(57)【要約】  本発明は、がん細胞死の誘引のための組成物および方法を提供する。組成物およびそれらを使用する方法は、がんの処置のための、およびがん細胞におけるアポトーシスの選択的誘引のための療法における組成物の使用を含む。本明細書に記載の薬物の組み合わせは、相乗的となり得、同じ量の他の化合物および化合物の組み合わせよりも低い神経毒性作用を有し得、特定のがんが以前に施されていた療法に耐性を有するようになった場合に効果的となり得る。
2018516936.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）化合物ＰＡＣ−１：
【化１】
2018516936.tif 000017
（ｂ）第２の活性薬剤であって、突然変異を有するＢＲＡＦ酵素の阻害剤である薬剤と；
（ｃ）薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体と
を含む組成物。
【請求項２】
突然変異を有するＢＲＡＦ酵素の阻害剤である前記第２の活性薬剤は、Ｖ６００ＥまたはＶ６００Ｋ突然変異を有する阻害剤ＢＲＡＦ酵素である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第２の活性薬剤は、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ＢＭＳ−９０８６６２、ＰＬＸ３６０３、またはＲＡＦ２６５である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記第２の活性薬剤は、ベムラフェニブまたはダブラフェニブである、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
ＭＥＫ阻害剤をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記担体は、水、緩衝剤、糖、セルロース、シクロデキストリン、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
ＰＡＣ−１の濃度は、約１μＭから約５０μＭである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記第２の活性薬剤の濃度は、約２５ｎＭから約１ｍＭである、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記第２の活性薬剤は、ベムラフェニブであり、ベムラフェニブの濃度は、約０．５μＭから約５０μＭである、請求項１または４に記載の組成物。
【請求項１０】
前記第２の活性薬剤は、ダブラフェニブであり、ダブラフェニブの濃度は、約０．５μＭから約５０μＭである、請求項１または４に記載の組成物。
【請求項１１】
がん細胞の成長または増殖を阻害する方法であって、がん細胞を有効量の請求項１の組成物と接触させ、それにより前記がん細胞の前記成長または増殖を阻害することを含む方法。
【請求項１２】
前記がん細胞は、黒色腫細胞、リンパ腫細胞、白血病細胞、骨肉種細胞、乳がん細胞、または卵巣癌細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
がん細胞におけるアポトーシスを誘引する方法であって、前記がん細胞を、有効量の化合物ＰＡＣ−１：
【化２】
2018516936.tif 000018
および有効量の第２の活性薬剤と接触させることを含み、前記第２の活性薬剤は、突然変異を有するＢＲＡＦ酵素の阻害剤であり、それにより前記がん細胞においてアポトーシスが誘引される方法。
【請求項１４】
前記第２の活性薬剤は、Ｖ６００ＥまたはＶ６００Ｋ突然変異を有するＢＲＡＦ酵素の阻害剤である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の活性薬剤は、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、ＢＭＳ−９０８６６２、エンコラフェニブ、ＰＬＸ３６０３、またはＲＡＦ２６５である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記がん細胞を有効量のＭＥＫ阻害剤と接触させることをさらに含む、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記接触は、ｉｎ  ｖｉｖｏである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記がん細胞は、ＰＡＣ−１および前記第２の活性薬剤と同時に接触される、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記がん細胞は、前記がん細胞を前記第２の活性薬剤と接触させる前に、ＰＡＣ−１と接触される、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記がん細胞は、前記がん細胞を前記第２の活性薬剤と接触させた後に、ＰＡＣ−１と接触される、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
それを必要とする患者におけるがんを処置する方法であって、患者に、治療有効量の化合物ＰＡＣ−１：
【化３】
2018516936.tif 000019
および有効量の第２の活性薬剤を同時に、または逐次的に投与することを含み、前記第２の活性薬剤は、突然変異を有するＢＲＡＦ酵素の阻害剤であり、それにより前記がんが処置される方法。
【請求項２２】
前記第２の活性薬剤は、Ｖ６００ＥまたはＶ６００Ｋ突然変異を有するＢＲＡＦ酵素の阻害剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２の活性薬剤は、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、ＢＭＳ−９０８６６２、エンコラフェニブ、ＰＬＸ３６０３、またはＲＡＦ２６５である、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物ＰＡＣ−１および前記第２の活性薬剤は、同時に投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記化合物ＰＡＣ−１および前記第２の活性薬剤は、逐次的に投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記化合物ＰＡＣ−１は、前記第２の活性薬剤の前に投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記化合物ＰＡＣ−１は、前記第２の活性薬剤の後に投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記がんは、黒色腫、白血病、結腸直腸がん、甲状腺がん、肺がん、卵巣がん、エルドハイム・チェスター病（ＥＣＤ）、またはランゲルハンス細胞組織球増殖症（ＬＣＨ）である、請求項２１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記患者に、治療有効量のＭＥＫ阻害剤を同時に、または逐次的に投与することをさらに含む、請求項２１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
がんの治療用の医薬を調製するための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３１】
前記がんは、黒色腫、白血病、結腸直腸がん、甲状腺がん、肺がん、卵巣がん、エルドハイム・チェスター病（ＥＣＤ）、またはランゲルハンス細胞組織球増殖症（ＬＣＨ）である、請求項３０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づき、２０１５年６月５日出願の米国仮特許出願第６２／１７１，８８２号、および２０１６年６月３日出願の米国仮特許出願第６２／３４５，６２９号に対する優先権を主張し、これらの出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシス、またはプログラム細胞死は、全ての多細胞生物の発生および恒常性において中心的役割を担っている。がんのよくある特質は、自然のアポトーシスシグナルに対する耐性である。がんの種類に依存して、この耐性は、アポトーシスカスケードにおける主要タンパク質の上方または下方制御に起因し得る。耐性はまた、これらのタンパク質をコードする遺伝子における突然変異にも起因し得る。これらの変化は、ミトコンドリアおよびカスパーゼ−９を通して進行する内因性アポトーシス経路、ならびに細胞死受容体およびカスパーゼ−８の作用が関与する外因性アポトーシス経路の両方において生じ得る。例えば、ｐ５３、Ｂｉｍ、Ｂａｘ、Ａｐａｆ−１、ＦＬＩＰおよび多くの他のタンパク質等のタンパク質の健康レベルの改変が、がんにおいて観察されている。これらの改変は、実行カスパーゼ（ｅｘｅｃｕｔｉｏｎｅｒ  ｃａｓｐａｓｅ）であるカスパーゼ−３およびカスパーゼ−７を活性化するために上流側のプロアポトーシスシグナルが適切に伝達されない、アポトーシスカスケードの欠陥をもたらし得る。
【０００３】
ほとんどのアポトーシス経路は、最終的にプロカスパーゼ−３の活性化が関与するため、上流側の遺伝学的異常は、アポトーシス回路を効果的に「破壊」し、その結果、そのような細胞は変則的に増殖する。がんにおけるアポトーシスの中心的役割を考慮して、アポトーシスカスケードにおける特定のタンパク質を標的化する治療薬を開発する研究がなされている。しかしながら、これらの治療薬は、アポトーシスカスケードの初期の（または中間から高い）位置を標的化するため、それらのメンバーの下流側のタンパク質における突然変異によるがんは、それらの化合物の可能な有益効果にまだ耐性を有する可能性がある。
【０００４】
治療目的において、アポトーシスカスケードのはるかに下流側のプロアポトーシスタンパク質を直接活性化する小分子を特定することが有利である。この手法は、カスケードにおける比較的低い位置が関与し得、したがってその上流側のアポトーシス機構における突然変異を有する細胞の死滅さえも可能にする。さらに、そのような治療戦略は、そのプロアポトーシスタンパク質ががん細胞において上方制御された場合、より高い成功の可能性を有する。したがって、アポトーシスの下流側エフェクタータンパク質、プロカスパーゼ−３を標的化する小分子を特定することが、現在のがん治療の大きな助けとなる。
【０００５】
プロカスパーゼ−３からカスパーゼ−３への変換または活性化は、その後多数のタンパク質基質の加水分解を触媒する活性な「実行」カスパーゼ形態の生成をもたらす。ある特定のがんにおいて、プロカスパーゼ−３のレベルは、正常組織に比べて高い。２０名の結腸がん患者からの一次分離株の研究では、隣接する非がん性組織に比べて、そのような分離株においてプロカスパーゼ−３が平均して６倍上方制御されることが明らかとなった。加えて、プロカスパーゼ−３は、ある特定の神経芽細胞腫、リンパ腫、および肝臓がんにおいて上方制御される。さらに、国立がん研究所開発治療プログラムによるがんスクリーニングに使用された６０の細胞株パネルにおけるプロカスパーゼ−３レベルの系統的評価が行われた。評価では、ある特定の肺がん、黒色腫、腎臓がん、および乳がんが、プロカスパーゼ−３発現の大幅に向上したレベルを示すことが明らかとなった。アポトーシスを達成する上での活性カスパーゼ−３の役割、ある特定のがん細胞型におけるプロカスパーゼ−３の比較的高いレベル、およびその自己活性化の興味深い安全なキャッチ（ｃａｔｃｈ）媒介抑制に起因して、プロカスパーゼ−３を直接改質する小分子は、標的化がん治療における大きな利用可能性を有し得る。
【０００６】
さらに、併用療法は、がん患者の処置にますます重要となっている。併用療法の目標は、化学治療薬の間の相加的または相乗的効果を達成し、それにより短縮化された処置時間、減少した毒性、および増加した患者生存率を促進することである。単一の生化学的経路で作用する薬物は、「合成致死性」の遺伝子の組み合わせを模倣し得るため、相乗効果または増強のための特に強力な候補である。したがって、がんの多くの形態の処置により効果的な治療が差し迫って必要とされており、抗がん薬の新たな相乗的組み合わせが、この追求の助けとなる。したがって、がん細胞の死滅に効果的であるが、細胞毒性薬の望ましくない毒性から正常な宿主組織を保護する、細胞毒性薬の新たな組み合わせを特定する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、治療的がん処置のための活性薬剤の組み合わせを含む組成物を提供する。組成物は、がん細胞死を誘引することができる小分子薬物を含む。薬物の組み合わせは、様々ながん疾患およびがん細胞型、例えば黒色腫、副腎がん、脳腫瘍、乳がん、直腸結腸がん、食道がん、胆嚢がん、白血病、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、神経芽腫、卵巣がん、膵臓がん、腎臓がん、甲状腺がん、エルドハイム・チェスター病（ＥＣＤ）、ランゲルハンス細胞組織球増殖症（ＬＣＨ）、および当技術分野において知られている他のがんに適用可能である。いくつかの実施形態において、組成物は、プロカスパーゼ−３等のプログラム細胞死経路メンバーと直接的または間接的に相互作用する。様々な実施形態において、組成物は、がん細胞の特定の型に対して選択可能であり、プロカスパーゼ−３等のプログラム細胞死経路メンバーと相互作用する他の化合物と比較して低減された神経毒性を有し得る。
【０００８】
本明細書に記載の併用抗がん治療は、「合成致死性」の遺伝子の組み合わせを模倣する、異なる生化学経路を標的化する薬物、または同じ経路における異なる標的を攻撃する薬物を含んでもよい。プロカスパーゼ−３活性化剤ＰＡＣ−１と、Ｖ６００Ｅ突然変異を有するＢＲＡＦキナーゼの阻害剤との組み合わせは、相加的効果を十分に超える程度の、がん細胞のアポトーシス死の誘引に指向する著しい相乗効果を示す。ＰＡＣ−１と、ＢＲＡＦ遺伝子／酵素のこれらの阻害剤との組み合わせは、化合物単独では効果が最小限または効果がない腫瘍モデルにおける腫瘍組織量を、効果的に低減することができる。データは、ＰＡＣ−１とＢＲＡＦ酵素のこれらの阻害剤との組み合わせの、がんの処置における著しい有効性を示しており、より広範には、この相乗的組み合わせが、著しく高められた治療的有用性を提供し得ることを示している。
【０００９】
したがって、本発明は、（ａ）化合物ＰＡＣ−１：
【化１】
2018516936.tif 000003
（ｂ）第２の活性薬剤であって、突然変異を有するＢＲＡＦ酵素の阻害剤である薬剤と；
（ｃ）薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体とを含む組成物を提供する。
【００１０】
突然変異を有するＢＲＡＦ酵素の阻害剤は、例えば、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、ＢＭＳ−９０８６６２（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、エンコラフェニブ（ＬＧＸ８１８）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＰＬＸ３６０３（ＲＯ５２１２０５４）（Ｈｏｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）、ＲＡＦ２６５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ソラフェニブ、または上述の活性物質の１つの誘導体もしくはプロドラッグであってもよい。ＢＲＡＦ酵素の特に効果的な阻害剤は、Ｖ６００ＥまたはＶ６００Ｋ突然変異を有するＢＲＡＦ酵素の阻害剤である。そのような阻害剤は、ベムラフェニブおよびダブラフェニブを含む。他の実施形態において、組成物は、トラメチニブ等のＭＥＫ阻害剤をさらに含む。代替として、第２の活性薬剤（この薬剤は、突然変異を有するＢＲＡＦ酵素の阻害剤である）は、トラメチニブ等のＭＥＫ阻害剤で置き換えられ、異なる二剤式組成物を提供し得る。様々な実施形態において、これらの活性物質は、同時に、または連続して患者に投与されてもよい。組成物用の担体は、水および／または活性物質を有利に送達するための任意選択の構成成分、例えば緩衝剤、糖、セルロース、シクロデキストリン、またはそれらの様々な組み合わせを含んでもよい。一実施形態において、シクロデキストリンは、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。
【００１１】
本発明はまた、がん細胞の成長または増殖を阻害する方法を提供する。この方法は、がん細胞を有効量の本明細書に記載の組成物と接触させることを含み、組成物は、ＰＡＣ−１（すなわち、第１の活性薬剤）および１種以上の第２の活性薬剤（例えば、突然変異を有するＢＲＡＦ酵素の阻害剤および／またはＭＥＫ阻害剤）の一方または両方を含んでもよい。組成物がＰＡＣ−１および第２の活性薬剤の一方のみを含む場合、方法は、その後にがん細胞を他方（複数可）と接触させることを含んでもよい。したがって、方法は、がん細胞を、ＰＡＣ−１および第２の活性薬剤と同時に、または逐次的に、有効量のＭＥＫ阻害剤と接触させることを含んでもよい。がん細胞をこれらの活性物質（例えば、ＰＡＣ−１ならびに第２および／または第３の活性薬剤）と接触させることにより、がん細胞の成長または増殖が効果的に阻害される。
【００１２】
本発明は、さらに、がん細胞におけるアポトーシスを誘引する方法を提供する。方法は、がん細胞を、有効量のＰＡＣ−１ならびに有効量の第２および／または第３の活性薬剤と接触させることを含んでもよく、それによりがん細胞においてアポトーシスが誘引される。接触は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏであってもよい。代替として、接触は、ｉｎ  ｖｉｖｏであってもよい。一実施形態において、がん細胞は、ＰＡＣ−１および第２の活性薬剤と同時に接触されてもよい。別の実施形態において、がん細胞は、がん細胞をＰＡＣ−１と接触させる前に、第２の活性薬剤と接触されてもよい。さらに別の実施形態において、がん細胞は、がん細胞を第２の活性薬剤と接触させる前に、ＰＡＣ−１と接触されてもよい。第３の活性薬剤（例えば、ＭＥＫ阻害剤）は、ＰＡＣ−１の前または後に、および第２の活性薬剤の前または後にがん細胞に投与されてもよい。
