(57)【要約】高感受性で高効率の陰イオン伝導チャネルロドプシンである、藻類由来の新クラスのロドプシンの特定及び特徴決定に用いられる方法及び組成物。これらの陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインは、クローン化され、哺乳類系で発現しており、したがってとりわけ光遺伝学的用途に、及び電気的活性のある細胞が媒介する障害の治療剤として、使用することができる。本明細書で説明するのは、光開閉型の塩素イオン伝導により、高感受性で高効率の膜過分極及び神経細胞のサイレンシングを提供する、光開閉型陰イオンチャネルの新ファミリー、陰イオンチャネルロドプシン（ＡＣＲ）である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種プロモーター配列に機能的に連結された組換え核酸であって
（ａ）配列番号１、配列番号３または配列番号１３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するペプチドをコードする配列；または
（ｂ）配列番号１、配列番号３または配列番号１３から選択される連続する２２５アミノ酸を含むペプチドをコードする配列；または
（ｃ）配列番号２、配列番号４またはその相補のヌクレオチド配列にハイブリダイズする配列
を含んでいる、前記組換え核酸。
【請求項２】
発現ベクターを含んでいる、請求項１に記載の組換え核酸。
【請求項３】
請求項１に記載の組換え核酸を含んでいる、組換え宿主細胞。
【請求項４】
前記宿主細胞は単離されたヒト細胞である、請求項３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５】
前記宿主細胞は非ヒト哺乳類細胞である、請求項３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６】
前記宿主細胞は細菌細胞である、請求項３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７】
前記宿主細胞は酵母細胞である、請求項３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項８】
前記宿主細胞は昆虫細胞である、請求項３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項９】
前記宿主細胞は植物細胞である、請求項３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１０】
前記宿主細胞は単離された神経細胞である、請求項３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１１】
前記宿主細胞は単離された電気的活性のある細胞である、請求項３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１２】
神経細胞が媒介する障害に罹患している対象の細胞の膜過分極の方法であって、
（ａ）前記対象の前記細胞に、前記細胞内で発現可能な、陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードする配列番号１、配列番号３、及び配列番号１３からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを送達すること；及び
（ｂ）前記ベクターを前記細胞内で発現させることが含まれ、ロドプシン発現によって前記神経細胞からのシグナルがサイレンシングされる、前記方法。
【請求項１３】
神経細胞が媒介する障害に罹患している対象の神経細胞サイレンシングの方法であって、
（ａ）前記対象の標的神経細胞に、前記標的神経細胞内で発現可能な、陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードする配列番号１、配列番号３、及び配列番号１３からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを送達すること；及び
（ｂ）前記ベクターを前記標的神経細胞内で発現させることが含まれ、ロドプシン発現の結果として前記標的神経細胞からのシグナルのサイレンシングが生じる、前記方法。
【請求項１４】
失明または盲目に罹患している対象の網膜の感光性を回復させる方法であって、
（ａ）前記対象の網膜に、網膜神経細胞内で発現可能な、陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードする配列番号１、配列番号３、及び配列番号１３からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを送達すること；及び
（ｂ）前記ベクターを前記網膜神経細胞内で発現させることが含まれ、ロドプシン発現により前記網膜神経細胞で高レベルの膜電位が得られる、前記方法。
【請求項１５】
（ａ）前記対象の細胞にロドプシンドメインをコードする発現ベクターを送達することであって、前記ベクターは、配列番号１、配列番号３及び配列番号１３から選択される陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードしプロモーター配列に機能的に連結されたオープン読み枠を含む、前記送達すること；及び
（ｂ）前記ベクターを前記細胞で発現させることが含まれ、ロドプシン発現により前記細胞で高レベルの膜電位が得られる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
ステップｃ）で、配列番号２またはその相補のヌクレオチド配列にハイブリダイズした前記配列は、さらに、フィルター結合ＤＮＡへの０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中４２℃での洗浄を含む、請求項１に記載の組換え核酸。
【請求項１７】
前記対象は哺乳類である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象はヒトである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記送達することには、製薬上許容される担体が含まれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
配列番号１、配列番号３または配列番号１３を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んでいる、ｃＤＮＡ由来核酸。
【請求項２１】
配列番号２、配列番号４、または配列番号１４〜１５の核酸配列を含んでいる、請求項１９に記載のｃＤＮＡ由来核酸。
【請求項２２】
請求項１９に記載のｃＤＮＡ由来核酸を含んでいる、発現ベクター。
【請求項２３】
電気的活性のある細胞が関与する障害に罹患している対象の電気的活性のある細胞の障害を治療する方法であって、
（ａ）前記対象の前記細胞に、前記細胞内で発現可能な、配列番号１、配列番号３、または配列番号１３からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを送達すること；及び
（ｂ）前記ベクターを前記電気的活性のある細胞内で発現させることが含まれ、ロドプシン発現によって前記電気的活性のある細胞からのシグナルがサイレンシングされる、前記方法。
【請求項２４】
電気的活性のある細胞が関与する障害に罹患している対象の電気的活性のある細胞の障害を治療する方法であって、
（ａ）前記対象に、遺伝子導入細胞内で発現可能な、配列番号１、配列番号３、及び配列番号１３からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む前記遺伝子導入細胞を送達すること；及び
（ｂ）前記ベクターを前記遺伝子導入細胞内で発現させることが含まれ、発現によって電気的活性のある細胞からのシグナルがサイレンシングされる、前記方法。
【請求項２５】
電気的活性のある細胞が媒介する障害に罹患している対象の電気的活性のある細胞のサイレンシングの方法であって、
（ａ）前記対象の標的神経細胞に、前記標的神経細胞で発現可能な陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードする配列番号１、配列番号３及び配列番号１３からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを送達すること；及び
（ｂ）前記ベクターを前記標的電気的活性のある細胞内で発現させることが含まれ、ロドプシン発現の結果として前記電気的活性のある細胞からのシグナルのサイレンシングが生じる、前記方法。
【請求項２６】
配列番号１５〜２４の配列と少なくとも約９０％同一である配列を有する陰イオン伝導チャネルロドプシンをコードする配列を含んでいる、単離された核酸分子。
【請求項２７】
配列番号１５〜２４の配列と少なくとも約９５％同一である配列を有する配列を含んでいる、請求項２６に記載の単離された核酸分子。
【請求項２８】
前記核酸はＤＮＡである、請求項２６に記載の単離された核酸分子。
【請求項２９】
前記核酸はＲＮＡである、請求項２６に記載の単離された核酸分子。
【請求項３０】
前記核酸はｍＲＮＡである、請求項２９に記載の単離された核酸分子。
【請求項３１】
請求項２６に記載の核酸分子を含んでいる、発現ベクター。
【請求項３２】
請求項２６に記載の核酸を含んでいる、組換え宿主細胞。
【請求項３３】
前記宿主細胞は単離されたヒト細胞である、請求項３２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３４】
前記宿主細胞は非ヒト哺乳類細胞である、請求項３２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３５】
前記宿主細胞は細菌細胞である、請求項３２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３６】
前記宿主細胞は酵母細胞である、請求項３２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３７】
前記宿主細胞は昆虫細胞である、請求項３２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３８】
前記宿主細胞は植物細胞である、請求項３２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３９】
前記宿主細胞は単離された神経細胞である、請求項３２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４０】
前記宿主細胞は単離された電気的活性のある細胞である、請求項３２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４１】
電気的活性のある細胞が関与する障害に罹患している対象を治療する方法であって、前記対象の前記電気的活性のある細胞の部位で有効量の陰イオン伝導チャネルロドプシンを発現させることが含まれる、前記方法。
【請求項４２】
前記対象は神経因性疼痛を抱えており、前記対象の前記疼痛の部位で有効量の陰イオン伝導チャネルロドプシンを発現させることが含まれる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記発現させることには、陰イオン伝導チャネルロドプシンを前記対象に投与することが含まれる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記陰イオン伝導チャネルロドプシンは、さらに、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）配列または細胞受容体結合配列を含んでいる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記発現させることには、陰イオン伝導チャネルロドプシンをコードするベクターを前記対象に投与することが含まれる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記ベクターはＲＮＡベクターである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ベクターはＤＮＡベクターである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記陰イオン伝導チャネルロドプシンをコードしている前記配列は、異種プロモーターに機能的に連結されている、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記プロモーターは、誘導性または抑制性プロモーターである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記プロモーターは、組織または細胞型に特異的なプロモーターである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記プロモーターは、神経細胞に特異的なプロモーターである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ベクターは、プラスミド、ウイルスベクターまたはエピソームベクターである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
前記ベクターは、さらに、自殺遺伝子の誘導性発現カセットを含んでいる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
前記対象は、四肢のどれかが切断されているか、糖尿病もしくは多発性硬化症があるか、または手術を受けたことがある、請求項４１に記載の方法。
【請求項５５】
前記陰イオン伝導チャネルロドプシンは、配列番号１、３または１３の配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる、請求項４１に記載の方法。
【請求項５６】
前記陰イオン伝導チャネルロドプシンは、配列番号２、４または１４〜１７の配列と約９０％同一である配列によってコードされている、請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年３月１９日に出願された米国特許仮出願第６２／１３５，４７０号、２０１５年４月２０日に出願された同第６２／１４９，８１２号、及び２０１５年１２月１日に出願された同第６２／２６１，８２１号の優先権を主張するものであり、それらの内容を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所の交付番号Ｒ３７ＧＭ０２７７５０、Ｒ２１ＭＨ０９８２８８、Ｓ１０ＲＲ０２２５３１として米国政府の助成を受けてなされた。米国政府は本発明に対し一定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、広くは、藻類由来のチャネルロドプシンを用いる方法及び組成物に関し、詳細には、光遺伝学的用途にまたは治療剤として使用される新規の特徴を有する陰イオン伝導チャネルロドプシンに関する。
【背景技術】
【０００４】
光遺伝学（Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８  （１）：  ２６−９，  ２０１１）は、光学的方法を利用して、インタクトな神経回路内で遺伝子標的である神経細胞を調査し制御することに関する。光遺伝学には光活性化チャネル及び酵素の導入が含まれ、特異的標的化メカニズムを用いることで細胞型の解像度を維持しながらミリ秒の高精度で神経活動の操作が可能になる。脳は高速系なので、ミリ秒スケールの時間精度は光遺伝学的の中心概念であり、そのおかげで所与の細胞における特定の活動電位パターンの原因的役割の調査が可能になっている。
【０００５】
緑鞭毛藻の運動挙動の光制御（走光性及び羞明応答）は、原核生物の走光性受容体や光開閉型イオン輸送体に相同である感覚性ロドプシンが媒介している。走光性過程では、藻類の感覚性ロドプシンが興奮すると、膜貫通光受容体電流が発生する。動物細胞で発現すると、藻類の走光性受容体は、光開閉型陽イオンチャネルとして機能する。これは「チャネルロドプシン」と命名されている。チャネルロドプシンは、細胞活性を光制御するための有用な分子ツールとなっている。
【０００６】
これらの光活性化チャネル及び酵素のそもそもの供給源は、数種の微生物オプシンであり、これには藻類由来のチャネルロドプシン−２（ＣｈＲ２）単成分光活性化陽イオンチャネルも含まれ、これは哺乳類におけるミリ秒スケールの時間的制御を可能にし、１つの遺伝子を発現させるだけで作用し、哺乳類脳組織からＣｈＲ２に補給される既存の発色団（レチナール）により可視スペクトル光にも応答した。ＣｈＲ２の実験的な活用性は、挙動する哺乳類から、ハエ、ミミズ、ゼブラフィッシュといった古典的なモデル生物まで、あらゆる動物モデルにおいてたちまち証明され、数百のグループがＣｈＲ２及び近縁微生物タンパク質を使って神経回路を研究している。現在、このファミリーのいくつかのメンバーが光遺伝学の分子ツールとして、すなわち細胞活性の光調節に使用されている。緑（緑藻植物）鞭毛藻類（６）の走光性受容体は、チャネルロドプシン（ＣｈＲ）として最もよく知られており、光開閉型陽イオンチャネルとしての機能のおかげで、遺伝子的標的の興奮性細胞集団の脱分極に広く用いられている。
【０００７】
過分極ロドプシンイオンポンプは、神経細胞発火を抑制するのに用いられているが、捕捉光子当たり１つしか電荷を輸送しないので、能力に限界がある。最近、ＣｈＲは遺伝子操作によりＣｌ−を伝導するようになったが、これらの光遺伝学的ツールには多少の陽イオン伝導性が残存しているので、さらに変異を加えて高い光感度が得られたとしても、チャネルの動態（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）はかなり減速されよう（Ｊ．  Ｗｉｅｔｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４４，  ４０９  （２０１４）及びＡ．  Ｂｅｒｎｄｔ，  Ｓ．  Ｙ．  Ｌｅｅ，  Ｃ．  Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，  Ｋ．  Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４４，  ４２０  （２０１４））。光遺伝学的過分極の理想は、高い伝導性を有し陰イオン選択性となるような進化により最適化された天然の光開閉型陰イオンチャネルである。
本明細書で説明するのは、新たに特定されたクラスのチャネルロドプシン、陰イオンチャネルロドプシン（ＡＣＲ）由来の修飾され最適化されたロドプシンドメイン、光開閉型陰イオンチャネルであり、光開閉型の塩素イオン伝導により、高感受性で高効率の膜過分極及び神経細胞サイレンシングを提供するものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８  （１）：  ２６−９，  ２０１１
【非特許文献２】Ｊ．  Ｗｉｅｔｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４４，  ４０９  （２０１４）
【非特許文献３】Ａ．  Ｂｅｒｎｄｔ，  Ｓ．  Ｙ．  Ｌｅｅ，  Ｃ．  Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，  Ｋ．  Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４４，  ４２０  （２０１４）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示の方法及び組成物は、新クラスのチャネルロドプシン、陰イオンチャネルロドプシン（ＡＣＲ）の発見と特定に一部基づいている。緑藻植物の藻類の光開閉型ロドプシン陽イオンチャネルは、標的神経細胞発火の光活性化のための膜脱分極の光遺伝学的ツールとして使用されて、神経科学研究を一変させた。神経細胞活動電位の光抑制は、同等に高効率の膜過分極ツールの不足により制限されてきた。本明細書で説明するのは、光開閉型の塩素イオン伝導により、高感受性で高効率の膜過分極及び神経細胞のサイレンシングを提供する、光開閉型陰イオンチャネルの新ファミリー、陰イオンチャネルロドプシン（ＡＣＲ）である。ＡＣＲは、厳密に陰イオンを伝導し、プロトンやより大きい陽イオンは完全に除外し、現在利用可能なほとんどの高効率の光遺伝学的タンパク質よりも３０００倍低い光強度で１００倍速い動態で膜を過分極する。Ｇ．ｔｈｅｔａオプシンの７ＴＭドメインをコードする配列（ＪＧＩタンパク質モデル１１１５９３、１４６８２８、１６１３０２にそれぞれ対応する、２９５、２９１、２８８ａａ）が、ヒトコドン用に最適化され合成された。機能的コンストラクト１１１５９３（ＧｔＡＣＲ１：配列番号１）及び１４６８２８（ＧｔＡＣＲ２：配列番号３）をコードする配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋに表示されよう（それぞれ受託番号ＫＰ１７１７０８、ＫＰ１７１７０９）。ＧｔＡＣＲ２を発現している神経細胞に照射すると、その活動電位スパイクが完全に阻害された。これらのＡＣＲは、とりわけ神経細胞または神経障害、たとえば限定ではないがパーキンソン病や癲癇、ならびに心機能障害で、興奮状態にある神経細胞のサイレンシングの光遺伝学的ツール用途で高レベルの膜電位を確立するための新規の膜過分極ツールを提供する。したがって、本明細書で提供するＡＣＲは、癲癇や心機能障害の治療で使用される新規の膜過分極ツールとして役立つことができる。
【００１０】
本明細書のいくつかの実施形態では、異種プロモーター配列に機能的に連結された組換え核酸が開示され、該組換え核酸は、配列番号１、配列番号３または配列番号１３からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるペプチドをコードする配列；または配列番号１、配列番号３、または配列番号１３から選択される連続する２２５アミノ酸を含むペプチドをコードする配列；または配列番号２、配列番号４、配列番号１４〜１５またはその相補のヌクレオチド配列にハイブリダイズする配列を含む。別の実施形態では、組換え核酸には発現ベクターが含まれる。組換え核酸の別の実施形態では、配列番号２、配列番号４、配列番号１４〜１５またはその相補のヌクレオチド配列にハイブリダイズした配列は、さらに、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中６５℃でのフィルター結合ＤＮＡ（ｆｉｌｔｅｒ−ｂｏｕｎｄ  ＤＮＡ）へのハイブリダイゼーション、及び０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中４２℃での洗浄を含む。さらなる実施形態では、異種プロモーター配列に機能的に連結された組換え核酸を含む組換え宿主細胞が開示され、該組換え核酸は、配列番号１、配列番号３または配列番号１３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有するペプチドをコードする配列；または配列番号１、配列番号３または配列番号１３から選択される連続する２２５アミノ酸を含むペプチドをコードする配列；または配列番号２、配列番号４、配列番号１４〜１５またはその相補のヌクレオチド配列にハイブリダイズする配列を含む。
【００１１】
さらなる実施形態では、ＡＣＲは、神経細胞または心筋細胞のコンパートメントで活動電位を誘導するかまたは誘導しない膜脱分極ツールとして用いることができる。したがって、いくつかの態様では、諸実施形態のＡＣＲコード配列には、さらに、宿主細胞のコンパートメント  コードｍＲＮＡまたはポリペプチドを標的とするシグナル配列が含まれる。
【００１２】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、単離されたヒト細胞；非ヒト哺乳類細胞；細菌細胞；酵母細胞；昆虫細胞；または植物細胞である。
【００１３】
代替実施形態では、本明細書で説明する核酸配列は、ゲノム編集及びゲノム標的化のためのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質−９ヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）の系を用いて細胞のゲノムを標的とすることができる。いくつかの実施形態では、一部の細胞への送達は、限定ではないがレンチウイルス（ＬＶ）、アデノウイルス（ＡｄＶ）及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などに基づく送達系を要することもある。
【００１４】
いくつかの実施形態では、失明または盲目に罹患している対象の網膜の感光性を回復させる方法が開示され、該方法には、該対象の網膜のＯＦＦ双極神経細胞に、網膜神経細胞内で発現可能なＡＣＲのロドプシンドメインをコードする配列番号１、配列番号３または配列番号１３からなる群より選択される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを送達すること；及び該ベクターを該網膜神経細胞内で発現させることが含まれ、ロドプシン発現によって、該網膜神経細胞が感光性になり、それによって感光性が回復して、該網膜またはその一部分のそのような神経細胞の光誘導型サイレンシングが可能になる。さらなる実施形態では、対象は哺乳類であり、さらなる実施形態では、対象はヒトである。失明または盲目に罹患している対象の網膜の感光性を回復させる方法のある実施形態では、  が開示され、該方法には、該対象の網膜に発現ベクターを送達することが含まれ、この送達することには、製薬上許容される担体が含まれる。
【００１５】
いくつかのさらなる実施形態では、配列番号１５〜２４の配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を有する陰イオン伝導チャネルロドプシンをコードする配列を含む単離された核酸分子が提供される。特定の態様では、この単離された核酸分子は、厳密な条件下で配列番号１５〜２４のうちの１つのヌクレオチド配列にハイブリダイズした配列を含み、該配列はフィルター結合ＤＮＡに０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中４２℃での洗浄を含み、陰イオン伝導チャネルロドプシンをコードする。いくつかの態様では、核酸はＤＮＡである。他の態様では、核酸はＲＮＡ（たとえば、ｍＲＮＡ）である。さらなる実施形態では、配列番号１５〜２４の配列と少なくとも約９０％同一である配列などの本明細書で提供する核酸分子を含む発現ベクターが提供される。
【００１６】
さらなる実施形態では、本明細書で提供する核酸（たとえば、配列番号１５〜２４の配列と少なくとも約９０％同一の配列）を含む組換え宿主細胞が提供される。いくつかの態様では、宿主細胞は単離されたヒト細胞である。他の態様では、宿主細胞は非ヒト哺乳類細胞である。いくつかの態様では、宿主細胞は細菌細胞である。特定の態様では、宿主細胞は酵母細胞である。他の態様では、宿主細胞は昆虫細胞である。いくつかの態様では、宿主細胞は植物細胞である。特定の態様では、宿主細胞は単離された神経細胞である。具体的には、宿主細胞は単離された電気的活性のある細胞である。
【００１７】
別の実施形態では、電気的活性のある細胞が関与する障害に罹患している対象を治療する方法が提供され、該方法には、対象の電気的活性のある細胞の部位で有効量の陰イオン伝導チャネルロドプシンを発現させることが含まれる。いくつかの態様では、対象は神経因性疼痛を抱えており、該方法には、対象の疼痛の部位で有効量の陰イオン伝導チャネルロドプシンを発現させることが含まれる。特定の態様では、対象は四肢のどれかが切断されているか、糖尿病や多発性硬化症があるか、または手術を受けたことがある。
