(57)【要約】ナノ粒子摂取によりフェロトーシスを経て誘導された細胞死の方法が、本明細書に記載される。さらに、本開示は、栄養枯渇環境と組み合わせた処置期間中の複数回の極小ナノ粒子の高濃度の投与、それにより、細胞性代謝経路を調節して、フェロトーシスという機構により細胞死を誘導することについて記載する。フェロトーシスは、鉄、反応性酸素種、および同期モードの細胞死実行を含む。一局面において、腫瘍組織における十分に高い濃度での蓄積のためにナノ粒子を投与し、フェロトーシス（例えば、鉄依存性壊死または反応性酸素種依存性壊死を含むフェロトーシス細胞死）を誘導するステップを含む、被験体の処置方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍組織における十分に高い濃度での蓄積のためにナノ粒子を投与し、フェロトーシス（例えば、鉄依存性壊死または反応性酸素種依存性壊死を含むフェロトーシス細胞死）を誘導するステップ
を含む、被験体の処置方法。
【請求項２】
前記ナノ粒子が極小ナノ粒子（例えば、Ｃドット、例えばＣ’ドット）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記高い濃度が、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記高い濃度が、前記腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である（例えば、前記高い濃度が、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの前記腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、前記ナノ粒子がシリカをベースとしており、例えば、前記ナノ粒子がＣドットまたはＣ’ドットである）、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記腫瘍組織が、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記腫瘍組織がフェロトーシスの誘導に感作されている、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
腫瘍組織への輸送（および／または腫瘍組織における蓄積）のために薬物を投与するステップ；および
（フェロトーシスを誘導するために）前記腫瘍組織における十分に高い濃度での蓄積のためにナノ粒子を投与するステップ
を含む、被験体の組み合わせ処置の方法。
【請求項８】
前記薬物が化学療法剤（例えば、ＴＡＳ−１０２）を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ナノ粒子が極小ナノ粒子（例えば、Ｃドット、例えばＣ’ドット）を含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記高い濃度が、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記高い濃度が、前記腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である（例えば、前記高い濃度は、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの前記腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、前記ナノ粒子はシリカをベースとしており、例えば、前記ナノ粒子はＣドットまたはＣ’ドットである）、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記腫瘍組織が、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍組織がフェロトーシスの誘導に感作されている、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬物を投与するステップおよび前記ナノ粒子を投与するステップが、前記薬物および前記ナノ粒子の両方を含む組成物を投与することによって達成される、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物がナノ粒子薬物コンジュゲートを含む、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
腫瘍組織（例えば、前立腺がん組織）からホルモンを欠乏させるステップ；および
前記腫瘍組織における十分に高い濃度での蓄積のためにナノ粒子を投与し、フェロトーシスを誘導するステップ
を含む、被験体の組み合わせ処置の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍組織が去勢（例えば、化学的去勢）を経てホルモンを欠乏させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ナノ粒子が極小ナノ粒子（例えば、Ｃドット、例えばＣ’ドット）を含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記高い濃度が、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記高い濃度が、前記腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である（例えば、前記高い濃度は、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの前記腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、前記ナノ粒子はシリカをベースとしており、例えば、前記ナノ粒子はＣドットまたはＣ’ドットである）、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記腫瘍組織が、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記腫瘍組織がフェロトーシスの誘導に感作されている、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記腫瘍組織が、腎臓、前立腺、メラノーマ、膵臓、肺、線維肉腫、乳房、脳、卵巣および結腸腫瘍組織からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記膵臓腫瘍組織がＢｘＰＣ３細胞を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記肺腫瘍組織がＨ１６５０細胞を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ナノ粒子が１５ｎｍ以下の平均直径を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ナノ粒子が１０ｎｍ以下の平均直径を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ナノ粒子が約５ｎｍから約７ｎｍ（例えば、約６ｎｍ）の平均直径を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ナノ粒子が１から２０個の標的化部分を含み、前記標的化部分が腫瘍細胞上の受容体に結合する（例えば、前記ナノ粒子が、１５ｎｍ以下、例えば１０ｎｍ以下、例えば約５ｎｍから約７ｎｍ、例えば約６ｎｍの平均直径を有する）、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
１から２０個の前記標的化部分がアルファ−メラニン細胞刺激ホルモン（αＭＳＨ）を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ナノ粒子が標的化部分（例えば、αＭＳＨ）を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ナノ粒子が処置の過程にわたって複数回投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
処置の過程にわたって前記ナノ粒子を３または４日ごとに投与するステップをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
投与される前記ナノ粒子に薬物（例えば、化学療法剤）が付着している、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記薬物がリンカー部分を介して付着している（例えば、共有結合または非共有結合で付着している）、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
がん処置および／または組織修復プロセス（例えば、創傷治癒）においてＣドットの治療能力を増加させるために、薬物送達が、投与される前記ナノ粒子の天然の免疫調節特性と組み合わされる（例えば、前記ナノ粒子がα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを含む、例えば、α−ＭＳＨが前記ナノ粒子の表面に結合している）（例えば、前記ナノ粒子が有機ポリマーコーティング（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含む）、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
被験体を処置する方法で使用するためのナノ粒子（例えば、極小ナノ粒子、例えばＣドット、例えばＣ’ドット）を含む組成物であって、
前記処置が、腫瘍組織における十分に高い濃度（例えば、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える）での蓄積のために前記被験体の腫瘍組織に前記組成物を送達し、フェロトーシスを誘導することを含む（例えば、前記高い濃度が前記腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である）（例えば、前記高い濃度が、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの前記腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、前記ナノ粒子がシリカをベースとしており、例えば、前記ナノ粒子がＣドットまたはＣ’ドットである）（例えば、前記腫瘍組織が、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）か、またはその他の点でフェロトーシスの誘導に対して感受性である）、組成物。
【請求項３８】
療法で使用するためにフェロトーシスを誘導するために、腫瘍組織における十分に高い濃度（例えば、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える）での蓄積のためのナノ粒子（例えば、極小ナノ粒子、例えばＣドット、例えばＣ’ドット）を含む（例えば、前記高い濃度が前記腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である）（例えば、前記高い濃度が、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの前記腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、前記ナノ粒子がシリカをベースとしており、例えば、前記ナノ粒子がＣドットまたはＣ’ドットである）（例えば、前記腫瘍組織が、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）か、またはその他の点でフェロトーシスの誘導に対して感受性である）組成物。
【請求項３９】
被験体を処置する方法で使用するための薬物（例えば、化学療法剤、例えばＴＡＳ１０２）を含む第１の組成物およびナノ粒子（例えば、極小ナノ粒子、例えばＣドット、例えばＣ’ドット）を含む第２の組成物であって、
前記処置が、
前記被験体の腫瘍組織への輸送（および／または腫瘍組織における蓄積）のために前記第１の組成物を送達すること；ならびに
腫瘍組織における十分に高い濃度（例えば、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える）での蓄積のために前記被験体の前記腫瘍組織に前記第２の組成物を送達し（例えば、前記高い濃度が前記腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である）（例えば、前記高い濃度が、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの前記腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、前記ナノ粒子がシリカをベースとしており、例えば、前記ナノ粒子がＣドットまたはＣ’ドットである）（例えば、前記腫瘍組織が、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）か、またはその他の点でフェロトーシスの誘導に対して感受性である）、フェロトーシスを誘導すること
を含む、第１の組成物および第２の組成物。
【請求項４０】
療法で使用するための、フェロトーシスを誘導するために、被験体の腫瘍組織への輸送（および／または腫瘍組織における蓄積）のための薬物（例えば、任意の化学療法剤、例えばＴＡＳ１０２）を含む第１の組成物；
および腫瘍組織における十分に高い濃度（例えば、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える）での蓄積のためのナノ粒子（例えば、極小ナノ粒子、例えばＣドット、例えばＣ’ドット）を含む第２の組成物（例えば、前記高い濃度が前記腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である）（例えば、前記高い濃度が、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの前記腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、前記ナノ粒子がシリカをベースとしており、例えば、前記ナノ粒子がＣドットまたはＣ’ドットである）（例えば、前記腫瘍組織が、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）か、またはその他の点でフェロトーシスの誘導に対して感受性である）。
【請求項４１】
被験体を処置する方法で使用するためのナノ粒子（例えば、極小ナノ粒子、例えばＣドット、例えばＣ’ドット）を含む組成物であって、
前記処置が、
前記被験体の腫瘍組織（例えば、前立腺組織）からホルモン（例えば、去勢（例えば、化学的去勢）を経て）を欠乏させること；および
腫瘍組織における十分に高い濃度（例えば、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える）での蓄積のために前記被験体の前記腫瘍組織に前記組成物を送達し（例えば、前記高い濃度が前記腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である）（例えば、前記高い濃度が、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの前記腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、前記ナノ粒子がシリカをベースとしており、例えば、前記ナノ粒子がＣドットまたはＣ’ドットである）（例えば、前記腫瘍組織が、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）か、またはその他の点でフェロトーシスの誘導に対して感受性である）、フェロトーシスを誘導すること
を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１５年５月２９日に出願された米国出願第６２／１６８，６３６号および２０１６年１月２０日に出願された米国出願第６２／２８０，９６０号（これらの開示は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
政府の支援
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）／Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒによって付与された助成金１Ｕ５４  ＣＡ１９９０８１−０１、Ｒ０１ＧＭ１１１３５０および１Ｒ０１ＣＡ１６１２８０−０１Ａ１の下、政府の支援を受けてなされた。
【０００３】
本発明は、分子レベルの相互作用を調節するための、ナノ粒子、例えば極小ナノ粒子の使用に一般的に関する（例えば、細胞性／非細胞性機能、例えば、細胞死）。特定の実施形態では、本発明は、フェロトーシス（ｆｅｒｒｏｐｔｏｓｉｓ）を経て栄養欠乏がん細胞で細胞死を選択的に誘導するための、極小ナノ粒子（例えば、ＣまたはＣ’ドット）を用いる処置の方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
高度に統合されたがん標的化ナノ医薬の設計および開発は、疾患特異的標的化を増強し、細胞内薬理学的標的へのアクセスを改善する見込みがある。しかし、生体系でのナノ医薬の消長を推進する分子レベルの相互作用（例えば、細胞性／非細胞性機能の調節）の詳細な理解は、捉えどころがないままである。例えば、エンドサイトーシスと細胞内輸送、生理的および／または代謝経路の間の複雑な相互作用、ならびに標的化ナノ粒子がこれらの複雑な系をナビゲートする方法は、ホメオスタシス調節にとって重要である可能性がある。さらに、この相互作用は、粒子プローブの特性、周囲の生物学的状態および疾患自体の性質のために異なることがある。さらに、粒子取り込みおよび特異的細胞内コンパートメントの中の蓄積は、機能的、代謝的および／またはエネルギーホメオスタシスを変更することができる。例えば、エンドサイトーシスおよび細胞内輸送を起こすいくつかの粒子ベースのプローブが、オートファジーを誘導し、リソソーム機能を阻害することが示されている。しかし、これらの効果が細胞生存を経時的に調節する方法は、不明なままである。
【０００５】
ＰＥＴ放射性標識およびインテグリン標的化ペプチドシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ）（ｃＲＧＤＹ）で前に表面適応された極小（例えば、２０ｎｍ以下、例えば１５ｎｍ以下、例えば１０ｎｍ以下の直径を有する）のＦＤＡ承認蛍光性有機シリカ粒子（Ｃドット）は、ヒトで作用する分子がん造影剤であることが見出された。例えば、Ｃドットは、小動物およびより大きな動物およびヒト被験体のメラノーマモデルでαｖβ３インテグリンを発現する一次および／または転移性病変の中に優先的に蓄積することに加えて、大半の腎臓クリアランスを実証することが示された。Ｃドットに関する詳細は、米国特許第８２９８６７７Ｂ２「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｉｌｉｃａ−ｂａｓｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」、米国特許出願公開第２０１３／００３９８４８Ａ１「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｉｌｉｃａ−ｂａｓｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」および米国特許出願公開第２０１４／０２４８２１０Ａ１「Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ  ｓｉｌｉｃａ−ｂａｓｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」に記載され、それらの内容は参照により完全に本明細書に組み込まれる。さらに、１４ｍｅｒペプチド類似体、アルファ−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）でさらに表面改変された、１０ｎｍ未満の範囲に下方制御可能な直径を有する、Ｃ’ドットと呼ばれる極小ポリ（エチレングリコール）でコーティングされた（ＰＥＧ化）近赤外（ＮＩＲ）蛍光性シリカナノ粒子は、悪性メラノーマ細胞で発現されるメラノコルチン−１受容体（ＭＣ１−Ｒ）を標的にすることが見出された。しかし、これらの粒子がどのように細胞機能および細胞内輸送を調節することができるかについて、未知のままである。
したがって、適用特異的ナノ医薬（例えば、ＣおよびＣ’ドット）プラットフォームの設計を改善するために、濃度および時系列過程の変動が粒子ベースのプローブの内部移行後の消長にどのように影響を与えるか決定する必要性がまだある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第８，２９８，６７７号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１３／００３９８４８号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１４／０２４８２１０号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ナノ粒子摂取によりフェロトーシスを経て誘導された細胞死の方法が、本明細書に記載される。さらに、本開示は、栄養枯渇環境と組み合わせた、処置の過程にわたって複数回の極小（例えば、２０ｎｍ以下、例えば１５ｎｍ以下、例えば１０ｎｍ以下の直径を有する）ナノ粒子の高濃度の投与、それにより、細胞性代謝経路を調節して、フェロトーシス機構により細胞死を誘導することについて記載する。フェロトーシスは、鉄、反応性酸素種、および同期モードの細胞死実行を含む。
【０００８】
特定の栄養欠乏環境でのα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを用いる細胞の処置は、薬物が存在しない場合でさえ、がん細胞でフェロトーシスを誘導することができることが見出された（または、α−ＭＳＨのないＰＥＧ−Ｃ’ドット、例えばα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットと比較して長期間を必要とする）。合わせると、本明細書に記載される結果は、アミノ酸の非存在下で培養され、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットで処置される細胞がフェロトーシスにより細胞死を起こすことを示した。この文脈において、フェロトーシスは、細胞から細胞に波状式に伝播することが観察された。理論に拘束される必要はないが、これは死誘導シグナルの細胞間伝達を示唆した。
【０００９】
一態様では、本発明は、腫瘍組織における十分に高い濃度での蓄積のためにナノ粒子を投与して、フェロトーシス（例えば、鉄依存性壊死または反応性酸素種依存性壊死を含むフェロトーシス細胞死）を誘導することを含む、被験体の処置方法に関する。
【００１０】
ある特定の実施形態では、ナノ粒子は極小ナノ粒子（例えば、Ｃドット、例えばＣ’ドット）を含む。
【００１１】
ある特定の実施形態では、高い濃度は、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える。ある特定の実施形態では、高い濃度は、腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である（例えば、高い濃度は、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、ナノ粒子はシリカをベースとしており、例えば、ナノ粒子はＣドットまたはＣ’ドットである）。
【００１２】
ある特定の実施形態では、腫瘍組織は、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）。
【００１３】
ある特定の実施形態では、腫瘍組織は、フェロトーシスの誘導に感作されている。
【００１４】
別の態様では、本発明は、腫瘍組織への輸送（および／または腫瘍組織における蓄積）のために薬物を投与すること；および腫瘍組織における十分に高い濃度での蓄積のためにナノ粒子を投与すること（それによりフェロトーシスを誘導すること）を含む、被験体の組み合わせ処置の方法に関する。
【００１５】
ある特定の実施形態では、薬物は化学療法剤（例えば、ＴＡＳ−１０２）を含む。
【００１６】
ある特定の実施形態では、ナノ粒子は極小ナノ粒子（例えば、Ｃドット、例えばＣ’ドット）を含む。
【００１７】
ある特定の実施形態では、高い濃度は、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える。ある特定の実施形態では、高い濃度は、腫瘍組織における０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である（例えば、高い濃度は、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、ナノ粒子はシリカをベースとしており、例えば、ナノ粒子はＣドットまたはＣ’ドットである）。
【００１８】
ある特定の実施形態では、腫瘍組織は、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）。ある特定の実施形態では、腫瘍組織は、フェロトーシスの誘導に感作されている。
【００１９】
ある特定の実施形態では、薬物を投与することおよびナノ粒子を投与することは、薬物およびナノ粒子の両方を含む組成物を投与することによって達成される。
【００２０】
ある特定の実施形態では、組成物はナノ粒子薬物コンジュゲートを含む。
【００２１】
別の態様では、本発明は、腫瘍組織（例えば、前立腺がん組織）からホルモンを欠乏させること；および腫瘍組織における十分に高い濃度での蓄積のためにナノ粒子を投与し、フェロトーシスを誘導することを含む、被験体の組み合わせ処置の方法に関する。
【００２２】
ある特定の実施形態では、腫瘍組織は、去勢（例えば、化学的去勢）を経てホルモンが欠乏する。
【００２３】
ある特定の実施形態では、ナノ粒子は極小ナノ粒子（例えば、Ｃドット、例えばＣ’ドット）を含む。
【００２４】
ある特定の実施形態では、高い濃度は、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える。ある特定の実施形態では、高い濃度は、腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である（例えば、高い濃度は、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、ナノ粒子はシリカをベースとしており、例えば、ナノ粒子はＣドットまたはＣ’ドットである）。
【００２５】
ある特定の実施形態では、腫瘍組織は、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）。
【００２６】
ある特定の実施形態では、腫瘍組織は、フェロトーシスの誘導に感作されている。
【００２７】
ある特定の実施形態では、腫瘍組織は、腎臓、前立腺、メラノーマ、膵臓、肺、線維肉腫、乳房、脳、卵巣および結腸腫瘍組織からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、膵臓腫瘍組織は、ＢｘＰＣ３細胞を含む。ある特定の実施形態では、肺腫瘍組織は、Ｈ１６５０細胞を含む。
【００２８】
ある特定の実施形態では、ナノ粒子は１５ｎｍ以下の平均直径を有する。ある特定の実施形態では、ナノ粒子は１０ｎｍ以下の平均直径を有する。ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、約５ｎｍから約７ｎｍ（例えば、約６ｎｍ）の平均直径を有する。
【００２９】
ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、１から２０個の標的化部分を含み、ここで標的化部分は腫瘍細胞上の受容体に結合する（例えば、ナノ粒子は、１５ｎｍ以下、例えば１０ｎｍ以下、例えば約５ｎｍから約７ｎｍ、例えば約６ｎｍの平均直径を有する）。ある特定の実施形態では、１から２０個の標的化部分は、アルファ−メラニン細胞刺激ホルモン（αＭＳＨ）を含む。ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、標的化部分（例えば、αＭＳＨ）を含む。
【００３０】
ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、処置の過程にわたって複数回投与される。
【００３１】
ある特定の実施形態では、本方法は、処置の過程にわたってナノ粒子を３または４日ごとに投与することをさらに含む。
【００３２】
ある特定の実施形態では、投与されるナノ粒子は、付着している薬物（例えば、化学療法剤）を有する。ある特定の実施形態では、薬物は、リンカー部分を介して付着している（例えば、共有結合または非共有結合で付着している）。
【００３３】
ある特定の実施形態では、がん処置および／または組織修復プロセス（例えば、創傷治癒）においてＣドットの治療能力を増加させるために、薬物送達は、投与されるナノ粒子の天然の免疫調節特性と組み合わされる（例えば、ナノ粒子はα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを含む、例えば、α−ＭＳＨがナノ粒子の表面に結合している）（例えば、ナノ粒子は有機ポリマーコーティング（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含む）。
【００３４】
別の態様では、本発明は、被験体を処置する方法で使用するためのナノ粒子（例えば、極小ナノ粒子、例えばＣドット、例えばＣ’ドット）を含む組成物であって、ここで、処置は、腫瘍組織における十分に高い濃度（例えば、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える）での蓄積のために被験体の腫瘍組織に組成物を送達し、フェロトーシスを誘導することを含む（例えば、高い濃度は、腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である）（例えば、高い濃度は、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、ナノ粒子はシリカをベースとしており、例えば、ナノ粒子はＣドットまたはＣ’ドットである）（例えば、腫瘍組織は、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）か、またはその他の点でフェロトーシスの誘導に対して感受性である）、組成物に関する。
【００３５】
別の態様では、本発明は、療法で使用するためにフェロトーシスを誘導するために、腫瘍組織における十分に高い濃度（例えば、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える）での蓄積のためのナノ粒子（例えば、極小ナノ粒子、例えばＣドット、例えばＣ’ドット）を含む組成物に関する（例えば、高い濃度は、腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である）（例えば、高い濃度は、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、ナノ粒子はシリカをベースとしており、例えば、ナノ粒子はＣドットまたはＣ’ドットである）（例えば、腫瘍組織は、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）か、またはその他の点でフェロトーシスの誘導に対して感受性である）。
【００３６】
別の態様では、本発明は、被験体を処置する方法で使用するための薬物（例えば、化学療法剤、例えばＴＡＳ１０２）を含む第１の組成物およびナノ粒子（例えば、極小ナノ粒子、例えばＣドット、例えばＣ’ドット）を含む第２の組成物であって、処置は、被験体の腫瘍組織への輸送（および／または腫瘍組織における蓄積）のために第１の組成物を送達すること；ならびに腫瘍組織における十分に高い濃度（例えば、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える）での蓄積のために被験体の腫瘍組織に第２の組成物を送達し（例えば、高い濃度は、腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である）（例えば、高い濃度は、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、ナノ粒子はシリカをベースとしており、例えば、ナノ粒子はＣドットまたはＣ’ドットである）（例えば、腫瘍組織は、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）か、またはその他の点でフェロトーシスの誘導に対して感受性である）、フェロトーシスを誘導することを含む、第１の組成物および第２の組成物に関する。
【００３７】
別の態様では、本発明は、療法で使用するためにフェロトーシスを誘導するために、被験体の腫瘍組織への輸送（および／または腫瘍組織における蓄積）のために薬物（例えば、任意の化学療法剤、例えばＴＡＳ１０２）を含む第１の組成物；および腫瘍組織における十分に高い濃度（例えば、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える）での蓄積のためのナノ粒子（例えば、極小ナノ粒子、例えばＣドット、例えばＣ’ドット）を含む第２の組成物に関する（例えば、高い濃度は、腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である）（例えば、高い濃度は、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、ナノ粒子はシリカをベースとしており、例えば、ナノ粒子はＣドットまたはＣ’ドットである）（例えば、腫瘍組織は、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）か、またはその他の点でフェロトーシスの誘導に対して感受性である）。
【００３８】
別の態様では、本発明は、被験体を処置する方法で使用するためのナノ粒子（例えば、極小ナノ粒子、例えばＣドット、例えばＣ’ドット）を含む組成物であって、処置は、被験体の腫瘍組織（例えば、前立腺組織）からホルモン（例えば、去勢（例えば、化学的去勢）を経て）を欠乏させること；および腫瘍組織における十分に高い濃度（例えば、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える）での蓄積のために被験体の腫瘍組織に組成物を送達し（例えば、高い濃度は、腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である）（例えば、高い濃度は、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、ナノ粒子はシリカをベースとしており、例えば、ナノ粒子はＣドットまたはＣ’ドットである）（例えば、腫瘍組織は、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）か、またはその他の点でフェロトーシスの誘導に対して感受性である）、フェロトーシスを誘導することを含む、組成物に関する。
【００３９】
本発明の１つの態様を含む実施形態（例えば、方法）の要素は、本発明の他の態様を含む実施形態（例えば、系）に適用することができ、逆もまた同じである。
【００４０】
定義
本開示がより容易に理解されるように、ある特定の用語を先ず下で定義する。以下の用語および他の用語の追加の定義は、本明細書全体で説明される。
【００４１】
本出願では、「または」の使用は、特に明記しない限り「および／または」を意味する。本出願で使用されるように、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」ならびにその用語の変形、例えば「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、他の添加物、構成要素、整数またはステップを排除するものではない。本出願で使用されるように、用語「約」および「およそ」は、同義語として使用される。約／およその有無に関係なくこの出願で使用されるいかなる数字も、関連分野の当業者によって理解されるいかなる正常な変動も含むものである。ある特定の実施形態では、用語「およそ」または「約」は、特に明記されない限り、または文脈からそうでないことが明白でない限り（そのような数字が可能な値の１００％を超える場合を除く）、明記された参照値のいずれかの方向（大きいか小さい）への２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満に入る値の範囲を指す。
【００４２】
「投与」：用語「投与」は、被験体に物質を導入することを指す。一般に、例えば、非経口（例えば、静脈内）、経口、局所、皮下、腹膜、動脈内、吸入、膣、直腸、経鼻、脳脊髄液への導入または体コンパートメントへの点滴注入を含む、任意の投与経路を利用することができる。ある特定の実施形態では、投与は経口である。さらに、または代わりに、ある特定の実施形態では、投与は非経口である。ある特定の実施形態では、投与は静脈内である。
【００４３】
「生体適合性」：本明細書で使用されるように、用語「生体適合性」は、ｉｎ  ｖｉｖｏで実質的な有害応答を導き出さない材料を記載するものである。ある特定の実施形態では、材料が細胞に毒性でないならば、それらは「生体適合性」である。ある特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞への材料の添加が２０％またはそれ未満の細胞死をもたらすならば、および／または材料のｉｎ  ｖｉｖｏ投与が炎症もしくは他のそのような有害作用を誘導しないならば、それらは「生体適合性」である。ある特定の実施形態では、材料は生分解性である。
【００４４】
「生分解性」：本明細書で使用されるように、「生分解性」材料は、細胞に導入したときに、細胞への有意な毒性作用なしで、細胞が再利用または処分することができる構成要素に細胞機構（例えば酵素分解）または加水分解によって分解される材料である。ある特定の実施形態では、生分解性材料の分解によって生じる構成要素は、ｉｎ  ｖｉｖｏで炎症および／または他の有害作用を誘導しない。ある特定の実施形態では、生分解性材料は、酵素的に分解される。あるいは、またはさらに、ある特定の実施形態では、生分解性材料は、加水分解によって分解される。ある特定の実施形態では、生分解性ポリマー材料は、それらの構成要素ポリマーに分解する。ある特定の実施形態では、生分解性材料（例えば、生分解性ポリマー材料を含む）の分解は、エステル結合の加水分解を含む。ある特定の実施形態では、材料（例えば、生分解性ポリマー材料を含む）の分解は、ウレタン結合の開裂を含む。
【００４５】
「がん」：本明細書で使用されるように、用語「がん」は、悪性の新生物または腫瘍を指す（Ｓｔｅｄｍａｎ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、２５版；Ｈｅｎｓｌｙ編；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９０年）。例示的ながんには、限定されずに、聴神経腫；腺癌；副腎がん；肛門がん；血管肉腫（例えば、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、血管肉腫）；虫垂がん；良性単クローン性高ガンマグロブリン血症；胆管がん（例えば、胆管癌）；膀胱がん；乳がん（例えば、乳房の腺癌、乳房の乳頭状癌、乳がん（ｍａｍｍａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ）、乳房の髄様癌）；脳がん（例えば、髄膜腫、神経膠芽腫、神経膠腫（例えば、星状細胞腫、希突起膠細胞腫）、髄芽細胞腫）；気管支がん；カルチノイド腫瘍；子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）（例えば、頸部の腺癌）；絨毛癌；脊索腫；頭蓋咽頭腫；結合組織がん；上皮癌；上衣細胞腫；内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）（例えば、カポジ肉腫、多発性特発性出血性肉腫）；子宮体がん（例えば、子宮がん、子宮肉腫）；食道がん（例えば、食道の腺癌、バーレット腺癌）；ユーイング肉腫；目のがん（例えば、眼内メラノーマ、網膜芽細胞腫）；家族性過好酸球増加症；胆のうがん；胃がん（例えば、胃腺癌）；消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）；胚細胞がん；頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮癌、口腔がん（例えば、口腔扁平上皮癌）、咽喉がん（例えば、喉頭がん、咽頭がん、鼻咽頭がん、口腔咽頭がん））；造血がん（例えば、白血病、例えば急性のリンパ球性白血病（ＡＬＬ）（例えば、Ｂ細胞ＡＬＬ、Ｔ細胞ＡＬＬ）、急性の骨髄性白血病（ＡＭＬ）（例えば、Ｂ細胞ＡＭＬ、Ｔ細胞ＡＭＬ）、慢性の骨髄性白血病（ＣＭＬ）（例えば、Ｂ細胞ＣＭＬ、Ｔ細胞ＣＭＬ）および慢性のリンパ球性白血病（ＣＬＬ）（例えば、Ｂ細胞ＣＬＬ、Ｔ細胞ＣＬＬ））；リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）（例えば、Ｂ細胞ＨＬ、Ｔ細胞ＨＬ）および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）（例えば、Ｂ細胞ＮＨＬ、例えば散在性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）（例えば、散在性大Ｂ細胞リンパ腫）、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（例えば、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫）、一次縦隔Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｐｌａｓｍａｃｙｔｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）（例えば、ワルデンストレームマクログロブリン血症）、毛様細胞性白血病（ＨＣＬ）、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆体Ｂリンパ芽球性リンパ腫および一次中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫；ならびに、Ｔ細胞ＮＨＬ、例えば、前駆体Ｔリンパ芽球性リンパ腫／白血病、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）（例えば、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）（例えば、菌状息肉腫、セザリー症候群）、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラーＴ細胞リンパ腫、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂肪組織炎様Ｔ細胞リンパ腫およ���未分化大細胞リンパ腫）；前記のような１つまたは複数の白血病／リンパ腫の混合；ならびに多発性骨髄腫（ＭＭ））、重鎖病（例えば、アルファ鎖病、ガンマ鎖病、ミュー鎖病）；血管芽腫；下咽頭がん；炎症性筋線維芽細胞腫瘍（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ｔｕｍｏｒ）；免疫細胞アミロイド症；腎臓がん（例えば、腎芽細胞腫、別名ウィルムス腫瘍、腎細胞癌）；肝がん（例えば、肝細胞がん（ＨＣＣ）、悪性の肝癌）；肺がん（例えば、気管支原性癌、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺の腺癌）；平滑筋肉腫（ＬＭＳ）；肥満細胞症（例えば、全身性肥満細胞症）；筋肉がん；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）；中皮腫；骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）（例えば、真性多血症（ＰＶ）、本態性血小板増加症（ＥＴ）、原因不明骨髄様化生（ＡＭＭ）別名骨髄線維症（ＭＦ）、慢性特発性骨髄線維症、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性好中球性白血病（ＣＮＬ）、好酸球増多症候群（ＨＥＳ）；神経芽細胞腫；神経線維腫（例えば、神経線維腫症（ＮＦ）１型または２型、神経鞘腫症）；神経内分泌がん（例えば、胃腸膵臓の神経内分泌腫瘍（ＧＥＰ  ＮＥＴ）、カルチノイド腫瘍）；骨肉腫（例えば、骨がん）；卵巣がん（例えば、嚢胞腺癌、卵巣の胎生期癌、卵巣の腺癌）；乳頭状腺癌；すい臓癌（例えば、膵臓の腺癌、管内乳頭状粘液性新生物（ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ  ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｍｕｃｉｎｏｕｓ  ｎｅｏｐｌａｓｍ）（ＩＰＭＮ）、島細胞腫瘍）；陰茎がん（例えば、陰茎および陰嚢のページェット病）；松果体腫；未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＴ）；形質細胞新生物；新生物随伴症候群；上皮内新生物；前立腺がん（例えば、前立腺腺癌）；直腸がん；横紋筋肉腫；唾液腺がん；皮膚がん（例えば、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、角化棘細胞腫（ＫＡ）、メラノーマ、基底細胞癌（ＢＣＣ））；小腸がん（例えば、虫垂がん）；軟部組織肉腫（例えば、悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）、脂肪肉腫、悪性の末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）、軟骨肉腫、線維肉腫、粘液肉腫）；脂腺癌；小腸がん；汗腺癌；滑膜腫；精巣がん（例えば、セミノーマ、精巣胎生期癌）；甲状腺がん（例えば、甲状腺の乳頭状癌、乳頭状甲状腺癌（ＰＴＣ）、髄質甲状腺がん）；尿道がん；膣がん；ならびに外陰部がん（例えば、外陰部のページェット病）が含まれる。
【００４６】
「担体」：本明細書で使用されるように、「担体」は、化合物と一緒に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。そのような医薬担体は、無菌の液体、例えば水および油、例えば、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などであってもよい。特に注射可能な溶液のために、水または水溶液食塩溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液が担体として好ましくは用いられる。適する医薬担体は、Ｅ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。
【００４７】
「化学療法剤」：本明細書で使用されるように、用語「化学療法剤」（例えば、抗がん薬）はその技術分野で理解されている意味を有し、例えば、具体的には、望ましくない細胞増殖に関連した１つまたは複数の疾患、障害または状態を処置するのに使用するために利用および／または推奨される薬剤を含む、１つまたは複数のアポトーシス誘発性、細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性の薬剤を指す。多くの実施形態では、化学療法剤はがんの処置において有益である。一部の実施形態では、化学療法剤は、１つもしくは複数のアルキル化剤、１つもしくは複数のアントラサイクリン、１つもしくは複数の細胞骨格撹乱化学物質（例えば、微小管標的化薬剤、例えば、タキサン、マイタンシンおよびその類似体）、１つもしくは複数のエポチロン、１つもしくは複数のヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ）、１つもしくは複数のトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、トポイソメラーゼＩおよび／もしくはトポイソメラーゼＩＩの阻害剤）、１つもしくは複数のキナーゼ阻害剤、１つもしくは複数のヌクレオチド類似体もしくはヌクレオチド前駆体類似体、１つもしくは複数のペプチド抗生物質、１つもしくは複数の白金ベースの薬剤、１つもしくは複数のレチノイド、１つもしくは複数のビンカアルカロイドならびに／または以下の（すなわち、関連する増殖抑制活性を共有する）ものの１つもしくは複数の１つもしくは複数の類似体であってよいか、それを含むことができる。一部の特定の実施形態では、化学療法剤は、アクチノマイシン、ａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸、オーリスタチン（Ａｕｉｒｉｓｔａｔｉｎ）、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、クルクミン、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イマチニブ、イリノテカン、マイタンシンおよび／またはその類似体（例えば、ＤＭ１）、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、マイタンシノイド、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンならびにその組み合わせの１つまたは複数であってよいか、それを含むことができる。一部の実施形態では、化学療法剤は、抗体−薬物コンジュゲートとの関連で利用することができる。一部の実施形態では、化学療法剤は、以下からなる群より選択される抗体−薬物コンジュゲートで見出されるものである：ｈＬＬ１−ドキソルビシン、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８、ｈＭＮ−１４−ＳＮ−３８、ｈＬＬ２−ＳＮ−３８、ｈＡ２０−ＳＮ−３８、ｈＰＡＭ４−ＳＮ−３８、ｈＬＬ１−ＳＮ−３８、ｈＲＳ７−Ｐｒｏ−２−Ｐ−Ｄｏｘ、ｈＭＮ−１４−Ｐｒｏ−２−Ｐ−Ｄｏｘ、ｈＬＬ２−Ｐｒｏ−２−Ｐ−Ｄｏｘ、ｈＡ２０−Ｐｒｏ−２−Ｐ−Ｄｏｘ、ｈＰＡＭ４−Ｐｒｏ−２−Ｐ−Ｄｏｘ、ｈＬＬ１−Ｐｒｏ−２−Ｐ−Ｄｏｘ、Ｐ４／Ｄ１０−ドキソルビシン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ブレンツキシマブベドチン、トラスツズマブエムタンシン、イノツズマブオゾガマイシン、グレムバツモマブベドチン（ｇｌｅｍｂａｔｕｍｏｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）、ＳＡＲ３４１９、ＳＡＲ５６６６５８、ＢＩＩＢ０１５、ＢＴ０６２、ＳＧＮ−７５、ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａ、ＡＭＧ−１７２、ＡＭＧ−５９５、ＢＡＹ−９４−９３４３、ＡＳＧ−５ＭＥ、ＡＳＧ−２２ＭＥ、ＡＳＧ−１６Ｍ８Ｆ、ＭＤＸ−１２０３、ＭＬＮ−０２６４、抗ＰＳＭＡ  ＡＤＣ、ＲＧ−７４５０、ＲＧ−７４５８、ＲＧ−７５９３、ＲＧ−７５９６、ＲＧ−７５９８、ＲＧ−７５９９、ＲＧ−７６００、ＲＧ−７６３６、ＡＢＴ−４１４、ＩＭＧＮ−８５３、ＩＭＧＮ−５２９、ボルセツズマブマフォドチン（ｖｏｒｓｅｔｕｚｕｍａｂ  ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）およびロルボツズマブメルタンシン（ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ  ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）。一部の実施形態では、化学療法剤は、ファルネシル−チオサリチル酸（ＦＴＳ）、４−（４−クロロ−２−メチルフェノキシ）−Ｎ−ヒドロキシブタンアミド（ＣＭＨ）、エストラジオール（Ｅ２）、テトラメトキシスチルベン（ＴＭＳ）、δ−トコトリエノール（δ−ｔｏｃａｔｒｉｅｎｏｌ）、サリノマイシンまたはクルクミンの１つまたは複数であってよいか、またはそれを含んでよい。
【００４８】
「組み合わせ療法」：本明細書で使用されるように、用語「組み合わせ療法」は、被験体が２つまたはそれを超える治療レジメン（例えば、２つまたはそれを超える治療剤）に同時に曝露される状況を指す。一部の実施形態では、２つまたはそれを超える薬剤が同時に投与されてもよく、一部の実施形態では、そのような薬剤は、逐次的に投与されてもよく、一部の実施形態では、そのような薬剤は、重複する投薬レジメンで投与される。
【００４９】
「ペプチド」または「ポリペプチド」：用語「ペプチド」または「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって一緒に連結される少なくとも２つの（例えば、少なくとも３つの）アミノ酸のストリングを指す。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸を含み、代わりに、またはさらに、ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、１つまたは複数の非天然のアミノ酸を含む（すなわち、天然に存在しないが、ポリペプチド鎖に組み込むことができる化合物；例えば、機能的イオンチャネルに首尾よく組み込まれた非天然アミノ酸の構造を提示する、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｃｏ．ｃａｌｔｅｃｈ．ｅｄｕ／〜ｄａｄｇｒｐ／Ｕｎｎａｔｓｔｒｕｃｔ．ｇｉｆを参照）および／または当該技術分野で公知であるアミノ酸類似体を代わりに用いることができる）。ある特定の実施形態では、タンパク質中のアミノ酸の１つまたは複数を、例えば、化学実体、例えば炭水化物基、ホスフェート基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、官能化（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）または他の改変のためのリンカーの付加などによって改変することができる。
【００５０】
「放射性標識」：本明細書で使用されるように、「放射性標識」は、少なくとも１つの元素の放射性同位体を含む部分を指す。例示的な適する放射性標識には、本明細書に記載されるものが限定されずに含まれる。ある特定の実施形態では、放射性標識は、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）で使用されるものである。ある特定の実施形態では、放射性標識は、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）で使用されるものである。ある特定の実施形態では、放射性同位体は、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、６４Ｃｕ、６７Ｇａ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、６７Ｃｕ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１４９Ｐｍ、９０Ｙ、２１３Ｂｉ、１０３Ｐｄ、１０９Ｐｄ、１５９Ｇｄ、１４０Ｌａ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１６５Ｄｙ、１６６Ｄｙ、６７Ｃｕ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、８９Ｚｒ、２２５Ａｃおよび１９２Ｉｒを含む。
