(57)【要約】ＬＰＡ（アポ（ａ））遺伝子の発現の阻害のためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤及びＲＮＡｉ剤コンジュゲートが記載される。１つまたは複数のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を随意で１つまたは複数の追加の治療剤と共に含む医薬組成物も記載される。記載されるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の肝細胞へのインビボでの送達は、ＬＰＡ遺伝子発現の阻害ならびに心血管性疾患及び心血管関連疾患の治療を提供する。本明細書において記載されるＲＮＡｉ剤は、ＬＰＡ遺伝子を発現する細胞への送達に際して、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の生物学的プロセスを介してＬＰＡの発現をインビトロ及び／またはインビボで阻害またはノックダウンする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＬＰＡ  ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤であって、
前記アンチセンス鎖が、
ａ）配列番号：１〜１０８のうちの任意のもののヌクレオチド２〜１９、または
ｂ）表１もしくは表２Ａのアンチセンス鎖のうちの任意のもの
のヌクレオチド配列を含む、前記ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤。
【請求項２】
前記センス鎖が、
ａ）配列番号：１９０〜２６８のうちの任意のもののヌクレオチド１〜１９、または
ｂ）表１もしくは表２Ｂのセンス鎖のうちの任意のもの
のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤。
【請求項３】
前記アンチセンス鎖が、配列番号：１２４６、配列番号：１２４２、配列番号：１２４４、配列番号：１２４８、配列番号：１２５０、配列番号：１２５２、または配列番号：１２５４、配列番号：１２８０、配列番号：１２８１、配列番号：１２８２、または配列番号：１２８３のうちの任意のもののヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤。
【請求項４】
ａ）前記アンチセンス鎖が配列番号：１２４６のヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖が配列番号：１２４７のヌクレオチド配列を含む；
ｂ）前記アンチセンス鎖が配列番号：１２４２のヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖が配列番号：１２４３のヌクレオチド配列を含む；
ｃ）前記アンチセンス鎖が配列番号：１２４４のヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖が配列番号：１２４５のヌクレオチド配列を含む；
ｄ）前記アンチセンス鎖が配列番号：１２４８のヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖が配列番号：１２４９のヌクレオチド配列を含む；
ｅ）前記アンチセンス鎖が配列番号：１２５０のヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖が配列番号：１２５１のヌクレオチド配列を含む；
ｆ）前記アンチセンス鎖が配列番号：１２５２のヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖が配列番号：１２５３のヌクレオチド配列を含む；または
ｇ）前記アンチセンス鎖が配列番号：１２５４のヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖が配列番号：１２５５のヌクレオチド配列を含む；または
ｈ）前記アンチセンス鎖が配列番号：１２８０のヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖が配列番号：１２６０のヌクレオチド配列を含む；または
ｉ）前記アンチセンス鎖が配列番号：１２８１のヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖が配列番号：１２５８のヌクレオチド配列を含む；または
ｊ）前記アンチセンス鎖が配列番号：１２８０のヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖が配列番号：１２８４のヌクレオチド配列を含む；または
ｋ）前記アンチセンス鎖が配列番号：１２８１のヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖が配列番号：１２８５のヌクレオチド配列を含む；または
ｌ）前記アンチセンス鎖が配列番号：１２８２のヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖が配列番号：１２５９のヌクレオチド配列を含む；または
ｍ）前記アンチセンス鎖が配列番号：１２８３のヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖が配列番号：１２４９のヌクレオチド配列を含む、
請求項３に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤。
【請求項５】
前記センス鎖及び／または前記アンチセンス鎖が、１〜６ヌクレオチドの長さの３’延長及び／または５’延長をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤。
【請求項６】
前記アンチセンス鎖が、配列番号：１５６、配列番号：１６４、または配列番号：１８８のうちの任意のもののヌクレオチド配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤。
【請求項７】
ａ）前記アンチセンス鎖が配列番号：１５６のヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖が配列番号：３１０のヌクレオチド配列を含む、
ｂ）前記アンチセンス鎖が配列番号：１６４のヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖が配列番号：３５７のヌクレオチド配列を含む、
ｃ）前記アンチセンス鎖が配列番号：１８８のヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖が配列番号：３８４のヌクレオチド配列を含む、
ｄ）前記アンチセンス鎖が配列番号：１６４のヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖が配列番号：３７６のヌクレオチド配列を含む、または
ｅ）前記アンチセンス鎖が配列番号：１６４のヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖が配列番号：３８４のヌクレオチド配列を含む、
請求項６に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤。
【請求項８】
前記センス鎖及び／またはアンチセンス鎖が独立して１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤。
【請求項９】
前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、デオキシチミジン、反転（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）デオキシチミジン、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、及びヌクレオチドを含む非天然塩基からなる群から独立して選択される、請求項８に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤。
【請求項１０】
前記ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤が１つまたは複数のホスホロチオエートヌクレオシド間リンケージを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤。
【請求項１１】
前記ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤が標的基をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤。
【請求項１２】
前記標的基がアシアロ糖タンパク質受容体リガンドを含む、請求項１１に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤。
【請求項１３】
前記アシアロ糖タンパク質受容体リガンドが、ガラクトースクラスターを含む、請求項１２に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤。
【請求項１４】
前記ガラクトースクラスターが、（Ｃ１１−ＰＥＧ３−ＮＡＧ３）、（Ｃ１１−ＰＥＧ３−ＮＡＧ３）、（Ｃ６−ＰＥＧ４−ＮＡＧ３）、（ＮＡＧ３）、（ＮＡＧ４）、（ＮＡＧ３−ＡＡ２）、（ＮＡＧ３−Ｐａｌｍ）、（ＮＡＧ１３）、（ＮＡＧ１８）、（ＮＡＧ２４）、（ＮＡＧ２５）、（ＮＡＧ２５）ｓ、（ＮＡＧ２６）、（ＮＡＧ２７）、（ＮＡＧ２８）、（ＮＡＧ２９）、（ＮＡＧ３０）、（ＮＡＧ３０）ｓ、（ＮＡＧ３１）、（ＮＡＧ１３）、（ＮＡＧ３１ｓ）、（ＮＡＧ３２）、（ＮＡＧ３３）、（ＮＡＧ３４）、（ＮＡＧ３５）、（ＮＡＧ３６）、及び（ＮＡＧ３７）からなる群から選択される、請求項１３に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤。
【請求項１５】
前記標的基がセンス鎖へコンジュゲートされる、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤。
【請求項１６】
前記標的基がセンス鎖の５’末端へコンジュゲートされる、請求項１５に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤。
【請求項１７】
前記標的基がセンス鎖の３’末端へコンジュゲートされる、請求項１５に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤。
【請求項１８】
前記ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤が連結基をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤。
【請求項１９】
前記ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤が１または２のオーバーハングを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤。
【請求項２０】
前記ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤が１または２のほつれた末端（ｆｒａｙｅｄ  ｅｎｄ）を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤。
【請求項２１】
前記ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤が１または２の平滑末端を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤。
【請求項２２】
前記ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤が表３Ａまたは表３Ｂ中の二重鎖配列のうちの任意のものを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤。
【請求項２３】
前記ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤が、ＡＤ０３４６０、ＡＤ０３５３６、ＡＤ０３５８１、ＡＤ０３５８３、ＡＤ３８４７、またはＡＤ０４１１０を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤。
【請求項２４】
医薬品の製造のための、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の使用。
【請求項２５】
１つまたは複数の追加の治療剤または治療をさらに含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤。
【請求項２６】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤。
【請求項２７】
前記ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤が、キット、容器、パック、ディスペンサー、前充填シリンジ、またはバイアル中でパッケージングされる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤。
【請求項２８】
細胞、組織、または被験体におけるＬＰＡ発現を阻害する方法であって、治療有効量の請求項１〜２６のいずれか一項に記載のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を前記被験体へ投与することを含む、前記方法。
【請求項２９】
前記組成物が非経口的に投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が肝細胞である、請求項２７〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
センス配列及びアンチセンス配列を含むＬＰＡ  ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤であって、前記アンチセンス配列が、表１または表２Ａのアンチセンス配列のうちの任意のもののヌクレオチド１〜１７、２〜１８、１〜１９、２〜１９、１〜２１、１〜２３、または１〜２６のヌクレオチド配列を含む、ＬＰＡ  ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
リポタンパク質（ａ）［Ｌｐ（ａ）］は不均一な低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）様粒子であり、脂質コア及びアポリポタンパク質Ｂ（アポＢ−１００）を、ユニークな構成物であるアポリポタンパク質（ａ）（アポ（ａ））（ジスルフィド結合を介してアポＢ−１００へ付加される）と共に含有する。
【０００２】
アポ（ａ）遺伝子（ＬＰＡ）は肝臓において優先的に発現され、発現はヒト及び非ヒト霊長動物に限られる。ヒトにおけるＬｐ（ａ）レベルは遺伝的に規定され、食餌、運動、または他の生活習慣の変化により有意に変化しない。ＬＰＡの長さは存在するＫｒｉｎｇｌｅ  ＫＩＶ２ドメインの数に依存して変動し、その発現は存在するドメインの数と逆相関する。正常なＬｐ（ａ）レベルは０．１〜２５ｍｇ／ｄｌの範囲であり、アメリカ合衆国における集団の約２５％が３０ｍｇ／ｄｌ以上のＬｐ（ａ）のレベルを有する。
【０００３】
複数の研究におけるＬｐ（ａ）レベルの分析により、心血管性疾患、卒中、及び他の関連する障害（アテローム硬化型狭窄が含まれる）についての独立危険因子として高レベルのＬｐ（ａ）が暗示されている。加えて、ゲノムワイド関連リアルタイム分析により、ＬＰＡもアテローム性動脈硬化性狭窄等の疾患についての遺伝的危険因子として暗示された。
【０００４】
治療法的リポタンパク質アフェレシスが、高脂血症患者においてＬｐ（ａ）レベル及びＬＤＬレベルの両方を低下させるために使用される場合に、心血管イベントの有意な低減が観察された。したがって、これら及び他のＬＰＡ関連疾患に関連する治療剤及び治療についての必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
選択的且つ効率的にＬＰＡ遺伝子の発現を阻害するための、ＬＰＡ（アポ（ａ）とも称される）ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤（ＲＮＡｉトリガーまたはトリガーとも称される）及びＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を含有する組成物が、本明細書において記載される。ＬＰＡは、アポリポタンパク質（ａ）（アポ（ａ））（リポタンパク質（ａ）粒子（Ｌｐ（ａ））の重要な構成要素）をコードする遺伝子の名称である。本明細書において記載されるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、疾患（ベルガー病、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、メタボリック症候群、急性冠症候群、大動脈弁狭窄症、大動脈弁閉鎖不全症、大動脈解離、網膜動脈閉塞症、脳血管疾患、腸間膜虚血症、上腸間膜動脈閉塞症、腎動脈狭窄症、安定狭心症／不安定狭心症、急性冠症候群、ヘテロ接合またはホモ接合の家族性高コレステロール血症、高アポβリポタンパク血症、アテローム性脳動脈硬化症、脳血管疾患、及び静脈血栓症が含まれるがこれらに限定されない）の予防もしくは治療、またはこれらの疾患の予防または治療のための医薬品の調製において使用され得る。
【０００６】
各々のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は少なくともセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。センス鎖及びアンチセンス鎖は、互いに対して、部分的、実質的、または全面的に相補的であり得る。本明細書において記載される各々のＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖の長さは、１７〜３０ヌクレオチドの長さであり得る。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、独立して１７〜２６ヌクレオチドの長さである。センス鎖及びアンチセンス鎖は同じ長さまたは異なる長さのいずれかであり得る。本明細書において記載されるＲＮＡｉ剤は、ＬＰＡ遺伝子を発現する細胞への送達に際して、ＬＰＡ遺伝子の発現をインビトロまたはインビボで阻害する。
【０００７】
ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、少なくとも連続１７ヌクレオチドのコアストレッチにわたって、ＬＰＡ  ｍＲＮＡ中の配列へ少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ｍＲＮＡ中の配列へ少なくとも９０％の同一性を有するセンス鎖のヌクレオチド配列は、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３ヌクレオチドの長さである。ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、少なくとも連続１６ヌクレオチドのコアストレッチにわたって、ＬＰＡ  ｍＲＮＡ及び対応するセンス鎖中の配列へ少なくとも９０％の相補性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ｍＲＮＡまたは対応するセンス鎖中の配列へ少なくとも９０％の相補性を有するアンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３ヌクレオチドの長さである。
【０００８】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、当技術分野において公知の任意のオリゴヌクレオチド送達技術を使用して、標的細胞または組織へ送達される。核酸送達方法には、リポソーム中のカプセル化によるもの、イオン導入によるもの、または他のベヒクル（ハイドロゲル、シクロデキストリン、生物分解性ナノカプセル剤及び生体接着性マイクロスフェア等）への取り込みによるもの、タンパク性ベクターまたはＤｙｎａｍｉｃ  Ｐｏｌｙｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（商標）（ＤＰＣ）が含まれるがこれらに限定されない（例えばＷＯ２０００／０５３７２２、ＷＯ２００８／００２２３０９、ＷＯ２０１１／１０４１６９及びＷＯ２０１２／０８３１８５を参照、その各々は参照により本明細書に援用される）。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は標的基へコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、標的基には、細胞受容体リガンド（Ｎ−アセチル−ガラクトサミン三量体を含むガラクトースクラスターが含まれる、ガラクトースクラスター等）が含まれ得る。
【０００９】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物が記載される。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、随意で、１つまたは複数の追加の（すなわち第２、第３などの）治療剤と組み合わせられる。追加の治療剤は、他のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤（例えばＬＰＡ標的内の異なる配列を標的とするＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤）であり得る。追加の治療剤は、小分子薬物、抗体、抗体断片、及び／またはワクチンでもあり得る。ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を、１つまたは複数の追加の治療剤有りまたは無しで１つまたは複数の賦形剤と組み合わせて、医薬組成物を形成することができる。
