(57)【要約】  本発明は、ペットフード製品または製品を持続可能に生産する方法であって、組成物中の魚油の全てまたは一部を、エイコサペンタエン酸（「ＥＰＡ」）およびドコサヘキサエン酸（「ＤＨＡ」）の単一の微生物源と置き換えることによって、ペットフード製品を調製する工程を含む方法に関する。好ましい実施形態において、ＤＨＡおよびＥＰＡを含む微生物源は、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属またはスラウストチトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の微生物に由来する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含有するペットフード製品または組成物を生産する方法であって、エイコサペンタエン酸（「ＥＰＡ」）およびドコサヘキサエン酸（「ＤＨＡ」）の単一の微生物源の添加組成物で前記ペットフード製品を調製する工程を含む方法。
【請求項２】
ペットフード製品を持続可能に生産する方法であって、前記製品中の魚油の全てまたは一部を、エイコサペンタエン酸（「ＥＰＡ」）およびドコサヘキサエン酸（「ＤＨＡ」）の単一の微生物源の添加組成物と置き換えることによって、前記ペットフード製品を調製する工程を含む方法。
【請求項３】
前記ペットフード製品は、総量が、前記ペットフード製品の重量パーセントとして測定されて少なくとも約０．０４％であるＥＰＡおよびＤＨＡを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＥＰＡの濃度の、ＤＨＡの濃度に対する比率は、前記微生物源中の、または前記ペットフード製品中のＥＰＡおよびＤＨＡの個々の濃度に基づいて、少なくとも０．２：１である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記添加組成物は、バイオマス、加工されたバイオマス、部分的に精製された油、および精製油からなる群から選択される形態で提供され、それらはいずれも前記微生物源から得られる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記微生物源が由来する微生物が、藻類、菌類、または酵母である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物は、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属またはスラウストチトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属のメンバーである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記微生物は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２０８、またはＰＴＡ−１０２０９、またはＰＴＡ−１０２１０、またはＰＴＡ−１０２１１、またはＰＴＡ−１０２１２、またはＰＴＡ−１０２１３、またはＰＴＡ−１０２１４、またはＰＴＡ−１０２１５によって受託されている種の特性を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物は、突然変異株である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物は、ＥＰＡおよびＤＨＡを含む微生物油を含有する多価不飽和脂肪酸を産生するように遺伝的に操作されたトランスジェニック微生物である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
単一の微生物源に由来するエイコサペンタエン酸（「ＥＰＡ」）およびドコサヘキサエン酸（「ＤＨＡ」）を含むペットフード製品の飼料添加組成物。
【請求項１２】
バイオマス、加工されたバイオマス、部分的に精製された油、および精製油からなる群から選択される形態で提供され、それらはいずれも前記微生物源から得られる、請求項１１に記載の添加組成物。
【請求項１３】
前記微生物源が由来する微生物が、藻類、菌類、または酵母である、請求項１１または１２に記載の添加組成物。
【請求項１４】
前記微生物は、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属またはスラウストチトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属のメンバーである、請求項１３に記載の添加組成物。
【請求項１５】
前記微生物は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２０８、またはＰＴＡ−１０２０９、またはＰＴＡ−１０２１０、またはＰＴＡ−１０２１１、またはＰＴＡ−１０２１２、またはＰＴＡ−１０２１３、またはＰＴＡ−１０２１４、またはＰＴＡ−１０２１５によって受託されている種の特性を有する、請求項１４に記載の添加組成物。
【請求項１６】
少なくとも４０ｗ／ｗ％のＤＨＡおよびＥＰＡ、好ましくは約５０ｗ／ｗ％のＤＨＡおよびＥＰＡを含有する精製された微生物油の形態である、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の添加組成物。
【請求項１７】
エイコサペンタエン酸（「ＥＰＡ」）およびドコサヘキサエン酸（「ＤＨＡ」）の単一の微生物源を含むペットフード製品。
【請求項１８】
総量が、前記ペットフード製品の重量パーセントとして測定されて少なくとも約０．０４％であるＥＰＡおよびＤＨＡを含む、請求項１７に記載のペットフード製品。
【請求項１９】
ＥＰＡの濃度の、ＤＨＡの濃度に対する比率は、前記微生物源中の、または前記ペットフード製品中のＥＰＡおよびＤＨＡの個々の濃度に基づいて、少なくとも０．２：１である、請求項１７または１８に記載のペットフード製品。
【請求項２０】
前記微生物源は微生物油であり、前記微生物油は、バイオマス、加工されたバイオマス、部分的に精製された油、および精製油からなる群から選択される形態で提供され、それらはいずれも前記微生物源から得られる、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のペットフード製品。
【請求項２１】
前記微生物源が由来する微生物が、藻類、菌類、または酵母である、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のペットフード製品。
【請求項２２】
前記微生物は、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属またはスラウストチトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属のメンバーである、請求項２１に記載のペットフード製品。
【請求項２３】
前記微生物は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２０８、またはＰＴＡ−１０２０９、またはＰＴＡ−１０２１０、またはＰＴＡ−１０２１１、またはＰＴＡ−１０２１２、またはＰＴＡ−１０２１３、またはＰＴＡ−１０２１４、またはＰＴＡ−１０２１５によって受託されている種の特性を有する、請求項２２に記載のペットフード製品。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ペット栄養の分野に属する。特定の態様において、本発明は、少なくとも魚油または魚粉の量が引き下げられたペットフード製品を持続可能に生産する方法に関する。
【０００２】
ペットを含む全ての脊椎動物種は、オメガ−６多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］およびオメガ−３多価不飽和脂肪酸の双方を食事で必要とする。エイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」；ｃｉｓ−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸；オメガ−３］およびドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」；ｃｉｓ−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸；２２：６オメガ−３］が、規則的な成長、健康、繁殖、および身体機能に必要とされる。
