(57)【要約】TNF受容体スーパーファミリータンパク質に結合するポリペプチドおよび作用物質、特に、GITR、OX40、またはCD40に特異的に結合する作用物質が開示される。該ポリペプチドまたは該作用物質は、融合ポリペプチド、特に、GITRL、OX40L、もしくはCD40Lを含むポリペプチド、および/または二重特異性作用物質を含んでもよい。免疫応答を誘導するためおよび/または亢進させるために該ポリペプチドまたは該作用物質を使用する方法、ならびにがんなどの疾患を処置するための方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト腫瘍壊死因子受容体リガンドスーパーファミリー(TNFSF)タンパク質の受容体に結合することができる該TNFSFタンパク質の細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含むポリペプチドであって、該細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、または第3のコピーの少なくとも1つが、該TNFSFタンパク質のストーク領域を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
前記TNFSFタンパク質が、GITRL、OX40L、4-1BBリガンド、APRIL、BAFF、CD27リガンド、CD30リガンド、CD40リガンド、EDA、EDA-A1、EDA-A2、Fasリガンド、LIGHT、リンホトキシン、リンホトキシンβ、リンホトキシン-α、TL1A、TNF-α、TRAIL、TRANCE、およびTWEAKからなる群より選択される、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記TNFSFタンパク質が(a)GITRLであり、かつ前記ポリペプチドがSEQ ID NO:5もしくはSEQ ID NO:66を含むか;
前記TNFSFタンパク質が(b)OX40Lであり、かつ前記ポリペプチドがSEQ ID NO:44、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、もしくはSEQ ID NO:72を含むか;または
前記TNFSFタンパク質が(c)CD40Lであり、かつ前記ポリペプチドがSEQ ID NO:85もしくはSEQ ID NO:97を含む、
請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記TNFSFタンパク質が(a)GITRLであり、かつ前記ストーク領域がLQLETAK(SEQ ID NO:32)を含むか;
前記TNFSFタンパク質が(b)OX40Lであり、かつ前記ストーク領域が、QVSHRYP(SEQ ID NO:55)、ALQVSHRYP(SEQ ID NO:74)、SHRYP(SEQ ID NO:75)、およびHRYP(SEQ ID NO:76)からなる群より選択されるか;または
前記TNFSFタンパク質が(c)CD40Lであり、かつ前記ストーク領域が、MQKGDQ(SEQ ID NO:98)、FEMQKGDQ(SEQ ID NO:99)、EMQKGDQ(SEQ ID NO:100)、QKGDQ(SEQ ID NO:101)、およびKGDQ(SEQ ID NO:102)からなる群より選択される、
請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
非TNFSFポリペプチドをさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記非TNFSFポリペプチドが、
(a)ヒトFc領域;
(b)免疫グロブリン重鎖;
(c)単鎖抗体;または
(d)Fab
を含む、請求項5に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記免疫グロブリン重鎖が、免疫グロブリン軽鎖と会合して抗原結合部位を形成する、請求項6に記載のポリペプチド。
【請求項８】
グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体(GITR)に特異的に結合する、請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
SEQ ID NO:7またはSEQ ID NO:9を含む、請求項8に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
GITRを活性化しかつ/またはGITR活性を誘導する、請求項1〜9のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
OX40に特異的に結合する、請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、またはSEQ ID NO:81を含む、請求項11に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
OX40を活性化しかつ/またはOX40活性を誘導する、請求項1〜7、11、または12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
CD40に特異的に結合する、請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
SEQ ID NO:90またはSEQ ID NO:92を含む、請求項14に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
CD40を活性化しかつ/またはCD40活性を誘導する、請求項1〜7、14、または15のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
ATCCに寄託されかつ指定番号PTA-122112が付与されたプラスミドによってコードされる、ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項1〜17のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、ホモ二量体作用物質。
【請求項１９】
請求項1〜17のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、ヘテロ二量体作用物質。
【請求項２０】
(a)請求項1〜17のいずれか一項に記載のポリペプチドと、
(b)抗体に由来する抗原結合部位と
を含む、二重特異性作用物質。
【請求項２１】
ホモ二量体またはヘテロ二量体である、請求項20に記載の二重特異性作用物質。
【請求項２２】
前記抗原結合部位が腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項20または21に記載の二重特異性作用物質。
【請求項２３】
前記抗原結合部位がPD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、またはTIM-3に特異的に結合する、請求項20または21に記載の二重特異性作用物質。
【請求項２４】
(a)細胞性免疫を増大させ;
(b)T細胞活性を増大させ;
(c)細胞溶解性T細胞(CTL)活性を増大させ;
(d)ナチュラルキラー(NK)活性を増大させ;
(e)調節性T細胞(Treg)活性を減少させるかもしくは阻害し;
(f)骨髄由来抑制性細胞(MDSC)活性を減少させるかもしくは阻害し;
(g)重大な副作用および/もしくは免疫に基づく毒性を引き起こすことなく有効な免疫応答を増大させ;かつ/または
(h)サイトカイン放出症候群(CRS)もサイトカインストームも引き起こすことなく有効な免疫応答を増大させる、
請求項1〜17のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項18〜23のいずれか一項に記載の作用物質。
【請求項２５】
請求項1〜17のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項18〜23のいずれか一項に記載の作用物質を産生する、細胞。
【請求項２６】
請求項1〜17のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項18〜23のいずれか一項に記載の作用物質と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項２７】
請求項1〜17のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするかまたは請求項18〜23のいずれか一項に記載の作用物質をコードする、ヌクレオチド配列
を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２８】
SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:51 、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:73、および SEQ ID NO:86からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項27または請求項28に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項３０】
請求項27もしくは請求項28に記載のポリヌクレオチドまたは請求項29に記載のベクターを含む、単離された細胞。
【請求項３１】
対象において免疫応答を誘導するか、活性化するか、促進するか、増大させるか、亢進させるか、または延長する方法であって、治療的有効量の請求項1〜17のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項18〜23のいずれか一項に記載の作用物質を投与する工程を含む、方法。
【請求項３２】
対象においてT細胞活性を増大させる方法であって、治療的有効量の請求項1〜17のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項18〜23のいずれか一項に記載の作用物質を該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項３３】
対象において細胞溶解性T細胞(CTL)活性を増大させる方法であって、治療的有効量の請求項1〜17のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項18〜23のいずれか一項に記載の作用物質を該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項３４】
対象においてナチュラルキラー(NK)活性を増大させる方法であって、治療的有効量の請求項1〜17のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項18〜23のいずれか一項に記載の作用物質を該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項３５】
対象において調節性T細胞(Treg)活性を減少させるかまたは阻害する方法であって、治療的有効量の請求項1〜17のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項18〜23のいずれか一項に記載の作用物質を該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項３６】
対象において骨髄由来抑制性細胞(MDSC)活性を減少させるかまたは阻害する方法であって、治療的有効量の請求項1〜17のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項18〜23のいずれか一項に記載の作用物質を該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項３７】
対象において腫瘍の成長を阻害する方法であって、治療的有効量の請求項1〜17のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項18〜23のいずれか一項に記載の作用物質を該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項３８】
対象においてがんを処置する方法であって、治療的有効量の請求項1〜17のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項18〜23のいずれか一項記載の作用物質を該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項３９】
前記がんが、結腸直腸がん、結腸がん、卵巣がん、膵臓がん、肺がん、肝臓がん、乳がん、腎臓がん、前立腺がん、胃腸がん、メラノーマ、子宮頸がん、膀胱がん、グリア芽細胞腫、頭頸部がん、リンパ腫、および白血病からなる群より選択される、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
少なくとも1種類のさらなる治療用物質を投与する工程をさらに含む、請求項31〜39のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ATCCに寄託されかつ指定番号PTA-122112が付与された、プラスミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2015年2月3日に出願された米国特許仮出願第62/111,404号、2015年4月27日に出願された米国特許仮出願第62/153,272号、2015年4月28日に出願された米国特許仮出願第62/154,008号、2015年9月15日に出願された米国特許仮出願第62/218,956号、および2015年11月24日に出願された米国特許仮出願第62/259,129号の優先権恩典を主張する。これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーに結合する作用物質、特に、GITRL、OX40L、またはCD40Lの細胞外ドメインを含む作用物質に関する。本発明はまた、免疫応答の調整および/またはがんなどの疾患の処置のために前記作用物質を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
免疫療法の基本は、自然免疫応答および適応免疫応答の両方を含む免疫系を操作および/または調整することである。免疫療法の一般的な目的は、「外来因子」、例えば、病原体または腫瘍細胞に対する免疫応答を制御することによって疾患を処置することである。しかしながら、場合によっては、免疫療法は、体内に普通に存在するタンパク質、分子、および/または組織に対する異常な免疫応答から発生することがある自己免疫疾患を処置するために用いられる。免疫療法は、特異的な免疫応答を誘導するもしくは亢進させる方法を含んでもよいか、または特異的な免疫応答を阻害もしくは低減する方法を含んでもよい。
【０００４】
免疫系は、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、抗原提示細胞、樹状細胞、単球、およびマクロファージを含むが、これらに限定されない多数の細胞タイプで構成される高度に複雑な系である。これらの細胞は、これらの相互作用および応答を制御するための複雑かつ精巧な系を有する。これらの細胞は、応答を食い止め、制御されていない免疫応答のマイナスの結果(例えば、自己免疫疾患またはサイトカインストーム)を可能にしないようにするために活性化機構および阻害機構ならびにフィードバックループを用いる。
【０００５】
がん免疫監視という概念は、免疫系が腫瘍細胞を認識し、免疫応答を開始し、腫瘍の発達および/または進行を抑制することができるという理論に基づいている。しかしながら、多くのがん細胞が、腫瘍の阻害なしの成長を可能にする免疫系回避機構を発達させていることは明らかである。がん/腫瘍免疫療法(免疫腫瘍学)は、腫瘍細胞に対するより有効な攻撃を実現して腫瘍細胞の死滅および/または腫瘍成長の阻害をブーストするために免疫系を活性化および/またはブーストすることができる新しくかつ新規の作用物質を開発することに焦点を当てている。
【発明の概要】
【０００６】
発明の簡単な概要
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー(TNFRSF)およびそのリガンド(TNFSF)に属するタンパク質は免疫系細胞の活性化、分化、および生存に深く関与している。TNFRSFメンバーには、4-1BB、BAFF、BCMA、CD27、CD30、CD40、DcR3、DcTRAILR1、DcTRAILR2、DR3、DR6、EDA2R、EDAR、Fas(CD95)、GITR、HVEM、リンホトキシンβR、NGFR、オステオプロテジェリン、OX40、RANK、RELT、TACI、TNFRH3、TNFR1、TNFR2、TRAILR1、TRAILR2、TRAILR3、TRAILR4、TROY、およびTWEAKRが含まれるが、これらに限定されない。TNFファミリーリガンドの受容体は、複数の細胞外システインリッチドメインを含有する、オリゴマーのI型またはIII型膜貫通タンパク質である。これらの受容体のいくつかはまた、リガンド結合後にカスパーゼ相互作用タンパク質を動員して、外因性のカスパーゼ活性化経路を開始する細胞内デスドメイン(DD)も含有する。デスドメインを欠く他のTNFスーパーファミリー受容体はTNF受容体関連因子に結合し、増殖または分化を導くことができる細胞内シグナル伝達経路を活性化する。これらの受容体はまたアポトーシスも開始することができるが、間接的な機構を介してアポトーシスを開始する。アポトーシスを調節することに加えて、いくつかのTNFスーパーファミリー受容体は、免疫細胞機能、例えば、B細胞のホメオスタシスおよび活性化、ナチュラルキラー細胞の活性化、ならびにT細胞共刺激の調節にも関与する。いくつかの他のTNFスーパーファミリー受容体は、毛包の発生および破骨細胞の発生などの細胞タイプ特異的応答を調節する。
【０００７】
TNFSFメンバーには、4-1BBリガンド、APRIL、BAFF、CD27リガンド、CD30リガンド、CD40リガンド(CD40L)、EDA、EDA-A1、EDA-A2、Fasリガンド(CD95L)、GITRリガンド(GITRL)、LIGHT、リンホトキシン、リンホトキシンβ、リンホトキシン-α、OX40リガンド(OX40L)、TL1A、TNF-α、TRAIL、TRANCE、およびTWEAKが含まれるが、これらに限定されない。ほとんどのTNFリガンドは、細胞外ドメインが特異的メタロプロテイナーゼによって切断されて可溶性サイトカインを生じることができるII型膜貫通タンパク質である。リンホトキシンβ(TNF-βとヘテロ三量体を形成する)およびBAFF(APRILとヘテロ三量体を形成する)を除いて、切断されたリガンドおよび切断されていないリガンドは非共有結合ホモ三量体として活性がある。TNFファミリーリガンドは、膜貫通ドメインとコア領域をつなぐ様々な長さのストーク(stalk)を特徴とする。ストークは、TNFファミリーリガンドの特徴的な構造であるTNF相同性ドメイン(THD)またはTNFドメインを含有する。TNFドメインは、「ゼリーロール(jelly-roll)」形態を有する逆平行のβプリーツシートサンドイッチである。β鎖の中にある保存残基が、三量体構造を安定化する特異的なサブユニット間接触をもたらす。隣接するβ鎖をつなぐループにある配列はファミリーメンバー特異的であり、受容体特異性を付与するのに重要である。興味深いことに、GITRL(グルココルチコイド誘導性TNF関連リガンド;TNFSF18)は他のTNFファミリーと比較して三量体の時には比較的ゆるく会合していると考えられ、二量体状態でも存在することが示されている。さらに、GITRL三量体そのものが会合して「スーパークラスター(supercluster)」を形成するという証拠がある(Zhou et al., 2008, PNAS, 105 :5465-5470)。GITRLが架橋して三量体形成が安定化すると活性が増大した(Wyzgol et al., 2009, J. Immunol., 183 : 1851-1861)。これらの結果から、GITRLは二量体から三量体、三量体スーパークラスターまでの範囲のオリゴマー状態で存在している可能性があり、これらの状態は、それぞれ、弱い〜強い範囲のGITR活性をもたらす可能性があること示唆された。
【０００８】
TNFRスーパーファミリーメンバーを標的とするアゴニスト抗体は一般的に二量体分子であり、抗体のそれぞれのアームがTNFRの1つのサブユニットに結合するので、本発明者らは、このアゴニスト抗体が天然三量体TNFファミリーメンバーのシグナル伝達の影響を完全に再現できない可能性があると仮説を立てた。GITRLが、GITRLのオリゴマー化状態を変えることで異なるシグナル伝達レベルを実現する可能性があることを示唆したデータを考慮すると、GITRLを安定した三量体の形で提示する治療用物質はシグナル伝達を誘発する点でアゴニストGITR抗体より活性が高くなる可能性があり、従って、このような三量体GITRL型は優れた免疫療法剤になる可能性があると仮説を立てた。さらに、2つまたはそれ以上のGITRL三量体をもたらす治療用物質はGITRL「スーパークラスター」の影響を実現し、アゴニストGITR抗体よりも効果が高い可能性があると仮説を立てた。この理論は、TNFRアゴニスト抗体と比較してTNFRリガンドの全てではないが、ほとんどについて当てはまると考えられる。
【０００９】
GITRLは三量体の時には比較的ゆるく会合しているので、安定した治療用GITRL三量体を効果的に産生する手段ははっきりと分かっていない。GITRL三量体を安定化する戦略の1つは、三量体の3つのサブユニットを単一のポリペプチドとして発現させることである。TNFファミリーメンバーは単鎖三量体として発現できることが以前に示されている(米国特許出願公開第2007/0286843号および同第2011/0162095号)。しかしながら、以前の単鎖TNFファミリーメンバー三量体変種の大きな欠点は、三量体の3つのサブユニットを相互に接続する外因性リンカー配列を導入したことであった。このようなリンカーは、起こり得る不安定性(instability)および不安定性(lability)を三量体に導入する可能性、ならびに/またはリンカーが外来配列であるので、起こり得る免疫原性の源となる可能性がある。
【００１０】
ヒトGITRL三量体の結晶構造は本発明者らによって調べられ、ある単量体からのN末端アミノ酸残基と、別の単量体からのC末端アミノ酸残基が互いに近接していることが観察された。これにより、それぞれの単量体間の距離を埋め、それによって、長いペプチドリンカーなしで単鎖GITRL三量体を生成できるようにするためには、非常に狭い範囲のアミノ酸残基、例えば、3〜7残基だけで十分な可能性があることが示唆された。GITRLをさらに分析すると、このタンパク質の膜貫通ドメインとTNF相同性ドメインの間には、いくつかのアミノ酸の「ストーク」が存在することが認められた。この短いストーク領域を用いて、GITRL単量体のC末端から、隣接するGITRL単量体のN末端までの距離を埋めるために、このやり方で、外因性ペプチドリンカー配列がない単鎖GITRL三量体を構築することができる可能性があると仮説を立てた。
【００１１】
TNFスーパーファミリーの他のリガンドは同様の構造を有する。しかしながらストーク領域のサイズおよびアミノ酸組成はリガンドごとに異なる。さらに、それぞれのTNFSFリガンドの天然三量体構造はいくらか独特のものであり、それぞれの単鎖三量体融合タンパク質が正しく折り畳まれるのに必要なストーク領域の量は、TNFSFリガンドごとに異なる場合がある。一部のTNFSFリガンド、特に、ストーク領域が非常に長いTNFSFリガンドについては、ストーク領域の断片のみを用いて単鎖三量体を生じさせ得る。
【００１２】
本発明は、ヒト腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー(TNFRSF)メンバーに結合する様々なポリペプチドおよび作用物質を提供する。本明細書で使用する「作用物質」という用語には、ポリペプチド、融合タンパク質、ホモ二量体分子、およびヘテロ二量体分子が含まれるが、これらに限定されない。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、ヒトグルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子関連タンパク質(GITR)に結合する。ある特定の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はGITRアゴニストである。一部の態様において、GITRに結合するポリペプチドまたは作用物質は可溶性GITRリガンド(GITRL)である。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はヒトOX40に結合する。ある特定の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はOX40アゴニストである。一部の態様において、OX40に結合するポリペプチドまたは作用物質は可溶性OX40リガンド(OX40L)である。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はヒトCD40に結合する。ある特定の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はCD40アゴニストである。一部の態様において、CD40に結合するポリペプチドまたは作用物質は可溶性CD40リガンド(CD40L)である。本発明は、本明細書に記載のポリペプチドおよび作用物質を使用する方法を提供する。一部の態様において、本発明は、がん免疫療法または免疫腫瘍学のために前記ポリペプチドおよび作用物質を使用する方法を提供する。一部の態様において、前記ポリペプチドおよび作用物質は、免疫応答を誘導するか、活性化するか、促進するか、増大させるか、亢進させるか、または延長する方法において用いられる。一部の態様において、前記ポリペプチドおよび作用物質は、がん、腫瘍、および/または腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導するか、活性化するか、促進するか、増大させるか、亢進させるか、または延長する方法において用いられる。一部の態様において、前記ポリペプチドおよび作用物質は、腫瘍または腫瘍細胞の成長を阻害する方法において用いられる。一部の態様において、前記ポリペプチドおよび作用物質は、がんを処置するための方法において用いられる。一部の態様において、前記方法はがん細胞の成長を阻害する工程を含む。本発明はまた、本明細書に記載の作用物質を含む組成物を提供する。一部の態様において、前記組成物は、本明細書に記載のポリペプチドおよび作用物質を含む薬学的組成物である。前記ポリペプチドおよび作用物質をコードするポリヌクレオチドならびに前記作用物質を作る方法も提供される。
【００１３】
一局面において、本発明は、ヒト腫瘍壊死因子受容体リガンドスーパーファミリー(TNFSF)タンパク質の受容体に結合することができるTNFSFタンパク質の細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含むポリペプチドを提供する。一部の態様において、ポリペプチドは、ヒト腫瘍壊死因子受容体リガンドスーパーファミリー(TNFSF)タンパク質の受容体に結合することができるTNFSFタンパク質の細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含み、細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、または第3のコピーの少なくとも1つはTNFSFタンパク質のストーク領域を含む。一部の態様において、TNFSFタンパク質は、GITRL、OX40L、4-1BBリガンド、APRIL、BAFF、CD27リガンド、CD30リガンド、CD40リガンド、EDA、EDA-A1、EDA-A2、Fasリガンド、LIGHT、リンホトキシン、リンホトキシンβ、リンホトキシン-α、TL1A、TNF-α、TRAIL、TRANCE、およびTWEAKからなる群より選択される。一部の態様において、TNFSFタンパク質はGITRLであり、細胞外ドメインの断片のあらゆるコピーがGITR結合断片である。ある特定の他の態様において、TNFSFタンパク質はOX40Lであり、細胞外ドメインの断片のあらゆるコピーがOX40結合断片である。ある特定の他の態様において、TNFSFタンパク質はCD40Lであり、細胞外ドメインの断片のあらゆるコピーがCD40結合断片である。一部の態様において、細胞外ドメインまたはその断片のコピーの少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てが細胞外ドメインのストーク領域を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドはFc領域をさらに含む。本明細書に記載のポリペプチドを含むか、または本明細書に記載のポリペプチドからなるホモ二量体作用物質、ヘテロ二量体作用物質、および二重特異性作用物質を含むが、それに限定されるわけではないポリペプチドおよび作用物質が提供される。
【００１４】
一部の態様において、ポリペプチドは、ヒト腫瘍壊死因子受容体リガンドスーパーファミリー(TNFSF)タンパク質の受容体に結合することができるTNFSFタンパク質の細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含み、細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、または第3のコピーの少なくとも1つはTNFSFタンパク質のストーク領域を含む。一部の態様において、TNFSFタンパク質の細胞外ドメインはストーク領域またはストーク領域断片を含む。一部の態様において、細胞外ドメインはストーク領域の短い断片しか含まない。一部の態様において、ストーク領域は約4〜20アミノ酸である。一部の態様において、ストーク領域は約4、5、6、7、8、9、または10アミノ酸である。一部の態様において、細胞外ドメインは、TNF相同性ドメインのすぐ上流にあるストーク領域(例えば、4〜10アミノ酸)を含む。一部の態様において、細胞外ドメインは、TNF相同性ドメインに隣接するストーク領域(例えば、4〜10アミノ酸)を含む。
【００１５】
別の局面において、本発明は、GITR(TNFRSF18)に結合するポリペプチドおよび作用物質を提供する。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はヒトGITRに結合する。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はマウスGITRに結合する。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は可溶性タンパク質である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、ヒトGITRに結合する可溶性タンパク質である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は融合ポリペプチドである。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも1コピーのGITRL細胞外ドメインまたはその断片を含む。本明細書で使用する、タンパク質の細胞外ドメインまたはその断片の「コピー」とは、一般的に、タンパク質の細胞外ドメインまたはその断片の単量体を指す。例えば、GITRL細胞外ドメインまたはその断片のコピーとは、一般的に、GITRLのタンパク質の細胞外ドメインまたはその断片の単量体を指す。従って、細胞外ドメインの複数の「コピー」とは、一般的に、GITRLの細胞外ドメインの二量体(2コピー)または細胞外ドメインの三量体(3コピー)を指す。一部の態様において、コピーは、既知配列の全く同じ複製物の(例えば、天然細胞外ドメインと100％の配列同一性を有する)ポリペプチドである。ある特定の他の態様では、前記ポリペプチドまたは融合ポリペプチドが受容体、すなわち、GITRに結合する能力を保持している限り、コピーの1つまたは複数は保存的置換などの変異を含む。例えば、ある特定の態様では、前記コピーは、天然細胞外ドメインまたはその断片と少なくとも約98％、少なくとも99％、または100％の配列同一性を有するポリペプチドでもよい。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも1コピーのヒトGITRL細胞外ドメインまたはその断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも1コピーのマウスGITRL細胞外ドメインまたはその断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも、ヒトGITRL細胞外ドメインの第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドである。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、ヒトGITRL細胞外ドメインまたはそのGITR結合断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドである。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも、ヒトGITRL細胞外ドメインの第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、細胞外ドメインのうち少なくとも1つはGITRLの「ストーク領域」を含む。一部の態様において、GITRLのストーク領域はLQLETAK(SEQ ID NO:32)である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも、ヒトGITRL細胞外ドメインの第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、それぞれの細胞外ドメインはGITRLの「ストーク領域」を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも、ヒトGITRL細胞外ドメインの第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、第2の細胞外ドメインおよび第3の細胞外ドメインしかGITRLの「ストーク領域」を含まない。一部の態様において、前記ポリ���プチドまたは作用物質は、少なくとも、ヒトGITRL細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、前記ポリペプチドはペプチドリンカーを全く含まない。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、ヒトGITRL細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、前記ポリペプチドは細胞外ドメインまたはその断片のどのコピーの間にも外因性ペプチドリンカーを含まない。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、ヒトGITRL細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、前記ポリペプチドは、ヒトGITRL細胞外ドメインまたはその断片の第1のコピーと第2のコピーとの間に外因性ペプチドリンカーを含まない。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、ヒトGITRL細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、前記ポリペプチドは、ヒトGITRL細胞外ドメインまたはその断片の第2のコピーと第3のコピーとの間に外因性ペプチドリンカーを含まない。
【００１６】
一部の態様において、前記作用物質(例えば、ポリペプチド)はヒトGITRLのおおよそアミノ酸71〜199を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はヒトGITRLのおおよそアミノ酸71〜199を含み、ヒトGITRLの配列はUniProt No.Q9UNG2である。一部の態様において、前記作用物質(例えば、ポリペプチド)は少なくとも1コピーのSEQ ID NO:3またはその断片を含む。一部の態様において、前記作用物質(例えば、ポリペプチド)は少なくとも2コピーのSEQ ID NO:3またはその断片を含む。一部の態様において、前記作用物質(例えば、ポリペプチド)は3コピーのSEQ ID NO:3を含む。一部の態様において、前記作用物質(例えば、ポリペプチド)は少なくとも1コピーのSEQ ID NO:64を含む。一部の態様において、前記作用物質(例えば、ポリペプチド)は少なくとも2コピーのSEQ ID NO:64を含む。一部の態様において、前記作用物質(例えば、ポリペプチド)は3コピーのSEQ ID NO:64を含む。一部の態様において、前記作用物質(例えば、ポリペプチド)はSEQ ID NO:5を含む。一部の態様において、前記作用物質(例えば、ポリペプチド)はSEQ ID NO:66を含む。一部の態様において、前記作用物質は融合ポリペプチドまたは融合タンパク質である。一部の態様において、融合タンパク質は非GITRLポリペプチド(すなわち、異種タンパク質)を含む。一部の態様において、融合ポリペプチドはFc領域を含む。一部の態様において、非GITRLポリペプチドはFc領域を含む。一部の態様において、Fc領域は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4免疫グロブリンに由来する。一部の態様において、Fc領域は、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、およびSEQ ID NO:14からなる群より選択される。一部の態様において、非GITRLポリペプチドは免疫グロブリン重鎖を含む。一部の態様において、免疫グロブリン重鎖は免疫グロブリン軽鎖と会合する。一部の態様において、免疫グロブリン重鎖および軽鎖は抗原結合部位を形成する。一部の態様において、非GITRLポリペプチドは単鎖抗体またはFabを含む。
【００１７】
一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドは、SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:7を含む。一部の態様において、前記作用物質は、ATCCに寄託されかつ指定番号PTA-122112が付与されたhGITRL-hIgG1プラスミドによってコードされるポリペプチドを含む。一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドは、SEQ ID NO:8またはSEQ ID NO:9を含む。
【００１８】
さらなる局面において、本発明は、SEQ ID NO:5またはSEQ ID NO:66と少なくとも約90％の配列同一性を有するポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドを含むポリペプチドまたは作用物質を提供する。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:5またはSEQ ID NO:66からなるポリペプチドを含む。
【００１９】
さらなる局面において、本発明は、OX40(TNFRSF4)に結合するポリペプチドおよび作用物質を提供する。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はヒトOX40に結合する。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はマウスOX40に結合する。一部の態様において、前記作用物質はポリペプチドである。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は可溶性タンパク質である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、ヒトOX40に結合する可溶性タンパク質である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は融合ポリペプチドである。一部の態様において、前記作用物質(例えば、ポリペプチド)は、少なくとも1コピーのOX40L(TNFSF4)細胞外ドメインまたはそのOX40結合断片を含む。一部の態様において、前記作用物質(例えば、ポリペプチド)は、少なくとも1コピーのヒトOX40L細胞外ドメインまたはその断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも1コピーのマウスOX40L細胞外ドメインまたはその断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも、ヒトOX40L細胞外ドメインの第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドである。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも、ヒトOX40L細胞外ドメインの第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、細胞外ドメインのうち少なくとも1つはOX40Lの「ストーク領域」を含む。一部の態様において、OX40Lのストーク領域はQVSHRYP(SEQ ID NO:55)である。一部の態様において、OX40Lのストーク領域は、ALQVSHRYP(SEQ ID NO:74)、SHRYP(SEQ ID NO:75)、またはHRYP(SEQ ID NO:76)を含むが、これらに限定されない変種である。本明細書で使用する変種ストーク領域はOX40Lのアミノ酸配列からなる。すなわち、これらの変種ストーク領域は外因性リンカーなどの外因性アミノ酸を全く含まない。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、ヒトOX40L細胞外ドメインの第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、それぞれの細胞外ドメインはOX40Lの「ストーク領域」または変種ストーク領域を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、ヒトOX40L細胞外ドメインの第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、第2の細胞外ドメインおよび第3の細胞外ドメインはOX40Lの「ストーク領域」または変種ストーク領域を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも、ヒトOX40L細胞外ドメインまたはそのOX40結合断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、前記ポリペプチドはペプチドリンカーを全く含まない。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、ヒトOX40L細胞外ドメインまたはそのOX-40結合断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、前記ポリペプチドは、ヒトOX40L細胞外ドメインまたはそのOX40結合断片の第1のコピーと第2のコピーとの間に外因性ペプチドリンカーを含まない。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、ヒトOX40L細胞外ドメインまたはそのOX40結合断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、前記ポリペ��チドは、ヒトOX40L細胞外ドメインまたはそのOX40結合断片の第2のコピーと第3のコピーとの間に外因性ペプチドリンカーを含まない。
【００２０】
一部の態様において、前記作用物質(例えば、ポリペプチド)はヒトOX40Lのおおよそアミノ酸50〜183を含む。一部の態様において、前記作用物質(例えば、ポリペプチド)は、ヒトOX40Lのおおよそアミノ酸51〜183を含む。一部の態様において、前記作用物質(例えば、ポリペプチド)はヒトOX40Lのおおよそアミノ酸53〜183を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はヒトOX40Lのおおよそアミノ酸50〜183、51〜183、または53〜183を含み、ヒトOX40Lの配列はUniProt No.P23510である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも1コピーのSEQ ID NO:42またはその断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも2コピーのSEQ ID NO:42またはその断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は3コピーのSEQ ID NO:42を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも1コピーのSEQ ID NO:67またはその断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも2コピーのSEQ ID NO:67またはその断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は3コピーのSEQ ID NO:67を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも1コピーのSEQ ID NO:78またはその断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも2コピーのSEQ ID NO:78またはその断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は3コピーのSEQ ID NO:78を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも1コピーのSEQ ID NO:77またはその断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも2コピーのSEQ ID NO:77またはその断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は3コピーのSEQ ID NO:77を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも1コピーのSEQ ID NO:79またはその断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも2コピーのSEQ ID NO:79またはその断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は3コピーのSEQ ID NO:79を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:44を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:69を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:70を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:71を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:72を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は融合ポリペプチドまたは融合タンパク質である。一部の態様において、融合タンパク質は非OX40Lポリペプチド(すなわち、異種タンパク質)を含む。一部の態様において、融合ポリペプチドはFc領域を含む。一部の態様において、非OX40LポリペプチドはFc領域を含む。一部の態様において、Fc領域は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4免疫グロブリンに由来する。一部の態様において、Fc領域は、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、およびSEQ ID NO:14からなる群より選択される。一部の態様において、非OX40Lポリペプチドは免疫グロブリン重鎖を含む。一部の態様において、免疫グロブ���ン重鎖は免疫グロブリン軽鎖と会合する。一部の態様において、免疫グロブリン重鎖および軽鎖は抗原結合部位を形成する。一部の態様において、非OX40Lポリペプチドは単鎖抗体またはFabを含む。
【００２１】
一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドはSEQ ID NO:45またはSEQ ID NO:46を含む。一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドはSEQ ID NO:47またはSEQ ID NO:48を含む。一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドはSEQ ID NO:80またはSEQ ID NO:81を含む。
【００２２】
さらなる局面において、本発明は、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、またはSEQ ID NO:72と少なくとも約90％の配列同一性を有するポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドを含むポリペプチドまたはポリペプチドまたは作用物質を提供する。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、またはSEQ ID NO:72からなるポリペプチドを含む。
【００２３】
さらなる局面において、本発明は、CD40(TNFRSF5)に結合するポリペプチドおよび作用物質を提供する。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はヒトCD40に結合する。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はマウスCD40に結合する。一部の態様において、前記作用物質はポリペプチドである。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は可溶性タンパク質である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、ヒトCD40に結合する可溶性タンパク質である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は融合ポリペプチドである。一部の態様において、前記作用物質(例えば、ポリペプチド)は、少なくとも1コピーのCD40L(TNFSF5)細胞外ドメインまたはそのCD40結合断片を含む。一部の態様において、前記作用物質(例えば、ポリペプチド)は、少なくとも1コピーのヒトCD40L細胞外ドメインまたはその断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも1コピーのマウスCD40L細胞外ドメインまたはその断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも、ヒトCD40L細胞外ドメインの第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドである。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも、ヒトCD40L細胞外ドメインの第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、細胞外ドメインのうち少なくとも1つはCD40Lの「ストーク領域」を含む。CD40Lのストーク領域は他のTNFSFメンバー(すなわち、GITRLおよびOX40L)の一部と比較して非常に長い。従って、一部の態様において、ヒトCD40L細胞外ドメインはストーク領域の短い断片しか含まない。一部の態様において、ストーク領域は約4〜20個のアミノ酸を含む。一部の態様において、ストーク領域は約4〜10個のアミノ酸を含む。一部の態様において、ストーク領域は、TNF相同性ドメインの上流にあるアミノ酸(例えば、4〜10個のアミノ酸)を含む。一部の態様において、ストーク領域は、TNF相同性ドメインに隣接するアミノ酸(例えば、4〜10個のアミノ酸)を含む。一部の態様において、CD40Lのストーク領域の断片はMQKGDQ(SEQ ID NO:98)である。一部の態様において、CD40Lのストーク領域の断片は、FEMQKGDQ(SEQ ID NO:99)、EMQKGDQ(SEQ ID NO:100)、QKGDQ(SEQ ID NO:101)、またはKGDQ(SEQ ID NO:102)である。本明細書で使用するストーク領域はCD40Lのアミノ酸配列からなる。すなわち、これらのストーク領域は外因性リンカーなどの外因性アミノ酸を全く含まない。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、ヒトCD40L細胞外ドメインの第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、それぞれの細胞外ドメインはCD40Lのストーク領域の断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、ヒトCD40L細胞外ドメインの第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、第2の細胞外ドメインおよび第3の細胞外ドメインはCD40Lのストーク領域の断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも、ヒトCD40LまたはそのCD40結合断片の細胞外ドメインの第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、前記ポリペプチドはペプチドリンカーを全く含まない。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、ヒトCD40L細胞外ドメインまたはそのCD40結合断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、前記ポリペプチドは、ヒトCD40L細胞外ドメインまたはそのCD40結合断片の第1のコピーと第2のコピーとの間に外因性ペプチドリンカーを含まない。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、ヒトCD40L細胞外ドメインまたはそのCD40結合断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、前記ポリペプチドは、ヒトCD40L細胞外ドメインまたはそのCD40結合断片の第2のコピーと第3のコピーとの間に外因性ペプチドリンカーを含まない。
【００２４】
一部の態様において、前記作用物質(例えば、ポリペプチド)は、ヒトCD40Lのおおよそアミノ酸113〜261を含む。一部の態様において、前記作用物質(例えば、ポリペプチド)は、ヒトCD40Lのおおよそアミノ酸111〜261を含む。一部の態様において、前記作用物質(例えば、ポリペプチド)は、ヒトCD40Lのおおよそアミノ酸112〜261を含む。一部の態様において、前記作用物質(例えば、ポリペプチド)は、ヒトCD40Lのおおよそアミノ酸114〜261を含む。一部の態様において、前記作用物質(例えば、ポリペプチド)は、ヒトCD40Lのおおよそアミノ酸115〜261を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、ヒトCD40Lのおおよそアミノ酸113〜261、111〜261、112〜261、114〜261、または115〜261を含み、ヒトCD40Lの配列はUniProt No.P29965である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも1コピーのSEQ ID NO:84またはその断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも2コピーのSEQ ID NO:84またはその断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は3コピーのSEQ ID NO:84を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも1コピーのSEQ ID NO:103またはその断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも2コピーのSEQ ID NO:103またはその断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は3コピーのSEQ ID NO:103を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも1コピーのSEQ ID NO:104またはその断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも2コピーのSEQ ID NO:104またはその断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は3コピーのSEQ ID NO:104を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも1コピーのSEQ ID NO:105またはその断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも2コピーのSEQ ID NO:105またはその断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は3コピーのSEQ ID NO:105を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも1コピーのSEQ ID NO:106またはその断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも2コピーのSEQ ID NO:106またはその断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は3コピーのSEQ ID NO:106を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:85を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:97を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は融合ポリペプチドまたは融合タンパク質である。一部の態様において、融合タンパク質は非CD40Lポリペプチド(すなわち、異種タンパク質)を含む。一部の態様において、融合ポリペプチドはFc領域を含む。一部の態様において、非CD40LポリペプチドはFc領域を含む。一部の態様において、Fc領域は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4免疫グロブリンに由来する。一部の態様において、Fc領域は、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、およびSEQ ID NO:14からなる群より選択される。一部の態様において、非CD40Lポリペプチドは免疫グロブリン重鎖を含む。一部の��様において、免疫グロブリン重鎖は免疫グロブリン軽鎖と会合する。一部の態様において、免疫グロブリン重鎖および軽鎖は抗原結合部位を形成する。一部の態様において、非CD40Lポリペプチドは単鎖抗体またはFabを含む。
