(57)【要約】  本発明は、微生物のトランスグルタミナーゼに媒介される、特にｍＴＧ２に媒介されるバイオコンジュゲーションで使用するための、特に抗体薬物コンジュゲートを製造するための新規ペプチド配列を提供する。ｍＴＧ２および本発明の新規ペプチド配列モチーフを使用するバイオコンジュゲーションの方法がさらに開示される。本発明は、本発明の新規配列モチーフを含むタンパク質ならびにそれをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−グルタミル−アミド結合を介して、アミノ供与体を含む基質に共有結合で連結された、少なくとも１つのアシルグルタミン含有アミノ供与体配列を含むタンパク質であって、前記少なくとも１つのアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列が、少なくとも配列番号１のアミノ酸配列（配列番号１（ＴＹＦＱＡＹＧ））を含む、タンパク質。
【請求項２】
前記アミノ供与体を含む基質が、少なくともε−アミノ基を含むか、または第１級アミノ末端アミノ基を有するＧＧＧの配列を有する少なくとも１つのトリペプチドを含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記アミノ供与体を含む基質が、リシン残基、リシン誘導体、少なくとも１つのリシン残基を含むポリペプチドである、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記アミノ供与体を含む基質がさらなる分子に共有結合している、請求項１から３までのいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記トリペプチドＧＧＧが、そのカルボキシ末端を介してさらなる分子に共有結合している、請求項１から４までのいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記さらなる分子が、染料、放射性同位体、薬物、リボザイム、ナノボディ、酵素、またはリンカーの１つである、請求項４または請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記リンカーが切断可能であるかまたは非切断性である、請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記リンカーが、染料、放射性同位体、または細胞毒とカップリングまたは共有結合している、請求項６または請求項７に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記アシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列が、配列番号２のアミノ酸配列（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＴＹＦＱＡＹＧＸ4Ｘ5Ｘ6）を含み、式中
Ｘ1は、疎水性アミノ酸であり、
Ｘ2は、負に荷電したアミノ酸であり、
Ｘ3は、ＣまたはＮであり、
Ｘ4は、ＣまたはＮであり、
Ｘ5は、極性の非荷電側鎖を有するアミノ酸の１つであり、
Ｘ6は、負に荷電したアミノ酸である
請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１０】
Ｘ1が、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、ＭまたはＧのいずれか１つであり、
Ｘ2が、ＤまたはＥの１つであり、
Ｘ3が、Ｃであり、
Ｘ4が、ＣまたはＮであり、
Ｘ5が、Ｓ、Ｔ、またはＮであり、
Ｘ6が、ＤまたはＥの１つである
請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１１】
Ｘ1が、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、ＭまたはＧのいずれか１つであり、
Ｘ2が、ＤまたはＥの１つであり、
Ｘ3が、Ｃであり、
Ｘ4が、Ｃであり、
Ｘ5が、Ｓ、ＴまたはＮであり、
Ｘ6が、ＤまたはＥの１つである
請求項９または請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項１２】
Ｘ1が、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、ＭまたはＧのいずれか１つであり、
Ｘ2が、Ｅであり、
Ｘ3が、Ｃであり、
Ｘ4が、Ｃであり、
Ｘ5が、Ｔであり、
Ｘ6が、Ｅである
請求項９から１１のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１３】
Ｘ1が、Ｇであり、
Ｘ2が、Ｅであり、
Ｘ3が、Ｃであり、
Ｘ4が、Ｃであり、
Ｘ5が、Ｔであり、
Ｘ6が、Ｅである（配列番号９０）
請求項９から１２のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１４】
抗体、抗原結合抗体フラグメント、Ｆｃドメイン、非免疫グロブリンスキャフォールド、または酵素のいずれか１つである、請求項１から１３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１５】
モノクローナル抗体、二価抗体、ＶＨＨ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）2、ｓｃＦｖである、請求項１から１４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１６】
前記モノクローナル抗体が、ヒトのまたはヒト化されたヒト抗体、またはそれらのフラグメントである、請求項１５に記載のタンパク質。
【請求項１７】
アミノ供与体を含む（基質）を、配列番号２のポリペプチド配列を含むアシルグルタミン含有アミノ酸供与体に共有結合でカップリングさせる方法であって、
トランスグルタミナーゼ、好ましくはｍＴＧ２の存在下で、前記アミノ供与体を含む基質と前記アシルグルタミン含有アミノ酸供与体とを接触させて、請求項１から１３までのいずれか１項に記載のタンパク質を得るステップを含む、方法。
【請求項１８】
前記アシルグルタミン含有アミノ酸供与体が、抗体、抗原結合抗体フラグメント、非免疫グロブリンスキャフォールド、または酵素である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アミノ供与体を含む基質が、染料、薬物、リボザイム、ナノボディ、酵素、またはリンカーとカップリングまたは共有結合している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２０】
前記リンカーが切断可能または非切断性であり、染料、放射性同位体、または細胞毒とカップリングしている、請求項１７から１９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１７から２０までのいずれか１項に記載の方法による方法により得ることができるタンパク質。
【請求項２２】
請求項１７から２１までのいずれか１項に記載の方法における配列番号２のポリペプチド配列の使用。
【請求項２３】
配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項２４】
配列番号２のポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号２のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２６】
請求項２５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２７】
請求項２５に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２８】
少なくとも１つの配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合フラグメント、二価抗体、またはＶＨＨ抗体。
【請求項２９】
ヒト化されているかまたはヒトのものである、請求項２８に記載の抗体。
【請求項３０】
ヒト化されているかまたはヒトモノクローナル抗体である、請求項２８または請求項２９に記載の抗体。
【請求項３１】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはＩｇＭタイプの抗体である、請求項２８から３０までのいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３２】
請求項１７から２０のいずれか１項に記載の方法により少なくとも１つのリンカーに共有結合でカップリングしている、請求項２８から３１までのいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３３】
前記リンカーが、染料、放射性同位体、または細胞毒とさらにカップリングしている、請求項３０から３２までのいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３４】
がん細胞の表面抗原に特異的に結合する、請求項３０から３３までのいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３５】
ｃ２２５（セツキシマブ）である、請求項３０から３４までのいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３６】
がんの治療に使用するための、請求項３０から３５までのいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３７】
前記がんが、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頚がん、皮膚がん、膵がん、好ましくは結直腸がん、転移性（ｍＣＲＣ）、切除不能の肝臓転移、頭頸部の扁平上皮細胞癌、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部の扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）である、請求項３６に記載の抗体。
【請求項３８】
請求項３０から３５までのいずれか１項に記載の抗体および少なくとも１種のさらなる薬学的活性成分を含む組成物。
【請求項３９】
請求項３０から３５までのいずれか１項に記載の抗体または請求項３９に記載の組成物と少なくとも１種のさらなる成分とを含む医薬。
【請求項４０】
治療を必要とするがんに罹患した対象を治療する方法であって、前記対象に治療有効量の請求項３９に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオコンジュゲーションの分野、特に、微生物のトランスグルタミナーゼに媒介されるバイオコンジュゲーション、およびバイオコンジュゲート、例えば抗体−薬物コンジュゲートなどを製造するためのその使用の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
合成分子または天然分子を用いたタンパク質の改変は、タンパク質の機能を研究するために、またはタンパク質に追加の性質を付け加えるために役立つ技法である。天然または合成高分子、特にタンパク質を含むバイオコンジュゲーションは、それらの構造を要求に合わせて作るためおよび機能的性質を操作するための強力な手段として出現した（例えば、Perez et al. Drug Discovery Today, 2014 Vol 19 (7): 869-881を参照されたい）。タンパク質の改変またはバイオコンジュゲーションは、典型的には、対象のタンパク質へのさらなる分子の化学的連結により、または酵素的に、のいずれかで行われる。
生体分子のコンジュゲーションのために現在利用されている化学的戦略は、システインおよびリシン残基が容易に改変され得るという事実を使用している。システイン残基は、それらをα−ハロケトンまたはマイケル反応受容体、例えばマレイミド誘導体などと反応させることによりアルキル化することができる。リシン残基の改変は、リシンの第１級アミノ基を介してタンパク質を標識する最も古く最も簡単な方法である。対象のタンパク質内のリシンのε−アミノ基は、活性化されたエステル、スルホニル塩化物、イソシアネートおよびイソチオシアネートと容易に反応して、対応するアミド、スルホンアミド、ウレアおよびチオウレアを生じることができる（例えば、Takaoka et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 4088-4106を参照されたい）。バイオコンジュゲーションのためには非常に効率的であるが、これらの化学的手法は必然的に不均一な混合物を生じる。この効果は、リシンを少ししか有しないより小さい分子で、例えばＩｇＧタイプの分子と比較してＦｃ領域を欠く抗体フラグメントにおいて、より顕著になる。バイオコンジュゲーションのさらなる例は、蛍光性タンパク質、染料のコンジュゲーション、または機能性分子、例えばＰＥＧ、ポルフィン、ペプチド、ペプチド核酸、および薬物を繋ぐことを含む（Takaoka et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 4088 - 4106）。
【０００３】
タンパク質バイオコンジュゲートの調製は、所望の成果に応じて困難のレベルが変化し得る。例えば、バイオコンジュゲーションは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の血清アルブミンへの単純且つ非特異的な接続（Abuchowski et al. J. of Biological Chemistry (1977) Vol. 252 (11): 3578-3581）から、非常に高度の技能を要する均一な抗体薬物バイオコンジュゲートの調製までの範囲にわたり得る。
【０００４】
この難題は、他の手法の中でも、酵素に媒介されるコンジュゲーションを適用することにより対処することができる。例えば、ＷＯ２０１４／００１３２５Ａ１には、抗体のＦｃ領域への部位特異的バイオコンジュゲーションのためのソルターゼＡの使用が開示されている。ソルターゼＡ（ＳｒｔＡ）は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）で最初に記載された、細菌の膜内在性タンパク質である。ＳｒｔＡは、細菌の細胞壁にタンパク質を固定するペプチド転移反応を触媒する。選別シグナルＬＰＸＴＧ、（Ｘ＝Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｎ、Ｑ、またはＫ）の認識で、触媒的システインが残基ＴとＧの間のペプチド結合を切断して、その結果チオアシル中間体の形成が生じる。次に、このチオアシル中間体は、求核剤として作用するアミノ末端グリシンと続いて反応することができる。ＳｒｔＡは、Ｎ末端（オリゴ）グリシンを求核剤として受け入れ、２分子間の新しいペプチド結合を創り出す。ＳｒｔＡは、生理学的条件下で機能して、タンパク質を例えばビオチンで標識する、またはＨＥＲ２−特異的組み替えＦａｂを植物細胞毒ゲロニンで機能化するバイオコンジュゲーション反応のために使用されてきた（例えば、Popp et al. (2011) Angew Chemie Int. Ed. 50: 5024-5032; Kornberger et al (2014) mAbs 6 (2): 354-366を参照されたい）。典型的には、標的のタンパク質をＬＰＸＴＧモチーフ、続いて精製タグによりカルボキシ末端で標識し、ＳｒｔＡで媒介されるペプチド転移により、精製タグを除去して、標識されたタンパク質が生じる。
【０００５】
バイオコンジュゲーション反応におけるＳｒｔＡの使用の主要な弱点の１つは、トランスペプチダーゼ反応を触媒するために必要な酵素の高濃度である。ＳｒｔＡの分子進化を使用して反応速度を改善するための試みがなされた結果、該酵素（ｅｎｚｍｅ）のＬＰＸＴＧモチーフに対する親和性が約１４０倍に増大した（例えば、Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jul 12; 108(28): 11399-11404を参照されたい）。ＳｒｔＡに媒介されるバイオコンジュゲーション反応を使用する別の欠点は、触媒される反応の可逆性である。ここで、ジケトピペラジンの形成を通して、ＳｒｔＡにより切除されたペプチドフラグメントの失活を経てアミノ末端グリシン含有部分を不可逆的に連結することができる化学的に改変されたＳｒｔＡ基質ＬＰＥＴＧＧ−イソアシル−セリンおよびＬＰＥＴＧＧ−イソアシル−ホモセリンの使用により、この限界を克服するための試みもなされた（例えば、Liu et al., J. Org. Chem. 2014, 79, 487-492を参照されたい）。
【０００６】
酵素に媒介される別の重要なバイオコンジュゲーション手法は、トランスグルタミナーゼ（ＴＧアーゼ）、特に微生物のトランスグルタミナーゼ（ｍＴＧアーゼ）の使用を含む。ＴＧアーゼは、哺乳動物、爬虫類、植物および微生物を含む数種類の生物体で検出される酵素の大きいファミリーである。トランスグルタミナーゼは、タンパク質−グルタミンγ−グルタミルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．３．２．１３）であり、それは、典型的には、グルタミン残基のリシン残基へのｐＨ依存性アミド基転移を触媒する。大部分のＴＧアーゼは、リシン基質に関して無差別のように思われ、アミン供与体として役立つリシンの代用基として５−アミノ−ペンチル基を受け入れるようにさえ思われる。しかしながら、グルタミン残基を基質として認識するＴＧアーゼの選択性は、グルタミン残基がＴＧアーゼにより受け入れられるためには、残基がタンパク質の可撓性領域に位置していなければならないことにおいて、はるかにより厳格であるように思われる（例えば、Jeger et al. Angew. Chem Int. Ed. 2010, 49, 9995-9997; Fontana et al. Adv Drug Deliv Rev. 2008 Jan 3; 60(1): 13-28を参照されたい）。
【０００７】
トランスグルタミナーゼは、大部分の組織および体液中に広く分布しており、種々の生理学的機能に関与すると考えられている。トランスグルタミナーゼに媒介される反応の１例は、第ＸＩＩＩａ因子による血液凝固中の出血の停止であり、それは、フィブリン分子間の架橋を触媒する活性化された血漿トランスグルタミナーゼの形態である（例えば、Griffin et al. Biochem. J. (2002) 368, 377-396を参照されたい）。しかしながら、細菌のトランスグルタミナーゼの生物学的機能は、大きく未知のままである。ストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）のｍＴＧアーゼが、気中菌糸（ａｅｒｉａｌ  ｈｙｐｈａｅ）および胞子の発達中に阻害タンパク質を架橋させると推測されてきた。
【０００８】
Ｓ．モバラエンシスからのトランスグルタミナーゼは、哺乳動物のＴＧアーゼに有意の相同性を示さず、最も詳細に特性決定されているヒトのＴＧアーゼファミリーのメンバーであるヒトＴＧ２と比較して、独特の構造を有する。その哺乳動物のオルソログと対照的に、Ｓ．モバラエンシスのｍＴＧ２は、カルシウムに依存せず、分子量は僅か３７．９ｋＤａであり、それは、第ＸＩＩＩ因子様ＴＧアーゼの分子量の約半分にすぎない。ｍＴＧ２は、その哺乳動物のオルソログより高い反応速度によっても特徴づけられる。ｍＴＧ２の広く行きわたった使用に寄与した別の態様は、該酵素は、組み替えタンパク質として容易に大量に製造することができるという事実であり、そのことがその生化学的性質に関連して、食品産業においてもｍＴＧ２の広い用途に導いた（例えば、Sommer at al. (2011) Protein Expression and Purification 77:9-19; Marx et al., (2008) Enzyme and Microbial technology 42:568-575を参照されたい）。ｍＴＧ２のランダムな突然変異生成も、酵素の熱力学的安定性を向上させるために使用されてきた（例えば、Journal of Biotechnology 136 (2008) 156- 162を参照されたい）。注目すべきこととして、上昇した温度におけるｍＴＧ２の向上した安定性を生じているすべての変異は、酵素のアミノ末端領域に位置する。
【０００９】
微生物のトランスグルタミナーゼ、ｍＴＧ２は、α−ラクトアルブミン、ヒト成長ホルモンおよびインターロイキン−２などのタンパク質の部位特異的および化学量論的ＰＥＧ化、または抗体の部位特異的および化学量論的改変のためにも使用されてきた（例えば、Jeger et al. Angew. Chem Int. Ed. 2010, 49, 9995-9997; Fontana et al., Adv Drug Deliv Rev 2008 Jan 3; 60(1): 13-28を参照されたい）。全体として、反応性グルタミンの数は、表面に露出したグルタミンの合計数と比較して低いことが見出された。
【００１０】
ｍＴＧ２は、天然の、完全にグリコシル化されたモノクローナル抗体上でトランスグルタミン化を触媒するために使用される場合、それぞれのモノクローナル抗体中の如何なるグルタミン残基も基質として認識しないことが見出された。脱グリコシル化抗体または非グリコシル化抗体のみが、ｍＴＧ２によって基質として認識されることが見出された。興味あることに、脱グリコシル化抗体または非グリコシル化抗体（Ｑ２９５）中で、１つのグルタミン残基のみがアシルグルタミン基質として役立つことが見出された。このことは、抗体薬物コンジュゲートを生成させるための抗体の部位特異的バイオコンジュゲーションのための、特にヒトにおける使用のためのｍＴＧ２の使用を強く制限する。興味あることに、Ｆｃ変異体（Ｎ２９７Ｑ）抗体が使用される場合、この第２のグルタミン残基もそれぞれの基質とともにｍＴＧ２により改変されることが見出された（Fontana et al. Adv Drug Deliv Rev. 2008 Jan 3;60(1):13-28）。
【００１１】
ｍＴＧに媒介されるＰＥＧ化について最も詳細に特性決定されたタンパク質の１つはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）である。ｈＧＨについて、２つのグルタミン残基が主要なコンジュゲーション部位、すなわちＱ４０およびＱ１４１として同定された。ｍＴＧの突然変異生成は、Ｑ１４１に対する選択性が増大したｍＴＧバリアントを生じた。別の研究で、サケのカルシトニンおよびヒト成長ホルモンについて、反応性グルタミンの周囲の二次構造における変化を生じさせると推定される溶媒中における変化は、単一のグルタミン残基とのコンジュゲーションを制限するために使用することができ、それ故、選択性を向上させることが見出された。
ヒトインターロイキン２（ｈｌＬ−２）の場合には、単一の反応性グルタミン（Ｇｌｎ７４）が見出され、１２ｋＤａのＰＥＧまたはガラクトースが末端の３つの触覚をもつグリコシドとコンジュゲーションされる。
【００１２】
人工的（Ａｒｔｉｆｉｃａｌ）なペプチド配列が、ｍＴＧ２の基質特異性をさらに調べるためにこれまで使用されてきた。例えば、基質のグルタミン残基周囲の配列効果は、各グリシンが数種のアミノ酸に個々に置換されたヘプタペプチド基質（ＧＧＧＱＧＧＧ）に関して最初に究明された（Ohtsuka et al. Biosci., Biotechnol., Biochem.64, 2608-13）。グルタミンのＮ末端における疎水性残基が、ＧＧＧＱＧＧＧペプチド（−３、−２、および−１位で）に比して反応を加速するが、しかしながら、全体として反応速度は低いことが見出された。
ｍＴＧの好ましい基質配列も、約１０11個の線状ペプチドのはるかに大きいライブラリーを利用するファージディスプレイペプチドライブラリーを使用して評価した。大部分の同定されたクローンは、芳香族アミノ酸（Ｗ、Ｆ、またはＹ）を−５〜−３位に、アルギニンまたは疎水性残基を＋１または＋２位に、および疎水性残基を−２および−１位に含有した（例えば、Sugimura et al., Archives of Biochemistry and Biophysics 477 (2008) 379- 383を参照されたい）。
抗体薬物コンジュゲートの生成のためのｍＴＧ２の使用は、機能的ペイロードのモノクローナル抗体対応物とのバイオコンジュゲーションを必要とする。抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）において、抗体は、非常に強い毒素のがん細胞への取り込みおよび放出を特異的に指示して、がん患者のための新規なおよび効果的な新しい治療の選択肢として近年大きい関心を引くようになった技法である。
【００１３】