【０００３】
伝統的に、入手の早さ、安値、および製品内に含有される豊富な必須脂肪酸により、ペットフードが挙げられる市販の動物飼料において、海水魚の油および魚粉が、ＤＨＡおよびＥＰＡの唯一の食物脂質源として用いられてきた。
【０００４】
典型的に、ペットフードは、捕えた野生種の小さな遠洋ペット（主にカタクチイワシ、マアジ、アオギス、カラフトシシャモ、イカナゴ、およびメンハーデン）に由来する魚粉および／または魚油を含む。
【０００５】
一年の魚油生産量は年間１５０万トンを越えないので、動物飼料業界は世界規模で急速に拡大しているため、魚油の供給源としての遠洋ペットの有限資源に依存し続けることはできない。ゆえに、ペットフード製品が挙げられる動物飼料製品の世界規模での要求の増大に歩調を合わすことができる魚油の持続可能な代替物を見つけて実現することが、かなり緊急に求められている。
【０００６】
多くの組織が、動物飼料生産について、魚油の入手可能性および持続性について先に述べた制限を認識している。例えば、米国において、海洋大気庁（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｏｃｅａｎｉｃ  ａｎｄ  Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）は、「養殖海産物の重要なヒト健康利益を維持しながら、水産養殖飼料に含有される魚粉および魚油の量を引き下げることとなる、代替食成分を同定する」Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｐｅｔ  ｆｏｏｄｓ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅにおいて、農務省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）と協力している。
【０００７】
米国特許第７９３２０７７号明細書は、組換え操作されたヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が、必須のオメガ−３ＰＵＦＡおよび／またはオメガ−６ＰＵＦＡを提供する手段として、そしてその固有のタンパク質：脂質：炭水化物組成、および固有の複雑な炭水化物プロフィール（マンナン：ベータグルカン：キチンをおよそ１：４：４．６の比率で含む）に基づいて、ペットフードが挙げられる殆どの動物飼料にとって有用な添加物であると示唆している。
【０００８】
米国特許出願公開第２００７／０２２６８１４号明細書は、発酵微生物から得られる少なくとも１つのバイオマスを含有する魚飼料調合物を開示しており、当該バイオマスは、総脂肪酸含有量に対して少なくとも２０％のＤＨＡを含有する。ＤＨＡ源として用いられる好ましい微生物は、ストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）属に属する生物である。
【０００９】
［発明の概要］
一実施形態において、本発明は、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含有するペットフード製品を生産する方法であって、エイコサペンタエン酸（「ＥＰＡ」）およびドコサヘキサエン酸（「ＤＨＡ」）の単一の微生物源を含有する添加組成物でペットフード製品を調製する工程を含む方法に関する。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、ペットフード製品を持続可能に生産する方法であって、組成物中の魚油の全てまたは一部を、エイコサペンタエン酸（「ＥＰＡ」）およびドコサヘキサエン酸（「ＤＨＡ」）の単一の微生物源と置き換えることによって、ペットフード製品を調製する工程を含む方法に関する。
【００１１】
好ましい実施形態において、ＤＨＡおよびＥＰＡを含む微生物源は、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属種の天然の微生物の本来の能力に基づくプロセスを用いて生産される。
【００１２】
第３の実施形態において、本発明は、ペットフード製品のための飼料添加組成物であって、エイコサペンタエン酸（「ＥＰＡ」）およびドコサヘキサエン酸（「ＤＨＡ」）の単一の微生物源を含む添加組成物に関する。
【００１３】
第４の実施形態において、本発明は、総量が、ペットフード製品の重量パーセントとして測定されて少なくとも約０．０４％である、微生物源に由来するＥＰＡおよびＤＨＡを含むペットフード製品に関する。
【００１４】
第５の実施形態において、本発明は、ＥＰＡおよびＤＨＡを含有する微生物の添加組成物を有するペットフード製品に関し、微生物の添加物は、単一の微生物から得られる。
【００１５】
第６の実施形態において、本発明は、ペットフード製品を持続可能に生産する方法に関し、前記方法は、組成物中の魚油の全てまたは一部を、エイコサペンタエン酸（「ＥＰＡ」）およびドコサヘキサエン酸（「ＤＨＡ」）の単一の微生物源と置き換えることによって、ペットフード製品を調製する工程を含み、前記微生物は、ＥＰＡおよびＤＨＡを含む微生物油を含有する多価不飽和脂肪酸を産生するように遺伝的に操作されたトランスジェニック微生物である。
【００１６】
好ましくは、トランスジェニック微生物は、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅ）目の微生物である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】イヌ中の血漿ＤＨＡおよびＥＰＡの濃度を表すグラフである。
【図２】ネコ中の血漿ＤＨＡおよびＥＰＡの濃度を表すグラフである。
【００１８】
［詳細な説明］
本開示において、いくつかの用語および略語が用いられる。以下の定義が与えられる：
「多価不飽和脂肪酸」は、「ＰＵＦＡ」と略される。
「トリアシルグリセロール」は、「ＴＡＧ」と略される。
「総脂肪酸」は、「ＴＦＡ」と略される。
「脂肪酸メチルエステル」は、「ＦＡＭＥ」と略される。
「乾燥細胞重」は、「ＤＣＷ」と略される。
【００１９】
本明細書中で用いられる用語「発明」または「本発明」は、特許請求の範囲および明細書において記載される本発明の全ての態様および実施形態に言及することが意図され、いずれかの特定の実施形態または態様に限定されると読まれるべきでない。
【００２０】
用語「ペットフード製品」、「ペットフード調合物」および「ペット食物組成物」は、本明細書中で互換的に用いられる。ペットフードは、最も一般的には、フレークの形態、乾燥した形態、または湿った形態で生産される。
【００２１】
「エイコサペンタエン酸」［「ＥＰＡ」］は、ｅｉｓ−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸の通称である。この脂肪酸は、２０：５のオメガ−３脂肪酸である。本開示において用いられる用語ＥＰＡは、別段の記載がある場合を除き、酸または酸の誘導体（例えば、グリセリド、エステル、リン脂質、アミド、ラクトン、または塩等）を指す。
【００２２】
「ドコサヘキサエン酸」［「ＤＨＡ」］は、ｅｉｓ−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸の通称である。この脂肪酸は、２２：６のオメガ−３脂肪酸である。本開示において用いられる用語ＤＨＡは、別段の記載がある場合を除き、酸または酸の誘導体（例えば、グリセリド、エステル、リン脂質、アミド、ラクトン、または塩等）を指す。
【００２３】
本明細書中で用いられる用語「添加組成物」は、以下からなる群から選択される形態で提供される微生物源に由来する物質を指す：バイオマス、加工されたバイオマス、部分的に精製された油、および精製された油（いずれも単一の微生物から得られる）。
【００２４】
