(57)【要約】【化１】2018538331.tif 000059  本願は、オベチコール酸の結晶形態Ａ、Ｄ、Ｆ、ＧおよびＩに関する。これらの結晶形態は、ＦＸＲ媒介疾患もしくは症状、心血管系疾患または胆汁うっ滞性肝疾患の治療もしく予防に、また、ＨＤＬコレステロールの低下、哺乳動物におけるトリグリセリドの低減、または繊維症の抑制に有用な薬物である、オベチコール酸の製造に（特に、その精製に）有用である。
2018538331.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２θが約５．０度および約５．３度にピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられるオベチコール酸の結晶形態。
【請求項２】
２θが約５．０度、約５．３度および約７．７度にピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる請求項１に記載の結晶形態。
【請求項３】
２θが約５．０度、約５．３度、約７．７度および約１０．０度にピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる請求項２に記載の結晶形態。
【請求項４】
２θが約５．０度、約５．３度、約７．７度、約１０．０度および約１１．０度にピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる請求項３に記載の結晶形態。
【請求項５】
２θが約５．０度、約５．３度、約７．７度、約１０．０度、約１１．０度および約１２．４度にピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる請求項４に記載の結晶形態。
【請求項６】
２θが約５．０度、約５．３度、約７．７度、約１０．０度、約１１．０度、約１２．４度および約１４．９度にピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる請求項５に記載の結晶形態。
【請求項７】
図４１に実質的に類似した粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる請求項１に記載の結晶形態。
【請求項８】
粉末Ｘ線回折パターンは、ＣｕＫα線を用いる回折計で集められる請求項７に記載の結晶形態。
【請求項９】
約９６％超の純度を有する請求項１に記載の結晶形態。
【請求項１０】
約９８％超の純度を有する請求項９に記載の結晶形態。
【請求項１１】
６−エチルウルソデオキシコール酸、３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸、６β−エチルケノデオキシコール酸、３α，７α−ジヒドロキシ−６−エチリデン−５β−コラン−２４−酸、ケノデオキシコール酸、および３α（３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイルオキシ）−７α−ヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸から選択される１種以上の不純物を合計で約４％未満有する請求項１に記載の結晶形態。
【請求項１２】
前記不純物全体の割合は、約３．８％未満である請求項１１に記載の結晶形態。
【請求項１３】
前記不純物全体の割合は、約３．６％未満である請求項１１に記載の結晶形態。
【請求項１４】
Ｄ、Ｆ、ＧおよびＩからなる群から選択されるオベチコール酸の結晶形態。
【請求項１５】
形態Ｄであり、かつ２θが約４．４度、約５．２度および約７．５度にピークを含むＸ線回折パターンによって特徴付けられる請求項１４に記載の結晶形態。
【請求項１６】
図４５に示すものに実質的に類似したＸ線回折パターンによって特徴付けられる請求項１５に記載の結晶形態。
【請求項１７】
形態Ｆであり、かつ２θが約８．０度、約１３．２度および約１３．８度にピークを含むＸ線回折パターンによって特徴付けられる請求項１４に記載の結晶形態。
【請求項１８】
図４９に示すものに実質的に類似したＸ線回折パターンによって特徴付けられる請求項１７に記載の結晶形態。
【請求項１９】
形態Ｇであり、かつ２θが約１２．９度および約１３．４度にピークを含むＸ線回折パターンによって特徴付けられる請求項１４に記載の結晶形態。
【請求項２０】
図５３に示すものに実質的に類似したＸ線回折パターンによって特徴付けられる請求項１９に記載の結晶形態。
【請求項２１】
形態Ｉであり、かつ２θが約７．２度にピークを含むＸ線回折パターンによって特徴付けられる請求項１４に記載の結晶形態。
【請求項２２】
図５７に示すものに実質的に類似したＸ線回折パターンによって特徴付けられる請求項２１に記載の結晶形態。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００１】
本発明は、オベチコール酸、ＦＸＲのアゴニスト、オベチコール酸の調製方法、オベチコール酸を含む医薬製剤、およびその治療的使用に関する。
【化１】
2018538331.tif 000003
【０００２】
本発明は、合成中間体として結晶性オベチコール酸を用いてオベチコール酸を調製する方法に関する。結晶性オベチコール酸は、形態Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、ＧおよびＩからなる群から選択される。本発明は、さらに、結晶性オベチコール酸を選択的に調製する方法に関する。
【０００３】
本発明は、２θが約５．０度および約５．３度に特徴的なピークを含むＸ線回折パターンによって特徴付けられる結晶性オベチコール酸形態Ａに関する。結晶性オベチコール酸形態Ａは、図４１に示したものと実質的に類似したＸ線回折パターンによって特徴付けられる。
【０００４】
本発明は、２θが約４．２度、約６．４度、約９．５度、約１２．５度および約１６．７度に特徴的なピークを含むＸ線回折パターンによって特徴付けられる結晶性オベチコール酸形態Ｃに関する。結晶性オベチコール酸形態Ｃは、図５に示したものと実質的に類似したＸ線回折パターンによって特徴付けられ、さらに、約９８±２℃に吸熱値を有する示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムによって特徴付けられる。
【０００５】
本発明は、２θが約４．４度、約５．２度、および約７．５度に特徴的なピークを含むＸ線回折パターンによって特徴付けられる結晶性オベチコール酸形態Ｄに関する。結晶性オベチコール酸形態Ｄは、図４５に示したものと実質的に類似したＸ線回折パターンによって特徴付けられる。
【０００６】
本発明は、２θが約８．０度、約１３．２度および約１３．８度に特徴的なピークを含むＸ線回折パターンによって特徴付けられる結晶性オベチコール酸形態Ｆに関する。結晶性オベチコール酸形態Ｆは、図４９に示したものと実質的に類似したＸ線回折パターンによって特徴付けられる。
【０００７】
本発明は、２θが約１２．９度および約１３．４度に特徴的なピークを含むＸ線回折パターンによって特徴付けられる結晶性オベチコール酸形態Ｇに関する。結晶性オベチコール酸形態Ｇは、図５３に示したものと実質的に類似したＸ線回折パターンによって特徴付けられる。
【０００８】
本発明は、２θが約７．２度に特徴的なピークを含むＸ線回折パターンによって特徴付けられる結晶性オベチコール酸形態Ｉに関する。結晶性オベチコール酸形態Ｉは、図５７に示したものと実質的に類似したＸ線回折パターンによって特徴付けられる。
【０００９】
本発明は、結晶性オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程を含む、オベチコール酸形態１を調製する方法に関する。
【００１０】
本発明は、３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＮａＢＨ４と反応させて結晶性オベチコール酸を形成する工程と、結晶性オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程とを含むオベチコール酸形態１の調製方法に関する。
【００１１】
本発明は、Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程と；３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＮａＢＨ４と反応させて結晶性オベチコール酸を形成する工程と；結晶性オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程とを含むオベチコール酸形態１の調製方法に関する。
【００１２】
本発明は、Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルをＮａＯＨと反応させてＥ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程と；Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程と；３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＮａＢＨ４と反応させて結晶性オベチコール酸を形成する工程と；結晶性オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程とを含むオベチコール酸形態１の調製方法に関する。
【００１３】
本発明は、３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コル−６−エン−２４−酸メチルエステルをＣＨ３ＣＨＯと反応させてＥ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルを形成する工程と；Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルをＮａＯＨと反応させてＥ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程と；Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程と；３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＮａＢＨ４と反応させて結晶性オベチコール酸を形成する工程と；結晶性オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程とを含むオベチコール酸形態１の調製方法に関する。
【００１４】
本発明は、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルをＬｉ［Ｎ（ＣＨ（ＣＨ３）２）２］およびＳｉ（ＣＨ３）３Ｃｌと反応させて３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コル−６−エン−２４−酸メチルエステルを形成する工程と；３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コル−６−エン−２４−酸メチルエステルをＣＨ３ＣＨＯと反応させてＥ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルを形成する工程と；Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルをＮａＯＨと反応させてＥ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程と；Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程と；３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＮａＢＨ４と反応させて結晶性オベチコール酸を形成する工程と；結晶性オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程とを含むオベチコール酸形態１の調製方法に関する。
【００１５】
本発明は、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＣＨ３ＯＨおよびＨ２ＳＯ４と反応させて３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルを形成する工程と；３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルをＬｉ［Ｎ（ＣＨ（ＣＨ３）２）２］およびＳｉ（ＣＨ３）３Ｃｌと反応させて３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コル−６−エン−２４−酸メチルエステルを形成する工程と；３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コル−６−エン−２４−酸メチルエステルをＣＨ３ＣＨＯと反応させてＥ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルを形成する工程と；Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルをＮａＯＨと反応させてＥ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程と；Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程と；３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸とＮａＢＨ４と反応させて結晶性オベチコール酸を形成する工程と；結晶性オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程とを含むオベチコール酸形態１の調製方法に関する。
【００１６】
本発明は、オベチコール酸形態１の調製方法であって、結晶性オベチコール酸形態Ａのオベチコール酸形態１への変換は、結晶性オベチコール酸形態ＡをＮａＯＨ水溶液に溶解しＨＣｌを添加する工程を含む方法に関する。
【００１７】
本発明は、オベチコール酸形態１の調製方法であって、結晶性オベチコール酸形態Ｃのオベチコール酸形態１への変換は結晶性オベチコール酸形態ＣをＮａＯＨ水溶液に溶解しＨＣｌを添加する工程を含む方法に関する。
【００１８】
本発明は、オベチコール酸形態１の調製方法であって、結晶性オベチコール酸形態Ｄのオベチコール酸形態１への変換は、結晶性オベチコール酸形態ＤをＮａＯＨ水溶液に溶解しＨＣｌを添加する工程を含む方法に関する。
【００１９】
本発明は、オベチコール酸形態１の調製方法であって、結晶性オベチコール酸形態Ｆのオベチコール酸形態１への変換は、結晶性オベチコール酸形態ＦをＮａＯＨ水溶液に溶解しＨＣｌを添加する工程を含む方法に関する。
【００２０】
本発明は、オベチコール酸形態１の調製方法であって、結晶性オベチコール酸形態Ｇのオベチコール酸形態１への変換は、結晶性オベチコール酸形態ＧをＮａＯＨ水溶液に溶解しＨＣｌを添加する工程を含む方法に関する。
【００２１】
本発明は、オベチコール酸形態１の調製方法であって、結晶性オベチコール酸形態Ｉのオベチコール酸形態１への変換は、結晶性オベチコール酸形態ＩをＮａＯＨ水溶液に溶解しＨＣｌを添加する工程を含む方法に関する。
【００２２】
本発明は、オベチコール酸形態１の調製方法であって、３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＮａＢＨ４を反応させて結晶性オベチコール酸を形成する工程は、塩基性水溶液中、約８５℃〜約１１０℃で行われる方法に関する。
【００２３】
本発明は、オベチコール酸形態１の調製方法であって、Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程は、約２０℃〜約１０５℃の温度、および約０．５ｂａｒ〜約５ｂａｒの圧力で行われる方法に関する。別の実施形態において、水素化は、約２０℃〜約１０５℃の温度範囲、例えば、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃および１００℃、ならびにその間の任意の温度で行われる。他の実施形態において、水素化は、約０．５ｂａｒ〜約５．５ｂａｒの圧力、例えば、０．６ｂａｒ、０．７ｂａｒ、０．８ｂａｒ、０．９ｂａｒ、１．０ｂａｒ、１．２ｂａｒ、１．４ｂａｒ、１．６ｂａｒ、１．８ｂａｒ、２．０ｂａｒ、２．２ｂａｒ、２．４ｂａｒ、２．６ｂａｒ、２．８ｂａｒ、３．０ｂａｒ、３．２ｂａｒ、３．４ｂａｒ、３．６ｂａｒ、３．８ｂａｒ、４．０ｂａｒ、４．２ｂａｒ、４．４ｂａｒ、５．０ｂａｒ、５．２ｂａｒ、５．３ｂａｒおよび５．４ｂａｒ、ならびにその間の任意の圧力で行われる。本発明は、オベチコール酸形態１の調製方法であって、Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルをＮａＯＨと反応させてＥ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程は、約２０℃〜約６０℃の温度で行われる方法に関する。
【００２４】
本発明は、オベチコール酸形態１の調製方法であって、３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コル−６−エン−２４−酸メチルエステルをＣＨ３ＣＨＯと反応させてＥ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルを形成する工程は、極性非プロトン性溶媒中、ＢＦ３の存在下に、約−５０℃〜約−７０℃の温度で行われる方法に関する。一実施形態において、反応は、ＢＦ３の存在下に、−６０℃未満〜約−７０℃の温度範囲で行われる。一実施形態において、反応は、ＢＦ３の存在下、約−６０℃の上限温度で行われる。
【００２５】
本発明は、オベチコール酸形態１の調製方法であって、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルをＬｉ［Ｎ（ＣＨ（ＣＨ３）２）２］およびＳｉ（ＣＨ３）３Ｃｌと反応させて３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コル−６−エン−２４−酸メチルエステルを形成する工程は、極性非プロトン性溶媒中、約−１０℃〜約−３０℃で行われる方法に関する。
【００２６】
本発明は、オベチコール酸形態１に調製方法であって、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＣＨ３ＯＨおよびＨ２ＳＯ４と反応させて３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルを形成する工程は、３時間の加熱が行われ、反応混合物のｐＨが塩基性水溶液で約９．５〜約１０のｐＨ範囲に調節される方法に関する。
【００２７】
本発明は、オベチコール酸、または、約９８％超、約９８．５％超、約９９．０％超または約９９．５％超の効力を有する、薬学的に許容されるその塩、溶媒和物またはアミノ酸抱合体に関する。本発明は、本発明の方法により製造されたオベチコール酸形態１、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【００２８】
本発明は、有効量のオベチコール酸形態１を投与することを含む、患者のＦＸＲ介在性疾患または病態を治療または予防する方法に関する。疾患または病態は、胆道閉鎖、胆汁うっ滞性肝疾患、慢性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、Ｃ型肝炎感染、アルコール性肝疾患、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、進行性の線維症による肝損傷、肝線維症、ならびにアテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、高コレステロール血症および高脂血症を含む心血管系疾患から選択される。本発明は、有効量のオベチコール酸形態１を投与することを含む、患者のトリグリセリドを減少させる方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、１ｍｇ／ｍＬで注入した（注入体積３μｌ）、実施例１の工程４の粗化合物５のＨＰＬＣ−ＵＶ／ＭＳクロマトグラムである。クロマトグラムは実施例２に記載の方法により得る。
【図２】図２は、１ｍｇ／ｍＬで注入した（注入量２０μＬ）、実施例１の工程４の化合物５、精製リファレンスのＨＰＬＣ−ＵＶ／ＭＳクロマトグラムである。クロマトグラムは実施例２に記載の方法により得る。
【図３】図３は、ＨＰＬＣ法による、実施例１の工程４の粗化合物５のＵＶクロマトグラムである。クロマトグラムは実施例２に記載の方法により得る。
【図４Ａ】図４Ａは、ＨＰＬＣ法で完全単離した、実施例１の工程４の化合物５のメインピークフラクション（ＲＴ  ２９．０分）からのｍ／ｚ８５０．６１９１４±３ｐｐｍの正確なイオントレースである（実施例２を参照）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＨＰＬＣ法で完全単離した、実施例１の工程４の化合物５のマイナーピークフラクション（ＲＴ  ２９．９分）からのｍ／ｚ８５０．６１９１４±３ｐｐｍの正確なイオントレースである（実施例２を参照）。
【図４Ｃ】図４Ｃは、実施例１の工程４の粗化合物５からのｍ／ｚ８５０．６１９１４±３ｐｐｍの正確なイオントレースである（実施例２を参照）。
【図４Ｄ】図４Ｄは、実施例１の工程４の化合物５、精製リファレンスからのｍ／ｚ８５０．６１９１４±３ｐｐｍの正確なイオントレースである（実施例２を参照）。
【図５】図５は、結晶性オベチコール酸形態ＣのＸＲＰＤディフラクトグラムである（実施例３を参照）。
【図６】図６は、結晶性オベチコール酸形態ＣのＴＧＡおよびＤＳＣのサーモグラムを示す。（実施例３を参照）。
【図７】図７は、２５℃、１１０℃および１２０℃での結晶性オベチコール酸のＶＴ−ＸＲＰＤディフラクトグラムを示す（実施例３を参照）。
【図８Ａ】図８Ａは、結晶性オベチコール酸形態ＣのＧＶＳ等温プロットである（実施例３を参照）。
【図８Ｂ】図８Ｂは、結晶性オベチコール酸形態ＣのＧＶＳ動的プロット（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｐｌｏｔ）である（実施例３を参照）。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ＧＶＳ解析前および後の結晶性オベチコール酸形態ＣのＸＲＰＤディフラクトグラムを示す（実施例３を参照）。
【図９】図９は、４０℃／７５％ＲＨで貯蔵する前および後の結晶性オベチコール酸形態ＣのＸＲＰＤディフラクトグラムを示す（実施例３を参照）。
【図１０】図１０は、オベチコール酸形態１のバッチ１のＸＲＰＤディフラクトグラムである（実施例５を参照）。
【図１１】図１１は、オベチコール酸形態１のバッチ１、２、３、４、５および６のＸＲＰＤディフラクトグラフ（ｄｉｆｆｒａｃｔｏｒｇｒａｐｈ）を示す（実施例５を参照）。
【図１２】図１２は、ｄ６−ＤＭＳＯ中でのオベチコール酸形態１のバッチ１のＮＭＲスペクトルである（実施例５を参照）。
【図１３】図１３は、オベチコール酸形態１のバッチ１、２、３、４、５および６の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す（実施例５を参照）。
【図１４】図１４は、オベチコール酸形態１の１３Ｃ  ＤＥＰＴＱ  ＮＭＲスペクトルの１０〜７５ｐｐｍ領域の拡大図である（実施例５を参照）。
【図１５】図１５は、四級炭素を抑制したオベチコール酸形態１の１３Ｃ  ＤＥＰＴ１３５  ＮＭＲスペクトルの０〜７５ｐｐｍ領域の拡大図である（実施例５を参照）。
【図１６】図１６は、オベチコール酸形態１の１３Ｃ定量ＮＭＲである（実施例５を参照）。
【図１７】図１７は、図１６の３２．３ｐｐｍにおけるピークの拡大図である（実施例５を参照）。
【図１８】図１８は、オベチコール酸形態１のバッチ１のＦＴ−ＩＲスペクトルである（実施例５を参照）。
【図１９】図１９は、オベチコール酸形態１のバッチ１のＴＧＡおよびＤＳＣのサーモグラムを示す（実施例５を参照）。
【図２０】図２０は、オベチコール酸形態１のバッチ１の変調ＤＳＣサーモグラムを示す（実施例５を参照）。
【図２１】図２１は、オベチコール酸形態１のバッチ１、２、３、４、５および６のＴＧＡトレースを示す（実施例５を参照）。
【図２２】図２２は、オベチコール酸形態１のバッチ１、２、３、４、５および６のＤＳＣトレースを示す（実施例５を参照）。
【図２３】図２３Ａは、オベチコール酸形態１のバッチ１の偏向顕微鏡写真である。図２３Ｂは、オベチコール酸形態１のバッチ２の偏向顕微鏡写真である。図２３Ｃは、オベチコール酸形態１のバッチ３の偏向顕微鏡写真である。図２３Ｄは、オベチコール酸形態１のバッチ４の偏向顕微鏡写真である。図２３Ｅは、オベチコール酸形態１のバッチ５の偏向顕微鏡写真である。図２３Ｆは、オベチコール酸形態１のバッチ６の偏向顕微鏡写真である。
【図２４】図２４は、オベチコール酸形態１のバッチ１のＧＶＳ等温プロットを示す（実施例５を参照）。
【図２５】図２５は、オベチコール酸形態１のバッチ１のＧＶＳ動態プロットを示す（実施例５を参照）。
【図２６】図２６は、ＧＶＳ前および後のオベチコール酸形態１のバッチ１のＸＲＰＤディフラクトグラムを示す（実施例５を参照）。
【図２７】図２７は、オベチコール酸形態１の３種のメタノール／水比におけるｐＫａを測定したグラフである（実施例５を参照）。
【図２８】図２８は、オベチコール酸形態１のＹａｓｕｄａ−Ｓｈｅｄｌｏｖｓｋｙプロットである（実施例５を参照）。
【図２９】図２９は、オベチコール酸形態１のｐＨに依る種類の分布を示すグラフである（実施例５を参照）。
【図３０】図３０は、オベチコール酸形態１の電位差測定により得られた電位差曲線を示すグラフである。（実施例５を参照）。
【図３１】図３１は、オベチコール酸形態１の脂溶性プロファイルを示す（実施例５を参照）。
【図３２】図３２は、４０℃／７５％ＲＨで貯蔵後のオベチコール酸形態１のバッチ１のＸＲＰＤディフラクトグラムを示す（実施例５を参照）。
【図３３】図３３は、２５℃／９７％ＲＨで貯蔵後のオベチコール酸形態１のバッチ１のＸＲＰＤディフラクトグラムを示す（実施例５を参照）。
【図３４】図３４は、５０％の確立水準で、オベチコール酸形態Ｇの分子を結晶構造からみた図で、非水素原子を異方性原子転位楕円体で示している（実施例６を参照）。
【図３５】図３５は、オベチコール酸形態Ｇの結晶構造の分子間水素結合を示す図で、水素結合は一点鎖線で示している（実施例６を参照）。
【図３６】図３６は、シミュレートした粉末パターン、集めた結晶の実験パターンおよびオベチコール酸形態ＧのＸＲＰＤオーバーレイを示す（実施例６を参照）。
【図３７】図３７は、オベチコール酸形態１および結晶形態Ｆを２０ｍｇ／ｋｇ経口投与した後の、時間に対する血漿オベチコール酸プロファイルのグラフを示す（実施例７を参照）。
【図３８】図３８は、投与後の異なる時間間隔におけるオベチコール酸形態１と結晶形態Ｆのタウロ抱合体の血漿中濃度を示すグラフである（実施例７を参照）。
【図３９】図３９は、形態１のＤＳＣ曲線を示す（実施例７を参照）。
【図４０】図４０は、形態ＦのＤＳＣ曲線を示す（実施例７を参照）。
【図４１】図４１は、結晶性オベチコール酸形態ＡのＸＲＰＤディフラクトグラムである（実施例３を参照）。
【図４２】図４２は、結晶性オベチコール酸形態ＡのＴＧＡサーモグラムおよびＤＳＣサーモグラムのオーバーレイである（実施例３を参照）。
【図４３】図４３は、形態ＡによるＧＶＳ実験の等温プロットである（実施例３を参照）。
【図４４】図４４は、形態ＡによるＧＶＳ実験の動態プロットである（実施例３を参照）。
【図４５】図４５は、結晶性オベチコール酸形態ＤのＸＲＰＤディフラクトグラムである（実施例９を参照）。
【図４６】図４６は、結晶性オベチコール酸形態ＤのＴＧＡサーモグラムおよびＤＳＣサーモグラムのオーバーレイである（実施例９を参照）。
【図４７】図４７は、形態ＤによるＧＶＳ実験の等温プロットである（実施例９を参照）。
【図４８】図４８は、形態ＤによるＧＶＳ実験の動態プロットである（実施例９を参照）。
【図４９】図４９は、結晶性オベチコール酸形態ＦのＸＲＰＤディフラクトグラムである（実施例９を参照）。
【図５０】図５０は、結晶性オベチコール酸形態ＦのＴＧＡサーモグラムおよびＤＳＣサーモグラムのオーバーレイである（実施例９を参照）。
【図５１】図５１は、形態ＦによるＧＶＳ実験の等温プロットである（実施例９を参照）。
【図５２】図５２は、形態ＦによるＧＶＳ実験の動態プロットである（実施例９を参照）。
【図５３】図５３は、結晶性オベチコール酸形態ＧのＸＲＰＤディフラクトグラムである（実施例９を参照）。
【図５４】図５４は、結晶性オベチコール酸形態ＧのＴＧＡサーモグラムおよびＤＳＣサーモグラムのオーバーレイである（実施例９を参照）。
【図５５】図５５は、形態ＧによるＧＶＳ実験の等温プロットである（実施例９を参照）。
【図５６】図５６は、形態ＧによるＧＶＳ実験の動態プロットである（実施例９を参照）。
【図５７】図５７は、結晶性オベチコール酸形態ＩのＸＲＰＤディフラクトグラムである（実施例９を参照）。
【図５８】図５８は、結晶性オベチコール酸形態ＩのＴＧＡサーモグラムおよびＤＳＣサーモグラムのオーバーレイである（実施例９を参照）。
【図５９】図５９は、結晶性オベチコール酸形態ＩによるＧＶＳ実験の等温プロットである（実施例９を参照）。
【図６０】図６０は、結晶性オベチコール酸形態ＩによるＧＶＳ実験の動態プロットである（実施例９を参照）。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本願は、オベチコール酸、実質的に純粋なオベチコール酸を含む、化学構造：
【化２】
2018538331.tif 000004
を有する薬学的に活性な成分（ＩＮＴ−７４７としても知られる）、合成中間体として結晶性オベチコール酸を含むオベチコール酸の調製方法、およびオベチコール酸の調製方法において、オベチコール酸および合成中間体の存在および純度を確認する分析方法を対象とする。本願はまた、医薬組成物およびオベチコール酸製剤、ならびにそのような組成物の使用を記載する。
【００３１】
オベチコール酸の調製方法
本願は、高純度のオベチコール酸を調製する方法を対象とする。本願の方法をスキーム１に示す。本方法は、６工程の合成と、それに続く１精製工程で、高純度のオベチコール酸を生成する。
【化３】
2018538331.tif 000005
【００３２】
本発明の方法はまた、化合物４および５がそれぞれ下記の化合物４Ａおよび５Ａの構造で示すＥおよびＺ異性体の混合物からなる、スキーム１に記載の方法を含む。
【化４】
2018538331.tif 000006
【００３３】
