(57)【要約】  本発明は、異なるマーカーのレベルの決定に基づいた、被験体における副腎白質ジストロフィーの診断方法に関する。本発明はまた、副腎白質ジストロフィーの進行をモニターするための方法、副腎白質ジストロフィーの治療法の効果をモニターするための方法、および副腎白質ジストロフィーの治療および／または予防に使用するためのフィンゴリモド、その類似体、代謝産物もしくは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の副腎白質ジストロフィーを診断するための方法であって、前記被験体から得たサンプル中の
−スフィンゴシン−１−ホスフェートのレベル、
−スフィンゴシン−２−ホスフェートキナーゼの発現レベル、
−スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体の発現レベル、
−アディポネクチンの発現レベル、
−ネオプテリンのレベル、
−第１表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第２表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第３表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第４表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第５表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル、
−第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第７表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル、および
−第８表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル
からなる群から選択される値を決定することを含み、
ここで、
参照値に対する
スフィンゴシン−１−ホスフェートのレベル上昇、
スフィンゴシン−２−ホスフェートキナーゼのレベル上昇、
スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体のレベル上昇、
アディポネクチンの発現レベル低下、
ネオプテリンのレベル上昇、
第１表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第２表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第３表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第４表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第５表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル上昇、
第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第７表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル上昇、
および／または
第８表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル上昇
が、被験体の副腎白質ジストロフィーへの罹患を示すとし、
前記値が腫瘍壊死因子Ａの発現レベルである場合には、炎症性脱髄を伴わない副腎白質ジストロフィーの発生を示すとする、方法。
【請求項２】
副腎白質ジストロフィーに罹患した被験体における副腎白質ジストロフィーの進行をモニターするための方法であって、前記被験体から得たサンプル中の
−スフィンゴシン−１−ホスフェートのレベル、
−スフィンゴシン−２−ホスフェートキナーゼの発現レベル、
−スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体の発現レベル、
−アディポネクチンの発現レベル、
−ネオプテリンのレベル、
−第１表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第２表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第３表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第４表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第５表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル、
−第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第７表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル、および
−第８表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル
からなる群から選択される値を決定することを含み、
ここで、
同被験体から早期に得たサンプルの決定された値に対する
スフィンゴシン−１−ホスフェートのレベル上昇、
スフィンゴシン−２−ホスフェートキナーゼのレベル上昇、
スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体のレベル上昇、
アディポネクチンの発現レベル低下、
ネオプテリンのレベル上昇、
第１表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第２表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第３表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第４表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第５表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル上昇、
第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第７表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル上昇、
および／または
第８表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル上昇
が、副腎白質ジストロフィーの悪化を示すとし、または、
同被験体から早期に得たサンプルの決定された値に対する
スフィンゴシン−１−ホスフェートのレベル低下、
スフィンゴシン−２−ホスフェートキナーゼのレベル低下、
スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体のレベル低下、
アディポネクチンの発現レベル上昇、
ネオプテリンのレベル低下、
第１表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第２表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第３表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第４表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第５表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル低下、
第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第７表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル低下、
および／または
第８表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル低下
が、副腎白質ジストロフィーの寛解を示すとする、方法。
【請求項３】
副腎白質ジストロフィーに罹患した被験体における副腎白質ジストロフィーの治療法の効果をモニターするための方法であって、前記被験体から得たサンプル中の
−スフィンゴシン−１−ホスフェートのレベル、
−スフィンゴシン−２−ホスフェートキナーゼの発現レベル、
−スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体の発現レベル、
−アディポネクチンの発現レベル、
−ネオプテリンのレベル、
−第１表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第２表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第３表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第４表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第５表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル、
−第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第７表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル、および
−第８表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル
からなる群から選択される値を決定することを含み、
ここで、
前記治療法を行う前に決定した値に対する
スフィンゴシン−１−ホスフェートのレベル上昇、
スフィンゴシン−２−ホスフェートキナーゼのレベル上昇、
スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体のレベル上昇、
アディポネクチンの発現レベル低下、
ネオプテリンのレベル上昇、
第１表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第２表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第３表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第４表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第５表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル上昇、
第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第７表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル上昇、
および／または
第８表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル上昇
が、前記治療法が有効ではないことを示すとし、または、
前記治療法を行う前に決定した値に対する
スフィンゴシン−１−ホスフェートのレベル低下、
スフィンゴシン−２−ホスフェートキナーゼのレベル低下、
スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体のレベル低下、
アディポネクチンの発現レベル上昇、
ネオプテリンのレベル低下、
第１表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第２表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第３表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第４表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第５表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル低下、
第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第７表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル低下、
および／または
第８表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル低下
が、前記治療法が有効であることを示すとする、方法。
【請求項４】
前記治療法が抗酸化化合物を含むものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗酸化化合物が、Ｎ−アセチルシステイン、リポ酸、およびビタミンＥの組み合わせである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記副腎白質ジストロフィーが、炎症性脱髄を伴わずに発生する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが、末梢単核細胞を含むサンプルである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記副腎白質ジストロフィーが、成人副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）、大脳副腎脊髄ニューロパチー（ｃＡＭＮ）、および副腎白質ジストロフィーの小児型（ｃＡＬＤ）からなる群から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
副腎白質ジストロフィーの治療および／または予防に使用するための、スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤。
【請求項１０】
フィンゴリモド、その類似体、代謝産物、もしくは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩である、請求項９に記載の使用のためのスフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤。
【請求項１１】
前記フィンゴリモド類似体がシポニモドである、請求項１０に記載の使用のためのスフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤。
【請求項１２】
前記副腎白質ジストロフィーが、成人副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）、大脳副腎脊髄ニューロパチー（ｃＡＭＮ）、および副腎白質ジストロフィーの小児型（ｃＡＬＤ）からなる群から選択される、請求項９から１１のいずれか一項に記載の使用のためのスフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤。
【請求項１３】
スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤と、アルファリポ酸、ビタミンＥ、およびＮ−アセチルシステインから選択される抗酸化剤、ミトコンドリアを標的とした抗酸化剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ミトコンドリア膜透過性遷移孔開口の阻害剤、抗炎症薬、ＰＰＡＲアゴニスト、ＲＸＲアゴニスト、サーチュイン１アゴニスト、脂質降下薬、ヘキサコサン酸（Ｃ２６：０）の循環レベルを低下させる脂肪酸組成物、ならびにオートファジー活性化因子からなる群から選択される１つ以上の薬物とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１４】
前記スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤が、フィンゴリモド、その類似体、代謝産物、もしくは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記フィンゴリモド類似体がシポニモドである、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
副腎白質ジストロフィーの治療および／または予防に使用するための、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記副腎白質ジストロフィーが、成人副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）、大脳副腎脊髄ニューロパチー（ｃＡＭＮ）、および副腎白質ジストロフィーの小児型（ｃＡＬＤ）からなる群から選択される、請求項１６に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１８】
前記阻害剤が、請求項１、２、または５から１０のいずれか一項に記載の方法を用いて診断を受けた患者に投与される、請求項９から１２のいずれか一項に記載の使用のためのスフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤または請求項１６もしくは１７に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１９】
患者が前記阻害剤または前記医薬組成物を投与される前に、請求項１、２、または５から１０のいずれか一項に記載の方法を用いた診断を受ける、請求項１８に記載の使用のためのスフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤または医薬組成物。
【請求項２０】
前記副腎白質ジストロフィーが炎症性脱髄を伴わずに発生する、請求項９から１２のいずれか一項に記載の使用のためのスフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤または請求項１６または１７に記載の使用のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は診断および治療の分野に関し、さらに詳細には副腎白質ジストロフィーの診断および治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
新生児１７，０００人に１人が罹患するＸ連鎖性副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ、ＯＭＩＭ番号３００１００）は、最も一般的な、単一遺伝子による白質ジストロフィーおよびペルオキシソーム病である。Ｘ−ＡＬＤは、脳における中枢性の炎症性脱髄、および／または緩やかに進行して脊髄における軸索変性をもたらす痙性対麻痺によって特徴付けられる。Ｘ−ＡＬＤはＡＢＣＤ１遺伝子（Ｘｑ２８）の変異によって引き起こされ、この遺伝子は超長鎖脂肪酸（Ｃ＞２２：０）および超長鎖脂肪酸ＣｏＡエステルの、分解のためのペルオキシソームへの移入に不可欠なペルオキシソーム膜タンパク質であるＡＴＰ結合カセット輸送体をコードする。ＡＢＣＤ１輸送体の機能欠損により、臓器や組織への超長鎖脂肪酸が蓄積され、かつ超長鎖脂肪酸のβ−酸化が損なわれる。特にヘキサコサン酸（Ｃ２６：０）は、特徴的な疾病マーカーである。
【０００３】
この疾病には３つの主要な型が報告されている。１つは成人にみられる遅発型で、副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）として知られている。患者は末梢神経障害および脊髄の皮質脊髄路に関連する遠位軸索障害を呈するが、主な症状としての明らかな炎症性脱髄と痙性対麻痺は示さない。この形態は、最終的には成人における大脳の炎症性脱髄を伴う致死型であるｃＡＭＮに進展し得る。小児期の大脳における形態であるｃＡＬＤにも、同様の転帰がみられる。今日、ｃＡＬＤ患者への治療は同種骨髄移植のみであるが、これには高い罹患率と死亡率が伴い、ほとんど無症状Ｘ−ＡＬＤ小児患者のみに利用可能である。ごく最近、レンチウイルスベクターを用いて、ＡＢＣＤ１  ｃＤＮＡによりＣＤ３４＋細胞を補正した遺伝子療法のアプローチが成功し、移植に代わる侵襲の少ない方法であることが証明された。