販売の承認を受けたＡＤＣの例は、転移性乳がんおよびホジキンリンパ腫の治療のためのＫａｄｃｙｌａ（登録商標）（トラスツズマブエムタンシン）およびＡｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン）を含む。これらの抗体ならびに現在臨床開発中の他の抗体候補は、例えばｍＴＧ２を使用するバイオコンジュゲーションによっては得られず、異なる数の薬物分子がそれらに結合した抗体の不均一な混合物を生じるそれらの製造のための化学的コンジュゲーション方法に依存する（例えば、Handbook of Therapeutic Antibodies、2nd edition, edited by S. Dubel and J. M. Reichert, John Wiley & Sons (2014), pp. 369を参照されたい）。
【００１４】
ＡＤＣの不均一性は、特に材料の重要な部分のコンジュゲーションが不十分な場合、薬効に不利に影響し得る。コンジュゲーションが不十分な抗体は、標的結合に関してＡＤＣと競合して、適当にコンジュゲーションされたＡＤＣの効力の低下を生じることが示された。抗体への増大した薬物負荷は、ＡＤＣの効力に不利に影響し得る。データは、薬物：抗体比の高いＡＤＣは、血流からより急速に除去されて、その結果効力は減少することを示した（例えば、Sanderson et al., Clin. Cancer Res. 2005; 11: 843-52を参照されたい）。抗ＣＤ３０モノクローナル抗体−アウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）コンジュゲートを用いる研究により、１：２〜１：４の抗体：薬物の化学量論を有するＡＤＣが最も効果的であり、１：４の比が最も好ましいことが示された（例えば、Hamblett et al.zz Clinical Cancer Research (2004) Vol. 10, 7063-7070を参照されたい）。
【００１５】
ＷＯ２０１３／０９２９８３には、ＴＧアーゼを使用する薬物で免疫グロブリンを機能化する方法が開示されている。この手法は、抗体の重鎖の内側にＱ供与体を生じさせるように指向された突然変異生成により新しい部位を得る方法を記載する。この経験的方法は、改変のためのグルタミン残基のＴＧアーゼによる選択を支配する規則が、まだ大いに未知なので、多数の変異体を試験する必要がある。その結果として、Ｑ供与体を担持する新しい抗体を開発するためにこの方法を使用することは、時間を消費し且つコストが増大することである。
ＷＯ２０１２／０５９８８２は、特異的に操作されたポリペプチドコンジュゲートおよびトランスグルタミナーゼを使用してそのようなコンジュゲートを作製する方法をさらに開示している。
ＷＯ２０１５／０９７２６７は、ｍＴＧ２に媒介されるコンジュゲーション反応のために利用され得るＳ．モバラエンシスのｍＴＧ２などのトランスグルタミナーゼと、グルタミン供与体として、選択的に反応するペプチド配列を開示している。
タンパク質とｍＴＧ２とのバイオコンジュゲーションに関する研究およびバイオコンジュゲーション反応のためのグルタミン供与体として利用することができる新しい配列モチーフの探査にもかかわらず、天然ＭＴＧの基質部位の配列も構造的環境も知られていない。
したがって、バイオコンジュゲートのより効率的な製造のための、特に抗体：薬物の化学量論が十分限定されたＡＤＣの製造のためのｍＴＧ２により認識される基質の範囲を広げる必要がある。
【発明の概要】
【００１６】
本発明者らは、驚くべきことに、少なくともアミノ酸配列ＴＹＦＱＡＹＧを含むストレプトマイセス・モバラエンシス株４０８４７のタンパク質を誘発するディスパーゼ自己分解から誘導されるアシルグルタミン含有供与体配列は、ｍＴＧ２に媒介されるトランスグルタミン化反応で効率的に使用することができることを見出した。
【００１７】
したがって、本発明は、第１の実施形態で、γ−グルタミル−アミド結合を介してアミノ供与体を含む基質に共有結合で連結した少なくとも１つのアシルグルタミン含有アミノ供与体配列を含むタンパク質であって、少なくとも１つのアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列は、配列番号１（配列番号１（ＴＹＦＱＡＹＧ））によるアミノ酸配列を含む、タンパク質を提供する。
１実施形態により、本発明によるアミノ供与体を含む基質は、少なくとも１個のε−アミノ基、または第１級アミノ末端アミノ基を有するＧＧＧの配列を有する少なくとも１個のトリペプチドを含む。
１実施形態において、本発明によるアミノ供与体を含む基質は、リシン残基、リシン誘導体、リシン薬物コンジュゲート、少なくとも１個のリシン残基を含むポリペプチドである。
１実施形態により、本発明の上の実施形態のいずれか１つによりアミノ供与体を含む基質は、さらなる分子に共有結合している。
１実施形態により、アミノ供与体を含む基質のトリペプチドＧＧＧは、そのカルボキシ末端を介してさらなる分子に共有結合している。
１実施形態において、本発明によるさらなる分子（ｍｏｅｌｃｕｌｅ）は、染料、放射性同位体、薬物、リボザイム、ナノボディ、酵素、またはリンカーのいずれか１つである。
１実施形態において、本発明によるさらなる分子は、切断可能であるかまたは非切断性であるリンカーである。
１実施形態により、本発明によるリンカーは、染料、放射性同位体、または細胞毒とカップリングまたは共有結合している。
【００１８】
好ましい実施形態において、上の実施形態のいずれか１つによる本発明のタンパク質は、アシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列を含み、その配列は、配列番号２（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＴＹＦＱＡＹＧＸ4Ｘ5Ｘ6）のアミノ酸配列を含み、ここで、
Ｘ1は、疎水性アミノ酸であり、
Ｘ2は、負に荷電したアミノ酸であり、
Ｘ3は、ＣまたはＮであり、
Ｘ4は、ＣまたはＮであり、
Ｘ5は、極性の非荷電側鎖を有するアミノ酸の１つであり、
Ｘ6は、負に荷電したアミノ酸である。
【００１９】
好ましい実施形態において、上の実施形態のいずれか１つによる本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列は、
Ｘ1が、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、ＭまたはＧのいずれか１つであり、
Ｘ2が、ＤまたはＥの１つであり、
Ｘ3が、Ｃであり、
Ｘ4が、ＣまたはＮであり、
Ｘ5が、Ｓ、Ｔ、またはＮであり、
Ｘ6が、Ｄ、またはＥの１つである
配列番号２のアミノ酸配列を含む。
好ましい実施形態によれば、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列は、
Ｘ1が、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、ＭまたはＧのいずれか１つであり、
Ｘ2が、ＤまたはＥの１つであり、
Ｘ3が、Ｃであり、
Ｘ4が、Ｃであり、
Ｘ5が、Ｓ、Ｔ、またはＮであり、
Ｘ6が、ＤまたはＥの１つである
配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【００２０】
より好ましい実施形態により、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列は、
Ｘ1が、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、ＭまたはＧのいずれか１つであり、
Ｘ2が、Ｅであり、
Ｘ3が、Ｃであり、
Ｘ4が、Ｃであり、
Ｘ5が、Ｔであり、
Ｘ6が、Ｅである
配列番号２のアミノ酸配列を含む。
さらにより好ましい実施形態によれば、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列は、配列番号９０のアミノ酸配列を含む。
１実施形態において、本発明によるタンパク質は、抗体、抗原結合抗体フラグメント、Ｆｃドメイン、酵素、非免疫グロブリンスキャフォールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）の１つである。
１実施形態において、本発明によるタンパク質は、モノクローナル抗体、二価抗体、ＶＨＨ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）2またはｓｃＦｖである。
好ましい実施形態により、本発明によるタンパク質は、ヒトのまたはヒト化されたモノクローナル抗体またはそれらのフラグメントである。
【００２１】
一態様において本発明は、アミノ供与体を含む本発明の基質を、配列番号２のポリペプチド配列を含むアシルグルタミン含有アミノ酸供与体に共有結合でカップリングさせる方法であって、トランスグルタミナーゼ、好ましくはｍＴＧ２の存在下で、本発明によるアミノ供与体を含む基質と本発明によるアシルグルタミン含有アミノ酸供与体とを接触させて、上の実施形態のいずれか１つによる本発明のタンパク質を得るステップを含む、方法を提供する。
１実施形態において、本発明の方法のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体は、抗体、抗原結合抗体フラグメント、酵素、または非免疫グロブリンスキャフォールドである。
１実施形態により、本発明の方法のアミノ供与体を含む基質は、染料、薬物、リボザイム、ナノボディ、酵素、またはリンカーとカップリングまたは共有結合する。
本発明の１実施形態により、リンカーは、切断可能であるかまたは非切断性であり、染料、放射性同位体、または細胞毒とカップリングする。
１実施形態において、本発明は、本明細書で開示された本発明の方法により得ることができるタンパク質を提供する。
１実施形態において、本発明は、本明細書で開示された実施形態のいずれか１つによる本発明の方法における、配列番号２のいずれか１つによるポリペプチド配列の使用を提供する。
１実施形態により、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むタンパク質を提供する。
１実施形態において、本発明は、配列番号２のポリペプチドを提供する。
１実施形態において、本発明は、本発明の配列番号２のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを提供する。
１実施形態において、本発明は、配列番号２のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
１実施形態において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは本明細書で開示された本発明によるベクターを含む宿主細胞を提供する。
１実施形態において、本発明は、配列番号２の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、本発明による抗体またはそれらの抗原結合フラグメント、二価抗体、またはＶＨＨ抗体を提供する。
したがって、本発明の抗体またはそれらの抗原結合フラグメント、二価抗体、またはＶＨＨ抗体は、ヒト化されているかまたはヒトのものである。
好ましい実施形態において、上で開示された本発明による抗体またはそれらの抗原結合フラグメントは、ヒト化されているかまたはヒトモノクローナル抗体である。
好ましい実施形態において、上で開示された本発明の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはＩｇＭタイプの抗体である。
１実施形態において、上で開示された本発明の抗体は、上で開示された少なくとも１つのリンカーと、上で開示された本発明の方法により共有結合でカップリングさせる。
１実施形態により、本発明のモノクローナル抗体の少なくとも１つのリンカーが、染料、放射性同位体、または細胞毒とさらにカップリングさせる。
好ましい実施形態において、本明細書で開示された本発明のモノクローナル抗体は、がん細胞表面抗原に特異的に結合する。
より好ましい実施形態では、上で開示された本発明のモノクローナル抗体はモノクローナル抗体ｃ２２５（セツキシマブ）である。
【００２２】
より好ましい実施形態において、本明細書で開示された本発明の抗体は、がんの治療で使用するためのものであり、より好ましくは、上で開示された本発明の抗体は、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頚がん、皮膚がん、膵がん、好ましくは転移性結直腸がん（ｍＣＲＣ）、切除不能の肝臓転移、頭頸部の扁平上皮細胞癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部の扁平上皮細胞がん（ＨＮＳＣＣ）の治療で使用するためのものである。
１実施形態により、本発明は、本発明の抗体および少なくとも１種のさらなる薬学的活性成分を含む組成物を提供する。
１実施形態において、本発明は、本明細書で開示された本発明の抗体を含む医薬または本発明による組成物および少なくとも１種のさらなる成分を含む医薬を提供する。
１実施形態において、本発明は、治療を必要とするがんに罹患した対象を治療する方法であって、前記患者に治療有効量の本発明による医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ａ）トランスグルタミナーゼに媒介される、グルタミン（Ｑ）のアミン供与体基質とのコンジュゲーション。ｂ）基質タンパク質ＤＡＩＰから取られた天然トランスグルタミナーゼ認識配列のアミノ酸配列（１）および操作された配列（２）およびコンジュゲーションのためのこの研究で使用される配列（３）。ｃ）ＤＡＩＰにおける機能的Ｑ２９８ループを模倣した操作されたトランスグルタミナーゼ認識配列（ＭＴＧタグ）のデザインの模式的描写。
【図２】操作されたモデルペプチドと全長モノクローナル抗体とのＭＴＧに媒介されるコンジュゲーション。ａ）トランスグルタミナーゼ認識モチーフを含有する操作されたモデルペプチド２および３を、モノビオチニルカダベリン（４、ＭＢＣ）を用いてＭＴＧに触媒される反応でビオチン化した。ｂ）配座が束縛されたペプチド２（○）（例えば、配列番号４の本発明のペプチド）を線状ペプチド３（●）（例えば、配列番号３または配列番号５の本発明のペプチドと）と比較したビオチン化速度。標準偏差を表す誤差バーは３組の実験から計算した。Ｃ末端にＭＴＧタグを有するビオチン化セツキシマブバリアントのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびウェスタンブロット分析（９：配列番号９０の本発明のＭＴＧタグ付き、１０：配列番号２４６の本発明のＭＴＧタグ付き）。ビオチン化は、ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートおよびＮＢＴ／ＢＣＩＰ（右パネル）を使用して可視化した。ｄ）ＭＴＧで促進されるビオチン化のために使用されるＣ末端ＭＴＧタグを有するセツキシマブバリアントの全体図（７および８）およびそれぞれのコンジュゲート抗体（９および１０）。
【図３】細胞アッセイおよびフローサイトメトリーにより研究されたビオチン化セツキシマブの結合。  ａ）ＥＧＦＲ陽性ＥＢＣ−１細胞およびＥＧＦＲ陰性ＣＨＯ−Ｋ１細胞（＋ＭＴＧｒｘ．、中央および下側のパネル）を使用してセツキシマブｗｔと比較するビオチン化セツキシマブバリアント９および１０の細胞結合アッセイ。細胞は、ＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｄｉａｍｏｎｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｍｏｕｎｔａｎｔを使用して固定されてＤＡＰＩ（青色）で標識され、ビオチン化はストレプトアビジン−ＡＦ４８８で標識することにより可視化された（緑色）。細胞を、共焦点顕微鏡を使用して走査した。合併写真（Ｍｅｒｇｅｄ  ｐｉｃｔｕｒｅｓ）を示差干渉対照で示した（ＤＩＣ）。ｂ）ビオチン化セツキシマブバリアント９とインキュベートされたＥＧＦＲ陽性ＥＢＣ−１細胞のフローサイトメトリー。ビオチン化セツキシマブと結合した細胞をストレプトアビジンＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲートの添加により蛍光標識した。
【図４】酸化されたペプチド２のトランスグルタミナーゼにより促進されたビオチン化のＲＰ−ＨＰＬＣ分析（勾配１０〜８０％）。２および５のピーク面積を分析してバックグラウンドを差し引いた。
【図５】精製された野性型セツキシマブ（レーン１）およびセツキシマブバリアント７および８のクーマシー染色された１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析（例えば、バリアント７は、本発明によるセツキシマブに対応し、カルボキシ末端で配列番号９０と融合して、ジスルフィド架橋により拘束または束縛されており、バリアントは、ジスルフィド架橋が形成されずにカルボキシ末端で配列番号２４６と融合して、配座は束縛されていないセツキシマブに対応する。抗体は、２−メルカプトエタノールの存在下で還元してからゲルに載せる（２μｇ／レーン）。予め染色されたタンパク質の梯子（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）は、タンパク質サイズをｋＤａで示している。
【図６】トランスグルタミナーゼに媒介されるセツキシマブコンジュゲーションの対照実験、ａ）埋め込まれたエンド−グルタミンをタンパク質から放出して、それらをトランスグルタミナーゼに接近可能にすると記載された活性物質である増大する濃度のアニオン界面活性剤Ｎ−ラウロイルサルコシン（ＬＳ）の存在下における野性型セツキシマブとモノビオチニルカダベリン（ＭＢＣ）とのトランスグルタミナーゼに媒介されるコンジュゲーションのクーマシー染色された１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析。ｂ）増大する濃度のアニオン界面活性剤Ｎ−ラウロイルサルコシン（ＬＳ）の存在下における野性型セツキシマブとモノビオチニルカダベリン（ＭＢＣ）とのトランスグルタミナーゼに媒介されるコンジュゲーションのウェスタンブロット分析。ビオチン化は、ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートおよびＮＢＴ／ＢＣＩＰを使用して検出した。予め染色されたタンパク質の梯子（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）がタンパク質サイズをｋＤａで示している。
【図７】ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析に先立ってトリプシン消化のために使用された１０の重鎖の模式的図。
【図８】１０のトリプシンで消化された重鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。
【図９】１０のトリプシンで消化された重鎖の詳細なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。
【図１０】（Ａ）トリプシン消化から誘導されたペプチドを、バイオインフォマティクスツールＧＰＭＡＷを使用することにより分析した。システイン残基におけるカルバミドメチル（ＣＡＭ）またはグルタミン残基におけるモノビオチニルカダベリン（ＭＢＣ）のいずれかにより改変されたペプチドに藍色で下線を引き、改変なく同定されたペプチドに赤紫色で下線を引いた。（Ｂ）残基の５６％網羅率が達成されたことを示す残基網羅率の統計分析。
【図１１】セツキシマブの野生型配列からのＣ末端リシンを有する（＋Ｋ４４７）抗体とこのＣ末端リシンを欠く（−Ｋ４４７）抗体を比較する、セツキシマブの野生型（ｗｔ）およびバリアント９および１０のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析。ＭＴＧにより触媒される分子内架橋が、ＭＴＧタグとセツキシマブの野生型配列からのＣ末端Ｌｙｓ残基（＋Ｋ４４７）との予備実験で観察された。この架橋はこのリシンを削除する（−Ｋ４４７）ことにより完全に撤廃することができた。
【図１２】ＴＡＭＲＡ−カダベリンおよび蛍光分析を使用する抗体コンジュゲーション有効度の決定。
【図１３】Ｅｌｌｍａｎ試薬を使用する抗体７および８中の遊離チオールの決定。
【図１４】（Ａ）ビオチン化セツキシマブを検出するためのストレプトアビジン−ＡＰ、ＮＢＴ／ＢＣＩＰを使用するウェスタンブロット。矢印は、セツキシマブ（ビオチニル化された）およびｍＴＧ２の位置を示す。（Ｂ）指示されたものを積載するレーンでクーマシー染色されたタンパク質ゲル（Ｃ）蛍光性アミノ供与体基質ＧＧＧ−ＴＡＭＲＡまたはＴＡＭＲＡ−カダベリン（ｃａｄａｖａｒｉｎｅ）とコンジュゲーションされたＭＴＧタグ１（配列番号９０）、またはＭＴＧタグ２（配列番号２４６）を含むセツキシマブを検出するための蛍光読み取り。
【図１５】トランスグルタミナーゼに媒介されるコンジュゲーション反応で使用される種々の第１級アミンについての細胞傷害性ペイロード。（１）非切断性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーおよび第１級アミノ基を有するモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、（２）切断可能バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルカルバメート（ｖｃ−ＰＡＢＣ）リンカー、ＰＥＧ−スペーサーおよび第１級アミンを有するモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、（３）切断可能バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルカルバメート（ｖｃ−ＰＡＢＣ）リンカーおよび脂肪族アミノ基を有するモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、（４）切断可能バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルカルバメート（ｖｃ−ＰＡＢＣ）リンカーおよび脂肪族アミノ基を有するモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）。
【図１６】：微生物のトランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）の触媒作用により合成された抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）。ＡＤＣは、図１５に示した細胞傷害性ペイロードの１〜４とその重鎖の各々にカルボキシ末端ＭＴＧタグを有するＩｇＧ１抗体（セツキシマブ）との酵素に媒介されるコンジュゲーションにより生成された。（Ａ）空試験、（Ｂ）非コンジュゲーション抗体対照、（Ｃ）ペイロード１に対するコンジュゲーションにより得られた種々の薬物対抗体比（ＤＡＲ）を有するＡＤＣ、（Ｄ）ペイロード２に対するコンジュゲーションにより得られた種々の薬物対抗体比（ＤＡＲ）を有するＡＤＣ、（Ｅ）ペイロード３に対するコンジュゲーションにより得られた種々の薬物対抗体比（ＤＡＲ）を有するＡＤＣ、（Ｆ）ペイロード４に対するコンジュゲーションにより得られた種々の薬物対抗体比（ＤＡＲ）を有するＡＤＣ。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
配列表
配列番号１〜配列番号２９４に記載の配列は本発明によるものであり、本発明の実施形態に従って使用することができる。
配列番号１  ＴＹＦＱＡＹＧ
配列番号２  Ｘ1Ｘ2Ｘ3  ＴＹＦＱＡＹＧ  Ｘ4Ｘ5Ｘ6
配列番号３  Ｘ1Ｘ2Ｃ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＸ5Ｘ6
配列番号４  Ｘ1Ｘ2Ｃ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＸ5Ｘ6
配列番号５  Ｘ1Ｘ2Ｎ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＸ5Ｘ6
配列番号６  Ｘ1Ｘ2Ｎ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＸ5Ｘ6
配列番号７  ＡＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＤ
配列番号８  ＶＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＤ
配列番号９  ＩＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＤ
配列番号１０  ＬＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＤ
配列番号１１  ＭＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＤ
配列番号１２  ＧＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＤ
配列番号１３  ＡＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＤ
配列番号１４  ＶＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＤ
