(57)【要約】本発明は、培養多能性幹細胞の質を評価するための新規な非侵襲的方法に関する。より具体的には、本発明は、細胞培養物の上清中のセルフリー核酸を評価することにより培養多能性幹細胞の遺伝子の完全性（たとえばＣＮＶの存在）を評価するための非侵襲的方法に関する。【選択図】図１
2018526018.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞の質を判定するための下記の工程を含むインビトロ非侵襲的方法：ｉ）多能性幹細胞が増殖している培養試料を用意する、ｉｉ）試料から核酸を抽出する、そしてｉｉｉ）核酸抽出物における少なくとも１つの遺伝子異常の存在および／またはレベルを判定する。
【請求項２】
ｉ）核酸抽出物における、表１から選択される少なくとも１つのハイパーリカレント配列の存在を判定する、そしてｉｉ）少なくとも１つのハイパーリカレント配列が検出された場合、多能性幹細胞が遺伝子異常を保有すると結論する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
遺伝子異常を含まない多能性幹細胞を単離するための、下記の工程を含む方法：
ｉ）請求項２に記載の方法を実施することにより多能性幹細胞培養物におけるハイパーリカレント配列のレベルを決定する、
ｉｉ）工程ｉ）で決定したレベルを基準値と比較する、
ｉｉｉ）工程ｉ）で決定したレベルが基準値と異なる場合、該多能性幹細胞培養物が、遺伝子異常を含まない多能性幹細胞を含有すると結論する、および
ｉｖ）遺伝子異常を含まない多能性幹細胞を単離する。
【請求項４】
多能性幹細胞またはそれに由来する分化した細胞を再生処置の必要がある対象に移植するための、下記の工程を含む方法：ｉ）請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法を実施する、ｉｉ）遺伝子異常を含まない多能性幹細胞を選択する、そしてｉｉｉ）工程ｉｉ）で選択した多能性幹細胞またはそれに由来する分化した細胞を対象に投与する。
【請求項５】
対象において再生処置の必要がある疾患を処置するための、下記の工程を含む方法：ｉ）請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法を実施する、ｉｉ）遺伝子異常を含まない多能性幹細胞を選択する、そしてｉｉｉ）工程ｉｉ）で選択した多能性幹細胞またはそれに由来する分化した細胞を対象に投与する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的に再生医療の分野に関する。より具体的には、本発明は多能性幹細胞の質を判定するための非侵襲的な方法およびキットに関する。より具体的には、本発明は培養多能性幹細胞の遺伝子の完全性(integrity)を評価するための非侵襲的な方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト多能性幹細胞(human pluripotent stem cell)（ｈＰＳＣ）の研究は、身体の多様な細胞タイプに影響を及ぼす疾患の理解および処置を移植用のヒト細胞の作製により補助するための、かつ薬物探査を可能にするための、新規ツールを提供する。ＰＳＣ（廃棄された胚の内部細胞塊(inner cell mass)から単離されたもの、すなわちヒト胚性幹細胞(human embryonic stem cell)（ｈＥＳＣ）、または分化した細胞から誘導されたもの、すなわち人工（誘導）多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell)（ｉＰＳＣ））は急速に増殖する驚異的な能力をもつ。実用レベルで、これは数千個、さらには数十万個の療法用細胞量を調製するのに十分な細胞を１つの細胞系から作製できることを意味する。ｈＥＳＣの分化誘導細胞を用いる幾つかの臨床試験が既に行なわれ、あるいは現在行なわれている：Ｇｅｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＮＣＴ０１２１７００８）はｈＥＳＣ由来の乏突起神経膠細胞の安全性を脊髄損傷患者において試験した。Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＡＣＴ）は、ｈＥＳＣ由来の網膜色素上皮(retinal pigment epithelial)（ＲＰＥ）細胞療法の安全性を、シュタルガルト黄斑ジストロフィー(Stargardt's Macular Dystrophy)（ＳＭＤ）（ＵＳＡ治験：ＮＣＴ０１３４５００６；ＵＫ治験：ＮＣＴ０１４６９８３２；韓国治験：ＮＣＴ０１６２５５５９）について、および委縮型（ドライ型）加齢黄斑変性(Dry Age-Related Macular Degeneration)（ＵＳＡ治験：ＮＣＴ０１３４４９９３；韓国治験：ＮＣＴ０１６７４８２９）について試験した。Ｖｉａｃｙｔｅは、インスリン産生細胞の安全性および有効性をＩ型糖尿病の被験者において試験中である（ＵＳＡ治験：ＮＣＴ０２２３９３５４）。Ｐｈｉｌｉｐｐｅ  Ｍｅｎａｓｃｈｅは、重篤な心不全においてヒト胚性幹細胞由来の前駆細胞を移植する試験を開始した（ＮＣＴ０２０５７９００）。Ｐｆｉｚｅｒ（ＮＣＴ０１６９１２６１）は、進行シュタルガルト病を伴う患者を治療するためにｈＥＳＣから誘導された移植網膜細胞を使用することの安全性を調べている。最後に、日本で最近開始された、理研の高橋政代により行なわれている試験は、滲出型（湿潤型）加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を伴う患者において自己人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞シートの移植の安全性を調べている。
【０００３】
これらの臨床試験はすべて、生物医学的可能性は膨大であるが、解決すべき幾つかの実際問題が残っていることを明らかにしている。最大関心事のひとつは遺伝子異常(genetic abnormality)である。
【０００４】
遺伝子異常はｈＰＳＣを再生医療に使用するための重大な関心事である。ｈＰＳＣクローンが遺伝子異常を示せば、これらの細胞およびそれらの分化した子孫は正常な成体組織生理を忠実に再現できない可能性があり、臨床現場でこれらの細胞を使用することに対する脅威になる可能性すらある。よって、そのような細胞における遺伝子異常の原因および程度を判定することが必須である。遺伝子異常(genetic aberration)は２カテゴリー、すなわち細胞培養により誘導されたものと細胞リプログラミングプロセスにより誘導されたものに分類できる。
【０００５】
ヒトＥＳＣは誘導時点では正常核型(karyotypically normal)である；しかし、細胞培養中に異数体(aneuploid)ｈＥＳＣクローンが出現する可能性がある。２００４年以来、未分化ｈＰＳＣを増幅させるために用いる培養条件が染色体の安定性に対して著しい影響をもつことが幾つかの試験によりレポートされた。そのような染色体異常はしばしば反回性(recurrent)である。染色体１２（最も頻繁に１２ｐ）、１７（特に１７ｑ）、２０またはＸの増加が、標準的な細胞遺伝学的方法（Ｇバンド法(G-banding)）を用いてしばしば検出された(Draper et al., 2004)。１１６３の核型を解析した４０のｈＥＳＣ系列の広範な試験により、ｈＥＳＣ培養物の１２．９％が染色体異常を示したと結論された(Taapken et al., 2011)。過去５年間にわたり、アレイベースの技術（仮想核型(virtual karyotype)とも呼ばれる）でゲノム変化の検出の解像度が改善された。アレイベースの比較ゲノムハイブリダイゼーション(Array-based comparative genomic hybridization)（ａＣＧＨ）または一塩基多型（ＳＮＰ）−アレイにより、小サイズのゲノム異常の同定が可能になり、ｈＰＳＣにおけるＤＮＡ変化の頻度はそれまで考えられていたものよりはるかに高い可能性があることすら明らかになった(Laurent et al., 2011; Narva et al., 2010)。これらの小サイズの染色体変化のうち、染色体２０ｑ１１．２１の位置における反回性のコピー数バリアント(copy number variant)（ＣＮＶ）が同定された(Lefort et al., 2008; Spits et al., 2008)。この２０ｑ１１．２１領域は多様な癌においても増幅される。さらに、２０ｑ１１．２の獲得が子宮頚癌の初期に起きることが示された。点変異も適応プロセスに関与する。より最近になって、全エキソームまたは全ゲノムのリシーケンシング(re-sequencing)が、ｈＰＳＣにおける一塩基対変異を同定するためのこれまで例のない解決策を提供した(Cheng et al., 2012; Funk et al., 2012; Gore et al., 2011)。細胞リプログラミングによるｉＰＳの作製は他の潜在的な変異源につながる。ＣＧＨマイクロアレイ(Martins-Taylor and Xu, 2010; Pasi et al., 2011)、ＳＮＰマイクロアレイ(Hussein et al., 2011; Laurent et al., 2011)、または次世代シーケンシング法(Gore et al., 2011; Ji et al., 2012)の使用による詳細な解析は、より微細な異常、たとえばコピー数バリエーション（ＣＮＶ）および変異が当初考えられていたより高い頻度でｉＰＳ細胞において起きることを示唆する。しかし、細胞リプログラミングにより誘導される変異の厳密な負荷は大きく論争されている(Bai et al., 2013)。それにもかかわらず、ｈｉＰＳは細胞培養中に遺伝子変化を蓄積する可能性もある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Draper, J. S., Moore, H. D., Ruban, L. N., Gokhale, P. J., Andrews, P. W., 2004. Culture and characterization of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 13, 325-36