本明細書中で用いられる用語「バイオマス」は、微生物細胞物質を指す。バイオマスは、自然の力で生産されてもよいし、天然の宿主、突然変異株、または組換え生産宿主の発酵から生産されてもよい。バイオマスは、細胞全体、細胞−溶解物全体、均質化された細胞、部分的に加水分解された細胞物質、および／または部分的に精製された細胞物質（例えば、微生物により産生された油）の形態であってよい。用語「加工されたバイオマス」は、付加的なプロセシング、例えば乾燥、低温殺菌、破壊その他（それぞれ、以下でより詳細に議論される）を受けたバイオマスを指す。
【００２５】
用語「脂質」は、あらゆる脂溶性の（すなわち、親油性の）天然分子を指す。脂質の総括が、米国特許出願公開第２００９／００９３５４３号明細書に与えられている。用語「油」は、２５℃にて液体であり、通常は不飽和結合の多い脂質物質を指す。
【００２６】
用語「抽出油」は、油が合成された微生物等の細胞物質から分離された油を指す。抽出油は、多種多様な方法によって得られ、最も単純な方法は物理的手段のみを伴うものである。例えば、種々のプレス構成（例えば、スクリュー、エキスペラ、ピストン、ビーズビータその他）を用いた機械破砕により、油を細胞物質から分離することができる。これ以外にも、油抽出は、種々の有機溶媒（例えばヘキサン）による処置を介して、酵素による抽出を介して、浸透圧ショックを介して、超音波抽出を介して、超臨界流体抽出（例えばＣＯ２抽出）を介して、鹸化を介して、そしてこれらの方法の併用を介して、起こすことができる。抽出油は、さらに精製されてもよいし、濃縮されてもよい。
【００２７】
「魚油」は、油が豊富な魚の組織に由来する油を指す。油が豊富な魚の例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：メンハーデン、カタクチイワシ、ニシン、カラフトシシャモ、およびタラ等。魚油は、ペットフード製品の典型的な構成要素である。
【００２８】
「植物油」は、植物から得られるあらゆる食用油を指す。典型的に、植物油は、植物の種子または穀粒から抽出される。
【００２９】
用語「トリアシルグリセロール」［「ＴＡＧ」］は、３つの脂肪アシル残基がグリセロール分子にエステル化された構成の中性脂質を指す。
【００３０】
ＴＡＧは、長鎖のＰＵＦＡおよび飽和脂肪酸、ならびにより短い鎖の飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸を含有してよい。「中性脂質」は、貯蔵脂肪として脂質体において細胞中に一般的に見出される脂質を指し、細胞のｐＨにて脂質が荷電基を有していないことからそう呼ばれている。通常、中性脂質は完全に無極性であり、水に対する親和性が無い。中性脂質は通常、脂肪酸とのグリセロールのモノエステル、ジエステル、および／またはトリエステルを指し、それぞれモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、もしくはトリアシルグリセロール、または一括してアシルグリセロールとも呼ばれる。
【００３１】
アシルグリセロールから遊離脂肪酸が放出されるには、加水分解反応が起こらなければならない。
【００３２】
本明細書中の用語「総脂肪酸」［「ＴＦＡ」］は、例えばバイオマスまたは油であり得る、所与のサンプル中の、塩基エステル転移法（当該技術において知られている）によって脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］に誘導体化され得る細胞の全脂肪酸の総計を指す。ゆえに、総脂肪酸は、遊離脂肪酸ではなく、中性脂質画分（ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、およびＴＡＧを含む）からの、そして極性脂質画分（例えば、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン画分を含む）からの脂肪酸を含む。
【００３３】
用語細胞の「総脂質含有量」は、乾燥細胞重［「ＤｅＷ」］のパーセントとしてのＴＦＡの一指標であるが、総脂質含有量は、ＤｅＷのパーセントとしてのＦＡＭＥ［「ＦＡＭＥ％ＤｅＷ」］の一指標として概算され得る。ゆえに、総脂質含有量［「ＴＦＡ％ＤｅＷ」］は、例えば、ＤｅＷ１００ミリグラムあたりの総脂肪酸ミリグラムに等しい。
【００３４】
総脂質中の脂肪酸濃度は、本明細書中で、ＴＦＡの重量パーセント（％ＴＦＡ）、例えば、ＴＦＡ１００ミリグラムあたりの所与の脂肪酸ミリグラムとして表される。本明細書中の開示において別段の記載がある場合を除き、総脂質に対する所与の脂肪酸パーセントへの言及は、％ＴＦＡとしての脂肪酸濃度に等しい（例えば、総脂質の％ＥＰＡが、ＥＰＡ％ＴＦＡに等しい）。
【００３５】
場合によっては、細胞中の所与の脂肪酸の含有量を、乾燥細胞重の重量パーセント（％ＤＣＷ）として表すことが有用である。ゆえに、例えば、エイコサペンタエン酸％ＤＣＷが、以下の式に従って決定されるであろう：（エイコサペンタエン酸％ＴＦＡ）］＊（ＴＦＡ％ＤＣＷ）／１００。しかしながら、乾燥細胞重の重量百分率（％ＤＣＷ）としての、細胞中の所与の脂肪酸の含有量は、以下として概算され得る：（エイコサペンタエン酸％ＴＦＡ）＊（ＦＡＭＥ％ＤＣＷ）／１００。
【００３６】
用語「脂質プロフィール」および「脂質組成」は、互換可能であり、特定の脂質画分中に、例えば総脂質または油中に含有される個々の脂肪酸の量に言及し、当該量は、ＴＦＡの重量パーセントとして表される。混合物中に存在する個々の脂肪酸の総計は、１００であるはずである。
【００３７】
用語「混合油」は、所望の組成物を得るための、本明細書中に記載される抽出油を、油のあらゆる組合せまたは個々の油と混合することによって得られる油を指す。ゆえに、例えば、所望のＰＵＦＡ組成物を得るために、異なる微生物由来のタイプの油が一緒に混合されてよい。代わりに、または追加的に、本明細書中に開示されるＰＵＦＡ含有油は、所望の組成物を得るために、魚油、植物油、または双方の混合物と混合されてよい。
【００３８】
用語「脂肪酸」は、約Ｃ１２からＣ２２の様々な鎖長の長鎖脂肪酸（アルカン酸）を指すが、より長い鎖長の酸およびより短い鎖長の酸の双方が知られている。主たる鎖長はＣ１６からＣ２２である。脂肪酸の構造は、「Ｘ：Ｙ」の単純な表記系によって表され、Ｘは、特定の脂肪酸中の炭素［「Ｃ」］原子の総数であり、Ｙは、二重結合の数である。「飽和脂肪酸」対「不飽和脂肪酸」、「一価不飽和脂肪酸」対「多価不飽和脂肪酸」［「ＰＵＦＡ」］、そして「オメガ−６脂肪酸」［「００−６」または「ｎ−６」］対「オメガ−３脂肪酸」［「００−３」または「ｎ−３」］の間の分化に関する付加的な詳細が、米国特許第７２３８４８２号明細書に与えられており、この出願は、参照によって本明細書中に組み込まれる。
【００３９】
「魚粉」は、ペットフード製品用のタンパク質源を指す。魚粉は、典型的に、ヒト食用の魚（例えば、サケ、マグロ）の加工と関連する漁業系廃棄物から生産されるか、単に魚粉を生産する目的で収穫された特定のペット（すなわち、ニシン、メンハーデン）から生産される。
【００４０】
典型的な魚油中に与えられるＥＰＡの量（総脂肪酸のパーセント［「％ＴＦＡ」］として）およびＤＨＡ％ＴＦＡは、ＥＰＡのＤＨＡに対する比率が変化するにつれ、変化する。典型的な値が、Ｔｕｒｃｈｉｎｉ，Ｔｏｒｓｔｅｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｎｇ（Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ  １：１０−５７（２００９））の研究に基づいて、表１に要約されている：
【００４１】
【表１】
2018530990.tif 000002
【００４２】
多くの場合、ＥＰＡ：ＤＨＡ比がより低い魚由来の油が、より低いコストのために、ペットフード製品に用いられる。
【００４３】
第４の態様において、ペットフード製品は、ペットフード製品の重量パーセントとして測定されて少なくとも約０．０４％である、単一の微生物源に由来するＥＰＡおよびＤＨＡの総量を含んでよい。この量（すなわち、０．０４％）は、典型的に、種々のペット動物の成長を支えるのに適した適切な最小濃度である。
【００４４】
本発明のペットフード製品は、ＤＨＡおよびＥＰＡの一つの源を含み、組成物中のＥＰＡ：ＤＨＡの比率は０．２：１から１：１であり、それぞれ、微生物源における、またはペットフード製品における総脂肪酸の重量パーセントとして測定される。
【００４５】
