(57)【要約】  本発明は、ミトコンドリアＤＮＡ枯渇及び／又は多重欠失症候群の治療において使用するための１以上のデオキシリボヌクレオシドを含む組成物を提供するが、但し、前記症候群はデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）代謝における欠陥によって引き起こされないものとする。本発明の使用により、患者の疾患の重症度とは独立してミトコンドリアＤＮＡレベルが回復され、これは本発明に対して多大な治療的価値を付与する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリアＤＮＡ枯渇および／または欠失症候群の治療で使用するための１以上のデオキシリボヌクレオシドを含む組成物であって、前記症候群がデオキシリボンクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）代謝における欠陥に起因しない、前記組成物。
【請求項２】
前記症候群の前記治療がポリメラーゼガンマ活性を増加させることによって達成される、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
前記１以上のデオキシリボヌクレオシドがカノニカルヌクレオシドである、請求項１又は２に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
前記症候群が前記ミトコンドリアＤＮＡ複製機構における欠陥に起因するものである、請求項１〜３のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項５】
前記欠陥が、前記ミトコンドリアＤＮＡ複製機構の１以上のタンパク質における１以上の突然変異に起因する、請求項１〜４のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項６】
前記１以上のタンパク質が、ＤＮＡポリメラーゼサブユニットガンマ１（ＰＯＬＧ１）、ＤＮＡポリメラーゼサブユニットガンマ２（ＰＯＬＧ２）、Ｔｗｉｎｋｌｅタンパク質（ＰＥＯ１）、ミトコンドリアゲノム維持エキソヌクレアーゼ１（ＭＧＭＥ１）、及びヒトヘリカーゼ／ヌクレアーゼＤＮＡ２タンパク質（ＤＮＡ２）からなる群から選択される、請求項５に記載の使用のための組成物。
【請求項７】
前記症候群がＤＮＡポリメラーゼサブユニットガンマ１（ＰＯＬＧ１）タンパク質における欠陥に起因する、請求項６に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
前記ミトコンドリアＤＮＡ枯渇及び欠失症候群が前記ミトコンドリア複製経路における欠陥によって引き起こされ、前記欠陥がＰＯＬＧ１タンパク質における以下の突然変異：Ｒ３０９Ｃ、Ｗ７４８Ｓ、Ｖ１１７７Ｌ、Ｇ８４８Ｓ、Ｅ１１４３、及びＥ１１４３Ｇの１以上に起因し、位置が配列番号１に関して言及される、請求項１〜７のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項９】
前記１以上のデオキシリボヌクレオシドが、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン、及びデオキシチミジンからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン、及びデオキシチミジンを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
他の更なるヌクレオシドを含まない、請求項１０に記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、ヌクレオシド分解の１以上の薬剤的に許容される阻害剤を更に含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、前記ヌクレオシド分解の１つの薬剤的に許容される阻害剤を更に含む、請求項１２に記載の使用のための組成物。
【請求項１４】
前記薬剤的に許容される阻害剤がデオキシアデノシン分解の阻害剤である、請求項１２〜１３のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１５】
前記阻害剤がエリスロ−９−（２−ヒドロキシ−３−ノニル）アデニン（ＥＨＮＡ）である、請求項１４に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬の分野に関し、特にミトコンドリア病の治療に関し、更に詳細には、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の欠失／枯渇に起因するミトコンドリア病に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアゲノム（ｍｔＤＮＡ）は、個々のミトコンドリアにおいて複数のコピーで通常は存在する１６．５ｋｂのＤＮＡ分子である。
【０００３】
メンデルのミトコンドリア病の重要なグループは、それらの産物がｍｔＤＮＡ複製又は維持に関与する核遺伝子における突然変異に起因する。このような稀な障害は、ゲノム間の伝達の欠陥、ｍｔＤＮＡ枯渇疾患、ｍｔＤＮＡ多重欠失疾患、又はミトコンドリア枯渇及び欠失疾患（ＭＤＤＳ）としても知られている。これらは特定のオーファンコード（ｏｒｐｈａｎ  ｃｏｄｅ）を有する：ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群についてはＯＲＰＨＡ３５６９８、多重ミトコンドリアＤＮＡ欠失症候群についてはＯＲＰＨＡ２５４８０７を有し、また、ミトコンドリアＤＮＡ枯渇についてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｍｉｍ．ｏｒｇ／ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃＳｅｒｉｅｓ／ＰＳ６０３０４１、多重ミトコンドリアＤＮＡ欠失についてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｍｉｍ．ｏｒｇ／ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃＳｅｒｉｅｓ／ＰＳ１５７６４０のＯＭＩＭデータベースで認識されている。これらの疾患は、罹患組織（例えば、骨格筋、肝臓、脳）の１つ又は組み合わせにおけるｍｔＤＮＡ異常の存在によって特徴づけられる遺伝的及び臨床的に異質な疾患の複雑な群である。
【０００４】
これらの障害の重症度及び進行はまた、軽度の兆候（例えば進行性外眼筋麻痺）から、有名なｍｔＤＮＡ枯渇症候群で見られるような乳幼児期での死に至る可能性がある重度の表現型に至るまで非常に多様性がある。
【０００５】
これまで、ゲノム間の伝達における欠陥に関連する殆どの遺伝子は、ｍｔＤＮＡ複製に直接関与するか、又はＤＮＡ合成のビルディングブロックであるデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の代謝に関与している。しかしながら、ＭＤＤＳに至る益々増加する突然変異が、未知の病理学的機序によるｍｔＤＮＡ不安定性を引き起こす遺伝子において特定されている（ＯＰＡ１、ＭＰＶ１７、ＦＢＸＬ４等）。ある遺伝子における欠陥は特異的に枯渇又は多重ｍｔＤＮＡ欠失のいずれかに至ると古くから考えられてきた。例えば、ＤＧＵＯＫ欠陥は通常、ｍｔＤＮＡ枯渇に至り、一方、ＯＰＡ１欠陥は典型的には多重ｍｔＤＮＡ欠失を引き起こす。それにもかかわらず、ｍｔＤＮＡ枯渇及び多重欠失がｍｔＤＮＡ複製および修復に影響を及ぼす同じ病原経路の考えられる兆候であり得るという証拠が増えてきている。最近まで幼児期に発症するｍｔＤＮＡ枯渇にのみ関連する遺伝子（ＴＫ２、ＤＧＵＯＫ）における突然変異は、現在では更に多重ｍｔＤＮＡ欠失を引き起こし、場合によっては成人で発症することが判明している。
【０００６】
ＭＤＤＳは多臓器障害であるので、関連する合併症の支援的ケア及び対症療法を提供するために、様々な専門医を含む集学的チームが必要である。
【０００７】
現在までに、これらの非常に複雑な疾患の治療に有効な療法は開発されていない。これは基本的に、そのような疾患を引き起こす正確な要因及びメカニズムに関する情報がないこと、１つの症候群と別の症候群との間の多様性等のためである。
【０００８】
上記にもかかわらず、ｄＮＴＰ利用可能性が損なわれることが知られているｄＮＴＰ代謝における欠陥によって引き起こされるＭＤＤＳの適切な療法を見出すいくつかの試みがなされている。例えば、最近の実験研究により、デオキシリボヌクレオチド生合成における欠陥のある段階を回避することで、ｍｔＤＮＡ枯渇を克服できることが示された。特に、プリンｄＮ一リン酸（ｄＮＭＰ）の添加は、ＴＫ２−ＫＯマウスにおけるｍｔＤＮＡ枯渇を救済できることが報告されている（非特許文献１）。更に、非特許文献２は、デオキシリボヌクレオシド及び／又はそれらの異化作用の特異的阻害剤の使用が、ｄＮＴＰホメオスタシスにおける欠陥のための異なるＭＤＤＳを治療するための有効な薬理学的アプローチであり得ることを報告している。
【０００９】