【００２５】
一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドはSEQ ID NO:89またはSEQ ID NO:90を含む。一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドはSEQ ID NO:91またはSEQ ID NO:92を含む。
【００２６】
さらなる局面において、本発明は、SEQ ID NO:85またはSEQ ID NO:97と少なくとも約90％の配列同一性を有するポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドを含むポリペプチドまたは作用物質ポリペプチドを提供する。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:85またはSEQ ID NO:97からなるポリペプチドを含む。
【００２７】
上述の局面および態様ならびに本明細書に記載の他の局面および態様のそれぞれの一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドは一価である。一部の態様において、前記作用物質は二価である。一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドは単一特異性である。一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドは二重特異性である。
【００２８】
上述の局面および態様ならびに本明細書に記載の他の局面および態様のそれぞれの一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドは二重特異性作用物質である。一部の態様において、二重特異性作用物質はホモ二量体タンパク質である。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質は、重鎖免疫グロブリンおよびTNFSF三量体を含むポリペプチドを含む。一部の態様において、重鎖免疫グロブリンは軽鎖と会合して抗原結合部位を形成する。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質は、抗体および単鎖TNFSF三量体を含むポリペプチドを含む。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質は、抗体および単鎖GITRL三量体を含むポリペプチドを含む。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質は、抗体および単鎖OX40L三量体を含むポリペプチドを含む。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質は、抗体および単鎖CD40L三量体を含むポリペプチドを含む。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質は、腫瘍抗原に特異的に結合する抗体を含む。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質は、PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、またはTIM3に特異的に結合する抗体を含む。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質はGITRおよびPD-1に結合する。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質はGITRおよびPD-L1に結合する。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質はOX40およびPD-1に結合する。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質はOX40およびPD-L1に結合する。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質はCD40およびPD-1に結合する。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質はCD40およびPD-L1に結合する。
【００２９】
上述の局面および態様ならびに本明細書に記載の他の局面および態様のそれぞれの一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドはヘテロ二量体二重特異性作用物質である。一部の態様において、二重特異性作用物質は、TNFRスーパーファミリーのメンバーに結合する第1のアームと、第2の標的に結合する第2のアームとを含む。一部の態様において、二重特異性作用物質は、GITRに結合する第1のアームと、第2の標的に結合する第2のアームとを含む。一部の態様において、二重特異性作用物質は、OX40に結合する第1のアームと、第2の標的に結合する第2のアームとを含む。一部の態様において、二重特異性作用物質は、CD40に結合する第1のアームと、第2の標的に結合する第2のアームとを含む。一部の態様において、二重特異性作用物質は、GITRに結合する第1のアームと、抗体に由来する抗原結合部位を含む第2のアームとを含む。一部の態様において、二重特異性作用物質は、OX40に結合する第1のアームと、抗体に由来する抗原結合部位を含む第2のアームとを含む。一部の態様において、二重特異性作用物質は、CD40に結合する第1のアームと、抗体に由来する抗原結合部位を含む第2のアームとを含む。一部の態様において、二重特異性作用物質は、抗原結合部位が腫瘍抗原に特異的に結合する第2のアームを含む。一部の態様において、二重特異性作用物質は、抗原結合部位が、PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、またはTIM3に特異的に結合する第2のアームを含む。一部の態様において、二重特異性作用物質は、GITRに結合する第1のアームと、免疫応答刺激作用物質を含む第2のアームとを含む。一部の態様において、二重特異性作用物質は、OX40に結合する第1のアームと、免疫応答刺激作用物質を含む第2のアームとを含む。一部の態様において、二重特異性作用物質は、CD40に結合する第1のアームと、免疫応答刺激作用物質を含む第2のアームとを含む。一部の態様において、免疫応答刺激作用物質は標的のアゴニストでもよい。一部の態様において、免疫応答刺激作用物質は標的のアンタゴニストでもよい。一部の態様において、免疫応答刺激作用物質は、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、インターロイキン3(IL-3)、インターロイキン12(IL-12)、インターロイキン1(IL-1)、インターロイキン2(IL-2)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、4-1BBリガンド、抗CD3抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIGIT抗体、抗PD1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG-3抗体、および抗TIM-3抗体からなる群より選択される。
【００３０】
一部の態様において、二重特異性作用物質は2つのアームを含み、それぞれのアームはヒトCH3ドメインを含み、それぞれのCH3ドメインはヘテロ二量体の形成を促進するように改変されている。一部の態様において、第1のCH3ドメインおよび第2のCH3ドメインは、ノブ-イントゥー-ホール(knob-into-hole)法を用いて改変されている。一部の態様において、第1のCD3ドメインおよび第2のCD3ドメインは静電効果に基づいて改変されている。一部の態様において、二重特異性作用物質は2つのアームを含み、第1のアームは、SEQ ID NO:15の位置253および292に対応する位置にアミノ酸置換を有する第1のヒトIgG1定常領域を含み、前記アミノ酸はグルタミン酸またはアスパラギン酸と交換され、第2のアームは、SEQ ID NO:15の位置240および282に対応する位置にアミノ酸置換を有する第2のヒトIgG1定常領域を含み、前記アミノ酸はリジンと交換される。一部の態様において、2つのアームは、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、およびSEQ ID NO:61からなる群より選択されるFc領域を含む。一部の態様において、二重特異性作用物質は2つのアームを含み、第1のアームは、SEQ ID NO:16の位置249および288に対応する位置にアミノ酸置換を有する第1のヒトIgG2定常領域を含み、前記アミノ酸はグルタミン酸またはアスパラギン酸と交換され、第2のアームは、SEQ ID NO:16の位置236および278に対応する位置にアミノ酸置換を有する第2のヒトIgG2定常領域を含み、前記アミノ酸はリジンと交換される。一部の態様において、2つのアームは、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、およびSEQ ID NO:31からなる群より選択されるFc領域を含む。
【００３１】
上述の局面および態様ならびに本明細書に記載の他の局面および態様のそれぞれの一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドは免疫応答を誘導し、活性化し、促進し、増大させ、亢進させ、かつ/または延長する。一部の態様において、前記作用物質はTh1型免疫応答を増大させる。一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドは細胞性免疫を増大させる。一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドはT細胞活性を増大させる。一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドは細胞溶解性T細胞(CTL)活性を増大させる.一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドはナチュラルキラー(NK)細胞活性を増大させる。一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドは調節性T細胞(Treg)活性を減少させる。一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドは骨髄由来抑制性細胞(MDSC)活性を減少させる。一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドは記憶T細胞の数またはパーセントを増加させる。一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドは重大な副作用および/または免疫に基づく毒性を引き起こすことなく有効な免疫応答を増大または亢進させる。一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドはサイトカイン放出症候群(CRS)もサイトカインストームも引き起こすことなく有効な免疫応答を増大または亢進させる。一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドはGITRLを介したシグナル伝達のアゴニストである。一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドはGITRシグナル伝達のアゴニストである。一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドは、OX40Lを介したシグナル伝達のアゴニストである。一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドはOX40シグナル伝達のアゴニストである。一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドはCD40Lを介したシグナル伝達のアゴニストである。一部の態様において、前記作用物質またはポリペプチドはCD40シグナル伝達のアゴニストである。
【００３２】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を含む組成物を提供する。本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を含む組成物を使用する方法も提供される。
【００３３】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。有効量の、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を含む組成物を対象に投与する工程を含む、対象(例えば、ヒト)においてがんを処置する方法および/または腫瘍成長を阻害する方法も提供される。有効量の、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を含む組成物を対象に投与する工程を含む、対象(例えば、ヒト)においてウイルス感染を処置する方法も提供される。
【００３４】
上述の局面ならびに本明細書の他の場所に記載の他の局面および/または態様のそれぞれの、ある特定の態様において、前記作用物質またはポリペプチドは単離されている。ある特定の態様において、前記作用物質またはポリペプチドは実質的に純粋である。
【００３５】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。一部の態様において、前記ポリヌクレオチドは単離されている。一部の態様において、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに前記ベクターおよび/または前記ポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。一部の態様において、本発明はまた、本明細書に記載のポリペプチドもしくは作用物質を含む細胞、または本明細書に記載のポリペプチドもしくは作用物質を産生する細胞を提供する。一部の態様において、前記細胞はモノクローナル細胞株である。
【００３６】
別の局面において、本発明は、対象の免疫応答を調整する方法を提供する。一部の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を投与する工程を含む、対象において免疫応答を誘導する方法を提供する。一部の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を投与する工程を含む、対象において免疫応答を活性化する方法を提供する。一部の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を投与する工程を含む、対象において免疫応答を促進する方法を提供する。一部の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を投与する工程を含む、対象において免疫応答を増大させる方法を提供する。一部の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を投与する工程を含む、対象において免疫応答を亢進させる方法を提供する。一部の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を投与する工程を含む、対象において免疫応答を延長する方法を提供する。一部の態様において、免疫応答は、抗原性刺激に対する免疫応答である。一部の態様において、抗原性刺激は腫瘍または腫瘍細胞である。一部の態様において、抗原性刺激は病原体である。一部の態様において、抗原性刺激はウイルスである。一部の態様において、抗原性刺激はウイルス感染細胞である。
【００３７】
一部の態様において、本発明は、免疫細胞の活性を増大させる方法を提供する。一部の態様において、本発明は、細胞を、有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質と接触させる工程を含む、免疫細胞の活性を増大させる方法を提供する。一部の態様において、免疫細胞は、T細胞、NK細胞、単球、マクロファージ、抗原提示細胞(APC)、および/またはB細胞である。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む、対象においてNK細胞の活性を増大させる方法を提供する。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む、対象においてT細胞の活性を増大させる方法を提供する。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む、対象においてCD4+ T細胞および/またはCD8+T細胞の活性を増大させる方法を提供する。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む、対象においてCTLの活性を増大させる方法を提供する。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む、対象においてT細胞、CTL、および/またはNK細胞の活性化を増大させる方法を提供する。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む、対象においてT細胞応答を増大させる方法を提供する。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む、対象においてTregの活性を阻害する方法を提供する。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む、対象においてTregの抑制活性を阻害する方法を提供する。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む、対象においてMDSCの活性を阻害する方法を提供する。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む、対象においてMDSCの抑制活性を阻害する方法を提供する。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む、重大な副作用および/もしくは免疫に基づく毒性を引き起こすことなく対象において免疫応答を誘導する方法を提供する。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む、サイトカイン放出症候群もサイトカインストームも引き起こすことなく、対象において免疫応答を誘導する方法を提供する。
【００３８】
別の局面において、本発明は、対象において免疫応答を誘導するか、活性化するか、促進するか、増大させるか、亢進させるか、または延長する方法を提供する。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む、対象において免疫応答を誘導するか、活性化するか、促進するか、増大させるか、亢進させるか、または延長する方法を提供する。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の、ヒトGITRに結合するポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む、対象において免疫応答を誘導するか、活性化するか、促進するか、増大させるか、亢進させるか、または延長する方法を提供する。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の、GITRシグナル伝達を活性化するかまたは亢進させるポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む、対象において免疫応答を誘導するか、活性化するか、促進するか、増大させるか、亢進させるか、または延長する方法を提供する。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の、ヒトOX40に結合するポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む、対象において免疫応答を誘導するか、活性化するか、促進するか、増大させるか、亢進させるか、または延長する方法を提供する。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の、OX40シグナル伝達を活性化するかまたは亢進させるポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む、対象において免疫応答を誘導するか、活性化するか、促進するか、増大させるか、亢進させるか、または延長する方法を提供する。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の、ヒトCD40に結合するポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む、対象において免疫応答を誘導するか、活性化するか、促進するか、増大させるか、亢進させるか、または延長する方法を提供する。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の、CD40シグナル伝達を活性化するかまたは亢進させるポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む、対象において免疫応答を誘導するか、活性化するか、促進するか、増大させるか、亢進させるか、または延長する方法を提供する。一部の態様において、免疫応答は、腫瘍細胞、腫瘍、またはがんに対する免疫応答である。一部の態様において、免疫応答は、ウイルス感染、ウイルス抗原、またはウイルス感染細胞に対する免疫応答である。
【００３９】
一部の態様において、本発明は、治療的有効量の、ヒト腫瘍壊死因子受容体リガンドスーパーファミリー(TNFSF)タンパク質の受容体に結合することができるTNFSFタンパク質の細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含むポリペプチドを対象に投与する工程を含む、対象においてT細胞活性を増大させる方法を提供する。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の、ヒトTNFSFタンパク質の受容体に結合することができるTNFSFタンパク質の細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含むポリペプチドを、対象に投与する工程を含む、対象においてCTL活性を増大させる方法を提供する。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の、ヒトTNFSFタンパク質の受容体に結合することができるTNFSFタンパク質の細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含むポリペプチドを、対象に投与する工程を含む、対象においてNK活性を増大させる方法を提供する。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の、ヒトTNFSFタンパク質の受容体に結合することができるTNFSFタンパク質の細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含むポリペプチドを、対象に投与する工程を含む、対象においてTreg活性を減少させるか、または阻害する方法を提供する。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の、ヒトTNFSFタンパク質の受容体に結合することができるTNFSFタンパク質の細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含むポリペプチドを、対象に投与する工程を含む、対象においてMDSC活性を減少させるか、または阻害する方法を提供する。一部の態様において、TNFSFタンパク質はGITRLである。一部の態様において、TNFSFタンパク質はOX40Lである。一部の態様において、TNFSFタンパク質はCD40Lである。本明細書に記載の方法の一部の態様において、対象はがんを有する。
【００４０】
一部の態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載の任意のポリペプチド、作用物質、および/または二重特異性作用物質を対象に投与する工程を含む、対象においてT細胞活性を増大させる方法を提供する。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載の任意のポリペプチド、作用物質、および/または二重特異性作用物質のポリペプチドを対象に投与する工程を含む、対象においてCTL活性を増大させる方を提供する。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載の任意のポリペプチド、作用物質、および/または二重特異性作用物質のポリペプチドを対象に投与する工程を含む、対象においてNK活性を増大させる方法を提供する。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載の任意のポリペプチド、作用物質、および/または二重特異性作用物質を対象に投与する工程を含む、対象においてTreg活性を減少させるかまたは阻害する方法を提供する。一部の態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載の任意のポリペプチド、作用物質、および/または二重特異性作用物質のポリペプチドを対象に投与する工程を含む、対象においてMDSC活性を減少させるかまたは阻害する方法を提供する。本明細書に記載の方法の一部の態様において、対象はがんを有する。
【００４１】
別の局面において、本発明は、腫瘍に対する抗原特異的記憶応答を亢進させる方法を提供する。一部の態様において、腫瘍に対する抗原特異的記憶応答を亢進させる方法は、治療的有効量の本明細書に記載の任意のポリペプチド、作用物質、および/または二重特異性作用物質を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、腫瘍に対する抗原特異的記憶応答を亢進させる方法は、治療的有効量の、ヒトTNFSFタンパク質の受容体に結合することができるTNFSFタンパク質の細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含むポリペプチドを、対象に投与する工程を含む。一部の態様において、TNFSFタンパク質はGITRLである。一部の態様において、TNFSFタンパク質はOX40Lである。一部の態様において、TNFSFタンパク質はCD40Lである。
【００４２】
別の局面において、本発明は、腫瘍に対する持続性または長期の免疫応答を活性化するかまたは亢進させる方法を提供する。一部の態様において、腫瘍に対する持続性の免疫応答を活性化するかまたは亢進させる方法は、治療的有効量の本明細書に記載の任意のポリペプチド、作用物質、および/または二重特異性作用物質を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、腫瘍に対する持続性の免疫応答を活性化するかまたは亢進させる方法は、治療的有効量の、ヒトTNFSFタンパク質の受容体に結合することができるTNFSFタンパク質の細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含むポリペプチドを、対象に投与する工程を含む。一部の態様において、TNFSFタンパク質はGITRLである。一部の態様において、TNFSFタンパク質はOX40Lである。一部の態様において、TNFSFタンパク質はCD40Lである。
【００４３】
別の局面において、本発明は、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する持続性または長期の免疫を誘導する方法を提供する。一部の態様において、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する持続性の免疫を誘導する方法は、治療的有効量の本明細書に記載の任意のポリペプチド、作用物質、および/または二重特異性作用物質を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する持続性の免疫を誘導する方法は、治療的有効量の、ヒトTNFSFタンパク質の受容体に結合することができるTNFSFタンパク質の細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含むポリペプチドを、対象に投与する工程を含む。一部の態様において、TNFSFタンパク質はGITRLである。一部の態様において、TNFSFタンパク質はOX40Lである。一部の態様において、TNFSFタンパク質はCD40Lである。
【００４４】
別の局面において、本発明は、腫瘍または腫瘍細胞を、有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質と接触させる工程を含む、腫瘍成長を阻害する方法を提供する。一部の態様において、腫瘍の成長を阻害する方法は、腫瘍または腫瘍細胞を、有効量の、ヒトGITRに結合するポリペプチドまたは作用物質と接触させる工程を含む。一部の態様において、腫瘍の成長を阻害する方法は、腫瘍または腫瘍細胞を、有効量の、ヒトOX40に結合するポリペプチドまたは作用物質と接触させる工程を含む。一部の態様において、腫瘍の成長を阻害する方法は、腫瘍または腫瘍細胞を、有効量の、ヒトCD40に結合するポリペプチドまたは作用物質と接触させる工程を含む。一部の態様において、腫瘍の成長を阻害する方法は、腫瘍微小環境を、有効量の、ヒトGITRに結合するポリペプチドまたは作用物質と接触させる工程を含む。一部の態様において、腫瘍の成長を阻害する方法は、腫瘍微小環境を、有効量の、ヒトOX40に結合するポリペプチドまたは作用物質と接触させる工程を含む。一部の態様において、腫瘍の成長を阻害する方法は、腫瘍微小環境を、有効量の、ヒトCD40に結合するポリペプチドまたは作用物質と接触させる工程を含む。
【００４５】
別の局面において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む、対象において腫瘍成長を阻害する方法を提供する。一部の態様において、対象において腫瘍の成長を阻害する方法は、治療的有効量の、ヒトGITRに結合するポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、対象において腫瘍の成長を阻害する方法は、治療的有効量の、ヒトOX40に結合するポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、対象において腫瘍の成長を阻害する方法は、治療的有効量の、ヒトCD40に結合するポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む。
【００４６】
別の局面において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む、対象においてがんを処置する方法を提供する。一部の態様において、対象においてがんを処置する方法は、治療的有効量の、GITRに結合するポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、対象においてがんを処置する方法は、治療的有効量の、OX40に結合するポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、対象においてがんを処置する方法は、治療的有効量の、CD40に結合するポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む。
【００４７】
別の局面において、本発明は、関心対象の抗原と組み合わせて、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む、対象において防御応答を刺激する方法を提供する。一部の態様において、関心対象の抗原は腫瘍抗原または腫瘍関連抗原(TAA)である。一部の態様において、関心対象の抗原はがん細胞バイオマーカーである。一部の態様において、関心対象の抗原はがん幹細胞マーカーである。
【００４８】
上述の局面および態様ならびに本明細書に記載の他の局面および態様のそれぞれの一部の態様において、前記方法は、少なくとも1種類のさらなる治療用物質を対象に投与する工程をさらに含む。一部の態様において、少なくとも1種類のさらなる治療用物質は化学療法剤である。一部の態様において、少なくとも1種類のさらなる治療用物質は第2の免疫応答刺激作用物質である。一部の態様において、少なくとも1種類のさらなる治療用物質はチェックポイント阻害物質である。一部の態様において、免疫応答刺激作用物質は、GM-CSF、M-CSF、G-CSF、IL-3、IL-12、IL-1、IL-2、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、4-1BBリガンド、抗CD3抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIGIT抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG-3抗体、および抗TIM-3抗体からなる群より選択される。一部の態様において、さらなる治療用物質は抗PD-1抗体である。一部の態様において、さらなる治療用物質は抗PD-L1抗体である。
【００４９】
本発明の局面または態様がマーカッシュグループまたは代替物の他のグループで説明された場合、本発明は、列挙されたグループ全体を全体として含むだけでなく、グループの各メンバーも個々に含み、メイングループの可能性のある全てのサブグループも含み、グループメンバーの1つまたは複数が存在しないメイングループも含む。本発明はまた、本発明において任意のグループメンバーの1つまたは複数の明確な除外も想定する。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１−１】(図1A)ヒトGITRLの膜アンカー三量体トポロジーを図示した代表的な図を示した。(図1B)ヒトGITRLのアミノ酸配列を示した(SEQ ID NO:1)。細胞質領域、シグナル-アンカー領域、および細胞外ドメインに印を付けた。細胞外ドメイン内にある「ストーク領域」に下線を引いた。
【図１−２】(図1C)天然GITRLの模式図。(図1D)GITRLのシグナル-アンカー領域と3コピーのGITRL細胞外ドメインを含む膜結合型単鎖GITRL三量体の模式図。(図1E)3コピーのGITRL細胞外ドメインを含む可溶性単鎖GITRL三量体の模式図。(図1F)Fc領域と連結した3コピーのGITRL細胞外ドメインを含む可溶性単鎖GITRL三量体-Fc融合ポリペプチドの模式図。
【図２】膜結合型単鎖GITRL三量体および可溶性GITRのFACS分析。HEK293細胞に、膜結合型単鎖ヒトGITRL三量体をコードする発現ベクターと、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする第2の発現ベクターとを一過的にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を可溶性ヒトGITR-Fc融合タンパク質とインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。FACSプロットの挿入した四角い枠の中にある細胞を観察することによって、陽性結合が判定された。
【図３】1つまたは複数の単鎖GITRL三量体を含有する、提案された分子の一部の模式図。これらの図は、1つまたは複数の単鎖TNFSFリガンド三量体を含有する、さらなる提案された分子を表す。
【図４】膜結合型GITRおよび可溶性単鎖GITRL三量体-Fc融合ポリペプチドのFACS分析。HEK293細胞に、完全長マウスGITRおよびGFPをコードする発現ベクターを一過的にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、マウスGITRL融合ポリペプチド336B1、336B2、336B3、336B4、336B6、336B10、非GITRL融合ポリペプチド336B5、および抗GITR抗体DTA-1とインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。FACSプロットの挿入した四角い枠の中にある細胞を観察することによって、陽性結合が判定された。
【図５】マウスGITRL三量体およびヒトGITRL三量体融合ポリペプチドとGITRとの結合の用量反応。マウスIgG2a Fcドメインを有する単鎖マウスGITRL三量体と、ヒトIgG1 Fcドメインを有する単鎖ヒトGITRL三量体のフローサイトメトリー結合分析を示した。HEK293細胞に、ヒトまたはマウスいずれかのGITRおよびGFPをコードする発現ベクターを一過的にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、示された融合タンパク質とインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。FACSプロットの挿入した四角い枠の中にある細胞を観察することによって、陽性結合が判定された。
【図６】GITRシグナル伝達の活性化。単鎖mGITRL三量体-Fc融合タンパク質がmGITRシグナル伝達を活性化する能力の分析を示した。NF-κB-ルシフェラーゼレポーター遺伝子およびmGITR cDNAを安定にトランスフェクトしたHEK293細胞を96ウェルプレートにプレートし、単鎖マウスGITRL三量体-Fc融合336B3、単鎖マウスGITRL三量体-Fc融合336B6、抗mGITR抗体DTA-1、または対照抗体とインキュベートした。24時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。DTA-1はアゴニスト抗体であり、正の対照として含めた。
【図７】GITRシグナル伝達の活性化。単鎖hGITRL三量体-Fc融合タンパク質がhGITRシグナル伝達を活性化する能力の分析を示した。NF-κB-ルシフェラーゼレポーター遺伝子およびGITR cDNAを安定にトランスフェクトしたHEK293細胞を96ウェルプレートにプレートし、単鎖ヒトGITRL三量体-Fc融合336B11とインキュベートした。24時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。
【図８Ａ】単鎖GITRL三量体-Fc融合ポリペプチドによる腫瘍成長の阻害。マウス結腸腫瘍株CT26.WTをBalb/cマウスに皮下移植した(n=10マウス/群)。7日目、10日目、14日目、および17日目に、マウスに0.25mg/マウスの単鎖mGITRL三量体-Fc融合タンパク質336B3、抗mGITR抗体DTA-1、または対照抗体を注射した。腫瘍成長をモニタリングし、示された時点で、腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。データを、注射後、数日間にわたる腫瘍量(mm3)として示した。(図8A)各群の平均値±SEM。
【図８Ｂ】単鎖GITRL三量体-Fc融合ポリペプチドによる腫瘍成長の阻害。マウス結腸腫瘍株CT26.WTをBalb/cマウスに皮下移植した(n=10マウス/群)。7日目、10日目、14日目、および17日目に、マウスに0.25mg/マウスの単鎖mGITRL三量体-Fc融合タンパク質336B3、抗mGITR抗体DTA-1、または対照抗体を注射した。腫瘍成長をモニタリングし、示された時点で、腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。データを、注射後、数日間にわたる腫瘍量(mm3)として示した。(図8B)336B3で処置した群およびDTA-1で処置した群に由来するそれぞれの個々のマウスの腫瘍量。
【図９】IFN-γおよびIL-10を対象にしたエリスポットアッセイ。抗mGITR抗体DTA-1、mGITRL三量体-Fc 336B3、または対照で処置した、CT26.WT腫瘍を有するマウスの脾臓から細胞を収集した。(図9A)IFN-γを産生する細胞の数を示した。(図9B)IL-10を産生する細胞の数を示した。
【図１０】NK細胞の細胞傷害性アッセイ。抗mGITR抗体DTA-1、mGITRL三量体-Fc 336B3、または対照で処置した、CT26.WT腫瘍を有するマウスの脾臓から細胞を収集した。CT26.WT標的細胞を10μMカルセインAMで標識し、25:1のE:T比で脾細胞と混合した。上清を収集し、カルセイン放出を蛍光光度計によって485nmの励起および535nmの発光で定量した。
【図１１】調節性T細胞(Treg)アッセイ。ナイーブT細胞を未処置マウスの脾臓から精製した。これらの精製されたT細胞を5μMバイオレットトラッキングダイ(violet tracking dye)で標識した。細胞増殖を刺激するために、2×105個のVTD標識T細胞を、抗CD3抗体および抗CD28抗体でコーティングしたビーズとインキュベートした。mGITRL三量体-Fc 336B3、抗mGITR抗体DTA-1、または対照で処置した、CT26WT腫瘍を有するマウスの脾臓から、マウスTreg単離キットを用いてTregを単離した。T細胞増殖に及ぼすTregの影響を判定するために、刺激されたVTD標識T細胞(エフェクター)を、単離された脾臓Tregと1:0.5のエフェクター:Treg比で共培養した。4日目に細胞を洗浄し、抗マウスCD4抗体または抗マウスCD8抗体とインキュベートした。細胞を、BD FACSCanto II機器およびBD FACSDivaソフトウェアv6.1.3を用いたFACS分析によって評価した。
【図１２】骨髄由来抑制性細胞(MDSC)アッセイ。ナイーブT細胞を未処置マウスの脾臓から精製した。これらの精製されたT細胞を5μMバイオレットトラッキングダイで標識した。細胞増殖を刺激するために、2×105個のVTD標識T細胞を、抗CD3抗体および抗CD28抗体でコーティングしたビーズとインキュベートした。mGITRL三量体-Fc 336B3、抗mGITR抗体DTA-1、または対照で処置した、CT26.WT腫瘍を有するマウスの脾臓から、マウスMDSC単離キットを用いてMDSCを単離した。刺激されたVTD標識T細胞(エフェクター)を、単離された脾臓MDSCと1:1のエフェクター:MDSC比で共培養した。4日目に、細胞を洗浄し、抗マウスCD4抗体または抗マウスCD8抗体とインキュベートした。細胞を、BD FACSCanto II機器およびBD FACSDivaソフトウェアv6.1.3を用いたFACS分析によって評価した。
【図１３】単鎖GITRL三量体-Fc融合ポリペプチドによる腫瘍成長の阻害。Renca細胞をBalb/cマウスに皮下移植した(n=10マウス/群)。7日目、11日目、14日目に、マウスに0.25mg/マウスの単鎖mGITRL三量体-Fc融合タンパク質336B3、抗mGITR抗体DTA-1、または対照抗体を注射した。腫瘍成長をモニタリングし、示された時点で、腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。データを、注射後、数日間にわたる腫瘍量(mm3)として示した。
【図１４】細胞傷害性アッセイ。(図14A)ナチュラルキラー細胞活性。抗mGITR抗体DTA-1、mGITRL三量体-Fc 336B3、または対照で処置した、Renca腫瘍を有するマウスの脾臓から細胞を収集した。YAC-1標的細胞を10μMカルセインAMで標識し、25:1および50:1のE:T比で脾細胞と混合した。上清を収集し、カルセイン放出を蛍光光度計によって485nmの励起および535nmの発光で定量した。(図14B)T細胞の細胞傷害性アッセイ。抗mGITR抗体DTA-1、mGITRL三量体-Fc 336B3、または対照で処置した、Renca腫瘍を有するマウスの脾臓から細胞を収集した。Renca標的細胞を10μMカルセインAMで標識し、25:1のE:T比で脾細胞と混合した。上清を収集し、カルセイン放出を蛍光光度計によって485nmの励起および535nmの発光で定量した。
【図１５−１】単鎖GITRL三量体-Fc融合ポリペプチドによる腫瘍成長の阻害-用量研究。マウス結腸腫瘍株CT26.WTをBalb/cマウスに皮下移植した(n=10マウス/群)。マウスを30mg/kg、12.5mg/kg、6.25mg/kg、3mg/kg、もしくは0.5mg/kgのmGITRL三量体-Fc 336B3で処置したか、または処置しなかった。腹腔内注射によって合計6回投与するためにマウスに週2回投薬した。腫瘍成長をモニタリングし、示された時点で、腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。(図15A〜15D)各処置群内にいる個々のマウスの腫瘍量。
【図１５−２】単鎖GITRL三量体-Fc融合ポリペプチドによる腫瘍成長の阻害-用量研究。マウス結腸腫瘍株CT26.WTをBalb/cマウスに皮下移植した(n=10マウス/群)。マウスを30mg/kg、12.5mg/kg、6.25mg/kg、3mg/kg、もしくは0.5mg/kgのmGITRL三量体-Fc 336B3で処置したか、または処置しなかった。腹腔内注射によって合計6回投与するためにマウスに週2回投薬した。腫瘍成長をモニタリングし、示された時点で、腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。(図15Eおよび15F)各処置群内にいる個々のマウスの腫瘍量。(図15G)各処置群の平均腫瘍量。
【図１６−１】単鎖GITRL三量体-Fc融合ポリペプチドによる腫瘍成長の阻害-用量研究。マウス結腸腫瘍株CT26.WTをBalb/cマウスに皮下移植した(n=10マウス/群)。マウスを2.5mg/kgのmGITRL三量体-Fc 336B3、12.5mg/kgのmGITRL三量体-Fcで処置したか、または処置しなかった(n=10/群)。マウスを2.5mg/kgの単一用量で処置したか、2.5mg/kgで2週間に1回処置したか、2.5mg/kgで週1回処置したか、2.5mg/kgで週2回処置したか、または3回だけ投与するために12.5mg/kgで週2回処置した。(図16A〜16D)各処置群内にいる個々のマウスの腫瘍量。
【図１６−２】単鎖GITRL三量体-Fc融合ポリペプチドによる腫瘍成長の阻害-用量研究。マウス結腸腫瘍株CT26.WTをBalb/cマウスに皮下移植した(n=10マウス/群)。マウスを2.5mg/kgのmGITRL三量体-Fc 336B3、12.5mg/kgのmGITRL三量体-Fcで処置したか、または処置しなかった(n=10/群)。マウスを2.5mg/kgの単一用量で処置したか、2.5mg/kgで2週間に1回処置したか、2.5mg/kgで週1回処置したか、2.5mg/kgで週2回処置したか、または3回だけ投与するために12.5mg/kgで週2回処置した。(図16Eおよび16F)各処置群内にいる個々のマウスの腫瘍量。(図16G)各処置群の平均腫瘍量。
【図１７−１】免疫細胞枯渇マウスにおける単鎖GITRL三量体-Fcタンパク質によるインビボ腫瘍成長の阻害。特定の細胞集団をインビボ枯渇させるために、腫瘍細胞を移植する2日前および1日前に、Balb/cマウスに抗CD4抗体(500ug/用量)、抗CD8抗体(500ug/用量)、抗CD4抗体と抗CD8抗体の組み合わせ(それぞれ500ug/用量)、抗アシアロGM-1抗体(25ul)、または対照IgG2抗体(LFT-2;500ug/用量)を腹腔内注射し、次いで、移植して1日後および実験中に週2回、さらに注射した。細胞枯渇マウスに、マウス結腸腫瘍株CT26.WTを皮下移植した(30,000細胞/マウス)。マウスを0.25mg/マウスのmGITRL三量体-Fc 336B3または対照抗体で処置した(n=10/群)。腹腔内注射によってマウスに週2回投薬した。腫瘍成長をモニタリングし、示された時点で、腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。(図17A〜17D)各処置群内にいる個々のマウスの腫瘍量。
【図１７−２】免疫細胞枯渇マウスにおける単鎖GITRL三量体-Fcタンパク質によるインビボ腫瘍成長の阻害。特定の細胞集団をインビボ枯渇させるために、腫瘍細胞を移植する2日前および1日前に、Balb/cマウスに抗CD4抗体(500ug/用量)、抗CD8抗体(500ug/用量)、抗CD4抗体と抗CD8抗体の組み合わせ(それぞれ500ug/用量)、抗アシアロGM-1抗体(25ul)、または対照IgG2抗体(LFT-2;500ug/用量)を腹腔内注射し、次いで、移植して1日後および実験中に週2回、さらに注射した。細胞枯渇マウスに、マウス結腸腫瘍株CT26.WTを皮下移植した(30,000細胞/マウス)。マウスを0.25mg/マウスのmGITRL三量体-Fc 336B3または対照抗体で処置した(n=10/群)。腹腔内注射によってマウスに週2回投薬した。腫瘍成長をモニタリングし、示された時点で、腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。(図17E)各処置群内にいる個々のマウスの腫瘍量。(図17F)各処置群の平均腫瘍量。
【図１８】単鎖GITRL三量体-Fcタンパク質および抗PD-1抗体によるインビボ腫瘍成長の阻害。マウス腺がん細胞株RencaをBalb/cマウスに皮下移植した(細胞5×105個/マウス)。マウスを12.5mg/kgの単鎖mGITRL三量体-Fc 336B3、抗PD-1抗体、336B3と抗PD-1抗体の組み合わせ、または対照抗体で処置した(n=20/群)。腹腔内注射によって3回だけ投与するためにマウスに336B3を週2回投与し、抗PD-1抗体を3週間にわたって週2回投与した。腫瘍成長をモニタリングし、示された時点で、腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。(図18A〜18D)各処置群内にいる個々のマウスの腫瘍量。
【図１９−１】単鎖GITRL三量体-Fcタンパク質および抗PD-L1抗体によるインビボ腫瘍成長の阻害。マウス結腸腫瘍株CT26.WTをBalb/cマウスに皮下移植した(30,000細胞/マウス)。マウスを0.25mg/マウスの単鎖mGITRL三量体-Fc 336B3、抗PD-L1抗体、336B3と抗PD-L1抗体の組み合わせ、または対照抗体で処置した(n=10〜20/群)。腹腔内注射によって3回だけ投与するためにマウスに336B3を週2回投薬し、抗PD-L1抗体を3週間にわたって週2回投与した。腫瘍成長をモニタリングし、示された時点で、腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。図19A〜19D、各処置群内にいる個々のマウスの腫瘍量。
【図１９−２】単鎖GITRL三量体-Fcタンパク質および抗PD-L1抗体によるインビボ腫瘍成長の阻害。マウス結腸腫瘍株CT26.WTをBalb/cマウスに皮下移植した(30,000細胞/マウス)。マウスを0.25mg/マウスの単鎖mGITRL三量体-Fc 336B3、抗PD-L1抗体、336B3と抗PD-L1抗体の組み合わせ、または対照抗体で処置した(n=10〜20/群)。腹腔内注射によって3回だけ投与するためにマウスに336B3を週2回投薬し、抗PD-L1抗体を3週間にわたって週2回投与した。腫瘍成長をモニタリングし、示された時点で、腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。図19E、CT26.WT細胞を用いた再曝露後の腫瘍成長。
【図２０−１】単鎖GITRL三量体-Fcタンパク質および抗PD-1抗体によるインビボ腫瘍成長の阻害。マウスメラノーマ細胞株B16-F10細胞をC57BL/6マウスに皮下移植した(5000細胞/マウス)。マウスを5mg/kgの単鎖mGITRL三量体-Fc 336B3、10mg/kgの抗mPD-1抗体、336B3と抗mPD-1抗体の組み合わせ、または対照抗体で処置した(n=10/群)。腹腔内注射によって、マウスに336B3、抗mPD-1抗体、または対照抗体を週2回投与した。腫瘍成長をモニタリングし、示された時点で、腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。(図20A〜20D)各処置群内にいる個々のマウスの腫瘍量。
【図２０−２】単鎖GITRL三量体-Fcタンパク質および抗PD-1抗体によるインビボ腫瘍成長の阻害。マウスメラノーマ細胞株B16-F10細胞をC57BL/6マウスに皮下移植した(5000細胞/マウス)。マウスを5mg/kgの単鎖mGITRL三量体-Fc 336B3、10mg/kgの抗mPD-1抗体、336B3と抗mPD-1抗体の組み合わせ、または対照抗体で処置した(n=10/群)。腹腔内注射によって、マウスに336B3、抗mPD-1抗体、または対照抗体を週2回投与した。腫瘍成長をモニタリングし、示された時点で、腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。(図20E)各処置群の平均腫瘍量。
【図２１−１】単鎖GITRL三量体-FcおよびOX40L三量体-Fc融合ポリペプチドによる腫瘍成長の阻害。マウス結腸腫瘍株CT26.WTをBalb/cマウスに皮下移植した(n=10マウス/群)。0.25mg/マウスの単鎖mOX40L三量体-Fc融合タンパク質、抗mOX40抗体、mGITRL三量体-Fc、抗mGITR抗体DTA-1、または対照抗体を3回投薬するためにマウスに週2回注射した。腫瘍成長をモニタリングし、示された時点で、腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。図21A、対照抗体で処置した群に由来するそれぞれの個々のマウスの腫瘍量。図21B、mOX40L-Fcで処置した群に由来するそれぞれの個々のマウスの腫瘍量。図21C、アゴニスト抗OX40抗体で処置した群に由来するそれぞれの個々のマウスの腫瘍量。図21D、3つのマウス群の平均腫瘍量。
【図２１−２】単鎖GITRL三量体-FcおよびOX40L三量体-Fc融合ポリペプチドによる腫瘍成長の阻害。マウス結腸腫瘍株CT26.WTをBalb/cマウスに皮下移植した(n=10マウス/群)。0.25mg/マウスの単鎖mOX40L三量体-Fc融合タンパク質、抗mOX40抗体、mGITRL三量体-Fc、抗mGITR抗体DTA-1、または対照抗体を3回投薬するためにマウスに週2回注射した。腫瘍成長をモニタリングし、示された時点で、腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。図21E、5つのマウス群の平均腫瘍量。データを、注射後、数日間にわたる腫瘍量(mm3)として示した。
【図２２】単鎖GITRL三量体-Fc融合ポリペプチドによる腫瘍成長の阻害-B16-B10マウスモデルにおける用量研究。B16-F10細胞をC57BL/6マウスに皮下注射し、約84mm3の平均サイズに達するようにした。マウスを0.5mg/kgの抗mGITR抗体DTA-1、30mg/kg、10mg/kg、2.5mg/kg、0.5mg/kg、および0.05mg/kgの単鎖mGITRL三量体-Fc 336B3、2つの異なる対照抗体、または食塩水で処置した(n=10/群)。腹腔内注射によって、マウスに336B3、抗体、または食塩水を週1回投与した。腫瘍成長をモニタリングし、腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。結果を、各処置群における300mm3未満の腫瘍のパーセントとして示した。
【図２３−１】サイトカイン産生。マウス結腸腫瘍株CT26.WTをBalb/cマウスに皮下移植した(n=10マウス/群)。0.25mg/マウスの単鎖mOX40L三量体-Fc融合タンパク質、抗mOX40抗体、mGITRL三量体-Fc、抗mGITR抗体DTA-1、または対照抗体を3回投薬するためにマウスに週2回注射した。腫瘍成長をモニタリングし、示された時点で、腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。26日目に、各処置群のマウスの脾臓から細胞を収集した。細胞を腫瘍特異的CD8+T細胞ペプチドAH-1の存在下または非存在下で培養した。48時間後に、Luminex(登録商標)プラットフォーム(ThermoFisher Scientific)のマルチプレックス(multiplex)パネルを用いて製造業者の説明書に従って、細胞上清中のサイトカインレベルを測定した。図23A、IL-2。図23B、IL-4。図23C、IL-5。図23D、IL-6。
【図２３−２】サイトカイン産生。マウス結腸腫瘍株CT26.WTをBalb/cマウスに皮下移植した(n=10マウス/群)。0.25mg/マウスの単鎖mOX40L三量体-Fc融合タンパク質、抗mOX40抗体、mGITRL三量体-Fc、抗mGITR抗体DTA-1、または対照抗体を3回投薬するためにマウスに週2回注射した。腫瘍成長をモニタリングし、示された時点で、腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。26日目に、各処置群のマウスの脾臓から細胞を収集した。細胞を腫瘍特異的CD8+T細胞ペプチドAH-1の存在下または非存在下で培養した。48時間後に、Luminex(登録商標)プラットフォーム(ThermoFisher Scientific)のマルチプレックス(multiplex)パネルを用いて製造業者の説明書に従って、細胞上清中のサイトカインレベルを測定した。図23E、IL-10。図23F、IL-13。図23G、MIP-1b。図23H、FasL-対照、OX40L-Fc、およびgITRL-Fcのサイトカインレベルはアッセイ限界より少なかった。
【図２３−３】サイトカイン産生。マウス結腸腫瘍株CT26.WTをBalb/cマウスに皮下移植した(n=10マウス/群)。0.25mg/マウスの単鎖mOX40L三量体-Fc融合タンパク質、抗mOX40抗体、mGITRL三量体-Fc、抗mGITR抗体DTA-1、または対照抗体を3回投薬するためにマウスに週2回注射した。腫瘍成長をモニタリングし、示された時点で、腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。26日目に、各処置群のマウスの脾臓から細胞を収集した。細胞を腫瘍特異的CD8+T細胞ペプチドAH-1の存在下または非存在下で培養した。48時間後に、Luminex(登録商標)プラットフォーム(ThermoFisher Scientific)のマルチプレックス(multiplex)パネルを用いて製造業者の説明書に従って、細胞上清中のサイトカインレベルを測定した。図23I、GM-CSF。図23J、sCD137。図23K、IFN-γ。図23L、グランザイムB。