本発明に従う添加組成物を製造する殆どのプロセスは、微生物発酵で始まることとなり、特定の微生物が、当該微生物の増殖、ならびにＥＰＡおよびＤＨＡを含む微生物油の産生を可能にする条件下で培養される。適切な時期に、微生物細胞は発酵容器から収穫される。この微生物バイオマスは、種々の手段、例えば脱水、乾燥、機械的破壊、ペレット化その他を用いて、機械的に加工されてよい。その後、バイオマス（またはそこから抽出された油）は、ペットフードの飼料添加物として（好ましくは、標準的なペットフード製品に用いられる魚油の少なくとも一部の代替物として）用いられる。ペットフードはその後、動物に、ペットフード由来のＥＰＡおよびＤＨＡが動物中に蓄積するように、寿命の少なくとも一部にわたって、与えられる。
【００４６】
本発明に従うＥＰＡおよびＤＨＡを含む微生物の添加組成物は、本明細書中で、ペットフード製品に用いられる様々な形態で提供され得、ＤＨＡおよびＥＰＡは典型的に、微生物バイオマスもしくは加工されたバイオマス内に、または部分的に精製された油の形態もしくは精製油内に含有される。場合によっては、微生物バイオマスまたは加工されたバイオマスを動物飼料組成物中に組み込むのが、最もコスト効率がよいであろう。その他の場合、微生物油（部分的に、または精製された形態）を動物飼料組成物中に、好ましくはペットフード製品中に組み込むことが有利であろう。
【００４７】
本発明に従う微生物は、藻類、菌類、または酵母である。好ましい微生物は、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅ）目の微生物であるスラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）である。スラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）は、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属およびスラウストチトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属のメンバーを含み、ＤＨＡおよびＥＰＡが挙げられるオメガ−３脂肪酸の代用源として認識されてきた。米国特許第５１３０２４２号明細書を参照。
【００４８】
好ましい実施形態において、微生物は、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属種の突然変異株である。シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属株は、ＤＨＡ等のＰＵＦＡの天然源であり、本発明に従う微生物源として用いられるように、突然変異誘発によって最適化されてよい。
【００４９】
ＤＨＡおよびＥＰＡ産生シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属株は、連続突然変異誘発に続いて、優れたＥＰＡおよびＤＨＡの産生ならびに特異的なＥＰＡ：ＤＨＡ比を実証する突然変異株の適切な選択によって、得られてよい。出発野生株として、世界中の幾多の微生物株保存機関、例えばＡＴＣＣおよびＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）に寄託されたものが挙げられる。典型的に、所望の突然変異株を得るには、連続的な２ラウンド以上の突然変異誘発を実行することが必須である。
【００５０】
酵母細胞に遺伝的変化を誘導することができるあらゆる化学剤または非化学剤（例えば、紫外線（ＵＶ）放射）が、突然変異原として用いられてよい。これらの剤は単独で用いられても互いに組み合わせて用いられてもよく、化学剤はそのままで用いられても溶媒と用いられてもよい。
【００５１】
例えば、株は、商業的に存続可能な量で、かつ特異的なＥＰＡ：ＤＨＡ比でＥＰＡおよびＤＨＡを産生するように突然変異し選択されてよい。
【００５２】
あるいは、本発明に従う微生物源は、ＰＵＦＡを産生するように遺伝的に形質転換された微生物によって産生されてよい。場合によっては、微生物は、例えば、宿主生物中のデルタ−６デサチュラーゼ／デルタ−６エロンガーゼ経路、またはデルタ−９エロンガーゼ／デルタ−８デサチュラーゼ経路のデサチュラーゼおよびエロンガーゼをコードする適切な異種遺伝子を発現することによるＤＨＡおよびＥＰＡの産生について、操作されてよい。
【００５３】
発現カセット内の異種遺伝子は典型的に、宿主細胞ゲノム中に統合される。特定の発現カセット内に含まれる特定の遺伝子は、宿主生物、そのＰＵＦＡプロフィールおよび／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼプロフィール、基質の利用可能性、ならびに所望の最終産物によって決まる。ＥＰＡを産生するＰＵＦＡポリケチドシンターゼ［「ＰＫＳ」］系、例えばシュワネラ・プトレファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）（米国特許第６１４０４８６号明細書）、シュワネラ・オレヤナ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｌｌｅｙａｎａ）（米国特許第７２１７８５６号明細書）、シュワネラ・ジャポニカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）（米国特許第７２１７８５６号明細書）およびビブリオ・マリヌス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ）（米国特許第６１４０４８６号明細書）において見出されるもの等が、ＥＰＡおよびＤＨＡの産生を可能にするのに適したＤＨＡ産生微生物中に導入されてもよい。ＤＨＡを生来産生する他のＰＫＳ系を備える宿主生物が、最大２：１以上のＥＰＡ：ＤＨＡ比を与えるのに適したＰＵＦＡの組合せの産生を可能にするように操作されてもよい。
【００５４】
当業者は、ＥＰＡおよびＤＨＡの生合成に適切な酵素をコードする１つまたは複数の発現カセットを、最適な微生物宿主生物中に導入するのに必須の考慮事項および技術に精通しており、多数の教示が文献において当業者に提供されている。これらの遺伝子操作された生物由来のＥＰＡおよびＤＨＡを含む微生物油は、本明細書中でペットフード製品に用いるのに適しており、油は、微生物バイオマスまたは加工されたバイオマス内に含有されてもよいし、油は、部分的に精製された油、または精製油であってもよい。
【００５５】
本発明に有用な微生物の典型的な種が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２０８、ＰＴＡ−１０２０９、ＰＴＡ−１０２１０、またはＰＴＡ−１０２１１、ＰＴＡ−１０２１２、ＰＴＡ−１０２１３、ＰＴＡ−１０２１４、ＰＴＡ−１０２１５によって受託されている。
【００５６】
一部の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２１２によって受託されている種の特性を有する単離微生物、またはそれに由来する株を対象とする。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２１２によって受託されている種の特性として、その増殖特性および表現型特性（表現型特性の例として、形態的特性および繁殖特性が挙げられる）、その物理的性質および化学的性質（例えば乾燥重および脂質プロフィール）、その遺伝子配列、ならびにそれらの組合せが挙げられ得、当該特性は、以前に同定された種に対して種を識別する。一部の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２１２によって受託されている種の特性を有する単離微生物を対象とし、特性として、１８ｓ  ｒＲＮＡが、配列番号１のポリヌクレオチド配列、または配列番号１と少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むこと、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２１２によって受託されている種の形態特性および繁殖特性、ならびにＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２１２によって受託されている種の脂肪酸プロフィールが挙げられる。
