(57)【要約】  本開示は、被験体における抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法、およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）で処置される被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、例えば、化学修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含み、被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答、または望ましくない免疫細胞の活性化（例えば、Ｂ細胞の活性化、サイトカインの分泌）を低減または阻害するように、ｍＲＮＡが、ｍｉＲ−１２６結合部位および／またはｍｉＲ−１４２結合部位など、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含む、方法を特色とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、前記被験体へと、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含み、前記被験体における、前記目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、前記ｍｍＲＮＡが、（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位；（ｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ−１２６結合部位；または（ｉｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および少なくとも１つのｍｉＲ−１２６結合部位を含み、前記ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、方法。
【請求項２】
前記ｍｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子内に封入して、静脈内投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｍｍＲＮＡを、毎週１回の注入により投与する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｍｍＲＮＡが、５’ＵＴＲ、前記目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレーム、（ｉ）前記少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位；（ｉｉ）前記少なくとも１つのｍｉＲ−１２６結合部位；または（ｉｉｉ）前記少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および少なくとも１つのｍｉＲ−１２６結合部位を含む３’ＵＴＲ、ならびに連結されるヌクレオシドの３’テーリング領域を含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ｍｍＲＮＡが、コード領域に対して異種性である、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ｍｍＲＮＡを、全修飾する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記ｍｍＲＮＡが、シュードウリジン（ψ）、シュードウリジン（ψ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２−チオウリジンおよび５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジンおよび５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、またはＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記ｍｍＲＮＡが、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザシュードウリジン、２−チオ−１−メチルシュードウリジン、２−チオ−５−アザウリジン、２−チオジヒドロシュードウリジン、２−チオジヒドロウリジン、２−チオシュードウリジン、４−メトキシ−２−チオシュードウリジン、４−メトキシシュードウリジン、４−チオ−１−メチルシュードウリジン、４−チオシュードウリジン、５−アザウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン、もしくは２’−Ｏ−メチルウリジン、またはこれらの組合せを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ｍｍＲＮＡが、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、α−チオグアノシン、もしくはα−チオアデノシン、またはこれらの組合せを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記目的のポリペプチドが、治療用タンパク質、サイトカイン、増殖因子、抗体、または融合タンパク質である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
脂質ナノ粒子が、リポソームである、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質および／またはイオン化脂質を含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記カチオン性脂質および／またはイオン化脂質が、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡまたはＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｍｍＲＮＡが、配列番号３に示される配列を含む、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｍｍＲＮＡが、少なくとも２つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、前記マイクロＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１つが、ｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｍｍＲＮＡが、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位と、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６−３ｐ、ｍｉＲ−１４６−５ｐ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、およびｍｉＲ−２７からなる群から選択される、ｍｉＲに対する第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｍｍＲＮＡが、配列番号２６に示される配列を含む、少なくとも１つのｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｍｍＲＮＡが、少なくとも２つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、前記マイクロＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１つが、ｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｍｍＲＮＡが、ｍｉＲ−１２６結合部位と、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６−３ｐ、ｍｉＲ−１４６−５ｐ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、およびｍｉＲ−２７からなる群から選択される、ｍｉＲに対する第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ｍｍＲＮＡ構築物が、ｍｉＲ−１２６結合部位およびｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ｍｍＲＮＡ構築物が、３つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ｍｍＲＮＡ構築物が、３つのｍｉＲ−１２６結合部位を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記目的のポリペプチドをコードする、前記コドン最適化オープンリーディングフレームが、終止コドンを含み、前記（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位；（ｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ−１２６結合部位；または（ｉｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および少なくとも１つのｍｉＲ−１２６結合部位を、前記終止コドンの後の、３’ＵＴＲの３０〜５０ヌクレオチドの中に配置する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記目的のポリペプチドをコードする、前記コドン最適化オープンリーディングフレームが、終止コドンを含み、前記（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位；（ｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ−１２６結合部位；または（ｉｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および少なくとも１つのｍｉＲ−１２６結合部位を、前記終止コドンの後の、３’ＵＴＲの少なくとも５０ヌクレオチドの中に配置する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位；（ｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ−１２６結合部位；または（ｉｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および少なくとも１つのｍｉＲ−１２６結合部位を、前記ｍｍＲＮＡ構築物の５’ＵＴＲ内に配置する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
目的のポリペプチドの、被験体への反復投与後における、抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、前記被験体へと、ＬＮＰ内に封入された、目的のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を静脈内投与するステップであり、前記ｍｍＲＮＡが、（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位；（ｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ−１２６結合部位；または（ｉｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および少なくとも１つのｍｉＲ−１２６結合部位を含み、前記ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；
前記被験体における、前記目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、前記被験体へと、ＬＮＰ内に封入された前記ｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップと
を含む方法。
【請求項２７】
目的のポリペプチドの、被験体への反復投与後における、抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、
（ｉ）前記被験体へと、ＬＮＰ内に封入された、目的のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を静脈内投与するステップであって、前記ｍｍＲＮＡが、（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位；（ｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ−１２６結合部位；または（ｉｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および少なくとも１つのｍｉＲ−１２６結合部位を含み、前記ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；
（ｉｉ）前記被験体に由来する試料中の抗薬物抗体のレベルを検出するステップと；
（ｉｉｉ）前記試料中の抗薬物抗体の前記レベルが低下したら、前記被験体における、前記目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、前記被験体へと、ＬＮＰ内に封入された前記ｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップと
を含む方法。
【請求項２８】
被験体における薬物関連毒性を低減または阻害する方法であって、前記被験体へと、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含み、前記被験体における、前記目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性を低減または阻害するように、前記ｍｍＲＮＡが、（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位；（ｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ−１２６結合部位；または（ｉｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および少なくとも１つのｍｉＲ−１２６結合部位を含み、前記ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、方法。
【請求項２９】
目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、前記被験体へと、前記目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、前記被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害するように、前記化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、前記化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、方法。
【請求項３０】
望ましくない免疫細胞の活性化の低減または阻害を、前記少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠く化学修飾ｍＲＮＡの対照投与と比較して決定する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記望ましくない免疫細胞の活性化の低減または阻害が、リンパ球の活性化の低減または阻害である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記リンパ球の活性化の低減または阻害が、Ｂ細胞の活性化の低減または阻害である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
Ｂ細胞の活性化の低減または阻害を、ＣＤ１９＋ＣＤ８６＋ＣＤ６９＋Ｂ細胞の頻度により決定する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記望ましくない免疫細胞の活性化の低減または阻害が、サイトカイン産生の低減または阻害を引き起こす、請求項２９から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
免疫細胞の活性化を、前記化学修飾ｍＲＮＡによりコードされる、前記目的のポリペプチドの発現の、対応する減少を伴わずに減少させる、請求項２９から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害する方法であって、前記被験体へと、前記目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、前記被験体における、望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害するように、前記化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、前記化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、方法。
【請求項３７】
望ましくないサイトカインの産生の低減または阻害を、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、前記少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠く化学修飾ｍＲＮＡの対照投与と比較して決定する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記サイトカインの産生の低減または阻害が、インターロイキン６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、またはインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の産生の低減または阻害である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記サイトカインの産生の低減または阻害が、インターロイキン６（ＩＬ−６）の産生の低減または阻害である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
サイトカインの産生を、前記化学修飾ｍＲＮＡによりコードされる、前記目的のポリペプチドの発現の、対応する減少を伴わずに減少させる、請求項３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記化学修飾ｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子内に封入して、静脈内投与する、請求項２９から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記化学修飾ｍＲＮＡを、毎週１回の注入により投与する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記化学修飾ｍＲＮＡが、５’ＵＴＲ、前記目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレーム、前記少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ、および連結されるヌクレオシドの３’テーリング領域を含む、請求項２９から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記化学修飾ｍＲＮＡが、前記オープンリーディングフレームに対して異種性である、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ｍＲＮＡを、全修飾する、請求項２９から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ｍＲＮＡが、シュードウリジン（ψ）、シュードウリジン（ψ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２−チオウリジンおよび５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジンおよび５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、またはＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む、請求項２９から４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記ｍＲＮＡが、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザシュードウリジン、２−チオ−１−メチルシュードウリジン、２−チオ−５−アザウリジン、２−チオジヒドロシュードウリジン、２−チオジヒドロウリジン、２−チオシュードウリジン、４−メトキシ−２−チオシュードウリジン、４−メトキシシュードウリジン、４−チオ−１−メチルシュードウリジン、４−チオシュードウリジン、５−アザウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン、もしくは２’−Ｏ−メチルウリジン、またはこれらの組合せを含む、請求項２９から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ｍＲＮＡが、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、α−チオグアノシン、もしくはα−チオアデノシン、またはこれらの組合せを含む、請求項２９から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、骨髄系細胞内で発現するマイクロＲＮＡに結合する、請求項２９から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、形質細胞様樹状細胞内で発現するマイクロＲＮＡに結合する、請求項２９から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、マクロファージ内で発現するマイクロＲＮＡに結合する、請求項２９から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位である、請求項２９から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号２６に示される配列を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ−１４２マイクロＲＮＡ結合部位である、請求項２９から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ｍｉＲ−１４２マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号３に示される配列を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ−１５５マイクロＲＮＡ結合部位である、請求項２９から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ｍｉＲ−１５５マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号３５に示される配列を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記目的のポリペプチドが、治療用タンパク質、サイトカイン、増殖因子、抗体、または融合タンパク質である、請求項２９から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記化学修飾ｍＲＮＡが、少なくとも２つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む、請求項２９から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記マイクロＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１つが、ｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記化学修飾ｍＲＮＡが、ｍｉＲ−１２６結合部位と、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６−３ｐ、ｍｉＲ−１４６−５ｐ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、およびｍｉＲ−２７からなる群から選択される、ｍｉＲに対する第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記化学修飾ｍＲＮＡが、ｍｉＲ−１２６結合部位およびｍｉＲ−１４２結合部位を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記脂質ナノ粒子が、リポソームである、請求項４１に記載の方法。
【請求項６４】
前記脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質および／またはイオン化脂質を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項６５】
前記カチオン性脂質および／またはイオン化脂質が、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡまたはＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、前記被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与するステップであり、前記化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、前記化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；
前記被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害するように、前記被験体へと、ＬＮＰ内に封入された前記化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップと
を含む方法。
【請求項６７】
目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の、被験体への反復投与後の前記被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、
（ｉ）前記被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与するステップであり、前記化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、
前記化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；
（ｉｉ）前記被験体に由来する試料中の免疫細胞の活性化のレベルを検出するステップと；
（ｉｉｉ）前記試料中の免疫細胞の活性化の前記レベルが低下したら、前記被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害するように、前記被験体へと、ＬＮＰ内に封入された前記化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップと
を含む方法。
【請求項６８】
前記望ましくない免疫細胞の活性化の低減または阻害が、Ｂ細胞の活性化の低減または阻害である、請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記望ましくない免疫細胞の活性化の低減または阻害が、サイトカインの産生の低減または阻害を引き起こす、請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項７０】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する方法であって、前記被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、前記目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、反復投与後の前記被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、前記化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、前記化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、方法。