【図２４−１】単鎖GITRL三量体-Fcタンパク質による腫瘍成長の阻害。CT26.WT細胞(30,000細胞/マウス)をBalb/cマウスに皮下移植し、腫瘍が約300mm3の平均サイズになるまで成長させた。マウスを0.25mg/マウスの単鎖mGITRL三量体-Fc 336B3、アゴニスト抗GITR抗体DTA-1、または対照抗体で処置した(n=17/群)。腹腔内注射によって合計3回投与するためにマウスに週2回投薬した。腫瘍成長をモニタリングし、腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。可能な場合、長期生存を評価するために80日を過ぎてもマウスを追跡した。図24A、対照抗体で処置した群に由来するそれぞれの個々のマウスの腫瘍量。図24B、mGITRL-Fcで処置した群に由来するそれぞれの個々のマウスの腫瘍量。
【図２４−２】単鎖GITRL三量体-Fcタンパク質による腫瘍成長の阻害。CT26.WT細胞(30,000細胞/マウス)をBalb/cマウスに皮下移植し、腫瘍が約300mm3の平均サイズになるまで成長させた。マウスを0.25mg/マウスの単鎖mGITRL三量体-Fc 336B3、アゴニスト抗GITR抗体DTA-1、または対照抗体で処置した(n=17/群)。腹腔内注射によって合計3回投与するためにマウスに週2回投薬した。腫瘍成長をモニタリングし、腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。可能な場合、長期生存を評価するために80日を過ぎてもマウスを追跡した。図24C、アゴニスト抗GITR抗体DTA-1で処置した群に由来するそれぞれの個々のマウスの腫瘍量。図24D、全処置群の生存曲線。
【図２５】ヒト化マウスモデルにおける単鎖GITRL三量体-Fcタンパク質による腫瘍成長の阻害。ヒト化マウスに患者由来メラノーマ腫瘍細胞(OMP-M9、75,000細胞/マウス)を皮下注射した。腫瘍が約60mm3の平均量に達するまで、16日間成長させた。腫瘍を有するマウスを2つの群に無作為化した(n=3マウス/群)。腫瘍を有するマウスを対照タンパク質またはhGITRL三量体-Fc OMP-336B11のいずれかで処置した。マウスに10mg/kgで週2回投薬した。腫瘍成長をモニタリングし、示された時点で腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
発明の詳細な説明
本発明は、免疫応答を調整する、ポリペプチド、可溶性タンパク質、融合タンパク質、ホモ二量体二重特異性分子、およびヘテロ二量体二重特異性分子を含むが、これらに限定されない新規の作用物質を提供する。前記作用物質には、細胞相互作用および免疫応答シグナル伝達に関与するTNFスーパーファミリーのメンバーである受容体およびリガンドのアゴニストおよびアンタゴニストが含まれる。関連するポリペプチドおよびポリヌクレオチド、前記作用物質を含む組成物、ならびに前記作用物質を作る方法も提供される。免疫応答を調整する作用物質をスクリーニングする方法が提供される。新規の作用物質を使用する方法、例えば、免疫応答を活性化する方法、免疫応答を刺激する方法、免疫応答を促進する方法、免疫応答を増大させる方法、NK細胞を活性化する方法、CTLを含むT細胞を活性化する方法、NK細胞の活性を増大させる方法、CTLを含むT細胞の活性を増大させる方法、NK細胞の活性を促進する方法、CTLを含むT細胞の活性を促進する方法、Tregの活性を阻害する方法、MDSCの活性を阻害する方法、腫瘍成長を阻害する方法、がんを処置する方法、および/またはウイルス性疾患を処置する方法が提供される。さらに、免疫応答を阻害する方法、免疫応答を抑制する方法、T細胞の活性を減少させる方法、および/または自己免疫疾患を処置する方法が提供される。
【００５２】
I.定義
本発明の理解を容易にするために、多数の用語および句を以下で定義する。
【００５３】
本明細書で使用する「アゴニスト」および「アゴニストの」という用語は、標的および/または経路の生物学的活性を直接的または間接的に、実質的に誘導するか、活性化するか、促進するか、増大させるか、または亢進させることができる、ポリペプチドまたは作用物質を指すか、またはこれについて説明する。「アゴニスト」という用語は、関心対象のタンパク質または他の標的の活性を部分的または完全に誘導するか、活性化するか、促進するか、増大させるか、または亢進させる、任意の作用物質を含むように本明細書において用いられる。
【００５４】
本明細書で使用する「アンタゴニスト」および「アンタゴニストの」という用語は、標的および/または経路の生物学的活性を直接的または間接的に、部分的または完全にブロックするか、阻害するか、低減するか、または中和することができる、ポリペプチドまたは作用物質を指すか、またはこれについて説明する。「アンタゴニスト」という用語は、関心対象のタンパク質または他の標的の活性を部分的または完全にブロックするか、阻害するか、低減するか、または中和する、任意の分子を含むように本明細書において用いられる。
【００５５】
本明細書で使用する「調整」および「調整する」という用語は、生物学的活性の変更または変化を指す。調整には活性の刺激または阻害が含まれるが、これらに限定されない。調整は活性の増大もしくは活性の減少でも、結合特性の変更でも、または、関心対象のタンパク質、経路、系、もしくは他の生物学的標的の活性に関連する生物学的特性、機能的特性、もしくは免疫学的特性の他の任意の変更でもよい。
【００５６】
本明細書で使用する「可溶性タンパク質」という用語は、細胞から可溶型で分泌することができるタンパク質またはその断片を指す。
【００５７】
「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」という用語は、少なくとも2つの遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子によって発現されるハイブリッドタンパク質を指す。
【００５８】
本明細書で使用する「リンカー」または「リンカー領域」という用語は、第1のポリペプチド(例えば、GITRL細胞外ドメインまたはその断片のコピー)と第2のポリペプチド(例えば、Fc領域)との間に挿入されるリンカーを指す。一部の態様において、リンカーはペプチドリンカーである。リンカーは、ポリペプチドの発現、分泌、または生理活性に悪影響を及ぼしてはならない。好ましくは、リンカーは、抗原性でなく、免疫応答を誘発しない。
【００５９】
本明細書で使用する「抗体」という用語は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または上記の任意の組み合わせなどの標的を、通常、免疫グロブリン分子の可変領域内にある少なくとも1つの抗原結合部位を介して認識し、かつ該標的に特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。本明細書で使用する、この用語は、無傷のポリクローナル抗体、無傷のモノクローナル抗体、抗体断片(例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片)、単鎖Fv(scFv)抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、単一特異性抗体、一価抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原結合部分を含む融合タンパク質、ならびに抗体が望ましい生物学的活性を示す限り、抗原結合部位を含む他の任意の改変された免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、5つの主要なクラスの免疫グロブリン:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM、またはそのサブクラス(アイソタイプ)(例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)のいずれかであり得る。IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMの重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンは異なる周知のサブユニット構造および三次元構造を有する。抗体は、裸でもよいか、または毒素および放射性同位体を含むがこれらに限定されない他の分子に結合体化されてもよい。
【００６０】
「抗体断片」という用語は無傷の抗体の一部を指し、かつ無傷の抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片、直鎖抗体、単鎖抗体、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用する「抗体断片」は抗原結合部位またはエピトープ結合部位を含む。
【００６１】
抗体の「可変領域」という用語は、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を単独で、または組み合わせて指す。一般的に、重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域はそれぞれ、4つのフレームワーク領域(FR)と、「超可変領域」とも知られる3つの相補性決定領域(CDR)からなる。各鎖内のCDRはフレームワーク領域によって近くにまとめられ、他の鎖からのCDRと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。CDRの決定には少なくとも2種類の技法:(1)異種間配列可変性に基づくアプローチ(すなわち、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD));および(2)抗原-抗体複合体の結晶学研究に基づくアプローチ(Al-Lazikani et al (1997) J. Mol. Biol. 273:927-948))がある。さらに、CDRを決定するために、これらの2つのアプローチの組み合わせが当技術分野において用いられることもある。
【００６２】
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、1つの抗原決定基、すなわちエピトープの極めて特異的な認識および結合に関与する均質な抗体集団を指す。これは、典型的に、異なる抗原決定基に対して作製された異なる抗体の混合物を含むポリクローナル抗体とは対照的である。「モノクローナル抗体」という用語は、無傷であり、かつ完全長であるモノクローナル抗体、ならびに抗体断片(例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、単鎖(scFv)抗体、抗体断片を含む融合タンパク質、および抗原結合部位を含む他の任意の改変された免疫グロブリン分子を包含する。さらに、「モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ作製、ファージ選択、組換え体発現、およびトランスジェニック動物を含むが、これらに限定されない任意の数の技法によって作製された、このような抗体を指す。
【００６３】
本明細書で使用する「ヒト化抗体」という用語は、最小の非ヒト配列を含む特異的な免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリンまたはその断片である、非ヒト(例えば、マウス)抗体の形を指す。典型的には、ヒト化抗体は、CDRの残基が、望ましい特異性、親和性、および/または結合能力を有する非ヒト種(例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはハムスター)のCDR由来の残基により置き換えられているヒト免疫グロブリンである。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域残基は、非ヒト種由来の抗体中の対応する残基で置き換えられる。さらに、ヒト化抗体を、Fvフレームワーク領域中および/または置き換えられた非ヒト残基内のさらなるアミノ酸残基の置換によって改変して、抗体の特異性、親和性、および/または結合能力を精緻にしかつ最適化することができる。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応するCDRのうちの全て、または実質的に全てを含有する可変ドメインを含む場合があるのに対して、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域である。一部の態様において、可変ドメインはヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域を含む。一部の態様において、可変ドメインはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域を含む。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域またはドメイン(Fc)の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域またはドメイン(Fc)の少なくとも一部を含むことができる。ヒト化抗体は、通常、キメラ抗体とは別個のものであるとみなされる。
【００６４】
本明細書で使用する「ヒト抗体」という用語は、ヒトによって産生された抗体、または当技術分野で公知の任意の技術を用いて作製された、ヒトによって産生された抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。
【００６５】
本明細書で使用する「キメラ抗体」という用語は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が2つまたはそれ以上の種に由来する抗体を指す。典型的には、軽鎖および重鎖両方の可変領域は、望ましい特異性、親和性、および/または結合能力を有する1つの哺乳動物種(例えば、マウス、ラット、ウサギなど)由来の抗体の可変領域に対応し、一方、定常領域は、別の種(通常、ヒト)において免疫応答が誘発されるのを避けるために、その種に由来する抗体中の配列と相同である。
【００６６】
「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は本明細書において同義に用いられ、かつ特定の抗体が認識し、特異的に結合することができる抗原の部分を指す。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは、連続したアミノ酸、およびタンパク質の三次フォールディング(tertiary folding)によって近接して並べられた非連続アミノ酸の両方から形成することができる。連続するアミノ酸から形成されたエピトープ(線状(linear)エピトープとも呼ばれる)は、タンパク質が変性した場合に典型的には保持されるのに対して、三次フォールディングによって形成されたエピトープ(コンホメーションエピトープとも呼ばれる)は、タンパク質が変性すると典型的には失われる。エピトープは独特の空間配置中に典型的には少なくとも3アミノ酸、より通常は少なくとも5、6、7、または8〜10アミノ酸を含む。
【００６７】
「選択的に結合する」または「特異的に結合する」という用語は、ポリペプチドまたは作用物質が、関連タンパク質および非関連タンパク質を含む別の物質より高頻度で、迅速に、長い期間で、高い親和性で、または前記を組み合わせてエピトープ、タンパク質、または標的分子と反応することを意味する。ある特定の態様において、「特異的に結合する」とは、例えば、約0.1mMまたはそれ未満、より通常は約1μM未満のKDで、ポリペプチドまたは作用物質がタンパク質または標的に結合することを意味する。ある特定の態様において、「特異的に結合する」とは、少なくとも約0.1μMもしくはそれ未満、少なくとも約0.01μMもしくはそれ未満、または少なくとも約1nMもしくはそれ未満のKDで、ポリペプチドまたは作用物質が標的に結合することを意味する。異なる種における相同タンパク質間には配列同一性があるので、特異的結合は、複数の種にあるタンパク質または作用物質を認識するポリペプチドまたは作用物質を含んでもよい。同様に、異なるタンパク質のポリペプチド配列のある特定の領域内には相同性があるので、特異的結合は、複数種のタンパク質または標的を認識するポリペプチドまたは作用物質を含んでもよい。ある特定の態様では、第1の標的に特異的に結合するポリペプチドまたは作用物質は第2の標的に特異的に結合してもよいかまたは特異的に結合しなくてもよいことが理解される。従って、「特異的結合」は、必ずしも、排他的な結合、すなわち、1種類の標的との結合を必要とするわけではない(だが、1種類の標的との結合を含んでもよい)。従って、ポリペプチドまたは作用物質は、ある特定の態様では、複数種の標的に特異的に結合してもよい。ある特定の態様では、複数種の標的がポリペプチドまたは作用物質の同じ抗原結合部位に結合してもよい。例えば、抗体は、ある特定の場合では、2つ同一の抗原結合部位を含んでもよく、これらの抗原結合部位はそれぞれ、2種類またはそれ以上のタンパク質にある同じエピトープに特異的に結合する。ある特定の他の態様では、抗体は二重特異性でもよく、特異性の異なる少なくとも2種類の抗原結合部位を含んでもよい。必ずしもそうとは限らないが、一般的に、「結合」についての言及は「特異的結合」を意味する。
【００６８】
「ポリペプチド」および「ペプチド」および「タンパク質」という用語は本明細書において同義に用いられ、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは直鎖または分枝鎖でもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。これらの用語はまた、天然に、あるいは介入によって、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との結合体化などの他の任意の操作もしくは修飾によって改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、1つまたは複数のアミノ酸類似体(例えば、非天然アミノ酸を含む)ならびに当技術分野において公知の他の修飾を含有するポリペプチドも、この定義に含まれる。本発明のポリペプチドは、ある特定の態様では抗体または他の免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーをベースとしてもよいため、単鎖または会合した鎖として生じることができることが理解される。
【００６９】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」および「核酸分子」という用語は本明細書において同義に用いられ、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNAおよびRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および/またはその類似体、あるいはDNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼによってポリマーに組み込むことができる任意の基質でもよい。
【００７０】
2つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチドの文脈において「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、配列同一性の一部として保存的アミノ酸置換を全く考慮することなく、最大一致(maximum correspondence)を得るように比較およびアラインメントされた場合に(必要であれば、ギャップを導入する)、同じであるか、または特定のパーセントの同じヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有する2つまたはそれ以上の配列または部分配列を指す。パーセント同一性は、配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを用いて、または目視検査によって、測定されてもよい。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントを得るために用いられることがある様々なアルゴリズムおよびソフトウェアが当技術分野において周知である。これらのアルゴリズムおよびソフトウェアには、BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin Package、およびそのバリエーションが含まれるが、これらに限定されない。一部の態様において、本発明の2つの核酸またはポリペプチドは実質的に同一である。実質的に同一であるとは、2つの核酸またはポリペプチドが最大限一致するように比較およびアラインメントされた場合に、配列比較アルゴリズムを用いて、または目視検査によって測定された場合に、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、一部の態様では少なくとも95％、96％、97％、98％、99％のヌクレオチド同一性またはアミノ酸残基同一性を有することを意味する。一部の態様において、同一性は、長さが少なくとも約10残基、少なくとも約20残基、少なくとも約40〜60残基、少なくとも約60〜80残基、またはその間の任意の整数値のアミノ酸配列の領域にわたって存在する。一部の態様において、同一性は、60〜80残基より長い領域、例えば、少なくとも約80〜100残基にわたって存在し、一部の態様では、配列は、比較されている配列、例えば、標的タンパク質または抗体のコード領域の完全長にわたって実質的に同一である。一部の態様において、同一性は、長さが少なくとも約10塩基、少なくとも約20塩基、少なくとも約40〜60塩基、少なくとも約60〜80塩基、またはその間の任意の整数値のヌクレオチド配列の領域にわたって存在する。一部の態様において、同一性は、60〜80塩基より長い領域、例えば、少なくとも約80〜1000塩基またはそれより多い領域にわたって存在する。一部の態様において、配列は、比較されている配列、例えば、関心対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の完全長にわたって実質的に同一である。
【００７１】
「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置き換えられる置換である。一般的に、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分枝(beta-branched)側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む、類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーが当技術分野において定義されている。例えば、チロシンをフェニルアラニンで置換するのが保存的置換である。一般的に、本発明のポリペプチド、可溶性タンパク質、および/または抗体の配列における保存的置換は、アミノ酸配列を含有するポリペプチド、可溶性タンパク質、または抗体と標的結合部位との結合を阻止しない。結合を無くさないアミノ酸保存的置換を特定する方法は当技術分野において周知である。
【００７２】
本明細書で使用する「ベクター」という用語は、宿主細胞において関心対象の1つまたは複数の遺伝子または配列を送達することができる、通常、発現することができる構築物を意味する。ベクターの例には、ウイルスベクター、裸のDNA発現ベクターまたはRNA発現ベクター、プラスミド、コスミド、またはファージベクター、カチオン性縮合剤と結合したDNA発現ベクターまたはRNA発現ベクター、ならびにリポソームにカプセル化されたDNA発現ベクターまたはRNA発現ベクターが含まれるが、これらに限定されない。
【００７３】
「単離された」ポリペプチド、可溶性タンパク質、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、天然では見出されない形をとる、ポリペプチド、可溶性タンパク質、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物である。単離されたポリペプチド、可溶性タンパク質、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、天然で見出される形をもはやとっていない程度まで精製されているポリペプチド、可溶性タンパク質、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物を含む。一部の態様において、単離された、ポリペプチド、可溶性タンパク質、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は実質的に純粋である。
【００７４】
本明細書で使用する「実質的に純粋な」という用語は、少なくとも50％の純度(すなわち、汚染物質を含まない)、少なくとも90％の純度、少なくとも95％の純度、少なくとも98％の純度、または少なくとも99％の純度である材料を指す。
【００７５】
本明細書で使用する「免疫応答」という用語は、自然免疫系および適応免疫系の両方からの応答を含む。「免疫応答」は細胞性免疫応答および/または体液性免疫応答を両方とも含む。「免疫応答」は、T細胞応答およびB細胞応答の両方、ならびに他の免疫系細胞、例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、マクロファージなどからの応答を含む。
【００７６】
本明細書で使用する「がん」および「がん性」という用語は、無秩序な細胞成長を特徴とする細胞集団がある哺乳動物における生理的状態を指すか、またはこれについて説明する。がんの例には、癌腫、芽腫、肉腫、ならびに血液がん、例えば、リンパ腫および白血病が含まれるが、これらに限定されない。
【００７７】
本明細書で使用する「腫瘍」および「新生物」という用語は、過度の細胞成長または増殖に起因する、前がん病変を含む良性(非がん性)または悪性(がん性)いずれかの任意の組織塊を指す。
【００７８】
本明細書で使用する「転移」という用語は、がんが、発生した部位(sight of origin)から他の身体領域に広がるか、または移って、新たな場所で同様のがん病変が発生するプロセスを指す。「転移性の」または「転移している」細胞とは、隣接する細胞との付着性接触を失い、血流またはリンパを介して疾患の原発部位から移動して、隣接する身体構造に侵入した細胞である。
【００７９】
「がん幹細胞」および「CSC」および「腫瘍幹細胞」および「腫瘍開始細胞」という用語は本明細書で同義に用いられ、かつ、(1)高い増殖能を有し;(2)非対称細胞分裂を行って、増殖能力または発生能力の低下した1つまたは複数のタイプの分化した後代細胞を生じることができ;かつ(3)自己複製または自己維持のために対称細胞分裂を行うことができる、がんまたは腫瘍に由来する細胞を指す。これらの特性によって、がん幹細胞は適切な宿主(例えば、マウス)に連続移植されると、腫瘍を形成できない大多数の腫瘍細胞と比較して腫瘍またはがんを形成または確立する能力が付与される。がん幹細胞は、分化に対して、無秩序な様式で自己複製を起こして、変異が生じるにつれて経時変化することができる異常細胞タイプを含む腫瘍を形成する。
【００８０】
「がん細胞」および「腫瘍細胞」という用語は、がん細胞集団の大部分を構成する非腫瘍形成性細胞と腫瘍形成性幹細胞(がん幹細胞)の両方を含む、がんもしくは腫瘍または前がん病変に由来する細胞の集団全体を指す。本明細書で使用する「がん細胞」または「腫瘍細胞」という用語は、複製および分化する能力が無い細胞だけを指している場合、このような腫瘍細胞とがん幹細胞を区別するために「非腫瘍形成性の」という用語で修飾される。
【００８１】
本明細書で使用する「腫瘍形成性の」という用語は、(さらなる腫瘍形成性がん幹細胞を生じる)自己複製の特性と、(分化した、従って、非腫瘍形成性の腫瘍細胞を生じる)他の全ての腫瘍細胞を発生するための増殖を含む、がん幹細胞の機能的特徴を指す。
【００８２】
本明細書で使用する「腫瘍形成能」という用語は、腫瘍に由来するランダムな細胞試料が、適切な宿主(例えば、マウス)に連続して移植された場合に触診可能な腫瘍を形成する能力を指す。
【００８３】
「対象」という用語は、特定の処置のレシピエントとなる、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類などを含むが、これらに限定されない任意の動物(例えば、哺乳動物)を指す。典型的には、本明細書ではヒト対象については「対象」および「患者」という用語が同義に用いられる。
【００８４】
「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府または州政府の規制当局によって認可されているかもしくは認可可能である物質、または米国薬局方、もしくはヒトを含む動物において使用するための一般に認められている他の薬局方に列挙されている物質を指す。
【００８５】
「薬学的に許容される賦形剤、担体、もしくはアジュバント」または「許容される薬学的担体」という用語は、本開示の少なくとも1種類の作用物質と共に対象に投与することができ、その薬理学的活性を破壊せず、治療効果を送達するのに十分な用量で投与された場合に無毒の賦形剤、担体、またはアジュバントを指す。普通、当業者および米食品医薬品局は、薬学的に許容される賦形剤、担体、またはアジュバントが任意の製剤の不活性成分と考える。
【００８６】
「有効量」または「治療的有効量」または「治療効果」という用語は、哺乳動物などの対象において、疾患または障害を「処置する」のに有効な、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質(例えば、融合タンパク質、可溶性受容体、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、有機低分子、または他の薬物)の量を指す。がんまたは腫瘍の場合には、治療的有効量のポリペプチドまたは作用物質(例えば、ポリペプチド、可溶性タンパク質、または抗体)は、治療効果を有し、従って、免疫応答をブーストしてもよいか、抗腫瘍応答をブーストしてもよいか、免疫細胞の細胞溶解活性を増大させてもよいか、免疫細胞による腫瘍細胞の死滅を増大させてもよいか、腫瘍細胞の数を低減してもよいか、腫瘍形成能、腫瘍形成頻度、もしくは腫瘍形成能力を減少させてもよいか、がん幹細胞の数もしくは頻度を低減してもよいか、腫瘍サイズを低減してもよいか、がん細胞集団を低減してもよいか、例えば、軟部組織および骨へのがんの拡大を含む、末梢器官へのがん細胞浸潤を阻害もしくは停止してもよいか、腫瘍もしくはがん細胞転移を阻害および停止してもよいか、腫瘍もしくはがん細胞成長を阻害および停止してもよいか、がんに関連する症状の1つもしくは複数をある程度まで緩和してもよいか、罹患率および死亡率を低減してもよいか、生活の質を改善してもよいか、またはこのような効果の組み合わせでもよい。
【００８７】
「処置する」もしくは「処置」もしくは「処置するために」または「軽減する」もしくは「軽減するために」という用語は、(1)診断された病理学的状態もしくは障害の症状を治癒し、診断された病理学的状態もしくは障害の症状を遅らせ、診断された病理学的状態もしくは障害の症状を和らげ、かつ/または診断された病理学的状態もしくは障害の進行を止める、治療的処置と、(2)標的とされた病理学的状態もしくは障害の発症を予防するかもしくは遅らせる予防的処置もしくは防止的処置の両方を指す。従って、処置を必要とする者には、既に障害がある者;障害になりやすい者;および障害を予防しようとする者が含まれる。がんまたは腫瘍の場合、患者が、以下の1つまたは複数を示す場合には、対象は本発明の方法に従って首尾良く「処置されている」:免疫応答の増大、抗腫瘍応答の増大、免疫細胞の細胞溶解活性の増大、免疫細胞による腫瘍細胞死滅の増大、がん細胞の数の低減もしくはがん細胞の完全な欠如、腫瘍サイズの縮小、軟部組織および骨へのがん細胞の拡大を含む末梢器官へのがん細胞浸潤の阻害もしくは欠如、腫瘍もしくはがん細胞の転移の阻害もしくは欠如、がん成長の阻害もしくは欠如、特定のがんに関連する1つもしくは複数の症状の緩和、罹患率および死亡率の低減、生活の質の改善、腫瘍形成能の低減、がん幹細胞の数もしくは頻度の低減、または効果の何らかの組み合わせ。
【００８８】
本開示および特許請求の範囲で使用する単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈によってはっきりと規定されていない限り複数形を含む。
【００８９】
本明細書において「を含む」という言葉で態様が説明された場合はいつでも、「からなる」および/または「から本質的になる」という用語で説明された他の類似する態様も提供されることが理解される。本明細書において「から本質的になる」という言葉で態様が説明された場合はいつでも、「からなる」で説明された他の類似する態様も提供されることも理解される。
【００９０】
本明細書で使用する、「約」値もしくはパラメータまたは「おおよそ」値もしくはパラメータについての言及は、その値もしくはパラメータに向けられた態様を含む(およびその態様について説明する)。例えば、「約X」について言及している説明は「X」の説明を含む。
【００９１】
本明細書において「Aおよび/またはB」などの句で用いられる「および/または」という用語は、AおよびB、AまたはB、A(のみ)、ならびにB(のみ)を含むことが意図される。同様に、「A、B、および/またはC」などの句で用いられる「および/または」という用語は、以下の態様のそれぞれを包含することが意図される:A、B、およびC;A、B、またはC;AまたはC;AまたはB;BまたはC;AおよびC;AおよびB;BおよびC;A(のみ);B(のみ);ならびにC(のみ)。
【００９２】
II.TNF受容体スーパーファミリー結合物質
本発明は、TNF受容体スーパーファミリー(TNFRSF)のメンバーに結合する作用物質を提供する。TNFRSFメンバーには、4-1BB、BAFF、BCMA、CD27、CD30、CD40、DcR3、DcTRAILR1、DcTRAILR2、DR3、DR6、EDA2R、EDAR、Fas(CD95)、GITR、HVEM、リンホトキシンβR、NGFR、オステオプロテジェリン、OX40、RANK、RELT、TACI、TNFRH3、TNFR1、TNFR2、TRAILR1、TRAILR2、TRAILR3、TRAILR4、TROY、およびTWEAKRが含まれるが、これらに限定されない。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はグルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体関連タンパク質(GITR)に結合する。これらの作用物質は本明細書中では「GITR結合物質」と呼ばれることがある。ある特定の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はGITRアゴニストである。ある特定の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はGITRシグナル伝達を誘導し、活性化し、亢進させ、増大させ、かつ/または延長する。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はOX40に結合する。これらのポリペプチドまたは作用物質は本明細書中では「OX40結合物質」と呼ばれることがある。ある特定の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はOX40アゴニストである。ある特定の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はOX40シグナル伝達を誘導し、活性化し、亢進させ、増大させ、かつ/または延長する。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はCD40に結合する。これらのポリペプチドまたは作用物質は本明細書中では「CD40結合物質」と呼ばれることがある。ある特定の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はCD40アゴニストである。ある特定の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はCD40シグナル伝達を誘導し、活性化し、亢進させ、増大させ、かつ/または延長する。
【００９３】
ある特定の態様において、前記作用物質はポリペプチドである。ある特定の態様において、前記作用物質は可溶性タンパク質である。一部の態様において、前記作用物質は融合ポリペプチドである。一部の態様において、前記作用物質は可溶性リガンドまたは可溶性「補助受容体」である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はヒトGITRLの断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はヒトOX40Lの断片を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はヒトCD40Lの断片を含む。一部の態様において、ヒトGITRL、OX40L、またはCD40Lの細胞外ドメインの断片は、細胞外ドメイン全体を含む可溶性作用物質と比較して変化した生物学的活性(例えば、長いタンパク質半減期)を示すことができる。
【００９４】
一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、ヒト腫瘍壊死因子受容体リガンドスーパーファミリー(TNFSF)タンパク質の受容体に結合することができるTNFSFタンパク質の細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、ヒト腫瘍壊死因子受容体リガンドスーパーファミリー(TNFSF)タンパク質の受容体に結合することができるTNFSFタンパク質の細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含み、細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、または第3のコピーの少なくとも1つはTNFSFタンパク質のストーク領域を含む。一部の態様において、TNFSFタンパク質は、GITRL、OX40L、4-1BBリガンド、APRIL、BAFF、CD27リガンド、CD30リガンド、CD40リガンド(CD40L)、EDA、EDA-A1、EDA-A2、Fasリガンド(CD95L)、LIGHT、リンホトキシン、リンホトキシン-β、リンホトキシン-α、TL1A、TNF-α、TRAIL、TRANCE、およびTWEAKからなる群より選択される。
【００９５】
ヒトGITRLの完全長アミノ酸(aa)配列は当技術分野において公知であり(UniProt No.Q9UNG2)、本明細書ではSEQ ID NO:1として提供される。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも1コピーのGITRL細胞外ドメインまたはそのGITR結合断片を含む。ある特定の態様において、GITRL「細胞外ドメイン」はSEQ ID NO:1のおおよそアミノ酸71〜199である。当業者は、GITRL細胞外ドメインに対応する正確なアミノ酸の理解の点で相違がある可能性がある。従って、本明細書に記載の細胞外ドメインのN末端および/またはC末端は1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、もしくはそれより多いアミノ酸分だけ伸びてもよいか、または短くなってもよい。本明細書で使用するGITRL細胞外ドメインは、一般的に、「ストーク領域」と「TNFファミリードメイン」を含む。従って、一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質の中にあるGITRL細胞外ドメインのコピーはGITRLの「ストーク領域」を含む。GITRLの「ストーク領域」はSEQ ID NO:1のおおよそアミノ酸71〜77である。ストーク領域はおおよそアミノ酸LQLETAK(SEQ ID NO:32)を含む。GITRLの「TNF相同性ドメイン」または「TNFファミリードメイン」はSEQ ID NO:1のおおよそアミノ酸89〜192である。GITRLのTNF相同性ドメインはSEQ ID NO:33を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、GITRL細胞外ドメインまたはそのGITR結合断片の第1、第2、および第3のコピーを含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも1コピーのSEQ ID NO:3を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも2コピーのSEQ ID NO:3を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は3コピーのSEQ ID NO:3を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも1コピーのSEQ ID NO:64を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも2コピーのSEQ ID NO:64を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は3コピーのSEQ ID NO:64を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、単鎖ポリペプチドとして、少なくとも、GITRL細胞外ドメインまたはそのGITR結合断片の第1、第2、および第3のコピーを含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:5を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:5と少なくとも約90％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:5と少なくとも約95％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:5と少なくとも96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:5から本質的になるポリペプチドを含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:5からなるポリペプチドを含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:66を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:66と少なくとも約90％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:66と少なくとも約95％の配列同一性を��するポリペプチドを含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:66と少なくとも約96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:66から本質的になるポリペプチドを含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:66からなるポリペプチドを含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも、GITRL細胞外ドメインの断片の第1、第2、および第3のコピーを含む。一部の態様において、GITRL細胞外ドメインのコピーは同じアミノ酸配列からなる。一部の態様において、GITRL細胞外ドメインのコピーは同一でない。一部の態様において、GITRL細胞外ドメインのコピーは野生型配列と比較してヒトGITRLのアミノ酸配列に置換、欠失、および/または付加を含む。
【００９６】
一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、ヒトGITRL細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドである。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、ヒトGITRL細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、細胞外ドメインのうち少なくとも1つはGITRLのストーク領域を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、ヒトGITRL細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、細胞外ドメインのうち少なくとも2つはGITRLのストーク領域を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、ヒトGITRL細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、それぞれの細胞外ドメインはGITRLのストーク領域を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、ヒトGITRL細胞外ドメインの第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、前記ポリペプチドはペプチドリンカー(すなわち、外因性ペプチドリンカー)を全く含まない。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、ヒトGITRL細胞外ドメインの第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、前記ポリペプチドは細胞外ドメインまたはその断片のどのコピーの間にも外因性ペプチドリンカーを含まない。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、ヒトGITRL細胞外ドメインの第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、それぞれの細胞外ドメインはストーク領域を含み、前記ポリペプチドはペプチドリンカー(すなわち、外因性ペプチドリンカー)を全く含まない。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、ヒトGITRL細胞外ドメインまたはそのGITR結合断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、細胞外ドメインの第2および第3のコピーはストークを含む。一部の態様において、GITRLのポリペプチドまたは細胞外ドメインはSEQ ID NO:1のアミノ酸71〜199を含む。一部の態様において、GITRL細胞外ドメインはSEQ ID NO:3を含む。一部の態様において、GITRL細胞外ドメインはSEQ ID NO:64を含む。一部の態様において、単鎖融合ポリペプチドはSEQ ID NO:5を含む。一部の態様において、単鎖融合ポリペプチドはSEQ ID NO:5からなる。一部の態様において、単鎖融合ポリペプチドはSEQ ID NO:66を含む。一部の態様において、単鎖融合ポリペプチドはSEQ ID NO:66からなる。
【００９７】
ヒトOX40Lの完全長アミノ酸(aa)配列は当技術分野において公知であり(UniProt No. P23510)、本明細書ではSEQ ID NO:40として提供される。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも1コピーのOX40L細胞外ドメインまたはその断片を含む。ある特定の態様において、OX40L「細胞外ドメイン」はSEQ ID NO:40のおおよそアミノ酸51〜83である。当業者は、OX40L細胞外ドメインに対応する正確なアミノ酸の理解の点で相違がある可能性がある。従って、本明細書に記載の細胞外ドメインのN末端および/またはC末端は1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、もしくはそれより多いアミノ酸分だけ伸びてもよいかまたは短くなってもよい。本明細書で使用するOX40L細胞外ドメインは、一般的に、「ストーク領域」と「TNFファミリードメイン」を含む。従って、一部の態様では、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質の中にあるOX40L細胞外ドメインのコピーはOX40Lの「ストーク領域」を含む。OX40Lの「ストーク領域」はSEQ ID NO:40のおおよそアミノ酸51〜57である。ストーク領域はおおよそアミノ酸QVSHRYP(SEQ ID NO:55)を含む。一部の態様において、ストーク領域は約4〜20個のアミノ酸を含む。一部の態様において、ストーク領域は約4〜10個のアミノ酸を含む。一部の態様において、ストーク領域は、TNF相同性ドメインの上流にあるアミノ酸(例えば、4〜10個のアミノ酸)を含む。一部の態様において、ストーク領域はストーク領域の断片を含む。一部の態様において、ストーク領域はさらなるアミノ酸を含む。一部の態様において、ストーク領域は、アミノ酸ALQVSHRYP(変種1; SEQ ID NO:74)を含む。一部の態様において、ストーク領域はアミノ酸SHRYP(変種2; SEQ ID NO:75)を含む。一部の態様において、ストーク領域はアミノ酸HRYP(変種3; SEQ ID NO:76)を含む。OX40Lの「TNF相同性ドメイン」または「TNFファミリードメイン」はSEQ ID NO:40のおおよそアミノ酸84〜178である。TNF相同性ドメインはSEQ ID NO:56を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも1コピーのSEQ ID NO:42を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも2コピーのSEQ ID NO:42を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は3コピーのSEQ ID NO:42を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも1コピーのSEQ ID NO:67を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも2コピーのSEQ ID NO:67を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は3コピーのSEQ ID NO:67を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも1コピーのSEQ ID NO:77を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも2コピーのSEQ ID NO:77を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は3コピーのSEQ ID NO:77を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも1コピーのSEQ ID NO:78を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも2コピーのSEQ ID NO:78を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は3コピーのSEQ ID NO:78を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも1コピーのSEQ ID NO:79を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも2コピーのSEQ ID NO:79を含む���一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は3コピーのSEQ ID NO:79を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、OX40L細胞外ドメインまたはそのOX40結合断片の第1、第2、および第3のコピーを含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、単鎖ポリペプチドとして、OX40L細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:44を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:44と少なくとも約90％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:44と少なくとも約95％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:44と少なくとも96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:44から本質的になるポリペプチドを含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:44からなるポリペプチドを含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:69を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:69と少なくとも約90％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:69と少なくとも約95％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:69と少なくとも96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:69から本質的になるポリペプチドを含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:69からなるポリペプチドを含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:71を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:71と少なくとも約90％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:71と少なくとも約95％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:71と少なくとも96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:71から本質的になるポリペプチドを含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:71からなるポリペプチドを含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも、OX40L細胞外ドメインの断片の第1、第2、および第3のコピーを含む。一部の態様において、OX40L細胞外ドメインのコピーは同じアミノ酸配列からなる。一部の態様において、OX40L細胞外ドメインのコピーは同一でない。一部の態様において、OX40L細胞外ドメインのコピーは野生型配列と比較してヒトOX40Lのアミノ酸配列に置換、欠失、および/または付加を含む。
【００９８】
一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも、ヒトOX40L細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドである。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも、ヒトOX40L細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、細胞外ドメインのうち少なくとも1つはストーク領域を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも、ヒトOX40L細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、それぞれの細胞外ドメインはストーク領域を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも、ヒトOX40L細胞外ドメインの第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、前記ポリペプチドはペプチドリンカー(すなわち、外因性ペプチドリンカー)を全く含まない。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも、ヒトOX40L細胞外ドメインの第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、それぞれの細胞外ドメインはストーク領域を含み、前記ポリペプチドはペプチドリンカー(すなわち、外因性ペプチドリンカー)を全く含まない。一部の態様において、OX40L細胞外ドメインはSEQ ID NO:40のアミノ酸51〜183を含む。一部の態様において、OX40L細胞外ドメインはSEQ ID NO:42を含む。一部の態様において、OX40L細胞外ドメインはSEQ ID NO:42からなる。一部の態様において、単鎖融合ポリペプチドはSEQ ID NO:44を含む。一部の態様において、単鎖融合ポリペプチドはSEQ ID NO:44からなる。一部の態様において、単鎖融合ポリペプチドはSEQ ID NO:69を含む。一部の態様において、単鎖融合ポリペプチドはSEQ ID NO:69からなる。
【００９９】
