(57)【要約】  本発明は、一つには、細胞および対象のがんを治療するのに有用な化合物、組成物および方法に関する。幾つかの態様では、本発明は、がん細胞において化学療法感受性を増加させて、および／または化学療法耐性を低減させる化合物および方法を含む。ある特定の態様では、本発明は、がん細胞を死滅させるのに有用な化合物および方法を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん細胞の化学療法感受性を増加させる方法であって、がん細胞を、１つまたは複数の化学療法剤に対するがん細胞の感受性を増加させるのに有効な量で、１つまたは複数の外因性ＭＣＪアゴニスト化合物と接触させるステップを含む方法。
【請求項２】
外因性ＭＣＪアゴニスト化合物が、ＭＣＪ分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＭＣＪ分子が、ＭＣＪポリペプチドまたはＭＣＪポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
がん細胞を接触させるステップが、がん細胞をＭＣＪアゴニスト化合物と接触させる様式で、医薬組成物中の外因性ＭＣＪアゴニスト化合物を投与するステップを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
医薬組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
外因性ＭＣＪアゴニスト化合物が、１つまたは複数のターゲティング剤を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
１つまたは複数のターゲティング剤が、細胞浸透性ペプチド、細胞内在化剤、ＨＩＶ由来のＴＡＴ配列、小分子、ポリヌクレオチド、リポソーム、合成ポリペプチド、ＰＥＧ化リポソーム、アクアソーム、生分解性ポリマー、ナノ粒子、オリゴヌクレオチド、またはポリペプチドを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞内在化剤が、ＴＡＴポリペプチド配列を含み、任意にYGKKRRQRRG（配列番号９）として記載されるＴＡＴポリペプチド配列またはその変異体を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
外因性ＭＣＪアゴニスト化合物が、１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング剤を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング剤が、ミトコンドリアターゲティングペプチド、ミトコンドリアへ輸送されるナノ粒子、またはミトコンドリアのためのリポソームベースの送達システムを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング剤が、ポリペプチドであり、任意に、該ポリペプチドが、GTRTWVPKGLKSP（配列番号１０）として記載されるアミノ酸配列またはその変異体を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ミトコンドリアターゲティングペプチドが、FXRFXKFXRFXK（配列番号３７）として記載されるアミノ酸配列またはその変異体を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ＭＣＪポリペプチドが、MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAKRPDADVDQQRLVRSL（配列番号１）、MAARGVIAPVGESLRYAEYL（配列番号２）、VIAPVGESL（配列番号３）、またはVGESLRYAEY（配列番号４）、MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAK＊RPDADVDQQRLVRSL（配列番号５）として記載される配列またはその変異体を含む、請求項３〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
配列番号１、２、３、４または５の変異体が、それぞれ、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＭＣＪポリペプチドの変異体が、配列番号１、２、３、４または５として記載されるＭＣＪポリペプチドアミノ酸配列の断片を含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＭＣＪポリペプチド変異体が、ＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列の断片を含み、該断片が、それと整列するＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列の領域に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
外因性ＭＣＪアゴニスト化合物が、YGKKRRQRRGMAARGVIAPVGESLRYAEYLGTRTWVPKGLKSP（配列番号６）、YGKKRRQRRGVIAPVGESLGTRTWVPKGLKSP（配列番号７）、YGKKRRQRRGVGESLRYAEYGTRTWVPKGLKSP（配列番号８）として記載されるアミノ酸配列またはその変異体を有するポリペプチドを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
がん細胞が、脊椎動物がん細胞であり、任意に哺乳動物がん細胞である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
がん細胞が、皮膚細胞、胸部組織細胞、筋細胞、循環細胞、結合組織細胞、骨細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、器官細胞、間充織細胞、結合組織細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、膠細胞、腺細胞、間質細胞、腎細胞、甲状腺細胞、幹細胞、造血細胞、リンパ球細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、心筋細胞、肝細胞、星状細胞、乏突起膠細胞、または脂肪細胞である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
がん細胞のがんが、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、神経膠腫、乳がん、卵巣がん、上皮がん、子宮がん、膣がん、前立腺がん、精巣がん、陰茎がん、結腸がん、直腸がん、子宮頸がん、咽喉がん、口腔がん、膵がん、腎臓がん、肝がん、肺がん、黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、頭頸部がん、胃がん、骨がん、結合組織がん、膀胱がん、眼がん、鼻腔がん、脂肪がん、甲状腺がん、非ホジキンリンパ腫、小腸がん、ウィルムス腫瘍、胃腸がん、ＣＮＳがん、ＰＮＳがん、食道がん、カポジ肉腫、胆嚢がん、中皮腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、骨肉腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、副鼻腔がん、網膜芽腫、および唾液がんである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
がん細胞が、対象に存在する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
がん細胞を、１つまたは複数の化学療法剤と接触させるステップをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
化学療法剤が、タキサン、アントラサイクリン、細胞傷害性薬物、白金ベースの薬物、代謝拮抗物質、塩基類似体、ヌクレオシド類縁体、ヌクレオチド類似体、葉酸代謝拮抗薬、メトトレキサート、アルカロイド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、イリノテカン、エトポシド、ベルケイド、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、ブレオマイシン、シクロホスファミド、シトキサン、エベロリムス、またはメトホルミンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
外因性ＭＣＪアゴニスト化合物が、がん細胞においてミトコンドリアＡＴＰ生産を低減させる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
外因性ＭＣＪアゴニスト化合物が、がん細胞においてＡＢＣ輸送体のレベルを減少させる、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
がん細胞が、内因性ＭＣＪ分子を含まない、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
がん細胞が、内因性ＭＣＪ分子を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
がん細胞が、複数のがん細胞のうちの１つである、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
複数のがん細胞が、内因性ＭＣＪ分子を含む１つまたは複数のがん細胞を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
複数のがん細胞が、内因性ＭＣＪ分子を含まない１つまたは複数のがん細胞を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
複数のがん細胞が、内因性ＭＣＪ分子を含まない１つまたは複数のがん細胞および内因性ＭＣＪ分子を含む１つまたは複数のがん細胞を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
ＭＣＪポリペプチドが、１つまたは複数のアセチル化アミノ酸残基を含む、請求項３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
アセチル化アミノ酸残基が、リジン（Ｋ）残基であり、任意に、ＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１として記載されるアミノ酸配列と整列させた場合に、配列番号１として記載される配列におけるＫ２５位に相当する、請求項３２の方法。
【請求項３４】
１つまたは複数の細胞においてがんを治療する方法であって、
１つまたは複数のがん細胞を、有効量の少なくとも１つの外因性ＭＣＪアゴニスト化合物と接触させて、１つまたは複数のがん細胞においてがんを治療するステップ
を含む、前記方法。
【請求項３５】
外因性ＭＣＪアゴニスト化合物が、ＭＣＪ分子を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＭＣＪ分子が、ＭＣＪポリペプチドまたはＭＣＪポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
１つまたは複数のがん細胞を接触させるステップが、１つまたは複数のがん細胞を外因性ＭＣＪアゴニスト化合物と接触させる様式で、医薬組成物中の外因性ＭＣＪアゴニスト化合物を投与するステップを含む、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
医薬組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
外因性ＭＣＪアゴニスト化合物が、１つまたは複数のターゲティング剤を含む、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
１つまたは複数のターゲティング剤が、細胞浸透性ペプチド、合成ポリペプチド、細胞内在化剤、ＨＩＶ由来のＴＡＴ配列、小分子、ポリヌクレオチド、リポソーム、ＰＥＧ化リポソーム、アクアソーム、生分解性ポリマー、ナノ粒子、オリゴヌクレオチド、またはポリペプチドを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
細胞内在化剤が、ＴＡＴポリペプチド配列を含み、任意にYGKKRRQRRG（配列番号９）として記載されるＴＡＴポリペプチド配列またはその変異体を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
外因性ＭＣＪアゴニスト化合物が、１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング剤を含む、請求項３４〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング剤が、ミトコンドリアターゲティングペプチド、ミトコンドリアへ輸送されるナノ粒子、またはミトコンドリアのためのリポソームベースの送達システムを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング剤が、ポリペプチドであり、任意に、該ポリペプチドが、GTRTWVPKGLKSP（配列番号１０）として記載されるアミノ酸配列またはその変異体を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
ミトコンドリアターゲティングペプチドが、FXRFXKFXRFXK（配列番号３７）として記載されるアミノ酸配列またはその変異体を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
ＭＣＪポリペプチドが、MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAKRPDADVDQQRLVRSL（配列番号１）、MAARGVIAPVGESLRYAEYL（配列番号２）、VIAPVGESL（配列番号３）、またはVGESLRYAEY（配列番号４）、MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAK＊RPDADVDQQRLVRSL（配列番号５）として記載される配列またはその変異体を含む、請求項３６〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
配列番号１、２、３、４または５の変異体が、それぞれ、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ＭＣＪポリペプチドの変異体が、配列番号１、２、３、４または５として記載されるＭＣＪポリペプチドアミノ酸配列の断片を含む、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項４９】
ＭＣＪポリペプチド変異体が、ＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列の断片を含み、該断片が、それと整列するＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列の領域に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
外因性ＭＣＪアゴニスト化合物が、YGKKRRQRRGMAARGVIAPVGESLRYAEYLGTRTWVPKGLKSP（配列番号６）、YGKKRRQRRGVIAPVGESLGTRTWVPKGLKSP（配列番号７）、YGKKRRQRRGVGESLRYAEYGTRTWVPKGLKSP（配列番号８）として記載されるアミノ酸配列またはその変異体を有するポリペプチドを含む、請求項３４〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
１つまたは複数のがん細胞が、脊椎動物がん細胞であり、任意に哺乳動物がん細胞である、請求項３４〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
１つまたは複数のがん細胞が、皮膚細胞、胸部組織細胞、筋細胞、循環細胞、結合組織細胞、骨細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、器官細胞、間充織細胞、結合組織細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、膠細胞、腺細胞、間質細胞、腎細胞、甲状腺細胞、幹細胞、造血細胞、リンパ球細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、心筋細胞、肝細胞、星状細胞、乏突起膠細胞、または脂肪細胞である、請求項３４〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
１つまたは複数のがん細胞のがんが、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、神経膠腫、乳がん、卵巣がん、上皮がん、子宮がん、膣がん、前立腺がん、精巣がん、陰茎がん、結腸がん、直腸がん、子宮頸がん、咽喉がん、口腔がん、膵がん、腎臓がん、肝がん、肺がん、黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、頭頸部がん、胃がん、骨がん、結合組織がん、膀胱がん、眼がん、鼻腔がん、脂肪がん、甲状腺がん、非ホジキンリンパ腫、小腸がん、ウィルムス腫瘍、胃腸がん、ＣＮＳがん、ＰＮＳがん、食道がん、カポジ肉腫、胆嚢がん、中皮腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、骨肉腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、副鼻腔がん、網膜芽腫、および唾液がんである、請求項３４〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
１つまたは複数のがん細胞が、内因性ＭＣＪ分子を含まない、請求項３４〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
１つまたは複数のがん細胞が、内因性ＭＣＪ分子を含む、請求項３４〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
１つまたは複数のがん細胞が、対象に存在する、請求項３４〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
外因性ＭＣＪアゴニスト化合物が、１つまたは複数のがん細胞においてミトコンドリアＡＴＰ生産を低減させる、請求項３４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
外因性ＭＣＪアゴニスト化合物が、１つまたは複数のがん細胞においてＡＢＣ輸送体のレベルを減少させる、請求項３４〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
１つまたは複数のがん細胞を、有効量の１つまたは複数の化学療法剤と接触させるステップをさらに含む、請求項３４〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
１つまたは複数の化学療法剤が、タキサン、アントラサイクリン、細胞傷害性薬物、白金ベースの薬物、代謝拮抗物質、塩基類似体、ヌクレオシド類縁体、ヌクレオチド類似体、葉酸代謝拮抗薬、メトトレキサート、アルカロイド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、イリノテカン、エトポシド、ベルケイド、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、ブレオマイシン、シクロホスファミド、シトキサン、エベロリムス、またはメトホルミンである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
１つまたは複数のがん細胞が、複数のがん細胞のうちの１つまたは複数である、請求項３４〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
複数のがん細胞が、内因性ＭＣＪ分子を含まない１つまたは複数のがん細胞を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
複数のがん細胞が、内因性ＭＣＪ分子を含む１つまたは複数のがん細胞を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
複数のがん細胞が、内因性ＭＣＪ分子を含まない１つまたは複数のがん細胞、および内因性ＭＣＪ分子を含む１つまたは複数のがん細胞を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
ＭＣＪポリペプチドが、１つまたは複数のアセチル化アミノ酸残基を含む、請求項３６〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
アセチル化アミノ酸残基が、リジン（Ｋ）残基であり、任意に、ＭＣＪポリペプチドのアミノ酸を配列番号１として記載されるアミノ酸配列と整列させた場合に、配列番号１として記載される配列におけるＫ２５位に相当する、請求項６５の方法。
【請求項６７】
治療中のがんにおける化学療法剤の有効性に対する外因性ＭＣＪアゴニスト化合物の効果を評価する方法であって、
（ａ）試験がん細胞を、化学療法剤と接触させるステップと；
（ｂ）試験がん細胞を、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物とさらに接触させるステップと；
（ｃ）さらに接触させた試験がん細胞においてがんを治療する際の化学療法剤の有効性を決定するステップと；
（ｄ）試験がん細胞に対する化学療法剤の決定された有効性を、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物と接触させない対照がん細胞においてがんを治療する際の化学療法剤の有効性と比較するステップと
を含み、対照がん細胞においてがんを治療する際の化学療法剤の有効性と比較した、試験がん細胞においてがんを治療する際の化学療法剤の異なる有効性は、がんを治療する際の化学療法剤の有効性に対する外因性ＭＣＪアゴニスト化合物の効果を示す、前記方法。
【請求項６８】
外因性ＭＣＪアゴニスト化合物が、ＭＣＪ分子を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
ＭＣＪ分子が、ＭＣＪポリペプチドまたはＭＣＪポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
外因性ＭＣＪアゴニスト化合物が、１つまたは複数のターゲティング剤を含む、請求項６７〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
１つまたは複数のターゲティング剤が、細胞浸透性ペプチド、合成ポリペプチド、細胞内在化剤、ＨＩＶ由来のＴＡＴ配列、小分子、ポリヌクレオチド、リポソーム、ＰＥＧ化リポソーム、アクアソーム、生分解性ポリマー、ナノ粒子、オリゴヌクレオチド、またはポリペプチドを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
細胞内在化剤が、ＴＡＴポリペプチド配列を含み、任意にYGKKRRQRRG（配列番号９）として記載されるＴＡＴポリペプチド配列またはその変異体を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
外因性ＭＣＪアゴニスト化合物が、１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング剤を含む、請求項６７〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング剤が、ミトコンドリアターゲティングペプチド、ミトコンドリアへ輸送されるナノ粒子、またはミトコンドリアのためのリポソームベースの送達システムを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング剤が、ポリペプチドであり、任意に、該ポリペプチドが、GTRTWVPKGLKSP（配列番号１０）として記載されるアミノ酸配列またはその変異体を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
ミトコンドリアターゲティングペプチドが、FXRFXKFXRFXK（配列番号３７）として記載されるアミノ酸配列またはその変異体を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
外因性ＭＣＪアゴニスト化合物が、接触させた細胞においてミトコンドリアＡＴＰ生産を低減させる、請求項６７〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
外因性ＭＣＪアゴニスト化合物が、接触させた細胞においてＡＢＣ輸送体のレベルを減少させる、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
ＭＣＪポリペプチドが、MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAKRPDADVDQQRLVRSL（配列番号１）、MAARGVIAPVGESLRYAEYL（配列番号２）、VIAPVGESL（配列番号３）、またはVGESLRYAEY（配列番号４）、MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAK＊RPDADVDQQRLVRSL（配列番号５）として記載される配列またはその変異体を含む、請求項６９〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
配列番号１、２、３、４または５の変異体が、それぞれ、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
ＭＣＪポリペプチドの変異体が、配列番号１、２、３、４または５として記載されるＭＣＪポリペプチドアミノ酸配列の断片を含む、請求項７９または８０に記載の方法。
【請求項８２】
ＭＣＪポリペプチド変異体が、ＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列の断片を含み、該断片が、それと整列するＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列の領域に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する、請求項７９〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
外因性ＭＣＪアゴニスト化合物が、YGKKRRQRRGMAARGVIAPVGESLRYAEYLGTRTWVPKGLKSP（配列番号６）、YGKKRRQRRGVIAPVGESLGTRTWVPKGLKSP（配列番号７）、YGKKRRQRRGVGESLRYAEYGTRTWVPKGLKSP（配列番号８）として記載されるアミノ酸配列またはその変異体を有するポリペプチドを含む、請求項６７〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
がん細胞が、脊椎動物がん細胞であり、任意に哺乳動物がん細胞である、請求項６７〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
がん細胞が、皮膚細胞、胸部組織細胞、筋細胞、循環細胞、結合組織細胞、骨細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、器官細胞、間充織細胞、結合組織細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、膠細胞、腺細胞、間質細胞、腎細胞、甲状腺細胞、幹細胞、造血細胞、リンパ球細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、心筋細胞、肝細胞、星状細胞、乏突起膠細胞、または脂肪細胞である、請求項６７〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
