(57)【要約】  エンドスタチンの突然変異体が提供される。前記突然変異体は、改善されたＡＴＰアーゼ活性ならびに改善された血管新生阻害および腫瘍阻害活性を有する。さらに、腫瘍などの血管新生関連疾患の治療における突然変異体の使用が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドスタチンまたはその変異体のＡＴＰアーゼ活性を増加させることを含む、エンドスタチンまたはその変異体の抗血管新生活性を増加させる方法。
【請求項２】
ＡＴＰアーゼ活性を増加させたエンドスタチン突然変異体を得るためのエンドスタチンまたはその変異体のＡモチーフおよび／またはＢモチーフおよび／またはＣモチーフに対する遺伝子工学を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子工学が以下のアプローチ：（１）配列番号１のＡモチーフＧＸＸＧＸＸＫにおいて保存されているアミノ酸残基Ｇ８９、Ｇ９２、およびＫ９５に対応するアミノ酸残基を変更せずに維持すること；（２）ＡモチーフＧＸＸＧＸＸＫ内の可変残基Ｘを調整することによりＡモチーフに対応するペプチドの空間的立体配座の柔軟性を高めること；（３）ＡモチーフＧＸＸＧＸＸＫの古典的配列の残基Ｋ９５の後にＳｅｒまたはＴｈｒを付加すること；（４）Ａモチーフの変化に応じてＢモチーフを調整すること；（５）Ｃモチーフのアミノ酸残基を部分的にまたは完全に変異させること；（６）Ｂモチーフの変化に応じてＣモチーフを調整すること；（７）Ａモチーフの変化に応じてＣモチーフを調整すること；（８）Ａ、Ｂ、およびＣモチーフを同時に変化させること、のうちの１以上を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｂモチーフを変更せずに維持する、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記エンドスタチン突然変異体がヒトエンドスタチン突然変異体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記エンドスタチン突然変異体が配列番号３〜３４および配列番号３７〜３９からなる群から選択される配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記エンドスタチン突然変異体が以下の群：配列番号３、配列番号２０、配列番号２１および配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０から選択される配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
抗血管新生活性を増加させた、エンドスタチンまたはその変異体の突然変異体であって、前記突然変異体は、そのＡＴＰ結合モチーフ内に突然変異を含んでなり、かつ、対応する野生型エンドスタチンまたはその変異体に比べて増加したＡＴＰアーゼ活性を有する、前記突然変異体。
【請求項９】
前記突然変異体のＡＴＰアーゼ活性を、対応する野生型エンドスタチンまたはその変異体に比べて少なくとも約１００％増加させた、請求項８に記載の突然変異体。
【請求項１０】
前記突然変異体のＡＴＰアーゼ活性を、対応する野生型エンドスタチンまたはその変異体に比べて少なくとも約２００％増加させた、請求項８に記載の突然変異体。
【請求項１１】
前記突然変異体のＡＴＰアーゼ活性を、対応する野生型エンドスタチンまたはその変異体に比べて少なくとも約３００％増加させた、請求項８に記載の突然変異体。
【請求項１２】
前記突然変異体が、配列番号１の８９〜９５番のアミノ酸残基からなるＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓモチーフに相当する配列に突然変異を含み、かつ、前記突然変異が１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、および／もしくは付加、またはそれらの組合せから選択され、かつ、前記突然変異が前記突然変異体のＡＴＰアーゼ活性を増加させる、請求項８に記載の突然変異体。
【請求項１３】
配列番号１の８９〜９５番のアミノ酸残基からなるＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓモチーフに相当する前記突然変異体の配列が部分的にまたは完全に欠失している、請求項１２に記載の突然変異体。
【請求項１４】
配列番号１の８９、９２および９５番のアミノ酸残基に相当する前記突然変異体の１以上のアミノ酸残基が部分的にまたは完全に置換されているか、または欠失している、請求項１２に記載の突然変異体。
【請求項１５】
（ａ）配列番号１の８９番のＧｌｙに相当するアミノ酸残基が欠失している、または非電荷もしくは芳香族アミノ酸で置換されている；あるいは
（ｂ）配列番号１の９２番のＧｌｙに相当するアミノ酸残基が欠失している、または非電荷アミノ酸で置換されている；あるいは
（ｃ）配列番号１の９５番のＬｙｓに相当するアミノ酸残基が欠失している、または正電荷もしくは非電荷アミノ酸で置換されている；あるいは
（ａ）〜（ｃ）の任意の組合せである、
請求項１２に記載の突然変異体。
【請求項１６】
（ａ）配列番号１の８９のＧｌｙに相当するアミノ酸残基が欠失している、またはＡｌａもしくはＰｒｏで置換されている；あるいは
（ｂ）配列番号１の９２番のＧｌｙに相当するアミノ酸残基が欠失している、またはＡｌａで置換されている；あるいは
（ｃ）配列番号１の９５番のＬｙｓに相当するアミノ酸残基が欠失している、またはＡｒｇもしくはＧｌｎで置換されている；あるいは
（ａ）〜（ｃ）の任意の組合せである、
請求項１５に記載の突然変異体。
【請求項１７】
前記突然変異体が配列番号３〜３４および配列番号３７〜３９からなる群から選択される配列を有する、請求項８に記載の突然変異体。
【請求項１８】
前記突然変異体が、以下の群：配列番号３、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０から選択される配列を有する、請求項８に記載の突然変異体。
【請求項１９】
ヒトエンドスタチンまたはその変異体の突然変異体である、請求項８〜１８のいずれか一項に記載の突然変異体。
【請求項２０】
請求項８〜１８のいずれか一項に記載の突然変異体と薬学上許容可能な担体とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項２１】
前記突然変異体がＰＥＧ分子と共有結合している、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記ＰＥＧ分子が５〜４０ｋＤの分子量である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記ＰＥＧ分子が前記突然変異体のＮ末端においてαアミノ基と共有結合している、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記ＰＥＧ分子がモノメトキシポリエチレングリコールである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記モノメトキシポリエチレングリコールがモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
患者に有効量の請求項８〜１８のいずれか一項に記載の突然変異体または請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、血管新生関連疾患を治療する方法。