【００１０】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を肝細胞（特に肝細胞）へインビボで送達するための組成物であって、標的基へコンジュゲートされたＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を含む、前記組成物が記載される。いくつかの実施形態において、標的基はアシアロ糖タンパク質リガンドである。
【００１１】
ＬＰＡ発現によって少なくとも部分的に媒介される病理学的状態を有するかまたは病理学的状態を発症するリスクがあるヒト被験体を治療する方法であって、治療有効量のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤またはＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤含有組成物を被験体へ投与するステップ（複数可）を含む、前記方法も記載される。ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤またはＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤含有組成物により被験体を治療する方法は、随意で、１つまたは複数の追加の（すなわち第２の）治療剤または治療を投与する１つまたは複数のステップと組み合わせられ得る。ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤及び追加の治療剤は単一の組成物中で投与され得るか、またはそれらは個別に投与され得る。追加の治療剤の例には、ＨＭｇ  Ｃｏ−Ａリダクターゼ阻害剤（スタチン）、エゼチミブ、ＰＣＳＫ−９阻害剤、ＣＴＥＰ阻害剤、ＡＮＧＰＴＬ３標的療法、ＡＰＯＣ３標的療法、及びナイアシンがを含まれるがこれらに限定されない。
【００１２】
記載されるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の使用は、疾患（ベルガー病、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、メタボリック症候群、急性冠症候群、大動脈弁狭窄症、大動脈弁閉鎖不全症、大動脈解離、網膜動脈閉塞症、脳血管疾患、腸間膜虚血症、上腸間膜動脈閉塞症、腎動脈狭窄症、安定狭心症／不安定狭心症、急性冠症候群、ヘテロ接合またはホモ接合の家族性高コレステロール血症、高アポβリポタンパク血症、アテローム性脳動脈硬化症、脳血管疾患、及び静脈血栓症が含まれるがこれらに限定されない）の予防または治療のための療法において使用され得る。かかる方法は、本明細書において記載されるようなＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を被験体（例えばヒト被検体または動物被験体）へ投与することを含む。
【００１３】
医薬組成物は、局部的または全身的な治療が所望されるかどうか及び治療される領域に依存して、多くの手法で投与され得る。投与は、当技術分野において一般的に公知の任意の手法（局所（例えば経皮パッチによる）、経肺（例えば粉末またはエアロゾルの吸入または吹送によって（ネブライザー経由、気管内、鼻腔内が含まれる））、表皮、経皮、経口、または非経口等であるがこれらに限定されない）によって行うことができる。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内の注射または点滴；皮膚下（例えば移植されたデバイスによって）、頭蓋内、実質内、髄腔内及び脳室内の投与が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される医薬組成物は皮下注射によって投与される。
【００１４】
記載されるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤及び／または組成物は、疾患（ベルガー病、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、メタボリック症候群、急性冠症候群、大動脈弁狭窄症、大動脈弁閉鎖不全症、大動脈解離、網膜動脈閉塞症、脳血管疾患、腸間膜虚血症、上腸間膜動脈閉塞症、腎動脈狭窄症、安定狭心症／不安定狭心症、急性冠症候群、ヘテロ接合またはホモ接合の家族性高コレステロール血症、高アポβリポタンパク血症、アテローム性脳動脈硬化症、脳血管疾患、及び静脈血栓症が含まれるがこれらに限定されない）の治療のための療法において使用され得る。かかる方法は、本明細書において記載されるようなＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を被験体（例えばヒト被検体または動物被験体）へ投与することを含む。
【００１５】
特別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実践または試験において、本明細書において記載されるものに類似するかまたは等価である方法及び材料を使用することができるが、好適な方法及び材料が後述される。すべての出版物、特許出願、特許、及び本明細書において言及される他の参照文献は、それらの全体を参照することによって援用される。矛盾する事例において、本明細書（定義が含まれる）が優先されるだろう。加えて、材料、方法、及び例は、単に説明的なものであり、限定を意図したものではない。
【００１６】
本発明の他の特色及び利点は、以下で詳述される記載及び請求項から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】０．５ｍｇ／ｋｇ（破線）または２ｍｇ／ｋｇ（実線）の指示されたＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の単回の皮下投与の後の、Ｌｐ（ａ）遺伝子導入（Ｔｇ）マウスにおける血清Ｌｐ（ａ）タンパク質レベルを例証するグラフ。Ｌｐ（ａ）レベルを１日目及び食塩水対照へ正規化した。
【図２】１ｍｇ／ｋｇ（破線）または３ｍｇ／ｋｇ（実線）の指示されたＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の３回の皮下用量の投与を、３週間の間に週に１回（１日目、８日目及び１５日目での用量）投与した後の、Ｌｐ（ａ）Ｔｇマウスにおける血清Ｌｐ（ａ）タンパク質レベルを例証するグラフ。Ｌｐ（ａ）レベルを１日目及び食塩水対照へ正規化した。
【図３】１日目に送達ポリマーにより１：１（ｗｔ／ｗｔ）で投薬された単回の２ｍｇ／ｋｇのＡＤ０１１９６  ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の投与の後の、カニクイザル血清におけるＬｐ（ａ）粒子レベルを例証するグラフ。Ｌｐ（ａ）レベルを２つの用量前の値（０日目として示される）へ正規化した。
【図４】１日目及び７１日目に送達ポリマーにより１：１（ｗｔ／ｗｔ）で投薬された４ｍｇ／ｋｇまたは６ｍｇ／ｋｇのＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の投与の後の、カニクイザル血清におけるＬｐ（ａ）粒子レベルを例証するグラフ。Ｌｐ（ａ）レベルを２つの用量前の値（０日目として示される）へ正規化した。４ｍｇ／ｋｇの用量＝黒色円；６ｍｇ／ｋｇの用量＝灰色正方形。
【図５】３ｍｇ／ｋｇのＡＤ０２８１９  ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の３回の週１回の皮下用量（１、８及び１５日目に）の後の、カニクイザル血清におけるＬｐ（ａ）粒子レベルを例証するグラフ。Ｌｐ（ａ）レベルを３つの用量前の値（０日目として示される）へ正規化した。
【図６】１日目に３ｍｇ／ｋｇのＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の単回の皮下投与の後の、カニクイザル血清におけるＬｐ（ａ）粒子レベルを例証するグラフ。ＡＤ０３４６０群及びＡＤ０３５３６群に、４８日目にＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の追加の１ｍｇ／ｋｇの用量を投与した。Ｌｐ（ａ）レベルを３つの用量前の値（０日目として示される）へ正規化した。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
ＬＰＡ遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤（本明細書においてＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤と称される）が、本明細書において記載される。本明細書において記載されるＲＮＡｉ剤は、ＬＰＡ遺伝子を発現する細胞への送達に際して、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の生物学的プロセスを介してＬＰＡの発現をインビトロ及び／またはインビボで阻害またはノックダウンする。本明細書において使用される時、特別に具体的に指摘されない限り、ＬＰＡは、必要に応じて、ＬＰＡ遺伝子、ＬＰＡ  ｍＲＮＡまたはＬＰ（ａ）タンパク質を指し得る。
【００１９】
ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤はセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。センス鎖及びアンチセンス鎖は各々、１７〜２３核酸塩基の長さのコア配列を含有する。アンチセンス鎖コア配列は、ＬＰＡ  ｍＲＮＡ中に存在するヌクレオチド配列（時には例えば標的配列と称される）へ１００％（完全に）相補的であるか、または少なくとも９０％（実質的に）相補的である。センス鎖コア配列は、アンチセンス鎖中の配列へ１００％（完全に）相補的であるか、または少なくとも９０％（実質的に）相補的であり、したがって、センス鎖コア配列は、ＬＰＡ  ｍＲＮＡ中に存在するヌクレオチド配列（標的配列）に完全に同一であるか、または少なくとも９０％同一である。センス鎖コア配列は対応するアンチセンスコア配列と同じ長さであり得るか、または異なる長さであり得る。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖コア配列は、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、センス鎖コア配列は、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチドの長さである。
【００２０】
ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖はアニールして二重鎖を形成する。ＬＰＡ  ＲＮＡｉのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、互いに対して、部分的、実質的、または全面的に相補的である。相補的な二重鎖領域内で、センス鎖コア配列は、アンチセンスコア配列へ少なくとも９０％相補的であるか、または１００％相補的である。いくつかの実施形態において、センス鎖コア配列は、アンチセンス鎖コア配列の対応する１７、１８、１９、２０または２１ヌクレオチドの配列へ、少なくとも９０％または１００％相補的な、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０または少なくとも２１ヌクレオチドの配列を含有する（すなわち、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンスコア配列は、少なくとも９０％塩基対を作るか、または１００％塩基対を作る、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０または少なくとも２１ヌクレオチドの領域を有する）。
【００２１】
本明細書において使用される時、及び特別の指示のない限り、「相補的」という用語は、第１のヌクレオチド配列（例えばＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはＬＰＡ  ｍＲＮＡ）を第２のヌクレオチド配列（例えばＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖）に関連して記載するのに使用される場合に、特定の条件下で第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズ（塩基対水素結合を形成）し、二重鎖（または二重らせん構造）を形成する、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの能力を指す。相補的な配列は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対または非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対を含み、ハイブリダイズする能力に関する上記の要求性が満たされる限り、天然ヌクレオチドもしくは修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド模倣体を含む。「完全に相補的」または「全面的に相補的」は、第１のポリヌクレオチドのコンティグ配列中の塩基のすべて（１００％）が、第２のポリヌクレオチドのコンティグ配列中の塩基の同じ数とハイブリダイズするだろうということを意味する。コンティグ配列は第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列のすべてまたは一部分を含み得る。本明細書において使用される時、「部分的に相補的」は、核酸塩基のハイブリダイズされたペアにおいて、第１のポリヌクレオチドのコンティグ配列中の塩基の少なくとも７０％が、第２のポリヌクレオチドのコンティグ配列中の塩基の同じ数とハイブリダイズするだろうということを意味する。本明細書において使用される時、「実質的に相補的」は、核酸塩基のハイブリダイズされたペアにおいて、第１のポリヌクレオチドのコンティグ配列中の塩基の少なくとも８５％が、第２のポリヌクレオチドのコンティグ配列中の塩基の同じ数とハイブリダイズするだろうということを意味する。本明細書において使用される時、「相補的」、「全面的に相補的」及び「実質的に相補的」という用語、は、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖とアンチセンス鎖、またはＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖とＬＰＡ  ｍＲＮＡの配列との間の塩基のマッチングに関して使用され得る。配列の同一性または相補性は修飾に非依存的である。同一性または相補性を決定する目的のために、例えばａ及びＡｆは、Ｕ（またはＴ）へ相補的であり、Ａに同一である。
【００２２】
本明細書において記載されるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖の長さは、独立して１７〜３０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、独立して１７〜２６ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、１９〜２６ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、記載されるＲＮＡｉ剤のセンス及びアンチセンス鎖は、独立して、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチドの長さである。センス鎖及びアンチセンス鎖は同じ長さまたは異なる長さのいずれかであり得る。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は各々２６ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、センス鎖は２３ヌクレオチドの長さであり、アンチセンス鎖は２１ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、センス鎖は２２ヌクレオチドの長さであり、アンチセンス鎖は２１ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、センス鎖は２１ヌクレオチドの長さであり、アンチセンス鎖は２１ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、センス鎖は１９ヌクレオチドの長さであり、アンチセンス鎖は２１ヌクレオチドの長さである。
【００２３】
センス鎖及び／またはアンチセンス鎖は、随意でそして独立して、３’末端、５’末端、またはコア配列の３’末端及び５’末端の両方で、追加の１、２、３、４、５または６ヌクレオチド（延長）を含有し得る。アンチセンス鎖追加ヌクレオチド（存在するならば）は、ＬＰＡ  ｍＲＮＡ中の対応する配列へ相補的または非相補的であり得る。センス鎖追加ヌクレオチド（存在するならば）は、ＬＰＡ  ｍＲＮＡ中の対応する配列に同一または非同一であり得る。アンチセンス鎖追加ヌクレオチド（存在するならば）は、対応するセンス鎖の追加ヌクレオチド（存在するならば）へ相補的または非相補的であり得る。
【００２４】
本明細書において使用される時、延長は、センス鎖コア配列及び／またはアンチセンス鎖コア配列の５’及び／または３’末端で、１、２、３、４、５または６ヌクレオチドを含む。センス鎖上の延長ヌクレオチドは、対応するアンチセンス鎖中のヌクレオチド（コア配列ヌクレオチドまたは延長ヌクレオチドのいずれか）へ相補的または非相補的であり得る。反対に、アンチセンス鎖上の延長ヌクレオチドは、対応するセンス鎖中のヌクレオチド（コア配列ヌクレオチドまたは延長ヌクレオチドのいずれか）へ相補的または非相補的であり得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、３’延長及び５’延長を含有する。いくつかの実施形態において、１つの鎖の３’延長ヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、他の鎖の１つまたは複数の５’延長ヌクレオチドと塩基対を作る。他の実施形態において、１つの鎖の３’延長ヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、他の鎖の１つまたは複数の５’延長ヌクレオチドと塩基対を作らない。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、３’延長を有するアンチセンス鎖及び５’延長を有するセンス鎖を有する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、１、２、３、４、５または６ヌクレオチドの長さの３’延長を有するアンチセンス鎖を含む。他の実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、１、２または３ヌクレオチドの長さの３’延長を有するアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の延長ヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、ウラシルヌクレオチドもしくはチミジンヌクレオチド、または対応するＬＰＡ  ｍＲＮＡへ相補的なヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、３’アンチセンス鎖の延長は、Ａｂ、ＡｂＡｂ、ＡＵＡ、ＵＧＣＵＵ、ＣＵＧ、ＵＧ、ＵＧＣＣ、ＣＵＧＣＣ、ＣＧＵ、ＣＵＵ、ＵＧＣＣＵＡ、ＣＵＧＣＣＵ、ＵＧＣＣＵ、ＵＧＡＵＵ、ＧＣＣＵＡＵ、Ｔ、ＴＴ（各々は５’から３’へリストされる）を含むかまたはそれらからなるがこれらに限定されない。
【００２６】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、１、２、３、４または５ヌクレオチドの長さの５’延長を有するアンチセンス鎖を含む。他の実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、１または２ヌクレオチドの長さの５’延長を有するアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の延長ヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、ウラシルヌクレオチドもしくはチミジンヌクレオチド、または対応するＬＰＡ  ｍＲＮＡへ相補的なヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、５’アンチセンス鎖の延長は、ＵＡ、ＴＵ、Ｕ、Ｔ、ＣＵＣ（各々は５’から３’へリストされる）を含むかまたはそれらからなるがこれらに限定されない。アンチセンス鎖は、記載される５’アンチセンス鎖延長のうちの任意のもの（存在するならば）と組み合わせて、上記の３’延長のうちの任意のものを有し得る。