配列番号１５  ＩＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＤ
配列番号１６  ＬＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＤ
配列番号１７  ＭＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＤ
配列番号１８  ＧＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＤ
配列番号１９  ＡＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＤ
配列番号２０  ＶＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＤ
配列番号２１  ＩＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＤ
配列番号２２  ＬＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＤ
配列番号２３  ＭＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＤ
配列番号２４  ＧＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＤ
配列番号２５  ＡＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＤ
配列番号２６  ＶＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＤ
配列番号２７  ＩＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＤ
配列番号２８  ＬＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＤ
配列番号２９  ＭＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＤ
配列番号３０  ＧＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＤ
配列番号３１  ＡＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＥ
配列番号３２  ＶＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＥ
配列番号３３  ＩＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＥ
【００２５】
配列番号３４  ＬＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＥ
配列番号３５  ＭＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＥ
配列番号３６  ＧＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＥ
配列番号３７  ＡＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＥ
配列番号３８  ＶＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＥ
配列番号３９  ＩＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＥ
配列番号４０  ＬＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＥ
配列番号４１  ＭＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＥ
配列番号４２  ＧＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＥ
配列番号４３  ＡＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＥ
配列番号４４  ＶＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＥ
配列番号４５  ＩＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＥ
配列番号４６  ＬＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＥ
配列番号４７  ＭＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＥ
配列番号４８  ＧＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＥ
配列番号４９  ＡＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＥ
配列番号５０  ＶＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＥ
配列番号５１  ＩＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＥ
配列番号５２  ＬＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＥ
配列番号５３  ＭＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＥ
配列番号５４  ＧＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＥ
配列番号５５  ＡＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＤ
配列番号５６  ＶＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＤ
配列番号５７  ＩＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＤ
配列番号５８  ＬＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＤ
配列番号５９  ＭＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＤ
配列番号６０  ＧＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＤ
配列番号６１  ＡＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＤ
配列番号６２  ＶＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＤ
配列番号６３  ＩＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＤ
配列番号６４  ＬＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＤ
配列番号６５  ＭＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＤ
配列番号６６  ＧＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＤ
配列番号６７  ＡＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＤ
配列番号６８  ＶＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＤ
配列番号６９  ＩＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＤ
配列番号７０  ＬＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＤ
配列番号７１  ＭＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＤ
配列番号７２  ＧＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＤ
配列番号７３  ＡＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＤ
配列番号７４  ＶＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＤ
配列番号７５  ＩＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＤ
配列番号７６  ＬＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＤ
配列番号７７  ＭＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＤ
配列番号７８  ＧＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＤ
配列番号７９  ＡＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＥ
配列番号８０  ＶＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＥ
【００２６】
配列番号８１  ＩＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＥ
配列番号８２  ＬＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＥ
配列番号８３  ＭＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＥ
配列番号８４  ＧＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＥ
配列番号８５  ＡＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＥ
配列番号８６  ＶＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＥ
配列番号８７  ＩＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＥ
配列番号８８  ＬＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＥ
配列番号８９  ＭＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＥ
配列番号９０  ＧＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＥ
配列番号９１  ＡＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＥ
配列番号９２  ＶＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＥ
配列番号９３  ＩＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＥ
配列番号９４  ＬＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＥ
配列番号９５  ＭＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＥ
配列番号９６  ＧＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＥ
配列番号９７  ＡＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＥ
配列番号９８  ＶＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＥ
配列番号９９  ＩＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＥ
配列番号１００  ＬＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＥ
配列番号１０１  ＭＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＥ
配列番号１０２  ＧＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＥ
配列番号１０３  ＡＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＤ
配列番号１０４  ＶＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＤ
配列番号１０５  ＩＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＤ
配列番号１０６  ＬＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＤ
配列番号１０７  ＭＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＤ
配列番号１０８  ＧＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＤ
配列番号１０９  ＡＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＤ
配列番号１１０  ＶＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＤ
配列番号１１１  ＩＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＤ
配列番号１１２  ＬＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＤ
配列番号１１３  ＭＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＤ
配列番号１１４  ＧＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＤ
配列番号１１５  ＡＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＤ
配列番号１１６  ＶＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＤ
配列番号１１７  ＩＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＤ
配列番号１１８  ＬＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＤ
配列番号１１９  ＭＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＤ
配列番号１２０  ＧＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＤ
配列番号１２１  ＡＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＤ
配列番号１２２  ＶＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＤ
配列番号１２３  ＩＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＤ
配列番号１２４  ＬＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＤ
配列番号１２５  ＭＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＤ
配列番号１２６  ＧＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＤ
配列番号１２７  ＡＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＥ
【００２７】
配列番号１２８  ＶＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＥ
配列番号１２９  ＩＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＥ
配列番号１３０  ＬＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＥ
配列番号１３１  ＭＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＥ
配列番号１３２  ＧＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＥ
配列番号１３３  ＡＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＥ
配列番号１３４  ＶＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＥ
配列番号１３５  ＩＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＥ
配列番号１３６  ＬＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＥ
配列番号１３７  ＭＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＥ
配列番号１３８  ＧＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＥ
配列番号１３９  ＡＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＥ
配列番号１４０  ＶＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＥ
配列番号１４１  ＩＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＥ
配列番号１４２  ＬＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＥ
配列番号１４３  ＭＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＥ
配列番号１４４  ＧＤＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＥ
配列番号１４５  ＡＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＥ
配列番号１４６  ＶＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＥ
配列番号１４７  ＩＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＥ
配列番号１４８  ＬＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＥ
配列番号１４９  ＭＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＥ
配列番号１５０  ＧＥＣ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＥ
配列番号１５１  ＡＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＤ
配列番号１５２  ＶＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＤ
配列番号１５３  ＩＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＤ
配列番号１５４  ＬＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＤ
配列番号１５５  ＭＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＤ
配列番号１５６  ＧＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＤ
配列番号１５７  ＡＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＤ
配列番号１５８  ＶＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＤ
配列番号１５９  ＩＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＤ
配列番号１６０  ＬＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＤ
配列番号１６１  ＭＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＤ
配列番号１６２  ＧＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＤ
配列番号１６３  ＡＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＤ
配列番号１６４  ＶＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＤ
配列番号１６５  ＩＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＤ
配列番号１６６  ＬＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＤ
配列番号１６７  ＭＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＤ
配列番号１６８  ＧＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＤ
配列番号１６９  ＡＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＤ
配列番号１７０  ＶＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＤ
配列番号１７１  ＩＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＤ
配列番号１７２  ＬＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＤ
配列番号１７３  ＭＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＤ
配列番号１７４  ＧＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＤ
【００２８】
配列番号１７５  ＡＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＥ
配列番号１７６  ＶＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＥ
配列番号１７７  ＩＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＥ
配列番号１７８  ＬＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＥ
配列番号１７９  ＭＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＥ
配列番号１８０  ＧＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＥ
配列番号１８１  ＡＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＥ
配列番号１８２  ＶＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＥ
配列番号１８３  ＩＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＥ
配列番号１８４  ＬＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＥ
配列番号１８５  ＭＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＥ
配列番号１８６  ＧＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＳＥ
配列番号１８７  ＡＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＥ
配列番号１８８  ＶＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＥ
配列番号１８９  ＩＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＥ
配列番号１９０  ＬＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＥ
配列番号１９１  ＭＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＥ
配列番号１９２  ＧＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＥ
配列番号１９３  ＡＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＥ
配列番号１９４  ＶＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＥ
配列番号１９５  ＩＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＥ
配列番号１９６  ＬＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＥ
配列番号１９７  ＭＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＥ
配列番号１９８  ＧＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＳＥ
配列番号１９９  ＡＮＤ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＤ
配列番号２００  ＶＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＤ
配列番号２０１  ＩＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＤ
配列番号２０２  ＬＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＤ
配列番号２０３  ＭＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＤ
配列番号２０４  ＧＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＤ
配列番号２０５  ＡＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＤ
配列番号２０６  ＶＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＤ
配列番号２０７  ＩＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＤ
配列番号２０８  ＬＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＤ
配列番号２０９  ＭＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＤ
配列番号２１０  ＧＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＤ
配列番号２１１  ＡＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＤ
配列番号２１２  ＶＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＤ
配列番号２１３  ＩＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＤ
配列番号２１４  ＬＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＤ
配列番号２１５  ＭＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＤ
配列番号２１６  ＧＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＤ
配列番号２１７  ＡＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＤ
配列番号２１８  ＶＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＤ
配列番号２１９  ＩＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＤ
配列番号２２０  ＬＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＤ
配列番号２２１  ＭＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＤ
【００２９】
配列番号２２２  ＧＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＤ
配列番号２２３  ＡＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＥ
配列番号２２４  ＶＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＥ
配列番号２２５  ＩＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＥ
配列番号２２６  ＬＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＥ
配列番号２２７  ＭＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＥ
配列番号２２８  ＧＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＥ
配列番号２２９  ＡＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＥ
配列番号２３０  ＶＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＥ
配列番号２３１  ＩＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＥ
配列番号２３２  ＬＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＥ
配列番号２３３  ＭＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＥ
配列番号２３４  ＧＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＴＥ
配列番号２３５  ＡＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＥ
配列番号２３６  ＶＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＥ
配列番号２３７  ＩＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＥ
配列番号２３８  ＬＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＥ
配列番号２３９  ＭＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＥ
配列番号２４０  ＧＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＥ
配列番号２４１  ＡＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＥ
配列番号２４２  ＶＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＥ
配列番号２４３  ＩＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＥ
配列番号２４４  ＬＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＥ
配列番号２４５  ＭＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＥ
配列番号２４６  ＧＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＴＥ
配列番号２４７  ＡＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＤ
配列番号２４８  ＶＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＤ
配列番号２４９  ＩＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＤ
配列番号２５０  ＬＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＤ
配列番号２５１  ＭＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＤ
配列番号２５２  ＧＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＤ
配列番号２５３  ＡＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＤ
配列番号２５４  ＶＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＤ
配列番号２５５  ＩＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＤ
配列番号２５６  ＬＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＤ
配列番号２５７  ＭＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＤ
配列番号２５８  ＧＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＤ
配列番号２５９  ＡＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＤ
配列番号２６０  ＶＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＤ
配列番号２６１  ＩＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＤ
配列番号２６２  ＬＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＤ
配列番号２６３  ＭＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＤ
配列番号２６４  ＧＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＤ
配列番号２６５  ＡＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＤ
配列番号２６６  ＶＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＤ
配列番号２６７  ＩＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＤ
配列番号２６８  ＬＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＤ
【００３０】
配列番号２６９  ＭＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＤ
配列番号２７０  ＧＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＤ
配列番号２７１  ＡＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＥ
配列番号２７２  ＶＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＥ
配列番号２７３  ＩＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＥ
配列番号２７４  ＬＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＥ
配列番号２７５  ＭＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＥ
配列番号２７６  ＧＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＥ
配列番号２７７  ＡＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＥ
配列番号２７８  ＶＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＥ
配列番号２７９  ＩＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＥ
配列番号２８０  ＬＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＥ
配列番号２８１  ＭＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＥ
配列番号２８２  ＧＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＣＮＥ
配列番号２８３  ＡＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＥ
配列番号２８４  ＶＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＥ
配列番号２８５  ＩＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＥ
配列番号２８６  ＬＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＥ
配列番号２８７  ＭＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＥ
配列番号２８８  ＧＤＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＥ
配列番号２８９  ＡＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＥ
配列番号２９０  ＶＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＥ
配列番号２９１  ＩＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＥ
配列番号２９２  ＬＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＥ
配列番号２９３  ＭＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＥ
配列番号２９４  ＧＥＮ  ＴＹＦＱＡＹＧ  ＮＮＥ
配列番号２９５  ＧＧＧＳＬＬＱＧ
配列番号２９６  ５’−ＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡＧＴＡＣ
配列番号２９７  ５’−ＣＣＴＧＡＡＡＧＴＡＧＧＴＧＣＡＣＴＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧ
配列番号２９８  ５’−ＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＣＧＧＴＧＣＡＧＣＣＧＴＡＧＧＣＣＴＧＡＡＡＧＴＡＧＧＴＧＣＡＣＴＣＧ
配列番号２９９  ５’−ＣＴＧＡＡＡＧＴＡＧＧＴＧＴＴＣＴＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧ
配列番号３００  ５’−ＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＣＧＧＴＡＴＴＧＣＣＧＴＡＧＧＣＣＴＧＡＡＡＧＴＡＧＧＴＧＴＴＣＴＣＧ
配列番号３０１  ５’−ＮＮＮ1ＮＮＮ2ＮＮＮ3ＡＣＮＴＡＹＴＴＹＣＡＲＧＣＮＴＡＹＧＧＮ  ＮＮＮ4ＮＮＮ5ＮＮＮ6
配列番号３０２  ＬＰＸＴＧ、Ｘ＝Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｎ、Ｑ、またはＫである。
配列番号３０３  ＧＧＧＹＫ
【００３１】
本発明を、下で詳細に説明するが、これらは変化してもよいので、本発明はここで記載された特定の方法、プロトコルおよび試薬に限定されないことが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のためだけのものであり、添付の請求項によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも理解されるべきである。特に断りのない限り、ここで使用される全ての技術的および科学的用語は、当業者により共通して理解される同じ意味を有する。
【００３２】
以下に、本発明の構成要素を説明する。これらの構成要素は特定の実施形態でリストに挙げるが、それらは追加の実施形態を創るための任意の様式でおよび任意の数で組み合わされてもよいことが理解されるべきである。種々に記載される例および好ましい実施形態は、本発明を、明示的に記載された実施形態にのみ限定すると解釈されるべきでない。この記載は、明示的に記載された実施形態を任意の数の開示されたおよび／または好ましい構成要素と組み合わせた実施形態を支持し、包含すると理解されるべきである。さらに、本出願中の全ての記載された構成要素の任意の入れ替えおよび組合せは、前後関係が他のように指示しない限り、本出願の記載により開示されたとみなされるべきである。
【００３３】
以下の本明細書および請求項全体を通して、前後関係で他のように要求されない限り、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変形形態は、述べられているメンバー、整数またはステップの包含を意味するが、如何なる他の述べられていないメンバー、整数またはステップの排除も意味しないと理解される。用語「ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ」は用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」の特定の実施形態であり、その場合如何なる他の述べられていないメンバー、整数またはステップも排除される。本発明の関係で、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」は用語「ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ」を包含する。
用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および本発明を記載する文脈で（特に請求項の文脈中で）使用される同様な言及は、特に断りのない限り、または文脈で明らかに矛楯しない限り、単数および複数の両方を含むと解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の記載は、範囲内に入る別々の各値を個々に言及する省略方法として役立つことが単に意図されているものである。明細書で他のように指示されない限り、個々の各値は、恰もそれが本明細書で個々に記載されたように本明細書に組み込まれる。本明細書中の如何なる言語も、本発明の実行に必須の如何なる特許請求されていない要素を指示すると解釈されるべきではない。
数件の文献が本明細書の本文全体にわたって引用されている。本明細書で引用された文献の各々（全ての特許、特許公開、科学的発表、メーカーの仕様書、使用説明書、その他を含む）は、前出であっても後掲であっても、それらの全体で参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中の如何なるものも、先行発明のおかげで、本発明がそのような開示に先んずる権利を与えられないと承認するものと解釈されるべきでない。
【００３４】
記載された目的は、本発明により、好ましくは、添付の請求項の主題により解決される。より好ましくは、本発明は、第１の実施形態に従ってγ−グルタミルアミド結合を介してアミノ供与体を含む基質と共有結合で連結した少なくとも１つのアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列を含むタンパク質により解決され、ここで、少なくとも１つのアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列は、少なくとも配列番号１のアミノ酸配列（配列番号１（ＴＹＦＱＡＹＧ））を含む。したがって、本発明は、少なくとも１個、例えば１、２、３、４、５、６、７、または８個、好ましくは１〜６個（例えば１、２、３、４、５、６個）、より好ましくは１〜４個（例えば１、２、３、４個）のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列を含むタンパク質を提供し、それにより本発明による少なくとも１個のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列がγ−グルタミルアミド結合を介してアミノ供与体を含む基質に共有結合で連結し、少なくとも１個のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列が少なくとも配列番号１のアミノ酸配列（ＴＹＦＱＡＹＧ）を含む。本発明による「アシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列」という用語は、長さが少なくとも７個のアミノ酸、例えば、長さが少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸であるアミノ酸配列に関し、それは、少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含む。本発明によるアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列は、例えば、配列番号１のアミノ酸配列に加えて天然または非天然のアミノ酸、または天然に生じるアミノ酸誘導体を含んでいてもよい。例えば、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列は、１、２、３、４、５、６、７または８個の非天然アミノ酸、または天然に生じるアミノ酸誘導体を含んでいてもよい。
【００３５】
例えば、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列に含まれてもよい非天然アミノ酸は、アジドノルロイシン、３−（１−ナフチル）アラニン、３−（２−ナフチル）アラニン、ｐ−エチニル−フェニルアラニン、ｐ−プロパルギル−オキシ−フェニルアラニン、ｍ−エチニル−フェニルアラニン、６−エチニル−トリプトファン、５−エチニル−トリプトファン、（Ｒ）−２−アミノ〜３−（４−エチニル−１Ｈ−ピロール−３−イル）プロパン酸、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−アジドフェニルアラニン、３−（６−クロロインドリル）アラニン、３−（６−ブロモインドリル）アラニン、３−（５−ブロモインドリル）アラニン、アジドホモアラニン、およびｐ−クロロフェニルアラニンを含んでいてもよい。例えば、天然に生じるアミノ酸誘導体は、４−ヒドロキシプロリン、ε−Ν，Ν，Ν−トリメチルリシン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、Ｏ−ホスホセリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ν−アセチルリシン、ω−Ν−メチルアルギニン、Ｎ−アセチルセリン、Ν，Ν，Ν−トリメチルアラニンを含んでもよい。
【００３６】
本発明による用語「γ−グルタミルアミド結合」は、イソペプチド結合、例えば、それぞれのポリペプチドまたはタンパク質のペプチド結合骨格の部分を形成しないアミド結合を指し、それは、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列のグルタミル残基のγ−炭素と本発明によるアミノ供与体を含む基質の第１級（１°）アミンとの間で形成される。
