(57)【要約】サバイビンに特異的な抗体、前記抗体をコードする核酸、及び前記抗体を投与することによってサバイビン-発現細胞を含む腫瘍を治療する方法を提供する。前記抗体組成物は、腫瘍の増殖を抑制するのに効果的であることが判明した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体においてサバイビン-発現腫瘍を治療する方法であって、サバイビン-発現腫瘍を有する個体に組成物を投与することを含み、前記組成物がサバイビンに特異的な抗体を含む、方法。
【請求項２】
前記抗体が、アミノ酸長９〜２３であり、且つ、配列ＱＭＦＦＣＦ(配列番号３)を含むペプチドに対して産生されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体が、配列ＤＬＡＱＭＦＦＣＦＫＥＬＥＧＷ(配列番号４)を有するペプチドに対して産生されたものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体又は多特異性抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が、アイソタイプＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ１を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含んでおり、
ａ）前記重鎖可変領域が、配列番号７の配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号８の配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号９の配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１０の配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１１の配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号１２の配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む、
又は
ｂ）前記重鎖可変領域が、配列番号１３の配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１４の配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号１５の配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１６の配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１７の配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号１８の配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む
請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記重鎖可変領域が、配列番号１９に少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号２０に少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記重鎖可変領域が、配列番号２１に少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号２２に少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
サバイビンに特異的に結合する単離モノクローナル抗体であって、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含んでおり、
ａ）前記重鎖可変領域が、配列番号７の配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号８の配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号９の配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１０の配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１１の配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号１２の配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む、
又は
ｂ）前記重鎖可変領域が、配列番号１３の配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１４の配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号１５の配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１６の配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１７の配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号１８の配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む
モノクローナル抗体。
【請求項１２】
前記重鎖可変領域が、配列番号１９に少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号２０に少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
前記重鎖可変領域が、配列番号２１に少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号２２に少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体又は多特異性抗体である、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体が、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥを有する、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１６】
前記抗体が、アイソタイプＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ１を有する、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
請求項１１に記載の抗体及び薬学的に許容されるキャリアを含む、医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１１に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項１９】
前記モノクローナル抗体が、アイソタイプＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ１である、請求項１８に記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項２０】
配列番号７〜１２の１つ又は複数の配列、あるいは配列番号８〜１８の１つ又は複数の配列をコードするポリヌクレオチド配列が導入されている形質転換細胞。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
この出願は、２０１５年９月４日に提出された米国仮出願第62/214,242号に基づく優先権を主張し、その開示は参照により本明細書中に包含される。
【背景技術】
【０００２】
サバイビンは、アポトーシス抑制物質のファミリーに属する細胞内タンパク質である。サバイビンは細胞分裂を調節する紡錘体装置と協調して働く。それは、細胞周期のG2/M期の間に特定の細胞で発現され、細胞周期進行のこの期の間に紡錘体微小管形成中心に結合する。サバイビンは、細胞周期を調節するため、およびアポトーシス細胞死を抑制するため、複数の異なる細胞部位で重要な役割を果たす。それは多くの異なる種類の癌細胞で頻繁に発現するが、正常な成人組織ではまれにしか発現しない。サバイビンペプチド配列は、ワクチン接種戦略を立てるために使用されてきた。いくつかの種類の癌を有する患者の生存は改善したが、特に診断時に進行疾患を有する患者については課題が残っている。このように、癌と戦うためのさらなる戦略を開発する需要がなお存続している。
【発明の概要】
【０００３】
本開示は、サバイビン発現細胞を含む腫瘍を治療するための組成物及び方法を提供する。本開示は、単離抗体(モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、それらのフラグメント及び変異体を含む)、前記抗体を含む組成物、前記抗体又はその一部又はその変異体をコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター、前記抗体及び／又は核酸分子を含む細胞、１種以上の抗体又は核酸分子を含むキット、腫瘍の増殖を抑制するために、前記抗体又は核酸分子、あるいは前記抗体又は核酸分子を含む細胞を使用する方法を提供する。
【０００４】
一面では、本開示は、サバイビンの一以上のエピトープに対して特異的に反応する単離抗体(ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体(mAb)であってもよい)を提供する。前記抗体は、サバイビンのペプチド又はその変異体の投与に反応して産生されてもよい。例えば、抗体は、ペプチド(9〜23アミノ酸長で、且つコア配列 QMFFCF(配列番号３)を含む)に反応して産生されることができる。
【０００５】