一実施形態において、Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４Ａ）のＥ／Ｚ異性体比は、約５０％、約６０％超、約７０％超、約８０％超、約８３％超、約８５％超、約９０％超、約９３％超、約９５％超または約９９％超である。一実施形態において、Ｅ／Ｚ比はＨＰＬＣにより決定される。一実施形態において、比は、約８０％超である。一実施形態において、比は、約８３％超である。一実施形態において、比は、約８５％超である。一実施形態において、比は、約９０％超である。一実施形態において、比は、約９３％超である。一実施形態において、比は、約９５％超である。一実施形態において、比は、約９９％超である。
【００３４】
一実施形態において、Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）のＥ／Ｚ異性体比は、約５０％、約６０％超、約７０％超、約８０％超、約８３％超、約８５％超、約９０％超、約９３％超、約９５％超または約９９％超である。一実施形態において、Ｅ／Ｚ比はＨＰＬＣにより決定される。一実施形態において、比は、約８０％超である。一実施形態において、比は、約８３％超である。一実施形態において、比は、約８５％超である。一実施形態において、比は、約９０％超である。一実施形態において、比は、約９３％超である。一実施形態において、比は、約９５％超である。一実施形態において、比は、約９９％超である。
【００３５】
本願の方法は、当該技術分野でこれまで報告されていない。本方法は、６工程の合成と、それに続く１精製工程である。工程１は、酸触媒の存在下に加熱して、７−ケトリトコール酸（ＫＬＣＡ）のＣ−２４カルボン酸をメタノールでエステル化してメチルエステル化合物１を生成する工程である。工程２は、強塩基の存在下にクロロシランを用いて化合物１からシリルエノールエーテルを形成して化合物３を生成する工程である。工程３は、酸の存在下、シリルエノールエーテル化合物３とアセトアルデヒドの酸を介したアルドール縮合反応により化合物４（または化合物４Ａ）を生成する工程である。工程４は、化合物４（または化合物４Ａ）のＣ−２４メチルエステルのエステル加水分解、すなわち鹸化により、カルボン酸化合物５（または化合物５Ａ）を生成する工程である。工程５は、化合物５（または化合物５Ａ）の６−エチリデン部分に水素を付加し、続いて最初に形成された６−βエチル基を異性化して化合物６を形成する工程である。工程６は、化合物６の７−ケト基を７α−ヒドロキシ基に選択的に還元して結晶性オベチコール酸を生成する工程である。工程７は、結晶性オベチコール酸のオベチコール酸形態１への変換である。
【００３６】
本発明の方法は、オベチコール酸形態１の調製方法であって、結晶形態のオベチコール酸を合成中間体として利用する方法に関する。
【００３７】
一実施形態において、本発明は、結晶性オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程を含むオベチコール酸形態１の調製方法に関する。
【００３８】
一実施形態において、本発明は、オベチコール酸形態１の調製方法であって、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）をＮａＢＨ４と反応させて結晶性オベチコール酸を形成する工程と、
結晶性オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程とを含む方法に関する。
【００３９】
一実施形態において、本発明は、オベチコール酸形態１の調製方法であって、
Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）を形成する工程と、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）をＮａＢＨ４と反応させて結晶性オベチコール酸を形成する工程と、
結晶性オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程とを含む方法に関する。
【００４０】
一実施形態において、本発明は、オベチコール酸形態１の調製方法であって、
Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）を形成する工程と、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）をＮａＢＨ４と反応させて結晶性オベチコール酸を形成する工程と、
結晶性オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程とを含む方法に関する。
【００４１】
一実施形態において、本発明は、オベチコール酸形態１の調製方法であって、
Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４Ａ）をＮａＯＨと反応させてＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）を形成する工程と、
Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）を形成する工程と、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）をＮａＢＨ４と反応させて結晶性オベチコール酸を形成する工程と、
結晶性オベチコール酸形態１に変換する工程とを含む方法に関する。
【００４２】
一実施形態において、本発明は、オベチコール酸形態１の調製方法であって、
Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４）をＮａＯＨと反応させてＥ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）を形成する工程と、
Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）を形成する工程と、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）をＮａＢＨ４と反応させて結晶性オベチコール酸を形成する工程と、
結晶性オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程とを含む方法に関する。
【００４３】
一実施形態において、本発明は、オベチコール酸形態１の調製方法であって、
３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コル−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）をＣＨ３ＣＨＯと反応させてＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４Ａ）を形成する工程と、
Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４Ａ）をＮａＯＨと反応させてＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）を形成する工程と、
Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）を形成する工程と、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）をＮａＢＨ４と反応させて結晶性オベチコール酸を形成する工程と、
結晶性オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程とを含む方法に関する。
【００４４】
一実施形態において、本発明は、オベチコール酸形態１の調製方法であって、
３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コル−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）をＣＨ３ＣＨＯと反応させてＥ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４）を形成する工程と、
Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４）をＮａＯＨと反応させてＥ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）を形成する工程と、
Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）を形成する工程と、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）をＮａＢＨ４と反応させて結晶性オベチコール酸を形成する工程と、
結晶性オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程とを含む方法に関する。
【００４５】
一実施形態において、本発明は、オベチコール酸形態１の調製方法であって、
３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）をＬｉ［Ｎ（ＣＨ（ＣＨ３）２）２］およびＳｉ（ＣＨ３）３Ｃｌと反応させて３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コル−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）を形成する工程と、
３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コル−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）をＣＨ３ＣＨＯと反応させてＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４Ａ）を形成する工程と、
Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４Ａ）をＮａＯＨと反応させてＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）を形成する工程と、
Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）を形成する工程と、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）をＮａＢＨ４と反応させて結晶性オベチコール酸を形成する工程と、
結晶性オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程とを含む方法に関する。
【００４６】
一実施形態において、本発明は、オベチコール酸形態１の調製方法であって、
３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）をＬｉ［Ｎ（ＣＨ（ＣＨ３）２）２］およびＳｉ（ＣＨ３）３Ｃｌと反応させて３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コル−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）を形成する工程と、
３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コル−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）をＣＨ３ＣＨＯと反応させてＥ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４）を形成する工程と、
Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４）をＮａＯＨと反応させてＥ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）を形成する工程と、
Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）を形成する工程と、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）をＮａＢＨ４と反応させて結晶性オベチコール酸を形成する工程と、
結晶性オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程とを含む方法に関する。
【００４７】
一実施形態において、本発明は、オベチコール酸形態１の調製方法であって、
３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（ＫＬＣＡ）をＣＨ３ＯＨおよびＨ２ＳＯ４と反応させて３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）を形成する工程と、
３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）をＬｉ［Ｎ（ＣＨ（ＣＨ３）２）２］およびＳｉ（ＣＨ３）３Ｃｌと反応させて３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コル−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）を形成する工程と、
３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コル−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）をＣＨ３ＣＨＯと反応させてＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４Ａ）を形成する工程と、
Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４Ａ）をＮａＯＨと反応させてＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）を形成する工程と、
Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）を形成する工程と、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）をＮａＢＨ４と反応させて結晶性オベチコール酸を形成する工程と、
結晶性オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程とを含む方法に関する。
【００４８】
一実施形態において、本発明は、オベチコール酸形態１の調製方法であって、
３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（ＫＬＣＡ）をＣＨ３ＯＨおよびＨ２ＳＯ４と反応させて３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）を形成する工程と、
３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）をＬｉ［Ｎ（ＣＨ（ＣＨ３）２）２］およびＳｉ（ＣＨ３）３Ｃｌと反応させて３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コル−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）を形成する工程と、
３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コル−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）をＣＨ３ＣＨＯと反応させてＥ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４）を形成する工程と、
Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４）をＮａＯＨと反応させてＥ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）を形成する工程と、
Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）を形成する工程と、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）をＮａＢＨ４と反応させて結晶性オベチコール酸を形成する工程と、
結晶性オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程とを含む方法に関する。
【００４９】
本発明は、結晶性オベチコール酸を合成中間体として使用してオベチコール酸形態１を調製する方法に関する。一実施形態において、結晶性オベチコール酸は形態Ａである。一実施形態において、結晶性オベチコール酸形態Ａは図４１に示したものと類似したＸ線回折パターンによって特徴付けられる。一実施形態において、結晶性オベチコール酸形態Ａは酢酸ｎ−ブチルから結晶化し、かつ再結晶化する。
【００５０】
他の実施形態において、結晶性オベチコール酸は形態Ｃである。一実施形態において、結晶性オベチコール酸形態Ｃは図５に示したものと類似したＸ線回折パターンによって特徴付けられる。他の実施形態において、結晶性オベチコール酸は形態Ｄである。一実施形態において、結晶性オベチコール酸形態Ｄは図４５に示したものと類似したＸ線回折パターンによって特徴付けられる。他の実施形態において、結晶性オベチコール酸は形態Ｆである。一実施形態において、結晶性オベチコール酸形態Ｆは図４９に示したものと類似したＸ線回折パターンによって特徴付けられる。他の実施形態において、結晶性オベチコール酸は形態Ｇである。一実施形態において、結晶性オベチコール酸形態Ｇは図５３に示したものと類似したＸ線回折パターンによって特徴付けられる。他の実施形態において、結晶性オベチコール酸は形態Ｉである。一実施形態において、結晶性オベチコール酸形態Ｉは図５７に示したものと類似したＸ線回折パターンによって特徴付けられる。
【００５１】
工程１
工程１は、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（ＫＬＣＡ）をＣＨ３ＯＨおよびＨ２ＳＯ４と反応させて３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）を形成する工程である。工程１の一実施形態において、反応混合物を約３時間加熱し、反応混合物のｐＨを塩基性水溶液で約９．５〜約１０のｐＨ値に調節する。一実施形態において、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）の単離は、活性炭による処理をさらに含む。一実施形態において、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）の単離は、活性炭による処理をさらに含まない。一実施形態において、活性炭による処理を行わずに３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）を単離することにより、収率をより高くすることができる。一実施形態において、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（１）のＣＨ３ＯＨおよびＨ２ＳＯ４との反応は、メタノール中で行われる。一実施形態において、塩基性溶液はＮａＯＨ水溶液である。一実施形態において、ｐＨ値は約９．５〜約１０である。
【００５２】
一実施形態において、メチルアルコールはメチル化試薬および反応溶媒として働く。一実施形態において、生成物を含有する溶液を活性炭で３０分間処理し、濾過して炭素固体を除く。一実施形態において、生成物を含有する溶液を活性炭で処理しない。生成物の沈澱させるため、約５℃〜約２０℃の水および晶結剤を添加する。他の実施形態において、水は約１０℃〜約１５℃である。一実施形態において、生成物を遠心分離で単離し、メタノールと水の混合液で洗浄する。一実施形態において、この濡れた物質の水分含有量をカール・フィッシャー（ＫＦ）法で定量する。一実施形態において、この物質を次工程で使用する前に回転式乾燥機で乾燥させる。一実施形態において、この物質を次工程で使用する前に乾燥させない。一実施形態において、濡れた物質をヘプタンで洗浄して、乾燥を改善する。
【００５３】
工程２
工程２は、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）をＬｉ［Ｎ（ＣＨ（ＣＨ３）２）２］およびＳｉ（ＣＨ３）３Ｃｌと反応させて３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コル−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）を形成する工程である。一実施形態において、工程２は、約−１０℃〜約−３０℃の極性非プロトン性溶媒中で行われる。一実施形態において、極性非プロトン性溶媒はテトラヒドロフランである。一実施形態において、温度は約−２０℃〜約−２５℃である。一実施形態において、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）のＬｉ［Ｎ（ＣＨ（ＣＨ３）２）２］およびＳｉ（ＣＨ３）３Ｃｌとの反応は、約２時間撹拌する。
【００５４】
一実施形態において、不活性条件下で化合物１を反応器に投入する。他の実施形態において、この工程の後半に添加するクロロトリメチルシランの加水分解を回避するため、残留水およびメタノールを、約６５℃および周囲圧力での共沸蒸留を繰り返すことによって除去する。他の実施形態において、必要に応じて残留物にＴＨＦを加え、蒸留を約４回繰り返す。他の実施形態において、蒸留を約３回、約２回または約１回行われる。一実施形態において、生成物を含有する残留溶液の最終含水量は≦０．０５％未満である（カール・フィッシャー滴定）。一実施形態において、生成物の溶液を約−１０℃〜約−３０℃に予冷し、その後、クロロトリメチルシランを添加する。他の実施形態において、溶液は約−２０℃〜約−２５℃に予冷する。一実施形態において、強塩基およびＴＨＦを別々の反応器に投入し、約−１０℃〜約−３０℃に冷却する。一実施形態において、強塩基はリチウムジイソプロピルアミドである。他の実施形態において、反応器は不活性、例えば、窒素雰囲気下またはアルゴン雰囲気下にある。他の実施形態において、塩基およびＴＨＦの溶液を約−２０℃〜約−２５℃に冷却する。一実施形態において、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル、ＴＨＦ、およびクロロトリメチルシランからなる乾燥し冷却した溶液を、約−１０℃〜約−３０℃の塩基性溶液に投入した。他の実施形態において、温度は約−２０℃〜約−２５℃である。一実施形態において、反応混合物を約２時間撹拌する。一実施形態において、後処理のために、反応混合物を予め冷却した酸性溶液に添加する。他の実施形態において、酸性溶液はクエン酸水溶液である。一実施形態において、添加後、水相を分離し、廃棄する。一実施形態において、約５０℃で真空蒸留することによって溶媒を有機層から除去する。一実施形態において、単離された残留物は、３α，７α−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コル−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）であり、次工程で「そのまま」使用される。あるいは、化合物３は、工程３の前に精製することができる。
【００５５】
工程３
工程３は、３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コル−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）をＣＨ３ＣＨＯと反応させて３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４）を形成する工程である。一実施形態において、工程３は、極性非プロトン性溶媒中、ＢＦ３の存在下、約−５０℃〜約−７０℃で行われる。一実施形態において、極性非プロトン性溶媒はジクロロメタンである。一実施形態において、ＢＦ３は、アセトニトリル中の１６重量％溶液である。他の実施形態において、反応はＢＦ３ジエチルエーテルの存在下で行われる。一実施形態において、温度は約−６０℃〜約−６５℃である。
【００５６】
一実施形態において、極性非プロトン性溶媒中の化合物３を不活性反応器に投入する。他の実施形態において、極性非プロトン性溶媒は前の工程からの残留溶媒（例えば、ＴＨＦ）である。一実施形態において、ＴＨＦを添加して、残留水およびジイソプロピルアミンを留去するのを助ける。約５０℃の最高温度で、残留量の極性非プロトン性溶媒を真空下で留去する。化合物３を含有する残留物中の含水量は、≦０．５％（カール・フィッシャー滴定）に制限される。次いで、化合物３を含有する残留物を極性非プロトン性溶媒に溶解し、約−５０℃〜約−７０℃に予備冷却する。極性非プロトン性溶媒はジクロロメタンである。他の実施形態において、極性非プロトン性溶媒中に化合物３を含有する残留物を、約−６０℃〜約−６５℃に予備冷却する。アセトアルデヒド（ＣＨ３ＣＨＯ）を添加する。極性非プロトン性溶媒と三フッ化ホウ素（ＢＦ３）溶媒和複合体を別々の反応器に投入し、その後、約−５０℃〜約−７０℃に冷却する。他の実施形態において、極性非プロトン性溶媒はジクロロメタンである。他の実施形態において、三フッ化ホウ素溶媒和複合体は、三フッ化ホウ素アセトニトリル複合体である。ＢＦ３溶液の温度は約−６０℃〜約−６５℃である。化合物３およびアセトアルデヒドを含有する溶液を、ＢＦ３溶液に約−６０℃〜約−６５℃で添加する。他の実施形態において、化合物３およびアセトアルデヒドを含有する溶液は乾燥している。一実施形態において、反応混合物を約−６０℃〜約−６５℃で約２時間撹拌し、約２３℃〜約２８℃にまで加熱し、さらに約２時間撹拌し、加水分解／後処理のために約２℃〜約１０℃にまで冷却する。一実施形態において、添加および撹拌の合計時間は約４時間である。一実施形態において、後処理のために、反応器からの冷却された溶液を、予め冷却した塩基性水溶液に添加する。他の実施形態において、塩基性水溶液は約５０重量％の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ；苛性ソーダ）である。一実施形態において、相を分離し、（下）有機層を別の反応器に移す。一実施形態において、溶媒を可能な限り５０℃以下（ＮＭＴ）で蒸留することによって有機層から除去する。一実施形態において、残留物は、３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４）と、いくらか残りのアセトニトリルおよびジクロロメタンを含む。工程４はＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４Ａ）を形成し得ると理解される。工程３の生成物は、工程４に直接使用される。
【００５７】
工程４
工程４は、３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４）をＮａＯＨと反応させてＥ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）を形成する工程である。一実施形態において、工程４に先立って、工程３からの残留物を約４５℃〜約６０℃に加熱して、残留量の溶媒を除去する。一実施形態において、温度は約４９℃〜約５５℃である。一実施形態において、３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４）をＮａＯＨと反応させるエステル加水分解反応は、メタノール、水、およびＮａＯＨ溶液中、約２０℃〜約２５℃で行われる。
【００５８】
一実施形態において、反応する３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４）を反応器に投入する。他の実施形態において、反応器は不活性、例えば、窒素雰囲気下またはアルゴン雰囲気下にある。５０℃ＮＭＴの温度で、残留量の溶媒を真空下で留去する。一実施形態において、残留物を約４５℃〜約６０℃にまで加熱する。他の実施形態において、残留物を約４９℃〜約５５℃にまで加熱する。他の実施形態において、工程３（化合物４）からの残留物を、メタノール、水および塩基性水溶液に溶解する。他の実施形態において、塩基性水溶液は約５０重量％の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ；苛性ソーダ）である。工程４のエステル加水分解反応は、約２０℃〜約６０℃で行い、加水分解反応が完了するまで撹拌する。一実施形態において、エステル加水分解は約２０℃〜約２５℃で行われる。反応混合物のｐＨが＞１２であるかを確認する。ｐＨが＜１２であるなら、追加のＮａＯＨを添加する。反応混合物を水で希釈し、温度を約２０℃〜約３５℃に調整する。他の態様において、反応混合物を水で希釈し、温度を約２５℃〜約３５℃に調節する。一実施形態において、後処理のために、相を分離し、下層の生成物に富む水層を別の反応器に移し、有機層を廃棄する。一実施形態において、生成物に富む水相のｐＨを酢酸エチルの存在下に酸水溶液で調節する。他の実施形態において、酸はクエン酸水溶液である。一実施形態において、相を分離し、上部の生成物に富む有機層を残し、下部の水層を廃棄する。一実施形態において、酢酸エチルを有機層から留去し、酢酸エチルに置き換える。一実施形態において、蒸留物の含水量が１％ＮＭＴになるまで、または一定の沸点に到達するまで、蒸留を繰り返す。一実施形態において、得られた生成物懸濁液を約１０℃〜約３０℃に冷却し、単離し、酢酸エチルで洗浄する。一実施形態において、得られた生成物を濾過（例えば、フィルターヌッチェ（ｆｉｌｔｅｒ  ｎｕｔｃｈｅ）、遠心分離など）によって単離する。他の実施形態において、化合物５を含有する得られた生成物懸濁液を約２０℃〜約２５℃に冷却する。一実施形態において、得られた生成物を真空下（例えば、コーンドライヤー、パドルドライヤー、トレイドライヤーなど）、約６０℃で乾燥させる。
【００５９】
一実施形態において、粗Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）をエタノールを使用して結晶化する。一実施形態において、エタノールおよび粗化合物５を反応器に投入する。他の実施形態において、反応器は不活性である。一実施形態において、粗化合物５を溶解するために、混合物を加熱還流する。一実施形態において、混合物を制御された冷却ランプで約１５℃〜約２０℃に冷却する。一実施形態において、結晶性化合物５を遠心分離機を用いて単離し、次いで、酢酸エチルで洗浄する。一実施形態において、結晶性化合物５を真空下（例えば、コーンドライヤー、パドルドライヤー、トレイドライヤーなど）、約６０℃で乾燥させる。試料を採取して、精製化合物５のアッセイ、純度、および水分を測定することができる。一実施形態において、精製化合物５は、３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸のＥ異性体およびＺ異性体の両方を含有する。一実施形態において、比Ｅ：Ｚは、約９９：１、約９８：２、約９５：５、約９０：１０、約８５：１５、約８０：２０、約７５：２５、約７０：３０、約６５：３５、約６０：４０、約５５：４５または約５０：５０である。精製化合物５の同定および特徴付けに関する詳細については実施例２を参照されたい。