【００３７】
１実施形態により、本発明によるアミノ供与体を含む基質は、第１級アミノ末端アミノ基を有するＧＧＧの配列を有する少なくともε−アミノ基または少なくとも１個のトリペプチドを含む。例えば、本発明によるアミノ供与体を含む基質は、Ｌ−リシンなどのリシン、またはリシン誘導体、またはそれらの構造的模倣体、例えばジアミノ酪酸（ＤＡＢ）、２，３−ジアミノプロパン酸、（２Ｓ）−２，８ジアミノオクタン酸、オルニチン（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅｍ）、チアリシン、１，５−ジアミノペンタン、またはＮ−（ビオチニル）カダベリンなどであってもよい。本発明によるアミノ供与体を含む基質は、例えば、染料（例えばＴＡＭＲＡ、またはＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）染料）、または例えばビオチンなどの他の分子とカップリングしたリシン誘導体も含んでいてもよい。本発明によるアミノ供与体を含む基質は、例えばＧＧＧトリペプチドであってもよく、それは、例えば、染料または、例えば、ＴＡＭＲＡ−エチレンジアミンまたはビオチン、例えば：
【００３８】
【化１】
2018529321.tif 000002
または例えば：
【００３９】
【化２】
2018529321.tif 000003
などの分子とさらにカップリングしていてもよい。
１実施形態において、本発明によるアミノ供与体を含む基質は、例えば、ポリペプチドを含む少なくとも１個のリシン残基を含んでいてもよい。
【００４０】
１実施形態により、本発明のアミノ供与体を含む基質は、さらなる分子に共有結合している。例えば、上で開示された本発明によるアミノ供与体を含む基質、例えば上で開示されたトリペプチドは、好ましくは、そのカルボキシ末端を介してさらなる分子に共有結合していてもよい。例えば、さらなる分子は、ペプチド結合、イソペプチド結合、または任意の他の共有結合、例えばジスルフィド結合などを介して共有結合していてもよい。
【００４１】
１実施形態により、上で開示された本発明によるさらなる分子は、染料、放射性同位体、薬物、リボザイム、ナノボディ、酵素、またはリンカーの１つである。例えば、本発明によるアミノ供与体を含む基質に共有結合した染料は、蛍光団であってもよい。したがって、本発明によるアミノ供与体を含む基質は、蛍光団に共有結合していてもよい。用語「蛍光団」は、本発明で使用される場合、特定の波長の光に曝露されることにより励起すると、異なる波長で発光する化合物を指し、例えば、本発明によるアミノ供与体を含む基質に共有結合していてもよい蛍光団は、１，８−ＡＮＳ、４−メチルウンベリフェロン、７−アミノ−４−メチルクマリン、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン、アクリジン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４０５（商標）、ＡＭＣＡ、ＡＭＣＡ−Ｘ、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１０１、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４３０（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８０（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（商標）、ＢＯＤＩＰＹ  ４９２／５１５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５３２（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４（商標）、ＢＯＤＩＰＹ５０５／５１５、Ｃｙ２、ｃｙＱＵＡＮＴ  ＧＲ、ＦＩＴＣ、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４、ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）５１４、ＥＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ｄＴｏｍａｔｏ、Ｃｙ３．５、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）、ローダミンレッド、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＢａｎａｎａ、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ、ＲＯＸ、ＤｙＬｉｇｈｔ５９４、カルシウムクリムソン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６１０（商標）、テキサスレッド、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＫａｔｅ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６６０（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０（商標）ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、ＤＲＡＱ−５、カルボキシナフトフルオレセイン、Ｃ７、ＤｙＬｉｇｈｔ７５０、Ｃｅｌｌｖｕｅ  ＮＩＲ７８０、ＤＭ−ＮＥＲＦ、エオシン、エリスロシン、フルオレセイン、ＦＡＭ、ヒドロキシクマリン、赤外染料（ＩＲＤ４０、ＩＲＤ７００、ＩＲＤ８００）、ＪＯＥ、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ  ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、メトキシクマリン、ナフトフルオレセイン、ＰｙＭＰＯ、５−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、６−カルボキシテトラメチルアミノ、カスケードブルー、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５，６−ＦＡＭ、塩化ダンシル、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、ＮＢＤ（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅ��ｎ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレジルファストバイオレット、クレジルブルーバイオレット、ブリリアントクレジルブルー、パラ−アミノ安息香酸、エリスロシン、フタロシアニン、アゾメチン、シアニン、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、希土類金属クリプテート、ユウロピウムトリスビピリジンジアミン、ユウロピウムクリプテートまたはキレート、ジアミン、ジシアニン、またはラホーヤブルー染料を含むことができる。本発明による蛍光団は、例えば、量子ドットを含むこともできる。本発明で使用される量子ドットという用語は、ナノ結晶の半径がその半導体材料の励起子のボーア半径のサイズ以下である半導体材料の単一の球形のナノ結晶を指す（励起子のボーア半径の値は、the CRC Handbook of Chemistry and Physics, 83rd ed., Lide、David R. (Editor), CRC Press, Boca Raton, Fla. (2002)などの半導体の性質に関する情報を含むハンドブックに見出されるデータから計算することができる）。量子ドットは、参考文献、例えば、Weller, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32: 41-53 (1993),Alivisatos, J. Phys. Chem. 100: 13226-13239 (1996)およびAlivisatos, Science 271: 933-937 (1996)などに記載されているので、当技術分野において知られている。
【００４２】
量子ドットは、例えば、直径が、約１ｎｍ〜約１０００ｎｍ、例えば１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ、または５００ｎｍ、好ましくは少なくとも約２ｎｍ〜約５０ｎｍであってもよく、より好ましくは、ＱＤは直径が、少なくとも約２ｎｍ〜約２０ｎｍ（例えば約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｎｍ）である。ＱＤは、それらの実質的に均一なナノメートルサイズにより特徴づけられ、しばしば約１０％〜１５％の多分散またはサイズ範囲を示す。ＱＤは、励起されると電磁放射線を放出することができて（即ち、ＱＤは発光性である）、１種または複数の第１の半導体材料の「コア」を含み、第２の半導体材料の「シェル」により取り囲まれ得る。半導体シェルにより取り囲まれたＱＤコアは「コア／シェル」ＱＤと称される。取り囲む「シェル」材料は、好ましくはコア材料のバンドギャップエネルギーより大きいバンドギャップエネルギーを有し、「コア」基質の原子間隔に近い原子間隔を有するように選択され得る。コアおよび／またはシェルは、ＩＩ〜ＶＩ族（ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＵＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、ＨｇＴｅ、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＳｅ、ＢａＴｅ等）の材料およびＩＩＩ〜Ｖ族（ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＧａＳｂ、ＩｎＮ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂ等）およびＩＶ族（Ｇｅ、Ｓｉ等）の材料、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、およびそれらの合金または混合物を含むが、これらに限定されない半導体材料であることができる。好ましいシェル材料はＺｎＳを含む。量子ドットは、本発明のリンカー、酵素、またはタンパク質と、当技術分野において知られた任意の方法、例えば、Nanotechnology. 2011 Dec 9;22(49):494006; Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 84 (2011) 360-368で開示された方法などによりカップリングしていてもよい。
【００４３】
１実施形態により、本発明のアミノ供与体を含む基質は、放射性同位体、例えば47Ｃａ、14Ｃ、137Ｃｓ、157Ｃｒ、57Ｃｏ、60Ｃｏ、67Ｃｕ、67Ｇａ、123Ｉ、125Ｉ、129Ｉ、131Ｉ、32Ｐ、75Ｓｅ、85Ｓｒ、35Ｓ、201Ｔｈ、3Ｈなどと共有結合していてもよく、好ましくは、放射性同位体は、さらなる分子（ｍｏｅｌｃｕｌｅ）、例えばキレート化剤などに組み込まれる。例えば、本発明のアミノ供与体を含む基質に共有結合したさらなる分子として使用され得る典型的なキレート化剤は、ＤＰＴＡ、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン−テトラ酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール−Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸、ＮＴＡ（ニトリロトリ酢酸）、ＨＥＤＴＡ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−トリ酢酸）、ＤＴＰＡ（２−［ビス［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］−エチル］アミノ］酢酸）、またはＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロ−ドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸）である。
【００４４】
例えば、１実施形態において、本発明によるアミノ供与体を含む基質は、薬物に共有結合していてもよい。用語「薬物」は、本発明で使用される場合、細胞、例えばがんまたは腫瘍細胞の生理学的機能を妨げる任意の化合物または分子を指す。本発明によるアミノ供与体を含む基質と連結し得る薬物は、細胞分裂抑制剤、または細胞傷害性活性物質を含むことができる。例えば、本発明によるアミノ供与体を含む基質に対する共有結合カップリングのために使用することができる細胞分裂抑制剤は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗生物質、有糸分裂阻害剤、ホルモン、またはホルモンアンタゴニストを含む。アルキル化剤は、例えば、ブスフラン（Ｍｙｌｅｒａｎ）、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ）、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ）、エストラムスチンホスフェート、イホスファミド、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン（フェニルアラニンマスタード）、プロカルバジン、チオテパ、ウラシルマスタードを含むことができ；代謝拮抗物質は、例えば、クラドリビン、シタラビン（シトシンアラビノシド）、フロキシウリジン（ＦＵＤＲ、５−フルオロデオキシウリジン）、フルダラビン、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、ゲミシタビン、ヒドロキシウレア、６−メルカプトプリン（６ＭＰ）、メトトレキセート（Ａｍｅｔｈｏｐｔｅｒｉｎ）、６−チオグアニン、ペントスタチン、ピボブロマン、テガフール、トリメトレキセート、グルクロネートを含むことができ；抗生物質は、例えば、アクラルビシン（ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ）、ブレオマイシン、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、プリカマイシン（Ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ）を含むことができ；または有糸分裂阻害剤は、例えば、エトポシド（ＶＰ−１６、ＶｅＰｅｓｉｄ）、テニポシド（ＶＭ−２６、Ｖｕｍｏｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンを含むことができ；使用することができるホルモン、もしくは、ホルモンアンタゴニストは、例えば、ブセレリン、コンジュゲートウマエストロゲン（プレマリン）、コルチゾン、Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｎｓｅｎｅ（Ｔａｃｅ）、デキサメタゾン（Ｄｅｃａｄｒｏｎ）、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、エチニルエストラジオール（Ｅｓｔｉｎｙｌ）、フルオキシメステロン（Ｈａｌｏｔｅｓｔｉｎ）、フルタミド、ゴセレリンアセテート（Ｚｏｌａｄｅｘ）、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート（Ｄｅｌａｌｕｔｉｎ）、リュープロリド、メドロキシプロゲステロンアセテート（Ｐｒｏｖｅｒａ）、メゲストロールアセテート（Ｍｅｇａｃｅ）、プレドニゾン、タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ）、テストラクトン（Ｔｅｓｌａｃ）、テストステロンを含む。これらの上で開示されたような細胞分裂抑制または抗新生物化合物は、先行技術で知られており、例えば、D. S. Fischer & T. M. Knobf (1989), The cancer chemotherapy handbook (3rd ed.). Chicago: Year Book Medical and Association of Community Cancer Centers (Spring, 1992), Compendia-based drug bulletin, Rockville、MDに見���すことができる。
例えば、１実施形態において、本発明によるアミノ供与体を含む基質は、Ｌ−アスパラギナーゼなどの酵素に共有結合していてもよい。
【００４５】
１実施形態により、本発明のアミノ供与体を含む基質は、例えば、リボザイムまたはナノボディに共有結合していてもよい。用語「リボザイム」は、本発明で使用される場合、トランススプライシング活性および自己スプライシング活性を有する酵素的に活性なＲＮＡ分子を指す。本発明の目的に対して、リボザイムは、トランススプライシング反応によりがん特異的遺伝子の活性を阻害し、それにより選択的抗がん効果を示すよう機能することができる。がん特異的遺伝子を不活性化することおよびがん治療遺伝子を活性化することができる限り、任意のリボザイムを本発明で使用することができる。
【００４６】
１実施形態において、本発明のアミノ供与体を含む基質は、例えば、ナノボディに共有結合していてもよい。本明細書において使用する場合、用語「ナノボディ」は、例えば、ラマ種（Ｌａｍａ  ｐａｃｃｏｓ、Ｌａｍａ  ｇｌａｍａおよびＬａｍａ  ｖｉｃｕｇｎａ）などの世界の新しいメンバーを含む、ラクダ科動物およびヒトコブラクダ、例えばＣａｍｅｌｕｓ  ｂａｃｌｒｉａｎｕｓおよびＣａｌｅｌｕｓ  ｄｒｏｍａｄｅｒｉｕｓから得られるＶＨＨ抗体などの、小さい単一の可変領域を含む抗体を指す。これらの種からの抗体は、サイズ、構造的複雑性およびヒト被験者に対する抗原性に関して特徴づけられてきた。見出されたこのファミリーの哺乳動物からのあるＩｇＧ抗体は、生来軽鎖を欠き、したがって他の動物からの抗体の２個の重鎖および２個の軽鎖を有する典型的な４鎖の第４級構造から構造的に区別される（例えば、ＷＯ９４／０４６７８、Hamers-Casterman C, Nature 363: 446-448; Harmsen (2007) Appl Microb Biotechnol 77:13-22を参照されたい）。
【００４７】
１実施形態により、本発明のアミノ供与体を含む基質は、例えば、リンカーに共有結合していてもよい。用語「リンカー」または「リンカーペプチド」は、２個の分子、例えば２個のポリペプチドドメインを連結する２個のポリペプチド配列、または例えばタンパク質および細胞分裂抑制薬、または毒素を接続または連結する合成または人工的アミノ酸配列を指す。用語「合成」または「人工的」は、本発明で使用される場合、天然には生じないアミノ酸配列を指す。
【００４８】
１実施形態により、本発明のアミノ供与体を含む基質と共有結合したリンカーは、切断可能であるかまたは非切断性である。用語「切断可能」は、本発明で使用される場合、プロテアーゼ、酸により、またはジスルフィド体（例えばグルタチオンに媒介されるまたはグルタチオンに敏感な）の還元により、切断され得るリンカーを指す。例えば、切断可能なリンカーは、バリン−シトルリンリンカー、ヒドラゾンリンカー、またはジスルフィドリンカーを含むことができる。例えば、本発明のアミノ供与体を含む基質に共有結合していてもよい非切断性リンカーは、ＭＭＡＦ（ｍｃ−ＭＭＡＦ）へのマレイミドカプロイルリンカー、Ｎ−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＭＣＣ）、またはメルカプト−アセトアミドカプロイルリンカーを含む。
１実施形態により、本発明によるリンカーは、染料、放射性同位体、または細胞毒とカップリングまたは共有結合している。したがって、本発明のアミノ供与体を含む基質に共有結合している本発明によるリンカーは、例えば、染料、放射性同位体、または細胞毒とカップリングまたは共有結合していてもよい。用語「カップリングしている」は、本発明によるリンカーについて使用される場合、染料、放射性同位体または細胞毒（ｃｙｔｏｘｉｎ）が、本発明によるリンカー分子に、非共有結合で、例えばイオン性、または疎水性相互作用により結び付けられている事実を指す。例えば、リンカーは、ストレプトアビジンを含むことができ、染料、放射性同位体または細胞毒がビオチン（ｂｉｏｔｉｏｎ）に共有結合していてもよい。例えば、放射性同位体の場合に、放射性同位体が、ビオチン（ｂｉｏｔｉｏｎ）に共有結合していてもよい、上で開示されたキレート化剤の１種にキレートされていてもよい。あるいは、放射性同位体は、例えば、ビオチン、例えば［８，９−３Ｈ］ビオチン中に組み込まれていてもよい（例えば、Robinson et al., J Biol Chem. 1983 May 25; 258(10): 6660-4を参照されたい）。
好ましくは、リンカーは、例えば「ペイロード」と称されることもある細胞毒に例えば共有結合で結合されていてもよい（例えばPerez et al. Drug Discovery Today Vol 19 (7)、July 2014を参照されたい）。
【００４９】
リンカー分子に共有結合で接続するために適する細胞毒は、例えば上で開示されたものを含み、２つの主要なクラスにグループ分けすることができる。第１のクラスは、微小管アセンブリーを不通にする細胞毒を含み、第２のクラスの細胞毒はＤＮＡ構造を標的とする。したがって、本発明によるリンカーに、例えば共有結合で結合されていてもよい細胞毒は、ドキソルビシン、カリケアマイシン、アウリスタチン、メイタンシン、デュオカルマイシン（ｄｕｏａｒｍｙｃｉｎ）およびそれらのアナログ、α−アマニチン（ａｍａｉｔｉｎ）、ツブリシンおよびそれらのアナログを含む。細胞毒を共有結合でリンカーに結び付ける方法は、当技術分野において知られており、例えば、Mol. Pharmaceutics 2015, 12, 1813-1835で開示された方法に従って行うことができる。したがって、上で開示された切断可能または非切断性リンカーに結び付けられて、さらに上で開示された細胞毒に結び付けられた本発明のアミノ供与体を含む基質は、例えば、トランスグルタミナーゼに媒介されるバイオコンジュゲーション反応で使用することができる。好ましくは、バイオコンジュゲーション反応は、ｍＴＧ２により触媒される。バイオコンジュゲーション反応は、ｍＴＧ２で触媒される反応を可能にする条件下で、ｍＴＧ２の存在下に、少なくとも配列番号１（ＴＹＦＱＡＹＧ）によるアミノ酸配列を含む上で開示された本発明による少なくとも１個のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列基質、および上で開示された本発明のアミノ供与体を含む基質を例えば含むことができる。
【００５０】
１実施形態により、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列は、配列番号２のアミノ酸配列（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＴＹＦＱＡＹＧＸ4Ｘ5Ｘ6）を含み、式中、
Ｘ1は、疎水性アミノ酸であり、
Ｘ2は、負に荷電したアミノ酸であり、
Ｘ3は、ＣまたはＮであり、
Ｘ4は、ＣまたはＮであり、
Ｘ5は、極性、非荷電側鎖を有する１つのアミノ酸であり、Ｘ6、は負に荷電したアミノ酸である。
【００５１】
したがって、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列において、Ｘ1は、アミノ酸Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｖの任意の１つを含むことができ、Ｘ2は、アミノ酸Ｄ、Ｅを含むことができ、Ｘ3、Ｘ4は、ＣまたはＮの１つであってもよく、Ｘ5は、Ｓ、Ｔ、ＮまたはＱの１つであってもよく、Ｘ6は、Ｄ、またはＥの１つであってもよい。したがって、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列は、配列番号１〜配列番号２９４のいずれか１つによるアミノ酸配列を含むことができて、例えば本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、
【００５２】
配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、配列番号２２４、配列番号２２５、
【００５３】
配列番号２２６、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４、配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号２６７、配列番号２６８、配列番号２６９、配列番号２７０、配列番号２７１、配列番号２７２、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号２７７、配列番号２７８、配列番号２７９、配列番号２８０、配列番号２８１、配列番号２８２、配列番号２８３、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８８、配列番号２８９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９４のいずれか１つを含むことができる。