試みがなされたにもかかわらず、これらや他のＭＤＤＳ異型のための治療的アプローチが依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｇａｒｏｎｅ  Ｃ，Ｇａｒｃｉａ−Ｄｉａｚ  Ｂ，Ｅｍｍａｎｕｅｌｅ  Ｖ，Ｌｏｐｅｚ  ＬＣ，Ｔａｄｅｓｓｅ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｄｅｏｘｙｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｙｐａｓｓ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ２  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．ＥＭＢＯ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｈｉｎｅ  ６：１０１６−１０２７．
【非特許文献２】Ｃａｍａｒａ  Ｙ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｖｉｏｑｕｅ  Ｅ，Ｓｃａｒｐｅｌｌｉ  Ｍ，Ｔｏｒｒｅｓ−Ｔｏｒｒｏｎｔｅｒａｓ  Ｊ，Ｃａｂａｌｌｅｒｏ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｓ  ａ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２３：２４５９−２４６７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、デオキシリボヌクレオシドの投与によって、ｄＮＴＰ代謝における欠陥によって引き起こされないＭＤＤＳ疾患におけるｍｔＤＮＡレベルの回復が可能になることを見出した。
【００１２】
これまで、ヌクレオシドの投与は、ｄＮＴＰ代謝における欠陥によって引き起こされるミトコンドリア病の治療においてのみ有効であると一般的に考えられていた。実際、先行技術は、ｄＮＴＰ代謝における欠陥によって引き起こされる疾患を、「欠陥のある」ヌクレオシドの投与によって克服できると仮定した［２］。従って、現在まで、特定のヌクレオチドにおける欠陥によって引き起こされる疾患のみが、問題になっている「欠陥のある」ヌクレオチド／ヌクレオシドの充分な量を投与して治療できることが予想された。
【００１３】
先行技術の教示とは逆に、本発明者らは、ポリメラーゼガンマタンパク質１（ｍｔＤＮＡ複製機構に関与する酵素の１つ）の触媒サブユニットに影響を及ぼすある突然変異を有するＭＤＤＳと以前に診断された患者由来の線維芽細胞サンプルにデオキシリボヌクレオシドを投与した。驚くべきことに、デオキシリボヌクレオシドをそれらのサンプルに投与することによって、患者が保有する突然変異とは独立に、ｍｔＤＮＡレベルが「正常」（健常）レベルに回復されることが判明した（表３、下記参照）。異なる突然変異によって引き起こされる、ＰＯＬＧ１酵素の異常機能（最終的に、複製機構の正しい働きにマイナスの影響を及ぼす）は、３人の患者由来の細胞全てについてデオキシリボヌクレオシドを投与することによって同じ程度まで克服することができることは予測できなかった。デオキシリボヌクレオシドの投与でのｍｔＤＮＡレベルの回復は、ｍｔＤＮＡ複製機構欠陥の原因となる突然変異とは無関係であることを示す。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
従って、第１の態様において、本発明は、ミトコンドリアＤＮＡ枯渇及び／又は欠失症候群の治療で使用するための１つ以上のカノニカルデオキシリボヌクレオシドを含む組成物を提供するが、但し、前記症候群はデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）代謝における欠陥に起因しないものとする。この態様はまた、ミトコンドリアＤＮＡ枯渇及び／又は欠失症候群の治療用薬剤を製造するための１つ以上のカノニカルデオキシリボヌクレオシドを含む組成物の使用として処方することもできるが、但し、前記症候群はデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）代謝における欠陥に起因しないものとする。この態様は、別法として、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）代謝における欠陥に起因しないミトコンドリアＤＮＡ枯渇及び／又は欠失症候群の治療法として処方することができ、当該方法は、治療上有効な量の１つ以上のカノニカルデオキシリボヌクレオシドを、それを必要とする対象に投与することを含む。
【００１５】
実験データは、ＰＯＬＧにおける欠陥のために異なる臨床症状に苦しむ患者由来の細胞で得られた。
【００１６】
ＰＯＬＧは、ＤＮＡポリメラーゼガンマと呼ばれるミトコンドリアＤＮＡポリメラーゼの触媒サブユニットをコードする遺伝子である。真核細胞では、ミトコンドリアＤＮＡは、ＰＯＬＧ遺伝子によってコードされる１４０ｋＤａの触媒サブユニット及びＰＯＬＧ２遺伝子によってコードされる５５ｋＤａの二量体補助サブユニットで構成される三量体タンパク質複合体であるＤＮＡポリメラーゼガンマによって複製される。触媒サブユニットは、３つの酵素活性、つまり、ＤＮＡポリメラーゼ活性、誤って組み込まれたヌクレオチドを校正する３’−５’エキソヌクレアーゼ活性、及び塩基除去修復に必要な５’−ｄＲＰリアーゼ活性を含む。下記実施例では、患者は、エキソヌクレアーゼ又はポリメラーゼドメイン（Ｒ３０９Ｃ（エキソヌクレアーゼドメイン中）、並びにＧ８４８Ｓ及びＶ１１７７Ｌ（ポリメラーゼドメイン中））及びリンカー領域（Ｗ７４８Ｓ）における突然変異に起因するＰＯＬＧ欠損症を患っていた。
【００１７】
本発明者らは驚くべきことに、デオキシリボヌクレオシドの投与は試験した全てのＰＯＬＧ突然変異体について「作用する」こと、突然変異がＰＯＬＧの機能又は構造のいずれに影響を及ぼすかに関係なく、ｍｔＤＮＡレベルが回復されて健常な対象によって示されるものと同じくらいになる程度で、突然変異ＰＯＬＧ形態の酵素活性が実質的に改善されることを見出した。即ち、デオキシリボヌクレオシドの投与は、前記投与前にポリメラーゼ活性が部分的に欠如したＰＯＬＧ酵素形態を過刺激する。
【００１８】
以下で提示する実験データ（下表３にまとめる）により、デオキシリボヌクレオシドの投与が、ＰＯＬＧ遺伝子における突然変異とは関係なくｍｔＤＮＡ重合速度を加速するために充分であり得ると結論づけることができる。しかし、これらの知見はまた、（ｍｔＤＮＡコピー数の減少又は多重ｍｔＤＮＡ欠失のいずれかによる）ｍｔＤＮＡの減少によって特徴づけられることが知られ、そして複製機構自体からのタンパク質（ポリメラーゼガンマの補助単位をコード化するＰＯＬＧ１、ＰＯＬＧ２；とりわけ、ＰＥＯ１、ＭＧＭＥ１、及びＤＮＡ２）又はｍｔＤＮＡ複製に間接的に関与するタンパク質（例えばＭＰＶ１７）における突然変異に起因する他のＭＤＤＳ疾患はまた、デオキシリボヌクレオシドの投与によりＰＯＬＧ酵素活性を過刺激することによって効率的に治療することができる：即ち、ＰＯＬＧ活性を増強することで、ｍｔＤＮＡレベルにおいて実質的な増加があり、これは、そのような損失（特定のタンパク質における特定の突然変異）の原因とは関係なく、ｍｔＤＮＡの損失を「中和」することができ、また「正常な」レベルを回復することができることも示唆する。
【００１９】
従って、ｄＮに基づく治療方針は、部分的又は完全に活性なポリメラーゼ活性のいずれかによって提供される、ｍｔＤＮＡの複製が攻撃される任意の欠陥におけるｍｔＤＮＡ枯渇を部分的又は完全に相殺することができる。
【００２０】
以下に示す実験から、ミトコンドリアＤＮＡレベルの回復は、患者の疾患の重症度とは無関係である可能性があると結論づけることもでき、このことは本発明に大きな治療的価値を付与する。
【００２１】
本発明のＭＤＤＳ対象の治療においてデオキシリボヌクレオシドの投与に関連するさらなる利点はコストであり（安価である）、それらの保存のために特別な要件がないことである。加えて、カノニカルデオキシリボヌクレオシドは全ての生物において通常存在する天然の化合物である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＮＣＢＩデータベースによるＰＯＬＧ１タンパク質のアミノ酸。強調表示されているのは以下の突然変異である：位置３０９→システインによるアルギニンの突然変異、位置７４８→セリンによるトリプトファンの突然変異、位置８４８→セリンによるグリシンの突然変異、位置１１４３→グリシンによるグルタミン酸の突然変異、位置１１７７→ロイシンによるバリンの突然変異。