【００６０】
工程４はまた、Ｅ／Ｚ異性体の混合物である化合物から出発して行うこともできる。例えば、工程４は、Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４Ａ）をＮａＯＨと反応させてＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）を形成する工程である。一実施形態において、工程４に先立って、工程３からの残留物を約４５℃〜約６０℃に加熱して、残留量の溶媒を除去する。一実施形態において、温度は約４９℃〜約５５℃である。一実施形態において、Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４Ａ）をＮａＯＨと反応させるエステル加水分解反応は、メタノール、水、およびＮａＯＨ溶液中、約２０℃〜約２５℃で行われる。一実施形態において、ＮａＯＨ溶液は５０重量％水溶液である。
【００６１】
一実施形態において、反応するＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４Ａ）を反応器に投入する。他の実施形態において、反応器は不活性、例えば、窒素雰囲気下またはアルゴン雰囲気下にある。５０℃ＮＭＴの温度で、残留量の溶媒を真空下で留去する。一実施形態において、残留物を約４５℃〜約６０℃にまで加熱する。一実施形態において、温度は約４９℃〜約５５℃である。一実施形態において、工程３からの残留物（化合物４Ａ）をメタノール、水および塩基性水溶液に溶解する。他の実施形態において、塩基性水溶液は約５０重量％の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ；苛性ソーダ）である。工程４のエステル加水分解反応は、約２０℃〜約６０℃で行い、加水分解反応が完了するまで撹拌する。一実施形態において、エステル加水分解は約２０℃〜約２５℃で行われる。反応混合物のｐＨが＞１２であるかを確認する。ｐＨが＜１２であるなら、追加のＮａＯＨを添加する。反応混合物を水で希釈し、温度を約２５℃〜約３５℃に調節する。一実施形態において、後処理のために、相を分離し、下層の生成物に富む水層を別の反応器に移し、有機層を廃棄する。一実施形態において、生成物に富む水相のｐＨを酢酸エチルの存在下に酸水溶液で調節する。他の実施形態において、酸はクエン酸水溶液である。一実施形態において、相を分離し、上部の生成物に富む有機層を残し、下部の水層を廃棄する。一実施形態において、酢酸エチルを有機層から留去し、酢酸エチルに置き換える。一実施形態において、蒸留物の含水量が１％ＮＭＴになるまで、または一定の沸点に到達するまで、蒸留を繰り返す。一実施形態において、得られた生成物懸濁液を約１０℃〜約３０℃に冷却し、単離し、酢酸エチルで洗浄する。一実施形態において、得られた生成物を濾過（例えば、フィルターヌッチェ（ｆｉｌｔｅｒ  ｎｕｔｃｈｅ）、遠心分離など）によって単離する。他の実施形態において、得られた、化合物５Ａを含有する生成物懸濁液を約２０℃〜約２５℃に冷却する。一実施形態において、得られた生成物を真空下（例えば、コーンドライヤー、パドルドライヤー、トレイドライヤーなど）、約６０℃で乾燥させる。化合物５Ａは、精製せずに工程５へ続けることができる。
【００６２】
一実施形態において、粗Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）をエタノールを使用して結晶化する。一実施形態において、エタノールおよび粗化合物５Ａを反応器に投入する。他の実施形態において、反応器は不活性である。一実施形態において、粗化合物５Ａを溶解するために、混合物を加熱還流する。一実施形態において、混合物を制御された冷却ランプで約１５℃〜約２０℃に冷却する。一実施形態において、結晶性化合物５Ａを遠心分離機を用いて単離し、次いで、酢酸エチルで洗浄する。一実施形態において、結晶性化合物５Ａを真空下（例えば、コーンドライヤー、パドルドライヤー、トレイドライヤーなど）、約６０℃で乾燥させる。一実施形態において、工程４の単離された結晶性生成物は化合物５である。
【００６３】
代替の工程４
化合物５は、代替の方法に従って調製することができる。一実施形態において、不活性反応器に化合物４を投入する。約５０℃（最高）で、溶媒（例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン）の残留量を真空下で留去することができる。残留物をメタノールに溶解し、冷却する。水および苛性ソーダ（５０重量％ＮａＯＨ）を添加する。一実施形態において、反応混合物を約２０℃〜約２５℃で約４時間撹拌する。溶液を水で希釈し、トルエンを添加する。撹拌後、相を分離し、下層の生成物に富む水層を不活性反応器に移す。有機層を廃棄する。生成物に富む水層のｐＨを、酢酸エチルの存在下、クエン酸水溶液で調節する。相を分離し、下層の水層を廃棄する。有機層を不活性反応器に移す。酢酸エチルを有機層から留去し、酢酸エチルに置き換える。一実施形態において、この操作を、蒸留物の含水量が１％以下になるまで、または一定の沸点に到達するまで繰り返す。得られた生成物懸濁液を約２０℃〜約２５℃に冷却し、化合物５を単離し、不活性遠心分離機中、酢酸エチルで洗浄する。真空下、約６０℃でタンブル乾燥機中で乾燥を行う。
【００６４】
この代替の工程４はまた、Ｅ／Ｚ異性体の混合物である化合物から出発して行うこともできる。一実施形態において、化合物４Ａを不活性反応器に投入する。約５０℃（最高）で、溶媒（例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン）の残留量を真空下で留去することができる。残留物をメタノールに溶解し、冷却する。水および苛性ソーダ（５０重量％、ＮａＯＨ）を添加する。一実施形態において、反応混合物を約２０℃〜約２５℃で約４時間撹拌する。溶液を水で希釈し、トルエンを添加する。撹拌後、相を分離し、下層の生成物に富む水層を不活性反応器に移す。有機層を廃棄する。生成物に富む水層のｐＨを、酢酸エチルの存在下、クエン酸水溶液で調節する。相を分離し、下の水層を廃棄する。生成物に富む有機層を不活性反応器に移す。酢酸エチルを有機層から留去し、酢酸エチルに置き換える。一実施形態において、この操作を、蒸留物の含水量が１％以下になるまで、または一定の沸点に到達するまで繰り返す。得られた生成物懸濁液を約２０℃〜約２５℃に冷却し、化合物５Ａを単離し、不活性遠心分離機中、酢酸エチルで洗浄する。真空下、約６０℃でタンブル乾燥機中で乾燥を行う。
【００６５】
工程５
工程５は、Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させてまず３α−ヒドロキシ−６β−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成し、これに塩基を介在させた異性化を行って３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）を形成する工程である。工程５は、１つの相（水素化および異性化を一緒に）または２つの別々の相（水素化に続いて異性化）で実施することができる。一実施形態において、工程５は、約９０℃〜約１１０℃の温度、および約０．５ｂａｒ〜約５ｂａｒの圧力で行われる。一実施形態において、後処理の間に、反応混合物の有機相を活性炭で処理する。一実施形態において、圧力は約０．５ｂａｒ〜約５．５ｂａｒである。他の実施形態において、圧力は約５ｂａｒである。他の実施形態において、水素化は、約０．５ｂａｒ〜約５．５ｂａｒの圧力、例えば、０．６ｂａｒ、０．７ｂａｒ、０．８ｂａｒ、０．９ｂａｒ、１．０ｂａｒ、１．２ｂａｒ、１．４ｂａｒ、１．６ｂａｒ、１．８ｂａｒ、２．０ｂａｒ、２．２ｂａｒ、２．４ｂａｒ、２．６ｂａｒ、２．８ｂａｒ、３．０ｂａｒ、３．２ｂａｒ、３．４ｂａｒ、３．６ｂａｒ、３．８ｂａｒ、４．０ｂａｒ、４．２ｂａｒ、４．４ｂａｒ、５．０ｂａｒ、５．２ｂａｒ、およびその間の任意の圧力で行われる。一実施形態において、水素化反応混合物を約１時間撹拌する。一実施形態において、Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスの存在下で約１００℃に加熱し、約２時間〜約５時間撹拌する。一実施形態において、Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスの存在下で約１００℃に加熱し、約３時間撹拌する。
【００６６】
一実施形態において、Ｐｄ／Ｃおよび水素ガスの存在下でのＥ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）は、塩基性溶液の存在下で行われる。一実施形態において、塩基性溶液は５０重量％の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ；苛性ソーダ）溶液を含有する水である。水素化反応後、反応混合物を約１００℃にまで加熱し（ベータ立体配置からアルファ立体配置へのＣ−６位の異性化を行うために）、次いで約４０℃〜約５０℃に冷却する。後処理のために、Ｐｄ／Ｃを濾別する。一実施形態において、濾液に酢酸ｎ−ブチルおよび酸を添加する。他の実施形態において、酸は塩酸（ＨＣｌ）である。水層を分離し、ｐＨ値を調べて酸性であることを確認した後、廃棄する。生成物に富む有機相を活性炭で処理する。一実施形態において、活性炭を濾別し、得られた生成物に富む濾液を蒸留によって濃縮し、得られた生成物懸濁液を約１０℃〜約３０℃に冷却する。他の実施形態において、生成物懸濁液を約１５℃〜約２０℃に冷却する。化合物６を含有する懸濁液を単離し、酢酸ｎ−ブチルで洗浄する。化合物６を加圧フィルターを用いて濾過する。一実施形態において、真空下、約８０℃で、加圧フィルター中で乾燥を行う。
【００６７】
工程５の一実施形態において、Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）、水、ＮａＯＨ溶液（例えば、５０重量％）、およびＰｄ／Ｃを、約５ｂａｒのＨ２ガスと約１００℃〜約１０５℃の温度で、Ｈ２の取り込みが終わるまで混合する。反応混合物を約４０℃〜約５０℃に冷却し、Ｐｄ／Ｃを濾別する。次いで、酢酸ｎ−ブチルおよびＨＣｌを、化合物６を含有する溶液に添加する。一実施形態において、水相を分離し、廃棄する。化合物６を含む有機相を活性炭で処理する。活性炭を濾別し、濾液を別の反応器に移し、そこで蒸留により濃縮し、次いで懸濁液を約５℃〜約２０℃に冷却する。一実施形態において、化合物６を濾過によって単離し、濾液を、真空下、約８０℃で、加圧フィルター上で乾燥させる。
【００６８】
工程５はまた、Ｅ／Ｚ異性体の混合物である化合物から出発して行うこともできる。例えば、工程５は、Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させ加熱して３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）を形成する工程である。工程５は、１つの相（水素化および異性化を一緒に）または２つの別々の相（水素化に続いて異性化）で実施することができる。一態様では、工程５は、約９０℃〜約１１０℃の温度、および約４ｂａｒ〜約５ｂａｒの圧力で行われる。一実施形態において、後処理の間に、反応混合物の有機相を活性炭で処理する。一実施形態において、圧力は約４．５ｂａｒ〜約５．５ｂａｒである。他の実施形態において、圧力は約５ｂａｒである。一実施形態において、水素化反応混合物を約１時間撹拌する。一実施形態において、Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）のＰｄ／Ｃおよび水素ガスとの反応は、約１００℃に加熱され、約２時間〜約５時間撹拌される。一実施形態において、Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）のＰｄ／Ｃおよび水素ガスとの反応は、約１００℃に加熱され、約３時間撹拌される。
【００６９】
一実施形態において、Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）のＰｄ／Ｃおよび水素ガスとの反応は、塩基性溶液の存在下で行われる。一実施形態において、塩基性溶液は、水および約５０重量％の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ；苛性ソーダ）溶液である。水素化反応後、反応混合物を約１００℃にまで加熱し（ベータ立体配置からアルファ立体配置へのＣ−６位の異性化を行うために）、次いで約４０℃〜約５０℃に冷却する。後処理のために、Ｐｄ／Ｃを濾別する。一実施形態において、濾液に酢酸ｎ−ブチルおよび酸を添加する。他の実施形態において、酸は塩酸（ＨＣｌ）である。水層を分離し、ｐＨ値を調べて酸性であることを確認した後、廃棄する。生成物に富む有機相を活性炭で処理する。一実施形態において、活性炭を濾別し、得られた生成物に富む濾液を蒸留によって濃縮し、得られた生成物懸濁液を約１０℃〜約３０℃に冷却する。他の実施形態において、生成物懸濁液を約１５℃〜約２０℃に冷却する。化合物６を含有する懸濁液を単離し、酢酸ｎ−ブチルで洗浄する。化合物６を加圧フィルターを用いて濾過する。一実施形態において、真空下、約８０℃で、加圧フィルター中で乾燥を行う。
【００７０】
工程５の一実施形態において、Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）、水、ＮａＯＨ溶液（例えば、５０重量％）、およびＰｄ／Ｃを、約５ｂａｒのＨ２ガスと約１００℃〜約１０５℃の温度で、Ｈ２の取り込みが終わるまで混合する。反応混合物を約４０℃〜約５０℃に冷却し、Ｐｄ／Ｃを濾別する。酢酸ｎ−ブチルおよびＨＣｌを、化合物６を含有する溶液に添加する。一実施形態において、水相を分離し、廃棄する。生成物に富む有機相を活性炭で処理する。活性炭を濾別し、濾液を別の反応器に移し、そこで蒸留により濃縮し、次いで生成物懸濁液を約５℃〜約２０℃に冷却する。一実施形態において、化合物６を濾過によって単離し、濾液を、真空下、約８０℃で、加圧フィルター上で乾燥させる。
【００７１】
他の実施形態において、化合物６を調製するための上記の水素化／異性化反応は、２相（化合物５または化合物５Ａから出発）で行われる。まず、水素化を約４〜５ｂａｒ、約２０℃〜約４０℃で行い、次に、反応混合物を約９５℃〜約１０５℃に加熱する。反応混合物を加熱すると、６位のエチル基が、最初に形成された６ベータ立体配置から所望の６アルファ立体配置に異性化される。反応混合物は、異性化が完了するまで加熱する。
【００７２】
工程６
工程６は３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）をＮａＢＨ４と反応させて結晶性オベチコール酸を形成する工程である。一実施形態において、工程６は、塩基性水溶液中、約８５℃〜約１１０℃の温度で実施される。一実施形態において、温度は約９０℃〜約９５℃である。一実施形態において、塩基性溶液はＮａＯＨ水溶液である。一実施形態において、塩基性溶液は、５０重量％のＮａＯＨ溶液と水との混合物である。一実施形態において、化合物６およびＮａＢＨ４の反応混合物を約３時間〜約５時間撹拌した。他の実施形態において、反応混合物を約４時間撹拌した。
【００７３】
後処理のために、反応が完了した後、混合物を約８０℃に冷却し、冷却された反応器に移す。一実施形態において、約２０℃〜約６０℃で、酢酸ｎ−ブチルおよび酸を添加する。一実施形態において、温度は約４０℃〜約４５℃である。他の実施形態において、酸はクエン酸である。水層を分離し、ｐＨ値を調べて酸性であることを確認した後、廃棄する。生成物に富む有機相を蒸留により濃縮する。一実施形態において、酢酸ｎ−ブチルを残留物に加え、再び留去する。一実施形態において、酢酸ｎ−ブチルを残留物に再び加え、次いで、ゆっくりと冷却する。他の実施形態において、残留物に約５０℃で種を入れる。他の実施形態において、結晶化が起こった後、混合物を５２℃に加熱し、その後、約１５℃〜約２０℃にゆっくりと冷却する。他の実施形態において、残留物を１５℃〜約２０℃に冷却する。一実施形態において、得られたオベチコール酸を酢酸ｎ−ブチルで洗浄する。一実施形態において、オベチコール酸を単離し、酢酸ｎ−ブチルで洗浄する（例えば、加圧フィルター中で）。他の実施形態において、加圧フィルターは不活性である。結晶性生成物が真空下、約６０℃で乾燥され、２θが約５．０度および約５．３度に特徴的なピークを含む、図４１に示したものと実質的に類似したＸ線回折パターンによって特徴付けられる形態Ａと同定される。一実施形態において、生成される結晶性オベチコール酸は有機溶媒（例えば、ヘプタン）から単離され、２θが約５．０度および約５．３度に特徴的なピークを含むＸ線回折パターンによって特徴付けられる。一実施形態において、結晶性オベチコール酸形態Ａは、図４１に示したものと実質的に類似したＸ線回折パターンによって特徴付けられる。結晶性オベチコール酸形態Ａの同定および特徴付けに関する詳細については実施例３を参照されたい。
【００７４】
工程７
工程７は、結晶性オベチコール酸形態Ａをオベチコール酸形態１に変換する工程である。一実施形態において、工程７は、結晶性オベチコール酸形態ＡをＮａＯＨ水溶液に溶解し、ＨＣｌを添加する工程を含む。
【００７５】
一実施形態において、結晶性オベチコール酸を水および苛性ソーダ溶液（５０重量％）に約２０℃〜約５０℃で溶解する。一実施形態において、温度は３０℃〜約４０℃である。一実施形態において、結晶性オベチコール酸は形態Ａである。一実施形態において、得られる結晶性オベチコール酸形態Ａの溶液を約２０℃〜約５０℃で希釈酸に添加する。他の実施形態において、温度は約３０℃〜約４０℃である。他の実施形態において、酸は塩酸（例えば、３７％）である。一実施形態において、３７％塩酸溶液を水で約１体積％未満に希釈する。一実施形態において、３７％塩酸溶液を水で約０．７体積％に希釈する。一実施形態において、生成物の希釈酸懸濁液を、約２０℃〜約５０℃で約３０分間撹拌する。他の実施形態において、温度は約３０℃〜約４０℃である。一実施形態において、オベチコール酸形態１を単離し、約２０℃ＮＭＴの水で（例えば、加圧フィルター中で）洗浄する。一実施形態において、オベチコール酸形態１オベチコール酸形態１を単離し、約２０℃ＮＭＴの水で（例えば、加圧フィルター中で）洗浄する。他の実施形態において、加圧フィルターは不活性である。生成物を、真空下、約５０℃ＮＭＴの温度で、加圧フィルターで乾燥させる。
【００７６】
本願の方法は、オベチコール酸形態１の調製において結晶性中間体を利用するが、これは、予期しなかったことに、最終生成物の調製全体および純度において有意な改善をもたらした。特に、合成の工程６は新規な結晶形態のオベチコール酸を生成する。この結晶形態の生成は、実質的に純粋なオベチコール酸形態１をもたらす。
【００７７】
本願の方法は、従来技術で開示された方法を改善するものである。オベチコール酸の調製は、米国特許出願公開第２００９／００６２５２６Ａ１号明細書（本明細書では「‘５２６刊行物」と呼ぶ）、米国特許第７，１３８，３９０号明細書（本明細書では「‘３９０特許」と呼ぶ）、および国際公開第２００６／１２２９７７号パンフレット（本明細書では「‘９７７出願」と呼ぶ）に開示されている。
【００７８】
‘３９０特許におけるオベチコール酸の調製方法（本明細書では「‘３９０方法」と呼ぶ）を、スキーム３（Ｒはエチル基である）に示す：
【化５】
2018538331.tif 000007
【００７９】
この方法は数工程を含むが、一連の欠点を提示する。全ての工程で、反応生成物がクロマトグラフィーカラム、すなわち、工業規模では使用することができない非常に高価な分離方法で精製される。さらに、工程２における反応収率は非常に低く（１２〜１３％）、全体的な収率はかなり低下し、それは３．５％より低い。この方法はまた、発癌剤として知られるヘキサメチレンホスホンアミドを反応体として使用する。
【００８０】
‘９７７出願におけるオベチコール酸の調製方法をスキーム４に示す。
【化６】
2018538331.tif 000008
【００８１】
オベチコール酸を調製するための‘９７７方法は、１つの精製工程（工程７）と、それに続く２つのさらなる精製工程とを含む８工程の合成プロセスである。‘９７７方法と本願の方法との間には、かなりの数の相違がある。以下の表Ａは、２つの方法間の相違点の少なくともいくつかを記載する：
【００８２】
【表１】
2018538331.tif 000009
【００８３】
‘９７７方法と比較した本願の方法における差異は、規模拡大の最適化、安全性、ならびに純度および方法全体の改善に関連する改善など、本方法に顕著な改善をもたらす。本願の方法によって製造されるオベチコール酸の純度は、実質的に純粋である。特に、本願の方法によって製造されるオベチコール酸は、‘３９０方法および‘９７７方法を含む従来技術の方法によって製造されるオベチコール酸よりも実質的に純粋である。例えば、本願の方法によって製造されたオベチコール酸と‘９７７方法によって製造されたオベチコール酸の分析証明書に示された結果の比較を、以下の表Ｂに示す。不純物のパーセンテージは、ＨＰＬＣ法を用いて測定した。
【００８４】
【表２】
2018538331.tif 000010
【００８５】
合成中間体としての結晶性オベチコール酸
オベチコール酸は、現在、非結晶性固体としての医薬品有効成分として開発されている。オベチコール酸の開発を促進するために、初期結晶化および多形性研究を行って、結晶形態が入手可能であるか否か、そしてもし入手可能であるなら、それらが開発に好適であるか否かを決定した。種々の溶媒中での材料の挙動をより良く理解するように設計された予備溶解度スクリーニングの後、その材料にはゲルを形成する傾向があり、おそらく結晶化可能であると思われた。次いで、広範な多形体スクリーニングを実施し、材料を広範囲の溶媒および結晶化条件に曝露して、可能な限り多くの関連する多形体を同定し、特徴を明らかにした。このスクリーニングにおいて、５つの異なる固体形態が見出された。
【００８６】
オベチコール酸の３つの形態（Ａ、ＣおよびＤ）は、０．２５モル当量の水および様々な量の広範な有機溶媒を含む混合水和物／溶媒和物であった。加熱すると、これらの固体は結晶性および溶媒を同時に失い、残念ながら、これらの溶媒和形態はそれらの低い融解温度および高い溶媒含有量のために、医薬成分としてのさらなる開発には適さなかった。また、このタイプに類似した「不適切な」形態が存在することにも留意されたい。例えば、低融点溶媒和形態、ならびにＳＣＸＲＤ（単結晶Ｘ線回折）によって一水和物／アニソール溶媒和物であることが示された別の形態の単結晶が、後の実験で見出された。
【００８７】
残りの２つの形態は融解温度がより高く、潜在的により有望であったが、それらのうちの１つ（形態Ｇ）は大規模では再現することができず、多くの試みにもかかわらず繰り返すことができなかった。この形態を単独で製造することが困難であるため、開発には不適当である。残りの非溶媒和形態Ｆは再現可能な方法で調製されたが、多くの再結晶手順、および有毒な溶媒であって、アミン、アルカリ、強酸、または高温もしくは断熱圧縮によって増感された場合、爆発することがあるニトロメタンの使用を必要とした。ニトロメタンの残留レベルに関する懸念により、形態Ｆもまた開発に適さないと判断した。結晶性オベチコール酸形態Ｉもまた同定された。
【００８８】
初期結晶化および多形体研究の全体的な結果により、材料は様々な形態の結晶性材料を形成し得るが、結晶性材料または形態はどれも開発に適切であるとは考えられないことが明らかになった。
【００８９】
本願の方法の最後から２番目の工程の中間体として結晶性オベチコール酸を製造することの重要性が発見されたのはずっと後のことであった。結晶性オベチコール酸は、本願の方法を用いて大規模で容易に単離することができた。この結晶性オベチコール酸は、初期の結晶化および多形体研究からの形態Ａと一致すると決定された。本願の方法の工程７において合成中間体として製造される形成、単離の容易さ、および高い純度の結晶性オベチコール酸は、実際、実質的に純粋なオベチコール酸の調製に重要である。
【００９０】
一実施形態において、本発明は、２θが約５．０度および約５．３度に特徴的なピークを含むＸ線回折パターンによって特徴付けられる結晶性オベチコール酸形態Ａに関する。一実施形態において、Ｘ線回折パターンは、２θが約５．０度、約５．３度および約７．７度に特徴的なピークを含む。一実施形態において、Ｘ線回折パターンは、２θが約５．０度、約５．３度、約７．７度および約１０．０度に特徴的なピークを含む。一実施形態において、Ｘ線回折パターンは、２θが約５．０度、約５．３度、約７．７度、約１０．０度および約１１．０度に特徴的なピークを含む。一実施形態において、Ｘ線回折パターンは、２θが約５．０度、約５．３度、約７．７度、約１０．０度、約１１．０度および約１２．４度に特徴的なピークを含む。一実施形態において、Ｘ線回折パターンは、２θが約５．０度、約５．３度、約７．７度、約１０．０度、約１１．０度、約１２．４度および約１４．９度に特徴的なピークを含む。一実施形態において、本発明は、図４１に示したものと実質的に類似したＸ線回折パターンによって特徴付けられる結晶性オベチコール酸形態Ａに関する。一実施形態において、Ｘ線回折パターンは、ＣｕＫα線を用いる回折計（４０ｋＶ、４０ｍＡ）で集められる。
【００９１】
一実施形態において、本発明は、結晶性オベチコール酸であって、前記結晶性オベチコール酸は形態Ａであり、かつ約９０％超の純度を有するオベチコール酸に関する。一実施形態において、前記結晶性オベチコール酸形態Ａの純度は、ＨＰＬＣによって測定される。一実施形態において、本発明は、結晶性オベチコール酸形態Ａ、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和物もしくはアミノ酸抱合体に関する。一実施形態において、溶媒和物はｎ−ブチル溶媒和物である。一実施形態において、純度は約９２％超である。一実施形態において、純度は約９４％超である。一実施形態において、純度は約９６％超である。一実施形態において、純度は約９８％超である。一実施形態において、純度は約９９％超である。
【００９２】
一実施形態において、本発明は、結晶性オベチコール酸であって、前記結晶性オベチコール酸は形態Ａであり、かつ約９０％超の力価を有するオベチコール酸に関する。一実施形態において、前記結晶性オベチコール酸形態Ａの純度は、ＨＰＬＣおよび／または当該技術分野で知られる他の分析手順によって決定される。一実施形態において、本発明は、結晶性オベチコール酸形態Ａ、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和物もしくはアミノ酸抱合体に関する。一実施形態において、溶媒和物は水和物である。一実施形態において、力価は約９２％超である。一実施形態において、力価は約９４％超である。一実施形態において、力価は約９６％超である。一実施形態において、力価は約９８超である。一実施形態において、力価は約９９％超である。
【００９３】
一実施形態において、本発明は、６−エチルウルソデオキシコール酸、３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸、６β−エチルケノデオキシコール酸、３α，７α−ジヒドロキシ−６−エチリデン−５β−コラン−２４−酸、ケノデオキシコール酸、および３α（３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイルオキシ）−７α−ヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸から選択される１種以上の不純物を合計で約４％未満含有する結晶性オベチコール酸形態Ａに関する。一実施形態において、不純物の合計は約３．８％未満である。一実施形態において、不純物の合計は約３．６％未満である。
【００９４】
一実施形態において、本発明は、２θが約４．２度、約６．４度、約９．５度、約１２．５度および約１６．７度に特徴的なピークを含むＸ線回折パターンによって特徴付けられる結晶性オベチコール酸形態Ｃに関する。一実施形態において、Ｘ線回折パターンは、２θが約４．２度、約６．４度、約９．５度、約１２．５度、約１２．６度、約１５．５度、約１５．８度、約１６．０度、約１６．７度および約１９．０度に特徴的なピークを含む。一実施形態において、Ｘ線回折パターンは、２θが約４．２度、約６．４度、約８．３度、約９．５度、約１１．１度、約１２．２度、約１２．５度、約１２．６度、約１５．５度、約１５．８度、約１６．０度、約１６．３度、約１６．７度、約１８．６度および約１９．０度に特徴的なピークを含む。一実施形態において、Ｘ線回折パターンは、２θが約４．２度、約６．４度、約８．３度、約９．５度、約１１．１度、約１２．２度、約１２．５度、約１２．６度、約１５．５度、約１５．８度、約１６．０度、約１６．３度、約１６．７度、約１７．０度、約１７．８度、約１８．６度、約１８．８度、約１９．０度、約２０．５度および約２０．９度に特徴的なピークを含む。一実施形態において、本発明は、図５に示したものと実質的に類似したＸ線回折パターンによって特徴付けられる結晶性オベチコール酸形態Ｃに関する。一実施形態において、Ｘ線回折パターンは、ＣｕＫα線を用いる回折計（４０ｋＶ、４０ｍＡ）で集められる。一実施形態において、Ｘ線回折パターンは、約１２．０〜約１２．８および約１５．４〜約２１．０に特徴的なピークを含む。
【００９５】
一実施形態において、本発明は、Ｍｅｔｔｌｅｒ  ＤＳＣ  ８２３ｅ装置による測定で、約９８±２℃に吸熱値を有する示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムにより特徴付けられる結晶性オベチコール酸形態Ｃに関する。一実施形態において、Ｍｅｔｔｌｅｒ  ＤＳＣ  ８２３ｅ装置により測定される示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムは約９８±２℃に吸熱値を有する。
【００９６】
一実施形態において、本発明は、結晶性オベチコール酸であって、前記結晶性オベチコール酸は形態Ｃであり、かつ約９０％超の純度を有する結晶性オベチコール酸に関する。一実施形態において、前記結晶性オベチコール酸形態Ｃの純度は、ＨＰＬＣによって決定される。一実施形態において、本発明は、結晶性オベチコール酸形態Ｃ、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和物もしくはアミノ酸抱合体に関する。一実施形態において、溶媒和物は水和物である。一実施形態において、純度は約９２％超である。一実施形態において、純度は約９４％超である。一実施形態において、純度は約９６％超である。一実施形態において、純度は約９８％超である。一実施形態において、純度は約９９％超である。