【請求項７１】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する方法であって、前記被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与するステップであり、前記化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、前記化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、ステップと；
前記被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、前記被験体へと、ＬＮＰ内に封入された前記化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップと
を含む方法。
【請求項７２】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、前記目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡが、Ｂ細胞を活性化させず、かつ／または前記ＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しない、請求項７０から７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
血中クリアランスの加速化の低減または阻害を、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、前記少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠く化学修飾ｍＲＮＡの対照投与と比較して決定する、請求項７０から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
血中クリアランスの加速化を、前記化学修飾ｍＲＮＡによりコードされる、前記目的のポリペプチドの発現の、対応する低下または阻害を伴わずに低減または阻害する、請求項７０から７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
２回にわたる連続投与の間の間隔が、２週間未満である、請求項７０から７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
２回にわたる連続投与の間の間隔が、１週間未満である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害する方法であって、前記被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、前記目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、反復投与後の前記被験体における、ＰＥＧを認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害するように、前記化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、前記化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、方法。
【請求項７８】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害する方法であって、前記被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与するステップであり、前記化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、前記化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；
前記被験体における、ＰＥＧを認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害するように、前記被験体へと、ＬＮＰ内に封入された前記化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップと
を含む方法。
【請求項７９】
前記化学修飾ｍＲＮＡが、５’ＵＴＲ、前記目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレーム、前記少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ、および連結されるヌクレオシドの３’テーリング領域を含む、請求項７０から７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記化学修飾ｍＲＮＡが、前記オープンリーディングフレームに対して異種性である、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記ｍＲＮＡを、全修飾する、請求項７０から８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記ｍＲＮＡが、シュードウリジン（ψ）、シュードウリジン（ψ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２−チオウリジンおよび５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジンおよび５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、またはＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む、請求項７０から８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記ｍＲＮＡが、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザシュードウリジン、２−チオ−１−メチルシュードウリジン、２−チオ−５−アザウリジン、２−チオジヒドロシュードウリジン、２−チオジヒドロウリジン、２−チオシュードウリジン、４−メトキシ−２−チオシュードウリジン、４−メトキシシュードウリジン、４−チオ−１−メチルシュードウリジン、４−チオシュードウリジン、５−アザウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン、もしくは２’−Ｏ−メチルウリジン、またはこれらの組合せを含む、請求項７０から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記ｍＲＮＡが、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、α−チオグアノシン、もしくはα−チオアデノシン、またはこれらの組合せを含む、請求項７０から８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、骨髄系細胞内で発現するマイクロＲＮＡに結合する、請求項７０から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ−１４２マイクロＲＮＡ結合部位である、請求項７０から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記ｍｉＲ−１４２マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号３に示される配列を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、形質細胞様樹状細胞内で発現するマイクロＲＮＡに結合する、請求項７０から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位である、請求項７０から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記ｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号２６に示される配列を含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、マクロファージ内で発現するマイクロＲＮＡに結合する、請求項７０から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ−１５５マイクロＲＮＡ結合部位である、請求項７０から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記ｍｉＲ−１５５マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号３５に示される配列を含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記目的のポリペプチドが、治療用タンパク質、サイトカイン、増殖因子、抗体、または融合タンパク質である、請求項７０から９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記化学修飾ｍＲＮＡが、少なくとも２つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む、請求項７０から９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記マイクロＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１つが、ｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記化学修飾ｍＲＮＡが、ｍｉＲ−１２６結合部位と、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６−３ｐ、ｍｉＲ−１４６−５ｐ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、およびｍｉＲ−２７からなる群から選択される、ｍｉＲに対する第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記化学修飾ｍＲＮＡが、ｍｉＲ−１２６結合部位およびｍｉＲ−１４２結合部位を含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
前記脂質ナノ粒子が、リポソームである、請求項７０から９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質および／またはイオン化脂質を含む、請求項７０から９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記カチオン性脂質および／またはイオン化脂質が、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡまたはＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）であって、前記ｍｍＲＮＡが、少なくとも２つの異なるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含み、前記マイクロＲＮＡが、造血系免疫細胞内で、またはＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現し、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する細胞内で発現され、前記ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、ｍｍＲＮＡ。
【請求項１０３】
前記造血系免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞などのリンパ系細胞である、請求項１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１０４】
前記造血系免疫細胞が、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、樹状細胞、巨核球、または血小板などの骨髄系細胞である、請求項１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１０５】
前記造血系免疫細胞が、造血前駆細胞である、請求項１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１０６】
前記ＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現し、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する細胞が、内皮細胞である、請求項１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１０７】
前記マイクロＲＮＡが、同じ目的の細胞型内または異なる目的の細胞型内で夥多である、請求項１０２から１０６のいずれか一項に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１０８】
前記マイクロＲＮＡが、複数の目的の細胞型内で夥多である、請求項１０２から１０６のいずれか一項に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１０９】
前記ｍｍＲＮＡが、造血系免疫細胞内で夥多なマイクロＲＮＡの少なくとも１つの第１のマイクロＲＮＡ結合部位および、内皮細胞内で夥多なマイクロＲＮＡの少なくとも１つの第２のマイクロＲＮＡ結合部位を含む、請求項１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１１０】
前記ｍｍＲＮＡが、Ｂ細胞内で夥多なマイクロＲＮＡの少なくとも１つの第１のマイクロＲＮＡ結合部位と、内皮細胞内で夥多なマイクロＲＮＡの、少なくとも１つの第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含む、請求項１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１１１】
前記ｍｍＲＮＡが、形質細胞様樹状細胞内で夥多なマイクロＲＮＡの、少なくとも１つの第１のマイクロＲＮＡ結合部位と、内皮細胞内で夥多なマイクロＲＮＡの、少なくとも１つの第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含む、請求項１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１１２】
第１のマイクロＲＮＡ結合部位の複数のコピーと、第２のマイクロＲＮＡ結合部位の少なくとも１つのコピーとを含む、請求項１０２から１１１のいずれか一項に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１１３】
前記第１のマイクロＲＮＡ結合部位の２つのコピーを含む、請求項１１２に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１１４】
同じマイクロＲＮＡの第１のマイクロＲＮＡ結合部位および第２のマイクロＲＮＡ結合部位を含む、請求項１０２から１１１のいずれか一項に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１１５】
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、同じマイクロＲＮＡの３ｐアームおよび５ｐアームのものである、請求項１１４に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１１６】
前記マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７、およびｍｉＲ−２６ａからなる群から選択される、請求項１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１１７】
前記マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、およびｍｉＲ−１５５からなる群から選択される、請求項１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１１８】
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ−１２６結合部位である、請求項１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１１９】
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ−１４２結合部位である、請求項１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１２０】
１つのマイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ−１２６結合部位であり、前記第２のマイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６−３ｐ、ｍｉＲ−１４６−５ｐ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、およびｍｉＲ−２７からなる群から選択されるマイクロＲＮＡに対するものである、請求項１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１２１】
少なくとも１つのｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位とを含む、請求項１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１２２】
少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位とを含む、請求項１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１２３】
少なくとも３つの異なるマイクロＲＮＡ結合部位を含み、前記マイクロＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１つが、ｍｉＲ−１２６結合部位である、請求項１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１２４】
少なくとも３つの異なるマイクロＲＮＡ結合部位を含み、前記マイクロＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１つが、ｍｉＲ−１４２結合部位である、請求項１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１２５】
少なくとも１つのｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐと、ｍｉＲ−１４６−３ｐ、ｍｉＲ−１４６−５ｐ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、およびｍｉＲ−２７からなる群から選択されるマイクロＲＮＡに対する第３のマイクロＲＮＡ結合部位とを含む、請求項１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１２６】
少なくとも１つのｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ−１５５結合部位とを含む、請求項１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１２７】
少なくとも１つのｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ−１５５結合部位とを含む、請求項１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１２８】
前記マイクロＲＮＡ結合部位を、前記ｍｍＲＮＡの前記５’ＵＴＲ内、３’ＵＴＲ内、または前記５’ＵＴＲ内および３’ＵＴＲ内の両方に配置した、先行する請求項のいずれかに記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１２９】
前記マイクロＲＮＡ結合部位を、前記ｍｍＲＮＡの前記３’ＵＴＲ内に配置する、請求項１２８に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１３０】
前記マイクロＲＮＡ結合部位を、前記ｍｍＲＮＡの前記５’ＵＴＲ内に配置する、請求項１２８に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１３１】
前記マイクロＲＮＡ結合部位を、前記ｍｍＲＮＡの前記５’ＵＴＲ内および３’ＵＴＲ内の両方に配置する、請求項１２８に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１３２】
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を、前記ｍｍＲＮＡのコード領域の終止コドンと直に隣接する前記３’ＵＴＲ内に配置する、請求項１２８に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１３３】
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を、前記ｍｍＲＮＡのコード領域の終止コドンの７０〜８０塩基下流の前記３’ＵＴＲ内に配置する、請求項１２８に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１３４】
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を、前記ｍｍＲＮＡのコード領域の開始コドンに直に先行する前記５’ＵＴＲ内に配置する、請求項１２８に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１３５】
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を、前記ｍｍＲＮＡのコード領域の開始コドンに１５〜２０ヌクレオチド先行する前記５’ＵＴＲ内に配置する、請求項１２８に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１３６】
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を、前記ｍｍＲＮＡのコード領域の開始コドンに７０〜８０ヌクレオチド先行する前記５’ＵＴＲ内に配置する、請求項１２８に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１３７】
互いと直に隣接するか、または５ヌクレオチド未満、５〜１０、１０〜１５、もしくは１５〜２０ヌクレオチドのスペーサーを伴って位置する、同じマイクロＲＮＡ結合部位の複数のコピーを含む、請求項１２８に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１３８】
前記３’ＵＴＲ内に配置された、同じマイクロＲＮＡ結合部位の複数のコピーを含み、前記第１のマイクロＲＮＡ結合部位が、終止コドンと直に隣接して位置し、前記第２のマイクロＲＮＡ結合部位および第３のマイクロＲＮＡ結合部位が、前記第１のマイクロＲＮＡ結合部位の３０〜４０塩基下流に位置する、請求項１２８に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１３９】
前記３’ＵＴＲ内に配置された、第１のマイクロＲＮＡ結合部位の２つのコピーと、第２のマイクロＲＮＡ結合部位の１つのコピーとを含み、前記第１のマイクロＲＮＡ結合部位の前記第１のコピーが、終止コドンと直に隣接して位置し、前記第２のマイクロＲＮＡ結合部位が、前記第１のマイクロＲＮＡ結合部位の前記第１のコピーの３０〜４０塩基下流に位置し、前記第１のマイクロＲＮＡ結合部位の前記第２のコピーが、前記第２のマイクロＲＮＡ結合部位の３０〜４０塩基下流に位置する、請求項１２８に記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１４０】
前記ｍｍＲＮＡが全修飾された、先行する請求項のいずれかに記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１４１】
シュードウリジン（ψ）、シュードウリジン（ψ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２−チオウリジンおよび５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジンおよび５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、またはＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む、先行する請求項のいずれかに記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１４２】
シュードウリジン（ψ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザシュードウリジン、２−チオ−１−メチルシュードウリジン、２−チオ−５−アザウリジン、２−チオジヒドロシュードウリジン、２−チオジヒドロウリジン、２−チオシュードウリジン、４−メトキシ−２−チオシュードウリジン、４−メトキシシュードウリジン、４−チオ−１−メチルシュードウリジン、４−チオシュードウリジン、５−アザウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン、もしくは２’−Ｏ−メチルウリジン、またはこれらの組合せを含む、先行する請求項のいずれかに記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１４３】
１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、α−チオグアノシン、もしくはα−チオアデノシン、またはこれらの組合せを含む、先行する請求項のいずれかに記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１４４】
前記目的のポリペプチドが、治療用タンパク質、サイトカイン、増殖因子、抗体、または融合タンパク質である、先行する請求項のいずれかに記載のｍｍＲＮＡ。
【請求項１４５】
先行する請求項のいずれかに記載のｍｍＲＮＡを含む、脂質ナノ粒子。
【請求項１４６】
リポソームを含む、請求項１４５に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１４７】
カチオン性脂質および／またはイオン化脂質を含む、請求項１４５に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１４８】
前記カチオン性脂質および／またはイオン化脂質が、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡまたはＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡである、請求項１４７に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１４９】
請求項１０２から１４４のいずれか一項に記載のｍｍＲＮＡ、または請求項１４５から１４８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子と、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１５０】
抗薬物抗体応答の低減もしくは阻害、または薬物関連毒性の阻害を必要とする被験体における、抗薬物抗体応答の低減もしくは阻害、または薬物関連毒性の阻害における使用のための、請求項１０２から１４４のいずれか一項に記載のｍｍＲＮＡ、請求項１４５から１４８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子、または請求項１４９に記載の医薬組成物。
【請求項１５１】