【非特許文献２】Taapken, S. M., Nisler, B. S., Newton, M. A., Sampsell-Barron, T. L., Leonhard, K. A., McIntire, E. M., Montgomery, K. D., 2011. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29, 313-4
【非特許文献３】Laurent, L. C., Ulitsky, I., Slavin, I., Tran, H., Schork, A., Morey, R., Lynch, C., Harness, J. V., Lee, S., Barrero, M. J., Ku, S., Martynova, M., Semechkin, R., Galat, V., Gottesfeld, J., Izpisua Belmonte, J. C., Murry, C., Keirstead, H. S., Park, H. S., Schmidt, U., Laslett, A. L., Muller, F. J., Nievergelt, C. M., Shamir, R., Loring, J. F., 2011. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8, 106-18
【非特許文献４】Narva, E., Autio, R., Rahkonen, N., Kong, L., Harrison, N., Kitsberg, D., Borghese, L., Itskovitz-Eldor, J., Rasool, O., Dvorak, P., Hovatta, O., Otonkoski, T., Tuuri, T., Cui, W., Brustle, O., Baker, D., Maltby, E., Moore, H. D., Benvenisty, N., Andrews, P. W., Yli-Harja, O., Lahesmaa, R., 2010. High-resolution DNA analysis of human embryonic stem cell lines reveals culture-induced copy number changes and loss of heterozygosity. Nat Biotechnol. 28, 371-7
【非特許文献５】Lefort, N., Feyeux, M., Bas, C., Feraud, O., Bennaceur-Griscelli, A., Tachdjian, G., Peschanski, M., Perrier, A. L., 2008. human embryonic stem cells reveal recurrent genomic instability at 20q11.21. Nat Biotechnol. 26, 1364-6
【非特許文献６】Spits, C., Mateizel, I., Geens, M., Mertzanidou, A., Staessen, C., Vandeskelde, Y., Van der Elst, J., Liebaers, I., Sermon, K., 2008. Recurrent chromosomal abnormalities in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 26, 1361-3
【非特許文献７】Cheng, L., Hansen, N. F., Zhao, L., Du, Y., Zou, C., Donovan, F. X., Chou, B. K., Zhou, G., Li, S., Dowey, S. N., Ye, Z., Chandrasekharappa, S. C., Yang, H., Mullikin, J. C., Liu, P. P., 2012. Low incidence of DNA sequence variation in human induced pluripotent stem cells generated by nonintegrating plasmid expression. Cell Stem Cell. 10, 337-44
【非特許文献８】Funk, W. D., Labat, I., Sampathkumar, J., Gourraud, P. A., Oksenberg, J. R., Rosler, E., Steiger, D., Sheibani, N., Caillier, S., Stache-Crain, B., Johnson, J. A., Meisner, L., Lacher, M. D., Chapman, K. B., Park, M. J., Shin, K. J., Drmanac, R., West, M. D., 2012. Evaluating the genomic and sequence integrity of human ES cell lines; comparison to normal genomes. Stem Cell Res. 8, 154-64
【非特許文献９】Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E., Lee, J. H., Loh, Y. H., Manos, P. D., Montserrat, N., Panopoulos, A. D., Ruiz, S., Wilbert, M. L., Yu, J., Kirkness, E. F., Izpisua Belmonte, J. C., Rossi, D. J., Thomson, J. A., Eggan, K., Daley, G. Q., Goldstein, L. S., Zhang, K., 2011. Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells. Nature. 471, 63-7
【非特許文献１０】Martins-Taylor, K., Xu, R. H., 2010. Determinants of pluripotency: from avian, rodents, to primates. J Cell Biochem. 109, 16-25
【非特許文献１１】Pasi, C. E., Dereli-Oz, A., Negrini, S., Friedli, M., Fragola, G., Lombardo, A., Van Houwe, G., Naldini, L., Casola, S., Testa, G., Trono, D., Pelicci, P. G., Halazonetis, T. D., 2011. Genomic instability in induced stem cells. Cell Death Differ. 18, 745-53
【非特許文献１２】Hussein, S. M., Batada, N. N., Vuoristo, S., Ching, R. W., Autio, R., Narva, E., Ng, S., Sourour, M., Hamalainen, R., Olsson, C., Lundin, K., Mikkola, M., Trokovic, R., Peitz, M., Brustle, O., Bazett-Jones, D. P., Alitalo, K., Lahesmaa, R., Nagy, A., Otonkoski, T., 2011. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471, 58-62
【非特許文献１３】Ji, J., Ng, S. H., Sharma, V., Neculai, D., Hussein, S., Sam, M., Trinh, Q., Church, G. M., McPherson, J. D., Nagy, A., Batada, N. N., 2012. Elevated coding mutation rate during the reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 435-40