【図２】ｍｔＤＮＡ枯渇および欠失症候群（ＭＤＤＳ）に関与する代謝経路の図。その機能不全がＭＤＤＳと関連するタンパク質は番号１（ｄＮＴＰ代謝に関与）、番号２（複製機構に属する）または番号３（未知の病理学的機序によってＭＤＤＳに関連付けられる）で表示されている。ＳＵＣＬＡ２およびＳＵＣＬＧ１とヌクレオチド二リン酸キナーゼとの関連性は実証されているが、それらのｄＮＴＰ代謝との関係は明らかにされていない。ｄＮＴＰ代謝に関与するが、ＭＤＤＳおよびデオキシリボヌクレオシド異化酵素の特異的阻害剤とはまだ関連づけられていない他のタンパク質も図示されている：テトラヒドロウリジン（ＴＨＵ）；５−クロロ−６−［１−（２−イミノピロリジニル）メチル］ウラシル塩酸塩（ＴＰＩ）、イムシリンＨ（ＩＨ）及びエリスロ−９−（２−ヒドロキシ−３−ノニル）アデニン（ＥＨＮＡ）。略語：ＡＢＡＴ：４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ；ＡＤＡ：アデノシンデアミナーゼ；ＡＮＴ１：アデニンヌクレオチドトランスロケータ１；ＣＤＡ：シチジンデアミナーゼ；ｃｄＮ：細胞質デオキシリボヌクレオチダーゼ；ｄＡｄｏ：デオキシアデノシン；ｄＣＫ：デオキシシチジンキナーゼ；ｄＣＴＤ：ｄＣＭＰデアミナーゼ；ｄＣｔｄ：デオキシシチジン；ｄＧＫ：デオキシグアノシンキナーゼ；ｄＧｕｏ：デオキシグアノシン；ｄｌｎｏ：デオキシイノシン；ＤＮＡ２：ＤＮＡ複製ヘリカーゼ２；ｄＴｈｄ：チミジン；ｄＵｒｄ：デオキシウリジン；ＥＮＴ１：平衡型ヌクレオシドトランスポータ１；ＦＢＸＬ４：Ｆ−ボックス及びロイシンリッチな反復タンパク質４；ｍｄＮ：ミトコンドリアデオキシリボヌクレオチダーゼ；ＭＦＮ２：マイトフュージン−２；ＭＧＭＥ１：ミトコンドリアゲノム維持エキソヌクレアーゼ１；ＭＰＶ１７：ミトコンドリア内膜ＭＰＶ１７；ＮＤＰＫ：ヌクレオチド二リン酸キナーゼ；ＮＭＰＫ：ヌクレオチド一リン酸キナーゼ；ＯＰＡ１：視神経萎縮１；ＰＮＰ：プリンヌクレオシドホスホリラーゼ；ＰＯＬＧ１：ポリメラーゼガンマサブユニット１；ＰＯＬＧ２：ポリメラーゼガンマサブユニット２；ＲＮＲ：リボヌクレオチドレダクターゼ；ＳＡＭＨＤ１：ＳＡＭドメイン及びＨＤドメイン含有タンパク質１；ＳＵＣＬＡ２：β−サブユニット、スクシネート−ＣｏＡリガーゼ；ＳＵＣＬＧ１：α−サブユニット、スクシネート−ＣｏＡリガーゼ；ＴＫ１：チミジンキナーゼ１；ＴＫ２：チミジンキナーゼ２；ＴＰ：チミジンホスホリラーゼ；ＴＳ：チミジル酸シンターゼ；Ｔｗｉｎｋｌｅ：ミトコンドリアＴｗｉｎｋｌｅヘリカーゼ。
【図３】表示された時間（ｔ０、ｔ７、ｔ１４、ｔ２１およびｔ２６）で集められた細胞におけるｍｔＤＮＡレベルを決定するために従った実験設計のスキーム。ｄＮの安定性を培養の２〜３日後（ｔ１６〜ｔ１７）に細胞培地でモニターした。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、ｄＮＴＰ代謝における欠陥以外の欠陥に起因するＭＤＤＳを患っている患者にデオキシリボヌクレオシドを投与すると、ｍｔＤＮＡレベルの回復を達成できるという知見に基づく。ヌクレオシドは、リン酸基のないヌクレオチドとして考えることができるグリコシルアミンである。ヌクレオシドは、単に核酸塩基（窒素含有塩基とも称する）及び五炭糖（リボースまたはデオキシリボースのいずれか）からなるのに対して、ヌクレオチドは、核酸塩基と五炭糖と１つ以上のリン酸基とから構成される。ヌクレオシドにおいて、塩基は、ベータ−グリコシド結合を介してリボース又はデオキシリボースのいずれかと結合する。ヌクレオシドの例としては、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、チミジン、及びおよびイノシンが挙げられる。
【００２４】
上記で説明したように、ＭＤＤＳ疾患はミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）複製における欠陥に起因する疾患群であり、ｍｔＤＮＡコピー数の減少（ｍｔＤＮＡ枯渇症候群）又は多重ｍｔＤＮＡ欠失（ｍｔＤＮＡ欠失症候群）のいずれかにより特徴づけられる障害を包含する。それらは、これらの種類の病理学の技術に関する参照サイトであるリンク先が存在しない（ｏｒｐｈａｎｅｄ）サイト及びＯｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ  ｃａｔａｌｏｇｕｅでよく認識されたものである。
【００２５】
このミトコンドリア病群は、所定の遺伝子群における突然変異に起因する充分に認識された障害群を構成し、従ってミトコンドリア障害に関する専門家に周知である。いくつかの例では、この疾患群が呼ばれている名称は様々であり得る：ｍｔＤＮＡ枯渇及び欠失症候群［３，４］；ゲノム間の伝達（又はシグナル伝達）の欠陥［５］；ｍｔＤＮＡ複製欠陥［６］；等。場合によってはこれらの名称の２以上が同じ刊行物中で共存する。
【００２６】
ｍｔＤＮＡ複製における欠陥に起因する疾患は、以下のものにおける突然変異に起因し得る：
Ａ：ｍｔＤＮＡ複製機構に属するタンパク質をコード化する遺伝子（図２において番号「２」で表示）［７、８、９、１０、１１］
Ｂ：ヌクレオシド／ヌクレオチド異化作用又は同化作用に関与するタンパク質をコード化する遺伝子（図２において番号「１」で表示）［１２、１３、１４、１５］
Ｃ：機能が未知であるか、あるいはその機能がカテゴリーＡ又はＢに属さず、ｍｔＤＮＡ複製プロセスと生化学的に関連づけることができないタンパク質をコード化する遺伝子（図２において番号「３」で表示）。［１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４］
【００２７】
この分類は当業者には明確に認識されている［３、４、６、２５、２６、２７］。
【００２８】
ｄＮＴＰはＤＮＡ合成の基質として複製フォークで必要とされる。哺乳類細胞は、２つの異なる代謝源、細胞質デノボ合成及びサルベージ経路からＤＮＡ合成及び修復のための前駆体を取得し、後者は細胞質及びミトコンドリアマトリックスに位置する酵素の２つの平行なセットに基づく。ｄＮＴＰの合成は、ＤＮＡ前駆体に関する細胞要求が最高である時点の、核ＤＮＡ複製にカップリングされる。ｄＮＴＰプールは複製相（Ｓ相）が終わったら、又は非分裂細胞においては、著しく減少する。デノボ合成はリボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＮＲ）の細胞質活性に基づく（それについて最近ミトコンドリアチミジル酸シンターゼが特定されたｄＴＭＰを除いて）。ＲＮＲは４つのリボヌクレオシド二リン酸全ての対応するデオキシリボヌクレオシド（ｄＮ）へのアロステリックに均衡のとれた還元を触媒して、細胞周期のＳ相の間に高濃度のｄＮＴＰを有する細胞を提供する。ＲＮＲは２コピーの大サブユニット（Ｒ１）と２つの小サブユニット（Ｒ２またはｐ５３Ｒ２）とを含むヘテロ四量体である。Ｒ２は有糸分裂後期においてプロテアソーム依存的分解を受けるが、ｐ５３Ｒ２は細胞周期全体にわたって存在し、その発現は非分裂細胞においても安定なままである。核ゲノム複製とは異なって、ｍｔＤＮＡ合成は細胞分裂から独立して起こる。ｐ５３Ｒ２によって支持される細胞質デノボ合成は、Ｓ相中にＲ２によって提供されるものと比較するとはるかに低いが、ｐ５３Ｒ２遺伝子上の突然変異はｍｔＤＮＡ枯渇に至るので、ｍｔＤＮＡ維持に対して必須であることが証明された。
【００２９】
サルベージ合成経路は、前駆体ヌクレオシドのｄＮＭＰ、ｄＮＤＰおよび最終的にはｄＮＴＰへの一連のリン酸化に基づく。この経路における最初の律速段階はデオキシヌクレオシドキナーゼによって不可逆的に触媒される。チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）及びデオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）はサイトゾルで機能し、一方、チミジンキナーゼ２（ＴＫ２）及びデオキシグアノシンキナーゼ（ｄＧＫ）はミトコンドリア内に局在化する。サルベージ経路に関与するミトコンドリアキナーゼの突然変異は、重度のＭＤＤＳを引き起こし、そのＤＮＡ維持及び修復のためのｄＮＴＰのサルベージ供給に関するミトコンドリア依存性を証明する。更なるヌクレオチドキナーゼは４つのｄＮＭＰ全てを完全にリン酸化して、ＤＮＡ合成に必要である最終的な対応するｄＮＴＰにする。サイトゾル及びミトコンドリアマトリックスは独立した区画であるが、それらは活発に連絡し、今まであまり明らかにされていない担体によりミトコンドリア内膜を超えてプール成分を双方向に交換する。このクロストークの結果として、ｄＮＴＰプールサイズの変化は、両区画で平行して起こると考えられる。従って、ミトコンドリアは分裂終了細胞におけるｄＮＴＰのそれら自身のサルベージ供給に関する欠陥の影響をより受けやすくなり、この場合、サイトゾルプールは大幅に減少した。
【００３０】
ｄＮＴＰプールサイズは、上記同化経路、ＤＮＡへの取り込み速度及びｄＮＴＰ分解の原因となる分解産物反応の間のバランスに依存する。
【００３１】
ｄＮＴＰは、ミトコンドリアポリメラーゼガンマ（ＰＯＬＧ）によってＤＮＡに取り込まれる基質として複製フォークで必要とされる。ｍｔＤＮＡ複製の正確なモードは現在議論中であるが、ポリメラーゼガンマ（ＰＯＬＧ１によってコード化される触媒サブユニットとＰＯＬＧ２によってコード化される２つの補助サブユニットとによって構成される）、Ｔｗｉｎｋｌｅヘリカーゼ及び一本鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質によって形成される基本的なミトコンドリアレプリソームがインビトロで再構成された［２８］。更なる充分に特徴づけられていない活動は、ｍｔＤＮＡ分子（例えば、プライマーゼ、トポイソメラーゼ）の完全なインビボ複製のため、そして異なる刺激及びストレスに反応したプロセスの開始及び調整のために必要である。いくつかの例は、複製プロセス（それぞれ７ＳＲＮＡ、ヘリカーゼ活性の成熟）においてあるレベルで関与するタンパク質をコード化するＭＧＭＥ１及びＤＮＡ２遺伝子であり、その突然変異は最近、ＭＤＤＳと関連づけられた。