ヒトCD40Lの完全長アミノ酸(aa)配列は当技術分野において公知であり(UniProt No.P29965)、本明細書ではSEQ ID NO:82として提供される。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも1コピーのCD40L細胞外ドメインまたはその断片を含む。ある特定の態様において、CD40L「細胞外ドメイン」はSEQ ID NO:82のおおよそアミノ酸47〜261である。当業者は、CD40L細胞外ドメインに対応する正確なアミノ酸の理解の点で相違がある可能性がある。従って、本明細書に記載の細胞外ドメインのN末端および/またはC末端は1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、もしくはそれより多いアミノ酸分だけ伸びてもよいかまたは短くなってもよい。本明細書で使用するCD40L細胞外ドメインは、一般的に、「ストーク領域」またはストーク領域の断片と「TNFファミリードメイン」を含む。CD40Lのストーク領域は約72アミノ酸であり、GITRLおよびCD40Lのストーク領域よりかなり長い。一部の態様において、単鎖CD40L三量体の正しいフォールディングおよびコンホメーションを可能にするために、ストーク領域は、GITRLおよびOX40Lのストーク領域と長さがもっと等しいCD40Lストーク領域の断片を含む。従って、一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質の中にあるCD40L細胞外ドメインのコピーはCD40Lのストーク領域の断片を含む。一部の態様において、ストーク領域は約4〜20個のアミノ酸を含む。一部の態様において、ストーク領域は約4〜10個のアミノ酸を含む。一部の態様において、ストーク領域は、TNF相同性ドメインの上流にあるアミノ酸(例えば、4〜10個のアミノ酸)を含む。CD40Lのストーク領域はSEQ ID NO:82のおおよそアミノ酸47〜112である。一部の態様において、ストーク領域はCD40Lストーク領域の断片を含む。一部の態様において、CD40Lストーク領域の断片は、MQKGDQ(SEQ ID NO:98;断片1);FEMQKGDQ(SEQ ID NO:99;断片2);EMQKGDQ(SEQ ID NO:100;断片3);QKGDQ(SEQ ID NO:101;断片4);またはKGDQ(SEQ ID NO:102;断片5)を含む。CD40Lの「TNF相同性ドメイン」または「TNFファミリードメイン」はSEQ ID NO:82のおおよそアミノ酸122〜261である。TNF相同性ドメインはSEQ ID NO:94を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも1コピーのSEQ ID NO:84を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも2コピーのSEQ ID NO:84を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は3コピーのSEQ ID NO:84を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも1コピーのSEQ ID NO:95を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも2コピーのSEQ ID NO:95を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は3コピーのSEQ ID NO:95を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも1コピーのSEQ ID NO:103を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも2コピーのSEQ ID NO:103を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は3コピーのSEQ ID NO:103を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも1コピーのSEQ ID NO:104を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも2コピーのSEQ ID NO:104を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は3コピーのSEQ ID NO:104を含む。一部の態様において、前��ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも1コピーのSEQ ID NO:105を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも2コピーのSEQ ID NO:105を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は3コピーのSEQ ID NO:105を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも1コピーのSEQ ID NO:106を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は少なくとも2コピーのSEQ ID NO:106を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は3コピーのSEQ ID NO:106を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、CD40L細胞外ドメインまたはそのCD40結合断片の第1、第2、および第3のコピーを含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、単鎖ポリペプチドとして、CD40L細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:85を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:85と少なくとも約90％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:85と少なくとも約95％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:85と少なくとも96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:85から本質的になるポリペプチドを含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:85からなるポリペプチドを含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:97を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:97と少なくとも約90％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:97と少なくとも約95％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:97と少なくとも96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:97から本質的になるポリペプチドを含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、SEQ ID NO:97からなるポリペプチドを含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも、CD40L細胞外ドメインの断片の第1、第2、および第3のコピーを含む。一部の態様において、CD40L細胞外ドメインのコピーは同じアミノ酸配列からなる。一部の態様において、CD40L細胞外ドメインのコピーは同一でない。一部の態様において、CD40L細胞外ドメインのコピーは野生型配列と比較してヒトCD40Lのアミノ酸配列に置換、欠失、および/または付加を含む。
【０１００】
一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも、ヒトCD40L細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドである。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも、ヒトCD40L細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、細胞外ドメインのうち少なくとも1つはストーク領域またはストーク領域断片を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも、ヒトCD40L細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、それぞれの細胞外ドメインはストーク領域またはストーク領域断片を含む。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも、ヒトCD40L細胞外ドメインの第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、前記ポリペプチドはペプチドリンカー(すなわち、外因性ペプチドリンカー)を全く含まない。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも、ヒトCD40L細胞外ドメインの第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドであり、それぞれの細胞外ドメインはストーク領域またはストーク領域断片を含み、前記ポリペプチドはペプチドリンカー(すなわち、外因性ペプチドリンカー)を全く含まない。一部の態様において、CD40L細胞外ドメインはSEQ ID NO:82のアミノ酸113〜261を含む。一部の態様において、CD40L細胞外ドメインはSEQ ID NO:84を含む。一部の態様において、OX40L細胞外ドメインはSEQ ID NO:84からなる。一部の態様において、CD40L細胞外ドメインはSEQ ID NO:103を含む。一部の態様において、OX40L細胞外ドメインはSEQ ID NO:103からなる。一部の態様において、CD40L細胞外ドメインはSEQ ID NO:104を含む。一部の態様において、OX40L細胞外ドメインはSEQ ID NO:104からなる。一部の態様において、CD40L細胞外ドメインはSEQ ID NO:105を含む。一部の態様において、OX40L細胞外ドメインはSEQ ID NO:105からなる。一部の態様において、OX40L細胞外ドメインはSEQ ID NO:106を含む。一部の態様において、OX40L細胞外ドメインはSEQ ID NO:106からなる。一部の態様において、単鎖融合ポリペプチドはSEQ ID NO:85を含む。一部の態様において、単鎖融合ポリペプチドはSEQ ID NO:85からなる。一部の態様において、単鎖融合ポリペプチドはSEQ ID NO:97を含む。一部の態様において、単鎖融合ポリペプチドはSEQ ID NO:97からなる。
【０１０１】
ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、1つまたは複数の(例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個などの)保存的置換を含み、かつGITRに結合することができる、細胞外ドメインGITRLアミノ酸配列の変種またはその断片を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、1つまたは複数の(例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個などの)保存的置換を含み、かつOX40に結合することができる、細胞外ドメインOX40Lアミノ酸配列の変種またはその断片を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、1つまたは複数の(例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個などの)保存的置換を含み、かつCD40に結合することができる、細胞外ドメインCD40Lアミノ酸配列の変種またはその断片を含む。
【０１０２】
一部の態様において、前記作用物質はポリペプチドである。一部の態様において、前記ポリペプチドは融合タンパク質である。ある特定の態様において、融合タンパク質は、少なくとも1コピーのヒトTNFSFメンバー細胞外ドメインまたはその断片を含み、非TNFSFポリペプチドをさらに含む。ある特定の態様において、融合タンパク質は、少なくとも1コピーのヒトGITRL細胞外ドメインまたはその断片を含み、非GITRLポリペプチドをさらに含む。ある特定の態様において、融合タンパク質は、少なくとも1コピーのヒトOX40L細胞外ドメインまたはその断片を含み、非OX40Lポリペプチドをさらに含む。ある特定の態様において、融合タンパク質は、少なくとも1コピーのヒトCD40L細胞外ドメインまたはその断片を含み、非CD40Lポリペプチドをさらに含む。ある特定の態様において、融合タンパク質は、ヒトFc領域、1種類もしくは複数種のタンパク質タグ(例えば、myc、FLAG、GST)、他の内因性タンパク質もしくはタンパク質断片、または細胞外ドメインと非TNFSFポリペプチド(例えば、非GITRLポリペプチドもしくは非OX40Lポリペプチド)との間にある任意のペプチド配列を含む他の任意の有用なタンパク質配列を含むが、これらに限定されない異種の機能的かつ構造的なポリペプチドに連結された、細胞外ドメインまたはその断片を含んでもよい。ある特定の態様において、非TNFSFポリペプチドはヒトFc領域を含む。ある特定の態様において、非GITRLポリペプチドはヒトFc領域を含む。ある特定の態様において、非OX40LポリペプチドはヒトFc領域を含む。ある特定の態様において、非CD40LポリペプチドはヒトFc領域を含む。Fc領域は、免疫グロブリンの任意のクラス、IgG、IgA、IgM、IgD、およびIgEから得ることができる。一部の態様では、Fc領域はヒトIgG1 Fc領域である。一部の態様では、Fc領域はヒトIgG2 Fc領域である。一部の態様では、Fc領域は野生型Fc領域である。一部の態様では、Fc領域は野生型Fc領域の天然変種である。一部の態様では、Fc領域は変異Fc領域である。一部の態様では、Fc領域のN末端は、(例えば、ヒンジドメイン内の)1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個のアミノ酸分だけ切断されている。一部の態様では、Fc領域のC末端は切断されている(例えば、リジンが存在しない)。一部の態様では、望ましくないジスルフィド結合形成を妨げるために、ヒンジドメイン内のアミノ酸が変えられる。一部の態様では、望ましくないジスルフィド結合形成を妨げるために、システインが異なるアミノ酸と取り替えられる。一部の態様では、望ましくないジスルフィド結合形成を妨げるために、システインがセリンと取り替えられる。ある特定の態様では、Fc領域は、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、または SEQ ID NO:14を含む。一部の態様において、Fc 領域はSEQ ID NO:10を含む。一部の態様において、Fc領域はSEQ ID NO:14を含む。
【０１０３】
一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は単鎖GITRL三量体-Fcタンパク質である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は単鎖GITRL三量体-IgG1 Fcタンパク質である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:7を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:6を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:7を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:7から本質的になる。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:6からなる。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:7からなる。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、ATCCに寄託されかつ指定番号PTA-122112が付与された「hGITRL-hIgG1」プラスミドによってコードされるポリペプチドを含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は単鎖GITRL三量体-IgG2 Fcタンパク質である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:8またはSEQ ID NO:9を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:8を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:9を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:8またはSEQ ID NO:9から本質的になる。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:8からなる。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:9からなる。
【０１０４】
一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は単鎖OX40L三量体-Fcタンパク質である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、単鎖OX40L三量体-IgG1 Fcタンパク質である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:45またはSEQ ID NO:46を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:45を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:46を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:45またはSEQ ID NO:46から本質的になる。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:45からなる。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:46からなる。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は単鎖OX40L三量体-IgG2 Fcタンパク質である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:47またはSEQ ID NO:48を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:47を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:48を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:47またはSEQ ID NO:48から本質的になる。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:47からなる。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:48からなる。
【０１０５】
一部の別の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は単鎖OX40L三量体-IgG1 Fcタンパク質である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:80またはSEQ ID NO:81を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:80を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:81を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:80またはSEQ ID NO:81から本質的になる。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:80からなる。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:81からなる。
【０１０６】
一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は単鎖CD40L三量体-Fcタンパク質である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は単鎖CD40L三量体-IgG1 Fcタンパク質である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:89またはSEQ ID NO:90を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:89を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:90を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:89またはSEQ ID NO:90から本質的になる。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:89からなる。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:90からなる。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は単鎖CD40L三量体-IgG2 Fcタンパク質である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:91またはSEQ ID NO:92を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:91を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:92を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:91またはSEQ ID NO:92から本質的になる。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:91からなる。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はSEQ ID NO:92からなる。
【０１０７】
ある特定の態様において、非TNFSFポリペプチド(例えば、非GITRLポリペプチド、非OX40Lポリペプチド、または非CD40Lポリペプチド)は、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、またはSEQ ID NO:14を含む。ある特定の態様において、非TNFSFポリペプチド(例えば、非GITRLポリペプチド、非OX40Lポリペプチド、または非CD40Lポリペプチド)は、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、またはSEQ ID NO:14から本質的になる。ある特定の態様において、非TNFSFポリペプチド(例えば、非GITRLポリペプチド、非OX40Lポリペプチド、または非CD40Lポリペプチド)は、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、またはSEQ ID NO:14からなる。
【０１０８】
ある特定の態様において、非GITRLポリペプチドまたは非OX40Lポリペプチドは免疫グロブリン重鎖を含む。ある特定の態様において、非CD40Lポリペプチドは免疫グロブリン重鎖を含む。ある特定の態様において、免疫グロブリン重鎖は免疫グロブリン軽鎖と会合する。一部の態様において、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖は抗原結合部位を形成する。ある特定の態様において、非GITRLポリペプチドまたは非OX40Lポリペプチドは抗体を含む。ある特定の態様において、非CD40Lポリペプチドは抗体を含む。ある特定の態様において、非GITRLポリペプチドまたは非OX40Lポリペプチドは単鎖抗体またはFabを含む。ある特定の態様において、非CD40Lポリペプチドは単鎖抗体またはFabを含む。
【０１０９】
ある特定の態様において、融合タンパク質は、ヒトGITRL細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーと非GITRLポリペプチドを含み、非GITRLポリペプチドのC末端はGITRL細胞外ドメインと連結されている。ある特定の態様において、融合タンパク質は、ヒトGITRL細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーと非GITRLポリペプチドを含み、非GITRLポリペプチドのN末端はGITRL細胞外ドメインと連結されている。一部の態様において、GITRL細胞外ドメインの第1のコピーは非GITRLポリペプチドのC末端と連結されている。一部の態様において、GITRL細胞外ドメインの第3のコピーは非GITRLポリペプチドのN末端と連結されている。一部の態様において、GITRL細胞外ドメインはFc領域のC末端と連結されている。一部の態様において、GITRL細胞外ドメインはFc領域のN末端と連結されている。一部の態様において、GITRL細胞外ドメインはFc領域に直接(すなわち、介在ペプチドリンカーなしで)連結されている。一部の態様において、GITRL細胞外ドメインはペプチドリンカーを介してFc領域と連結されている。
【０１１０】
ある特定の態様において、融合タンパク質は、少なくとも、ヒトOX40L細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーと非OX40Lポリペプチドを含み、非OX40LポリペプチドのC末端はOX40L細胞外ドメインと連結されている。ある特定の態様において、融合タンパク質は、少なくとも、ヒトOX40L細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーと非OX40Lポリペプチドを含み、非OX40LポリペプチドのN末端はOX40L細胞外ドメインと連結されている。一部の態様において、OX40L細胞外ドメインの第1のコピーは非OX40LポリペプチドのC末端と連結されている。一部の態様において、OX40L細胞外ドメインの第3のコピーは非OX40LポリペプチドのN末端と連結されている。一部の態様において、OX40L細胞外ドメインはFc領域のC末端と連結されている。一部の態様において、OX40L細胞外ドメインはFc領域のN末端と連結されている。一部の態様において、OX40L細胞外ドメインはFc領域に直接(すなわち、介在ペプチドリンカーなしで)連結されている。一部の態様において、OX40L細胞外ドメインはペプチドリンカーを介してFc領域と連結されている。
【０１１１】
ある特定の態様において、融合タンパク質は、少なくとも、ヒトCD40L細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーと非CD40Lポリペプチドを含み、非CD40LポリペプチドのC末端はCD40L細胞外ドメインと連結されている。ある特定の態様において、融合タンパク質は、少なくとも、ヒトCD40L細胞外ドメインまたはその断片の第1、第2、および第3のコピーと非CD40Lポリペプチドを含み、非CD40LポリペプチドのN末端はCD40L細胞外ドメインと連結されている。一部の態様において、CD40L細胞外ドメインの第1のコピーは非CD40LポリペプチドのC末端と連結されている。一部の態様において、CD40L細胞外ドメインの第3のコピーは非CD40LポリペプチドのN末端と連結されている。一部の態様において、CD40L細胞外ドメインはFc領域のC末端と連結されている。一部の態様において、CD40L細胞外ドメインはFc領域のN末端と連結されている。一部の態様において、CD40L細胞外ドメインはFc領域に直接(すなわち、介在ペプチドリンカーなしで)連結されている。一部の態様において、CD40L細胞外ドメインはペプチドリンカーを介してFc領域と連結されている。
【０１１２】
本明細書で使用する「リンカー」という用語は、第1のポリペプチド(例えば、TNFSF、例えば、GITRL、OX40L、もしくはCD40Lの細胞外ドメイン、またはその断片)と第2のポリペプチド(例えば、Fc領域)との間に挿入されるリンカーを指す。一部の態様では、リンカーはペプチドリンカーである。リンカーは、融合タンパク質の発現、分泌、または生理活性に悪影響を及ぼしてはならない。リンカーは抗原性があってはならず、免疫応答を誘発してはならない。適切なリンカーは当業者に公知であり、グリシン残基およびセリン残基の混合物を含むことが多く、立体障害のないアミノ酸を含むことが多い。有用なリンカーに組み込むことができる他のアミノ酸にはスレオニン残基およびアラニン残基が含まれる。リンカーの長さは異なってもよく、例えば、長さは1〜50アミノ酸、長さは1〜22アミノ酸、長さは1〜10アミノ酸、長さは1〜5アミノ酸、または長さは1〜3アミノ酸でもよい。リンカーには、SerGly、GGSG、GSGS、GGGS、nが1〜7であるS(GGS)n、GRA、ポリ(Gly)、ポリ(Ala)、
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が含まれ得るが、これらに限定されない。一部の態様において、リンカーは切断部位を含んでもよい。一部の態様において、リンカーは、第2のポリペプチドが第1のポリペプチドから分離され得るように酵素切断部位を含んでもよい。本明細書で使用するリンカーは、第1のポリペプチド(例えば、GITRL、OX40L、またはCD40Lの細胞外ドメイン)のC末端に由来するアミノ酸残基も、第2のポリペプチド(例えば、Fc領域)のN末端に由来するアミノ酸残基も含まない介在ペプチド配列である。
【０１１３】
一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はGITRに特異的に結合して、GITRアゴニストとして働く。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はGITRに特異的に結合して、GITRシグナル伝達を活性化する。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はGITRに特異的に結合して、GITR活性を誘導するか、活性化するか、促進するか、増大させるか、亢進させるか、または延長する。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はOX40に特異的に結合して、OX40アゴニストとして働く。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はOX40に特異的に結合して、OX40シグナル伝達を活性化する。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はOX40に特異的に結合して、OX40活性を誘導するか、活性化するか、促進するか、増大させるか、亢進させるか、または延長する。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はCD40に特異的に結合して、CD40アゴニストとして働く。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はCD40に特異的に結合して、CD40シグナル伝達を活性化する。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はCD40に特異的に結合して、CD40活性を誘導するか、活性化するか、促進するか、増大させるか、亢進させるか、または延長する。
【０１１４】
一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はGITRに特異的に結合して、免疫応答を調整する。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はGITRに特異的に結合して、免疫応答を誘導し、増強させ、増大させ、かつ/または延長する。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はOX40に特異的に結合して、免疫応答を調整する。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はOX40に特異的に結合して、免疫応答を誘導し、増強させ、増大させ、かつ/または延長する。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はCD40に特異的に結合して、免疫応答を調整する。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はCD40に特異的に結合して、免疫応答を誘導し、増強させ、増大させ、かつ/または延長する。
【０１１５】
一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は、TNFRSFのメンバー(例えば、GITR、OX40、またはCD40)に、約1μMもしくはそれ未満、約100nMもしくはそれ未満、約40nMもしくはそれ未満、約20nMもしくはそれ未満、約10nMもしくはそれ未満、約1nMもしくはそれ未満、または約0.1nMもしくはそれ未満の解離定数(KD)で特異的に結合する。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はTNFRSFのメンバー(例えば、GITR、OX40、またはCD40)に約1nMまたはそれ未満のKDで結合する。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はTNFRSFのメンバー(例えば、GITR、OX40、またはCD40)に約0.1nMまたはそれ未満のKDで結合する。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はヒトTNFRSFおよび/またはマウスTNFRSFに約10nMまたはそれ未満のKDで結合する。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はヒトTNFRSFに約10nMまたはそれ未満のKDで結合する。
【０１１６】
一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はヒトGITRおよび/またはマウスGITRに約10nMまたはそれ未満のKDで結合する。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はヒトGITRおよび/またはマウスGITRに約1nMまたはそれ未満のKDで結合する。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はヒトGITRおよび/またはマウスGITRに約0.1nMまたはそれ未満のKDで結合する。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はヒトGITRに結合し、マウスGITRに結合しない。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はヒトGITRに約10nMまたはそれ未満のKDで結合する。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はヒトGITRに約1nMまたはそれ未満のKDで結合する。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はヒトGITRに約0.1nMまたはそれ未満のKDで結合する。
【０１１７】
一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はヒトOX40および/またはマウスOX40に約10nMまたはそれ未満のKDで結合する。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はヒトOX40および/またはマウスOX40に約1nMまたはそれ未満のKDで結合する。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はヒトOX40および/またはマウスOX40に約0.1nMまたはそれ未満のKDで結合する。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はヒトOX40に結合し、マウスOX40に結合しない。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はヒトOX40に約10nMまたはそれ未満のKDで結合する。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はヒトOX40に約1nMまたはそれ未満のKDで結合する。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はヒトOX40に約0.1nMまたはそれ未満のKDで結合する。
【０１１８】
一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はヒトCD40および/またはマウスCD40に約10nMまたはそれ未満のKDで結合する。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はヒトCD40および/またはマウスCD40に約1nMまたはそれ未満のKDで結合する。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はヒトCD40および/またはマウスCD40に約0.1nMまたはそれ未満のKDで結合する。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はヒトCD40に結合し、マウスCD40に結合しない。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はヒトCD40に約10nMまたはそれ未満のKDで結合する。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はヒトCD40に約1nMまたはそれ未満のKDで結合する。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はヒトCD40に約0.1nMまたはそれ未満のKDで結合する。
【０１１９】
一部の態様において、TNFRSFのメンバー(例えば、GITR、OX40、またはCD40)に対する前記ポリペプチドまたは作用物質の解離定数は、Biacoreチップ上に固定された、TNFRSF細胞外ドメインの少なくとも一部を含むTNFRSF融合タンパク質を用いて求められた解離定数である。
【０１２０】
一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は、約1μMもしくはそれ未満、約100nMもしくはそれ未満、約40nMもしくはそれ未満、約20nMもしくはそれ未満、約10nMもしくはそれ未満、約1nMもしくはそれ未満、または約0.1nMもしくはそれ未満の50％効果濃度(half maximal effective concentration)(EC50)でTNFRSFのメンバー(例えば、ヒトGITR、OX40、またはCD40)に結合する。
【０１２１】
ある特定の態様において、融合ポリペプチドは、当業者に公知のように組換えDNA法を用いて作製される。一部の態様において、特定のタンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドは、例えば、このタンパク質をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたRT-PCRによって哺乳動物細胞から単離され、従来の技法を用いてヌクレオチド配列が決定される。単離された、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、大腸菌(E.coli)、サルCOS細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされた場合に前記ポリペプチドを産生する適切な発現ベクターにクローニングされてもよい。他の態様において、組換えタンパク質またはその断片は、ファージディスプレイライブラリーから、または他の細胞表面ディスプレイ法を用いて、単離されてもよい。
【０１２２】
タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドは、組換えDNA技術を用いた多くの異なるやり方で、代わりのタンパク質または変種タンパク質を生じるように改変することができる。タンパク質の部位特異的変異誘発または高密度変異誘発を用いて、組換えタンパク質の特異性、親和性、安定性などを最適化することができる。
【０１２３】
タンパク質は、一般的に、タンパク質の輸送を誘導するシグナル配列を含有する。シグナル配列(シグナルペプチドまたはリーダー配列とも呼ばれる)は新生ポリペプチドのN末端に位置する。シグナル配列はポリペプチドを小胞体に標的化し、タンパク質は目的地に、例えば、細胞小器官の内部空間、内膜、細胞外膜に仕分けされるか、または分泌を介して細胞外部に仕分けされる。タンパク質が小胞体に輸送された後に、ほとんどのシグナル配列はシグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。ポリペプチドからのシグナル配列の切断は、通常、アミノ酸配列中の特異的部位で起こり、シグナル配列内のアミノ酸残基に依存する。通常、一カ所の特異的切断部位があるが、複数の切断部位がシグナルペプチダーゼによって認識および/または使用されて、ポリペプチドの均質でないN末端が生じる場合がある。例えば、シグナル配列内にある異なる切断部位を用いると、異なるN末端アミノ酸を有する発現ポリペプチドを生じることができる。従って、一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドは、異なるN末端を有するポリペプチドの混合物を含んでもよい。一部の態様において、N末端の長さは1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、またはそれより多いアミノ酸分だけ異なる。一部の態様において、N末端の長さは1個、2個、3個、4個、または5個のアミノ酸分だけ異なる。一部の態様において、前記ポリペプチドは実質的に均質である、すなわち、前記ポリペプチドは同じN末端を有する。一部の態様において、前記ポリペプチドのシグナル配列は、前記タンパク質の天然配列と比較して1つまたは複数の(例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個などの)アミノ酸置換および/または欠失を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドのシグナル配列は、一カ所の切断部位が優勢になり、それによって、あるN末端を有する実質的に均質なポリペプチドが生じるのを可能にするアミノ酸置換および/または欠失を含む。一部の態様において、融合ポリペプチドのシグナル配列は、融合ポリペプチドの中に含まれる前記タンパク質の天然シグナル配列でない。
【０１２４】
ある特定の態様において、本明細書に記載のポリペプチド、作用物質、または融合ポリペプチドは免疫グロブリンのFc領域を含む。本発明のポリペプチドまたは作用物質の一部は、天然Fc領域または変えられていないFc領域を含む、ほぼ同じ免疫原性の融合タンパク質と比較した場合に、望ましい生化学的特徴、例えば、増大したがん細胞局在化、増大した腫瘍浸透、短くなった血清半減期、または長くなった血清半減期を提供するように、Fc領域の少なくとも一部が欠失されているか、または他のやり方で変えられている融合タンパク質を含むことが当業者により理解される。Fc領域に対する改変は、1つまたは複数のドメインにおける1つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含んでもよい。本明細書において開示された改変された融合タンパク質は、2つの重鎖定常ドメイン(CH2もしくはCH3)の1つもしくは複数、またはヒンジ領域に対する変化または改変を含んでもよい。他の態様において、CH2ドメイン全体が取り除かれてもよい(ΔCH2構築物)。一部の態様において、取り除かれる定常領域ドメインは、典型的には、存在しない定常領域によって付与される、分子可動性の一部をもたらす短いアミノ酸スペーサー(例えば、10個のaa残基)と取り替えられる。
【０１２５】
一部の態様において、改変された融合タンパク質は、CH3ドメインをヒンジ領域または第1のポリペプチドに直接連結するように操作される。他の態様では、ヒンジ領域または第1のポリペプチドと、改変されたCH2ドメインおよび/またはCH3ドメインとの間にペプチドスペーサーまたはリンカーが挿入される。例えば、CH2ドメインが欠失されており、5〜20アミノ酸スペーサーを用いて、残っているCH3ドメイン(改変または非改変)がヒンジ領域または第1のポリペプチドとつなげられている構築物が発現されてもよい。このようなスペーサーを付加することにより、定常ドメインの調節エレメントを遊離状態でアクセス可能に保つこと、またはヒンジ領域の可動性を保つことができる。しかしながら、アミノ酸スペーサーは場合によっては免疫原性を有することが判明しており、構築物に対して望ましくない免疫応答を誘発する場合があることに留意しなければならない。従って、ある特定の態様では、融合タンパク質の望ましい生物学的特性が維持されるように、構築物に付加されるスペーサーは全て比較的、免疫原性がない。
【０１２６】
一部の態様において、改変された融合タンパク質には、定常ドメインの部分的欠失しかなくてもよいか、または数個のアミノ酸の置換、さらには1個のアミノ酸の置換しかなくてもよい。例えば、Fc結合を大幅に低減させ、それによって、がん細胞局在化および/または組織浸透力を高めるには、CH2ドメインの選択された領域にある1個のアミノ酸を変異させることで十分な場合がある。同様に、特定のエフェクター機能(例えば、補体C1q結合)を制御する1つまたは複数の定常領域ドメインの一部を単に欠失させることが望ましい場合がある。定常領域のこのような部分的欠失は、この定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能をそのままにしながら、前記ポリペプチドまたは作用物質の選択された特性(血清半減期)を改善する可能性がある。さらに、上記で言及したように、開示された融合タンパク質の定常領域は、結果として生じる構築物のプロファイルを向上させる、1つまたは複数のアミノ酸の変異または置換によって改変されてもよい。この点で、改変された融合タンパク質の構成および免疫原性プロファイルを実質的に維持しながら、保存された結合部位(例えば、Fc結合)によって提供される活性を混乱させることが可能な場合がある。ある特定の態様では、改変された融合タンパク質は、エフェクター機能の減少もしくは増大などの望ましい特性を強化するような、または細胞毒もしくは炭水化物接着部位をもっと増やすような、定常領域への1個または複数個のアミノ酸の付加を含む。
【０１２７】
定常領域はいくつかのエフェクター機能を媒介することが当技術分野において公知である。例えば、補体のC1成分と、(抗原に結合した)IgG抗体またはIgM抗体のFc領域が結合すると補体系が活性化される。補体活性化は細胞病原体のオプソニン化および溶解において重要である。補体活性化はまた炎症応答も刺激し、自己免疫過敏にも関与する場合がある。さらに、Fc領域は、Fc受容体(FcR)を発現する細胞に結合することができる。IgG(γ受容体)、IgE(ε受容体)、IgA(α受容体)、およびIgM(μ受容体)を含む異なるクラスの抗体に特異的な多くのFc受容体がある。
【０１２８】
一部の態様において、改変された融合タンパク質はエフェクター機能が変化しており、その結果として、前記ポリペプチドまたは作用物質の生物学的プロファイルが影響を受ける。例えば、一部の態様では、定常領域ドメインの(点変異または他の手段による)欠失または不活性化によって、循環中の改変された作用物質のFc受容体結合が低下し、それによって、がん細胞局在化および/または腫瘍浸透が増大する可能性がある。他の態様では、定常領域改変によって前記ポリペプチドまたは作用物質の血清半減期が延びるかまたは短くなる。一部の態様では、定常領域はジスルフィド結合またはオリゴ糖部分付着部位が無くなるように改変される。
【０１２９】
ある特定の態様において、改変された融合タンパク質には、Fc領域に通常、関連する1つまたは複数のエフェクター機能がない。一部の態様では、前記ポリペプチドまたは作用物質には抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性がない、および/または補体依存性細胞傷害(CDC)活性がない。ある特定の態様では、前記ポリペプチドまたは作用物質はFc受容体および/または補体因子に結合しない。ある特定の態様では、前記ポリペプチドまたは作用物質には、Fc領域に通常、関連するエフェクター機能がない。
【０１３０】
本発明のポリペプチドおよび作用物質は、当技術分野において公知の任意の方法によって、標的との特異的結合についてアッセイすることができる。使用することができるイムノアッセイには、Biacore分析、FACS分析、免疫蛍光、免疫細胞化学、ウエスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、ELISA、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈殿反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光イムノアッセイ、およびプロテインAイムノアッセイなどの技法を用いた競合的アッセイ系および非競合的アッセイ系が含まれるが、これらに限定されない。このようなアッセイは日常的なものであり、当技術分野において周知である。
【０１３１】
例えば、試験作用物質(例えば、ポリペプチド)とヒトGITRとの特異的結合はELISAを用いて測定される場合がある。ELISAアッセイは、GITRタンパク質を調製する工程、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルをGITRでコーティングする工程、検出可能な化合物、例えば、酵素基質(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ)に結合体化された試験作用物質をウェルに添加する工程、ある期間にわたってインキュベートする工程、およびGITRに結合した作用物質の存在を検出する工程を含む。一部の態様において、試験作用物質は、検出可能な化合物に結合体化されず、その代わりに、前記作用物質を認識する標識された二次抗体がウェルに添加される。一部の態様において、ウェルをGITRでコーティングする代わりに、試験作用物質がウェルにコーティングされてもよく、GITRが添加され、GITRを認識する検出可能な化合物に結合体化された第2の抗体を用いて結合を検出することができる。当業者であれば、検出されるシグナルを増やすように改変することができるパラメータ、ならびに当技術分野において公知のELISAの他のバリエーションについて精通しているであろう。
【０１３２】
別の例では、試験作用物質(例えば、ポリペプチド)とヒトGITRとの特異的結合はFACSを用いて測定される場合がある。FACSスクリーニングアッセイは、GITRを発現するcDNA構築物を作製し、トランスフェクションによって構築物を細胞に導入し、細胞表面にGITRを発現させ、試験作用物質を、トランスフェクトされた細胞と混合し、ある期間にわたってインキュベートする工程を含んでもよい。試験作用物質が結合した細胞は、検出可能な化合物と結合体化した二次抗体(例えば、PE結合抗Fc抗体)とフローサイトメーターを用いることで特定される場合がある。当業者であれば、検出されるシグナルを最適化するように改変することができるパラメータ、ならびにスクリーニング(例えば、遮断抗体のスクリーニング)を強化し得るFACSの他のバリエーションについて精通しているであろう。
【０１３３】
競合的結合アッセイによって、試験作用物質と標的(例えば、ヒトGITR)との結合親和性および作用物質-標的相互作用のオフレートを求めることができる。競合的結合アッセイの一例は、漸増量の非標識標的の存在下で、標識された標的(例えば、3Hもしくは125Iで標識されたGITR)またはその断片もしくは変種を関心対象の作用物質とインキュベーションした後に、標識標的に結合した作用物質を検出する工程を含むラジオイムノアッセイである。標的(例えば、ヒトGITR)に対する作用物質の親和性および結合オフレートはスキャッチャードプロット分析によるデータから求めることができる。一部の態様では、標的(例えば、ヒトGITR)に結合する作用物質の結合オンレートおよびオフレートを求めるためにBiacore動態解析が用いられる。Biacore動態解析は、標的(例えば、ヒトGITR)がチップ表面に固定化されているチップからの作用物質の結合および解離を解析する工程を含む。
【０１３４】
本発明はまた、ホモ二量体作用物質およびヘテロ二量体作用物質/分子を包含する。一部の態様において、ホモ二量体作用物質はポリペプチドである。一部の態様において、ヘテロ二量体分子はポリペプチドである。一般的に、ホモ二量体分子は2つの同一のポリペプチドを含む。一般的に、ヘテロ二量体分子は2つの非同一のポリペプチドを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体分子、例えば、二重特異性作用物質は、少なくとも2種類の標的に結合することができる。標的は、例えば、単一細胞の表面にある2つの異なるタンパク質でもよいか、または2つの別々の細胞の表面にある2つの異なるタンパク質でもよい。一部の態様において、二重特異性作用物質はポリペプチドである。従って、一部の態様において、ヘテロ二量体分子の1つのポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチド(例えば、GITR、OX40、またはCD40に結合する単鎖三量体-Fcタンパク質)を含み、ヘテロ二量体分子の1つのポリペプチドは抗体である。ホモ二量体作用物質、ヘテロ二量体作用物質、および/または二重特異性作用物質の構造について述べるために、本明細書において「アーム」という用語が用いられることがある。本明細書で使用する、それぞれの「アーム」は標的に対して作製されている。一部の態様において、ある「アーム」は、抗体に由来する抗原結合部位を含んでもよい。一部の態様において、ある「アーム」は、受容体の結合部分を含んでもよい。一部の態様において、ホモ二量体作用物質は2つの同一のアームを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体作用物質は2つの異なるアームを含む。一部の態様において、二重特異性作用物質は2つの異なるアームを含む。
【０１３５】
一部の態様において、二重特異性作用物質は、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を含む。一部の態様において、二重特異性作用物質はホモ二量体タンパク質である(図3(ii)は代表的な図を示す)。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質は、重鎖免疫グロブリンとTNFSF三量体を含むポリペプチドを含む。一部の態様において、重鎖免疫グロブリンは軽鎖と会合して抗原結合部位を形成する。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質は、抗体と単鎖TNFSF三量体を含むポリペプチドを含む。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質は、単鎖抗体と単鎖TNFSF三量体を含むポリペプチドを含む。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質は、抗体と単鎖GITRL三量体を含むポリペプチドを含む。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質は、抗体と単鎖OX40L三量体を含むポリペプチドを含む。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質は、抗体と単鎖CD40L三量体を含むポリペプチドを含む。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質は、腫瘍抗原に特異的に結合する抗体を含む。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質は、免疫細胞上にある抗原に特異的に結合する抗体を含む。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質は、PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、またはTIM3に特異的に結合する抗体を含む。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質はGITRおよびPD-1に結合する。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質はGITRおよびPD-L1に結合する。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質はOX-40およびPD-1に結合する。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質はOX-40およびPD-L1に結合する。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質はCD40およびPD-1に結合する。一部の態様において、ホモ二量体二重特異性作用物質はCD40およびPD-L1に結合する。
【０１３６】
一部の態様において、二重特異性作用物質はヘテロ二量体タンパク質である(図3(iii)は代表的な図を示す)。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、抗体に由来する抗原結合部位(例えば、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖によって形成される抗原結合部位)とTNFSF三量体を含む。ある特定の態様において、二重特異性作用物質は、免疫応答刺激作用物質またはその機能的断片とTNFSF三量体を含む。
【０１３７】
一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、ある標的に結合することができ、「非結合」機能も含んでいる。従って、一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質の1つのポリペプチドは、本明細書に記載の(例えば、TNFRSF、例えば、GITR、OX40、またはCD40に結合する)ポリペプチドを含み、ヘテロ二量体作用物質の1つのポリペプチドは、さらなる免疫応答刺激作用物質である。本明細書で使用する「免疫応答刺激作用物質」という句は最も広い意味で用いられ、任意の免疫系成分の活性化を誘導することによって、またはその活性を増大させることによって、免疫系を直接的または間接的に刺激する物質を指す。例えば、免疫応答刺激作用物質は、サイトカイン、ならびに腫瘍抗原および病原体に由来する抗原を含む様々な抗原を含んでもよい。一部の態様において、免疫応答刺激作用物質には、コロニー刺激因子(例えば、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、幹細胞因子(SCF))、インターロイキン(例えば、IL-1、IL2、IL-3、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18)、免疫抑制機能をブロックする抗体(例えば、抗CTLA-4抗体、抗CD28抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体)、toll様受容体(例えば、TLR4、TLR7、TLR9)、またはB7ファミリーメンバー(例えば、CD80、CD86)が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３８】
