(57)【要約】  患者における癌の治療は、該患者に有効量の抗体および有効量のＮＫ細胞を投与する工程を含み、該抗体が、ＮＫ細胞の表面上の抗原を結合し、かつ該抗体が、該癌の細胞上のＦｃレセプターに結合する。抗癌活性は、Ｒ−ＡＤＣＣを介して抗体をまさに結合する癌細胞に対するＮＫ細胞の得られる殺傷作用を介する。
2018516881.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（Ｒ−ＡＤＣＣ）を介して患者の癌を治療する方法であって、該患者に有効量の抗体を投与する工程を含み、
該抗体が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面上の抗原を結合し、かつ
該抗体が、該癌の細胞上のＦｃレセプターに結合する、
方法。
【請求項２】
前記抗体が、ＣＤ１６、ＣＤ３２またはＣＤ６４から選択されるＦｃレセプターを結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ−ＡＤＣＣにより癌細胞の殺傷が達成される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
血液癌の治療のための、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項５】
癌幹細胞の殺傷による癌の治療のための、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項６】
白血病、例えば、急性骨髄性白血病または急性リンパ性白血病、の治療のための、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項７】
Ｂ細胞リンパ腫の治療のための、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
固形癌の治療のための、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記抗体の全身投与を含む、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体が、ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４から選択される抗原のようなＮＫ細胞表面マーカー、例えば、細胞傷害性レセプター、に結合する、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１１】
患者の腫瘍を治療するために、該患者に有効量の前記抗体および有効量のＮＫ細胞を投与する工程を含み、
該抗体が、ＮＫ細胞の表面上の抗原を結合し、かつ
該抗体が、該腫瘍の細胞上のＦｃレセプターに結合する、
前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体の投与前、投与と同時、または投与後に、前記ＮＫ細胞を投与する工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＮＫ細胞に結合された前記抗体を投与する工程を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＮＫ細胞に結合された前記抗体を投与する工程前に、該ＮＫ細胞と該抗体とをプレインキュベートする工程を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＮＫ細胞が、癌細胞株から得られたＮＫ細胞である、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１６】
癌細胞株から誘導された前記細胞が、インビボにて分裂して腫瘍を形成することを防ぐように放射線照射されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＮＫ細胞が、インビボにて分裂して腫瘍を形成することを防ぐように活性化可能な自殺遺伝子を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＮＫ細胞がＫＨＹＧ−１細胞またはその誘導物である、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１９】
患者の腫瘍を治療する方法であって、該患者に有効量のＫＨＹＧ−１細胞を投与する工程を含む、方法。
【請求項２０】
癌の治療のための、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
血液細胞の腫瘍または固形腫瘍の治療のための、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
白血病の治療のための、請求項１９から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
急性骨髄性白血病の治療のための、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｒ−ＡＤＣＣを介して患者の腫瘍を治療する方法であって、該患者に有効量のＮＫ細胞を投与する工程を含み、
該患者内の抗体が、該ＮＫ細胞の表面上の抗原を結合し、かつ
該抗体が、該腫瘍の細胞上のＦｃレセプターに結合する、
方法。
【請求項２５】
前記ＮＫ細胞が癌細胞株から誘導される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
癌細胞株から誘導された前記細胞が、インビボにて分裂して腫瘍を形成することを防ぐように放射線照射されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＮＫ細胞が、インビボにて分裂して腫瘍を形成することを防ぐように活性化可能な自殺遺伝子を含む、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＮＫ細胞がＫＨＹＧ−１細胞またはその誘導物である、請求項２４から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
患者の腫瘍の治療に用いるための抗体であって、
該抗体が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面上の抗原を結合し、かつ
該抗体が、該腫瘍の細胞上のＦｃレセプターに結合する、ＦＧじ
抗体。
【請求項３０】
前記抗体が、ＣＤ１６、ＣＤ３２またはＣＤ６４から選択されるＦｃレセプターを結合する、請求項２９に記載の使用のための抗体。
【請求項３１】
Ｒ−ＡＤＣＣにより腫瘍細胞の殺傷が達成される、請求項２９または３０に記載の使用のための抗体。
【請求項３２】
白血病の治療のための、請求項２９から３１のいずれかに記載の使用のための抗体。
【請求項３３】
Ｒ−ＡＤＣＣを介して患者の腫瘍を治療するための組み合わせで使用される抗体およびＮＫ細胞であって、
該抗体が、該ＮＫ細胞の表面上の抗原を結合し、かつ
該抗体が、該腫瘍の細胞上のＦｃレセプターに結合する、
組み合わせで使用される抗体およびＮＫ細胞。
【請求項３４】
前記治療が、前記抗体の投与前、投与と同時、または投与後に、前記ＮＫ細胞を投与する工程を含む、請求項３３に記載の組み合わせで使用される抗体およびＮＫ細胞。
【請求項３５】
前記治療が、前記ＮＫ細胞に結合された前記抗体を投与する工程を含む、請求項３３または３４に記載の組み合わせで使用される抗体およびＮＫ細胞。
【請求項３６】
前記ＮＫ細胞が、癌細胞株から得られたＮＫ細胞である、請求項３３から３５のいずれかに記載の組み合わせで使用される抗体およびＮＫ細胞。
【請求項３７】
前記ＮＫ細胞がＫＨＹＧ−１細胞またはその誘導物である、請求項３３から３６のいずれかに記載の組み合わせで使用される抗体およびＮＫ細胞。
【請求項３８】
患者の腫瘍の治療に使用するためのＫＨＹＧ−１細胞。
【請求項３９】
癌の治療のための、請求項３８に記載の使用のためのＫＨＹＧ−１細胞。
【請求項４０】
患者の腫瘍の治療に使用するためのＮＫ細胞であって、
該患者内の抗体が、該ＮＫ細胞の表面上の抗原を結合し、かつ
該抗体が、該腫瘍の細胞上のＦｃレセプターに結合する、
使用のためのＮＫ細胞。
【請求項４１】
前記ＮＫ細胞が癌細胞株から誘導される、請求項４０に記載の使用のためのＮＫ細胞。
【請求項４２】
前記ＮＫ細胞がＫＨＹＧ−１細胞またはその誘導物である、請求項４０または４１に記載の使用のためのＮＫ細胞。
【請求項４３】
（ａ）ＮＫ細胞と、
（ｂ）該ＮＫ細胞に結合する抗体と
を含む、組成物。
【請求項４４】
腫瘍の治療に使用するための、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
血液細胞の腫瘍または固形腫瘍の治療のための、請求項４３または４４に記載の組成物。
【請求項４６】
白血病の治療のための、請求項４３から４５のいずれかに記載の組成物。
【請求項４７】
急性骨髄性白血病の治療のための、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４８】
前記抗体が、ＣＤ１６、ＣＤ３２またはＣＤ６４から選択されるＦｃレセプターを結合する、請求項４３から４７のいずれかに記載の組成物。
【請求項４９】
前記抗体が、細胞傷害性レセプター、例えば、ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４から選択されるＮＫ細胞表面抗原、に結合する、請求項４３から４８のいずれかに記載の組成物。
【請求項５０】
前記ＮＫ細胞が、癌細胞株から得られるＮＫ細胞である、請求項４３から４９のいずれかに記載の組成物。
【請求項５１】
癌細胞株から誘導された前記細胞が、インビボにて分裂して腫瘍を形成することを防ぐように放射線照射されている、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