【００５４】
１実施形態により、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列において、Ｘ1は、アミノ酸Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、ＭまたはＧのいずれか１つを含むことができ、Ｘ2は、アミノ酸Ｄ、Ｅを含むことができ、Ｘ3は、Ｃであってもよく、Ｘ4は、ＣまたはＮであってもよく、Ｘ5は、Ｓ、Ｔ、またはＮのいずれか１つであってもよく、Ｘ6は、ＤまたはＥの１つであってもよい。したがって、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０のいずれか１つによるアミノ酸配列を含むことができる。
【００５５】
好ましい実施形態によれば、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列は、Ｘ3およびＸ4が両方ともＣである配列番号４（Ｘ1Ｘ2ＣＴＹＦＱＡＹＧＣＸ5Ｘ6）によるアミノ酸配列を含み、その結果、ジスルフィド結合が２個のシステイン残基Ｘ3およびＸ4の間で形成され得て、それがループ様構造を形成し、アミノ残基ＴＹＦＱＡＧがループ様構造を形成する。本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列において、Ｘ1は、アミノ酸Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、ＭまたはＧのいずれか１つであってもよく、Ｘ2は、ＤまたはＥであってもよく、Ｘ3およびＸ4は、両方ともＣであり、Ｘ5は、Ｓ、ＴまたはＮの１つであってもよく、Ｘ6は、アミノ酸ＤまたはＥの１つであってもよい。したがって、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８のいずれか１つによるアミノ酸配列を含むことができる。
【００５６】
本発明のペプチドは、当技術分野で任意の知られた方法により、例えば、Atherton、E.; Sheppard, R.C. (1989). Solid Phase peptide synthesis: a practical approach. Oxford, England: IRL Press. ISBN 0-19-963067-4、または Stewart, J.M.; Young, J.D. (1984). Solid phase peptide synthesis (2nd ed.)、ISBN 0-935940- 03-0)で開示された方法に従って合成することができる。ペプチドは、例えば、ＡｍｐｈｉＳｐｈｅｒｅｓ  ４０ＲＡＭ樹脂（Ａｇｉｌｅｎｔ、０．２７ｍｍｏｌ／ｇ）上でＬｉｂｅｒｔｙ  Ｂｌｕｅ（商標）マイクロ波ペプチド合成機を０．１ｍｍｏｌスケールで使用してマイクロ波で補助されるＦｍｏｃ−ＳＰＰＳによって合成することもできる。それぞれのカルボキシ官能性アミノ酸の活性化は、例えばＯｘｙｍａ／Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）により実施することができる。アミノ末端のＦｍｏｃ基の脱保護は、例えば、Ｏｘｙｍａの存在下でＤＭＦ中２０％ピペリジンを使用して行うことができる。合成サイクル中に、全てのアミノ酸は、例えば、９０℃に（システインを５０℃に）加熱されてもよい。その場合、ペプチドは、例えば、９４％ＴＦＡ、２％トリエチルシラン、２％アニソール、２％Ｈ2Ｏの標準的切断カクテルにより樹脂から切断され得る。例えば、配列番号４のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体ペプチドが合成されたときに、例えば、約１ｍＭから約５０ｍＭ、または約１０ｍＭから約４０ｍＭの濃度ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の存在下などの非酸化的合成および切断条件下で。残基Ｘ3とＸ4の間のジスルフィド架橋形成は、酸化条件下で、例えばｐＨ８．４の１００ｍＭ（ＮＨ4）2ＣＯ3水溶液中１ｍｇｍｌ-1で達成することができて、その場合、酸化反応はＲＰ−ＨＰＬＣによりモニターすることができる。
【００５７】
より好ましい実施形態では、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列において、Ｘ1は、アミノ酸Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、ＭまたはＧのいずれか１つであってもよく、Ｘ2は、Ｅであり、Ｘ3、Ｘ4は、両方ともＣであり、Ｘ5は、Ｔであり、Ｘ6は、Ｅである。したがって、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列は、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、または配列番号９０のいずれか１つを含むことができる。
より好ましい実施形態によれば、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列において、配列は配列番号９０（ＧＥＣＴＹＦＱＡＹＧＣＴＥ）によるアミノ酸配列を含む。
【００５８】
上で開示された本発明によるアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列は、対象のタンパク質、例えば酵素または抗体などに、例えば共有結合で結合されていてもよい。例えば、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列をコードするポリヌクレオチドは、抗体の軽鎖または重鎖をコードするｃＤＮＡ構造にポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により付加することができる。例えば、ＳＯＥ−ＰＣＲは、PCR Methods Appl. 1993 May; 2(4): 301-4、または例えば、Critical Reviews in Oral Biology and Medicine, 4 (3/4): 581-590 (1993)で開示された原理に従って使用することができる。
１実施形態において、上で開示された本発明によるアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列を含むタンパク質は、抗体、抗原結合抗体フラグメント、Ｆｃドメイン、酵素、非免疫グロブリンスキャフォールドであってもよい。したがって、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列は、抗体、抗原結合フラグメント、Ｆｃドメイン、酵素、非免疫グロブリンスキャフォールドに共有結合で結合していてもよい。
【００５９】
例えば、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列を含む本発明によるタンパク質は、抗体であってもよく、ここで、用語「抗体」は、標的、例えば炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド、その他などに、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を通して特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。本発明で使用される場合、用語「抗体」は、完全なポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、特に断りのない限り、完全抗体と特異的結合を競合するそれらの任意の抗原結合フラグメント、抗原結合部分を含む融合タンパク質、抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された形態、多エピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）も包含する。
【００６０】
用語「モノクローナル抗体」は、本発明によるタンパク質について使用される場合、単一の結合特異性を示す抗体を指し、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特性を示すものであり、何らかの特定の方法による抗体の製造を必要とするものとして解釈されるべきでない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler et at., Nature, 256:495 (1975)により記載されたハイブリドーマ（例えばマウスのまたはヒトの）の方法により作製されてもよく、または組み替えＤＮＡの方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）により作製されてもよい。「モノクローナル抗体」は、Clackson et at. , Nature, 352: 624-628 (1991) およびMarks et at., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)に記載された技法を使用してファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
用語「ヒトモノクローナル抗体」は、本発明によるタンパク質について使用される場合、ヒトの生殖細胞系列の免疫グロブリン配列から誘導された可変領域および定常領域を有するモノクローナル抗体を指す。用語「ヒト化」は、本発明に関して使用される場合、好ましくは、抗体のその標的抗原に結合する能力を担当するその相補性決定領域（ＣＤＲ）セグメントの一部が非ヒト起源であるが、アミノ酸配列がヒトバリアントのものと本質的に同一であるモノクローナル抗体を指す。用語「キメラモノクローナル抗体」は、本発明で使用される場合、マウスのＦａｂフラグメントがヒトＦｃに接合されたモノクローナル抗体を指す。
【００６１】
１実施形態において、上で開示された本発明によるタンパク質は、抗原結合フラグメントである。用語「抗原結合フラグメント」は、本発明のタンパク質について使用される場合、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｄ、Ｆｖ、ドメイン抗体を指し、「ナノボディ」（ｄＡｂｓ、またはＶＨＨ、例えば、サメおよびラクダ科の動物の抗体、例えば、mAbs (2015) 7:1, 15-25; Current Opinion in Structural Biology 2015, 32: 1-8を参照されたい）とも称され、フラグメントは、相補性決定領域（ＣＤＲ）、単鎖可変フラグメント抗体（ｓｃＦｖ）、マキシボディ、低分子化抗体、細胞内発現抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖ、およびポリペプチドに特異的抗原結合を与えるのに十分な、免疫グロブリンの少なくとも一部分を含有するポリペプチドを含む。本発明により使用される「二重特異性抗体」とは、２個の異なった標的分子に結合し得る抗体であり、本発明による「二価抗体」は、１個の標的分子の２個の異なった部位に結合することができる抗体である。用語「ｓｃＦｖ」は、本発明で使用される場合、リンカーにより接続された抗体重鎖可変ドメイン（または領域；ＶＨ）および抗体軽鎖可変ドメイン（または領域；ＶＬ）を含み、定常ドメインを欠く分子を指す。例えば、本発明のタンパク質は、例えば、ナノボディのカルボキシ末端に融合した本発明によるアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列を含むナノボディであってもよい。したがって、本発明によるナノボディは、例えば、ｍＴＧ２に媒介されるバイオコンジュゲーションで使用することもできて、それにより、アミノ供与体を含む基質は、例えば、上で開示されたリンカー−細胞毒とさらにカップリングしてもよく、または例えば、上で開示された放射性同位体もしくは染料とさらにカップリングしてもよい。本発明のナノボディは、例えば、がんの治療、または撮像の目的に使用することができる。例えば、ＥＧＦＲ、またはＨＥＲ２に特異的に結合する68Ｇａとカップリングした本発明のナノボディは、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２を発現している腫瘍を検出または撮像するためのＰｅｔ撮像のために使用することができる。用語「特異的結合」またはそれらの任意の語法の変動は、本発明の抗体、抗原結合フラグメント（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｄ、Ｆｖ）、モノクローナル抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）またはナノボディの、そのそれぞれの標的（例えばＥＧＦＲ、またはＨＥＲ２）に、少なくとも約１×１０-6、例えば１×１０-6、１×１０-7Ｍ、１×１０-8Ｍ、１×１０-9Ｍ、１×１０-10Ｍ、１×１０-11Ｍ、１×１０-12Ｍ、１×１０-13Ｍ、１×１０-14Ｍ、１×１０-15Ｍ、好ましくは１×１０-10Ｍと１×１０-15Ｍの間、より好ましくは約１×１０-12Ｍ〜約１×１０-15の間のＫＤで結合する能力を指す。
【００６２】
用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本発明で使用される場合、用語「抗体」と互換的に使用することができる。基本的な４鎖抗体ユニットは、２個の同一の軽（Ｌ）鎖および２個の同一の重（Ｈ）鎖で構成されるヘテロテトラマー糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドと一緒になった５個の基本的ヘテロテトラマーユニットからなり、１０個の抗原結合部位を含有するが、一方、ＩｇＡ抗体は、Ｊ鎖との組合せで重合して多価集合体を形成することができる２〜５個の基本的４鎖ユニットを含む。ＩｇＧの場合に、４鎖ユニットは一般的に約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、Ｈ鎖に１個の共有結合のジスルフィド結合により連結しているが、それに対して、２個のＨ鎖は、Ｈ鎖のイソタイプに依存して１個または複数のジスルフィド結合により相互に連結されている。各ＨおよびＬ鎖は、規則的な間隔の鎖内ジスルフィド架橋も有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に、可変ドメイン（ＶＨ）、それに続くαおよびγ鎖の各々に対する３個の定常ドメイン（ＣH）およびμおよびεイソタイプに対する４個のＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に、可変ドメイン（ＶＬ）、続いてその他端に定常ドメインを有する。ＶＬはＶＨと位置を揃え、ＣＬは重鎖（ＣH1）の第１の定常ドメインと位置を揃える。特定のアミノ酸残基が、軽鎖と重鎖の可変ドメインの間の界面を形成していると考えられる。ＶＨおよびＶＬの対が一緒になって単一の抗原結合部位を形成する。種々のクラスの抗体の構造および性質については、例えば、Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr and Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994、page 71 and Chapter 6を参照されたい。任意の脊椎動物種からのＬ鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダと呼ばれる２個の明確に識別されるタイプの１つと帰属させることができる。それらの重鎖（ＣＨ）の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、異なったクラスまたはイソタイプに帰属させることができる。５クラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、それぞれα、δ、ε、γおよびμと命名される重鎖を有する。γおよびαクラスは、ＣＨ配列および機能における比較的小さい差を基準にしてサブクラスにさらに分けられて、例えば、ヒトは、以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ｌｇＡ１およびＩｇκ１を発現している。ＩｇＧは、それが正常では血漿中に見出される第２の最も豊富なタンパク質として存在するので、主要なクラスを構成する。免疫グロブリン融合タンパク質では、ＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインが、しばしば免疫グロブリン部分として使用され、その理由はＩｇＧ１は任意の血清タンパク質のなかで最長の血清半減期を有するからである。Ｆｃ部分は、例えば、ＷＯ０２／０９４８５２で開示されたものなどのＦｃバリアントも含んで（例えばそこで開示された変形Ｆｃ−４８８、Ｆｃ４、Ｆｃ５、Ｆｅ６、Ｆｃ７、およびＦｃ８を有するＦｃアミノ酸配列）、Ｆｃ部分のエフェクター（ｅｆｆｃｔｏｒ）機能を低下させることがある。
【００６３】
例えば、本発明によるタンパク質は、本発明によるアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列およびＦｃドメインを含む融合タンパク質であってもよく、その血清中の半減期を延長させることができ、その際、本発明によるアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列は、Ｆｃ部分のカルボキシ末端で融合している。末端のリシン（Ｋ）残基は、例えばＦｃ部分で、例えばＩｇＧタイプの抗体で、またはＦｃ融合タンパク質で、ＰＣＲに基づく部位指向突然変異生成により除去されて分子間架橋を回避することができる。ＰＣＲに基づく部位指向突然変異生成は、例えば、Nucleic Acids Res. 1989 Aug 25;17(16):6545-51, Biotechniques. 1993 Oct; 15(4):700-4, Nucl. Acids Res., 32: e115, 2004で開示された方法に従って行うことができる。例えば、部位指向突然変異生成のために使用され得るプライマー対は、例えば、http://Bioinfomatics.org/primerxで利用可能なｗｅｂベースで自動化されたツールにより選択することもできる。あるいは、末端リシン残基を欠く本発明によるタンパク質をコードする対応するｃＤＮＡは、カスタム遺伝子合成により得ることができる（例えば、Nature 432, 1050-1054 (23 December 2004); Nucleic Acids Res. 2007 Apr; 35(8): e61.; ACS Synth. Biol. 3, 97-106 (2014); Nat. Methods 6, 343-345 (2009); Nucleic Acids Res. 40、e55 (2012); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 20404-20409 (2008)を参照されたい）。
【００６４】
１実施形態において、本発明によるタンパク質は、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列を含む非免疫グロブリンスキャフォールドである。用語、非免疫グロブリンスキャフォールドは、本発明によるタンパク質について使用される場合、Ｉｇ分子に基づかない親和性タンパク質を指す。非免疫グロブリンスキャフォールドタンパク質は、例えば、Nature Biotechnology 23，1257-1268，2005，Trends Biotechnol. 2015 Jul;33(7):408-18で開示されたものを含む。例えば、本発明によるタンパク質は、アルブミン結合ドメイン、フィトシスタチンタンパク質（ｐｈｙｔｏｃｙｓｔａｔｏｎ）（Ａｄｈｉｒｏｎ）、アドネクチン、黄色ブドウ球菌のタンパク質ＡのＺ−ドメイン、γ−Β−クリスタリン（アフィリン）、ｓｔｅｆｉｎ  Ａ、ＤＮＡ結合タンパク質Ｓａｃ７ａ、ａｌｐｈａｂｏｄｙｍ  ｌｉｐｏｃａｌｉｎｓ（アンチカリン）、またはβ−カテニンの同族体（例えばアルマジロのタンパク質）であってもよい。例えば、本明細書で開示された本発明によるタンパク質は、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列を含むことができ、それにより、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列は、本発明によるタンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端に存在することができる。本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列を、上で開示された本発明のタンパク質のアミノ−またはカルボキシ末端に位置させることにおける決定要因は、それが該タンパク質の意図される使用を妨げるか否かである。例えば、本発明によるタンパク質が、抗体は、例えばモノクローナル抗体である場合、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列とカルボキシ末端で融合したタンパク質が好ましく、それにより、配列番号２のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列は、軽鎖または重鎖、または重鎖および軽鎖の両方と融合することができ、それにより２個（例えば両軽鎖（ＬＣ）で、または両重鎖（ＨＣ）で）または４個の本発明によるアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列を含むモノクローナル抗体を提供する。
【００６５】
１実施形態において、本発明は、上で開示された本発明によるアミノ供与体を含む基質を、配列番号２のポリペプチド配列を含む本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体に共有結合でカップリングする方法を提供し、該方法は、
本発明によるアミノ供与体を含む基質と本発明によるアシルグルタミン含有アミノ酸供与体とを、トランスグルタミナーゼ、好ましくはｍＴＧ２の存在下で接触させて、上で開示された本発明のタンパク質を得るステップを含む。したがって、本発明の方法では、上で開示された本発明によるアミノ供与体を含む基質と本発明によるアシルグルタミン含有アミノ酸供与体、例えば、本明細書で開示された配列番号７〜２９４のいずれかとを、ｍＴＧ２の存在下で接触させて上で開示された本発明のタンパク質を得る。用語「接触させる」は、本発明の方法で使用される場合、２個以上の分子、例えば、本発明によるアミノ供与体を含む基質およびアシルグルタミン含有アミノ酸供与体などが、互いに密接して物理的接触にもたらされ、例えば同じ反応混合物または水溶液の一部を形成する任意の状況を指す。例えば、本発明の方法によるｍＴＧ２に媒介される反応は、本発明によるアシルグルタミン含有アミノ酸供与体を、１〜６０モル当量の、または１〜５０モル当量の本発明によるアミノ供与体を含む基質と、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９モル当量で、または例えば、約２モルから約４５モル、約５モルから約４０モル、約１０モルから約３５モル、約１２．５モルから約３０モル、約１５モルから約３２．５モル、約７．５モルから約２７．５モル、約１７．５モルから約２５モル、約０．５モルから約１モルのモル当量で反応させることを含むことができる。本発明によるアシルグルタミン含有アミノ酸供与体の濃度は、約０．１ｍｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．５ｍｇ／ｍｌから約７５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌ、約２．５ｍｇ／ｍｌから約４５ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌから約４０ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから約３５ｍｇ／ｍｌ、約１２．５ｍｇ／ｍｌから約３０ｍｇ／ｍｌ、約１５ｍｇ／ｍｌから約２５ｍｇ／ｍｌ、約１７．５から約２０ｍｇ／ｍｌ、例えば、０．１５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．３５ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．４５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．５５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４、ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１１ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１３ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１９ｍｇ／ｍｌ、２３ｍｇ／ｍｌ、２７ｍｇ／ｍｌ、３１ｍｇ／ｍｌ、３３ｍｇ／ｍｌ、３７．５ｍｇ／ｍｌ、４１ｍｇ／ｍｌ、４２ｍｇ／ｍｌ、４３ｍｇ／ｍｌ、４４ｍｇ／ｍｌ、４６ｍｇ／ｍｌ、４７ｍｇ／ｍｌ、４８ｍｇ／ｍｌ、４９ｍｇ／ｍｌであってもよい。