【００９７】
一実施形態において、本発明は、結晶性オベチコール酸であって、前記結晶性オベチコール酸は形態Ｃであり、かつ約９０％超の力価を有する結晶性オベチコール酸に関する。
一実施形態において、前記結晶性オベチコール酸形態Ｃの純度は、ＨＰＬＣおよび／または当該技術分野で知られる他の分析手順によって決定される。一実施形態において、本発明は、結晶性オベチコール酸形態Ｃ、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和物もしくはアミノ酸抱合体に関する。一実施形態において、
溶媒和物は水和物である。一実施形態において、力価は約９２％超である。一実施形態において、力価は約９４％超である。一実施形態において、力価は約９６％超である。一実施形態において、力価は約９８％超である。一実施形態において、力価は約９９％超である。
【００９８】
一実施形態において、本発明は、６−エチルウルソデオキシコール酸、３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸、６β−エチルケノデオキシコール酸、３α，７α−ジヒドロキシ−６−エチリデン−５β−コラン−２４−酸、ケノデオキシコール酸、および３α（３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイルオキシ）−７α−ヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸から選択される１種以上の不純物を合計で約４％未満含有する結晶性オベチコール酸形態Ｃに関する。一実施形態において、不純物の合計は約３．８％未満である。一実施形態において、不純物の合計は約３．６％未満である。
【００９９】
本願の実施例３は、これらの結晶形態のオベチコール酸の完全な特徴付けを提供する。
【０１００】
オベチコール酸の単結晶Ｘ線構造を得て、絶対立体化学を割り当てた。例えば、結晶性オベチコール酸形態Ｇの単結晶Ｘ線構造を、０．１℃／ｍｉｎで５℃に冷却し、続いてＲＴ／５０℃、８時間のサイクルで１週間行って熟成させた後のアセトニトリル溶液からオベチコール酸を再結晶させて得た結晶から決定した。
【０１０１】
構造は斜方晶系であり、空間群はＰ２１２１２１であり、非対称単位の中にオベチコール酸１分子を含有する。最終のＲ１［Ｉ＞２σ（Ｉ）］＝３．２２％である。フラックパラメータ＝−０．０１（１３）を用いて、以下に示すように分子の絶対立体化学を決定した。構造は無秩序であった。
【化７】
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【０１０２】
オベチコール酸形態１（非結晶性）対結晶性オベチコール酸形態Ｆのバイオアベイラビリティ研究を行った（実施例７）。研究の結果は、固体オベチコール酸の物理状態が、対象に経口投与したときの分子のバイオアベイラビリティに一定の役割を果たし得ること示している。固体オベチコール酸形態１（非結晶性）および結晶性形態Ｆの、経口投与後の血漿中動態および腸内吸収効率ならびに薬物動態を、当該技術分野で知られた方法により評価した。本発明の実施例８は、オベチコール酸の形態１または形態Ｆの投与後の、オベチコール酸血漿中濃度対時間、ｔｍａｘ、ＣｍａｘおよびＡＵＣのプロファイルを示す（図３７〜３８を参照）。結晶性形態Ｆは、オベチコール酸形態１（非結晶性）よりも高いバイオアベイラビリティを有する。血漿プロファイルは、形態Ｆがより効率的に吸収され（より高いＡＵＣ）、かつこの薬物が腸内の内容物中に最適に分布していることを反映して、動態もより安定していることを示している。
【０１０３】
オベチコール酸形態１（非結晶性）の水への溶解度は、形態Ｆのそれよりも僅かに高い。形態Ｆは、熱重量分析（ＴＧＡ）が試験した温度範囲で重量減少を全く示さなかったことから、安定であると思われる。
【０１０４】
実質的に純粋なオベチコール酸
本願は、実質的に純粋なオベチコール酸、および薬学的に許容されるその塩、溶媒和物またはアミノ酸抱合体を提供する。
【化８】
2018538331.tif 000012
薬学的に活性な成分のオベチコール酸に対する他の名称は、ＩＮＴ−７４７、３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸、６α−エチル−ケノデオキシコール酸、６−エチル−ＣＤＣＡ、６ＥＣＤＣＡ、およびコラン−２４−酸、６−エチル−３，７−ジヒドロキシ−，（３α，５β，６α，７α）−である。
【０１０５】
本願は、オベチコール酸形態１を含む組成物、および安全で、かつ大規模にオベチコール酸を生成する高純度オベチコール酸形態１の合成方法を提供する。一態様では、オベチコール酸形態１は、商業規模の方法で製造される。「商業規模の方法」という用語は、少なくとも約１００グラムの単一バッチとして実行される方法を指す。一態様では、本願の方法は、高収率（＞８０％）で、かつ少ない不純物で、オベチコール酸形態１を製造する。
【０１０６】
本明細書で使用する「純度」という用語は、ＨＰＬＣに基づくオベチコール酸の量を指す。純度は、化合物の「有機」純度に基づく。純度は、水、溶媒、金属、無機塩などのいかなる量の尺度も含まない。一態様では、オベチコール酸の純度は、ピーク下の面積を比較することによって、参照基準の純度と比較される。他の態様では、純度についての既知の基準は、オブチコール酸参照基準である。一態様では、オベチコール酸は、約９６％超の純度を有する。一態様では、オベチコール酸は、約９８％超の純度を有する。例えば、オベチコール酸形態１の純度は、９６．０％、９６．１％、９６．２％、９６．３％、９６．４％、９６．５％、９６．６％、９６．７％、９６．８％、９６．９％、９７．０％、９７．１％、９７．２％、９７．３％、９７．４％、９７．５％、９７．６％、９７．７％、９７．８％、９７．９％、９８．０％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％である。例えば、オベチコール酸形態１の純度は、９８．０％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％である。例えば、オベチコール酸の純度は、９８．０％、９８．５％、９９．０％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％である。例えば、オベチコール酸の純度は、９８．５％、９９．０％または９９．５％である。一実施形態において、オベチコール酸は、オベチコール酸形態１である。
【０１０７】
一実施形態において、本発明は、約９８％超の純度を有するオベチコール酸に関する。一実施形態において、純度はＨＰＬＣにより決定される。他の実施形態において、本発明は、オベチコール酸、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和物もしくはアミノ酸抱合体に関する。一実施形態において、純度は約９８．５％超である。一実施形態において、純度は約９９．０％超である。一実施形態において、純度は約９９．５％超である。一実施形態において、オベチコール酸は、オベチコール酸形態１である。
【０１０８】
本明細書で使用する「力価」という用語は、既知の基準（例えば、約９５％〜約１０２％の許容基準）の量に基づくオベチコール酸の量の尺度である。力価は、水、溶媒、有機不純物および無機不純物を含む全ての可能な不純物を考慮する。一態様では、既知の基準はオベチコール酸である。一態様では、オベチコール酸は、約９６％超の力価を有する。一態様では、オベチコール酸は、約９８％超の力価を有する。一態様では、既知の基準はオベチコール酸である。他の態様では、力価は、１００％から、水、硫酸塩灰分、残留溶媒、ならびに他の不純物内容物、例えば６−エチルウルソデオキシコール酸、３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸、６β−エチルケノデオキシコール酸、３α，７α−ジヒドロキシ−６−エチリデン−５β−コラン−２４−酸、ケノデオキシコール酸、および３α（３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイルオキシ）−７α−ヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸の量を差し引いたものである。他の実施形態において、力価は、水、溶媒、金属、無機塩、および他の無機または有機不純物による不純物を説明する。例えば、オベチコール酸形態１の力価は、９６．０％、９６．１％、９６．２％、９６．３％、９６．４％、９６．５％、９６．６％、９６．７％、９６．８％、９６．９％、９７．０％、９７．１％、９７．２％、９７．３％、９７．４％、９７．５％、９７．６％、９７．７％、９７．８％、９７．９％、９８．０％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％である。一態様では、オベチコール酸形態１の力価は、９８．０％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％である。例えば、オベチコール酸の力価は、９８．０％、９８．５％、９９．０％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％である。例えば、オベチコール酸の力価は、９８．５％、９９．０％または９９．５％である。一実施形態において、オベチコール酸は、オベチコール酸形態１である。
【０１０９】
一実施形態において、本発明は、６−エチルウルソデオキシコール酸、３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸、６β−エチルケノデオキシコール酸、３α，７α−ジヒドロキシ−６−エチリデン−５β−コラン−２４−酸、ケノデオキシコール酸、および３α（３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイルオキシ）−７α−ヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸から選択される１種以上の不純物を合計で約２％未満含有するオベチコール酸に関する。一実施形態において、不純物の合計は約１．５％未満である。一実施形態において、不純物の合計は約１．４％未満である。一実施形態において、オベチコール酸は、オベチコール酸形態１である。
【０１１０】
一実施形態において、オベチコール酸は、約１０％未満の水、約９％未満の水、約８％未満の水、約７％未満の水、約６％未満の水、約５％未満の水、約４％未満の水、約３％未満の水、約２％未満の水または約１％未満の水を含有する。一実施形態において、オベチコール酸は約１．２％未満の水を含有する。一実施形態において、オベチコール酸は約１．０％未満の水を含有する。一実施形態において、オベチコール酸は、オベチコール酸形態１である。
【０１１１】
他の実施形態において、オベチコール酸は、６−エチルウルソデオキシコール酸および３α，７α−ジヒドロキシ−６−エチリデン−５β−コラン−２４−酸を０．１５％以下（ＮＭＴ）含有する。他の実施形態において、オベチコール酸は、６−エチルウルソデオキシコール酸および３α，７α−ジヒドロキシ−６−エチリデン−５β−コラン−２４−酸を合計で約０．０７％未満含有する。一実施形態において、オベチコール酸は、６−エチルウルソデオキシコール酸および３α，７α−ジヒドロキシ−６−エチリデン−５β−コラン−２４−酸を合計で約０．０６％未満含有する。一実施形態において、オベチコール酸は、６−エチルウルソデオキシコール酸および３α，７α−ジヒドロキシ−６−エチリデン−５β−コラン−２４−酸を合計で約０．０５％未満含有する。一実施形態において、オベチコール酸は、オベチコール酸形態１である。
【０１１２】
一実施形態において、オベチコール酸は、０．１５％以下（ＮＭＴ）の３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を含有する。一実施形態において、オベチコール酸は、約０．０７％未満の３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を含有する。一実施形態において、オベチコール酸は、約０．０６％未満の３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を含有する。一実施形態において、オベチコール酸は、約０．０５％未満の３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を含有する。一実施形態において、オベチコール酸は、オベチコール酸形態１である。
【０１１３】
一実施形態において、オベチコール酸は、０．１５％以下（ＮＭＴ）の６β−エチルケノデオキシコール酸を含有する。一実施形態において、オベチコール酸は、約０．０７％未満の６β−エチルケノデオキシコール酸を含有する。一実施形態において、オベチコール酸は、約０．０６％未満の６β−エチルケノデオキシコール酸を含有する。一実施形態において、オベチコール酸は、約０．０５％未満の６β−エチルケノデオキシコール酸を含有する。一実施形態において、オベチコール酸は、オベチコール酸形態１である。
【０１１４】
一実施形態において、オベチコール酸は、３％以下（ＮＭＴ）のケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）を含有する。一実施形態において、オベチコール酸は、約１％未満のＣＤＣＡを含有する。一実施形態において、オベチコール酸は、約０．５％未満のＣＤＣＡを含有する。一実施形態において、オベチコール酸は、約０．３％未満のＣＤＣＡを含有する。一実施形態において、オベチコール酸は、約０．２％未満のＣＤＣＡを含有する。一実施形態において、オベチコール酸は、オベチコール酸形態１である。
【０１１５】
一実施形態において、オベチコール酸は、ＣＤＣＡおよび６−エチルウルソデオキシコール酸を４％以下（ＮＭＴ）含有する。
【０１１６】
一実施形態において、オベチコール酸は、１．５％以下（ＮＭＴ）の３α（３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイルオキシ）−７α−ヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸を含有する。一実施形態において、オベチコール酸は、約１％未満の３α（３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイルオキシ）−７α−ヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸を含有する。一実施形態において、オベチコール酸は、約０．０７％未満の３α（３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイルオキシ）−７α−ヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸を含有する。一実施形態において、オベチコール酸は、約０．０６％未満の３α（３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイルオキシ）−７α−ヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸を含有する。一実施形態において、オベチコール酸は、約０．０５％未満の３α（３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイルオキシ）−７α−ヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸を含有する。一実施形態において、オベチコール酸は、オベチコール酸形態１である。
【０１１７】
経口製剤および投与
オベチコール酸は経口投与用である。一実施形態において、本製剤は、ＦＸＲ介在性疾患および病態の予防および治療のための経口投与である。一実施形態において、本製剤はオベチコール酸形態１を含む。他の実施形態において、本製剤は実質的に純粋なオベチコール酸を含む。
【０１１８】
経口投与に適切な製剤は、それぞれ所定量のオベチコール酸を含有する、錠剤、カプセル、カシェー（薬物を与えるために薬剤師により使用されるウェハカプセル）、トローチ剤などの個別の単位として；粉剤もしくは顆粒剤として；水性または非水性の液剤または懸濁剤として；または水中油もしくは油中水エマルションとして提供され得る。
【０１１９】
本発明の製剤は、任意の好適な方法によって、一般的には、オベチコール酸を、液体もしくは微粉化固体担体またはその両方と、必要な割合で均一かつ均質に混合し、次いで必要に応じて、得られた混合物を所望の形状に成形することによって、調製することができる。
【０１２０】
例えば、錠剤は、粉末または顆粒のオベチコール酸と、１種以上の任意選択の成分、例えば、結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤もしくは界面活性分散剤などとを含む均質混合物を圧縮することによって、または粉末化した活性成分と不活性液体希釈剤との均質混合物を成型することによって、調製することができる。
【０１２１】
例えば、対象の体重、例えば約３０ｋｇ〜約７０ｋｇのヒト、に基づき目標用量レベルに到達するために、１錠以上の錠剤を投与し得る。
【０１２２】
一実施形態において、対象は小児であり、製剤は胆道閉鎖を治療するために使用される。「肝外性胆管減少症」および「進行性閉塞性胆管症」としても知られる胆道閉鎖は先天性または後天性の肝疾患であり、移植された肝臓同種移植片の慢性拒絶の主要な形態の１つである。先天性型では、肝臓と小腸の間の総胆管が閉塞しているか、または存在しない。後天性型は自己免疫疾患の状況において最も頻繁に起こり、移植された肝臓同種移植片の慢性拒絶の主要な形態の１つである。
【０１２３】
胆道閉鎖症の乳児および小児は、進行性胆汁うっ滞を呈し、次のような通常付随する全ての特徴を持つ：黄疸、掻痒、成長遅延を伴う吸収不良、脂溶性ビタミン欠乏症、高脂血症、および最終的には門脈圧亢進を伴う肝硬変。認識されなければ、肝臓は依然としてビリルビンを抱合することができ、抱合したビリルビンは血液脳関門を通過することができないので、この病態は肝不全をもたらす（しかし、核黄疸は引き起こさない）。この病態の原因は不明である。唯一有効な治療法は、葛西手術または肝移植などの特定の手術である。
【０１２４】
一実施形態において、ヒト小児は葛西手術を受けており、出生時に胆管がないか、または出生時に完全に遮断されている場合、葛西手術によってそれらに効果的に胆管機能がもたらされる。
【０１２５】
上記で具体的に述べた成分に加えて、本発明の経口製剤は、問題にしている製剤のタイプに配慮した上で、薬学分野の当業者に知られている他の薬剤を含んでもよい。好適には、経口製剤は香味剤を含み得る。
【０１２６】
一実施形態において、本発明は、オベチコール酸、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和物もしくはアミノ酸抱合体の医薬製剤に関し、ここで、オベチコール酸は本発明の方法によって製造される（オベチコール酸形態１）。他の実施形態において、本製剤は経口投与される。
【０１２７】
一実施形態において、本製剤は錠剤の形態である。他の実施形態において、本製剤は、オベチコール酸、および微結晶セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、コーティング材料またはコロイド状二酸化ケイ素から選択される１種以上の成分を含む。一実施形態において、コーティング材料は、Ｏｐａｄｒｙ（登録商標）コーティング材料である。
【０１２８】
他の実施形態において、本製剤は、１錠当たり約０．１ｍｇ〜約１５００ｍｇのオベチコール酸を含む。他の実施形態において、本製剤は、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ含む。他の実施形態において、本製剤は、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ含む。他の実施形態において、本製剤は、約１ｍｇ〜約３０ｍｇ含む。他の実施形態において、本製剤は、約４ｍｇ〜約２６ｍｇ含む。他の実施形態において、本製剤は、約５ｍｇ〜約２５ｍｇ含む。一実施形態において、本製剤は、約１ｍｇ〜約２ｍｇ含む。一実施形態において、本製剤は、約１．２ｍｇ〜約１．８ｍｇ含む。一実施形態において、本製剤は、約１．３ｍｇ〜約１．７ｍｇ含む。一実施形態において、本製剤は、約１．５ｍｇ含む。
【０１２９】
一実施形態において、本製剤は、１錠当たり約１ｍｇ〜約２５ｍｇのオベチコール酸を含む。一実施形態において、本製剤は、約１ｍｇのオベチコール酸、約１８０〜約１９０ｍｇの微結晶セルロース、約１０〜約１５ｍｇのデンプングリコール酸ナトリウム、約１〜約３ｍｇのステアリン酸マグネシウム、および約５ｍｇ〜約１０ｍｇのコーティング材料を含む。一実施形態において、コーティング材料は、Ｏｐａｄｒｙ（登録商標）コーティング材料である。
【０１３０】
一実施形態において、本製剤は、１錠当たり約１ｍｇ〜約２５ｍｇのオベチコール酸を含む。一実施形態において、本製剤は、約１ｍｇのオベチコール酸、約１８５．０ｍｇの微結晶セルロース、約１２．０ｍｇのデンプングリコール酸ナトリウム、約２．０ｍｇのステアリン酸マグネシウム、および約８．０ｍｇのコーティング材料を含む。一実施形態において、コーティング材料は、Ｏｐａｄｒｙ（登録商標）コーティング材料である。
【０１３１】
一実施形態において、本製剤は、１錠当たり約１ｍｇ〜約２５ｍｇのオベチコール酸を含む。一実施形態において、本製剤は、約５ｍｇのオベチコール酸、約１７５〜約１９０ｍｇの微結晶セルロース、約１０〜約１５ｍｇのデンプングリコール酸ナトリウム、約１〜約３ｍｇのステアリン酸マグネシウム、および約５ｍｇ〜約１０ｍｇのコーティング材料を含む。一実施形態において、コーティング材料は、Ｏｐａｄｒｙ（登録商標）コーティング材料である。
【０１３２】
一実施形態において、本製剤は、１錠当たり約１ｍｇ〜約２５ｍｇのオベチコール酸を含む。一実施形態において、本製剤は、約５ｍｇのオベチコール酸、約１８１．０ｍｇの微結晶セルロース、約１２．０ｍｇのデンプングリコール酸ナトリウム、約２．０ｍｇのステアリン酸マグネシウム、および約８．０ｍｇのコーティング材料を含む。一実施形態において、コーティング材料は、Ｏｐａｄｒｙ（登録商標）コーティング材料である。
【０１３３】
一実施形態において、本製剤は、１錠当たり約１ｍｇ〜約２５ｍｇのオベチコール酸を含む。一実施形態において、本製剤は、約１０ｍｇのオベチコール酸、約１７０ｍｇ〜約１８０ｍｇの微結晶セルロース、約１０〜約１５ｍｇのデンプングリコール酸ナトリウム、約１ｍｇ〜約３ｍｇのステアリン酸マグネシウム、および約５ｍｇ〜約１０ｍｇのコーティング材料を含む。一実施形態において、コーティング材料はＯｐａｄｒｙ（登録商標）コーティング材料である。
【０１３４】
一実施形態において、本製剤は、１錠当たり約１ｍｇ〜約２５ｍｇのオベチコール酸を含む。一実施形態において、本製剤は、約１０ｍｇのオベチコール酸、約１７６．０ｍｇの微結晶セルロース、約１２．０ｍｇのデンプングリコール酸ナトリウム、約２．０のステアリン酸マグネシウム、および約８．０ｍｇのコーティング材料を含む。一実施形態において、コーティング材料は、Ｏｐａｄｒｙ（登録商標）コーティング材料である。
【０１３５】
一実施形態において、本製剤は、１錠当たり約１ｍｇ〜約２５ｍｇのオベチコール酸を含む。一実施形態において、本製剤は、約２５ｍｇのオベチコール酸、約１５０ｍｇ〜約１６０ｍｇの微結晶セルロース、約１０ｍｇ〜約１５ｍｇのデンプングリコール酸ナトリウム、約１ｍｇ〜約３ｍｇのステアリン酸マグネシウム、約５〜約１０ｍｇのコーティング材料、および約１〜１０ｍｇのコロイド状二酸化ケイ素を含む。一実施形態において、コーティング材料は、Ｏｐａｄｒｙ（登録商標）コーティング材料である。
【０１３６】
一実施形態において、本製剤は、１錠当たり約１ｍｇ〜約２５ｍｇのオベチコール酸を含む。一実施形態において、本製剤は、約２５ｍｇのオベチコール酸、約１５７．０ｍｇの微結晶セルロース、約１２．０ｍｇのデンプングリコール酸ナトリウム、約２．０ｍｇのステアリン酸マグネシウム、約８．０ｍｇのコーティング材料、および約４．０ｍｇのコロイド状二酸化ケイ素を含む。一実施形態において、コーティング材料は、Ｏｐａｄｒｙ（登録商標）コーティング材料である。
【０１３７】
本明細書で使用する全てのパーセンテージおよび比は、別段の指示がない限り、重量に基づく。パーセント二量体不純物は、一般的に分析的ＨＰＬＣにより定量される場合、面積パーセントに基づく。
【０１３８】
組成物が特定の成分を有する、含む、または含有すると記載される記載を通じて、組成物はまた、列挙した成分から実質的に構成される、または列挙した成分から構成されるとも考えられる。同様に、方法またはプロセスが、特定のプロセス工程を有する、含む、または含有すると記載される場合、プロセスはまた、列挙したプロセスから実質的に構成される、または列挙したプロセスから構成される。さらに、工程の順序、またはある一定の動作を行う順序が、本発明が操作可能である限り重要ではないことを理解すべきである。さらに、２つ以上の段階または動作を同時に行い得る。
【０１３９】
【表３】
2018538331.tif 000013
【０１４０】
一実施形態において、錠剤は黄色のＯｐａｄｒｙ（登録商標）を含む。他の実施形態において、錠剤は白色のＯｐａｄｒｙ（登録商標）を含む。他の実施形態において、錠剤は緑色のＯｐａｄｒｙ（登録商標）を含む。
【０１４１】
医薬組成物
オベチコール酸、例えば、オベチコール酸形態１、実質的に純粋な形態のオベチコール酸、および結晶性形態のオベチコール酸、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和物もしくはアミノ酸抱合体は、種々の医薬目的に有用である。オベチコール酸は、ＦＸＲ介在性疾患および病態の予防または治療のための方法において使用され得る。一実施形態において、疾患または病態は、胆道閉鎖、胆汁うっ滞性肝疾患、慢性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、Ｃ型肝炎感染、アルコール性肝疾患、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、進行性の線維症による肝損傷、肝線維症、ならびにアテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、高コレステロール血症および高脂血症を含む心血管系疾患から選択される。一実施形態において、オベチコール酸形態１は、トリグリセリドを低下させるための方法において使用され得る。一実施形態において、結晶性オベチコール酸は、トリグリセリドを低下させるための方法において使用され得る。オベチコール酸形態１または結晶性オベチコール酸は、ＨＤＬを増加させ得る。オベチコール酸形態１または結晶性オベチコール酸の他の効果としては、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ビリルビン、ＡＬＴ、ＡＳＴ、およびＧＧＴの低下が挙げられる。
【０１４２】
一実施形態において、本発明は、オベチコール酸および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関し、ここで、オベチコール酸は本発明の方法によって製造される、例えばオベチコール酸形態１である。一実施形態において、医薬組成物は、実質的に純粋なオベチコール酸および薬学的に許容される担体を含む。他の実施形態において、医薬組成物は、結晶性オベチコール酸および薬学的に許容される担体を含む。他の実施形態において、結晶性オベチコール酸は形態Ａである。他の実施形態において、結晶性オベチコール酸は形態Ｃである。一実施形態において、結晶性オベチコール酸は形態Ｄである。一実施形態において、結晶性オベチコール酸は形態Ｆである。一実施形態において、結晶性オベチコール酸は形態Ｇである。一実施形態において、結晶性オベチコール酸は形態Ｉである。
【０１４３】
一実施形態において、本発明は、本発明の方法によって製造されるオベチコール酸形態１またはその医薬組成物を有効量投与することを含む、対象のＦＸＲ介在性疾患または病態を治療または予防する方法に関する。一実施形態において、本発明は、本発明の方法によって製造される実質的に純粋なオベチコール酸またはその医薬組成物を有効量投与することを含む、対象のＦＸＲ介在性疾患または病態を治療または予防する方法に関する。一実施形態において、本発明は、結晶性オベチコール酸またはその医薬組成物を有効量投与することを含む、対象のＦＸＲ介在性疾患または病態を治療または予防する方法に関する。他の実施形態において、結晶性オベチコール酸は形態Ｃである。一実施形態において、結晶性オベチコール酸は形態Ａである。一実施形態において、結晶性オベチコール酸は形態Ｃである。一実施形態において、結晶性オベチコール酸は形態Ｄである。一実施形態において、結晶性オベチコール酸は形態Ｆである。一実施形態において、結晶性オベチコール酸は形態Ｇである。一実施形態において、結晶性オベチコール酸は形態Ｉである。
【０１４４】
他の実施形態において、疾患または病態は、心血管系疾患または胆汁うっ滞性肝疾患であり、トリグリセリドを低下させるためのものである。他の実施形態において、心血管系疾患は、アテローム性動脈硬化症または高コレステロール血症である。他の実施形態において、本対象は哺乳動物である。他の実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【０１４５】
一実施形態において、本化合物または医薬組成物は、経口、非経口または局所投与される。一実施形態において、本化合物または医薬組成物は経口投与される。
【０１４６】
一実施形態において、本発明は、胆汁うっ滞性疾患に罹患している対象の線維症を抑制する方法であって、有効量のオベチコール酸またはその医薬組成物を対象に投与する工程を含む方法に関し、ここでオベチコール酸は本発明の方法によって製造される。一実施形態において、本発明は、胆汁うっ滞性疾患に罹患していない対象の線維症を抑制する方法であって、有効量のオベチコール酸またはその医薬組成物を対象に投与する工程を含む方法に関し、ここでオベチコール酸は本発明の方法によって製造される。実施形態において、抑制する線維症は、ＦＸＲが発現する器官で発症する。
【０１４７】