一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、GITRL三量体を含む第1のポリペプチドと、腫瘍抗原に特異的に結合する抗体を含む第2のポリペプチドを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、OX40L三量体を含む第1のポリペプチドと、腫瘍抗原に特異的に結合する抗体を含む第2のポリペプチドを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、CD40L三量体を含む第1のポリペプチドと、腫瘍抗原に特異的に結合する抗体を含む第2のポリペプチドを含む。腫瘍抗原に対する結合特異性を有する二重特異性作用物質は、GITRL、OX40L、またはCD40L三量体ポリペプチドを腫瘍に向けるのに使用することができる。例えば、二重特異性作用物質は、GITRL、OX40L、またはCD40L三量体ポリペプチドを、腫瘍抗原を発現するか、または腫瘍抗原を過剰発現する腫瘍に向けるのに用いられることがある。これは、腫瘍微小環境の近くで、または腫瘍微小環境内で免疫応答を誘導するのにおよび/または亢進させるのに有用な場合がある。一部の態様において、二重特異性作用物質は腫瘍浸潤免疫細胞の活性を誘導するのにまたは亢進させるのに用いられることがある。
【０１３９】
一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、TNFSF三量体を含む第1のポリペプチドと、免疫応答分子に特異的に結合する抗体を含む第2のポリペプチドを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、GITRL三量体を含む第1のポリペプチドと、免疫応答分子に特異的に結合する抗体を含む第2のポリペプチドを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、OX40L三量体を含む第1のポリペプチドと、免疫応答分子に特異的に結合する抗体を含む第2のポリペプチドを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、CD40L三量体を含む第1のポリペプチドと、免疫応答分子に特異的に結合する抗体を含む第2のポリペプチドを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、GITRL三量体を含む第1のポリペプチドと、免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合する抗体を含む第2のポリペプチドを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、OX40L三量体を含む第1のポリペプチドと、免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合する抗体を含む第2のポリペプチドを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、CD40L三量体を含む第1のポリペプチドと、免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合する抗体を含む第2のポリペプチドを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、GITRL三量体を含む第1のポリペプチドと、PD-1に特異的に結合する抗体を含む第2のポリペプチドを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、GITRL三量体を含む第1のポリペプチドと、PD-L1に特異的に結合する抗体を含む第2のポリペプチドを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、OX40L三量体を含む第1のポリペプチドと、PD-1に特異的に結合する抗体を含む第2のポリペプチドを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、OX40L三量体を含む第1のポリペプチドと、PD-L1に特異的に結合する抗体を含む第2のポリペプチドを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、CD40L三量体を含む第1のポリペプチドと、PD-1に特異的に結合する抗体を含む第2のポリペプチドを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、CD40L三量体を含む第1のポリペプチドと、PD-L1に特異的に結合する抗体を含む第2のポリペプチドを含む。
【０１４０】
一部の態様において、さらに強力な細胞性免疫応答を誘発するように、ヘテロ二量体分子(例えば、二重特異性作用物質)は、第1の標的(例えば、GITR、OX40、またはCD40)と、第2の標的、例えば、白血球の表面にあるエフェクター分子(例えば、CD2、CD3、CD28、もしくはCD80)またはFc受容体(例えば、CD64、CD32、もしくはCD16)に結合することができる。
【０１４１】
一部の態様において、ヘテロ二量体またはホモ二量体いずれかの二重特異性作用物質は個別の作用物質と比較して効果が向上している。あらゆる作用物質(例えば、可溶性タンパク質またはサイトカイン)には、特有の薬物動態(PK)(例えば、循環半減期)があり得ることは当業者に公知である。一部の態様において、二重特異性作用物質は、2種類の活性作用物質および/またはポリペプチドのPKを同時発生させる能力を有し、2種類の個別の作用物質および/またはポリペプチドは異なるPKプロファイルを有する。一部の態様において、二重特異性分子は、2種類の作用物質および/またはポリペプチドの作用を共通の領域(例えば、腫瘍および/または腫瘍微小環境)に集める能力を有する。一部の態様において、二重特異性分子は、2種類の作用物質および/またはポリペプチドの作用を共通標的(例えば、腫瘍または腫瘍細胞)に集める能力を有する。一部の態様において、二重特異性作用物質は、2種類の作用物質および/またはポリペプチドの作用を、複数の生物学的経路または免疫応答の複数の局面に標的化する能力を有する。一部の態様において、二重特異性作用物質は、ポリペプチドおよび/または作用物質単独より毒性および/または副作用が弱い。一部の態様において、二重特異性作用物質は、2種類の個別のポリペプチドおよび/または作用物質の混合物と比較して毒性および/または副作用が弱い。一部の態様において、二重特異性作用物質は治療指数が大きい。一部の態様において、二重特異性作用物質は、2種類の個別のポリペプチドおよび/もしくは作用物質の混合物、または単一作用物質としてのポリペプチドおよび/もしくは作用物質と比較して治療指数が大きい。
【０１４２】
単鎖TNFSF三量体は3つの天然TNFSF分子と非常に似たやり方で機能するので、すなわち、3つのTNFRSF分子に結合するので、単鎖TNFSF分子は、抗TNFSFアゴニスト抗体よりも活性が高い可能性があると考えられている。対照的に、抗TNFRSF抗体は2つのTNFRSF分子にしか結合することができず、そのため、どんな潜在的作用も弱くなる。抗体を含む二重特異性分子の作製には、一般的に、その抗体が一価(すなわち、1アーム(one-armed)抗体)であることが必要である。これにより、特に、活性化が標的分子のクラスター化に依存する場合には、アゴニスト抗体の作用は完全に排除されないにしても弱くなる。単鎖TNFSF(例えば、GITRL三量体、OX40L三量体、またはCD40L三量体)は3つのTNFRSF分子に結合することができ、従って、ヘテロ二量体二重特異性分子またはホモ二量体二重特異性分子の一部として機能性も効果も全く失わない。
【０１４３】
一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性分子は、単鎖TNFSF三量体を含む第1のポリペプチドと、抗体を含む第2のポリペプチドを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性分子は、単鎖TNFSF三量体を含む第1のポリペプチドと、アンタゴニスト抗体を含む第2のポリペプチドを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性分子は、単鎖GITRL三量体を含む第1のポリペプチドと、アンタゴニスト抗体を含む第2のポリペプチドを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性分子は、単鎖OX40L三量体を含む第1のポリペプチドと、アンタゴニスト抗体を含む第2のポリペプチドを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性分子は、単鎖CD40L三量体を含む第1のポリペプチドと、アンタゴニスト抗体を含む第2のポリペプチドを含む。
【０１４４】
一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、(a)GITRL細胞外ドメインまたはそのGITR結合断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドを含む第1のアームと、(b)抗体に由来する抗原結合部位を含む第2のアームとを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、(a)GITRL細胞外ドメインまたはそのGITR結合断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドを含む第1のアームと、(b)免疫応答刺激作用物質を含む第2のアームとを含む。一部の態様において、第1のアームの少なくとも1コピーのGITRL細胞外ドメインはSEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:64を含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、SEQ ID NO:5またはSEQ ID NO:66を含む第1のアームを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、非GITRLポリペプチドをさらに含む第1のアームを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、非GITRLポリペプチドに直接連結された、本明細書に記載の単鎖融合GITRLポリペプチドを含む。一部の態様において、単鎖融合ポリペプチドはリンカーによって非GITRLポリペプチドに接続される。一部の態様において、非GITRLポリペプチドはヒトFc領域を含む。一部の態様において、非GITRLポリペプチドは、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、またはSEQ ID NO:61を含む。
【０１４５】
一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、(a)OX40L細胞外ドメインまたはそのOX40結合断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドを含む第1のアームと、(b)抗体に由来する抗原結合部位を含む第2のアームとを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、(a)OX40L細胞外ドメインまたはそのOX40結合断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドを含む第1のアームと、(b)免疫応答刺激作用物質を含む第2のアームとを含む。一部の態様において、第1のアームの少なくとも1コピーのOX40L細胞外ドメインは、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:78、またはSEQ ID NO:79を含む。一部の態様において、二重特異性作用物質は、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、またはSEQ ID NO:72を含む第1のアームを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、非OX40Lポリペプチドをさらに含む第1のアームを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、非OX40Lポリペプチドに直接連結された、本明細書に記載の単鎖融合OX40Lポリペプチドを含む。一部の態様において、単鎖融合ポリペプチドはリンカーによって非OX40Lポリペプチドに接続される。一部の態様において、非OX40LポリペプチドはヒトFc領域を含む。一部の態様において、非OX40Lポリペプチドは、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、またはSEQ ID NO:61を含む。
【０１４６】
一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、(a)CD40L細胞外ドメインまたはそのCD40結合断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドを含む第1のアームと、(b)抗体に由来する抗原結合部位を含む第2のアームとを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、(a)CD40L細胞外ドメインまたはそのCD40結合断片の第1、第2、および第3のコピーを含む単鎖融合ポリペプチドを含む第1のアームと、(b)免疫応答刺激作用物質を含む第2のアームとを含む。一部の態様において、第1のアームの少なくとも1コピーのCD40L細胞外ドメインは、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、またはSEQ ID NO:106を含む。一部の態様において、二重特異性作用物質は、SEQ ID NO:85またはSEQ ID NO:97を含む第1のアームを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、非CD40Lポリペプチドをさらに含む第1のアームを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性作用物質は、非CD40Lポリペプチドに直接連結された、本明細書に記載の単鎖融合CD40Lポリペプチドを含む。一部の態様において、単鎖融合ポリペプチドはリンカーによって非CD40Lポリペプチドに接続される。一部の態様において、非CD40LポリペプチドはヒトFc領域を含む。一部の態様において、非CD40Lポリペプチドは、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、またはSEQ ID NO:61を含む。
【０１４７】
一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性分子は、単鎖TNFSF三量体を含む第1のポリペプチドと、免疫応答刺激作用物質を含む第2のポリペプチドを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性分子は、単鎖GITRL三量体を含む第1のポリペプチドと、免疫応答刺激作用物質を含む第2のポリペプチドを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性分子は、単鎖OX40三量体を含む第1のポリペプチドと、免疫応答刺激作用物質を含む第2のポリペプチドを含む。一部の態様において、ヘテロ二量体二重特異性分子は、単鎖CD40三量体を含む第1のポリペプチドと、免疫応答刺激作用物質を含む第2のポリペプチドを含む。
【０１４８】
一部の態様において、多量体分子(例えば、二重特異性作用物質)は第1のCH3ドメインと第2のCH3ドメインを含み、これらはそれぞれ、ヘテロ多量体またはヘテロ二量体の形成を促進するように改変されている。一部の態様において、第1のCH3ドメインと第2のCH3ドメインはノブ-イントゥー-ホール法を用いて改変される。一部の態様において、第1のCH3ドメインと第2のCH3ドメインは、静電相互作用を変えるアミノ酸変化を含む。一部の態様において、第1のCH3ドメインと第2のCH3ドメインは、疎水性/親水性相互作用を変えるアミノ酸変化を含む(例えば、米国特許出願公開第2011/0123532号を参照されたい)。
【０１４９】
一部の態様において、ヘテロ二量体分子(例えば、二重特異性作用物質)は、(a)SEQ ID NO:15の位置253および292に対応する位置にあるアミノ酸がグルタミン酸またはアスパラギン酸で置き換えられた第1のヒトIgG1定常領域と、SEQ ID NO:15の240および282に対応する位置にあるアミノ酸がリジンで置き換えられた第2のヒトIgG1定常領域;(b)SEQ ID NO:16の位置249および288に対応する位置にあるアミノ酸がグルタミン酸またはアスパラギン酸で置き換えられた第1のヒトIgG2定常領域と、SEQ ID NO:16の位置236および278に対応する位置にあるアミノ酸がリジンで置き換えられた第2のヒトIgG2定常領域;(c)SEQ ID NO:17の位置300および339に対応する位置にあるアミノ酸がグルタミン酸またはアスパラギン酸で置き換えられた第1のヒトIgG3定常領域と、SEQ ID NO:17の位置287および329に対応する位置にあるアミノ酸がリジンで置き換えられた第2のヒトIgG3定常領域;ならびに(d)SEQ ID NO:18の位置250および289に対応する位置にあるアミノ酸がグルタミン酸またはアスパラギン酸で置き換えられた第1のヒトIgG4定常領域と、SEQ ID NO:18の位置237および279に対応する位置にあるアミノ酸がリジンで置き換えられた第2のIgG4定常領域からなる群より選択される重鎖定常領域を含む。
【０１５０】
一部の態様において、ヘテロ二量体分子(例えば、二重特異性作用物質)は、(a)SEQ ID NO:15の位置253および292に対応する位置にあるアミノ酸がグルタミン酸またはアスパラギン酸で置き換えられた第1のヒトIgG1 CH2およびCH3ドメインと、SEQ ID NO:15の240および282に対応する位置にあるアミノ酸がリジンで置き換えられた第2のヒトIgG1 CH2およびCH3ドメイン;(b)SEQ ID NO:16の位置249および288に対応する位置にあるアミノ酸がグルタミン酸またはアスパラギン酸で置き換えられた第1のヒトIgG2 CH2およびCH3ドメインと、SEQ ID NO:16の位置236および278に対応する位置にあるアミノ酸がリジンで置き換えられた第2のヒトIgG2 CH2およびCH3ドメイン;(c)SEQ ID NO:17の位置300および339に対応する位置にあるアミノ酸がグルタミン酸またはアスパラギン酸で置き換えられた第1のヒトIgG3 CH2およびCH3ドメインと、SEQ ID NO:17の位置287および329に対応する位置にあるアミノ酸がリジンで置き換えられた第2のヒトIgG3 CH2およびCH3ドメイン;ならびに(d)SEQ ID NO:18の位置250および289に対応する位置にあるアミノ酸がグルタミン酸またはアスパラギン酸で置き換えられた第1のヒトIgG4 CH2およびCH3ドメインと、SEQ ID NO:18の位置237および279に対応する位置にあるアミノ酸がリジンで置き換えられた第2のIgG4 CH2およびCH3ドメインからなる群より選択される重鎖CH2およびCH3ドメインを含む。
【０１５１】
一部の態様において、ヘテロ二量体分子は2つのアームを含み、第1のアームは、SEQ ID NO:15の位置253および292に対応する位置にアミノ酸置換を有する第1のヒトIgG1定常領域を含み、前記アミノ酸はグルタミン酸またはアスパラギン酸で置き換えられ、第2のアームは、SEQ ID NO:15の位置240および282に対応する位置にアミノ酸置換を有する第2のヒトIgG1定常領域を含み、前記アミノ酸はリジンで置き換えられる。一部の態様において、2つのアームは、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、およびSEQ ID NO:61からなる群より選択されるFc領域を含む。一部の態様において、第1のアームはSEQ ID NO:58を含み、第2のアームはSEQ ID NO:59を含む。一部の態様において、第1のアームはSEQ ID NO:60を含み、第2のアームはSEQ ID NO:61を含む。
【０１５２】
一部の態様において、ヘテロ二量体分子は2つのアームを含み、第1のアームは、SEQ ID NO:16の位置249および288に対応する位置にアミノ酸置換を有する第1のヒトIgG2定常領域を含み、前記アミノ酸は、グルタミン酸またはアスパラギン酸で置き換えられ、第2のアームは、SEQ ID NO:16の位置236および278に対応する位置にアミノ酸置換を有する第2のヒトIgG2定常領域を含み、前記アミノ酸はリジンで置き換えられる。一部の態様において、2つのアームは、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、およびSEQ ID NO:31からなる群より選択されるFc領域を含む。一部の態様において、第1のアームはSEQ ID NO:26を含み、第2のアームはSEQ ID NO:27を含む。一部の態様において、第1のアームはSEQ ID NO:28を含み、第2のアームはSEQ ID NO:30を含む。一部の態様において、第1のアームはSEQ ID NO:29を含み、第2のアームはSEQ ID NO:31を含む。
【０１５３】
一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は一価である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は一価の可溶性タンパク質である。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は二価である。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は三価である。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は単一特異性である。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は二重特異性である。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は多重特異性である。一部の態様において、前記作用物質は、2つのアームを含むヘテロ二量体タンパク質であり、少なくとも1つのアームは一価である。一部の態様において、前記作用物質は、2つのアームを含むヘテロ二量体タンパク質であり、少なくとも1つのアームは二価である。一部の態様において、前記作用物質は、2つのアームを含むヘテロ二量体タンパク質であり、少なくとも1つのアームは三価である(すなわち、3つの標的分子に結合する)。
【０１５４】
一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、本明細書に記載の融合タンパク質および/またはポリペプチドと実質的に相同なポリペプチドを含む。これらの作用物質は、例えば、保存的置換変異、すなわち、類似のアミノ酸による1つまたは複数のアミノ酸の置換を含有してもよい。例えば、保存的置換とは、同じ一般的なクラス内の別のアミノ酸によるアミノ酸の置換、例えば、別の酸性アミノ酸によるある酸性アミノ酸の置換、別の塩基性アミノ酸によるある塩基性アミノ酸の置換、または別の中性アミノ酸によるある中性アミノ酸の置換を指す。保存的アミノ酸置換によって意図されるものは当技術分野において周知であり、本明細書において説明される。
【０１５５】
ある特定の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はGITRに結合して、免疫応答を調整する。ある特定の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はOX40に結合して、免疫応答を調整する。ある特定の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はCD40に結合して、免疫応答を調整する。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は免疫応答を活性化するか、および/または増大させる。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は細胞性免疫を増大させるか、促進するか、または亢進させる。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は自然細胞性免疫を増大させるか、促進するか、または亢進させる。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は適応細胞性免疫を増大させるか、促進するか、または亢進させる。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はT細胞活性を増大させるか、促進するか、または亢進させる。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はCD4+T細胞活性を増大させるか、促進するか、または亢進させる。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はCD8+T細胞活性を増大させるか、促進するか、または亢進させる。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はCTL活性を増大させるか、促進するか、または亢進させる。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はNK細胞活性を増大させるか、促進するか、または亢進させる。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はリンホカイン活性化キラー細胞(LAK)活性を増大させるか、促進するか、または亢進させる。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は腫瘍浸潤リンパ球(TIL)活性を増大させるか、促進するか、または亢進させる。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はTreg細胞活性を阻害するか、または減少させる。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はMDSC細胞活性を阻害するか、または減少させる。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は腫瘍細胞死滅を増大させるか、促進するか、または亢進させる。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は腫瘍成長の阻害を増大させるか、促進するか、または亢進させる。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は、重大な副作用および/もしくは免疫に基づく毒性を引き起こすことなく有効な免疫応答を増大または亢進させる。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は、サイトカイン放出症候群(CRS)もサイトカインストームも引き起こすことなく有効な免疫応答を増大または亢進させする。
【０１５６】
一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はGITRに結合して、GITRシグナル伝達を誘導し、亢進させ、増大させ、かつ/または延長する。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はOX40に結合して、OX40シグナル伝達を誘導し、亢進させ、増大させ、かつ/または延長する。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はCD40に結合して、CD40シグナル伝達を誘導し、亢進させ、増大させ、かつ/または延長する。
【０１５７】
ある特定の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はヒトGITRのアゴニスト(直接的または間接的のいずれか)である。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はGITRのアゴニストであり、免疫応答を活性化するか、および/または増大させる。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はGITRのアゴニストであり、NK細胞および/またはT細胞の活性(例えば、細胞溶解活性またはサイトカイン産生)を活性化しかつ/または増大させる。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は活性を少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または約100％増大させる。
【０１５８】
ある特定の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はヒトOX40のアゴニスト(直接的または間接的のいずれか)である。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はOX40のアゴニストであり、免疫応答を活性化するか、および/または増大させる。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はOX40のアゴニストであり、NK細胞および/またはT細胞の活性(例えば、細胞溶解活性またはサイトカイン産生)を活性化しかつ/または増大させる。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は活性を少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または約100％増大させる。
【０１５９】
ある特定の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はヒトCD40のアゴニスト(直接的または間接的のいずれか)である。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はCD40のアゴニストであり、免疫応答を活性化するか、および/または増大させる。一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はCD40のアゴニストであり、NK細胞および/またはT細胞の活性(例えば、細胞溶解活性またはサイトカイン産生)を活性化しかつ/または増大させる。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は活性を少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または約100％増大させる。
【０１６０】
ある特定の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はNK細胞の活性化を増大させる。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はT細胞の活性化を増大させる。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質がNK細胞および/またはT細胞を活性化すると、NK細胞および/またはT細胞の活性化のレベルが少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％増大する。
【０１６１】
ある特定の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はTreg細胞の抑制活性を阻害するか、または減少させる。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はTreg細胞の活性を阻害する。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質がTreg細胞の抑制活性を阻害すると、Treg細胞の抑制活性は少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％阻害される。
【０１６２】
ある特定の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はMDSCの抑制活性を阻害するか、または減少させる。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質はMDSCの活性を阻害する。ある特定の態様において、ポリペプチドまたは作用物質がMDSCの抑制活性を阻害すると、MDSCの抑制活性は少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％阻害される。
【０１６３】
ポリペプチドまたは作用物質(または候補結合物質)が免疫応答を調整するかどうか判定するためのインビボアッセイおよびインビトロアッセイは当技術分野において公知であるか、または開発中である。一部の態様では、T細胞活性化を検出する機能アッセイを使用することができる。一部の態様では、Treg活性を検出する機能アッセイを使用することができる。一部の態様では、MDSC活性を検出する機能アッセイを使用することができる。一部の態様では、NK細胞活性を検出する機能アッセイを使用することができる。一部の態様では、細胞溶解性T細胞活性を検出する機能アッセイを使用することができる。一部の態様では、サイトカイン産生を検出するアッセイを使用することができる。一部の態様では、サイトカイン産生細胞を検出するアッセイを使用することができる。
【０１６４】
ある特定の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は腫瘍成長を阻害することができる。ある特定の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、インビボで(例えば、マウスモデルにおいて、および/またはがんを有するヒトにおいて)腫瘍成長を阻害することができる。
【０１６５】
ある特定の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は腫瘍の腫瘍形成能を低減することができる。ある特定の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はマウスモデルなどの動物モデルにおいて腫瘍の腫瘍形成能を低減することができる。ある特定の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、マウスモデルなどの動物モデルにおいて、がん幹細胞を含む腫瘍の腫瘍形成能を低減することができる。ある特定の態様において、腫瘍内のがん幹細胞の数または頻度は、少なくとも約1/2、約1/3、約1/5、約1/10、約1/50、約1/100、または約1/1000だけ低減する。ある特定の態様において、がん幹細胞の数または頻度の低減は動物モデルを用いた限界希釈アッセイによって決定される。腫瘍内のがん幹細胞の数または頻度の低減を決定する限界希釈アッセイの使用に関するさらなる例およびガイダンスは、例えば、国際公報番号WO2008/042236、米国特許出願公開第2008/0064049号、および米国特許出願公開第2008/0178305号において見ることができる。
【０１６６】
ある特定の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は、以下の作用のうちの1つまたは複数を有する:腫瘍細胞の増殖を阻害すること、腫瘍成長を阻害すること、腫瘍の腫瘍形成能を低減すること、腫瘍内のがん幹細胞の頻度の低減によって腫瘍の腫瘍形成能を低減すること、腫瘍細胞の細胞死を誘発すること、細胞接触依存性成長の阻害を増大させること、腫瘍細胞アポトーシスを増大させること、上皮間葉転換(EMT)を低減すること、または腫瘍細胞の生存を減少させること。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、以下の作用の1つまたは複数を有する:ウイルス感染を阻害すること、慢性ウイルス感染を阻害すること、ウイルス量を低減する、ウイルス感染細胞の細胞死を誘発すること、またはウイルス感染細胞の数もしくはパーセントを低減すること。
【０１６７】
ある特定の態様では、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも約5時間、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約2日、少なくとも約3日、少なくとも約1週間、少なくとも約2週間、または少なくとも3週間のマウス、ラット、カニクイザル、またはヒトにおける循環半減期を有する。ある特定の態様では、前記ポリペプチドまたは作用物質は、少なくとも約5時間、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約3日、少なくとも約1週間、少なくとも約2週間、または少なくとも3週間のマウス、ラット、カニクイザル、またはヒトにおける循環半減期を有するIgG(例えば、IgG1またはIgG2)融合タンパク質である。ポリペプチドおよび可溶性受容体などの作用物質の半減期を延長(または短縮)させる方法は当技術分野において公知である。例えば、IgG融合タンパク質の循環半減期を延長させる公知の方法には、pH6.0で抗体と胎児性Fc受容体(FcRn)とのpH依存的結合を増大させる、Fc領域への変異の導入が含まれる。Fc領域が無い可溶性受容体の循環半減期を延長させる公知の方法には、ペグ化などの技法が含まれる。
【０１６８】
本発明の一部の態様において、前記作用物質はポリペプチドである。前記ポリペプチドは、GITRに結合する、組換えポリペプチド、天然ポリペプチド、または合成ポリペプチドでもよい。前記ポリペプチドは、OX40に結合する、組換えポリペプチド、天然ポリペプチド、または合成ポリペプチドでもよい。前記ポリペプチドは、CD40に結合する、組換えポリペプチド、天然ポリペプチド、または合成ポリペプチドでもよい。本発明のアミノ酸配列の中には、タンパク質の構造または機能に重大な影響を及ぼすことなく変えることができるものもあることが当技術分野において認められる。従って、本発明は、GITRに対して大きな結合活性を示す前記ポリペプチドのバリエーションをさらに含む。本発明はまた、OX40に対して大きな結合活性を示す前記ポリペプチドのバリエーションも含む。本発明はまた、CD40に対して大きな結合活性を示す前記ポリペプチドのバリエーションも含む。一部の態様において、前記ポリペプチドのアミノ酸配列のバリエーションには、欠失、挿入、逆位、反復、および他のタイプの置換が含まれる。
【０１６９】
前記ポリペプチド、その類似体および変種は、通常、ポリペプチドの一部にはない、さらなる化学部分を含有するように、さらに改変することができる。誘導体化部分はポリペプチドの溶解度、生物学的半減期、および/または吸収を改善することができる。これらの部分はまたポリペプチドおよび変種の望ましくない副作用を低減するか、または無くすこともできる。化学部分の概要は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, Londonにおいて見ることができる。
【０１７０】
本明細書に記載のポリペプチドは、当技術分野において公知の任意の適切な方法によって産生することができる。このような方法は、直接的なタンパク質合成法から、ポリペプチド配列をコードするDNA配列の構築、および適切な宿主におけるこれらの配列の発現に及ぶ。一部の態様において、DNA配列は、組換え技術を用いて、関心対象の野生型タンパク質をコードするDNA配列を単離または合成することによって構築される。任意で、この配列は、その機能類似体を得るために部位特異的変異誘発によって変異誘発することができる。
【０１７１】
一部の態様では、関心対象のポリペプチドをコードするDNA配列は、オリゴヌクレオチド合成機を用いた化学合成によって構築され得る。オリゴヌクレオチドは、望ましいポリペプチドのアミノ酸配列と、関心対象の組換えポリペプチドが産生される宿主細胞において好ましいコドンを選択することに基づいて設計することができる。標準的な方法を用いて、関心対象の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を合成することができる。例えば、完全なアミノ酸配列を用いて、逆翻訳(back-translate)した遺伝子を構築することができる。さらに、特定の単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するDNAオリゴマーを合成することができる。例えば、望ましいポリペプチドの一部をコードする、いくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、次いで、連結することができる。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には、相補的に組み立てるための5'オーバーハングまたは3'オーバーハングを含有する。
【０１７２】
(合成、部位特異的変異誘発、または別の方法によって)組み立てたら、関心対象の特定のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、望ましい宿主におけるタンパク質の発現に適した発現制御配列に機能的に連結することができる。適切に組み立てられたことは、ヌクレオチド配列決定、制限酵素マッピング、および/または適切な宿主における生物学的に活性なポリペプチドの発現によって確かめることができる。当技術分野において周知のように、宿主において、トランスフェクトされた遺伝子の高い発現レベルを得るためには、遺伝子は、選択された発現宿主において機能する転写発現制御配列および翻訳発現制御配列に機能的に連結しなければならない。
【０１７３】
ある特定の態様では、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質をコードするDNAを増幅および発現するために組換え発現ベクターが用いられる。例えば、組換え発現ベクターは、作用物質のポリペプチド鎖をコードする合成DNA断片またはcDNAに由来するDNA断片が、哺乳動物遺伝子、微生物遺伝子、ウイルス遺伝子、または昆虫遺伝子に由来する適切な転写調節エレメントおよび/または翻訳調節エレメントに機能的に連結されている複製可能なDNA構築物でもよい。転写単位は、一般的に、(1)遺伝子発現を調節する役割を有する遺伝因子またはエレメント、例えば、転写プロモーターまたはエンハンサー、(2)mRNAに転写され、タンパク質に翻訳される構造配列またはコード配列、ならびに(3)適切な転写および翻訳の開始配列および終結配列の集合を含む。調節エレメントは、転写を制御するオペレーター配列を含むことがある。複製起点によって通常、付与される、宿主において複製する能力と、形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子をさらに組み込むことができる。DNA領域は、これらが機能的に互いに関連している場合に「機能的に連結されている」。例えば、シグナルペプチド(分泌リーダー)のDNAは、ポリペプチド分泌に関与する前駆体としてポリペプチドが発現されるのであれば、ポリペプチドDNAに機能的に連結されている。プロモーターは、コード配列の転写を制御すれば、コード配列に機能的に連結されている。または、リボソーム結合部位は、コード配列が翻訳されるように配置されていれば、コード配列に機能的に連結されている。一部の態様では、酵母発現系における使用を目的とした構造エレメントには、宿主細胞により翻訳されるタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列が含まれる。他の態様では、組換えタンパク質がリーダー配列も輸送配列もなく発現される場合、N末端メチオニン残基を含むことがある。この残基は、任意で、最終産物を得るために発現組換えタンパク質から後で切断されてもよい。
【０１７４】
発現制御配列および発現ベクターの選択は宿主の選択によって決まる。多種多様な発現宿主/ベクターの組み合わせを使用することができる。真核生物宿主に有用な発現ベクターには、例えば、SV40、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、およびサイトメガロウイルスに由来する発現制御配列を含むベクターが含まれる。細菌宿主に有用な発現ベクターには、公知の細菌プラスミド、例えば、pCR1、pBR322、pMB9およびその誘導体を含む大腸菌に由来するプラスミド、さらに広い宿主域のプラスミド、例えば、M13、ならびに他の繊維状一本鎖DNAファージが含まれる。
【０１７５】
ポリペプチド(または標的として使用するタンパク質)を発現させるのに適した宿主細胞には、適切なプロモーターの制御下にある、原核生物、酵母細胞、昆虫細胞、または高等真核細胞が含まれる。原核生物には、グラム陰性生物またはグラム陽性生物、例えば、大腸菌または桿菌が含まれる。高等真核細胞には、下記に記載の哺乳動物に由来する樹立細胞株が含まれる。無細胞翻訳系も用いられることがある。細菌宿主、真菌宿主、酵母宿主、および哺乳動物細胞宿主と使用するのに適したクローニングベクターおよび発現ベクターは当業者に周知である。
【０１７６】
組換えポリペプチドを発現させるために様々な哺乳動物培養系が用いられる。哺乳動物細胞における組換えタンパク質の発現は、このようなタンパク質がおおむね正しく折り畳まれ、適切に修飾され、かつ生物学的に機能するので望ましい場合がある。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、COS-7(サル腎臓由来)、L-929(マウス線維芽細胞由来)、C127(マウス乳がん由来)、3T3(マウス線維芽細胞由来)、CHO(チャイニーズハムスター卵巣由来)、HeLa(ヒト子宮頸がん由来)、BHK(ハムスター腎臓線維芽細胞由来)、HEK-293(ヒト胚腎臓由来)細胞株、およびその変種が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、非転写エレメント、例えば、複製起点、発現させようとする遺伝子に連結される適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに他の5'または3'隣接非転写配列、ならびに5'または3'非翻訳配列、例えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、ならびに転写終結配列を含むことができる。
【０１７７】
昆虫細胞培養系(例えば、バキュロウイルス)における組換えタンパク質の発現もまた、正しく折り畳まれ、かつ生物学的に機能するタンパク質を産生するための頑強な方法を提供する。昆虫細胞において異種タンパク質を産生するためのバキュロウイルス系は当業者に周知である。
【０１７８】
従って、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドおよび作用物質を含む細胞を提供する。一部の態様において、前記細胞は、本明細書に記載のポリペプチドおよび作用物質を産生する。ある特定の態様において、前記細胞は融合タンパク質を産生する。一部の態様において、前記細胞は可溶性受容体/リガンドを産生する。一部の態様において、前記細胞は抗体を産生する。一部の態様において、前記細胞は二重特異性作用物質を産生する。一部の態様において、前記細胞は二重特異性抗体を産生する。一部の態様において、前記細胞はホモ二量体二重特異性作用物質を産生する。一部の態様において、前記細胞はヘテロ二量体二重特異性作用物質を産生する。
【０１７９】
形質転換宿主により産生されたタンパク質は任意の適切な方法に従って精製することができる。標準的な方法には、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、およびサイジング(sizing)カラムクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質精製のための他の任意の標準的な技法が含まれる。適切なアフィニティカラム上での通過による容易な精製を可能にするために、アフィニティタグ、例えば、ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列、およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼをタンパク質に取り付けることができる。単離されたタンパク質はまた、タンパク質分解、質量分析法(MS)、核磁気共鳴(NMR)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、およびX線結晶学などの技法を用いて物理的に特徴決定することもできる。
【０１８０】
一部の態様では、最初に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、AmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットを用いて、組換えタンパク質を培養培地に分泌する発現系からの上清を濃縮することができる。濃縮工程後に、濃縮物を適切な精製マトリックスに適用することができる。一部の態様では、陰イオン交換樹脂、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル(DEAE)基を有するマトリックスまたは支持体を使用することができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製において一般に用いられる他のタイプでもよい。一部の態様では、陽イオン交換工程を使用することができる。適切な陽イオン交換体には、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性のマトリックスが含まれる。一部の態様では、セラミックヒドロキシアパタイト(CHT)を含むが、これらに限定されないヒドロキシアパタイト媒体を使用することができる。ある特定の態様では、ポリペプチドまたは作用物質をさらに精製するために、疎水性RP-HPLC媒体、例えば、ペンダントメチル基または他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いた1つまたは複数の逆相HPLC工程を使用することができる。均質な組換えタンパク質を得るために、前述の精製工程の一部または全てを様々な組み合わせで使用することもできる。
【０１８１】
一部の態様では、細菌培養において産生された組換えタンパク質は、例えば、最初に、細胞ペレットから抽出し、その後に、1回または複数回の濃縮、塩析、水性イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフィー工程を行うことによって単離することができる。最後の精製工程にはHPLCを使用することができる。組換えタンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む任意の便利な法によって破壊することができる。
【０１８２】
ある特定の態様では、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は、免疫グロブリンFc領域を含まないポリペプチドである。ある特定の態様では、前記ポリペプチドは、プロテインA、プロテインG、リポカリン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサス反復ドメイン、およびチオレドキシンからなる群より選択されるタイプのタンパク質スキャフォールドを含む。タンパク質標的に高親和性で結合する非抗体ポリペプチドを特定および産生するための様々な方法が当技術分野において公知である。ある特定の態様では、結合ポリペプチドを産生および/または特定するために、ファージディスプレイ技術が用いられることがある。ある特定の態様では、結合ポリペプチドを産生および/または特定するために、哺乳動物細胞ディスプレイ技術が用いられることがある。
【０１８３】
さらに、血清半減期を延ばす(または短くする)ようにポリペプチドを改変することが望ましい場合がある。これは、例えば、サルベージ(salvage)受容体結合エピトープを前記ポリペプチドに組み込むことによって、前記ポリペプチドにある適切な領域を変異させることによって、またはペプチドタグにエピトープを組み込み、次いで、これを、(例えば、DNA合成もしくはペプチド合成によって)どちらかの端に、もしくは中央で前記ポリペプチドと融合させることによって達成することができる。
【０１８４】
ヘテロ結合分子も本発明の範囲内にある。ヘテロ結合分子は、共有結合した2種類のポリペプチドからなる。例えば、免疫細胞を、腫瘍細胞などの不必要な細胞に標的化するために、このような抗体が提案されている。ヘテロ結合分子は、架橋剤が関与する方法を含む、合成タンパク質化学において公知の方法を用いてインビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成することによって免疫毒素を構築することができる。この目的に適した試薬の例には、イミノチオラートおよびメチル-4-メルカプトブチルイミダートが含まれる。
【０１８５】
ある特定の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は、多数の結合体化した形(すなわち、免疫結合体もしくは放射性結合体(radioconjugate))または結合体化していない形のいずれか1つで使用することができる。ある特定の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、CDCおよびADCCを含む対象の自然防御機構を用いて悪性細胞またはがん細胞を排除するために、結合体化していない形で使用することができる。
【０１８６】
ある特定の態様において、本明細書に記載の作用物質は低分子である。「低分子」という用語は、一般的に、定義からしてペプチド/タンパク質ではない低分子量有機化合物を指す。
【０１８７】
一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は細胞傷害作用物質に結合体化される。一部の態様において、細胞傷害作用物質は、メトトレキセート、アドリアマイシン(adriamicin)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロランブシル、ダウノルビシン、または他の挿入剤を含むが、これらに限定されない化学療法剤である。一部の態様において、細胞傷害作用物質は、細菌、真菌、植物、もしくは動物に由来する酵素活性を有する毒素、またはジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンA鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、シナアブラギリ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンシンタンパク質、アメリカヤマゴボウ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、およびPAP-S)、ニガウリ(Momordica charantia)阻害物質、クルシン、クロチン、サボンソウ(Sapaonaria officinalis)阻害物質、ゲロニン、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)、およびトリコテセン(tricothecene)を含むが、これらに限定されない、その断片である。一部の態様において、細胞傷害作用物質は、放射性結合体または放射性結合作用物質を生成するための放射性同位体である。放射性結合作用物質を生成するために、90Y、125I、131I、123I、111In、131In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re、188Re、および212Biを含むが、これらに限定されない様々な放射性核種を用いることができる。ポリペプチドまたは作用物質と、カリチアマイシン、マイタンシノイド、トリコテン(trichothene)、およびCC1065、ならびに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体などの1種類または複数種の低分子毒素との結合体も使用することができる。ポリペプチドまたは作用物質と細胞傷害作用物質との結合体は、様々な二官能性タンパク質カップリング物質、例えば、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジジチオール(pyridyidithiol))プロピオナート(SPDP)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(例えば、アジプイミド酸ジメチルHCL)、活性エステル(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド(例えば、グルタレルデヒド(glutareldehyde))、ビス-アジド化合物(例えば、ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン2,6-ジイソシアネート)、およびビス活性フッ素化合物(例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン)を用いて作製される。
【０１８８】
III.ポリヌクレオチド
ある特定の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを包含する。「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコード配列しか含まないポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列および/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形をとってもよいか、またはDNAの形をとってもよい。DNAはcDNA、ゲノムDNA、および合成DNAを含み、二本鎖または一本鎖でもよく、一本鎖であればコード鎖または非コード(アンチセンス)鎖でもよい。
【０１８９】
