培地を決定することを可能にするための方法を提供するという目的に基づくものであった。
【００１２】
加えて本発明は、特定のタンパク質の最適化された分泌を伴う遺伝子改変細胞を提供するという目的に基づくものであり、その遺伝子改変細胞の遺伝子または突然変異、特に分泌シグナルペプチドに対する遺伝子またはこれらの遺伝子内の突然変異は選択的に導入されたものであって、特定のタンパク質の分泌または細胞膜のトランス側の特定のタンパク質の濃度を増加させるための上述のスクリーニングプロセスによって好適であると識別されたものである。
【００１３】
上述の目的の少なくとも１つを達成するための寄与は、本発明のカテゴリ形成請求項の主題によって行われる。さらなる寄与は、本発明の特定の実施形態を表す従属請求項の主題によって行われる。
【００１４】
実施形態
｜１｜自身の野生型に対して遺伝子改変されており、かつ蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む細胞であって、ここで蛍光タンパク質の発現は、細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に依存する。
【００１５】
｜２｜実施形態｜１｜に従う細胞であって、ここで蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列は少なくとも１つの異種プロモーターの制御下にあり、前記異種プロモーターは、野生型の細胞において、野生型の細胞における発現が細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に依存する遺伝子の発現を制御する。
【００１６】
｜３｜実施形態｜１｜または｜２｜に従う細胞であって、ここで細胞はコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、またはマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｋｔｅｒｉｕｍ）属の細胞である。
【００１７】
｜４｜先行実施形態の１つに従う細胞であって、ここでプロモーターはｃｇ０７０６プロモーター、ｃｇ０９９６プロモーター、ｃｇ０９９８プロモーター、ｃｇ１３２５プロモーター、ｈｔｒＡプロモーター、ｌｉａＩプロモーター、ｍｐｒＡプロモーター、またはｐｅｐＤプロモーターからなる群より選択される。
【００１８】
｜５｜実施形態｜１｜から｜４｜のうちの１つに従う細胞であって、ここで細胞はコリネバクテリウム属の細胞であり、プロモーターはｃｇ０７０６プロモーター、ｃｇ０９９６プロモーター、ｃｇ０９９８プロモーター、またはｃｇ１３２５プロモーターである。
【００１９】
｜６｜実施形態｜５｜に従う細胞であって、ここで蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列はｃｇ０９９６プロモーターおよびｃｇ０９９８プロモーターの組み合わせの制御下にあり、ここでｃｇ０９９６プロモーターはｃｇ０９９８プロモーターの上流に位置する。
【００２０】
｜７｜実施形態｜１｜から｜４｜のうちの１つに従う細胞であって、ここで細胞はバチルス属の細胞であり、プロモーターはｈｔｒＡプロモーターまたはｌｉａＩプロモーターである。
【００２１】
｜８｜実施形態｜１｜から｜４｜のうちの１つに従う細胞であって、ここで細胞はマイコバクテリウム属の細胞であり、プロモーターはｍｐｒＡプロモーターまたはｐｅｐＤプロモーターである。
【００２２】
｜９｜実施形態｜１｜から｜４｜のうちの１つに従う細胞であって、ここで細胞は大腸菌属の細胞であり、プロモーターはｈｔｒＡプロモーターである。
【００２３】
｜１０｜先行実施形態の１つに従う細胞であって、ここで蛍光タンパク質は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）またはこのタンパク質の変異体である。
【００２４】
｜１１｜細胞懸濁物における、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌増加を特徴とする細胞を識別するための方法であって、次の方法ステップ、
α１）実施形態｜１｜から｜１０｜のうちの１つに従う細胞を含む細胞懸濁物を提供するステップと、
α２）細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に関して異なる細胞を含む細胞懸濁物を得るために細胞の遺伝子改変を行うステップと、
α３）細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌を増加させている、細胞懸濁物中の個々の細胞を識別するステップと
を含む。
【００２５】
｜１２｜実施形態｜１１｜に従う方法であって、ここで方法ステップα２）における遺伝子改変は、非標的突然変異誘発または代謝工学によって行われる。
【００２６】
｜１３｜実施形態｜１１｜または｜１２｜に従う方法であって、次の方法ステップ、
α４）識別された細胞を細胞懸濁物から分離するステップをさらに含む。
【００２７】
｜１４｜実施形態｜１３｜に従う方法であって、ここで分離するステップはフローサイトメトリによって行われる。
【００２８】
｜１５｜細胞懸濁物における、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の高分泌を特徴とする細胞を識別するため、または細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の高分泌を特徴とする細胞を含む細胞懸濁物を識別するための方法であって、次の方法ステップ、
β１）
−  実施形態｜１｜から｜１０｜のうちの１つに従う複数の細胞を含む細胞懸濁物であって、ここで細胞懸濁物中の細胞は、細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に関して互いに異なる、細胞懸濁物、
または
−  複数の細胞懸濁物であって、各細胞懸濁物は実施形態｜１｜から｜１０｜のうちの１つに従う細胞を含み、ここで細胞懸濁物は、細胞によって細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に関して互いに異なる、複数の細胞懸濁物
を提供するステップと、
β２）細胞懸濁物中の異なる細胞、または異なる細胞懸濁物を培養するステップと、
β３）細胞膜を通過してサイトゾル外空間へタンパク質を高分泌している、細胞懸濁物中の個々の細胞を識別するか、または細胞膜を通過してサイトゾル外空間へタンパク質を高分泌している細胞を含む個々の細胞懸濁物を識別するステップと
を含む。
【００２９】
｜１６｜タンパク質の組み換え体生成のために最適化された培地組成を識別するための方法であって、次の方法ステップ、
γ１）培地の組成に関して互いに異なる複数の培地を提供するステップと、
γ２）それらの異なる培地において、実施形態｜１｜から｜１０｜のうちの１つに従う細胞を培養することによって複数の細胞懸濁物を得るステップであって、この細胞懸濁物の細胞は、培地の組成の相違のために、細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の分泌量に関して互いに異なる、ステップと、
γ３）細胞膜を通過してサイトゾル外空間へタンパク質を高分泌している細胞を含む細胞懸濁物を識別するステップと
を含む。
【００３０】
｜１７｜タンパク質の組み換え体生成のために最適化された培養条件を識別するための方法であって、次の方法ステップ、
δ１）実施形態｜１｜から｜１０｜のうちの１つに従う細胞を含む複数の細胞懸濁物を提供するステップと、
δ２）これらの細胞懸濁物中の細胞を異なる培養条件下で培養することによって、異なる細胞懸濁物中の細胞が、培養条件の相違のために、細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に関して互いに異なるようにするステップと、
δ３）細胞膜を通過してサイトゾル外空間へタンパク質を高分泌している細胞を含む細胞懸濁物を識別するステップと
を含む。
【００３１】
｜１８｜細菌細胞の膜を損傷する特性を有することによる抗菌活性を特徴とする化合物を識別するため、あるいは遺伝学的に異なる細菌細胞、または異なる生理的状態もしくは異なる増殖相における遺伝学的に同一の細胞の集団に対するこうした化合物の効果を分析するための方法であって、次の方法ステップ、
ε１）実施形態｜１｜から｜１０｜のうちの１つに従う細胞を含む細胞懸濁物を提供するステップと、
ε２）化合物の存在下で懸濁物中の細胞を培養するステップと、
ε３）細胞内蛍光活性の検出によって、化合物の抗菌活性および濃度依存性の抗菌活性を決定するステップと
を含む。
【００３２】
｜１９｜細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の最適化された分泌を伴う、自身の野生型に対して遺伝子改変された細胞を産生するための方法であって、次の方法ステップ、
Ｉ）実施形態｜１｜から｜１０｜のうちの１つに従う細胞を含む細胞懸濁物を提供するステップと、
ＩＩ）細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に関して異なる細胞を含む細胞懸濁物を得るために細胞の遺伝子改変を行うステップと、
ＩＩＩ）細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌を増加させている、細胞懸濁物中の個々の細胞を識別するステップと、
ＩＶ）識別された細胞を細胞懸濁物から分離するステップと、
Ｖ）識別および分離された細胞における、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌増加の原因となった、遺伝子改変された遺伝子Ｇ１からＧｎまたは突然変異Ｍ１からＭｍを識別するステップと、
ＶＩ）遺伝子Ｇ１からＧｎの少なくとも１つおよび／または突然変異Ｍ１からＭｍの少なくとも１つを含むゲノムを有する、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の最適化された分泌を伴う、自身の野生型に対して遺伝子改変された細胞を産生するステップと
を含む。
【００３３】
｜２０｜実施形態｜１９｜に従う方法であって、ここで方法ステップＩＩ）における遺伝子改変は、非標的突然変異誘発または代謝工学によって行われる。
【００３４】
｜２１｜実施形態｜１９｜または｜２０｜に従う方法によって得られる細胞。
【００３５】
｜２２｜タンパク質を生成するための方法であって、次の方法ステップ、
（ａ）実施形態｜１９｜から｜２０｜に従う方法によって、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の最適化された分泌を伴う、自身の野生型に対して遺伝子改変された細胞を産生するステップと、
（ｂ）栄養素を含む培地において、細胞がその栄養素からタンパク質を生成する条件下で、細胞を培養するステップとを含む。
【００３６】
｜２３｜実施形態｜２２｜に従う方法であって、ここでタンパク質はホルモン、毒素（ｔｏｘｉｎｅ）、抗体、構造タンパク質、酵素、輸送タンパク質、貯蔵タンパク質、チャネルタンパク質、調節タンパク質、蛍光タンパク質、または選択的結合、重合、コート、安定化、修復、単離の能力を有するタンパク質である。
【００３７】
｜２４｜混合物を調製するための方法であって、次の方法ステップ、
（Ａ）実施形態｜２２｜または｜２３｜の１つに従う方法によってタンパク質を生成するステップと、
（Ｂ）そのタンパク質を、そのタンパク質とは異なる混合物構成要素と混合するステップとを含む。
【００３８】
｜２５｜実施形態｜２４｜に従う方法であって、ここで混合物は食品、動物の餌、医薬組成物、食品製造のための組成物、接着組成物、織物の仕上げ組成物、またはリグノセルロース分解性組成物である。
【００３９】
本発明は、自身の野生型に対して遺伝子改変されており、かつ蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む細胞に関し、ここで蛍光タンパク質の発現は、細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に依存する。
【００４０】
このサイトゾル外空間は、細胞膜によってサイトゾル空間（細胞質）から分離されている。本明細書において用いられる「サイトゾル外空間」という表現は一般的に、（サイトゾル空間から見たときの）細胞膜の中および向こうにある任意の体積要素を包含しており、そこにはペプチドグリカン層ならびにペリプラズムおよび細菌外膜（グラム陰性細菌およびディダームグラム陽性細菌または外膜を有するグラム陽性細菌の場合）が含まれる。加えて、「サイトゾル外空間」という表現には、細胞膜の直接の周囲よりも遠く離れた範囲が包含され、そこには培養上清の総体積が含まれる。
【００４１】
好ましくは、細胞の「野生型」とは、進化によって自然に形成されたままの状態で存在するゲノムを有する細胞を意味するものと理解される。この用語は、細胞全体および個々の遺伝子の両方に対して用いられる。特に、ヒトによって組み換え法によって少なくとも部分的に改変された遺伝子配列を有する細胞または遺伝子は、したがって「野生型」という用語に該当しない。
【００４２】
本発明に従う改変細胞は、好ましくは、細胞膜を通過してサイトゾル外空間に特定のタンパク質を分泌する細胞である。本明細書において用いられる「タンパク質」という用語はその最も広い意味で、ペプチド結合によって接続された２つまたはそれ以上のアミノ酸を含む化合物として理解される必要があり、その化合物は細胞のタンパク質生合成の産物である。したがって「タンパク質」という表現は高分子量のタンパク質（すなわち１０，０００Ｄａより大きい分子量を有するタンパク質）だけでなく、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、最大１０アミノ酸を含むオリゴペプチド、１０から１００アミノ酸を含むポリペプチド、および１００より多くのアミノ酸を含むマクロペプチドも包含する。さらに、タンパク質の性質に依存して、タンパク質は重合アミノ酸に加えて、たとえば翻訳時または翻訳後のグリコシル化によってもたらされる糖残基などのさらなる構成要素を含んでもよい。
【００４３】
タンパク質は、たとえばホルモン、毒素、抗体、構造タンパク質（たとえばコラーゲンなど）、酵素、輸送タンパク質、または調節タンパク質などであり得る。好適なタンパク質は、ヒト成長ホルモン、デス−Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；チロキシン；リポタンパク質；α１−抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体（ｌｅｕｔｉｎｉｚｉｎｇ）ホルモン；グルカゴン；凝固因子、たとえば第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、およびフォン・ヴィルブランド（ｙｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄｓ）因子など；抗凝固因子、たとえばプロテインＣなど；心房性ナトリウム利尿因子（ａｔｒｉａｌ  ｎａｔｕｒｉｅｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）；肺サーファクタント；プラスミノーゲンアクチベーター、たとえばウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ：ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）など；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子アルファおよびベータ；エンケファリナーゼ；血清アルブミン、たとえばヒト血清アルブミンなど；ミュラー管抑制因子；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、たとえばベータ−ラクタマーゼなど；ＤＮアーゼ；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；ホルモンまたは成長因子に対する受容体；インテグリン；トロンボポエチン；プロテインＡまたはＤ；リウマトイド因子；神経栄養因子、たとえば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ：ｂｏｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、ニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）−３、−４、−５、もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、もしくはＮＴ−６）など、または神経成長因子（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、たとえばＮＧＦ−βなど；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ：ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）；線維芽細胞成長因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、たとえばａＦＧＦおよびｂＦＧＦなど；上皮成長因子（ＥＧＦ：ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ：ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、たとえばＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５を含む、ＴＧＦアルファおよびＴＧＦベータなど；インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、たとえばＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、およびＣＤ−１９など；エリスロポエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質（ＢＭＰ：ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）；ソマトトロピン；インターフェロン、たとえばインターフェロンアルファ、ベータ、およびガンマなど；コロニー刺激因子（ＣＳＦ：ｃｏｌｏｎ���  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ）、例、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ：ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｓ）、例、ＩＬ−１からＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、たとえばＡＩＤＳエンベロープの一部分など；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；抗体；ならびに上に挙げたポリペプチドのいずれかのフラグメントからなる群より選択され得る。好適な酵素はトランスグルタミナーゼ、デヒドロゲナーゼ（たとえばアルコールデヒドロゲナーゼなど）、モノオキシゲナーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、グリコシダーゼ（たとえばアミラーゼ、キシラナーゼ、スクラーゼ、マルターゼ、アラビナーゼ、イソマルターゼ、またはフルクターゼなど）、ヌクレアーゼ（たとえばリボヌクレアーゼ、デスオキシリボヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、トポイソメラーゼ、またはリガーゼなど）、ホスファターゼ（たとえばフィターゼまたはアルカリホスファターゼなど）、ポリメラーゼ（たとえばＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼなど）、およびリアーゼを含む。