【００２７】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、１、２、３、４または５ヌクレオチドの長さの３’延長を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、センス鎖の延長ヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、アデノシンヌクレオチド、ウラシルヌクレオチドもしくはチミジンヌクレオチド、ＡＴジヌクレオチド、またはＬＰＡ  ｍＲＮＡの配列中のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、３’アンチセンス鎖の延長は、Ｔ、ＵＵＡｂ、ＵＡｂ、Ａｂ、ＵＴ、ＴＴ、ＵＵＴ、ＴＴＴ、またはＴＴＴＴ（各々は５’から３’へリストされる）を含むかまたはそれらからなるがこれらに限定されない。
【００２８】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、１、２、３、４、５または６ヌクレオチドの長さの５’延長を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、センス鎖の延長ヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、ウラシルヌクレオチドもしくはアデノシンヌクレオチド、またはＬＰＡ  ｍＲＮＡの配列中のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、センス鎖の５’延長は、ＣＡ、ＡＵＡＧＧＣ、ＡＵＡＧＧ、ＡＵＡＧ、ＡＵＡ、Ａ、ＡＡ、ＡＣ、ＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＧＧＣ、ＵＡＵＣＡ、ＵＡＵＣ、Ａｂ、ＵＣＡ、ＵＡＵ（各々は５’から３’へリストされる）であり得るがこれらに限定されない。センス鎖は３’延長及び／または５’延長を有し得る。
【００２９】
ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の形成において使用されるヌクレオチド配列の例は、表１、２Ａ、２Ｂ、３Ａ及び３Ｂ中で提供される。本明細書において使用される時、「配列」または「ヌクレオチド配列」という用語は、標準的なヌクレオチド命名法及び本明細書において記載される修飾ヌクレオチドについての手引きを使用して、修飾または非修飾にかかわらず、文字の連続により記載される核酸塩基、ヌクレオチド及び／またはヌクレオシドの連続または順序を指す。
【００３０】
ＲＮＡｉ剤には、小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡｓ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びダイサー基質（例えば米国特許第８０８４５９９号、同第８３４９８０９号、及び同第８５１３２０７号）が含まれるがこれらに限定されない。
【００３１】
非修飾ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列は表１中で提供される。ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の形成において、表１中でリストされる配列の各々におけるヌクレオチドの各々は、修飾ヌクレオチドであり得る。
【表１−１】
2018529732.tif 000002
【表１−２】
2018529732.tif 000003
【表１−３】
2018529732.tif 000004
【表１−４】
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【表１−５】
2018529732.tif 000006
【表１−６】
2018529732.tif 000007
【００３２】
本明細書において記載されるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、センス鎖とアンチセンス鎖のアニールによって形成される。表１または表２Ｂ中でリストされる配列を含有するセンス鎖は、表１または表２Ａ中でリストされる配列を含有する任意のアンチセンス鎖にハイブリダイズされ得るが、但し、２つの配列は連続した１６、１７、１８、１９、２０または２１ヌクレオチド配列にわたって少なくとも９０％の相補性の領域を有する。
【００３３】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖は、表１中の配列のうちの任意のもののヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖は、表１中の配列のうちの任意のもののヌクレオチドの配列１〜１７、２〜１７、１〜１８、２〜１８、１〜１９、２〜１９、１〜２０、２〜２０、１〜２１、２〜２１、１〜２２、２〜２２、１〜２３、２〜２３、１〜２４、２〜２４、１〜２５、２〜２５、１〜２６、または２〜２６を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤センス鎖は、表１中の配列のうちの任意のもののヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤センス鎖は、表１中の配列のうちの任意のもののヌクレオチドの配列１〜１７、２〜１７、１〜１８、２〜１８、１〜１９、２〜１９、１〜２０、２〜２０、１〜２１、２〜２１、１〜２２、２〜２２、１〜２３、２〜２３、１〜２４、２〜２４、１〜２５、２〜２５、１〜２６、または２〜２６を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ数のヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、異なる数のヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の３’末端は平滑末端を形成する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の５’末端は平滑末端を形成する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤の両方の末端は平滑末端を形成する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のどちらの末端も平滑末端ではない。本明細書において使用される時、平滑末端は、２つのアニールされた鎖の端部のヌクレオチドが相補的である（相補的塩基対を形成する）二本鎖ＲＮＡｉ剤の末端を指す。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の３’末端はほつれた末端（ｆｒａｙｅｄ  ｅｎｄ）を形成する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の５’末端はほつれた末端を形成する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤の両方の末端はほつれた末端を形成する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のどちらの末端もほつれた末端ではない。本明細書において使用される時、ほつれた末端は、２つのアニールされた鎖の端部のヌクレオチドが対を形成する（すなわちオーバーハングを形成しない）が、相補的ではない（すなわち非相補的な対を形成する）二本鎖ＲＮＡｉ剤の末端を指す。本明細書において使用される時、オーバーハングは、二本鎖ＲＮＡｉ剤の１つの鎖の末端での１つまたは複数の非対合ヌクレオチドのストレッチである。非対合ヌクレオチドはセンス鎖またはアンチセンス鎖上にあり得、３’オーバーハングまたは５’オーバーハングのいずれかを生成する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、平滑末端及びほつれた末端、平滑末端及び５’オーバーハング末端、平滑末端及び３’オーバーハング末端、ほつれた末端及び５’オーバーハング末端、ほつれた末端及び３’オーバーハング末端、２つの５’オーバーハング末端、２つの３’オーバーハング末端、５’オーバーハング末端及び３’オーバーハング末端、ほつれた２つの末端、または２つの平滑末端を含有する。
【００３５】
ヌクレオチド塩基（または核酸塩基）はヘテロ環式のピリミジン化合物またはプリン化合物であり、すべての核酸の構成物であり、それらには、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）が含まれる。本明細書において使用される時、「ヌクレオチド」という用語には、修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド模倣体、脱塩基部位（ＡｂまたはＸ）、または代替置換部分（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｍｏｉｅｔｙ）が含まれ得る。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、塩、混合塩、または遊離酸として調製または提供される。
【００３６】
修飾ヌクレオチド
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含有する。本明細書において使用される時、「修飾ヌクレオチド」は、リボヌクレオチド（２’−ヒドロキシルヌクレオチド）以外のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドのうちの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％が修飾される。修飾ヌクレオチドには、デオキシヌクレオチド、ヌクレオチド模倣体、脱塩基ヌクレオチド（Ｘ、Ａｂとして本明細書において表わされる）、２’修飾ヌクレオチド、３’−３’リンケージ（反転（ｉｎｖｅｒｔｅｄ））ヌクレオチド（ｉｎｖｄＮ、ｉｎｖＮ、ｉｎｖｎ、ｉｎｖＸ、ｉｎｖＡｂとして本明細書において表わされる）、非天然塩基を含むヌクレオチド、架橋されたヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、２’，３’−セコヌクレオチド模倣体（ロックされていない核酸塩基類似体、ＮＵＮＡまたはＮＵＮＡとして本明細書において表わされる）、ロックされたヌクレオチド（ＮＬＮＡまたはＮＬＮＡとして本明細書において表わされる）、３’−Ｏ−メトキシ（２’ヌクレオシド間連結された）ヌクレオチド（３’−ＯＭｅｎとして本明細書において表わされる）、２’−Ｆ−アラビノヌクレオチド（ＮｆＡＮＡまたはＮｆＡＮＡとして本明細書において表わされる）、５’−Ｍｅ，２’−フルオロヌクレオチド（５Ｍｅ−Ｎｆとして本明細書において表わされる）、モルホリノヌクレオチド、ビニルホスホネートデオキシリボヌクレオチド（ｖｐｄＮとして本明細書において表わされる）、ビニルホスホネート含有ヌクレオチド、及びシクロプロピルホスホネート含有ヌクレオチド（ｃＰｒｐＮ）が含まれるがこれらに限定されない。２’修飾ヌクレオチド（すなわち５員糖環の２’位でヒドロキシル基以外の基を備えたヌクレオチド）には、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（ヌクレオチド配列中の小文字「ｎ」として本明細書において表わされる）、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド（Ｎｆとして本明細書において表わされ、２’−フルオロヌクレオチドとしても本明細書において表わされる）、２’−デオキシヌクレオチド（ｄＮとして本明細書において表わされる）、２’−メトキシエチル（２’−Ｏ−２−メトキシルエチル）ヌクレオチド（ＮＭまたは２’−ＭＯＥとして本明細書において表わされる）、２’−アミノヌクレオチド、及び２’−アルキルヌクレオチドが含まれるがこれらに限定されない。所与の化合物中のすべての位置が修飾される必要はない。反対に、２つ以上の修飾は、単一のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤中に、またはその単一のヌクレオチド中にさえ取り込まれ得る。ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、当技術分野において公知の方法によって合成及び／または修飾され得る。１つのヌクレオチドでの修飾は別のヌクレオチドでの修飾に非依存的である。
【００３７】
修飾ヌクレオチドには、修飾核酸塩基を有するヌクレオチドも含まれ得る。修飾核酸塩基には、合成核酸塩基及び天然核酸塩基、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、及びＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンが含まれる）、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシン、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル誘導体及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル誘導体及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及び５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン及び６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換のアデニン及びグアニン、５−ハロ（特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル）及び他の５−置換のウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン及び３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンが含まれるがこれらに限定されない。
【００３８】
修飾ヌクレオシド間リンケージ
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の１つまたは複数ヌクレオチドは、非標準的なリンケージまたは骨格（すなわち修飾ヌクレオシド間リンケージまたは修飾骨格）によって連結される。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオシド間リンケージは、非ホスフェート含有共有結合のヌクレオシド間リンケージである。修飾ヌクレオシド間リンケージまたは修飾ヌクレオシド間骨格には、５’−ホスホロチオエート基（ｓＮ、ｓｎ、ｓＮｆまたはｓｄＮでのように、ヌクレオチドの前の小文字「ｓ」として本明細書において表わされる）、キラルホスホロチオエート、チオホスフェート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキル−ホスホトリエステル、メチルホスホネート及び他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートが含まれる）、ホスフィネート、ホスホロアミダート（３’−アミノホスホロアミダート及びアミノアルキルホスホロアミダートが含まれる）、チオノホスホロアミダート、チオノアルキル−ホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、モルホリノリンケージ、及び正常な３’−５’リンケージを有するボラノホスフェート、２’−５’連結されたこれらの類似体、及び隣接するペアのヌクレオシド単位が３’−５’から５’−３’へまたは２’−５’から５’−２’へ連結された反転極性を有するものが含まれるがこれらに限定されない。他の実施形態において、修飾ヌクレオシド間リンケージまたは修飾ヌクレオシド間骨格は、リン原子を欠損する。リン原子を欠損する修飾ヌクレオシド間リンケージには、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルの糖間リンケージ、混合ヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルの糖間リンケージ、または１つもしくは複数の短鎖のヘテロ原子もしくはヘテロ環式の糖間リンケージが含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオシド間骨格には、シロキサン骨格、スルフィド骨格、スルホキシド骨格及びスルホン骨格；ホルムアセチル（ｆｏｒｍａｃｅｔｙｌ）骨格及びチオホルムアセチル（ｔｈｉｏｆｏｒｍａｃｅｔｙｌ）骨格、メチレン基を含むホルムアセチル骨格及びチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファミン酸塩骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート骨格及びスルホンアミド骨格、アミド骨格；及び混合されたＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成要素部分を有する他のものが含まれるがこれらに限定されない。
【００３９】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は１、２、３、４のホスホロチオエートリンケージを含有することができるか、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は１、２、３、もしくは４のホスホロチオエートリンケージを含有することができるか、またはセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は独立して１、２、３もしくは４のホスホロチオエートリンケージを含有することができる。
【００４０】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、２つのホスホロチオエートヌクレオシド間リンケージを含有する。いくつかの実施形態において、２つのホスホロチオエートヌクレオシド間リンケージは、センス鎖の３’末端からの位置１〜３のヌクレオチドの間である。いくつかの実施形態において、２つのホスホロチオエートヌクレオシド間リンケージは、センス鎖の５’末端からの位置１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、４〜５、または６〜８のヌクレオチドの間である。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、４つのホスホロチオエートヌクレオシド間リンケージを含有する。いくつかの実施形態において、４つのホスホロチオエートヌクレオシド間リンケージは、センス鎖の５’末端からの位置１〜３のヌクレオチドの間であり、５’末端からの位置１９〜２１、２０〜２２、２１〜２３、２２〜２４、２３〜２５、または２４〜２６のヌクレオチドの間である。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、センス鎖中に２つのホスホロチオエートヌクレオシド間リンケージ及びアンチセンス鎖中に４つのホスホロチオエートヌクレオシド間リンケージを含有する。
【００４１】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチド及び１つまたは複数の修飾ヌクレオシド間リンケージを含有する。いくつかの実施形態において、２’−修飾ヌクレオチドは修飾ヌクレオシド間リンケージと組み合わせられる。
【００４２】
修飾ヌクレオチドを有するＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤
修飾ヌクレオチドを含有するアンチセンス鎖の例を表２Ａ中で提供する。修飾ヌクレオチドを含有するセンス鎖の例を表２Ｂ中で提供する。表２Ａ及び２Ｂ中で、以下の表記を使用して修飾ヌクレオチドを指示する。
Ｎ＝２’−ＯＨ（非修飾）リボヌクレオチド（ｆまたはｄの指示なしの大文字）
ｎ＝２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド
Ｎｆ＝２’−フルオロ修飾ヌクレオチド
ｄＮ＝２’−デオキシヌクレオチド
ＮＵＮＡ＝２’，３’−セコヌクレオチド模倣体（ロックされていない核酸塩基類似体）
ＮＬＮＡ＝ロックされたヌクレオチド
ＮｆＡＮＡ＝２’−Ｆ−アラビノヌクレオチド
ＮＭ＝２’−メトキシエチルヌクレオチド
Ａｂ＝脱塩基リボース
（ｉｎｖｄＮ）＝反転デオキシリボヌクレオチド（３’−３’連結されたヌクレオチド）
（ｉｎｖＡｂ）＝反転脱塩基ヌクレオチド
（ｉｎｖｎ）＝反転２’−ＯＭｅヌクレオチド
ｓ＝ホスホロチオエート連結ヌクレオチド
ｐ＝ホスフェート
ｖｐｄＮ＝ビニルホスホネートデオキシリボヌクレオチド
（３’ＯＭｅｎ）＝３’−ＯＭｅヌクレオチド
（５Ｍｅ−Ｎｆ）＝５’−Ｍｅ，２’−フルオロヌクレオチド
ｃＰｒｐ＝シクロプロピルホスホネート
ｅｐＴｃＰｒ＝表４を参照
ｅｐＴＭ＝表４を参照。
【００４３】
加えて、以下の標的基及び連結基：（Ａｌｋ−ＰＥＧ５−Ｃ６）、（Ｃ１１−ＰＥＧ３−ＮＡＧ３）、（Ｃ１２）、（Ｃ６−ＰＥＧ４−ＮＡＧ３）、（Ｃ６−ＳＳ−Ａｌｋ−Ｍｅ）、（Ｃｈｏｌ−ＴＥＧ）、（Ｄｙ５４０）、（ＮＡＧ１３）、（ＮＡＧ１８）、（ＮＡＧ２４）、（ＮＡＧ２５）、（ＮＡＧ２６）、（ＮＡＧ２７）、（ＮＡＧ２８）、（ＮＡＧ２９）、（ＮＡＧ３０）、（ＮＡＧ３１）、（ＮＡＧ３２）、（ＮＡＧ３３）、（ＮＡＧ３４）、（ＮＡＧ３５）（ＮＡＧ３６）、（ＮＡＧ３７）、（ＮＡＧ４）、（ＰＡＺ）、（Ｓｐ１８）、（ステリル）、（Ａｌｋ−ＳＭＰＴ−Ｃ６）が、表２Ａ及び２Ｂ中でリストされる。各々のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖は、配列の５’末端及び／または３’末端へコンジュゲートされた、上で指示される標的基または連結基のうちの任意のものに加えて、他の標的基または連結基を有し得る。これらの基についての化学構造を表４中で提供する。
【表２Ａ−１】
2018529732.tif 000008
【表２Ａ−２】
2018529732.tif 000009