【００１８】
特定の態様では、発現させることには、陰イオン伝導チャネルロドプシンを対象に投与することが含まれる。いくつかの態様では、陰イオン伝導チャネルロドプシンは、配列番号１、３または１３の配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様では、陰イオン伝導チャネルロドプシンは、配列番号２、４または１４〜１７の配列と約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列によってコードされる。いくつかの態様では、陰イオン伝導チャネルロドプシンは、さらに、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）配列または細胞受容体結合配列を含む。本明細書では、「細胞透過性ペプチド」という用語は、ポリペプチドが細胞膜（たとえば、真核生物細胞の場合は形質膜）を横断するのを許容するポリペプチド配列のセグメントに関する。ＣＰＰセグメントの例としては、限定ではないが、ＨＩＶＴａｔ（たとえば、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ；配列番号２５）、ヘルペスウイルスＶＰ２２、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオボックス遺伝子産物、プロテグリンＩ、ペネトラチン（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ；配列番号２６）またはメリチン（ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ；配列番号２７）に由来するセグメントが挙げられる。特定の態様ではＣＰＰは、Ｔ１（ＴＫＩＥＳＬＫＥＨＧ；配列番号２８）、Ｔ２（ＴＱＩＥＮＬＫＥＫＧ；配列番号２９）、２６（ＡＡＬＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＥＡＡＡＡ；配列番号３０）またはＩＮＦ７（ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＥＧＷＹＧＣＧ；配列番号３１）ＣＰＰ配列を含む。
【００１９】
いくつかの態様では、発現させることには、陰イオン伝導チャネルロドプシンをコードするベクターを対象に投与することが含まれる。特定の態様では、ベクターはＲＮＡベクターである。他の態様では、ベクターはＤＮＡベクターである。いくつかの態様では、ベクターはプラスミド、ウイルスベクターまたはエピソームベクターである。特定の態様では、ベクターは、さらに、自殺遺伝子の誘導性発現カセットを含む。
【００２０】
特定の態様では、陰イオン伝導チャネルロドプシンをコードする配列は、異種プロモーターに機能的に連結されている。いくつかの態様では、プロモーターは誘導性または抑制性プロモーターである。特定の態様では、プロモーターは組織型または細胞型に特異的なプロモーターである。具体的には、プロモーターは神経細胞に特異的なプロモーターである。
【００２１】
本明細書では、特定成分に関して「基本的に含まない」とは、その特定成分はいずれも組成物中に意図的に配合されるのではなく、かつ／または単に汚染物質として、もしくは痕跡量で存在することを指す。したがって、組成物に不慮に混入する特定成分の総量は０．０１％よりもかなり少ない。標準的な分析法では特定成分量が検出できないような組成物が最も好ましい。
【００２２】
本明細書では、「ａ」や「ａｎ」は、１以上を意味することができる。本明細書の請求項（複数可）では、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語に関して使用する場合、「ａ」や「ａｎ」は、１、あるいは２以上を意味することができる。
【００２３】
本開示では、「ｏｒ」という用語について、代わりの選択肢という定義と「及び／または」という定義とを採用しているが、請求項中の「ｏｒ」の用法は、明確に代わりの選択肢を示す場合のみ、あるいは択一である場合を除いて、「及び／または」を意味するものとする。本明細書では、「ａｎｏｔｈｅｒ」は、少なくとも２つ目以上を意味することができる。
【００２４】
本明細書全体で、「約」という用語は、ある値が、デバイス特有の誤差、値の測定方法による誤差、または被験者間の偏差を含むことを示すのに用いられる。
【００２５】
本発明のその他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになろう。なお、詳細な説明及び具体的な実施例では本発明の好ましい実施形態を示しているが、それらは例示のみを目的とするものと理解すべきである。当業者にとっては、本発明の精神及び範囲における様々な変更や改変が詳細な説明から明らかになるからである。
【００２６】
以下の図面は、本明細書の一部であり、本発明のさらなる態様を示すために含まれるものである。本明細書で示す具体的な実施形態の詳細な説明と併せてこれらの図面の１つ以上を参照することによって、本発明をよりよく理解することができる。本特許または特許出願は、カラー図面を少なくとも１つは含んでいる。米国特許庁に申請し、必要な手数料を支払えば、本特許または特許出願公開のカラー図面（複数可）を含む複製が入手できる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】Ｇ．ｔｈｅｔａ  ＡＣＲの系統及び光活性。図１Ａは、陽イオンチャネルロドプシン（ＣＣＲ）と陰イオン伝導チャネルロドプシン（ＡＣＲ）の系統樹の図である。図１Ｂは膜貫通へリックス２の、図１Ｃは膜貫通へリックス３の、それぞれＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントの図である。生物の略称は、ＧｔはＧｕｉｌｌａｒｄｉａ  ｔｈｅｔａ；ＣｒはＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ；ＣａはＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ａｕｇｕｓｔａｅ；ＭｖはＭｅｓｏｓｔｉｇｍａ  ｖｉｒｉｄｅ；ＨｓはＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｌｉｎａｒｕｍ；ＮｍはＮｏｎｌａｂｅｎｓ  ｍａｒｉｎｕｓである。最後の残基の番号を右側に示す。螺旋体２の保存Ｇｌｕ残基を黄色でハイライトし、バクテリオロドプシンＡｓｐ８５の位置のＧｌｕ残基を赤色でハイライトしている。図１Ｄの大きい図は、−６０ｍＶで飽和光パルスに応答したＨＥＫ２９３細胞内ＧｔＡＣＲ１、ＧｔＡＣＲ２、及びＣｒＣｈＲ２の光電流の図であり、図１Ｄの差込図は、ピーク電流の平均振幅（ベタ塗りのバー）と定常電流の平均振幅（あや目模様のバー）の図である（ｎ＝１８〜２０細胞）。ノイズ分析によると、ＧｔＡＣＲ２の単一伝導性は、最も広く使用されている陽イオン伝導チャネルロドプシンＣｒＣｈＲ２について報告されているものよりも２５倍大きかった。図１Ｅは、ピーク電流振幅、定常電流振幅、及び上昇率の刺激強度への依存性を示す図である。図１Ｆは、光電流の作用スペクトルの図である。
【図１Ｂ】同上
【図１Ｃ】同上
【図１Ｄ】同上
【図１Ｅ】同上
【図１Ｆ】同上
【図２Ａ】ＡＣＲは陽イオンを伝導しない。−６０ｍＶから２０ｍＶ刻みで変化させたＥｈで、ＨＥＫ２９３細胞内ＧｔＡＣＲ１（図２Ａ）及びＧｔＡＣＲ２（図２Ｂ）が発生した光電流（下から上の方向；液間電位差（ＬＪＰ）値は（表１））。ピペット溶液は標準だったが、バス溶液は記載のとおりであった。図２Ｃは、バスの異なるｐＨで電流と電圧の関係を測定した図である。データ（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝４〜６細胞）はＬＪＰについて補正し、−６０ｍＶ、ｐＨ７．４の測定値を基準として正規化した。ＣｒＣｈＲ２の代表データを比較のために示す。図２Ｄは、バスの様々な陽イオン組成で測定したＥｒｅｖシフトの図である。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３〜６細胞）である。
【図２Ｂ】同上
【図２Ｃ】同上
【図２Ｄ】同上
【図３Ａ】ＡＣＲの陰イオン選択性。−６０ｍＶから２０ｍＶ刻みで変化させたＥｈで、ＨＥＫ２９３細胞内ＧｔＡＣＲ１（図３Ａ）及びＧｔＡＣＲ２（図３Ｂ）が発生した光電流（下から上の方向；液間電位差（ＬＪＰ）値は（表１））。ピペット溶液は標準だったが、バス溶液は記載のとおりであった。図３Ｃはバス内の異なるＣｌ−濃度で電流と電圧の関係を測定した図である。データ（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝４〜６細胞）はＬＪＰについて補正し、−６０ｍＶ、１５６ｍＭ  Ｃｌ−の測定値を基準として正規化した。縦破線は、用いたバス濃度のＣｌ−のＮｅｒｎｓｔ平衡電位を示す。図３Ｄは、バスの様々な陰イオン組成で測定したＥｒｅｖシフトの図である。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３〜６細胞）である。
【図３Ｂ】同上
【図３Ｃ】同上
【図３Ｄ】同上
【図４Ａ】過分極ツールとしてのＧｔＡＣＲ２。（図４Ａ及び図４Ｃは）ピペットでは低Ｃｌ−濃度、バスでは高Ｃｌ−濃度で、−８０ｍＶから２０ｍＶ刻みで変化させたＥｈで、ＨＥＫ２９３細胞内ＧｔＡＣＲ２が発生した光電流（図４Ａ）及び培養錐体神経細胞内ＧｔＡＣＲ２が発生した光電流（図４Ｃ）（下から上の方向；液間電位差（ＬＪＰ）値は（表１及び表２））。図４Ｂは、２０ｍＶでＨＥＫ２９３細胞内ＧｔＡＣＲ２及びａｒｃｈａｅｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−３（Ａｒｃｈ）が発生した光電流の光強度依存性の図である。低速Ｃｌ−伝導ＣｈＲ変異体のデータは前掲のＪ．  Ｗｉｅｔｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１４）及びＡ．  Ｂｅｒｎｄｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１４）のものである。矢印は光感受性の差を示す。図４Ｄは、図４Ｃで示す神経細胞で測定された電流と電圧の関係を示す図である。データ（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝５細胞）はＬＪＰについて補正した（表２）。縦破線は静止電位（Ｅｒｅｓｔ）を示す。Ｃｌ−伝導ＣｈＲ変異体のデータは前掲のＪ．  Ｗｉｅｔｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１４）及びＡ．  Ｂｅｒｎｄｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１４）のものである。図４Ｅは、ＧｔＡＣＲ２を発現している神経細胞にパルス（１０ミリ秒、１０ｋＨｚ）電流注入して誘発した、スパイキングの光抑制の図である。光強度は８．５Ｅ−３ｍＷ／ｍｍ２であった。図４Ｆは、電気的に誘発したスパイクの光強度依存性の図である。暗時と明時の電気誘発シグナル間の振幅の差は図示のように計算した。
【図４Ｂ】同上
【図４Ｃ】同上
【図４Ｄ】同上
【図４Ｅ】同上
【図４Ｆ】同上
【図５−１】Ｇ．ｔｈｅｔａタンパク質モデルの系統樹。微生物ロドプシンと相同のモデルをＪｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＪＧＩ）シーケンシング・プロジェクト（以下のワールドワイドウェブを参照のこと：ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／Ｇｕｉｔｈ１／Ｇｕｉｔｈ１．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）で予測されたなかから選択し、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いてアラインメントした。この系統樹は近隣結合法により作製した。ＧｔＲ１、ＧｔＲ２及びＧｔＲ３は、以前特定されたタンパク質である。８つのモデルには、既知のロドプシンでレチナールと共有結合する７番目の膜貫通螺旋体の保存Ｌｙｓ残基が存在せず、したがってオプシン近縁タンパク質とみなすべきである。
【図５−２】同上
【図６Ａ】バス内で異なるＣｌ−濃度で測定したＧｔＡＣＲ１の電流と電圧の関係。図６Ａでは、データ（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝４〜６細胞）は、液間電位差のデータであり、−６０ｍＶ、１５６ｍＭ  Ｃｌ−で測定された値を基準として正規化した。縦破線は、用いたバス濃度のＣｌ−のＮｅｒｎｓｔ平衡電位を示す。図６Ｂは、ピペットでは低Ｃｌ濃度、バスでは高Ｃｌ濃度で、ＨＥＫ２９３細胞内ＧｔＡＣＲ１が発生した光電流の図である。膜電位は増幅器出力で−８０ｍＶから２０ｍＶ刻みで変化させた。
【図６Ｂ】同上
【図７Ａ】増幅器出力で−６０ｍＶから２０ｍＶ刻みで変化させた膜電位で（下から上の方向）、１−ｓ光パルス（５２０ｎｍ）に応答してＨＥＫ２９３細胞内ＰｓｕＡＣＲ１が発生した光電流の図である。ピペットとバスの溶液のＣｌ−濃度は記載のとおりであった。図７Ｄは、凡例内に示す溶液で測定したピーク電流の電圧依存性（ＩＥ曲線）の図である。データ（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝４〜９細胞）は、−６０ｍＶ、標準溶液で測定した値を基準として正規化し、液間電位差について補正した。
【図７Ｂ】同上
【図７Ｃ】同上
【図７Ｄ】同上
【図８】（陰イオンでは）不透過Ａｓｐ−または（陽イオンでは）不透過ＮＭＧ＋を用いて得られた値からの、バスの様々な陰イオン組成（左）または陽イオン組成（右）で測定したＰｓｕＡＣＲ１光電流のＥｒｅｖのシフトの図である。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３〜９細胞）である。
【図９】ＰｓｕＡＣＲ１光電流の作用スペクトルの図である。
【図１０Ａ】図１０ａは、増幅器出力で記載の電圧値で、レーザー光励起（６ｎｓ、５３２ｎｍ）に応答してＰｓｕＡＣＲ１が発生した典型的な光電流（黒実線）の図である。電流減衰に３つの指数関数を当てはめ（破線）、そこからプロット上に示した時定数を求めた。図１０ｂは、ピーク振幅が５０％まで減少するのに必要な時間の逆として計算された３種の既知のＡＣＲのチャネル閉速度の図である。図１０ｃは、電流減衰成分の振幅の電圧依存性の図である。図１０ｄは、５ミリ秒の光パルスを用いたダブルフラッシュ実験でそれぞれ飽和強度５２０ｎｍ、５１５ｎｍ、４７０ｎｍで測定したＰｓｕＡＣＲ１、ＧｔＡＣＲ１及びＧｔＡＣＲ２のピーク電流の暗回復の図である。プロット上の数字は、各タンパク質の５０％ピーク回復に要する暗期（ｄａｒｋ  ｉｎｔｅｒｖａｌ）を示す。図１０ｂ〜ｄのパネルのデータポイントは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３〜８細胞）である。
【図１０Ｂ】同上
【図１０Ｃ】同上
【図１０Ｄ】同上
【図１１Ａ】図１１ａは、チャネル電流の反転電位でＰｓｕＡＣＲ１から記録された高速負電流（実線、左側の軸）、及びその上昇と減衰の指数関数当てはめ（点線）、及び増幅器出力で−６０ｍＶで同じ細胞から記録されたチャネル電流（破線、右側の軸）の図である。図１１ｂは、ＰｓｕＡＣＲ１を発現している典型的な細胞における高速負電流（四角マークと実線、左側の軸）及びチャネル電流（丸マークと破線、右側の軸）の電圧依存性の図である。図１１ｃは、高速負電流のバスｐＨへの依存性の図である。データポイントは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３〜５細胞）である。
【図１１Ｂ】同上
【図１１Ｃ】同上
【図１２】ＡＣＲとＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ＣＣＲのロドプシンドメインのＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント。左側の数字は各配列断片の最後の残基の番号を示す。ＣＣＲの螺旋体２と３で保存されているカルボン酸残基を赤色でハイライトし、ＡＣＲの対応する極性及び非極性残基をそれぞれ緑色と黄色でハイライトする。
【図１３】ＰｓｕＡＣＲ１電流減衰成分の時定数の電圧依存性。データポイントは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝８細胞）である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
配列表の説明
配列表は、Ｇ．ｔｈｅｔａオプシンの７ＴＭドメインをコードする配列に由来する（ＪＧＩタンパク質モデル１１１５９３、１４６８２８、１６１３０２にそれぞれ対応する、２９５、２９１、２８８ａａ）、ヒトコドン用に最適化され合成された、陰イオンチャネルロドプシンドメインのアミノ酸配列と核酸配列を示している。
【００２９】
配列番号１は、ＧｔＡＣＲ１のアミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号２は、ＧｔＡＣＲ１をコードする核酸配列である。
【００３１】
配列番号３は、ＧｔＡＣＲ２のアミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号４は、ＧｔＡＣＲ２をコードする核酸配列である。
【００３３】
配列番号５は、Ｇｔ１６１３０２のアミノ酸配列である。
【００３４】
配列番号６は、Ｇｔ１６１３０２をコードする核酸配列である。
【００３５】
配列番号７は、ＣｒＣｈＲ１（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉチャネルロドプシン１、別名Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ感覚ロドプシンＡ：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ５０８９６５）のアミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号８はＣｒＣｈＲ２（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉチャネルロドプシン２、別名Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ感覚ロドプシンＢ：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ５０８９６６）のアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号９は、ＣａＣｈＲ１（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ（Ｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ）  ａｕｇｕｓｔａｅチャネルロドプシン１：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＮ５９６９５１）のアミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号１０は、ＭｖＣｈＲ１（Ｍｅｓｏｓｔｉｇｍａ  ｖｉｒｉｄｅチャネルロドプシン１：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＦ９２２２９３）のアミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号１１は、ＨｓＨＲ（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｌｉｎａｒｕｍハロロドプシン：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿０１０９０２０９０．１）のアミノ酸配列である。
【００４０】
配列番号１２は、ＮｍＨＲ（Ｎｏｎｌａｂｅｎｓ  ｍａｒｉｎｕｓ塩素イオンポンプロドプシン：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＯ５５２７６．１）のアミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号１３は、ＰｓｕＡＣＲ１のアミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号１４は、ＰｓｕＡＣＲ１をコードする合成核酸配列である。
【００４３】
配列番号１５は、ＰｓｕＡＣＲ１をコードする合成核酸配列である。
【００４４】
配列番号１６は、ＧｔＡＣＲ１をコードする合成核酸配列である。
【００４５】
配列番号１７は、ＧｔＡＣＲ２をコードする合成核酸配列である。
【００４６】
配列番号１８は、Ｇｔ１６１３０２をコードする合成核酸配列である。
【００４７】
配列番号１９は、ＣｒＣｈＲ１をコードする合成核酸配列である。
【００４８】
配列番号２０は、ＣｒＣｈＲ２をコードする合成核酸配列である。
【００４９】
配列番号２１は、ＣａＣｈＲ１をコードする合成核酸配列である。
【００５０】
配列番号２２は、ＭＣｈＲ１をコードする合成核酸配列である。
【００５１】
配列番号２３は、ＨｓＨＲをコードする合成核酸配列である。
【００５２】
配列番号２４は、ＮｍＨＲをコードする合成核酸配列である。
【００５３】
例示的な実施形態の説明
最近まで、チャネルロドプシンは、動物細胞に形質移入されると神経細胞発火の光活性化に使用される、光開閉型陽イオンチャネルとして機能する走光性受容体であった。本明細書で説明するのは、光開閉型の塩素イオン伝導によって、高感受性で高効率の膜過分極及び神経細胞サイレンシングをもたらす、新クラスの光開閉型チャネル、陰イオンチャネルロドプシン（ＡＣＲ）である。ＡＣＲは陰イオンを厳密に伝導し、プロトンや高分子量の陽イオンは除外する。また、現在利用されている最も高効率の光遺伝学的タンパク質と比べて３０００倍低い光強度で１００倍速い動態で膜過分極をもたらす。
【００５４】
数種の藻類から走光性受容体電流をスクリーニングすることによって、高速動態の高効率なＡＣＲを特定し特徴を決定した。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、特に有用な藻類のチャネルロドプシンを特定し特徴を決定するのを容易にする技術を提供する。
【００５５】
Ｉ．定義
本開示では、単数形には複数形も含まれるものとし、特に断らない限り、「ａ」や「ａｎ」という単語は「少なくとも１」を意味し、「ｏｒ」を使う場合は「及び／または」を意味するものとする。さらに、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」という用語ならびに「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」や「ｉｎｃｌｕｄｅｄ」などの変化形を使う場合、それは限定する用法ではない。また、「要素」や「成分」などの用語は、特に断らない限り、１単位の要素や成分を含む場合も、２単位以上の要素や成分を含む場合も包含している。
【００５６】
本明細書では、「約」という用語を百分率やその他の数量に関して使う場合、その百分率やその他の数量の±１０％を意味する。たとえば「約８０％」という用語は、８０％±８％を含むことになる。
【００５７】
本明細書で使用する見出しは、単なる構成上のものであり、本明細書で説明する主題を何ら限定するものではない。本出願で引用するあらゆる文書、またはその一部、たとえば限定ではないが、特許文献、特許出願、記事、書籍、論文などは、あらゆる目的でその内容を参照により本明細書に明確に援用する。援用する文献または類似の資料の１つ以上において用語の定義が本出願のものと異なる場合は、本出願の定義が優先される。
【００５８】
本明細書では、特に断らない限り、電気的活性のある細胞が関与する障害、たとえば限定ではないが、本発明の方法及び組成物を用いることができる神経細胞機能障害、神経細胞が媒介する障害、視覚障害または心機能障害という用語には、限定ではないが、神経細胞の機能不全、脳、中枢神経系、末梢神経系の障害、神経の異常、記憶障害や曲げ（ｌｅａｎｉｎｇ）障害、不整脈、パーキンソン病、癲癇、視覚障害、脊髄損傷、限定ではないが自己免疫疾患（たとえば、多発性硬化症、ギランバレー症候群、重症筋無力症、狼瘡、及び炎症性腸疾患）関連の神経痛；癌及びその治療に使われる化学療法や放射線；圧迫／トラウマ（たとえば、首の神経の圧迫、挫滅傷、及び手根管症候群）；糖尿病性神経障害；薬の副作用；及び毒性物質；運動神経疾患（たとえば筋委縮性側索硬化症、進行性球麻痺、進行性筋委縮症、及び原発性側索硬化症）；栄養障害（たとえばビタミンＢ６やビタミンＢ１２）；炎症性疾患；限定ではないが湿疹、アトピー性皮膚炎、乾燥肌関連の掻痒、ならびにアレルギー性の掻痒；迷走神経の活性を変える疾患や障害などが含まれる。
【００５９】
本明細書では、特に断らない限り、本発明の方法及び組成物を用いて１種以上の視覚パラメーターを向上させることができる「視覚障害」という用語には、限定ではないが、眼の前側セグメントと後側セグメントの両方に影響を及ぼす発達障害も含まれる。前側セグメントの障害としては、限定ではないが、緑内障、白内障、角膜ジストロフィー、円錐角膜が挙げられる。後側セグメントの障害としては、限定ではないが、網膜ジストロフィーや退化による光受容体の機能不全及び／または死滅を原因とする盲目障害が挙げられる。網膜障害としては、先天性停止性夜盲症、加齢による黄斑退化、及び先天性錐体ジストロフィー、ならびに網膜色素変性症（ＲＰ）関連の多くの障害が挙げられる。
【００６０】
本明細書では、特に断らない限り、「ｔｒｅａｔ（治療する）」「ｔｒｅａｔｉｎｇ」「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」及び「ｔｈｅｒａｐｙ」という用語は、患者が、電気的活性のある細胞が関与する障害、たとえば限定ではないが神経細胞の機能障害、神経細胞が媒介する障害、視覚障害または心機能障害に罹患している場合の、そのような障害の１つ以上の症状または影響の重症度を軽減する行為を意図している。また文脈が許せば、「ｔｒｅａｔ」「ｔｒｅａｔｉｎｇ」及び「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」という用語は、電気的活性のある細胞が関与する障害、たとえば限定ではないが神経細胞の機能障害、神経細胞が媒介する障害、視覚障害または心機能障害のリスクが高い個人が、電気的活性のある細胞が関与する障害、たとえば限定ではないが神経細胞の機能障害、神経細胞が媒介する障害、視覚障害または心機能障害が発症する前に、重症度を軽減するような、適切な手術及び／または他の医療介入が確実に受けられるようにする行為も指す。本明細書では、特に断らない限り、「ｐｒｅｖｅｎｔ（予防する）」「ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ」及び「ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ」という用語は、患者が電気的活性のある細胞が関与する障害、たとえば限定ではないが神経細胞の機能障害、神経細胞が媒介する障害、視覚障害または心機能障害に罹患する前にとられる、電気的活性のある細胞が関与する障害、たとえば限定ではないが神経細胞の機能障害、神経細胞が媒介する障害、視覚障害または心機能障害の発症を遅らせ、かつ／または阻害するかもしくは重症度を軽減する行為を意図している。