【００５１】
「被験体」：本明細書で使用されるように、用語「被験体」は、ヒトおよび哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌおよびウマ）を含む。多くの実施形態では、被験体は、哺乳動物、特に霊長類、特にヒトである。ある特定の実施形態では、被験体は、畜産動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、雌ウシ、ブタなど；家禽、例えばニワトリ、カモ、ガチョウ、シチメンチョウなど；および家畜化された動物、特にペット、例えばイヌおよびネコである。ある特定の実施形態（例えば、特に研究関連）では、被験体の哺乳動物は、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類または近交系ブタなどのブタなどである。
【００５２】
「実質的に」：本明細書で使用されるように、用語「実質的に」は、目的の特徴または特性の全体またはほぼ全体の範囲または程度を示す定性的状態を指す。生物分野の当業者は、生物的および化学的現象が完結すること、および／または完了まで進行すること、または絶対的な結果を達成もしくは回避することは、あるとしても稀であることを理解する。したがって、用語「実質的に」は、本明細書で、多くの生物的および化学的現象に内在する完全性の潜在的欠如を捉えるために使用される。
【００５３】
「治療剤」：本明細書で使用されるように、「治療剤」という語句は、被験体に投与したときに治療効果を有する、ならびに／または所望の生物学的および／もしくは薬理学的効果を導き出す任意の薬剤を指す。
【００５４】
「処置」：本明細書で使用されるように、用語「処置」は（「処置する」または「処置すること」も）、特定の疾患、障害および／または状態を部分的または完全に軽減、改善、緩和、阻害する、その発症を遅らせる、その重症度を低減する、ならびに／またはその１つもしくは複数の症状、特徴および／もしくは原因の発生率を低減する物質の任意の投与を指す。そのような処置は、関連する疾患、障害および／もしくは状態の徴候を示さない被験体、ならびに／または疾患、障害および／もしくは状態の初期の徴候だけを示す被験体のものであってもよい。あるいは、またはさらに、そのような処置は、関連する疾患、障害および／または状態の１つまたは複数の確立された徴候を示す被験体のものであってもよい。ある特定の実施形態では、処置は、関連する疾患、障害および／または状態を患っていると診断された被験体のものであってもよい。ある特定の実施形態では、処置は、関連する疾患、障害および／または状態の発生の危険の増加と統計学的に相関する１つまたは複数の感受性因子を有することが既知の被験体のものであってもよい。
【００５５】
限定でなく例示目的のために、本明細書に図が提示される。
【００５６】
本開示の前述のおよび他の目的、態様、特徴および利点は、添付の図面と併せて得られる以下の記載を参照することによってより明らかになり、より良好に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｋは、シリカをベースとした極小α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット粒子がアミノ酸欠乏条件で細胞死を誘導することを示す。図１Ａは、例示的なα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットが、蛍光性（例えば、Ｃｙ５封入）コアおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コーティングおよびアルファメラニン細胞刺激ホルモン（αＭＳＨ）改変外部を有する、極小の直径６ｎｍのシリカベースの粒子であることを示す。
【００５８】
【図１−２】図１Ａ〜１Ｋは、シリカをベースとした極小α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット粒子がアミノ酸欠乏条件で細胞死を誘導することを示す。図１Ｂは、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットが、細胞内のリソソームネットワークに局在化することを示す。ＬＡＭＰ１−ＧＦＰを発現するＭ２１メラノーマ細胞を、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット（１５μＭ）で２４時間処置した。ナノ粒子（Ｃｙ５蛍光、偽着色およびＬＡＭＰ１−ＧＦＰ）の間の共局在は画像中で併合していることに留意する。バー＝１０μｍ。
【００５９】
【図１−３】図１Ａ〜１Ｋは、シリカをベースとした極小α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット粒子がアミノ酸欠乏条件で細胞死を誘導することを示す。図１Ｃ〜１Ｅは、栄養豊富な培地で、および指示したα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット濃度で処置して４０時間培養したＭ２１細胞で、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットが十分に耐容されることを示す。ナノ粒子は、細胞生存（図１Ｄ）や細胞増殖（図１Ｅ）に有意な影響を及ぼさなかった。バーは、平均＋／−平均の標準誤差を示す。各々につき５つの独立した視野を有する、Ｎ＝３の生物実験。個々の実験値については、図１０Ａおよび１０Ｂを参照のこと。スケールエラーバーは、Ｓ．Ｄ．を示す。バー＝１０μｍ。
【００６０】
【図１−４】図１Ａ〜１Ｋは、シリカをベースとした極小α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット粒子がアミノ酸欠乏条件で細胞死を誘導することを示す。図１Ｆ〜１Ｈは、ナノ粒子処置細胞でオートファジーおよびリソソーム機能が撹乱されていないことを示す。ブロットは、リソソーム阻害剤であるコンカナマイシンＡ（ＣｏｎＡ、１００ｎＭで１時間）の存在下（＋）および非存在下（−）での、未処置およびアミノ酸飢餓（ＡＡ−ｓｔ）細胞と比較した、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの漸増用量で２４時間処置した細胞でのＬＣ３−Ｉおよび−ＩＩを示す。ＬＣ３−ＩＩ（図１Ｇ）のレベルはナノ粒子処置によって変更されず、ＣｏｎＡによって誘導可能なＬＣ３−ＩＩ蓄積（図１Ｈ）、オートファジーターンオーバーの尺度は、処置細胞と対照細胞の間で類似している。ＳＥＭバーは、平均＋／−平均の標準誤差を示す。各群でＮ＝３。個々の実験値については、図１０Ｃおよび１０Ｄを参照のこと。
【００６１】
【図１−５】図１Ａ〜１Ｋは、シリカをベースとした極小α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット粒子がアミノ酸欠乏条件で細胞死を誘導することを示す。図１Ｉ〜１Ｊは、ナノ粒子処置が無アミノ酸培地で培養されたＭ２１細胞の細胞死を誘導することを示す。画像は、ＡＡ−ｓｔ条件での生きている対照細胞および死んだＳｙｔｏｘグリーン陽性ナノ粒子処置細胞を示す。スケールバー＝１０μｍ。図１Ｉは、経時的顕微鏡検査法によって決定した、５０時間後の完全培地（完全）またはＡＡ−ｓｔ条件でのパーセントＳｙｔｏｘグリーン陽性細胞を示す（図１Ｊ）。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。各群についてＮ＝４。各反復は、１つの生物実験からのものであり、５つの独立視野で定量化されている。
【００６２】
【図１−６】図１Ａ〜１Ｋは、シリカをベースとした極小α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット粒子がアミノ酸欠乏条件で細胞死を誘導することを示す。図１Ｋは、免疫不全（ＳＣＩＤ／Ｂｅｉｇｅ）マウスで異種移植片を作製する前に、７２時間の培養において、完全培地中の１５μＭのα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを用いて処置したＭ２１細胞が、未処置の細胞（丸）に対して成長阻害（逆三角形）を実証することを示す。概略図は、異種移植腫瘍成長対対照細胞をアッセイするために（１）培養中の粒子をローディングするＭ２１メラノーマ細胞および（２）粒子をローディングされたＭ２１細胞をマウスに注射することを含むワークフローを示す。データは、１群につき３つの腫瘍からの２２日間の成長にわたる平均腫瘍体積を示す。バーは、平均＋／−平均の標準誤差を示す。粒子処置Ｍ２１細胞は、研究間隔を通して対照と比較して統計的に有意な（ｐ＜０．００１）成長阻害を示した。Ｐ値は、データの長軸方向の性質を考慮するために一般化推定方程式によって推定された回帰モデルでのワルド検定からのものである。
【００６３】
【図２−１】図２Ａ〜２Ｆは、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット粒子によって誘導された細胞死が、アポトーシスでもネクロトーシスでもオートーシス（ａｕｔｏｓｉｓ）でもないことを示す。図２Ａは、アミノ酸の非存在下で１５μＭのα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを用いて培養されたＭＣＦ１０Ａヒト乳房上皮細胞が、壊死性の特徴を伴う細胞死を３０時間後に起こすことを示す。挿入図は、矢印で示す瀕死細胞を示す。蛍光画像は、死細胞核のＳｙｔｏｘグリーン標識を示す。バー＝１０μｍ。
【００６４】
【図２−２】図２Ａ〜２Ｆは、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット粒子によって誘導された細胞死が、アポトーシスでもネクロトーシスでもオートーシス（ａｕｔｏｓｉｓ）でもないことを示す。図２Ｂ〜２Ｆは、経時的顕微鏡検査法によって決定した、１５μＭのα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの存在下または非存在下における完全培地またはアミノ酸飢餓（ＡＡ−ｓｔ）条件でのＭＣＦ１０Ａおよびマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）培養における、および４０時間後（ＭＣＦ１０Ａ）（図２Ｂ）または４５時間後（ＭＥＦ）（図２Ｃ）の細胞死（Ｓｙｔｏｘグリーン＋）の定量化を示す。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。１群につきＮ＝５。各反復は、１つの生物実験からのものであり、５つの独立視野で定量化されている。
【００６５】
【図２−３】図２Ａ〜２Ｆは、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット粒子によって誘導された細胞死が、アポトーシスでもネクロトーシスでもオートーシス（ａｕｔｏｓｉｓ）でもないことを示す。図２Ｂ〜２Ｆは、経時的顕微鏡検査法によって決定した、１５μＭのα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの存在下または非存在下における完全培地またはアミノ酸飢餓（ＡＡ−ｓｔ）条件でのＭＣＦ１０Ａおよびマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）培養における、および４０時間後（ＭＣＦ１０Ａ）（図２Ｂ）または４５時間後（ＭＥＦ）（図２Ｃ）の細胞死（Ｓｙｔｏｘグリーン＋）の定量化を示す。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。１群につきＮ＝５。各反復は、１つの生物実験からのものであり、５つの独立視野で定量化されている。図２Ｄ〜２Ｆは、細胞死アッセイ（図２Ｂ〜２Ｃに示されるアッセイと類似の）が、３８時間の経時実験の後に定量化された、ＭＣＦ１０ＡでのＢｃｌ２過剰発現によるアポトーシスの阻害（図２Ｄ）、または、４５時間後に定量化された、ＭＥＦでのＢａｘおよびＢａｋの欠失（図２Ｅ）、または、４５時間後に定量化された、ＭＥＦでのｒｉｐｋ３の欠失によるネクロトーシスの阻害（図２Ｆ）、または、４５時間（図２Ｆ）後のＭＥＦでのＡｔｇ５のノックアウトによるオートファジーの阻害は、アミノ酸飢餓および１５μＭのα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット処置によって誘導される細胞死を阻害しないことを示すことを示す。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。１群につきＮ＝５。各反復は、１つの生物実験からのものであり、５つの独立視野で定量化されている。
【図２−４】図２Ａ〜２Ｆは、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット粒子によって誘導された細胞死が、アポトーシスでもネクロトーシスでもオートーシス（ａｕｔｏｓｉｓ）でもないことを示す。図２Ｂ〜２Ｆは、経時的顕微鏡検査法によって決定した、１５μＭのα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの存在下または非存在下における完全培地またはアミノ酸飢餓（ＡＡ−ｓｔ）条件でのＭＣＦ１０Ａおよびマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）培養における、および４０時間後（ＭＣＦ１０Ａ）（図２Ｂ）または４５時間後（ＭＥＦ）（図２Ｃ）の細胞死（Ｓｙｔｏｘグリーン＋）の定量化を示す。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。１群につきＮ＝５。各反復は、１つの生物実験からのものであり、５つの独立視野で定量化されている。図２Ｄ〜２Ｆは、細胞死アッセイ（図２Ｂ〜２Ｃに示されるアッセイと類似の）が、３８時間の経時実験の後に定量化された、ＭＣＦ１０ＡでのＢｃｌ２過剰発現によるアポトーシスの阻害（図２Ｄ）、または、４５時間後に定量化された、ＭＥＦでのＢａｘおよびＢａｋの欠失（図２Ｅ）、または、４５時間後に定量化された、ＭＥＦでのｒｉｐｋ３の欠失によるネクロトーシスの阻害（図２Ｆ）、または、４５時間（図２Ｆ）後のＭＥＦでのＡｔｇ５のノックアウトによるオートファジーの阻害は、アミノ酸飢餓および１５μＭのα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット処置によって誘導される細胞死を阻害しないことを示すことを示す。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。１群につきＮ＝５。各反復は、１つの生物実験からのものであり、５つの独立視野で定量化されている。
【図２−５】図２Ａ〜２Ｆは、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット粒子によって誘導された細胞死が、アポトーシスでもネクロトーシスでもオートーシス（ａｕｔｏｓｉｓ）でもないことを示す。図２Ｂ〜２Ｆは、経時的顕微鏡検査法によって決定した、１５μＭのα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの存在下または非存在下における完全培地またはアミノ酸飢餓（ＡＡ−ｓｔ）条件でのＭＣＦ１０Ａおよびマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）培養における、および４０時間後（ＭＣＦ１０Ａ）（図２Ｂ）または４５時間後（ＭＥＦ）（図２Ｃ）の細胞死（Ｓｙｔｏｘグリーン＋）の定量化を示す。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。１群につきＮ＝５。各反復は、１つの生物実験からのものであり、５つの独立視野で定量化されている。図２Ｄ〜２Ｆは、細胞死アッセイ（図２Ｂ〜２Ｃに示されるアッセイと類似の）が、３８時間の経時実験の後に定量化された、ＭＣＦ１０ＡでのＢｃｌ２過剰発現によるアポトーシスの阻害（図２Ｄ）、または、４５時間後に定量化された、ＭＥＦでのＢａｘおよびＢａｋの欠失（図２Ｅ）、または、４５時間後に定量化された、ＭＥＦでのｒｉｐｋ３の欠失によるネクロトーシスの阻害（図２Ｆ）、または、４５時間（図２Ｆ）後のＭＥＦでのＡｔｇ５のノックアウトによるオートファジーの阻害は、アミノ酸飢餓および１５μＭのα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット処置によって誘導される細胞死を阻害しないことを示すことを示す。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。１群につきＮ＝５。各反復は、１つの生物実験からのものであり、５つの独立視野で定量化されている。
【００６６】
【図３−１】図３Ａ〜３Ｇは、フェロトーシスが、α−ＭＳＨ粒子誘導細胞死の基礎をなす機構であることを示す。図３Ａ〜３Ｃは、１５μＭのα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット、ならびに、（図３Ａ）４０時間後の１μＭのフェロスタチン−１（Ｆｅｒ−１）、（図３Ｂ）３８時間後の１００μＭのデフェロキサミン（ＤＦＯ）、および（図３Ｃ）４０時間後の５０μＭのブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、２００μＭのアスコルビン酸（ＡＡ）、１００μＭのトロロクス、１０ｍＭのＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）または５ｍＭのグルタチオン（ＧＳＨ）の存在下または非存在下における、完全培地（完全）またはアミノ酸飢餓（ＡＡ−ｓｔ）条件で培養されたＭＣＦ１０Ａ細胞での細胞死（Ｓｙｔｏｘグリーン＋）の定量化を示す。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。１群につきＮ＝５。各反復は、１つの生物実験からのものであり、５つの独立視野で定量化されている。
【図３−２】図３Ａ〜３Ｇは、フェロトーシスが、α−ＭＳＨ粒子誘導細胞死の基礎をなす機構であることを示す。図３Ａ〜３Ｃは、１５μＭのα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット、ならびに、（図３Ａ）４０時間後の１μＭのフェロスタチン−１（Ｆｅｒ−１）、（図３Ｂ）３８時間後の１００μＭのデフェロキサミン（ＤＦＯ）、および（図３Ｃ）４０時間後の５０μＭのブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、２００μＭのアスコルビン酸（ＡＡ）、１００μＭのトロロクス、１０ｍＭのＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）または５ｍＭのグルタチオン（ＧＳＨ）の存在下または非存在下における、完全培地（完全）またはアミノ酸飢餓（ＡＡ−ｓｔ）条件で培養されたＭＣＦ１０Ａ細胞での細胞死（Ｓｙｔｏｘグリーン＋）の定量化を示す。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。１群につきＮ＝５。各反復は、１つの生物実験からのものであり、５つの独立視野で定量化されている。
【図３−３】図３Ａ〜３Ｇは、フェロトーシスが、α−ＭＳＨ粒子誘導細胞死の基礎をなす機構であることを示す。図３Ａ〜３Ｃは、１５μＭのα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット、ならびに、（図３Ａ）４０時間後の１μＭのフェロスタチン−１（Ｆｅｒ−１）、（図３Ｂ）３８時間後の１００μＭのデフェロキサミン（ＤＦＯ）、および（図３Ｃ）４０時間後の５０μＭのブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、２００μＭのアスコルビン酸（ＡＡ）、１００μＭのトロロクス、１０ｍＭのＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）または５ｍＭのグルタチオン（ＧＳＨ）の存在下または非存在下における、完全培地（完全）またはアミノ酸飢餓（ＡＡ−ｓｔ）条件で培養されたＭＣＦ１０Ａ細胞での細胞死（Ｓｙｔｏｘグリーン＋）の定量化を示す。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。１群につきＮ＝５。各反復は、１つの生物実験からのものであり、５つの独立視野で定量化されている。
【００６７】
【図３−４】図３Ａ〜３Ｇは、フェロトーシスが、α−ＭＳＨ粒子誘導細胞死の基礎をなす機構であることを示す。図３Ｄおよび３Ｅは、１５μＭのα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットによりアミノ酸飢餓条件でフェロトーシスを起こすＭＣＦ１０Ａの経時分析からの画像を示す。画像の左側から右にかけて死（Ｓｙｔｏｘグリーン陽性）が細胞から細胞に広がることに留意する。スケールバー＝１０μｍ。
【図３−５】図３Ａ〜３Ｇは、フェロトーシスが、α−ＭＳＨ粒子誘導細胞死の基礎をなす機構であることを示す。図３Ｄおよび３Ｅは、１５μＭのα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットによりアミノ酸飢餓条件でフェロトーシスを起こすＭＣＦ１０Ａの経時分析からの画像を示す。画像の左側から右にかけて死（Ｓｙｔｏｘグリーン陽性）が細胞から細胞に広がることに留意する。スケールバー＝１０μｍ。
【００６８】
【図３−６】図３Ａ〜３Ｇは、フェロトーシスが、α−ＭＳＨ粒子誘導細胞死の基礎をなす機構であることを示す。図３Ｆ〜３Ｇは、１５μＭのα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを用いて処置した細胞における死およびアミノ酸撤去の前に脂質ＲＯＳが蓄積することを示す。図３Ｆは、脂質ＲＯＳを検出するＣ１１−ＢＯＤＩＰＹの存在下で培養された処置細胞を示す。細胞死の数時間前（一番下の画像の細胞死より前の、各画像で示される時間）にＣ１１−ＢＯＤＩＰＹの蛍光強度が増加することに留意する。図３Ｇは、粒子処置およびアミノ酸飢餓細胞（点線）またはエラスチン処置細胞（黒線）でのＣ１１−ＢＯＤＩＰＹ蛍光の定量化を示す。１つの生物実験から、５つの細胞からの平均強度＋／−標準偏差を示す。ゼロ時間は、ＤＩＣ顕微鏡検査法によって決定された細胞死の時間を示す。細胞死の３時間から４時間前の間にＣ１１−ＢＯＤＩＰＹ染色の強度が増加することに留意する。
【００６９】
【図４−１】図４Ａ〜４Ｇは、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットが、異なるタイプのがん細胞で細胞死を誘導することができることを示す。図４Ａ〜４Ｆは、１５μＭα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの存在下または非存在下における、完全培地（完全）または無アミノ酸培地（ＡＡ−ｓｔ）での（図４Ａ〜４Ｂ）４０時間後のＢｘＰＣ３膵癌細胞、（図４Ｃ〜４Ｄ）４５時間後のＨ１６５０肺癌細胞および（図４Ｅ〜４Ｆ）６５時間後のＨＴ１０８０線維肉腫細胞における細胞死（Ｓｙｔｏｘグリーン＋）の定量化を示す。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。１群につきＮ＝５。各反復は、１つの生物実験からのものであり、５つの独立視野で定量化されている。スケールバー＝１０μｍ。
【図４−２】図４Ａ〜４Ｇは、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットが、異なるタイプのがん細胞で細胞死を誘導することができることを示す。図４Ａ〜４Ｆは、１５μＭα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの存在下または非存在下における、完全培地（完全）または無アミノ酸培地（ＡＡ−ｓｔ）での（図４Ａ〜４Ｂ）４０時間後のＢｘＰＣ３膵癌細胞、（図４Ｃ〜４Ｄ）４５時間後のＨ１６５０肺癌細胞および（図４Ｅ〜４Ｆ）６５時間後のＨＴ１０８０線維肉腫細胞における細胞死（Ｓｙｔｏｘグリーン＋）の定量化を示す。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。１群につきＮ＝５。各反復は、１つの生物実験からのものであり、５つの独立視野で定量化されている。スケールバー＝１０μｍ。
【図４−３】図４Ａ〜４Ｇは、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットが、異なるタイプのがん細胞で細胞死を誘導することができることを示す。図４Ａ〜４Ｆは、１５μＭα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの存在下または非存在下における、完全培地（完全）または無アミノ酸培地（ＡＡ−ｓｔ）での（図４Ａ〜４Ｂ）４０時間後のＢｘＰＣ３膵癌細胞、（図４Ｃ〜４Ｄ）４５時間後のＨ１６５０肺癌細胞および（図４Ｅ〜４Ｆ）６５時間後のＨＴ１０８０線維肉腫細胞における細胞死（Ｓｙｔｏｘグリーン＋）の定量化を示す。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。１群につきＮ＝５。各反復は、１つの生物実験からのものであり、５つの独立視野で定量化されている。スケールバー＝１０μｍ。
【００７０】
【図４−４】図４Ａ〜４Ｇは、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットが、異なるタイプのがん細胞で細胞死を誘導することができることを示す。図４Ｇは、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットナノ粒子によって誘導されたフェロトーシスの例示的なモデルを示す。アミノ酸欠乏（Ｉ）およびリソソームへのナノ粒子摂取（ＩＩ）の両方は、グルタチオンの枯渇につながり（図７Ｄ〜７Ｅを参照）、リソソーム鉄、反応性酸素種（ＲＯＳ）の公知のインデューサー、に依存するフェロトーシス、およびフェロスタチン−１およびリポロキシスタチン−１によってブロックされる脂質過酸化の誘導に一緒に寄与する。
【００７１】
【図５−１】図５Ａ〜５Ｋは、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットがＨＴ１０８０および７８６−Ｏ異種移植モデルで腫瘍成長を阻害することを示す。図５Ａ、５Ｂおよび５Ｋは、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット処置（Ｔ；ｎ＝５）および食塩水処置（Ｃ；ｎ＝３）マウスにおける７８６−Ｏ（図５Ｋ）およびＨＴ１０８０（図５Ｂ）平均腫瘍体積測定のグラフによる要約を各々示し、エラーバーは、標準偏差を示す。３つの高用量α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット（または、対照ビヒクル）処置を、１０日間にわたってｉ．ｖ．注射した（ａ；矢印）。一部（図５Ａ）からの個々のＨＴ−１０８０腫瘍体積測定は、図５Ｂに示す。対照腫瘍体積に対して、データは粒子処置後の腫瘍成長の著しい阻害および部分的腫瘍退縮を示す（ＨＴ−１０８０：ｐ＜０．００１；７８６−ＯＬ：Ｐ＜０．０１）。Ｐ値は、データの長軸方向の性質を考慮するために一般化推定方程式によって推定された回帰モデルでのワルド検定からのものである。