【表２Ａ−３】
2018529732.tif 000010
【表２Ａ−４】
2018529732.tif 000011
【表２Ａ−５】
2018529732.tif 000012
【表２Ａ−６】
2018529732.tif 000013
【表２Ａ−７】
2018529732.tif 000014
【表２Ａ−８】
2018529732.tif 000015
【表２Ａ−９】
2018529732.tif 000016
【表２Ａ−１０】
2018529732.tif 000017
【表２Ａ−１１】
2018529732.tif 000018
【表２Ａ−１２】
2018529732.tif 000019
【表２Ａ−１３】
2018529732.tif 000020
【表２Ａ−１４】
2018529732.tif 000021
【表２Ａ−１５】
2018529732.tif 000022
【表２Ａ−１６】
2018529732.tif 000023
【表２Ａ−１７】
2018529732.tif 000024
【表２Ａ−１８】
2018529732.tif 000025
【表２Ａ−１９】
2018529732.tif 000026
【表２Ａ−２０】
2018529732.tif 000027
【表２Ｂ−１】
2018529732.tif 000028
【表２Ｂ−２】
2018529732.tif 000029
【表２Ｂ−３】
2018529732.tif 000030
【表２Ｂ−４】
2018529732.tif 000031
【表２Ｂ−５】
2018529732.tif 000032
【表２Ｂ−６】
2018529732.tif 000033
【表２Ｂ−７】
2018529732.tif 000034
【表２Ｂ−８】
2018529732.tif 000035
【表２Ｂ−９】
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【表２Ｂ−１０】
2018529732.tif 000037
【表２Ｂ−１１】
2018529732.tif 000038
【表２Ｂ−１２】
2018529732.tif 000039
【表２Ｂ−１３】
2018529732.tif 000040
【表２Ｂ−１４】
2018529732.tif 000041
【表２Ｂ−１５】
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【表２Ｂ−１６】
2018529732.tif 000043
【表２Ｂ−１７】
2018529732.tif 000044
【００４４】
表２Ｂ中でリストされる配列を含有するセンス鎖は、表２Ａ中でリストされる配列を含有する任意のアンチセンス鎖にハイブリダイズされ得るが、但し、２つの配列は連続した１６、１７、１８、１９、２０または２１ヌクレオチド配列にわたって少なくとも９０％の相補性の領域を有する。代表的なＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、表３Ａ及び３Ｂ中で示される二重鎖識別番号によって表わされる。
【００４５】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は本明細書において提示される二重鎖識別番号のうちの任意のものから構成される。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は本明細書において提示される二重鎖識別番号のうちの任意のものからなる。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、本明細書において提示される二重鎖識別番号のうちの任意のセンス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、本明細書において提示される二重鎖識別番号のうちの任意のセンス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチド配列、ならびに標的基及び／または連結基を含み、そこで、標的基及び／または連結基はセンス鎖またはアンチセンス鎖へ共有結合で連結される（すなわちコンジュゲートされる）。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、本明細書において提示される二重鎖識別番号のうちの任意のセンス鎖及びアンチセンス鎖の修飾ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、本明細書において提示される二重鎖識別番号のうちの任意のセンス鎖及びアンチセンス鎖の修飾ヌクレオチド配列、ならびに標的基及び／または連結基を含み、そこで、標的基及び／または連結基はセンス鎖またはアンチセンス鎖へ共有結合で連結される。
【表３Ａ−１】
2018529732.tif 000045
【表３Ａ−２】
2018529732.tif 000046
【表３Ａ−３】
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【表３Ａ−４】
2018529732.tif 000048
【表３Ａ−５】
2018529732.tif 000049
【表３Ａ−６】
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【表３Ａ−７】
2018529732.tif 000051
【表３Ａ−８】
2018529732.tif 000052
【表３Ａ−９】
2018529732.tif 000053
【表３Ａ−１０】
2018529732.tif 000054
【表３Ａ−１１】
2018529732.tif 000055
【表３Ａ−１２】
2018529732.tif 000056
【表３Ａ−１３】
2018529732.tif 000057
【表３Ａ−１４】
2018529732.tif 000058
【表３Ａ−１５】
2018529732.tif 000059
【表３Ａ−１６】
2018529732.tif 000060
【表３Ａ−１７】
2018529732.tif 000061
【表３Ａ−１８】
2018529732.tif 000062
【表３Ａ−１９】
2018529732.tif 000063
【表３Ａ−２０】
2018529732.tif 000064
【表３Ａ−２１】
2018529732.tif 000065
【表３Ａ−２２】
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【表３Ａ−２３】
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【表３Ａ−２４】
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【表３Ｂ−１】
2018529732.tif 000069
【表３Ｂ−２】
2018529732.tif 000070
【表３Ｂ−３】
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【表３Ｂ−４】
2018529732.tif 000072
【表３Ｂ−５】
2018529732.tif 000073
【表３Ｂ−６】
2018529732.tif 000074
【表３Ｂ−７】
2018529732.tif 000075
【表３Ｂ−８】
2018529732.tif 000076
【表３Ｂ−９】
2018529732.tif 000077
【００４６】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２４２（ＴＣＧＵＡＵＡＡＣＡＡＵＡＡＧＧＧＧＣ）のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２４４（ＵＣＧＵＡＵＡＡＣＡＡＵＡＡＧＧＧＧ）のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２４６（ＵＣＧＵＡＵＡＡＣＡＡＵＡＡＧＧＧ）のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２４８（ＴＧＡＧＡＡＵＧＡＧＣＣＵＣＧＡＵＡＡ）のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２５０（ＵＧＡＧＡＡＵＧＡＧＣＣＵＣＧＡＵＡ）のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２５２（ＵＧＡＧＡＡＵＧＡＧＣＣＵＣＧＡＵ）のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２５４（ＵＧＵＡＵＡＡＣＡＡＵＡＡＧＧＧＧ）のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２８０（ＣＧＵＡＵＡＡＣＡＡＵＡＡＧＧＧＧＣ）のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２８１（ＧＡＧＡＡＵＧＡＧＣＣＵＣＧＡＵＡＡ）のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２８２（ＵＣＧＵＡＵＡＡＣＡＡＵＡＡＧＧＧＧＣ）のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２８３（ＵＧＡＧＡＡＵＧＡＧＣＣＵＣＧＡＵＡＡ）のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドのうちの１つまたは複数は修飾される。
【００４７】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２４３（ＧＣＣＣＣＵＵＡＵＵＧＵＵＡＵＡＣＧＡ）のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２４５（ＣＣＣＣＵＵＡＵＵＧＵＵＡＵＡＣＧＡ）のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２４７（ＣＣＣＵＵＡＵＵＧＵＵＡＵＡＣＧＡ）のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２４９（ＵＵＡＵＣＧＡＧＧＣＵＣＡＵＵＣＵＣＡ）のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２５１（ＵＡＵＣＧＡＧＧＣＵＣＡＵＵＣＵＣＡ）のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２５３（ＡＵＣＧＡＧＧＣＵＣＡＵＵＣＵＣＡ）のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２５５（ＣＣＣＣＵＵＡＵＵＧＵＵＡＵＡＣＡ）のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含む。ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２８４（ＧＣＣＣＣＵＵＡＵＵＧＵＵＡＵＡＣＧ）のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２８５（ＵＵＡＵＣＧＡＧＧＣＵＣＡＵＵＣＵＣ）のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドのうちの１つまたは複数は修飾される。
【００４８】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２４２のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖及び配列番号：１２４３のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２４４のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖及び配列番号：１２４５のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２４６のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖及び配列番号：１２４７のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２４８のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖及び配列番号：１２４９のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２５０のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖及び配列番号：１２５１のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２５２のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖及び配列番号：１２５３のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２５４のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖及び配列番号：１２５５のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２８０のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖及び配列番号：１２８４のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２８１のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖及び配列番号：１２８５のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２８２のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖及び配列番号：１２５９のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１２８３のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖及び配列番号：１２４９のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドのうちの１つまたは複数は修飾される。
【００４９】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１５６、１６４または１８８のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：３１０、３５７、３８４または３７６のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１５６／３１０、配列番号：１６４／３５７、配列番号：１８８／３８４、配列番号：１６４／３７６、または配列番号：１６４／３８４のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドのうちの１つまたは複数は修飾される。
【００５０】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：６３７、７０９、７９０、７８７または７８８のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１１３２、１１３５、１１８９、１１９１または１１８６のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：６３７／１１３２、配列番号：７０９／１１３５、配列番号：７９０／１１８９、配列番号：７８７／１１９１、または配列番号：７８８／１１８６のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む。
【００５１】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：６３７、７０９、７９０、７８７または７８８を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１１３２、１１３５、１１８９、１１９１または１１８６を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：６３７／１１３２、配列番号：７０９／１１３５、配列番号：７９０／１１８９、配列番号：７８７／１１９１、または配列番号：７８８／１１８６を含む。
【００５２】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：６３７、７０９、７９０、７８７または７８８からなる。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：１１３２、１１３５、１１８９、１１９１または１１８６からなる。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、配列番号：６３７／１１３２、配列番号：７０９／１１３５、配列番号：７９０／１１８９、配列番号：７８７／１１９１、または配列番号：７８８／１１８６からなる。
【００５３】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、表３Ａまたは３Ｂのアンチセンス鎖／センス鎖の二重鎖のうちの任意のもののヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、表３Ａまたは３Ｂのアンチセンス鎖／センス鎖の二重鎖のうちの任意のもののヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、アシアロ糖タンパク質受容体リガンド標的基をさらに含む。
【００５５】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、表３Ａまたは３Ｂのアンチセンス鎖／センス鎖の二重鎖のうちの任意のもののヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、（Ｃ１１−ＰＥＧ３−ＮＡＧ３）、（Ｃ１１−ＰＥＧ３−ＮＡＧ３）、（Ｃ６−ＰＥＧ４−ＮＡＧ３）、（ＮＡＧ３）、（ＮＡＧ４）、（ＮＡＧ３−ＡＡ２）、（ＮＡＧ３−Ｐａｌｍ）、（ＮＡＧ１３）、（ＮＡＧ１８）、（ＮＡＧ２４）、（ＮＡＧ２５）、（ＮＡＧ２５）ｓ、（ＮＡＧ２６）、（ＮＡＧ２７）、（ＮＡＧ２８）、（ＮＡＧ２９）、（ＮＡＧ３０）、（ＮＡＧ３０）ｓ、（ＮＡＧ３１）、（ＮＡＧ１３）、（ＮＡＧ３１ｓ）、（ＮＡＧ３２）、（ＮＡＧ３３）、（ＮＡＧ３４）、（ＮＡＧ３５）、（ＮＡＧ３６）、及び（ＮＡＧ３７）からなる群から選択される標的基をさらに含む。
【００５６】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、表３Ａまたは３Ｂのアンチセンス鎖／センス鎖の二重鎖のうちの任意のものの修飾ヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、表３Ａまたは３Ｂのアンチセンス鎖／センス鎖の二重鎖のうちの任意のものの修飾ヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、アシアロ糖タンパク質受容体リガンド標的基をさらに含む。
【００５８】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、表３Ａまたは３Ｂのアンチセンス鎖／センス鎖の二重鎖のうちの任意のものの修飾ヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、（Ｃ１１−ＰＥＧ３−ＮＡＧ３）、（Ｃ１１−ＰＥＧ３−ＮＡＧ３）、（Ｃ６−ＰＥＧ４−ＮＡＧ３）、（ＮＡＧ３）、（ＮＡＧ４）、（ＮＡＧ３−ＡＡ２）、（ＮＡＧ３−Ｐａｌｍ）、（ＮＡＧ１３）、（ＮＡＧ１８）、（ＮＡＧ２４）、（ＮＡＧ２５）、（ＮＡＧ２５）ｓ、（ＮＡＧ２６）、（ＮＡＧ２７）、（ＮＡＧ２８）、（ＮＡＧ２９）、（ＮＡＧ３０）、（ＮＡＧ３０）ｓ、（ＮＡＧ３１）、（ＮＡＧ１３）、（ＮＡＧ３１ｓ）、（ＮＡＧ３２）、（ＮＡＧ３３）、（ＮＡＧ３４）、（ＮＡＧ３５）、（ＮＡＧ３６）、及び（ＮＡＧ３７）からなる群から選択される標的基をさらに含む。
【００５９】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、表３Ａまたは３Ｂの二重鎖のうちの任意のものを含む。
【００６０】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、表３Ａまたは３Ｂの二重鎖のうちの任意のものからなる。
【００６１】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列ＡＤ０３４６０、ＡＤ０３５３６、ＡＤ０３５８１、ＡＤ０３５８３、ＡＤ３８４７、またはＡＤ０４１１０を有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む。
【００６２】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列ＡＤ０３４６０、ＡＤ０３５３６、ＡＤ０３５８１、ＡＤ０３５８３、ＡＤ３８４７、またはＡＤ０４１１０を有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、アシアロ糖タンパク質受容体リガンド標的基をさらに含む。