【請求項２７】
前記血管新生関連疾患が腫瘍、肥満、脂肪肝、またはインスリン抵抗性である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２８】
血管新生関連疾患を治療するための医薬の製造における、請求項８〜１８のいずれか一項に記載の突然変異体の使用。
【請求項２９】
前記血管新生関連疾患が腫瘍、肥満、脂肪肝、またはインスリン抵抗性である、請求項２８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な組換えタンパク質薬に関する。具体的には、本発明は、天然エンドスタチンに比べて、より高いＡＴＰアーゼ活性ならびにより高い血管新生阻害および腫瘍成長阻害活性を有するエンドスタチンの変異体を提供する。本発明はまた、腫瘍および他の血管新生関連疾患の治療における前記変異体の使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
１９９７年に、ハーバード大学のＪｕｄａｈ  Ｆｏｌｋｍａｎ博士は内因性血管新生阻害剤：エンドスタチン（本明細書ではＥＳと略す）を発見した。ＥＳは、コラーゲンＸＶＩＩＩのカルボキシル末端由来の酵素消化産物であり、分子量は約２０ｋＤａであり、１８３個のアミノ酸残基を含んでなる。組換えエンドスタチンは、薬剤耐性を示すことなく種々のマウス腫瘍を阻害することができ、あるいは治癒することさえできる(Folkman J. et al. Cell 1997; 88:277-285; Folkman J. et al. Nature 1997; 390:404-407)。腫瘍阻害におけるＥＳの機序は、その血管新生を阻害すること、ならびに腫瘍への栄養素および酸素の供給を遮断することである。
【０００３】
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）は、生命にとって最も基本的なエネルギー源であり、生命活動の維持に極めて重要である。正常な生理状態では、細胞および血液のＡＴＰのモル濃度はそれぞれ１〜１０ｍＭおよび１００μＭである。アデノシントリホスファターゼとも呼ばれるＡＴＰアーゼは、ＡＴＰの加水分解によるエネルギー放出、および同時にアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）およびリン酸イオン（Ｐｉ）の産生を触媒する酵素種である。加えて、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）に含まれる高エネルギー結合もまたタンパク質生合成にエネルギーを供給し得る。
【０００４】
Ｈｓｐ９０、ミオシンなどの多くの重要なタンパク質は、エネルギー供給をＡＴＰに依存する。これらのタンパク質はそれら自体、通常、ＡＴＰアーゼ活性を有する。様々なＡＴＰアーゼは配列および三次構造が異なるが、それらは通常ＡＴＰ結合モチーフ、すなわち、Ｐループ構造を持つ(Andrea T. Deyrup, et al., 1998, JBC, 273(16):9450-9456)。Ｐループ構造に典型的な配列はＧＸＸＧＸＸＫであり(Driscoll, W. J., et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92:12328-12332)、配列中、Ｘは任意のアミノ酸残基を表し、他のアミノ酸残基（２つのＧおよび１つのＫ）は、比較的よく保存されている。通常、これらのＡＴＰアーゼ中のＡＴＰ結合モチーフはＧＴＰとも結合でき、従って、多くのＡＴＰアーゼがＧＴＰアーゼ活性も同時に持つ。
【０００５】
腫瘍を有する場合、癌細胞および新血管内皮細胞は極めて活発な代謝活性を有し、その代謝は正常な成熟細胞のものとは大きく異なる。一方、癌細胞および活発に増殖している細胞は多量のＡＴＰを消費する必要があり、他方、癌細胞および活発に増殖している細胞がグルコースからＡＴＰを産生する効率はむしろ低く、このような好気的解糖によるＡＴＰ産生の低効率の方法は、「ワールブルグ効果」と呼ばれる。この方法におけるＡＴＰ産生の効率は極めて低いが、細胞構造の組み立てに使用可能な多数の構成ブロックがこのプロセスで産生され、しかしながらこのプロセスは細胞増殖にとってより有用である(Matthew G., et al., 2009, Science, 324:1029-1033)。
【０００６】
従来技術では、天然エンドスタチンは極めて高いＡＴＰアーゼ活性を有し、その配列（配列番号１）の８９〜９５番のアミノ酸Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓは、ＧＸＸＧＸＸＫの形態の古典的ＡＴＰ結合モチーフを有することが示されている。従来技術では、ＥＳのＡＴＰアーゼ活性は、ＥＳの内皮細胞移動阻害活性と負の関係があることが示され、この現象はワールブルグ効果によって説明することができる。このパターンは、ＡＴＰアーゼ活性を低下させた一連のＥＳ突然変異体で証明および解明されている（ＰＣＴ／ＣＮ２０１２／０８１２１０）。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ＥＳのＡＴＰアーゼ活性、およびこのような活性に基づくＥＳ薬設計およびより高い抗腫瘍活性を有するＥＳ突然変異体に関する。
【０００８】
ＧＸＸＧＸＸＫの形態の古典的ＡＴＰ結合モチーフに加え、天然ＥＳ分子はＡＴＰアーゼ活性に関連する別の部位、すなわち、天然ＥＳ配列（配列番号１）の１７１〜１７５番に補助結合モチーフＶａｌ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕも有することが本発明により見出され、前記モチーフは別の古典型のＡＴＰ結合モチーフ：ｈｈｈｈＥ（配列中、ｈは疎水性アミノ酸残基を表す）に従う。
【０００９】
また、２つのＡＴＰ結合モチーフが調整された場合にのみ、ＥＳのＡＴＰアーゼ活性は保証され得ることも本発明により見出される。これら２つのモチーフ内で、ＧＸＸＧＸＸＫ結合モチーフを有する部位が主要な結合および触媒機能を遂行し、ｈｈｈｈＥ形態の結合モチーフは、ＥＳと基質ＡＴＰの結合状態に影響を与えることによりＡＴＰアーゼ活性に重要な影響を持つ。従って、ＥＳのＡＴＰアーゼ活性は、これら２つのＡＴＰ結合モチーフのアミノ酸残基の欠失、挿入または置換によって変化させることができる。
【００１０】
本発明において、ＥＳ分子内の、ＧＸＸＧＸＸＫの形態を有するＡＴＰ結合モチーフは、Ｗａｌｋｅｒ  Ａモチーフ（すなわち、Ａモチーフ）と呼ばれる。このＡモチーフは、主要な触媒的働きを果たす。ＥＳのＡＴＰアーゼ活性は、Ａモチーフのアミノ酸残基の欠失、挿入または置換によって増加（増強）または低下（低減）させ得る。
【００１１】
本発明において、ＥＳ分子内の、ｈｈｈｈＥの形態を有するＡＴＰ結合モチーフは、Ｗａｌｋｅｒ  Ｂモチーフ（Ｂモチーフ）と呼ばれる。Ｂモチーフは主としてＥＳとＡＴＰの結合を助け、ＡＴＰの加水分解を直接触媒することはしない。従って、Ｂモチーフのアミノ酸残基の欠失、挿入または置換は、通常、ＥＳのＡＴＰアーゼ活性を低下させるだけである。しかしながら、理論的には、特定のＡモチーフに関して、Ｂモチーフにおける適当な変化はＡＴＰアーゼ活性の増加もまた引き起こし得る。よって、ＡＴＰアーゼ活性が改善されたＥＳ突然変異体が望まれるなら、ＡモチーフおよびＢモチーフは薬物設計において適合して調節されなければならない。
