(57)【要約】  本発明は、ジユビキチン変異タンパク質に基づく新規のＨｅｒ２結合分子に関する。本発明は更に、薬物動態を調節する部分に、又は治療若しくは診断活性成分に任意に融合又はコンジュゲートされたＨｅｒ２結合タンパク質に関する。本発明は更に、これらのＨｅｒ２結合タンパク質の医学における使用、好ましくは、癌の診断又は治療における使用に関する。  【選択図】図１１
2018529310.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列を具えるＨｅｒ２結合タンパク質において、ジユビキチン（配列番号：４）のＲ４２、Ｉ４４、Ｈ６８、Ｖ７０、Ｒ７２、Ｌ７３、Ｒ７４、Ｋ８２、Ｌ８４、Ｑ１３８、Ｋ１３９、Ｅ１４０、Ｓ１４１、及びＴ１４２位から選択される１２、１３、又は１４のアミノ酸が置換され、前記Ｈｅｒ２結合タンパク質はジユビキチン（配列番号：４）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、前記Ｈｅｒ２結合タンパク質はＨｅｒ２に対して７００ｎＭ未満の結合親和性（ＫＤ）を有することを特徴とするＨｅｒ２結合タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のＨｅｒ２結合タンパク質において、ジユビキチン（配列番号：４）の１、２、３、４、５、又は６の更なる置換を具えることを特徴とするＨｅｒ２結合タンパク質。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＨｅｒ２結合タンパク質において、
４２位から選択されるアミノ酸は極性アミノ酸により置換され、
４４位から選択されるアミノ酸は疎水性又は極性アミノ酸により置換され、
６８位から選択されるアミノ酸は芳香族アミノ酸により置換され、
７０位から選択されるアミノ酸は芳香族アミノ酸により置換され、
７２位から選択されるアミノ酸は極性又は芳香族アミノ酸により置換され、
７３位から選択されるアミノ酸は塩基性又は酸性アミノ酸以外の任意のアミノ酸により置換され、
７４位から選択されるアミノ酸は芳香族、塩基性又は極性アミノ酸により置換され、
８２位から選択されるアミノ酸は塩基性又は酸性アミノ酸以外の任意のアミノ酸により置換され、
８４位から選択されるアミノ酸は塩基性又は酸性アミノ酸により置換され、
１３８位から選択されるアミノ酸は塩基性又は酸性又は極性アミノ酸により置換され、
１３９位から選択されるアミノ酸は酸性又は疎水性アミノ酸又はグリシンにより置換され、
１４０位から選択されるアミノ酸は芳香族アミノ酸により置換され、
１４１位から選択されるアミノ酸は疎水性又は極性又は塩基性アミノ酸により置換され、及び／又は
１４２位から選択されるアミノ酸は疎水性又は極性アミノ酸により置換される
ことを特徴とするＨｅｒ２結合タンパク質。
【請求項４】
請求項３に記載のＨｅｒ２結合タンパク質において、前記アミノ酸はＲ４２Ｔ、Ｒ４２Ｓ、Ｒ４２Ｌ、Ｉ４４Ａ、Ｉ４４Ｖ、Ｉ４４Ｓ、Ｉ４４Ｔ、Ｈ６８Ｗ、Ｈ６８Ｙ、Ｈ６８Ｆ、Ｖ７０Ｙ、Ｖ７０Ｗ、Ｒ７２Ｔ、Ｒ７２Ｆ、Ｒ７２Ｇ、Ｒ７２Ｙ、Ｌ７３Ｗ、Ｌ７３Ｓ、Ｌ７３Ｖ、Ｌ７３Ｉ、Ｒ７４Ｙ、Ｒ７４Ｓ、Ｒ７４Ｎ、Ｒ７４Ｋ、Ｋ８２Ｔ、Ｋ８２Ｌ、Ｋ８２Ｎ、Ｋ８２Ｉ、Ｋ８２Ｙ、Ｌ８４Ｈ、Ｌ８４Ｄ、Ｌ８４Ｅ、Ｌ８４Ｓ、Ｑ１３８Ｓ、Ｑ１３８Ｒ、Ｑ１３８Ｅ、Ｋ１３９Ｅ、Ｋ１３９Ｇ、Ｋ１３９Ｌ、Ｅ１４０Ｗ、Ｓ１４１Ａ、Ｓ１４１Ｒ、Ｔ１４２Ｉ、Ｔ１４２Ｌ、及び／又はＴ１４２Ｎから選択されることを特徴とするＨｅｒ２結合タンパク質。
【請求項５】
請求項４に記載のＨｅｒ２結合タンパク質において、前記アミノ酸はＱ１３８Ｓ、Ｋ１３９Ｅ、Ｅ１４０Ｗ、Ｓ１４１Ａ、及びＴ１４２Ｉ；又はＱ１３８Ｒ、Ｋ１３９Ｇ、Ｅ１４０Ｗ、及びＴ１４２Ｌ；又はＱ１３８Ｅ、Ｋ１３９Ｌ、Ｅ１４０Ｗ、Ｓ１４１Ｒ、及びＴ１４２Ｎから選択されることを特徴とするＨｅｒ２結合タンパク質。
【請求項６】
請求項４に記載のＨｅｒ２結合タンパク質において、前記アミノ酸はＲ４２Ｔ、Ｉ４４Ａ、Ｈ６８Ｗ、Ｖ７０Ｙ、Ｒ７２Ｔ、Ｌ７３Ｗ、Ｒ７４Ｙ、Ｋ８２Ｔ、及びＬ８４Ｈから選択されることを特徴とするＨｅｒ２結合タンパク質。
【請求項７】
請求項４に記載のＨｅｒ２結合タンパク質において、前記アミノ酸はＲ４２Ｓ、Ｉ４４Ｖ、Ｈ６８Ｙ、Ｖ７０Ｙ、Ｒ７２Ｆ、Ｌ７３Ｓ、Ｋ８２Ｌ、及びＬ８４Ｄから選択されることを特徴とするＨｅｒ２結合タンパク質。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載のＨｅｒ２結合タンパク質において、前記アミノ酸配列は配列番号：５−３８の前記アミノ酸配列のうち１つから選択されることを特徴とするＨｅｒ２結合タンパク質。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載のＨｅｒ２結合タンパク質において、前記Ｈｅｒ２結合タンパク質は前記モノクローナル抗体トラスツズマブと異なる又は非重複のＨｅｒ２エピトープに結合することを特徴とするＨｅｒ２結合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載のＨｅｒ２結合タンパク質が、好ましくは、（ｉ）ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン、アルブミン結合ペプチド、又は免疫グロブリン、又は免疫グロブリン断片、多糖から選択される薬物動態を調節する部分、及び（ｉｉ）任意に、モノクローナル抗体又はその断片、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒性化合物、酵素、又はそれらの誘導体、又は放射性核種から選択される治療活性成分、及び（ｉｉｉ）任意に、蛍光化合物、光増感剤、タグ、酵素、又は放射性核種から選択される診断成分、からなる群（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）の少なくとも１員から選択される、少なくとも１つの追加の分子を更に具えることを特徴とするＨｅｒ２結合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１０に記載のＨｅｒ２結合タンパク質において、ＥＧＦＲ特異性を有するモノクローナル抗体を具えることを特徴とする、Ｈｅｒ２結合タンパク質。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のＨｅｒ２結合タンパク質において、診断又は医学において使用するための、好ましくは、癌の診断又は治療において使用するためであることを特徴とする、Ｈｅｒ２結合タンパク質。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載のＨｅｒ２結合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸分子を具えるベクター。
【請求項１５】
請求項１から１２のいずれか一項に記載のＨｅｒ２結合タンパク質、請求項１３に記載の核酸、及び／又は請求項１４のベクターを具える宿主細胞又は非ヒト宿主。
【請求項１６】
請求項１から１２のいずれか一項に記載のＨｅｒ２結合タンパク質、請求項１３に記載の核酸、請求項１４に記載のベクター、及び／又は請求項１５に記載の宿主細胞を具える組成物。
【請求項１７】
請求項１から１２のいずれか一項に記載のＨｅｒ２結合タンパク質の製造方法において、前記Ｈｅｒ２結合タンパク質を得るために適切な条件下で請求項１５の宿主細胞を培養するステップ、及び、任意に、前記Ｈｅｒ２結合タンパク質を単離するステップを具えることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジユビキチン変異タンパク質に基づく新規のＨｅｒ２結合分子に関する。本発明は更に、薬物動態を調節する部分に、又は治療若しくは診断活性成分に任意に融合又はコンジュゲートされたＨｅｒ２結合タンパク質に関する。本発明は更に、これらのＨｅｒ２結合タンパク質の医学における使用、好ましくは、癌の診断又は治療における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
膜結合した受容体型チロシンキナーゼＨｅｒ２は、多くの乳癌だけでなく、特に癌の攻撃形態を伴う卵巣、胃、及び子宮癌の発症及び進行において重要な役割を果たす。この発癌遺伝子の過剰発現が、悪性腫瘍、主として上皮由来の悪性腫瘍において報告され、癌の再発及び予後不良に関連している。３つのドメインタンパク質（細胞外、膜貫通、細胞内のチロシンキナーゼドメイン）は、細胞増殖を媒介し、アポトーシスを阻害している。リガンドがＨｅｒ２の細胞外ドメインに結合すると、Ｈｅｒ２は受容体と二量体を形成し、それによりＨｅｒ２の細胞内ドメインが活性化され、増殖、分化、移動、又はアポトーシス等の細胞プロセスを媒介する。従って、Ｈｅｒ２の機能を調節することは、癌治療の開発、特に、Ｈｅｒ２の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体に基づくものにとって重要なアプローチである。トラスツズマブ又はペルツズマブ等の治療用の抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体は、癌、特に乳癌の治療に利用可能である。
【０００３】
［本発明の技術的課題］
しかし、モノクローナル抗体は、複雑な分子構造、大きいサイズ、困難な製造方法等、大きな欠点を有する。更に、現在入手可能なＨｅｒ２結合分子で疾患を治療することは、全ての患者にとって有効ではなく、深刻な副作用をもたらす場合がある。
【０００４】
特に効果的な腫瘍を標的とした治療及び診断において、改良した新規の薬剤で癌を効果的に治療することが強く医療で必要とされていることは言うまでもない。現在の治療及び診断に代わるものを見つける、つまりＨｅｒ２モノクローナル抗体を、非免疫グロブリンベースのＨｅｒ２結合薬剤等のより小さく且つより複雑でないＨｅｒ２特異的な分子により置換するという継続的な必要性が生じている。
【０００５】
抗体の欠点を解消するために、診断及び治療用途に適した新規のＨｅｒ２結合分子は、Ｈｅｒ２への親和性、Ｈｅｒ２への特異性、及び高い安定性等の特性を含むべきである。
【０００６】
従って、本発明の目的は、Ｈｅｒ２の過剰発現による癌の治療及び診断における新たな改良した方法において、新規のＨｅｒ２結合非免疫グロブリン分子を提供することである。特に、例えば簡易化した分子エンジニアリングを可能とするため、Ｈｅｒ２に対して高親和性及び特異性を有し、より複雑でない小さい構造と組み合わされた、新規の結合タンパク質を提供することが目的である。
【０００７】
非免疫グロブリン系結合薬剤等の小さいＨｅｒ２結合タンパク質により、特に、ユビキチン変異タンパク質に基づくＨｅｒ２結合分子（アフィリン（登録商標）分子としても知られる）により、解決法が本発明に提供される。
【０００８】
抗体と比較して、本発明のＨｅｒ２結合タンパク質の大きな利点は、（ｉ）小さくされたサイズ（例えば、最大で１５２のアミノ酸）、（ｉｉ）単純な分子構造（抗体の４つの鎖と比べて１つの鎖）、及び（ｉｉｉ）翻訳後の修飾は可能だが、完全な機能性のために必要ではない、ということに関して複雑性が軽減されたことである。本発明の結合タンパク質は、有利な物理化学的特性（安定性及び可溶性等）、高レベルの発現を有する分子フォーマットを提供し、容易な製造方法を可能とする。本発明のＨｅｒ２特異的アフィリン分子は、Ｈｅｒ２への高親和性により、Ｈｅｒ２への特異性により、及び高安定性により特徴付けられ、新規の治療及び診断の可能性を提供する。
【０００９】
上述の目的及び利点は、添付の独立項の主題により達成される。本発明は、ジユビキチンの少なくとも１２のアミノ酸の位置で置換を有するジユビキチン変異タンパク質に基づく特異的Ｈｅｒ２結合タンパク質に関する例を提供することで、上記で示した要件を満たす。本発明の好適な実施形態は、従属項、並びに以下の説明、実施例、及び図面に含まれる。上記の概要は、本発明により解決される全ての課題を必ずしも説明していない。
【発明の概要】
【００１０】
第１の態様において、本発明はＨｅｒ２結合タンパク質に関し、Ｈｅｒ２結合タンパク質は、アミノ酸配列を具え、ジユビキチン（配列番号：４）のＲ４２、Ｉ４４、Ｈ６８、Ｖ７０、Ｒ７２、Ｌ７３、Ｒ７４、Ｋ８２、Ｌ８４、Ｑ１３８、Ｋ１３９、Ｅ１４０、Ｓ１４１、及びＴ１４２位から選択される少なくとも１２のアミノ酸が置換され、Ｈｅｒ２結合タンパク質はジユビキチン（配列番号：４）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、Ｈｅｒ２結合タンパク質はＨｅｒ２に関して７００ｎＭ未満の結合親和性（ＫＤ）を有し、好ましくは、結合親和性はＥＬＩＳＡにより、又は表面プラズモン共鳴アッセイにより決定される。
【００１１】
本発明の別の態様は、Ｈｅｒ２結合タンパク質に関し、好ましくは、（ｉ）例えばポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ヒト血清アルブミン結合タンパク質、アルブミン結合ペプチド、又は免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、多糖から選択される薬物動態を調節する部分、及び（ｉｉ）任意に、例えばモノクローナル抗体又はその断片、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒性化合物、酵素、又はそれらの誘導体、又は放射性核種から選択される治療活性成分、及び（ｉｉｉ）任意に、例えば蛍光化合物、光増感剤、タグ、酵素、又は放射性核種から選択される診断成分、からなる群（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）の少なくとも１員から選択される、少なくとも１つの追加の分子を更に具える。
【００１２】
本発明は、更なる態様において、本発明の結合タンパク質を含む又はそれからなるＨｅｒ２結合タンパク質をコードする核酸又は複数の核酸、並びに当該核酸又は複数の核酸を含むベクター又は複数のベクター、及び当該ベクター又は複数のベクターを含む宿主細胞又は複数の宿主細胞を提供する。
【００１３】
別の態様は、診断又は医学における使用のための、特に、癌の診断又は治療における使用のための当該Ｈｅｒ２結合タンパク質、又は当該Ｈｅｒ２結合タンパク質をコードする核酸分子、又は当該Ｈｅｒ２結合タンパク質を具えるベクター、又は当該Ｈｅｒ２結合タンパク質を具える宿主細胞、又は当該Ｈｅｒ２結合タンパク質を具える非ヒト宿主に関する。
【００１４】
別の態様は、本発明のＨｅｒ２結合タンパク質、本発明の核酸分子、本発明のベクター、又は本発明の宿主細胞を具える、好ましくは、癌の診断又は治療における使用のための組成物に関する。
【００１５】
本発明の別の態様は、本発明の前述の態様のいずれかのＨｅｒ２結合タンパク質の製造方法に関し、適切な条件下で宿主細胞を培養するステップ、及び、任意に、その製造されたＨｅｒ２結合タンパク質を単離するステップを具える。
【００１６】
発明の概要は、必ずしも本発明の全ての特徴を説明するものではない。他の実施形態は、以下の詳細な説明から見て明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
図面は以下を示す。