【００１３】
本発明はまた、それを必要とする患者におけるがんを処置する方法を提供する。方法は、患者に、治療有効量のＰＡＣ−１の化合物と、第２の活性薬剤であって、突然変異、例えばＶ６００Ｅ突然変異またはＶ６００Ｋ突然変異を有するＢＲＡＦ酵素の阻害剤である薬剤とを同時に、または逐次的に投与することを含み、それによりがんが処置される。ある特定の実施形態において、第２の活性薬剤は、ベムラフェニブまたはダブラフェニブ：
【化２】
2018516936.tif 000004
【化３】
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上述のように、ＰＡＣ−１および第２の活性薬剤は、同時に投与されてもよい。別の実施形態において、ＰＡＣ−１および第２の活性薬剤は、逐次的に投与される。逐次的に投与される場合、第２の活性薬剤はＰＡＣ−１の前に投与されてもよく、または第２の活性薬剤はＰＡＣ−１の後に投与されてもよい。追加的な実施形態において、治療有効量のＭＥＫ阻害剤が患者に投与されてもよい。ＭＥＫ阻害剤は、ＰＡＣ−１および第２の活性薬剤に対して同時に、または逐次的に投与されてもよい。したがって、様々な実施形態において、ＭＥＫ阻害剤は、ＰＡＣ−１または第２の活性薬剤の前に、それと同時に、またはその後に投与されてもよい。
【００１４】
接触または処置され得るがん（または、場合によってはがん細胞）は、例えば、黒色腫、副腎がん、脳腫瘍、乳がん、直腸結腸がん、食道がん、胆嚢がん、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、神経芽腫、卵巣がん、膵臓がん、腎臓がん、甲状腺がん、エルドハイム・チェスター病（ＥＣＤ）、ランゲルハンス細胞組織球増殖症（ＬＣＨ）、またはヘアリー細胞白血病を含む白血病であってもよい。黒色腫は、ベムラフェニブ耐性黒色腫を含むＢＲＡＦｉ耐性黒色腫であってもよい。甲状腺がんは、甲状腺乳頭がんであってもよい。肺がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）であってもよい。いくつかの実施形態において、がんは、脳腫瘍、リンパ腫、または骨組織におけるがん細胞であってもよい。例えば、がんは、膠芽細胞腫または乏突起膠腫であってもよい。別の実施形態において、がん細胞は、骨肉種細胞であってもよく、処置されるがんは骨がんである。死滅または阻害され得るがん細胞の他の種類、および処置され得る他のがん性状態は、以下に記載される。
【００１５】
したがって、本発明は、医学的治療における使用のための、本明細書に記載の組成物の使用を提供する。医学的治療は、がん、例えば黒色腫および／または本明細書において列挙される他のがんの処置であってもよい。本発明はまた、哺乳動物における疾患、例えばヒトにおけるがんを処置するための医薬の製造のための、本明細書に記載のような組成物の使用を提供する。医薬は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体を含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
以下の図面は、本明細書の一部を成し、本発明のある特定の実施形態または様々な態様をさらに示すために含まれる。いくつかの場合において、本発明の実施形態は、本明細書に示される詳細な説明と組み合わせて添付の図面を参照することにより、最も良く理解され得る。説明および添付の図面は、本発明のある特定の例、またはある特定の態様を強調し得る。しかしながら、当業者には、例または態様の一部が、本発明の他の例または態様と組み合わせて使用されてもよいことが理解される。
【００１７】
【図１Ａ−Ｃ】Ｖ６００ＥＢＲＡＦまたはＷＴＢＲＡＦ細胞株におけるベムラフェニブおよびＰＡＣ−１の効果である。（Ａ）９つの細胞株のパネルにおけるベムラフェニブおよびＰＡＣ−１のＩＣ５０値（５日間）である。（Ｂ）および（Ｃ）：Ｖ６００ＥＢＲＡＦを有する細胞株は、ベムラフェニブ（１０μＭ）およびＰＡＣ−１（１２μＭ）（Ｂ）、またはベムラフェニブ（０．５μＭ）およびＰＡＣ−１（１２μＭ）（Ｃ）での２４時間の処置後、アポトーシス（アネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ＰＩ染色により評価される）を生じる細胞の有意により高いパーセントを有し、一方、この組み合わせは、野生型ＢＲＡＦを有する細胞株に対し無視できる効果を有する。水平の破線は、２つの薬剤の単なる相加的効果から推定される細胞死のレベルを表す。値は、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして報告されている。アポトーシスの誘引のための組み合わせが個々の薬剤の相加的効果（水平破線）と異なるかどうかを決定するための双方向相互作用に対して示されたＰ値は、統計学的に有意である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図２Ａ−Ｅ】ＰＡＣ−１＋ベムラフェニブは、Ａ３７５細胞においてアポトーシス死およびカスパーゼ活性を誘引するように強力に相乗作用する。（Ａ）２４時間の処置後に誘引されたアポトーシス細胞死（アネキシンＶ／ＰＩ染色およびフローサイトメトリーにより評価される）のパーセントを示す。示される値は、低い％のアポトーシス細胞死を表す白、および高い％のアポトーシス細胞死を表す濃い灰色でヒートマッピングされている。（Ｂ）Ｃｏｍｂｏｓｙｎソフトウェアにより各組み合わせに対して計算された組み合わせ指数（ＣＩ）である。ＣＩ値は、薄い灰色の最低値および黒の最高値でヒートマッピングされている。（Ｃ）ＰＡＣ−１およびベムラフェニブの組み合わせで処置された細胞において、有意なカスパーゼ−３／−７酵素活性が観察される。ＰＡＣ−１（１２μＭ）およびベムラフェニブ（１０μＭ）単独は、効果をほとんど有さない（全ての時点において、ＤＭＳＯ対照に対するｐ値＞０．１）。細胞溶解物中のカスパーゼ−３／−７活性を、蛍光発生Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ基質を用いて評価した。活性は、１μＭのスタウロスポリン（ＳＴＳ）を陽性対照として用い、アッセイ内で観察された最小および最大活性に対して正規化して表現される。組み合わせが相加と異なるかどうかを決定するための双方向相互作用に対して示されたＰ値は、示された時点において統計的に有意である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｄ）ＰＡＣ−１（１２μＭ）およびベムラフェニブ（１０μＭ）単独は、Ａ３７５細胞におけるＰＡＲＰ−１切断に対する効果をほどんど有さないが、組み合わせではウェスタンブロットにより有意なＰＡＲＰ−１切断が観察される。（Ｅ）２４時間後、低濃度のベムラフェニブ（０．１μＭおよび０．２５μＭ）において、ＥＲＫ１／２リン酸化の阻害は観察されなかった／低かった。より高濃度のベムラフェニブ（０．５μＭおよび１μＭ）では、ＥＲＫ１／２のリン酸化は、ＰＡＣ−１の追加あり、またはなしで効果的に阻害されたが、これは、ＰＡＣ−１の効果がＭＡＰＫ経路の下流側であることを示している。しかしながら、切断されたＰＡＲＰ−１は、ＥＲＫ１／２リン酸化の不完全な阻害が観察されたベムラフェニブの濃度（０．１および０．２５μＭ）であっても、ベムラフェニブ／ＰＡＣ−１の組み合わせで処置された細胞においてのみ観察された。値は、少なくとも３回の実験の平均±ＳＥＭとして報告されている。
【図３Ａ−Ｃ】ベムラフェニブ＋トラメチニブの組み合わせへのＰＡＣ−１の追加は、Ａ３７５およびＵＡＣＣ−６２細胞においてアポトーシス死およびカスパーゼ活性を誘引するように強力に相乗作用する。（Ａ）２４時間の処置後のアポトーシス細胞死のパーセントを示す。トラメチニブ（１００ｎＭ）およびベムラフェニブ（１０μＭ）の組み合わせは、アポトーシス細胞の数の最小限の増加をもたらす。ＰＡＣ−１（１２μＭ）の追加は、３つの薬剤の相加的効果を上回る、アポトーシス細胞の数の劇的な増加をもたらす。（Ｂ）トラメチニブ（１００ｎＭ）およびベムラフェニブ（１０μＭ）の組み合わせは、Ａ３７５およびＵＡＣＣ−６２細胞におけるＰＡＲＰ−１切断に対する効果をほとんど有さないが、ＰＡＣ−１（１２μＭ）の追加によって、有意なＰＡＲＰ−１切断およびプロカスパーゼ−３レベルの低減がウェスタンブロットにより観察される。（Ｃ）ベムラフェニブおよびトラメチニブの組み合わせは、カスパーゼ−３／−７活性の相加的増加をもたらすが、ＰＡＣ−１の追加は、２４時間後、Ａ３７５およびＵＡＣＣ−６２におけるカスパーゼ−３／−７酵素活性の有意な増加をもたらす。ＰＡＣ−１（１２μＭ）、ベムラフェニブ（１０μＭ）およびトラメチニブ（１００ｎＭ）単独は、効果をほとんど有さない（ＤＭＳＯ対照に対するｐ値＞０．１）。活性は、陽性対照に対して正規化して表現される。水平の破線は、２つの薬剤の単なる相加的効果から推定される細胞死のレベルを表す。値は、少なくとも３回の実験の平均±ＳＥＭとして報告されている。アポトーシスの誘引のための組み合わせが個々の薬剤の相加的効果と異なるかどうかを決定するための双方向相互作用に対して示されたＰ値は、統計学的に有意である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図４Ａ−Ｅ】ＰＡＣ−１＋ベムラフェニブの組み合わせは、黒色腫のＡ３７５皮下マウス異種移植モデルにおいて、腫瘍成長を抑制する。（Ａ）Ａ３７５モデルにおける、ＰＡＣ−１、ベムラフェニブ、およびそれらの組み合わせの効果である。皮下腫瘍を保有するマウスに、１５日間投薬した。マウスに、ＰＡＣ−１を１日１回ｉ．ｐ．注射により１００ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝６）で、ベムラフェニブを１日２回（ｐ．ｏ．）により１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８）で、またはＰＡＣ−１＋ベムラフェニブの組み合わせ（ｎ＝８）を投薬した。ｘ軸の下の黒線は、試験中のマウスへの投薬期間を示す。腫瘍体積は、平均±ＳＥＭとしてプロットされている。（Ｂ）切除した腫瘍の質量である。（Ｃ）腫瘍溶解物を、プロカスパーゼ−３レベルの変化に関してウェスタンブロットにより分析した。負荷対照としてアクチンを使用した。バンド強度は、ＩｍａｇｅＪを使用して定量した。（Ｄ）アクチン負荷対照に対して正規化されたプロカスパーゼ−３レベルのプロットである。（Ｅ）ホルマリン固定腫瘍試料の免疫組織化学的染色後の、Ｋｉ−６７に対して陽性である細胞のパーセンテージである。４つの処置群のそれぞれに対して、各試料において２０００細胞が計数された。示されるＰ値は、対照マウスに対するものである（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図５Ａ−Ｄ】長期細胞培養実験において、低濃度のＰＡＣ−１（１μＭ）は、ベムラフェニブと組み合わせると、細胞の再成長を有意に遅延させる。（Ａ）ベムラフェニブおよびＰＡＣ−１で処置されたＡ３７５細胞におけるＥｍａｘ値の比較である。（Ｂ）３０日の期間ＰＡＣ−１（４μＭ）またはベムラフェニブ（１０μＭ）で処置されたＡ３７５およびＳＫ−ＭＥＬ−５細胞である。（Ｃ）Ａ３７５細胞を、ＰＡＣ−１（１μＭ）、ベムラフェニブ（５μＭもしくは１０μＭ）、または組み合わせで処置した。５、１０または２０日後、ウェルを１０％トリクロロ酢酸で固定し、０．５％スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）染料で染色し、ＢｉｏＲａｄ  ＧｅｌＤｏｃ  ＲＸで画像化した。対照およびＰＡＣ−１試料の２０日目の画像は、細胞が過密により成長不可能であったため、示されていない。（Ｄ）（Ｃ）の定量であり、ＳＲＢ染料は、ｐＨ１０．４の１０ｍＭトリス塩基に溶解しており、吸光度は５１０ｎｍで読み取られている。処置の開始前の０日目における吸光度に対して正規化することにより、５１０ｎｍでの補正された吸光度を連続処置の日数に対してプロットした。値は、少なくとも３回の実験の平均±ＳＥＭとして報告されている。ベムラフェニブ単独対ベムラフェニブおよびＰＡＣ−１（１μＭ）で処置されたウェルの間で、Ｔ検定を行った。１０日目に、ベムラフェニブ（１０μＭ）およびＰＡＣ−１（１μＭ）で処置されたウェルのみが、ベムラフェニブ（１０μＭ）単独（ｐ＝０．０４９）処置と有意に異なっている。２０日目に、ベムラフェニブ（５または１０μＭ）およびＰＡＣ−１（１μＭ）で処置されたウェルが、示されているように、ベムラフェニブ（５または１０μＭ）と有意に異なっている（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図６Ａ−Ｄ】ＰＡＣ−１は、ベムラフェニブ耐性Ａ３７５ＶＲ細胞において活性を維持する。（Ａ）ベムラフェニブは、親Ａ３７５に対して、Ａ３７５Ｒにおいて有意により活性化が低い。（Ｂ）０．５または１μＭのベムラフェニブによる処置は、２時間後、Ａ３７５ＶＲにおけるＥＲＫ１／２のリン酸化を阻害することができない。同じ条件下で、親Ａ３７５細胞株においてＥＲＫ１／２リン酸化の完全阻害が観察された。（Ｃ）ＰＡＣ−１は、Ａ３７５Ｒ細胞株において活性を維持する。値は、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして報告されている。（Ｄ）Ａ３７５ＶＲ異種移植モデルにおける、ＰＡＣ−１、ベムラフェニブ、およびそれらの組み合わせの効果である。皮下腫瘍を保有するマウスに、１５日間投薬した。マウスに、ＰＡＣ−１を１日２回ｉ．ｐ．注射により１００ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝７）で、ベムラフェニブを１日２回（ｐ．ｏ．）により１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）で、またはＰＡＣ−１＋ベムラフェニブの組み合わせ（ｎ＝５）を投薬した。ｘ軸の上の黒線は、試験中のマウスへの投薬期間を示す。腫瘍体積は、平均＋ＳＥＭとしてプロットされている。示されるＰ値は、対照マウスに対するものである（＊ｐ＜０．０５）。
【図７Ａ−Ｅ】ＰＡＣ−１およびベムラフェニブは、ＳＫ−ＭＥＬ−５細胞においてアポトーシス死およびカスパーゼ活性を誘引するように強力に相乗作用する。（Ａ）２４時間の処置後に誘引されたアポトーシス細胞死（アネキシンＶ／ＰＩ染色およびフローサイトメトリーにより評価される）のパーセントを示す。示される値は、低い％のアポトーシス細胞死を表す白、および高い％のアポトーシス細胞死を表す濃い灰色でヒートマッピングされている。（Ｂ）Ｃｏｍｂｏｓｙｎソフトウェアにより各組み合わせに対して計算された組み合わせ指数（ＣＩ）である。ＣＩ値は、薄い灰色の最低値および黒の最高値でヒートマッピングされている。（Ｃ）ＰＡＣ−１およびベムラフェニブの組み合わせで処置された細胞において、有意なカスパーゼ−３／−７酵素活性が観察され；ＰＡＣ−１（１２μＭ）およびベムラフェニブ（１０μＭ）単独は、効果をほとんど有さない（全ての時点において、ＤＭＳＯ対照に対するｐ値＞０．１）。細胞溶解物中のカスパーゼ−３／−７活性を、蛍光発生Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ基質を用いて評価した。活性は、１μＭのスタウロスポリン（ＳＴＳ）を陽性対照として用いて、アッセイ内で観察された最小および最大活性に対して正規化して表現される。（Ｄ）ＰＡＣ−１（１２μＭ）およびベムラフェニブ（１０μＭ）単独は、ＳＫ−ＭＥＬ−５細胞におけるＰＡＲＰ−１切断に対する効果をほどんど有さないが、組み合わせではウェスタンブロットにより有意なＰＡＲＰ−１切断が観察される。（Ｅ）２４時間後、ベムラフェニブ（０．５μＭおよび１μＭ）は、ＥＲＫ１／２のリン酸化をＰＡＣ−１の追加あり、またはなしで阻害したが、これは、ＰＡＣ−１の効果がＭＡＰＫ経路の下流側であることを示している。しかしながら、切断されたＰＡＲＰ−１は、ベムラフェニブ／ＰＡＣ−１の組み合わせで処置された細胞においてのみ観察された。値は、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして報告されている。組み合わせが相加と異なるかどうかを決定するための双方向相互作用に対して示されたＰ値は、示された時点において統計的に有意である（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図８Ａ−Ｅ】ＰＡＣ−１およびベムラフェニブは、ＵＡＣＣ−６２細胞においてアポトーシス死およびカスパーゼ活性を誘引するように強力に相乗作用する。（Ａ）２４時間の処置後に誘引されたアポトーシス細胞死（アネキシンＶ／ＰＩ染色およびフローサイトメトリーにより評価される）のパーセントを示す。示される値は、低い％のアポトーシス細胞死を表す白、および高い％のアポトーシス細胞死を表す濃い灰色でヒートマッピングされている。（Ｂ）Ｃｏｍｂｏｓｙｎソフトウェアにより各組み合わせに対して計算された組み合わせ指数（ＣＩ）である。ＣＩ値は、薄い灰色の最低値および黒の最高値でヒートマッピングされている。（Ｃ）ＰＡＣ−１およびベムラフェニブの組み合わせで処置された細胞において、有意なカスパーゼ−３／−７酵素活性が観察され、ＰＡＣ−１（１２μＭ）およびベムラフェニブ（１０μＭ）単独は、効果をほとんど有さない（全ての時点において、ＤＭＳＯ対照に対するｐ値＞０．１）。細胞溶解物中のカスパーゼ−３／−７活性を、蛍光発生Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ基質を用いて評価した。活性は、１μＭのＳＴＳを陽性対照として用いて、アッセイ内で観察された最小および最大活性に対して正規化して表現される。（Ｄ）ＰＡＣ−１（１２μＭ）およびベムラフェニブ（１０μＭ）単独は、ＵＡＣＣ−６２細胞におけるＰＡＲＰ−１切断に対する効果をほどんど有さないが、組み合わせではウェスタンブロットにより有意なＰＡＲＰ−１切断が観察される。