(57)【要約】ヒトにおけるパーキンソン病の処置および/または予防のための方法および組成物が提供される。具体的には、（a）少なくとも3％のドーパミン作動性ニューロンを含む細胞集団であって、ドーパミン作動性ニューロンが、FOXA2、β-チューブリン、およびチロシンヒドロキシラーゼ（TH）を発現する、細胞集団と、（b）神経栄養因子と、（c）薬学的に許容される担体とを含む、組成物；ならびに、患者自身の細胞に由来するドーパミン作動性ニューロンを含む組成物を投与または移植する段階を含む、パーキンソン病の処置および/または予防のための方法である。2018506559.tif 000005
2018506559.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）少なくとも3％のドーパミン作動性ニューロンを含む細胞集団であって、該ドーパミン作動性ニューロンが、FOXA2、β-チューブリン、およびチロシンヒドロキシラーゼ（TH）を発現する、細胞集団；
（b）神経栄養因子；ならびに
（c）薬学的に許容される担体
を含む、パーキンソン病の処置および/または予防のための組成物。
【請求項２】
神経栄養因子が、グリア細胞系由来神経栄養因子（GDNF）、ニュールツリン（NRTN）、アルテミン（ARTN）、およびパーセフィン（PSPN）からなる群より選択される、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
神経栄養因子が、GDNFである、請求項1または2記載の組成物。
【請求項４】
細胞集団が、少なくとも20％のドーパミン作動性ニューロンを含む、請求項1、2、または3記載の組成物。
【請求項５】
細胞集団が、4〜40％のドーパミン作動性ニューロンを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６】
細胞集団が、奇形腫形成細胞を含まない、請求項1〜5のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７】
奇形腫形成細胞が、TRA60および/またはSSEAを発現する、請求項1〜6のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８】
薬学的に許容される担体が、人工脳脊髄液である、請求項1〜7のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
ドーパミン作動性ニューロンが、分裂終了細胞である、請求項1〜8のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０】
体積が1 mL未満である、請求項1〜9のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１１】
細胞集団が、少なくとも10,000個のドーパミン作動性ニューロンを含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２】
異種成分不含有である、請求項1〜11のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１３】
ドーパミン作動性ニューロンが、フットプリント不含有である、請求項1〜12のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１４】
ドーパミン作動性ニューロンが、Gタンパク質内向き整流性カリウムチャネル（GIRK）-2をさらに発現する、請求項1〜13のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１５】
請求項1記載の組成物を、それを必要とする対象の尾状核、被殻、側坐核、または視床下核に投与し、それにより、パーキンソン病を処置および/または予防する段階
を含む、パーキンソン病を処置および/または予防するための方法。
【請求項１６】
組成物が、被殻に投与される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
組成物が、両側性に投与される、請求項15または16記載の方法。
【請求項１８】
組成物が、定位的注入を使用して投与される、請求項15、16、または17記載の方法。
【請求項１９】
対象が、パーキンソン病を有すると診断されている、および/またはポジトロン放出断層撮影（PET）スキャニングによって移植後にモニターされる、請求項15〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
統一パーキンソン病評価尺度（UPRDS）を使用して、成功した移植について対象が診断またはモニターされる、請求項15〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
対象がヒトである、請求項15〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
方法が繰り返される、請求項15〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
対象がパーキンソン病の症状を実質的に有さなくなるまで、方法が繰り返される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
被殻において通常観察される機能的ドーパミン作動性シナプスの少なくとも60％を回復させる、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
症状の十分な臨床的制御を達成するために、対象が必要とするL-ドパの用量を減少させる、請求項15〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
（a）パーキンソン病の症状を制御するために、L-ドパを受容している対象の尾状核、被殻、側坐核、または視床下核に請求項1記載の組成物を投与する段階；
（b）ドーパミン作動性ニューロンの生着および/またはL-ドパに関連する副作用について対象をモニターする段階；ならびに
（c）パーキンソン病の症状の十分な臨床的制御を維持しながらL-ドパに関連する副作用を減少させるために、必要とされるL-ドパの用量を減少させるかまたは除去する段階
を含む、症状の十分な臨床的制御を達成するために、パーキンソン病患者が必要とするL-ドパの用量を減少させるための方法。
【請求項２７】
図10に概略される段階を含む、パーキンソン病を処置および/または予防する方法。
【請求項２８】
（a）対象から得られた体細胞をiPS細胞にリプログラミングする段階；
（b）iPS細胞のドーパミン作動性ニューロンへの分化を促進するために、iPS細胞を、レチノイン酸、ヒトSHH、およびFGF8Aに接触させる段階であって、該ドーパミン作動性ニューロンが、FOXA2、β-チューブリン、およびチロシンヒドロキシラーゼを発現する、段階；ならびに
（c）奇形腫形成細胞である段階（b）の細胞集団を除去する段階
を含む、方法。
【請求項２９】
段階（c）の細胞集団が、FOXA2、β-チューブリン、およびチロシンヒドロキシラーゼを発現する少なくとも4％のドーパミン作動性ニューロンを含む、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
ドーパミン作動性ニューロンが、GIRK2をさらに発現する、請求項28または29記載の方法。
【請求項３１】
TRA160および/またはSSEAを発現する細胞を除くことによって、段階（b）の細胞集団から奇形腫形成細胞が除去される、請求項28、29、または30記載の方法。
【請求項３２】
体細胞が、末梢血単核細胞（PBMC）または線維芽細胞である、請求項28〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
段階（b）または段階（c）の細胞集団を凍結および解凍する段階をさらに含む、請求項28〜32のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
段階（c）の除去後の培養物を薬学的に許容される担体と混合する段階をさらに含む、請求項28〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
パーキンソン病の処置および/または予防のための、請求項1〜14のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2015年2月26日付けで出願された米国特許仮出願第62/121,333号の35 U.S.C.119条（e）に基づく恩典を主張するものであり、その内容は、参照として本明細書に全体が組み入れられる。
【０００２】
開示の分野
本開示は、パーキンソン病の処置および/または予防における細胞組成物およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
パーキンソン病、アルツハイマー病、およびハンチントン病などの神経変性障害は、これまで以上に社会において目立ってきている。パーキンソン病（PD）は、運動緩慢、硬直、および静止時振戦によって臨床的に特徴付けられる進行性の神経変性疾患である。運動異常は、黒質緻密部（SN）におけるドーパミン作動性ニューロンの特異的損失および線条体ドーパミン（DA）レベルの枯渇に関連する。線条体DAの損失は、臨床的身体障害の重症度に相関するが、PDの臨床的所見は、SNニューロンの約80〜85％が変性し、線条体DAレベルが約60〜80％に枯渇するまで、明らかではない。
【０００４】
腹側中脳におけるDAニューロンは、2つの主要な群：SNにおけるA9群、ならびに内側および腹側の被蓋におけるA10群からなる。これらの細胞群の各々は、異なる解剖学的構造に投射し、異なる機能に関与する。A9細胞は、主に背外側の線条体に投射し、運動機能の制御に関与するが、A10細胞は、腹内側の線条体、辺縁系、および皮質領との関連性を提供し、報酬および情動行動に関与する。異なる軸索投射およびシナプス結合性における相違に加え、これらの群のDA細胞は、類似の神経伝達物質アイデンティティーにもかかわらず、機能的相違を説明する神経化学および電気生理学的性質における相違を示す。A9細胞およびA10細胞におけるこれらの相違はまた、PDにおける神経変性に対する特異的な反応に反映される。ヒトPD脳における死後解析は、約10％の生存率を有するA9群の選択的な細胞損失に対して、A10群は約60％の生存率を有する広い残存を示す。これは、A9細胞がPDにおける変性を生じる内因子および/または外因子に対してより脆弱性であることを示す。加えて、背腹側/吻側尾側/内外方向の軸における神経変性の3つの領域的勾配が、PDにおいて報告されている。A9亜群内の尾側および外側に位置する腹側DA細胞は、PDにおいて最も脆弱性の細胞である。対照的に、A10細胞内のDA細胞亜群の内側および吻側の部分（すなわち、吻側線状核、RLi）が受ける影響は最小である（5〜25％の細胞損失）。
【０００５】
細胞移植療法は、パーキンソン病を含む神経変性疾患を処置するために使用されており、ある程度成功している（例えば、Bjorklund et al., Nat. Neurosci., 3:537-544, 2000（非特許文献1））。しかし、細胞ベースの治療の広範な適用は、十分な量の神経細胞の利用可能性によるであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Bjorklund et al., Nat. Neurosci., 3:537-544, 2000
【発明の概要】
【０００７】
概要
本明細書において、患者自身の細胞に由来するドーパミン作動性ニューロンを含む組成物を投与または移植することによる、パーキンソン病の処置および/または予防のための方法および組成物が提供される。
【０００８】
したがって、一つの局面において、パーキンソン病の処置および/または予防のための組成物であって、（a）少なくとも3％のドーパミン作動性ニューロンを含む細胞集団であって、ドーパミン作動性ニューロンが、FOXA2、β-チューブリン、およびチロシンヒドロキシラーゼ（TH）を発現する、細胞集団；（b）神経栄養因子；ならびに（c）薬学的に許容される担体を含む、組成物が、本明細書において提供される。
【０００９】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の一つの態様において、神経栄養因子は、グリア細胞系由来神経栄養因子（GDNF）、ニュールツリン（NRTN）、アルテミン（ARTN）、およびパーセフィン（PSPN）からなる群より選択される。
【００１０】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、神経栄養因子は、GDNFである。
【００１１】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、細胞集団は、少なくとも20％のドーパミン作動性ニューロンを含む。
【００１２】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、細胞集団は、4〜40％のドーパミン作動性ニューロンを含む。
【００１３】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、細胞集団は、奇形腫形成細胞を含まない。
【００１４】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、奇形腫形成細胞は、TRA60および/またはSSEAを発現する。
【００１５】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、薬学的に許容される担体は、人工脳脊髄液である。
【００１６】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、ドーパミン作動性ニューロンは、分裂終了細胞である。
【００１７】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、組成物の体積は、1 mL未満である。
【００１８】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、細胞集団は、少なくとも10,000個のドーパミン作動性ニューロンを含む。
【００１９】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、組成物は、異種成分不含有である。
【００２０】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、ドーパミン作動性ニューロンは、フットプリント不含有である。
【００２１】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、ドーパミン作動性ニューロンは、Gタンパク質内向き整流性カリウムチャネル（GIRK）-2をさらに発現する。
【００２２】
本明細書に提供される別の局面は、本明細書に記載の組成物を、それを必要とする対象の尾状核、被殻、側坐核、または視床下核に投与し、それにより、パーキンソン病を処置および/または予防する段階を含む、パーキンソン病を処置および/または予防するための方法に関する。
【００２３】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の一つの態様において、組成物は被殻に投与される。
【００２４】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、組成物は両側性に投与される。
【００２５】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、組成物は、定位的注入を使用して投与される。
【００２６】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、対象は、パーキンソン病を有すると診断されている、および/またはポジトロン放出断層撮影（PET）スキャニングによって移植後にモニターされる。
【００２７】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、統一パーキンソン病評価尺度（UPRDS）を使用して、対象は、成功した移植について診断またはモニターされる。
【００２８】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、対象はヒトである。
【００２９】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、方法は繰り返される。
【００３０】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、対象がパーキンソン病の症状を実質的に有さなくなるまで、方法は繰り返される。
【００３１】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、方法は、機能的ニューロンの数を、被殻において通常観察される機能的ドーパミン作動性シナプスの少なくとも60％に回復させる。
【００３２】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、方法は、症状の十分な臨床的制御を達成するために、対象が必要とするL-ドパの用量を減少させる。
【００３３】
本明細書に提供される別の局面は、症状の十分な臨床的制御を達成するために、パーキンソン病患者が必要とするL-ドパの用量を減少させるための方法であって、（a）パーキンソン病の症状を制御するために、L-ドパを受容している対象の尾状核、被殻、側坐核、または視床下核に本明細書に記載の組成物を投与する段階；（b）ドーパミン作動性ニューロンの生着および/またはL-ドパに関連する副作用について対象をモニターする段階；ならびに（c）パーキンソン病の症状の十分な臨床的制御を維持しながらL-ドパに関連する副作用を減少させるために、必要とされるL-ドパの用量を減少させるかまたは除去する段階を含む、方法に関する。
【００３４】
本明細書に提供される別の局面は、図10に概略される段階を含む、パーキンソン病を処置および/または予防する方法に関する。
【００３５】
本明細書に提供される別の局面は、（a）対象から得られた体細胞をiPS細胞にリプログラミングする段階；（b）iPS細胞のドーパミン作動性ニューロンへの分化を促進するために、iPS細胞を、レチノイン酸、ヒトSHH、およびFGF8Aに接触させる段階であって、ドーパミン作動性ニューロンが、FOXA2、β-チューブリン、およびチロシンヒドロキシラーゼを発現する、段階；ならびに（c）奇形腫形成細胞である段階（b）の細胞集団を除去する段階を含む、方法に関する。