【００６３】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列ＡＤ０３４６０、ＡＤ０３５３６、ＡＤ０３５８１、ＡＤ０３５８３、ＡＤ３８４７、またはＡＤ０４１１０を有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、（Ｃ１１−ＰＥＧ３−ＮＡＧ３）、（Ｃ１１−ＰＥＧ３−ＮＡＧ３）、（Ｃ６−ＰＥＧ４−ＮＡＧ３）、（ＮＡＧ３）、（ＮＡＧ４）、（ＮＡＧ３−ＡＡ２）、（ＮＡＧ３−Ｐａｌｍ）、（ＮＡＧ１３）、（ＮＡＧ１８）、（ＮＡＧ２４）、（ＮＡＧ２５）、（ＮＡＧ２５）ｓ、（ＮＡＧ２６）、（ＮＡＧ２７）、（ＮＡＧ２８）、（ＮＡＧ２９）、（ＮＡＧ３０）、（ＮＡＧ３０）ｓ、（ＮＡＧ３１）、（ＮＡＧ１３）、（ＮＡＧ３１ｓ）、（ＮＡＧ３２）、（ＮＡＧ３３）、（ＮＡＧ３４）、（ＮＡＧ３５）、（ＮＡＧ３６）、及び（ＮＡＧ３７）からなる群から選択される標的基をさらに含む。
【００６４】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、修飾ヌクレオチド配列ＡＤ０３４６０、ＡＤ０３５３６、ＡＤ０３５８１、ＡＤ０３５８３、ＡＤ３８４７、またはＡＤ０４１１０を有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、修飾ヌクレオチド配列ＡＤ０３４６０、ＡＤ０３５３６、ＡＤ０３５８１、ＡＤ０３５８３、ＡＤ３８４７、またはＡＤ０４１１０を有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、アシアロ糖タンパク質受容体リガンド標的基をさらに含む。
【００６６】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、修飾ヌクレオチド配列ＡＤ０３４６０、ＡＤ０３５３６、ＡＤ０３５８１、ＡＤ０３５８３、ＡＤ３８４７、またはＡＤ０４１１０を有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、（Ｃ１１−ＰＥＧ３−ＮＡＧ３）、（Ｃ１１−ＰＥＧ３−ＮＡＧ３）、（Ｃ６−ＰＥＧ４−ＮＡＧ３）、（ＮＡＧ３）、（ＮＡＧ４）、（ＮＡＧ３−ＡＡ２）、（ＮＡＧ３−Ｐａｌｍ）、（ＮＡＧ１３）、（ＮＡＧ１８）、（ＮＡＧ２４）、（ＮＡＧ２５）、（ＮＡＧ２５）ｓ、（ＮＡＧ２６）、（ＮＡＧ２７）、（ＮＡＧ２８）、（ＮＡＧ２９）、（ＮＡＧ３０）、（ＮＡＧ３０）ｓ、（ＮＡＧ３１）、（ＮＡＧ１３）、（ＮＡＧ３１ｓ）、（ＮＡＧ３２）、（ＮＡＧ３３）、（ＮＡＧ３４）、（ＮＡＧ３５）、（ＮＡＧ３６）、及び（ＮＡＧ３７）からなる群から選択される標的基をさらに含む。
【００６７】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、ＡＤ０３４６０、ＡＤ０３５３６、ＡＤ０３５８１、ＡＤ０３５８３、ＡＤ３８４７、またはＡＤ０４１１０を含む。
【００６８】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、ＡＤ０３４６０、ＡＤ０３５３６、ＡＤ０３５８１、ＡＤ０３５８３、ＡＤ３８４７、またはＡＤ０４１１０からなる。
【００６９】
非ヌクレオチド基
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、１つまたは複数の非ヌクレオチド基（標的基、連結基、送達ポリマー、または送達ベヒクルが含まれるがこれらに限定されない）を含有するか、またはそれらへコンジュゲートされる。非ヌクレオチド基は、ＲＮＡｉ剤の標的化、送達または付加を促進することができる。標的基及び連結基の例を表４中で提供する。非ヌクレオチド基は、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖のいずれかの３’末端及び／または５’末端へ共有結合で連結され得る。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の３’末端及び／または５’末端へ連結された非ヌクレオチド基を含有する。いくつかの実施形態において、非ヌクレオチド基は、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端へ連結される。非ヌクレオチド基は、リンカー／連結基によってＲＮＡｉ剤へ直接的にまたは間接的に連結され得る。いくつかの実施形態において、非ヌクレオチド基は、不安定であるか、切断可能であるか、または可逆的である結合またはリンカーによってＲＮＡｉ剤へ連結される。
【００７０】
いくつかの実施形態において、非ヌクレオチド基は、それが付加されているＲＮＡｉ剤またはコンジュゲートの薬物動態特性または生体内分布特性を促進して、コンジュゲートの細胞特異的または組織特異的な分布及び細胞特異的な取込みを改善する。いくつかの実施形態において、非ヌクレオチド基は、ＲＮＡｉ剤のエンドサイトーシスを促進する。
【００７１】
標的基
標的基は、一価、二価、三価、四価、またはより高い原子価を有する。代表的な標的基には、細胞表面分子への親和性を備えた化合物、細胞受容体リガンド、ハプテン、抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、及び細胞表面分子への親和性を備えた抗体模倣体が、限定されずに含まれる。いくつかの実施形態において、標的基は、リンカー（ＰＥＧリンカー等）または１、２もしくは３の脱塩基基及び／もしくはリビトール基を使用して、ＲＮＡｉ剤へ連結される。いくつかの実施形態において、標的基はガラクトースクラスターを含む。
【００７２】
本明細書において記載されるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、５’末端での反応基（アミン基等）を有して合成され得る。反応基は、続いて当技術分野において典型的な方法を使用して標的部分を付加するために使用され得る。
【００７３】
いくつかの実施形態において、標的基はアシアロ糖タンパク質受容体リガンドを含む。いくつかの実施形態において、アシアロ糖タンパク質受容体リガンドは、１つまたは複数のガラクトース誘導体またはガラクトースクラスターを含むかまたはそれらからなる。本明細書において使用される時、ガラクトース誘導体という用語には、ガラクトース、及びガラクトースの親和性以上のアシアロ糖タンパク質受容体についての親和性を有するガラクトースの誘導体の両方が含まれる。ガラクトース誘導体には、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−ホルミルガラクトサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−プロピオニル−ガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブタノイル−ガラクトサミン、及びＮ−イソ−ブタノイルガラクトス−アミンが含まれるがこれらに限定されない（例えばＩｏｂｓｔ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｋ．Ｊ．Ｂ．Ｃ．１９９６，２７１，６６８６を参照）。オリゴヌクレオチド及び他の分子の肝臓へのインビボの標的化のために有用なガラクトース誘導体及びガラクトースクラスターは、当技術分野において公知である（例えばＢａｅｎｚｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｔｅ，１９８０，Ｃｅｌｌ，２２，６１１−６２０；Ｃｏｎｎｏｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７，９３９−９４５を参照）。ガラクトース誘導体を使用して、それらが肝細胞の表面上で発現されたアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）へ結合することを介して、分子を肝細胞へインビボで標的化してきた。ＡＳＧＰｒ（複数可）へのＡＳＧＰｒリガンドの結合は、肝細胞への細胞特異的標的化、及び肝細胞の中への分子のエンドサイトーシスを促進する。ガラクトースクラスターは、当技術分野において公知の方法を使用して、ＲＮＡｉポリヌクレオチドの３’末端または５’末端へ付加され得る。
【００７４】
本明細書において使用される時、ガラクトースクラスターは、２〜４の端部のガラクトース誘導体を有する分子を含む。端部のガラクトース誘導体は、そのＣ−１炭素を介して分子へ付加される。いくつかの実施形態において、ガラクトースクラスターは、ガラクトース誘導体三量体、三分枝ガラクトース誘導体、または三価ガラクトース誘導体である。いくつかの実施形態において、ガラクトースクラスターは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む。いくつかの実施形態において、ガラクトースクラスターは三価Ｎ−アセチル−ガラクトサミンを含む。いくつかの実施形態において、ガラクトースクラスターは、ガラクトース誘導体四量体、四分枝ガラクトース誘導体、または四価ガラクトース誘導体である。いくつかの実施形態において、ガラクトースクラスターは四価Ｎ‐アセチル−ガラクトサミンを含む。
【００７５】
本明細書において使用される時、ガラクトース三量体は３つのガラクトース誘導体を含有し、各々は中央の分岐点へ連結される。本明細書において使用される時、ガラクトース誘導体四量体は４つのガラクトース誘導体を含有し、各々は中央の分岐点へ連結される。ガラクトース誘導体は、サッカライドのＣ−１炭素を介して中央の分岐点へ付加され得る。いくつかの実施形態において、ガラクトース誘導体はリンカーまたはスペーサーによって分岐点へ連結される。いくつかの実施形態において、リンカーまたはスペーサーは柔軟な親水性スペーサー（ＰＥＧ基等）である（例えば米国特許第５８８５９６８号；Ｂｉｅｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９５  Ｖｏｌ．３９  ｐ．１５３８−１５４６を参照）。いくつかの実施形態において、ＰＥＧスペーサーはＰＥＧ３スペーサーである。分岐点は３つのガラクトース誘導体の付加を許容し、ＲＮＡｉ剤への分岐点の付加をさらに許容する任意の小分子であり得る。分岐点基の例は、ジ−リジンまたはジ−グルタメートである。ＲＮＡｉ剤への分岐点の付加は、リンカーまたはスペーサーを介して起こり得る。いくつかの実施形態において、リンカーまたはスペーサーは、柔軟な親水性スペーサー（ＰＥＧスペーサー等であるがこれに限定されない）を含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧスペーサーは、ＰＥＧ３スペーサー（３つのエチレン単位）である。他の実施形態において、ＰＥＧスペーサーは１〜２０のエチレン単位（ＰＥＧ１〜ＰＥＧ２０）を有する。いくつかの実施形態において、ガラクトース誘導体はＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃまたはＮＡＧ）を含む。いくつかの実施形態において、ガラクトースクラスターはガラクトース誘導体四量体から構成され、それは例えばＮ−アセチル−ガラクトサミン四量体であり得る。
【００７６】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を肝細胞へインビボで送達するための医薬組成物が記載される。かかる医薬組成物は、例えば、ガラクトースクラスターへコンジュゲートされるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を含み得る。いくつかの実施形態において、ガラクトースクラスターは、ガラクトース誘導体三量体（それは例えばＮ−アセチル−ガラクトサミン三量体であり得る）、またはガラクトース誘導体四量体（それは例えばＮ−アセチル−ガラクトサミン四量体であり得る）から構成される。標的基には、（Ｃｈｏｌ−ＴＥＧ）、（ＴＥＧ−Ｃｈｏｌ）、（Ｃ１１−ＰＥＧ３−ＮＡＧ３）、（Ｃｍ−ＰＥＧｎ−ＮＡＧ３）、（Ｃｘ−ＰＥＧｚ−ＮＡＧ３）、（ＮＡＧ３）、（ＮＡＧ４）、（ＮＡＧ３−ＡＡ２）、（ＮＡＧ３−Ｐａｌｍ）、（ＮＡＧ１３）、（ＮＡＧ１８）、（ＮＡＧ２４）、（ＮＡＧ２５）、（ＮＡＧ２５）ｓ、（ＮＡＧ２６）、（ＮＡＧ２７）、（ＮＡＧ２８）、（ＮＡＧ２９）、（ＮＡＧ３０）、（ＮＡＧ３０）ｓ、（ＮＡＧ３１）、（ＮＡＧ１３）、（ＮＡＧ３１ｓ）、（ＮＡＧ３２）、（ＮＡＧ３３）、（ＮＡＧ３４）、（ＮＡＧ３５）、（ＮＡＧ３６）、及び（ＮＡＧ３７）が含まれるがこれらに限定されない。
【００７７】
連結基
いくつかの実施形態において、連結基はＲＮＡｉ剤へコンジュゲートされる。連結基は、標的基または送達ポリマーまたは送達ベヒクルへの薬剤の共有結合を促進する。連結基は、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖の３’末端または５’末端へ連結され得る。いくつかの実施形態において、連結基はＲＮＡｉ剤センス鎖へ連結される。いくつかの実施形態において、連結基は、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端または３’末端へコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、連結基は、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端へコンジュゲートされる。連結基の例には、Ａｌｋ−ＳＭＰＴ−Ｃ６、Ａｌｋ−ＳＳ−Ｃ６、ＤＢＣＯ−ＴＥＧ、Ｍｅ−Ａｌｋ−ＳＳ−Ｃ６、及びＣ６−ＳＳ−Ａｌｋ−Ｍｅ、反応基（第一級アミン及びアルキン等）、アルキル基、脱塩基リボース、リビトール、及び／またはＰＥＧ基が含まれるがこれらに限定されない。
【００７８】
リンカーまたは連結基は、対象となる１つの化学基（ＲＮＡｉ剤等）またはセグメントを、１つまたは複数の共有結合によって対象となる別の化学基（標的基または送達ポリマー等）またはセグメントへ連結する、２つの原子の間の接続である。不安定なリンケージは不安定な結合を含有する。リンケージは、２つの繋がれた原子の間の距離を増加させるスペーサーを随意で含み得る。スペーサーは、柔軟性及び／または長さをリンケージへさらに加え得る。スペーサーには、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、及びアラルキニル基が含まれ得るがこれらに限定されず；その各々は、１つまたは複数のヘテロ原子、ヘテロ環、アミノ酸、ヌクレオチド、及びサッカライドを含有することができる。スペーサー基は当技術分野において周知であり、先行するリストは、記載の範囲を限定することを意味しない。
【００７９】
連結基には、アルキル、ＰＥＧ、（Ｃ６−ＰＥＧｎ−Ａｌｋ）、（Ｃｎ−ＳＭＰＴ−Ａｌｋ）、及び（Ｃｎ−ＳＳ−Ａｌｋ−Ｍｅ）が含まれるがこれらに限定されない。
【００８０】
３’もしくは５’の標的基もしくは連結基を含有する表２Ａ及び２Ｂ中でリストされるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のうちの任意のものは、あるいは、３’もしくは５’の標的基もしくは連結基を含有しないか、または表４中で図示されるものが含まれるがこれらに限定されない異なる３’または５’の標的基もしくは連結基を含有し得る。表１、２Ａ及び２Ｂ中でリストされるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のヌクレオチド配列のうちの任意のものは、修飾または非修飾にかかわらず、表４中で図示されるものが含まれるがこれらに限定されない３’または５’の標的基または連結基を含有し得る。表３Ａ及び３Ｂ中でリストされるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の二重鎖のうちの任意のものは、修飾または非修飾にかかわらず、表４中で図示されるものが含まれるがこれらに限定されない標的基または連結基をさらに含み、標的基または連結基は、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の二重鎖のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの３’または５’末端へ付加され得る。
【表４−１】
2018529732.tif 000078
【表４−２】
2018529732.tif 000079
【表４−３】
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【表４−４】
2018529732.tif 000081
【表４−５】
2018529732.tif 000082
【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【表４−９】
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【表４−１０】
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【表４−１１】
2018529732.tif 000088
【００８１】
上記の構造の各々において、ＮＡＧは、Ｎ−アセチル−ガラクトサミンまたは別のＡＳＧＰＲリガンドを含む。各々の（ＮＡＧｘ）は、リン酸基（（ＮＡＧ２５）、（ＮＡＧ３０）、及び（ＮＡＧ３１）でのように）、またはホスホロチオエート基（（ＮＡＧ２５）ｓ、（ＮＡＧ３０）ｓ、及び（ＮＡＧ３１）ｓでのように）、または別の連結基によって、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤へ付加され得る。あるいは、当技術分野において公知の他の連結基が使用され得る。
【化１】
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【００８２】
送達ベヒクル
いくつかの実施形態において、送達ベヒクルを使用して、ＲＮＡｉ剤を細胞または組織へ送達することができる。送達ベヒクルは、細胞または組織へのＲＮＡｉ剤の送達を改善する化合物である。送達ベヒクルは、ポリマー（両親媒性ポリマー等）、膜活性ポリマー、ペプチド、メリチンペプチド、メリチン様ペプチド（ＭＬＰ）、脂質、可逆的に修飾されたポリマーもしくはペプチド、または可逆的に修飾された膜活性ポリアミンを含むかまたはそれらからなるがこれらに限定されない。
【００８３】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、脂質、ナノ粒子、ポリマー、リポソーム、ミセル、ＤＰＣまたは当技術分野において利用可能な他の送達系と組み合わせることができる。ＲＮＡｉ剤は、標的基、脂質（コレステロール及びコレステリルの誘導体が含まれるがこれらに限定されない）、ナノ粒子、ポリマー、リポソーム、ミセル、ＤＰＣ（例えばＷＯ２０００／０５３７２２、ＷＯ２００８／００２２３０９、ＷＯ２０１１／１０４１６９、及びＷＯ２０１２／０８３１８５、ＷＯ２０１３／０３２８２９、ＷＯ２０１３／１５８１４１を参照、その各々は参照により本明細書に援用される）、または当技術分野において利用可能な他の送達系へ化学的にコンジュゲートすることもできる。
【００８４】
医薬組成物
哺乳動物においてＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を肝細胞へインビボで送達する方法が本明細書において記載される。いくつかの実施形態において、送達ベヒクルが使用され得る。送達ベヒクルは、ＲＮＡｉ剤の細胞への送達を改善する化合物である。送達ベヒクルは、ポリマー（両親媒性ポリマー等）、膜活性ポリマー、ペプチド（メリチンまたはメリチン様ペプチド等）、可逆的に修飾されたポリマーもしくはペプチド、または脂質であり得るがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、アシアロ糖タンパク質リガンドを含む標的リガンドへ連結される。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、ガラクトースクラスターを含むかまたはそれらからなる標的リガンドへ連結される。
【００８５】
ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を使用して、例えば被験体中の細胞、細胞群または組織におけるＬＰＡの発現を阻害することができる。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を使用して、被験体へ投与するための組成物（すなわち医薬組成物または医薬品）を製剤化する。本明細書において使用される時、医薬組成物または医薬品は、薬理学的有効量の記載されるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のうちの少なくとも１つ、及び１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む。薬学的に許容される賦形剤（賦形剤）は、安全性について適切に評価され、薬物送達系中に意図的に含まれる医薬品活性成分（ＡＰＩ、治療用産物、例えばＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤）以外の物質である。賦形剤は、意図された投薬量で治療的効果を発揮しないかまたは発揮することが意図されない。賦形剤は、ａ）製造の間の薬物送達系のプロセシングを支援する、ｂ）ＡＰＩの安定性、バイオアベイラビリティーもしくは患者許容性を保護、支援もしくは促進する、ｃ）製品同定を支援する、及び／またはｄ）貯蔵もしくは使用の間のＡＰＩの送達の全体的な安全性、有効性の任意の他の属性を促進する、ように作用し得る。薬学的に許容される賦形剤は、不活性物質であってもまたはそうでなくてもよい。
【００８６】
賦形剤には、吸収促進剤、接着阻害剤、消泡剤、酸化防止剤、結合剤、結合剤、バッファー剤、担体、コーティング剤、着色料、送達促進剤、送達ポリマー、デキストラン、デキストロース、希釈液、崩壊剤、乳化剤、増量剤、充填剤、香料、流動促進剤、保湿剤、滑沢剤、油、ポリマー、防腐剤、食塩水、塩、溶媒、糖、懸濁化剤、持続放出マトリックス、甘味料、増粘剤、等張化剤、ベヒクル、撥水剤、及び湿潤剤が含まれるがこれらに限定されない。