（Ｅ）２４時間後、ベムラフェニブ（０．５μＭおよび１μＭ）は、ＥＲＫ１／２のリン酸化をＰＡＣ−１の追加あり、またはなしで阻害したが、これは、ＰＡＣ−１の効果がＭＡＰＫ経路の下流側であることを示している。ＰＡＣ−１のみで処置された細胞において最小限の切断されたＰＡＲＰ−１が観察されたが、これは、ベムラフェニブ／ＰＡＣ−１の組み合わせで処置された細胞では顕著に増加した。値は、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして報告されている。組み合わせが相加と異なるかどうかを決定するための双方向相互作用に対して示されたＰ値は、示された時点において統計的に有意である（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図９Ａ−Ｄ】アネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ＰＩプロットにより評価されるような、（Ａ）Ａ３７５、（Ｂ）ＳＫ−ＭＥＬ−５および（Ｃ）ＵＡＣＣ−６２細胞株における２４時間の処置後の、細胞株におけるベムラフェニブ（３０μＭ）と組み合わせたＰＡＣ−１ａ（１２μＭ）対ＰＡＣ−１（１２μＭ）の効果である。報告されたアポトーシスのパーセントは、ＤＭＳＯ対照試料に対して正規化されている。水平の破線は、２つの薬剤の単なる相加的効果から推定される細胞死のレベルを表す。（Ｄ）ＰＡＣ−１（１２μＭ）およびベムラフェニブ（１０μＭ）単独は、Ａ３７５細胞におけるＰＡＲＰ−１切断に対し最小限の効果を有するが、組み合わせでは増加したＰＡＲＰ−１切断が観察される。ベムラフェニブ（１０μＭ）と組み合わされたＰＡＣ−１ａ（１２μＭ）は、ＰＡＲＰ−１切断を増加させない。値は、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして報告されている。アポトーシスの誘引のための組み合わせが個々の薬剤の相加的効果（水平破線）と異なるかどうかを決定するための双方向相互作用に対して示されたＰ値は、統計学的に有意である（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１０Ａ−Ｃ】ＷＴＢＲＡＦを含むＭＩＡ  ＰａＣａ−２（突然変異ＫＲＡＳおよびＷＴＢＲＡＦ）ならびにＣＨＬ−１（ＷＴＫＲＡＳおよびＷＴＢＲＡＦ）細胞株における、ＰＡＣ−１およびベムラフェニブの組み合わせの効果である。（Ａ）ＰＡＣ−１（１２μＭ）＋ベムラフェニブ（３０μＭ）で処置された場合、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２およびＣＨＬ−１細胞株において、プロカスパーゼ−３活性化に対する効果は観察されない。細胞溶解物中のカスパーゼ−３／−７活性を、蛍光発生Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ基質を用いて評価した。活性は、１μＭのＳＴＳを陽性対照として用いて、アッセイ内で観察された最小および最大活性対して正規化して表現される。（Ｂ）２４時間後、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞においてＰＡＲＰ−１切断に対する効果は観察されなかった。（Ｃ）２４時間の処置後、ＰＡＣ−１（１２μＭ）およびベムラフェニブ（３０μＭ）は、ＣＨＬ−１細胞におけるＰＡＲＰ−１切断に対する効果を有さない。値は、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして報告されている。
【図１１】１５日間の連続投薬後に致死させた腫瘍保有マウスの画像である。４つの処置群は、対照（ｎ＝６、０ｍｇ／ｋｇ  ＰＡＣ−１およびベムラフェニブ）；１００ｍｇ／ｋｇのＰＡＣ−１（ｎ＝６）で１日１回、１０ｍｇ／ｋｇのベムラフェニブ（ｎ＝８）で１日２回、ならびに１００ｍｇ／ｋｇのＰＡＣ−１（１日１回）および１０ｍｇ／ｋｇのベムラフェニブ（１日２回）（ｎ＝８）の組み合わせで処置されたマウスである。
【図１２Ａ−Ｂ】ベムラフェニブによるＵＡＣＣ−６２細胞の長期処置におけるＰＡＣ−１（１μＭ）の追加は、細胞の再成長を有意に遅延させる。（Ａ）ＵＡＣＣ−６２細胞を、ＰＡＣ−１（１μＭ）、ベムラフェニブ（５μＭもしくは１０μＭ）、または組み合わせで処置した。２〜３日毎に培地を洗浄し、新しい化合物を各ウェルに添加した。５、１０または２０日後、ウェルを１０％トリクロロ酢酸で固定し、０．５％スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）染料で染色し、ＢｉｏＲａｄ  ＧｅｌＤｏｃ  ＲＸで画像化した。対照およびＰＡＣ−１試料の２０日目の画像は、細胞が過密により成長不可能であったため、示されていない。（Ｂ）（Ａ）の定量であり、ＳＲＢ染料は、ｐＨ１０．４の１０ｍＭトリス塩基に溶解しており、吸光度は５１０ｎｍで読み取られている。処置の開始前の０日目における吸光度に対して正規化することにより、５１０ｎｍでの補正された吸光度を連続処置の日数に対してプロットした。値は、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして報告されている。ベムラフェニブ単独対ベムラフェニブおよびＰＡＣ−１（１μＭ）で処置されたウェルの間で、両側Ｔ検定を行った。１０日目に、ベムラフェニブ（１０μＭ）およびＰＡＣ−１（１μＭ）で処置されたウェルのみが、ベムラフェニブ（１０μＭ）単独（ｐ＝０．０３５）処置と有意に異なっている。２０日目に、ベムラフェニブ（５または１０μＭ）およびＰＡＣ−１（１μＭ）で処置されたウェルが、グラフに示されているように、ベムラフェニブ（５または１０μＭ）と有意に異なっている（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１３Ａ−Ｃ】Ａ３７５ＶＲ細胞におけるＰＡＣ−１およびベムラフェニブの組み合わせの効果である。（Ａ）２４時間の処置後に誘引されたアポトーシス細胞死（アネキシンＶ／ＰＩ染色およびフローサイトメトリーにより評価される）のパーセントを示す。（Ｂ）（Ａ）において観察されるアポトーシス細胞死は、Ｂｌｉｓｓ独立モデルにより予測されるものよりも高い。過剰の細胞死は、［ｆ（観察、アポトーシス）−（ｆ（ＰＡＣ−１、アポトーシス）＋ｆ（ベムラフェニブ、アポトーシス）−ｆ（ＰＡＣ−１、アポトーシス）＊ｆ（ベムラフェニブ、アポトーシス））］＊１００％として計算される。これは、観察される効果が、相加的ではなくむしろ相乗的であることを示している。（Ｃ）２４時間後のＡ３７５ＶＲでのアポトーシスの活性化における、ＰＡＣ−１およびベムラフェニブの相乗効果である。この効果は、不活性なＰＡＣ−１ａが使用された場合無効化される。水平の破線は、２つの薬剤の単なる相加的効果から推定される細胞死のレベルを表す。値は、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして報告されている。アポトーシスの誘引のための組み合わせが個々の薬剤の相加的効果（水平破線）と異なるかどうかを決定するための双方向相互作用に対して示されたＰ値は、統計学的に有意である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
多くのがんは、標準的な化学治療に耐性を有するか、またはある期間後に特定の化学治療薬に対し耐性を有するようになる。本明細書に記載の併用療法は、第２の活性薬剤、例えば突然変異を有するＢＲＡＦ酵素の阻害剤の化学治療特性と相乗作用し、活性物質の１つのみではより効果的ではない、または完全に非効果的である条件下で有効性を提供し得る、ＰＡＣ−１によるプロカスパーゼ−１活性化を利用する。これらの化合物はまた、標的化されたがん治療において有効となり得、より低いレベルのプロカスパーゼ−３を有する非がん性細胞に対する比較的低減された副作用を伴うがん細胞の死滅の選択性の利点が存在し得る。これらの低減された副作用は、毒性、特に神経毒性の低減を含み得る。
【００１９】
本明細書に記載の化合物の組み合わせ、組成物および方法は、アポトーシスまたはプログラム細胞死および他の化学治療メカニズムの調整により、がんの処置に効果的となるように作用し得る。一実施形態において、アポトーシスの調整は、アポトーシスの誘引または活性化による。様々な実施形態において、化合物の投与は、同時、または代替として逐次的であってもよい。
【００２０】
したがって、本発明は、例えば黒色腫、結腸直腸がん、甲状腺がん、肺がん、または卵巣がんの処置のための、ＰＡＣ−１による活性薬剤の増強のための方法を提供する。アポトーシスの間、カスパーゼ−３へのタンパク質分解によりチモーゲンプロカスパーゼ−３が活性化され、次いで、この活性カスパーゼ−３が多数の細胞基質を切断し、アポトーシスプログラムを実行する。プロカスパーゼ−３タンパク質レベルは、様々な腫瘍組織学において上昇するため、プロカスパーゼ−３の薬物媒介直接活性化は、選択的抗がん戦略として極めて効果的となり得る。
【００２１】
ある特定の化合物は、プロカスパーゼ−３の活性および自己成熟を向上させ、がん細胞におけるアポトーシスを誘引することができる。プロカスパーゼ活性化化合物１（ＰＡＣ−１）は、阻害亜鉛イオンのキレート化によりプロカスパーゼ−３の活性を高め、培養物中のがん細胞におけるアポトーシスを誘引し、複数のマウス腫瘍モデルにおいて有効性を有する。ＰＡＣ−１と突然変異を有するＢＲＡＦ酵素の阻害剤との新規な組み合わせは、本明細書に記載のようにがん細胞の処置に相乗的に効果的であることが判明している。ＰＡＣ−１は、アポトーシスカスケードにおける後の段階で作用するため、これは、本明細書に記載のように、広範な化学治療活性薬剤と独自に相乗作用することができる。
【００２２】
黒色腫は、最も一般的な皮膚悪性腫瘍であり、転移後は皮膚がんの致死性の形態であると考えられる。これは、米国において５番目に一般的ながんである。黒色腫における１つの一般的な突然変異は、ＢＲＡＦタンパク質のキナーゼドメインにおけるグルタミン酸塩（Ｖ６００Ｅ）に対するバリンの置換である（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００２，４１７，９４９）。Ｖ６００Ｅ突然変異は、ＢＲＡＦおよび下流側ＭＥＫ−ＥＲＫシグナル伝達経路を構成的に活性化し、腫瘍形成をもたらす。黒色腫の約５０％がＢＲＡＦタンパク質にＶ６００Ｅ突然変異を有するという発見は、Ｖ６００ＥＢＲＡＦ阻害剤の開発、およびその後の２０１１年におけるベムラフェニブの承認に拍車をかけた。Ｖ６００ＥＢＲＡＦ阻害剤、例えばベムラフェニブ（および２０１３年に承認されたダブラフェニブ）は、数週間の治療内での腫瘍組織量の目覚しい低減、および３ヶ月から４ヶ月の無進行生存の延長をもたらす。
【００２３】
その初期の抗黒色腫活性にもかかわらず、Ｖ６００ＥＢＲＡＦ阻害剤に対する耐性が急速に発生する。耐性腫瘍の大部分において、ＭＡＰＫシグナル伝達経路の再活性化が観察され、転移性黒色腫に対する処置計画にＭＥＫ１／２阻害剤（例えばトラメチニブ）を追加する動機となる。ＭＥＫ１／２およびＶ６００ＥＢＲＡＦ阻害剤を用いた最前線の併用療法は、以前にＶ６００ＥＢＲＡＦ阻害処置を受けていない患者において、耐性までの平均時間の３．７から４．１ヶ月の遅延に効果的であるが、すでに以前のＶ６００ＥＢＲＡＦ阻害剤治療がうまくいかなかった患者へのＭＥＫ１／２阻害剤の追加は、抗がん有効性において最低限の改善をもたらすにすぎない。現行の治療の現在の臨床的制限を考慮して、他のキナーゼ阻害剤を用いた新規で合理的に設計された併用試験が研究されている。現在までの全ての努力にもかかわらず、標的化Ｖ６００ＥＢＲＡＦ治療への耐性の発達は、処置された患者の事実上１００％において生じ、このクラスの薬剤に対する薬剤耐性獲得は、転移性黒色腫患者への劇的に向上した生存率の利益に対する大きな障害となっている。
【００２４】
ベムラフェニブと、多様で薬剤化可能なキナーゼの阻害剤との組み合わせに焦点を置いてきた多くの研究とは対照的に、ベムラフェニブと、アポトーシス経路を活性化する薬剤との併用療法は、広範には研究されていなかった。この研究不足は、黒色腫細胞がそのアポトーシスシグナル伝達経路においていくつかの欠陥を有し、これによって多くのプロアポトーシス刺激に対して耐性となることに一部起因し得る。我々は、これらのアポトーシス欠陥の下流側でアポトーシスを誘引する好適なプロアポトーシス薬剤が、Ｖ６００ＥＢＲＡＦ阻害剤と極めて相乗的であると仮定した。
【００２５】
黒色腫細胞でのアポトーシスシグナル伝達カスケードにおける異常は、プロカスパーゼ−３の活性化の上流側であることを考慮して、プロカスパーゼ−３を直接活性化する薬剤が、この併用療法の興味深い候補である。さらに、黒色腫は、プロカスパーゼ−３の上昇した発現を有するため、プロカスパーゼ−３活性化剤がそのような細胞に対し有効で、選択性を有するはずである。さらに、Ｖ６００ＥＢＲＡＦ阻害剤は、カスパーゼ−３により媒介されるアポトーシス細胞死を誘引することが知られており、したがって、ベムラフェニブと直接的プロカスパーゼ−３活性化剤との組み合わせは、いずれかの単剤の効果と比べて、劇的に向上したカスパーゼ−３活性およびがん細胞死をもたらし得る。ＰＡＣ−１は、不安定な阻害亜鉛のキレート化により細胞プロカスパーゼ−３を直接活性化する小分子である。多様な起源のがんにおけるプロカスパーゼ−３の過剰発現に起因して、ＰＡＣ−１およびその誘導体は、非がん性細胞を維持しながら、がん細胞におけるアポトーシスを選択的に誘引する。ＰＡＣ−１は、黒色腫の異種移植モデルを含むがんの複数のマウスモデルにおいて、単剤活性を発揮する。重要なことに、マウス腫瘍モデルにおける有利な前臨床活性に加えて、２０１５年３月以降、ヒトがん患者が第Ｉ相臨床試験の一部としてＰＡＣ−１を摂取している（ＮＣＴ０２３５５５３５）。
【００２６】
最初に承認されたＢＲＡＦ阻害剤であるベムラフェニブは、Ｖ６００Ｅ  ＢＲＡＦタンパク質（Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２０１２，１１，８７３）を有する黒色腫患者に対する標的化治療薬である。ベムラフェニブによる処置は、アポトーシスおよび急速な腫瘍退縮をもたらし、Ｖ６００Ｅ  ＢＲＡＦタンパク質を有する黒色腫患者の無進行生存を、５．３ヶ月延長する（ＭｃＡｒｔｈｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．２０１４，１５，３２３）。ベムラフェニブは、黒色腫の処置において著しい進展を示すが、臨床においては耐性の発生が大きな関心事となっている。ベムラフェニブとＭＥＫ阻害剤との併用療法は、無進行生存の期間を３．７ヶ月延長することが臨床的に試験されているが、ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路の再活性化に起因して最終的に耐性が生じる（Ｌａｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１４，３７１，１８６７）。
【００２７】
アポトーシスカスケードにおける実行カスパーゼであるプロカスパーゼ−３の上昇した発現は、黒色腫を含む様々ながんにおいて報告されている（Ｆｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ．２００１，１１，３８５；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．２００９，４０，９５０）。したがって、プロカスパーゼ−３の小分子活性化は、アポトーシスカスケードにおいてプロカスパーゼ−３が担う主要な役割により、黒色腫の魅力的な治療戦略である。プロカスパーゼ−３活性化化合物１（ＰＡＣ−１）は、プロカスパーゼ−３を阻害する亜鉛イオンの不安定なプールをキレートし、そのようにしてアポトーシス死のためにがん細胞をプライミングする小分子である（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００９，３８８，１４４）。ＰＡＣ−１は、黒色腫のマウス異種移植モデルにおいて単剤有効性を示し、抗がん戦略としてのプロカスパーゼ−３活性化の可能性が正当化されている（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．２０１４，８，１６４０）。ＰＡＣ−１はアポトーシス死のために細胞をプライミングし、ベムラフェニブはがん細胞におけるアポトーシスを誘引することを考慮すると、ＰＡＣ−１と組み合わされたベムラフェニブは、治療有効性を劇的に向上させることが分かる。
【００２８】
最近我々は、ＰＡＣ−１が、最近黒色腫の処置に承認された薬物であるベムラフェニブ（ゼルボラフとして市販されている）を含む、Ｖ６００Ｅ突然変異を有するＢＲＡＦ酵素の阻害剤との卓越した相乗効果を示すことを発見した。我々のデータに基づき（図１〜１３を参照されたい）、ＰＡＣ−１は、ダブラフェニブ（商品名タフィンラー）およびその他も含む、このクラスの全ての薬物（Ｖ６００ＥまたはＶ６００Ｋ突然変異を有するＢＲＡＦ酵素の阻害剤）と、等しい相乗効果を示す。
【００２９】
Ｖ６００Ｅ  ＢＲＡＦタンパク質を含有する様々な黒色腫細胞株におけるアポトーシス細胞死を向上させる上での、ベムラフェニブ等のＶ６００Ｅ突然変異を有するＢＲＡＦ酵素の阻害剤の、ＰＡＣ−１との相乗活性が、本明細書に記載される。重要なことに、ＰＡＣ−１は、ベムラフェニブ耐性Ａ３７５Ｒ細胞株における活性を保持し、これは、ＢＲＡＦ阻害剤処置を上回って進行した黒色腫におけるその実用性を示している。
【００３０】
定義
以下の定義は、明細書および特許請求の範囲の明確で一貫した理解を提供するために含まれる。本明細書において使用される場合、列挙される用語は以下の意味を有する。本明細書において使用される全ての他の用語および語句は、当業者により理解されるような通常の意味を有する。そのような通常の意味は、Ｈａｗｌｅｙ’ｓ  Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  １４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｂｙ  Ｒ．Ｊ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，２００１等の専門用語辞典を参照することにより得ることができる。