【図１】図１は、Ｈｅｒ２結合アフィリン分子を示す。  図１Ａは、Ｈｅｒ２結合タンパク質を生成するために置換されるジユビキチン（配列番号：４）の位置を列挙する。一列目には、対応するアミノ酸の位置が列挙される。全てのＨｅｒ２結合タンパク質（例えば、配列番号：５−３８）は少なくとも、配列番号：４のＲ４２、Ｉ４４、Ｈ６８、Ｖ７０、Ｒ７２、Ｌ７３、Ｒ７４、Ｋ８２、Ｌ８４、Ｑ１３８、Ｋ１３９、Ｅ１４０、Ｓ１４１、及びＴ１４２位から選択される１２の位置において置換される。表中の「．」は、例えば、配列番号：６、３１、３３、３４、３５、３６、及び３７で例示のように野生型位置（変更なし）を指す。  図１Ｂは、図１Ａと同様のアミノ酸交換を示すが、交換は以下のコードにより翻訳され、アミノ酸を同様の生物物理特性でグループ化する。波線「〜」は「極性アミノ酸（Ｔ、Ｓ、Ｎ、又はＱ）」の記号であり、「Ｈ」は疎水性アミノ酸（例えば、Ａ、Ｍ、Ｌ、Ｖ、Ｉ）の記号であり、「Ｏ」は芳香族アミノ酸（例えば、Ｆ、Ｗ、Ｙ）の記号であり、「＋」は塩基性アミノ酸（例えば、Ｋ、Ｒ、Ｈ）の記号であり、「−」は酸性アミノ酸（例えば、Ｄ、Ｅ）の記号であり、「Ｇ」はグリシンに対応する。  図１Ｃは、更なる置換を列挙する。つまり、全てのＨｅｒ２結合タンパク質は、配列番号：４のアミノ酸Ｒ４２、Ｉ４４、Ｈ６８、Ｖ７０、Ｒ７２、Ｌ７３、Ｒ７４、Ｋ８２、Ｌ８４、Ｑ１３８、Ｋ１３９、Ｅ１４０、Ｓ１４１、及びＴ１４２位から選択される少なくとも１２の置換に加えて、０、１、２、３、４、５、又は６の更なる修飾を有する。  図１Ｄは、図１Ｃと同様のアミノ酸交換を示すが、交換は図１Ｂで説明した同様の生物物理特性を有するアミノ酸をグループ化するコードに従って翻訳される。
【図２】図２は、Ｈｅｒ２結合アフィリン分子（例えば、配列番号：５−３８）の生化学的キャラクタライゼーションを示す。ここで示すのは、ＳＰＲアッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅ；表の３列目）及び温度安定性（ＤＳＦ；表の４列目）から得られる結合合親和性（ＫＤ）である。
【図３】図３は、ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いたラベルフリーの相互作用アッセイを介したＨｅｒ２結合タンパク質の分析を示す。チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）上に固定されたＨｅｒ２への結合について、アフィリンタンパク質の異なる濃度（０、０．１３７、０．４１１５、１．２３４５、３．７０３７、１１．１１、及び３３．３３ｎＭ）が分析され、アフィリンタンパク質とＨｅｒ２との間の相互作用を分析した。図３Ａは、アフィリン‐１４２６２８のＨｅｒ２への結合キネティクスを示す。図３Ｂは、アフィリン‐１４４６３３のＨｅｒ２への結合キネティクスを示す。
【図４】図４は、細胞のＨｅｒ２への結合を確認するＨｅｒ２結合タンパク質の機能的キャラクタライゼーションを示す。図は、ＦＡＣＳ分析により決定した、外来性のＨｅｒ２を発現するＳｋＢｒ３細胞への結合を示す。Ｈｅｒ２結合タンパク質（「アフィリン」）は、ＳｋＢｒ３細胞（ダークグレーのバー）上に５０ｎＭで結合を示し、ＨＥＫ／２９３細胞上には活性を示さない（図４Ａ及び図４Ｂを参照）。Ｈｅｒ２を発現するＳｋＢｒ３への弱い結合又は無結合が、アフィリン‐１４２６５５（「１４２６５５」という）、アフィリン‐１４１９６５、アフィリン‐１４２４６５（「１４２４６５」という）、アフィリン‐１４２５０２（「１４２５０２」という）、及びジユビキチン（「ジ‐ユビ」という）について見られた。
【図５】図５は、フローサイトメトリー分析により決定される、外来性のＨｅｒ２を発現するＳｋＢｒ３細胞へのＨｅｒ２結合タンパク質の濃度依存性の機能的結合を示す。ここに示すのは、結合タンパク質の３３３ｎＭから５．６ｐＭの希釈系列である。アフィリン‐１４１９２６（図５Ａ）及びアフィリン‐１４１８９０（図５Ｂ）は、ＳｋＢｒ３細胞上の濃度依存性結合を示す。
【図６】図６は、フローサイトメトリー分析により決定される、外来性のＨｅｒ２を過剰発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞への結合を確認するＨｅｒ２結合タンパク質の機能的キャラクタライゼーションを示す。Ｈｅｒ２結合タンパク質は、５０ｎＭ、５ｎＭ、及び０．５ｎＭの濃度でＣＨＯ−Ｋ１−Ｈｅｒ２細胞上への結合を示す。図６Ａは、アフィリン‐１４２６２７、アフィリン‐１４２６２８、アフィリン‐１４２６５４、及びアフィリン‐１４１８８４のＨｅｒ２結合を示す；図６Ｂは、アフィリン‐１４４６３１、アフィリン‐１４４６３２、アフィリン‐１４４６３３、アフィリン‐１４４６３４、アフィリン‐１４４６３５、アフィリン‐１４４６３６、アフィリン‐１４４６３７の細胞のＨｅｒ２結合を示し、図６Ｃはアフィリン‐１４４５６７の細胞のＨｅｒ２結合、及び５００ｎＭでの１４２５０２の低レベルのみの結合を示す。従って、細胞のＨｅｒ２結合は、試験を行った最小の濃度でも１４２５０２を除く全ての結合分子について確認された。ジユビキチンはＣＨＯ−Ｋ１−Ｈｅｒ２−細胞上で結合を示さなかった（例えば、図６Ｂに示す）。
【図７】図７は、アフィリン‐１４２６２８の濃度依存性結合を示す。図は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ分析）（対照：空ベクター  ＣＨＯ−Ｋ１−ｐＥｎｔｒｙ細胞）により決定される、外来性のＨｅｒ２を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞へのアフィリン‐１４２６２８の結合を示す。５０ｎＭ、５ｎＭ、０．５ｎＭの異なるアフィリンタンパク質濃度でのヒストグラムが、ジユビキチン１３９０９０（配列番号：４）と比較して示される。アフィリン‐１４２６２８は、Ｈｅｒ２過剰発現細胞株上での濃度依存性シフトを引き起こす。
【図８】図８は、フローシトメトリーにより決定される、外来性のＨｅｒ２を発現するＳｋＢｒ３−細胞へのＨｅｒ２結合タンパク質の濃度依存性の機能的結合を示す。Ｈｅｒ２過剰発現ＳｋＢｒ３細胞との相互作用を分析するのに、アフィリン‐１４２６２８の１００ｎＭから０．０６ｐＭの希釈系列が用いられた。図８は、アフィリン‐１４２６２８の濃度依存性結合を示す。
【図９】図９は、免疫蛍光染色による、Ｈｅｒ２−過剰発現ＳｋＢｒ３−細胞上の異なるＨｅｒ２結合タンパク質の結合分析を示す。図９Ａは、アフィリン‐１４１８８４、アフィリン‐１４２６２８、アフィリン‐１４１９２６、アフィリン‐１４４６３７、アフィリン‐１４２４１８の５０ｎＭの濃度を示す。図９Ｂは、アフィリン‐１４４５６７、ジユビキチン（１３９０９０）、ＰＢＳ、及びトラスツズマブ（ハーセプチン）の５０ｎＭの濃度を示す。アフィリン‐１４１８８４、アフィリン‐１４２６２８、アフィリン‐１４１９２６、アフィリン‐１４４６３７、アフィリン‐１４２４１８は、Ｈｅｒ２−過剰発現細胞株上への強力な結合を示す一方、アフィリン‐１４４５６７及びジユビキチン（１３９０９０）はＳｋＢｒ３細胞上のＨｅｒ２に結合しない。
【図１０】図１０は、Ｈｅｒ２結合タンパク質がＳＫＯＶ−３異種移植片腫瘍組織に結合することを確認する。ここで示されるのは、ヒトの卵巣腺癌細胞から由来したＨｅｒ２−発現腫瘍組織上の５０ｎＭのアフィリン‐１４１８８４及び５０ｎＭのアフィリン‐１４２６２８の免疫組織学的な染色である。アフィリン‐１４１８８４及びアフィリン‐１４２６２８は、Ｈｅｒ２を発現する組織上への強い結合を示す。ジユビキチン（１３９０９０）はＳＫＯＶ−３組織スライドに結合しないことを示す。
【図１１】図１１は、Ｈｅｒ２−発現ＳＫＯＶ−３−腫瘍組織スライド、及びＨｅｒ２発現のない肺組織スライド上のＨｅｒ２結合タンパク質の免疫組織学的結合分析を示す。アフィリン‐１４１８８４及びアフィリン‐１４２６２８はＳＫＯＶ−３組織上の２０ｎＭの強力な結合を示す。肺組織への結合は見られなかった。更に、肝臓、心筋、及び卵巣から得られた組織へのアフィリン‐１４１８８４及びアフィリン‐１４２６２８の結合は見られなかった。
【図１２】図１２は、アフィリン‐１４２６２８及びアフィリン‐１４３６９２が異なるＨｅｒ２エピトープに結合することを示す（競合分析；結合分析ＳＰＲ）。これらのＨｅｒ２結合タンパク質は、Ｈｅｒ２結合に関して競合せず、従って、Ｈｅｒ２と異なる又は非重複のエピトープを用いている。
【図１３】図１３は、Ｈｅｒ２結合タンパク質アフィリン‐１４２６２８及びアフィリン‐１４３６９２がトラスツズマブ（ハーセプチン）以外の異なるＨｅｒ２エピトープに結合することを示す。
【図１４】図１４は、二重特異性融合タンパク質のＨｅｒ２及びＥＧＦＲへの同時結合を示す。Ｈｅｒ２結合タンパク質のＥＧＦＲ特異的モノクローナル抗体（セツキシマブ）への融合は、融合タンパク質配列番号：４４−４７の例に示すように、二重特異的標的化を可能とする。
【図１５】図１５は、Ｈｅｒ２過剰発現ＣＨＯ  Ｋ１細胞（図１５Ｂ）上、及びＥＧＦＲ過剰発現ＣＨＯ  Ｋ１細胞（図１５Ｂ）上でのセツキシマブ（ＣＬ−１４９２６；配列番号：４４）の軽鎖のＣ末端に融合する、Ｈｅｒ２特異的アフィリンを具える二重特異的融合タンパク質のフローサイトメトリック結合分析を示す。融合タンパク質は、両方の細胞外標的への結合を示す。図では、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を示し、示された濃度でのアフィリン‐抗体融合タンパク質のＥＧＦＲ及びＨｅｒ２発現細胞への結合を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明を以下でより詳細に説明する前に、本明細書に記載の特定の方法、プロトコル、及び試薬は変化することがあるため、本発明はこれらに限定されないことを理解すべきである。本明細書で用いられる用語は特定の実施例を説明する目的のためだけであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図していない、ということも理解すべきである。特に定義がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者に共通に理解されるものと同様の意味を有する。
【００１９】
好ましくは、本明細書で用いられる用語は、“Ａ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ  ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）”，Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｗ，Ｎａｇｅｌ，Ｂ．ａｎｄ  Ｋｏｅｌｂｌ，Ｈ．ｅｄｓ．（１９９５），Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，ＣＨ−４０１０  Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に記載の通り定義される。
【００２０】
以下に続く本明細書及び特許請求の範囲を通じて、文脈上必要とする場合を除き、“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”の語、及び“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”、“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”等の変形は、記載した整数若しくはステップ、又は整数若しくはステップの群を含むことを意味し、他の如何なる整数若しくはステップ、又は整数若しくはステップの群を排除することではないことが理解されるだろう。幾つかの文献（例えば、特許、特許出願、科学的刊行物、製造業者の仕様書、指示書、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎｓ、等）が本願の明細書を通して引用される。記載したものは、本発明が先行発明によりそのような開示に先行する権利がないことの自認として構成されるべきではない。本明細書で引用される文献の一部は、「参照により組み込まれる」ものとしてみなされる。そのように組み込まれた参照の定義又は教示と、本明細書に記載の定義又は教示との間に不一致が生じる場合、本明細書の記載を優先する。
【００２１】
本明細書で言及される全ての配列は、添付の配列表に開示され、その配列表は全ての内容及び開示とともに本明細書の一部である。
【００２２】
［本願で用いられる重要な用語の一般的定義］
「タンパク質」及び「ポリペプチド」の用語は、ペプチド結合により連結された任意の２以上のアミノ酸鎖を指し、産物の特定の長さを指さない。従って、「ペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は２以上のアミノ酸鎖を指すのに用いられる任意の他の用語は「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」の用語は、これらの用語のいずれかに代わり又は置き換えて用いることができる。「ポリペプチド」の用語は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、タンパク質分解切断、非天然アミノ酸による修飾、及び当技術分野で周知の同様の修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの翻訳後修飾の産物を指すことをも意図している。従って、２以上のタンパク質部分を具える結合タンパク質も、「タンパク質」又は「ポリペプチド」の用語の定義に該当する。
【００２３】
「ユビキチン」又は「非修飾ユビキチン」の用語は、配列番号：１によるユビキチン、及び配列番号：２（標的への結合に影響しない４５、７５、７６位での点変異）のような少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質、配列番号：４によるユビキチン、配列番号：４８によるジユビキチンのような少なくとも９５％同一性を有するタンパク質、以下の定義によるタンパク質を指す。哺乳類、例えば、ヒト、霊長類、ブタ、及びげっ歯類からのユビキチン分子が特に好ましい。一方、ユビキチンの源は関連しない、というのは当技術分野によると、全ての真核生物ユビキチンは高度に保存され、これまで研究された哺乳類のユビキチンはアミノ酸配列について全く同一のためである。更に、任意の他の真核生物源を使用することが出来る。例えば、酵母のユビキチンは、野生型ヒトユビキチン（配列番号：１）と３つのアミノ酸が異なるのみである。
【００２４】
「ジユビキチン」の用語は、ヘッドトゥーテールの方向に互いに連結される、２つの非修飾ユビキチン部分を具えるタンパク質を指す。配列番号：４（野生型ユビキチンの４５、７５、７６、１５１、１５２位の点変異；これらの点変異は標的への結合に影響しない；クローン１３９０９０）、及び配列番号：４８で例を挙げる。配列番号：４と配列番号：４８との間のアミノ酸配列同一性は９６．７％である。本発明に係るジユビキチンは、２つのユビキチン部分からなる１５２のアミノ酸の人工タンパクであり、それらの２つのユビキチン部分はペプチドリンカーなしに互いに直接連結される。本明細書で理解されるジユビキチンは、配列番号：４と少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質である。