【００３６】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、移植組成物は、FOXA2、β-チューブリン、およびチロシンヒドロキシラーゼを発現する少なくとも4％のドーパミン作動性ニューロンを含む。
【００３７】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、ドーパミン作動性ニューロンは、GIRK2をさらに発現する。
【００３８】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、奇形腫形成細胞は、TRA160および/またはSSEAを発現する細胞を除くことによって、段階（b）の細胞集団から除去される。
【００３９】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、体細胞は、末梢血単核細胞（PBMC）または線維芽細胞である。
【００４０】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、方法は、段階（b）または段階（c）の細胞集団を凍結および解凍する段階をさらに含む。
【００４１】
本明細書に提供されるこの局面および全ての他の局面の別の態様において、方法は、段階（c）の除去後の培養物を薬学的に許容される担体と混合する段階をさらに含む。
【００４２】
本明細書に提供される別の局面は、パーキンソン病の処置および/または予防のための、本明細書に記載の組成物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】パーキンソン病を処置するための例示的方法の略図である。
【図２Ａ】図2A〜2E、CM iPSC由来のドーパミンニューロンの自己移植後の、PD運動症状の機能改善、ドーパミン再取り込みの増加、および移植された被殻における神経再支配。図2A、分化されたCM-iPSCを、安定な両側性パーキンソニズムを有する3匹のCM（MF25-04、MF66-02、MF27-04）の被殻中に片側性に移植した。動物は、移植後1〜2年間、追跡調査された。移植後6ヶ月から、MF25-04において、全体的な昼間（午前6時から午後6時）の活性の持続的増加によって決定されるように、機能改善が観察された。非移植対照群および非生存移植片群は、それぞれ、n＝4およびn＝3の動物の平均データを表し、エラーバーはSEMを示す。
【図２Ｂ】図2A〜2E、CM iPSC由来のドーパミンニューロンの自己移植後の、PD運動症状の機能改善、ドーパミン再取り込みの増加、および移植された被殻における神経再支配。図2B、MF25-04における微細な運動技能は、コンピュータ化された到達タスクMAPを使用して評価された。移植後2年で、左上肢におけるMAPパフォーマンスは、移植前の値と比較して、有意に改善された（p＜0.05、一元配置ANOVAの後、Tukeyの多重比較試験）。右上肢におけるパフォーマンスの変化は、観察されなかった。示されたデータは、5回の繰り返し試験の平均（ベースライン）、2回の繰り返し試験の平均（移植後1年）、および3回の繰り返し試験の平均（移植後2年）を表す。エラーバーはSEMを表す。
【図２Ｃ】図2A〜2E、CM iPSC由来のドーパミンニューロンの自己移植後の、PD運動症状の機能改善、ドーパミン再取り込みの増加、および移植された被殻における神経再支配。図2C、MF25-04におけるドーパミン再取り込みの機能解析は、DATのマーカーである11C-CFTに対するPET神経画像化によって測定された。11C-CFT結合の増加は、移植後2年で、移植された被殻において観察された。白矢印は、高強度のCFT PETシグナルの領域を示す。
【図２Ｄ】図2A〜2E、CM iPSC由来のドーパミンニューロンの自己移植後の、PD運動症状の機能改善、ドーパミン再取り込みの増加、および移植された被殻における神経再支配。図2D、MF25-04における移植された被殻（右、R）および非移植被殻（左、L）における、DAT免疫染色の弱拡大顕微鏡写真は、移植された側の神経再支配を示す。移植されたドーパミンニューロンの沈着は、四角（g）で示される。IC、内包；LGP、外側の淡蒼球；LV、側脳室；3V、第三脳室；cc、脳梁。
【図２Ｅ】図2A〜2E、CM iPSC由来のドーパミンニューロンの自己移植後の、PD運動症状の機能改善、ドーパミン再取り込みの増加、および移植された被殻における神経再支配。図2E、移植されたドーパミンニューロンはまた、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）を使用して標識された。四角で囲まれた領域は、右図において高い拡大率で示される。宿主被殻中への伸長組み込みを伴うドーパミンニューロンの強い生存が観察された。
【図３Ａ】図3A〜3H、自己移植後2年での生着したCM iPSC由来のニューロンの表現型の、死後の免疫組織化学解析を使用して、MF25-04における移植片をさらに特徴付けた。図3A、免疫蛍光染色により、移植されたドーパミンニューロンが、移植後2年で、FOXA2、TH、およびbIIIチューブリンに対して同時標識されたことが確認された。
【図３Ｂ】図3A〜3H、自己移植後2年での生着したCM iPSC由来のニューロンの表現型の、死後の免疫組織化学解析を使用して、MF25-04における移植片をさらに特徴付けた。図3B、DAT、TH、およびTOM20（ミトコンドリア外膜タンパク質）に対する標識は、移植されたドーパミンニューロンの線維に沿ったDATの点状の発現、ならびに細胞体および神経突起の至る所のミトコンドリアの典型的局在を示した。
【図３Ｃ】図3A〜3H、自己移植後2年での生着したCM iPSC由来のニューロンの表現型の、死後の免疫組織化学解析を使用して、MF25-04における移植片をさらに特徴付けた。図3C、5-HTに対する免疫蛍光染色は、移植片内のセロトニン作動性ニューロンの存在および局在を示した。
【図３Ｄ】図3A〜3H、自己移植後2年での生着したCM iPSC由来のニューロンの表現型の、死後の免疫組織化学解析を使用して、MF25-04における移植片をさらに特徴付けた。図3D、線条体GABA作動性中型有棘ニューロンのマーカーであるDARPP-32に対する標識は、宿主被殻、および移植片-宿主境界のところどころのDARPP-32-ir線維において、強い標識を示す。
【図３Ｅ】図3A〜3H、自己移植後2年での生着したCM iPSC由来のニューロンの表現型の、死後の免疫組織化学解析を使用して、MF25-04における移植片をさらに特徴付けた。図3E、Ki-67を使用して、MF25-04からのCM-iPSC由来の神経細胞移植片に増殖性細胞が存在するかどうかを決定した。Ki-67-免疫反応性細胞は、移植片中で観察されなかった。
【図３Ｆ】図3A〜3H、自己移植後2年での生着したCM iPSC由来のニューロンの表現型の、死後の免疫組織化学解析を使用して、MF25-04における移植片をさらに特徴付けた。図3F、Ki-67を使用して、MF25-04からのCM-iPSC由来の神経細胞移植片に増殖性細胞が存在するかどうかを決定した。陽性対照として、同動物の海馬においていくつかのKi-67免疫反応性増殖性細胞が観察された（矢印で識別される）。
【図３Ｇ】図3A〜3H、自己移植後2年での生着したCM iPSC由来のニューロンの表現型の、死後の免疫組織化学解析を使用して、MF25-04における移植片をさらに特徴付けた。図3G、宿主被殻におけるIba1を使用したミクログリアの組織学的解析は、典型的な静止ミクログリアを示す。
【図３Ｈ】図3A〜3H、自己移植後2年での生着したCM iPSC由来のニューロンの表現型の、死後の免疫組織化学解析を使用して、MF25-04における移植片をさらに特徴付けた。図3H、移植片におけるIba1を使用したミクログリアの組織学的解析は、典型的な静止ミクログリアを示す。
【図４Ａ】図4A〜4E、CM iPSCからのドーパミンニューロンの生成。図4A、FOXA2ドーパミンニューロンへの細胞の底板領域形成を支持する確立された分化プロトコールを使用して、MF25-04からのCM iPSCを中脳様ドーパミンニューロンへと分化した（Cooper et al., 2010）。
【図４Ｂ】図4A〜4E、CM iPSCからのドーパミンニューロンの生成。図4B〜4E、インビトロで49日目（DIV49）における分化されたニューロンのインビボでの移植に先立って、DIV47に、免疫細胞化学を使用して、βIII-チューブリン、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）、およびFOXA2に対して標識されたニューロンのパーセンテージを決定した。
【図４Ｃ】図4A〜4E、CM iPSCからのドーパミンニューロンの生成。図4B〜4E、インビトロで49日目（DIV49）における分化されたニューロンのインビボでの移植に先立って、DIV47に、免疫細胞化学を使用して、βIII-チューブリン、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）、およびFOXA2に対して標識されたニューロンのパーセンテージを決定した。
【図４Ｄ】図4A〜4E、CM iPSCからのドーパミンニューロンの生成。図4B〜4E、インビトロで49日目（DIV49）における分化されたニューロンのインビボでの移植に先立って、DIV47に、免疫細胞化学を使用して、βIII-チューブリン、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）、およびFOXA2に対して標識されたニューロンのパーセンテージを決定した。
【図４Ｅ】図4A〜4E、CM iPSCからのドーパミンニューロンの生成。図4B〜4E、インビトロで49日目（DIV49）における分化されたニューロンのインビボでの移植に先立って、DIV47に、免疫細胞化学を使用して、βIII-チューブリン、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）、およびFOXA2に対して標識されたニューロンのパーセンテージを決定した。
【図５Ａ】図5A〜5I、CM iPSC由来のドーパミンニューロンの自己移植後の宿主被殻のドーパミン作動性の神経再支配、ならびにMF27-04およびMF66-02におけるCM iPSC由来の移植片ならびに非生存移植片におけるIba1-irミクログリア。図5A〜5C、THに対する免疫蛍光染色は、CM iPSC由来の神経細胞の自己移植の後、MF25-04の移植された被殻における宿主被殻の広範なドーパミン作動性の神経支配を示し、MF27-04（図5B）およびMF66-02（図5C）では神経支配は比較的少なかった。挿入画像は、対側（非移植側）の被殻の比較領域におけるTH標識を示す。側脳室（LV）。
【図５Ｂ】図5A〜5I、CM iPSC由来のドーパミンニューロンの自己移植後の宿主被殻のドーパミン作動性の神経再支配、ならびにMF27-04およびMF66-02におけるCM iPSC由来の移植片ならびに非生存移植片におけるIba1-irミクログリア。図5A〜5C、THに対する免疫蛍光染色は、CM iPSC由来の神経細胞の自己移植の後、MF25-04の移植された被殻における宿主被殻の広範なドーパミン作動性の神経支配を示し、MF27-04（図5B）およびMF66-02（図5C）では神経支配は比較的少なかった。挿入画像は、対側（非移植側）の被殻の比較領域におけるTH標識を示す。側脳室（LV）。
【図５Ｃ】図5A〜5I、CM iPSC由来のドーパミンニューロンの自己移植後の宿主被殻のドーパミン作動性の神経再支配、ならびにMF27-04およびMF66-02におけるCM iPSC由来の移植片ならびに非生存移植片におけるIba1-irミクログリア。図5A〜5C、THに対する免疫蛍光染色は、CM iPSC由来の神経細胞の自己移植の後、MF25-04の移植された被殻における宿主被殻の広範なドーパミン作動性の神経支配を示し、MF27-04（図5B）およびMF66-02（図5C）では神経支配は比較的少なかった。挿入画像は、対側（非移植側）の被殻の比較領域におけるTH標識を示す。側脳室（LV）。
【図５Ｄ】図5A〜5I、CM iPSC由来のドーパミンニューロンの自己移植後の宿主被殻のドーパミン作動性の神経再支配、ならびにMF27-04およびMF66-02におけるCM iPSC由来の移植片ならびに非生存移植片におけるIba1-irミクログリア。図5D〜5F、FOXA2およびTHに対する免疫蛍光染色は、MF27-04 （図5E）およびMF66-02（図5F）における移植片と比較して、MF25-04（図5D）の移植片において、より多くの数の移植されたドーパミンニューロンがFOXA2およびTHに対して同時標識されたことを示した。FOXA2/TH同時標識ニューロンの例は、星印を使用して識別される。
【図５Ｅ】図5A〜5I、CM iPSC由来のドーパミンニューロンの自己移植後の宿主被殻のドーパミン作動性の神経再支配、ならびにMF27-04およびMF66-02におけるCM iPSC由来の移植片ならびに非生存移植片におけるIba1-irミクログリア。図5D〜5F、FOXA2およびTHに対する免疫蛍光染色は、MF27-04 （図5E）およびMF66-02（図5F）における移植片と比較して、MF25-04（図5D）の移植片において、より多くの数の移植されたドーパミンニューロンがFOXA2およびTHに対して同時標識されたことを示した。FOXA2/TH同時標識ニューロンの例は、星印を使用して識別される。
【図５Ｆ】図5A〜5I、CM iPSC由来のドーパミンニューロンの自己移植後の宿主被殻のドーパミン作動性の神経再支配、ならびにMF27-04およびMF66-02におけるCM iPSC由来の移植片ならびに非生存移植片におけるIba1-irミクログリア。図5D〜5F、FOXA2およびTHに対する免疫蛍光染色は、MF27-04 （図5E）およびMF66-02（図5F）における移植片と比較して、MF25-04（図5D）の移植片において、より多くの数の移植されたドーパミンニューロンがFOXA2およびTHに対して同時標識されたことを示した。FOXA2/TH同時標識ニューロンの例は、星印を使用して識別される。
【図５Ｇ】図5A〜5I、CM iPSC由来のドーパミンニューロンの自己移植後の宿主被殻のドーパミン作動性の神経再支配、ならびにMF27-04およびMF66-02におけるCM iPSC由来の移植片ならびに非生存移植片におけるIba1-irミクログリア。図5G〜5I、被殻におけるIba1を使用したミクログリアの組織学的解析は、非生存移植片（図5G）の穿刺経路（nt）ならびにMF27-04（図5H）およびMF66-02（図5I）からのCM iPSC由来の移植片の領域において、穏やかに増加した強さのIba1染色を示す。
【図５Ｈ】図5A〜5I、CM iPSC由来のドーパミンニューロンの自己移植後の宿主被殻のドーパミン作動性の神経再支配、ならびにMF27-04およびMF66-02におけるCM iPSC由来の移植片ならびに非生存移植片におけるIba1-irミクログリア。図5G〜5I、被殻におけるIba1を使用したミクログリアの組織学的解析は、非生存移植片（図5G）の穿刺経路（nt）ならびにMF27-04（図5H）およびMF66-02（図5I）からのCM iPSC由来の移植片の領域において、穏やかに増加した強さのIba1染色を示す。
【図５Ｉ】図5A〜5I、CM iPSC由来のドーパミンニューロンの自己移植後の宿主被殻のドーパミン作動性の神経再支配、ならびにMF27-04およびMF66-02におけるCM iPSC由来の移植片ならびに非生存移植片におけるIba1-irミクログリア。図5G〜5I、被殻におけるIba1を使用したミクログリアの組織学的解析は、非生存移植片（図5G）の穿刺経路（nt）ならびにMF27-04（図5H）およびMF66-02（図5I）からのCM iPSC由来の移植片の領域において、穏やかに増加した強さのIba1染色を示す。
【図６】細胞分化の方法の概要、および試験に含まれる動物の臨床スコアの変更。CM-iPSCおよび単為発生ES細胞（Cyno-1）は、Cooper et al.（Cooper et al., 2010）、Sundberg et al.（Sundberg et al., 2013）、またはSanchez-Pernaute et al.（Sanchez-Pernaute et al., 2005）に従って分化された。試験期間は、移植後の生存時間を示す。パーキンソン病の評価尺度（PRS）は、統一パーキンソン病評価尺度（UPDRS）の運動下位尺度から改変され、マカクのために開発された（Imbert et al., 2000）。PRSは、最も重度である24を含む、0〜24の範囲であった。全体運動活性スコアは、活性モニターを使用して収集された（AW64 Actiwatch, Philips Electronics）（Mann et al., 2005）。
【図７】中脳DAニューロンへのiPSCの異種成分不含有分化。以前に公表された中脳ドーパミン作動性分化プロトコール（Cooper et al 2010）の、フィーダー不含有および異種成分不含有バージョンを、組換えタンパク質の代わりに低分子を使用し、異種成分不含有培地を使用し、MS5ストローマ細胞をヒト化された基体で置換することによって、開発した。図7A、THおよびFoxA2の同時染色によって同定された中脳DAニューロンは、異種成分不含有プロトコールから生成される。DIV49でのTH/FoxA2+ ニューロンのパーセンテージは、マウスフィーダー細胞を使用して生成されたものと同等である。図7Aおよび7B、Ki67陽性細胞は、主にネスチン陽性であり、分裂細胞が神経前駆細胞集団に由来することを示す。BIIIチューブリン陽性細胞のパーセンテージはまた、3つの異なるプロトコールで同等である。約25〜35％の培養物が、BIIIチューブリン陽性である。図7C、中脳DAニューロンは、ラットにおける線条体中に移植された10週後に、存在している（株は、（i）ヒトNCAM、（ii）TH、および（iii）FoxA2を含む）。スケールバー：20 μM。
【図８】異種成分不含有およびフィーダー不含有の条件下で生成された中脳DAニューロンは、異種植え込みの後、長期間生存し、片側性パーキンソン病のラットの行動回復を生じる。細胞は、DIV49で6-OHDA損傷ラットの線条体に移植された。図8A、アンフェタミン誘導回転は、経時的に有意に減少し、移植の20週後において、損傷対照ラットと比較して有意に低かった。図8B、対側足の使用（シリンダー試験で評価された）は、移植の24週後、有意に改善された。図8C、TH陽性ニューロンは、移植の24週後、移植片の全体にわたって観察された。