【００６１】
本明細書では、特に断らない限り、「ｍａｎａｇｅ（管理する）」「ｍａｎａｇｉｎｇ」及び「ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ」という用語には、電気的活性のある細胞が関与する障害、たとえば限定ではないが神経細胞の機能障害、神経細胞が媒介する障害、視覚障害または心機能障害に罹患したことのある患者がそのような疾患、障害または状態を再発することを予防し、遅延させ、または重症度を軽減することが含まれる。これらの用語には、電気的活性のある細胞が関与する障害の閾、発症、及び／または持続期間を調節すること、電気的活性のある細胞が関与する障害に対する患者の反応を変化させること、あるいは細胞膜前後の所望の膜電位を維持及び／または確立することが含まれる。
【００６２】
本明細書では、特に断らない限り、化合物の「治療有効量」は、電気的活性のある細胞が関与する障害、たとえば限定ではないが神経細胞の機能障害、神経細胞が媒介する障害、視覚障害または心機能障害の治療または管理において治療効果をもたらす、または電気的活性のある細胞が関与する障害、たとえば限定ではないが神経細胞の機能障害、神経細胞が媒介する障害、視覚障害または心機能障害に関連する１つ以上の症状を遅延させるか最小限化するのに十分な量である。化合物の治療有効量は、化合物の単剤としての量、または電気的活性のある細胞が関与する障害、たとえば限定ではないが神経細胞の機能障害、神経細胞が媒介する障害、視覚障害または心機能障害の治療または管理において治療効果をもたらす１種以上の療法及び／または治療剤と併用での量を意味する。
【００６３】
「治療有効量」という用語には、電気的活性のある細胞が関与する障害、たとえば限定ではないが神経細胞の機能障害、神経細胞が媒介する障害、視覚障害または心機能障害を緩和する量、電気的活性のある細胞が関与する障害を改善もしくは軽減する量、または治療全体を改善する量、または別の治療剤の治療効果を増強する量が含まれることもある。
【００６４】
本明細書では、特に断らない限り、化合物の「予防有効量」は、電気的活性のある細胞が関与する障害、たとえば限定ではないが神経細胞の機能障害、神経細胞が媒介する障害、視覚障害または心機能障害、あるいは電気的活性のある細胞が関与する障害に関連する１つ以上の症状の発症を予防または遅延させる、あるいはその再発を予防または遅延させるのに十分な量である。予防有効量の化合物は、化合物の単剤としての量、または電気的活性のある細胞が関与する障害、たとえば限定ではないが神経細胞の機能障害、神経細胞が媒介する障害、視覚障害または心機能障害の予防に効果のある１種以上の他の治療及び／または予防剤と併用での量を意味する。「予防有効量」という用語には、電気的活性のある細胞が関与する障害、たとえば限定ではないが神経細胞の機能障害、神経細胞が媒介する障害、視覚障害または心機能障害を予防する量、予防全体を改善する量、または別の予防剤の予防効果を増強する量が含まれ得る。「予防有効量」は、たとえば、電気的活性のある細胞が関与する障害、たとえば限定ではないが神経細胞の機能障害、神経細胞が媒介する障害、視覚障害または心機能障害が発症する前に処方することができる。
【００６５】
本明細書では、「患者」または「対象」には、本明細書で説明するような電気的活性のある細胞が関与する障害、たとえば限定ではないが神経細胞の機能障害、神経細胞が媒介する障害、視覚障害または心機能障害に罹患し得る哺乳類生物、たとえばヒト及び非ヒト哺乳類、たとえば限定ではないが、齧歯目動物、マウス、ラット、非ヒト霊長目動物、イヌやネコなどのペット動物、ならびにたとえばヒツジ、ウシ、ウマなどの家畜が含まれる。
【００６６】
本明細書では、「保存的置換」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの構造及び機能的特性を保存するアミノ酸置換を広く指す。そのような機能的に等価な（保存的置換）ペプチドアミノ酸配列としては、限定ではないが、結果としてサイレント変化が得られるような、ヌクレオチド配列でコードされるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の付加または置換が挙げられ、したがって機能的に等価な遺伝子産物が得られる。保存的アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／または両親媒性といった性質の類似性に基づいて行うことができる。たとえば、非極性（疎水性）アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンがあり、極性が中性のアミノ酸にはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンがあり、正電荷の（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リジン、及びヒスチジンがあり、負電荷の（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸がある。
【００６７】
本明細書では、「レッドシフト」は、長波長へのシフトである。これに対し、「ブルーシフト」は短波長へのシフトになる。これらの用語は光を照射する物質と光を吸収する物質の両方に当てはまる。
【００６８】
本明細書では、「ロドプシンドメイン」という語句は、ロドプシンの特徴的な７回膜貫通螺旋体（７ＴＭ）構造「ロドプシンフォールド」を指す。本明細書では、チャネルオプシンはアポタンパク質であり、チャネルロドプシンはタンパク質とレチナールである。本明細書では、「チャネルロドプシン」という用語は、光開閉型イオンチャネルとして機能するレチニリデンタンパク質（ロドプシン）を指す。
【００６９】
同一性または相同性のパーセントは、関連するアミノ酸配列の長さに関して決定される。したがって、本発明のあるポリペプチドがそれよりも長いポリペプチドに含まれる場合、相同性％は、この長い方のポリペプチドが本発明のポリペプチドに対応している部分にだけ関して決定されるのであって、この長い方のポリペプチドの全長の相同性％ではない。核酸配列に対する相対的な「同一性パーセント」すなわち「同一性％」は、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈツール（ＢＬＡＳＴ）エンジンによりアライメントした少なくとも２つのポリヌクレオチド配列同士のヌクレオチド同一性％を指す。Ｔａｔｕｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  １７４：２４７−２５０を参照されたい。このＢＬＡＳＴエンジンは、米国メリーランド州ベセスダにある国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）によって公開されている。２つのポリヌクレオチド配列をアラインメントするには、「ｂｌａｓｔｎ」プログラムが入ったＢＬＡＳＴを使用する。
【００７０】
ポリペプチド配列に対する「同一性パーセント」すなわち「同一性％」は、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈツール（ＢＬＡＳＴ）エンジンによりアラインメントした少なくとも２つのポリペプチド配列同士のアミノ酸同一性％を指す。前述のＴａｔｕｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）を参照されたい。このＢＬＡＳＴエンジンは、米国メリーランド州ベセスダにある国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）によって公開されている。２つのポリペプチド配列をアラインメントするには、「ｂｌａｓｔｐ」プログラムが入ったＢＬＡＳＴを使用する。
【００７１】
ＩＩ．チャネルロドプシン
Ｇ．ｔｈｅｔａオプシンの７ＴＭドメインをコードする配列（Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＪＧＩ）シーケンシング・プロジェクト（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／Ｇｕｉｔｈ１／Ｇｕｉｔｈ１．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）のタンパク質モデル１１１５９３、１４６８２８、１６１３０２にそれぞれ対応する２９５、２９１及び２８８ａａ）をヒトコドン用に最適化し合成し、高速動態を有する高効率のＡＣＲとして２種を特定し特徴決定した。本明細書で提供するいくつかの実施形態は、やはり機能的特徴が決定されている新規ＡＣＲの機能的ドメインのアミノ酸配列及び核酸配列である。いくつかのそのようなＡＣＲはチャネルロドプシンの高感受性かつ高効率のＡＣＲドメインを有すると判定されており、それらをクローン化し、ＧｔＡＣＲ１（配列番号１及び２）、ＧｔＡＣＲ２（配列番号３及び４）またはＧｔ１６１３０２（配列番号５及び６）として特定した。これらはＧｕｉｌｌａｒｄｉａ  ｔｈｅｔａの陰イオン伝導チャネルロドプシンに由来した。１１１５９３の機能的コンストラクトをＧｔＡＣＲ１（配列番号１及び２）と特定し、１４６８２８の機能的コンストラクトをＧｔＡＣＲ２（配列番号３及び４）と特定し、ＧｅｎＢａｎｋに寄託した（受託番号ＫＰ１７１７０８及びＫＰ１７１７０９）。また、いくつかの実施形態では、ＧｔＡＣＲ１、ＧｔＡＣＲ２またはＧｔ１６１３０２（配列番号１、配列番号３または配列番号５）と特定されたこれらの新規ＡＣＲドメインの用法と組成物も提供される。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ＧｔＡＣＲの保存バリアント（たとえば、ＧｔＡＣＲ１またはＧｔＡＣＲ２）またはそのペプチド断片が提供される。「保存的」アミノ酸置換は、ポリペプチド中のアミノ酸をサイズや電荷など同様の特性をもつ別のアミノ酸で置換することを指す。特定の実施形態では、保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドは、未置換のポリペプチドの活性を少なくとも１つは維持している。保存的アミノ酸置換には、生体系での合成ではなく典型的には化学的ペプチド合成によって組み込まれる、非天然アミノ酸残基が含まれ得る。これらには、限定ではないが、ペプチド模倣体、及びその他の逆向形態もしくは反転形態のアミノ酸部分が含まれる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、  は本開示の方法のいずれかであり、配列番号１または３の全部または一部のアミノ酸配列を有している高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメイン、または高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンのコードされたロドプシンドメインの生物学的活性を保持しているその生物学的活性断片、または配列番号１または３のまたは該断片の生物学的活性のある保存アミノ酸置換バリアント。
【００７４】
Ａ．チャネルロドプシンのポリペプチド
いくつかの実施形態では、高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードする単離されたポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１、配列番号３または配列番号１３のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号１、配列番号３または配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号１、配列番号３または配列番号１３のアミノ酸配列と８５％〜９５％〜１００％の相同性を有する。
【００７５】
いくつかの実施形態では、  は、タンパク質組成物は、配列番号１、配列番号３または配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００７６】
本明細書で説明する陰イオン伝導チャネルロドプシンのアミノ酸配列（配列番号１または３）、ならびにそのアナログ及び誘導体、及び機能的断片たとえば限定ではないがロドプシン／７ＴＭドメインを含む、様々な実施形態で使用することができるペプチドアミノ酸配列。実際に、いくつかの実施形態では、特定のヌクレオチド配列によってコードされる任意の所望のペプチドアミノ酸配列を用いることができ、所望のペプチドアミノ酸配列の全部または任意の部分をコードする任意のポリヌクレオチド配列を用いることができる。遺伝コードの変性については周知であり、したがって、各陰イオン伝導チャネルロドプシンのペプチドのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、アミノ酸をコードすることができる周知の核酸「３塩基」コドン（たいていは単に「コドン」）の包括的代表である。したがって、本明細書で意図されるように、本明細書で説明する陰イオン伝導チャネルロドプシンのペプチドアミノ酸配列は、遺伝コード（たとえば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  １０９ページの表４−１  （Ｄａｒｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  １９８６）を参照のこと）と合わせて、そのようなアミノ酸配列をコードできる核酸配列のあらゆる様々な並べ替え及び組合せの包括的代表である。
【００７７】
そのような機能的に等価なペプチドアミノ酸配列（保存的置換）には、限定ではないが、ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の付加または置換（ただしサイレント変化をもたらすもの）が含まれ、それによって機能的に等価な遺伝子産物が生産される。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／または両親媒性といった性質の類似性に基づいて行うことができる。たとえば、非極性（疎水性）アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンがあり、極性が中性のアミノ酸にはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンがあり、正電荷の（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リジン、及びヒスチジンがあり、負電荷の（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸がある。
【００７８】
天然の残基は、共通する側鎖の特性に基づき分類することができる：疎水性（Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ）；中性親水性（Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ）；酸性（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）；塩基性（Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ）；鎖の向きに影響する残基（Ｇｌｙ、Ｐｒｏ）；及び芳香族（Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ）。たとえば、非保存的置換では、これらのクラスのメンバーの１つと別のクラスのメンバーを交換することもある。
【００７９】
特定の実施形態においては、置換の際に、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮されることもある。各アミノ酸には、疎水性と電荷を基に疎水性親水性指標が割り当てられている。それらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。
【００８０】
相互作用性の生物学的機能をタンパク質に与えるのに、特定の事例では、アミノ酸の疎水性親水性指標が重要であることは、当業界でも理解されている（Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １５７：１０５−１３１  （１９８２））。特定の事例では、特定のアミノ酸を同様の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸と置換して、同様の生物学的活性が保持できることがわかっている。疎水性親水性指標に基づいて変更を行う場合、特定の実施形態では、疎水性親水性指標が±２以内のアミノ酸の置換が含まれる。特定の実施形態では、±１以内のアミノ酸の置換が含まれ、特定の実施形態では、±０．５以内のアミノ酸の置換が含まれる。
【００８１】
類似のアミノ酸同士の置換は、親水性に基づいて効果的に行うことができ、この実施形態のようにそうして生成した生物学的機能タンパク質またはペプチドを免疫学的実施形態で使用する場合は特に効果的である。特定の実施形態では、隣接するアミノ酸の親水性に支配されるタンパク質の最大局在平均親水性は、このタンパク質の免疫原性及び抗原性と相関があり、すなわちこのタンパク質の生物学的特性と相関がある。
【００８２】
アミノ酸残基に割り当てられた親水性の値は、アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）及びトリプトファン（−３．４）である。類似の親水性値に基づいて変更する場合、特定の実施形態では、親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が含まれる。特定の実施形態では、±１以内のアミノ酸の置換が含まれ、特定の実施形態では、±０．５以内のアミノ酸の置換が含まれる。
【００８３】
当業者であれば、周知の技法により、本明細書に記載のポリペプチドの好適なバリアントを決定できよう。特定の実施形態では、当業者は、活性に関して重要ではないと考えられる領域を標的とすることによって、活性を壊すことなく変更できる分子の好適な領域を特定することができる。特定の実施形態では、当業者は、類似の複数のポリペプチドで保存されている残基及び分子の部分を特定することができる。
【００８４】
特定の実施形態では、生物学的活性または構造にとって重要であり得る領域でも、生物学的活性を壊すことなく、またはポリペプチド構造に有害な影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換の対象とすることができる。
【００８５】
さらに、特定の実施形態では、当業者は、活性または構造にとって重要な類似のポリペプチドの残基を特定した構造機能研究の諸文献を当たることができる。そのような比較に鑑み、特定の実施形態では、当業者は、類似のタンパク質の活性または構造にとって重要なアミノ酸残基に相当する、あるタンパク質中のアミノ酸残基の重要度を予測することができる。特定の実施形態では、当業者は、そうして予測した重要なアミノ酸残基に対して、化学的に類似するアミノ酸置換を選択することができる。
【００８６】
特定の実施形態では、当業者はまた、アミノ酸配列及び三次元構造を、類似のポリペプチドの三次元構造に関連して分析することができる。特定の実施形態では、そのような情報に鑑み、当業者はポリペプチドのアミノ酸残基のアラインメントを、その三次元構造を参照して予測できる。特定の実施形態では、当業者は、タンパク質表面に存在すると予測されるアミノ酸残基が他の分子との重要な相互作用に関与する可能性があるため極端に変更しない、と選択することもできる。
【００８７】
さらに、特定の実施形態では、当業者は、所望のアミノ酸残基それぞれに１つのアミノ酸置換を含む試験バリアントを作ることができる。特定の実施形態では、次に、このバリアントを当業者には既知の活性アッセイでスクリーニングすることができる。特定の実施形態では、そのようなバリアントを、好適なバリアントについての情報を収集するのに用いることができる。たとえば、特定の実施形態では、ある特定のアミノ酸残基を変更した結果、壊れた、必要以上に低下した、または不適切な活性となることを発見した場合は、そのような変更を有するバリアントを回避することができる。換言すると、特定の実施形態では、そのようなルーチンの実験から収集した情報に基づき、当業者は、単独でも他の変異との組合せでも、さらなる置換を回避すべきアミノ酸を容易に決定することができる。
【００８８】
二次構造の予測を研究した科学文献はいくつもある。たとえば、Ｍｏｕｌｔ  Ｊ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  ７（４）：４２２−４２７  （１９９６），  Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １３（２）：２２２−２４５  （１９７４）；  Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １１３（２）：２１１−２２２  （１９７４）；  Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  Ｒｅｌａｔ．  Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４７：４５−１４８  （１９７８）；  Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ４７：２５１−２７６及びＣｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．，  ２６：３６７−３８４  （１９７９）を参照されたい。さらに、現在は、二次構造を予測するのに役立つコンピューター・プログラムも利用できる。二次構造を予測するひとつの方法は、相同性モデリングに基づくものである。たとえば、３０％よりも高い配列同一性をもつ、あるいは４０％よりも高い類似性をもつ２種のポリペプチドまたはタンパク質は、類似の構造トポロジーをもつことが多い。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の発展により、ポリペプチド構造におけるフォールド数の推測を含め、二次構造の予測可能性が増大している。たとえば、Ｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．，  ２７（１）：２４４−２４７  （１９９９）を参照されたい。所与のポリペプチドまたはタンパク質のフォールド数には限りがあって、構造の重要な数が解明すれば、格段に正確な予測が可能になる、とする研究もある（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．，  ７（３）：３６９−３７６  （１９９７））。
【００８９】
二次構造を予測するさらなる方法としては、「スレディング」（たとえば、Ｊｏｎｅｓ，  Ｄ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．，  ７（３）：３７７−８７  （１９９７）；  Ｓｉｐｐｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ４（１）：１５−１９  （１９９６）を参照のこと））、「プロファイル分析」（たとえば、Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５３：１６４−１７０  （１９９１）；  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍ．，  １８３：１４６−１５９  （１９９０）；  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８４（１３）：４３５５−４３５８  （１９８７）を参照のこと）、及び「進化的連結（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ）」（たとえば、Ｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．，  ２７（１）：２４４−２４７  （１９９９）及びＢｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．，  ７（３）：３６９−３７６  （１９９７）を参照のこと）が挙げられる。
【００９０】
特定の実施形態では、基準チャネルロドプシンまたはロドプシンドメイン（ＧｔＡＣＲ）のバリアントにはグリコシル化バリアントが含まれ、グリコシル化部位の数及び／または種類は、基準の陰イオン伝導チャネルロドプシンまたはロドプシンドメイン（ＧｔＡＣＲ）のアミノ酸配列に対して改変されている。特定の実施形態では、ポリペプチドのバリアントは、天然のポリペプチドよりも多数または少数のＮ連結グリコシル化部位を含む。Ｎ連結グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒで特徴付けられ、Ｘとされるアミノ酸残基は、プロリンを除くどのアミノ酸残基でもよい。アミノ酸残基を置換してこの配列を作ると、Ｎ連結糖鎖の付加が可能な新たな部位ができる。あるいは、この配列を排する置換によって、既存のＮ連結糖鎖が除去される。特定の実施形態では、Ｎ連結糖鎖の再配置がなされ、１つ以上のＮ連結グリコシル化部位（一般的には天然のもの）が除去され、１つ以上の新しいＮ連結部位が作られる。例示的バリアントとしては、システインバリアントが挙げられ、基準チャネルロドプシンまたはロドプシンドメイン（ＧｔＡＣＲ）のアミノ酸配列に対し、１つ以上のシステイン残基が欠失しているか、別のアミノ酸（たとえば、セリン）で置換されている。特定の実施形態では、システインバリアントは、不溶性封入体の単離後などにポリペプチドやタンパク質を生物学的に活性のあるコンフォメーションへと再度折り畳まなければならないときに便利であり得る。特定の実施形態では、システインバリアントは、天然ポリペプチドよりもシステイン残基の数が少ない。特定の実施形態では、システインバリアントは、対を形成しなかったシステインによる相互作用を最小限化するために、偶数のシステイン残基を有する。
【００９１】
特定の実施形態においては、アミノ酸置換は、次のようなものである：（１）タンパク質分解されにくくする、（２）酸化しにくくする（３）タンパク質複合体を形成する結合親和性を改変する、（４）結合親和性を改変する、かつ／または（４）そのようなポリペプチドに他の物理化学的または機能的特性を付与しまたは修飾する。特定の実施形態においては、１つまたは複数のアミノ酸置換（特定の実施形態では、保存アミノ酸置換）を、天然配列中（特定の実施形態では、分子間接触を形成しているドメイン（複数可）外のポリペプチドの一部分）に設けることができる。特定の実施形態では、保存アミノ酸置換は、一般に、基準配列の構造特徴を大幅に変えてはならない（たとえば、特定の実施形態では、置換アミノ酸は、基準配列に生じる螺旋体を壊すようなものや、この基準配列を特徴付ける他の種類の二次構造を中断させるものであってはならない）。
【００９２】
当業界で認識されているポリペプチドの二次構造及び三次構造の諸例が、たとえばＰｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｅｄ．，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８４））；  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．  Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｔｏｏｚｅ，  ｅｄｓ．，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．  （１９９１））；及びＴｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｔ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５  （１９９１）などで説明されている。