【００５７】
更なる実施形態において、突然変異株は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２１３、ＰＴＡ−１０２１４、またはＰＴＡ−１０２１５によって受託されている株である。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２１３、ＰＴＡ−１０２１４、およびＰＴＡ−１０２１５と関連する微生物は、ブタペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙ）に従って、２００９年７月１４日に、米国菌培養収集所（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１  １０−２２０９に寄託された。
【００５８】
一部の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２０８によって受託されている種の単離微生物を対象とする。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２０８と関連する単離微生物は、本明細書中で、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ種のＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１０２０８としても知られる。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２０８と関連する微生物は、ブタペスト条約に従って、２００９年７月１４日に、米国菌培養収集所，Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１  １０−２２０９に寄託された。
【００５９】
一部の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２０８によって受託されている微生物の突然変異株を対象とする。更なる実施形態において、突然変異株は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２０９、ＰＴＡ−１０２１０、またはＰＴＡ−１０２１１によって受託されている株である。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２０９、ＰＴＡ−１０２１０、およびＰＴＡ−１０２１１と関連した微生物は、ブタペスト条約に従って、２００９年９月２５日に、米国菌培養収集所，Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１  １０−２２０９に寄託された。
【００６０】
本発明に従う微生物は、微生物によってＰＵＦＡが産生される条件下の発酵培地中で培養されて増殖することができる。典型的に、微生物は、炭素および窒素の源と共に、微生物の増殖ならびに／またはＥＰＡおよびＤＨＡの産生を可能にするいくつかの付加的な化学物質または物質が供給される。発酵条件は、用いられる微生物によって決まることとなり、結果として生じるバイオマスにおいて所望のＰＵＦＡの含有量が高くなるように最適化されてよい。
【００６１】
一般に、培養条件は、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素・窒素比、様々なミネラルイオンの量、酸素レベル、増殖温度、ｐＨ、バイオマス生産フェーズの長さ、油蓄積フェーズの長さ、ならびに細胞収穫の時間および方法を修正することによって最適化されてよい。
【００６２】
所望量のＥＰＡおよびＤＨＡが微生物によって産生されると、発酵培地は、ＰＵＦＡを含む微生物バイオマスが得られるように処理されてよい。例えば、発酵培地は濾過されてもよいし、それ以外のやり方では、水性成分の少なくとも一部が取り除かれるように処理されてもよい。発酵培地および／または微生物バイオマスはさらに加工されてよく、例えば、微生物バイオマスは、微生物油および／またはＰＵＦＡを損なう虞がある内因性微生物酵素の活性を引き下げるために、低温殺菌されてもよいし、他の手段を介して処理されてもよい。微生物バイオマスは、（例えば、所望の水含有量への）乾燥、もしくは（例えば、細胞含有物へのアクセシビリティをより大きくする物理的手段、例えばビーズビータ、スクリュー押出しその他を介した）機械的破壊手段、またはこれらの組合せに曝されてよい。微生物バイオマスは、取扱いの簡略化のために顆粒状にされてもよいし、ペレット化されてもよい。先に記載される手段のいずれかから得られた微生物バイオマスは、ＥＰＡおよびＤＨＡを含む部分的に精製された、または精製された微生物油形態の源として用いられ得る。この微生物油源はその場合、ペットフード製品の好ましい飼料添加物として用いられ得る。
【００６３】
本発明に従う微生物油の好ましい例が、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に由来する油であって、
−少なくとも４０ｗ／ｗ％のＤＨＡおよびＥＰＡ、好ましくは約５０ｗ／ｗ％のＤＨＡおよびＥＰＡを、
−約０．２：１〜１：１、好ましくは０．４：１〜０．８：１のＥＰＡ：ＤＨＡ比で、そして
−安定性を実現するために加えられる少なくとも１つの酸化防止剤
を含有する油である。
【００６４】
本方法において、微生物源由来のＥＰＡおよびＤＨＡを含むペットフード製品は、持続可能に生産される。本明細書中の開示に基づいて、魚油の再生可能代替物が、ペットフード製品を持続可能に生産する手段として利用され得ることが明らかであろう。
【００６５】
ペットフード製品は、ミクロ成分およびマクロ成分を含む。
【００６６】
栄養機能を備えるマクロ成分が、成長およびパフォーマンスに必要とされるタンパク質およびエネルギーを動物に提供する。ペットに関して、ペットフード製品は、ペットに以下のものを理想的に提供するべきである：１）エネルギー用の（とりわけ心筋および骨格筋用の）脂肪酸源として機能する脂肪；および２）タンパク質の構築ブロックとして機能するアミノ酸。脂肪はまた、ビタミン吸収を補助する；例えば、ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫは、脂溶性であり、脂肪と併せてのみ消化、吸収、かつ輸送され得る。典型的には植物起源の炭水化物（例えば、コムギ、ヒマワリ粉、トウモロコシグルテン、大豆粉）も多くの場合、ペットフード製品に含まれるが、炭水化物は、タンパク質または脂肪に勝る優れたペット用エネルギー源ではない。
【００６７】
脂肪は典型的に、魚粉（微量の魚油を含有する）および魚油の、ペットフード製品中への組込みを介して提供される。ペットフード製品に用いられ得る抽出油として、魚油（例えば、油が豊富な魚のメンハーデン、カタクチイワシ、ニシン、カラフトシシャモ、およびタラの肝臓に由来）および植物油（例えば、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ種子およびアマニに由来）が挙げられる。典型的に、魚油が好ましい油である。なぜなら、長鎖オメガ−３多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］、ＥＰＡ、およびＤＨＡを含有するからである；対照的に、植物油は、ＥＰＡおよび／またはＤＨＡの源を提供しない。これらのＰＵＦＡは、ペットの成長および健康に必要とされる。典型的なペットフード製品は、ペットフード製品の重量パーセントとして測定されて約１５〜３０％の油（例えば、魚、植物その他）を含む。
【００６８】
別の主要なマクロ成分が、タンパク質源である。ペットフード製品中に供給されるタンパク質は、植物起源または動物起源のものであってよい。例えば、動物起源のタンパク質は、海洋動物由来のもの（例えば、ペット粉、魚油、ペットタンパク質、オキアミ粉、カラスガイ粉、エビ殻、イカ粉、イカ油その他）であってもよいし、陸上動物由来のもの（例えば、血粉、卵粉、レバー粉、肉粉、肉骨粉、カイコ、蛹粉、ホエー粉末その他）であってもよい。植物起源のタンパク質として、大豆粉、トウモロコシグルテン粉、小麦グルテン、綿実粉、キャノーラ粉、ヒマワリ粉、および米等が挙げられ得る。