【００３２】
一実施形態において、症候群の治療は、ポリメラーゼガンマ活性を増加させることによって達成される。
【００３３】
一実施形態において、１以上のデオキシリボヌクレオシドはカノニカルデオキシリボヌクレオシドである。有利なことには、そのようなデオキシリボヌクレオシドを用いると、効果の開始は、代謝産物の余分なプロセッシングが必要ないので、更に早くなり得る。加えて、カノニカルデオキシリボヌクレオシドは内在性デオキシリボヌクレオシドと実質的に同一であるので、この疾患の治療に関連する副作用の危険性が低減し得る。
【００３４】
本発明の第１の態様の一実施形態において、症候群は、ミトコンドリアＤＮＡ複製機構における欠陥に起因する。
【００３５】
本発明の第１の態様の別の実施形態において、欠陥は、ミトコンドリアＤＮＡ複製機構の１以上のタンパク質における１つ以上の突然変異に起因する。
【００３６】
さらに別の実施形態において、タンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼサブユニットガンマ１（ＰＯＬＧ１）、ＤＮＡポリメラーゼサブユニットガンマ２（ＰＯＬＧ２）、Ｔｗｉｎｋｌｅタンパク質（ＰＥＯ１）、ミトコンドリアゲノム維持エキソヌクレアーゼ１（ＭＧＭＥ１）、及びヒトヘリカーゼ／ヌクレアーゼＤＮＡ２タンパク質からなる群から選択される。別の実施形態において、タンパク質はＤＮＡポリメラーゼサブユニットガンマ１（ＰＯＬＧ１）またはＴｗｉｎｋｌｅタンパク質である。
【００３７】
ポリメラーゼガンマは、１つの触媒サブユニット（ＰＯＬＧ１によってコードされる）と処理能力因子及びＤＮＡ結合のモジュレータとして作用する２つの補助サブユニット（ＰＯＬＧ２によってコードされる）とによって構成されるヘテロ三量体である。そのＮＣＢＩデータベースの受入番号はＮＰ＿００１１１９６０３．１である（図１及び配列番号１としても提供）。
【００３８】
ＰＯＬＧ関連障害は、幼少期から後期成人期まで存在する広範且つ重複した一連の表現型を提示する。ＰＯＬＧ関連障害の臨床表現型には、常染色体劣性及び優性成人発症ＰＥＯ、ミオクローヌてんかん、ミオパシー、感覚性運動失調（ＭＥＭＳＡ）症候群、ミトコンドリア劣性運動失調症候群（ＭＩＲＡＳ）、及び感覚性運動失調を含む運動失調−神経障害スペクトラム、神経障害、構音障害、眼筋麻痺（ＳＡＮＤＯ）症候群、及び肝脳ＭＤＳ（Ａｌｐｅｒｓ−Ｈｕｔｔｅｎｌｏｃｈｅｒ症候群）が含まれる。最近、ＭＮＧＩＥの臨床的特徴を有するが白質脳症を有さない個体においてＰＯＬＧ突然変異が特定された。
【００３９】
Ａｌｐｅｒｓ−Ｈｕｔｔｅｎｌｏｃｈｅｒ症候群の発生率は約１：５０，０００であると推定されている。それは、ＰＯＬＧ突然変異に関連し、難治性てんかん及び精神運動遅滞、神経障害、及び肝不全を伴う進行性脳症によって特徴づけられる、最も重度の表現型である。罹患者は、通常、２歳から４歳の間で発作（局所、全身性、ミオクローヌス、持続性部分てんかん、またはてんかん重積症）、典型的には視覚または視覚的前兆に関連する頭痛、低血圧、及び精神運動発達退行を提示する。疾患経過の早期で、反射消失および低血圧が存在し、後に痙攣性不全対麻痺が続いて起こり、これは数か月から数年に及び、精神運動発達退行に至る。罹患者は、トランスアミナーゼ上昇を伴う肝臓機能不全、低アルブミン血症、凝血異常、低血糖症、及び高アンモニア血を発症する。肝臓合併症は急速に進行して数ヶ月以内に末期肝不全となる可能性がある。ＣＳＦタンパク質は概して上昇する。神経画像処理は、グリオーシス及び全身性脳萎縮を示し得る。肝臓組織学は、大滴性及び小滴性脂肪肝、小葉中心性壊死、線維症、肝硬変、胆管増殖、及びミトコンドリア増殖を示し得る。ｍｔＤＮＡ量は肝臓で減少する。疾患進行は様々であり、発症からの平均余命は３ヶ月から１２年まで及ぶ。
【００４０】
一実施形態において、ミトコンドリアＤＮＡ枯渇及び／又は欠失症候群はミトコンドリア複製経路における欠陥に起因し、前記欠陥はＰＯＬＧ１タンパク質における以下の突然変異の１つ以上に起因する：システインによるアルギニンの位置３０９での突然変異［２９］、セリンによるトリプトファン残基の位置７４８の突然変異（ｒｓ１１３９９４０９７）、セリンによるグリシンの位置８４８の突然変異（ｒｓ１１３９９４０９８）、グリシンによるグルタミン酸の位置１１４３での突然変異（ｒｓ２３０７４４１）、及びロイシンによるバリンの位置１１７７での突然変異。
【００４１】
あるいは、本発明の第１の態様の別の実施形態において、欠陥は、ＡＮＴ１、ＭＰＶ１７、ＳＵＣＬＡ２、ＦＢＸＬ４、ＡＢＡＴ、ＳＵＣＬＧ１、ＭＦＮ２、及びＯＰＡ１からなる群から選択される１つ以上のタンパク質における１つ以上の突然変異に起因する。第１の態様の別の実施形態において、欠陥は、ＯＰＡ１、ＳＵＣＬＡ２、及びＳＵＣＬＧ１からなる群から選択されるタンパク質における１つ以上の突然変異に起因する。
【００４２】
別の実施形態において、１つ以上のデオキシリボヌクレオシドはカノニカルデオキシリボヌクレオシドである。別の実施形態において、１つ以上のデオキシリボヌクレオシドは、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン、及びデオキシチミジンからなる群から選択される。更に別の実施形態において、組成物は４つのカノニカルデオキシリボヌクレオシドを含む。更に別の実施形態において、組成物は４つのカノニカルデオキシリボヌクレオシドを含み、更なるヌクレオシドを含まない（このことは、組成物が「デオキシリボヌクレオシド成分」としてこれら４つのデオキシリボヌクレオシドを一意的に含むが、賦形剤、担体等を含み得ることを意味する）。更に別の実施形態において、組成物は、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシシチジン、及びデオキシグアノシンを含む。更に別の実施形態において、組成物は、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシシチジン、及びデオキシグアノシンを含み、更なるヌクレオシドを含まない（このことは、組成物が「ヌクレオシド成分」としてこれら４つのヌクレオシドを一意的に含むが、賦形剤、担体等を含み得ることを意味する）。
【００４３】
当業者は、ｍｔＤＮＡレベルを回復するためのデオキシリボヌクレオシドの一つひとつの量（即ち、ミトコンドリア障害の兆候及び症状を改善するために治療上有効な量）を決定することができる。別の実施形態において、組成物が複数のカノニカルデオキシリボヌクレオシドを含む場合、ヌクレオシドは等モル比で存在する。
【００４４】
一実施形態において、組成物は、デオキシアデノシン（ｄＡｄｏ）、デオキシシチジン（ｄＣｔｄ）、デオキシグアノシン（ｄＧｕｏ）、及びデオキシチミジン（通常、チミジン、ｄＴｈｄと呼ばれる）からなり、全てのヌクレオシドが等モル比である組み合わせを含む。
【００４５】
別の実施形態において、組成物は、１以上のヌクレオシド分解の薬剤的に許容される阻害剤を更に含む。
【００４６】
最新技術の周知のヌクレオシド分解阻害剤がある。非限定的実例としては以下のものが挙げられる：ｄＧｕｏ分解阻害剤としてはインムシリン（Ｉｎｍｕｃｉｌｉｎ）Ｈ又はフォロデシン、ｄＣｔｄ分解阻害剤としてはテトラヒドロウリジン、ｄＴｈｄ分解阻害剤としては５−クロロ−６−［１−（２−イミノピロリジニル）メチル］ウラシル塩酸塩（ＴＰＩ）、及びｄＡｄｏ分解阻害剤としてはエリスロ−９−（２−ヒドロキシ−３−ノニル）アデニン（ＥＨＮＡ）。図１はこれらの阻害剤の作用様式を示す。
【００４７】
当業者は、ｍｔＤＮＡレベルを回復するための（１又は複数の）ヌクレオシドの生物学的利用能を保証するために必要な（１又は複数の）阻害剤の量を決定することができる。
【００４８】
一実施形態において、組成物は、１つの薬剤的に許容されるヌクレオシド分解阻害剤を更に含む。別の実施形態において、薬剤的に許容される阻害剤は、デオキシアデノシン分解の阻害剤である。別の実施形態において、阻害剤はエリスロ−９−（２−ヒドロキシ−３−ノニル）アデニン（ＥＨＮＡ）である。
【００４９】
本明細書中での使用について記載されている活性成分は、そのような組成物が経口、直腸、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内等）、又は吸入経路、浸透圧ポンプ、局所、眼等による送達に適するように選択された薬剤的に好適な賦形剤又は担体を用いて処方することができる。
【００５０】
軟膏は、脂肪状、ワックス状、又は合成基剤中に組み込まれた活性成分からなる半固体製剤である。
【００５１】
