(57)【要約】本発明は対象において適応免疫応答を誘導するための組成物及び方法に関する。ある特定の実施形態において、本発明は、抗原、アジュバント、またはそれらの組み合わせをコードするヌクレオシド修飾核酸分子を含む組成物を提供する。例えば、ある特定の実施形態において、上記組成物は、抗原、アジュバント、またはそれらの組み合わせをコードするヌクレオシド修飾核酸分子を含むワクチンを含む。
2018526321.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の抗原をコードする少なくとも１種のヌクレオシド修飾ＲＮＡを含む、対象において適応免疫応答を誘導するための組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１種の単離されたヌクレオシド修飾ＲＮＡがプソイドウリジンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記少なくとも１種の単離されたヌクレオシド修飾ＲＮＡが１−メチル−プソイドウリジンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記少なくとも１種の抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生生物抗原、腫瘍関連抗原、及び腫瘍特異抗原からなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１種の抗原がＨＩＶ抗原を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＨＩＶ抗原がエンベロープ（Ｅｎｖ）を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１種の抗原がインフルエンザ抗原を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記インフルエンザ抗原がヘマグルチニン（ＨＡ）を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
アジュバントを更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも１種のヌクレオシド修飾ＲＮＡが少なくとも１種のアジュバントを更にコードする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記少なくとも１種のヌクレオシド修飾ＲＮＡが前記ＬＮＰ中に封入されている、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ワクチンである請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＬＮＰが、式（Ｉ）：
【化４２】
2018526321.tif 000064
の構造を有する化合物または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体であって、式中、
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立に、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−または炭素−炭素二重結合であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ１ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ１ｂは該Ｒ１ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ１ｂ及び該Ｒ１ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ２ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ２ｂは該Ｒ２ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ２ｂ及び該Ｒ２ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ３ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ３ｂは該Ｒ３ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ３ｂ及び該Ｒ３ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ４ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ４ｂは該Ｒ４ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ４ｂ及び該Ｒ４ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立にメチルまたはシクロアルキルであり、
Ｒ７は、それぞれの存在毎に独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に非置換のＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、またはＲ８及びＲ９が、該Ｒ８及びＲ９が結合する窒素原子と共に、１つの窒素原子を含む５、６または７員ヘテロ環式リングを形成し、
ａ及びｄはそれぞれ独立に０〜２４の整数であり、
ｂ及びｃはそれぞれ独立に１〜２４の整数であり、
ｅは１または２である、
前記化合物または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＬＮＰが、式（ＩＩ）：
【化４３】
2018526321.tif 000065
の構造を有する化合物または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体であって、式中、
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立に、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｘ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ−、または直接の結合であり、
Ｇ１はＣ１〜Ｃ２アルキレン、−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−または直接の結合であり、
Ｇ２は−Ｃ（＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａまたは直接の結合であり、
Ｇ３はＣ１〜Ｃ６アルキレンであり、
ＲａはＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ１ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ１ｂは該Ｒ１ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ１ｂ及び該Ｒ１ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ２ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ２ｂは該Ｒ２ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ２ｂ及び該Ｒ２ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ３ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ３ｂは該Ｒ３ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ３ｂ及び該Ｒ３ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ４ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ４ｂは該Ｒ４ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ４ｂ及び該Ｒ４ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立にＨまたはメチルであり、
Ｒ７はＣ４〜Ｃ２０アルキルであり、
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立にＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、またはＲ８及びＲ９が、該Ｒ８及びＲ９が結合する窒素原子と共に、５、６または７員ヘテロ環式リングを形成し、
ａ、ｂ、ｃ及びｄはそれぞれ独立に１〜２４の整数であり、
ｘは０、１または２である、
前記化合物または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＬＮＰが、式（ＩＩＩ）：
【化４４】
2018526321.tif 000066
の構造を有する化合物または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体であって、式中、
Ｌ１またはＬ２の一方が、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｘ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ−、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−または−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ−であり、且つＬ１またはＬ２の他方が−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｘ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ−、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−もしくは−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ−または直接の結合であり、
Ｇ１及びＧ２はそれぞれ独立に、非置換のＣ１〜Ｃ１２アルキレンまたはＣ１〜Ｃ１２アルケニレンであり、
Ｇ３はＣ１〜Ｃ２４アルキレン、Ｃ１〜Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルケニレンであり、
ＲａはＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、Ｃ６〜Ｃ２４アルキルまたはＣ６〜Ｃ２４アルケニルであり、
Ｒ３はＨ、ＯＲ５、ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４または−ＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり、
Ｒ４はＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、
Ｒ５はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
ｘは０、１または２である、
前記化合物または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＬＮＰが以下の構造のうちの１種を有する化合物を含む、請求項１１に記載の組成物：
【化４５】
2018526321.tif 000067
2018526321.tif 000068
【請求項１８】
前記ＬＮＰが、以下の構造（ＩＶ）：
【化４６】
2018526321.tif 000069
を有するペグ化脂質または薬学的に許容されるその塩、互変異生体もしくは立体異性体であって、式中、
Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立に、任意選択で１もしくは複数のエステル結合が間に入った、１０〜３０の炭素原子を含有する、直鎖状または分枝状の、飽和または不飽和のアルキル鎖であり、
ｚは３０〜６０の範囲の平均値を有する、
前記ペグ化脂質または薬学的に許容されるその塩、互変異生体もしくは立体異性体を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ペグ化脂質が以下の構造（ＩＶａ）：
【化４７】
2018526321.tif 000070
を有し、
式中、ｎは前記ペグ化脂質の平均分子量が約２５００ｇ／ｍｏｌとなるように選択される整数である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
対象における適応免疫応答の誘導方法であって、少なくとも１種の抗原をコードする少なくとも１種のヌクレオシド修飾ＲＮＡを含む有効量の組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１種の単離されたヌクレオシド修飾ＲＮＡがプソイドウリジンを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１種の単離されたヌクレオシド修飾ＲＮＡが１−メチル−プソイドウリジンを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１種の抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生生物抗原、腫瘍関連抗原、及び腫瘍特異抗原からなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１種の抗原がＨＩＶ抗原を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＨＩＶ抗原がエンベロープ（Ｅｎｖ）を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１種の抗原がインフルエンザ抗原を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記インフルエンザ抗原がヘマグルチニン（ＨＡ）を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
有効量のアジュバントを前記対象に投与することを更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１種のヌクレオシド修飾ＲＮＡが少なくとも１種のアジュバントを更にコードする、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記組成物が脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１種のヌクレオシド修飾ＲＮＡが前記ＬＮＰ中に封入されている、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記組成物がワクチンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＬＮＰが、式（Ｉ）：
【化４８】
2018526321.tif 000071
の構造を有する化合物または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体であって、式中、
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立に、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−または炭素−炭素二重結合であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ１ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ１ｂは該Ｒ１ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ１ｂ及び該Ｒ１ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ２ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ２ｂは該Ｒ２ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ２ｂ及び該Ｒ２ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ３ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ３ｂは該Ｒ３ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ３ｂ及び該Ｒ３ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ４ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ４ｂは該Ｒ４ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ４ｂ及び該Ｒ４ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立にメチルまたはシクロアルキルであり、
Ｒ７は、それぞれの存在毎に独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に非置換のＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、またはＲ８及びＲ９が、該Ｒ８及びＲ９が結合する窒素原子と共に、１つの窒素原子を含む５、６または７員ヘテロ環式リングを形成し、
ａ及びｄはそれぞれ独立に０〜２４の整数であり、
ｂ及びｃはそれぞれ独立に１〜２４の整数であり、
ｅは１または２である、
前記化合物または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＬＮＰが、式（ＩＩ）：
【化４９】
2018526321.tif 000072
の構造を有する化合物または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体であって、式中、
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立に、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｘ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ−、または直接の結合であり、
Ｇ１はＣ１〜Ｃ２アルキレン、−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−または直接の結合であり、
Ｇ２は−Ｃ（＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａまたは直接の結合であり、
Ｇ３はＣ１〜Ｃ６アルキレンであり、
ＲａはＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ１ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ１ｂは該Ｒ１ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ１ｂ及び該Ｒ１ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ２ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ２ｂは該Ｒ２ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ２ｂ及び該Ｒ２ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ３ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ３ｂは該Ｒ３ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ３ｂ及び該Ｒ３ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ４ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ４ｂは該Ｒ４ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ４ｂ及び該Ｒ４ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立にＨまたはメチルであり、
Ｒ７はＣ４〜Ｃ２０アルキルであり、
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立にＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、またはＲ８及びＲ９が、該Ｒ８及びＲ９が結合する窒素原子と共に５、６または７員ヘテロ環式リングを形成し、
ａ、ｂ、ｃ及びｄはそれぞれ独立に１〜２４の整数であり、
ｘは０、１または２である、
前記化合物または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＬＮＰが、式（ＩＩＩ）：
【化５０】
2018526321.tif 000073
の構造を有する化合物または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体であって、式中、
Ｌ１またはＬ２の一方が、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｘ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ−、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−または−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ−であり、且つＬ１またはＬ２の他方が−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｘ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ−、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−もしくは−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ−または直接の結合であり、
Ｇ１及びＧ２はそれぞれ独立に、非置換のＣ１〜Ｃ１２アルキレンまたはＣ１〜Ｃ１２アルケニレンであり、
Ｇ３はＣ１〜Ｃ２４アルキレン、Ｃ１〜Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルケニレンであり、
ＲａはＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、Ｃ６〜Ｃ２４アルキルまたはＣ６〜Ｃ２４アルケニルであり、
Ｒ３はＨ、ＯＲ５、ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４または−ＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり、
Ｒ４はＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、
Ｒ５はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
ｘは０、１または２である、
前記化合物または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＬＮＰが以下の構造のうちの１種を有する化合物を含む、請求項３０に記載の方法：
【化５１】
2018526321.tif 000074
2018526321.tif 000075
【請求項３７】
前記ＬＮＰが、以下の構造（ＩＶ）：
【化５２】
2018526321.tif 000076
を有するペグ化脂質または薬学的に許容されるその塩、互変異生体もしくは立体異性体であって、式中、
Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立に、任意選択で１もしくは複数のエステル結合が間に入った、１０〜３０の炭素原子を含有する、直鎖状または分枝状の、飽和または不飽和のアルキル鎖であり、
ｚは３０〜６０の範囲の平均値を有する、
前記ペグ化脂質または薬学的に許容されるその塩、互変異生体もしくは立体異性体を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記ペグ化脂質が以下の構造（ＩＶａ）：
【化５３】
2018526321.tif 000077
を有し、
式中、ｎは前記ペグ化脂質の平均分子量が約２５００ｇ／ｍｏｌとなるように選択される整数である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記組成物が皮内、皮下、及び筋内からなる群より選択される送達経路によって投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項４０】
前記組成物の単回投与を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項４１】
前記組成物の複数回投与を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項４２】
ウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌性感染症、寄生生物性感染症、及びがんからなる群より選択される少なくとも１種を治療または予防する、請求項２０に記載の方法。
【請求項４３】
ＨＩＶ感染症を治療または予防する、請求項２０に記載の方法。
【請求項４４】
インフルエンザ感染症を治療または予防する、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年４月２７日出願の米国仮特許出願第６２／１５３，１４３号の優先権を主張し、該出願の内容はその全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
連邦支援研究または開発に関する表示
本発明は国立保健研究所により授与されたＲＯ１−ＡＩ−０９０７８８に基づく政府支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
核酸ワクチン（ＮＡＶ）は２０年以上にわたって開発途上にある。ＤＮＡワクチン法の使用に関しては顕著な進歩がある一方で、ＲＮＡワクチン接種法についてはそれほどの進捗が見られない。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）ワクチンは短時間で開発される可能性があり、強力な応答を示し得る。ｍＲＮＡワクチンは、核に送達される必要があるＤＮＡワクチンと比較して、細胞質に送達されれば応答を示すという利点がある。
【０００４】
しかしながら、ｍＲＮＡワクチンの開発は、ｍＲＮＡの安定性、送達及び自然免疫系によるｍＲＮＡ自体に対する免疫原性に起因する問題によって妨げられてきた。近年エキソ・ビボ環境において、ＲＮＡワクチンを最適化することが幾分有効であることが判ってきてはいるが、イン・ビボで直接投与される場合に、現行のｍＲＮＡワクチンの製造方法では、不十分な抗体及びＣＤ８＋  Ｔ細胞応答しか与えない。
【０００５】
したがって、本技術分野においては、適応免疫応答を誘導するための、抗原をコードするＲＮＡを用いる組成物及びその使用方法の改良が必要とされている。本発明は未だ対処がなされていないこのニーズを満たす。
【発明の概要】
【０００６】
一態様において、本発明は、少なくとも１種の抗原をコードする少なくとも１種のヌクレオシド修飾ＲＮＡを含む、対象において適応免疫応答を誘導するための組成物を提供する。一実施形態において、上記少なくとも１種の単離されたヌクレオシド修飾ＲＮＡはプソイドウリジンを含む。一実施形態において、上記少なくとも１種の単離されたヌクレオシド修飾ＲＮＡは１−メチル−プソイドウリジンを含む。
【０００７】
一実施形態において、上記ヌクレオシド修飾ＲＮＡによってコードされる上記少なくとも１種の抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生生物抗原、腫瘍関連抗原、または腫瘍特異抗原である。一実施形態において、上記少なくとも１種の抗原はＨＩＶ抗原を含む。一実施形態において、上記ＨＩＶ抗原はエンベロープ（Ｅｎｖ）を含む。一実施形態において、上記少なくとも１種の抗原はインフルエンザ抗原を含む。一実施形態において、上記インフルエンザ抗原はヘマグルチニン（ＨＡ）を含む。
【０００８】
一実施形態において、上記組成物はアジュバントを更に含む。一実施形態において、上記少なくとも１種のヌクレオシド修飾ＲＮＡは少なくとも１種のアジュバントを更にコードする。一実施形態において、上記組成物はワクチンである。
【０００９】
一実施形態において、上記組成物は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を更に含む。一実施形態において、上記少なくとも１種のヌクレオシド修飾ＲＮＡは上記ＬＮＰ中に封入されている。一実施形態において、上記ＬＮＰは、式（Ｉ）：
【化１】
2018526321.tif 000003
の構造を有する化合物または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体であって、式中、
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立に、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−または炭素−炭素二重結合であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ１ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ１ｂは該Ｒ１ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ１ｂ及び該Ｒ１ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ２ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ２ｂは該Ｒ２ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ２ｂ及び該Ｒ２ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ３ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ３ｂは該Ｒ３ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ３ｂ及び該Ｒ３ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ４ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ４ｂは該Ｒ４ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ４ｂ及び該Ｒ４ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立にメチルまたはシクロアルキルであり、
Ｒ７は、それぞれの存在毎に独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に非置換のＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、またはＲ８及びＲ９が、該Ｒ８及びＲ９が結合する窒素原子と共に、１つの窒素原子を含む５、６または７員ヘテロ環式リングを形成し、
ａ及びｄはそれぞれ独立に０〜２４の整数であり、
ｂ及びｃはそれぞれ独立に１〜２４の整数であり、
ｅは１または２である、
上記化合物または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む。
【００１０】
一実施形態において、上記ＬＮＰは、式（ＩＩ）：
【化２】
2018526321.tif 000004
の構造を有する化合物または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体であって、式中、
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立に、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｘ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ−、または直接の結合であり、
Ｇ１はＣ１〜Ｃ２アルキレン、−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−または直接の結合であり、
Ｇ２は−Ｃ（＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａまたは直接の結合であり、
Ｇ３はＣ１〜Ｃ６アルキレンであり、
ＲａはＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ１ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ１ｂは該Ｒ１ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ１ｂ及び該Ｒ１ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ２ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ２ｂは該Ｒ２ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ２ｂ及び該Ｒ２ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ３ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ３ｂは該Ｒ３ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ３ｂ及び該Ｒ３ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ４ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ４ｂは該Ｒ４ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ４ｂ及び該Ｒ４ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立にＨまたはメチルであり、
Ｒ７はＣ４〜Ｃ２０アルキルであり、
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立にＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、またはＲ８及びＲ９が、該Ｒ８及びＲ９が結合する窒素原子と共に、５、６または７員ヘテロ環式リングを形成し、
ａ、ｂ、ｃ及びｄはそれぞれ独立に１〜２４の整数であり、
ｘは０、１または２である、
上記化合物または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む。
【００１１】
一実施形態において、上記ＬＮＰは、式（ＩＩＩ）：
【化３】
2018526321.tif 000005
の構造を有する化合物または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体であって、式中、
Ｌ１またはＬ２の一方が、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｘ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ−、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−または−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ−であり、且つＬ１またはＬ２の他方が−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｘ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ−、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−もしくは−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ−または直接の結合であり、
Ｇ１及びＧ２はそれぞれ独立に、非置換のＣ１〜Ｃ１２アルキレンまたはＣ１〜Ｃ１２アルケニレンであり、
Ｇ３はＣ１〜Ｃ２４アルキレン、Ｃ１〜Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルケニレンであり、
ＲａはＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、Ｃ６〜Ｃ２４アルキルまたはＣ６〜Ｃ２４アルケニルであり、
Ｒ３はＨ、ＯＲ５、ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４または−ＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり、
Ｒ４はＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、
Ｒ５はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
ｘは０、１または２である、
上記化合物または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む。
【００１２】
一実施形態において、上記ＬＮＰは以下の構造のうちの１種を有する化合物を含む：
【化４】
2018526321.tif 000006
2018526321.tif 000007
【００１３】
一実施形態において、上記ＬＮＰは、以下の構造（ＩＶ）：
【化５】
2018526321.tif 000008
を有するペグ化脂質または薬学的に許容されるその塩、互変異生体もしくは立体異性体であって、式中、
Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立に、任意選択で１もしくは複数のエステル結合が間に入った、１０〜３０の炭素原子を含有する、直鎖状または分枝状の、飽和または不飽和のアルキル鎖であり、
ｚは３０〜６０の範囲の平均値を有する、
上記ペグ化脂質または薬学的に許容されるその塩、互変異生体もしくは立体異性体を含む。
【００１４】
一実施形態において、上記ペグ化脂質は以下の構造（ＩＶａ）：
【化６】
2018526321.tif 000009
を有し、
式中、ｎは上記ペグ化脂質の平均分子量が約２５００ｇ／ｍｏｌとなるように選択される整数である。
【００１５】
一態様において、本発明は、対象における適応免疫応答の誘導方法を提供する。上記方法は、少なくとも１種の抗原をコードする少なくとも１種のヌクレオシド修飾ＲＮＡを含む有効量の組成物を上記対象に投与することを含む。一実施形態において、上記少なくとも１種の単離されたヌクレオシド修飾ＲＮＡはプソイドウリジンを含む。一実施形態において、上記少なくとも１種の単離されたヌクレオシド修飾ＲＮＡは１−メチル−プソイドウリジンを含む。
【００１６】
一実施形態において、上記ヌクレオシド修飾ＲＮＡによってコードされる上記少なくとも１種の抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生生物抗原、腫瘍関連抗原、または腫瘍特異抗原である。一実施形態において、上記少なくとも１種の抗原はＨＩＶ抗原を含む。一実施形態において、上記ＨＩＶ抗原はエンベロープ（Ｅｎｖ）を含む。一実施形態において、上記少なくとも１種の抗原はインフルエンザ抗原を含む。一実施形態において、上記インフルエンザ抗原はヘマグルチニン（ＨＡ）を含む。
【００１７】
一実施形態において、上記組成物はアジュバントを更に含む。一実施形態において、上記少なくとも１種のヌクレオシド修飾ＲＮＡは少なくとも１種のアジュバントを更にコードする。一実施形態において、上記組成物はワクチンである。
【００１８】
一実施形態において、上記組成物は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を更に含む。一実施形態において、上記少なくとも１種のヌクレオシド修飾ＲＮＡは上記ＬＮＰ中に封入されている。一実施形態において、上記ＬＮＰは、式（Ｉ）：
【化７】
2018526321.tif 000010
の構造を有する化合物または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体であって、式中、
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立に、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−または炭素−炭素二重結合であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ１ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ１ｂは該Ｒ１ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ１ｂ及び該Ｒ１ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ２ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ２ｂは該Ｒ２ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ２ｂ及び該Ｒ２ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ３ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ３ｂは該Ｒ３ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ３ｂ及び該Ｒ３ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ４ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ４ｂは該Ｒ４ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ４ｂ及び該Ｒ４ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立にメチルまたはシクロアルキルであり、
Ｒ７は、それぞれの存在毎に独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に非置換のＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、またはＲ８及びＲ９が、該Ｒ８及びＲ９が結合する窒素原子と共に、１つの窒素原子を含む５、６または７員ヘテロ環式リングを形成し、
ａ及びｄはそれぞれ独立に０〜２４の整数であり、
ｂ及びｃはそれぞれ独立に１〜２４の整数であり、
ｅは１または２である、
上記化合物または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む。
【００１９】
一実施形態において、上記ＬＮＰは、式（ＩＩ）：
【化８】
2018526321.tif 000011
の構造を有する化合物または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体であって、式中、
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立に、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｘ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ−、または直接の結合であり、
Ｇ１はＣ１〜Ｃ２アルキレン、−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−または直接の結合であり、
Ｇ２は−Ｃ（＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａまたは直接の結合であり、
Ｇ３はＣ１〜Ｃ６アルキレンであり、
ＲａはＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ１ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ１ｂは該Ｒ１ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ１ｂ及び該Ｒ１ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ２ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ２ｂは該Ｒ２ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ２ｂ及び該Ｒ２ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ３ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ３ｂは該Ｒ３ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ３ｂ及び該Ｒ３ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ４ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ４ｂは該Ｒ４ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ４ｂ及び該Ｒ４ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立にＨまたはメチルであり、