がん細胞のがんが、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、神経膠腫、乳がん、卵巣がん、上皮がん、子宮がん、膣がん、前立腺がん、精巣がん、陰茎がん、結腸がん、直腸がん、子宮頸がん、咽喉がん、口腔がん、膵がん、腎臓がん、肝がん、肺がん、黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、頭頸部がん、胃がん、骨がん、結合組織がん、膀胱がん、眼がん、鼻腔がん、脂肪がん、甲状腺がん、非ホジキンリンパ腫、小腸がん、ウィルムス腫瘍、胃腸がん、ＣＮＳがん、ＰＮＳがん、食道がん、カポジ肉腫、胆嚢がん、中皮腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、骨肉腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、副鼻腔がん、網膜芽腫、および唾液がんである、請求項６７〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
外因性ＭＣＪアゴニスト化合物が、接触させた試験がん細胞においてミトコンドリアＡＴＰ生産を低減させる、請求項６７〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
外因性ＭＣＪアゴニスト化合物が、接触させた試験がん細胞においてＡＢＣ輸送体のレベルを減少させる、請求項６７〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
化学療法剤が、タキサン、アントラサイクリン、細胞毒、白金ベースの薬物、代謝拮抗物質、塩基類似体、ヌクレオシド類縁体、ヌクレオチド類似体、葉酸代謝拮抗薬、メトトレキサート、アルカロイド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、イリノテカン、エトポシド、ベルケイド、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、ブレオマイシン、シクロホスファミド、シトキサン、エベロリムス、またはメトホルミンである、請求項６７〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
試験がん細胞が、内因性ＭＣＪ分子を含まない、請求項６７〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
試験がん細胞が、内因性ＭＣＪ分子を含む、請求項６７〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
試験がん細胞が内因性ＭＣＪ分子を含まない場合には、対照細胞が内因性ＭＣＪ分子を含まず、試験がん細胞が内因性ＭＣＪ分子を含む場合には、対照細胞が内因性ＭＣＪ分子を含む、請求項９０または９１に記載の方法。
【請求項９３】
ＭＣＪポリペプチドが、１つまたは複数のアセチル化アミノ酸残基を含む、請求項６９〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
アセチル化アミノ酸残基が、リジン（Ｋ）残基であり、任意に、ＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１として記載されるアミノ酸配列と整列させた場合に、配列番号１として記載される配列におけるＫ２５位に相当する、請求項９３の方法。
【請求項９５】
ＭＣＪ分子、ターゲティング剤、および任意に細胞内在化剤を含むＭＣＪアゴニスト化合物を含む組成物。
【請求項９６】
ＭＣＪ分子が、ＭＣＪポリペプチドである、請求項９５に記載の組成物。
【請求項９７】
外因性ＭＣＪアゴニスト化合物が、１つまたは複数のターゲティング剤を含む、請求項９５または９６に記載の組成物。
【請求項９８】
１つまたは複数のターゲティング剤が、細胞浸透性ペプチド、ミトコンドリアターゲティング剤、合成ポリペプチド、細胞内在化剤、ＨＩＶ由来のＴＡＴ配列、小分子、ポリヌクレオチド、リポソーム、ＰＥＧ化リポソーム、アクアソーム、生分解性ポリマー、ナノ粒子、オリゴヌクレオチド、またはポリペプチドを含む、請求項９７に記載の組成物。
【請求項９９】
細胞内在化剤が、ＴＡＴポリペプチド配列を含み、任意にYGKKRRQRRG（配列番号９）として記載されるＴＡＴポリペプチド配列またはその変異体を含む、請求項９５に記載の組成物。
【請求項１００】
外因性ＭＣＪアゴニスト化合物が、１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング剤を含む、請求項９５〜９９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０１】
１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング剤が、ミトコンドリアターゲティングペプチド、ミトコンドリアへ輸送されるナノ粒子、またはミトコンドリアのためのリポソームベースの送達システムを含む、請求項１００に記載の組成物。
【請求項１０２】
１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング剤が、ポリペプチドであり、任意に、該ポリペプチドが、GTRTWVPKGLKSP（配列番号１０）として記載されるアミノ酸配列またはその変異体を含む、請求項１００に記載の組成物。
【請求項１０３】
ミトコンドリアターゲティング剤が、FXRFXKFXRFXK（配列番号３７）として記載されるアミノ酸配列またはその変異体を含む、請求項１００に記載の組成物。
【請求項１０４】
ＭＣＪポリペプチドが、MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAKRPDADVDQQRLVRSL（配列番号１）、MAARGVIAPVGESLRYAEYL（配列番号２）、VIAPVGESL（配列番号３）、またはVGESLRYAEY（配列番号４）、MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAK＊RPDADVDQQRLVRSL（配列番号５）として記載される配列またはその変異体を含む、請求項９６〜１０３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０５】
配列番号１、２、３、４または５の変異体が、それぞれ、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する、請求項１０４に記載の組成物。
【請求項１０６】
ＭＣＪポリペプチドの変異体が、配列番号１、２、３、４または５として記載されるＭＣＪポリペプチドアミノ酸配列の断片を含む、請求項１０４または１０５に記載の組成物。
【請求項１０７】
ＭＣＪポリペプチド変異体が、ＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列の断片を含み、該断片が、それと整列するＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列の領域に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する、請求項１０４〜１０６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０８】
ＭＣＪポリペプチドが、１つまたは複数のアセチル化アミノ酸残基を含む、請求項９６〜１０７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０９】
アセチル化アミノ酸残基が、リジン（Ｋ）残基であり、任意に、ＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１として記載されるアミノ酸配列と整列させた場合に、配列番号１として記載される配列におけるＫ２５位に相当する、請求項１０８に記載の組成物。
【請求項１１０】
請求項９５〜１０９のいずれか一項に記載の組成物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１１１】
がん細胞を死滅させる方法であって、がん細胞を、がん細胞を死滅させるのに有効な量で請求項９５〜１０９のいずれか一項に記載の組成物と接触させるステップを含む、前記方法。
【請求項１１２】
がん細胞が、内因性ＭＣＪ分子を含まない、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
がん細胞が、内因性ＭＣＪ分子を含む、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１４】
がん細胞が、対象に存在する、請求項１１１〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
対象が、哺乳動物であり、任意にヒトである、請求項１１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１５年２月１８日に出願された米国仮出願第６２／１１７，５３０号の利益を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号ＡＩ０９４０２７およびＣＡ１２７０９９の下で、政府支援を受けて行った。政府は、本発明のある特定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、一つには、化学療法剤に対するがん細胞の感受性を増加させて、化学療法剤に対するがん細胞の耐性を低減させて、がん細胞死を増加させる方法および化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々ながんに関する治療は、がんを伴う患者において急速に分裂する細胞を死滅させるための化学療法剤の投与を含み得る。がん細胞が１つまたは複数の化学療法剤に対して耐性を発現する場合に、化学療法において問題が生じて、がんを治療に対して不応性にする。治療剤に対する耐性は、化学療法の有効性を低減させて、治療失敗の実例を増加させる。がん治療は、がん細胞を死滅させて、がん患者に安全に投与することができる比較的数少ない化合物または作用物質によって複雑になる。また、化学療法剤に対する耐性の発現は、がん治療の選択肢の利用可能性を低減させる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明の一態様によれば、がん細胞の化学療法感受性を増加させる方法が提供される。上記方法は、がん細胞を、１つまたは複数の化学療法剤に対するがん細胞の感受性を増加させるのに有効な量で、１つまたは複数の外因性ＭＣＪアゴニスト化合物と接触させるステップを含む。幾つかの実施形態では、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物は、ＭＣＪ分子を含む。幾つかの実施形態では、ＭＣＪ分子は、ＭＣＪポリペプチドまたはＭＣＪポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、がん細胞を接触させるステップは、がん細胞をＭＣＪアゴニスト化合物と接触させる様式で、医薬組成物中の外因性ＭＣＪアゴニスト化合物を投与するステップを含む。幾つかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。幾つかの実施形態では、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物は、１つまたは複数のターゲティング剤を含む。幾つかの実施形態では、１つまたは複数のターゲティング剤は、細胞浸透性ペプチド、細胞内在化剤（cell internalization agent）、ＨＩＶ由来のＴＡＴ配列、小分子、ポリヌクレオチド、リポソーム、ミトコンドリアターゲティング剤、合成ポリペプチド、ＰＥＧ化リポソーム、アクアソーム（aquasome）、生分解性ポリマー、ナノ粒子、オリゴヌクレオチド、またはポリペプチドを含む。幾つかの実施形態では、細胞内在化剤は、ＴＡＴポリペプチド配列を含み、任意にYGKKRRQRRG（配列番号９）として記載されるＴＡＴポリペプチド配列またはその変異体を含む。ある特定の実施形態では、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物は、１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング剤を含む。幾つかの実施形態では、１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング剤は、ミトコンドリアターゲティングペプチド、ミトコンドリアへ輸送されるナノ粒子、またはミトコンドリアのためのリポソームベースの送達システムを含む。幾つかの実施形態では、１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング剤は、ポリペプチドであり、任意に、該ポリペプチドは、GTRTWVPKGLKSP（配列番号１０）として記載されるアミノ酸配列またはその変異体を含む。幾つかの実施形態では、ミトコンドリアターゲティングペプチドは、FXRFXKFXRFXK（配列番号３７）として記載されるアミノ酸配列またはその変異体を含む。幾つかの実施形態では、ＭＣＪポリペプチドが、MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAKRPDADVDQQRLVRSL（配列番号１）、MAARGVIAPVGESLRYAEYL（配列番号２）、VIAPVGESL（配列番号３）、またはVGESLRYAEY（配列番号４）、MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAK＊RPDADVDQQRLVRSL（配列番号５）として記載される配列またはその変異体を含む。ある特定の実施形態では、配列番号１、２、３、４または５の変異体は、それぞれ、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、ＭＣＪポリペプチドの変異体は、配列番号１、２、３、４または５として記載されるＭＣＪポリペプチドアミノ酸配列の断片を含む。幾つかの実施形態では、ＭＣＪポリペプチド変異体は、ＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列の断片を含み、該断片は、それと整列するＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列の領域に対し���少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物は、YGKKRRQRRGMAARGVIAPVGESLRYAEYLGTRTWVPKGLKSP（配列番号６）、YGKKRRQRRGVIAPVGESLGTRTWVPKGLKSP（配列番号７）、YGKKRRQRRGVGESLRYAEYGTRTWVPKGLKSP（配列番号８）として記載されるアミノ酸配列またはその変異体を有するポリペプチドを含む。幾つかの実施形態では、がん細胞は、脊椎動物がん細胞であり、任意に哺乳動物がん細胞である。幾つかの実施形態では、がん細胞は、皮膚細胞、胸部組織細胞、筋細胞、循環細胞、結合組織細胞、骨細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、器官細胞、間充織細胞、結合組織細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、膠細胞、腺細胞、間質細胞、腎細胞、甲状腺細胞、幹細胞、造血細胞、リンパ球細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、心筋細胞、肝細胞、星状細胞、乏突起膠細胞、または脂肪細胞である。幾つかの実施形態では、がん細胞のがんが、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、神経膠腫、乳がん、卵巣がん、上皮がん、子宮がん、膣がん、前立腺がん、精巣がん、陰茎がん、結腸がん、直腸がん、子宮頸がん、咽喉がん、口腔がん、膵がん、腎臓がん、肝がん、肺がん、黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、頭頸部がん、胃がん、骨がん、結合組織がん、膀胱がん、眼がん、鼻腔がん、脂肪がん、甲状腺がん、非ホジキンリンパ腫、小腸がん、ウィルムス腫瘍、胃腸がん、ＣＮＳがん、ＰＮＳがん、食道がん、カポジ肉腫（Karposi sarcoma）、胆嚢がん、中皮腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、骨肉腫（osteoscarcoma）、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫（rhabdomyoscarcoma）、副鼻腔がん、網膜芽腫、および唾液がんである。ある特定の実施形態では、がん細胞は、対象に存在する。幾つかの実施形態では、上記方法はまた、がん細胞を、１つまたは複数の化学療法剤と接触させるステップをさらに含む。幾つかの実施形態では、化学療法剤は、タキサン、アントラサイクリン、細胞毒、白金ベースの薬物、代謝拮抗物質、塩基類似体、ヌクレオシド類縁体、ヌクレオチド類似体、葉酸代謝拮抗薬、メトトレキサート、アルカロイド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、イリノテカン、エトポシド、ベルケイド、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、ブレオマイシン、シクロホスファミド、シトキサン、エベロリムス、またはメトホルミンである。ある特定の実施形態では、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物は、がん細胞においてミトコンドリアＡＴＰ生産を低減させる。幾つかの実施形態では、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物は、がん細胞においてＡＢＣ輸送体のレベルを減少させる。幾つかの実施形態では、がん細胞は、内因性ＭＣＪ分子を含まない。幾つかの実施形態では、がん細胞は、内因性ＭＣＪ分子を含む。ある特定の実施形態では、がん細胞は、複数のがん細胞のうちの１つである。幾つかの実施形態では、複数のがん細胞は、内因性ＭＣＪ分子を含む１つまたは複数のがん細胞を含む。幾つかの実施形態では、複数のがん細胞は、内因性ＭＣＪ分子を含まない１つまたは複数のがん細胞を含む。ある特定の実施形態では、複数のがん細胞は、内因性ＭＣＪ分子を含まない１つまたは複数のがん細胞および内因性Ｍ���Ｊ分子を含む１つまたは複数のがん細胞を含む。ある特定の実施形態では、ＭＣＪポリペプチドは、１つまたは複数のアセチル化アミノ酸残基を含む。幾つかの実施形態では、アセチル化アミノ酸残基は、リジン（Ｋ）残基であり、任意に、ＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１として記載されるアミノ酸配列と整列させた場合に、配列番号１として記載される配列におけるＫ２５位に相当する。
【０００４】
本発明の別の態様によれば、１つまたは複数の細胞においてがんを治療する方法が提供される。上記方法は、１つまたは複数のがん細胞を、有効量の少なくとも１つの外因性ＭＣＪアゴニスト化合物と接触させて、１つまたは複数のがん細胞においてがんを治療するステップを含む。幾つかの実施形態では、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物は、ＭＣＪ分子を含む。ある特定の実施形態では、ＭＣＪ分子は、ＭＣＪポリペプチドまたはＭＣＪポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のがん細胞を接触させるステップは、１つまたは複数のがん細胞を外因性ＭＣＪアゴニスト化合物と接触させる様式で、医薬組成物中の外因性ＭＣＪアゴニスト化合物を投与するステップを含む。幾つかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。幾つかの実施形態では、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物は、１つまたは複数のターゲティング剤を含む。幾つかの実施形態では、１つまたは複数のターゲティング剤は、細胞浸透性ペプチド、ミトコンドリアターゲティング剤、合成ポリペプチド、細胞内在化剤、ＨＩＶ由来のＴＡＴ配列、小分子、ポリヌクレオチド、リポソーム、ＰＥＧ化リポソーム、アクアソーム、生分解性ポリマー、ナノ粒子、オリゴヌクレオチド、またはポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、細胞内在化剤は、ＴＡＴポリペプチド配列を含み、任意にYGKKRRQRRG（配列番号９）として記載されるＴＡＴポリペプチド配列またはその変異体を含む。幾つかの実施形態では、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物は、１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング剤を含む。幾つかの実施形態では、１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング剤は、ミトコンドリアターゲティングペプチド、ミトコンドリアへ輸送されるナノ粒子、またはミトコンドリアのためのリポソームベースの送達システムを含む。幾つかの実施形態では、１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング剤は、ポリペプチドであり、任意に、該ポリペプチドは、GTRTWVPKGLKSP（配列番号１０）として記載されるアミノ酸配列またはその変異体を含む。幾つかの実施形態では、ミトコンドリアターゲティングペプチドは、FXRFXKFXRFXK（配列番号３７）として記載されるアミノ酸配列またはその変異体を含む。ある特定の実施形態では、ＭＣＪポリペプチドは、MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAKRPDADVDQQRLVRSL（配列番号１）、MAARGVIAPVGESLRYAEYL（配列番号２）、VIAPVGESL（配列番号３）、またはVGESLRYAEY（配列番号４）、MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAK＊RPDADVDQQRLVRSL（配列番号５）として記載される配列またはその変異体を含む。幾つかの実施形態では、配列番号１、２、３、４または５の変異体が、それぞれ、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、ＭＣＪポリペプチドの変異体は、配列番号１、２、３、４または５として記載されるＭＣＪポリペプチドアミノ酸配列の断片を含む。幾つかの実施形態では、ＭＣＪポリペプチド変異体は、ＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列の断片を含み、該断片は、それと整列するＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列��領域に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物は、YGKKRRQRRGMAARGVIAPVGESLRYAEYLGTRTWVPKGLKSP（配列番号６）、YGKKRRQRRGVIAPVGESLGTRTWVPKGLKSP（配列番号７）、YGKKRRQRRGVGESLRYAEYGTRTWVPKGLKSP（配列番号８）として記載されるアミノ酸配列またはその変異体を有するポリペプチドを含む。幾つかの実施形態では、１つまたは複数のがん細胞は、脊椎動物がん細胞であり、任意に哺乳動物がん細胞である。幾つかの実施形態では、１つまたは複数のがん細胞は、皮膚細胞、胸部組織細胞、筋細胞、循環細胞、結合組織細胞、骨細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、器官細胞、間充織細胞、結合組織細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、膠細胞、腺細胞、間質細胞、腎細胞、甲状腺細胞、幹細胞、造血細胞、リンパ球細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、心筋細胞、肝細胞、星状細胞、乏突起膠細胞、または脂肪細胞である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のがん細胞のがんは、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、神経膠腫、乳がん、卵巣がん、上皮がん、子宮がん、膣がん、前立腺がん、精巣がん、陰茎がん、結腸がん、直腸がん、子宮頸がん、咽喉がん、口腔がん、膵がん、腎臓がん、肝がん、肺がん、黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、頭頸部がん、胃がん、骨がん、結合組織がん、膀胱がん、眼がん、鼻腔がん、脂肪がん、甲状腺がん、非ホジキンリンパ腫、小腸がん、ウィルムス腫瘍、胃腸がん、ＣＮＳがん、ＰＮＳがん、食道がん、カポジ肉腫（Karposi sarcoma）、胆嚢がん、中皮腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、骨肉腫（osteoscarcoma）、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫（rhabdomyoscarcoma）、副鼻腔がん、網膜芽腫、および唾液がんである。幾つかの実施形態では、１つまたは複数のがん細胞は、内因性ＭＣＪ分子を含まない。幾つかの実施形態では、１つまたは複数のがん細胞は、内因性ＭＣＪ分子を含む。幾つかの実施形態では、１つまたは複数のがん細胞は、対象に存在する。ある特定の実施形態では、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物は、１つまたは複数のがん細胞においてミトコンドリアＡＴＰ生産を低減させる。幾つかの実施形態では、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物は、１つまたは複数のがん細胞においてＡＢＣ輸送体のレベルを減少させる。幾つかの実施形態では、上記方法はまた、１つまたは複数のがん細胞を、有効量の１つまたは複数の化学療法剤と接触させるステップをさらに含む。幾つかの実施形態では、１つまたは複数の化学療法剤は、タキサン、細胞傷害性薬物、アントラサイクリン、白金ベースの薬物、代謝拮抗物質、塩基類似体、ヌクレオシド類縁体、ヌクレオチド類似体、葉酸代謝拮抗薬、メトトレキサート、アルカロイド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、イリノテカン、エトポシド、ベルケイド、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、ブレオマイシン、シクロホスファミド、シトキサン、エベロリムス、またはメトホルミンである。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のがん細胞は、複数のがん細胞のうちの１つまたは複数である。幾つかの実施形態では、複数のがん細胞は、内因性ＭＣＪ分子を含まない１つまたは複数のが��細胞を含む。幾つかの実施形態では、複数のがん細胞は、内因性ＭＣＪ分子を含む１つまたは複数のがん細胞を含む。ある特定の実施形態では、複数のがん細胞は、内因性ＭＣＪ分子を含まない１つまたは複数のがん細胞、および内因性ＭＣＪ分子を含む１つまたは複数のがん細胞を含む。幾つかの実施形態では、ＭＣＪポリペプチドは、１つまたは複数のアセチル化アミノ酸残基を含む。幾つかの実施形態では、アセチル化アミノ酸残基は、リジン（Ｋ）残基であり、任意に、ＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１として記載されるアミノ酸配列と整列させた場合に、配列番号１として記載される配列におけるＫ２５位に相当する。
【０００５】