【００２５】
「修飾ユビキチン」及び「ユビキチン変異タンパク質」及び「アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎ）」の用語は全て同義的に用いられ、置き換え可能である。本明細書で用いられる「修飾ユビキチン」又は「ユビキチン変異タンパク質」又は「アフィリン」は、ユビキチン変異タンパク質が、少なくとも１０倍低い又は非修飾ユビキチンに存在しない標的エピトープ又は抗原に特異的な結合親和性を有する限り、アミノ酸交換、挿入、欠失、又はそれらの組み合わせによる当該非修飾ユビキチンとは異なるユビキチンの誘導体を指す。このユビキチン変異タンパク質（アフィリン；修飾ユビキチン）の機能特性は、ｄｅ  ｎｏｖｏで作られた機能である。
【００２６】
「アフィリン（登録商標）」（Ｓｃｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＧｍｂＨの登録商標）の用語は、ユビキチン変異タンパク質に基づく非免疫グロブリン由来の結合タンパク質を指す。アフィリンタンパク質は、例えば配列番号：１に示すように、自然界に存在する又は自然界から単離された天然ユビキチンではない。本発明の範囲は、非修飾ユビキチンを除く。本発明に係るアフィリン分子はヘッドトゥーテール融合で互いに連結した２つの異なって修飾されたユビキチン部分、又は１つの修飾されたユビキチン部分を具える、本質的にそれからなる、若しくはそれからなるアフィリン分子のいずれかを具える、本質的にそれからなる、若しくはそれからなる。「ヘッドトゥーテール融合」は、例えば本明細書に参照として組み込まれるＥＰ２３７９５８１  Ｂ１に記載のように、（ヘッド）Ｎ‐Ｃ‐Ｎ‐Ｃ‐（テール）の方向に２つのタンパク質を連結することによりそれらのタンパク質を互いに融合するもの（タンデム分子）と理解すべきである。ヘッドの部分は第１部分として指定され、テールの部分は第２部分として指定される。このヘッドトゥーテール融合において、２つの部分はリンカーなしで直接連結されることがある（例えば、配列番号：５−３８）。代替的に、２つのタンパク質の融合は、本明細書に記載のようにリンカー、例えばポリペプチドリンカーを介して行うことができる。
【００２７】
「置換」は、「保存的」と「非保存的」置換とを含む。「保存的置換」は例えば、関与するアミノ酸残基の極性、電荷、サイズ、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性における類似性に基づいて行うことができる。アミノ酸は、以下の標準アミノ酸の群に分けることが可能である：（１）疎水性側鎖：Ａｌａ（Ａ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）；（図１の「Ｈ」の記号）；（２）酸性極性側鎖：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）（図１の「−」の記号）；（３）塩基性側鎖極性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）（図１の「＋」の記号）；（４）芳香族アミノ酸：Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｐｈｅ（Ｆ）（図１の「Ｏ」の記号）；（５）極性アミノ酸：Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）（図１の「波」の記号）；（６）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｐｒｏ（Ｐ）；及び（７）Ｃｙｓ（Ｃ）。本明細書で用いられるように、「保存的置換」は、上記で示した標準アミノ酸の群の同一群内に列挙された別のアミノ酸によるアミノ酸の交換として定義される。例えば、ＧｌｕによるＡｓｐの交換は、そのような修飾されたポリペプチドにおける１つの負電荷を保つ。更に、Ｇｌｙ及びＰｒｏは、α−へリックスを破壊できることに基づいて互いに置換可能である。上記の群内の一部の好ましい保存的置換は、以下の下位群内での交換である：（ｉ）Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅ；（ｉｉ）Ｓｅｒ及びＴｈｒ；（ｉｉｉ）Ａｓｎ及びＧｌｎ；（ｉｖ）Ｌｙｓ及びＡｒｇ；及び（ｖ）Ｔｙｒ及びＰｈｅ。既知の遺伝コード並びに、組み換え及び合成ＤＮＡ技術を考慮すると、熟練した科学者は保存的アミノ酸変異体をコードするＤＮＡを容易に構成することができる。本明細書で用いられるように、「非保存的置換」又は「非保存的アミノ酸交換」は、上記で示したアミノ酸の群（１）−（７）の異なる群に列挙した別のアミノ酸によるアミノ酸の交換と定義される。
【００２８】
「挿入」の用語は、ユビキチンのオリジナルのアミノ酸配列へのアミノ酸の追加を具え、ここでユビキチンは顕著な構造変化を伴わずに安定したままである。当然、ループ領域は規則的な二次構造要素を連結する。ヒト非修飾ユビキチン（配列番号：１）の構造は、ベータシート及びアルファへリックスのような二次構造要素を連結するアミノ酸領域８−１１、１７−２２、３５−４０、４５−４７、及び５０−６３で６つのループを明らかにする。本発明の一実施例において、挿入と置換との組み合わせを有するユビキチン変異タンパク質を具えるＨｅｒ２結合タンパク質が開示される。一実施例において、ユビキチン変異タンパク質は、好ましくはアミノ酸８−１１内の最もＮ末端側ループ内に２−１０のアミノ酸残基の挿入を有する。特に、挿入されるアミノ酸残基の数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０で、好ましくは２−１０のアミノ酸残基で、最も好ましくは６−９のアミノ酸残基である。
【００２９】
本発明により用いられる「抗体」の用語は、２つの重鎖と２つの軽鎖（免疫グロブリン又はＩｇＧ抗体）とを有するモノクローナル抗体を具える。更に、結合特異性を保つそれらの断片又は誘導体も、「抗体」の用語に含まれる。「抗体」の用語は、キメラ（ヒト定常ドメイン、非ヒト可変ドメイン）、単鎖及びヒト化（非ヒトＣＤＲを除くヒト抗体）抗体のような実施例も含む。２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる全長ＩｇＧ抗体が、本発明で最も好ましい。重鎖及び軽鎖は、非共有結合性の相互作用及びジスルフィド結合を介して連結される。
【００３０】
本明細書において、「標的抗原」、「標的」、「抗原」、及び「結合パートナー」の用語は、全て同義的に用いられ、交換可能である。好ましくは、標的は、本明細書で以下に定義する複数の標的のうちの１つである。「抗原」の用語は、本明細書で用いられるように広い意味で解釈されるべきで、本発明の結合タンパク質の結合部分により結合される任意の標的部分を含む。
【００３１】
本発明による「結合可能なタンパク質」又は「結合タンパク質」又は「結合Ｈｅｒ２」又は「結合親和性」は、定義された標的抗原への結合能を具えるタンパク質を指す。「Ｈｅｒ２結合タンパク質」の用語は、Ｈｅｒ２に対する高親和性結合能を有するタンパク質を指す。
【００３２】
「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を提供する抗原結合分子の部位、つまり１以上のアミノ酸残基を指す。天然の免疫グロブリン分子は、典型的には２つの抗原結合部位を有し、Ｆａｂ分子は、典型的には単一の抗原結合部位を有する。
【００３３】
「エピトープ」の用語は、本明細書で定義されるような抗原結合タンパク質により結合可能な任意の分子決定基を含み、抗原を標的とする抗原結合タンパク質により結合される標的抗原の領域であり、抗原がタンパク質の場合、抗原結合タンパク質と直接接触する特定のアミノ酸を含んでよい。立体配座エピトープでは、アミノ酸残基が一次配列では分離するが、ポリペプチドが天然三次元構造に折りたためられると、分子の表面では互いに近くに位置する。リニアエピトープは、タンパク質鎖の単一のリニアセグメントに隣接して位置する２以上のアミノ酸残基により特徴付けられる。その他の場合、エピトープはグリシコル化、リン酸化、硫酸化、アセチル化、脂肪酸、又はその他のような標的タンパク質の翻訳後修飾からの決定基を含むことができる。
【００３４】
「融合した」という語は、成分（例えば、アフィリン分子及びモノクローナル抗体、又はＦａｂフラグメント）がペプチド結合により直接又はペプチドリンカーを介して連結されることを意味する。
【００３５】
「融合タンパク質」の用語は、少なくとも第２のタンパク質に遺伝子的に結合する少なくとも第１のタンパク質を具えるタンパク質に関する。融合タンパク質は、もともと別個のタンパク質をコード化する２以上の遺伝子の結合を通じて作られる。従って、融合タンパク質は、単一のリニアポリペプチドとして発現する、異なる又は同一の結合タンパク質のマルチマーを具えることができる。それは、１、２、３、又はそれ以上の第１の及び／又は第２の結合タンパク質を具えることができる。本明細書で用いられる融合タンパク質は、例えばモノクローナル抗体又はその断片のような少なくとも第２の結合タンパク質と融合される少なくとも第１の結合タンパク質（例えば、アフィリン）を具える。そのような融合タンパク質は、例えば、多量体化部分、ポリペプチドタグ、ポリペプチドリンカー等を含むがそれらに限定されない、標的の結合と関わりのない追加のドメインを更に具えることができる。
【００３６】
本明細書で用いられる「コンジュゲート」という語は、第２のタンパク質又は非タンパク質性部分等の他の物質に化学的に付着した少なくとも第１のタンパク質を具える、又は本質的に第１のタンパク質からなるタンパク質に関する。コンジュゲーションは、有機合成により、又は酵素的な翻訳後修飾の自然過程を含む酵素の使用により行うことができる。タンパク質コンジュゲートの例は、糖タンパク質（炭水化物成分とコンジュゲートしたタンパク質）又はリポタンパク質（脂質成分とコンジュゲートしたタンパク質）である。分子は、例えば任意の形のリンカーを通して１又はいくつかの部位に付着可能である。化学結合は、置換（例えば、Ｎ−スクシンイミジル化学）、付加又は付加環化（例えば、マレイミド化学又はクリックケミストリー）又は酸化化学（例えば、ジスルフィド形成）を含む、当業者に周知の化学構造により行うことが可能である。本発明のタンパク質に化学的に付着した非タンパク質のポリマー分子のいくつかの例は、ヒドロキシエチルスターチ、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、樹枝状ポリマー、又はポリオキシアルキレン、その他である。
【００３７】
融合タンパク質又はタンパク質コンジュゲートは、１以上の反応基、又はリガンドのようなペプチド性又は非ペプチド性部分、又は放射性核種若しくはトキシンのような治療上或いは診断上関連する分子を更に具えてよい。また例えば、糖、オリゴ糖、多糖、脂肪酸等の小さい有機又は非アミノ酸ベースの化合物も具えてよい。対象のタンパク質をそのような非タンパク質成分に付着させる方法はこの技術分野で周知であり、従ってここでは更に詳細に説明しない。
【００３８】
「二重特異性結合分子」又は「多重特異的な結合分子」の用語は、抗原結合分子が２又は多数の異なるエピトープに特異的に結合可能であることを意味する。典型的に、二重特異性抗原結合分子は２つの抗原結合部位を具え、各々が異なるエピトープに対して特異的である。特定の実施例において、二重特異性抗原結合分子は、２つのエピトープ、特に２つの異なる細胞上で発現される２つのエピトープに同時に結合することができる。「二重特異性結合分子」又は「二重特異性結合タンパク質」の用語は、本発明の結合タンパク質が２つの異なるエピトープに結合可能であることを意味する。また、本発明の二重特異性結合分子は、２つの異なるエピトープに同時に結合可能である。このことは、二重特異性コンストラクトは、少なくとも１つのエピトープ「Ａ」及び少なくとも１つのエピトープ「Ｂ」に同時に結合可能であり、ここで「Ａ」及び「Ｂ」は同一ではない。２つのエピトープは、同一又は異なる標的抗原に位置してよく、それは、本発明の融合分子が１つの標的を、２つの異なるエピトープ又は２つの標的抗原でそれぞれの１つのエピトープと結合できることを意味する。同様に、「多重特異性結合分子」は同時に複数のエピトープに結合可能で、ここでエピトープは同一又は異なる抗原に位置してよい。
【００３９】
代替的に、当該結合タンパク質は、同一又は異なる標的分子上の異なる非重複エピトープに結合することができ、従って、例えばエピトープＡＢ、ＢＣ、ＡＤ、ＡＢＣ、又はＡＢＣＤにそれぞれ結合するαβ、βγ、αδ、αβγ、αβγδという、二重特異性、三重特異性、多重特性等に分類される。例えば、Ｈｅｒ２特異的アフィリン及び抗‐ＥＧＦＲ−モノクローナル抗体を有する融合タンパク質は、二重特異性である。
【００４０】
「多量体結合分子」の用語は、結合タンパク質α，β及び／又はγ等の２以上の部分（つまり、二価又は多価）、例えば、αα、βββ、ααβ、ααββ、αγγ、ββγ、αβγδδ等を具える、多価及び／又は多重特異性である融合タンパク質を指す。例えば、ααβγは三重特異性で、エピトープＡに対して二価である。例えば、本明細書に記載のＨｅｒ２特異的アフィリン及びモノクローナル抗体の融合タンパク質は、これらが少なくとも２つの結合タンパク質（例えば、アフィリン及びモノクローナル抗体）を具えるため、少なくとも「二価」である。当該結合タンパク質は、例えば、結合タンパク質の組成が、（α）２、（α）３、（α）４、（β）２、（β）３、（β）４等と記載される、標的抗原（単一特異的）上の同一又は重複エピトープに特異的に結合してよい。この場合、融合分子は単一特異性であるが、エピトープＡ又はエピトープＢに対して二価、三価、四価、又は多価である。
【００４１】
「アミノ酸配列同一性」の用語は、２以上のタンパク質のアミノ酸配列の同一性（又は差異）の定量的比較を指す。基準ポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を並べて、必要に応じてギャップを導入して最大パーセント配列同一性を達成した後の、基準ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。
【００４２】
配列同一性を決定するために、クエリータンパク質の配列が基準タンパク質の配列に対して、例えば、配列番号：４（ジユビキチン）又は配列番号：１（ユビキチン）に対して並べられる。整列方法は、当分野において周知である。例えば、配列番号：４又は配列番号：１のアミノ酸配列に対する任意のポリペプチドのアミノ酸配列同一性の程度を決定するのに、好ましくはＳＩＭローカル類似性プログラムが用いられ（Ｘｉａｏｑｕｉｎ  Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ  （１９９１），Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，  ｖｏｌ．  １２：３３７−３５７）、無料で入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｓｉｍ−ｐｒｏｔ．ｈｔｍｌについても参照のこと）。多重整列分析については、好ましくは、ＣｌｕｓｔａｌＷが用いられる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２２（２２）：４６７３−４６８０）。