この開示の抗体は、配列番号７に示される配列を有する相補性決定領域(CDR)1、配列番号８に示される配列を有するCDR2、及び配列番号９に示される配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号１０に示される配列を有するCDR1、配列番号１１に示される配列を有するCDR2、及び配列番号１２に示される配列を有するCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)とを含むモノクローナル抗体であってもよく；あるいは、配列番号１３に示される配列を有するCDR1、配列番号１４に示される配列を有するCDR2、及び配列番号１５に示される配列を有するCDR3を含むVHと、配列番号１６に示される配列を有するCDR1、配列番号１７に示される配列を有するCDR2、及び配列番号１８に示される配列を有するCDR3を含むVLとを含むモノクローナル抗体であってもよい。
【０００６】
本開示の抗体は、キメラ抗体であっても、ヒト抗体であっても、ヒト化抗体であってもよい。キメラ抗体又はヒト化抗体では、重鎖及び／又は軽鎖のある部分は、ある１つの種から得られた配列と同一であるか相同性を有し得る一方、他の部分は別の種から得られた配列と同一であるか相同性を有し得る。例えば、マウスのモノクローナル抗体を単離するか、生成し、その後、これらの抗体(又はそれから導き出した配列情報)の一部を、キメラ抗体又はヒト化抗体を産生するために使用してもよい。例えば、マウスを１種以上のサバイビンペプチドで免疫化し、その後腹水サンプルを採取してもよい。モノクローナル抗体および対応するハイブリドーマ細胞株のパネルを開発するために、前記サンプルをスクリーニングし、選択することができる。その後、モノクローナル抗体から得られた部分又は配列を、キメラ抗体又はヒト化抗体を産生するために使用することができる。本開示の抗体は、抗体フラグメント、単鎖抗体、二重特異性又は多特異性の抗体であってもよい。
【０００７】
本開示は、前記抗体(mAbを含む)配列の一部又は全てをコードする配列を含む核酸分子を提供する。本開示は、前記核酸分子を含む細胞も提供する。
【０００８】
本開示は、治療を必要とする個体の腫瘍を治療する方法を提供し、当該方法は、前記個体に、サバイビン(例えばヒトサバイビンなど)に特異的な一以上の抗体を含む組成物を投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
［図１］図１は、GL261グリオーマを有するC57BL/6マウスにおける頭蓋内グリオーマモデルに対する、抗-サバイビンモノクローナル抗体の効果を表す。マウスは、腫瘍移植後、抗-サバイビン抗体を７日に１回投与された。生存率は、時間の関数として示される。IgGは、通常のマウス非特異的IgGである。コントロールは、未治療の腫瘍移植マウスである。
【００１０】
［図２］図２は、GL261グリオーマを有するC57BL/6マウスにおける皮下腫瘍モデルに対する、抗-サバイビンポリクローナル及びモノクローナル抗体の効果を表す。マウスは、腫瘍移植後、７日に１回、表示の治療を受けた。SurVaxMは、サバイビンワクチンである；抗-サバイビン血清(抗体)は、活性サバイビンワクチン又はサバイビンペプチドを投与された非担癌プールマウスから得た。コントロールは、未治療の腫瘍移植マウスである。
【００１１】
［図３］図３は、GL261グリオーマを有するC57BL/6マウスにおける皮下腫瘍モデルに対する、抗-サバイビンポリクローナル抗体の効果を表す。マウスは、腫瘍移植後、７日に１回、表示の治療を受けた。SurVaxMは、サバイビンワクチンである；抗-サバイビン血清(抗体)は、活性SurVaxMワクチンを投与された非担癌プールマウスから得た。マウスは５０日まで経過観察された。
【００１２】
［図４］図４は、ヌード(免疫不全)マウスにおけるB16マウスメラノーマに対する２つのモノクローナル抗体の効果を表す。腫瘍体積は、非特異的IgG、mAb 2C2、及びmAb H30を投与されたグループについて示される。各点は、一匹の動物を表す。
【００１３】
［図５］図５は、C57Bl/6(免疫正常)マウスにおけるB16マウスメラノーマに対する２つのモノクローナル抗体の効果を表す。腫瘍体積は、非特異的IgG、mAb 2C2、及びmAb H30を投与されたグループについて示される。各点は、一匹の動物を表す。
【００１４】
［図６］図６は、ヌード(免疫不全)マウスにおけるB16マウスメラノーマに対する２つのモノクローナル抗体の効果を、時間の関数として表す。腫瘍体積は、非特異的IgG、mAb 2C2、及びmAb H30を投与されたグループについて示される。
【００１５】
［図７］図７は、C57Bl/6(免疫正常)マウスにおけるB16マウスメラノーマに対する２つのモノクローナル抗体の効果を、時間の関数として表す。腫瘍体積は、非特異的IgG、mAb 2C2、及びmAb H30を投与されたグループについて示される。
【００１６】
［図８］図８は、ヌード(免疫不全)マウスにおけるGL261マウスグリオーマに対する２つのモノクローナル抗体の効果を表す。腫瘍体積は、コントロール(未治療)、非特異的IgG、mAb 2C2、及びmAb H30を投与されたグループについて示される。各点は、一匹の動物を表す。
【００１７】
［図９］図９は、C57Bl/6(免疫正常)マウスにおけるGL261マウスグリオーマに対する２つのモノクローナル抗体の効果を表す。腫瘍体積は、コントロール、非特異的IgG、mAb 2C2、及びmAb H30を投与されたグループについて示される。各点は、一匹の動物を表す。
【００１８】
［図１０］図１０は、C57Bl/6(免疫正常)マウスにおけるGL261マウスグリオーマに対する２つのモノクローナル抗体の効果を、時間の関数として表す。腫瘍体積は、コントロール、非特異的IgG、mAb 2C2、及びmAb H30を投与されたグループについて示される。
【００１９】
［図１１］図１１は、ヌード(免疫不全)マウスにおけるGL261マウスグリオーマに対する２つのモノクローナル抗体の効果を、時間の関数として表す。腫瘍体積は、コントロール、非特異的IgG、mAb 2C2、及びmAb H30を投与されたグループについて示される。
【００２０】
［図１２］図１２は、サバイビンワクチン(配列番号４)を投与された患者における総IgGの産生を表す。データは８人の患者について示される。血清ELISA研究は、野生型サバイビンペプチド(アミノ酸53-67[配列番号２７])に対する血清IgG反応性の進行性の増加を示す。
【００２１】
［図１３］図１３は、サバイビンワクチン(配列番号４)を投与された患者におけるサバイビン特異的IgGの産生を表す。データは８人の患者について示される。血清ELISA研究は、改変サバイビンペプチド(アミノ酸53-67/M57[配列番号４])に対する血清IgG反応性の進行性の増加を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本開示は、サバイビンペプチド-ワクチン接種マウスから得た抗血清及び精製したサバイビンに対するマウスモノクローナル抗体が、動物モデルにおいて腫瘍の増殖を有意に抑制するという我々の知見に基づいている。サバイビンは、細胞によって分泌されず、又は細胞表面に提示されない(MHCクラスI提示関連を除いて)と考えられている細胞内タンパク質であるため、これは驚くべきことである。このように、抗体-媒介性(受動性)サバイビン免疫療法は、有効であるとは予測されていなかった。しかしながら、我々はそれが有効であることを発見した。
【００２３】
この開示は、単離された抗体及びそのフラグメント、抗体又はそのフラグメントをコードする単離された核酸分子、抗体又はそのフラグメントを産生する細胞、抗体又はそのフラグメントをコードする核酸を含むベクター又は細胞、前述のいずれかを含む組成物、前述のいずれかを製造する方法、及び、前記抗体及びそのフラグメントを使用する方法、又は癌(例えば、サバイビン-発現腫瘍を伴うもの)の治療において、前記抗体及びそのフラグメント、又は核酸分子を使用する方法を提供する。
【００２４】
この出願の配列表の説明は、以下の通りである。
【００２５】
配列番号１は、ヒトサバイビンの２３アミノ酸長のフラグメントを表すアミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号２は、１つのアミノ酸変異を有する、配列番号１の変異体である。
【００２７】
配列番号３は、配列番号２の６アミノ酸長のフラグメントである。
【００２８】
配列番号４は、配列番号２の１５アミノ酸長のフラグメントであって、配列番号３の配列を含む。
【００２９】
配列番号５は、配列番号２の１０アミノ酸長のフラグメントであって、配列番号３の配列を含む。
【００３０】
配列番号６は、配列番号２の９アミノ酸長のフラグメントであって、配列番号３の配列を含む。
【００３１】
配列番号７は、mAb 2C2E7のVH CDR1のアミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号８は、mAb 2C2E7のVH CDR2のアミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号９は、mAb 2C2E7のVH CDR3のアミノ酸配列である。
【００３４】
配列番号１０は、mAb 2C2E7のVL CDR1のアミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号１１は、mAb 2C2E7のVL CDR2のアミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号１２は、mAb 2C2E7のVL CDR3のアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号１３は、mAb 30H3D2のVH CDR1のアミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号１４は、mAb 30H3D2のVH CDR2のアミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号１５は、mAb 30H3D2のVH CDR3のアミノ酸配列である。
【００４０】
配列番号１６は、mAb 30H3D2のVL CDR1のアミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号１７は、mAb 30H3D2のVL CDR2のアミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号１８は、mAb 30H3D2のVL CDR3のアミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号１９は、mAb 2C2E7の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００４４】