【００１２】
驚くべきことに、本発明により、ＡＴＰアーゼ活性が有意に改善されたＥＳ突然変異体に関して、それらの内皮細胞の移動を阻害し、腫瘍を阻害する活性は、天然ＥＳおよびＡＴＰアーゼ活性を低下させたＥＳ突然変異体の活性よりも有意に高いことが見出された。
【００１３】
ＥＳは、抗血管新生タンパク質であり、その最も基本的な機能は、内皮細胞の活性を抑制することにより血管新生を阻害することであり、よって、それは腫瘍、網膜黄斑変性、肥満、糖尿病などの血管新生関連疾患を治療することができる。本発明者らは、より高いＡＴＰアーゼ活性を有するＥＳ突然変異体が、血管新生関連疾患（例えば、腫瘍、肥満、脂肪肝、インスリン抵抗性など）の阻害に、天然ＥＳまたはＡＴＰアーゼ活性を低下させたＥＳ突然変異体よりも改善した活性を示すことを見出した。
【００１４】
加えて、ＥＳの抗血管新生活性とそのＡＴＰアーゼ活性の間の関連の発見に基づき、ＡＴＰアーゼ活性をさらに変更する（例えば、増加させる）ために、従って、腫瘍などの血管新生関連疾患をより良好に阻害するＥＳ薬を得るために、ＥＳ突然変異体を分子クローニングアプローチによって設計することができる。
【００１５】
本発明はまた、ＥＳまたはその変異体のＡＴＰアーゼ活性を増加させることを含む、ＥＳまたはその変異体の抗腫瘍活性を改善する方法を提供する。具体的には、ＡＴＰアーゼ活性を増加させたＥＳまたはその変異体の突然変異体を得るために、遺伝子工学的アプローチによりＥＳまたはその変異体の２つのＡＴＰ結合モチーフに突然変異を導入することができ、前記突然変異体は、内皮細胞移動阻害活性の増加および腫瘍阻害活性の増加など、改良された生物学的活性を有する。
【００１６】
本発明はまた、抗血管新生活性を増加させたＥＳ突然変異体であって、そのＡＴＰ結合モチーフに突然変異を含み、かつ、野生型ＥＳまたはそのいくつかの変異体に比べて高いＡＴＰアーゼ活性を有するＥＳ突然変異体を提供する。
【００１７】
好ましくは、野生型ＥＳと比較した場合、前記ＥＳ突然変異体のＡＴＰアーゼ活性は少なくとも１００％増加し、これは前記ＥＳ突然変異体のＡＴＰアーゼ活性が野生型ＥＳの活性の２００％、野生型ＥＳの活性の３００％またはそれを超える活性であることを意味する。ＡＴＰアーゼ活性を低下させる操作スキームに比べて、ＡＴＰアーゼ活性を増加させる操作スキームは、最適化に大きな余地がある。
【００１８】
いくつかの実施形態では、対応する野生型ＥＳまたはその変異体と比較した場合、ＡＴＰアーゼ活性を増加させた突然変異体は、そのＡＴＰ結合モチーフのＡモチーフに突然変異を含む。例えば、前記突然変異体は、配列番号１の８９〜９５番のアミノ酸残基からなるＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓモチーフに対応する配列に突然変異を含み、前記突然変異は、１もしくは数個のアミノ酸の欠失、挿入もしくは置換、またはそれらの組合せから選択され、前記突然変異は、前記突然変異体のＡＴＰアーゼ活性の増加をもたらす。
【００１９】
いくつかの実施形態では、Ａモチーフ、すなわち、配列番号１の８９〜９５番のアミノ酸残基からなるＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓモチーフに対応する前記突然変異体の配列が変異され、前記突然変異は、前記突然変異体のＡＴＰアーゼ活性の増加をもたらす。
【００２０】
いくつかの実施形態では、前記突然変異体は、野生型ＥＳまたはその変異体と比較した場合にＢモチーフに突然変異を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、配列番号１の１７１〜１７５番のアミノ酸残基からなるＢモチーフ、すなわち、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ補助結合モチーフに対応する前記突然変異体の配列は、部分的にまたは完全に変異を受けている。
【００２２】
また、本発明により、ＥＳにＣモチーフ（Ｗａｌｋｅｒ  Ｃモチーフ）、すなわち、配列番号１の１４１〜１４４番のアミノ酸残基からなるＧｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒモチーフが存在し、それはＥＳの抗血管新生活性に重要な効果を持つことも見出された。
【００２３】
いくつかの実施形態では、Ｃモチーフ、すなわち、配列番号１の１４１〜１４４番のアミノ酸残基からなるＧｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒモチーフに相当する前記突然変異体の配列は、部分的にまたは完全に変異され、ＥＳのＡＴＰアーゼ活性および抗血管新生活性を増加させることができる。
【００２４】
好ましくは、Ｃモチーフに対応する配列番号１の１４１〜１４４番のアミノ酸残基からなるＧｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒモチーフは、ＥＳの抗血管新生機能を増加させ得るＡｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｌａに完全に変異されている。
【００２５】
好ましくは、突然変異体のＣモチーフに対応するモチーフの突然変異操作は、ＥＳの抗血管新生機能をさらに増加させるためにＡおよびＢモチーフの突然変異操作と組み合わせて行うことができる。
【００２６】
好ましくは、以下の操作スキームをＥＳまたはその変異体に適用すると、そのＡＴＰアーゼ活性を増加させる：（１）配列番号１のＡモチーフＧＸＸＧＸＸＫにおいて保存されているアミノ酸残基Ｇ８９、Ｇ９２、およびＫ９５に対応するアミノ酸残基を変更せずに維持すること；（２）ＡモチーフＧＸＸＧＸＸＫ内の可変残基Ｘを調製することによりＡモチーフに対応するペプチドの空間的立体配座の柔軟性を高めること；（３）ＡモチーフＧＸＸＧＸＸＫの古典的配列の残基Ｋ９５の後にＳｅｒまたはＴｈｒを付加すること；（４）Ａモチーフの変化に応じてＢモチーフを調整すること；（５）Ｃモチーフのアミノ酸残基を部分的にまたは完全に変異させること；（６）Ｂモチーフの変化に応じてＣモチーフを調整すること；（７）Ａモチーフの変化に応じてＣモチーフを調整すること；（８）Ａ、Ｂ、およびＣモチーフを同時に変化させること。
【００２７】
上記の８つのスキームはそれぞれ単独で使用することができ、より好ましくは、ＡＴＰアーゼ活性を増加させたより良いＥＳ突然変異体を得るために組み合わせて使用することができる。
【００２８】
詳細な実施形態では、本発明のＥＳ突然変異体は、以下の群：配列番号３〜３４および配列番号３７〜３９から選択される配列を有する。好ましくは、本発明のエンドスタチン突然変異体は、以下の群：配列番号３、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０から選択される配列を有する。
【００２９】
好ましくは、上記のような本発明のＥＳ突然変異体は、ヒトＥＳ突然変異体である。
【００３０】
より好ましくは、上記のような本発明のＥＳ突然変異体は、ＡＴＰアーゼ結合部位に突然変異を含んでなる。
【００３１】