【００４３】
本発明の文脈において、修飾配列と元となる配列（「親配列」ともいう）との配列同一性の程度は一般的に、明示的な示されない限りは、非修飾配列の全長に対して計算される。所定の位置の基準アミノ酸配列と異なるクエリー配列の各アミノ酸は、１つの相違として数えられる。クエリー配列における挿入又は欠失も１つの差異として数えられる。例えば、２つのユビキチン部分間でのリンカーの挿入は、基準配列と比較して１つの差異として数えられる。次に、相違の合計は、基準配列の長さに関連し、非同一のパーセンテージが得られる。同一性の定量的パーセンテージは、１００から非同一性のパーセンテージを引いて計算される。非修飾ユビキチンに対して並べられたユビキチン変異タンパク質の同一性を決定する特定の事例において、特に４５、７５、及び／又は７６位における差は、ユビキチン変異タンパク質の新規の結合能力に関係がないため、数えられない。ユビキチン部分は、アミノ酸残基４５、７５、及び／又は７６で結合能に影響を与えることなく修飾可能だが、当該修飾は、恐らくは変異タンパク質の生化学的特性の修飾実現に関連する。一般的に、修飾の出発物質として用いられるユビキチンは、配列番号：１に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、又は少なくとも９７％のアミノ酸同一性、又は少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有する。従って、例えば、基準配列に対して９５％「同一」であるポリペプチドは、例えば、基準配列と比較して１００のアミノ酸毎に５つの点変異又は４つの点変異及び１の挿入等を具えることができる。
【００４４】
「解離定数」又は「ＫＤ」の用語は、特定の結合親和性を定義する。本明細書で用いられるように、「ＫＤ」の用語（通常は「ｍｏｌ／Ｌ」で測定されるが、「Ｍ」と省略されることもある）は、第１の化合物と第２の化合物との特定の相互作用の解離平衡定数を指すことを意図している。本発明の文脈において、ＫＤの用語は特に、Ｈｅｒ２結合タンパク質とＨｅｒ２との結合親和性を説明するのに用いられる。高親和性は、ＫＤの低い値に対応する。従って、「少なくとも例えば１０−７ＭのＫＤ」という表現は、１０−７Ｍ以下の値（より強く結合する）を意味する。１×１０−７Ｍは１００ｎＭに対応する。１０−５Ｍから１０−１２Ｍまでの値は、定量可能な結合親和性と見なすことができる。用途に応じて、１０−７Ｍから１０−１２Ｍの値は、クロマトグラフ的用途、又は診断若しくは治療的用途に好適である。本発明に従って、標的結合に対する親和性は、７×１０−７Ｍ（７００ｎＭ）以下の範囲である。最終的な標的結合親和性は、１０−９Ｍ（１ｎＭ）以下が理想である。
【００４５】
本発明の結合タンパク質は、リンカーなしに直接連結する２つのユビキチン変異タンパク質を具え、ジユビキチン（配列番号：４又は配列番号：４８）の４２、４４、６８、７０、７２、７３、７４、８２、８４、１３８、１３９、１４０、１４１、及び１４２から選択される少なくとも１２、１３又は１４位での置換を有する特異的且つ高親和性Ｈｅｒ２結合タンパク質であり、任意に、０、１、２、３、４、５又は６の更なる置換をもたらす。
【００４６】
本発明の結合タンパク質は、他の機能的タンパク質部分に、例えば遺伝子的に融合可能である。本発明のそのような融合タンパク質の文脈において、「リンカー」の用語は、単一のアミノ酸、又は少なくとも２つの他のタンパク質部分を共有結合的に連結するポリペプチドに指す。リンカーは、第１のタンパク質及び第２のタンパク質、又はタンパク質部分に例えば遺伝子的に融合され、単一のリニアポリペプチド鎖を生成する。リンカーの長さ及び組成は、少なくとも１から約５０までのアミノ酸で変えてよい。好ましくは、リンカーの長さは、１から３０のアミノ酸である。より好ましくは、ペプチドリンカーは１から２０のアミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０のアミノ酸の長さを有している。ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、ヒトへの免疫原性がなく、プロテアーゼに対して安定であり、任意に、二次構造を形成しないことが好ましい。グリシリン又はセリンのような小さいアミノ酸を含むリンカーを例とする。リンカーはグリシンに富むものとすることができる（例えば、リンカーの残基の５０％以上をグリシン残基とすることができる）。グリシン及びセリン残基のみからなる可変長のグリシン‐セリン‐リンカーが好ましい。一般的には、構造（ＳＧＧＧ）ｎのリンカー又はＳＧＧＧの順列、例えば（ＧＧＧＳ）ｎ、を用いることができ、ここでｎは１から６の任意の数字、好ましくは１又は２又は３とすることができる。また、更なるアミノ酸を具えるリンカーも好ましい。タンパク質の遺伝的融合のための他のリンカーが当分野において周知で、それを用いることができる。本発明の一実施例において、第１の結合タンパク質（例えば、アフィリン）及び第２の結合タンパク質（例えば、モノクローナル抗体又はその断片）は、（Ｇ３Ｓ）４リンカーを介して連結される。
【００４７】
本発明の結合タンパク質の化学コンジュゲートの場合、「リンカー」の用語は任意の化学部分、又はポリエチレングリコール、その他といった化学ポリマーを指す。その化学部分は、Ｈｅｒ２結合タンパク質を他のタンパク質性又は非タンパク質性部分と、共有結合的に、又は非共有結合的に（例えば、水素結合、イオン性相互作用、又はファンデルワールス相互作用であり、２つの異なる部分に付着した２つの相補的核酸が互いにハイブリタイズするようなもの）結び付けるものである。そのようなリンカーは、タンパク質のアミノ酸側鎖、Ｎ末端α−アミノ又はＣ末端カルボキシル基を通じてタンパク質への化学的付着を可能とする反応基、を具えてよい。そのようなリンカー及び反応基は、当業者に周知であり、これ以上説明しない。
【００４８】
Ｈｅｒ２（ヒト上皮成長因子受容体２；同義名はＥｒｂＢ‐２、Ｎｅｕ、ＣＤ３４０又はｐ１８５）は、１９８４年に最初に記述された１８５‐ｋＤａの受容体である（Ｓｃｈｌｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：５１３−５１６）。この遺伝子の増幅又は過剰発現は、ある侵攻性の乳癌の発症及び進行で重要な役割を果たすことが示され、Ｈｅｒ２は疾病の重要なバイオマーカー及び治療の標的として知られている。Ｈｅｒ２が担う他の腫瘍は卵巣癌及び胃癌を含む。ヒトＨｅｒ２は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００４４３９により表され、Ｈｅｒ２の細胞外領域（残基１−６５２）はユニプロットアクセッション番号ｐ０４６２６により表される。「Ｈｅｒ２」の用語は、ＮＰ＿００４４３９に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、又は９７％以上、又は１００％の配列同一性を示し、Ｈｅｒ２の機能性を有する、全てのポリペプチドを具える。
【００４９】
［発明の実施例の詳細な説明］
本発明のＨｅｒ２結合タンパク質は、ヘッドトゥーテール方向でリンカーなしに直接結びついた、２つの異なって修飾されたユビキチン部分を具え、本質的にそれからなり、又はそれからなる。本発明のＨｅｒ２結合タンパク質は、ジユビキチン（配列番号：４）に対して少なくとも８５％のアミノ酸同一性を有し、つまり、Ｈｅｒ２に対するジユビキチン（配列番号：４）の新規の結合特性を生成するのに、最大で２３のアミノ酸がジユビキチン（配列番号：４）で修飾される（合計１５２のアミノ酸）。新規のＨｅｒ２結合タンパク質の更に好ましいアミノ酸同一性は、ジユビキチン（配列番号：４）に対して少なくとも８６％、少なくとも８７％（修飾された２０のアミノ酸に相当）、少なくとも８８％、又は少なくとも８９％、少なくとも９０％（修飾された１５のアミノ酸に相当）、少なくとも９１％（修飾された１４のアミノ酸に相当）、少なくとも９２％（修飾された１２のアミノ酸に相当）である。従って、本発明のＨｅｒ２結合タンパク質は、ジユビキチンに対して８５％から９２％の同一性、より好ましくはジユビキチンに対して８７％から９１％の同一性を示す。Ｈｅｒ２に対して７００ｎＭ以下の結合親和性（ＫＤ）を有する本発明のＨｅｒ２結合タンパク質は、ジユビキチン（配列番号：４）によるアミノ酸配列を具え、本質的にそれからなり、又はそれからなる。ここで、ジユビキチン（配列番号：４）のＲ４２、Ｉ４４、Ｈ６８、Ｖ７０、Ｒ７２、Ｌ７３、Ｒ７４、Ｋ８２、Ｌ８４，Ｑ１３８、Ｋ１３９、Ｅ１４０、Ｓ１４１及びＴ１４２位から選択される少なくとも１２、１３、又は１４のアミノ酸から選択されるアミノ酸が置換され、ここで、Ｈｅｒ２結合タンパク質は、ジユビキチン（配列番号：４）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。本発明に記載されるＨｅｒ２結合タンパク質は、配列番号：４に対して９２％以下の配列同一性を示す。好ましいＨｅｒ２結合タンパク質は、Ｒ４２、Ｉ４４、Ｈ６８、Ｖ７０、Ｒ７２、Ｌ７３、Ｒ７４、Ｋ８２、Ｌ８４、Ｑ１３８、Ｋ１３９、Ｅ１４０、Ｓ１４１及びＴ１４２から選択される少なくとも１２、１３、又は１４のアミノ酸が置換される限り、ジユビキチン（配列番号：４）に対して少なくとも８５％を有する１５２のアミノ酸を具える。全てのＨｅｒ２結合タンパク質は、Ｒ４２、Ｖ７０、Ｒ７２、Ｌ７３、Ｋ８２、Ｌ８４、Ｑ１３８、Ｋ１３９、Ｅ１４０、及びＴ１４２位で、好ましくはＩ４４、Ｈ６８、Ｒ７４、及びＳ１４１位で置換を有する。驚くことに、配列番号：４の当該１２、１３又は１４位における置換の特定の組み合わせは、高親和性のＨｅｒ２結合タンパク質をもたらす。これらのタンパク質は、ｄｅ  ｎｏｖｏで作られた人工タンパク質である。本発明のＨｅｒ２結合タンパク質は天然には存在しない。ｄｅ  ｎｏｖｏで作られたＨｅｒ２結合タンパク質の例は、配列番号：５−３８に提供される。
【００５０】
Ｈｅｒ２結合タンパク質は、ジユビキチン（配列番号：４）の４２、４４、６８、７０、７２、７３、７４、８２、８４、１３８、１３９、１４０、１４１及び１４２位から選択される少なくとも１２の位置で置換され、例えば、配列番号：２９、３３では更なる置換を有さず、例えば配列番号：２７、２８、３１、３２では１つの追加の置換を有し、例えば配列番号：１４、１６、２１、２５、２６、３０、３５は２つの追加の置換を有し、例えば配列番号：６、１２、１３、１５、１７、１８、２０、３４、３６は３つの追加の置換を有し、例えば配列番号：１０、１１、１９、２２、２３、２４は４つの追加の置換を有し、例えば配列番号：５、７、８、９は５つの追加の置換を有し、配列番号：３７は６つの追加の置換を有する。例えば、配列番号：４の４２、４４、６８、７０、７２、７３、７４、８２、８４、１３８、１３９、１４０、１４１及び１４２位における少なくとも１２の置換のほかに更なる１、２、３、４、５又は６の置換は、好ましくは配列番号：４の６、１０、１１、１５、２０、２１、２３、２７、２８、３１、３４、３６、４０、４６、４８、４９、５２、５８、６２、６３、７５、７８、８８、９２、９５、９６、９８、１１４、１２０、１２４、１３１、１３３、１４４、及び／又は１４７位から選択されてよい（図１及び表１を参照）。
【００５１】
2018529310.tif 000003
【００５２】
Ｈｅｒ２結合タンパク質の多くの例が本発明で提供される（例えば、図１ａ、配列番号：５−３８を参照）。本発明のＨｅｒ２結合アフィリン分子は、７００ｎＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満（例えば、配列番号：６、１４、１５、１８、２２、２４、２５、２６、２８、３５、３６、３８）、及びより好ましくは１ｎＭ未満（例えば、配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１９、２０、２３）の計測可能な結合親和性（Ｂｉａｃｏｒｅにより決定された結合親和性；例えば図２を参照）をもって、Ｈｅｒ２の単離された細胞外ドメインに結合する。ジユビキチン（配列番号：４）は本来、如何なる計測可能な結合親和性をもってもＨｅｒ２に結合することはない。本発明の全てのＨｅｒ２結合タンパク質は、高親和性をもって、Ｈｅｒ２に対してｄｅ  ｎｏｖｏで生み出された結合を示す。
【００５３】
ジユビキチン（配列番号：４）に基づくＨｅｒ２結合タンパク質の好ましい置換は、７０及び１４０位から選択されるアミノ酸の芳香族アミノ酸による置換である。ジユビキチン（配列番号：４）に基づくＨｅｒ２結合タンパク質の更に好ましい置換は、４２位から選択されるアミノ酸の極性アミノ酸による置換で、４４位は疎水性又は極性アミノ酸により置換され、６８位は芳香族アミノ酸により置換され、７２位は極性又は芳香族アミノ酸により置換され、７３位は塩基性又は酸性アミノ酸以外の任意のアミノ酸により置換され、７４位は芳香族、塩基性又は極性アミノ酸により置換され、８２位は塩基性又は酸性アミノ酸以外の任意のアミノ酸により置換され、８４位は塩基性又は酸性アミノ酸により置換され、１３８位は塩基性又は酸性又は極性アミノ酸により置換され、１３９位は酸性又は疎水性アミノ酸又はグリシンにより置換され、１４１位は疎水性又は極性又は塩基性アミノ酸により置換され、及び／又は１４２位は疎水性又は極性アミノ酸により置換される。ジユビキチン（配列番号：４）に基づくＨｅｒ２結合タンパク質の好ましい置換は、Ｒ４２Ｔ、Ｒ４２Ｓ、Ｒ４２Ｌ、Ｉ４４Ａ、Ｉ４４Ｖ、Ｉ４４Ｓ、Ｉ４４Ｔ、Ｈ６８Ｗ、Ｈ６８Ｙ、Ｈ６８Ｆ、Ｖ７０Ｙ、Ｖ７０Ｗ、Ｒ７２Ｔ、Ｒ７２Ｆ、Ｒ７２Ｇ、Ｒ７２Ｙ、Ｌ７３Ｗ、Ｌ７３Ｓ、Ｌ７３Ｖ、Ｌ７３Ｉ、Ｒ７４Ｙ、Ｒ７４Ｓ、Ｒ７４Ｎ、Ｒ７４Ｋ、Ｋ８２Ｔ、Ｋ８２Ｌ、Ｋ８２Ｎ，Ｋ８２Ｉ、Ｋ８２Ｙ、Ｌ８４Ｈ、Ｌ８４Ｄ、Ｌ８４Ｅ、Ｌ８４Ｓ、Ｑ１３８Ｓ、Ｑ１３８Ｒ、Ｑ１３８Ｅ、Ｋ１３９Ｅ、Ｋ１３９Ｇ、Ｋ１３９Ｌ、Ｅ１４０Ｗ、Ｓ１４１Ａ、Ｓ１４１Ｒ、Ｔ１４２Ｉ、Ｔ１４２Ｌ、及び／又はＴ１４２Ｎから選択される。更に好ましいのは、配列番号：４におけるアミノ酸置換の特定の組み合わせを有するＨｅｒ２結合タンパク質で、例えば、配列番号：７−２９及び３８において、例えば、少なくともＲ４２Ｔ、Ｉ４４Ａ、Ｈ６８Ｗ、Ｖ７０Ｙ、Ｒ７２Ｔ、Ｌ７３Ｗ、Ｒ７４Ｙ、Ｋ８２Ｔ、Ｌ８４Ｈである。
【００５４】
ジユビキチン（配列番号：４）におけるアミノ酸置換の特定の組み合わせを有する他の好ましいＨｅｒ２結合タンパク質は、例えば、配列番号：３４、３５、３６、３７における、例えば、少なくともＲ４２Ｓ、Ｉ４４Ｖ、Ｈ６８Ｙ、Ｖ７０Ｙ、Ｒ７２Ｆ、Ｌ７３Ｓ、Ｋ８２Ｌ、Ｌ８４Ｄである。ジユビキチン（配列番号：４）におけるアミノ酸置換の特定の組み合わせを有するＨｅｒ２結合タンパク質で、例えば、Ｑ１３８Ｓ、Ｋ１３９Ｅ、Ｅ１４０Ｗ、Ｓ１４１Ａ、Ｔ１４２Ｉ（例えば、配列番号：５、７−２９、３３、３６、３７）、又はＱ１３８Ｒ、Ｋ１３９Ｇ、Ｅ１４０Ｗ、Ｔ１４２Ｌ（例えば、配列番号：６、３４、３５）、又はＱ１３８Ｅ、Ｋ１３９Ｌ、Ｅ１４０Ｗ、Ｓ１４１Ｒ、Ｔ１４２Ｎ（例えば、配列番号：３０、３１、３２）は更に好ましい。
【００５５】