一実施形態において、胆汁うっ滞性疾患は、アルカリホスファターゼ、７−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、および５’ヌクレオチダーゼの血清中濃度の異常な上昇を有するものと定義される。他の実施形態において、胆汁うっ滞性疾患はさらに、少なくとも１つの臨床症状とともに現れるものと定義される。他の実施形態において、症状はかゆみ（掻痒）である。他の実施形態において、線維症は、肝線維症、腎臓線維症、および腸線維症からなる群から選択される。他の実施形態において、胆汁うっ滞性疾患は、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、薬物誘導性胆汁うっ滞、遺伝性胆汁うっ滞、および妊娠の肝内胆汁うっ滞からなる群から選択される。他の実施形態において、対象は、原発性肝臓および胆道癌、転移性癌、敗血症、長期にわたる完全静脈栄養、嚢胞性線維症、および肉芽腫性肝疾患からなる群から選択される疾患または病態を伴う胆汁うっ滞性疾患に罹患していない。
【０１４８】
一実施形態において、対象は、Ｂ型肝炎；Ｃ型肝炎；肝寄生虫症；移植後細菌、ウイルスおよび真菌感染；アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）；非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）；非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）；メトトレキサート、イソニアジド、オキシフェニスタチン、メチルドパ、クロルプロマジン、トルブタミドまたはアミオダロンにより誘発される肝疾患；自己免疫肝炎；サルコイドーシス；ウィルソン病；ヘモクロマトーシス；ゴーシェ病；ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩ、ＩＸおよびＸ型糖原病；α１−アンチトリプシン欠乏；ツェルウェーガー症候群；チロシン血症；フルクトース血症；ガラクトース血症；バッド・キアリ症候群、静脈閉塞性疾患または門脈血栓症を伴う血管撹乱；および先天性肝線維症からなる群から選択される疾患を伴う肝線維症を有する。
【０１４９】
他の実施形態において、対象は、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線照射後の大腸炎、および顕微鏡的大腸炎からなる群から選択される疾患を伴う腸管線維症を有する。
【０１５０】
他の実施形態において、対象は、糖尿病性腎症、高血圧性腎硬化症、慢性糸球体腎炎、慢性移植糸球体症、慢性間質性腎炎、および多発性嚢胞腎からなる群から選択される疾患を伴う腎臓線維症を有する。
【０１５１】
定義
便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において用いられる特定の用語が、ここに集められている。
【０１５２】
本明細書で使用する用語「オベチコール酸」または「ＯＣＡ」は、以下の化学構造を有する化合物を指す。
【化９】
2018538331.tif 000014
オベチコール酸の他の化学名には、以下が含まれる：３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸、６α−エチル−ケノデオキシコール酸、６−エチル−ＣＤＣＡ、６ＥＣＤＣＡ、コラン−２４−酸、６−エチル−３，７−ジヒドロキシ−，（３α，５β，６α，７α）−およびＩＮＴ−７４７。オベチコール酸のＣＡＳ登録番号は、４５９７８９−９９−２である。この用語は、オベチコール酸のすべての形態、例えば、非結晶性、結晶性、および実質的に純粋を指す。
【０１５３】
本明細書で使用する用語「結晶性オベチコール酸」は、以下の化学構造を有する化合物の結晶性形態を指す。
【化１０】
2018538331.tif 000015
結晶性オベチコール酸は、化合物が三空間次元における特定の結晶充填配置に結晶化されるか、または化合物が外表面（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｆａｃｅ  ｐｌａｎｅ）を有することを意味する。オベチコール酸（または、薬学的に許容されるその塩、アミノ酸抱合体もしくは溶媒和物）の結晶形態は、様々な結晶充填配置に結晶化し得、それらの全てが、オベチコール酸の同じ元素組成を有する。様々な結晶形態は通常、Ｘ線回折パターン、赤外線スペクトル、融点、密度、硬度、結晶形状、光学的特性および電気的特性、安定性、ならびに溶解度が異なる。再結晶溶媒、結晶化速度、保存温度、および他の要因により、一結晶形態が優位を占め得る。オベチコール酸の結晶は、様々な条件下、例えば、様々な溶媒、温度その他の下での結晶化によって、調製され得る。
【０１５４】
本明細書で使用する「結晶性オベチコール酸形態Ａ」という用語は、図４１に示したものと実質的に類似するＸ線回折パターンを有するオベチコール酸の結晶形態、例えば、実施例３で特徴付けられる結晶形態の１つを指す。
【０１５５】
本明細書で使用する「結晶性オベチコール酸形態Ｃ」という用語は、図５に示したものと実質的に類似するＸ線回折パターンを有するオベチコール酸の結晶形態、例えば、実施例３で特徴付けられる結晶形態の１つを指す。
【０１５６】
本明細書で使用する「実質的に純粋なオベチコール酸」という用語は、約９５％超の力価を有するオベチコール酸を指す。オベチコール酸の力価は、例えば、水、溶媒、ならびにオベチコール酸の試料中に存在する他の有機および無機不純物を含む不純物を考慮する。他の実施形態において、力価の既知の基準は１００％オベチコール酸であり、力価は既知の標準の１００％から、溶媒、水、ならびに他の有機および無機不純物などの不純物のパーセンテージを差し引くことによって決定される。一態様では、無機不純物は、例えば、無機塩および硫酸塩灰分を含む。一態様では、有機不純物は、６−エチルウルソデオキシコール酸、３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸、６β−エチルケノデオキシコール酸、３α，７α−ジヒドロキシ−６−エチリデン−５β−コラン−２４−酸、ケノデオキシコール酸、および３α（３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイルオキシ）−７α−ヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸を含む。不純物の量は、当該分野で知られる手順、例えば、ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、またはＵＳ  ＰｈａｒｍａｃｏｐｅｉａもしくはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａによる方法、あるいはこれらの方法の２つ以上の組み合わせによって決定することができる。
【０１５７】
本明細書で使用する「純度」という用語は、例えばＨＰＬＣから得られる化合物の化学分析を指す。一実施形態において、化合物の純度は、比較のためのそのそれぞれのピーク下の面積により、参照基準、例えば、オベチコール酸の純度と比較される。一実施形態において、純度は、試料中の有機不純物を説明する。
【０１５８】
本明細書で使用する「反応混合物」という用語は、一緒に組み合わされた１つ以上の物質の混合物を指す。一実施形態において、物質を混合または組み合わせることにより、元の物質の１つ以上に化学的変換または変化が引き起こされる。
【０１５９】
本明細書で使用する「オベチコール酸形態１」という用語は、非結晶性オベチコール酸を指す。一実施形態において、この形態のオベチコール酸は、合成中間体としての結晶性オベチコール酸を経て製造される。例えば、この形態のオベチコール酸は、本願の方法により、合成中間体としての結晶性オベチコール酸形態Ａを経て製造される。一実施形態において、オベチコール酸形態１は、薬学的に活性な成分として使用される形態である。より詳しくは、実施例５を参照されたい。
【０１６０】
「治療する」は、病態、疾患、障害などの改善をもたらすあらゆる効果、例えば、緩和、軽減、調節、または消失を含む。疾患状態を「治療する」または「治療」は、以下を含む：病態を抑制すること、すなわち、疾患状態もしくはその臨床症状の進行を阻止すること；または疾患状態を軽減すること、すなわち、疾患状態もしくはその臨床症状の一次的もしくは永続的な後退を引き起こすこと。
【０１６１】
疾患状態を「予防する」は、疾患状態に曝露され得るかまたは罹患し易いが疾患状態の症状をまだ経験していないかまたは呈していない対象において、疾患状態の臨床症状を発現させないようにすることを含む。
【０１６２】
「疾患状態」は、何らかの疾患、障害、病態、症状または兆候を意味する。
【０１６３】
本明細書で使用する「有効量」という用語は、適切な用量投与時に急性または慢性的な治療効果をもたらす、オベチコール酸（例えば、ＦＸＲ活性化リガンド）の量を指す。このような効果としては、疾患／病態（例えば、肝臓、腎臓、または腸の線維症）、および関連する合併症の症状、徴候、および根底にある病状の、何らかの検出可能な程度までの予防、矯正、阻害、または反転が挙げられる。
【０１６４】
「治療有効量」は、疾患を治療するために哺乳類に投与された場合に、その疾患のこうした治療効果をもたらすのに十分であるオベチコール酸の量を意味する。「治療有効量」は、オベチコール酸、疾患およびその重症度、ならびに治療される哺乳類の年齢、体重などに応じて変動する。
【０１６５】
治療有効量のオベチコール酸を、ヒトまたは動物への投与のために薬学的に許容される担体と共に製剤化することができる。したがって、オベチコール酸またはその製剤は、有効量の化合物を提供するため、例えば、経口、非経口、または局所経路を介して投与することができる。代替の実施形態において、本開示に従って調製されたオベチコール酸を使用して医療装置、例えばステントにコーティングまたは含浸させることができる。
【０１６６】
本明細書で使用する「薬理学的効果」は、療法の意図される目的を達成する、対象においてもたらされる効果を包含する。一実施形態において、薬理学的効果は、治療される対象の主要な適応症が予防、緩和、または軽減されることを意味する。例えば、薬理学的効果は、治療される対象における主要な適応症の予防、緩和、または軽減をもたらすものであろう。他の実施形態において、薬理学的効果は、治療される対象の主要な適応症の障害または症状が予防、緩和、または軽減されることを意味する。例えば、薬理学的効果は、治療される対象における主要な適応症の予防または軽減をもたらすものであろう。
【０１６７】
本開示はまた、１つ以上の原子が、自然界に最も一般的に見られる原子質量または質量数と異なる原子質量または質量数を有する原子に置き換えられているという点以外、本開示の式および以下において列挙したものと同一である、同位体標識されたオベチコール酸、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和物もしくはアミノ酸抱合体を包含する。オベチコール酸、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和物もしくはアミノ酸抱合体に組み込むことができる同位体の例としては、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、および１８Ｆなどの、水素、炭素、窒素、フッ素の同位体が挙げられる。
【０１６８】
前述の同位体および／または他の原子の他の同位体を含有する、オベチコール酸、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和物もしくはアミノ酸抱合体は、本開示の範囲内である。同位体標識されたオベチコール酸、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和物もしくはアミノ酸抱合体、例えば、３Ｈ、１４Ｃなどの放射性同位体が組み込まれたものは、薬物および／または基質組織分布分析において有用である。トリチウム標識、すなわち３Ｈ、および炭素−１４、すなわち１４Ｃ同位体は、調製および検出の容易さから特に好ましい。さらに、重水素、すなわち２Ｈなどのより重い同位体での置換は、より大きい代謝安定性に起因する特定の治療的利点、例えばインビボ半減期の延長または投薬量の必要性の低下をもたらすことができ、それ故、状況により好ましい可能性があり、同位体標識されたオベチコール酸、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和物もしくはアミノ酸抱合体は、一般に、同位体標識されていない試薬を、容易に利用可能な同位体標識された試薬で置換することにより、本開示のスキーム中および／または実施例中に開示した手順を実行することによって調製することができる。一実施形態において、オベチコール酸、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和物もしくはアミノ酸抱合体は、同位体標識されていない。一実施形態において、重水素化されたオベチコール酸は、生化学分析アッセイに有用である。他の実施形態において、オベチコール酸、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和物もしくはアミノ酸抱合体は、放射性同位体で標識されている。
【０１６９】
「幾何異性体」は、その存在が二重結合を軸とする束縛回転によるものである、ジアステレオマーを意味する。これらの立体配置は、接頭辞シスおよびトランス、またはＺおよびＥによってそれらの名称において異なり、それらは、その基が、Ｃａｈｎ−Ｉｎｇｏｌｄ−Ｐｒｅｌｏｇ則に従い、分子において二重結合と同側または逆側にあることを示す。
【０１７０】
「溶媒和物」は、溶媒の化学量論的な量または非化学量論的な量を含有する溶媒付加形態を意味する。オベチコール酸は、結晶性固体状態で一定のモル比の溶媒分子を捕捉する傾向を有し、したがって溶媒和物を形成する可能性がある。溶媒が水である場合、形成される溶媒和物は水和物であり、溶媒がアルコールである場合、形成される溶媒和物はアルコラートである。水和物は、水の１つ以上の分子と、中で水がそのＨ２Ｏとしての分子状態を保持している物質のうちの１つとの組み合わせによって形成され、このような組合せにより、１種以上の水和物を形成することが可能となる。さらに、本発明の化合物、例えば本化合物の塩は、水和もしくは非水和（無水）形態で、または他の溶媒分子との溶媒和物として存在し得る。水和物の非限定的な例としては、一水和物、二水和物などが挙げられる。溶媒和物の非限定的な例としては、エタノール溶媒和物、アセトン溶媒和物などが挙げられる。
【０１７１】
「互変異性体」は、その構造が原子の配置において著しく異なるが、容易かつ急速な平衡状態で存在する化合物を指す。オベチコール酸は、異なる互変異性体として表し得ることが理解されるであろう。また、本発明のオベチコール酸および合成中間体が互変異性形態を有する場合、全ての互変異性形態が本発明の範囲内にあることが意図され、そしてオベチコール酸の命名が、いかなる互変異性形態も排除しないことも理解されるべきである。本発明のオベチコール酸および合成中間体は、ケト−エノールを含むいくつかの互変異性形態で存在し得る。例えば、ケト−エノール互変異性では、電子と水素原子との同時移動が起こる。互変異性体は、溶液中で互変異性セットの混合物として存在する。固体形態では、通常、１つの互変異性体が優位である。たとえ１つの互変異性体が記載されている可能性があるとしても、本発明は、本化合物のすべての互変異性体を含む。
【０１７２】
特に明記しない限り、不斉炭素原子から生じる異性体（例えば、全てのエナンチオマーおよびジアステレオマー）が、本発明の範囲内に含まれることは理解されるべきである。このような異性体は、古典的な分離技術により、また立体化学的に調節される合成により、実質的に純粋な形態で得ることができる。さらに、本願で論じる構造および他の化合物および部分にも、そのすべての互変異性体が含まれる。アルケンは、適切な場合、Ｅ−またはＺ−配置を含む可能性がある。オベチコール酸および合成中間体は、立体異性形態で存在することができ、このため、個々の立体異性体として、または混合物として製造することができる。
【０１７３】
「医薬組成物」は、対象への投与に適した形態のオベチコール酸を含有する製剤である。一実施形態において、医薬組成物は、バルクまたは単位剤形である。投与を容易にし、かつ投与量を均一にするために、単位剤形で組成物を処方することが有利であり得る。本明細書で使用する単位剤形とは、治療する対象に対する単位投与量として適した、物理的に個別の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と組み合わせて所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性な試薬を含有する。本発明の単位剤形に対する仕様は、活性試薬の特有の特徴および達成しようとする特定の治療効果、ならびに個体の治療のための活性剤などの配合の技術分野における固有の制限により決定され、これらに直接依存する。
【０１７４】
単位剤形は、例えば、カプセル剤、ＩＶバッグ、錠剤、エアゾール吸入器の単一ポンプ、またはバイアルを含む種々の形態のいずれかである。組成物の単位用量中のオベチコール酸（例えば、オベチコール酸、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和物もしくはアミノ酸抱合体からなる製剤）の量は、有効量であり、関係する特定の治療によって変わる。当業者は、患者の年齢および状態に応じて、投薬量に対する日常的な変更を行うことが時として必要であることを理解するであろう。投与量は投与経路にも依存するであろう。経口、肺、直腸、非経口、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、吸入、頬側、舌下、胸膜内、クモ膜下腔内、鼻腔内などの様々な経路が企図される。本発明の化合物の局所投与または経皮投与のための剤型として、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、および吸入薬が挙げられる。一実施形態において、オベチコール酸は、薬学的に許容される担体、および必要とされる任意の保存剤、緩衝液、または噴射剤と無菌条件下で混合される。
【０１７５】
用語「フラッシュ用量」は、急速に分散する剤形であるオベチコール酸製剤を指す。
【０１７６】
用語「即時放出」は、比較的短い期間、一般に最大約６０分での剤形からのオベチコール酸の放出と定義される。用語「調節放出」は、遅延放出、徐放、およびパルス化放出を含むと定義される。用語「パルス化放出」は、剤形からの薬物の一連の放出と定義される。用語「持続放出」または「徐放」は、長期にわたる剤形からのオベチコール酸の持続的な放出と定義される。
【０１７７】
「対象」としては、哺乳類、例えば、ヒト、ペット（例えば、イヌ、ネコ、鳥類など）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、家禽など）、および実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、鳥類など）が挙げられる。一実施形態において、対象はヒトである。一実施形態において、対象はヒト小児（例えば、約３０ｋｇ〜約７０ｋｇ）である。一実施形態において、ヒト小児は葛西手術を受けており、出生時に胆管がないか、または出生時に完全に遮断されている場合、葛西手術によってそれらに効果的に胆管機能がもたらされる。
【０１７８】
本明細書で使用する「薬学的に許容される」という句は、健全な医学的判断の範囲内で、合理的なベネフィット／リスク比と釣り合った、過剰な毒性、刺激、アレルギー性反応または他の問題もしくは合併症がなく、ヒトおよび動物の組織と接触させる使用に適切である、化合物、材料、組成物、担体および／または剤形を指す。
【０１７９】
「薬学的に許容される賦形剤」は、一般に安全で、無毒性であり、生物学的にも他の点でも不快ではない医薬組成物を調製することにおいて有用である賦形剤を意味し、獣医学での使用ならびにヒトの薬学的使用に許容可能な賦形剤を含む。本明細書および特許請求の範囲において用いられる「薬学的に許容される賦形剤」は、１つのそのような賦形剤および複数のそのような賦形剤の双方を含む。
【０１８０】
オベチコール酸は、いかなる製剤も伴わずに直接投与することも可能であるが、通常、薬学的に許容される賦形剤とオベチコール酸とを含む医薬製剤の形態で投与される。これらの製剤は、経口、頬側、直腸、鼻腔内、経皮、皮下、静脈内、筋肉内および鼻腔内を含む様々な経路により投与し得る。オベチコール酸の経口製剤は、本明細書の「経口製剤および投与」というタイトルのセクション下でさらに記載されている。
【０１８１】
一実施形態において、オベチコール酸は、経皮的に投与することができる。経皮投与するためには、経皮送達装置（「パッチ」）が必要である。そのような経皮パッチは、量を制御して本発明の化合物を連続的または非連続的に注入するのに用いられ得る。医薬品の送達のための経皮パッチの構築および使用は当該技術分野ではよく知られている。例えば、米国特許第５，０２３，２５２号明細書を参照されたい。このようなパッチは、医薬品を連続的に、パルス状に、または要求に応じた送達のために構築され得る。
【０１８２】
本発明の一実施形態において、頬側および／もしくは舌下、または経鼻投与に適合した製剤中に、上に記載した通りのオベチコール酸を少なくとも含む医薬製剤が提供される。この実施形態は、胃系統によるおよび／または肝臓を通した初回通過代謝などの胃の合併症を避ける方式でのオベチコール酸の投与を提供する。この投与経路はまた、吸着時間を短縮し、より迅速な治療効果の開始を提供することができる。本開示の化合物は、舌下／頬側製剤を促進するために特に好都合な溶解度プロファイルを提供することができる。こうした製剤は、一般的に、活性成分を吸収させるため、製剤が表面領域と接触する比較的短い時間に、舌下／頬側粘膜の限られた表面領域に十分な量の活性成分を送達するかなり高濃度の活性成分を必要とする。したがって、その高い溶解度と組み合わせた非常に高い活性のオベチコール酸は、その舌下／頬側製剤に対する適合性を高める。
【０１８３】
オベチコール酸は、それぞれが約０．１ｍｇ〜約１５００ｍｇを含有する単位剤形に製剤化することが好ましい。他の実施形態において、製剤は約１ｍｇ〜約１００ｍｇを含む。他の実施形態において、製剤は約１ｍｇ〜約５０ｍｇを含む。他の実施形態において、製剤は約１ｍｇ〜約３０ｍｇを含む。他の実施形態において、製剤は約４ｍｇ〜約２６ｍｇを含む。他の実施形態において、製剤は約５ｍｇ〜約２５ｍｇを含む。一実施形態において、製剤は約１ｍｇ〜約２ｍｇを含む。一実施形態において、製剤は約１．２ｍｇ〜約１．８ｍｇを含む。一実施形態において、製剤は約１．３ｍｇ〜約１．７ｍｇを含む。一実施形態において、製剤は約１．５ｍｇを含む。用語「単位剤形」はヒト対象および他の哺乳動物の単位投薬量として適した、物理的に個別の単位を指し、各単位は、上記のような適切な医薬賦形剤と組み合わせて所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性物質を含有する。
【０１８４】
オベチコール酸は、一般に、広い投薬量範囲にわたって有効である。例えば、１日当たりの投薬量は、通常、約０．０００１〜約３０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲内にある。成人のヒトの治療では、単一用量または分割用量で約０．１〜約１５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲が特に好ましい。実施形態において、製剤は約０．１ｍｇ〜約１５００ｍｇを含む。他の実施形態において、製剤は約１ｍｇ〜約１００ｍｇを含む。他の実施形態において、製剤は約１ｍｇ〜約５０ｍｇを含む。他の実施形態において、製剤は約１ｍｇ〜約３０ｍｇを含む。他の実施形態において、製剤は約４ｍｇ〜約２６ｍｇを含む。他の実施形態において、製剤は約５ｍｇ〜約２５ｍｇを含む。一実施形態において、製剤は約１ｍｇ〜約２ｍｇを含む。一実施形態において、製剤は約１．２ｍｇ〜約１．８ｍｇを含む。一実施形態において、製剤は約１．３ｍｇ〜約１．７ｍｇを含む。一実施形態において、製剤は約１．５ｍｇを含む。しかしながら、実際に投与するオベチコール酸の量は、治療する病態、選択した投与経路、投与するオベチコール酸の形態、個々の患者の年齢、体重および応答、ならびに患者の症状の重症度を含む関連する状況に照らして、医師によって決定され、したがって、上記の投与量範囲が本発明の範囲を決して限定するものではないことは理解されよう。いくつかの場合、前述の範囲の下限未満の投薬量レベルが十分過ぎる可能性があり、一方、他の場合に、さらに大きい用量を、こうしたより大きい用量が１日全体を通した投与のためにいくつかのより小さい用量に最初に分割することを条件として、いかなる有害な副作用も引き起こさずに使用することができる。
【０１８５】
「本発明の方法」は、本明細書に記載するオベチコール酸の調製方法を指し、ここで、この方法は、結晶性オベチコール酸を調製することを含む。
【０１８６】
「線維症」は、組織または器官における、過剰な線維性結合組織、例えば瘢痕組織の発達を包含する病態を指す。このような瘢痕組織の生成は、疾患、外傷、化学的毒性などによる器官の感染、炎症または損傷に反応して起こり得る。線維症は、肝臓、腎臓、腸、肺、心臓などを含む種々の異なる組織および器官において発症し得る。
【０１８７】
本明細書で使用する「阻害する」または「阻害」という用語は、疾患または病態の発生または進行における何らかの検出可能な正の効果を指す。このような正の効果としては、疾患または病態の少なくとも１つの症状または徴候の開始の遅延または予防、症状または徴候の緩和または逆転、および症状または徴候のさらなる悪化の遅延または防止を挙げることができる。
【０１８８】
本明細書で使用する「胆汁うっ滞性疾患」は、肝臓からの胆汁排出に障害があるかまたはそれが遮断される何らかの疾患または病態を指し、これは肝臓または胆管で起こり得る。肝内胆汁うっ滞および肝外胆汁うっ滞は、胆汁うっ滞疾患の２つのタイプである。（肝臓内で起こる）肝内胆汁うっ滞は、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、敗血症（全身感染）、急性アルコール性肝炎、薬物毒性、（静脈内供給される）完全静脈栄養、悪性腫瘍、嚢胞性線維症および妊娠で最もよく見られる。（肝臓の外側で起こる）肝外胆汁うっ滞は、胆管腫瘍、狭窄、嚢胞、憩室、総胆管での結石、膵炎、膵臓腫瘍または仮性嚢胞、および近くの器官における腫瘤または腫瘍による圧迫により引き起こされ得る。
【０１８９】
胆汁うっ滞性疾患の臨床症状および徴候としては、かゆみ（掻痒）、疲労、皮膚または眼の黄疸、ある種の食物の消化不能、吐き気、嘔吐、白色便、暗色尿および右上腹部痛が挙げられる。胆汁うっ滞性疾患の患者は、患者の血清中のアルカリホスファターゼ、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、５’ヌクレオチダーゼ、ビリルビン、胆汁酸、およびコレステロールのレベルの測定を含む一連の標準的な臨床検査に基づいて臨床的に診断され追跡され得る。一般に患者は、診断マーカーであるアルカリホスファターゼ、ＧＧＴ、および５’ヌクレオチダーゼの３つ全ての血清レベルが異常に高いとみなされたなら、胆汁うっ滞性疾患を有すると診断される。これらのマーカーの正常な血清レベルは、試験プロトコールに依り、検査室間および手順間である程度、変動し得る。したがって、医師は、特定の検査室および試験手順に基づいて、各マーカーに対して何が異常に上昇した血液レベルであるかを決定することができよう。例えば、胆汁うっ滞性疾患に罹患した患者は一般に、血中のアルカリホスファターゼが約１２５ＩＵ／Ｌ超、ＧＧＴが約６５ＩＵ／Ｌ超、そして５’ヌクレオチダーゼが約１７ＮＩＬ超である。血清マーカーレベルの可変性ゆえに、胆汁うっ滞性疾患は、かゆみ（掻痒）などの上記症状の少なくとも１つに加えて、これらの３種類のマーカーの異常なレベルに基づいて診断され得る。
【０１９０】
用語「器官」は、細胞および組織からなり、かつ生体において一部の特定の機能を実行する、分化した構造体（心臓、肺、腎臓、肝臓などにみられる）を指す。この用語はまた、機能を実行し、または活動に協力する身体部分（例えば、眼、および視覚的な器官を構成する関連した構造体）を包含する。用語「器官」はさらに、完全な構造体に潜在的に発達することができる分化した細胞および組織のあらゆる部分的構造体（例えば、肝臓の葉または切片）を包含する。
【０１９１】
本明細書で引用される全ての刊行物および特許文献は、このような刊行物または文献のそれぞれが具体的かつ個別に、参照により本明細書中に組み込まれるように指示されているかのように、参照により本明細書中に組み込まれる。刊行物および特許文献の引用は、何れも関連先行技術であると認めることを意図するものではなく、また、その内容または日付に関しても何ら受け入れを構成するものではない。本発明をここで書面により記載しているが、当業者は、本発明が様々な実施形態で実施され得、前述の説明および以下の実施例が、例示目的のものであり、続く特許請求の範囲を限定するものではないことを認識しているであろう。
【０１９２】
本明細書において、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、単数形は複数も含む。別段の定めがない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾がある場合は、本明細書が優先する。
【０１９３】
本明細書で使用する全てのパーセンテージおよび比は、別段の指示がない限り、重量に基づく。
【実施例】
【０１９４】
実施例１：オベチコール酸の合成
この合成手順で参照する化合物番号は、スキーム１および各工程に対応する反応で使われている番号である。
【０１９５】
工程１−３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）の調製：
【化１１】
2018538331.tif 000016
反応１：Ｃ−２４カルボン酸である７−ケトリトコール酸（ＫＬＣＡ）のエステル化
酸触媒（硫酸、１．０ｍＬ）の存在下、メチルアルコール（２５００ｍＬ）を用いて３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（ＫＬＣＡ；５００．０ｇ、１．２８ｍｏｌ）をエステル化し、６２℃〜６４℃にまで約３時間加熱して、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）を得た。この反応では、メチルアルコールはメチル化試薬および反応溶媒として働く。後処理のために、水酸化ナトリウム溶液（２Ｎ）でｐＨ値をｐＨ９．５〜１０に調節した。溶液を活性炭（２５ｇ）で約３０分間処理し、濾過して炭素固体を除去した。あるいは、溶液の活性炭処理は行わなかった。生成物を沈殿させるために、１０℃〜１５℃の水（６２５ｍＬ）を１５分かけて加え、種となる物質を加えた。１０℃〜１５℃で１時間、反応混合物を撹拌する。約２０〜２５分かけて追加の水（１８７５ｍＬ）を加えた。１０℃〜１５℃で３０分間、生成物懸濁液を撹拌した。生成物を遠心分離により単離し、メタノールと水の混合物（１：１、３５０ｍＬ）で洗浄した。カール・フィッシャー（ＫＦ）法により、この濡れた材料の水分含有量を定量した。回転式乾燥機により、７０℃ＮＭＴで、この物質を真空乾燥した。この物質は、乾燥させずに次の工程で使用することもできる。収量（乾燥生成物基準で計算）は５０１．４ｇ（１．２４ｍｏｌ、９６．８％）である。