望ましくない免疫細胞の活性化の低減もしくは阻害、または望ましくないサイトカインの産生の低減もしくは阻害を必要とする被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化の低減もしくは阻害、または望ましくないサイトカインの産生の低減もしくは阻害における使用のための、請求項１０２から１４４のいずれか一項に記載のｍｍＲＮＡ、請求項１４５から１４８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子、または請求項１４９に記載の医薬組成物。
【請求項１５２】
血中クリアランスの加速化の低減または阻害を必要とする被験体における、血中クリアランスの加速化の低減または阻害における使用のための、請求項１０２から１４４のいずれか一項に記載のｍｍＲＮＡ、請求項１４５から１４８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子、または請求項１４９に記載の医薬組成物。
【請求項１５３】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生の低減または阻害を必要とする被験体における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生の低減または阻害における使用のための、請求項１０２から１４４のいずれか一項に記載のｍｍＲＮＡ、請求項１４５から１４８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子、または請求項１４９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年１０月５日に出願された米国仮特許出願第６２／２３７，４６２号、２０１６年４月１日に出願された米国仮特許出願第６２／３１７，２６８号、２０１６年４月１日に出願された米国仮特許出願第６２／３１７，２７１号、２０１６年４月１日に出願された米国仮特許出願第６２／３１７，３６６号、２０１６年５月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／３３８３８５号、２０１６年５月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／３３８，３８６号、２０１６年５月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／３３８，３８８号、および２０１６年６月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／３５０，１４９号の利益を主張する。上記参照特許出願の全体の内容は、本明細書に参照による組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
組換え抗体、サイトカイン、および増殖因子などの生物学的薬剤は、多種多様な疾患の処置において有効であることが示されており、今や、ＦＤＡは、多数のこのような薬剤を、ヒトにおける使用のために承認している（総説については、Ｋｉｎｃｈ，  Ｍ．Ｓ．（２０１５年）、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｔｏｄａｙ、２０巻：３９３〜３９８頁を参照されたい）。ＦＤＡにより承認された生物学的薬剤の圧倒的大部分は、タンパク質ベースの薬剤である。より近年になって、メッセンジャーＲＮＡベースの薬剤が、破壊的な治療モダリティーとして開発されている。感染性疾患ワクチンおよび腫瘍ワクチンの両方を含む、有効なｍＲＮＡベースのワクチンについては、いくつかの例が報告されている（それぞれの総説については、Ｍａｒｃ  Ｍ．Ａ．ら（２０１５年）、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｓｅｐ、１２巻：１〜１５頁；およびＳａｈｉｎ，  Ｕ．ら（２０１４年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、１３巻：７５９〜７８０頁を参照されたい）。より近年には、ｍＲＮＡベースの薬剤の使用が、例えば、目的の治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡ構築物を使用する治療目的で追求されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｍａｒｃ  Ｍ．Ａ．ら（２０１５年）、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｓｅｐ、１２巻：１〜１５頁
【非特許文献２】びＳａｈｉｎ，  Ｕ．ら（２０１４年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、１３巻：７５９〜７８０頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
したがって、ｍＲＮＡベースの治療剤など、被験体におけるｍＲＮＡベースの薬剤の使用のための、新たな手法および方法、特に、被験体におけるｍＲＮＡベースの薬剤の安全性および／または治療効能に関して、有利な特性をもたらす方法が必要とされている。
本発明は、被験体へと投与されるｍＲＮＡベースの薬剤を伴う使用のための方法であって、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、ｍＲＮＡベースの薬剤の使用に有利な特色をもたらす方法を提供する。今や、驚くべきことに、非ヒト霊長動物への、目的のタンパク質をコードする、ｍＲＮＡベースの薬剤の投与は、動物における、望ましくない免疫応答の発達をもたらしうるが、この場合、動物において、ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質に対する抗体が検出されうることが発見されている。動物には、タンパク質治療薬ではなく、ｍＲＮＡ構築物を投与したので、これは、予測されない結果であり、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける標的組織内の、目的のタンパク質の局所的産生が、コードされるタンパク質生成物に対する応答をもたらすことも予測されなかった。非ヒト霊長動物において観察された応答はまた、他の関与性の動物モデル系においても研究されており、当技術分野で認知される抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答であって、組換えタンパク質治療薬の分野、および低分子治療薬の分野のいずれにおいてもなお見られるＡＤＡ応答に類似する。古典的な抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答は、例えば、それに対して方向づけられた抗体を発生させうる、組換えタンパク質治療薬の全身投与に対する応答であると一般に理解されている点で、当業者には、用語法の認識可能な区別は明らかである。ｍＲＮＡ治療薬の分野では、本明細書で記載される動物研究において観察される抗体応答は、ｍＲＮＡベースの薬物自体に対する応答ではない。逆に、抗体応答は、ｍＲＮＡ薬によりコードされるタンパク質生成物に対する応答である。当業者は、このような現象を、抗タンパク質抗体（ＡＰＡ）と称しうるが、薬理学的に類似する効果のために、本出願では、抗薬物抗体（ＡＤＡ）について当技術分野で認知されている用語法を活用する。
【０００５】
注目すべきことに、今や、ｍＲＮＡ構築物への、従来の免疫細胞内、またはＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現させ、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する任意の細胞内で（例えば、末梢リンパ系器官および／または脾細胞および／または内皮細胞の免疫細胞内で）発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位の組入れが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＡＤＡ応答の劇的な阻害を結果としてもたらすこともまた、発見されている。したがって、本開示は、抗薬物抗体応答を低減または阻害するための方法であって、目的のタンパク質を、従来の免疫細胞内、またはＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現させ、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する任意の細胞内で（例えば、脾臓細胞、例えば、脾臓の骨髄系細胞、および／または内皮細胞など、末梢リンパ系器官の免疫細胞内で）発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）によりコードする方法を提示する。例示的な態様では、本開示は、抗薬物抗体応答を低減または阻害するための方法であって、目的のタンパク質を、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、例えば、修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）によりコードし、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、従来の免疫細胞内、またはＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現させ、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する任意の細胞内で（例えば、脾臓細胞、例えば、脾臓の骨髄系細胞、および／または内皮細胞など、末梢リンパ系器官の免疫細胞内で）発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位をさらに含む方法を提示する。本開示の方法では、被験体に、被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、目的のポリペプチドをコードし、少なくとも１つの免疫細胞発現ｍｉＲに対する結合部位を含むｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを投与する。例示的な実施形態では、ｍｉＲ結合部位は、免疫細胞内（例えば、末梢リンパ系器官および／または脾細胞の免疫細胞内）で、夥多に、または優先的に発現するｍｉＲに対するものである。例示的な実施形態では、ｍｉＲ結合部位を、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡの非翻訳領域（ＵＴＲ）内（例えば、３’ＵＴＲ内、５’ＵＴＲ内、または３’ＵＴＲ内および５’ＵＴＲ内の両方）に組み入れる。こうして、本開示の方法では、抗薬物抗体応答を、目的のタンパク質のアミノ酸配列を変更する必要性を伴わずに、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位の組入れによる翻訳の抑圧に由来する、可能な成分を伴うｍＲＮＡによる転写後調節を介して低減または阻害する。
【０００６】
一実施形態では、免疫細胞内で発現する少なくとも１つのｍｉＲは、ｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位である。別の実施形態では、免疫細胞内で発現する少なくとも１つのｍｉＲは、ｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位などのｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位である。したがって、本開示は、被験体における抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、被験体へと、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、例えば、修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含み、被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および／または少なくとも１つのｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位を含み、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法を提示する。一実施形態では、ｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号３に示される配列を含む。一実施形態では、ｍｉＲ−１２６結合部位は、ｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位である。一実施形態では、ｍｉＲ−１２６−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号２６に示される配列を含む。
【０００７】
他の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、およびｍｉＲ−２７からなる群から選択されるｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。本明細書では、番号で言及されるｍｉＲは、同じｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの対向するアームに由来する、２つの成熟マイクロＲＮＡの一方（例えば、３ｐマイクロＲＮＡまたは５ｐマイクロＲＮＡ）を指す場合がある。本明細書では、番号で言及される全てのｍｉＲは、配列１つ当たり３ｐアームおよび５ｐアームの両方を含むことを意図する。
【０００８】
別の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含む。多様な実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、１つ〜４つ、１つ、２つ、３つ、または４つのｍｉＲ結合部位を含む。これらのｍｉＲ結合部位は、ｍｉＲ−１４２（ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１４２−５ｐを含む）、ｍｉＲ−１４６（ｍｉＲ−１４６−３ｐおよびｍｉＲ−１４６−５ｐを含む）、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１２６（ｍｉＲ−１２６−３ｐおよびｍｉＲ−１２６−５ｐを含む）、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７、およびこれらの組合せからなる群から選択されるマイクロＲＮＡに対するものでありうる。別の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、この場合、ｍｉＲ結合部位のうちの１つは、ｍｉＲ−１４２−３ｐに対するものである。多様な実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、およびｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、およびｍｉＲ−１４６、またはｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１２６（例えば、ｍｉＲ−１２６−３ｐ）に対する結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、この場合、ｍｉＲ結合部位のうちの１つは、ｍｉＲ−１２６（例えば、ｍｉＲ−１２６−３ｐ）に対するものである。多様な実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１２６、およびｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１２６、およびｍｉＲ−１４６、またはｍｉＲ−１２６およびｍｉＲ−１４２に対する結合部位を含む。一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位およびｍｉＲ−１２６結合部位を含む。
【０００９】
一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、５’ＵＴＲ、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレーム、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ、および連結されるヌクレオシドの３’テーリング領域を含む。多様な実施形態では、３’ＵＴＲは、免疫細胞内で発現する、好ましくは免疫細胞内（例えば、末梢リンパ系器官および／または脾細胞の免疫細胞内）で、夥多に、または優先的に発現するｍｉＲに対する、１つ〜４つ、少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。他の実施形態では、３’ＵＴＲは、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位、または免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、この場合、１つのｍｉＲ結合部位は、ｍｉＲ−１４２−３ｐに対するものである。別の実施形態では、３’ＵＴＲは、少なくとも１つのｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位、または免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、この場合、１つのｍｉＲ結合部位は、ｍｉＲ−１２６に対するものである。一実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位および／またはｍｉＲ−１２６結合部位）は、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの１〜１００ヌクレオチドの中に配置される。別の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位および／またはｍｉＲ−１２６結合部位）は、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの３０〜５０ヌクレオチドの中に配置される。別の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および／またはｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位）は、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの少なくとも５０ヌクレオチドの中に配置される。
【００１０】
別の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、コード領域に対して異種性である、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含む。
【００１１】
別の実施形態では、化学修飾ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを、全修飾する。他の実施形態では、化学修飾ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、本明細書でさらに記載される、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む。
【００１２】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、シュードウリジン（ψ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、シュードウリジン（ψ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２−チオウリジンおよび５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’−Ｏ−メチルウリジンを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’−Ｏ−メチルウリジンおよび５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。
【００１３】
一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザシュードウリジン、２−チオ−１−メチルシュードウリジン、２−チオ−５−アザウリジン、２−チオジヒドロシュードウリジン、２−チオジヒドロウリジン、２−チオシュードウリジン、４−メトキシ−２−チオシュードウリジン、４−メトキシシュードウリジン、４−チオ−１−メチルシュードウリジン、４−チオシュードウリジン、５−アザウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン、または２’−Ｏ−メチルウリジンである。一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの１または複数の組合せ（例えば、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの、２つ、３つ、または４つの組合せ）を含む。
【００１４】
一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、α−チオグアノシン、またはα−チオアデノシンである。一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの１または複数の組合せ（例えば、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの、２つ、３つ、または４つの組合せ）を含む。
【００１５】
一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子内に封入して、静脈内投与する。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、リポソームである。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質および／またはイオン化脂質を含む。一実施形態では、カチオン性脂質および／またはイオン化脂質は、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡまたはＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡである。
【００１６】
一実施形態では、目的のポリペプチドは、治療用タンパク質、サイトカイン、増殖因子、抗体、または融合タンパク質である。本明細書では、目的のポリペプチドのさらなる例について記載する。
【００１７】
一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを、毎週１回の注入により投与する。別の実施形態では、注入は、静脈内注入である。別の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを、毎週１回の注入により、少なくとも４週間にわたり投与する。別の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを、腫瘍内投与する。本明細書では、適する投与量レジメンについてさらに記載する。
【００１８】
別の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドの、被験体への反復投与後における、抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、例えば修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を、静脈内投与するステップであり、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および／または少なくとも１つのｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位を含み、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップとを含む方法を提示する。
【００１９】
別の態様では、本開示は、目的のポリペプチドの、被験体への反復投与後における、抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、
（ｉ）被験体へと、ＬＮＰ内に封入された、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、例えば修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を、静脈内投与するステップであり、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および／またはｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位）を含み、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；
（ｉｉ）被験体に由来する試料中の抗薬物抗体のレベルを検出するステップと；
（ｉｉｉ）試料中の抗薬物抗体のレベルが低下したら、被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップと
を含む方法を提示する。
【００２０】
別の態様では、本開示は、被験体における薬物関連毒性を低減または阻害する方法であって、被験体へと、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、例えば、修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含み、被験体における、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性を低減または阻害するように、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および／またはｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位）を含み、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法を提示する。一実施形態では、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性は、被験体における血球数の減少（血球減少症）である。一実施形態では、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性は、被験体における自己免疫である。一実施形態では、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性は、被験体における補体媒介作用である。一実施形態では、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性は、被験体における造血の減少である。他の実施形態では、薬物関連毒性は、例えば、腎毒性または肝毒性でありうる。
【００２１】
加えて、今やさらに、従来の免疫細胞内、またはＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現させ、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する任意の細胞内で（例えば、脾臓細胞、例えば、脾臓の骨髄系細胞、および／または内皮細胞など、末梢リンパ系器官の免疫細胞内で）発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に対する、少なくとも１つの結合部位であって、ｍｉＲ−１２６結合部位および／またはｍｉＲ−１４２結合部位などの結合部位の、ｍＲＮＡへの組入れが、ｍＲＮＡが投与される被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化（例えば、Ｂ細胞の活性化、サイトカインの分泌）を低減または阻害することも発見されている。さらに、この少なくとも１つのｍｉＲ結合部位の、ｍＲＮＡへの組入れが、ｍＲＮＡが投与される、脂質を含む化合物または組成物の、血中クリアランスの加速化（ＡＢＣ）を、低減または阻害しうることも発見されている。さらに、この少なくとも１つのｍｉＲ結合部位の、ｍＲＮＡへの組入れは、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の成長および／もしくは活性化を低減もしくは阻害することも可能であり、かつ／または、Ｂ細胞による、ｍＲＮＡが投与される、脂質を含む化合物または組成物に対するＩｇＭの産生であって、例えば、Ｂ細胞による、脂質を含む化合物または組成物のリン脂質成分（例えば、ホスファチジルコリン）に対するＩｇＭの産生など、ＩｇＭの産生も低減もしくは阻害しうる。