【００９３】
他の実施形態では、改良された特性及び特徴を有するＡＣＲを提供する方法及び組成物が提供され、そのような特性及び特徴により、とりわけ光遺伝学的技法において該組成物の利用性が拡大する。改良された特性としては、限定ではないが、ヒトコドンに使用でき、合成できるようにすることが挙げられる。これらの実施形態は、光開閉型の塩素イオン伝導により、高い感受性及び高効率の膜過分極、及び神経細胞サイレンシングを提供する。
【００９４】
Ｂ．融合タンパク質
ポリペプチドもしくはペプチドまたはペプチドの切断型もしくは変異体バージョンが、無関係のまたは相同性のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドと融合されており、本明細書で説明する所望のペプチドをコードする核酸及び／またはアミノ酸配列に基づき設計することができる、融合タンパク質の使用。そのような融合タンパク質としては、限定ではないが、タンパク質またはペプチドを安定させ、インビボの半減期を延長するＩｇＦｃ融合；融合タンパク質を細胞膜に固定できるような任意のアミノ酸配列との融合；またはマーカー機能を提供する酵素、蛍光タンパク質、もしくは発光タンパク質との融合が挙げられる。相同タンパク質への融合タンパク質としては、限定ではないが、関連機能をもつ陰イオン伝導チャネルロドプシンの相同（オルソロガスまたはパラロガス）タンパク質の一部分と融合させる陰イオン伝導チャネルロドプシンの一部分をコードするように操作された遺伝子から生産されるものが挙げられる。たとえば、異種のチャネルロドプシン同士のキメラを、それぞれに固有の有益な特性を組み合わせるように、作製することができる。いくつかの態様では、この実施形態のキメラチャネルロドプシンは、第１のチャネルロドプシン由来の配列の約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％を含み、残りの配列は第２のチャネルロドプシンに由来する。いくつかの態様では、キメラチャネルロドプシンは、第１のチャネルロドプシンのロドプシンドメインを含み、残りの配列は第２のチャネルロドプシンに由来する。さらなる態様では、キメラチャネルロドプシンは、第１のチャネルロドプシンの膜貫通ドメインを１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ含むことができ、残りの膜貫通ドメインは第２のチャネルロドプシンに由来する。
【００９５】
特定の実施形態では、融合タンパク質は、発現している該融合タンパク質に選択的に結合する抗体を使って容易に精製することができる。代替の実施形態では、融合タンパク質の精製は、ペプチドをコードする核酸配列を組換えプラスミドまたはその一部分にサブクローニングし、アミノ末端（Ｎ末端）またはカルボキシ末端（Ｃ末端）のヒスチジン６残基からなるタグ（「Ｈｉｓタグ」；たとえば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：８９７２−８９７６，  １９９１を参照のこと）に翻訳により融合させることで実施できる。そのようなコンストラクトを発現している細胞からの抽出物を、Ｎｉ２＋ニトリロ酢酸−アガロースカラムにロードし、ヒスチジンタグがついたタンパク質をイミダゾールを含有する緩衝液を用いて選択的に溶出させる。
【００９６】
Ｃ．チャネルロドプシンをコードする核酸
いくつかの実施形態では、異種プロモーター配列に機能的に連結された組換え核酸が提供され、この組換え核酸は、配列番号１、配列番号３または配列番号１３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するペプチドをコードする配列；または、配列番号１、配列番号３または配列番号１３から選択される連続する２２５アミノ酸で構成されるペプチドをコードする配列；または、配列番号２、配列番号４またはその相補のヌクレオチド配列にハイブリダイズする配列を含んでいる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、藻類由来の高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、ロドプシンドメインは、その配列が配列番号１、配列番号３または配列番号１３で説明されるペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、配列番号１または配列番号３で示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１、配列番号３または配列番号１３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む発現ベクターが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１もしくは配列番号３のアミノ酸配列をコードする核酸配列、または配列番号２もしくは配列番号４の核酸配列の核酸配列またはその一部分の断片を含む発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００９８】
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡに由来しかつＡＣＲのロドプシンドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、ロドプシンドメインは、その配列が配列番号１、配列番号３または配列番号１３で説明されるペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、配列番号１または配列番号３で示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡに由来する、単離された核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１、配列番号３または配列番号１３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む発現ベクターが提供される。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡに由来し、配列番号１、配列番号３または配列番号１３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００９９】
いくつかの実施形態では、高効率で高感受性のＡＣＲの７ＴＭまたはロドプシンドメインをコードするｃＤＮＡ由来核酸配列の少なくとも一部分によってコードされるアミノ酸配列を含む単離されたペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ由来核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む単離されたペプチドが提供される。
【０１００】
いくつかの実施形態では、高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンに由来する陰イオンロドプシンドメインをコードする核酸配列によってコードされる連続配列を含む、単離されたペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１、配列番号３またはその断片のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２、配列番号４または配列番号６からなる群の核酸配列の少なくとも一部分によってコードされ陰イオンロドプシンまたは陰イオン伝導チャネルロドプシンとして機能するアミノ酸配列を含む、単離されたペプチドが提供される。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、配列番号１、配列番号３または配列番号１３のアミノ酸配列、または、配列番号２、配列番号４または配列番号６のｃＤＮＡ由来核酸配列によってコードされ陰イオン伝導チャネルロドプシンとして機能する７ＴＭドメイン／ロドプシンドメインのアミノ酸配列を含む、単離されたペプチドが提供される。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、ロドプシンは、その配列が配列番号１、配列番号３または配列番号１３で示されるペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、配列番号１、配列番号３または配列番号１３で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１、配列番号３または配列番号１３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む発現ベクターが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１、配列番号３または配列番号１３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードする配列を含むペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１、配列番号３または配列番号１３のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、単離されたペプチドには、配列番号１、配列番号３または配列番号１３のアミノ酸配列、またはその断片が含まれる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子が提供され、該核酸分子は、配列番号２、配列番号４、または配列番号１４〜１５の配列を有する。他の実施形態では、配列番号２、配列番号４、または配列番号１４〜１５で示されるなかから選択される核酸配列、及び配列番号１、配列番号３または配列番号１３で示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む発現ベクターが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２、配列番号４、または配列番号１４〜１５で示す核酸配列、及び配列番号１、配列番号３または配列番号１３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、単離された核酸は、高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３または配列番号１３の連続する少なくとも１６アミノ酸をコードする。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３または配列番号１３の連続する少なくとも２０アミノ酸をコードする。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１または配列番号３の連続する少なくとも３５アミノ酸をコードする。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１または配列番号３の連続する少なくとも５０アミノ酸をコードする。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３または配列番号１３の連続する少なくとも７５アミノ酸をコードする。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３または配列番号１３の連続する少なくとも３３アミノ酸をコードする。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３または配列番号１３の任意の連続する部分を含むペプチドをコードする。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ  ｔｈｅｔａ由来の新規の陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸が提供される。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３または配列番号１３の連続する少なくとも１６アミノ酸をコードする。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３または配列番号１３の連続する少なくとも２０アミノ酸をコードする。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３または配列番号１３の連続する少なくとも３５アミノ酸をコードする。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３または配列番号１３の連続する少なくとも５０アミノ酸をコードする。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３または配列番号１３の連続する少なくとも７５アミノ酸をコードする。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３または配列番号１３の連続する少なくとも３３アミノ酸をコードする。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３または配列番号１３を含むペプチドをコードする。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ  ｔｈｅｔａの陰イオン伝導チャネルロドプシンの機能的ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。いくつかの実施形態では、配列番号１、配列番号３もしくは配列番号１３またはその断片のアミノ酸の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２２８、２２９、２３０、２３５、２４０２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、２９６またはそれ以上の連続するアミノ酸をコードする単離された核酸。さらに、いくつかの実施形態では、これらの整数間の任意の範囲。
【０１０６】
他の実施形態では、本発明は、配列番号１、配列番号３もしくは配列番号１３またはその断片のアミノ酸と、いくつかの実施形態では約７０％〜約７５％、さらなる実施形態では約７５％〜約８０％、さらなる実施形態では約８０％〜９０％、またはさらなる実施形態では約９０％〜約９９％（たとえば９５％）同一（または相同）であるアミノ酸を有する、単離されたポリペプチドまたはポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。
【０１０７】
他の実施形態では、本発明は、配列番号１、配列番号３もしくは配列番号１３またはその断片のアミノ酸と、約７０％〜約７５％；またはより好ましくは約７５％〜約８０％；またはより好ましくは約８０％〜９０％；またはさらに好ましくは約９０％〜約９９％同一であるアミノ酸を有するポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、コード配列そのものの長さに関わらず、核酸セグメントを、他のＤＮＡ配列と、たとえばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、複数のクローン化部位、他のコードセグメントなどと、組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、たとえば、異種プロモーターに機能的に連結された、配列番号１もしくは配列番号３またはその断片のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸が提供される。
【０１０９】
特定の実施形態では、本発明は、配列番号２または配列番号４と一緒に使用することができる適切なプライマーから選択されるプライマーを用いて、テンプレート核酸からの増幅によって得られる、単離された核酸を提供する。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、  は本開示の方法のいずれかであり、発現ベクターとしては、限定ではないがＡＡＶウイルスベクターが挙げられる。いくつかの実施形態では、  は本開示の方法のいずれかであり、プロモーターは構成（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）プロモーターである。いくつかの実施形態では、  は本開示の方法のいずれかであり、構成プロモーターとしては、限定ではないが、ＣＭＶプロモーターまたはハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、  は本開示の方法のいずれかであり、プロモーターとしては、限定ではないが、誘導性の及び／または細胞型に特異的なプロモーターが挙げられる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、配列番号１、配列番号３または配列番号１３から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むｃＤＮＡ由来核酸が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１、配列番号３または配列番号１３から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むｃＤＮＡ由来核酸が提供され、該ｃＤＮＡ由来核酸は、配列番号２、配列番号４、または配列番号１４〜１５の核酸配列を含む。他の実施形態では、配列番号１、配列番号３または配列番号１３から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むｃＤＮＡ由来核酸を含む発現ベクターが提供される。
【０１１２】
本開示の方法及び組成物で使用されるチャネルロドプシン核酸配列としては、限定ではないが、本開示の藻類に由来する陰イオン伝導チャネルロドプシンの活性部分ＧｔＡＣＲ１（アミノ酸配列番号１、及び核酸配列の配列番号２）、ＧｔＡＣＲ２（アミノ酸配列番号３、及び核酸配列の配列番号４）が挙げられ、これらには、限定ではないが本明細書で説明するもの、たとえば限定ではないがロドプシンドメイン、限定ではないが本開示のロドプシンドメイン（配列番号１）などの本開示の藻類に由来する陰イオン伝導チャネルロドプシンの活性部分をコードする核酸配列が含まれる。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、本開示の陰イオン伝導チャネルロドプシンの限定ではないがロドプシンドメインなどの活性部分の使用には、本明細書で説明する配列（その発現ベクターも含む）の全部または一部分が含まれ、それに加えて使用が意図されるのが、本開示の陰イオン伝導チャネルロドプシンの限定ではないがロドプシンドメインなどの活性部分をコードする任意のヌクレオチド配列、連続的なオープン読み枠（ＯＲＦ）であり、該ＯＲＦは、本明細書で説明する陰イオン伝導チャネルロドプシンまたはチャネルオプシン配列の相補配列に厳密な条件下でハイブリダイズし（たとえば０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡ中６５℃でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション、次いで０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中６８℃での洗浄（“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  Ｖｏｌ．  １  ａｎｄ  ２  （Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  １９８９）））、機能的に等価な陰イオン伝導チャネルロドプシン（または限定ではないがロドプシンドメインなどのその活性部分）遺伝子産物またはその活性部分をコードするものである。さらに使用が意図されるのは、陰イオン伝導チャネルロドプシンのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の相補配列に、中程度に厳密な条件でハイブリダイズする（たとえば、０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中４２℃での洗浄（前掲の“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”））が、なおも機能的に等価な陰イオン伝導チャネルロドプシン産物をコードする任意のヌクレオチド配列である。陰イオン伝導チャネルロドプシンの機能的等価物としては、限定ではないが、異種または同種（オルソログ、パラログ及びより広いホモログ）に存在する天然バージョンの陰イオン伝導チャネルロドプシン、及び天然もしくは遺伝子操作（部位を指定した変異誘発、遺伝子シャッフル、または進化の誘導、たとえば米国特許第５，８３７，４５８号で説明しているもの）の変異体バージョンの陰イオン伝導チャネルロドプシン、または限定ではないがロドプシンドメインなどのその活性部分が挙げられる。本開示には、特定されたチャネルロドプシンのポリヌクレオチド配列の（遺伝コードの重複による）変性核酸バリアントの使用も含まれる。
【０１１４】
さらに使用が意図されるのは、本明細書で説明する陰イオン伝導チャネルロドプシン配列の対応領域と約９９％、９５％、９０％、または約８５％の類似率（たとえばウィスコンシン大学のＧＣＧ配列分析パッケージ（ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ３．０、Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、ミシガン州アナーバー）でデフォルトのパラメーターを用いるＢＬＡＳＴ配列比較分析による測定）のポリヌクレオチド配列によってコードされる、陰イオン伝導チャネルロドプシンＯＲＦまたはそれらの機能的等価物をコードするポリヌクレオチドである。
【０１１５】
特定の実施形態では、本発明は、アミノ酸配列中に、チャネルロドプシンまたはその機能的部分もしくはバリアント、たとえば特定されクローン化されているＧｔＡＣＲ１及びＧｔＡＣＲ２（配列番号１及び３）及びＰｓｕＡＣＲ１（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドをコードする単離された核酸セグメント及び組換えベクターに関する。いくつかの実施形態では、チャネルロドプシンの一部分及び  は、全長チャネルロドプシンのアミノ酸と同一ではないかまたは生物学的機能が等価である比較的少数のアミノ酸を有する。「機能的に等価」という用語は、当業界ではよく理解されている。したがって、特定されクローン化されたＧｔＡＣＲ１（配列番号１）、ＧｔＡＣＲ２（配列番号３）またはＰｓｕＡＣＲ１（配列番号１３）のアミノ酸と約７０％〜約８０％；またはより好ましくは約８５％〜約９０％；またはさらに好ましくは約９０〜９５％及び約９９％同一のまたは機能的に等価なアミノ酸を有する配列。
【０１１６】
本発明の核酸セグメントは、コード配列そのものの長さに関わらず、他の配列と、たとえばプロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、複数のクローン化部位、他のコードセグメントなどと組み合わせることができ、したがって全体の長さが互いにかなり異なり得る。したがって、ほとんどどのような長さの核酸断片でも使用できるものと意図され、トータルの長さは、好ましくは、調製しやすさ及び所期の組換えＤＮＡプロトコルでの使いやすさに応じて決められる。たとえば、配列番号１及び３のポリペプチドをコードする核酸に相補的な約１０〜１５または２０、３０、または４０ほどのヌクレオチドの、最大２０００ほどの塩基対長さの短片を含む核酸断片を調製することができる。トータルの長さが約８０００、７０００、６０００、５０００、４０００、３０００、２０００、１０００、５００、２００、１００及び約５０塩基対のＤＮＡセグメントも有用であると意図される。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、チャネルロドプシンまたはその断片をコードする単離された核酸、及びチャネルロドプシンタンパク質またはペプチドをコードしそのアミノ酸配列中に配列番号１及び３によるアミノ酸配列を含む核酸配列が組み込まれた組換えベクター。いくつかの実施形態では、チャネルロドプシンまたはその断片をコードするタンパク質をコードする精製された核酸セグメント、組換えベクターは、さらに、該チャネルロドプシンをコードする核酸セグメントに機能的に連結されたプロモーターを含む発現ベクターと定義することができる。
【０１１８】
さらなる実施形態では、チャネルロドプシンをコードする核酸セグメントを含む組換えベクターにより組み換えられた宿主細胞が提供される。組換え宿主細胞は、原核生物細胞でも真核生物細胞でもよい。本明細書では、「（遺伝子）操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」または「組換え」細胞という用語は、チャネルロドプシンをコードする遺伝子などの組換え遺伝子が導入されている細胞を指すものとする。したがって、遺伝子操作された細胞は、組換え導入遺伝子を含まない天然細胞と区別される。したがって遺伝子操作された細胞は、人工的に導入された遺伝子（複数可）を有する細胞である。組換え導入遺伝子は、ゲノム遺伝子のコピーまたはｃＤＮＡ遺伝子のコピーのいずれかになり、あるいはこの導入遺伝子と自然界では結合しないプロモーターに隣接して配置される遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、チャネルロドプシンをコードする核酸配列と同一または相補的な、連続する約１４、１５〜２０、３０、４０、５０、またはさらに約１００〜約２００ほどのヌクレオチド区間からなる配列領域を有する核酸分子。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明するチャネルロドプシンをコードする核酸配列は、クラスター化されて規則的に配置された短い回文配列のリピート（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を用いて宿主細胞ゲノムを標的とすることができる。Ｓａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｊｏｕｎｇ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ３２（４）：  ３４７−  ３５５を参照されたい（参照により本明細書に援用する）。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系には、配列特異的にＤＮＡに結合する非コードＲＮＡ分子（ガイド）ＲＮＡ、及びヌクレアーゼ機能（たとえば２つのヌクレアーゼドメイン）を有するＣａｓタンパク質（たとえば、Ｃａｓ９）が含まれる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ（標的配列に対し特異的なｃｒＲＮＡと固定ｔｒａｃｒＲＮＡの融合も含む）が細胞に導入される。一般には、ｇＲＮＡの５’末端の標的部位は、相補性塩基対形成により、Ｃａｓヌクレアーゼを遺伝子などの標的部位に向ける。いくつかの実施形態では、標的部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の、典型的にはＮＧＧまたはＮＡＧなどの５’側の位置に基づいて選択される。この点において、標的ＤＮＡ配列に対応するようにガイドＲＮＡの最初の２０ヌクレオチドを修飾することによって、所望の配列をｇＲＮＡの標的とする。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明するように、ＣＲＩＳＰＲ系は標的部位でＤＳＢを誘導し、続いて切断が生じる。他の実施形態では、「ニッカーゼ」とされるＣａｓ９バリアントが用いられて、標的部位で単一鎖に切れ目（ニック）を入れる。いくつかの態様では、たとえば特異性を強化するために対のニッカーゼを用い、それぞれが１対の異なるｇＲＮＡによって配向されて配列を標的とし、したがってニックが同時に導入されると５’オーバーハングが導入される。