【００３１】
本明細書における「一実施形態」、「実施形態」等への言及は、説明される実施形態が特定の態様、特徴、構造、部分、または特性を含み得るが、全ての実施形態が必ずしもその態様、特徴、構造、部分、または特性を含むとは限らないことを示す。さらに、そのような語句は、必然的ではないが、本明細書の他の部分において言及される同じ実施形態を指し得る。さらに、実施形態に関連して特定の態様、特徴、構造、部分、または特性が説明される場合、明示的に説明されているか否かを問わず、そのような態様、特徴、構造、部分、または特性に影響を与える、またはそれを他の実施形態と関連付けることは、当業者の理解の範囲内である。
【００３２】
文脈上異なる定義が明示されていない限り、単数形は複数形の言及も含む。したがって、例えば、「化合物」への言及は、複数のそのような化合物を含み、よって化合物Ｘは、複数の化合物Ｘを含む。さらに、特許請求の範囲は、任意選択的要素を除外するように作成され得ることが留意される。したがって、この記述は、本明細書に記載の任意の要素、および／または請求要素の列挙もしくは「消極的」限定の使用に関連した「唯一」、「のみ」等の排他的用語の使用の根拠となる。
【００３３】
「および／または」という用語は、この用語が関連する項目のいずれか１つ、項目の任意の組み合わせ、または項目の全てを意味する。「１つ以上」および「少なくとも１つ」という語句は、特にその使用の文脈において読まれた場合、当業者によって容易に理解される。例えば、この語句は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、１０個、１００個、または、列挙された下限よりも約１０倍、１００倍、もしくは１０００倍高い任意の上限を意味し得る。例えば、フェニル基上の１つ以上の置換基は、１つから５つ、または１つから４つ、例えばフェニル環が二置換されている場合を指す。
【００３４】
「約」という用語は、特定された値の±５％、±１０％、±２０％、または±２５％の変動を指し得る。例えば、「約５０」パーセントは、いくつかの実施形態において、４５から５５パーセントの変動を有し得る。整数範囲に対しては、「約」という用語は、範囲の各端部における列挙された整数より大きい、および／または小さい１つまたは２つの整数を含み得る。本明細書において別段に指定されない限り、「約」という用語は、個々の成分、組成物、または実施形態の機能性の点で等価である、列挙された範囲に近い値、例えば重量パーセントを含むことが意図される。約という用語はまた、本段落において上述されたような列挙された範囲の端点を修飾し得る。
【００３５】
当業者に理解されるように、成分の量、分子量等の特性、反応条件等を表現するものを含む全ての数字は、概数であり、いかなる場合でも任意選択で「約」という用語により修飾されるものとして理解される。これらの値は、本明細書における説明の教示を利用して当業者が得ようとしている所望の特性に依存して変動し得る。また、そのような値は、各試験測定において見られる標準偏差から必然的に生じる変動性を本質的に含有することが理解される。
【００３６】
当業者に理解されるように、あらゆる目的において、特に記載された説明に関して、本明細書において列挙された全ての範囲はまた、あらゆる可能な部分範囲およびその部分範囲の組み合わせ、ならびに範囲を構成する個々の値、特に整数値を包含する。列挙された範囲（例えば、重量パーセントまたは炭素基）は、その範囲内のそれぞれの特定の値、整数、少数、または識別情報を含む。任意の列挙された範囲は、少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１、または１０分の１まで分割された同じ範囲を十分に説明し有効とするものとして容易に認識され得る。限定されない例として、本明細書において議論される各範囲は、下の３分の１、中間の３分の１、および上の３分の１等に容易に分割され得る。また、当業者により理解されるように、「まで」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」、「超」、「以上」等の全ての言語は、列挙された数字を含み、そのような用語は、その後上述のように部分範囲に分割されてもよい範囲を指す。同様に、本明細書において列挙される全ての比率は、より広い比率に含まれる全ての部分比率を含む。したがって、ラジカル、置換基、および範囲に対して列挙された特定の値は、例示のみを目的とし、ラジカルおよび置換基に対する他の定義された値または定義された範囲内の他の値を除外しない。
【００３７】
また、メンバーが一般的な様式で、例えばマーカッシュ群で互いにグループ化された場合、本発明は、全体として列挙された群全体だけでなく、個々に群の各メンバーを、および主要な群の全ての可能な部分群を包含することが、当業者に容易に理解される。さらに、全ての目的において、本発明は、主要な群だけでなく、群のメンバーの１つ以上が存在しない主要な群も包含する。したがって、本発明は、列挙された群のメンバーの任意の１つ以上の明示的な除外を想定している。したがって、開示されたカテゴリーまたは実施形態のいずれに対しても、列挙された要素、種、または実施形態の任意の１つ以上が、例えば明示的な負の限定における使用のために、そのようなカテゴリーまたは実施形態から除外され得る条件が適用されてもよい。
【００３８】
「接触させる」という用語は、例えば生理学的反応、化学反応、または物理的変化をもたらすための、例えば溶液中、反応混合物中、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏでの、細胞または分子レベルを含む、触れさせる、接触させる、または近接もしくは密接させる行為を指す。
【００３９】
「同時に」は、（１）時間的に同時期であること、または（２）共通の処置スケジュールの過程の間異なる時点であることを意味する。
【００４０】
「逐次的に」は、方法において使用される１つの活性薬剤の投与に続く、別の活性薬剤の投与を指す。１つの活性薬剤の投与後、次の活性薬剤は、第１の薬剤の実質的に直後に投与されてもよく、または、次の活性薬剤は、第１の活性薬剤の後の有効期間後に投与されてもよく、有効期間は、第１の活性薬剤の投与からの最大限の利益が実現するために与えられる時間量である。
【００４１】
「有効量」は、疾患、障害、および／もしくは状態を処置する、または列挙された効果、例えば活性化もしくは阻害等をもたらすために効果的な量を指す。例えば、有効量は、処置される状態または症状の進行または重症度を低減するために効果的な量であってもよい。治療有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。「有効量」という用語は、例えば、宿主における疾患もしくは障害を処置する、または疾患もしくは障害の症状を処置するために効果的な本明細書に記載の化合物の量、または本明細書に記載の化合物の組み合わせの量を含むことを意図する。したがって、「有効量」は、一般に、所望の効果を提供する量を意味する。
【００４２】
一実施形態において、有効量は、単独で、または薬学的担体と組み合わせて、細胞または対象、例えば患者への単回または複数回投与後に、過剰増殖性細胞の死滅またはその成長の停止を含む、成長または増殖の阻害において効果的である、本明細書に記載の活性薬剤の量を指す。そのような成長阻害または死滅は、そのような処置がない場合に予測される期間を超える対象、例えば患者の生存の延長、または、そのような処置がない場合に比べた対象の予後の任意の改善として反映され得る。
【００４３】
「処置すること」、「処置する」および「処置」という用語は、（ｉ）疾患、病態もしくは医学的状態を阻害する、またはその発達を停止させること；疾患、病態または医学的状態を緩和すること；および／あるいは（ｉｉｉ）疾患、病態または医学的状態に関連する症状を減弱することを含む。したがって、「処置する」、「処置」、および「処置すること」という用語は、処置されている状態または症状の進行または重症度を低下させること、止めること、または逆転させることを含み得る。したがって、「処置」という用語は、必要に応じて医学的および／または治療上の投与を含み得る。いくつかの実施形態において、「処置」、「処置する」または「処置される」という用語は、（ｉ）対象となる症状もしくは疾患の低減もしくは排除（治療）、または（ｉｉ）腫瘍の排除もしくは破壊（治癒）を指し得る。
【００４４】
「阻害する」、「阻害すること」、および「阻害」という用語は、疾患、感染、状態、または細胞の群の成長または進行の抑制、中断、または逆転を指す。阻害は、例えば、処置または接触がない場合に生じる成長または進行と比較して、約２０％、４０％、６０％、８０％、９０％、９５％、または９９％より高くてもよい。さらに、「誘引する」、「阻害する」、「増強する」、「上昇させる」、「増加させる」、「減少させる」、または同様の用語は、２つの状態間の定量的差異を示し、２つの状態間の少なくとも統計学的に有意な差異を指し得る。例えば、「過剰増殖性細胞の成長を阻害するために効果的な量」とは、細胞の成長速度が、いくつかの実施形態において、少なくとも統計学的に有意に未処置細胞と異なり得ることを意味する。そのような用語は、本明細書において、例えば増殖速度に適用され得る。
【００４５】
過剰増殖性細胞、例えば新生細胞の「成長または増殖を阻害する」という語句は、その成長および転移を抑制、妨害、停止、または止めることを指し、必ずしも新生成長の完全排除を示すとは限らない。
【００４６】
「がん」という用語は、一般に、異常細胞の制御不能な成長により引き起こされる１００を超える疾患の群のいずれかを指す。がんは、固形腫瘍およびリンパ腫、ならびに白血病等の非固形がんの形態をとり得る。成熟するまで再生し、次いで必要な場合のみ損傷細胞に置き換わる正常細胞とは異なり、がん細胞は、無制限に成長および分裂し、付近の細胞を押しのけ、最終的に身体の他の部位に広がる。
【００４７】
本発明は、がんおよびがん性状態、特にＶ６００Ｅ  ＢＲＡＦタンパク質またはＶ６００Ｋ  ＢＲＡＦタンパク質を有するがんを処置するための方法を提供する。「がん性状態」という用語は、細胞が急速な増殖または新形成を特徴とする異常な状況または状態にある、任意の状態に関連する。がん性状態は、本来悪性または非悪性（例えば前がん状態）であってもよい。「がん性状態」をさらに説明するために、「過剰増殖性」、「過形成性」、「過形成」、「悪性」、「新生」および「新形成」という用語が使用され得る。これらの用語は、同義的に使用され得、組織病理学的な種類、侵襲性の段階、またはがん性決定（例えば悪性および非悪性）とは無関係に、全ての種類の過剰増殖性成長、過形成性成長、がん性成長または腫瘍形成プロセス、転移組織または悪性形質転換細胞、組織もしくは器官を含むことが意図される。
【００４８】
「新形成」という用語は、正常な成長制御に対する応答性の喪失、例えば新生細胞成長をもたらす新細胞成長を指す。「過形成」は、異常に高い成長速度を示している細胞を指す。しかしながら、これらの用語は、その文脈により明らかなように同義的に使用され得、一般に異常な細胞成長速度を経験している細胞を指す。「新形成」および「過形成」は、良性、前がん状態、ｉｎ−ｓｉｔｕ癌、悪性、固形、または非固形であってもよい腫瘍を含む。処置され得るいくつかのがん性状態の例は、これらに限定されないが、肛門がん、膀胱移行上皮がん、骨がん、乳がん、子宮頸がん、直腸結腸がん、胃がん、頭頸部がん、カポジ肉腫、白血病、肺がん、例えば気管支原性肺がん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がん、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、悪性リンパ腫、神経芽細胞腫、骨原性癌（例えば骨のがん）、眼科がん（例えば網膜芽細胞腫および目の他のがん）、卵巣がん、前立腺がん、腎臓がん、皮膚がん、例えば黒色腫、軟部組織肉腫、甲状腺がん、ならびにウィルムス腫瘍を含む。本発明の範囲内の非悪性過剰増殖性状態（例えば前がん状態）の他の例は、これらに限定されないが、腺腫、軟骨腫、内軟骨腫、線維腫、筋腫、粘液腫、神経線維腫症、骨芽細胞腫、骨軟骨腫、骨腫、乳頭状腫瘍等を含み、本明細書に記載の他のがんを含む。
【００４９】
「白血病」または「白血病性がん」という用語は、造血および免疫系（血液およびリンパ系）の全てのがんまたは新形成を指す。これらの用語は、血液および骨髄中の白血球およびその前駆体のゆがめられた増殖および発達を特徴とする、血液形成器官の進行性の悪性疾患を指す。骨髄腫は、血液および骨髄細胞の他の種類の腫瘍を指す。リンパ腫は、リンパ組織の腫瘍を指す。白血病の例は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む。
【００５０】
本明細書に記載のように、本発明の組成物および方法は、末端性黒子性黒色、光線性角化症、腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、星状細胞腫、バルトリン腺癌、基底細胞癌、気管支腺癌、毛細管、カルチノイド、癌腫、癌肉腫、海綿状、胆管癌、軟骨肉腫（ｃｈｏｎｄｏｓａｒｃｏｍａ）、脈絡叢乳頭腫／癌、明細胞癌、嚢胞腺腫、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、上衣、類上皮、ユーイング肉腫、線維層板型、限局性結節性過形成、ガストリノーマ、胚細胞腫瘍、グリア芽腫、グルカゴン産生腫瘍、血管芽細胞腫、血管内皮腫、血管腫、肝細胞腺腫、肝腺腫症、肝細胞癌、インスリノーマ、上皮内腫瘍、皮内扁平上皮腫瘍、浸潤性扁平上皮癌、大細胞癌、平滑筋肉腫、悪性黒子、悪性黒色腫、悪性中皮腫、髄芽腫、髄上皮腫、黒色腫、髄膜腫瘍、中皮性、転移性癌、粘膜表皮癌、神経芽腫、神経上皮腺癌結節型黒色腫、燕麦細胞癌、オリゴデンドログリア、骨肉腫、膵ポリペプチド、乳頭状漿液性腺癌、松果体細胞、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽細胞腫、腎細胞癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌、小細胞癌、軟部組織癌、ソマトスタチン産生腫瘍、扁平上皮癌、扁平上皮細胞癌、中皮下、表在拡大型黒色腫、未分化癌、ぶどう膜メラノーマ、いぼ状癌、ＶＩＰ産生腫瘍、高分化癌およびウィルムス腫瘍等の状態を含む、様々な新形成疾患の処置に使用され得る。したがって、本明細書に記載の組成物および方法は、皮膚がん、膀胱がん、脳腫瘍（頭蓋内腫瘍、例えば神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎｉｎｉｇｉｏｍａ）、神経線維腫症および腺腫を含む）、乳がん、結腸がん、肺がん（ＳＣＬＣもしくはＮＳＣＬＣ）、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、ならびに／または本明細書において列挙される他のがんを処置するために使用され得る。
【００５１】
いくつかの実施形態において、ＰＡＣ−１と第２の活性薬剤（例えば、突然変異を有するＢＲＡＦ酵素の阻害剤、例えば活性薬剤ベムラフェニブ）との組み合わせは、黒色腫に特に効果的となり得る。処置され得る他のがんは、これらに限定されないが、乏突起膠腫、および多形性膠芽腫（ＧＢＭ）を含む膠芽腫を含む。がん性細胞により影響を受けた組織は、脳自体（例えば、頭蓋もしくは脊髄中心管）またはリンパ組織内、血管内、脳神経内、脳髄膜（髄膜）、頭蓋骨、下垂体、または松果腺内にあってもよい。処置され得る脳腫瘍の特定の形態は、星状細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、脊索腫、ＣＮＳ（中枢神経系）リンパ腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、神経節膠腫、神経節細胞腫（節神経腫とも呼ばれる）、星状細胞腫、乏突起膠腫、および上衣腫を含む神経膠腫、血管芽細胞腫（血管腫瘍とも呼ばれる）、未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、例えば髄芽腫、髄膜腫、ならびに前庭神経鞘腫（かつて聴神経腫／神経鞘腫として知られていた）を含む。
【００５２】
組み合わせはまた、身体の他の器官に由来する頭蓋内領域に進入する転移腫瘍を処置するために使用され得る。これらの状態は、典型的には、二次性脳腫瘍と呼ばれる。ＰＡＣ−１と第２の活性薬剤との組み合わせにより処置され得る二次性脳腫瘍は、肺がん、乳がん、悪性黒色腫、腎臓がん、結腸癌、および他の癌腫に由来する脳の転移腫瘍を含む。
【００５３】
本発明の範囲内のがん性状態の他の例は、これらに限定されないが、神経芽腫および骨原性癌腫（例えば、骨のがんまたは骨の組織の新生成長）を含む。ＰＡＣ−１と第２の活性薬剤との組み合わせにより処置され得る悪性原発性骨腫瘍の例は、骨肉種、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫等、ならびに、乳房、肺、および前立腺の癌腫を含む、他の器官から広がった転移性病変等の二次骨腫瘍を含む。
【００５４】
治療薬剤および活性
プロカスパーゼ活性化化合物−１（ＰＡＣ−１；（２−（４−ベンジルピペラジン−１−イル）−Ｎ−［（２−ヒドロキシ−３−プロパ−２−エニル−フェニル）メチリデンアミノ］アセトアミド）は、がん性細胞におけるアポトーシスを選択的に誘引する。ＰＡＣ−１を調製する方法は、米国特許第８，７７８，９４５号（Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。ＰＡＣ−１は、阻害亜鉛イオンのキレート化によりプロカスパーゼ−３の活性を向上させ、がん細胞におけるアポトーシスを誘引する。ＰＡＣ−１は、プロカスパーゼ−３の活性および自己成熟を向上させ、がん細胞におけるアポトーシスを誘引することができる。ＰＡＣ−１はまた、突然変異を有するＢＲＡＦ酵素の阻害剤（二次活性物質）の化学治療活性を向上させるが、しばしばＰＡＣ−１または二次活性物質のいずれか単独ではより非効果的であるか、または完全に不活性である。