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
いかなるＤＮＡ変異も悪性トランスフォーメーションプロセスにおけるステップとなる可能性があるので、これらの遺伝子異常は強い関心事である。さらに、ある異常は反回性が高く、それは細胞生存、細胞増殖または分化妨害の増強により仲介される強い選択圧を示唆する。これらの機能性修飾はＰＳＣの悪性トランスフォーメーションしやすさを増大させ、期待されるそれらの療法特性を変化させる可能性がある。
【０００８】
多能性幹細胞のＤＮＡの完全性は主に核型解析により評価される。古典的な核型判定法の明らかな解像限界を克服するために、他のアプローチ、たとえばＣＧＨアレイまたはＳＮＰマイクロアレイが試験された；しかし、実際に危惧される発癌の可能性がある変異とＰＳＣの生物学的挙動に何らかの影響を及ぼす可能性がないかまたはほとんどないＤＮＡ修飾あるいは単なる多型とを識別するために用いる方法についてのコンセンサスはない。ＤＮＡシーケンシング技術およびそれらの解像（一塩基解像における全ゲノムマップ）はきわめて急速に改善されつつあり、それらの価格は急速に低下しているので、いつかはＰＳＣのルーティン解析が全ゲノムシーケンシングに依存することになるであろうと予想できる。しかし、これらの手法にはそれぞれ強い制限がある。たとえば、古典的な核型判定法は時間がかかり、細胞遺伝学者を養成する必要があり、かつ５Ｍｂ未満の長さの異常を検出することはできない。マイクロアレイベースのアプローチは、解析に専念するコア施設およびバイオインフォマティクス専門家を必要とする。最後に、ハイスループットシーケンシング法、たとえばＮＧＳはまだこの用途に最適化されておらず、データを処理するのに必要な時間が長く、かつ同様にバイオインフォマティクス専門家を必要とする。
【０００９】
したがって、ｈＰＳＣにおける大部分の反回性異常を検出できる迅速で安価な非侵襲的（細胞を破壊しない）方法に対する強いニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、多能性幹細胞の質を判定するための非侵襲的な方法およびキットに関する。
本発明はまた、培養多能性幹細胞の遺伝子の完全性を評価するための非侵襲的な方法およびキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１：ワークフローの模式図。培養ｈＰＳＣを定性するための上清のゲノム解析の想定使用。ｈＰＳＣ上清を採集し、総ｃｆＤＮＡを抽出する。次いでＰＣＲを実施する。結果を次いでバイオインフォマティクスにより解析して、ｃｆＤＮＡ中のバイオマーカーを検出する。
【図２】図２：ＳＥＡｄｂにおいて収集されたｈＰＳＣ遺伝子異常の反回。色勾配：＃  試験；バブルサイズ：ゲノム領域の長さ；Ｙ：反回性スコア(recurrence score)；Ｘ：染色体。
【図３】図３：最多遺伝子変化＞１Ｍｂを宿している２１の染色体について、表１の４０セットの配列（Ｓｏｎｄｅｓ：Ｓ１−Ｓ４０）が染色体異常の９３，５％に及ぶ。
【図４】図４：ｈＰＳＣ上清試料中のｃｆＮＡの検出および定量。２つのｈＰＳＣ上清において、対照としてヒト包皮線維芽細胞(foreskin fibroblast)由来のＤＮＡを５種類の濃度（３３０ｐｇ、１１０ｐｇ、１３ｐｇ、３．３ｐｇおよび０．３３ｐｇ）で用いて、ヒトＡＬＵリピート配列増幅を評価した。ｑＰＣＲ実験をＲｏｃｈｅ  ＬＣ４８０で実施した。各サイクルで蛍光を取得し、サイクル数に対してプロットした。測定した蛍光量の増加は、反応中に生成したＰＣＲ生成物の量に比例する。ｈＰＳＣにおけるｃｆＮＡの測定濃度は３３０ｐｇ〜１１０ｐｇである。
【図５】図５：上清ベースのトリソミー(trisomy)２０の検出。Ａ．２つのｈＰＳＣ系列における代表的な異常核型：ＨＤ２９１（４７，ＸＹ，＋１２）（左パネル）およびＨＤ１２９（４７，ＸＹ，＋２０）（右パネル）。Ｂ．トリソミー２０にのみ特異的なハイパーリカレント配列（高反回配列）(hyper-recurrent sequence)を用いる、２つのｈＰＳＣ系列およびそれらの上清におけるトリソミー２０のｄｄＰＣＲ定量。厳密な三重ウェルを用いたコピー数プロットにより、異常なｈＰＳＣ細胞ＨＤ１２９およびそれらの上清にのみトリソミー２０の存在が明らかになったが、ＨＤ２９１には存在しなかった。ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ（商標）  ソフトウェアにより作成したすべてのエラーバーは９５％信頼区間を表わす。
【図６】図６：高感度ＱＸ２００システムにより、特異的ハイパーリカレント配列を用いるｈＰＳＣ上清中のトリソミー２０の定量が可能になる。試料濃度をコピー数／μｌとしてプロットする。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
自己複製(self-renewal)によって永続するけれども分化して特定組織の成熟細胞になることができる多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、再生医療の鍵となるツールである。再生医療は、損傷または罹患した細胞、組織および臓器を身体が修復、置換、復元および再生するのを可能にする革新的医療についての幅広い定義である。しかし、細胞培養は、幹細胞の特性を変化させるかあるいはそれらに腫瘍形成の素因をもたらす可能性のあるエピジェネティック異常および遺伝子異常を生じる可能性がある。ＰＳＣの臨床使用が急速に拡大するのに伴って、細胞増殖中およびバッチをリリースする前の多能性幹細胞（ＰＳＣ）を特性判定するためのツールを改良する好機である。
【００１３】
本発明者らは、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）において培養におけるｈＰＳＣ不安定性のバイオマーカーである一組の“ハイパーリカレント配列”を決定し（表１）、培養中および臨床使用前に幹細胞をルーティンに評価するために使用できる迅速かつ実施しやすい試験を提唱する。
【００１４】
表１：４０のハイパーリカレント配列のリスト
位置はｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｂｕｉｌｄ  ３７（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）に基づく増幅の５’末端を表わす
【００１５】
【表１】
2018526018.tif 000003
【００１６】
したがって、本発明は、多能性幹細胞の質を判定するための下記の工程を含むインビトロ非侵襲的方法に関する：ｉ）多能性幹細胞が増殖している培養試料を用意する、ｉｉ）試料から核酸を抽出する、そしてｉｉｉ）核酸抽出物における少なくとも１つの遺伝子異常の存在および／またはレベルを判定する。
【００１７】
本明細書中で用いる用語“多能性幹細胞”または“ＰＳＣ”は、それの一般的な意味をもち、人体のいずれかの細胞に分化できる多能性細胞、たとえば胚性幹細胞（ＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を表わす。用語“多能性”は、必ずしもすべての細胞タイプにではないが多種多様な細胞タイプの１つに分化できる細胞を表わす。本発明に用いる細胞には下記のものが含まれるが、それらに限定されない：心筋細胞およびその前駆細胞；神経前駆細胞；膵ランゲルハンス島細胞、特に膵β−細胞；造血幹細胞および前駆細胞；間葉幹細胞；ならびに筋サテライト細胞。本発明の方法は多能性幹細胞に適用できるが、他の幹細胞、生殖細胞または体細胞（たとえば、間葉幹細胞(mesenchymal stem cell)（ＭＳＣ）、卵母細胞、胚、線維芽細胞など）にも適用できる。
【００１８】
“多能性幹細胞の質を判定する”とは、本発明の方法は多能性幹細胞が再生医療に関係する遺伝子異常または特定の配列を保有するかどうかの判定を目的とすることを意味するものとする。本発明の方法は、培養多能性幹細胞の遺伝子の完全性および遺伝子の安定性の評価を可能にする。
【００１９】
本明細書中で用いる用語“遺伝子異常(genetic abnormality)”は、個体および多能性幹細胞のゲノムに存在する可能性があるいずれかの事象であって、表現型疾患(phenotypic disease)および致死を引き起こす可能性があるものを表わす。遺伝子異常には下記のものが含まれるが、それらに限定されない：トリソミー(trisomy)、トランスロケーション、クアドリソミー(quadrisomy)、異数性、部分的異数性、モノソミー(monosomy)、核型異常、イソ二動原体染色体(isodicentric chromosome)、イソ染色体、反転、挿入、重複、欠失、コピー数バリエーション(copy number variation)（ＣＮＶ）、染色体トランスロケーション、一塩基バリエーション(Single nucleotide variation)（ＳＮＶ）、およびヘテロ接合性の喪失(Loss of heterozygosity)（ＬＯＨ）。一般に、用語“遺伝子異常”は、たとえば表１に記載したハイパーリカレント配列を表わす。
【００２０】
用語“培養試料”は、培養上清、培地、および培養物に懸濁している細胞を表わす。