【００６６】
本発明の方法において、ｍＴＧ２は、例えば、基質に対して、例えばアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列を含むタンパク質に対して、約０．０１モル当量から約２モル当量の量で、約０．０５モル当量から約１．５モル当量、約０．１モル当量から約１．１２５モル当量、約０．１２５モル当量から約１．７５モル当量、約０．２５モル当量、０．３モル当量、０．４モル当量、０．５モル当量、０．６モル当量、０．７モル当量、０．８モル当量から約１モル当量、または約１モル当量から約２．５モル当量で存在してもよく、好ましくはｍＴＧ２は本発明の方法で約１モル当量の量で使用される。本発明の方法で、反応は、例えば、２５℃〜３７℃で約１〜５時間、または約２〜４時間、または約２．５時間から約３．５時間、または約１時間、２時間、３時間、４時間進行させてもよい。本発明の方法は、例えば、任意の適当な緩衝液、例えばＨＥＰＥＳ（４−２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、またはＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）などの中で約ｐＨ７．０のｐＨで実施することができる。
【００６７】
１実施形態により、本発明の方法で使用することができる本発明によるアシルグルタミン含有アミノ酸供与体は、上で開示されたものであってもよく、例えば本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体は、上で開示された抗体、抗原結合抗体フラグメント、酵素、または非免疫グロブリンスキャフォールドであってもよい。
【００６８】
微生物のトランスグルタミナーゼ、例えば本発明の実施形態に従って使用され得るｍＴＧ２などは、Biochem. J. (1994) 299: 825-829で開示された方法により、ストレプトベルチシリウム・モバラエンスまたは任意のその亜株、例えば４０８４７などから得ることができる。例えば、ストレプトベルチシリウム・モバラエンスは、例えば、Ando et al. (1989) Agric. Biol. Chem. 53, 2613-2617に記載されたように培養することができる。２Ｌのエルレンマイヤフラスコで、０．１ｍｌの胞子懸濁液を、ポリペプトン、２．０％；酵母抽出物、０．２％；Ｋ2ＨＰＯ4、０．２％；ＭｇＳＯ4７Ｈ2Ｏ、０．１％；ジャガイモデンプン、２．０％；グルコース、０．５％；ｐＨ７．０を含有する５００ｍｌの培地中で成長させることができる。培養は３０℃で継続することができ、培養には通気して９０回転／分で９〜１１日間、最大酵素活性に達するまで振盪する。次に、培養液を、菌糸体から遠心分離により１００００ｇで１０分間分離することができ、続いてひだ折り濾紙で濾過する。上清は、直接クロマトグラフィーで利用するかまたは−２０℃で後の使用のために貯蔵することもできる。スケールアップされた製造のために、１．０ｍｌの細胞懸濁液を、２．０％の代わりに２．５％ジャガイモデンプン、０．５％の代わりに１．０％グルコースを含有する３．５Ｌの培地に移すことができる。培養は、第１日の間、通気（２リットル／分）および攪拌して、１４０〜１８０回転／分で、その後３００〜３５０回転／分で成長させることができる。最大の酵素活性は通常７日後に達成される。ストレプトベルチシリウム・モバラエンスは、例えばＡＴＣＣ（登録商標）（ＡＴＣＣ２９０３２）、または例えばＤＳＭ  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツから得ることができる。
【００６９】
１実施形態において、本発明の方法で使用される本発明のアミノ供与体を含む基質は、上で開示された染料、薬物、リボザイム、ナノボディ、酵素、またはリンカーとカップリングまたは共有結合する。例えば、アシルグルタミン含有アミノ酸供与体は、そのカルボキシ末端に配列番号２の、または例えば本明細書で開示された配列番号７〜２９４のいずれ１つかによる本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸配列を含む、上で定義された抗体または抗原結合フラグメントであってもよい。例えば、アミノ供与体を含む基質は、上で定義された通りでもよく、例えば、少なくとも１個のリシン残基を含むペプチド、または上で開示されたトリペプチドＧＧＧであってもよく、それらは、例えば上で開示されたリンカー、染料、薬物、リボザイム、ナノボディ、または酵素とカップリングしていてもよい。
【００７０】
１実施形態により、本発明の方法で使用されるリンカーは、例えば、上で定義された細胞傷害性薬物（ペイロード）、染料、または放射性同位体とさらに連結されていてもよい。本発明の方法では、アシルグルタミン含有アミノ酸供与体およびアミノ供与体を含む基質は、上で開示された量で存在する微生物のトランスグルタミナーゼ２と、例えば、反応混合物中に約１：４０モル当量の比で（抗体：アミノ供与体を含む基質）、または上で開示された任意のモル当量で、例えば上で開示された本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列を含む抗体に対して１：１モル当量で存在してもよい。本発明の方法により、反応は、例えば、約１〜５時間、２５℃〜３７℃で、例えば１時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間または５時間、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、または３７℃で進行するに任せてもよい。
【００７１】
１実施形態において、本発明は、上で開示された本発明の方法により得ることができる本発明によるタンパク質を提供する。したがって、本発明により得ることができるタンパク質は、本明細書で開示された任意のタンパク質、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を含む本明細書で開示された抗体、抗原結合フラグメント、酵素、または非免疫グロブリンスキャフォールドであってもよい。例えば、本発明の方法により得ることができるタンパク質は、本明細書で開示された配列番号２の少なくとも１個のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列、好ましくは、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体（例えば、Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＴＹＦＱＡＹＧＸ4Ｘ5Ｘ6）の間で形成されたイソペプチド結合を介して共有結合で結合された２個、より好ましくは４個の上で開示されたアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列を含む抗体薬物コンジュゲートを含むことができて、その場合、イソペプチド結合は中央のグルタミン残基（下線を引いた）とアミノ供与体を含む基質のアミノ基との間で形成される。
【００７２】
１実施形態において、本発明は、上で開示された本発明の方法における配列番号２のポリペプチド配列の使用に関する。したがって、本発明は、本発明の方法における本明細書で開示された１個または２個以上の、例えば１、２、３、４、５個、またはそれを超える本発明のポリペプチド配列の使用に関する。例えば、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、配列番号２２４、配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４、配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号２６７、配列番号２６８、配列番号２６９、配列番号２７０、配列番号２７１、配列番号２７２、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号２７７、配列番号２７８、配列番号２７９、配列番号２８０、配列番号２８１、配列番号２８２、配列番号２８３、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８８、配列番号２８９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、または配列番号２９４の本発明の方法における使用に関する。
【００７３】
例えば、配列番号２のポリペプチドは、上で開示された抗体のＨＣまたはＬＣとカルボキシ末端で融合されていてもよい。例えば、Ｘ3、Ｘ4が両方とも上で開示されたＣである配列が好ましく、したがって、ポリペプチド配列、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、または配列番号１３８の使用、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、または配列番号９０のいずれかの使用がより好ましい。
【００７４】
１実施形態において、本発明は、本発明の配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。したがって、本発明は、以下の構造の配列番号２の本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：
５’−ＮＮＮ1ＮＮＮ2ＮＮＮ3ＡＣＮＴＡＹＴＴＹＣＡＲＧＣＮＴＡＹＧＧＮＮＮＮ4ＮＮＮ5ＮＮＮ6−３’（配列番号３０１）、
式中、Ｎは任意のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ）、Ｙは、ピリミジン塩基（ＣまたはＴ）を表し、Ｒはプリン塩基（ＡまたはＧ）を表す。塩基の命名法は、生化学国際連合命名委員会（Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＮＣ−ＩＵＢ））によった、例えばJ. Biol. Chem., 1986, 261, 13-17を参照されたい。ＮＮＮ1〜ＮＮＮ6はコドン１〜６を示し、ここで、コドンＮＮＮ1は配列番号２のアミノ酸Ｘ1をコードし、ＮＮＮ2は配列番号２のアミノ酸Ｘ2、ＮＮＮ3は配列番号２のアミノ酸Ｘ3、ＮＮＮ4は配列番号２のアミノ酸Ｘ4、ＮＮＮ5は配列番号２のアミノ酸Ｘ5、およびＮＮＮ6は配列番号２のアミノ酸Ｘ6を示す。例えば、ポリヌクレオチドの意図される使用に依存して、コドンの使用法は、特定の宿主に対して、例えばポリヌクレオチドが、上で開示された本発明のペプチドまたは本発明のタンパク質を、哺乳動物、原核生物または真核生物の宿主で発現させるために使用された場合、最適化されるべきであり、それぞれの宿主により異なったコドン用法が考慮されるべきである。例えば、本発明のポリヌクレオチドが、治療薬を製造するために、齧歯目またはヒトの細胞系統、例えばＣＨＯまたはＨＥＫ２９３細胞などで発現させるために使用される場合に、対応するコドン用法は、例えばタンパク質の製造を増大させるように使用されるべきである（Trends in Molecular Medicine, November 2014, Vol. 20, No. 11）。しかしながら、本発明によるコドンＮＮＮ1〜ＮＮＮ6は、停止コドン、例えばＴＡＧ（琥珀色）、ＴＡＡ（黄土色）、またはＴＧＡ（オパール色）をコードすることができない。
【００７５】
したがって、ＮＮＮ1は、コドンＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＧ、ＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ、ＧＴＧ、ＡＴＴ、ＡＴＣ、ＡＴＡ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＡＴＧ、ＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ、ＧＧＧのいずれか１つであることができ、ＮＮＮ2は、コドンＧＡＴ、ＧＡＣ、ＧＡＡ、ＧＡＧのいずれか１つであることができ、ＮＮＮ3、ＮＮＮ4は、コドンＴＧＴ、ＴＧＣ、ＡＡＴ、ＡＡＣのいずれか１つであることができ、ＮＮＮ5は、コドンＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、ＡＧＣ、ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＧ、ＡＡＴ、ＡＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＧのいずれか１つであることができ、ＮＮＮ6は、コドンＧＡＴ、ＧＡＣ、ＧＡＡ、ＧＡＧのいずれか１つであることができる。
【００７６】
１実施形態において、本発明は、上で開示された本発明のポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。本発明によるベクターは、例えば発現ベクターであってもよい。用語「発現ベクター」は、本発明によるベクターについて使用される場合、少なくとも１種のポリペプチド、例えば少なくとも配列番号２〜配列番号２９４のいずれかの本発明のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列と作動的に連結されたプロモーターまたはプロモーター成分などの遺伝子発現制御領域を含む核酸ベクターを指す。例えば、ｐＣＭＶベース発現ベクター、またはｐＤ９１２ベースベクターおよびそれらのバリアント、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）発現ベクター、ｐｃＤＮＡベース発現ベクター、またはｐＪΩベクター（例えば、Nucleic Acids Research, Vol. 18, No. 4を参照されたい）、またはレトロウイルスまたはレンチウイルスの製造のために使用され得るベクター（例えば、Front Biosci. 1999 Jun 1 ;4: D481-96を参照されたい）を含んでいてもよい発現ベクター。例えば抗体の軽鎖または重鎖をコードする対応するｃＤＮＡが、ＭＣＳ中にクローニングされる場合、本発明によるベクターにおいて、ポリヌクレオチドは、例えば、インフレームの融合タンパク質を発生させることを可能にする５’または３’からの複数のクローニング部位（ＭＣＳ）を含んでいてもよい。ＭＣＳの位置に依存して、本発明のポリヌクレオチドは、アミノ末端またはカルボキシ末端融合タンパク質として発現されるであろう。
【００７７】
１実施形態において、本発明は、上で開示された、例えば、配列番号２の、もしくは例えば配列番号７〜２９４のいずれかによる本発明のポリヌクレオチド配列を含む、または上で開示された本発明によるベクターを含む宿主細胞も提供する。例えば、本発明のポリヌクレオチドまたは上で開示された本発明によるベクターを含む本発明による宿主細胞は、本発明によるベクターを含有することができる任意のタイプの細胞を指す。該宿主細胞は、真核生物の細胞、例えば、植物、動物、カビ、または藻（例えばフェオダクチラム・トリコルヌツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）であってもよく、または原核生物の細胞、例えば、細菌または原生動物であってもよい。宿主細胞は、培養された細胞または初生細胞、即ち、生物体、例えば、ヒトから直接単離された細胞であってもよい。宿主細胞は、接着性細胞または懸濁された細胞、即ち、懸濁液中で成長する細胞であってもよい。本発明による宿主細胞は、例えば、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＮＳ０、ｐｅｒ．Ｃ６、ＭＣＦ−７、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ−１、Ｃｏｓ−７、ＰＣ−１２、３Ｔ３、Ｖｅｒｏ、ｖｅｒｏ−７６、ＰＣ３、Ｕ８７、ＳＡＯＳ−２、ＬＮＣＡＰ、ＤＵ１４５、Ａ４３１、Ａ５４９、Ｂ３５、Ｈ１２９９、ＨＵＶＥＣ、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、Ｃａｃｏ−２、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｂ１１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＢＨＫ、ＡＧＥ１．ＨＮ、Ｎａｍａｌｗａ、ＷＩ−３８、ＭＲＣ−５、ＨｅｐＧ２、Ｌ−９２９、ＲＡＢ−９、ＳＩＲＣ、ＲＫ１３、１１Ｂ１１、１Ｄ３、２．４Ｇ２、Ａ−１０、Ｂ−３５、Ｃ−６、Ｆ４／８０、ＩＥＣ−１８、Ｌ２、ＭＨ１Ｃ１、ＮＲＫ、ＮＲＫ−４９Ｆ、ＮＲＫ−５２Ｅ、ＲＭＣ、ＣＶ−１、ＢＴ、ＭＤＢＫ、ＣＰＡＥ、ＭＤＣＫ．１、ＭＤＣＫ．２、Ｄ−１７、または例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、シュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）およびメタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、または例えばＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｓ２、Ｈｉ５、またはＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４細胞、または例えばＤＨ５α大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含むことができる。
【００７８】
１実施形態において本発明は、抗体またはそれらの抗原結合フラグメント、二価抗体、または配列番号２の少なくとも１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体も提供する。抗体、それらの抗原結合フラグメント、二価抗体、または本発明によるＶＨＨ抗体は、上で開示された通りである。例えば、本発明による抗体は、配列番号２の少なくとも１つのアミノ酸配列（例えば本発明によるアシルグルタミン含有アミノ酸供与体）を、例えば軽鎖または重鎖に対するカルボキシ末端融合体として含むことができる。本発明による抗体は、好ましくは、配列番号２の２または４個の本発明のアミノ酸配列を含み、例えば本発明の抗体は、それらのカルボキシ末端に配列番号２の本発明のアミノ酸配列を含む２本の軽鎖、または２本の重鎖を含むことができる。好ましくは、重鎖および軽鎖は両方ともカルボキシ末端融合体として配列番号２の本発明のアミノ酸配列を含む。本発明の抗体は、例えば、上で開示されたＰＣＲに基づく部位指向突然変異生成により改変されて、Ｆｃドメインにおける末端リシン残基が除去されることもある。
【００７９】
１実施形態により、上で開示された本発明による抗体は、上で開示されたヒトのまたはヒト化されたモノクローナル抗体、好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはＩｇＭタイプの抗体である。本発明の抗体は、上で開示された本発明の方法によりそれに共有結合でカップリングした少なくとも１つのリンカーを含む。例えば、本発明の抗体は、１、２、３、または４つのリンカー（例えば、上で開示された切断可能または非切断性の）を含むことができて、それらは本明細書で開示された本発明の方法により抗体と共有結合でカップリングしている。１実施形態により、本発明のリンカーは、上で開示された染料、放射性同位体、または細胞毒とさらにカップリングする。
【００８０】
１実施形態において、上で開示された本発明の抗体は、がん細胞の表面抗原に特異的に結合する。本発明によるがん細胞の表面抗原は、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ４、ＡＦＰ、ανβ3インテグリン、ＭＵＣ１６、ＣＤ４、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ２２７、ＥｐＣａｍ、ＧＤ３、ＰＳＭＡ、またはＶＥＧＦを含むが、これらに限定されない。本発明によるがん細胞の表面抗原は、がん幹細胞、例えばＣＤ１２３、ＣＬＬ−１、ＳＬＡＭの組合せなど（シグナル伝達リンパ球活性化分子ファミリー受容体；Yilmaz et al., "SLAM family markers are conserved among hematopoietic stem cells from old and reconstituted mice and markedly increase their purity," Hematopoiesis 107: 924-930 (2006)を参照されたい）、例えば、ＣＤ１５０、ＣＤ２４４、およびＣＤ４８、および米国特許第６，００４，５２８号で開示されたこれらのマーカーなども含む。
【００８１】
好ましい実施形態において、本発明による抗体は、セツキシマブ（ｃ２２５）、または例えばＥＧＦＲに結合するそのバイオシミラーである。用語「バイオシミラー」は、本発明のセツキシマブについて使用される場合、バイオシミラー製品を（臨床的に不活性な成分における微量の差はあるが）参照製品と「高度に類似した」製品として定義しているＵＳＦＤＡにより公表された実用的定義と一致するように使用される。実際、安全性、純度、および効能に関して、参照製品とバイオシミラー製品の間に臨床的に意味のある相違はないものとし得る（アメリカ合衆国公衆衛生局（ＰＨＳ）条例§２６２）。
【００８２】
例えば、本発明によるセツキシマブ（または例えばそのバイオシミラー）は、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは４つの本発明によるアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列を含む。例えば、本発明によるセツキシマブは上で定義された、さらに上記の細胞毒とカップリングした２個、または好ましくは４個のリンカーを含む。
【００８３】
１実施形態により、本発明によるセツキシマブ（または例えばそのバイオシミラー）は、がんの治療に使用することができる。用語「がん」は、本発明で使用される場合、制御されないかもしくは調節されない細胞増殖、低下した細胞分化、周囲組織に侵入する不適切な能力、および／または正規の場所外の部位で新しい成長を確立する能力により特徴づけられる細胞の障害を指す。用語「がん」は、原発性および転移性がんをさらに包含する。本発明の抗体セツキシマブは、例えば、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頚がん、皮膚がん、膵がん、好ましくは結直腸がん、転移性（ｍＣＲＣ）、切除不能の肝転移、頭頸部の扁平上皮細胞癌、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部の扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）の１つを治療するために使用することができる。セツキシマブ（ｃ２２５、またはそのバイオシミラー）は、例えば、そのような治療から特に恩恵を受ける患者、例えば上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を発現するＲＡＳ野生型転移性結直腸がんを有する患者で使用することができる。本発明によるセツキシマブ（またはそのバイオシミラー）は、イリノテカンを主とする化学療法との組合せで、または例えばＦＯＬＦＯＸと組み合せた第１選択の治療で、または例えば、オキサリプラチンを主とするおよびイリノテカンを主とする療法が不成功であった患者およびイリノテカンに不耐性の患者で、単一の活性物質として使用することもできる。
【００８４】
１実施形態において、本発明は、上で開示された本発明の抗体を含み、少なくとも１種のさらなる薬学的活性成分を含む組成物を提供する。例えば、本発明による組成物は、水性または凍結乾燥された形態にあるセツキシマブ（または例えばそのバイオシミラー）および少なくとも１種のさらなら化学療法剤を含むことができて、ここで該活性物質は、カペシタビン、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（ｄｅｏｘｙｕｉｒｉｄｉｎｅ）、イリノテカン、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、フロキシウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、ブレオマイシン、パクリタキセル、クロラムブシル、ミトキサントロン、カンプトテシン、トポテカン、テニポシド、コルセミド、コルヒチン、ペメトレキセド、ペントスタチン、チオグアニン；リューコボリン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、または５−ＦＵとリューコボリンの組合せ、５−フルオロウラシルとフォリン酸の組合せ（５−ＦＵ／ＦＡ）、５−フルオロウラシル／フォリン酸（５−ＦＵ／ＦＡ）とオキサリプラチン（ＦＬＯＸ）の組合せ、５−ＦＵ、リューコボリン、オキサリプラチン（ＦＯＬＦＯＸ）の組合せ、または５−ＦＵ、リューコボリン、およびイリノテカン（ＦＯＬＦＩＲＩ）の組合せ、またはリューコボリン、５−ＦＵ、オキサリプラチン、およびイリノテカン（ＦＯＬＦＯＸＩＲＩ）の組合せ、またはカペシタビンとオキサリプラチンの組合せ（ＣａｐｅＯｘ）を含む群から選択される。