【００８７】
医薬組成物は、医薬組成物中で一般的に見出される他の追加の構成要素を含有し得る。かかる追加の構成要素には、止痒剤、収斂剤、局部麻酔剤、または抗炎症剤（例えば抗ヒスタミン剤、ジフェンヒドラミンなど）が含まれるがこれらに限定されない。本明細書において定義されるＲＮＡｉ剤を発現または含む細胞、組織または単離された器官が、「医薬組成物」として使用され得ることも想定される。本明細書において使用される時、「薬理学的有効量」、「治療有効量」、または単純に「有効量」は、意図される薬理学的、治療的または予防的な結果を生ずるＲＮＡｉ剤のその量を指す。
【００８８】
いくつかの実施形態において、記載されるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、第２のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤もしくは他のＲＮＡｉ剤、小分子薬物、抗体、抗体断片、及び／またはワクチンが含まれるがこれらに限定されない、１つまたは複数の追加の治療剤または治療と、組み合わせられる。追加の治療剤の例には、ＨＭｇ  Ｃｏ−Ａリダクターゼ阻害剤（スタチン）、エゼチミブ、ＰＣＳＫ−９阻害剤、ＣＴＥＰ阻害剤、療法標的化ＡＮＧＰＴＬ３、療法標的化ＡＰＯＣ３、及びナイアシンが含まれるがこれらに限定されない。
【００８９】
記載されるＲＮＡｉ剤及び本明細書において開示されるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物は、キット、容器、パック、またはディスペンサー中にパッケージングされるかまたは含まれ得る。ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤及び前記ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物は、充填済みシリンジまたはバイアル中にパッケージングされ得る。
【００９０】
いくつかの実施形態において、記載されるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のうちの少なくとも１つを含む医薬組成物が企図される。これらの医薬組成物は、細胞、組織または生物体におけるＬＰＡ遺伝子の発現の阻害において有用である。いくつかの実施形態において、記載される医薬組成物を使用して、ＬＰＡ発現の低減または阻害から利益を得る疾患、病態または障害を有する被験体を治療する。いくつかの実施形態において、記載される医薬組成物を使用して、ＬＰＡ発現の低減または阻害から利益を得る疾患、病態または障害を発症するリスクがある被験体を治療する。ＬＰＡ発現の低減または阻害から利益を得る疾患、病態または障害は、ベルガー病、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、メタボリック症候群、急性冠症候群、大動脈弁狭窄症、大動脈弁閉鎖不全症、大動脈解離、網膜動脈閉塞症、脳血管疾患、腸間膜虚血症、上腸間膜動脈閉塞症、腎動脈狭窄症、安定狭心症／不安定狭心症、急性冠症候群、ヘテロ接合またはホモ接合の家族性高コレステロール血症、高アポβリポタンパク血症、アテローム性脳動脈硬化症、脳血管疾患、及び静脈血栓症が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、被験体は、ヒト患者が含まれるがこれらに限定されない哺乳動物である。
【００９１】
本明細書において記載されるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のうちの少なくとも１つを含む細胞、組織及び非ヒト生物体が企図される。これらの細胞、組織または非ヒト生物体は、当技術分野において利用可能な任意の手段による細胞、組織または非ヒト生物体へのＲＮＡｉ剤の送達によって、作製される。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト細胞が含まれるがこれらに限定されない哺乳類細胞である。細胞、組織または非ヒト生物体は、研究のために、または研究ツール（例えば薬物試験または診断）として有用である。
【００９２】
治療の方法
いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を使用して、ＬＰＡ発現の低減または阻害から利益を得る、疾患、病態もしくは障害を有するか、または疾患、病態もしくは障害を有するリスクがある、被験体を治療する。ＬＰＡ遺伝子発現の低減及び／または阻害から利益を得る被験体の治療には、治療法及び／または予防のための治療が含まれる。疾患、病態または障害の例には、ベルガー病、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、メタボリック症候群、急性冠症候群、大動脈弁狭窄症、大動脈弁閉鎖不全症、大動脈解離、網膜動脈閉塞症、脳血管疾患、腸間膜虚血症、上腸間膜動脈閉塞症、腎動脈狭窄症、安定狭心症／不安定狭心症、急性冠症候群、ヘテロ接合またはホモ接合の家族性高コレステロール血症、高アポβリポタンパク血症、アテローム性脳動脈硬化症、脳血管疾患、及び静脈血栓症が含まれるるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、方法は、本明細書において記載されるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を含む組成物（医薬組成物等）を治療される哺乳動物へ投与することを含む。
【００９３】
いくつかの実施形態において、記載されるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のうちの１つまたは複数の治療有効量は、被験体へ投与され、それによって被験体におけるＬＰＡの発現を阻害する（例えば被験体におけるＬＰＡの発現の阻害の有効量）。いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のうちの１つまたは複数を使用してＬＰＡ発現の低減または阻害から利益を得る疾患または障害を有する被験体を治療する。いくつかの実施形態において、記載されるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を使用して、ＬＰＡ発現の低減または阻害から利益を得る疾患または障害を有する被験体における少なくとも１つ症状を治療または予防する。被験体は、治療有効量の記載されるＲＮＡｉ剤のうちの任意の１つまたは複数を投与され、それによって症状を治療する。いくつかの実施形態において、被験体は、予防有効量の記載されるＲＮＡｉ剤のうちの任意の１つまたは複数を投与され、それによって少なくとも１つの症状を予防する。
【００９４】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を使用して臨床所見を治療または管理し、そこで、かかる治療、予防または管理を必要とする被験体は、治療有効量または予防有効量のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤またはＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を含有する本明細書において記載される組成物のうちの１つまたは複数を投与される。いくつかの実施形態において、方法は、本明細書において記載されるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を含む組成物を治療される哺乳動物へ投与することを含む。
【００９５】
いくつかの実施形態において、方法は、第２の治療剤または治療を投与するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２の治療剤は、他のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤（例えばＬＰＡ標的内の異なる配列を標的とするＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤）である。他の実施形態において、第２の治療剤は、小分子薬物、抗体、抗体断片、及びワクチンを含む群から選択され得る。
【００９６】
投与経路とは、ＲＮＡｉ剤が身体と接触させられる通路である。一般に、被験体の治療のための薬物及び核酸を投与する方法は当技術分野において周知であり、本明細書において記載される組成物の投与へ適用することができる。本明細書において記載される化合物は、特定の経路に適切にあつらえた調製物において任意の好適な経路によって投与され得る。したがって、本明細書において記載される化合物は、注射によって、例えば静脈内、筋肉内、皮内、皮下、または腹腔内に投与され得る。
【００９７】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤または本明細書において記載される組成物は、当技術分野において公知のオリゴヌクレオチド送達技術を使用して、細胞、細胞群、組織、または被験体へ送達され得る。一般に、核酸分子の送達（インビトロまたはインビボ）のために当技術分野において認識される任意の好適な方法は、本明細書において記載されるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤による使用に適合させることができる。例えば、送達は、局部投与（例えば直接噴射、インプランテーション、または局所投与）、全身投与、または皮下経路、静脈内経路、経口経路、腹腔内経路もしくは非経口経路（頭蓋内（例えば脳室内、実質内及び髄腔内）投与、筋肉内投与、経皮投与、気道（エアロゾル）投与、経鼻投与、直腸投与、局所（頬腔及び舌下が含まれる）投与が含まれる）によることができる。ある特定の実施形態において、組成物は、皮下または静脈内の点滴または注射によって投与される。
【００９８】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、脂質、ナノ粒子、ポリマー、リポソーム、ミセル、ＤＰＣまたは当技術分野において利用可能な他の送達系と組み合わせることができる。ＲＮＡｉ剤は、標的基、脂質（コレステロール及びコレステリルの誘導体が含まれるがこれらに限定されない）、ナノ粒子、ポリマー、リポソーム、ミセル、ＤＰＣ（例えばＷＯ２０００／０５３７２２、ＷＯ２００８／００２２３０９、ＷＯ２０１１／１０４１６９、及びＷＯ２０１２／０８３１８５を参照、その各々は参照により本明細書に援用される）、または当技術分野において利用可能な他の送達系へ化学的にコンジュゲートすることもできる。ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は送達ポリマーへコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態において、送達ポリマーは、可逆的にマスク／修飾された両親媒性膜活性ポリアミンである。
【００９９】
発現の阻害
本明細書において使用される時、「サイレンシングさせる」、「低減する」、「阻害する」、「ダウンレギュレートする」、または「遺伝子発現をノックダウンする」という用語は、ＬＰＡ遺伝子を指す場合に、遺伝子から転写されるＲＮＡのレベル、またはＬＰＡ遺伝子が転写される細胞、細胞群もしくは組織中のｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチド、タンパク質もしくはタンパク質サブユニットのレベルによって測定されるように、細胞、細胞群または組織が記載されるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤による治療される場合に、そのように治療されたかもしくは治療されていない第２の細胞、細胞群もしくは組織と比較して、またはＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の投与の前の同じ細胞、細胞群もしくは組織と比較して、遺伝子の発現が低減することを意味する。
【０１００】
いくつかの実施形態において、記載されるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤が投与される被験体におけるＬＰＡの遺伝子発現レベル及び／またはｍＲＮＡのレベルは、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を投与される前の被験体またはＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を投与されない被験体と比べて、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％低減される。被験体における遺伝子発現レベル及び／またはｍＲＮＡのレベルは、被験体の細胞、細胞群及び／または組織中で低減され得る。いくつかの実施形態において、記載されるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤が投与された被験体におけるＬＰＡのタンパク質レベルは、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を投与される前の被験体またはＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を投与されない被験体と比べて、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％低減される。被験体におけるタンパク質レベルは、被験体の細胞、細胞群、組織、血液及び／または他の体液中で低減され得る。遺伝子発現、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルの低減は当技術分野において公知の任意の方法によって査定され得る。ＬＰＡ  ｍＲＮＡレベル及び／またはタンパク質レベルの低減または減少は、まとめてＬＰＡの低減もしくは減少またはＬＰＡの発現の阻害もしくは低減と本明細書において称される。
【０１０１】
ＲＮＡｉ剤を指す場合に、細胞の中への導入は、ＲＮＡｉ剤を細胞の中へ機能的に送達することを意味する。機能的送達によって、ＲＮＡｉ剤が細胞へ送達され、予想される生物学的活性（例えば遺伝子発現の配列特異的阻害）を有することが意味される。
【０１０２】
細胞及び組織ならびに非ヒト生物体
本明細書において記載されるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のうちの少なくとも１つを含む細胞、組織及び非ヒト生物体が企図される。これらの細胞、組織または非ヒト生物体は、細胞、組織または非ヒト生物体へのＲＮＡｉ剤の送達によって作製される。
【０１０３】
上で提供される実施形態及び項目は、ここで以下の非限定的実施例で説明される。
【実施例】
【０１０４】
実施例１。ＲＮＡｉ剤の合成。
Ａ）合成。オリゴヌクレオチド合成において使用される固相上のホスホロアミダイト技術に従って、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を合成した。スケールに依存して、ＭｅｒＭａｄｅ９６Ｅ（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）またはＭｅｒＭａｄｅ１２（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）のいずれかを使用した。制御された孔径のガラスでできている固体支持体（ＣＰＧ、５００Åまたは６００Å、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａｓｔｏｎ、ＰＡ、米国から得られた）上で、合成を遂行した。すべてのＤＮＡ、２’−修飾ＲＮＡ、及びＵＮＡホスホロアミダイトを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ、米国）から購入した。具体的には、以下の２’−Ｏ−メチルホスホロアミダイトを使用した。（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−（ベンゾイル）−２’−Ｏ−メチル−アデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピイ−ラミノ（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙ−ｌａｍｉｎｏ））ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシ−トリチル−Ｎ４−（アセチル）−２’−Ｏ−メチル−シチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−アミノ）ホスホロアミダイト、（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−（イソブチリル）−２’−Ｏ−メチル−グアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノ−エチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト、及び５’−Ｏ−ジメトキシ−トリチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト。２’−デオキシ−２’−フルオロ−ホスホル−アミダイトは、２’−Ｏ−メチルＲＮＡアミダイトと同じ保護基を保有していた。以下のＵＮＡホスホロアミダイトを使用した。５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−ベンゾイル−２’，３’−セコ−アデノシン、２’−ベンゾイル−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロ−アミダイト、５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−アセチル−２’，３’−セコ−シトシン、２’−ベンゾイル−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソ−プロピル）］−ホスホロアミダイト、５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−イソブチリル−２’，３’−セコ−グアノシン、２’−ベンゾイル−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロアミダイト、及び５’−（４，４’−ジメトキシ−トリチル）−２’，３’−セコ−ウリジン，２’−ベンゾイル−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソ−プロピル）］−ホスホロアミダイト。すべてのアミダイトを無水アセトニトリル（５０ｍＭ）中で溶解し、分子篩（３Å）を添加した。オリゴマーの５’末端にＴＥＧ−コレステロールを導入するために、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ、米国）からの１−ジメトキシトリチルオキシ−３−Ｏ−（Ｎ−コレステリル−３−アミノプロピル）−トリエチレングリコール−グルセリル−２−Ｏ−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ，−ジイソプロピル）−ホスホロアミダイトを用いた。５’−修飾を合成サイクルの修飾なしに導入した。５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＢＴＴ��アセトニトリル中で２５０ｍＭ）を活性化剤溶液として使用した。カップリング時間は、１０分（ＲＮＡ）、１８０秒（コレステロール）、９０秒（２’ＯＭｅ及びＵＮＡ）、及び６０秒（２’Ｆ及びＤＮＡ）であった。ホスホロチオエートリンケージを導入するために、無水アセトニトリル中で３−フェニル１，２，４−ジチアゾリン−５−オン（ＰＯＳ、ＰｏｌｙＯｒｇ，Ｉｎｃ．、Ｌｅｏｍｉｎｓｔｅｒ、ＭＡ、米国から得られた）の１００ｍＭ溶液を用いた。具体的な配列については、表１、２Ａ及び２Ｂを参照されたい。
【０１０５】
Ｂ．支持体結合オリゴマーの切断及び脱保護。固相合成の最終化後に、乾燥した固体支持体を、水中の４０重量％のメチルアミン及び２８％の水酸化アンモニウム溶液（Ａｌｄｒｉｃｈ）の１：１体積溶液により、３０℃で２時間処理した。溶液を蒸発させ、固形残留物を水中で再構成した（以下を参照）。
【０１０６】
Ｃ．精製。粗製コレステロールを含有するオリゴマーを、Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ３００  Ｃ４  ５ｕ分取カラム及びＳｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−８システムを使用する逆相ＨＰＬＣによって精製した。バッファーＡは１００ｍＭのＴＥＡＡ（ｐＨ７．５）であり５％のアセトニトリルを含有し、バッファーＢは１００ｍＭのＴＥＡＡであり９５％のアセトニトリルを含有していた。２６０ｎｍの紫外線トレースを記録した。次いで、１００ｍＭの重炭酸アンモニウム（ｐＨ６．７）及び２０％のアセトニトリルのランニングバッファーによりセファデックスＧ−２５ミディアムをパックしたＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＸＫ  １６／４０カラムを使用するサイズ排除ＨＰＬＣ上で、適切な画分を実行した。他の粗製オリゴマーを、ＴＫＳｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷ  １３ｕカラム及びＳｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−８システムを使用する陰イオン交換ＨＰＬＣによって精製した。バッファーＡは２０ｍＭのトリス、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ９．０）であり２０％のアセトニトリルを含有し、バッファーＢはバッファーＡと同じものに１．５Ｍの塩化ナトリウムを添加した。２６０ｎｍの紫外線トレースを記録した。適切な画分をプールし、次いで、オリゴマーを含有するコレステロールについて、記載されるようにサイズ排除ＨＰＬＣ上で実行した。