【０１９６】
工程２−３α，７α−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コル−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）の調製：
【化１２】
2018538331.tif 000017
反応２：７−ケトリトコールメチルエステルからのシリルエノールエーテルの生成
不活性条件下で、残留水分およびメタノールを含有する化合物１（６０．６９ｇ、１５０ｍｍｏｌ、乾燥物質として計算）を反応器に投入し、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、３６３ｍＬ）に溶解した。大気圧下、約６５℃で共沸蒸留を繰り返すことにより、水とメタノールを除去した。必要に応じて残留物にＴＨＦを加え、蒸留を約４回繰り返した。残留溶液の最終水分含有量は≦０．０５％（カール・フィッシャー滴定）でなければならない。この溶液を−２０℃〜−２５℃に予め冷却し、その後、約３０〜４５分以内にクロロトリメチルシラン（７３．３３ｇ、６７５ｍｍｏｌ、４．５当量）を加えた。窒素雰囲気下で、リチウムジイソプロピルアミド（２８％ＬＤＡ溶液、９００ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ（５０４ｍＬ）を別の不活性反応器に投入し、−２０℃〜−２５℃に冷却した。脱水し冷却した化合物１、ＴＨＦ（８４ｍＬ）およびクロロトリメチルシランの溶液を−２０℃〜−２５℃のＬＤＡ溶液に加えた。その後、約２時間、反応混合物を撹拌した。後処理のために、２℃〜８℃に予備冷却したクエン酸水溶液（３００ｍＬに３４．６ｇ）に反応混合物を加えた。添加後、水相を分離して廃棄した。最高５０℃の真空蒸留により、有機相から液体分を除去した。分離した残留物は、化合物３およびいくらかの残留溶媒を含んでいたが、そのまま次の工程で使用した。
【０１９７】
工程３−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４）の調製：
【化１３】
2018538331.tif 000018
反応３：シリルエノールエーテルとアセトアルデヒドのアルドール縮合
化合物３（１６４．６８ｇ、３００ｍｍｏｌ、乾燥物質として計算）のＴＨＦ溶液を不活性反応器に投入した。最高温度５０℃でＴＨＦの残留量を真空下で留去した。次に進むには、残留物中の水分含有量は≦０．５％（カール・フィッシャー滴定）に制限された。その後、残留物をジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解させ、−６０℃〜−６５℃に予備冷却した。その後、アセトアルデヒド（３３．８ｍＬ、６００ｍｍｏｌ）を加えた。窒素雰囲気下で、ジクロロメタン（７００ｍＬ）および三フッ化ホウ素（１６重量％アセトニトリル溶液、３１８ｇ、７５０ｍｍｏｌ）アセトニトリル複合体を別の反応器に投入し、その後、−６０℃〜−６５℃に冷却した。−６０℃〜−６５℃で、脱水した化合物３溶液を加えた。反応混合物を−６０℃〜−６５℃で約２時間撹拌し、２３℃〜２８℃にまで加熱し、さらに約３時間撹拌し、加水分解／後処理のために約２℃〜１０℃に冷却した。後処理のために、反応器からの冷却した溶液を、予め冷却した５０重量％の苛性ソーダの水溶液（４０ｍＬ）と６６０ｍＬの水に加えた。約１０分間強く撹拌した後、相を分離し、（下層の）有機層を別の反応器に移した。５０℃ＮＭＴで蒸留し、有機層から溶媒をできるだけ除去した。化合物４と、いくらか残留しているアセトニトリルおよびジクロロメタンとからなる残留物をドラム缶に排出した。Ｅ／Ｚ異性体の混合物である化合物４Ａも、上記工程３に記載の手順で調製することができる。
【０１９８】
工程４−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）の調製：
【化１４】
2018538331.tif 000019
反応４：Ｃ−２４エステルの鹸化
化合物４（２５８．３７ｇ、６００ｍｍｏｌ、乾燥物質として計算）を不活性反応器に投入した。５０℃ＮＭＴの温度で、残留量の溶媒を真空下で留去した。残留物をメタノール（３６０ｍＬ）に溶解し、水（５４ｍＬ）および５０重量％の苛性ソーダ（５４ｍＬ）を加えた。反応混合物を４９℃〜５３℃にまで加熱し、この温度で少なくとも２時間撹拌した。反応混合物のｐＨが＞１２であるかを確認する。ｐＨが＜１２であるなら、追加のＮａＯＨを加え、２時間の反応を繰り返す。溶液を水（１０００ｍＬ）で希釈し、温度を２５℃〜３５℃に調節した。後処理のために、反応混合物を少なくとも３０分間静置させた。相を分離し、下層の水層を別の反応器に移し、有機層を廃棄した。酢酸エチル（１４００ｍＬ）とクエン酸水溶液（４８０ｍＬ中２４４ｇ）を強く撹拌しながら水層に加えた。反応混合物を２５℃〜３５℃で１０分間撹拌した。相を分離し、下層の水層を廃棄した。酢酸エチルを有機層から留去し、酢酸エチル（８００ｍＬ）で置換した。蒸留物の水分含有量が１％ＮＭＴになるまで、または沸点が一定値に達するまでこの操作を繰り返した。この懸濁液を２０℃〜２５℃に冷却し、３０分間撹拌し、その後、生成物を分離して酢酸エチル（１００ｍＬ、３〜４回）で洗浄した。乾燥を、約６０℃、真空下で回転式乾燥機により行った。粗化合物５の収量は１１８．７１ｇ（ＫＬＣＡから４７．５％）である。Ｅ／Ｚ異性体の混合物である化合物４Ａは、Ｅ／Ｚ異性体の混合物である化合物５Ａを生成する出発物質としても使用することができる。
【０１９９】
その後、エタノールを用いて粗化合物５を結晶化した。結晶化のための粗化合物もまた、Ｅ／Ｚ異性体の混合物である化合物５Ａとすることができる。エタノール（３９０〜５２０ｍＬ）と粗化合物５（１３０ｇ）を不活性反応器に投入した。粗化合物５を溶解するために、反応混合物を加熱還流した。その後、反応混合物を制御された直線的冷却勾配で、３〜５時間以内に１５℃〜２０℃に冷却した。遠心分離により結晶化合物５Ａを分離し、その後、酢酸エチル（５０〜１００ｍＬ、２回）で洗浄した。回転式乾燥機により約６０℃で真空乾燥を行った。これにより８５．８ｇ（６６％）の収量を得た。精製した化合物５の化学分析、純度および水分を測定するために試料を採取した。精製した化合物５は３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸のＥ異性体である。精製化合物５の同定および特徴付けに関する詳細については実施例２を参照されたい。精製した化合物５、すなわちＥ異性体の単離は、任意選択とすることができる。Ｅ異性体とＺ異性体の溶解度は異なる。Ｅ異性体の溶解性は低いので、Ｚ異性体を洗い流すようにして結晶化する。
【０２００】
化合物５を調製する代替法は以下のようである。化合物４（１１１．９６ｇ）を不活性反応器に投入した。最高５０℃で、残留量の溶媒（例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン）を真空下で留去した。残留物をメタノール（１５６ｍＬ）に溶解し、約１０℃に冷却した。水道水（２３．４ｍＬ）と５０％の苛性ソーダ（２３．４ｍＬ）を加えた。反応混合物を約２０℃〜約２５℃で約４時間撹拌した。溶液を水道水（４３３ｍＬ）で希釈し、トルエン（１４４ｍＬ）を加えた。撹拌後、相を分離し、下層の水層を不活性反応器に移した。有機層を廃棄した。酢酸エチル（６０７ｍＬ）とクエン酸溶液（２０８ｍＬの水に１０５．７ｇ）を強く撹拌しながら水層に加えた。相を分離し、下層の水層を廃棄した。有機層を不活性反応器に移した。酢酸エチルを有機層から留去し、酢酸エチル（３４７ｍＬ）で置換した。一実施例では、蒸留物の水分含有量が約１％以下になるまで、または沸点が一定値に達するまで、この操作を酢酸エチル（１７３ｍＬ）で繰り返した。この懸濁液を２０℃〜２５℃に冷却した。化合物５を単離し、不活性遠心分離を伴った酢酸エチルによる洗浄（各回４３ｍＬで３〜４回）を行った。約６０℃の真空下、回転式乾燥機で乾燥を行った（化合物１基準で６４．８％の収率）。化合物４Ａ（Ｅ／Ｚ異性体の混合物）もまた、化合物５Ａ（Ｅ／Ｚ異性体の混合物）を生成する工程４の出発物質として使用することができる。
【０２０１】
工程５−３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）の調製：
【化１５】
2018538331.tif 000020
反応５：６−エチリデン部分の水素化
精製した化合物５（１１０ｇ、２６４ｍｍｏｌ）、水（１１００ｍＬ）、５０％苛性ソーダ溶液（３５．８ｍＬ、６８２ｍｍｏｌ）およびパラジウム触媒（Ｐｄ／Ｃ、１１ｇ）の混合物を水素化反応器に投入した。温度を２５℃〜３５℃に調節し、窒素（２ｂａｒ）で３回、水素（１ｂａｒ）で３回、反応器をフラッシュした。これらの圧力値は、周囲圧力（＝０ｂａｒ）に対する相対値として与えられる。５ｂａｒの水素圧を印加し、反応混合物を１００℃にまで１．５時間加熱し（アルファ位の異性化のために）、その後、水素圧を４．５〜５ｂａｒに維持しながら３時間撹拌した。その後、反応混合物を４０℃〜５０℃に冷却した。後処理のために、Ｐｄ／Ｃを濾別する。濾液に酢酸ｎ−ブチル（１３２０ｍＬ）および塩酸（６７．８ｍＬ、８１５ｍｍｏｌ、３７％）を加えた。水相は分離して廃棄した。４０〜５０℃で約１０分間、有機相を活性炭（５．５ｇ）で処理した。活性炭を濾別し、蒸留により濾液を濃縮し、得られた懸濁液を２〜３時間以内に１５℃〜２０℃に冷却した。沈殿した化合物６を単離し、酢酸ｎ−ブチル（１６０ｍＬ）で洗浄した。生成物を加圧濾過器を使用して濾過した。加圧濾過器内において、約６０℃で真空乾燥を行った。これにより８９．８ｇ（８１．２％）の化合物６を得た。化合物６を調製するために、工程５でＥ／Ｚ異性体の混合物である化合物５Ａを使用することができる。
【０２０２】
工程６−３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸（オベチコール酸）の調製：
【化１６】
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反応６：７α−ヒドロキシ基への７−ケト基の選択的還元
化合物６（８６ｇ、２０５．４ｍｍｏｌ）、水（６８８ｍＬ）および５０％水酸化ナトリウム溶液（５６．４ｍＬ）の混合物を、５０重量％水酸化ナトリウム溶液（１．５ｍＬ）および水（２０ｍＬ）の混合物中、９０℃〜１０５℃で、水素化ホウ素ナトリウム（７．７７ｇ、２０５．４ｍｍｏｌ）と反応させた。反応混合物を加熱還流し、少なくとも３時間撹拌した。後処理のために、反応完了後、混合物を約８０℃に冷却し、冷却した反応器に移した。３０℃〜５０℃で、酢酸ｎ−ブチル（８６０ｍＬ）と、クエン酸（３２０．２ｇ、無水物）を水（４９１ｍＬ）に溶解した溶液とを加えた。水相を分離し、ｐＨ値が酸性であることを確認した後、廃棄した。有機相を移動させて、蒸留した。残留物を酢酸ｎ−ブチルで希釈し、１５℃〜２０℃に徐冷し、遠心分離により粗オベチコール酸を濾過した。濡れた生成物を酢酸ｎ−ブチルから結晶化した。生成物のオベチコール酸を単離し、酢酸ｎ−ブチル（４３ｍＬ、４回）により不活性の加圧濾過器内で洗浄した。加圧濾過器内において、約８０℃で真空乾燥を行った。これにより、２θが約５．０度および５．３度に特徴的なピークを含む、Ｘ線回折パターンにより特徴付けられた結晶性オベチコール酸６７．３４ｇ（７７．９％）を得た。結晶性オベチコール酸形態Ａは、図４１に示すものと実質的に類似のＸ線回折パターンにより特徴付けられる。結晶性オベチコール酸の同定および特徴付けに関する詳細については実施例３を参照されたい。
【０２０３】
工程７−オベチコール酸形態１の調製：
【化１７】
2018538331.tif 000022
反応７：結晶性オベチコール酸形態Ａからのオベチコール酸形態１の調製
２θが約５．０度および５．３度に特徴的なピークを含む、Ｘ線回折パターンにより特徴付けられた結晶性オベチコール酸形態Ａ（５８ｇ）を、３０℃〜４０℃で、水（８７０ｍＬ）および苛性ソーダ溶液（５０％、８．７ｍＬ、１６６ｍｍｏｌ）に溶解した。すべての固形分が溶解するまでこの混合物を撹拌した。以下の後処理により、生成物を沈殿させた。３０℃〜４０℃でオベチコール酸溶液を、水（８７０ｍＬ）で希釈した塩化水素酸（３７％、１６．０５ｍＬ、１９３ｍｍｏｌ）に、フィルターを介して徐々に加えた。３０℃〜４０℃で懸濁液を約３０分間撹拌し、その後、２０℃以下（ＮＭＴ）に冷却した。生成物を単離し、不活性の加圧濾過器内で水（４６５ｍＬ、６回）により洗浄した。加圧濾過器内において、５０℃ＮＭＴの温度で真空乾燥を行った。これにより、５３．２ｇ（９１．７％）のオベチコール酸形態１を得た。
【０２０４】
実施例２：Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）の特徴付け
化合物５は、本願の方法のキーとなる中間体である。この化合物を酢酸エチルから単離し、その後、エタノールから結晶化した。高純度の化合物５は、化合物６ならびに、その後の、２θが約５．０度および５．３度に特徴的なピークを含む、Ｘ線回折パターンにより特徴付けられる結晶性オベチコール酸形態Ａ、および、実質的に純粋なオベチコール酸を含む、オベチコール酸形態１の効率的で高収率の生成を可能にする。
【０２０５】
実施例１の工程４で生成する化合物５の構造を、１Ｈ  ＮＭＲ、１３Ｃ  ＮＭＲおよび質量分析計を使用して確認した。工程４からの粗生成物は、ＬＣ／ＭＳカップリングのクォリティ・コントロール法１により作成されたＵＶクロマトグラムで、保持時間（ＲＴ）２７．４５７分に主生成物を、ＲＴ２８．０７８分に副生成物を与えた。２種の生成物は化合物５のＥ／Ｚ異性体である：
【化１８】
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これらの２種の異性体は、ＭＳ／ＭＳスペクトルで同一の精密質量および同一のフラグメンテーションを示す。それらは、質量分析データでは区別することができない。
【０２０６】
Ｅ／Ｚ異性体ピークを分離するためにセミ分取法を使用し、２段アプローチによりＥ／Ｚ異性体の構造を確認した。ＨＰＬＣクォリティ・コントロール法１では不揮発性のリン酸緩衝液を使用しており、したがって不揮発性緩衝液を使用して直接ＬＣ／ＭＳを連結することは不可能であった。この方法の適合性に対する予備試験から、ＵＰＬＣ法のみが、Ｅ／Ｚ異性体を十分に分離するための非常に高い段数を与えることが示された。２段アプローチは次のようである：工程Ａは、新たに開発したＵＰＬＣ／ＭＳ法による２つの試料中のＥ／Ｚ異性体の同定であり、工程Ｂは、ＨＰＬＣ法２によるＥ／Ｚ異性体ピーク画分の分離およびその後のＵＰＬＣ／ＭＳ法１による同定である。この方法の実験上の詳細は次のようである：
【０２０７】
【表４】
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【０２０８】
結果を図１および図２に示す。図１および２は、高性能ＵＰＬＣカラムで得た、「粗化合物５」（図１）および化合物５の「精製した参照」（図２）のＵＰＬＣ  ＵＶ／ＭＳクロマトグラムである。図１では、試料をＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  １：１中に１ｍｇ／ｍＬで溶解した；２００×２ｍｍ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＧＯＬＤ  Ｒ１２２；ＬＭＡ：Ｈ２Ｏ＋１０ｍＭ  ＡＦ＋０．１％ＨＦｏ；ＬＭＢ：ＡＣＮ；４５％−２０−６０％（１０）；０．４ｍＬ／ｍｉｎ；４０℃；ＵＶＡ＝２００ｎｍ；注入体積３μＬ。図２では、試料をＡＣＮ／Ｈ２Ｏ中に１ｍｇ／ｍｌで溶解した；２００×２ｍｍ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＧＯＬＤ  Ｒ１２２；Ａ：１０ｍＭ  ＡＦ＋０．１％ＨＦｏ；Ｂ：ＡＣＮ；４５％−２０−６０％Ｂ（１０）；０．４ｍＬ／ｍｉｎ；注入体積２０μＬ。両試料で、主成分（ＲＴ  ９．９２分）と副成分（ＲＴ  １０．７７分）の分子量は予想通り同一であり、２つの化合物の精密質量は、以下の正イオンおよび負イオンの測定データである表Ｄおよび表Ｅに示すように、提供された構造と一致した。
【０２０９】
【表５】
2018538331.tif 000025
【０２１０】
【表６】
2018538331.tif 000026
【０２１１】
クォリティ・コントロールＨＰＬＣ法２のポータビリティを確実にするために、正確に指定された条件下で元の分離を繰り返した。主ピークと副ピークはセミ分取として分離された。得られたＵＶクロマトグラムに、トラップされた画分の位置をマークして図３に示す。図３は、ＨＰＬＣ法２を使用した粗化合物５のＵＶクロマトグラムである；１２５×４ｍｍ  Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ  ＳＴＡＲ  Ｃ１８  ５μｍ  ＡＧ；ＬＭＡ：Ｈ２Ｏ  Ｈ３ＰＯ４でｐＨ２．６；ＬＭＢ：ＡＣＮ；３０％Ｂ−１０−３５％−３０−６０％−１−９０％（９）；１ｍＬ／ｍｉｎ；３５℃；ＵＶＡ＝２００ｎｍ；ｏｈｎｅ  ＭＳ；２５ｍＬ。その後、新たに開発したＵＰＬＣ／ＭＳ法により、単離した画分を別々に分析した。イオンを正確に評価するために、８５０．６１９１４±３ｐｐｍのトレース量の準分子イオン［２Ｍ＋ＮＨ４］を使用した。主ピーク画分、副ピーク画分および２つの試料について得られたクロマトグラムを図４（Ａ〜Ｄ）に示す。ＭＳの研究で、クォリティ・コントロール法２により、ＲＴ２７．４５７分およびＲＴ２８．０７８分に生じた２つのピークは、化学式Ｃ２６Ｈ４０Ｏ４を有する２つの異性体であることが示された。この化学式は、提案されたＥ／Ｚ異性体の構造と一致する。このように、ＵＰＬＣ−ＭＳ法の開発により、３α−ヒドロキシ−エチリデン−７−ケト−５β−コリン−２４酸のＥ／Ｚ異性体は、クロマトグラフィーにより高分解能で分離できることが示された。ＦＲ−ＩＣＲ質量分析計からの正確なＭＳデータは、提案されたＥ／Ｚ異性体の構造と一致する。両異性体で同一の化学式Ｃ２６Ｈ４０Ｏ４が得られた。
【０２１２】
セミ分取ＨＰＬＣ法２によるＥ／Ｚ異性体ピークの分離、およびその後のＵＰＬＣ−ＭＳ法による同定によって、我々はクォリティ・コントロール法２により描かれた２つのピーク（ＲＴ２７．４５７分およびＲＴ２８．０７８分、図１を参照されたい）が、化学式Ｃ２６Ｈ４０Ｏ４を有する２つの異性体であることを示すことができる。この化学式は、提案したＥ／Ｚ−異性体の構造と一致する。下記のＮＭＲの結果と併せて、次の割り当てが得られた：ＲＴ２７．４５７分は、Ｅ異性体に、ＲＴ２８．０７８分は、Ｚ異性体に属する。
【０２１３】
３α−ヒドロキシ−エチリデン−７−ケト−５β−コリン−２４酸のＥ異性体に対する１Ｈおよび１３Ｃシフトの割り当てを下に示す。「Ｌ．Ｂｅｔｔａｒｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＩ  Ｆａｒｍａｃｏ  ５５（２０００），５１−５５（物質  ３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸）にしたがって、シフトを推定した。
【化１９】
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【０２１４】
【表７】
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【０２１５】
【表８】
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【０２１６】
実施例３：結晶性オベチコール酸の特徴付け
Ｉ．スキーム１の工程６および実施例１からの生成物の固体状態の特徴付けにより、オベチコール酸は結晶であることが示された。この結晶形態は形態Ａと名付けられ、実質的に図４１のＸ線ディフラクトグラムに類似しており、２θが約５．０度および５．３度のピークにより特徴付けられる。形態ＡのＸ線回折に対応するデータを下記表４に示す。
【０２１７】
【表９】
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【０２１８】
結晶性オベチコール酸形態Ａの小規模合成
非晶質オベチコール酸（約３０ｍｇ）を秤量してガラス製バイアルに入れ、５０℃に温めた。ｎ−酢酸ブチル（６０μＬ）を加え、観察した。試料を５０℃で１時間撹拌し、０．１℃／ｍｉｎの直線的冷却速度で５℃まで冷却した。試料を５℃で２日間撹拌した。固形分を濾過し、空気乾燥し、ＸＲＰＤにより分析した。溶液を冷凍庫に約４８時間保管し、その後、形態Ａを提供するために周囲条件で放置して蒸発させた。形態Ａのさらなる調製方法を実施例９に示す。
【０２１９】
結晶性オベチコール酸形態Ａの大規模合成
非晶質オベチコール酸（約１ｇ）を秤量し、大型のガラス製バイアルに入れ、５０℃に温めた。酢酸エチル（１．５ｍｌ、１．５体積）を５０℃で加え、透明溶液を調製した。逆溶媒（ヘプタン、２．０ｍｌ、２体積）を加え、最初、濁った沈殿物を生成し、撹拌してこれをオイルに転化した。５０℃で１時間撹拌後、オイルはそのままであったので０．５ｍｌ（０．５体積）の酢酸エチルを加えてオイルを溶解し、濁った液体を生成した。すぐ上の小規模実験からの試料約１ｍｇを、種として試料に加えた。試料を５０℃でさらに１時間撹拌し、その後、０．１℃／ｍｉｎの直線的冷却速度で−２０℃まで冷却した。試料を−２０℃で終夜撹拌し、その後、少量の固形分を濾過し、空気乾燥し、ＸＲＰＤにより分析した。残りの試料を０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターに通して濾過し、２ｍｌのヘプタンで２回洗浄した。試料を約３０分間空気乾燥し、その後、真空オーブン中、室温で終夜乾燥した。得られた白色固体（８９８．９ｍｇ）は、図４１のものに実質的に類似したＸ線ディフラクトグラムを有する形態Ａとして特徴付けられた。図４２は、結晶性オベチコール酸形態ＡのＴＧＡおよびＤＧＣサーモグラムのオーバーレイである。図４３は形態Ａを用いたＧＶＳ実験の等温プロットである。図４４は、形態Ａを用いたＧＶＳ実験の動態プロットである。
【０２２０】
ＩＩ．以下は、結晶性オベチコール酸形態Ｃの特徴付けを要約した表である。
【０２２１】
【表１０】
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【０２２２】
熱分析
３４ポジションのオートサンプラーを備えたＭｅｔｔｌｅｒ  ＤＳＣ  ８２３ｅにより、ＤＳＣ（示差走査熱量測定）データを収集した。認定インジウムを使用し、エネルギーおよび温度について計器をキャリブレーションした。通常、０．５〜１ｍｇの各試料を、ピンホールを有するアルミニウムパンに入れ、２５℃から３５０℃へ１０℃・ｍｉｎ−１で加熱した。試料上方の窒素パージは５０ｍｌ・ｍｉｎ−１を維持した。計器の制御およびデータ解析ソフトウェアとして、ＳＴＡＲｅ  ｖ９．２０を使用した。
【０２２３】
３４ポジションのオートサンプラーを備えたＭｅｔｔｌｅｒ  ＴＧＡ／ＳＤＴＡ  ８５１ｅにより、ＴＧＡ（熱重量分析）データを収集した。認定インジウムを使用し、温度について計器をキャリブレーションした。通常、５〜１０ｍｇの各試料を、予め秤量したアルミニウム製ルツボに入れ、周囲温度から３００℃へ１０℃・ｍｉｎ−１で加熱した。試料上方の窒素パージは５０ｍｌ・ｍｉｎ−１を維持した。計器の制御およびデータ解析ソフトウェアとして、ＳＴＡＲｅ  ｖ９．２０を使用した。
【０２２４】
結晶性オベチコール酸形態ＣのＴＧＡにより、２つの重量減少ステップが観察された。最初は室温（ｒ．ｔ．）と８５℃（０．４１％）との間で起こり、２番目は８５℃〜１１５℃（４．１０％）の間で起こった。最初の重量減少ステップは、水分の減少に帰すことができ、二番目のステップは残留水分の減少（１．２％前後の重量減少を伴う水分）および結合ヘプタンの減少（約３．４％の重量減少）に帰すことができる。結晶性オベチコール酸形態Ｃは、０．１５〜０．２モルの間の溶媒（ヘプタン）および約１．５％（重量／重量）（０．３モル）を含有した。結晶性オベチコール酸形態ＣのＤＳＣサーモグラムは１ヵ所で吸熱を示した。これは、かなりシャープであり、開始は９８℃前後であった。図６を参照されたい。異なる溶媒は異なる沸点を有するであろうから、ＤＳＣおよびＴＧＡ実験において異なる温度で蒸発するであろう。
【０２２５】
粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）分析
Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＸＳ  Ｃ２  ＧＡＤＤＳ
ＣｕＫα線（４０ｋＶ、４０ｍＡ）、自動化ＸＹＺステージ、自動試料ポジショニング用のレーザービデオ顕微鏡およびＨｉＳｔａｒ  ２次元領域検出器を使用して、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＸＳ  Ｃ２  ＧＡＤＤＳ回折計により粉末Ｘ線回折パターンを収集した。Ｘ線光学系は、０．３ｍｍのピンホールコリメータと結合したシングルＧｏｅｂｅｌ多層膜ミラーから構成された。認定コランダム標準（ＮＩＳＴ１９７６）（平板）により、毎週、性能チェックを行った。
【０２２６】
ビームの発散、すなわち試料上のＸ線ビームの有効径は、約４ｍｍであった。試料−検出器間の距離を２０ｃｍとすることで、２θの有効範囲として３．２°〜２９．７°を得、θ−θ連続スキャンモードを採用した。通常、試料はＸ線ビームに１２０秒間露光された。データ収集にはソフトウェアＧＡＤＤＳ  ｆｏｒ  ＷＮＴ  ４．１．１６を使用し、データはＤｉｆｆｒａｃ  Ｐｌｕｓ  ＥＶＡ  ｖ９．０．０．２またはｖ１３．０．０．２を使用して分析し、提示した。
【０２２７】
周囲条件：周囲条件で分析する試料を、粉末を粉砕せずにそのまま平板試料として調製した。約１〜２ｍｇの試料をガラススライドの上で軽く圧縮し、平らな表面を得た。
【０２２８】
非周囲条件：非周囲条件で分析する試料を、熱伝導性化合物を含むシリコンウエハ上にセットした。その後、試料を約１０℃・ｍｉｎ−１で適切な温度にまで加熱し、その後、約１分間等温状態を保った後、データ収集を開始した。
【０２２９】
Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＸＳ／Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｄ５０００
ＣｕＫα線（４０ｋＶ、４０ｍＡ）、θ−θゴニオメーター、Ｖ２０発散および受光スリット、グラファイト製第２モノクロメーターならびにシンチレーションカウンターを使用し、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｄ５０００回折計により、粉末Ｘ線回折パターンを収集した。計器の性能チェックは、認定コランダム標準（ＮＩＳＴ  １９７６）を使用して行う。データ収集にはソフトウェアＤｉｆｆｒａｃ  Ｐｌｕｓ  ＸＲＤ  Ｃｏｍｍａｎｄｅｒ  ｖ２．３．１を使用し、データはＤｉｆｆｒａｃ  Ｐｌｕｓ  ＥＶＡ  ｖ１１，０．０．２またはｖ１３．０．０．２を使用して分析し、提示した。
【０２３０】
試料は、受け取ったままの粉末を使用した平板試料として、周囲条件で分析した。研磨したゼロ−バックグラウンド（５１０）のシリコンウエハを切削した窪みに、約２０ｍの試料を、静かに充填した。分析中、試料をそれ自身の面内で回転させた。データ収集の詳細は以下の通りである：
・角度範囲：２θで２〜４２°
・ステップサイズ：２θで０．０５°
・収集時間：４ｓ・ステップ−１
【０２３１】
Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＸＳ  Ｄ８  Ａｄｖａｎｃｅ
ＣｕＫα線（４０ｋＶ、４０ｍＡ）、θ−２θゴニオメーター、Ｖ４発散および受光スリット、Ｇｅ製モノクロメーターならびにＬｙｎｘｅｙｅ検出器を使用し、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄ８回折計により、粉末Ｘ線回折パターンを収集した。計器の性能チェックは、認定コランダム標準（ＮＩＳＴ  １９７６）を使用して行う。データ収集にはソフトウェアＤｉｆｆｒａｃ  Ｐｌｕｓ  ＸＲＤ  Ｃｏｍｍａｎｄｅｒ  ｖ２．５．０を使用し、データはＤｉｆｆｒａｃ  Ｐｌｕｓ  ＥＶＡ  ｖ１１．０．０．２またはｖ１３．０．０．２を使用して分析し、提示した。
【０２３２】
試料は、粉末をそのまま使用して平板試料とし、周囲条件で分析した。研磨したゼロ−バックグラウンド（５１０）のシリコンウエハを切削した窪みに、約５ｍの試料を、静かに充填した。分析中、試料をそれ自身の面内で回転させた。データ収集の詳細は以下の通りである：
・角度範囲：２θで２〜４２°
・ステップサイズ：２θで０．０５°
・収集時間：０．５ｓ・ステップ−１
【０２３３】
Ｘ線ディフラクトグラムに対応するデータを下記の表に示す。データ収集にはソフトウェアＤｉｆｆｒａｃ  Ｐｌｕｓ  ＸＲＤ  Ｃｏｍｍａｎｄｅｒ  ｖ２．６．１を使用し、データはＤｉｆｆｒａｃ  ＰｌｕｓＥＶＡ  ｖ１３．０．０．２またはｖ１５．０．０．０を使用して分析し、提示した。試料は、粉末をそのまま使用して平板試料とし、周囲条件で分析した。研磨したゼロ−バックグラウンド（５１０）のシリコンウエハを切削した窪みに、試料を、静かに充填した。分析中、試料をそれ自身の面内で回転させた。データ収集の詳細は以下の通りである：
・角度範囲：２θで２〜４２°
・ステップサイズ：２θで０．０５°
・収集時間：０．５ｓ・ステップ−１
【０２３４】
【表１１】
2018538331.tif 000032
【０２３５】
ＶＴ−ＸＲＰＤ（可変温度Ｘ線回折）により、ＤＳＣサーモグラムに見られる吸熱は、加熱時に形態の変化が観察されないものの、試料の脱溶媒和に対応するものであることが明らかになった。ＶＴ−ＸＲＰＤ実験は、大きい空間で試料を露出させて行ったのに対し、ＤＳＣ実験は制限された閉じた空間で行ったので、ＤＳＣとＶＴ−ＸＲＰＤデータとの間には温度差が存在する。この差は２０℃前後あり、ＤＳＣ実験ではるかに低い温度で試料が溶融し、ＶＴ−ＸＲＰＤ実験では１１０℃で試料が依然結晶に見える理由の説明になる。ＶＴ−ＸＲＰＤは、この物質から溶媒を乾燥させると、溶媒和した形態の物質と一致している結晶度を低下させることを示している。図７を参照されたい。
【０２３６】
重量式蒸気吸着（ＧＶＳ）