【００４４】
本発明に従う特に好ましい細胞は、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイウェロマイセス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、大腸菌、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、マイコバクテリウム、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の細胞であり、ここではブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、大腸菌、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイウェロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・ブランキイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｌａｎｋｉｉ）、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｎｏｍａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が特に好ましい。本発明に従う最も好ましい細胞は、コリネバクテリウム、バチルス、マイコバクテリウム、大腸菌、サッカロマイセス、およびピキア属の細胞であり、ここではコリネバクテリウム・グルタミクム、枯草菌、および大腸菌が特に非常に好ましい細菌株である。
【００４５】
加えて特に好適なのは、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１５８０６、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）ＡＴＣＣ１７９６５、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９、ブレビバクテリウム・フラバムＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９、およびブレビバクテリウム・ジバリカツム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）ＡＴＣＣ１４０２０、ならびにそれらから作製されるタンパク質を分泌する突然変異体および菌株からなる群より選択される細胞である。
【００４６】
自身の野生型に対して遺伝子改変された本発明に従う細胞は、蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含むことを特徴とし、ここで蛍光タンパク質の発現は、細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に依存する。
【００４７】
蛍光タンパク質をコードする当業者に公知のすべての遺伝子配列が、蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列として可能である。オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒａ）属の自己蛍光タンパク質、たとえば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、および異なる波長範囲において蛍光を発するその変異体（例、黄色蛍光タンパク質（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＹＦＰ；青色蛍光タンパク質（ｂｌｕｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＢＦＰ；シアン蛍光タンパク質（ｃｙａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＦＰ）、またはその蛍光が増強されたもの（例、高感度（ｅｎｈａｎｃｅｄ）ＧＦＰすなわちＥＧＦＰ、またはＥＹＦＰ、ＥＢＦＰ、もしくはＥＣＦＰ）などをコードする遺伝子配列が特に好適である。しかし、たとえばＢＤバイオサイエンシズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、フランクリン・レイクス（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ）、ＵＳＡによって公知のものなどのＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＡｃＧＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗなどのその他の蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列も使用され得る。加えて好適なのは、たとえばエボカタル社（ｅｖｏｃａｔａｌ  ＧｍｂＨ）、モンハイム（Ｍｏｎｈｅｉｍ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から得ることのできるフラビンモノヌクレオチドベース蛍光タンパク質（ＦｂＦＰ：Ｆｌａｖｉｎ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）などの蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列である。
【００４８】
蛍光タンパク質の発現が、細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に依存するために、このタンパク質分泌の関数として細胞によって制御され得るという特徴は、本発明に従って転写レベルで実現され得る。細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に依存して、結果的により多いかまたは少ない量の、リボソーム内で蛍光タンパク質を形成するために翻訳され得るｍＲＮＡが形成される。
【００４９】
これに関連して、翻訳レベルでの発現の制御は、少なくとも１つの異種プロモーターの制御下にある蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列によってもたらされてもよく、その異種プロモーターは、野生型の細胞において、野生型の細胞における発現が細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に依存する遺伝子の発現を制御する。蛍光タンパク質をコードしており、かつこうしたプロモーターの制御下にあるＤＮＡ配列のことを、以後「センサ」と呼ぶ。
【００５０】
「少なくとも１つの異種プロモーターの制御下にある」という表現は、そのプロモーターが天然の態様で、特にその少なくとも１つのプロモーターを単離して任意にはプロモーター効率をさらに上げるために遺伝子改変する前の供給源細胞において、その蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現を制御していないことを示す。これに関連して、「こうしたプロモーターに由来する」という表現は、本発明に従う遺伝子改変細胞（すなわちセンサを含む細胞）に含有される、蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現を制御する少なくとも１つのプロモーターが、供給源細胞に同一の核酸配列を有して含まれる必要のあるプロモーターでなくてもよいことを意味する。むしろ、プロモーター効率を上げる目的のために、このプロモーター配列はたとえば個々の塩基の挿入、欠失または置換などによって、たとえば個々の核酸配列のパリンドローム化などによって改変されていてもよい。加えて、蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現を制御する少なくとも１つのプロモーターは、必ずしも遺伝子改変細胞自体のゲノム（すなわち、センサを含む本発明に従う細胞のゲノム）に含有されるプロモーターまたはプロモーターに由来するものでなくてもよい。しかし、もしその少なくとも１つのプロモーターが遺伝子改変細胞自体のゲノムに含有されるプロモーターまたはプロモーターに由来するものであって、その遺伝子改変細胞において細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に依存して発現する遺伝子の発現を制御するものであれば、完全に有利であることが判明するだろう。
【００５１】
本発明に従う細胞において、蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列は、少なくとも１つのプロモーターの制御下にある。好ましくは、この状況における「少なくとも１つのプロモーターの制御下にある」という用語は、蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列が、その少なくとも１つのプロモーターに機能的に連結されていることを意味するものと理解されるべきである。少なくとも１つのプロモーターと蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列とが機能的に連結されるとは、これら２つの配列および任意にはたとえばターミネーターなどのさらなる調節要素が、核酸配列のトランスジェニック発現において各々の調節要素が自身の機能を果たせるように、順次配置されているときである。このためには、化学的な意味での直接的連結は絶対に必要ではない。たとえばエンハンサー配列などの遺伝子制御配列は、遠く離された位置または他のＤＮＡ分子からでも標的配列に対して自身の機能を発揮することができる。蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列がプロモーター配列の後ろ（すなわち３’末端）に位置していて、２つの配列が互いに共有結合される配置が好ましい。加えて、蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列とプロモーターとが、これら２つの遺伝子配列の間に相同遺伝子（つまり、野生型細胞においてそのプロモーターによって発現が制御されている遺伝子）の部分配列が残るようにして互いに機能的に連結されることも可能である。こうしたＤＮＡコンストラクトの発現においては、蛍光タンパク質と、相同遺伝子の対応する部分配列によってコードされるアミノ酸配列との融合タンパク質が得られる。相同遺伝子のこうした部分配列の長さは、蛍光タンパク質の機能的能力、すなわちそれが特定の波長の光によって励起されたときに蛍光を発する特性が顕著に損なわれない限り、重要ではない。
【００５２】
少なくとも１つのプロモーターおよび蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列に加えて、この特定の実施形態に従うと、本発明に従う細胞はレギュレーターをコードする遺伝子配列をも含んでもよく、このレギュレーターは好ましくは、細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるべきタンパク質、またはこうしたタンパク質の変異体、特にそのタンパク質のミスフォールド版と、任意の態様で直接的または間接的に相互作用するタンパク質である。レギュレーターとタンパク質とのこの直接的または間接的な相互作用は、ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列の結合親和性に影響するものであり、細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に依存する。この状況において、レギュレーターは原則としてアクチベーターであってもリプレッサーであってもよい。
【００５３】
本発明に従うと、可能なプロモーターは原則として、細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に依存する遺伝子の発現を、機能的連結を介して通常制御するすべてのプロモーターである。こうした遺伝子によってコードされるタンパク質は、好ましくはプロテアーゼ、ペプチダーゼ、熱ショックタンパク質、ファージショックタンパク質、シグマ因子、抗シグマ因子、２成分シグナル伝達系、３成分シグナル伝達系、ＡＢＣトランスポーター、膜結合タンパク質、ペリプラズムタンパク質、推定分泌タンパク質、調節タンパク質（それら自身によってさらなるタンパク質を制御する）、細胞壁生合成に関与するタンパク質、タイコ酸生合成に関与するタンパク質、ペニシリン結合タンパク質、外膜生合成に関与するタンパク質、膜結合シャペロン、ペリプラズムシャペロン、細胞壁抗生物質（たとえばバシトラシン、バンコマイシンなど）応答性のタンパク質、アルカリショック応答性のタンパク質、界面活性剤応答性のタンパク質、フェノール応答性のタンパク質、有機溶剤応答性のタンパク質、浸透圧保護に関与するタンパク質、またはＳｅｃ依存性タンパク質分泌、細胞壁抗生物質、アルカリショック、界面活性剤、フェノール、もしくは有機溶剤などに応答する機能不明のタンパク質を含む群に属する。
【００５４】
プロモーターはさらに、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌増加の場合に特定のアクチベーターと相互作用して、このやり方で蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現をもたらすプロモーターであるか、またはリプレッサーによって阻害されるプロモーターであってもよく、このリプレッサーは細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌増加の場合にプロモーターから拡散し、その結果として阻害が除去されて蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現がもたらされる。
【００５５】
以下に、本発明に従う細胞の好適な実施例がより詳細に説明される。しかし、現時点では本発明が以下の実施例に限定されないことが強調されるべきである。
【００５６】
遺伝子改変細胞は、ｃｇ０７０６プロモーター（Ｐｃｇ０７０６）またはその変異体、ｃｇ０９９６プロモーター（Ｐｃｇ０９９６）またはその変異体、ｃｇ０９９８プロモーター（Ｐｃｇ０９９８）またはその変異体、ｃｇ１３２５プロモーター（Ｐｃｇ１３２５）またはその変異体、あるいはこれらのプロモーターまたは変異体の組み合わせ、特にｃｇ０９９６プロモーター（Ｐｃｇ０９９６）またはその変異体とｃｇ０９９８プロモーター（Ｐｃｇ０９９８）またはその変異体との組み合わせであって、ここでｃｇ０９９６プロモーター（Ｐｃｇ０９９６）またはその変異体は、自身は蛍光タンパク質遺伝子配列をコードする配列に融合されているｃｇ０９９８プロモーター（Ｐｃｇ０９９８）またはその変異体の上流に位置する、プロモーターの制御下にある蛍光タンパク質をコードする配列を含む、遺伝子改変コリネバクテリウム細胞であってもよい。蛍光タンパク質をコードする配列がｃｇ０９９６プロモーター（Ｐｃｇ０９９６）またはその変異体とｃｇ０９９８プロモーター（Ｐｃｇ０９９８）またはその変異体との組み合わせの制御下にあり、ここでｃｇ０９９６プロモーター（Ｐｃｇ０９９６）またはその変異体はｃｇ０９９８プロモーター（Ｐｃｇ０９９８）またはその変異体の上流に位置するとき、ｃｇ０９９８プロモーターまたはその変異体の配列は、ｃｇ０９９６プロモーターまたはその変異体に直接接続されてもよいし、ｃｇ０９９６プロモーターまたはその変異体から最大２５００塩基対、好ましくは最大１０００塩基対、より好ましくは最大２００塩基対だけ分離されてもよい。
【００５７】