本発明のさらに別の態様によれば、治療中のがんにおける化学療法剤の有効性に対する外因性ＭＣＪアゴニストの効果を評価する方法が提供される。上記方法は、（ａ）試験がん細胞を、化学療法剤と接触させるステップと；（ｂ）試験がん細胞を、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物とさらに接触させるステップと；（ｃ）さらに接触させた試験がん細胞においてがんを治療する際の化学療法剤の有効性を決定するステップと；（ｄ）試験がん細胞に対する化学療法剤の決定された有効性を、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物と接触させない対照がん細胞においてがんを治療する際の化学療法剤の有効性と比較するステップとを含み、対照がん細胞においてがんを治療する際の化学療法剤の有効性と比較した、試験がん細胞においてがんを治療する際の化学療法剤の異なる有効性は、がんを治療する際の化学療法剤の有効性に対する外因性ＭＣＪアゴニスト化合物の効果を示す。幾つかの実施形態では、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物は、ＭＣＪ分子を含む。ある特定の実施形態では、ＭＣＪ分子は、ＭＣＪポリペプチドまたはＭＣＪポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物は、１つまたは複数のターゲティング剤を含む。幾つかの実施形態では、１つまたは複数のターゲティング剤は、ミトコンドリアターゲティング剤、細胞浸透性ペプチド、細胞内在化剤、合成ポリペプチド、ＨＩＶ由来のＴＡＴ配列、小分子、ポリヌクレオチド、リポソーム、ＰＥＧ化リポソーム、アクアソーム、生分解性ポリマー、ナノ粒子、オリゴヌクレオチド、またはポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、細胞内在化剤は、ＴＡＴポリペプチド配列を含み、任意にYGKKRRQRRG（配列番号９）として記載されるＴＡＴポリペプチド配列またはその変異体を含む。幾つかの実施形態では、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物は、１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング剤を含む。幾つかの実施形態では、１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング剤は、ミトコンドリアターゲティングペプチド、ミトコンドリアへ輸送されるナノ粒子、またはミトコンドリアのためのリポソームベースの送達システムを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング剤は、ポリペプチドであり、任意に、該ポリペプチドは、GTRTWVPKGLKSP（配列番号１０）として記載されるアミノ酸配列またはその変異体を含む。幾つかの実施形態では、ミトコンドリアターゲティングペプチドは、FXRFXKFXRFXK（配列番号３７）として記載されるアミノ酸配列またはその変異体を含む。幾つかの実施形態では、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物は、接触させた細胞においてミトコンドリアＡＴＰ生産を低減させる。幾つかの実施形態では、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物は、接触させた細胞においてＡＢＣ輸送体のレベルを減少させる。ある特定の実施形態では、ＭＣＪポリペプチドは、MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAKRPDADVDQQRLVRSL（配列番号１）、MAARGVIAPVGESLRYAEYL（配列番号２）、VIAPVGESL（配列番号３）、またはVGESLRYAEY（配列番号４）、MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAK＊RPDADVDQQRLVRSL（配列番号５）として記載される配列またはその変異体を含む。幾つかの実施形態では、配列番号１、２、３、４または５の変��体は、それぞれ、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、ＭＣＪポリペプチドの変異体は、配列番号１、２、３、４または５として本明細書中に記載されるＭＣＪポリペプチドアミノ酸配列の断片を含む。幾つかの実施形態では、ＭＣＪポリペプチド変異体は、ＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列の断片を含み、該断片は、それと整列するＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列の領域に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物は、YGKKRRQRRGMAARGVIAPVGESLRYAEYLGTRTWVPKGLKSP（配列番号６）、YGKKRRQRRGVIAPVGESLGTRTWVPKGLKSP（配列番号７）、YGKKRRQRRGVGESLRYAEYGTRTWVPKGLKSP（配列番号８）として記載されるアミノ酸配列またはその変異体を有するポリペプチドを含む。幾つかの実施形態では、がん細胞は、脊椎動物がん細胞であり、任意に哺乳動物がん細胞である。幾つかの実施形態では、がん細胞は、皮膚細胞、胸部組織細胞、筋細胞、循環細胞、結合組織細胞、骨細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、器官細胞、間充織細胞、結合組織細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、膠細胞、腺細胞、間質細胞、腎細胞、甲状腺細胞、幹細胞、造血細胞、リンパ球細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、心筋細胞、肝細胞、星状細胞、乏突起膠細胞、または脂肪細胞である。ある特定の実施形態では、がん細胞のがんは、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、神経膠腫、乳がん、卵巣がん、上皮がん、子宮がん、膣がん、前立腺がん、精巣がん、陰茎がん、結腸がん、直腸がん、子宮頸がん、咽喉がん、口腔がん、膵がん、腎臓がん、肝がん、肺がん、黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、頭頸部がん、胃がん、骨がん、結合組織がん、膀胱がん、眼がん、鼻腔がん、脂肪がん、甲状腺がん、非ホジキンリンパ腫、小腸がん、ウィルムス腫瘍、胃腸がん、ＣＮＳがん、ＰＮＳがん、食道がん、カポジ肉腫（Karposi sarcoma）、胆嚢がん、中皮腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、骨肉腫（osteoscarcoma）、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫（rhabdomyoscarcoma）、副鼻腔がん、網膜芽腫、および唾液がんである。幾つかの実施形態では、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物は、接触させた試験細胞においてミトコンドリアＡＴＰ生産を低減させる。幾つかの実施形態では、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物は、接触させた試験がん細胞においてＡＢＣ輸送体のレベルを減少させる。幾つかの実施形態では、化学療法剤は、タキサン、アントラサイクリン、白金ベースの薬物、代謝拮抗物質、塩基類似体、ヌクレオシド類縁体、ヌクレオチド類似体、葉酸代謝拮抗薬、メトトレキサート、アルカロイド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、イリノテカン、エトポシド、ベルケイド、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、ブレオマイシン、シクロホスファミド、シトキサン、エベロリムス、またはメトホルミンである。ある特定の実施形態では、試験がん細胞は、内因性ＭＣＪ分子を含まない。幾つかの実施形態では、試験がん細胞は、内因性ＭＣＪ分子を含む。幾つかの��施形態では、試験がん細胞が、内因性ＭＣＪ分子を含まない場合には、対照細胞は、内因性ＭＣＪ分子を含まず、試験がん細胞が、内因性ＭＣＪ分子を含む場合には、対照細胞は、内因性ＭＣＪ分子を含む。ある特定の実施形態では、ＭＣＪポリペプチドは、１つまたは複数のアセチル化アミノ酸残基を含む。幾つかの実施形態では、アセチル化アミノ酸残基は、リジン（Ｋ）残基であり、任意に、ＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１として記載されるアミノ酸配列と整列させた場合に、配列番号１として記載される配列におけるＫ２５位に相当する。
【０００６】
本発明の別の態様によれば、組成物が提供される。上記組成物は、１つまたは複数のＭＣＪ分子、１つまたは複数のターゲティング剤、および任意に１つまたは複数の細胞内在化剤を含む１つまたは複数のＭＣＪアゴニスト化合物を含む。幾つかの実施形態では、ＭＣＪ分子は、ＭＣＪポリペプチドである。ある特定の実施形態では、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物は、１つまたは複数のターゲティング剤を含む。幾つかの実施形態では、１つまたは複数のターゲティング剤は、細胞浸透性ペプチド、合成ポリペプチド、細胞内在化剤、ＨＩＶ由来のＴＡＴ配列、小分子、ポリヌクレオチド、リポソーム、ＰＥＧ化リポソーム、アクアソーム、生分解性ポリマー、ナノ粒子、オリゴヌクレオチド、またはポリペプチドを含む。幾つかの実施形態では、細胞内在化剤は、ＴＡＴポリペプチド配列を含み、任意にYGKKRRQRRG（配列番号９）として記載されるＴＡＴポリペプチド配列またはその変異体を含む。ある特定の実施形態では、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物は、１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング剤を含む。幾つかの実施形態では、１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング剤は、ミトコンドリアターゲティングペプチド、ミトコンドリアへ輸送されるナノ粒子、またはミトコンドリアのためのリポソームベースの送達システムを含む。幾つかの実施形態では、１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング剤は、ポリペプチドであり、任意に、該ポリペプチドは、GTRTWVPKGLKSP（配列番号１０）として記載されるアミノ酸配列またはその変異体を含む。幾つかの実施形態では、ミトコンドリアターゲティングペプチドは、FXRFXKFXRFXK（配列番号３７）として記載されるアミノ酸配列またはその変異体を含む。ある特定の実施形態では、ＭＣＪポリペプチドは、MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAKRPDADVDQQRLVRSL（配列番号１）、MAARGVIAPVGESLRYAEYL（配列番号２）、VIAPVGESL（配列番号３）、またはVGESLRYAEY（配列番号４）、MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAK＊RPDADVDQQRLVRSL（配列番号５）として記載される配列またはその変異体を含む。幾つかの実施形態では、配列番号１、２、３、４または５の変異体は、それぞれ、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、ＭＣＪポリペプチドの変異体は、配列番号１、２、３、４または５として記載されるＭＣＪポリペプチドアミノ酸配列の断片を含む。幾つかの実施形態では、ＭＣＪポリペプチド変異体は、ＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列の断片を含み、該断片は、それと整列するＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列の領域に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、ＭＣＪポリペプチドは、１つまたは複数のアセチル化アミノ酸残基を含む。幾つかの実施形態では、アセチル化アミノ酸残基は、リジン（Ｋ）残基であり、任意に、ＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１として記載されるアミノ酸配列と整列させた場合に、配列番号１として記載される配列におけるＫ２５位に相当する。
【０００７】
本発明のさらに別の態様によれば、医薬組成物が提供される。上記医薬組成物は、本発明の上述の組成物の任意の実施形態を含み、任意にまた、薬学的に許容される担体を含む。
【０００８】
本発明の別の態様によれば、がん細胞を死滅させる方法が提供される。上記方法は、がん細胞を、がん細胞を死滅させるのに有効な量で本発明の上述の組成物の任意の実施形態と接触させるステップを含む。幾つかの実施形態では、がん細胞は、内因性ＭＣＪ分子を含まない。幾つかの実施形態では、がん細胞は、内因性ＭＣＪ分子を含む。ある特定の実施形態では、がん細胞は、対象に存在する。幾つかの実施形態では、対象は、哺乳動物であり、任意にヒトである。
配列の簡単な説明
配列番号１は、４０個のアミノ酸のＮ末端ＭＣＪポリペプチドである：
MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAKRPDADVDQQRLVRSL。
【０００９】
配列番号２は、２０個のアミノ酸のＮ末端ＭＣＪポリペプチドである：MAARGVIAPVGESLRYAEYL。
配列番号３は、９個のアミノ酸のＭＣＪポリペプチドである：VIAPVGESL。
【００１０】
配列番号４は、１０個のアミノ酸のＭＣＪポリペプチドである：VGESLRYAEY。
配列番号５は、２５位にアセチル化リジンを有する配列番号１の４０個のアミノ酸ポリペプチドである：MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAK＊RPDADVDQQRLVRSL。（注釈  Ｋ＊は、アセチル化アミノ酸残基である）
配列番号６は、配列番号２として記載されるアミノ酸配列、ＴＡＴアミノ酸配列およびミトコンドリア送達アミノ酸配列を有するＭＣＪアゴニスト化合物であり、それは、本明細書中でＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳポリペプチドとも称される：
YGKKRRQRRGMAARGVIAPVGESLRYAEYLGTRTWVPKGLKSP。
【００１１】
配列番号７は、配列番号３として記載されるアミノ酸配列、ＴＡＴアミノ酸配列およびミトコンドリア送達アミノ酸配列を有するＭＣＪアゴニスト化合物である：YGKKRRQRRGVIAPVGESLGTRTWVPKGLKSP。
【００１２】
配列番号８は、配列番号４として記載されるアミノ酸配列、ＴＡＴアミノ酸配列およびミトコンドリア送達アミノ酸配列を有するＭＣＪアゴニスト化合物である：YGKKRRQRRGVGESLRYAEYGTRTWVPKGLKSP。
【００１３】
配列番号９は、「Ｇ」スペーサーアミノ酸が最終アミノ酸位置において付加されたＴＡＴターゲティングポリペプチドのアミノ酸配列である：YGKKRRQRRG。
配列番号１０は、「Ｇ」スペーサーアミノ酸が最初のアミノ酸位置において付加されたミトコンドリア送達ポリペプチドのアミノ酸配列である：GTRTWVPKGLKSP。
【００１４】
配列番号１１は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＡＡＤ３８５０６．１として記載されるヒトＤＮＡＪドメイン含有タンパク質ＭＣＪのアミノ酸配列である。
MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAKRPDADVDQQGLVRSLIAVGLGVAALAFAGRYAFRIWKPLEQVITETAKKISTPSFSSYYKGGFEQKMSRREAGLILGVSPSAGKAKIRTAHRRVMILNHPDKGGSPYVAAKINEAKDLLETTTKH。
【００１５】
配列番号１２は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＡＦ１２６７４３．１として記載されるヒトＤＮＡＪドメイン含有タンパク質ＭＣＪのｍＲＮＡ配列である。
ggtcaggaaagctcaggcaagcccaccctcaggcattacagctagactccgagcttactgggcagtcatctgattcgaccaacatcagttcgcagggcttaagcccagtcccttacggcggctggggagggaccaggcccaagtatataaagctccctgagggtccgcgttggctttgcgcctgtgagtgtgattcaagaacgtcccagtgcccttggctcctttcggagtgtgaccccgtgcttgcacgggacacgttacccagctcgggtgagaagggtatcttccgggaacctcgcctttaatagcacaacgagcgcagagtccactggatctgcgagaagaaaccgcgctaactagtttgtccctacggccgcctcgtagtcactgccgcggcgccttgagtctccgggccgccttgccatggctgcccgtggtgtcatcgctccagttggcgagagtttgcgctacgctgagtacttgcagccctcggccaaacggccagacgccgacgtcgaccagcagggactggtaagaagtttgatagctgtaggactgggtgttgcagctcttgcatttgcaggtcgctacgcatttcggatctggaaacctctagaacaagttatcacagaaactgcaaagaagatttcaactcctagcttttcatcctactataaaggaggatttgaacagaaaatgagtaggcgagaagctggtcttattttaggtgtaagcccatctgctggcaaggctaagattagaacagctcataggagagtcatgattttgaatcacccagataaaggtggatctccttacgtagcagccaaaataaatgaagcaaaagacttgctagaaacaaccaccaaacattgatgcttaaggaccacactgaaggaaaaaaaaagaggggacttcgaaaaaaaaaaaagccctgcaaaatattctaaaacatggtcttcttaattttctatatggattgaccacagtcttatcttccaccattaagctgtataacaataaaatgttaatagtcttgctttttattatcttttaaagatctccttaaattct。
【００１６】
配列番号１３は、マウスＤＮＡＪドメイン含有タンパク質ＭＣＪのアミノ酸配列である。
MATGGGVTSRESLRYAEYLPPSAQRSDADIDHTAGRRLIAVGLGVAAVAFAGRYAFQIWKPLEQVITATARKISSPSFSSYYKGGFEQKMSKREASLILGVSPSAGKAKIRTAHKRIMILNHPDKGGSPYVASKINEAKDLLEASSKAN。
【００１７】
配列番号１４は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＡＡＨ９５４００．１として記載されるサブファミリーＣのヒトＤｎａＪ（Ｈｓｐ４０）ホモログのアミノ酸配列である。
MAARGVIAPV GESLRYAEYL QPSAKRPDAD VDQQRLVRSL IAVGLGVAAL AFAGRYAFRI WKPLEQVITE TAKKISTPSF SSYYKGGFEQ KMSRREAGLI LGVSPSAGKA KIRTAHRRVM ILNHPDKGGS PYVAAKINEA KDLLETTTKH。
【００１８】
配列番号１５は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＢＣ０９５４００．１として記載されるサブファミリーＣのヒトＤｎａＪ（Ｈｓｐ４０）ホモログのヌクレオチド配列である。
agtctccgggccgccttgccatggctgcccgtggtgtcatcgctccagttggcgagagtttgcgctacgctgagtacttgcagccctcggccaaacggccagacgccgacgtcgaccagcagagactggtaagaagtttgatagctgtaggcctgggtgttgcagctcttgcatttgcaggtcgctacgcatttcggatctggaaacctctagaacaagttatcacagaaactgcaaagaagatttcaactcctagcttttcatcctactataaaggaggatttgaacagaaaatgagtaggcgagaagctggtcttattttaggtgtaagcccatctgctggcaaggctaagattagaacagctcataggagagtcatgattttgaatcacccagataaaggtggatctccttacgtagcagccaaaataaatgaagcaaaagacttgctagaaacaaccaccaaacattgatgcttaaggaccacactgaaggaaaaaaaaagaggggacttcaaaaaaaaaaaaaaagccctgcaaaatattctaaaacatggtcttcttaattttctatatggattgaccacagtcttatcttccaccattaagctgtataacaataaaatgttaatagtcttgctttttattatcttttaaagatctccttaaattctataactgatcttttttcttattttgtttgtgacattcatacatttttaagatttttgttatgttctgaattcccccctacacacacacacacacacacacacacacacgtgcaaaaaatatgatcaagaatgcaattgggatttgtgagcaatgagtagacctcttattgtttatatttgtaccctcattgtcaatttttttttagggaatttgggactctgcctatataaggtgttttaaatgtcttgagaacaagcactggctgatacctcttggagatatgatctgaaatgtaatggaatttattaaatggtgtttagtaaagtaggggttaaggacttgttaaagaaccccactatctctgagaccctatagccaaagcatgaggacttggagagctactaaaatgattcaggtttacaaaatgagccctgtgaggaaaggttgagagaagtctgaggagtttgtatttaattatagtcttccagtactgtatattcattcattactcattctacaaatatttattgaccccttttgatgtgcaaggcactatcgtgcgtcccctgagagttgcaagtatgaagcagtcatggatcatgaaccaaaggaacttatatgtagaggaaggataaatcacaaatagtgaatactgttagatacagatgatatattttaaaagttcaaaggaagaaaagaatgtgttaaacactgcatgagaggaggaataagtggcatagagctaggctttagaaaagaaaaatattccgataccatatgattggtgaggtaagtgttattctgagatgagaattagcagaaatagatatatcaatcggagtgattagagtgcagggtttctggaaagcaaggtttggacagagtggtcatcaaaggccagccctgtgacttacactgcattaaattaatttcttagaacatagtccctgatcattatcactttactattccaaaggtgagagaacagattcagatagagtgccagcattgtttcccagtattcctttacaaatcttgggttcattccaggtaaactgaactactgcattgtttctatcttaaaatactttttagatatcctagatgcatctttcaacttctaacattctgtagtttaggagttctcaaccttggcattattgacatgttaggccaaataattttttttgtgggaggtctcttgtgcgttttagatgattagcaataatccctgacctgttatctactaaagactagtcgtttctcatcagttgtgacaacaaaaatggttccagatattgccaaatgccctttagaggacagtaatcgcccccagttgagaaccatttcagtaaaactttaattactattttttcttttggtttataaaataatgatcctgaattaaattgatggaaccttgaagtcgataaaatatatttcttgctttaaagtccccatacgtgtcctactaattttctcatgctttagtgttttcacttttctcctgttatccttgtacctaagaatgccatcccaatccccagatgtccacctgcccaaagtctaggcatagctgaaggccaagctaaaatgtatccctctttttctggtacatgcagcaaaagtaatatgaattatcagctttctgagagcaggcattgtatctgtcttgtttggtgttacattggcacccaataaatatttgttgagcgaaaaaaaaaaaaaaa。
【００１９】
配列番号１６は、２１個のアミノ酸であり、そのＣ末端に「Ｃ」残基を含むＮ末端ＭＣＪポリペプチドである：MAARGVIAPVGESLRYAEYLC。
配列番号１７は、３８個のアミノ酸のＭＣＪポリペプチドである：MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAKRPDADVDQQRLVR。
【００２０】
配列番号１８は、ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列である：YGKKRRQRRGMAARGVIAPVGESLRYAEYL。
配列番号１９  MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAKRPDA。
配列番号２０  MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSA。
配列番号２１  MAARGVIAPVGESLRYAE。
配列番号２２  RGVIAPVGESLRYAEYLC。
配列番号２３  AARGVIAPVGESLRYAEYL。
配列番号２４  MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAKRPDADV。
配列番号２５  MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAKRPDADVDQQGLVRS。
配列番号２６  MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAKRPDADVDQQGL。
配列番号２７  MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAKRPDADVD。
配列番号２８  MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAK。
配列番号２９  MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAKRPDAD。
配列番号３０  MAARGVIAPVGESLRYAEYLQP。
配列番号３１  MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAKR。
配列番号３２  GVIAPVGESLRYAEYL。
配列番号３３  ARGVIAPVGESLRYAEYL。
配列番号３４  VIAPVGESLRYAEYL。
配列番号３５  MAARGVIAPVGES。
【００２１】
配列番号３６は、ＴＡＴターゲティングポリペプチドのアミノ酸配列である：YGKKRRQRR。
配列番号３７は、ミトコンドリア送達ポリペプチドのアミノ酸配列である：TRTWVPKGLKSP。
【００２２】
配列番号３８は、ＭＩＴＯ−Ｎ−ＭＣＪのアミノ酸配列である。配列において、「FX」は、シクロヘキシルアラニンである：FxRFxKFxRFxKMAARGVIAPVGESLRYAEYL。