Ｒ７はＣ４〜Ｃ２０アルキルであり、
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立にＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、またはＲ８及びＲ９が、該Ｒ８及びＲ９が結合する窒素原子と共に、５、６または７員ヘテロ環式リングを形成し、
ａ、ｂ、ｃ及びｄはそれぞれ独立に１〜２４の整数であり、
ｘは０、１または２である、
上記化合物または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む。
【００２０】
一実施形態において、上記ＬＮＰは、式（ＩＩＩ）：
【化９】
2018526321.tif 000012
の構造を有する化合物または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体であって、式中、
Ｌ１またはＬ２の一方が、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｘ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ−、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−または−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ−であり、且つＬ１またはＬ２の他方が−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｘ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ−、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−もしくは−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ−または直接の結合であり、
Ｇ１及びＧ２はそれぞれ独立に、非置換のＣ１〜Ｃ１２アルキレンまたはＣ１〜Ｃ１２アルケニレンであり、
Ｇ３はＣ１〜Ｃ２４アルキレン、Ｃ１〜Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルケニレンであり、
ＲａはＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、Ｃ６〜Ｃ２４アルキルまたはＣ６〜Ｃ２４アルケニルであり、
Ｒ３はＨ、ＯＲ５、ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４または−ＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり、
Ｒ４はＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、
Ｒ５はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
ｘは０、１または２である、
上記化合物または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む。
【００２１】
一実施形態において、上記ＬＮＰは以下の構造のうちの１種を有する化合物を含む：
【化１０】
2018526321.tif 000013
2018526321.tif 000014
【００２２】
一実施形態において、上記ＬＮＰは、以下の構造（ＩＶ）：
【化１１】
2018526321.tif 000015
を有するペグ化脂質または薬学的に許容されるその塩、互変異生体もしくは立体異性体であって、式中、
Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立に、任意選択で１もしくは複数のエステル結合が間に入った、１０〜３０の炭素原子を含有する、直鎖状または分枝状の、飽和または不飽和のアルキル鎖であり、
ｚは３０〜６０の範囲の平均値を有する、
上記ペグ化脂質または薬学的に許容されるその塩、互変異生体もしくは立体異性体を含む。
【００２３】
一実施形態において、上記ペグ化脂質は以下の構造（ＩＶａ）：
【化１２】
2018526321.tif 000016
を有し、
式中、ｎは上記ペグ化脂質の平均分子量が約２５００ｇ／ｍｏｌとなるように選択される整数である。
【００２４】
一実施形態において、上記組成物は皮内、皮下、または筋内送達によって投与される。一実施形態において、上記方法は上記組成物の単回投与を含む。一実施形態において、上記方法は上記組成物の複数回投与を含む。
【００２５】
一実施形態において、上記方法は、ウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌性感染症、寄生生物性感染症、及びがんからなる群より選択される少なくとも１種を治療または予防する。一実施形態において、上記方法はＨＩＶ感染症を治療または予防する。一実施形態において、上記方法はインフルエンザ感染症を治療または予防する。
【００２６】
以下の本発明の好ましい実施形態の詳細な説明は、添付の図面と併せて読めばよりよく理解されよう。本発明を例証することを目的に、現時点において好ましい実施形態を図面に示している。但し、本発明は、これらの図面に示される実施形態の配置及び手段そのものに限定されることはないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図２〜図１１に適用されるＥＮＶ−ＬＮＰ免疫化のための実験の構成を図解する概略図である。動物に、３μｇ、１０μｇまたは３０μｇのいずれかの、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に封入した、ＨＩＶ−１  ＣＤ４非依存性Ｒ３ＡエンベロープをコードするｍＲＮＡを２回皮内注射した。対照マウスには、３０μｇの、ＬＮＰ中に複合体化した、ホタルルシフェラーゼ（ＬＵＣ）をコードするｍＲＮＡを注射した。２回のｍＲＮＡ−ＬＮＰの注射の間に４週間の間隔をおき、動物を２回目の注射の１４日後にと殺した。
【図２】ＥＮＶ−ＬＮＰによる２回の免疫化によって強固なＣＤ４＋  Ｔ細胞応答が誘発されることを図解する一組のグラフである。これらのグラフは抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生（左）及びＴＮＦ−α産生（右）を示す。個々の動物のサイトカイン産生が、脾臓中の全ＣＤ４＋  Ｔ細胞のパーセントとして示される。ＩＦＮ＝インターフェロン、ＴＮＦ＝腫瘍壊死因子。Ｌｕｃ＝３０μｇの、対照のルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ−ＬＮＰを皮内（ＩＤ）注射した対照マウス。全ての細胞内サイトカインの測定を、完全なエンベロープ配列の１１アミノ酸がオーバーラップする１５量体のペプチドプールで刺激した後、多色フローサイトメトリーを用いて実施した。平均値の標準誤差が示される。
【図３】ＥＮＶ−ＬＮＰによる２回の免疫化によって強固なＣＤ４＋  Ｔ細胞応答が誘発されることを図解するグラフである。このグラフは抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞によるＩＬ−２の産生を示す。個々の動物のサイトカイン産生が、脾臓中の全ＣＤ４＋  Ｔ細胞のパーセントとして示される。ＩＬ−２＝インターロイキン２。Ｌｕｃ＝３０μｇの、対照のルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ−ＬＮＰを皮内（ＩＤ）注射した対照マウス。全ての細胞内サイトカインの測定を、完全なエンベロープ配列の１１アミノ酸がオーバーラップする１５量体のペプチドプールで刺激した後、多色フローサイトメトリーを用いて実施した。平均値の標準誤差が示される。
【図４】ＥＮＶ−ＬＮＰによる２回の免疫化によって強固な多機能性ＣＤ４＋  Ｔ細胞応答が誘発されることを図解するグラフである。このグラフは２回目の皮内免疫化の１４日後の、ワクチン接種した動物における１、２、及び３機能性の抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞の分布を示す。この棒グラフは表示した１種、２種または３種のサイトカインを産生する抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞の百分率を示す。全ての細胞内サイトカインの測定を、完全なエンベロープ配列の１１アミノ酸がオーバーラップする１５量体のペプチドプールで刺激した後、多色フローサイトメトリーを用いて実施した。平均値の標準誤差が棒上に示される。
【図５】ＥＮＶ−ＬＮＰによる２回の免疫化によって、濾胞性ヘルパーＴ（Ｔｆｈ）細胞の総数が有意に増加することを図解するグラフである。このグラフはワクチン接種した動物における脾臓Ｔｆｈ細胞の出現頻度を示す。ＣＤ４、ＣＸＣＲ５及びＰＤ−１マーカーを用いてＴｆｈ細胞を測定した。Ｅ１０＝１０μｇの、ＩＤ注射したｉＲ３ＡエンベロープをコードするｍＲＮＡ。Ｅ３０＝３０μｇの、ＩＤ注射したｉＲ３ＡエンベロープをコードするｍＲＮＡ。Ｌｕｃ＝３０μｇの、ＩＤ注射した対照のルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ。ナイーブ：注射していない動物。
【図６】ＥＮＶ−ＬＮＰによる２回の皮内免疫化によって強固なＣＤ８＋  Ｔ細胞応答が誘発されることを図解する一組のグラフである。これらのグラフは抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生（左）及びＴＮＦ−α産生（右）を示す。個々の動物のサイトカイン産生が示される。Ｅ１０＝１０μｇの、ＩＤ注射したｉＲ３ＡエンベロープをコードするｍＲＮＡ。Ｅ３０＝３０μｇの、ＩＤ注射したｉＲ３ＡエンベロープをコードするｍＲＮＡ。Ｌｕｃ＝３０μｇの、ＩＤ注射した対照のルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ。全ての細胞内サイトカインの測定を、完全なエンベロープ配列の１１アミノ酸がオーバーラップする１５量体のペプチドプールで刺激した後、多色フローサイトメトリーを用いて実施した。平均値の標準誤差が示される。
【図７】ＥＮＶ−ＬＮＰによる２回の皮内免疫化によって強固なＣＤ８＋  Ｔ細胞応答が誘発されることを図解する一組のグラフである。これらのグラフは抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞のＩＬ−２産生（左）及びＣＤ１０７ａ産生（右）を示す。個々の動物のＩＬ−２及びＣＤ１０７ａの産生が示される。Ｅ１０＝１０μｇの、ＩＤ注射したｉＲ３ＡエンベロープをコードするｍＲＮＡ。Ｅ３０＝３０μｇの、ＩＤ注射したｉＲ３ＡエンベロープをコードするｍＲＮＡ。Ｌｕｃ＝３０μｇの、ＩＤ注射した対照のルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ。全ての細胞内サイトカインの測定を、完全なエンベロープ配列の１１アミノ酸がオーバーラップする１５量体のペプチドプールで刺激した後、多色フローサイトメトリーを用いて実施した。平均値の標準誤差が示される。
【図８】ＥＮＶ−ＬＮＰによる２回の皮内免疫化によって強固な多機能性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答が誘発されることを図解する一連のグラフである。これらのグラフはワクチン接種した動物における１、２、及び３機能性の抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の分布を示す。円グラフは１種、２種または３種のサイトカインを産生する抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の分布を示す。棒グラフは１種、２種または３種のサイトカインを産生する抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の出現頻度を示す。ＥＮＶ１０＝１０μｇの、ＩＤ注射したｉＲ３ＡエンベロープをコードするｍＲＮＡ。ＥＮＶ３０＝３０μｇの、ＩＤ注射したｉＲ３ＡエンベロープをコードするｍＲＮＡ。Ｌｕｃ＝３０μｇの、ＩＤ注射した対照のルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ。全ての細胞内サイトカインの測定を、完全なエンベロープ配列の１１アミノ酸がオーバーラップする１５量体のペプチドプールで刺激した後、多色フローサイトメトリーを用いて実施した。平均値の標準誤差が棒上に示される。Ｇ＝ＩＮＦ−γ、Ｔ＝ＴＮＦ−α、１０７＝ＣＤ１０７ａ。
【図９Ａ】ＥＮＶ−ＬＮＰによる免疫化によって強固なＢ細胞応答を誘発することを図解する一連のグラフに含まれ、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定される抗原特異的抗体応答を示すグラフである。ｍＲＮＡ−ＬＮＰの２回の皮内注射後にＨＩＶ−１  ｇｐ１２０特異的ＩｇＧの力価を測定するための実験を行った。ｇｐ１２０でプレートを被覆し、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを用いてｇｐ１２０特異的ＩｇＧを測定するｇｐ１２０特異的ＥＬＩＳＡアッセイによって力価を測定した。平均値の標準誤差が棒上に示される。
【図９Ｂ】ＥＮＶ−ＬＮＰによる免疫化によって強固なＢ細胞応答を誘発することを図解する一連のグラフに含まれ、ｍＲＮＡ−ＬＮＰによる２回の免疫化の２週間後に、類似した量のＥｎｖ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が産生されることを実証する一組のグラフである。
【図１０】実施例の実験結果を示すグラフである。マウスを、３０μｇの、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）をコードする、ＬＮＰと複合体化した１−メチル−プソイドウリジン−ｍＲＮＡ、または１０μｇもしくは３０μｇの、複合体化した、ＨＩＶエンベロープｉＲ３Ａをコードする１−メチル−プソイドウリジン修飾ｍＲＮＡで、皮内経路によって１ヶ月間隔で２回免疫化した。血清を、ティア１のＭＮ．３株及び対照のＭＬＶによって、ＨＩＶ感染を中和する能力に関して分析した。血清を段階希釈し、５０％阻害の希釈率を示す。各記号は個々のマウスを表す。
【図１１】実施例の実験結果を示すグラフである。マウスを、１０μｇまたは３０μｇの、ＬＮＰに複合体化した、ＨＩＶエンベロープｉＲ３Ａをコードする１−メチル−プソイドウリジン修飾ｍＲＮＡで、１ヶ月間隔で皮内経路によって２回免疫化した。血清を、Ｔｉｔｅｒ２のＸ２２７８＿Ｃ２＿Ｂ６株及び対照であるＭＬＶによって、ＨＩＶ感染を中和する能力に関して分析した。血清を段階希釈し、５０％阻害の希釈率を示す。
【図１２】ＥＮＶ  ｍＲＮＡ−ＬＮＰ免疫化のための実験の構成を図解する概略図である。動物に、３０μｇの、脂質ナノ粒子中に封入した、ＨＩＶ−１  ＣＤ４非依存性Ｒ３ＡエンベロープをコードするｍＲＮＡの単回皮内注射を行った（ＥＮＶ）。対照マウスには、３０μｇの、ＬＮＰ中に複合体化した、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを注射した。動物をｍＲＮＡ投与の１４日後にと殺した。
【図１３】３０μｇのＥＮＶ  ｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回注射によって強固なＣＤ４＋  Ｔ細胞応答が誘発されることを図解する一組のグラフである。これらのグラフは、抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生（左）及びＴＮＦ−α産生（右）を示す。個々の動物のサイトカイン産生が示される。ＥＮＶ＝３０μｇの、ＩＤ注射したｉＲ３ＡエンベロープをコードするｍＲＮＡ。Ｌｕｃ＝３０μｇの、ＩＤ注射した対照のルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ。全ての細胞内サイトカインの測定を、完全なエンベロープ配列の１１アミノ酸がオーバーラップする１５量体のペプチドプールで刺激した後、多色フローサイトメトリーを用いて実施した。ペプチド刺激後のサイトカインを発現する全脾臓細胞のパーセントを表す。平均値の標準誤差が示される。
【図１４】３０μｇのＥＮＶ  ｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回注射によって強固なＣＤ４＋  Ｔ細胞応答が誘発することを図解する一組のグラフである。これらのグラフは、抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞のＩＬ−２産生（左）及びＣＤ１０７ａ産生（右）を示す。個々の動物のＩＬ−２及びＣＤ１０７ａの産生が示される。ＥＮＶ＝３０μｇの、ＩＤ注射したｉＲ３ＡエンベロープをコードするｍＲＮＡ。Ｌｕｃ＝３０μｇの、ＩＤ注射した対照のルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ。全ての細胞内サイトカインの測定を、完全なエンベロープ配列の１１アミノ酸がオーバーラップする１５量体のペプチドプールで刺激した後、多色フローサイトメトリーを用いて実施した。平均値の標準誤差が示される。
【図１５】３０μｇのＥＮＶ  ｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回注射によって強固な多機能性ＣＤ４＋  Ｔ細胞応答が誘発されることを図解する一連のグラフである。これらのグラフはワクチン接種した動物における１、２、及び３機能性の抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞の分布を示す。円グラフは１種、２種または３種のサイトカインを産生する抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞の分布を示す。棒グラフは１種、２種または３種のサイトカインを産生する抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞の出現頻度を示す。ＥＮＶ＝３０μｇの、ＩＤ注射したｉＲ３ＡエンベロープをコードするｍＲＮＡ。Ｌｕｃ＝３０μｇの、ＩＤ注射した対照のルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ。全ての細胞内サイトカインの測定を、完全なエンベロープ配列の１１アミノ酸がオーバーラップする１５量体のペプチドプールで刺激した後、多色フローサイトメトリーを用いて実施した。平均値の標準誤差が棒上に示される。Ｇ＝ＩＮＦ−γ、Ｔ＝ＴＮＦ−α、２＝ＩＬ−２。
【図１６】３０μｇのＥＮＶ  ｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回注射によって、脾臓中のＴｆｈ細胞の総数が有意に増加することを図解するグラフである。このグラフはワクチン接種した動物におけるＴｆｈ細胞の出現頻度を示す。ＣＤ４、ＣＸＣＲ５及びＰＤ−１マーカーを用いてＴｆｈ細胞を測定した。ＥＮＶ＝３０μｇの、ＩＤ注射したｉＲ３ＡエンベロープをコードするｍＲＮＡ。Ｌｕｃ＝３０μｇの、ＩＤ注射した対照のルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ。平均値の標準誤差が棒上に示される。ナイーブ：注射していない動物。
【図１７】３０μｇのＥＮＶ−ＬＮＰの単回注射によって強固な抗原特異的Ｔｆｈ細胞免疫応答が誘発されることを図解する一連のグラフである。これらのグラフは、抗原特異的Ｔｆｈ  ＣＤ４＋  Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生（左上）、ＴＮＦ−α産生（右上）、及びＩＬ−２産生（下）を示す。Ｔｆｈ細胞は核Ｂｃｌ６の発現によって識別した。個々の動物のサイトカイン産生が示される。ＥＮＶ＝３０μｇの、ＩＤ注射したｉＲ３ＡエンベロープをコードするｍＲＮＡ。Ｌｕｃ＝３０μｇの、ＩＤ注射した対照のルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ。全ての細胞内サイトカインの測定を、完全なエンベロープ配列の１１アミノ酸がオーバーラップする１５量体のペプチドプールで刺激した後、多色フローサイトメトリーを用いて実施した。平均値の標準誤差が示される。
【図１８】３０μｇのＥＮＶ−ＬＮＰの単回注射によって強固な多機能性Ｔｆｈ細胞免疫応答が誘発されることを図解する一連のグラフである。これらのグラフはワクチン接種した動物における１、２、及び３機能性の抗原特異的Ｔｆｈ細胞の分布を示す。円グラフは１種、２種または３種のサイトカインを産生する抗原特異的Ｔｆｈ細胞の分布を示す。Ｔｆｈ細胞は核Ｂｃｌ６の発現によって識別した。棒グラフは１種、２種または３種のサイトカインを産生する抗原特異的Ｔｆｈ細胞の出現頻度を示す。ＥＮＶ＝３０μｇの、ＩＤ注射したｉＲ３ＡエンベロープをコードするｍＲＮＡ。Ｌｕｃ＝３０μｇの、ＩＤ注射した対照のルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ。全ての細胞内サイトカインの測定を、完全なエンベロープ配列の１１アミノ酸がオーバーラップする１５量体のペプチドプールで刺激した後、多色フローサイトメトリーを用いて実施した。平均値の標準誤差が棒上に示される。Ｇ＝ＩＮＦ−γ、Ｔ＝ＴＮＦ−α、２＝ＩＬ−２。
【図１９】３０μｇのＥＮＶｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回注射によってＩｇＧ産生Ｂ細胞応答が誘発されることを図解するグラフである。このグラフは、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定される抗原特異的抗体応答を示す。ｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回注射後にＨＩＶ−１  ｇｐ１２０特異的ＩｇＧの力価を測定するための実験を行った。ＥＮＶ＝３０μｇの、ＩＤ注射したｉＲ３ＡエンベロープをコードするｍＲＮＡ。Ｌｕｃ＝３０μｇの、ＩＤ注射した対照のルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ。ナイーブ＝注射していない動物。平均値の標準誤差が棒上に示される。
【図２０】ヌクレオシド修飾及びＬＮＰ複合体化の利点を実証する実施例の実験結果を示すグラフである。マウスを、１０μｇの、ｉＲ３Ａ  ＨＩＶエンベロープをコードする、非修飾ｍＲＮＡ、１−メチル−プソイドウリジンｍＲＮＡ、または１−メチル−プソイドウリジン−ＬＮＰ複合体化ｍＲＮＡで、１ヶ月間隔で皮内経路により２回免疫化した。２回目の免疫化の１４日後に得た脾臓細胞を、エンベロープがオーバーラップするペプチドによる６時間の刺激によって分析し、またＣＤ３＋、ＣＤ８＋  Ｔ細胞によるＣＤ１０７Ａまたは細胞内ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２の発現に関して分析した。対照（培地）による刺激への応答を各マウスについて差し引いた。６頭のマウスの群を平均した。修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰ応答は、未複合体化修飾ｍＲＮＡまたは非修飾ｍＲＮＡすなわち対照（ルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡ）で処置したマウスよりも有意に大きかった（ｐ＜０．０１）。
【図２１】ヌクレオシド修飾及びＬＮＰ複合体化の利点を実証する実施例の実験結果を示すグラフである。マウスを、１０μｇの、全てｉＲ３Ａ  ＨＩＶエンベロープをコードする、非修飾ｍＲＮＡ、１−メチル−プソイドウリジンｍＲＮＡ、またはＬＮＰと複合体化した１−メチル−プソイドウリジンｍＲＮＡで、１ヶ月間隔で皮内経路により２回免疫化した。脾臓細胞を、エンベロープがオーバーラップするペプチドによる６時間の刺激によって分析し、またＣＤ３＋、ＣＤ４＋  Ｔ細胞による細胞内ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２の発現に関して分析した。対照（培地）による刺激への応答を各マウスについて差し引いた。６頭のマウスの群を平均した。修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰ応答は、未複合体化修飾ｍＲＮＡまたは非修飾ｍＲＮＡすなわち対照（ルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡ）で処置したマウスよりも有意に大きかった（ｐ＜０．０１）。
【図２２】ヌクレオシド修飾及びＬＮＰ複合体化の利点を実証する実施例の実験結果を示すグラフである。マウスを、１０μｇの、未複合体化の、ＨＩＶエンベロープｉＲ３Ａをコードする１−メチル−プソイドウリジン修飾ｍＲＮＡ（裸のｉＲ３Ａ）、ルシフェラーゼをコードする１−メチル−プソイドウリジンｍＲＮＡ−ＬＮＰ（ｌｕｃ−ＬＮＰ）、またはＬＮＰと複合体化したｉＲ３Ａ  ｍＲＮＡで、１ヶ月間隔で皮内経路により２回免疫化した。ＥＬＩＳＡにより、血清をエンベロープ（ｇｐ１２０）特異的応答に関して分析した。血清を１：１０００に希釈して分析した。ｇｐ１２０に特異的なモノクローナル抗体を用いて血清中の濃度を測定した。
【図２３】３０μｇの、ＰＲ８  ＨＡをコードするｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回投与の１０日後に検出したＩＦＮ−γ陽性（左）、ＴＮＦ−α陽性（中央）、及びＩＬ−２陽性（右）ＣＤ４＋  Ｔ細胞によって測定されたＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を測定する実施例の実験結果を示すグラフである。全ての細胞内サイトカインの測定を、完全なヘマグルチニン配列の１１アミノ酸がオーバーラップする１５量体のペプチドプールで刺激した後、多色フローサイトメトリーを用いて実施した。平均値の標準誤差が棒上に示される。
【図２４】ＰＲ８  ＨＡをコードするｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回免疫化後の多機能性ＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を調べる実施例の実験結果を示す一連のグラフである。円グラフは１種、２種または３種のサイトカインを産生する抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞の分布を示す。棒グラフは１種、２種または３種のサイトカインを産生する抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞の比を示す。Ｇ＝ＩＮＦ−γ、Ｔ＝ＴＮＦ−α、２＝ＩＬ−２。全ての細胞内サイトカインの測定を、完全なヘマグルチニン配列の１１アミノ酸がオーバーラップする１５量体のペプチドプールで刺激した後、多色フローサイトメトリーを用いて実施した。平均値の標準誤差が棒上に示される。
【図２５】３０μｇの、ＰＲ８  ＨＡをコードするｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回投与の１４日後に検出したＩＦＮ−γ陽性（左）及びＴＮＦ−α陽性（右）ＣＤ８＋  Ｔ細胞によって測定されたＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を測定する実施例の実験結果を示すグラフである。全ての細胞内サイトカインの測定を、完全なヘマグルチニン配列の１１アミノ酸がオーバーラップする１５量体のペプチドプールで刺激した後、多色フローサイトメトリーを用いて実施した。平均値の標準誤差が棒上に示される。
【図２６】１０μｇまたは３０μｇのいずれかの、ＰＲ８  ＨＡ  ｍＲＮＡ−ＬＮＰの投与の１４日後及び２８日後のＨＩ力価を示す実施例の実験結果を示す一連のグラフである。力価は、七面鳥赤血球をＰＲ８ヘマグルチニンで被覆する、標準的なヘマグルチニン阻害アッセイによって測定した。２倍ずつ増加させる希釈率での血清をＲＢＣに添加し、赤血球凝集が失われる時点での力価を測定した。
【図２７】ＰＲ８  ＨＡをコードするｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回投与によって、胚中心（ＧＣ）Ｂ細胞が増加することを実証する実施例の実験結果を示す一連のグラフである。ＧＣ  Ｂ細胞を、ＩｇＤ−、Ｂ２２０＋、ＣＤ１３８−、ＣＤ１９＋、ＩｇＭ−］、ＣＤ３−及びＣＤ１４−と定義した。脾臓細胞の数を計測し、これにＧＣ  Ｂ細胞の％を乗じることによって脾臓中の全細胞数を算出した。
【図２８】ＰＲ８  ＨＡをコードするｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回投与によって、脾臓中の全メモリーＢ細胞が増加することを実証する実施例の実験結果を示す一連のグラフである。メモリーＢ細胞を、ＣＤ３−、ＣＤ１４−、ＣＤ１１ｃ＋、Ｔ−ｂｅｔ＋と定義した。脾臓細胞の数を計測し、これにメモリーＢ細胞の％を乗じることによって脾臓中の全細胞数を算出した。
【図２９】ＰＲ８  ＨＡをコードするｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回投与によって、脾臓中の全Ｔｆｈ細胞が増加することを実証する実施例の実験結果を示す一連のグラフである。Ｔｆｈ細胞を、ＣＤ４＋細胞、メモリー＋細胞、ＣＸＣＲ５＋細胞、ＰＤ−１＋細胞として定義した。脾臓細胞の数を計測し、これにＴｆｈ細胞の％を乗じることによって脾臓中の全細胞数を算出した。
【図３０】３０μｇの、ＰＲ８  ＨＡをコードするｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回投与の１０日後に検出したＩＦＮ−γ陽性（左）及びＩＬ−２陽性（右）ＣＤ８＋  Ｔ細胞によって測定されたＣＤ８＋  Ｔｆｈ細胞応答を測定する実施例の実験結果を示すグラフである。Ｔｆｈ細胞はＢｃｌ６の発現によって識別した。
【図３１】ＰＲ８  ＨＡをコードするｍＲＮＡ−ＬＮＰで免疫化したマウスの脾臓から精製した全Ｔ細胞と比較した、Ｔｆｈ細胞におけるサイトカイン発現の相対的な量を実証する実施例の実験結果を示すグラフである。全てのＴ細胞を陰性選択によって選択した。Ｔｆｈ細胞を、メモリー＋細胞、ＣＸＣＲ５＋細胞、ＰＤ−１＋細胞を選択するフローサイトメトリー選別によって更に精製した。ｍＲＮＡをＴ細胞集団から単離し、特異的プライマーを用いたリアルタイムＰＣＲによって分析した。値は普遍的なｍＲＮＡと比較したものとして表す。
【図３２】Ｔ濾胞調節細胞が修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰの投与によって増加しないことを実証する実施例の実験結果を示すグラフである。Ｔｆｈ細胞を、メモリー＋、ＣＸＣＲ５＋、ＰＤ−１＋、Ｂｃｌ６＋として識別し、Ｔ濾胞調節細胞を、メモリー＋、ＣＸＣＲ５＋、ＰＤ−１＋、Ｂｃｌ６＋、ＦｏｘＰ３＋として識別した。データは、Ｔ濾胞調節細胞であったＴｆｈ細胞の百分率として表す。
【図３３】ＨＡ  ｍＲＮＡ−ＬＮＰまたは対照で単回免疫化したマウスにおけるインフルエンザ負荷後の、病気の尺度としての体重減少を実証する実施例の実験結果を示すグラフである。
【図３４】２週時（中央）及び４週時（右）における、頭部及び茎部の両方がＨ１由来であるヘマグルチニンに対するＨＡ結合を実証する実施例の実験結果を示す一連のグラフである。
【図３５】ヘマグルチニンの茎部領域への特異的結合を実証する実施例の実験結果を示す一連のグラフである。２週時（中央）及び４週時（右）における、Ｈ５−頭部／Ｈ１−茎部ＨＡ（上）及びＨ５−頭部／Ｈ３−茎部（下）を含むハイブリッドヘマグルチニンに対するＨＡ結合。
【図３６】経時的な、ＨＡ全体への結合（左）及びＨＡ茎部結合（右）を調べる実施例の実験結果を示す一組のグラフである。免疫化後、経時的に茎部結合が増加することが実証される。
【図３７】ＰＲ８  ＨＡをコードする修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回投与後のヘマグルチニン阻害によって測定される中和力価が、投与後６ヶ月において変化していないことを実証する実験の結果を示すグラフである。
【図３８】Ｃａｌ／７／２００９  ＨＡをコードするｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回投与の２週間後に測定したＨＡ阻害力価を示す実験結果を示すグラフである。
【図３９】ＣＡ０９  ＨＡをコードするｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回投与後２週間で検出した、ＩＦＮ−γ陽性（左上）、ＴＮＦ−α陽性（右上）、及びＩＬ−２陽性（下）ＣＤ４＋  Ｔ細胞によって測定されたＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を測定する実施例の実験結果を示す一連のグラフである。個々の動物のサイトカイン産生を、脾臓中の全ＣＤ４＋  Ｔ細胞のパーセントとして表示する。ポリ（Ｃ）＝３０μｇの、皮内（ＩＤ）注射した対照であるポリ（Ｃ）ｍＲＮＡ−ＬＮＰを注射した対照マウス（ＩＤ）。全ての細胞内サイトカインの測定を、完全なＨＡ配列の１１アミノ酸がオーバーラップする１５量体のペプチドプールで刺激した後、多色フローサイトメトリーを用いて実施した。平均値の標準誤差が示される。
【図４０】ＣＡ０９  ＨＡをコードするｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回投与の２週間後のＴｆｈ細胞応答を測定する実施例の実験結果を示すグラフである。Ｔｆｈ細胞を、ＣＤ４＋細胞、メモリー＋細胞、ＣＸＣＲ５＋細胞、ＰＤ−１＋細胞として定義した。誤差棒は平均値の標準誤差である。
【図４１】筋内注射（左）及び皮内注射（右）によって投与した、ＣＡ０９  ＨＡをコードするｍＲＮＡの単回投与後のＨＡ阻害力価を測定する実施例の実験結果を示す一組のグラフである。
【図４２】コドン最適化した非修飾ＨＡ  ｍＲＮＡによってＩＮＦ−α産生が誘導され、ｍ１Ψ修飾ｍＲＮＡでは誘導が起こらないことを実証する実施例の実験結果を示すグラフであり、このことは、非修飾の、コドン最適化した、ＨＡをコードするｍＲＮＡが自然免疫応答を誘導することを実証している。
【図４３】ＨＰＬＣ精製したヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰの静脈内注射によっては、炎症促進性サイトカインまたはＩ型インターフェロンが誘導されないことを実証する実施例の実験結果を示す一連のグラフである。
【図４４】ヌクレオシド修飾したＨＡをコードするｍＲＮＡの投与により、非修飾のＨＡをコードするｍＲＮＡと比較して、ＩＦＮ−γ産生（左）、ＴＮＦ−α産生（中心）、及びＩＬ−２産生（右）によって測定されるＣＤ４＋  Ｔ細胞応答が、有意により良好に誘導されることを実証する実施例の実験結果を示す一連のグラフである。
【図４５】ヌクレオシド修飾したＨＡをコードするｍＲＮＡの投与により、非修飾のＨＡをコードするｍＲＮＡと比較して、脾臓中のＴｆｈ細胞の数が増加することを実証する実施例の実験結果を示すグラフである。
【図４６】ヌクレオシド修飾したＨＡをコードするｍＲＮＡの投与により、非修飾のＨＡをコードするｍＲＮＡと比較して、抗原特異的Ｔｆｈ細胞応答の出現頻度が増加することを実証する実施例の実験結果を示すグラフである。
【図４７】ヌクレオシド修飾したＨＡをコードするｍＲＮＡの投与により、非修飾のＨＡをコードするｍＲＮＡと比較して、非修飾のコドン最適化したｍＲＮＡまたはｍ１Ψ修飾ｍＲＮＡの単回投与の１０日後に測定したＨＡ阻害力価が上昇することを実証する実施例の実験結果を示すグラフである。
【図４８】ＬＮＰ中に複合体化した（左）及び裸の（右）、投与した、ルシフェラーゼをコードするｍ１Ψ修飾ｍＲＮＡのｍＲＮＡ翻訳を調べる実施例の実験結果を示す一組のグラフである。翻訳は、ルシフェラーゼをコードするｍ１Ψ−ｍＲＮＡを注射し、次いで４時間後にＤ−ルシフェリンを投与し、ＩＶＩＳスペクトル上で画像化することによって測定した。活性は、増加したシグナルの領域を選択し、ＩＶＩＳソフトウェアを用いることによって定量化した。
【図４９】マウスに皮内注射した異なるＬＮＰ処方を比較する実施例の実験結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は対象において適応免疫応答を誘導するための組成物及び方法に関する。ある特定の実施形態において、本発明は、少なくとも１種の抗原、アジュバント、またはそれらの組み合わせをコードする少なくとも１種のヌクレオシド修飾ＲＮＡを含む組成物を提供する。例えば、一実施形態において、上記組成物は、少なくとも１種の抗原、アジュバント、またはそれらの組み合わせをコードする少なくとも１種のヌクレオシド修飾ＲＮＡを含むワクチンであり、該ワクチンは、上記対象において上記少なくとも１種の抗原に対する免疫を誘導し、したがって、上記対象において上記少なくとも１種の抗原に関連する病原体または病理に対する免疫を誘導する。ある特定の実施形態において、上記少なくとも１種のヌクレオシド修飾ＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に封入されている。
【００２９】
定義
別段の定義がなされない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載されるものと類似のまたは等価な任意の方法及び物質を本発明の実施または試験において用いることができるが、好ましい方法及び材料を記載する。
【００３０】
本明細書では、以下の用語のそれぞれは、本節における該用語に関連する意味を有する。
【００３１】
冠詞の「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、１または複数（すなわち、少なくとも１）の当該冠詞の文法上の目的語を指すために用いられる。例として、「ある要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」とは１の要素または複数の要素を意味する。
【００３２】
本明細書で使用される「約」は、量、時間的な期間などの測定可能な値に言及する場合に、明示した値からの±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、一層より好ましくは±１％、更により好ましくは±０．１％の変化を包含することを意味し、というのはかかる変化が開示された方法を実施するのに適していることによる。
【００３３】
本明細書で使用される「抗体」という用語は免疫グロブリン分子を指し、免疫グロブリン分子は抗原と特異的に結合する。抗体は天然源由来または組換え源由来の完全な免疫グロブリンであってよく、完全な免疫グロブリンの免疫反応性部分であってもよい。抗体は一般には免疫グロブリン分子の四量体である。本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２、ならびに一本鎖抗体及びヒト化抗体を含む多様な形態で存在し得る（Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｉｎ：Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；  Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｈｏｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；  Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）。
【００３４】
「抗体フラグメント」という用語は完全な抗体の一部を指し、且つ完全な抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、及びＦｖフラグメント、直鎖抗体、ｓｃＦｖ抗体、及び抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３５】
本明細書で用いられる「抗体重鎖」は、全ての、天然起源の立体配座における抗体分子中に存在する２種のポリペプチド鎖のうちの大きい方を指す。
【００３６】
本明細書で用いられる「抗体軽鎖」は、全ての、天然起源の立体配座における抗体分子中に存在する２種のポリペプチド鎖のうちの小さい方を指す。κ及びλ軽鎖は２種の主たる抗体軽鎖イソ型を指す。
【００３７】
本明細書で使用される「合成抗体」という用語は、例えばバクテリオファージによって発現される抗体などの、組換えＤＮＡ技術を用いて生成される抗体を意味する。この用語はまた、当該の抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成された抗体をも意味すると解釈されるべきであり、該ＤＮＡ分子は、抗体タンパク質、または該抗体を特定するアミノ酸配列を発現し、ここで上記ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、本技術分野で利用可能であり且つ周知の合成ＤＮＡ技術またはアミノ酸配列技術を用いて得られたものである。この用語はまた、当該の抗体をコードするＲＮＡ分子の合成によって生成された抗体をも意味すると解釈されるべきである。該ＲＮＡ分子は、抗体タンパク質、または該抗体を特定するアミノ酸配列を発現し、ここで上記ＲＮＡは、本技術分野において利用可能であり且つ周知の、（合成もしくはクローン化された）ＤＮＡの転写または他の技術によって得られたものである。
【００３８】
本明細書で使用される「抗原」または「Ａｇ」という用語は、適応免疫応答を誘発する分子として定義される。この免疫応答は、抗体産生、もしくは特異的免疫担当細胞の活性化、またはそれらの両方を含んでいてもよい。当業者ならば、実質的に全てのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原として働き得ることを理解するであろう。更に、抗原は、組換えもしくはゲノムのＤＮＡまたはＲＮＡから誘導し得る。したがって、適応免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡまたはＲＮＡが、本明細書において用いられる用語としての「抗原」をコードすることを当業者ならば理解するであろう。更に、当業者ならば、抗原は遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はないことを理解するであろう。本発明は、限定されないが、２種以上の遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を含むこと、及びこれらのヌクレオチド配列が、所望の免疫応答を誘発するために様々な組み合わせで配置されることは容易に明らかである。更に、当業者ならば、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原が合成、生成させることができるまたは生物学的試料から誘導することができることは容易に明らかである。かかる生物学的試料としては、組織試料、腫瘍試料、細胞または生物学的流体が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３９】
本明細書で使用される「アジュバント」という用語は、抗原特異的適応免疫応答を増強する任意の分子として定義される。
【００４０】
「疾患」という用語は、動物の健康状態であって、当該の動物が恒常性を維持することができず、且つ当該の疾患が改善されない場合、該動物の健康が悪化し続ける上記健康状態である。これに対して、動物における「障害」は、当該の動物が恒常性を維持することはできるが、該障害がない場合よりもより好ましくない健康状態である。障害は、これを未治療のまま放置しても、必ずしも当該動物の健康状態を更に低下させるとは限らない。
【００４１】
本明細書で用いられる「有効量」は、治療上のまたは予防上の恩恵を与える量を意味する。
【００４２】
「コードする」は、規定されたヌクレオチドの配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）または規定されたアミノ酸の配列のいずれか及びそれらに由来する生物学的特性を有する、生物学的過程における他のポリマーならびに高分子の合成のためのテンプレートとしての役割を果たす、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中の、特定のヌクレオチドの配列の固有の特性を指す。したがって、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が細胞または他の生物学的系においてタンパク質を産生する場合、当該遺伝子は当該タンパク質をコードする。コード鎖であって、そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、且つ通常は配列リストに記載される上記コード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のためのテンプレートとして用いられる非コード鎖の両方を、当該タンパク質またはその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産生物をコードすると称することができる。
【００４３】
「発現ベクター」は、発現されるべきヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは発現のための十分なシス作用エレメントを含み、発現のための他のエレメントが宿主細胞によってまたはイン・ビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込んだ、コスミド、プラスミド（例えば、裸のまたはリポソーム中に含まれる）ＲＮＡ、及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）などの本技術分野で公知のベクターの全てが含まれる。
【００４４】
「相同な」は、２種のポリペプチド間または２種の核酸分子間の配列類似性または配列同一性を指す。比較される２種の配列の両方の位置が同一の塩基またはアミノ酸単量体サブユニットによって占有される場合、例えば、２種のＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンによって占有される場合、これらの分子はその位置において相同である。２種の配列間の相同性のパーセントは、比較した位置の数で除した、２種の配列によって共有される、一致するまたは相同な位置の数×１００の関数である。例えば、２種の配列における１０の位置の内の６の位置が一致するまたは相同である場合、当該の２種の配列は６０％相同である。例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣ及びＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を共有する。一般に、２種の配列が最大の相同性を与えるように整列された状態で比較が行われる。