【０００４】
対照的に、今日までにＡＭＮ患者への満足できる治療法はみつかっていない。疾病の基礎をなす病理機序についての研究によれば、過剰なＣ２６：０はミトコンドリアの酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）機能を阻害し、ミトコンドリアのＲＯＳを誘発すると仮定されている。これによってミトコンドリアの生合成およびミトコンドリアのカルシウムシグナル伝達が妨害されることから、ミトコンドリアとペルオキシソーム間のクロストークが強調され、本疾病の原因としてのミトコンドリアの二次的関与が指摘される。薬物の標的となり得る、これらの経路における標的、例えばＰＧＣ−１α、Ｓｉｒｔ１、またはｍＴＯＲが同定され、Ａｂｃｄ１−マウスモデル（ＡＭＮのモデル）における前臨床試験が成功して、臨床試験が可能となった。Ｘ−ＡＬＤの全体的な臨床スペクトルは単一遺伝子ＡＢＣＤ１の変異によって始まるが、脱髄、炎症過程、軸索変性、および副腎不全の病理機序は明らかに異なる。したがって、Ｘ−ＡＬＤ／ＸＡＭＮの臨床症状を決定的に形作るさらなる病原性因子が存在するはずである。神経組織に存在する幾つかの分子的病変は、過剰なＣ２６：０と共にインキュベーションすることにより、線維芽細胞またはその他の細胞において再現可能であり、これらにはプロテアソームおよびミトコンドリア区画の酸化ストレスまたは機能障害が含まれる。このような知見にも関わらず、ペルオキシソームの脂肪酸代謝における単一の欠陥が、多様な神経性の表現型をどのように誘発し得るかについては不明確である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、疾病の診断のみではなく、その進行と治療法の効果をモニターすることが可能になる、本疾病の新しいバイオマーカーが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
驚くべきことに本発明者らは、Ｘ−ＡＬＤ患者ではスフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）経路が亢進しており、ＳＰＨＫ２酵素およびスフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１のレベル、ならびにＳＰＨＫの産物であるスフィンゴシン−１−ホスフェート（Ｓ１Ｐ）のレベルの増大がもたらされることを見出した（実施例１）。さらに、Ｘ−ＡＬＤ患者の非標的メタボロームアッセイをＡｂｃｄ１−マウス脊髄の機能ゲノミクス解析と組み合わせることで、本発明者らはＸ−ＡＬＤ患者におけるレベルが変化している一連のバイオマーカーを同定した（実施例２）。したがって、そのような分子のレベルを、Ｘ−ＡＬＤの診断および疾病進行のモニターのため、またはＸ−ＡＬＤ患者が治療法に応答するか否かを判定するために用いることが可能になる。
【０００７】
したがって第一の態様において、本発明は、被験体の副腎白質ジストロフィーを診断するための方法に関し、該方法は、前記被験体から得たサンプル中の
−スフィンゴシン−１−ホスフェートのレベル、
−スフィンゴシンキナーゼ２の発現レベル、
−スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体の発現レベル、
−アディポネクチンの発現レベル、
−ネオプテリンのレベル、
−第１表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第２表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第３表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第４表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第５表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル、
−第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第７表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル、および
−第８表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル
からなる群から選択される値を決定することを含み、
ここで、
参照値に対する
スフィンゴシン−１−ホスフェートのレベル上昇、
スフィンゴシンキナーゼ２のレベル上昇、
スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体のレベル上昇、
アディポネクチンの発現レベル低下、
ネオプテリンのレベル上昇、
第１表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第２表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第３表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第４表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第５表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル上昇、
第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第７表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル上昇、
および／または
第８表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル上昇
は、被験体の副腎白質ジストロフィーへの罹患を示すとし、
前記値が腫瘍壊死因子Ａの発現レベルである場合には、炎症性脱髄を伴わない副腎白質ジストロフィーの発生を示すとする。
【０００８】
第二の態様において、本発明は、副腎白質ジストロフィーに罹患した被験体における副腎白質ジストロフィーの進行をモニターするための方法に関し、該方法は、前記被験体から得たサンプル中の
−スフィンゴシン−１−ホスフェートのレベル、
−スフィンゴシンキナーゼ２の発現レベル、
−スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体の発現レベル、
−アディポネクチンの発現レベル、
−ネオプテリンのレベル、
−第１表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第２表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第３表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第４表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第５表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル、
−第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第７表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル、および
−第８表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル
からなる群から選択される値を決定することを含み、
ここで、
同被験体から早期に得たサンプルの決定された値に対する
スフィンゴシン−１−ホスフェートのレベル上昇、
スフィンゴシンキナーゼ２のレベル上昇、
スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体のレベル上昇、
アディポネクチンの発現レベル低下、
ネオプテリンのレベル上昇、
第１表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第２表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第３表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第４表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第５表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル上昇、
第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第７表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル上昇、
および／または
第８表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル上昇
は、副腎白質ジストロフィーの悪化を示すとし、または、
同被験体から早期に得たサンプルの決定された値に対する
スフィンゴシン−１−ホスフェートのレベル低下、
スフィンゴシンキナーゼ２のレベル低下、
スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体のレベル低下、
アディポネクチンの発現レベル上昇、
ネオプテリンのレベル低下、
第１表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第２表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第３表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第４表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第５表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル低下、
第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第７表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル低下、
および／表または
第８表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル低下
は、副腎白質ジストロフィーの寛解を示すとする。
【０００９】
第三の態様において、本発明は、副腎白質ジストロフィーに罹患した被験体における副腎白質ジストロフィーの治療法の効果をモニターするための方法に関し、該方法は、前記被験体から得たサンプル中の
−スフィンゴシン−１−ホスフェートのレベル、
−スフィンゴシンキナーゼ２の発現レベル、
−スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体の発現レベル、
−アディポネクチンの発現レベル、
−ネオプテリンのレベル、
−第１表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第２表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第３表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第４表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第５表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル、
−第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第７表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル、および
−第８表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル
からなる群から選択される値を決定することを含み、
ここで、
前記治療法を行う前に決定した値に対する
スフィンゴシン−１−ホスフェートのレベル上昇、
スフィンゴシンキナーゼ２のレベル上昇、
スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体のレベル上昇、
アディポネクチンの発現レベル低下、
ネオプテリンのレベル上昇、
第１表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第２表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第３表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第４表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第５表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル上昇、
第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第７表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル上昇、
および／または
第８表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル上昇
は、前記治療法が有効ではないことを示すとし、または、
前記治療法を行う前に決定した値に対する
スフィンゴシン−１−ホスフェートのレベル低下、
スフィンゴシンキナーゼ２のレベル低下、
スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体のレベル低下、
アディポネクチンの発現レベル上昇、
ネオプテリンのレベル低下、
第１表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第２表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第３表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第４表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第５表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル低下、
第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第７表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル低下、
および／または
第８表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル低下
は、前記治療法が有効であることを示すとする。
【００１０】
加えて、本発明者らは抗酸化剤によるＸ−ＡＬＤ患者の治療がＳ１Ｐレベルを低下させることも見出した。これはＳ１Ｐレベルを低下させる分子、例えばフィンゴリモドのようなＳ１ＰＲ１の阻害剤を用いたＸ−ＡＬＤの治療への扉を開くものである。
【００１１】
したがって、第四の態様において、本発明は、副腎白質ジストロフィーの治療および／または予防に用いる、スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤に関する。
【００１２】
第五の態様において、本発明は、スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤と、アルファリポ酸、ビタミンＥ、およびＮ−アセチルシステインから選択される抗酸化剤、ミトコンドリアを標的とした抗酸化剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ミトコンドリア膜透過性遷移孔開口の阻害剤、抗炎症薬、ＰＰＡＲアゴニスト、ＲＸＲアゴニスト、サーチュイン１アゴニスト、脂質降下薬、ヘキサコサン酸（Ｃ２６：０）の循環レベルを低下させる脂肪酸組成物、ならびにオートファジー活性化因子からなる群から選択される１つ以上の薬物とを含んでなる医薬組成物に関する。
【００１３】
第六の態様において、本発明は、副腎白質ジストロフィーの治療および／または予防に使用するための、第五の態様の医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ａ．ＡＭＮ患者の末梢単核細胞におけるスフィンゴシン−２−ホスファターゼキナーゼおよびスフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１のレベルが、健常者対照に比較して上昇していることを示した図である。Ｑ−ＰＣＲの結果を示す。Ｂ．抗酸化剤による治療前後の、ＡＭＮ患者の末梢単核細胞におけるスフィンゴシン−１−ホスフェートのレベルを、健常者対照に比較して示した図である。レベルはＨＰＬＣ１２９０シリーズとＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦとを組み合わせて分析した。メタボローム解析の結果。有意差はＡＮＯＶＡとそれに続くチューキーＨＳＤ事後検定によって決定した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図２】ＡＭＮ患者の体液中のエイコサノイド、酸化した多価不飽和脂肪酸、およびアディポカインのレベルを示した図である（ｎ＝１３のＡＭＮ患者および年齢と性別が一致した１３人の健常人）。（Ａ）３．５および１２か月齢のＡｂｃｄ１−脊髄におけるＢ４ｇａｌｔ６、Ｐｌａ２ｇ４ｃ、Ｃｅｐｔ１、Ｒｄｈ１１、Ｃｙｐ２７ａ１、Ｐｐａｒα、Ｐｐａｒβ／δ、Ｐｐａｒγ、およびＧｐｘ４遺伝子の発現。遺伝子発現は、参照用の対照遺伝子であるマウスＲｐｌ０に対して標準化した。（Ｂ）ＡＭＮ患者および健常者対照から得たＰＢＭＣにおけるＢ４ＧＡＬＴ６、ＰＬＡ２Ｇ４Ｃ、ＣＥＰＴ１、ＲＤＨ１１、ＣＹＰ２７Ａ１、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ／δ、ＰＰＡＲγ、およびＧＰＸ４遺伝子の発現。遺伝子発現は、参照用の対照遺伝子であるヒトＲＰＬ０に対して標準化した。（Ｃ）炎症関連脂質であるアラキドン酸（ＡＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、プロスタグランジンＤ２、Ｅ２およびＦ２α（ＰＧＤ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２α）、６−ケト−ＰＧＦ１α、（±）９−ヒドロキシ−１０Ｅ、１２Ｚオクタデカジエン酸（９Ｓ−ＨＯＤＥ）、（±）１３（Ｓ）−ヒドロキシ−９Ｚ、１１Ｅオクタデカジエン酸（１３Ｓ−ＨＯＤＥ）、（±）１２−、および１５−ヒドロキシ−５Ｚ、８Ｚ、１１Ｚ、１３Ｅエイコサテトラエン酸（１２Ｓ−ＨＥＴＥおよび１５Ｓ−ＨＥＴＥ）、ならびにトロンボキサンＢ２（ＴＸＢ２）の相対的レベル。（Ｄ）ＡＭＮ患者および対照から得た血清中のＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＩＬ６、ＩＬ８、ＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質−１またはＣＣＬ２）、ＮＧＦ（神経成長因子）、ＴＮＦα、レプチン、アディポネクチン、総ＰＡＩ−１（プラスミノーゲン活性化抑制因子−１）、およびレジスチンのレベルを、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ技術を用いて定量した。値は平均±ＳＥＭである。有意差は、シャピロ・ウィルク正規性検定に従い、片側スチューデントｔ検定（＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１）またはウィルコクソン順位和検定（＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、および＃＃＃Ｐ＜０．００１）によって決定した。