【図９】成熟異種移植片は、増殖性細胞を含まない。ラットは、12日間毎日、BrdU注入（50mg/kg/日）を与えられた。図9A、脳室下帯における増殖性細胞は、効果的に標識された（陽性対照）。図9B、移植7週後、増殖性細胞は、移植片において依然として観察することができた。図9C、6ヶ月まで、移植片由来の増殖性細胞は観察されなかった。
【図１０】被殻中へのiPS由来のドーパミン作動性ニューロンの自己移植のための例示的プロトコール。図10に示される移植のための例示的方法は、細胞数、沈着の数、沈着部位または管（tract）の数、投与のための流速、細胞濃度などを含む。図10におけるプロトコールは、Cooper et al.に記載された元のプロトコールを49日から28日に短縮するように改変されることに注意することが重要である。図10に概略される方法は単なる例であり、パーキンソン病の最適な処置および/または予防のために当業者によってさらに最適化され得る。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
詳細な説明
本明細書に提供される方法および組成物は、部分的には、ヒトにおけるパーキンソン病の処置のための組成物および方法の開発および最適化に基づく。方法および組成物は、ドーパミン作動性ニューロンへの分化のためのiPS細胞を生成するために、患者の体細胞を利用する。
【００４５】
定義
用語「患者」、「対象」、および「個体」は、本明細書において互換的に使用され、予防的処置を含む処置が提供される動物、特にヒトを意味する。本明細書に使用される、用語「対象」は、ヒトおよび非ヒト動物を意味する。用語「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳動物」は、本明細書において互換的に使用され、例えば、非ヒト霊長類などの哺乳動物（特に、高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシ、ならびにニワトリ、両生類、爬虫類といった非哺乳動物などの、全ての脊椎動物を含む。一つの態様において、対象はヒトである。別の態様において、対象は、実験動物または疾患モデルとしての動物代用物である。別の態様において、対象は、ペット動物（例えば、イヌ、ネコ、ラット、モルモット、ハムスターなど）を含む家畜動物である。
【００４６】
本明細書に使用される、用語「人工多能性幹細胞」（iPS細胞）は、1つまたは複数の転写因子の誘導された発現を介した、体細胞（例えば、皮膚細胞、線維芽細胞、血液細胞、末梢血単核細胞（PBMC）など）に由来する多能性細胞を意味する。iPS細胞は、インビトロまたはインビボのいずれかにおける適した増殖条件下で、2つ以上の分化された細胞型または細胞系統へと自己再生およびその後の分化をすることが可能である。一つの特定の態様において、iPS細胞は、例えば、Takahashi et al.（Cell, 126:663-676, 2006）に記載される方法に従い、Oct4、Sox2、c-Myc、およびKlf4の過剰発現により線維芽細胞から派生する。iPS細胞を産生するための他の方法は、例えば、Takahashi et al.（Cell, 131:861-872, 2007）およびNakagawa et al.（Nat. Biotechnol., 26:101-106, 2008）に記載されている。ヒトiPS細胞が、ヒトへの投与のためのドーパミン作動性ニューロンを誘導するために使用される場合、細胞における「フットプリント（footprint）」を残さない方法を使用して、iPS細胞を産生することが好ましい。換言すれば、分化およびヒトの処置のために使用されるiPS細胞は、核酸配列をゲノム中に挿入するベクターの使用を含まない、1つまたは複数の転写因子の誘導された発現を使用して産生されるべきである。したがって、一つの態様において、ヒトを処置するための方法における使用のためのiPS細胞は、体細胞を、少なくとも1つの非挿入ベクター、プラスミド、タンパク質、修飾されたRNA、または低分子に接触させることによる、少なくとも1つの転写因子（例えば、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、またはそれ以上の転写因子）の誘導された発現によって生成される。iPS細胞の生成の際、iPS細胞が外因性ベクターを含まず「フットプリント不含有」とみなされるように、細胞は、非挿入ベクターまたはプラスミドを希釈するために培養物において増殖および継代され得る。
【００４７】
本明細書に使用されるように、障害または状態を「予防する」医薬は、統計的試料において、無処置の対照試料と比べて、処置された試料における障害もしくは状態の出現を低下させる化合物、または無処置の対照試料と比べて、障害もしくは状態の1つもしくは複数の症状の発症を遅延させるか、またはそれを低下させる化合物を意味する。
【００４８】
用語「処置する」は、予防的および/または治療的な処置を含む。用語「予防的または治療的な」処置は、当技術分野で認識されており、1つまたは複数の対象組成物の宿主への投与を含む。望まない状態（例えば、宿主動物の疾患または他の望まない状態）の臨床兆候の前にそれが投与される場合、処置は予防的であり（すなわち、望まない状態の発症に対して宿主を保護する）、望まない状態の兆候の後にそれが投与される場合、処置は治療的である（すなわち、存在している望まない状態またはその副作用を減らす、改善する、または安定化することが意図される）。一つの態様において、用語「処置する」は、統一パーキンソン病評価尺度を使用して評価されるような、パーキンソン病の治癒を意味し得る。
【００４９】
本明細書に使用される、用語「異種成分不含有」は、細胞培地成分を意味する場合、処置される対象と同じ種である、タンパク質、増殖因子、および他の成分を使用して培地成分が産生されることを意味する。例えば、ヒトが処置される場合、「異種成分不含有」は、非ヒト成分を完全に含まない細胞培地および増殖成分ならびに産生方法を意味する。すなわち、異種成分不含有の成分は、ヒトに特異的なタンパク質および/もしくは核酸配列を含み、別の種（例えば、マウス、ラット、ウマ、イヌ、モルモットなど）に由来する成分への接触なしにインビトロもしくはインビボのいずれかで産生されるか、または如何なる非ヒト成分も除かれ、標準的な検出方法のレベルより下である。
【００５０】
本明細書に使用される、用語「フットプリント不含有」は、細胞のゲノム中への核酸の組み込みまたは細胞のゲノムの永久的変更を生じない、リプログラミングまたは分化因子の一過性過剰発現を使用して産生される細胞または組成物を意味する。すなわち、フットプリント不含有細胞を産生するためのリプログラミングまたは分化の方法は、細胞のゲノム中への核酸の組み込みを可能にするベクターの使用を包含せずにリプログラミングをもたらすための、例えば、タンパク質、修飾されたRNA、非組み込み型ベクター（例えば、アデノウイルスベクター）、プラスミド、または低分子（例えば、レンチウイルスなどのレトロウイルス）の投与を含む。
【００５１】
本明細書に使用される、用語「パーキンソン病の症状を実質的に含まない」は、パーキンソン病の症状を制御または軽減するために、対象がL-ドパなどの支持的処置を必要としないような、パーキンソン病の臨床症状の減少を意味する。熟練の臨床医は、統一パーキンソン病評価尺度（UPRDS）に基づく対象の評価から、対象が「パーキンソン病の症状を実質的に含まない」かどうかを容易に決定し得る。
【００５２】
本明細書に使用される、用語「症状の十分な臨床的制御」は、L-ドパのさらなる増加を必要としないか、または患者に対処する熟練した臨床医によって判断されるようなパーキンソン病の別の支持的処置を必要としない、症状のレベルを意味する。「十分な臨床的制御」は、症状の完全な減少を意味しなくてもよく、この用語は、症状制御のレベルが、処置の用量をさらに増加させてもさらなる症状制御を提供することはなく処置の副作用を増加させるだけであることを意味する。熟練した臨床医は、臨床的制御のどのレベルがその患者にとって適切なまたは許容されるかを個別の基準で決定するために、患者に対処することができる。
【００５３】
用語「低下する」、「減少した」、「減少」、または「阻害する」は全て、本明細書において、統計的に有意な量で、性質、レベル、または他のパラメーターの低下または少なくなることを意味するために使用される。いくつかの態様において、「減少する」、「減少」、「低下する」、または「阻害する」は、典型的には、参照レベル（例えば、所与の処置の非存在）と比較して、少なくとも10％の低下を意味し、例えば、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、またはそれ以上の低下を含み得る。本明細書に使用される、「減少」または「阻害」は、参照レベルと比較して、完全な阻害または減少を包含しない。「完全な阻害」は、参照レベルと比較して、100％の阻害である。低下は、好ましくは、所与の障害を有しない個体についての正常の範囲内として許容されるレベルまで下がり得る。
【００５４】
用語「増加した」、「増加する」、「増強する」、または「活性化する」は全て、本明細書において、統計的に有意な量で、性質、レベル、または他のパラメーターの増加を意味するために使用される；如何なる誤解も避けるために、用語「増加した」、「増加する」、「増強する」、または「活性化する」は、参照レベルと比較して、少なくとも10％の増加を意味し、例えば、参照レベルと比較して、少なくとも約20％、もしくは少なくとも約30％、もしくは少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、もしくは少なくとも約60％、もしくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％の増加、もしくは100％までおよびそれを含む増加、もしくは10〜100％の任意の増加、または参照レベルと比較して、少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍もしくは少なくとも約10倍の増加、少なくとも約20倍の増加、少なくとも約50倍の増加、少なくとも約100倍の増加、少なくとも約1000倍もしくはそれ以上の増加を意味する。
【００５５】
用語「薬学的に許容される」は、過度な毒性を有さずに対象（例えば、哺乳動物またはヒト）に投与され得る化合物および組成物を意味する。 
【００５６】
本明細書に使用される、用語「薬学的に許容される担体」は、活性成分と組み合わされた場合、成分が生物学的活性を保持するようにさせ、対象の免疫系と非反応性である、任意の材料または物質を含み得る。例には、リン酸緩衝生理食塩水、水、油/水エマルジョンなどのエマルジョン、人工脳脊髄液、および様々な種類の湿潤剤などの、標準的な薬学的担体が含まれるが、これらに限定されない。用語「薬学的に許容される担体」は、組織培養培地を除外する。
【００５７】
本明細書に使用される、用語「含む（comprising）」は、示された定義された要素に加えて他の要素も存在し得ることを意味する。「含む」の使用は、限定ではなく包括を示す。
【００５８】
本明細書に使用される、用語「から本質的になる（consisting essentially of）」は、所与の態様のために必要とされる要素を意味する。用語は、本発明の態様における基本的且つ新規または機能的特徴に大きく影響しない、追加の要素を許容する。
【００５９】
本明細書に使用される、用語「からなる（consisting of）」は、態様の記載に言及されていない如何なる要素も除く、本明細書に記載の組成物、方法、およびそれぞれの構成要素を意味する。
【００６０】
さらに、文脈によって別途要求されない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。
【００６１】
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコール、および試薬などには限定されず、したがって、そこから様々であり得ることが理解されるべきである。本明細書に使用される用語は、特定の態様のみを記載する目的のためのものであり、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００６２】
パーキンソン病における細胞療法
パーキンソン病（PD）の主な病理学的特徴は、後に線条体神経伝達の調節不全およびPDの運動症状（運動緩慢、硬直、振戦）の発症を生じる、黒質緻密部（SNc）におけるドーパミン（DA）ニューロンの進行性の損失である。可能な場合、さらなる神経変性を予防するために、疾患の前臨床段階で神経保護ストラテジーを開始することが合理的であろう。しかし実際には、選択的に脆弱性のドーパミンニューロンの多く（約60％）が機能障害に陥るかまたは死滅し、そして結果として線条体ドーパミンの約70％が枯渇する、PD症状の進行期に既に達するまで、多くの患者は臨床的運動症状を有さないままである。このことから、そして如何なる変性の遅延も絶対的であるとは考えにくいため、失われたニューロンの細胞置換を開発することは、合理的である。そのような「生細胞」置換療法は、古典的薬理学とは概念的に異なる。PDのための現在の主要な処置は、ドーパミンレベルを上昇させるかまたはドーパミン受容体を刺激する、レボドパ（L-ドパ）またはドーパミン作動性アゴニストを使用した薬理学的アプローチに基づく。この処置は、長年にわたって効果的であり得るが、その長期間および慢性的使用は、ウェアリング・オフ、オンオフの変動、およびL-ドパ誘導性ジスキネジアと呼ばれる異常な動作を含む「運動合併症」の発症を生じ得る。L-ドパは血液脳関門を通過し、ここでドパ-デカルボキシラーゼ含有細胞によってドーパミンに変換される。これらは、線条体ドーパミン末端自体の残存を含み、また、血液脳関門壁における細胞およびセロトニンニューロンを含む非ドーパミン作動性細胞である。L-ドパの経口（非連続）投与後の非ドーパミン作動性細胞におけるL-ドパからドーパミンへの変換は、ドーパミンの拍動性の非生理学的放出を生じ、これは、線条体における過敏なドーパミン受容体に作用し得、ジスキネジアの発症に寄与し得る。
【００６３】
PDにおける細胞ベースの治療アプローチは、疾患プロセスによる黒質線条体ドーパミン末端損失を、尾状核-被殻および黒質中に直接置かれた胎児または幹細胞由来のドーパミンニューロンで置換することを目的とする。PDにおける中脳ドーパミンニューロンでの細胞置換療法は、PDの運動症状およびL-ドパ誘導性ジスキネジアの両方に対処する。最も成功した場合において、L-ドパ投薬の必要性は、なくなるかまたは大幅に減少する。新しい中脳様ドーパミンニューロンが、黒質線条体ドーパミンニューロンの正常標的領域中に生着すると、それらは、成熟宿主線条体ニューロンを有するシナプスを確立し、宿主脳において生理学的に適切なドーパミン放出およびシナプスフィードバック制御を提供する（Vinuela et al., 2008；Zetterstrom et al., 1986）。この様式におけるドーパミン末端の置換は、生理学的放出および再取り込みのメカニズムを失っている線条体中へのドーパミンのポンプ様の薬理学的送達と比べ、PDの運動症状の回復に非常に効果的であり得る。
【００６４】
胎児ドーパミンニューロン移植後のPD患者に対する長期間の顕著な且つ神経学的に明確な利点（DA薬物療法なしで統一パーキンソン病評価尺度（UPDRS）スコアの約50〜60％の減少）が18年を超えて報告され（Hallett et al., 2014；Kefalopoulou et al., 2014；Barker et al., 2013；Mendez et al., 2005；Politis et al., 2010）、これは、PDのための現在のあらゆる処置にまさる。さらに、移植された胎児ドーパミンニューロンは、少なくとも14年を超えて、PD運動スコアの進行性の悪化を防ぎ得る（Kefalopoulou et al., 2014）。これらの臨床的利点は、PETおよび機能的MRI神経画像化を使用した生理学的変化の証拠に関連する。
【００６５】
発明者による以前のデータはまた、移植された胎児腹側中脳ドーパミンニューロンが、PD患者の被殻への移植後、宿主脳において疾患プロセスが進行中であるにもかかわらず、長期間（これまでに試験された最も長い時点で、移植後14年まで）健康に残存することを示している。
【００６６】
診療所におけるPDのためのDAニューロンを使用した細胞置換療法は、従来、胎児起源に由来する腹側中脳DAニューロンを利用してきた。本明細書に記載されるiPSCは、PDおよび他の疾患における細胞置換のための細胞起源として、胚性幹細胞（ESC）にまさるいくつかの利点を提供し、それには、患者自身の細胞を使用できることまたはHLAハプロタイプ一致細胞を使用できること、したがって、患者特異的またはHLA一致細胞が利用できるために如何なる免疫抑制の必要性もなくなることが含まれる。免疫適合性は、移植の全ての分野において非常に重要であることが広く知られている。免疫抑制は、ささいな事項ではなく、胎児由来のドーパミンニューロン移植の臨床試験において以前に報告されたいくつかの可変性の基礎となり得る（Barker et al., 2013）。実際、胎児細胞移植6ヶ月後の免疫療法の休止後、PD患者は移植による利益を失ったことが以前に報告されており（Olanow et al., 2003）、このように、遅延性免疫または炎症反応が、移植されたドーパミンニューロンの長期間の生存、増殖、および機能に影響し得た。
【００６７】
人工多能性幹細胞
人工多能性幹（iPS）細胞技術は、患者の免疫反応を制限する細胞療法のための同質遺伝子的細胞を提供するという利点を有する。脳は、比較的、免疫特権を有するが、活性化ミクログリアは、移植されたニューロンのシナプス機能を損ない得る（Soderstrom et al., 2008）。iPS細胞は、非多能性細胞から、典型的には成体体細胞から人工的に派生させた多能性幹細胞の一種である。これは、マウス線維芽細胞を4つの遺伝子（Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4）でトランスフェクトしてiPS細胞を得たYamanaka et al.によって初めて示された。その後、iPS細胞は、ヒト成体体細胞から派生されている。（Takahashi et al. Cell, 131:861-872 （2007）；Yu et al. Science, 318:1917-1920, 2007）。
【００６８】