この場合、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌増加が、蛍光タンパク質の発現をもたらす。ｃｇ０７０６プロモーター、ｃｇ０９９８プロモーター、ｃｇ１３２５プロモーター、またはこれらのプロモーターの変異体の場合、こうした細胞はプロモーターと、そのプロモーターの制御下にある蛍光タンパク質の配列とに加えて、ｃｇ０７０６−ｃｇ１３２５レギュレーターもしくはこの配列の変異体、またはｃｇ０９９６−ｃｇ０９９８レギュレーターもしくはこの配列の変異体をコードする遺伝子配列をさらに含み得る。ｃｇ０７０６プロモーターのＤＮＡ配列は配列番号０１に対応し、ｃｇ０９９６プロモーターのＤＮＡ配列は配列番号０２に対応し、ｃｇ０９９８プロモーターのＤＮＡ配列は配列番号０３に対応し、ｃｇ１３２５プロモーターのＤＮＡ配列は配列番号０４に対応する。ｃｇ０７０６−ｃｇ１３２５レギュレーターをコードするＤＮＡ配列は配列番号０５に対応し、ｃｇ０９９６−ｃｇ０９９８レギュレーターをコードするＤＮＡ配列は配列番号０６に対応する。
【００５８】
加えて、遺伝子改変細胞は、ｈｔｒＡプロモーター（ＰｈｔｒＡ）またはその変異体の制御下にある蛍光タンパク質をコードする配列を含む、遺伝子改変バチルス細胞であってもよい。この場合も、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌増加が、蛍光タンパク質の発現をもたらす。ｈｔｒＡプロモーターの場合、こうした細胞はプロモーターと、そのプロモーターの制御下にある蛍光タンパク質の配列とに加えて、Ｃｓｓレギュレーターをコードする遺伝子配列またはこの配列の変異体をさらに含み得る。Ｃｓｓレギュレーターによって制御されるｈｔｒＡプロモーターのＤＮＡ配列は配列番号０７に対応し、ＣｓｓレギュレーターをコードするＤＮＡ配列は配列番号０８に対応する。
【００５９】
遺伝子改変細胞は、ｌｉａＬプロモーター（ＰｌｉａＬ）またはその変異体の制御下にある蛍光タンパク質をコードする配列を含む、遺伝子改変バチルス細胞であってもよい。この場合も、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌増加が、蛍光タンパク質の発現をもたらす。ｌｉａＬプロモーターの場合、こうした細胞はプロモーターと、そのプロモーターの制御下にある蛍光タンパク質の配列とに加えて、ＬｉａＲレギュレーターをコードする遺伝子配列またはこの配列の変異体、ＬｉａＦタンパク質をコードする遺伝子配列またはこの配列の変異体、ＬｉａＳタンパク質をコードする遺伝子配列またはこの配列の変異体、あるいはこれらの配列の２つまたはそれ以上の組み合わせをさらに含み得る。ＬｉａＲレギュレーターによって制御されるｌｉａＬプロモーターのＤＮＡ配列は配列番号０９に対応し、ＬｉａＲレギュレーターをコードするＤＮＡ配列は配列番号１０に対応し、ＬｉａＦタンパク質をコードするＤＮＡ配列は配列番号１１に対応し、ＬｉａＳタンパク質をコードするＤＮＡ配列は配列番号１２に対応する。
【００６０】
遺伝子改変細胞は、ｍｐｒＡプロモーター（ＰｍｐｒＡ）またはその変異体の制御下にある蛍光タンパク質をコードする配列を含む、遺伝子改変マイコバクテリウム細胞であってもよい。この場合も、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌増加が、蛍光タンパク質の発現をもたらす。ｍｐｒＡプロモーターの場合、こうした細胞はプロモーターと、そのプロモーターの制御下にある蛍光タンパク質の配列とに加えて、ＭｐｒＢレギュレーターをコードする遺伝子配列またはこの配列の変異体、シグマ因子σＥ（ＳｉｇＥ）をコードする遺伝子配列またはこの配列の変異体、あるいは両方の配列の組み合わせをさらに含み得る。シグマ因子σＥ（ＳｉｇＥ）によってＭｐｒＢレギュレーターによって制御されるｍｐｒＡプロモーターのＤＮＡ配列は配列番号１３に対応し、ＭｐｒＢレギュレーターをコードするＤＮＡ配列は配列番号１４に対応し、シグマ因子σＥ（ＳｉｇＥ）をコードするＤＮＡ配列は配列番号１５に対応する。
【００６１】
加えて、遺伝子改変細胞は、ｈｔｒＡプロモーターまたはその変異体の制御下にある蛍光タンパク質をコードする配列を含む、遺伝子改変大腸菌細胞であってもよい。この場合も、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌増加が、蛍光タンパク質の発現をもたらす。ｈｔｒＡプロモーターの場合、こうした細胞はプロモーターと、そのプロモーターの制御下にある蛍光タンパク質の配列とに加えて、ＣｐｘＲレギュレーターをコードする遺伝子配列またはこの配列の変異体をさらに含み得る。ＣｐｘＲレギュレーターによって制御されるｈｔｒＡプロモーターのＤＮＡ配列は配列番号１６に対応し、ＣｐｘＲレギュレーターをコードするＤＮＡ配列は配列番号１７に対応する。
【００６２】
上記において特定のプロモーターＸまたは特定のレギュレーターをコードする遺伝子配列Ｙを記載するときに用いられる「変異体」という用語は、以下を含む。
（１）遺伝子配列ＸおよびＹとそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％、最も好ましくは１００％が同一であるすべての核酸であり、その同一性は対応する核酸の全長にわたる同一性である。
（２）特定のレギュレーターをコードする遺伝子配列Ｙの場合、対応するレギュレーターのアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％、最も好ましくは１００％が同一であるアミノ酸配列をコードするすべての核酸。
（３）レギュレーターをコードする遺伝子配列Ｙの場合、同じレギュレーターをコードしているが、遺伝コードの縮重のために遺伝子配列Ｙとは異なるすべての核酸。
（４）配列ＸおよびＹそれぞれの相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なすべての核酸。
【００６３】
本明細書において用いられる「ハイブリダイゼーション」という用語は、「核酸分子の鎖が相補鎖と塩基対形成によって結合する任意のプロセス（ａｎｙ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｂｙ  ｗｈｉｃｈ  ａ  ｓｔｒａｎｄ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｊｏｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｓｔｒａｎｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒｉｎｇ）」（Ｊ．Ｃｏｏｍｂｓ（１９９４）Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を含む。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸分子間の結合の強度）は、たとえば核酸分子間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成したハイブリッドのＴｍ、および核酸分子内のＧ：Ｃ比などの因子に影響される。
【００６４】
本明細書において用いられる「Ｔｍ」という用語は、「融解温度」に関して用いられる。融解温度とは、二本鎖核酸分子の集団の半分が一本鎖に解離する温度である。核酸分子のＴｍを算出するための等式は、当該技術分野において周知である。標準的参考文献に示されるとおり、Ｔｍ値の簡単な推定は、核酸分子が１Ｍ  ＮａＣｌの水溶液中にあるときには等式Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）によって算出されてもよい（例、ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＹｏｕｎｇ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（１９８５）を参照）。他の参考文献はより複雑な計算を含んでおり、それらはＴｍの算出のために構造および配列の特徴を考慮するものである。ストリンジェントな条件は当業者に公知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１〜６．３．６に見出され得る。
【００６５】
特に、「ストリンジェンシー条件」という用語が示す条件においては、相補核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、またはｓｓＲＮＡ）のフラグメントまたはそれと同一である１００の連続したヌクレオチドまたはそれ以上、１５０の連続したヌクレオチドまたはそれ以上、２００の連続したヌクレオチドまたはそれ以上、あるいは２５０の連続したヌクレオチドまたはそれ以上が、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ：ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中の５０℃でのハイブリダイゼーションと、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の５０℃または６５℃、好ましくは６５℃での洗浄と同等の条件下で、特異的核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、またはｓｓＲＮＡ）とハイブリダイズする。好ましくは、ハイブリダイズ条件は７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中の５０℃でのハイブリダイゼーションと、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の５０℃または６５℃、好ましくは６５℃での洗浄と同等であり、より好ましくはハイブリダイズ条件は７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中の５０℃でのハイブリダイゼーションと、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の５０℃または６５℃、好ましくは６５℃での洗浄と同等である。好ましくは、相補ヌクレオチドはｆｒｕＡ核酸のフラグメントまたは全体とハイブリダイズする。代替的に、好ましいハイブリダイゼーション条件は、６５℃での１×ＳＳＣまたは４２℃での１×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミド中のハイブリダイゼーションに続く６５℃での０．３×ＳＳＣ中の洗浄、あるいは５０℃での４×ＳＳＣまたは４０℃での６×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミド中のハイブリダイゼーションに続く５０℃での２×ＳＳＣ中の洗浄を含む。さらに好ましいハイブリダイゼーション条件は０．１％ＳＤＳ、０．１  ＳＳＤ、および６５℃である。
【００６６】
よって原則として、上述のプロモーターと、蛍光タンパク質をコードし、かつこのプロモーターの制御下にある核酸とを含む本発明に従う細胞を産生するためのさまざまな可能性が存在する。
【００６７】
第１の可能性は、たとえば、上述のプロモーターの１つと好ましくは対応レギュレーターをコードする遺伝子配列とをすでに含むゲノムを有する細胞から出発し、次いで細胞のゲノムに蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を、この遺伝子配列がそのプロモーターの制御下になるように導入することからなる。適切であれば、蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列をゲノムに組み込む前または後に、プロモーター効率を上げる目的のために、１つまたはそれ以上のヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、またはヌクレオチド挿入によって、プロモーター自体の核酸配列が改変され得る。
【００６８】
第２の可能性は、たとえば、プロモーター配列と、蛍光タンパク質をコードし、かつこのプロモーターの制御下にある遺伝子配列とを含む１つまたはそれ以上の核酸コンストラクトを細胞に導入することからなり、ここではプロモーター効率を上げる目的のために、１つまたはそれ以上のヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、またはヌクレオチド挿入によって、プロモーター自体の核酸配列を改変することも可能である。核酸コンストラクトの挿入は染色体または染色体外で、たとえば染色体外で複製するベクターにおいて行われてもよい。好適なベクターは、特定の細菌株において複製されるものである。多数の公知のプラスミドベクター、たとえばｐＺ１（Ｍｅｎｋｅｌら、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９）６４：５４９〜５５４）、ｐＥＫＥｘ１（Ｅｉｋｍａｎｎｓら、Ｇｅｎｅ  １０２：９３〜９８（１９９１））、またはｐＨＳ２−１（Ｓｏｎｎｅｎら、Ｇｅｎｅ  １０７：６９〜７４（１９９１））などは、潜在性プラスミドｐＨＭ１５１９、ｐＢＬ１、またはｐＧＡ１に基づいている。その他のプラスミドベクター、たとえばｐＣＧ４（米国特許第４，４８９，１６０号）、またはｐＮＧ２（Ｓｅｒｗｏｌｄ−Ｄａｖｉｓら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ６６，１１９〜１２４（１９９０））、またはｐＡＧ１（米国特許第５，１５８，８９１号）に基づくものなどが同じ態様で使用され得る。しかし、このリストは本発明を限定するものではない。
【００６９】
プロモーターと、このプロモーターの制御下の遺伝子配列とを含む遺伝子コンストラクトの生成、および細胞の染色体へのこうしたコンストラクトの組み込み、またはこの遺伝子コンストラクトを含む染色体外複製ベクターの細胞への移行に対する指示は、たとえばＭａｒｔｉｎら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５，１３７〜１４６（１９８７））、Ｇｕｅｒｒｅｒｏら（Ｇｅｎｅ  １３８，３５〜４１（１９９４））、ＴｓｕｃｈｉｙａおよびＭｏｒｉｎａｇａ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６，４２８〜４３０（１９８８））、Ｅｉｋｍａｎｎｓら（Ｇｅｎｅ  １０２，９３〜９８（１９９１））、欧州特許出願公開第０  ４７２  ８６９Ａ号、米国特許第４，６０１，８９３号、ＳｃｈｗａｒｚｅｒおよびＰｕｅｈｌｅｒ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９，８４〜８７（１９９１）、Ｒｅｍｓｃｈｅｉｄら（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６０，１２６〜１３２（１９９４））、ＬａＢａｒｒｅら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７５，１００１〜１００７（１９９３））、国際公開第９６／１５２４６Ａ号、Ｍａｌｕｍｂｒｅｓら（Ｇｅｎｅ  １３４，１５〜２４（１９９３）、特開平１０−２２９８９１Ａ号、ＪｅｎｓｅｎおよびＨａｍｍｅｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ５８，１９１〜１９５（１９９８））、ならびに遺伝学および分子生物学の公知のテキストなどによって、当業者に十分に公知である。
【００７０】
加えて本発明は、細胞懸濁物における、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌増加を特徴とする細胞を識別するための方法に関し、この方法は次の方法ステップ、
α１）自身の野生型に対して遺伝子改変されており、かつ蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む、本発明に従う細胞を含む細胞懸濁物を提供するステップであって、ここで蛍光タンパク質の発現は、細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に依存する、ステップ、
α２）細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に関して異なる細胞を含む細胞懸濁物を得るために細胞の遺伝子改変を行うステップ、
α３）細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌を増加させている、細胞懸濁物中の個々の細胞を識別するステップ、
α４）任意には、識別された細胞を細胞懸濁物から分離するステップを含む。
【００７１】
本発明に従う方法のステップα１）において、最初に、栄養培地と多数の上述の遺伝子改変細胞とを含む細胞懸濁物が提供される。
【００７２】
本発明に従う方法のステップα２）において、次いで、細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に関して異なる細胞を含む細胞懸濁物を得るために、細胞懸濁物中の細胞の１つまたはそれ以上が遺伝子改変される。
【００７３】
細胞懸濁物の遺伝子改変は、標的もしくは非標的突然変異誘発または代謝工学によって行われてもよく、非標的突然変異誘発が特に好ましい。
【００７４】
標的突然変異誘発においては、細胞の特定の遺伝子における突然変異が制御された態様で生成される。可能な突然変異は移行、トランスバージョン、挿入、および欠失である。酵素活性に対するアミノ酸置換の影響に依存して、「ミスセンス突然変異」または「ナンセンス突然変異」と呼ばれる。遺伝子の少なくとも１塩基対の挿入または欠失は「フレームシフト突然変異」をもたらし、その結果として誤ったアミノ酸が取り込まれるか、または翻訳が途中で中断される。いくつかのコドンの欠失は、典型的に酵素活性を完全に失わせる。こうした突然変異を生じさせるための指示は先行技術に属しており、たとえばＫｎｉｐｐｅｒｓによるテキスト（「Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｋ」，第６版，Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９５）、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒによるテキスト（「Ｇｅｎｅ  ｕｎｄ  Ｋｌｏｎｅ」，ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９０）、またはＨａｇｅｍａｎｎによるテキスト（「Ａｌｌｇｅｍｅｉｎｅ  Ｇｅｎｅｔｉｋ」，Ｇｕｓｔａｖ  Ｆｉｓｃｈｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，１９８６）などの遺伝学および分子生物学の公知のテキストに見出され得る。詳細、特に標的突然変異誘発のこれらの方法に関する有用な参考文献は、たとえば独国特許出願公開第１０２  ２４  ０８８Ａ号などに見出され得る。