【図３】ＡＭＮ患者から得たＰＢＭＣのシグナル伝達に関連する炎症性サイトカイン、ケモカイン、および受容体を示した図である（ｎ＝１３のＡＭＮ患者および年齢と性別が一致した１３人の健常人）。（Ａ）Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙ  ＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  Ｑ−ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ（Ｑｉａｇｅｎ）の８４遺伝子の発現。遺伝子発現は内部対照に対して標準化した。（Ｂ）ＡＭＮ患者および健常者対照から得たＰＢＭＣにおけるＩＬ４、ＩＬ６、ＳＴＡＴ６、ＳＯＣＳ３、およびＳＴＡＴ１遺伝子の発現。遺伝子発現は、参照用の対照遺伝子であるヒトＲＰＬ０に対して標準化した。遺伝子は、Ｔｈ２およびＴｈ１／Ｔｈ１７の極性形成の役割に従って分類した。値は平均±ＳＥＭを表す。有意差は、シャピロ・ウィルク正規性検定に従い、片側スチューデントｔ検定（＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１）またはウィルコクソン順位和検定（＃Ｐ＜０．０５および＃＃Ｐ＜０．０１）によって決定した。
【図４】フィンゴリモドおよびシポニモドが、Ａｂｃｄ１−／Ａｂｃｄ２−／−マウスの自発運動障害を予防することを示した図である。（Ａ〜Ｂ）１６か月齢のＷＴ、Ａｂｃｄ１−／Ａｂｃｄ２−／−（ＤＫＯ）、フィンゴリモド処置Ａｂｃｄ１−／Ａｂｃｄ２−／−（ＤＫＯ＋フィンゴリモド）、およびシポニモド処置Ａｂｃｄ１−／Ａｂｃｄ２−／−（ＤＫＯ＋シポニモド）にトレッドミル（Ａ）およびバークロス（Ｂ）試験を行った。処置は１２か月齢に開始して４か月間行った。（Ａ）統計解析には各動物の平均（平均）および最高成績（最大）スコアを用いた。ベルトからの落下までの潜時（ショック時間）および受けたショックの回数を５分後に計算した。（Ｂ）バーを越えるまでに要した時間および滑り落ちの回数を数値化した。値は平均±ＳＤ（Ａ〜Ｃでは１条件あたりｎ＝１６＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くチューキーＨＳＤ事後検定）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の診断方法
第一の態様において、本発明は、被験体の副腎白質ジストロフィーを診断するための方法に関し、該方法は以下、本発明の診断方法または本発明の第一の方法と称され、前記被験体から得たサンプル中の
−スフィンゴシン−１−ホスフェートのレベル、
−スフィンゴシンキナーゼ２の発現レベル、
−スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体の発現レベル、
−アディポネクチンの発現レベル、
−ネオプテリンのレベル、
−第１表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第２表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第３表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第４表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第５表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル、
−第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第７表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル、および
−第８表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル
からなる群から選択される値を決定することを含み、
ここで、
参照値に対する
スフィンゴシン−１−ホスフェートのレベル上昇、
スフィンゴシンキナーゼ２のレベル上昇、
スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体のレベル上昇、
アディポネクチンの発現レベル低下、
ネオプテリンのレベル上昇、
第１表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第２表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第３表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第４表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第５表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル上昇、
第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第７表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル上昇、
および／または
第８表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル上昇
は、被験体の副腎白質ジストロフィーへの罹患を示すとし、
前記値が腫瘍壊死因子Ａの発現レベルである場合には、炎症性脱髄を伴わない副腎白質ジストロフィーの発生を示すとする。
【００１６】
本明細書で用いられる用語「診断」は、被験体において可能性のある疾病を決定および／または同定しようと試みるための方法、すなわち診断手順、およびこの方法によって到達した見解、すなわち診断上の見解の両方を指す。このように「診断」は、個人の状態を、治療および予後についての医学的決定を可能にする別々の異なったカテゴリーへ分類する試みともみなされ得る。特に用語「副腎白質ジストロフィーの診断」は、被験体に副腎白質ジストロフィーが存在することを同定または検出する能力に関する。当業者の理解によれば、この診断は、分析したサンプルの１００％において正確であると断言するものではない。しかしながら、分析したサンプルの統計的に有意な量が正確に分類されていることが求められる。統計的に有意な量は、当業者により様々な統計ツールを用いて確立できる。このような統計ツールの実例としては、信頼区間の決定、ｐ値の決定、スチューデントｔ検定、またはフィッシャーの判別関数などが挙げられるが（例えばＤｏｗｄｙ  ａｎｄ  Ｗｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８３を参照）、これらに限定されない。信頼区間は、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％である。ｐ値は、好ましくは０．１未満、０．０５未満、０．０１未満、０．００５未満、または０．０００１未満である。本発明の教示は、好ましくは解析後に決定した群または集団内の被験体のうち、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の正確な診断を可能にする。
【００１７】
本明細書で用いられる用語「副腎白質ジストロフィー」または「Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィー」または「ＡＬＤ」または「Ｘ−ＡＬＤ」は、単一遺伝子による白質ジストロフィー（ミエリンの異常な形成、代謝回転、または破壊によって特徴付けられる疾患群）を指し、これによって脳、副腎、末梢神経系の進行性の損傷、および最終的には死がもたらされる。特定の実施形態において、副腎白質ジストロフィーは、
−成人副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）：末梢神経障害および脊髄の遠位軸索障害によって特徴付けられるが、炎症性脱髄の徴候を示さない遅発型、
−脳の炎症性脱髄を伴う大脳副腎脊髄ニューロパチー（ｃＡＭＮ）、および
−重度な大脳の炎症性脱髄によって特徴付けられる、小児大脳型（ｃＡＬＤ）
からなる群から選択される。
【００１８】
さらに好ましい実施形態において、副腎白質ジストロフィーは副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）である。
【００１９】
本発明の診断方法に従って決定された値がＴＮＦＡの発現レベルである場合、すなわちバイオマーカーがＴＮＦＡである場合、ＡＬＤは炎症性脱髄を伴わずに発生する。本発明の診断方法に従って決定された値がＴＮＦＡの発現レベルでない場合、すなわちバイオマーカーがＴＮＦＡでない場合、ＡＬＤは炎症性脱髄を伴うかまたは伴わずに発生し得る。特定の実施形態において、ＡＬＤは炎症性脱髄を伴わずに発生する。
【００２０】
本明細書で用いられる用語「炎症性脱髄」は、脳実質への末梢免疫細胞の誘導および浸潤によってもたらされる、神経組織（限定はされないが、例えば神経細胞またはグリア細胞（例えば乏突起膠細胞）のような中枢神経系の細胞、または神経突起、軸索、もしくはミエリンのような、それらの特異的断片）の損傷または破壊によって特徴付けられる病理学的状態を指す。特に、炎症性脱髄は、炎症誘発性サイトカインを放出するミクログリア細胞の活性化によって、および／または、Ｔおよび／またはＢ細胞および／または単球／マクロファージの活性化によって誘発され得る。
【００２１】
用語「被験体」は、哺乳類に分類されるすべての動物を指し、限定はされないが、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌｓ）、霊長類およびヒト、例えばヒト、非ヒト霊長類、雌ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、またはげっ歯類を含む。好ましくは、被験体はいずれかの年齢もしくは人種の、男性または女性のヒトである。
【００２２】
本明細書で用いられる用語「サンプル」は、被験体から分離された生物由来物質を指す。生体サンプルは、ＲＮＡ、タンパク質、または脂質のレベル検出に適した、いずれかの生物由来物質を含む。特定の実施形態において、サンプルは研究される被験体由来の遺伝物質、例えばＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ、ヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）、ｍＲＮＡなどを含む。サンプルは、いずれかの適切な組織または体液、例えば血液、唾液、血漿、血清、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、糞便、外科的検体、生検によって得た検体、およびパラフィン包埋した組織サンプルから分離できる。特定の実施形態において、本発明の方法に従って被験体から得たサンプルは、血清、血漿、および末梢血単核細胞すなわち「ＰＢＭＣ」を含むサンプルからなる群から選択される。さらに特定の実施形態において、サンプルは、ＰＢＭＣを含むサンプルである。さらになお特定の実施形態において、ＰＢＭＣを含むサンプルは血液である。特定の実施形態において、マーカーがアディポネクチン、または第１表、第２表、第６表、もしくは第７表に示すマーカーの１つである場合、サンプルは血清または血漿である。別の特定の実施形態において、サンプルがスフィンゴシン−１−ホスフェート、スフィンゴシン−２−ホスフェートキナーゼ、スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体、または第３表、第４表、第５表、もしくは第８表に示すマーカーの１つである場合、サンプルは、ＰＢＭＣを含むサンプルである。
【００２３】
本明細書で用いられる用語「マーカー」または「バイオマーカー」は、その発生や量が特定の状況、例えばＡＬＤに特徴的な、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物または代謝産物のような生体分子を指す。
【００２４】
本発明の診断方法に有用なマーカーを以下に挙げる。
・スフィンゴシン−１−ホスフェート
本明細書で用いられる用語「スフィンゴシン−１−ホスフェート」または「Ｓ１Ｐ」または「リゾスフィンゴ脂質」は、以下の式で表されるシグナル伝達スフィンゴ脂質を指す。
【化１】
2018529081.tif 000002
【００２５】
・スフィンゴシンキナーゼ２
本明細書で用いられる用語「スフィンゴシンキナーゼ２」または「ＳＰＨＫ２」は、スフィンゴシンのリン酸化を触媒してスフィンゴシン−１−ホスフェートを形成する酵素の核アイソフォームをコードする遺伝子を指す。ヒトでは、この遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ遺伝子ＩＤ５６８４８（２０１５年５月４日公開）に対応し、前記遺伝子によってコードされるタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースにおいて受託番号Ｑ９ＮＲＡ０（２０１５年４月２９日公開）により定義される。
【００２６】
・スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１
本明細書で用いられる用語「スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１」または「Ｓ１ＰＲ１」は、スフィンゴシン−１−ホスフェートのＧタンパク質共役型受容体をコードする遺伝子を指す。ヒトでは、この遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ遺伝子ＩＤ８８７９（２０１５年５月４日公開）に対応し、前記遺伝子によってコードされるタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースにおいて受託番号Ｐ２１４５３（２０１５年４月２９日公開）により定義される。
【００２７】
・アディポネクチン
本明細書で用いられる用語「アディポネクチン」または「ＡＤＩＰＯＱ」は、脂質代謝およびインスリン感受性の制御に関わるアディポカインをコードする遺伝子を指す。ヒトでは、この遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ遺伝子ＩＤ９３７０（２０１５年５月１７日公開）に対応し、前記遺伝子によってコードされるタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースにおいて受託番号Ｑ１５８４８（２０１５年４月２９日公開）により定義される。
【００２８】
・ネオプテリン
本明細書で用いられる用語「ネオプテリン」は、以下の式で表されるプテリジンを指す。
【化２】
2018529081.tif 000003
【００２９】
・第１表に示すマーカー
【表１】
2018529081.tif 000004
【００３０】
・第２表に示すマーカー
【表２】
2018529081.tif 000005
【表３】
2018529081.tif 000006
【表４】
2018529081.tif 000007
【表５】
2018529081.tif 000008
【００３１】
・第３表に示すマーカー
【表６】
2018529081.tif 000009
【表７】
2018529081.tif 000010
【表８】
2018529081.tif 000011
【表９】
2018529081.tif 000012
【表１０】
2018529081.tif 000013
【表１１】
2018529081.tif 000014
【表１２】
2018529081.tif 000015
【表１３】
2018529081.tif 000016
【表１４】
2018529081.tif 000017
【表１５】
2018529081.tif 000018
【表１６】
2018529081.tif 000019
【表１７】
2018529081.tif 000020
【表１８】
2018529081.tif 000021
【表１９】
2018529081.tif 000022
【表２０】
2018529081.tif 000023
【表２１】
2018529081.tif 000024
【００３２】
・第４表に示すマーカー
【表２２】
2018529081.tif 000025
【表２３】
2018529081.tif 000026
【表２４】
2018529081.tif 000027
【表２５】
2018529081.tif 000028
【００３３】
・第５表に示すマーカー
【表２６】
2018529081.tif 000029
【００３４】
・第６表に示すマーカー
【表２７】
2018529081.tif 000030
【００３５】
・第７表に示すマーカー
【表２８】
2018529081.tif 000031
【００３６】
・第８表に示すマーカー
【表２９】
2018529081.tif 000032
【表３０】
2018529081.tif 000033
【表３１】
2018529081.tif 000034
【００３７】
特定の実施形態において、本発明の診断方法は、被験体から得たサンプル中のスフィンゴシン−１−ホスフェートのレベルを決定することを含む。別の特定の実施形態において、本発明の診断方法は、被験体から得たサンプル中の、
−スフィンゴシン−１−ホスフェート、
−スフィンゴシン−２−ホスフェートキナーゼ、
−スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体、
−アディポネクチン、
−ネオプテリン、
−第１表に示すマーカー、
−第２表に示すマーカー、
−第３表に示すマーカー、
−第４表に示すマーカー、
−第５表に示すマーカー、
−第６表に示すマーカー、
−第７表に示すマーカー、および
−第８表に示すマーカー、
からなる群のマーカーのいずれかの組み合わせのレベルを決定することを含む。
【００３８】
特定の実施形態において、本発明の診断方法は、被験体から得たサンプル中のＴＡＧ（６３：２）のレベルを決定することを含む。
【００３９】
特定の実施形態において、本発明の診断方法は、被験体から得たサンプル中のスフィンゴシン−１−ホスフェートおよびＴＡＧ（６３：２）のレベルを決定することを含む。
【００４０】
特定の実施形態において、本発明の診断方法は、被験体から得たサンプル中の１２−Ｓ−ＨＥＴＥおよびアディポネクチンのレベルを決定することを含む。
【００４１】
特定の実施形態において、本発明の診断方法は、被験体から得たサンプル中の１５−Ｓ−ＨＥＴＥのレベルを決定することを含む。特定の実施形態において、本発明の診断方法は、被験体から得たサンプル中のＭＣＰ−１のレベルを決定することを含む。
【００４２】
特定の実施形態において、本発明の診断方法は、被験体から得たサンプル中の、第７表に示す少なくとも１つのマーカーのレベルおよびアディポネクチンの発現レベルから選択される値を決定することを含む。さらに特定の実施形態において、本発明の診断方法は、被験体から得たサンプル中の第７表に示すマーカーのレベルおよびアディポネクチンの発現レベルを決定することを含む。
【００４３】
別の特定の実施形態において、本発明の診断方法は、被験体から得たサンプル中の、第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベルを決定することを含む。さらに特定の実施形態において、本発明の診断方法は、被験体から得たサンプル中の、第６表に示すマーカーのレベルを決定することを含む。
【００４４】
別の特定の実施形態において、本発明の診断方法は、被験体から得たサンプル中の、ＩＬ９、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２６、ＣＸＣＬ１２、およびＣＣＲ８から選択される少なくとも１つのマーカーの発現レベルを決定することを含む。さらに特定の実施形態において、本発明の診断方法は、被験体から得たサンプル中の、ＩＬ９、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２６、ＣＸＣＬ１２、およびＣＣＲ８の発現レベルを決定することを含む。
【００４５】