前記ＮＫ細胞が、インビボにて分裂して腫瘍を形成することを防ぐように活性化可能な自殺遺伝子を含む、請求項５０または５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記ＮＫ細胞がＫＨＹＧ−１細胞またはその誘導物である、請求項４３から５２のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＫ細胞、抗体ならびに癌の治療のための関連の方法、使用および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、骨髄分化に決定づけられた前駆細胞を包含する造血悪性腫瘍であり、成人（９０％）および小児（１５〜２０％）の双方において急性白血病のかなりの部分を占める（Hurwitz, Mounceら、1995；Lowenberg, Downingら、1999）。８０％の患者が標準の化学療法で寛解を達成するにもかかわらず（Hurwitz, Mounceら、1９９５；Ribeiro, Razzoukら、2005）、生存率は、微小残存病変（ＭＲＤ）からの高い再発率のための満足のいくものではない。５年生存率は年齢に依存し、小児では６０％であり（Rubnitz 2012）、６５歳以下の成人では４０％であり（Lowenberg, Downingら、1999）、そして6５歳を超える成人では１０%である（FerraraおよびSchiffer、2013）。これらの結果は、患者に適合された造血細胞ドナーがあれば改善され得るが、ほとんどはなく、治療の代替アプローチの必要性が強調される。
【０００３】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は細胞傷害性リンパ球であり、独特の表現型およびエフェクター機能を有し、これらは例えば、ナチュラルキラーＴ（ＮＫ−Ｔ）細胞とは異なる。例えば、ＮＫ−Ｔ細胞はＣＤ３およびＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）の双方を発現するが、ＮＫ細胞はそうではない。ＮＫ細胞は、マーカーＣＤ１６およびＣＤ５６を発現していることがしばしば見られ、ＣＤ１６はＦｃレセプターとして機能し、そして以下に説明する抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（antibody dependent cell-mediated cytotoxity）（ＡＤＣＣ）を介在する。ＮＫ細胞は天然に細胞傷害性であるが、細胞傷害性が増大されたＮＫ細胞株が開発されている。ＮＫ−９２およびＫＨＹＧ−１は、広範に研究されそして癌治療法での有望性を示す２つの細胞株を表す（Swiftら、2011；Swiftら、2012）。
【０００４】
ＫＨＹＧ−１細胞は、プレ活性化されることが知られている。内因性ＮＫ細胞とは異なり、ＫＨＹＧ−１細胞は常に極性化しており、それらの細胞傷害性を増大し、それらをより早く外部刺激に応答するようにする。ＮＫ−９２細胞は、ＫＨＹＧ−１細胞よりも高いベースラインの細胞傷害性を有する。
【０００５】
さらに、ＮＫ細胞は、それらの表面上に活性化レセプターおよび阻害レセプターの両方を発現している。リガンドを活性化レセプター（例えば、ＮＫｐ３０）に結合した際に、より細胞傷害性のＮＫ表現型を生じるシグナルが生成される。ＮＫｐ３０介在性ＮＫ活性化は、血液癌細胞の殺傷の増大を生じることが示された（Mullerら、2014）。さらに、ＷＯ２００５／００９４６５は、ＡＤＣＣを介するウイルス感染のための治療として、ＮＫ細胞表面上の活性化レセプターに特異的な抗体とのＮＫ細胞の同時投与を記載する。
【０００６】
ハプロタイプ移植において、移植片対白血病効果は、ＫＩＲレセプター−リガンド不適合があるときＮＫ細胞により介在されると考えられており、これによって、ＡＭＬの治療での生存の改善に至り得る（Ruggeri, Capanniら、2002；Ruggeri, Mancusiら、2005）。さらに、迅速なＮＫ回復が、ＡＭＬでハプロタイプＴ枯渇造血細胞移植（ＨＣＴ）を受けた患者におけるより良好な結果およびより強いＧＶＬ効果と関連している（Savani, Mielkeら、2007）。他の知験は、成人（Miller, Soignierら、2005）および小児（Rubnitz, Inabaら、2010）においてＡＭＬを治療するために、エクスビボにて増殖した半合致（haploidentical）ＮＫ細胞を用いた。
【０００７】
いくつかの永久ＮＫ細胞株が樹立され、そして最も注目すべきであるのはＮＫ−９２（上記）であり、これは、非ホジキンリンパ腫の患者に由来し、ＣＤ１６（Ｆｃガンマレセプター）を除いて定型的なＮＫ細胞マーカーを発現する。ＮＫ−９２は、大規模な臨床前試験を受けており、活性化されたＮＫ細胞およびリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞と比較して、広範な腫瘍に対する優れた溶解を示す（Gong, Makiら、1994）。初代ＡＭＬに対するＮＫ−９２細胞の細胞傷害性が確立されている（Yan, Steinherzら、1998)。別のＮＫ細胞株であるＫＨＹＧ−１は、臨床用途のための可能性のある競争者であると同定されており（Suckら、2005）、そして放射線照射されたときにその細胞傷害性を保持するが（Suckら、2006）、それにもかかわらず、細胞傷害性を減少し、そのためＡＭＬ幹細胞を優先的にターゲティングすることが示されているＮＫ−９２ほどに注意を惹かなかった（Williamsら、2010）。
【０００８】
ＡＤＣＣは、ＮＫ細胞が、標的細胞に結合された抗体のＦｃ領域を認識し、そして標的細胞殺傷を促進する周知の現象である（Grierら、2012；Dengら、2014；Kobayashiら、2014）。これが生じるためには、ＮＫ細胞が、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）を発現しなければならない。ＮＫ  ＦｃＲが抗体のＦｃ領域に結合後、より細胞傷害性のＮＫ表現型が広がる。これによって、しばしば、抗体が特異的に結合する標的細胞の殺傷が増大される。
【０００９】
Notterらは、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞を抗ＣＤ３抗体でプレコートすることが、自家ＡＭＬ芽球の殺傷を増強し得ることを示した。ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよび抗ＣＤ３モノクローナル抗体の組み合わせが、ＡＭＬのための可能性のある治療として提案された。
【００１０】
しかし、全ての現在の養子免疫療法プロトコルが、ドナーのエフェクター細胞の質および量の変動による影響を受けている。このような変動は、より一般的な治療を提供するのに有効な細胞株が入手できれば排除され得る。腫瘍へのＴ細胞のターゲティングが１つの治療選択肢（例えば、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）改変を介する）として提案されているが、これは、Ｔ細胞の遺伝子操作を要する。
【００１１】
したがって、白血病（ＡＭＬを含む）、一般には他の血液癌、およびなおより一般にはヒトの他の癌のための代替の治療、および好ましくは改善された治療の必要性が存在している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、特にヒトにおける腫瘍（特に癌）の治療のための代替の方法、使用、および組成物を提供することである。実施形態は、改善された方法、使用、および組成物の提供を目的とする。より具体的な実施形態は、特定癌（例えば、血液癌（例えば白血病））のための治療を提供することを目的とする。特定の実施形態は、癌治療における抗体およびエフェクター細胞の組み合わせを利用することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本明細書において、ＮＫ細胞上の抗原に結合する抗体を用いて、癌を治療する方法であって、当該抗体とＮＫ細胞との組み合わされた複合体がそこで癌細胞に結合する、方法が提供される。このような方法に用いるための抗体もまた提供される。この分野の定説は、ＮＫ細胞が抗体依存性である抗腫瘍発生特性を有し、抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介して作用し得ることである。本発明においては、驚くべきことに、抗体が標的細胞のＮＫ細胞介在性殺傷に寄与しつつも、それらは異なる機構を介してそうなることである。
【００１４】
本発明によれば、抗体とＮＫ細胞との組み合わせを用いて、腫瘍（例えば、癌）を治療する方法が提供される。実施例では、ＫＨＹＧ−１細胞（ＣＤ１６陰性ＮＫ集団）が特に使用されている。このような方法において使用するための抗体およびＮＫ細胞の組み合わせも提供される。
【００１５】
ＫＨＹＧ−１型細胞またはその改変された変異体を用いて、腫瘍（例えば、癌）を治療する方法が提供される。また、これらの細胞もまた、このような方法において使用するために提供される。
【００１６】
（ａ）ＮＫ細胞と、（ｂ）ＮＫ細胞上の特定活性化レセプターに結合する抗体とを含む組成物が提供される。これらは、腫瘍および癌の治療における使用に適している。
【００１７】
本発明に従って特に治療され得る疾患としては、癌、血液癌、白血病（特に、急性骨髄性白血病）が挙げられる。特に、ヒトにおける腫瘍および癌が治療され得る。本明細書中で腫瘍とは、新生物もまた包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、白血病細胞株パネルに対するＮＫ−９２およびＫＨＹＧ−１の細胞傷害性を示す。
【図２】図２は、白血病細胞株に対するＫＨＹＧ−１細胞傷害性に関する活性化レセプターの抗体前処理の効果を示す。
【図３】図３は、初代ＡＭＬ試料に対するＫＨＹＧ−１細胞傷害性に関する活性化レセプターの抗体前処理の効果を示す。
【図４】図４は、白血病細胞株に対するＫＨＹＧ−１細胞傷害性に関する種々の濃度の抗ＮＫｐ３０および抗ＮＫｐ４４を用いた抗体前処理の効果を示す。
【図５】図５は、白血病細胞株に対するＫＨＹＧ−１細胞傷害性に関する種々の濃度の抗ＮＫｐ３０および抗ＮＫｐ４４を用いた抗体前処理の効果を示す。
【図６】図６は、白血病細胞株（Ｋ５６２、ＫＧ１、ＫＧ１ａ、ＯＣＩ／ＡＭＬ３、ＯＣＩ／ＡＭＬ５）上のＦｃガンマレセプター発現を示す。
【図７】図７は、ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４前処理ＮＫ−９２およびＫＨＹＧ−１細胞のＣＤ３２発現およびデルタ細胞傷害性の回帰分析を示す。
【図８】図８は、ＯＣＩ／ＡＭＬ５に対する抗体での前処理あり／なしのＫＨＹＧ−１のメチルセルロース細胞傷害性アッセイを示す。
【図９】図９は、抗ＮＫｐ３０あり／なしのｉＫＨＹＧ−１とのＯＣＩ／ＡＭＬ５のインビトロインキュベーションおよびＮＳＧマウスにおけるインビボ増殖を示す。
【図１０】図１０は、ＮＫｐ３０前処理あり／なしのｉＫＨＹＧ−１を用いたＮＳＧマウスにおけるＯＣＩ／ＡＭＬ５白血病の治療を示す。
【図１１】図１１は、ＮＫｐ３０前処理あり／なしのｉＫＨＹＧ−１を用いた初代ＡＭＬ異種移植ＮＳＧマウスの治療を示す。