本発明のＨｅｒ２結合タンパク質は、配列番号：５−３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を具える。本発明のＨｅｒ２結合タンパク質は、配列番号：５−３８のアミノ酸配列のうち１以上に対して少なくとも８５％、又は少なくとも８７％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９６％の配列同一性を示すアミノ酸配列を具えることが好ましい。図１は、Ｈｅｒ２結合タンパク質の例を示す。
【００５６】
更なる実施例において、配列番号：１に基づくＨｅｒ２結合タンパク質は、配列番号：１の６２、６３、６４、６５、６６位における置換と、可能であれば、例えば、２、４、６、又は８位における更なる１、２、３、４、５、又は６の修飾とに加えて、天然ループ内で好ましくはＮ末端部の第１のループ内にアミノ酸の挿入を具える。配列番号：１に基づく好ましいＨｅｒ２結合タンパク質は、配列番号：１のアミノ酸領域６２−６６において置換を有する。その置換は、当該配列番号：１の天然ループ領域に、好ましくは領域８−１１に、更に好ましくは配列番号：１に対応する９及び１０位の間における、２−１０のアミノ酸、好ましくは４−９のアミノ酸、更に好ましくは６，７、８、又は９のアミノ酸の挿入と組み合わされる。例えば、Ｈｅｒ２結合アフィリン‐１４４５６７（配列番号：３９）は、配列番号：１（２Ｒ、４Ｇ、６Ｇ、６２Ｒ、６３Ｆ、６４Ｗ、６５Ｋ、６６Ｋ）の２、４、６、６２、６３、６４、６５、６６位での置換に加えて、配列番号：１の９位で６アミノ酸（ＰＹＥＴＱＶ、配列番号：４２）の挿入を有する。Ｈｅｒ２結合アフィリン‐１４３６９２（配列番号：４０）は、配列番号：１（２Ｄ、４Ｄ、６Ｍ、６２Ｈ、６３Ｗ、６４Ｉ、６５Ｌ、６６Ｎ）の２、４、６、６２、６３、６４、６５、６６位における置換に加えて、配列番号：１の９位で９のアミノ酸（ＡＧＮＰＳＨＭＨＨ、配列番号：４３）の挿入を有する。本発明のＨｅｒ２結合タンパク質は、配列番号：３９及び配列番号：４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を具える。Ｈｅｒ２結合タンパク質は、少なくとも配列番号：３９−４０のアミノ酸配列のうち１以上に対して少なくとも８５％、又は少なくとも８７％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９６％の配列同一性を示すアミノ酸配列を具えることが好ましい。
【００５７】
Ｈｅｒ２結合タンパク質の更なる特徴は、可溶性タンパク質の形で行うことができる。適切な方法は、当業者に知られており、又は文献に記載されている。結合親和性を決定する方法は、それ自体が周知であり、例えば、当技術分野において知られる以下の方法から選択可能である：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースの技術、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、蛍光分光技術、等温滴定型カロリメトリー（ＩＴＣ）、超遠心分離分析法、放射免疫測定法（ＲＩＡ又はＩＲＭＡ）、及び改良型化学発光（ＥＣＬ）。これらの方法の一部が以下の実施例で説明される。
【００５８】
安定性の分析について、例えば、化学的又は物理的アンフォールディングに関連して分光学又は蛍光ベースの方法が当業者に知られている。Ｈｅｒ２結合タンパク質の特徴に関する例示的な方法は、本発明の実施例の項目で概説する。
【００５９】
例えば、生化学的な標的結合分析が、図２で要約され、実施例で更に説明される。本発明の全ての結合タンパク質は、ＳＰＲベースの技術により決定されるように、Ｈｅｒ２に対して７００ｎＭ未満の親和性を有する。第１の態様の実施例において、Ｈｅｒ２‐結合タンパク質は、０．０１ｎＭから７００ｎＭ、より好ましくは０．０５ｎＭから５００ｎＭ、より好ましくは０．１ｎＭから１００ｎＭ、より好ましくは０．１ｎＭから２０ｎＭ、より好ましくは０．１ｎＭから１０ｎＭの範囲でヒトＨｅｒ２に対する解離定数ＫＤを有する。解離定数ＫＤは、ＥＬＩＳＡにより、又は表面プラズモン共鳴アッセイにより決定可能である。典型的には、解離定数ＫＤは、２０℃、２５℃、又は３０℃で決定される。特段記載がない限り、本明細書に記載のＫＤ値は、表面プラズモン共鳴により２５℃で決定される。
【００６０】
更に、温度安定性は、実施例において更に詳細に説明されて、図２で示されるように、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）により決定される。図２で示される結果に加えて、少なくとも８０％の可溶性が、サイズ排除クロマトグラフィーにより全てのＨｅｒ２結合分子に対して確認された；本発明のＨｅｒ２結合分子で凝集を示すものはなかった。図３は、２つの異なるＨｅｒ２結合タンパク質に対する結合キネティクスを示す。
【００６１】
アフィリン分子を比較する競合的結合の実験は、異なるＨｅｒ２結合タンパク質、例えばアフィリン‐１４２６２８及びアフィリン‐１４３６９２、により結合されるエピトープは同一でなく、又は非重複（図１２を参照）であることを示す。
【００６２】
これらのＨｅｒ２結合タンパク質は、Ｈｅｒ２結合に関して競合しない。更に、Ｈｅｒ２結合タンパク質は、モノクローナル抗体トラスツズマブと異なるＨｅｒ２エピトープに結合する。図１３は、アフィリン‐１４２６２８及びアフィリン‐１４３６９２が、トラスツズマブと異なる又は非重複のＨｅｒ２エピトープに結合することを示す。更に、アフィリン‐１４１９２６（配列番号：２８）、アフィリン‐１４１８８４（配列番号：３８）、アフィリン‐１４１８９０（配列番号：３０）、及びアフィリン‐１４１９７５（配列番号：３７）は、トラスツズマブと異なる又は非重複のＨｅｒ２のエピトープに結合する（表２）。表２に示す第１のＫＤはＨｅｒ２への結合を示し、表２の第２のＫＤはトラスツズマブの存在下でのＨｅｒ２への結合を示す。両方の値がほぼ同一のため、アフィリンタンパク質はトラスツズマブと異なる又は非重複のエピトープに結合すると結論付けることができる。それに対して、トラスツズマブと類似又は重複のエピトープは、アフィリン‐１４１９３１（配列番号：２７）、アフィリン‐１４１９１２（配列番号：３１）、及びアフィリン‐１４１９３５（配列番号：３２）を示す。
【００６３】
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【００６４】
追加の機能的特性解析は、Ｈｅｒ２過剰発現細胞、例えば、ＳｋＢｒ３細胞及び遺伝子改変のＣＨＯ−Ｋ１細胞について細胞のＨｅｒ２結合分析により行われた。アフィリン分子の異なる濃度が試験された。図４−９に示すように、Ｈｅｒ２細胞標的結合が確認された。
【００６５】
更に、アフィリン結合タンパク質はヒト由来の細胞からの腫瘍組織上のＨｅｒ２への結合を示す（図１０及び図１１を参照）。特に、驚くことに、アフィリン分子はＳＫＯＶ−３腫瘍組織で発現されたＨｅｒ２に強い結合を示す。肺、肝臓、心筋、及び卵巣からの組織に結合は見られなかった。
【００６６】
本発明の一実施例は、本発明のＨｅｒ２結合タンパク質、及び少なくとも１つの追加のタンパク質又は分子を更に含む。追加のタンパク質は、第１の結合タンパク質としての抗原に対する同一又は異なる特異性を有する、第２の結合タンパク質であってよい。本発明の一実施例は、アフィリン抗体融合タンパク質又はコンジュゲートを具える融合タンパク質又はコンジュゲートを含み、任意に、群（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の少なくとも１員から好ましくは選択される部分に更に融合又はコンジュゲートされる。群は（ｉ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ヒト血清アルブミン、アルブミン結合ペプチド、又は免疫グロブリン（Ｉｇ）又はＩｇ断片、多糖から選択される薬物動態を調節する部分、及び（ｉｉ）任意に、モノクローナル抗体又はその断片、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒性化合物、酵素、又はその誘導体、又は放射性核種から選択される治療活性成分、及び（ｉｉｉ）任意に、蛍光化合物、光増感剤、タグ、酵素、放射性核種から選択される診断成分、からなる。コンジュゲート分子は、例えば、ペプチドリンカー配列又は担体分子を通じて１又はいくつかの部位に付着可能である。
【００６７】
本発明によりタンパク質コンジュゲートを生成するためにタンパク質性又は非タンパク質性の部分と更に結合することは、技術分野で周知の化学的方法を適用して行うことが可能である。特に、システイン又はリジン残基の誘導体形成に特異的な結合化学を適用することができる。非天然アミノ酸の導入の場合、化学合成の更なる経路、例えば、「クリックケミストリー」又はアルデヒド特異的化学等が可能である。
【００６８】
そのようにして得られたコンジュゲートは、以下の例のうち１以上から選択可能である：（ｉ）リジン残基を介したタンパク質の結合、（ｉｉ）マレイミド化学を介したシステイン残基を介したタンパク質の結合；特にシステイン残基は特異的に導入でき、更なる部分の結合に適した任意の位置に配置できる、（ｉｉｉ）ペプチド性又はタンパク質原生の結合。対象のタンパク質を他の機能成分に共有結合的又は非共有結合的に付着させるこれらの及び他の方法は、技術分野において周知であり、従ってここでは更に詳しく説明しない。
【００６９】
更なる実施例は、好ましくは、ＰＥＧ、ＨＳＡ又はＩｇ若しくはＩｇ断片、例えば、Ｆｃ断片から選択される薬物動態又は生体内分布を調節する部分を更に具える、本発明に係る結合タンパク質に関する。延長された半減期を有するタンパク質を製造するための幾つかの技術は、技術分野において知られている。
【００７０】
本発明の結合タンパク質は、モノクローナル抗体又はその断片を具える、又はそれからなる第２の結合タンパク質を具えることもできる。一実施例において、第２の結合タンパク質は、ＥＧＦＲに対する特異性を有するモノクローナル抗体である。驚くことに、ＥＧＦＲモノクローナル抗体及びＨｅｒ２特異的なアフィリンからなる二重特異性の結合タンパク質は、ＥＧＦＲとＨｅｒ２との両方に特異的に結合可能であることが発見された。融合タンパク質のＥＧＦＲ結合レベルは、驚くことにセツキシマブのＥＧＦＲ結合レベルよりも高い。
【００７１】
本発明の幾つかの実施例において、Ｈｅｒ２とＥＧＦＲとに同時に特異的に結合するポリペプチドを具える二重特異性の結合分子が提供される。図１４は、二重特異性のアフィリン‐抗体結合タンパク質の両方の標的抗原（Ｈｅｒ２及びＥＧＦＲ）への同時結合を示す。図１５は、Ｈｅｒ２過剰発現細胞（図１５ａ）及びＥＧＦＲ過剰発現細胞（図１５ｂ）上のアフィリン‐抗体結合タンパク質（例えば、軽鎖へのＣ末端融合；ＣＬ−１４１９２６、配列番号：４４）のフローサイトメトリー結合分析を示す。当該図は、平均蛍光強度を示し、アフィリン‐抗体融合タンパク質のＨｅｒ２及びＥＧＦＲ過剰発現細胞への濃度依存性結合を表す。
【００７２】
本発明の更なる態様において、Ｈｅｒ２結合タンパク質又は融合タンパク質又はコンジュゲートが医学において、特に、好ましくは癌における医学的治療又は診察方法において用いられる。膜タンパク質Ｈｅｒ２は、腫瘍細胞で上表制御されることが知られ、腫瘍細胞の非制御増殖及び転移の形成をもたらす。癌患者への新たな療法は、例えば、モノクローナル抗体トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））又はペルツズマブ（パージェタ（登録商標）のような標的治療によるＨｅｒ２の抑制を含む。Ｔ−ＤＭ１という抗体‐薬物複合体は、Ｈｅｒ２を過剰発現する乳房、子宮、及び卵巣の癌肉腫に対して効果が高い。
【００７３】
Ｈｅｒ２の過剰発現は、様々な癌について記載されている。例えば、Ｈｅｒ２の過剰発現は、乳癌の約１５％−３０％、及び胃／胃食道癌の１０％−３０％で発生し、卵巣、子宮内膜、膀胱、肺、大腸、頭部及び首のような他の癌でも見られている。従って、本発明のＨｅｒ２結合タンパク質を具える医薬組成物は、Ｈｅｒ２が特に乳房、卵巣、胃に加えて、肺、頭部、首、頸部、前立腺、膵臓等をも含むがこれらに限定されない疾患の発症に関連する、癌の治療に用いることができる。
【００７４】
組成物は、本発明のＨｅｒ２結合タンパク質の治療上又は診断上有効量を含む。投与されるタンパク質の量は、治療される生物、疾患の種類、患者の年齢及び体重、及びそれ自体が周知である更なる要因によって決まる。
【００７５】
本発明の一部の実施例は、Ｈｅｒ２結合タンパク質を説明する。そのＨｅｒ２結合タンパク質は、少なくとも７００ｎＭの高親和性をもってＨｅｒ２の細胞外領域に結合するが、細胞結合を有さないか、又は弱い細胞結合のみを有する。そのようなＨｅｒ２結合タンパク質は、可溶性受容体と細胞に結合した受容体とをＨｅｒ２結合タンパク質が識別する必要がある、特定の医学的応用に特に有益である。可溶性Ｈｅｒ２は、癌患者の血液中に頻繁に発見される。細胞に結合した受容体ではなく、可溶性のＨｅｒ２（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイのような）に結合するＨｅｒ２結合タンパク質は、可溶性Ｈｅｒ２が疾患進行の予測バイオマーカーとなる診断用途に用いることが可能である。更に、可溶性Ｈｅｒ２にのみ結合するＨｅｒ２‐結合アフィリンタンパク質の特定の治療用途は、特に、可溶性受容体と細胞に結合した受容体とに結合する治療用抗体（例えば、トラスツズマブ）との組み合わせにおいて有用である。この場合、アフィリンは、好ましくは、可溶性Ｈｅｒ２分子に結合し、細胞における治療介入に利用可能なより多くの抗体分子を残す。このことにより、心毒性の副作用が知られている抗体の量を少なくする機会が切り開かれる。そのようなＨｅｒ２結合タンパク質の例が本発明で提供される（例えば、アフィリン‐１４２４６５、アフィリン‐１４２６５５、アフィリン‐１４２５０２、アフィリン‐１４１９６５、及びアフィリン‐１４４５６７）。
【００７６】
本発明は、本発明のＨｅｒ２結合タンパク質、融合タンパク質又はコンジュゲート又は核酸分子、本発明のベクター、及び／又は宿主細胞又はウィルス、及び薬学的に許容可能なキャリアを具える医薬組成物を含む。本発明は、本発明のＨｅｒ２結合タンパク質又はコンジュゲート又は核酸分子、本発明のベクター、及び／又は診断上許容可能なキャリアを有する宿主細胞又は非ヒト宿主を具える診断剤を更に含む。組成物は、薬学的又は診断上許容可能なキャリアを含み、任意に、それ自体が知られている補助剤及び賦形剤を更に含むことができる。これらは、例えば、安定剤、界面活性剤、塩、緩衝剤、着色剤等を含むが、これらに限定されない。
【００７７】
Ｈｅｒ２結合タンパク質を具える医薬組成物は、液状製剤、凍結乾燥物、クリーム、局所投与用のローション、エアロゾルの形態、粉末、顆粒の形態、エマルション又はリポソーム製剤の形態とすることができる。組成物は、好ましくは、無菌、非発熱性及び等張であり、それ自体が知られている薬学的に従来型で許容可能な添加剤を含む。更に、米国薬局方、又はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙの規則（１９９０）を参照する。ヒト及び家畜の医学療法及び予防において、本発明に係る少なくとも１つのＨｅｒ２結合タンパク質を含む薬学的に有効な医薬は、それ自体が知られている方法により調剤可能である。ガレヌス調剤に応じて、これらの組成物は注射又は注入による非経口に、全身的に、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、経皮的に、又は他の従来から採用される適用方法により投与可能である。製剤の種類は、治療される疾患の種類、投与ルート、疾患の重症度、治療が行われる患者、及び医学の分野で当業者に知られる他の要因に依る。