【０１２１】
いくつかの態様では、１つ以上のガイドＲＮＡ（リボ核酸）が、細胞で発現させたヌクレアーゼ活性をもつ酵素、たとえばヌクレアーゼ活性をもつＤＮＡ結合タンパク質を、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）上の標的位置に配向し、この酵素はＤＮＡを切断し、本明細書で説明する外生ドナー核酸が、たとえば相同組換えによって、このＤＮＡに挿入される。例示的方法が、たとえば米国特許公開第２０１４０３５７５３０号及び国際公開ＷＯ２０１５００６２９０で説明されており、両方を参照により本明細書に援用する。
【０１２２】
したがって、本開示の特定の実施形態は、外生ＤＮＡ（たとえば、チャネルロドプシンをコードする核酸配列）、及び、ＤＮＡに共存し消化または切断し、そのＤＮＡに相同組換えなどによって該外生ＤＮＡを挿入する、ＤＮＡ結合タンパク質などのヌクレアーゼ酵素とガイドＲＮＡの使用に基づいている。当業者であれば、様々な目的でＤＮＡに結合させるためのそのようなＤＮＡ結合タンパク質は簡単にわかる。そのようなＤＮＡ結合タンパク質は、天然のものでもよい。本開示の範囲に含まれるＤＮＡ結合タンパク質としては、本明細書ではガイドＲＮＡと呼ばれるＲＮＡにガイドされることができるものが挙げられる。この態様によると、ガイドＲＮＡとＲＮＡによってガイドされるＤＮＡ結合タンパク質とは、ＤＮＡに共存する複合体を形成する。そのようなヌクレアーゼ活性をもつＤＮＡ結合タンパク質は当業者には既知であり、ヌクレアーゼ活性をもつ天然ＤＮＡ結合タンパク質、たとえばＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣａｓ９タンパク質などがこれに含まれる。このようなＣａｓ９タンパク質及びＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は当業界ではよく記述されている。Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ９，  Ｊｕｎｅ  ２０１１，  ｐｐ．  ４６７−４７７を、補足情報も含めて参照されたい（本明細書に参照により援用する）。
【０１２３】
ヌクレアーゼ活性機能を有して二本鎖ＤＮＡに切れ目を入れるかまたはそれを切断する、例示的ＤＮＡ結合タンパク質。そのようなヌクレアーゼ活性は、ヌクレアーゼ活性を示す１つ以上のポリペプチド配列をもつＤＮＡ結合タンパク質から得ることができる。そのような例示的ＤＮＡ結合タンパク質は、２つの別々のヌクレアーゼドメインを持つことができ、各ドメインは、二本鎖ＤＮＡの特定の鎖を切断するかまたは切れ目を入れる役割を担う。ヌクレアーゼ活性を有する、当業者には既知の例示的ポリペプチド配列には、ＭｃｒＡ−ＨＮＨヌクレアーゼ関連ドメイン及びＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインが含まれる。したがって、例示的ＤＮＡ結合タンパク質は、天然の、ＭｃｒＡ−ＨＮＨヌクレアーゼ関連ドメイン及びＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを１つ以上含むものである。
【０１２４】
Ｄ．組換え発現
本明細書で説明する所望のペプチドアミノ酸配列は、化学合成することができるが（たとえば“Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ”（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  ｅｄ．，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  １９８４）を参照のこと）、大きいポリペプチド配列は、当業界では周知の、所望のペプチドをコードする核酸配列を含む核酸を発現させる技法を用いる組換えＤＮＡ技術により生産するのが有利な場合もある。そのような方法により、ペプチドをコードするヌクレオチド配列及び転写と翻訳を制御する適切なシグナルを含む発現ベクターを作製することができる。これらの方法としては、たとえば、インビトロの組換えＤＮＡ技法、合成技法、及びインビボの遺伝子組換えが挙げられる（たとえば、前掲の“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”や“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”を参照のこと）。あるいは、所望のペプチドをコードするＲＮＡ及び／またはＤＮＡをコードするヌクレオチド配列を、たとえばシンセサイザーにより化学合成して作製することができる（たとえば、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ｇａｉｔ，  ｅｄ．，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ，  １９８４）を参照のこと）。
【０１２５】
様々な宿主発現ベクター系を使って、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させることができる。所望のペプチドまたはポリペプチドが可溶性であるかまたは可溶性の誘導体であるとき、このペプチドまたはポリペプチドを宿主細胞培養液から回収することができる。すなわち、このペプチドまたはポリペプチドが分泌されない場合は宿主細胞から、このペプチドまたはポリペプチドが宿主細胞によって分泌される場合は培養液から、回収することができる。しかし、好適な発現系には、細胞膜内に留められる所望のポリペプチドまたは機能的等価物を発現する、遺伝子操作された宿主細胞も含まれる。そのような発現系からの所望のペプチドの精製または濃縮は、適切な洗浄剤及び脂質ミセルを用いて、当業者には既知の方法により行うことができる。さらに、そのような遺伝子操作された宿主細胞自体は、ペプチドの構造的機能的特徴の保持が望ましいだけでなく、たとえば特定の薬物スクリーニングアッセイで生物学的活性の評価が望ましい状況で使用されることもある。
【０１２６】
特定の用途では、一過性の発現系が望ましい。しかし、長期間高収率で組換えタンパク質またはペプチドを生産する場合、安定した発現が一般に好まれる。たとえば、所望のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または融合タンパク質を安定的に発現する細胞株を遺伝子操作で作製できる。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現制御要素（たとえば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）及び選択性マーカーによって制御されるＤＮＡで宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡを導入した後、遺伝子操作された細胞を濃縮培地で約１〜２日かけて増殖させ、次いで選択培地に変更する。組換えプラスミドの選択性マーカーは、選択に対し耐性を与えるので、細胞はプラスミドを自体の染色体に安定的に組み込み、成長してフォーカスを形成する。次にそれをクローン化して細胞株にすることができる。この方法は、所望の遺伝子産物またはその一部分を発現する細胞株を遺伝子操作により作製するのに有利に使用できる。そのような遺伝子操作された細胞株は、所望のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの内在的な活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニング及び評価で特に有用となり得る。
【０１２７】
いくつかの選択系が使用でき、それらには、限定ではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １１：２２３−２３２，  １９７７）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ａｎｄ  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ４８：２０２６−２０３４，  １９６２）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ２２：８１７−８２３，  １９８０）遺伝子が含まれ、これらはそれぞれｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−細胞、ａｐｒｔ−細胞で用いることができる。抗代謝耐性を基に、以下の遺伝子を選択することもできる：ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）（メトトレキサートに対する耐性を与える（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：３５６７−３５７０，  １９８０，及びＯ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：１５２７−１５３１，  １９８１））；グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）（ミコフェノール酸に対する耐性を与える（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：２０７２−２０７６，  １９８１））；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）（アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与える（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５０：１−１４，  １９８１））；及びハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）（ハイグロマイシンに対する耐性を与える（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ３０：１４７−１５６，  １９８４））。
【０１２８】
本開示の方法で使用するための組成物を提供するために使用することができる宿主細胞／発現系としては、限定ではないが、所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換させた細菌（たとえば、Ｅ．  ｃｏｌｉ、Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの細菌；所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換させた酵母（たとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）；所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルス発現ベクター（たとえば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（たとえば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染させた、または所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（たとえば、Ｔｉプラスミド）で形質転換させた植物細胞系；または所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列及び哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター（たとえば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウイルス由来のプロモーター（たとえば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現コンストラクトを有する哺乳類細胞系（たとえば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）が挙げられる。
【０１２９】
細菌系では、発現させた所望の遺伝子産物の所期の用途に応じて、いくつもの異なる発現ベクターを有利に選択することができる。たとえば、そのようなタンパク質を大量に生産するとき、たとえば所望のペプチドを含む医薬組成物を生成したり、そのタンパク質の抗体を作ったりする場合には、容易に精製できる融合タンパク質産物の高レベルの発現を誘導するベクターが望ましいこともある。そのようなベクターとしては、限定ではないが：Ｅ．  ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２：１７９１−１７９４，  １９８３）（融合タンパク質が生産されるように、所望のペプチドをコードする配列をｌａｃＺコード領域とインフレームで個別にベクター内に結合させることができる）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｙｅ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：３１０１−３１１０，  １９８５及びＶａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４：５５０３−５５０９，  １９８９）などが挙げられる。ｐＧＥＸベクター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）も、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として所望のペプチド部分の発現に用いることができる。一般には、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、次いで遊離グルタチオンの存在下で溶離することによって、溶解細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、所望のペプチドをコードするクローン遺伝子産物をＧＳＴ部分から解放できるように、トロンビンまたはファクターＸａプロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０１３０】
ある例示的な昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、所望のペプチドをコードする配列を発現させるためのベクターとして用いられる。このウイルスはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中で増殖する。所望のペプチドをコードする配列は、ウイルスの非重要領域（たとえばポリヘドリン遺伝子）へと個別にクローン化され、ＡｃＮＰＶプロモーター（たとえばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれる。所望のペプチドをコードする配列の挿入が成功すると、その結果としてポリヘドリン遺伝子が不活化し、非閉塞組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によってコードされるタンパク質コートのないウイルス）が生産される。次にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞をこの組換えウイルスに感染させ、挿入したポリヌクレオチドをこの細胞内で発現させる（たとえば、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ４６：５８４−５９３，  １９８３及び米国特許第４，２１５，０５１を参照のこと）。
【０１３１】
哺乳類宿主細胞では、いくつかのウイルスベースの発現系を利用することができる。発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列を、アデノウイルス転写／翻訳複合体、たとえば、後期プロモーター及び三要素リーダー配列に連結することができる。次いでこのキメラ配列を、インビトロまたはインビボの組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入する。ウイルスゲノムの非重要領域（たとえば、領域Ｅ１またはＥ３）に挿入すると、その結果として感染宿主内で生存でき所望のペプチド産物を発現させる能力のある組換えウイルスが生じる（たとえば、Ｌｏｇａｎ  ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：３６５５−３６５９，  １９８４を参照のこと）。挿入された所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列が高効率で翻訳されるように、特異的な開始シグナルを要することもある。これらのシグナルにはＡＴＧ開始コドン及び隣接する配列が含まれる。場合によっては、ＡＴＧ開始コドンをおそらくは含む外生翻訳制御シグナルが準備されることもある。さらに、開始コドンは、挿入した全体が確実に翻訳されるように、所望のペプチドをコードするコード配列の読み枠と一致していなければならない。これらの外生翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然でも合成でも様々な起源であってよい。適切な翻訳エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含めることによって、発現効率を高めることができる（たとえば、Ｎｅｖｉｎｓ，  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９：３０７−３２２，  １９８６を参照のこと）。
【０１３２】
酵母では、構成プロモーターまたは誘導的プロモーターを含むいくつかのベクターを使用することができる。概要としては、たとえば前掲の“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”  Ｃｈ．  １３，  Ｂｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５３：５１６−５４４，  １９８７，  “ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，  Ｖｏｌ．  ＩＩ，  Ｃｈ．  ３  （Ｇｌｏｖｅｒ，  ｅｄ．，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．，  １９８６）；  Ｂｉｔｔｅｒ，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５２：６７３−６８４，  １９８７，  “Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：  Ｌｉｆｅ  Ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ”  （Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８１）及び“Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”  （Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８２）を参照されたい。
【０１３３】
植物では、様々な異なる植物発現ベクターを用いることができ、所望のペプチドをコードする配列は、いくつかあるプロモーターのどれによって発現させてもよい。たとえば、ＣａＭＶの３５ＳＲＮＡまたは１９ＳＲＮＡプロモーター（Ｂｒｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：５１１−５１４，  １９８４）またはＴＭＶのコートタンパク質プロモーター（Ｔａｋａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６：３０７−３１１，  １９８７）などのウイルスプロモーターを使用することができる。あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのプロモーター（Ｃｏｒｕｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ３：１６７１−１６７９，  １９８４，  ａｎｄ  Ｂｒｏｇｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：８３８−８４３，  １９８４）またはヒートショックプロモーター、たとえば大豆ｈｓｐ１７．５−Ｅまたはｈｓｐ１７．３−Ｂ（Ｇｕｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ６：５５９−５６５，  １９８６）などの植物プロモーターを使用することができる。これらのコンストラクトは、たとえばＴｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、または電気穿孔により、植物細胞に導入することができる。そのような技法の概要としては、たとえば、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＶＩＩＩのＷｅｉｓｓｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ（Ｓｃｈｕｌｅｒ  ａｎｄ  Ｚｉｅｌｉｎｓｋｉ，  ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  １９８８）、及び“Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｈ．  ７−９  （Ｇｒｉｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｖｅｙ，  ｅｄｓ．，  Ｂｌａｃｋｉｅ  ＆  Ｓｏｎ，  Ｌｔｄ．，  Ｇｌａｓｇｏｗ，  Ｓｃｏｔｌａｎｄ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ，  １９８８）を参照されたい。
【０１３４】
さらには、挿入された所望のペプチドをコードする配列の発現を調節する、または所望のペプチドをコードする核酸配列を所望どおりに修飾しプロセスする宿主細胞株を選択することができる。そのようなタンパク質産物の修飾（たとえば、グリコシル化）及びプロセシング（たとえば、切断）は、そのタンパク質の特定の機能に影響を及ぼすことができる。種々の宿主細胞が、タンパク質及びペプチドの翻訳後プロセシング及び修飾に関する特徴的な特定の機構を有している。適切な細胞株または宿主系は、発現する所望のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドが正しくまたは所望どおりに修飾されプロセシングされるように、選択することができる。そのために、所望のペプチドをコードする核酸配列の一次転写、及びグリコシル化及び／またはリン酸化の所望のプロセシングができるような細胞機構を有する真核生物の宿主細胞が使用される。そのような哺乳類宿主細胞としては、限定ではないが、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＶＥＲＯ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、ＨｅＬａ細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ＭＤＣＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞、ＷＩ３８細胞、ヒト肝細胞癌細胞（たとえば、ＨｅｐＧ２）、及びＵ９３７細胞が挙げられる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明する核酸配列の１つを含む組換え宿主細胞。いくつかの実施形態では、本明細書で説明するポリペプチドの１つを含むタンパク質組成物。
【０１３６】
ＩＩＩ．使用方法
いくつかの実施形態では、本明細書で説明する高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンの、部位特異的変異誘発及びキメラ作製による分子操作バリアント（活性が改善されているものもある）。いくつかの実施形態では、チャネルロドプシンは、走光性及び羞明応答の受容体として働く。チャネルロドプシンが光励起されると、細胞膜の脱分極が開始する。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、数種の陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをクローン化し、哺乳類ＨＥＫ２９３細胞で発現させるとチャネル活性があることが判明した。これらの方法により、新規の陰イオン伝導チャネルロドプシンバリアントは、種々の用途のなかでもとりわけ光遺伝学に関して優れた特性をもつ、と判定された。
【０１３８】
光遺伝学の、特に生きた動物での用途に関する主な難点のひとつが、生体組織によって刺激光が散乱し、ヘモグロビンに吸収されることである。長波長吸収の光遺伝学的ツールは、こういった作用からの最小限の光減衰を示すが、ほとんどの微生物ロドプシンはこのカテゴリーに入らない。たとえば、他にもいくつかの有用な特性をもつので光遺伝学では脱分極ツールとして最も頻繁に使用されるＣｈＲ２の最高吸収波長は、４７０ｎｍである。
【０１３９】
一般に、光遺伝学的ツールの長波長吸収は、刺激光の組織散乱とヘモグロビンによる吸収を最小限化することで、刺激光の透過度を増加させるのに望ましいとされている。いくつかの実施形態では、光遺伝学的微生物ロドプシンの長波長感受性は、３，４−デヒドロレチナール（Ａ２レチナール）により強化された。Ａ２レチナール（３，４−デヒドロレチナール）は天然レチノイドであり、その１１シス体が特定の無脊椎動物、魚及び両生類の光受容体細胞中に見られ、このレチナールだけの場合もあるし、Ａ１レチナールにさらに発色団がある場合もある。発色団のβイオノン環に追加の二重結合が存在すると、Ａ１（通常の）レチナールにより形成される色素よりも長波長の光を吸収する色素になる。Ａ１／Ａ２比の変化によって、生物は外的環境に適応する間、自然に視覚スペクトル感受性を順応させるチューニングを行う。ブリーチした微生物ロドプシン（バクテリオロドプシン、ハロロドプシン、感覚性ロドプシンＩ及びＩＩ）をインビトロでオールトランス３，４−デヒドロレチナール（Ａ２レチナール）で再構成しても、それらの吸収スペクトルが長波長にシフトする。いくつかの実施形態では、光遺伝学的ツールのスペクトル特性を、オールトランスＡ２レチナールの組込みによって修飾した。Ａ２レチナールの付加により、イオンポンプもチャネルロドプシンも、吸収が大幅にレッドシフトした機能的色素を形成する。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、光遺伝学的微生物ロドプシンの長波長感受性は、Ａ２レチナールを用いて増強させることができる。いくつかの実施形態では、発色団の置換は、光遺伝学的ツールの効率を改善するための相補的戦略となる。Ａ１レチナールをＡ２レチナールで置換すると、試験ロドプシンは、一般にはその機能の他の側面を改変しなくても、スペクトル感受性がより長い波長に大きくシフトする。