処置される対象に応じて、iPS細胞は、例えば、マウス、ヒト、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、ハムスター、イヌ、モルモット、または非ヒト霊長類細胞などの、哺乳動物細胞であり得る。例えば、最終目的が、患者への移植のための治療用細胞を生成することである場合、患者に由来する細胞が、iPS細胞を生成するために望ましく使用される。一つの態様において、iPS細胞はヒトiPS細胞である。適した態様において、本方法に使用されるiPS細胞は、PD患者に由来する。別の態様において、本明細書に記載される方法および組成物において使用されるiPS細胞は、自己処置のためにPD患者に由来する。
【００６９】
iPS細胞を作製するために有用な体細胞は、任意の適した起源から入手され得、および任意の分化された細胞型であり得る。ある態様において、体細胞は、血液、滑液、または組織から得られる。リプログラミングのための例示的な体細胞は、血液細胞、末梢血単核細胞（PBMC）、または線維芽細胞を含むが、これらに限定されない。
【００７０】
本明細書に使用される用語としての体細胞は、生殖系列細胞を除く、生物の体を形成する任意の細胞を意味する。精子および卵子、それらが作製される細胞（生殖母細胞）、および未分化幹細胞は別として、哺乳動物体の全ての細胞型は、分化された体細胞である。例えば、内臓、皮膚、骨、血液、および結合組織は全て、分化された体細胞で構成されている。
【００７１】
本明細書に記載される組成物および方法での使用のための、さらなる体細胞型は、線維芽細胞（例えば、初代線維芽細胞）、筋細胞（例えば、ミオサイト）、卵丘細胞、神経系細胞、乳腺細胞、肝細胞、心筋細胞、および膵島細胞を含む。いくつかの態様において、体細胞は、初代細胞系であり、または初代もしくは二代目の細胞系の後代である。いくつかの態様において、体細胞は、ヒト試料、例えば、毛包、血液試料、生検（例えば、皮膚生検または脂肪生検）、スワブ試料（例えば、口腔スワブ試料）から得られ、したがって、ヒト体細胞である。
【００７２】
分化された体細胞のいくつかの非制限的な例は、上皮、内皮、ニューロン、脂肪、心臓、骨格筋、免疫細胞、肝臓、脾臓、肺、循環血液細胞、胃腸、腎臓、骨髄、および膵臓細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、体細胞は、脳、肝臓、肺、腸、胃、腸管、脂肪、筋肉、子宮、皮膚、脾臓、内分泌器官、骨などを含むがこれらに限定されない、任意の体細胞組織から単離された初代細胞であり得る。さらに、体細胞は、マウス、ウシ、サル、ブタ、ウマ、ヒツジ、またはヒト細胞を含む非制限的な例を含む、任意の哺乳動物種に由来し得る。いくつかの態様において、体細胞はヒト体細胞である。
【００７３】
リプログラミングされた細胞が、ヒトにおけるパーキンソン病の処置のために使用される場合、処置される患者から単離された体細胞を使用することが望ましいが、必須ではない。
【００７４】
本質的に、当技術分野において公知の任意の方法が、体細胞をiPS細胞にリプログラミングするために使用され得る。組成物がヒトに投与されるものである場合、リプログラミングの方法はフットプリント不含有であることが好ましく、例えば、特定のリプログラミング因子を過剰発現する核酸を組み込むことによるiPS細胞のゲノムに持続的または永久的な変更を行わないことが好ましい。例示的な方法は、修飾されたRNA、プラスミド、非組み込み型ベクター、タンパク質、または低分子を使用したリプログラミングを含む。
【００７５】
本明細書に使用される、用語「リプログラミング」は、分化された細胞（例えば、体細胞）の分化状態を変更または逆転するプロセスを意味する。言い方を変えれば、リプログラミングは、細胞の分化を、逆のより未分化またはより原始的な型の細胞にするプロセスを意味する。多くの初代細胞を培養することは、完全に分化された特徴をいくらか損失させることに注意すべきである。したがって、用語「分化された細胞」に含まれるそのような細胞を単に培養しても、これらの細胞は、分化されていない細胞（例えば、未分化細胞）または多能性細胞にはならない。分化された細胞の多能性への移行は、培養において分化された特徴の部分的な損失を導く刺激を超えた、リプログラミング刺激を必要とする。リプログラミングされた細胞はまた、培養において制限された数の分裂の能力しか一般的に有さない初代細胞親と比べて、増殖能を失うことなく長く継代する能力という特徴を有する。
【００７６】
リプログラミングされる細胞は、リプログラミングの前に、部分的または最終的のいずれかで分化されてよい。いくつかの態様において、リプログラミングは、分化された細胞（例えば、体細胞）の分化状態を、多能性（pluripotent）状態または多分化能（multipotent）状態に逆転することを含む。いくつかの態様において、リプログラミングは、分化された細胞（例えば、体細胞）の分化状態を、未分化細胞（例えば、胚性様細胞）に完全または部分的に逆転することを含む。得られた細胞は、「リプログラミングされた細胞」と呼ばれ、リプログラミングされた細胞が多能性である場合、それらは、「人工多能性幹細胞」（iPSCまたはiPS細胞）と呼ばれる。
【００７７】
リプログラミングは、例えば、細胞分化の間に生じる、核酸修飾の少なくともいくつかの遺伝的パターン（例えば、メチル化）の逆転、クロマチン凝縮、エピジェネティックな変化、ゲノムインプリンティングなどの変化を含み得る。
【００７８】
リプログラミングは、例えば、Oct-4（Oct-3/4またはPouf51としても知られる）、Sox1、Sox2、Sox3、Sox15、Sox18、NANOG、Klf1、Klf2、Klf4、Klf5、NR5A2、c-Myc、l-Myc、n-Myc、Rem2、Tert、およびLIN28を含む幹細胞関連遺伝子をコードする核酸の組み合わせを導入することによって達成され得る。上述のように、リプログラミングのために使用される厳密な方法が、本明細書に記載される方法および組成物に必ずしも重要であるわけではない。しかし、リプログラミングされた細胞から分化された細胞が、例えば、ヒトの治療において使用されるものである場合、一つの態様において、リプログラミングは、ゲノムを変更する方法によっては達成されない。したがって、そのような態様において、リプログラミングは、例えば、ウイルスまたはプラスミドベクターを使用することなく達成される。リプログラミングのこれらの方法は、例えば、癌を促進する可能性のあるゲノム損傷を誘発する可能性の低いことから、治療目的のために使用される細胞において好まれ得る。
【００７９】
開始細胞の集団に由来するリプログラミングの効率（すなわち、リプログラミングされた細胞の数）は、Shi, Y., et al （2008） Cell-Stem Cell 2:525-528、Huangfu, D., et al （2008） Nature Biotechnology 26（7）:795-797、およびMarson, A., et al （2008） Cell-Stem Cell 3:132-135によって示されるように、様々な低分子の添加によって増強され得る。したがって、人工多能性幹細胞の産生の効率または割合を増強する剤または剤の組み合わせが、患者特異的または疾患特異的なiPSCの産生において使用され得る。リプログラミング効率を増強する剤のいくつかの非制限的な例は、可溶性Wnt、Wnt馴化培地、BIX-01294（G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ）、PD0325901（MEK阻害剤）、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤、バルプロ酸、5'-アザシチジン、デキサメタゾン、スベロイルアニリド、ヒドロキサム酸（SAHA）、ビタミンC、およびトリコスタチン（TSA）などを含む。
【００８０】
リプログラミング増強剤の他の非制限的な例は、ヒドロキサム酸スベロイルアニリド（SAHA（例えば、MK0683、ボリノスタット）および他のヒドロキサム酸）、BML-210、デプデシン（Depudecin）（例えば、（-）-デプデシン）、HCトキシン、ヌルスクリプト（Nullscript）（4-（1,3-ジオキソ-1H,3H-ベンゾ［de］イソキノリン-2-イル）-N-ヒドロキシブタンアミド）、フェニルブチレート（例えば、フェニル酪酸ナトリウム）、およびバルプロ酸（（VPA）および他の短鎖脂肪酸）、スクリプタイド（Scriptaid）、スラミンナトリウム、トリコスタチンA（TSA）、APHA化合物8、アピシジン、酪酸ナトリウム、ピバロイルオキシメチルブチレート（Pivanex、AN-9）、トラポキシンB、クラミドシン、デプシペプチド（FR901228またはFK228としても知られる）、ベンズアミド（例えば、CI-994（例えば、N-アセチルジナリン（dinaline））、およびMS-27-275）、MGCD0103、NVP-LAQ-824、CBHA（m-カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサム酸）、JNJ16241199、チューバシン（Tubacin）、A-161906、プロキサミド（proxamide）、オキサムフラチン、3-Cl-UCHA（例えば、6-（3-クロロフェニルウレイド）カプロンヒドロキサム酸）、AOE（2-アミノ-8-オキソ-9,10-エポキシデカン酸）、CHAP31、およびCHAP 50を含む。他のリプログラミング増強剤は、例えば、HDACのドミナントネガティブ形態（例えば、触媒的に不活性な形態）、HDACのsiRNA阻害剤、およびHDACに特異的に結合する抗体を含む。そのような阻害剤は、例えば、BIOMOL International、Fukasawa、Merck Biosciences、Novartis、Gloucester Pharmaceuticals、Aton Pharma、Titan Pharmaceuticals、Schering AG、Pharmion、MethylGene、およびSigma Aldrichなどから入手可能である。
【００８１】
本明細書に記載される方法での使用のための多能性幹細胞の誘導を確認するために、単離されたクローンは、幹細胞マーカーの発現について試験され得る。体細胞に由来する細胞におけるそのような発現は、細胞を、人工多能性幹細胞として同定する。幹細胞マーカーは、SSEA3、SSEA4、CD9、Nanog、Fbx15、Ecat1、Esg1、Eras、Gdf3、Fgf4、Cripto、Dax1、Zpf296、Slc2a3、Rex1、Utf1、およびNat1を含む、非制限的な群から選択され得る。一つの態様において、Oct4またはNanogを発現する細胞が、多能性として同定される。そのようなマーカーの発現を検出するための方法は、ウエスタンブロットまたはフローサイトメトリー解析などの、例えば、コードされたポリペプチドの存在を検出するRT-PCRおよび免疫学的方法を含み得る。いくつかの態様において、検出は、RT-PCRのみを含むのではなく、タンパク質マーカーの検出も含む。細胞内マーカーは、RT-PCRを介して最も良く同定され得、細胞表面マーカーは、例えば免疫細胞化学によって、容易に同定される。本明細書に開示されるリプログラミングされた体細胞は、アルカリホスファターゼ（AP）；ABCG2；ステージ特異的胎児抗原-1（SSEA-1）；SSEA-3；SSEA-4；TRA-1-60；TRA-1-81；Tra-2-49/6E；ERas/ECAT5、E-カドヘリン；b-III-チューブリン；a-平滑筋アクチン（a-SMA）；線維芽細胞増殖因子4（Fgf4）、Cripto、Dax1；亜鉛フィンガータンパク質296 （Zfp296）；N-アセチルトランスフェラーゼ-1（Nat1）；ES細胞関連転写物1（ECAT1）；ESG1/DPPA5/ECAT2；ECAT3；ECAT6；ECAT7；ECAT8；ECAT9；ECAT10；ECAT15-1；ECAT15-2；Fthl17；Sal14；未分化胚細胞転写因子（Utf1）；Rex1；p53；G3PDH；TERTを含むテロメラーゼ；サイレントX染色体遺伝子；Dnmt3a；Dnmt3b；TRIM28；Fボックス含有タンパク質15（Fbx15）；Nanog/ECAT4；Oct3/4；Sox2；Klf4；c-Myc；Esrrb；TDGF1；GABRB3；Zfp42、FoxD3；GDF3；CYP25A1；発生多能性関連（developmental pluripotency-associated）2（DPPA2）；T細胞リンパ腫限界点1（Tcl1）；DPPA3/Stella；DPPA4；多能性のための他の一般的マーカーなどを含む、任意の数の多能性細胞マーカーを発現し得る。他のマーカーは、Dnmt3L；Sox15；Stat3；Grb2；b-カテニン、およびBmi1を含み得る。そのような細胞はまた、人工多能性幹細胞が誘導される体細胞に特徴的なマーカーの下方調節によって特徴付けられ得る。
【００８２】
単離された細胞の多能性幹細胞の特徴は、iPSCが3つの胚葉の各々の細胞に分化する能力を試験評価することによって確認され得る。一つの例として、ヌードマウスのクローンの奇形腫形成が、単離されたクローンの多能性の特徴を評価するために使用され得る。細胞をヌードマウスに導入し、細胞から生じる腫瘍において組織学および/または免疫組織化学を実施する。例えば、3つ全ての胚葉からの細胞を含む腫瘍の増殖は、細胞が多能性幹細胞であることをさらに示す。
【００８３】
多能性幹細胞を細胞培養する、発生させる、および分化させるための方法は、当技術分野において標準的な文献を用いて実施され得、本明細書においては詳細に記載されない。当業者は、そうではないことが明示的に要求される場合を除き、iPS細胞は、一次組織、iPS細胞の表現型特徴を有する確立された系、および3つの胚葉の各々の子孫を生成する能力を依然として有するそのような系の誘導体を含むことを認識するであろう。iPS細胞培養物は、集団における幹細胞およびそれらの誘導体の大きな割合が、胚または成体起源の分化された細胞からそれらを明確に区別する未分化細胞の形態学的特徴を表す場合、「未分化」または「実質的に未分化」として説明される。未分化iPS細胞は、当業者によって容易に認識され、典型的には、二次元の顕微鏡視野において、高い核/細胞質割合および顕著な核小体が見られる。集団内の未分化細胞のコロニーは、往々にして、分化された隣接細胞によって囲まれていることが理解される。それにもかかわらず、未分化コロニーは、適切な条件下で集団が培養または継代されても持続し、個々の未分化細胞は、細胞集団のかなりの割合を構成する。実質的に未分化である培養物は、少なくとも20％の未分化iPS細胞を含み、少なくとも40％、60％、または80％の未分化PS細胞を含み得る。
【００８４】
iPS細胞の分化
一つの局面において、A9表現型（例えば、FOXA2、b-チューブリン、およびチロシンヒドロキシラーゼを発現する）またはA10表現型を有するドーパミン作動性ニューロンを含む細胞集団を作製するための方法は、iPS細胞を、好ましくはSN-A9およびVTA-A10 DAニューロンの表現型を有するものを含むドーパミン作動性ニューロンへとiPS細胞の運命を方向付けるために十分な量の、レチノイン酸（RA）、活性化形態のヒトSHH、WNT1、およびFGF8Aに接触させることを提供する。いくつかの態様において、iPS細胞は、約10-9〜10-7 M RA（例えば、約2×10-9〜約5×10-8 M、または約5×10-9〜約2×10-8 M）の存在下で分化される。特定の態様において、iPS細胞は、約10-8 M RAの存在下で分化される。いくつかの態様において、RAの存在下での神経外胚葉性分化は、10〜18日間進められる。一つの態様において、RAの存在下での神経外胚葉性分化は、2日毎に培地を変更して、14日間進められる。分化の後、神経外胚葉性コロニーは、DAニューロン表現型への分化のために選択され、再播種される。
【００８５】
いくつかの態様において、DAニューロン表現型への分化は、活性化形態のヒトSHH、WNT1、およびFGF8Aと共に神経外胚葉性コロニーを培養することによって生じる。いくつかの態様において、細胞は、ヒトSHH、WNT1、およびFGF8Aの存在下で18〜35日間、分化される。特定の態様において、細胞は、ヒトSHH、WNT1、およびFGF8Aの存在下で28日間分化され、その後、SHH、WNT1、およびFGF8Aを含まないが、BDFN、AA、cAMP、GDNF、およびTGF-β3の1つまたは複数（例えば、2つ、3つ、4つ、または5つ全て）の存在下で、49日目まで分化される。
【００８６】
いくつかの態様において、ヒトSHHは、活性化形態のヒトSHHである。成熟生物学的活性形態のSHH分子は、その前駆タンパク質の自己触媒切断によって産生され、完全長ヒトSHHタンパク質の残基24〜197に一般的に対応する前駆分子のN末端ドメインに対応する（Pepinsky et al, 1998；Taylor et al., 2001）。一つの態様において、有効量のヒトSHHタンパク質は、約100〜約1000 ng/mlの培養培地中の最終濃度を提供するために十分な量である。特定の態様において、有効量のヒトSHHタンパク質は、約500 ng/mlの培養培地中の最終濃度を提供するために十分な量である。いくつかの態様において、神経前駆細胞は、活性化SHHタンパク質に接触される。いくつかの態様において、過強力な（supra-potent）形態の活性化SHHタンパク質が使用され得る。例えば、そのような修飾された活性化SHHタンパク質は、例えば、N末端アシルアミドおよびチアゾリジンを含む、N末端修飾を有する活性化SHHタンパク質；ならびに生物学的活性を増加するために突然変異を誘発された活性化SHHタンパク質を含む（Taylor et al., 2001）。一つの態様において、修飾された活性化SHHは、天然に生じる化学的に修飾されたCys残基の代わりに置換されたN末端Ile-Ile配列を含む、175アミノ酸残基からなるヒト細胞から産生された20 kDaのタンパク質である、C24II SHHである（Taylor et al., 2001を参照のこと）。他の修飾された活性化SHHタンパク質は、例えば、C24III、C24IIII、C23IIW、C24IW、C24F、C24I、C24FIF、C24W、C24I-G25I、およびC24Mを含む（Taylor et al., 2001）。過強力な形態の活性化SHHタンパク質を使用する場合、使用される量は、天然の活性化SHHの量より少ないが、先に記載された量と同じ生物学的活性を提供するために十分であり得る。または、より高いレベルのSHH生物学的活性を細胞に送達するために、より多い量が使用され得る。
【００８７】