【図１２】図１２は、白血病細胞株に対する細胞傷害性に関する抗ＮＫｐ３０抗体およびこの抗体のＦａｂフラグメントを用いたＫＨＹＧ−１の前処理の効果を比較する。
【図１３】図１３は、ソートなしのＯＣＩ／ＡＭＬ５細胞およびＣＤ３０ｌｏｗＯＣＩ／ＡＭＬ５細胞に対する抗ＮＫｐ３０コートＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害性を比較する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
実施例において以下詳述するように、腫瘍細胞（特に癌細胞）の治療が、抗体およびＮＫ細胞を組み合わせにて用いて達成された。本発明者らは、インビトロで、そしてヒト癌治療のインビボモデルを用いて、逆抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（reverse antibody dependent cell-mediated cytotoxity）に基づいて本発明の実施形態の有用性を示した。
【００２０】
したがって、本発明によれば、患者の腫瘍を治療する方法であって、該患者に有効量の抗体を投与する工程を含み、該抗体が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面上の抗原を結合し、かつ該抗体が、該腫瘍の細胞上のＦｃレセプターに結合する、方法が提供される。
【００２１】
以下の実施例において、どんなふうに抗体が腫瘍細胞の表面上のＦｃレセプター（例えば、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）、ＣＤ３２（ＦｃγＩＩ）またはＣＤ６４（ＦｃγＩ）から選択される）を適切に結合し得るかが示されている。抗体は、Ｆｃ領域、またはそうでなければ、腫瘍細胞上のＦｃレセプターを結合し得る部分を含む。Ballらは、初代ＡＭＬ上のＦｃγレセプターの発現の研究を行い、以下の頻度を記録した：ＦｃγＲＩ（５８％）；ＦｃγＩＩ，（６７％）；およびＦｃγ  ＩＩＩ，（２６％）。ＦｃγＩおよびＩＩレセプター発現は、ＦＡＢ  Ｍ４およびＭ５形態と非常に高い相関を示した。よって、本発明の治療は、１つまたはそれ以上のＦｃレセプターを発現することが同定された腫瘍／癌に適している。一例では、ヒト化抗ＮＫ細胞活性化レセプター抗体単独が投与される。好ましくは、この抗体は、抗ＮＫｐ３０または抗ＮＫｐ４４である。
【００２２】
結果として、抗体のＮＫ細胞への結合およびその結合した組み合わせの腫瘍細胞への結合が、腫瘍細胞死に至る。よって、抗体の役割は、事実上、エフェクターＮＫ細胞を標的癌細胞に架橋することである。典型的には、抗体は、Ｆｃ領域（これは、定義によりＦｃレセプターを結合する）を含む。他の適切な抗体は、（何らかの理由で）厳密にはＦｃ領域とは言わないが、それにもかかわらず使用の際、ＮＫ細胞よりむしろ腫瘍細胞上のＦｃレセプターを結合する部分を含み得る。したがって、本発明の特定の実施形態の特徴は、ＮＫ細胞がＦｃレセプターを発現しないことである。
【００２３】
抗体は、実質的に全てが同じ結合特性を有する１セットまたは複数の抗体として用いられ得る。あるいは、異なるＮＫ細胞表面マーカーまたはタンパク質に結合する抗体、あるいは異なるＦｃ領域を含む抗体の混合物が用いられ得、あるいは、実際に、異なる抗体は、治療に用いられる複数の抗体内で、両局面において異なり得る。
【００２４】
腫瘍細胞の殺傷は、逆抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（Ｒ−ＡＤＣＣ）と呼ばれる機構を介して本発明の特定の実施形態の使用において達成される。本明細書に含まれる特定の実施例は、管理者の支援の下、これを初めて実証し、そして検証例は、腫瘍細胞の細胞傷害性がＲ−ＡＤＣＣの結果であることがもっともらしいことを示している。
【００２５】
本明細書中の上記および下記の方法、使用および組成物は、癌（特にヒトにおける癌）の治療（例えば、血液細胞の癌または固形癌の治療）に適している。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態では、癌細胞の殺傷は癌幹細胞の殺傷により達成され、改善された癌治療を提供する。以下により詳細に記載する本発明の特定の実施例は、クローン性白血病癌細胞の殺傷を示している。
【００２７】
本発明の実施形態は、血液癌（hematologic cancer）（血液、骨髄および／またはリンパ節の癌である）の治療に特に適している。これらは、白血病、リンパ腫および骨髄腫を含む。治療され得る特定の癌は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（Ｔ細胞リンパ腫およびＢ細胞リンパ腫を含む）、無症候性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、活動型骨髄腫（active myeloma）および軽鎖骨髄腫（light chain myeloma）から選択される。特に、本発明は、ＡＬＬ、ＡＭＬおよびＢ細胞リンパ腫を治療するために有用である。
【００２８】
本発明のさらなる実施形態は、癌細胞表面上のＦｃレセプターの発現によって特徴づけられる癌の治療に特に適している。これらは、ＡＬＬ、ＡＭＬおよびＢ細胞リンパ腫を含み、そして黒色腫（例えば、悪性黒色腫）もまた含む。
【００２９】
本発明により治療され得る腫瘍のさらなる特定の例は、膀胱癌、軟骨肉腫、結腸癌、胃腸癌、神経膠腫、頭頸部癌、腎癌、肝癌、卵巣癌、膵癌、軟組織／筋組織癌、前立腺癌、乳（乳腺）癌、胚細胞癌、多発性骨髄腫、組織球肉腫、黒色腫、皮膚癌、子宮癌、および大腸癌から選択される。
【００３０】
活性因子およびその組み合わせを必要な患者に送達するため、種々の投与経路が、当業者に知られる。本発明の実施形態は、血液癌治療のためである。抗体またはＮＫ細胞あるいはそれらの組み合わせの投与は、全身的または局所的であり得、例えば、腹腔内経路を介してなされ得る。
【００３１】
活性因子のターゲティングの増大は、腫瘍細胞にその因子をホーミング（home）するように設計された手段によって適切に達成される。ＮＫ細胞は、進行性腫瘍において大量に見出されなくともよい。これは、腫瘍がサイトカイン／ケモカインシグナリングに干渉する結果であり得る。腫瘍内サイトカイン／ケモカイン療法は、ＮＫ細胞を癌にターゲティングするために用いられ得、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１は、全て腫瘍部位でＮＫ細胞を活性化し、癌細胞の溶解を増大させ得る（Zamaiら、2007）。ＮＫエフェクター細胞の腫瘍部位へのホーミングの増大もまた、腫瘍血管系の破壊、例えば、メトロノミック化学療法（metronomic chemotherapy）によるか、または血管形成をターゲティングする薬物の使用により可能なものとなされ（Meleroら、2014）、癌血管を介するＮＫ細胞浸潤を正常化し得る。
【００３２】
他の実施形態では、活性因子が、より直接的に投与される。したがって、投与は、直接的に腫瘍内にすることができ、特に固形腫瘍に適している。あるいは、投与は、腹腔内にすることができる（例えば、転移性の卵巣癌の場合）。
【００３３】
本発明に使用するための抗体（単独または細胞との組み合わせで）は、好ましくは、ＮＫ細胞上の細胞表面抗原、タンパク質またはマーカーに結合する。結合は、抗体を露出させ、結合のために独立して利用可能な状態で付着させることができ、この部分が、次いで腫瘍細胞にＦｃレセプターを介して結合する。本明細書中で実施されかつ記載される実施例では、抗体は、ＮＫ表面上の抗原／レセプターに結合する。適切なレセプターは公知のＮＫ細胞活性化レセプターであり、例えば、天然の細胞傷害性レセプターである。以下の使用において、抗体は、これらの活性化レセプターを活性化したか、または他に作動させた（そのアゴニストであった）。個々の例は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ−１およびＮＫＧ２Ｄであり、最初の２つは本発明の有効性を示すのに首尾よく用いられた。
【００３４】
本発明の実施形態において、ＮＫ細胞は、多発性骨髄腫（ＭＭ）の治療のため、ＳＬＡＭＦ７（ＣＳ−１）に特異的な抗体と組み合わせて用いられる。抗原はＮＫ細胞上に存在し、したがって、治療はＲ−ＡＤＣＣを介して生じる。好ましくは、ＫＨＹＧ−１細胞が用いられ、ＳＬＡＭＦ７抗体が市販されている。
【００３５】
本発明の別の実施形態において、ＮＫ細胞は、ＡＭＬの治療のため、抗体と組み合わせて用いられる。公知のＡＭＬ細胞は、ＳＬＡＭＦ７の発現を欠くが、ＣＤ３２（Ｆｃレセプター）を発現する。したがって、ＳＬＡＭＦ７抗体を用いるＡＤＣＣは可能ではなく、ＡＭＬの治療はＲ−ＡＤＣＣを介して生じる。好ましくは、ＫＨＹＧ−１細胞が用いられ、ＳＬＡＭＦ７抗体が市販されている。
【００３６】
さらなる実施形態では、ブロッキング抗体が用いられ、この抗体は、ＮＫ表面上の阻害レセプターを結合し、これを中和する。ブロッキング抗体に適切な抗原／レセプターとしては、ＣＤ８５ｄ（ＬＩＲ−２）、ＣＤ８５Ｊ（ＬＩＲ−１）、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴおよびＴＩＭ−３が挙げられる。
【００３７】
したがって、抗体が、ＮＫ細胞の表面にのみ発現された抗原に特異的であることが好ましい。当該抗原は、好ましくは癌上で発現されず、好ましくは任意の他の細胞上でも有意な程度に発現されない。それにも関わらず、投与前にＮＫ細胞が抗体でプレコートされた場合、この特異性のレベルはさほど重要でなくなる。
【００３８】
本発明は組み合わせ療法を提供し、したがって、本明細書中に記載し、そして請求する患者の腫瘍を治療するための方法は、患者に有効量の抗体および有効量のＮＫ細胞を投与する工程を含み、
抗体は、ＮＫ細胞の表面上の抗原を結合し、かつ
抗体は、腫瘍の細胞上のＦｃレセプターに結合する。
【００３９】
ＮＫ細胞の投与は、抗体との組み合わせであり（そこで、これら２つの合わさった効果が実現される）、そして抗体の投与前、投与と同時または投与後に生じ得る。一例では、外因性ＮＫ細胞（好ましくはＫＨＹＧ−１細胞）がヒト化抗ＮＫ活性化レセプター抗体（好ましくは抗ＮＫｐ３０）と組み合わせて投与される。このＮＫ細胞は、それらの増殖能が（例えば、放射線照射により）消失したものである。
【００４０】
ＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１は、身体の正常細胞にそれらの細胞傷害性の影響を与えることがより少なくなるので、他のＮＫ細胞株（例えばＮＫ−９２）よりも好ましい。なぜなら、ＮＫ−９２細胞の高いベースライン細胞傷害性は、患者への投与の際に副作用の危険性を増大し得るからである。