【０１４１】
光遺伝学的技法には、神経活動の操作と神経細胞機能の制御を可能にする、光活性化チャネルと酵素の導入が含まれる。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の方法及び組成物は、細胞に導入され、細胞活性及び細胞機能の操作を容易にすることができる。たとえば米国特許出願第１３／６２２，８０９号の米国特許公開第２０１３００９０４５４号、ならびにＭａｔｔｉｓ，  Ｊ．，  Ｔｙｅ，  Ｋ．  Ｍ．，  Ｆｅｒｅｎｃｚｉ，  Ｅ．  Ａ．，  Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，  Ｃ．，  Ｏ’Ｓｈｅａ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｐｒａｋａｓｈ，  Ｒ．，  Ｇｕｎａｙｄｉｎ，  Ｌ．  Ａ．，  Ｈｙｕｎ，  Ｍ．，  Ｆｅｎｎｏ，  Ｌ．  Ｅ．，  Ｇｒａｄｉｎａｒｕ，  Ｖ．，  Ｙｉｚｈａｒ，  Ｏ．  ａｎｄ  Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ，  Ｋ．  （２０１２）  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｆｏｒ  ａｐｐｌｙｉｎｇ  ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｏｏｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｏｐｓｉｎｓ．  Ｎａｔ．  ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，  １５９−１７２；及びＺｈａｎｇ，  Ｆ．，  Ｖｉｅｒｏｃｋ，  Ｊ．，  Ｙｉｚｈａｒ，  Ｏ．，  Ｆｅｎｎｏ，  Ｌ．  Ｅ．，  Ｔｓｕｎｏｄａ，  Ｓ．，  Ｋｉａｎｉａｎｍｏ−  ｍｅｎｉ，  Ａ．，  Ｐｒｉｇｇｅ，  Ｍ．，  Ｂｅｒｎｄｔ，  Ａ．，  Ｃｕｓｈｍａｎ，  Ｊ．，  Ｐｏｌｌｅ，  Ｊ．，  Ｍａｇｎｕｓｏｎ，  Ｊ．，  Ｈｅｇｅ−  ｍａｎｎ，  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ，  Ｋ．  （２０１１）  Ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｏｐｓｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｏｏｌｓ．  Ｃｅｌｌ  １４７，  １４４６−１４５７）を参照されたい。
【０１４２】
光遺伝学的技法は、したがって本開示の方法及び組成物は、複雑な神経回路の機能及び正常な脳内及び様々な神経条件における情報処理を特徴付け、大脳皮質の機能を測定し、学習と記憶のプロセスを特徴付け操作し、シナプス伝達と可塑性のプロセスを特徴付け操作し、遺伝子発現の光制御的な誘導を提供し、細胞の運動などの活動の光制御を提供するのに使用することができる。
【０１４３】
本開示の方法及び組成物の臨床応用としては（限定ではないが）、次のような治療に関する光遺伝学アプローチが挙げられる：加齢による黄斑退化、糖尿病性網膜症、及び網膜色素変性症、ならびに光受容体細胞が失われるその他の状態の視覚障害の遺伝子治療として網膜の受容体後の神経細胞にチャネルロドプシンを導入することによる視力回復；電気的ペースメーカー装置ではなく、房室束（ヒス束）の興奮性心筋細胞に組み込まれたチャネルロドプシンを用いて心拍リズムを制御する、心機能制御；パーキンソン病患者のドーパミン関連運動機能障害の回復；鬱病の寛解；脊髄損傷後の呼吸の改善；幹細胞分化の非侵襲的制御、及び移植細胞の組織及びネットワーク機能に対する具体的な貢献の評価を可能にすること。電気的活性のあるどのような細胞群でも、たとえば限定ではないが、上述したような細胞や心筋細胞などは、ＡＣＲ抑制の対象とすることができる。そのようなＡＣＲは、心筋細胞の活動電位の高効率での光抑制にも有用であり得るので、限定ではないが頻脈などの心機能不全の治療も可能になる。いくつかの実施形態では、本明細書で説明する組成物及び方法は、現行の心臓抗不整脈治療の電気生理学的な負の効果なしに心臓の細胞や組織を容易に光刺激すること、及び脳や心臓の異常興奮部位に特定した刺激またはサイレンシングによって症状を緩和することに使用することができる。いくつかの実施形態では、そのような光遺伝学的技法は、現在埋め込みデバイス治療を受けている人も含めた患者の不規則な心拍を鎮め、回復させ、またはリセットするのに用いることができる。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明する組成物及び方法は、直接的ウイルス遺伝子送達（たとえば限定ではないがＡＡＶ）により、または培養液中で生成または形質転換させた、ＡＣＲを担持するドナー細胞（たとえば限定ではないが心筋細胞、プルキンエ細胞及びヒス束細胞など）を送達することにより、心臓の細胞または領域に影響を及ぼすのに用いることができる。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、神経細胞が媒介する障害に罹患している対象の細胞の膜過分極の方法であって、該方法には、該対象の細胞に、該細胞内で発現可能な陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードする配列番号１、配列番号３または配列番号１３からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを送達すること；及び該ベクターを該細胞内で発現させることが含まれ、ロドプシン発現の結果として膜過分極が生じる。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、神経細胞が媒介する障害に罹患している対象の神経細胞のサイレンシングの方法であって、該方法には、該対象の標的神経細胞に、該標的神経細胞内で発現可能な陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードする配列番号１、配列番号３または配列番号１３からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを送達すること；及び該ベクターを該標的神経細胞内で発現させることが含まれ、ロドプシン発現の結果として該標的神経細胞からのシグナルのサイレンシングが生じる。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、失明または盲目に罹患している対象の網膜の感光性を回復させる方法であって、該方法には、該対象の網膜に、網膜神経細胞内で発現可能な陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードする配列番号１、配列番号３または配列番号１３からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを送達すること；及び該ベクターを該網膜神経細胞内で発現させることが含まれ、ロドプシン発現により、該網膜神経細胞で高レベルの膜電位が得られる。
【０１４８】
したがって、いくつかの実施形態では、陰イオン伝導チャネルロドプシン、高感受性で高効率の膜過分極を提供する光開閉型陰イオンチャネルが、ＧｔＡＣＲ１（配列番号１）及びＧｔＡＣＲ２（配列番号３）として提供され、これらはＧｕｉｌｌａｒｄｉａ  ｔｈｅｔａの陰イオン伝導チャネルロドプシンに由来しており、光遺伝学的技法及び光遺伝学的治療アプローチを強化するのに用いることができる。
【０１４９】
陰イオン伝導チャネルロドプシン、限定ではないがロドプシンドメインなどのその機能的または活性部分、及び機能的等価物としては、限定ではないが、天然バージョンのＡＣＲ及びそのオーソログ及びホモログ、ならびに天然もしくは遺伝子操作（部位を指定した変異誘発、遺伝子シャッフル、または進化の誘導、たとえば米国特許第５，８３７，４５８号で説明しているもの）のＡＣＲ変異体バージョンが挙げられる。本開示の藻類ＡＣＲ由来のポリヌクレオチド配列の（遺伝コードの重複による）変性核酸バリアントの使用も含まれる。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、神経細胞障害を治療する方法が提供され、該方法には、（ａ）標的神経細胞に、該標的神経細胞内で発現可能な高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードする核酸発現ベクターを送達することであって、該ベクターは、高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードしプロモーター配列及び任意選択により転写制御配列に機能的に連結されたオープン読み枠を含んでおり；及び（ｂ）該ベクターを該標的神経細胞内で発現させることが含まれ、ロドプシン発現の結果として、該標的神経細胞を光曝露すると高感受性で高効率の膜過分極及び神経細胞サイレンシングが生じる。いくつかの実施形態では、ロドプシンドメインは、配列番号１または配列番号３によってコードされている。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、神経細胞障害を治療する方法が提供され、該方法には、（ａ）標的神経細胞に、該標的神経細胞内で発現可能な藻類由来の陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードする核酸発現ベクターを送達することであって、該ベクターは、陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードしプロモーター配列及び任意選択により転写制御配列に機能的に連結されたオープン読み枠を含んでおり；及び（ｂ）該ベクターを該標的神経細胞内で発現させることが含まれ、ロドプシン発現によって、該標的神経細胞は光曝露されるとサイレンシングされる。いくつかの実施形態では、ロドプシンドメインは、配列番号１、配列番号３または配列番号１３によってコードされている。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、網膜の光感受性を回復する方法が提供され、該方法には、（ａ）網膜神経細胞に、該網膜神経細胞内で発現可能な高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードする核酸発現ベクターを送達することであって、該ベクターは、高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードしプロモーター配列及び任意選択により転写制御配列に機能的に連結されたオープン読み枠を含んでおり；及び（ｂ）該ベクターを該網膜神経細胞内で発現させることが含まれ、ロドプシン発現によって、該網膜神経細胞が感光性になり、それによって該網膜またはその一部分の光感受性が回復する。いくつかの実施形態では、ロドプシンドメインは、配列番号１、配列番号３または配列番号１３によってコードされている。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、網膜の光感受性を回復する方法が提供され、該方法には、（ａ）網膜神経細胞に、該網膜神経細胞内で発現可能な高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードする核酸発現ベクターを送達することであって、該ベクターは、高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードしプロモーター配列及び任意選択により転写制御配列に機能的に連結されたオープン読み枠を含んでおり；及び（ｂ）該ベクターを該網膜神経細胞内で発現させることが含まれ、ロドプシン発現によって、該網膜神経細胞が感光性になり、それによって該網膜またはその一部分の光感受性が回復する。いくつかの実施形態では、ロドプシンドメインは、配列番号１、配列番号３または配列番号１３によってコードされている。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、レチナール光受容体細胞が変性しつつあるかまたは変性して死滅している失明または盲目に罹患している対象の網膜の感光性を回復する方法が提供され、該方法には、（ａ）該対象の網膜に、網膜神経細胞内で発現可能な高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードする核酸ベクターを送達することであって、該ベクターは、高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードしプロモーター配列及び任意選択により転写制御配列に機能的に連結されたオープン読み枠を含んでおり；及び（ｂ）該ベクターを該網膜神経細胞内で発現させることが含まれ、ロドプシン発現によって、該網膜神経細胞が感光性になり、それによって該網膜またはその一部分の感光性が回復する。いくつかの実施形態では、ロドプシンドメインは、配列番号１、配列番号３または配列番号１３によってコードされている。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明する組成物及び方法は、現行の心臓抗不整脈治療の電気生理学的な負の効果なしに心臓の細胞や組織を容易に光刺激すること、または、脳や心臓の異常興奮部位に特定した刺激またはサイレンシングによって症状を緩和することに使用することができる。いくつかの実施形態では、そのような光遺伝学的技法は、現在埋め込みデバイス治療を受けている人も含めた患者の不規則な心拍を鎮め、回復させ、またはリセットするのに用いることができる。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明する組成物及び方法は、直接的ウイルス遺伝子送達（たとえば限定ではないがＡＡＶ）により、または培養液中で生成または形質転換させた、ＡＣＲを担持するドナー細胞（たとえば限定ではないが心筋細胞、プルキンエ細胞及びヒス束細胞など）を送達することにより、心臓の細胞または領域に影響を及ぼすのに用いることができる。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、電気的活性のある細胞が関与する障害に罹患している対象の電気的活性のある細胞の障害を治療する方法が提供され、該方法には、（ａ）該対象の細胞に、該細胞内で発現可能な配列番号１、配列番号３または配列番号１３から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを送達すること；及び（ｂ）該ベクターを該電気的活性のある細胞内で発現させることが含まれ、ロドプシン発現によって、該電気的活性のある細胞からのシグナルがサイレンシングされる。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、電気的活性のある細胞が関与する障害に罹患している対象の電気的活性のある細胞の障害を治療する方法が提供され、該方法には、（ａ）該対象に遺伝子導入細胞を送達することであって、該遺伝子導入細胞はその中で発現可能な配列番号１、配列番号３または配列番号１３から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含んでおり；及び（ｂ）該ベクターを該遺伝子導入細胞内で発現させることが含まれ、発現によって、電気的活性のある細胞からのシグナルがサイレンシングされる。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、電気的活性のある細胞が媒介する障害に罹患している対象の電気的活性のある細胞のサイレンシングの方法が提供され、該方法には、（ａ）該対象の標的神経細胞に、該標的神経細胞内で発現可能な陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードする配列番号１、配列番号３または配列番号１３から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを送達すること；及び（ｂ）該ベクターを該標的の電気的活性のある細胞内で発現させることが含まれ、ロドプシン発現の結果として、電気的活性のある細胞からのシグナルのサイレンシングが生じる。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞が提供され、該宿主細胞は、単離された電気的活性のある細胞である。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、神経細胞障害を治療する方法であって、該方法には、（ａ）標的神経細胞に、該標的神経細胞内で発現可能な高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードする核酸発現ベクターを送達することであって、前記ベクターは、高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードしプロモーター配列及び任意選択により転写制御配列に機能的に連結されたオープン読み枠を含んでおり；及び（ｂ）該発現ベクターを該標的神経細胞内で発現させることが含まれ、陰イオン伝導チャネルロドプシン発現によって、該標的神経細胞は光曝露されるとサイレンシングされる。いくつかの実施形態では、上述の発現ベクターは、プロモーター配列とロドプシンドメイン配列とに機能的に連結された１つ以上の転写制御配列も含んでいる。いくつかの実施形態では、高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインは、配列番号１または３の全部または一部のアミノ酸配列、及び配列番号１または３のロドプシンドメイン配列、またはチャネルロドプシンのコードされたロドプシンドメインの生物学的活性を保持しているその生物学的活性断片を有しているか、または配列番号１または３のまたは該断片の生物学的活性のある保存アミノ酸置換バリアントである。いくつかの実施形態では、発現ベクターとしては、ＡＡＶウイルスベクターが含まれる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成プロモーターである。いくつかの実施形態では、構成プロモーターは、ＣＭＶプロモーターまたはハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性の及び／または細胞型特異的プロモーターである。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、網膜の光感受性を回復する方法であって、該方法には、（ａ）対象の網膜神経細胞に、該網膜神経細胞内で発現可能な高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードする核酸発現ベクターを送達することであって、該発現ベクターは、高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードしプロモーター配列及び任意選択により１つ以上の転写制御配列に機能的に連結されたオープン読み枠を含んでおり；及び（ｂ）該発現ベクターを該網膜神経細胞内で発現させることが含まれ、ロドプシン発現によって、該網膜神経細胞が感光性になり、それによって該網膜またはその一部分の光感受性が回復する。いくつかの実施形態では、高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインは、配列番号１または３の全部または一部のアミノ酸配列、及び配列番号１または３のロドプシンドメイン配列、または高効率で高感受性なチャネルロドプシンのコードされたロドプシンドメインの生物学的活性を保持しているその生物学的活性断片を有しているか、または配列番号１、３または１３の、及び配列番号１、３または１３のロドプシンドメイン配列のまたは該断片の生物学的活性のある保存アミノ酸置換バリアントである。いくつかの実施形態では、発現ベクターとしてはＡＡＶ（たとえば、ＡＡＶ２）ウイルスベクターが含まれる。いくつかの実施形態では、プロモーターは構成プロモーターである。いくつかの実施形態では、構成プロモーターは、ＣＭＶプロモーターまたはハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性の及び／または細胞型特異的プロモーターである。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、レチナール光受容体細胞が変性しつつあるかまたは変性して死滅している失明または盲目に罹患している対象の網膜の感光性を回復する方法であって、該方法には、（ａ）該対象の網膜に、網膜神経細胞内で発現可能な高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードする核酸ベクターを送達することであって、該発現ベクターは、高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインをコードしプロモーター配列及び任意選択により転写制御配列に機能的に連結されたオープン読み枠を含んでおり；及び（ｂ）該発現ベクターを該網膜神経細胞内で発現させることが含まれ、ロドプシン発現によって、該網膜神経細胞が感光性になり、それによって該網膜またはその一部分の感光性が回復する。いくつかの実施形態では、高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインは、配列番号１、３または１３の全部または一部のアミノ酸配列、及び配列番号１、３または１３のロドプシンドメイン配列、または高効率で高感受性の陰イオン伝導チャネルロドプシンのコードされたロドプシンドメインの生物学的活性を保持しているその生物学的活性断片を有しているか、あるいは配列番号１、３または１３の、及び配列番号１、３または１３のロドプシンドメイン配列のまたは該断片の生物学的活性のある保存アミノ酸置換バリアントである。いくつかの実施形態では、発現ベクターとしてはＡＡＶ（たとえば、ＡＡＶ２）ウイルスベクターが含まれる。いくつかの実施形態では、プロモーターは構成プロモーターである。いくつかの実施形態では、構成プロモーターは、ＣＭＶプロモーターまたはハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性の及び／または細胞型特異的プロモーターである。
【０１６３】
Ａ．治療剤としての組成物
チャネルロドプシン、または限定ではないがロドプシンドメインなどのその活性断片の治療剤としての使用。特定の実施形態では、本開示の組成物及び  は、光遺伝学的技法及びその用途の改善のために用いられ、また、たとえば神経細胞が媒介する障害、神経障害（たとえばパーキンソン病）の診断、予防、及び／または治療の補助、及び視覚障害の治療としても用いることができる。
【０１６４】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、たとえば神経細胞が媒介する障害、神経障害（たとえばパーキンソン病）の治療、管理、及び／または予防のため、及び視覚障害の治療として、１種以上の追加の化合物または剤（「追加の活性剤」）と併用で投与することができる。そのような治療剤は、たとえば、神経細胞が媒介する障害、神経障害（たとえばパーキンソン病）を治療または緩和するために、及び視覚障害の治療として、治療有効用量を患者に投与することができる。治療有効用量とは、疾患症状の発症の遅延、寛解、または妨害をもたらすのに十分な化合物の量を指す。
【０１６５】
そのような組成物の毒性及び治療効果は、細胞培養液や実験動物でたとえばＬＤ５０（集団の５０％致死量）及びＥＤ５０（集団の５０％治療有効用量）を決定する、標準的な製薬上の手順によって決定できる。毒性と治療効果の用量比は治療指標であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０と表現される。高い治療指標を示す組成物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物も特定の実施形態では使用されることがあるが、ふつうは、非感染細胞に与え得る損傷を最小限化することによって有害事象を軽減させるために、そのような組成物の標的を罹患組織部位に特化するような送達系を設計するよう注意するはずである。
【０１６６】
細胞培養アッセイや動物試験から得られるデータを用いて、ヒトに使用する用量範囲を計算することができる。そのような組成物の用量は、毒性がほとんどないかまったくないＥＤ５０を含めた循環濃度の範囲内であるのが好ましい。用量はこの範囲内で、用いられる剤形や利用される投与経路によって、変わることもある。あらゆる組成物について、治療有効用量は、まずは細胞培養アッセイから見積もることができる。用量は、細胞培養物で決定したＩＣ５０（すなわち、症状の半分最大抑制が得られる試験組成物の濃度）を含む循環血漿濃度が動物モデルで得られるように計算することができる。この情報を使って、ヒトで有用な用量をより正確に決定することができる。血漿レベルは、たとえば高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０１６７】
たとえば神経障害（たとえばパーキンソン病）の治療及び視覚障害の治療が意図される場合、適切な用量はまた、動物試験から、被験対象の体重１ｋｇ当たりの生理活性剤の最大許容用量すなわちＭＴＤを決定することもできる。一般には、試験される少なくとも１つの動物種は、哺乳類である。当業者は常にヒトなどの他の種に対する有効用量を推測し毒性を回避している。ヒトで有効性を試験する前に、第Ｉ相臨床試験により安全な用量を決定することができる。
【０１６８】
さらに、生理活性剤は、たとえばその生理活性剤の安定性を強化するような、またはそうではなくその薬理特性を強化するような（たとえば、インビボ半減期の延長、毒性低下など）、定評のあるあらゆる組成物または構造物と結合させてもよいし複合体を形成してもよい。
【０１６９】
そのような治療剤は、当業者には知られているいくつかの方法のどれでも投与することができ、該方法としては、限定ではないが、吸引、皮下注射（ｓｕｂ−ｑ）、静脈内注射（Ｉ．Ｖ．）、腹腔内注射（Ｉ．Ｐ．）、筋内注射（Ｉ．Ｍ．）、または髄腔内注射、あるいは局所塗布（経皮剤、軟膏、クリーム、膏薬、点眼薬など）が挙げられ、以下により詳しく説明する。
【０１７０】
Ｂ．医薬組成物
本明細書で説明する組成物にしたがい使用される医薬組成物は、１種以上の生理学的に許容される担体または賦形剤を使って一般的な方法で製剤することができる。
【０１７１】