【００２２】
したがって、一態様では、本開示は、目的のポリペプチドをコードするＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡを投与された被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害するための方法であって、被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害するように、被験体へと、従来の免疫細胞内、またはＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現させ、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する任意の細胞内で（例えば、脾臓細胞、例えば、脾臓の骨髄系細胞、および／または内皮細胞など、末梢リンパ系器官の免疫細胞内で）発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に対する、少なくとも１つの結合部位であり、ｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位および／またはｍｉＲ−１４２マイクロＲＮＡ結合部位などの結合部位を含む、目的のポリペプチドをコードするＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、例えば、化学修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含む方法を提示する。別の態様では、本開示は、目的のポリペプチドをコードするＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡを投与された被験体における、望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害するための方法であって、被験体における、望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害するように、被験体へと、従来の免疫細胞内、またはＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現させ、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する任意の細胞内で（例えば、脾臓細胞、例えば、脾臓の骨髄系細胞、および／または内皮細胞など、末梢リンパ系器官の免疫細胞内で）発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に対する、少なくとも１つの結合部位であり、ｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位および／またはｍｉＲ−１４２マイクロＲＮＡ結合部位などの結合部位を含む、目的のポリペプチドをコードするＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、例えば、化学修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含む方法を提示する。ＲＮＡは、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、化学修飾ｍＲＮＡ（本明細書では、ｍｍＲＮＡと称する）などのｍＲＮＡでありうる。ｍｍＲＮＡは、全修飾する（すなわち、ｍｍＲＮＡ内の、特定の種類の、全てのヌクレオチドまたはヌクレオ塩基を修飾する）こともでき、部分修飾することもできる（すなわち、ｍＲＮＡ内の、特定の種類の、ヌクレオチドまたはヌクレオ塩基の一部を修飾するか、または修飾ヌクレオ塩基および非修飾ヌクレオ塩基の連なりを含有するキメラｍＲＮＡとしうる）。
【００２３】
一実施形態では、望ましくない免疫細胞の活性化の低減または阻害および／またはサイトカイン産生を、対照ＲＮＡ、例えば、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に対する、少なくとも１つの結合部位であって、ｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位、および／またはｍｉＲ−１４２マイクロＲＮＡ結合部位などの結合部位を欠くｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡの投与と比較して決定する。一実施形態では、免疫細胞の活性化を、少なくとも１０％減少させる。別の実施形態では、免疫細胞の活性化を、少なくとも２５％減少させる。さらに別の実施形態では、免疫細胞の活性化を、少なくとも５０％減少させる。さらに別の実施形態では、免疫細胞の活性化を、ｍＲＮＡによりコードされる、目的のポリペプチド（例えば、治療用タンパク質）の発現の、対応する減少を伴わずに減少させる。
【００２４】
一実施形態では、免疫細胞の活性化は、リンパ球の活性化である。一実施形態では、リンパ球の活性化は、Ｂ細胞の活性化である。一実施形態では、Ｂ細胞の活性化を、ＣＤ１９＋ＣＤ８６＋ＣＤ６９＋Ｂ細胞の頻度により決定する。別の実施形態では、Ｂ細胞の活性化を、例えば、血清中または全脾臓細胞によるサイトカインの分泌により決定する。一実施形態では、Ｂ細胞の活性化を、例えば、血清中または全脾臓細胞による、インターロイキン６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、またはインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の分泌により決定する。一実施形態では、Ｂ細胞の活性化を、例えば、血清中または全脾臓細胞による、ＩＬ−６の分泌により決定する。一実施形態では、サイトカイン産生の低減または阻害を、インターロイキン６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、またはインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の産生の低減または阻害により決定する。別の実施形態では、サイトカイン産生の低減または阻害を、インターロイキン６（ＩＬ−６）の産生の低減または阻害により決定する。
【００２５】
別の実施形態では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、反復投与後の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法を提示する。
【００２６】
一部の実施形態では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与するステップであり、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップとを含む方法を提示する。
【００２７】
一部の実施形態では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、反復投与後の被験体における、ＰＥＧを認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法を提示する。
【００２８】
さらなる実施形態では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、反復投与後の被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法を提示する。
【００２９】
一部の実施形態では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、反復投与後の被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法を提示する。
【００３０】
さらなる実施形態では、１回または複数回の後続の投与の実施時の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、ＬＮＰは、Ｂ細胞を活性化させず、かつ／またはＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しない。一部の実施形態では、ＩｇＭ分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識する。
【００３１】
一部の実施形態では、血中クリアランスの加速化の低減または阻害を、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠く化学修飾ｍＲＮＡの対照投与と比較して決定する。さらなる実施形態では、血中クリアランスの加速化を、化学修飾ｍＲＮＡによりコードされる、目的のポリペプチドの発現の、対応する低下または阻害を伴わずに低減または阻害する。
【００３２】
一部の実施形態では、２回にわたる連続投与の間の間隔は、２週間未満である。他の実施形態では、２回にわたる連続投与の間の間隔は、１週間未満である。
【００３３】
一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、５’ＵＴＲ、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレーム、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に対する、少なくとも１つの結合部位であって、ｍｉＲ−１２６（例えば、ｍｉＲ−１２６−３ｐ）マイクロＲＮＡ結合部位、またはｍｉＲ−１４２（例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐ）マイクロＲＮＡ結合部位などの結合部位を含む３’ＵＴＲ、および連結されるヌクレオシドの３’テーリング領域を含む。一実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つの結合部位（例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位および／またはｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位）は、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの１〜１００ヌクレオチドの中に配置される。別の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に対する、少なくとも１つの結合部位であって、ｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位、および／またはｍｉＲ−１４２マイクロＲＮＡ結合部位などの結合部位は、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの３０〜５０ヌクレオチドの中に配置される。別の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に対する、少なくとも１つの結合部位であって、ｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位、および／またはｍｉＲ−１４２マイクロＲＮＡ結合部位などの結合部位は、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの少なくとも５０ヌクレオチドの中に配置される。別の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つの結合部位（例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位および／またはｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位）は、３’ＵＴＲ内のどこか（例えば、終止コドンの後の、最初の１００ヌクレオチド後方）に配置される。別の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、オープンリーディングフレームに対して異種性である、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含む。
【００３４】
多様な実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、１つ〜４つ、１つ、２つ、３つ、または４つのｍｉＲ結合部位を含み、この場合、ｍｉＲ結合部位のうちの少なくとも１つは、ｍｉＲ−１２６結合部位である。一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも２つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、この場合、マイクロＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１つは、ｍｉＲ−１２６結合部位である。一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１２６結合部位と、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６−３ｐ、ｍｉＲ−１４６−５ｐ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、およびｍｉＲ−２７からなる群から選択される、ｍｉＲに対する第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１２６（例えば、ｍｉＲ−１２６−３ｐ）結合部位およびｍｉＲ−１４２（例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐ）結合部位を含む。一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも３つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、この場合、マイクロＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１つは、ｍｉＲ−１２６結合部位である。一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１２６結合部位、ｍｉＲ−１４２（例えば、ｍｉＲ＿１４２−３ｐ）結合部位、ならびにｍｉＲ−１４６−３ｐ、ｍｉＲ−１４６−５ｐ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、およびｍｉＲ−２７からなる群から選択されるｍｉＲに対する、第３のマイクロＲＮＡ結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１２６結合部位、ｍｉＲ−１４２（例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐ）結合部位、およびｍｉＲ−１５５結合部位を含む。一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも４つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１２６結合部位、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、およびｍｉＲ−１５５結合部位を含む。本明細書では、番号で言及されるｍｉＲは、同じｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの対向するアームに由来する、２つの成熟マイクロＲＮＡの一方（例えば、３ｐマイクロＲＮＡまたは５ｐマイクロＲＮＡ）を指す場合がある。本明細書では、番号で言及される全てのｍｉＲは、配列１つ当たり３ｐアームおよび５ｐアームの両方を含むことを意図する。
【００３５】
一実施形態では、ｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位は、配列番号２６に示される配列を含む。
【００３６】
一実施形態では、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位は、配列番号３に示される配列を含む。
【００３７】
一実施形態では、ｍｉＲ−１５５結合部位は、配列番号３５に示される配列を含む。
【００３８】
一部の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、骨髄系細胞内で発現するマイクロＲＮＡに結合する。他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、形質細胞様樹状細胞内で発現するマイクロＲＮＡに結合する。さらに他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、マクロファージ内で発現するマイクロＲＮＡに結合する。
【００３９】
別の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを、特定の化学修飾のために全修飾する。本明細書では、適する化学修飾の種類についてさらに記載する。他の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、１もしくは複数の修飾ヌクレオチド、または本明細書でさらに記載されるヌクレオ塩基を含む。
【００４０】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、シュードウリジン（ψ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、シュードウリジン（ψ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２−チオウリジンおよび５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’−Ｏ−メチルウリジンを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’−Ｏ−メチルウリジンおよび５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。
【００４１】
一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザシュードウリジン、２−チオ−１−メチルシュードウリジン、２−チオ−５−アザウリジン、２−チオジヒドロシュードウリジン、２−チオジヒドロウリジン、２−チオシュードウリジン、４−メトキシ−２−チオシュードウリジン、４−メトキシシュードウリジン、４−チオ−１−メチルシュードウリジン、４−チオシュードウリジン、５−アザウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン、または２’−Ｏ−メチルウリジンである。一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの１または複数の組合せ（例えば、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの、２つ、３つ、または４つの組合せ）を含む。
【００４２】
一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、α−チオグアノシン、またはα−チオアデノシンである。一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの１または複数の組合せ（例えば、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの、２つ、３つ、または４つの組合せ）を含む。
【００４３】
一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子内に封入して、静脈内投与する。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、リポソームである。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質および／またはイオン化脂質を含む。一実施形態では、カチオン性脂質および／またはイオン化脂質は、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡまたはＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡである。
【００４４】
一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、目的のポリペプチドをコードする。多様な実施形態では、目的のポリペプチドは、治療用タンパク質、サイトカイン、増殖因子、抗体、または融合タンパク質である。本明細書では、目的のポリペプチドのさらなる例について記載する。
【００４５】
一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを、毎週１回の注入により投与する。別の実施形態では、注入は、静脈内注入である。別の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを、毎週１回の注入により、少なくとも４週間にわたり投与する。別の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを、腫瘍内投与する。本明細書では、適する投与量レジメンについてさらに記載する。
【００４６】
別の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化（例えば、Ｂ細胞の活性化）および／または望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害する方法であって、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、例えば、修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を、静脈内投与するステップであり、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、ｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位、および／または少なくとも１つのｍｉＲ−１４２マイクロＲＮＡ結合部位など、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に対する、少なくとも１つの結合部位を含み、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化、および／または望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップとを含む方法を提示する。
【００４７】
別の態様では、本開示は、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、被験体へと反復投与した後における、望ましくない免疫細胞の活性化（例えば、Ｂ細胞の活性化）、および／または望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害する方法であって、
（ｉ）被験体へと、ＬＮＰ内に封入された、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、例えば、修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を、静脈内投与するステップであり、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、ｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位、および／または少なくとも１つのｍｉＲ−１４２マイクロＲＮＡ結合部位など、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に対する、少なくとも１つの結合部位を含み、
ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；
（ｉｉ）被験体に由来する試料中の免疫細胞の活性化のレベルを検出するステップと；
（ｉｉｉ）試料中の免疫細胞の活性化のレベルが低下したら、被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化、および／または望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップと
を含む方法を提示する。
【００４８】
さらに別の態様では、本開示は、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）であって、少なくとも２つの異なるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含み、マイクロＲＮＡが、造血系免疫細胞内、またはＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現させ、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する細胞内で発現するｍｉＲ結合部位を含み、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むｍｍＲＮＡを提示する。一部の態様では、造血系免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞などのリンパ系細胞である。一部の態様では、造血系免疫細胞は、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、樹状細胞、巨核球、または血小板などの骨髄系細胞である。一部の態様では、造血系免疫細胞は、造血前駆細胞である。一部の態様では、ＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現させ、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する細胞は、内皮細胞である。
【００４９】
本開示の一部の態様では、ｍｍＲＮＡは、少なくとも２つの異なるマイクロＲＮＡ結合部位を含み、マイクロＲＮＡは、同じ目的の細胞型内または異なる目的の細胞型内で夥多である。一部の態様では  マイクロＲＮＡは、複数の目的の細胞型内で夥多である。
【００５０】
一部の態様では、本開示は、造血系免疫細胞内で夥多なマイクロＲＮＡの、少なくとも１つの第１のマイクロＲＮＡ結合部位と、内皮細胞内で夥多なマイクロＲＮＡの、少なくとも１つの第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含み、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むｍｍＲＮＡを提示する。
【００５１】
一部の態様では、本開示は、Ｂ細胞内で夥多なマイクロＲＮＡの、少なくとも１つの第１のマイクロＲＮＡ結合部位と、内皮細胞内で夥多なマイクロＲＮＡの、少なくとも１つの第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含み、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むｍｍＲＮＡを提示する。
【００５２】
一部の態様では、本開示は、形質細胞様樹状細胞内で夥多なマイクロＲＮＡの、少なくとも１つの第１のマイクロＲＮＡ結合部位と、内皮細胞内で夥多なマイクロＲＮＡの、少なくとも１つの第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含み、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むｍｍＲＮＡを提示する。
【００５３】
本開示の一部の態様では、ｍｍＲＮＡは、第１のマイクロＲＮＡ結合部位の複数のコピー（２つ、３つ、４つのコピー）と、第２のマイクロＲＮＡ結合部位の少なくとも１つのコピーとを含む。一部の態様では、ｍｍＲＮＡは、第１のマイクロＲＮＡ結合部位の２つのコピーと、第２のマイクロＲＮＡ結合部位の１つのコピーとを含む。
【００５４】
一部の態様では、本開示は、例えば、同じマイクロＲＮＡの３ｐアームおよび５ｐアームに対する、マイクロＲＮＡ結合部位など、同じマイクロＲＮＡに対する、第１のマイクロＲＮＡ結合部位および第２のマイクロＲＮＡ結合部位を含むｍｍＲＮＡを提示する。
【００５５】