本発明はまた、上記のような本発明のＥＳ突然変異体と薬学上許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物も提供する。本発明の医薬組成物では、前記ＥＳ突然変異体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子と共有結合している。好ましくは、前記ＰＥＧ分子は、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）であり、前記ＰＥＧ分子の分子量は５〜４０ｋＤ、例えば、５〜２０ｋＤ、または２０〜４０ｋＤであり得、好ましくは、前記ＰＥＧ分子の分子量は２０ｋＤであり、例えば、２０ｋＤのモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、例えば、モノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）またはモノメトキシポリエチレングリコールブチラルド（ｍＰＥＧ−Ｂｕｔｙ）である。
【００３２】
好ましくは、ＰＥＧ分子は、前記ＥＳ突然変異体のＮ末端においてαアミノ基と共有結合している。
【００３３】
本発明の医薬組成物は、当技術分野で周知の薬学上許容可能な担体を用いる常法により、例えば、それを散剤または注射剤に処方することにより得ることができる。
【００３４】
用語「治療上有効な量」は、本明細書で使用する場合、ヒト身体において、臨床家により求められる生物学的または医学的応答を生じるのに十分な有効化合物の量を意味する。この用量は使用する化合物、投与様式、疾患の状態およびその他の因子によって異なると認識される。患者に許容可能な典型的な一日用量は、体重１ｋｇ当たり０．０１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲であり得る。
【００３５】
本発明はまた、腫瘍患者に上記のような本発明のＥＳ突然変異体または本発明の医薬組成物を投与することを含んでなる、腫瘍を治療するための方法を提供する。対象への投与は、好都合には静注などの当業者に公知の方法によって実施され得る。
【００３６】
本発明はまた、肥満、脂肪肝またはインスリン抵抗性に苦しむ患者に、上記のような本発明のＥＳ突然変異体または本発明の医薬組成物を投与することを含んでなる、肥満、脂肪肝またはインスリン抵抗性を治療する方法も提供する。
【００３７】
本発明はまた、血管新生関連疾患の治療のための医薬の製造における上記のようなＥＳ突然変異体の使用に関する。例えば、前記血管新生関連疾患は、腫瘍、肥満、脂肪肝、インスリン抵抗性などであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、操作された細菌におけるＥＳ突然変異体Ｓ０３の発現を示す。
【図２】図２は、ＥＳ突然変異体Ｓ０３およびそのｍＰＥＧ修飾産物の精製を示す。（Ａ）封入体からのタンパク質の精製。（Ｂ）再折り畳みタンパク質の精製。（Ｃ）修飾タンパク質の精製。
【図３】図３は、天然ヒトＥＳ配列を示す。但し、大腸菌(Escherichia coli)で組換え発現された場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸残基Ｍは無作為に欠失していることがある。
【図４】図４は、Ｓ０３配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸残基Ｍは無作為に欠失していることがある。
【図５】図５は、Ｓ０４配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸残基Ｍは無作為に欠失していることがある。
【図６】図６は、Ｓ０５配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸残基Ｍは無作為に欠失していることがある。
【図７】図７は、Ｓ０６配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸残基Ｍは無作為に欠失していることがある。
【図８】図８は、Ｓ０７配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸残基Ｍは無作為に欠失していることがある。
【図９】図９は、Ｓ０８配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸残基Ｍは無作為に欠失していることがある。
【図１０】図１０は、Ｓ１１配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸残基Ｍは無作為に欠失していることがある。
【図１１】図１１は、Ｓ１３配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸残基Ｍは無作為に欠失していることがある。
【図１２】図１２は、Ｓ１４配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸残基Ｍは無作為に欠失していることがある。
【図１３】図１３は、Ｓ１５配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸残基Ｍは無作為に欠失していることがある。
【図１４】図１４は、Ｓ１６配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸残基Ｍは無作為に欠失していることがある。
【図１５】図１５は、Ｓ１７配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸残基Ｍは無作為に欠失していることがある。
【図１６】図１６は、Ｓ１８配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸残基Ｍは無作為に欠失していることがある。
【図１７】図１７は、Ｓ１９配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸残基Ｍは無作為に欠失していることがある。
【図１８】図１８は、Ｓ２０配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸残基Ｍは無作為に欠失していることがある。
【図１９】図１９は、ＮＳＮ１配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸残基Ｍは無作為に欠失していることがある。
【図２０】図２０は、ＮＳＮ２配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸残基Ｍは無作為に欠失していることがある。
【図２１】図２１は、ＮＳＮ３配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸残基Ｍは無作為に欠失していることがある。
【図２２】図２２は、ＮＳＮ４配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸残基Ｍは無作為に欠失していることがある。
【図２３】図２３は、Ｅ１７６Ａ配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸残基Ｍは無作為に欠失していることがある。
【図２４】図２４は、Ｃ１７４Ｅ配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸残基Ｍは無作為に欠失していることがある。
【図２５】図２５は、Ｅ−Ｍ配列を示す。但し、大腸菌により組換え発現された場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸残基Ｍは無作為に欠失していることがある。