配列番号３９は、シクロヘキシルアラニン含有配列である：FXRFXKFXRFXK。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】培地単独で（Ｍｅｄ）または培地＋５０μΜ濃度のＭＣＪポリペプチド（Ｎ−ＭＣＪ、配列番号２）；ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪポリペプチド（ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ、配列番号１８）；もしくはＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳポリペプチド（ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳ、配列番号６）において３日間インキュベートした（標準的な手順を使用して）ＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞からの結果を示すグラフを示す図である。他のインキュベーション条件下よりもＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳポリペプチドとともにインキュベートした細胞セットにいて、著しく多い細胞死が見られた。
【図２】図２Ａ〜Ｂは、ＭＣＦ７（図２Ａ）またはＭＣＦ７／ＡＤＲ（図２Ｂ）を１０μΜまたは５０μΜ濃度のＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳポリペプチド（配列番号６）を含む培地においてインキュベートした場合に、細胞を培地単独において、または１μΜ濃度のＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳポリペプチドにおいてインキュベートした場合よりも、細胞数において著しく大きな低減を示す２つのグラフを示す図である。
【図３】欄（１）培地単独；欄（２）５０μΜ濃度のＮ−ＭＣＪポリペプチド（配列番号２）を含む培地；欄（３）５０μΜ濃度のＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪポリペプチド（配列番号１８）を含む培地；および欄（４）５０μΜ濃度のＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳポリペプチド（配列番号６）を含む培地において２日インキュベートしたＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞の顕微鏡写真画像を提供する図である。
【図４】がん細胞においてミトコンドリア呼吸を低減させることによって、化学療法剤に対する細胞の感受性が回復／増加することを示す結果を示す図である。共焦顕微鏡検査画像および分析により、ドキソルビシンおよびオリゴマイシンで処理したＭＣＦ７／ｓｉＭＣＪ細胞（ここで、ＭＣＪ発現は、ＭＣＪに関するｓｈＲＮＡによって破壊された）においてのみ、ドキソルビシン蓄積が示された。
【図５】様々な濃度のＮ−ＭＣＪアゴニストポリペプチド（配列番号２８）に対する複合体Ｉ阻害％のグラフを提供する図である。グラフは、種々の濃度のＭＣＪポリペプチドを有するｓｉＭＣＪ／ＭＣＦ７細胞からのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのミトコンドリア抽出物をインキュベートすることによって、ペプチドを有さない抽出物からの活性に対して複合体Ｉ活性が阻害されることを示す。
【図６】化学療法剤ドキソルビシンおよび３つのＭＣＪアゴニスト化合物：Ｐ１：配列番号２として記載されるアミノ酸配列を有するＮ−ＭＣＪ；Ｐ２：配列番号１８として記載されるアミノ酸配列を有するＴＡＴ−ＭＣＪ；およびＰ３：配列番号６として記載されるアミノ酸配列を有するＴＡＴ−ＭＣＪ−ＭＴＳの種々の組合せを含むおよび含まない培地において内因性ＭＣＪが欠如したＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞をインキュベートすることによって得られる結果を示すグラフを提供する図である。グラフはまた、培地単独またはドキソルビシンを含む培地のいずれかにおいて処理されたＭＣＦ７細胞から得られる結果を示す。
【図７】培地単独［Ｍｅｄ］、ドキソルビシンを含有する培地［Ｄｏｘ］；配列番号６のアミノ酸配列を有するＴＡＴ−ＭＣＪ−ＭＴＳポリペプチドを含有する培地［ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳ］；ならびにＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳポリペプチド（配列番号６）およびドキソルビシンを含有する培地［ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳ  Ｄｏｘ］においてＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞をインキュベートすることによって得られる結果を示すグラフを提供する図である。
【図８】ＭＣＪポリペプチド欠損乳房腫瘍がｉｎ  ｖｉｖｏで化学療法処理に対して耐性であることを実証する結果のグラフを提供する図である。ＭＭＴＶ（ｎ＝４）およびＭＣＪ  ＫＯ  ＭＭＴＶ（ｎ＝４）マウスを、１日おきに２週間、ｉ．ｐ．投与によってドキソルビシン（２ｍｇ／Ｋｇ）で処理して、経時的な腫瘍サイズの変化を決定した。グラフは、ＭＭＴＶマウスにおける腫瘍サイズが、ドキソルビシンの処理によって経時的に減少した一方で、内因性ＭＣＪポリペプチドを欠損するＭＣＪ  ＫＯ  ＭＭＴＶマウスにおける腫瘍サイズは、減少せず、ドキソルビシン処理とともに経時的に増加し続けたことを示す。
【図９】ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳポリペプチドによるｉｎ  ｖｉｖｏでの処理が、化学療法に対するＭＣＪポリペプチド欠損乳房腫瘍の応答を増加させたことを実証する実験からの結果のグラフを提供する図である。ＭＣＪ  ＫＯ  ＭＭＴＶマウスは、ドキソルビシン単独で（Ｄｏｘ）、または配列番号６として記載されるアミノ酸を有するＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳポリペプチドと組み合わせて（Ｄｏｘ＋ｐｅｐ）処理した。図９は、内因性ＭＣＪポリペプチドが欠如したがん細胞を含む腫瘍を有するマウスに、ＭＣＪアゴニスト化合物および化学療法剤を投与することが、ＭＣＪアゴニスト化合物を投与されない類似のマウスに化学療法剤を投与することよりも腫瘍サイズの大きな低減をもたらしたことを示す。
【図１０】ＭＣＪ  ＫＯ  ＭＭＴＶマウスを、ドキソルビシン（２ｍｇ／Ｋｇ）単独［Ｄｏｘ］、ＭＣＪアゴニスト化合物：本明細書中で配列番号６として記載されるアミノ酸配列を有するＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳポリペプチドと組み合わせたドキソルビシン［Ｄｏｘ／ｐｅｐ］；またはＭＣＪアゴニスト化合物（配列番号６）と組み合わせたドキソルビシン（ここで、ｄｏｘおよびＭＣＪアゴニスト化合物処理の４日後に、ＭＣＪ化合物処理を停止して、ドキソルビシン処理のみを続けた）［Ｄｏｘ／ｐｅｐ＋４ｄ−］で処理した場合に得られる結果を示すグラフを提供する図である。図１０は、３つの処理のうちで、ＭＣＪアゴニスト化合物を組み合わせたドキソルビシン［ｄｏｘ／ｐｅｐ］での処理が、腫瘍サイズを低減させるのに最も成功したことを示す。
【図１１Ａ】カプラン−マイヤープロッター（ｋｍｐｌｏｔ．ｃｏｍ）データベースを使用した乳がんにおける無再発生存（ＲＦＳ）に関するカプランマイヤー曲線を提供する図である。「低ＭＣＪ」は、最も低い四分位数でＭＣＪを発現する腫瘍を有する患者を指す一方で、「高ＭＣＪ」は、他の全ての患者（上位３つの四分位数におけるＭＣＪ発現）を含む。図１１Ａは、施される療法に関係なく全ての患者を含む（ｎ＝１，６６０）。ハザード比（ＨＲ）およびログランクｐ値が示される。
【図１１Ｂ】カプラン−マイヤープロッター（ｋｍｐｌｏｔ．ｃｏｍ）データベースを使用した乳がんにおける無再発生存（ＲＦＳ）に関するカプランマイヤー曲線を提供する図である。「低ＭＣＪ」は、最も低い四分位数でＭＣＪを発現する腫瘍を有する患者を指す一方で、「高ＭＣＪ」は、他の全ての患者（上位３つの四分位数におけるＭＣＪ発現）を含む。図１１Ｂは、化学療法で治療されることがわかっている全ての患者を含む（ｎ＝１０４）。ハザード比（ＨＲ）およびログランクｐ値が示される。
【図１１Ｃ】カプラン−マイヤープロッター（ｋｍｐｌｏｔ．ｃｏｍ）データベースを使用した乳がんにおける無再発生存（ＲＦＳ）に関するカプランマイヤー曲線を提供する図である。「低ＭＣＪ」は、最も低い四分位数でＭＣＪを発現する腫瘍を有する患者を指す一方で、「高ＭＣＪ」は、他の全ての患者（上位３つの四分位数におけるＭＣＪ発現）を含む。図１１Ｃは、内分泌療法を受けたことがわかっている全ての患者を含む（ｎ＝１８５）。ハザード比（ＨＲ）およびログランクｐ値が示される。
【図１１Ｄ】カプラン−マイヤープロッター（ｋｍｐｌｏｔ．ｃｏｍ）データベースを使用した乳がんにおける無再発生存（ＲＦＳ）に関するカプランマイヤー曲線を提供する図である。「低ＭＣＪ」は、最も低い四分位数でＭＣＪを発現する腫瘍を有する患者を指す一方で、「高ＭＣＪ」は、他の全ての患者（上位３つの四分位数におけるＭＣＪ発現）を含む。図１１Ｄは、化学療法を受けたことがわかっているトリプルネガティブ（ＴＮ）患者のみを含む（ｎ＝５３）。ハザード比（ＨＲ）およびログランクｐ値が示される。
【図１２】図１２Ａ〜Ｂは、ＭｉｔｏＳｔｒｅｓｓアッセイ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ビレリカ、ＭＡ）からの結果のグラフを提供する図である。図１２Ａは、ヒト乳がんＭＣＦ７細胞において、およびＭＣＦ７／ｓｉＭＣＪ細胞において、ＭｉｔｏＳｔｒｅｓｓアッセイを使用して決定した酸素消費速度（ＯＣＲ）分析の結果を示す。図１２Ｂは、乳房腫瘍が野生型ＭＭＴＶ（ＷＴ）およびＭＣＪ  ＫＯ  ＭＭＴＶ（ＭＣＪ  ＫＯ）マウスから収集された場合の結果を示し、腫瘍細胞は、図１２Ａに関して記載するように、ＯＣＲ分析のために単離および使用した。
【図１３】ＭＣＪポリペプチド（上部）；ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ｍｔｓポリペプチド（中央）；およびＭＩＴＯ−Ｎ−ＭＣＪポリペプチド（下部）を示す模式図である。ある特定の配列領域が示される。
【図１４】図１４Ａ〜Ｃは、ＯＣＲに対するＭＣＪアゴニストポリペプチドの効果および細胞の呼吸容量を示すグラフを提供する図である。図１４Ａ〜Ｂは、ＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞をＳｅａｈｏｒｓｅ培養プレート上で一晩、平板培養した場合の結果を示す。細胞は、本明細書中で他に記載するようなＭｉｔｏＳｔｒｅｓｓアッセイ前の最後の９時間、培地単独（培地）、ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ｍｔｓペプチド（ＴＡＴペプチド）（５０μΜ）（図１４Ａ）またはＭＩＴＯ−Ｎ−ＭＣＪペプチド（Ｍｉｔｏペプチド）（２５μΜ）（図１４Ｂ）で前処理した。製造業者（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ビレリカ、ＭＡ）により推奨されるような処理に関する標準的なフローチャートを使用した：オリゴマイシン（Ｏ）、ＦＣＣＰ（Ｆ）ならびにロテノンおよびアンチマイシン（Ｒ＋Ａ）。図１４Ｃは、ＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞をＳｅａｈｏｒｓｅ培養プレート上で２４時間、平板培養して、ＭｉｔｏＳｔｒｅｓｓアッセイを使用してＯＣＲに関して直接アッセイした場合の結果を示す。オリゴマイシンを、ビヒクル（緩衝液）またはＭＩＴＯ−Ｎ−ＭＣＪペプチドで置き換えた。
【図１５】図１５Ａ〜Ｃは、アゴニストポリペプチドによる処理が、乳がん細胞において化学療法耐性を克服し得ることを実証するブロットおよびグラフを提供する図である。図１５Ａは、ＭＣＦ７細胞およびＭＣＦ７／ＡＤＲ（ＡＤＲ）細胞におけるＭＣＪに関するウェスタンブロット分析の結果を提供する図である。アクチンは、負荷対照として使用した。図１５Ｂは、ＭＣＲ７／ＡＤＲ細胞（８×１０４個）を平板培養して、１８〜２０時間後に、培地単独、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）（３μΜ）、ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ｍｔｓペプチド（５０μΜ）またはＭＩＴＯ−Ｎ−ＭＣＪペプチド（２５のμΜ）で処理した場合の結果を示す。生細胞を２日後に計数した。図１５Ｃは、図１５Ｂに関して記載するように、ＭＣＦ７細胞（８×１０４個）を平板培養、処理、収集および計数した結果を示す。
【図１６】図１６Ａ〜Ｂは、ＭＣＪアゴニストに対する応答を示すグラフを提供する図である。図１６Ａは、ＭＣＲ７／ＡＤＲ細胞（８×１０４個）を平板培養して、１８〜２０時間後に、培地単独、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）（３μΜ）、ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ｍｔｓペプチド（５μΜ）またはその両方の組合せで処理した場合の結果を示す。細胞を２日後に収集して、生細胞を計数した。図１６Ｂは、ＭＣＪ  ＫＯ  ＭＭＴＶマウス（ｎ＝３）を、０日目、２日目および３日目に、ｉ．ｐ．投与によってドキソルビシン単独（Ｄｏｘ）（２ｍｇ／Ｋｇ）でまたはｓ．ｃ．投与したＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ｍｔｓペプチド（１０ｍｇ／Ｋｇ）と組み合わせて処理した場合の結果を示す。マウスを４日目に収集した。経時的な腫瘍のサイズを、カリパス測定で決定して、処理前の初期サイズに対する百分率として表す。対応のあるｔ検定によって決定される場合にｐ＜０．０５。
【図１７】図１７Ａ〜Ｄは、ＡＭＬのＭＣＪアゴニスト阻害を示す結果のグラフを提供する図である。図１７Ａ〜Ｂは、Ｍｏｌｍ１３細胞（１０４個の細胞）を、培地、ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ｍｔｓペプチド（ＴＡＴ）（２５μΜ）、ＭＩＴＯ−Ｎ−ＭＣＪペプチド（２５μΜ）、ＡＣ２２０（２ｎＭ）またはペプチドとＡＣ２２０との組合せの存在下でインキュベートした場合の結果を示す。生細胞の数を３日後に測定した。図１７Ｂは、図１７ＡにおけるＡＣ２２０からの処理細胞に関する単離結果を示す。図１７Ｃは、図１７Ａと同様に（但し、ＴＡＴは５０μＭで使用した）処理したＭｏｌｍ１３細胞からの結果を示し、２２時間後に、細胞をＴＭＲＥで標識して、フローサイトメトリーによって検査した。ＴＭＲＥに関して陰性である生細胞（ＴＭＲＥｎｅｇ）の百分率が示される。図１７Ｄは、図１７Ｃと同様に処理したＭｏｌｍ１３細胞からの結果を示し、２２時間後に、細胞をｍｉｔｏ−ＰＹ１で標識して、フローサイトメトリーによって検査した。生ＰＹ１＋細胞の百分率が示される。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
がんの複雑で変化する性質に起因して、がんの発達および／またはその治療で役割を果たし得る多様な生理的メカニズムを理解することは、困難なままである。がん細胞のＭＣＪポリペプチドの考え得る生理的効果は、これまでに研究されており、がん細胞におけるＭＣＪポリペプチドの増加レベルと、腫瘍成長の増加との間の正相関が報告されており、がん細胞におけるＭＣＪレベルを増加させるための処理が、がんを治療するのに無効であるだけでなく、ＭＣＪは、腫瘍成長を増加させる可能性が高いことも示唆している。驚くべきことに、１つまたは複数のがん細胞へのＭＣＪアゴニスト化合物および化学療法剤の投与が、がん細胞死を増加させて、がんを治療することが、ここで確認された。本発明のある特定の態様では、がん細胞および／またはがんを有する対象へのＭＣＪアゴニスト化合物および化学療法剤の投与は、化学療法剤が、投与されるＭＣＪアゴニスト化合物の非存在下でがん細胞へ投与される場合に発生するよりも、多くのがん細胞死が治療によって起こる相乗的な治療効果をもたらし得る。また、予期せぬことに、がん細胞へのＭＣＪアゴニスト化合物の投与は、がん細胞の死をもたらし得ることも、ここで確認された。したがって、本発明のある特定の態様は、１つまたは複数のがん細胞を、細胞、組織または対照におけるがんを治療するための１つまたは複数のＭＣＪアゴニスト化合物と接触させるステップを含む。
【００２５】
ある特定のＭＣＪアゴニスト化合物を含む方法および化合物が、がんを治療して、および／または化学療法剤に対するがん細胞感受性を増加させるのに使用され得ることをここで発見した。メチル化制御Ｊタンパク質（ＭＣＪ）は、１５０個のアミノ酸の小タンパク質であり、ＤｎａＪＣファミリーの特有の成員である。ＭＣＪは、一般的なＮ末端位置とは対照的に、Ｃ末端に位置するＪ−ドメインを含有し、ＭＣＪのＮ末端領域は、他の公知のタンパク質と相同性を有さない。さらに、ＭＣＪはまた、膜貫通ドメインを含有するが、大部分のＤｎａＪタンパク質は可溶性である。ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＡＡＤ３８５０６．１のヒトＤＮＡＪドメイン含有タンパク質ＭＣＪのアミノ酸配列は、本明細書中で配列番号１１として記載される。配列番号１２は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＡＦ１２６７４３．１として記載されるヒトＤＮＡＪドメイン含有タンパク質ＭＣＪのｍＲＮＡ配列である。ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＡＡＨ９５４００．１は、本明細書中で配列番号１４として提供されるサブファミリーＣのヒトＤｎａＪ（Ｈｓｐ４０）ホモログのアミノ酸配列である。配列番号１５は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＢＣ０９５４００．１として記載されるサブファミリーＣのヒトＤｎａＪ（ＨＳＰ４０）ホモログのヌクレオチド配列である。
【００２６】
本発明は、一つには、細胞、組織および対象におけるがんを治療するのに有用な方法およびＭＣＪアゴニスト化合物に関する。本発明のある特定の態様では、ＭＣＪアゴニスト化合物は、ＭＣＪポリペプチドまたはＭＣＪポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであるＭＣＪ分子を含み、任意に１つまたは複数のターゲティング剤を含み、任意に１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング剤を含む。本発明のある特定の実施形態では、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物による処理は、１つまたは複数のがん細胞を、１つまたは複数のＭＣＪ分子と接触させるステップを含んでもよく、ここで接触させるステップは、細胞において化学療法薬感受性を増加させて、化学療法剤に対する細胞の耐性を減少させる。本発明のある態様の実施形態では、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物による処理は、１つまたは複数のがん細胞を、１つまたは複数の外因性ＭＣＪ分子と接触させるステップを含んでもよく、ここで接触は、接触させたがん細胞の１つまたは複数の死をもたらす。
【００２７】
「外因性」という用語は、ＭＣＪアゴニスト化合物またはＭＣＪ分子に関して本明細書中で使用する場合、がん細胞に投与される化合物または分子を意味する。したがって、例えば、同じＭＣＪ分子が細胞中で天然に存在する場合でさえ、細胞に投与されるＭＣＪポリペプチドは、外因性ＭＣＪ分子である。本明細書中では、細胞における天然の発現に起因して細胞中に存在するＭＣＪ分子を、内因性ＭＣＪ分子と称する。したがって、本発明のある特定の態様では、がん細胞を、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物と接触させるステップ、および／または外因性ＭＣＪアゴニスト化合物を細胞もしくは対象に投与するステップは、細胞を、外因性ＭＣＪ分子と接触させ、および／または細胞もしくは対象に外因性ＭＣＪ分子を投与したことを意味する。
【００２８】
本発明のある特定の態様では、ＭＣＪ分子は、がんを治療するために、がん細胞に投与され得る。がん細胞に投与されるＭＣＪ分子（ポリペプチドまたはコードポリヌクレオチド）は、本明細書中では外因性ＭＣＪ分子と称されてもよい。その細胞における天然の発現に起因して、また外因性ＭＣＪ分子の投与に起因せずに天然で発現されその細胞に存在するＭＣＪ分子は、本明細書では「内因性」ＭＣＪ分子と称される。非限定的な例が本明細書中で配列番号１として記載されるＭＣＪ分子は、単独でまたは本発明の化合物の一部としてがん細胞に投与されてもよく、したがって外因性ＭＣＪ分子であり得る。その天然の発現のため細胞中に存在するＭＣＪ分子（その非限定的な例が配列番号１として記載される配列である）が、本明細書中で「内因性」ＭＣＪ分子と称され得ることが理解されよう。したがって、ＭＣＪ分子は、ＭＣＪ分子が、例えば本発明の化合物、組成物および／または方法を使用して、細胞に投与されたか、またはＭＣＪ分子が、細胞中で発現されて、本発明の処理もしくは化合物の結果として細胞中に存在しないかどうかに依存して、外因性ＭＣＪ分子または内因性ＭＣＪ分子であり得る。
【００２９】
本発明の分子、化合物、組成物および本発明の方法は、がんを有するか、またはがんを有する危険性のある対象を治療するのに使用され得る。したがって、本発明の方法および化合物は、細胞において、および対象においてがんを治療するのに有用である。また本発明は、一つには、１つまたは複数の化学療法剤との接触に対するがん細胞の感受性を増加させること、および化学療法剤との接触に対してがん細胞の耐性を低減させることにも関する。限定することを意図しないが、本発明のある特定の態様では、がん細胞を、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物と接触させることにより、がん細胞においてＡＢＣ輸送体のレベルを減少させてもよく、本発明の幾つかの態様では、がん細胞を、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物と接触させることにより、がん細胞においてミトコンドリアＡＴＰ生産を減少させてもよい。化学療法剤に対するがん細胞の感受性の増加は、がん細胞においてミトコンドリアＡＴＰ生産を減少させ、および／またはがん細胞においてＡＢＣ輸送体のレベルを減少させるのに有効な量で、がん細胞をＭＣＪアゴニスト化合物と接触させることに起因してもよく、それは、がん細胞において１つまたは複数の化学療法剤の存在を維持するのを助長することが可能であり、それは、化学療法剤によりがん細胞を死滅させる際の有効性の増加をもたらし得る。１つまたは複数の化学療法剤に対するがん細胞の感受性を増加させること、感受性なし（レベルゼロ）から、より高レベルの感受性まで増加させること、またはゼロよりも大きい感受性の既存レベルから、より高レベルの感受性まで増加させることのいずれかは、がん細胞が１つまたは複数の化学療法剤に応答できないことを防止し得る。１つまたは複数の化学療法剤に対するがん細胞の感受性を増加させることは、１つまたは複数の化学療法剤による処理に対するがん細胞の応答を増加させ、がん細胞の死をもたらす可能性がある。
【００３０】
本発明のＭＣＪアゴニスト化合物を使用して処理され得る細胞として、がん細胞が挙げられるが、これに限定されない。本発明の方法、化合物または組成物を使用して処理されるがん細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏであり得る。ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞は、対象中に存在し得る。本明細書中で使用する場合、細胞に関して使用する場合「１つまたは複数」という用語は、単一の細胞または複数の細胞を意味する。複数の細胞は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、５００、１，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１００，０００，０００またはそれよりも多い細胞を含む（その間の全ての整数を含む）。本発明の幾つかの態様では、１つの細胞または複数の細胞は、細胞培養であってもよく、または、対象中に存在してもよい。複数の細胞は、細胞の均一または不均一の組であり得る。本明細書中では、均一の複数の細胞は、目的の１つまたは複数の細胞の特徴が、複数の細胞の全てに関して同じである複数の細胞を意味する。細胞それぞれが、同じである目的の１つまたは複数の特徴を有するが、細胞は、完全に同一である必要はなく、目的の特徴以外の特色または特徴は、複数の異なる細胞において異なってもよいということに基づいて、均一の複数の細胞が、均一であると理解されよう。例えば、複数の細胞間での他の類似性または差に関係なく、（１）全ての細胞が、ＭＣＪ分子を天然で発現するか、または（２）細胞がいずれも、ＭＣＪ分子を天然で発現しない場合、複数の細胞を均一であると称してもよい。本明細書中で使用する場合、不均一の複数の細胞は、目的の１つまたは複数の細胞の特徴が、異なる細胞において異なる複数の細胞を意味する。例えば、複数の細胞間での他の類似性または差に関係なく、複数の細胞の１つまたは複数が、ＭＣＪ分子を天然で発現し、細胞の１つまたは複数が、ＭＣＪ分子を天然で発現しない場合、複数の細胞を不均一であると称してもよい。本発明のある特定の態様では、複数の細胞は、対象中に存在する。がん細胞が、異なるステージおよび時期に異なるＭＣＪ分子を天然で発現し得ることが理解されよう。例えば、内因性ＭＣＪポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、がん細胞の生命のある特定のステージでがん細胞において発現されなくてもよく、がん細胞の生命における他のステージで発現されてもよい。したがって、複数の細胞は、目下、内因性ＭＣＪ分子を有する細胞および内因性ＭＣＪ分子を有さない他のがん細胞を含んでもよく、１つまたは複数の内因性ＭＣＪ分子の存在に関する複数の細胞の組成は、がんの異なるステージで変化し得る。本発明のいくつかの態様では、複数のがん細胞は、１つまたは複数のＭＣＪ分子の発現に関して均一の複数または不均一の複数であってもよく、複数の細胞は、複数の１つまたは複数のがん細胞の異なるステージで、均一である状態と不均一である状態との間で変化し得る。
【００３１】
本明細書中では、対象は、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギおよび霊長類（例えば、サル）を含むがこれらに限定されない脊椎動物を意味する。本発明のある特定の態様では、対象は、家畜動物、野生動物または農業動物であってもよい。したがって、本発明は、ヒトおよび非ヒト対象における疾患または病態を治療するのに使用することができる。例えば、本発明の方法および組成物は、獣医学用途で、ならびにヒト防止および治療レジメンにおいて使用することができる。本発明の幾つかの実施形態では、対象は、ヒトである。本発明の幾つかの実施形態では、対象は、１つまたは複数のがんを有する。
【００３２】
本発明のＭＣＪアゴニスト化合物は、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、神経膠腫、乳がん、卵巣がん、上皮がん、子宮がん、膣がん、前立腺がん、精巣がん、陰茎がん、結腸がん、直腸がん、子宮頸がん、咽喉がん、口腔がん、膵がん、腎臓がん、肝がん、肺がん、黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、頭頸部がん、胃がん、骨がん、結合組織がん、膀胱がん、眼がん、鼻腔がん、脂肪がん、甲状腺がん、非ホジキンリンパ腫、小腸がん、ウィルムス腫瘍、胃腸がん、中枢神経系（ＣＮＳ）がん、末梢神経系（ＰＮＳ）がん、食道がん、カポジ肉腫（Karposi sarcoma）、胆嚢がん、中皮腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、骨肉腫（osteoscarcoma）、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫（rhabdomyoscarcoma）、副鼻腔がん、網膜芽腫、および唾液がんを含むがこれらに限定されない１つまたは複数の異なるタイプのがんを治療するために細胞、組織および／または対象に投与され得る。
【００３３】