【図５−２】図５Ａ〜５Ｋは、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットがＨＴ１０８０および７８６−Ｏ異種移植モデルで腫瘍成長を阻害することを示す。図５Ａ、５Ｂおよび５Ｋは、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット処置（Ｔ；ｎ＝５）および食塩水処置（Ｃ；ｎ＝３）マウスにおける７８６−Ｏ（図５Ｋ）およびＨＴ１０８０（図５Ｂ）平均腫瘍体積測定のグラフによる要約を各々示し、エラーバーは、標準偏差を示す。３つの高用量α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット（または、対照ビヒクル）処置を、１０日間にわたってｉ．ｖ．注射した（ａ；矢印）。一部（図５Ａ）からの個々のＨＴ−１０８０腫瘍体積測定は、図５Ｂに示す。対照腫瘍体積に対して、データは粒子処置後の腫瘍成長の著しい阻害および部分的腫瘍退縮を示す（ＨＴ−１０８０：ｐ＜０．００１；７８６−ＯＬ：Ｐ＜０．０１）。Ｐ値は、データの長軸方向の性質を考慮するために一般化推定方程式によって推定された回帰モデルでのワルド検定からのものである。
【００７２】
【図５−３】図５Ａ〜５Ｋは、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットがＨＴ１０８０および７８６−Ｏ異種移植モデルで腫瘍成長を阻害することを示す。図５Ｃは、代表的Ｈ１０８０腫瘍異種移植片の代表的な全身Ｃｙ５蛍光イメージングを示す。図５Ｄは、代表的な対照および処置腫瘍からのＨ＆Ｅ染色組織切片の低倍率像が、対照検体が対応する処置検体よりサイズが不相応に大きいことを明らかにすることを示す。図５Ｅ〜５Ｈは、Ｍａｃ−２による腫瘍切片の免疫組織化学的染色が、（図５Ｅ）低いおよび（図５Ｇ）高い倍率の像で対照腫瘍切片（Ｔ）の周辺の散乱したマクロファージ（矢印）を示すが、Ｍａｃ−２染色処置切片の対応する（図５Ｆ）低いおよび（図５Ｈ）高い倍率の像は、類似の位置で腫瘍を囲む多数のＭａｃ−２陽性細胞を示す（ボックス、ｄ、ｆ；矢印）ことを示す。少数の腫瘍内Ｍａｃ−２陽性細胞にも留意のこと。
【００７３】
【図５−４】図５Ａ〜５Ｋは、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットがＨＴ１０８０および７８６−Ｏ異種移植モデルで腫瘍成長を阻害することを示す。図５Ｅ〜５Ｈは、Ｍａｃ−２による腫瘍切片の免疫組織化学的染色が、（図５Ｅ）低いおよび（図５Ｇ）高い倍率の像で対照腫瘍切片（Ｔ）の周辺の散乱したマクロファージ（矢印）を示すが、Ｍａｃ−２染色処置切片の対応する（図５Ｆ）低いおよび（図５Ｈ）高い倍率の像は、類似の位置で腫瘍を囲む多数のＭａｃ−２陽性細胞を示す（ボックス、ｄ、ｆ；矢印）ことを示す。少数の腫瘍内Ｍａｃ−２陽性細胞にも留意のこと。図５Ｉは、阻害剤および粒子の組み合わせ処置（Ｔ＋Ｌ；ｎ＝３）対粒子処置単独（Ｔ；ｎ＝３）を受けたマウスにおける個々のＨＴ１０８０腫瘍体積測定のグラフによる要約を示す。１０日間にわたる３つの高用量α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット処置（腹腔内注射阻害剤を用いるまたは用いない）。阻害剤および粒子の組み合わせ処置の後、粒子処置単独に対して腫瘍増殖の著しい進行が見られる（ｐ＜０．００１）。
【００７４】
【図５−５】図５Ａ〜５Ｋは、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットがＨＴ１０８０および７８６−Ｏ異種移植モデルで腫瘍成長を阻害することを示す。図５Ｊは、代表的な粒子曝露腫瘍が、リプロクススタチン−１（右の腫瘍）でさらに処置したとき、検体のサイズが不相応により大きいことを明らかにすることを示す。スケールバー：１ｍｍ（図５Ｄ、図５Ｅおよび図５Ｆ）；５０μｍ（図５Ｇ、図５Ｈ）；１ｃｍ（図５Ｊ）。図５Ａ、５Ｂおよび５Ｋは、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット処置（Ｔ；ｎ＝５）および食塩水処置（Ｃ；ｎ＝３）マウスにおける７８６−Ｏ（図５Ｋ）およびＨＴ１０８０（図５Ｂ）平均腫瘍体積測定のグラフによる要約を各々示し、エラーバーは、標準偏差を示す。３つの高用量α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット（または、対照ビヒクル）処置を、１０日間にわたってｉ．ｖ．注射した（ａ；矢印）。一部（図５Ａ）からの個々のＨＴ−１０８０腫瘍体積測定は、図５Ｂに示す。対照腫瘍体積に対して、データは粒子処置後の腫瘍成長の著しい阻害および部分的腫瘍退縮を示す（ＨＴ−１０８０：ｐ＜０．００１；７８６−ＯＬ：Ｐ＜０．０１）。Ｐ値は、データの長軸方向の性質を考慮するために一般化推定方程式によって推定された回帰モデルでのワルド検定からのものである。
【００７５】
【図６−１】図６Ａ〜６Ｃは、７８６−ＯおよびＨＴ−１０８０細胞でのナノ粒子誘導細胞死およびＨＴ−１０８０腫瘍の血管化を示す。（図６Ａ）５０時間後のＳＫＯＶ３卵巣癌細胞および（図６Ｂ）５日後のＨＴ１０８０線維肉腫細胞での細胞死（Ｓｙｔｏｘグリーン＋）の定量化。細胞は、示された濃度のα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの存在下または非存在下で、完全培地（完全）または無アミノ酸培地（ＡＡ−ｓｔ）で培養した。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。１群につきＮ＝５。
【００７６】
【図６−２】図６Ａ〜６Ｃは、７８６−ＯおよびＨＴ−１０８０細胞でのナノ粒子誘導細胞死およびＨＴ−１０８０腫瘍の血管化を示す。（図６Ａ）５０時間後のＳＫＯＶ３卵巣癌細胞および（図６Ｂ）５日後のＨＴ１０８０線維肉腫細胞での細胞死（Ｓｙｔｏｘグリーン＋）の定量化。細胞は、示された濃度のα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの存在下または非存在下で、完全培地（完全）または無アミノ酸培地（ＡＡ−ｓｔ）で培養した。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。１群につきＮ＝５。図６Ｃ〜６Ｅは、１５μＭのα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの存在下または非存在下における、アミノ酸飢餓７８６−Ｏ腎臓がん細胞での細胞死（Ｓｙｔｏｘグリーン＋）の定量化を示す。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。１群につきＮ＝５。各反復は、１つの生物実験からのものであり、５つの独立視野で定量化されている。スケールバー＝１０μｍ。アポトーシス死（図６Ｅ）と比較した形態および迅速なＳｙｔｏｘグリーン陽性（図６Ｄ）によって、壊死性の細胞死を決定した。
【００７７】
【図７−１】図７Ａ〜７Ｋは、ナノ粒子が鉄取り込みおよびグルタチオンレベルに影響することを示す。図７Ａ〜７Ｃは、２５μＭのＨＤＣＦＤＡを使用してサイトゾルＲＯＳのレベルについて（図７Ｂ）、および２μＭのＣ１１−ＢＯＤＩＰＹ（５８１／５９１）を使用して脂質過酸化レベルについて（図７Ｃ）、完全培地中の１５μＭのα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットで２４時間処置したＭＣＦ１０Ａ細胞をフローサイトメトリーによって調べたことを示す。図７Ａは、粒子処置細胞（青色の集団）のＣｙ５蛍光を示す。
【００７８】
【図７−２】図７Ａ〜７Ｋは、ナノ粒子が鉄取り込みおよびグルタチオンレベルに影響することを示す。図７Ｄは、１５μＭのα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットまたは４００μＭのブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）、グルタチオンのための律速酵素であるγ−グルタミルシステインシンテターゼの阻害剤、の存在下または非存在下において、完全培地（完全）または無アミノ酸培地（ＡＡ−ｓｔ）で２４時間培養したＭＣＦ１０Ａ細胞での還元型グルタチオン（ＧＳＨ）レベルの定量化を示す。ＢＳＯ処置と同様に、ナノ粒子処置およびアミノ酸欠乏が、単独で、または組み合わせてグルタチオンレベルを低減することに注意すべきである。バーは、３つの独立した実験からの平均＋／−平均の標準誤差を示す。個々の実験値については、図１２Ｄを参照のこと。図７Ｅは、全グルタチオンレベルがナノ粒子処置細胞で低減されること、ならびに、アミノ酸飢餓細胞、ナノ粒子処置細胞（αＭＳＨ）およびグルタチオン生産阻害剤ＢＳＯで処置した細胞における２４時間後の全グルタチオンの相対レベルを示す。図７Ｆは、１５μＭのα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット（白色のバー）またはαＭＳＨペプチドを欠くＰＥＧ−Ｃ’ドット（陰影のついたバー）の存在下における、ＡＡ−ｓｔ条件で培養したＭＣＦ１０Ａ細胞の４０時間および６８時間での細胞死（Ｓｙｔｏｘグリーン＋）の定量化を示す。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。１群につきＮ＝５。各反復は、１つの生物実験からのものであり、５つの独立視野で定量化されている。
【００７９】
【図７−３】図７Ａ〜７Ｋは、ナノ粒子が鉄取り込みおよびグルタチオンレベルに影響することを示す。図７Ｇは、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットが鉄に結合し、処置細胞が鉄レベルを増加させたことを示す。データは、αＭＳＨナノ粒子保存試料および未処置細胞（両方とも検出限界未満の「対照」である）、培養培地から精製されたα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット（ＮＰ＋培地）、およびナノ粒子で処置した細胞（ＮＰ＋細胞）から決定された鉄濃度を示す。鉄濃度標準は、赤色データポイントとして示す。全ての測定は、三連で実行された１つの生物実験からの平均である。生データは、表１に示す。図７Ｈは、１５μＭのα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを用いる処置、またはクエン酸鉄アンモニウム（ＦＡＣ）を用いる処置によってフェリチン重鎖発現がアミノ酸飢餓（ＡＡ−ｓｔ）細胞で増加し、ＤＦＯを用いる処置によって減少することを示す。ウェスタンブロットは、示された試薬を用いる処置の２４時間後の、アクチンローディング対照と比較したフェリチン重鎖（ＦＴＨ１）発現を示す。
【００８０】
【図７−４】図７Ａ〜７Ｋは、ナノ粒子が鉄取り込みおよびグルタチオンレベルに影響することを示す。図７Ｉは、鉄（ＦＡＣ）を用いる細胞の処置が、アミノ酸飢餓（ＡＡ−ｓｔ）条件でα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット誘導死を模倣するのに十分であることを示す。グラフは、表示されるように処置された細胞のパーセント細胞死（Ｓｙｔｏｘグリーン＋）の定量化を示す。
【００８１】
【図７−５】図７Ａ〜７Ｋは、ナノ粒子が鉄取り込みおよびグルタチオンレベルに影響することを示す。図７Ｊは、エラスチンを用いる前処置がナノ粒子によって誘導されたフェロトーシスに対して感作することを示す。グラフは、示された処置の１８時間後（白色のバー）または２４時間後（陰影をつけたバー）の、パーセントＨＴ−１０８０細胞死（Ｓｙｔｏｘグリーン＋細胞）を示す。エラスチンを用いる４時間の前処置は、「−」または「＋」と示す。エラスチン前処置はそれ自体細胞死を誘導しない（「無処置」）が、前処置培養（「＋」）は１８および２４時間でより多くの細胞死を起こすので、連続エラスチン処置（「エラスチン」）およびα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット（１５μＭ）とアミノ酸飢餓の組み合わせ（「ＡＡ−ｓｔ＋αＭＳＨ」）の両方に対して感作することに留意する。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。１群につきＮ＝５。各反復は、１つの生物実験からのものであり、５つの独立視野で定量化されている。
【００８２】
【図７−６】図７Ａ〜７Ｋは、ナノ粒子が鉄取り込みおよびグルタチオンレベルに影響することを示す。図７Ｋは、ＧＰＸ４活性が粒子処置によって阻害されないことを示す。データは、示された処置の後に収集された細胞溶解物からのＧＰＸ４の比活性を示す。データは、３つの独立した生物実験からのものであり、バーは、平均＋／−平均の標準誤差を表す。
【００８３】
【図８−１】図８Ａ〜８Ｇは、アポトーシスおよびネクロトーシス阻害細胞およびリプロキシスタチン−１の対照アッセイを示す。図８Ａは、無アミノ酸培地で培養し、１００ｎＭのコンカナマイシンＡ（ＣｏｎＡ）で処置したＭＣＦ１０Ａ細胞が細胞死を起こし、細胞小疱形成および断片化を含むアポトーシスの形態学的特徴を伴うことを示す。
【００８４】
【図８−２】図８Ａ〜８Ｇは、アポトーシスおよびネクロトーシス阻害細胞およびリプロキシスタチン−１の対照アッセイを示す。図８Ｂは、Ｂｃｌ２過剰発現およびＣｏｎＡ処置の存在下または非存在下において完全培地（完全）またはアミノ酸飢餓（ＡＡ−ｓｔ）条件で培養されたＭＣＦ１０Ａ細胞での細胞死（Ｓｙｔｏｘグリーン＋）の定量化を示す。Ｂｃｌ２は、ＡＡ−ｓｔ条件でＣｏｎＡ処置によって誘導されるアポトーシスを阻害することに留意する。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。１群につきＮ＝５。各反復は、１つの生物実験からのものであり、５つの独立視野で定量化されている。
【００８５】
【図８−３】図８Ａ〜８Ｇは、アポトーシスおよびネクロトーシス阻害細胞およびリプロキシスタチン−１の対照アッセイを示す。図８Ｃは、ＲＩＰＫ３のノックアウトがネクロトーシスを阻害することを示す。グラフは、ネクロトーシスを誘導するために、１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα、１μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド（ＣＨＸ）および２０μＭのｚＶＡＤの組み合わせで処置した、野生型（ｗｔ）およびＲＩＰＫ３−／−ＭＥＦのパーセント細胞死（Ｓｙｔｏｘグリーン＋）を示す。ＲＩＰＫ３−／−ＭＥＦは細胞死を起こさず、３０μＭのネクロスタチン−１（Ｎｅｃ−１）、ネクロトーシス阻害剤、で処置したｗｔ細胞に類似することに留意する。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。１群につきＮ＝５。各反復は、１つの生物実験からのものであり、５つの独立視野で定量化されている。
【００８６】
【図８−４】図８Ａ〜８Ｇは、アポトーシスおよびネクロトーシス阻害細胞およびリプロキシスタチン−１の対照アッセイを示す。図８Ｄは、５０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを用いる処置に応答してアポトーシスを起こすＭＣＦ１０Ａ細胞が、細胞死の非同期パターンを示すことを示す。左の画像は、アポトーシスを起こす細胞の経時的顕微鏡検査法からの画像を示す（明るい＝Ｓｙｔｏｘグリーン）。右の画像は、個々の細胞死のタイミングを表すために偽着色した、左の画像からのＳｙｔｏｘグリーン陽性の核を示す。ここで細胞死の時間的パターンは、図３Ｄおよび３Ｅと比較して非同期である。全てのスケールバー＝１０μｍ。
【００８７】
【図８−５】図８Ａ〜８Ｇは、アポトーシスおよびネクロトーシス阻害細胞およびリプロキシスタチン−１の対照アッセイを示す。図８Ｅは、１５μＭのα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの非存在下（左）および存在下（右）において完全培地で７２時間培養されたＭ２１細胞を示す（粒子蛍光はシアンで示す）。図８Ｆは、完全培地で７２時間の粒子処置の３日および１０日での、対照および粒子処置細胞のパーセント細胞死（Ｓｙｔｏｘグリーン＋細胞）を示す。完全培地条件での粒子処置は、細胞生存度を阻害しないことに留意する。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。１群につきＮ＝５。各反復は、１つの生物実験からのものであり、５つの独立視野で定量化されている。
【００８８】
【図８−６】図８Ａ〜８Ｇは、アポトーシスおよびネクロトーシス阻害細胞およびリプロキシスタチン−１の対照アッセイを示す。図８Ｇは、リプロキシスタチン−１処置が粒子誘導細胞死を阻害することを示す。１５μＭのα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットおよび１μＭのリプロキシスタチン−１の存在下または非存在下においてアミノ酸飢餓（ＡＡ−ｓｔ）条件で培養された、ＭＣＦ１０Ａ細胞での４０時間後の細胞死（Ｓｙｔｏｘグリーン＋）の定量化。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。１群につきＮ＝５。各反復は、１つの生物実験からのものであり、５つの独立視野で定量化されている。
【００８９】
【図８−７】図８Ｈは、リプロキシスタチン−１処置がエラスチン処置によって誘導されるＣ１１−ＢＯＤＩＰＹ染色を阻害することを示す。画像は、対照細胞から６時間後に、エラスチン（５μＭ）で処置したＣ１１−ＢＯＤＩＰＹとインキュベートした細胞が、図３Ｆ〜３Ｇにおけるように細胞死を起こしたことを示す。エラスチン＋リプロキシスタチン−１処置細胞におけるＣ１１−ＢＯＤＩＰＹ染色の非存在に留意する。
【００９０】
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｃは、粒子処置腫瘍の画像を示す。図９Ａは、違った大きさのＰＥＧ−Ｃ’ドットで処置したＨＴ−１０８０細胞での細胞死測定を示す。αＭＳＨペプチドを欠く６ｎｍまたは１０ｎｍの１５μＭのＰＥＧ−Ｃ’ドットの非存在下または存在下において、完全培地またはＡＡ−ｓｔ条件で４８時間培養したＨＴ−１０８０細胞死（Ｓｙｔｏｘグリーン＋）の定量化。エラーバーは、Ｓ．Ｄ．を表す。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。１群につきＮ＝５。
【００９１】
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｃは、粒子処置腫瘍の画像を示す。図９Ｂは、ＨＴ−１０８０腫瘍が良く血管化されていることを示す。画像は、粒子注射の１０日後に収集し、内皮マーカーＣＤ３１のために免疫組織化学によって染色した、代表的なＨＴ−１０８０異種移植検体を示す。全腫瘍の低倍率（４×）顕微鏡画像（上の画像）および腫瘍領域の高倍率（４０×）画像（下の像）。腫瘍全体における血管の存在に留意する。スケールバー＝５００μｍ（低倍率）；５０μｍ（高倍率）。
【００９２】
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｃは、粒子処置腫瘍の画像を示す。図９Ｃは、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット処置７８６−Ｏ腫瘍が、動員された多数のマクロファージを示すことを示す。Ｍａｃ−２染色処置切片の低（上の画像）および高（下の画像）倍率像は、類似の位置（ボックス）で腫瘍を囲む顕著なＭａｃ−２陽性細胞を示す。
【００９３】
【図１０−１】図１０Ａ〜１０Ｊは、図１Ｃ〜１Ｆおよび図２Ａ〜２Ｅからのグラフの個々のデータポイントを示す。図１０Ａは、図１Ｃの細胞生存グラフ（左側）からのデータが示されることを示す。Ｎ＝３の生物実験、各データポイントは５つの独立した視野からの平均を表す。図１０Ｂは、図１Ｃの細胞増殖グラフ（右側）からのデータが示されることを示す。Ｎ＝３の生物実験、各データポイントは５つの独立した視野からの平均を表す。図１０Ｃは、個々のＬＣ３−ＩＩ／アクチン値が、図１Ｄの左のグラフから示されることを示す。各群につきＮ＝３のウェスタンブロット。１５μｍの条件が、０．７９にプロットされる２つの値を有することに留意する。図１０Ｄは、個々のＬＣ３−ＩＩターンオーバー値が、図１Ｄの右のグラフから示されることを示す。各群につきＮ＝３のウェスタンブロット。
【００９４】
【図１０−２】図１０Ａ〜１０Ｊは、図１Ｃ〜１Ｆおよび図２Ａ〜２Ｅからのグラフの個々のデータポイントを示す。図１０Ｅは、図１Ｅの細胞死グラフからのデータが示されることを示す。Ｎ＝４の生物実験、各データポイントは５つの独立した視野からの平均を表す。図１０Ｆは、図２Ｂの左側の細胞死グラフからのデータが、各群のＮ＝５について示されることを示す。各反復は、同じ生物実験の独立した視野である。図１０Ｇは、図２Ｂの右側の細胞死グラフからのデータが、各群のＮ＝５について示されることを示す。各反復は、同じ生物実験の独立した視野である。図１０Ｈは、図２Ｃの細胞死グラフからのデータが、各群のＮ＝５について示されることを示す。各反復は、同じ生物実験の独立した視野である。
【００９５】
【図１０−３】図１０Ａ〜１０Ｊは、図１Ｃ〜１Ｆおよび図２Ａ〜２Ｅからのグラフの個々のデータポイントを示す。図１０Ｉは、図２Ｄの細胞死グラフからのデータが、各群のＮ＝５について示されることを示す。各反復は、同じ生物実験の独立した視野である。図１０Ｊは、図２Ｅの細胞死グラフからのデータが、各群のＮ＝５について示されることを示す。各反復は、同じ生物実験の独立した視野である。
【００９６】
【図１１−１】図１１Ａ〜１１Ｉは、図３Ａ〜３Ｆ、４Ａ〜４Ｃおよび８Ａ〜８Ｇからのグラフの個々のデータポイントを示す。図１１Ａは、図３Ａの細胞死グラフからのデータが示されることを示す。Ｎ＝３の生物実験、各データポイントは５つの独立した視野からの平均を表す。図１１Ｂは、図３Ｃの細胞死グラフからのデータが示されることを示す。各群につきＮ＝５。各反復は、同じ生物実験の独立した視野である。図１１Ｃは、図３Ｂの細胞死グラフからのデータが示されることを示す。Ｎ＝３の生物実験、各データポイントは５つの独立した視野からの平均を表す。図１１Ｄは、図４Ａの細胞死グラフからのデータが示されることを示す。各群につきＮ＝５。各反復は、同じ生物実験の独立した視野である。
【００９７】
【図１１−２】図１１Ａ〜１１Ｉは、図３Ａ〜３Ｆ、４Ａ〜４Ｃおよび８Ａ〜８Ｇからのグラフの個々のデータポイントを示す。図１１Ｅは、図４Ｂの細胞死グラフからのデータが示されることを示す。各群につきＮ＝５。各反復は、同じ生物実験の独立した視野である。図１１Ｆは、図４Ｃの細胞死グラフからのデータが示されることを示す。Ｎ＝３の生物実験、各データポイントは５つの独立した視野からの平均を表す。図１１Ｇは、図８Ｂの細胞死グラフからのデータが示されることを示す。各群につきＮ＝５。各反復は、同じ生物実験の独立した視野である。図１１Ｈは、図８Ｃの細胞死グラフからのデータが示されることを示す。各群につきＮ＝５。各反復は、同じ生物実験の独立した視野である。図１１Ｉは、図８Ｆの細胞死グラフからのデータが示されることを示す。各群につきＮ＝５。各反復は、同じ生物実験の独立した視野である。
【００９８】
【図１２−１】図１２Ａ〜１２Ｅは、図６Ｂ〜６Ｃおよび７Ｂ〜７Ｈからのグラフの個々のデータポイントを示す。図１２Ａは、図６Ｂの細胞死グラフからのデータが示されることを示す。各群につきＮ＝５。各反復は、同じ生物実験の独立した視野である。図１２Ｂは、図７Ｃの細胞死グラフからのデータが示されることを示す。各群につきＮ＝５。各反復は、同じ生物実験の独立した視野である。
【００９９】
【図１２−２】図１２Ａ〜１２Ｅは、図６Ｂ〜６Ｃおよび７Ｂ〜７Ｈからのグラフの個々のデータポイントを示す。図１２Ｃは、図７Ｆの細胞死グラフからのデータが示されることを示す。各群につきＮ＝５。各反復は、同じ生物実験の独立した視野である。図１２Ｄは、図７Ｂ（上のグラフ）からのグルタチオン定量化のデータが示されることを示す。Ｎ＝３の独立した生物実験。
【０１００】
【図１２−３】図１２Ａ〜１２Ｅは、図６Ｂ〜６Ｃおよび７Ｂ〜７Ｈからのグラフの個々のデータポイントを示す。図１２Ｅは、図７Ｇの細胞死グラフからのデータが示されることを示す。各群につきＮ＝５。各反復は、同じ生物実験の独立した視野である。
【発明を実施するための形態】
【０１０１】
明細書全体で、組成物が特定の構成成分を有する（ｈａｖｉｎｇ）、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載される場合、または、方法が特定のステップを有する（ｈａｖｉｎｇ）、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載される場合、さらに、列挙される構成成分から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）、またはそれからなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）本発明の組成物があること、および列挙される加工ステップから本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）、またはそれからなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）本発明による方法があることが考えられる。
【０１０２】
本発明が作動可能なままである限り、ステップの順序またはある特定の動作を実行する順序は重要でないことを理解すべきである。さらに、２つまたはそれを超えるステップまたは動作を同時に実行することができる。
【０１０３】
例えば背景技術の節での任意の刊行物への本明細書での言及は、その刊行物が本明細書に提示される請求項のいずれかに関して先行技術としての役目をすることを認めるものではない。背景技術の節は明瞭さのために提供され、いかなる請求項に関する先行技術の記載も意味するものでない。
【０１０４】
本明細書に記載される様々な実施形態は、ＦＤＡ−ＩＮＤ承認の極小ナノ粒子、例えばＣおよびＣ’ドットを利用する。本明細書に記載される様々な実施形態は、薬物送達適用へのそれらの適合を実証し、（１）細胞および異種移植モデルが、ある範囲の濃度および時間（例えば、数日から数週）にわたってメラノーマ標的化Ｃ’ドット（例えば、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット）処置にどのように応答するか、ならびに（２）細胞経路が粒子摂取によって影響されるかどうかを検討する詳細な細胞生物学的分析を実行した。
【０１０５】
細胞死プログラムフェロトーシスを誘導するために、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを用いる細胞の処置およびアミノ酸飢餓の組み合わせがどのように相乗的に作用するかが、本明細書に記載される。さらに、メラノーマ標的化ペプチドと適合された直径１０ｎｍ未満の蛍光性（Ｃｙ５色素含有）シリカナノ粒子（例えば、Ｃ’ドット）を使用する濃度依存的および時間依存的処置が細胞に及ぼす影響が本明細書で実証される。本開示は、鉄、反応性酸素種および細胞死実行の同期モードを含むフェロトーシス機構によって、高濃度の極小ナノ粒子（例えば、直径１０ｎｍ未満、例えばＣドットまたはＣ’ドット）が細胞死をどのように誘導するかを記載する。ある特定の実施形態では、高い濃度は、被験体の腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である（ここで、この範囲は本明細書に記載されるマウス研究に基づく推定値である）。ある特定の実施形態では、高い濃度は、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、ナノ粒子はシリカをベースとしており、例えば、ナノ粒子はＣドットまたはＣ’ドットである。ある特定の実施形態では、局所濃度は、腫瘍タイプおよび／または被験体に依存する。
【０１０６】
本開示は、これらの粒子の高い濃度は、栄養豊富な培地で培養した非がん細胞およびがん細胞の両方で概して良好に耐容されたことを記載する。粒子処置および代謝的（例えば、アミノ酸）欠乏の組み合わせは相乗的に作用して、がん細胞を高率に死滅させた。理論に拘束される必要はないが、摂取されたナノ粒子はリソソームネットワークに局在化するが、リソソーム機能を阻害せず、ナノ粒子誘導死がオートファジー経路と独立して起こる。
【０１０７】