ある特定の態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、およびSEQ ID NO:9からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、およびSEQ ID NO:81からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、およびSEQ ID NO:106からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:73、およびSEQ ID NO:86からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。一部の態様において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意のGITR結合物質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の態様において、前記ポリヌクレオチドは、ブダペスト条約の規定に基づいて2015年4月21日にATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USAに寄託されかつ指定番号PTA-122112が付与されたプラスミド「hGITRL-hIgG1」である。一部の態様において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意のOX40結合物質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の態様において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意のCD40結合物質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の態様において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意のGITR結合物質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、シグナル配列を含む。一部の態様において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意のOX40結合物質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、シグナル配列を含む。一部の態様において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意のCD40結合物質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、シグナル配列を含む。一部の態様において、ベクターは前記ポリヌクレオチドを含む。一部の態様において、細胞は前記ポリヌクレオチドを含む。一部の態様において、細胞は前記ベクターを含む。一部の態様において、前記細胞は単離されている。
【０１９０】
ある特定の態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、およびSEQ ID NO:9からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと少なくとも80％同一の、少なくとも85％同一の、少なくとも90％同一の、少なくとも95％同一の、一部の態様では少なくとも96％、97％、98％、または99％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。ある特定の態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、およびSEQ ID NO:81からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと少なくとも80％同一の、少なくとも85％同一の、少なくとも90％同一の、少なくとも95％同一の、一部の態様では少なくとも96％、97％、98％、または99％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。ある特定の態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、およびSEQ ID NO:106からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと少なくとも80％同一の、少なくとも85％同一の、少なくとも90％同一の、少なくとも95％同一の、一部の態様では少なくとも96％、97％、98％、または99％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。
【０１９１】
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、およびSEQ ID NO:9からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドも提供される。SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、およびSEQ ID NO:81からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドも提供される。SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、およびSEQ ID NO:106からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドも提供される。ある特定の態様において、ハイブリダイゼーションは高ストリンジェンシー条件下で行われる。高ストリンジェンシー条件は当業者に公知であり、(1)洗浄のために低いイオン強度および高い温度、例えば、50℃で、15mM塩化ナトリウム/1.5mMクエン酸ナトリウム(1×SSC)+0.1％ドデシル硫酸ナトリウムを使用する条件;(2)ハイブリダイゼーションの間に、5×SSC(0.75M NaCl、75mMクエン酸ナトリウム)に溶解した変性剤、例えば、ホルムアミド、例えば、50％(v/v)ホルムアミド+0.1％ウシ血清アルブミン/0.1％Ficoll/0.1％ポリビニルピロリドン/50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.5を42℃で使用する条件;または(3)50％ホルムアミド、5×SSC、50mMリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1％ピロリン酸ナトリウム、5×デンハート溶液、超音波処理済みサケ精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS、および10％硫酸デキストランを42℃で使用し、55℃で50％ホルムアミドを含有する0.2×SSCで洗浄し、その後に、EDTAを含有する0.1×SSCからなる高ストリンジェンシー洗浄を55℃で行う条件を含んでもよいが、これに限定されない。
【０１９２】
ある特定の態様において、ポリヌクレオチドは、同じ読み枠で、ポリヌクレオチド、例えば、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチド(例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列)と融合した成熟ポリペプチドのコード配列を含む。リーダー配列を有するポリペプチドがプレタンパク質であり、成熟型ポリペプチドを形成するために宿主細胞によって切断されるリーダー配列を有してもよい。前記ポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質+さらなる5'アミノ酸残基であるプロタンパク質をコードしてもよい。プロ配列を有する成熟タンパク質がプロタンパク質であり、不活性型タンパク質である。プロ配列が切断されると、活性のある成熟タンパク質が残る。
【０１９３】
ある特定の態様において、ポリヌクレオチドは、同じ読み枠で、マーカー配列、例えば、コードされるポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列と融合した成熟ポリペプチドのコード配列を含む。例えば、マーカー配列は、細菌宿主の場合、マーカーと融合した成熟ポリペプチドを精製するための、pQE-9ベクターによって供給されるヘキサヒスチジンタグでもよい。または、マーカー配列は、哺乳動物宿主(例えば、COS-7細胞)が用いられる場合、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来する血球凝集素(HA)タグでもよい。一部の態様において、マーカー配列は、他のアフィニティタグと共に使用することができ、配列DYKDDDDK(SEQ ID NO:39)のペプチドであるFLAG-タグである。
【０１９４】
本発明はさらに、例えば、断片、類似体、および/または誘導体をコードする上記で説明したポリヌクレオチドの変種に関する。
【０１９５】
ある特定の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも約80％同一、少なくとも約85％同一、少なくとも約90％同一、少なくとも約95％同一、一部の態様では少なくとも約96％、97％、98％、または99％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。
【０１９６】
本明細書で使用する、参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば95％「同一の」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドという句は、前記ポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の100ヌクレオチドごとに5個までの点変異を含むことができること以外は、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意味することが意図される。言い換えると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列にあるヌクレオチドを5％まで欠失させるか、または別のヌクレオチドで置換することができる。または、参照配列にある全ヌクレオチドの5％までの数のヌクレオチドを参照配列に挿入することができる。参照配列のこれらの変異は参照ヌクレオチド配列の5'末端位置もしくは3'末端位置または末端位置の間にあるどの場所でも起こってもよく、参照配列においてヌクレオチド間で個別に散在してもよく、参照配列内で1つまたは複数の連続したグループとなって散在してもよい。
【０１９７】
ポリヌクレオチド変種は、コード領域、非コード領域、またはその両方の変化を含有してもよい。一部の態様において、ポリヌクレオチド変種は、サイレントな置換、付加、または欠失を生じるが、コードされるポリペプチドの性質も活性も変えない変化を含有する。一部の態様において、ポリヌクレオチド変種は、(遺伝暗号の縮重により)ポリペプチドのアミノ酸配列を変えないサイレントな置換を含む。ポリヌクレオチド変種は、様々な理由で、例えば、特定の宿主に合わせてコドン発現を最適化するように生成することができる(すなわち、ヒトmRNAのコドンを、細菌宿主、例えば、大腸菌に好ましいコドンに変えることができる)。一部の態様において、ポリヌクレオチド変種は配列の非コード領域またはコード領域において少なくとも1つのサイレント変異を含む。
【０１９８】
一部の態様において、コードされるポリペプチドの発現(または発現レベル)を調整するために、または変えるためにポリヌクレオチド変種が生成される。一部の態様において、コードされるポリペプチドの発現を増やすために、ポリヌクレオチド変種が生成される。一部の態様において、コードされるポリペプチドの発現を減らすために、ポリヌクレオチド変種が生成される。一部の態様において、ポリヌクレオチド変種は、コードされるポリペプチドの発現を親ポリヌクレオチド配列と比較して増やす。一部の態様において、ポリヌクレオチド変種は、コードされるポリペプチドの発現を親ポリヌクレオチド配列と比較して減らす。
【０１９９】
一部の態様において、ヘテロ二量体分子の産生を増やすために、(コードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなく)少なくとも1種類のポリヌクレオチド変種が生成される。一部の態様において、二重特異性作用物質、二重特異性抗体、またはヘテロ二量体作用物質の産生を増やすために、(コードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなく)少なくとも1種類のポリヌクレオチド変種が生成される。
【０２００】
ある特定の態様において、前記ポリヌクレオチドは単離されている。ある特定の態様において、前記ポリヌクレオチドは実質的に純粋である。
【０２０１】
本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターおよび細胞も提供される。一部の態様において、発現ベクターはポリヌクレオチド分子を含む。一部の態様において、宿主細胞は、前記ポリヌクレオチド分子を含む発現ベクターを含む。一部の態様において、宿主細胞はポリヌクレオチド分子を含む。
【０２０２】
IV.使用方法および薬学的組成物
本発明のポリペプチドまたは作用物質は、がん免疫療法などの治療的処置方法を含むが、これに限定されない様々な用途において有用である。ある特定の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は、免疫応答を活性化するのに、促進するのに、増大させるのに、および/もしくは亢進させるのに、腫瘍成長を阻害するのに、腫瘍量を低減するのに、腫瘍退縮を誘導するのに、腫瘍細胞アポトーシスを増大させるのに、ならびに/または腫瘍の腫瘍形成能を低減するのに有用である。ある特定の態様において、本発明のポリペプチドまたは作用物質はまたウイルスなどの病原体に対する免疫療法にも有用である。ある特定の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は、ウイルス感染を阻害するのに、ウイルス感染を低減するのに、ウイルス感染細胞アポトーシスを増大させるのに、および/またはウイルス感染細胞の死滅を増大させるのに有用である。前記使用方法は、インビトロ方法、エクスビボ方法、またはインビボ方法でもよい。
【０２０３】
本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を用いて、対象において免疫応答を活性化するための方法を提供する。一部の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を用いて、対象において免疫応答を促進するための方法を提供する。一部の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を用いて、対象において免疫応答を増大させるための方法を提供する。一部の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を用いて、対象において免疫応答を亢進させるための方法を提供する。一部の態様において、免疫応答の活性化、促進、増大、および/または亢進は細胞性免疫の増大を含む。一部の態様において、免疫応答の活性化、促進、増大、および/または亢進はTh1型応答の増大を含む。一部の態様において、免疫応答の活性化、促進、増大、および/または亢進はT細胞活性の増大を含む。一部の態様において、免疫応答の活性化、促進、増大、および/または亢進はCD4+T細胞活性の増大を含む。一部の態様において、免疫応答の活性化、促進、増大、および/または亢進はCD8+T細胞活性の増大を含む。一部の態様において、免疫応答の活性化、促進、増大、および/または亢進はCTL活性の増大を含む。一部の態様において、免疫応答の活性化、促進、増大、および/または亢進はNK細胞活性の増大を含む。一部の態様において、免疫応答の活性化、促進、増大、および/または亢進はT細胞活性の増大およびNK細胞活性の増大を含む。一部の態様において、免疫応答の活性化、促進、増大、および/または亢進はCTL活性の増大およびNK細胞活性の増大を含む。一部の態様において、免疫応答の活性化、促進、増大、および/または亢進はTreg細胞の抑制活性の阻害または減少を含む。一部の態様において、免疫応答の活性化、促進、増大、および/または亢進はMDSCの抑制活性の阻害または減少を含む。一部の態様において、免疫応答の活性化、促進、増大、および/または亢進は記憶T細胞のパーセントの数の増加を含む。一部の態様において、免疫応答の活性化、促進、増大、および/または亢進は長期免疫記憶機能の増大を含む。一部の態様において、免疫応答の活性化、促進、増大、および/または亢進は長期記憶の増大を含む。一部の態様において、免疫応答の活性化、促進、増大、および/または亢進は、重大な副作用および/または免疫に基づく毒性の証拠を含まない。一部の態様において、免疫応答の活性化、促進、増大、および/または亢進はサイトカイン放出症候群(CRS)の証拠もサイトカインストームの証拠も含まない。一部の態様において、免疫応答は抗原性刺激の結果である。一部の態様において、抗原性刺激は腫瘍細胞である。一部の態様において、抗原性刺激はがんである。一部の態様において、抗原性刺激は病原体である。一部の態様において、抗原性刺激はウイルス感染細胞である。
【０２０４】
作用物質またはポリペプチドが免疫応答を調整、活性化、または阻害するかどうか判定するためのインビボアッセイおよびインビトロアッセイは当技術分野において公知であるか、または開発されている最中である。
【０２０５】
一部の態様において、対象において免疫応答を増大させる方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質はヒトGITRに結合する。一部の態様において、対象において免疫応答を増大させる方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質は、GITRに特異的に結合する単鎖融合ポリペプチドである。一部の態様において、対象において免疫応答を増大させる方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質は単鎖GITRL三量体を含む。
【０２０６】
一部の態様において、対象において免疫応答を増大させる方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質はヒトOX40に結合する。一部の態様において、対象において免疫応答を増大させる方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質は、OX40に特異的に結合する単鎖融合ポリペプチドである。一部の態様において、対象において免疫応答を増大させる方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質は単鎖OX40L三量体を含む。
【０２０７】
一部の態様において、対象において免疫応答を増大させる方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質はヒトCD40に結合する。一部の態様において、対象において免疫応答を増大させる方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質は、CD40に特異的に結合する単鎖融合ポリペプチドである。一部の態様において、対象において免疫応答を増大させる方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質は単鎖CD40L三量体を含む。
【０２０８】
本明細書に記載の方法のある特定の態様において、腫瘍に対する持続性または長期の免疫応答を活性化するかまたは亢進させる方法は、治療的有効量の、ヒトGITRに結合するポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、腫瘍に対する持続性の免疫応答を活性化するかまたは亢進させる方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質は、GITRに特異的に結合する単鎖融合ポリペプチドである。一部の態様において、腫瘍に対する持続性の免疫応答を活性化するかまたは亢進させる方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質は単鎖GITRL三量体を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドは単鎖GITRL三量体とFc領域を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドは336B3である。一部の態様において、前記ポリペプチドは336B11である。
【０２０９】
本明細書に記載の方法のある特定の態様において、腫瘍に対する持続性または長期の免疫応答を活性化するかまたは亢進させる方法は、治療的有効量の、ヒトOX40に結合するポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、腫瘍に対する持続性の免疫応答を活性化するかまたは亢進させる方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質は、OX40に特異的に結合する単鎖融合ポリペプチドである。一部の態様において、腫瘍に対する持続性の免疫応答を活性化するかまたは亢進させる方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質は単鎖OX40L三量体を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドは単鎖OX40L三量体とFc領域を含む。
【０２１０】
本明細書に記載の方法のある特定の態様において、腫瘍に対する持続性または長期の免疫応答を活性化するかまたは亢進させる方法は、治療的有効量の、ヒトCD40に結合するポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、腫瘍に対する持続性の免疫応答を活性化するかまたは亢進させる方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質は、CD40に特異的に結合する単鎖融合ポリペプチドである。一部の態様において、腫瘍に対する持続性の免疫応答を活性化するかまたは亢進させる方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質は単鎖CD40L三量体を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドは単鎖CD40L三量体とFc領域を含む。
【０２１１】
本明細書に記載の方法のある特定の態様において、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する持続性または長期の免疫を誘導する方法は、治療的有効量の、ヒトGITRに結合するポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する持続性の免疫を誘導する方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質は、GITRに特異的に結合する単鎖融合ポリペプチドである。一部の態様において、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する持続性の免疫を誘導する方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質は単鎖GITRL三量体を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドは単鎖GITRL三量体とFc領域を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドは336B3である。一部の態様において、前記ポリペプチドは336B11である。
【０２１２】
本明細書に記載の方法のある特定の態様において、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する持続性または長期の免疫を誘導する方法は、治療的有効量の、ヒトOX40に結合するポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する持続性の免疫を誘導する方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質は、OX40に特異的に結合する単鎖融合ポリペプチドである。一部の態様において、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する持続性の免疫を誘導する方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質は単鎖OX40L三量体を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドは単鎖OX40L三量体とFc領域を含む。
【０２１３】
本明細書に記載の方法のある特定の態様において、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する持続性または長期の免疫を誘導する方法は、治療的有効量の、ヒトCD40に結合するポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する持続性の免疫を誘導する方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質は、CD40に特異的に結合する単鎖融合ポリペプチドである。一部の態様において、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する持続性の免疫を誘導する方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質は単鎖CD40L三量体を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドは単鎖CD40L三量体とFc領域を含む。
【０２１４】
本明細書に記載の方法のある特定の態様において、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する方法は、治療的有効量の、ヒトGITRに結合するポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質は、GITRに特異的に結合する単鎖融合ポリペプチドである。一部の態様において、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質は単鎖GITRL三量体を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドは単鎖GITRL三量体とFc領域を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドは336B3である。一部の態様において、前記ポリペプチドは336B11である。
【０２１５】
本明細書に記載の方法のある特定の態様において、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する方法は、治療的有効量の、ヒトOX40に結合するポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質は、OX40に特異的に結合する単鎖融合ポリペプチドである。一部の態様において、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質は単鎖OX40L三量体を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドは単鎖OX40L三量体とFc領域を含む。
【０２１６】
本明細書に記載の方法のある特定の態様において、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する方法は、治療的有効量の、ヒトCD40に結合するポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質は、CD40に特異的に結合する単鎖融合ポリペプチドである。一部の態様において、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは作用物質は単鎖CD40L三量体を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドは単鎖CD40L三量体とFc領域を含む。
【０２１７】
本発明はまた、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を用いて、腫瘍の成長を阻害するための方法も提供する。ある特定の態様において、腫瘍の成長を阻害する方法は、インビトロで、細胞混合物をポリペプチドまたは作用物質と接触させる工程を含む。例えば、免疫細胞(例えば、T細胞、細胞溶解性T細胞、またはNK細胞)と混合した不死化細胞株またはがん細胞株が、試験作用物質が添加された培地中で培養される。一部の態様において、腫瘍細胞は、患者試料、例えば、組織生検材料、胸水、または血液試料から単離され、免疫細胞(例えば、T細胞、細胞溶解性T細胞、および/またはNK細胞)と混合され、試験作用物質が添加された培地中で培養される。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は免疫細胞の活性を増大させ、促進し、かつ/または亢進させる。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は腫瘍細胞成長を阻害する。
【０２１８】
ある特定の態様において、腫瘍の成長を阻害する方法は、インビボで腫瘍または腫瘍細胞を本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質と接触させる工程を含む。ある特定の態様において、腫瘍または腫瘍細胞をポリペプチドまたは作用物質と接触させる工程は動物モデルにおいて企てられる。例えば、試験作用物質は、腫瘍を有するマウスに投与されてもよい。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、マウスにおいて免疫細胞の活性を増大させ、促進し、かつ/または亢進させる。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は腫瘍成長を阻害する。一部の態様において、腫瘍成長を阻止するために、動物に腫瘍細胞が投与されるのと同時に、または腫瘍細胞が投与された直後に、前記ポリペプチドまたは作用物質は投与される(「予防モデル」)。一部の態様において、腫瘍が、指定されたサイズまで成長した後に、前記ポリペプチドまたは作用物質は治療剤として投与される(「治療モデル」)。
【０２１９】
ある特定の態様において、腫瘍の成長を阻害する方法は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む。ある特定の態様において、対象はヒトである。ある特定の態様において、対象は腫瘍を有するか、対象は腫瘍が取り除かれている。
【０２２０】
さらに、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む、対象において腫瘍の成長を阻害する方法を提供する。ある特定の態様において、腫瘍はがん幹細胞を含む。ある特定の態様において、腫瘍内のがん幹細胞の頻度は、前記ポリペプチドまたは作用物質の投与によって低減する。一部の態様において、治療的有効量のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む、対象における腫瘍内のがん幹細胞の頻度を低減する方法が提供される。一部の態様において、前記ポリペプチドは336B3である。一部の態様において、前記ポリペプチドは336B11である。
【０２２１】
さらに、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む、対象において腫瘍の腫瘍形成能を低減する方法を提供する。ある特定の態様において、腫瘍はがん幹細胞を含む。一部の態様において、腫瘍の腫瘍形成能は、腫瘍内のがん幹細胞の頻度を低減することによって低減する。一部の態様において、前記方法は、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を使用する工程を含む。ある特定の態様において、腫瘍内のがん幹細胞の頻度はポリペプチドまたは作用物質の投与によって低減する。
【０２２２】
一部の態様において、腫瘍は固形腫瘍である。ある特定の態様において、腫瘍は、結腸直腸腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、肝臓腫瘍、乳腺腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、神経内分泌腫瘍、胃腸腫瘍、メラノーマ、子宮頸部腫瘍、膀胱腫瘍、グリア芽細胞腫、および頭頸部腫瘍からなる群より選択される腫瘍である。ある特定の態様において、腫瘍は結腸直腸腫瘍である。ある特定の態様において、腫瘍は卵巣腫瘍である。一部の態様において、腫瘍は肺腫瘍である。ある特定の態様において、腫瘍は膵臓腫瘍である。ある特定の態様において、腫瘍はメラノーマ腫瘍である。一部の態様において、腫瘍は膀胱腫瘍である。
【０２２３】
一部の態様において、腫瘍は、前記ポリペプチドまたは作用物質、例えば、腫瘍抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む二重特異性作用物質によって標的化される腫瘍抗原を発現するか、または過剰発現する。
【０２２４】
本発明はさらに、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む、対象においてがんを処置するための方法を提供する。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はGITRに結合して、がんの成長を阻害または低減する。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はOX40に結合して、がんの成長を阻害または低減する。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質はCD40に結合して、がんの成長を阻害または低減する。一部の態様において、前記ポリペプチドは336B3である。一部の態様において、前記ポリペプチドは336B11である。
【０２２５】
本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象(例えば、処置を必要とする対象)に投与する工程を含む、がんを処置する方法を提供する。ある特定の態様において、対象はヒトである。ある特定の態様において、対象はがん性腫瘍を有する。ある特定の態様において、対象は腫瘍が取り除かれている。
【０２２６】
ある特定の態様において、がんは、結腸直腸がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、肝臓がん、乳がん、腎臓がん、前立腺がん、胃腸がん、メラノーマ、子宮頸がん、神経内分泌がん、膀胱がん、脳がん、グリア芽細胞腫、および頭頸部がんからなる群より選択されるがんである。ある特定の態様において、がんは膵臓がんである。ある特定の態様において、がんは卵巣がんである。ある特定の態様において、がんは結腸直腸がんである。ある特定の態様において、がんは乳がんである。ある特定の態様において、がんは前立腺がんである。ある特定の態様において、がんは肺がんである。ある特定の態様において、がんはメラノーマである。一部の態様において、がんは膀胱がんである。
【０２２７】
一部の態様において、がんは血液がんである。一部の態様において、がんは、急性骨髄性白血病(AML)、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、T細胞急性リンパ芽球性白血病(T-ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、毛様細胞性白血病、慢性骨髄性白血病(CML)、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、および皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)からなる群より選択される。
【０２２８】
本発明はまた、細胞を、有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質と接触させる工程を含む、細胞におけるTNFRSF(例えば、GITR、OX40、またはCD40)シグナル伝達を活性化するかまたは亢進させる方法も提供する。一部の態様において、細胞におけるGITRシグナル伝達を活性化するかまたは亢進させる方法は、細胞を、有効量の本明細書に記載のGITR結合ポリペプチドまたは作用物質と接触させる工程を含む。一部の態様において、細胞におけるOX40シグナル伝達を活性化するかまたは亢進させる方法は、細胞を、有効量の本明細書に記載のOX40結合ポリペプチドまたは作用物質と接触させる工程を含む。一部の態様において、細胞におけるCD40シグナル伝達を活性化するかまたは亢進させる方法は、細胞を、有効量の本明細書に記載のCD40結合ポリペプチドまたは作用物質と接触させる工程を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドは336B3である。一部の態様において、前記ポリペプチドは336B11である。ある特定の態様において、前記細胞はT細胞である。一部の態様において、前記細胞は細胞溶解性細胞である。一部の態様において、前記細胞はCTLである。一部の態様において、前記細胞はNK細胞である。ある特定の態様において、前記方法は、細胞を前記ポリペプチドまたは作用物質と接触させる工程が、治療的有効量の前記ポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含むインビボ方法である。一部の態様において、前記方法はインビトロ方法またはエクスビボ方法である。
【０２２９】
本発明は、TNFRSFおよび/またはTNFSFの発現レベルを決定する方法を提供する。一部の態様において、GITR発現レベルが決定される。一部の態様において、GITRL発現レベルが決定される。一部の態様において、OX40発現レベルが決定される。一部の態様において、OX40L発現レベルが決定される。一部の態様において、CD40発現レベルが決定される。一部の態様において、CD40L発現レベルが決定される。細胞、腫瘍、またはがんにおける核酸発現レベルを決定するための方法は当業者に公知である。これらの方法には、PCRに基づくアッセイ、マイクロアレイ分析、およびヌクレオチド配列決定(例えば、NextGen配列決定)が含まれるが、これらに限定されない。細胞、腫瘍、またはがんにおけるタンパク質発現レベルを決定するための方法には、ウエスタンブロット分析、タンパク質アレイ、ELISA、免疫組織化学(IHC)、およびFACSが含まれるが、これらに限定されない。
【０２３０】
腫瘍またはがんの核酸発現レベルまたはタンパク質発現レベルが高いかどうか決定するための方法では様々な試料を使用することができる。一部の態様において、試料は、腫瘍またはがんを有する対象から採取される。一部の態様において、試料は新鮮な腫瘍/がん試料である。一部の態様において、試料は、凍結した腫瘍/がん試料である。一部の態様において、試料は、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した試料である。一部の態様において、試料は血液試料である。一部の態様において、試料は血漿試料である。一部の態様において、試料は細胞溶解産物まで処理される。一部の態様において、試料はDNAまたはRNAまで処理される。
【０２３１】
本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を含む組成物を提供する。本発明はまた、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む薬学的組成物も提供する。一部の態様において、薬学的組成物は免疫療法において用いられる。一部の態様において、薬学的組成物は免疫腫瘍学において用いられる。一部の態様において、前記組成物は腫瘍成長の阻害において用いられる。一部の態様において、薬学的組成物は対象(例えば、ヒト患者)における腫瘍成長の阻害において用いられる。一部の態様において、前記組成物はがんの処置において用いられる。一部の態様において、薬学的組成物は対象(例えば、ヒト患者)におけるがんの処置において用いられる。
【０２３２】
精製された本発明の作用物質と、薬学的に許容されるビヒクル(例えば、担体または賦形剤)を組み合わせることによって、保管および使用のための製剤が調製される。当業者は、普通、薬学的に許容される担体、賦形剤、および/または安定剤が製剤または薬学的組成物の不活性成分であると考える。
【０２３３】
一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は、20mMヒスチジン、40mM NaCl、5％スクロース、および0.01％ポリソルベート20を含む緩衝液中に製剤化される。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は、pH5.5の、20mMヒスチジン、40mM NaCl、5％スクロース、および0.01％ポリソルベート20を含む緩衝液中に製剤化される。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は、pH6.0の、20mMヒスチジン、40mM NaCl、5％スクロース、および0.01％ポリソルベート20を含む緩衝液中に製剤化される。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は、pH6.5の、20mMヒスチジン、40mM NaCl、5％スクロース、および0.01％ポリソルベート20を含む緩衝液中に製剤化される。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は、pH6.0の、20mMヒスチジン、100mM NaCl、150mMスクロース、および0.01％ポリソルベート20を含む緩衝液中に製剤化される。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は、pH7.5の、10mMリン酸カリウムおよび0.04％ポリソルベート20を含む緩衝液中に製剤化される。
【０２３４】
従って、一部の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を含み、約20mMヒスチジン、約40mM NaCl、約5％スクロース、および約0.01％ポリソルベート20をさらに含む組成物または薬学的組成物を提供する。一部の態様において、組成物のpHは約pH5.5、約pH6.0、または約pH6.5である。
【０２３５】
一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質は、凍結乾燥され、かつ/または凍結乾燥された形で保管される。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を含む製剤は凍結乾燥される。
【０２３６】
適切な薬学的に許容されるビヒクルには、無毒の緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸;塩、例えば、塩化ナトリウム;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化物質;防腐剤、例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノール、およびm-クレゾール;低分子量ポリペプチド(例えば、約10未満のアミノ酸残基);タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン;炭水化物、例えば、単糖、二糖、グルコース、マンノース、またはデキストリン;キレート剤、例えば、EDTA;糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール;塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム;金属錯体、例えば、Zn-タンパク質錯体;および非イオン界面活性剤、例えば、TWEENまたはポリエチレングリコール(PEG)が含まれるが、これらに限定されない。(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London)。
【０２３７】
本発明の薬学的組成物は局所処置または全身処置のための多様な手法で投与することができる。投与は、表皮パッチもしくは経皮パッチ、軟膏、ローション剤、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液剤、および散剤による局部投与;ネブライザーによる投与を含む、散剤もしくはエアゾール剤の吸入もしくはガス注入による肺投与、気管内投与、および鼻腔内投与;経口投与;または静脈内投与、動脈内投与、腫瘍内投与、皮下投与、腹腔内投与、もしくは筋肉内投与(例えば、注射もしくは注入)を含む非経口投与;あるいは頭蓋内投与(例えば、くも膜下腔内投与もしくは脳室内投与)でもよい。
【０２３８】
治療用製剤は単位剤形でもよい。このような製剤には、錠剤、丸剤、カプセル、散剤、顆粒剤、水もしくは非水性媒体に溶解した溶液もしくは懸濁液、または坐剤が含まれる。錠剤などの固形組成物では、主要な有効成分が薬学的担体と混合されている。従来の錠剤化成分には、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、またはゴム、および希釈剤(例えば、水)が含まれる。これらを用いて、本発明の化合物またはその無毒な薬学的に許容される塩の均質な混合物を含有する固体の予備処方組成物を形成することができる。次いで、固体の予備処方組成物は上述のタイプの単位剤形にさらに分けられる。長期作用という利点を与える剤形を得るために、製剤または組成物の錠剤、丸剤などがコーティングされてもよいか、または他の方法で調合されてもよい。例えば、錠剤または丸剤は内部組成物が外部成分によって覆われてもよい。さらに、崩壊に抵抗するよう働いて、内部成分がそのまま胃を通過するのを可能にするか、またはその放出を遅らせることができる腸溶層によって、2つの成分は分離されてもよい。このような腸溶層またはコーティングには様々な材料を使用することができる。このような材料には、多くのポリマー酸、ならびにポリマー酸と、セラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースのような材料との混合物が含まれる。
【０２３９】
本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質はまたマイクロカプセルの中に封入することもできる。このようなマイクロカプセルは、例えば、コアセルベーション技法または界面重合法によって調製され、それぞれ、例えば、Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London.に記載のように、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセルを、コロイド状薬物送達システム(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル)の中に、またはマクロエマルジョンの中に入れる。
【０２４０】
ある特定の態様では、薬学的製剤には、リポソームと複合体化した本発明のポリペプチドまたは作用物質が含まれる。リポソームを生成する方法は当業者に公知である。例えば、リポソームの中には、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(PEG-PE)を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発によって作製できるものもある。規定された孔径のフィルターに通してリポソームを押し出すことにより、望ましい直径を有するリポソームを得ることができる。
【０２４１】
ある特定の態様では、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を含む徐放性調製物を生成することができる。徐放性調製物の適切な例には、ポリペプチドまたは作用物質を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、そのマトリックスは、成形された物品(例えば、フィルムまたはマイクロカプセル)の形をしている。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル、例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)またはポリ(ビニルアルコール)、ポリ乳酸、L-グルタミン酸と7エチル-L-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商標)(乳酸-グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドで構成される注射可能なミクロスフェア)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ショ糖酢酸イソ酪酸エステル、ならびにポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【０２４２】
ある特定の態様では、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を投与する工程に加えて、前記方法または処置は、少なくとも1種類のさらなる免疫応答刺激作用物質を投与する工程をさらに含む。一部の態様において、さらなる免疫応答刺激作用物質には、コロニー刺激因子(例えば、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、幹細胞因子(SCF))、インターロイキン(例えば、IL-1、IL2、IL-3、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18)、チェックポイント阻害物質、免疫抑制機能をブロックする抗体(例えば、抗CTLA-4抗体、抗CD28抗体、抗CD3抗体)、toll様受容体(例えば、TLR4、TLR7、TLR9)、またはB7ファミリーのメンバー(例えば、CD80、CD86)が含まれるが、これらに限定されない。さらなる免疫応答刺激作用物質は、前記ポリペプチドもしくは作用物質が投与される前に、前記ポリペプチドもしくは作用物質が投与されると同時に、および/または前記ポリペプチドもしくは作用物質が投与された後に投与することができる。ポリペプチドまたは作用物質と免疫応答刺激作用物質を含む薬学的組成物も提供される。一部の態様において、免疫応答刺激作用物質は、1種類、2種類、3種類、またはそれより多い免疫応答刺激作用物質を含む。
【０２４３】
ある特定の態様では、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を投与する工程に加えて、前記方法または処置は少なくとも1種類のさらなる治療用物質を投与する工程をさらに含む。さらなる治療用物質は、前記ポリペプチドもしくは作用物質が投与される前に、前記ポリペプチドもしくは作用物質が投与されると同時に、および/または前記ポリペプチドもしくは作用物質が投与された後に投与することができる。ポリペプチドまたは作用物質とさらなる治療用物質を含む薬学的組成物も提供される。一部の態様において、少なくとも1種類のさらなる治療用物質は、1種類、2種類、3種類、またはそれより多いさらなる治療用物質を含む。
【０２４４】
2種類またはそれ以上の治療用物質を用いた併用療法では、異なる作用機構によって働く作用物質を使用することが多いが、このことは必要とされない。異なる作用機構を有する作用物質を用いた併用療法を用いると相加効果または相乗効果が得られることがある。併用療法を用いると、各作用物質の用量が、単独療法において用いられる用量より少なくなり、それによって、前記ポリペプチドもしくは作用物質の毒性副作用が低減しかつ/または前記ポリペプチドもしくは作用物質の治療指数が増加する可能性がある。併用療法は、耐性がん細胞が発生する可能性を小さくする可能性がある。一部の態様において、併用療法は、免疫応答に影響を及ぼす(例えば、応答を亢進させるかまたは活性化する)治療用物質と、腫瘍/がん細胞に影響を及ぼす(腫瘍/がん細胞を阻害または死滅する)治療用物質とを含む。
【０２４５】
本明細書に記載の方法の一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質と、少なくとも1種類のさらなる治療用物質を組み合わせると相加的または相乗的な結果が得られる。一部の態様において、併用療法は前記ポリペプチドまたは作用物質の治療指数を増加させる。一部の態様において、併用療法は、さらなる治療用物質の治療指数を増加させる。一部の態様において、併用療法は、前記ポリペプチドまたは作用物質の毒性および/または副作用を減少させる。一部の態様において、併用療法は、さらなる治療用物質の毒性および/または副作用を減少させる。
【０２４６】
治療用物質の有用なクラスには、例えば、抗チューブリン剤、アウリスタチン(auristatin)、DNA副溝結合物質、DNA複製阻害物質、アルキル化剤(例えば、白金錯体、例えば、シスプラチン、モノ(白金)、ビス(白金)、およびトリ-核白金錯体、ならびにカルボプラチン)、アントラサイクリン、抗生物質、葉酸代謝拮抗剤、代謝拮抗物質、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン(lexitropsin)、ニトロソ尿素、プラチノール、プリン代謝拮抗物質、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害物質、ビンカアルカロイドなどが含まれる。ある特定の態様では、第2の治療用物質は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗有糸分裂剤、トポイソメラーゼ阻害物質、または血管形成阻害物質である。
【０２４７】
本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質と組み合わせて投与され得る治療用物質には化学療法剤が含まれる。従って、一部の態様では、前記の方法または処置は、本発明のポリペプチドまたは作用物質と化学療法剤を組み合わせて、または化学療法剤のカクテルと組み合わせて投与することを伴う。ポリペプチドまたは作用物質による処置は、化学療法が投与される前に、化学療法が投与されると同時に、または化学療法が投与された後に行うことができる。併用投与は、1種類の薬学的製剤中におけるもしくは別個の製剤を用いた同時投与を含んでもよいか、またはどちらの順番でもよいが、活性作用物質の全てがその生物活性を同時に発揮できるように一般的にある期間内で行われる連続投与を含んでもよい。このような化学療法剤の調製および投与計画は、製造業者の説明書に従って、または当業者により経験的に決定されたように使用することができる。このような化学療法の調製および投与計画はまた、The Chemotherapy Source Book, 4th Edition, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PAに記載されている。
【０２４８】
本発明において有用な化学療法剤には、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロスホスファミド(cyclosphosphamide)(サイトキサン(CYTOXAN));アルキルスルホナート、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン;アジリジン、例えば、ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、およびウレドーパ(uredopa);アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチローロメラミン(trimethylolomelamime)を含む、エチレンイミンおよびメチルアメラミン(methylamelamine)、ナイトロジェンマスタード、例えば、クロランブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビシン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード;ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン;抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン(carabicin)、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ユベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン;代謝拮抗物質、例えば、メトトレキセートおよび5-フルオロウラシル(5-FU);葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート;プリン類似体、例えば、フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン(thiamiprine)、チオグアニン;ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シトシンアラビノシド、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、5-FU;アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン;抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン;葉酸補充剤、例えば、フロリン酸(folinic acid);アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトレキサート(edatraxate);デフォファミン(defofamine);デメコルチン;ジアジクオン;エルフォルミチン(elformithine);酢酸エリプチニウム;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシ尿素;レンチナン;ロニダミン;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダモール;ニトラクリン;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ポドフィリニック酸;2-エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK;ラゾキサン;シゾフラン(sizofuran);スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジクオン;2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン;ウレタン;���ンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン(gacytosine);アラビノシド(Ara-C);タキソイド、例えば、パクリタキセル(タキソール(TAXOL))およびドセタキセル(タキソテール(TAXOTERE));クロランブシル;ゲムシタビン;6-チオグアニン;メルカプトプリン;白金類似体、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン;ビンブラスチン;白金;エトポシド(VP-16);イホスファミド;マイトマイシンC;ミトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン;ナベルビン;ノバントロン;テニポシド;ダウノマイシン;アミノプテリン;イバンドロン酸;CPT11;トポイソメラーゼ阻害物質RFS2000;ジフルオロメチルオルニチン(DMFO);レチノイン酸;エスペラミシン;カペシタビン(ゼローダ(XELODA));および前記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含まれるが、これらに限定されない。化学療法剤には、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように働く抗ホルモン剤、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害4(5)-イミダゾール、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン、およびトレミフェン(ファレストン(FARESTON))を含む抗エストロゲン、ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン、ならびに前記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も含まれる。ある特定の態様において、さらなる治療用物質はシスプラチンである。ある特定の態様において、さらなる治療用物質はカルボプラチンである。