【００４５】
「免疫原」は、免疫応答を生じさせるために体内に導入される任意の物質を指す。当該の物質は、タンパク質などの物理的分子であってもよく、またはＤＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくはウイルスなど、ベクターによってコードされていてもよい。
【００４６】
「単離された」は、自然の状態から変化を受けたまたは取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物中に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離されて」いないが、その自然の状態の共存する物質から部分的または完全に分離された同一の核酸またはペプチドは「単離されている」。単離された核酸またはタンパク質は実質的に精製された形態で存在していてもよく、または例えば、宿主細胞などの非天然の環境中に存在していてもよい。
【００４７】
本発明の文脈において、一般に出現するヌクレオシド（Ｎ−グリコシド結合を介してリボースまたはデオキシリボース糖に結合した核酸塩基）に関する以下の略語が用いられる。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシチジンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、「Ｕ」はウリジンを指す。
【００４８】
別段の明示がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重したバージョンであり、同一のアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という表現はまた、当該のタンパク質をコードするヌクレオチド配列が一部のバージョンにおいてイントロン（複数可）を含むことができる範囲でイントロンを含んでいてもよい。
【００４９】
本明細書で使用される「調節する」という用語は、対象における応答のレベルであって、治療薬または化合物の非存在下での当該の対象における応答のレベルと比較した、及び／または他の点では同一であるが治療を受けていない対象における応答のレベルと比較した、上記応答のレベルの検出可能な増加または減少を媒介することを意味する。この用語は、生得のシグナルまたは応答を混乱させる及び／またはそれらに影響を及ぼし、それにより対象、好ましくはヒト、において有益な治療上の応答を媒介することを包含する。
【００５０】
別段の明示がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重したバージョンであり、同一のアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質及びＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含んでいてもよい。また、上記ヌクレオチド配列は、細胞内の翻訳機構によって翻訳可能な修飾ヌクレオシドを含んでいてもよい。例えば、全てのウリジンがプソイドウリジン、１−メチルプソイドウリジン、または別の修飾ヌクレオシドで置換されているｍＲＮＡ。
【００５１】
「作動可能に連結された」という用語は、調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結であって、後者を発現させる上記機能的連結を指す。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列との機能的関係に置かれている場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、該プロモーターは該コード配列に作動可能に連結されている。概して、作動可能に連結されたＤＮＡまたはＲＮＡ配列は連続しており、必要に応じて、２種のタンパク質コード領域を同一の読み枠中で結合する。
【００５２】
本明細書中では、「患者」、「対象」、「個体」などの用語は同義で用いられ、イン・ビトロまたはイン・シチューのいずれであっても、本明細書に記載の方法に適する任意の動物またはその細胞を指す。特定の非限定的な実施形態において、上記患者、対象または個体はヒトである。
【００５３】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語はヌクレオチドの連鎖として定義される。更に、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書で使用される核酸とポリヌクレオチドとは同義である。当業者であれば、核酸はポリヌクレオチドであり、ポリヌクレオチドは単量体の「ヌクレオチド」へと加水分解することができるという一般的な知識を有する。上記単量体のヌクレオチドはヌクレオシドへと加水分解することができる。本明細書で使用されるポリヌクレオチドとしては、限定はされないが、組換え手段、すなわち、通常のクローニング技術及びＰＣＲ（商標）などを用いた、組換えライブラリまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングを含む、本技術分野で利用可能な任意の手段によって、及び合成的手段によって得られる全ての核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
ある特定の例において、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸は「ヌクレオシド修飾核酸」であり、これは少なくとも１種の修飾ヌクレオシドを含む核酸を指す。「修飾ヌクレオシド」は修飾を有するヌクレオシドを指す。例えば、１００を超える種々のヌクレオシド修飾がＲＮＡにおいて同定されている（Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ：１９９９  ｕｐｄａｔｅ．Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２７：１９６−１９７）。
【００５５】
ある特定の実施形態において、「プソイドウリジン」は、別の実施形態において、ｍ１ａｃｐ３Ψ（１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン）を指す。別の実施形態において、この用語は、ｍ１Ψ（１−メチルプソイドウリジン）を指す。別の実施形態において、この用語は、Ψｍ（２’−Ｏ−メチルプソイドウリジン）を指す。別の実施形態において、この用語は、ｍ５Ｄ（５−メチルジヒドロウリジン）を指す。別の実施形態において、この用語は、ｍ３Ψ（３−メチルプソイドウリジン）を指す。別の実施形態において、この用語は、更に修飾されていないプソイドウリジン部分を指す。実施形態において、この用語は、上記のプソイドウリジンのいずれかのモノリン酸エステル、ジリン酸エステル、またはトリリン酸エステルを指す。別の実施形態において、この用語は、本技術分野で公知の任意の他のプソイドウリジンを指す。各可能な選択肢は本発明の別個の実施形態を表す。
【００５６】
本明細書で使用される「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は同義で用いられ、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基から構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２のアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成することができるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドとしては、ペプチド結合によって互いに結合した２以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が挙げられる。本明細書で用いられる場合、この用語は、本技術分野で一般的に、例えば、ペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも称される短鎖、ならびに本技術分野で一般的にタンパク質と称され、多くの種類があるより長い連鎖の両方を指す。「ポリペプチド」としては、数ある中でも、例えば、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質などが挙げられる。上記ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【００５７】
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するために必要な、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列として定義される。例えば、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼによって認識され、イン・ビトロ転写によってｍＲＮＡを生成するために用いられるプロモーター。
【００５８】
本明細書で用いられる、抗体に関する「特異的に結合する」という用語は、特定の抗原を認識するが、試料中の他の分子を実質的に認識しないまたは該分子実質的に結合しない抗体を意味する。例えば、１つの種由来のある抗原に特異的に結合する抗体はまた、１つまたは複数の他の種由来の当該の抗原にも結合する場合がある。しかし、かかる異種間反応性は、それ自体が特異的であるとの抗体の分類を変更するものではない。別の例において、ある抗原に特異的に結合する抗体はまた、当該の抗原の異なる対立遺伝子型にも結合する場合がある。しかしながら、かかる異種間反応性は、それ自体が特異的であるとの抗体の分類を変更するものではない。いくつかの例において、「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語は、抗体、タンパク質、またはペプチドの第２の化学種との相互作用に関して用いられ、当該の相互作用が当該の化学種上の特定の構造（例えば、抗原決定基すなわちエピトープ）の存在に依存する、例えば、抗体が、全般的にタンパク質に対してではなく、特定のタンパク質の構造を認識して結合することを意味する場合がある。ある抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、エピトープＡを含有する分子（または遊離の非標識Ａ）が標識「Ａ」及び抗体を含む反応混合物中に存在すると、当該抗体に結合した標識Ａの量が減少することとなる。
【００５９】
本明細書で使用される「治療上の」は治療及び／または予防を意味する。治療効果は、疾患もしくは障害の状態の少なくとも１つの徴候または症状の抑制、減退、寛解、または根絶によって得られる。
【００６０】
「治療有効量」という用語は、研究者、獣医師、医師または他の臨床家によって求められている組織、系、もしくは対象の生物学的または医学的応答を誘発することとなる対象化合物の量を指す。「治療有効量」という用語は、投与された場合に、治療を受けている障害もしくは疾患の１つまたは複数の徴候または症状の発症を予防するか、または該徴候または症状をある程度緩和するのに十分な化合物の量を含む。治療有効量は、当該化合物、当該疾患及びその重篤度ならびに治療を受ける対象の年齢、体重などに依存して変化することとなる。
【００６１】
疾患を「治療する」は、該用語が本明細書で用いられる場合、対象に生じる疾患もしくは障害の少なくとも１つの徴候または症状の頻度あるいは重篤度を低下させることを意味する。
【００６２】
本明細書で使用される「形質移入された（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）」または「形質転換された（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」または「形質導入された（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）」という用語は、外因性核酸が宿主細胞中に移入または導入される過程を指す。「形質移入された」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸で形質移入された、形質転換されたまたは形質導入された細胞である。上記細胞は初生の対象とする細胞及びその後代を包含する。
【００６３】
本明細書で使用される「転写制御下」または「作動可能に連結された」という表現は、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始及びポリヌクレオチドの発現を制御するために、プロモーターがポリヌクレオチドに対して正しい位置及び方向にあることを意味する。
【００６４】
「ベクター」は、単離された核酸を含み、当該単離された核酸を細胞の内部に送達するために用いることができる物質の組成物である。数多くのベクターが本技術分野で公知であり、線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に連結したポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスが挙げられるが、これらに限定はされない。したがって、「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを包含する。この用語はまた、例えばポリリシン化合物、リポソームなどの核酸の細胞中への移動を容易にする非プラスミド及び非ウイルス化合物をも包含すると解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００６５】
「アルキル」は、１〜２４の炭素原子（Ｃ１〜Ｃ２４アルキル）、１〜１２の炭素原子（Ｃ１〜Ｃ１２アルキル）、１〜８の炭素原子（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）または１〜６の炭素原子（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）を有する、飽和または不飽和（すなわち、１つまたは複数の二重結合及び／または三重結合を含む）の、且つ当該分子の残部に単結合により結合する、炭素原子及び水素原子のみからなる直鎖状または分枝状炭化水素鎖ラジカル、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、１−メチルエチル（イソプロピル）、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、１，１−ジメチルエチル（ｔ−ブチル）、３−メチルヘキシル、２−メチルヘキシル、エテニル、プロパ−１−エニル、ブタ−１−エニル、ペンタ−１−エニル、ペンタ−１，４−ジエニル、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニルなどを指す。別段の明示がない限り、アルキル基は任意選択で置換されている。
【００６６】
「アルキレン」または「アルキレン鎖」は、飽和または不飽和（すなわち、１つまたは複数の二重結合（アルケニレン）及び／または三重結合（アルキニレン）を含む）であり、例えば、１〜２４の炭素原子（Ｃ１〜Ｃ２４アルキレン）、１〜１５の炭素原子（Ｃ１〜Ｃ１５アルキレン）、１〜１２の炭素原子（Ｃ１〜Ｃ１２アルキレン）、１〜８の炭素原子（Ｃ１〜Ｃ８アルキレン）、１〜６の炭素原子（Ｃ１〜Ｃ６アルキレン）、２〜４の炭素原子（Ｃ２〜Ｃ４アルキレン）、１〜２の炭素原子（Ｃ１〜Ｃ２アルキレン）を有する、炭素原子及び水素原子のみからなる、当該分子の残部をラジカル基に結合する直鎖状または分枝状の２価の炭化水素鎖、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、ｎ−ブチレン、エテニレン、プロペニレン、ｎ−ブテニレン、プロピニレン、ｎ−ブチニレンなどを指す。上記アルキレン鎖は、単結合または二重結合を介して当該分子の残部と結合し、単結合または二重結合を介してラジカル基と結合する。当該分子の上記残部及び上記ラジカル基への当該アルキレン鎖の結合点は、当該連鎖内の１の炭素または任意の２の炭素を介することがきる。本明細書において特段の明示がない限り、アルキレン鎖は任意選択で置換されていてもよい。
【００６７】
「シクロアルキル」または「炭素環式リング」は、炭素原子及び水素原子のみからなる安定な非芳香族単環式または多環式炭化水素ラジカルを指し、該「シクロアルキル」または「炭素環式リング」は、３〜１５の炭素原子を有する、好ましくは３〜１０の炭素原子を有する縮合環系または架橋環系を含んでいてもよく、且つ飽和または不飽和であり、単結合によって当該分子の残部に結合している。単環式ラジカルとしては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、及びシクロオクチルが挙げられる。多環式ラジカルとしては、例えば、アダマンチル、ノルボルニル、デカリニル、７，７−ジメチルビシクロ［２．２．１］ヘプタニルなどが挙げられる。別段の明示がない限り、シクロアルキル基は任意選択で置換されている。
【００６８】
「シクロアルキレン」は２価のシクロアルキル基である。本明細書において別段の明記がない限り、シクロアルキレン基は任意選択で置換されていてもよい。
【００６９】
「ヘテロシクリル」または「ヘテロ環式リング」は、２〜１２の炭素原子及び窒素、酸素及び硫黄からなる群より選択される１〜６のヘテロ原子からなる安定な３〜１８員非芳香環ラジカルを指す。本明細書において別段の明記がない限り、上記ヘテロシクリルラジカルは、単環式リング系、二環式リング系、三環式リング系または四環式リング系であってもよく、これらは縮合環系または架橋環系を含んでいてもよく、当該ヘテロシクリルラジカル中の窒素原子、炭素原子または硫黄原子は、任意選択で酸化されていてもよく、窒素原子は任意選択で四級化されていてもよく、上記ヘテロシクリルラジカルは部分的または完全に飽和していてもよい。かかるヘテロシクリルラジカルの例としては、ジオキソラニル、チエニル［１，３］ジチアニル、デカヒドロイソキノリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オクタヒドロインドリル、オクタヒドロイソインドリル、２−オキソピペラジニル、２−オキソピペリジニル、２−オキソピロリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、４−ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリジニル、キヌクリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフリル、トリチアニル、テトラヒドロピラニル、チオモルホリニル、チアモルホリニル、１−オキソ−チオモルホリニル、及び１，１−ジオキソ−チオモルホリニルが挙げられるが、これらに限定はされない。別段の明示がない限り、ヘテロシクリル基は任意選択で置換されていてもよい。
【００７０】
本明細書で使用される「置換された」は、少なくとも１つの水素原子が、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩなどのハロゲン原子；オキソ基（＝Ｏ）；ヒドロキシル基（−ＯＨ）；アルコキシ基（−ＯＲａ、但しＲａはＣ１〜Ｃ１２アルキルまたはシクロアルキル）、カルボキシル基（−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒａまたは−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａ、但しＲａはＨ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルまたはシクロアルキル）；アミン基（−ＮＲａＲｂ、但しＲａ及びＲｂはそれぞれ独立にＨ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルまたはシクロアルキル）；Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基；及びシクロアルキル基などの非水素原子への結合によって置換されている上記基（例えば、アルキル、シクロアルキルまたはヘテロシクリル）のいずれかを意味する。いくつかの実施形態において、上記置換基はＣ１〜Ｃ１２アルキル基である。他の実施形態において、上記置換基はシクロアルキル基である。他の実施形態において、上記置換基はフルオロなどのハロ基である。他の実施形態において、上記置換基はオキソ基である。他の実施形態において、上記置換基はヒドロキシル基である。他の実施形態において、上記置換基はアルコキシ基である。他の実施形態において、上記置換基はカルボキシル基である。他の実施形態において、上記置換基はアミン基である。
【００７１】
「任意選択の」または「任意選択で」（例えば、任意選択で置換された）は、その後に記載される状況の事象が生じても生じなくてもよいこと、及び上記記載は、上記事象または状況が生じる場合及びそれらが生じない場合を包含することを意味する。例えば、「任意選択で置換されたアルキル」は、当該アルキルラジカルが置換されていてもされていなくてもよいこと、及び上記記載は、置換されたアルキルラジカル及び置換基をもたないアルキルラジカルの両方を包含することを意味する。
【００７２】
範囲：本開示を通して、本発明の様々な態様を範囲形式で提示する場合がある。範囲形式の記載は単に利便性及び簡潔さのためのものであることを理解するべきであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきものではない。したがって、範囲の記載は、その範囲内の全ての可能な部分範囲及び個々の数値を具体的に開示しているものとみなすべきである。例えば、１〜６などの範囲の記述は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等の部分範囲、ならびに当該範囲内の個々の数字、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６を具体的に開示しているものとみなすべきである。このことは当該範囲の幅の如何を問わず適用される。
【００７３】
詳細な説明
本発明は対象において適応免疫応答を誘導するための組成物及び方法に関する。ある特定の実施形態において、本発明は抗原をコードする核酸分子を含む組成物を提供し、該抗原は上記対象において適応免疫応答を誘導する。例えば、ある特定の実施形態において、上記組成物は抗原をコードする核酸分子を含むワクチンを含む。
【００７４】
一実施形態において、本発明の組成物はイン・ビトロ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡを含む。例えば、ある特定の実施形態において、本発明の組成物は抗原をコードするＩＶＴ  ＲＮＡを含み、該抗原は適応免疫応答を誘導する。ある特定の実施形態において、上記抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生生物抗原、腫瘍特異抗原、または腫瘍関連抗原のうちの少なくとも１種である。但し、本発明は、いずれの特定の抗原または抗原の組み合わせにも限定されない。
【００７５】
ある特定の実施形態において、本組成物の抗原をコードする核酸はヌクレオシド修飾ＲＮＡである。本発明は、抗原をコードするヌクレオシド修飾ＲＮＡが、強固なＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、またはＴｆｈ細胞の抗原特異的免疫応答を誘導するという知見に一部基づいている。更に、上記抗原をコードするヌクレオシド修飾ＲＮＡは、抗原特異的抗体の産生を誘導することが認められた。上記ヌクレオシド修飾ＲＮＡは、現在のプライムブーストワクチン投与計画及びウイルスベクターに基づく投与計画と同等またはそれを上回る適応免疫応答を誘導することが実証される。
【００７６】
ある特定の実施形態において、本組成物は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む。例えば、一実施形態において、本組成物は、ＬＮＰ内に封入された抗原をコードする核酸分子を含む。特定の例において、上記ＬＮＰは当該核酸分子の細胞内取込みを増強する。
【００７７】
ある特定の実施形態において、本組成物はアジュバントを含む。ある特定の実施形態において、本組成物はアジュバントをコードする核酸分子を含む。例えば、一実施形態において、本組成物はアジュバントをコードするヌクレオシド修飾ＲＮＡを含む。一実施形態において、本組成物は抗原及びアジュバントをコードするヌクレオシド修飾ＲＮＡを含む。一実施形態において、本組成物は抗原をコードする第１のヌクレオシド修飾ＲＮＡと、アジュバントをコードする第２のヌクレオシド修飾ＲＮＡとを含む。
【００７８】
一実施形態において、本発明は対象における適応免疫応答の誘導方法を提供する。例えば、本方法は、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物、がんなどに対する、上記対象の免疫を与えるために用いることができる。いくつかの実施形態において、本方法は、抗原、アジュバント、またはそれらの組み合わせをコードする１種または複数種のヌクレオシド修飾ＲＮＡを含む組成物を上記対象に投与することを含む。
【００７９】
一実施形態において、本方法は、例えば皮内投与を始めとする、上記対象への本組成物の全身投与を含む。ある特定の実施形態において、本方法は上記対象へ複数回の投与を行うことを含む。別の実施形態において、本方法は、適応免疫応答を誘導するのに有効な本組成物の単回投与を行うことを含む。
【００８０】
ワクチン
一実施形態において、本発明は対象において適応免疫応答を誘導するための免疫原性組成物を提供する。例えば、一実施形態において、上記免疫原性組成物はワクチンである。組成物がワクチンとして有用であるためには、該組成物は、細胞、組織または哺乳動物（例えば、ヒト）において当該の抗原に対する適応免疫応答を誘導する必要がある。ある特定の例において、上記ワクチンは当該の哺乳動物において防御免疫応答を誘導する。本明細書で使用される「免疫原性組成物」は、抗原（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）、抗原をコードする核酸、抗原もしくは細胞成分を発現または提示する細胞、あるいはそれらの組み合わせを含んでいてもよい。特定の実施形態において、本組成物は、本明細書に記載されるいずれかのペプチド抗原、もしくはその免疫原性機能的等価物の全てまたは一部を含むかあるいはコードする。他の実施形態において、本組成物は、更なる免疫刺激剤またはかかる刺激剤をコードする核酸を含む混合物の形態である。免疫刺激剤としては、更なる抗原、免疫調節剤、抗原提示細胞またはアジュバントが挙げられるが、これらに限定はされない。他の実施形態において、１種または複数種の更なる薬剤が当該の抗原または免疫刺激剤に、任意の組み合わせで共有結合している。ある特定の実施形態において、上記抗原性組成物はＨＬＡアンカーモチーフアミノ酸に結合しているか、またはこれを含む。
【００８１】
本発明の文脈において、「ワクチン」という用語は動物への接種時に免疫を誘導する物質を指す。
【００８２】
本発明のワクチンは、その核酸及び／または細胞成分の組成が変化してもよい。非限定的な例において、抗原をコードする核酸はアジュバントと共に製剤されてもよい。当然のことながら、本明細書に記載の様々な組成物は、追加の成分を更に含んでいてもよい。例えば、１種または複数種のワクチン成分は、脂質、リポソーム、または脂質ナノ粒子中に含まれていてもよい。別の非限定的な例において、ワクチンは１種または複数種のアジュバントを含んでいてもよい。本発明のワクチン及びその種々の成分は、本明細書に開示される、または本開示に照らして当業者に公知であろういずれかの方法によって調製及び／または投与することができる。
【００８３】
上記抗原の発現による免疫の誘導は、当該抗原に対する宿主中の免疫系の全てまたは任意の一部の応答をイン・ビボまたはイン・ビトロで観察することによって検出することができる。
【００８４】
例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導の検出方法は周知である。生体内に侵入した異物はＡＰＣの作用によりＴ細胞及びＢ細胞に提示される。ＡＰＣによって抗原特異的な形態で提示された抗原に応答するＴ細胞は、当該の抗原による刺激によって細胞傷害性Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球すなわちＣＴＬとも呼ばれる）に分化する。次いでこれらの抗原によって刺激された細胞は増殖する。この過程は本明細書においてＴ細胞の「活性化」と呼ばれる。したがって、ポリペプチドもしくはペプチドまたはそれらの組み合わせのエピトープによるＣＴＬの誘導は、ＡＰＣによるＴ細胞へのポリペプチドもしくはペプチドまたはそれらの組み合わせのエピトープの提示、及びＣＴＬの誘導の検出によって評価することができる。更に、ＡＰＣは、Ｂ細胞、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、マクロファージ、好酸球及びＮＫ細胞を活性化する効果を有する。
【００８５】
樹状細胞（ＤＣ）をＡＰＣとして用いるＣＴＬの誘導作用の評価方法は本技術分野で周知である。ＤＣはＡＰＣの中でも強固なＣＴＬ誘導作用を有する代表的なＡＰＣである。本発明の方法において、ポリペプチドもしくはペプチドまたはそれらの組み合わせのエピトープは、初期にはＤＣによって発現され、次いでこのＤＣがＴ細胞と接触する。ＤＣとの接触後に着目する細胞に対する細胞傷害作用を有するＴ細胞が検出されることは、ポリペプチドもしくはペプチドまたはそれらの組み合わせのエピトープが上記細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する活性を有することを示す。更に、誘導された免疫応答は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイなどの抗ＩＦＮ−γ抗体を用いた視覚化により、固定化されたペプチドまたはペプチドの組み合わせを有する抗原提示細胞の存在下でＣＴＬによって産生及び放出されたＩＦＮ−γを測定することによって調べることもできる。
【００８６】
ＤＣとは別に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）もＡＰＣとして用いることができる。ＣＴＬの誘導はＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下でＰＢＭＣを培養することによって増強されることが報告されている。同様に、ＣＴＬはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）及びＩＬ−７の存在下でＰＢＭＣを培養することによって誘導されることが示されている。
【００８７】
これらの方法によりＣＴＬ誘導活性を有することが確認された抗原は、ＤＣ活性化作用及びその後のＣＴＬ誘導活性を有する抗原である。更に、ＡＰＣによる抗原の提示によって細胞傷害性を獲得したＣＴＬも、抗原に関連する障害に対するワクチンとして用いることができる。
【００８８】
上記抗原の発現による免疫の誘導は、当該の抗原に対する抗体産生の誘導を観察することによって更に確認することができる。例えば、抗原をコードする組成物で免疫化された実験動物において当該の抗原に対する抗体が誘導される場合、及び抗原関連の病理がこれらの抗体によって抑制される場合、当該組成物は免疫を誘導すると判定される。
【００８９】
上記抗原の発現による免疫の誘導は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の誘導を観察することによって更に確認することができる。ＣＤ４＋  Ｔ細胞は標的細胞を溶解することもできるが、主としてＣＴＬ及び抗体の生成を含む他の形式の免疫応答の誘導を支援する。ＣＤ４＋  Ｔ細胞による支援の形式は、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ９細胞、Ｔｈ１７細胞、制御性Ｔ細胞、または濾胞性ヘルパーＴ（Ｔｆｈ）細胞として特徴付けられる。各サブタイプのＣＤ４＋  Ｔ細胞はある特定の形式の免疫応答を支援する。本発明にとって特に興味深いのは、Τｆｈサブタイプが高親和性抗体の生成を支援することである。
【００９０】
本発明の治療用化合物または組成物を、疾患もしくは障害に罹患しているかまたはそれらの発症の危険性がある（もしくはそれらに感受性である）対象に、予防的に（すなわち、当該疾患または障害を予防するために）、または治療的に（すなわち、当該疾患または障害を治療するために）投与してもよい。かかる対象は標準的な臨床的方法を用いて識別することができる。本発明の文脈において、予防的投与は、疾患または障害が予防されるか、あるいはその進行が遅延されるように、疾患の顕著な臨床症状の発現の前に行われる。医学の分野の文脈において、「予防する」という用語は、疾患による死亡または病的状態の負荷を低減する任意の活動を包含する。予防は、１次、２次及び３次の予防レベルで行うことができる。１次の予防は疾患の発症を回避する一方、２次及び３次レベルの予防は疾患の進行及び症状の出現を予防し、ならびに、機能を回復させ且つ疾患に関連する合併症を低減することによって既に罹患している疾患の悪影響を低減することを目的とする活動を包含する。
【００９１】
核酸
一実施形態において、本発明はヌクレオシド修飾核酸分子を含む。一実施形態において、上記ヌクレオシド修飾核酸分子は抗原をコードする。一実施形態において、上記ヌクレオシド修飾核酸分子は複数の抗原をコードする。ある特定の実施形態において、上記ヌクレオシド修飾核酸分子は、抗原であって、当該抗原に対する適応免疫応答を誘導する上記抗原をコードする。一実施形態において、本発明はアジュバントをコードするヌクレオシド修飾核酸分子を含む。
【００９２】
あるいは、本明細書に記載の、抗原またはアジュバントをコードするヌクレオチド配列は、得られるポリヌクレオチドが本発明に係るポリペプチドをコードするとの条件で、元のヌクレオチド配列に対する配列変異、例えば、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、挿入及び／または除去を含んでいてもよい。したがって、本発明の範囲は、本明細書中に記載されるヌクレオチド配列と実質的に相同であり、且つ目的の抗原またはアジュバントをコードするヌクレオチド配列を包含する。
【００９３】
ある特定の実施形態において、上記ヌクレオチド配列はＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原をコードする。例えば、ある特定の実施形態において、上記ヌクレオチド配列は、配列番号または配列番号２のヌクレオチド配列によってコードされるＨＩＶ  Ｅｎｖをコードする。一実施形態において、上記ヌクレオチド配列はインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）をコードする。例えば、ある特定の実施形態において、上記ヌクレオチド配列はＰＲ８由来のＨＡをコードする。例えば、一実施形態において、上記ヌクレオチド配列は配列番号３のアミノ酸配列を有するＰＲ８  ＨＡをコードする。ある特定の実施形態において、上記ヌクレオチド配列は配列番号４または配列番号５のヌクレオチド配列によってコードされるＰＲ８  ＨＡをコードする。例えば、ある特定の実施形態において、上記ヌクレオチド配列はＣａｌ／７／２００９由来のＨＡをコードする。例えば、一実施形態において、上記ヌクレオチド配列は配列番号６のアミノ酸配列を有するＣａｌ／７／２００９  ＨＡをコードする。ある特定の実施形態において、上記ヌクレオチド配列は配列番号７または配列番号８のヌクレオチド配列によってコードされるＣａｌ／７／２００９／ＨＡをコードする。
【００９４】
本明細書では、あるヌクレオチド配列は、本明細書に記載のヌクレオチド配列のいずれかに対して、当該のヌクレオチド配列が上記ヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％、有利には少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性度を有する場合に、「実質的に相同」である。抗原をコードするヌクレオチド配列と実質的に相同であるヌクレオチド配列は、一般的には、例えば、保存的または非保存的置換を導入することによって、当該ヌクレオチド配列中に含まれる情報に基づいて、当該抗原の産生生物から単離することができる。可能な修飾の他の例としては、当該配列中への１もしくは複数のヌクレオチドの挿入、当該配列のいずれかの末端における１もしくは複数のヌクレオチドの付加、または当該配列のいずれかの末端もしくは内部の１もしくは複数のヌクレオチドの除去が挙げられる。２種のポリヌクレオチド間の同一性度は、当業者に広く知られているコンピュータアルゴリズム及び方法を用いて決定される。
【００９５】
更に、本発明の範囲は、本明細書中に記載されるアミノ酸配列と実質的に相同であり、元のアミノ酸配列の免疫原性機能を維持するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を包含する。
【００９６】
本明細書で使用される場合、あるアミノ酸配列は、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれかに対して、当該のアミノ酸配列が上記アミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、有利には少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性度を有する場合に、「実質的に相同」である。２種のアミノ酸配列間の同一性は、好ましくはＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，ＮＣＢＩＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０  （１９９０））を用いて決定される。
【００９７】
一実施形態において、本発明は抗原をコードするヌクレオチド配列を含む構築物に関する。一実施形態において、上記構築物は複数の抗原をコードする複数のヌクレオチド配列を含む。例えば、ある特定の実施形態において、上記構築物は、１種以上、２種以上、５種以上、１０種以上、１５種以上、または２０種以上の抗原をコードする。一実施形態において、本発明は、アジュバントをコードするヌクレオチド配列を含む構築物に関する。一実施形態において、上記構築物は抗原をコードする第１のヌクレオチド配列と、アジュバントをコードする第２のヌクレオチド配列とを含む。
【００９８】
一実施形態において、本組成物は複数の構築物を含み、各構築物は１種または複数種の抗原をコードする。ある特定の実施形態において、本組成物は、１種以上、２種以上、５種以上、１０種以上、１５種以上、または２０種以上の構築物を含む。一実施形態において、本組成物は抗原をコードするヌクレオチド配列を含む第１の構築物と、アジュバントをコードするヌクレオチド配列を含む第２の構築物とを含む。
【００９９】
別のある特定の実施形態において、上記構築物は、翻訳制御エレメントに作動可能に結合する。この構築物は、本発明のヌクレオチド配列の発現のために作動可能に結合した調節配列を組み込み、したがって発現カセットを形成することができる。
【０１００】
ベクター
上記抗原またはアジュバントをコードする核酸配列は、例えば、当該遺伝子を発現する細胞由来のライブラリをスクリーニングすることによる、上記遺伝子を含むことが知られているベクターから該遺伝子を誘導することによる、または標準的な技法を用いて、上記遺伝子を含有する細胞及び組織から直接単離することによるなどの、本技術分野で公知の組換え方法を用いて得ることができる。あるいは、目的の遺伝子を合成的に生成させることができる。
【０１０１】
上記核酸は多くの種類のベクターにクローニングすることができる。例えば、上記核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを含む、但しこれらに限定されないベクターにクローニングすることができる。特に着目すべきベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、配列決定ベクター及びイン・ビトロ転写のために最適化されたベクターが挙げられる。
【０１０２】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油型乳化液、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質系システムなどのコロイド分散系が挙げられる。イン・ビトロ及びイン・ビボでの送達ビヒクルとして用いるための例示的なコロイド系はリポソーム（例えば、人工膜ベシクル）である。
【０１０３】
非ウイルス送達システムが利用される場合、例示としての送達ビヒクルはリポソームである。当該核酸の宿主細胞への導入（イン・ビトロ、エクス・ビボまたはイン・ビボ）に対しては脂質製剤の使用が企図される。別の態様において、上記核酸は脂質を伴っていてもよい。この脂質を伴う核酸は、リポソームの水性の内部に封入されていてもよく、リポソームの脂質二重層内に散在していてもよく、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方に結び付いた連結分子を介してリポソームに結合していてもよく、リポソーム中に封入されていてもよく、リポソームと複合体化されていてもよく、脂質を含有する溶液中に分散していてもよく、脂質と混合されていてもよく、脂質と組み合わされていてもよく、懸濁液として脂質中に含まれていてもよく、ミセルに含まれるかもしくはミセルと複合体化されていてもよく、または他の形態で脂質を伴っていてもよい。脂質、脂質／ＲＮＡまたは脂質／発現ベクターを伴う組成物は、溶液中のいずれかの特定の構造に限定されない。例えば、該組成物は、二層構造で、ミセルとして、または「崩壊した」構造で存在してもよい。該組成物はまた、おそらくは均一ではない大きさまたは形状の凝集物を形成して、単に溶液中に散在していてもよい。脂質は天然起源のまたは合成の脂質であってよい脂肪質の物質である。例えば、脂質としては、細胞質に天然起源の脂肪滴、ならびに脂肪酸、脂肪族アルコール、脂肪族アミン、脂肪族アミノアルコール及び脂肪族アルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素及びそれらの誘導体を含有する化合物の群が挙げられる。
【０１０４】
使用に適した脂質は商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）から入手可能であり、リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）はＫ＆Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ニューヨーク州プレインビュー）から入手可能であり、コレステロール（「Ｃｈｏｌ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから入手可能であり、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及び他の脂質はＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（アラバマ州バーミンガム）から入手可能である。脂質のクロロホルムまたはクロロホルム／メタノール保存溶液は約−２０℃で保存することができる。クロロホルムはメタノールよりも容易に留去されることから、単独の溶媒として用いられる。「リポソーム」は、密閉された脂質二重層または凝集体の生成によって形成される多様な単層膜及び多重膜脂質ビヒクルを包含する総称である。リポソームは、リン脂質二重層膜及び内部水性媒体を有するベシクル構造を有するものとして特徴付けることができる。多重膜リポソームは水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。多重膜リポソームは、リン脂質を過剰の水溶液中に懸濁させると自ずと形成される。上記脂質成分は、閉鎖構造を形成する前に自己再構成を起こし、脂質二重層の間に水及び溶解した溶質を封入する（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５：５０５−１０）。但し、通常のベシクル構造とは異なる溶液中の構造を有する組成物も包含される。例えば、上記脂質はミセル構造をとっていてもよく、または単に脂質分子の不均一な凝集体として存在してもよい。また、リポフェクタミン−核酸複合体も企図される。
【０１０５】
外因性核酸を宿主細胞に導入するために、または他の形態で細胞を本発明の阻害剤に曝露するために用いられる方法かにかかわらず、上記宿主細胞におけるｍＲＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイを行うことができる。かかるアッセイとしては、例えば、ノーザンブロッティング及びＲＴ−ＰＣＲなどの当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ；例えば、免疫原性的手段（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット）によるまたは本発明の範囲内にある薬剤を識別するための本明細書に記載のアッセイによる、特定のペプチドの有無の検出などの「生化学的」アッセイが挙げられる。
【０１０６】
イン・ビトロ転写ＲＮＡ
一実施形態において、本発明の組成物は抗原をコードするイン・ビトロ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡを含む。一実施形態において、本発明の組成物は複数の抗原をコードするＩＶＴ  ＲＮＡを含む。一実施形態において、本発明の組成物はアジュバントをコードするＩＶＴ  ＲＮＡを含む。一実施形態において、本発明の組成物は１種または複数種の抗原及び１種または複数種のアジュバントをコードするＩＶＴ  ＲＮＡを含む。
【０１０７】
一実施形態において、ＩＶＴ  ＲＮＡは一過性トランスフェクションの形態として細胞に導入することができる。合成的に生成させたプラスミドＤＮＡテンプレートを用いたイン・ビトロ転写によりＲＮＡが生成される。任意の供給源由来の着目するＤＮＡを、適宜のプライマー及びＲＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲによってイン・ビトロｍＲＮＡ合成用のテンプレートへと直接転換することができる。上記ＤＮＡの供給源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列または他の適宜のＤＮＡ源であってよい。一実施形態において、イン・ビトロ転写用の望ましいテンプレートは、例えば、本明細書の他の箇所に記載されるような、病原体または腫瘍に関連する抗原を始めとする、適応免疫応答を誘導することができる抗原である。一実施形態において、イン・ビトロ転写用の望ましいテンプレートは、適応免疫応答を増強することができるアジュバントである。