【図２６】図２６は、内皮細胞移動阻害活性に関する非修飾ＥＳ突然変異体Ｓ０３、ＮＳＮ４およびＥ−Ｍの比較を示す。
【図２７】図２７は、内皮細胞移動阻害活性に関するＥＳ突然変異体Ｅ１７６ＡとＣ１７４Ｅの比較を示す。
【図２８】図２８は、内皮細胞移動阻害活性に関する修飾ＥＳ突然変異体ＭＳ０３、ＭＳ０４、ＭＳ０５、ＭＳ０６、ＭＳ０７、ＭＳ０８、ＭＳ１１、およびＭＳ１３の比較を示す。
【図２９】図２９は、内皮細胞移動阻害活性に関する修飾ＥＳ突然変異体ＭＳ０３、ＭＳ１４、ＭＳ１５、ＭＳ１６、ＭＳ１７、ＭＳ１８、ＭＳ１９、およびＭＳ２０の比較を示す。
【図３０】図３０は、内皮細胞移動阻害活性に関する修飾ＥＳ突然変異体ＭＳ０３、ＭＮＳＮ１、ＭＮＳＮ２、ＭＮＳＮ３およびＭＮＳＮ４の比較を示す。
【図３１】図３１は、ＥＳの増幅のためのフォワードＰＣＲプライマー配列（配列番号３５）を示す。
【図３２】図３２は、ＥＳの増幅のためのリバースＰＣＲプライマー配列（配列番号３６）を示す。
【図３３】図３３は、ＥＳ突然変異体３６（配列番号２５）、２４９（配列番号２６）、３８１（配列番号２７）、５７（配列番号２８）、１１４（配列番号２９）、１２４（配列番号３０）および１２５（配列番号３１）の配列を示す。
【図３４】図３４は、ＥＳ突然変異体１６０（配列番号３２）、１６３（配列番号３３）および１１９（配列番号３４）の配列を示す。
【図３５】図３５は、内皮細胞移動阻害活性に関する非修飾ＥＳ突然変異体３６、２４９、３８１と修飾ＥＳ突然変異体Ｍ３６、Ｍ２４９、Ｍ３８１の比較を示す。
【図３６】図３６は、内皮細胞移動阻害活性に関する修飾ＥＳ突然変異体ＮＳＮ４、Ｍ２４９、Ｍ１１９、Ｍ１６０、Ｍ１６３、Ｍ１２５、Ｍ５７、Ｍ１２４およびＭ１１４の比較を示す。
【図３７】図３７は、非修飾ＥＳ突然変異体Ｅｎｄｕ−Ｅ−Ｍ（配列番号３７）、Ｅｎｄｕ−１１４（配列番号３８）およびＥｎｄｕ−５７（配列番号３９）の配列を示す。
【図３８】図３８は、内皮細胞移動阻害活性に関する非修飾ＥＳ突然変異体Ｅｎｄｕ−Ｅ−Ｍ、Ｅｎｄｕ−１１４およびＥｎｄｕ−５７の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
特に断りのない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者により共通に理解されている意味を有するものとする。一般に、本明細書で使用される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質および核酸化学に関連する名称および技術は当技術分野で周知であり、慣用されている。
【００４０】
特に断りのない限り、本明細書で使用される方法および技術は、一般に、常法または本明細書に引用されている参照文献に従って実施される。
【００４１】
ＥＳ、ＥＳ突然変異体およびＰＥＧ修飾産物
ＥＳ（エンドスタチン）は、天然エンドスタチン、例えば、配列番号１の配列を有するヒトエンドスタチンを意味し、ヒトＥＳが大腸菌で組換え発現された場合、アミノ酸残基Ｍが一部の産物のＮ末端に無作為に付加される（図３）。本出願では、ＥＳ突然変異体は、ＡＴＰ結合モチーフにおけるアミノ酸欠失、挿入または置換など、ＥＳ変異体の１またはいくつかのアミノ酸残基を変異させることにより得られる突然変異体タンパク質を意味する。ＥＳ突然変異体は天然型であり得、例えば、ＥＳが酵母で組換え発現される場合、Ｎ末端の無作為な欠失のためにＮ末端において４個のアミノ酸が欠失したＥＳ突然変異体が産生されることがあり、さらに、Ｃ末端のＫも無作為に欠失していることがある。ＥＳ突然変異体はまた、例えば、タンパク質発現を促進し、安定性を改善するために人工的に構築することもでき、Ｅｎｄｕは、遺伝子工学的手段により天然ＥＳのＮ末端に９個の付加的アミノ酸残基ＭＧＧＳＨＨＨＨＨを付加することにより作出された突然変異体であり、大腸菌で組換え発現される場合に、最初のアミノ酸Ｍは無作為に欠失していることがあり、これによりＥｎｄｕは配列番号２の配列を有することになる。
【００４２】
本発明における非修飾型および修飾型のＥＳおよびＥＳ突然変異体タンパク質は総てＢｅｉｊｉｎｇ  Ｐｒｏｔｇｅｎ社により提供された。
【００４３】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾ＥＳはＭ２ＥＳと呼称され、ＰＥＧ修飾ＥＳ突然変異体は、突然変異体名称の前に「Ｍ」を付けて呼称される：例えば、ＰＥＧ修飾ＥＳ突然変異体Ｓ０３はＭＳ０３と呼称され、ＰＥＧ修飾ＥＳ突然変異体ＮＳＮ１はＭＮＳＮ１と呼称される。例えば、本発明のいくつかの詳細な実施形態では、ＭＳ０３またはＭＮＳＮ１と呼称される分子は、分子量２０ｋＤのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）により修飾された、Ｓ０３またはＮＳＮ１と呼ばれる突然変異体の産物であり得、それらのカップリング部位は、活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基とＳ０３またはＮＳＮ１のＮ末端αアミノ基である。
【００４４】
ＡＴＰ結合モチーフは、ＡＴＰアーゼ活性を有するタンパク質分子内の、ＡＴＰと結合する典型的なアミノ酸配列を意味する。ＡＴＰ結合モチーフは通常、１つのＰループ構造を有し、このＰループ構造は以下の典型的な配列：ＧＸＸＧＸＸＫ、（Ｇ／Ａ）ＸＸＸＸＧＫ（Ｔ／Ｓ）、ＧＸＸＸＸＧＫＳおよびＧＸＸＧＸＧＫＳを有する。ヒトＥＳでは、ＡＴＰ結合モチーフは主としてＧＸＸＧＸＸＫの形態の配列を意味し、配列中、Ｘで置換されないアミノ酸残基はより保存性が高い。一般に、これらのＡＴＰ結合モチーフはまた、ＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰなどとも結合できる。
【００４５】
本発明で言及されるＡＴＰ結合モチーフは、Ａモチーフ（Ｗａｌｋｅｒ  Ａモチーフ）、Ｂモチーフ（Ｗａｌｋｅｒ  Ｂモチーフ）およびＣモチーフ（Ｗａｌｋｅｒ  Ｃモチーフ）を含む。Ａモチーフは、ＧＸＸＧＸＸＫの形態の配列を有する部位を意味し、配列中、Ｘは可変アミノ酸残基である。Ａモチーフは、ＥＳおよびＡＴＰ結合および触媒的加水分解の主要部位である。Ｂモチーフは、ｈｈｈｈＥの形態の配列を有する部位を意味し、配列中、ｈは疎水性アミノ酸残基である。ＢモチーフはＡＴＰとＥＳの結合に関与し、ＥＳとＡＴＰの結合に影響を及ぼすことによりＥＳのＡＴＰアーゼ活性に影響を及ぼす。Ｃモチーフは、ＥＳ分子においてＧｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（すなわち、ＥＡＰＳ）の配列を有する部位を意味し、ＥＳとＡＴＰとの結合に間接的に影響を及ぼすことによりＥＳのＡＴＰアーゼ活性に影響を与える可能性があり、このことはＥＳ−ＡＴＰ複合体の結晶構造の情報によって確認する必要がある。加えて、タンパク質の空間的立体配座はペプチド鎖の折り畳みにより形成されるので、一次配列において隣接するアミノ酸残基は空間的立体配座では互いに近接し、逆に、一次配列では遠隔のアミノ酸残基が空間的立体配座では互いに近接することも多い。タンパク質分子の局部的な立体配座の安定性は、全体的な分子の立体配座の安定性に大きく依存し、局部的なアミノ酸配列の変化は全体的な分子の立体配座の変化をもたらし得る。よって、当業者には、Ａ、Ｂ、およびＣの３つのモチーフから離れた、ＥＳとＡＴＰの相互作用の調節に関与する他の部位も存在し、それらの部位もまたＥＳのＡＴＰアーゼ活性に影響を与え、血管新生を阻害し得ることが認識されるであろう。これらの部位は、単独で、またはＡ、Ｂ、Ｃモチーフもしくはそれらの任意の組合せとの組合せにおいて、ＥＳのＡＴＰアーゼ活性に影響を及ぼし、血管新生を阻害する役割を果たす可能性がある。よって、本発明のいくつかの実施形態では、Ａ、Ｂ、Ｃモチーフまたはそれらの組合せにおける突然変異に加え、より良い結果を達成するために、前記３つのモチーフ以外の部位にも突然変異を導入した。