配列番号２０は、mAb 2C2E7の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号２１は、mAb 30H3D2の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００４６】
配列番号２２は、mAb 30H3D2の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００４７】
配列番号２３は、2C2E7の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列である(それは、配列番号１９のアミノ酸配列をコードする)。
【００４８】
配列番号２４は、2C2E7の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列である(それは、配列番号２０のアミノ酸配列をコードする)。
【００４９】
配列番号２５は、30H3D2の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列である(それは、配列番号２１のアミノ酸配列をコードする)。
【００５０】
配列番号２６は、30H3D2の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列である(それは、配列番号２２のアミノ酸配列をコードする)。
【００５１】
配列番号２７は、ヒトサバイビンの１５アミノ酸長のフラグメントである。
【００５２】
ワクチンは、抗-サバイビン癌免疫療法を促進させる一つの方法を提供するが、抗体を用いる受動免疫療法を使用する利点は複数ある。例えば、ヒト化モノクローナル抗体は、１）HLA-制限を受けない(ペプチドワクチンとは異なって)、２）腫瘍によって著しく免疫システムが損なわれた患者において癌細胞に対する即効作用を潜在的に有し得る、３）投与可能である(doseable)、及び、４）代替の又は補完的な作用機序を活用するために、ワクチン又は他の薬物又は治療(例えば、放射線療法など)と併用できる。上記利点の一以上は、一般のmAb(キメラ抗体、ヒト抗体及びヒト化抗体を含む)にも当てはまる。
【００５３】
本明細書で使用される「サバイビンペプチド」(単数又は複数)という用語は、全長サバイビンのフラグメントを意味し、これには、野生型サバイビン(例えば、ヒトサバイビン)と反応する抗体を作成できるペプチドの変異体が含まれる。本明細書で使用される「抗-サバイビン抗体」という用語は、サバイビン又は１種以上のサバイビンペプチド(その変異体を含む)に対して作成された抗体を意味する。
【００５４】
一面では、本開示は、サバイビンの一以上のエピトープに対して反応性を示す、抗体又はそのフラグメント(ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体を含む)を含む組成物を提供する。適切なサバイビンエピトープ又はその変異体の例は、米国特許第7,943,138及び 8,580,269に挙げられており、その開示は参照により本明細書に包含される。本開示の組成物は、ヒトサバイビン内の配列と同一のペプチド又はその変異体であるペプチド(例えば、少なくとも95％同一)の投与に反応して産生された抗体を含む。例えば、抗体は、以下のサバイビン配列の一部 ENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDD(配列番号１)の変異体であるペプチドの投与後、個体において産生され、及び個体から単離されてもよい。前記変異体は、ENEPDLAQMFFCFKELEGWEPDD(配列番号２−配列番号１の第９位のCをMに変更)であってもよい。投与されるペプチドは、配列番号２の９〜２３(その間の全ての整数を含む)の連続アミノ酸であって、そのペプチドがコア配列 QMFFCF(配列番号３)を含むものであってもよい。代表的なサバイビンペプチドとして、DLAQMFFCFKELEGW(配列番号４)、AQMFFCFKEL(配列番号５)、及びQMFFCFKEL(配列番号６)が挙げられる。単離抗体又はそのフラグメントは、修飾無しで使用されてもよく、あるいは、それらは、例えば、本明細書に記載されるキメラ抗体又はヒト化抗体あるいは様々なフラグメントを産生するなどのために操作されてもよい。一実施形態では、ペプチド DLAQMFFCFKELEGW(配列番号４)に対して反応性であるヒト化抗体又はそのフラグメントが産生される。
【００５５】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、全抗体分子、全長免疫グロブリン分子、例えば自然発生の全長免疫グロブリン分子、又は免疫グロブリン遺伝子断片リコンビナトリアルプロセスによって形成された全長免疫グロブリン分子、及び抗体フラグメントを包含する。抗体フラグメントは、少なくとも１つの抗体-抗原結合サイトを含むフラグメントであってもよい。抗体フラグメントは、例えば、サバイビンに、又はモチーフ DLAQCFFCFKELEGW(配列番号２７)を含むそのフラグメントに特異的結合を示すことができる。用語「抗体」には、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性(例えば、二重特異性)抗体、組換抗体、ヒト抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体が含まれ得る。用語「抗体」には、組換えで発現された抗原結合性タンパク質、及び抗原結合性合成ペプチドも包含され得る。さらに、用語「抗体」には、ミニボディ、及び二重特異性抗体が含まれ、その全ては、好ましくはサバイビン又はそのフラグメント、特にヒトサバイビンに特異的結合性を示す。本明細書で使用される「抗体」という用語は、インビボで製造された免疫グロブリン、及びインビトロで製造された免疫グロブリン(例えば、ハイブリドーマなどによって)も含まれ得る。本開示の抗体は、例えば、アセチル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、又はポリエチレングリコール化(ペグ化)、及び糖鎖付加によって修飾されてもよい。本明細書で使用される「抗体」という用語は、本明細書に開示される全ての抗体を包含することを意図している。例えば、用語「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体、又はその抗原(すなわち、サバイビン)結合性フラグメントを指すことができる。
【００５６】
サバイビンペプチドの投与は、ポリクローナル抗体の産生のために使用することができる。例えば、適切な動物に、１種以上のサバイビンペプチドを投与し、血清を採取することができる。さらに、ヒト抗-サバイビン抗体-発現細胞を、サバイビン又はサバイビンペプチドをワクチン接種した免疫化動物又は患者から(例えば、臨床治験に参加している個体から)単離することができる。患者サンプルから得たIgG+メモリーB細胞を増やし、IgG-分泌細胞に分化するよう誘導することができ、IgG-分泌細胞を、高親和性標的(サバイビンペプチド)結合性についてスクリーニングすることができる。前記細胞を、ハイブリドーマを作成するために使用することも可能である。抗体遺伝子の可変領域を、PIPE法を利用するRT-PCR(Dodev TS et al. (2014) Scientific Reports 4, 5885. doi:10.1038/srep058853)によって、単離細胞からクローン化できる。組換えヒト、ヒト化又はキメラmAbを、これらの分子から構築することができ、発現させ、機能性及び結合親和性アッセイにおいて、及び抗腫瘍活性についてスクリーニングすることができる。この関連で、我々は、臨床研究において複数の患者で特異抗体をELISAにより検出することができた。サンプルは、後の使用のために（メモリーＢ細胞を単離するための）冷凍することができる。
【００５７】
本開示の抗体は、完全な免疫グロブリン分子(ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体など)であってもよく、あるいはその抗原結合性フラグメントであってもよく、Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv、dAb、Fd、CDRフラグメント、単鎖抗体(scFv)、二価単鎖抗体、単鎖ファージ抗体、二重特異性抗体、ナノボディなどが挙げられるが、これらに限定されない。抗体のフラグメントは、合成的に製造されてもよく、又は無傷の免疫グロブリンの酵素的又は化学的切断によって製造されてもよく、あるいは、組換えDNA技術によって遺伝子改変されてもよい。これらの技術は当該分野で周知である。
【００５８】
一実施形態では、本開示は、単離された抗体を提供する。「単離された」という用語は、抗体又はそのフラグメントが、その自然環境から分離された及び／又は回収されたことを意味する。その自然環境から抗体を単離することにより、その自然環境内に通常は存在する他の活性物質(例えば、他のタンパク質)によって干渉されずにその抗体を使用できるようになる。
【００５９】
一実施形態では、本開示は、サバイビン又はサバイビンペプチドをラクダ科の動物に導入することによりラクダ科の動物によって製造される単一ドメイン抗体又はナノボディを生成すること及び単離することを提供する。ナノボディは、一般的に重鎖抗体であり、それゆえ重鎖ホモ二量体を含み、抗体軽鎖を含まない。これらの抗体は、一般的に、単一の可変領域と２つの定常領域(CH2及びCH3)を含む。
【００６０】
本開示の抗体は、ヒト又は非ヒト動物から得てもよい。多くの動物では、無傷の免疫グロブリンは、２本の重鎖と２本の軽鎖を有する。軽鎖のそれぞれは、ジスルフィド結合によって重鎖に共有結合している。２本の重鎖は、別のジスルフィド結合によって互いに結合している。軽鎖は、一般的に、一つの可変領域(VL)と一つの定常領域(CL)を有する。重鎖も、一つの可変領域(VH)を有し得る。前記可変領域は、複数の相補性決定領域(CDR)を含んでいる。重鎖は、さらに、３つ又は４つの定常領域(CH1、CH2、CH3、及びCH4)を有し得る。定常領域の違いにより、様々なアイソタイプ(IgA, IgD, IgE, IgG, 及びIgMなど)がもたらされる。
【００６１】