本発明のＭＣＪアゴニスト化合物は、皮膚細胞、胸部組織細胞、筋細胞、循環細胞、結合組織細胞、骨細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、器官細胞、間充織細胞、結合組織細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、膠細胞、腺細胞、間質細胞、腎細胞、甲状腺細胞、幹細胞、造血細胞、リンパ球細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、心筋細胞、肝細胞、星状細胞、乏突起膠細胞、および脂肪細胞を含むがこれらに限定されない多数の異なるタイプの細胞を処理するため利用され投与され得る。本発明のある特定の態様では、本発明の方法および／またはＭＣＪ化合物によって処理される細胞は、がん細胞であってもよく、がんは、上述のがんまたは他の当該技術分野で公知のがんもしくは新生物のいずれかであり得る。
【００３４】
本発明のある態様では、腫瘍は、腫瘍中で（is）、互いに空間的に近接する複数のがん細胞を含む。本発明の幾つかの態様では、複数の細胞は、互いに空間的に近接して存在しない場合があり、例えば、それらは、対象中に存在してもよいが、対象の２つまたはそれよりも多い異なる空間領域、組織および／または器官において空間的に分離されてもよい。本発明の幾つかの態様では、複数のがん細胞は、原発性がんおよび続発性がん（例えば転移）の１つまたは複数；１つまたは複数の原発性がん、および／または１つまたは複数の続発性がんを含む。本明細書中で使用する場合、原発性がんは、最初の元のがんに関して使用され、続発性がんは、原発性がんを離脱して、移動して、対象における異なる組織または器官中に存在するがん細胞を含む。続発性がんからのがん細胞は、元の原発性がんと同じがんタイプであってもよい。特定の実施形態では、対象は、１つよりも多いがんタイプを有してもよい。本発明のある特定の実施形態では、がん細胞は、転移性がん細胞である。本発明のある特定の態様では、がん細胞は、１つまたは複数の化学療法剤に対して耐性である。ある特定の実施形態では、化学療法耐性がん細胞は、転移の一部である転移性がんである。
【００３５】
本発明の方法および化合物が適用され得る対象の非限定的な例は、対象が１つまたは複数のがんを有すると診断されるか、１つまたは複数のがんを有する疑いがあるか、あるいは１つまたは複数のがんを有する危険性がある態様である。本発明の方法は、本発明の方法および／またはＭＣＪアゴニスト化合物を使用した処理時に、がんと診断されて、（１）１つまたは複数のがんの治療を受けており、（２）１つまたは複数のがんの治療を受けたことがあり、および／または（３）１つまたは複数のがんに関する治療を施される対象に適用することができる。
【００３６】
本発明の幾つかの態様では、対象は、１つまたは複数のがんを有するか、または発症する危険性がある。がんを発症する危険性がある対象は、がんを発症する制御された危険性と比較して、がんを発症する増加した確率を有する。本発明の幾つかの実施形態では、危険性のレベルは、危険性の統制レベルと比較して統計学的に有意であり得る。危険性がある対象として、例えば、遺伝子異常（その存在は、がんを発症するより高い見込みに対して相関関係を有することが実証されている）を有する対象；原発性がんに関する治療（例えば、原発性腫瘍の除去であるが、これに限定すると意図されない）を受けたが、続発性がんおよび／または転移および／または別のタイプのがんに対する危険性があるとみなされる対象；本発明のがん治療以外のがん治療を受けている対象；１つまたは複数のがんの家族歴および／または既往歴を有する対象；化学毒素または活性などの作用物質に曝露させた対象；および／またはこれまでにがんに関して治療され、見かけの寛解の状態にある対象が挙げられ得る。
【００３７】
本発明の幾つかの態様では、ＭＣＪ分子、例えば、ＭＣＪポリペプチドコードポリヌクレオチドまたはＭＣＪポリペプチドのがん細胞におけるレベルを増加させることが、がんを治療し得る。本発明の幾つかの実施形態では、がん細胞を、外因性ＭＣＪ分子と接触させることは、外因性ＭＣＪ分子と接触させていない実質的に類似のがん細胞と比較した場合、細胞におけるＭＣＪ分子のレベルを増加させ、１つまたは複数の化学療法剤に対するがん細胞の感受性を増加させる。化学療法剤に対するがん細胞の感受性を増加させることは、化学療法剤に対して増加した感受性を有さない実質的に類似のがん細胞と比較した場合、がん細胞を化学療法剤によって接触させると、細胞が、死によって化学療法剤に応答する可能性がより高いことを意味する。したがって、本発明の幾つかの実施形態は、細胞、組織または対象に、がんの治療として細胞、組織または対象において外因的なＭＣＪポリペプチド活性のレベルを増加させるのに有効な量で、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物を投与する方法を含む。
【００３８】
ＭＣＪポリペプチド活性（例えば、ＭＣＪポリペプチドのレベルおよび／またはＭＣＪポリペプチドの機能）は、決定して、本発明によるＭＣＪポリペプチド活性の対照値と比較することができる。対照値は、既定値であってもよく、それは、様々な形態を取ることができる。それは、中央値または平均値などの単一カットオフ値であり得る。それは、正常な量のＭＣＪポリペプチド活性を有する細胞または個体の群および異常な量のＭＣＪポリペプチド活性を有する細胞または個体の群などの比較群に基づいて確立することができる。比較群の別の例は、がんの１つまたは複数の症状あるいは診断を有する細胞または対象の群およびがんの１つまたは複数の症状あるいは診断を有さない細胞または対象の群であり得る。別の比較群は、がんの病歴を有する対象およびかかる病歴を有さない対象の群であってでもよい。既定値は、当然のことながら、選択される特定の集団に依存する。例えば、細胞の見かけ上健常な集団は、がん細胞の集団と異なる「正常」範囲を有し得る。したがって、選択される既定値は、個体または細胞が収まるカテゴリーを考慮することができる。適切な範囲およびカテゴリーは、当業者によって日常的な実験だけによって選択することができる。本明細書中で使用する場合、「異常な」は、正常な対照と比較した場合に有意に異なることを意味する。ＭＣＪポリペプチドの異常に低いレベルとは、選択される対照に対して低いことを意味し、正常な対照中のレベルと比較した場合、対象または細胞における０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％のレベルの減少を含み得る。
【００３９】
本発明による対照は、既定値に加えて、実験材料と平行して試験される材料の試料であってもよいことが理解されよう。例として、実験試料と平行して試験されるべき製造によって生成される対照集団からの試料または対照試料が挙げられ、また対照は、本発明の処理を含むがこれに限定されないがん治療より前の、がん治療中の、またはがん治療後の対象からの試料であり得る。
【００４０】
本発明のある特定の態様では、１つまたは複数の外因性ＭＣＪ分子は、１つまたは複数の細胞を外因性ＭＣＪ分子と接触させて、１つまたは複数の細胞におけるＭＣＪ分子のレベルを増加させる様式で、１つまたは複数のがん細胞に投与される。増加は、本発明の幾つかの態様では、これまでに細胞に投与された外因性ＭＣＪ分子および／または天然の発現に起因して細胞中に存在する内因性分子のレベルからであってもよい。本発明のある特定の態様では、増加は、ゼロのレベルからゼロよりも大きいレベルまでであってもよい。本発明の幾つかの実施形態では、細胞におけるＭＣＪ分子のレベルは、外因性ＭＣＪ分子の投与より前の細胞におけるＭＣＪ分子のレベルからの少なくとも０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、５００％分またはそれよりも多く増加し得る。
【００４１】
化合物、分子および方法
本発明は、幾つかの態様では、細胞、組織および／または対象においてＭＣＪ分子のレベルを増加させる方法に関する。本発明のある特定の態様では、細胞におけるＭＣＪ分子のレベルを増加させることは、細胞におけるＭＣＪ活性を増加させ得る。本発明の幾つかの実施形態では、ＭＣＪポリペプチドのレベルは、ＭＣＪポリペプチドの発現を増加することによって増加され得る。したがって、本発明の幾つかの実施形態は、細胞、組織または対象におけるＭＣＪポリペプチドコードポリヌクレオチドのレベルを増加させることを含んでもよく、それは、細胞、組織または対象におけるＭＣＪポリペプチドのレベルおよび活性の１つまたは複数の増加をもたらし得る。本発明のある特定の実施形態では、方法は、細胞、組織または対象においてがんを治療するために、細胞、組織または対象にＭＣＪポリペプチドを送達することによって、細胞、組織または対象におけるＭＣＪポリペプチドのレベルを増加させることを含む。
【００４２】
本明細書中で使用する場合、「治療する」、「治療される」または「治療している」という用語は、がんに関して使用される場合、疾患または病態を発症している対象の見込みを減少させる予防的治療を指してもよく、またがんを排除または改善して、がんがより進む（例えば、転移する、伝播すること、増大するなど）のを防止して、および／または治療の非存在下と比較してがんの進行を遅くさせるための、対象ががんを発症した後の治療を指してもよい。
【００４３】
本発明のある特定の実施形態では、がん細胞を、外因性ＭＣＪ分子と接触させることは、がん細胞におけるＭＣＪポリペプチドの活性を増加させる。ＭＣＪ分子の例として、ＭＣＪポリペプチドまたはＭＣＪポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。本発明のＭＣＪポリペプチドの非限定的な例として、配列番号１〜５、１１、１３、１４、１６、１７および１９〜３５が挙げられる。当業者は、本発明の方法における使用のためのより長いＭＣＪポリペプチドの断片および／または完全長ＭＣＪポリペプチドの断片であるさらなるＭＣＪポリペプチドをどのように調製するかを理解する。ＭＣＪポリペプチド断片の非限定的な例は、配列番号３０、３１および３２として記載され、そのそれぞれは、配列番号１の断片、また配列番号１１の断片であり、配列番号３２はまた、配列番号３０および配列番号３１の断片である。本発明の幾つかの実施形態では、完全長ＭＣＪポリペプチドの断片は、配列番号１１として記載されるアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列またはその変異体（但し、配列番号１１として記載される完全長ＭＣＪポリペプチド配列に相当する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４または１４５個アミノ酸を有さない）を有し得ることが理解されよう。かかるポリペプチドは、当業者によって容易に想定される。例えば、限定することを意図しないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれよりも多いアミノ酸が、MAARGVIAPVGESLRYAEYLとして記載されるアミノ酸配列（配列番号２）を含む配列または本明細書中に開示する別のＭＣＪポリペプチド配列のＣ末端に付加されてもよい。本発明の幾つかの態様では、付加されるアミノ酸は、断片配列を有する完全長ＭＣＪポリペプチド配列と同じ位置のアミノ酸に相当してもよく、完全長配列は整列される。完全長ＭＣＪの断片（例えば、配列番号１１の断片）であるＭＣＪポリペプチドは、本発明の治療法の実施形態で使用することができる。
【００４４】
本発明のある特定の態様では、ＭＣＪアゴニスト化合物は、ＭＣＪポリペプチドまたはＭＣＪコードポリヌクレオチドおよび１つまたは複数のターゲティング剤を含む。ターゲティング剤の非限定的な例は、細胞浸透性ペプチド、細胞内在化剤、ＨＩＶ由来のＴＡＴ配列、小分子、ポリヌクレオチド、リポソーム、ＰＥＧ化リポソーム、アクアソーム、生分解性ポリマー、ナノ粒子、オリゴヌクレオチド、およびポリペプチドである。本発明のある特定の実施形態では、ターゲティング剤は、ＭＣＪアゴニスト化合物を特異的な細胞または組織へ誘導すること、細胞へのＭＣＪアゴニスト化合物の内在化等のうちの１つまたは複数を助長する。本発明のある特定の態様では、ターゲティング剤は、ＴＡＴポリペプチド配列を含み、任意にYGKKRRQRRとして記載されるＴＡＴポリペプチド配列（配列番号３６）もしくはその変異体、またはグリシン「Ｇ」スペーサーアミノ酸を有する配列番号３６であるYGKKRRQRRG（配列番号９）もしくはその変異体を含む細胞内在化剤である。本発明の幾つかの態様では、ＭＣＪアゴニスト化合物は、１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング剤を含み、その非限定的な例は、ミトコンドリアターゲティングペプチド；ミトコンドリアへ輸送されるナノ粒子、およびミトコンドリアのためのリポソームベースの送達システムである。本発明のある特定の態様では、ミトコンドリアターゲティング剤は、ポリペプチドであり、任意に、ポリペプチドは、TRTWVPKGLKSPとして記載されるアミノ酸配列（配列番号３７）もしくはその変異体、またはグリシン「Ｇ」スペーサーアミノ酸を有する配列番号３７であるGTRTWVPKGLKSP（配列番号１０）もしくはその変異体を含む。本発明のある特定の態様では、ミトコンドリアターゲティング剤は、合成ポリペプチドであり、任意に、ポリペプチドは、アミノ酸配列FXRFXKFXRFXK（式中、Ｆｘは、シクロヘキシルアラニンアミノ酸残基を表す）を含む配列番号３９として記載されるアミノ酸配列を含む。アミノ酸配列FXRFXKFXRFXKおよびＭＣＪポリペプチドを含む本発明のＭＣＪアゴニストポリペプチドの非限定的な例は、ＭＩＴＯ−Ｎ−ＭＣＪであり、その配列は、FXRFXKFXRFXKMAARGVIAPVGESLRYAEYL（配列番号３８）である。
【００４５】
本発明のある特定の態様では、外因性ＭＣＪアゴニスト化合物は、ＭＣＪポリペプチドおよび１つまたは複数のターゲティングポリペプチドを含む。ＭＣＪアゴニスト化合物におけるペプチドは、本発明の幾つかの実施形態では、本明細書中に記載するポリペプチドの変異体であってもよい。したがって、本発明のアゴニスト化合物におけるＭＣＪポリペプチドは、本明細書中で記載する配列またはその変異体を有し得る。同様に、本発明のある特定の実施形態では、ターゲティング剤は、本明細書中に記載するターゲティング剤、別の当該技術分野で公知のターゲティングポリペプチドまたはそれらの変異体であってもよい。ポリペプチドターゲティング剤を含む実施形態では、ポリペプチドは、本明細書中で記載するもの、別の当該技術分野で公知のターゲティングポリペプチドのアミノ酸配列またはその変異体などのアミノ酸配列を含んでもよい。ターゲティング剤の変異体もまた、本発明の幾つかの態様において包含されることが理解されよう。例えば、ペプチドターゲティング剤のアミノ酸配列は、本明細書中に記載するものから、または別の当該技術分野で公知のターゲティングポリペプチド配列から修飾することができる。当業者は、本明細書中で記載される開示と併せて、標準的な方法を使用して変異体ターゲティング剤を調製および利用することができる。
【００４６】
変異体ポリペプチド（本明細書中で「修飾」ポリペプチドとも称される）は、アミノ酸または非アミノ酸部分の欠失、点突然変異、切断、アミノ酸置換および／または付加を含んでもよい。本発明のポリペプチドの修飾は、ポリペプチドをコードする核酸配列の修飾によって行われてもよく、あるいは、修飾は、例えば切断、リンカー分子の付加、蛍光標識などの検出可能な部分の付加等によって、ポリペプチドに直接行われてもよい。修飾はまた、ポリペプチドのアミノ酸配列の全てまたは一部を含む融合タンパク質を包含する。本発明のある特定の実施形態では、ポリペプチドの修飾は、ポリペプチドのアセチル化でもあってよい。非限定的な例では、ＭＣＪポリペプチド変異体は、１つまたは複数のアミノ酸残基でアセチル化されるＭＣＪポリペプチドであってもよい。配列番号５は、アセチル化リジン残基を含むＭＣＪポリペプチドの非限定的な例である。本発明のＭＣＪポリペプチドは、１つまたは複数のアセチル化アミノ酸残基を含んでもよく、本発明のある特定の実施形態では、ＭＣＪポリペプチドは、アセチル化リジン（Ｋ）残基を含む。本発明のある特定の実施形態では、ＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号１として記載されるアミノ酸配列と整列させた場合に、ＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列におけるアセチル化リジン残基の位置は、配列番号１として記載される配列におけるＫ２５位に相当する。本発明のある特定の実施形態では、配列番号１の配列のＫ２５に相当するアセチル化リジンに加えて、またはアセチル化リジンの非存在下で、本発明のＭＣＪポリペプチドにおける１つまたは複数の他のアミノ酸残基をアセチル化してもよい。
【００４７】
本発明のある特定の実施形態では、ポリペプチド変異体は、その生理学的活性とは無関係のポリペプチドの特色を変更するために特異的に修飾されるポリペプチドであってもよい。例えば、システイン残基は、不必要なジスルフィド結合を防止するために置換または欠失させることができる。残基を、ポリペプチドのＮまたはＣ末端に付加してもよく、例えば、配列番号１６は、（配列番号２）として記載されるＭＣＪポリペプチドの最遠のＣ末端にシステイン残基（Ｃ）を含む。ポリペプチドは、修飾を伴って合成することができ、および／または修飾は、アミノ酸置換、欠失もしくは付加を選択および導入することによってポリペプチドにおいて行うことができる。続いて、修飾ポリペプチドは、１つまたは複数の活性（例えば、化学療法剤に対してがん細胞の感受性を増加させること、がん細胞を死滅させる際の有効性等）に関して試験して、どの修飾が、所望の特性を伴う修飾ポリペプチドを提供するかを決定することができる。
【００４８】
当業者はまた、保存的アミノ酸置換をポリペプチドにおいて行って、機能的に等価なポリペプチド、即ち、それぞれ修飾ＭＣＪポリペプチド、または未修飾ＭＣＪポリペプチドの機能性を保持する修飾ＭＣＪアゴニスト化合物、または未修飾ＭＣＪアゴニスト化合物を供給し得ることを理解する。本明細書中で使用する場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換が行われるポリペプチドの相対電荷またはサイズ特性を変更させないアミノ酸置換を指す。アミノ酸の保存的置換は、本発明の幾つかの実施形態では、下記群内のアミノ酸間で行われる置換を含む：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。ポリペプチド変異体は、ポリペプチド配列を変更させる、かかる技術分野における当業者に公知の方法に従って調製することができる。機能的に等価なポリペプチド変異体の非限定的な例は、ＭＣＪポリペプチドの保存的アミノ酸置換を有するＭＣＪポリペプチドであり、および／またはＭＣＪポリペプチドの断片である。本発明のある特定の実施形態では、ＭＣＪポリペプチド変異体は、ＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列の断片を含み、断片は、それと整列するＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列の領域に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有する。
【００４９】
本明細書中では、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関する「修飾される」または「修飾」という用語は、相当する未修飾配列と比較して、配列において、それぞれ１個、２個、３個、４個、５個、６個もしくはより多い核酸またはアミノ酸の変化を指す。例えば、限定すると意図されないが、修飾ポリペプチドは、それが１個、２個、３個、４個、５個、６個もしくはより多いアミノ酸置換、欠失、挿入またはそれらの組合せを有すること以外は、第１のＭＣＪポリペプチド配列のものと同一であってもよく、したがってこれは、第１のＭＣＪポリペプチド配列の変異体である。
【００５０】
発明は、幾つかの態様では、本明細書中に記載するものからの１つまた複数の置換あるいは他の修飾を有するポリペプチドを含む。例えば、限定すると意図されないが、ＭＣＪポリペプチドの配列を、１つまたは複数の置換、欠失、挿入または他の修飾で修飾することができ、発現；細胞局在化；化学療法剤に対してがん細胞の感受性を増加させる際の有効性；化学療法剤に対してがん細胞の耐性を低減させる際の有効性；およびがん細胞を死滅させるためのポリペプチドの有効性を含むが、これらに限定されない特徴に関して本明細書中に記載する方法を使用して試験することができる。本発明のＭＣＪ分子は、本明細書中に提供するＭＣＪポリペプチドおよび核酸配列、ならびに本明細書中に記載する、それぞれ、アミノ酸または核酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する変異体を含む。本発明のＭＣＪアゴニスト化合物は、幾つかの実施形態では、本明細書中に提供する１つまたは複数のＭＣＪおよびターゲティングポリペプチド配列、ならびに本明細書中に記載するアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有し得る変異体を含んでもよい。本発明のポリペプチドＭＣＪアゴニスト化合物をコードするポリヌクレオチドは、本明細書中に記載するポリペプチド配列をコードする核酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する核酸配列含んでもよいことが理解されよう。
【００５１】
配列同一性は、当該技術分野で公知の標準的な技法を使用して決定することができる。２つのアミノ酸配列のパーセント同一性（類似性）を決定するために、配列を、最適な比較目的で並べる（例えば、他のタンパク質との最適な整列のために１つのタンパク質の配列において、ギャップを導入することができる）。続いて、相当するアミノ酸位置にあるアミノ酸残基を比較する。１つの配列における位置が、他の配列における相当する位置と同じアミノ酸残基で占有される場合、分子は、その位置で同一性／類似性を有する。２つの配列間でのパーセント同一性またはパーセント類似性は、配列により共有される同一位置の数の関数である（即ち、％同一性または％類似性＝同一位置の数／位置の総数×１００）。かかる整列は、かかる目的で当該技術分野で設計および使用される公知の多数の周知のコンピューターアルゴリズムのいずれか１つを使用して実行することができる。同様に、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列のパーセント同一性／類似性は、核酸に関する当該技術分野で公知の整列および比較方法を使用して決定することができる。本発明のＭＣＪおよび／またはターゲティングポリペプチドは、本明細書中で記載される、それぞれＭＣＪおよび／またはターゲティングポリペプチド配列よりも短くてもよく、または長くてもよい。さらに、本発明の核酸は、当該技術分野で公知の技法を使用して、さらなるコード領域、したがってさらなるポリペプチド配列を得るのに使用してもよい。
【００５２】
修飾配列（それらは、本明細書中では変異体とも称される）は、幾つかの実施形態では、カセットもしくはＰＣＲ突然変異誘発または当該技術分野で公知の他の技法を使用して、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡにおける核酸の部位特異的突然変異誘発によって調製されて、ポリペプチドをコードするＤＮＡを産生してもよく、その後、組換え細胞培養でＤＮＡを発現させる。アミノ酸置換が、ポリペプチドの小さな断片に行われる場合、置換は、ポリペプチドを直接合成することによって行うことができる。本発明のある特定の実施形態では、ポリペプチドの変異体または断片の活性は、本明細書中で開示するように、変更させたポリペプチドをコードする遺伝子を、細菌または哺乳類発現ベクターにクローニングすること、ベクターを適切な宿主細胞に導入すること、変更させたポリペプチドを発現すること、およびポリペプチドの機能性に関して試験することによって試験することができる。
【００５３】
アミノ酸置換は通常、単一の残基であり、本発明のある特定の実施形態では、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはより多い置換は、本発明のＭＣＪおよび／またはターゲティングポリペプチドのアミノ酸配列において、例えば、限定することを意図しないが、配列番号１〜３５として本明細書で記載される配列において行うことができる。本発明のＭＣＪおよび／またはターゲティングポリペプチドのアミノ酸配列における、例えば、限定することを意図しないが、配列番号１〜３５として本明細書で記載される配列におけるアミノ酸挿入は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個のアミノ酸の挿入を含んでもよいが、より大きな挿入は許容され得る。本発明のＭＣＪおよび／またはターゲティングポリペプチドの配列における、例えば、限定することを意図しないが、配列番号１〜３５として本明細書で記載される配列におけるアミノ酸欠失は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個または１５個のアミノ酸の欠失を含んでもよいが、より大きな挿入は許容され得る。置換、欠失、挿入またはそれらの任意の組合せは、本発明のある特定のＭＣＪアゴニスト化合物の構成成分であり得る最終的な修飾ＭＣＪおよび／またはターゲティングポリペプチドに達するように使用してもよい。概して、これらの変化は、分子の変更を最低限に抑えるように数個のアミノ酸で成される。しかしながら、より大きな変化は、ある特定の状況において許容され得る。本発明の修飾ＭＣＪおよび／またはターゲティングポリペプチドは、幾つかの実施形態では、非天然アミノ酸ならびに天然アミノ酸を組み込んでもよい。非天然アミノ酸は、本発明のＭＣＪおよび／またはターゲティングポリペプチドにおいて含まれて、細胞浸透、ターゲティング、送達、機能、安定性などの特徴を増強させるか、または毒性などを低下させることができる。
【００５４】
治療および方法
がん細胞におけるＭＣＪ分子のレベルを増加させる本発明の外因性ＭＣＪアゴニスト化合物を、がんの治療を必要とする対象に有効量で投与してもよい。対象に、ＭＣＪポリペプチドレベルおよび／または活性を増加させる外因性ＭＣＪアゴニスト化合物を投与することにより、対象においてがんを低減し得る。がんを治療するのに有用な外因性ＭＣＪアゴニスト化合物は、本発明の幾つかの実施形態では、ＭＣＪポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。したがって、本発明の方法は、外因性ＭＣＪポリペプチドまたは外因性ＭＣＪポリペプチドコード核酸を、対象に投与することを含み得る。
【００５５】
本明細書中で使用する場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、交換可能に使用され、したがって、ポリペプチドという用語は、完全長タンパク質を指すのに使用されてもよく、また完全長タンパク質の断片を指すのに使用されてもよい。本明細書中で使用する場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸配列」という用語は、交換可能に使用されてもよく、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等を含むが、これらに限定されない遺伝物質を含んでもよく、それらは、完全長配列および／またはそれらの断片を含んでもよい。本明細書中で使用する場合、本発明の「ＭＣＪポリペプチド」または「ＭＣＪコードポリヌクレオチド」は、本明細書中で開示するＭＣＪ配列およびかかる配列の変異体を指すと理解される。ポリペプチド、タンパク質、またはそれらの断片およびかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関して本明細書中で使用する場合、「外因性」という用語は、化合物が細胞または対象に投与されて、細胞または対象中で天然に存在しなかったことを意味する。外因性ＭＣＪポリペプチドまたはＭＣＪポリペプチドコード核酸配列は、その配列の観点から、それぞれ、内因性ＭＣＪポリペプチドまたはＭＣＪポリペプチドコード核酸配列と同一であり得るが、細胞または対象に投与されたと理解されよう。
【００５６】