【００４１】
本発明の実施において、抗体がＮＫ細胞に結合して投与される治療が成功している。ＮＫ細胞に結合された抗体を投与する前に抗体をＮＫ細胞とプレインキュベートすることは、この組み合わせを調製する１つの方法である。なお別の例では、ＮＫ細胞（例えばＫＨＹＧ−１）は、投与前に、ヒト化抗ＮＫ活性化レセプター抗体（好ましくは抗ＮＫｐ３０）で前処理される。このＮＫ細胞は、それらの増殖能が（例えば、放射線照射により）消失したものである。
【００４２】
一般に、ＮＫ細胞は、本発明の方法、使用、および組成物に適していると考えられる。ある実施形態では患者自身のＮＫ細胞が使用されるが（例えば、エクスビボで）、外因性ＮＫ細胞が好適に使用される。本明細書中の特定の実施例で使用された細胞のように、ＮＫ細胞は、癌細胞株から得られたＮＫ細胞であり得る。有利なことに、ＮＫ細胞、好ましくは、その腫瘍形成性を減少させるように処理されたもの（例えば、それを死滅させ、かつ／または分裂不能にすることによる）は、血液癌細胞株から得られ得、そして血液癌の治療のため、本発明の方法において用いられ得る。用いられるべきＮＫ細胞を結合する抗体が利用され、そして、全ての提案されたＮＫ細胞のために、細胞表面分子を結合する抗体（好ましくは、本明細書中に記載されたような）が同定され得ると考えられる。
【００４３】
癌由来細胞を治療用途により許容可能なものとするため、一般に、それが患者において腫瘍を形成する傾向を低減するかまたは除去するように、なんらかの方法で前処理される。実施例に用いた特定のＮＫ細胞は、それらが分裂不能とされているので、安全である。それらは、放射線照射されて、それらの殺傷能力を保持するが、約３〜４日以内に死亡する。本明細書中の方法に使用するための可能性のあるＮＫ細胞の処理は、インビボでそれらが分裂して腫瘍を形成することを防ぐ放射線照射、および腫瘍形成性を低減する遺伝子改変（例えば、インビボで細胞が分裂して腫瘍を形成することを防ぐように活性化可能な自殺遺伝子をコードする配列を挿入すること）が挙げられる。自殺遺伝子は、外因性（例えば、循環）因子によって作動され得、次いで、当該遺伝子を発現する細胞において細胞死を引き起こし得る。
【００４４】
本発明の特定の実施形態は、ＮＫ細胞株（ＫＨＹＧ−１）を使用する。その誘導物（derivative）もまた使用され得る。例えば、すぐ上に記載の改変によって誘導されるか、または培養により誘導される。さらなる特定の実施形態では、ＮＫ細胞株ＮＫ−９２またはその誘導物が用いられる。
【００４５】
これらの細胞は、本発明の特定の方法において単独で使用され得る。したがって、本発明によれば、患者の腫瘍を治療する方法は、患者に有効量のＫＨＹＧ−１細胞を投与する工程を含む。患者の腫瘍を治療する方法は、一般に、患者に有効量のＮＫ細胞を投与する工程を含み、患者における抗体は、ＮＫ細胞の表面上の抗原を結合し、かつこの抗体は、腫瘍の細胞上のＦｃレセプターにさらに結合する。本発明のより先の方法の好適かつ選択的な局面は、これらの方法の好適かつ選択的な局面を形成する。
【００４６】
なおさらに、本発明は、記載の抗体、ＮＫ細胞および本明細書中に記載の使用のためのそれらの組み合わせを提供する。したがって、本発明は、患者の腫瘍の治療に使用するための抗体を提供し、この抗体は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面上の抗原を結合し、かつこの抗体は、腫瘍の細胞上のＦｃレセプターに結合する。本発明は、患者の腫瘍の治療のために組み合わせで使用するための抗体およびＮＫ細胞を提供し、この抗体は、ＮＫ細胞の表面上の抗原を結合し、かつこの抗体は、腫瘍の細胞上のＦｃレセプターに結合する。本発明は、患者の腫瘍の治療に使用するためのＫＨＹＧ−１細胞またはその誘導物を提供する。本発明はまた、患者の腫瘍の治療に使用するためのＮＫ細胞を提供し、患者における抗体は、ＮＫ細胞の表面上の抗原を結合し、かつこの抗体は、腫瘍の細胞上のＦｃレセプターに結合する。
【００４７】
なおさらに、本発明は、（ａ）ＮＫ細胞と、（ｂ）該ＮＫ細胞に結合する抗体とを含む、組成物を提供する。
【００４８】
この組成物は、本明細書の別の箇所に記載の通りの使用のためのものであり、したがって、腫瘍（例えば、血液細胞の腫瘍または固形腫瘍）の治療に適し、癌の治療に適している。特定の実施形態において、組成物は、白血病（急性骨髄性白血病を含む）の治療のためのものである。
【００４９】
組成物における抗体は、典型的には、別の箇所に記載のとおりであり、したがって、ＣＤ１６、ＣＤ３２またはＣＤ６４から選択されるＦｃレセプターを結合し得、かつＮＫ細胞細胞傷害性レセプター（例えばＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４）を結合し得る。抗体の他の特徴は、本発明の方法および使用に関して記載の通りであり、ここで繰り返さない。
【００５０】
同様に、組成物のＮＫ細胞の他の選択的かつ好ましい特徴は、本発明の他の方法および使用に関して別の箇所に記載のとおりである。
【実施例】
【００５１】
本発明を、ＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１の使用によりヒトの白血病細胞死が引き起こされること、および、この効果がＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４を介するＲ−ＡＤＣＣおよび抗体上のＦｃ領域を結合するＣＤ３２の標的細胞上の存在により増強されることに関して、より具体的に詳細に記載する。本発明を、以下の実施例において、添付の図面を参照して説明する。
【００５２】
本発明の本実施例において、活性化レセプターに対するモノクローナル抗体でのＮＫ細胞株の前処理が、白血病細胞株および初代ＡＭＬ芽球に対する細胞傷害性の数倍の増強を引き起こすことが示されている。この効果は、ＣＤ３２発現標的に対するＫＨＹＧ−１の抗ＮＫｐ３０および抗ＮＫｐ４４前処理で最も著しかった。他の（別の信用できる）説明を除く、さらなる特定の研究が、増強の機構としてＲ−ＡＤＣＣを示した。
【００５３】
インビボモデルでＮＫｐ３０前処理ＫＨＹＧ−１の影響をさらに示した。
【００５４】
（方法）
（細胞株および初代試料）
Ｋ５６２をＡＴＣＣから入手し、そして２０％ＦＢＳおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）のそれぞれを加えたＩＭＤＭ中に維持した。ＫＧ１およびＫＧ１ａをＡＴＣＣから入手し、そして２０％ＦＢＳおよび１０％ＦＢＳのそれぞれを加えたＩＭＤＭ中に維持した。ＯＣＩ／ＡＭＬ２、３および５をOntario Cancer Institute（ＯＣＩ）で誘導した。ＯＣＩ／ＡＭＬ２および３を、１０％ＦＢＳを加えたＭＥＭアルファ中で培養し、そしてＯＣＩ／ＡＭＬ５を、１０％ＦＢＳおよび１０％５６３７膀胱癌腫条件培地を加えたＭＥＭアルファ中で培養した。ＫＨＧＹ−１をヒューマンサイエンス研究資源バンク（The Human Science Research Resources Bank）（ＪＣＲＢ０１５６；日本国東京）から購入し、そしてＧＭ１（４５０Ｕ／ｍｌおよびヒトＡ／Ｂ血清を添加したエクスビボ（Ex Vivo）培地）中で培養した。ＮＫ−９２をDr. Hans Klingemannから入手し、そしてまたヒトＡ／Ｂ血清および４５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加したEx Vivo（ＧＭ１）中で培養した。ＫＨＹＧ−１を、インビボ実験で使用する前に、１０００ｃＧｙで放射線照射した（ｉＫＨＹＧ−１）。５種の初代ＡＭＬ試料をPrincess Margaret Hospital Leukemia Tissue Bankから施設のプロトコルに従って入手した（５８９０、０８０１７９、０８００７８、０８０００８、０９０９）。
【００５５】
（クロム遊離アッセイ）
我々のグループ（Williams, Wangら、2010）によって以前記載し、第２章の方法のセクションに詳述した通りの標準的なクロム遊離アッセイを利用した。簡潔には、１×１０６の標的細胞を１００μＣｉのＮａ２５１ＣｒＯ４で２時間標識し、その後に１ウェル当たり１００００細胞を播種し、次いで種々の濃度のＮＫ−９２で処理した。上清中に存在する５１Ｃｒの量をガンマカウンターを用いて決定し、溶解パーセント（％溶解）を算出した。
【００５６】
（ＮＫ細胞エフェクターの抗体前処理）
使用した全ての抗体は、Biolegendからであった。ＮＫ前処理実験のために、以下のＮＫレセプターに対する抗体を利用した（クローン；製品番号）：ＮＫｐ３０（クローンＰ３０−１５；３２５２０４）、ＮＫｐ４４（クローンＰ４４−８；３２５１０４）、ＮＫｐ４６（クローン９Ｅ２；３３１９０４）、ＤＮＡＭ−１（クローンＤＸ−１１；３１６８０２）、ＮＫＧ２Ｄ（クローン１Ｄ１１；３２０８１０）、ＣＤ７（ＣＤ７−６Ｂ７；３４３１０２）。トリニトロールフェノール＋ＫＬＨに特異的なアイソタイプコントロールを利用した：ＭＧ１−４５（クローンＭＧ１−４５；４０１４０４）およびＭＧ２ａ−５２（クローンＭＧ２ａ−５３、４０１５０２）。簡潔には、１．５×１０６のＮＫ細胞（ＮＫ−９２またはＫＨＹＧ−１）を１ｍｌのＡＩＭ−Ｖ無血清培地で１時間処理し、１０ｍｌのＡＩＭ−Ｖ培地中で洗浄し、そして１．５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ培地中に再懸濁した（１×１０６／ｍｌ）。抗体の濃度は１０μｇ／ｍｌ〜０．０１μｇ／ｍｌの範囲であった。ＮＫ細胞懸濁液の０．１μｌ（１０５細胞）を９６ウェルＵ底プレート中でまたＡＩＭ−Ｖ培地中にある１００００腫瘍標的に添加し、１０：１のＥ：Ｔ比を得た。
【００５７】
（フローサイトメトリー）
ＢＭの免疫フェノタイピングをＦＣ５００を用いて行った。ＦＡＣＳ緩衝液をＰＢＳ＋２ｍＭ  ＥＧＴＡ＋２％ＦＢＳを用いて作製した。白血病および食道癌細胞株の通常のフローサイトメトリーのために、Ｆｃγレセプターに対する以下の抗体を利用した：ＣＤ１６  ＡＰＣ（クローン３Ｇ８、３０２０１１）、ＣＤ３２  ＰＥ（クローンＦＵＮ−２、３０３２０５）、ＣＤ６４  ＦＩＴＣ（クローン１０．１；３０５００５）。抗体濃度は２０００００〜１，０００，０００細胞を有する５０μｌ反応容量中で約１μｇ／ｍｌで利用した。
【００５８】
（高スループットサンプリングフローサイトメトリー）