【００７５】
しかし本発明に従うと、方法ステップα２）における遺伝子改変が、非標的突然変異誘発によって行われることが特に好ましい。こうした非標的突然変異誘発の例は、たとえばＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの化学物質による細胞の処理、またはＵＶ光による細胞の照射である。突然変異を誘発するためのこうした方法は一般的に公知であり、とりわけＭｉｌｌｅｒ（「Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９２））、またはハンドブック「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」，ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）において調べることができる。
【００７６】
本発明に従うプロセスのさらなる実施形態に従うと、方法ステップα２）において遺伝子改変を代謝工学によって達成することも可能である。本明細書において用いられる「代謝工学」という用語は、遺伝子細胞情報の標的遺伝子改変を示す。この改変は、遺伝子をその種に属さない種に導入すること（すなわち異種遺伝子）、ネイティブ遺伝子の重複（すなわち相同遺伝子）、遺伝子の欠失、相同もしくは異種遺伝子の再配列、またはたとえばシグナル配列、アテニュエーター、プロモーター、もしくはターミネーターなどの調節配列の導入を含む。代謝工学を行うための方法は当該技術分野において公知であり、たとえばＭｕｅｌｈａｒｄｔによるテキスト（「Ｔｈｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｅｒ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ／ｇｅｎｏｍｉｃｓ」，第６版，Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２００９）、Ｗｉｎｋによるテキスト（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，第２版，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧａＡ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２０１１）などの遺伝学および分子生物学の公知のテキストから導出できる。
【００７７】
代謝工学の一例は、Ｓｅｃシグナルペプチドをコードしており、かつタンパク質配列をコードする遺伝子と直接または間接的に融合されるときに、細胞からの融合タンパク質の分泌をもたらす調節配列の導入である（ＲｕｓｃｈおよびＫｅｎｄａｌｌ，２００７，「Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ｄｒｉｖｅ  Ｓｅｃ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６，９６６５ｅ９６７３；Ｂｅｎｄｔｓｅｎら，２００４：「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＳｉｇｎａｌＰ  ３．０」，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０，７８３ｅ７９５；Ｎｉｅｌｓｅｎら，１９９７：「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅｓ」，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０，１ｅ６；ｖｏｎ  ＨｅｉｊｎｅおよびＡｂｒａｈｍｓｅｎ，１９８９：「Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．２，５３１ｅ５３４；ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，１９８９：「Ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｓｉｇｎ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｈｏｓｔｓ」，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２４４，４３９ｅ４４６；Ｄａｌｂｅｙら，２０１２：「Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｐａｔｈｗａｙ」，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．７６，３１１ｅ３５０）。代謝工学の他の例は、タンパク質コード遺伝子のコドン使用頻度の変動、タンパク質コード遺伝子を制御するプロモーターの変動、またはタンパク質コード遺伝子の上流領域のリボソーム結合部位の変動である。
【００７８】
方法ステップα２）における細胞の遺伝子改変によって、細胞中で起こった突然変異の性質に依存して、特定の細胞においては、たとえば酵素活性の増加または低減、特定の酵素の発現の増加または低減、特定のトランスポータータンパク質の活性の増加または低減、特定のトランスポータータンパク質の発現の増加または低減、レギュレータータンパク質内の突然変異、調節配列内の突然変異、構造タンパク質内の突然変異、ＲＮＡ制御要素内の突然変異、新たな（異種）酵素活性の導入、新たな（異種）レギュレータータンパク質の導入、新たな（異種または合成）調節配列の導入、新たな（異種）構造タンパク質の導入、あるいは新たな（異種）ＲＮＡ制御要素の導入などの結果として、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌増加があってもよく、それによってプロモーターを介した対応レギュレータータンパク質との相互作用によって、蛍光タンパク質の発現が影響を受ける。したがって、突然変異の結果として細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌が増加した細胞は、この細胞中で蛍光タンパク質が形成されるために区別される。よって蛍光タンパク質に対する遺伝子は、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌増加に対するレポーター遺伝子として作用する。
【００７９】
本発明に従う方法の方法ステップα３）において、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌を増加させている細胞懸濁物中の個々の細胞は、したがって細胞内蛍光活性を検出することによって識別される。このために、蛍光タンパク質を励起して発光させる周波数の電磁放射に細胞懸濁物を曝露する。
【００８０】
本発明に従う方法の特定の構成に従うと、方法ステップα３）における細胞の識別の後、好ましくは直後にさらなる方法ステップα４）が行われ、ここで識別された細胞は細胞懸濁物から分離され、この分離は好ましくはフローサイトメトリ（ＦＡＣＳ＝蛍光標識細胞分取（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ））によって行われ、特に非常に好ましくは高性能フローサイトメトリ（ＨＴ−ＦＡＣＳ＝高スループット蛍光標識細胞分取（ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ））によって行われる。フローサイトメトリによる細胞懸濁物の分析の詳細は、たとえばＳａｃｋ  Ｕ，Ｔａｒｎｏｋ  Ａ，Ｒｏｔｈｅ  Ｇ（ｅｄｓ．）：Ｚｅｌｌｕｌａｅｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ．Ｇｒｕｎｄｌａｇｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｅｎ  ｕｎｄ  ｋｌｉｎｉｓｃｈｅ  Ａｎｗｅｎｄｕｎｇｅｎ  ｄｅｒ  Ｄｕｒｃｈｆｌｕｓｓｚｙｔｏｍｅｔｒｉｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ，２００７，２７〜７０頁などに見出され得る。
【００８１】
したがって本発明に従う方法によって、細胞中で標的または非標的突然変異が生じたか、または代謝工学によって遺伝子情報が変更された細胞懸濁物において、突然変異によって細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌増加がもたらされた細胞を、細胞の活力に影響することなく標的とする態様で単離することが可能である。
【００８２】
本発明に従うセンサは、上述のとおりに細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌増加をもたらす遺伝子改変を識別するためのみに使用され得るのではなく、方法ステップβ１）からβ３）、γ１）からγ３）、δ１）からδ３）、またはε１）からε３）を含む以下の方法に記載されるとおり、このセンサは次のことのためにも用いられ得る。
−  複数の遺伝学的に異なる細胞を含む細胞懸濁物において、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の特に高い分泌を特徴とする細胞を識別すること、
−  細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質分泌に対して細胞培養条件を最適化すること、
−  細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質分泌に対して培地を最適化すること、または
−  細菌細胞の膜を損傷する特性を有することによる抗菌活性を特徴とする化合物を識別すること、もしくは遺伝学的に異なる細菌細胞の集団に対するこうした化合物の効果を分析すること。
【００８３】
加えて本発明は、細胞懸濁物における、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の高分泌を特徴とする細胞を識別するため、または細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の高分泌を特徴とする細胞を含む細胞懸濁物を識別するための方法に関し、この方法は次の方法ステップ、
β１）−  自身の野生型に対して遺伝子改変されており、かつ蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む、本発明に従う複数の細胞を含む細胞懸濁物であって、ここで蛍光タンパク質の発現は細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に依存し、細胞懸濁物中の細胞は、細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に関して互いに異なる、細胞懸濁物、
または
−  複数の細胞懸濁物であって、各細胞懸濁物は、自身の野生型に対して遺伝子改変されており、かつ蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む、本発明に従う細胞を含み、ここで蛍光タンパク質の発現は細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に依存し、細胞懸濁物は、細胞によって細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に関して互いに異なる、複数の細胞懸濁物
を提供するステップ、
β２）細胞懸濁物中の異なる細胞、または異なる細胞懸濁物を培養するステップ、
β３）細胞膜を通過してサイトゾル外空間へタンパク質を高分泌している、細胞懸濁物中の個々の細胞を識別するか、または細胞膜を通過してサイトゾル外空間へタンパク質を高分泌している細胞を含む個々の細胞懸濁物を識別するステップを含む。
【００８４】
この特定のプロセスに関連して用いられる「細胞膜を通過してサイトゾル外空間へタンパク質を高分泌している細胞」という表現は、細胞懸濁物中のその他の細胞に比べて、またはその他の細胞懸濁物に比べて細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量が特に多いことを特徴とする細胞または細胞懸濁物を示す。
【００８５】
加えて本発明は、タンパク質の組み換え体生成のために最適化された培地組成を識別するための方法に関し、この方法は次の方法ステップ、
γ１）培地の組成に関して互いに異なる複数の培地を提供するステップ、
γ２）自身の野生型に対して遺伝子改変されており、かつ蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む、本発明に従う細胞を培養するステップであって、ここで蛍光タンパク質の発現は、異なる培地において細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に依存し、それによって複数の細胞懸濁物が得られ、この細胞懸濁物の細胞は、培地の組成の相違のために、細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に関して互いに異なる、ステップ、
γ３）細胞膜を通過してサイトゾル外空間へタンパク質を高分泌している細胞を含む細胞懸濁物を識別するステップを含む。
【００８６】
この特定のプロセスに関連して用いられる「細胞膜を通過してサイトゾル外空間へタンパク質を高分泌している細胞」という表現は、その他の細胞懸濁物に比べて細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量が特に多いことを特徴とする細胞懸濁物を示す。したがって、この細胞懸濁物において細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質分泌量が多いことは、この特定の細胞懸濁物に用いられる培地が、細胞膜を通過してサイトゾル外空間に大量のタンパク質を分泌することを意図した細胞の培養に対して特に有利であることを示す。
【００８７】
プロセスステップγ１）において提供される培地は、炭素源の種類および量、窒素源の種類および量、リン酸源の種類および量、微量元素の種類および量、塩の種類および量、界面活性物質の種類および量、ビタミンの種類および量、緩衝剤の種類および量などに関して互いに異なっていてもよい。
【００８８】
加えて本発明は、タンパク質の組み換え体生成のために最適化された培養条件を識別するための方法に関し、この方法は次の方法ステップ、
δ１）自身の野生型に対して遺伝子改変されており、かつ蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む、本発明に従う細胞を含む複数の細胞懸濁物を提供するステップであって、ここで蛍光タンパク質の発現は、細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に依存する、ステップ、
δ２）これらの細胞懸濁物中の細胞を異なる培養条件下で培養することによって、異なる細胞懸濁物中の細胞が、培養条件の相違のために、細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に関して互いに異なるようにするステップ、
δ３）細胞膜を通過してサイトゾル外空間へタンパク質を高分泌している細胞を含む細胞懸濁物を識別するステップを含む。
【００８９】
この特定のプロセスに関連して用いられる「細胞膜を通過してサイトゾル外空間へタンパク質を高分泌している細胞」という表現は、その他の細胞懸濁物に比べて細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量が特に多いことを特徴とする細胞懸濁物を示す。したがって、この細胞懸濁物において細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量が多いことは、この実験設定において選択された培養条件が、細胞膜を通過してサイトゾル外空間に大量のタンパク質を分泌することを意図した細胞の培養に対して特に有利であることを示す。
【００９０】
プロセスステップδ２）における培養条件の変動は、たとえば温度、撹拌速度、酸素供給、供給速度、誘導物質を加える時点、培養期間、および細胞培養を行うやり方（バッチプロセス、連続的発酵など）などに関するものであり得る。
【００９１】
加えて本発明は、細菌細胞の膜を損傷する特性を有することによる抗菌活性を特徴とする化合物を識別するため、あるいは遺伝学的に異なる細菌細胞、または異なる生理的状態もしくは異なる増殖相における遺伝学的に同一の細胞の集団に対するこうした化合物の効果を分析するための方法に関し、この方法は次の方法ステップ、
ε１）自身の野生型に対して遺伝子改変されており、かつ蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む、本発明に従う細胞を含む複数の細胞懸濁物を提供するステップであって、ここで蛍光タンパク質の発現は、細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に依存する、ステップ、
ε２）化合物の存在下でこれらの細胞懸濁物中の細胞を培養するステップ、
ε３）細胞内蛍光活性の検出によって、化合物の抗菌活性を決定するステップを含む。
【００９２】