【００５５】
驚くべきことに、ＰＡＣ−１およびその誘導体は、突然変異を有するＢＲＡＦ酵素の阻害剤の活性と相乗作用することができる。したがって、本発明は、本発明の追加的な組成物を提供するために、本明細書に記載の組成物中の活性薬剤ＰＡＣ−１が米国特許第８，５９２，５８４号（Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）または米国特許第８，７７８，９４５号（Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）（これらの特許は、参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載のようなＰＡＣ−１誘導体と交換され得るさらなる実施形態を提供する。そのようなＰＡＣ−１誘導体の一例は、ＳＰＡＣ−１（４−（（４−（２−（２−（３−アリル−２−ヒドロキシベンジリデン）ヒドラジニル）−２−オキソエチル）ピペラジン−１−イル）メチル）ベンゼンスルホンアミド）である。ＰＡＣ−１およびその誘導体はまた、トラメチニブ等のＭＥＫ阻害剤の活性と相乗作用することができる。
【００５６】
したがって、ＰＡＣ−１は、本明細書に記載のような突然変異を有するＢＲＡＦ酵素の阻害剤、および／またはＭＥＫ阻害剤、例えばトラメチニブ、コビメチニブ、ビニメチニブ（ＭＥＫ１６２）、セルメチニブ、ＰＤ−３２５９０１、ＣＩ−１０４０、ＰＤ０３５９０１、もしくはＴＡＫ−７３３と組み合わせることができる。ＭＥＫ阻害剤は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼを阻害する薬物、キナーゼ酵素ＭＥＫ１および／またはＭＥＫ２である。これらは、ある特定のがんにおいて過剰に活性であるＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路に影響を与えるために使用され得る。
【００５７】
治療組成物中のＰＡＣ−１またはＰＡＣ−１誘導体の量または濃度は、がん細胞成長を阻害する、がん細胞におけるアポトーシスを誘引する、または第２の活性薬剤と相乗作用するために効果的な量または濃度であってもよい。例えば、ＰＡＣ−１の濃度は、約０．２μＭから約５ｍＭ、または約２μＭから約５０μＭ、典型的には約２．５μＭ、約５μＭ、約７．５μＭ、約１０μＭ、約１２．５μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約２５μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、もしくは約５０μＭ、または上述の値のいずれかの間の範囲であってもよい。同様に、第２の活性薬剤（例えば、突然変異を有するＢＲＡＦ酵素の阻害剤、例えばベムラフェニブまたはダブラフェニブ）の濃度は、約１ｎＭから約１ｍＭ、もしくは約２５ｎＭから約１ｍＭ、典型的には約１ｎＭ、約２ｎＭ、約３ｎＭ、約５ｎＭ、約１０ｎＭ、約２５ｎＭ、約５０ｎＭ、約１００ｎＭ、約２５０ｎＭ、約５００ｎＭ、約７５０ｎＭ、約９００ｎＭ、約１μＭ、約２．５μＭ、約５μＭ、約７．５μＭ、約１０μＭ、約１２．５μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約２５μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、約７５μＭ、約１００μＭ、約１２５μＭ、約１５０μＭ、約２００μＭ、約２５０μＭ、約３００μＭ、約５００μＭ、約７５０μＭ、もしくは約１ｍＭ、または上述の値のいずれかの間の範囲であってもよい。当業者は、特定濃度の投薬量での活性薬剤の量を、例えば固体投薬形態における使用のための活性薬剤の量に容易に変換することができる。
【００５８】
様々な実験に対するデータを、図１〜１３に示す。ＰＡＣ−１およびベムラフェニブは、黒色腫細胞においてアポトーシス死およびカスパーゼ活性を誘引するように強力に相乗作用する。ＰＡＣ−１＋ベムラフェニブで処置された細胞において、劇的なプロカスパーゼ−３活性化が観察される。さらに、１２μＭのＰＡＣ−１および１０μＭのベムラフェニブ単独は、Ａ３７５細胞におけるＰＡＲＰ−１切断に対する効果をほどんど有さないが、組み合わせでは（ウェスタンブロットにより）著しいＰＡＲＰ−１切断が観察される。さらに、ベムラフェニブおよびＭＥＫ阻害剤トラメチニブの組み合わせへのＰＡＣ−１の追加は、組み合わせのカスパーゼ−３活性およびプロアポトーシス効果を著しく向上させる。さらに、低濃度のＰＡＣ−１の追加は、ベムラフェニブによる処置後のがん細胞の再成長を遅延させる。ＰＡＣ−１はまた、細胞培養においてベムラフェニブ耐性Ａ３７５ＶＲ細胞に対する有効性を維持し、ベムラフェニブと相乗作用して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡ３７５ＶＲ細胞成長に対する抗腫瘍効果を発揮する。我々のデータは、同時プロカスパーゼ−３活性化と組み合わされたＭＡＰＫシグナル伝達の阻害が、ベムラフェニブの抗腫瘍活性を向上させ、耐性の発達を軽減するための効果的な戦略であることを示している。したがって、本発明は、ベムラフェニブ耐性がんを有する患者に、ベムラフェニブ治療、および／またはベムラフェニブ／ＭＥＫ阻害剤治療と組み合わせてＰＡＣ−１を投与することにより、ベムラフェニブ耐性を克服する方法を提供する。
【００５９】
本発明の方法
本発明は、がん細胞におけるアポトーシスを選択的に誘引する方法であって、がん細胞に、前記がん細胞のプロカスパーゼ−３分子を改質することができる化合物の組み合わせを投与することを含み、化合物の組み合わせは、ＰＡＣ−１および第２の活性薬剤である方法を提供する。また、がん細胞におけるアポトーシスを選択的に誘引する方法であって、がん細胞に、がん細胞のプロカスパーゼ−３分子を改質することができる化合物の組み合わせを投与することを含み、化合物の組み合わせは、ＰＡＣ−１および第２の活性薬剤であり、例えば、がん細胞は、処置を必要とする患者内に存在する方法が提供される。
【００６０】
本発明は、列挙された化合物の組み合わせがＰＡＣ−１および第２の活性薬剤である追加の方法であって、（ａ）プロカスパーゼ活性剤化合物によるがん細胞の処置に対する潜在的感受性を特定することと、（ｂ）がん細胞を、有効量のプロカスパーゼ活性剤化合物と第２の活性薬剤との組み合わせに曝露することとを含む方法を提供する。また、がん細胞を処置する方法であって、（ａ）プロカスパーゼ活性剤化合物によるがん細胞の処置に対する潜在的感受性を特定することと、（ｂ）前記がん細胞を、有効量のＰＡＣ−１および第２の活性薬剤に曝露することとを含み、ＰＡＣ−１は、プロカスパーゼ−３およびプロカスパーゼ−７の少なくとも一方を活性化することができる方法が提供される。また、がん細胞における死を誘引する（例えばがん細胞を死滅させる）方法であって、がん細胞に、活性薬剤、およびがん細胞のプロカスパーゼ−３分子を活性化することができる化合物、例えばＰＡＣ−１を投与することを含む方法が提供される。
【００６１】
本発明は、さらに、有効量のＰＡＣ−１と第２の活性薬剤との組み合わせを含む医薬を提供する。医薬は、細胞におけるアポトーシスを誘引する方法において使用され得る。いくつかの実施形態において、化合物の組み合わせは、患者において認識可能な神経毒性作用をもたらすほどには血液脳関門を横断しない。本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、１つ以上の細胞を有効量の本明細書に記載の化合物の組み合わせと接触させることを含む。したがって、本発明はまた、細胞を有効量の本明細書に記載の化合物の組み合わせと接触させることと、がん治療を必要とする患者を、有効量の本明細書に記載の化合物の組み合わせで処置することとを含む、細胞を処置する方法を提供する。
【００６２】
本明細書に記載のように、本発明は、上昇したプロカスパーゼ−３レベルを有する腫瘍細胞を有する患者を処置する方法を提供する。方法は、上昇したプロカスパーゼ−３レベルを有する腫瘍細胞を有する患者に、本明細書に記載の治療有効量のＰＡＣ−１と第２の活性薬剤との組み合わせ、またはその組成物を投与することを含んでもよい。本発明は、さらに、上昇したプロカスパーゼ−３レベルを有する腫瘍細胞を処置する方法であって、腫瘍細胞を、本明細書に記載の治療有効量のＰＡＣ−１と第２の活性薬剤との組み合わせに曝露することを含み、腫瘍細胞は、処置される、死滅される、または成長を阻害される方法を提供する。腫瘍または腫瘍細胞は、悪性腫瘍細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞は、黒色腫、結腸直腸、甲状腺、肺、または卵巣がん細胞である。
【００６３】
ＰＡＣ−１は、患者への投与のための単一剤形において第２の活性薬剤と組み合わされてもよい。併用療法は、同時期または逐次的計画として投与されてもよい。逐次的に投与される場合、組み合わせは、２回以上の投与で投与され得る。
【００６４】
併用療法は、「相乗効果」、すなわち、一緒に使用される活性成分が、化合物の別個の使用から得られる効果の合計よりも優れている場合に達成される効果を提供し得る。相乗効果は、ＰＡＣ−１および第２の活性薬剤が、（１）配合製剤化され、組み合わされた製剤として同時期に投与もしくは送達される、（２）別個の製剤として交互に、もしくは並行して送達される、または（３）いくつかの他の計画により送達される場合に達成され得る。交互治療において送達される場合、相乗効果は、化合物が逐次的に、例えば別個の錠剤、丸薬もしくはカプセルとして、または別個の注射器での異なる注射により投与または送達された場合に達成され得る。一般に、交互治療中、有効用量の各活性成分は、逐次的に、すなわち順次投与されてもよく、一方併用療法においては、有効用量の２種以上の活性成分は、一緒に投与される。相乗的抗がん効果とは、組み合わせの個々の化合物の予測される純粋に相加的な効果よりも高い抗がん効果を指す。併用療法は、米国特許第６，８３３，３７３号（ＭｃＫｅａｒｎ  ｅｔ  ａｌ．）によりさらに説明されており、これは、ＰＡＣ−１と組み合わされ得る追加的な活性薬剤、ならびに、ＰＡＣ−１で処置され得るがんの追加的な種類および他の状態を含む。
【００６５】
したがって、ＰＡＣ−１は、がん治療のための第２の活性薬剤との組み合わせにおいて使用され得る。ＰＡＣ−１は、数分から数週間の範囲の間隔をもって第２の活性薬剤の投与に先行してもよく、またはそれに伴ってもよい。第２の活性薬剤およびＰＡＣ−１が別個に細胞に適用される実施形態において、薬剤およびＰＡＣ−１が細胞に対しまだ有利に組み合わされた効果を発揮することができるように、各送達の間に著しい期間が経過しないことが一般に確保される。例えば、そのような場合において、細胞、組織または生物を、実質的に同時期に（すなわち約数分未満で）２つの様式に接触させてもよいことが企図される。他の態様において、組み合わせの第２の活性薬剤は、ＰＡＣ−１の投与前および／または投与後約１分、約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約４５分、約６０分、約２時間、約３時間、約４時間、約６時間、約８時間、約９時間、約１２時間、約１５時間、約１８時間、約２１時間、約２４時間、約２８時間、約３１時間、約３５時間、約３８時間、約４２時間、約４５時間以内、または約４８時間以上で投与されてもよい。ある特定の他の実施形態において、第２の活性薬剤は、ＰＡＣ−１の投与前および／または投与後約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約８日、約９日、約１２日、約１５日、約１６日、約１８日、約２０日、または約２１日以内に投与されてもよい。しかしながら、いくつかの実施形態において、各投与の間に数週間（例えば、約１、約２、約３、約４、約６、または約８週間以上）が経過する場合、処置の期間を大幅に延長することが望ましくなり得る。
【００６６】
本発明の化学治療組成物の患者への投与は、典型的には、該当する場合には毒性を考慮して、化学治療薬の投与のための一般的なプロトコルに従う。処置サイクルは、必要に応じて繰り返されることが推測される。また、様々な標準治療または補助がん治療、および外科的介入が、説明された組み合わせと組み合わせて適用され得ることが企図される。これらの治療は、化学治療、免疫治療、遺伝子治療および手術を含むが、これらに限定されない。
【００６７】
薬学的製剤
本明細書に記載の化合物は、例えば、化合物を薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体と組み合わせることにより、治療用薬学的組成物を調製するために使用され得る。化合物は、塩または溶媒和物の形態で担体に添加されてもよい。例えば、化合物が安定な非毒性の酸または塩基塩を形成するのに十分に塩基性または酸性である場合、塩としての化合物の投与が適切となり得る。薬学的に許容される塩の例は、生理学的に許容されるアニオンを形成する酸で形成された有機酸付加塩、例えば、トシル酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩、およびβ−グリセロリン酸塩である。塩酸塩、ハロゲン化物、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、および炭酸塩を含む、好適な無機塩もまた形成され得る。
【００６８】
薬学的に許容される塩は、当技術分野において知られている標準的手順を使用して、例えば、アミン等の十分に塩基性の化合物を好適な酸と反応させ、生理学的に許容されるイオン性化合物を生成することにより得ることができる。カルボン酸のアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウムもしくはリチウム）またはアルカリ土類金属（例えば、カルシウム）塩もまた、同様の方法により調製することができる。
【００６９】
本明細書に記載の式の化合物は、薬学的組成物として製剤化されてもよく、哺乳動物宿主、例えばヒト患者に様々な形態で投与されてもよい。形態は、選択された投与経路、例えば、経口または非経口投与、静脈内、筋肉内、局所的または皮下経路に特定して適応されてもよい。
【００７０】
本明細書に記載の化合物は、薬学的に許容されるビヒクル、例えば不活性希釈剤または吸収可能な可食担体と組み合わせて全身投与されてもよい。経口投与の場合、化合物は、硬質または軟質シェルゼラチンカプセル内に封入されてもよく、錠剤に圧縮されてもよく、または、患者の食生活における食品中に直接組み込まれてもよい。化合物はまた、１種または複数種の賦形剤と組み合わされてもよく、また摂取可能な錠剤、口腔錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハ等の形態で使用されてもよい。そのような組成物および調製物は、典型的には、少なくとも０．１％の活性化合物を含有する。組成物および調製物のパーセンテージは、変動し得、好都合には、所与の単位剤形の重量の約０．５％から約６０％、約１％から約２５％、または約２％から約１０％であってもよい。そのような治療上有用な組成物中の活性化合物の量は、効果的な用量レベルを得ることができるような量であってもよい。
【００７１】
錠剤、トローチ、丸薬、カプセル等はまた、トラガカントガム、アカシア、トウモロコシデンプンまたはゼラチン等の結合剤；第二リン酸カルシウム等の賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸等の崩壊剤；およびステアリン酸マグネシウム等の滑剤の１つ以上を含有してもよい。スクロース、フルクトース、ラクトースもしくはアスパルテーム等の甘味剤；または、ペパーミント、ウィンターグリーンの油、もしくはチェリー香味料等の香味剤が添加されてもよい。単位剤形がカプセルである場合、カプセルは、上記の種類の材料に加えて、植物油またはポリエチレングリコール等の液体担体を含有してもよい。様々な他の材料が、コーティングとして、または別様には固体単位剤形の物理的形態を変更するために存在してもよい。例えば、錠剤、丸薬、またはカプセルは、ゼラチン、ワックス、シェラックまたは糖等でコーティングされてもよい。シロップまたはエリキシル剤は、活性化合物と、甘味剤としてのスクロースまたはフルクトースと、保存剤としてのメチルおよびプロピルパラベンと、染料、ならびにチェリーまたはオレンジフレーバー等の香味料を含有してもよい。任意の単位剤形の調製に使用されるいずれの材料も、使用される量において薬学的に許容され、実質的に非毒性であるべきである。さらに、活性化合物は、徐放調製物およびデバイス中に組み込まれてもよい。
【００７２】
活性化合物は、点滴または注射により、静脈内または腹腔内投与されてもよい。活性化合物またはその塩の溶液は、任意選択で非毒性界面活性剤と混合された水中で調製されてもよい。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、もしくはそれらの混合物中で、または薬学的に許容される油中で調製されてもよい。通常の保存および使用条件下では、調製物は、微生物の成長を予防するために保存剤を含有してもよい。
【００７３】
注射または点滴に好適な薬学的剤形は、任意選択でリポソーム内にカプセル化された滅菌注射または点滴溶液または分散液の即時調製用に適合された活性成分を含む滅菌水溶液、分散液、または滅菌粉末を含み得る。最終的な剤形は、製造および保存の条件下で無菌、流体および安定であるべきである。液体担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、植物油、非毒性グリセリルエステル、およびそれらの好適な混合物を含む溶媒または液体分散媒であってもよい。例えば、リポソームの形成により、分散液の場合は必要な粒径を維持することにより、および界面活性剤の使用により、適正な流動性を維持することができる。微生物の活動の防止は、様々な抗菌および／または抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によりもたらすことができる。多くの場合において、等張剤、例えば砂糖、緩衝剤、または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよび／またはゼラチンによりもたらすことができる。