【００６９】
マクロ成分の技術的機能は重なってもよく、例えば、小麦グルテンは、ペレット化助剤として、そして栄養価が比較的高いそのタンパク質含有量のために、用いられてよい。グアーゴムおよび小麦粉が言及されてもよい。
【００７０】
ミクロ成分として、添加物、例えばビタミン、微量ミネラル、ペットフード抗生物質、および他の生物製剤が挙げられる。１００ｍｇ／ｋｇ（１００ｐｐｍ）未満のレベルで用いられるミネラルが、ミクロミネラルまたは微量ミネラルと考えられる。
【００７１】
栄養機能を備えるミクロ成分は全て、生物製剤および微量ミネラルである。それらは生物学的プロセスに関係し、良好な健康および高いパフォーマンスに必要とされる。ビタミン、例えばビタミンＡ、Ｅ、Ｋ３、Ｄ３、Ｂ１、Ｂ３、Ｂ６、Ｂ１２、Ｃ、ビオチン、葉酸、パントテン酸、ニコチン酸、塩化コリン、イノシトール、およびパラアミノ安息香酸が言及されてよい。ミネラル、例えばカルシウム、コバルト、銅、鉄、マグネシウム、リン、カリウム、セレンおよび亜鉛の塩が言及されてよい。他の成分として、抗酸化剤、ベータグルカン、胆汁酸塩、コレステロール、酵素、グルタミン酸一ナトリウム、カロチノイドその他が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００７２】
ミクロ成分の技術的機能は主に、ペレット化、無毒化、カビ予防、酸化防止その他に関係する。
【００７３】
本発明の成分に加えて、ドッグフード組成物に成分を提供する典型的な成分が、例えば、鶏肉／牛肉／七面鳥、肝臓、粉砕精白オオムギ、粉砕トウモロコシ、動物脂肪、全乾燥卵、家禽タンパク質加水分解物、植物油、炭酸カルシウム、塩化コリン、塩化カリウム、ヨード塩、酸化鉄、酸化亜鉛、硫酸銅、酸化マンガン、亜セレン酸ナトリウム、ヨウ素酸カルシウム、プロビタミンＤ、ビタミンＢ１、ナイアシン、パントテン酸カルシウム、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、ビタミンＢ１２を含む。
【００７４】
本発明の成分に加えて、キャットフード組成物に成分を提供する典型的な成分は、牛肉、鶏肉、乾燥ニワトリ肝臓、ラム肉、ラム肝臓、豚肉、七面鳥肉、七面鳥肝臓、家禽ミール、魚粉、家禽タンパク質加水分解物、動物脂肪、植物油、大豆粉、エンドウブラン、トウモロコシグルテン、全乾燥卵、粉砕トウモロコシ、トウモロコシフラワー、米、米フラワー、乾燥テンサイモラセス、フルクトオリゴ糖、可溶性繊維、植物ゴム、セルロース粉末、クレイ、パン酵母、ヨウ素添加塩化ナトリウム、硫酸カルシウム、三リン酸ナトリウム、リン酸二カルシウム、炭酸カルシウム、塩化カリウム、塩化コリン、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、酸化鉄、硫酸銅、硫酸鉄、酸化マンガン、ヨウ素酸カルシウム、亜セレン酸ナトリウム、プロビタミンＤ、チアミン、ナイアシン、パントテン酸カルシウム、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、ビタミンＢ１２、タウリン、Ｌ−カルニチン、カゼイン、Ｄ−メチオニンを含む。
【００７５】
ウェットペットフードは、約７０から約８５％の水分、および約１５から約２５％の乾物を含有する。
【００７６】
成犬用の典型的なウェットフードは、例えば、本発明に従うＤＨＡおよびＥＰＡの微生物源に加えて、少なくとも２４％のタンパク質、１５％の脂肪、５２％のデンプン、０．８％の繊維、３％のリノール酸、０．６％のカルシウム、０．５％のリン（Ｃａ：Ｐ比は１：１である）、０．２％のカリウム、０．６％のナトリウム、０．０９％の塩化物、０．０９％のマグネシウム、１７０ｍｇ／ｋｇの鉄、１５ｍｇ／ｋｇの銅、７０ｍｇ／ｋｇのマンガン、２２０ｍｇ／ｋｇの亜鉛、４ｍｇ／ｋｇのヨウ素、０．４３ｍｇ／ｋｇのセレン、７４０００ＩＵ／ｋｇのビタミンＡ、１２００ＩＵ／ｋｇのビタミンＤ、１１ｍｇ／ｋｇのビタミンＢ１、６ｍｇ／ｋｇのリボフラビン、３０ｍｇ／ｋｇのパントテン酸、２０ｍｇ／ｋｇのナイアシン、４．３ｍｇ／ｋｇのピリドキシン、０．９ｍｇ／ｋｇの葉酸、０．２μｇ／ｋｇのビタミンＢ１２、２５００ｍｇ／ｋｇのコリン、２５００ｍｇ／ｋｇのコリンを含んでよい。全てのパーセンテージは、総食物組成物の乾物重に基づく。
【００７７】
成猫用の典型的なウェットフードは、例えば、本発明に従うＤＨＡおよびＥＰＡの微生物源に加えて、少なくとも４４％のタンパク質、２５％の脂肪、２０％のデンプン、２．５％の繊維、０．８％のカルシウム、０．６％のリン、０．８％のカリウム、０．３％のナトリウム、０．０９％の塩化物、０．０８％のマグネシウム、０．２５％のタウリン、１７０ｍｇ／ｋｇの鉄、１５ｍｇ／ｋｇの銅、７０ｍｇ／ｋｇのマンガン、２２０ｍｇ／ｋｇの亜鉛、４ｍｇ／ｋｇのヨウ素、０．４３ｍｇ／ｋｇのセレン、７４０００ＩＵ／ｋｇのビタミンＡ、１２００ＩＵ／ｋｇのビタミンＤ、１１ｍｇ／ｋｇのビタミンＢ１、６ｍｇ／ｋｇのリボフラビン、３０ｍｇ／ｋｇのパントテン酸、２０ｍｇ／ｋｇのナイアシン、４．３ｍｇ／ｋｇのピリドキシン、０．９ｍｇ／ｋｇの葉酸、０．２μｇ／ｋｇのビタミンＢ１２、２５００ｍｇ／ｋｇのコリン、２５００ｍｇ／ｋｇのコリンを含んでよい。全てのパーセンテージは、総食物組成物の乾物重に基づく。
【００７８】
ドライペットフードは、約６から約１４％の水分、および約８６％以上の乾物を含有する。
【００７９】
成犬用の典型的なドライフードは、例えば、本発明に従うＤＨＡおよびＥＰＡの微生物源に加えて、少なくとも２５％のタンパク質、１２％の脂肪、４１．５％のデンプン、２．５％の繊維、１％のリノール酸、１％のカルシウム、０．８％のリン（Ｃａ：Ｐ比は１：１である）、０．６％のカリウム、０．３５％のナトリウム、０．０９％の塩化物、０．１％のマグネシウム、１７０ｍｇ／ｋｇの鉄、３５ｍｇ／ｋｇの銅、７０ｍｇ／ｋｇのマンガン、２２０ｍｇ／ｋｇの亜鉛、４ｍｇ／ｋｇのヨウ素、０．４３ｍｇ／ｋｇのセレン、１５０００ＩＵ／ｋｇのビタミンＡ、１２００ＩＵ／ｋｇのビタミンＤ、１１ｍｇ／ｋｇのビタミンＢ１、６ｍｇ／ｋｇのリボフラビン、３０ｍｇ／ｋｇのパントテン酸、２０ｍｇ／ｋｇのナイアシン、４．３ｍｇ／ｋｇのピリドキシン、０．９ｍｇ／ｋｇの葉酸、０．２μｇ／ｋｇのビタミンＢ１２、２５００ｍｇ／ｋｇのコリンを含んでよい。全てのパーセンテージは、総食物組成物の乾物重に基づく。
【００８０】
成猫用の典型的なフードは、例えば、本発明に従うＤＨＡおよびＥＰＡの微生物源に加えて、少なくとも３２％のタンパク質、１５％の脂肪、２７．５％のデンプン、１１％の食物繊維、４．５％の繊維、３．４％のリノール酸、０．０８％のアラキドン酸、０．１５％のタウリン、５０ｍｇ／ｋｇのＬ−カルニチン、５．１％のカルシウム、０．８％のリン（Ｃａ：Ｐ比は、少なくとも１：１である）、０．６％のカリウム、０．４％のナトリウム、０．６％の塩化物、０．０８％のマグネシウム、１９０ｍｇ／ｋｇの鉄、３０ｍｇ／ｋｇの銅、６０ｍｇ／ｋｇのマンガン、２０５ｍｇ／ｋｇの亜鉛、２．５ｍｇ／ｋｇのヨウ素、０．２ｍｇ／ｋｇのセレン、２５０００ＩＵ／ｋｇのビタミンＡ、１５００ＩＵ／ｋｇのビタミンＤ、２０ｍｇ／ｋｇのビタミンＢ１、４０ｍｇ／ｋｇのリボフラビン、５６ｍｇ／ｋｇのパントテン酸、１５３ｍｇ／ｋｇのナイアシン、１４ｍｇ／ｋｇのピリドキシン、３．２ｍｇ／ｋｇの葉酸、０．２ｍｇ／ｋｇのビタミンＢ１２、３０００ｍｇ／ｋｇのコリンを含んでよい。全てのパーセンテージは、総食物組成物の乾物重に基づく。
【００８１】
ドライフードは、例えば、非常に短時間の、生の成分の調理、特定のギブル形状およびギブルサイズへの成形およびカット、そして同時に有害微生物の駆除を含むスクリュー押出法によって調製され得る。成分は、拡張可能な均質の生地に混合されて、押出機内で調理（蒸気／圧力）されて、加圧高熱下で強制的にプレートに通されてよい。調理後、ギブルは冷却され、場合によってはそれから、例えばニワトリまたはウサギ由来の肝臓または腸等の、液体または粉末の加水分解形態の動物組織を含む液体脂または消化物を含み得るコーティングがスプレーされる。その後、熱風乾燥により総水分含有量が１０％以下に引き下げられる。
【００８２】