ＤＶＳＩｎｔｒｉｎｓｉｃ  Ｃｏｎｔｒｏｌソフトウェアｖ１．０．０．３０により制御された、ＳＭＳ  ＤＶＳ  Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ水蒸気吸着測定装置を使用して吸着等温線を得た。試料温度は、装置の制御により２５℃に維持した。湿度は、全流量が２００ｍｌ・ｍｉｎ−１の割合の乾燥および湿潤窒素流を混合することにより制御した。相対湿度は、試料の近くに設置した較正済みＲｏｔｒｏｎｉｃプローブ（ダイナミックレンジは１．０〜１００％ＲＨ）により測定した。％ＲＨ（相対湿度）の関数としての試料の重量変化（マスリラクゼーション）を、微量天秤（精度は±０．００５ｍｇ）により絶えずモニターした。
【０２３７】
周囲条件で、風袋を秤量したステンレス製メッシュバスケットに５〜２０ｍｇの試料を入れた。試料の着脱は４０％ＲＨ、２５℃（通常の室内条件）で行った。下記概要のように水蒸気吸着等温線を測定した（２回のスキャンで完全な１サイクル）。標準の等温線は、０．５〜９０％ＲＨの範囲で間隔を１０％ＲＨとし、２５℃で測定した。データ解析は、ＤＶＳ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｕｉｔｅ  ｖ６．０．０．７．を使用して、マイクロソフトのエクセルで行った。ＳＭＳ  ＤＶＳ  Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓの方法のパラメータは、以下のようである：
【０２３８】
【表１２】
2018538331.tif 000033
【０２３９】
等温線の完了後、試料を回収し、ＸＲＰＤで再度分析した。
【０２４０】
結晶性オベチコール酸形態Ｃの分析で、０〜９０％ＲＨにおいて１．１８％の質量増加が認められ、試料はやや吸湿性であることが示された。この水分の取り込みは、分析を通して定常状態時のものであり、全工程で平衡であった。曲線のヒステリシスは小さく、試料は取り込んだ水分を容易に失うことを示している。ＧＶＳ分析後のＸＲＰＤ分析で、試料に変化がなかったことが示された。図８Ａ、図８Ｂおよび図８Ｃを参照されたい。
【０２４１】
カール・フィッシャー滴定（ＫＦ）による水分測定
ハイドラナールクーロマットＡＧ試薬およびアルゴンパージを使用し、Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＤＬ３９  Ｃｏｕｌｏｍｅｔｅｒにより、各試料の水分含有率を測定した。秤量した固体試料を、水分の侵入を防ぐためにＳｕｂａｓｅａｌに接続した白金製ＴＧＡパン上の容器に入れた。１回の滴定に約１０ｍｇの試料を使用し、２回の測定を行った。
【０２４２】
カール・フィッシャー分析により、結晶性オベチコール酸形態Ｃは、約０．３モルの水分に相当する１．５％の水分を含有することが示された。
【０２４３】
４０℃、７５％ＲＨにおける１週間安定性
４０℃、７５％ＲＨ（相対湿度）におけるオベチコール酸の安定性を次のように決定した。４０℃／７５％ＲＨの湿潤室に１週間、オベチコール酸の試料を保管した。試料を再度ＸＲＰＤにより分析し、変化していないことがわかった。
【０２４４】
固相の研究により、オベチコール酸形態Ｃの結晶化には、比較的大量の有機溶媒の存在が必要であることが示された。オベチコール酸形態１が保管中に自然に結晶化して結晶性オベチコール酸形態Ｃを形成することは殆どあり得ない。
【０２４５】
実施例４：オベチコール酸錠剤の処方
下記の表は、オベチコール酸錠剤の定量的組成を示す。５ｍｇ、１０ｍｇおよび２５ｍｇ製剤が、フェーズ３の臨床試験物質として用いられた。
【０２４６】
【表１３】
2018538331.tif 000034
【０２４７】
実施例５：オベチコール酸形態１の特徴付け
オベチコール酸形態１は、オベチコール酸の非結晶性形態を指す。この形態のオベチコール酸は、合成中間体としての結晶性オベチコール酸を経て製造することができる。オベチコール酸形態１は、薬学的に活性な成分として使用することができる。オベチコール酸形態１を以下のように特徴付けし分析した。
【０２４８】
以下の手法を用いて、オベチコール酸形態１のバッチ１を特徴付けした：粉末Ｘ線回折法（ＸＰＲＤ）による結晶度の評価、１Ｈおよび１３Ｃ核磁気共鳴法（ＮＭＲ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴ−ＩＲ）、視覚的評価（例えば、粒子の形／大きさ）、熱特性（例えば、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）および熱重量分析（ＴＧＡ））、カール・フィッシャー（ＫＦ）法による水分測定、４０℃かつ７５％ＲＨでの保管および２週間後のＸＲＰＤによる再分析、電位差測定法によるｐＫａ、電位差測定法によるＬｏｇ  Ｐ／Ｄ（オクタノール／水）、ならびに重量式蒸気吸着（ＧＶＳ；例えば、採取した固体のＸＲＰＤ分析を伴う完全な吸脱着サイクル）を用いた湿度に対する安定性。オベチコール酸形態１の、別の５個のバッチ（例えば、バッチ２、３、４、５および６）も次の手法を使用して特徴付けし、比較した：ＸＲＰＤによる評価およびメインのバッチ１のパターンとの比較、１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲ、ＦＴ−ＩＲ、視覚的評価（例えば、粒子の形／大きさ）、熱特性（例えば、ＤＳＣ、ＴＧＡおよび高温顕微鏡）ならびにＫＦ法による水分測定。
【０２４９】
粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）分析
ＣｕＫα線（４０ｋＶ、４０ｍＡ）、自動化ＸＹＺステージ、自動試料ポジショニング用のレーザービデオ顕微鏡およびＨｉＳｔａｒ  ２次元領域検出器を使用して、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＸＳ  Ｃ２  ＧＡＤＤＳ回折計により粉末Ｘ線回折パターンを収集した。Ｘ線光学系は、０．３ｍｍのピンホールコリメータと結合したシングルＧｏｅｂｅｌ多層膜ミラーから構成される。ビームの発散、すなわち試料上のＸ線ビームの有効径は、約４ｍｍであった。試料−検出器間の距離を２０ｃｍとすることで、２θの有効範囲として３．２°〜２９．７°を得、θ−θ連続スキャンモードを採用した。通常、試料はＸ線ビームに１２０秒間露光された。データ収集にはソフトウェアＧＡＤＤＳ  ｆｏｒ  ＷＮＴ  ４．１．１６を使用し、データはＤｉｆｆｒａｃＰｌｕｓ  ＥＶＡ  ｖ９．０．０．２またはｖ１３．０．０．２を使用して分析し、提示した。
【０２５０】
周囲条件で分析する試料は、粉末を粉砕せずにそのまま平板試料として調製した。約１〜２ｍｇの試料をシリコンウエハ上で軽く押し付けて、フラットな表面を得た。ディフラクトグラムは、オベチコール酸形態１が非結晶性であることを示している（図１０および図１１を参照されたい）。
【０２５１】
ＮＭＲによる特徴付け
オートサンプラーを備え、ＤＲＸ４００コンソールにより制御されるＢｒｕｋｅｒ製４００ＭＨｚの装置により、ＮＭＲスペクトルを収集した。標準のＢｒｕｋｅｒをロードした実験を使用し、Ｔｏｐｓｐｉｎ  ｖ１．３（パッチレベル８）と共に実行するＩＣＯＮＮＭＲ  ｖ４．０．４（ビルド１）を使用して自動化実験を行った。ルーチンでない分光法では、Ｔｏｐｓｐｉｎのみの使用によりデータを得た。特段の断りがない限り、試料はｄ６−ＤＭＳＯ中で調製した。ＡＣＤ  ＳｐｅｃＭａｎａｇｅｒ  ｖ９．０９（ビルド７７０３）を使用してオフライン解析を行った。
【０２５２】
図１２は、バッチ１の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。バッチ２〜６の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルも記録し、バッチ１のスペクトルと比較した。図１３を参照されたい。スペクトルは全て類似しているが、水分量は異なっている。プロトンの大きなグループの積分において、ピークが重なって別々に積分できない０．７５ｐｐｍ〜２ｐｐｍの間で、いくらか差があるのが確認される。０．７５〜２ｐｐｍの領域の変動を考慮に入れて、バッチ１〜６のスペクトルで積分したトータルのプロトン数を表Ｊに示す。
【０２５３】
【表１４】
2018538331.tif 000035
【０２５４】
カルボン酸のプロトンは除いており、それでプロトンの数は、４３となるはずであるが、実際には６つのスペクトルで４０から４３の間で変動している。しかしながら、変動が生じている領域（０．７５〜２ｐｐｍ）は非常に広く、ベースラインの品質のためにこの積分を信頼することはできない。
【０２５５】
スペクトルに十分な割り当てを行うことができず、積分も変動したために、バッチ２の１３Ｃ  ＮＭＲを記録した。ＣＨ２および四級炭素のピークは上向きに示し、ＣＨ３およびＣＨ基は下向きに示すＤＥＰＴＱスペクトルを図１４に示す。下向きのピークが１３個あり、これらは９個のＣＨおよび４個のＣＨ３基に対応する。これはその構造と一致する。カルボン酸の炭素のピークは１７５ｐｐｍに見られた。目的領域を鮮明にするために、それをこの拡大された図面から除いてある。しかしながら、上向きのピークは１１個のみであるが、分子（カルボニルを除く）には１０個のＣＨ２基および２個の四級炭素があるので１２個存在すべきである。１個の炭素が他の信号と重なり合っているようである。したがって、重なり合っている信号が四級かどうかを示すことができる、四級炭素の信号を抑制するＤＥＰＴ１３５スペクトルを収集した。図１５を参照されたい。ＤＥＰＴ１３５スペクトルとＤＥＰＴＱスペクトルの比較により、１個のピーク（４２．５ｐｐｍの）が消失していることがわかる。この分子には、消失した２個のピークに対応する２個の四級炭素が存在する。したがって、重なり合った炭素信号は四級のものである。
【０２５６】
さらに、炭素の緩和時間を決定する実験を行い、消失した四級炭素信号が別の炭素信号とどこで重なり合っているのかを決定した。図１６を参照されたい。この１３Ｃスペクトルは、統合されたピークを含む。これにより、３２．３ｐｐｍのピークは２個の炭素からなることが示された。３２．３ｐｐｍのピークの拡大図を図１７で参照されたい。このように、統合を考慮することで今や２６個の炭素が説明され（カルボン酸を含む）、これはその構造と一致する。
【０２５７】
ＡＴＲによるＦＴ−ＩＲ
Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＡＴＲサンプリングアクセサリーを装着した、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｏｎｅによりデータを収集した。Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｖ５．０．１ソフトウェアを用いてデータを収集し、分析した。図１８を参照されたい。
【０２５８】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）および熱重量分析（ＴＧＡ）による熱分析
５０ポジションのオートサンプラーを備えたＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｑ２０００により、ＤＳＣデータを収集した。認定インジウムを使用し、エネルギーおよび温度について計器をキャリブレーションした。通常、０．５〜３ｍｇの各試料を、ピンホールを有するアルミニウムパンに入れ、２５℃から３００℃へ１０℃・ｍｉｎ−１で加熱した。試料上方の窒素パージは５０ｍｌ・ｍｉｎ−１を維持した。機器制御にはソフトウェアＡｄｖａｎｔａｇｅ  ｆｏｒ  Ｑ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｖ２．８．０．３９２およびＴｈｅｒｍａｌ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｖ４．８．３を使用し、データはＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｖ４．３Ａを使用して分析した。変調ＤＳＣでは、以前の通り試料を調製し、パンを２５℃から２００℃まで２℃・ｍｉｎ−１で加熱した。変調器の条件は、振幅を０．２０℃、周期を４０ｓとした。サンプリング間隔は１ｓｅｃ／ｐｔとした。
【０２５９】
１６ポジションのオートサンプラーを備えたＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｑ５００ＴＧＡにより、ＴＧＡデータを収集した。認定アルメルを使用し、温度について計器をキャリブレーションした。通常、５〜１０ｍｇの各試料を、予め秤量した白金ルツボおよびアルミニウムＤＳＣパンに入れ、周囲温度から３５０℃へ１０℃・ｍｉｎ−１で加熱した。試料上方の窒素パージは６０ｍｌ・ｍｉｎ−１を維持した。機器制御にはソフトウェアＡｄｖａｎｔａｇｅ  ｆｏｒ  Ｑ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｖ２．８．０．３９２およびＴｈｅｒｍａｌ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｖ４．８．３を使用した。
【０２６０】
バッチ１の熱分析を、ＤＳＣおよびＴＧＡにより行った。ＴＧＡの出力形状（図１９を参照されたい）は、周囲温度〜１２１℃の間で１．７％の重量減少を示すが、これはおそらく水分の減少である。ＤＳＣの出力形状（図１９を参照されたい）は、おそらく水分の減少に対応するブロードな低温の吸熱と、その後の９４℃から始まる小さな吸熱を示す。
【０２６１】
この第２の吸熱はガラス転移を意味するかもしれず、変調ＤＳＣによりさらに詳しく調べた（図２０を参照されたい）。この手法は、ガラス転移などの可逆的な出来事を、溶媒の減少または結晶形態の融解などの不可逆的なものから分離することができる。変調ＤＳＣの可逆的な熱流の出力形状は、９５℃に変曲点（Ｔｇ）を有するステップとしてガラス転移を示す。これはガラス転移にしては高く、形態１が安定であることを示唆している。非可逆的な熱流の出力形状で８９℃から始まる小さな吸熱は、ガラス転移点におけるバルクの物質の分子緩和に対応する。
【０２６２】
ＤＳＣの出力形状（図１９を参照されたい）は、分解が２２０℃前後で始まることを示しており、これはまた、ＴＧＡの出力形状で曲線が下を向く温度に対応する。
【０２６３】
バッチ１、２、３、４、５および６のＴＧＡの出力形状は類似の形である（図２１）。周囲温度〜１２０℃の間で測定された重量減少を表Ｋに示す。これらは、ＮＭＲで観察された変動する水分量と一致する。これらの量を、カール・フィッシャー（ＫＦ）水分滴定によりさらに定量した。ＫＦによる水分の測定を参照されたい。
【０２６４】
【表１５】
2018538331.tif 000036
【０２６５】
比較のために、６個のバッチのＤＳＣの出力形状を図２２に示す。出力形状は類似しており、ＤＳＣおよびＴＧＡの節でみられるような、様々な水分量と一致する、大きさが様々でブロードな低温の吸熱、および、その後のガラス転移点前後の小さい吸熱がある。結果を表Ｌに要約する。
【０２６６】
【表１６】
2018538331.tif 000037
【０２６７】
偏光顕微鏡（ＰＬＭ）
画像取り込みのためにデジタルビデオカメラを備えた、Ｌｅｉｃａ  ＬＭ／ＤＭ偏光顕微鏡で試料を研究した。少量の各試料をシリコンオイル中のスライドグラス上に置き、カバーグラスで覆って、個々の粒子ができるだけ分離するようにした。試料を、適切な倍率で、またλ着色フィルターと連結した部分偏光で観察した。
【０２６８】
図２３Ａ〜２３Ｆは、バッチ１、２、３、４、５および６が、小さい不規則な粒子の大きな硬い凝集物から構成された材料であることを示す。バッチ１、２、３、４、５および６は全て同じように見える。平面偏光下では複屈折は観察されなかったが、これは材料が非結晶性であることと一致する。粒子径は１μｍ未満〜３μｍの範囲である。これらの粒子のサイズが小さいことは、それらが極めて急速に沈殿したことを示唆する。
【０２６９】
重量式蒸気吸着（ＧＶＳ）
ＳＭＳ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｕｉｔソフトウェアにより制御された、ＳＭＳ  ＤＶＳ  Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ水蒸気吸着測定装置を使用して吸着等温線を得た。試料温度は計器の制御により２５℃に維持した。湿度は、全流量が２００ｍｌ・ｍｉｎ−１の乾燥および湿潤窒素流を混合することにより制御した。相対湿度は、試料の近くに設置した較正済Ｒｏｔｒｏｎｉｃプローブ（ダイナミックレンジは１．０〜１００％ＲＨ）により測定した。％ＲＨの関数としての試料の重量変化（マスリラクゼーション）を、微量天秤（精度は±０．００５ｍｇ）により絶えずモニターした。
【０２７０】
通常、５〜２０ｍｇの試料を、風袋を秤量したステンレス製メッシュバスケットに周囲条件で入れた。試料の着脱は４０％ＲＨ、２５℃（通常の室内条件）で行った。下記概要のように水蒸気吸着等温線を測定した（２回のスキャンで完全な１サイクル）。標準の等温線は、０．５〜９０％ＲＨの範囲で間隔を１０％ＲＨとし、２５℃で測定した。
【０２７１】
【表１７】
2018538331.tif 000038
【０２７２】
２５℃でバッチ１の重量式蒸気吸着（ＧＶＳ）等温線を得、図２４に示した。試料は適度な吸湿性を有しているようであり、０から９０％までの相対湿度（ＲＨ）で３．８％の全重量変化を示す。ヒステリシス（吸脱着曲線の間の領域）は小さく、試料は吸着した水分を容易に放出することを示している。水和物の生成は観察されない。全実験の終了後、顕著な重量変化はなかった（０．３％）。
【０２７３】
ＧＶＳの動態プロット（図２５）から、水分の吸着は主に非常な高湿度で生じ、脱着は非常な低湿度で生じたことが示される。吸着フェーズでは、８０％ＲＨまで試料は極めて急速に平衡に達するが、９０％ＲＨでは平衡までに比較的長い時間を要した。脱着では、集合体は全ステップで安定であった。
【０２７４】
ＧＶＳの終了後、試料を回収し、ＸＲＰＤにより再分析を行ったところ、この物質は依然非結晶性であることが示された（図２６）。
【０２７５】
カール・フィッシャー滴定（ＫＦ）による水分測定
ハイドラナールクーロマットＡＧ試薬およびアルゴンパージを使用し、Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＤＬ３９  Ｃｏｕｌｏｍｅｔｅｒにより、各試料の水分含有率を測定した。秤量した固体試料を、水分の侵入を防ぐためにＳｕｂａｓｅａｌに結合された、白金製ＴＧＡパン上の容器に入れた。１回の滴定に約１０ｍｇの試料を使用し、２回の測定を行った。
【０２７６】
カール・フィッシャー電量測定による水分の滴定により、水分２．４重量％の結果を得た。これは、ＴＧＡで観察された重量減少より少し大きい。これは、水分のいくらかは加熱時にこの物質から放出されないが、これら２つの手法の、異なる実験手順によっては放出されやすくなることを意味するものと考えられる。
【０２７７】
カール・フィッシャー電量測定により、各バッチの水分含有量を決定した。表Ｎに、これらの結果ならびに、これらと先に得られたカール・フィッシャーの結果およびＴＧＡで観察された重量減少との比較を示す。３種の分析全てにおいて傾向が同じであるように、データは一貫性を有している。先に得たカール・フィッシャーデータは、ここで得た結果より少ない水分量を示している。このことは、いくつかの試料は他のものより多くの水分を取り込んでいるが、この物質が吸湿性であることと一致している。ＴＧＡの重量減少は一貫して、カール・フィッシャー滴定で得た結果より少ないが、これはいくらかの水分がこの物質中に捕捉されていて加熱では放出されないが、実験手順によっては放出され得ることを意味しているものと考えられる。
【０２７８】
【表１８】
2018538331.tif 000039
【０２７９】
ｐＫａの測定および推定
Ｄ−ＰＡＳアタッチメントを備えたＳｉｒｉｕｓ  ＧｌｐＫａ装置でｐＫａの測定データを収集した。測定は、水溶液中、２５℃でＵＶにより、またメタノール−水混合物中、電位差測定法により行った。滴定溶媒のイオン強度調整（ＩＳＡ）を０．１５Ｍ  ＫＣｌ（水溶液）で行った。メタノール−水混合物中で得られた値は、Ｙａｓｕｄａ−Ｓｈｅｄｌｏｖｓｋｙの外挿により、共溶媒０％に補正した。Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  Ｐｒｏソフトウェアｖ１．０を使用してデータを精密化した。ＡＣＤ  ｐＫａ推定ソフトウェアｖ９を使用して、ｐＫａ値の推定を行った。
【化２０】
2018538331.tif 000040
【０２８０】
共溶媒としてメタノールを使用して、電位差測定法によりオベチコール酸のｐＫａを測定し（図２７）、Ｙａｓｕｄａ−Ｓｈｅｄｌｏｖｓｋｙの外挿により共溶媒０％に外挿した（図２８）。ｐＫａは所与のｐＨで、この化合物の中性およびイオン化した形態の割合を決めることができる。図２９にｐＨに依存する種の分布を示す。
【０２８１】
ＬｏｇＰの決定
ＬｏｇＰ、ＬｏｇＰｉｏｎおよびＬｏｇＤ値を得るためにオクタノール：イオン強度調整（ＩＳＡ）した水の３種の比を使用して、Ｓｉｒｉｕｓ  ＧｌｐＫａ装置による電位差滴定法によりデータを収集した。Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  Ｐｒｏソフトウェアｖ１．０を使用してデータを精密化した。ＡＣＤ  ｖ９およびＳｙｒａｃｕｓｅ  ＫＯＷＷＩＮ  ｖ１．６７ソフトウェアを使用してＬｏｇ  Ｐ値を推定した。
【０２８２】
【表１９】
2018538331.tif 000041
【０２８３】
ＬｏｇＰをＡＣＤソフトウェアで推定後、電位差測定法により測定した。オクタノール／ＩＳＡ水の３種の異なる比で、３回の滴定を行ない、図３０にプロットした異なる曲線を得た。黒色の曲線は、純粋な水溶液のｐＫａ滴定であり、３色の曲線はオクタノール／ＩＳＡ水の３種の比に対応する。ｐＫａのシフトによりＬｏｇＰの決定が可能になる。
【０２８４】
親油性曲線（ｐＨの関数としてのｌｏｇＤ）を図３１に示す。ＬｏｇＤは分配計数であり、特定のｐＨで存在する全ての種の統合親油性を意味する。ＬｏｇＰは、純粋な中性種の分配係数に対応する化合物の定数であり、ＬｏｇＰｉｏｎは、純粋なイオン化種のそれである。ＬｏｇＰおよびＬｏｇＰｉｏｎは、それぞれＹ軸と、ｐＨ目盛りの始点での接線（分子が純粋に中性形態であるとき）およびｐＨ目盛りの終点での接線（分子が完全にイオン化しているとき）との交点として、親油性曲線から決定することができる。
【０２８５】
４０℃、７５％ＲＨおよび２５℃、９７％ＲＨにおける２週間安定性
固体形態の加速安定性試験において、バッチ１の試料を４０℃、７５％相対湿度（ＲＨ）で保管した。非常な高湿度の影響をチェックするために、別の試料を２５℃、９７％相対湿度で保管した。両試料とも、５日後および２週間後にＸＲＰＤにより再分析した。両試料とも、２種の保管条件で２週間まで、非結晶性のままであり、形態１がこれらの条件に対して安定であることが示された。図３２および図３３を参照されたい。
【０２８６】
分析した６個のバッチは全て非結晶性であった。変調ＤＳＣ実験により、９５℃でガラス転移点を測定した。使用した全ての分析手法で、６個のバッチは非常に類似しているように見え、それらの唯一の違いはカール・フィッシャー滴定により１．９％から２．８％まで変動する水分含有量であった。熱分析からは、変動する水分量が示され、１７５〜２２０℃前後で分解が始まることが示された。ｐＫａの測定値は４．８２であり、ＬｏｇＰは５．５４であった。顕微鏡による評価では、非常に小さい不定形粒子の大きな硬質の凝集体が示された。
【０２８７】
安定性試験では、この物質は加速条件（４０℃／７５％ＲＨ）下または高湿度条件（２５℃／９７％ＲＨ）下で２週間経過後も、依然非結晶性であることが示された。重量式蒸気吸着（ＧＶＳ）分析では、この物質は適度に吸湿性であり、全重量増加は０〜９０％相対湿度（ＲＨ）で３．８％であることが示された。ＧＶＳで水和物は観察されなかった。ＧＶＳの後でＸＲＰＤにより再分析した試料は、依然非結晶性であった。高いガラス転移点および安定性の試験結果からは、非結晶性形態が安定であることが示唆される。
【０２８８】
実施例６：単結晶Ｘ線構造および絶対立体化学
０．１℃／ｍｉｎで５℃に冷却し、続いてＲＴ／５０℃、８時間のサイクルを１週間行って熟成させた後のアセトニトリル溶液からオベチコール酸を再結晶させて得た結晶から、オベチコール酸の単結晶Ｘ線構造を決定した（図３４を参照されたい）。構造は形態Ｇと一致しており、この物質の参照パターンとして、シミュレートしたＸＲＰＤパターンを作製した。形態Ｇは例えばオベチコール酸のアセトニトリル溶液を冷却することにより調製することができる。
【０２８９】
構造は斜方晶系であり、空間群はＰ２１２１２１であり、非対称単位の中にオベチコール酸１分子を含有する。最終のＲ１［Ｉ＞２σ（Ｉ）］＝３．２２％である。結晶は、寸法約０．４×０．４×０．３ｍｍのプリズム形態を示した。この分子の絶対立体化学として、フラックパラメータ＝−０．０１（１３）を有し、キラル中心がＣ５、Ｃ９、Ｃ１０およびＣ１４にあるＳ、およびキラル中心がＣ３、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１３、Ｃ１７およびＣ２２にあるＲと決定された。Ｒ構造でキラル中心Ｃ５、Ｃ９、Ｃ１０およびＣ１４を有する反転構造およびＳ構造でキラル中心Ｃ３、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１３、Ｃ１７およびＣ２２を有する反転構造では、フラックパラメータ＝１．０１（１３）であり、上述の割り当てが確認された。
【０２９０】
全体として、この構造は強力なデータセットを有し、欠陥を有しない。
【化２１】
2018538331.tif 000042
【０２９１】
立体化学の割り当てに使用したソフトウェア（ＰＬＡＴＯＮ）はキラル中心（Ｃ８）をＲの立体中心と決定するが、ＡＣＤソフトウェア（およびＣａｈｎ−Ｉｎｇｏｌｄ−Ｐｒｅｌｏｇ）による（Ｃ８）の割り当てはＳである。しかしながら、Ｂ／Ｃリングシステムへのトランスリング接合の割り当ては結晶構造により絶対的に決められる。
【０２９２】
Ｂｉｊｖｏｅｔ差に対してベイズ統計学を用いて絶対構造の決定を行う（Ｈｏｏｆｔｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．，（２００８），４１，９６−１０３）と、提示した絶対構造が正しいことの確立は１．０００であり、絶対構造がラセミ双晶または偽構造である確率はそれぞれ０．０００および０．０００であることがわかる。フラック等価およびその不確かさをこのプログラムで計算すると−０．０１９（１７）である。
【０２９３】
オベチコール酸の構造は、互いに融合した１個の５員環および３個の６員環を含有する。５員環（Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６およびＣ１７）の配座解析を行うと、この環に対する最も近いパッカリング記述子は半いす型であることがわかる。３個の６員環（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ１０）；（Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９およびＣ１０）ならびに（Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１１、Ｃ１２Ｃ１３およびＣ１４）の配座解析を行うと、これらの環に対する最も近いパッカリング記述子はいす型であることがわかる。
【０２９４】
結晶構造に２つの固有の分子間水素結合が観察される。オベチコール酸の各分子は、Ｏ１およびＯ４の酸素は、それぞれレセプターとして働くＯ３およびＯ１の酸素へのドナーとして働き、Ｏ１−Ｈ１Ｃ−−−Ｏ３［Ｄ・・・Ａ＝２．７４１９（１２）Å］およびＯ４−Ｈ４Ｃ−−−Ｏ１［Ｄ・・・Ａ＝２．６０５３（１３）Å］として、オベチコール酸の対称性に関連する２つの異なる分子に対して水素結合を形成する（図３５を参照されたい）。これらの相互作用は、複雑な３次元水素結合ネットワークを構築することになる。最終の差フーリエマップからは、それぞれ０．４０２および−０．１７６ｅÅ−３の最大および最小電子密度が示される。
【０２９５】
この構造について計算したＸＲＰＤパターンに、実験したバッチでオーバーレイすると、この結晶はそのバルクに一致し、オベチコール酸形態Ｇであることが示される（図３６を参照されたい）。
【０２９６】
【表２０】
2018538331.tif 000043
【０２９７】
【表２１】
2018538331.tif 000044
【０２９８】
構造精密化の概要は以下の通りである。
【０２９９】
【表２２】
2018538331.tif 000045
【０３００】
実施例７：オベチコール酸形態１（非結晶性）と結晶（形態Ｆ）形態との間のバイオアベイラビリティの違い
固体オベチコール酸の物理状態は、対象（例えばラット）に経口投与したときの分子のバイオアベイラビリティに役割を果たし得る。オベチコール酸の固体非結晶性形態および結晶形態の、１回の経口投与後の血漿中動態および腸内吸収効率ならびに薬物動態を評価するために、下記の研究を行った。オベチコール酸形態１（非結晶性）または形態Ｆの投与後、オベチコール酸の結晶中濃度対時間のプロファイル、ｔｍａｘ、ＣｍａｘおよびＡＵＣを比較した（図３７〜３８を参照されたい）。
【０３０１】
オベチコール酸形態１（非結晶性）および形態Ｆをラットに投与し、各動物で少なくとも３時間、異なる時間に血液を採取した。オベチコール酸の各形態について、６匹の動物で研究した。
【０３０２】
実験プロトコール：
オベチコール酸形態１（非結晶性）および結晶形態Ｆを試験物質として使用した。形態Ｆは、アセトニトリルまたはニトロメタンから熟成により調製することができる。製剤を、ｐＨ４の懸濁水として調製した。研究用モデルは、約２２５〜約２５０ｇのオスの成獣Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットである（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。投与経路ごとに６匹の動物を使用した。投与量は経口で２０ｍｇ／ｋｇ／５ｍＬである。動物を、オベチコール酸処方による処置の前に、一晩絶食させた。経口投与は胃への強制投与により行った。
【０３０３】
１日目、左頸静脈（ＳＯＰ  ＶＩＶＯ／ＳＡＦ６）にカニューレを埋め込む予定の動物に、イソフルランにより麻酔を施した。実験は、外科手術から回復した１日後から開始した。約５００μＬの血液（２５０μＬの血漿）をカニューレを通してヘパリン化シリンジ（ヘパリンナトリウム）に採取し、直ちに氷／水浴中のマイクロチューブに集めた。１時間以内に、４℃、１００００ｘｇで５分間、試料を遠心分離した。血漿を直ちにマイクロチューブに移し、−２０℃で保管した。血液試料は、投与後、３０分、１時間、１．３時間、２時間および３時間後に採取した。血漿試料を、ＨＰＬＣ−ＥＳ／ＭＳ／ＭＳ定量法を使用して分析した。薬物動態の研究を、ノンコンパートメント法を使用して行った。
【０３０４】
結果：
２種の固体形態の一回分、２０ｍｇ／Ｋｇ−体重を経口投与後、オベチコールの平均血漿中濃度を図３７に示す。値は、各製剤について、６セットの実験の平均である。標準偏差をグラフ中に記す。