本明細書中で用いる用語“核酸”は、当技術分野におけるそれの一般的な意味をもち、コーディングまたは非コーディング核酸配列を表わす。核酸にはＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）が含まれる。よって、核酸の例にはＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、およびｓｎＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。用語“核酸”は、遊離核酸(free nucleic acid)（ｆＮＡ）（細胞の核または細胞のミトコンドリアコンパートメントに由来するもの）、たとえばセルフリーＤＮＡ、遊離ＲＮＡ分子、マイクロＲＮＡ、および長い非コーディングＲＮＡにも関係する。“遊離核酸”とは、核酸が多能性幹細胞により放出され、多能性幹細胞が増殖している培地中に存在することを意味するものとする。
【００２１】
遊離した細胞核酸を調製試料から抽出するために、当業者は当技術分野で周知のいずれかの方法を使用できる。たとえば、実施例に記載する方法を使用できる。
特定の態様において、本発明の方法は下記の工程を含む：ｉ）核酸抽出物における少なくとも１つのハイパーリカレント配列の存在を判定する、そしてｉｉ）少なくとも１つのハイパーリカレント配列が検出された場合、その多能性幹細胞が遺伝子異常を保有すると結論する。
【００２２】
一般に、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０のハイパーリカレント配列を表１から選択できる。
【００２３】
核酸抽出物におけるハイパーリカレント配列の存在およびレベルの判定は、当技術分野で周知の多様な手法により実施できる。特定の態様において、核酸抽出物におけるハイパーリカレント配列の存在およびレベルを判定するためにドロップレットディジタルＰＣＲ(droplet digital-PCR)“ｄｄＰＣＲ”を実施できる。ｄｄＰＣＲは、その際に用いられる方法またはデバイスであって、上清または培地中におけるＤＮＡ配列の定量を可能にするものを表わす。
【００２４】
核酸抽出物におけるハイパーリカレント配列の存在およびレベルの判定は、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ、定量ＰＣＲ、ハイスループット  ペアエンド(paired-end)シーケンシング、次世代シーケンシング、およびキャピラリー電気泳動などの手法により実施することもできる。
【００２５】
核酸、特にＤＮＡまたはｍＲＮＡ中におけるハイパーリカレント配列を検出するための代表的方法には下記のものが含まれるが、それらに限定されない：制限酵素断片長多型、ハイブリダイゼーション法、シーケンシング、エキソヌクレアーゼ抵抗、マイクロシーケンシング、ｄｄＮＴＰを用いる固相伸長、ｄｄＮＴＰを用いる溶液中での伸長、オリゴヌクレオチドアッセイ、一塩基多型を検出するための方法、たとえば動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション(dynamic allele-specific hybridisation)、ライゲーション連鎖反応(ligation chain reaction)、ミニ-シーケンシング、ＤＮＡ“チップ”、ＰＣＲまたはモレキュラービーコン(molecular beacon)と併せた一重または二重標識プローブとの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、その他。
【００２６】
一般に、ハイパーリカレント配列を増幅後に検出する。たとえば、単離したＲＮＡに逆転写と増幅を組み合わせて施すことができる；ハイパーリカレント配列に対して特異的であるかあるいはハイパーリカレント配列を含む領域を増幅できる特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いる、ポリメラーゼ連鎖反応による逆転写と増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）など。第１の別法によれば、特異的な逆転写（適切な場合には）と増幅を確実にするプライマーアニーリングのための条件を選ぶことができる；したがって、増幅生成物の出現は特定のハイパーリカレント配列の存在の診断となる。別の方法では、ＲＮＡを逆転写および増幅するか、あるいはＤＮＡを増幅し、その後、適切なプローブとのハイブリダイゼーションにより、または直接シーケンシングもしくは当技術分野で既知である他のいずれか適切な方法により、増幅配列中のハイパーリカレント配列を検出することができる。たとえば、ＲＮＡから得られたｃＤＮＡをクローニングし、シーケンシングして、ハイパーリカレント配列を同定することができる。
【００２７】
特に、シーケンシングは本発明に関して使用できる理想的な手法である。当業者はポリヌクレオチドをシーケンシングするための幾つかの方法に精通している。これらには下記のものが含まれるが、それらに限定されない：サンガー(Sanger)シーケンシング（ジデオキシシーケンシングとも呼ばれる）、およびMetzgerが概説した種々の一塩基合成(sequencing-by-synthesis)（ＳＢＳ）方法(Metzger ML 2005, Genome Research 1767)、ハイブリダイゼーションによる、ライゲーションによる(たとえば、WO 2005/021786)、分解による(たとえば、U.S. Patent No. 5,622,824および6,140,053)シーケンシング、ナノポアシーケンシング。好ましくは、マルチプレックスアッセイにおいて、ディープシーケンシングが好ましい。用語“ディープシーケンシング(deep sequencing)”は、複数の核酸を並行してシーケンシングする方法を表わす。参照：たとえばBentley et al, Nature 2008, 456:53-59。Ｒｏｃｈｅ／４５４(Margulies et al., 2005a)、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ(Bentley et al., 2008)、Ｌｉｆｅ／ＡＰＧ（ＳＯＬｉＤ）(McKernan et al., 2009)およびＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ(Eid et al., 2009)により製造された主要な市販プラットフォームをディープシーケンシングに使用できる。たとえば、４５４法では、シーケンシングすべきＤＮＡを分画し、アダプターを供給するか、あるいはアダプターを含有するプライマーを用いてＤＮＡのセグメントをＰＣＲ増幅することができる。アダプターは、ＤＮＡキャプチャービーズ(DNA Capture Bead)への結合のために、またエマルジョンＰＣＲ増幅プライマーおよびシーケンシングプライマーのアニーリングのために必要な、ヌクレオチド２５−ｍｅｒである。ＤＮＡフラグメントを一本鎖にし、１つのＤＮＡフラグメントを１つのビーズに結合させるようにＤＮＡキャプチャービーズに付着させる。次に、ＤＮＡを含むビーズを油中水混合物に乳化すると、１つのビーズのみを含むマイクロロリアクターが得られる。このマイクロロリアクター内でフラグメントがＰＣＲ増幅されて、ビーズ当たり数百万のコピー数が得られる。ＰＣＲ後に、エマルジョンを破壊し、ビーズをピコタイタープレート(pico titer plate)に装填する。ピコタイタープレートの各ウェルは１つのビーズのみを収容できる。シーケンシング酵素をウェルに添加し、ヌクレオチドを一定の順序でウェル上に流す。ヌクレオチド取込みの結果、ピロリン酸が放出され、それが化学発光信号をもたらす反応を触媒する。この信号をＣＣＤカメラにより記録し、ソフトウェアを用いてその信号をＤＮＡ配列に変換する。ｌｌｌｕｍｉｎａ法(Bentley (2008))では、一本鎖状のアダプター供給したフラグメントを光学透明表面に付着させ、“架橋増幅(bridge amplification)”を施す。この操作の結果、それぞれがユニークＤＮＡフラグメントのコピーを含有する数百万のクラスターが得られる。ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、および４種類の標識された可逆性ターミネーターヌクレオチドを添加し、表面をレーザー蛍光によりイメージングして、標識の位置および性質を決定する。次いで保護基を除去し、このプロセスを数サイクル繰り返す。ＳＯＬｉＤ法(Shendure (2005))は４５４シーケンシングに類似し、ＤＮＡフラグメントをビーズの表面で増幅させる。シーケンシングは、標識プローブのライゲーションと検出のサイクルを伴う。ハイスループットシーケンシングのための他の幾つかの手法が現在開発中である。そのような例は、Ｈｅｌｉｃｏｓ  ｓｙｓｔｅｍ(Harris (2008))、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ(Drmanac (2010))およびＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ(Lundquist (2008))である。これはきわめて急速に進歩している技術分野であるので、本発明へのハイスループットシーケンシング法の適用性は当業者に明らかであろう。
【００２８】