本開示の一部の態様は、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）であって、少なくとも２つの異なるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含み、マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７、およびｍｉＲ−２６ａからなる群から選択され、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むｍｍＲＮＡを提示する。一部の態様では、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、およびｍｉＲ−１５５からなる群から選択される。一部の態様では、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号２６に明示されるものなどのｍｉＲ−１２６結合部位である。一部の態様では、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号３に明示されるものなどのｍｉＲ−１４２結合部位である。
【００５６】
さらに他の態様では、本開示は、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）であって、少なくとも２つの異なるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含み、１つのマイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ−１２６結合部位であり、第２のマイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６−３ｐ、ｍｉＲ−１４６−５ｐ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、およびｍｉＲ−２７からなる群から選択されるマイクロＲＮＡに対するものであり、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むｍｍＲＮＡを提示する。
【００５７】
他の態様では、本開示は、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）であって、ｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位と、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位とを含み、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むｍｍＲＮＡを提示する。一部の態様では  ｍｍＲＮＡは、５’ＵＴＲ内または３’ＵＴＲ内に、配列番号２６に明示される単一のｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位と、配列番号３に明示される単一のｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位とを含む。一部の態様では、ｍｍＲＮＡは、それぞれ、配列番号３および配列番号５１に明示されるものなど、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位とを含む。
【００５８】
さらに他の態様では、本開示は、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）であって、少なくとも３つの異なるマイクロＲＮＡ結合部位を含み、マイクロＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１つが、ｍｉＲ−１２６結合部位であり、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むｍｍＲＮＡを提示する。
【００５９】
一部の態様では、本開示は、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）であって、少なくとも３つの異なるマイクロＲＮＡ結合部位を含み、マイクロＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１つが、ｍｉＲ−１４２結合部位であり、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むｍｍＲＮＡを提示する。
【００６０】
さらに他の態様では、本開示は、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）であって、少なくとも１つのｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐと、ｍｉＲ−１４６−３ｐ、ｍｉＲ−１４６−５ｐ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、およびｍｉＲ−２７からなる群から選択されるマイクロＲＮＡに対する第３のマイクロＲＮＡ結合部位とを含み、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むｍｍＲＮＡを提示する。一部の態様では、ｍｍＲＮＡは、少なくとも１つのｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ−１５５結合部位（例えば、配列表に明示される１５５−５ｐ結合部位）とを含む。一部の態様では、ｍｍＲＮＡは、少なくとも１つのｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ−１５５結合部位とを含む。
【００６１】
先行する態様および関連する態様のうちのいずれかでは、本開示は、５’ＵＴＲ、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレーム、３’ＵＴＲ、および連結されるヌクレオシドの３’テーリング領域を含み、マイクロＲＮＡ結合部位を、ｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内、３’ＵＴＲ内、または５’ＵＴＲ内および３’ＵＴＲ内の両方に配置したｍｍＲＮＡを提示する。一部の態様では、マイクロＲＮＡ結合部位を、ｍｍＲＮＡの３’ＵＴＲ内に配置する。一部の態様では、マイクロＲＮＡ結合部位を、ｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内に配置する。一部の態様では、マイクロＲＮＡ結合部位を、ｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内および３’ＵＴＲ内の両方に配置する。一部の態様では、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を、ｍｍＲＮＡのコード領域の終止コドンと直に隣接する３’ＵＴＲ内に配置する。一部の態様では、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を、ｍｍＲＮＡのコード領域の終止コドンの７０〜８０塩基下流の３’ＵＴＲ内に配置する。一部の態様では、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を、ｍｍＲＮＡのコード領域の開始コドンに直に先行する５’ＵＴＲ内に配置する。一部の態様では、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を、ｍｍＲＮＡのコード領域の開始コドンに１５〜２０ヌクレオチド先行する５’ＵＴＲ内に配置する。一部の態様では、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を、ｍｍＲＮＡのコード領域の開始コドンに７０〜８０ヌクレオチド先行する５’ＵＴＲ内に配置する。
【００６２】
一部の態様では、本開示は、５’ＵＴＲ内、３’ＵＴＲ内、またはこれらの両方の中に、互いと直に隣接して位置するか、または５ヌクレオチド未満、５〜１０、１０〜１５、もしくは１５〜２０ヌクレオチドのスペーサーを伴って位置する、同じマイクロＲＮＡ結合部位または異なるマイクロＲＮＡ結合部位の複数のコピーを含むｍｍＲＮＡを提示する。一部の態様では、ｍｍＲＮＡは、３’ＵＴＲ内に配置される、同じマイクロＲＮＡ結合部位の複数のコピーを含み、この場合、第１のマイクロＲＮＡ結合部位は、終止コドンと直に隣接して位置し、第２のマイクロＲＮＡ結合部位および第３のマイクロＲＮＡ結合部位は、第１のマイクロＲＮＡ結合部位の３０〜４０塩基下流に位置する。一部の態様では、ｍｍＲＮＡは、３’ＵＴＲ内に配置される、第１のマイクロＲＮＡ結合部位の２つのコピーと、第２のマイクロＲＮＡ結合部位の１つのコピーとを含み、この場合、第１のマイクロＲＮＡ結合部位の第１のコピーは、終止コドンと直に隣接して位置し、第２のマイクロＲＮＡ結合部位は、第１のマイクロＲＮＡ結合部位の第１のコピーの３０〜４０塩基下流に位置し、第１のマイクロＲＮＡ結合部位の第２のコピーは、第２のマイクロＲＮＡ結合部位の３０〜４０塩基下流に位置する。
【００６３】
前出の態様または関連する態様のうちのいずれかでは、本開示は、ｍｍＲＮＡが全修飾された修飾ｍＲＮＡを提示する。
【００６４】
前出の態様または関連する態様のうちのいずれかでは、本開示は、シュードウリジン（ψ）、シュードウリジン（ψ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２−チオウリジンおよび５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジンおよび５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、またはＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含むｍｍＲＮＡを提示する。
【００６５】
前出の態様または関連する態様のうちのいずれかでは、本開示は、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザシュードウリジン、２−チオ−１−メチルシュードウリジン、２−チオ−５−アザウリジン、２−チオジヒドロシュードウリジン、２−チオジヒドロウリジン、２−チオシュードウリジン、４−メトキシ−２−チオシュードウリジン、４−メトキシシュードウリジン、４−チオ−１−メチルシュードウリジン、４−チオシュードウリジン、５−アザウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン、もしくは２’−Ｏ−メチルウリジン、またはこれらの組合せを含むｍｍＲＮＡを提示する。
【００６６】
前出の態様または関連する態様のうちのいずれかでは、本開示は、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、α−チオグアノシン、もしくはα−チオアデノシン、またはこれらの組合せを含むｍｍＲＮＡを提示する。
【００６７】
前出の態様または関連する態様のうちのいずれかでは、本開示は、目的のポリペプチドをコードするｍｍＲＮＡであって、目的のポリペプチドが、治療用タンパク質、サイトカイン、増殖因子、抗体、または融合タンパク質であるｍｍＲＮＡを提示する。
【００６８】
前出の態様または関連する態様のうちのいずれかでは、本開示は、本明細書で記載される修飾ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提示する。一部の態様では、脂質ナノ粒子は、リポソームを含む。一部の態様では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質および／またはイオン化脂質を含む。一部の態様では、カチオン性脂質および／またはイオン化脂質は、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡまたはＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡである。
【００６９】
前出の態様または関連する態様のうちのいずれかでは、本開示は、本明細書で記載される、ｍｍＲＮＡまたは脂質ナノ粒子と、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む医薬組成物を提示する。
【００７０】
前出の態様または関連する態様のうちのいずれかでは、本開示は、それを必要とする被験体における、抗薬物抗体応答の低減もしくは阻害、または薬物関連毒性の阻害における使用のための、本明細書で記載される、ｍｍＲＮＡ、脂質ナノ粒子、または医薬組成物を提示する。
【００７１】
前出の態様または関連する態様のうちのいずれかでは、本開示は、それを必要とする被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化の低減もしくは阻害、または望ましくないサイトカインの産生の低減もしくは阻害における使用のための、本明細書で記載される、ｍｍＲＮＡ、脂質ナノ粒子、または医薬組成物を提示する。
【００７２】
前出の態様または関連する態様のうちのいずれかでは、本開示は、それを必要とする被験体における、血中クリアランスの加速化の低減または阻害における使用のための、本明細書で記載される、ｍｍＲＮＡ、脂質ナノ粒子、または医薬組成物を提示する。
【００７３】
前出の態様または関連する態様のうちのいずれかでは、本開示は、それを必要とする被験体における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生の低減または阻害における使用のための、本明細書で記載される、ｍｍＲＮＡ、脂質ナノ粒子、または医薬組成物を提示する。
【００７４】
本開示の多様な実施形態についての詳細を、下記の記載に明示する。本開示の他の特色、目的、および利点は、記載および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、表示の用量の、ｈＥＰＯをコードする（しかし、ｍｉＲ結合部位を欠く）ｍｍＲＮＡ、または陽性対照としての組換えｈＥＰＯタンパク質で処置されたカニクイザルにおける、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）タンパク質のレベルであって、表示の処置日における注入の６時間後におけるレベルを示す棒グラフである。
【００７６】
【図２】図２は、３’ＵＴＲ内にｍｉＲ部位の挿入を伴わないｍＲＮＡ構築物、および３’ＵＴＲ内にｍｉＲ部位を挿入したｍＲＮＡ構築物についての概略図である。
【００７７】
【図３】図３は、ＰＢＳ、またはｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかもしくは含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで処置されたカニクイザルにおける抗ｈＥＰＯ抗体レベルを比較するグラフである。抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答について陽性の動物が指し示される。
【００７８】
【図４】図４Ａ〜Ｃは、ｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１２６結合部位、またはｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、０．０５ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで処置されたマウスにおけるタンパク質の発現レベル（図４Ａ）、Ｂ細胞の頻度（図４Ｂ）、および活性化Ｂ細胞の頻度（図４Ｃ）を示すグラフである。
【００７９】
【図５】図５Ａ〜Ｂは、ｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１２６結合部位、またはｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、０．２ｍｇ／ｋｇ（図５Ａ）または１ｍｇ／ｋｇ（図５Ｂ）のｍｍＲＮＡの単回投与で処置されたマウスについて、タンパク質の発現レベルを示すグラフである。
【００８０】
【図６】図６Ａ〜Ｂは、ｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１２６結合部位、またはｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、０．２ｍｇ／ｋｇ（図６Ａ）または１ｍｇ／ｋｇ（図６Ｂ）のｍｍＲＮＡの２回の投与で処置されたマウスについて、タンパク質の発現レベルを示すグラフである。
【００８１】
【図７】図７は、ｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１２６結合部位、またはｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、表示の用量（０．２ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ）のｍｍＲＮＡの単回投与で処置されたマウスの、Ｂ細胞の頻度を示すグラフを提示する。
【００８２】
【図８】図８は、ｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１２６結合部位、またはｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、表示の用量（０．２ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ）のｍｍＲＮＡの単回投与で処置されたマウスの、活性化Ｂ細胞の頻度を示すグラフを提示する。
【００８３】
【図９】図９は、ｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１２６結合部位、またはｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、表示の投与量（０．２ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ）のｍｍＲＮＡの２回の投与で処置されたマウスの、Ｂ細胞の頻度を示すグラフを提示する。
【００８４】
【図１０】図１０は、ｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１２６結合部位、またはｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、表示の投与量（０．２ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ）のｍｍＲＮＡの２回の投与で処置されたマウスの、活性化Ｂ細胞の頻度を示すグラフを提示する。
【００８５】
【図１１】図１１Ａ〜Ｂは、ｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１２６結合部位、またはｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、０．２ｍｇ／ｋｇ（図１１Ａ）または１ｍｇ／ｋｇ（図１１Ｂ）のｍｍＲＮＡの単回投与で処置されたマウスにおけるＩＬ−６レベルを示すグラフである。
【００８６】
【図１２】図１２Ａ〜Ｂは、ｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１２６結合部位、またはｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、０．２ｍｇ／ｋｇ（図１２Ａ）または１ｍｇ／ｋｇ（図１２Ｂ）のｍｍＲＮＡの２回の投与で処置されたマウスにおけるＩＬ−６レベルを示すグラフである。
【００８７】
【図１３】図１３Ａ〜Ｃは、ｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１２６結合部位、またはｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡの２回の投与で処置されたマウスにおける、ＩＬ−６レベル（図１３Ａ）、ＴＮＦ−αレベル（図１３Ｂ）、およびＩＦＮ−γレベル（図１３Ｃ）を示すグラフである。
【００８８】
【図１４】図１４Ａ〜Ｃは、ｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１２６結合部位、またはｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、１ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡの２回の投与で処置されたマウスにおける、ＩＬ−６レベル（図１４Ａ）、ＴＮＦ−αレベル（図１４Ｂ）、およびＩＦＮ−γレベル（図１４Ｃ）を示すグラフである。
【００８９】
【図１５】図１５Ａ〜Ｂは、ＬｕｃをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１２６結合部位、またはｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで、１週間（図１５Ａ）または２週間（図１５Ｂ）にわたり処置されたマウスにおける全身の発光により測定される、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）の発現レベルを示すグラフである。
【００９０】
【図１６】図１６は、ＬｕｃをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１２６結合部位、またはｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで処置されたマウスにおける全Ｂ細胞の頻度を示すグラフを提示する。
【００９１】
【図１７】図１７は、ＬｕｃをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１２６結合部位、またはｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで処置されたマウスにおける活性化Ｂ細胞の頻度を示すグラフを提示する。
【００９２】
【図１８Ａ−Ｂ】図１８Ａ〜Ｃは、ＬｕｃをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１２６結合部位、またはｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで処置されたマウスにおいて分泌される、ＩＬ−６レベル（図１８Ａ）、ＴＮＦ−αレベル（図１８Ｂ）、およびＩＦＮ−γレベル（図１８Ｃ）を示すグラフである。
【図１８Ｃ】図１８Ａ〜Ｃは、ＬｕｃをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１２６結合部位、またはｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで処置されたマウスにおいて分泌される、ＩＬ−６レベル（図１８Ａ）、ＴＮＦ−αレベル（図１８Ｂ）、およびＩＦＮ−γレベル（図１８Ｃ）を示すグラフである。
【００９３】
【図１９】図１９Ａ〜Ｂは、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１５５−５ｐ結合部位、またはこれらの複数のコピーもしくは組合せを欠くか、または含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで、１週間（図１９Ａ）または２週間（図１９Ｂ）にわたり処置されたマウスの、血清中のＥＰＯの発現レベルを示すグラフである。
【００９４】
【図２０】図２０は、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１５５−５ｐ結合部位、またはこれらの複数のコピーもしくは組合せを欠くか、または含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで、１週間にわたり処置されたマウスにおける全Ｂ細胞の頻度を示すグラフを提示する。
【００９５】
【図２１】図２１は、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１５５−５ｐ結合部位、またはこれらの複数のコピーもしくは組合せを欠くか、または含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで、１週間にわたり処置されたマウスにおける活性化Ｂ細胞の頻度を示すグラフを提示する。
【００９６】
【図２２】図２２は、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１５５−５ｐ結合部位、またはこれらの複数のコピーもしくは組合せを欠くか、または含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで、２週間にわたり処置されたマウスにおける全Ｂ細胞の頻度を示すグラフを提示する。
【００９７】
【図２３】図２３は、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１５５−５ｐ結合部位、またはこれらの複数のコピーもしくは組合せを欠くか、または含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで、２週間にわたり処置されたマウスにおける活性化Ｂ細胞の頻度を示すグラフを提示する。
【００９８】
【図２４Ａ】図２４Ａ〜Ｃは、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１５５−５ｐ結合部位、またはこれらの複数のコピーもしくは組合せを欠くか、または含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで、２週間にわたり処置されたマウスにおいて分泌される、ＩＬ−６レベル（図２４Ａ）、ＴＮＦ−αレベル（図２４Ｂ）、およびＩＦＮ−γレベル（図２４Ｃ）を示すグラフである。
【図２４Ｂ】図２４Ａ〜Ｃは、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１５５−５ｐ結合部位、またはこれらの複数のコピーもしくは組合せを欠くか、または含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで、２週間にわたり処置されたマウスにおいて分泌される、ＩＬ−６レベル（図２４Ａ）、ＴＮＦ−αレベル（図２４Ｂ）、およびＩＦＮ−γレベル（図２４Ｃ）を示すグラフである。
【図２４Ｃ】図２４Ａ〜Ｃは、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１５５−５ｐ結合部位、またはこれらの複数のコピーもしくは組合せを欠くか、または含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで、２週間にわたり処置されたマウスにおいて分泌される、ＩＬ−６レベル（図２４Ａ）、ＴＮＦ−αレベル（図２４Ｂ）、およびＩＦＮ−γレベル（図２４Ｃ）を示すグラフである。
【００９９】
【図２５】図２５Ａ〜Ｂは、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２結合部位、ｍｉＲ−１２６結合部位またはｍｉＲ−１４２、およびｍｉＲ−１２６結合部位を欠くか、または含有するｍｍＲＮＡで処置されたマウスにおける脾臓ＣＤ１９＋Ｂ細胞中のＣＤ２７＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞の百分率（図２５Ａ）およびＣＤ２７＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞内のＣＤ２７の発現レベル（図２５Ｂ）を示すグラフである。
【０１００】
【図２６】図２６Ａ〜Ｂは、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２結合部位、ｍｉＲ−１２６結合部位またはｍｉＲ−１４２、およびｍｉＲ−１２６結合部位を欠くか、または含有するｍｍＲＮＡで処置されたマウスにおける脾臓細胞中の全ＣＤ１１ｃ＋細胞の頻度（図２６Ａ）および活性化樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ７０＋ＣＤ８６＋細胞）の百分率（図２６Ｂ）を示すグラフである。
【０１０１】
【図２７】図２７は、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２結合部位、ｍｉＲ−１２６結合部位またはｍｉＲ−１４２、およびｍｉＲ−１２６結合部位を欠くか、または含有するｍｍＲＮＡで処置されたマウスから単離された形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の存在下における、ナイーブＢ細胞の成長レベルを示すグラフを提示する。
【０１０２】
【図２８Ａ−Ｂ】図２８Ａ〜Ｃは、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２結合部位、ｍｉＲ−１２６結合部位またはｍｉＲ−１４２、およびｍｉＲ−１２６結合部位を欠くか、または含有する、２回の投与（図２８Ａ）、３回の投与（図２８Ｂ）、または４回の投与（図２８Ｃ）のｍｍＲＮＡで処置されたマウスにおける、血清抗ＰＥＧ  ＩｇＭ抗体のレベルを示すグラフである。