細胞表面マーカーに対する商業的に有効なＦＩＴＣ、ＰＥまたはＡＰＣ結合抗体（３７４）（BD Pharmingen, eBioscience, Abcam, AbD Serotech, BioLegend, Lifespan Biosciences, Miltenyi, R&D Systems, Beckman-Coulter, およびImgenex）を、１：２５の希釈で、１％ウシ血清アルブミンおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを添加したハンクス平衡塩類溶液（ＦＡＣＳ緩衝液）中に、９６ウェルプレートの個々のウェルに小分けした（補遺表１、２）。ＮＫ−９２またはＫＨＹＧ−１細胞（３０×１０ｅ６）を１０ｍｌのＰＢＳ中に調製し、スピンダウンし、そしてＨＢＳＳ＋１％ＢＳＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ中に再懸濁して、そして１×１０６／ｍｌに容量調整した。５０μｌの細胞懸濁液（５００００細胞）懸濁液を各ウェルに添加し、１：５０の最終抗体希釈を得た。細胞を、０．２５〜１．０×１０６／ｍＬの濃度で氷上で３０分間染色し、冷ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、そして０．１μｇ／ｍＬ  ＤＡＰＩを有するＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、死細胞を排除した。フローサイトメトリーをHigh Throughput Sampler装備Becton-Dickinson LSRIIフローサイトメーターを用いて実施した。プレートを自動化フローサイトメトリープレートリーダー内に配置した。データを取得し、FlowJo 9で分析した。ゲーティングストラテジーは、ＦＳおよびＳＳプロットと引き続くＤＡＰＩ染色との両方を利用して非生存細胞を排除し、その後、ＦＳＣ−ＨおよびＦＳＣ−Ｗを用いてダブレットを排除した。最終ゲートを生存非染色細胞の周囲に輪郭づけた。陽性細胞の％および平均蛍光強度を各マーカーについて定量した。
【００５９】
（動物）
The Jackson LaboratoryからのＮＯＤ／ＳＣＩＤガンマｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスをOntario Cancer Institute動物施設で、Animal Care Committeeにより認可されたプロトコルに従って飼育し、維持した。実験期間中、マウスに放射線照射食品およびバイトリル（Baytril）含有水を自由に与えた。ＡＭＬの注入前に、生着を容易にするため、ＮＳＧマウスを２００ｃＧｙで放射線照射した。２×１０６細胞の投与を利用する腹腔内（ｉｐ）および静脈内（ｉｖ）注射経路ＯＣＩ／ＡＭＬ５  ＮＳＧ異種移植片モデルを開発した。ＯＣＩ／ＡＭＬ５の増殖能に関するｉＫＨＹＧ−１とのインビトロのインキュベーションの影響を決定するために、人道的エンドポイントで死亡させるように、この腹腔内（ｉｐ）注射経路を利用した。簡潔には、ＯＣＩ／ＡＭＬ５細胞を、１０：１のＥ：Ｔ比で、（１μｇ／ｍｌ抗ＮＫｐ３０で１時間の前処理あり／なしの）ｉＫＨＹＧ−１ありまたはなしで１５ｍｌ円錐管中でインキュベートし、１２００ｒｐｍで遠心してペレット化し、そして３７℃にて４時間インキュベートした。次いで、細胞混合物を洗浄してＰＢＳ中に再懸濁し、そして２００μｌのＰＢＳ中、２０×１０６のｉＫＨＹＧ−１またはＮＫｐ３０  ｉＫＨＹＧ−１細胞あり、またはなしで２×１０ｅ６のＯＣＩ／ＡＭＬ５細胞を、５匹のＮＳＧマウスからなる３群に腹腔内（ｉｐ）注射した。
【００６０】
ＮＫ細胞株治療の効果をインビボで決定するために、ＯＣＩ／ＡＭＬ５または初代ＡＭＬを０日目に静脈内（ｉｖ）注射し、３日目にｉＫＨＹＧ−１または抗ＮＫｐ３０前処理ｉＫＨＹＧ−１処理を開始したものと開始しないものとを用意した（１０×１０６で６回投与；３、５、７、１０、１２、１４日目）。初代ＡＭＬ試料（０８０１７９）を、攻撃的な生着特徴（aggressive engraftment features）を有するＭ４白血病から誘導し、そしてこれらの実験に使用する前にＮＳＧマウスに通過させた。
【００６１】
（カルセイン細胞傷害性アッセイ）
ＯＣＩ／ＡＭＬ５細胞を、ＣＤ３２について、ＣＤ３２ａ、ｂおよびｃをターゲティングする３つのｓｉＲＮＡ産物を用いてノックダウンした。引き続き、ＯＣＩ／ＡＭＬ５  ＣＤ３２ノックダウン細胞をセルソーターで選別してＣＤ３２低画分を取得し、取得ゲートを底の１０％集団に対して設定した。ＯＣＩ／ＡＭＬ５およびＣＤ３２ ｌｏｗ ＯＣＩ／ＡＭＬ５細胞株に対するＮＫ細胞細胞傷害性を、カルセイン細胞傷害性アッセイを用いて決定した。標的細胞を１０μＭのカルセイン−ＡＭで３０分間標識した。その後、無血清ＲＰＭＩ培地中で２回洗浄を行った。次いで、細胞をＡＩＭ−Ｖ無血清培地中で５×１０４／ｍｌにて再懸濁し、そして１００μｌの細胞懸濁液をＵ底の９６ウェルプレートに添加した。ＮＫ−９２およびＣＤ１６＋ＩＬ−２＋ＮＫ−９２細胞の両方を１０：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比にてエフェクター細胞として使用した。標的に対するエフェクター細胞添加後、プレートを５００ｇにて１分間遠心した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ（２％）を用いて、最大カルセイン遊離を決定した。プレートを３７℃にて２時間インキュベートした後、４８０／５３０ｎｍでの読み取りのため、７５μｌの上清を新たなプレートに移した。
【００６２】
（統計）
Medcalcソフトウェアを用いてログランク検定を用いてカプラン・マイヤー生存曲線によって、生存率分析を行った。Medcalcソフトウェアで実施される両側スチューデントｔ検定を用いて、細胞傷害性および生着データの比較を行った。線形回帰分析をMedcalcソフトウェアを用いて行い、そしてこれを用いて、最良適合直線（best fit line）、決定係数（Ｒ２）、Ｆ検定および有意水準と共に分散プロットを作成した。
【００６３】
（結果）
（白血病細胞株に対するＮＫ−９２およびＫＨＹＧ−１細胞傷害性）
ＮＫ−９２およびＫＨＹＧ−１を、クロム遊離アッセイを用いて１０：１のＥ：Ｔ比にて白血病細胞株パネル（Ｋ５６２，ＫＧ１，ＯＣＩ／ＡＭＬ２，３および５）に対して試験した。両細胞株は、これらの標的に対する細胞傷害性を示し、ＮＫ−９２は、ＫＨＹＧ−１よりも全体的に良好な細胞傷害性を示した（図１）。ＯＣＩ／ＡＭＬ５は、ＮＫ−９２殺傷に対して特に感受性であり、６８％の溶解パーセントであり、これは、Ｋ５６２に対するものを超えた。ＯＣＩ／ＡＭＬ２は、両細胞株による殺傷に対して比較的耐性であり、極小の細胞傷害性を示した。
【００６４】
Ｋ５６２に対するＮＫ−９２細胞傷害性は、全てのエフェクター標的比で、カルシウムキレート化によって完全に無効化された。このことは、顆粒エキサイトーシスが、細胞傷害性の主要手段であったことを示す。しかし、特に１：１および５：１のエフェクター：標的比にて、ＫＨＹＧ−１によるＫ５６２の少量の残余の殺傷が存在した。
【００６５】
（活性化レセプター特異的抗体でＮＫ−９２およびＫＨＹＧ−１を前処理する効果）
標的細胞Ｋ５６２、ＫＧ１ａおよびＯＣＩ／ＡＭＬ５との共インキュベーション前に、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ−１、ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ７に特異的な抗体（１０μｇ／ｍｌ）でＮＫ−９２およびＫＨＹＧ−１を前処理することにより、白血病標的のＮＫ細胞株介在性認識における一般の活性化レセプターの役割に取り組むことを試みた。アイソタイプコントロールとして、標的外の抗体（off-target antibody）を用いた。ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６に対する抗体でのＮＫ−９２の前処理が、予想外に、アイソタイプコントロールを上回ってＫ５６２の殺傷を増大した［１．３倍（ｐ＜０．０００１）、１．２倍（ｐ＜０．０５）、１．２倍（ｐ＝０．１１）］。一方、抗ＮＫｐ３０処理は、ＫＧ１ａ［＋１．８倍（ｐ＜０．０００１）］およびＯＣＩ／ＡＭＬ５［１．２倍（ｐ＜０．０１）］の殺傷を増強した。
【００６６】
ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６に対する抗体でのＫＨＹＧ−１の処理は、アイソタイプコントロールを上回ってＫ５６２の殺傷を増大した［１．４倍（ｐ＜０．００１）、１．５倍（ｐ＜０．０１）、１．２倍（ｐ＜０．０５）］。一方、抗ＮＫｐ３０処理はＫＧ１ａの殺傷を増大し［２．６倍（ｐ＜０．０１）］、そして抗ＮＫｐ３０、抗ＮＫｐ４４および抗ＮＫｐ４６処理はＯＣＩ／ＡＭＬ５の殺傷を増大した［３．４倍（ｐ＜０．００００１）、３．２倍（ｐ＜０．０００１）、１．８倍（ｐ＜０．０００１）］（図２）。ＤＮＡＭ−１およびＮＫＧ２Ｄに対する抗体でＮＫ細胞株を前処理することは、細胞傷害性に関する影響は極小であった。
【００６７】
次いで、Ｋ５６２および２つの初代ＡＭＬ細胞株を用いて同様の実験を試みた。ＮＫ−９２およびＫＨＹＧ−１を、白血病標的細胞Ｋ５６２、ならびに初代ＡＭＬ試料０８００７８および０９０９との共インキュベーション前に、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ−１、ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ７に特異的な抗体（１０μｇ／ｍｌ）で前処理した。初代ＡＭＬ試料に対するＮＫ−９２細胞傷害性は、抗ＮＫｐ３０で前処理した場合、アイソタイプコントロールを上回る著しい増大を示した［７．１倍（ｐ＜０．００１）および３．０倍（ｐ＜０．０００１）］。
【００６８】
抗ＮＫｐ３０または抗ＮＫｐ４４のいずれかでのＫＨＹＧ−１の前処理は、初代ＡＭＬ試料０８００７８［１６．９倍（ｐ＜０．０００１）および１７．６倍（ｐ＜０．００１）］および０９０９［２．８倍（ｐ＜０．０００１）および２．９倍（ｐ＜０．００１）］に対する細胞傷害性について、アイソタイプコントロールよりも劇的な増大を生じた（図３）。次いで、抗ＮＫｐ３０および抗ＮＫｐ４４が介在する殺傷増強の投与量依存性を、いくつかの投与量範囲を試験することにより調べた。
【００６９】