別の特定の実施形態において、本発明の診断方法は、被験体から得たサンプル中の、ＩＬ３６Ａ、ＩＬ３６Ｂ、ＩＬ３６Ｇ、ＩＬ３６ＲＮ、ＩＦＮＡ２、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＲ１、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、およびＣＡＲＤ１８から選択される少なくとも１つのマーカーの発現レベルを決定することを含む。さらに特定の実施形態において、本発明の診断方法は、被験体から得たサンプル中の、ＩＬ３６Ａ、ＩＬ３６Ｂ、ＩＬ３６Ｇ、ＩＬ３６ＲＮ、ＩＦＮＡ２、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＲ１、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、およびＣＡＲＤ１８の発現レベルを決定することを含む。
【００４６】
本明細書で用いられる用語「レベル」は、サンプル中に検出されるバイオマーカーの量を指す。
【００４７】
本明細書で用いられる用語「発現レベル」は、被験体のサンプル中の、遺伝子によって産生される遺伝子産物の測定可能な量を指し、ここで遺伝子産物は転写産物または翻訳産物であってよい。当業者は、遺伝子発現レベルが、前記遺伝子のメッセンジャーＲＮＡのレベルまたは前記遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルを測定することによって定量できることを理解する。
【００４８】
本発明の診断方法に従ってマーカーのレベルを決定する方法は、マーカーのタイプ、すなわち脂質、極性代謝産物、または遺伝子に依存し得る。
【００４９】
本発明の診断方法に従ったマーカーが脂質である場合、マーカーのレベルは、サンプル中の脂質の決定および定量化に適した、当該技術分野において公知のいずれかの方法によって決定できる。限定されない実例として、特定の脂質のレベルは、クロマトグラフィー、マススペクトロメトリー、核共鳴分光法、蛍光分光法、または二面偏波式干渉分光法、ＨＰＬＣのような高速分離法、および／または免疫学的方法によって決定できる。特定の実施形態において、本発明の第一の方法に従ったマーカーが脂質である場合、前記バイオマーカーのレベルは、分離技術を脂質マーカーの同定および定量化の方法と組み合わせて用いることにより決定される。さらに特定の実施形態において、該分離技術はクロロホルム：メタノールによる抽出であり、脂質バイオマーカーの同定および定量化の方法は、クロマトグラフィー、好ましくはＲＰＬＣと、マススペクトロメトリー、好ましくはＱｑＴＯＦとの組み合わせである。
【００５０】
本明細書で用いられる用語「ＲＰＬＣ」または「逆相液体クロマトグラフィー」は、極性移動相および非極性固定相を用いて、混合物の成分を分離、同定、および定量する技術を指す。
【００５１】
本明細書で用いられる用語「ＭＳ」または「マススペクトロメトリー」は、タンデムマススペクトロメトリー、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）、飛行時間型（ＴＯＦ）マススペクトロメトリー、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦマススペクトロメトリー、ＭＡＬＤＩ四重極飛行時間型（Ｑ−ＴＯＦ）マススペクトロメトリー、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）−ＴＯＦマススペクトロメトリー、ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ、ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ、ＥＳＩイオントラップ型マススペクトロメトリー、ＥＳＩトリプル四重極マススペクトロメトリー、ＥＳＩフーリエ変換マススペクトロメトリー（ＦＴＭＳ）、ＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳ、ＭＡＬＤＩイオントラップ型ＴＯＦ、およびＥＳＩイオントラップ型ＴＯＦのような、様々な方法を指す。これらのマススペクトロメトリー法は当該技術分野において公知である。その最も基本的なレベルにおいて、マススペクトロメトリーは、分子をイオン化して得られたイオンの質量を測定することに関わる。分子は周知の方法でイオン化されているため、分子の分子量は一般にイオンの質量から正確に決定できる。ＭＳｎは、測定したイオンの同一性をさらに確実にするための、得られたイオンのその後の断片化を指す。例えば、ＭＳ２またはタンデムマススペクトロメトリー（ＭＳ／ＭＳ）は、親イオンの分子量に加えて情報を提供できるため、タンパク質の同定に用いられてもよい。タンデムマススペクトロメトリーは、最初に対象イオン（親イオン）の質量スペクトルを得た後、そのイオンを断片化して、断片（産物イオン）の質量スペクトルを得ることに関わる。特定の親イオン由来の産物イオンを定量することを移行と称する。したがってタンデムマススペクトロメトリーは、ペプチドもしくはタンパク質の正確な配列または特徴的な代謝産物の化学構造を同定するために、分子量情報と、分子量情報と組み合わせて使用できる断片化パターンとの両方を提供する。ＭＳ３では例えば、得られた産物イオンを断片化する（すなわち親イオンにおいてそれらを変換する）ことにより、定量化および／または特徴付けに有用な、新たな産物イオンのセットが得られる。本明細書で用いられる用語「ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ」または「四重極飛行時間型エレクトロスプレー」は、特定のイオンの電荷に対する質量の比が、最初の四重極から検出器までの飛行時間の測定によって決定される装置または質量分析計の使用からなるマススペクトロメトリー技術を指す。イオンは、決定された条件下での気体（通常は窒素）の流れにおいて、既知の源である電場を適用することによって、クロマトグラフィー溶離液から産生される。このイオン化手順はエレクトロスプレーと称される。得られたイオンを高真空システムに導入した後、あるレベルに調節した電場へこれらを曝露することによって、最初の四重極がイオンを加速する。その後、同じ電荷をもつすべてのイオンが同じ動的エネルギーを示す。したがって装置内の高真空におけるイオンの速度は、電荷に対する質量の比に依存し得る。距離が既知である場合、これらのイオンの「飛行時間」を測定することによって、同条件に供した、電荷に対する質量の比が既知である実験物質に基づき、電荷に対する質量の比を推定できる。用語「ＥＳＩ−ＱｑＱ」または「トリプル四重極エレクトロスプレー」は、３つの四重極の連続的使用により、上に定義した特定のマススペクトロメトリー移行の選択が可能になる、同様のマススペクトロメトリーシステムからなるマススペクトロメトリー技術を指す。
【００５２】
本発明の診断方法に従ったマーカーが極性代謝産物である場合、前記マーカーのレベルは、サンプル中の極性代謝産物の決定および定量化に適した、当該技術分野において公知のいずれかの方法によって決定できる。限定されない実例として、特定の極性代謝産物のレベルは、クロマトグラフィー、マススペクトロメトリー、核共鳴分光法、蛍光分光法、または二面偏波式干渉分光法、ＨＰＬＣのような高速分離法、および／または免疫学的方法によって決定できる。特定の実施形態において、本発明の診断方法に従ったマーカーが極性代謝産物である場合、前記マーカーのレベルは、分離技術を極性代謝産物の同定および定量化の方法と組み合わせて用いることにより決定される。さらに特定の実施形態において、該分離技術はメタノールによる抽出であり、極性代謝産物の同定および定量化の方法は、クロマトグラフィー、好ましくはＨＰＬＣと、マススペクトロメトリー、好ましくはＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦもしくはＥＳＩ−ＱｑＱまたは同様のＭＳｎ（ＭＳ／ＭＳまたはＭＳ／ＭＳ／ＭＳ）技術との組み合わせである。
【００５３】
本明細書で用いられる用語「ＨＰＬＣ」または「高速液体クロマトグラフィー」は、混合物の成分を分離、同定、および定量するために分析化学において用いられる技術を指し、ここで分離の程度は、移動相に圧力を加えて、支持マトリックス上の固定相、典型的には高密度に充てんされたカラムを通すことによって増大する。
【００５４】
本発明の診断方法に従ったマーカーが遺伝子である場合、前記遺伝子の発現レベルは、前記遺伝子のメッセンジャーＲＮＡのレベルまたは前記遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルを測定することによって決定できる。
【００５５】
メッセンジャーＲＮＡのレベルは、当該技術分野において周知の方法によって決定できる。例えば？に含まれる核酸は、最初に、標準法に従って、例えば溶解酵素または化学溶液を用いて抽出されるか、または製造者の指示に従って、核酸結合樹脂により抽出される。次に、抽出されたｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーション（例えばノーザンブロット分析、またはｍＲＮＡを標識ｃＤＮＡに転換した後のオリゴヌクレオチドマイクロアレイ）および／または増幅（例えばＲＴ−ＰＣＲ）によって検出される。定量または半定量ＲＴ−ＰＣＲが好ましい。リアルタイム定量または半定量ＲＴ−ＰＣＲが特に有利である。好ましくは、ｃＤＮＡの増幅を推定上のゲノム混入から区別するために、イントロンに重なるようなプライマーペアを設計した。適切なプライマーは、当業者によって容易に設計され得る。その他の増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。好ましくは、ｍＲＮＡの量は、定量または半定量ＲＴ−ＰＣＲによるか、またはリアルタイム定量または半定量ＲＴ−ＰＣＲによって測定される。
【００５６】
特定の実施形態において、本発明の診断方法に従ったマーカーがスフィンゴシンキナーゼ２および／またはスフィンゴシン−１−ホスフェート受容体である場合、前記マーカーの発現レベルは、それぞれのｍＲＮＡのレベルを測定することによって決定される。
【００５７】
タンパク質のレベルは、サンプル中のタンパク質の決定および定量化に適した、当該技術分野において公知のいずれかの方法によって決定できる。限定されない実例として、タンパク質のレベルは、測定するタンパク質（または抗原決定基を含むその断片）への特異的な結合能をもつ抗体の使用と、それに続く、得られた抗原−抗体複合体の定量化とを含む技術によるか、あるいは抗体の使用を含まない技術、例えば質量分析法に基づく技術によって決定できる。抗体は、モノクローナル、ポリクローナルまたはそれらの断片、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、およびヒト化抗体であってよい。同様に、抗体は標識されていてもよい。本発明に使用可能なマーカーの実例としては、放射性同位元素、酵素、フルオロフォア、化学発光試薬、酵素補助因子または基質、酵素阻害剤、粒子、または色素が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従って使用可能な公知の試験が広範囲に存在する。例えば非標識抗体（一次抗体）および標識抗体（二次抗体）、ウェスタンブロットまたは免疫ブロット、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、ＲＩＡ（放射性免疫測定法）、競合ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ（二抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）、二次元ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、免疫細胞化学および免疫組織化学技術、免疫比濁法、免疫蛍光法、特異的抗体、または試薬ストリップおよび抗体結合量子ドットに基づくアッセイの形態であるコロイド沈殿に基づくアッセイを含む、バイオチップまたはタンパク質マイクロアレイの使用に基づいた技術が、組み合わせて応用される。タンパク質を検出および定量するその他の形態には、例えばアフィニティークロマトグラフィー技術またはリガンド結合アッセイがある。
【００５８】
本発明の診断方法は、マーカーのレベルを参照値と比較することを含む。
【００５９】
本明細書で用いられる用語「参照値」は、被験体から集めたサンプルから得た値またはデータを評価するための参照として用いられる、予め決定された基準に関する。参照値または参照レベルは、絶対値、相対値、上限または下限の値、値の範囲、平均値（ａｎ  ａｖｅｒａｇｅ  ｖａｌｕｅ）、中央値、平均値（ａ  ｍｅａｎ  ｖａｌｕｅ）、または特定の対照またはベースライン値と比較した値であってよい。参照値は、個別のサンプル値、例えば試験される被験体のサンプルから得た値であるが、早期に得た値に基づいていてもよい。参照値は、多数のサンプル、例えば実際の年齢が一致する群の被験体集団から得たサンプルに基づいてよいか、または試験されるサンプルを含むかまたは含まないサンプルのプールに基づいていてもよい。
【００６０】
本発明の第一の方法に従った参照値は、ＡＬＤに罹患していない被験体（すなわち対照被験体）の１以上から得ることができる。被験体がＡＬＤの診断を受けていない場合には、ＡＬＤに罹患していないとみなされる。ＡＬＤの診断は以下の基準に従って行われる。ＡＬＤが疑われるのが男性の場合、ＡＬＤの診断は血漿中のＶＬＣＦＡ（超長鎖脂肪酸）レベルが上昇している際に行われ、ＡＢＣＤ１遺伝子の変異の同定によって確認される。ＡＬＤが疑われるのが女性の場合、診断用の検査としてＡＢＣＤ１遺伝子の変異の解析が選択される。その理由は、ＡＬＤをもつ女性の１５％は、血漿中のＶＬＣＦＡレベルが正常なためである。
【００６１】
本発明の診断方法によれば、マーカーのレベルまたは発現レベルが「低下」しているとみなされるのは、サンプル中の前記マーカーのレベル／発現レベルが参照値よりも低い場合である。マーカーのレベル／発現レベルが参照値よりも低いとみなされるのは、その参照値より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、またはそれを超えて低い場合である。
【００６２】
同様に、本発明の診断方法に関連して、マーカーのレベルまたは発現レベルが「上昇」しているとみなされるのは、サンプル中の前記マーカーのレベル／発現レベルが参照値よりも高い場合である。バイオマーカーのレベル／発現レベルが参照値よりも高いとみなされるのは、その参照値より少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、またはそれを超えて高い場合である。
【００６３】
副腎白質ジストロフィーの進行をモニターするための方法
第二の態様において、本発明は、副腎白質ジストロフィーに罹患した被験体における副腎白質ジストロフィーの進行をモニターするための方法に関し、該方法は以下、本発明の第二の方法と称され、前記被験体から得たサンプル中の
−スフィンゴシン−１−ホスフェートのレベル、
−スフィンゴシン−２−ホスフェートキナーゼの発現レベル、
−スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体の発現レベル、
−アディポネクチンの発現レベル、
−ネオプテリンのレベル、
−第１表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第２表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第３表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第４表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第５表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル、
−第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第７表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル、および
−第８表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル
からなる群から選択される値を決定することを含み、
ここで、
前記被験体から早期に得たサンプルの決定された値に対する
スフィンゴシン−１−ホスフェートのレベル上昇、
スフィンゴシン−２−ホスフェートキナーゼのレベル上昇、
スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体のレベル上昇、
アディポネクチンの発現レベル低下、
ネオプテリンのレベル上昇、
第１表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第２表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第３表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第４表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第５表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第７表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
および／または
第８表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
は、副腎白質ジストロフィーの悪化を示し、また、
前記被験体から早期に得たサンプルの決定された値に対する
スフィンゴシン−１−ホスフェートのレベル低下、
スフィンゴシン−２−ホスフェートキナーゼのレベル低下、
スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体のレベル低下、
アディポネクチンの発現レベル上昇、
ネオプテリンのレベル低下、
第１表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第２表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第３表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第４表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第５表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル低下、
第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第７表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル低下、
および／または
第８表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル低下
は、副腎白質ジストロフィーの寛解を示すとする。
【００６４】
用語「副腎白質ジストロフィー」、「サンプル」、「レベル」、「発現レベル」、「マーカー」、「上昇」、および「低下」については、本発明の第一の方法と関連させて定義した。マーカーであるスフィンゴシン−１−ホスフェート、スフィンゴシン−２−ホスフェートキナーゼ、スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体、アディポネクチン、ネオプテリン、および第１〜８表に示すマーカー、ならびにこれらのマーカーのレベルを決定する技術についても、本発明の第一の方法と関連させて定義した。これらの用語に関する、本発明の第一の方法の特定の好ましい実施形態は、本発明の第二の方法にも適用できる。
【００６５】
特定の実施形態において、本発明の第二の方法は、被験体から得たサンプル中のスフィンゴシン−１−ホスフェートのレベルを決定することを含む。別の特定の実施形態において、本発明の第二の方法は、被験体から得たサンプル中の、
−スフィンゴシン−１−ホスフェート、
−スフィンゴシン−２−ホスフェートキナーゼ、
−スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体、
−アディポネクチン、
−ネオプテリン、
−第１表に示すマーカー、
−第２表に示すマーカー、
−第３表に示すマーカー、
−第４表に示すマーカー、
−第５表に示すマーカー、
−第６表に示すマーカー、
−第７表に示すマーカー、および