好適なクリームの例としては、油中水及び水中油エマルジョンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。油中水クリームは、セチルアルコール又はセトステアリルアルコール等の脂肪族アルコールの乳化剤及び乳化ワックスに類似しているが、これらに限定されない特性を有する好適な乳化剤を使用することによって処方することができる。水中油クリームは、セトマクロゴール乳化ワックス等の乳化剤を使用して処方することができる。好適な特性には、エマルジョンの粘度を修飾する能力並びに広範囲のｐＨにわたる物理的及び化学的安定性が含まれる。水溶性又は混和性クリーム基剤は、防腐系を含んでもよく、また緩衝して許容される生理的ｐＨを維持することができる。
【００５２】
上記局所投与法に加えて、本発明の化合物を全身投与する様々な方法がある。１つのそのような手段は、対象者が吸引する活性化合物からなる呼吸域粒子のエアゾル懸濁液を含む。活性化合物は肺を介して血流中に吸収され、薬剤的に有効な量で体循環と接触する。呼吸域粒子は、吸入に際して口及び喉頭を通過するのに十分小さい粒子サイズを有する液体又は固体であり得る。
【００５３】
対象に活性化合物を全身投与する別の手段は、液剤の点鼻薬の形態の液体／液体懸濁液、又は対象が吸入する呼吸域粒子の鼻腔用スプレーの形態での投与を含む。鼻腔用スプレー又は点鼻薬を製造するための活性化合物の液体医薬組成物は、当業者に公知の技術によって滅菌パイロジェンフリー水又は滅菌食塩水等の好適なビヒクルと活性化合物とを組み合わせることによって調製することができる。
【００５４】
活性化合物の全身投与の他の手段は、式Ｉの化合物を含む医薬組成物が、固体、溶液、エマルジョン、分散液、ミセル、リポソーム等の形態である経口投与を含み、結果として得られる処方は、鼻、経腸、又は非経口適用に適した有機又は無機担体又は賦形剤との混合物で、本明細書における使用について想定された活性化合物を含む。活性成分は、例えば、錠剤、ペレット、カプセル、トローチ、ロゼンジ、水性又は油性懸濁液、分散可能な粉末又は顆粒、坐剤、溶液、エマルジョン、懸濁液、ハード又はソフトカプセル、カプレット又はシロップ又はエリキシル及び使用に適した任意の他の形態のための通常の非毒性の薬剤的又は生理学的に許容される担体と配合することができる。使用できる担体としては、アカシアゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプンペースト、三ケイ酸マグネシウム、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイド状シリカ、ジャガイモデンプン、尿素、中鎖長トリグリセリド、デキストラン、及び固体、半固体、又は液体形態の、製剤の製造で使用するのに適した他の担体が挙げられる。更に、補助剤、安定剤、増粘剤、及び着色剤を使用することができる。本明細書中での使用のために想定される活性化合物は、投与されると所望の効果をもたらすために充分な量（即ち、治療上有効な量）で製剤処方中に含まれる。
【００５５】
経口送達システム開発の当業者は慣習的基準を用いて選択できるので、粉末、溶液、懸濁液、又は錠剤は生理学的に適合性のビヒクル中に活性化合物を含む。例えば、そのような処方は、薬剤的に洗練された味の良い製剤を提供するために、香味剤（例えばペパーミント、ウィンターグリーン油、又はチェリー）、着色剤、保存剤等から選択される１以上の薬剤を含んでもよい。非毒性で薬剤的に許容される賦形剤との混合物中に活性成分を含む錠剤は公知方法によって製造することもできる。使用する賦形剤は、例えば、（１）炭酸カルシウム、ラクトース、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム等の不活性希釈剤、（２）コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸等の造粒剤および崩壊剤、（３）トラガカントガム、コーンスターチ、ゼラチン、アカシア等の結合剤、並びに（４）ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク等の潤滑剤であってよい。錠剤はコーティングされていなくてもよいし、又は公知技術によってコーティングして、胃腸管中での崩壊及び吸収を遅らせ、それによってより長時間にわたって作用を持続させることができる。例えば、グリセリルモノステアレート又はグリセリルジステアレート等の時間遅延材料を用いてもよい。
【００５６】
経口使用のための処方がハードゼラチンカプセルの形態である場合、活性成分を、不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、カオリン等と混合することができる。それらはまた、活性成分が水又は油媒体、例えば、ピーナッツ油、液体パラフィン、オリーブ油等と混合されているソフトゼラチンカプセルの形態であってもよい。
【００５７】
対象に対して活性化合物を全身投与する更なる手段は、治療上有効な量の化合物が体循環に達するような活性化合物の坐剤形態を含む。
【００５８】
投与される活性化合物の特定の処方の溶解度に応じて、ミトコンドリア障害の兆候及び症状を改善する一日用量を１又は複数の単位用量投与に分割することができる。
【００５９】
明細書及び特許請求の範囲全体にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」の語及びこの語の変化形は、他の技術的特徴、添加剤、成分、又はステップを排除することを意図しない。更に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」の語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」の場合を包含する。発明の更なる目的、利点、及び特徴は、記載の精査により当業者には明らかになるか、又は発明の実施によりわかる可能性がある。以下の実施例を実例として提供し、それらは発明を限定することを意図しない。更に、本発明は本明細書中で記載する特定の好ましい実施形態のあらゆる可能な組み合わせを対象とする。
【実施例】
【００６０】
１．方法
患者
ＰＯＬＧ欠損症を患っている３人の患者由来の細胞を実験に採用した。全ての対象は我々の治験審査委員会及びヘルシンキ宣言に従ってインフォームドコンセントを提出した。ＰＯＬＧにおける突然変異（ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００１１１９６０３．１）はサンガー法シーケンシングによって３人の患者全てにおいて特定された。全ＤＮＡを、線維芽細胞からＱｉａＡＭＰ  Ｍｉｎｉ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、関心対象の突然変異部位を含む約５００ｂｐのフラグメントを、下記プライマー対及びｒＴａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用いて従来型ＰＣＲによって増幅した：
【００６１】
使用したプライマーは以下のとおりであった：
プライマー１（Ｒ３０９Ｃ、９２５  ｃ→ｔ）
順方向プライマー  ＧＴＣＣＡＣＡＣＣＡＣＣＡＡＧＣＡＧＴ（配列番号２）
逆方向プライマー  ＧＧＴＣＣＣＡＡＧＣＡＣＴＡＴＧＣＴＣＣ（配列番号３）
プライマー２  （Ｗ７４８Ｓ  ｃ．２２４３Ｇ→Ｃ）
順方向プライマー  ＣＣＴＴＧＣＴＧＡＡＴＧＣＡＧＧＴＧＣＴ（配列番号４）
逆方向プライマー  ＴＧＴＧＣＣＴＧＡＡＡＴＣＡＣＡＣＴＣＴＧＴ（配列番号５）
プライマー３（Ｇ８４８Ｓ  ｃ．２５４２Ｇ→Ａ）
順方向プライマー  ＡＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＡＧＴＧＧＴＴＧＴ（配列番号６）
逆方向プライマー  ＣＣＣＴＣＡＧＡＧＣＣＣＡＧＴＴＴＣＴＡＣ（配列番号７）
プライマー３（Ｅ１１４３Ｇ  ｃ．３４２８Ａ→Ｇ）
順方向プライマー  ＣＣＣＡＧＴＴＴＡＴＧＡＣＣＡＧＣＣＧＴ（配列番号８）
逆方向プライマー  ＣＡＡＧＧＡＡＣＧＣＴＣＡＣＣＣＡＡＡＧ（配列番号９）
プライマー４（Ｖ１１７７Ｌ  ｃ．３５２９Ｇ→Ｃ）
順方向プライマー  ＡＧＧＧＧＡＡＧＣＣＣＴＧＣＴＣＴＡＡＧ（配列番号１０）
逆方向プライマー  ＡＣＡＡＡＴＧＴＧＴＴＧＴＧＣＴＣＡＣＣＣ（配列番号１１）
【００６２】
シーケンシング反応を、同じプライマー及びＢｉｇＤｙｅ  ｖ３．１シーケンシングキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて実施し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｘ−Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ精製キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって精製し、そしてＡＢＩ  ３１３０シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で配列決定した。患者１（ｐ．Ｒ３０９Ｃ突然変異についてホモ接合性）は重度の神経学的表現型（神経障害、脳症、ＭＮＧＩＥ様）を患っていて、２０歳で死に至った；患者２（ｐ．Ｗ７４８Ｓ及びｐ．Ｇ８４８Ｓ突然変異について複合ヘテロ接合体）は重症度の低い表現型であるが主に神経学的（神経障害、神経科的症状、ＭＮＧＩＥ様）を患っていた；患者３（シスｐ．Ｖ１１７７Ｌ及びｐ．Ｅ１１４３Ｇにおける２つの優性アミノ酸変化についてヘテロ接合体）はＰＥＯ（進行性外眼筋麻痺）、神経科的症状及び近位筋脱力の優性遺伝の周知のパターンを提示した。３人の患者全てからの骨格筋はｍｔＤＮＡ欠失の蓄積を示したが、顕著な枯渇は示さなかった。