【０２４９】
本明細書に記載の方法のある特定の態様において、化学療法剤はトポイソメラーゼ阻害物質である。トポイソメラーゼ阻害物質は、トポイソメラーゼ酵素(トポイソメラーゼIまたはII)の働きを妨害する化学療法剤である。トポイソメラーゼ阻害物質には、ドキソルビシンHCl、クエン酸ダウノルビシン、ミトキサントロンHCl、アクチノマイシンD、エトポシド、トポテカンHCl、テニポシド(VM-26)、およびイリノテカン、ならびにこれらのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含まれるが、これらに限定されない。一部の態様において、さらなる治療用物質はイリノテカンである。
【０２５０】
ある特定の態様において、化学療法剤は代謝拮抗物質である。代謝拮抗物質は、正常な生化学反応に必要な代謝産物に似ているが、細胞の1つまたは複数の正常機能、例えば、細胞分裂を妨害するのに十分に異なる構造を有する化学物質である。代謝拮抗物質には、ゲムシタビン、フルオロウラシル、カペシタビン、メトトレキセートナトリウム、ラルチトラキセド、ペメトレキセド、テガフール、シトシンアラビノシド、チオグアニン、5-アザシチジン、6-メルカプトプリン、アザチオプリン、6-チオグアニン、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、およびクラドリビン、ならびにこれらのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の態様では、さらなる治療用物質はゲムシタビンである。
【０２５１】
本明細書に記載の方法のある特定の態様において、化学療法剤は、チューブリンに結合する剤を含むが、これに限定されない有糸分裂阻害剤である。一部の態様において、前記剤はタキサンである。ある特定の態様では、前記剤は、パクリタキセルもしくはドセタキセル、またはパクリタキセルもしくはドセタキセルの薬学的に許容される塩、酸、もしくは誘導体である。ある特定の態様では、前記剤は、パクリタキセル(タキソール)、ドセタキセル(タキソテール)、アルブミン結合パクリタキセル(例えば、nab-パクリタキセル;アブラキサン(ABRAXANE))、DHA-パクリタキセル、またはPG-パクリタキセルである。ある特定の他の態様では、有糸分裂阻害剤は、ビンカアルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、もしくはビンデシン、またはその薬学的に許容される塩、酸、もしくは誘導体を含む。一部の態様では、有糸分裂阻害剤は、キネシンEg5の阻害物質または有糸分裂キナーゼ、例えば、AuroraAもしくはPlk1の阻害物質である。ある特定の態様では、さらなる治療用物質はパクリタキセルである。ある特定の態様では、さらなる治療用物質はnab-パクリタキセルである。
【０２５２】
本明細書に記載の方法の一部の態様において、さらなる治療用物質は低分子などの作用物質を含む。例えば、処置は、本発明のポリペプチドまたは作用物質と、EGFR、HER2(ErbB2)、および/またはVEGFを含むが、これらに限定されない腫瘍関連抗原に対する阻害物質として働く低分子との併用投与を伴ってもよい。一部の態様において、本発明のポリペプチドまたは作用物質は、ゲフィチニブ(イレッサ(IRESSA))、エルロチニブ(タルセバ(TARCEVA))、スニチニブ(ステント(SUTENT))、ラパタニブ(lapatanib)、バンデタニブ(ザクティマ(ZACTIMA))、AEE788、CI-1033、セジラニブ(レセンチン(RECENTIN))、ソラフェニブ(ネクサバール(NEXAVAR))、およびパゾパニブ(GW786034B)からなる群より選択されるプロテインキナーゼ阻害物質と併用投与される。一部の態様において、さらなる治療用物質はmTOR阻害物質を含む。
【０２５３】
本明細書に記載の方法のある特定の態様において、さらなる治療用物質は、がん幹細胞経路を阻害する低分子である。一部の態様において、さらなる治療用物質はNotch経路の阻害物質である。一部の態様において、さらなる治療用物質はWnt経路の阻害物質である。一部の態様において、さらなる治療用物質はBMP経路の阻害物質である。一部の態様において、さらなる治療用物質はHippo経路の阻害物質である。一部の態様において、さらなる治療用物質はmTOR/AKR経路の阻害物質である。一部の態様において、さらなる治療用物質はRSPO/LGR経路の阻害物質である。
【０２５４】
本明細書に記載の方法の一部の態様において、さらなる治療用物質は抗体などの生物学的分子を含む。例えば、処置は、本発明のポリペプチドまたは作用物質と、EGFR、HER2/ErbB2、および/またはVEGFに結合する抗体を含むが、これらに限定されない、腫瘍関連抗原に対する抗体との併用投与を伴ってもよい。ある特定の態様において、さらなる治療用物質は、がん幹細胞マーカーに特異的な抗体である。一部の態様において、さらなる治療用物質は、Notch経路の成分に結合する抗体である。一部の態様において、さらなる治療用物質は、Wnt経路の成分に結合する抗体である。ある特定の態様において、さらなる治療用物質は、がん幹細胞経路を阻害する抗体である。一部の態様において、さらなる治療用物質はNotch経路の阻害物質である。一部の態様において、さらなる治療用物質はWnt経路の阻害物質である。一部の態様において、さらなる治療用物質はBMP経路の阻害物質である。一部の態様において、さらなる治療用物質は、β-カテニンシグナル伝達を阻害する抗体である。ある特定の態様において、さらなる治療用物質は、血管形成阻害物質である抗体(例えば、抗VEGF抗体または抗VEGF受容体抗体)である。ある特定の態様において、さらなる治療用物質は、ベバシズマブ(アバスチン(AVASTIN))、ラムシルマブ(ramucirumab)、トラスツズマブ(ハーセプチン(HERCEPTIN))、ペルツズマブ(オムニターグ(OMNITARG))、パニツムマブ(ベクチビックス(VECTIBIX))、ニモツズマブ(nimotuzumab)、ザルツムマブ、またはセツキシマブ(エルビタックス(ERBITUX))である。
【０２５５】
本明細書に記載の方法の一部の態様において、さらなる治療用物質は、免疫応答を調整する抗体である。一部の態様において、さらなる治療用物質は、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、または抗TIGIT抗体である。
【０２５６】
さらに、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を用いた処置は、他の生物分子、例えば、1種類または複数種のサイトカイン(例えば、リンホカイン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、および/もしくは成長因子)との併用処置を含んでもよいか、または腫瘍の外科的除去、がん細胞の除去、もしくは処置を行っている医師により必要であると考えられた他の任意の療法を伴ってもよい。一部の態様において、さらなる治療用物質は免疫応答刺激作用物質である。
【０２５７】
本明細書に記載の方法の一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、アドレノメデュリン(AM)、アンジオポエチン(Ang)、BMP、BDNF、EGF、エリスロポエチン(EPO)、FGF、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GDF9、HGF、HDGF、IGF、遊走刺激因子(migration-stimulating factor)、ミオスタチン(GDF-8)、NGF、ニューロトロフィン、PDGF、トロンボポエチン、TGF-α、TGF-β、TNF-α、VEGF、PｌGF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、およびIL-18からなる群より選択される成長因子と組み合わせることができる。
【０２５８】
本明細書に記載の方法の一部の態様において、さらなる治療用物質は免疫応答刺激作用物質である。一部の態様において、免疫応答刺激作用物質は、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、インターロイキン3(IL-3)、インターロイキン12(IL-12)、インターロイキン1(IL-1)、インターロイキン2(IL-2)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、4-1BBリガンド、抗CD3抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIGIT抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG-3抗体、および抗TIM-3抗体からなる群より選択される。
【０２５９】
本明細書に記載の方法の一部の態様において、免疫応答刺激作用物質は、PD-1活性のモジュレーター、PD-L1活性のモジュレーター、PD-L2活性のモジュレーター、CTLA-4活性のモジュレーター、CD28活性のモジュレーター、CD80活性のモジュレーター、CD86活性のモジュレーター、4-1BB活性のモジュレーター、OX40活性のモジュレーター、KIR活性のモジュレーター、Tim-3活性のモジュレーター、LAG3活性のモジュレーター、CD27活性のモジュレーター、CD40活性のモジュレーター、GITR活性のモジュレーター、TIGIT活性のモジュレーター、CD20活性のモジュレーター、CD96活性のモジュレーター、IDO1活性のモジュレーター、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子(TNF)ファミリーのメンバー、および免疫賦活性オリゴヌクレオチドからなる群より選択される。
【０２６０】
本明細書に記載の方法の一部の態様において、免疫応答刺激作用物質は、PD-1アンタゴニスト、PD-L1アンタゴニスト、PD-L2アンタゴニスト、CTLA-4アンタゴニスト、CD80アンタゴニスト、CD86アンタゴニスト、KIRアンタゴニスト、Tim-3アンタゴニスト、LAG3アンタゴニスト、TIGITアンタゴニスト、CD20アンタゴニスト、CD96アンタゴニスト、および/またはIDO1アンタゴニストからなる群より選択される。
【０２６１】
本明細書に記載の方法の一部の態様において、PD-1アンタゴニストは、PD-1に特異的に結合する抗体である。一部の態様において、PD-1に結合する抗体は、KEYTRUDA(MK-3475)、ピディリズマブ(pidilizumab)(CT-011)、ニボルマブ(nivolumab)(OPDIVO、BMS-936558、MDX-1106)、MEDI0680(AMP-514)、REGN2810、BGB-A317、PDR-001、またはSTI-A1110である。一部の態様において、PD-1に結合する抗体、例えば、APE2058、APE1922、APE1923、APE1924、APE1950、もしくはAPE1963と確認された抗体、またはこれらの任意の抗体のCDR領域を含有する抗体はPCT公報WO2014/179664に記載されている。他の態様において、PD-1アンタゴニストはPD-L2、例えば、AMP-224を含む融合タンパク質である。他の態様において、PD-1アンタゴニストはペプチド阻害物質、例えば、AUNP-12である。
【０２６２】
一部の態様において、PD-L1アンタゴニストは、PD-L1に特異的に結合する抗体である。一部の態様において、PD-L1に結合する抗体は、アテゾリズマブ(atezolizumab)(RG7446、MPDL3280A)、MEDI4736、BMS-936559(MDX-1105)、アベルマブ(avelumab)(MSB0010718C)、KD033、KD033の抗体部分、またはSTI-A1014である。一部の態様において、PD-L1に結合する抗体、例えば、Ab-14、Ab-16、Ab-30、Ab-31、Ab-42、Ab-50、Ab-52、またはAb-55、またはこれらの任意の抗体のCDR領域を含有する抗体はPCT公報WO2014/055897に記載されている。
【０２６３】
一部の態様において、CTLA-4アンタゴニストは、CTLA-4に特異的に結合する抗体である。一部の態様において、CTLA-4に結合する抗体はイピリムマブ(ヤーボイ(YERVOY))またはトレメリムマブ(tremelimumab)(CP-675,206)である。一部の態様において、CTLA-4アンタゴニストは、CTLA-4融合タンパク質、例えば、KAHR-102である。
【０２６４】
一部の態様において、LAG3アンタゴニストは、LAG3に特異的に結合する抗体である。一部の態様において、LAG3に結合する抗体は、IMP701、IMP731、BMS-986016、LAG525、およびGSK2831781である。一部の態様において、LAG3アンタゴニストには、可溶性LAG3受容体、例えば、IMP321が含まれる。
【０２６５】
一部の態様において、KIRアンタゴニストは、KIRに特異的に結合する抗体である。一部の態様において、KIRに結合する抗体はイリルマブ(lirilumab)である。
【０２６６】
一部の態様において、免疫応答刺激作用物質は、CD28アゴニスト、4-1BBアゴニスト、OX40アゴニスト、CD27アゴニスト、CD80アゴニスト、CD86アゴニスト、CD40アゴニスト、およびGITRアゴニストからなる群より選択される。
【０２６７】
一部の態様において、OX40アゴニストにはOX40リガンドまたはそのOX40結合部分が含まれる。例えば、OX40アゴニストはMEDI6383でもよい。一部の態様において、OX40アゴニストは、OX40に特異的に結合する抗体である。一部の態様において、OX40に結合する抗体は、MEDI6469、MEDI0562、またはMOXR0916(RG7888)である。一部の態様において、OX40アゴニストは、OX40リガンドを発現することができるベクター(例えば、発現ベクターまたはウイルス、例えば、アデノウイルス)である。一部の態様においてOX40発現ベクターはDelta-24-RGDOXまたはDNX2401である。
【０２６８】
一部の態様において、4-1BB(CD137)アゴニストは、アンチカリンなどの結合分子である。一部の態様において、アンチカリンはPRS-343である。一部の態様において、4-1BBアゴニストは、4-1BBに特異的に結合する抗体である。一部の態様において、4-1BBに結合する抗体はPF-2566(PF-05082566)またはウレルマブ(urelumab)(BMS-663513)である。
【０２６９】
一部の態様において、CD27アゴニストは、CD27に特異的に結合する抗体である。一部の態様において、CD27に結合する抗体はバリルマブ(varlilumab)(CDX-1127)である。
【０２７０】
一部の態様において、GITRアゴニストはGITRリガンドまたはそのGITR結合部分を含む。一部の態様において、GITRアゴニストは、GITRに特異的に結合する抗体である。一部の態様において、GITRに特異的に結合する抗体は、TRX518、MK-4166、またはINBRX-110である。
【０２７１】
一部の態様において、免疫応答刺激作用物質には、サイトカイン、例えば、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、および腫瘍壊死因子(TNF)ファミリーのメンバーが含まれるが、これらに限定されない。一部の態様において、免疫応答刺激作用物質には免疫賦活性オリゴヌクレオチド、例えば、CpGジヌクレオチドが含まれる。
【０２７２】
一部の態様において、免疫応答刺激作用物質には、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗CD28抗体、抗CD80抗体、抗CD86抗体、抗4-1BB抗体、抗OX40抗体、抗KIR抗体、抗Tim-3抗体、抗LAG3抗体、抗CD27抗体、抗CD40抗体、抗GITR抗体、抗TIGIT抗体、抗CD20抗体、抗CD96抗体、または抗IDO1抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【０２７３】
一部の態様において、対象においてがんを処置する方法は、チェックポイント阻害物質と組み合わせて、治療的有効量の本明細書に記載のGITR結合ポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-1抗体である。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-1抗体であり、がんはメラノーマである。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-1抗体であり、がんは肺がんである。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-1抗体であり、がんは膀胱がんである。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-1抗体であり、がんは血液がんである。
【０２７４】
一部の態様において、対象においてがんを処置する方法は、チェックポイント阻害物質と組み合わせて、治療的有効量の本明細書に記載のGITR結合ポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-L1抗体である。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-L1抗体であり、がんはメラノーマである。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-L1抗体であり、がんは肺がんである。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-L1抗体であり、がんは膀胱がんである。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-L1抗体であり、がんは乳がんである。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-L1抗体であり、がんは血液がんである。
【０２７５】
一部の態様において、対象においてがんを処置する方法は、チェックポイント阻害物質と組み合わせて、治療的有効量の本明細書に記載のOX40結合ポリペプチドまたは作用物質を、対象に投与する工程を含む。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-1抗体である。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-1抗体であり、がんはメラノーマである。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-1抗体であり、がんは肺がんである。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-1抗体であり、がんは膀胱がんである。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-1抗体であり、がんは血液がんである。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-L1抗体である。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-L1抗体であり、がんはメラノーマである。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-L1抗体であり、がんは肺がんである。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-L1抗体であり、がんは膀胱がんである。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-L1抗体であり、がんは乳がんである。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-L1抗体であり、がんは血液がんである。
【０２７６】
一部の態様において、対象においてがんを処置する方法は、チェックポイント阻害物質と組み合わせて、治療的有効量の本明細書に記載のCD40結合ポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-1抗体である。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-1抗体であり、がんはメラノーマである。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-1抗体であり、がんは肺がんである。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-1抗体であり、がんは膀胱がんである。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-1抗体であり、がんは血液がんである。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-L1抗体である。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-L1抗体であり、がんはメラノーマである。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-L1抗体であり、がんは肺がんである。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-L1抗体であり、がんは膀胱がんである。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-L1抗体であり、がんは乳がんである。一部の態様において、チェックポイント阻害物質は抗PD-L1抗体であり、がんは血液がんである。
【０２７７】
本明細書に記載の方法のある特定の態様において、処置は、本発明のポリペプチドまたは作用物質と放射線療法との併用投与を伴う。ポリペプチドまたは作用物質による処置は、放射線療法の投与の前に、放射線療法の投与と同時に、または放射線療法の投与の後に行ってもよい。このような放射線療法の投与計画は当業者により決定することができる。
【０２７８】
本明細書に記載の方法のある特定の態様において、処置は、本発明のポリペプチドまたは作用物質と抗ウイルス療法との併用投与を伴う。ポリペプチドまたは作用物質による処置は、抗ウイルス療法の投与の前に、抗ウイルス療法の投与と同時に、または抗ウイルス療法の投与の後に行ってもよい。併用療法において用いられる抗ウイルス薬は、対象に感染しているウイルスによって決まる。
【０２７９】
併用投与は、1種類の薬学的製剤中におけるもしくは別個の製剤を用いた同時投与を含んでもよいか、またはどちらの順番でもよいが、一般的に、活性作用物質の全てがその生物活性を同時に発揮できるような期間内で行われる連続投与を含んでもよい。
【０２８０】
本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質と少なくとも1種類のさらなる治療用物質の組み合わせは、任意の順序で投与されてもよいか、または同時に投与されてもよいことが理解される。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は、第2の治療用物質を用いて以前に治療されたことがある患者に投与される。ある特定の他の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質と第2の治療用物質は実質的に同時に、または同時に投与される。例えば、対象は、第2の治療用物質(例えば、化学療法)による治療コースを受けながらポリペプチドまたは作用物質が与えられてもよい。ある特定の態様では、ポリペプチドまたは作用物質は、第2の治療用物質で処置して1年以内に投与される。ある特定の他の態様では、ポリペプチドまたは作用物質は、第2の治療用物質で処置して10ヶ月以内、8ヶ月以内、6ヶ月以内、4ヶ月以内、または2ヶ月以内に投与される。ある特定の他の態様では、ポリペプチドまたは作用物質は、第2の治療用物質で処置して4週間以内、3週間以内、2週間以内、または1週間以内に投与される。一部の態様では、ポリペプチドまたは作用物質は、第2の治療用物質で処置して5日以内、4日以内、3日以内、2日以内、または1日以内に投与される。さらに、2種類の(またはそれより多い)作用物質または処置が数時間または数分のうちに(すなわち、実質的に同時に)対象に投与されてもよいことが理解される。
【０２８１】
疾患を治療する場合、本発明のポリペプチドまたは作用物質の適切な投与量は、処置しようとする疾患のタイプ、疾患の重篤度および経過、疾患の応答性、前記ポリペプチドまたは作用物質が治療目的または予防目的で投与されるかどうか、以前の療法、患者の病歴などによって決まる。これらは全て、治療を行っている医師の自由裁量に委ねられている。前記ポリペプチドまたは作用物質は一度に投与されてもよく、数日〜数ヶ月間続く一連の処置にわたって投与されてもよいか、または治癒するまで、もしくは疾患状態が低下(例えば、腫瘍サイズが縮小)するまで投与されてもよい。最適な投与計画は患者の体内の薬物蓄積測定値から算出することができ、個々の作用物質の相対的な効果に応じて変化する。投与を行っている医師は、最適投与量、投与方法、および反復率を容易に決定することができる。ある特定の態様において、投与量は、0.01μg〜100mg/kg体重、0.1μg〜100mg/kg体重、1μg〜100mg/kg体重、1mg〜100mg/kg体重、1mg〜80mg/kg体重、10mg〜100mg/kg体重、10mg〜75mg/kg体重、または10mg〜50mg/kg体重である。ある特定の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質の投与量は約O.1mg〜約20mg/kg体重である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質の投与量は約O.1mg/kg体重である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質の投与量は約0.25mg/kg体重である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質の投与量は約0.5mg/kg体重である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質の投与量は約1mg/kg体重である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質の投与量は約1.5mg/kg体重である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質の投与量は約2mg/kg体重である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質の投与量は約2.5mg/kg体重である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質の投与量は約5mg/kg体重である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質の投与量は約7.5mg/kg体重である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質の投与量は約10mg/kg体重である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質の投与量は約12.5mg/kg体重である。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質の投与量は約15mg/kg体重である。ある特定の態様において、投与量は1日に、1週間に、1ヶ月に、または1年に1回またはそれ以上与えることができる。ある特定の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は1週間に1回、2週間に1回、3週間に1回、または4週間に1回、与えられる。
【０２８２】
一部の態様において、ポリペプチドまたは作用物質は多量の初回「負荷(loading)」量で投与され、その後に、それより少ない1つまたは複数の用量で投与されてもよい。一部の態様において、投与頻度も変わってもよい。一部の態様において、投与計画は、初回量を投与し、その後に、1週間に1回、2週間に1回、3週間に1回、または1か月に1回、さらなる用量(または「維持」用量)を投与する工程を含んでもよい。例えば、投与計画は、初回負荷量を投与し、その後に、毎週維持量、例えば、初回量の半分を投与する工程を含んでもよい。または、投与計画は、初回負荷量を投与し、その後に、維持量、例えば、初回量の半分を隔週で投与する工程を含んでもよい。または、投与計画は、3週間にわたって3つの初回量を投与し、その後に、維持量、例えば、同じ量を隔週で投与する工程を含んでもよい。
【０２８３】
当業者に公知であるとおり、どの治療用物質の投与でも副作用および/または毒性が生じる可能性がある。場合によっては、副作用および/または毒性は、治療に有効な用量の特定の作用物質を投与するのを止めるほど重篤である。場合によっては、薬物療法は中断しなければならず、他の作用物質が試みられる場合がある。しかしながら、同じ薬効分類(therapeutic class)にある多くの作用物質が同様の副作用および/または毒性を示すことが多い。このことは、患者は療法を停止しなければならないか、または可能なら、治療用物質に関連する不快な副作用に苦しまなければならないことを意味する。
【０２８４】
一部の態様において、投与計画は特定の回数の投与または「サイクル」に限定される場合がある。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は3回、4回、5回、6回、7回、8回、またはそれより多いサイクルのために投与される。例えば、前記ポリペプチドまたは作用物質は6回のサイクルのために2週間ごとに投与される、前記ポリペプチドまたは作用物質は6回のサイクルのために3週間ごとに投与される、前記ポリペプチドまたは作用物質は4回のサイクルのために2週間ごとに投与される、前記ポリペプチドまたは作用物質は4回のサイクルのために3週間ごとに投与されるなど。当業者は投与計画を決定し、その後に変更することができる。
【０２８５】
従って、本発明は、1種類または複数種の作用物質を投与するために間欠投与戦略を使用する工程を含む、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する方法を提供する。間欠投与戦略を使用する工程によって、ポリペプチドまたは作用物質、化学療法剤などの投与に関連する副作用および/または毒性が低減する可能性がある。一部の態様において、ヒト対象においてがんを処置するための方法は、治療に有効な用量のポリペプチドまたは作用物質と治療に有効な用量の化学療法剤を対象に併用投与する工程を含み、前記作用物質の一方または両方は間欠投与戦略に従って投与される。一部の態様において、間欠投与戦略は、初回量のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程、および後の用量の前記ポリペプチドまたは作用物質を、およそ2週間に1回、投与する工程を含む。一部の態様において、間欠投与戦略は、初回量のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程、および後の用量の前記ポリペプチドまたは作用物質を、およそ3週間に1回、投与する工程を含む。一部の態様において、間欠投与戦略は、初回量のポリペプチドまたは作用物質を対象に投与する工程、および後の用量の前記ポリペプチドまたは作用物質を、およそ4週間に1回、投与する工程を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドまたは作用物質は間欠投与戦略を用いて投与され、化学療法剤は毎週投与される。
【０２８６】
V.スクリーニング
本発明は、免疫応答を調整する作用物質を特定するためのスクリーニング方法を提供する。一部の態様において、本発明は、免疫応答を調整する、タンパク質、抗体、ペプチド、ペプチド模倣体、低分子、化合物、または他の薬物を含むが、これらに限定されない候補作用物質をスクリーニングするための方法を提供する。
【０２８７】
一部の態様において、免疫応答を調整する候補作用物質をスクリーニングする方法は、前記ポリペプチドまたは作用物質が免疫応答細胞に影響を及ぼすかどうか判定する工程を含む。一部の態様において、免疫応答を調整する候補作用物質をスクリーニングする方法は、前記ポリペプチドまたは作用物質が免疫細胞の活性を増大できるかどうか判定する工程を含む。一部の態様において、免疫応答を調整する候補作用物質をスクリーニングする方法は、前記ポリペプチドまたは作用物質がCTLおよび/またはNK細胞などの細胞溶解性細胞の活性を増大できるかどうか判定する工程を含む。一部の態様において、免疫応答を調整する候補作用物質をスクリーニングする方法は、前記ポリペプチドまたは作用物質がTregおよび/またはMDSCなどのサプレッサー細胞の活性を阻害できるかどうか判定する工程を含む。
【０２８８】
VI.本明細書に記載の作用物質を含むキット
本発明は、本明細書に記載の方法を実施するために使用することができる、本明細書に記載のポリペプチドまたは作用物質を含むキットを提供する。ある特定の態様において、キットは、1つまたは複数の容器の中に、少なくとも1種類の精製された作用物質を含む。一部の態様において、キットは、全対照を含む、検出アッセイを実施するのに必要および/または十分な成分、アッセイを実施するための指示、ならびに結果を分析および提示するための任意の必要なソフトウェアを全て備える。当業者は、本発明の開示された作用物質を、当技術分野において周知の確立したキットの形式の1つに容易に組み入れることができることを容易に認識する。
【０２８９】
さらに、ポリペプチドまたは作用物質と少なくとも1種類のさらなる治療用物質を含む。キットが提供される。ある特定の態様において、第2の(または第3以上の)治療用物質は化学療法剤である。ある特定の態様において、第2の(または第3以上の)治療用物質は血管形成阻害物質である。
【０２９０】
本開示の態様を、以下の非限定的な実施例を参照してさらに明確にすることができる。以下の非限定的な実施例は、本開示のある特定の抗体の調製と、本開示の抗体を使用する方法を詳述する。本開示の範囲から逸脱することなく、材料と方法の両方に多くの変更を加えることができることは当業者に明らかである。
【実施例】
【０２９１】
実施例1
単鎖GITRL三量体構築物の作製
本明細書において議論したように、hGITRLタンパク質は細胞表面でホモ三量体に組織化し、3つのGITR分子と相互作用および/または結合する。細胞表面にあるGITRL三量体の代表的な図を図1Aに示した。ヒトGITRL三量体の結晶構造が本発明者らによって調べられ、ある単量体からのN末端アミノ酸残基と、第2の単量体からのC末端アミノ酸残基が互いに近い距離にあることが観察された。これにより、各単量体間の距離を埋め、それによって、単鎖GITRL三量体を生成できるようにするためには、非常に短い範囲のアミノ酸残基、例えば、3〜7残基だけで十分な可能性があると示唆された。GITRLの構造および配列をさらに分析したところ、GITRLタンパク質の膜貫通ドメインとTNF相同性ドメインとの間には数アミノ酸の範囲が存在することが観察された。この範囲は「ストーク」領域と呼ばれる(図1Aおよび1Bを参照されたい)。本発明者らは、この短いストーク領域を用いて、GITRL単量体のC末端と、隣接するGITRL単量体のN末端との距離を埋め、このやり方で、外因性ペプチドリンカー配列がない単鎖GITRL三量体を構築することができると仮説を立てた。
【０２９２】
膜結合型単鎖hGITRL三量体構築物は、膜貫通領域(シグナル-アンカー配列-SEQ ID NO:1のアミノ酸51〜70)と3コピーのストーク領域およびTNFファミリードメイン(SEQ ID NO:1のアミノ酸71〜199; SEQ ID NO:3も)を用いて作製した。ストーク領域およびTNFファミリードメインを含む配列は本明細書ではGITRL細胞外ドメインとも呼ばれる。代表的な図を図1Dに示した。
【０２９３】
可溶性単鎖hGITRL三量体構築物も作製した(図1E)。ヒトIgG1 Fc領域に連結した3コピーのヒトGITRL細胞外ドメインを含む、さらなる構築物(336B11;シグナル配列があるSEQ ID NO:6と、シグナル配列がないSEQ ID NO:7)を作製した。代表的な図を図1Fに示した。
【０２９４】
他のTNFSF三量体構築物を生成するには、GITRL三量体構築物を作製するために本明細書において開示されたおおまかなアウトラインに追従することができる。例えば、本発明者らは、いくつかのOX40L三量体(SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:71;およびSEQ ID NO:72)、OX40L三量体-Fcタンパク質(SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、およびSEQ ID NO:48)、CD40L三量体(SEQ ID NO:85およびSEQ ID NO:88)、ならびにCD40L三量体-Fcタンパク質(SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、およびSEQ ID NO:92)を作製した。
【０２９５】
実施例2
GITRへのGITRL三量体結合のFACS分析
単鎖hGITRL三量体がヒトGITRに結合する能力を試験するために結合研究を行った。ヒトHEK-293細胞に、(1)前記の膜結合型単鎖hGITRL三量体構築物をコードする発現ベクターと、トランスフェクションマーカーとして(2)緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする発現ベクターとを一過的にコトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞をhGITR-Fcまたは対照融合タンパク質とインキュベートした。細胞をPE結合抗ヒトFc二次抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０２９６】
図2に示したように、hGITR-Fcは、細胞表面にある単鎖hGITRL三量体に結合することができた。これらの結果から、単鎖hGITRL構築物は、生物学的に機能する三量体構造の形をとり、hGITRと相互作用できることが証明された。
【０２９７】
実施例3
GITRL三量体融合タンパク質および結合
本発明者らは、免疫グロブリンFc領域バックボーンを用いて可溶性単鎖GITRL三量体を作製することができ、このGITRL三量体は潜在的にFc領域のN末端にもFc領域のC末端にも連結することができると仮説を立てた。これにより、2つのGITRL三量体を含有する分子が生じ、活性が増大すると考えられる。Fc領域バックボーンの構造可動性によって二重特異性ホモ二量体作用物質も作製することができると考えられる。例えば、単鎖GITRL三量体が免疫グロブリン重鎖と連結した抗体-GITRL融合タンパク質を設計することができると考えられる。抗原結合部位を形成するように、免疫グロブリン重鎖は免疫グロブリン軽鎖と会合できると考えられる。抗体-GITRL融合タンパク質は単鎖免疫グロブリンの一部として抗体重鎖および軽鎖を含むことができると考えられる。異なる設計では、抗体-GITRL融合タンパク質はFabまたはscFvなどの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むことができると考えられる。
【０２９８】
または、あるアームが、単鎖GITRL三量体を含むFc融合タンパク質を含み、第2のアームが、免疫グロブリン重鎖を含む第2のFc融合タンパク質を含む二重特異性ヘテロ二量体作用物質を設計することができると考えられる。前記のように、抗原結合部位を形成するように、免疫グロブリン重鎖は免疫グロブリン軽鎖と会合することができると考えられる。第2のアームは、単鎖免疫グロブリンの一部として抗体重鎖および軽鎖、または重鎖可変領域および軽鎖可変領域、例えば、FabもしくはscFvに連結したFc領域を含むことができると考えられる。これらの形式の一部の模式図を図3に示した。
【０２９９】
これらの形式のいくつかを、マウスIgG1またはIgG2 Fc領域、ヒトIgG1またはIgG2 Fc領域、およびマウスIgG1またはIgG2抗体を用いて組換えタンパク質として産生した。優先的にヘテロ二量体化する一対のヒトIgG2 CH3ドメイン変種を用いて二重特異性ヘテロ二量体作用物質を生成した。336B3は、マウスIgG2a Fc領域のC末端と連結した単鎖マウスGITRL三量体である。336B10は、マウスIgG2a Fc領域のN末端と連結した単鎖マウスGITRL三量体である。336B11は、ヒトIgG1領域のN末端と連結した単鎖ヒトGITRL三量体である。336B11は、ブダペスト条約の規定に基づいて2015年4月21日にATCC,10801 University Boulevard, Manassas, VA, USAに寄託されかつ指定番号PTA-122112が付与された、プラスミド「hGITRL-hIgG1」によってコードされる融合タンパク質を含む。336B1は、マウスIgG1抗体に連結した単鎖マウスGITRL三量体である。336B2は、マウスIgG2a抗体に連結した単鎖マウスGITRL三量体である。336B4は、あるアームが、ヒトIgG2 Fc領域に連結したマウスGITRL三量体であり、第2のアームが、ヒトIgG2 Fc領域に連結したマウス抗体可変領域であるヘテロ二量体作用物質である。
【０３００】
これらの融合タンパク質がGITRと相互作用する能力を試験するために結合研究を行った。ヒトHEK-293細胞に、(1)完全長マウスGITR(細胞表面発現)をコードする発現ベクターと、トランスフェクションマーカーとして(2)GFPをコードする発現ベクターとを一過的にコトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞をGITRL融合タンパク質または対照タンパク質とインキュベートした。細胞をPE結合抗ヒトFc二次抗体またはPE結合抗マウスFc二次抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０３０１】
図4に示したように、GITRL三量体を含むFc融合タンパク質は、細胞表面に発現しているGITRに強く結合する。結果から、GITRL三量体はFcタンパク質のN末端またはC末端のいずれかに連結された場合にGITRに結合することができ、GITRLは1個の三量体として発現された場合に、または複数の三量体が存在する場合にGITRに結合できることが証明された。さらに、GITRL三量体は異なるアイソタイプのFc領域または抗体に融合された場合に機能した。重要なことに、GITRL三量体はまた二重特異性のホモ二量体分子またはヘテロ二量体分子の状況でもGITRに結合した。
【０３０２】
マウスGITRに結合する単鎖mGITRL三量体-Fc(336B10)と、ヒトGITRに結合する単鎖hGITRL三量体-Fc(336B11)の比較を行った。ヒトHEK-293細胞に、(1)完全長のマウスGITRまたはヒトGITR(細胞表面発現)をコードする発現ベクターと、(2)トランスフェクションマーカーとしてGFPをコードする発現ベクターとを一過的にコトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞を、ある範囲の濃度(2倍希釈20μg/ml〜0.156μg/ml)のmGITRL三量体-Fc 336B10またはhGITRL三量体-Fc 336B11とインキュベートした。細胞をPE結合抗ヒトFc二次抗体またはPE結合抗マウスFc二次抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０３０３】
図5に示したように、単鎖mGITRL三量体-Fcおよび単鎖hGITRL三量体-FcはそれぞれのGITRに強く結合し、結合について同様の用量反応を示す。
【０３０４】
さらなる研究から、ヒトGITRL三量体-Fc 336B11はカニクイザルGITRに結合することが分かっている。
【０３０５】
実施例4
GITRL三量体-FcによるGITRシグナル伝達の活性化
単鎖GITRL三量体-Fcタンパク質がGITRを介してシグナル伝達を誘導するかどうか判定するために、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。安定にトランスフェクトされたNF-kB-ルシフェラーゼレポーター遺伝子とマウスGITR cDNAとを含有するHEK-293細胞株を使用した。細胞を96ウェルプレートにプレートし、ある範囲の濃度(5倍希釈20μg/ml〜0.01μg/ml)の単鎖mGITRL-Fc融合タンパク質336B3、単鎖mGITRL-Fc融合タンパク質336B6、抗GITR抗体DTA-1、または対照抗体とインキュベートした。336B3は、三量体がIgG2A Fc領域のC末端で連結しているmGITRL三量体-Fcのホモ二量体である(「2-三量体」バージョン)。336B6は、Fc領域のうち1つしかGITRL三量体に連結しておらず、GITRL三量体はIgG2A Fc領域のN末端に連結している(「1アーム」または「1-三量体」バージョン)。DTA-1は、GITRを標的とするアゴニスト抗体であり、正の対照として含めた。
【０３０６】
図6に示したように、1個のGITRL三量体を含有するFc融合タンパク質(336B6)と、2個のGITRL三量体を含有するFc融合タンパク質(336B3)はルシフェラーゼを強く刺激することができた。これらの結果から、GITRL三量体は生物学的に関連するやり方でGITRシグナル伝達を強く誘導できることが示唆される。興味深いことに、単鎖GITRL三量体形式はアゴニスト抗GITR抗体より強いGITRシグナル伝達を誘導することができた。さらに、この研究では、2コピーの単鎖GITRL三量体を含有する融合タンパク質(336B3)は、GITRL三量体を1つしか含有しない融合タンパク質(336B6)よりも大きな最大刺激をもたらすことができた。これらの結果は、GITRを活性化するのに単鎖GITRL三量体形式がアゴニスト抗体形式よりも強くなる可能性があり、複数のコピーのGITRL三量体が「スーパークラスター」として機能してさらにより強力にGITRを活性化する可能性があるという本発明者らの仮説と一致している。
【０３０７】
これらの実験を、ヒトGITRL三量体-Fc融合タンパク質(336B11)と、NF-kB-ルシフェラーゼレポーター遺伝子およびヒトGITR cDNAとを安定にトランスフェクトしたHEK-293細胞を用いて繰り返した。細胞を96ウェルプレートにプレートし、ある範囲の濃度(3倍希釈20μg/ml〜0.08μg/ml)の単鎖hGITRL-Fc融合タンパク質336B11とインキュベートした。
【０３０８】
図7に示したように、単鎖ヒトGITRL三量体-Fcタンパク質336B11タンパク質はルシフェラーゼを強く刺激することができた。これらの結果はマウスGITRL三量体を用いて得られた結果と同等であり、ヒトGITRL三量体がGITRシグナル伝達を刺激できることを示している。
【０３０９】
実施例5
単鎖GITRL三量体-Fcタンパク質によるインビボ腫瘍成長の阻害
マウス結腸腫瘍株CT26.WTをBalb/cマウスに皮下移植した(25,000細胞/マウス)。マウスを0.25mg/マウスの単鎖mGITRL三量体-Fc 336B3、アゴニスト抗GITR抗体DTA-1、または対照抗体で処置した(n=10/群)。7日目、10日目、14日目、および17日目に、腹腔内注射によってマウスに投薬した。腫瘍成長をモニタリングし、示された時点で腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。
【０３１０】
図8Aに示したように、mGITRL三量体-Fc 336B3を用いた処置によってCT26.WT腫瘍の成長が強く阻害および/または阻止された。アゴニスト抗GITR抗体DTA-1を用いた処置によっても腫瘍成長が阻害された。各群の中にある個々のマウスからの結果を調べることによって、336B3とDTA-1との違いの、さらに微細な写真を見ることができる。図8Bに示したように、336B3を用いた処置によって10匹全てのマウスで腫瘍成長が阻害されたのに対して、DTA-1を用いた処置によって腫瘍成長はより少ない程度で阻害され、10匹のマウスのうち1匹では腫瘍成長は阻止されなかったように思われた。これらの結果から、単鎖GITRL三量体は免疫療法剤として活性があり、腫瘍成長を抑制する効果がアゴニストGITR抗体よりも強くなる可能性があることが分かる。
【０３１１】
実施例6
IFN-γおよびIL-10のエリスポットアッセイ
エリスポットは、サイトカイン分泌細胞を検出するための高感度イムノアッセイである。簡単に述べると、エリスポットアッセイでは、マイクロプレートのウェルにプレコーティングした、望ましいサイトカインに特異的な捕捉抗体を使用する。細胞をウェルに分配し、あらゆるサイトカイン分泌細胞のすぐ近くにある固定化抗体は、分泌されたサイトカインに結合する。標準的な洗浄工程および適切な検出試薬とのインキュベーションが続く。例えば、ビオチン化検出抗体の後に、アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジンと発色基質溶液が一般的に用いられる。色のついた沈殿物がサイトカイン局在化部位に形成し、スポットとして現れる。それぞれの個々のスポットは個々のサイトカイン分泌細胞を表している。スポットは、自動リーダーシステムを用いて、または手作業で顕微鏡を用いて、計数されてもよい。
【０３１２】
インターフェロン(IFN)-γ分泌細胞がマウスIFN-γエリスポットキット(MabTech, Cincinnati, OH)を用いて検出された。実施例5で前述したように、mGITRL三量体-Fc 336B、抗mGITR抗体DTA-1、または対照で処置した、CT26.WT腫瘍を有するマウスの脾臓から細胞を単離した。マウスIFN-γに特異的な捕捉抗体でプレコーティングした提供されたプレートに、それぞれのマウスからの脾細胞(細胞2×105個/ウェル)を分配した。細胞を腫瘍特異的CD8+T細胞ペプチド(AH-1)の存在下または非存在下で培養し、37℃でインキュベートした。AH-1ペプチドの配列(SPSYVYHQF; SEQ ID NO:54)は、CT26.WT細胞株に内在するエコトロピックマウス白血病プロウイルスのgp70エンベロープタンパク質のH2-Ld-拘束(restricted)エピトープ(アミノ酸6〜14)である。48時間後に、製造業者の説明書に従ってIFN-γ分泌細胞が検出された。6000 F-z Bioreader(Biosys, Miami, FL)を用いてスポットを計数した。データを平均±S.E.Mスポット/ウェルで表した。
【０３１３】
図9Aに示したように、mGITRL三量体-Fc 336B3および抗mGITR抗体DTA-1で処置したマウスでは、AH-1ペプチドとインキュベートした場合に、腫瘍特異的IFN-γ分泌CD8+T細胞が増大した。この増大は大きく、336B3の場合では約2.5倍の増大であったのに対して、DTA-1の場合では約1.9倍の増大であった。さらに、336B3で処置したマウスではIFN-γ分泌T細胞の数は腫瘍特異的ペプチドの非存在下でも増加した。この増加は抗GITR抗体DTA-1では見られなかった。
【０３１４】
IFN-γは、一般的に、NK細胞、Th1 CD4+T細胞、CD8+T細胞、抗原提示細胞、およびB細胞によって産生される。研究から、IFN-γは腫瘍免疫において役割を果たし、他のサイトカイン、特に、IL-12およびIL-2によって媒介される抗腫瘍活性の制御因子である可能性があることが示唆された。従って、IFN-γを増やすGITRL三量体-Fcを用いて処置すると抗腫瘍免疫が亢進するはずである。
【０３１５】
IL-10分泌細胞がマウスIL-10エリスポットキット(MabTech)を用いて検出された。mGITRL三量体-Fc 336B、抗mGITR抗体DTA-1、または対照で処置した、CT26.WT腫瘍を有するマウスの脾臓から細胞を単離した。マウスIL-10に特異的な抗体でコーティングした提供された96ウェルプレートに、各処置群内にいる各マウスからの脾細胞(5×105個/ウェル)を分配した。細胞を腫瘍特異的CD8+T細胞ペプチド(AH-1)の存在下または非存在下で培養し、37℃でインキュベートした。48時間後に、製造業者の説明書に従ってIL-10分泌細胞が検出された。Bioreader 6000 F-z機器(BioSys)を用いて画像を取り込み、スポット数、スポット面積、および/または全体の光学密度を求めた。データを平均±S.E.Mスポット/ウェルで表した。
【０３１６】
図9Bに示したように、抗mGITR抗体DTA-1で処置したマウスにおけるIL-10分泌細胞は、細胞を腫瘍特異的ペプチドの存在下でインキュベートしても非存在下でインキュベートしても、対照で処置したマウスと比較して有意に増大した。興味深いことに、mGITRL三量体-Fc 336B3で処置したマウスに由来するIL-10分泌細胞の数は腫瘍特異的ペプチドが存在しない場合だけ有意に増加した。このことから、細胞が腫瘍特異的ペプチドAH-1で刺激された場合には、対照で処置したマウスと比較して、ごくわずかしか増大しないことが証明された。
【０３１７】
IL-10は一般的にTregおよびヘルパーT細胞によって産生される。IL-10は、元々は、自然免疫細胞の成長および/または分化を調整し、T細胞、特に、細胞傷害性T細胞の活性化およびエフェクター機能を抑制するTh2サイトカインとして認められた。最近になって、IL-10はいくつかの免疫刺激効果を有することが示され、従って、多面的機能を有すると考えられている。IFN-γなどのTh1サイトカインは、IL-10を含むTh2サイトカインの産生を対抗制御する(counter-regulate)ので、336B3処置は多量のIFN-γ産生を誘導することによってIL-10産生を抑制する可能性がある。従って、336B3処置はIFN-γ産生を増やすと共に、IL-10産生を抑制することによって抗腫瘍免疫を促進する可能性がある。
【０３１８】
これらのデータから、GITRL三量体-FcはIFN-γを多量に産生することによって腫瘍特異的CD8+T細胞活性を促進できることが示唆される。これらの結果からまた、GITRL三量体-Fcはアゴニスト抗GITR抗体よりも効率的に抗腫瘍免疫を誘導できることが示唆され得る。さらに、これらの結果から、GITRL三量体-Fcが免疫細胞および/または免疫応答に影響を及ぼしている機構は抗GITR抗体の機構とは異なることが示唆され得る。
【０３１９】
実施例7
細胞傷害性アッセイ
ナチュラルキラー細胞またはNK細胞は自然免疫系に不可欠な細胞傷害性リンパ球の一種である。腫瘍標的に対する細胞の細胞傷害活性を評価することによって、mGITRL三量体-Fc 336B3で処置したマウスにおけるNK細胞活性を評価した。実施例5において前述した、CT26.WT腫瘍を有するマウスの脾臓から細胞を収集した。細胞を、10％(v/v)胎仔ウシ血清(FBS)、2mM L-グルタミン、100U/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシン(Gibco)を加えたRPMI1640培養培地(Gibco/Life Technologies, Grand Island, NY)に溶解して96ウェルV底プレートにプレートした。CT26.WT標的細胞を10μMカルセインAM(Life Technologies)で37℃で1時間標識し、次いで、25:1のエフェクター:標的(E:T)比で脾細胞と組み合わせた。37℃で4時間インキュベートした後に、無細胞上清を収集し、カルセイン放出を蛍光光度計によって485nmの励起および535nmの発光で定量した。特異的細胞溶解(specific cell lysis)のパーセントを溶解％=100×(ER-SR)/(MR-SR)として求めた。式中、ER、SR、およびMRは、それぞれ、実験カルセイン放出、自発カルセイン放出、および最大カルセイン放出を表している。自発放出は、培地のみで(すなわち、エフェクター細胞の非存在下で)インキュベートした標的細胞が発した蛍光であるのに対して、最大放出は、等量の10％SDSを用いて標的細胞を溶解することによって求められる。
【０３２０】
図10に示したように、CT26.WT腫瘍を有するマウスに由来するNK細胞は、マウスをmGITRL三量体-Fc 336B3で処置した場合に、対照抗体で処置したマウスに由来する細胞と比較して増大したCT26.WT標的細胞死滅能力を示した。この効果は、抗mGITR抗体DTA-1を用いて見られた、どんな効果よりも大きかった。溶解量は少なかったが、これらの結果から、mGITRL三量体-Fcによる処置はNK活性を増大させ、抗腫瘍免疫応答を亢進させることができると示唆される。さらに、mGITRL三量体-Fcを用いた効果は、抗GITR抗体を用いて観察されたものよりも強力であった。
【０３２１】
実施例8
調節性T細胞(Treg)アッセイ