【００４６】
本発明者らは、供試したＥＳ、ＥＳ変異体、ＥＳ突然変異体およびそれらのｍＰＥＧ修飾産物のＡＴＰアーゼ活性が内皮細胞移動阻害活性に正の相関があり、すなわち、内皮細胞移動阻害活性が高いＥＳ突然変異体はＡＴＰアーゼ活性も高いことを見出した。この発見に基づき、内皮細胞移動阻害活性が高いＥＳを得るために、本発明者らは、ＥＳのＡＴＰ結合モチーフにおけるアミノ酸欠失、挿入または置換により、ＥＳのＡＴＰアーゼ活性を増加させることができる。
【００４７】
よって、本発明はまた、ＥＳまたはその変異体のＡＴＰアーゼ活性を増加させることを含む、ＥＳまたはその変異体の、血管新生および腫瘍成長を阻害する活性を増加させる方法を提供する。具体的には、遺伝子工学的手段により、ＡＴＰアーゼ活性を増加させたＥＳまたはその変異体の突然変異体を得るために、ＥＳまたはその変異体の、ＡＴＰ結合に関与するＡモチーフＧＸＸＧＸＸＫに、またはＡモチーフとＢモチーフに同時に、またはＣモチーフに、またはＡ、ＢおよびＣモチーフの任意の組合せに突然変異を導入することができる。これらの突然変異体は、血管新生を阻害する（例えば、内皮細胞の移動を阻害する）活性の増加および腫瘍成長を阻害する活性の増加などの、改良された生物学的活性を有する。とりわけ、Ｂモチーフにおける突然変異は、通常、血管新生および腫瘍成長を阻害する活性の低下をもたらすので、Ｂモチーフの突然変異には特に注意を払うべきである。
【００４８】
よって、本発明の一例では、以下の突然変異がＥＳのＡモチーフまたはＢモチーフに導入された。
Ｓ０３−配列番号３（図４）
Ｓ０４−配列番号４（図５）
Ｓ０５−配列番号５（図６）
Ｓ０６−配列番号６（図７）
Ｓ０７−配列番号７（図８）
Ｓ０８−配列番号８（図９）
Ｓ１１−配列番号９（図１０）
Ｓ１３−配列番号１０（図１１）
Ｓ１４−配列番号１１（図１２）
Ｓ１５−配列番号１２（図１３）
Ｓ１６−配列番号１３（図１４）
Ｓ１７−配列番号１４（図１５）
Ｓ１８−配列番号１５（図１６）
Ｓ１９−配列番号１６（図１７）
Ｓ２０−配列番号１７（図１８）
ＮＳＮ１−配列番号１８（図１９）
ＮＳＮ２−配列番号１９（図２０）
ＮＳＮ３−配列番号２０（図２１）
ＮＳＮ４−配列番号２１（図２２）
Ｅ１７６Ａ−配列番号２２（図２３）
Ｃ１７４Ｅ−配列番号２３（図２４）
Ｅ−Ｍ−配列番号２４（図２５）
３６−配列番号２５（図３３）
２４９−配列番号２６（図３３）
３８１−配列番号２７（図３３）
５７−配列番号２８（図３３）
１１４−配列番号２９（図３３）
１２４−配列番号３０（図３３）
１２５−配列番号３１（図３３）
１６０−配列番号３２（図３４）
１６３−配列番号３３（図３４）
１１９−配列番号３４（図３４）
Ｅｎｄｕ−Ｅ−Ｍ−配列番号３７（図３７）
Ｅｎｄｕ−５７−配列番号３８（図３７）
Ｅｎｄｕ−１１４−配列番号３９（図３７）
【００４９】
ＡＴＰアーゼ活性を生化学的方法により測定した場合に、内皮細胞移動阻害活性を増加させた突然変異体のＡＴＰアーゼ活性は、ＥＳの内皮細胞移動阻害活性よりも有意に高かったことが判明した（表１）。
【００５０】
ＡＴＰ結合モチーフにおける突然変異により生じたＥｎｄｕのＡＴＰアーゼ活性および内皮細胞移動阻害活性の変化は、同じ突然変異によって生じたＥＳ関連活性の変化と同等であったことが判明した。従って、本発明者らは、ＥＳにおけるＡＴＰ結合モチーフを変異させることによりＡＴＰアーゼ活性および内皮細胞移動阻害活性を変化させる方法をＥＳ突然変異体に適用することも可能であると考える。
【００５１】
よって、本発明はまた、血管新生阻害活性を増加させたＥＳ突然変異体であって、それらのＡモチーフおよび／またはＢモチーフおよび／またはＣモチーフに突然変異を含んでなり、そのＡＴＰアーゼ活性が、対応する野生型ＥＳまたはその変異体に比べて増加した突然変異体も提供する。
【００５２】
好ましくは、ＥＳ突然変異体のＡＴＰアーゼ活性は、野生型ＥＳに比べて少なくとも１００％増加し、すなわち、前記突然変異体のＡＴＰアーゼ活性は野生型ＥＳの活性の２００％であり、野生型ＥＳの活性の３００％またはそれを超える。
【００５３】
いくつかの実施形態では、前記突然変異体は、対応する野生型ＥＳまたはＥＳ変異体と比較した場合に、それらのＡＴＰ結合モチーフに突然変異を含んでなる。例えば、前記突然変異体は、配列番号１の８９〜９５番のアミノ酸残基からなるＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓモチーフに対応する配列に突然変異を有し、前記突然変異は１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの組合せから選択され、これにより前記突然変異体は増加したＡＴＰアーゼ活性を有することとなる。
【００５４】
好ましくは、以下の操作スキームをＥＳまたはその変異体に適用すると、そのＡＴＰアーゼ活性を増加させる（１）配列番号１のＡモチーフＧＸＸＧＸＸＫにおいて保存されているアミノ酸残基Ｇ８９、Ｇ９２、およびＫ９５に対応するものを変更せずに維持すること；（２）ＡモチーフＧＸＸＧＸＸＫ内の可変残基Ｘを調製することによりＡモチーフに対応するペプチドの空間的立体配座の柔軟性を高めること；（３）場合により、古典的ＡモチーフＧＸＸＧＸＸＫの配列の残基Ｋ９５の後にＳｅｒまたはＴｈｒを付加すること；（４）Ａモチーフの変化に応じてＢモチーフを調整すること；（５）Ｃモチーフのアミノ酸残基を部分的にまたは完全に変異させること；（６）Ｂモチーフの変化に応じてＣモチーフを調整すること；（７）Ａモチーフの変化に応じてＣモチーフを調整すること；（８）Ａ、Ｂ、およびＣモチーフを同時に変化させること。
【００５５】
詳細な実施形態では、本発明のＥＳ突然変異体は、以下：配列番号３〜２１、および２４からなる群から選択される配列を含んでなる。好ましくは、本発明のエンドスタチン突然変異体は、以下：配列番号３、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２４からなる群から選択される配列を含んでなる。
【００５６】
好ましくは、本発明のＥＳ突然変異体はヒトＥＳ突然変異体である。
【００５７】
本発明はまた、患者に有効量の、上記のような本発明のエンドスタチン突然変異体または上記のような本発明の医薬組成物を投与することを含んでなる、腫瘍を治療する方法も提供する。血管新生関連疾患には、腫瘍、肥満、脂肪肝およびインスリン抵抗性が含まれる。好ましくは、血管新生関連疾患は腫瘍である。
【００５８】
本発明を以下の限定されない例によりさらに説明する。本発明はこれらの例に限定されないと理解されるべきである。
【実施例】
【００５９】
実施例１：ＥＳ組換え株の構築
本実施例では、エンドスタチンをヒト肺癌細胞Ａ５４９のｃＤＮＡからクローニングし、ｐＥＴ３０ａプラスミドに連結した。遺伝子増幅に使用した５’プライマーはＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＧＣＧＡＣＴＴＣ（図３１、配列番号３５）であり、３’プライマーはＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴ  ＴＡＣＴＴＧＧＡＧＧＣＡＧＴＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧ（図３２、配列番号３６）であった。エンドヌクレアーゼはそれぞれＮｄｅＩおよびＸｈｏＩであった。