【００７８】
更なる態様において、本発明は、特定の標的／抗原、又はそのアイソフォームに特異的に結合する、本発明に係るＨｅｒ２結合タンパク質を具える診断用組成物を診断上許容可能なキャリアとともに開示する。増加したＨｅｒ２発現は、腫瘍の悪性と相関するので、患者のＨｅｒ２発現の状況についての情報を得るために、非侵襲型イメージングの診断法を開発することが望ましい。更に、Ｈｅｒ２イメージングは、治療療法に対する患者の反応の評価に有用である。例えば、適切な放射性同位体又は蛍光色素分子で標識された本発明のタンパク質を使用することは、腫瘍及び転移の位置を決定するための非侵入型イメージングで採用することができる（参照に関して、例えば、Ｍｉｌｅｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ２３：６１９−６３１；Ｈｏｅｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１，Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  １２９：８７０−８７８を参照）。それらの薬物動態の特性により、無傷の抗体は通常のイメージングには適していない。それらのサイズが小さいこと及び親和性が高いことにより、本発明の放射性同位体又は蛍光色素分子標識した融合タンパク質は、イメージング用診断薬としての使用により適すると考えられる。
【００７９】
本発明のタンパク質は、治療に有利に適用可能であると考えられる。特に、分子は、優れた腫瘍標的効果及び所望の体内分布、従って低減した副作用を示すと考えられる。本発明の医薬組成物は、任意の従来の方法で製造してよい。
【００８０】
特定の標的抗原に特異的に結合するユビキチン変異タンパク質を生成するユビキチンの誘導体生成が技術分野において記載されている。例えば、配列番号：４で示される配列が改変されたライブラリーを作成可能である。好ましくは、改変は、ジユビキチン（配列番号：４）のＲ４２、Ｉ４４、Ｈ６８、Ｖ７０、Ｒ７２、Ｌ７３、Ｒ７４、Ｋ８２、Ｌ８４、Ｑ１３８、Ｋ１３９、Ｅ１４０、Ｓ１４１、及びＴ１４２位から選択される少なくとも１２のアミノ酸を具える。他の実施例において、ライブラリーが作成可能で、そこでは配列番号：１で示される配列は、Ｎ末端側部分のループの４−１０のアミノ酸の延長と組み合わせで、少なくとも配列番号：１の６２、６３、６４、６５、６６位に位置するアミノ酸で改変されている。Ｈｅｒ２への新規の結合能を有するタンパク質を生成するため、追加の１、２、３、４、５、又は６のアミノ酸が置換可能である。
【００８１】
選択されたアミノ酸の修飾のステップが、本発明に従って、好ましくは選択されたアミノ酸のランダム変異誘発により遺伝子レベルで行われる。好ましくは、ユビキチンの修飾は、それぞれのタンパク質に属するＤＮＡの改変のための遺伝子工学の方法により行われる。
【００８２】
好ましくは、改変は、技術分野で説明したような置換、挿入又は欠失である。ユビキチン由来の新規の結合タンパク質の生成のためのアミノ酸残基の置換は、任意の所望のアミノ酸で行うことが可能である。このことは、本明細書で参照によって組み込まれる、ＥＰ１６２６９８５Ｂ１、ＥＰ２３７９５８１Ｂ１、及びＥＰ２７２１１５２で詳細に説明される。
【００８３】
配列番号：４又は配列番号：１に基づく新規の結合タンパク質の生成のためのアミノ酸の置換は、任意の所望のアミノ酸で行うことができる。このことは、本明細書で参照によって組み込まれる、例えば、ＥＰ１６２６９８５Ｂ１及びＥＰ２３７９５８１Ｂ１で詳細に説明される。例えば、１４の位置で２０の天然アミノ酸のランダム分布を仮定すると、２０の１４乗（２０１４）の理論上のユビキチン変異タンパク質のプールを生成し、それぞれが異なるアミノ酸組成、及び潜在的に異なる結合特性を有する。この遺伝子の大きなプールは、異なるアフィリン結合タンパク質のライブラリーを構成する。
【００８４】
例によって、変異生成の起点は、例えば、配列番号：４及び１のタンパク質をコードするｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡであってよい。更に、配列番号：４及び１に示すタンパク質をコードする遺伝子も合成的に作製可能である。ＤＮＡは、当業者に知られる方法により作製、改変及び増幅可能である。部位特異的な変異生成の方法、ランダム変異生成の方法で、ＰＣＲ又は同様の方法を用いる変異生成の方法等、それ自体が知られる手順が、変異生成に利用可能である。全ての方法は当業者に知られている。
【００８５】
本発明の好適な実施例において、変異生成が行われるアミノ酸の位置が予め決められる。それぞれの場合において、異なる変異体のライブラリーは、一般的に、それ自体が知られる方法を用いて確立される。一般的に、修飾されるアミノ酸の事前選択は、修飾されるユビキチンタンパク質に関して利用可能な構造情報に基づいて行うことができる。ランダム化される異なるアミノ酸の異なるセットの選択は、異なるライブラリーをもたらす。
【００８６】
上述のように得られた遺伝子プールライブラリーは、ディスプレイ方法等の選択方法のためのタンパク質の発現を可能とする適切な機能的遺伝要素と組み合わせることが可能である。発現したタンパク質は、結合親和性が存在する場合、パートナー同士の結合を可能とするため、本発明により標的分子と接触する。この方法は、標的分子への結合能を有するタンパク質の特定を可能とする。例えば、本明細書において参照によって組み込まれる、ＥＰ２３７９５８１Ｂ１を参照のこと。
【００８７】
本発明による接触は、好ましくは、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、細胞表面ディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、又はバクテリア表面ディスプレイ方法等の適切な表示及び選択方法により、好ましくはファージディスプレイ方法により行われる。完全な開示のために、以下の文献も参照する：Ｈｏｅｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．３（１９９３），５７２−５７９；Ｗｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２（１９９２），５９７−６０４；ａｙ  ｅｔ  ａｌ／．Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９６），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ。上述の方法は、当業者に知られている。ライブラリーは、ファージミドベクター（例えば、ｐＣＤ８７ＳＡ（Ｐａｓｃｈｋｅ，Ｍ．ａｎｄ  Ｗ．Ｈｏｈｎｅ（２００５）．“Ｇｅｎｅ  ３５０（１）：７９−８８））にクローニング可能である。ライブラリーは、ファージ上にディスプレイされてよく、それぞれの標的抗原に対するパニングのラウンドの繰り返しの対象としてよい。増強したファージプールからのユビキチン変異タンパク質は、個々のタンパク質の発現のため、発現ベクターにクローニング化される。好ましくは、ユビキチン変異タンパク質の発現は、自動化ハイスループットスクリーニングプラットフォーム上のＥＬＩＳＡ等、確立された方法により特定の結合タンパク質のスクリーニングを可能とする。次に、所望の結合特性を有する特定されたクローンは、アフィリン分子のアミノ酸配列を明らかにするためシーケンシングされる。特定された結合タンパク質は、例えば、上述のような特定された配列の改変及びファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、パニング、及びスクリーニングステップの繰り返しに基づいて追加のライブラリーを生成することにより、更なる成熟ステップの対象とされてよい。
【００８８】
本発明のＨｅｒ２結合分子は、通常の有機合成法、固相を利用した合成法、断片ライゲーション法等の多くの従来及び周知技術により、又は市販の自動合成器により作製可能である。一方、それらは従来の組換え法単独で、又は従来の合成法との組み合わせによっても作製可能である。更に、それらは無細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳によっても作製可能である。本発明によるコンジュゲートは、本明細書で上述のように例えばリジン又はシステインベース化学のような化学的手法によって化合物を結合させるにより得ることができる。
【００８９】
本発明の別の態様によると、本発明の結合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドも含む。本発明は、本発明の単離されたポリヌクレオチドを具える発現ベクター、及び本発明の単離されたポリヌクレオチド又は発現ベクターを具える宿主細胞も更に提供する。
【００９０】
例えば、本発明のＨｅｒ２結合タンパク質をコードする１以上のポリヌクレオチドは、適切な宿主において発現されてよく、産生された結合タンパク質は単離可能である。当該ポリヌクレオチドを具えるベクターは、本発明に含まれる。更なる実施例において、本発明は、本発明の核酸分子を具えるベクターに関連する。ベクターは、タンパク質をコードする情報を宿主細胞の中に移すのに用いられる任意の分子又は実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ、又はウィルス）を意味する。
【００９１】
本発明は更に、本発明の核酸分子又は本発明のベクターを具える単離された細胞に関連する。適する宿主細胞は、原核生物又は真核生物を含む。様々な哺乳類又は昆虫細胞培養系も、組換えタンパク質を発現するために採用可能である。
【００９２】
実施例において、本発明は、本発明のベクターを有する宿主細胞又は非ヒト宿主にも関連する。宿主細胞は、核酸配列により形質転換され、又は形質転換可能であり、それにより対象の遺伝子を発現する細胞である。その用語は、親細胞の子孫が、形態又は遺伝子的構成で元々の親細胞と同一であるか否かに関わらず、対象の遺伝子が存在する限りは、その子孫を含む。本発明に従って、宿主は、本発明のタンパク質が導入された、及び／又はそれを発現する遺伝子導入非ヒト動物であってよい。好ましい実施例において、遺伝子導入動物は非ヒト哺乳動物である。
【００９３】
別の態様において、本発明の結合タンパク質を製造する方法が提供され、ａ）本発明の宿主細胞を、結合タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップと、ｂ）産生された結合タンパク質を単離するステップとを具える。本発明は、本発明の方法により産生された結合タンパク質も含む。原核生物又は真核生物を培養するための適切な条件は、当業者に周知である。
【００９４】
本発明の一実施例は、上述の本発明による結合タンパク質の作製方法を対象とし、当該方法は、以下のステップ：（ａ）本発明の任意の態様に従ってＨｅｒ２結合タンパク質をコードする核酸を作製するステップと；（ｂ）当該核酸を発現ベクターに導入するステップと；（ｃ）当該発現ベクターを宿主細胞に導入するステップと；（ｄ）宿主細胞を培養するステップと；（ｅ）宿主細胞を、Ｈｅｒ２結合タンパク質が発現される培養条件の対象とし、それにより上述のようなＨｅｒ２結合タンパク質を産生するステップと；（ｆ）ステップ（ｅ）で産生されたＨｅｒ２結合タンパク質を任意に単離するステップと；（ｇ）Ｈｅｒ２結合タンパク質を上述のような更なる機能部分と任意にコンジュゲートさせるステップと、を具える。
【００９５】
タンパク質産生を目的とした細胞の培養及びタンパク質発現は、少容量の振とうフラスコから大型の発酵槽に至るまで任意の規模で行うことが可能で、当業者に周知の技術を適用する。
【００９６】
本発明に従って修飾されたユビキチンタンパク質の発現に続いて、それ自体が知られる方法により、更に精製及び濃縮が可能である。選択された方法は、当業者にそれ自体が周知である幾つかの要因、例えば使用される発現ベクター、宿主生物、対象使用分野、タンパク質のサイズ、及び他の要因に依存する。
【００９７】
一般的に、精製タンパク質を培養混合物から単離することは、遠心分離法、沈殿、凝集、異なる態様のクロマトグラフィー、濾過、透析、濃縮、それらの組み合わせおよび他の当業者に周知の従来の方法及び技術を適用して行うことができる。クロマトグラフィー法は当業者に周知であり、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー）、又はアフィニティクロマトグラフィーを具えるが、これらに限定されない。
【００９８】
精製を簡素化するため、本発明により修飾されたタンパク質は、分離物質に対して増加した親和性を有する他のペプチド配列に融合可能である。好ましくは、ユビキチン変異タンパク質の機能性に悪影響がない、又は特定のプロテアーセ切断部位の導入により精製後に単離可能である融合体が選択される。そのような方法も、当業者に知られている。
【実施例】
【００９９】
本発明の更なる説明のため、以下の実施例が提供される。本発明は、Ｈｅｒ２への結合をもたらす、ジユビキチン（配列番号：４又は４８）、又は野生型ユビキチン（配列番号：１又は２）の特定の修飾により、特に例示される。しかし、本発明はそのことに限定されず、以下の実施例は、上記記載に基づく本発明の実行可能性を示すにすぎない。本発明の完全の開示のため、参照により本出願に完全に組み込まれる、本出願記載の文献も参照する。
【０１００】
［実施例１  結合タンパク質の特定］
ライブラリー構築及びクローニング。バランス良く調整されたアミノ酸分布を実現するため、それぞれ７つのランダム化したアミノ酸の位置を具える２つのユビキチン部分が、トリプレット技術（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成された。システインを除く１９のアミノ酸をコードする予め作られた二重鎖のトリプレットの混合物が合成に用いられた。両方のユビキチン部分は、（それら２つのユビキチン部分の間のリンカーなしで）ヘッドトゥー方向で直接連結され、１４のランダム化したアミノ酸の位置を有する１５２のアミノ酸のタンパク質をもたらす。１４のランダム化した位置を有するジユビキチンの配列が、配列番号：３に示される：
ＭＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＸＬＸＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＸＬＸＬＸＸＸＡＡＭＱＩＦＶＸＴＸＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＷＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＸＸＸＸＸＬＨＬＶＬＲＬＲＡＡ。
【０１０１】
１４のランダム化したアミノ酸は、ジユビキチンの４２、４４、６８、７０、７２、７３、７４、８２、８４、１３８、１３９、１４０、１４１及び１４２位に対応する。ジユビキチンの配列が、配列番号：４に示される：
ＭＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＡＡＭＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＷＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＡＡ。
【０１０２】
そのコンストラクトは、当業者に知られる標準的な方法を用いて、修飾ｐＣＤ８７ＳＡファージミド（本明細書ではｐＣＤ１２という）でライゲートされた。ｐＣＤ１２ファージミドは、Ｎ末端の追加のアミノ酸なしにタンパク質のプロセシングを実現するため、修飾されたｔｏｒＡリーダー配列（アミノ酸配列ＱＰＡＭＡの欠失）を具える。ライゲーション混合物のアリコートが、大腸菌ＥＲ２７３８（Ｌｕｃｉｇｅｎ）のエレクトロポレーションに用いられた。そのライブラリーは、ＳＰＩＦという。特に記載がない限り、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．に記載される、確立された組換え型遺伝子学的手法が用いられた。
【０１０３】
標的：組換え型ヒトＨｅｒ２−Ｆｃキメラが、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入された。ヒトＨｅｒ２（ユニプロットアクセッション番号  ｐ００４６２６；残基１−６５２）の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列が、Ｃ末端でヒトＩｇＧ１のＦｃ領域と遺伝的に融合された。
【０１０４】
ＴＡＴファージディスプレイ選択。選択システムとしてＴＡＴファージディスプレイを用いて、ＳＰＩＦライブラリーは一定のタンパク質標的Ｈｅｒ２に対して濃縮された。コンピテントなバクテリアＥＲ２７３８細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎｅ）を、ＳＰＩＦライブラリーを有するファージミドｐＣＤ１２で形質転換した後、当業者に知られる標準的な方法を用いて、ファージ増幅及び精製が行われた。選択に関して、標的タンパク質が、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）タンパク質Ａ又はＧ上に固定化されたＦｃ−融合タンパク質（Ｈｅｒ２−Ｆｃ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）として提供された。ファージ培養中の標的濃度は、２００ｎＭ（第１のラウンド）から５０ｎＭ（第３のラウンド）へと変化した。標的ファージ複合体が磁気的に溶液から分離され、数回洗浄された。標的結合ファージは、トリプシンにより溶出された。Ｆｃ−結合変異体のファージライブラリーを枯渇させるため、ＩｇＧ１（Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の固定されたＦｃ−断片によるファージの事前選択が、ラウンド２及び３の前に行われた。
【０１０５】
標的特異的ファージのプールを特定するため、それぞれの選択ラウンドで溶出及び再増幅されたファージを、ファージプールＥＬＩＳＡにより分析した。媒体結合マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）のウェルは、Ｈｅｒ２−Ｆｃ（２．５μｇ／ｍｌ）及びＩｇＧ１のＦｃ−断片（５μｇ／ｍｌ）でそれぞれコーティングされた。結合したファージは、α−Ｍ１３  ＨＲＰ−コンジュゲート抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて検出した。ラウンド３で溶出及び再増幅されたファージは、標的への特異的な結合を示し、次いで、エラープローンＰＣＲによるプールの成熟に用いられた。単離したファージミドプールは、エラープローンＰＣＲ（ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のテンプレートとして用いた。ライブラリーの位置に対して追加の置換を有するＳＰＩＦ変異体の増幅したプールは、ファージミドｐＣＤ１２に再度クローニングされ、ファージ増幅及び精製のためＥＲ２７３８に形質転換された。ファージは、上述のように再び２ラウンドのパニングの対象となった。標的は、ラウンド１及び２で、それぞれ５ｎＭ及び１ｎＭの濃度で用いられた。両方のラウンドについて、ＩｇＧ１のＦｃ−断片による事前選択が行われた。特異的な標的結合について成熟及び選択したプールを分析するために、ファージプールＥＬＩＳＡが上述のように行われた。
【０１０６】
標的結合ファージプールの発現ベクターへのクローニング。選択手順が完了すると、成熟選択ラウンド１及び２の標的特異的なＤＮＡのプールは、当業者に知られる方法に従ってＰＣＲにより増幅され、適切な制限ヌクレアーゼで切り取られ、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ  ＩＩ（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）を具える発現ベクターｐＥＴ−２８ａ（Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の誘導体にライゲートされた。
【０１０７】
シングルコロニーヒット分析。ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の形質転換後、カナマイシン耐性シングルコロニーを生育させた。標的結合の修飾ユビキチンの変異体の発現は、自己誘導培地（Ｓｔｕｄｉｅｒ，２００５）を用いて、３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＢｉｏＯｎｅ）での培養により達成した。細胞を採取し、続いてＢｕｇＢｕｓｔｅｒ試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）により化学的又は酵素的に、又は凍結／融解サイクルにより機械的にそれぞれ溶解した。遠心分離後、結果として生じる上清を、高結合の３８４マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＢｉｏＯｎｅ）上に固定された標的を用いて、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。結合タンパク質の検出は、ＴＭＢ−Ｐｌｕｓ基質（Ｂｉｏｔｒｅｎｄ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）との組み合わせたＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ＨＲＰコンジュゲート（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）により達成した。反応は、０．２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４溶液を加えることにより停止し、プレートリーダーで６２０ｎｍに対して４５０ｎｍで測定した。
【０１０８】
［実施例２  Ｈｅｒ２結合タンパク質の発現及び精製］
アフィリン分子を、当業者に知られる標準的な方法を用いて、発現ベクターにクローニングし、以下で述べるように精製及び分析した。全てのアフィリンタンパク質が発現され、アフィニティクロマトグラフィー及びゲル濾過により高純度に精製した。アフィニティクロマトグラフィー精製後、Ａｅｋｔａ  ｓｙｓｔｅｍ及びＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００  Ｈｉｌｏａｄ  １６／６００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ  ＨＰＬＣ又はＳＥＣ）を行った。カラムは、１２０ｍｌの容量を有し、２ＣＶで平衡化された。サンプルへは、精製バッファーを１ｍｌ／分の流速で注いだ。信号強度が１０ｍＡＵに達するとフラクションコレクションが開始する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に続いて、陽性のフラクションをプールし、それらのタンパク質濃度を測定した。
【０１０９】
更なる分析には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥ−ＨＰＬＣ、及びＲＰ−ＨＰＬＣが含まれる。タンパク質濃度は、モル吸光係数を用いて、２８０ｎｍでの吸光測定により決定した。ＲＰクロマトグラフィー（ＲＰ  ＨＰＬＣ）は、Ｄｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣシステム、及びＶｙｄａｃ  ２１４ＭＳ５４  Ｃ４（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ、３００Å）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。
【０１１０】
［実施例３  Ｈｅｒ２結合タンパク質の可溶性分析］
上清及び再懸濁されたペレットは、ＮｕＰａｇｅ  Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ  ゲルにより分析し、クマシ―により染色した。タンパク質は、８Ｍ尿素の添加により、ペレットから回収した。Ｈｅｒ２結合タンパク質は、少なくとも８０％可溶（配列番号：５、２７、３０、３７、３８）、少なくとも９０％可溶（配列番号：６、２０、２３、２８、３４）、少なくとも９５％可溶（配列番号：７、９、１０、１１、２２、２９）、１００％可溶（配列番号：８、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２５、２６、３３、３５、３６）という高い可溶性を示した。
【０１１１】
［実施例４  Ｈｅｒ２結合タンパク質は高温で安定である］
本発明の結合タンパク質の熱安定性は、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）により測定された。それぞれのプローブを、０．１μｇ／μＬの濃度でＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ３８４−ウェルプレートに移し、ＳＹＰＲＯオレンジ染料を適切な希釈で添加した。２５から９５℃の温度匂配を毎分１℃の加熱速度でプログラムした（ＶｉｉＡ−７、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。蛍光は、５２０ｎｍの励起波長及び６２３ｎｍの発光波長で常に測定した（ＶｉｉＡ−７、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。熱アンフォールディング（Ｔｍ、融点）の転移中点を、選択された変異体について図２に示す。本発明のＨｅｒ２結合タンパク質は、同様の融解温度を有する。全ての結合タンパク質の安定性は、対照タンパク質の安定性と同等である。
【０１１２】
［実施例５  Ｈｅｒ２結合タンパク質の分析（表面プラズモン共鳴、ＳＰＲ）］
ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ＳＰＲランニングバッファーで平衡化した。表面露出カルボキシルは、反応性エステル基を得るため、ＥＤＣ及びＮＨＳの混合物を通過することにより活性化した。７００−１５００ＲＵのＨｅｒ２−Ｆｃ（オン‐リガンド）をフローセル上に固定し、ＩｇＧ−Ｆｃ（オフ‐リガンド）は別のフローセル上に、標的に対して１：３（ｈＩｇＧ−Ｆｃ：標的）の比で固定化した。未反応のＮＨＳ基をブロックするため、リガンド固定化後にエタノールアミンの注入を用いた。リガンド結合に伴い、タンパク質分析物が表面に蓄積し、屈折率が増加した。この屈折率の変化をリアルタイムで計測し、レスポンス又はレゾナンス単位（ＲＵ）対時間としてプロットした。分析物を、３０μｌ／分の流速でチップに段階希釈して注いだ。会合を３０秒間、解離を６０秒間行った。各ランの後、チップの表面を、３０μｌの再生バッファーで再生し、ランニングバッファーで平衡化した。トラスツズマブの希釈系列は陽性対照として機能し、一方、非修飾ユビキチンの希釈系列は陰性対照を表す。対照サンプルを、３０μｌ／分の流速でマトリックスに注入する一方、会合を６０秒間、解離を１２０秒間行った。再生及び再平衡化が前述のとおり行われた。Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて結合の試験を行った；データ評価は、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １：１モデル（Ｒｌ＝０）を用いて、製造業者により提供されたＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．０ソフトウェアを介して行った。Ｈｅｒ２への結合の結果を図２に示す。評価した解離定数（ＫＤ）はオフ‐ターゲットに対して標準化して、示した。
【０１１３】
［実施例６  機能のキャラクタライゼーション：細胞表面に発現したＨｅｒ２への結合（フローサイトメトリー）］
Ｈｅｒ２結合タンパク質の表面露出Ｈｅｒ２との相互作用を分析するのに、フローサイトメトリーを用いた。Ｈｅｒ２を過剰発現するヒト乳腺腺癌由来ＳｋＢｒ３細胞、Ｈｅｒ２を過剰発現するトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、Ｈｅｒ２非発現のヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ／２９３、及び空ベクターの対照ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いた。結果を図４−８に要約する。
【０１１４】
細胞をＦＣＳを含む培地中でトリプシン処理及び再混濁して、予め冷却したＦＡＣＳブロッキングバッファー中で洗浄及び染色した。２×１０６細胞／ｍｌの細胞濃度を細胞染色のために作製し、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に、各細胞株についてｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで満たした。
【０１１５】