驚くべきことに、本発明に従うセンサは、細菌細胞の膜を損傷する特性を有することによる抗菌活性を特徴とする化合物を識別するためにも使用され得ることが発見された。もしこうした化合物が本発明に従うセンサを含む細胞の膜を損傷すれば、細胞内の蛍光タンパク質の発現増加が観察される。
【００９３】
したがって、たとえば所与の化合物が細菌細胞の膜を損傷する能力を有するかどうか、または所与の化合物がどの濃度において細菌細胞の膜を損傷する能力を有するかなどを決定するために、本発明に従うセンサを含む細胞を用いることができる。この目的のために、本発明に従うセンサを含む細胞の懸濁物に１つまたは異なる濃度の化合物を加え、この化合物の存在下で細胞をインキュベートして、細胞内蛍光活性の検出を介して、その化合物が細胞膜を損傷するかどうか、およびその化合物がどの濃度で細胞膜を損傷するかを決定する。
【００９４】
加えて、たとえば、複数の遺伝学的に異なる細胞または異なる生理的状態もしくは異なる増殖相における遺伝学的に同一の細胞を含む細胞懸濁物の中のどの細胞が、細菌細胞の細胞膜を損傷することが既知である特定の化合物に対して感受性であるかなどを決定するために、本発明に従うセンサを含む細胞を用いることができる。この目的のために、遺伝学的に異なる細胞（たとえば異なる種の細胞など）または異なる生理的状態もしくは異なる増殖相における遺伝学的に同一の細胞の懸濁物に化合物を加え、各細胞は本発明に従うセンサを含んでおり、この化合物の存在下で細胞をインキュベートして、細胞内蛍光活性の検出を介して、どの細胞がその化合物に感受性であるかを決定する。
【００９５】
加えて本発明は、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の最適化された分泌を伴う、自身の野生型に対して遺伝子改変された細胞の産生のための方法に関し、この方法は次の方法ステップ、
Ｉ）自身の野生型に対して遺伝子改変されており、かつ蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む、本発明に従う細胞を含む細胞懸濁物を提供するステップであって、ここで蛍光タンパク質の発現は、細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に依存する、ステップ、
ＩＩ）細胞膜を通過してサイトゾル外空間に分泌されるタンパク質の量に関して異なる細胞を含む細胞懸濁物を得るために細胞の遺伝子改変を行うステップ、
ＩＩＩ）細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌を増加させている、細胞懸濁物中の個々の細胞を識別するステップ、
ＩＶ）識別された細胞を細胞懸濁物から分離するステップ、
Ｖ）識別および分離された細胞における、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌増加の原因となった、遺伝子改変された遺伝子Ｇ１からＧｎまたは突然変異Ｍ１からＭｍを識別するステップ、
ＶＩ）遺伝子Ｇ１からＧｎの少なくとも１つおよび／または突然変異Ｍ１からＭｍの少なくとも１つを含むゲノムを有する、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の最適化された分泌を伴う、自身の野生型に対して遺伝子改変された細胞を産生するステップを含む。
【００９６】
方法ステップＩ）からＩＶ）に従うと、最初に突然変異誘発または代謝工学によって、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌を増加させている細胞が産生されて、細胞懸濁物から分離される。これらのプロセスステップに関する詳細については、上述のプロセスステップｉ）からｉｖ）が参照される。
【００９７】
方法ステップＶ）において、識別および分離された細胞における、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌増加の原因となった、遺伝子改変された遺伝子Ｇ１からＧｎまたは突然変異Ｍ１からＭｍは、次いで当業者に公知の遺伝学的方法によって識別され、数値ｎおよびｍは識別および分離された細胞において観察された改変遺伝子、ならびにそれぞれの観察された突然変異の数に依存する。好ましくは、この状況における手順は、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌を刺激することが既知である細胞内の遺伝子またはプロモーター配列の配列を最初に分析するように行われる。もしこれらの遺伝子のいずれにも突然変異が認識されなければ、適切なさらに改変された遺伝子Ｇｉまたはさらなる突然変異Ｍｉを識別するために、識別および分離された細胞の全ゲノムを分析する。この態様で、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の分泌増加をもたらす有利な改変遺伝子配列Ｇｉまたは有利な突然変異Ｍｉを識別できる。
【００９８】
さらなる方法ステップＶＩ）において、遺伝子Ｇ１からＧｎの少なくとも１つおよび／または突然変異Ｍ１からＭｍの少なくとも１つを含むゲノムを有する、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の最適化された分泌を伴う、自身の野生型に対して遺伝子改変された細胞を、次いで産生できる。このために、方法ステップＶ）において観察された有利な改変遺伝子Ｇおよび／または改変突然変異Ｍの１つまたはそれ以上が、標的とされる態様で細胞に導入される。特定の突然変異のこの標的導入は、たとえば「遺伝子置換」などによって行われ得る。この方法においては、インビトロで目的の遺伝子に、たとえば欠失、挿入または塩基置換などの突然変異が生成される。生成された対立遺伝子は、次に標的宿主に対して非複製的なベクターにクローニングされ、次いでこれが形質転換または接合によって標的宿主に移される。組み込みをもたらす第１の「クロスオーバー」事象と、標的遺伝子または標的配列における切除をもたらす好適な第２の「クロスオーバー」事象とによる相同組み換えの後に、突然変異または対立遺伝子の取り込みが達成される。
【００９９】
加えて本発明は、上述の方法によって得られた、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の最適化された分泌を伴う細胞に関する。
【０１００】
加えて本発明は、タンパク質の生成のためのプロセスに関し、このプロセスは次の方法ステップ、
（ａ）上述の方法によって、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の最適化された分泌を伴う、自身の野生型に対して遺伝子改変された細胞を産生するステップ、
（ｂ）栄養素を含む培地において、細胞がその栄養素からタンパク質を生成する条件下で、細胞を培養するステップを含む。
【０１０１】
この方法によって調製され得る好適なタンパク質は、ホルモン、毒素、抗体、構造タンパク質、酵素、輸送タンパク質、または調節タンパク質を含む。特に好適なのは、本発明に従う細胞に関連してすでに言及されたタンパク質である。
【０１０２】
方法ステップ（ａ）において産生される、細胞膜を通過するサイトゾル外空間へのタンパク質の最適化された分泌を伴う、本発明に従う遺伝子改変された細胞は、方法ステップ（ｂ）において栄養培地中で、バッチ法（バッチ培養）、またはフェドバッチ法（フィード法）、または反復フェドバッチ法（反復性フィード法）で、タンパク質を生成する目的のために連続的または非連続的に培養され得る。たとえば英国特許第１００９３７０Ａ号などに記載される半連続法も想定され得る。公知の培養法の概要は、Ｃｈｍｉｅｌによるテキスト（「Ｂｉｏｐｒｏｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ  １．Ｅｉｎｆｕｅｈｒｕｎｇ  ｉｎ  ｄｉｅ  Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ」，Ｇｕｓｔａｖ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，１９９１）、またはＳｔｏｒｈａｓによるテキスト（「Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ  ｕｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ  Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ」，Ｖｉｅｗｅｇ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、１９９４）に記載されている。
【０１０３】
使用されるべき栄養培地は、特定の菌株の要求を好適な態様で満たす必要がある。さまざまな微生物の培地の説明は、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）のハンドブック「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」に含まれている。
【０１０４】
栄養培地は、炭水化物、たとえばグルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、およびセルロースなど、油および油脂、たとえばダイズ油、ヒマワリ油、ピーナッツ油、およびココナツ油脂など、脂肪酸、たとえばパルミチン酸、ステアリン酸、およびリノール酸など、アルコール、たとえばグリセロールおよびメタノールなど、炭化水素、たとえばメタンなど、アミノ酸、たとえばＬ−グルタメートもしくはＬ−バリンなど、または有機酸、たとえば酢酸などを炭素源として含み得る。これらの物質は個別に用いられても、混合物として用いられてもよい。
【０１０５】
栄養培地は、有機窒素含有化合物、たとえばペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、コーンスティープリカー、大豆粉、および尿素など、または無機化合物、たとえば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、および硝酸アンモニウムなどを窒素源として含み得る。窒素源は個別に用いられても、混合物として用いられてもよい。
【０１０６】
栄養培地は、リン酸、リン酸二水素カリウム、もしくはリン酸水素二カリウム、または対応するナトリウム含有塩をリン源として含み得る。栄養培地はさらに、増殖に必要な金属塩、たとえば硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄などを含む必要がある。最後に上記の物質に加えて、必須増殖物質、たとえばアミノ酸およびビタミンなどが用いられ得る。栄養培地に好適な前駆物質がさらに加えられてもよい。上記の出発物質は１回限りのバッチの形で培養物に加えられてもよいし、培養中に好適な態様で供給されてもよい。
【０１０７】
培養物のｐＨを制御するために、たとえば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水などの塩基性化合物、またはたとえばリン酸もしくは硫酸などの酸性化合物が、好適な態様で用いられる。気泡の発生を制御するために、たとえば脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤が用いられてもよい。プラスミドの安定性を維持するために、たとえば抗生物質などの選択的作用を有する好適な物質が培地に加えられてもよい。好気性の条件を維持するために、酸素またはたとえば空気などの酸素含有気体混合物が培養物に導入される。培養物の温度は通常１５℃から４５℃、好ましくは２５℃から４０℃である。
【０１０８】
加えて本発明は、混合物の調製のための方法に関し、この方法は次の方法ステップ、
（Ａ）上述の方法によってタンパク質を生成するステップ、
（Ｂ）そのタンパク質を、そのタンパク質とは異なる混合物構成要素と混合するステップを含む。
【０１０９】
混合物は食品、動物の餌、医薬組成物、食品製造のための組成物、たとえば酵母で膨らませた焼成品において粉々に崩れる質感プロファイルを達成するための酵素的モノグリセリド代替品として用いられるデンプン分解酵素および脂肪分解酵素を含む混合物など、接着組成物、織物の仕上げ組成物、またはリグノセルロース分解性組成物であってもよい。
【０１１０】
ここで図面および非限定的実施例の助けによって、本発明をより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】菌株ＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０７０６におけるバシトラシン（Ｂａｃ：Ｂａｃｉｔｒａｃｉｎｅ）濃度の関数としての蛍光検出を示す図である（実施例１ｃを参照）。
【図２】菌株ＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０７０６におけるバンコマイシン（Ｖａｎ：Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎｅ）濃度の関数としての蛍光検出を示す図である（実施例１ｃを参照）。
【図３】菌株ＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０７０６  ｐＣＬＴＯＮ２−ＡｍｙＥにおけるＡｍｙＥの分泌レベルまたは細胞膜のトランス側のＡｍｙＥの濃度の関数としての蛍光検出を示す図である（実施例１ｅを参照）。
【図４】菌株ＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２におけるクチナーゼの分泌レベルまたは細胞膜のトランス側のクチナーゼの濃度の関数としての蛍光検出を示す図である（実施例３ｄ）。
【図５】菌株Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０７０６Ｓ  ｐＥＫＥｘ２−ＡｍｙＡの細胞のインビボ蛍光をＡｍｙＡの分泌レベルの関数として示す図であり、ここで細胞はソルビトールを有するか、または有さない栄養培地中で培養されている（実施例１ｇ））。
【図６】クチナーゼの分泌レベルまたは細胞膜のトランス側のクチナーゼの濃度の関数としてのインビボ蛍光を示す図であり、ここでは異なる遺伝学的バックグラウンドを有する菌株（ＡＴＣＣ１３０３２  ｇＳｅｎ０９９６＿８およびＭＢ００１  ｇＳｅｎ０９９６＿８）が用いられている（実施例３ｆ））。
【図７】クチナーゼの分泌レベルまたは細胞膜のトランス側のクチナーゼの濃度の関数としてのインビボ蛍光を示す図であり、ここでは異なる分泌シグナルペプチドが用いられている（実施例３ｉ））。
【図８】菌株Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔ（ＮｐｒＥ）（図８Ａ）、菌株Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔ（Ｙｗｍｃ）（図８Ｂ）、および両方の菌株を１：１の比率で含有する混合培養物（図８Ｃ）に対して蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によって行われたインビボ蛍光発光の検査を示す図である（実施例３ｋ））。
【実施例】
【０１１２】
実施例１
細胞の実施例による第１の実施形態に従う本発明に従う細胞の産生であり、この細胞において、蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列はｃｇ０７０６プロモーターの制御下にあり、かつ蛍光タンパク質の発現は、細菌細胞の膜を損傷する特性を有することによる抗菌活性を特徴とする化合物の存在および濃度、または細胞膜のトランス側のα−アミラーゼ（ＡｍｙＥ）の濃度に依存する。
【０１１３】
ａ）ベクターｐＳｅｎ０７０６およびｐＳｅｎ０７０６Ｓの構築
プロモーターＰ（ｃｇ０７０６）とレポーター遺伝子ｅｙｆｐ（配列番号１８；ｅＹＦＰのタンパク質配列：配列番号１９）との融合物の構築を、プロモーター配列のＰＣＲ増幅と、その後のベクターｐＳｅｎＬｙｓへのクローニングとによって達成した（Ｂｉｎｄｅｒら：「Ａ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｒｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｌｅｖｅｌ」；Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３（５），Ｒ４０，２０１２）。コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡが鋳型の役割をし、オリゴヌクレオチド０７０６−Ｓａｌ−ｆＩＩ（配列番号２０）および０７０６−ＲＢＳＮｄｅ−ｒ（配列番号２１）がプライマーの役割をした。ｐＳｅｎＬｙｓは、ｅｙｆｐをコードする配列をすでに含んでいる。
０７０６−ＲＢＳＮｄｅ＿ｒ：
ＧＣＧＣＡＴＡＴＧＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＴＡＧＣＧＧＧＴＣＴＧＣＣＡＣＡＴＴＴＧＣＴＧ
０７０６−Ｓａｌ−ｆＩＩ：
ＧＣＧＧＴＣＧＡＣＧＧＧＴＡＡＡＣＧＴＧＧＧＡＴＡＴＡＡＡ
【０１１４】
０．８％アガロースゲルからの増殖フラグメントの精製後、フラグメントを制限酵素ＳａｌＩおよびＮｄｅＩで消化し、反応混合物の精製後、同様にＳａｌＩおよびＮｄｅＩで開いて脱リン酸化したベクターｐＳｅｎＬｙｓにフラグメントをライゲーションした。このライゲーション混合物を直接用いて大腸菌ＸＬ１−ブルーを形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬＢプレート上で形質転換体の選択を行った。これらのプレート上で増殖し、したがってカナマイシン耐性であった３２コロニーを、コロニーＰＣＲに用いた。ベクターｐＳｅｎＬｙｓにプロモーターフラグメントが挿入されたかどうかをチェックするために、プライマーＳｅｎＣａｓ−ｆｗ（配列番号２４）およびＴＫＰ−ｓｅｑ−ｒｖ（配列番号２５）によってコロニーＰＣＲを行った。アガロースゲルにおけるコロニーＰＣＲの分析は、分析されたサンプル中に３４３ｂｐのサイズを有する期待どおりのＰＣＲ産物を示し、より大規模なプラスミド調製のために４つのコロニーを培養した。１６ｈの培養後、遠心分離によってこれらの培養物を集め、プラスミドＤＮＡを調製した。コロニーＰＣＲで用いたプライマーによって、これらのプラスミド調製物のうち２つの配列を決定し、挿入物の配列は期待される配列と１００％の同一性を示した。結果として得られたプラスミドをｐＳｅｎ０７０６（配列番号３５）と名付けた。