【００６０】
上記の組換えプラスミドを、従来の分子クローニング技術に従って大腸菌に形質転換し、発現させた。
【００６１】
実施例２：ＡＴＰ結合モチーフ突然変異を有するＥＳ突然変異株の構築
本実施例では、野生型ヒトＥＳのＡＴＰ結合モチーフに対して突然変異操作を行った。上流および下流プライマーならびに形質転換法は実施例１と同じであった。突然変異体の番号および生じた変化は次の通りである。
Ｓ０３−配列番号３（図４）  Ｎ末端の４つのアミノ酸残基ＨＳＨＲを欠失させるとともに、ＡモチーフをＧＥＳＧＡＧＫとなるように変異させ、Ｔを挿入した；
Ｓ０４−配列番号４（図５）  Ｎ末端の４つのアミノ酸残基ＨＳＨＲを欠失させ、Ａモチーフの後にＳを挿入した。同時に、ＢモチーフのＥとそれに続くアミノ酸残基ＮＳＦＭＴＡＳＫを欠失させた；
Ｓ０５−配列番号５（図６）  Ｎ末端の４つのアミノ酸残基ＨＳＨＲを欠失させ、Ａモチーフの後にＴを挿入した。同時に、ＢモチーフのＥとそれに続くアミノ酸残基ＮＳＦＭＴＡＳＫを欠失させた；
Ｓ０６−配列番号６（図７）  Ｎ末端の４つのアミノ酸残基ＨＳＨＲを欠失させるとともに、ＡモチーフをＧＥＳＧＡＧＫとなるように変異させ、次いで、Ｔを挿入した。同時に、ＢモチーフのＥとそれに続くアミノ酸残基ＮＳＦＭＴＡＳＫを欠失させた；
Ｓ０７−配列番号７（図８）  ＡモチーフをＧＥＳＧＡＧＫとなるように変異させ、Ｔを挿入した。同時に、Ｃ末端アミノ酸残基ＳＦＭＴＡＳＫを欠失させた；
Ｓ０８−配列番号８（図９）  ＡモチーフをＧＥＳＧＡＧＫとなるように変異させ、Ｔを挿入した。同時に、Ｃ末端アミノ酸残基ＴＡＳＫを欠失させた；
Ｓ１１−配列番号９（図１０）  Ｃ末端アミノ酸残基ＳＦＭＴＡＳＫを欠失させた；
Ｓ１３−配列番号１０（図１１）  Ｎ末端残基ＨＳを欠失させ、ＡモチーフをＧＥＳＧＡＧＫとなるように変異させ、Ｔを挿入した。同時に、Ｃ末端のＳＦＭＴＡＳＫを欠失させた；
Ｓ１４−配列番号１１（図１２）  Ｎ末端残基ＨＳを欠失させ、ＡモチーフをＧＥＳＧＡＧＫとなるように変異させ、Ｔを挿入した。同時に、Ｃ末端のＴＡＳＫを欠失させた；
Ｓ１５−配列番号１２（図１３）  Ｎ末端残基ＨＳを欠失させ、ＡモチーフをＧＥＳＧＡＧＫとなるように変異させ、Ｔを挿入した。同時に、Ｃ末端のＫを欠失させた；
Ｓ１６−配列番号１３（図１４）  Ｎ末端残基Ｈを欠失させ、ＡモチーフをＧＥＳＧＡＧＫとなるように変異させ、Ｔを挿入した。同時に、Ｃ末端のＫを欠失させた；
Ｓ１７−配列番号１４（図１５）  Ｎ末端残基Ｈを欠失させ、ＡモチーフをＧＥＳＧＡＧＫとなるように変異させ、Ｔを挿入した。同時に、Ｃ末端のＳＦＭＴＡＳＫを欠失させた；
Ｓ１８−配列番号１５（図１６）  Ｎ末端残基Ｈを欠失させ、ＡモチーフをＧＥＳＧＡＧＫとなるように変異させ、Ｔを挿入した。同時に、Ｃ末端のＴＡＳＫを欠失させた；
Ｓ１９−配列番号１６（図１７）  Ｎ末端残基Ｈを欠失させ、ＡモチーフをＧＥＳＧＡＧＫとなるように変異させ、Ｔを挿入した；
Ｓ２０−配列番号１７（図１８）  Ｎ末端残基ＨＳを欠失させ、ＡモチーフをＧＥＳＧＡＧＫとなるように変異させ、Ｔを挿入した；
ＮＳＮ１−配列番号１８（図１９）  Ｓｅｒ−８８を欠失させ、ＡモチーフをＧＥＳＧＡＧＫとなるように変異させ、Ｔを挿入した；
ＮＳＮ２−配列番号１９（図２０）  ＡモチーフをＧＥＳＧＡＧＫとなるように変異させ、Ｐ９６ＴおよびＧ９７Ｐ；
ＮＳＮ３−配列番号２０（図２１）  ＡモチーフをＧＥＳＧＡＧＫとなるように変異させ、Ｐ９６Ｔ；
ＮＳＮ４−配列番号２１（図２２）  ＡモチーフをＧＥＳＧＡＧＫとなるように変異させ、Ｐ９６Ｔ、Ｇｌｙ−９８を挿入した；
Ｅ１７６Ａ−配列番号２２（図２３）  Ｅ１７６Ａ；
Ｃ１７４Ｅ−配列番号２３（図２４）  Ｃ１７４Ｅ；
Ｅ−Ｍ−配列番号２４（図２５）  ＡモチーフをＧＥＳＧＡＧＫとなるように変異させ、Ｔを挿入した。
【００６２】
実施例３：組換えＥＳおよびその突然変異体の発現および調製
本実施例では、ＥＳおよびその突然変異体の発現および調製は、一例としてＳ０３を挙げて以下に簡単に記載される：ＥＳまたはその突然変異体操作株を、振盪フラスコ内のＬＢ培地中で一晩、分散培養し、５Ｌのファーメンター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）に播種し、誘導のためにＩＰＴＧを適時に加えた。誘導後、培養を約４時間続け、次いで、細菌を回収し、電気泳動により分析した（図１）。
【００６３】
菌体をＰＢＳバッファーに再懸濁させ、高圧ホモジナイザーで３回繰り返して十分に破砕し、各回の破砕の後に遠心分離を行って沈降物を回収し、その後、これをＰＢＳバッファーに再懸濁させた。破砕した細菌の沈降物を、８Ｍ尿素を含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．５）に溶解した後、ＤＥＡＥクロマトグラフィー媒体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー  ｐＨ８．５で溶出させた。浸透画分を回収し、再生前に精製タンパク質を得た。タンパク質の再折りたたみの後に、ＣＭクロマトグラフィー媒体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、０〜５００ｍＭの塩濃度範囲のＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー  ｐＨ８．５を用いて勾配溶出を行い、９５％より高い純度の再折り畳みタンパク質を得た（図２Ａ、Ｂ）。再折り畳みタンパク質をＮａＡｃ−ＨＡｃ（ｐＨ６．０）に対して透析した。平均分子量２０ｋＤのモノメトキシポリエチレングリコールプロパナール（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ、２０ｋＤａ、Ｂｅｉｊｉｎｇ  ＪｉａｎＫａｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を用い、製品仕様書に記載の操作法に従って、再折り畳みタンパク質のＮ末端単一修飾を行った。この修飾産物を、ＳＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製し、０〜５００ｍＭ濃度のＮａＣｌを用いて勾配溶出を行い、目的画分を得た（図２Ｃ）。
【００６４】
他のＥＳ突然変異体およびそれらの修飾産物の調製も上記と同じとした。
【００６５】
実施例４：ＥＳ、ＥＳ突然変異体およびそれらのｍＰＥＧ修飾産物のＡＴＰアーゼ活性アッセイ
本実施例では、従来技術（ＰＣＴ／ＣＮ２０１２／０８１２１０）に開示されている、ＡＴＰアーゼ活性を試験するための方法を使用した。ＥＳ、ＥＳ突然変異体およびそれらのｍＰＥＧ修飾産物ＡＴＰアーゼ活性を試験した。これらの結果を表１に示す。比較的高いＡＴＰアーゼ活性を有するタンパク質ミオシン（ブタ心臓から抽出、Ｓｉｇｍａ）をこのアッセイの陽性対照として使用した。
【００６６】
実施例５：ＥＳおよびＥＳ突然変異体の内皮細胞移動阻害活性