−第８表に示すマーカー、
からなる群のマーカーのいずれかの組み合わせのレベルを決定することを含む。
【００６６】
特定の実施形態において、本発明の第二の方法は、被験体から得たサンプル中のＴＡＧ（６３：２）のレベルを決定することを含む。
【００６７】
特定の実施形態において、本発明の第二の方法は、被験体から得たサンプル中のスフィンゴシン−１−ホスフェートおよびＴＡＧ（６３：２）のレベルを決定することを含む。
【００６８】
特定の実施形態において、本発明の第二の方法は、被験体から得たサンプル中の１２−Ｓ−ＨＥＴＥおよびアディポネクチンのレベルを決定することを含む。
【００６９】
特定の実施形態において、本発明の第二の方法は、被験体から得たサンプル中の１５−Ｓ−ＨＥＴＥのレベルを決定することを含む。特定の実施形態において、本発明の第二の方法は、被験体から得たサンプル中のＭＣＰ−１のレベルを決定することを含む。
【００７０】
特定の実施形態において、本発明の第二の方法は、被験体から得たサンプル中の、第７表に示す少なくとも１つのマーカーのレベルおよびアディポネクチンの発現レベルから選択される値を決定することを含む。さらに特定の実施形態において、本発明の第二の方法は、被験体から得たサンプル中の第７表に示すマーカーのレベルおよびアディポネクチンの発現レベルを決定することを含む。
【００７１】
別の特定の実施形態において、本発明の第二の方法は、被験体から得たサンプル中の、第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベルを決定することを含む。さらに特定の実施形態において、本発明の第二の方法は、被験体から得たサンプル中の、第６表に示すマーカーのレベルを決定することを含む。
【００７２】
別の特定の実施形態において、本発明の第二の方法は、被験体から得たサンプル中の、ＩＬ９、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２６、ＣＸＣＬ１２、およびＣＣＲ８から選択される少なくとも１つのマーカーの発現レベルを決定することを含む。さらに特定の実施形態において、本発明の第二の方法は、被験体から得たサンプル中の、ＩＬ９、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２６、ＣＸＣＬ１２、およびＣＣＲ８の発現レベルを決定することを含む。
【００７３】
別の特定の実施形態において、本発明の第二の方法は、被験体から得たサンプル中の、ＩＬ３６Ａ、ＩＬ３６Ｂ、ＩＬ３６Ｇ、ＩＬ３６ＲＮ、ＩＦＮＡ２、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＲ１、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、およびＣＡＲＤ１８から選択される少なくとも１つのマーカーの発現レベルを決定することを含む。さらに特定の実施形態において、本発明の第二の方法は、被験体から得たサンプル中の、ＩＬ３６Ａ、ＩＬ３６Ｂ、ＩＬ３６Ｇ、ＩＬ３６ＲＮ、ＩＦＮＡ２、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＲ１、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、およびＣＡＲＤ１８の発現レベルを決定することを含む。
【００７４】
特定の実施形態において、副腎白質ジストロフィーは、成人副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）、大脳副腎脊髄ニューロパチー（ｃＡＭＮ）、および副腎白質ジストロフィーの小児型（ｃＡＬＤ）からなる群から選択される。
【００７５】
ＡＬＤは炎症性脱髄を伴うかまたは伴わずに発生し得る。特定の実施形態において、副腎白質ジストロフィーは炎症性脱髄を伴わずに発生する。
【００７６】
特定の実施形態において、本発明の第二の方法に従ったマーカーがスフィンゴシンキナーゼ２および／またはスフィンゴシン−１−ホスフェート受容体である場合、前記マーカーの発現レベルは、それぞれのｍＲＮＡのレベルを測定することによって決定される。
【００７７】
さらに特定の実施形態において、サンプルは、ＰＢＭＣを含むサンプルである。さらになお特定の実施形態において、ＰＢＭＣを含むサンプルは血液である。
【００７８】
本明細書で用いられる用語「ＡＬＤに罹患した被験体」は、ＡＬＤの診断を受けた被験体を指す。ＡＬＤの診断は、本発明の診断方法との関連で説明される診断基準に基づいて行うことができる。
【００７９】
本明細書で用いられる用語「進行をモニターする」は、ＡＬＤの診断を受けた被験体における疾病の進展、すなわちＡＬＤが悪化したかまたは寛解したかの決定を指す。
【００８０】
本明細書で用いられる用語「ＡＬＤの悪化」は、この疾病が最初の評価段階よりも後の段階で、例えば自発運動能の悪化または痙縮の増大へと進行することを意味する。特定の実施形態において、ＡＬＤの悪化は、大脳の炎症性脱髄の出現を意味する。別の特定の実施形態において、ＡＬＤの悪化は、ＡＭＮからｃＡＭＮへの進行を意味する。
【００８１】
本明細書で用いられる用語「寛解」は、疾患、状態、または疾病、例えばＡＬＤの症状の１つ以上の減少を指す。
【００８２】
本発明の第二の方法は、被験体から得たサンプル中の１つ以上のマーカーのレベルまたは発現レベルを比較すること、前記被験体から早期に得たサンプルにおいて決定された同じ１つ以上のマーカーのレベルまたは発現レベルの値と比較することに関連する。特定の実施形態において、サンプル中のマーカーのレベル／発現レベルは、同じタイプのサンプル中の前記マーカーのレベル／発現レベルと比較される。
【００８３】
副腎白質ジストロフィーの治療法の効果をモニターするための方法
第三の態様において、本発明は、副腎白質ジストロフィーに罹患した被験体における副腎白質ジストロフィーの治療法の効果をモニターするための方法に関し、該方法は以下、本発明の第三の方法と称され、前記被験体から得たサンプル中の
−スフィンゴシン−１−ホスフェートのレベル、
−スフィンゴシン−２−ホスフェートキナーゼの発現レベル、
−スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体の発現レベル、
−アディポネクチンの発現レベル、
−ネオプテリンのレベル、
−第１表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第２表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第３表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第４表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第５表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル、
−第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル、
−第７表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル、および
−第８表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル
からなる群から選択される値を決定することを含み、
ここで、
前記治療法を行う前に決定した値に対する
スフィンゴシン−１−ホスフェートのレベル上昇、
スフィンゴシン−２−ホスフェートキナーゼのレベル上昇、
スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体のレベル上昇、
アディポネクチンの発現レベル低下、
ネオプテリンのレベル上昇、
第１表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第２表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第３表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第４表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第５表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル上昇、
第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第７表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル上昇、
および／または
第８表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル上昇
は、前記治療法が有効ではないことを示すとし、または、
前記治療法を行う前に決定した値に対する
スフィンゴシン−１−ホスフェートのレベル低下、
スフィンゴシン−２−ホスフェートキナーゼのレベル低下、
スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体のレベル低下、
アディポネクチンの発現レベル上昇、
ネオプテリンのレベル低下、
第１表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第２表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第３表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第４表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル上昇、
第５表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル低下、
第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベル低下、
第７表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル低下、
および／または
第８表に示す少なくとも１つのマーカーの発現レベル低下
は、前記治療法が有効であることを示すとする。
【００８４】
用語「副腎白質ジストロフィー」、「サンプル」、「レベル」、「発現レベル」、「マーカー」、「上昇」、および「低下」については、本発明の第一の方法と関連させて定義した。マーカーであるスフィンゴシン−１−ホスフェート、スフィンゴシン−２−ホスフェートキナーゼ、スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体、アディポネクチン、ネオプテリン、および第１〜８表に示すマーカー、ならびにこれらのマーカーのレベルを決定する技術についても、本発明の第一の方法と関連させて定義した。用語「ＡＬＤに罹患した被験体」については、本発明の第二の方法と関連させて定義した。これらの用語に関する、本発明の第一の方法および第二の方法の特定の好ましい実施形態は、本発明の第三の方法にも適用できる。
【００８５】
特定の実施形態において、副腎白質ジストロフィーは、成人副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）、大脳副腎脊髄ニューロパチー（ｃＡＭＮ）、および副腎白質ジストロフィーの小児型（ｃＡＬＤ）からなる群から選択される。
【００８６】
ＡＬＤは炎症性脱髄を伴うかまたは伴わずに発生し得る。特定の実施形態において、ＡＬＤは炎症性脱髄を伴わずに発生する。
【００８７】
特定の実施形態において、本発明の第三の方法は、被験体から得たサンプル中のスフィンゴシン−１−ホスフェートのレベルを決定することを含む。別の特定の実施形態において、本発明の第三の方法は、被験体から得たサンプル中の、
−スフィンゴシン−１−ホスフェート、
−スフィンゴシン−２−ホスフェートキナーゼ、
−スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体、
−アディポネクチン、
−ネオプテリン、
−第１表に示すマーカー、
−第２表に示すマーカー、
−第３表に示すマーカー、
−第４表に示すマーカー、
−第５表に示すマーカー、
−第６表に示すマーカー、
−第７表に示すマーカー、および
−第８表に示すマーカー、
からなる群のマーカーのいずれかの組み合わせのレベルを決定することを含む。
【００８８】
特定の実施形態において、本発明の第三の方法は、被験体から得たサンプル中のＴＡＧ（６３：２）のレベルを決定することを含む。
【００８９】
特定の実施形態において、本発明の第三の方法は、被験体から得たサンプル中のスフィンゴシン−１−ホスフェートおよびＴＡＧ（６３：２）のレベルを決定することを含む。
【００９０】
特定の実施形態において、本発明の第三の方法は、被験体から得たサンプル中の１２−Ｓ−ＨＥＴＥおよびアディポネクチンのレベルを決定することを含む。
【００９１】
特定の実施形態において、本発明の第三の方法は、被験体から得たサンプル中の１５−Ｓ−ＨＥＴＥのレベルを決定することを含む。特定の実施形態において、本発明の第三の方法は、被験体から得たサンプル中のＭＣＰ−１のレベルを決定することを含む。
【００９２】
特定の実施形態において、本発明の第三の方法は、被験体から得たサンプル中の、第７表に示す少なくとも１つのマーカーのレベルおよびアディポネクチンの発現レベルから選択される値を決定することを含む。さらに特定の実施形態において、本発明の第三の方法は、被験体から得たサンプル中の第７表に示すマーカーのレベルおよびアディポネクチンの発現レベルを決定することを含む。
【００９３】
別の特定の実施形態において、本発明の第三の方法は、被験体から得たサンプル中の、第６表に示す少なくとも１つのマーカーのレベルを決定することを含む。さらに特定の実施形態において、本発明の第三の方法は、被験体から得たサンプル中の、第６表に示すマーカーのレベルを決定することを含む。
【００９４】
別の特定の実施形態において、本発明の第三の方法は、被験体から得たサンプル中の、ＩＬ９、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２６、ＣＸＣＬ１２、およびＣＣＲ８から選択される少なくとも１つのマーカーの発現レベルを決定することを含む。さらに特定の実施形態において、本発明の第三の方法は、被験体から得たサンプル中の、ＩＬ９、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２６、ＣＸＣＬ１２、およびＣＣＲ８の発現レベルを決定することを含む。
【００９５】
別の特定の実施形態において、本発明の第三の方法は、被験体から得たサンプル中の、ＩＬ３６Ａ、ＩＬ３６Ｂ、ＩＬ３６Ｇ、ＩＬ３６ＲＮ、ＩＦＮＡ２、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＲ１、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、およびＣＡＲＤ１８から選択される少なくとも１つのマーカーの発現レベルを決定することを含む。さらに特定の実施形態において、本発明の第三の方法は、被験体から得たサンプル中の、ＩＬ３６Ａ、ＩＬ３６Ｂ、ＩＬ３６Ｇ、ＩＬ３６ＲＮ、ＩＦＮＡ２、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＲ１、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、およびＣＡＲＤ１８の発現レベルを決定することを含む。
【００９６】
特定の実施形態において、本発明の第三の方法に従ったマーカーは、アディポネクチン、ＴＮＦ、ＩＬ−８、１２Ｓ−ＨＥＴＥ、１５Ｓ−ＨＥＴＥ、ＴＸＢ２、ＩＮＦＡ２、ＩＬ４、ＩＬ１０、ＩＬ３６、ＣＣＲ３、ＣＸＣＬ９、およびネオプテリンからなる群から選択される。
【００９７】
特定の実施形態において、本発明の第三の方法に従ったマーカーがスフィンゴシンキナーゼ２および／またはスフィンゴシン−１−ホスフェート受容体である場合、前記マーカーの発現レベルは、それぞれのｍＲＮＡのレベルを測定することによって決定される。
【００９８】
さらに特定の実施形態において、サンプルは、ＰＢＭＣを含むサンプルである。さらになお特定の実施形態において、ＰＢＭＣを含むサンプルは血液である。
【００９９】
本明細書で用いられる用語「副腎白質ジストロフィーの治療法」は、健康上の問題を、通常は診断後に改善させる試みか、または健康上の問題の予防または出現を指す。このように、この用語は必ずしも治癒、すなわち疾病の完全な逆転を意味するものではない。前記治療法は、特定の疾病に対する好ましい効果を有することが知られていても、または知られていなくてもよい。この用語には、対象における癌のような望ましくない生理的変化または疾患を阻止もしくは停止（減少）させる、治療上の処置および予防的または防止的な手段の両方が含まれる。本発明の目的のために、有益であるかまたは望ましい臨床的結果には、症状の軽減、疾病の拡大の減少、病的状態の安定（具体的には悪化しない）、疾病の進行の遅延または停止、検出できるかまたはできない、病的状態の改善または緩和および寛解（部分的および完全の両方）が含まれるが、これらに限定されない。この用語には、治療を受けない場合に予想される生存と比較した、生存の延長、疾病のない生存および症状のない生存も含まれる。治療を必要とする被験体には、既に状態または疾患に罹患した被験体、および状態または疾患に罹患する傾向のある被験体、または状態または疾患が予防されるべき被験体が含まれる。
【０１００】
ＡＬＤの治療法の実例としては、抗酸化剤、ミトコンドリアを標的とした抗酸化剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ミトコンドリア膜透過性遷移孔開口の阻害剤、抗炎症薬、ＰＰＡＲアゴニスト、ＲＸＲアゴニスト、サーチュイン１アゴニスト、脂質降下薬、ヘキサコサン酸（Ｃ２６：０）の循環レベルを低下させる脂肪酸組成物、ならびにオートファジー活性化因子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
本明細書で用いられる用語「抗酸化剤」は、例えば、活性酸素種の形成を阻止するか、または活性酸素種がいずれかの損傷をもたらす前にそれらを除去する、活性酸素種のレベルを減少させる物質を指す。抗酸化剤の例としては、アルファリポ酸、ビタミンＥ、およびＮ−アセチルシステインが挙げられる。
【０１０２】
本明細書で用いられる用語「ミトコンドリアを標的とした抗酸化剤」は、ｉｎ  ｖｉｖｏでミトコンドリア内に選択的に濃縮される抗酸化剤を指す。ミトコンドリアを標的とした抗酸化剤の例としては、ミトキノン（ＭｉｔｏＱ）および［２−（３，４−ジヒドロ−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル）エチル］トリフェニルホスホニウムブロミド（ＭｉｔｏＶｉｔＥ）が挙げられる。
【０１０３】
本明細書で用いられる用語「ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤」は、ヒストン脱アセチル化酵素の機能に干渉する物質を指す。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の例としては、ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット、バルプロ酸、ベリノスタット、モセチノスタット、ＰＣＩ−２４７８１、エンチノスタット、ＳＢ９３９、レスミノスタット、ギビノスタット、ＣＵＤＣ−１０１、ＡＲ−４２、ＣＨＲ−２８４５、ＣＨＲ−３９９６、４ＳＣ−２０２、ＣＧ２００７４５、ＡＣＹ−１２１５、スルホラファンおよびケベトリン（ｋｅｖｅｔｒｉｎ）が挙げられる。本明細書で用いられる「ミトコンドリア膜透過性遷移孔開口の阻害剤」は、内膜チャネルの開口によって引き起こされる、ミトコンドリア内膜の透過性の非特異的な増大を遮断する物質を指す。ミトコンドリア膜透過性遷移孔開口の阻害剤の例としては、シクロスポリンＡおよびその誘導体、ＮＩＭ８１１、ジフェニルボリン酸２−アミノエチルならびにボンクレキン酸が挙げられる。
【０１０４】