ＭＣＪポリペプチドに関して本明細書中で使用する命名法は、本発明のある特定の実施形態では、完全長ＭＣＪポリペプチドに関してＭＣＪポリペプチドの領域の指標として、ＭＣＪポリペプチドのＮ末端に対する言及を含み得る。したがって、本明細書中の幾つかのＭＣＪ配列で使用する「Ｎ−」または「−Ｎ−」の指標は、完全長ＭＣＪポリペプチドのＮ末端領域に対するＭＣＪポリペプチドの配列の対応を指す。本発明のＭＣＪポリペプチドに関して本明細書中で使用する命名法は、「Ｎ末端」に関して「−Ｎ−」または「Ｎ−」を含むことができるが、必ずしも含む必要はないことが理解されよう。したがって、本明細書中で「Ｎ−ＭＣＪポリペプチド」と称されるＭＣＪポリペプチドは、「ＭＣＪポリペプチド」とも称され得る。同様に、本明細書中で「ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳ」と称される本発明のＭＣＪアゴニスト化合物は、本明細書中で「ＴＡＴ−ＭＣＪ−ＭＴＳ」とも称され得る。「Ｎ」は、ＭＣＪのＮ末端アミノ酸で始まるＭＣＪアミノ酸配列を指す。本発明の方法および化合物の実施形態で有用である幾つかのＭＣＪポリペプチドであるが、全てではないＭＣＪポリペプチドは、メチオニン（Ｍ）であるＮ末端アミノ酸を含むことが理解されよう。本発明の方法および化合物のある特定の実施形態では、ＭＣＪアゴニスト化合物は、それぞれＮ末端アミノ酸（Ｍ）を含む配列番号１、配列番号２および配列番号１１などのＭＣＪポリペプチドのＮ末端で始まる１位、２位、３位、４位、５位、６位（それらは、アミノ酸に対応する：それぞれＭ、Ａ、Ａ、Ｒ、Ｇ、Ｖ）またはそれより高い位置に相当する残基位置におけるアミノ酸を含まないＭＣＪポリペプチドを含んでもよい。Ｎ末端アミノ酸「Ｍ」を含まないが、本発明の方法および化合物で有用であるＭＣＪポリペプチド配列の非限定的な例は、配列番号３、４、２２、２３および３２〜３４である。
【００５７】
本発明の幾つかの態様によれば、１つまたは複数の外因性ＭＣＪポリペプチドは、本発明の方法で投与され得る。本発明の幾つかの実施形態では、ＭＣＪポリペプチドのレベルまたは機能は、ＭＣＪポリペプチドを細胞および／またはミトコンドリアに遺伝的に導入することによって調節してもよく、ＭＣＪポリペプチドの遺伝的に標的とされる発現のための試薬および方法が提供される。遺伝的ターゲティングを使用して、ＭＣＪポリペプチドを特異的な細胞型に、特異的な細胞サブタイプに、生物内の特異的な空間領域に、および細胞内の細胞下領域に送達することができる。遺伝的ターゲティングはまた、発現されるＭＣＪポリペプチドの量および発現のタイミングの制御に関する。本発明の幾つかの実施形態は、ＭＣＪポリペプチドの遺伝的に標的とされる発現のための試薬を含み、ここで、試薬は、ＭＣＪポリペプチドをコードするか、またはＭＣＪポリペプチドの機能的断片をコードする核酸を含有するベクターを含む。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、異なる遺伝子環境の間で、それが作動的に連結された別の核酸を輸送することが可能なポリヌクレオチド分子を指す。「ベクター」という用語はまた、核酸分子を輸送することが可能であるウイルスまたは生物を指す。ベクターのタイプの１つが、エピソーム、即ち、染色体外複製が可能な核酸分子である。幾つかの有用なベクターは、それらが連結される核酸の自律複製および／または発現が可能であるものである。それらが作動的に連結される遺伝子の発現を誘導することが可能なベクターは、本明細書中で「発現ベクター」と称する。他の有用なベクターとして、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびファージなどのウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の幾つかの方法で有用なベクターは、ＭＣＪポリペプチドを、分裂細胞および非分裂細胞へ遺伝的に挿入することができ、ＭＣＪポリペプチドを、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞である細胞へ挿入することができる。
【００５９】
本発明の方法で有用なベクターは、１つまたは複数のシグナル配列および／またはプロモーター配列、またはそれらの組合せを含むが、これらに限定されないさらなる配列を含んでもよい。発現ベクターおよびそれらの使用方法は、当該技術分野で公知である。本発明のある特定の実施形態では、ベクターは、本発明のＭＣＪポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸または遺伝子を含むレンチウイルスであってもよい。レンチウイルスは、安定な細胞株を創出するのに使用され得るベクターの非限定的な例である。「細胞株」という用語は、本明細書中で使用する場合、適当な媒体を前提として増殖し続ける確立した細胞培養物である。
【００６０】
本発明の方法およびベクターで使用され得るプロモーターとして、細胞特異的プロモーターまたは一般のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。細胞特異的なプロモーターおよび一般のプロモーターを選択および使用する方法は、当該技術分野で周知である。多種多様な細胞型でＭＣＪポリペプチドの発現を可能にする多目的のプロモーター、したがって様々な細胞型で広く発現される遺伝子、例えば「ハウスキーピング遺伝子」用のプロモーターの非限定的な例を使用して、様々な細胞型でＭＣＪポリペプチドを発現することができる。一般のプロモーターの非限定的な例は、本明細書中の他の箇所で提供され、適切な代替的プロモーターは、当該技術分野で公知である。本発明のある特定の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターでもあってもよく、その例として、テトラサイクリンオンまたはテトラサイクリンオフ等が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６１】
本発明の治療方法で投与されてもよいさらなる化合物は、ＭＣＪポリペプチド活性を増加させる小分子または化学ＭＣＪアゴニストを含む。かかる小分子および化学物質を同定および試験する方法は、本明細書中に提供する教示と併せて、当該技術分野で公知のライブラリスクリーニングおよび実験手順の使用を含んでもよい。
【００６２】
投与戦略
本発明のＭＣＪアゴニスト化合物は、単独で、または１つまたは複数のさらなる化合物と組み合わせて投与されてもよい。幾つかの実施形態では、本発明のＭＣＪアゴニスト化合物は、１つまたは複数のさらなる治療剤または治療と相乗的な様式で作用してもよく、１つまたは複数の治療剤または活性の有効性を増加させてもよい。したがって、例えば、化学療法剤と併せたがん細胞へのＭＣＪアゴニスト化合物の投与は、化学療法剤のがん細胞死滅有効性を増強させてもよい。したがって、ＭＣＪアゴニスト化合物は、がんを治療するのに投与される１つまたは複数の化学療法剤または治療の有効性を増加させてもよい。化学療法剤の非限定的な例は、タキサン、アントラサイクリン、白金ベースの薬物、代謝拮抗物質、塩基類似体、ヌクレオシド類縁体、ヌクレオチド類似体、葉酸代謝拮抗薬、メトトレキサート、アルカロイド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、イリノテカン、エトポシド、ベルケイド、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、ブレオマイシン、シクロホスファミド、シトキサン、エベロリムス、およびメトホルミンである。本発明の治療方法はまた、本発明のＭＣＪアゴニスト化合物と接触されているがん細胞の結果として、他の当該技術分野で公知の化学療法剤へのがん細胞の感受性の増加をもたらし得る。
【００６３】
さらなるＭＣＪアゴニスト化合物を、本発明の方法で同定および使用することができることが理解されよう。例えば、本明細書中で提示するアッセイおよび方法を使用して、細胞および／または対象に投与された場合にＭＣＪポリペプチドレベルおよび／または活性を増加させるそれらの能力、ならびにがんを治療するそれらの能力に関して、候補化合物を評価することができる。本明細書中に記載する本発明のＭＣＪアゴニスト化合物は、単独で、または本発明の治療方法におけるターゲティング剤、標識剤および／または細胞傷害性薬物などの他の分子と併せて使用することができる。
【００６４】
本発明の幾つかの態様で有用なターゲティング剤は、本発明のＭＣＪアゴニスト化合物を、皮膚細胞、胸部組織細胞、筋細胞、幹細胞、循環細胞、結合組織細胞、骨細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、器官細胞、間充織細胞、結合組織細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、膠細胞、腺細胞、間質細胞、腎細胞、甲状腺細胞、幹細胞、造血細胞、リンパ球細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、心筋細胞、肝細胞、星状細胞、乏突起膠細胞、卵母細胞、または脂肪細胞などの、治療されるべき特異的な細胞型へ誘導するか、または誘導するのを助長するターゲティング剤である。本発明の幾つかの態様で有用なある特異的なターゲティング剤は、ＭＣＪアゴニスト化合物を、ミトコンドリアなどの細胞小器官へ誘導するか、または誘導するのを助長する作用物質であり得る。
【００６５】
最適なターゲティング剤は、がんの性質に依存する。幾つかの場合において、ＭＣＪアゴニスト化合物を、１つまたは複数の皮膚細胞、胸部組織細胞、筋細胞、循環細胞、結合組織細胞、幹細胞、骨細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、器官細胞、間充織細胞、結合組織細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、膠細胞、腺細胞、間質細胞、腎細胞、甲状腺細胞、幹細胞、造血細胞、リンパ球細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、心筋細胞、肝細胞、星状細胞、乏突起膠細胞、卵母細胞、および脂肪細胞へ標的とすることが望ましい場合がある。当業者は、日常的な方法を使用して本発明の実施形態で、適切なターゲティング剤に気づき、それらを選択および使用することが可能である。本発明のある特定の実施形態で有用なターゲティング剤の非限定的な例は、細胞浸透性ペプチド、細胞内在化剤、ＨＩＶ由来のＴＡＴ配列、小分子、ポリヌクレオチド、リポソーム、ＰＥＧ化リポソーム、アクアソーム、生分解性ポリマー、ナノ粒子、オリゴヌクレオチド、および他のターゲティングポリペプチドである。本発明のある特定の実施形態でＭＣＪアゴニスト化合物を細胞に送達するのに使用してもよい細胞ターゲティングポリペプチドの非限定的な例は、配列：YGKKRRQRRG（配列番号９）を含むＴＡＴポリペプチド、またはその変異体である。
【００６６】
本発明は幾つかの態様では、本発明のＭＣＪアゴニスト化合物を、ミトコンドリアに送達するためにターゲティング剤を含む。ミトコンドリアターゲティング剤の非限定的な例は、グラミシジンＳベースのミトコンドリアターゲティング剤、ミトコンドリアターゲティングペプチド、ミトコンドリアへ輸送されるナノ粒子、ならびにミトコンドリアのためのリポソームベースの送達システム、カルニチン−アシルカルニチントランスロカーゼシステム、チトクロムおよびリンゴ酸デヒドロゲナーゼを利用する作用物質である。本発明の幾つかの実施形態で使用され得るターゲティングシグナルのさらなる例は、Ｄｉｅｋｅｒｔ，Ｋ．他、（ＰＮＡＳ）（１９９９年）第９６巻、第２１号、１１７５２〜１１７５７頁；Ａｄｄｙａ，Ｓ．他、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（１９９７年）第１３９巻、第３号、５８９〜５９９頁；Ｄｅｌ  Ｇａｉｚｏ，Ｖ．他、（２００３年）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．およびＭｅｔａｂｏｌ．、第８０巻、１７０〜１８０頁に記載されており、それらは、参照により本明細書に組み込まれる。本発明のある特定の態様では、ミトコンドリアターゲティング剤は、ポリペプチドであり、任意に、ポリペプチドは、GTRTWVPKGLKSP（配列番号１０）として記載されるアミノ酸配列またはその変異体を含む。
【００６７】
標識剤は、細胞および組織のＭＣＪアゴニスト化合物の位置を決定するために、本発明の方法および化合物のある特定の実施形態で使用されてもよく、また投与された治療化合物の細胞、組織または細胞小器官位置を評価するために用いてもよい。酵素標識、色素、放射標識、蛍光標識等などの標識剤を結合および利用する手順は、当該技術分野で周知である。
【００６８】
本発明の組成物、化合物および方法は、がんを治療するための他の手順と組み合わせた利用によって増強され得る。幾つかの場合において、治療手順は、医薬および／または手術、放射線療法などの別の治療剤または治療の投与を含んでもよい。したがって、本発明の幾つかの実施形態では、本発明のＭＣＪアゴニスト化合物の投与は、がんを治療するための別の療法の投与前、投与と同時または投与後の１つまたは複数で実行され得る。ＭＣＪアゴニスト化合物の投与を含む本発明の治療方法は、前がん、形成異常、腫瘍、転移、寛解、再発等を含むがんの任意のステージで使用することができる。本発明の方法はまた、成功しなかったか、最小限に成功したか、および／または対象においてがんの進行を遅くするか、もしくは停止させるのにもはや成功しない１つまたは複数の別の抗がん薬、化学療法薬、手術または放射線治療でこれまでに治療した対象に使用されてもよい。例えば、限定すると意図されないが、対象または細胞が、化学療法耐性である場合、本発明のＭＣＪアゴニスト化合物を、対象に投与してもよく、またはがん細胞に接触させてもよい。１つまたは複数のがん細胞へのＭＣＪアゴニストの投与は、化学療法剤による治療に対して、接触させたがん細胞の１つまたは複数の化学療法耐性を低減させて、また接触させたがん細胞の１つまたは複数の感受性を増加させ得る。
【００６９】
有効量
本発明のＭＣＪアゴニスト化合物は、がんを治療するための有効量で、細胞または対象に投与される。「がんを治療するための有効量」は、所望の生物学的効果を実現するのに必要であるか、または十分な量である。例えば、本発明のＭＣＪアゴニスト化合物の有効量は、（ｉ）がんの進行を遅くするか、または中断させること、（ｉｉ）複数のがん細胞を死滅させること、および（ｉｉｉ）がんの１つまたは複数の症状を逆転させることの１つまたは複数を行うのに必要な量であり得る。本発明の幾つかの態様によれば、有効量は、組み合わせるか、または同時投与されるか、または単独で投与される場合に、がんの防止または治療のいずれかでがんにおける所望の治療応答をもたらす、単独でのまたは別の医薬もしくは治療と組み合わせた本発明のＭＣＪアゴニスト化合物のその量である。本発明の幾つかの態様では、所望の生物学的効果は、複数のがん細胞の死；化学療法剤に対する１つまたは複数のがん細胞の感受性の増加；がんに起因する症状の改善および／または絶対的排除；例えば対象ががんを有さないこと、またはがんの存在、レベルもしくは腫瘍サイズおよび重篤性のうちの１つまたは複数が低減されることを示す診断試験から明らかであるようながんの完全な抑止のうちの１つまたは複数であり得る。
【００７０】
通常、有効量のＭＣＪアゴニスト化合物は、盲検試験において対照集団に対する試験集団に関して有効用量を確立する臨床試験において決定される。幾つかの実施形態では、有効量は、所望の応答をもたらす有効量、例えば、がんを減少させる量、１つまたは複数のがん細胞の化学療法感受性を増加させる量で、がんを有する細胞および／または対象においてがんの寛解期状態を維持する量である。したがって、がんを治療するための有効量は、投与されると、対象における外因性ＭＣＪポリペプチドの量を、ＭＣＪアゴニスト化合物の投与なしで対象または組織で見られる量を上回る量へ増加させる量であり得る。がんを治療する場合、本発明の治療に対する所望の応答は、細胞、組織および／または対象において、がんの１つまたは複数の症状または生理的特徴を低減あるいは排除させている可能性がある。低減または排除は、一時的であってもよく、または永続的であってもよい。がんの状態は、公知の方法を使用してモニタリングすることができる。本発明の幾つかの態様では、がんの治療に対する所望の応答は、がんの発症を遅延させることまたは防止すること、がんの進行を遅くすること、遅延させることまたは停止させること、がんの寛解を維持すること等を含む。
【００７１】
本発明のＭＣＪアゴニスト化合物の有効量はまた、投与後のがん細胞死の増加、がんの減少、がんの化学療法感受性の増加等のような細胞または対象に対するＭＣＪアゴニスト化合物の投与の生理的効果を評価することによって決定され得る。本明細書中でのように、「投与すること」という用語は、１つまたは複数のがん細胞を治療することに関して使用する場合、１つまたは複数のがん細胞をＭＣＪアゴニスト化合物と接触させることを意味する。同様に、本発明の治療方法の幾つかの実施形態では、ＭＣＪアゴニスト化合物を対象に投与することは、対象の１つまたは複数のがん細胞を、投与されるＭＣＪアゴニスト化合物と接触させることを含む。本発明のある特定の実施形態では、ＭＣＪアゴニスト化合物は、医薬組成物の一部である。本発明のある特定の実施形態では、ＭＣＪアゴニスト化合物は、医薬組成物の一部として投与されてもよく、ここで、投与の様式は、１つまたは複数のがん細胞をＭＣＪアゴニスト化合物と接触させるのに適切である。ＭＣＪアゴニスト化合物を含む本発明の医薬組成物はまた、薬学的に許容される担体を含んでもよい。
【００７２】
本発明のＭＣＪアゴニスト化合物の有効性を決定するのに適したアッセイは、当業者に公知であり、治療に対する応答のレベルを測定するのに使用することができ、対象に投与されるＭＣＪアゴニスト化合物の量は、かかる測定に少なくとも部分的に基づいて変更させることができる。本発明のがん治療に対する応答の測定の非限定的な例として、がん診断試験、ステージ分類、腫瘍測定、スキャン等が挙げられる。治療の量は、例えば、投与する医薬組成物の量を増加または減少させること、投与する医薬組成物を変化させること、投与の経路を変化させること、投薬のタイミングを変化させること、別の治療剤（その非限定的な例は、化学療法剤である）の投与を変化させることなどのうちの１つまたは複数によって変更させてもよい。有効量は、治療されている特定のがん、治療されている対象の年齢および身体状態、がんのステージおよび重篤性、治療の持続期間、前療法、併用療法または切迫療法（存在する場合）の性質、投与の特定経路、ならびに医療関係者の知識および見解の範囲内のさらなる要因によって多様である。例えば、有効量は、個体が１つまたは複数のがん細胞中に存在する内因性ＭＣＪ分子を有する程度に、および／または対象のがん細胞が、化学療法耐性であるかどうか、または他の要因に依存し得る。
【００７３】
がんの治療に関するＭＣＪアゴニスト化合物、ＭＣＪ分子、ＭＣＪポリペプチドまたはそのコードポリヌクレオチドの１つまたは複数の有効量は、特定化合物または分子、化合物または分子の送達の様式、およびそれが単独で使用されるか、または別の治療剤もしくは化合物と組み合わせて使用されるかどうかに応じて多様であり得る。任意の特定の用途に関する有効量もまた、治療されているがん、投与している特定の化合物、対象のサイズまたは代謝性疾患もしくは状態の重篤性などの要因に応じて多様であり得る。当業者は、過度の実験を必要とせずに本発明の特定の化合物の有効量を経験的に決定することができる。本明細書中に提供する教示と併せて、様々な活性ＭＣＪアゴニスト化合物およびＭＣＪ分子の中から選択をして、効力、相対的なバイオアベイラビリティ、患者の体重、有害な副作用の重篤性および投与の好ましい様式などの要因を重み付けすることによって、特定の対象において実質的に毒性を引き起こさず、さらにがんを治療するのに完全に有効である有効な予防または治療上の治療レジメンを計画することができる。
【００７４】
医薬組成物投与量および／またはＭＣＪ分子の投与量は、特に任意の合併症の場合には個々の医療専門家または獣医師によって調節されてもよい。治療上有効量は通常、毎日１回または複数回用量の投与で、１日または複数日の間、０．０１ｍｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇから約２００ｍｇ／ｋｇ、または約０．２ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇまで多様である。絶対量は、併用治療、用量の数ならびに年齢、身体状態、サイズおよび体重を含む個々の対象のパラメーターを含む様々な要因に依存する。これらは、当業者に周知の要因であり、単なる日常的な実験を用いて対処することができる。幾つかの実施形態では、最大用量、即ち、正当な医学的判断に従う最も高い安全な用量を使用することができる。
【００７５】
本発明の化合物の複数回用量もまた意図される。幾つかの場合において、本発明のＭＣＪアゴニスト化合物は、少なくとも毎日、１日おきに、週１回、隔週で、月１回等で投与することができる。用量は、１日につき１回または１日につき１回以上、例えば、１つの２４時間の期間中に２回、３回、４回、５回またはそれより多い回数で投与することができる。
【００７６】
本発明の医薬組成物は、単独で、互いに組み合わせて、および／または他の薬物療法、または代謝性疾患もしくは状態を有する対象に投与される他の治療レジメンと組み合わせて投与してもよい。本発明の実施形態で使用する医薬組成物は、好ましくは滅菌であり、（１）接触させたがん細胞において化学療法剤に対する感受性を増加させること、（２）接触させた細胞において化学療法剤に対する耐性を減少させること、（３）接触させたがん細胞を死滅させること、（４）所望の治療的応答を生じることの１つまたは複数を行うのに有効量のＭＣＪアゴニスト化合物を、対象への投与に適した重量または用量の単位で含有する。
【００７７】
対象に投与されるがんを治療するための医薬組成物および／またはＭＣＪアゴニスト化合物の用量は、種々のパラメーターに従って、特に使用する投与の様式および対象の状態に従って選択することができる。他の要因として、治療の所望の期間が挙げられ得る。対象における応答が、適用される初回用量で不十分である場合には、より高い用量（または異なるより局所的な送達経路によって効果的により高い用量）を、患者の許容性が許す程度まで用いてもよい。
【００７８】
投与方法
ＭＣＪアゴニスト化合物に関する様々な投与経路が利用可能である。選択される特定の送達様式は、治療されている特定の状態および治療有効性に必要とされる投与量に依存する。本発明の方法は、一般的に言うと、臨床上許容されない有害作用を引き起こすことなく有効なレベルの治療をもたらす任意の様式を意味する医学的に許容される任意の投与様式を使用して実行され得る。本発明の幾つかの実施形態では、本発明のＭＣＪアゴニスト化合物は、経口、経腸、粘膜、経皮および／または非経口経路を介して投与され得る。「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋内、腹腔内および胸骨内の注射または注入技法を含む。他の経路として、経鼻（例えば、胃−鼻チューブを介して）、真皮、膣内、直腸および舌下が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の送達経路は、髄腔内、脳室内または頭蓋内を含んでもよい。本発明の幾つかの実施形態では、本発明のＭＣＪアゴニスト化合物は、徐放性マトリックス内に配置させて、対象におけるマトリックスの配置によって投与されてもよい。本発明の幾つかの態様では、ＭＣＪアゴニスト化合物は、特定の細胞または細胞小器官（その非限定的な例は、ミトコンドリアである）を目標とする送達剤でコーティングしたナノ粒子を使用して、細胞および／または対象に投与されてもよい。
【００７９】
本発明のＭＣＪアゴニスト化合物は、製剤中に投与されてもよく、それは、薬学的に許容される溶液中に投与されてもよく、それは日常的に、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合性担体、補助剤、および任意に他の治療成分を含有し得る。本発明の方法によれば、化合物は、医薬組成物中に投与されてもよい。概して、医薬組成物は、本発明の化合物および薬学的に許容される担体を含む。薬学的に許容される担体は、当業者に周知であり、日常的な方法を使用して選択および利用され得る。本明細書中で使用する場合、薬学的に許容される担体は、活性成分の生物学的活性の有効性、例えば、ＭＣＪアゴニスト化合物の、化学療法剤に接触させたがん細胞の感受性を増加させる能力および／またはＭＣＪアゴニスト化合物の、がん細胞を死滅させる能力を妨害しない無毒性材料を意味する。
【００８０】
薬学的に許容される担体は、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤および当該技術分野で周知である他の材料を含んでもよい。例示的な薬学的に許容される担体は、米国特許第５，２１１，６５７号に記載されており、他は当業者に公知である。かかる調製物は、塩、緩衝剤、防腐剤、適合性担体、および任意に他の治療剤を日常的に含有し得る。薬において使用する場合、塩は、薬学的に許容されるべきであるが、薬学的に許容されない塩は、利便性よく使用されて、それらの薬学的に許容される塩を調製してもよく、本発明の範囲から除外されない。かかる薬理学的および薬理的に許容される塩として、下記酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸等から調製されるものが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、薬学的に許容される塩は、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩などのアルカリ金属またはアルカリ土属塩類として調製することができる。
【００８１】
本発明の幾つかの実施形態では、ＭＣＪアゴニスト化合物は、組織に直接投与されてもよい。幾つかの実施形態では、化合物が投与される組織が、がんが存在するか、またはがんが存在する可能性が高いか、もしくはがんが発生する可能性が高い組織である。直接的な組織投与は、直接的な注射または他の当該技術分野で公知の手段によって達成され得る。ＭＣＪアゴニスト化合物は、一度投与されてもよく、あるいは複数の投与で投与されてもよい。複数回で投与される場合、ＭＣＪアゴニスト化合物は、種々の経路を介して投与され得る。例えば、最初の（または最初の数回の）投与は、罹患組織へ直接行ってもよい一方で、それより後の投与は、全身性であってもよい。
【００８２】
ＭＣＪアゴニスト化合物は、それを全身的に投与したことが望ましい場合には、注射による、例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用に製剤化され得る。注射用の製剤は、添加防腐剤を伴って、または伴わずに、単位投薬形態で、例えばアンプルで、または多重用量容器で提供され得る。医薬組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンなどの形態を取ってもよく、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの製剤化用物質（formulatory agents）を含有してもよい。
【００８３】
非経口投与用の製剤としては、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体としては、生理食塩水および緩衝媒質を含む水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルとして、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液または不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養補充薬、電解質補充薬（リンゲルデキストロースに基づくものなど）等が挙げられる。例えば、抗菌薬、酸化防止剤、キレート剤および不活性ガス等などの防腐剤および他の添加剤もまた存在してもよい。低用量は、静脈内投与などの他の形態の投与に起因し得る。対象における応答が、適用される初期用量で不十分である場合には、より高い用量（または異なるより局所的な送達経路によって効果的により高い用量）を、患者の許容性が許す程度まで用いてもよい。１日につき複数回用量は、１つまたは複数のＭＣＪアゴニスト化合物の適切な全身性もしくは局所レベルを達成するように必要に応じて使用され得る。
【００８４】
さらに他の実施形態では、送達ビヒクルは、哺乳動物レシピエントへの移植に適している生体適合性微粒子または移植片である。本方法に従って有用である例示的な生体内分解性移植片は、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９５／２４９２９号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されており、それは、生物学的高分子を含有するための生体適合性、生分解性ポリマーマトリックスについて記載している。かかる送達手段は、当該技術分野で周知であり、対象における本発明の化合物の持続性放出を達成するのに使用することができ、分解せずに、むしろ長期間にわたって拡散によって放出するように選択され得る。
【００８５】