本実施例では、従来技術（ＰＣＴ／ＣＮ２０１２／０８１２１０）に開示されているトランスウェル内皮細胞アッセイを使用した。内皮細胞ＨＭＥＣを以下の群に分け、異なる処理を施した。第１群：陰性対照群、無ＥＳ（同量のバッファー溶液を加えた）処理；第２群：ＥＳ（２０μｇ／ｍＬ）処理；第３群：ＥＳ突然変異体ＹＨ−１６（２０μｇ／ｍＬ）処理；第４群：ＥＳ突然変異体Ｓ０３（２０μｇ／ｍＬ）処理；第５群：ＥＳ突然変異体ＮＳＮ４（２０μｇ／ｍＬ）処理；第６群：ＥＳ突然変異体Ｅ−Ｍ（２０μｇ／ｍＬ）処理。結果は、Ｓ０３、ＮＳＮ４およびＥ−Ｍの内皮細胞移動阻害活性がＥＳに比べて有意に増加したことを示した。Ｓ０３、ＮＳＮ４およびＥ−Ｍ処理群の移動細胞の数は、ＥＳ処理群のそれぞれおよそ３０％、１６％および４０％であった（図２６）。
【００６７】
ＥＳ突然変異体Ｅ１７６ＡおよびＣ１７４Ｅの内皮細胞移動阻害活性も同じアッセイを用いて試験した。Ｅ１７６ＡおよびＣ１７４Ｅの内皮細胞移動阻害活性は両方ともＥＳより低かった（図２７）。
【００６８】
実施例６：ｍＰＥＧ修飾ＥＳ、ＥＳ突然変異体の内皮細胞移動阻害活性
ｍＰＥＧ修飾ＥＳ、ＥＳ突然変異体の内皮細胞移動阻害活性は、実施例５に記載の方法によって試験した。内皮細胞移動阻害活性の増強は、突然変異タンパク質間の活性の違いをより明瞭に反映するために多くの突然変異タンパク質に関して有意であったことから、本実施例では、低用量（すなわち、５μｇ／ｍＬ）を用いて細胞を処理したところ、次のように、なお明確な阻害効果を観測することができた。
【００６９】
ｍＰＥＧ修飾ＥＳ突然変異体ＭＳ０３、ＭＳ０４、ＭＳ０５、ＭＳ０６、ＭＳ０７、ＭＳ０８、ＭＳ１１、ＭＳ１３の内皮細胞移動阻害活性（図２８）。とりわけ、ＭＳ０３、ＭＳ０４、ＭＳ０７、ＭＳ１１、ＭＳ１３の内皮細胞移動阻害活性は、Ｍ２ＥＳの活性よりも有意に良好であり、ＭＳ０３処置群の移動細胞数はＭ２ＥＳ処理群の約１／８であり、ＭＳ０４、ＭＳ０７、ＭＳ１１およびＭＳ１３処理群の移動細胞数はＭ２ＥＳ処理群の約１／２であり、ＭＳ０５、ＭＳ０６およびＭＳ０８の内皮細胞移動阻害活性はＭ２ＥＳの活性よりも低かった。
【００７０】
ｍＰＥＧ修飾ＥＳ突然変異体ＭＳ０３、ＭＳ１４、ＭＳ１５、ＭＳ１６、ＭＳ１７、ＭＳ１８、ＭＳ１９、ＭＳ２０の内皮細胞移動阻害活性（図２９）。とりわけ、ＭＳ０３、ＭＳ１４、ＭＳ１７の内皮細胞移動阻害活性は、Ｍ２ＥＳの活性より有意に良好であり、ＭＳ１５、ＭＳ１９の内皮細胞移動阻害活性は、Ｍ２ＥＳの活性と有意差は無く、ＭＳ１６、ＭＳ１８、ＭＳ２０の内皮細胞移動阻害活性は、Ｍ２ＥＳの活性より低かった。
【００７１】
ｍＰＥＧ修飾ＥＳ突然変異体ＭＳ０３、ＭＮＳＮ１、ＭＮＳＮ２、ＭＮＳＮ３、ＭＮＳＮ４の内皮細胞移動阻害活性（図３０）。とりわけ、ＭＳ０３、ＭＮＳＮ１、ＭＮＳＮ２、ＭＮＳＮ３およびＭＮＳＮ４の内皮細胞移動阻害活性は、Ｍ２ＥＳの活性よりも有意に良好であり、ＭＮＳＮ４処理群の移動細胞数はＭ２ＥＳの約１／２０であった。
【００７２】
ＡＴＰアーゼ活性を増加させた突然変異は、ＥＳの場合と同等かまたは有意に高い内皮細胞移動阻害活性を示し、ＡＴＰアーゼ活性と内皮細胞移動阻害活性の間の正の相関と一致する。
【００７３】
実施例７：ＥＳ突然変異株の構築
本実施例では、野生型ヒトＥＳに対して突然変異操作を行い、具体的な方法、上流および下流プライマーおよび操作方法は実施例１と同じとした。突然変異体の番号およびそれらの配列を図３３および図３４に示す。
【００７４】
３６−配列番号２５（図３３）  Ｎ末端の３つのアミノ酸残基ＨＳＨを欠失させ、Ａ３９Ｑ、およびＧｌｙ−８９を欠失させた；
２４９−配列番号２６（図３３）  Ｎ末端の３つのアミノ酸残基ＨＳＨを欠失させ、ＡモチーフをＧＳＱＧＱＬＱとなるように変異させ、ＣモチーフをＤＥＲＧとなるように変異させた；
３８１−配列番号２７（図３３）  ＡモチーフをＧＳＥＡＰＬＲとなるように変異させた；
５７−配列番号２８（図３３）  ＡモチーフをＧＥＳＧＡＧＫとなるように変異させ、ＣモチーフをＤＳＲＡとなるように変異させた；
１１４−配列番号２９（図３３）  ＢモチーフをＶＬＣＩＡとなるように変異させ、ＣモチーフをＤＳＲＡとなるように変異させた；
１２４−配列番号３０（図３３）  Ｎ末端の４つのアミノ酸残基ＨＳＨＲを変異させ、ＡモチーフをＧＳＥＧＰＬＲとなるように変異させ、ＣモチーフをＤＳＲＡとなるように変異させた；
１２５−配列番号３１（図３３）  Ｎ末端の４つのアミノ酸残基を変異させ、ＡモチーフをＧＳＥＧＰＬＲとなるように変異させ、ＣモチーフをＤＳＲＡとなるように変異させ、かつ、ＫをＣ末端に付加した；
１６０−配列番号３２（図３４）  Ａ、Ｂ、およびＣモチーフ以外のアミノ酸残基を変異させた、配列を参照；
１６３−配列番号３３（図３４）  ＡモチーフをＧＳＱＧＱＬＱとなるように変異させ、ＣモチーフをＥＴＴＧとなるように変異させた；
１１９−配列番号３４（図３４）  ＡモチーフをＶＳＱＧＱＬＱとなるように変異させた。
【００７５】
実施例８：ｍＰＥＧ修飾ＥＳおよびＥＳ突然変異体の内皮細胞移動阻害活性
ｍＰＥＧ修飾ＥＳおよびＥＳ突然変異体の内皮細胞移動阻害活性は、実施例６に記載の方法によって試験され、次のように詳述される：
ｍＰＥＧ修飾ＥＳ突然変異体３６、２４９、３８１および修飾Ｓ突然変異体Ｍ３６、Ｍ２４９、Ｍ３８１の内皮細胞移動阻害活性（図３５）。とりわけ、３６処理群の移動細胞数は、ＥＳ処理群の約７０％であった。２４９および３８１群の活性とＥＳ群の活性の間の内皮細胞移動阻害には有意な差は無く、修飾突然変異体Ｍ３６処理群の移動細胞数はＥＳ処理群の約５０％であり、Ｍ２４９、Ｍ３８１群の活性とＥＳ群の活性の間の内皮細胞移動阻害には有意な差は無かった。
【００７６】
ｍＰＥＧ修飾ＥＳ突然変異体ＮＳＮ４、Ｍ２４９、Ｍ１１９、Ｍ１６０、Ｍ１６３、Ｍ１２５、Ｍ５７、Ｍ１２４、Ｍ１１４の内皮細胞移動阻害活性（図３６）。ＮＳＮ４、Ｍ２４９、Ｍ１６０、Ｍ１６３、Ｍ１２５、Ｍ５７、Ｍ１２４、Ｍ１１４の内皮細胞移動阻害活性は、Ｍ２ＥＳの活性に比べて有意に高かった。Ｍ１１９は、Ｍ２ＥＳに比べて有意差は無かった。とりわけ、Ｍ５７、Ｍ１２４およびＭ１１４処理群の移動細胞数は、Ｍ２ＥＳ処理群のそれぞれ約３４％、２８％および２４％であった。
【００７７】
実施例９：ＥＳ突然変異株の構築
本実施例では、Ｅｎｄｕに対して突然変異操作を行い、具体的な方法、上流および下流プライマーおよび形質転換法は実施例１と同じとした。突然変異体の番号およびそれらの配列を図３７に示す。
【００７８】
Ｅｎｄｕ−Ｅ−Ｍ−配列番号３７（図３７）  Ｎ末端にＭＧＧＳＨＨＨＨＨを付加し、ＡモチーフをＧＥＳＧＡＧＫとなるように変異させ、その後にＴを挿入した；
Ｅｎｄｕ−５７−配列番号３８（図３７）  Ｎ末端にＭＧＧＳＨＨＨＨＨを付加し、ＡモチーフをＧＥＳＧＡＧＫとなるように変異させ、その後にＴを挿入した；
Ｅｎｄｕ−１１４−配列番号３９（図３７）  Ｎ末端にＭＧＧＳＨＨＨＨＨを付加し、ＡモチーフをＧＥＳＧＡＧＫとなるように変異させ、その後にＴを挿入した。
【００７９】
実施例１０：ｍＰＥＧ修飾ＥＳ突然変異体の内皮細胞移動阻害活性
ｍＰＥＧ修飾ＥＳ突然変異体Ｅｎｄｕ−Ｅ−Ｍ、Ｅｎｄｕ−５７、Ｅｎｄｕ−１１４の内皮細胞移動阻害活性を、実施例６に記載の方法により試験した（図３８）。
【００８０】
Ｅｎｄｕ−Ｅ−Ｍ、Ｅｎｄｕ−５７およびＥｎｄｕ−１１４の内皮細胞移動阻害活性は、Ｅｎｄｕ（対照）の活性よりも有意に良好であり、阻害率はそれぞれ６４％、５０％および３４％であった。
【００８１】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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