缶詰の（ウェット）フードは、例えば、肉および野菜、ゲル化剤、肉汁、ビタミン、ミネラル、ならびに水が挙げられる生の成分を混合することによって、調製されてよい。混合物はその場合、生産ライン上の缶中に入れられて、蓋が上にシールされて、満たされた缶は、約１３０℃の温度で約５０〜１００分間滅菌される。
【００８３】
イヌ飼料組成物の典型的な配合が、以下の表に示される。
ＤＨＡ  高５．５〜中１．９〜低０．２ｇ／ｋｇ乾物
ＥＰＡ  高５．０〜中１．９〜低０．２ｇ／ｋｇ乾物
ビタミンＥ  ５００ｍｇ／ｋｇ食事
ビタミンＣ  ３００ｍｇ／ｋｇ食事
ベータカロチン  ５０ｍｇ／ｋｇ
ビタミンＢ１  ２０ｍｇ／ｋｇ
ビタミンＢ６  １４ｍｇ／ｋｇ
ビタミンＢ１２  ０．０５ｍｇ／ｋｇ
【００８４】
本発明を広く説明してきたが、本明細書中に与えられる実施例を参照することによって、更なる理解を得ることができる。この実施例は説明することだけを目的としており、限定することは意図されない。
【００８５】
［実施例１  ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２１２によって受託されている単離微生物の増殖特性］
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２１２によって受託されている単離微生物を、下記のように、個々の発酵ランにおける増殖特性について調査した。典型的な培地および培養条件を表３に示す。
【００８６】
【表２】
2018530990.tif 000003
【００８７】
典型的な培養条件は、以下の通りである：
ｐＨ  ６．５〜９．５、約６．５〜約８．０、もしくは約６．８〜約７．８；
温度：  摂氏１５〜３０度、摂氏約１８〜約２８度、もしくは摂氏約２１〜約２３度；
酸素の溶解：  ０．１〜約１００％飽和、約５〜約５０％飽和、もしくは約１０〜約３０％飽和；および／または
グリセロールの調整＠：  ５〜約５０ｇ／Ｌ、約１０〜約４０ｇ／Ｌ、もしくは約１５〜約３５ｇ／Ｌ。
【００８８】
１０００ｐｐｍのＣｌ、２２．５℃、２０％の溶解酸素、ｐＨ７．３による炭素（グリセロール）および窒素供給培養において、ＰＴＡ−１０２１２は、１０Ｌの発酵槽容量での１３８時間の培養後に、２６．２ｇ／Ｌの乾燥細胞重をもたらした。脂質収率は７．９ｇ／Ｌであった；オメガ−３収率は５．３ｇ／Ｌであった；ＥＰＡ収率は３．３ｇ／Ｌであり、ＤＨＡ収率は１．８ｇ／Ｌであった。脂肪酸含有量は３０．３重量％であった；ＥＰＡ含有量は、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）の４１．４％であった；ＤＨＡ含有量は、ＦＡＭＥの２６．２％であった。これらの条件下で、脂質産生能は１．３８ｇ／Ｌ／日であり、オメガ−３産生能は０．９２ｇ／Ｌ／日であり、ＥＰＡ産生能は０．５７ｇ／Ｌ／日、そしてＤＨＡ産生能は０．３１ｇ／Ｌ／日であった。
【００８９】
１０００ｐｐｍのＣｌ、２２．５℃、２０％の溶解酸素、ｐＨ７．３による炭素（グリセロール）および窒素供給培養において、ＰＴＡ−１０２１２は、１０Ｌの発酵槽容量での１８９時間の培養後に、３８．４ｇ／Ｌの乾燥細胞重をもたらした。脂質収率は１８ｇ／Ｌであった；オメガ−３収率は１２ｇ／Ｌであった；ＥＰＡ収率は５ｇ／Ｌであり、ＤＨＡ収率は６．８ｇ／Ｌであった。脂肪酸含有量は、４５重量％であった；ＥＰＡ含有量は、ＦＡＭＥの２７．８％であった；ＤＨＡ含有量は、ＦＡＭＥの３７．９％であった。これらの条件下で、脂質産生能は２．３ｇ／Ｌ／日であり、オメガ−３産生能は１．５ｇ／Ｌ／日であり、ＥＰＡ産生能は０．６３ｇ／Ｌ／日、そしてＤＨＡ産生能は０．８６ｇ／Ｌ／日であった。
【００９０】
１０００ｐｐｍのＣｌ、２２．５℃、２０％の溶解酸素、ｐＨ６．８〜７．７による炭素（グリセロール）および窒素供給培養において、ＰＴＡ−１０２１２は、１０Ｌ発酵槽容量での１８９時間の培養後に、１３ｇ／Ｌの乾燥細胞重をもたらした。脂質収率は５．６ｇ／Ｌであった；オメガ−３収率は３．５ｇ／Ｌであった；ＥＰＡ収率は１．５５ｇ／Ｌであり、ＤＨＡ収率はｌ．９ｇ／Ｌであった。脂肪酸含有量は、３８重量％であった；ＥＰＡ含有量は、ＦＡＭＥの２９．５％であった；ＤＨＡ含有量は、ＦＡＭＥの３６％であった。これらの条件下で、脂質産生能は０．６７ｇ／Ｌ／日であり、オメガ−３産生能は０．４ｇ／Ｌ／日であり、ＥＰＡ産生能は０．２０ｇ／Ｌ／日、そしてＤＨＡ産生能は０．２４ｇ／Ｌ／日であった。
【００９１】
１０００ｐｐｍのＣｌ、２２．５〜２８．５℃、２０％の溶解酸素、ｐＨ６．６〜７．２による炭素（グリセロール）および窒素供給培養において、ＰＴＡ−１０２１２は、１０Ｌ発酵槽容量での１９１時間の培養後に、３６．７ｇ／Ｌ〜４８．７ｇ／Ｌの乾燥細胞重をもたらした。脂質収率は１５．２ｇ／Ｌ〜２５．３ｇ／Ｌであった；オメガ−３収率は９．３ｇ／Ｌ〜１３．８ｇ／Ｌであった；ＥＰＡ収率は２．５ｇ／Ｌ〜３．３ｇ／Ｌであり、ＤＨＡ収率は５．８ｇ／Ｌ〜１１ｇ／Ｌであった。脂肪酸含有量は、４２．４重量％〜５３重量％であった；ＥＰＡ含有量は、ＦＡＭＥの９．８％〜２２％であった；ＤＨＡ含有量は、ＦＡＭＥの３８．１％〜４３．６％であった。これらの条件下で、脂質産生能は１．９ｇ／Ｌ／日〜３．２ｇ／Ｌ／日であり、オメガ−３産生能は１．２ｇ／Ｌ／日〜１．７のｇ／Ｌ／日であり、ＥＰＡ産生能は０．３１ｇ／Ｌ／日〜０．４１ｇ／Ｌ／日、そしてＤＨＡ産生能は０．７２ｇ／Ｌ／日〜１．４ｇ／Ｌ／日であった。
【００９２】
［実施例２］
Ｋｕｎｏによって加えられるＤＨＡの実験データ
【００９３】
［実施例３］
市販のドライドッグフード（Ｈｉｌｌ’ｓ  Ｐｅｔ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ＧｍｂＨ，Ｌｉｅｂｉｇｓｔｒａｓｓｅ  ２−２０，Ｄ−２２１１３によって供給されるイヌ用のＨｉｌｌ’ｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｄｉｅｔ「Ｃａｎｉｎｅ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｄｒｙ」）に、体重１ｋｇあたり４ｍｇから１２０ｍｇのＤＨＡおよびＥＰＡ全体の１日用量を対象に投与するのに十分な量の、４５ｗ／ｗ％のＤＨＡおよびＥＰＡ（ＥＰＡ：ＤＨＡ比は０．４：１〜０．８：１）を含有する微生物油をスプレー／施薬する。混合物全体を押出加工する前に、最終フード組成物中に３０ｍｇのビタミンＣ／ｋｇ、３００ＩＵのビタミンＥ／ｋｇ、および２８０ｍｇのβカロチン／ｋｇを提供するのに十分な量の、更なるビタミンＣおよびビタミンＥならびにβカロチンを組み込む。食物組成物は、約９０重量％の乾物を含有するように乾燥させる。
【００９４】
［実施例４］
市販のウェットドッグフード（Ｈｉｌｌ’ｓ  Ｐｅｔ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ＧｍｂＨ，Ｌｉｅｂｉｇｓｔｒａｓｓｅ  ２−２０，２２１１３  Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙによって供給されるイヌ用のＨｉｌｌ’ｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｄｉｅｔ「Ｃａｎｉｎｅ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｗｅｔ」）に、体重１ｋｇあたり４ｍｇから１２０ｍｇのＤＨＡおよびＥＰＡの１日用量を対象に投与するのに十分な量の、実施例３の微生物油をスプレー／施薬する。混合物全体を調理する前に、最終フード組成物中に３０ｍｇのビタミンＣ／ｋｇ、３００ＩＵのビタミンＥ／ｋｇ、および２８０ｍｇのβカロチン／ｋｇを提供するのに十分な量の、更なるビタミンＣおよびビタミンＥならびにβカロチンを組み込む。食物組成物は、約９０重量％の乾物を含有するように乾燥させる。
【００９５】
［実施例５］
市販のイヌ用おやつ（Ｍｅｒａ  Ｔｉｅｍａｈｒｕｎｇ  ＧｍｂＨ，Ｍａｒｉｅｎｓｔｒａｓｓｅ  ８０−８４，４７６２５  Ｋｅｖｅｌａｅｒ−Ｗｅｔｔｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙによって供給されるイヌ用のＭｅｒａ  Ｄｏｇ「Ｂｉｓｃｕｉｔ」）に、体重１ｋｇあたり４ｍｇから１２０ｍｇのＤＨＡおよびＥＰＡの１日用量を対象に投与するのに十分な量の、実施例３の微生物油をスプレー／施薬する。混合物全体を押出加工する前に、最終フード組成物中に３０ｍｇのビタミンＣ／ｋｇ、３００ＩＵのビタミンＥ／ｋｇ、および２８０ｍｇのβカロチン／ｋｇを提供するのに十分な量の、更なるビタミンＣおよびビタミンＥならびにβカロチンを組み込む。食物組成物は、約９０重量％の乾物を含有するように乾燥させる。