本明細書で用いられる用語「抗炎症薬」は、炎症を減少させる物質を指す。抗炎症薬の例としては、サリチル酸塩、例えばアセチルサリチル酸、ジフルニサルおよびサルサラート；プロピオン酸誘導体、例えばイブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、デクスケトプロフェン、フルルビプロフェン、オキサプロジン、ロキソプロフェン；酢酸誘導体、例えばインドメタシン、スリンダク、エトドラク、ケトロラク、ジクロフェナク、ナブメトン；エノール酸誘導体、例えばピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカムおよびイソキシカム；フェナム酸誘導体、例えばメフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸およびトルフェナム酸；選択的ＣＯＸ−２阻害剤、例えばセレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、パレコキシブ、ルミラコキシブ、エトリコキシブおよびフィロコキシブ；スルホンアニリド類、例えばニメスリド；およびその他の化合物、例えばリコフェロンが挙げられる。
【０１０５】
本明細書で用いられる用語「ＰＰＡＲアゴニスト」は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体を刺激する物質を指す。ＰＰＡＲアゴニストの例としては、ＧＷ−９６６２、チアゾリジンジオン類、例えばロシグリタゾン、ピオグリタゾンおよびその誘導体；フィブラート類、例えばベザフィブラート、シプロフィブラート、クロフィブラート、ジェムフィブロジルおよびフェノフィブラート；ならびにグリタザール類、例えばムラグリタザール、テサグリタザールおよびアレグリタザールが挙げられる。
【０１０６】
本明細書で用いられる用語「ＲＸＲアゴニスト」は、レチノイドＸ受容体を刺激する物質を指す。ＲＸＲアゴニストの例としては、ＣＤ３２５４、ドコサヘキサエン酸、フルオロベキサロテン、ベキサロテン、レチノイン酸およびＳＲ１１２３７が挙げられる。
【０１０７】
本明細書で用いられる用語「サーチュイン１アゴニスト」は、サーチュイン１酵素を刺激する物質を指す。サーチュイン１アゴニストの例としては、レスベラトロールおよびＳＲＴ−１７２０が挙げられる。
【０１０８】
本明細書で用いられる用語「抗高脂血症剤」は、血中の脂質や低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を低下させ、かつ／または高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を増加させる、ＰＰＡＲアゴニストおよびフィブラート類以外の物質を指す。抗高脂血症剤の例としては、スタチン類、例えばアトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチン；ナイアシン；胆汁酸捕捉剤、例えばコレスチラミン、コレセベラムおよびコレスチポール；その他の化合物、例えばフィトステロール類、エゼチミブ、オルリスタットおよびナイアシンが挙げられる。
【０１０９】
用語「ヘキサコサン酸（Ｃ２６：０）の循環レベルを低下させる脂肪酸組成物」は、当業者に公知のいずれかの適切な技術によって決定可能な、ヘキサコサン酸（Ｃ２６：０）の循環レベルの低下をもたらす脂肪酸組成物を指す。前記脂肪酸組成物の実例としては、４部のオレイン酸トリグリセリドと１部のエルカ酸トリグリセリドから形成され、オレイン酸およびエルカ酸のトリアシルグリセロール型であり、オリーブ油と菜種油から調製される、ロレンツォ油がある。
【０１１０】
特定の実施形態において、ＡＬＤの治療法は抗酸化化合物を含む。さらに特定の実施形態において、該抗酸化化合物は、Ｎ−アセチルシステイン、リポ酸、およびビタミンＥの組み合わせである。
【０１１１】
フィンゴリモドの使用
第四の態様において、本発明は、副腎白質ジストロフィーの治療および／または予防に使用するための、スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤に関する。
【０１１２】
あるいは本発明は、副腎白質ジストロフィーの治療および／または予防のための薬剤の製造における、スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤の使用に関する。
【０１１３】
あるいは本発明は、被験体の副腎白質ジストロフィーを治療および／または予防する方法に関し、該方法は、前記被験体に、治療有効量のスフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤を投与することを含む。
【０１１４】
用語「副腎白質ジストロフィー」および「被験体」ならびにそれらの特定の好ましい実施形態は、以前に定義した。
【０１１５】
本明細書で用いられる用語「スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤」または「Ｓ１ＰＲ１の阻害剤」は、スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性を阻害する化合物を指し、アンタゴニスト、抑制性抗体、タンパク質をコードする遺伝子の発現を阻止する化合物、およびｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを減少させる化合物の発現が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、Ｓ１ＰＲ１阻害剤は、Ｓ１ＰＲ１の細胞内での分解を誘導できる。用語「スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１」または「Ｓ１ＰＲ１」については以前に定義した。
【０１１６】
当業者は、いずれかの適切なアッセイ、例えば、欧州特許出願公開第２３６４９７６  Ａ１号に記載されているアッセイによって、特定の化合物がＳ１ＰＲ１の阻害剤であるか否かを決定できる。特定の実施形態において、Ｓ１ＰＲ１阻害剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＳＰ１受容体活性の検出可能な低下（例えば、欧州特許出願公開第２３６４９７６  Ａ１号に記載されているアッセイのようなアッセイによる測定で、少なくとも１０％のＳＰ１受容体活性の低下）を誘導できる。特定の実施形態において、Ｓ１ＰＲ１阻害剤は、Ｓ１Ｐの循環レベルを減少させることが可能である。Ｓ１Ｐの循環レベルは、以前に記載したようにマススペクトロメトリーによって決定できる。別の特定の実施形態において、Ｓ１ＰＲ１阻害剤は、末梢リンパ球のＳ１ＰＲ１の発現レベルを減少させることが可能である。Ｓ１ＰＲ１の発現レベルは、以前に説明したように、前記遺伝子のメッセンジャーＲＮＡのレベル、または前記遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルを測定することによって決定できる。
【０１１７】
Ｓ１ＰＲ１の阻害剤の限定されない実例は以下のとおりである：オザニモド、ＦＴＹ７２０、ＡＡＬ（Ｒ）、ＫＲＰ−２０３、セラリフィモド（ｃｅｒａｌｉｆｉｍｏｄ）、ポネシモド、シポニモド、ＣＹＭ−５４４２、ＲＰ−００１、ＢＡＦ３１２、ＯＮＯ−４６４１、ＣＳ−０７７７、ＲＰＣ−１０６３、ＳＥＷ２８７１、ＶＰＣ２３０９、ＶＰＣ４４１６、Ｗ１４６、ＶＰＣ２５２３９、ＧＳＫ２０１８６８２、フィンゴリモド、それらの類似体、代謝産物、もしくは誘導体、またはそれらの薬剤的に許容される塩。
【０１１８】
特定の実施形態において、スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤は、フィンゴリモド、その類似体、代謝産物、もしくは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩である。
【０１１９】
本明細書で用いられる用語「フィンゴリモド」または「ＦＴＹ７２０」は、以下の式：
【化３】
2018529081.tif 000035
で表される化合物を指す。
【０１２０】
フィンゴリモドはスフィンゴシン−１−ホスフェート（Ｓ１Ｐ）の類似体であり、スフィンゴシンキナーゼ２（ＳＰＨＫ２）によってフィンゴリモドリン酸塩へとリン酸化される。Ｓ１Ｐと同様に、フィンゴリモドリン酸塩はスフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１（Ｓ１ＰＲ１）に結合でき、その後内部に取り込まれる。次にＳ１Ｐ受容体が分解されることによって、細胞表面のシグナル伝達が阻止される。したがってフィンゴリモドは、Ｓ１Ｐ受容体の機能に、間接的に拮抗することになる。
【０１２１】
本明細書で用いられる用語「類似体」は、その化合物に関して同様の生化学活性を有する化合物に構造的に由来するかまたは相同であるいずれかの実体を指す。特定の実施形態において、フィンゴリモド類似体は、スフィンゴシン１ホスフェート受容体、特にＳ１ＰＲ１に結合でき、その細胞内での分解を促進する。フィンゴリモド類似体の限定されない実例は以下のとおりである：シポニモド、ＫＲＰ−２０３、ポネシモド、ＲＰＣ−１０６３、および米国特許第８，６７３，９８２号に記載の化合物。特定の実施形態において、フィンゴリモド類似体は、シポニモド、ＫＲＰ−２０３、ポネシモド、およびＲＰＣ−１０６３からなる群から選択される。さらに特定の実施形態において、フィンゴリモド類似体はシポニモドである。
【０１２２】
用語「シポニモド」または「ＢＡＦ３１２」は、以下の式：
【化４】
2018529081.tif 000036
で表される化合物を指す。
【０１２３】
用語「ＫＲＰ−２０３」は、以下の式：
【化５】
2018529081.tif 000037
で表される化合物を指す。
【０１２４】
用語「ポネシモド」は、以下の式：
【化６】
2018529081.tif 000038
で表される化合物を指す。
【０１２５】
用語「ＲＰＣ−１０６３」は、以下の式：
【化７】
2018529081.tif 000039
または
【化８】
2018529081.tif 000040
で表される化合物を指す。
【０１２６】
本明細書で用いられる用語「誘導体」には、所定の化合物に構造的に由来する実体、すなわち化学誘導体化を行った、例えばさらなる化学基を置換または付加して、溶解度または生物学的利用能のようないずれかの物理化学的特性を変化（医薬品としての使用のために）させた、化学化合物が含まれる。誘導体にはいわゆるプロドラッグが含まれる。
【０１２７】
本明細書で用いられる用語「代謝産物」は、酵素反応によって得られたいずれかの化合物、すなわち酵素が関与する方法によって合成された化合物を指す。特定の実施形態において、フィンゴリモドの代謝産物はフィンゴリモドリン酸塩である。
【０１２８】
用語「薬剤的に許容される塩」は、レシピエントへの投与によって、本明細書に記載する化合物を提供（直接的または間接的に）できるいずれかの塩を指す。好ましくは、本明細書で用いられる用語「薬剤的に許容される塩」は、連邦政府もしくは州政府の規制当局により承認されているか、または米国薬局方、もしくは動物、さらに詳細にはヒトにおける使用のためのその他の一般に認められた薬局方に収載された塩であることを意味する。塩の調製は、当該技術分野において公知の方法によって行うことができる。
【０１２９】
例えば、薬剤的に許容されるフィンゴリモドの塩は、酸付加塩、塩基付加塩または金属塩であってよく、これらは塩基または酸成分を含む親化合物から、従来の化学的方法によって合成できる。一般にこのような塩は、例えば、水または有機溶媒または２つの混合液中で、適切な塩基または酸の化学量論量である、これらの化合物の遊離酸または塩基の形態を反応させることによって調製される。一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性溶媒が好ましい。特定の実施形態において、薬剤的に許容される塩は酸付加塩である。適切な塩の例としては、塩酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、酢酸塩、乳酸塩、酪酸塩、プロピオン酸塩、硫酸塩、メタンスルホン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、硝酸塩、スルホン酸塩、シュウ酸塩および／またはコハク酸塩が挙げられる。
【０１３０】
さらに特定の実施形態において、フィンゴリモドの薬剤的に許容される塩は塩酸塩である。
【０１３１】
特定の実施形態において、スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤、さらに詳細にはフィンゴリモド、その類似体、代謝産物もしくは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩は、神経伝達物質受容体調節薬と同時には投与されない。さらに特定の実施形態において、神経伝達物質受容体調節薬は、ベンズトロピン、カルベタペンタン、クレマスチン、ピンドロール、イプラトロピウム、アトロピン、ＧＢＲ１２９３５、Ｓｎｃ−８０、ＢＤ−１  ０４７、サルメテロール、アルブテロール、トリフロペラジン、またはそれらの塩から選択される。さらになお特定の実施形態において、神経伝達物質受容体調節薬は、ベンズトロピン、クレマスチン、サルメテロール、サルブタモール、トリフロペラジン、またはそれらの塩から選択される。さらになお特定の実施形態において、神経伝達物質受容体調節薬は、ベンズトロピンまたはその塩（例えばベンズトロピンメシラート）から選択される。
【０１３２】
特定の実施形態において、スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤、さらに詳細にはフィンゴリモド、その類似体、代謝産物もしくは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩は、メチルグリオキサールビス（グアニルヒドラゾン）（ＭＧＢＧまたはミトグアゾン）と同時には投与されない。本明細書で用いられる用語「メチルグリオキサールビス（グアニルヒドラゾン）」または「ＭＧＢＧ」または「ミトグアゾン」は、スペルミジン、ポリアミンの合成を触媒するＳ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ（ＳＡＭＤＣ、ＡＭＤ−Ｉ）の、競合的ポリアミン阻害剤を指す。
【０１３３】
特定の実施形態において、副腎白質ジストロフィーは、成人副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）、大脳副腎脊髄ニューロパチー（ｃＡＭＮ）、および副腎白質ジストロフィーの小児型（ｃＡＬＤ）からなる群から選択される。
【０１３４】
ＡＬＤは炎症性脱髄を伴うかまたは伴わずに発生し得る。特定の実施形態において、ＡＬＤは炎症性脱髄を伴わずに発生する。
【０１３５】
本明細書で用いられる用語「治療および／または予防」は、スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤、さらに詳細にはフィンゴリモド、その類似体、代謝産物もしくは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、またはスフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤、さらに詳細にはフィンゴリモド、その類似体、代謝産物もしくは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩を含む医薬製剤を投与して、副腎白質ジストロフィー、好ましくは成人副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）、大脳副腎脊髄ニューロパチー（ｃＡＭＮ）または副腎白質ジストロフィーの小児型（ｃＡＬＤ）副腎白質ジストロフィー、さらになお好ましくは副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）に罹患しているか、または罹患する危険性のある患者の健康を保持することを意味する。前記用語はまた、スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤、さらに詳細にはフィンゴリモド、その類似体、代謝産物もしくは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、またはスフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤、さらに詳細にはフィンゴリモド、その類似体、代謝産物もしくは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩を含む医薬製剤を投与して、副腎白質ジストロフィー、好ましくは成人副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）、大脳副腎脊髄ニューロパチー（ｃＡＭＮ）または副腎白質ジストロフィーの小児型（ｃＡＬＤ）副腎白質ジストロフィー、さらになお好ましくは副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）に付随する１つ以上の症状を阻止、寛解または排除することも含む。
【０１３６】
薬物または薬理学的に有効な薬剤に関する用語「有効」量または「治療有効量」は、所望の効果をもたらすために、無毒であるが十分な薬物または薬剤の量を指す。本発明の併用療法において、併用した成分の「有効量」は、別の成分と併用して使用した上で所望の効果がもたらされる、その化合物の量である。「有効な」量は、個体の年齢および全体的状態、単数または複数の特定の有効薬剤などに応じて、被験体ごとに異なり得る。したがって、常に正確な「有効量」を特定できるわけではない。しかしながら、いずれの個体における適切な「有効」量も、当業者の日常的な実験によって決定され得る。
【０１３７】
一般に、スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤、さらに詳細にはフィンゴリモド、その類似体、代謝産物もしくは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩の有効な投与量は、疾患の重症度、または年齢、体重または投与方法に依存し得る。実際に医師は、副腎白質ジストロフィー、好ましくは成人副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）、大脳副腎脊髄ニューロパチー（ｃＡＭＮ）または副腎白質ジストロフィーの小児型（ｃＡＬＤ）副腎白質ジストロフィー、さらになお好ましくは副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）に罹患しているかまたは罹患する危険性のある患者に最適となるように、実際の投与量および投与計画を決定するであろう。
【０１３８】
別の態様において、本発明は、副腎白質ジストロフィーの治療および／または予防に使用するための、スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤、さらに詳細にはフィンゴリモド、その類似体、代謝産物もしくは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩に関し、ここで前記スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤、さらに詳細にはフィンゴリモド、その類似体、代謝産物もしくは誘導体、またはその前記薬剤的に許容される塩は、本発明の診断方法を用いて診断を受けた患者に投与される。特定の実施形態において、患者は、スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤、さらに詳細にはフィンゴリモド、その類似体、代謝産物もしくは誘導体、またはその前記薬剤的に許容される塩を投与される前に、本発明の診断方法を用いた診断を受ける。
【０１３９】
医薬組成物
第五の態様において、本発明は、スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤と、アルファリポ酸、ビタミンＥ、およびＮ−アセチルシステインから選択される抗酸化剤、ミトコンドリアを標的とした抗酸化剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ミトコンドリア膜透過性遷移孔開口の阻害剤、抗炎症薬、ＰＰＡＲアゴニスト、ＲＸＲアゴニスト、サーチュイン１アゴニスト、脂質降下薬、ヘキサコサン酸（Ｃ２６：０）の循環レベルを低下させる脂肪酸組成物、ならびにオートファジー活性化因子からなる群から選択される１つ以上の薬物とを含んでなる医薬組成物、以下、本発明の医薬組成物と称される、に関する。