【図２８Ｃ】図２８Ａ〜Ｃは、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２結合部位、ｍｉＲ−１２６結合部位またはｍｉＲ−１４２、およびｍｉＲ−１２６結合部位を欠くか、または含有する、２回の投与（図２８Ａ）、３回の投与（図２８Ｂ）、または４回の投与（図２８Ｃ）のｍｍＲＮＡで処置されたマウスにおける、血清抗ＰＥＧ  ＩｇＭ抗体のレベルを示すグラフである。
【０１０３】
【図２９】図２９は、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１２６結合部位、またはｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで、６週間にわたり処置されたマウスの、血清中のＥＰＯの発現レベルを示すグラフを提示する。
【０１０４】
【図３０】図３０は、ＬｕｃをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１２６結合部位、またはｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで、５週間にわたり処置されたマウスの、血清中のルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）の発現レベルを示すグラフを提示する。
【０１０５】
【図３１】図３１Ａ〜Ｄは、７．５ｎｇ（図３１Ａ）、１５ｎｇ（図３１Ｂ）、５０ｎｇ（図３１Ｃ）または１００ｎｇ（図３１Ｄ）の用量の、ＬＮＰ内の、Ｌｕｃ  ｍＲＮＡ構築物と、ｅＧＦＰ  ｍＲＮＡ構築物との等モル混合物であって、ｍＲＮＡ構築物が、認識可能なｍｉＲ部位を含有しない（対照）か、１Ｘ  ｍｉＲ−１２２結合部位もしくは３Ｘ  ｍｉＲ−１２２結合部位を含有するか、またはｅＧＦＰ配列およびＬｕｃ配列と類似する配列を伴う推定ｍＲＮＡ（対照）を含有する、等モル混合物をトランスフェクトされた初代肝細胞内の、ｅＧＦＰの発現レベルを示すグラフである。
【０１０６】
【図３２】図３２Ａ〜Ｄは、７．５ｎｇ（図３２Ａ）、１５ｎｇ（図３２Ｂ）、５０ｎｇ（図３２Ｃ）または１００ｎｇ（図３２Ｄ）の用量の、認識可能なｍｉＲ部位を含有しない（対照）か、１Ｘ  ｍｉＲ−１２２結合部位もしくは３Ｘ  ｍｉＲ−１２２結合部位を含有するか、またはカスパーゼ様配列を伴う推定ｍＲＮＡであって、開始コドンを伴わない推定ｍＲＮＡ（対照）を含有する、カスパーゼｍＲＮＡ構築物をトランスフェクトされた初代肝細胞の、コンフルエント相パーセント（カスパーゼ媒介毒性の尺度としての）を示すグラフである。
【０１０７】
【図３３】図３３は、認識可能なｍｉＲ部位を含有しない（対照）か、１Ｘ  ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を含有するか、または３Ｘ  ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を含有するｍＲＮＡ構築物を投与されたカニクイザルにおける、ｈＥＰＯの発現レベルを示すグラフを提示する。
【０１０８】
【図３４】図３４は、認識可能なｍｉＲ部位を含有しない（対照）か、３’ＵＴＲ内のｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位（１Ｘまたは３Ｘ）、５’ＵＴＲ内のｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位（Ｐ１、Ｐ２またはＰ３に挿入された）、または３’ＵＴＲ内および５’ＵＴＲ内の両方におけるｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を含有するｍＲＮＡ構築物をトランスフェクトされたＲＡＷ２６４．７細胞内の、ｅＧＦＰの発現レベルを示す棒グラフを提示する。
【０１０９】
【図３５】図３５は、認識可能なｍｉＲ部位を含有しない（対照）か、３’ＵＴＲ内のｍｉＲ−１２２結合部位（１Ｘまたは３Ｘ）、５’ＵＴＲ内のｍｉＲ−１２２結合部位（Ｐ１、Ｐ２またはＰ３に挿入された）、または３’ＵＴＲ内および５’ＵＴＲ内の両方におけるｍｉＲ−１２２結合部位を含有するｍＲＮＡ構築物をトランスフェクトされた初代肝細胞内の、ｈＥＰＯの発現レベルを示す棒グラフを提示する。
【発明を実施するための形態】
【０１１０】
タンパク質ベースの治療薬の臨床的使用と関連する１つの課題は、患者の免疫系が治療剤に対する抗体を発生させる、望ましくない抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答の発達である（総説については、例えば、Ｓｕｂｒａｍａｎｙａｍ，  Ｍ．（２００６年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ．、３巻：１５１〜１５６頁；Ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ，  Ａ．Ｓ．およびＳｃｏｔｔ，  Ｄ．Ｗ．（２００７年）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８巻：４８２〜４９０頁；Ｎｅｃｈａｎｓｋｙ，  Ａ．およびＫｉｒｃｈｅｉｓ，  Ｒ．（２０１０年）、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｄｒｕｇ．  Ｄｉｓｃｏｖ．、５巻：１０６７〜１０７９頁を参照されたい）。ＡＤＡ応答の発達は、組換え抗体による生物学的薬剤および抗体以外の生物学的薬剤のいずれについても報告されている（例えば、Ｂｒｉｃｋｅｌｍａｉｅｒ，  Ｍ．ら（１９９９年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２２７巻：１２１〜１３５頁；Ｒｕｆ，  Ｐ．ら（２０１０年）、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、６９巻：６１７〜６２５頁；Ｌｕｎｄｋｖｉｓｔ，  Ｍ．ら（２０１３年）、Ｍｕｌｔ．  Ｓｃｌｅｒ．、１９巻：７５７〜７６４頁を参照されたい）。ＡＤＡ応答は、治療剤の効果に干渉するかまたはこれを中和し、これにより、薬物動態および効能に影響を及ぼしうる。中和抗体（ＮＡＢ）は一般に、中和しない結合抗体（ＢＡＢ）より重要であるが、いずれも、臨床的帰結をもたらしうる。
【０１１１】
さらに、アレルギー反応、補体の活性化、および他の有害事象も、ＡＤＡの発達と関連し、これにより、薬物の安全性に影響を及ぼすことが多い。したがって、ＡＤＡは、生物学的薬剤を、長期にわたる処置のために使用する能力における重要な因子である。
【０１１２】
修飾ｍＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の、治療剤としての使用は、タンパク質ベースの治療薬に対する、魅力的な代替法をもたらす。ｍＲＮＡ治療薬は、タンパク質ベースの治療技術を上回る、例えば、コードされるタンパク質特徴に対する忠実度（タンパク質は、身体自身の翻訳装置により産生されるため）、高感度で微調整可能な薬物動態プロファイル（タンパク質発現は、一過性とすることが可能であることから、一部の治療法では、薬物動態および投与を良好に制御するのに好適でありうる）、優れた安全性プロファイル（多様なワクチン臨床試験において明らかにされている）、核への移動を必要としない細胞質内の機能性であって、ｍＲＮＡ投与のほぼ直後において、タンパク質翻訳を結果としてもたらすことから、ゲノムへの組入れの危険性を排するほか、製造の容易さであり、例えば、ｍＲＮＡを、多様で一般的な、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ過程、例えば、生物を必要としない、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける転写反応により産生する容易さももたらす機能性を含む、いくつかの利点をもたらす。さらに、ｍＲＮＡは、例えば、ワクチン適用において、セルフアジュバンティング特性を有するようにデザインすることもでき、例えば、治療適用において、免疫原性の活性化を回避するようにデザインすることもできる。しかし今や、特に、ｍＲＮＡの投与が、コードされるタンパク質の、免疫細胞内、例えば、脾臓内の発現を、直接的または間接的にもたらす場合に、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡの投与はまた、ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質に対する抗薬物抗体応答の発達ももたらしうることが発見されている。しかし、驚くべきことに、免疫細胞内（例えば、末梢リンパ系器官の免疫細胞内および／または脾細胞内）で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位の、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への組込みが、ｍＲＮＡを、被験体に投与する場合における、目的のタンパク質に対する抗薬物抗体応答を低減しうることも裏付けられている。
【０１１３】
したがって、本開示は、特に、脾臓など、免疫系組織内の転写後調節により、目的のタンパク質に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を低減または阻害するための方法を提示する。本開示はまた、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位の、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）への組込みにより、被験体における薬物関連毒性を低減する方法も提示する。本開示の方法で使用される好ましいマイクロＲＮＡ結合部位は、免疫細胞内（例えば、末梢リンパ系器官および／または脾細胞の免疫細胞内）で、夥多に、または優先的に発現するｍｉＲに結合するマイクロＲＮＡ結合部位である。特に好ましいマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１４２−３ｐに対するものである。別の特に好ましいマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２６に対するものである。
【０１１４】
実施例１で記載される通り、カニクイザルに、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）をコードするｍｍＲＮＡ構築物を投与するｉｎ  ｖｉｖｏ研究は、動物におけるｈＥＰＯレベルが、時間経過にわたり低下するという観察をもたらした。さらに、網状赤血球減少症および骨髄における造血の低減もまた観察された。これらの結果は、動物において抗薬物抗体が発生する可能性を示唆し、これは、血清についてのＥＬＩＳＡ解析により確認された。いかなる形でも理論に束縛されないが、研究において使用されるｍＲＮＡ送達系（脂質ナノ粒子であるＬＮＰを使用する）による先行見聞は、ｍＲＮＡが、主に、肝臓に分布するが、また、脾臓にも分布し、したがって、この分布は、ｍＲＮＡによりコードされる、制作されるタンパク質に対する免疫の強化をもたらしうることを裏付けた。ここでもまた、理論または機構に束縛されないが、脾臓内でなされる、コードされるタンパク質（血流を介する直接的な送達による、脾臓へのＬＮＰ分布に基づき送達されるか、または特化した抗原提示細胞を介して間接的に送達された）の発現は、適切なエピトープ（すなわち、目的のタンパク質に由来する）の、Ｔ細胞への提示を介する、Ｔ細胞依存性の抗体産生をもたらしうる可能性がある。
【０１１５】
これに取り組むため、実施例２で記載される通り、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位（例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐに対する、少なくとも１つの結合部位）を含む、さらなるｍＲＮＡ構築物をデザインした。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、ｍｉＲ含有ｍＲＮＡ構築物の投与は、レシピエント動物におけるＡＤＡ応答の発達の著明な低減をもたらした。
【０１１６】
当技術分野におけるタンパク質ベースの治療薬の臨床的使用と関連する別の課題は、治療用タンパク質に対する、望ましくない免疫細胞の活性化（例えば、Ｂ細胞の活性化）の発達であって、免疫媒介性副作用をもたらす発現である。しかし、今や、例えば、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡの投与であって、特に、ｍＲＮＡの投与が、コードされるタンパク質の、免疫細胞、例えば、脾細胞内の発現を直接的にまたは間接的にもたらす場合の投与はまた、望ましくない免疫細胞の活性化（例えば、サイトカインの産生を含む、Ｂ細胞の活性化）の発達ももたらしうることが発見されている。しかし、驚くべきことに、末梢リンパ系組織内および／または内皮細胞内で発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）に対する、少なくとも１つの結合部位、特に、少なくとも１つのｍｉＲ−１２６結合部位および／またはｍｉＲ−１４２結合部位の、ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への組込みが、ｍＲＮＡを、被験体へと投与した場合における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害しうることも裏付けられている。したがって、本開示は、ｍＲＮＡベースの治療剤を使用する場合に、望ましくない免疫細胞の活性化を、特に、末梢リンパ系器官または脾臓など、免疫系組織内の転写後調節により、低減または阻害する組成物および方法を提示する。
【０１１７】
実施例３で記載される実験は、ｍｉＲ−１２６結合部位もしくはｍｉＲ−１４２（例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐ）結合部位、または２つの部位の組合せの、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡ構築物への組込みが、構築物を投与された動物において、ｍｉＲ結合部位を欠く構築物で処置された動物と比較して、活性化Ｂ細胞の頻度の低減、ならびにサイトカイン（ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ）産生のレベルの低減をもたらすことを裏付けた。ｍｉＲ−１２６結合部位単独の効果は、ｍｉＲ−１４２結合部位単独の効果より強力であり、２つの部位を組合せで使用した場合に、最も強い効果が見られた。Ｂ細胞の活性化の頻度およびサイトカインの産生は、抗体応答を含む、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、初期の免疫応答の惹起についての指標である。こうして、これらの結果は、ｍｉＲ−１２６結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れ（単独の、またはｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位と組み合わせた）が、レシピエント動物における、コードされるタンパク質に対するＡＤＡ応答の発達の低減をもたらしうることを指し示す。
【０１１８】
いかなる形でも理論に束縛されないが、ｍｉＲ−１２６結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れは、ｍｉＲ−１２６の発現パターンに基づき、１または複数の可能な機構による免疫細胞の活性化の低減または阻害をもたらしうる。マイクロＲＮＡ−１２６は、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）内で、高度かつ選択的に発現し、これらの細胞の、成熟、生存、およびエフェクター機能を調節することが公知である（Ａｇｕｄｏ，  Ｊ．ら（２０１４年）、Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５巻：５４〜６２頁；Ｃｅｌｌａ，  Ｍ．およびＴｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，  Ｇ．（２０１４年）、Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５巻：８〜９頁）。形質細胞様樹状細胞は、末梢血単核細胞のうちの０．１％未満、および全脾臓細胞のうちの０．４〜０．６％を占め、活性化すると、樹状細胞へと分化し、インターフェロンを産生し、生得的免疫と後天的免疫との間の連結として用いられるほか、抗原提示においても役割を果たしうる（ｐＤＣについての総説には、例えば、Ｊｅｇａｌｉａｎ，  Ａ．Ｇ．ら（２００９年）、Ａｄｖ．  Ａｎａｔ．  Ｐａｔｈｏｌ．、１６巻：３９２〜４０４頁；Ｒｅｉｚｉｓ，  Ｂ．ら（２０１１年）、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２９巻：１６３〜１８３頁；Ｔｅｌ，  Ｊ．ら（２０１２年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐ．、６１巻：１２７９〜１２８８頁を参照されたい）。さらに、ｐＤＣはまた、Ｂ細胞の活性化および分化の促進、ならびにサイトカイン産生の刺激にも関与する（例えば、Ｄｏｕａｇ，  Ｉ．ら（２００９年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８２巻：１９９１〜２００１頁；Ｄｉｎｇ，  Ｃ．ら（２００９年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８３巻：７１４０〜７１４９頁；Ｇｕｊｅｒ，  Ｃ．ら（２０１１年）、Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃ．  Ｂｉｏｌ．、８９巻：８１１〜８２１頁を参照されたい）。したがって、ｍｉＲ−１２６結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れにより観察される、Ｂ細胞の活性化頻度の低減、およびサイトカイン産生の低減は、例えば、ｐＤＣの抗原提示機能が阻害され、かつ／またはｐＤＣが、外来核酸に対して、有効な応答をもたらすことができず、かつ／またはｐＤＣの成熟および生存が阻害され、これにより、Ｂ細胞の活性化の促進の低減、およびサイトカイン産生の低減がもたらされ、次いで、これらの効果の全体的な結果が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、ｍＲＮＡ構築物によりコードされるタンパク質に対するＡＤＡ応答の低減となることから生じうる。
【０１１９】
加えて、ｍｉＲ−１２６は、内皮細胞内で発現することも公知である（例えば、Ｆｉｓｈ，  Ｊ．Ｅ．ら（２００８年）、Ｄｅｖ．  Ｃｅｌｌ．、１５巻：２７２〜２８４頁；Ｗａｎｇ，  Ｓ．ら（２００８年）、Ｄｅｖ．  Ｃｅｌｌ．、１５巻：２６１〜２７１頁を参照されたい）。したがって、ｍｉＲ−１２６結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れの効果は、内皮細胞内のｍｉＲ−１２６の存在度と関連しうる。こうして、ｍｉＲ−１２６結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れは、ｉｎ  ｖｉｖｏの内皮細胞内でコードされるタンパク質の発現の低減をもたらしうる結果として、内皮細胞による抗原提示の低減をもたらすことから、Ｂ細胞の活性化の頻度およびサイトカインの産生の共時的な低減をもたらす結果として、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてコードされるタンパク質に対するＡＤＡ応答の低減をもたらす。
【０１２０】
実施例６で裏付けられる通り、ｍｉＲ−１４２および／またはｍｉＲ−１２６結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れは、ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞の総頻度の低減、ならびにＣＤ１１ｃ＋脾臓細胞集団内の、活性化樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ７０＋ＣＤ８６＋細胞）の頻度の低減をもたらす。これに対し、ｍｉＲ−１４２および／またはｍｉＲ−１２６結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れは、脾臓ＣＤ１９＋Ｂ細胞中の、ＣＤ２７＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞の頻度にも影響を及ぼさず、ＣＤ２７＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞集団内のＣＤ２７の発現レベルにも影響を及ぼさなかった。さらに、ｍｉＲ結合部位含有構築物で処置されたマウスから単離されたｐＤＣと共にインキュベートしたところ、ｍｉＲ結合部位を欠くｍＲＮＡ構築物による処置と比較して、ナイーブＢ細胞の成長も低減された。したがって、この実験のデータは、提起される機構であって、ｍｉＲ結合部位の１つまたは組合せを含む修飾ｍＲＮＡ構築物で処置されたマウスにおける、Ｂ細胞の活性化の阻害およびサイトカインの産生の阻害が、ｐＤＣの頻度および／または活性化の減少から生じ、これにより、Ｂ細胞刺激の減少であり、ＣＤ７０−ＣＤ２７間相互作用の減少または樹状細胞によるサイトカイン分泌の低減からも同様に生じる低下をもたらすという機構を裏書きする。
【０１２１】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）など、脂質を含む化合物および組成物の使用であって、治療剤、例えば、修飾ｍＲＮＡを送達する使用に関しては、２回目および後続の投与時において、薬剤が、血液から急速にクリアランスされる、別個の課題（すなわち、血中クリアランスの加速化（ＡＢＣ））も存在する。機構は、脂質を含む化合物または組成物（例えば、ＬＮＰ）の、Ｂ細胞、特に、Ｂ１ａ細胞による認識であって、ホスファチジルコリンなどの脂質成分の、ＣＤ３６および／またはＴＬＲによる認識を介する認識を含む。活性化Ｂ１ａ細胞は、ＩｇＭ、特に、ＡＢＣに寄与しうる（例えば、急性相応答型機構を介して）、天然ＩｇＭを分泌する。脂質を含む化合物または組成物（例えば、ＬＮＰ）のリン脂質成分（例えば、ＤＳＰＣ）はまた、例えば、循環中の血小板も活性化させうる。活性化血小板は、凝集してマクロファージに結合し、これは、後に、炎症性サイトカインを放出し、脾臓へと遊走しうる。脂質を含む化合物または組成物（例えば、ＬＮＰ）の、脾臓への封鎖は、ほぼ投与の直後に起こる。
【０１２２】
ＡＢＣは、少なくとも部分的に、Ｂ細胞、具体的には、Ｂ１ａ細胞により媒介されることが発見されている。これらのＢ細胞は通常、各々に対するアフィニティーは比較的低度であるが、様々な抗原に結合することが可能なことを意味する、多重反応性である天然ＩｇＭ抗体の分泌の一因となる。薬剤の第１の用量の実施時に、Ｂ１ａ細胞は、薬剤に結合し、活性化し、これにより、ホスファチジルコリンなどの薬剤に結合する天然ＩｇＭを分泌する。次いで、脂質を含む化合物または組成物の、２回目または後続の投与は、循環ＩｇＭによりターゲティングされ、急速にクリアランスされる。本明細書でＢ２細胞またはＣＤ１９（＋）Ｂ細胞と称する、従来のＢ細胞もまた、ＡＢＣに関与している。具体的には、従来のＢ細胞は、ＩｇＭ応答を最初に惹起し、続いて、メモリー応答と共時的な、ＩｇＧ応答を惹起することも可能である。従来のＢ細胞は、投与された薬剤およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に対して反応し、ＡＢＣを媒介するＩｇＭ（および、最終的に、ＩｇＧ）に寄与する。この課題に対するかつての解決策は、ＬＮＰ組成物を投与された被験体における免疫応答を抑制することに焦点を当てていた。特に、共投薬レジメン（例えば、抗ヒスタミン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ステロイド、コルチコステロイドなど）が、免疫系を抑制するのに使用されている。しかし今や、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１５５、およびこれらの組合せ）に対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位の、修飾ｍＲＮＡ構築物への組込みが、脂質を含む化合物または修飾ｍＲＮＡを含む組成物を、被験体へと投与する場合に、ＡＢＣを低減または阻害しうることが発見されている。具体的には、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位の、修飾ｍＲＮＡへの組込みは、形質細胞様樹状細胞の成長および／もしくは活性化を、低減もしくは阻害する場合もあり、かつ／または抗ＰＥＧ  ＩｇＭの産生を低減もしくは阻害する場合もあることが発見されている。例えば、実施例７で裏付けられる通り、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れは、脂質を含む化合物またはｍＲＮＡ構築物を含む組成物を投与されたマウスにおいて、血清抗ＰＥＧ  ＩｇＭ抗体レベルの減少をもたらす。
【０１２３】
本明細書で記載される、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位の、脂質を含む化合物または組成物により送達される、修飾ｍＲＮＡ構築物への組入れが、ＡＢＣの低減または阻害をもたらす、複数の可能な機構が存在する。一実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位の作用機構は、構築物内のｍｉＲＮＡ結合部位が、結合部位に結合するマイクロＲＮＡ「を吸い上げる」、マイクロＲＮＡ「スポンジ」である。このマイクロＲＮＡは、それらを調節するのにそれほど／全く利用可能でなくなるので、これは、特異的マイクロＲＮＡの天然標的に対する調節解除をもたらしうる。この筋書は、マイクロＲＮＡのノックダウン／ノックアウト効果を模倣する。マイクロＲＮＡの天然標的の適正な調節が、細胞が有効な免疫細胞として作用する能力に必要な例では、このマイクロＲＮＡスポンジ型効果は、細胞が免疫応答をもたらすことを不可能とする。また、マイクロＲＮＡによる内因性標的の調節解除が、細胞のホメオスタシス（例えば、カルシウムシグナル伝達）を破壊することから、ストレス応答（例えば、フォールディングされなかったタンパク質の応答）をもたらす可能性もある。代替的に、マイクロＲＮＡ結合部位の、ｍＲＮＡへの組入れが、このｍＲＮＡの、特異的なマイクロＲＮＡ保有細胞型内の発現を抑制する可能性もある。また、マイクロＲＮＡ結合部位の組入れが、ＴＬＲ７などのセンサーが、それを認識する前に、ｍＲＮＡの分解をもたらす可能性もある。後者の２つの機構は、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）により媒介される、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に対する、１または複数の結合部位を含むｍＲＮＡの切断に依存する。また、これらの機構が、いずれも協同的に作用して、ｍｉＲにより媒介され、観察される、本明細書で記載される作用をもたらす可能性もある。
【０１２４】
関与する機構に関わらず、本明細書で記載される、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れの結果としてもたらされる影響は、脂質を含む化合物または組成物を認識する免疫細胞（例えば、ｐＤＣ、Ｂ細胞（例えば、循環Ｂ細胞）、マクロファージ）が、活性化せず、したがって、Ｂ細胞（例えば、脾臓Ｂ細胞）を活性化させるように、脾臓へと遊走しないことである。加えて、サイトカインの産生（例えば、ＩＬ−６）も、低減または阻害され、これにより、さらに免疫細胞の活性化が防止される。Ｂ細胞の活性化の低減または阻害は、天然のＩｇＭ（例えば、Ｂ１ａ細胞による）、ＩｇＭ、およびＩｇＧの低減または阻害を結果としてもたらす。これらの分子の産生は、ＡＢＣに不可欠であり、したがって、それらの産生の低減または阻害は、ＡＢＣ全体を低減または阻害する。
【０１２５】
したがって、本開示は、脂質を含む化合物または組成物であって、目的のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡを含む化合物または組成物を使用する場合に、ＡＢＣを低減または阻害するための方法を提示する。
【０１２６】
本開示の多様な態様について、下記の小節でさらに記載する。
【０１２７】
ｍＲＮＡ