【０１１５】
スペクチノマイシン耐性媒介配列をＰＣＲで増幅した後に、そのＰＣＲ産物をベクターｐＳｅｎ０７０６にクローニングすることによって、ｐＳｅｎ０７０６のカナマイシン耐性の代わりにスペクチノマイシン耐性を有する変異体であるプラスミドｐＳｅｎ０７０６Ｓを得た。プラスミドｐＥＫＥｘ３がＰＣＲに対する鋳型の役割をし、オリゴヌクレオチドＳｐｃ  ＳａｃＩＩ−ｆ（配列番号２２）およびＳｐｃ  Ｂｇｌ−ｒ（配列番号２３）がプライマーの役割をした。
Ｓｐｃ  ＳａｃＩＩ−ｆ：
ＧＣＧＣＣＧＣＧＧＡＣＴＡＡＴＡＡＣＧＴＡＡＣＧＴＧＡＣＴＧＧＣＡＡＧＡＧ
Ｓｐｃ  Ｂｇｌ−ｒ：
ＧＣＧＡＧＡＴＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＴＴＧＣＴＧＡＣ
【０１１６】
０．８％アガロースゲルからの増殖フラグメントの精製後、フラグメントを制限酵素ＳａｃＩＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、反応混合物の精製後、同様にＳａｃＩＩおよびＢｇｌＩＩで消化して脱リン酸化したベクターｐＳｅｎ０７０６にフラグメントをライゲーションした。このライゲーション混合物を直接用いて大腸菌ＸＬ１−ブルーを形質転換し、１００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含有するＬＢプレート上で形質転換体の選択を行った。これらのプレート上で増殖し、したがってスペクチノマイシン耐性であった４コロニーを、培養液（１００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含有する５ｍｌのＬＢ培地）への接種に用いた。１６ｈの培養後、これらの培養物を遠心分離し、プラスミドＤＮＡを調製した。プライマーＳｅｎＣａｓ−ｆｗ（配列番号２４）およびＴＫＰ−ｓｅｑ−ｒｖ（配列番号２５）によってこれらのプラスミド調製物のうち２つの配列を決定し、挿入物の配列は期待される配列と１００％の同一性を示した。結果として得られたプラスミドをｐＳｅｎ０７０６Ｓと名付けた。
ＳｅｎＣａｓ−ｆｗ：
ＧＴＣＧＣＣＧＴＣＣＡＧＣＴＣＧＡＣＣＡＧＧＡＴＧ
ＴＫＰ−ｓｅｑ−ｒｖ：
ＣＧＧＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＴＡＡＧＴＡＧＴＴＣＧ
【０１１７】
ｂ）ｐＳｅｎ０７０６によるコリネバクテリウム・グルタミクムの形質転換
Ｔａｕｃｈら，２００２（Ｃｕｒｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５（５）（２００２），３６２〜７頁に記載されるとおりに、Ｃ．グルタミクム菌株ＡＴＣＣ１３０３２のコンピテント細胞を調製した。Ｔａｕｃｈらによって記載されるとおりに、エレクトロポレーションによってこれらの細胞をｐＳｅｎ０７０６で形質転換した。２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを有するＢＨＩＳプレート上で形質転換体の選択を行った。こうして得たクローンをＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０７０６と名付けた。
【０１１８】
ｃ）細菌細胞の膜を損傷する特性を有することによる抗菌活性を特徴とする化合物の濃度の関数としての蛍光の検出。
【０１１９】
ＢｉｏＬｅｃｔｏｒシステム（ｍ２ｐ−ｌａｂｓ社（ＧｍｂＨ）、５２４９９  ベスヴァイラー（Ｂａｅｓｗｅｉｌｅｒ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））中のマイクロタイター寸法（Ｆｌｏｗｅｒｐｌａｔｅ（登録商標）ＭＴＰ−４８−Ｂ）において、菌株ＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０７０６の細胞を０．８ｍｌのＣＧＸＩＩ培地（Ｋｅｉｌｈａｕｅｒら，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：５５９５〜６０３）で培養することによって、インビボ蛍光発光の検査を行った。このシステムは、４８の培養物の並行培養ならびに培養物増殖および蛍光の定期的な自動光学測定を可能にする。菌株ＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０７０６の細胞を有する１０の培養物を接種してＯＤ０．１とし、２４時間培養した。４時間後に抗生物質バンコマイシンまたはバシトラシンを培養物に加えた。バンコマイシン濃度を０；１．２５；２．５；５；１０；１５；２０μｇ／ｍｌに調整し、バシトラシン濃度を０；１；４μｇ／ｍｌに調整した。１０分毎に培養物の細胞密度および蛍光を測定した。波長４８５ｎｍの光によって蛍光を励起し、５２０／１０ｎｍにてＥＹＦＰの蛍光発光測定を行った。ＢｉｏＬｅｃｔｉｏｎ  Ｖ．２．４．１．０ソフトウェアによって、培養物の蛍光をデジタルで記録した。異なるバンコマイシンまたはバシトラシン濃度を有する培養物の蛍光発光も異なることを観察した（図１および図２）。
【０１２０】
ｄ）ｐＣＬＴＯＮ２−ＡｍｙＥによるＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０７０６の形質転換
上述のＣ．グルタミクム菌株ＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０７０６のコンピテント細胞を、上述のとおりにエレクトロポレーションによってベクターｐＣＬＴＯＮ２−ＡｍｙＥで形質転換した。このベクターは、枯草菌のデンプン分解酵素α−アミラーゼ（ＡｍｙＥ）と、コリネバクテリウム・グルタミクムのＳｅｃ経路によるタンパク質の排出を可能にするためのＳｅｃ特異的ネイティブシグナルペプチドとをコードする核酸配列を含む。プライマーＡｍｙＥ−ＨｐａＩ−ｆ（配列番号３３）およびＡｍｙＥ−ＳａｃＩ−ｒ（配列番号３４）によって枯草菌の染色体ＤＮＡからＡｍｙＥコード配列を増幅し、ＨｐａＩおよびＳａｃＩによって制限し、ＳｍａＩ／ＳａｃＩで切断したｐＣＬＴＯＮ２ベクター、すなわちｐＣＬＴＯＮ１（緻密に制御可能な遺伝子発現を可能にする、コリネバクテリウム・グルタミクムに対するテトラサイクリン誘導性発現ベクター。Ｌａｕｓｂｅｒｇ  Ｆ，Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ  ＡＲ，Ｈｅｙｅｒ  Ａ，Ｅｇｇｅｌｉｎｇ  Ｌ，Ｆｒｅｕｄｌ  Ｒ．Ｐｌａｓｍｉｄ．２０１２  ６８（２）：１４２〜７）のスペクチノマイシン耐性を与える派生体にライゲーションすることによって、ｐＣＬＴＯＮ２−ＡｍｙＥを調製した。こうして得たクローンをＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０７０６  ｐＣＬＴＯＮ２−ＡｍｙＥと名付けた。
ＡｍｙＥ−Ｈｐａ−ｆ：
ＧＣＧＣＧＴＴＡＡＣＣＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＧＡＴＡＴＧＴＴＴＧＣ
ＡｍｙＥ−Ｓａｃ−ｒ：
ＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＴＡＧＴＧ
【０１２１】
ｅ）ＡｍｙＥの分泌レベル、または細胞膜のトランス側のＡｍｙＥの濃度の関数としての蛍光検出（パラメータ変動）
ＢｉｏＬｅｃｔｏｒシステム（ｍ２ｐ−ｌａｂｓ社、５２４９９  ベスヴァイラー、ドイツ）中のマイクロタイター寸法（Ｆｌｏｗｅｒｐｌａｔｅ（登録商標）ＭＴＰ−４８−Ｂ）において、菌株ＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０７０６  ｐＣＬＴＯＮ２−ＡｍｙＥの細胞を０．８ｍｌのＣＧＸＩＩ培地（Ｋｅｉｌｈａｕｅｒら，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：５５９５〜６０３）で培養することによって、インビボ蛍光発光の検査を行った。菌株ＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０７０６  ｐＣＬＴＯＮ２−ＡｍｙＥの細胞を有する３つの培養物を接種してＯＤ０．１とし、２４時間培養した。４時間後にアンヒドロテトラサイクリン（ＡＴｃ：Ａｎｈｙｄｒｏｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）を加えることによって、ＡｍｙＥの発現を誘導した。異なる発現強度をもたらすように、ＡＴｃ濃度を０、１００、２５０ｎｇ／ｍｌに調整した。１０分毎に培養物の細胞密度および蛍光を測定した。波長４８５ｎｍの光によって蛍光を励起し、５２０／１０ｎｍにてＥＹＦＰの蛍光発光測定を行った。ＢｉｏＬｅｃｔｉｏｎ  Ｖ．２．４．１．０ソフトウェアによって、培養物の蛍光をデジタルで記録した。異なる態様で誘導した培養物の蛍光発光も異なることを観察した（図３）。２４時間後にＦｌｏｗｅｒｐｌａｔｅ（登録商標）内の培養物を遠心分離して細胞をペレットにし、無細胞培養上清を得た。２０μｌの各培養上清を用いて、アミラーゼアッセイ（Ｐｈａｄｅｂａｓアミラーゼテスト（Ａｍｙｌａｓｅ  Ｔｅｓｔ）、マグル（Ｍａｇｌｅ）ＡＢ、ルンド（Ｌｕｎｄ）、スウェーデン（Ｓｗｅｄｅｎ））によって分泌ＡｍｙＥの酵素活性を定量化した。これらの選択した培養条件下で最適とみなされるべきＡＴｃ濃度によって誘導した培養上清におけるアミラーゼのより高い活性は、より高い蛍光発光と相関することを観察した。
【０１２２】
ｆ）ｐＥＫＥｘ２−ＡｍｙＡによるＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０７０６Ｓの形質転換
上述の菌株Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０７０６Ｓのコンピテント細胞を、上述のとおりにエレクトロポレーションによってベクターｐＥＫＥｘ２−ＡｍｙＡで形質転換した。このベクターは、バチルスからのデンプン分解酵素α−アミラーゼ（ＡｍｙＡ）と、Ｃ．グルタミクムのＳｅｃ経路によるタンパク質の排出を可能にするためのＳｅｃ特異的ネイティブシグナルペプチドとをコードする核酸配列を含む。プライマーＡｍｙＡ−ＢａｍＨＩ−ｆ（配列番号４０）およびＡｍｙＡ−ＳａｃＩ−ｒ（配列番号４１）によってバチルスの染色体ＤＮＡからＡｍｙＡコード配列を増幅し、ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩによって制限し、ＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ切断ｐＥＫＥｘ２ベクター（Ｅｉｋｍａｎｎｓら、Ｇｅｎｅ  １０２：９３〜９８（１９９１））にライゲーションすることによって、ｐＥＫＥｘ２−ＡｍｙＡを調製した。こうして得たクローンをＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０７０６Ｓ  ｐＥＫＥｘ２−ＡｍｙＡと名付けた。
ＡｍｙＡ−ＢａｍＨＩ−ｆ：
ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＡＡＡＣＧＴＡＡＡＡＡＴＧＧＡＴＴＡＡＴＣ
ＡｍｙＡ−ＳａｃＩ−ｒ：
ＧＣＧＧＡＧＣＴＣＴＡＡＴＴＡＴＴＴＡＣＣＣＡＴＡＴＡＧＡＴＡＣＡＧＡＣＣＣＡＣ
【０１２３】
ｇ）ソルビトール含有量に関する栄養培地の変動の実施例としての、ＡｍｙＡの分泌レベル、または細胞膜のトランス側のＡｍｙＡの濃度の関数としての蛍光検出。
【０１２４】
ＢｉｏＬｅｃｔｏｒシステム（ｍ２ｐ−ｌａｂｓ社、５２４９９  ベスヴァイラー、ドイツ）中のマイクロタイター寸法（Ｆｌｏｗｅｒｐｌａｔｅ（登録商標）ＭＴＰ−４８−Ｂ）において、菌株Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０７０６Ｓ  ｐＥＫＥｘ２−ＡｍｙＡの細胞を、９１ｇ／ｌのソルビトールの添加を伴うか、または伴わない０．８ｍｌの「Ｄｉｆｃｏブレインハートインフュージョン（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）」培地（Ｄｉｆｃｏ、ベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｋｉｎｓｏｎ）ＢＤ、１ベクトン・ドライブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｒｉｖｅ）、フランクリン・レイクス（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ）、ＮＪ  ＵＳＡ）で培養することによって、インビボ蛍光発光の検査を行った。菌株ＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０７０６Ｓ  ｐＥＫＥｘ２−ＡｍｙＡの細胞を有する４つの培養物を接種してＯＤ０．１とし、２４時間培養した。４時間後にイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ：Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄ）を加えることによって、ＡｍｙＡの発現を誘導した。異なる発現強度をもたらすように、ＩＰＴＧ濃度を１０μＭまたは５０μＭに調整した。１０分毎に培養物の細胞密度および蛍光を測定した。波長４８５ｎｍの光によって蛍光を励起し、５２０／１０ｎｍにてＥＹＦＰの蛍光発光測定を行った。ＢｉｏＬｅｃｔｉｏｎ  Ｖ．２．４．１．０ソフトウェアによって、培養物の蛍光をデジタルで記録した。異なる態様で誘導した培養物の蛍光発光も異なっていること、およびソルビトールを伴うかまたは伴わない栄養培地で増殖した培養物の蛍光発光は異なることを観察した（図５）。２４時間後にＦｌｏｗｅｒｐｌａｔｅ（登録商標）内の培養物を遠心分離して細胞をペレットにし、無細胞培養上清を得た。２０μｌの各培養上清を用いて、アミラーゼアッセイ（Ｐｈａｄｅｂａｓアミラーゼテスト（Ａｍｙｌａｓｅ  Ｔｅｓｔ）、マグルＡＢ、ルンド、スウェーデン）によって分泌ＡｍｙＡの酵素活性を定量化した。培養上清におけるアミラーゼのより高い活性は、より高い蛍光発光と相関することを観察した。
【０１２５】
実施例２
細胞の実施例による第１の実施形態に従う本発明に従う細胞の産生であり、この細胞において、蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列はｃｇ１３２５プロモーターの制御下にあり、かつ蛍光タンパク質の発現は、細菌細胞の膜を損傷する特性を有することによる抗菌活性を特徴とする化合物の存在および濃度、または細胞膜のトランス側の特定のタンパク質の濃度に依存する。
【０１２６】
ａ）ベクターｐＳｅｎ１３２５の構築
プロモーターＰ（ｃｇ１２３５）とレポーター遺伝子ｅｙｆｐ（配列番号１８；ｅＹＦＰのタンパク質配列：配列番号１９）との融合物の構築を、プロモーター配列のＰＣＲ増幅と、その後のベクターｐＳｅｎＬｙｓへのクローニングとによって達成した（Ｂｉｎｄｅｒら：「Ａ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｒｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｌｅｖｅｌ」；Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３（５），Ｒ４０，２０１２）。コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡが鋳型の役割をし、オリゴヌクレオチド１３２５−Ｓａｌ−ｆ（配列番号２６）および１３２５−ＲＢＳＮｄｅ−ｒ（配列番号２７）がプライマーの役割をした。ｐＳｅｎＬｙｓは、ｅｙｆｐをコードする配列をすでに含んでいる。
１３２５−Ｓａｌ−ｆ：
ＧＣＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＡＧＧＧＴＴＴＡＣＴＴＧ
１３２５−ＲＢＳＮｄｅ−ｒ：
ＧＣＧＣＡＴＡＴＧＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＴＡＡＣＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＴＣＣ
【０１２７】
１％アガロースゲルからの増殖フラグメントの精製後、フラグメントを制限酵素ＳａｌＩおよびＮｄｅＩで消化し、反応混合物の精製後、同様にＳａｌＩおよびＮｄｅＩで消化して脱リン酸化したベクターｐＳｅｎＬｙｓにフラグメントをライゲーションした。このライゲーション混合物を直接用いて大腸菌ＸＬ１−ブルーを形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬＢプレート上で形質転換体の選択を行った。これらのプレート上で増殖し、したがってカナマイシン耐性であった４８コロニーを、コロニーＰＣＲに用いた。ベクターｐＳｅｎＬｙｓにプロモーターフラグメントが挿入されたかどうかをチェックするために、プライマーＳｅｎＣａｓ−ｆｗ（配列番号２４）およびＴＫＰ−ｓｅｑ−ｒｖ（配列番号２５）によってコロニーＰＣＲを行った。アガロースゲルにおけるコロニーＰＣＲの分析は、分析されたサンプル中に２５０ｂｐのサイズを有する期待どおりのＰＣＲ産物を示し、より大規模なプラスミド調製のために４つのコロニーを培養した。１６ｈの培養後、遠心分離によってこれらの培養物を集め、プラスミドＤＮＡを調製した。コロニーＰＣＲで用いたプライマーによって、これらのプラスミド調製物のうち２つの配列を決定し、挿入物の配列は期待される配列と１００％の同一性を示した。結果として得られたプラスミドをｐＳｅｎ１３２５（配列番号３６）と名付けた。