【００６３】
細胞培養
初代培養線維芽細胞を患者１〜３及び４人の健常ドナーの皮膚バイオプシーから入手した。全ての対象は我々の治験審査委員会及びヘルシンキ宣言にしたがってインフォームドコンセントを提出した。
【００６４】
細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２の加湿インキュベータ中で、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及びストレプトマイシンを追加した４．５ｇ／Ｌのグルコース、並びに１０％透析ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、９．５ｃｍ２の６ウェルプレート中に播種した。緊密なコンフルエンスに達した後、ＦＢＳを０．１％まで減じて休止を誘導し、そして５ｎｇ／ｍｌのＥｔＢｒ（エチジウムブロマイド、Ｍｅｒｃｋ）での同時処理を開始した（０日、ｔ０）。細胞培地を同じ処理で２〜３日ごとに２週間置換した。第１４日（ｔ１４）に、ＥｔＢｒを細胞培地から除去し、全ての細胞のセットの処理を２００μΜの４つのデオキシヌクレオシド（ｄＮ）全て：ｄＡｄｏ（デオキシアデノシン、Ｓｉｇｍａ）、ｄＣｔｄ（デオキシシチジン、Ｓｉｇｍａ）、ｄＧｕｏ（デオキシグアノシン、Ｓｉｇｍａ）、ｄＴｈｄ（デオキシチミジン、Ｓｉｇｍａ）、及び５μΜのＥＨＮＡ（Ｓｉｇｍａ）で開始した。細胞のセットを未処理のままにし、全てのパラメータを平行してモニターした。細胞培地を同じ処理で２〜３日おきに更に１２日間置換した。第１６又は１７日に、培地を集め、更に使用するまで−２０℃で保存した。ＤＮＡ分析のために、細胞を第０、７、１４、２１、及び２６日にトリプシン処理によって収集し、リン酸緩衝食塩水で洗浄し、ペレット化し、そしてＤＮＡ単離まで−２０℃で保存した（図２）。ＱｉａＡＭＰ  ＤＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＤＮＡを単離した。
【００６５】
細胞培養培地中のデオキシヌクレオシド安定性の評価
ｄＮ及びいくつかの関連する代謝産物を、タンデム質量分析と結合した液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ装置（Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ−Ｘｅｖｏ（商標）ＴＱ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ，Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して、以前に記載されているようにして測定した［２］。細胞培地を１４，０００×ｇ及び４℃で３０分間限界ろ過（３ｋＤａ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ｆｉｌｔｅｒｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によってタンパク質除去した後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。
【００６６】
ｍｔＤＮＡ調査
ｍｔＤＮＡコピー数は以前に記載されたように定量的ＰＣＲにより評価した［２］。
【００６７】
ＰＣＲ条件及びＮｉｓｈｉｇａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．［３０］で開示されたプライマーに従ってロングレンジＰＣＲブロットによってｍｔＤＮＡ欠失を調査した：
【００６８】
順方向プライマー（Ｆ１１４２〜１５１６）：
ＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＡＡＧＴＡＴＡＣＴＴＣＡＡＡＧＧ（配列番号１２）
逆方向プライマー（Ｒ１１８０〜１１４６）：
ＡＣＣＧＣＣＡＧＧＴＣＣＴＴＴＧＡＧＴＴＴＴＡＡＧＣＴＧＴＧＧＣＴＣＧ（配列番号１３）
【００６９】
２．結果
ＥｔＢｒ曝露はＰＯＬＧ欠損休止線維芽細胞においてより大きなｍｔＤＮＡ枯渇を誘導する。
【００７０】
ｍｔＤＮＡ枯渇の治療可能性を試験する場合の重要な制限は、多くの場合、ＭＤＤＳ患者由来の細胞が細胞培養においてｍｔＤＮＡ異常を示さないという事実である。この理由から、ｍｔＤＮＡ複製に影響を及ぼす分子欠陥を証明するために、異なるモデルが開発された。ＥｔＢｒ曝露は、培養された細胞においてｍｔＤＮＡ枯渇させるため、そして正常なｍｔＤＮＡレベルを回復するそれらの複製能力を分析するために、最新技術で繰り返し用いられてきた（Ｐｏｎｔａｒｉｎｅｔ  ａｌ．“Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｐ５３Ｒ２  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ”，２０１２，ＰＮＡＳ，ｖ．１０９（３３），ｐａｇｅｓ  １３３０２−１３３０７）。ｍｔＤＮＡ枯渇を健常対照とＰＯＬＧ欠損静止細胞の両方において、５ｎｇ／ｍｌのＥｔＢｒに１４日間曝露することによって誘導した。すべての細胞において著しいｍｔＤＮＡ枯渇が観察された。しかしながら、全てのＰＯＬＧ欠損細胞は、健常対照から得られた線維芽細胞株において観察されるものと比べて線維芽細胞株においてより高度のｍｔＤＮＡ枯渇を経験した（ｍｔＤＮＡ残留レベル±ＳＥの平均百分率：１７．５±２，３％、対照細胞：３９．６８±６．６％）。このデータは、ＰＯＬＧ突然変異に起因する分子欠陥が複製プロセスのＥｔＢｒ障害を悪化させ得ることを示唆する。
【００７１】
ＰＯＬＧ欠損線維芽細胞は、ｄＮ＋ＥＨＮＡの組み合わせで処理された場合、ＥｔＢｒ強制枯渇後のｍｔＤＮＡレベルを完全に回復する。
【００７２】
ＥｔＢｒ除去後、４つのｄＮ全てで細胞培養培地の補足のｍｔＤＮＡレベル回復に対する影響を調査した。ｄＡｄｏが細胞外及び細胞内酵素分解に特に敏感であることが、主にＡＤＡ（アデノシンデアミナーゼ）によって以前に報告された［２］。従って、ｄＡｄｏ異化作用の部分阻害を発揮し、その安定性を改善するために、培地に等モル濃度の全ての４つのカノニカルｄＮ（２００μΜのｄＧｕｏ、ｄＡｄｏ、ｄＴｈｄ、及びｄＣｔｄ）＋５μΜのＥＨＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を添加した。Ｃａｍａｒａ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，２０１４［２］で開示されたものと同じプロトコルにしたがって、１６〜１７日で、添加されたｄＮの濃度を測定し、また２〜３日ならし培地中のそれらの誘導代謝産物の一部を測定した。部分分解にもかかわらず、全ての場合で残存する全てのｄＮの濃度は最初に添加されたものの７０％より高かった（表２）。対照又は患者由来の細胞からの馴らし培地間でｄＮ安定性における有意差は観察されなかった。
【００７３】
【表１】
2018516923.tif 000002
【００７４】
結果は、３つの異なるＰＯＬＧ欠損細胞株及び４つの対照細胞株からの平均±ＳＤである。ｄＵｒｄ：デオキシウリジン；ｄＩｎｏ：デオキシイノシン。
【００７５】
ｍｔＤＮＡ回復を、ｄＮ補足の存在下または不在下のいずれかでＥｔＢｒ除去の前後でモニターした（Ｃａｍａｒａ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，２０１４［２］のプロトコルと同じプロトコルに従う）。対照細胞からのｍｔＤＮＡコピー数はｄＮ処置に関係なくＥｔＢｒ除去の１２日後に初期レベルの１００％を超える値に達した（ｍｔＤＮＡ残留レベル±ＳＥの平均百分率：１２９．８±３５．２％処置なし、１５３．９±４０．６％処置あり）。反対に、ＰＯＬＧ欠損細胞はｄＮを追加しなければ正常なｍｔＤＮＡレベルを回復できなかった（２６．６±１．５％）。
【００７６】
【表２】
2018516923.tif 000003
【００７７】
値は、０日のｍｔＤＮＡコピー数に対するｍｔＤＮＡコピー数の百分率として表す。ＥｔＢｒで誘発された枯渇の後、細胞を実験第１４日からｄＮ＋ＥＨＮＡで処理するか又は処理しない。
【００７８】
表３に示す結果から、カノニカルヌクレオシドの投与により、ＭＤＤＳ患者において健常な対象で見られるものに匹敵するｍｔＤＮＡレベルを達成するのが可能になると結論づけることができる（１５０．３±２１．９％、表３）。従って、このデータは、ヌクレオシドの投与が、ｄＮＴＰ代謝欠陥におけるもの以外の欠陥に起因するＭＤＤＳを患っている患者において、ｍｔＤＮＡレベルを「健康な」状態に関連するレベルまで回復できることを表し、この種類の疾患の治療における組み合わせの治療可能性を表す。
【００７９】
引用文献