【０１０８】
一実施形態において、ＰＣＲに用いられる上記ＤＮＡはオープンリーディングフレームを含む。上記ＤＮＡは生物のゲノム由来の天然起源のＤＮＡ配列由来であってよい。一実施形態において、上記ＤＮＡは遺伝子の一部の着目する全長遺伝子である。上記遺伝子は、５’及び／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の一部または全てを含んでいてよい。上記遺伝子はエキソン及びイントロンを含んでいてよい。一実施形態において、ＰＣＲに用いられる上記ＤＮＡはヒト遺伝子である。別の実施形態において、ＰＣＲに用いられる上記ＤＮＡは５’及び３’ＵＴＲを含むヒト遺伝子である。別の実施形態において、ＰＣＲに用いられる上記ＤＮＡは、細菌、ウイルス、寄生生物、及び真菌を含む病原性生物または共生生物由来の遺伝子である。別の実施形態において、ＰＣＲに用いられる上記ＤＮＡは、５’及び３’ＵＴＲを含む細菌、ウイルス、寄生生物、及び真菌を含む病原性生物または共生生物由来である。あるいは、上記ＤＮＡは天然起源の生物では通常発現されない人工ＤＮＡ配列であってもよい。例示的な人工ＤＮＡ配列は、互いに結合して、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成する遺伝子の部分を含む人工ＤＮＡ配列である。上記互いに結合するＤＮＡの部分は単一の生物由来または複数の生物由来であってよい。
【０１０９】
ＰＣＲ用のＤＮＡ源として用いることができる遺伝子としては、生物において適応免疫応答を誘導または増強するポリペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。好ましい遺伝子は、短期間の治療に有用な遺伝子、または投与量もしくは発現する遺伝子に関する安全性の懸念がある遺伝子である。
【０１１０】
様々な実施形態において、プラスミドが、トランスフェクションに用いられるｍＲＮＡのイン・ビトロ転写用のテンプレートを生成させるために用いられる。
【０１１１】
安定性及び／または翻訳効率を助長する能力を有する化学構造を用いてもよい。上記ＲＮＡは、好ましくは５’及び３’ＵＴＲを有する。一実施形態において、上記５’ＵＴＲは０〜３０００ヌクレオチドの長さである。コード領域に付加される５’及び３’ＵＴＲ配列の長さは、上記ＵＴＲの異なる領域にアニールするＰＣＲ用のプライマーの設計を始めとする、但しこれに限定されない、様々な方法によって変えることができる。この手法を用いて、当業者は、転写されるＲＮＡのトランスフェクション後に最適な翻訳効率を達成するために必要な５’及び３’ＵＴＲの長さを修正することができる。
【０１１２】
上記５’及び３’ＵＴＲは、着目する遺伝子のための、天然起源の内在性５’及び３’ＵＴＲであってよい。あるいは、着目する遺伝子に対して内在性ではないＵＴＲ配列を、上記ＵＴＲ配列を順方向プライマー及び逆方向プライマーに組み込むことによって、またはテンプレートのいずれかの他の修飾によって付加することができる。着目する遺伝子に対して内在性ではないＵＴＲ配列を用いることは、上記ＲＮＡの安定性及び／または翻訳効率を修正するのに有用な場合がある。例えば、３’ＵＴＲ配列中のＡＵに富むエレメントは、ｍＲＮＡの安定性を低下させる場合があることが知られている。したがって、３’ＵＴＲを、本技術分野で周知のＵＴＲの特性に基づいて、転写されたＲＮＡの安定性を向上させるように選択または設計することができる。
【０１１３】
一実施形態において、上記５’ＵＴＲは内在性遺伝子のコザック配列を含んでいてよい。あるいは、着目する遺伝子に対して内在性でない５’ＵＴＲが上記のようにＰＣＲによって付加される場合、コンセンサスコザック配列を、上記５’ＵＴＲ配列を付加することによって再設計することができる。コザック配列は、一部のＲＮＡ転写物の翻訳効率を向上させることができるが、効率的な翻訳を可能にするために全てのＲＮＡにとって必要とは思われない。多くのｍＲＮＡに関するコザック配列の要件が本技術分野で公知である。他の実施形態において、上記５’ＵＴＲは、ＲＮＡゲノムが細胞内で安定なＲＮＡウイルスから誘導することができる。他の実施形態において、種々のヌクレオチド類似体を３’または５’ＵＴＲに用いて、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を阻害することができる。
【０１１４】
遺伝子クローニングを必要とすることなく、ＤＮＡテンプレートからのＲＮＡの合成を可能にするためには、転写のプロモーターが、転写されるべき配列の上流のＤＮＡテンプレートに結合される必要がある。ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーターとして機能する配列が順方向プライマーの５’末端に付加される場合、該ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは転写されるべきオープンリーディングフレームの上流のＰＣＲ産物中に組み込まれた状態になる。一つの好ましい実施形態において、上記プロモーターは、本明細書の他の箇所に記載される、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターとしては、Ｔ３及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定はされない。Ｔ７、Ｔ３及びＳＰ６プロモーターのためのコンセンサスヌクレオチド配列が本技術分野において公知である。
【０１１５】
好ましい実施形態において、上記ｍＲＮＡは、当該細胞内でのリボソーム結合、翻訳の開始及びｍＲＮＡの安定性を決定する、５’末端上のキャップ及び３’ポリ（Ａ）テールの両方を有する。環状ＤＮＡテンプレート、例えば、プラスミドＤＮＡ上では、ＲＮＡポリメラーゼは真核細胞における発現には適さない長いコンカテマー生成物を産生する。３’ＵＴＲの末端で直鎖化されたプラスミドＤＮＡの転写により、転写後にポリアデニル化された場合に真核トランスフェクションに有効な通常の大きさのｍＲＮＡが生じる。
【０１１６】
直鎖ＤＮＡテンプレート上では、ファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは該テンプレートの最後の塩基を越えて転写物の３’末端を伸長させることができる（Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ及びＭｉｅｒｅｎｄｏｒｆ，Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：６２２３−３６  （１９８５）；  Ｎａｃｈｅｖａ及びＢｅｒｚａｌ−Ｈｅｒｒａｎｚ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：１４８５−６５  （２００３）。
【０１１７】
従来のポリＡ／Ｔ配列のＤＮＡテンプレートへの組み込み方法は分子クローニングである。しかし、プラスミドＤＮＡ中に組み込まれたポリＡ／Ｔ配列はプラスミドを不安定にする場合があり、これはプラスミド増殖のための組換え不能な細菌細胞を用いることによって改善することができる。
【０１１８】
ＲＮＡのポリ（Ａ）テールは、Ｅ．ｃｏｌｉポリＡポリメラーゼ（Ｅ−ＰＡＰ）または酵母ポリＡポリメラーゼなどのポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いてイン・ビトロ転写後に更に伸長することができる。一実施形態において、ポリ（Ａ）テールの長さを１００ヌクレオチドから３００〜４００ヌクレオチドへと増加させことによって、当該ＲＮＡの翻訳効率が約２倍増加する。また、異なる化学基の３’末端への結合により、ｍＲＮＡの安定性を向上させることができる。かかる結合は、修飾／人工ヌクレオチド、アプタマー及び他の化合物を含み得る。例えば、ＡＴＰ類似体を、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いてポリ（Ａ）テールに組み込むことができる。ＡＴＰ類似体は上記ＲＮＡの安定性を更に向上させることができる。
【０１１９】
５’キャップはｍＲＮＡ分子に安定性も与える。好ましい実施形態において、上記方法によって産生されたＲＮＡは、５’キャップ１構造を含む。かかるキャップ１構造はワクシニアキャッピング酵素及び２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素（ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ、ウィスコンシン州マディソン）を用いて生成させることができる。あるいは、５’キャップは、本技術分野で公知であり、本明細書に記載の技法を用いて与えられる（Ｃｏｕｇｏｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２９：４３６−  ４４４  （２００１）；  Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，７：１４６８−９５  （２００１）；  Ｅｌａｎｇｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３０：９５８−９６６  （２００５））。
【０１２０】
ＲＮＡは、多くの異なる方法、例えば、電気穿孔法（Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ−ＩＩ（Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ国ケルン））、（ＥＣＭ８３０（ＢＴＸ）（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、マサチューセッツ州ボストン）、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ、コロラド州デンバー）、Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｔ、ドイツ国ハンブルグ）、リポフェクションを用いたカチオン性リポソーム媒介トランスフェクション、ポリマーによる封入、ペプチド媒介トランスフェクション、または「遺伝子銃」などの微粒子銃粒子送達システム（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）（例えば、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１２（８）：８６１−７０  （２００１）を参照されたい））を含む、但しこれらに限定されない、市販の方法のいずれかを用いて標的細胞中に導入することができる。ある特定の実施形態において、本発明のＲＮＡは、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ｍＲＮＡトランスフェクションキット（Ｍｉｒｕｓ、ウィスコンシン州マディソン）の使用を含む方法で細胞に導入され、該方法はいくつかの例において、高効率、低毒性のトランスフェクションを提供する。
【０１２１】
ヌクレオシド修飾ＲＮＡ
一実施形態において、本発明の組成物は本明細書に記載の、抗原をコードするヌクレオシド修飾核酸を含む。一実施形態において、本発明の組成物は複数の抗原をコードするヌクレオシド修飾核酸を含む。一実施形態において、本発明の組成物は本明細書に記載のアジュバントをコードするヌクレオシド修飾核酸を含む。一実施形態において、本発明の組成物は１種または複数種の抗原及び１種または複数種のアジュバントをコードするヌクレオシド修飾核酸を含む。
【０１２２】
例えば、一実施形態において、本組成物はヌクレオシド修飾ＲＮＡを含む。一実施形態において、本組成物はヌクレオシド修飾ｍＲＮＡを含む。ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡは、例えば、安定性の向上、自然免疫原性の低下または消失、及び翻訳の増強を含む、非修飾ｍＲＮＡに対する特定の利点を有する。本発明において有用なヌクレオシド修飾ｍＲＮＡは米国特許第８，２７８，０３６号に更に記載されており、該特許は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０１２３】
ある特定の実施形態において、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡは、いかなる病態生理的経路も活性化せず、非常に効率的に且つ送達のほぼ直後に翻訳され、数日間持続するイン・ビボでの連続的なタンパク質産生のためのテンプレートとしての役割を果たす（Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １６：１８３３−１８４０；  Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０：９４８−９５３）。生理効果を発揮するために必要なｍＲＮＡの量は小さく、そのことによって該ｍＲＮＡはヒトの治療に適用可能となる。例えば、本明細書に記載するように、抗原をコードするヌクレオシド修飾ｍＲＮＡは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞及び抗原特異的抗体の産生を誘導する能力があることが実証されている。例えば、ある特定の例において、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡによってコードされる抗原は、非修飾ｍＲＮＡによってコードされる抗原と比較して、抗原特異的抗体のより大きな産生を誘導する。
【０１２４】
ある特定の例において、上記コードｍＲＮＡを送達することによってタンパク質を発現させることは、タンパク質、プラスミドＤＮＡまたはウイルスベクターを用いる方法に対して多くの利点を有する。ｍＲＮＡトランスフェクションの間は、所望のタンパク質のコード配列が細胞に送達される唯一の物質であり、したがって、プラスミド骨格、ウイルス遺伝子、及びウイルスタンパク質に伴う全ての副作用を回避する。更に重要なことに、上記ｍＲＮＡは、ＤＮＡ及びウイルスに基づくベクターとは異なり、ゲノム中に取込まれる危険性を有さず、且つタンパク質産生はｍＲＮＡの送達直後に開始する。例えば、上記コードｍＲＮＡのイン・ビボ注入の１５〜３０分以内に、高レベルの循環タンパク質が測定されている。ある特定の実施形態において、タンパク質ではなくｍＲＮＡを用いることも多くの利点を有する。循環中のタンパク質の半減期は短いことが多いことから、タンパク質による治療は頻繁な投与を要することとなる一方、ｍＲＮＡは数日間連続してタンパク質を産生するためのテンプレートを提供する。タンパク質の精製は問題を含んでおり、タンパク質が副作用を引き起こす凝集物及び他の不純物を含む場合がある（Ｋｒｏｍｍｉｎｇａ及びＳｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ、２００５、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０５０：２５７−２６５）。
【０１２５】
ある特定の実施形態において、上記ヌクレオシド修飾ＲＮＡは、天然起源の修飾ヌクレオシドであるプソイドウリジンを含む。ある特定の実施形態において、プソイドウリジンを含むことによって、上記ｍＲＮＡはより安定に、非免疫原性に、及び高度に翻訳可能になる（Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １６：１８３３−１８４０；  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３８：５８８４−５８９２；  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３９：９３２９−９３３８；  Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３９：ｅｌ４２；  Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０：９４８−９５３；  Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２３：１６５−１７５）。
【０１２６】
プソイドウリジンを含む修飾ヌクレオシドがＲＮＡ中に存在することによって、該ＲＮＡの自然免疫原性を抑制することが実証されている（Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２３：１６５−１７５）。更に、プソイドウリジンを含有する、タンパク質をコードするイン・ビトロ転写ＲＮＡは、修飾ヌクレオシドを含有しない、または他の修飾ヌクレオシドを含有するＲＮＡよりもより効率的に翻訳され得る（Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １６：１８３３−１８４０）。その後、プソイドウリジンが存在することによってＲＮＡの安定性が改善され（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３９：９３２９−９３３８）、ＰＫＲの活性化と翻訳の阻害の両方を抑制する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３８：５８８４−５８９２）ことが示されている。優れた翻訳の潜在能力を有し、且つ自然免疫原性をもたないプソイドウリジン含有ＲＮＡを得るために重要である分取ＨＰＬＣ精製手順が確立されている（Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３９：ｅｌ４２）。マウス及びマカクに、ＨＰＬＣ精製した、エリスロポエチンをコードするプソイドウリジン含有ＲＮＡを投与することによって血清ＥＰＯレベルが有意に増加し（Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０：９４８−９５３）、したがってプソイドウリジン含有ｍＲＮＡがイン・ビボタンパク療法に適していることが確認された。
【０１２７】
本発明は、プソイドウリジンまたは修飾ヌクレオシドを含むＲＮＡ、オリゴリボヌクレオチド、及びポリリボヌクレオチド分子を含む。ある特定の実施形態において、本組成物は抗原をコードする単離された核酸を含み、該核酸はプソイドウリジンまたは修飾ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、本組成物は、抗原、アジュバント、またはそれらの組み合わせをコードする単離された核酸を含むベクターを含み、該核酸はプソイドウリジンまたは修飾ヌクレオシドを含む。
【０１２８】
一実施形態において、本発明のヌクレオシド修飾ＲＮＡは、本明細書の他の箇所に記載されるＩＶＴ  ＲＮＡである。例えば、ある特定の実施形態において、上記ヌクレオシド修飾ＲＮＡはＴ７ファージＲＮＡポリメラーゼによって合成される。別の実施形態において、上記ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡはＳＰ６ファージＲＮＡポリメラーゼによって合成される。別の実施形態において、上記ヌクレオシド修飾ＲＮＡはＴ３ファージＲＮＡポリメラーゼによって合成される。
【０１２９】
一実施形態において、上記修飾ヌクレオシドはｍ１ａｃｐ３Ψ（１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジンである。別の実施形態において、上記修飾ヌクレオシドはｍ１Ψ（１−メチルプソイドウリジン）である。別の実施形態において、上記修飾ヌクレオシドはΨｍ（２’−Ｏ−メチルプソイドウリジン）である。別の実施形態において、上記修飾ヌクレオシドはｍ５Ｄ（５−メチルジヒドロウリジン）である。別の実施形態において、上記修飾ヌクレオシドはｍ３Ψ（３−メチルプソイドウリジン）である。別の実施形態において、上記修飾ヌクレオシドは更に修飾されていないプソイドウリジン部分である。別の実施形態において、上記修飾ヌクレオシドは上記のプソイドウリジンのいずれかのモノリン酸エステル、ジリン酸エステル、またはトリリン酸エステルである。別の実施形態において、上記修飾ヌクレオシドは本技術分野で公知の任意の他のプソイドウリジン様ヌクレオシドである。
【０１３０】
別の実施形態において、本発明のヌクレオシド修飾ＲＮＡにおいて修飾されるヌクレオシドはウリジン（Ｕ）である。別の実施形態において、上記修飾されるヌクレオシドはシチジン（Ｃ）である。別の実施形態において、上記修飾されるヌクレオシドはアデノシン（Ａ）である。別の実施形態において、上記修飾されるヌクレオシドはグアノシン（Ｇ）である。
【０１３１】
別の実施形態において、本発明の修飾ヌクレオシドはｍ５Ｃ（５−メチルシチジン）である。別の実施形態において、上記修飾ヌクレオシドはｍ５Ｕ（５−メチルウリジン）である。別の実施形態において、上記修飾ヌクレオシドはｍ６Ａ（Ｎ６−メチルアデノシン）である。別の実施形態において、上記修飾ヌクレオシドはｓ２Ｕ（２−チオウリジン）である。別の実施形態において、上記修飾ヌクレオシドはΨ（プソイドウリジン）である。別の実施形態において、上記修飾ヌクレオシドはＵｍ（２’−Ｏ−メチルウリジン）である。
【０１３２】
他の実施形態において、上記修飾ヌクレオシドは、ｍ１Ａ（１−メチルアデノシン）；ｍ２Ａ（２−メチルアデノシン）；Ａｍ（２’−Ｏ−メチルアデノシン）；ｍｓ２ｍ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデノシン）；ｉ６Ａ（Ｎ６−イソペンテニルアデノシン）；ｍｓ２ｉ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６イソペンテニルアデノシン）；ｉｏ６Ａ（Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｇ６Ａ（Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン）；ｔ６Ａ（Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｔ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｈｎ６Ａ（Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；Ａｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸））；Ｉ（イノシン）；ｍ１Ｉ（１−メチルイノシン）；ｍ１Ｉｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン）；ｍ３Ｃ（３−メチルシチジン）；Ｃｍ（２’−Ｏ−メチルシチジン）；ｓ２Ｃ（２−チオシチジン）；ａｃ４Ｃ（Ｎ４−アセチルシチジン）；ｆ５Ｃ（５−ホルミルシチジン）；ｍ５Ｃｍ（５，２’−Ｏ−ジメチルシチジン）；ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチルシチジン）；ｋ２Ｃ（ライシジン）；ｍ１Ｇ（１−メチルグアノシン）；ｍ２Ｇ（Ｎ２−メチルグアノシン）；ｍ７Ｇ（７−メチルグアノシン）；Ｇｍ（２’−Ｏ−メチルグアノシン）；ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン）；ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン）；Ｇｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸））；ｙＷ（ワイブトシン）；ｏ２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ＊（非修飾ヒドロキシワイブトシン）；ｉｍＧ（ワイオシン）；ｍｉｍＧ（メチルワイオシン）；Ｑ（クエオシン）；ｏＱ（エポキシクエオシン）；ｇａｌＱ（ガラクトシル−クエオシン）；ｍａｎＱ（マンノシル−クエオシン）；ｐｒｅＱ０（７−シアノ−７−デアザグアノシン）；ｐｒｅＱ１（７−アミノメチル−７−デアザグアノシン）；Ｇ＋（アルケオシン（ａｒｃｈａｅｏｓｉｎｅ））；Ｄ（ジヒドロウリジン）；ｍ５Ｕｍ（５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｓ４Ｕ（４−チオウリジン）；ｍ５ｓ２Ｕ（５−メチル−２−チオウリジン）；ｓ２Ｕｍ（２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ａｃｐ３Ｕ（３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン）；ｈｏ５Ｕ（５−ヒドロキシウリジン）；ｍｏ５Ｕ（５−メトキシウリジン）；ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸）；ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル）；ｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン））；ｍｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）；ｍｃｍ５Ｕ（５−メトキシカルボニルメチルウリジン）；ｍｃｍ５Ｕｍ（５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン）；ｎｍ５ｓ２Ｕ（５−アミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５Ｕ（５−メチルアミノメチルウリジン）；ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン）；ｎｃｍ５Ｕ（５−カルバモイルメチルウリジン）；ｎｃｍ５Ｕｍ（５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕｍ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン）；Ｉｍ（２’−Ｏ−メチルイノシン）；ｍ４Ｃ（Ｎ４−メチルシチジン）；ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチルシチジン）；ｈｍ５Ｃ（５−ヒドロキシメチルシチジン）；ｍ３Ｕ（３−メチルウリジン）；ｃｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルウリジン）；ｍ６Ａｍ（Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン）；ｍ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，Ｏ−２’−トリメチルアデノシン）；ｍ２，７Ｇ（Ｎ２，７−ジメチルグアノシン）；ｍ２，２，７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン）；ｍ３Ｕｍ（３，２’−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｍ５Ｄ（５−メチルジヒドロウリジン）；ｆ５Ｃｍ（５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン）；ｍ１Ｇｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ１Ａｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン）；τｍ５Ｕ（５−タウリノメチルウリジン）；τｍ５ｓ２Ｕ（５−タウリノメチル−２−チオウリジン））；ｉｍＧ−１４（４−デメチルワイオシン）；ｉｍＧ２（イソワイオシン）；またはａｃ６Ａ（Ｎ６−アセチルアデノシン）である。
【０１３３】
別の実施形態において、本発明のヌクレオシド修飾ＲＮＡは上記修飾の２種以上の組み合わせを含む。別の実施形態において、上記ヌクレオシド修飾ＲＮＡは上記の修飾の３種以上の組み合わせを含む。別の実施形態において、上記ヌクレオシド修飾ＲＮＡは上記修飾の４種以上の組み合わせを含む。
【０１３４】
別の実施形態において、本発明のヌクレオシド修飾ＲＮＡ中の残基の０．１％〜１００％が、（例えば、プソイドウリジンまたは修飾ヌクレオシド塩基のいずれかの存在によって）修飾されている。別の実施形態において、上記残基の０．１％が修飾されている。別の実施形態において、修飾された残基の分率は０．２％である。別の実施形態において、上記分率は０．３％である。別の実施形態において、上記分率は０．４％である。別の実施形態において、上記分率は０．５％である。別の実施形態において、上記分率は０．６％である。別の実施形態において、上記分率は０．８％である。別の実施形態において、上記分率は１％である。別の実施形態において、上記分率は１．５％である。別の実施形態において、上記分率は２％である。別の実施形態において、上記分率は２．５％である。別の実施形態において、上記分率は３％である。別の実施形態において、上記分率は４％である。別の実施形態において、上記分率は５％である。別の実施形態において、上記分率は６％である。別の実施形態において、上記分率は８％である。別の実施形態において、上記分率は１０％である。別の実施形態において、上記分率は１２％である。別の実施形態において、上記分率は１４％である。別の実施形態において、上記分率は１６％である。別の実施形態において、上記分率は１８％である。別の実施形態において、上記分率は２０％である。別の実施形態において、上記分率は２５％である。別の実施形態において、上記分率は３０％である。別の実施形態において、上記分率は３５％である。別の実施形態において、上記分率は４０％である。別の実施形態において、上記分率は４５％である。別の実施形態において、上記分率は５０％である。別の実施形態において、上記分率は６０％である。別の実施形態において、上記分率は７０％である。別の実施形態において、上記分率は８０％である。別の実施形態において、上記分率は９０％である別の実施形態において、上記分率は１００％である。
【０１３５】
別の実施形態において、上記分率は５％未満である。別の実施形態において、上記分率は３％未満である。別の実施形態において、上記分率は１％未満である。別の実施形態において、上記分率は２％未満である。別の実施形態において、上記分率は４％未満である。別の実施形態において、上記分率は６％未満である。別の実施形態において、上記分率は８％未満である。別の実施形態において、上記分率は１０％未満である。別の実施形態において、上記分率は１２％未満である。別の実施形態において、上記分率は１５％未満である。別の実施形態において上記分率は２０％未満である。別の実施形態において、上記分率は３０％未満である。別の実施形態において上記分率は４０％未満である。別の実施形態において、上記分率は５０％未満である。別の実施形態において、上記分率は６０％未満である。別の実施形態において、上記分率は７０％未満である。
【０１３６】
別の実施形態において、所与のヌクレオシド（すなわち、ウリジン、シチジン、グアノシン、またはアデノシン）の残基の０．１％が修飾されている。別の実施形態において、修飾される上記所与のヌクレオチドの分率は０．２％である。別の実施形態において、上記分率は０．３％である。別の実施形態において、上記分率は０．４％である。別の実施形態において、上記分率は０．５％である。別の実施形態において、上記分率は０．６％である。別の実施形態において、上記分率は０．８％である。別の実施形態において、上記分率は１％である。別の実施形態において、上記分率は１．５％である。別の実施形態において、上記分率は２％である。別の実施形態において、上記分率は２．５％である。別の実施形態において、上記分率は３％である。別の実施形態において、上記分率は４％である。別の実施形態において、上記分率は５％である。別の実施形態において、上記分率は６％である。別の実施形態において、上記分率は８％である。別の実施形態において、上記分率は１０％である。別の実施形態において、上記分率は１２％である。別の実施形態において、上記分率は１４％である。別の実施形態において、上記分率は１６％である。別の実施形態において、上記分率は１８％である。別の実施形態において、上記分率は２０％である。別の実施形態において、上記分率は２５％である。別の実施形態において、上記分率は３０％である。別の実施形態において、上記分率は３５％である。別の実施形態において、上記分率は４０％である。別の実施形態において、上記分率は４５％である。別の実施形態において、上記分率は５０％である。別の実施形態において、上記分率は６０％である。別の実施形態において、上記分率は７０％である。別の実施形態において、上記分率は８０％である。別の実施形態において、上記分率は９０％である。別の実施形態において、上記分率は１００％である。
【０１３７】
別の実施形態において、修飾される所与のヌクレオチドの分率は８％未満である。別の実施形態において、上記分率は１０％未満である。別の実施形態において、上記分率は５％未満である。別の実施形態において、上記分率は３％未満である。別の実施形態において、上記分率は１％未満である。別の実施形態において、上記分率は２％未満である。別の実施形態において、上記分率は４％未満である。別の実施形態において、上記分率は６％未満である。別の実施形態において、上記分率は１２％未満である。別の実施形態において、上記分率は１５％未満である。別の実施形態において、上記分率は２０％未満である。別の実施形態において、上記分率は３０％未満である。別の実施形態において、上記分率は４０％未満である。別の実施形態において、上記分率は５０％未満である。別の実施形態において、上記分率は６０％未満である。別の実施形態において、上記分率は７０％未満である。
【０１３８】
別の実施形態において、本発明のヌクレオシド修飾ＲＮＡは、同一の配列を有する非修飾ＲＮＡ分子よりもより効率的に細胞中で翻訳される。別の実施形態において、上記ヌクレオシド修飾ＲＮＡは、標的細胞によって翻訳される能力の増強を示す。別の実施形態において、翻訳が、該ヌクレオシド修飾ＲＮＡの非修飾の相当物と比較して２倍の倍率で増強される。別の実施形態において、翻訳が３倍の倍率で増強される。別の実施形態において、翻訳が５倍の倍率で増強される。別の実施形態において、翻訳が７倍の倍率で増強される。別の実施形態において、翻訳が１０倍の倍率で増強される。別の実施形態において、翻訳が１５倍の倍率で増強される。別の実施形態において、翻訳が２０倍の倍率で増強される。別の実施形態において、翻訳が５０倍の倍率で増強される。別の実施形態において、翻訳が１００倍の倍率で増強される。別の実施形態において、翻訳が２００倍の倍率で増強される。別の実施形態において、翻訳が５００倍の倍率で増強される。別の実施形態において、翻訳が１０００倍の倍率で増強される。別の実施形態において、翻訳が２０００倍の倍率で増強される。別の実施形態において、上記倍率は１０〜１０００倍である。別の実施形態において、上記倍率は１０〜１００倍である。別の実施形態において、上記倍率は１０〜２００倍である。別の実施形態において、上記倍率は１０〜３００倍である。別の実施形態において、上記倍率は１０〜５００倍である。別の実施形態において、上記倍率は２０〜１０００倍である。別の実施形態において、上記倍率は３０〜１０００倍である。別の実施形態において、上記倍率は５０〜１０００倍である。別の実施形態において、上記倍率は１００〜１０００倍である。別の実施形態において、上記倍率は２００〜１０００倍である。別の実施形態において、翻訳が、他の有意な量または範囲の量によって増強される。
【０１３９】
別の実施形態において、本発明のヌクレオシド修飾された抗原をコードするＲＮＡは、同様の配列を有する非修飾のイン・ビトロ合成ＲＮＡ分子よりも、有意により大きな適応免疫応答を誘導する。別の実施形態において、上記修飾ＲＮＡ分子は、該修飾ＲＮＡ分子の非修飾の相当物よりも２倍大きな適応免疫応答を示す。別の実施形態において、上記適応免疫応答は３倍の倍率で増加する。別の実施形態において、上記適応免疫応答は５倍の倍率で増加する。別の実施形態において、上記適応免疫応答は７倍の倍率で増加する。別の実施形態において、上記適応免疫応答は１０倍の倍率で増加する。別の実施形態において、上記適応免疫応答は１５倍の倍率で増加する。別の実施形態において、上記適応免疫応答は２０倍の倍率で増加する。別の実施形態において、上記適応免疫応答は５０倍の倍率で増加する。別の実施形態において、上記適応免疫応答は１００倍の倍率で増加する。別の実施形態において、上記適応免疫応答は２００倍の倍率で増加する。別の実施形態において、上記適応免疫応答は５００倍の倍率で増加する。別の実施形態において、上記適応免疫応答は１０００倍の倍率で増加する。別の実施形態において、上記適応免疫応答は２０００倍の倍率で増加する。別の実施形態において、上記適応免疫応答は別の倍率差で増加する。
【０１４０】
別の実施形態において、「有意により大きな適応免疫応答を誘導する」は、適応免疫応答の検出可能な増加を指す。別の実施形態において、この用語は、適応免疫応答の倍率で表した増加（例えば、上記に列挙した倍率で表した増加の一つ）を指す。別の実施形態において、この用語は、有効な適応免疫応答を依然として誘導しながら、同一の種を有する非修飾ＲＮＡ分子よりもより低い用量または頻度で当該ヌクレオシド修飾ＲＮＡを投与することができるような増加を指す。別の実施形態において、上記増加は、単回用量を用いて上記ヌクレオシド修飾ＲＮＡを投与して、効果的な適応免疫応答を誘導できるような増加である。
【０１４１】
別の実施形態において、本発明のヌクレオシド修飾ＲＮＡは、同様の配列を有する非修飾のイン・ビトロ合成ＲＮＡ分子よりも有意に低い自然免疫原性を示す。別の実施形態において、上記修飾ＲＮＡ分子は、該修飾ＲＮＡ分子の非修飾の相当物よりも２分の１の低さの自然免疫応答を示す。別の実施形態において、自然免疫原性は３分の１の縮小率で低下する。別の実施形態において、自然免疫原性は、５分の１の縮小率で低下する。別の実施形態において、自然免疫原性は７分の１の縮小率で低下する。別の実施形態において、自然免疫原性は１０分の１の縮小率で低下する。別の実施形態において、自然免疫原性は１５分の１の縮小率で低下する。別の実施形態において、自然免疫原性は２０分の１の縮小率で低下する。別の実施形態において、自然免疫原性は５０分の１の縮小率で低下する。別の実施形態において、自然免疫原性は１００分の１の縮小率で低下する。別の実施形態において、自然免疫原性は２００分の１の縮小率で低下する。別の実施形態において、自然免疫原性は５００分の１の縮小率で低下する。別の実施形態において、自然免疫原性は１０００分の１の縮小率で低下する。別の実施形態において、自然免疫原性は２０００分の１の縮小率で低下する。別の実施形態において、自然免疫原性は、別の縮小率差で低下する。
【０１４２】
別の実施形態において、「有意に低い自然免疫原性を示す」は、自然免疫原性の検出可能な低下を指す。別の実施形態において、この用語は、自然免疫原性の縮小率で表した低下（例えば、上記に列挙した縮小率で表した低下の一つ）を指す。別の実施形態において、この用語は、有効量の上記ヌクレオシド修飾ＲＮＡを、検出可能な自然免疫応答を引き起こすことなく投与することができるような低下を指す。別の実施形態において、この用語は、上記ヌクレオシド修飾ＲＮＡが、組換えタンパク質の産生を検出可能に低下させるのに十分な自然免疫応答を誘発することなく、繰り返し投与することができるような低下を指す。別の実施形態において、上記低下は、上記ヌクレオシド修飾ＲＮＡが、組換えタンパク質の検出可能な産生を排除するのに十分な自然免疫応答を誘発することなく、繰り返し投与することができるようなものである。
【０１４３】
脂質ナノ粒子
一実施形態において、ヌクレオシド修飾ＲＮＡの送達は、本明細書の他の箇所に記載される例示的なＲＮＡトランスフェクション方法を始めとする、任意且つ適宜の送達方法を含む。ある特定の実施形態において、ヌクレオシド修飾ＲＮＡの対象への送達は、接触させるステップの前に、当該のヌクレオシド修飾ＲＮＡをトランスフェクション試薬と混合することを含む。別の実施形態において、本発明の方法は、ヌクレオシド修飾ＲＮＡをトランスフェクション試薬と共に投与することを更に含む。別の実施形態において、上記トランスフェクション試薬はカチオン性脂質試薬である。
【０１４４】
別の実施形態において、上記トランスフェクション試薬は脂質系トランスフェクション試薬である。別の実施形態において、上記トランスフェクション試薬はタンパク質系トランスフェクション試薬である。別の実施形態において、上記トランスフェクション試薬はポリエチレンイミン系トランスフェクション試薬である。別の実施形態において、上記トランスフェクション試薬はリン酸カルシウムである。別の実施形態において、上記トランスフェクション試薬はＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、またはＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）である。別の実施形態において、上記トランスフェクション試薬は本技術分野で公知の任意の他のトランスフェクション試薬である。
【０１４５】
別の実施形態において、上記トランスフェクション試薬はリポソームを形成する。別の実施形態において、リポソームは細胞内安定性を増加させ、取込み効率を高め、生物学的活性を改善する。別の実施形態において、リポソームは、細胞膜を構成する脂質と類似の様式で配置された脂質からなる中空の球状ベシクルである。別の実施形態において、リポソームは水溶性化合物を捕捉するための内部水性空間を有し、大きさが直径で０．０５〜数ミクロンの範囲である。別の実施形態において、リポソームは生物学的に活性な形態で細胞にＲＮＡを送達することができる。
【０１４６】
一実施形態において、本組成物は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）及び本明細書に記載の１種または複数種の核酸分子を含む。例えば、一実施形態において、本組成物は、ＬＮＰ及び１種もしくは複数種の抗原、アジュバント、またはそれらの組み合わせをコードする１種または複数種のヌクレオシド修飾ＲＮＡ分子を含む。
【０１４７】
「脂質ナノ粒子」という用語は、１種または複数種の脂質、例えば式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の脂質を含む、少なくとも一方向の寸法がナノメートルオーダー（例えば、１〜１，０００ｎｍ）である粒子を指す。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は本明細書に記載のヌクレオシド修飾ＲＮＡを含む製剤中に含まれる。いくつかの実施形態において、かかる脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質（例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の脂質）ならびに、中性脂質、荷電脂質、ステロイド及びポリマーに結合した脂質（例えば、化合物ＩＶａなどの、構造（ＩＶ）のペグ化脂質などのペグ化脂質）から選択される１種または複数種の賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、上記ヌクレオシド修飾ＲＮＡは、当該脂質ナノ粒子の脂質部分、または該脂質ナノ粒子の脂質部分の一部もしくは全てによって包み込まれた水性空間に封入され、それによって、宿主生物または細胞の機構、例えば有害な免疫応答によって誘導される酵素分解または他の望ましくない作用から当該ヌクレオシド修飾ＲＮＡを保護する。
【０１４８】
様々な実施形態において、上記脂質ナノ粒子は、約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、または約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、または１５０ｎｍの平均径を有し、実質的に無毒である。ある特定の実施形態において、上記ヌクレオシド修飾ＲＮＡは、上記脂質ナノ粒子中に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に対して耐性である。
【０１４９】
上記ＬＮＰは、上記１種または複数種の核酸分子が結合する、またはその中に該１種または複数種の核酸分子が封入される粒子を形成することができる、任意の脂質を含んでいてよい。「脂質」という用語は、脂肪酸の誘導体（例えば、エステル）であり、一般に水には不溶であるが多くの有機溶媒に可溶であることを特徴とする、一群の有機化合物を指す。脂質は、通常、少なくとも３種の分類、すなわち、（１）油脂ならびにワックスを含む「単純脂質」、（２）リン脂質及び糖脂質を含む「複合脂質」、ならびに（３）ステロイドなどの「誘導脂質」に分けられる。
【０１５０】
一実施形態において、上記ＬＮＰは、１種または複数種のカチオン性脂質、及び１種または複数種の安定化脂質を含む。安定化脂質には中性脂質及びペグ化脂質が含まれる。
【０１５１】
一実施形態において、上記ＬＮＰはカチオン性脂質を含む。本明細書で使用される「カチオン性脂質」という用語は、ｐＨが当該脂質のイオン化可能な基のｐＫよりも低い場合にはカチオン性であるかまたはカチオン性になる（プロトン化される）が、より高いｐＨ値においては次第により中性となる脂質を指す。上記ｐＫよりも低いｐＨ値においては、上記脂質は負に荷電した核酸と会合することができる。ある特定の実施形態において、上記カチオン性脂質は、ｐＨ低下時に正電荷を帯びる双性イオン性脂質を含む。
【０１５２】
ある特定の実施形態において、上記カチオン性脂質は、生理的ｐＨなどの選択的なｐＨで正味の正電荷を有する多数の脂質種のいずれかを含む。かかる脂質としては、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、３−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロ酢酸塩（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、及びＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）が挙げられるが、これらに限定はされない。また、本発明で用いることができる多くのカチオン性脂質の市販の調合剤が入手可能である。これらの調合剤としては、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（ニューヨーク州グランドアイランド）から市販される、ＤＯＴＭＡ及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含むカチオン性リポソーム）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから市販される、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロ酢酸塩（ＤＯＳＰＡ）及び（ＤＯＰＥ）を含むカチオン性リポソーム）、ならびにＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．（ウィスコンシン州マディソン）から市販される、エタノール中のジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）を含むカチオン性脂質）が挙げられる。以下の脂質は、カチオン性であり、生理的ｐＨより低いｐＨにおいて正電荷を有する：ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡ、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）。