これらの効果がｉｎ  ｖｉｖｏにおける栄養枯渇状態に拡張するかどうか決定するために、異種移植片を粒子曝露がん細胞から生成したか、または粒子複数回投薬戦略を使用して静脈内処置した。この目的で、濃度依存的持続的成長阻害が観察され、部分的腫瘍退縮を伴った腫瘍成長動態の抑制が起こった。したがって、これらのデータは、高濃度および栄養欠乏条件の下で用いられた極小の表面官能化されたシリカベースのナノ粒子が、フェロトーシス機構によって細胞死を誘導したことを実証した。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、シリカ、ポリマー（例えば、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ））、生物学的製剤（例えば、タンパク質担体）および／または金属（例えば、金、鉄）を含む。ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、ここに参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒａｄｂｕｒｙらによる米国特許出願公開第２０１３／００３９８４８Ａ１号に記載される「Ｃドット」である。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、ナノ粒子は球状である。ある特定の実施形態では、ナノ粒子は非球状である。ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、金属／半金属／非金属、金属／半金属／非金属酸化物、−スルフィド、−カーバイド、−ニトリド、リポソーム、半導体、および／またはその組み合わせからなる群より選択される材料であるか、またはそれを含む。ある特定の実施形態では、金属は、金、銀、銅および／またはその組み合わせからなる群より選択される。
【０１１０】
ナノ粒子は、シリカ（ＳｉＯ２）、チタニア（ＴｉＯ２）、アルミナ（Ａｌ２Ｏ３）、ジルコニア（ＺｒＯ２）、ゲルマニウム（ＧｅＯ２）、五酸化タンタル（Ｔａ２Ｏ５）、ＮｂＯ２などを含む金属／半金属／非金属酸化物、ならびに／または金属／半金属／非金属ホウ化物、カーバイド、スルフィドおよびニトリド、例えばチタンおよびその組み合わせ（Ｔｉ、ＴｉＢ２、ＴｉＣ、ＴｉＮなど）を含む非酸化物を含むことができる。
【０１１１】
ナノ粒子は、１つまたは複数のポリマー、例えば、ヒトで使用するために２１Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１７７．２６００の下で米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された１つまたは複数のポリマー、例えば、限定されずに、ポリエステル（例えば、ポリ乳酸、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリバレロラクトン、ポリ（１，３−ジオキサン−２−オン））；ポリ酸無水物（例えば、ポリ（セバシン酸無水物））；ポリエーテル（例えば、ポリエチレングリコール）；ポリウレタン；ポリメタクリレート；ポリアクリレート；ポリシアノアクリレート；ＰＥＧおよびポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）のコポリマーを含むことができる。
【０１１２】
ナノ粒子は、１つまたは複数の分解性ポリマー、例えば、ある特定のポリエステル、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリホスホエステル、ある特定のポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリ（アミノ酸）、ポリアセタール、ポリエーテル、生分解性ポリシアノアクリレート、生分解性ポリウレタンおよび多糖を含むことができる。例えば、使用することができる具体的な生分解性ポリマーには、限定されずに、ポリリシン、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）（ＰＬＣ）およびポリ（グリコリド−ｃｏ−カプロラクトン）（ＰＧＣ）が含まれる。別の例示的な分解性ポリマーはポリ（ベータ−アミノエステル）であり、それは本出願に従って使用するのに好適かもしれない。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、１つまたは複数の官能基を有するか、または有するように改変することができる。そのような官能基（ナノ粒子の中またはその表面の）は、任意の薬剤（例えば、検出可能な実体、標的化実体、治療的実体またはＰＥＧ）との会合のために使用することができる。表面官能性を導入または改変することによって表面電荷を変化させることに加えて、異なる官能基の導入は、リンカー（例えば、（開裂可能なまたは（生）分解可能な）ポリマー、例えば、限定されずに、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ＰＬＧＡなど）、標的化／ホーミング薬剤、および／またはその組み合わせのコンジュゲーションを可能にする。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、１つまたは複数の標的化リガンド（または、部分）（例えば、それに付着している）、例えば、限定されずに、小分子（例えば、フォレート、色素など）、アプタマー（例えば、Ａ１０、ＡＳ１４１１）、多糖、小生体分子（例えば、葉酸、ガラクトース、ビスホスホネート、ビオチン）、オリゴヌクレオチドおよび／またはタンパク質（例えば、（ポリ）ペプチド（例えば、αＭＳＨ、ＲＧＤ、オクトレオチド、ＡＰペプチド、上皮成長因子、クロロトキシン、トランスフェリンなど）、抗体、抗体断片、タンパク質など）を含む。ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、１つまたは複数の造影／画像化剤（例えば、蛍光色素、（キレート化）放射性同位体（ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ）、ＭＲ活性剤、ＣＴ剤）、および／または治療剤（例えば、小分子薬、治療的（ポリ）ペプチド、治療的抗体、（キレート化）放射性同位体など）を含む。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、ＰＥＴ（陽電子放射断層撮影）トレーサは、画像化剤として使用される。ある特定の実施形態では、ＰＥＴトレーサは、８９Ｚｒ、６４Ｃｕ、［１８Ｆ］フッ化デオキシグルコースを含む。ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、これらのおよび／または他の放射性標識を含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の標的化リガンド（または、部分）は、同じタイプのものであってよいか、または異なる種であってもよい。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、１つまたは複数のフルオロフォアを含む。フルオロフォアは、蛍光色素、蛍光色素クエンチャー分子、任意の有機もしくは無機の色素、金属キレートまたは任意の蛍光性酵素基質、例えばプロテアーゼで活性化可能な酵素基質を含む。ある特定の実施形態では、フルオロフォアは、長鎖炭素親和性シアニン（ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ  ｃａｒｂｏｐｈｉｌｉｃ  ｃｙａｎｉｎｅ）を含む。他の実施形態では、フルオロフォアは、ＤｉＩ、ＤｉＲ、ＤｉＤなどを含む。蛍光色素は、遠赤外および近赤外蛍光色素（ＮＩＲＦ）を含む。蛍光色素は、限定されずに、カルボシアニンおよびインドシアニン蛍光色素を含む。ある特定の実施形態では、画像化剤には、市販の蛍光色素、例えば、限定されずに、Ｃｙ５．５、Ｃｙ５およびＣｙ７（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ６６０、ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ６８０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７９０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ＶｉｖｏＴａｇ６８０、ＶｉｖｏＴａｇ−Ｓ６８０およびＶｉｖｏＴａｇ−Ｓ７５０（ＶｉｓＥｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ）；Ｄｙ６７７、Ｄｙ６８２、Ｄｙ７５２およびＤｙ７８０（Ｄｙｏｍｉｃｓ）；ＤｙＬｉｇｈｔ５４７、ＤｙＬｉｇｈｔ６４７（Ｐｉｅｒｃｅ）；ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０およびＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０（ＡｎａＳｐｅｃ）；ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ  ８００ＲＳおよびＩＲＤｙｅ  ７００ＤＸ（Ｌｉ−Ｃｏｒ）；ならびに、ＡＤＳ７８０ＷＳ、ＡＤＳ８３０ＷＳおよびＡＤＳ８３２ＷＳ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｙｅ  Ｓｏｕｒｃｅ）およびＫｏｄａｋ  Ｘ−ＳＩＧＨＴ６５０、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−ＳＩＧＨＴ６９１、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−ＳＩＧＨＴ７５１（Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ  Ｈｅａｌｔｈ）が含まれる。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、例えば目的のがん組織／細胞を標的にする、１つまたは複数の標的化リガンドを含む（例えば、それらが付着している）。
【０１１８】
処置することができるがんには、例えば、前立腺がん、乳がん、精巣がん、子宮頸がん、肺がん、結腸がん、骨がん、神経膠腫、神経膠芽腫、多発性骨髄腫、肉腫、小細胞癌、メラノーマ、腎臓がん、肝がん、頭頸部がん、食道がん、甲状腺がん、リンパ腫、膵臓（例えば、ＢｘＰＣ３）、肺（例えば、Ｈ１６５０）および／または白血病が含まれる。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、治療剤、例えば、薬物（例えば、化学療法薬）および／または治療的放射性同位体を含む。本明細書で使用されるように、「治療剤」は、被験体に投与したときに治療効果を有する、ならびに／または所望の生物学的および／もしくは薬理学的効果を導き出す任意の薬剤を指す。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、例えば、組み合わせ療法が使用される場合、治療方法の実施形態は、ナノ粒子の投与および１つまたは複数の薬物（例えば、別個に、またはナノ粒子にコンジュゲートして）、例えば、１つまたは複数の化学療法薬、例えばソラフェニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、ＭＥＫ１６２、エトポシド、ラパチニブ、ニロチニブ、クリゾチニブ、フルベストラント、ベムラフェニブ、ベキソロテンおよび／またはカンプトテシンの投与を含む。
【０１２１】
ナノ粒子の表面化学、コーティングの均一性（コーティングがある場合）、表面電荷、組成、濃度、投与の頻度、形状および／またはサイズは、所望の治療効果、例えばがん細胞のフェロトーシスを生じるように調整することができる。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、ナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）が、薬物送達適用のために使用される。ＮＤＣに関する詳細は、例えば、その内容が参照により本明細書に完全に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１５／１８３８８２Ａ１号に記載される。
【実施例】
【０１２３】
本明細書で記載されるように、細胞の取り込みを促進するためにＭＣ１−Ｒ−標的化Ｃ’ドットを使用した（図１Ａ）。粒子で２４時間処置した、ＭＣ１−Ｒを発現しているヒトメラノーマ細胞（Ｍ２１）細胞のライブイメージングは、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットのリソソームとの共局在を明らかにした。摂取された粒子がリソソームまたは後期エンドソームのネットワークに存在したことを示すために、ＧＦＰタグ付きのリソソーム結合膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）の発現によって共局在を可視化した（図１Ｂ）。最高１５μＭまで増加する濃度のα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット粒子を用いて処置したＭ２１細胞は、対照細胞において観察される率と同様の生存率および増殖率を示した（図１Ｃ〜１Ｅ）。これらの結果は、高濃度のこれらのナノ粒子とのインキュベーションが、細胞によって十分に耐容されることを実証した。α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを用いて処置した細胞内でリソソームが適切に機能していたかどうかを次に調査した。これを決定するために、リソソーム分解のために細胞内基質を標的とする、オートファジー経路を調査した。オートファジーは、オートファゴソーム膜上に脂質付加され、リソソームとのオートファゴソームの融合後に分解される、オートファジータンパク質微小管結合タンパク質１軽鎖３（ＬＣ３）の基底レベルおよびターンオーバー率を定量化することによって調査した。オートファゴソームと結合し、脂質付加された形態のＬＣ３（ＬＣ３−ＩＩと呼ばれる）の蓄積を、サイトゾルの、脂質付加されていない形態（ＬＣ３−Ｉと呼ばれる）に対する、リソソームを通るフラックスの尺度またはオートファジー誘導の尺度としてウェスタンブロットによって定量化した（図１Ｆ〜１Ｈ）。
【０１２４】
リソソーム依存的な様式で生じるＬＣ３−ＩＩのターンオーバーは、リソソーム機能の読み出しとして測定することもできる。リソソームが適切に機能しているときには、リソソーム阻害剤、例えば、リソソーム液胞型Ｈ＋−ＡＴＰアーゼ（Ｖ−ＡＴＰアーゼ）を阻害するコンカナマイシンＡ（ＣｏｎＡ）などでの処置は、分解の欠如に起因するＬＣ３−ＩＩの蓄積を導く。対照的に、リソソームが機能不全である場合には、ＣｏｎＡでの処置は、ＬＣ３−ＩＩレベルを変化させないことになる。０．１５μＭから１５μＭまで増加する濃度のα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットで２４時間処置した細胞は、対照細胞と比較して同様の相対ＬＣ３−ＩＩレベルを有しており、オートファジーがナノ粒子処置によって誘導も撹乱もされないことが示唆される。ｐＨを高めることによってリソソーム機能を阻害してオートファゴソーム分解をブロックする、リソソーム阻害剤ＣｏｎＡでの細胞の処置は、粒子で処置した細胞において対照と比較して同様のＬＣ３−ＩＩの蓄積をもたらしており、細胞に高濃度のα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットをローディングしたときでもリソソームが適切に機能していることを実証している（図１Ｆ〜１Ｈ）。
【０１２５】
次に、オートファジーを誘導するために栄養欠乏条件下で培養した細胞にナノ粒子を投与した。無アミノ酸培地中で培養した細胞をα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットで処置し、経時的イメージングによって調査した。アミノ酸欠乏は、粒子の非存在下でＭ２１細胞によって十分に耐容されたのに対して、アミノ酸欠乏細胞の１５μＭのα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットでの処置は、これは栄養豊富な培地中の細胞には影響しなかったが、高い率で細胞死に導いた。細胞死は、断裂した形質膜を有する細胞を標識する膜不透過性核酸色素である、Ｓｙｔｏｘグリーンの取り込みによって検出した（図１Ｉ〜１Ｊ）。これは、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットは、概して十分に耐容されるが、栄養欠乏がん細胞は処置に感受性であることを実証する。この発見がｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍成長について結果を有しうるかどうかを決定するために、Ｍ２１メラノーマ細胞を、栄養豊富な条件下での培養においてα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットと共にインキュベートし、これは細胞生存率に影響しなかったが（図１Ｃ〜１Ｅおよび図８Ｅ〜８Ｆ）、次いで、粒子曝露された細胞、ならびに粒子曝露されていない細胞をマウス内に側腹部腫瘍異種移植片として注射して栄養欠乏状態を促進させた。αＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットをローディングしたＭ２１メラノーマ細胞は、粒子曝露されていない細胞と比較して統計的に有意な成長阻害を示した（ｐ＜０．００１）。測定可能な腫瘍成長は、粒子曝露した細胞から、細胞注射の１０日後まで生じなかった。理論に拘束される必要はないが、これらの発見により、高濃度のα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットでの処置は、培養およびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて栄養欠乏の条件下で細胞死を誘導しうることが示唆される。
【０１２６】
次に、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットで処置した細胞が、栄養欠乏条件下で細胞死を起こす機構を調査した。理論に拘束される必要はないが、死にかけている細胞の形態の検査により、アポトーシス中に通常観察される細胞の小疱形成および断片化なしで、細胞の膨張および形質膜の断裂を引き起こしている、壊死の形態が示唆された（図２Ａおよび図８Ａ）。細胞死の機構をより明確に特定するために、２種の非腫瘍細胞株、ヒト乳腺上皮細胞ＭＣＦ１０Ａおよびマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を利用し、無アミノ酸培地中でα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの存在下で培養したときに、高い率で死ぬことも観察された（図２Ｂ〜２Ｃ）。抗アポトーシス性タンパク質Ｂｃｌ−２の過剰発現によってアポトーシスに対して抵抗性にされた細胞（ＭＣＦ１０Ａ−Ｂｃｌ２）（図８Ｂ）またはＢａｘおよびＢａｋの遺伝的欠失によってアポトーシスに対して抵抗性にされた細胞（Ｂａｘ／Ｂａｋ−／−ＭＥＦ）は、対照細胞の率と同様の率で細胞死を起こしており、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットで誘導された細胞死は、アポトーシスによって生じないことが示唆される（図２Ｄおよび図２Ｅ）。
【０１２７】
次に、細胞死が、ＲＩＰＫ３キナーゼを必要とする、プログラムされた形態の壊死である、ネクロトーシスによって生じていたかどうかを決定した。Ｂａｘ／Ｂａｋ−／−ＭＥＦと同様に、ネクロトーシスに耐性である（図８Ｃ）Ｒｉｐｋ３−／−ノックアウトＭＥＦも、対照と比較して同様の率で細胞死を起こした。理論に拘束される必要はないが、この結果により、ナノ粒子処置は、ネクロトーシスを誘導しないことが示唆された（図２Ｆ）。
【０１２８】
次に、オートーシスと呼ばれる、オートファジー経路を含む最近記載されている形態の細胞死が関与しうるかどうかを、オートファジーを完全に欠損したオートファジー関連遺伝子５ノックアウトＭＥＦ（Ａｔｇ５−／−ＭＥＦ）をアミノ酸の非存在下でα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットで処置することによって決定した。Ａｔｇ５−／−ＭＥＦは、対照細胞と同様の率で細胞死を起こしており、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットで誘導された細胞死は、オートファジーを伴わず、オートーシスではないことが実証される（図２Ｆ）。合わせて、これらのデータより、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット処置とアミノ酸欠乏との組み合わせによって誘導される細胞死は、アポトーシス、ネクロトーシス、およびオートーシスとは独立に生じることが実証された。
【０１２９】
次に、鉄および脂質活性酸素種（ＲＯＳ）に依存的なプロセスを介して生じる最近記載されている細胞死機構である、フェロトーシスが、グルタチオン枯渇によって誘導されるかどうか、およびα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットで誘導された細胞死に関与するかどうかを決定した。最初に、脂質ＲＯＳのスカベンジャーであるフェロトーシスの薬理学的阻害剤である、フェロスタチン−１およびリプロクススタチン−１が、この状況において細胞死をブロックすることができるかどうかを決定した。フェロスタチン−１またはリプロクススタチン−１のいずれかでの処置は、細胞生存率をレスキューし、アミノ酸欠乏条件下でナノ粒子の非存在下で生じるレベルまで細胞死を減少させた（図３Ａ、図８Ｇ）。
【０１３０】
ナノ粒子で誘導された細胞死は、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、アスコルビン酸（Ａｓｃ酸）およびトロロクスを含む、他の抗酸化剤での処置によっても阻害され、あるいは、代替的に、グルタチオンまたは、グルタチオンの前駆体である、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）の添加を通してのグルタチオン過多によっても阻害された（図２Ｂ〜２Ｃ）。ナノ粒子で誘導される細胞死中に脂質ＲＯＳが蓄積するかどうかを調査するために、粒子曝露した細胞を脂質酸化指示薬Ｃ１１−ＢＯＤＩＰＹの存在下でイメージングした。リプロクススタチン−１で阻害可能な様式で、公知のフェロトーシス誘導剤エラスチンでの処置に応じて、細胞死の前の染色の増加が生じるのを認めた（図３Ｆ〜Ｇ、図８Ｈ）。エラスチン処置によって誘導される細胞死と同様に、Ｃ１１−ＢＯＤＩＰＹ染色によって検出される脂質ＲＯＳは、無アミノ酸条件下でのナノ粒子処置による細胞死の誘導の数時間前に蓄積した（図３Ｆ〜３Ｇ）。ナノ粒子で誘導される死が、フェロトーシスの要件である、鉄に依存するかどうかをさらに調査するために、鉄過剰症を処置するために使用される鉄キレート剤でありフェロトーシスをブロックすることが報告されている薬剤である、デフェロキサミン（ＤＦＯ）で処置した細胞が、細胞死をほぼ完全に阻害したことが見出された（図３Ｂ）。これらのデータは、アミノ酸飢餓細胞の高いα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット濃度での処置が、フェロトーシスを誘導することを実証している（図３Ｃ）。注目すべきことに、この状況におけるフェロトーシスは、アポトーシスなどの他の型の死を起こす細胞について見出されるもの（図８Ｄ）とは異なり、細胞から細胞に波状式に伝播することも観察された（図３Ｄおよび３Ｅ）。理論に拘束される必要はないが、これにより、死を誘導するシグナルの細胞から細胞への伝達が示唆された。
【０１３１】
ＭＣＦ１０Ａ細胞およびＭＥＦがフェロトーシスによって細胞死を起こすことを決定した後に、より広い種類のがん細胞においてこの様式でアミノ酸欠乏およびナノ粒子処置によって細胞死を誘導することができるかどうかを決定した。例えば、ＭＣＦ１０Ａ、ＭＥＦ、およびＭ２１細胞、ＢｘＰＣ３膵癌細胞、Ｈ１６５０肺癌細胞、ＨＴ１０８０線維肉腫細胞、および７８６−Ｏ腎癌細胞も、アミノ酸の非存在下においてα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットで処置したときに、高い率の壊死を起こす。このデータは、多様な種々のがん細胞型においてアミノ酸の非存在下でナノ粒子によって細胞死を誘導することができることを示している（図４Ａ〜４Ｆ、図６Ｃ〜６Ｅ）。
【０１３２】
注目すべきことに、ＨＴ−１０８０細胞は、完全培地中で培養したとき（図４Ｅ〜４Ｆ）および飢餓培地中で１／１０の低粒子濃度で培養したとき（図６Ｂ）、ナノ粒子処置に応じて壊死を起こし、これらの細胞は、この形態の細胞死に特に感受性であることが示唆される。
【０１３３】
これらの結果に基づき、粒子で誘導される処置の応答が、７８６−Ｏ腎癌およびＨＴ１０８０線維肉腫の異種移植モデルにおいて生じうるかどうかをさらに決定した。複数回投薬送達スキームを使用して、側腹部の７８６−ＯまたはＨＴ−１０８０腫瘍を有する免疫抑制されたマウスにおいて、標的化された粒子プローブ（ｎ＝５）または０．９％食塩溶液（ｎ＝３）のいずれかの３種の高用量静脈内（ｉ．ｖ．）処置後１０日の期間にわたって腫瘍成長を評価した。食塩水ビヒクルでの注射後に測定された時間と共に急速に増大している腫瘍体積と比較して、両方の腫瘍型について実験間隔にわたって複数用量の粒子処置で統計的に有意な腫瘍成長の阻害が観察されたが（図５Ａ、５Ｂ、５Ｉ、５Ｋ）、ＨＴ−１０８０異種移植片ではより大きかった。注目すべきことに、これは、最初の注射後４〜５日の間隔の中で、粒子処置したすべてのＨＴ−１０８０腫瘍について５０％を超える部分的な腫瘍退縮を伴った（例えば、部分的な腫瘍退縮の範囲５７％〜７８％；約６４％の平均部分的腫瘍退縮を有する）（図５Ｂ）。残りの実験間隔にわたり、粒子処置した腫瘍体積は減少した。例えば、１０日の実験期間の終わりまでに、処置したＨＴ−１０８０腫瘍体積は、対照体積と比較して約８５％の統計的に有意な減少を示し（ｐ＜０．００１）、処置した７８６−Ｏ腫瘍体積は、約７３％の統計的に有意な低減を示した（ｐ＜０．０１）（図５Ａ、５Ｂ）。ＨＴ１０８０側腹部異種移植片を有するマウスにおける代表的な全身光学イメージングは、最初のαＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット注射後に腫瘍配置の部位で強い蛍光シグナルを示し、静脈内に注射された粒子の局在を示唆した（図５Ｃ）。
【０１３４】
代表的な対照腫瘍（ｎ＝１）および処置した腫瘍（ｎ＝２）からの対応するＨ＆Ｅ染色組織切片（図５Ｄ）により、多病巣性の壊死を示している高密度で細胞性かつ侵襲性の新生物が明らかにされた。対照腫瘍は、明白な形態学的な相違なく、処置した腫瘍よりも平均で有意に大きかった。マクロファージマーカーＭａｃ−２の免疫組織化学的染色により、低倍率および高倍率の両方で、対照腫瘍の周りに認められるものと比較して、多数の、処置した腫瘍を取り囲む動員されたマクロファージが明らかにされた（図５Ｅ〜５Ｈ）。腫瘍内のＭａｃ−２陽性細胞は、すべての腫瘍において同様に少数で存在した。
【０１３５】
ナノ粒子処置から生じる腫瘍成長の阻害がフェロトーシスに関連していた可能性があったかどうかをさらに調査するために、腫瘍を有するマウスを、１０日の期間にわたってリプロクススタチン−１の毎日の腹腔内（ｉ．ｐ．）用量で処置し、粒子で誘導される腫瘍収縮に対する効果を決定した。ＨＴ１０８０異種移植マウス（ｎ＝３）において、その後投与した３種の高用量粒子処置リプロクススタチン−１は、粒子に曝露していない腫瘍において認められるものとほぼ同等のレベルまで成長阻害を有意に低下させた（図５Ｉ）。リプロクススタチン−１で処置した粒子曝露した腫瘍における平均的な毎日の成長は、１４．６ｍｍ３（９５％ＣＩ：１０．１〜１８．９）であり、粒子処置のみについての−０．８７ｍｍ３（９５％ＣＩ：−１．０６〜−０．６９）と比較して、１５．３ｍｍ３（ＣＩ：１３．１〜１７．６；ｐ＜０．００１）の相違であった。対応する粒子曝露した腫瘍検体は、毎日リプロクススタチン−１を投与した粒子処置した腫瘍よりも平均で有意に小さかった（図５Ｊ）。