核酸（特に、遺伝子、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、およびｓｎｏＲＮＡ）の発現レベルの判定は、多様な周知方法のいずれかにより評価できる。一般に、調製した核酸は下記を含む（ただし、それらに限定されない）ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイに使用できる：サザンまたはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析、たとえば定量ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）、およびプローブアレイ、たとえばＧｅｎｅＣｈｉｐプローブ（商標）  ＤＮＡアレイ（ＡＦＦ  ＹＭＥＴＲＩＸ）。有利には、核酸の発現レベルの分析は、たとえばＲＴ−ＰＣＲ(U. S. Patent No. 4,683,202中に述べられた実験態様)、リガーゼ連鎖反応(BARANY, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.88, p: 189-193, 1991)、自立配列複製(self sustained sequence replication)(GUATELLI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.57, p: 1874-1878, 1990)、転写増幅システム(KWOH et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.86, p: 1173-1177, 1989)、Ｑ−ベータレプリカーゼ(LIZARDI et al., Biol. Technology, vol.6, p: 1197, 1988)、ローリングサークル複製(rolling circle replication) (U. S. Patent No. 5,854,033)、または他のいずれかの核酸増幅法による核酸増幅のプロセス、続いて当業者に周知の手法を用いる増幅分子の検出を伴う。リアルタイム定量または半定量ＲＴ−ＰＣＲが好ましい。特定の態様において、判定は、試料を選択試薬、たとえばプローブまたはプライマーとハイブリダイズさせ、それにより核酸の存在を検出し、あるいはその量を測定することを含む。ハイブリダイゼーションはいずれか適切なデバイス、たとえばプレート、マイクロタイターディッシュ、試験管、ウェル、ガラス、カラムなどにより実施できる。本発明において着目する核酸との配列相補性または相同性を示す核酸は、ハイブリダイゼーションプローブまたは増幅プライマーとして有用である。そのような核酸は同等サイズの相同領域と同一である必要はないが、一般に少なくとも約８０％同一であり、より好ましくは８５％同一であり、よりさらに好ましくは９０〜９５％同一であると解釈される。ある態様において、ハイブリダイゼーションを検出するのに適した手段、たとえば検出可能な標識と組み合わせて、核酸を用いるのが有利であろう。蛍光性、放射性、酵素性または他のリガンド（たとえば、アビジン／ビオチン）を含めて、多様な適切な指示薬が当技術分野で知られている。プローブおよびプライマーは、それらがハイブリダイズする核酸に対して“特異的”である；すなわち、それらは好ましくは高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下（最高の融解温度−Ｔｍ−に相当；たとえば、５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣ；１×ＳＣＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウムである）でハイブリダイズする。多数の定量アッセイがＱｉａｇｅｎ（Ｓ．Ａ．，フランス、クールタボー）またはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（米国フォスターシティー）から市販されている。核酸の発現レベルは、絶対発現プロフィールまたは正規化発現プロフィールとして表わすことができる。一般に、発現プロフィールは、着目する核酸の絶対発現プロフィールを、それの発現と、無関係な核酸、たとえば構成性発現するハウスキーピングｍＲＮＡの発現との比較により補正することによって正規化される。正規化に適したｍＲＮ���には、ハウスキーピングｍＲＮＡ、たとえばＵ６、Ｕ２４、Ｕ４８およびＳ１８が含まれる。この正規化により、１試料、たとえば患者試料における発現プロフィールと他の試料との比較、または異なる供給源からの試料間の比較が可能になる。
【００２９】
プローブおよび／またはプライマーを、一般に検出可能な分子または物質、たとえば蛍光性分子、放射性分子、または当技術分野で既知である他のいずれかの標識で標識する。標識は一般的に信号を発生する（直接または間接的に）ことが知られている。用語“標識された”は、検出可能な物質をカップリングさせること（すなわち、物理的に連結させること）によるプローブおよびプライマーの直接標識化、ならびに直接標識された他の試薬との反応性による間接標識化を包含するものとする。検出可能な物質の例には、放射性物質または蛍光体（たとえば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）またはインドシアニン（Ｃｙ５））が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
本発明の方法は、多能性幹細胞培養物の質を判定し、次いで遺伝子異常を含まない多能性幹細胞を単離するのに特に適切である。この方法は、前記のように遺伝子異常を含まない多能性幹細胞を含有する多能性幹細胞培養物の分解を避けるのに特に適切であり、それを単離および培養することができる。
【００３１】
したがって、本発明は、遺伝子異常を含まない多能性幹細胞を単離するための、下記の工程を含む方法に関する：
ｉ）本発明による方法を実施することにより多能性幹細胞培養物におけるハイパーリカレント配列のレベルを決定する、
ｉｉ）工程ｉ）で決定したレベルを基準値と比較する、
ｉｉｉ）工程ｉ）で決定したレベルが基準値と異なる場合、その多能性幹細胞培養物が遺伝子異常を含まない多能性幹細胞を含有すると結論する、
ｉｖ）遺伝子異常を含まない多能性幹細胞を単離する。
【００３２】
多能性幹細胞を単離する工程は、当技術分野で周知の多様な手法、たとえばｆｌｕｉｄｉｇｍ法により実施できる。
特定の態様において、基準値は実験的、経験的、または理論的に決定できる閾値またはカットオフ値である。閾値は、当業者が認識するように既存の実験条件に基づいて任意に選択することもできる。最適な感度および特異度を得るためには、試験の機能およびベネフィット／リスクバランス（偽陽性と偽陰性の臨床予後）に従った閾値を決定しなければならない。一般に、最適な感度および特異度（したがって、閾値）は、実験データに基づく受信者動作特性(Receiver Operating Characteristic)（ＲＯＣ）曲線を用いて決定できる。好ましくは、当業者は核酸レベル（本発明の方法に従って得られたもの）と決定された閾値を比較することができる。本発明の一態様において、閾値は遺伝子異常を保有する多能性幹細胞培養物において決定された核酸レベル（または比、またはスコア）から誘導される。さらに、適正に寄託された歴史的多能性幹細胞培養物における核酸レベル（または比、またはスコア）の後向き測定値をこれらの閾値の樹立に使用できる。
【００３３】
本発明の方法は、臨床決定に到達するために特に適切である。本明細書中で用いる用語“臨床決定”は、対象の健康状態または生存に影響を及ぼす転帰をもつ行動をとるか否かのいずれかの決定を表わす。特に、本発明に関して、臨床決定は多能性幹細胞を対象に伝達、グラフト、移植するか否かの決定を表わす。臨床決定は、望ましくない表現型を低減する行動をとるためにさらなる試験を実施するという決定を表わすこともできる。よって、特に、前記の方法は遺伝子異常を保有する多能性幹細胞を対象に伝達するのを臨床医が避ける補助になるであろう。前記の方法は、遺伝子異常を保有する多能性幹細胞による対象の汚染を避け、遺伝子異常を保有する多能性幹細胞を対象に伝達することにより引き起こされる悪性疾患などの疾患の発症を避けるためにも特に適切である。前記の方法は、多能性幹細胞を投与することにより投与の必要がある対象を副作用なしに処置するためにも特に適切である。
【００３４】
本明細書中で用いる用語“対象”は哺乳動物を表わす。一般に、本発明による対象は多能性幹細胞移植を用いる再生処置の必要があるいずれかの対象（好ましくはヒト）を表わす。用語“対象”は、他の哺乳動物、たとえば霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、またはマウスをも表わす。特定の態様において、用語“対象”は多能性幹細胞移植を用いる再生処置の必要がある疾患、たとえば脊髄損傷、シュタルガルト黄斑ジストロフィー（ＳＭＤ）、委縮型（ドライ型）加齢黄斑変性、Ｉ型糖尿病、心血管障害、たとえば心不全、進行シュタルガルト病、滲出型（湿潤型）加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、筋ジストロフィー、神経および網膜の疾患、肝疾患、ならびに糖尿病に罹患しているかあるいは罹患しやすい対象を表わす。