【０１５３】
一実施形態において、上記カチオン性脂質はアミノ脂質である。本発明に有用である好適なアミノ脂質としては、全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１２／０１６１８４に記載されるものが挙げられる。代表的なアミノ脂質としては、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパン塩化塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイル−３−トリメチルアミノプロパン塩化塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、及び２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１５４】
好適なアミノ脂質としては、式：
【化１３】
2018526321.tif 000017
を有するアミノ脂質であって、
式中、Ｒ１及びＲ２は同一であるかまたは異なっているかのいずれかであり、独立に、任意選択で置換されたＣ１０〜Ｃ２４アルキル、任意選択で置換されたＣ１０〜Ｃ２４アルケニル、任意選択で置換されたＣ１０〜Ｃ２４アルキニル、または任意選択で置換されたＣ１０〜Ｃ２４アシルであり、
Ｒ３及びＲ４は同一であるかまたは異なっているかのいずれかであり、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６アルケニル、もしくは任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６アルキニルであるか、またはＲ３及びＲ４が結合して、任意選択で置換された、４〜６の炭素原子ならびに窒素及び酸素から選択される１もしくは２のヘテロ原子のヘテロ環式リングを形成してもよく、
Ｒ５は存在しないかまたは存在するかのいずれかであり、存在する場合には水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
ｍ、ｎ及びｐは同一であるかまたは異なっているかのいずれかであり、独立に０または１のいずれかであり、但し、ｍ、ｎ、及びｐは同時に０ではなく、
ｑは０、１、２、３、または４であり、
Ｙ及びＺは同一であるかまたは異なっているかのいずれかであり、独立にＯ、Ｓ、またはＮＨである、
上記アミノ脂質が挙げられる。
【０１５５】
一実施形態において、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ、リノレイルであり、上記アミノ脂質は、ジリノレイルアミノ脂質である。一実施形態において、上記アミノ脂質はジリノレイルアミノ脂質である。
【０１５６】
代表的な有用なジリノレイルアミノ脂質は式：
【化１４】
2018526321.tif 000018
を有し、式中、ｎは０、１、２、３、または４である。
【０１５７】
一実施形態において、上記カチオン性脂質はＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡである。一実施形態において、上記カチオン性脂質はＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（上述のＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、但しｎは２）である。
【０１５８】
一実施形態において、上記ＬＮＰの上記カチオン性脂質成分は、式（Ｉ）：
【化１５】
2018526321.tif 000019
の構造または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体であって、式中、
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立に、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−または炭素−炭素二重結合であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ１ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ１ｂは該Ｒ１ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ１ｂ及び該Ｒ１ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ２ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ２ｂは該Ｒ２ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ２ｂ及び該Ｒ２ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ３ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ３ｂは該Ｒ３ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ３ｂ及び該Ｒ３ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ４ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ４ｂは該Ｒ４ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ４ｂ及び該Ｒ４ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立にメチルまたはシクロアルキルであり、
Ｒ７は、それぞれの存在毎に独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に非置換のＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、またはＲ８及びＲ９が、該Ｒ８及びＲ９が結合する窒素原子と共に、１つの窒素原子を含む５、６または７員ヘテロ環式リングを形成し、
ａ及びｄはそれぞれ独立に０〜２４の整数であり、
ｂ及びｃはそれぞれ独立に１〜２４の整数であり、
ｅは１または２である、
上記構造または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体を有する。
【０１５９】
式（Ｉ）のある特定の実施形態において、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａもしくはＲ４ａのうちの少なくとも１つはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、またはＬ１もしくはＬ２の少なくとも一方は−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−もしくは−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−である。他の実施形態において、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、ａが６である場合にはイソプロピルでなく、またはａが８である場合にはｎ−ブチルではない。
【０１６０】
一層更なる式（Ｉ）の実施形態において、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａもしくはＲ４ａのうちの少なくとも１つはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、またはＬ１もしくはＬ２の少なくとも一方は−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−もしくは−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、ａが６である場合にはイソプロピルでなく、またはａが８である場合にはｎ−ブチルではない。
【０１６１】
他の式（Ｉ）の実施形態において、Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に非置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキルであるか、またはＲ８及びＲ９が、該Ｒ８及びＲ９が結合する窒素原子と共に、１つの窒素原子を含む５、６もしく７員ヘテロ環式リングを形成する。
【０１６２】
式（Ｉ）のある特定の実施形態において、Ｌ１またはＬ２のいずれか一方は、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−または炭素−炭素二重結合であってよい。Ｌ１及びＬ２はそれぞれ−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−であってもよく、またはそれぞれ炭素−炭素二重結合であってもよい。
【０１６３】
いくつかの式（Ｉ）の実施形態において、Ｌ１またはＬ２の一方は−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。他の実施形態において、Ｌ１及びＬ２は共に−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。
【０１６４】
いくつかの式（Ｉ）の実施形態において、Ｌ１またはＬ２の一方は−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−である。他の実施形態において、Ｌ１及びＬ２は共に−（Ｃ＝Ｏ）Ｏである。
【０１６５】
いくつかの他の式（Ｉ）の実施形態において、Ｌ１またはＬ２の一方は炭素−炭素二重結合である。他の実施形態において、Ｌ１及びＬ２は共に炭素−炭素二重結合である。
【０１６６】
更に他の式（Ｉ）の実施形態において、Ｌ１またはＬ２の一方は−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｌ１またはＬ２のうちの他方は−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−である。更なる実施形態において、Ｌ１またはＬ２の一方は−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｌ１またはＬ２のうちの他方は炭素−炭素二重結合である。一層更なる実施形態において、Ｌ１またはＬ２の一方は−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−であり、Ｌ１またはＬ２のうちの他方は炭素−炭素二重結合である。
【０１６７】
本明細書を通して用いられる「炭素−炭素」二重結合は、以下の構造：
【化１６】
2018526321.tif 000020
のうちの１つを指すことが理解され、式中、Ｒａ及びＲｂはそれぞれの存在毎に独立に、Ｈまたは置換基である。例えば、いくつかの実施形態において、Ｒａ及びＲｂはそれぞれの存在毎に独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルまたはシクロアルキル、例えばＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルである。
【０１６８】
他の実施形態において、式（Ｉ）の脂質化合物は、以下の構造（Ｉａ）：
【化１７】
2018526321.tif 000021
を有する。
【０１６９】
他の実施形態において、式（Ｉ）の脂質化合物は、以下の構造（１ｂ）：
【化１８】
2018526321.tif 000022
を有する。
【０１７０】
更に他の実施形態において、式（Ｉ）の脂質化合物は、以下の構造（Ｉｃ）：
【化１９】
2018526321.tif 000023
を有する。
【０１７１】
式（Ｉ）の脂質化合物のある特定の実施形態において、ａ、ｂ、ｃ及びｄはそれぞれ独立に、２〜１２の整数または４〜１２の整数である。他の実施形態において、ａ、ｂ、ｃ及びｄはそれぞれ独立に、８〜１２または５〜９の整数である。いくつかのある特定の実施形態において、ａは０である。いくつかの実施形態において、ａは１である。他の実施形態において、ａは２である。更なる実施形態において、ａは３である。更に他の実施形態において、ａは４である。いくつかの実施形態において、ａは５である。他の実施形態において、ａは６である。更なる実施形態において、ａは７である。更に他の実施形態において、ａは８である。いくつかの実施形態において、ａは９である。他の実施形態において、ａは１０である。更なる実施形態において、ａは１１である。更に他の実施形態において、ａは１２である。いくつかの実施形態において、ａは１３である。他の実施形態において、ａは１４である。更なる実施形態において、ａは１５である。更に他の実施形態において、ａは１６である。
【０１７２】
いくつかの他の式（Ｉ）の実施形態において、ｂは１である。他の実施形態において、ｂは２である。更なる実施形態において、ｂは３である。更に他の実施形態において、ｂは４である。いくつかの実施形態において、ｂは５である。他の実施形態において、ｂは６である。更なる実施形態において、ｂは７である。更に他の実施形態において、ｂは８である。いくつかの実施形態において、ｂは９である。他の実施形態において、ｂは１０である。更なる実施形態において、ｂは１１である。更に他の実施形態において、ｂは１２である。いくつかの実施形態において、ｂは１３である。他の実施形態において、ｂは１４である。更なる実施形態において、ｂは１５である。更に他の実施形態において、ｂは１６である。
【０１７３】
いくつかの更なる式（Ｉ）の実施形態において、ｃは１である。他の実施形態において、ｃは２である。更なる実施形態において、ｃは３である。更に他の実施形態において、ｃは４である。いくつかの実施形態において、ｃは５である。他の実施形態において、ｃは６である。更なる実施形態において、ｃは７である。更に他の実施形態において、ｃは８である。いくつかの実施形態において、ｃは９である。他の実施形態において、ｃは１０である。更なる実施形態において、ｃは１１である。更に他の実施形態において、ｃは１２である。いくつかの実施形態において、ｃは１３である。他の実施形態において、ｃは１４である。更なる実施形態において、ｃは１５である。更に他の実施形態において、ｃは１６である。
【０１７４】
式（Ｉ）のいくつかのある特定の他の実施形態において、ｄは０である。いくつかの実施形態において、ｄは１である。他の実施形態において、ｄは２である。更なる実施形態において、ｄは３である。更に他の実施形態において、ｄは４である。いくつかの実施形態において、ｄは５である。他の実施形態において、ｄは６である。更なる実施形態において、ｄは７である。更に他の実施形態において、ｄは８である。いくつかの実施形態において、ｄは９である。他の実施形態において、ｄは１０である。更なる実施形態において、ｄは１１である。更に他の実施形態において、ｄは１２である。いくつかの実施形態において、ｄは１３である。他の実施形態において、ｄは１４である。更なる実施形態において、ｄは１５である。更に他の実施形態において、ｄは１６である。
【０１７５】
式（Ｉ）のいくつかの他の様々な実施形態において、ａとｄとは同一である。いくつかの他の実施形態において、ｂとｃとは同一である。いくつかの他の特定の実施形態において、ａとｄとは同一であり、且つｂとｃとは同一である。
【０１７６】
式（Ｉ）におけるａとｂとの和及びｃとｄとの和は、所望の特性を有する式（Ｉ）の脂質を得るために変動し得る因子である。一実施形態において、ａとｂとは、それらの和が１４〜２４の範囲の整数となるように選択される。他の実施形態において、ｃとｄとは、それらの和が１４〜２４の範囲の整数となるように選択される。更なる実施形態において、ａとｂとの和及びｃとｄとの和は同一である。例えば、いくつかの実施形態において、ａとｂとの和及びｃとｄとの和は共に、１４〜２４の範囲であってよい同一の整数である。一層更なる実施形態において、ａ、ｂ、ｃ及びｄは、ａとｂとの和及びｃとｄとの和が１２以上になるように選択される。
【０１７７】
式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、ｅは１である。他の実施形態において、ｅは２である。
【０１７８】
式（Ｉ）のＲ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａにおける置換基は特に限定されない。ある特定の実施形態において、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａはそれぞれの存在毎にＨである。ある特定の他の実施形態において、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａのうちの少なくとも１つはＣ１〜Ｃ１２アルキルである。ある特定の他の実施形態において、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａのうちの少なくとも１つはＣ１〜Ｃ８アルキルである。ある特定の他の実施形態において、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａのうちの少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルキルである。上述の実施形態のいくつかにおいて、上記Ｃ１〜Ｃ８アルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ヘキシルまたはｎ−オクチルである。
【０１７９】
式（Ｉ）のある特定の実施形態において、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ４ａ及びＲ４ｂはそれぞれの存在毎にＣ１〜Ｃ１２アルキルである。
【０１８０】
式（Ｉ）の更なる実施形態において、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ及びＲ４ｂのうちの少なくとも１つはＨであるか、またはＲ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ及びＲ４ｂはそれぞれの存在毎にＨである。
【０１８１】
式（Ｉ）のある特定の実施形態において、Ｒ１ｂは該Ｒ１ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ１ｂ及び該Ｒ１ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成する。上述の他の実施形態において、Ｒ４ｂは該Ｒ４ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ４ｂ及び該Ｒ４ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成する。
【０１８２】
上述の実施形態において、式（Ｉ）のＲ５及びＲ６における置換基は特に限定されない。ある特定の実施形態において、Ｒ５もしくはＲ６の一方または両方はメチルである。ある特定の他の実施形態において、Ｒ５もしくはＲ６の一方または両方はシクロアルキル、例えばシクロヘキシルである。これらの実施形態において、上記シクロアルキルは置換されていても置換されていなくてもよい。ある特定の他の実施形態において、上記シクロアルキルはＣ１〜Ｃ１２アルキル、例えばｔｅｒｔ−ブチルによって置換されている。
【０１８３】
上述の式（Ｉ）の実施形態において、Ｒ７における置換基は特に限定されない。ある特定の実施形態において、少なくとも１つのＲ７はＨである。いくつかの他の実施形態において、Ｒ７はそれぞれの存在毎にＨである。ある特定の他の実施形態において、Ｒ７はＣ１〜Ｃ１２アルキルである。
【０１８４】
上述の式（Ｉ）のある特定の他の実施形態において、Ｒ８またはＲ９の一方はメチルである。他の実施形態において、Ｒ８及びＲ９は共にメチルである。
【０１８５】
いくつかの異なる式（Ｉ）の実施形態において、Ｒ８及びＲ９は、該Ｒ８及びＲ９が結合する窒素原子と共に、５、６または７員ヘテロ環式リングを形成する。上述のいくつかの実施形態において、Ｒ８及びＲ９は、該Ｒ８及びＲ９が結合する窒素原子と共に、５員ヘテロ環式リング、例えばピロリジニル環を形成する。
【０１８６】
様々な異なる実施形態において、式（Ｉ）の脂質は、以下の表１に示す構造のうちの１つを有する。
【表１】
2018526321.tif 000024
2018526321.tif 000025
2018526321.tif 000026
2018526321.tif 000027
2018526321.tif 000028
2018526321.tif 000029
2018526321.tif 000030
【０１８７】
いくつかの実施形態において、上記ＬＮＰは、式（Ｉ）の脂質、ヌクレオシド修飾ＲＮＡならびに中性脂質、ステロイド及びペグ化脂質から選択される１種または複数種の賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の脂質は化合物Ｉ−５である。いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の脂質は化合物Ｉ−６である。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、上記ＬＮＰの上記カチオン性脂質成分は、式（ＩＩ）：
【化２０】
2018526321.tif 000031
の構造または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体であって、式中、
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立に、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｘ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ−、または直接の結合であり、
Ｇ１はＣ１〜Ｃ２アルキレン、−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−または直接の結合であり、
Ｇ２は−Ｃ（＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａまたは直接の結合であり、
Ｇ３はＣ１〜Ｃ６アルキレンであり、
ＲａはＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ１ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ１ｂは該Ｒ１ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ１ｂ及び該Ｒ１ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ２ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ２ｂは該Ｒ２ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ２ｂ及び該Ｒ２ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ３ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ３ｂは該Ｒ３ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ３ｂ及び該Ｒ３ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれの存在毎に独立に、（ａ）ＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ４ａはＨもしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ４ｂは該Ｒ４ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ４ｂ及び該Ｒ４ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、
Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立にＨまたはメチルであり、
Ｒ７はＣ４〜Ｃ２０アルキルであり、
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立にＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、またはＲ８及びＲ９が、該Ｒ８及びＲ９が結合する窒素原子と共に５、６または７員ヘテロ環式リングを形成し、
ａ、ｂ、ｃ及びｄはそれぞれ独立に１〜２４の整数であり、
ｘは０、１または２である、
上記構造または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体を有する。
【０１８９】
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態において、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立に、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−または直接の結合である。他の実施形態において、Ｇ１及びＧ２はそれぞれ独立に−（Ｃ＝Ｏ）−または直接の結合である。いくつかの異なる実施形態において、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立に、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−または直接の結合であり、且つＧ１及びＧ２はそれぞれ独立に−（Ｃ＝Ｏ）−または直接の結合である。
【０１９０】
式（ＩＩ）のいくつかの異なる実施形態において、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立に、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｘ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａ−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＲａＳ（Ｏ）ｘＮＲａ−、−ＮＲａＳ（Ｏ）ｘ−または−Ｓ（Ｏ）ｘＮＲａ−である。
【０１９１】
式（ＩＩ）の上述の他の実施形態において、上記脂質化合物は以下の構造（ＩＩＡ）または（ＩＩＢ）：
【化２１】
2018526321.tif 000032
の１つを有する。
【０１９２】
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態において、上記脂質化合物は構造（ＩＩＡ）を有する。他の実施形態において、上記脂質化合物は構造（ＩＩＢ）を有する。
【０１９３】
上述の式（ＩＩ）の実施形態のいずれかにおいて、Ｌ１またはＬ２の一方は−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。例えば、いくつかの実施形態において、Ｌ１及びＬ２のそれぞれは−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。
【０１９４】
式（ＩＩ）のいくつかの異なる実施形態において、Ｌ１またはＬ２の一方は−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−である。例えば、いくつかの実施形態において、Ｌ１及びＬ２のそれぞれは−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−である。
【０１９５】
式（ＩＩ）の異なる実施形態において、Ｌ１またはＬ２の一方は直接の結合である。本明細書で用いられる「直接の結合」は、基（例えば、Ｌ１またはＬ２）が存在しないことを意味する。例えば、いくつかの実施形態において、Ｌ１及びＬ２のそれぞれは直接の結合である。
【０１９６】
式（ＩＩ）の他の異なる実施形態において、Ｒ１ａ及びＲ１ｂの少なくとも１つの存在に関して、Ｒ１ａはＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ１ｂは該Ｒ１ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ１ｂ及び該Ｒ１ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成する。
【０１９７】
式（ＩＩ）の更に他の異なる実施形態において、Ｒ４ａ及びＲ４ｂの少なくとも１つの存在に関して、Ｒ４ａはＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ４ｂは該Ｒ４ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ４ｂ及び該Ｒ４ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成する。
【０１９８】
式（ＩＩ）の更なる実施形態において、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの少なくとも１つの存在に関して、Ｒ２ａはＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ２ｂは該Ｒ２ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ２ｂ及び該Ｒ２ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成する。
【０１９９】
式（ＩＩ）の他の異なる実施形態において、Ｒ３ａ及びＲ３ｂの少なくとも１つの存在に関して、Ｒ３ａはＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、且つＲ３ｂは該Ｒ３ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ３ｂ及び該Ｒ３ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成する。
【０２００】
式（ＩＩ）の様々な他の実施形態において、上記脂質化合物は、以下の構造（ＩＩＣ）または（ＩＩＤ）：
【化２２】
2018526321.tif 000033
のうちの一方を有し、式中、ｅ、ｆ、ｇ及びｈはそれぞれ独立に１〜１２の整数である。
【０２０１】
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態において、上記脂質化合物は構造（ＩＩＣ）を有する。他の実施形態において、上記脂質化合物は構造（ＩＩＤ）を有する。
【０２０２】
構造（ＩＩＣ）または（ＩＩＤ）の様々な実施形態において、ｅ、ｆ、ｇ及びｈはそれぞれ独立に４〜１０の整数である。
【０２０３】
式（ＩＩ）のある特定の実施形態において、ａ、ｂ、ｃ及びｄはそれぞれ独立に２〜１２の整数または４〜１２の整数である。他の実施形態において、ａ、ｂ、ｃ及びｄはそれぞれ独立に８〜１２または５〜９の整数である。いくつかのある特定の実施形態において、ａは０である。いくつかの実施形態において、ａは１である。他の実施形態において、ａは２である。更なる実施形態において、ａは３である。更に他の実施形態において、ａは４である。いくつかの実施形態において、ａは５である。他の実施形態において、ａは６である。更なる実施形態において、ａは７である。更に他の実施形態において、ａは８である。いくつかの実施形態において、ａは９である。他の実施形態において、ａは１０である。更なる実施形態において、ａは１１である。更に他の実施形態において、ａは１２である。いくつかの実施形態において、ａは１３である。他の実施形態において、ａは１４である。更なる実施形態において、ａは１５である。更に他の実施形態において、ａは１６である。
【０２０４】
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態において、ｂは１である。他の実施形態において、ｂは２である。更なる実施形態において、ｂは３である。更に他の実施形態において、ｂは４である。いくつか実施形態において、ｂは５である。他の実施形態において、ｂは６である。更なる実施形態において、ｂは７である。更に他の実施形態において、ｂは８である。いくつかの実施形態において、ｂは９である。他の実施形態において、ｂは１０である。更なる実施形態において、ｂは１１である。更に他の実施形態において、ｂは１２である。いくつかの実施形態において、ｂは１３である。他の実施形態において、ｂは１４である。更なる実施形態において、ｂは１５である。更に他の実施形態において、ｂは１６である。
【０２０５】
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態において、ｃは１である。他の実施形態において、ｃは
２である。更なる実施形態において、ｃは３である。更に他の実施形態において、ｃは４である。いくつか実施形態において、ｃは５である。他の実施形態において、ｃは６である。更なる実施形態において、ｃは７である。更に他の実施形態において、ｃは８である。いくつかの実施形態において、ｃは９である。他の実施形態において、ｃは１０である。更なる実施形態において、ｃは１１である。更に他の実施形態において、ｃは１２である。いくつかの実施形態において、ｃは１３である。他の実施形態において、ｃは１４である。更なる実施形態において、ｃは１５である。更に他の実施形態において、ｃは１６である。
【０２０６】
式（ＩＩ）のいくつかのある特定の実施形態において、ｄは０である。いくつかの実施形態において、ｄは１である。他の実施形態において、ｄは２である。更なる実施形態において、ｄは３である。更に他の実施形態において、ｄは４である。いくつかの実施形態において、ｄは５である。他の実施形態において、ｄは６である。更なる実施形態において、ｄは７である。更に他の実施形態において、ｄは８である。いくつかの実施形態において、ｄは９である。他の実施形態において、ｄは１０である。更なる実施形態において、ｄは１１である。更に他の実施形態において、ｄは１２である。いくつかの実施形態において、ｄは１３である。他の実施形態において、ｄは１４である。更なる実施形態において、ｄは１５である。更に他の実施形態において、ｄは１６である。
【０２０７】
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態において、ｅは１である。他の実施形態において、ｅは２である。更なる実施形態において、ｅは３である。更に他の実施形態において、ｅは４である。いくつかの実施形態において、ｅは５である。他の実施形態において、ｅは６である。更なる実施形態において、ｅは７である。更に他の実施形態において、ｅは８である。いくつかの実施形態において、ｅは９である。他の実施形態において、ｅは１０である。更なる実施形態において、ｅは１１である。更に他の実施形態において、ｅは１２である。
【０２０８】
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態において、ｆは１である。他の実施形態において、ｆは２である。更なる実施形態において、ｆは３である。更に他の実施形態において、ｆは４である。いくつかの実施形態において、ｆは５である。他の実施形態において、ｆは６である。更なる実施形態において、ｆは７である。更に他の実施形態において、ｆは８である。いくつかの実施形態において、ｆは９である。他の実施形態において、ｆは１０である。更なる実施形態において、ｆは１１である。更に他の実施形態において、ｆは１２である。
【０２０９】
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態において、ｇは１である。他の実施形態において、ｇは２である。更なる実施形態において、ｇは３である。更に他の実施形態において、ｇは４である。いくつか実施形態において、ｇは５である。他の実施形態において、ｇは６である。更なる実施形態において、ｇは７である。更に他の実施形態において、ｇは８である。いくつかの実施形態において、ｇは９である。他の実施形態において、ｇは１０である。更なる実施形態において、ｇは１１である。更に他の実施形態において、ｇは１２である。
【０２１０】
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態において、ｈは１である。他の実施形態において、ｅは２である。更なる実施形態において、ｈは３である。更に他の実施形態において、ｈは４である。いくつか実施形態において、ｅは５である。他の実施形態において、ｈは６である。更なる実施形態において、ｈは７である。更に他の実施形態において、ｈは８である。いくつかの実施形態において、ｈは９である。他の実施形態において、ｈは１０である。更なる実施形態において、ｈは１１である。更に他の実施形態において、ｈは１２である。
【０２１１】
式（ＩＩ）のいくつかの他の様々な実施形態において、ａとｄとは同一である。いくつかの他の実施形態において、ｂとｃとは同一である。いくつかのある特定の他の実施形態において、ａとｄとは同一であり、且つｂとｃとは同一である。
【０２１２】
式（ＩＩ）のａとｂとの和及びｃとｄとの和は、所望の特性を有する脂質を得るために変動し得る因子である。一実施形態において、ａとｂとは、それらの和が１４〜２４の範囲の整数となるように選択される。他の実施形態において、ｃとｄとは、それらの和が１４〜２４の範囲の整数となるように選択される。更なる実施形態において、ａとｂとの和及びｃとｄとの和は同一である。例えば、いくつかの実施形態において、ａとｂとの和及びｃとｄとの和は共に、１４〜２４の範囲であってよい同一の整数である。一層更なる実施形態において、ａ、ｂ、ｃ及びｄは、ａとｂとの和及びｃとｄとの和が１２以上になるように選択される。
【０２１３】
式（ＩＩ）のＲ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａにおける置換基は特に限定されない。いくつかの実施形態において、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａのうちの少なくとも１つはＨである。ある特定の実施形態において、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａはそれぞれの存在毎にＨである。ある特定の他の実施形態において、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａのうちの少なくとも１つはＣ１〜Ｃ１２アルキルである。ある特定の他の実施形態において、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａのうちの少なくとも１つはＣ１〜Ｃ８アルキルである。ある特定の他の実施形態において、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ４ａのうちの少なくとも１つはＣ１〜Ｃ６アルキルである。いくつかの上述の実施形態において、上記Ｃ１〜Ｃ８アルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ヘキシルまたはｎ−オクチルである。
【０２１４】
式（ＩＩ）のある特定の実施形態において、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれの存在毎にＣ１〜Ｃ１２アルキルである。
【０２１５】
式（ＩＩ）の更なる実施形態において、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ及びＲ４ｂのうちの少なくとも１つはＨであるか、またはＲ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ及びＲ４ｂは、それぞれの存在毎にＨである。
【０２１６】
式（ＩＩ）のある特定の実施形態において、Ｒ１ｂは該Ｒ１ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ１ｂ及び該Ｒ１ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成する。上述の他の実施形態において、Ｒ４ｂは該Ｒ４ｂが結合する炭素原子と共に、隣接するＲ４ｂ及び該Ｒ４ｂが結合する炭素原子と協同して炭素−炭素二重結合を形成する。
【０２１７】
式（ＩＩ）のＲ５及びＲ６における置換基は、上述の実施形態において特に限定されない。ある特定の実施形態において、Ｒ５またはＲ６の一方はメチルである。他の実施形態において、Ｒ５またはＲ６のそれぞれはメチルである。
【０２１８】
式（ＩＩ）のＲ７における置換基は上述の実施形態において特に限定されない。ある特定の実施形態において、Ｒ７はＣ６〜Ｃ１６アルキルである。いくつかの他の実施形態において、Ｒ７はＣ６〜Ｃ９アルキルである。これらの実施形態のいくつかにおいて、Ｒ７は、−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲｂ、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒｂ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、−ＯＲｂ、−Ｓ（Ｏ）ｘＲｂ、−Ｓ−ＳＲｂ、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｂ、−ＳＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、−ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＯＲｂ、−ＮＲａＳ（Ｏ）ｘＮＲａＲｂ、−ＮＲａＳ（Ｏ）ｘＲｂまたは−Ｓ（Ｏ）ｘＮＲａＲｂによって置換されており、但し、ＲａはＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、ＲｂはＣ１〜Ｃ１５アルキルであり、ｘは０、１または２である。例えば、いくつかの実施形態において、Ｒ７は−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲｂまたは−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒｂによって置換されている。
【０２１９】
上述の式（ＩＩ）の様々な実施形態において、Ｒｂは分枝状のＣ１〜Ｃ１5アルキルである。例えば、いくつかの実施形態において、Ｒｂは以下の構造のうちの１つを有する：
【化２３】
2018526321.tif 000034
【０２２０】
上述の式（ＩＩ）のある特定の他の実施形態において、Ｒ８またはＲ９の一方はメチルである。他の実施形態において、Ｒ８及びＲ９は共にメチルである。
【０２２１】
式（ＩＩ）のいくつかの異なる実施形態において、Ｒ８及びＲ９は、該Ｒ８及びＲ９が結合する窒素原子と共に、５、６または７員ヘテロ環式リングを形成する。いくつかの上述の実施形態において、Ｒ８及びＲ９は、該Ｒ８及びＲ９が結合する窒素原子と共に、５員ヘテロ環式リング、例えばピロリジニル環を形成する。いくつかの異なる、上述の実施形態において、Ｒ８及びＲ９は、該Ｒ８及びＲ９が結合する窒素原子と共に、６員ヘテロ環式リング、例えばピペラジニル環を形成する。
【０２２２】
上述の式（ＩＩ）の脂質の更に他の実施形態において、Ｇ３はＣ２〜Ｃ４アルキレン、例えばＣ３アルキレンである。
【０２２３】
様々な異なる実施形態において、上記脂質化合物は以下の表２に示す構造のうちの１つを有する。
【表２】
2018526321.tif 000035
2018526321.tif 000036
2018526321.tif 000037
2018526321.tif 000038
2018526321.tif 000039
【０２２４】
いくつかの実施形態において、上記ＬＮＰは、式（ＩＩ）の脂質、ヌクレオシド修飾ＲＮＡならびに中性脂質、ステロイド及びペグ化脂質から選択される１種または複数種の賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）の脂質は化合物ＩＩ−９である。いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）の脂質は化合物ＩＩ−１０である。いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）の脂質は化合物ＩＩ−１１である。いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）の脂質は化合物ＩＩ−１２である。いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）の脂質は化合物ＩＩ−３２である。
【０２２５】
いくつかの他の実施形態において、上記ＬＮＰの上記カチオン性脂質成分は、式（ＩＩＩ）：
【化２４】
2018526321.tif 000040
の構造または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体であって、式中、
Ｌ１またはＬ２の一方が、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｘ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ−、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−または−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ−であり、且つＬ１またはＬ２の他方が−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｘ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ−、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−もしくは−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ−または直接の結合であり、
Ｇ１及びＧ２はそれぞれ独立に、非置換のＣ１〜Ｃ１２アルキレンまたはＣ１〜Ｃ１２アルケニレンであり、
Ｇ３はＣ１〜Ｃ２４アルキレン、Ｃ１〜Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルケニレンであり、
ＲａはＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、Ｃ６〜Ｃ２４アルキルまたはＣ６〜Ｃ２４アルケニルであり、
Ｒ３はＨ、ＯＲ５、ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４または−ＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり、
Ｒ４はＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、
Ｒ５はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
ｘは０、１または２である、
上記構造または薬学的に許容されるその塩、互変異生体、プロドラッグもしくは立体異性体を有する。
【０２２６】
上述の式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態において、上記脂質は、以下の構造（ＩＩＩＡ）または（ＩＩＩＢ）：
【化２５】
2018526321.tif 000041
であって、式中、
Ａは３〜８員シクロアルキルまたはシクロアルキレン環であり、
Ｒ６はそれぞれの存在毎に独立に、Ｈ、ＯＨまたはＣ１〜Ｃ２４アルキルであり、
ｎは１〜１５の範囲の整数である、
上記構造のうちの１つを有する。
【０２２７】
上述の式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態において、上記脂質は構造（ＩＩＩＡ）を有し、他の実施形態において、上記脂質は構造（ＩＩＩＢ）を有する。
【０２２８】
他の式（ＩＩＩ）の実施形態において、上記脂質は、以下の構造（ＩＩＩＣ）または（ＩＩＩＤ）：
【化２６】
2018526321.tif 000042
であって、式中、ｙ及びｚはそれぞれ独立に１〜１２の範囲の整数である上記構造ののうちの１つを有する。
【０２２９】
上述の式（ＩＩＩ）のいずれかの実施形態において、Ｌ１またはＬ２の一方は−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。例えば、いくつかの実施形態において、Ｌ１及びＬ２のそれぞれは−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。上述のいずれかのいくつかの異なる実施形態において、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立に、（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−または−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。例えば、いくつかの実施形態において、Ｌ１及びＬ２のそれぞれは−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−である。
【０２３０】
いくつかの異なる式（ＩＩＩ）の実施形態において、上記脂質は、以下の構造（ＩＩＩＥ）または（ＩＩＩＦ）：
【化２７】
2018526321.tif 000043
のうちの１つを有する。
【０２３１】
いくつかの上述の式（ＩＩＩ）の実施形態において、上記脂質は以下の構造（ＩＩＩＧ）、（ＩＩＩＨ）、（ＩＩＩＩ）、または（ＩＩＩＪ）：
【化２８】
2018526321.tif 000044
のうちの１つを有する。
【０２３２】
式（ＩＩＩ）のいくつかの上述の実施形態において、ｎは、２〜１２、例えば２〜８または２〜４の範囲の整数である。例えば、いくつかの実施形態において、ｎは３、４、５または６である。いくつかの実施形態において、ｎは３である。いくつかの実施形態において、ｎは４である。いくつかの実施形態において、ｎは５である。いくつかの実施形態において、ｎは６である。
【０２３３】
上述の式（ＩＩＩ）のいくつかの他の実施形態において、ｙ及びｚはそれぞれ独立に、２〜１０の範囲の整数である。例えば、いくつかの実施形態において、ｙ及びｚはそれぞれ独立に、４〜９または４〜６の範囲の整数である。
【０２３４】
いくつかの上述の式（ＩＩＩ）の実施形態において、Ｒ６はＨである。他の上述の実施形態において、Ｒ６はＣ１〜Ｃ２４アルキルである。他の実施形態において、Ｒ６はＯＨである。
【０２３５】
いくつかの式（ＩＩＩ）の実施形態において、Ｇ３は非置換である。他の実施形態において、Ｇ３は置換されている。様々な異なる実施形態において、Ｇ３は直鎖状のＣ１〜Ｃ２４アルキレンまたは直鎖状のＣ１〜Ｃ２４アルケニレンである。
【０２３６】
上述の式（ＩＩＩ）のいくつかの他の実施形態において、Ｒ１もしくはＲ２、またはそれらの両方はＣ６〜Ｃ２４アルケニルである。例えば、いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に以下の構造：
【化２９】
2018526321.tif 000045
であって、式中、
Ｒ７ａ及びＲ７ｂはそれぞれの存在毎に独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、
ａは２〜１２の整数であり、
Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ及びａはそれぞれ、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立に６〜２０の炭素原子を含むように選択される、上記構造を有する。例えば、いくつかの実施形態において、ａは５〜９または８〜１２の範囲の整数である。
【０２３７】
いくつかの上述の式（ＩＩＩ）の実施形態において、Ｒ７ａの少なくとも１つの存在はＨである。例えば、いくつかの実施形態において、Ｒ７ａはそれぞれの存在毎にＨである。他の異なる上述の実施形態において、Ｒ７ｂの少なくとも１つの存在はＣ１〜Ｃ８アルキルである。例えば、いくつかの実施形態において、Ｃ１〜Ｃ８アルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ヘキシルまたはｎ−オクチルである。
【０２３８】
異なる式（ＩＩＩ）の実施形態において、Ｒ１もしくはＲ２、またはそれらの両方は、以下の構造のうちの１つを有する：
【化３０】
2018526321.tif 000046
【０２３９】
上述の式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態において、Ｒ３は、ＯＨ、ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４または−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ４である。いくつかの実施形態において、Ｒ４はメチルまたはエチルである。
【０２４０】
様々な異なる実施形態において、式（ＩＩＩ）のカチオン性脂質は、以下の表３に示される構造のうちの１つを有する。
【表３】
2018526321.tif 000047
2018526321.tif 000048
2018526321.tif 000049
2018526321.tif 000050
2018526321.tif 000051
【０２４１】
いくつかの実施形態において、上記ＬＮＰは式（ＩＩＩ）の脂質、ヌクレオシド修飾ＲＮＡならびに中性脂質、ステロイド及びペグ化脂質から選択される１種または複数種の賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）の脂質は化合物ＩＩＩ−３である。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）の脂質は化合物ＩＩＩ−７である。
【０２４２】
ある特定の実施形態において、上記カチオン性脂質は、約３０〜約９５モルパーセントの量で上記ＬＮＰ中に存在する。一実施形態において、上記カチオン性脂質は、約３０〜約７０モルパーセントの量で上記ＬＮＰ中に存在する。一実施形態において、上記カチオン性脂質は、約４０〜約６０モルパーセントの量で上記ＬＮＰ中に存在する。一実施形態において、上記カチオン性脂質は、約５０モルパーセントの量で上記ＬＮＰ中に存在する。一実施形態において、上記ＬＮＰはカチオン性脂質のみを含む。
【０２４３】
ある特定の実施形態において、上記ＬＮＰは、粒子の形成を該粒子の形成中に安定化させる、１種または複数種の更なる脂質を含む。
【０２４４】
好適な安定化脂質としては中性脂質及びアニオン性脂質が挙げられる。
【０２４５】
「中性脂質」という用語は、生理的ｐＨにおいて非荷電または中性の双性イオン形態のいずれかで存在する、多数の脂質種のいずれか１種を指す。代表的な中性脂質としては、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、及びセレブロシドが挙げられる。
【０２４６】
例示的な中性脂質としては、例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）及びジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレインイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−ｔｒａｎｓ  ＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、ならびに１，２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ｔｒａｎｓＤＯＰＥ）が挙げられる。一実施形態において、上記中性脂質は１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。
【０２４７】
いくつかの実施形態において、上記ＬＮＰは、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ及びＳＭから選択される中性脂質を含む。様々な実施形態において、上記カチオン性脂質（例えば、式（Ｉ）の脂質）の上記中性脂質に対するモル比は約２：１〜約８：１の範囲である。
【０２４８】
様々な実施形態において、上記ＬＮＰは、ステロイドまたはステロイド類似体を更に含む。「ステロイド」は以下の炭素骨格：
【化３１】
2018526321.tif 000052
を含む化合物である。
【０２４９】
ある特定の実施形態において、上記ステロイドまたはステロイド類似体はコレステロールである。いくつかのこれらの実施形態において、上記カチオン性脂質（例えば、式（Ｉ）の脂質）のコレステロールに対するモル比は約２：１〜１：１の範囲である。
【０２５０】
「アニオン性脂質」は、生理的ｐＨにおいて負に荷電した任意の脂質を指す。これらの脂質としては、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、及び中性脂質に結合した他のアニオン性修飾基が挙げられる。
【０２５１】
ある特定の実施形態において、上記ＬＮＰは、糖脂質（例えば、モノシアロガングリオシドＧＭ１）を含む。ある特定の実施形態において、上記ＬＮＰはコレステロールなどのステロールを含む。
【０２５２】
いくつかの実施形態において、上記ＬＮＰはポリマー結合脂質を含む。「ポリマー結合脂質」という用語は、脂質部分とポリマー部分の両方を含む分子を指す。ポリマー結合脂質の例はペグ化脂質である。「ペグ化脂質」という用語は、脂質部分とポリエチレングリコール部分の両方を含む分子を指す。ペグ化脂質は本技術分野で公知であり、１−（モノメトキシ−ポリエチレングリコール）−２，３−ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ−ｓ−ＤＭＧ）などが挙げられる。
【０２５３】
ある特定の実施形態において、上記ＬＮＰは、ポリエチレングリコール−脂質（ペグ化脂質）である更なる安定化脂質を含む。好適なポリエチレングリコール−脂質としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールが挙げられる。代表的なポリエチレングリコール−脂質としては、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ、及びＰＥＧ−ｓ−ＤＭＧが挙げられる。一実施形態において、上記ポリエチレングリコール−脂質は、Ｎ−［（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバミル］−１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−アミン（ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ）である。一実施形態において、上記ポリエチレングリコール−脂質はＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ）である。他の実施形態において、上記ＬＮＰは、１−（モノメトキシ−ポリエチレングリコール）−２，３−ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）などのペグ化ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）、４−Ｏ−（２’，３’−ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル−ｌ−Ｏ−（ω−メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオナート（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ）などのＰＥＧスクシネートジアシルグリセロール（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ）、ペグ化セラミド（ＰＥＧ−ｃｅｒ）、またはω−メトキシ（ポリエトキシ）エチル−Ｎ−（２，３−ジ（テトラデカンオキシ）プロピル）カルバマートもしくは２，３−ジ（テトラデカンオキシ）プロピル−Ｎ−（ω−メトキシ（ポリエトキシ）エチル）カルバマートなどのＰＥＧジアルコキシプロピルカルバマートを含む。様々な実施形態において、上記カチオン性脂質の上記ペグ化脂質に対するモル比は、約１００：１〜約２５：１の範囲である。
【０２５４】
いくつかの実施形態において、上記ＬＮＰは、以下の構造（ＩＶ）：
【化３２】
2018526321.tif 000053
または薬学的に許容されるその塩、互変異性体もしくは立体異性体であって、
Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立に、任意選択で１もしくは複数のエステル結合が間に入った、１０〜３０の炭素原子を含有する、直鎖状または分枝状の、飽和または不飽和のアルキル鎖であり、
ｚは３０〜６０の範囲の平均値を有する、
上記構造または薬学的に許容されるその塩、互変異性体もしくは立体異性体を有するペグ化脂質を含む。
【０２５５】
いくつかのペグ化脂質（ＩＶ）の上述の実施形態において、ｚが４２である場合、Ｒ１０及びＲ１１は両者が共にｎ−オクタデシルであることはない。いくつかの他の実施形態において、Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立に、１０〜１８の炭素原子を含有する、直鎖状または分枝状の、飽和または不飽和のアルキル鎖である。いくつかの実施形態において、Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立に、１２〜１６の炭素原子を含有する、直鎖状または分枝状の、飽和または不飽和のアルキル鎖である。いくつかの実施形態において、Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立に、１２の炭素原子を含有する、直鎖状または分枝状の、飽和または不飽和のアルキル鎖である。いくつかの実施形態において、Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立に、１４の炭素原子を含有する、直鎖状または分枝状の、飽和または不飽和のアルキル鎖である。いくつかの実施形態において、Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立に、１６の炭素原子を含有する、直鎖状または分枝状の、飽和または不飽和のアルキル鎖である。一層更なる実施形態において、Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立に、１８の炭素原子を含有する、直鎖状または分枝状の、飽和または不飽和のアルキル鎖である。更に他の実施形態において、Ｒ１０は１２の炭素原子を含有する、直鎖状または分枝状の、飽和または不飽和のアルキル鎖であり、Ｒ１１は１４の炭素原子を含有する、直鎖状または分枝状の、飽和または不飽和のアルキル鎖である。
【０２５６】
様々な実施形態において、ｚは、（ＩＩ）のＰＥＧ部分が約４００〜約６０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有するように選択される範囲にわたる。いくつかの実施形態において、平均のｚは約４５である。
【０２５７】
他の実施形態において、上記ペグ化脂質は、以下の構造のうちの１つを有し：
【化３３】
2018526321.tif 000054
ｎは、上記ペグ化脂質の平均分子量が約２５００ｇ／ｍｏｌになるように選択された整数である。
【０２５８】
ある特定の実施形態において、上記更なる脂質は、約１〜約１０モルパーセントの量で上記ＬＮＰ中に存在する。一実施形態において、上記更なる脂質は、約１〜約５モルパーセントの量で上記ＬＮＰ中に存在する。一実施形態において、上記更なる脂質は、約１モルパーセントまたは約１モルパーセントで上記ＬＮＰ中に存在する。
【０２５９】
いくつかの実施形態において、上記ＬＮＰは、式（Ｉ）の脂質、ヌクレオシド修飾ＲＮＡ、中性脂質、ステロイド及びペグ化脂質を含む。いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の脂質は化合物Ｉ−６である。異なる実施形態において、上記中性脂質はＤＳＰＣである。他の実施形態において、上記ステロイドはコレステロールである。更に別の実施形態において、上記ペグ化脂質は化合物ＩＶａである。
【０２６０】
ある特定の実施形態において、上記ＬＮＰは、該ＬＮＰを細胞または細胞集団に標的化することができる１つまたは複数の標的化部分を含む。例えば、一実施形態において、上記標的化部分は、該ＬＮＰを細胞表面上に存在する受容体に導くリガンドである。
【０２６１】
ある特定の実施形態において、上記ＬＮＰは、１つまたは複数の内部移行ドメインを含む。例えば、一実施形態において、上記ＬＮＰは、細胞に結合して、該ＬＮＰの内部移行を誘導する１つまたは複数のドメインを含む。例えば、一実施形態において、上記１つまたは複数の内部移行ドメインは、細胞表面上に存在する受容体に結合して、受容体媒介性の上記ＬＮＰの取り込みを誘導する。ある特定の実施形態において、上記ＬＮＰはイン・ビボで生体分子に結合し、そこで上記ＬＮＰが結合した生体分子は次いで細胞表面受容体によって認識されて、内部移行を誘導することができる。例えば、一実施形態において、上記ＬＮＰは全身性ＡｐｏＥに結合し、これが該ＬＮＰ及びそれに伴うカーゴの取込みにつながる。
【０２６２】
他の例示的なＬＮＰ及びそれらの製造は、本技術分野において、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１２０２７６２０９号、Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２８（２）：１７２−１７６；  Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１８（７）：１３５７−１３６４；  Ｂａｓｈａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１９（１２）：２１８６−２２００；  Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｊ  Ｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  Ｃ  Ｎａｎｏｍａｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，１１６（３４）：１８４４０−１８４５０；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．，１３１（５）：Ｅ７８１−９０；  Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，１：ｅ３７；  Ｊａｙａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．，５１（３４）：８５２９−８５３３；  Ｍｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．２，ｅ１３９；  Ｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，２１（８）：１５７０−１５７８；及びＴａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，９（５）：６６５−７４に記載があり、これらはそれらの全体が参照により援用される。
【０２６３】
以下の反応スキームは、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の脂質の製造方法を図解する。
【０２６４】
【化３４】
2018526321.tif 000055
式（Ｉ）の脂質の実施形態（例えば、化合物Ａ−５）は、概括的反応スキーム１（「方法Ａ」）に従って調製することができ、スキーム中、Ｒは飽和もしくは不飽和のＣ１〜Ｃ２４アルキルまたは飽和もしくは不飽和のシクロアルキルであり、ｍは０または１であり、ｎは１〜２４の整数である。概括的反応スキーム１を参照し、構造Ａ−１の化合物は商業的供給源から購入するか、または当業者に周知の方法に従って調製することができる。Ａ−１、Ａ−２及びＤＭＡＰの混合物をＤＣＣで処理してブロミドＡ−３が得られる。ブロミド（Ａ−３）、塩基（例えば、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）及びＮ，Ｎ−ジメチルジアミン（Ａ−４）の混合物を、必要な後処理及び／または精製ステップの後にＡ−５を生成させるのに十分な温度及び時間で加熱する。
【０２６５】
【化３５】
2018526321.tif 000056
式（Ｉ）の化合物の他の実施形態（例えば、化合物Ｂ−５）は、概括的反応スキーム２（「方法Ｂ」）に従って調製することができ、スキーム中、Ｒは飽和もしくは不飽和のＣ１〜Ｃ２４アルキルまたは飽和もしくは不飽和のシクロアルキルであり、ｍは０または１であり、ｎは１〜２４の整数である。概括的反応スキーム２示すように、構造Ｂ−１の化合物は商業的供給源から購入するか、または当業者に周知の方法に従って調製することができる。Ｂ−１（１当量）の溶液を酸塩化物（Ｂ−２）（１当量）及び塩基（例えばトリエチルアミン）で処理する。粗生成物を酸化剤（例えば、クロロクロム酸ピリジニウム）で処理し、中間生成物（Ｂ−３）を回収する。次いで、粗製Ｂ−３、酸（例えば酢酸）、及びＮ，Ｎ−ジメチルアミノアミン  （Ｂ−４）の溶液を還元剤（例えば、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム）で処理して、必要な後処理及び／または精製の後にＢ−５を得る。
【０２６６】
出発物質Ａ−１及びＢ−１は、飽和のメチレン炭素のみを含むものとして上記されるが、炭素−炭素二重結合を含む化合物の調製には、炭素−炭素二重結合を含む出発物質も用いてよいことに留意されたい。
【０２６７】
【化３６】
2018526321.tif 000057
式（Ｉ）の脂質の異なる実施形態（例えば、化合物Ｃ−７またはＣ９）は、概括的反応スキーム３（「方法Ｃ」）に従って調製することができ、スキーム中、Ｒは飽和もしくは不飽和のＣ１〜Ｃ２４アルキルまたは飽和もしくは不飽和のシクロアルキルであり、ｍは０または１であり、ｎは１〜２４の整数である。概括的反応スキーム３を参照し、構造Ｃ−１の化合物は商業的供給源から購入するか、または当業者に周知の方法に従って調製することができる。
【０２６８】
【化３７】
2018526321.tif 000058
式（ＩＩ）の化合物の実施形態（例えば、化合物Ｄ−５及びＤ−７）は、概括的反応スキーム４（「方法Ｄ」）に従って調製することができ、スキーム中、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｌ１、Ｌ２、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、ａ、ｂ、ｃ及びｄは本明細書で定義されるとおりであり、Ｒ７’はＲ７またはＣ３〜Ｃ１９アルキルを表す。概括的反応スキーム１を参照し、構造Ｄ−１及びＤ−２の化合物は、商業的供給源から購入するか、または当業者に周知の方法に従って調製することができる。Ｄ−１及びＤ−２の溶液を還元剤（例えば、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム）で処理して、いずれかの必要な後処理の後にＤ−３を得る。Ｄ−３及び塩基（例えば、トリメチルアミン、ＤＭＡＰ）の溶液を、アシルクロリド（Ｄ−４）（またはカルボン酸及びＤＣＣ）で処理して、必要な後処理及び／または精製の後にＤ−５を得る。Ｄ−５をＬｉＡｌＨ４（Ｄ−６）で還元して、必要な後処理及び／または精製の後にＤ−７を得ることができる。
【０２６９】
【化３８】
2018526321.tif 000059
式（ＩＩ）の脂質の実施形態（例えば、化合物Ｅ−５）は、概括的反応スキーム５（「方法Ｅ」）に従って調製することができ、スキーム中、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｌ１、Ｌ２、Ｇ３、ａ、ｂ、ｃ及びｄは本明細書で定義されるとおりである。概括的反応スキーム２を参照し、構造Ｅ−１及びＥ−２の化合物は、商業的供給源から購入するか、または当業者に周知の方法に従って調製することができる。Ｅ−１（過剰）、Ｅ−２及び塩基（例えば、炭酸カリウム）の混合物を加熱して、必要な後処理の後にＥ−３を得る。Ｅ−３及び塩基（例えば、トリメチルアミン、ＤＭＡＰ）の溶液を、アシルクロリド（Ｅ−４）（またはカルボン酸及びＤＣＣ）で処理して、必要な後処理及び／または精製後にＥ−５を得る。
【０２７０】
【化３９】
2018526321.tif 000060
概括的反応スキーム６は、式（ＩＩＩ）の脂質の調製のための例示的な方法（方法Ｆ）を提供する。概括的反応スキーム６中のＧ１、Ｇ３、Ｒ１及びＲ３は式（ＩＩＩ）に対して本明細書で定義するとおりであり、Ｇ１’は、Ｇ１の１炭素短い同族体を指す。構造Ｆ−１の化合物は購入されるかまたは本技術分野で公知の方法に従って調製される。適宜の縮合条件（例えば、ＤＣＣ）下でのＦ−１のジオール（Ｆ−２）との反応によりエステル／アルコール（Ｆ−３）が生成され、次いでこれをアルデヒド（Ｆ−４）へと酸化する（例えば、ＰＣＣ）ことができる。還元的アミノ化条件下でのＦ−４のアミン（Ｆ−５）との反応によって式（ＩＩＩ）の脂質が生成される。
【０２７１】
当業者にとっては、様々なこれらに代わる式（ＩＩＩ）の脂質の調製の手順が利用可能であることに留意されたい。例えば、Ｌ１及びＬ２がエステル以外である他の式（ＩＩＩ）の脂質を、適宜の出発物質を用いた類似の方法に従って調製することができる。更に、概括的反応スキーム６はＧ１とＧ２とが同一である式（ＩＩＩ）の脂質の調製を示すが、これは本発明の必須の態様ではなく、Ｇ１とＧ２とが異なる化合物を得るための上記反応スキームの改変が可能である。
【０２７２】
本明細書に記載のプロセスにおいて、中間体化合物の官能基を適宜の保護基で保護する必要がある場合があることは当業者に理解されよう。かかる官能基としては、ヒドロキシ、アミノ、メルカプト及びカルボン酸が挙げられる。ヒドロキシに対する好適な保護基としては、トリアルキルシリルまたはジアリールアルキルシリル（例えば、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリルまたはトリメチルシリル）、テトラヒドロピラニル、ベンジルなどが挙げられる。アミノ、アミジノ及びグアニジノに対する好適な保護基としては、ｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルなどが挙げられる。メルカプトに対する好適な保護基としては、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ’’（Ｒ’’はアルキル、アリールまたはアリールアルキルである）、ｐ−メトキシベンジル、トリチルなどが挙げられる。カルボン酸に対する好適な保護基としては、アルキルエステル、アリールエステルまたはアリールアルキルエステルが挙げられる。保護基は標準的な技法に従って付加または除去することができ、該標準的な技法は当業者に公知であり且つ本明細書に記載されている。保護基の使用は、Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．Ｗ．及びＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｚ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （１９９９），３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙに詳細に記載されている。当業者ならば理解するであろうが、上記保護基は、Ｗａｎｇ樹脂、Ｒｉｎｋ樹脂または２−クロロトリチルクロリド樹脂などのポリマー樹脂であってもよい。
【０２７３】
抗原
本発明は対象において適応免疫応答を誘導する組成物を提供する。一実施形態において、本組成物は抗原を含む。一実施形態において、本組成物は抗原をコードする核酸配列を含む。例えば、ある特定の実施形態において、本組成物は抗原をコードするヌクレオシド修飾ＲＮＡを含む。上記抗原は、対象において適応免疫応答を誘導するポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含む、但しこれらに限定されない、任意の分子または化合物であってよい。
【０２７４】
一実施形態において、上記抗原は、病原体に関連するポリペプチドまたはペプチドであって、当該抗原が該抗原、ひいては上記病原体に対する適応免疫応答を誘導するような上記ポリペプチドまたはペプチドを含む。一実施形態において、上記抗原は病原体に関連するポリペプチドまたはペプチドのフラグメントであって、当該抗原が当該病原体に対する適応免疫応答を誘導するような上記フラグメントを含む。
【０２７５】
ある特定の実施形態において、上記抗原は、本明細書に記載の抗原のアミノ酸配列と実質的に相同であり、且つ元のアミノ酸配列の免疫原性機能を保持するアミノ酸配列を含む。例えば、ある特定の実施形態において、上記抗原の上記アミノ酸配列は、元のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、有利には少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性度を有する。
【０２７６】
一実施形態において、上記抗原は核酸分子の核酸配列によってコードされる。ある特定の実施形態において、上記核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、それらの変異体、それらのフラグメント、またはそれらの組み合わせを含む。一実施形態において、上記核酸配列は修飾された核酸配列を含む。例えば、一実施形態において、上記抗原をコードする核酸配列は、本明細書の他の箇所に詳細に記載されるヌクレオシド修飾ＲＮＡを含む。ある特定の例において、上記核酸配列は、ペプチド結合によって上記抗原に連結されたリンカー配列またはタグ配列をコードする更なる配列を含む。
【０２７７】
ある特定の実施形態において、ヌクレオシド修飾核酸分子によってコードされる上記抗原は、任意の数の生物、例えばウイルス、寄生生物、細菌、真菌または哺乳動物由来のタンパク質、ペプチド、それらのフラグメント、もしくはそれらの変異体、またはそれらの組み合わせを含む。例えば、ある特定の実施形態において、上記抗原は、自己免疫疾患、アレルギー、または喘息に関連する。他の実施形態において、上記抗原は、がん、ヘルペス、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エボラ、肺炎球菌、ヘモフィルスインフルエンザ、髄膜炎菌、デング熱、結核、マラリア、ノロウイルスまたはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に関連する。ある特定の実施形態において、上記抗原は、２種以上の異なる生物のアミノ酸配列に基づくコンセンサス配列を含む。ある特定の実施形態において、上記抗原をコードする核酸配列は、本組成物が送達される生物における効果的な翻訳に対して最適化される。
【０２７８】
一実施形態において、上記抗原は、腫瘍特異抗原または腫瘍関連抗原であって、当該腫瘍に対して適応免疫応答を誘導するような上記抗原を含む。一実施形態において、上記抗原は、腫瘍特異抗原または腫瘍関連抗原のフラグメントであって、当該抗原が当該腫瘍に対して適応免疫応答を誘導するような上記フラグメントを含む。ある特定の実施形態において、上記腫瘍特異抗原または腫瘍関連抗原は宿主タンパク質の突然変異体である。
【０２７９】
ウイルス抗原
一実施形態において、上記抗原は、ウイルス抗原、またはそのフラグメント、またはその変異体を含む。上記ウイルス抗原は、以下の科のうちの１つに属するウイルスに由来する：アデノウイルス科、アレナウイルス科、ブンヤウイルス科、カリシウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルソミクソウイルス科、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、ラブドウイルス科、またはトガウイルス科。ある特定の実施形態において、上記ウイルス抗原は、パピローマウイルス、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ポリオウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、天然痘ウイルス（大痘瘡及び小痘瘡）、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、デング熱ウイルス、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス、黄熱病ウイルス、ノーウォークウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）、毛状細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩ）、カリフォルニア脳炎ウイルス、ハンタウイルス（出血熱）、狂犬病ウイルス、エボラ熱ウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、単純ヘルペス１（口腔ヘルペス）、単純ヘルペス２（陰部ヘルペス）、帯状疱疹（水痘帯状疱疹、別名、水痘）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、例えばヒトＣＭＶ、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、フラビウイルス、口蹄疫ウイルス、チクングニヤウイルス、ラッサウイルス、アレナウイルス、またはがんを引き起こすウイルス由来である。
【０２８０】
肝炎抗原
一実施形態において、上記抗原は、肝炎ウイルス抗原（すなわち、肝炎抗原）、またはそのフラグメント、もしくはその変異体を含む。ある特定の実施形態において、上記肝炎抗原は、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、及び／またはＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）由来の抗原または免疫原を含む。ある特定の実施形態において、上記肝炎抗原は全長タンパク質の全長または免疫原性フラグメントである。
【０２８１】
一実施形態において、上記肝炎抗原はＨＡＶ由来の抗原を含む。例えば、ある特定の実施形態において、上記肝炎抗原は、ＨＡＶカプシドタンパク質、ＨＡＶ非構造タンパク質、それらのフラグメント、それらの変異体、またはそれらの組み合わせを含む。
【０２８２】
一実施形態において、上記肝炎抗原はＨＣＶ由来の抗原を含む。例えば、ある特定の実施形態において、上記肝炎抗原は、ＨＣＶヌクレオカプシドタンパク質（すなわち、コアタンパク質）、ＨＣＶエンベロープタンパク質（例えば、Ｅ１及びＥ２）、ＨＣＶ非構造タンパク質（例えば、ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、及びＮＳ５ｂ）、それらのフラグメント、それらの変異体、またはそれらの組み合わせを含む。
【０２８３】
一実施形態において、上記肝炎抗原はＨＤＶ由来の抗原を含む。例えば、ある特定の実施形態において、上記肝炎抗原は、ＨＤＶデルタ抗原、そのフラグメント、またはその変異体を含む。
【０２８４】
一実施形態において、上記肝炎抗原はＨＥＶ由来の抗原を含む。例えば、ある特定の実施形態において、上記肝炎抗原は、ＨＥＶカプシドタンパク質、そのフラグメント、またはその変異体を含む。
【０２８５】
一実施形態において、上記肝炎抗原はＨＢＶ由来の抗原を含む。例えば、ある特定の実施形態において、上記肝炎抗原は、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ表面タンパク質、ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ、遺伝子ＸによってコードされるＨＢＶタンパク質、それらのフラグメント、それらの変異体、またはそれらの組み合わせを含む。ある特定の実施形態において、上記肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ａコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｂコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｃコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｄコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｅコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｆコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｇコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｈコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ａ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｅ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｆ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｇ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｈ表面タンパク質、それらのフラグメント、それらの変異体、またはそれらの組み合わせを含む。
【０２８６】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原
一実施形態において、上記抗原は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、またはそのフラグメント、もしくはその変異体を含む。例えば、ある特定の実施形態において、上記抗原は、ＨＰＶ１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、４５型、５２型、及び５８型由来の抗原を含み、これらは子宮頸がん、直腸がん、及び／または他のがんを引き起こす。一実施形態において、上記抗原はＨＰＶ６型及び１１型由来の抗原を含み、これらは性器疣贅を引き起こし、且つ頭頸部がんの原因であることが知られている。例えば、ある特定の実施形態において、上記ＨＰＶ抗原は、任意のＨＰＶの型に由来するＨＰＶ  Ｅ６もしくはＥ７ドメイン、またはそれらのフラグメントもしくは変異体を含む。
【０２８７】
ＲＳＶ抗原
一実施形態において、上記抗原は、ＲＳＶ抗原またはそのフラグメント、もしくはその変異体を含む。例えば、ある特定の実施形態において、上記ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ融合タンパク質（本明細書では「ＲＳＶ  Ｆ」、「ＲＳＶ  Ｆタンパク質」及び「Ｆタンパク質」とも呼ばれる。）、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。一実施形態において、上記ヒトＲＳＶ融合タンパク質は、ＲＳＶサブタイプＡ及びＢの間で保存される。ある特定の実施形態において、上記ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９４．１）由来のＲＳＶ  Ｆタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。一実施形態において、上記ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ａ２株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＢ５９８５８．１）由来のＲＳＶ  Ｆタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。ある特定の実施形態において、上記ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の単量体、二量体もしく三量体、またはそれらのフラグメントもしくは変異体である。本発明によれば、ある特定の実施形態において、上記ＲＳＶ  Ｆタンパク質は融合前形態または融合後形態である。
【０２８８】
一実施形態において、上記ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ付着糖タンパク質（本明細書では「ＲＳＶ  Ｇ」、「ＲＳＶ  Ｇタンパク質」及び「Ｇタンパク質」とも呼ばれる。）、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。上記ヒトＲＳＶ  Ｇタンパク質はＲＳＶサブタイプＡ及びＢの間で異なる。一実施形態において、上記抗原はＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９３）由来のＲＳＶ  Ｇタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。一実施形態において、上記ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶサブタイプＢ単離株Ｈ５６０１、ＲＳＶサブタイプＢ単離株Ｈ１０６８、ＲＳＶサブタイプＢ単離株Ｈ５５９８、ＲＳＶサブタイプＢ単離株Ｈ１１２３、またはそれらのフラグメントもしくは変異体由来のＲＳＶ  Ｇタンパク質を含む。
【０２８９】
他の実施形態において、上記ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ非構造タンパク質１（「ＮＳ１タンパク質」）、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。例えば、一実施形態において、上記ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９８７．１）由来のＲＳＶ  ＮＳ１タンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。一実施形態において、上記ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ非構造タンパク質２（「ＮＳ２タンパク質」）、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。例えば、一実施形態において、上記ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９８８．１）由来のＲＳＶ  ＮＳ２タンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。一実施形態において、上記ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶヌクレオカプシド（「Ｎ」）タンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。例えば、一実施形態において、上記ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９８９．１）由来のＲＳＶ  Ｎタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体である。一実施形態において、上記ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶリン酸化タンパク質（「Ｐ」）タンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。例えば、一実施形態において、上記ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９０．１）由来のＲＳＶ  Ｐタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。一実施形態において、上記ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶマトリクスタンパク質（「Ｍ」）タンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。例えば、一実施形態において、上記ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９１．１）由来のＲＳＶ  Ｍタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。
【０２９０】