【０１３６】
α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットおよびアミノ酸飢餓での細胞の組み合わせ処置は、細胞死プログラムフェロトーシスを誘導するのに相乗的に働いており、そのナノ粒子の高用量送達は、腫瘍成長を阻害して腫瘍退縮を引き起こすことができる；これらの効果は、リプロクススタチン−１の存在下で逆にすることもできる。例えば、この状況におけるフェロトーシス誘導のための栄養欠乏およびナノ粒子処置の組み合わされた要件は、正常細胞を残したまま、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞に関与する可能性がある（例えば、腫瘍組織は、代謝ストレスを受けることが知られており、かつ正常組織と比較して栄養が限られているため）。標的化された極小のシリカナノ粒子それ自体も、標的化を促進するリガンドで改変されたときに、非腫瘍組織よりも効率良く腫瘍組織内に優先的に蓄積されることが示されている。
【０１３７】
本明細書で記載されるように、静脈内送達後のＨＴ１０８０異種移植片内でのナノ粒子の蓄積が腫瘍成長を有意に阻害して部分的な腫瘍退縮を誘導することを見出した。リプロクススタチン−１のさらなる添加は、粒子に曝露していない腫瘍において認められるものとほぼ同等のレベルまでこれらの効果を逆にした。これらの発見により、選択されたがんの型において観察される粒子処置と栄養欠乏との間の潜在的な相乗効果が強調され、理論に拘束される必要はないが、そのような代謝戦略を利用することによって、フェロトーシスの関与が治療的な潜在可能性を有しうることが示唆される。
【０１３８】
細胞残渣を貪食することによる疾患防御および創傷修復におけるマクロファージの役割は十分に確立されているが、粒子処置した腫瘍の周囲のマクロファージの数における、対照腫瘍についてのものと比較して顕著な増加の重要性は完全に明らかなわけではない。高度なマクロファージ可塑性が腫瘍微小環境からの局所的な合図に応じて生じうること、および、活性化に応じて、マクロファージが、腫瘍収縮に関連したそれらの機能におけるシフトを含む、組織恒常性を維持するために必要とされる一範囲の役割を引き受けることができることをさらに認めることができる。これらのデータは、すでにがんのイメージングおよび検出のための臨床試験中であるが、例えば、表面に付着する細胞傷害剤の必要ない、分子的に標的化されたＣ’ドットの治療的適用を示す。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、フェロトーシスを誘導する。がんを標的化するためのαＭＳＨペプチドでの粒子の表面改変は、細胞の内部移行を促進する（データは示していない）。αＭＳＨでの粒子表面改変は、αＭＳＨ標的化リガンドで改変されていないＰＥＧコーティングしたＣ’ドットで、たとえより遅い速度であっても、その誘導が生じる（これは、α−ＭＳＨ改変されたプラットフォームと比較してより遅いベース粒子の内部移行を反映しうる）ので、試験した細胞株においてフェロトーシスのために必要とされない（図７Ｆ）。
【０１４０】
したがって、ある特定の実施形態では、脱プロトン化された表面シラノール基および／またはフラクタル内部構造がその構造内での鉄の吸着および／または組み込みを導くことができるので、天然のシリカ粒子それ自体がフェロトーシスを誘導する活性を有する。二重に脱イオン化した水調製物と比較して、培養培地と共にインキュベートしたα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの鉄ローディングが見出された（図７Ｇ、図８Ａ〜８Ｆ）。増加した鉄ローディングは、酸化第二鉄溶液と共にインキュベートしたときに濃度依存的な様式で生じ、鉄ローディング能力における低下を伴った（図８Ａ〜８Ｆ）。さらに、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットナノ粒子処置した細胞について、処置していない細胞と比較して上昇した細胞内鉄レベルが見出された（図７Ｇ、表１）。また、粒子処置した細胞は、サイトゾルの鉄を結合するフェリチンの重鎖（ＦＴＨ１）の発現を上方調節する（図７Ｈ）。クエン酸鉄アンモニウム（ＦＡＣ）での処置による細胞内への鉄ローディングは、粒子処置を模倣しかつアミノ酸飢餓細胞においてフェロトーシスを誘導するのに十分であることも見出されており（図７Ｉ）、これらのシリカベースのナノ粒子は、細胞内に鉄をローディングすることによってフェロトーシスに関与しうることが示唆される。増加した鉄取り込みは、考えられるところでは増加したＲＯＳ生成によって、グルタチオンの枯渇を導くことができる。グルタチオンレベルは、粒子で処置した細胞において抑制されることが見出され（図７Ｄ〜７Ｅ）、シスチン取り込みをブロックすることによってグルタチオン産生を阻害する、エラスチンでの前処置は、粒子で誘導されるフェロトーシスに対して細胞を感作させ、グルタチオン枯渇は、粒子で誘導される死に対して律速であることが示唆される（図７Ｊ）。
【０１４１】
表１は、マイクロ波プラズマ原子発光分光法（ＭＰ−ＡＥＳ）によって測定される鉄濃度を示す。
【表１】
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【０１４２】
まとめると、本明細書に記載の例示的なデータは、粒子処置によって誘導されるフェロトーシスが、フェロトーシスを実行する、グルタチオンの抑制および脂質ＲＯＳの蓄積を導く、細胞内への鉄取り込みに関与するというモデルを支持する（図４Ｇ）。脂質ＲＯＳは、脂質過酸化に対して細胞を保護してフェロトーシスを阻害するグルタチオンペルオキシダーゼ４（ＧＰＸ４）酵素の低下した活性により、グルタチオンを抑制した細胞内に蓄積しうる。粒子処置が、処置した細胞溶解物からの酵素アッセイにおいてＧＰＸ４活性を阻害することは見出されなかった（図７Ｋ）。同様に、粒子処置が、ＧＰＸ４の直接的な阻害によって脂質過酸化を導かないモデルは見出されなかった。
【０１４３】
一部のがん（例えば、ＨＴ１０８０、７８６−０）も同様に、この細胞死の機構に特に感受性であり得、これにより、抗腫瘍効果を達成するために必要な粒子濃度の閾値を低下させることができる。ＨＴ−１０８０がん細胞は、栄養豊富な条件下でも、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットで誘導されるフェロトーシスを起こすことが見出されており（図４Ｅ〜４Ｆ）、これらの細胞は、アミノ酸を欠乏させた条件において１／１０のナノ粒子濃度でも死滅する（図６Ｂ）。ＨＴ−１０８０腫瘍は、十分に血管化され（図９Ｂ）、粒子で誘導される死に対するこれらのがん細胞の感受性は、栄養豊富な条件下でも（図４Ｅ〜４Ｆ）、静脈内粒子送達後に観察される強い抗腫瘍効果に寄与しうることが示唆される。
【０１４４】
本明細書中で使用されるナノ粒子の濃度は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞死を誘導するため（例えば、１５μＭ）またはｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍成長阻害および退縮を阻害するため（例えば、６０μＭ）のいずれかのために選択されており、ヒト被験体において単一用量のイメージングに基づく解析のために現在使用されているものよりも少なくとも４桁高いのに対して、局所的な濃度は、複数回投薬戦略、組み合わせ処置レジメンの部分として、かつ／または標的部位における直接的なカテーテル注入によって腫瘍部位においてかなり高いレベルまで動かすことができる。このような投薬スケジュールは、オフターゲット毒性を低減しかつ効率的な腎クリアランスを促進しながら最大の腫瘍対バックグラウンド比を得るように設計することができる。注目すべきことに、腫瘍血管系の漏れやすさは、全身注射したナノ粒子の腫瘍組織における蓄積をもたらす可能性があり、さらには腫瘍内での栄養欠乏にも寄与する。理論に拘束される必要はないが、これにより、ナノ粒子および栄養欠乏の相乗効果がｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍部位に制限されうることがさらに示唆される。異なる腫瘍細胞株は、フェロトーシス誘導機構に対するそれらの感受性において明らかに異なりうることも見出された。例えば、卵巣がん細胞株、ＳＫＯＶ３は、アミノ酸欠乏およびα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの組み合わせ処置による細胞死に対する耐性を示したことが見出された（図６Ａ）。対照的に、ＨＴ１０８０線維肉腫細胞は、栄養豊富な条件下でも（図４Ｅ〜４Ｆ）、アミノ酸欠乏条件において１／１０のナノ粒子濃度（１．５μＭ）で、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットナノ粒子で誘導されるフェロトーシスを起こした（図６Ｂ）。この場合、ＨＴ１０８０細胞内への標的化粒子取り込みは、おそらく、非特異的なエンドサイトーシス経路を介して生じた。フェロトーシスは鉄依存的な細胞死であるので、理論に拘束される必要はないが、異なる感受性は、部分的に、細胞内で利用可能な鉄の量によりうる。例えば、鉄は、細胞恒常性に必須の成分であるが、細胞小器官を損傷しうるＲＯＳも生成しうる。細胞は、取り込み、排出、または貯蔵所から不安定な鉄プール（ＬＩＰ）へのシフトによって鉄利用可能性を調節することができ、これらのプロセスの一部はがんにおいて変化する。癌遺伝子ｃ−ｍｙｃおよびＥ１ａは、貯蔵所から代謝的に活性なＬＩＰに鉄をシフトさせることができる、サイトゾルの主要な鉄貯蔵タンパク質である、フェリチンのレベルを低下させ、フェリチンの抑制は、ＤＮＡ合成を活性化することによってＲａｓ依存的な増殖を刺激することができる。フェロトーシスを誘導する薬物は、最初は、Ｒａｓ駆動性腫瘍細胞の選択的な死滅を付与する小分子のスクリーニングにおいて発見された。さらに、試験した上記のがん細胞株の中で、ＨＴ１０８０は、Ｒａｓ変異を有する唯一の細胞株である。したがって、変異体Ｒａｓを有するがん細胞が、一般的にナノ粒子処置に対してより感受性であるかどうかが決定されることになる。
【０１４５】
一部のナノ材料（例えば、６３ｎｍ程度（例えば、Ｃ’ドットよりも１桁大きい）の直径を有するコーティングされていないシリカ粒子）は、細胞内でＲＯＳを誘導することが示されている。対照的に、１０ｎｍ未満の直径のα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットで２４時間処置した細胞におけるサイトゾルまたは脂質のＲＯＳのいずれのレベルの上昇も検出されなかった（図７Ａ〜７Ｃ）。上記のように、アミノ酸飢餓およびナノ粒子処置は、いずれも細胞内のグルタチオンレベルを低下させ、相加効果も有することが見出された（図７Ｄ〜７Ｅ）。理論に拘束される必要はないが、このデータにより、この状況における細胞死が、少なくとも部分的には、システインの取り込みを制限することによってグルタチオン産生を阻害するフェロトーシス誘導剤エラスチンと同様のグルタチオン枯渇によって引き起こされうることが示唆される。
【０１４６】
本明細書中で使用されるナノ粒子は、ｉｎ  ｖｉｖｏでがんを標的化するためのαＭＳＨペプチドで表面改変された。この改変も細胞の取り込みを促進することが示された（データは示していない）。フェロトーシス誘導は、αＭＳＨ標的化リガンドで改変されていないＰＥＧコーティングしたＣ’ドットでも観察されているので、この粒子表面改変は、フェロトーシスに関与するようには見えない。しかし、αＭＳＨ改変のないＰＥＧコーティングしたＣ’ドットによって引き起こされる死は、ＭＣ１−Ｒを発現しているメラノーマ細胞において、α−ＭＳＨ改変されたプラットフォームであるものと比較して低下したベース粒子の取り込みの率に起因して細胞集団内でより遅い動態で生じた（図７Ｆ）。他方では、アミノ酸欠乏条件下でのフェロトーシスの誘導において粒子サイズがきわめて重要な役割を果たすことが見出された。より小さな直径（約６ｎｍ）のＰＥＧ化Ｃ’ドットへの曝露の４８時間後に見出された高い百分率のＳｙｔｏｘグリーン標識ＨＴ１０８０細胞（例えば、８０％）と比較して、より大きな直径（約１０ｎｍ）の粒子とのインキュベーションの後に見出された標識細胞の百分率はかなり低く、２５％程度であり、無処置の細胞を超えてわずかに上昇しただけであった（図９Ａ〜９Ｃ）。
【０１４７】
考えられるところでは、一部のがんの感受性は、抗腫瘍効果を発揮するために必要な粒子濃度を低下させることができたのに対して、複数の高用量の処置が十分に耐容されることも見出された。粒子およびビヒクルで処置したＨＴ−１０８０および７８６−Ｏを有するマウスからの腫瘍、肝臓、腎臓、および血液学の検体の評価を実験例の終了時に行った。完全血球算定、血清化学、ならびに肝臓および腎臓の組織病理学において、対照動物と比較して、粒子で処置したマウスにおいて中程度に上昇した間接および総ビリルビン血清濃度を除き、有意な群差は見出されなかった（表２、表３）。しかし、完全血球算定において溶血反応がないことならびに組織病理学および血清化学において肝臓損傷のないことを考慮に入れると、この発見に帰することができた機構はない。したがって、これらの発見により、複数の高用量のα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット処置は十分に耐容されることが示唆される。粒子処置した（顕著）およびビヒクル処置した（軽度）腫瘍検体間のマクロファージ染色の程度についてもまとめている（表４）。
【０１４８】
表２は、腫瘍を有するマウスにおける代謝濃度プロファイル、腎プロファイル、および肝機能プロファイルを示す。
【表２−１】
2018516249.tif 000003
【表２−２】
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【０１４９】
表３は、腫瘍を有するマウスにおける血液学的プロファイルを示す。
【表３】
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【０１５０】
表４は、腫瘍を有するマウスにおける組織病理学的プロファイルを示す。
【表４】
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【０１５１】
Ｃドットがフェロトーシスに寄与する機構は、他の種類のナノ材料が、この形態の細胞死を誘導するための同様の効果を有しうるかどうか、ならびに粒子構造、組成、または表面化学特性における他の制御されたバリエーションがフェロトーシスの誘導を変える、またはさらに排除することができるかどうかを特定するために決定されうる。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、細胞の運命のレドックスモジュレーター、ならびに腫瘍退縮および成長阻害のメディエーターとしての、ナノ粒子で誘導されたフェロトーシスの能力は、同期的かつ選択的に、この機構に対して感受性が最も高いがんに感受性のがんを死滅させるために治療的にこのプロセスを利用することが可能でありうることを示唆している。
【０１５２】
ある特定の実施形態では、腫瘍の血管分布は、粒子送達、栄養および酸素状態、および処置応答に影響する。ある特定の実施形態では、多様な前臨床腫瘍型にわたる腫瘍の血管分布の評価は、フェロトーシスによる細胞死の誘導に好適なモデルの改良されたスクリーニングを提供する。ある特定の実施形態では、評価は、適切な組み合わせ処置パラダイムを特定する。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、Ｃ’ドット特性（例えば、構造、組成、または表面化学）における制御されたバリエーションは、フェロトーシスの誘導を促進する、または排除する。例えば、Ｃ’ドットサイズは、アミノ酸欠乏条件下で観察される効果の大きさにおいてきわめて重要な役割を果たすことが見出された（図９Ａ）。より小さな直径（約６ｎｍ）のＰＥＧ化Ｃ’ドットは、より大きな直径（約１０ｎｍ）のＣ’ドットについて見出されるもの（約２５％）と比較して有意に高い百分率のＳｙｔｏｘグリーン標識ＨＴ−１０８０細胞（約８０％）細胞を導いた。
【０１５４】
さらに、リプロクススタチン−１に対する応答は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍機構としてのフェロトーシスのための一例を提供するのに対して、他の機構は、粒子処置した腫瘍への顕著なマクロファージ動員を考慮に入れると、これに限定されないが腫瘍微小環境の調節などに寄与しうる（図５Ｇおよび５Ｈ、ＨＴ−１０８０；図９Ｃ、７８６−Ｏ）。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、組み合わせ療法は、フェロトーシスの誘導を促進するために被験体に投与されうる。例えば、薬物（例えば、ＴＡＳ−１０２）を腫瘍細胞に投与することができ、次いで、十分に高い濃度のナノ粒子を投与し、フェロトーシスを誘導することができる。ＴＡＳ−１０２についての詳細は、Ｒ．  Ｊ．  Ｍａｙｅｒら、ＮＥＪＭ、２０１５年５月１４日による「Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ＴＡＳ−１０２  ｆｏｒ  Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ」の中で見出すことができ、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、腫瘍からホルモンを欠乏させることができ（例えば、去勢）、腫瘍に投与する十分に高い濃度のナノ粒子は、ホルモンまたは阻害剤の処置に曝露していない腫瘍と比較して、フェロトーシスの細胞死プログラムを誘導および／またはさらに促進することもできる。
【０１５６】
いかなる特定の理論にも制限されることを望むものではないが、ホルモン性去勢（および／または栄養、例えば、アミノ酸の欠乏）は、近くにある粒子を内部移行する受容体を過剰発現することによって細胞が補うことを引き起こすことが仮定される。ある特定の実施形態では、フェロトーシスに対する鉄の効果をさらに利用することができる。例えば、代替の実施形態では、ある特定の細胞型は、フェロトーシスの誘導のためのナノ粒子を内部移行するために代謝的またはホルモン的に欠乏させることを必要としなくてもよい。
【０１５７】
腫瘍微小環境およびマクロファージ可塑性／活性化のナノ粒子調節
異なるマクロファージサブセットは、がんにおける保護性または病原性のいずれかの役割と関連付けられている。典型的に活性化された、「炎症促進性」Ｍ１表現型マクロファージは、抗腫瘍免疫における役割を有し、腫瘍発生における保護性の役割を有する。これらのマクロファージは、腫瘍を死滅させる機構を活性化し、腫瘍関連マクロファージおよび骨髄由来の抑制性細胞の抑制性の活性に拮抗する。Ｍ１マクロファージは、Ｔｏｌｌ様受容体リガンド（リポ多糖など）およびインターフェロン−γによって活性化され、これは、ヘルパーＴ細胞サブタイプＴＨ１の応答を増幅し、抗腫瘍応答における正のフィードバックループをもたらす。さらに、Ｍ１マクロファージは、中でも、炎症促進性サイトカインおよび誘導型一酸化窒素合成酵素を発現する。代替的に、活性化された、「消散促進性（ｐｒｏ−ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ）」マクロファージ（Ｍ２マクロファージ）は、抗炎症性機能を有し、創傷治癒を調節する。さらに、これらは、腫瘍特異性適応免疫応答を抑制し、腫瘍の増殖、浸潤、転移、間質リモデリングおよび血管新生を促進する。
【０１５８】
腫瘍標的化部分（例えば、アルファメラニン細胞刺激ホルモン）を含まないおよび含むシリカナノ粒子を、細胞死プログラム（例えば、フェロトーシス）および薬物療法を評価するために動物モデルにおいて引き続き試験する。本明細書で記載されるように、少数のＭａｃ−２陽性マクロファージ、ネズミマクロファージマーカーが、免疫組織化学的染色によって対照腫瘍を取り囲む軟組織内に示され、一方、粒子処置腫瘍は、低および高倍率の両方で同じ位置にはるかに多数のＭａｃ−２陽性細胞によって囲まれていた。対照病変部付近のものと比べて粒子処置腫瘍を取り囲むマクロファージの数のこの顕著な増加は、細胞残渣を貪食することによって疾患防御および創傷修復における役割を有する。これは、マクロファージは、腫瘍微小環境からの局所的な合図に応じて高い程度の可塑性を実証する（例えば、個別の安定な亜集団ではなく、一連の活性化表現型を表す）ことで知られていることをさらに認識することができ、腫瘍収縮に関連したこれらの機能のシフトを含めた組織恒常性を維持するのに必要とされる活性化の際の一連の役割を仮定することができる。
【０１５９】
記載した上記の結果、ならびに関連した腫瘍成長阻害および収縮は、極小シリカナノ粒子サイズ（例えば、６ｎｍ）を様々な正味電荷、サイズ、およびコンホメーションの表面官能性と組み合わせるこのハイブリッド無機−有機プラットフォームにとって完全に予想外であった。ある特定の実施形態では、これらの結果が単にフェロトーシスに起因し得るか否か、または腫瘍微小環境内の免疫調節および／もしくは他の活性化代謝／非免疫プロセスが役割を果たしたか否かに関する機構を決定することができる。いずれの理論にも拘束されることを望むことはないが、Ｃドットの物理化学的性質（例えば、サイズ、電荷、付着した表面化学部分）は、腫瘍微小環境からの局所的な合図に応じてこのようなプロセスを調節することができる。
【０１６０】
ある特定の実施形態では、タンパク質コロナ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｒｏｎａ）（例えば、ＩｇＧ、アルブミンなど）が、全身投与後に粒子表面付近に形成することが決定されており、マクロファージの表現型活性化（例えば、炎症促進性（Ｍ１）および／または消散促進性（Ｍ２））をもたらす。ある特定の実施形態では、血液／血漿検体、ネズミ腫瘍組織、ｅｘ  ｖｉｖｏヒト腫瘍組織検体内で抽出された粒子間のマクロファージの表現型活性化のプロファイルの差異を決定する。
【０１６１】
ある特定の実施形態では、粒子の存在に対する単球／マクロファージ応答を決定および／または制御する。ある特定の実施形態では、殺腫瘍性挙動を達成するための腫瘍微小環境の他のコンポーネントの応答を決定および／または制御する。ある特定の実施形態では、治療用ナノ粒子の表面化学が単球／マクロファージ応答に影響を及ぼす。ある特定の実施形態では、治療用ナノ粒子の表面化学を、単球／マクロファージ応答を制御するように設計する。
【０１６２】
ある特定の実施形態では、天然のおよび／または表面官能化された極小シリカナノ粒子（例えば、Ｃドット）が、マクロファージ（例えば、Ｍ１マクロファージ）を活性化する。ある特定の実施形態では、ＩＬ−１２がＴＨ１細胞によるＩＦＮγ産生を刺激するため、高ＩＬ−１２レベルが存在する（例えば、ＩＬ−１０レベルは、低いはずである）。ある特定の実施形態では、ｉＮＯＳ発現、ならびにＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＬＰＳのレベルを測定する。ある特定の実施形態では、転写因子（例えば、ＩＲＦ−５、ＳＴＡＴ−１）を測定する。ある特定の実施形態では、Ｍ１細胞が分泌するサイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６、Ｉｌ−１５、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２３）を測定する。Ｍ１マクロファージは、他のタイプの免疫細胞を誘引し、免疫応答を統合／編成する炎症促進性サイトカインおよびケモカインを分泌する。Ｍ１マクロファージは、高レベルの主要組織適合複合体（ＭＨＣ）、共刺激分子、およびＦｃγＲも発現する。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、Ｍ１表現型に関連した遺伝子の上方調節および／または下方調節が起こる。ある特定の実施形態では、シグナル伝達経路および／または免疫エフェクター、例えば、ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐ４４／ｐ４２  ＭＡＰＫ、ＪＮＫなど、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６の上方調節（例えば、共刺激分子）、ならびにＩ−Ａ／Ｉ−Ｅ活性化マーカー（例えば、Ｂ細胞活性化）が、天然のおよび／または表面官能化された極小シリカナノ粒子によって生じる。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、マクロファージ活性化は、細胞を殺すのにＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ様受容体４）およびＲＯＳシグナル伝達に依存する。ある特定の実施形態では、ＬＰＳ誘導表現型（例えば、発現プロファイリング）は、天然のおよび／または表面官能化された極小シリカナノ粒子に曝露されるとき起こる。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、マクロファージポドソーム（例えば、細胞外マトリックス分解形成および細胞外マトリックス分解活性に必要とされる因子を送達することによって遊走および浸潤を可能にするアクチンに富む細胞表面構造）に対するＣドットの機能的効果を決定することができる。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、がん関連炎症を、表面官能化されたＣドットを使用して患者において標的とすることができる。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、「悪い」および「良い」炎症プロセスを、Ｃドット生理化学的特性によって変更して腫瘍発達の代わりに適応免疫を促進する。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、薬物送達（または他の療法）を、Ｃドットの天然の免疫調節特性と組み合わせて、がん処置および／または組織修復プロセス（例えば、創傷治癒）におけるＣドットの治療可能性を増大させる。
【０１６９】
ある特定の実施形態では、デュアルモダリティ粒子プローブを用いた用量漸増試験を使用して、イメージング所見が組織学的に確認されている、ＰＤＧＦＢ駆動性神経膠腫におけるダサチニブ−ＮＤＣおよびＥＧＦＲｍｔ＋前臨床側腹部／脳異種移植片モデルにおけるゲフィチニブ−ＮＤＣの両方についての天然薬物に対する標的化治療薬送達、浸透、および最大処置応答の改善を調査する。薬物動態学的試験も、これらの薬剤を用いて実施して予想外の毒性を評価し、粒子薬量測定を評価した。マウスの別個のコホートに、デュアルモダリティ粒子プローブを注射して薬物対粒子送達および分布を追跡することによって、プラットフォームの安定性をモニターすることができる。腫瘍部位における有効薬物濃度の予期される増大は、以前に観察された優先的な腫瘍での貯留、および治療薬投薬要件を定量的に推定する能力に基づく。
【０１７０】
細胞培養および構築物