【００３５】
したがって、本発明の方法は、多能性幹細胞が対象への健全な伝達、グラフト、移植を行なう能力の評価を可能にする。本発明の方法は、対象に伝達、グラフト、移植できる多能性幹細胞の遺伝子検査および選択を可能にする。
【００３６】
本発明の方法を実施することにより選択された多能性幹細胞およびそれに由来する分化した細胞を再生医療に利用できる。用語“再生医療”はそれの一般的な意味をもち、年齢、疾患、損傷、または先天的欠損のため失われた細胞、組織または臓器の機能を修復または置換するために、生きている機能性細胞および組織を作製するプロセスに関係する再生処置を表わす。
【００３７】
したがって、本発明はまた、多能性幹細胞またはそれに由来する分化した細胞を再生処置の必要がある対象に移植するための、下記の工程を含む方法に関する：ｉ）本発明による方法を実施する、ｉｉ）遺伝子異常を含まない多能性幹細胞を選択する、そしてｉｉｉ）工程ｉｉ）で選択した多能性幹細胞またはそれに由来する分化した細胞を対象に投与する。
【００３８】
さらなる側面において、本発明は再生処置の必要がある対象において、遺伝子異常を伝達するリスクを最小限にして、多能性幹細胞移植を用いて疾患を処置するために特に適切である。本発明の方法は、再生処置の必要がある対象において、遺伝子異常を保有する多能性幹細胞の移植により引き起こされる悪性疾患などの疾患のリスクを最小限にして、多能性幹細胞移植を用いて疾患を処置するためにも適切である。
【００３９】
したがって、本発明はまた、対象において再生処置の必要がある疾患を処置するための、下記の工程を含む方法に関する：ｉ）本発明による方法を実施する、ｉｉ）遺伝子異常を含まない多能性幹細胞を選択する、そしてｉｉｉ）工程ｉｉ）で選択した多能性幹細胞またはそれに由来する分化した細胞を対象に投与する。
【００４０】
さらなる側面において、本発明は、その必要がある対象において再生処置に対する応答を増強するための、下記の工程を含む方法に関する：ｉ）本発明による方法を実施する、ｉｉ）遺伝子異常を含まない多能性幹細胞を選択する、そしてｉｉｉ）工程ｉｉ）で選択した多能性幹細胞またはそれに由来する分化した細胞を対象に投与する。
【００４１】
本発明はまた、前記の方法を実施するためのキットに関するものであり、その際、キットは核酸抽出物における少なくとも１つの遺伝子異常の存在および／またはレベルを決定するための手段を含む。一般に、キットは前記のプローブ、プライマー、マクロアレイまたはマイクロアレイを含む。たとえば、キットは前記に定めた一組のプローブを含むことができ、それらは予め標識されていてもよい。あるいは、プローブは標識されていなくてもよく、標識化のための成分がキット内の別の容器に収容されていてもよい。キットはさらに、そのハイブリダイゼーションプロトコルに必要なハイブリダイゼーション試薬または適切にパッケージされた他の試薬および材料（必要ならば、固相マトリックスを含む）、ならびに標準品を含むことができる。あるいは、本発明のキットは増幅プライマー（たとえば、ステム−ループプライマー）を含むことができ、それらは予め標識されていてもよく、あるいはアフィニティー精製部分または付着部分を含むことができる。キットはさらに、その増幅プロトコルに必要な増幅試薬ならびに適切にパッケージされた他の試薬および材料を含むことができる。キットはさらに、増幅が起きたかどうかを判定するために必要な手段を含むことができる。キットは、たとえばＰＣＲ緩衝液および酵素；陽性対照配列、反応制御プライマー；ならびに特定の配列を増幅および検出するための指示を含むこともできる。
【００４２】
本発明をさらに、下記の図面および実施例により説明する。ただし、これらの実施例および図面は決して本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【００４３】
実施例１：
方法：
ｈＰＳＣの培養および上清採集
ヒトＰＳＣ（ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣ）をＧｅｌｔｒｅｘ（商標）上の３５−ｍｍウェル内において、ゼノフリー（異種動物由来成分不含）(xeno-free)完全合成培地(completely defined medium)（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（商標）培地）の存在下で培養した。細胞を機械的に解離させてバルク培養で増殖させるか、あるいは酵素により解離させて単細胞継代に適合させた。培地を毎日交換した。ｈＰＳＣを含まない培地を対照としてインキュベートした。ＰＳＣのルーティン継代の直前に各ウェルから１ｍｌの上清（ｈＰＳＣ調整培地）を採集し、直ちに無菌の、ＤＮＡ−、ＤＮａｓｅ−、ＲＮａｓｅ−、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）阻害剤−不含のチューブに入れて凍結し、核酸精製まで−８０℃に保存した。外来ＤＮＡによる試料汚染を阻止するために適切な注意を払った。
【００４４】
核酸精製
２００μｌの上清から、ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ、ヒルデン）を用い、調製プロトコルに従って、核酸を抽出した。要約すると、２０μｌのプロテアーゼＫおよび２００μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＡＬをそれぞれの上清に添加した。１５秒間のパルスボルテックス撹拌の後、細胞溶解混合物を５６℃で１０分間、エッペンドルフチューブ（１．５ｍｌ）内でインキュベートした。高温での高度変性条件がいずれの結合タンパク質からの核酸の完全放出にも好ましかった。２００μｌの冷エタノール（１００％）を溶解物に添加した後、試料をＱＩＡａｍｐ  Ｍｉｎｉカラム上へ移した。溶解物を６０００ｇで１分間の遠心により引き出すのに伴って、セルフリー核酸がメンブレンに吸着した。夾雑物は２回の洗浄工程（Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＷ１およびＢｕｆｆｅｒ  ＡＷ２中での）に際して効率的に洗浄除去された。最後に、セルフリー核酸を３０μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＡＥ中に溶離し、−２０℃で保存した。
【００４５】
セルフリー核酸（ｃｆＮＡ）の定量
それぞれの上清中のｃｆＮＡの濃度を、定量ＰＣＲ法（ＬＣ４８０，Ｒｏｃｈｅ）により決定した対応するＡＬＵ−１１５  ＰＣＲ生成物の濃度に対比して評価した。この目的のために、市販の２×  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ドイツ）ならびにUmetani et al. (2006)に記載されたフォワードおよびリバースＡＬＵ−プライマー０．２５μＭを含有する総体積１０μＬの反応混合物に、１μｌの各ｃｆＮＡ溶出試料を添加した。ＥｐＭｏｔｉｏｎ  ５０７０リキッドハンドリングワークステーション（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）により、反応を白色９６ウェルプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内に設定した。すべての反応を三重に実施した。陰性対照（ＲＮＡｓｅ／ＤＮＡｓｅを含まない水）をそれぞれの実験に含めた。ｈＰＳＣから直接抽出したゲノム核酸の連続希釈液により得られた標準曲線を用いて、上清中のｃｆＮＡ濃度を決定した。
【００４６】
ｃｆＮＡにおけるデジタルドロップレットＰＣＲ(digital droplet PCR)システム（ｄｄＰＣＲ）を用いるＣＮＶ検出
ｄｄＰＣＲアッセイを先に記載されたように(Abyzov et al. 2002)実施した。要約すると、ｄｄＰＣＲワークフローは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ指示（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＱＸ２００システム）に従った、反応の設定、ドロップレットの作成、サーマルサイクリングおよびドロップレットリーダー上の走行からなる。ｄｄＰＣＲは、蛍光標識した内部ハイブリダイゼーションプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）をｃｆＮＡにおけるＣＮＶの検出に利用する。反応は普通は着目する領域（たとえば：ＣＮＶ−ＩＤ１，ｄＨｓａＣＰ２５０６３１９）をターゲティングする１プライマー対およびいずれかの基準遺伝子（たとえば：ＲＰＰ３０，ｄＨｓａＣＰ２５００３５０）をターゲティングする第２プライマー対を用いて設定される。これら２プライマー（ターゲットおよび基準）は異なる蛍光体（ＦＡＭおよびＨＥＸ）で標識されている。それぞれの上清からのｃｆＮＡの装入物をＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ反応混合物に添加した。そのような反応混合物は、ｄｄＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  Ｎｏ  ｄＵＴＰ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｅｆ：１８６３０２３）およびプライマーを、最終体積２０μｌ中に含有していた。