医薬組成物は、たとえば組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、透明度、色、等張性、匂い、滅菌性、安定性、溶出もしくは放出速度、吸着性もしくは浸透性を改変、維持、または保存するための製剤材料を含むことができる。好適な製剤材料としては、限定ではないが：アミノ酸（たとえば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン及びリジン）；抗菌剤；抗酸化剤（たとえば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム及び亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝液（たとえば、ホウ酸、炭酸水素、トリスＨＣｌ、クエン酸、リン酸などの有機酸）；バルク剤（たとえば、マンニトールやグリシン）；キレート剤（たとえば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ））；錯化剤（たとえば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、及びヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン）；充填剤；モノサッカライド、ジサッカライドなどの糖類（たとえば、グルコース、マンノース及びデキストリン）；タンパク質（たとえば、血清アルブミン、ゼラチン及び免疫グロブリン）；着色剤、香料、及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（たとえば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（たとえばナトリウム）；保存料（たとえば、ベンザルコニウム塩素イオン、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸及び過酸化水素）；溶媒（たとえば、グリセリン、プロピレングリコール及びポリエチレングリコール）；糖アルコール（たとえば、マンニトールやソルビトール）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（たとえば、プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート（たとえば、ポリソルベート２０やポリソルベート８０）、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール及びｔｙｌｏｘａｐａｌ）；安定化剤（たとえば、スクロースやソルビトール）；浸透圧改良剤（たとえば、アルカリ金属ハロゲン化物（たとえば、ナトリウム塩素イオンまたはカリウム塩素イオン）、マンニトール、及びソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤；及び製薬上アジュバント（“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，  １８ｔｈ  Ｅｄ．  （Ｇｅｎｎａｒｏ，  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，  １９９０））が挙げられる。
【０１７２】
さらに、本明細書で説明する治療ペプチドを半減期延長ビヒクルに結合させることができる。特定の例示的半減期延長ビヒクルは当業界では既知であり、限定ではないが、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール、及びデキストランが挙げられる（たとえば、ＰＣＴ国際出願ＷＯ９９／２５０４４を参照のこと）。
【０１７３】
これらの剤は、注射による、たとえばボーラス注射や持続点滴による非経口投与用に製剤することができる。注射用製剤は、たとえば、保存料と一緒に、アンプルや反復用量容器内で単位剤形とすることができる。組成物は、水系または油系のビヒクル中の懸濁剤、溶液または乳液の形態であってもよく、懸濁剤、安定剤及び／または分散剤などの配合剤を含んでいることもある。あるいは、活性成分は、好適なビヒクル、たとえば、滅菌されたパイロジェン除去済みの水で使用前に構成される粉末形態とすることもできる。
【０１７４】
この剤は、たとえば一般的な坐薬基剤であるココアバターやその他グリセリドなどを含む坐薬や停留浣腸剤などの直腸投与用の組成物として製剤することもできる。
【０１７５】
既に説明した各種製剤に加えて、剤は、デポー調製物として製剤することもできる。このような長時間作用する製剤は、埋め込み（たとえば皮下や筋内）または筋内注射によって投与されることがある。たとえば、剤は、（たとえば許容される油中の乳剤として）好適なポリマー材料もしくは疎水性材料といっしょに、またはイオン交換樹脂といっしょに、あるいはやや難溶性の誘導体として、たとえばやや難溶性の塩として、製剤することができる。組成物は、所望により、活性成分を含有する１つ以上の単位剤形を収容することができる包装体またはディスペンサー装置に入っていてもよい。包装体には、たとえば、金属フォイルまたはプラスチックフォイル、たとえばブリスター・パックなどが含まれることがある。包装体またはディスペンサー装置には、投与時の注意事項が添付されることがある。
【０１７６】
活性組成物は、当業者には周知の放出制御手段または送達デバイスによって投与することができる。その例としては、限定ではないが、米国特許第３，８４５，７７０号、同第３，９１６，８９９号、同第３，５３６，８０９号、同第３，５９８，１２３号、同第４，００８，７１９号、同第５，６７４，５３３号、同第５，０５９，５９５号、同第５，５９１，７６７号、同第５，１２０，５４８号、同第５，０７３，５４３号、同第５，６３９，４７６号、同第５，３５４，５５６号、及び同第５，７３３，５６６号で説明されているものが挙げられる。そのような剤形は、あらゆる比率の所望の放出プロファイルを提供するために、たとえば、ヒドロプロピルメチルセルロース、その他のポリマーマトリックス、ジェル、浸透膜、浸透圧系、多層コーティング、マイクロ粒子、リポソーム、マイクロスフィア、またはそれらの組合せを用いて１種以上の活性成分を徐放するかまたは放出制御することができる。例示的な徐放性マトリックスとしては、限定ではないが、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ乳酸（たとえば米国特許第３，７７３，９１９号及び欧州特許出願ＥＰ０５８，４８１号を参照のこと）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（たとえばＳｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６，  １９８３）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）（たとえばＬａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．  １５：１６７−２７７，  １９８１，及びＬａｎｇｅｒ，  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ  １２：９８−１０５，  １９８２を参照のこと）、エチレン酢酸ビニル（前掲のＬａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、及びポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシブチル酸（欧州特許出願ＥＰ１３３，９８８号）が挙げられる。徐放性組成物としては、当業界で知られているいくつかの方法のいずれかで調製することができるリポソーム（たとえば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：３６８８−３６９２，  １９８５及び欧州特許出願ＥＰ０３６，６７６号、ＥＰ０８８，０４６号、及びＥＰ１４３，９４９号）が挙げられる。本開示の組成物に使用される、本明細書で説明するものも含めて当業者には既知の好適な放出制御製剤は、容易に選択することができる。特定の実施形態には、限定ではないが放出制御用のタブレット、カプセル、ジェルキャップ、及びカプレットなどの経口投与に適した単回単位剤形が含まれる。
【０１７７】
すべての放出制御製剤に共通する目的は、非放出制御製剤で得られる治療効果よりも高い治療効果を得ることである。理想としては、最適な設計の放出制御調製物を医療に使用する際の特徴は、最小限の薬物を用いて最小限の時間で病状を治療または制御することである。放出制御製剤の利点としては、薬物の活性が続くこと、投与回数が少ないこと、及び患者コンプライアンスが高いことが挙げられる。さらに、放出制御製剤は、作用が開始する時間または薬物の血中レベルなどのその他の特徴を左右するために用いられることもあり、したがって副作用（たとえば有害事象）の発生を左右することができる。
【０１７８】
ほとんどの放出制御製剤は、所望の治療効果が直ちに生じる量の活性成分を最初に放出し、その後は長期間にわたりこの治療効果レベルまたは予防効果レベルが維持できるように、継続的に徐々にその他の量の活性成分を放出するように設計されている。この活性成分の比較的一定したレベルを体内で維持するためには、代謝されて体外に排出される活性成分量を補う速度で薬物が剤形から放出されなくてはならない。活性成分の放出制御は、限定ではないがｐＨ、温度、酵素、水またはその他の生理的な条件もしくは組成などの様々な条件によって刺激することができる。
【０１７９】
場合によっては、本開示の方法及び組成物の活性成分は、一度に、または同じ投与ルートで患者に投与しないことが好ましい。したがって、いくつかの実施形態では、医療関係者が使用する場合に患者への適量の活性成分の投与を簡素化するキットが提供される。
【０１８０】
典型的なキットには、本開示の治療剤の１種以上の単回単位剤形が、単剤で、または本開示の組成物との併用が可能な別剤の単回単位剤形との組合せで、含まれる。本開示のキットはさらに、活性成分の投与に使用されるデバイスを含むことができる。そのようなデバイスの例としては、限定ではないが、シリンジ、点滴バッグ、パッチ、及び吸引器が挙げられる。
【０１８１】
本開示のキットはさらに、１種以上の活性成分の投与に用いることができる製薬上許容されるビヒクルを含むことができる。たとえば、活性成分が、非経口投与用に再構成する必要のある固体として提供される場合、キットは、好適なビヒクルの密封容器を含むことができ、その中に活性成分を溶解させて、非経口投与に適した、微粒子を含まない滅菌溶液を形成することができる。製薬上許容されるビヒクルの例としては、限定ではないが、注射ＵＳＰ用の水；水系ビヒクル、たとえば限定ではないがナトリウム塩素イオン注射、リンゲル注射、デキストロース注射、デキストロースとナトリウム塩素イオン注射、及び乳酸リンゲル注射；水混和性ビヒクル、たとえば限定ではないが、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、及びポリプロピレングリコール；並びに非水系ビヒクル、たとえば限定ではないがコーン油、綿実油、落花生油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、及び安息香酸ベンジルが挙げられる。しかし、特定の実施形態では、本開示の製剤は、アルコール類、またはその他の共溶媒、油、タンパク質を一切含まない。
【０１８２】
Ｃ．遺伝子導入動物
本開示は、藻類由来の陰イオン伝導チャネルロドプシン導入遺伝子を全細胞中に担持しているヒト遺伝子導入動物と非ヒト遺伝子導入動物、ならびに藻類由来の陰イオン伝導チャネルロドプシン導入遺伝子を全部ではなく一部の細胞中、たとえば特定の電気的活性のある細胞中に担持している非ヒト遺伝子導入動物を作製し使用する方法及び組成物を提供する。ヒト及びあらゆる種の非ヒト哺乳類、たとえば限定ではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ミニブタ、ヤギ、及び非ヒト霊長類、たとえば、ヒヒ、サル、及びチンパンジーが、藻類由来の陰イオン伝導チャネルロドプシンポリヌクレオチドを担持する（及び／または、藻類由来のポリペプチドを発現させる）遺伝子導入動物の作製に用いることができ、単一の導入遺伝子として、またはたとえばヘッドトゥーヘッドまたはヘッドトゥーテールに並べてコンカテマーとして、組み込むことができる。藻類由来の陰イオン伝導チャネルロドプシン導入遺伝子はまた、特定の細胞型に選択的に導入し、活性化させることもできる（たとえばＬａｋｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：６２３２−６２３６，  １９９２を参照されたい）。そのような細胞型に特異的な活性化に必要な制御配列は、対象とする細胞型によって決まり、当業者にとっては明白である。
【０１８３】
藻類由来陰イオン伝導チャネルロドプシンまたはその断片の導入遺伝子を、哺乳類陰イオン伝導チャネルロドプシン遺伝子の内在コピーの染色体部位に組み込むことが望ましい場合は、標的遺伝子組換えが一般的に好ましい。簡単に説明すると、そのような技法を用いる場合、内在性陰イオン伝導チャネルロドプシン遺伝子に相同ないくつかのヌクレオチド配列を含むベクターが、それらのヌクレオチド配列を染色体配列との相同組換えによって内在性チャネルロドプシン遺伝子に組み込み、機能を欠損させるように、設計される（すなわち「ノックアウト」動物）。こうすれば、非機能的配列を内在性チャネルロドプシン遺伝子に挿入することによって、内在性チャネルロドプシン遺伝子の発現を排除することもできる。導入遺伝子は、特定の細胞型に選択的に導入することもできるので、その細胞型でだけ内在性チャネルロドプシン遺伝子を不活化することができる（たとえばＧｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：１０３−１０６，  １９９４）。そのような細胞型に特異的な不活化に必要な制御配列は、対象とする細胞型によって決まり、当業者にとっては明白である。
【０１８４】
当業界で知られているあらゆる技法を用いて、チャネルロドプシンまたはその断片の導入遺伝子を動物に導入して遺伝子導入動物の樹立系統を作ることができる。そのような技法としては、限定ではないが、前核マイクロインジェクション（米国特許第４，８７３，１９１号）；レトロウイルスによる生殖系細胞への遺伝子導入（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：６１４８−６１５２，  １９８５）；胚性幹細胞の標的遺伝子組換え（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ５６：３１３−３２１，  １９８９）；胚の電気穿孔（Ｌｏ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３：１８０３−１８１４，  １９８３）；精子による遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ５７：７１７−７２３，  １９８９）；及び米国特許第５，４６４，７６４号で説明されるような陽性陰性の選択が挙げられる。そのような技法の概要としては、たとえばＧｏｒｄｏｎ，  Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃｙｔｏｌ．  １１５：１７１−２２９，  １９８９を参照されたい。
【０１８５】
遺伝子導入動物を作製したら、組換えチャネルロドプシン遺伝子またはその断片の発現について、標準的技法を活用して検定することができる。初回スクリーニングでは、サザンブロット解析またはＰＣＲ技法により動物組織を分析して、チャネルロドプシン導入遺伝子が組み込まれたかどうかを検定することができる。遺伝子導入動物の組織におけるチャネルロドプシン導入遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルは、限定ではないが、動物から採取された細胞型試料のノザンブロット解析、インサイツのハイブリダイゼーション解析、及びＲＴ−ＰＣＲなどの技法によって評価することもできる。藻類由来のチャネルロドプシンの発現組織の試料は、チャネルロドプシン導入遺伝子産物に対して選択性のある抗体を用いて、免疫細胞化学的に評価することもできる。
【０１８６】
Ｄ．導入遺伝子による治療
特定の実施形態では、本開示の組成物及び  は、光遺伝学的技法及び用途を改善するために用いられ、また、神経障害、たとえば限定ではないがパーキンソン病ならびに視覚障害の診断、予防、及び／または治療の補助にも使用することができる。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、方法及び組成物が、藻類由来の複数のチャネルロドプシンを特定し特徴決定するのに用いられる。チャネルロドプシンのロドプシンドメインのクローン化及び発現、及び哺乳類細胞での発現は、これらのチャネルロドプシンの改良された特徴を光遺伝学的用途ならびに治療剤に使用できることを示している。
【０１８８】
たとえば、本開示の方法及び組成物は、たとえば哺乳類のレチナール遺伝子治療に用いることができる（他もあるがとりわけ米国特許第５，８２７，７０２号、同第７８２４８６９号及び米国特許公開第２０１０００１５０９５号ならびにＷＩＰＯパンフレットＷＯ２０００／１５８２２及びＷＯ１９９８／４８０９７で説明されているもの）。外生核酸が細胞に吸収されて発現するような条件下で該細胞に該外生核酸を接触させて、遺伝子操作された視覚細胞を生産する。外生核酸は、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはプラスミドとして説明される。組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を使ったレチナールのレポーター遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子導入が健常な霊長類で実証されている（Ｂｅｎｎｅｔｔ，  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６，  ９９２０−２５）。光受容体の急速変性モデルにおけるＲＰ６５遺伝子変異を使用しての遺伝子治療、及び変異遺伝子を正常遺伝子と置換または交換する置換治療による光受容体の救済（たとえば米国特許公開第２００４／００２２７６６号を参照のこと）が、自然に生じた重篤なレチナール変性疾患のイヌモデル（ヒトＬＣＡと似ているＲＰＥ６５変異イヌ）の治療に使用されている。ウイルスを使った遺伝子治療方法で、罹患した網膜の生存している網膜神経細胞において感光性膜チャネルまたは分子を発現させることにより、本発明は、回復した視野の空間的時間的解像度が高い、失明または盲目の恒久的な治療を行うことができる。
【０１８９】
本開示の陰イオン伝導チャネルロドプシンの活性部分をコードする核酸配列としては、限定ではないが、配列番号１、３及び１３で特定されているロドプシンドメインまたは配列番号２のロドプシンドメイン配列をコードする核酸配列が挙げられる。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、真核生物の神経細胞などの細胞の標的ポリヌクレオチドを修飾する方法が提供される。いくつかの実施形態では、この方法には、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて、該標的ポリヌクレオチドを切断し、そうすることでこの標的ポリヌクレオチドを修飾することが含まれ、このＣＲＩＳＰＲ複合体は、該標的ポリヌクレオチドの標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体をなすＣＲＩＳＰＲ酵素を備えており、該ガイド配列は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合している。いくつかの実施形態では、該切断には、標的配列の位置での該ＣＲＩＳＰＲ酵素による１本または２本の鎖の切断が含まれる。いくつかの実施形態では、該切断の結果、標的遺伝子の転写が減少する。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、該切断された標的ポリヌクレオチドを外生テンプレートポリヌクレオチドとの相同組換えによって修復することを含み、該修復の結果として、チャネルロドプシンをコードする１つ以上のヌクレオチドが該標的ポリヌクレオチドに挿入される。
【０１９１】
ある例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系の、ＲＮＡにガイドされるＤＮＡ結合タンパク質である。ある例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。一態様においては、遺伝子操作されたＣａｓ９−ｇＲＮＡ系が提供され、これは所望により部位特異的な、ＲＮＡにガイドされるゲノム切断、及び本明細書で提供する外生チャネルロドプシンをコードする核酸の挿入によるゲノム修飾を可能にする。ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ上の標的部位または標的座位に対し相補的である。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡキメラであってもよい。Ｃａｓ９は、標的のゲノムＤＮＡに、またはその近くに結合する。１つ以上のガイドＲＮＡは、標的のゲノムＤＮＡに、またはその近くに結合する。Ｃａｓ９は標的のゲノムＤＮＡを切断し、このＤＮＡの切断部位に外生ドナーＤＮＡが挿入される。
【０１９２】
したがって、方法は、ガイドＲＮＡをＣａｓ９タンパク質及びチャネルロドプシンをコードする外生核酸といっしょに用いることによって、ＲＮＡをコードする核酸及び外生ドナー核酸の挿入、ＲＮＡの発現、ＤＮＡを切断するようなＲＮＡとＣａｓ９と該ＤＮＡの共存、及び外生ドナー核酸の挿入を繰り返すことによって、チャネルロドプシンをコードする外生核酸をＣａｓ９発現細胞内のＤＮＡに多重的に挿入することに関する。方法のステップは、あらゆる所望の数のＤＮＡ修飾を得るために、何度繰り返してもよい。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明するようなチャネルロドプシンを眼の神経細胞に導入し発現させると、たとえば、そのような変性をもつ対象のそのような網膜の光感受性、及び視覚応答の１つ以上の側面や機能的視覚の回復をもたらす。疾患のためこの能力がない対象の網膜の光感受性を回復させることにより、視覚に必要な最も基本的な光応答の機構が提供される。いくつかの実施形態では、陰イオン伝導チャネルロドプシンのＧｔＡＣＲ１及びＧｔＡＣＲ２などの機能的ドメインは、チャネルロドプシンをインビボで網膜内層神経細胞内で発現させることによって、杆体や錐体が変性している網膜の光感受性回復に用いることができる。いくつかの実施形態では、これらのチャネルロドプシンは、限定ではないが、網膜移植、皮質移植、外側膝状核移植、または視神経移植などの技法により導入することができる。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、陰イオン伝導チャネルロドプシンは、対象の網膜の杆体や錐体が死滅した後に残存している領域または部分の網膜神経細胞に、核酸だけをまたは発現ベクターに入れた核酸を導入することによって、挿入される。そのような発現ベクターは、遺伝子治療に用いられることがわかっているウイルス系、たとえば限定ではないが、ＡＡＶ（たとえばＡＡＶ２）、レトロウイルスなどに所望の核酸配列を導入することによって作製することができる。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、陰イオン伝導チャネルロドプシンを網膜介在神経細胞に挿入することができる。するとこれらの細胞は、マウスで電気生理学的に実証されているように、光感受性となることができ、視神経及び高次視覚路を介して、視覚認知が生じる視覚野にシグナルを送ることができるようになる。いくつかの実施形態では、他にも経路はあるが、硝子体内及び／または網膜下の注射によってチャネルロドプシン分子またはそれを発現するウイルスベクターを送達することができる。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、本開示の藻類由来の陰イオン伝導チャネルロドプシンの活性部分、たとえば限定ではないがこれらの陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメインは、網膜の光感受性回復に使用することができ、網膜神経細胞に該神経細胞内で発現可能な藻類由来の陰イオン伝導チャネルロドプシン（たとえば限定ではないがこれらの陰イオン伝導チャネルロドプシンのロドプシンドメイン）をコードする核酸発現ベクターを送達することによって（このベクターには、該ロドプシンをコードするオープン読み枠、該オープン読み枠に機能的に結合されているプロモーター配列、及び任意選択により転写制御配列が含まれている）、及び該ベクターを該神経細胞内で発現させることによって、光感受性を回復させることができる。
【０１９７】
特定の実施形態では、チャネルロドプシンは、藻類由来の陰イオン伝導チャネルロドプシン、たとえば限定ではないが陰イオン伝導チャネルロドプシンの機能的ドメインであってもよく、たとえば限定ではないが、ＧｔＡＣＲ１、ＧｔＡＣＲ２またはＧｔ１６１３０２またはその生物学的活性断片もしくは保存アミノ酸置換バリアント、たとえば限定ではないがロドプシンドメインであってもよい。ベクター系は、組換えＡＡＶ（たとえば、ＡＡＶ２）であってもよく、プロモーターは構成プロモーター、たとえば限定ではないが、ＣＭＶプロモーターまたはハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ−アクチンプロモーター（ＣＡＧ）であってもよい。
【実施例】
【０１９８】
ＩＶ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために、本明細書に含まれるものである。当業者であれば、以下の実施例における本開示の技法は、発明者が見出した、本発明の実施において良好に機能する技法を代表するものであり、したがって本発明の実施の好ましいモードを構成するとみなすことができる、ということを理解されよう。しかし、当業者であれば、本開示に鑑み、開示されている具体的な実施形態に多くの変更を加えることが可能であること、及び、それでも本発明の精神と範囲を逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを理解すべきである。
【０１９９】
実施例１  材料及び方法
分子生物学的方法：Ｇ．ｔｈｅｔａオプシンの７ＴＭドメインをコードする配列（ＪＧＩタンパク質モデル１１１５９３、１４６８２８、１６１３０２にそれぞれ対応する、２９５、２９１、２８８ａａ）をヒトコドンに使用できるように最適化し合成し（Ｇｅｎｅｗｉｚ社、米国ニュージャージー州サウスプレインフィールト）、ＥＹＦＰタグとインフレームで、クローン化して哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１とした（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国ニューヨーク州グランドアイランド）。機能的コンストラクト１１１５９３（ＧｔＡＣＲ１）及び１４６８２８（ＧｔＡＣＲ２）をコードする配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋ（受託番号はそれぞれＫＰ１７１７０８、ＫＰ１７１７０９）に寄託した。ａｒｃｈａｅｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−３（Ａｒｃｈ）をコードする遺伝子は、Ｅｄｗａｒｄ  Ｓ．  Ｂｏｙｄｅｎ博士（マサチューセッツ工科大学、米国マサチューセッツ州ボストン）のご厚意により提供された。変異は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ部位指定変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国カリフォルニア州サンタクララ）によって導入し、ＤＮＡシーケンシングにより確認した。