一つの態様において、DAニューロン表現型への分化は、神経外胚葉性コロニーをFGF8Aと共に培養することによって生じる。FGF8A（線維芽細胞増殖因子8A）。FGF8は、マウス乳癌細胞のアンドロゲン依存性増殖に必須の増殖因子として最初に発見された、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーである。マウスFGF8 mRNAのスプライシングは、a〜hと命名される8個の分泌型アイソフォームを生成する。FGF8a、b、e、およびfのみがヒトに存在する。FGF8は22アミノ酸（aa）シグナル配列、アイソフォームによって変動するN末端ドメイン（最も短いものはFGF8aの20aa）、125 aaのFGFドメイン、および37 aaのプロリンリッチC末端配列を含む。いくつかの態様において、FGF8Aは、組換えヒトFGF8Aである。一つの態様において、有効量のヒトFGF8Aタンパク質は、約10〜約1000 ng/mlのヒトFGF8Aタンパク質の培養培地中の最終濃度を提供するために十分な量である。特定の態様において、有効量のヒトFGF8Aタンパク質は、約100 ng/mlの培養培地中の最終濃度を提供するために十分な量である。
【００８８】
いくつかの態様において、DAニューロン表現型への分化は、ノギン含有または非含有のいずれか、およびフィーダー細胞（例えば、MS5フィーダー細胞）非含有で、神経外胚葉性コロニーをヒトWNT1タンパク質と共に培養することによって生じる。WNT1は、胚における発生研究において、適切にパターン形成されたVM神経前駆細胞を生成するために必要とされることが示されている（Muhr et al., 1999；Nordstrom et al., 2002, 2006）。本明細書にはまた、外因性SHH拮抗なしでのFOXA2神経前駆細胞のニューロン分化が生じ得ることが示されている。如何なる理論に縛られることも望まないが、この結果は、インビトロで分泌されたSHHアンタゴニストのいずれかが、ニューロン分化を誘導するために十分であるか、またはヒト細胞におけるVM DAニューロン新生のために、SHH拮抗の必要性は比較的少ないことを示す。いくつかの態様において、WNT1は組換えヒトWNT1である。一つの態様において、有効量のヒトWNT1タンパク質は、約10〜約1000 ng/mlのヒトWNT1タンパク質の培養培地中の最終濃度を提供するために十分な量である。特定の態様において、有効量のヒトWNT1タンパク質は、約100 ng/mlの培養培地中の最終濃度を提供するために十分な量である。
【００８９】
分化された細胞がヒトに投与される場合、細胞は、「フットプリント不含有」、「異種成分不含有」、または「非アレルゲン性」細胞の生成を可能にする条件下で分化されることが好ましい。例えば、非ヒト成分、特に非ヒト（例えば、マウス）フィーダー細胞の存在下でのヒト細胞の分化を避けるために注意を払うべきである。加えて、WNT1またはSHHなどの分化因子への曝露は、投与前にこれらの成分が培養物から洗い流され、または希釈され得ることを保証するために、一過性であるべきである。したがって、ある態様において、分化成分は、細胞のゲノム中に核酸の挿入を可能にするベクターを使用して神経外胚葉性細胞に接触されることはない。一つの態様において、iPS細胞を神経細胞に分化させるために使用される方法は、マウスフィーダー細胞の代わりに、ヒト化された基体を使用する。別の態様において、iPS細胞を分化させるために使用する方法は、組換えまたは発現された分化因子の代わりに、分化因子として低分子またはタンパク質を使用する。
【００９０】
神経変性疾患の処置のための方法
中枢神経系において、多数の機能的に異なる種類のドーパミン作動性（DA）ニューロンが、いくつかの脳領域で見出される。パーキンソン病（PD）の基本的な運動症状は、著しい変性に対する特定の中脳（SN-A9）型DAニューロンの脆弱性によって引き起こされる。本発明は、ドーパミン作動性ニューロン、特に、A9表現型を有するドーパミン作動性ニューロンを生成すること、および患者の脳中にこれらのドーパミン作動性ニューロンを移植することによって、患者における神経変性疾患（例えば、パーキンソン病）を処置するための方法を提供する。ドーパミン作動性ニューロンは、例えば、これらの細胞を、有効量のレチノイン酸、ヒトソニックヘッジホッグ（SHH）タンパク質、WNT1タンパク質、およびFGF8Aタンパク質に接触させることによって、神経前駆細胞から生成される。任意で、神経前駆細胞は、本明細書に記載される培養条件下で、PS細胞をRAおよび他の分化因子に接触させることによって生成され得る。
【００９１】
移植は、同種（同一の種の遺伝的に異なるメンバー間）、自己（生物自身の細胞または組織の移植）、同系（同一の種の遺伝的に同一のメンバー間（例えば、一卵性双生児））、または異種（異なる種のメンバー間）であり得る。通常、DAニューロンは、変性によりPDを生じたDAニューロンを置換するために、脳の黒質（特に、緻密領域の中または緻密領域に隣接する）、腹側被蓋野（VTA）、尾状核、被殻、側坐核、視床下核、またはそれらの組み合わせの中に移植される。A9 DAニューロンの細胞体は黒質中に位置するが、それらの軸索は、ドーパミン放出が生じる前脳構造中に広がっているため、黒質、尾状核、または被殻への移植が実施される。A10 DAニューロンを置換することが望ましい疾患状態において、DAニューロンは、脳のVTA、側坐核、または両方の領域中に移植される。PDの後期において、認知行動障害は、脳の尾状核、大脳皮質深層、側坐核、および黒質領域におけるDA損失およびシナプス機能障害から生じ得る。したがって、腹側被蓋DAニューロン表現型A10は、失ったA10 DA機能を置換するために、これらの領域に特異的に移植されるであろう。特に、尾状核への、A10 DAニューロンまたはA10 DAニューロンに分化するために刺激された細胞の移植は、最も有効な置換であろう。
【００９２】
神経変性疾患を有する患者の脳への本明細書に記載される移植組成物の移植は、失ったDAニューロン、非DAニューロン、または機能障害性DAニューロンの置換を生じる。細胞は、疾患の少なくとも1つの有害作用/症状を少なくとも部分的に減少もしくは軽減させるか、または疾患の薬理学的処置用量の減少を可能にするように、機能障害性DAニューロンを置換するために適した量で、パーキンソン病を有する対象中に導入される。細胞は、少なくとも細胞の一部分が生き残っている対象において、所望の位置に細胞を送達する任意の適した経路によって、対象に投与され得る。典型的には、移植組成物は、定位的注入によって、尾状核、被殻、側坐核、または視床下核に注入される。細胞の少なくとも約5％、好ましくは少なくとも約10％、より好ましくは少なくとも約20％、さらにより好ましくは少なくとも約30％、さらにまたより好ましくは少なくとも約40％、最も好ましくは少なくとも約50％またはそれ以上が、対象への投与後に生存している。対象への投与後の細胞の生存期間は、数時間、例えば、24時間〜数日と短くても、数週間〜数ヶ月と長くてもよい。対象に細胞を送達するために使用され得る移植方法は、Bjorklund et al.（Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 99:2344-2349, 2002）によって記載される。
【００９３】
これらの投与方法を達成するために、本発明の細胞は、対象への細胞の注入（例えば、定位的注入）または植え込みによる導入を促進する送達デバイスに挿入され得る。典型的には、細胞は、細胞懸濁液として標的領域に注入される。または、DAニューロンは、そのような送達デバイスに入れられる場合、固体または半固体の支持マトリックス中に埋め込まれ得る。
【００９４】
細胞移植療法は、典型的には、神経系の損傷領域中への、又は損傷部位に隣接する部位での、置換細胞集団の実質内（例えば、脳内）移植を含む。最も一般的には、治療用細胞は、定位的注入によって特定の部位に送達される。移植のための従来技術は、例えば、Bjorklund et al.（Neural Grafting in the Mammalian CNS, eds. Elsevier, pp. 169-178, 1985）、Leksell et al.（Acta Neurochir., 52:1-7, 1980）、およびLeksell et al.（J. Neurosurg., 66:626-629, 1987）に記載されている。注入標的領域の同定および位置の特定は、一般的に、植え込み前の非侵襲性脳画像化技術（例えば、MRI）を使用して実施されるであろう（例えば, Leksell et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 48:14-18, 1985参照のこと）。簡単に言うと、患者脳の選択された領域中への細胞の投与は、挿入されるマイクロシリンジの針を許容するために、孔を開け、硬膜を貫通することによって実施され得る。または、細胞は、脳室中に注入され得、または脊髄領域中に髄腔内注入され得る。同じ細胞懸濁液ならびに細胞の混合物を使用して、いくつかの部位で同時に複数の移植を実施することも可能である。複数の移植または複数の注入部位は、尾状核および/または被殻などのより大きな脳構造に細胞を投与するために、特に有用である。
【００９５】
治療組成物
本明細書に記載されるような、インビトロ細胞培養および単離の後、細胞は、植え込みのために調製される。細胞は、細胞培養培地（例えば、イーグルの最小基本培地）、リン酸緩衝生理食塩水、または人工脳脊髄液（aCSF）などの生理学的に適合性の担体中に懸濁化される。移植される細胞懸濁液の体積は、植え込み部位、処置の目標、および溶液中の細胞密度によって様々であろう。パーキンソン病の処置のため、約30〜100 μlの細胞懸濁液が、各黒質内または被殻内注入において投与され、各患者は、左および右の黒質または被殻領域の各々の中への単回または複数回注入を受容し得る。
【００９６】
薬学的に許容される担体および希釈剤は、生理食塩水、水性緩衝溶液、溶媒、および/または分散媒を含む。そのような担体および希釈剤の使用は、当技術分野において周知である。溶液は、好ましくは、無菌であり、流体である。適切には、溶液は、製造および貯蔵の条件下で安定であり、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、またはチメロサールの使用を通じて、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護される。本発明の溶液は、薬学的に許容される担体もしくは希釈剤、および必要な場合には他の成分中に、本明細書に記載される細胞を組み入れることによって、調製され得る。
【００９７】
いくつかの態様において、細胞は、植え込みの前に、透過性膜内にカプセル封入される。カプセル封入は、宿主の免疫系に対する障壁を提供し、移植片拒絶および炎症を阻害する。細胞カプセル封入のいくつかの方法が、使用され得る。いくつかの例において、細胞は、個々にカプセル封入されるであろう。他の例において、多くの細胞が同じ膜内にカプセル封入されるであろう。細胞カプセル封入のいくつかの方法は、European Patent Publication No. 301,777、またはU.S. Pat. No. 4,353,888、4,744,933、4,749,620、4,814,274、5,084,350、および5,089,272などに記載されるように、当技術分野において周知である。
【００９８】
細胞カプセル封入の一つの方法において、単離された細胞は、ゲルビーズまたは液滴を形成するために、アルギン酸ナトリウムと混合され、塩化カルシウム中に押し出し成型される。ゲルビーズは、膜を形成するために、高分子量（例えば、MW 60〜500 kDa）濃度（0.03〜0.1％ w/v）ポリアミノ酸（例えば、ポリ-L-リジン）とインキュベートされる。形成されたカプセルの内部は、クエン酸ナトリウムを使用して再度液化される。これは、比較的大きな分子（MW 約200〜400 kDa）に対して高度に透過性であるが細胞を内部に保持する単一の膜を、細胞の周りに形成する。カプセルは、捕捉されたアルギン酸ナトリウムが拡散し、カプセルが平衡状態に拡張するために、生理学的に適合性の担体中で数時間インキュベートされる。得られたアルギン酸除去カプセルは、膜透過性を減少する低分子量のポリアミノ酸と反応される（MWカットオフ  約40〜80 kDa）。
【００９９】
対象への導入の前に、DAニューロンは、免疫学的拒絶を阻害するために改変することができる。例えば、移植された細胞の拒絶を阻害するため、および移植レシピエントにおける免疫学的非反応性を達成するために、本発明の方法は、対象への導入前の細胞の表面上の免疫原性抗原の変更を含み得る。細胞上の1つまたは複数の免疫原性抗原を変更するこの段階は、単独で行っても、または対象におけるT細胞活性を阻害する剤を対象に投与することと組み合わせて行ってもよい。または、移植された細胞の拒絶の阻害は、移植された細胞の表面上の免疫原性抗原の以前の変更がない場合、対象におけるT細胞活性を阻害する剤を対象に投与することによって達成され得る。T細胞活性を阻害する剤は、対象内でT細胞の除去（例えば、隔離）または破壊を生じるか、または対象内でT細胞機能を阻害する剤として定義される。T細胞は、対象に依然として存在し得るが、それらが増殖またはエフェクター機能（例えば、サイトカイン産生、細胞毒性など）を誘発もしくは実施できないように、非機能的状態にある。T細胞活性を阻害する剤はまた、未成熟T細胞（例えば、胸腺細胞）の活性または成熟を阻害し得る。レシピエント対象におけるT細胞活性の阻害に使用するための適した剤は、例えば、シクロスポリンA、FK506、またはRS-61443などの正常免疫機能を阻害または干渉する免疫抑制剤である。投与され得る追加の治療剤は、ステロイド（例えば、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、およびデキサメタゾンなどのグルココルチコイド）を含む。
【０１００】
本発明者らは、ドーパミン作動性ニューロンの適切な生着、および症状の退縮または除去を達成するためには、ある閾値数の細胞が必要であることを示した。例えば、本発明者らは、およそ13,000個のドーパミン作動性ニューロンが、霊長類動物モデルにおけるパーキンソン病の症状を減少または除去し得ることを見出した。したがって、一つの態様において、移植組成物は、FOXA2、チロシンヒドロキシラーゼ、およびβ-チューブリンを発現する（例えば、A9表現型を有する）少なくとも7000個のドーパミン作動性ニューロンを含む。他の態様において、移植組成物は、少なくとも8000個、少なくとも9000個、少なくとも10,000個、少なくとも11,000個、少なくとも12,000個、少なくとも13,000個、少なくとも14,000個、少なくとも15,000個、少なくとも16,000個、少なくとも17,000個、少なくとも18,000個、少なくとも19,000個、少なくとも20,000個、少なくとも25,000個、少なくとも30,000個、少なくとも35,000個、少なくとも40,000個、少なくとも45,000個、少なくとも50,000個、少なくとも55,000個、少なくとも60,000個、少なくとも65,000個、少なくとも70,000個、少なくとも75,000個、少なくとも80,000個、少なくとも85,000個、少なくとも90,000個、少なくとも95,000個、少なくとも100,000個の、FOXA2、チロシンヒドロキシラーゼ、およびβ-チューブリンを発現するドーパミン作動性ニューロンを含む。
【０１０１】
パーキンソン病を処置および/または予防するために有用な移植組成物は、FOXA2、チロシンヒドロキシラーゼ、およびβ-チューブリンを発現するドーパミン作動性ニューロンの純粋な同種培養物であることを必要としないことは、当業者に認識されるであろう（データは示さず）。したがって、一つの態様において、移植組成物は、少なくとも2％の、FOXA2、チロシンヒドロキシラーゼ、およびβ-チューブリンを発現するドーパミン作動性ニューロンを含む。他の態様において、移植組成物は、少なくとも3％、少なくとも4％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、またはそれ以上の、FOXA2、チロシンヒドロキシラーゼ、およびβ-チューブリンを発現するドーパミン作動性ニューロンを含む。
【０１０２】
本発明者らは、他の細胞成分を含む、FOXA2、チロシンヒドロキシラーゼ、およびβ-チューブリンを発現するドーパミン作動性ニューロンの純粋でない混合物を含む移植組成物が、移植の際のドーパミン作動性ニューロンのより良い生着を有し、より良い処置およびパーキンソン病の症状の減少を生じることを見出した（データは示さず）。したがって、いくつかの態様において、移植組成物は、他の細胞成分の中で、75％未満、70％未満、65％未満、60％未満、55％未満、50％未満、45％未満、40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、9％未満、8％未満、7％未満、6％未満、5％未満、4％未満、3％未満、または2％未満の、FOXA2、チロシンヒドロキシラーゼ、およびβ-チューブリンを発現するドーパミン作動性ニューロンを含む。ある態様において、移植組成物は、1〜60％、1〜50％、1〜40％、1〜30％、1〜20％、1〜10％、1〜5％、20〜60％、30〜60％、40〜60％、10〜60％、10〜50％、10〜40％、10〜30％、10〜20％、20〜60％、20〜50％、20〜40％、20〜30％、30〜60％、30〜50％、30〜40％、40〜60％、40〜50％、5〜30％、5〜20％、5〜10％、2〜4％、4〜6％、10〜20％、30〜40％、40〜50％、50〜60％の範囲、またはそれらの間の任意の範囲の、FOXA2、チロシンヒドロキシラーゼ、およびβ-チューブリンを発現するドーパミン作動性ニューロンを含む。
【０１０３】
本発明者らはまた、パーキンソン病の症状を減少または除去するために必要とされる、ドーパミン作動性ニューロンの生着またはシナプス形成の閾値量が存在することを見出した（データは示さず）。典型的には、パーキンソン病の症状は、疾患が進行期に達し、ドーパミン作動性ニューロンの約60％が機能障害性または死滅に達するまで、すなわち、機能する細胞が40％未満になるまで、生じない。したがって、移植組成物は、例えば、少なくとも45％まで機能的ドーパミン作動性ニューロンの総数を増加することによって、パーキンソン病の症状を減少または除去することを目的とする。他の態様において、移植組成物は、ドーパミン作動性ニューロンの少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％まで機能的ドーパミン作動性ニューロンの数を増加させるために有用な数の細胞を投与するために、調整される。本発明者らはまた、機能しうる数のシナプスが形成されるまでパーキンソン病の症状が減少しないことを見出した。いくつかの態様において、正常対象における脳領域に存在するシナプスの少なくとも40％の形成または再形成を可能にするために必要とされる細胞の数に基づき、投与される細胞の数を調整することは、有用である。例えば、パーキンソン病の症状は、脳において通常観察される細胞またはシナプスの約40〜50％で機能的シナプスまたはニューロンが存在するまで、減少または軽減されない。したがって、ある態様において、移植組成物は、正常脳において観察される機能的シナプスの少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％の形成を達成するために調整される。