構築した各ｄｄＰＣＲ反応混合物を次いで８チャネルディスポーザブルドロップレット発生装置カートリッジ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｅｆ：１８６４００８）の試料ウェルに装填した。体積６０μＬのドロップレット発生オイル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｅｆ：１８６３００５）を、各チャネル用のオイルウェルに装填した。カートリッジをドロップレット発生装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）内へ配置した。カートリッジをドロップレット発生装置から取り出し、ドロップレットウェル内に採集されたドロップレットを次いでマルチチャネルピペットにより手動で９６ウェルＰＣＲプレートに移した。プレートにホイルシールをヒートシールし、次いで一般的なサーマルサイクラーに乗せ、エンドポイントまで増幅させた（４０〜５０サイクル）。マイクロフルイディクス技術を用いて、反応ミックスをオイル表面とＰＣＲ反応ミックスを含有する水性コアとから構成される球状ドロップレットに分割する。ドロップレットにサーマルサイクリングを施す。増幅の後、各ドロップレットの蛍光をドロップレットリーダーによって連続的に読み取る。着目するターゲット領域または基準を含有するドロップレット（陽性ドロップレット）は対応するチャネルにおいて蛍光を発生し、一方、ターゲットを含まないもの（陰性ドロップレット）は蛍光を発生しない。各ターゲットについての陽性および陰性ドロップレットのカウントは、ポアソン分布(Poisson distribution)により試料中のターゲットの濃度に関係する。
【００４７】
結果：
自己複製によって永続するけれども分化して特定組織の成熟細胞になることができる多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、再生医療の鍵となるツールである。再生医療は、損傷または罹患した細胞、組織および臓器を身体が修復、置換、復元および再生するのを可能にする革新的医療についての幅広い定義である。しかし、細胞培養は、幹細胞の特性を変化させるかあるいはそれらに腫瘍形成の素因をもたらす可能性のあるエピジェネティック異常および遺伝子異常を生じる可能性がある。ＰＳＣの臨床使用が急速に拡大するのに伴って、細胞増殖中およびバッチをリリースする前の多能性幹細胞（ＰＳＣ）を特性判定するためのツールを改良する好機である。
【００４８】
現在、培養多能性幹細胞の遺伝子の完全性を評価するための信頼できる市販の遺伝学的および非侵襲的な方法はない。本発明は、培養ＰＳＣが増殖している際に採集した上清中に存在するＤＮＡの遺伝子異常を検出する工程を含む、培養ｈＰＳＣのゲノムの完全性を評価するための方法に関する。
【００４９】
本発明者らはｈＰＳＣ中に、培養ｈＰＳＣ不安定性のバイオマーカーである一組の“ハイパーリカレント配列”を決定し（表１）、幹細胞を培養中および臨床使用前にルーティンに評価するために使用できる迅速で実施しやすい試験を提唱する（図１）。
【００５０】
ｈＰＳＣ培養中に起きる反回性の遺伝子変化
本発明者らは、核型解析、ＦＩＳＨ、マイクロアレイ解析（ＳＮＰ、ａＣＧＨ）またはＮＧＳにより得られた、あらゆるタイプのゲノム異常の視覚化に貢献するためのデータベース“ＳＥＡｄｂ”を開発した。ＳＥＡｄｂは下記のリンクを介してアクセスできる：seadb.org (ログイン: seadb and pwd: SEAdb)。本発明者らは４０００００を超える異常およびバリアントについて異常を収集した。
【００５１】
本発明者らは、ｈＰＳＣ培養に際して起きる大部分の反回性遺伝子変化は＞１Ｍｂの核型異常およびコピー数バリエーション（ＣＮＶ）であることを示した（図２）。
これと対照的に、より小さな遺伝子異常、たとえば変異(mutation)およびｉｎｄｅｌは、ほとんど反回性ではない。＞１Ｍｂの遺伝子変化がＳＥＡｄｂに１１７１存在する。本発明者らは、ＰＳＣ培養によって誘発されるゲノム修飾を最も受けやすいゲノム上の位置の同定を補助する反回性スコア(recurrency score)を選定した。たとえば、＞１Ｍｂの遺伝子変化の大部分を宿している２１の染色体について、本発明者らは表１の４０組の配列（Ｓｏｎｄｅｓ：Ｓ１−Ｓ４０）が染色体異常の９３，５％に及ぶことを示した（図３）。
【００５２】
病原性配列を検出するためのＤＮＡ源としての細胞培養上清
培養幹細胞のゲノムの完全性を評価するための主な制約は、試験を実施するために培養試料を破壊する必要があることである。したがって、本発明者らは細胞培養上清についてゲノムの完全性を調べることができると提唱する。
【００５３】
実際に、細胞培養上清は、ゲノムＤＮＡより低い分子量をもつ二本鎖分子である短いフラグメント（７０〜２００塩基対の長さ）または最大２１ｋｂの長いフラグメントの形のセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含有する。ｃｆＤＮＡ放出のメカニズムはほとんど分かっていないが、壊死、アポトーシス、食作用または能動放出が役割をもつとが示唆されている(Choi et al., 2005; Gahan et al., 2008; Stroun et al., 2001)。
【００５４】
ｃｆＤＮＡは血清または血漿中に存在し、染色体異常を調べるための非侵襲的試験に用いられる(Hui and Bianchi, 2013)。特定の胎児性異数体、たとえばトリソミー１３、１８または２１を、母体血清試料由来のセルフリー胎児性ＤＮＡ中に検出できることが立証された(Dan et al., 2012; Fairbrother et al., 2013; Nicolaides et al., 2014)。さらに母体血漿中の胎児性ｃｆＤＮＡは、ターゲット領域キャプチャーシーケンシング(target region capture sequencing)を用いて病原性のコピー数バリエーション（ＣＮＶ）を検出するためにも用いられる(Ge et al., 2013)。
【００５５】
ｃｆＤＮＡは種々の体液（血清、血漿）中に放出され、病原性ＣＮＶを検出するために使用できるという知見に基づいて、本発明者らは、病原性ＣＮＶを検出し、ｈＰＳＣの非侵襲的分析を実施するための供給源として、細胞破壊を避けて上清中に存在するＤＮＡを使用することを提唱する。
【００５６】
幹細胞上清中の外来ＤＮＡ供給源の可能性を評価するために、本発明者らはＡＬＵリピートの定量リアルタイムＰＣＲを用いる(Umetani et al., 2006)。２つのｈＥＳＣからの２つの上清における総ｃｆＤＮＡのＡＬＵ−ｑＰＣＲによる定量（三重）は、ｃｆＤＮＡがすべての被験試料中に検出され、測定されたｃｆＤＮＡ濃度は３３０ｐｇ〜１１０ｐｇであることを明白に示した（図４）。
【００５７】
これらの結果はｈＰＳＣ上清がセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含有することを立証する；それはおそらく死細胞からの遺伝子材料の放出および浮動している生細胞から生じるのであろう。ｈＰＳＣ上清中に放出されたｃｆＤＮＡの検出は、配列バイオマーカーを用いる遺伝子異常評価を容易にするためのまだ探査されていないツールである。
【００５８】
用語“培地”は、細胞を培養、生長または増殖させるための栄養素溶液に関係する。用語“細胞培養物”は、人工的なインビトロ環境で維持、培養または生長している細胞を表わす。
【００５９】
用語“ＣＮＶ”は、ＤＮＡの１以上のセクションのコピー数の、異常な、またはある遺伝子については正常なバリエーションをもつ細胞を生じる、ゲノムＤＮＡの変化に関係する。ＣＮＶは、特定の染色体上の欠失した（正常数より少ない）または重複した（正常数より多い）比較的大きなゲノム領域に対応する。
【００６０】
実施例２：
方法：
核型判定
ヒト多能性幹細胞をＴｒｙＰＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で解離させ、３日間増殖させて、中間指数期に到達させた。次いで中期停止のために単細胞を１／１０，０００  ＫａｒｙｏＭＡＸ（登録商標）  Ｃｏｌｃｅｍｉｄ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に９０分間インキュベートした後、０．０７５Ｍ  ＫＣｌ溶液で３７℃において２０分間、低張膨潤させ、氷冷したメタノール／氷酢酸（３：１，ｖｏｌ／ｖｏｌ）中で連続３回固定した。２０マイクロリットルの核懸濁液をガラススライド上に滴下し、１８．４℃および湿度６０％で風乾し、水中で５分間、再水和した後、ＥＡＲＬＥオレンジまたは１０×ＥＢＳＳ中において８７℃で５５分間変性させた。次いでスライドを冷水中ですすぎ、３％  ＧＩＥＭＳＡで３分間染色し、５回すすぎ、風乾させた。Ｍｅｔａｆｅｒ  Ｓｌｉｄｅ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ（ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍ）を用いてスペクトル鏡検および分析を実施した。
【００６１】
ｄｄＰＣＲデータの解析および統計