１．Ｇａｒｏｎｅ  Ｃ，Ｇａｒｃｉａ−Ｄｉａｚ  Ｂ，Ｅｍｍａｎｕｅｌｅ  Ｖ，Ｌｏｐｅｚ  ＬＣ，Ｔａｄｅｓｓｅ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｄｅｏｘｙｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｙｐａｓｓ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ２  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．ＥＭＢＯ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｈｉｎｅ  ６：１０１６−１０２７．
２．Ｃａｍａｒａ  Ｙ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｖｉｏｑｕｅ  Ｅ，Ｓｃａｒｐｅｌｌｉ  Ｍ，Ｔｏｒｒｅｓ−Ｔｏｒｒｏｎｔｅｒａｓ  Ｊ，Ｃａｂａｌｌｅｒｏ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｓ  ａ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２３：２４５９−２４６７．
３．Ｃａｍａｒａ  Ｙ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｖｉｏｑｕｅ  Ｅ，Ｓｃａｒｐｅｌｌｉ  Ｍ，Ｔｏｒｒｅｓ−Ｔｏｒｒｏｎｔｅｒａｓ  Ｊ，Ｍａｒｔｉ  Ｒ（２０１３）Ｆｅｅｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｓａｌｖａｇｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｔｏ  ｒｅｓｃｕｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  １８：９５０−９５７．
４．Ｓｕｏｍａｌａｉｎｅｎ  Ａ，Ｉｓｏｈａｎｎｉ  Ｐ（２０１０）Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ−ｍａｎｙ  ｇｅｎｅｓ，ｃｏｍｍｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ  Ｄｉｓｏｒｄ  ２０：４２９−４３７．
５．Ｓｐｉｎａｚｚｏｌａ  Ａ，Ｚｅｖｉａｎｉ  Ｍ（２００５）Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ−ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｉｎｔｅｒｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｇｅｎｅ  ３５４：１６２−１６８．
６．Ｃｏｐｅｌａｎｄ  ＷＣ（２０１２）Ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４７：６４−７４．
７．Ｎａｖｉａｕｘ  ＲＫ，Ｎｙｈａｎ  ＷＬ，Ｂａｒｓｈｏｐ  ＢＡ，Ｐｏｕｌｔｏｎ  Ｊ，Ｍａｒｋｕｓｉｃ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｇａｍｍａ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｍｔＤＮＡ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｃｈｉｌｄ  ｗｉｔｈ  Ａｌｐｅｒｓ’  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ４５：５４−５８．
８．Ｈａｋｏｎｅｎ  ＡＨ，Ｉｓｏｈａｎｎｉ  Ｐ，Ｐａｅｔａｕ  Ａ，Ｈｅｒｖａ  Ｒ，Ｓｕｏｍａｌａｉｎｅｎ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  Ｔｗｉｎｋｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｏｎｓｅｔ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ  ｗｉｔｈ  ｍｔＤＮＡ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ．Ｂｒａｉｎ  １３０：３０３２−３０４０．
９．Ｋｏｒｎｂｌｕｍ  Ｃ，Ｎｉｃｈｏｌｌｓ  ＴＪ，Ｈａａｃｋ  ＴＢ，Ｓｃｈｏｌｅｒ  Ｓ，Ｐｅｅｖａ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｌｏｓｓ−  ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＭＧＭＥ１  ｉｍｐａｉｒ  ｍｔＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｕｓｅ  ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．
１０．Ｒｏｎｃｈｉ  Ｄ，Ｄｉ  Ｆｏｎｚｏ  Ａ，Ｌｉｎ  Ｗ，Ｂｏｒｄｏｎｉ  Ａ，Ｌｉｕ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＤＮＡ２  Ｌｉｎｋ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｍｙｏｐａｔｈｙ  ｔｏ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．
１１．Ｌｏｎｇｌｅｙ  ＭＪ，Ｃｌａｒｋ  Ｓ，Ｙｕ  Ｗａｉ  Ｍａｎ  Ｃ，Ｈｕｄｓｏｎ  Ｇ，Ｄｕｒｈａｍ  ＳＥ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）  Ｍｕｔａｎｔ  ＰＯＬＧ２  ｄｉｓｒｕｐｔｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｇａｍｍａ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ａｎｄ  ｃａｕｓｅｓ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｐｌｅｇｉａ．Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ７８：１０２６−１０３４．
１２．Ｍａｎｄｅｌ  Ｈ，Ｓｚａｒｇｅｌ  Ｒ，Ｌａｂａｙ  Ｖ，Ｅｌｐｅｌｅｇ  Ｏ，Ｓａａｄａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｔｈｅ  ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ｗｉｔｈ  ｄｅｐｌｅｔｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｅｒｅｂｒａｌ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２９：３３７−３４１．
１３．Ｓａａｄａ  Ａ，Ｓｈａａｇ  Ａ，Ｍａｎｄｅｌ  Ｈ，Ｎｅｖｏ  Ｙ，Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｍｕｔａｎｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｍｙｏｐａｔｈｙ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２９：３４２−３４４．
１４．Ｂｏｕｒｄｏｎ  Ａ，Ｍｉｎａｉ  Ｌ，Ｓｅｒｒｅ  Ｖ，Ｊａｉｓ  ＪＰ，Ｓａｒｚｉ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＲＭ２Ｂ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｐ５３−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  （ｐ５３Ｒ２），ｃａｕｓｅｓ  ｓｅｖｅｒｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３９：７７６−７８０．
１５．Ｎｉｓｈｉｎｏ  Ｉ，Ｓｐｉｎａｚｚｏｌａ  Ａ，Ｈｉｒａｎｏ  Ｍ  （１９９９）  Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＭＮＧＩＥ，ａ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：６８９−６９２．
１６．Ｒｏｕｚｉｅｒ  Ｃ，Ｂａｎｎｗａｒｔｈ  Ｓ，Ｃｈａｕｓｓｅｎｏｔ  Ａ，Ｃｈｅｖｒｏｌｌｉｅｒ  Ａ，Ｖｅｒｓｃｈｕｅｒｅｎ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）  Ｔｈｅ  ＭＦＮ２  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ  ’ｐｌｕｓ’  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｂｒａｉｎ  １３５：２３−３４．