更に他の実施形態において、上記ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ小型疎水性（「ＳＨ」）タンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。例えば、一実施形態において、上記ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９２．１）由来のＲＳＶ  ＳＨタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。一実施形態において、上記ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶマトリクスタンパク質２−１（「Ｍ２−１」）タンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。例えば、一実施形態において、上記ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９５．１）由来のＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。一実施形態において、上記ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶマトリクスタンパク質２−２（「Ｍ２−２」）タンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。例えば、一実施形態において、上記ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９７．１）由来のＲＳＶ  Ｍ２−２タンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。一実施形態において、上記ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶポリメラーゼＬ（「Ｌ」）タンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。例えば、一実施形態において、上記ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９６．１）由来のＲＳＶ  Ｌタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。
【０２９１】
インフルエンザ抗原
一実施形態において、上記抗原は、インフルエンザ抗原またはそのフラグメント、もしくはその変異体を含む。上記インフルエンザ抗原は、哺乳動物において１種または複数種のインフルエンザ血清型に対して適応免疫応答を誘発することができるインフルエンザ抗原である。ある特定の実施形態において、上記抗原は、全長翻訳産物ヘマグルチニン（ＨＡ）０、サブユニットＨＡ１、サブユニットＨＡ２、それらの変異体、それらのフラグメント、またはそれらの組み合わせを含む。ある特定の実施形態において、上記インフルエンザヘマグルチニン抗原は、インフルエンザＡ血清型Ｈ１、インフルエンザＡ血清型Ｈ２、またはインフルエンザＢの１種または複数種の株に由来する。
【０２９２】
一実施形態において、上記インフルエンザ抗原は、少なくとも１種の抗原性エピトープであって、それに対して免疫応答が誘発され得る特定のインフルエンザ免疫原に対して有効であることができる、上記エピトープを含有する。ある特定の実施形態において、上記抗原は、無傷インフルエンザウイルス中に存在する免疫原性部位及びエピトープの全レパートリーを提供し得る。
【０２９３】
いくつかの実施形態において、上記インフルエンザ抗原は、Ｈ１  ＨＡ、Ｈ２ＨＡ、Ｈ３  ＨＡ、Ｈ５  ＨＡ、またはＢＨＡ抗原を含む。ある特定の実施形態において、上記インフルエンザ抗原は、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリクスタンパク質、核タンパク質、Ｍ２外部ドメイン−核タンパク質（Ｍ２ｅ−ＮＰ）、それらの変異体、それらのフラグメント、またはそれらの組み合わせを含む。
【０２９４】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原
一実施形態において、上記抗原は、ＨＩＶ抗原またはそのフラグメント、もしくはその変異体を含む。
【０２９５】
ある特定の実施形態において、上記ＨＩＶ抗原は、エンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。例えば、ある特定の実施形態において、上記ＨＩＶ抗原は、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、またはそれらの組み合わせから選択されるＥｎｖタンパク質を含む。
【０２９６】
ある特定の実施形態において、上記ＨＩＶ抗原は、ｎｅｆ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖ、またはそれらの変異体のフラグメントのうちの少なくとも１種を含む。
【０２９７】
上記ＨＩＶ抗原は、ＨＩＶの任意の株に由来するものであってよい。例えば、ある特定の実施形態において、上記ＨＩＶ抗原は、ＨＩＶグループＭ、Ｎ、Ｏ、及びＰ、ならびにサブタイプＡ、ＨＩＶサブタイプＢ、ＨＩＶサブタイプＣ、ＨＩＶサブタイプＤ、サブタイプＥ、サブタイプＦ、サブタイプＧ、サブタイプＨ、サブタイプＪ、またはサブタイプＫ由来の抗原を含む。一実施形態において、上記ＨＩＶ抗原は、ＨＩＶ−Ｒ３Ａ株由来のＥｎｖまたはそのフラグメントもしくは変異体（Ｒ３Ａ−Ｅｎｖ）を含む。
【０２９８】
寄生生物抗原
ある特定の実施形態において、上記抗原は、寄生生物抗原またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。ある特定の実施形態において、上記寄生生物は、原生動物、ぜん虫、または外部寄生生物である。ある特定の実施形態において、上記ぜん虫（ｈｅｌｍｉｎｔｈ）（すなわち、ぜん虫（ｗｏｒｍ）は、扁虫（例えば、吸虫及び条虫）、鉤頭虫、または回虫（例えば、ギョウ虫）である。ある特定の実施形態において、上記外部寄生生物は、シラミ、ノミ、マダニ及びダニである。
【０２９９】
ある特定の実施形態において、上記寄生生物は、以下の疾患を引き起こすいずれかの寄生生物である：アカントアメーバ角膜炎、アメーバ症、アスカリアーシス、バベシア症、バランチジウム症、アライグマ回虫症（Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉａｓｉｓ）、シャーガス病、肝吸虫症、コクリオミイヤ、クリプトスポリジウム症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、象皮症、ぎょう虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、ジアルジア症、顎口虫症、膜様条虫症、イソスポーラ症、片山熱、リースマニア症、ライム病、マラリア、横川吸虫症、ハエ幼虫症、オンコセルカ症、シラミ寄生症、疥癬、住血吸虫症、睡眠病、糞線虫症、テニア条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、旋毛虫病、及び鞭虫症。
【０３００】
ある特定の実施形態において、上記寄生生物は、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ、Ａｎｉｓａｋｉｓ、Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ、ウマバエ、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉ、トコジラミ、Ｃｅｓｔｏｄａ（条虫）、ツツガムシ、Ｃｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ  ｈｏｍｉｎｉｖｏｒａｘ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ、鉤虫、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｌｉｎｇｕａｔｕｌａ  ｓｅｒｒａｔａ、肝吸虫、Ｌｏａ  ｌｏａ、Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ−肺吸虫、ギョウ虫、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ、ダニ、条虫、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、鞭虫、またはＷｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉである。
【０３０１】
マラリア抗原
一実施形態において、上記抗原は、マラリア抗原（すなわち、ＰＦ抗原もしくはＰＦ免疫原）、またはそのフラグメント、もしくはその変異体を含む。例えば、一実施形態において、上記抗原はマラリアを引き起こす寄生生物由来の抗原を含む。一実施形態において、上記マラリアを引き起こす寄生生物はＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである。
【０３０２】
いくつかの実施形態において、上記マラリア抗原は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ免疫原ＣＳ；ＬＳＡｌ；ＴＲＡＰ；ＣｅｌＴＯＳ；及びＡｍａ１ののうちの１種または複数種を含む。上記免疫原は全長タンパク質の全長または免疫原性フラグメントであってよい。
【０３０３】
細菌抗原
一実施形態において、上記抗原は細菌抗原またはその断片もしくは変異体を含む。ある特定の実施形態において、上記細菌は、以下の門のいずれかに属する：Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｃａｌｄｉｓｅｒｉｃａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ、Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎｅｔｅｓ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ−Ｔｈｅｒｍｕｓ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｉ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｅ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｔｅｓ、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ、及びＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ。
【０３０４】
ある特定の実施形態において、上記細菌はグラム陽性菌またはグラム陰性菌である。ある特定の実施形態において、上記細菌は、好気性菌または嫌気性菌である。ある特定の実施形態において、上記細菌は独立栄養菌または従属栄養菌である。ある特定の実施形態において、上記細菌は中温菌、好中球、極限菌、好酸菌、アルカリ性菌、好熱菌、求核菌、好塩菌、または好感菌である。
【０３０５】
ある特定の実施形態において、上記細菌は、炭疽菌、抗生物質耐性細菌、病原菌、食中毒菌、感染菌、サルモネラ菌、黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌、または破傷風菌である。ある特定の実施形態において、上記細菌は、マイコバクテリア、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである。
【０３０６】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原
一実施形態において、上記抗原は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原（すなわち、ＴＢ抗原もしくはＴＢ免疫原）、またはその断片、もしくはその変異体を含む。上記ＴＢ抗原はＴＢ抗原のＡｇ８５ファミリー、例えば、Ａｇ８５Ａ及びＡｇ８５Ｂ由来であってよい。上記ＴＢ抗原はＴＢ抗原のＥｓｘファミリー、例えば、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、ＥｓｘＣ、ＥｓｘＤ、ＥｓｘＥ、ＥｓｘＦ、ＥｓｘＨ、ＥｓｘＯ、ＥｓｘＱ、ＥｓｘＲ、ＥｓｘＳ、ＥｓｘＴ、ＥｓｘＵ、ＥｓｘＶ、及びＥｓｘＷ由来であってよい。
【０３０７】
真菌抗原
一実施形態において、上記抗原は真菌抗原またはその断片もしくは変異体を含む。ある特定の実施形態において、上記真菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ酵母（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｔｔｉｉ、皮膚糸状菌、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｍｕｃｏｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ、またはＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍである。
【０３０８】
腫瘍抗原
ある特定の実施形態において、上記抗原は、例えば、腫瘍関連抗原または腫瘍特異抗原を含む腫瘍抗原を含む。本発明の文脈において、「腫瘍抗原」または「過剰増殖性障害抗原」または「過剰増殖性障害に関連する抗原」は、特異的過剰増殖性障害に共通する抗原を指す。ある特定の態様において、本発明の過剰増殖性障害抗原は、原発性または転移性黒色腫、中皮腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺がん、肝臓がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がん及び乳がん、前立腺がん、卵巣がん、膵臓がんなどの腺癌を含む、但しこれらに限定されないがんに由来する。
【０３０９】
腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞媒介免疫応答を誘発する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。一実施形態において、本発明の腫瘍抗原は、哺乳動物のがん腫に由来する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）によって免疫原的に認識される１種または複数種の抗原性がんエピトープを含む。上記抗原の選択は、本発明の組成物によって治療または予防が行われる特定の種類のがんに依存する。
【０３１０】
腫瘍抗原は本技術分野において周知であり、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、チログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸管カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、スルビビン及びテロメラーゼ、前立腺癌腫抗原１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体及びメソセリンが挙げられる。
【０３１１】
一実施形態において、上記腫瘍抗原は、悪性腫瘍に伴う１種または複数種の抗原性がんエピトープを含む。悪性腫瘍は免疫攻撃の標的抗原としての役割を果たし得る多くのタンパク質を発現する。これらの分子としては、黒色腫におけるＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ及びＧＰ１００ならびに前立腺がんにおける前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）及び前立腺特異抗原（ＰＳＡ）などの組織特異的抗原が挙げられるが、これに限定はされない。他の標的分子は、がん遺伝子ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ−２などの形質転換関連分子の群に属する。標的抗原の更に別の群は、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）などの胎児性抗原である。Ｂ細胞リンパ腫において、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個々の腫瘍に特有の真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３７などのＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原の他の候補である。これらの抗原のいくつか（ＣＥＡ、ＨＥＲ−２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、イディオタイプ）は、モノクローナル抗体を用いた受動免疫療法の標的として使用されてきたが、これは限定的な成功しか収めていない。
【０３１２】
本発明において言及される腫瘍抗原の種類はまた、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であってもよい。ＴＳＡは腫瘍細胞に特有であり、体内の他の細胞には存在しない。ＴＡＡ関連抗原は腫瘍細胞に特有ではなく、むしろ、抗原に対する免疫寛容の状態を誘導できない条件下において、正常細胞上でも発現される。腫瘍上での抗原の発現は、免疫系が該抗原に対して応答可能となる条件下で起こり得る。ＴＡＡは、免疫系が未成熟で応答できない胎児発生時に正常細胞上で発現する抗原である場合があり、または正常細胞上では通常は極めて低レベルでしか存在しないが、腫瘍細胞上では大幅に高いレベルで発現する抗原である場合がある。
【０３１３】
ＴＳＡ抗原またはＴＡＡ抗原の非限定的な例としては、以下が挙げられる：ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ  １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２などの分化抗原及びＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐＩ５などの腫瘍特異的多系統抗原；ＣＥＡなどの過剰発現した胚性抗原；ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕなどの、過剰発現したがん遺伝子及び突然変異した腫瘍抑制遺伝子；ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲなどの、染色体転座に起因する特有な腫瘍抗原；ならびにエプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡ及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７などのウイルス抗原。他の巨大な、タンパク質系の抗原としては、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ  １５、ｐ  １６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α−フェトプロテイン、β−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３＼ＣＡ  ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ  １９５、ＣＡ  ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ−関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、及びＴＰＳが挙げられる。
【０３１４】
好ましい実施形態において、上記抗原としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＭＹ−ＥＳＯ−１  ＴＣＲ、ＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲなどが挙げられるが、これらに限定はされない。
【０３１５】
アジュバント
一実施形態において、本組成物はアジュバントを含む。一実施形態において、本組成物はアジュバントをコードする核酸分子を含む。一実施形態において、上記アジュバントをコードする核酸分子はＩＶＴ  ＲＮＡである。一実施形態において、上記アジュバントをコードする核酸分子はヌクレオシド修飾ＲＮＡである。
【０３１６】
例示的なアジュバントとしては、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ａｔｔｒａｃｔｉｎｇ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｈｙｍｕｓ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ｍｕｃｏｓａｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、シグナル配列が欠失し、且つ任意選択でＩｇＥ由来のシグナルペプチドを含むＩＬ−１５を含むＣＤ８６が挙げられるが、これらに限定はされない。有用なアジュバントとなり得る他の遺伝子としては以下をコードする遺伝子が挙げられる：ＭＣＰ−Ｉ、ＭＩＰ−Ｉａ、ＭＩＰ−Ｉｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−Ｉ、ＶＬＡ−Ｉ、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−Ｉ、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の変異形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経増殖因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｉｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−Ｉ、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−Ｉ、Ａｐ−Ｉ、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−Ｉ、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、抗ＣＴＬＡ４−ｓｃ、抗ＬＡＧ３−Ｉｇ、抗ＴＩＭ３−Ｉｇ及びそれらの機能的フラグメント。
【０３１７】
医薬組成物
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学の分野で公知であるかまたは今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、かかる調製方法は、活性成分を担体または１種もしくは複数種の他の補助成分と混合し、次いで、必要または望ましい場合には、上記の生成物を所望の単回もしくは複数回投与単位に賦形または包装するステップを含む。
【０３１８】
本明細書において提示される医薬組成物の説明は、主として、ヒトへの医師の処方による投与に適した医薬組成物を対象とするが、当業者ならば、かかる組成物が、一般に、あらゆる種類の動物への投与に適することを理解するであろう。ヒトへの投与に適した医薬組成物を種々の動物に投与するのに適したものとするための該組成物の改変は十分に理解されており、通常の熟練した獣医学の薬理学者は、必要な場合には、単に通常の実験によって、かかる改変を設計し且つ実施することができる。本発明の医薬組成物の投与が企図される対象としては、ヒト及び他の霊長動物、非ヒト霊長動物、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、及びイヌなどの商業的に適切な哺乳動物を含む哺乳動物が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０３１９】
本発明の方法において有用な医薬組成物は、眼科的、経口、経直腸、経膣、非経口、局所、経肺、鼻腔内、経頬側、静脈内、脳室内、皮内、筋内投与、または別の投与の経路に適した製剤として調製し、包装し、または販売してもよい。企図される他の製剤としては、投射されるナノ粒子、リポソーム製剤、上記活性成分を含有する再封赤血球、及び免疫原系製剤が挙げられる。
【０３２０】
本発明の医薬組成物は、バルクで、単一の単位用量として、または複数の単一の単位用量として調製、包装または販売されてもよい。本明細書で用いられる「単位用量」は、所定量の上記活性成分を含む本医薬組成物の個別の量である。上記活性成分の量は一般に、対象に投与されることとなる活性成分の投与量またはかかる投与量の都合のよい一部分、例えば、かかる投与量の１／２または１／３などに等しい。
【０３２１】
本発明の医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される担体、及び任意の更なる成分の相対的な量は、治療を受ける対象が何であるか、その大きさ、及び状態に応じて、更に、当該組成物が投与されることとなる経路に応じて変化するであろう。例として、本組成物は０．１％〜１００％（ｗ／ｗ）の活性成分を含んでいてもよい。
【０３２２】
本発明の医薬組成物は、上記活性成分に加えて、１種または複数種の更なる薬学的に活性な薬剤を更に含んでいてもよい。
【０３２３】
本発明の医薬組成物の制御放出製剤または持続性放出製剤は、従来の技術を用いて製造することができる。
【０３２４】
本明細書では、医薬組成物の「非経口投与」は、対象の組織に物理的に切れ目を設けること及び該組織の切れ目を通して本医薬組成物を投与することを特徴とする、任意の投与経路を包含する。したがって、非経口投与としては、組成物の注射による、外科的切開を介した組成物の適用による、組織を貫通した非外科的創傷を介した組成物の適用によるなどの上記医薬組成物の投与が挙げられるが、これらに限定はされない。特に、非経口投与は、眼内、硝子体内、皮下、腹腔内、筋内、皮内、胸骨内注射、腫瘍内、静脈内、脳室内及び腎透析注入技法を含むことが企図される。
【０３２５】
非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、無菌水または無菌等張生理食塩水などの薬学的に許容される担体と組み合わせた上記活性成分を含む。かかる製剤は、ボーラス投与または連続的投与に適した形態で調製、包装、または販売されてもよい。注射製剤は、アンプル中または防腐剤が入った複数回投与用の容器中などの単位剤形で、調製、包装、または販売されてもよい。非経口投与用製剤としては、油性または水性ビヒクル中の懸濁液剤、溶液剤、乳化液剤、ペースト剤、及び移植用徐放性または生分解性製剤が挙げられるが、これらに限定はされない。かかる製剤は、懸濁剤、安定化剤、または分散剤を含む、但しこれらに限定されない１種または複数種の更なる成分を更に含んでいてもよい。非経口投与用製剤の一実施形態において、上記活性成分は、適宜のビヒクル（例えば、無菌の発熱物質不含水）を用いた再構成であって、再構成された組成物を非経口投与する前に行われる上記再構成のための乾燥（すなわち粉末または顆粒）形態で提供される。
【０３２６】
本医薬組成物は、無菌の注射用の水性もしくは油性懸濁液剤または溶液剤の形態で調製、包装、または販売されてもよい。この懸濁液剤または溶液剤は公知の技術に従って製剤化することができ、上記活性成分に加えて、本明細書に記載の分散剤、湿潤剤、または懸濁剤などの更なる成分を含んでいてもよい。かかる無菌注射用製剤は、例えば、水もしくは１，３−ブタンジオールなどの非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒を用いて調製することができる。他の許容される希釈剤及び溶媒としては、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウム溶液、及び合成モノまたはジグリセリドなどの不揮発性油が挙げられるが、これらに限定はされない。有用な他の非経口投与用製剤としては、リポソーム製剤中の、または生分解性ポリマー系の成分としての、微結晶形態の上記活性成分を含む上記製剤が挙げられる。徐放または移植用の組成物は、乳化液、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、もしくは難溶性塩などの薬学的に許容される、ポリマー材料または疎水性材料を含んでいてもよい。
【０３２７】
本発明の医薬組成物は、口腔を経由する肺投与に適した製剤として調製、包装、または販売されてもよい。かかる製剤は、上記活性成分を含み、約０．５〜約７ナノメートル、好ましくは約１〜約６ナノメートルの範囲の径を有する乾燥粒子を含んでいてもよい。かかる組成物は、好都合には、乾燥粉末であって、噴射剤の流れが導かれて上記粉末を分散させることができる乾燥粉末タンクを備える装置を用いた、または密封容器中の低沸点噴射剤中に溶解または懸濁させた上記活性成分を備える装置などの、自己噴射性溶媒／粉末投薬容器を用いた投与のための上記乾燥粉末の形態である。かかる粉末は、重量で少なくとも９８％の粒子が０．５ナノメートルより大きな径を有し、数で少なくとも９５％の粒子が７ナノメートル未満の径を有する粒子を含むことが好ましい。重量で少なくとも９５％の上記粒子が１ナノメートルより大きな径を有し、数で少なくとも９０％の上記粒子が６ナノメートル未満の径を有することがより好ましい。乾燥粉末組成物は、好ましくは、砂糖などの固体微粉末希釈剤を含み、好都合には単位剤形として提供される。
【０３２８】
低沸点噴射剤は、一般に、大気圧において６５°Ｆ未満の沸点を有する液体噴射剤を含む。一般に、上記噴射剤は、上記組成物の５０〜９９．９％（ｗ／ｗ）を構成してもよく、活性成分は、該組成物の０．１〜２０％（ｗ／ｗ）を構成してもよい。上記噴射剤は、液体の非イオン性界面活性剤もしくは固体のアニオン性界面活性剤または固体希釈剤（好ましくは上記活性成分を含む粒子と同一のオーダーの粒子径を有する）などの更なる成分を更に含んでいてもよい。
【０３２９】
非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、無菌水または無菌等張生理食塩水などの薬学的に許容される担体と組み合わせた上記活性成分を含む。かかる製剤は、ボーラス投与または連続的投与に適した形態で調製、包装、または販売されてもよい。注射製剤は、アンプル中または防腐剤が入った複数回投与用の容器中などの単位剤形で、調製、包装、または販売されてもよい。非経口投与用製剤としては、油性または水性ビヒクル中の懸濁液剤、溶液剤、乳化液剤、ペースト剤、及び移植用徐放性または生分解性製剤が挙げられるが、これらに限定はされない。かかる製剤は、懸濁剤、安定化剤、または分散剤を含む、但しこれらに限定されない１種または複数種の更なる成分を更に含んでいてもよい。非経口投与用製剤の一実施形態において、上記活性成分は、適宜のビヒクル（例えば、無菌の発熱物質不含水）を用いた再構成であって、再構成された組成物を非経口投与する前に行われる上記再構成のための乾燥（すなわち粉末または顆粒）形態で提供される。
【０３３０】
本医薬組成物は、無菌の注射用の水性もしくは油性懸濁液剤または溶液剤の形態で調製、包装、または販売されてもよい。この懸濁液剤または溶液剤は公知の技術に従って製剤化することができ、上記活性成分に加えて、本明細書に記載の分散剤、湿潤剤、または懸濁剤などの更なる成分を含んでいてもよい。かかる無菌注射用製剤は、例えば、水もしくは１，３−ブタンジオールなどの非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒を用いて調製することができる。他の許容される希釈剤及び溶媒としては、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウム溶液、及び合成モノまたはジグリセリドなどの不揮発性油が挙げられるが、これらに限定はされない。有用な他の非経口投与用製剤としては、リポソーム製剤中の、または生分解性ポリマー系の成分としての、微結晶形態の上記活性成分を含む上記製剤が挙げられる。徐放または移植用の組成物は、乳化液、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、もしくは難溶性塩などの薬学的に許容される、ポリマー材料または疎水性材料を含んでいてもよい。
【０３３１】
本明細書で用いられる「更なる成分」としては、以下うちのの１種または複数種が挙げられるが、これらに限定はされない：賦形剤；界面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；顆粒化剤及び崩壊剤；結合剤；滑沢剤；甘味料；香味料；着色料；防腐剤；ゼラチンなどの生理的に分解性の組成物；水性ビヒクル及び溶媒；油性ビヒクル及び溶媒；懸濁剤；分散剤または湿潤剤；乳化剤、粘滑剤；緩衝剤；塩；増粘剤；充填剤；乳化剤；抗酸化剤；抗生剤；抗真菌剤；安定剤；及び薬学的に許容されるポリマー材料または疎水性材料。本発明の医薬組成物に含まれてもよい他の「更なる成分」は本技術分野で公知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８５，Ｇｅｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）に記載され、該文献は参照により本明細書に援用される。
【０３３２】
治療方法
本発明は、１種または複数種の抗原、１種または複数種のアジュバント、またはそれらの組み合わせをコードする１種または複数種の単離された核酸を含む、有効量の組成物を投与することを含む、対象における適応免疫応答の誘導方法を提供する。
【０３３３】
一実施形態において、本方法は、上記対象において、抗原に関連する感染症、疾患、または障害に対する免疫を提供する。したがって、本発明は、上記抗原に関連する感染症、疾患、もしくは障害の治療または予防方法を提供する。例えば、本方法は、投与される組成物の抗原の種類に応じて、ウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌性感染症、寄生生物性感染症、もしくはがんを治療または予防するために用いることができる。例示的な抗原及び関連する感染症、疾患、及び腫瘍は、本明細書の他の箇所に記載されている。
【０３３４】
一実施形態において、本組成物は、上記抗原に関連する感染症、疾患、またはがんを有する対象に投与される。一実施形態において、本組成物は、上記抗原に関連する感染症、疾患、またはがんを発症する危険性がある対象に投与される。例えば、本組成物は、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物などと接触する危険性がある対象に投与されてもよい。一実施形態において、本組成物は、遺伝的要因、環境的要因などにより、高いがん発症の尤度を有する対象に投与される。
【０３３５】
一実施形態において、本方法は、１種または複数種の抗原及び１種または複数種のアジュバントをコードする１種または複数種のヌクレオシド修飾核酸分子を含む組成物を投与することを含む。一実施形態において、本方法は、１種または複数種の抗原をコードする第１のヌクレオシド修飾核酸分子及び１種または複数種のアジュバントをコードする第２のヌクレオシド修飾核酸分子を含む組成物を投与することを含む。一実施形態において、本方法は、１種または複数種の抗原をコードする１種または複数種のヌクレオシド修飾核酸分子を含む第１の組成物を投与すること、及び１種または複数種のアジュバントをコードする１種または複数種のヌクレオシド修飾核酸分子を含む第２の組成物を投与することを含む。
【０３３６】
ある特定の実施形態において、本方法は、複数の抗原、アジュバント、またはそれらの組み合わせをコードする複数のヌクレオシド修飾核酸分子を対象に投与することを含む。
【０３３７】
ある特定の実施形態において、本発明の方法は、投与後の少なくとも数日間、本明細書に記載の抗原またはアジュバントの持続的発現を可能にする。但し、ある特定の実施形態において、本方法は、ある特定の実施形態において上記核酸が当該対象のゲノムに組み込まれないことから、一過性の発現も提供する。
【０３３８】
ある特定の実施形態において、本方法は、本明細書に記載の抗原またはアジュバントの安定した発現を提供するヌクレオシド修飾ＲＮＡを投与することを含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオシド修飾ＲＮＡの投与によって、自然免疫応答は殆どまたは全く生じない一方、効果的な適応免疫応答が誘導される。
【０３３９】
治療方法における本発明の組成物の投与は、本技術分野で公知の方法を用いた、多数の異なる方法で実施することができる。一実施形態において、本発明の方法は、例えば、経腸または非経口投与を含む、上記対象の全身投与を含む。ある特定の実施形態において、本方法は本組成物の皮内送達を含む。別の実施形態において、本方法は本組成物の静脈内送達を含む。いくつかの実施形態において、本方法は本組成物の筋内送達を含む。一実施形態において、本方法は本組成物の皮下送達を含む。一実施形態において、本方法は本組成物の吸入を含む。一実施形態において、本方法は本組成物の鼻腔内送達を含む。
【０３４０】
本発明の組成物は、単独で、または別の薬剤との併用で対象に投与してもよいことが理解されよう。
【０３４１】
したがって、本発明の治療方法及び予防方法は、本発明の方法を実施するための、本明細書に記載の、抗原、アジュバント、またはそれらの組み合わせをコードする医薬組成物の使用を包含する。本発明の実施に有用な医薬組成物を、ｎｇ／ｋｇ／日から及び１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量を送達するように投与してもよい。一実施形態において、本発明は、哺乳動物において、１０ｎＭから及び１０μＭの本発明の化合物の濃度を生じる用量の投与を想定する。
【０３４２】
一般的には、本発明の方法において哺乳動物、好ましくはヒトに投与してもよい投薬量は、当該哺乳動物の体重１キログラム当たり０．０１μｇ〜約５０ｍｇの範囲であるが、投与される正確な投薬量は、哺乳動物の種類及び治療を受ける疾患状態の種類、当該哺乳動物の年齢及び投与経路を含む、但しこれらに限定されない任意の数の因子に応じて変化するであろう。上記化合物の上記投与量は、当該哺乳動物の体重１キログラム当たり約０．１μｇ〜約１０ｍｇで変化することが好ましい。上記投与量は、当該哺乳動物の体重１キログラム当たり約１μｇ〜約１ｍｇで変化することがより好ましい。
【０３４３】
本組成物は、哺乳動物に毎日数回といった高頻度で投与されてもよく、または１日に１回、週に１回、２週間に１回、１ヶ月に１回などのより低い頻度で、または、例えば数ヶ月に１回もしくは１年に１回以下の場合すらある更に低いい頻度で投与されてもよい。投与の頻度は、当業者には容易に明らかであり、治療を受ける疾患の種類及び重篤度、当該哺乳動物の種類及び年齢などの、但しこれらに限定されない任意の数の因子に依存することとなる。
【０３４４】
ある特定の実施形態において、本発明の免疫原性組成物またはワクチンの投与は、単回投与によって実施されてもよく、または複数回投与によって追加免疫されてもよい。
【０３４５】
一実施形態において、本発明は、本明細書に記載の、１種もしくは複数種の抗原またはアジュバントをコードする１種または複数種の組成物を投与することを含む方法を含む。ある特定の実施形態において、本方法は相加効果を有し、上記組み合わせの投与の全体としての効果は、各抗原またはアジュバントの投与の効果の合計にほぼ等しい。他の実施形態において、本方法は相乗効果を有し、上記組み合わせの投与の全体としての効果は、各抗原またはアジュバントの投与の効果の合計よりも大きい。
【実施例】
【０３４６】
以下の実験実施例を参照することによって、本発明を更に詳細に説明する。これらの実施例は例証のみを目的として提示されており、別段の明示がない限り限定することを意図するものではない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されるものとは何ら解釈されるべきものではなく、本明細書で提示される教示の結果として明らかになる任意且つ全ての変化形を包含すると解釈されるべきものである。
【０３４７】
当業者ならば、更なる説明がなくとも、上述の説明及び以下の例証のための実施例を用いて、本発明を作製及び利用し、特許請求の範囲に記載の方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に示すのであって、如何様にも、本開示の残余の部分を限定するものとして解釈されるべきものではない。
【０３４８】
実施例１：ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質をコードする修飾ＲＮＡによる適応免疫応答の誘導
マウスモデルにおいて、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質をコードする修飾ＲＮＡの適応免疫を誘導する能力を検討するための実験を実施した。第１の一連の実験において、動物に、３μｈ、１０μｇ（Ｅ１０）または３０μｇ（Ｅ３０）の、脂質ナノ粒子中に封入した、ＨＩＶ−１  ＣＤ４非依存性Ｒ３ＡエンベロープをコードするｍＲＮＡ（ＥＮＶ−ＬＮＰ）を２回皮内注射した。実施例１〜４の脂質ナノ粒子は、ｍＲＮＡ、カチオン性脂質（化合物Ｉ−６）、ＤＳＰＣ、コレステロール及びペグ化脂質（化合物１４−６）を含み、実施例１５に従って調製した。実施例５の脂質ナノ粒子は、ｍＲＮＡ、記載したカチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール及びペグ化脂質（化合物１４−６）を含み、これも実施例１５に従って調製した。得られたＥＮＶ−ＬＮＰの平均径は７６ｎｍであり、多分散指数は０．００７であった。Ｑｕａｎｔ−ＩＴ  Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、ＬＮＰを破壊し全ｍＲＮＡを露出させるための２％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  ＴＸ１００界面活性剤を含有する、相当する試料中の全ｍＲＮＡに対するＬＮＰ試料中の遊離ｍＲＮＡをアッセイして、封入効率を９５％と決定した。対照マウスには、３０μｇの、脂質ナノ粒子中に複合体化したホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ（ＬＵＣ）を注射した。これらの対照ＬＮＰは平均直径が７４ｎｍであり、多分散指数は０．００７であり、封入効率は９２％であった。ｍＲＮＡ−ＬＮＰの注射の間には４週間の間隔をおき、２回目の注射の１４日後に動物をと殺した（図１）。上記免疫化した動物由来の細胞及び血清を分析した。
【０３４９】
多色フローサイトメトリーを用いて、完全なエンベロープ配列の１１アミノ酸がオーバーラップする１５量体のペプチドプールで刺激した後の細胞における細胞内サイトカイン産生を測定した。
【０３５０】
ＥＮＶ−ＬＮＰによる免疫化によって、抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２の産生（図２及び図３）が誘導されることが認められた。ワクチン接種した動物における一、二、及び三機能性抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞の分布を評価するために更に分析を行った。Ｅｎｖで処置した動物は、より高い割合（％）の、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２の３種全て、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの両方、ならびにＴＮＦ−α及びＩＬ−２の両方を産生するＣＤ４  ＋細胞を産生することが認められた（図４）。まとめると、このデータは、ＥＮＶ−ＬＮＰによる免疫化によって強固且つ高品質のＣＤ４＋  Ｔ細胞応答が誘発されることを実証している。
【０３５１】
ＥＮＶ−ＬＮＰによる免疫化によって、高親和性抗体応答の生起に重要なＴ嚢胞ヘルパー（Ｔｆｈ）細胞の数が有意に増加することも認められた。ＣＤ４、ＣＸＣＲ５及びＰＤ−１マーカーを用いてＴｆｈ細胞を測定した（図５）。ＣＸＣＲ５＋ＩＣＯＳ＋ＣＤ４＋  Ｔ細胞及びＰＤ−１＋ＩＣＯＳ＋ＣＤ４＋  Ｔ細胞について、同一の比率のＴｆｈ細胞が得られる。
【０３５２】
抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞のサイトカイン産生も調べた。ＥＮＶ−ＬＮＰによる免疫化によって、抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２及びＣＤ１０７ａの産生（図６及び図７）が誘導されることが認められた。ワクチン接種した動物における一、二、及び三機能性抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の分布を評価するために更に分析を行った。Ｅ１０で処置した動物は、より高い割合の、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＣＤ１０７ａの３種全て、ＩＦＮ−γ及びＣＤ１０７ａの両方、ＴＮＦ−α及びＣＤ１０７ａの両方、ならびにＣＤ１０７ａ単独を産生するＣＤ８  ＋細胞を産生することが認められた（図８）。更に、Ｅ３０で処置した動物は、より高い割合の、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＣＤ１０７ａの３種全てを産生するＣＤ８  ＋細胞を産生することが認められた。まとめると、このデータは、ＥＮＶ−ＬＮＰによる免疫化によって強固なＣＤ８＋  Ｔ細胞応答が誘発されることを実証している。
【０３５３】
ＥＬＩＳＡアッセイを行って、３μｇ、１０μｇ、または３０μｇの、脂質ナノ粒子中に封入した、ＨＩＶ−１  ＣＤ４非依存性Ｒ３ＡエンベロープをコードするｍＲＮＡで免疫化したマウスにおける、ＨＩＶエンベロープ免疫原に対する抗原特異的Ｂ細胞応答を検討した。具体的には、ＨＩＶ−ｌｇｌ２０特異的ＩｇＧ力価を、ｍＲＮＡ−ＬＮＰの２回の注射後に測定した。力価は、ｇｐ１２０特異的ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。ＥＮＶ−ＬＮＰで処置したマウスは、対照と比較した、ｇｐ１２０特異的ＩｇＧのレベルの増加によって測定される、抗原特異的Ｂ細胞応答を示すことが認められた（図９Ａ）。更に、２回の免疫化の２週間後に、同様の量のＥｎｖ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａが産生されることが認められた。
【０３５４】