ターゲット特異的アッセイ（ｄＨｓａＣＰ２５０６３１９）についての蛍光を記録しているドロップレットの数を、基準特異的アッセイ（ｄＨｓａＣＰ２５００３５０）について得られたカウントと比較した。製造業者のＱｕａｎｔａＳｏｆｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，米国カリフォルニア州）を用い、ポアソン統計を適用することにより、最終コピー数を計算した：
λ＝ｌｎ（１−ｐ）
ここで、“λ”はドロップレット当たりの平均コピー数であり、“ｐ”はドロップレットの総数に対する陽性ドロップレットの比である。
【００６２】
結果：
ｄｄＰＣＲ法を用いるｈＰＳＣ上清における遺伝子の完全性の評価：ルーティンスクリーニングに適用
遺伝子の完全性のスクリーニングの評価は、ｈＰＳＣ上清中のｃｆＤＮＡを検査することにより可能である。本発明者らは２つの異数体ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）系列ＨＤ１２９およびＨＤ２９１を用いてこの試験の実施可能性を確認した。一般的なＲ−バンド核型判定により判定して、ＨＤ１２９はリソミー２０（４７，ＸＹ，＋２０）を示し、一方、ＨＤ２９１はトリソミー１２（４７，ＸＹ，＋１２）を示した。本発明者らの特定のハイパーリカレント配列を用いるトリソミー２０分析およびｄｄＰＣＲ法のために、それぞれ対応する細胞および上清を採集した。図５に示すように、（ｉ）ＨＤ１２９  ｈＰＳＣ系列についてはｄｄＰＣＲ法を用いてｈＰＳＣ上清中にゲノム異常（この場合はトリソミー２０）が検出されるが、ＨＤ２９１系列には検出されず、これにより核型の結果が確認される、（ｉｉ）上清からの遺伝子異常スクリーニング結果と対応する核型との間に相関性がみられ、これは多能性幹細胞の遺伝子の完全性を評価するために上清中に存在するｃｆＮＡを使用できるという概念の証拠を立証する。上清を用いることによる幹細胞スクリーニングの利点は、破壊せずに幹細胞の遺伝子の完全性を評価できることであろう。さらに、ドロップレットディジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）に基づくこの簡単な方法の使用によって、培養上清を含めて少量の材料から迅速、効率的かつ容易にｈＰＳＣ系列をスクリーニングすることが可能になる。これらの有益性は、この方法をルーティン利用の可能性をもたらす、より魅力的なものにすることができる。最後に、本発明者らの方法は、遺伝子の完全性の検査のために厳密なゲノム解析が要求される他のいかなる実験にも適用できる（たとえば：間葉幹細胞（ＭＳＣ）などを含む多能性幹細胞、生殖細胞、リンパ球、胚、または体細胞）。
【００６３】
確実な検査のための核酸の最小濃度
ｈＰＳＣ系列ＨＤ１２９から採集した上清から抽出した種々の濃度の核酸（１，１ｎｇ／μＬ，０，４ｎｇ／μＬ，０，１ｎｇ／μＬ，３，７ｐｇ／μＬ，１，１ｐｇ／μＬ，０，４ｐｇ／μＬ）を試験することにより、ｄｄＰＣＲを用いるトリソミー２０配列検出の感度を評価した。図６に示すように、きわめて低い濃度（０，１ｎｇ／μＬの低さ）ではあるがなお信頼できるスクリーニング結果を得るのに十分である濃度から得られた信号間にトリソミー２０信号が検出された。
【００６４】
参考文献
この出願全体において、種々の参考文献が本発明に関係する分野の技術水準を記載している。これらの参考文献の開示内容を本明細書に援用する。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年5月10日(2018.5.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞又はそれに由来する分化した細胞の質を判定するための下記の工程を含むインビトロ非侵襲的方法：ｉ）幹細胞が増殖している培養試料を用意する、ｉｉ）該培養試料の上清から核酸を抽出する、そしてｉｉｉ）核酸抽出物における少なくとも１つの遺伝子異常の存在および／またはレベルを判定する。
【請求項２】
幹細胞が多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
核酸抽出物における表１から選択される少なくとも１つのハイパーリカレント配列の中に遺伝子異常の存在を判定する工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
幹細胞が間葉幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
幹細胞が造血幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
幹細胞に由来する分化した細胞がリンパ球である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
遺伝子異常をＰＣＲにより検出する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＰＣＲがディジタルドロップレットＰＣＲである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
遺伝子異常を次世代シーケンシングにより検出する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子異常をマイクロアレイ解析により検出する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
移植方法において使用するための幹細胞またはそれに由来する分化した細胞であって、該方法が下記の工程：
ｉ）請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法を実施する工程、
ｉｉ）遺伝子異常を含まない幹細胞を選択する工程、および
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で選択した幹細胞またはそれに由来する分化した細胞を再生処置の必要がある対象に投与する工程、
を含む、上記幹細胞またはそれに由来する分化した細胞。
【請求項１２】
対象において再生処置の必要がある疾患を処置するための方法において使用するための幹細胞であって、該方法が下記の工程：
ｉ）請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法を実施する工程、
ｉｉ）遺伝子異常を含まない幹細胞を選択する工程、および
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で選択した幹細胞またはそれに由来する分化した細胞を対象に投与する工程、
を含む、上記幹細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
確実な検査のための核酸の最小濃度
ｈＰＳＣ系列ＨＤ１２９から採集した上清から抽出した種々の濃度の核酸（１，１ｎｇ／μＬ，０，４ｎｇ／μＬ，０，１ｎｇ／μＬ，３，７ｐｇ／μＬ，１，１ｐｇ／μＬ，０，４ｐｇ／μＬ）を試験することにより、ｄｄＰＣＲを用いるトリソミー２０配列検出の感度を評価した。図６に示すように、きわめて低い濃度（０，１ｎｇ／μＬの低さ）ではあるがなお信頼できるスクリーニング結果を得るのに十分である濃度から得られた信号間にトリソミー２０信号が検出された。
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
［態様１］多能性幹細胞の質を判定するための下記の工程を含むインビトロ非侵襲的方法：ｉ）多能性幹細胞が増殖している培養試料を用意する、ｉｉ）試料から核酸を抽出する、そしてｉｉｉ）核酸抽出物における少なくとも１つの遺伝子異常の存在および／またはレベルを判定する。
［態様２］ｉ）核酸抽出物における、表１から選択される少なくとも１つのハイパーリカレント配列の存在を判定する、そしてｉｉ）少なくとも１つのハイパーリカレント配列が検出された場合、多能性幹細胞が遺伝子異常を保有すると結論する工程を含む、態様１に記載の方法。
［態様３］遺伝子異常を含まない多能性幹細胞を単離するための、下記の工程を含む方法：
ｉ）態様２に記載の方法を実施することにより多能性幹細胞培養物におけるハイパーリカレント配列のレベルを決定する、
ｉｉ）工程ｉ）で決定したレベルを基準値と比較する、
ｉｉｉ）工程ｉ）で決定したレベルが基準値と異なる場合、該多能性幹細胞培養物が、遺伝子異常を含まない多能性幹細胞を含有すると結論する、および
ｉｖ）遺伝子異常を含まない多能性幹細胞を単離する。
［態様４］多能性幹細胞またはそれに由来する分化した細胞を再生処置の必要がある対象に移植するための、下記の工程を含む方法：ｉ）態様１〜３のいずれか１に記載の方法を実施する、ｉｉ）遺伝子異常を含まない多能性幹細胞を選択する、そしてｉｉｉ）工程ｉｉ）で選択した多能性幹細胞またはそれに由来する分化した細胞を対象に投与する。
［態様５］対象において再生処置の必要がある疾患を処置するための、下記の工程を含む方法：ｉ）態様１〜３のいずれか１に記載の方法を実施する、ｉｉ）遺伝子異常を含まない多能性幹細胞を選択する、そしてｉｉｉ）工程ｉｉ）で選択した多能性幹細胞またはそれに由来する分化した細胞を対象に投与する。
【国際調査報告】
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