【０１２８】
ｂ）ｐＳｅｎ１３２５によるコリネバクテリウム・グルタミクムの形質転換
Ｔａｕｃｈら，２００２（Ｃｕｒｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５（５）（２００２），３６２〜７頁に記載されるとおりに、Ｃ．グルタミクム菌株ＡＴＣＣ１３０３２のコンピテント細胞を調製した。Ｔａｕｃｈらによって記載されるとおりに、エレクトロポレーションによってこれらの細胞をｐＳｅｎ１３２５で形質転換した。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを有するＢＨＩＳプレート上で形質転換体の選択を行った。こうして得たクローンをＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ１３２５と名付けた。
【０１２９】
ｃ）細菌細胞の膜を損傷する特性を有することによる抗菌活性を特徴とする化合物の濃度の関数としての蛍光の検出。
【０１３０】
ＢｉｏＬｅｃｔｏｒシステム（ｍ２ｐ−ｌａｂｓ社、５２４９９  ベスヴァイラー、ドイツ）中のマイクロタイター寸法（Ｆｌｏｗｅｒｐｌａｔｅ（登録商標）ＭＴＰ−４８−Ｂ）において、菌株ＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ１３２５の細胞を０．８ｍｌのＣＧＸＩＩ培地（Ｋｅｉｌｈａｕｅｒら，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：５５９５〜６０３）で培養することによって、インビボ蛍光発光の検査を行った。菌株ＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ１３２５の細胞を有する１３の培養物を接種してＯＤ０．１とし、２４時間培養した。４時間後に抗生物質バンコマイシンまたはバシトラシンを培養物に加えた。バンコマイシン濃度を０；１．２５；２．５；５；１０；１５；２０μｇ／ｍｌに調整し、バシトラシン濃度を０；０．２５；０．５；１；２；４μｇ／ｍｌに調整した。１０分毎に培養物の細胞密度および蛍光を測定した。波長４８５ｎｍの光によって蛍光を励起し、５２０／１０ｎｍにてＥＹＦＰの蛍光発光測定を行った。ＢｉｏＬｅｃｔｉｏｎ  Ｖ．２．４．１．０ソフトウェアによって、培養物の蛍光をデジタルで記録した。異なるバンコマイシンまたはバシトラシン濃度を有する培養物の蛍光発光も異なることを観察した。
【０１３１】
実施例３
細胞の実施例による第１の実施形態に従う本発明に従う細胞の産生であり、この細胞において、蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列はｃｇ０９９６プロモーターおよびｃｇ０９９８プロモーターの共通の制御下にあり、かつ蛍光タンパク質の発現は、細胞膜のトランス側の特定のタンパク質の濃度に依存する。
【０１３２】
ａ）ベクターｐＳｅｎ０９９６＿８、ｐＳｅｎ０９９６＿８ｃ、およびｐＳｅｎ０９９６＿８ｅの構築
プロモーターＰ（ｃｇ０９９６）およびＰ（ｃｇ０９９８）とレポーター遺伝子ｅｙｆｐ（配列番号１８；ｅＹＦＰのタンパク質配列：配列番号１９）との融合物の構築を、合成ＤＮＡフラグメント（ｐＳｅｎ０９９６＿８に対して配列番号２８、ｐＳｅｎ０９９６＿８ｃに対して配列番号２９、およびｐＳｅｎ０９９６＿８ｅに対して配列番号３０）の化学合成と、ベクターｐＳｅｎＬｙｓへのそれらのライゲーションとによって達成した（Ｂｉｎｄｅｒら：「Ａ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｒｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｌｅｖｅｌ」；Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３（５），Ｒ４０，２０１２）。ｐＳｅｎＬｙｓは、ｅｙｆｐをコードする配列をすでに含んでいる。
【０１３３】
合成ＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳａｌＩおよびＮｄｅＩで切断し、その後反応混合物を精製した後、切り出したＤＮＡフラグメントを、同様にＳａｌＩ／ＮｄｅＩで消化して脱リン酸化したベクターｐＳｅｎＬｙｓとの個別のライゲーション反応に用いた。このライゲーション混合物を直接用いて大腸菌ＸＬ１−ブルーを別々に形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬＢプレート上で形質転換体の選択を行った。これらのプレートの各々の上で増殖し、したがってカナマイシン耐性であった８コロニーを、コロニーＰＣＲに用いた。ｐＳｅｎＬｙｓに合成ＤＮＡフラグメントが挿入されたことを確認するために、プライマーＳｅｎＣａｓ−ｆｗ（配列番号２４）およびＴＫＰ−ｓｅｑ−ｒｖ（配列番号２５）を用いてコロニーＰＣＲを行った。
【０１３４】
アガロースゲルにおけるコロニーＰＣＲの分析は、分析されたサンプル中にｐＳｅｎ０９９６＿８の場合は８７２ｂｐのサイズ、ｐＳｅｎ０９９６＿８ｃの場合は４１３ｂｐのサイズ、およびｐＳｅｎ０９９６＿８ｅの場合は２７７４ｂｐのサイズを有する期待どおりのＰＣＲ産物を示し、より大規模なプラスミド調製のために各々８つのコロニーを培養した。１６ｈの培養後、遠心分離によってこれらの培養物を集め、プラスミドＤＮＡを調製した。プライマーＪＰＳ０００３（配列番号３１）およびＪＰＳ０００４（配列番号３２）によって、これらのプラスミド調製物の各々１つの配列を決定し、挿入物の配列は期待される配列と１００％の同一性を示した。結果として得られたプラスミドをｐＳｅｎ０９９６＿８（配列番号３７）、ｐＳｅｎ０９９６＿８ｃ（配列番号３８）、およびｐＳｅｎ０９９６＿８ｅ（配列番号３９）と名付けた。
ＪＰＳ０００３：
ＣＴＧＡＡＣＴＴＧＴＧＧＣＣＧＴＴＴＡＣ
ＪＰＳ０００４：
ＴＴＧＴＴＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧ
【０１３５】
ｂ）ｐＳｅｎ０９９６＿８、ｐＳｅｎ０９９６＿８ｃ、およびｐＳｅｎ０９９６＿８ｅによるコリネバクテリウム・グルタミクムの形質転換
Ｔａｕｃｈら，２００２（Ｃｕｒｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５（５）（２００２），３６２〜７頁に記載されるとおりに、Ｃ．グルタミクム菌株ＡＴＣＣ１３０３２のコンピテント細胞を調製した。Ｔａｕｃｈらによって記載されるとおりに、エレクトロポレーションによってこれらの細胞をｐＳｅｎ０９９６＿８またはｐＳｅｎ０９９６＿８ｃまたはｐＳｅｎ０９９６＿８ｅのいずれかで形質転換した。
【０１３６】
ｃ）ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔによるＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８またはＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８ｃまたはＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８ｅの形質転換
上述のＣ．グルタミクム菌株ＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８またはＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８ｃまたはＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８ｅのコンピテント細胞を、上述のとおりにエレクトロポレーションによってベクターｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔで形質転換した。このベクターは、フザリウム・ソラニ・ピシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ  ｐｉｓｉ）からのリパーゼ酵素クチナーゼ（Ｃｕｔｉｎａｓｅ）（ＦｓＣｕｔ）と、コリネバクテリウム・グルタミクムのＳｅｃ経路によるタンパク質の排出を可能にするためのＳｅｃ特異的シグナルペプチドＮｐｒＥとをコードする核酸配列を含む。合成ＤＮＡフラグメント（配列番号３３）を化学合成し、その合成ＤＮＡフラグメントをＰｓｔＩ／ＳａｃＩによって制限し、制限フラグメントを同じく消化したベクターｐＣＬＴＯＮ２、すなわちｐＣＬＴＯＮ１（緻密に制御可能な遺伝子発現を可能にする、コリネバクテリウム・グルタミクムに対するテトラサイクリン誘導性発現ベクター。Ｌａｕｓｂｅｒｇ  Ｆ，Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ  ＡＲ，Ｈｅｙｅｒ  Ａ，Ｅｇｇｅｌｉｎｇ  Ｌ，Ｆｒｅｕｄｌ  Ｒ．Ｐｌａｓｍｉｄ．２０１２  ６８（２）：１４２〜７）のスペクチノマイシン耐性を与える派生体にライゲーションすることによって、ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔを得た。こうして得たクローンを、ＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔ、ＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８ｃ  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔ、またはＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８ｅ  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔと名付けた。
【０１３７】
ｄ）クチナーゼの分泌レベル、または細胞膜のトランス側のクチナーゼの濃度の関数としての蛍光検出（パラメータ変動）
ＢｉｏＬｅｃｔｏｒシステム（ｍ２ｐ−ｌａｂｓ社、５２４９９  ベスヴァイラー、ドイツ）中のマイクロタイター寸法（Ｆｌｏｗｅｒｐｌａｔｅ（登録商標）ＭＴＰ−４８−Ｂ）において、菌株ＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔの細胞を０．８ｍｌのＣＧＸＩＩ培地（Ｋｅｉｌｈａｕｅｒら，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：５５９５〜６０３）で培養することによって、インビボ蛍光発光の検査を行った。菌株ＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔの細胞を有する３つの培養物を接種してＯＤ０．１とし、２４時間培養した。４時間後にアンヒドロテトラサイクリン（ＡＴｃ）を加えることによって、クチナーゼの発現を誘導した。異なる発現強度をもたらすように、ＡＴｃ濃度を０、１００、２５０ｍＭに調整した。１０分毎に培養物の細胞密度および蛍光を測定した。波長４８５ｎｍの光によって蛍光を励起し、５２０／１０ｎｍにてＥＹＦＰの蛍光発光測定を行った。ＢｉｏＬｅｃｔｉｏｎ  Ｖ．２．４．１．０ソフトウェアによって、培養物の蛍光をデジタルで記録した。異なる態様で誘導した培養物の蛍光発光も異なることを観察した（図４）。２４時間後にＦｌｏｗｅｒｐｌａｔｅ（登録商標）内の培養物を遠心分離して細胞をペレットにし、無細胞培養上清を得た。２０μｌの各培養上清を用いて、ｐ−ニトロフェニルパルミテート（ｐＮＰＰ：ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐａｌｍｉｔａｔｅ）アッセイによって分泌クチナーゼの酵素活性を定量化した。これらの選択した培養条件下で最適とみなされるべきＡＴｃ濃度によって誘導した培養上清におけるクチナーゼのより高い活性は、より高い蛍光発光と相関することを観察した。
【０１３８】
ｅ）ベクターｐＫ１９−ｐＳｅｎ０９９６＿８ｅの構築
鋳型としてのＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡならびにプライマー０９９８ｕｐ−ｆ（配列番号４２）および０９９８ｕｐ−ｒ（配列番号４３）によるｃｇ０９９８上流領域の増幅と、鋳型としてのＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡならびにプライマー０９９８ｄｗ−ｆ（配列番号４４）および０９９８ｄｗ−ｒ（配列番号４５）によるｃｇ０９９８下流領域の増幅と、鋳型としてのｐＳｅｎ０９９６＿８ｅならびにプライマーｅｙｆｐ−ｏｌ−ｆ（配列番号４６）およびｅｙｆｐ−ｏｌ−ｒ（配列番号４７）によるｅｙｆｐコード配列の増幅と、その後の鋳型としての上記ＰＣＲ反応のＰＣＲ産物ならびにプライマー０９９８ｕｐ−ｆおよび０９９８ｄｗ−ｒによるオーバーラップ伸長ＰＣＲとによって、ｐＫ１９−ｐＳｅｎ０９９６＿８ｅを調製した。最後にオーバーラップ伸長ＰＣＲの産物をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化し、ＳｍａＩ切断プラスミドｐＫ１９（配列番号４８）にライゲーションした。
０９９８ｕｐ−ｆ：ＧＡＡＧＡＡＡＣＣＧＣＣＧＡＡＡＣＧＴＣＡＡＧＣ
０９９８ｕｐ−ｒ：ＣＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＣ
０９９８ｄｗ−ｆ：ＧＴＴＴＡＡＡＡＧＡＧＴＴＡＡＴＣＴＧＣＡＴＣＴＡＡＴＣＡＡＧＴＡＧＣＣ
０９９８ｄｗ−ｒ：ＧＣＣＡＴＣＡＣＧＡＡＴＴＧＣＣＧＡＡＣＧＡＧ
ｅｙｆｐ−ｏｌ−ｆ：ＧＡＧＡＡＣＣＣＧＧＡＣＣＧＴＧＣＡＴＣＧＴＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＣＡＴＡＴＧＧ
ｅｙｆｐ−ｏｌ−ｒ：
ＧＣＡＧＡＴＴＡＡＣＴＣＴＴＴＴＡＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧ
【０１３９】
このライゲーション混合物を直接用いて大腸菌ＸＬ１−ブルーを形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび１００μｇ／ｍｌ  Ｘｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（５−Ｂｒｏｍ−４−ｃｈｌｏｒ−３−ｉｎｄｏｘｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄ））を含有するＬＢプレート上で、青／白スクリーニングによって形質転換体の選択を行った。各々のより大規模なプラスミド調製のために４つのコロニーを培養した。１６ｈの培養後、遠心分離によってこれらの培養物を集め、プラスミドＤＮＡを調製して、プライマーＭ１３ｕｎｉ（−４３）（配列番号４９）およびＭ１３ｒｅｖ（−４９）（配列番号５０）による配列決定に用いた。挿入物の配列は期待される配列と１００％の同一性を示した。結果として得られたプラスミドをｐＫ１９−ｐＳｅｎ０９９６＿８ｅ（配列番号５１）と名付けた。
Ｍ１３ｕｎｉ（−４３）：ＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴ
Ｍ１３ｒｅｖ（−４９）：ＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ
【０１４０】
ｆ）菌株Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２  ｇＳｅｎ０９９６＿８およびＣ．グルタミクムＭＢ００１  ｇＳｅｎ０９９６＿８の構築。
Ｔａｕｃｈら，２００２（Ｃｕｒｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５（５）（２００２），３６２〜７頁）に記載されるとおりに、Ｃ．グルタミクム菌株ＡＴＣＣ１３０３２およびＣ．グルタミクムＭＢ００１  ｇＳｅｎ０９９６＿８のコンピテント細胞を調製した。上述のとおりに、エレクトロポレーションによってこれらの細胞をベクターｐＫ１９−ｐＳｅｎ０９９６＿８ｅで形質転換した。このベクターはＣ．グルタミクム中で複製できないため、カナマイシン含有アガープレート上のコロニーは、ｐＳｅｎ０９９６＿８ｅ配列を含有するベクターを相同組み換えによって自身の染色体に組み込んだ細胞からのみ増殖し得る。第２の相同組み換えにおいて、ベクターは再び染色体から取り除かれて、ゲノム中に導入したｐＳｅｎ０９９６＿８ｅ配列のみを残してもよい。それらの細胞に対する選択のために、カナマイシン含有アガープレートで増殖したコロニーを選択し、複合培地で培養し、１０％サッカロースを含有するアガープレートに蒔く。ベクターｐＫ１９はレバンスクラーゼをコードする枯草菌の遺伝子ｓａｃＢの改変変異体を含んでおり、レバンスクラーゼはサッカロースからレバンへの反応を触媒し、後者はＣ．グルタミクムにとって毒性である。よってサッカロース含有アガー上のコロニーは、第２の相同組み換えによって組み込まれたベクター配列を除去し、ゲノム中に導入したｐＳｅｎ０９９６＿８ｅ配列のみを残した細胞からのみ増殖し得る。こうして得たクローンをＡＴＣＣ１３０３２  ｇＳｅｎ０９９６＿８およびＭＢ００１  ｇＳｅｎ０９９６＿８と名付けた（Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ａ．，Ｔａｕｃｈ，Ａ．，Ｊａｅｇｅｒ，Ｗ．，Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ，Ｊ．，Ｔｈｉｅｒｂａｃｈ，Ｇ．，Ｐｕｅｈｌｅｒ，Ａ．（１９９４），Ｓｍａｌｌ  ｍｏｂｉｌｉｚａｂｌｅ  ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｐＫ１８  ａｎｄ  ｐＫ１９：ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ，Ｇｅｎｅ  １４５：６９〜７３）。
【０１４１】
ｇ）細菌株の遺伝学的バックグラウンドの変動の実施例としての、ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔによるＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２  ｇＳｅｎ０９９６＿８およびＭＢ００１  ｇＳｅｎ０９９６＿８の形質転換。