【０１４０】
用語「スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤」、さらに詳細には「アルファリポ酸、ビタミンＥ、およびＮ−アセチルシステインから選択される抗酸化剤」、「ミトコンドリアを標的とした抗酸化剤」、「ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤」、「抗炎症薬」、「ＰＰＡＲアゴニスト」、「ＲＸＲアゴニスト」、「サーチュイン１アゴニスト」、「抗高脂血症剤」、および「ヘキサコサン酸（Ｃ２６：０）の循環レベルを低下させる脂肪酸組成物」については以前に定義した。
【０１４１】
特定の実施形態において、スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤は、フィンゴリモド、その類似体、代謝産物、もしくは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩である。特定の実施形態において、フィンゴリモド類似体は、シポニモド、ＫＲＰ−２０３、ポネシモド、およびＲＰＣ−１０６３からなる群から選択される。さらに特定の実施形態において、フィンゴリモド類似体はシポニモドである。本明細書で用いられる用語「併用」は、副腎白質ジストロフィー、好ましくは成人副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）、大脳副腎脊髄ニューロパチー（ｃＡＭＮ）または副腎白質ジストロフィーの小児型（ｃＡＬＤ）副腎白質ジストロフィー、さらになお好ましくは副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）に罹患しているかまたは罹患する危険性のある患者への、フィンゴリモド、その類似体、代謝産物もしくは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩と、以前に定義した関連する治療薬との、同一かまたは別々の医薬製剤における投与、および同時または異なる時間の投与を包含することが意図される。
【０１４２】
併用薬物は、１つの組み合わされた単位剤形または２つの別々の単位剤形によって、同時に、または１つの薬物の後に別の薬物が投与されてよい。単位剤形は固定された組み合わせであってもよい。
【０１４３】
同時使用（投与）は、例えば２つ以上の有効成分の１つの固定された組み合わせの形態によって行われてよいか、または別々に処方された２つ以上の有効成分の同時投与によって行われてもよい。
【０１４４】
連続使用（投与）は、好ましくは、併用する成分のうちの１つ（またはそれを超える）成分を一時点で、別の成分を別時点で、すなわち長期間交互に投与することを意味し、好ましくはその併用が、独立して投与された単一化合物よりも効率的となるように投与される。
【０１４５】
別々の使用（投与）は、好ましくは、併用する成分を、異なる時点でそれぞれ独立して投与することを意味する。
【０１４６】
本発明の好ましい実施形態において、スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤、さらに詳細にはフィンゴリモド、その類似体、代謝産物もしくは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩と、別の薬物とは、同じ組成物の一部を形成する。
【０１４７】
別の好ましい実施形態において、スフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１の阻害剤、さらに詳細にはフィンゴリモド、その類似体、代謝産物もしくは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、およびその他の薬物は、同時または異なる時間に投与するための、別々の組成物として提供される。
【０１４８】
特定の実施形態において、医薬組成物は、薬剤的に許容される賦形剤も含む。
【０１４９】
用語「薬剤的に許容される賦形剤」は、それと共に有効成分が投与される、希釈剤、補助剤、担体、またはビヒクルを指す。このような医薬賦形剤は、無菌の液体、例えば水、およびピーナッツ油、大豆油、ミネラルオイル、胡麻油などのような、石油、動物、野菜、または合成に由来するものを含む油であってよい。水または水溶液、生理食塩水溶液ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、好ましくは担体、特に注射用溶液として、または緩衝液、等張液もしくは溶解度を高める薬剤としても用いられる。適切な医薬担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”または“Ｔｒａｔａｄｏ  ｄｅ  Ｆａｒｍａｃｉａ  Ｇａｌｅｎｉｃａ”，Ｃ．Ｆａｕｌｉ  ｉ  Ｔｒｉｌｌｏ，Ｌｕｚａｎ  ５，Ｓ．Ａ．ｄｅ  Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓ，１９９３に記載されている。
【０１５０】
本発明の医薬組成物は、様々な調製物の形で投与されてよい。医薬組成物の例としては、経口、局所または非経口投与のための、いずれかの固体（錠剤、丸剤、カプセル、顆粒など）または液体（溶液、懸濁液、シロップまたはエマルション）組成物が挙げられる。
【０１５１】
好ましい実施形態において、医薬組成物は経口用の形態である。医薬組成物の経口用形態は固体または液体であってよい。経口投与に適した剤形は、錠剤、カプセル、丸剤、顆粒、シロップ、または溶液であってよい。好ましくは、医薬組成物は、錠剤、カプセル、丸剤、および顆粒からなる群から選択される固体であり、さらに好ましくは錠剤である。
【０１５２】
固体経口用医薬組成物は、当該技術分野において公知である従来の賦形剤、例えば結合剤、例えばシロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、またはポリビニルピロリドン；注入剤、例えばラクトース、糖類、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトール、またはグリシン；打錠潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム；崩壊剤、例えばデンプン、ポリビニルピロリドン、デンプングリコール酸ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、または結晶セルロース；、またはラウリル硫酸ナトリウムのような薬剤的に許容される湿潤剤を含んでもよい。好ましくは、賦形剤は、ラクトース一水和物、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、およびステアリン酸マグネシウムからなる群から選択される。
【０１５３】
固体経口用組成物は、混合、注入、または打錠の従来法によって調製されてよい。これらの組成物中に有効薬剤をまんべんなく分配するため、大量の注入剤を用いた混合操作が繰り返し行われ得る。このような操作は当該技術分野においては標準的である。例えば錠剤は、湿式または乾式造粒により調製されてよく、通常の薬務において周知の方法に従い、特に腸溶コーティングによって任意にコートされる。
【０１５４】
別の態様において、本発明は、副腎白質ジストロフィーの治療および／または予防に使用するための、本発明の医薬組成物に関する。あるいは本発明は、副腎白質ジストロフィーの治療および／または予防のための薬剤の製造における、本発明の医薬組成物の使用に関する。あるいは本発明は、被験体の副腎白質ジストロフィーを治療および／または予防する方法に関し、該方法は、前記被験体に、治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む。
【０１５５】
特定の実施形態において、副腎白質ジストロフィーは、成人副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）、大脳副腎脊髄ニューロパチー（ｃＡＭＮ）、および副腎白質ジストロフィーの小児型（ｃＡＬＤ）からなる群から選択される。
【０１５６】
ＡＬＤは炎症性脱髄を伴うかまたは伴わずに発生し得る。特定の実施形態において、ＡＬＤは炎症性脱髄を伴わずに発生する。
【０１５７】
別の態様において、本発明は、副腎白質ジストロフィーの治療および／または予防に使用するための、本発明の医薬組成物に関し、ここで前記医薬組成物は、本発明の診断方法を用いて診断を受けた患者に投与される。特定の実施形態において、患者は、本発明の医薬組成物を投与される前に、本発明の診断方法を用いた診断を受ける。
【実施例】
【０１５８】
実施例１：ＡＭＮ患者の末梢単核細胞におけるスフィンゴシン−２−ホスファターゼキナーゼおよびスフィンゴシン−１−ホスフェート受容体１のレベルは上昇している
図１Ａにおいて、本発明者らは、スフィンゴシン−１−Ｐの合成を制御する２つの酵素であるＳＰＨＫ２（スフィンゴシンキナーゼ２）およびＳ１ＰＲ１（スフィンゴシン１−Ｐ受容体）の増加を同定するために、ＡＭＮ患者のＰＢＭＣにＱ−ＰＣＲ実験を行い、ＡＭＮ患者において増加していることを見出した。図１Ｂにおいて、本発明者らは、ＨＰＬＣ／ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦアプローチを用いて、ＡＭＮ患者の血漿中のスフィンゴシン１−Ｐのレベルを測定した。ＡＭＮ患者では、スフィンゴシン１−Ｐ（Ｓ１Ｐ）のレベルは異常に上昇しており、炎症誘発性Ｓ１Ｐ経路の上方制御が強調された。この結果は、ＡＭＮ、およびＸ−ＡＬＤを治療するために、フィンゴリモド、フィンゴリモド類似体、代謝産物、誘導体、および分子などのような、Ｓ１Ｐ経路の阻害剤を使用することの強力な理論的根拠となる。
【０１５９】
さらに、図１Ｂの実験は、抗酸化剤の組み合わせ（Ｎ−アセチルシステイン、ビタミンＥ、およびリポ酸）による３か月の治療が、Ｓ１Ｐのレベルを正常化できることを示したため、これまでに報告されていない、Ｘ−ＡＬＤにおけるこの経路の酸化還元への依存が示唆される。
【０１６０】
実施例２：糖脂質およびグリセロリン脂質によるシグナル伝達の変化は、副腎脊髄ニューロパチーにおける炎症性カスケードを駆動する
本発明者らは、患者および対照から得たＰＢＭＣおよび血漿にメタボローム／リピドーム解析を行うことによって、ＡＭＮの分子的特長を同定することを開始した。結果は、統合バイオインフォマティクス解析を用いて、疾病進行の異なる段階にＡｂｃｄ１−マウスモデルの脊髄から得たトランスクリプトームデータと組み合わせた。これに続き、独立した相補的技術を用いた実験的な検証によって、幾つかの重要な調節不全経路を特定した。
【０１６１】
ＡＭＮ患者の血漿およびＰＢＭＣにおける、メタボロームおよびリピドーム解析
ＡＭＮ患者および健康な性別と年齢が一致した対照から血漿およびＰＢＭＣを採取した。それらの分子プロファイルを特徴付けるために、マススペクトロメトリーを用いたリピドームおよびメタボローム解析を用いた。代謝産物を抽出するための単一の普遍的な方法は無いため、２つの独立したプロトコルを用いて、極性（メタボローム）から無極性（リピドーム）分子まで、広範囲の分子を評価した。したがって、血漿およびＰＢＭＣにおけるＡＭＮ関連の変化を特徴付けるために、ＬＣ−Ｑ−ＴＯＦシステムを用いた非標的メタボロームおよびリピドーム解析を行った。
【０１６２】
血漿に対し、同じ群内で少なくとも５０％のサンプルに見られる分子的特色を用いて（メタボロームおよびリピドーム解析それぞれに対して、３００８および５５７９）、クラスタリング解析を行った。このアプローチは、ＡＭＮが、血漿のメタボロームおよびリピドームプロファイル両方を決定する主要因子であることを示した。対照およびＡＭＮ個体の間の代謝的な違いをさらに探索するため、ＰＣＡ（目的変数なしの技術）およびＰＬＳ−ＤＡ（目的変数ありの技術）を含む多変量統計解析を用いた。両技術によって、ＡＭＮ特異的な血漿メタボロームおよびリピドームの特長が明らかにされた。血漿サンプルの統計解析により、代謝産物および脂質種を含む３４８分子が、遺伝子型の間で有意に異なっていることが分かり、これらの分子の幾つかが同定された。
【表３２】
2018529081.tif 000041
すべての同一性は正確な質量と保持時間に基づいて確認した。＊これらの同一性は、正確な質量、保持時間、およびＭＳ／ＭＳスペクトルに基づいた。１倍率変化は、未処理の強度を対数変換して算出した。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ多重検定補正によるスチューデントｔ検定、ｐ＜０，０５、を用いた。
【０１６３】
分子と推定上の同一性とを組み合わせた経路分析により、セラミド分解およびスフィンゴミエリン代謝のような、脂質により駆動される炎症関連経路を含む幾つかの標的が明らかになった。
【０１６４】
ＰＢＭＣの分析により、胆汁酸生合成経路に含まれる代謝産物（コール酸、グリココール酸、および５−β−コレスタン−３α，７α，１２α−トリオール）は、ＡＭＮと対照被験体の間で有意に異なっていることが見出された。ＡＭＮ群において３つの遊離脂肪酸（ｎ−ヘキサン酸、エイコサペンタエン酸、およびヘキサデカン二酸）のレベルが低下していることも見出された（第９表）。最後に、神経伝達に関連しているとされるγ−アミノブチレートの異化反応における中間体であるコハク酸セミアルデヒドが、ＡＭＮ患者のサンプル中で上昇していた。
【０１６５】
同様のアプローチを血漿の解析にも応用することにより、ＰＢＭＣメタボロームプロファイルは、リピドームプロファイルよりも良好に群間を識別することが観察された。統計解析により、群間で７９３分子が有意に異なっていることが明らかになった。
【表３３】
2018529081.tif 000042
【表３４】
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【表３５】
2018529081.tif 000044
すべての同一性は正確な質量と保持時間に基づいて確認した。＊これらの同一性は、正確な質量、保持時間、およびＭＳ／ＭＳスペクトルに基づいた。ａ、ｂ、ｃ：保持時間の異なる等圧分子。１倍率変化は、未処理の強度を対数変換して算出した。メタボロミクスおよびリピドームに対しては、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ多重検定補正によるスチューデントｔ検定、ｐ＜０，０５、を用いた。
【０１６６】
第１０表に推定上の同一性をもつ分子を挙げる。特に、ＡＭＮのＰＢＭＣサンプル中のヒスタミン濃度は対照サンプルよりも高く、キサンチン酸化酵素の産物であるヒポキサンチンのレベルも高かった。ＡＭＮでは胆汁酸の代謝が阻害されているという示唆を支持するものとして、ＡＭＮ患者のＰＢＭＣサンプル中の５β−コレスタン−３α，７α，１２α，２６−テトロールのレベルは対照サンプルよりも有意に高かった。興味深いことに、ラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）のような糖脂質、およびグリセロホスファチジルエタノールアミン経路の代謝産物（ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびＣＤＰ−エタノールアミン）のほとんど、およびトリグリセリド種は、ＡＭＮ患者において上昇していた（第１０表）。Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−Ｐａｔｈプラットホームを用いた推定上の同一性をもつ分子の経路解析により、セラミド分解、スフィンゴミエリン代謝、およびロイコトリエン、プロスタグランジン、およびトロンボキサンサブファミリーの代謝産物を含むエイコサノイド生合成のような生物活性のある脂質経路によって駆動される炎症誘発カスケードを含む、幾つかの中心点が明らかになった。まとめると、同定されたすべての代謝産物のほとんどが、炎症および／または酸化還元の恒常性に関連していた。
【０１６７】
Ｘ−ＡＬＤにおける「〜ミクス」データの統合解析
疾病の原因と関連し得る、異なる種と細胞型に渡る疾病のコア分子の足跡を明らかにするため、次にメタボロームおよびリピドームの結果をＡｂｃｄ１−マウス脊髄のトランスクリプトームデータと統合した。３．５、１２、および２２か月齢のＸ−ＡＬＤマウス脊髄のトランスクリプトームとＡＭＮ患者のＰＢＭＣおよび血漿のメタボロームとの間で共通する調節不全経路について解析した。共有される３つの調節不全経路、すなわちｉ）脂質およびリポタンパク質の代謝、ｉｉ）ＧＰＣＲ（Ｇタンパク質共役型受容体）によるシグナル伝達、およびｉｉｉ）スフィンゴ脂質の代謝、が突出していた。経路ｉ）およびｉｉ）は、血漿でも調節不全状態であった。代謝反応を正確に視覚化するため、Ｋｅｇｇによる代謝マップ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ−ｂｉｎ／ｓｈｏｗ＿ｐａｔｈｗａｙ？ｍａｐ０１１００ｖ）を用いて、本発明者ら独自のＡＭＮメタボロームマップを作成した。この統合解析アプローチにより、酵素の発現（Ａｂｃｄ１−マウス脊髄から）およびそれらの反応産物または基質（ＡＭＮ患者の血漿またはＰＢＭＣから）の両方に同方向への傾向がみられ、障害の幾つかの中心点が得られた。酵素代謝産物の組み合わせを協調して調節不全にする４つの領域が同定された。第一は、グルコシルセラミドからベータ−１，４−ガラクトース転移酵素（Ｂ４ＧＡＬＴ６）を通したラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）の合成である。この酵素の発現はトランスクリプトーム解析において上昇しており、脊髄のＱ−ＰＣＲアッセイでも確認された（図２Ａ）。第二の中心点は、ＣＤＰ−エタノールアミンを基質、ホスファチジルエタノールアミンを産物、およびエタノールアミンリン酸転移酵素ＣＥＰＴ１を触媒酵素とした、グリセロリン脂質代謝の調節不全に焦点を当てる。さらに、ホスファチジルエタノールアミンは、ホスファチジルセリン合成酵素によってホスファチジルセリンに転換される。ＣＥＰＴ１はまた、ＣＤＰコリンからジアシルグリセロールへホスホコリンを転移することによって、ホスファチジルコリン合成の最終段階を触媒する。得られたホスファチジルコリンは、カルシウム非依存性の、細胞質ホスホリパーゼ２γ、ｃＰＬＡ２γ（ＰＬＡ２Ｇ４Ｃ）によってアラキドン酸へ代謝される。これは、グリセロリン脂質を加水分解して、エイコサノイドおよびジアシルグリセロールのような、炎症過程のシグナル伝達分子およびセカンドメッセンジャーの産生の前駆体として役立つ遊離脂肪酸およびリゾリン脂質を産生する酵素ファミリーである。脊髄のトランスクリプトミクス解析によると、Ｐｌａ２ｇ４ｃおよびＣｅｐｔ１の転写が上昇しており、これはＡｂｃｄ１−脊髄のＱ−ＰＣＲ検証分析によっても確認され（図２Ａ）、３か月齢という非常に早い段階でみられた（図２Ａ）。協調された調節不全の第三の領域は、レチノール（ビタミンＡ）からのレチノイン酸生合成経路における、レチノール脱水素酵素１１（ＲＤＨ１１）によるレチナール（レチンアルデヒド）形成である。レチナールにおけるこの増加は、Ａｂｃｄ１−脊髄のトランスクリプトーム、ＡＭＮ患者の単核細胞（図２Ｂ）およびＡｂｃｄ１−マウス脊髄（図２Ａ）のＱ−ＰＣＲ検証分析にお��るＲｄｈ１１の転写レベルの上昇とも関連している。ＲＤＨ１１はステロール調節性エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）によって誘導される膜結合型酵素で、レチナールに加え、ヒトＸ−ＡＬＤサンプルに見出された酸化産物である４−ヒドロキシノネナール（４−ＨＮＥ）のような、その他の毒性の脂肪アルデヒドを減少させることが示唆されている。ＲＤＨ１１の機能不全は脳および網膜の発生に関わるヒト症候群の原因となり、この酵素の重要性が強調される。第四の中心点は胆汁酸生合成に焦点が当てられるもので、ペルオキシソームβ−酸化の最終産物であるコール酸およびグリココール酸のレベルが低下している。このことは、Ａｂｃｄ１−マウス脊髄におけるペルオキシソームの二機能性タンパク質およびラセマーゼＡＭＡＣＲ酵素発現の調節不全とも一致している。本発明者らは、同経路の上流に、胆汁合成経路のコレステロール中間体である５−β−コレスタン−３α，７α，１２α−トリオールおよび５β−コレスタン−３α，７α，１２α，２６−テトロールの蓄積を見出した。５−β−コレスタン−３α，７α，１２α−トリオールから５β−コレスタン−３α，７α，１２α，２６−テトロールへの酸化工程を触媒する酵素は、ミトコンドリアに存在するチトクロムＰ４５０スーパーファミリーのメンバーであるステロール２７水酸化酵素（ＣＹＰ２７Ａ１）である。脊髄のトランスクリプトーム解析から予想されたように、ＣＹＰ２７Ａ１の転写レベルはＰＢＭＣで上昇していた（図２Ｂ）。特にこの酵素の不活性化は、中枢神経の脱髄、運動失調、および痙性対麻痺に付随するまれな常染色体潜性の脂質蓄積病である、脳腱黄色腫症（ＯＭＩＭ  ２１３７００）に関与する。加えて、脂肪酸代謝（合成および酸化）の幾つかの酵素が調節不全であることが、トランスクリプトーム解析で観察され、このような酵素にはアセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ２（ミトコンドリアの３−オキソアシル−補酵素Ａチオラーゼ）（Ａｃａａ２）；アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼアルファ（Ａｃａｃａ）；アシル−ＣｏＡ脱水素酵素；短鎖／分岐鎖（Ａｃａｄｓｂ）；ヒドロキシアシル−ＣｏＡ脱水素酵素（Ｈａｄｈ）；およびヒドロキシアシル−ＣｏＡ脱水素酵素／３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ／エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（三機能性タンパク質）、アルファサブユニット（Ｈａｄｈａ）が含まれる。メタボロミクスによって同定された、ヘキサン酸およびミリスチン酸のような幾つかの脂肪酸のレベルの同時変化は、オリジナルのＫｅｇｇマップには記載されていないものの、関連性があると考えられる。