ＭＥＦおよびＨＴ１０８０細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）と共に１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＭＳＫＣＣ  Ｍｅｄｉａ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）中で培養した。ＭＣＦ１０Ａ細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシンと共に５％ウマ血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｆｌｏｗｅｒｙ  Ｂｒａｎｃｈ、ＧＡ）、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）、１０μｇ／ｍｌインスリン（Ｓｉｇｍａ）、０．５μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ）、および１００ｎｇ／ｍｌコレラ毒素（Ｓｉｇｍａ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で培養した。Ｍ２１、ＢｘＰＣ３、Ｈ１６５０、および７８６−Ｏ細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシンと共に１０％  ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ＳＫＯＶ３細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシンと共に１０％  ＦＢＳを補充したマッコイ５ａ変法培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。無アミノ酸培地を、熱不活化ＦＢＳ（ＭＥＦ、ＨＴ１０８０、Ｍ２１、ＢｘＰＣ３、Ｈ１６５０、およびＳＫＯＶ３細胞について）またはウマ血清（ＭＣＦ１０Ａ細胞について）を４時間透析し、その後、ＭＷＣＯ３５００透析管（２１−１５２−９；Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）内のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で４℃にて一晩インキュベートし、アミノ酸を用いずに調製した基本培地に添加することによって調製した。ＰＲｅｔｒｏ−Ｌａｍｐ１−ＧＦＰを、レトロウイルス形質導入によってＭ２１細胞内に導入し、安定細胞株を、ピューロマイシン（２μｇ  ｍｌ−１）を用いて選択した。
【０１７１】
試薬
以下の試薬を示した濃度で使用した：コンカナマイシンＡ（ＣｏｎＡ）（Ｓｉｇｍａ）１００ｎＭ；ＳＹＴＯＸグリーン核酸染色剤（Ｓ７０２０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）５ｎＭ；フェロスタチン−１（Ｆｅｒ−１）（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）１μＭ；リプロクススタチン−１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏについてそれぞれ１μＭおよび１２５ｍｇ／ｋｇ；デフェロキサミン（ＤＦＯ）（Ｓｉｇｍａ）１００μＭ；ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）（Ｓｉｇｍａ）５０μＭ；アスコルビン酸（Ａｓｃ酸）（Ｓｉｇｍａ）２００μＭ；トロロクス（Ｓｉｇｍａ）１００μＭ；Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（Ｓｉｇｍａ）１０ｍＭ；グルタチオン（ＧＳＨ）（Ｓｉｇｍａ）５ｍＭ；ＴＮＦα（Ｓｉｇｍａ）１００ｎｇ／ｍｌ；シクロヘキシミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ）、ネクロトーシスおよびアポトーシスを誘導するために、それぞれ１μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌ；ｚＶＡＤ（Ｓｉｇｍａ）２０μＭ；ネクロスタチン−１（Ｓｉｇｍａ）３０μＭ；ブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）（Ｓｉｇｍａ）４００μＭ；クエン酸鉄アンモニウム（ＦＡＣ）（Ｓｉｇｍａ、Ｆ５８７９）４００μＭ；エラスチン（Ｓｉｇｍａ）、５μＭ、Ｃ１１−ＢＯＤＩＰＹ（５８１／５９１）２μＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。試薬は、ＣｏｎＡを例外として生物学的アッセイの開始時に培養物に添加し、ＣｏｎＡは、ウエスタンブロッティングのための溶解の１時間前に添加した。
【０１７２】
ペプチド合成
二重アミノヘキサン酸（Ａｈｘ２）脂肪族リンカーおよびＮ−Ａｃ−Ｃｙｓを有する改変メラノコルチン−１受容体標的化ペプチドＲｅ（Ａｒｇ１１）ＣＣＭＳＨを、標準的な固相Ｆｍｏｃペプチド化学を使用して合成した。レニウム環化αＭＳＨペプチド類似体、Ａｃ−Ｃｙｓ１−（Ａｈｘ）２−ｄＬｙｓ２−Ｒｅ［Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−ｄＰｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ］−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＨ２を、ＬＣＱ  ＦＬＥＥＴイオントラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とカップリングしたＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムで分析および精製し、凍結乾燥によって最終的に回収した。
【０１７３】
α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの合成および特徴付け
αＭＳＨは、神経免疫モジュレーターであり、その受容体、ＭＣ１−Ｒは、マクロファージ上に存在する。ある特定の実施形態では、αＭＳＨペプチドをナノ粒子（例えば、Ｃ’ドット）に付着させる。ある特定の実施形態では、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを組み合わせ療法に使用する。例えば、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットは、フェロトーシスを誘導し、αＭＳＨペプチドを介して免疫調節をもたらす。
【０１７４】
有機色素Ｃｙ５を封入する異なるサイズの蛍光シリカナノ粒子（Ｃ’ドット）を水中で合成した。αＭＳＨペプチドを、マレイミド末端シラン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に、そのＮ末端アセチル化システインチオールを介してコンジュゲートしてα−ＭＳＨ−ＰＥＧを形成した。コンジュゲートをＰＥＧ化ステップにおいて粒子表面に付着させて、αＭＳＨ官能化されたＣ’ドットすなわちα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを生成した。合成された粒子試料を水で透析し、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって精製した後、さらに特徴付けた。封入および天然Ｃｙ５色素の吸収および発光スペクトルプロファイルを、Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  ５０００分光光度計（Ｖａｒｉａｎ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）および蛍光分光計（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ、Ｂｉｒｍｉｎｇｔｏｎ、ＮＪ）を使用して得た。遊離Ｃｙ５色素に対するα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの流体力学半径、明度、および濃度を、固体状態６３３ｎｍ励起で構成された自家製の蛍光相関分光法（ＦＣＳ）セットアップを使用して決定した。
【０１７５】
ウエスタンブロッティング
細胞をこすり取って氷冷ＲＩＰＡ緩衝液（プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む、ｐＨ７．４の５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１％  ＮＰ４０、０．１％  ＳＤＳ）中に入れ、氷上で１０分間溶解させた。次いで溶解物を、１５，８７０ｇで４℃にて２０分間遠心分離し、タンパク質をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）によって定量化した。試料を、１５％ポリアクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ポリビニルジフルオリド膜に移し、これを、ＴＢＳＴおよび５％  ＢＳＡでブロックし、ブロッキング緩衝液中に希釈した一次抗体（抗ＬＣ３Ａ／Ｂ（４１０８；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、抗ＦＴＨ１（３９９８；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、および抗アクチン（Ａ１９７８；Ｓｉｇｍａ））と共に４℃で一晩インキュベートした。ブロットを、西洋わさびペルオキシダーゼにコンジュゲートした二次抗体と共にインキュベートし、タンパク質を、高感度化学発光検出（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して検出した。デンシトメトリー分析を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して実行した。
【０１７６】
経時的顕微鏡検査法
細胞をガラス底皿（ＭａｔＴｅｋ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ）上に蒔いた。一晩および蛍光および微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）画像を、Ｎｉｋｏｎ  ＴＩ−Ｅ倒立顕微鏡、ＣｏｏｌＳＮＡＰ  ＨＱ２  ＣＣＤ（電荷結合素子）カメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）を使用して示した時間にわたって３０分毎に取得した。生細胞インキュベーションチャンバーにより、細胞を３７℃および５％ＣＯ２で維持した。ＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を使用した。細胞生存、死、および増殖を含めた細胞運命を手作業で定量化し、ＮＩＳ  ＥｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアおよびＩｍａｇｅ  Ｊを使用して処理した。
【０１７７】
グルタチオン定量化
グルタチオン測定のために、ＨＴ−１０８０細胞を６ｃｍ細胞培養皿上に蒔き、無アミノ酸ＤＭＥＭ＋１０％透析済みＦＢＳ中で、１５μＭのα−ＭＳＨタグ付きナノ粒子と共にインキュベートし、死の予測時間のおよそ２時間前に回収した。対照として、細胞を、完全または無アミノ酸ＤＭＥＭ  ３部およびＨ２Ｏ  １部のミックス、または完全培地中１００μＭのＢＳＯで処置した。細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、冷溶解緩衝液５０μＬ中で細胞擦過によって回収した。タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイを使用して測定し、試料体積を、それぞれが同じ最終タンパク質濃度を有するように調整した。製造者の指示に従って、全グルタチオンを、グルタチオンアッセイキット（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、７０３００２）を使用して測定し、還元型グルタチオンを、ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ（商標）グルタチオンアッセイキット（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＩＧＴ−２５０）を使用して測定した。
【０１７８】
反応性酸素種の分析
細胞を、１５μＭのα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを用いてまたは用いずに２４時間処置し、次いでＨ２ＤＣＦＤＡ（２５μＭ）またはＣ１１−ＢＯＤＩＰＹ（５８１／５９１）（２μＭ）（共にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を補充したハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（Ｇｉｂｃｏ）５００μＬ中に回収および再懸濁し、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、細胞を新鮮なＨＢＳＳ  ５００μＬ中に再懸濁し、フローサイトメーター（ＭｏＦｌｏ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）のＦＬ１チャネルを使用して分析した。データは、条件１つ当たり最低１０，０００細胞から収集した。
【０１７９】
鉄測定
Ｃ’ドットの鉄ローディング能力測定について、α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット（６０μＭ）５０μＬを鉄含有培地（８．６μＭ）１５０μＬまたは一連の鉄（Ｆｅ３＋）濃度（２μＭ〜２ｍＭ、表１）にわたって調製したＦｅＣｌ３溶液１５０μＬに添加した。溶液を室温で４８時間回転させ（１６０ｒｐｍ）、その後、ＰＤ−１０カラムを使用してＣ’ドットから遊離鉄を分離し、水で溶出した。細胞試料を、培地中で粒子と共に、および粒子無しで４８時間インキュベートした後、遠心分離し、ペレット化し、３回洗浄した後、リン酸緩衝食塩溶液中に再懸濁した。鉄測定値（パーツパービリオン、ｐｐｂ）を、鉄ローディング能力と共に、マイクロ波プラズマ−原子発光分光法を使用して決定した。鉄ローディング能力は、精製粒子に曝露されたＣ’ドット（または細胞）中の鉄の量を精製前に測定した初期の鉄の合計量によって除し、１００を乗じた比として計算した。すべての実験は、三連で実施した。
ＧＰＸ４活性アッセイ
ＧＰＸ４比活性アッセイは、Ｒｏｖｅｒｉおよび共同研究者によって実施された。簡単に言えば、凍結細胞ペレットを、溶解緩衝液（１００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＫＣｌ、０．１％  ＣＨＡＰＳ、３ｍＭのβ−メルカプトエタノール、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル）１００μＬ中に再懸濁し、５０回乳棒でストロークすることによってホモジナイズした。試料を氷上で１５分間インキュベートし、細胞残渣を遠心分離（２００００ｇおよび１０分、４℃）によって除去した。ホモジナイズされた細胞由来の上清５０μＬを使用して、２０μＭホスファチジルコリンヒドロペルオキシド（ＰＣＯＯＨ）の存在下で、アッセイ緩衝液（５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、３ｍＭのＧＳＨ、２００μＭのＮＡＤＰＨ、および０．６Ｕ／ｍｌグルタチオン還元酵素を含有する１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．８）１ｍｌ中で酵素活性を測定した。ＧＰＸ４活性を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  ＧｍｂＨ）で３４０ｎｍの吸光度の低下によって検出可能なＮＡＤＰＨのグルタチオン還元酵素依存性消費量によって決定した。試料中のタンパク質含有量を、比色６６０ｎｍ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ法（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）によって決定した。
【０１８０】
動物モデルおよび腫瘍接種
すべての動物実験は、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒの施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコールによって、かつ動物愛護のＮＩＨ指針に従って実施した。ヒトメラノーマ（Ｍ２１）異種移植片を、免疫不全雄ＳＣＩＤ／Ｂｅｉｇｅ（Ｃ．Ｂ−１７／ＩｃｒＨｓｄ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＬｙｓｔｂｇ−Ｊ）マウス（生後６〜８週；Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｏｕｔｈ  Ｅａｓｔｏｎ、ＭＡ）の剃毛した側腹部に生成した。ヒト肉腫ＨＴ１０８０および７８６−Ｏ側腹部異種移植片（約２×１０６細胞／１００μｌ）を、静脈内粒子注射の同じモデルを使用してさらに生成した。４５〜７５ｍｍ３の平均初期腫瘍体積を、すべての実験に使用した。
【０１８１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投薬ストラテジーおよび検査
血清補充培地中で培養した５００万個のＭ２１細胞を、粒子曝露の２日後に（ｎ＝３）または曝露無しで（ｎ＝３）、２３ゲージトロカール針を使用してマウスの右側腹部内に皮下移植して、メラノーマ異種移植片を確立した。後続の試験において、マウスを、２つの異なる処置群のうちの１つに割り当てて、１０日の期間にわたって３回（すなわち、０、４、７日目に）投与した高濃度（６０μＭ）のｉ．ｖ．注射α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット（ｎ＝５匹のマウス；２００μｌ）に対するＨＴ−１０８０および７８６−Ｏ腫瘍の応答を評価した。対照ＨＴ−１０８０および７８６−Ｏマウス（ｎ＝３）に、０．９％食塩水ビヒクルを同じ時点に投与した。第３の処置試験では、ＨＴ−１０８０マウスを、２つの群のうちの１つに割り当てて、１０日の期間にわたって、単独での、またはリプロクススタチン１を腹腔内投与した後の（ｎ＝３匹のマウス、１２５ｍｇ／ｋｇ）、３回の高濃度用量（６０μＭ）のｉ．ｖ．注射α−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット（ｎ＝３匹のマウス；２００μｌ）に対する応答を評価した。腫瘍サイズは、処置の間隔にわたってカリパスを使用して測定した。すべてのマウスを、腫瘍細胞接種の部位において触診によって検査し、病的状態または死亡の徴候についての腫瘍成長試験が終結するまで毎日観察した。腫瘍体積（Ｖ；４／３・π・ｄ１２・ｄ２／８）を計算するのに使用される腫瘍の２つの直交する直径（ｄ１≦ｄ２）を、細胞を注射した後毎日カリパスで測定した。
【０１８２】
蛍光イメージング
動物を、イソフルランを使用して麻酔し、全身光学蛍光イメージングを取得して腫瘍部位におけるナノ粒子蛍光を特定した。マウスを、製造者の推奨に従って選択したＣｙ５蛍光（励起６５０ｎｍ、発光６８０ｎｍ）およびバックグラウンド蛍光（励起４６５ｎｍ、発光６００ｎｍ）のためのブロックおよびフィルターと共にＩＶＩＳスペクトル光子計数装置光学イメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を使用して０．１〜１秒間走査した。蛍光バックグラウンドを、製造者の指示に従って同様に差し引いた。蛍光信号を、放射効率（（光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）／（ｍＷ／ｃｍ２）として報告した。
【０１８３】
組織病理学的分析
ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング試験の終結直後に、ＨＴ−１０８０および７８６−Ｏ雄および雌マウスを、ＣＯ２吸入によって安楽死させ、代表的な粒子曝露（ｎ＝２）および対照（ｎ＝１）腫瘍ならびに肝臓および腎臓検体を剖検で切り取った。血液検体を完全血球算定および血清化学のためにさらに得た。切り取った腫瘍、肝臓、および腎臓を、１０％中性緩衝ホルマリン中で２４時間固定し、アルコールおよびキシレンで処理し、パラフィン中に包埋し、５ミクロンの厚さで切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。追加の切片を、Ｍａｃ−２（ｐＨ６．０緩衝液中の熱誘導エピトープ回復［ＨＩＥＲ］後に１：１００の濃度で施用した一次抗体Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  ＣＬ８９４２Ｂ）、ミエロペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ  Ａ０３９８、１：１０００、ＨＩＥＲ  ｐＨ６．０）、切断カスパーゼ−３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９６６１、１：２５０、ＨＩＥＲ  ｐＨ６．０）、およびＫｉ−６７（Ａｂｃａｍ  ａｂ１６６６７、１：１００、ＨＩＥＲ  ｐＨ９．０）について免疫組織化学によって染色した。Ｍａｃ−２染色を、アビジン−ビオチン検出システム（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ  Ｋｉｔ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＰＫ−６１００）を用いて手作業で実施した。他の染色は、Ｂｏｎｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｒｅｆｉｎｅ検出キット（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ＤＳ９８００）を使用してＬｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  ＲＸ自動染色機で実施した。腫瘍切片は、以前に記載したＴＵＮＥＬ法によっても染色した。すべてのスライドは、有資格獣医病理学者によって検査された。
【０１８４】
腫瘍血管分布評価
腫瘍血管分布を、Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  ＲＸ自動染色プラットフォーム（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、ＣＤ３１について免疫組織化学によりＨＴ−１０８０腫瘍を染色することによって評価した。ｐＨ９．０で熱誘導エピトープ回復をした後、一次抗体（ラットモノクローナル、カタログ＃ＤＩＡ−３１０；Ｄｉａｎｏｖａ）を１：２５０の濃度で施用し、その後ポリマー検出システム（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ  Ｂｏｎｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｒｅｆｉｎｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用した。
【０１８５】
統計
体積−時間プロファイルを、一般化推定方程式手法によって計算したロバストな標準誤差を使用して、２つの処置群間で比較した。フェロトーシスに対する薬理学的阻害剤、リプロクススタチン−１を用いた、および用いない粒子処置腫瘍成長プロファイルを、線形モデルを使用して比較した。データの長軸方向のアスペクト（ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  ａｓｐｅｃｔ）を、一般化推定方程式を使用して考慮に入れた。統計的有意性は、Ｐ＜０．０５であるとされた。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年1月23日(2018.1.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェロトーシス（例えば、鉄依存性壊死または反応性酸素種依存性壊死を含むフェロトーシス細胞死）を誘導するに十分に高い濃度での腫瘍組織における蓄積のためのナノ粒子を含む、被験体の処置のための組成物。
【請求項２】
前記ナノ粒子が極小ナノ粒子（例えば、Ｃドット、例えばＣ’ドット）を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記高い濃度が、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記高い濃度が、前記腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である（例えば、前記高い濃度が、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの前記腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、前記ナノ粒子がシリカをベースとしており、例えば、前記ナノ粒子がＣドットまたはＣ’ドットである）、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記腫瘍組織が、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記腫瘍組織がフェロトーシスの誘導に感作されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
腫瘍組織への輸送（および／または腫瘍組織における蓄積）のための薬物；および
（フェロトーシスを誘導するに）十分に高い濃度での前記腫瘍組織における蓄積のためのナノ粒子
を含む、被験体の処置のための組み合わせ物。
【請求項８】
腫瘍組織への輸送（および／または腫瘍組織における蓄積）のための薬物を含む、被験体の処置のための組成物であって、前記組成物は、（フェロトーシスを誘導するに）十分に高い濃度での前記腫瘍組織における蓄積のためのナノ粒子と組み合わせて投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項９】
（フェロトーシスを誘導するに）十分に高い濃度での腫瘍組織における蓄積のためのナノ粒子を含む、被験体の処置のための組成物であって、前記組成物は、前記腫瘍組織への輸送（および／または前記腫瘍組織における蓄積）のための薬物と組み合わせて投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項１０】
前記薬物が化学療法剤（例えば、ＴＡＳ−１０２）を含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の組み合わせ物または組成物。
【請求項１１】
前記ナノ粒子が極小ナノ粒子（例えば、Ｃドット、例えばＣ’ドット）を含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の組み合わせ物または組成物。
【請求項１２】
前記高い濃度が、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の組み合わせ物または組成物。
【請求項１３】
前記高い濃度が、前記腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である（例えば、前記高い濃度は、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの前記腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、前記ナノ粒子はシリカをベースとしており、例えば、前記ナノ粒子はＣドットまたはＣ’ドットである）、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の組み合わせ物または組成物。
【請求項１４】
前記腫瘍組織が、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の組み合わせ物または組成物。
【請求項１５】
前記腫瘍組織がフェロトーシスの誘導に感作されている、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の組み合わせ物または組成物。
【請求項１６】
前記薬物および前記ナノ粒子が、前記薬物および前記ナノ粒子の両方を含む組成物を使用して投与されることを特徴とする、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の組み合わせ物または組成物。
【請求項１７】
前記組み合わせ物または組成物がナノ粒子薬物コンジュゲートを含む、請求項７〜１６のいずれか一項に記載の組み合わせ物または組成物。