調節性T細胞(Treg)はホメオスタシスの維持および自己免疫応答の阻止において必要不可欠な役割を果たしている。Tregは小さなT細胞サブセットであり、そのほとんどがCD4+細胞であり、CD25(IL-2受容体α鎖)と他のTreg細胞関連分子マーカーを発現する。転写因子であるFoxp3は、Treg細胞が発達および機能するための因子であることが認められている。Foxp3はまた、ヒトTreg細胞における特異性に関して正当性が疑われてきたが、Treg細胞を他のT細胞亜集団から規定および特定するための特異的マーカーとみなされている。CD4+Treg細胞のほかに、CD8+Treg細胞が別の細胞集団に相当し、Foxp3は、CD4+Treg細胞と比較してCD8+Treg細胞が発達および機能するのに重要でない可能性がある。
【０３２２】
ナイーブCD4+T細胞またはナイーブCD8+T細胞の増殖に及ぼすTregの効果を判定することによって、mGITRL三量体-Fc 336B3で処置したマウスにおけるTregの機能性を評価した。ナイーブT細胞は、マウスCD3+T細胞濃縮カラム(mouse CD3+ T-cell enrichment column)(R&D Systems)を用いて未処置マウスの脾臓から精製した。これらの精製されたT細胞を5μMバイオレットトラッキングダイ(VTD; Life Technologies)で標識した。細胞増殖を刺激するために、2×105個のVTD標識T細胞を、抗CD3抗体および抗CD28抗体でコーティングしたビーズとインキュベートした。mGITRL三量体-Fc 336B3、抗mGITR抗体DTA-1、または対照で処置した、CT26.WT腫瘍を有するマウス(実施例5を参照されたい)の脾臓から、マウスTreg単離キット(mouse Treg isolation kit)(Miltenyi Biotec)を用いてTregを単離した。T細胞増殖に及ぼすTregの影響を判定するために、刺激されたVTD標識T細胞(エフェクター)を、単離された脾臓Tregと共培養した(1:0.5のエフェクター:Treg比)。4日目には、細胞を洗浄し、抗マウスCD4抗体または抗マウスCD8抗体とインキュベートした。BD FACSCanto II機器およびBD FACSDivaソフトウェアv6.1.3を用いたFACS分析によって細胞を評価した。標識された細胞が分裂するにつれて、VTDシグナルは半分に低下する。従って、分析ゲートは、このアッセイにおいてTregなしで得られる最大シグナルと、抗CD3/CD28刺激なしで得られる最小シグナルとの間に設定した。CD4+T細胞およびCD8+T細胞について、この領域内にある(VTD発現が低下した)細胞のパーセントを用いて、CD4+T細胞およびCD8+T細胞の増殖を算出した。抑制パーセントを[最大シグナル-(試料シグナル/最大シグナル)]×100として算出した。
【０３２３】
図11に示したように、抗mGITR抗体DTA-1または対照で処置したマウスに由来するTregを用いて見られた抑制と比較して、mGITRL三量体-Fc 336B3を用いた処置によって、ナイーブCD4+T細胞増殖に対するTregの抑制機能が強く減少した。同様に、DTA-1または対照で処置したマウスに由来するTregを用いて見られた抑制と比較して、336B3を用いた処置によって、ナイーブCD8+T細胞増殖に対するTregの抑制機能が低減した。
【０３２４】
これらの結果から、mGITRL三量体-Fcを用いた処置はTregの機能および/または抑制の低減につながる可能性があることが示唆される。この効果は、免疫応答の「ブレーキを外している」と考えることができる。従って、Treg機能が低減することで、全体の抗腫瘍免疫応答を亢進させ得る。
【０３２５】
実施例9
骨髄由来抑制性細胞(MDSC)アッセイ
研究によって、腫瘍免疫の強力な抑制因子である、従って、がん免疫療法を妨げる大きな障害である骨髄起源の細胞が特定されている(例えば、Ostrand-Rosenberg et al., 2009, J. Immunol., 182:4499-4506を参照されたい)。骨髄由来抑制性細胞(MDSC)は、がんを有するほとんどの患者および実験動物の血液、リンパ節、骨髄の中と腫瘍部位に蓄積する。MDSCは適応免疫および自然免疫の両方を阻害することが示されている。
【０３２６】
MDSCは抗腫瘍免疫応答を阻害することによって、血管形成を促進することによって、および転移前環境を作り出すことによってがん進行を容易にすると考えられている。MDSCはCD4+T細胞およびCD8+T細胞の増殖および活性化を抑制し、それによって、抗腫瘍免疫を阻害する。重要なことに、MDSCはTregの生成を容易にする。
【０３２７】
MDSCは不均質な骨髄系細胞ファミリーである。マウスにおいて、MDSCは骨髄系列分化抗原Gr1およびCD11bの細胞表面発現を特徴とする。MDSCは2つの亜集団:顆粒球性MDSC(G-MDSC)および単球性MDSC(M-MDSC)に分けることができる。G-MDSCは、典型的には、多葉性の核と、CD11b+Ly6G+Ly6C低表現型を有するのに対して、M-MDSCは単球の形態とCD11b+Ly6G+/-Ly6C高表現型を有する。両MDSC集団とも、アルギナーゼ、誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)、一酸化窒素、および活性酸素種の産生の増大を含む複数の機構によってT細胞応答を抑制することが示されている。従って、MDSCは免疫抑制性の腫瘍微小環境に寄与しており、抗腫瘍免疫応答の効果を限定する可能性がある。
【０３２８】
ナイーブCD4+T細胞またはCD8+T細胞の増殖に及ぼすMDSCの効果を判定することによって、mGITRL三量体-Fc 336B3で処置したマウスにおけるMDSCの機能性を評価した。ナイーブT細胞は、マウスCD3+T細胞濃縮カラム(R&D Systems)を用いて未処置マウスの脾臓から精製した。これらの精製されたT細胞を5μMバイオレットトラッキングダイ(VTD; Life Technologies)で標識した。細胞増殖を刺激するために、2×105個のVTD標識T細胞を、抗CD3抗体および抗CD28抗体でコーティングしたビーズとインキュベートした。mGITRL三量体-Fc 336B3、抗mGITR抗体DTA-1、または対照で処置した、CT26.WT腫瘍を有するマウス(実施例5を参照されたい)の脾臓から、マウスMDSC単離キット(mouse MDSC isolation kit)(Miltenyi Biotec)を用いてMDSCを単離した。T細胞増殖に及ぼすMDSCの影響を判定するために、刺激されたVTD標識T細胞(エフェクター)を、単離された脾臓MDSCと共培養した(1:1のエフェクター:MDSC比)。4日目に細胞を洗浄し、抗マウスCD4抗体または抗マウスCD8抗体とインキュベートした。BD FACSCanto II機器およびBD FACSDivaソフトウェアv6.1.3を用いたFACS分析によって細胞を評価した。標識された細胞が分裂するにつれて、VTDシグナルは半分に低下する。従って、分析ゲートは、このアッセイにおいてMDSCなしで得られる最大シグナルと、抗CD3/CD28刺激なしで得られる最小シグナルとの間に設定した。CD4+T細胞およびCD8+T細胞について、この領域内にある(VTD発現が低下した)細胞のパーセントを用いて、CD4+T細胞およびCD8+T細胞の増殖を算出した。抑制パーセントを[最大シグナル-(試料シグナル/最大シグナル)]×100として算出した。
【０３２９】
図12に示したように、対照で処置したマウスに由来するMDSCを用いて見られた抑制と比較して、mGITRL三量体-Fc 336B3を用いた処置によって、ナイーブCD4+T細胞増殖に対するMDSCの抑制機能が強く減少した。この低減は、抗GITR抗体で処置したマウスに由来する細胞では目立たなかった。対照的に、対照で処置したマウスに由来するMDSCを用いて見られた抑制と比較して、336B3を用いた処置は、ナイーブCD8+T細胞増殖に対するMDSCの抑制機能にほんのわずかしか影響を及ぼさなかった。
【０３３０】
これらの結果から、mGITRL三量体-Fcを用いた処置はMDSCの機能および/または抑制にある程度の影響を及ぼす可能性があることが示唆される。MDSC機能が低減することで、全体の抗腫瘍免疫応答をさらに亢進させ得る。
【０３３１】
実施例10
単鎖GITRL三量体-Fcタンパク質によるインビボ腫瘍成長の阻害
Rencaは、ATCCから入手したBalb/c由来腎臓腺がん細胞株である。Renca細胞をBalb/cマウスに皮下移植し(細胞5×105個/マウス)、7日間成長させ、平均サイズは約78mm3に達した。マウスを0.25mg/マウスの単鎖mGITRL三量体-Fc 336B3、アゴニスト抗GITR抗体DTA-1、または対照抗体で処置した(n=10/群)。7日目、11日目、および14日目に、腹腔内注射によってマウスに投薬した。腫瘍成長をモニタリングし、示された時点で腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。
【０３３２】
図13に示したように、mGITRL三量体-Fc 336B3を用いた処置によってRenca腫瘍の成長が強く阻害された。アゴニスト抗GITR抗体DTA-1を用いた処置によっても腫瘍成長が阻害されたが、336B3より少ない程度で阻害された。結果を個々のマウスレベルで評価した場合に、25日目までに、336B3で処置した20匹のマウスのうち9匹(45％)の腫瘍が1回目の処置時のサイズより小さいサイズまで退縮し、3匹のマウスの腫瘍が検出不可能になった。対照的に、25日目までに、DTA-1で処置した20匹のマウスのうち5匹(25％)の腫瘍しか1回目の処置時のサイズより小さいサイズまで退縮せず、4匹のマウスの腫瘍が検出不可能になった。
【０３３３】
これらの結果は、単鎖GITRL三量体が異なる起源の腫瘍における免疫腫瘍剤として活性があり、腫瘍成長を阻害する効果がアゴニストGITR抗体より大きい可能性があるという考えを裏付けている。
【０３３４】
実施例11
細胞傷害性アッセイ
ナチュラルキラー(NK)細胞傷害性アッセイのために、マウスリンパ芽球細胞株YAC-1を使用した。細胞を、10％(v/v)胎仔ウシ血清(FBS)、2mM L-グルタミン、100U/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシン(Gibco)を加えたRPMI1640培養培地(Gibco/Life Technologies, Grand Island, NY)に溶解して5％CO2の加湿雰囲気中で37℃で培養した。YAC-1細胞はNK細胞活性に対して感受性があることが知られており、NK細胞アッセイの良い標的である。
【０３３５】
実施例10において前述したマウスの脾臓から細胞を収集した。細胞を、10％(v/v)胎仔ウシ血清(FBS)、2mM L-グルタミン、100U/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシン(Gibco)を加えたRPMI1640培養培地(Gibco/Life Technologies, Grand Island, NY)に溶解して96ウェルV底プレートにプレートした。YAC-1標的細胞を10μMカルセインAM(Life Technologies)で37℃において1時間標識し、次いで、25:1または50:1のエフェクター:標的比で脾細胞と組み合わせた。37℃で4時間インキュベートした後に、無細胞上清を収集し、カルセイン放出を蛍光光度計によって485nmの励起および535nmの発光で定量した。特異的細胞溶解のパーセントを溶解％=100×(ER-SR)/(MR-SR)として求めた。式中、ER、SR、およびMRは、それぞれ、実験カルセイン放出、自発カルセイン放出、および最大カルセイン放出を表している。自発放出は、培地のみで(すなわち、エフェクター細胞の非存在下で)インキュベートした標的細胞が発した蛍光であるのに対して、最大放出は、等量の10％SDSを用いて標的細胞を溶解することによって求められる。
【０３３６】
Renca細胞を注射したマウスに由来するNK細胞は、マウスをmGITRL三量体-Fc 336B3で処置した場合に、対照抗体で処置したマウスに由来する細胞と比較して増大したYAC-1標的細胞死滅能力を示した。抗mGITR抗体DTA-1を用いた処置でも、標的細胞を死滅する能力が増大したが、336B3より少ない程度で増大した(図14A)。
【０３３７】
CD8+T細胞特異的MHCクラスI腫瘍ペプチド配列はRenca細胞株については知られていない。従って、Renca細胞をスティミュレーター(stimulator)として使用した。Renca細胞を25μg/mlマイトマイシンC(Sigma-Aldrich)で37℃で30分間処理し、洗浄し、10％FCS、2mM L-グルタミン、および抗生物質を含有するRPMI-1640培地に107細胞/mlで再懸濁した。マイトマイシンで処理したRenca細胞と脾細胞をIL-2(2ng/ml)の存在下で共培養し、37℃で5日間インキュベートし、収集し、計数し、前記のように細胞傷害性アッセイで使用した。標的としてカルセインAM標識Renca細胞を25:1のエフェクター:標的比で使用した。4時間後にカルセイン放出を判定し、前記のように特異的溶解(specific lysis)を算出した。
【０３３８】
図14Bに示したように、Renca細胞を注射したマウスに由来するCD8+細胞傷害性細胞は、このマウスをmGITRL三量体-Fc 336B3で処置した場合に、抗GITR抗体または対照で処置したマウスに由来する細胞と比較して増大したRenca標的細胞死滅能力を示した。
【０３３９】
実施例12
外因性ペプチドリンカーを有するhGITRL三量体-Fcタンパク質および外因性ペプチドリンカーを有さないhGITRL三量体-Fcタンパク質の特徴決定
ストーク領域(LQLETAK; SEQ ID NO:32)を、アミノ酸配列GGGSGGG(SEQ ID NO:57)からなる外因性 ペプチドリンカーと取り替えたヒトGITRL三量体-Fc(IgG1)融合タンパク質を作製した。この「リンカーを有するhGITRL三量体-Fc」構築物を336B13と名付け(シグナル配列があるSEQ ID NO:62と、シグナル配列がないSEQ ID NO:63)、hGITRL三量体-Fc 336B11と共に安定性研究において使用した。これらのタンパク質は、20mMヒスチジン、40mM NaCl、5％スクロース、および0.01％ポリソルベート20からなる、3つの異なるpH(5.5、6.0、および6.5)の緩衝液中に製剤化した。試料を室温で保管し、0週間、2週間、および3ヶ月の時点に分析の予定を立てた。
【０３４０】
サイズ排除クロマトグラフィー-高速液体クロマトグラフィー(SEC-HPLC)を用いて試料を分析した。この分析アッセイは、相対的な大きさによってタンパク質種を分離することで、試料中にある高分子量のタンパク質凝集物および/または小さなタンパク質断片に対して無傷の単量体タンパク質の存在量を評価することによってタンパク質の相対的純度を定量するのに用いられる。50μgのタンパク質をTosoh Biosciences TSK G3000SW-xlサイズ排除クロマトグラフィーカラム(7.8mm I.D.x30cm)に注入し、Waters 2695 Separations Module HPLC機器を用いてアッセイを行った。
【０３４１】
【表１】
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【０３４２】
表1に示したように、2週間の時点で凝集物の変化はかなり小さかったが、(天然ストーク領域がある)hGITRL三量体-Fc 336B11は、(ペプチドリンカーがある)hGITRL三量体-Fc 336B13よりも安定性が高いと考えられた。336B11は、実際に、2週間の時点で全てのpHで0時点より凝集物が少なかった。対照的に、2週間の時点で(全てのpHで)、(外因性リンカーがある)336B13の凝集物パーセントは高かった。
【０３４３】
さらに、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を用いて試料を分析した。この分析アッセイは、タンパク質の大きさに従ってタンパク質を分離するのに用いられ、他の物理的特徴に従ってタンパク質を分離するのに用いられない。タンパク質が分離されたら、試料中にある高分子量のタンパク質凝集物および/または小さなタンパク質断片に対する無傷の単量体タンパク質の量を評価することができる。各試料について4μgのタンパク質を4〜20％SDS-PAGEゲル上で非還元条件下で泳動させた。ゲルバンドがTyphoon Trio イメージング機器(GE Healthcare)を用いて検出され、ImageQuant TL(GE Healthcare)ソフトウェアを用いたデンシトメトリーによって定量された。これらのPAGEゲル上にある主な優勢なバンドは単量体GITRL三量体-Fcタンパク質であるのに対して、主なバンドよりも大きなバンドはどれも凝集物であり、主なバンドよりも小さなバンドはどれもタンパク質断片である。
【０３４４】
【表２】
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【０３４５】
非還元SDS-PAGE分析から、2週間にわたって3つ全てのpHで、(天然ストーク領域がある)hGITRL三量体-Fc 336B11の主なゲルバンドのパーセントはほとんど変化しないことが分かった(表2)。対照的に、(ペプチドリンカーがある)hGITRL三量体-Fc 336B13の主なゲルバンドのパーセントは約20％減少し、それに対応して、3つ全てのpHで高分子量バンドおよび低分子量バンドが増大した(表2)。
【０３４６】
これらの結果は、天然ストーク領域が個々のGITRLドメインを連結しているGITRL三量体-Fc融合タンパク質は、外因性ペプチドリンカーが個々のGITRLドメイン間にあり、天然ストーク領域がないGITRL三量体-Fc融合タンパク質よりも安定性が高いという考えを裏付けている。
【０３４７】
実施例13
単鎖GITRL三量体-Fcタンパク質によるインビボ腫瘍成長の阻害-用量研究
単鎖GITRL三量体-Fcは腫瘍成長を阻害するのに有効なことが示されたので、用量範囲研究を行った。マウス結腸腫瘍株CT26.WTをBalb/cマウスに皮下移植し(25,000細胞/マウス)、腫瘍を約115mm3の平均サイズまで成長させた。マウスを30mg/kg、12.5mg/kg、6.25mg/kg、3mg/kg、もしくは0.5mg/kgのmGITRL三量体-Fc 336B3で処置したか、または処置しなかった(n=10/群)。腹腔内注射によって合計6回投与するために、マウスに週2回投薬した。腫瘍成長をモニタリングし、示された時点で腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。
【０３４８】
図15A〜15Fは、各処置群内にいる個々のマウスの腫瘍量を示す。図15Gは、各処置群の平均腫瘍量を示す。mGITRL三量体-Fc 336B3を用いた処置によって、最低レベルの0.5mg/kgを含めて各用量でCT26.WT腫瘍の成長が強く阻害された。表3に示したように、18日目には、30mg/kg、12.5mg/kg、6.25mg/kg、および3mg/kgの336B3で処置したマウスの少なくとも50％において、腫瘍は検出不可能なサイズまで退縮していた。0.5mg/kgの最低用量でさえ、10匹のマウスのうち3匹において完全な腫瘍退縮が観察された。
【０３４９】
【表３】
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【０３５０】
GITRL三量体による腫瘍成長の阻害に及ぼす投薬頻度の影響を評価するために、さらなる実験を行った。前述したように、CT26.WT腫瘍細胞をBalb/cマウスに皮下移植した(25,000細胞/マウス)。腫瘍を約104mm3の平均サイズまで成長させた。マウスを2.5mg/kgのmGITRL三量体-Fc 336B3、12.5mg/kgのmGITRL三量体-Fcで処置したか、または処置しなかった(n=10/群)。マウスを2.5mg/kgの単一用量で処置したか、2.5mg/kgで2週間に1回処置したか、2.5mg/kgで週1回処置したか、2.5mg/kgで週2回処置したか、または3回だけ投与するために12.5mg/kgで週2回処置した。
【０３５１】
図16A〜16Fは、各処置群内にいる個々のマウスの腫瘍量を示す。図16Gは、各処置群の平均腫瘍量を示す。mGITRL三量体-Fc 336B3を用いた処置によって、それぞれの投薬間隔でCT26.WT腫瘍の成長が強く阻害された。表4に示したように、20日目に、全ての投薬間隔で、2.5mg/kg 336B3で処置したマウスの少なくとも20％において、腫瘍は検出不可能なサイズまで退縮していた。2.5mg/mg 336B3の単一用量であっても、腫瘍成長は強く阻害され、2匹のマウスの腫瘍が検出不可能になった。
【０３５２】
【表４】
2018508233.tif 000006
＊マウスには3回しか投与しなかった。
【０３５３】
これらの結果から、単鎖GITRL三量体が免疫療法剤として効果があることが証明された。概して、これらの結果は、有意な抗腫瘍効果を見るのに必要なGITRL三量体-Fcの量が少なかったことと、さらには、限られた用量で有意な効果が見られたことについては驚くべきことである。特に、予備データから2mg/kgで336B3のPKが非直線的であり、半減期が約12時間しかなかったことが示唆されたことを考慮すると、これらの結果は予想外のものであった。
【０３５４】
実施例14
免疫細胞枯渇マウスにおける単鎖GITRL三量体-Fcタンパク質によるインビボ腫瘍成長の阻害
GITRL三量体による腫瘍成長の阻害にどの免疫細胞集団が関与するかを評価するために実験を行った。特定の細胞集団をインビボ枯渇させるために、腫瘍細胞を移植する2日前および1日前に、Balb/cマウスに、抗CD4抗体(500ug/用量)、抗CD8抗体(500ug/用量)、抗CD4抗体と抗CD8抗体の組み合わせ(それぞれ500ug/用量)、抗アシアロGM-1抗体(25ul)、または対照IgG2抗体(LFT-2; 500ug/用量)を腹腔内注射し、次いで、移植して1日後および実験中に週2回、さらに注射した。細胞枯渇マウスにマウス結腸腫瘍株CT26.WTを皮下移植した(30,000細胞/マウス)。移植後7日目に、マウスを0.25mg/マウスのmGITRL三量体-Fc 336B3または対照抗体で処置した(n=10/群)。7日目に、平均腫瘍サイズは細胞枯渇マウス群に応じて約20〜50mm3であった。腹腔内注射によってマウスに週2回投薬した。腫瘍成長をモニタリングし、示された時点で腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。
【０３５５】
処置マウスのNK細胞を枯渇させるために抗アシアロGM-1抗体が用いられたが、この抗体はNK細胞に加えて他の細胞にも結合することが知られている。抗アシアロGM1抗体で処置したマウスからの結果は、これらのマウスが病気になり、19日目前に全て安楽死させられたので示さなかった。
【０３５６】
図17Fは、各マウス群の平均腫瘍量を示す。図17A〜17Eは、各群内にいる個々のマウスの腫瘍量を示す。以前の実験で見られたように、GITRL三量体-Fc 336B3を用いた処置によって腫瘍成長が有意に阻害された(図17B)。CD4+細胞の枯渇はGITRL-三量体-Fc 336B3の有効性を最小限にしか低減しなかった(図17C)。対照的に、CD8+細胞の枯渇はGITRL三量体-Fc 336B3の有効性に有意な影響を及ぼした。この場合、個々のマウスにおいて観察された腫瘍量は、対照で処置したマウスにおいて見られた腫瘍量と非常に似ていた(それぞれ、図17Dおよび図17A)。CD4+細胞およびCD8+細胞が両方とも枯渇されたマウスでは、対照で処置したマウスより高い腫瘍成長レベルが見られた(図17Eと図17Aを比較)。
【０３５７】
これらの結果から、GITRL三量体-Fc 336B3の抗腫瘍活性において機能的CD8+細胞は中心的な役割を果たしていることが証明された。CD4+CD8+枯渇マウスにおいて見られた腫瘍成長レベルが大きかったことから、336B3で処置したマウスにおいて、CD4+T細胞はCD8+T細胞が腫瘍成長を低減する能力を亢進させることおよび/またはその能力に必要なことが分かる。この結果は、GITRL三量体-Fcによって誘導される有効な抗腫瘍CTL活性には機能的なCD4+ヘルパーT細胞が重要なことを示している。
【０３５８】
実施例15
単鎖GITRL三量体-Fcタンパク質および抗PD-1抗体によるインビボ腫瘍成長の阻害
マウス腺がん細胞株RencaをBalb/cマウスに皮下移植し(細胞5×105個/マウス)、処置の1日目に(移植後7日目)、腫瘍は約52mm3の平均サイズであった。マウスを12.5mg/kgの単鎖mGITRL三量体-Fc 336B3、抗PD-1抗体、336B3と抗PD-1抗体の組み合わせ、または対照抗体で処置した(n=20/群)。腹腔内注射によって3回だけ投与するためにマウスに336B3を週2回投与し、抗PD-1抗体を3週間にわたって週2回投与した。腫瘍成長をモニタリングし、腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。
【０３５９】
図18Bに示したように、mGITRL三量体-Fc 336B3を用いた処置によって、高いパーセントのマウスにおいてRenca腫瘍の成長が強く阻害された。前の実施例において見られたように、336B3による処置は腫瘍の成長を阻害することができるだけでなく、腫瘍退縮を、多くの場合は検出不可能なレベルまで誘導することもできる。抗PD-1抗体による処置は単剤として腫瘍成長を阻害することにあまり成功しなかった(図18C)。GITRL三量体-Fc 336B3と抗PD-1抗体の組み合わせによる処置は、単剤である336B3と同様の結果であった(図18D)。
【０３６０】
これらの結果は、単鎖GITRL三量体が単剤として、かつ短期間だけ投与された場合でも非常に強力な免疫療法剤であるという考えを裏付けている。それに加えて、GITRL三量体-Fcタンパク質の有効性は、これを他の免疫療法剤と組み合わせることによってさらに強化される可能性がある。
【０３６１】
実施例16
単鎖GITRL三量体-Fcタンパク質および抗PD-L1抗体によるインビボ腫瘍成長の阻害
マウス結腸腫瘍株CT26.WTをBalb/cマウスに皮下移植した(30,000細胞/マウス)。処置の1日目(移植後10日目)に、腫瘍は約105mm3の平均サイズであった。マウスを0.25mg/マウスの単鎖mGITRL三量体-Fc 336B3、抗PD-L1抗体、336B3と抗PD-L1抗体の組み合わせ、または対照抗体で処置した(n=10〜20/群)。腹腔内注射によって3回だけ投与するためにマウスに336B3を週2回投与し、抗PD-L1抗体を3週間にわたって週2回投与した。腫瘍成長をモニタリングし、腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。
【０３６２】
図19Bに示したように、mGITRL三量体-Fc 336B3を用いた処置によって、高いパーセントのマウスにおいてCT26.WT腫瘍の成長が強く阻害された。前の実施例において見られたように、336B3による処置は腫瘍の成長を阻害することができるだけでなく、腫瘍退縮を、多くの場合は検出不可能なレベルまで誘導することもできる。抗PD-L1抗体による処置は単剤として腫瘍成長を阻害することにあまり成功しなかった(図19C)。GITRL三量体-Fc 336B3と抗PD-L1抗体の組み合わせによる処置は、単剤である336B3と同様の結果であった(図19D)。組み合わせ処置の結果は、もっと長い期間ではGITRL三量体単独よりも優れている可能性がある。
【０３６３】
抗腫瘍性記憶細胞集団の存在および/または機能性を評価する方法の1つは、以前に処置されたことのあるマウスを新鮮な腫瘍細胞に再曝露することである。再曝露研究には、GITRL-Fc 336B3、抗mPD-L1抗体、または336B3と抗mPD-L1抗体の組み合わせを用いて以前に処置されたことのある(前記の研究からの)マウスを使用した。1回目の腫瘍注射の少なくとも128日後に腫瘍が完全に退縮していたマウスおよび腫瘍が検出不可能であったマウスをCT26.WT腫瘍細胞(30,000個の細胞)に再曝露した。腫瘍再曝露に供するマウスには、再曝露を受ける100日前に最後の処置用量が与えられている。対照群として、ナイーブBalb/cマウス(n=10)にCT26.WT腫瘍細胞(30,000個の細胞)を注射した。腫瘍成長をモニタリングし、示された時点で腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。データを平均±S.E.Mで表した。
【０３６４】
ナイーブマウスにおけるCT26.WT腫瘍の平均腫瘍量は28日目まで着実に成長し、平均腫瘍量は約1750mm3であった。以前の実験から、抗PD-L1抗体で以前に処置されたことがあり、腫瘍が完全に退縮したマウスは2匹しかいなかったが、これらの2匹のマウスは腫瘍再曝露に対して完全な免疫を示した。GITRL-Fcで以前に処置されたことがあり、腫瘍が完全に退縮したマウスは13匹であった。これらのマウスのうち2匹しか、再曝露後に腫瘍が成長しなかった。他の11匹のマウスは腫瘍再曝露に対して完全な免疫を示した。さらに、336B3と抗PD-L1抗体の組み合わせで以前に処置されたことがあり、腫瘍が完全に退縮したマウスは7匹であった。これらのマウスは腫瘍再曝露に対して完全な免疫を示した。これらの結果(28日目の時点)を図19Eに示した。
【０３６５】
単剤として、または抗PD-L1抗体と組み合わせてGITRL-Fc 336B3で処置したマウスはCT26.WT腫瘍細胞を用いた再曝露から強く保護されると考えられた。これらの結果から、GITRL-Fc 336B3を単剤またはチェックポイント阻害物質と組み合わせて処置した後には免疫原記憶(immunogenic memory)が存在することが示唆される。
【０３６６】
実施例17
単鎖GITRL三量体-Fcタンパク質および抗PD-1抗体によるインビボ腫瘍成長の阻害
マウスメラノーマ細胞株B16-F10は、C57BL/6マウスにおいて最初に発生した低免疫原性腫瘍であり、ヒトにおける転移性腫瘍の低免疫原性を反映すると考えられている。これらの細胞は、いくつかの異なるタイプの抗がん療法に応答しないことが示されており、従って、B16-F10腫瘍は「ハイバー(high bar)」モデルとみなされている。B16-F10細胞をC57BL/6マウスに皮下移植し(5000細胞/マウス)、処置の1日目(移植後8日目)に、腫瘍は約51mm3の平均サイズであった。マウスを5mg/kgの単鎖mGITRL三量体-Fc 336B3、10mg/kgの抗mPD-1抗体、336B3と抗mPD-1抗体の組み合わせ、または対照抗体で処置した(n=10/群)。腹腔内注射によって、マウスに336B3、抗mPD-1抗体、または対照抗体を週2回投与した。腫瘍成長をモニタリングし、示された時点で腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。
【０３６７】
図20Eは、各マウス群における平均腫瘍量を示す。図20A〜20Dは、各群にいる個々のマウスの腫瘍量を示す。抗PD-1抗体による処置はB16-F10モデルにおける腫瘍成長に影響を及ぼさなかったが、GITRL三量体-Fc 336B3による処置は、このモデルにおいて大きな有効性を有することが示された。これらの結果を各群の平均腫瘍量として考えた場合に、336B6と抗PD-1抗体の組み合わせでは、抗腫瘍活性はわずかにしか増大しないと考えられた。しかしながら、個々のマウスの結果を考えた場合に、336B3と抗PD-1抗体の組み合わせを用いた処置によって、処置マウスの50％において腫瘍成長が有意な量まで阻害されたことは明らかである(図20D)。
【０３６８】
B16-F10腫瘍モデルにおけるGITRL三量体-Fc 336B3の有効な用量範囲を評価するために、経過観察研究を行った。B16-F10細胞をC57BL/6マウスに皮下注射し、処置の1日目に、腫瘍は約84mm3の平均サイズであった。マウスを0.5mg/kgの抗mGITR抗体DTA-1、30mg/kg、10mg/kg、2.5mg/kg、0.5mg/kg、および0.05mg/kgの単鎖mGITRL三量体-Fc 336B3、2つの異なる対照抗体、または食塩水で処置した(n=10/群)。腹腔内注射によって、マウスに336B3、抗体、または食塩水を週1回投与した。腫瘍成長をモニタリングし、腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。
【０３６９】
研究終了時(18日目)に、腫瘍が300mm3未満マウスのパーセントを図22に示した。GITRL三量体-Fc 336B3による処置は、0.05mg/kgの最低用量を含めて試験されたどの投与量でも個々の腫瘍の腫瘍成長を阻害することが観察された。さらに、10mg/kgで処置した群では3匹のマウスで腫瘍は完全に退縮した。2.5mg/kgで処置した群では1匹のマウスで腫瘍は完全に退縮した。
【０３７０】
これらの結果は、低免疫原性とみなされるものである「ハイバー」マウスモデルにおいて評価された場合でも単鎖GITRL三量体の活性が強力であるというさらなる証拠である。
【０３７１】
実施例18
単鎖OX40L三量体-Fcタンパク質によるインビボ腫瘍成長の阻害
マウス結腸腫瘍株CT26.WTをBalb/cマウスに皮下移植した(30,000細胞/マウス)。腫瘍を7日間成長させ、平均サイズは約77mm3に達した。マウスを0.25mg/マウスの単鎖mOX40L三量体-Fc 338F2、アゴニスト抗OX40抗体、単鎖mGITRL三量体-Fc、アゴニスト抗GITR抗体DTA-1、または対照抗体で処置した(n=10/群)。マウスに合計3用量にわたって週2回、投薬した。腫瘍成長をモニタリングし、示された時点で腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。
【０３７２】
図21Dおよび21Eに示したように、mOX40L三量体-Fcを用いた処置によってCT26.WT腫瘍の成長が強く阻害および/または阻止された。アゴニスト抗OX40抗体を用いた処置によっても腫瘍成長が阻害されたが、OX40L三量体-Fc分子より少ない程度で阻害された。各群の中にある個々のマウスからの結果を調べることによって、OX40L三量体-Fcによる処置からの腫瘍成長とOX40抗体による処置からの腫瘍成長との違いの、さらに微細な写真を見ることができる。図21Bに示したように、OX40L三量体-Fc分子で処置したマウスにおいて腫瘍が検出不可能になったマウスは6/10匹であったに対して、抗OX40抗体で処置した群において腫瘍が検出不可能になったマウスは1匹しかいなかった。
【０３７３】
GITRL三量体-Fc 336B3を用いて見られた結果と同様に、これらの結果から、単鎖OX40L三量体-Fcは免疫療法剤として活性が非常に高く、腫瘍成長を抑制する効果がアゴニストOX40抗体よりも大きい可能性があることが分かる。
【０３７４】
実施例19
サイトカイン産生
GITRL三量体-Fc、OX40L三量体-Fcタンパク質、抗GITR抗体、または抗OX40抗体を用いた処置後のサイトカイン産生を評価した。26日目に、実施例18で前述したマウスの脾臓から細胞を収集した。細胞を腫瘍特異的CD8+T細胞ペプチドAH-1の存在下または非存在下で培養した。48時間後に、Luminex(登録商標)プラットフォーム(ThermoFisher Scientific)のマルチプレックスパネルを用いて製造業者の説明書に従って、細胞上清中のサイトカインレベルを測定した。
【０３７５】
図23A〜23Lに示したように、対照抗体で処置したマウスからのサイトカイン量と比べて、アゴニスト抗GITR抗体または抗OX40抗体で処置したマウスからは、測定したサイトカイン(IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、MIP-lb、FasL、GM-CSF、sCD137、グランザイムB)のほぼ全てが多量に産生された。これは、GITRL三量体-FcまたはOX40L三量体-Fcタンパク質で処置したマウスから産生されたサイトカインレベルと著しい対照をなしている。GITRL-FcまたはOX40L-Fcで処置したマウスから産生されたサイトカインレベルは対照と比べて増大せず、ほとんどの場合で、サイトカインレベルは対照より少なかった。さらに、処置マウスからの血漿試料の予備分析から、GITRL-FcまたはOX40L-Fcで処置したマウスと比較して、アゴニスト抗GITR抗体または抗OX40抗体で処置したマウスでは同じようにサイトカイン産生が増大する傾向があることが分かっている。
【０３７６】
これらの結果から、GITRL三量体-Fcタンパク質およびOX40L三量体-Fcタンパク質を用いた場合、GITRおよびOX40を標的とするアゴニスト抗体と比較して、免疫機能に及ぼす影響に著しい違いがあることが分かる。特に、GITRL-Fcタンパク質およびOX40L-Fcタンパク質を用いて処置しても脾細胞によるサイトカイン産生レベルは上昇しなかった。これに対して、アゴニストGITR抗体およびOX40抗体による処置後に著しく上昇することが観察された広い一連のサイトカインは、正常な免疫機能が大きく破壊されたことを示す予期外の免疫学的結果である。IL4、IL-5、IL-6、IL-10、およびIL-13を含む、アゴニスト抗体処置後にアップレギュレートされることが観察されたサイトカインの多くは、長続きする抗腫瘍免疫応答を発生するのに必要な適切なTh1型免疫応答を免疫系が開始する能力を小さくする傾向がある生物学的機能をもつ。重要なことに、これらの力強いサイトカインのレベルの上昇は、アゴニスト抗体の治療指数を低減し得る望ましくない毒性(すなわち、サイトカインストーム)に寄与する可能性がある。抗GITR抗体および抗OX40抗体を用いた場合に、これらの結果は似ているので、この発見は、GITRまたはOX-40に影響を及ぼし、潜在的に他のTNFRファミリーに影響を及ぼすアゴニスト抗体の全てに共通する「クラス効果」がある可能性があることを示唆している。
【０３７７】
実施例20
単鎖GITRL三量体-Fcタンパク質によるインビボ腫瘍成長の阻害
マウス結腸腫瘍株CT26.WTをBalb/cマウスに皮下移植した(30,000細胞/マウス)。大きな確立した腫瘍細胞塊に対するGITRL三量体-Fcタンパク質の効果を研究するために、約300mm3の平均サイズに達するまで腫瘍を成長させた。マウスを0.25mg/マウスの単鎖mGITRL三量体-Fc 336B3、アゴニスト抗GITR抗体DTA-1、または対照抗体で処置した(n=17/群)。腹腔内注射によって合計3回投与するためにマウスに週2回投薬した。腫瘍成長をモニタリングし、腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。可能な場合、長期生存を評価するために80日を過ぎてもマウスを追跡した。
【０３７８】
40日目までの各群にいる個々のマウスの腫瘍成長を図24A〜Cに示し、生存率パーセントを図24Dに示した。mGITRL三量体-Fc 336B3で処置したマウスにおいて、CT26.WT腫瘍の成長は強く阻害および/または阻止された。処置マウスの少なくとも50％において、腫瘍は、処置前の腫瘍サイズより小さなサイズまで退縮していた(図24B)。アゴニスト抗GITR抗体DTA-1は少数の処置マウスでしか腫瘍成長を阻害しなかった(図24C)。腫瘍成長は未処置マウスでは非常に速く進行し、28日目までに15匹のマウスが安楽死させられた。図24Dに示した生存曲線は、アゴニスト抗GITR抗体と比較してGITRL三量体-Fc 336B3が有効なことをはっきりと証明している。
【０３７９】
これらの結果から、単鎖GITRL三量体は大きな確立した腫瘍に対しでも免疫療法剤として活性があり、腫瘍成長を抑制し、確立した腫瘍を退縮し、生存率を増加させる効果がアゴニストGITR抗体よりも大きいことが分かる。
【０３８０】
実施例21
ヒトGITRL三量体-Fcタンパク質によるヒト化マウスにおけるインビボ腫瘍成長の阻害
ヒト化マウスモデルを用いて、ヒト腫瘍に対するヒトGITRL三量体-Fcタンパク質による処置の有効性を研究した。ヒト化マウスはJackson Laboratoriesから入手した。これらのマウスは、ヒト造血幹細胞(CD34+細胞)を放射線照射済みNSGマウスに注射することによって作り出される。15週間後に、成熟ヒトリンパ球の存在がフローサイトメトリーによって確かめられる。各マウスに患者由来メラノーマ腫瘍細胞(OMP-M9、75,000細胞/マウス)を皮下注射した。腫瘍が約60mm3の平均量に達するまで16日間成長させた。腫瘍を有するマウスを2つの群に無作為化した(n=3マウス/群)。腫瘍を有するマウスを対照タンパク質またはhGITRL三量体-Fc OMP-336B11のいずれかで処置した。マウスに10mg/kgで週2回投薬した。腫瘍成長をモニタリングし、示された時点で腫瘍量を電子ノギスを用いて測定した。
【０３８１】
図25に示したように、対照と比較して、ヒトGITRL三量体-Fcで処置したマウスでは腫瘍成長が阻害された。これらの結果から、ヒトGITRL三量体-Fc OMP-336B11はヒトリンパ球の抗腫瘍免疫応答を増強するのに有効であり、インビボでヒト腫瘍成長を阻害するのに寄与したことが分かる。従って、これらの結果から、代用のマウスGITRL三量体-Fcタンパク質とマウス腫瘍モデルを用いて行った前臨床研究と同時進行して、患者由来異種移植片を有するヒト化マウスモデルを用いてヒトGITRL三量体-Fc分子を研究できることが証明された。
【０３８２】
本明細書に記載の実施例および態様は例示目的にすぎず、本明細書に記載の実施例および態様を考慮して様々な修正または変更が当業者に示唆され、本願の精神および範囲の中に含まれることが理解される。
【０３８３】
本明細書において引用された、刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、ならびにポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の両方を含むアクセッション番号/データベース配列は全て、それぞれ個々の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、またはアクセッション番号/データベース配列が参照により組み入れられるように詳細かつ個々に示されるのと同じ程度に、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０３８４】
本願において開示された配列は以下である。
ヒトGITRL(TNFSF18)のアミノ酸配列(SEQ ID NO:1)
2018508233.tif 000007
ヒトGITRLシグナル/アンカー領域および細胞外ドメインのアミノ酸配列(SEQ ID NO:2)
2018508233.tif 000008
ヒトGITRL細胞外ドメインのアミノ酸配列(SEQ ID NO:3)
2018508233.tif 000009
下線を引いたシグナル配列を有するヒト単鎖GITRL三量体のアミノ酸配列(SEQ ID NO:4)
2018508233.tif 000010
シグナル配列を有さないヒト単鎖GITRL三量体のアミノ酸配列(SEQ ID NO:5)
2018508233.tif 000011
下線を引いたシグナル配列を有する336B11ヒト単鎖GITRL三量体-Fc(IgG1)のアミノ酸配列(SEQ ID NO:6)
2018508233.tif 000012
シグナル配列を有さない336B11ヒト単鎖GITRL三量体-Fc(IgG1)のアミノ酸配列(SEQ ID NO:7)
2018508233.tif 000013
下線を引いたシグナル配列を有する336B14ヒト単鎖GITRL三量体-Fc(IgG2)のアミノ酸配列(SEQ ID NO:8)
2018508233.tif 000014
シグナル配列を有さない336B14ヒト単鎖GITRL三量体-Fc(IgG2)のアミノ酸配列(SEQ ID NO:9)
2018508233.tif 000015
ヒトIgG1 Fc領域(SEQ ID NO:10)
2018508233.tif 000016
ヒトIgG1 Fc領域(SEQ ID NO:11)
2018508233.tif 000017
ヒトIgG1 Fc領域(SEQ ID NO:12)
2018508233.tif 000018
ヒトIgG2 Fc領域(SEQ ID NO:13)
2018508233.tif 000019
ヒトIgG2 Fc領域(SEQ ID NO:14)
2018508233.tif 000020
ヒトIgG1重鎖定常領域(SEQ ID NO:15)
2018508233.tif 000021
ヒトIgG2重鎖定常領域(SEQ ID NO:16)
2018508233.tif 000022
ヒトIgG3重鎖定常領域(SEQ ID NO:17)
2018508233.tif 000023
ヒトIgG4重鎖定常領域(SEQ ID NO:18)
2018508233.tif 000024
ヒトGITRLのヌクレオチド配列(SEQ ID NO:19)
2018508233.tif 000025
ヒトGITRLシグナル/アンカー領域および細胞外ドメインのヌクレオチド配列(SEQ ID NO:20)
2018508233.tif 000026
ヒトGITRL細胞外ドメインのヌクレオチド配列(SEQ ID NO:21)
2018508233.tif 000027
シグナル配列を有さないヒト単鎖GITRL三量体のヌクレオチド配列(SEQ ID NO:22)
2018508233.tif 000028
シグナル配列を有するヒト単鎖GITRL三量体のヌクレオチド配列(SEQ ID NO:23)
2018508233.tif 000029
336B11ヒト単鎖GITRL三量体-Fc(IgG1)のヌクレオチド配列(SEQ ID NO:24)
2018508233.tif 000030
336B14ヒト単鎖GITRL三量体-Fc(IgG2)のヌクレオチド配列(SEQ ID NO:25)
2018508233.tif 000031
ヒトIgG2 Fc領域(13Aバージョン)(SEQ ID NO:26)
2018508233.tif 000032
ヒトIgG2 Fc領域(13Bバージョン)(SEQ ID NO:27)
2018508233.tif 000033
ヒトIgG2 Fc領域(13Aバージョン)(SEQ ID NO:28)
2018508233.tif 000034
ヒトIgG2 Fc領域(13Aバージョン)(SEQ ID NO:29)
2018508233.tif 000035
ヒトIgG2 Fc領域(13Bバージョン)(SEQ ID NO:30)
2018508233.tif 000036
ヒトIgG2 Fc領域(13Bバージョン)(SEQ ID NO:31)
2018508233.tif 000037
ヒトGITRLストーク領域(SEQ ID NO:32)
LQLETAK
ヒトGITRL TNF相同性ドメイン(SEQ ID NO:33)
2018508233.tif 000038
リンカー(SEQ ID NO:34)
ESGGGGVT
リンカー(SEQ ID NO:35)
LESGGGGVT
リンカー(SEQ ID NO:36)
GRAQVT
リンカー(SEQ ID NO:37)
WRAQVT
リンカー(SEQ ID NO:38)
ARGRAQVT
FLAGタグ(SEQ ID NO:39)
DYKDDDDK
ヒトOX40L(TNFSF4)のアミノ酸配列(SEQ ID NO:40)
2018508233.tif 000039
ヒトOX40L膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインのアミノ酸配列(SEQ ID NO:41)
2018508233.tif 000040
ヒトOX40L細胞外ドメインのアミノ酸配列(SEQ ID NO:42)
2018508233.tif 000041
下線を引いたシグナル配列を有するヒト単鎖OX40L三量体のアミノ酸配列(SEQ ID NO:43)
2018508233.tif 000042
シグナル配列を有さないヒト単鎖OX40L三量体のアミノ酸配列(SEQ ID NO:44)
2018508233.tif 000043
下線を引いたシグナル配列を有する338F3ヒト単鎖OX40L三量体-Fc(IgG1)のアミノ酸配列(SEQ ID NO:45)
2018508233.tif 000044
シグナル配列を有さない338F3ヒト単鎖OX40L三量体-Fc(IgG1)のアミノ酸配列(SEQ ID NO:46)
2018508233.tif 000045
下線を引いたシグナル配列を有するヒト単鎖OX40L三量体-Fc(IgG2)のアミノ酸配列(SEQ ID NO:47)
2018508233.tif 000046
シグナル配列を有さないヒト単鎖OX40L三量体-Fc(IgG2)のアミノ酸配列(SEQ ID NO:48)
2018508233.tif 000047
ヒトOX40Lのヌクレオチド配列(SEQ ID NO:49)
2018508233.tif 000048
ヒトOX40L細胞外ドメインのヌクレオチド配列(SEQ ID NO:50)
2018508233.tif 000049
シグナル配列を有するヒト単鎖OX40L三量体のヌクレオチド配列(SEQ ID NO:51)
2018508233.tif 000050
シグナル配列を有さないヒト単鎖OX40L三量体のヌクレオチド配列(SEQ ID NO:52)
2018508233.tif 000051
ヒト単鎖OX40L-Fc(IgG1)三量体のヌクレオチド配列(SEQ ID NO:53)
2018508233.tif 000052
AH-1ペプチド(SEQ ID NO:54)
SPSYVYHQF
OX40Lストーク領域(SEQ ID NO:55)
QVSHRYP
OX40L TNF相同性ドメイン(SEQ ID NO:56)
2018508233.tif 000053
リンカー(SEQ ID NO:57)
GGGSGGG
ヒトIgG1 Fc領域(13Aバージョン)(SEQ ID NO:58)
2018508233.tif 000054
ヒトIgG1 Fc領域(13Bバージョン)(SEQ ID NO:59)
2018508233.tif 000055
ヒトIgG1 Fc領域(13Aバージョン)(SEQ ID NO:60)
2018508233.tif 000056
ヒトIgG1 Fc領域(13Bバージョン)(SEQ ID NO:61)
2018508233.tif 000057
リンカーを有し、下線を引いたシグナル配列を有する、336B13ヒト単鎖GITRL三量体-Fc(IgG1)(SEQ ID NO:62)
2018508233.tif 000058
リンカーを有しシグナル配列を有さない、336B13ヒト単鎖GITRL三量体-Fc(IgG1)(SEQ ID NO:63)
2018508233.tif 000059
ストーク領域を有さないヒトGITRL細胞外ドメインのアミノ酸配列(SEQ ID NO:64)
2018508233.tif 000060
下線を引いたシグナル配列を有するヒト単鎖GITRL三量体(2つのストーク領域)のアミノ酸配列(SEQ ID NO:65)
2018508233.tif 000061
シグナル配列を有さないヒト単鎖GITRL三量体(2つのストーク領域)のアミノ酸配列(SEQ ID NO:66)
2018508233.tif 000062
ストーク領域を有さないヒトOX40L細胞外ドメインのアミノ酸配列(SEQ ID NO:67)
2018508233.tif 000063
下線を引いたシグナル配列を有するヒト単鎖OX40L三量体(2つのストーク領域)のアミノ酸配列(SEQ ID NO:68)
2018508233.tif 000064
シグナル配列を有さないヒト単鎖OX40L三量体(2つのストーク領域)のアミノ酸配列(SEQ ID NO:69)
2018508233.tif 000065
シグナル配列を有さない338F4ヒト単鎖OX40L三量体のアミノ酸配列(SEQ ID NO:70)
2018508233.tif 000066
シグナル配列を有さない338F5ヒト単鎖OX40L三量体のアミノ酸配列(SEQ ID NO:71)
2018508233.tif 000067
シグナル配列を有さない338F6ヒト単鎖OX40L三量体のアミノ酸配列(SEQ ID NO:72)
2018508233.tif 000068
シグナル配列を有さない338F5ヒト単鎖OX40L三量体のヌクレオチド配列(SEQ ID NO:73)
2018508233.tif 000069
OX40Lストーク領域変種1(SEQ ID NO:74)
ALQVSHRYP
OX40Lストーク領域変種2(SEQ ID NO:75)
SHRYP
OX40Lストーク領域変種3(SEQ ID NO:76)
HRYP
ヒトOX40L細胞外ドメインアミノ酸配列変種1(SEQ ID NO:77)
2018508233.tif 000070
ヒトOX40L細胞外ドメインアミノ酸配列変種2(SEQ ID NO:78)
2018508233.tif 000071
ヒトOX40L細胞外ドメインアミノ酸配列変種3(SEQ ID NO:79)
2018508233.tif 000072
下線を引いたシグナル配列を有する338F5ヒト単鎖OX40L三量体-Fc(IgG1)のアミノ酸配列(SEQ ID NO:80)
2018508233.tif 000073
シグナル配列を有さない338F5ヒト単鎖OX40L三量体-Fc(IgG1)アミノ酸配列(SEQ ID NO:81)
2018508233.tif 000074
ヒトCD40L(TNFSF5)のアミノ酸配列(SEQ ID NO:82)
2018508233.tif 000075
ヒトCD40L細胞外ドメインのアミノ酸配列(SEQ ID NO:83)
2018508233.tif 000076
ストーク断片1を有するヒトCD40L細胞外ドメイン(aa113〜261)(SEQ ID NO:84)
2018508233.tif 000077
シグナル配列を有さないヒト単鎖CD40L三量体のアミノ酸配列(SEQ ID NO:85)
2018508233.tif 000078
シグナル配列を有さないヒト単鎖CD40L三量体のヌクレオチド配列(SEQ ID NO:86)
2018508233.tif 000079
ヒトCD40Lアンカー領域および細胞外ドメインのアミノ酸配列(SEQ ID NO:87)
2018508233.tif 000080
下線を引いたシグナル配列を有するヒト単鎖CD40L三量体のアミノ酸配列(SEQ ID NO:88)
2018508233.tif 000081
下線を引いたシグナル配列を有するヒト単鎖CD40L三量体-Fc(IgG1)のアミノ酸配列(SEQ ID NO:89)
2018508233.tif 000082
シグナル配列を有さないヒト単鎖CD40L三量体-Fc(IgG1)のアミノ酸配列(SEQ ID NO:90)
2018508233.tif 000083
下線を引いたシグナル配列を有するヒト単鎖CD40L三量体-Fc(IgG2)のアミノ酸配列(SEQ ID N0:91)
2018508233.tif 000084
シグナル配列を有さないヒト単鎖CD40L三量体-Fc(IgG2)のアミノ酸配列(SEQ ID NO:92)
2018508233.tif 000085
ヒトCD40Lストーク領域(SEQ ID NO:93)
2018508233.tif 000086
ヒトCD40L TNF相同性ドメイン(SEQ ID NO:94)
2018508233.tif 000087
ストーク領域を有さないヒトCD40L細胞外ドメインのアミノ酸配列(SEQ ID NO:95)
2018508233.tif 000088
下線を引いたシグナル配列を有するヒト単鎖CD40L三量体(2つのストーク領域)のアミノ酸配列(SEQ ID NO:96)
2018508233.tif 000089
シグナル配列を有さないヒト単鎖CD40L三量体(2つのストーク領域)のアミノ酸配列(SEQ ID NO:97)
2018508233.tif 000090
ヒトCD40Lストーク領域-断片1(SEQ ID NO:98)
MQKGDQ
ヒトCD40Lストーク領域-断片2(SEQ ID NO:99)
FEMQKGDQ
ヒトCD40Lストーク領域-断片3(SEQ ID NO:100)
EMQKGDQ
ヒトCD40Lストーク領域-断片4(SEQ ID NO:101)
QKGDQ
ヒトCD40Lストーク領域-断片5(SEQ ID NO:102)
KGDQ
ストーク断片2を有するヒトCD40L細胞外ドメイン(aa111〜261)(SEQ ID NO:103)
2018508233.tif 000091
ストーク断片3を有するヒトCD40L細胞外ドメイン(aa112〜261)(SEQ ID NO:104)
2018508233.tif 000092
ストーク断片4を有するヒトCD40L細胞外ドメイン(aa114〜261)(SEQ ID NO:105)
2018508233.tif 000093
ストーク断片5を有するヒトCD40L細胞外ドメイン(aa115〜261)(SEQ ID NO:106)
2018508233.tif 000094
【図１−１】
2018508233.tif 000095
【図１−２】
2018508233.tif 000096
【図２】
2018508233.tif 000097
【図３】
2018508233.tif 000098
【図４】
2018508233.tif 000099
【図５】
2018508233.tif 000100
【図６】
2018508233.tif 000101
【図７】
2018508233.tif 000102
【図８Ａ】
2018508233.tif 000103
【図８Ｂ】
2018508233.tif 000104
【図９】
2018508233.tif 000105
【図１０】
2018508233.tif 000106
【図１１】
2018508233.tif 000107
【図１２】
2018508233.tif 000108
【図１３】
2018508233.tif 000109
【図１４】
2018508233.tif 000110
【図１５−１】
2018508233.tif 000111
【図１５−２】
2018508233.tif 000112
【図１６−１】
2018508233.tif 000113
【図１６−２】
2018508233.tif 000114
【図１７−１】
2018508233.tif 000115
【図１７−２】
2018508233.tif 000116
【図１８】
2018508233.tif 000117
【図１９−１】
2018508233.tif 000118
【図１９−２】
2018508233.tif 000119
【図２０−１】
2018508233.tif 000120
【図２０−２】
2018508233.tif 000121
【図２１−１】
2018508233.tif 000122
【図２１−２】
2018508233.tif 000123
【図２２】
2018508233.tif 000124
【図２３−１】
2018508233.tif 000125
【図２３−２】
2018508233.tif 000126
【図２３−３】
2018508233.tif 000127
【図２４−１】
2018508233.tif 000128
【図２４−２】
2018508233.tif 000129
【図２５】
2018508233.tif 000130
【手続補正書】
【提出日】平成29年10月11日(2017.10.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018508233000001.app
【国際調査報告】
2018508233.tif 000131
2018508233.tif 000132
2018508233.tif 000133
2018508233.tif 000134
2018508233.tif 000135