CDRは、抗原のエピトープへの結合を主に担う。各鎖のCDRは、通常、CDR1、CDR2、及びCDR3と称され(N-末端から順に番号が付される)、通常、特定のCDRが位置する鎖によって特定される。それゆえ、VH CDR3(又はVH-CDR3)は、それが確認される抗体の重鎖の可変領域に位置し、他方、VL CDR1(又はVL-CDR1)は、それが確認される抗体の軽鎖の可変領域のCDR1である。サバイビン又はサバイビンペプチドに結合する抗体は、例えば、特異的なVH領域及びVL領域配列、すなわち特異的なCDR配列を有する。異なる特異性(すなわち、異なる抗原のための異なる結合部位)を有する抗体は、異なるCDRを有する。
【００６２】
本明細書で使用されるVH又はVHという用語は、免疫グロブリンの重鎖の可変領域を指し、Fv、scFv、dsFv又はFabの重鎖を含み、VL又はVLという用語は、免疫グロブリンの軽鎖の可変領域を指し、Fv、scFv、dsFv又はFabの軽鎖を含む。
【００６３】
「モノクローナル抗体」という用語は、Ｂリンパ球の単一クローンによって、又は単一抗体の軽鎖及び／又は重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞によって産生された抗体を指す。モノクローナル抗体は、当業者に既知の方法によって、例えば、骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞の融合によりハイブリッド抗体-形成細胞を作ることによって、製造される。例えば、マウス(あるいは他の適切な動物)を、１種以上のサバイビンペプチドで免疫化することができ、その後腹水サンプルを採取することができる。モノクローナル抗体及び対応するハイブリドーマ細胞株のパネルを開発するために、このサンプルをスクリーニングし、選抜することができる。マウスの(あるいは他の)モノクローナル抗体は、所望により単離されあるいは産生され、及びその後にヒト化されてもよい。
【００６４】
本開示の抗体は、どのクラスの抗体であってもよい。例えば、本開示の抗体は、抗体アイソタイプIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD又はIgEであってもよい。例えば、抗体はIgG2bであってもよい。本明細書で使用される「アイソタイプ」という用語は、特に、重鎖定常領域の遺伝子によってコードされる抗体の種類(例えば、IgGなど)を指すことができる。ヒトの免疫グロブリン定常領域の配列は当該分野で既知であり、国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)、米国国立医学図書館などの公開データベースから利用可能である。
【００６５】
「キメラ抗体」という用語は、ある種(例えば、ヒト)由来のフレームワーク残基と、サバイビンに特異的に結合する別の種、例えばマウス抗体由来のCDR(一般的に、抗原結合をもたらす)を有する抗体を指す。キメラ抗体において、重鎖及び／又は軽鎖のいくつかの部分は、ある種由来の配列と同一であっても相同性であってもよく、他の部分は別の種由来の配列と同一であっても相同性であってもよい。キメラ抗体は、一般的に、免疫原性の低下と安定性の増加を示す。マウスの免疫グロブリン可変領域をクローニングする技術は当該分野において既知である(例えば「Orlandi et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86: 3833 (1989)」及び「Leung et al., Hybridoma 13:469 (1994)」等を参照)。キメラ抗体の例として、ヒト以外の動物(例えば、マウス、ラット、又はニワトリ)由来の抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドが、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の定常領域をコードするポリヌクレオチドと連結して、キメラ抗体をコードするポリヌクレオチド(DNAなど)を形成することができる。キメラ抗体の例として、配列番号１９と２０を含むもの、及び配列番号２０と２１を含むものが挙げられる。
【００６６】
「ヒト」抗体(「完全ヒト」抗体とも呼ばれる)は、ヒトのフレームワーク領域と、
単一の又は異なるヒト免疫グロブリンのCDRを全て含む抗体である。このように、一つのヒト抗体のフレームワークを、異なるヒト抗体由来のCDRを含ませるために操作することができる。ヒト抗体を製造する方法は、当該分野で既知である(例えば「Mancini et al., 2004, New Microbiol. 27:315-28; Conrad」及び 「Scheller, 2005, Comb. Chem. High Throughput Screen. 8:117-26」などを参照)。
【００６７】
「ヒト化抗体」は、一般的に、非ヒトであるソースからヒト抗体に移入された(すなわち、ヒト抗体に導入された)アミノ酸残基を一以上有するヒト抗体である。例えば、ヒト化抗体は、げっ歯類、ラビット、イヌ、ヤギ、又はウマなどの種に由来する抗体のCDRが、ヒトの重及び軽可変領域に移入されている組換えタンパク質である。抗体分子の定常領域(フレームワーク領域とも呼ばれる)は、一般に、ヒト抗体のものと同じである。CDRを提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれることがあり、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれることがある。例えば、ヒト化免疫グロブリンにおいて、全てのCDRがドナー免疫グロブリンに由来していてもよい。定常領域は、常に存在する必要はないが、もし存在する場合、それらは、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５〜９０％、例えば約９５％以上同一であってもよい。ヒト化抗体は、CDRを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合する。ヒト化免疫グロブリン又は抗体のアクセプターフレームワークは、ドナーフレームワーク由来のアミノ酸による限られた数の置換を有していてもよい。ヒト化又は他のモノクローナル抗体は、抗原結合又は他の免疫グロブリンの機能に実質的に影響しない、さらなる保存的アミノ酸置換を有していてもよい。ヒト化免疫グロブリンは、遺伝子工学により構築することができる(例えば、米国特許第5,585,089号及び米国公開公報第2010/0196266号参照)。例えば、マウスのモノクローナル抗体を単離するか作成し、その後ヒト化してもよい。ヒト化抗体の例として、配列番号７〜１２の配列を有するCDRを含むもの、及び配列番号１３〜１８の配列を有するCDRを含むものが挙げられる。
【００６８】
抗体フラグメントは、酵素消化によって製造することができる。例えば、抗体のパパイン消化により、「Fab」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合性フラグメントと、１つの「Fc」フラグメントが生じる。Fabフラグメントは、完全なL鎖と、H鎖の可変領域ドメイン(VH)と、一つの重鎖の第一の定常領域とを含む。各Fabフラグメントは、抗原結合に関して一価である(すなわち、単一の抗原結合サイトを有する)。抗体のペプシン処理は、単一の大きなF(ab')2フラグメントを生じさせ、これは、ジスルフィドで連結された２つのFabフラグメントにおおむね相当し、二価の抗原結合活性を有し、抗原を架橋する能力を有する。「Fv」は、完全抗原-認識及び-結合サイトを含む最少の抗体フラグメントであり、「sFv」又は「scFv」と略される単鎖(一本鎖)Fvも、抗体フラグメントであり、連結され一つのポリペプチド鎖となったVH及びVL抗体ドメインを含む。「二重特異性抗体(diabody)」という用語は、Vドメインの鎖内(intra-chain)ではなく鎖間(inter-chain)ペアリングが達成されるように、VHとVLドメインの間に短いリンカー(複数)を有するsFvフラグメント(複数)を作成することによって(結果として二価のフラグメント、すなわち２つの抗原結合サイトを有するフラグメントになる)調製される小さな抗体フラグメントを指す。単一ドメイン抗体(sdAb)は、単一の単量体の可変抗体ドメインを有する抗体フラグメントである。ScAbは、ラクダ科の動物でみられる重鎖抗体から作成できる。抗体フラグメントは、単一の可変領域であってもよく、単一のCDRからなる又は単一のCDRを含むペプチドであってもよい。単鎖抗体は、リンカーにより互いに直線的に連結された重鎖可変領域と軽鎖可変領域を有する。単鎖抗体をコードするポリヌクレオチド(DNA等)は、重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、リンカーをコードするポリヌクレオチド(典型的には、１０〜２０ヌクレオチド)、及び軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを結合することによって製造することができ、前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域は両方ともヒト抗体に由来するものである。
【００６９】
本発明の抗体は、二重特異性又は多特異性であってもよい。二重特異性抗体(diabody)は、抗原の少なくとも２つの異なるエピトープ(例えば、サバイビンの２つの異なるエピトープ)に結合特異性を有する抗体である。例えば、二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド(DNA等)は、例えば、重鎖可変領域Ａをコードするポリヌクレオチド、軽鎖可変領域Ｂをコードするポリヌクレオチド、重鎖可変領域Ｂをコードするポリヌクレオチド、及び軽鎖可変領域Ａをコードするポリヌクレオチドを順に連結することによって、製造できる。好ましくは、前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域は両方ともヒト抗体に由来するものである。
【００７０】
本開示は、配列番号１〜２９に示す配列の変異体を提供する。例えば、変異体は、配列番号１〜２７に開示された配列と、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は、９９％以上の配列相同性を有していてもよい。
【００７１】