【０１０４】
ある態様において、移植組成物は、生着を改善し得るか、または組成物における細胞の生存性もしくは健康を改善し得る因子をさらに含む。そのような因子は、増殖因子、神経栄養因子、神経新生サイトカイン、または1つもしくは複数の分化因子であり得る。細胞がヒトに投与される場合、そのような因子は異種成分不含有であるべきである。一つの態様において、神経栄養因子は、移植組成物に添加される。例示的な神経栄養因子は、グリア細胞系由来神経栄養因子（GDNF）、ニュールツリン（NRTN）、アルテミン（ARTN）、およびパーセフィン（PSPN）を含むが、これらに限定されない。本明細書に記載される方法および組成物における使用のための例示的ニューロトロフィンは、神経増殖因子（NGF）、脳由来の神経栄養因子（BDNF）、ニューロトロフィン-3（NT-3）、およびニューロトロフィン-4（NT-4）を含むが、これらに限定されない。
【０１０５】
移植組成物がヒトに投与される場合、iPS細胞から分化されたドーパミン作動性ニューロンを含む培養物は、腫瘍または奇形腫を形成し得る細胞を除去されるべきである。そのような細胞の除去は、培養物から1つまたは複数の幹細胞マーカーを発現する細胞を除くことによって実施され得る。一つの態様において、培養物は、SSEAおよび/またはTRA160を発現する細胞を除去される。
【０１０６】
脳の特定の領域に移植組成物を投与することの複雑な性質を考慮し、本発明者らは、移植組成物が、一つには脳への局在性の損傷を最小限にするために、小さい体積であるべきことを見出した。組成物は、1を超える部位（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10）に投与され得、体積は、各部位に2回またはそれ以上の回数、注入され得る。したがって、いくつかの態様において、移植組成物は、2 mL未満、1.75 mL未満、1.5 mL未満、1.25 mL未満、1.0 mL未満、0.9 mL未満、0.8 mL未満、0.7 mL未満、0.6 mL未満、0.5 mL未満、0.4 mL未満、0.3 mL未満、0.2 mL未満、0.1 mL未満、またはそれより小さい体積である。
【０１０７】
細胞移植
移植は、同種（同一の種の遺伝的に異なるメンバー間）、自己（生物自身の細胞または組織の移植）、同系（同一の種の遺伝的に同一のメンバー間（例えば、一卵性双生児））、または異種（異なる種のメンバー間）であり得る。いくつかの態様において、免疫抑制剤の必要性を避けるために、自己移植が好まれる。典型的には、ドーパミン作動性ニューロンは、変性によりパーキンソン病（PD）を生じたドーパミン作動性ニューロンを置換するために、脳の黒質、腹側被蓋野（VTA）、尾状核、被殻、側坐核、視床下核、またはそれらの任意の組み合わせの中に移植される。A9ドーパミン作動性（DA）ニューロンの細胞体は黒質中に位置するが、それらの軸索は、ドーパミン放出が生じる前脳構造中に広がっているため、黒質、尾状核、または被殻中への移植が実施される。パーキンソン病の齧歯類モデルにおいて、A9 DA細胞の生着が、症状の減少などに関して最良の結果を有することが示されたことから、多くの場合において、A9 DAニューロンを含む組成物を移植することが望ましい。
【０１０８】
A10 DAニューロンを置換することが望ましい疾患状態において、DAニューロン（ES細胞のインビトロの分化から得られる）は、脳のVTA、側坐核、または両方の領域中に移植される。PDの後期において、認知行動障害は、脳の尾状核、大脳皮質深層、側坐核、および黒質領域における、DA損失およびシナプス機能障害から生じ得る。腹側被蓋DAニューロン表現型A10は、失ったA10 DA機能を置換するために、これらの領域に特異的に移植されるであろう。特に、尾状核への、A10 DAニューロンまたはA10 DAニューロンに分化するために刺激された細胞の移植は、好ましく且つ最も有効な置換であろう。
【０１０９】
神経変性疾患を有する患者の脳への本明細書に記載される組成物の移植は、失われたDAニューロン、非DAニューロン、または機能障害性DAニューロンの置換をもたらす。組成物は、疾患の少なくとも1つの有害作用または症状を少なくとも部分的に減少もしくは軽減させるように、機能障害性DAニューロンを置換するために適した量で、パーキンソン病を有する対象中に導入される。細胞は、少なくとも細胞の一部分が生き残っている対象において、所望の位置に細胞を送達する任意の適した経路によって、対象に投与され得る。少なくとも5％が生存していることが好ましい。他の態様において、細胞の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、または少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、またはそれ以上が、対象への投与後に生存している。対象への投与後の細胞の生存期間は、数時間、例えば、24時間〜数日と短くても、数週間〜数ヶ月と長くてもよい。対象にドーパミン作動性ニューロンを含む組成物を送達するために使用され得る移植方法は、Bjorklund et al.（Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:2344-2349, 2002）によって記載されている。DAニューロンは、緩衝生理食塩水などの生理学的に適合性の担体中で投与され得る。ヒト対象においてニューロン変性によって特徴付けられる障害を処置するために、DAニューロン集団は、細胞が、細胞の少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％がドーパミン作動性である細胞集団を患者中で形成するように、薬学的に許容される担体中25,000〜250,000細胞/マイクロリットルの懸濁液として、患者に導入される。好ましくは、懸濁液は、50,000〜200,000細胞/マイクロリットルである。より好ましくは、懸濁液は、75,000〜150,000細胞/マイクロリットルである。
【０１１０】
いくつかの態様において、対象は、本明細書に記載される方法（例えば、UPDRSまたはPETスキャニングを使用した評価）に従って、移植組成物を投与する前に、パーキンソン病を有するとはじめに診断される。いくつかの態様において、対象は、細胞を投与する前に、パーキンソン病を発症するリスクがあるとはじめに診断される（例えば、パーキンソン病の家族歴を有する対象、またはパーキンソン病に対する素因を示す遺伝的パターンを有する対象）。
【０１１１】
本明細書に記載される局面のいくつかの態様において、移植組成物の細胞は、ドーパミン作動性ニューロンの分化前およびそれを必要とする対象への投与前に、培養物中において増殖される。
【０１１２】
これらの投与方法を達成するために、移植組成物は、対象への細胞の注入または植え込みによる導入を促進する送達デバイスに挿入され得る。典型的には、細胞は、細胞懸濁液として標的領域に注入される。または、そのような送達デバイスに入れられる場合、DAニューロンは固体または半固体の支持マトリックス中に埋め込まれ得る。
【０１１３】
溶液は、本発明の細胞が生存可能なままである薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。薬学的に許容される担体および希釈剤は、生理食塩水、水性緩衝溶液、溶媒、および/または分散媒を含む。そのような担体および希釈剤の使用は、当技術分野において周知である。溶液は、好ましくは、無菌であり、流体である。好ましくは、溶液は、製造および貯蔵の条件下で安定であり、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、またはチメロサールの使用を通じて、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護される。本明細書に記載される方法および組成物に用いる使用のための溶液は、薬学的に許容される担体もしくは希釈剤、および必要な場合には他の成分中に、本明細書に記載される細胞を組み入れることによって、調製され得る。
【０１１４】
本明細書に記載されるDAニューロンが取り込まれ得、または埋め込まれ得る支持マトリックスは、レシピエント適合性であり、且つレシピエントに対して有害でない産物に分解するマトリックスを含む。天然および/または合成生分解性マトリックスは、そのようなマトリックスの例である。天然生分解性マトリックスは、例えば、コラーゲンマトリックスを含む。合成生分解性マトリックスは、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの合成ポリマーを含む。これらのマトリックスは、インビボで細胞に対して支持および保護を提供する。
【０１１５】
いくつかの態様において、移植方法は、当初の移植が生着することを可能にするための所定の時間間隔の後（例えば、最初の処置の後少なくとも3ヶ月、少なくとも4ヶ月、少なくとも5ヶ月、少なくとも6ヶ月、少なくとも1年、少なくとも18ヶ月、少なくとも2年、少なくとも3年、またはそれ以上）、繰り返される。繰り返される処置は、例えば、パーキンソン病を減少または除去するために必要な閾値レベルの生着を可能にするために、実施され得る。いくつかの態様において、方法は、2回、3回、4回、5回、またはそれ以上、繰り返される。
【０１１６】
有効性測定
本明細書に使用される、用語「有効量」は、少なくとも1つまたは複数のパーキンソン病の症状を軽減するために必要とされる、FOXA2、β-チューブリン、およびチロシンヒドロキシラーゼ（TH）を発現するドーパミン作動性ニューロン集団の量を意味し、所望の効果を提供するために十分な量の組成物に関する。本明細書に使用される有効量はまた、疾患の症状の発症を予防もしくは遅延する（例えば、これらに限定されないが、動作の開始の困難性などの、疾患の症状の進行を遅くする）か、疾患の症状を変化させるか、または疾患の症状を逆転するために十分な量を含む。任意の所与の場合において、適切な「有効量」は、日常的な実験法を使用して、当業者によって決定され得る。脳の複雑さおよび細胞生着の予測不可能性を考慮すると、細胞の「有効量」は異なる患者間で多様であり得るが、当業者は、投与される細胞の量が実際に「有効量」であるかを後知恵として容易に決定し得ることが理解される。したがって、さらなる処置は、それに応じて改変され得る。
【０１１７】
処置の有効性は、熟練した臨床医によって決定され得る。しかし、パーキンソン病の症状の1つもしくは全て、または他の臨床的に許容される症状もしくはマーカーが、例えば、本明細書に記載される、FOXA2、β-チューブリン、およびチロシンヒドロキシラーゼを発現するドーパミン作動性ニューロンを含む組成物での処置の後、少なくとも10％まで減少される場合、処置は、本明細書において使用されるように、「有効な処置」とみなされる。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、且つ/または本明細書に記載される。
【０１１８】
パーキンソン病の指標は、動作を開始するための時間の増加、振戦、筋肉の硬直、起立困難、歩行困難、不随意運動、筋硬直、障害性協調、引きずり歩行、眩暈、平衡障害、健忘、錯乱、表情の減少、嚥下困難、流涎、意図していないもがきなどを含む。
【０１１９】
一つの態様において、有効な処置は、パーキンソン病の症状の十分な制御を維持するために、必要とされるL-ドパなどの薬理学的処置の用量の減少によって決定される。
【０１２０】
一つの態様において、処置の有効性は、統一パーキンソン病評価尺度（UPDRS）を使用してモニターされる。
【０１２１】
本発明は、以下の番号付けされた項目のいずれか一つにより定義されるであろう。
1.（a）少なくとも3％のドーパミン作動性ニューロンを含む細胞集団であって、該ドーパミン作動性ニューロンが、FOXA2、β-チューブリン、およびチロシンヒドロキシラーゼ（TH）を発現する、細胞集団；
（b）神経栄養因子；ならびに
（c）薬学的に許容される担体
を含む、パーキンソン病の処置および/または予防のための組成物。
2.神経栄養因子が、グリア細胞系由来神経栄養因子（GDNF）、ニュールツリン（NRTN）、アルテミン（ARTN）、およびパーセフィン（PSPN）からなる群より選択される、項目1の組成物。
3.神経栄養因子が、GDNFである、項目1または2の組成物。
4.細胞集団が、少なくとも20％のドーパミン作動性ニューロンを含む、項目1、2、または3の組成物。
5.細胞集団が、4〜40％のドーパミン作動性ニューロンを含む、項目1〜4のいずれか一つの組成物。
6.細胞集団が、奇形腫形成細胞を含まない、項目1〜5のいずれか一つの組成物。
7.奇形腫形成細胞が、TRA60および/またはSSEAを発現する、項目1〜6のいずれか一つの組成物。
8.薬学的に許容される担体が、人工脳脊髄液である、項目1〜7のいずれか一つの組成物。
9.ドーパミン作動性ニューロンが、分裂終了細胞である、項目1〜8のいずれか一つの組成物。
10.体積が1 mL未満である、項目1〜9のいずれか一つの組成物。
11.細胞集団が、少なくとも10,000個のドーパミン作動性ニューロンを含む、項目1〜10のいずれか一つの組成物。
12.異種成分不含有である、項目1〜11のいずれか一つの組成物。
13.ドーパミン作動性ニューロンが、フットプリント不含有である、項目1〜12のいずれか一つの組成物。
14.ドーパミン作動性ニューロンが、Gタンパク質内向き整流性カリウムチャネル（GIRK）-2をさらに発現する、項目1〜13のいずれか一つの組成物。
15.項目1の組成物を、それを必要とする対象の尾状核、被殻、側坐核、または視床下核に投与し、それにより、パーキンソン病を処置および/または予防する段階
を含む、パーキンソン病を処置および/または予防するための方法。
16.組成物が、被殻に投与される、項目15の方法。
17.組成物が、両側性に投与される、項目15または16の方法。
18.組成物が、定位的注入を使用して投与される、項目15、16、または17の方法。
19.対象が、パーキンソン病を有すると診断されている、および/またはポジトロン放出断層撮影（PET）スキャニングによって移植後にモニターされる、項目15〜18のいずれか一つの方法。
20.統一パーキンソン病評価尺度（UPRDS）を使用して、成功した移植について対象が診断またはモニターされる、項目15〜19のいずれか一つの方法。
21.対象がヒトである、項目15〜20のいずれか一つの方法。
22.方法が繰り返される、項目15〜21のいずれか一つの方法。
23.対象がパーキンソン病の症状を実質的に有さなくなるまで、方法が繰り返される、項目22の方法。
24.被殻において通常観察される機能的ドーパミン作動性シナプスの少なくとも60％を回復させる、項目22の方法。
25.症状の十分な臨床的制御を達成するために、対象が必要とするL-ドパの用量を減少させる、項目15〜24のいずれか一つの方法。
26.（a）パーキンソン病の症状を制御するために、L-ドパを受容している対象の尾状核、被殻、側坐核、または視床下核に項目1の組成物を投与する段階；
（b）ドーパミン作動性ニューロンの生着および/またはL-ドパに関連する副作用について対象をモニターする段階；ならびに
（c）パーキンソン病の症状の十分な臨床的制御を維持しながらL-ドパに関連する副作用を減少させるために、必要とされるL-ドパの用量を減少させるかまたは除去する段階
を含む、症状の十分な臨床的制御を達成するために、パーキンソン病患者が必要とするL-ドパの用量を減少させるための方法。
27.図10に概略される段階を含む、パーキンソン病を処置および/または予防する方法。
28.（a）対象から得られた体細胞をiPS細胞にリプログラミングする段階；
（b）iPS細胞のドーパミン作動性ニューロンへの分化を促進するために、iPS細胞を、レチノイン酸、ヒトSHH、およびFGF8Aに接触させる段階であって、該ドーパミン作動性ニューロンが、FOXA2、β-チューブリン、およびチロシンヒドロキシラーゼを発現する、段階；ならびに
（c）奇形腫形成細胞である段階（b）の細胞集団を除去する段階
を含む、方法。
29.段階（c）の細胞集団が、FOXA2、β-チューブリン、およびチロシンヒドロキシラーゼを発現する少なくとも4％のドーパミン作動性ニューロンを含む、項目28の方法。
30.ドーパミン作動性ニューロンが、GIRK2をさらに発現する、項目28または29の方法。
31.TRA160および/またはSSEAを発現する細胞を除くことによって、段階（b）の細胞集団から奇形腫形成細胞が除去される、項目28、29、または30の方法。
32.体細胞が、末梢血単核細胞（PBMC）または線維芽細胞である、項目28〜31のいずれか一つの方法。
33.段階（b）または段階（c）の細胞集団を凍結および解凍する段階をさらに含む、項目28〜32のいずれか一つの方法。
34.段階（c）の除去後の培養物を薬学的に許容される担体と混合する段階をさらに含む、項目28〜33のいずれか一つの方法。
35.パーキンソン病の処置および/または予防のための、項目1〜14のいずれか一つの組成物の使用。
【実施例】
【０１２２】
実施例1：パーキンソン病の非ヒト霊長類モデルにおける移植後の自己iPSC由来のドーパミンニューロンの成功した機能
概要
患者特異的な人工多能性幹細胞（iPSC）由来のニューロンの自己移植は、神経学的疾患の処置のための見込みのある臨床的アプローチである。非ヒト霊長類モデルにおけるiPSC由来のドーパミンニューロンの長期間の有効性、実現可能性、および安全性の前臨床的証明は、細胞療法の臨床開発において重要な段階である。ここで、カニクイザル（CM）が、パーキンソン病（PD）モデルとして使用され、iPSC由来の中脳ドーパミンニューロンの自己移植後2年まで解析された。最も成功したプロトコールでの動物において、CM-iPSCの片側性生着が、免疫抑制を必要とせずに、ドーパミンニューロン移植側と対側の機能的運動改善を徐々に生じ、運動活性を増加したことが見出された。死後解析は、中脳様ドーパミン作動性ニューロンの強力な生存および移植された被殻中への広範囲の伸長を示した。