【００７４】
無菌注射溶液は、必要に応じて上で列挙された様々な他の成分と共に、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、任意選択で濾過滅菌を行うことにより調製され得る。無菌注射溶液の調製用の無菌粉末の場合、調製方法は、真空乾燥およびフリーズドライ技術を含んでもよく、これにより、活性成分および溶液中に存在する追加的な任意の所望の成分の粉末が得られる。
【００７５】
有用な固体担体は、微粉化された固体、例えばタルク、粘土、微結晶性セルロース、シリカ、アルミナ等を含む。有用な液体担体は、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アルコール、グリコール、または水−アルコール／グリコールブレンドを含み、化合物は、任意選択で非毒性界面活性剤を利用して、効果的なレベルで溶解または分散し得る。所与の用途における特性を最適化するために、香料および追加の抗菌剤等のアジュバントが添加されてもよい。得られた液体組成物は、包帯および他の包帯材に含浸させるために使用される吸収パッドから塗布されてもよく、または、ポンプ式もしくはエアロゾル噴霧器を使用して罹患領域に噴霧されてもよい。増粘剤、例えば合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩およびエステル、脂肪アルコール、改質セルロース、または改質鉱物材料もまた、液体担体と共に使用され得る。
【００７６】
本明細書に記載の活性薬剤の有用な用量は、動物モデルにおけるそれらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性およびｉｎ  ｖｉｖｏ活性を比較することにより決定され得る。マウスおよび他の動物における有効用量のヒトへの外挿方法は、当技術分野において知られており、例えば、米国特許第４，９３８，９４９号（Ｂｏｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）を参照されたい。処置における使用に必要とされる化合物またはその活性塩もしくは誘導体の量は、選択される特定の化合物または塩だけでなく、投与経路、処置されている状態の性質、ならびに患者の年齢および状態によっても変動し、最終的には、担当の医師または臨床医学者の判断による。
【００７７】
しかしながら、一般に、活性薬剤の好適な投薬量は、１日当たり約０．５から約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約１０から約７５ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、１日当たり、被投与者のキログラム体重当たり３から約５０ｍｇ、好ましくは６から９０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内、最も好ましくは１５から６０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内である。化合物は、好都合には、例えば、単位剤形当たり５ｍｇから１０００ｍｇ、好都合には１０ｍｇから７５０ｍｇ、最も好都合には５０ｍｇから５００ｍｇの活性成分を含有する単位剤形として製剤化されてもよい。いくつかの実施形態において、ＰＡＣ−１用量は、約５０〜２５０ｍｇ／ｋｇ、約７５〜１５０ｍｇ／ｋｇ、または約１００ｍｇ／ｋｇである。様々な実施形態において、ＢＲＡＦ遺伝子または酵素の阻害剤の用量は、約０．５ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇから約１５ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇである。ＭＥＫ阻害剤用量は、これらの活性薬剤のいずれかと同様の量、または、これらの活性薬剤のいずれかの量の約２分の１から約１０分の１であってもよい。一実施形態において、本発明は、そのような単位剤形の１つ以上として製剤化された、本明細書に記載の活性薬剤または活性薬剤の組み合わせを含む組成物を提供する。
【００７８】
望ましい投薬量は、好都合には、単一投薬量または適切な間隔で投与される分割投薬量として、例えば１日当たり２回、３回、４回またはそれ以上の部分投薬量として提示されてもよい。部分投薬量そのものが、例えば、複数の個別のゆったりと間隔をあけた投与、例えば、吸入器からの複数の吸引、または経口投与までさらに分割されてもよい。
【００７９】
活性薬剤の組み合わせは、有利には、例えば、単位剤形当たり１００から５，０００ｍｇ／ｍ２、３００から４，０００ｍｇ／ｍ２、３７０から３，７００ｍｇ／ｍ２、５０から７５０ｍｇ／ｍ２、または７５０から４，０００ｍｇ／ｍ２の活性薬剤を含有する単位剤形として投与されてもよい。各活性薬剤はまた、個々に、または組み合わせて、約１ｍｇ／ｋｇから約２５０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、もしくは約１５０ｍｇ／ｋｇ、または上述の値のいずれか１つから上述の値の他のいずれかまでの範囲で投与されてもよい。活性薬剤はまた、単独または組み合わせて、約１μｍｏｌ／Ｌから約２５μｍｏｌ／Ｌ、または約１０μｍｏｌ／Ｌ、または約１５μｍｏｌ／Ｌの薬物の定常状態血漿濃度を提供するために、対象に投与されてもよい。
【００８０】
いくつかの実施形態において、本発明は、約１０ｎＭから約１００μＭの有効濃度の活性薬剤を提供する。別の実施形態において、有効濃度は、約２００ｎＭから約５０μＭ、約５００ｎＭから約４０μＭ、約７５０ｎＭから約２５μＭ、約１μＭから約２０μＭ、または約１μＭから約１０μＭである。別の実施形態において、有効濃度は、直接プロカスパーゼ活性化アッセイ、細胞アポトーシス誘引アッセイ、または動物臨床治療評価において、５０％活性濃度等の値とみなされる。一実施形態において、そのような値は、約２００μＭ未満である。別の実施形態において、値は、約１０μＭ未満であるが、約１０ｎＭより高い。望ましい投薬量は、好都合には、単一投薬量または適切な間隔で投与される分割投薬量として、例えば１日当たり２回、３回、４回またはそれ以上の部分投薬量として提示されてもよい。部分投薬量そのものが、例えば、複数の個別のゆったりと間隔をあけた投与までさらに分割されてもよい。
【００８１】
本明細書に記載の活性薬剤は、効果的な抗腫瘍薬剤となり得、任意の単一薬剤の投与と比較して、より高い有効性および／または低減された毒性を有し得る。本発明は、哺乳動物等の患者または対象におけるがんを処置する治療方法であって、がんを有する哺乳動物に、有効量の本明細書に記載の化合物または組成物を投与することを含む方法を提供する。哺乳動物は、霊長類、ヒト、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ヤギ、ウシ等を含む。がんは、任意の様々な種類の悪性新生物、例えば、本明細書に記載のものの中でも、結腸がん、乳がん、黒色腫、または白血病を指し、一般に、望ましくない細胞増殖、例えば無秩序な成長、分化の欠如、局所組織浸潤、および転移を特徴とする。
【００８２】
組成物のがんを処置する能力は、当技術分野において周知のアッセイを使用することにより決定され得る。例えば、処置プロトコルの設計、毒性評価、データ分析、腫瘍細胞死滅の定量、および移植性腫瘍スクリーンの使用の生物学的意義が知られている。さらに、組成物のがんを処置する能力は、本明細書において引用されている引用文献および特許文献におけるアッセイを使用して決定され得る。
【００８３】
本発明はまた、化合物のプロドラッグ形態を提供する。ｉｎ  ｖｉｖｏでＰＡＣ−１または本明細書において列挙される別の活性薬剤を提供するように変換される任意の化合物が、プロドラッグである。プロドラッグを形成する多くの方法が、当技術分野において周知である。プロドラッグおよびそれらを調製する方法の例は、中でも、Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４２，ａｔ  ｐｐ．３０９−３９６，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｋ．Ｗｉｄｄｅｒ，ｅｔ．ａｌ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８５）；Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｋｒｏｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎ  ａｎｄ  Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ５，「Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ」  ｂｙ  Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，ａｔ  ｐｐ．１１３−１９１，１９９１）；Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．８，ｐ．１−３８（１９９２）；Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．７７，ｐ．２８５（１９８８）；およびＮｏｇｒａｄｙ（１９８５）Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ  ３８８−３９２）において見出される。
【００８４】
さらに、いくつかの実施形態において、ＰＡＣ−１は、ＰＡＣ−１誘導体または他の阻害剤、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，６３２，９７２号（Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第８，７７８，９４５号（Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、もしくは米国特許第８，９１６，７０５号（Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許出願公開第２００７／００４９６０２号（Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許出願第１２／５９７，２８７号（Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、または国際公開第ＷＯ２０１４／０２２８５８号（Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）に記載の化合物と交換されてもよい。本明細書における開示と組み合わせて使用され得る、がん治療のための有用な化合物、方法および技術は、上述の文献だけでなく、米国特許第６，３０３，３２９号（Ｈｅｉｎｒｉｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第６，４０３，７６５号（Ａｌｎｅｍｒｉ）、米国特許第６，８７８，７４３号（Ｃｈｏｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、および米国特許第７，０４１，７８４号（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、ならびに米国特許出願公開第２００４／０１８０８２８号（Ｓｈｉ）に記載されている。
【００８５】
試験を実行するため、およびがん細胞株を評価するための方法は、Ｐｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００６，２（１０），５４３−５５０；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００９，３８８，１４４−１５８；およびＰｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０，７０（１８），７２３２−７２４１に記載のように行うことができる。
【００８６】
以下の実施例は、上述の発明を例示することを意図しており、その範囲を狭めるように解釈されるべきではない。実施例は、本発明が実践され得る多くの他の様式を示唆していることが、当業者に容易に認識される。本発明の範囲内であることを維持しながら、多くの変形および修正を行うことができることが理解されるべきである。
【実施例】
【００８７】
例１．ベムラフェニブとプロカスパーゼ−３活性化との組み合わせは、突然変異ＢＲＡＦ黒色腫において相乗作用する。
【００８８】
ベムラフェニブ耐性の発達は、Ｖ６００ＥＢＲＡＦ突然変異による転移性黒色腫の処置のためのこの薬剤の長期有効性を制限する。ベムラフェニブによる下流側のＭＡＰＫシグナル伝達の阻害は、カスパーゼ−３により媒介されるアポトーシス細胞死を誘引するが、これは、プロカスパーゼ−３活性化剤の追加が、抗がん効果を向上させることができることを示唆している。ここで、我々は、プロカスパーゼ活性化化合物であるＰＡＣ−１とベムラフェニブとの組み合わせが、Ｖ６００ＥＢＲＡＦ突然変異を保有する黒色腫細胞株におけるカスパーゼ−３活性およびアポトーシス細胞死の向上において高い相乗作用を呈することを示す。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、組み合わせは、マウスにおける有利な安全性プロファイルを示し、著しい抗腫瘍効果を発揮する。我々は、さらに、ベムラフェニブおよびＭＥＫ阻害剤トラメチニブの臨床的に有用な組み合わせへのＰＡＣ−１の追加が、組み合わせのカスパーゼ−３活性およびプロアポトーシス効果を極めて向上させることを実証する。さらに、低濃度のＰＡＣ−１の追加はまた、ベムラフェニブによる処置後の細胞の再成長を遅延させる。最後に、ＰＡＣ−１は、細胞培養におけるベムラフェニブ耐性Ａ３７５ＶＲ細胞に対する有効性を維持し、ベムラフェニブと相乗作用して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡ３７５ＶＲ細胞成長に対する抗腫瘍効果を発揮する。総合的に、我々のデータは、同時プロカスパーゼ−３活性化と組み合わされたＭＡＰＫシグナル伝達の阻害が、ベムラフェニブの抗腫瘍活性を向上させ、耐性の発達を軽減するための効果的な戦略であることを示している。
【００８９】
ここで、我々は、Ｖ６００ＥＢＲＡＦ黒色腫におけるカスパーゼ−３活性およびアポトーシス細胞死の向上における、ＰＡＣ−１＋ベムラフェニブおよびＰＡＣ−１＋ベムラフェニブ＋トラメチニブの相乗的活性を報告する。増加したアポトーシス細胞死の結果、ＰＡＣ−１＋ベムラフェニブの組み合わせは、Ｖ６００ＥＢＲＡＦ黒色腫のマウス異種移植モデルにおいて、個々の薬剤の抗腫瘍効果をはるかに上回る、腫瘍体積の著しい低減を誘引する。さらに、ベムラフェニブ感受性黒色腫におけるアポトーシス死の、ＰＡＣ−１の追加によるこの向上は、ベムラフェニブへの曝露後の細胞の再成長を著しく遅延させる。最後に、ＰＡＣ−１は、培養中、ベムラフェニブ耐性Ａ３７５ＶＲ細胞において効果を持続し、ベムラフェニブと相乗作用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるこれらの細胞の腫瘍成長を抑制するが、これは、現在利用可能な処置の選択肢がほとんどないＢＲＡＦ阻害剤処置を上回って進行した黒色腫におけるこの組み合わせの実用性を示している。
【００９０】
ＰＡＣ−１とベムラフェニブとの組み合わせは、Ｖ６００ＥＢＲＡＦ突然変異を有する細胞におけるアポトーシスを向上させる。多様な起源およびＢＲＡＦ突然変異状態の９つの細胞株のパネルにおいて、ベムラフェニブは、Ｖ６００ＥＢＲＡＦ突然変異を保有する細胞株のみにおいて有効であり（２００〜５５０ｎＭの間のＩＣ５０値）、以前に報告された値と一致する（図１Ａ）。同じ細胞株のパネルにおけるＰＡＣ−１の評価は、ＰＡＣ−１が、ＢＲＡＦ突然変異状態とは無関係に、全ての細胞株において同様の活性を維持する（１〜４μＭの間のＩＣ５０値）ことを示している（図１Ａ）。次いで、ＰＡＣ−１＋ベムラフェニブの組み合わせのアポトーシス細胞死を誘引する能力を、これらの細胞株において評価した。ベムラフェニブもＰＡＣ−１も単剤としては著しいアポトーシス死を誘引しない（≦１０％）条件下では（化合物による２４時間のインキュベーション）、ＰＡＣ−１＋ベムラフェニブの組み合わせは、Ｖ６００ＥＢＲＡＦ突然変異を有する細胞株において、著しいアポトーシス（２０〜４５％）を誘引する（図１Ｂ）。Ｖ６００ＥＢＲＡＦ細胞株において、ＰＡＣ−１と組み合わせてより低い濃度のベムラフェニブ（０．５μＭ）を評価した場合も、同様の傾向が観察された（図１Ｃ）。しかしながら、ＰＡＣ−１＋ベムラフェニブの組み合わせは、野生型ＢＲＡＦを有する細胞株においては相乗的アポトーシスを誘引しない（図１Ｂ）。
【００９１】
ＰＡＣ−１およびベムラフェニブは、相乗作用して、Ａ３７５、ＳＫ−ＭＥＬ−５およびＵＡＣＣ−６２細胞におけるカスパーゼ−３活性およびアポトーシスを向上させる。観察された相乗作用をより広範に探求するために、単剤として最小限のアポトーシスを誘引するＰＡＣ−１およびベムラフェニブの濃度のマトリックスで処置された３つのヒトＶ６００ＥＢＲＡＦ黒色腫細胞株において、アポトーシス死を評価した。これらの実験において、アポトーシス細胞の数の大幅な増加（単剤のみの相加的効果を上回る）が、Ａ３７５（図２Ａ）、ＳＫ−ＭＥＬ−５（図７Ａ）およびＵＡＣＣ−６２（図８Ａ）において観察された。この薬物の組み合わせの相乗作用を定量するために、組み合わせ指数（ＣＩ）を計算した。相乗作用を呈する薬物の組み合わせは、１未満のＣＩ値を有し、１の値は、相加的効果を反映する（Ｃｈｏｕ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ  ２００６；５８：６２１−８１）。計算ＣＩ値の９３％は１未満であり（図２Ｂ中のＡ３７５、図７Ｂ中のＳＫ−ＭＥＬ−５および図８Ｂ中のＵＡＣＣ−６２）、これは、試験した３つ全ての細胞株にわたる組み合わせの相乗作用を示している。