本開示は、キメラ抗原受容体(CAR)を発現するよう形質導入されたＴ細胞を提供する。本開示のCAR分子は、サバイビンに対する抗体の特異性と、Ｔ細胞受容体-活性化細胞内領域を組み合わせて、特異的抗-サバイビンを示す、それゆえ、抗-腫瘍細胞性免疫活性を示すキメラタンパク質を生じる。CAR分子は、重鎖及び軽鎖可変領域の一以上のCDRを含んでもよい。この開示は、さらに、CARを安定に発現するために遺伝的に改変されたＴ細胞を提供する。CARを発現するＴ細胞は、本明細書において、CAR Ｔ細胞又はCAR改変Ｔ細胞と呼ばれる。例えば、Ｔ細胞は、特異抗体(例えば、本明細書に記載するモノクローナル抗体)のサバイビン認識領域と、CD3-ゼータ鎖の細胞内領域とを組み合わせて、単一のキメラタンパク質を構成するCARを安定に発現するために、遺伝的に改変されてもよい。
【００７２】
一例として、この開示は、サバイビン(ヒトサバイビンであってもよい)に特異的に結合する、モノクローナル抗体(単離モノクローナル抗体であってもよい)を提供する。一例として、2C2と名付けられたmAb、及びH30(又は30H3)と名付けられたmAbが提供される。最終的な抗体配列決定及びIgG精製のために使用されたmAb 2C2のサブクローンは、2C2E7と命名され、最終的な抗体配列決定及びIgG精製のために使用されたmAb H30のサブクローンは、30H3D2と命名された。抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む。重鎖可変領域は、VH CDR1、VH CDR2およびVH CDR3を含み、軽鎖可変領域は、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3を含む。一例として、VH CDR1はアミノ酸配列 TYGMS(配列番号７)を有し、VH CDR2はアミノ酸配列 WINPYSGVPTYAVDFKG(配列番号８)を有し、VH CDR3はアミノ酸配列 GGRRGDFGY(配列番号９)を有し；VL CDR1はアミノ酸配列 SASSSISYMH(配列番号１０)を有し、VL CDR2はアミノ酸配列 DTSKLAS(配列番号１１)を有し、VL CDR3はアミノ酸配列 HQRSSHHT(配列番号１２)を有する。別の例として、VH CDR1はアミノ酸配列 SYGMS(配列番号１３)を有し、VH CDR2はアミノ酸配列 TISSGGSHTYYPDSVRG(配列番号１４)を有し、VH CDR3はアミノ酸配列 HPIYYYISSYAMDY(配列番号１５)を有し；VL CDR1はアミノ酸配列 RSSQSLVHSTGNTYLH(配列番号１６)を有し、VL CDR2はアミノ酸配列 KVSNRFS(配列番号１７)を有し、VL CDR3はアミノ酸配列 SQSTHVPPT(配列番号１８)を有する。
【００７３】
本開示の抗体は、配列番号７，８，９に示す配列とは異なる１又は２のアミノ酸を含むVH CDRを有する、及び／又は配列番号１０，１１，１２に示す配列とは異なる１又は２のアミノ酸を含むVL CDRを有する抗体であってもよい。本開示の抗体は、配列番号１３，１４，１５に示す配列とは異なる１又は２のアミノ酸を含むVH CDRを有する、及び／又は配列番号１６，１７，１８に示す配列とは異なる１又は２のアミノ酸を含むVL CDRを有する抗体であってもよい。
【００７４】
本開示の抗体は、その重鎖可変領域が、配列番号１９の配列を含み、その軽鎖可変領域が配列番号２０の配列を含む抗体であってもよい。配列番号１９の配列において、アミノ酸１〜１９はリーダー配列を表し、アミノ酸２０〜４９はフレームワーク領域(FR)1を示し、アミノ酸５０〜５４はCDR1を表し、アミノ酸５５〜６８はFR2を表し、アミノ酸６９〜８５はCDR2を表し、アミノ酸８６〜１１７はFR3を表し、アミノ酸１１８〜１２６はCDR3を表し、及びアミノ酸１２７〜１３７はFR4を表す。配列番号２０の配列において、アミノ酸１〜２２はリーダー配列を表し、アミノ酸２３〜４５はFR1を示し、アミノ酸４６〜５５はCDR1を表し、アミノ酸５６〜７０はFR2を表し、アミノ酸７１〜７７はCDR2を表し、アミノ酸７８〜１０９はFR3を表し、アミノ酸１１０〜１１７はCDR3を表し、及びアミノ酸１１８〜１２７はFR4を表す。
【００７５】
本開示の抗体は、その重鎖可変領域が、配列番号２１の配列を含み、その軽鎖可変領域が配列番号２２の配列を含む抗体であってもよい。配列番号２１の配列において、アミノ酸１〜１９はリーダー配列を表し、アミノ酸２０〜４９はFR1を示し、アミノ酸５０〜５４はCDR1を表し、アミノ酸５５〜６８はFR2を表し、アミノ酸６９〜８５はCDR2を表し、アミノ酸８６〜１１７はFR3を表し、アミノ酸１１８〜１３１はCDR3を表し、及びアミノ酸１３２〜１４２はFR4を表す。配列番号２２の配列において、アミノ酸１〜１９はリーダー配列を表し、アミノ酸２０〜４２はFR1を示し、アミノ酸４３〜５８はCDR1を表し、アミノ酸５９〜７３はFR2を表し、アミノ酸７４〜８０はCDR2を表し、アミノ酸８１〜１１２はFR3を表し、アミノ酸１１３〜１２１はCDR3を表し、及びアミノ酸１２２〜１３１はFR4を表す。
【００７６】
本開示の抗体は、配列番号１９の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２０の配列を含む軽鎖可変領域とを有する抗体、又はその変異体(９０〜９９％の配列相同性を有する)であってもよい。本開示の抗体は、配列番号２１の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２２の配列を含む軽鎖可変領域とを有する抗体、又はその変異体(９０〜９９％の配列相同性を有する)であってもよい。抗体は、前記リーダー配列を除く(すなわち、アミノ酸１〜１９を除く)配列番号１９の配列を含む重鎖可変領域、及び／又は前記リーダー配列を除く(すなわち、アミノ酸１〜２２を除く)配列番号２０の配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体、又はその変異体(９０〜９９％の配列相同性を有する)であってもよい。本開示の抗体は、前記リーダー配列を除く(すなわち、アミノ酸１〜１９を除く)配列番号２１の配列を含む重鎖可変領域、及び／又は前記リーダー配列を除く(すなわち、アミノ酸１〜１９を除く)配列番号２２の配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体、又はその変異体(９０〜９９％の配列相同性を有する)であってもよい。
【００７７】
本開示の抗体は、配列番号１９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を有し、配列番号７の配列を有するCDR1、配列番号８の配列を有するCDR2、配列番号９の配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域、及び／又は、配列番号２０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を有し、配列番号１０の配列を有するCDR1、配列番号１１の配列を有するCDR2、配列番号１２の配列を有するCDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体であってもよい。
【００７８】
本開示の抗体は、配列番号２１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を有し、配列番号１３の配列を有するCDR1、配列番号１４の配列を有するCDR2、配列番号１５の配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域、及び／又は、配列番号２０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を有し、配列番号１６の配列を有するCDR1、配列番号１７の配列を有するCDR2、配列番号１８の配列を有するCDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体であってもよい。
【００７９】
本開示の抗体は、配列番号７，８及び９の配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3を含む重鎖可変領域、及び、配列番号１０，１１及び１２の配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、又は、配列番号１３，１４及び１５の配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3を含む重鎖可変領域、及び、配列番号１６，１７及び１８の配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、及びCDR3を含む軽鎖可変領域を含むキメラ抗体、ヒト抗体又はヒト化抗体であってもよい。
【００８０】
本開示は、サバイビン特異抗体の重鎖可変領域の全て又は一部をコードする単離されたヌクレオチド配列も提供する。例えば、本開示は、配列番号２３又は２５の配列を含む単離核酸分子を提供する。本開示の単離ヌクレオチド分子は、サバイビン特異抗体の軽鎖可変領域の全て又は一部をコードしてもよい。例えば、単離核酸分子は、配列番号２４又は２６の配列を含むことができる。核酸分子の変異体は、重鎖可変領域について配列番号２３又は２５の配列、又は軽鎖可変領域について配列番号２４又は２６の配列と、少なくとも９０％〜少なくとも９９％の同一性を有することができる。
【００８１】
本開示は、サバイビンのエピトープを認識する一以上のCDRをコードする配列(例えば、配列番号７〜１８をコードする配列など)を含むか、あるいは当該配列からなる単離された核酸分子も提供する。核酸分子は、配列番号７〜１８の配列のいずれかからなってもよく、あるいは核酸分子は、配列番号７〜１８の一以上の配列を含み、且つ別の１〜５０のヌクレオチド(通常前記配列に隣接している)をさらに含んでもよい。
【００８２】
本開示は、本明細書で提供される抗体(mAbを含む)又はそのサバイビン結合性フラグメントをコードする発現ベクター又は他のポリヌクレオチド配列を含む細胞を提供する。mAb又はそのサバイビン結合性フラグメントをコードするヌクレオチド配列は、任意の適切な発現ベクター(その多くは、当該分野において既知である、及び／又は市販されている)を使用して発現することができる。ベクターは、核酸配列、例えば、ホスト細胞内でそれを複製可能にする複製起点など、を一般に含む。ベクターは、選択マーカー遺伝子も含むことができる。重鎖及び軽鎖は、一つの発現ベクター、例えばプラスミドで発現させることができ、又は重鎖及び軽鎖は、同じ細胞内で異なるプラスミドで発現させることができ、その後発現した重鎖及び軽鎖が通常のmAb構造を形成してもよい。mAb又はそのサバイビン結合性フラグメントは、本開示の利益を考慮して、従来の技術を用いて単離及び／又は精製することができる。