【０１２３】
結果
細胞療法は、パーキンソン病（PD）における黒質（SN）ドーパミンニューロンの変性などの、その症状が特定の細胞型の損失によって定義される神経変性疾患における細胞の特定の集団を置換するための興味深い機会を提供する。自己細胞起源としての人工多能性幹細胞（iPSC）由来のニューロンの使用は、PDにおいて同種ドナー細胞によって引き起こされる現在の制限を解消する。胎児腹側中脳同種移植片は、18年を超える間、ヒトPD脳において生存し、機能し得る（C.R. Freed et al., 2013, Soc. Neurosci., abstract；Hallett et al., 2014；Kefalopoulou et al., 2014；Mendez et al., 2005；Politis et al., 2010）；しかし、そのような技術は、人工妊娠中絶からの胎児ドナー組織を必要とするため、患者にとって容易に選択可能な治療選択肢にはなり得ないであろう。脳における同種移植はまた、同質遺伝子的移植と比較して、時間と共に、より大きな免疫反応を生じる（Duan et al., 1995；Morizane et al., 2013）。患者特異的なiPSCに由来する中脳様ドーパミンニューロンの生成およびその後の自己移植は、PDにおける細胞置換のための合理的な長期的ストラテジーである。非ヒト霊長類 PDモデルにおける自己移植の以前の報告は、同種移植片にまさる自己移植片の利点を示し、移植後6ヶ月〜1年までの間、霊長類脳におけるドーパミンニューロンの生存を示した（Emborg et al., 2013；Morizane et al., 2013；Sundberg et al., 2013）。しかし、PD非ヒト霊長類モデルにおける自己移植後のiPSC由来のドーパミンニューロンの長期間の機能、生存、および安全性は、未だ確立されていない。
【０１２４】
全ての試験は、ハーバード・メディカル・スクールの実験動物審査委員会（Harvard Medical School Institutional Animal Care and Use Committee）（IACUC）によって承認された。カニクイザル（CM）においてパーキンソニズムを誘導するために、全身性低用量の1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン（MPTP）が投与され、振戦、硬直、運動緩慢、運動低下、体位/平衡障害、ならびに全体的および微細な運動技能の両方の機能障害を含む、全体運動活性の進行性および持続性の減少ならびに安定な両側性パーキンソン病の症候群を生じた（図6）（Brownell et al., 1998a；Hantraye et al., 1992；Wullner et al., 1994）。以前に記載されたように、全ての動物は、11C-（2b-カルボメトキシ-3b-（4-フルオロフェニル）トロパン）（11C-CFT）結合能によって測定された被殻におけるドーパミントランスポーター（DAT）の著しい損失を示した（Brownell et al., 1998a）。連続する一連の試験において、3匹のMPTP損傷CM（MF25-04、MF66-02、およびMF27-04）は、生着した自己iPSC由来のドーパミンニューロンの機能および生存を評価するために、被殻へのCM-iPSC由来の神経細胞の自己移植を受けた。MF25-04からのCM-iPSCは、Cooper et al.（2010）のプロトコールを使用して分化され、MF27-04およびMF66-02からのCM-iPSCは、Sundberg et al.（2013）のプロトコールを使用して分化された。この試験の動物は、試験期間に如何なる免疫抑制も受けなかった。
【０１２５】
全体的な昼間の運動活性は、自動化された活性モニターを使用して、iPSC由来の神経細胞の自己移植を受けたMPTP損傷CMにおいて測定された（図1A）。移植後6ヶ月において、動物MF25-04（自己iPSC移植片）における昼間活性カウントは、ベースライン値と比較した（移植片と対側の）上肢運動機能であり、MF25-04における移植後12ヶ月まで観察され、この減少は、移植後24ヶ月で有意に達した（p＜0.05、一元配置ANOVA）。MF25-04における右上肢運動機能の使用は、移植処置後24ヶ月を超えても有意に変化しなかった。パーキンソン病の兆候の重症度はまた、パーキンソン病の評価尺度を使用して、毎月評価された（図6）。MF25-04におけるパーキンソン病の評価尺度の運動低下小区分の減少が観察された；移植前のスコア2から（最大可能スコアは3である）移植後12ヶ月でのスコア0、これは、試験完了時まで0で安定したままだった（表1）。全体としては、MF25-04において観察された経時的な機能回復は、類似の胎児非ヒト霊長類ドーパミンニューロンの発生的成熟、伸長、および結合性と一致した（Redmond et al., 2008；Tsui and Isacson, 2011）。動物MF27-04およびMF66-02では、分化されたCM-iPSCの自己移植後1〜2年において、全体運動活性、MAP試験時間、または運動低下における著しい変化は観察されず（図2A；図6）、生着したCM-iPSC由来の中脳ドーパミンニューロンの生存および移植された被殻の神経再支配が不十分であることが示される（Grealish et al., 2010；Redmond et al., 2008）。運動行動はまた、以前に記載されたように、分化された霊長類胚性幹（ES）細胞（Cyno-1）での同種移植を受けた、免疫抑制を行わないMPTP損傷CMにおいて解析され（Sanchez-Pernaute et al., 2005）、50個未満の生存ドーパミン作動性ニューロンが、移植された被殻中で死後に検出され（「非生存移植片」群と呼ぶ）（n＝3）、非移植MPTP損傷CMにおいてもそうであった（n＝4）（図6）。非生存移植片群において、動物は、移植処置後、試験終了までの12ヶ月間追跡され；この期間にこれらの動物において運動行動における有意な変化は観察されなかった（図2A）。運動行動はまた、この両側性MPTP非ヒト霊長類モデルの長期間の機能安定性と一致して、パーキンソン病の動物の非移植対照群において2年の期間を超えて変化しなかった（図2A）（Brownell et al., 1998a；Hantraye et al., 1992；Wullner et al., 1994）。
【０１２６】
MF25-04 iPSC自己移植片ケースにおいて、パーキンソン病の運動症状における機能改善が観察されたため、CM-iPSC由来の神経細胞の移植2年後に、尾状核および被殻におけるドーパミン神経末端を評価するために、11C-CFT-PETスキャニングが実施された（Brownell et al., 1998a；Hantraye et al., 1992；Jenkins et al., 2004）。移植2年後に、非移植左被殻と比較して、右被殻において、11C-CFT結合部位の著しい増加が観察され、これは、移植側の機能的ドーパミン作動性ニューロンを示す（図2C）。
【０１２７】
MF25-04における機能的移植片を示す運動改善およびポジティブな神経画像を考慮し、移植片生存および形態学の詳細な死後検査を、移植2年後に実施した。脳の巨視的検査は、宿主線条体実質の置換または圧迫なしに、被殻および正常線条体細胞構造内で移植片沈着部位を示した。DATの免疫組織化学的標識は、DAT免疫反応性（-ir）ドーパミンニューロンのクラスターを含む被殻における2つの異なる領域を示した（図2D）。移植されたおよび移植されていない全被殻の顕微鏡的画像化は、非移植側と比較して、移植された被殻において著しく増加したDAT標識を示し、これは、生着したCM-iPSC由来のドーパミン作動性ニューロンに由来する移植された被殻の強力な神経再支配を示す。
【０１２８】
TH-irドーパミンニューロンの立体解析学的細胞カウントは、被殻において13,029個の生存している移植されたドーパミン作動性ニューロンの存在を示した。生着したTH-irニューロン（図2E）は、移植片の周辺に主に位置し、齧歯類およびヒト胎児VM移植片のケースにおけるA9様ドーパミンニューロンのパターンと類似して、宿主被殻中に軸索を伸ばした（Mendez et al., 2005；Vinuela et al., 2008）。比較として、CM MF27-04（Sundberg et al., 2013）およびMF66-02の移植された被殻における、生存しているTH-irドーパミンニューロンの数もまた決定された。これらのケースは、iPSC由来のドーパミンニューロンの自己移植を受けたが、MF25-04と対照的に、移植後1〜2年において如何なる機能改善も示さなかった。MF27-04およびMF66-02の移植された被殻において、それぞれ、合計8,551個および7,938個のTH-ir ドーパミンニューロンが存在した。MF25-04、MF27-04、およびMF66-02の移植片からの被殻へのTH-ir線維の伸長の比較は、この動物において観察された機能回復と一致して、MF25-04においてより広範なドーパミン作動性の神経再支配を示した（図5A〜5C）。これらのデータは、移植された被殻の適切な神経支配と共に、十分な数の移植された中脳ドーパミンニューロンが生存する場合は、運動機能における改善が達成され、十分な生存が存在せず（13,000個未満のドーパミンニューロン）、被殻のドーパミン軸索神経再支配が不良である場合は、CMは回復しないことを示す。これらのデータはまた、この一連のiPSC移植において、Cooper et al.（2010）のニューロン分化プロトコールが最も成功したことを示す。ドーパミンニューロン移植は、線条体における十分な数の適切なA9ドーパミン作動性ニューロン（およびそれらのシナプス）を提供するために適応したレベルにおいて作用し、動作（機能）を開始する。これと一致して、ラット片側性PDモデルにおける胎児ドーパミンニューロン移植の後、新しい線条体ドーパミン作動性シナプスの閾値（無傷の線条体の75％〜85％）が達せられて初めて行動回復が生じることが、以前に示されている（Brownell et al., 1998b）。PDにおける臨床的使用のためのiPSC由来の中脳様ドーパミンニューロンの開発の際には、PD運動症状の改善のために、移植された中脳様ドーパミンニューロンの必要最少量の生存（Grealish et al., 2014）および除神経された被殻の十分な神経再支配の必要性を考慮に入れることが不可欠であろう。
【０１２９】
FOXA2/TH/bIIIチューブリン標識化の共局在により、MF25-04の移植片における中脳様ドーパミンニューロンの存在が確認された（図3A）。別々のFOXA2/TH標識化が、3つのCM-iPSC移植片（MF25-04、MF27-04、およびMF66-02）の各々において並行して実施され、MF27-04およびMF66-02における移植片と比較して、MF25-04の移植片において、より高頻度のFOXA2/TH共標識された（中脳様）ドーパミンニューロンを示した（図5D〜5F）。移植されたTH-ir細胞体および突起に沿ったDATの点状発現により、MF25-04における成熟シナプスの形成が確認された（図3B）。ニューロンの健康状態の追加の評価基準のために、TH-irニューロン内のミトコンドリアの局在が、ミトコンドリアマーカーであるミトコンドリア外膜トランスロカーゼ20（TOM20）を使用して評価された（Hallett et al., 2014）。MF25-04における移植されたニューロンの細胞体および突起の至る所にTOM20-irミトコンドリアの均質な局在が観察され（図3B）、ドーパミンニューロンストレスまたは変性の間、以前に報告されたような、ミトコンドリアの核周囲の蓄積または断片化の証拠は存在しなかった（Sterky et al., 2011）。
【０１３０】
5HTに対する免疫蛍光標識化（図3C）は、CMiPSC由来の移植片のケースであるMF25-04に含まれるセロトニン作動性ニューロンを試験するために実施された。セロトニン作動性ニューロンは分布状態で観察され、齧歯類およびヒト胎児VM移植片に関して以前に報告された（Mendez et al., 2008；Vinuela et al., 2008）。DARPP-32を使用した移植された被殻における線条体中型有棘GABA作動性ニューロンに対する標識（図3D）は、胎児VM組織において以前に報告されたような、いくつかの移植片-宿主相互作用を示唆する移植片-宿主境界で、宿主被殻核周部および低密度のDARPP-32-ir線維において、強いDARPP-32標識を示した（Doucet et al., 1989）。増殖マーカーであるKi-67による免疫染色は、移植24ヶ月後、陽性標識された細胞を移植片中に示さなかった（図3Eおよび3F）。陽性対照として、いくつかのKi-67標識細胞が、同動物（MF25-04）の歯状回において観察された。これらのデータは、移植4週後に低いパーセンテージのKi-67-ir細胞が観察されたが、成熟移植片（移植16週後）においてはKi-67-ir細胞は見出されなかったという、ラットにおけるCM-iPSC由来の神経細胞異種移植を用いた本発明者らの以前の研究（Deleidi et al., 2011）と一致する。
【０１３１】
Iba1に対する免疫組織化学を使用したミクログリア反応性の組織学的解析は、CM-iPSC由来の移植片内のミクログリア細胞密度における限局性の増加を示した（図3G、図3H、図5H、および図5I）。しかし、Iba1標識化は、「非生存」移植片群の穿刺経路において観察されたものと相違せず（図5G）、自己iPSC移植片の周囲の宿主被殻における免疫反応は存在しなかった。以前の報告は、自己移植と比較して、同種iPSC由来の神経細胞が、非ヒト霊長類脳への移植後およそ4ヶ月で、より高いミクログリア活性化、ならびにMHCII（クラスII主要組織適合複合体）ミクログリア発現および白血球の浸潤を誘発することを示している（Morizane et al., 2013）。したがって、免疫抑制を必要としない自己移植の経路は、ドナーに完全に一致しない細胞起源の使用よりも、細胞療法のためのより成功した経路である。この研究は、成功したケースにおいて、ドーパミンシナプス神経支配が、パーキンソニズムにおける予測された神経学的改善を伴うことを示す。しかし、機能改善の閾値に達するために、およそ13,000個の霊長類中脳ドーパミンニューロンが必要であった。この研究のさらなる最適化は、例えば、中脳ドーパミンニューロンの用量を増加させることによって、同等またはより高い中脳ドーパミンニューロン生存を提供するための、および、例えば臨床試験における、大規模な使用に拡大するための、一貫したプロトコールの生成を含み得る。
【０１３２】
本発見は、PDの非ヒト霊長類モデルにおいて、自己iPSC由来の中脳様ドーパミンニューロンが生着し得、長い期間（少なくとも2年）にわたり生存し得、かつ運動機能を改善し得ることを示すための、前臨床概念研究の初めての証明を提供する。そのような自己iPSC由来のドーパミンニューロンは、如何なる免疫抑制もなく、除神経された被殻の顕著且つ完全な神経再支配を提供し得る。本発明者らは、本発明者らの以前の研究および他者による研究を含む今日までの研究において報告されたうちで、最も広範な、インビボでのiPSC由来ドーパミンニューロンの生着後のドーパミン作動性軸索伸長を観察した（Emborg et al., 2013；Kikuchi et al., 2011；Sundberg et al., 2013）。加えて、現在の研究において、iPSC由来の神経細胞を使用した以前の齧歯類の試験と一致して、移植片過増殖、腫瘍形成、または炎症反応のいずれも観察されなかった（Hargus et al., 2010；Sundberg et al., 2013；Wernig et al., 2008）。
【０１３３】
自己移植の使用についての一般的関心事は、移植されたニューロンに存在する、根源的なPD関連遺伝的変異が、中脳ドーパミン作動性ニューロンの疾患症状に対する脆弱性を増加するかどうかである。しかし、そのような脆弱性は、（PDケースの少数を表す）そうした遺伝的リスクを有する典型的患者において、出生から少なくとも50〜60年間、極めて最適レベルで細胞機能を妨げない。加えて、理論に拘束されることは望まないが、宿主脳における疾患プロセスの進行にかかわらず、移植された胎児ニューロンがPD患者においてどれだけ長期間健康を維持するのかを考慮すれば（Hallett et al., 2014）、重度な遺伝的リスクを有するケースにおいてさえ、iPSC由来のニューロンは合理的なストラテジーであることが予測される。
【０１３４】
要約すると、本研究は、前臨床的状況において、iPSC由来のドーパミンニューロンを使用した移植のための概念の証拠を明確に示す。そして、iPSC移植が臨床的利点を提供するであろうと推測することは合理的であり、胎児移植で観察されたものと類似の移植片生存時間が期待される（Barker et al., 2013；Hallett et al., 2014；Kefalopoulou et al., 2014）。ポジティブな神経画像を伴う神経学的に妥当な機能改善を示すデータは、iPSCを使用した細胞療法の継続的開発および臨床への変換のために不可欠である。全体として、PDにおける細胞置換のためにiPSC由来の中脳ドーパミンニューロンを使用することに対して、強力な免疫学的、機能的、および生物学的な理論的根拠が存在する。異なる（非ニューロン）細胞型の生成を使用し評価するため、およびPD患者への移植に使用されるiPSC由来の中脳ドーパミンニューロンの生成のための臨床プロトコールを改良し続けるために、最適且つ最も安全なドーパミンニューロン分化プロトコールを決定するために、方法の最適化が実施され得る。
【０１３５】
参考文献
2018506559.tif 000003
【０１３６】
例示的方法および材料
CM-iPSCの生成および中脳様ドーパミンニューロンへの分化