投与量応答曲線の線形部分を決定し、ＥＣ５０％を概算する試みにおいて、ＮＫ細胞株の前処理は、Ｋ５６２、ＯＣＩ／ＡＭＬ３およびＯＣＩ／ＡＭＬ５ならびに初代ＡＭＬ０８００７８に対して種々の投与量の抗ＮＫｐ３０および抗ＮＫｐ４４（１、５および１０μｇ／ｍｌ）を用いて行った。投与量応答は、ＯＣＩ／ＡＭＬ３および初代ＡＭＬ試料０８００７８に対するＮＫ−９２の抗ＮＫｐ３０前処理で見られたが、ＥＣ５０％は、用いた最も低い投与量（１μｇ／ｍｌ）より低かった（データは示さず）。ＫＨＹＧ−１は、抗ＮＫｐ３０および抗ＮＫｐ４４の両方の抗体前処理の全ての投与量範囲で見られた増強と同程度の増強を有した（データは示さず）。
【００７０】
次いで、より低い投与量範囲を選択し、アイソタイプコントロール、抗ＮＫｐ３０および抗ＮＫｐ４４で０．１、０．５および１μｇ／ｍｌにて前処理したＮＫ細胞株を利用した。アイソタイプコントロールで前処理したＮＫ−９２およびＫＨＹＧ−１は、Ｋ５６２、ＯＣＩ／ＡＭＬ３、ＯＣＩ／ＡＭＬ５およびＫＧ１に対する細胞傷害性に関する効果は極小であり、投与量応答はなかった。抗ＮＫｐ３０前処理は、ＯＣＩ／ＡＭＬ３（ＥＣ５０％、約０．１μｇ／ｍｌ）およびＫＧ１（ＥＣ５０％、＜０．１μｇ／ｍｌ）に対してのみ、ＮＫ−９２細胞傷害性を増強した。ＮＫ−９２の抗ＮＫｐ３０および抗ＮＫｐ４４の組み合わせ前処理（０．１μｇ／ｍｌ）は、いかなる標的に対する細胞傷害性に関しても付加的なまたは相乗的な効果を有さなかった。
【００７１】
抗ＮＫｐ３０前処理は全ての標的に対するＫＨＹＧ−１細胞傷害性を増強し、Ｋ５６２（ＥＣ５０％、約０．１μｇ／ｍｌ）、ＯＣＩ／ＡＭＬ３（ＥＣ５０％、＜０．１μｇ／ｍｌ）、およびＫＧ１（ＥＣ５０％、＜０．１μｇ／ｍｌ）について投与量応答が見られた。一方、ＯＣＩ／ＡＭＬ５は、最も低い投与量からプラトーを示した（ＥＣ５０％、＜０．１μｇ／ｍｌ）。抗ＮＫｐ４４前処理は、全ての標的に対するＫＨＹＧ−１細胞傷害性を増強し、Ｋ５６２についてのみ投与量応答が見られ（ＥＣ５０％、約０．１μｇ／ｍｌ）、ＯＣＩ／ＡＭＬ３、ＫＧ１およびＯＣＩ／ＡＭＬ５は、最も低い投与量からプラトーを示した（ＥＣ５０％、＜０．１μｇ／ｍｌ）。（図４）。
【００７２】
ＫＨＹＧ−１の抗ＮＫｐ３０および抗ＮＫｐ４４前処理の組み合わせ（０．１μｇ／ｍｌ）は、Ｋ５６２、ＯＣＩ／ＡＭＬ３およびＫＧ１に対して各抗体単独よりも細胞傷害性に関してより大きな増強を示したが、ＯＣＩ／ＡＭＬ５に対しては示さなかった。
【００７３】
０．１μｇ／ｍｌの抗ＮＫｐ３０および抗ＮＫｐ４４の組み合わせ投与は、この投与量レベルで各抗体単独の効果を超過するだけでなく、Ｋ５６２、ＯＣＩ／ＡＭＬ３およびＫＧ１について、１０倍多い投与量（１μｇ／ｍｌ）の各抗体単独の効果にも匹敵するか、または超過し、真の相乗作用を示した。
【００７４】
ＫＨＹＧ−１で処理した細胞株標的についての処理なし、アイソタイプコントロール、抗ＮＫｐ３０、抗ＮＫｐ４０および抗ＮＫｐ３０と抗ＮＫｐ４４との組み合わせの各群（０．１μｇ／ｍｌ）ならびに抗ＮＫｐ３０および抗ＮＫｐ４４（１μｇ／ｍｌ）の％溶解値を、比較のため表にまとめる（表１）。
【００７５】
【表１】
2018516881.tif 000003
【００７６】
多くの場合、投与量応答が０．１〜１μｇ／ｍｌの範囲で見られ得たが、最も低い投与量がＥＣ５０％を超過した。したがって、１対数（ｌｏｇ）低い投与量範囲を試験する追加の実験を行った。（０．０１、０．１および１μｇ／ｍｌ）。この範囲で、アイソタイプコントロール（ＭＧ２ａ−５３）抗体の極小の効果があったが、投与量応答は見られなかった（データは示さず）。０．０１、０．１、および１μｇ／ｍｌの抗ＮＫｐ３０でのＮＫ−９２の前処理は、ＯＣＩ／ＡＭＬ３の細胞傷害性のみを増強し（ＥＤ５０％、０．０１〜０．１μｇ／ｍｌ）、抗ＮＫｐ４４前処理の効果はなかった。
【００７７】
抗ＮＫｐ３０および抗ＮＫｐ４４前処理は、全ての標的に対するＫＨＹＧ−１細胞傷害性を増強し、Ｋ５６２、ＯＣＩ／ＡＭＬ３およびＯＣＩ／ＡＭＬ５について投与量応答が見られた（ＥＣ５０％、０．０１〜０．１μｇ／ｍｌ）。
【００７８】
ＫＨＹＧ−１の抗ＮＫｐ３０および抗ＮＫｐ４４前処理の組み合わせ（０．０１μｇ／ｍｌ）は、この投与量レベルで、ＯＣＩ／ＡＭＬ３に対する細胞傷害性に関してのみ相乗的な効果を示した。
【００７９】
０．０１μｇ／ｍｌの抗ＮＫｐ３０および抗ＮＫｐ４４の組み合わせ投与は、各抗体単独の効果を超過し（２倍）、そして絶対的細胞傷害性は、各抗体の１０倍高い投与量（０．１μｇ／ｍｌ）に匹敵した。ＫＨＹＧ−１およびそのアイソタイプコントロールで処理した細胞株標的についての処理なし、アイソタイプコントロール、抗ＮＫｐ３０、抗ＮＫｐ４０および抗ＮＫｐ３０と抗ＮＫｐ４４との組み合わせの各群（０．０１μｇ／ｍｌ）ならびに抗ＮＫｐ３０および抗ＮＫｐ４４（１μｇ／ｍｌ）の％溶解値を、比較のため表にまとめる（表２）。
【００８０】
【表２】
2018516881.tif 000004
【００８１】
ＮＫ細胞株の抗ＮＫｐ３０および抗ＮＫｐ４４前処理が固形腫瘍に対する細胞傷害性を増強し得たかを決定するために、食道癌細胞株（ＦＬＯ−１、ＯＥ−３３、ＳＫＧＴ−４、ＫＹＡＥ−１）を用いて同じ実験を行った。しかし、０．１μｇ／ｍｌの抗ＮＫｐ３０および抗ＮＫｐ４４  ｍＡｂでのＮＫ−９２およびＫＨＹＧ−１の前処理は、アイソタイプコントロールと比べて、これらの４つの食道癌細胞株に対する細胞傷害性を増強しなかった。このことは、白血病細胞上に存在するが食道癌細胞株には存在しない、抗体前処理ＮＫ細胞株の増強効果の介在を担う独特の細胞表面マーカーの存在を示唆した。
【００８２】
（Ｆｃγレセプター発現および細胞傷害性の増強の関係）
２つの代表的な白血病細胞株標的（ＯＣＩ／ＡＭＬ３およびＯＣＩ／ＡＭＬ５）においてＨＴＳフローサイトメトリーを行い、抗ＮＫｐ３０または抗ＮＫｐ４４コートＮＫ細胞株の細胞傷害性の増強に関与し得る可能性のある細胞表面マーカーについて評価した。両細胞株上の高度のＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩ）発現に注目した。引き続き、Ｆｃγレセプター（ＣＤ１６、ＣＤ３２およびＣＤ６４）の発現について、全ての白血病細胞株および食道癌細胞株において通常のフローサイトメトリーを行った。白血病細胞株は、白血病株Ｋ５６２、ＫＧ１、ＫＧ１ａ、ＯＣＩ／ＡＭＬ３、およびＯＣＩ／ＡＭＬ５上で、ＦｃγレセプターＩＩ（ＣＤ３２）の比較的高い発現を示したが、ＦｃγレセプターＩ（ＣＤ６４）またはＦｃγレセプターＩＩＩ（ＣＤ１６）は非常に低い発現であった。
【００８３】
Ｋ５６２についてのヒストグラム形状は、ＣＤ３２の中程度の発現および高発現の両方の亜集団の存在を示唆した。ＫＧ１ａは、ＣＤ３２の陰性および低発現の亜集団の２集団を有するようであった。ＯＣＩ／ＡＭＬ３は、２つのＣＤ３２高発現亜集団を表す明確な２ピークを有した。ＫＧ１（中程度）およびＯＣＩ／ＡＭＬ５（高）において、ＣＤ３２発現細胞の明確な単集団が存在した。食道癌株（ＯＥ−３３、ＦＬＯ−１、ＫＹＡＥ−１およびＳＫＧＴ−４）上でＦｃγレセプターの有意な発現はなかった。
【００８４】
各白血病細胞株および食道癌細胞株の陽性率をフローサイトメトリープロットから決定した。１０μｇ／ｍｌの抗ＮＫｐ３０または抗ＮＫｐ４４のいずれかの抗体で前処理した場合のＮＫ−９２およびＫＨＹＧ−１の細胞傷害性の増強を測定する先の細胞傷害性アッセイからのデータをアイソタイプコントロールと比較し、デルタ細胞傷害性を算出した。アイソタイプコントロールに対し、デルタ細胞傷害性をＣＤ３２発現の程度と回帰分析を用いて相関させ、最良適合直線を作成し、決定係数（Ｒ２）および統計的有意性を算出した。抗体前処理ＮＫ−９２のデルタ細胞傷害性と標的のＣＤ３２発現との関係の回帰分析は、抗ＮＫｐ３０（Ｒ２＝０．１３；ｐ＝０．３４）および抗ＮＫｐ４４（Ｒ２＝０．２２；ｐ＝０．２０）前処理について相関性を示さなかった（ＡおよびＢ）。
【００８５】
しかし、抗体前処理ＫＨＹＧ−１のデルタ細胞傷害性と標的のＣＤ３２発現との関係の回帰分析は、抗ＮＫｐ３０（Ｒ２＝０．７１；ｐ＜０．０１）および抗ＮＫｐ４４（Ｒ２＝０．６４；ｐ＜０．０１）前処理の両方について相関性を示した（ＣおよびＤ）。
【００８６】
（クローン原性ＯＣＩ／ＡＭＬ５に対するＮＫ細胞株細胞傷害性に関する抗ＮＫｐ３０前処理の効果）
クローン原性白血病細胞に対する抗ＮＫｐ３０および抗ＮＫｐ４４前処理ＮＫ細胞株の効果を決定するために、標的としてＯＣＩ／ＡＭＬ５を利用し、以前確立したクローン原性細胞傷害性アッセイを利用した。殺傷の比較を、処理なし、アイソタイプコントロール（ＭＧ１−４５）および抗ＣＤ７前処理ＮＫ細胞株を用いて行った。ＣＤ７は、ＮＫ−９２およびＫＨＹＧ−１上で高発現されるが、これらの細胞において活性化能力は確認されていない。したがって、抗ＣＤ７抗体前処理を追加のコントロールとして選択した。アイソタイプコントロールとＣＤ７前処理ＮＫ−９２との間に差はなかった。０．１μｇ／ｍｌの抗ＮＫｐ３０でのＮＫ−９２の前処理は、ベースラインおよびアイソタイプコントロールと比べて、ＯＣＩ／ＡＭＬ５クローン原性能力に関しわずかな影響（＋３．７％；ｐ＜０．０５）を有するのみであった。
【００８７】
しかし、抗ＮＫｐ３０でのＫＨＹＧ−１の前処理は、ベースラインおよびアイソタイプコントロールと比べて３倍（＋６３．１％；ｐ＜０．０００１）、％コロニー阻害を増強した（図８）。ＮＫ−９２のベースラインの％コロニー阻害（６１．９％）はＫＨＹＧ−１（３２．０％）よりも大きかったが、抗ＮＫｐ３０前処理ＫＨＹＧ−１（９０．７％）は、ＮＫ−９２に比べて阻害が大きかった（＋２８．８％；ｐ＜０．０００１）。
【００８８】
（ＮＳＧ異種移植モデルにおける白血病進行についてのＯＣＩ／ＡＭＬ５能力に対する抗ＮＫｐ３０前処理ｉＫＨＹＧ−１のインビトロ効果）
ＯＣＩ／ＡＭＬ５異種移植モデルにおけるインビボでの白血病進行に関して、ＫＨＹＧ−１のインビトロの細胞傷害性効果を試験した。ＫＨＹＧ−１増殖を、使用前の１０００ｃＧｙでの放射線照射により予防した。１μｇ／ｍｌ  抗ＮＫｐ３０前処理あり／なしの放射線照射ＫＨＹＧ−１（ｉＫＨＹＧ−１）とＯＣＩ／ＡＭＬ５細胞を１時間、共インキュベートし、その後、１０：１のＥ：ＴにてＯＣＩ／ＡＭＬ５細胞と４時間、共インキュベートした。引き続き、エンドポイントまで生存した３群のＮＳＧマウスに細胞混合物を腹腔内（ｉｐ）注射した。個々のＮＳＧマウスに、２０×１０６の生存エフェクター細胞（ｉＫＨＹＧ−１または抗ＮＫｐ３０前処理ｉＫＨＹＧ−１）あり／なしで２×１０６のＯＣＩ／ＡＭＬ５細胞を注射した。９週目に、コントロールマウスは進行性悪性腹水を発症し、腹膜網に極小の脾腫と埋め込まれた血管の腫瘍を伴った。
【００８９】
ｉＫＨＹＧ−１との共インキュベーションは、生存を改善しなかった（ｐ＝０．９２）。しかし、抗ＮＫｐ３０前処理ｉＫＨＹＧ−１は、治療なし群（ｐ＜０．０５）またはｉＫＨＹＧ−１群（ｐ＜０．０５）と比べて生存を改善した。