本開示は、目的のポリペプチドをコードし、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２６結合部位および／またはｍｉＲ−１４２結合部位）を含む、単離ＲＮＡ、特に、ｍＲＮＡ、例えば、化学修飾ｍＲＮＡを提示する。他の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２６結合部位および／またはｍｉＲ−１４２結合部位）を含むが、必ずしも、目的のポリペプチドをコードしないＲＮＡ、例えば、化学修飾ＲＮＡを提示する。後者のＲＮＡはまた、ｍＲＮＡの他の典型的な特色（下記に記載するｍＲＮＡの特色など）を欠く場合もあるが、ｍｉＲ−１２６結合部位および／またはｍｉＲ−１４２結合部位を含みうる。
【０１２８】
ＲＮＡは、天然のＲＮＡの場合もあり、非自然発生のＲＮＡの場合もあり、例えば、ｍＲＮＡでありうる。ｍＲＮＡは、下記で記載される、１または複数の修飾ヌクレオ塩基、修飾ヌクレオシド、または修飾ヌクレオチドを含み、この場合は、「化学修飾ｍＲＮＡ」と称する場合があるが、本明細書ではまた、「修飾ｍＲＮＡ」または「ｍｍＲＮＡ」とも称する。本明細書で記載される「ヌクレオシド」とは、有機塩基（例えば、プリンまたはピリミジン）またはその誘導体（本明細書ではまた、「ヌクレオ塩基」とも称する）と組み合わせた、糖分子（例えば、五炭糖またはリボース）またはその誘導体を含有する化合物と規定される。本明細書で記載される「ヌクレオチド」とは、リン酸基を含むヌクレオシドと規定される。
【０１２９】
ｍＲＮＡは、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、および／またはコード領域（例えば、オープンリーディングフレーム）を含みうる。ｍＲＮＡは、数百（例えば、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、または９００）または数千（例えば、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００）の塩基対を含む、任意の適する数の塩基対を含みうる。任意の数（例えば、全て、一部、またはゼロ）のヌクレオ塩基、ヌクレオシド、またはヌクレオチドは、カノニカル分子種の類似体の場合もあり、置換されている場合もあり、修飾されている場合もあり、これら以外の形で非自然発生の場合もある。ある特定の実施形態では、特定のヌクレオチド型またはヌクレオ塩基型の全てが修飾されうる。
【０１３０】
一実施形態では、ｍＲＮＡは、オープンリーディングフレーム（コード領域）の５’末端に配置される、第１のフランキング領域と、オープンリーディングフレーム（コード領域）の３’末端に配置される、第２のフランキング領域とを含み、この場合、第１のフランキング領域は、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含み、第２のフランキング領域は、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含む。一実施形態では、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲと、３’ＵＴＲとは、同じ分子種から導出されない。一実施形態では、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、ベータ−グロビンから導出されない。一実施形態では、５’非翻訳領域は、ｍＲＮＡのコード領域に対して異種性である。別の実施形態では、３’非翻訳領域は、ｍＲＮＡのコード領域に対して異種性である。さらに別の実施形態では、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域は、ｍＲＮＡのコード領域に対して異種性である。さらに別の実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも２つの終止コドンを含む。
【０１３１】
ｍＲＮＡ構築物における使用に適する５’ＵＴＲの配列の非限定的な例を、配列番号５３に示す。ｍＲＮＡ構築物における使用に適する３’ＵＴＲの配列の非限定的な例を、配列番号３０に示す。当技術分野では、ｍＲＮＡ構築物における使用に適する、他の適する５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲも周知である。
【０１３２】
例えば、適する５’ＵＴＲは、β−グロビン遺伝子（例えば、Ｋａｒｉｋｏら（２００８年）、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒａｐ．、１６巻：１８３３〜４０頁；ＵＳ８，２７８，０６３、ＵＳ９，０１２，２１９を参照されたい）、α−グロビン遺伝子（例えば、ＵＳ９，０１２，２１９を参照されたい）、ヒトチトクロームｂ−２４５αポリペプチド遺伝子（ＣＹＢＡ）（例えば、Ｆｅｒｉｚｉら（２０１５年）、Ｌａｂ．  Ｃｈｉｐ．、２３巻：１４５６〜１４６４頁を参照されたい）、ヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）（例えば、Ｔｈｅｓｓら（２０１５年）、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒａｐ．、２３巻：１４５６〜１４６４頁；ＷＯ２０１５／０２４６６７を参照されたい）、ＴＯＰ遺伝子（例えば、ＷＯ２０１５／１０１４１４、ＷＯ２０１５／１０１４１５、ＷＯ２０１５／０６２７３８、ＷＯ２０１５／０２４６６７、ＷＯ２０１５／０２４６６７を参照されたい）、リボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子（例えば、ＷＯ２０１５／１０１４１４、ＷＯ２０１５／１０１４１５、ＷＯ２０１５／０６２７３８を参照されたい）、およびＡＴＰ５１遺伝子（例えば、ＷＯ２０１５／０２４６６７を参照されたい）に由来する５’ＵＴＲ、ならびにタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）（例えば、Ｋａｔａｌｉｎら（２０１２年）、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒａｐ．、２０巻：９４８〜９５３頁；ＵＳ８，２７８，０６３、ＵＳ９，０１２，２１９を参照されたい）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）（例えば、Ａｎｄｒｉｅｓら（２０１５年）、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ、２１７巻：３３７〜３４４頁を参照されたい）、およびＣＭＶ即初期１（ＩＥ１）遺伝子（例えば、ＵＳ２０１４０２０６７５３、ＷＯ２０１４／０８９４８６、ＷＯ２０１３／１８５０６９、ＷＯ２０１４／１４４１９６、ＷＯ２０１４／１５２６５９、ＷＯ２０１４／１５２９４０、ＷＯ２０１４／１５２７７４、ＷＯ２０１４／１５３０５２を参照されたい）に由来する５’ＵＴＲを含む、ウイルス性５’ＵＴＲを含む。合成５’ＵＴＲについては記載されており、また、使用にも適する（例えば、ＭａｎｄａｌおよびＲｏｓｓｉ（２０１３年）、Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ、５巻：６８〜８２頁を参照されたい）。
【０１３３】
加えて、例えば、適する３’ＵＴＲは、β−グロビン遺伝子（例えば、Ｋａｒｉｋｏら（２００８年）、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒａｐ．、１６巻：１８３３〜４０頁；ＵＳ８，２７８，０６３；ＵＳ９，０１２，２１９；ＷＯ２００７／０３６３６６、ＵＳ２０１１／００６５１０３、ＷＯ２０１１／０１５３４７、ＷＯ２０１２／０７２０９６、ＷＯ２０１３／１４３５５５、ＷＯ２０１４／０７１９６３を参照されたい）、α−グロビン遺伝子（例えば、ＵＳ９，０１２，２１９；ＷＯ２０１５／１０１４１４、ＷＯ２０１５／１０１４１５、ＷＯ２０１５０２４６６７を参照されたい）、ヒトチトクロームｂ−２４５αポリペプチド遺伝子（ＣＹＢＡ）（例えば、Ｆｅｒｉｚｉら（２０１５年）、Ｌａｂ．  Ｃｈｉｐ．、２３巻：１４５６〜１４６４頁を参照されたい）、アルブミン遺伝子（例えば、Ｔｈｅｓｓら（２０１５年）、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒａｐ．、２３巻：１４５６〜１４６４頁を参照されたい）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子（例えば、ＵＳ２０１４０２０６７５３、ＷＯ２０１３／１８５０６９、ＷＯ２０１４／０８９４８６、ＷＯ２０１４／１４４１９６、ＷＯ２０１４／１５２６５９、ＷＯ２０１４１５２９４０、ＷＯ２０１４／１５２７７４、ＷＯ２０１４／１５３０５２を参照されたい）、リボソームｒｐｓ９タンパク質遺伝子（例えば、ＷＯ２０１５／１０１４１４を参照されたい）、ＦＩＧ４遺伝子（例えば、ＷＯ２０１５／１０１４１５を参照されたい）、ヒトアルブミン７遺伝子（例えば、ＷＯ２０１５／１０１４１５、ＷＯ２０１５／１０１４１４、ＷＯ２０１５／０６２７３、ＷＯ２０１５／０２４６６７、ＷＯ２１０５／０６２７３７を参照されたい）に由来する３’ＵＴＲ、ならびにベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）（例えば、Ａｎｄｒｉｅｓら（２０１５年）、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ、２１７巻：３３７〜３４４頁を参照されたい）に由来する３’ＵＴＲを含む、ウイルス性３’ＵＴＲを含む。
【０１３４】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるｍＲＮＡは、５’キャップ構造、鎖終結ヌクレオチド、Ｋｏｚａｋ配列（Ｋｏｚａｋコンセンサス配列としてもまた公知である）、ステムループ、ポリＡ配列、および／またはポリアデニル化シグナルを含みうる。他の実施形態では、ｍＲＮＡは、ポリＡ配列および／またはポリアデニル化シグナルを欠き、ｍＲＮＡを安定化させるための代替的な構造を含有する。
【０１３５】
５’キャップ構造または５’キャップ分子種とは、リンカーにより接続された、２つのヌクレオシド部分を含む化合物であり、自然発生のキャップ、非自然発生のキャップもしくはキャップ類似体、または抗リバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）から選択することができる。キャップ分子種は、１または複数の修飾ヌクレオシドおよび／またはリンカー部分を含みうる。例えば、天然ｍＲＮＡキャップは、グアニンヌクレオチドと、それらの５’位において三リン酸連結により接続された、７つの位置においてメチル化されたグアニン（Ｇ）ヌクレオチド、例えば、一般にｍ７ＧｐｐｐＧと書く、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇとを含みうる。キャップ分子種はまた、抗リバースキャップ類似体でもありうる。可能なキャップ分子種の非限定的なリストは、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ、ｍ７３’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ２７，Ｏ３’ＧｐｐｐＧ、ｍ２７，Ｏ３’ＧｐｐｐｐＧ、ｍ２７，Ｏ２’ＧｐｐｐｐＧ、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ、ｍ７３’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ２７，Ｏ３’ＧｐｐｐＧ、ｍ２７，Ｏ３’ＧｐｐｐｐＧ、およびｍ２７，Ｏ２’ＧｐｐｐｐＧを含む。多様な実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチルグアノシン、２’フルオログアノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソグアノシン、２−アミノグアノシン、ＬＮＡグアノシン、および２−アジドグアノシンからなる群から選択される５’末端キャップを含みうる。一実施形態では、５’末端キャップは、Ｃａｐ１である。
【０１３６】
ｍＲＮＡは、代わりに、または加えて、鎖終結ヌクレオシドを含みうる。例えば、鎖終結ヌクレオシドは、それらの糖基の２’位および／または３’位で脱酸素化されたヌクレオシドを含みうる。このような分子種は、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−デオキシウリジン、３’−デオキシシトシン、３’−デオキシグアノシン、３’−デオキシチミン、ならびに２’，３’−ジデオキシアデノシン、２’，３’−ジデオキシウリジン、２’，３’−ジデオキシシトシン、２’，３’−ジデオキシグアノシン、および２’，３’−ジデオキシチミンなどの２’，３’−ジデオキシヌクレオシドを含みうる。一部の実施形態では、例えば、３’末端における、鎖終結ヌクレオチドの、ｍＲＮＡへの組込みは、例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１３／１０３６５９号において記載されている、ｍＲＮＡの安定化を結果としてもたらしうる。
【０１３７】
ｍＲＮＡは、代わりに、または加えて、ヒストンステムループなどのステムループを含みうる。ステムループは、２、３、４、５、６、７、８、またはそれよりも多いヌクレオチド塩基対を含みうる。例えば、ステムループは、４、５、６、７、または８ヌクレオチド塩基対を含みうる。ステムループは、ｍＲＮＡの任意の領域内に配置されうる。例えば、ステムループは、非翻訳領域（５’非翻訳領域または３’非翻訳領域）内に配置される場合もあり、コード領域内に配置される場合もあり、ポリＡ配列内またはポリＡテール内に配置される場合もあり、これらの前に配置される場合もあり、これらの後に配置される場合もある。一部の実施形態では、ステムループは、翻訳の開始、翻訳の効率、および／または転写の終結など、ｍＲＮＡの１または複数の機能に影響を及ぼしうる。
【０１３８】
ｍＲＮＡは、代わりに、または加えて、ポリＡ配列および／またはポリアデニル化シグナルを含みうる。ポリＡ配列は、完全に、またはほぼ、アデニンヌクレオチドまたはその類似体もしくは誘導体から構成されうる。ポリＡ配列は、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域に隣接して配置されるテールでありうる。一部の実施形態では、ポリＡ配列は、ｍＲＮＡの核からの移出、翻訳、および／または安定性に影響を及ぼしうる。
【０１３９】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、第１のコード領域および第２のコード領域を、第１のコード領域と、第２のコード領域との間で内部における翻訳の開始を可能とする、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含む介在配列、または２Ａペプチドなどの自己切断ペプチドをコードする介在配列と共に含む、バイシストロニックのｍＲＮＡである。ＩＲＥＳ配列および２Ａペプチドは典型的に、同じベクターからの、複数のタンパク質発現を増強するのに使用される。当技術分野では、様々なＩＲＥＳ配列が公知かつ利用可能であり、例えば、脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳを含むＩＲＥＳ配列を使用することができる。
【０１４０】
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、自己切断ペプチドをコードする配列を含みうる。自己切断ペプチドは、２Ａペプチドでありうるがこれらに限定されない。当技術分野では、様々な２Ａペプチドが公知かつ利用可能であり、例えば口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、Ａ型ウマ鼻炎ウイルス２Ａペプチド、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａペプチド、および１型ブタテッショウウイルス２Ａペプチドを含む２Ａペプチドを使用することができる。２Ａペプチドは、リボソームスキッピングにより、１つの転写物から、２つのタンパク質を発生させるのに、通常のペプチド結合が、２Ａペプチド配列において損なわれる結果として、１つの翻訳事象から、２つの不連続タンパク質が産生されるように、いくつかのウイルスにより使用されている。非限定的な例として、２Ａペプチドは、タンパク質配列：ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号４）、その断片または変異体を有しうる。一実施形態では、２Ａペプチドは、最後のグリシンと、最後のプロリンとの間で切断する。別の非限定的な例として、本開示のポリヌクレオチドは、タンパク質配列：ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号４）、その断片または変異体を有する２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含みうる。２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の一例は、ＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＣＴＡＣＴＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴ（配列番号５）である。例示的な一実施形態では、２Ａペプチドは、以下の配列：５’−ＴＣＣＧＧＡＣＴＣＡＧＡＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＴＣＡＡＡＡＴＴＧＴＣＧＣＴＣＣＴＧＴＣＡＡＡＣＡＡＡＣＴＣＴＴＡＡＣＴＴＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＡＡＡＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＡＴＧＴＡＧＡＡＡＧＣＡＡＴＣＣＡＧＧＴＣＣＡＣＴＣ−３’（配列番号６）によりコードされる。２Ａペプチドのポリヌクレオチド配列は、本明細書で記載される方法および／または当技術分野で公知の方法により、修飾またはコドン最適化することができる。
【０１４１】
一実施形態では、この配列を使用して、２つまたはそれよりも多い、目的のポリペプチドのコード領域を分離することができる。非限定的な例として、２Ａペプチドをコードする配列は、第１のコード領域Ａと、第２のコード領域Ｂとの間にありうる（Ａ−２Ａｐｅｐ−Ｂ）。２Ａペプチドの存在は、１つの長いタンパク質の、タンパク質Ａ、タンパク質Ｂ、および２Ａペプチドへの切断を結果としてもたらす。タンパク質Ａと、タンパク質Ｂとは、同じペプチドの場合もあり、異なるペプチドの場合もあり、目的のポリペプチドの場合もある。
【０１４２】
修飾ｍＲＮＡ
一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、１または複数の修飾ヌクレオ塩基、修飾ヌクレオシド、または修飾ヌクレオチド（「化学修飾ｍＲＮＡ」と称するが、本明細書ではまた、「修飾ｍＲＮＡ」または「ｍｍＲＮＡ」とも称する）を含む。一部の実施形態では、修飾ｍＲＮＡは、基準の非修飾ｍＲＮＡと比較した、安定性の増強、細胞内貯留、翻訳の増強、および／または、ｍＲＮＡが導入される細胞の生得的免疫応答の実質的な誘導の欠如を含む有用な特性を有しうる。したがって、修飾ｍＲＮＡの使用は、タンパク質産生の効率、核酸の細胞内貯留を増強しうるほか、免疫原性の低減ももたらしうる。
【０１４３】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、１または複数の（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つの）異なる修飾ヌクレオ塩基、ヌクレオシド、またはヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、１または複数の（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれよりも多い）異なる修飾ヌクレオ塩基、ヌクレオシド、またはヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾ｍＲＮＡは、ｍｍＲＮＡが導入される細胞内の分解を、対応する非修飾ｍＲＮＡと比べて低減している可能性がある。
【０１４４】
一実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオシド（またはヌクレオチド）修飾を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣであるリボヌクレオシドの化学構造と比較した、少なくとも１つの修飾を含む。さらに別の実施形態では、ｍＲＮＡは、
（ａ）連結ヌクレオシドの第１の領域であって、目的のポリペプチドをコードする第１の領域と；
（ｂ）５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と、少なくとも１つの５’末端キャップとを含む、前記第１の領域と比べて５’側に配置される、第１のフランキング領域と；
（ｃ）３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）と、連結ヌクレオシドの３’テーリング配列とを含む、前記第１の領域と比べて３’側に配置される、第２のフランキング領域であって、
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの化学修飾ヌクレオシドを含む第２のフランキング領域と
を含む単離ポリヌクレオチドである。
【０１４５】
一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する、例示的なヌクレオ塩基およびヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザウリジン、６−アザウリジン、２−チオ−５−アザウリジン、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオシュードウリジン、２−チオシュードウリジン、５−ヒドロキシウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリルウリジン、５−ハロウリジン（例えば、５−ヨードウリジンまたは５−ブロモウリジン）、３−メチルウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチルウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチルシュードウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチルウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチルウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチルウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチルウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチルウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニルウリジン、１−プロピニルシュードウリジン、５−タウリノメチルウリジン（τｍ５Ｕ）、１−タウリノメチルシュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオシュードウリジン、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち、ヌクレオ塩基であるデオキシチミンを有する）、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、５−メチル−２−チオウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオシュードウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチルシュードウリジン、３−メチルシュードウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチルシュードウリジン、１−メチル−１−デアザシュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザシュードウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロシュードウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチルジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオジヒドロウリジン、２−チオジヒドロシュードウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオウリジン、４−メトキシシュードウリジン、４−メトキシ−２−チオシュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α−チオウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン（Ｕｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’−Ｏ−��チルシュードウリジン（ψｍ）、２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’−Ｏ−ジメチルウリジン（ｍ３Ｕｍ）、および５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチルウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオウリジン、デオキシチミジン、２’−Ｆ−アラウリジン、２’−Ｆウリジン、２’−ＯＨ−アラウリジン、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジン、および５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）］ウリジンを含む。
【０１４６】
一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する、例示的なヌクレオ塩基およびヌクレオシドは、５−アザシチジン、６−アザシチジン、シュードイソシチジン、３−メチルシチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４−アセチルシチジン（ａｃ４Ｃ）、５−ホルミルシチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４−メチルシチジン（ｍ４Ｃ）、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロシチジン（例えば、５−ヨードシチジン）、５−ヒドロキシメチルシチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチルシュードイソシチジン、ピロロシチジン、ピロロシュードイソシチジン、２−チオシチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチルシチジン、４−チオシュードイソシチジン、４−チオ−１−メチルシュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザシュードイソシチジン、１−メチル−１−デアザシュードイソシチジン、ゼブラリン、５−アザゼブラリン、５−メチルゼブラリン、５−アザ−２−チオゼブラリン、２−チオゼブラリン、２−メトキシシチジン、２−メトキシ−５−メチルシチジン、４−メトキシシュードイソシチジン、４−メトキシ−１−メチルシュードイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、α−チオシチジン、２’−Ｏ−メチルシチジン（Ｃｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチルシチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチルシチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチルシチジン（ｍ４Ｃｍ）、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチルシチジン（ｍ４２Ｃｍ）、１−チオシチジン、２’−Ｆ−アラシチジン、２’−Ｆ−シチジン、および２’−ＯＨ−アラシチジンを含む。