【００９２】
アポトーシスの増加が実行プロカスパーゼの増加した活性化の結果であるかどうかを評価するために、蛍光性基質を使用して、カスパーゼ−３／−７酵素活性をＡ３７５細胞（溶解後）において評価した。ベムラフェニブまたはＰＡＣ−１単独で（図１Ｂにおいて使用されたのと同じ濃度で）処置されたＡ３７５細胞において、これらの時点および濃度でカスパーゼ−３活性の無視できる増加が観察された（図２Ｃ）。しかしながら、Ａ３７５細胞をＰＡＣ−１およびベムラフェニブで処置すると、処置後７時間という早さでカスパーゼ−３活性の著しい増加が観察された（図２Ｃ）。ウェスタンブロット分析では、単剤はいずれもこれらの時点および濃度でＰＡＲＰ−１切断に対する効果を有していなかったが、組み合わせは、ＰＡＣ−１＋ベムラフェニブの組み合わせで処置された細胞における増加したカスパーゼ−３／−７活性の結果である、著しい切断ＰＡＲＰ−１をもたらした（図２Ｄ）。組み合わせによる２４時間の処置後、Ａ３７５細胞においてほぼ完全なＰＡＲＰ−１の切断が観察された（図２Ｄ）。ＳＫ−ＭＥＬ−５（図７Ｃおよび７Ｄ）ならびにＵＡＣＣ−６２細胞（図８Ｃおよび８Ｄ）においても、カスパーゼ−３／−７活性アッセイおよびＰＡＲＰ−１の切断の同様の結果が観察された。
【００９３】
ＰＡＣ−１誘導体ＰＡＣ−１ａは、亜鉛キレートモチーフを有さず、したがってプロカスパーゼ−３を活性化またはアポトーシスを誘引しない。
【化４】
2018516936.tif 000006
ベムラフェニブと組み合わせたＰＡＣ−１ａの使用は、Ａ３７５、ＳＫ−ＭＥＬ−５またはＵＡＣＣ−６２細胞において、アポトーシスを生じる細胞の割合の著しい増加をもたらさなかった（図９Ａ−Ｃ）。この結果はまた、ＰＡＣ−１ａおよびベムラフェニブの組み合わせで処置された細胞において増加したＰＡＲＰ−１切断が存在しないことと一致し（図９Ｄ）、細胞がアポトーシス死を生じなかったことを示している。
【００９４】
アポトーシス細胞死を向上させるためには、ＥＲＫ１／２リン酸化の阻害およびプロカスパーゼ−３の活性化が必要である。図１Ｂにおけるデータと一致して、ＰＡＣ−１＋ベムラフェニブの組み合わせで処置された場合、２つのＷＴＢＲＡＦ細胞株においてカスパーゼ−３活性またはＰＡＲＰ−１切断の向上は観察されなかった（図１Ａ〜Ｃ）。ＷＴＢＲＡＦを保有する細胞株においてＰＡＣ−１＋ベムラフェニブの相乗作用が存在しないことは、アポトーシス細胞死の劇的な向上を誘引するには、ＥＲＫ１／２の阻害およびプロカスパーゼ−３の活性化の両方が必要であることを示唆している。実際に、ベムラフェニブによる２４時間の処置後、高濃度（３０μＭ）のベムラフェニブであっても、ＷＴＢＲＡＦ細胞株においてＥＲＫ１／２リン酸化の阻害は観察されなかった（図１Ｂおよび１Ｃ）。この観察は、ベムラフェニブがＷＴＢＲＡＦ細胞においてＥＲＫ１／２リン酸化を阻害せず、逆説的にそれを活性化するという以前の報告と一致している。
【００９５】
これをさらに調査するために、Ａ３７５（Ｖ６００ＥＢＲＡＦを保有する）細胞を、ＰＡＣ−１、ベムラフェニブ、または組み合わせで処置し、切断ＰＡＲＰ−１およびＥＲＫ１／２リン酸化の存在について調べた。２４時間後、ベムラフェニブ（０．５および１．０μＭ）ならびに組み合わせで処置された細胞においては、ホスホ−ＥＲＫ１／２バンドが観察されなかった（図２Ｅ）。しかしながら、ＰＡＣ−１およびベムラフェニブの両方で処置された細胞においてのみ、切断ＰＡＲＰ−１の量の著しい増加が観察された（図２Ｅ）。ＳＫ−ＭＥＬ−５（図７Ｅ）およびＵＡＣＣ−６２細胞（図８Ｅ）においても、同様の結果が観察された。ＥＲＫ１／２リン酸化の不完全な阻害が観察された低濃度のベムラフェニブ（０．１および０．２５μＭ）でも、その単剤効果に勝るＰＡＲＰ−１切断の若干の増加が観察された（図２Ｅ）。この結果は、ＥＲＫ１／２リン酸化の不完全な阻害であっても、ＥＲＫ１／２シグナル伝達の下流側であるプロカスパーゼ−３活性化が、ベムラフェニブ処置へのＰＡＣ−１の追加により向上され得ることを示唆している。まとめると、データは、ＰＡＣ−１によるプロカスパーゼ−３活性化が、Ｖ６００ＥＢＲＡＦ突然変異を有する細胞株において、ベムラフェニブのプロアポトーシス効果を劇的に向上させることを示している。
【００９６】
ベムラフェニブおよびトラメチニブへのＰＡＣ−１の追加は、カスパーゼ−３活性およびアポトーシスを向上させる。トラメチニブ等のＭＥＫ１／２阻害剤の追加は、Ｖ６００ＥＢＲＡＦ黒色腫におけるベムラフェニブの有効性を向上させるために、臨床において広く使用されている。この組み合わせとのＰＡＣ−１の効果を探求するために、ＰＡＣ−１の存在下または非存在下で細胞をベムラフェニブ＋トラメチニブで処置し、アポトーシスを評価した。Ａ３７５およびＵＡＣＣ−６２細胞株の両方において、ベムラフェニブ＋トラメチニブ併用処置は、アポトーシス細胞の数の相加的増加をもたらすにすぎなかった（図３Ａ）。一方で、ＰＡＣ−１の追加は、単剤のみの相加的効果を上回るアポトーシス細胞の数の大きな増加をもたらした（図３Ａ）。ベムラフェニブ＋トラメチニブ併用処置は、ＰＡＲＰ−１切断をもたらさなかったが、ＰＡＣ−１の追加は、ほぼ量的なＰＡＲＰ−１の切断をもたらした（図３Ｂ）。ＰＡＣ−１の存在下での増加したアポトーシス細胞死が実行カスパーゼの向上した酵素活性の結果であるかどうかを探求するために、ＰＡＣ−１を追加した、または追加しないベムラフェニブ＋トラメチニブで処置されたＡ３７５およびＵＡＣＣ−６２細胞のカスパーゼ−３／−７活性を評価した。この場合も、ＰＡＣ−１が含められた場合にカスパーゼ−３／−７活性の劇的な増加が観察され、これは、ＰＡＣ−１の追加なしでは見られない効果であった（図３Ｃ）。
【００９７】
ベムラフェニブおよびＰＡＣ−１の組み合わせは、Ａ３７５異種移植モデルにおいて腫瘍組織量を著しく低減する。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＡＣ−１＋ベムラフェニブの組み合わせの抗腫瘍効果を決定するために、Ａ３７５異種移植モデル（Ｙａｄａｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２０１４；１３：２２５３−６３）を使用した。このモデルでは、ヌードマウスにＡ３７５細胞を皮下接種し、腫瘍を成長させた後、腫瘍体積に基づいてマウスを４つの群に無作為化し［Ｆ＝０．０３＜Ｆｃｒｉｔｉｃａｌ（３．０１）］、ＰＡＣ−１、ベムラフェニブ、または組み合わせを１５日間投薬した。ＰＡＣ−１単独での処置は、未処置対照マウスと比較して、腫瘍質量および体積の最小限の低減をもたらした（図４Ａおよび４Ｂ）。ベムラフェニブ単独を投薬されたマウスは、対照と比較して腫瘍体積および質量の中程度の低減（５３％；ｐ＝０．０４）を経験し（図４Ａおよび４Ｂ）、８匹のマウスのうち３匹は、対照マウスと同等の腫瘍質量を有していた（図４Ｂ）。一方、ＰＡＣ−１およびベムラフェニブの組み合わせで処置されたマウスは、対照マウスと比較して著しくより少ない腫瘍組織量を有していた（図４Ａ、４Ｂおよび図１１）。これらのマウスでは、腫瘍体積の７８％の低減が観察され（図４Ａ、ｐ＝０．０００８対対照）、８匹のマウスのうち６匹は、質量が０．２ｇ未満の腫瘍を有しており（図４Ｂ）、ＰＡＣ−１がｉｎ  ｖｉｖｏにおいてベムラフェニブの抗腫瘍効果を向上させ、処置に対する反応の変動性を低減することを示している。
【００９８】
ウェスタンブロットによる腫瘍試料におけるプロカスパーゼ−３レベルの検査は、他の投薬群における可変の反応に対し、併用処置を受けたマウスから得られた腫瘍試料においてのみ、プロカスパーゼ−３の量の認識可能な一貫した低減を示した（図４Ｃおよび４Ｄ）。免疫組織化学的染色を使用して、ＰＡＣ−１＋ベムラフェニブで処置された腫瘍におけるＫｉ−６７発現細胞のパーセンテージの著しい低減が観察された（図４Ｅ）が、これは、ＰＡＣ−１＋ベムラフェニブの組み合わせが、プロカスパーゼ−３活性化を増幅することだけでなく、細胞増殖を減弱させることもできたことを示している。最後に、ＰＡＣ−１＋ベムラフェニブで処置されたマウスにおいて、血液毒性は観察されなかった（表１）が、これは組み合わせの有利な安全性プロファイルを示している。まとめると、ｉｎ  ｖｉｖｏデータは、ＰＡＣ−１＋ベムラフェニブの相乗作用がカスパーゼ−３活性およびアポトーシス細胞死の誘引の増加、ならびに細胞増殖の低減をもたらすことを示す細胞培養結果と一致している。
【表１】
2018516936.tif 000007
【００９９】
ＰＡＣ−１での長期的な処置は細胞再成長を防止し、ベムラフェニブへのＰＡＣ−１の追加は、細胞再成長の開始を遅延させる。Ａ３７５細胞におけるベムラフェニブのＥｍａｘ（高濃度の化合物により誘引される細胞死パーセント）は、５日後に９６．８±０．３％であり（図５Ａ）、Ａ３７５細胞の約３％がベムラフェニブに対し非感受性であることを示している。同じ条件下において、ＰＡＣ−１は９９．４±０．７％のＥｍａｘを有し（図５Ａ）、ＰＡＣ−１がＡ３７５細胞を量的に死滅させ、非感受性細胞は極めて少ないことを示している。したがって、我々は、ベムラフェニブによる長期的な処置はがん細胞の再成長をもたらし、一方ＰＡＣ−１での処置は再成長を防止するはずであると仮定した。この仮定を調査するために、Ａ３７５およびＳＫ−ＭＥＬ−５細胞を低密度で播種し、ＰＡＣ−１（４μＭ）またはベムラフェニブ（１０μＭ）で３０日間まで連続的に処置した。ベムラフェニブで処置されたＡ３７５およびＳＫ−ＭＥＬ−５細胞では、２０日という早さで細胞の再成長が観察された（図５Ｂ）。しかしながら、ＰＡＣ−１で処置されたウェルでは、３０日後であっても再成長は観察されなかった（図５Ｂ）。したがって、より高いＥｍａｘ値と一致して、ＰＡＣ−１は、量的に細胞を死滅させ、それにより再成長を防止することができる。
【０１００】
低濃度のＰＡＣ−１の追加がベムラフェニブと組み合わさってがん細胞再成長を防止するかどうかを調査するために、Ａ３７５およびＵＡＣＣ−６２細胞を低密度で９６ウェルプレートに播種し、ＰＡＣ−１（１μＭ）、ベムラフェニブ（５μＭもしくは１０μＭ）、または組み合わせで２０日間まで連続的に処置した。５日後、ＰＡＣ−１、ベムラフェニブ、または組み合わせによる処置はそれぞれ、対象と比較して細胞数の著しい低減をもたらした（Ａ３７５：図５Ｃおよび５Ｄ；ＵＡＣＣ−６２：図１２Ａおよび１２Ｂ）。１０日目には、ＰＡＣ−１処置ウェルと対照との間に観察され得る差はなかった。５μＭまたは１０μＭのベムラフェニブで処置されたウェルでは、細胞死はそれぞれ８９．４±１．４％および９３．２±１．１％であった。しかしながら、Ａ３７５細胞が１μＭのＰＡＣ−１および５μＭまたは１０μＭのベムラフェニブで処置されたウェルでは、増加した細胞死が観察され、それぞれ９６．１±１．０％および９７．９±０．７％であった。より完全な細胞死を達成したことにより、より少ない割合の細胞が、ＰＡＣ−１およびベムラフェニブの両方で処置されたウェルに残留した。２０日間の処置後、ベムラフェニブ単独処置ウェルにおいてコロニーの著しい再成長が観察されたが、併用処置を受けたウェルでは観察されなかった（Ａ３７５：図５Ｃおよび５Ｄ；ＵＡＣＣ−６２：図１２Ａおよび１２Ｂ）。この結果は、ＰＡＣ−１およびベムラフェニブで細胞を併用処置することにより誘引されるより完全な細胞死が、Ａ３７５およびＵＡＣＣ−６２の再成長の遅延に効果的であることを示している。
【０１０１】
ＰＡＣ−１は、ベムラフェニブ耐性黒色腫においてｉｎ  ｖｉｖｏでベムラフェニブと相乗作用する。ベムラフェニブに対する獲得した耐性を有する細胞株においてＰＡＣ−１が活性を維持するかどうかを評価するために、Ａ３７５親細胞株を逐次的により高い濃度のベムラフェニブ（０．５μＭから１．０μＭ）中で２ヶ月間成長させることにより、ベムラフェニブ耐性Ａ３７５ＶＲ細胞株を生成した。Ａ３７５ＶＲの耐性のメカニズムを決定するために、ＭＥＫ１／２、ＮＲＡＳおよびＡＫＴの遺伝子を配列決定したが、耐性を付与する一般に報告されている突然変異は見られなかった（Ｒｉｚｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１４；２０：１９６５−７７）。同様に、Ｖ６００ＥＢＲＡＦ  ｍＲＮＡのスプライス変異もまた観察されなかった。ｑＰＣＲにより、Ａ３７５ＶＲ細胞は、Ａ３７５と比較して約３倍高いレベルのＭＤＲ１  ｍＲＮＡを有する。しかしながら、ドキソルビシンまたはシスプラチンに対して耐性を有する卵巣細胞における１０００倍まで高いレベルのＭＤＲ１  ｍＲＮＡと比較して、ＭＤＲ１  ｍＲＮＡ過剰発現のレベルは低いとみなされ、これは、耐性がＭＤＲ表現型の劇的な上方制御に起因する可能性が低いことを示している。
【０１０２】
ベムラフェニブはＡ３７５ＶＲ細胞株を死滅させ、１．５μＭの５日ＩＣ５０値を有し、親Ａ３７５の感受性と比較して有効性は１２分の１の低さである（図６Ａ）。さらに、Ａ３７５ＶＲのベムラフェニブＥｍａｘは７９±６．３％であり、これは親Ａ３７５細胞株よりも１４％低い。ベムラフェニブ（０．５または１μＭ）で２時間の親Ａ３７５細胞の処置は、ＥＲＫ１／２リン酸化の完全な阻害をもたらすが、この効果はＡ３７５ＶＲでは観察されず、ベムラフェニブに対するＡ３７５ＶＲの耐性および継続するＭＡＰＫシグナル伝達と一致している（図６Ｂ）。一方、ＰＡＣ−１はＡ３７５ＶＲに対して活性を維持し、２．４μＭのＩＣ５０値（親細胞株の１．２μＭに対して、図６Ｃ）および同様のＥｍａｘを有する。我々は、耐性Ａ３７５ＶＲ細胞株においてベムラフェニブがＥＲＫ１／２リン酸化およびＭＡＰＫシグナル伝達を阻害する能力がないにもかかわらず、組み合わせは、ＥＲＫ１／２リン酸化の不完全な阻害の条件下でも、ＰＡＣ−１＋ベムラフェニブ処置において観察されるＰＡＲＰ−１切断に基づく相乗効果を発揮する部分的能力を保持し得ると仮定した（図２Ｅ）。ＰＡＣ−１がＡ３７５ＶＲ細胞をベムラフェニブ誘引アポトーシスに再び感受性とし得るかどうかを調査するために、Ａ３７５ＶＲ細胞を低濃度のベムラフェニブと組み合わせてＰＡＣ−１で処置した。この併用処置は、アポトーシスを生じる細胞の数の増加をもたらした（図１３Ａ、１３Ｃ）が、これは、ＰＡＣ−１の追加が、Ａ３７５ＶＲのベムラフェニブに対する耐性メカニズムを回避することができることを示している。この効果は、不活性変異体ＰＡＣ−１ａを使用すると、無効化された（図１３Ｃ）。ＰＡＣ−１＋ベムラフェニブの組み合わせは相乗作用を呈し、Ｂｌｉｓｓ独立モデル（Ｂｌｉｓｓ，Ａｎｎ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｌ  １９３９；２６：５８５−６１５）による予測よりも平均７．５％高いアポトーシス細胞の数を誘引した（図１３Ａおよび１３Ｂ）。最後に、ＰＡＣ−１がｉｎ  ｖｉｖｏでベムラフェニブと相乗作用し得るかどうかを決定するために、Ａ３７５ＶＲ細胞をヌードマウスに皮下移植し、マウスにベムラフェニブ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＰＡＣ−１（１００ｍｇ／ｋｇ）または組み合わせを１５日間毎日投薬した。ベムラフェニブまたはＰＡＣ−１単独での処置は、このｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいていかなる抗腫瘍効果も発揮しないが、組み合わせでの処置は、未処置対照と比較して腫瘍体積の著しい低減をもたらした（図６Ｄ）。
【０１０３】
考察。黒色腫細胞でのアポトーシスシグナル伝達カスケードにおける異常は、プロカスパーゼ−３の活性化の上流側であることを考慮して、プロカスパーゼ−３を直接活性化する小分子が、アポトーシス回路の欠陥を回避することによりアポトーシスを誘引し得る。プロカスパーゼ−３のＰＡＣ−１による活性化は、以前に培養中の黒色腫細胞に対する単剤有効性を有することが示されており（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１４；８：１６４０−５２；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１０；７０：７２３２−４１；Ｐｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２００６；２：５４３−５０）、我々はここで、ＰＡＣ−１＋ベムラフェニブ、またはＰＡＣ−１＋ベムラフェニブ＋トラメチニブが、Ｖ６００ＥＢＲＡＦ突然変異を有する黒色腫におけるカスパーゼ−３活性およびアポトーシス細胞死の誘引において強力な相乗作用を呈することを示す。黒色腫の他に、Ｖ６００ＥＢＲＡＦ突然変異は、エルドハイム・チェスター病（ＥＣＤ）（５４％），ランゲルハンス細胞組織球増殖症（ＬＣＨ）（５７％）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）（１．５％）およびヘアリー細胞白血病（１００％）を含むいくつかの他のがんにおいて報告されている。２つの最近の第ＩＩ相試験において、Ｖ６００ＥＢＲＡＦ突然変異を保有するいくつかの非黒色腫がんにおけるベムラフェニブの有効性が報告されたが、ＮＳＣＬＣ、ＥＣＤ、ＬＣＨおよび難治性ヘアリー細胞白血病を有する患者において有望な結果が見られた。この臨床データ、ならびに、Ｖ６００ＥＢＲＡＦ黒色腫においてＰＡＣ−１、ベムラフェニブ、およびトラメチニブの間の有効な相乗作用を示す我々の現在の研究を考慮して、これらのＰＡＣ−１／薬物の組み合わせは、Ｖ６００ＥＢＲＡＦ突然変異を保有する他の悪性腫瘍において有効性を有し得る。
【０１０４】