【００９０】
（ＯＣＩ／ＡＭＬ５または初代ＡＭＬ異種移植マウスについての治療効力に関するｉＫＨＹＧ−１の抗ＮＫｐ３０前処理の効果）
尾静脈を通じた５×１０６のＯＣＩ／ＡＭＬ５細胞の注入によりＮＳＧマウスにおけるＯＣＩ／ＡＭＬ５生着能を評価し、そして２週間目に骨髄生着を測定した。ＯＣＩ／ＡＭＬ５の骨髄生着を骨髄試料におけるヒトＣＤ３３発現測定により検出し、骨髄生着は比較的迅速であるが変動することが分かった（１３．０、５２．３、２９．９、６３．５％）。その後の生存エンドポイント実験では、２×１０６のＯＣＩ／ＡＭＬ５細胞を５匹マウスの群に静脈内（ｉｖ）注射した。ＯＣＩ／ＡＭＬ５異種移植マウスについて、次いでｉＫＨＹＧ−１または抗ＮＫｐ３０前処理ｉＫＨＹＧ−１（１０×１０６の６回の腹腔内（ｉｐ）投与）で処理しなかったものと、処理したものとを得た。ｉＫＨＹＧ−１（＋３５日、生存期間中央値；ｐ＜０．０５）または抗ＮＫｐ３０前処理ｉＫＨＹＧ−１（＋３７日、生存期間中央値；ｐ＜０．０５）のいずれかで処理したマウスの生存はコントロールを有意に上回った。
【００９１】
初代ＡＭＬを接種したＮＳＧマウスへの注射前に、放射線照射ＮＫ−９２およびＫＨＹＧ−１について抗ＮＫｐ３０（１μｇ／ｍｌ）で前処理を行ったものおよび行わなかったものの効力を試験するためのモデルとして、ＮＳＧマウスにおいて生着して白血病を引き起こすことが知られる初代ＡＭＬ試料（０８０１７９）を利用した。ｉＫＨＹＧ−１およびｉＮＫ−９２は、初代ＡＭＬモデルにおいて生存を延長しなかったが、抗ＮＫｐ３０で前処理したｉＫＨＹＧ−１では、ｉＫＨＹＧ−１単独に対し有意な傾向で（ｐ＝０．２０）、幾分長い期間生存したマウスが見られた（コントロール中央値よりも３〜４週上回る）（図１１）。
【００９２】
（細胞傷害性機構の解明）
これまでの研究は、抗ＮＫｐ３０抗体でのＫＨＹＧ−１の前処理が、いくつかの細胞株および初代ＡＭＬ標的に対する細胞傷害性を大きく増強することに至ったことを示した。しかし、この実験データを説明し得る多くの可能性のある機構が存在し、観察結果の有用性および治療におけるその適用に関して疑問を生ずる。
【００９３】
実際の機構を探り当てるために、さらなる実験を考案した。詳細には、抗ＮＫｐ３０（Ｐ３０−１５）クローンおよびアイソタイプコントロール（ＭＧ１−４５）のＦａｂフラグメントを作製した。ＫＨＹＧ−１を０．１μｇ／ｍｌの抗ＮＫｐ３０およびアイソタイプコントロールの全抗体またはＦａｂフラグメントで１時間、プレコートし、次いでＡＩＭ−Ｖ培地中で洗浄した。次いで、プレコートしたＫＨＹＧ−１をＫ５６２、ＫＧ１およびＯＣＩ／ＡＭＬ５標的に対する４時間のクロム放出アッセイに用いた（図１２）。抗ＮＫｐ３０抗体のみが、これらの３つの細胞株に対する細胞傷害性を有意に増強し得、他方、抗ＮＫｐ３０抗体フラグメントは、細胞傷害性をブロックしたか（Ｋ５６２）、細胞傷害性に関して影響がなかったか（ＫＧ１）、またはアイソタイプコントロールＦａｂを上回る効果が極小であった（ＯＣＩ／ＡＭＬ５）。
【００９４】
標的細胞上のＦｃレセプター発現が減少する実験をさらに考案した。詳細には、ＫＨＹＧ−１細胞傷害性の抗体介在性増強の標的ＣＤ３２依存性を決定するために、Ｒ−ＡＤＣＣが原因機構となる証拠として、ＣＤ３２の３つの遺伝子アイソフォーム（ａ、ｂおよびｃ）のｓｉＲＮＡノックダウンの使用を試みた。ＯＣＩ／ＡＭＬ５細胞株で完全なＣＤ３２のノックダウンを達成することができなかったが、細胞ソートを用いて、カルセイン細胞傷害性アッセイにおいて引き続き試験するためにＣＤ３２  ｌｏｗ  ＯＣＩ／ＡＭＬ５集団を得ることができた。
【００９５】
ソートなしのＯＣＩ／ＡＭＬ５標的は、それらが０．１ｕｇ／ｍｌの抗ＮＫｐ３０抗体で前処理されない限り、ＫＨＹＧ−１細胞に対して耐性であった。１０：１のエフェクター：標的比にて高度の細胞傷害性を生じ、これは、ＮＫ感受性Ｋ５６２細胞株に近似する。ＣＤ３２  ｌｏｗ  ＯＣＩ／ＡＭＬ５は抗ＮＫｐ３０前処理ＫＨＹＧ−１細胞に対して感受性であったが、増強の程度はソートなしのＯＣＩ／ＡＭＬ５よりも１２％低かった（ｐ＝０．０２）（図１３）。
【００９６】
この培養環境の状況において、ＮＫ細胞は標的癌細胞と共に局在化され、これは、非常に有意な効果であり、細胞傷害性の増強が標的上のＦｃγレセプターＩＩ（ＣＤ３２）発現に依存することを示しており、ＫＨＹＧ−１細胞の抗体増強細胞傷害性の機構としてＲ−ＡＤＣＣをさらに支持する。
【００９７】
したがって、増強の機構はＲ−ＡＤＣＣであって、共活性化、共刺激または他の効果ではないことが決定された。このように、本明細書中の研究全体に基づいて治療開発の進展が可能となった。
【００９８】
（考察）
ここで、ウシ胎児血清を欠きかつ今後の臨床適用に適し得る臨床グレード培地（ＧＭ１）を使用し、ＫＨＹＧ−１を用いた全ての実験を行った。初代ＡＭＬに対するＫＨＹＧ−１細胞傷害性は以前に報告されていなかった。白血病細胞株および初代ＡＭＬ試料の両方の殺傷で、ＫＨＹＧ−１が抗体なしではＮＫ−９２よりも有効でなかったことに留意した。
【００９９】
ＮＫ細胞の細胞傷害性と通常関連した活性化レセプターパネル（天然細胞傷害性レセプターＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ−１）に対する抗体でＮＫ−９２およびＫＨＹＧ−１を前処理する効果を決定することを試みた。１０μｇ／ｍｌで、白血病細胞株標的パネルに対する細胞傷害性をブロックする可能性を予想したが、抗体のいくつかから細胞傷害性の刺激を観察し、細胞傷害性のブロックは見られなかった。ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６に対する抗体でのＮＫ−９２の処理は、Ｋ５６２の殺傷を約１０％増大したが、抗ＮＫｐ３０処理のみがＫＧ１ａおよびＯＣＩ／ＡＭＬ５の殺傷を増強した。さらに、抗ＮＫｐ３０前処理ＮＫ−９２は、初代ＡＭＬの殺傷を大きく増強したが、抗ＮＫｐ４４前処理ＮＫ−９２ではこのような増強はなかった。
【０１００】
ＨＴＳフローサイトメトリーは、ＮＫ−９２と比較してＫＨＹＧ−１上で、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６のより高い発現を示した。これらの天然細胞傷害性レセプターの全てに対するそれぞれの抗体でのＫＨＹＧ−１の処理が、ＮＫ−９２よりも大きな割合で、Ｋ５６２およびＯＣＩ／ＡＭＬ５の殺傷を増大した。初代ＡＭＬに対するＫＨＹＧ−１細胞傷害性は、抗ＮＫｐ３０または抗ＮＫｐ４４での前処理を行ったＮＫ−９２よりも大きく増強された。ＤＮＡＭ−１、ＮＫＧ２Ｄ（両方とも、ＮＫ細胞認識に通常関与する）に対する抗体でのＮＫ細胞株の前処理は、いくつかの実験において標的Ｋ５６２に対する小さな統計学的に有意な阻害効果を誘導した。これは、認識におけるこれらの分子の可能性がある役割を示している。しかし、抗ＤＮＡＭ−１および抗ＮＫＧ２Ｄは、両細胞株上のＤＮＡＭ−１およびＮＫＧ２Ｄの高発現に関わらず、逆ＡＤＣＣを促進することはできなかった。
【０１０１】
抗体介在性細胞傷害性増強の投与量応答曲線を決定することを試みたところ、これは、ＯＣＩ／ＡＭＬ５に対するＫＨＹＧ−１を用いて最も著しかった。ＯＣＩ／ＡＭＬ５に対するＫＨＹＧ−１細胞傷害性の増加は、０．０１μｇ／ｍｌ程度の低さで見られた。これは、この刺激効果のＥＣ５０に近い。０．１μｇ／ｍｌで増強のプラトーが生じ始め、１μｇ／ｍｌで効力の増大はわずかであった。このアプローチではＮＫ−９２はＫＨＹＧ−１より増強が少ないが、特にＯＣＩ／ＡＭＬ３に対して、０．０１μｇ／ｍｌ投与量範囲で効果が観察され得た。これは、ＮＫ−９２細胞傷害性に対していくぶん耐性である。
【０１０２】
用いた抗体は、内因性ＮＫ細胞の細胞傷害性の研究（Markel, Seidmanら、2009）に基づき、ブロッキング抗体として報告されていた。これは、観察された結果と不一致である。抗ＮＫｐ３０（Ｐ３０−１５）クローンおよびアイソタイプコントロール（ＭＧ１−４５）のＦａｂフラグメントを作製した。ＫＨＹＧ−１を抗ＮＫｐ３０およびアイソタイプコントロールの全抗体または各々のＦａｂフラグメントでプレコートし、その後、Ｋ５６２、ＫＧ１およびＯＣＩ／ＡＭＬ５標的と共インキュベートした。抗ＮＫｐ３０抗体のみが、これらの３つの細胞株に対する細胞傷害性を有意に増強することができた。
【０１０３】
さらに、ＣＤ３２の低発現についてＯＣＩ／ＡＭＬ５標的細胞の集団を選択し、その後、抗ＮＫｐ３０抗体でプレコートしたＫＨＹＧ−１細胞と共培養した。抗ＮＫｐ３０コートしたＫＨＹＧ−１細胞がＣＤ３２ｌｏｗＯＣＩ／ＡＭＬ５標的細胞を殺傷する能力は、高レベルのＣＤ３２を発現するソートなしのＯＣＩ／ＡＭＬ５細胞群と比較した場合に有意に低下していた。
【０１０４】
これらの予期されなかったが有利な結果は、細胞傷害性の増大が逆ＡＤＣＣを介するものであったことを示す。
【０１０５】
Ｒ−ＡＤＣＣ機構が観察された細胞傷害性の増大を担うことは、Ｆｃレセプターを発現しないかまたは低レベルで発現することが知られている４つの食道細胞株が、抗ＮＫｐ３０抗体または抗ＮＫｐ４４抗体のいずれかでプレコートしたＫＨＹＧ−１細胞での処理に対して反応しなかったという結果から、さらに確認された。
【０１０６】
したがって、本発明は、ＮＫ細胞株細胞傷害性（実施例においては白血病細胞株、およびより重要には初代ＡＭＬ細胞に対する）を増強する手段であるが、より広範な適用の手段としても、Ｒ−ＡＤＣＣを用いる。
【０１０７】
次いで、抗ＮＫｐ３０および抗ＮＫｐ４４でのＮＫ細胞株の前処理の増強効果が、我々が確立したメチルセルロース細胞傷害性アッセイを用いてクローン原性細胞に対して保持されるかを決定することを試みた。ＮＫ−９２がＯＣＩ／ＡＭＬ５コロニー形成の阻害に比較的有効であったが、これは、抗ＮＫｐ３０での前処理によりアイソタイプコントロールよりも増強され得なかったことに留意した。しかし、ＫＨＹＧ−１は、単独ではＯＣＩ／ＡＭＬ５コロニー形成の阻害に、より有効でなかったが、これは、抗ＮＫｐ３０抗体での前処理により３倍増強することができた。このコロニーの阻害は、白血病幹細胞および前駆細胞を代表する細胞株集団内のクローン原性細胞に関する細胞傷害または細胞増殖抑制の効果を示す。したがって、これは、逆ＡＤＣＣが白血病幹細胞に対する細胞傷害性を促進する証拠を提供した。
【０１０８】
インビボでのＮＫ細胞株治療の影響を評価するために、ＮＳＧマウスにおけるＯＣＩ／ＡＭＬ５異種移植モデルを確立した。ＯＣＩ／ＡＭＬ５は、Ｍ４白血病患者に由来したが、これは、ＣＤ３３を高発現し、インビボでの追跡に有用である（Wang, Koistinenら、1991）。ＯＣＩ／ＡＭＬ５の静脈内（ｉｖ）注射が、脾腫および骨髄生着を伴う白血病を生じたことを確認した。しかし、腹腔内（ｉｐ）注射は、通常の白血病よりむしろ、より長い時間枠にわたって進行性悪性腹水を引き起こす傾向にあった。