【００８３】
単離されたモノクローナル抗体又はそのフラグメントは、酵素タグ、蛍光性タグ又は放射性タグを用いるなどして、標識されてもよく、又は、例えば毒素などのエフェクター分子に抱合させることができる。
【００８４】
本開示は、抗体又はそのフラグメント、及び薬学的に適切なキャリアを含む医薬組成物を提供する。適切なキャリアとして、使用する用量及び濃度でレシピエントに無毒な賦形剤、又は安定剤が挙げられ、且つ、バッファー、例えば酢酸、Tris、リン酸、クエン酸及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンなどの抗酸化剤；防腐剤、例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチルパラベン又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール：シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストリンなどの単糖類、二糖類、及び他の炭水化物、キレート剤、例えばEDTA；等張化剤(tonicifier)、例えばトレハロース及び塩化ナトリウム；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；界面活性剤、例えば、ポリソルベート；塩形成対イオン、例えばナトリウム；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、Tween又はポリエチレングリコール(PEG)が挙げられる。この医薬組成物は、他の治療薬を含むことができる。
【００８５】
本開示の組成物は、１種類のモノクローナル抗体又は２種類以上のモノクローナル抗体を含んでもよい。本開示の組成物は、１種以上の抗体、又はそのフラグメントあるいは変異体を含んでもよい。組成物は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を含んでもよい。組成物は、抗体の１又は複数のサブタイプを含んでもよい。例えば、組成物は、IgG又はIgMの混合物、あるいはIgG1、IgG2、及びIgG2bの１又は複数の混合物を含んでもよい。本開示の組成物は、抗体を唯一の有効成分として含んでもよく、ここで前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はそれらの組み合わせであってもよい。「有効成分」とは、その成分が腫瘍増殖を抑制することによって抗腫瘍効果を有することを意味する。
【００８６】
本開示の医薬組成物は、１種以上の抗体を、0.1 mg/ml〜100 mg/ml、1 mg/ml〜10 mg/ml、1 mg/ml〜50 mg/ml、1 mg/ml〜100 mg/ml、10 mg/ml〜100 mg/ml、又は50 mg/ml〜100 mg/mlの濃度範囲で(各抗体又は全抗体の濃度)で含むことができる。例えば、本開示の医薬組成物は、抗体を、少なくとも又は約0.1 mg/ml、少なくとも又は約1 mg/ml、少なくとも又は約5 mg/ml、少なくとも又は約10 mg/ml、少なくとも又は約50 mg/ml、少なくとも又は約100 mg/ml含むことができる。
【００８７】
本開示の組成物は、当該分野で既知の常法によって投与することができる。例えば、抗体又はそのフラグメントを含む組成物は、静脈内、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局所的あるいは吸入経路を介して、又は、脳内あるいは髄腔内対流強化送達(intra-spinal convection-enhanced delivery)又は直接腫瘍内注射によって投与することができる。前記抗体は、標的部位に(例えば、腫瘍に又は腫瘍内に)非経口的に直接投与されてもよい。前記組成物は、単回投与として、又は複数回投与として導入されてもよく、及びある期間にわたって連続的に導入されてもよい。一実施形態では、前記組成物は、ある期間(少なくとも２日)の間、例えば２〜３０日の期間(及びその間の全ての期間)、毎日投与されてもよい。一実施形態では、それは７〜１０日間毎日投与される。あるいはそれは、所望の間隔(例えば、２，３，４，５日ごと等)で投与されてもよい。
【００８８】
本発明の方法で採用される特定の投与計画の形式及び特徴は、投与経路及び他の周知の変動要素(例えば、個体の大きさ及び疾患の段階)によって影響を受けることが当業者によって認識されるであろう。さらに、前記組成物は、治療を必要とする個体に投与するために単位投与形態の形で提供することができる。抗体は、投与前に元に戻される(再構築される)凍結乾燥の形で提供することができる。再構築用媒体として、無菌の0.9％生理食塩水又は適切な生理学的バッファーあるいは水、又は投与前にタンパク質を再構築するために当該分野で既知の他の溶液が使用できる。
【００８９】
本開示は、治療の必要がある個体に投与するために使用できるキットも提供する。キットは、例えば、１種以上の抗体(凍結乾燥形態であってもよい)、任意で、再構築用媒体、及び投与説明書を含むことができる。キットは、単一用量又は複数の用量を含むことができる。
【００９０】
本開示は、腫瘍(サバイビン-発現細胞を含む腫瘍など)を治療する方法を提供する。そのような腫瘍は、本明細書で「サバイビン-発現腫瘍」と称されることがある。「治療」という用語は、治療されている特定の状態の存在に付随する一以上の症状又は特徴の減少を指す。治療は、必ずしも、完全寛解を意味せず、再発又は再燃を防止することを意味しない。例えば、本開示は、腫瘍の大きさを減少する、又は腫瘍の増殖を停止する、又は腫瘍(サバイビン-発現細胞を含む腫瘍など)の増殖率を減少する、又は腫瘍を有している個体に付随する他の任意の症状を減少する(これらの全ては「治療」とみなされる)ための方法を提供し、当該方法は、治療の必要がある個体に、本明細書に記載されている抗体又はそのフラグメントを含む組成物を、治療的有効量で投与することを含む。一実施形態では、前記方法は受動免疫方法である。
【００９１】
本発明の組成物によって治療できる腫瘍の例として、グリオーマ、神経膠芽腫、髄芽腫、多発性骨髄腫、メラノーマ、髄膜腫、乳腺癌、卵巣癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫、結腸癌、膵癌、肝癌、腎癌、肉腫などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
本発明の方法は、ワクチンとしてのサバイビンペプチドの使用と組み合わせて行うことができる。本発明の組成物は他の治療の前に、同時に、または後に投与することができる。
【００９３】
一態様において、本開示は、サバイビンの一つ又は複数のエピトープに対して反応性である単離抗体を含む組成物を提供し、前記単離抗体又はその抗原結合性フラグメントは、サバイビンの一つ又は複数のエピトープに結合する。前記抗体は、配列 ENEPDLAQMFFCFKELEGWEPDD(配列番号２)を有するペプチド、又はそのフラグメント(例えば、配列番号４の)の投与に反応して産生されてもよく、前記フラグメントは、配列番号２の９〜２３の(その間の全ての整数を含む)連続アミノ酸を有し、且つ、前記ペプチドはコア配列 QMFFCF(配列番号３)を含む。前記組成物に含まれる抗体(単数又は複数)は、サバイビンペプチドの投与に反応して産生された単離抗体(単数又は複数)のみであってもよい。前記組成物は、他のタンパク質、例えばキャリアタンパク質を含んでいてもよい。前記抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体又はヒト化抗体であってもよい。前記抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、あるいは、単鎖抗体、又は多特異性抗体であってもよい。
【００９４】
特定の抗原に対する抗体の反応性は、例えば、ELISAなどの常法によって測定することができる。反応性は結合親和性の指標である。結合親和性は、抗原/抗体解離速度または競合的ラジオイムノアッセイなどによっても測定できる。抗原に対する抗体の特異的結合は、それが高い親和性で抗原と結合し、無関係の抗原に特異的に結合しないことを意味する。
【００９５】
一態様において、本開示は、治療の必要な個体に、配列 ENEPDLAQMFFCFKELEGWEPDD(配列番号２)を有するペプチド、又はそのフラグメント(例えば、配列番号４)の投与に反応して産生された１種以上の抗体を含む組成物を治療的有効量で投与することを含む受動免疫法を提供し、前記フラグメントは、配列番号２の９〜２３(その間の全ての整数を含む)連続アミノ酸を有し、且つ、前記ペプチドはコア配列 QMFFCF(配列番号３)を含み、抗体は被検体(ヒト又は非ヒト)から単離されたものであり、それらはハイブリドーマ上清中で産生された、又はハイブリドーマ上清から得られたものでも、あるいは単離抗体の配列を使用して設計された抗体であってもよい。
【００９６】
以下の実施例は、説明のために提供され、限定を意図していない。
【実施例１】
【００９７】
この実施例は、腫瘍増殖に対する抗-サバイビン抗体の効果を実証する動物実験を説明する。
【００９８】
マウスを免疫化するため、DLAQMFFCFKELEGW-キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)(SurVaxM)(SVN53-67/M57-KLH)(配列番号4)を投与する。マウスに、100μgのペプチドを皮下注射した。７日に１度、２８日の期間にわたって繰り返しマウスを免疫化した。最後の免疫化の２週間後に、マウスを、CO2窒息により安楽死させ、心穿刺により血液を採取した。血液を凝血させ、10,000 x gで遠心分離して、澄んだ血清を調製した。腫瘍移植モデルにおいてマウスを受動免疫するためにサバイビン抗血清を使用した。
【００９９】