【０１０７】
Ｄ．アニーリング。０．２×ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水、１×、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｅｌｌｇｒｏ）中の等モル溶液（センス及びアンチセンス）を組み合わせることによって、相補鎖を混合して、ＲＮＡｉ剤を形成した。この溶液を７０℃のサーモミキサーの中へ置き、９５℃へ加熱し、９５℃で５分間保持し、室温へ徐冷した。いくらかのＲＮＡｉ剤を凍結乾燥し、−１５〜−２５℃で保存した。０．２×ＰＢＳ中で紫外線−可視光線分光計上での溶液吸光度を測定することによって、二重鎖濃度を決定した。次いで、２６０ｎｍでの溶液吸光度に変換係数及び希釈係数を掛けて、二重鎖濃度を決定した。特別の指示の無い限り、すべての変換係数は０．０３７ｍｇ／（ｍＬ・ｃｍ）であった。いくつかの実験について、変換係数は実験的に決定した吸光係数から計算した。
【０１０８】
実施例２。ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のインビトロの一次分析。インシリコの分析によって、ヒトと非ヒト霊長動物で交差反応性があると同定される候補配列をスクリーニングした。１０８のインシリコで同定された可能性のあるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を合成し、３つの群においてインビトロの有効性についてスクリーニングした。スクリーニングの目的のために、ヒトＬＰＡ  ｃＤＮＡ配列（アクセッション番号ＮＭ＿００５５７７．１）を、商業的に入手可能な哺乳類発現ベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から、商業的に入手可能なレポーターベースのスクリーニングプラスミド、ｐｓｉＣＨＥＣＫ２（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の中へサブクローニングし、それによりＲｅｎｉｌｌａ属ルシフェラーゼ／ＬＰＡ融合ｍＲＮＡが生成された。ヒトバックグラウンドにおけるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の有効性のために、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ヒト肝細胞癌株）を、９６ウェルフォーマット中に１ウェルあたり約１０，０００細胞でプレーティングした。１０８のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の各々を、１ウェルあたり５０〜１００ｎｇのＬＰＡ−ｐｓｉＣＨＥＣＫ２プラスミドＤＮＡ及び１ウェルあたり０．２μＬのＬｉｐｏＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００と共に、２つまたは３つの濃度（１ｎＭ及び０．１ｎＭ、または０．０２ｎＭ、０．２ｎＭ及び２ｎＭ）で共トランスフェクションした。Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、構成的に発現するホタルルシフェラーゼ（これもｐｓｉＣＨＥＣＫ２プラスミド上に存在する）のレベルへ正規化したＲｅｎｉｌｌａ属ルシフェラーゼレベルの測定によって、遺伝子ノックダウンを決定した（表５Ａ及び５Ｂ）。
【表５Ａ】
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【表５Ｂ−１】
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【表５Ｂ−２】
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【表５Ｃ−１】
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【表５Ｃ−２】
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【表５Ｄ−１】
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【表５Ｄ−２】
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【表５Ｄ−３】
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【表５Ｄ−４】
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【０１０９】
実施例３。ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のＥＣ５０の決定。同じ細胞及びトランスフェクション条件を使用して、１５０ｆＭ〜３ｎＭの範囲のＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の濃度で、１０ポイントのＥＣ５０曲線を生成した。ＥＣ５０をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して決定した（表６）。
【表６】
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【０１１０】
実施例４。構造活性相関（ＳＡＲ）によりデザインされたＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のインビトロの分析。ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のＳＡＲセット（ＡＤ０１５３２に基づく３６４の配列及びＡＤ０１５３３に基づく３５１の配列）を合成し、有効性についてインビトロでスクリーニングした。スクリーニングの目的のために、２７５６ｂｐのＫＩＶ−３〜ＫＩＶ−９のヒトＬＰＡ  ｃＤＮＡ配列（アクセッション番号  ＮＭ＿００５５７７．１）を合成し、商業的に入手可能なレポーターベースのスクリーニングプラスミド、ｐｓｉＣＨＥＣＫ２（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の中へクローニングし（ＧｅｎｅＷｉｚ、Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ）、それによりＲｅｎｉｌｌａ属ルシフェラーゼ／ＬＰＡ融合ｍＲＮＡが生成された。ヒトバックグラウンドにおけるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の有効性のために、ＨｕＨ７細胞（ヒト肝細胞癌株）を、９６ウェルフォーマット中に１ウェルあたり約７５００細胞でプレーティングした。ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の各々を、１ウェルあたり２５ｎｇのＬＰＡ−ｐｓｉＣＨＥＣＫ２プラスミドＤＮＡ及び１ウェルあたり０．２μＬのＬｉｐｏＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００と共に、２つの濃度（１ｎＭ及び０．１ｎＭ、または１０ｎＭ及び１ｎＭ）で共トランスフェクションした。Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、構成的に発現するホタルルシフェラーゼ（これもｐｓｉＣＨＥＣＫ２プラスミド上に存在する）のレベルへ正規化したＲｅｎｉｌｌａ属ルシフェラーゼレベルの測定によって、遺伝子ノックダウンを決定した（表７Ａ及び７Ｂ）。
【表７Ａ−１】
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【表７Ａ−２】
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【表７Ａ−３】
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【表７Ａ−４】
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【表７Ｂ−１】
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【表７Ｂ−２】
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【表７Ｂ−３】
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【表７Ｂ−４】
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【表７Ｂ−５】
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【表７Ｂ−６】
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【０１１１】
実施例５。一過性遺伝子導入マウス及び遺伝子導入マウスにおけるＲＮＡｉ剤の有効性のインビボの分析。
Ａ）投与及びサンプル採取。ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の有効性をインビボで評価するために、一過性遺伝子導入マウスを使用した。コレステロールコンジュゲートＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の投与の少なくとも３０日前に、野生型マウスに、マウスアルブミンプロモーターの制御下でＳＥＡＰ遺伝子を含有するプラスミドを、ハイドロダイナミック尾静脈注射によって注射した。ＬＰＡ遺伝子標的配列はプラスミドの３’ＵＴＲでクローニングした。これらのマウスをＳＥＡＰ−ＬＰＡ  ＨＴＶマウスとして示す。コレステロールコンジュゲートＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を、１日目にＭＬＰ送達ポリマーを使用して、マウスへ投与した（ＷＯ２０１２／０８３１８５、参照により本明細書に援用される；メリチンを合成しＣＤＭ−ＮＡＧにより修飾して、その中で記載されるようなＭＬＰ送達ポリマーを得た）。各々のマウスに、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤＋ＭＬＰ送達ポリマー（ほとんどの事例において、１：１ｗ／ｗのＲＮＡｉ剤：ＭＬＰ送達ポリマー）の用量を含有する、２００〜２５０μＬの溶液を尾静脈の中へ静脈内（ＩＶ）注射した。いくつかの実験において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を送達ポリマーへ直接コンジュゲートした。ポリマーコンジュゲートＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を、尾静脈の中へ同様に注射した。指示されたＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤（表８Ｂ）を、５４．４％のエトキシエチルアミノアクリレート（ＥＥＡＡ）アミン単量体及び４５．６％のプロピルアクリレートプロピル単量体を有する、ポリアクリレートポリマー（ＡＲＦ１１６４−１０６Ａ−５）（分子量４１９６２ｇ／ｍｏｌ、ポリマーはＷＯ２０１３／１５８１４１中で記載されるように合成した）へコンジュゲートし、３×ＡＣｉｔ−ＮＡＧ、６×ＡＣｉｔ−ＰＥＧによりマスクした（ポリマーはＷＯ２０１２／０９２３７３及びＰＣＴ／ＵＳ１６／３４５１２中で記載されるようにマスクした）。対照血清（治療前）サンプルを、−４日目または−１日目に注射前のマウスからとった。注射後に、血清サンプルを、マウス４、８、１５、２２、２９、３６及び４３日目からとった。何匹かのマウスについて、サンプルを４日目の代わりに３日目または５日目に収集した。
【０１１２】
追加の実験において、全長ＬＰＡを一過性に発現する遺伝子導入マウスを使用して、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤をインビボで評価した。コレステロール標的化ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の投与の少なくとも３０日前に、免疫不全の（Ｎｏｄ．ｓｃｉｄ）マウスに、マウスアルブミンプロモーターの制御下でＬＰＡ  ｃＤＮＡを含有するミニサークルを、ハイドロダイナミック尾静脈注射によって注射した。これらのマウスをＬＰＡ  ｍｃ  ＨＴＶマウスとして示す。コレステロール標的ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤またはＮＡＧ（ＧａｌＮＡｃとも称される）コンジュゲートＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のいずれかを、１日目にマウスへ投与した。コレステロール標的化ＲＮＡｉ剤について、各々のマウスに、ＲＮＡｉ剤＋ＭＬＰ送達ポリマー（１：１ｗ／ｗのＲＮＡｉ剤：ＭＬＰ送達ポリマー）の用量を含有する、２００〜２５０μＬの溶液を尾静脈の中へ静脈内（ＩＶ）注射した。ＮＡＧコンジュゲートＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤について、マウスに、緩衝食塩水中のＲＮＡｉ剤の用量を含有する、３００μｌの溶液を肩の間の背中上の弛緩性皮膚の中へ皮下（ＳＣ）注射した。いくつかのサンプルについて、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を、ＭＬＰ送達ペプチド有りまたは無しのいずれかで投与した。ＭＬＰ送達ペプチドにより送達されるＲＮＡｉ剤を、ＲＮＡｉ剤＋ＭＬＰ送達ポリマー（ほとんどの事例において、１：２ｗ／ｗのＲＮＡｉ剤：ＭＬＰ送達ポリマー）の用量を含有する、２００〜２５０μＬの溶液を尾静脈の中へ静脈内（ＩＶ）注射することよって投与した。対照血清（治療前）サンプルを、−４日目または−１日目に注射前のマウスからとった。注射後に、血清サンプルを、マウス４、８、１５、２２、２９、３６及び４３日目からとった。何匹かのマウスについて、サンプルを４日目の代わりに３日目または５日目に収集した。
【０１１３】
追加実験において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤をアポ（ａ）及びＬｐ（ａ）遺伝子導入マウスへ投与した（Ｆｒａｚｅｒ  ＫＡ  ｅｔ  ａｌ  １９９５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９：４２４−４３１）。このマウスは、５’及び３’の両方の追加の配列を備えた全ＬＰＡ遺伝子（アポ（ａ）タンパク質をコードする）を含有するＹＡＣからのヒトアポ（ａ）を発現する。Ｌｐ（ａ）マウスは、ヒトａｐｏＢ−１００発現マウスへ、アポ（ａ）ＹＡＣ含有マウスを掛け合わせることによって繁殖させた（Ｃａｌｌｏｗ  ＭＪ  ｅｔ  ａｌ  １９９４，ＰＮＡＳ  ９１：２１３０−２１３４）。コレステロール標的化ＲＮＡｉ剤及びＮＡＧコンジュゲートＲＮＡｉ剤を上記のように投与した。対照血清（治療前）サンプルを、−１日目に注射前のマウスからとった。注射後に、血清サンプルを、マウス４、８、１５、２２、２９、３６、４３、５０、５７及び６４日目からとった。
【０１１４】
Ｂ）ＬＰＡ発現ノックダウンのリアルタイム分析。ＳＥＡＰ−ＬＰＡ  ＨＴＶマウスについて、血清におけるＳＥＡＰタンパク質レベルを、Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ（商標）化学発光レポーター遺伝子分析システム（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、マウスからの血清のアッセイによってモニタリングした。正規化について、所定の時間点での各々の動物についてのＳＥＡＰレベルをその動物における治療前の発現レベルによって割って、「治療前へ正規化した」発現の比を決定した。次いで、特異的な時間点での発現を群内の個体の中で平均化した。
【０１１５】
ＬＰＡ  ｍｃ  ＨＴＶマウス及び遺伝子導入マウスについて、血清中のヒトアポ（ａ）タンパク質レベルを、アポ（ａ）についてのＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ）を使用して、マウスからの血清をアッセイすることによってモニタリングした。正規化について、時間点での各々の動物についてのアポ（ａ）レベルをその動物における治療前の発現レベルによって割って（この事例において１日目）、「１日目へ正規化した」発現の比を決定した。次いで、「１日目へ正規化した」個別の動物についての比を平均の「１日目へ正規化した」食塩水対照群中のすべてのマウスの比によって割ることによって、特異的な時間点での発現を食塩水対照群へ正規化した。これは、対照群中のものへ正規化した各々の時間点についての発現をもたらした。
【０１１６】
Ｌｐ（ａ）レベルを、製造者の推奨に従ってＣｏｂａｓ  Ｉｎｔｅｇｒａ  ４００（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）上で決定した。正規化について、時間点での各々の動物についてのアポ（ａ）レベルをその動物における治療前の発現レベルによって割って（この事例において１日目）、「１日目へ正規化した」発現の比を決定した。次いで、「１日目へ正規化した」個別の動物についての比を平均の「１日目へ正規化した」食塩水対照群中のすべてのマウスの比によって割ることによって、特異的な時間点での発現を食塩水対照群へ正規化した。これは、対照群中のものへ正規化した各々の時間点についての発現をもたらした。
【表８Ａ−１】
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【表８Ａ−２】
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【表８Ｂ】
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【表８Ｃ−１】
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【表８Ｃ−２】
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【表８Ｃ−３】
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【表８Ｃ−４】
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【０１１７】
実施例６。ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のインビボのスクリーニング及びＳＥＡＰのノックダウンの時間経過。コレステロールコンジュゲートＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を、一過性遺伝子導入マウスへ上記のように投与した。各々のマウスに、８ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーにより８ｍｇ／ｋｇのＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の単回の静脈内（ＩＶ）用量を投与した。血清中のＳＥＡＰタンパク質レベルを３６日までの間モニタリングした。ノックダウンレベル及び応答の継続時間を表９中で示す。８５％を超えるＳＥＡＰ血清タンパク質レベルにおける減少が、試験されたすべてのＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の投与に後続して得られ；試験された２つのＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤以外のすべてで９９．４％を超えるノックダウンが示された。ＡＤ０１１９６及びＡＤ０１１９９は、３６日目で＞９５％のノックダウンを示した。
【０１１８】
実施例７。ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のインビボのスクリーニング及びより低いＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤用量でのＬＰＡのノックダウンの時間経過。コレステロールコンジュゲートＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を、一過性遺伝子導入マウスへ上記のように投与した。各々のマウスに、２ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーにより２ｍｇ／ｋｇのＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の単回の静脈内（ＩＶ）用量を投与した。血清中のＳＥＡＰタンパク質レベルを４３日までの間モニタリングした（表１０）。
【０１１９】