【０１０９】
インビボ増殖に関するインビトロでの細胞傷害性の効果を決定するために、（抗ＮＫｐ３０前処理あり／なしでの）ｉＫＨＹＧ−１ありまたはなしでＯＣＩ／ＡＭＬ５をインキュベートし、そしてこの細胞を腹腔内（ｉｐ）注射した。この注射経路を静脈内（ｉｖ）の代わりに利用した。細胞量が多く（２×１０６のＯＣＩ／ＡＭＬ５＋２０×１０６の生存ｉＫＨＹＧ−１＋約３×１０６の非生存ｉＫＨＹＧ−１）かつＫＨＹＧ−１細胞が比較的大きいことから、尾静脈を介して注射するとマウスの肺にストレスを引き起こし得たためである。ｉＫＨＹＧ−１との共インキュベーションでは影響がなかったが、抗ＮＫｐ３０前処理ｉＫＨＹＧ−１は、生存期間中央値を１０日延ばした。
【０１１０】
引き続き、静脈内（ｉｖ）注射ＯＣＩ／ＡＭＬ５  ＮＳＧ異種移植モデルを利用し、抗ＮＫｐ３０前処理ありまたはなしでのｉＫＨＹＧ−１の治療効力を試験した。予期されないことに、ｉＫＨＹＧ−１は、バルクのＯＣＩ／ＡＭＬ５に対し、ＣＲＡでの細胞傷害性が低いにもかかわらず、生存期間中央値を３５日延ばすことができた。しかし、ＫＨＹＧ−１は、この発見のいくつかの根拠を提供するＣＲＡにより決定されたように、バルクのＯＣＩ／ＡＭＬ５よりもクローン原性ＯＣＩ／ＡＭＬ５に対する細胞傷害性が３倍良好であった。これは、インビボ癌モデルにおけるＫＨＹＧ−１による効力の最初の実証であり、放射線照射細胞が持続し得、腫瘍量を低減させ得ることを確認する。これはまた、放射線照射細胞がインビボで機能し得ることの最初の証拠でもある。次いで、初代ＡＭＬ異種移植モデルを用いてｉＫＨＹＧ−１および抗ＮＫｐ３０  ｉＫＨＹＧ−１を試験し、ｉＫＨＹＧ−１は効力を欠くが、抗ＮＫｐ３０  ｉＫＨＹＧ−１処理群では生存が向上する傾向があることを示した。
【０１１１】
まとめると、ＮＫ−９２およびＫＨＹＧ−１が広範な白血病標的に対する細胞傷害性を有することを示した。これは、抗ＮＫｐ３０抗体および抗ＮＫｐ４４抗体により数倍増強され得る。ＫＨＹＧ−１について、癌細胞殺傷は、標的細胞上のＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）と抗体でコートしたエフェクターとの相互作用を介するＲ−ＡＤＣＣを介して達成された。さらに、ＮＫ細胞表面マーカーに対する抗体は、クローン原性白血病細胞（癌幹細胞）に対するＫＨＹＧ−１の細胞傷害性を増強し、白血病のインビボ増殖を低減した。
【０１１２】
したがって、本発明は、Ｒ−ＡＤＣＣを介する、抗体、ＮＫ細胞、またはこれら両方の組み合わせを用いる腫瘍の治療のための方法、使用および組成物を提供する。
【０１１３】
（追加の文献）
Notter, M., W. D. Ludwigら、(1993).「Selective targeting of human lymphokine-activated killer cells by CD3 monoclonal antibody against the interferon-inducible high-affinity Fc gamma RI receptor (CD64) on autologous acute myeloid leukemic blast cells.」Blood 82(10): 3113-3124.
Pende, D., S. Paroliniら、(1999).「Identification and molecular characterization of NKp30, a novel triggering receptor involved in natural cytotoxicity mediated by human natural killer cells.」Journal of Experimental Medicine 190(10): 1505-1516.
Saxena, R. K., Q. B. Saxenaら、(1982).「Identity of effector cells participating in the reverse antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity.」Immunology 46(2): 459-464.
Lee, H. W.ら、(2014).「Evaluation of therapeutic effects of natural killer (NK) cell-based immunotherapy in mice using in vivo apoptosis bioimaging with a caspace-3 sensor.」The FASEB Journal 28(7):2932-2941.
Jing, Y.ら、(2015). 「Identification of an ADAM17 cleavage region in human CD16 (Fc[gamma]RIII) and the engineering of a non-cleavable version of the receptor in NK cells.」PLOS One 10(3):e0121788.
Ferlazzo, G.ら、(2002).「Human dendritic cells activate resting natural killer (NK) cells and are recognized via the NKp30 receptor by anctivated NK cells.」195(3):343-351.
Williams, B.A. (2010).「Clonogenic assays measure leukemia stem cell killing not dectectable by chromium release and flow cytometric cytotoxicity assays.」Cytotherapy 12(7):951-960.
Arnon, T.I.ら、(2008).「Harnessing soluble NK cell killer receptors for the generation of novel cancer immune therapy.」PLOS One 3(5):e2150.
Williams, B. (2010).「NK-92 preferentially targets acute myeloid leukemia stem cells.」Blood 116(21):1745.
Suck, G.ら、(2006).「Irradiated KHYG-1 retains cytotoxicity: potential for adoptive immunotherapy with a natural killer cell line.」International Journal of Radiation Biology 82(5):355-361.
Swift, B.ら、(2012).「Natural killer cell lines preferentially kill clonogenic multiple myeloma cells and decrease myeloma engraftment in a bioluminescent xenograft mouse model.」Haematologica-The Hematology Journal 97(7):1020-1028.
Kobayashi, E.ら、(2014).「Antibody-dependent cellular cytotoxicity and cytokine/chemokine secretion by KHYG-1 cells stably expressing Fc[gamma]RIIIA.」 Immunology Letters 161(1):59-64.
Grier, J.T.ら、(2012).「Human immunodeficiency-causing mutation defines CD16 in spontaneous NK cell cytotoxicity.」Journal of Clinical Investigation 122(10):3769-3780.
Deng, X. (2014).「Ex vivo-expanded natural killer cells kill cancer cells more effectively than ex vivo-expanded [gamma] [delta] T cells.」International Immunopharmacology 22(2):486-491.
Muller, T.ら、(2014).「Allogeneic and xenogeneic anti-tumor effect of callithrix jacchus natural killer cells is dependent on KNp30 and B7-H6 interaction. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents 28(2):183-193.
Swift, B.ら、(2011).「Efficacy of NK-92 against human multiple myeloma in a NOD/SCID gamma null mouse model.」 Blood 118(21):807.
【図１】
2018516881.tif 000005
【図２】
2018516881.tif 000006
【図３】
2018516881.tif 000007
【図４】
2018516881.tif 000008
【図５】
2018516881.tif 000009
【図６】
2018516881.tif 000010
【図７】
2018516881.tif 000011
【図８】
2018516881.tif 000012
【図９】
2018516881.tif 000013
【図１０】
2018516881.tif 000014
【図１１】
2018516881.tif 000015
【図１２】
2018516881.tif 000016
【図１３】
2018516881.tif 000017
【国際調査報告】
2018516881.tif 000018
2018516881.tif 000019
2018516881.tif 000020
2018516881.tif 000021