【０２００】
ＨＥＫ２９３記録方法：ＨＥＫ２９３（ヒト胎児由来腎臓）細胞に、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＡ形質移入試薬（Ｗａｃｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡ社、米国バージニア州リッチモンド）を用いて形質移入した。保存溶液としてオールトランスレチナール（Ｓｉｇｍａ社、米国ミズーリ州セントルイス）をエタノール中最終濃度５μＭで加えた。形質移入後４８〜７２時間で、Ａｘｏｐａｔｃｈ２００Ｂ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、米国カリフォルニア州ユニオンシティ）で測定した。シグナルはｐＣｌａｍｐ１０ソフトウェアを用いてＤｉｇｉｄａｔａ１４４０Ａでデジタル化した（いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）。ホウケイ酸ガラスで抵抗２〜５ＭΩのパッチピペットを作製した。溶液の組成物を表Ｓ１に示す。全実験で４Ｍの塩橋を用いた。液間電位差（ＬＪＰ）はＣｌａｍｐＥｘ内蔵ＬＪＰ計算機で計算した。Ｐｏｌｙｃｈｒｏｍｅ  ＩＶ光源（Ｔ．Ｉ．Ｌ．Ｌ．  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ社、独国Ｇｒａｆｅｌｆｉｎｇ）と機械的シャッター（Ｕｎｉｂｌｉｔｚ  Ｍｏｄｅｌ  ＬＳ６、Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社、米国ニューヨーク州ロチェスター；半開時間０．５ミリ秒）を組み合わせて、連続的な光パルスを供給した。光強度は、内蔵Ｐｏｌｙｃｈｒｏｍｅシステムまたは中性濃度フィルターによって減衰させた。４０ｘ対物レンズの焦平面の最大量子密度は８．５ｍＷ／ｍｍ２であった。
【０２０１】
陽イオン透過度を試験するための実験では、バス内で１５０ｍＭ  ＮＭＧ＋で測定した基準値を、１５０ｍＭ  Ｎａ＋（ｐＨ５．４）、１５０ｍＭ  Ｎａ＋（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  Ｋ＋（ｐＨ７．４）または７５ｍＭ  Ｃａ２＋（ｐＨ７．４）でそれぞれ測定した値から差し引いてＥｒｅｖシフトを計算した。バス内のＣｌ−濃度はすべての陽イオンで１５５．６ｍＭであった。陰イオンの透過度の試験では、Ｅｒｅｖシフトは、１５０ｍＭ  Ａｓｐ−で測定した基準値を、７５ｍＭ  ＳＯ４２−または１５０ｍＭのＦ−、Ｂｒ−、Ｉ−またはＮＯ３−でそれぞれ測定した値から差し引いて計算した。バス内のＮａ＋濃度はＦ−を除く全陰イオンで１５０ｍＭであった（表１）。
【表１】
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【０２０２】
神経細胞の記録：神経細胞で発現させるために、ＧｔＡＣＲ２−ＥＹＦＰコンストラクトを、Ｃａｒｌｏｓ  Ｌｏｉｓ博士（マサチューセッツ工科大学、米国マサチューセッツ州ボストン）から提供されたｐＦＵＧＷレンチウイルスベクターに導入した。このレンチウイルスは、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国ニューヨーク州グランドアイランド）を用いてＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国ニューヨーク州グランドアイランド）に、エンベローププラスミドｐＣＭＶ−ＶＳＶＧ、パッケージングプラスミドｐΔ８．９（いずれもＬｏｉｓ博士提供）及びｐＦＵＧＷ−ＧｔＡＣＲ２−ＥＹＦＰプラスミドの３種を形質移入して生産した。Ｅ１８  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの海馬をＢｒａｉｎＢｉｔｓ社（米国イリノイ州スプリングフィールド）のキットの一部として入手し、同社提供のプロトコルにより一次神経細胞培養液を調製した。細胞は、ポリリジンでコートしたカバーガラス上のＮｂＡｃｔｉｖ４培地で培養し、０．４μＭのオールトランスレチナール（培地中酢酸レチナールに追加しての最終濃度）を補充した。形質移入後１０〜１９日でパッチクランプ測定を行った。ＨＥＫ細胞について上述したのと同じ光励起源と測定設定を使った。スパイク形成は電流クランプモードで測定した。溶液の組成を表２に示す。
【表２】
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省略記号：ＨＥＰＥＳ  ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸；ＬＪＰ  液間電位差；ＮＭＧＮ−メチル−Ｄ−グルカミン。濃度単位はすべてｍＭ。
【０２０３】
実施例２  ロドプシンの特徴決定
確認されている緑藻植物由来のＣｈＲ約５０種のうち、既に試験されているものはすべて陽イオンチャネルのみである。しかし、これらの生物からクローン化されたいくつかのロドプシン配列は、チャネル活性を示さなかった。緑藻植物Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ  ｔｈｅｔａの核ゲノム配列は完全に決定されている（Ｂ．  Ａ．  Ｃｕｒｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４９２，  ５９  （２０１２））。モデルタンパク質をＢＬＡＳＴ検索すると、微生物（Ｉ型）ロドプシンと相同のヒット数は５３件あった。いずれもＣｈＲに対し高い相同性はなかったが、ある特定のクラスターのモデル（図１Ａ）は、緑藻植物ＣｈＲの特徴的な残基特徴をいくらか有していた（図１Ｂ）。
【０２０４】
Ｇ．ｔｈｅｔａタンパク質の７ＴＭドメインをコードする配列１１１５９３、１４６８２８及び１６１３０２は、ＨＥＫ２９３細胞で良好に発現した。最初の２つのコンストラクトは光電流を発生したが、３番目のコンストラクトは発生しなかった。以下に示すように、最初の２つは光開閉型陰イオンチャネルとして機能する。したがって、これらをそれぞれＧｔＡＣＲ１とＧｔＡＣＲ２（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ  ｔｈｅｔａ陰イオンチャネルロドプシン１と２）と命名した。
【０２０５】
標準的な溶液（ピペットは１２６ｍＭ  ＫＣｌ、バスは１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４；その他の成分は表１を参照のこと）を用いて、保持電位（Ｅｈ）−６０ｍＶでＧｔＡＣＲ１とＧｔＡＣＲ２が発生した電流は、内向き電流であった（図１Ｄの大きい図）。ＧｔＡＣＲ１とＧｔＡＣＲ２が発生する平均定常電流は、最も頻繁に用いられる光遺伝学的ツールＣｒＣｈＲ２が発生するものよりもそれぞれ８倍と６倍大きいが、不活化はかなり小さかった（図１の差込図）。ＧｔＡＣＲ１とＧｔＡＣＲ２の光電流の半減時間は、それぞれ２００ミリ秒と９０ミリ秒であった。電流上昇率の刺激強度への依存性は、振幅よりも高い飽和レベルが示されたため（図１Ｅ）、作用スペクトルの作製に用いた。ＧｔＡＣＲ１は、５１５ｎｍの光に最大感受性を示し、またスペクトルの短波長側スロープにショルダーを示した（図１Ｆ）。ＧｔＡＣＲ２の感受性は４７０ｎｍでピークになり、４４５ｎｍと４１５ｎｍでもバンドを有した（図１Ｆ）。
【０２０６】
標準の溶液を用いると（前の段落を参照のこと）ＧｔＡＣＲ１とＧｔＡＣＲ２の光電流の符号は膜脱分極後に逆転した（それぞれ図２Ａと図２Ｂ）。試験範囲の−６０〜６０ｍＶでは、電流と電圧の関係（ＩＥ曲線）は、緑藻植物ＣｈＲのものとは違って線形であった（図２Ｃ）（Ｄ．  Ｇｒａｄｍａｎｎ，  Ａ．  Ｂｅｒｎｄｔ，  Ｆ．  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ｐ．  Ｈｅｇｅｍａｎｎ，  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  １０１，  １０５７  （２０１１）で説明されている）。Ｇ．ｔｈｅｔａロドプシンのイオン透過性の特徴を決定するため、バス溶液の様々なイオン組成でＩＥ曲線を測定し、Ｅｒｅｖを決定した。緑藻植物ＣｈＲの最も透過性の高いイオンはプロトンであるが、ＧｔＡＣＲ１とＧｔＡＣＲ２が発生する電流のＥｒｅｖはｐＨに影響されなかった（図２Ｃ）。さらに、大きな非透過性有機陽イオンＮ−メチル−グルカミン（ＮＭＧ＋）をＮａ＋、Ｋ＋、またはＣａ２＋に換えてもＥｒｅｖシフトは観察されず（図２Ｄ）、ＧｔＡＣＲ１とＧｔＡＣＲ２は緑藻植物ＣｈＲが伝導する陽イオンを透過させないことが示唆された。
【０２０７】
バス内のＣｌ−の大半を大きな有機陰イオンであるアスパラギンに換えて、Ｃｌ−のＮｅｒｎｓｔ平衡電位（ＥＣｌ）８１ｍＶが生じると、Ｅｒｅｖは８０ｍＶにシフトした（図３Ａ〜図３Ｃ）が、これはＧｔＡＣＲ１及びＧｔＡＣＲ２が発生する電流が受動的Ｃｌ−輸送による場合のみに予測されたとおりである。次に、種々の陰イオンの透過性を、バス内で非透過性Ａｓｐ−に換えることにより比較した。両方のＧ．ｔｈｅｔａ  ＡＣＲで、Ｉ−、ＮＯ３−、またはＢｒ−は、Ｃｌ−よりもさらに大きなＥｒｅｖシフトをもたらし、Ｆ−は小さなシフトをもたらしたが、ＳＯ４２−は不透過であった。決定されたＡＣＲの透過度順ＮＯ３−＞Ｉ−＞Ｂｒ−＞Ｃｌ−＞Ｆ−＞ＳＯ４２−＝Ａｓｐ−は、動物細胞由来の多くの古典的Ｃｌ−チャネルの離液系列特徴と一致している。
【０２０８】
ＡＣＲの顕著な特徴は、バクテリオロドプシン（ＢＲ）のプロトンアクセプターＡｓｐ８５の位置の非カルボン酸残基であり、ほぼ全ての陽イオン選択性ＣｈＲがそこにＧｌｕ残基を有している（図１Ｃで赤色でハイライトしている螺旋体３のカラム５）。これをＧｌｕに換えると、発現を阻害することなく電流が１０００倍超低下した。これらの残存する微弱な電流の動態は大きく変化した。しかし最も重要なのは、バス内で塩素イオンをアスパラギン酸で置換した後Ｅｒｅｖが実質上変化しなかったことからも明らかなように（図６Ａ）、野生型とは大きく違って、この変異によりＡＣＲの陰イオン選択性が排除されたことである。したがって、プロトンアクセプター位置のカルボン酸残基の不存在は、ＡＣＲの陰イオン選択性の必須要件であると思われる。対応する位置の非電離残基も、ｈａｌｏａｒｃｈａｅａ及び海生フラボバクテリア由来の塩素イオンポンプ型ロドプシンの典型であり（図１Ｃ）、ｈａｌｏａｒｃｈａｅａｌハロロドプシンについて示されるように、この残基は非光分解状態で塩素イオン結合部位の一部を形成している。
【０２０９】
神経細胞などのほとんどの動物細胞の細胞質内Ｃｌ−濃度は低い。そのような条件下では（ピペットでは６ｍＭのＣｌ−、バスでは１５６ｍＭ）、Ｇ．ｔｈｅｔａ  ＡＣＲはＨＥＫ２９３細胞内でＥＣｌよりも高いＥｈで過分極電流を発生した（ＧｔＡＣＲ２は図４Ａ、ＧｔＡＣＲ１は図６Ｂ）。ＧｔＡＣＲ２光電流の振幅はＧｔＡＣＲ１電流と類似していたが、動態はより速く、このことは神経細胞活性の制御にとって有利である。光電流の振幅が大きいことは、ＡＣＲを光誘導過分極の光遺伝学的ツールとして極めて有望なものにしている。ＧｔＡＣＲ２は、光遺伝学的スパイク抑制でよく使用されるツール、プロトンポンプａｒｃｈａｅｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−３（Ａｒｃｈ）と同様の振幅の過分極光電流を１万倍低い光強度で発生した（図４Ｂ）。最も高効率のＣｌ−伝導ＣｈＲ変異体の過分極光電流の最大振幅は、＜０．６ｎＡであったが、動態は非常に緩慢だった。ＧｔＡＣＲ２では、そのような振幅の電流及び１００倍速い動態が、３０００倍低い光強度で観察された（図４Ｂ）。これらの特性は、Ｇ．ｔｈｅｔａ  ＡＣＲを、これまで利用されている高効率過分極光遺伝学的ツールよりもさらに高効率なものにしている。
【０２１０】
培養ラット錐体神経細胞で、−８８ｍＶよりも高いＥｈでＧｔＡＣＲ２が発生する過分極電流（図４Ｃ及び図４Ｄ）。この値は、まさに発明者らの条件下のＥＣｌに対応し（表２）、ＧｔＡＣＲ２が神経細胞において陰イオンのみを伝導することを裏付けている。この厳密な選択性は、これまでに報告されているＣｌ−伝導ＣｈＲ変異体（残存する陽イオンの透過性により、ＥｒｅｖはＥＣｌよりも２５〜３０ｍＶ正である）に対し２つめの有利な点である。ＧｔＡＣＲ２が膜を過分極する電位範囲は、したがって、神経細胞の典型的な静止電位の値も超えてかなり広くなる（図４Ｄ）。電流クランプ実験では、ＧｔＡＣＲ２は、３ｘ１０−３ｍＷ／ｍｍ２よりも高い光強度で電気的に誘発されたスパイクを、高い時間精度で、完全に抑制した（図４Ｅ及び図４Ｆ）。
【０２１１】
特定の機構に縛られることを望むものではないが、配列に大きな違いがあることからも予測できるように、ＡＣＲの陰イオン伝導機構は、Ｃｌ−伝導ＣｈＲ変異体のものとは異なるようである。ＡＣＲには、ＣｒＣｈＲ２で説明した、陽イオン選択性フィルターのＧｌｕ９０に対応するＧｌｕ残基が含まれる。この陽イオン伝導チャネルにＣｌ−透過性を与えるために、Ｇｌｕ９０は電荷のない残基（Ｓｅｒ（１５））または陽イオン残基（ＬｙｓまたはＡｒｇ（１４））で置換する必要がある。しかし、ＡＣＲにＧｌｕ９０ホモログが存在することは、陽イオンチャネルの場合と違って、陰イオンチャネルでは陰イオン透過性の妨げにならないことを示している。系統的及び機能的に、ＡＣＲは、陽イオンチャネルロドプシン（ＣＣＲ）とは基本的に異なる別個のロドプシンクラスで構成されている。天然の陰イオンチャネルとして、ＡＣＲは、極めて光感受性が高く、完全な陰イオン選択性があり、及び動態も高速になるような進化によって最適化された、過分極光遺伝学的ツールを提供する。
【０２１２】
実施例３  ＰｓｕＡＣＲ１は光開閉型陰イオンチャネル（ＡＣＲ）である
上述したＧ．ｔｈｅｔａ由来のＡＣＲと非常に類似しているさらなるＡＣＲが、海生地中植物Ｐｒｏｔｅｏｍｏｎａｓ  ｓｕｌｃａｔａで特定されている。この配列は、ＰｓＣｈＲ１として特定されており（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＦ９９２０７４を参照のこと。参照により本明細書に援用する）、培養神経細胞で発現すると、光電流を発生することが示されている（Ｋｌａｐｏｅｔｋｅ  ＮＣ，  Ｍｕｒａｔａ  Ｙ，  Ｋｉｍ  ＳＳ，  Ｐｕｌｖｅｒ  ＳＲ，  Ｂｉｒｄｓｅｙ−Ｂｅｎｓｏｎ  Ａ，  Ｃｈｏ  ＹＫ，  Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ＴＫ，  Ｃｈｕｏｎｇ  ＡＳ，  Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ＥＪ，  Ｔｉａｎ  Ｚ，  Ｗａｎｇ  Ｊ，  Ｘｉｅ  Ｙ，  Ｙａｎ  Ｚ，  Ｚｈａｎｇ  Ｙ，  Ｃｈｏｗ  ＢＹ，  Ｓｕｒｅｋ  Ｂ，  Ｍｅｌｋｏｎｉａｎ  Ｍ，  Ｊａｙａｒａｍａｎ  Ｖ，  Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅ−Ｐａｔｏｎ  Ｍ，  Ｗｏｎｇ  ＧＫ，  Ｂｏｙｄｅｎ  ＥＳ．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２０１４  Ｍａｒ；  １１（３）：３３８−４６））が、これらの光電流は詳しく特徴づけられておらず、測定も陽イオン伝導と陰イオン伝導の区別をしていなかった。以下の実施例では、対応するＰ．ｓｕｌｃａｔａタンパク質がＧ．ｔｈｅｔａ由来のＡＣＲと似たような光開閉型陰イオン伝導性を示すが、培養哺乳類細胞におけるその光電流の振幅はより小さい、ということを実証する。したがって、本明細書ではこれをＰｓｕＡＣＲ１（配列番号１３及び配列番号１４）と呼ぶ。略称Ｐｓはすでに緑藻Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ  ｓｕｂｃｏｒｄｉｆｏｒｍｉｓのＣＣＲで使用されているので、種名の３番目の文字を付加している。
【０２１３】
さらに、ＰｓｕＡＣＲ１の一次タンパク質配列は、上述のＧ．ｔｈｅｔａ由来のＡＣＲ（配列番号１及び３）と全体的に非常に似ており、その特性もいくつか示している。ＰｓｕＡＣＲ１は、ＣｒＣｈＲ２をＣｌ−伝導チャネルに変換するには中性または正電荷の残基で置換する必要があったＣｒＣｈＲ２のＧｌｕ−９０に対応するＧｌｕ残基（Ｇｌｕ−６４）を含んでいる。バクテリオロドプシン（Ａｓｐ−８５）におけるプロトンアクセプターの位置は、非カルボン酸残基で占められているが、ＰｓｕＡＣＲ１では、Ｇ．ｔｈｅｔａ由来のＡＣＲ（配列番号１及び３）のようにＳｅｒではなく、Ａｌａ（Ａｌａ−９３）である。最後に、Ｃ１Ｃ２キメラの結晶構造により内側陽イオンチャネルゲートを形成すると予測される３つの残基（Ｔｙｒ−１０９、Ｈｉｓ−１７３及びＨｉｓ−３０４）はどれも、ＰｓｕＡＣＲ１  ＡＣＲ（配列番号１３及び１４）でもＧ．ｔｈｅｔａ由来のＡＣＲ（配列番号１及び３）でも保存されない：Ｔｙｒ−１０９は３種のタンパク質全てＭｅｔで置換され；Ｈｉｓ−１７３（バクテリオロドプシンのＡｓｐ−９６に対応する位置）は、ＧｔＡＣＲ１ではＬｅｕで置換され、ＧｔＡＣＲ２（配列番号３）とＰｓｕＡＣＲ１（配列番号１３）ではＧｌｎ（ロドプシンナトリウムポンプと同様）で置換され；Ｈｉｓ−３０４はＧｔＡＣＲ１ではＡｌａで置換され、ＧｔＡＣＲ２ではＳｅｒで置換され、ＰｓｕＡＣＲ１（配列番号１３）ではＡｒｇで置換される。
【０２１４】
ＰｓｕＡＣＲ１（配列番号１３及び１４）の電気生理学的特性を決定するために、これをヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞で発現させて、電圧クランプ条件下で光電流値を測定した。その結果を図７に示す。発明者らの標準溶液（ピペットでは１２６ｍＭ  ＫＣｌ、バスでは１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて記録した、飽和強度の光パルスに応答する一連の電流トレースを図７Ａに示す。増幅器出力で−６０ｍＶでの平均ピーク振幅は７０７±１８４ｐＡ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝１８細胞）であり、Ｇ．ｔｈｅｔａ由来のＡＣＲ（配列番号１及び３）が同条件下で発生した電流よりもおよそ１０倍低かった。別の相違点は、ＰｓｕＡＣＲ１（配列番号１３及び１４）の電流は、連続照射の下、急速に不活化して平坦レベル５６±２％（平均±ＳＥＭ、ｎ＝１８細胞）を示したが、Ｇ．ｔｈｅｔａ由来のＡＣＲ（配列番号１及び３）の光電流の不活化は、より少なく緩慢だったことである。ＰｓｕＡＣＲ１（配列番号１３及び１４）の光電流の符号は、膜電位がより正の値にシフトすると逆転した。そのピーク振幅の保持電位（Ｅｈ）に対する依存性（ＩＥ曲線）は線形であり（図７Ｄの黒線）、Ｇ．ｔｈｅｔａ  ＡＣＲ（配列番号１及び３）も同様であるが、ＣＣＲに典型的な外向きの整流とは対照的である。標準溶液中で記録した光電流の反転電位（Ｅｒｅｖ）はゼロに近似していた（図７Ｄの黒色のマークと線）。
【０２１５】
バス内のＣｌ−の大半をアスパラギン酸に換えると、Ｅｒｅｖは７２±２ｍＶ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５細胞）にシフトした。これらの条件下で測定された典型的な一連の光電流を図７Ｂに示し、ＩＥ曲線を図７Ｄに示す（赤色のマークと線）。ピペットではＣｌ−をＡｓｐ−に換え、バス溶液は標準の場合、Ｅｒｅｖは−７０±２ｍＶにシフトした（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４細胞）。これらの条件の光電流とＩＥ曲線をそれぞれ図８Ｃと図８Ｄに示す（青色のマークと線）。これらの結果は、ＰｓｕＡＣＲ１光電流が受動的Ｃｌ−輸送によるものであることを示している。
【０２１６】
バス内のＣｌ−を他の陰イオンに換えてＩＥ曲線を測定したとき。各陰イオンで測定した、非透過性Ａｓｐ−からのＥｒｅｖ値のシフトを図８に示す。Ｇ．ｔｈｅｔａ  ＡＣＲについては、Ｉ−が最も透過性の高い、そしてＦ−が最も透過性の低いハロゲン化物だったが、二価の硫酸は実質的に不透過であった。同様に、バス内で非透過性Ｎ−メチル−グルカミン（ＮＭＧ＋）の代わりにＮａ＋、Ｋ＋またはＣａ２＋で測定したとき、あるいはバスｐＨが７．４から５．４に低下したときも、Ｅｒｅｖは実質的にシフトしなかった（図８）。これらの結果から、ＰｓｕＡＣＲ１が光開閉型陰イオンチャネルであることが裏付けられた。
【０２１７】
ｐＨ７．４で測定したＰｓｕＡＣＲ１光電流の作用スペクトルの最大は５２０ｎｍであり、５５０ｎｍにショルダーがあった（図９）。ｐＨ５．４まで低下させても、スペクトル最大値の位置はシフトしなかった。
【０２１８】
シングルターンオーバー条件下のＰｓｕＡＣＲ１光電流の動態の特徴を決定するために、レーザーフラッシュ（６ナノ秒）を使って光励起した（図１０ａ）。既に特徴決定したＧ．ｔｈｅｔａのＡＣＲと比べると、ＰｓｕＡＣＲ１のｐＨ７．４でのチャネル閉は約８倍速かった（図１０ｂ）。電流減衰に３つの指数関数を当てはめた。３つ目の最遅成分の振幅全体への貢献度は最小だった。ＰｓｕＡＣＲ１光電流の３種の減衰成分の振幅の電圧依存性（ＩＥ曲線）を図１０ｃに示す。全成分の反転電位は実験誤差内で同じであった。ＧｔＡＣＲ１で先に観察されたものとは異なり、全成分の時定数（τ）の電圧依存性は微弱であった（図１３）。ピーク電流の回復速度を二重フラッシュ実験で測定した。ＰｓｕＡＣＲ１は、ＧｔＡＣＲ２よりも約５倍速く、ＧｔＡＣＲ１よりも約８倍速かった（図１０ｄ）。
【０２１９】
チャネル電流の反転電位で、高速の負のシグナルが記録された。その時間経過は記録システムの時間分解能により制限された（図１１ａ）。この記録された、ＰｓｕＡＣＲ１からの高速電流の内向き方向は、レチナール異性化に関する初期の電荷移動に相当した。ＰｓｕＡＣＲ１のこの電流の振幅は試験範囲のバスのＶｈにもｐＨにも依存しておらず（図１１ｂ及び図１１ｃ）、この電流の起点がレチナール異性化であることがさらに示された。
＊＊＊
【０２２０】
本明細書で開示し権利を主張するすべての方法は、本開示に鑑み、必要以上に実験しなくても作製し実施することができる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態に照らして説明してきたが、当業者には、本発明の概念、精神及び範囲を逸脱することなく、本明細書で説明する方法、方法のステップまたはステップの順序に変更を加えることができることは明らかになろう。より具体的には、化学的及び生理学的に関連のある特定の剤を本明細書で説明する剤と入れ替えても同じかまたは類似の結果が得られることは、当業者には明らかになろう。当業者には明白なそのような類似の代用物や変更形態はすべて、付属の特許請求の範囲により定められる本発明の概念、精神及び範囲の内とみなす。
【０２２１】
参考文献
以下の参照文献は、本明細書に記載の内容の例示的手順やその他の詳細事項を補足する範囲において参照により本明細書に援用する。
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２２．Ｄ．  Ｇｒａｄｍａｎｎ，  Ａ．  Ｂｅｒｎｄｔ，  Ｆ．  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ｐ．  Ｈｅｇｅｍａｎｎ，  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  １０１，  １０５７  （２０１１）．
２３．Ｔ．  Ｊ．  Ｊｅｎｔｓｃｈ，  Ｖ．  Ｓｔｅｉｎ，  Ｆ．  Ｗｅｉｎｒｅｉｃｈ，  Ａ．  Ａ．  Ｚｄｅｂｉｋ，  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．  ．８２，  ５０３  （２００２）．
２４．Ｍ．  Ｋｏｌｂｅ，  Ｈ．  Ｂｅｓｉｒ，  Ｌ．  Ｏ．  Ｅｓｓｅｎ，  Ｄ．  Ｏｅｓｔｅｒｈｅｌｔ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８，  １３９０  （２０００）．
２５．Ｐ．  Ｂｒｅｇｅｓｔｏｖｓｋｉ，  Ｔ．  Ｗａｓｅｅｍ，  Ｍ．  Ｍｕｋｈｔａｒｏｖ，  Ｆｒｏｎｔ．  Ｍｏｌ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２，  １５  （２００９）．
２６．Ｓ．  Ｊ．  Ｈｕｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７，  ｅ４０９３７  （２０１２）．
２７．Ｋ．  Ｒｕｆｆｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ４１０，  ７３７  （２０１１）．
２８．Ｋ．  Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８７，  ６９０４  （２０１２）．
【図１Ａ】
2018509909.tif 000004
【図１Ｂ】
2018509909.tif 000005
【図１Ｃ】
2018509909.tif 000006
【図１Ｄ】
2018509909.tif 000007
【図１Ｅ】
2018509909.tif 000008
【図１Ｆ】
2018509909.tif 000009
【図２Ａ】
2018509909.tif 000010
【図２Ｂ】
2018509909.tif 000011
【図２Ｃ】
2018509909.tif 000012
【図２Ｄ】
2018509909.tif 000013
【図３Ａ】
2018509909.tif 000014
【図３Ｂ】
2018509909.tif 000015
【図３Ｃ】
2018509909.tif 000016
【図３Ｄ】
2018509909.tif 000017
【図４Ａ】
2018509909.tif 000018
【図４Ｂ】
2018509909.tif 000019
【図４Ｃ】
2018509909.tif 000020
【図４Ｄ】
2018509909.tif 000021
【図４Ｅ】
2018509909.tif 000022
【図４Ｆ】
2018509909.tif 000023
【図５−１】
2018509909.tif 000024
【図５−２】
2018509909.tif 000025
【図６Ａ】
2018509909.tif 000026
【図６Ｂ】
2018509909.tif 000027
【図７Ａ】
2018509909.tif 000028
【図７Ｂ】
2018509909.tif 000029
【図７Ｃ】
2018509909.tif 000030
【図７Ｄ】
2018509909.tif 000031
【図８】
2018509909.tif 000032
【図９】
2018509909.tif 000033
【図１０Ａ】
2018509909.tif 000034
【図１０Ｂ】
2018509909.tif 000035
【図１０Ｃ】
2018509909.tif 000036
【図１０Ｄ】
2018509909.tif 000037
【図１１Ａ】
2018509909.tif 000038
【図１１Ｂ】
2018509909.tif 000039
【図１１Ｃ】
2018509909.tif 000040
【図１２】
2018509909.tif 000041
【図１３】
2018509909.tif 000042
【配列表】
2018509909000001.app
【国際調査報告】
2018509909.tif 000043
2018509909.tif 000044
2018509909.tif 000045
2018509909.tif 000046