実施例８。アポ（ａ）遺伝子導入（Ｔｇ）マウスにおけるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のインビボ試験。ＡＤ０１１９６をマウスへ上記のように投与した。各々のマウスに、２ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーまたは食塩水のいずれかにより２ｍｇ／ｋｇのＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の単回の静脈内（ＩＶ）用量を投与した。血清中のヒトアポ（ａ）（アポ（ａ））レベルを６４日までの間モニタリングした（表１１）。１５日目に、食塩水群中の動物に、２ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーにより２ｍｇ／ｋｇの対照マウス第ＶＩＩ因子（Ｆ７）ＲＮＡｉ剤の単回の静脈内用量を投与した。２２日目に、Ｆ７レベルをすべての動物において測定した。Ｆ７活性は投薬７日後に９９％までノックダウンされ、血清アポ（ａ）レベルに対する効果はなかった。ＡＤ０１１９６は、最下点でアポ（ａ）レベルの＞３ｌｏｇ１０のノックダウンを示し、３週間後に＞８０％のノックダウンが観察された（表１１）。
【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【０１２０】
実施例９。ＭＬＰ送達ポリマーによるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤送達に後続する、非ヒト霊長動物におけるアポリポタンパク質（ａ）（アポ（ａ））のノックダウン。ＭＬＰ送達ポリマー及びＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を作製し、薬学的に許容されるバッファー中で上記のように組み合わせた。１日目に、２匹のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）霊長動物（両方ともオス、それぞれ５．０ｋｇ及び８．１５ｋｇ）に、２ｍｇ／ｋｇのＡＤ０１１９６＋２ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーを注射した。各々の注射について、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤＋ＭＬＰ送達ポリマー（２ｍｌ／ｋｇ）を、２２〜２５ゲージの静脈内カテーテルを使用して、伏在静脈の中へ注射した。指示された時間点（表１２中で指示される）で、血液サンプルを採血し、アポ（ａ）レベル、脂質レベル及び毒性マーカーについて分析した。血液を大腿静脈から収集し、霊長動物はすべての血液採取の前に一晩断食させた。血中尿素窒素（ＢＵＮ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、クレアチニン、総コレステロール（ＴＣ）及びトリグリセリド（ＴＧ）についての血液検査は、Ｍｅｒｉｔｅｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで自動化化学分析器上で遂行された。リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）についての血液検査は、自動化化学分析器上で測定された。血清アポ（ａ）レベルはＥＬＩＳＡによって測定された。アポ（ａ）の有意なノックダウンは２２日目で観察され、９４．５％の平均最大ノックダウンが観察された。Ｌｐ（ａ）の平均最大ノックダウンは９１．５％であり、１５日目で観察された（図３）。用量関連性毒性は治療された動物において観察されなかった。
【表１２−１】
2018529732.tif 000120
【表１２−２】
2018529732.tif 000121
【表１３】
2018529732.tif 000122
【０１２１】
実施例１０。ＮＡＧコンジュゲートＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のインビボのスクリーニング及びノックダウンの時間経過。ＮＡＧ−コンジュゲートＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を、一過性遺伝子導入マウスへ上記のように投与した。各々のマウスに、１ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーにより２ｍｇ／ｋｇのＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の単回の静脈内（ＩＶ）用量、または１０ｍｇ／ｋｇのＮＡＧコンジュゲートＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の単回の皮下（ＳＣ）用量のいずれかを投与した。血清中のＳＥＡＰタンパク質レベルを２２日までの間モニタリングした。ノックダウンレベル及び応答の継続時間を表１４〜１５中で示す。ＡＤ０１５２９、ＡＤ０１５３２及びＡＤ０１５３３は、ＭＬＰ送達ポリマーによるＩＶ投与に後続してＳＥＡＰレベルの≧８５％のノックダウン、及びＮＡＧコンジュゲートＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の単独のＳＣ投与に後続してＳＥＡＰレベルの≧６０％の最大ノックダウンを示した。
【表１４】
2018529732.tif 000123
【表１５】
2018529732.tif 000124
【０１２２】
実施例１１。修飾ＮＡＧコンジュゲートＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のインビボのスクリーニング及びノックダウンの時間経過。指示されたＮＡＧコンジュゲートＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を、ＳＥＡＰ−ＬＰＡ  ＨＴＶマウスへ上記のように投与した。各々のマウスに、１０ｍｇ／ｋｇのＮＡＧコンジュゲートＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤の単回の皮下（ＳＣ）用量を投与した。血清中のＳＥＡＰタンパク質レベルを２２日までの間モニタリングした。ノックダウンレベル及び応答の継続時間を表１６〜１７中で示す。ＡＤ０１７６５及びＡＤ０１７６８は８９％のノックダウン活性を示した。
【表１６】
2018529732.tif 000125
【表１７】
2018529732.tif 000126
【０１２３】
実施例１２。アポ（ａ）ＴｇマウスにおけるＮＡＧコンジュゲートＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のインビボ試験。ＮＡＧコンジュゲートＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を、アポ（ａ）Ｔｇマウスへ上記のように投与した。各々のマウスに、１０ｍｇ／ｋｇのＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤または食塩水のいずれかの単回の皮下（ＳＣ）用量を投与した。血清中のヒトアポ（ａ）（アポ（ａ））レベルを日までの間モニタリングした（表１８）。ＡＤ０１７６５は、８日目で９６％のノックダウンでアポ（ａ）レベルの最大ノックダウンを示し、投薬の３週間後に＞７４％のノックダウンが観察された。
【表１８】
2018529732.tif 000127
【０１２４】
実施例１３。ＬＰＡ  ｍｃ  ＨＴＶマウスにおけるＮＡＧコンジュゲートＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のインビボ試験。指示されたＮＡＧコンジュゲートＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を、ＬＰＡ  ｍｃ  ＨＴＶマウスへ上記のように投与した。各々のマウスに、１０ｍｇ／ｋｇのＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤または食塩水のいずれかの単回の皮下（ＳＣ）用量を投与した。血清中のヒトアポ（ａ）（アポ（ａ））レベルを４日目に分析した（表１９）。ＡＤ０２００１、ＡＤ０１７６５及びＡＤ０１７６８は、４日目で＞９０％のノックダウンを示した。
【表１９】
2018529732.tif 000128
【０１２５】
実施例１４。ＭＬＰ送達ポリマーによるＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤送達に後続する、非ヒト霊長動物におけるアポリポタンパク質（ａ）（アポ（ａ））のノックダウン。ＭＬＰ送達ポリマー及びＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を作製し、薬学的に許容されるバッファー中で組み合わせた。１日目及び７１日目に、２匹のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）霊長動物に、４ｍｇ／ｋｇのＡＤ０１１９６＋４ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーまたは６ｍｇ／ｋｇのＡＤ０１１９６＋６ｍｇ／ｋｇのＭＬＰ送達ポリマーのいずれかを注射した。各々の注射について、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤＋ＭＬＰ送達ポリマーを、２２〜２５ゲージの静脈内カテーテルを使用して、伏在静脈の中へ注射した。指示された時間点で（図４）、血液サンプルを採血し、前述されるようにアポ（ａ）レベル、脂質レベル及び毒性マーカーについて分析した。アポ（ａ）の有意なノックダウンが第１の投薬後に観察され、４ｍｇ／ｋｇの用量について１５日目に９６％、及び６ｍｇ／ｋｇの用量について１５日目に９６％の平均最大ノックダウンが観察された。第１の投薬後のＬｐ（ａ）の平均最大ノックダウンは、４ｍｇ／ｋｇの用量について２９日目に９８．５％及び６ｍｇ／ｋｇの用量について２２日目に９８．５％であった。用量関連性毒性は治療された動物において観察されなかった。
【０１２６】
実施例１５。Ｌｐ（ａ）ＴｇマウスにおけるＮＡＧコンジュゲートＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のインビボ試験−用量応答。ＮＡＧコンジュゲートＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を、Ｌｐ（ａ）Ｔｇマウスへ上記のように投与した。各々のマウスに、０．５ｍｇ／ｋｇもしくは２ｍｇ／ｋｇ用量レベルのＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤または食塩水のいずれかの単回の皮下（ＳＣ）用量を投与した。血清中のＬｐ（ａ）レベルを４３日目までモニタリングした（図１、図２）。すべてのＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤はより高い用量で用量応答を示し、１５日目と２２日目との間の最下点でより大きなノックダウンを示した。
【０１２７】
実施例１６。アポ（ａ）特異的ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤分子送達に後続する、非ヒト霊長動物におけるアポリポタンパク質（ａ）（アポ（ａ））のノックダウン。ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を、皮下（ＳＣ）注射のために本明細書において記載されるように薬学的に許容されるバッファー中で調製した。１、７及び１５日目に、２匹のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）霊長動物に、３ｍｇ／ｋｇのＡＤ０２７１３、ＡＤ０２８１９、ＡＤ０２８２０、またはＡＤ０２８２１を皮下注射した。加えて、ＡＤ０２８１９で処理したサルに、５７日目及び８５日目に３ｍｇ／ｋｇのＡＤ０２８１９を再び投薬した。血液サンプルを採血し、前述されるようにアポ（ａ）レベル、脂質レベル及び毒性マーカーについて分析した。Ｌｐ（ａ）の有意なノックダウンが観察され、ＡＤ０２７１３について４３日目に８９％の平均最大ノックダウンが観察され、ＡＤ０２８１９について３６日目に８７％が観察され、ＡＤ０２８２０について３６日目に７９％が観察され、ＡＤ０２８２１について２９日目に９５％が観察された（図５）。用量関連性毒性は治療された動物において実験時間にわたって観察されなかった。
【０１２８】
実施例１７。ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤送達に後続する、非ヒト霊長動物におけるアポリポタンパク質（ａ）（アポ（ａ））のノックダウン。ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を、皮下（ＳＣ）注射のために本明細書において記載されるように薬学的に許容されるバッファー中で調製した。１日目に、２匹のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）霊長動物に、３ｍｇ／ｋｇのＡＤ０３２７２、ＡＤ０３４６２、ＡＤ０３５４９、ＡＤ０３５４７、ＡＤ０３６６８、ＡＤ０３４６０、またはＡＤ０３５３６を皮下注射した。加えて、ＡＤ０３４６０及びＡＤ０３５３６で処理したサルに、４８日目にそれぞれの１ｍｇ／ｋｇのＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を再び投薬した。血液サンプルを採血し、前述されるようにアポ（ａ）レベル、脂質レベル及び毒性マーカーについて分析した。Ｌｐ（ａ）の有意なノックダウンが観察され、ＡＤ０３２７２について１５日目に６２％、ＡＤ０３４６２について１５日目に２８％、ＡＤ０３５４９について２９日目に４７％、ＡＤ０３５４７について１５日目に４４％、ＡＤ０３６６８について２２日目に５３％、ＡＤ０３４６０について２９日目に７９％、及びＡＤ０３５３６について２２日目に７１％の平均最大ノックダウンであった（図６）。用量関連性毒性は治療された動物において実験時間にわたって観察されなかった。
【０１２９】
実施例１８。アポ（ａ）特異的ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤分子送達に後続する、霊長動物におけるアポリポタンパク質（ａ）（アポ（ａ））のノックダウン。ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を作製し、皮下（ＳＱ）注射のために上記されるように薬学的に許容されるバッファー中で組み合わせた。１日目に、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）霊長動物に、食塩水または２ｍｇ／ｋｇのＡＤ０３４６０、ＡＤ０３５３６、ＡＤ０３８５１、ＡＤ０３８５３、またはＡＤ０４１１０を皮下注射した。血液サンプルを採血し、前述されるように８及び１５日目にアポ（ａ）レベル、脂質レベル及び毒性マーカーについて分析した。Ｌｐ（ａ）レベルを３つの投薬前の値の平均へ正規化した。
【表２０】
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【図１】
2018529732.tif 000130
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年7月31日(2017.7.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列ＡＤ０３４６０、ＡＤ０３５３６、ＡＤ０３８５１、ＡＤ０３８５３、ＡＤ３８４７、またはＡＤ０４１１０を有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列ＡＤ０３４６０、ＡＤ０３５３６、ＡＤ０３８５１、ＡＤ０３８５３、ＡＤ３８４７、またはＡＤ０４１１０を有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、アシアロ糖タンパク質受容体リガンド標的基をさらに含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列ＡＤ０３４６０、ＡＤ０３５３６、ＡＤ０３８５１、ＡＤ０３８５３、ＡＤ３８４７、またはＡＤ０４１１０を有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、（Ｃ１１−ＰＥＧ３−ＮＡＧ３）、（Ｃ１１−ＰＥＧ３−ＮＡＧ３）、（Ｃ６−ＰＥＧ４−ＮＡＧ３）、（ＮＡＧ３）、（ＮＡＧ４）、（ＮＡＧ３−ＡＡ２）、（ＮＡＧ３−Ｐａｌｍ）、（ＮＡＧ１３）、（ＮＡＧ１８）、（ＮＡＧ２４）、（ＮＡＧ２５）、（ＮＡＧ２５）ｓ、（ＮＡＧ２６）、（ＮＡＧ２７）、（ＮＡＧ２８）、（ＮＡＧ２９）、（ＮＡＧ３０）、（ＮＡＧ３０）ｓ、（ＮＡＧ３１）、（ＮＡＧ１３）、（ＮＡＧ３１ｓ）、（ＮＡＧ３２）、（ＮＡＧ３３）、（ＮＡＧ３４）、（ＮＡＧ３５）、（ＮＡＧ３６）、及び（ＮＡＧ３７）からなる群から選択される標的基をさらに含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、修飾ヌクレオチド配列ＡＤ０３４６０、ＡＤ０３５３６、ＡＤ０３８５１、ＡＤ０３８５３、ＡＤ３８４７、またはＡＤ０４１１０を有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、修飾ヌクレオチド配列ＡＤ０３４６０、ＡＤ０３５３６、ＡＤ０３８５１、ＡＤ０３８５３、ＡＤ３８４７、またはＡＤ０４１１０を有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、アシアロ糖タンパク質受容体リガンド標的基をさらに含む。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、修飾ヌクレオチド配列ＡＤ０３４６０、ＡＤ０３５３６、ＡＤ０３８５１、ＡＤ０３８５３、ＡＤ３８４７、またはＡＤ０４１１０を有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、（Ｃ１１−ＰＥＧ３−ＮＡＧ３）、（Ｃ１１−ＰＥＧ３−ＮＡＧ３）、（Ｃ６−ＰＥＧ４−ＮＡＧ３）、（ＮＡＧ３）、（ＮＡＧ４）、（ＮＡＧ３−ＡＡ２）、（ＮＡＧ３−Ｐａｌｍ）、（ＮＡＧ１３）、（ＮＡＧ１８）、（ＮＡＧ２４）、（ＮＡＧ２５）、（ＮＡＧ２５）ｓ、（ＮＡＧ２６）、（ＮＡＧ２７）、（ＮＡＧ２８）、（ＮＡＧ２９）、（ＮＡＧ３０）、（ＮＡＧ３０）ｓ、（ＮＡＧ３１）、（ＮＡＧ１３）、（ＮＡＧ３１ｓ）、（ＮＡＧ３２）、（ＮＡＧ３３）、（ＮＡＧ３４）、（ＮＡＧ３５）、（ＮＡＧ３６）、及び（ＮＡＧ３７）からなる群から選択される標的基をさらに含む。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、ＡＤ０３４６０、ＡＤ０３５３６、ＡＤ０３８５１、ＡＤ０３８５３、ＡＤ３８４７、またはＡＤ０４１１０を含む。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
いくつかの実施形態において、ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤は、ＡＤ０３４６０、ＡＤ０３５３６、ＡＤ０３８５１、ＡＤ０３８５３、ＡＤ３８４７、またはＡＤ０４１１０からなる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
賦形剤には、吸収促進剤、接着阻害剤、消泡剤、酸化防止剤、結合剤、バッファー剤、担体、コーティング剤、着色料、送達促進剤、送達ポリマー、デキストラン、デキストロース、希釈液、崩壊剤、乳化剤、増量剤、充填剤、香料、流動促進剤、保湿剤、滑沢剤、油、ポリマー、防腐剤、食塩水、塩、溶媒、糖、懸濁化剤、持続放出マトリックス、甘味料、増粘剤、等張化剤、ベヒクル、撥水剤、及び湿潤剤が含まれるがこれらに限定されない。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
実施例１２。アポ（ａ）ＴｇマウスにおけるＮＡＧコンジュゲートＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤のインビボ試験。ＮＡＧコンジュゲートＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を、アポ（ａ）Ｔｇマウスへ上記のように投与した。各々のマウスに、１０ｍｇ／ｋｇのＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤または食塩水のいずれかの単回の皮下（ＳＣ）用量を投与した。血清中のヒトアポ（ａ）（アポ（ａ））レベルを２２日までの間モニタリングした（表１８）。ＡＤ０１７６５は、８日目で９６％のノックダウンでアポ（ａ）レベルの最大ノックダウンを示し、投薬の３週間後に＞７４％のノックダウンが観察された。
【表１８】
2018529732.tif 000136
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
実施例１８。アポ（ａ）特異的ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤分子送達に後続する、霊長動物におけるアポリポタンパク質（ａ）（アポ（ａ））のノックダウン。ＬＰＡ  ＲＮＡｉ剤を作製し、皮下（ＳＱ）注射のために上記されるように薬学的に許容されるバッファー中で組み合わせた。１日目に、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）霊長動物に、食塩水または２ｍｇ／ｋｇのＡＤ０３４６０、ＡＤ０３５３６、ＡＤ０３８５１、ＡＤ０３８５３、またはＡＤ０４１１０を皮下注射した。血液サンプルを採血し、前述されるように８及び１５日目にアポ（ａ）レベル、脂質レベル及び毒性マーカーについて分析した。Ｌｐ（ａ）レベルを３つの投薬前の値の平均へ正規化した。
【表２０】
2018529732.tif 000137
【国際調査報告】
2018529732.tif 000138
2018529732.tif 000139
2018529732.tif 000140
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