いくつかの実験で、異なる濃度のアフィリンタンパク質を、Ｈｅｒ２過剰発現細胞及び対照細胞に添加した。それぞれのアフィリン５０ｎＭを、ＳｋＢｒ３及びＨｅｒ２陰性ＨＥＫ／２９３−細胞について試験し（図４Ａ及び４Ｂ）。３３３ｎＭから５．６ｎＭまでの希釈系列（図５）、及び１００ｎＭから０．０６ｐＭまでの希釈系列（図８）を、ＳｋＢｒ３細胞に添加した。Ｈｅｒ２過剰発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞、及びＨｅｒ２−陰性ＣＨＯ−Ｋ１−ｐＥｎｔｒｙ細胞株について、５００ｎＭから０．５ｎＭのアフィリン濃度（図６及び図７）を試験した。４５分後に、上清を除去し、ＦＡＣＳブロッキングバッファーで１：３００に希釈された、１００μｌ／ウェルのウサギ抗Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ抗体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ；Ａ００６２６から入手）を添加した。一次抗体の除去後、ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手；Ａ１１００８）が、１：１０００希釈で加えた。フローサイトメトリー測定は、励起波長４８８ｎｍ及び発光波長５２５／３０ｎｍで、メルクミルポア社製のＧｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ  ５ＨＴ装置上で行った。アフィリン‐１４１８８４、アフィリン‐１４１８９０、アフィリン‐１４１９１２、アフィリン‐１４１９２６、アフィリン‐１４１９３１、アフィリン‐１４１９３５、アフィリン‐１４１９６５、アフィリン‐１４１９７５（図４Ａ）、アフィリン‐１４２４１８、アフィリン‐１４２４３７、アフィリン‐１４２４６５、アフィリン‐１４２５０２、アフィリン‐１４２６０９、アフィリン‐１４２６１８、アフィリン‐１４２６２０、アフィリン‐１４２６２７、アフィリン‐１４２６２８、アフィリン‐１４２６５４、アフィリン‐１４２６６５、アフィリン‐１４２６７２、アフィリン‐１４１８８４（図４Ｂ）、及びアフィリン‐１４１９２６及びアフィリン‐１４１８９０（図５）の結合について、ＳｋＢｒ３の結果を示す。アフィリン‐１４２６２８、アフィリン‐１４２６５４、アフィリン‐１４１８８４、アフィリン‐１４２６２７、アフィリン‐１４４６３１、アフィリン‐１４４６３２、アフィリン‐１４４６３３、アフィリン‐１４４６３４、アフィリン‐１４４６３５、アフィリン‐１４４６３６、アフィリン‐１４４６３７、アフィリン‐１４４５６７、及びアフィリン‐１４２５０２の結合について、ＣＨＯ−Ｋ１−Ｈｅｒ２細胞の結果を、図６ａ−ｃに示す。（５０ｎＭ−０．５ｎＭ）アフィリン‐１４２６２８のＣＨＯ−Ｋ１−Ｈｅｒ２細胞及びＣＨＯ−Ｋ１−ｐＥｎｔｒｙ細胞への濃度依存性結合を、図７に示す。同等量のジユビキチン（１３９０９０）を、実験において該当する場合（例えば、図４Ａ、４Ｂ、６Ａ、６Ｂ、及び７に示す実験において）、陰性対照として用いた。
【０１１６】
しかし、アフィリン‐１４２４６５（配列番号：３３）、アフィリン‐１４２６５５（配列番号：３４）、アフィリン‐１４２５０２（配列番号：４９）、及びアフィリン‐１４１９６５（配列番号：５０）は、Ｈｅｒ２を過剰発現するＳｋＢｒ３細胞には弱い結合しか示さなかった。配列番号：３４、３５、４９、及び５０は、少なくとも以下の置換を有する：（ジユビキチンの）４２Ｓ、４４Ｖ、６８Ｙ、７０Ｙ、７２Ｆ、７３Ｓ、８２Ｌ、８４Ｄ、１３８Ｒ、１３９Ｇ、１４０Ｗ、１４２Ｌ。アフィリン‐１４２４１８及びアフィリン‐１４２６５５はそれぞれ、更に２つの置換（Ｋ６３Ｉ、Ｑ７８Ｒ）又は更に４つの置換（Ｑ３１Ｌ、Ｄ５８Ｖ、Ｑ７８Ｒ、Ｐ９５Ｓ）を有する。Ｈｅｒ２の細胞外ドメインに少なくとも７００ｎＭの高親和性で結合するが、細胞結合がない又は弱いＨｅｒ２結合タンパク質は、特定の用途、例えば、細胞のＨｅｒ２ではなく、可溶性のＨｅｒ２のみに対して、高親和であるＨｅｒ２結合タンパク質を要する特定の診断又は治療用途に、特に有用である。アフィリン‐１４２４１８は、Ｈｅｒ２を過剰発現するＳｋＢｒ３細胞への結合を示す（図４ｂ、図９）。
【０１１７】
［実施例７  細胞表面に発現したＨｅｒ２への結合（免疫細胞化学及び蛍光顕微法）］
外来性のヒトＨｅｒ２を発現する細胞上で、本発明のタンパク質の結合が確認された。５０ｎＭのアフィリン‐１４１８８４、アフィリン‐１４２６２８、アフィリン‐１４１９２６、アフィリン‐１４４６３７、アフィリン‐１４２４１８、及びアフィリン‐１４４５６７が、Ｈｅｒ２発現ＳｋＢｒ３細胞、及び陰性対照細胞株ＨＥＫ／２９３について試験された。陰性対照としてジユビキチン（１３９０９０）が用いられ、１０ｎＭのトラスツズマブが、陽性対照として機能した。細胞は、１×１０５細胞／ｍｌの濃度で、Ｌａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）チャンバースライド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に蒔いた。７２時間を超える培養後、細胞を、メタノールで固定し（５分、２０℃）、続いてブロッキング（ＰＢＳに５％のウマ胎児血清、１時間）、及び５０ｎＭのアフィリンで、常温で４５分間インキュベーションを行った。１時間のウサギ抗Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ抗体（１：５００）のインキュベーション、及び続いて１時間の抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８抗体（１：１０００）のインキュベーションにより、アフィリン結合を検出した。トラスツズマブの結合は、抗ヒト‐ＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８抗体（１：１０００）で証明された。細胞核は、４μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩで染色した。全てのインキュベーションステップは、室温で行った。図９Ａは、アフィリン‐１４１８８４、アフィリン‐１４２６２８、アフィリン‐１４１９２６、アフィリン‐１４４６３７、及びアフィリン‐１４２４１８の強い結合を示す。アフィリン‐１４４５６７及びジユビキチンの弱い結合又は陰性結合を、図９Ｂに示す。同等の結合がトラスツズマブで検出された。Ｈｅｒ２陰性細胞株ＨＥＫ／２９３について非特異的結合は見られなかった。
【０１１８】
［実施例８  機能のキャラクタライゼーション：Ｈｅｒ２結合タンパク質は、腫瘍細胞上に発現した細胞外Ｈｅｒ２に結合する（免疫組織化学及び蛍光顕微法）］
ＳＫＯＶ−３腫瘍、肺、肝臓、心筋、及び卵巣のクライオ組織セクションが、本発明の結合タンパク質を分析するのに用いられた。組織断片を、氷冷アセトンで１０分間固定し、続いて、アフィリン‐１４１８８４及びアフィリン‐１４２６２８の異なる濃度（２０ｎＭ及び５０ｎＭ）、及び同等量の陰性対照としてジユビキチンクローン１３９０９０又は陽性対照として１０ｎＭのトラスツズマブを用いて１時間ブロック及びインキュベーションを行った。ＰＢＳで洗浄後、組織をウサギ抗Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ抗体（１：５００）でもって室温で１時間インキュベートションを行い、続いて、トラスツズマブへの二次抗体として、ヤギ抗ウサギ  Ａｌｅｘａ４８８（１：１０００）又はヤギ抗ヒト  ＩｇＧ  Ａｌｅｘａ５９４（１：１０００）でインキュベーションを行った。細胞核は、ＤＡＰＩで可視化した。チャンバースライドは覆われ、ガラススライドをＭｏｗｉｏｌ及びカバーガラスで覆った。スライスは、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｓｃｏｐｅで画像取得した。Ａ１顕微鏡及び画像は、標準的なソフトウェアパッケージを用いて処理した。図１０及び１１は、非結合タンパク質クローン１３９０９０と比較した、ＳＫＯＶ−３腫瘍スライスへのアフィリン‐１４１８８４及びアフィリン‐１４２６２８の特異的結合を示す。肺組織上では結合は見られなかった（図１１）。更なる組織スライス（肝臓、心筋、及び卵巣組織）を試験したが、特異的染色は見られなかった。
【０１１９】
［実施例９  Ｈｅｒ２結合アフィリン分子が、抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体トラスツズマブ以外のエピトープに結合するという競合分析］
特定のトラスツズマブの異なるＨｅｒ２エピトープに結合するアフィリンタンパク質は、特定の医療実施例において有用である。本発明の単離されたＨｅｒ２結合タンパク質が、抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体トラスツズマブと競合可能であるか否かを調べるため、以下のアッセイを行った：（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの）Ｈｅｒ２をＮＨＳ／ＥＤＣ化学によりＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅチップ上に固定し、１０００レスポンス単位（ＲＵ）を得た。第１の実験では、全ての変異体は、１つの定められた濃度（２．５μＭ）で、３０μｌ／分  ＰＢＳＴ  ０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（図１２）の流速で注入した。第２の実験では、最初にチップの表面が飽和するまで、同一のフローチャネルへトラスツズマブ（２００ｎＭ）を前投与した（図１３）。トラスツズマブを投与した後、変異体は実験１と同一の方法（２．５μＭ）で注入した。より明確にするため、両方のセンソグラムのトレースは、最後に注入したＨｅｒ２結合タンパク質に合わせた。
【０１２０】
Ｈｅｒ２結合タンパク質の結合はトラスツズマブの存在により影響を受けなかったことが示された。従って、競合は見られず、これは、トラスツズマブ及び本発明のＨｅｒ２結合タンパク質が、異なる又は重複しないＨｅｒ２エピトープ、つまり、トラスツズマブ以外の異なる表面露出アミノ酸に結合することを意味する（図１３を参照）。これは、アフィリン‐１４２６２８（配列番号：１９）、アフィリン‐１４３６９２（配列番号：３９）、アフィリン‐１４１９２６（配列番号：２８）、アフィリン‐１４１８８４（配列番号：３８）、アフィリン‐１４１８９０（配列番号：３０）、及びアフィリン‐１４１９７５（配列番号：３７）について見られた。これらの結合タンパク質は、トラスツズマブに対して一次及び獲得耐性があると報告されている癌治療において特に有用であろう。アフィリン‐１４１９３１（配列番号：２７）、アフィリン‐１４１９１２（配列番号：３１）、及びアフィリン‐１４１９３５（配列番号：３２）は、トラスツズマブと同一の又は重複するＨｅｒ２エピトープに結合する。
【０１２１】
［実施例１０  Ｈｅｒ２結合タンパク質及びＥＧＦＲ抗体セツキシマブの二重特異性の融合タンパク質の結合分析］
Ｈｅｒ２結合タンパク質を、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体セツキシマブの軽鎖又は重鎖のＣ又はＮ末端に連結した。融合タンパク質は、Ｈｅｒ２結合タンパク質（例えば、アフィリン‐１４１９２６）をそれぞれ、抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブの重鎖のＮ末端に融合（ＮＨ１４１９２６、配列番号：４７という）、抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブの重鎖のＣ末端に融合（ＣＨ１４１９２６、配列番号：４５という）、抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブの軽鎖のＮ末端に融合（ＮＬ１４１９２６、配列番号：４６という）、及び、抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブの軽鎖のＣ末端に融合（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、ＣＬ１４１９２６、配列番号：４４という）することにより生成した。配列番号：４４−４７の最初の２０のアミノ酸までがシグナル配列である。融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを、過度的にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（登録商標）２９３−Ｆ細胞にトランスフェクトし、無血清／無動物成分媒体中で発現した。発現は、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ分析により確認した。融合タンパク質は、ＡＥＫＴＡｘｐｒｅｓｓ（登録商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＰｒｏｔａｉｎ  Ａ  アフィニティクロマトグラフィー（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｃａｔ  ｎｏ１７−０４０２−０１）により上清から精製した。融合タンパク質の更なる精製は、ゲル濾過により達成した。更なる分析には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥ−ＨＰＬＣ、及びＲＰ−ＨＰＬＣが含まれた。本発明の結合タンパク質の熱安定性は、上述のような示差走査型蛍光定量法により決定した。熱のアンフォールディング（Ｔｍ、融点）の転移中点を、融合タンパク質について決定した；全ての融合タンパク質は、Ｔｍ＝６３．９℃から６７．９℃の間の熱安定性を有する（表３を参照）。全ての結合タンパク質の安定性は、対照タンパク質の安定性と同等である。
【０１２２】
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【０１２３】
統合試験は、上述のように、及び図１４に示すように、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。更に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞で個別に発現する標的受容体への融合タンパク質の結合に関するＦＡＣＳ分析により、細胞への結合を確認した（図１５）。その結果を表４及び表５に要約する。
【０１２４】
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【０１２５】
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【０１２６】
受容体タンパク質ＥＧＦＲ及びＨｅｒ２の様々な型の癌（例えば、乳房、結腸、及び前立腺癌）における共発現は、患者の予後不良に関連することが知られている。図１４では、細胞外ドメインＨｅｒ２−Ｆｃを固定したＢｉａｃｏｒｅチップを用いた。二重特異性の融合タンパク質を注入し、３５０秒後、細胞外ドメインＥＧＦＲ−Ｆｃを濃度１００ｎＭから２５ｎＭの間で１：２の希釈系列で注入した。図１４は、二重特異性のアフィリン‐抗体融合タンパク質の両方の標的への同時結合を示す。この効果により、分子イメージングにおける治療用途で、本発明の二重特異性のＥＧＦＲ−Ｈｅｒ２融合タンパク質を具える生成物の選択性及び効率性が増大するであろう。図１５は、変異体ＣＬ１４１９２６のフローサイトメトリー計測法により、２つの相互作用部分のそれぞれの標的への結合を、Ｈｅｒ２（図１５ａ）及びＥＧＦＲ（図１５ｂ）を過剰発現するＣＨＯ細胞上で示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年12月25日(2017.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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