【００８５】
１実施形態により、本発明は、上で開示された本発明の抗体、または本発明による組成物および少なくとも１種のさらなる成分を含む医薬組成物を提供する。したがって、本発明は、本発明の抗体を含み、賦形剤および／または安定剤および／または界面活性剤および／または防腐剤を含んでいてもよい医薬組成物を提供する。本明細書において使用する用語「賦形剤」は、例えば、希釈剤などの活性成分でない医薬製品の成分を意味する。本発明の医薬組成物を調製することに有用な賦形剤は、一般的に安全で無毒性である。本発明の医薬組成物で使用することができる界面活性剤には、例えば、例えば、アルキル硫酸ナトリウムの混合物などのアニオン性界面活性剤、例えば第四級アンモニウムおよびピリジニウムカチオン性界面活性剤などのカチオン性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤、例えばソルビタンエステル、ポリソルベート、例えばポリソルバト２０（ポリオキシエチレン−（２０）−ソルビタンモノラウラート）、ポリソルバト２１（ポリオキシエチレン−（４）−ソルビタンモノラウラート）、ポリソルバト４０（ポリオキシエチレン−（２０）−ソルビタンモノパルミタート）、ポリソルバト６０（ポリオキシエチレン−（２０）−ソルビタン−モノステアラート）、ポリソルバト６１（ポリオキシエチレン−（４）−ソルビタンモノステアラート）、ポリソルバト６５（ポリオキシエチレン−（２０）−ソルビタントリステアラート）、ポリソルバト８０（ポリオキシエチレン−（２０）−ソルビタンモノオレアート）、ポリソルバト８１（ポリオキシエチレン−（５）−ソルビタンモノオレアート）ポリソルバト８５（ポリオキシエチレン−（２０）−ソルビタントリオレアート）、ポリソルバト１２０（ポリオキシエチレン−（２０）−ソルビタンモノイソステアラート）、またはポロキサマー、例えばポロキサマー１０５、ポロキサマー１０８、ポロキサマー１２２、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１０５安息香酸塩などが含まれる。本発明による医薬（ｐｈａｒｍａｖｅｕｔｉｃａｌ）組成物に含まれ得る防腐剤は、０．００４％〜０．０１％の濃度の塩化ベンズアルコニウムであってもよい。
【００８６】
１実施形態において、本発明は、治療を必要とするがんに罹患した対象を治療する方法であって、前記対象（例えば、好ましくはヒトである患者）に治療有効量の本明細書で開示された医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。したがって、本発明は、例えば上で開示された、治療を必要とするがんに罹患した対象を、治療有効量の本発明のｃ２２５（セツキシマブ）抗体で治療する方法を提供する。例えば、本発明によるセツキシマブは、約１２５ｍｇ／ｍ2から約５００ｍｇ／ｍ2身体表面、好ましくは約２５０ｍｇ／ｍ2から約４００ｍｇ／ｍ2身体表面の濃度で投与することができて、その場合、セツキシマブの投薬は、例えば、Ｄｕｂｏｉｓの方法に従って計算することができて、対象の体表面積（ｍ2）は対象の体重を使用して計算される：ｍ2＝（質量ｋｇ0.425×高さｃｍ0.725）×０．００７１８４。
【実施例】
【００８７】
以下の例は、本発明をさらに例示することが意図されている。それらは、本発明の主題の事物または範囲をそれらに限定することを意図されない。
（例１）
ペプチドの固相合成および精製
ペプチドは、ＡｍｐｈｉＳｐｈｅｒｅｓ  ４０ＲＡＭ樹脂（Ａｇｉｌｅｎｔ、０．２７ｍｍｏｌ／ｇ）上で、マイクロ波に補助されるＦｍｏｃ−ＳＰＰＳにより、Ｌｉｂｅｒｔｙ  Ｂｌｕｅ  ＴＭマイクロ波ペプチド合成機を０．１ｍｍｏｌスケールで使用して合成された。それぞれのカルボキシ官能性アミノ酸の活性化は、Ｏｘｙｍａ／Ν，Ν’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）により実施した。アミノ末端Ｆｍｏｃ基の脱保護は、ＤＭＦ中２０％のピペリジンをＯｘｙｍａの存在で使用して達成した。合成サイクル中、全てのアミノ酸を９０℃に（システインは５０℃に）加熱した。ペプチドを、樹脂から、９４％ＴＦＡ、２％トリエチルシラン、２％アニソール、２％Ｈ2Ｏの標準的切断カクテルにより切断した。システインを含有するペプチドは、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の存在下で切断してシステインの望ましくない酸化を抑制した。２時間切断した後、ペプチドを冷ジエチルエーテル中で沈殿させて、ジエチルエーテルで２回洗浄した。ジスルフィドで架橋された粗ペプチドを１００ｍＭ（ＮＨ4）2ＣＯ3水溶液（ｐＨ８．４）中において１ｍｇｍｌ-1で酸化して、酸化はＲＰ−ＨＰＬＣによりモニターした。その後、ペプチドを分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって単離した。
【００８８】
ＲＰ−ＨＰＬＣ
ペプチドをＶａｒｉａｎ製の分析ＲＰ−ＨＰＬＣ（９２０−ＬＣ）でＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ５μＢＤＳ  Ｃ１８ＬＣカラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ、１３０Å）を使用して、クロマトグラフィーにより分析した。ペプチドをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ５μＣ１８ＬＣカラム（２５０×１２．２ｍｍ、５μｍ、１００Å）を使用して、半分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｖａｒｉａｎ）により単離した。溶離剤Ａ（水）および溶離剤Ｂ（９０％ａｑ．ＭｅＣＮ）は、各々０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有した。
【００８９】
ＥＳＩ−ＭＳ分析
ＥＳＩ質量スペクトルは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  ５μＣ４ＬＣカラム（５０×１ｍｍ、５μｍ、３００Ａ）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣＭＳ−２０２０で、０．１％ギ酸水溶液（溶離剤Ａ）および０．１％ギ酸を含有するアセトニトリル（溶離剤Ｂ）の溶離剤系を使用することにより収集した。
【００９０】
（例２）
ペプチドビオチン化アッセイ
ペプチドをＤＭＳＯ中に５０ｍｇ／ｍｌで溶解して、酵素によるコンジュゲーションのためにｐＨ７．０の１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳで１．２５ｍｇ／ｍｌに希釈した。モノビオチニルカダベリンをペプチドに対して５倍モル過剰で加えて、１／５０（質量／質量）の酵素／基質比で酵素反応を微生物のトランスグルタミナーゼの添加により開始した。ペプチド２（配列番号９０）および参照ペプチドＧＧＧＳＬＬＱＧ（配列番号２９５）を含むペプチドビオチン化アッセイのためには、微生物のトランスグルタミナーゼの量を、それぞれ１／３８５および１／１８２（質量／質量）の酵素／基質比に減らした。反応混合物を３７℃でインキュベートした。反応混合物のアリコートを０、１５、３０、６０、１２０、および１８０分後に採取して、反応を、遠心分離透析（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−１０、１０．０００ＮＭＷＬ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してトランスグルタミナーゼ除去により停止させた。アリコートをＲＰ−ＨＰＬＣによって１０〜８０％溶離剤Ｂ（ＭｅＣＮの９０％水溶液）の勾配を使用することにより１ｍｌ／分で２０分かけて分析した（図４を参照されたい）。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析から集めた分画をＥＳＩ−ＭＳによりさらに分析した。
【００９１】
（例３）
トランスグルタミナーゼを使用する酵素抗体コンジュゲーション
抗体の発現および精製。野性型セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））をコードするプラスミドは、Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）の好意で提供された。重鎖のＣ末端にＴＧタグを含有するセツキシマブ変異体を、下に記載する標準的ＳＯＥＰＣＲ技法により調製した。Ｃ末端リシンは、両方の構造でε−アミノ基とトランスグルタミナーゼに接近可能なグルタミンとの交差反応性を避けるために除去した。抗体を、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞からＥｘｐｉ２９３発現系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して一時的に発現させた。状態調節した上清をＰＲＯＳＥＰ−Ａ培地を含むスピンカラムに適用して（Ｍｏｎｔａｇｅ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１．５Ｍグリシン／ＮａＯＨ、３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．０で洗浄した。タンパク質をｐＨ２．５の０．２Ｍグリシン／ＨＣｌで溶離させて、ｐＨ９．０の１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌで中和した。溶離したタンパク質を１×ＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で透析して４℃で貯蔵した。
【００９２】
タグ付きセツキシマブ（重鎖末端のリシンを欠く）のＰＣＲに基づく生成
ＰＣＲを使用して、重鎖のカルボキシ末端リシン残基を欠くｃ２２５（セツキシマブ）構造を生成した。末端リシン残基および配列番号２４６のカルボキシ末端アミノ酸配列を含むＣ２２５をコードするプラスミドを、配列番号２９６、配列番号２９９の配列を有するプライマー（両方とも１ピコモルで）を使用して１０サイクル（ＰＣＲ条件：３分＠９８℃（初期変性）、１０秒＠９８℃、３０秒＠５５℃、１５秒＠７２℃）、続いて配列番号２９６、配列番号３００の配列を有するプライマー（１０ピコモルのプライマー）を使用して、以下のサイクル条件：１０秒＠９８℃、３０秒＠５５℃、１５秒＠７２℃、最終の延長５分＠７２℃で２０サイクルにより増幅した。
【００９３】
生じた増幅生成物をゲルで精製して、その後ＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨＩを使用して（３時間＠３７℃）制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｉｎ）消化にかけた。次に、ＰＣＲ精製キットを使用して、制限フラグメントを精製した。次に、フラグメントをＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨＩで消化されたｐＴＴ５＿Ｃ２２５＿ＨＣベクター中にクローニングした（Ｃ２２５重鎖をコードする）。
【００９４】
トランスグルタミナーゼを使用する抗体コンジュゲーション
抗体を０．５ｍｇ／ｍｌに調節して、コンジュゲーション部位当たり４０モル当量のモノビオチニルカダベリン（ＭＢＣ）および１モル当量の微生物のトランスグルタミナーゼ（ｍＴＧアーゼ）と、ｐＨ７．０の１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中で３時間２５℃でインキュベートした。分析結果のために、反応混合物を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、ビオチン化重鎖を半乾燥ウェスタンブロットによりストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびＮＢＴ／ＢＣＩＰで可視化した。抗体複合体を分取で製造するために、過剰の基質およびｍＴＧアーゼをサイズ排除クロマトグラフィーにより、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００１０／３００ＧＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、０．５ｍｌ／分）を用いて除去した。
【００９５】
コンジュゲーションされた抗体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析。ＭＳ−分析に先立って、抗体（６μｇ）を２−メルカプトエタノールを含有するＳＤＳローディング染料中で還元して、重鎖と軽鎖を、変性条件下で１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離した。タンパク質をクーマシーＭｅＯＨ染色により可視化した。改変された重鎖に対応するタンパク質のバンドを切り出して、小片に切り、ＭＱ水で１５分間２回洗浄して、ＡｃＯＨおよびＭｅＯＨを染色から除去した。その後、ゲル片をｐＨ８．０の２：３ＭｅＣＮ：５０ｍＭ重炭酸アンモニウムで２回３０分間洗浄して、染色を除去した。ゲル片をＭｅＣＮで脱水して５０℃で乾燥した。５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中で２０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を加え、試料を６０℃で４５分間インキュベートしてジスルフィド結合を還元した。試料が室温に冷却された後、ＤＴＴ溶液を除去して、還元されたシステインを暗所で５０ｍＭの重炭酸アンモニウム中の５５ｍＭヨードアセトアミド（ＩＡＡ）の添加により４５分間アルキル化した。過剰のアルキル化混合物を除去して、ゲル片を５０ｍＭ重炭酸アンモニウムを用いてｐＨ８．０で２回洗浄した。次に、ゲル片をＭｅＣＮで２回脱水して、５０ｍＭ重炭酸アンモニウムで膨潤させた後、それらを脱水して２０ｎｇ／μｌトリプシン（ＮＥＢ、トリプシン−ウルトラ、質量分析法規格）を含有する５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中で膨潤させて最終の１：２０の酵素／基質比を得た。トリプシン消化は、終夜３７℃で実施した。ペプチドを、５０％ＭｅＣＮ、１％ギ酸の添加により３０分間振盪により２回抽出した。ペプチドを含有する合わされた上清を凍結乾燥して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより分析した。ゲル消化において、手順は、文献（M. Wilm, A. Shevchenko, T. Houthaeve, S. Breit, L. Schweigerer, T. Fotsis, M. Mann, Nature 1996, 379, 466-469）から採用した。
【００９６】
蛍光測定による抗体コンジュゲーション有効度の決定
抗体コンジュゲーション有効度をＮ−（テトラメチルロダミニル）カダベリン（ＴＡＭＲＡ−カダベリン）を用いる抗体標識および５４７ｎｍの励起波長および５７３ｎｍの発光波長における蛍光の測定により決定した。この目的のために、抗体を、１．０ｍｇ／ｍｌに調節してＴＡＭＲＡ−カダベリンのコンジュゲーション部位当たり２０モル当量およびｐＨ７．０の１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中０．５モル当量の微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）と３時間２５℃でインキュベートした。結合していないＴＡＭＲＡ−カダベリンをＰＢＳで平衡化されたタンパク質脱塩スピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して２回ゲル濾過により除去した。非抗体試料を同じ様式でインキュベートして処理し、ゲル濾過後、残存する遊離ＴＡＭＲＡ−カダベリンを排除した。この対照から測定された弱い蛍光を、その後、抗体試料の蛍光から差し引いた。ＴＡＭＲＡ−カダベリンのコンジュゲーションされた抗体の濃度は、ＰＢＳ中９．７２〜０．１９μΜの範囲のＴＡＭＲＡ−カダベリンの標準的曲線を使用して（ウェル当たり４０μｌ）、およびプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００）を使用する蛍光読み取りにより決定した。標識された抗体／標識されていない抗体のパーセンテージは、各標識された抗体が、ＭＴＧタグに接続した重鎖における２つのＴＡＭＲＡ部分にコンジュゲーションされていると仮定して、全抗体濃度から計算した（２８０ｎｍで決定した、９：ＭＷ＝１４８２１１．７２ｇ／モル  ε２８０＝２２３４００Ｍ−１ｍ−１、１０：ＭＷ＝１４８２５９．５５ｇ／モル  ε２８０＝２２３１５０Ｍ−１ｍ−１）。分析結果のために、反応混合物も１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、ＴＡＭＲＡで標識された重鎖を蛍光読み取りにより可視化した。
【００９７】
（例４）
細胞結合の実験
細胞系統。ＥＢＣ−１およびＣＨＯ−Ｋ１細胞を、両方ともそれぞれ１０％ウシ胎児（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で補完された４ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＤＭＥＭ−Ｆ１２＋ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））が添加されたＤＭＥＭ中において、３７℃および５％ＣＯ２で培養した。
【００９８】
細胞結合の実験。細胞結合の実験は、ＥＧＦＲを過発現するＥＢＣ−１［３］およびＥＧＦＲ−陰性ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、共焦点の蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーとそれぞれ組み合わせて使用することにより実施した。洗浄およびインキュベーションステップは、１％ＢＳＡが添加されたＰＢＳを使用して４℃で実施した。顕微鏡に基づく実験のために、細胞をガラスのカバースリップ上で成長させ、続いてそれぞれ１００ｎＭの抗体複合体および１：２００の希釈ストレプトアビジンＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲート（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で次々に標識した。次に、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定して、ＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｄｉａｍｏｎｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｍｏｕｎｔａｎｔを用いて検鏡板に固定し、１００×対物レンズ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を備えたＬｅｉｃａのＴＣＳ  ＳＰ５共焦点顕微鏡を使用して走査した。フローサイトメトリーのためには、２×１０5個の細胞を、１００ｎＭのそれぞれの抗体複合体および１：２００に希釈されたストレプトアビジンＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲート（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、引き続くステップでインキュベートした。細胞の蛍光をＢＤ  Ｉｎｆｌｕｘ細胞ソーターおよびＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｓｏｒｔｗａｒｅを使用して２×１０4事象の検出で決定した。
【００９９】
（例５）
ｍＴＧ２およびＧＧＧアミノ供与体を含む基質を使用するセツキシマブ（ｃ２２５）のバイオコンジュゲーション
末端のリシン残基（Ｋ４４７）が除去されたセツキシマブの重鎖バリアント９および１０（９：配列番号９０の本発明のＭＴＧタグ付き、１０：配列番号２４６の本発明のＭＴＧタグ付き）を、ビオチン−カダベリン（ｃａｄａｖａｒｉｎｅ）、またはＧＧＧＹＫ−ビオチンとコンジュゲーションさせた。
ｍＴＧ２に媒介されるコンジュゲーション反応を実施するためのアッセイ条件は下記の通りであった。
アッセイ条件                                                    濃度［μΜ］
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣＩ    １×
ｍＴＧ（０．４ｅｑ．）                                          １．３６４
セツキシマブ（本発明による）                                    ０．５ｍｇ／ｍｌ
ＭＢＣ／ＧＧＧ−ビオチン／ＧＧＧ−ＴＡＭＲＡ／ＴＡＭＲＡ−カダベリン
（５０モル当量）                                                １７０．４
インキュベーション時間：                                        ３時間＠２２℃
２２℃で３時間のインキュベーションの後、反応を２．５μｌのＳＤＳローディング染料を加えることにより停止させ、続いて９８℃で５分間変性させた。１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに試料を加えて３００Ｖ、４０ｍＡで、所望の分離が達成されるまで行った（図１４Ｂを参照されたい）。ウェスタンブロットを行った（１２Ｖ、４００ｍＡ、４５分）。蛍光の検出は、ポリアクリルアミドゲルをＵＶスクリーン上に置くことにより行なった（λ＝２６０〜２８０ｎｍ）（図１４Ｃ）。
結果
本発明のＭＴＧ−タグ１、またはＭＴＧ−タグ２を含むセツキシマブだけが蛍光で標識されたが、それに対して本発明の配列番号９０、配列番号２４６のポリペプチド配列を有しない野生型セツキシマブは蛍光で標識されず、本発明のＭＴＧタグがｍＴＧ２により効率的に認識されたことを示した。
【０１００】
（例６）
ＭＴＧで促進されるコンジュゲーション反応
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を、配列番号２４６でタグ付けされた１ｍｇ／ｍｌのセツキシマブ（例えば、重鎖の各々のカルボキシ末端に配列番号２４６を含むセツキシマブ）、２０当量の細胞傷害性ペイロード１〜４、および０．１当量の微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）を含有する、ＭＴＧに触媒される反応で合成した。反応は、ＰＢＳ中ｐＨ７．４、３７℃で１６時間実施して、１体積のＨＩＣ緩衝液Ａの添加により停止させた。
【０１０１】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によるＡＤＣの分析
ＡＤＣを、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によりＴＳＫゲルブチル−ＮＰＲカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、４．６ｍｍ×３．５ｃｍ、２．５μｍ）でＡｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  １２６０ＨＰＬＣを使用して評価した。ＨＩＣの方法を、５０ｍＭ  ＮａＨ2Ｐ０4、１．５Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ2  ｐＨ７．５（緩衝液Ａ）および５０ｍＭ  ＮａＨ2Ｐ０4  ｐＨ７．５（緩衝液Ｂ）の移動相を使用して適用し、０．７５Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ2中のＡＤＣ（４５μｇ）を載せて、０％緩衝液Ｂで２．５分、それに続いて２５分かけて１００％緩衝液Ｂになる線形勾配からなる勾配で、０．９ｍｌ／分の流速で溶離させた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ−Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018529321.tif 000023