ＨＩＶエンベロープｉＲ３Ａをコードする修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰ複合体による２回の免疫化後に産生された抗ＥＮＶ抗体の機能活性を調べるための実験を行った。ＭＮと呼ばれる中和しやすいＨＩＶのティア１株及びＸ２２７８＿Ｃ２＿Ｂ６と呼ばれる中和し難いＨＩＶのティア２株に対する中和力価を決定し、モロニー白血病ウイルス（ＭＬＶ）に対する対照中和力価を差し引いた。皮内注射したｉＲ３Ａ修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰによる免疫化により、高レベルのティア１の中和（図１０）及びティア２の中和（図１１）が誘導されることが認められた。
【０３５５】
マウスに、３０μｇの、脂質ナノ粒子中に封入した、ＨＩＶ−１  ＣＤ４非依存性Ｒ３ＡエンベロープをコードするｍＲＮＡ（ＥＮＶ）を１回皮内注射する別の一連の実験を行った。対照マウスには、３０μｇの、脂質ナノ粒子中に複合体化したホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ（ＬＵＣ）を注射した。ｍＲＮＡ投与の１４日後に動物をと殺した（図１２）。
【０３５６】
３０μｇのＥＮＶ−ＬＮＰの単回皮内投与によって処置した動物において、抗原特異的ＣＤ４＋細胞のサイトカイン産生を測定した。ＥＮＶ−ＬＮＰの単回注射による免疫化によって、抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２及びＣＤ１０７ａの産生（図１３及び図１４）が誘導されることが認められた。ワクチン接種した動物における一、二、及び三機能性抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞の分布を評価するために更に分析を行った。ＥＮＶ−ＬＮＰで処置した動物は、より高い割合の、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２の両方を産生するＣＤ４  ＋細胞を産生することが認められた（図１５）。まとめると、このデータは、ＥＮＶ−ＬＮＰの単回投与による免疫化によって強固なＣＤ４＋  Ｔ細胞応答が誘発されることを実証している。
【０３５７】
ＥＮＶ−ＬＮＰによる免疫化によってＴｆｈ細胞の数が有意に増加することも認められた。ＣＤ４、ＣＸＣＲ５及びＰＤ−１マーカーを用いて全Ｔｆｈ細胞を決定した（図１６）。
【０３５８】
次いで、抗原特異的Ｔｆｈ細胞によるサイトカイン産生を調べた。ＥＮＶ−ＬＮＰの単回注射による免疫化によって、抗原特異的Ｔｆｈ細胞によるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２の産生（図１７）が誘導されることが認められた。
【０３５９】
ワクチン接種した動物における一、二、及び三機能性抗原特異的Ｔｆｈ細胞の分布を評価するために更に分析を行った。ＥＮＶ−ＬＮＰの単回投与で処置した動物は、より高い割合の、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ２の３種全てを産生するＴｆｈ細胞を産生することが認められた（図１８）。まとめると、このデータは、ＥＮＶ−ＬＮＰの単回投与による免疫化によって強固なＴｆｈ細胞免疫応答が誘発されることを実証している。
【０３６０】
ＥＬＩＳＡアッセイを行って、ＥＮＶ−ＬＮＰの単回投与によって免疫化したマウスにおける抗原特異的Ｂ細胞応答を検討した。具体的には、ＨＩＶ−ｌｇｌ２０特異的ＩｇＧ力価を、ＥＮＶ−ＬＮＰの単回投与後に測定した。力価は、ｇｐ１２０特異的ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。上記ＥＮＶ−ＬＮＰの単回投与によって、対照動物及びナイーブ動物と比較したｇｐ１２０特異的ＩｇＧのレベルの増加によって測定される、強固な抗原特異的Ｂ細胞応答が誘導されることが認められた（図１９）。
【０３６１】
単独で送達されたヌクレオシド修飾ＲＮＡに対してＬＮＰ複合体化ヌクレオシド修飾ＲＮＡによって誘導された適応免疫応答を比較するための実験を実施した。マウスを、１ヶ月間隔をおいて皮下経路により、１０μｇの、非修飾ｍＲＮＡ、１−メチル−プソイドウリジン修飾ｍＲＮＡ、または１−メチル−プソイドウリジン修飾且つＬＮＰ複合体化ｍＲＮＡ（全てｉＲ３Ａ抗原をコードする）によって２回免疫化した。
【０３６２】
脾臓細胞を、エンベロープがオーバーラップするペプチドでの６時間の刺激によって分析し、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋  Ｔ細胞に対するＣＤ１０７Ａもしくは細胞内ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２の発現（図２０）、またはＣＤ３＋、ＣＤ４＋  Ｔ細胞に対する細胞内ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２の発現（図２１）について分析した。ＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞におけるヌクレオシド修飾ＲＮＡ−ＬＮＰ応答は、未複合体化修飾ｍＲＮＡまたは非修飾ｍＲＮＡすなわち対照（ルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡ）によって処置したマウスよりも有意に大きく（ｐ＜０．０１）（図２０及び図２１）、これはＬＮＰ複合体化の優位性を実証している。
【０３６３】
未複合体化または複合体化ヌクレオシド修飾ＲＮＡでの免疫化によって誘導されたエンベロープ特異的抗体応答を調べるための実験も実施した。マウスを、１ヶ月間隔をおいて皮内経路により、１０μｇの、ＨＩＶエンベロープｉＲ３Ａをコードする未複合体化１−メチル−プソイドウリジン修飾ｍＲＮＡ（裸のｉＲ３Ａ）、ルシフェラーゼをコードする１−メチル−プソイドウリジン−ＬＮＰ複合体化ｍＲＮＡ（ｌｕｃ−ＬＮＰ）、または１−メチル−プソイドウリジン−ＬＮＰ複合体化したｉＲ３ＡをコードするｍＲＮＡ（ｉＲ３Ａ−ＬＮＰ）によって２回免疫化した。血清をＥＬＩＳＡによりエンベロープ（ｇｐ１２０）特異的応答について分析した。血清を１：１０００に希釈して分析した。ｇｐ１２０に特異的なモノクローナル抗体を用いて血清中の濃度を決定した。ｉＲ３Ａ−ＬＮＰによる免疫化によって、ｇｐ１２０特異的抗体応答が増加することが認められた。
【０３６４】
実施例２：インフルエンザ抗原をコードする修飾ＲＮＡによる適応免疫応答の誘導
ここで示す実験は、インフルエンザ抗原（すなわち、ヘマグルチニン（ＨＡ））をコードするヌクレオシド修飾ＲＮＡが、対象においてインフルエンザ特異的適応免疫応答を誘導することを実証している。これらの試験において、ＰＲ８及びＡ／Ｃａｌ／７／２００９インフルエンザ株由来のＨＡを用いた。ＰＲ８及びＡ／Ｃａｌ／７／２００９  ＨＡに関するアミノ酸配列、ヌクレオチド配列、及びコドン最適化配列は下に記載する。
【０３６５】
実験はｍ１Ψ修飾ｍＲＮＡを用いて行った。初期の実験は、ＰＲ８  ＨＡをコードする修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰ（３０μｇ）の単回投与の１０日後のＣＤ４＋  Ｔ細胞におけるサイトカイン産生を調べるために実施した。３０μｇの、ＰＲ８  ＨＡをコードする修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回皮内投与によって、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ及びスプリットウイルスと比較して、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２の産生の増加が誘導されることが認められた（図２３）。スプリットウイルスは、標準的な筋内インフルエンザワクチンに使用されている。このウイルスは、初期にはニワトリ胚尿膜液中で増殖される。該液体を回収し、清澄化し、濃縮し、精製して殆ど全ての卵タンパク質を除去する。次いでこのウイルスを不活性化し、構成成分へと分解する化学物質で該ウイルスを破壊して、スプリットウイルスを生成させる。
【０３６６】
更に、３０μｇの、ＰＲ８  ＨＡをコードする修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回皮内投与後の多機能性ＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を観察し、該観察において、ＰＲ８  ＨＡをコードする修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰは、対照のルシフェラーゼをコードするＲＮＡ及び１０００ＨＡＵの不活性化ＰＲ８ウイルスの筋内注射と比較して、有意により大きな割合（％）の細胞において、測定した３種全てのサイトカインの発現を誘導した（図２４）。
【０３６７】
ＰＲ８  ＨＡをコードする修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰ（３０μｇ）の単回皮内投与の１０日後のＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるサイトカイン産生を調べるための実験を実施した。３０μｇの、ＰＲ８  ＨＡをコードする修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回投与によって、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ及びスプリットウイルスと比較して、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの産生の増加が誘導されることが認められた（図２５）。
【０３６８】
１０μｇまたは３０μｇのいずれかの、ＰＲ８  ＨＡをコードする修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰの皮内注射の１４日後または２８日後に誘導された、ＨＩ力価によって測定される中和レベルを検出するための更なる実験を実施した。中和力価は標準的なヘマグルチニン阻害アッセイによって測定し、該アッセイでは、七面鳥赤血球をＰＲ８ヘマグルチニンで被覆した。２倍で増加させた希釈率での血清をＲＢＣに添加し、赤血球凝集が失われる時点での力価を測定した。１０μｇ及び３０μｇの、ＰＲ８  ＨＡをコードする修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰの投与の両方によって、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡと比較して力価が上昇することが認められた（図２６）。更に、ＰＲ８インフルエンザによる急性感染によって誘導される中和のレベルは、修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰによって誘導されるレベルよりも低かった（Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１２１：３９５４−３９６４）。
【０３６９】
ＰＲ８  ＨＡをコードする修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回投与によって、ＩｇＤ−、Ｂ２２０＋、ＣＤ１３８−、ＣＤ１９＋、ＩｇＭ−、ＣＤ３−及びまたはＣＤ１４−であることによって測定される胚中心Ｂ細胞の産生が誘導されることが更に認められた（図２７）。また、ＰＲ８  ＨＡをコードする修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回皮内投与によって、ＣＤ１１ｃ＋Ｔ−ＢＥＴ＋細胞の数によって測定される、脾臓における全メモリーＢ細胞の増加が誘導される（図２８）。
【０３７０】
Ｂ細胞応答及びメモリーを駆動する上で重要な、Ｔ嚢胞ヘルパー（Ｔｆｈ）細胞に対するＨＡをコードする修飾ｍＲＮＡの投与の効果を調べるための更なる検討を実施した。ＰＲ８  ＨＡをコードする修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回投与によって、脾臓中の全Ｔｆｈ細胞の増加が誘導されることが認められた（図２９）。更に、３０μｇの、ＰＲ８  ＨＡをコードする修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰの投与によって、脾臓細胞をオーバーラップするＨＡペプチドによって刺激し、Ｔｆｈ細胞がＢｃｌ６＋として定義された場合に、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ及び生ウイルス対照による処置と比較して、ＣＤ４＋  Ｔｆｈ細胞におけるＩＦＮ−γ及びＩＬ−２の産生が増加した（図３０）。
【０３７１】
ＰＲ８  ＨＡをコードする修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰで免疫化したマウスの脾臓から精製したＴｆｈ細胞において、ＩＬ−４、ＩＬ−２１、及びＩＦＮ−γのサイトカイン発現を測定した（図３１）。ＰＲＢ修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰによる免疫化の１０日後の脾臓細胞を単離した。Ｔ細胞を、ＣＤ３による陽性選択またはＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ１６、ＣＤ５６による陰性選択のいずれかによって選択した。全Ｔ細胞を、直接分析する（全てのＴ細胞）か、またはＣＸＣＲ５＋及びＰＤ−１＋細胞、Ｔ濾胞ヘルパー細胞の選択によって更に精製するかのいずれかとした。ＩＬ−４、ＩＬ−２１、及びＩＦＮ−ｇのレベルを、対照としてＧＡＰＤＨを用いたリアルタイムＰＣＲによって測定した。データは普遍的な標準ｍＲＮＡと比較した倍率の差として表す。更に、ＰＲ８  ＨＡをコードする修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰの投与によっては、Ｔｆｈ調節細胞の割合は増加しないことが認められた（図３２）。
【０３７２】
１０μｇまたは３０μｇのいずれかの、ＰＲ８  ＨＡをコードする修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰで免疫化したマウスに対するインフルエンザ負荷の影響を調べるための実験も実施した。１０μｇまたは３０μｇのいずれかの、ＰＲ８  ＨＡをコードする修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰによって皮内注射で免疫化した上記負荷マウスは、感染後１５日の試験期間を通して体重を維持した一方、対照動物は体重の減少（図３３）及び顕著な死亡率を示した。
【０３７３】
インフルエンザ茎部の応答を調べて、インフルエンザ株全体にわたる普遍的な防御を誘導する可能性を評価するため、及びＴｆｈ細胞によって駆動される親和性成熟を測定するための実験を実施した。現在のインフルエンザワクチンは茎部の応答を誘導しない。
【０３７４】
１０μｇまたは３０μｇのいずれかの、ＰＲ８  ＨＡをコードする修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回皮内投与で処置した動物の血清のＨＡ結合能を評価するための実験を実施した。Ｈ１  ＨＡ（Ｈ１−頭部／Ｈ１−茎部）への結合が、投与後４週間で、投与後２週間と比較して増加することが認められた（図３４）。更に、１０μｇまたは３０μｇのいずれかの、ＰＲ８  ＨＡをコードする修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰの投与によって、Ｈ５−頭部／Ｈ１−茎部ハイブリッドＨＡに結合する能力によって示される、茎部に対して特異的なＩｇＧが誘導されることが認められた（図３５）。また、単回の皮内免疫化後６３日まで、ＨＡ全体の結合及びＨＡ茎部結合が経時的に増加することも認められた（図３６）。
【０３７５】
次に、ＰＲ８  ＨＡをコードする修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰによって誘導される適応免疫応答の持続性を評価した。ＰＲ８  ＨＡをコードする修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回皮内投与後の抗体応答は、投与後６ヶ月において変化せずに維持されることが認められた（図３７）。
【０３７６】
ｍ１Ψ修飾ＲＮＡ−ＬＮＰであって、該ｍ１Ψ修飾ＲＮＡがＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９  ＨＡ（以下、「ＣＡ０９  ＨＡ」）をコードする上記ｍ１Ψ修飾ＲＮＡ−ＬＮＰを用いて更なる実験を行った。ＣＡ０９  ＨＡは２０１５〜２０１６ワクチンに用いられた異なるインフルエンザＨＡであり、臨床上重要である。３０μｇの、ＣＡ０９  ＨＡをコードするｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回皮内投与によって、該単回皮内投与の２週間後に、ＨＡ阻害力価によって測定される抗原特異的適応免疫応答が誘導されることが認められた（図３８）。
【０３７７】
更に、３０μｇの、ＣＡ０９  ＨＡをコードするｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回投与によって、単回投与の２週間後に測定した、ポリ（Ｃ）対照との比較での、ＣＤ４＋  Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２の増加が誘導されることが認められた（図３９）。３０μｇの、ＣＡ０９  ＨＡをコードするｍＲＮＡ−ＬＮＰの単回投与によって、単回投与の２週間後に測定したＴｆｈ細胞の割合が増加することも認められた（図４０）。
【０３７８】
ＣＡ０９  ＨＡをコードするｍＲＮＡ−ＬＮＰの筋内送達の有効性を調べるための実験を実施した。対象に、１０μｇ、３０μｇ、もしくは９０μｇのいずれかの、ＣＡ０９  ＨＡをコードするｍＲＮＡ−ＬＮＰを筋内注射によって、または３μｇ、１０μｇ、もしくは３０μｇのＣＡ０９  ＨＡをコードするｍＲＮＡ−ＬＮＰを皮内注射によって投与した。筋内注射によって、皮内注射と比較して同様の免疫応答が生じたが、３倍多いｍＲＮＡを要することが認められた（図４１）。
【０３７９】
本明細書に示したデータは、本インフルエンザ用修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰワクチンの明確な優位性を実証している。インフルエンザに対して完全に防御するために、ナイーブな宿主において、単回の免疫化しか必要としないことが示されているのは重要なことである。これは、非複製ワクチンによる単回免疫化が高力価のＩｇＧ応答を誘導することができ、且つ該応答の４分の１を超える部分が茎部に向けられることが実証された初めての報告であると理解する。如何なる特定の理論に拘束されることも望むものではないが、上記の強力な抗体応答は、おそらくＣＤ４ヘルパー応答の半分を構成するＴｆｈ応答に起因するもの思われる。更に、上記ｍＲＮＡ−ＬＮＰワクチンは異なる経路による送達後に有効であり得ることが実証され、このことは該ｍＲＮＡ−ＬＮＰワクチンの有用性を大幅に拡大する。
【０３８０】
実施例３：修飾ｍＲＮＡの強力なＴｆｈ応答の誘導の機序
ＬＮＰ中のヌクレオシド修飾ｍＲＮＡは自然免疫応答を誘導しない。これが強力なＴｆｈ応答を生じさせるアジュバント効果の欠如であるかどうかを調べた。これを検討するために、ヌクレオシド修飾が欠如する点のみが異なり、当該ヌクレオシド配列の修飾を含むＰＲ８  ＨＡ  ｍＲＮＡを作成した。これによって同様のレベルの翻訳は生じるが、上記非修飾ｍＲＮＡは自然免疫応答を誘導する。
【０３８１】
コドン最適化しＦＰＬＣ精製した、但し非修飾であるＨＡ  ｍＲＮＡは１型インターフェロン産生を誘導することが認められ、このことは非修飾ＨＡ  ｍＲＮＡが自然免疫応答を誘導することを実証している。しかし、上記ｍ１Ψ修飾ｍＲＮＡは自然免疫応答を誘導しなかった（図４２）。更に、ＨＰＬＣ精製したヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ−ＬＮＰの静脈内注射によって、炎症誘発性サイトカインＩＬ−６、ＩＦＮ−α、またはＴＮＦ−αの産生は誘導されないことが認められ（図４３）、このことは自然免疫の活性化の欠如を実証している。
【０３８２】
ｍ１Ψ修飾ｍＲＮＡを非修飾のコドン最適化ｍＲＮＡと、それらのＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を誘導する能力について比較するための実験を実施した。上記ヌクレオシド修飾したＨＡをコードするｍＲＮＡ（自然免疫応答を誘導しない）は、非修飾のＨＡをコードするｍＲＮＡ（自然免疫応答を誘導する）と比較して、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２の産生の増加によって測定される、より良好なＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を誘導することが認められた（図４４）。
【０３８３】
３０μｇの、非修飾のコドン最適化したＰＲ８  ＨＡをコードするｍＲＮＡと比較した、３０μｇの、ｍ１Ψ修飾したＨＡをコードするｍＲＮＡの皮内投与によって生起される適応免疫応答を調べるための実験を実施した。ｍ１Ψ修飾したＨＡをコードするｍＲＮＡは、非修飾のＨＡをコードするｍＲＮＡ及び対照と比較して、脾臓におけるＴｆｈ細胞のレベルの上昇を生じさせることが認められた（図４５）。また、ｍ１Ψ修飾したＨＡをコードするｍＲＮＡの投与によって、非修飾のＨＡをコードするｍＲＮＡと比較して、ＣＤ４＋  Ｂｃｌ６＋ＩＦＮ−γ＋  Ｔ細胞の割合によって測定される、より大きな抗原特異的Ｔｆｈ細胞応答が生じた（図４６）。最後に、ｍ１Ψ修飾したＨＡをコードするｍＲＮＡは、単回投与の１０日後にＨＡ阻害力価によって測定される、より大きなＨＡ特異的抗体応答を誘導した（図４７）。
【０３８４】
これらの実験は、非修飾ｍＲＮＡに対してｍ１Ψを含有すること、及びＲＮＡセンサーを活性化する能力（非修飾のみが有する）の点においてのみ異なり、類似の翻訳レベルを有していたＨＡをコードするｍＲＮＡが、適応免疫応答の誘導において差異のある能力を有することを実証している。上記ｍ１Ψ修飾ｍＲＮＡはより大きな抗原特異的免疫応答を誘導することが認められた。自然免疫の活性化またはアジュバント活性またはＩＦＮ−αの誘導の欠如が強力なＴｆｈ細胞の誘導を誘導したことが、最も重要なことである。
【０３８５】
実施例４：ｍＲＮＡの送達
上記ｍ１Ψ修飾ｍＲＮＡの発現を視覚化するための実験を実施した。マウスに、０．１μｇ、１μｇ、もしく５μｇの、裸のまたはＬＮＰ複合体化したｍ１ΨルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを注射し、Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ（ＩＶＩＳ）によって画像化した。全ての条件でｍＲＮＡの翻訳が認められた（図４８）。ＬＮＰの複合体化によって、ｍＲＮＡ翻訳のレベル及び持続時間が増加する（図４８）。
【０３８６】
実施例５：ＬＮＰ製剤の比較
封入したｍＲＮＡの有効な翻訳によって判定される、種々のＬＮＰ製剤の有効性を調べるために実験を実施した。ルシフェラーゼをコードするｍ−ＲＮＡを含むＬＮＰを、実施例１５に記載のようにして調製した。試験したＬＮＰは、カチオン性脂質Ｉ−５，Ｉ−６、ＩＩ−９，ＩＩ−１０、ＩＩ−１１，ＩＩ−１２，ＩＩ−３２、ＩＩＩ−３またはＩＩＩ−７を含んでいた。他の成分は実施例１５に記載したとおりであった。６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに、３μｇのルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ−ＬＮＰを皮内注射した。ルシフェラーゼの発現をＩＶＩＳによって測定した。データは、ｍＲＮＡが様々なＬＮＰを用いて効果的に送達され得ることを示している（図４９）。したがって、該データは、少なくとも１種の抗原をコードするヌクレオシド修飾ＲＮＡを送達するために、広範囲のＬＮＰを用いることができることの証拠を提供している。
【０３８７】
実施例６：化合物Ｉ−５の合成
化合物Ｉ−５を、以下の方法Ｂに従って調製した。
すなわち、ヘキサン−１，６−ジオール（１０ｇ）の塩化メチレン（４０ｍＬ）及びテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）の溶液を塩化２−ヘキシルデカノイル（１０ｇ）及びトリエチルアミン（１０ｍＬ）で処理した。この溶液を１時間撹拌し、溶媒を除去した。この反応混合物をヘキサン中に懸濁させ、ろ過し、ろ液を水洗した。溶媒を除去し、残渣を、ヘキサン、続いて塩化メチレンを溶離液として用いてシリカゲル（５０ｇ）カラムに流下させ、６−（２’−ヘキシルデカノイルオキシ）ヘキサン−１−オールを油状物（７．４ｇ）として得た。
【０３８８】
上記精製した生成物（７．４ｇ）を塩化メチレン（５０ｍＬ）に溶解し、クロロクロム酸ピリジニウム（５．２ｇ）で２時間処理した。ジエチルエーテル（２００ｍＬ）を添加し、上清をシリカゲル床に通してろ過した。ろ液から溶媒を除去し、得られた油状物を、酢酸エチル／ヘキサン（０〜５％）勾配を用いてシリカゲル（５０ｇ）カラムに流下させた。６−（２’−ヘキシルデカノイルオキシ）ドデカナール（５．４ｇ）を油状物として回収した。
【０３８９】
上記生成物（４．９ｇ）、酢酸（０．３３ｇ）及び２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアミン（０．４０ｇ）の塩化メチレン（２０ｍＬ）溶液をトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（２．１ｇ）で２時間処理した。この溶液を水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウム上で脱水し、ろ過し、溶媒を除去した。残渣を、メタノール／塩化メチレン（０〜８％）勾配を用いてシリカゲル（５０ｇ）カラムに流下させ、所望の生成物（１．４ｇ）を無色油状物として得た。
【０３９０】
実施例７：化合物Ｉ−６の合成
化合物Ｉ−６を、以下の方法Ｂに従って調製した。
すなわち、ノナン−１，９−ジオール（１２．６ｇ）の塩化メチレン（８０ｍＬ）溶液を２−ヘキシルデカン酸（１０．０ｇ）、ＤＣＣ（８．７ｇ）及びＤＭＡＰ（５．７ｇ）で処理した。この溶液を２時間撹拌した。この反応混合物をろ過し、溶媒を除去した。残渣を加温したヘキサン（２５０ｍＬ）に溶解し、結晶化させた。溶液をろ過し、溶媒を除去した。残渣を塩化メチレンに溶解し、希塩酸で洗浄した。有機画分を無水硫酸マグネシウム上で脱水し、ろ過し、溶媒を除去した。残渣を、０〜１２％酢酸エチル／ヘキサンを溶離液として用いてシリカゲルカラム（７５ｇ）に流下させ、９−（２’−ヘキシルデカノイルオキシ）ノナン−１−オール（９．５ｇ）を油状物として得た。
【０３９１】
上記生成物を塩化メチレン（６０ｍＬ）に溶解し、クロロクロム酸ピリジニウム（６．４ｇ）で２時間処理した。ジエチルエーテル（２００ｍＬ）を添加し、上清をシリカゲル床に通してろ過した。ろ液から溶媒を除去し、得られた油状物を、酢酸エチル／ヘキサン（０〜１２％）勾配を用いてシリカゲル（７５ｇ）カラムに流下させ、９−（２’−エチルヘキサノイルオキシ）ノナナール（６．１ｇ）を油状物として得た。
【０３９２】
上記粗生成物（６．１ｇ）、酢酸（０．３４ｇ）及び２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアミン（０．４６ｇ）の塩化メチレン（２０ｍＬ）溶液をトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（２．９ｇ）で２時間処理した。この溶液を塩化メチレンで希釈し、水酸化ナトリウム水溶液、次いで水で洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウム上で脱水し、ろ過し、溶媒を除去した。残渣を、メタノール／塩化メチレン（０〜８％）勾配を用いてシリカゲル（７５ｇ）カラムに、続いて塩化メチレン／酢酸／メタノール勾配を用いて第２のカラム（２０ｇ）に流下させた。精製した画分を塩化メチレンに溶解し、希水酸化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で脱水し、ろ過し、溶媒を除去して、所望の生成物（１．６ｇ）を無色油状物として得た。
【０３９３】
実施例８：化合物ＩＩ−９の合成
【化４０】
2018526321.tif 000061
化合物ＩＩ−９を以下の方法Ｄに従って調製した。すなわち、
ステップ１
３−ジメチルアミン−１−プロピルアミン（１当量、１．３ｍｍｏｌ、１３３ｍｇ、１６３ｕＬ；ＭＷ  １０２．１８、ｄ  ０．８１２）及びケトン９ａ（１当量、０．８８５ｇ、１．３ｍｍｏｌ）をＤＣＥ（８ｍＬ）中で混合し、次いでトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（１．４当量、１．８２ｍｍｏｌ、３８６ｍｇ；ＭＷ  ２１１．９４）及びＡｃＯＨ（１当量、１．３ｍｍｏｌ、７８ｍｇ、７４ｕＬ、ＭＷ  ６０．０５、ｄ  １．０６）で処理した。この混合物をＡｒ雰囲気下、室温で２日間撹拌した。この反応混合物をヘキサン−ＥｔＯＡｃ（９：１）で希釈し、０．１Ｎ  ＮａＯＨ（２０ｍＬ）の添加によってクエンチした。有機相を分離し、飽和ＮａＨＣＯ３、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上脱水し、デカントし、濃縮して、所望の生成物９ｂをわずかに黄色の濁った油状物（１．０７ｇ、１．３９８ｍｍｏｌ）として得た。
【０３９４】
ステップ２
塩化ノナノイル（１．３当量、１．２７ｍｍｏｌ、２２５ｍｇ）のベンゼン（１０ｍＬ）溶液を、室温で、ステップ１由来の化合物９ｂ（０．７５ｇ、０．９８ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（５当量、４．９０ｍｍｏｌ、０．６８ｍＬ）及びＤＭＡＰ（２０ｍｇ）のベンゼン（１０ｍＬ）溶液に、シリンジによって１０分間かけて添加した。添加後、この混合物を室温で終夜晩撹拌した。メタノール（５．５ｍＬ）を添加して過剰な塩化アシルを除去した。３時間後、この混合物をシリカゲルのパッド（１．２ｃｍ）を通してろ過した。濃縮して無色油状物（０．７０ｇ）を得た。
【０３９５】
上記粗生成物（０．７０ｇ）をシリカゲル上でのフラッシュドライカラムクロマトグラフィー（０〜４％のＭｅＯＨのクロロホルム溶液）によって精製した。これにより４５７ｍｇ（０．５０ｍｍｏｌ、５１％）の無色油状物が得られた。１ＨＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ：４．５４−４．３６ （非常にｂｒ．，推定０．３Ｈ，アミド結合に関する緩慢な異性化に起因），３．９７７，３．９７３ （２組のダブレット，５．８ Ｈｚ，４Ｈ），３．６３ （クインテット様，６．８ Ｈｚ，０．７Ｈ），３．１４−３．０９ （ｍ，２Ｈ），２．３３−２．２５ （ｍ，８Ｈ），２．２３，２．２２ （２組のシングレット，６Ｈ），１．７６−１．５６ （ｍ，１０Ｈ），１．４９−１．３９ （ｍ，４Ｈ），１．３７−１．１１ （６２Ｈ），０．９２−０．８６ （ｍ，１５Ｈ）。
【０３９６】
実施例９：化合物ＩＩ−１０の合成
化合物ＩＩ−１０を概括的手順Ｄに従って調製して、２４５ｍｇの無色油状物を得た（０．２７ｍｍｏｌ、２ステップに対して合計収率５３％）。１ＨＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ：４．８７ （クインテット様，６．３ Ｈｚ，２Ｈ），４．５４−４．３６ （非常にブロード，推定０．３Ｈ，アミド結合に関する緩慢な異性化に起因），３．６３ （クインテット様，６．８ Ｈｚ，０．７Ｈ），３．１４−３．０９ （ｍ，２Ｈ），２．３３−２．２５ （ｍ，８Ｈ），２．２３，２．２２ （２組のシングレット，６Ｈ），１．７６−１．５６ （ｍ，８Ｈ），１．５５−１．３９ （ｍ，１２Ｈ），１．３７−１．１１ （６０Ｈ），０．９２−０．８６ （ｍ，１５Ｈ）。
【０３９７】
実施例１０：化合物ＩＩ−１１の合成
化合物ＩＩ−１１を概括的手順Ｄに従って調製して、２３９ｍｇの無色油状物を得た（０．２６ｍｍｏｌ、２ステップに対して合計収率５２％）。１ＨＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ：４．８７ （クインテット様，６．３ Ｈｚ，２Ｈ），４．５４−４．３６ （非常にブロード，推定０．３Ｈ，アミド結合に関する緩慢な異性化に起因），３．６３ （クインテット様，６．８ Ｈｚ，０．７Ｈ），３．１４−３．０９ （ｍ，２Ｈ），２．３３−２．２５ （ｍ，８Ｈ），２．２３，２．２２ （２組のシングレット，６Ｈ），１．７６−１．５６ （ｍ，８Ｈ），１．５５−１．３９ （ｍ，１２Ｈ），１．３７−１．１１ （６２Ｈ），０．９２−０．８６ （ｍ，１５Ｈ）。
【０３９８】
実施例１１：化合物ＩＩ−１２の合成
化合物ＩＩ−１２を概括的手順Ｄに従って調製して、１９８ｍｇの無色油状物を得た（０．２０ｍｍｏｌ、２ステップに対して合計収率４６％）。１ＨＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ：４．５４−４．３６ （非常にブロード，推定０．３Ｈ，アミド結合に関する緩慢な異性化に起因），３．９７４，３．９７１ （２組のダブレット，５．８ Ｈｚ，４Ｈ），３．６３ （クインテット様，６．８ Ｈｚ，０．７Ｈ），３．１４−３．０９ （ｍ，２Ｈ），２．３３−２．２５ （ｍ，８Ｈ），２．２３，２．２２ （２組のシングレット，６Ｈ），１．７６−１．５６ （ｍ，１０Ｈ），１．４９−１．３９ （ｍ，４Ｈ），１．３７−１．１１ （７６Ｈ），０．９２−０．８６ （ｍ，１５Ｈ）。
【０３９９】
実施例１２：化合物ＩＩＩ−３の合成
６−（２’−ヘキシルデカノイルオキシ）ヘキサン−１−アール（２．４ｇ）、酢酸（０．３３ｇ）及び４−アミノブタン−１−オール（０．２３ｇ）の塩化メチレン（２０ｍＬ）溶液をトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（１．３ｇ）で２時間処理した。この溶液を炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウム上で脱水し、ろ過し、溶媒を除去した。残渣を、メタノール／塩化メチレン（０〜８／１００〜９２％）勾配を用いてシリカゲルカラムに流下させ、化合物３を無色油状物（０．４ｇ）として得た。
【０４００】
実施例１３：化合物ＩＩＩ−７の合成
６−（２’−ヘキシルデカノイルオキシ）ヘキサン−１−アール（２．４ｇ）、酢酸（０．１４ｇ）及び５−アミノペンタン−１−オール（０．２４ｇ）の塩化メチレン（２０ｍＬ）溶液をトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（１．３ｇ）で２時間処理した。この溶液を炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウム上で脱水し、ろ過し、溶媒を除去した。残渣を、メタノール／塩化メチレン（０〜８／１００〜９２％）勾配を用いてシリカゲルカラムに流下させ、化合物７を無色油状物（０．５ｇ）として得た。
【０４０１】
実施例１４：代表的なＰＥＧ脂質の合成
【化４１】
2018526321.tif 000062
ペグ化脂質１４−６（「ＰＥＧ−ＤＭＡ」）を上記反応スキームに従って調製し、スキーム中、ｎは当該ペグ化脂質中のエチレンオキシド繰返し単位の範囲の中心値に近似する。
【０４０２】
１４−１及び１４−２の合成
ミリスチン酸（６ｇ、２６ｍｍｏｌ）のトルエン（５０ｍＬ）溶液に、室温で塩化オキサリル（３９ｍｍｏｌ、１．５当量、５ｇ）を添加した。得られた混合物を７０℃で２時間加熱した後、この混合物を濃縮した。残渣をトルエン中にすくい入れ、再度濃縮した。残留した油状物を１０℃で、濃アンモニア溶液（２０ｍＬ）にシリンジによって添加した。この反応混合物をろ過し、水洗した。白色固体を減圧下で乾燥した。所望の生成物を白色固体（３．４７ｇ、１５ｍｍｏｌ、５８．７％）として得た。
【０４０３】
１４−３の合成
２０−２（３．４７ｇ、１５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（７０ｍＬ）懸濁液に、水素化リチウムアルミニウム（１．１４ｇ、３０ｍｍｏｌ）を室温で３０分の間に少しずつ添加した。次いでこの混合物を終夜、穏やかに（６５℃の油浴）加熱還流した。この混合物を５℃に冷却し、硫酸ナトリウム９水和物を添加した。この混合物を２時間撹拌し、セライト層を通してろ過し、１５％のＭｅＯＨのＤＣＭ溶液（２００ｍＬ）で洗浄した。ろ液及び洗浄液を一つにまとめて濃縮した。残留した固体を減圧下で乾燥した。所望の生成物を白色固体（２．８６  １３．４ｍｍｏｌ、８９．５％）として得た。
【０４０４】
１４−４の合成
ミリスチン酸（３．８６ｇ、１６．９ｍｍｏｌ）のベンゼン（４０ｍＬ）及びＤＭＦ（１滴）の溶液に、塩化オキサリル（２５．３５ｍｍｏｌ、１．５当量、３．２２ｇ）を室温で添加した。この混合物を室温で１．５時間撹拌した。６０℃で３０分間加熱した。この混合物を濃縮した。残渣をトルエン中にすくい入れ、再度濃縮した。残留した油状物（淡黄色）を２０ｍＬのベンゼン中に入れ、１０℃で、２０−３（２．８６  １３．４ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（３．５３ｍＬ、１．５当量）のベンゼン（４０ｍＬ）溶液に、シリンジによって添加した。添加後、得られた混合物を室温で終夜撹拌した。この反応混合物を水で希釈し、２０％のＨ２ＳＯ４でｐＨ６〜７に調節した。この混合物をろ過し、水洗した。淡色の固体が得られた。この粗生成物をメタノールから再結晶した。これにより所望の生成物がオフホワイトの固体（５．６５ｇ、１３ｍｍｏｌ、１００％）として得られた。
【０４０５】
１４−５の合成
２０−４（５．６５ｇ、１３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（６０ｍＬ）懸濁液に、水素化アルミニウムリチウム（０．９９ｇ、２６ｍｍｏｌ）を室温で３０分の間に少しずつ添加した。次にこの混合物を終夜穏やかに加熱還流した。この混合物を０℃に冷却し、硫酸ナトリウム９水和物を添加した。この混合物を２時間撹拌し、次いでセライト及びシリカゲルのパッドを通してろ過し、まずエーテルで洗浄した。ろ液が白濁し沈殿を形成した。ろ過によって白色固体を得た。この固体をＭｅＯＨから再結晶し、無色結晶質の固体（２．４３ｇ）。
【０４０６】
次に、上記セライト及びシリカゲルのパッドを、５％のＭｅＯＨのＤＣＭ溶液（４００ｍＬ）、次いで１％のトリエチルアミンを含む１０％のＭｅＯＨのＤＣＭ溶液（３００ｍＬ）で洗浄した。所望の生成物を含有する画分を一つにまとめて濃縮した。白色固体が得られた。この固体をＭｅＯＨから再結晶し、無色結晶質の固体（０．７９ｇ）。上記２つの固体（２．４３ｇ及び０．７９ｇ）を一つにまとめ、減圧下で乾燥した（３．２０ｇ、６０％）。１ＨＮＭＲ （７．２７ ｐｐｍにおけるＣＤＣｌ３） δ：２．５８ （ｔ様，７．２ Ｈｚ，４Ｈ），１．５２−１．４４ （ｍ，４Ｈ），１．３３−１．２４ （ｍ，４４Ｈ），０．８９ （ｔ様，６．６ Ｈｚ，６Ｈ），２．１−１．３ （非常にブロード，１Ｈ）。
【０４０７】
１４−６の合成
２０−５（７ｍｍｏｌ、２．８７ｇ）及びトリエチルアミン（３０ｍｍｏｌ、４．１８ｍＬ）のＤＣＭ（１００ｍＬ）溶液に、ｍＰＥＧ−ＮＨＳ（ＮＯＦより、５．０ｍｍｏｌ、９．９７ｇ、ＰＥＧ  ＭＷ約２，０００、ｎ＝約４５）のＤＣＭ（１２０ｍＬ）溶液を添加した。２４時間後に、この反応溶液を水（３００ｍＬ）で洗浄した。水相をＤＣＭ（１００ｍＬ×２）で２回抽出した。ＤＣＭ抽出液を一つにまとめ、飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で脱水し、ろ過し、途中まで濃縮した。上記濃縮した溶液（約３００ｍＬ）を約−１５Ｃで冷却した。ろ過によって白色固体（１．０３０ｇ、未反応の出発アミン）を得た。上記ろ過にＥｔ３Ｎ（１．６ｍｍｏｌ、０．２２２ｍＬ、４当量）及び無水酢酸（１．６ｍｍｏｌ、１６４ｍｇ）を添加した。この混合物を室温で３時間撹拌し、次いで固体となるまで濃縮した。残留した固体をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（０〜８％のメタノールのＤＣＭ溶液）によって精製した。これによって所望の生成物を白色固体（９．２１１ｇ）として得た。１ＨＮＭＲ （７．２７ ｐｐｍにおけるＣＤＣｌ３） δ：４．１９ （ｓ，２Ｈ），３．８３−３．４５ （ｍ，１８０−２００Ｈ），３．３８ （ｓ，３Ｈ），３．２８ （ｔ様，７．６ Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２Ｎ），３．１８ （ｔ様，７．８ Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２Ｎ），１．８９ （ｓ，６．６ Ｈ，水），１．５８−１．４８ （ｍ，４Ｈ），１．３６−１．２１ （ｍ，４８−５０Ｈ），０．８８ （ｔ様，６．６ Ｈｚ，６Ｈ）。
【０４０８】
実施例１５：脂質ナノ粒子組成物の調製
ＬＮＰを以下のようにして調製した。カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ−脂質（化合物１４−６）を、概略５０：１０：３８．５：１．５のモル比でエタノールに溶解した。脂質例えば１、２、３及び４はカチオン性脂質化合物Ｉ−６及び上述の成分を含んでいた。実施例５のＬＮＰは示したカチオン性脂質及び上述の成分を含んでいた。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を、概略１０：１〜３０：１の全脂質対ｍＲＮＡ重量比で調製した。簡単に説明すると、上記ｍＲＮＡを０．０５〜０．２ｍｇ／ｍＬに、１０〜５０ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ４中で希釈した。シリンジポンプを用いて、上記エタノール性脂質溶液を上記ｍＲＮＡ水溶液と、約１：５〜１：３（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の比で、１５ｍｌ／分を超える全流速で混合した。次いでエタノールを除去し、外部緩衝液を透析によってＰＢＳに置き換えた。最後に、当該脂質ナノ粒子を０．２μｍの細孔の無菌フィルタを通してろ過した。脂質ナノ粒子の大きさは、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  （Ｍａｌｖｅｒｎ、英国）を用いた準弾性光散乱によって測定して、７０〜９０ｎｍ径であった。
【０４０９】
実施例１６：配列
以下の表４は、本明細書に記載の配列の識別名ならびに核酸配列及びアミノ酸配列の説明を示す。
【表４】
2018526321.tif 000063
【０４１０】
本明細書に引用されるそれぞれの且つ全ての特許、特許出願、及び刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。本発明は特定の実施形態を参照して開示されたが、他の当業者によって、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明の他の実施形態及び変化形が案出され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、全てのかかる実施形態及び等価の変化形を包含すると解釈されることが意図される。
【図１】
2018526321.tif 000078
【図２】
2018526321.tif 000079
【図３】
2018526321.tif 000080
【図４】
2018526321.tif 000081
【図５】
2018526321.tif 000082
【図６】
2018526321.tif 000083
【図７】
2018526321.tif 000084
【図８】
2018526321.tif 000085
【図９Ａ】
2018526321.tif 000086
【図９Ｂ】
2018526321.tif 000087
【図１０】
2018526321.tif 000088
【図１１】
2018526321.tif 000089
【図１２】
2018526321.tif 000090
【図１３】
2018526321.tif 000091
【図１４】
2018526321.tif 000092
【図１５】
2018526321.tif 000093
【図１６】
2018526321.tif 000094
【図１７】
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【図１８】
2018526321.tif 000096
【図１９】
2018526321.tif 000097
【図２０】
2018526321.tif 000098
【図２１】
2018526321.tif 000099
【図２２】
2018526321.tif 000100
【図２３】
2018526321.tif 000101
【図２４】
2018526321.tif 000102
【図２５】
2018526321.tif 000103
【図２６】
2018526321.tif 000104
【図２７】
2018526321.tif 000105
【図２８】
2018526321.tif 000106
【図２９】
2018526321.tif 000107
【図３０】
2018526321.tif 000108
【図３１】
2018526321.tif 000109
【図３２】
2018526321.tif 000110
【図３３】
2018526321.tif 000111
【図３４】
2018526321.tif 000112
【図３５】
2018526321.tif 000113
【図３６】
2018526321.tif 000114
【図３７】
2018526321.tif 000115
【図３８】
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【図３９】
2018526321.tif 000117
【図４０】
2018526321.tif 000118
【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
2018526321.tif 000121
【図４４】
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【図４５】
2018526321.tif 000123
【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
2018526321.tif 000126
【図４９】
2018526321.tif 000127
【配列表】
2018526321000001.app
【国際調査報告】
2018526321.tif 000128
2018526321.tif 000129
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