カニクイザル（CM）iPSCは、3匹の成体雄性モーリシャスCM、MF25-04、MF66-02、およびMF27-04から、以前に記載されたように生成された（Deleidi et al., 2011；Sundberg et al., 2013）。FOXA2ドーパミンニューロンへの細胞の底板領域形成を支持する確立された分化プロトコールを使用して、MF25-04からのCM-iPSCは、インビトロで49日を超えて、MF66-02およびMF27-04からのCM-iPSCは、インビトロで30日を超えて、中脳様ドーパミンニューロンに分化された（Cooper et al., 2010；Sundberg et al., 2013）。インビトロの幹細胞の正常な発生的な領域特殊化は培養物に添加された分化因子に基づいており、使用された分化プロトコールに関わりなく、細胞表現型の類似の比率が期待される（例えば、Cooper vs. Sundberg）。さらに、分化プロトコールにおいて生成されたドーパミン作動性ニューロンのおよそのパーセンテージ（5〜10％）は、発生中の中脳におけるドーパミン作動性ニューロンの正常なパーセント含量と類似する（Isacson et al., 1995）。Cooper et al., 2010のCM系MF25-04の分化を使用して、47日目、移植の2日前に、細胞の51％がβIII-チューブリン-免疫反応性（-ir）ニューロンであり、7％がチロシンヒドロキシラーゼ（TH）-irドーパミン作動性ニューロンであった。細胞の2％が、THおよびFOXA2（胚性脳構造である底板のマーカー）に対して標識された。分化された培養物は、残存する未分化iPSCの不在を示すOct4に対して陰性に染色された。Sundberg et al., 2013のCM系MF27-04およびMF66-02の分化を使用して、インビトロの移植前データは、28日目、移植の2日前に、細胞の21〜23％がβIII-チューブリン-irニューロンであり、9％がTH-irドーパミン作動性ニューロンであったことを示した。細胞の1〜2％が、THおよびFOXA2に対して標識化された。移植前の細胞の生存性は、0.4％のトリパンブルー溶液（Sigma-Aldrich（登録商標））を使用した色素排除染色を使用して計算された。非標識（生）細胞の数（血球計数器を用いて手動でカウントされた）は、全（死＋生）細胞におけるパーセンテージとして表された。
【０１３７】
両側性PDのMPTP非ヒト霊長類モデルおよび行動解析
MPTPの全身注入を使用したCM（n=10）における両側性パーキンソニズムの誘導は、以前に記載されたように実施された（Astradsson et al., 2009；Brownell et al., 1998；Hantraye et al., 1992；Wullner et al., 1994）。動物は、ニューイングランド霊長類研究センター（New England Primate Research Center）（NEPRC）にて個々のホームケージに収容された。全ての試験は、ハーバード・メディカル・スクールの実験動物審査委員会（IACUC）によって承認された。
【０１３８】
簡単に言うと、動物は、生理食塩水で希釈された低用量のMPTP（Sigma-Aldrich（登録商標））を1〜2週間毎に、用量当たり0.15〜0.3mg/kgで静脈内投与された。MPTP投与の期間または用量は、安定な両側性パーキンソニズムが達成されるまで、個々の動物に合わせて実施された（Brownell et al., 1998；Jenkins et al., 2004；Sanchez-Pernaute et al., 2005）。MPTPは、平均10±3週（3〜28週の範囲）の間、投与され、平均累積MPTP用量は、3.42±0.9 mg/kg（0.9〜8.55 mg/kgの範囲）であった。パーキンソン病の運動症状は、統一パーキンソン病評価尺度（UPDRS）の運動下位尺度から改変されマカクのために開発されたパーキンソン病の評価尺度（PRS）を使用して、（MPTP投与の間は毎週、安定なパーキンソニズムが確立された後は毎月）等級付けされた（Imbert et al., 2000）。パーキンソン病の評価尺度は、最も重度である24を含む、0〜24の範囲であった。全体運動活性スコアは、2〜4ヶ月毎に1回、1週間装着された活性モニター（AW64 Actiwatch, Philips Electronics）を使用して収集され（Mann et al., 2005）、微細な運動技能は、コンピュータ化された到達動作解析パネル（MAP）タスクを使用して評価された（Gash et al., 1999）。細胞移植パラダイム（以下参照）は、安定なパーキンソン病のベースラインに達する2〜4年以内に開始された。
【０１３９】
運動行動の統計的解析
統計的解析は、GraphPad Prism（Version 4.0）（GraphPad Software, Inc）を使用して実施された。MAPタスクを使用して、左または右の微細な運動技能を経時的（移植前、移植後12ヶ月、および移植後24ヶ月）に解析するために、一元配置ANOVAの後、 Tukeyの多重比較試験が実施された。全ての試験は、p＜0.05で有意とみなした。
【０１４０】
ドーパミントランスポーター（DAT）機能のための神経画像化、および解剖学的MRI
被殻におけるドーパミン再取り込みを、以前に記載されたように、MPTP投与の前、安定なパーキンソン病の段階での最終MPTP投与の少なくとも3ヶ月後、およびMF25-04においてCM-iPSC由来の神経細胞の移植の2年後に、PET試験およびDATトレーサー11C-CFTの結合によって測定した（Brownell et al., 1998）。
【０１４１】
CM-iPSCまたはCyno-ES由来の細胞のいずれかの移植の前に、各動物は、脳の構造画像化のための磁気共鳴画像化（MRI）を行った。移植のための定位座標は、手術のために使用された同じ定位フレームに置かれた動物で得られたサル脳の3D再構築によるMRI T2強調冠状画像およびT1強調軸性画像において、e-フィルムバージョン1.8.3（Merge eFilm, Milwaukee）を使用して定義された。
【０１４２】
CM-iPSC由来の神経細胞の移植
交連後の被殻における4つの注入部位は、前交連（AC）から後方へ増加する距離（ミリメートルで表す）によって、前後AC-1、AC-3、AC-5、およびAC-7として定義された。手術は無菌条件下で実施された。麻酔は、ケタミンで誘導され、挿管によるイソフルラン麻酔により維持された。頭部皮膚調製の後、標的領域の曝露を可能にするために正中皮膚切開が実施され、したがって、筋肉および筋膜は、頭蓋表面を曝露するために後退され、標的領域に穿頭孔が開けられた。細胞懸濁液は、丸い先端の20G Hamilton針を使用して、各管における注入の結果として8分の待ち時間で、各前後部位で4mmに沿ってゆっくり注入された（2μl/分）。合計1000万個の神経細胞が、MF25-04の右の交連後の被殻に移植され、100,000細胞/μlの密度で4つの注入管中に均一に分布された。MF66-02およびMF27-04 CM iPSCから分化された合計4000万個の神経細胞は、右（MF66-02）または左（MF27-04）交連後の被殻中に移植され、4つの注入管中に200,000細胞/μlの密度で均一に分布された。
【０１４３】
注入の完了後、手術部位を洗浄し、穿頭孔を骨ろうで塞ぎ、筋膜、筋肉、および皮膚を、面内で縫合した。動物は、セファゾリン（12時間当たり20 mg/kg、筋肉内）およびデキサメタゾン（1 mg/日、筋肉内）を5日間、鎮痛剤（12時間当たりブプレノルフィン0.005 mg/kg、筋肉内）を3日間、受容した。シクロスポリンは与えられなかった。コルチコステロイドは、浮腫および炎症を減少させるために、通常の神経外科的なプラクティスとして、手術後に3日間、与えられた。動物は合併症を示さず、移植後2年まで追跡調査された。この試験の動物は、試験期間に如何なる免疫抑制も受けなかった。
【０１４４】
対照移植動物
3匹のパーキンソン病のCMは、以前に記載されたように、2〜600万個の分化された単為発生ES細胞（Cyno-1）の被殻内同種移植を受けた（Sanchez-Pernaute et al., 2005）。動物は、死後の組織学的解析の前に、移植後1年間、追跡調査された。移植片の生存解析は、各動物における移植片が、少なくとも50個の生存ドーパミンニューロンという本発明者らの基準に合格しなかったことを示し、この一連の動物は、これ以降、「非生存移植片」群として定義された。
【０１４５】
非移植対照動物
4匹のMPTP損傷パーキンソン病のCMは、非移植対照動物として、並行してこの試験に使用された。これらの動物は、安定なパーキンソニズムの誘導後2年間、上記の運動行動およびパーキンソニズムの解析のために追跡調査された。
【０１４６】
免疫細胞化学および免疫組織化学
ドーパミンニューロンの移植前解析のために、培養細胞を、4％パラホルムアルデヒド中で固定し、10％正常ヤギまたはロバ血清中で室温で1時間インキュベートした。一次抗体を室温で3時間添加し、その後、蛍光色素結合二次抗体（Alexa Fluorヤギまたはロバ抗ウサギ/マウス/ヒツジ/ヤギ488/568/660；1:500［Molecular Probes, Eugene, OR］）と1時間インキュベートした。MF25-04からの培養細胞は、移植2日前、DIV47に解析された。MF27-04およびMF66-02からの培養細胞は、移植2日前、DIV28に解析された。
【０１４７】
行動評価の完了後、動物を、ケタミンで鎮静し（15mg/kg）、ペントバルビタールで麻酔し（ネンブタール（Nembutal）；25mg/kg、静脈内）、氷冷ヘパリン化生理食塩水およびその後4％のパラホルムアルデヒドで経心的に灌流した。脳を、18時間、後固定し、段階的ショ糖溶液中で平衡化し（PBS中20％〜30％）、凍結ミクロトームで40μmスライスを作製し連続的に回収した。切片を、免疫ペルオキシダーゼまたは免疫蛍光技術のいずれかを使用して染色した。免疫ペルオキシダーゼ染色のための切片を、3％の過酸化水素中で30分間処理し（Humco, Texarkana, TX, USA）、PBS中で3回洗浄し、一次抗体との4℃で48時間のインキュベートの前に、PBS中の10％正常ロバ血清（Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA）および0.1％Triton X-100中で60分間インキュベートした。PBS中で10分間3回リンスした後、切片を、PBS中のビオチン化二次抗体（ロバ抗ウサギ/マウス/ラット/ヒツジ；Vector Laboratories, 1:300）中で、室温で60分間インキュベートした。切片を、PBS中で3回リンスし、PBS中のストレプトアビジン-ビオチン複合体（Vectastain ABC Elite Kit；Vector Laboratories）中で、室温で60分間インキュベートした。PBSによる十分なリンスの後、3,3'-ジアミノベンジジン溶液（Vector Laboratories）中のインキュベートによって染色を可視化した。免疫蛍光のために、切片を、PBS中で10分間3回リンスし、PBS中の10％正常ロバ血清（Vector Laboratories）および0.1％Triton X 100中で60分間インキュベートし、その後、一次抗体と室温で48時間インキュベートした。PBS中でのさらに3回の10分間のリンスの後、切片を、10％正常ロバ血清を含むPBS中で二次抗体（蛍光色素結合Alexa Fluor（登録商標）ロバ抗ウサギ/マウス/ヒツジ488/568/660；1:500［Molecular Probes］；Alexa Fluor（登録商標）488結合ストレプトアビジン；1:500［Molecular Probes］；ビオチン化ヤギ抗ラット［Vector Laboratories］）と、室温で60分間インキュベートした。共焦点顕微鏡を使用して免疫蛍光染色を検査し（LSM510 Meta；Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA）、z軸解析によって共局在を確認した。選択された切片において、特異的染色を確認するために一次抗体は除外された。
【０１４８】
以下の一次抗体が使用された：ウサギまたはヒツジ抗TH、1:300［Pel-Freez］；ラットDAT、1:200［Chemicon］；マウス抗βIIIチューブリン、1:1000［Covance］；ヤギ抗FOXA2、1:100［Santa Cruz Biotechnology］；マウス抗Oct4、3μg/mL［DSHB Iowa］；ウサギ抗5HT、1:20,000［ImmunoStar］；ウサギ抗Ki-67、1:500［Vector Labs］、ウサギ抗DARPP-32、1:500［Cell Signaling］、ウサギ抗Iba1、1:300［Wako］。
【０１４９】
移植されたドーパミンニューロンの立体解析
MF25-04、MF66-02、およびMF27-04において移植されたTH-irニューロンの立体解析学的カウントは、以前に記載されたような、不偏性の立体解析学的細胞カウント方法を使用して実施された（Redmond et al., 2008）。光学的ディセクターシステムは、Ludlコンピュータ制御x-y-z移動ステージへのハード連結Olympus BX-60顕微鏡、高感度日立3CCDビデオカメラシステム（Hitachi, Japan）、およびPCコンピュータを含む、コンピュータアシスト画像解析システムからなった。TH-irニューロンのカウントは、Microbrightfield立体解析学的ソフトウエアを使用して実施され、光学的フラクショネータープローブを使用して計算された。プローブの正確性を評価するためにエラーの係数が使用され、p＜0.05は許容可能とみなした。
【０１５０】
補足的参考文献
2018506559.tif 000004
【０１５１】
実施例2：パーキンソン病のためのヒトiPSCベースの細胞療法
例示的臨床産物およびそれらの使用
一つの態様において、移植組成物は、中脳ドーパミン作動性運命に分化され、品質確認され、凍結および解凍された、GMPグレードの、パーキンソン病（PD）患者由来のフットプリント不含有の人工多能性幹細胞（iPSC）である。
【０１５２】
PD患者のiPSCは、エピソームiPSCリプログラミングキットを使用して、末梢血単核細胞（PBMC）から得られる。リプログラミングキットは、5つのエピソーム（非組み込み）ベクター、Oct4、Sox2、Lin28、Klf4、およびL-Mycを含み（Okita K et al., Nature Methods 8, 409-412, 2011）、導入遺伝子不含有でウイルス不含有のiPSCを産生する。エピソームベクターは、エレクトロポレーションによって、細胞中に導入される。iPSCは、GMP設備において産生および増殖され、正常核型を有すること、奇形腫を形成する能力、幹細胞（多能性）マーカーを発現すること、ならびにエンドトキシンおよび微生物を含まないことについて品質確認される。
【０１５３】
iPSCからドーパミン作動性（DA）ニューロンへの分化は、腹側中脳（VM）ドーパミンニューロンの分化を促進する、低分子を使用したGMP設備における異種成分不含有条件下で生じる。得られた細胞産物は、胎児腹側中脳と類似のレベルでVMドーパミンニューロンを含むVM様細胞調製物である。細胞調製物は、微生物およびエンドトキシンを含まないこと、正しい細胞表面マーカーを発現すること、および多能性幹細胞を欠いていることについて品質確認される。一つの態様において、細胞は、TRA160および/またはSSEAに対する抗体に結合する細胞を除くことによって、TRA160-およびSSEA発現細胞が除去される。品質確認された細胞バッチは、使用まで凍結保存される。各GMPグレード細胞調製物は、解凍され、臨床的使用前に安全性についてインビトロおよびインビボでのバイオアッセイにおいて十分に試験される。
【０１５４】
一つの態様において、自己iPSC由来の中脳ドーパミンニューロンは、パーキンソン病を有する患者またはそれを有すると疑われる患者に、定位的被殻内注入によって送達される。一つの態様において、移植は、片側性または両側性であり、交連後の被殻中への移植である。典型的には、いくつかの（例えば、2、3、4、5、またはそれ以上の）被殻標的が同定されるかまたは患者のMRIスキャンから計算される。
【０１５５】
典型的には、体積160〜320μl中2000〜5000万個の細胞という適切な細胞用量が、被殻中の4つの注入管を通して注入される。一つの態様において、移植処置は、フレームベースのまたはフレームなしのナビゲーションを使用して、インジェクターシステムに連結されたシリンジ針を使用した、定位的注入を含む。患者自身の体細胞に由来する自己細胞が使用される場合、移植後の免疫抑制は必要も要求もされないことは重要である。移植の有効性は、PD患者のために日常的に使用される臨床評価（例えば、UPDRS）を使用して決定することができ、任意で、活性およびジスキネジアを得るための追加の電子デバイス、および移植されたドーパミンニューロンの生存の存在を確立し、経時的な変化のインビボの読み出しを得るための連続PETスキャンを含み得る。
【０１５６】
ヒト移植において安全な細胞産物のための異種成分不含有条件への分化プロトコールの変換
iPSCを中脳DAニューロンに分化した本発明者らによって以前に公表された基本の分化プロトコール（Cooper et al., 2010）は、マウスフィーダー細胞におけるプロトコールの開始ならびに非ヒト組換えタンパク質および培地起源の使用などの、ヒト移植に不適合性の要素を含んでいた。したがって、本発明者らは、同等の組成および品質の細胞産物を生じる、以前のプロトコールの異種成分不含有バージョンを開発した。このプロトコールにおいて、マウスフィーダー細胞はヒト化された基体で置換され、組換えタンパク質は低分子で置換され、使用された全ての培地産物は異種成分不含有の培地産物である。中脳DAニューロンのパーセンテージは、Cooper et al.のプロトコールで観察されたものと同等であり、正常胎児中脳の範囲内である。免疫抑制されたラット線条体に移植されると、改変されたプロトコールで分化された細胞は、生存する（図7）。細胞はまた、免疫抑制されたラットにおいて長期間生存し、DAニューロン損失を有するラットの運動非対称を改善する（図8）。
【０１５７】
移植前の細胞調製物には増殖性細胞が存在するが、これらの細胞は、経時的に、移植片において最終分化し、成熟するようである。インビトロの移植前データは、これらの増殖性細胞の大部分が、神経前駆体において観察されるマーカーである中間径フィラメントタンパク質ネスチンに対して陽性であり、多能性細胞ではないことを示す。増殖性細胞が移植片に存在するかどうかを決定するために、移植7週後および6ヶ月後のラットにおいてBrdU試験が実施された。移植7週後、BrdUを12日間与えられたラット（50 mg/kg/日）において、いくつかの点在するBrdU陽性細胞が観察され、これは、分裂細胞を示す。しかし、移植6ヶ月後の成熟移植片において、本発明者らは、如何なる移植片由来の増殖性細胞も検出しなかった（図9）。さらに、これらの細胞調製物を移植した後、ラットにおいて腫瘍形成は観察されなかった（n＞300ラット、6年超）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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