【請求項１８】
フェロトーシスを誘導するに十分に高い濃度での腫瘍組織における蓄積のためのナノ粒子を含む、被験体の処置のための組成物であって、前記腫瘍組織（例えば、前立腺がん組織）からホルモンが欠乏させられている、組成物。
【請求項１９】
前記腫瘍組織が去勢（例えば、化学的去勢）を経てホルモンを欠乏させられている、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ナノ粒子が極小ナノ粒子（例えば、Ｃドット、例えばＣ’ドット）を含む、請求項１８または１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記高い濃度が、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記高い濃度が、前記腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である（例えば、前記高い濃度は、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの前記腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、前記ナノ粒子はシリカをベースとしており、例えば、前記ナノ粒子はＣドットまたはＣ’ドットである）、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記腫瘍組織が、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記腫瘍組織がフェロトーシスの誘導に感作されている、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記腫瘍組織が、腎臓、前立腺、メラノーマ、膵臓、肺、線維肉腫、乳房、脳、卵巣および結腸腫瘍組織からなる群より選択される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組成物または組み合わせ物。
【請求項２６】
前記膵臓腫瘍組織がＢｘＰＣ３細胞を含む、請求項２５に記載の組成物または組み合わせ物。
【請求項２７】
前記肺腫瘍組織がＨ１６５０細胞を含む、請求項２５に記載の組成物または組み合わせ物。
【請求項２８】
前記ナノ粒子が１５ｎｍ以下の平均直径を有する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の組成物または組み合わせ物。
【請求項２９】
前記ナノ粒子が１０ｎｍ以下の平均直径を有する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の組成物または組み合わせ物。
【請求項３０】
前記ナノ粒子が約５ｎｍから約７ｎｍ（例えば、約６ｎｍ）の平均直径を有する、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の組成物または組み合わせ物。
【請求項３１】
前記ナノ粒子が１から２０個の標的化部分を含み、前記標的化部分が腫瘍細胞上の受容体に結合する（例えば、前記ナノ粒子が、１５ｎｍ以下、例えば１０ｎｍ以下、例えば約５ｎｍから約７ｎｍ、例えば約６ｎｍの平均直径を有する）、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の組成物または組み合わせ物。
【請求項３２】
１から２０個の前記標的化部分がアルファ−メラニン細胞刺激ホルモン（αＭＳＨ）を含む、請求項３１に記載の組成物または組み合わせ物。
【請求項３３】
前記ナノ粒子が標的化部分（例えば、αＭＳＨ）を含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組成物または組み合わせ物。
【請求項３４】
前記組成物または組み合わせ物が処置の過程にわたって複数回投与されることを特徴とする、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組成物または組み合わせ物。
【請求項３５】
前記組成物または前記組み合わせ物が、処置の過程にわたって３または４日ごとに投与されることを特徴とする、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の組成物または組み合わせ物。
【請求項３６】
前記ナノ粒子に薬物（例えば、化学療法剤）が付着している、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の組成物または組み合わせ物。
【請求項３７】
前記薬物がリンカー部分を介して付着している（例えば、共有結合または非共有結合で付着している）、請求項３６に記載の組成物または組み合わせ物。
【請求項３８】
がん処置および／または組織修復プロセス（例えば、創傷治癒）においてＣドットの治療能力を増加させるために、前記薬物が送達され、薬物送達が前記ナノ粒子の天然の免疫調節特性と組み合わされる（例えば、前記ナノ粒子がα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを含む、例えば、α−ＭＳＨが前記ナノ粒子の表面に結合している）（例えば、前記ナノ粒子が有機ポリマーコーティング（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含む）ことを特徴とする、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の組成物または組み合わせ物。
【請求項３９】
被験体の処置における使用のための、ナノ粒子（例えば、極小ナノ粒子、例えばＣドット、例えばＣ’ドット）を含む組成物であって、
フェロトーシスを誘導するに十分に高い濃度（例えば、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える）での腫瘍組織における蓄積のために前記被験体の腫瘍組織に前記組成物が送達される（例えば、前記高い濃度が前記腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である）（例えば、前記高い濃度が、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの前記腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、前記ナノ粒子がシリカをベースとしており、例えば、前記ナノ粒子がＣドットまたはＣ’ドットである）（例えば、前記腫瘍組織が、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）か、またはその他の点でフェロトーシスの誘導に対して感受性である）ことを特徴とする、組成物。
【請求項４０】
療法で使用するためにフェロトーシスを誘導するために、腫瘍組織における十分に高い濃度（例えば、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える）での蓄積のためのナノ粒子（例えば、極小ナノ粒子、例えばＣドット、例えばＣ’ドット）を含む（例えば、前記高い濃度が前記腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である）（例えば、前記高い濃度が、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの前記腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、前記ナノ粒子がシリカをベースとしており、例えば、前記ナノ粒子がＣドットまたはＣ’ドットである）（例えば、前記腫瘍組織が、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）か、またはその他の点でフェロトーシスの誘導に対して感受性である）組成物。
【請求項４１】
被験体の処置における使用のための、薬物（例えば、化学療法剤、例えばＴＡＳ１０２）を含む第１の組成物およびナノ粒子（例えば、極小ナノ粒子、例えばＣドット、例えばＣ’ドット）を含む第２の組成物を含む組み合わせ物であって、
前記被験体の腫瘍組織への輸送（および／または腫瘍組織における蓄積）のために前記第１の組成物が送達され；ならびに
腫瘍組織における十分に高い濃度（例えば、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える）での蓄積のために前記被験体の前記腫瘍組織に前記第２の組成物が送達され（例えば、前記高い濃度が前記腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である）（例えば、前記高い濃度が、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの前記腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、前記ナノ粒子がシリカをベースとしており、例えば、前記ナノ粒子がＣドットまたはＣ’ドットである）（例えば、前記腫瘍組織が、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）か、またはその他の点でフェロトーシスの誘導に対して感受性である）、フェロトーシスが誘導されること
を特徴とする、組み合わせ物。
【請求項４２】
療法で使用するための組み合わせ物であって、
被験体の腫瘍組織への輸送（および／または腫瘍組織における蓄積）のための薬物（例えば、任意の化学療法剤、例えばＴＡＳ１０２）を含む第１の組成物；および
フェロトーシスを誘導するに十分に高い濃度（例えば、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える）での腫瘍組織における蓄積のためのナノ粒子（例えば、極小ナノ粒子、例えばＣドット、例えばＣ’ドット）を含む第２の組成物（例えば、前記高い濃度が前記腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である）（例えば、前記高い濃度が、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの前記腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、前記ナノ粒子がシリカをベースとしており、例えば、前記ナノ粒子がＣドットまたはＣ’ドットである）（例えば、前記腫瘍組織が、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）か、またはその他の点でフェロトーシスの誘導に対して感受性である）
を含む、組み合わせ物。
【請求項４３】
被験体の処置における使用のための、ナノ粒子（例えば、極小ナノ粒子、例えばＣドット、例えばＣ’ドット）を含む組成物であって、
腫瘍組織における十分に高い濃度（例えば、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える）での蓄積のために前記被験体の前記腫瘍組織に前記組成物が送達され（例えば、前記高い濃度が前記腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である）（例えば、前記高い濃度が、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの前記腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、前記ナノ粒子がシリカをベースとしており、例えば、前記ナノ粒子がＣドットまたはＣ’ドットである）（例えば、前記腫瘍組織が、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）か、またはその他の点でフェロトーシスの誘導に対して感受性である）、フェロトーシスが誘導され、前記被験体の腫瘍組織（例えば、前立腺組織）からホルモン（例えば、去勢（例えば、化学的去勢）を経て）が欠乏させられていることを特徴とする、組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
本開示の前述のおよび他の目的、態様、特徴および利点は、添付の図面と併せて得られる以下の記載を参照することによってより明らかになり、より良好に理解される。
例えば、本発明の実施形態において、以下の項目が提供される。
（項目１）
腫瘍組織における十分に高い濃度での蓄積のためにナノ粒子を投与し、フェロトーシス（例えば、鉄依存性壊死または反応性酸素種依存性壊死を含むフェロトーシス細胞死）を誘導するステップ
を含む、被験体の処置方法。
（項目２）
前記ナノ粒子が極小ナノ粒子（例えば、Ｃドット、例えばＣ’ドット）を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記高い濃度が、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記高い濃度が、前記腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である（例えば、前記高い濃度が、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの前記腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、前記ナノ粒子がシリカをベースとしており、例えば、前記ナノ粒子がＣドットまたはＣ’ドットである）、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記腫瘍組織が、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記腫瘍組織がフェロトーシスの誘導に感作されている、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
腫瘍組織への輸送（および／または腫瘍組織における蓄積）のために薬物を投与するステップ；および
（フェロトーシスを誘導するために）前記腫瘍組織における十分に高い濃度での蓄積のためにナノ粒子を投与するステップ
を含む、被験体の組み合わせ処置の方法。
（項目８）
前記薬物が化学療法剤（例えば、ＴＡＳ−１０２）を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記ナノ粒子が極小ナノ粒子（例えば、Ｃドット、例えばＣ’ドット）を含む、項目７または８に記載の方法。
（項目１０）
前記高い濃度が、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える、項目７〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記高い濃度が、前記腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である（例えば、前記高い濃度は、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの前記腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、前記ナノ粒子はシリカをベースとしており、例えば、前記ナノ粒子はＣドットまたはＣ’ドットである）、項目７〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記腫瘍組織が、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）、項目７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記腫瘍組織がフェロトーシスの誘導に感作されている、項目７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記薬物を投与するステップおよび前記ナノ粒子を投与するステップが、前記薬物および前記ナノ粒子の両方を含む組成物を投与することによって達成される、項目７〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記組成物がナノ粒子薬物コンジュゲートを含む、項目７〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
腫瘍組織（例えば、前立腺がん組織）からホルモンを欠乏させるステップ；および
前記腫瘍組織における十分に高い濃度での蓄積のためにナノ粒子を投与し、フェロトーシスを誘導するステップ
を含む、被験体の組み合わせ処置の方法。
（項目１７）
前記腫瘍組織が去勢（例えば、化学的去勢）を経てホルモンを欠乏させる、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記ナノ粒子が極小ナノ粒子（例えば、Ｃドット、例えばＣ’ドット）を含む、項目１６または１７に記載の方法。
（項目１９）
前記高い濃度が、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える、項目１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記高い濃度が、前記腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である（例えば、前記高い濃度は、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの前記腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、前記ナノ粒子はシリカをベースとしており、例えば、前記ナノ粒子はＣドットまたはＣ’ドットである）、項目１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記腫瘍組織が、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）、項目１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記腫瘍組織がフェロトーシスの誘導に感作されている、項目１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記腫瘍組織が、腎臓、前立腺、メラノーマ、膵臓、肺、線維肉腫、乳房、脳、卵巣および結腸腫瘍組織からなる群より選択される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記膵臓腫瘍組織がＢｘＰＣ３細胞を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記肺腫瘍組織がＨ１６５０細胞を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記ナノ粒子が１５ｎｍ以下の平均直径を有する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記ナノ粒子が１０ｎｍ以下の平均直径を有する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記ナノ粒子が約５ｎｍから約７ｎｍ（例えば、約６ｎｍ）の平均直径を有する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記ナノ粒子が１から２０個の標的化部分を含み、前記標的化部分が腫瘍細胞上の受容体に結合する（例えば、前記ナノ粒子が、１５ｎｍ以下、例えば１０ｎｍ以下、例えば約５ｎｍから約７ｎｍ、例えば約６ｎｍの平均直径を有する）、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
１から２０個の前記標的化部分がアルファ−メラニン細胞刺激ホルモン（αＭＳＨ）を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記ナノ粒子が標的化部分（例えば、αＭＳＨ）を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記ナノ粒子が処置の過程にわたって複数回投与される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
処置の過程にわたって前記ナノ粒子を３または４日ごとに投与するステップをさらに含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
投与される前記ナノ粒子に薬物（例えば、化学療法剤）が付着している、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記薬物がリンカー部分を介して付着している（例えば、共有結合または非共有結合で付着している）、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
がん処置および／または組織修復プロセス（例えば、創傷治癒）においてＣドットの治療能力を増加させるために、薬物送達が、投与される前記ナノ粒子の天然の免疫調節特性と組み合わされる（例えば、前記ナノ粒子がα−ＭＳＨ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを含む、例えば、α−ＭＳＨが前記ナノ粒子の表面に結合している）（例えば、前記ナノ粒子が有機ポリマーコーティング（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含む）、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
被験体を処置する方法で使用するためのナノ粒子（例えば、極小ナノ粒子、例えばＣドット、例えばＣ’ドット）を含む組成物であって、
前記処置が、腫瘍組織における十分に高い濃度（例えば、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える）での蓄積のために前記被験体の腫瘍組織に前記組成物を送達し、フェロトーシスを誘導することを含む（例えば、前記高い濃度が前記腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である）（例えば、前記高い濃度が、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの前記腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、前記ナノ粒子がシリカをベースとしており、例えば、前記ナノ粒子がＣドットまたはＣ’ドットである）（例えば、前記腫瘍組織が、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）か、またはその他の点でフェロトーシスの誘導に対して感受性である）、組成物。
（項目３８）
療法で使用するためにフェロトーシスを誘導するために、腫瘍組織における十分に高い濃度（例えば、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える）での蓄積のためのナノ粒子（例えば、極小ナノ粒子、例えばＣドット、例えばＣ’ドット）を含む（例えば、前記高い濃度が前記腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である）（例えば、前記高い濃度が、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの前記腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、前記ナノ粒子がシリカをベースとしており、例えば、前記ナノ粒子がＣドットまたはＣ’ドットである）（例えば、前記腫瘍組織が、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）か、またはその他の点でフェロトーシスの誘導に対して感受性である）組成物。
（項目３９）
被験体を処置する方法で使用するための薬物（例えば、化学療法剤、例えばＴＡＳ１０２）を含む第１の組成物およびナノ粒子（例えば、極小ナノ粒子、例えばＣドット、例えばＣ’ドット）を含む第２の組成物であって、
前記処置が、
前記被験体の腫瘍組織への輸送（および／または腫瘍組織における蓄積）のために前記第１の組成物を送達すること；ならびに
腫瘍組織における十分に高い濃度（例えば、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える）での蓄積のために前記被験体の前記腫瘍組織に前記第２の組成物を送達し（例えば、前記高い濃度が前記腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である）（例えば、前記高い濃度が、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの前記腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、前記ナノ粒子がシリカをベースとしており、例えば、前記ナノ粒子がＣドットまたはＣ’ドットである）（例えば、前記腫瘍組織が、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）か、またはその他の点でフェロトーシスの誘導に対して感受性である）、フェロトーシスを誘導すること
を含む、第１の組成物および第２の組成物。
（項目４０）
療法で使用するための、フェロトーシスを誘導するために、被験体の腫瘍組織への輸送（および／または腫瘍組織における蓄積）のための薬物（例えば、任意の化学療法剤、例えばＴＡＳ１０２）を含む第１の組成物；
および腫瘍組織における十分に高い濃度（例えば、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える）での蓄積のためのナノ粒子（例えば、極小ナノ粒子、例えばＣドット、例えばＣ’ドット）を含む第２の組成物（例えば、前記高い濃度が前記腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である）（例えば、前記高い濃度が、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの前記腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、前記ナノ粒子がシリカをベースとしており、例えば、前記ナノ粒子がＣドットまたはＣ’ドットである）（例えば、前記腫瘍組織が、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）か、またはその他の点でフェロトーシスの誘導に対して感受性である）。
（項目４１）
被験体を処置する方法で使用するためのナノ粒子（例えば、極小ナノ粒子、例えばＣドット、例えばＣ’ドット）を含む組成物であって、
前記処置が、
前記被験体の腫瘍組織（例えば、前立腺組織）からホルモン（例えば、去勢（例えば、化学的去勢）を経て）を欠乏させること；および
腫瘍組織における十分に高い濃度（例えば、１μＭを超える、例えば１５μＭを超える、例えば６０μＭを超える）での蓄積のために前記被験体の前記腫瘍組織に前記組成物を送達し（例えば、前記高い濃度が前記腫瘍組織において０．１８μＭから１．８μＭの範囲内の局所濃度である）（例えば、前記高い濃度が、少なくとも０．１８μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭまたは少なくとも０．６μＭの前記腫瘍組織における局所濃度であり；例えば、前記ナノ粒子がシリカをベースとしており、例えば、前記ナノ粒子がＣドットまたはＣ’ドットである）（例えば、前記腫瘍組織が、十分にアミノ酸が欠乏している（または代謝的に欠乏している）か、またはその他の点でフェロトーシスの誘導に対して感受性である）、フェロトーシスを誘導すること
を含む、組成物。
【国際調査報告】
2018516249.tif 000059
2018516249.tif 000060
2018516249.tif 000061
2018516249.tif 000062