Ｅｍａｘパラメータは、培養中のがん細胞を量的に死滅させる化合物の能力を評価するのに有用な測定基準である（Ｆａｌｌａｈｉ−Ｓｉｃｈａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２０１３；９：７０８−１４）。１００％未満のＥｍａｘ値は、がん細胞集団を死滅させる薬物の能力の不均一性を意味する。ここで、我々は、ベムラフェニブがＶ６００ＥＢＲＡＦ突然変異Ａ３７５細胞において約９７％のＥｍａｘを有するが、ＰＡＣ−１のＥｍａｘ値は１００％に近づくことを示す。このため、ＰＡＣ−１による長期実験において、Ａ３７５またはＳＫ−ＭＥＬ−５細胞の再成長は観察されない。しかしながら、ベムラフェニブのみで２０日間処置されたＡ３７５、ＵＡＣＣ−６２およびＳＫ−ＭＥＬ−５細胞では、広範囲の再成長が観察された。ベムラフェニブへの低濃度のＰＡＣ−１（１μＭ）の追加により、細胞において再成長はほとんどまたは全く観察されなかった。これらの結果は、低濃度のＰＡＣ−１（１μＭ、ｉｎ  ｖｉｖｏで容易に達成されるＰＡＣ−１濃度（Ｌｕｃａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ  ２０１１；２９：９０１−１１））の追加が、耐性の遅延において臨床的に効果的となり得ることを示している。カスパーゼ−３活性の著しい増加に続く、併用処置の早期におけるアポトーシスの顕著な誘引は、最初はベムラフェニブに対し非感受性であった細胞の大きな割合を死滅させる可能性がある。その結果、処置により影響を受けていない細胞の大幅により少ない残りの割合が存在し、これは細胞の再成長の遅延に重要である。
【０１０５】
現在、ベムラフェニブ耐性黒色腫を発症した患者に残された選択肢は僅かである。ＭＥＫ１／２阻害剤トラメチニブは、Ｖ６００ＥＢＲＡＦ突然変異を有する黒色腫に承認されているが、以前の治療がうまくいかなかった患者において、ＢＲＡＦ阻害剤と組み合わせて、限定された活性を発揮する（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１３；３１：４８２−８９）。我々の結果は、ＰＡＣ−１がまだベムラフェニブと相乗作用して、ベムラフェニブ耐性腫瘍において抗腫瘍効果を発揮することを示している。したがって、ＰＡＣ−１の追加は実行可能であり、ベムラフェニブ処置後に黒色腫が進行した患者に対する代替治療選択肢となり得る。ＰＡＣ−１＋ベムラフェニブの組み合わせは十分な耐容性を有し、良好な安全性プロファイルを有し、ｉｎ  ｖｉｖｏで著しい抗腫瘍効果を示す。ＰＡＣ−１は、現在第Ｉ相臨床試験中であり（ＮＣＴ０２３５５５３５）、ベムラフェニブおよびトラメチニブは両方とも、Ｖ６００ＥＢＲＡＦ黒色腫に対する承認された第一線の処置である。したがって、本研究において説明された相乗作用の臨床前の実証を、Ｖ６００ＥＢＲＡＦ突然変異を保有するがんを有するヒト患者においてこの新規な組み合わせが評価され得る臨床試験に移行させる明確な道が存在する。
【０１０６】
材料および方法
細胞培養および試薬。Ａ３７５（ＣＲＬ−１６１９）およびＣＨＬ−１（ＣＲＬ−９４４６）は、それぞれ１１／５／２０１４および１１／１８／２０１４にＡＴＣＣから購入した。Ａ３７５ＳＭは、Ｉｓｉａｈ  Ｆｉｄｌｅｒ教授（ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｔｅｘａｓ）により、１０／３０／２０１４に提供された。Ｂ１６−Ｆ１０、Ｈ４６０、およびＨＣＴ１１６を除く全ての細胞株は、１０％ＦＢＳ（Ｇｅｍｉｎｉ）を添加したＤＭＥＭ中で培養した。Ｂ１６−Ｆ１０、Ｈ４６０、およびＨＣＴ１１６は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で培養した。ベムラフェニブ、トラメチニブおよびアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（１００４０−０２）は、それぞれＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、およびＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈから購入した。次の抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した：抗ＰＡＲＰ−１（９５４２）、抗カスパーゼ−３（９６６２）、抗β−アクチン（４９６７）、抗ホスホ−ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（４３７０）、抗ＥＲＫ１／２（４６９５）および抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰ結合型（７０７４）。抗切断ＰＡＲＰ−１（ａｂ３２５６１）抗体は、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓから購入した。ＰＡＣ−１およびＰＡＣ−１ａは、以前に報告されたように合成した（Ｐｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２００６；２：５４３−５０）。
【０１０７】
細胞株の認証。全てのヒト細胞株（Ａ３７５、Ａ３７５ＳＭ、ＣＨＬ−１、Ｈ４６０、ＨＣＴ１１６、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２、ＳＫ−ＭＥＬ−５、およびＵＡＣＣ−６２）は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｒｉｚｏｎａ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｅにおいて、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１６ＨＳ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）：１５  Ａｕｔｏｓｏｍａｌ  Ｌｏｃｉ、Ｘ／Ｙを使用して認証された。試験の結果およびフェログラムを記録した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂにおいて、マイコプラズマ検出ＰＣＲを使用して、Ａ３７５細胞に対しマイコプラズマ試験を行った。
【０１０８】
細胞増殖アッセイ。９６ウェルプレートにウェル当たり１０００〜２０００の細胞を播種し、接着させてから、ＰＡＣ−１またはベムラフェニブのＤＭＳＯ溶液を各ウェルに添加した。スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイにより、増殖を評価した。
【０１０９】
アネキシンＶ／ＰＩフローサイトメトリー分析。１２ウェルプレートに７０，０００の細胞を播種し、接着させてから化合物を添加した。細胞を化合物で３７℃で２４時間処置し、その後細胞を採取し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＰＩ（０．５５μｇ／ｍＬ）染料と事前に混合された４５０μＬの冷緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）中に再懸濁させた。試料をＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターで分析し、ＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｖ３−２を使用してデータ分析を行った。
【０１１０】
カスパーゼ−３／７活性アッセイ。５，０００〜８，０００の細胞を９６ウェルプレートに播種し、接着させた。細胞を、１μＭのスタウロスポリンで２４時間、または陽性対照としての１３μＭのラプチナール（ｒａｐｔｉｎａｌ）（Ｐａｌｃｈａｕｄｈｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ２０１５；１３：２０２７−３６）で３時間、陰性対照としてのＤＭＳＯならびに示された濃度のＰＡＣ−１およびベムラフェニブで０、２、４、７、１０、１２、１６、２０もしくは２４時間処置した。次いで、蛍光性基質（λｅｘ＝４００ｎｍ、λｅｍ＝５０５ｎｍ）として２０μＭのＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む、二官能性溶解および活性緩衝液（２００ｍＭのＨＥＰＥＳ、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＤＴＴ、０．４ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ、ｐＨ７．４）の添加により、プレートをカスパーゼ−３／７活性に関して評価した。Ｓｙｎｅｒｇｙマルチモードリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）でプレートを３７℃で３０分間プレインキュベートし、次いで３分間隔で３０分間読み出した。各ウェルに対する傾きを計算した。活性は、アッセイ中に観察された最小および最大活性に正規化して表現される。
【０１１１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ耐性アッセイ。８００のＡ３７５またはＵＡＣＣ−６２細胞を、９６ウェルプレートに播種し、一晩接着させた。翌日、ベムラフェニブ（５もしくは１０μＭ）またはＰＡＣ−１（１μＭ）を、６回の技術的な反復で、５、１０および２０日間処置した。試験期間中、２〜３日毎に新鮮な培地および化合物を添加した。５、１０または２０日の終わりに、ウェルを４℃で１時間、１０％冷トリクロロ酢酸で固定した。次いで、ウェルを洗浄し、乾燥させ、室温で３０分間、０．５％ＳＲＢ染料で染色した。次いで、ウェルを０．１％酢酸で洗浄し、乾燥させた。この時点で、ＧｅｌＤｏｃ  ＸＲ（ＢｉｏＲａｄ）でプレートの画像を撮影した。最後に、２００μＬの１０ｍＭトリス塩基（ｐＨ＞１０．４）をウェルに添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して５１０ｎｍでの吸光度を読み出した。５１０ｎｍでの吸光度を、実験の時間経過に対する細胞増殖を示すものとして、処置後日数に対してプロットした。
【０１１２】
免疫ブロッティング。ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液を使用して、細胞および腫瘍組織を溶解した。各試料のタンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）により決定した。２０μｇのタンパク質を含有する細胞溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの４〜２０％勾配ゲル（ＢｉｏＲａｄ）の各レーンに投入した。ウェスタンブロット分析のために、タンパク質をＰＤＶＦ膜上に移した。
【０１１３】
ＰＣＲおよび配列決定。Ａ３７５およびＡ３７５ＶＲ細胞を溶解し、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出した。ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（ＢｉｏＲａｄ）を使用した逆転写反応に、９００ｎｇのＲＮＡを使用した。ｑＰＣＲ反応は、７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。通常のＰＣＲ反応は、ＭｙＦｉ  Ｍｉｘ  ＰＣＲキット（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を使用して３５サイクルで行い、１％アガロースゲルで行った。標的単位複製配列をゲル抽出し、ＵＩＵＣコア配列決定施設で配列決定した。使用されたプライマーは、以下の表中に見ることができる。
【表２】
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【０１１４】
Ａ３７５およびＡ３７５ＶＲ異種移植モデル。全ての動物試験は、ＵＩＵＣ  ＩＡＣＵＣガイドライン（プロトコル番号１４２９２）に従って行った。１：１  ＤＭＥＭ：マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中の０．１ｍＬのＡ３７５またはＡ３７５ＶＲを、６〜７（Ａ３７５）または５（Ａ３７５ＶＲ）週齢の雌無胸腺ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）の右脇腹に注射した。両方のモデルにおいて、マウスを４つの群：対照、１００ｍｇ／ｋｇのＰＡＣ−１、１０ｍｇ／ｋｇのベムラフェニブ、および１００ｍｇ／ｋｇのＰＡＣ−１と１０ｍｇ／ｋｇのベムラフェニブとの組み合わせに無作為化した（ｎ＝８）。最初の腫瘍体積測定を行い、１５日の期間の投薬を開始した。ベムラフェニブは、１％メチルセルロース中の５％ＤＭＳＯとして製剤化し、強制経口（ｐ．ｏ．）により１日２回与えた。ＰＡＣ−１は、ｐＨ５．５の２００ｍｇ／ｍＬのヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン中で製剤化し、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により与えた。腫瘍の長さおよび幅の測定を週３回行い、体積を０．５２＊Ｌ＊Ｗ２として計算した。試験の終わりに、マウスを安楽死させ、腫瘍を切除した。腫瘍を秤量し、ウェスタンブロットおよび免疫組織化学に使用した。
【０１１５】
Ａ３７５腫瘍の免疫組織化学およびＫｉ−６７指数の定量。免疫組織化学（ＩＨＣ）を、Ｈ＆Ｅ染色後、４μｍ厚のホルマリン固定パラフィン包埋Ａ３７５腫瘍に対して行い、十分な組織完全性と共に新生細胞集団の存在が確認された。Ｋｉ−６７に対する抗体（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＃ＣＲＭ３２５）をＩＨＣに使用し、ＩｎｔｅｌｌｉＰＡＴＨ  ＦＬＸ  ＤＡＢ色原体キット（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＃ＩＰＫ  ５０１０  Ｇ８０）を使用して染色を可視化した。ヒト扁桃腺を陽性対照組織として使用した。ポリマー陰性対照血清（マウスおよびウサギ）（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＃ＮＣ４９９）を、陰性対照として一次抗体と置換した。Ｋｉ−６７指数の定量のために、２０００の新生細胞を計数し、陽性細胞のパーセンテージを計算した。２０００の細胞を定量するには小さ過ぎる腫瘍では、新生細胞の最大数を計数した。全てのスライドは、１人の獣医病理学者により検討された。
【０１１６】
例２．薬学的剤形
以下の製剤は、本明細書に記載の組み合わせ化合物（例えば、ＰＡＣ−１および第２の活性薬剤）、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物（以降で「化合物Ｘ」と呼ばれ、これは１つの活性薬剤または２つの活性薬剤の組み合わせであってもよい）の治療的または予防的投与に使用され得る代表的な薬学的剤形を例示する。
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【０１１７】
これらの製剤は、製薬分野において周知である従来の手順により調製され得る。上記の薬学的組成物は、周知の製薬技術に従い、活性成分（複数種を含む）「化合物Ｘ」の異なる量および種類に対応するように変更され得ることが理解される。エアロゾル製剤（ｖｉ）は、標準的な定量エアロゾルディスペンサーと併せて使用され得る。さらに、特定の成分および割合は、例示を目的としている。成分は、好適な等価物（例えば上述の構成成分）と交換されてもよく、対象となる剤形の所望の特性に従って割合が変更されてもよい。
【０１１８】
例３．錠剤形態
以下の製剤は、本明細書に記載の組み合わせ化合物（例えば、ＰＡＣ−１および第２の活性薬剤）、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物の治療的または予防的投与に使用され得る代表的な薬学的剤形を例示する。
【表９】
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【表１０】
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第２の薬剤は、例えば、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、ＢＭＳ−９０８６６２（ＸＬ２８１としても知られる）、エンコラフェニブ（ＬＧＸ８１８）、ＰＬＸ３６０３（ＲＯ５２１２０５４）、またはＲＡＦ２６５（１−メチル−５−［２−［５−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ピリジン−４−イル］オキシ−Ｎ−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−ベンズイミダゾール−２−アミン）であってもよい。また、第２の薬剤は、ＭＥＫ阻害剤、またはＭＥＫ阻害剤と上述の活性物質の１つとの組み合わせであってもよい。さらに、ＭＥＫ阻害剤を投与するために（例えば、活性物質の第３の別個の、および逐次的投与として）、錠剤Ｂに類似した第３の薬学的剤形が使用されてもよい。これらの製剤は、製薬分野において周知である従来の手順により調製され得る。上記の薬学的組成物は、周知の製薬技術に従い、活性薬剤の異なる量および種類に対応するように変更され得ることが理解される。さらに、特定の成分および割合は、例示を目的としている。成分は、好適な等価物（例えば上述の構成成分）と交換されてもよく、対象となる剤形の所望の特性に従って割合が変更されてもよい。
【０１１９】
開示された実施形態および実施例を参照しながら、特定の実施形態が上で説明されたが、そのような実施形態は単なる例示であり、本発明の範囲を限定しない。本発明から逸脱することなく、当技術分野における通常の技術に従って、以下の特許請求の範囲において定義される本発明のより広い態様に変更および修正が行われてもよい。
【０１２０】
全ての出版物、特許および特許文献は、個々に参照により組み込まれるのと同等に、参照により本明細書に組み込まれる。本開示に矛盾する制限は、本開示から認められない。本発明は、様々な特定の、および好ましい実施形態および技術を参照しながら説明された。しかしながら、本発明の精神および範囲内であることを維持しながら、多くの変形および修正を行うことができることが理解されるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【国際調査報告】
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