【０１６８】
ＡＭＮ患者血液中にみられる炎症および酸化ストレス
炎症カスケードを支配する、スフィンゴ糖脂質およびグリセロリン脂質代謝の調節不全を指摘する、〜ミクスデータの統合解析に由来する仮説を検証するため、幾つかの相補的アプローチを用いた。それらは以下のとおりであった：ｉ）定量マススペクトロメトリーパネルによって、ほとんどがアラキドン酸誘導体である、血漿中の炎症および過酸化脂質マーカーの脂質メディエーターを評価する（Ｂｉｏｃｒａｔｅｓ）；ｉｉ）Ｑ−ＰＣＲアレイによって、炎症性サイトカインおよびそれらの関連受容体の、ＰＢＭＣ中の発現を測定する；およびｉｉｉ）ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（商標）技術を用いた免疫測定法によって、血漿中のアディポカインおよびサイトカインを同定する。Ｂｉｏｃｒａｔｅｓ  ＭＳ／ＭＳ分析により、ＡＭＮサンプル中で、アラキドン酸代謝産物の３つの炎症性産物、すなわちエイコサノイドであるトロンボキサンＢ２、ならびに１２−および１５−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（ＴＸＢ２、１２Ｓ−ＨＥＴＥおよび１５Ｓ−ＨＥＴＥ）が上昇していることが特定された（図２Ｃ）。ロイコトリエンＢ４、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、４−ヒドロキシ−２−ノネナール（４−ＨＮＥ）、１５Ｓ−ＨＥＴＥ、および９／１３−ＨＯＤＥのようなアラキドン酸代謝産物は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ／δおよびＰＰＡＲγの強力なリガンドであることから、これら脂質代謝および炎症のマスター制御因子の発現をＱ−ＰＣＲによって分析した。その結果、ＡＭＮ患者のＰＢＭＣにおいてＰＰＡＲβ／δは上昇していたがＰＰＡＲαまたはＰＰＡＲγはそうではなかったこと（図２Ｂ）、およびＰＰＡＲγは１２か月齢のＡｂｃｄ１−脊髄において低下していたこと（図２Ａ）が示された。
【０１６９】
次に本発明者らは、「ミクス」統合解析によって示唆された炎症過程を強調し得る、サイトカインの相関レベルの調査を開始した。Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ技術の使用により、ＡＭＮ患者の血漿において、幾つかの炎症性サイトカイン（ＨＧＦ、ＩＬ６、ＩＬ８、ＭＣＰ−１およびＴＮＦα）のレベル上昇、およびアディポネクチンのレベル低下（図２Ｄ）が観察された。これは、ＡＭＮ血漿における著明な炎症誘発性プロファイルを示唆している。後者のアディポカインは、神経変性との関連が新たに発見された、脂肪組織から分泌される抗炎症性ホルモンであり、本発明者らはこれがＡｂｃｄ１−マウスモデルの血漿において低下していることを見出した。次に、ＡＭＮ患者のＰＢＭＣにおける幾つかのサイトカインおよびそれらの受容体の発現について調べた。サイトカインアレイにより、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）（炎症誘発性）および／またはＴｈ２（より保護的）極性に関わる幾つかの分子が、ＡＭＮ患者のＰＢＭＣにおいて上昇していることが示された（図３Ａ）。標的Ｑ−ＰＣＲを用いて、サイトカインシグナル抑制因子（ＳＯＣＳ）およびシグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）ファミリーメンバー（ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ６およびＳＯＣＳ３）の発現を評価することにより、炎症性プロファイルデータを補完した（図３Ｂ）。炎症性サイトカインの発現制御に加え、ＳＯＣＳおよびＳＴＡＴファミリー遺伝子もまた、Ｔｈ細胞のＴｈ１、Ｔｈ２、またはＴｈ１７表現型への極性化を制御するため、自己分泌および傍分泌の免疫調節能による獲得免疫応答において中心的役割を果たしている。興味深いことに、ＡＭＮ患者のＰＢＭＣにおいて、免疫細胞による炎症誘発性Ｔｈ１の分化応答を駆動するＳＴＡＴ１の発現上昇がみられたが、ＩＬ４と共にＴｈ２の成熟に関わるＳＯＣＳ３およびＳＴＡＴ６のレベルも上昇していた（図３Ｂ）。ＰＢＭＣのサイトカインプロファイル発現は、古典的なＩＬ１／ＴＮＦα／ＩＬ６経路の代わりに、ＩＬ３６経路（ＩＬ３６Ａ、ＩＬ３６ＢおよびＩＬ３６Ｇ）を通した炎症活性化を示していた。さらに、Ｔｈ２マーカーであるＩＬ９／ＩＬ９Ｒ、ならびにＩＬ４、ＩＬ５／ＩＬ５Ｒ、ＩＬ１０およびＩＬ１３の発現上昇も検出された（図３Ａ）。結論として、ＡＭＮ患者におけるサイトカイン遺伝子プロファイルは、Ｔｈ１、Ｔｈ１７、またはＴｈ２応答のいずれかに強く方向付けられてはおらず、より一般的な炎症性不均衡が示唆された。
【０１７０】
実施例３：Ａｂｃｄ１−／Ａｂｃｄ２−／−マウスにおけるフィンゴリモドおよびシポニモドによる治療の効果
方法
自発運動試験
トレッドミル試験
トレッドミル装置は、速度および勾配を変更できる可変性スピードベルトから構成されていた。フットショック（０．２ｍＡ）があるベルトの後ろに、通電グリッドが位置しており、マウスがベルトから落下した際に適用された。トレッドミル装置（Ｐａｎｌａｂ、バルセロナ、スペイン）は、プレキシガラスチャンバーに格納された、速度（５から１５０ｃｍ／ｓ）および勾配（０〜２５°）を変更できるベルト（５０ｃｍ長および２０ｃｍ幅）から構成されていた。ベルトから落下するまでの潜時（秒によるショック時間）および受けたショック数を測定した。マウスを、既に動いているベルトの上に、通電グリッドから外向きの、ベルトの動きと反対の方向に置いた。したがって、フットショックを避けるためには、マウスは前方へ運動する必要がある。
【０１７１】
マウスは、５回の試行による１日のセッションにおいて評価した。最初の試行で、ベルト速度は２０ｃｍ／ｓ、傾斜は５°に設定した。第二および第三の試行で、ベルト速度は１０ｃｍ／ｓ、勾配はそれぞれ１０°および２０°に増大させた。次に、第四および第五の試行で、傾斜は２０°のままで、ベルト速度をそれぞれ２０および３０ｃｍ／ｓに増大させた。最初の３回の試行では、マウスは１分間走行させた。第四および第五の試験では、実験時間はそれぞれ３分および７分間とした。各試験の間隔は、それぞれ１、１、５、および２０分間とした。マウスを２０ｃｍ／ｓｅｃまで上げた速度と２０°の傾斜による連続試行に供した際、１つのセッションから別のセッションまで、ＷＴおよびＡｂｃｄ１−／Ａｂｃｄ２−／−マウスの間に差は検出されなかった。しかしながら、ベルト速度を３０ｃｍ／ｓｅｃまで上げ、傾斜が２０°であった際、このタスクにはより強い協調が必要とされたため、Ａｂｃｄ１−／Ａｂｃｄ２−／−マウスおよび対照の間に差が検出された。したがってこれらの条件は、フィンゴリモドおよびシポニモドの効果を評価するために選択された。
【０１７２】
トレーニングセッションの成績はすべての群で正常であったことから、スキルが正しく獲得されたことが示唆される（データ未提示）。ショック時間とショック数との間の比を、自発運動欠陥の指標として用いた。
【０１７３】
平行バークロス試験
長さ１００ｃｍおよび幅２ｃｍ（直径）の木製の棒を用いて、バークロス試験を行った。この棒は、マウスが後肢を端に突き出して立つには十分な幅があり、側面をわずかでも踏み誤ると、滑り落ちるようになっている。棒は実験台の表面から５０ｃｍ高くなっており、動物は飛び降りることができず、棒から落ちても怪我をしないようになっている。マウスは棒の一端に置かれ、別の端へと渡ることが予想された。滑り落ちの原因としてのタスクに慣れるように、すべての動物に対して、前日および試験セッションの開始時に棒上で４回の試行が行われた。実験セッションの４回の連続試行において、側面からの後肢の滑り落ちおよび棒からの落下の回数を記録した。動物が落下した場合、棒の落下した場所に置き直し、タスクを完了させるようにした。各動物が使用した後に、棒の汚れをエタノールで落とした。
【０１７４】
統計解析
データは平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。有意差は、正規性を検証した後、スチューデントｔ検定または一元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くチューキーＨＳＤ事後検定（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）によって決定した。統計解析は、ソフトウェアプログラムＳＰＳＳ  １２．０を用いて行った。
【０１７５】
結果
以前に記載したように（Ｍｏｒａｔｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０１５  Ｎｏｖ；２２（１１）：１７４２−５３；Ｍｏｒａｔｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｒａｉｎ．２０１３  Ａｕｇ；１３６（Ｐｔ８）：２４３２−４３）、最もよく用いられるＸ−ＡＬＤのモデルであるＡｂｃｄ１−／Ａｂｃｄ２−／−欠損マウスの自発運動の欠陥を、フィンゴリモドおよびシポニモドによる処置後に、トレッドミルおよびバークロス実験を用いて評価した（図４を参照）。トレッドミル実験においては、ＷＴマウスに比べてダブルノックアウトマウスのショック時間は長く、ショック回数も多かった。明らかに、フィンゴリモドおよびシポニモド処置から４か月後には、この割合はＷＴの割合と変わらなくなっていた（図４Ａ）。バークロス実験においては、ダブルノックアウト変異体はバランスを保つためにしばしば落下し、棒から滑り落ちる傾向も高く、棒の反対側のプラットホームに達するまでの時間も長かった。滑り落ちの回数および棒を渡るために必要な時間もまた、フィンゴリモドおよびシポニモドによる処置後に正常化した（図４Ｂ）。全体的に見ると、これらのデータは、フィンゴリモドおよびシポニモドによる処置が、Ｘ−ＡＬＤマウスにおける疾病の進行を抑止することを示している。
【０１７６】
実施例４：ＡＭＮ患者における重度および中等度の表現型の間での、バイオマーカーのレベルの違い
【表３６】
2018529081.tif 000045
ＥＤＳＳおよび６ＭＷＴパラメーターによる評価で、アディポネクチンおよびＣＸＣＬ９のレベルは中等度表現型の患者では低く、重度の患者では高かった。ＩＬ３６Ａのプロファイルは異なっており、中等度の患者では、さらに上昇していた。ＥＤＳＳは痙縮の臨床基準で、６ＭＷＴは６分間の歩行距離を測定する臨床試験である。データは片側対応ｔ検定または片側ウィルコクソン符号順位検定によって解析した。治験はＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌ．ｇｏｖに登録した（ＮＣＴ０１４９５２６０）。
【表３７】
2018529081.tif 000046
モデルの予測精度の平均としてのピアソン相関。
【０１７７】
ｌｍｔｅｓｔパッケージを用いた尤度比試験を応用して、年齢および治療前の６ｍｔＷＴにおける歩行距離のような交絡変数から正則化回帰法によって選択した変数の影響を区別した（ｈｔｔｐ：／／ｃｒａｎ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｄｏｃ／Ｒｎｅｗｓ／）。試験モデルとして、年齢および６ｍｔＷＴのみを用い、制限（または帰無）ネスティッド・モデルに対して選択した変数を用いて一般化線形回帰を行った。Ｘ−ＡＬＤおよび対照を区別する力を、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することによって評価した。ＲにおけるｐＲＯＣパッケージを用いて、ＡＵＣとその標準誤差および９５％信頼区間を計算した。すべての統計解析は、Ｒプログラミング環境におけるＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージを用いて行った。治療前および治療後６か月に測定した変数を用いて、予測される６ｍｔＷＴとアッセイの終了時に測定した実際の６ｍｔＷＴの間に強い相関が示された。治療前の１２Ｓ−ＨＥＴＥおよびアディポネクチンのレベルの組み合わせが、治療前の表現型の重症度を予測するものであった。治療後の１５Ｓ−ＨＥＴＥのレベルは、治療後の表現型の重症度を予測するものであった（改善または改善なし）。治療前および後のＭＣＰ−１のレベルの間の比は治療の奏功を予測するものであった。治験はＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌ．ｇｏｖに登録した（ＮＣＴ０１４９５２６０）。
【０１７８】
すべての統計解析は、Ｒプログラミング環境におけるＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージを用いて行った。
【０１７９】
実施例５：炎症性マーカーに対する抗酸化剤治療の効果
【表３８】
2018529081.tif 000047
抗酸化剤治療６か月後の、治療前と比較した、炎症性マーカーであるＴＮＦ、ＩＬ８、ネオプテリン、１２Ｓ−ＨＥＴＥ、１５Ｓ−ＨＥＴＥ、ＴＸＢ２、ＩＦＮＡ２、ＩＬ４、ＩＬ３６Ａ、ＣＣＲ３の有意な減少と、保護的サイトカインであるアディポネクチン、ＩＬ１０、およびＣＸＣＬ９の増大。片側対応ｔ検定または片側ウィルコクソン符号順位検定によって解析した（個別患者ｎ＝１１）。治験はＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌ．ｇｏｖに登録した（ＮＣＴ０１４９５２６０）。
【０１８０】
実施例６：バイオマーカーのレベルに基づいた予測ＡＭＮモデルの正確度
ＡＭＮの潜在的なバイオマーカーとして提案される分子の妥当性を支持するため、Ｍｅｔａｂｏａｎａｌｉｓｔプラットホームを用いて、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析を行った（Ｘｉａ，Ｊ．，Ｓｉｎｅｌｎｉｋｏｖ，Ｉ．，Ｈａｎ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｗｉｓｈａｒｔ，Ｄ．Ｓ．（２０１５）ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ  ３．０−ｍａｋｉｎｇ  ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ  ｍｏｒｅ  ｍｅａｎｉｎｇｆｕｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４３，Ｗ２５１−２５７）。このプラットホームは、細胞ライセートおよび血漿中に存在するイオン化陽性および陰性両方の代謝産物を用いて行った。結果は、スフィンゴシン１ホスフェートに対するＲＯＣ曲線下面積が０．９７６であり（９５％信頼区間、以下ＣＩは０．８８２〜１）、この目的への可能性が示された。以上の測定値から計算すると、内部標準に適合させた、スフィンゴシン−１−ホスフェートの特定のｍ／ｚ値および保持時間において計算された至適なカットオフ値２１９００ｍｓカウントが、１００％の検出感度（または１００％真陽性率）と８４％の特異性（１５．４％偽陽性率）をもたらす。
【０１８１】
相互検証解析を用いて（線形ベクトル支持法を用いて１００）、ほとんどのサンプルが正確に帰属しており、１つの対照サンプルのみがＡＭＮ群に帰属していることを開示した。さらに、１００の相互検証に基づいた平均正確度は０．８９２（９０％に近い正確度）、提供データの正確度は０．８であった。
【０１８２】
モデルの全体の質を改善するためにさらなる変数が必要かどうかを評価するため、データベースに含まれるその他のバイオマーカーを用いて同様の検定を行った。ＲＯＣ曲線はバランスの取れたサブサンプリングを用いたモンテカルロ相互検証（ＭＣＣＶ）によって作成した。各ＭＣＣＶにおいて、サンプルの３分の２（２／３）を用いて特色の重要性を評価した。次に、トップ２、３、５、１０．．．１００（最大）の重要な変数を用いて、除外された１／３のサンプルにおいて検証された分類モデルを構築した。各モデルにおいて、手順を複数回繰り返して成績および信頼区間を計算した。線形支持ベクトルマシンアプローチ（ＳＶＭ）を分類法として選択し、およびソフトウェアに組み込まれた支持ベクトルマシンアプローチを、特色の順位法として選択した。
【０１８３】
発見データセットに含まれるその他の変数を用いることで（提案されるバイオマーカーの予測ＲＯＣ値については第１５表を参照）、正確度の高いモデルをデザインできる（２変数モデルに対するＡＵＣ：０．９５  ＣＩ  ０．７５〜１；３変数の場合：０．９７６  ＣＩ  ０．７６４〜１；５変数の場合：０．９８６  ＣＩ  ０．８２７〜１；１０変数の場合０．９９９  ＣＩ  １〜１）。
【表３９】
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【表４０】
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【０１８４】
このように、１０の潜在的なバイオマーカーによる多変量モデルは、１００％の正確度に到達した。同様に、相互検証解析（線形ベクトル支持法を用いて１００）を用いて、１００％のサンプルが正確に帰属していることが開示された。
【０１８５】
さらなる変数の導入が、予測される正確度を改善するか否かの評価において、２変数モデルから４４変数モデルまでを用いた結果、正確度の増大（８９．８％から９９．２％）が示された。
【０１８６】
例えば２変数のシステムにどの変数が含まれたかについて考慮すると、最も高い正確度を示した２変数は、スフィンゴシン１ホスフェートおよびＴＡＧ（６３：２）であった。
【図１】
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【図２ＡＢ】
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【図２ＣＤ】
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【図３Ａ】
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【図３ＡＢ】
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【図４】
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【国際調査報告】
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