１７．Ｒｅｎａｌｄｏ  Ｆ，Ａｍａｔｉ−Ｂｏｎｎｅａｕ  Ｐ，Ｓｌａｍａ  Ａ，Ｒｏｍａｎａ  Ｃ，Ｆｏｒｉｎ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）  ＭＦＮ２，ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ．Ｂｒａｉｎ．
１８．Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ  Ｅ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ  Ｍ，Ｂａｔｂａｙｌｉ  Ｍ，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  Ｅ，Ｈｊａｌｍａｒｓｏｎ  Ｏ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＳＵＣＬＧ１  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ，ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｐａｔｈｉｃ  ｆｏｒｍ，ｗｉｔｈ  ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄｕｒｉａ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  １６９：２０１−２０５．
１９．Ａｍａｔｉ−Ｂｏｎｎｅａｕ  Ｐ，Ｖａｌｅｎｔｉｎｏ  ＭＬ，Ｒｅｙｎｉｅｒ  Ｐ，Ｇａｌｌａｒｄｏ  ＭＥ，Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）  ＯＰＡ１  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ  ’ｐｌｕｓ’  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｂｒａｉｎ  １３１：３３８−３５１．
２０．Ｂｌａｋｅｌｙ  ＥＬ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ａ，Ｈａｄｄｅｎ  ＲＤ，Ｂｏｄｉ  Ｉ，Ｈｅ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）  ＭＰＶ１７  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃａｕｓｅｓ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ  ａｎｄ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｔＤＮＡ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｕｓｃｌｅ．Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ  Ｄｉｓｏｒｄ  ２２：５８７−５９１．
２１．Ｓｐｉｎａｚｚｏｌａ  Ａ，Ｖｉｓｃｏｍｉ  Ｃ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｖｉｚａｒｒａ  Ｅ，Ｃａｒｒａｒａ  Ｆ，Ｄ’Ａｄａｍｏ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）  ＭＰＶ１７  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａｎ  ｉｎｎｅｒ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｉｓ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｉｎ  ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３８：５７０−５７５．
２２．Ｗｅｄｄｉｎｇ  ＩＭ，Ｋｏｈｔ  Ｊ，Ｔｒａｎ  ＧＴ，Ｍｉｓｃｅｏ  Ｄ，Ｓｅｌｍｅｒ  ＫＫ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）  Ｓｐａｓｔｉｃ  ｐａｒａｐｌｅｇｉａ  ｔｙｐｅ  ７  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９：ｅ８６３４０．
２３．Ｂｏｎｎｅｎ  ＰＥ，Ｙａｒｈａｍ  ＪＷ，Ｂｅｓｓｅ  Ａ，Ｗｕ  Ｐ，Ｆａｑｅｉｈ  ＥＡ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＦＢＸＬ４  ｃａｕｓｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ  ａｎｄ  ａ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ９３：４７１−４８１．
２４．Ｇａｉ  Ｘ，Ｇｈｅｚｚｉ  Ｄ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＭＡ，Ｂｉａｇｏｓｃｈ  ＣＡ，Ｓｈａｍｓｅｌｄｉｎ  ＨＥ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＦＢＸＬ４，ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｃａｕｓｅ  ｅａｒｌｙ−ｏｎｓｅｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｐａｔｈｙ．Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ９３：４８２−４９５．
２５．Ｎｏｇｕｅｉｒａ  Ｃ，Ａｌｍｅｉｄａ  ＬＳ，Ｎｅｓｔｉ  Ｃ，Ｐｅｚｚｉｎｉ  Ｉ，Ｖｉｄｅｉｒａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ．Ｉｔａｌ  Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  ４０：３４．
２６．Ｃｏｐｅｌａｎｄ  ＷＣ  （２００８）  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  ５９：１３１−１４６．
２７．Ｃｏｐｅｌａｎｄ  ＷＣ  （２０１４）  Ｄｅｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｃｈｉｌｄ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２９：１２１６−１２２４．
２８．Ｋｏｒｈｏｎｅｎ  ＪＡ，Ｐｈａｍ  ＸＨ，Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ  Ｍ，Ｆａｌｋｅｎｂｅｒｇ  Ｍ  （２００４）  Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｍｔＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｓｏｍｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２３：２４２３−２４２９．
２９．Ａｍｉｏｔ  Ａ，Ｔｃｈｉｋｖｉｌａｄｚｅ  Ｍ，Ｊｏｌｙ  Ｆ，Ｓｌａｍａ  Ａ，Ｈａｔｅｍ  ＤＣ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｓｅｕｄｏ−ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３７：１０１−１０９．
３０．Ｎｉｈｉｇａｋｉ  Ｙ，Ｍａｒｔｉ  Ｒ，Ｈｉｒａｎｏ  Ｍ  （２００４）  ＮＤ５  ｉｓ  ａ  ｈｏｔ−ｓｐｏｔ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｔｙｐｉｃａｌ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｎｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｐａｔｈｙ．Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３：９１−１０１．
【図１】
2018516923.tif 000004
【図２】
2018516923.tif 000005
【図３】
2018516923.tif 000006
【配列表】
2018516923000001.app
【国際調査報告】
2018516923.tif 000007
2018516923.tif 000008
2018516923.tif 000009
2018516923.tif 000010