【０３０５】
結晶形態を投与後、Ｃｍａｘは１．５時間後に達成され、血漿中オベチコール酸濃度は、通常の速度論に従って１つの最大値をとり、３時間後に投与量がＣｍａｘのほぼ半分になる。
【０３０６】
オベチコール酸形態１（非結晶性）形態１投与後の動態プロファイルは、結晶形態Ｆのものとは異なる。３０分後に、初期の血漿中濃度のピークが得られ、２時間後に第２のピークが得られる。６匹のラットからのデータの変動は極めて低く、この挙動は結晶形態のものとは統計的に異なる。研究した３時間のＡＵＣは結晶形態の方が大きい。速度論からは、オベチコール酸は３時間後にも依然血漿中に存在することが示唆される。オベチコール酸が肝臓を通過すると、肝臓代謝物のタウロ抱合体が生成され、これが胆汁中に分泌され、腸肝循環に蓄積することは以前に示されている。したがって、タウロ抱合体の測定は、肝臓を通るオベチコール酸の通過量の決定に使用することができる。タウロ抱合体の生成を図３８に示すが、これにより、結晶形態を投与した後の方が、タウロ抱合体の生成はより迅速であり、より高濃度であることが示される。
【０３０７】
融点およびガラス転移
オベチコール酸形態１（非結晶性）形態１および結晶形態Ｆの融点を従来法により測定した。参照用化合物として、ケノデオキシコール酸およびウルソデオキシコール酸の融点を測定した。測定は３回行った。結晶形態では、固体から液体状態への転移を融点（Ｔｍ）と定義するが、非結晶性形態ではガラス転移温度（Ｔｇ）と定義する。測定値を摂氏℃およびケルビン°Ｋの両方で次の表に示す。
【０３０８】
【表２３】
2018538331.tif 000046
【０３０９】
結果：
ＣＤＣＡおよびＵＤＣＡについて得た値は、ＵＤＣＡの融点はＣＤＶＡのそれより高いという先の報告と一致している。形態１のガラス転移温度Ｔｇ（１０２〜１１２℃）は、形態Ｆの融点Ｔｍ（１２０〜１２４℃）より低い。２つの固体状態の形態を比較するとき、この観察されたパターンは先に報告されたデータと一致する。形態Ｆは、より高い温度（２３５〜２３７℃）に別の転移を有する。
【０３１０】
ケルビン度で表した最も高い融点とガラス転移点との比は、他の薬物および他の胆汁酸と極めて類似している。（Ｊ．Ｋｅｒｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｒｍｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５（２４８）８１−９５）。
【０３１１】
示差走査熱量分析
オベチコール酸の結晶性および非結晶性形態の融点および物理的状態をより良く定義するために、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）による分析を行った。使用した装置は、Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＤＳＣ８２１ｅ型であった。約４〜５ｍｇの各形態１および形態Ｆを分析に供した。１０℃／ｍｉｎの加熱速度で、３０〜３００℃の温度範囲に化合物を曝露した。
【０３１２】
図３９にオベチコール酸の結晶形態Ｆで得たＤＳＣ曲線を示す。１２０．０４℃に、この化合物の融点に対応する１つの吸熱転移が検出された。この結果は、高温顕微鏡（ＨＳＭ）によっても確かめられた；３０℃〜２４０℃の温度範囲で観察された固体−液体転移は、１２２〜１２４℃であった。ＤＳＣの出力形状において、形態Ｆで得られたピークの形状および強度は、結晶形態が示す典型的な挙動と一致する。しかしながら、ピークの幅は幾分ブロードである；これは均質な結晶でないことが原因であると考えられる。３０〜３００℃の温度範囲で、熱重量分析（ＴＧＡ）はいかなる重量減少も示さなかった。
【０３１３】
図４０にオベチコール酸の非結晶性形態１で得たＤＳＣ曲線を示す。７９．９５℃に１つの吸熱転移を観察した。ピークの形状および強度は、非結晶性化合物に期待される挙動と一致する。これらの物質では、固体−液体転移（ガラス転移）に要するエネルギーは、結晶性化合物より少ない。３０〜３００℃の温度範囲で、サーモグラムはいかなる重量減少も示さなかった。
【０３１４】
水溶性
オベチコール酸形態１（非結晶性）および結晶性形態Ｆの水への溶解度を、当該技術分野で知られている手順により測定した。要約していえば、低ｐＨ（ＨＣｌ  ０．１ｍｏｌ／Ｌ）で固体を水に懸濁させ、僅かに撹拌しながら２５℃で１週間、放置して平衡化させた。飽和溶液を濾過し、溶液中の化合物の濃度をＨＰＬＣ−ＥＳ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。
【０３１５】
【表２４】
2018538331.tif 000047
【０３１６】
形態１は、形態Ｆの９．１μｍｏｌ／Ｌより高い溶解度１７．９μｍｏｌ／Ｌを示した。
【０３１７】
オベチコール酸のバイオアベイラビリティのデータによれば、結晶性形態Ｆの方がオベチコール酸形態１（非結晶性）より高い。形態１の投与後に早期の血漿濃度ピークが認められるものの、血漿プロファイルは、形態Ｆがより効率的に吸収され（より高いＡＵＣ）、かつこの薬物が腸内の内容物中に最適に分布していることを反映して、動態もより安定していることを示している。形態１は、Ｃｍａｘが形態Ｆより低い、この早期のピーク、その後の後期の第２のピークを示す。
【０３１８】
形態１の水への溶解度は、形態Ｆよりも高い。形態Ｆは、熱重量分析（ＴＧＡ）が試験した温度範囲で重量減少を全く示さなかったことから、安定であると思われる。
【０３１９】
これらの結果によれば、形態Ｆは、経口投与の場合に、より効率的に腸に吸収され、肝臓に取り込まれるようである。主たる肝臓の代謝物タウロ抱合体の生成速度は、形態１と比較すると形態Ｆでほぼ２倍であり、腸肝循環および３時間後の血漿中濃度においてより効率的に移動し、かつ蓄積されることを示唆している。
【０３２０】
実施例８：放射能標識したオベチコール酸の調製
以下のスキームにより、放射能標識したオベチコール酸を調製した。
【化２２】
2018538331.tif 000048
【０３２１】
ＮＭＲスぺクトルは、外径５ｍｍの管（Ｎｏｒｅｌｌ、Ｉｎｃ．５０７−ＨＰ）に入れたＣＤＣ１３およびＭｅＯＤ−ｄ４の溶液中３０℃で記録し、Ｖａｒｉａｎ  ＶＮＭＲＳ−４００により４００ＭＨｚで１Ｈについて収集した。ケミカルシフト（δ）はテトラメチルシラン（ＴＭＳ＝０．００ｐｐｍ）からの相対値であり、ｐｐｍで表した。ＥＳＴ（−）イオン化モードで作動させたＡｃｃｅｌａ−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ  Ｆｌｅｅｔを用い、Ｉｏｎ−ｔｒａｐ  Ｍａｓｓ  ＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒによりＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定を行った。ＨＰＬＣは、β−Ｒａｍと直列に繋いだＡｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズ（カラム：Ｘｔｅｒｒａ  ＭＳ  Ｃ８、２５０×４．６ｍｍ、５μｍ、４０℃）により測定した。比放射能は、ＬＳＡ（液体シンチレーション分析器、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ  ２９００ＴＲ）により測定した。
【０３２２】
化合物２Ｘの調製
【化２３】
2018538331.tif 000049
ジイソプロピルアミン（１．５９ｇ、１５．８ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（６．０ｍＬ）溶液に、−２０℃でｎ−ＢｕＬｉ（６．３０ｍＬ、２．５Ｍ、１５．８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を−２０℃で１時間撹拌した後、−７８℃に冷却し、ＴＭＳＣ１（１．７２ｇ、１５．８ｍｍｏｌ）を加え、続いて乾燥ＴＨＦ（６．０ｍＬ）中の化合物１Ｘ（３．００ｇ、６．２９ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を−７８℃で１時間撹拌し、ＮａＨＣＯ３を加えて反応を停止させ、室温で３０分間撹拌した。有機層を分離して真空濃縮し、化合物２Ｘ（３．２９ｇ、９５％）を得、さらなる精製を行わずに次の工程で使用した。
【０３２３】
化合物３Ｘの調製
【化２４】
2018538331.tif 000050
トルエン（１．０ｍＬ）中の［１−１４Ｃ］アセトアルデヒド（３３０ｍＣｉ、５．６３ｍｉｎｏｌ）（［１４Ｃ］ＢａＣＯ３、ＳＡ＝５８．６ｍＣｉ／ｍｍｏｌから調製）と、ＤＣＭ（２．０ｍＬ）中のアセトアルデヒド（１３０ｍｇ、２．９５ｍｍｏｌ）とを−７８℃で混合し、その後、化合物２Ｘ（３．２９ｇ、６．００ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１３．０ｍＬ）溶液に移し、続いて−７８℃でＢＦ３・ＯＥｔ２（１．０５ｇ、７．４０ｍｍｏｌ）を加えた。−７８℃で１時間撹拌した後、反応混合物を３５℃まで加熱し、上記温度で１時間撹拌した。水（１０ｍＬ）を加えて反応を停止させ、ＤＣＭにより水層を抽出し、有機層を一緒にして無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、真空濃縮した。残留物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝５：１〜３：１）で精製して、白色固体の化合物３Ｘ（１０２ｍＣｉ、３１％、ＳＡＷ３７．０ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３，Ｖａｒｉａｎ，４００ＭＨｚ）：８  ０．６５（３Ｈ，ｓ）；０．９３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．０１（３Ｈ，ｓ），１．０６−１．４９（１２Ｈ，ｍ），１．６２−２．０４（７Ｈ，ｍ），１．６９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．１８−２．２８（２Ｈ，ｍ），２．３２−２．４３（２Ｈ，ｍ），２．５８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．８，４．０Ｈｚ），３．６２−３．７０（１Ｈ，ｍ），３．６７（３Ｈ，ｓ），６．１８（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）．
【０３２４】
化合物４Ｘの調製
【化２５】
2018538331.tif 000051
化合物３Ｘ（１０２ｍＣｉ、２．７５ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（６．０ｍＬ）溶液に、室温でＮａＯＨ（２２０ｍｇ、５．５０ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（３．０ｍＬ）溶液を加えた。４５℃で１時間反応混合物を撹拌した後、室温にまで冷却し、減圧下でＭｅＯＨを除去し、Ｈ２Ｏ（１２ｍＬ）で希釈した。水層をＨ３ＰＯ４により酸性化し、ＤＣＭにより抽出し、有機層を真空濃縮した。残留物をＥｔ２Ｏに懸濁させ、沈殿物を濾過により回収して、白色固体の化合物４Ｘ（８６．３ｍＣｉ、８５％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＩ３，Ｖａｒｉａｎ，４００ＭＨｚ）；８  ０．６３（３Ｈ，ｓ），０．９２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），０．９９（３Ｈ，ｓ），１．０４−１．５０（１３Ｈ，ｍ），１．６１−２．０１（７Ｈ，ｍ），１．６７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），２．２１−２．２８（２Ｈ，ｍ），２．３５−２．４１（２Ｈ，ｍ），２．５６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．８，４．０Ｈｚ），３．５８−３．６９（１Ｈ，ｍ），６．１６（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）．
【０３２５】
化合物５Ｘの調製
【化２６】
2018538331.tif 000052
化合物４Ｘ（８６．３ｍＣｉ、２．３５ｍｍｏｌ）と、０．５ＭのＮａＯＨ（１０ｍＬ、５．０ｍｍｏｌ）水溶液中に５％のＰｄ／Ｃ（１００ｍｇ）を加えた混合物とをＨ２雰囲気（バルーン方式）下、室温で１０時間撹拌し、その後、１００℃で１４時間撹拌した。濾過により触媒を除去し、水で洗浄し、濾液をＨ３ＰＯ４により酸性化した。沈殿物を濾過により回収し、固形分をＥｔＯＡｃに溶解し、塩水で洗浄し、ＳｉＯ２ショートパッドを通して濾過し、真空濃縮した。残留固体をＥｔＯＡｃにより再結晶化して白色固体の化合物５Ｘ（６７．７ｍＣｉ、７８％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ−ｄ４，Ｖａｒｉａｎ，４００ＭＨｚ）：８  ０．７１（３１１，ｓ），０．７５−０．８４（１Ｈ，ｍ），０．８１（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），０．９２１．０１（１Ｈ，ｍ），０．９６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），１．０６−１．３８（７Ｈ，ｍ），１．２５（３Ｈ，ｓ），１．４１−１．９６（１２１１，ｍ），２．０１−２．０５（１Ｈ，ｍ），２．１１−２．２４（２Ｈ，ｍ），２．３０−２．３７（１Ｈ，ｍ），２．５０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ），２．８０−２．８５（１Ｈ，ｍ），３．４２−３．４９（１Ｈ，ｍ）．
【０３２６】
［エチル−１−１４Ｃ］オベチコール酸の調製
【化２７】
2018538331.tif 000053
２ＭのＮａＯＨ（４．５０ｍＬ、９．００ｍｍｏｌ）水溶液に化合物５Ｘ（６７．７ｍＣｉ、１．８３ｍｍｏｌ）を加えた溶液に、ＮａＢＨ４（４１６ｍｇ、１１．０ｍｍｏｌ）の１１２０（２．０ｍｌ）溶液を８０℃で加えた。反応混合物を１００℃で２時間撹拌した後、水（６．０ｍＬ）を室温で加えＨ３ＰＯ４により酸性化した。水層をＤＣＭで抽出し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で脱水し、ＳｉＯ２ショートパッドを通して濾過し、真空濃縮した。残留物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：１〜１：３）で精製し、白色固体生成物（４４．０ｍＣｉ、６５％）を得た。生成物（４４．０ｍＣｉ、１．１９ｍｍｏｌ）とオベチコール酸（１２０ｍｇ、０．２８５ｍｍｏｌ）をＥｔＯＡｃ（４ｍＬ）に溶解し、この溶液を５０℃で２時間撹拌し、その後、真空濃縮した。Ｅｔ２Ｏ中に懸濁した残留オイル、すなわち析出物を濾過して回収し、白色固体の［エチル−１−１４Ｃ］オベチコール酸（５６０ｍｇ、３８．５ｍＣｉ、ＳＡ＝２９ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，Ｖａｒｉａｎ，４００ＭＨｚ）：８  ０．６６（３Ｈ，ｓ），０．８８（３１１，ｓ），０．９３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），０．９３（３Ｈ，ｄ，Ｉ＝６．４Ｈｚ），０．９６−１．０４（１Ｈ，ｍ），１．０８−１．５２（１４Ｈ，ｍ），１．５１−１．６０（１０１１，ｍ），２．２２−２．３０（１１１，ｍ），２．３６−２．４４（１Ｈ，ｍ），３．３８−３．４５（１１１，ｍ），３．７１（ＩＨ，ｓ）．
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（ＭＳ：ＬＣＱ  Ｆｌｅｅｔ）：ＭＳ計算値：４２１．５６；ＭＳ測定値：４２１．０７［Ｍ−Ｈ］−。
ラジオＴＬＣ：シリカ６０Ｆ２５４のＴＬＣプレートおよび移動相はＥｔＯＡｃ。放射化学的純度９８．９０％、Ｒｆ＝０．６７５
ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズ）：移動相；アセトニトリル：５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝３）：ＭｅＯＨ＝４５０：４５０：１００。
放射化学的純度９８．１９％（β−ｒａｍ）、Ｒｔ＝２０．００分。
［エチル−１−１４Ｃ］オベチコール酸は分子式１４Ｃ１Ｃ２５Ｈ４４Ｏ４を有し、ＬＳＣ測定による比放射能２９ｍＣｉ／ｍｍｏｌにおいて分子量４２１．４６を有する。
【０３２７】
実施例９．結晶性オベチコール酸の合成
形態Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、およびＩの選択的合成手順を識別し、以下に示した。これらの実験結果を表５に示す。
【０３２８】
手順１：冷却、その後の熟成
非晶質オベチコール酸（約３０ｍｇ）を秤量し、ガラス製バイアルに入れ、５０℃に温めた。５０℃で、２体積（６０μｌ）のアセトニトリルを加えた。最初、試料はガムを形成したが、これは溶媒１４体積を加えた後は溶解した。撹拌すると、固体の薄片の沈殿が観察された。０．２５℃／ｍｉｎの直線的冷却速度で、試料を５℃に冷却した。得られた懸濁物をＸＲＰＤにより分析し、熟成させた（５０℃／ＲＴの８時間のサイクルで振盪した）。５日間の熟成後、試料を室温に戻し、ＸＲＰＤで再分析した。
【０３２９】
手順２：冷却
非晶質オベチコール酸（約３０ｍｇ）を秤量してガラス製バイアルに入れ、５０℃に温めた。溶媒を加え（表５の通り）、観察した。試料を５０℃で１時間撹拌し、その後、０．１℃／ｍｉｎの直線的冷却速度で５℃まで冷却した。試料を５℃で２日間撹拌した。固形分を濾過し、空気乾燥し、ＸＲＰＤにより分析した。溶液を冷凍庫で約４８時間保存し、その後、周囲条件に放置して蒸発させた。固体をＸＲＰＤにより分析した。
【０３３０】
手順３：逆溶媒の添加、その後の冷却
非晶質オベチコール酸（約３０ｍｇ）を秤量してガラス製バイアルに入れ、５０℃に温めた。溶媒を（表５の通り）加えて非晶質物質を溶解し、その後、逆溶媒（ヘプタン、体積は表５の通り）を加えて観察した。試料を５０℃で１時間撹拌し、その後、０．１℃／ｍｉｎの直線的冷却速度で５℃まで冷却した。試料を５℃で２日間撹拌した。固形分を濾過し、空気乾燥し、ＸＲＰＤにより分析した。
【０３３１】
手順４：熟成
非晶質オベチコール酸（約３０ｍｇ）を秤量してガラス製バイアルに入れ、５０℃に温めた。溶媒を加え（表５の通り）非晶質物質を溶解した。試料を５０℃で１時間撹拌し、その後、熟成させた（５０℃／ＲＴの８時間のサイクルで振盪した）。３日後、固形分を含有する試料を濾過し、空気乾燥してＸＲＰＤで分析した。溶液状試料は、冷却器の上限温度で熟成させ（４０℃／ＲＴの４時間のサイクルで撹拌した、手順４ｂ）、１〜２日後に、生成した固体をＸＲＰＤにより分析した。
【０３３２】
手順５：逆溶媒、その後の冷却
非晶質オベチコール酸（約３０ｍｇ）を秤量してガラス製バイアルに入れ、５０℃に温めた。ＭＴＢＥ（９０μｌ、３体積）を加えて非晶質物質を溶解し、その後、逆溶媒（ヘプタン９０μｌ、３体積）を加えて観察した。試料を５０℃で１時間撹拌し、その後、０．２℃／ｍｉｎの直線的冷却速度で２５℃まで冷却した。２５℃で約３０分後に、得られた固形分を濾過し、空気乾燥し、ＸＲＰＤにより分析した。
【０３３３】
手順６：熟成
非晶質オベチコール酸（約３０ｍｇ）を秤量し、ガラス製バイアルに入れ、５０℃に温めた。非晶質物質を溶解するためにアニソール（９０μＬ、３体積）を加えた。試料を全部で１７日間熟成した（４０℃／ＲＴの４時間のサイクルで振盪した）。
【０３３４】
手順７：冷スラリー
非晶質オベチコール酸（約３０ｍｇ）を秤量してガラス製バイアルに入れ、５℃に冷却した。アセトニトリル／水の混合物（同様に５℃に予冷）を加え、試料を５℃で終夜撹拌した。観察を行い、固形分を濾過し、空気乾燥してＸＲＰＤで分析した。いくつかの固体は大きな塊であり、これらはＸＲＰＤ分析の前に粉砕した。１つの試料は粘着性の固体であったので、５℃で合計１７日間撹拌して硬質の固体塊を生成し、これを粉砕してＸＲＰＤで分析した。
【０３３５】
手順８：冷却
非晶質オベチコール酸（約３０ｍｇ）を秤量し、ガラス製バイアルに入れ、５０℃に温めた。非晶質物質を溶解するために溶媒（表５を参照されたい）を加え、５０℃で１時間試料を撹拌した。０．１℃／ｍｉｎの直線的冷却速度で試料を−２０℃に冷却した。−２０℃で終夜撹拌した後、試料を室温に戻し、得られた固形分を濾過し、空気乾燥してＸＲＰＤにより分析した。
【０３３６】
【表２５】
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【０３３７】
Ａ．結晶性オベチコール酸形態Ｄの小規模合成
１つの方法では、非晶質オベチコール酸（約３０ｍｇ）を秤量してガラス製バイアルに入れ、５０℃に温めた。メチルイソブチルケトン（９０μＬ）を加え、観察した。試料を５０℃で１時間撹拌し、その後、０．１℃／ｍｉｎの直線的冷却速度で５℃まで冷却した。試料を５℃で２日間撹拌した。固形分を濾過し、空気乾燥しＸＲＰＤにより分析した。溶液を冷凍庫に約４８時間保存し、その後、周囲条件に放置して蒸発させた。固体をＸＲＰＤで分析し、ピークを表６に示す。
【０３３８】
【表２６】
2018538331.tif 000055
【０３３９】
Ｂ．結晶性オベチコール酸形態Ｄの大規模合成
１つの方法では、非晶質オベチコール酸（約１ｇ）を秤量し、大型のガラス製バイアルに入れ、５０℃に温めた。ＭＩＢＫ（２．０ｍｌ、２体積）を５０℃で加え、撹拌すると透明溶液が生成した。試料を５０℃で２時間撹拌し、その後、０．１℃／ｍｉｎの直線的冷却速度で−２０℃まで冷却した。試料を−２０℃で終夜撹拌し、その後、少量の固形分を濾過し、空気乾燥し、ＸＲＰＤにより分析した。残りの試料は、０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターを通して濾過した。試料を約３０分間空気乾燥し、その後、真空オーブン中、室温で終夜乾燥した。得られた白色固体は形態Ｄとして特徴付けられた。図４５は結晶性オベチコール酸形態ＤのＸＲＰＤディフラクトグラムである。図４６は結晶性オベチコール酸形態ＤのＴＧＡとＤＳＣサーモグラムのオーバーレイである。図４７は結晶性オベチコール酸形態Ｄを用いたＧＶＳ実験の等温プロットである。図４８は結晶性オベチコール酸形態Ｄを用いたＧＶＳ実験の動態プロットである。
【０３４０】
Ｃ．結晶性オベチコール酸形態Ｆの小規模合成
１つの方法では、非晶質オベチコール酸（約３０ｍｇ）を秤量し、ガラス製バイアルに入れ、５０℃に温めた。非晶質物質を溶解するためにニトロメタンを加えた。試料を５０℃で１時間撹拌し、その後、熟成させた（５０℃／ＲＴの８時間のサイクルで振盪した）。３日後、固形分を含有する試料を濾過し、空気乾燥してＸＲＰＤで分析した。固体をＸＲＰＤで分析し、ピークを表７に示す。
【０３４１】
【表２７】
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【０３４２】
Ｄ．結晶性オベチコール酸形態Ｆの大規模合成
１つの方法では、オベチコール酸（約１ｇ）を秤量し、大型のガラス製バイアルに入れ、５０℃に温めた。５０℃でニトロメタン（１５．０ｍｌ、１５体積）を加えると、試料からゴム状の固体ボールが生成した。試料を終夜熟成（５０℃／ＲＴの８時間のサイクルで振盪した）させると、試料は大きい硬質固体の塊と針状粒子の懸濁液になった。固体のいくらかを白色粉末に粉砕し、ＸＲＰＤにより分析した。固体の塊を手動で砕き、さらに２４時間熟成させた。得られた懸濁液の少量を濾過し、空気乾燥し、ＸＲＰＤにより分析した。試料の残りを０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターを通して濾過した。試料を約４０分間空気乾燥し、その後、真空オーブン中４０℃で終夜乾燥した。得られた白色固体は形態Ｆとして特徴付けられた。図４９は結晶性オベチコール酸形態ＦのＸＲＰＤディフラクトグラムである。図５０は結晶性オベチコール酸形態ＦのＴＧＡとＤＳＣサーモグラムのオーバーレイである。図５１は形態Ｆを用いたＧＶＳ実験の等温プロットである。図５２は形態Ｆを用いたＧＶＳ実験の動態プロットである。
【０３４３】
Ｅ．結晶性オベチコール酸形態Ｇの小規模合成
１つの方法では、非晶質オベチコール酸（約３０ｍｇ）を秤量し、ガラス製バイアルに入れ、５０℃に温めた。５０℃で、２体積（６０μｌ）のアセトニトリルを加えた。最初、試料はガムを生成したが、これは溶媒１４体積を加えた後は溶解した。撹拌すると、固体の薄片の沈殿が観察された。０．２５℃／ｍｉｎの直線的冷却速度で、試料を５℃に冷却した。得られた懸濁物をＸＲＰＤにより分析し、その後、熟成させた（５０℃／ＲＴの８時間のサイクルで振盪した）。５日間の熟成後、試料を室温に戻し、ＸＲＰＤで再分析した。ピーク群を表８に示す。
【０３４４】
【表２８】
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【０３４５】
Ｆ．結晶性オベチコール酸形態Ｇの大規模合成
非晶質オベチコール酸（約１００ｍｇ）を秤量し、ガラス製バイアルに入れ、５０℃に温めた。１００ｍｇ規模の実験を１０件並行して行った。各試料にアセトニトリル（０．５ｍｌ、５体積、５０℃に予め加熱）を加えると、５０℃で放置することにより大部分が溶解する、無色のガムが生成した。各試料には、小規模実験の生成物約１ｍｇを、種として加え、３日間熟成した（５０℃／ＲＴの８時間のサイクルで振盪）。熟成後、試料はバイアルの壁面に結晶を含有し、バイアルの底には、掻き取ると白色粉末になる硬質の固体を含有した。各試料をＸＲＰＤにより分析し、その試料は全て０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターを通して濾過し、一緒にした。試料を約３０分間空気乾燥し、その後、真空オーブン中、室温で終夜乾燥した。得られた白色固体（７９５．８ｍｇ）は形態Ｇとして特徴付けられ、同定された。図５３は結晶性オベチコール酸形態ＧのＸＲＰＤディフラクトグラムである。図５４は結晶性オベチコール酸形態ＧのＴＧＡとＤＳＣサーモグラムのオーバーレイである。図５５は形態Ｇを用いたＧＶＳ実験の等温プロットである。図５６は形態Ｇを用いたＧＶＳ実験の動態プロットである。
【０３４６】
Ｇ．結晶性オベチコール酸形態Ｉの小規模合成
１つの方法では、非晶質オベチコール酸（約３０ｍｇ）を秤量してガラス製バイアルに入れ、５℃に冷却した。アセトニトリル／水の混合物（５０／５０、６０μＬ）を加え、試料を５℃で終夜撹拌した。観察を行い、固形分を濾過し、空気乾燥してＸＲＰＤで分析した。いくつかの固体は大きな塊であり、これらはＸＲＰＤ分析の前に粉砕した。１つの試料は粘着性の固体であったので、５℃で合計１７日間撹拌して硬質固体塊を形成し、これを粉砕してＸＲＰＤで分析した。図９にそのピークを示す。
【０３４７】
【表２９】
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【０３４８】
Ｈ．結晶性オベチコール酸形態Ｉの大規模合成
非晶質オベチコール酸（約１ｇ）を秤量し、大型のガラス製バイアルに入れ、５℃に冷却した。アセトニトリル／水混合物（２ｍｌ、５０／５０体積／体積の２体積予備混合物、５℃に予め冷却）を加えると、試料からオフホワイトでゴム状の大きな固体の塊が生成した。試料を５℃で終夜撹拌したところ、硬質白色固体の大きな塊となった。固体の塊を白色粉末に粉砕し、少量を濾過し、空気乾燥してＸＲＰＤにより分析した。試料を５℃でさらに４日間撹拌し、その後、生じた少量の懸濁物を濾過し、空気乾燥し、ＸＲＰＤにより分析した。残りの試料は、０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターを通して濾過した。試料を約４０分間空気乾燥し、その後、真空オーブン中、室温で終夜乾燥した。得られた白色固体（９５５．４ｍｇ）を特徴付けした。図５７は結晶性オベチコール酸形態ＩのＸＲＰＤディフラクトグラムである。図５８は結晶性オベチコール酸形態ＩのＴＧＡとＤＳＣサーモグラムのオーバーレイである。図５９は形態Ｉを用いたＧＶＳ実験の等温プロットである。図６０は形態Ｉを用いたＧＶＳ実験の動態プロットである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
2018538331.tif 000074
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2018538331.tif 000077
【図１４】
2018538331.tif 000078
【図１５】
2018538331.tif 000079
【図１６】
2018538331.tif 000080
【図１７】
2018538331.tif 000081
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2018538331.tif 000084
【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
2018538331.tif 000089
【図２３Ｄ】
2018538331.tif 000090
【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２４】
2018538331.tif 000093
【図２５】
2018538331.tif 000094
【図２６】
2018538331.tif 000095
【図２７】
2018538331.tif 000096
【図２８】
2018538331.tif 000097
【図２９】
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【図３０】
2018538331.tif 000099
【図３１】
2018538331.tif 000100
【図３２】
2018538331.tif 000101
【図３３】
2018538331.tif 000102
【図３４】
2018538331.tif 000103
【図３５】
2018538331.tif 000104
【図３６】
2018538331.tif 000105
【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
2018538331.tif 000110
【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
2018538331.tif 000119
【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【国際調査報告】
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