腫瘍増殖に対する抗-サバイビン抗体の有効性を証明するために、頭蓋内皮下腫瘍モデルを使用した。頭蓋内研究には、解剖参照ポイントとして、ブレグマ頭蓋縫合に対し、1mm前方、2mm側方、深さ3mmに位置する頭蓋内穿孔を通じて進入させた２６ゲージ針により1×105のGL261グリオーマ細胞を移植した、C57BL/6マウスを麻酔して使用した。３日後、マウスを無作為にグループ分けし、10μgの抗-サバイビン抗体又はコントロール用の10μgの通常のIgGを注射した。抗体を、合計で２０日間に４用量となるように、５日ごとに投与した。マウスについて、腫瘍増殖の指標として神経障害の兆候を追跡し、定められた基準に従って屠殺した。データは生存率で表され、カプラン・マイヤープロットで示される(p＜0.0001)。
【０１００】
２３ゲージ皮内針により右側腹部皮下に1×106のGL261 グリオーマ細胞を移植することにより皮下腫瘍モデルを確立した。直径約2mmに達するまで、７日間腫瘍を増殖させた。その後７日目に、マウスに、100μgのSurVaxM(SVN53-67/M57-KLH)サバイビンワクチン；又は50μlの抗-サバイビン抗体をマウス血清の形で投与した(前記血清は、SurVaxMサバイビンワクチン、又はサバイビンに対し反応性のモノクローナル抗体を接種された非担癌のプールされたマウスから得たSurVaxM又は10μgのmAb(抗体)をあらかじめ投与されたマウスから得た）。７日ごと・４用量で２８日間に渡って処置を繰り返した。腫瘍は毎日測定し、式「V＝XY2/2」を使用して体積を算出した。マウスは６０日間追跡された。データを、併合した腫瘍体積(図１)及び個々の腫瘍進行(図２)で示す(p＜0.0001)。SurVaxMワクチンとは、そのペプチドが配列 DLAQMFFCFKELEGW(配列番号４)を有するワクチンを指す。
【０１０１】
これらの研究の結果は次の通りであった。図１に示すように、腫瘍移植後、７日に１回抗-サバイビン抗体を投与された、GL261グリオーマを有する頭蓋内グリオーマモデルC57BL/6マウスでは、抗-サバイビン抗体を投与されたマウスは、コントロールより有意に長く生存した。使用したIgGは、正常マウスの非特異的IgGである。図２は、GL261グリオーマを有するC57BL/6マウスの皮下腫瘍モデルを示す。マウスは、腫瘍移植後、７日に１回、表示する処置を受けた。頭蓋内研究と同様に、精製mAb又は抗血清のどちらかを受けたマウスは、コントロールより有意に小さい腫瘍を有し、活性ワクチン自体によって観察された抗腫瘍効果に匹敵した。図３は、GL261グリオーマを有するC57BL/6マウスの皮下腫瘍モデルを示す。マウスは、腫瘍移植後、７日に１回、表示する処置を受けた。SurVaxMはサバイビンワクチンである；抗-サバイビン血清(抗体)は、活性SurVaxMワクチンを受けた非担癌プールマウスから得た。データは、５０日間にわたるそれぞれの腫瘍増殖を示す(１グループあたりｎ＝４)。
【０１０２】
これらのデータは、サバイビン抗体の投与が、腫瘍体積の減少と生存期間の延長に有効であることを実証する。
【実施例２】
【０１０３】
この実験は、モノクローナル抗体の産生と、腫瘍増殖を抑止する抗体の有効性を説明する。
【０１０４】
方法：
【０１０５】
細胞株と培養条件：
GL261マウスグリオーマ細胞株とB16f1マウスメラノーマ細胞株を、100mm組織培養プレート上で、10％ウシ胎児血清、5000単位ペニシリン/ストレプトマイシン、50μMの2-メルカプトエタノール、25mMのHEPES、及び１×非必須アミノ酸を含む完全ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)にて、３７℃にて5％CO2で、１週間に２〜３回培地を交換しながら、成長させた。
【０１０６】
ペプチド：
ペプチド合成は、Fmoc化学と固相支持樹脂(Genscript, Piscataway, NJ)を使用して行った。各ペプチドは、使用するまで−２０℃で貯蔵され、DMSOで希釈された。抗原配列１：DLAQMFFCFKELEGW(配列番号４)；抗原配列２：DLAQCFFCFKELEGW(配列番号２７)；免疫原：ペプチド(Lot：614429-1)-KLHコンジュゲート
【０１０７】
抗体産生のためのマウスの免疫化
１０匹のマウスを、抗体産生のラウンドごとに使用した。５匹のBalb/cマウスと５匹のC57Bl/6マウスを、抗原１(SVN53-67/M57)に対して反応性の抗血清を産生するために使用した。マウスを免疫源：ペプチド-KLHコンジュゲート(SVN53-67/M57-KLH)で免疫化した。血清サンプルは、４ラウンドの免疫化後に得た。間接ELISA分析によりサバイビン反応性抗血清を確認した上で、陽性試験マウスを、ハイブリドーマ産生のために選択した。SP2/0骨髄腫細胞に融合させた各反応性マウス由来の細胞を用いて、複数のハイブリドーマ細胞株を産生した。これらの細胞株のうち２つのサブクローンを、さらに単離して特性評価した。
【０１０８】
抗体反応性のための間接的ELISA
96ウェルELISAプレートを、被覆抗原Ａ：(SVN53-67/M57)DLAQMFFCFKELEGW(配列番号４)又は被覆抗原Ｂ：(野生型SVN53-67)DLAQCFFCFKELEGW(配列番号２７) を含むリン酸緩衝食塩水(pH 7.4)で被覆した(1μg/mL、100μL/ウェル)。マウスの抗血清又はハイブリドーマ細胞培養上清を、被覆プレートに、100ul/ウェル適用し、インキュベートした。二次抗体：ペルオキシダーゼ-AffiniPureヤギ抗-マウスIgG、Fcγをその後添加し、標準的な検出を行った。
【０１０９】
ハイブリドーマ配列決定：
TRIzol(登録商標)試薬(Ambion, Cat. No.:15596-026)の技術マニュアルに従って、ハイブリドーマ細胞から全RNAを単離した。アガロースゲル電気泳動によって全RNAを分析した。アイソタイプ特異的アンチセンスプライマー、又はPrimeScriptTM 1st Strand cDNA合成キット(Takara, Cat. No.:6110A)の技術マニュアルによる一般的なプライマーを使用して、全RNAをcDNAに逆転写した。ＶＨとＶＬの抗体フラグメントは、GenScriptのRACEの標準的な操作手順に従って増幅した。増幅した抗体フラグメントを別々に、標準的な分子クローニング手順を使用して、標準クローニングベクターにクローニングした。正確なサイズのインサートを有するクローンを特定するために、コロニーPCRスクリーニングを行った。正確なサイズのインサートを有する５つ以上の単一コロニーを、各抗体フラグメントのために配列決定した。正確なＶＨ及びＶＬインサートサイズを有する５つの単一コロニーを、配列決定に回した。５つの異なるクローンのＶＨ及びＶＬ遺伝子はほぼ同一であった。コンセンサス配列は、産生された抗体の配列であると考えられる。
【０１１０】
患者血清の抗体測定
患者血清を採取し−８０℃で貯蔵した。澄んだ血清の連続希釈物を、プレコートELISAプレート(Flat Bottom, Nunc)上の未コンジュゲート・サバイビンペプチド、遊離KLH、及びランダムペプチド(20μg/mL、1μg/ウェル)に、三つ組で適用した。サンプルを４℃で一晩インキュベートし、洗浄した(PBS、1％BSA)。HRPコンジュゲート抗-ヒトIgG検出抗体(Bio-Rad)を、２５℃にて１時間添加した。プレートを４回洗浄し、TMB比色溶液(Biolegend)を室温で添加し、１５分間発色させ、Bio-Rad自動プレートリーダーで読み取った(450nm)。
【０１１１】
腫瘍増殖研究のためのマウスの免疫化
マウスにおける概念の検証研究は、100μLの抗-SVN53-67/M57ハイブリドーマ上清又は10μgの精製モノクローナル抗体を用いて行った。マウスに対して、まず、マウスGL261グリオーマ細胞又はB16f1マウスメラノーマ細胞を、頭蓋内か皮下のどちらかに移植した。腫瘍移植後４日目に、マウスに、週に１回、最大で５週間、抗体の腹腔内注射を繰り返し行い、腫瘍の増殖を追跡した。
【０１１２】
脳内GL261腫瘍細胞注射と生存分析：
オスのC57BL/6マウス(Charles River, Horsham, PA)を、イソフルランガスで麻酔し、定位固定ヘッドフレーム(David Kopf Instruments, Tujunga, CA)で固定した。正中頭皮に切り込みを作り、ブレグマを特定した。深部前頭白質内に細胞を移植するために、定位座標を測定した(ブレグマに対して、2.0 mm側方で、1.2 mm前方)。この位置に穿頭孔を開け、2.5μLのDMEMに懸濁させた 1×105のGL261細胞を、固定された２５ゲージ針を有するハミルトンシリンジによって、硬膜に対して3.0 mmの深さに注射した。注射は、1μL/分で行われた。針を引き抜き、切り込みを縫合した。カプラン・マイヤー生存プロットを描き、生存期間中央値を、全グループについて決定した。１グループあたりｎ＝８マウス
【０１１３】
皮下腫瘍増殖研究：
2×107のGl261細胞又は1×106のB16f1細胞を100μLのPBSに懸濁させた液を、オスのC57Bl/6(免疫正常)マウス(Charles River, Horsham, PA)、及びヌード(免疫不全)NCr-nu/nuマウス(Charles River, Horsham, PA)の剪毛した右側腹部皮下に注射した。腫瘍増殖は毎日ノギスで測定し、体積は式 V＝(a・(b2))/2によって算出した(式中、Vは体積であり、aとbは腫瘍の垂直径である)。データは、経時的な腫瘍増殖及び比較平均腫瘍体積として表される。提示された様々な研究において、１グループあたり、ｎ＝４，５または１０のマウス
【０１１４】
結果：
【０１１５】
ハイブリドーマを産生するために、配列番号４の改変サバイビンペプチドを使用した。１０匹のマウスに、配列番号４のペプチドを含む15μg/mlのペプチドワクチンを投与した。これらのうち、９匹のマウスが、抗-サバイビン価を呈した。複数のハイブリドーマ系統を作製し、これらは、配列番号４のペプチド及びサバイビンペプチド DLAQCFFCFKELEGW(配列番号２７)(当該配列はヒトサバイビンの一部と同一である)に対して反応性の抗体を産生した。さらなる特性評価を行う為、ハイブリドーマの中から、特に２つを選択した。これらは、2C2及び30H3と名付けられた。これらのハイブリドーマから、それぞれ一つのクローンをさらに特性評価した。これらは、それぞれ、2C2E7及び30H3D2と名付けられた。2C2E7はアイソタイプIgG2bを有することが判明し、30H3D2はアイソタイプIgG1を有することが判明した。従って、正確な重鎖及び軽鎖可変領域インサートサイズを有する２，３の単一コロニーが配列決定された。これらの配列は、ほぼ同一であることが判明し、コンセンサス配列が作成された。mAb 2C2E7の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列を、配列番号１９及び２０にそれぞれ示す。mAb 30H3D2の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列を、配列番号２１及び２２にそれぞれ示す。配列番号１９，２０，２１及び２２のアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列を、配列番号２３，２４，２５及び２６にそれぞれ示す。