非生分解性および生分解性ポリマーマトリックスの両方を使用して、本発明の１つまたは複数のＭＣＪ化合物を細胞および／または対象に送達することができる。幾つかの実施形態では、マトリックスは、生分解性であり得る。マトリックスポリマーは、天然または合成ポリマーであり得る。ポリマーは、一般的には数時間から数年またはそれよりも長い規模での、放出が望ましい期間に基づいて選択され得る。通常、数時間から３〜１２ヶ月に及ぶ期間にわたる放出が使用される。ポリマーは、任意に水中にその重量の最大約９０％を吸収することができるヒドロゲルの形態で存在し、さらに任意に、多価イオンまたは他のポリマーと架橋される。
【００８６】
本発明のある特定の実施形態では、ＭＣＪアゴニスト化合物は、拡散によって生体内分解性移植片を使用して、またはポリマーマトリックスの分解によって送達され得る。かかる使用のための例示的な合成ポリマーは、当該技術分野で周知である。生分解性ポリマーおよび非生分解性ポリマーは、当該技術分野で公知の方法を使用して、本発明の１つまたは複数のＭＣＪアゴニスト化合物の送達に使用され得る。生体内分解性ヒドロゲルなどの生体接着性ポリマー（Ｈ．Ｓ．Ｓａｗｈｎｅｙ、Ｃ．Ｐ．ＰａｔｈａｋおよびＪ．Ａ．Ｈｕｂｅｌｌ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１９９３年、第２６巻、５８１〜５８７頁を参照、その教示は、本明細書中に組み込まれる）もまた、治療のために本発明の１つまたは複数のＭＣＪアゴニスト化合物を送達するのに使用され得る。さらなる適した送達システムとしては、時間放出、遅延放出または持続性放出送達システムが挙げられ得る。かかるシステムは、ＭＣＪアゴニスト化合物の反復投与を回避することができ、対象および医師に対する利便性を高める。多くのタイプの放出送達システムが利用可能であり、当業者に公知である（例えば、米国特許第５，０７５，１０９号；同第４，４５２，７７５号；同第４，６７５，１８９号；同第５，７３６，１５２号；同第３，８５４，４８０号；同第５，１３３，９７４号；および同第５，４０７，６８６号（それらの教示それぞれが、参照により本明細書中に組み込まれる））。さらに、ポンプベースのハードウェア送達システムを使用することができ、その幾つかは、移植に適応される。
【００８７】
長期持続放出移植片の使用は、対象の予防的治療に、および再発がんを発症する危険性のある対象に特に適切であり得る。長期放出は、本明細書中で使用する場合、移植片が、少なくとも３０日、６０日、９０日またはそれよりも長い間、治療レベルの活性成分を送達するように構築および配置されることを意味する。長期間持続性放出移植片は、当業者に周知であり、上述の放出システムの幾つかを含む。
【００８８】
本発明の１つまたは複数のＭＣＪアゴニスト化合物の治療用製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、所望の度合いの純度を有するＭＣＪアゴニスト化合物を、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第２１版（２００６年）］と混合することによって、保管用に調製され得る。許容される担体、賦形剤または安定剤は、用いる投与量および濃度でレシピエントに対して無毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノールおよびｍ−クレゾールなどの）；低分子量（約１０個未満の残基）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖類、二糖類および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体など）；および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されない。
【００８９】
有効性の決定およびアッセイ
本発明のある特定の態様は、がんの治療におけるＭＣＪアゴニスト化合物の有効性を評価する方法を含む。かかる方法は、ＭＣＪ化合物と接触させたがん試験細胞に対する効果を、ＭＣＪアゴニスト化合物と接触させない実質的に類似したがん対照細胞の状態と比較することを含んでもよい。対照細胞と比較した接触させた試験細胞の化学療法感受性の増加、細胞死の可能性増加および化学療法耐性の減少などの（しかしこれらに限定されない）望ましい効果の１つまたは複数の変化は、がんの治療に関するＭＣＪアゴニスト化合物の有効性を示す。本発明の幾つかの実施形態では、アッセイ方法は、生物学的試料を対象から得ることと、ＭＣＪアゴニスト化合物と接触させることと、任意に細胞を化学療法剤と接触させることと、細胞の応答（例えば、化学療法感受性の増加、細胞死の可能性の増加、化学療法耐性の減少等）を評価することとを含んでもよい。試験細胞の応答を、対照がん細胞と比較してもよい。本明細書中で使用する場合、生物学的試料は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生物学的試料であってもよく、またはｉｎ  ｖｉｖｏで検出される（例えば、得られる）試料であってもよい。本明細書中で使用する場合、生物学的試料は、細胞試料、組織試料、血液試料、体液試料、細胞成分試料等であり得る。生物学的試料は、細胞、組織または細胞小器官を含んでもよく、皮膚細胞、胸部組織細胞、筋細胞、循環細胞、結合組織細胞、幹細胞、骨細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、器官細胞、間充織細胞、結合組織細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、膠細胞、腺細胞、間質細胞、腎細胞、甲状腺細胞、幹細胞、造血細胞、リンパ球細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、心筋細胞、肝細胞、星状細胞、乏突起膠細胞、卵母細胞、または脂肪細胞などの細胞型を含んでもよいが、これらに限定されない。本発明の幾つかの実施形態では、生物学的試料は、１つまたは複数のがん細胞を含んでもよい。
【００９０】
がんを評価するためのアッセイとしては、（１）対象においてがんを治療する際のＭＣＪアゴニスト化合物の有効性を特徴付けること、（２）１つまたは複数のＭＣＪアゴニスト化合物を投与すること、ならびに１つまたは複数の化学療法剤、放射線治療、外科的治療および他の治療上の処理を施すことを含む併用治療を評価すること、（３）単独での、または組み合わせたＭＣＪアゴニスト化合物の決定した有効性に少なくとも部分的に基づいて、がんに関する治療を選択すること、および（４）対象においてがんの治療の少なくとも一部としてＭＣＪアゴニストを投与することが挙げられ得るが、これらに限定されない。したがって、本発明の方法の実施形態を使用して、対象を特徴付けることができ、治療レジメンをモニタリングすることができ、治療を選択することができ、疾患の状態をより良好に理解することができる。
【００９１】
本発明は、幾つかの態様では、がん細胞および／または対象に投与されるＭＣＪポリペプチドの有効性を決定するための各種アッセイを含む。細胞、組織、対象および試料（例えば、対象由来の、培養液中の、など）においてＭＣＪポリペプチド有効性を決定するのに有用である本発明の方法として、がん細胞死、がん細胞の化学療法感受性を決定するための診断アッセイが挙げられるが、これに限定されない。がんを治療するためのＭＣＪポリペプチドの有効性の評価は、当該技術分野で公知のがん診断評価および追跡方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば細胞培養液、細胞試料、細胞懸濁液等中で行うことができ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば生存対象において行うことができる。がんを治療するための候補ＭＣＪアゴニスト化合物の有効性の評価はまた、例えば化学療法感受性を増加させること、化学耐性を減少させること、およびがん細胞死を増加させることのうちの１つまたは複数を行う候補ＭＣＪアゴニスト化合物の能力を評価するためのスクリーニングアッセイとして、培養液由来の細胞において本発明のアッセイを使用して行ってもよい。細胞、組織または対象において効果的に化学療法感受性を増加させて、がん細胞死を増加させて、および／または化学療法耐性を減少させるＭＣＪアゴニスト化合物は、１つまたは複数の治療レジメンでがんの治療において使用されてもよく、その非限定的な例として、単独での、化学療法剤、放射線療法、がん手術等の投与前、投与中または投与後の細胞または対象への１つまたは複数のＭＣＪアゴニスト化合物の投与が挙げられる。治療レジメンは、対象においてがんの予防的または治療のいずれかであり得ることが理解されよう。
【００９２】
本発明の幾つかの実施形態では、ＭＣＪポリペプチドを含むＭＣＪアゴニスト化合物のがん治療有効性は、がん細胞をＭＣＪアゴニスト化合物と接触させることにより、細胞または組織においてＭＣＪポリペプチドのレベルおよび／または活性が増加されるかどうかを決定することによって評価することができる。本発明のある特定の実施形態では、投与するＭＣＪポリペプチドの有効性を決定するのに評価することができるがん細胞における活性は、ＭＣＪポリペプチドと接触させたがん細胞におけるミトコンドリアＡＴＰ生産、ＭＣＪポリペプチドと接触させたがん細胞におけるＡＢＣ輸送体のレベル、およびＭＣＪポリペプチドと接触させたがん細胞の死のうちの１つまたは複数であり得る。がん細胞におけるミトコンドリアＡＴＰ生産の低減、がん細胞におけるＡＢＣ輸送体のレベルの減少、およびＭＣＪアゴニスト化合物と接触させたがん細胞の死のうちの１つまたは複数は、がんに関する治療としての、投与するＭＣＪポリペプチドの有効性を示す。
【００９３】
当業者に理解されるように、治療の評価はまた、がんの症状または臨床エンドポイントの評価に基づいてもよく、かかる評価は、がんの状態および／またはがんに関する本発明の治療の有効性を評価するために本発明の方法と併用することができる。
【００９４】
キット
本発明の化合物および医薬組成物ならびに使用説明書を含むキットもまた、本発明の範囲内である。本発明のキットは、ＭＣＪアゴニスト化合物の１つまたは複数を含んでもよく、それを使用して、がんを治療し得る。１つまたは複数のＭＣＪアゴニスト化合物を含有するキットは、本発明の治療方法のために調製することができる。本発明のキットの構成成分は、水性媒質中、または凍結乾燥形態のいずれかでパッケージングされ得る。本発明のキットは、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、フラスコ、シリンジ等などの１つまたは複数の容器手段または一連の容器手段を、その中に閉じ込めた状態で受け入れるよう区分されている担体を含んでもよい。第１の容器手段または一連の容器手段は、１つまたは複数のＭＣＪアゴニスト化合物、１つまたは複数のＭＣＪポリペプチド、１つまたは複数のＭＣＪポリペプチドコードポリヌクレオチド、１つまたは複数のターゲティング剤等などの１つまたは複数の構成成分を含有してもよい。
【００９５】
本発明のキットはまた、指示書を含んでもよい。指示書は通常、書面形式であり、本発明のＭＣＪアゴニスト化合物の調製および／またはがん治療もしくはアッセイにおける本発明のＭＣＪアゴニスト化合物の使用を実行するためのガイダンスを提供する。
【００９６】
下記実施例は、本発明の実施の特定の場合を説明するために提供されるものであり、本発明の範囲を限定すると意図されない。当業者にとって明らかであるように、本発明は、様々な組成物および方法に応用される。
【実施例】
【００９７】
実施例に関する材料および方法
細胞培養物。ＭＣＦ７およびＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞は、Ｋｅｎ  Ｃｏｗａｎ博士（国立がん研究所、ベセスダ、ＭＤ）から厚意により提供された。ＭＣＦ７／ｓｉＭＣＪ細胞は、Ｈａｔｌｅ，Ｋ．Ｍ．他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２７、２９５２〜２９６６頁（２００７年）に記載されるように、ＭＣＪ（ｓｉＭＣＪ）に関するｓｈＲＮＡを発現するプラスミドによる安定なトランスフェクションによって生成させた。細胞は全て、５％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ゲイザースバーグ、ＭＤ）中で、３７℃（C）、５％ＣＯ２で維持した。
マウス。ＭＣＪノックアウトマウスは、これまでにＨａｔｌｅ，Ｋ．他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３３、２３０２〜２３１４頁、（２０１３年）に記載されている。ＭＣＪ  ＫＯマウスは、過去に記載されたＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウス［Ｇｕｙ，Ｃ．Ｔ．他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２、９５４〜９６１頁（１９９２年）］と交雑させて、ＭＣＪ  ＫＯ  ＭＭＴＶマウスを産ませた。野生型ＭＭＴＶマウスおよびＭＣＪ  ＫＯ  ＭＭＴＶマウスは、実験に使用した。マウスは全て、バーモント大学の動物ケア施設で滅菌状態下に収容した。手順は、バーモント大学動物実験委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）によって承認された。
ドキソルビシン蓄積のための共焦顕微鏡法。ＭＣＦ７／ｓｉＭＣＪ細胞を、処理の前日にＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔカバーガラス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ベッドフォード、ＭＡ）に播種した。２０時間目に、オリゴマイシン（５μΜ）または培地を細胞に添加した。３時間後、ドキソルビシン（３μΜ）を添加して、細胞をさらに４時間、インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄して、３．７％パラホルムアルデヒド中に固定させた。ドキソルビシンは、共焦顕微鏡で視覚化することができる固有の蛍光を有する。核染色に関して、ＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、オレゴン）を使用した。細胞は、共焦顕微鏡法（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  ＭＥＴＡ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃａｒｌ  Ｚｉｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｃ．、ソーンウッド、ＮＹ）によって視覚化させた。ＭＣＦ７／ｓｉＭＣＪおよびｓｉＭＣＪ／ＭＣＦ７という用語は、本明細書中では交換可能に使用される。
明視野顕微鏡法。生細胞を、倒立明視野顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で画像化した。４００倍の倍率を使用した。
細胞計数。細胞を、トリプシン処理して、洗浄して、培地中に再懸濁した。生存細胞は、死滅細胞（青として視覚化される）を除外するためにトリパンブルー色素を使用して計数することによって測定した。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのドキソルビシンおよびペプチド処理。ドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は、最終濃度３μΜで使用した。実施例に記載する３つの異なるペプチド（配列番号２、１８または６）は、１０ｍＭのストック濃度でＰＢＳ中に再懸濁させた。ペプチドは、各実施例に関して示されるような種々の濃度で（１、１０または５０μΜ）使用した。処理の前日に（処理の１８〜２０時間前に）、細胞を平板培養した。ペプチドのみを有する処理に関して、ペプチドを、示した濃度でプレートに添加して、２または３日後に（各実施例に関して示すように）、細胞をトリプシン処理して、再懸濁させて、計数した。ドキソルビシンおよびペプチドによる処理に関して、細胞を、相当するペプチドで前処理した４時間後に、ドキソルビシンを添加した。
ｉｎ  ｖｉｖｏでのドキソルビシンおよびペプチド処理。ＭＴＶマウスおよびＭＣＪ  ＫＯ  ＭＭＴＶマウスを使用して、ドキソルビシンおよびＭＣＪペプチドに対する応答をアッセイした。処理は、これらのマウスが発症する乳房腫瘍が３００ｍｍ３に到達したら、およそ２．５〜３ヵ月齢で開始した。ドキソルビシンは、２ｍｇ／Ｋｇの用量で、ＰＢＳ中で腹腔内（intreperitoneal）投与した（マウス１匹当たり１００μｌ）。ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ｍｔｓペプチド（配列番号６）は、１０ｍｇ／Ｋｇの用量で、ＰＢＳ中での皮下注入によりドキソルビシン時に投与した（マウス１匹当たり１００μｌ）。ドキソルビシンおよびペプチドの投与は、示した期間、１日おきに実行した。垂直な腫瘍直径は、副尺ノギスを使用して測定し、腫瘍体積は、楕円体に関する式（幅×高さ×長さ）／２を使用して推定した。
複合体Ｉ活性。複合体Ｉ活性の分析は、複合体Ｉ（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅ）の精製に関するプロトコールに従って生成されるミトコンドリア抽出物を使用して実行した。活性は、ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅからのＣｏｍｐｌｅｘ  Ｉ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅアッセイキットおよび製造業者によって推奨されるプロトコールを使用してアッセイした。Ｈａｔｌｅ，Ｋ．他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３３、２３０２〜２３１４頁、（２０１３年）に記載されるように、ＭＣＦ７／ｓｉＭＣＪ細胞からのミトコンドリア抽出物（５μｇ）をアッセイに使用した。Ｎ−ＭＣＪペプチド（例えば、配列番号２８として記載されるポリペプチド）を、最終濃度０（ペプチドなし）、５０または１００μΜで抽出物に添加した。
【００９８】
実施例１：実験１および２
ＭＣＪは、ミトコンドリア呼吸鎖およびミトコンドリア由来のＡＴＰ生産の内因性の負の調節因子として同定されている。がん細胞は主に、ミトコンドリア由来のＡＴＰを使用する代わりに、ＡＴＰを生成する経路として解糖系を使用して、迅速に成長する。結果として、ミトコンドリアの阻害ががんの成長を増加させると考えられていたため、ミトコンドリアは、がん治療のための主要な標的とは考えられていなかった。
【００９９】
ＭＣＪのＮ末端領域、ターゲティング剤およびミトコンドリアターゲティング剤を含有する組換えペプチドを生成した。ターゲティング剤は、がん細胞に浸透するように組換えペプチドを誘導し、ミトコンドリアターゲティング剤は、浸透した細胞において組換えペプチドをミトコンドリアへ誘導した。この実験では、ターゲティング剤は、ＴＡＴ−タグおよびミトコンドリアターゲティングシグナルを含む。組み合わせた組換えポリペプチドは、浸透した細胞のミトコンドリア中でＭＣＪ機能のアゴニストとして作用した。このＭＣＪ組換えペプチド単独による、ＭＣＪを天然で含有しない（内因性ＭＣＪポリペプチドを含有しない）乳がん細胞の処理は、がん細胞の死を引き起こし、ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳポリペプチドが、内因性ＭＣＪポリペプチドを含まないがんを治療するための新規治療剤であることを実証した。
【０１００】
実験１
ＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞は、培地単独中で、または培地＋それぞれ培地中５０μＭの濃度での３つの異なるＭＣＪベースのポリペプチド中で３日間インキュベートした（標準的な手順を使用して）。セット１の細胞は、培地中でインキュベートして、対照セットとして働いた。セット２の細胞は、ターゲティング剤ポリペプチドを有さずに、５０μＭ濃度のＭＣＪポリペプチドを含む培地中でインキュベートした。ターゲティング剤ポリペプチドを有さないＮ−ＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列は、MAARGVIAPVGESLRYAEYL（配列番号２）であった。セット３の細胞は、５０μＭ濃度のＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪポリペプチドを含む培地中でインキュベートした。ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪポリペプチドのアミノ酸配列は、YGKKRRQRRGMAARGVIAPVGESLRYAEYL（配列番号１８）であった。セット４の細胞は、５０μＭ濃度のＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳポリペプチドを含む培地中でインキュベートし、それは、アミノ酸配列：YGKKRRQRRGMAARGVIAPVGESLRYAEYLGTRTWVPKGLKSP（配列番号６）を有していた。結果は、図１に示し、それは、３日のインキュベーション後、各条件下での細胞数のグラフを示す。ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳポリペプチドとともにインキュベートした細胞セット（セット４）において、著しく多い細胞死が生じた。
【０１０１】
実験２
ＭＣＦ７細胞およびＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞は、培地単独中で、または種々の濃度の、YGKKRRQRRGMAARGVIAPVGESLRYAEYLGTRTWVPKGLKSP（配列番号６）として記載されるアミノ酸配列を有するＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＳ−ＭＴＳポリペプチドを含む培地中で２日間インキュベートした（標準的な手順を使用して）。図２は、細胞を、培地単独中で、または１μＭ濃度のＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳポリペプチドを含む培地中でインキュベートした場合よりも、ＭＣＦ７（図２Ａ）またはＭＣＦ７／ＡＤＲ（図２Ｂ）細胞を、１０μＭまたは５０μＭ濃度のＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳポリペプチドを含む培地中でインキュベートした場合に、細胞数の著しく多い低減を示した実験の結果を示す。図３は、（１）培地単独、（２）５０μＭ濃度の配列番号２として記載されるＮ−ＭＣＪポリペプチドを含む培地（３）５０μＭ濃度の配列番号１８として記載されるＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪポリペプチドを含む培地および（４）５０μＭ濃度の配列番号６として記載されるＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳポリペプチドを含む培地中で２日間インキュベートしたＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞の顕微鏡写真の画像を示す。図３は、各培養に関して２つの独立した画像（上の行および下の行）を示す。結果により、Ｎ−ＭＣＪまたはＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪペプチドの存在は、細胞の増殖に影響を及ぼさず（培地のみに対して差が見られない）、ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳペプチドを使用した場合には、培養プレートに結合したままである細胞がほとんどないことが示される。
【０１０２】
実施例２：実験３〜実験７
腫瘍の多剤耐性は、がんの治療における主要な問題である。化学療法薬に対するがん細胞の化学療法耐性を克服するための新規戦略をここで同定および試験する。化学療法耐性の主要なメカニズムは、腫瘍細胞における薬物の蓄積を防止するＡＢＣ薬物排出輸送体の腫瘍細胞における存在である。ＡＢＣ輸送体は、ＡＴＰに高度に依存している。がん細胞は主として、ＡＴＰを生成するための経路として解糖系を使用して、迅速に成長するが、ここではミトコンドリア由来のＡＴＰが、ミトコンドリアの動的な局面に起因して、特定の局在的なプロセスにおける要因と同定されている。がん細胞のミトコンドリアは、ＡＢＣ薬物排出輸送体の活性を高めることができるＡＴＰの局所レベルの増加を提供するので、ミトコンドリアは、がんの化学療法耐性に寄与することがここで同定されており、その非限定的な例は、乳がんである。ＭＣＪは、ミトコンドリア呼吸鎖およびミトコンドリア由来のＡＴＰ生産の内因性の負の調節因子であるとここで同定される。ＭＣＪのＮ末端領域は、特有の配列である。
【０１０３】
ＭＣＪポリペプチドの１つまたは複数のＮ末端領域は、ＭＣＪ機能に対するアゴニストとして使用することができ、がん細胞においてミトコンドリア由来のＡＴＰ、それによりＡＢＣ輸送体を阻害することができるかどうかを決定するために実験を行った。実験は、Ｎ−ＭＣＪポリペプチドを、ＭＣＪが欠如した細胞へ送達することを含み、ポリペプチドの送達により標準的な化学療法に対する腫瘍細胞の感受性が回復したかどうかを決定した。研究は、ミトコンドリアを標的とするＮ−ＭＣＪペプチドを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルで実行し、結果は、がん細胞へのＭＣＪアゴニストポリペプチドの投与が、化学療法剤であるドキソルビシンに対するがん細胞の化学療法感受性を増加させることが示した。実験により、Ｎ−ＭＣＪポリペプチドおよびそれらの変異体は、標準的な化学療法に応答できない乳がんおよび他のがんに対する新規治療であることが確認された。
【０１０４】
実験３
がん細胞においてミトコンドリア呼吸を低減させることにより、化学療法剤に対する細胞の感受性が回復されるかどうかを決定するために実験を行った。実験の結果により、ミトコンドリア呼吸の阻害は、ＭＣＪで欠乏している細胞における薬物蓄積が回復することが実証された。ＭＣＦ７／ｓｉＭＣＪ細胞を、５μＭの濃度で４時間、ドキソルビシン単独またはドキソルビシンおよびオリゴマイシン（複合体Ｖ／ＡＴＰ合成酵素の阻害剤）で処理した。細胞におけるドキソルビシン固有の蛍光を共焦点顕微鏡法によって表示した。ＤＡＰＩ色素を核マーカーとして使用した。共焦点顕微鏡法分析により、ドキソルビシンおよびオリゴマイシンで処理したＭＣＦ７／ｓｉＭＣＪ細胞においてのみ、ドキソルビシン蓄積（核中で）が示された。図４は、細胞の核を検出するためのＤＡＰＩ染色単独（青色）（左の列）、ドキソルビシンの細胞内蓄積を検出するためのドキソルビシン蛍光単独（赤色）（第２の列）、ドキソルビシンおよびＤＡＰＩの共存（紫色、青色と赤色の組合せ）を示すＤＡＰＩおよびドキソルビシン蛍光の両方のマージ（第３の列）を示す顕微鏡写真の画像を示す。
【０１０５】
実験４
ＭＣＪは、呼吸鎖の複合体Ｉと相互作用して、複合体Ｉの内因性阻害剤である。この阻害効果を媒介するＭＣＪの領域は知られていない。内因性Ｎ−ＭＣＪペプチド自体がこの効果を再生することができるかどうかを決定するために実験を行った。ＭＣＪポリペプチドを、ｓｉＭＣＪ／ＭＣＦ７細胞（ＭＣＪが欠如した）から生成したミトコンドリア抽出物へ添加することにより、それらの抽出物において呼吸鎖の複合体Ｉのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性が阻害され、阻害の度合いは用量依存的であることが、実験により実証された。図５は、様々な濃度でのＮ−ＭＣＪポリペプチドが複合体Ｉ活性を阻害することができるかどうかを決定するための実験の結果のグラフを示す。ミトコンドリア抽出物は、ｓｉＭＣＪ／ＭＣＦ７細胞から作製され、複合体Ｉ活性アッセイ中に、様々な濃度のアミノ酸配列：MAARGVIAPVGESLRYAEYLQPSAK（配列番号２８）を有するＭＣＪポリペプチドの存在下でインキュベートした。ミトコンドリア由来の抽出物中の複合体Ｉ活性の阻害パーセントを決定した。図５におけるグラフに示すように、複合体Ｉ阻害のパーセントは、増加濃度のＭＣＪポリペプチドとともにインキュベートすると増加した。複合体Ｉの阻害は、ミトコンドリアによる、より少ないＡＴＰ生産をもたらし、化学療法剤に対するがん細胞の感受性を増加させる。
【０１０６】
実験５