【００９６】
［実施例６］
市販のドライキャットフード（Ｈｉｌｌ’ｓ  Ｐｅｔ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ＧｍｂＨ，Ｌｉｅｂｉｇｓｔｒａｓｓｅ  ２−２０，Ｄ−２２１１３によって供給されるネコ用のＨｉｌｌ’ｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｄｉｅｔ「Ｆｅｌｉｎｅ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｄｒｙ」）に、体重１ｋｇあたり４ｍｇから１２０ｍｇのＤＨＡおよびＥＰＡの１日用量を対象に投与するのに十分な量の、実施例３の微生物油をスプレー／施薬する。混合物全体を押出加工する前に、最終フード組成物中に３０ｍｇのビタミンＣ／ｋｇ、３００ＩＵのビタミンＥ／ｋｇ、および２８０ｍｇのβカロチン／ｋｇを提供するのに十分な量の、更なるビタミンＣおよびビタミンＥならびにβカロチンを組み込む。食物組成物は、約９０重量％の乾物を含有するように乾燥させる。
【００９７】
［実施例７］
市販のウェットキャットフード（Ｈｉｌｌ’ｓ  Ｐｅｔ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ＧｍｂＨ，Ｌｉｅｂｉｇｓｔｒａｓｓｅ  ２−２０，Ｄ−２２１１３によって供給されるネコ用のＨｉｌｌ’ｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｄｉｅｔ「Ｆｅｌｉｎｅ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｗｅｔ」）に、体重１ｋｇあたり４ｍｇから１２０ｍｇのＤＨＡおよびＥＰＡの１日用量を対象に投与するのに十分な量の、実施例３の微生物油をスプレー／施薬する。混合物全体を調理する前に、最終フード組成物中に３０ｍｇのビタミンＣ／ｋｇ、３００ＩＵのビタミンＥ／ｋｇ、および２８０ｍｇのβカロチン／ｋｇを提供するのに十分な量の、更なるビタミンＣおよびビタミンＥならびにβカロチンを組み込む。食物組成物は、約９０重量％の乾物を含有するように乾燥させる。
【００９８】
［実施例８］
市販のネコ用おやつ（Ｗｈｉｓｋａｓ，Ｍａｓｔｅｒｆｏｏｄｓ  ＧｍｂＨ，Ｅｉｔｚｅｒ  Ｓｔｒ．２１５，２７２８３  Ｖｅｒｄｅｎ／Ａｌｌｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙによって供給されるネコ用のＷｈｉｓｋａｓ  Ｄｅｎｔａｂｉｔｓ）に、体重１ｋｇあたり４ｍｇから１２０ｍｇのＤＨＡおよびＥＰＡの１日用量を対象に投与するのに十分な量の、実施例３の微生物油をスプレー／施薬する。混合物全体を押出加工する前に、最終フード組成物中に３０ｍｇのビタミンＣ／ｋｇ、３００ＩＵのビタミンＥ／ｋｇ、および２８０ｍｇのβカロチン／ｋｇを提供するのに十分な量の、更なるビタミンＣおよびビタミンＥならびにβカロチンを組み込む。食物組成物は、約９０重量％の乾物を含有するように乾燥させる。
【００９９】
［実施例９  ＤＨＡおよびＥＰＡが豊富な藻類油が、イヌ中の血漿ＤＨＡおよびＥＰＡの濃度を有意に増大させる］
目的：本研究の目的は、先に記載した藻類油製品中のＤＨＡおよびＥＰＡが、イヌにおいて生物学的に利用可能かを試験することである。
【０１００】
［研究設計］
イヌ：３０頭のビーグル犬（１〜１１歳のオス１４頭およびメス１６頭）を用いた。
【０１０１】
食事：押出加工したドライドッグフードを、コントロール食として用いた。成長および繁殖に関するＡＡＦＣＯ  Ｄｏｇ  Ｆｏｏｄ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｐｒｏｆｉｌｅｓを満たすように調製した。コントロール食中の鶏脂を犠牲にして、コントロール食の乾燥ギブルを、１．７％（試験食１）または５．１％（試験食２）の藻類油（ＤＳＭ；バッチ番号：ＶＹ０００１０６７２；製品コード：５０１５８１６）で高めることによって、２つの試験食を製造した。コントロール食および試験食中のＤＨＡおよびＥＰＡの分析濃度を表４に示す。
【０１０２】
【表３】
2018530990.tif 000004
【０１０３】
手順：イヌにコントロール食を２８日間与えた後、性別および年齢に基づいて、群あたりイヌ１０頭となるように３つの群に階層化し、コントロール、試験１、および試験２の実験食の１つをさらに２８日間与えた。フード摂取量を毎日、そして体重を毎週測定した。血漿ＤＨＡおよびＥＰＡの測定のために、頸静脈穿刺を介して血液サンプルを２８日目、４２日目および５６日目に収集した。２８日目および５６日目に、獣医が、試験食２を与えたイヌの皮膚および毛を、あらゆる異常について評価した。研究中、イヌはフレッシュな水道水を常に飲むことが可能であった。
【０１０４】
結果：血漿ＤＨＡおよびＥＰＡの濃度は、試験食１または試験食２を与えたイヌにおいて、用量に反応して有意に増大した（ｐ＜０．０５；図１）。フード摂取量および体重の変化は、研究中、群間で類似していた。皮膚および毛に及ぼす悪影響は、試験食２を与えたイヌにおいて観察されなかった。
【０１０５】
結論：ＤＨＡおよびＥＰＡが豊富な藻類油は、イヌ中の血漿ＤＨＡおよびＥＰＡの濃度を有意に増大させる。藻類油中のＤＨＡおよびＥＰＡは、イヌにおいて生物学的に利用可能である。
【０１０６】
［実施例１０  ＤＨＡおよびＥＰＡが豊富な藻類油が、ネコ中の血漿ＤＨＡおよびＥＰＡの濃度を有意に増大させる］
目的：本研究の目的は、先に記載した藻類油製品中のＤＨＡおよびＥＰＡが、ネコにおいて生物学的に利用可能かを試験することである。
【０１０７】
［研究設計］
ネコ：毛の長い、または毛の短い飼いネコ３０頭（２〜１２歳のオス５頭およびメス２５頭）を用いた。
【０１０８】
食事：押出加工したドライキャットフードを、コントロール食として用いた。成長および繁殖に関するＡＡＦＣＯ  Ｃａｔ  Ｆｏｏｄ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｐｒｏｆｉｌｅｓを満たすように調製した。コントロール食中の鶏脂を犠牲にして、コントロール食の乾燥ギブルを、１．７％（試験食１）または５．１％（試験食２）の藻類油（ＤＳＭ；バッチ番号：ＶＹ０００１０６７２；製品コード：５０１５８１６）で高めることによって、２つの試験食を製造した。コントロール食および試験食中のＤＨＡおよびＥＰＡの分析濃度を表５に示す。
【０１０９】
【表４】
2018530990.tif 000005
【０１１０】
手順：ネコにコントロール食を２６日間与えた後、性別および年齢に基づいて、群あたりネコ１０頭となるように３つの群に階層化し、コントロール、試験１、および試験２の実験食の１つをさらに２８日間与えた。フード摂取量を毎日、そして体重を毎週測定した。血漿ＤＨＡおよびＥＰＡの測定のために、頸静脈穿刺を介して血液サンプルを２６日目、４０日目および５４日目に収集した。２６日目および５４日目に、獣医が、試験食２を与えたネコの皮膚および毛を、あらゆる異常について評価した。研究中、ネコはフレッシュな水道水を常に飲むことが可能であった。
【０１１１】
結果：血漿ＤＨＡおよびＥＰＡの濃度は、試験食１または試験食２を与えたネコにおいて、用量に反応して有意に増大した（ｐ＜０．０５；図１）。フード摂取量および体重の変化は、研究中、群間で類似していた。皮膚および毛に及ぼす悪影響は、試験食２を与えたネコにおいて観察されなかった。
【０１１２】
結論：ＤＨＡおよびＥＰＡが豊富な藻類油は、ネコ中の血漿ＤＨＡおよびＥＰＡの濃度を有意に増大させる。藻類油中のＤＨＡおよびＥＰＡは、ネコにおいて生物学的に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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