【０１１６】
抗体2C2E7の重鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列を以下に示す：
MGWLWNLLFLMAAAQSAQAQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTTYGMSWVKQAPGRGLKWMGWINPYSGVPTYAVDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARGGRRGDFGYWGQGTTLTVSS(配列番号１９)
【０１１７】
抗体2C2E7の軽鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列を以下に示す：
MDFQVQIFSFLLISASVILSSGQIGLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSISYMHWYQQKPGTSPKTWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRSSHHTFGGGTKLEIK(配列番号２０)
【０１１８】
抗体30H3D2の重鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列を以下に示す：
MNFGLSLIFLALILKGVQCEVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRLTPDKRLEWVATISSGGSHTYYPDSVRGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHPIYYYISSYAMDYWGQGTSVTVSS(配列番号２１)
【０１１９】
抗体30H3D2の軽鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列を以下に示す：
MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSTGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFGGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPTFGGGTKLEIK(配列番号２２)
【０１２０】
配列番号１９に示すmAb 2C2E7の重鎖可変領域のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を以下に示す：
ATGGGTTGGCTGTGGAACTTGCTATTCCTGATGGCAGCTGCCCAAAGTGCCCAAGCACAGATCCAGTTGGTACAATCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAACCTATGGAATGAGCTGGGTGAAACAGGCTCCAGGAAGGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACCCCTACTCTGGAGTGCCAACATATGCTGTTGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCAAGAGGAGGGCGGAGGGGGGACTTTGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(配列番号２３)
【０１２１】
配列番号２０に示すmAb 2C2E7の軽鎖可変領域のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を以下に示す：
ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATACTGTCCAGCGGACAAATTGGTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTATAAGTTACATGCATTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCACCTCCCCCAAAACATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCATCAGCGGAGTAGTCACCACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA(配列番号２４)
【０１２２】
配列番号２１に示すmAb 30H3D2の重鎖可変領域のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を以下に示す：
ATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGCCCTTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCTGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGCAGTGGTGGTAGTCACACCTACTATCCAGACAGTGTGAGGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACACCCAATTTATTACTACATTAGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(配列番号２５)
【０１２３】
配列番号２２に示すmAb 30H3D2の軽鎖可変領域のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を以下に示す：
ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTACTGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCGGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(配列番号２６)
【０１２４】
動物を免疫化するために使用したペプチド(配列番号４)に対する、及びヒトサバイビン由来の配列(配列番号２７)に対する結合について、抗体を試験した。15 ng/mLの抗体濃度の2C2E7は、配列番号４の改変サバイビンペプチドに(OD 1.019)、及び配列番号２７の野生型サバイビンペプチドに(OD 0.891)結合するのに十分であった。シグナル：ブランクの比が＞2：1である最大希釈における2C2E7の力価は、1：512,000であり、高親和性抗体で予測されるものと一致する。さらに、31 ng/mLの抗体濃度の30H3D2は、配列番号４の改変サバイビンペプチドに(OD 1.021)、及び配列番号２７の野生型サバイビンペプチドに(OD 0.874)結合するのに十分であった。シグナル：ブランクの比が＞2：1である最大希釈における30H3の力価は、1：512,000であり、高親和性抗体で予測されるものと一致する。
【０１２５】
抗体は、その後動物モデルにおいて、腫瘍の増殖に対する作用を決定するために使用された。動物モデルは、実施例１で使用したものと同一である。結果を図４〜１１に示す。2C2及びH30抗-サバイビン抗体の研究は、皮下マウス腫瘍モデルで行った。マウスに、移植腫瘍を定着させ、その後、３０日の期間にわたり、５〜７日ごとに、2C2、H30又は非特異的IgGを用いた治療を始めた。２つのホストマウス系統を使用し、NCr-nu/nu(ヌード)を図４，６，８，１０に、C57Bl/6マウスを図５，７，９，１１に示す。ヌードマウスは、免疫不全モデルを表し、このモデルでは、抗体の活性は、免疫系のサポートなしで、標的への直接抗体結合に特に依存すると予想される。C57Bl/6マウスは、免疫正常モデルを表し、その抗体は、マクロファージ、樹状細胞及びＴ細胞などの免疫学的サポート機構のさらなる関与から利益を得る可能性がある。B16メラノーマ(図４〜７)及びGL261グリオーマ細胞(図８〜１１)は、2C2又はH30抗体で治療された際、C57Bl/6(免疫正常)モデルにおいてその増殖が阻害されること(図５，７)及び、ヌード(免疫不全)モデルでも、程度はより低いもののその増殖が阻害される(図４，６)ことを示した。この観察は、ヌードマウスにおける免疫サポートの欠如によっても完全には抑止されない(図４，６，８，１０)、C57Bl/6マウスにおける強い免疫介在性抗体依存性の応答を示す(図５，７，９，１１)。免疫不全モデル(図４，６，８，１０)における、抗体-依存性増殖阻害の持続性は、免疫系に依存しない又は直接増殖抑制性の抗体成分それ自体が加わったことを強く示唆する。ロズウェルパーク癌研究所におけるSurVaxM(SVN53-67/M57-KLH)配列番号４の第Ｉ相臨床試験(FDA承認済/I171010)に登録されたグリオーマ患者は、臨床試験プロトコル期間の間、SurVaxMペプチドに予想外の抗体応答を生じることが観察された。本明細書に示される８人の患者は、配列番号２７のアミノ酸からなる野生型サバイビンペプチド、及び配列番号４のアミノ酸からなる改変サバイビンペプチド(１５のアミノ酸からなる免疫ペプチド配列にも含まれている)の両方に交差反応性である、反応性の抗血清を生じた。これらの抗体は、治療目的のために使用することができる。
【０１２６】
本開示内容を、特定の実施形態及び実施例を使用して説明してきたが、通常の修正は当業者にとって自明であり、そのような修正は、本開示及び特許請求の範囲内であることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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