実験の結果を図６に示し、それは、内因性ＭＣＪが欠如したＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞において、３μＭ濃度の化学療法剤ドキソルビシン、および５０μＭ濃度のＴＡＴ−ＭＣＪ−ＭＴＳポリペプチド（配列番号６）を含有する培地中での細胞のインキュベーションが、（１）３μＭ濃度の化学療法剤単独、（２）３μＭ濃度の化学療法剤＋５０μＭ濃度のＴＡＴ−ＭＣＪポリペプチド、例えば配列番号１８、および（３）３μＭ濃度の化学療法剤＋５０μＭ濃度のＮ−ＭＣＪポリペプチド、例えば配列番号２で処理した類似の細胞よりも、著しく高レベルのがん細胞死をもたらしたことを示す。また、結果により、ＭＣＦ７細胞において、３μＭ濃度のドキソルビシンを含有する培地による処理は、培地単独で処理したＭＣＦ７細胞と比較して、有意なレベルの細胞死をもたらすことが実証された。
【０１０７】
実験６
実験の結果を図７に示し、それは、内因性ＭＣＪが欠如したＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞において、３μＭ濃度の化学療法剤ドキソルビシン、および２μＭ濃度のＴＡＴ−ＭＣＪ−ＭＴＳポリペプチド（配列番号６）を含有する培地中での細胞のインキュベーションが、（１）培地のみ、（２）３μＭ濃度の化学療法剤単独で処理した類似の細胞よりも、著しく高レベルのがん細胞死をもたらしたことを示す。結果により、ＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞を、ドキソルビシンを伴わない、２μＭ濃度のＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳポリペプチド（配列番号６）を含有する培地と接触させることは、（１）培地のみまたは（２）３μＭ濃度の化学療法剤単独における類似の細胞よりも、有意な細胞死をもたらすが、ポリペプチド単独による細胞死のレベルは、ＭＣＪポリペプチド（配列番号６）および化学療法剤を用いた処理よりも低いことが示された。
【０１０８】
実験７
ＭＣＪの損失が、化学療法耐性の原因であり得るかどうかに対処するために、乳房腫瘍マウスモデルを使用して実験を行った。過去に生成されたＭＣＪノックアウトマウス［Ｈａｔｌｅ，Ｋ．Ｍ．他、（２０１３年）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３３：２３０２〜２３１４頁］は、腫瘍を迅速に発症するＭＭＴＶ−ＰｙＭＴトランスジェニックマウス［Ｇｕｙ，Ｃ．Ｔ．他、（１９９２年）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２：９５４〜９６１頁］と交雑させた。腫瘍成長速度は、ＷＴとＭＣＪ  ＫＯマウスとの間で同等であった。続いて、両方の群のマウスを、ドキソルビシン（がん治療に関する標準的な化学療法薬）で処理して、腫瘍サイズを１２日間追跡した。ＭＭＴＶ−Ｐｙマウスにおける腫瘍のサイズは低減したが、ＭＣＪ  ＫＯ  ＭＭＴＶ−Ｐｙマウスにおける乳房腫瘍は、成長し続けたか、または収縮しなかった（図８）。したがって、腫瘍におけるＭＣＪの損失が、乏しい化学療法応答に寄与することを実証し、また化学療法耐性を克服する方法におけるＭＣＪ機能の増加を支持した。
【０１０９】
これらの実験の結果により、ＭＣＪポリペプチドを欠損した乳房腫瘍は、ｉｎ  ｖｉｖｏで化学療法治療に対して耐性であることが実証された。図８は、腹腔内投与によりドキソルビシン（２ｍｇ／Ｋｇ）で、１日おきに２週間処理したＭＭＴＶ（ｎ＝４）およびＭＣＪ  ＫＯ  ＭＭＴＶ（ｎ＝４）マウスからの結果のグラフを示す。経時的な腫瘍のサイズは、ノギス測定によって決定し、処理前の初期サイズに対する百分率として表される。対応のあるｔ検定により決定される場合にｐ＜０．０５。結果により、内因性ＭＣＪポリペプチドを欠損したマウスは、化学療法剤であるドキソルビシンで処理した場合に、腫瘍サイズはあまり低減しないことが実証された。
【０１１０】
図９における実験により、ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳポリペプチドによるｉｎ  ｖｉｖｏでの処理は、ＭＣＪポリペプチドを欠損した乳房腫瘍の、化学療法に対する応答を増加させることが実証された。ＭＣＪ  ＫＯ  ＭＭＴＶマウスは、腹腔内投与単独によって（Ｄｏｘ）または皮下投与したＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳポリペプチドと組み合わせて（Ｄｏｘ＋ｐｅｐ）、ドキソルビシン（２ｍｇ／Ｋｇ）で処理した。経時的な腫瘍のサイズは、ノギス測定によって決定し、処理の４日後の腫瘍サイズの変化を示す。対応のあるｔ検定により決定される場合にｐ＜０．０５。図９に示す結果により、内因性ＭＣＪポリペプチドが欠如したがん細胞を含む腫瘍を有するマウスに、ＭＣＪアゴニスト化合物（例えば、アミノ酸配列YGKKRRQRRGMAARGVIAPVGESLRYAEYLGTRTWVPKGLKSP（配列番号６）を有するＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳポリペプチド）およびドキソルビシンなどの化学療法剤を投与することは、化学療法剤を、ＭＣＪアゴニスト化合物を投与してしない類似のマウスに投与することよりも、腫瘍サイズの大きな低減を示すことが実証される。結果により、化学療法剤およびＭＣＪアゴニスト化合物による組合せ治療は、化学療法剤に対するがん細胞の感受性を高め、化学療法剤単独による処理と比較して、細胞死を増加させたことが示される。
【０１１１】
さらなる実験では、ＭＣＪ  ＫＯ  ＭＭＴＶマウスは、腹腔内投与単独によって（Ｄｏｘ）または皮下投与したＭＣＪアゴニスト化合物：ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳポリペプチドと組み合わせて（Ｄｏｘ＋ｐｅｐ）、化学療法剤［ドキソルビシン（２ｍｇ／Ｋｇ）］で処理した。異なる状況では、ｄｏｘおよびペプチドによる処理の４日後に、ペプチド処理を停止した一方で、ドキソルビシン処理を単独で続けた（Ｄｏｘ／ｐｅｐ＋４ｄ−）。経時的な腫瘍のサイズは、ノギス測定によって決定した。結果を図１０に示し、それは、３つの処理のうち、処理期間の全体の間のＭＣＪアゴニスト化合物と組み合わせたドキソルビシンにより処理が、腫瘍サイズを低減させるのに最も成功したことを示す。ＭＣＪアゴニスト化合物は、アミノ酸配列：YGKKRRQRRGMAARGVIAPVGESLRYAEYLGTRTWVPKGLKSP（配列番号６）を有するＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ＭＴＳポリペプチドであった。
【０１１２】
実施例３
がんおよび化学療法応答におけるＭＣＪの役割
乳がんにおける遺伝子発現を検査するための３つのデータベース（ＴＣＧＡを含む）からの複合データを有するカプラン−マイヤープロッターウェブサイトを使用して、乳がんが、低レベルのＭＣＪを発現する患者は、腫瘍が、高レベルのＭＣＪを発現する患者に対して、有意に低減された生存を示すことを同定した（図１１Ａ）。生存の差は、化学療法を受けた患者に比較を限定すると、より一層顕著であり、低ＭＣＪを有する乳腺腫瘍を有する化学療法で処理した患者は、高ＭＣＪを有する患者よりも、生存が短かった（図１１Ｂ）。対比して、患者が内分泌療法を受けた場合は、低ＭＣＪ腫瘍患者と高ＭＣＪ腫瘍患者との間に差は見られなかった（図１１Ｃ）。乳がん患者の中でも、ＥＲ、ＰＲおよびＨｅｒＲ受容体が欠如しているため「トリプルネガティブ」（ＴＮ）と規定される群は、最も悪い予後を示す。ＴＮ患者は、内分泌またはハーセプチンで治療することができず、唯一の選択肢として化学療法を残す。これらの患者は、はじめは化学療法に良好に応答するが、腫瘍は、非常に速く再発して、多くの場合転移性となり、利用可能な治療が効かなくなる。結果は、ＴＮ群における低ＭＣＪ腫瘍を有する、より高頻度の患者が存在することを示した。さらに、化学療法で処理したＴＮ群における生存分析（それらの大部分）により、腫瘍における低ＭＣＪ発現は、乏しい生存を予測することが示された（図１１Ｄ）。まとめると、これらの研究の結果は、原発性乳がんにおける低ＭＣＪ発現は、乳がん患者の乏しい化学療法応答を相関することを示す。したがって、多発がんに関する腫瘍におけるＭＣＪ発現の損失は、乏しい転帰および化学療法に対する乏しい応答に関するバイオマーカーとして使用され得る。
【０１１３】
実施例４
ＭＣＪは、ミトコンドリアの内因性の負の調節因子である
ＭＣＪのｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンを有する（ＭＣＦ７／ＳｉＭＣＪ細胞）ヒト乳がん細胞株ＭＳＦ７細胞は、複合体Ｉ活性を増加させた。ミトコンドリア呼吸に関して広く認められている代用物であるミトコンドリア酸素消費速度（ＯＣＲ）を測定するＳｅａｈｏｒｓｅＸ２４分析器およびＭｉｔｏＳｔｒｅｓｓアッセイ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ノースビレリカ、ＭＡ）（製造業者のプロトコールに従って本明細書中の実施例で使用される）を使用して、ミトコンドリア呼吸に対するＭＣＪの影響を検査するために実験を行った。ヒト乳がんＭＣＦ７細胞（化学療法に対して感受性であり、ＭＣＪを発現する）およびＭＣＦ７／ｓｉＭＣＪ細胞（化学療法耐性であり、ＭＣＪが欠如した）におけるミトコンドリア呼吸の分析は、ＭＣＦ７細胞におけるＯＣＲに対して、ＭＣＦ７／ｓｉＭＣＪ細胞においてより高い基礎ＯＣＲを示した（図１２Ａ）。さらに、最大呼吸容量（ミトコンドリアアンカップラーＦＣＣＰの添加後に決定される）もまた、ＭＣＦ７／ｓｉＭＣＪ細胞において大幅に高かった（図１２Ａ）。さらに、ＭＭＴＶ−Ｐｙマウス［Ｇｕｙ，Ｃ．Ｔ．他、（１９９２年）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２：９５４〜９６１頁］およびＭＣＪ  ＫＯ  ＭＭＴＶ−Ｐｙマウス由来の原発性乳房腫瘍細胞におけるＯＣＲのＳｅａｈｏｒｓｅＭｉｔｏＳｔｒｅｓｓ分析により、ヒトＭＣＦ７／ｓｉＭＣＪ細胞と同様に、基礎ＯＣＲおよび最大呼吸容量が、ＭＣＪ  ＫＯ腫瘍細胞よりも高いことが明らかとなった（図１２Ｂ）。これらの結果により、ＭＣＪの損失は、ヒトおよびマウスがん細胞においてミトコンドリア呼吸の増強をもたらすことが実証される。
【０１１４】
実施例５
ＭＣＪ機能を回復させて、ミトコンドリア代謝を損なうＭＣＪアゴニストペプチド
ＭＣＪ機能を回復させることが、がんにおける化学療法耐性を克服するのに使用され得ることを実証する研究を行った。ＭＣＪ機能を回復させて、ミトコンドリア代謝を低減させて、がん化学療法耐性を克服する、最低毒性で正常な組織への送達可能なＭＣＪアゴニストを開発した。
【０１１５】
２つの異なる送達可能なアゴニストＮ−ＭＣＪペプチド（図１３に示す模式図）を開発した。第１の送達可能なアゴニストポリペプチドは、本明細書中でＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ｍｔｓポリペプチドと称され、ａ）転写（ＴＡＴ）タグのＨＩＶトランス活性化因子（配列番号３６  YGKKRRQRR）、ｂ）部分的Ｎ−ＭＣＪ領域（２０ａａ）、およびｃ）チトクロムＰ４５０１Ａ１由来のミトコンドリアターゲティング配列（ｍｔｓ）（配列番号３７  TRTWVPKGLKSP）、ならびに２つのターゲティングタグとＮ−ＭＣＪ配列との間に挿入される２つのグリシン「Ｇ」スペーサーを含む本明細書中で配列番号６として記載されるアミノ酸配列を有する。
【０１１６】
第２の送達可能なアゴニストポリペプチドは、本明細書中でＭＩＴＯ−Ｎ−ＭＣＪペプチドと称され、配列番号３８  FxRFxKFxRFxKMAARGVIAPVGESLRYAEYLとして記載されるアミノ酸配列を有する。配列番号３８では、Ｆｘ残基は、シクロヘキシルアラニンである。ＭＩＴＯ−Ｎ−ＭＣＪポリペプチドは、ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ｍｔｓポリペプチドに含まれる同じＮ−ＭＣＪ配列、およびｂ）細胞膜を通り抜けることが可能であることが示されており、またある特定の配列のミトコンドリア局在化をもたらす、合成アミノ酸を使用して生成される合成ペプチドである「ＭＩＴＯペプチド」とも称される「ミトコンドリアペプチド」を含む［Ｈｏｒｔｏｎ，ＫＬ．他、（２００８年）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５：３７５〜３８２頁］。
【０１１７】
アゴニストペプチドを試験して、それらが、特定のＭＣＪ機能を回復させるかどうかを決定し、ミトコンドリア呼吸におけるアゴニストポリペプチドの影響を検査した。ＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞は、ＭＣＦ７細胞に由来する多剤耐性乳がん細胞である。ＭＣＦ７細胞に対比して、ＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞は、全体的にＭＣＪが欠如している［Ｈａｔｌｅ，Ｋ．Ｍ．他、（２００７年）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２７：２９５２〜２９６６頁を参照］。ＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞におけるミトコンドリア呼吸は、ＭＣＦ７細胞のミトコンドリア呼吸と比較して非常に高い。ＯＣＲは、ＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞、およびＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ｍｔｓペプチドで９時間、前処理したＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞において、Ｓｅａｈｏｒｓｅ分析器により決定した。ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ｍｔｓペプチドは、基礎ＯＣＲレベルならびに最大呼吸容量を減少させた（ＦＣＣＰを用いたＯＣＲレベル）（図１４Ａ）。ＭＩＴＯ−Ｎ−ＭＣＪペプチドによるＯＣＲに対する効果は、より一層明白であり（図１４Ｂ）、より低いペプチド濃度で観察された。これらのデータは、ペプチドが、細胞に浸透することができ、より重要なことには、ミトコンドリアに到達して、呼吸を阻害したことを示した。これらの２つのペプチド間で共通する唯一の事柄は、Ｎ−ＭＣＪ配列であるので、これらのデータにより、その効果は、Ｎ−ＭＣＪペプチドに特異的であることが実証された。
【０１１８】
Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ｍｉｔｏ−ｓｔｒｅｓｓ分析を進行中の細胞上に直接添加した場合の、ミトコンドリア呼吸に対するＭＩＴＯ−Ｎ−ＭＣＪペプチドの効果を決定するためにアッセイを行った。この場合、まず、基礎レベルでＯＣＲを測定して、続いてビヒクル（Ｓｅａｈｏｒｓｅ緩衝液）またはＭＩＴＯ−Ｎ−ＭＣＪペプチドのいずれかを、Ｓｅａｈｏｒｓｅからのポートの１つで添加した。次に、ＯＣＲ測定を１８０分の間実施して、続いて最大呼吸容量を測定するためのＦＣＣＰ、ならびに最終的にはロテノンおよびアンチマイシン（複合体Ｉおよび複合体ＩＩの阻害剤）の添加を行った。ＭＩＴＯ−Ｎ−ＭＣＪペプチドは、ミトコンドリア呼吸の顕著な低減を引き起こした（図１４Ｃ）。さらに、ビヒクルのみを投与した細胞と比較して、最大呼吸容量（ＦＣＣＰ後）は、ＭＩＴＯ−Ｎ−ＭＣＪペプチドの添加によってひどく損なわれた（図１４Ｃ）。結果により、アゴニストＭＣＪペプチドはともに、送達可能であり、細胞に浸透して、ミトコンドリアに到達することができ、ともにミトコンドリア呼吸の阻害剤化合物として有効であることが示された。
【０１１９】
実施例６
ＭＣＪアゴニストペプチドによる処理は、乳がん細胞の化学療法耐性を克服することができる
本明細書中で他に記載されるように、ＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞は、とりわけドキソルビシン、パクリタキセル、ビンクリスチンを含む広範囲の化学療法薬に対して耐性である。特に、親ＭＣＦ７細胞と対照を成して、それらは、ＭＣＪ発現を全体的に欠如し（図１５Ａ）、それらは、増殖に関してはミトコンドリアにより依存している、［Ａｌａｋｈｏｖａ，Ｅ．Ｙ．他、（２０１０年）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １４２：８９〜１００頁を参照］。ドキソルビシンは、ＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞の増殖に対して影響しなかった（図１５Ｂ）が、ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ｍｔｓおよびＭＩＴＯ−Ｎ−ＭＣＪペプチドはともに、それら自体で、これらの耐性細胞の増殖を制限するのに劇的な効果を有した（図１５Ｂ）。実験結果により、ＭＩＴＯ−Ｎ−ＭＣＪペプチドの有効性は、ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪペプチドの有効性より大きい（２〜３倍）ことが示された。「ｍｔｓ」が欠如した対照ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪペプチドは、効果がなかった。ＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞に対する効果とは対照的に、これらの細胞がドキソルビシンに対して感受性であった（図１５Ｃ）としても、２つのＭＣＪアゴニストはいずれも、ＭＣＦ７細胞に対して影響がなかった（図１５Ｃ）。これらの結果により、２つのＭＣＪアゴニストが、それら自体で多剤耐性乳がん細胞の激増を阻止することができることが示され、また標準的間化学療法よりも大きな有効性が示された。さらに、これらのＭＣＪアゴニストが、ＭＣＪ発現をすでに維持するＭＣＦ７細胞に影響を及ぼさなかったので、結果により、ＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞に対する効果は、全般的な毒性の結果ではなく、これらの細胞におけるＭＣＪ活性の回復により媒介される特定の効果であることが示された。ＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞は、薬剤耐性に関する機構として低ＭＣＪ発現を有するように進化させた。
【０１２０】
ＭＣＪアゴニストがまた、多剤乳がん細胞において標準的な化学療法と協同することができるかどうかを決定するために、それ自体で細胞生存率に影響を与えない低用量（１０倍低い）でＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ｍｔｓペプチドの効果を試験する実験を行った。ＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞を、ドキソルビシン、ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ｍｔｓペプチド単独または組み合わせて処理した。ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ｍｔｓペプチドはそれ自体、著しい効果を有さず、それは、ドキソルビシンに対する応答を明らかに増加した（図１６Ａを参照）。したがって、低用量で、ＭＣＪアゴニストは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで乳がん細胞の化学療法耐性を克服することができる。ＭＭＴＶ乳房腫瘍マウスモデルを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏで化学療法剤と組み合わせたＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ｍｔｓペプチドの効果を試験する研究も行った。本明細書中で他で言及されるように、ＭＣＪ  ＫＯ  ＭＭＴＶマウスにおけるＭＣＪが欠如した腫瘍は、ドキソルビシン治療に対して応答しなかったか、または乏しい応答しか示さなかった。したがって、ＭＣＪ  ＫＯ  ＭＭＴＶマウスを、ドキソルビシン単独、またはドキソルビシンおよびＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ｍｔｓペプチドで処理して、腫瘍サイズを追跡した。ドキソルビシン単独で処理したＭＣＪ  ＫＯマウス由来の腫瘍は成長し続けたが、ドキソルビシンおよびペプチドで処理したマウス由来の腫瘍では、腫瘍の退縮および成長の遅延が見られた（図１６Ｂを参照）。これらの結果は、ＭＣＪアゴニストが、ｉｎ  ｖｉｖｏで化学療法耐性腫瘍の化学療法に対する応答を高めることができるという結論を支持した。また、これらの結果は、これらの処理マウスにおいて、明らかな異常が観察されなかったので、ＭＣＪアゴニストの投与が、ｉｎ  ｖｉｖｏで多くの毒性を引き起こさないことを支持した。
【０１２１】
実施例７
ＡＭＬに対するＭＣＪアゴニストの治療効果
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、最も一般的な成人の急性白血病であり、小児白血病の２０％を示す。細胞傷害性化学療法によるＡＭＬの最前線の治療は、高い寛解率を達成するが、患者の７５〜８０％が、初期療法後に応答しないか、または再発して、ほとんどの患者が、それらの疾患で死亡する［Ｓｔｏｎｅ，Ｒ．Ｍ．他、（２００４年）Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｍ  ｓｏｃ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｅｄｕ  Ｐｒｏｇｒａｍ、９８〜１１７頁を参照］。応答は、ＡＭＬを有する小児にとって良好であるが、治癒率は、受け入れにくいほど低いままであり（６０％未満）、現行の療法は、実質的に即座でかつ長期の副作用を伴って、患者に対して多大な負担を課す。ＡＭＬにおける治療としてＭＣＪアゴニストを投与してＭＣＪを回復させるという治療可能性を評価するために実験を行った。Ｍｏｌｍ１３およびＭｖ４１１  ＡＭＬ細胞は、ＭＣＪ発現を全体的に欠如することを見出した。Ｍｏｌｍ１３  ＡＭＬ細胞を、２つのＭＣＪアゴニストであるＦｌｔ３阻害剤ＡＣ２２０またはＡＣ２２０と、本発明者らのＭＣＪアゴニストとの組合せのいずれかで処理した。処理の３日後、生存率を決定した。ＭＩＴＯ−Ｎ−ＭＣＪアゴニストは、Ｍｏｌｍ１３細胞に対して大規模な効果を有し、実質的な細胞死に至る（例えば、図１７Ａを参照）。ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ｍｔｓはまた、単独で、より中程度の効果を有した（図１７Ａ）。ＡＣ２２０は、Ｍｏｌｍ１３細胞死を誘導するのに（それらのＦｌｔ３突然変異に起因して）有効であったが、依然として生存しているＡＣ２２０に不応性のわずかな細胞が存在し（図１７Ａおよび図１７Ｂ）、この不応性分集団は、ＡＭＬ患者における疾患の再発の原因となり得ると考えられる［Ａｌｖｅｒｅｚ−Ｃａｌｄｅｒｏｎ，Ｍ．Ａ．他、（２０１５年）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２１：１３６０〜１３７２頁を参照］。実験結果により、ＡＣ２２０と、ＭＣＪアゴニストとの組合せが、特にＭＩＴＯ−Ｎ−ＭＣＪに関して、この耐性群を効果的に排除することが示された（図１７Ｂ）。類似の結果が、第２のＦｌｔ３突然変異ＡＭＬであるＭｖ４１１を用いて得られた（データは示していない）。
【０１２２】
ＴＭＲＥ色素で染色することによって、ＭＣＪアゴニストの、ミトコンドリア膜電位に対する効果を評価するための実験を行った。ＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ｍｔｓに関して観察されるより中程度の効果を考慮して（図１７Ａ〜図１７Ｂ）、５０μΜのこのペプチドを実験で使用した。処理の２２時間後、ＭＣＪアゴニストペプチドはともに、わずかなＭｏｌｍ１３細胞においてミトコンドリア膜電位の損失（ＴＭＲＥ陰性細胞）を引き起こした（図１７Ｃ）。しかしながら、最も著しい効果は、２つのＭＣＪアゴニストのいずれかと組み合わせたＡＣＣ２２０による細胞の処理によって得られた（図１７Ｃ）。ＡＭＬ細胞は、主に、ＥＴＣから電子漏出の結果として、ミトコンドリアにおいて発生する反応性酸素種（ＲＯＳ）のレベルに対して感受性がある。ＭＣＪは、複合体間の電子伝達を促進して、電子漏出を最低限に抑えるように［Ａｃｉｎ−Ｐｅｒｅｚ，Ｒ．他、（２００８年）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ３２：５２９〜５３９頁およびＬａｐｕｅｎｔｅ−Ｂｒｕｎ，Ｅ．他、（２０１３年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４０：１５６７〜１５７０頁を参照］形成されるＥＴＣ呼吸性超複合体の形成を妨害することができることが、過去に示された［Ｈａｔｌｅ．Ｋ．他、（２０１３年）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ｂｏｉｌ  ３３：２３０２〜２３１４頁］。ＰＹ１色素で染色することによるミトコンドリアＲＯＳ（ｍＲＯＳ）レベルの分析により、ＭＣＪアゴニストはともに、処理の２２時間後にｍＲＯＳの産生を誘導することができ（図１７Ｄ）、またそれらは、ＡＣ２２０と明らかに協同して、ｍＲＯＳの大量産生を引き起こす（図１７Ｄ）ことが示された。ＭＣＪアゴニストの効果は、処理の５時間後にすでに観察された。したがって、ＭＣＪアゴニストであるＭＩＴＯ−Ｎ−ＭＣＪおよびＴＡＴ−Ｎ−ＭＣＪ−ｍｔｓペプチドは、ＭＣＪが悪性細胞によって損失される場合に、ＡＭＬを治療するために治療的に使用してもよく、現在では臨床試験でＦｌｔ３阻害剤と組み合わせて相乗的に使用することができる。ＭＣＪアゴニストおよびＦｌｔ３阻害剤の組合せは、ＡＭＬ再発を防止または遅延し得る。
【０１２３】
等価体
本発明の幾つかの実施形態を、本明細書中で記載および説明してきたが、当業者は、機能を実行して、ならびに／あるいは結果および／または本明細書中に記載する利点の１つまたは複数を得るための様々な他の手段および／または構造を容易に思い描き、かかる変形および／または変更はそれぞれ、本発明の範囲内であると考えられる。より一般的には、当業者は、本明細書中に記載するパラメーター、寸法、材料および形状は全て、例示的であると容易に理解し、実際のパラメーター、寸法、材料および／または形状は、本発明の教示が使用される（単数／複数）特定用途（単数または複数）に依存する。当業者は、本明細書中に記載する本発明の特定の実施形態に対する多くの等価体を認識するか、または単なる日常的な実験を使用して確認することが可能である。したがって、上述の実施形態は、単に例として提示されること、また併記の特許請求の範囲およびその等価体の範囲内で、本発明は、具体的に記載および特許請求される場合とは別のやり方で実施され得ることが理解されよう。本発明は、本明細書中に記載する個々の特徴、システム、物品、材料および／または方法のそれぞれに関する。さらに、２つまたはそれ以上のかかる特徴、システム、物品、材料および／または方法の任意の組合せは、かかる特徴、システム、物品、材料および／または方法が、相互に矛盾しない場合に、本発明の範囲内に含まれる。
【０１２４】
定義は全て、本明細書中で規定および使用するように、辞書的定義、参照により組み込まれる文書における定義および／または定義した用語の通常の意味を統制すると理解されるべきである。
【０１２５】
本明細書におけるおよび特許請求の範囲における不定冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、本明細書中で使用する場合、明らかに反対を示さない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【０１２６】
本明細書におけるおよび特許請求の範囲における「および／または」という語句は、本明細書中で使用する場合、そのように等位結合された要素、即ち幾つかの場合では結合的に存在し、また他の場合では分離的に存在する要素の「一方または両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」節によって具体的に同定される要素以外の他の要素は、具体的に同定にされるそれらの要素に関連されても、または関連がなくても、明らかに反対を示さない限り、任意に存在してもよい。
【０１２７】
本出願において引用または参照される全ての参照文献、特許および特許出願および刊行物は、本明細書でそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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