【０１４２】
Ｔａｕｃｈら，２００２（Ｃｕｒｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５（５）（２００２），３６２〜７頁）に記載されるとおりに、Ｃ．グルタミクム菌株ＡＴＣＣ１３０３２  ｇＳｅｎ０９９６＿８およびＭＢ００１  ｇＳｅｎ０９９６＿８のコンピテント細胞を調製した。上述のとおり、エレクトロポレーションによってこれらの細胞をベクターｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔで形質転換した。こうして得たクローンをＡＴＣＣ１３０３２  ｇＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔおよびＭＢ００１  ｇＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔと名付けた。
【０１４３】
ｈ）クチナーゼの分泌レベル、または細胞膜のトランス側のクチナーゼの濃度の関数としての蛍光検出。
【０１４４】
ＢｉｏＬｅｃｔｏｒシステム（ｍ２ｐ−ｌａｂｓ社、５２４９９  ベスヴァイラー、ドイツ）中のマイクロタイター寸法（Ｆｌｏｗｅｒｐｌａｔｅ（登録商標）ＭＴＰ−４８−Ｂ）において、菌株Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔおよびＭＢ００１  ｇＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔの細胞を０．８ｍｌのＣＧＸＩＩ培地（Ｋｅｉｌｈａｕｅｒら，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：５５９５〜６０３）で培養することによって、インビボ蛍光発光の検査を行った。菌株ＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔの細胞を有する３つの培養物と、菌株ＭＢ００１  ｇＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔの３つの培養物とを接種してＯＤ０．１とし、２４時間培養した。４時間後にアンヒドロテトラサイクリン（ＡＴｃ）を加えることによって、クチナーゼの発現を誘導した。異なる発現強度をもたらすように、ＡＴｃ濃度を０ｍＭおよび２５０ｍＭに調整した。１０分毎に培養物の細胞密度および蛍光を測定した。波長４８５ｎｍの光によって蛍光を励起し、５２０／１０ｎｍにてＥＹＦＰの蛍光発光測定を行った。ＢｉｏＬｅｃｔｉｏｎ  Ｖ．２．４．１．０ソフトウェアによって、培養物の蛍光をデジタルで記録した。異なる態様で誘導した培養物の蛍光発光も異なること、および異なる菌株の培養物の蛍光発光は異なることを観察した（図６）。２４時間後にＦｌｏｗｅｒｐｌａｔｅ（登録商標）内の培養物を遠心分離して細胞をペレットにし、無細胞培養上清を得た。２０μｌの各培養上清を用いて、ｐ−ニトロフェニルパルミテート（ｐＮＰＰ）アッセイによって分泌クチナーゼの酵素活性を定量化した。培養上清におけるクチナーゼのより高い活性はより高い蛍光発光と相関しており、センサシグナルの光学分析によって、異なるレベルのクチナーゼ分泌または細胞膜のトランス側の異なる濃度のクチナーゼを有する菌株の差別化が可能であることを観察した。
【０１４５】
ｉ）分泌シグナルペプチドの変動の実施例としての、ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔ（ＮｐｒＥ）およびｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔ（Ｙｗｍｃ）によるＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２  ｇＳｅｎ０９９６＿８の形質転換。
【０１４６】
Ｔａｕｃｈら，２００２（Ｃｕｒｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５（５）（２００２），３６２〜７頁）に記載されるとおりに、Ｃ．グルタミクム菌株ＡＴＣＣ１３０３２  ｇＳｅｎ０９９６＿８のコンピテント細胞を調製した。上述のとおりに、エレクトロポレーションによってこれらの細胞をベクターｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔ（ＮｐｒＥ）およびｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔ（Ｙｗｍｃ）で形質転換した。これらのベクターは上述のｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔの変異体であり、クチナーゼのネイティブ分泌シグナル配列をＮｐｒＥまたはＹｗｍｃシグナル配列（配列番号５２、配列番号５３）で置換したものである。こうして得たクローンをＡＴＣＣ１３０３２  ｇＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔ（ＮｐｒＥ）およびＡＴＣＣ１３０３２  ｇＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔ（Ｙｗｍｃ）と名付けた。
【０１４７】
ｊ）クチナーゼの分泌レベルまたは細胞膜のトランス側のクチナーゼの濃度の関数としての蛍光検出。
【０１４８】
ＢｉｏＬｅｃｔｏｒシステム（ｍ２ｐ−ｌａｂｓ社、５２４９９  ベスヴァイラー、ドイツ）中のマイクロタイター寸法（Ｆｌｏｗｅｒｐｌａｔｅ（登録商標）ＭＴＰ−４８−Ｂ）において、菌株Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔ（ＮｐｒＥ）およびＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔ（Ｙｗｍｃ）の細胞を０．８ｍｌのＣＧＸＩＩ培地（Ｋｅｉｌｈａｕｅｒら，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：５５９５〜６０３）で培養することによって、インビボ蛍光発光の検査を行った。菌株ＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔ（ＮｐｒＥ）の細胞を有する３つの培養物および菌株ＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔ（Ｙｗｍｃ）の細胞を有する３つの培養物を接種してＯＤ０．１とし、２４時間培養した。４時間後に２５０ｍＭのアンヒドロテトラサイクリン（ＡＴｃ）を加えることによって、クチナーゼの発現を誘導した。１０分毎に培養物の細胞密度および蛍光を測定した。波長４８５ｎｍの光によって蛍光を励起し、５２０／１０ｎｍにてＥＹＦＰの蛍光発光測定を行った。ＢｉｏＬｅｃｔｉｏｎ  Ｖ．２．４．１．０ソフトウェアによって、培養物の蛍光をデジタルで記録した。異なる分泌シグナルペプチドと融合したクチナーゼを発現する菌株の蛍光発光も異なることを観察した（図７）。２４時間後にＦｌｏｗｅｒｐｌａｔｅ（登録商標）内の培養物を遠心分離して細胞をペレットにし、無細胞培養上清を得た。２０μｌの各培養上清を用いて、ｐ−ニトロフェニルパルミテート（ｐＮＰＰ）アッセイによって分泌クチナーゼの酵素活性を定量化した。培養上清におけるクチナーゼのより高い活性は、より高い蛍光発光と相関することを観察した。
【０１４９】
ｋ）加えて、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によってインビボ蛍光発光の検査を行った。菌株Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔ（ＮｐｒＥ）、菌株Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔ（Ｙｗｍｃ）の培養物、および両方の菌株を１：１および１：１００（ＮｐｒＥ：Ｙｗｍｃ）の比率で含有する混合培養物を０．８ｍｌのＣＧＸＩＩ培地（Ｋｅｉｌｈａｕｅｒら，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：５５９５〜６０３）に接種し、ＢｉｏＬｅｃｔｏｒシステム（ｍ２ｐ−ｌａｂｓ社、５２４９９  ベスヴァイラー、ドイツ）中のマイクロタイター寸法（Ｆｌｏｗｅｒｐｌａｔｅ（登録商標）ＭＴＰ−４８−Ｂ）において培養した。４時間後に２５０ｍＭのアンヒドロテトラサイクリン（ＡＴｃ）を加えることによって、クチナーゼの発現を誘導した。さらに１０時間のインキュベーション後、すべての培養物の光学特性を分析した。異なる分泌シグナルペプチドと融合したクチナーゼを発現する菌株の蛍光発光も異なることを観察した（図８Ａおよび図８Ｂ）。菌株ＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔ（ＮｐｒＥ）およびＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔ（Ｙｗｍｃ）の両方の細胞を含有する混合培養物（図８Ｃ）を用いて、ベクトン・ディキンソン（ベクトン・ディキンソンＢＤ、１ベクトン・ドライブ、フランクリン・レイクス、ＮＪ  ＵＳＡ）のＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  セルソーターＩＩＩによって細胞を分別した。ＦＡＣＳ設定は、「前方散乱」（ＮＤフィルタ１．０）に対して１６ｍＶ、「側方散乱」に対して２６９ｍＶの電子利得における「前方散乱」および「側方散乱」に対する閾値限界として２００であった。４８８ｎｍの波長にてＥＹＦＰの励起を行い、上流に接続した発光帯域フィルタ（ｂａｎｄ  ｐａｔｈ  ｆｉｌｔｅｒ）５３０／３０ｎｍによる４００ｍＶにおける「パラメータ利得」ＰＭＴによって検出した。ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  セルソーターＩＩＩを用いて、各混合培養物の４４の細胞をＥＹＦＰ蛍光に関して分別し、９６ウェルマイクロタイタープレート（各ウェルは２００μｌのＣＧＸＩＩ培地を含む）に保存した（図８Ｃ）。１６時間の培養後、遠心分離によってこれらの培養物を集め、プラスミドＤＮＡを調製した。プライマーｐＥＫＥｘ２−ｆｗ（配列番号５４）およびｐＥＫＥｘ２−ｒｖ（配列番号５５）によって、プラスミド調製物の配列を決定した。１：１混合培養物の場合、４６の分別細胞のうちの４４がＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔ（ＮｐｒＥ）であり、４６細胞のうち２つがＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔ（Ｙｗｍｃ）であることを観察した。１：１００混合培養物の場合、４６の分別細胞のうちの１６がＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔ（ＮｐｒＥ）であり、４６細胞のうち３０がＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔ（Ｙｗｍｃ）であることを観察した。
ｐＥＫＥｘ２−ｆｗ：ＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧ
ｐＥＫＥｘ２−ｒｖ：ＣＡＧＡＣＣＧＣＴＴＣＴＧＣＧＴＴＣ
【０１５０】
ｌ）Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔ（ＮｐｒＥ）の突然変異誘発
菌株Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔ（ＮｐｒＥ）を「Ｄｉｆｃｏブレインハートインフュージョン」培地（Ｄｉｆｃｏ、ベクトン・ディキンソンＢＤ、１ベクトン・ドライブ、フランクリン・レイクス、ＮＪ  ＵＳＡ）中で３０℃にて一晩増殖させて、この培養物５ｍｌを、１ｍｌジメチルスルホキシドに溶解した０．５ｍｇのＮ−メチル−Ｎ−ニトロソ−Ｎ’−ニトログアニジンの溶液０．１ｍｌと組み合わせた。この培養物を３０℃にて１５分間振とうした。その後、細胞を４℃にて２，５００×ｇで遠心分離し、５ｍｌの０．９％ＮａＣｌに再懸濁した。この遠心分離ステップおよび再懸濁ステップを繰り返した。こうして得た細胞懸濁物に７．５ｍｌの８０％グリセロールを加え、この突然変異細胞懸濁物のアリコートを−２０℃にて保存した。この細胞懸濁物２００μｌを用いて０．８ｍｌのＣＧＸＩＩ培地（Ｋｅｉｌｈａｕｅｒら，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：５５９５〜６０３）に接種した。マイクロタイター寸法（Ｆｌｏｗｅｒｐｌａｔｅ（登録商標）ＭＴＰ−４８−Ｂ）において、３０℃および１０００ｒｐｍにてインキュベーションを行った。４時間後に２５０ｍＭのアンヒドロテトラサイクリン（ＡＴｃ）を加えることによって、クチナーゼの発現を誘導した。さらに１０時間のインキュベーション後、上述のとおりＦＡＣＳによってすべての培養物の光学特性を分析した。ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  セルソーターＩＩＩを用いて、毎秒１０，０００粒子の分析速度で８，０００，０００の細胞を分析し、３８４の細胞をＥＹＦＰ蛍光に関して分別し、９６ウェルマイクロタイタープレート（各ウェルは２００μｌのＣＧＸＩＩ培地を含む）に保存した。プレートを１０００ｒｐｍおよび３０℃にて１６ｈ培養した。堆積した３８４細胞のうち３３６が増殖して培養物となった。これらを用いて新鮮なＣＧＸＩＩ培地に接種し、１，０００ｒｐｍおよび３０℃にて２４ｈ培養した。４時間後に２５０ｍＭのアンヒドロテトラサイクリン（ＡＴｃ）を加えることによって、クチナーゼの発現を誘導した。２４時間後に培養物を遠心分離して細胞をペレットにし、無細胞培養上清を得た。２０μｌの各培養上清を用いて、ｐ−ニトロフェニルパルミテート（ｐＮＰＰ）アッセイによって分泌クチナーゼの酵素活性を定量化した。出発および対照菌株としてのＡＴＣＣ１３０３２  ｐＳｅｎ０９９６＿８  ｐＣＬＴＯＮ２−ＦｓＣｕｔ（ＮｐｒＥ）と比較して、単離した菌株の培養上清においては分泌クチナーゼの増強した酵素活性を測定したことを観察した。
【０１５１】
【表１−１】
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【０１５２】
【表１−２】
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【０１５３】
【表１−３】
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【０１５４】
【表１−４】
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【０１５５】
【表１−５】
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【０１５６】
【表１−６】
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【０１５７】
【表１−７】
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【０１５８】
【表１−８】
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【０１５９】
【表１−９】
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【０１６０】
【表１−１０】
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【０１６１】
【表１−１１】
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【０１６２】
【表１−１２】
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【０１６３】
【表１−１３】
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【０１６４】
【表１−１４】
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【０１６５】
【表１−１５】
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【０１６６】
【表１−１６】
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【０１６７】
【表１−１７】
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【０１６８】
【表１−１８】
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【０１６９】
【表１−１９】
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【０１７０】
【表１−２０】
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【０１７１】
【表１−２１】
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【０１７２】
【表１−２２】
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【０１７３】
【表１−２３】
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【０１７４】
【表１−２４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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