【０１４７】
一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する、例示的なヌクレオ塩基およびヌクレオシドは、α−チオアデノシン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−ハロプリン（例えば、２−アミノ−６−クロロプリン）、６−ハロプリン（例えば、６−クロロプリン）、２−アミノ−６−メチルプリン、８−アジドアデノシン、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチルアデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン（ｉ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６−メチルＮ６−トレオニルカルバモイルアデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン（ｈｎ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６−アセチルアデノシン（ａｃ６Ａ）、７−メチルアデニン、２−メチルチオアデニン、２−メトキシアデニン、α−チオアデノシン、２’−Ｏ−メチルアデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン（ｍ１Ａｍ）、２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸）（Ａｒ（ｐ））、２−アミノ−Ｎ６−メチルプリン、１−チオアデノシン、８−アジドアデノシン、２’−Ｆ−アラアデノシン、２’−Ｆ−アデノシン、２’−ＯＨ−アラアデノシン、およびＮ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノンアデシル）−アデノシンを含む。
【０１４８】
一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する、例示的なヌクレオ塩基およびヌクレオシドは、α−チオグアノシン、イノシン（Ｉ）、１−メチルイノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４−デメチルワイオシン（ｉｍＧ−１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙＷ）、ペルオキシワイブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ＯｈｙＷ）、未修飾ヒドロキシワイブトシン（ＯｈｙＷ＊）、７−デアザグアノシン、クエオシン（Ｑ）、エポキシクエオシン（ｏＱ）、ガラクトシルクエオシン（ｇａｌＱ）、マンノシルクエオシン（ｍａｎＱ）、７−シアノ−７−デアザグアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザグアノシン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７−デアザ−８−アザグアノシン、６−チオグアノシン、６−チオ−７−デアザグアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザグアノシン、７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、６−チオ−７−メチルグアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシグアノシン、１−メチルグアノシン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２−メチルグアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン（ｍ２２Ｇ）、Ｎ２，７−ジメチルグアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７−ジメチルグアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８−オキソグアノシン、７−メチル−８−オキソグアノシン、１−メチル−６−チオグアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオグアノシン、α−チオグアノシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２−メチル−２’−Ｏ−メチルグアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−２’−Ｏ−メチルグアノシン（ｍ２２Ｇｍ）、１−メチル−２’−Ｏ−メチルグアノシン（ｍ１Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチル−２’−Ｏ−メチルグアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’−Ｏ−メチルイノシン（Ｉｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン（ｍ１Ｉｍ）、２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸）（Ｇｒ（ｐ））、１−チオグアノシン、Ｏ６−メチルグアノシン、２’−Ｆ−アラグアノシン、および２’−Ｆ−グアノシンを含む。
【０１４９】
一部の実施形態では、本開示のｍｍＲＮＡは、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの１または複数の組合せ（例えば、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの、２つ、３つ、または４つの組合せ）を含む。
【０１５０】
一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザシュードウリジン、２−チオ−１−メチルシュードウリジン、２−チオ−５−アザウリジン、２−チオジヒドロシュードウリジン、２−チオジヒドロウリジン、２−チオシュードウリジン、４−メトキシ−２−チオシュードウリジン、４−メトキシシュードウリジン、４−チオ−１−メチルシュードウリジン、４−チオシュードウリジン、５−アザウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン、または２’−Ｏ−メチルウリジンである。一部の実施形態では、本開示のｍｍＲＮＡは、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの１または複数の組合せ（例えば、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの、２つ、３つ、または４つの組合せ）を含む。
【０１５１】
一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する、例示的なヌクレオ塩基およびヌクレオシドは、Ｎ４−アセチルシチジン（ａｃ４Ｃ）、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロシチジン（例えば、５−ヨードシチジン）、５−ヒドロキシメチルシチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチルシュードイソシチジン、２−チオシチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチルシチジンを含む。一部の実施形態では、本開示のｍｍＲＮＡは、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの１または複数の組合せ（例えば、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの、２つ、３つ、または４つの組合せ）を含む。
【０１５２】
一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する、例示的なヌクレオ塩基およびヌクレオシドは、７−デアザアデニン、１−メチルアデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチルアデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）を含む。一部の実施形態では、本開示のｍｍＲＮＡは、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの１または複数の組合せ（例えば、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの、２つ、３つ、または４つの組合せ）を含む。
【０１５３】
一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する、例示的なヌクレオ塩基およびヌクレオシドは、イノシン（Ｉ）、１−メチルイノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７−デアザグアノシン、７−シアノ−７−デアザグアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザグアノシン（ｐｒｅＱ１）、７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、１−メチルグアノシン（ｍ１Ｇ）、８−オキソグアノシン、７−メチル−８−オキソグアノシンを含む。一部の実施形態では、本開示のｍｍＲＮＡは、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの１または複数の組合せ（例えば、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの、２つ、３つ、または４つの組合せ）を含む。
【０１５４】
一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、α−チオグアノシン、またはα−チオアデノシンである。一部の実施形態では、本開示のｍｍＲＮＡは、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの１または複数の組合せ（例えば、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの、２つ、３つ、または４つの組合せ）を含む。
【０１５５】
一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、シュードウリジン（ψ）を含む。一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、シュードウリジン（ψ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）を含む。一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）を含む。一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、２−チオウリジンおよび５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、例えば、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、２’−Ｏ−メチルウリジンを含む。一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、２’−Ｏ−メチルウリジンおよび５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）を含む。一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。
【０１５６】
ある特定の実施形態では、本開示のｍｍＲＮＡを、特定の修飾について、一様に修飾する（すなわち、全修飾する、配列全体にわたり修飾する）。例えば、ｍｍＲＮＡは、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）または５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）で一様に修飾しうるが、これは、ｍｍＲＮＡ配列内の、全てのウリジン残基またはシトシン残基を、それぞれ、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）または５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）で置きかえることを意味する。同様に、本開示のｍｍＲＮＡは、配列内に存在する任意の種類のヌクレオシド残基について、上記で明示した残基などの修飾残基で置きかえることにより、一様に修飾することができる。
【０１５７】
一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡを、コード領域（例えば、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム）内で修飾することができる。他の実施形態では、ｍＲＮＡを、コード領域以外の領域内で修飾することができる。例えば、一部の実施形態では、それらの一方または両方が、独立に、１または複数の異なるヌクレオシド修飾を含有しうる、５’−ＵＴＲおよび／または３’−ＵＴＲを提供する。このような実施形態では、ヌクレオシド修飾はまた、コード領域内にも存在しうる。
【０１５８】
本開示のｍｍＲＮＡ内に存在しうる、ヌクレオシド修飾およびこれらの組合せの例は、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１２０４５０７５号、同第ＷＯ２０１４０８１５０７号、同第ＷＯ２０１４０９３９２４号、同第ＷＯ２０１４１６４２５３号、および同第ＷＯ２０１４１５９８１３号において記載されている、ヌクレオシド修飾およびこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。
【０１５９】
本開示のｍｍＲＮＡは、糖、ヌクレオ塩基、および／またはヌクレオシド間連結に対する修飾の組合せを含みうる。これらの組合せは、本明細書で記載される、任意の１または複数の修飾を含みうる。
【０１６０】
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオシドの組合せの例を、下記の表１および表２に提示する。これらの修飾ヌクレオチドの組合せを使用して、本開示のｍｍＲＮＡを形成することができる。ある特定の実施形態では、修飾ヌクレオシドで、本開示のｍｍＲＮＡの天然ヌクレオチドを、部分的に置換することもでき、完全に置換することもできる。非限定的な例として、天然ヌクレオチドであるウリジンを、本明細書で記載される修飾ヌクレオシドで置換することができる。別の非限定的な例では、天然ヌクレオチドであるウリジンを、本明細書で開示される修飾ヌクレオシドのうちの少なくとも１つで、部分的に（例えば、天然ウリジンのうちの、約０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９．９％）置換することができる。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【０１６１】
本開示に従い、本開示のポリヌクレオチドを、表１または表２の修飾の組合せまたは単一の修飾を含むように合成してもよい。
【０１６２】
単一の修飾を列挙する場合、列挙されるヌクレオシドまたはヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオシドである、これらのＡ、Ｕ、Ｇ、またはＣの１００パーセントを表す。百分率を列挙する場合、これらの百分率は、存在するＡ、Ｕ、Ｇ、またはＣの三リン酸の総量のうちの、ヌクレオ塩基である、これらの特定のＡ、Ｕ、Ｇ、またはＣの三リン酸の百分率を表す。例えば、組合せ：２５％の５−アミノアリルＣＴＰ＋７５％のＣＴＰ／２５％の５−メトキシＵＴＰ＋７５％のＵＴＰは、シトシン三リン酸のうちの２５％が、５−アミノアリルＣＴＰであるが、シトシンのうちの７５％は、ＣＴＰである一方、ウラシルのうちの２５％が、５−メトキシＵＴＰであるが、ウラシルのうちの７５％は、ＵＴＰであるポリヌクレオチドを指す。修飾ＵＴＰが列挙されない場合、自然発生のＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、および／またはＣＴＰを、ポリヌクレオチド内で見出されるヌクレオチド部位の１００％において使用する。この例では、ＧＴＰヌクレオチドおよびＡＴＰヌクレオチドの全てを、非修飾とする。
【０１６３】
本開示のｍＲＮＡまたはその領域は、最適化されたコドンでありうる。当技術分野では、コドン最適化法が公知であり、様々な目的：適正なフォールディングを確保するように、宿主生物におけるコドン頻度とマッチさせる目的、ｍＲＮＡの安定性を増大させるかもしくは二次構造を低減するように、ＧＣ含量にバイアスをかける目的、遺伝子の構築または発現を損ないうる、タンデムリピートコドンもしくは塩基の連なりを最小化する目的、転写制御領域および翻訳制御領域をカスタマイズする目的、タンパク質のトラフィッキング配列を挿入もしくは除去する目的、コードされるタンパク質内の翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）を除去／付加する目的、タンパク質ドメインを付加、除去、またはシャッフルする目的、制限部位を挿入もしくは欠失させる目的、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡ分解部位を修飾する目的、翻訳速度を調整して、タンパク質の多様なドメインが適正にフォールディングすることを可能とする目的、またはポリヌクレオチド内の問題の二次構造を低減するかもしくは消失させる目的で有用でありうる。当技術分野では、コドン最適化のツール、アルゴリズム、およびサービスが公知であり、非限定的な例は、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）、および／または特許権のある方法によるサービスを含む。一実施形態では、例えば、哺乳動物細胞内の発現を最適化するか、またはｍＲＮＡの安定性を増強するように、最適化アルゴリズムを使用して、ｍＲＮＡ配列を最適化する。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で記載されるポリヌクレオチド配列のうちのいずれかに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。
【０１６５】
本開示のｍＲＮＡは、当技術分野で利用可能な手段であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）および合成法を含むがこれらに限定されない手段により産生することができる。酵素（ＩＶＴ）法、固相法、液相法、組合せ合成法、小領域合成法、およびライゲーション法を活用することができる。一実施形態では、ＩＶＴによる酵素的合成法を使用して、ｍＲＮＡを制作する。当技術分野では、ＩＶＴによりポリヌクレオチドを制作する方法が公知であり、それらの内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／３００６２号において記載されている。したがって、本開示はまた、本明細書で記載されるｍＲＮＡを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて転写するのに使用しうる、ポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ、構築物、およびベクターも含む。
【０１６６】
非天然の修飾ヌクレオ塩基は、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡへと、合成時に導入することもでき、合成後に導入することもできる。ある特定の実施形態では、修飾は、ヌクレオシド間連結上の場合もあり、プリンまたはピリミジン塩基の場合もあり、糖の場合もある。特定の実施形態では、修飾は、ポリヌクレオチド鎖の末端に導入することもでき、ポリヌクレオチド鎖内の他の場所に導入することもでき、化学合成により導入することもでき、ポリメラーゼ酵素より導入することもできる。修飾核酸およびそれらの合成の例については、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５８５１９号において開示されている。修飾ポリヌクレオチドの合成についてはまた、ＶｅｒｍａおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７６巻、９９〜１３４頁（１９９８年）においても記載されている。
【０１６７】
酵素的ライゲーション法または化学的ライゲーション法を使用して、ポリヌクレオチドまたはそれらの領域を、ターゲティング剤または送達剤、蛍光標識、液体、ナノ粒子など、異なる機能的部分とコンジュゲートさせることができる。ポリヌクレオチドおよび修飾ポリヌクレオチドのコンジュゲートについては、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１巻（３号）、１６５〜１８７頁（１９９０年）において総説されている。
【０１６８】
免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、マイクロＲＮＡ結合部位
マイクロＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡ）とは、１９〜２５ヌクレオチド長（一般に１９〜２３ヌクレオチド長であり、最も典型的には、２２ヌクレオチド長）の非コードＲＮＡであって、核酸分子の３’ＵＴＲに結合し、核酸分子の安定性を低減するか、または翻訳を阻害することにより、翻訳後において遺伝子発現を下方調節する非コードＲＮＡである。本開示のｍＲＮＡは、１もしくは複数のマイクロＲＮＡ標的配列もしくはマイクロＲＮＡ標的部位、マイクロＲＮＡ結合性配列もしくはマイクロＲＮＡ結合部位、マイクロＲＮＡ配列と相補的な配列、またはマイクロＲＮＡシード領域もしくはマイクロＲＮＡシード配列と相補的な配列を含みうる。このような配列は、それらの内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国公開第ＵＳ２００５／０２６１２１８号および米国公開第ＵＳ２００５／００５９００５号において教示されている、マイクロＲＮＡなど、任意の公知のマイクロＲＮＡに対応しうる。マイクロＲＮＡ配列は、「シード」領域または「シード」配列、すなわち、成熟マイクロＲＮＡの２〜８位の領域内の配列であって、ｍｉＲＮＡの標的配列に対する、完壁なワトソン−クリック型相補性を有する配列を含む。マイクロＲＮＡのシード領域またはシード配列の塩基は、標的配列と完全な相補性を有する。マイクロＲＮＡは、ＲＮＡ転写物の領域から酵素的に導出され、自身に折り返されて、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（前駆体ｍｉＲＮＡ）と称することが多い短鎖ヘアピン構造を形成する。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは典型的に、その３’末端において、２ヌクレオチドの突出を有し、３’ヒドロキシル基および５’リン酸基を有する。この前駆体ｍＲＮＡは、核内でプロセシングされ、その後、細胞質へと輸送され、そこで、ＤＩＣＥＲ（ＲＮアーゼＩＩＩ酵素）によりさらにプロセシングされ、約２２ヌクレオチドの成熟マイクロＲＮＡを形成する。次いで、成熟マイクロＲＮＡは、リボ核粒子へと組み込まれて、遺伝子サイレンシングを媒介するＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体である、ＲＩＳＣを形成する。当技術分野で認識されている、成熟ｍｉＲＮＡのための命名法は典型的に、成熟ｍｉＲＮＡが導出されるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡアームを指示するものであり、「５ｐ」とは、マイクロＲＮＡが、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡヘアピンの５プライムアームに由来することを意味し、「３ｐ」とは、マイクロＲＮＡが、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡヘアピンの３プライム末端に由来することを意味する。本明細書では、番号で言及されるｍｉＲは、同じｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの対向するアームに由来する、２つの成熟マイクロＲＮＡの一方（例えば、３ｐマイクロＲＮＡまたは５ｐマイクロＲＮＡ）を指す場合がある。本明細書で言及される全てのｍｉＲは、３ｐまたは５ｐの呼称により特に、指定されない限り、配列ごとに、３ｐアームおよび５ｐアームの両方を含むことを意図する。
【０１６９】
一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、１または複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位を含みうる。本明細書で使用される「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位」という用語は、ｍｉＲＮＡと相互作用するか、会合するか、またはこれに結合するように、ｍｉＲＮＡの全てまたは領域に対する十分な相補性を有するポリヌクレオチド内、例えば、ＤＮＡ内またはＲＮＡ転写物内の配列を指す。例示的な実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位を、ｍＲＮＡ内、例えば、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内および／または３’ＵＴＲ内に組み入れる。ｍｉＲに対して十分な相補性を有するｍｉＲ結合部位の配列とは、ｍｉＲにより媒介されるｍＲＮＡの調節、例えば、ｍｉＲにより媒介される、ｍＲＮＡの翻訳の抑圧または分解を容易とするのに十分な相補性の程度を指す。本開示の例示的な態様では、ｍｉＲに対して十分な相補性を有するｍｉＲ結合部位の配列とは、ｍｉＲにより媒介されるｍＲＮＡの分解、例えば、ｍｉＲによりガイドされる、ｍＲＮＡのＲＩＳＣ媒介切断を容易とするのに十分な相補性の程度を指す。ｍｉＲ結合部位は、例えば、１９〜２５ヌクレオチド長のｍｉＲ配列、１９〜２３ヌクレオチド長のｍｉＲ、最も典型的には、２２ヌクレオチド長のｍｉＲ配列に対する相補性を有しうる。ｍｉＲ結合部位は、ｍｉＲの一部だけ、例えば、自然発生のｍｉＲより１、２、３、または４ヌクレオチド短い一部に相補的でありうる。所望の調節が、ｍＲＮＡの分解である場合は、十全または完全な相補性（例えば、自然発生のｍｉＲの全てまたは著明な部分にわたり、十全に相補的であるかまたは完全に相補的であること）が好ましい。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列と相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列と完全な相補性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列と相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列と完全な相補性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、１、２、または３ヌクレオチドの置換、末端の付加、および／またはトランケーションを除き、ｍｉＲＮＡ配列と完全な相補性を有する。
【０１７０】
１または複数のｍｉＲ結合性配列を、様々な異なる目的のうちの１または複数のために、本開示のｍＲＮＡ内に組み込むことができる。例えば、１または複数のｍｉＲＮＡ結合部位の、本開示のｍＲＮＡへの組込みは、問題のｍｉＲＮＡが、ターゲティング可能である（例えば、標的細胞内または標的組織内で発現する）という条件で、分子を、分解または翻訳の低減のためにターゲティングしうる。一部の実施形態では、１または複数のｍｉＲＮＡ結合部位の、本開示のｍＲＮＡへの組込みは、核酸分子の送達時における、オフ標的作用の危険性を低減する場合もあり、かつ／またはｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドの発現の組織特異的調節を可能とする場合もある。さらに他の実施形態では、１または複数のｍｉＲＮＡ結合部位の、本開示のｍＲＮＡへの組込みは、ｉｎ  ｖｉｖｏの核酸送達時における免疫応答をモジュレートしうる。さらなる実施形態では、１または複数のｍｉＲＮＡ結合部位の、本開示のｍＲＮＡへの組込みは、本明細書で記載される、脂質を含む化合物および組成物の、血中クリアランスの加速化（ＡＢＣ）もモジュレートしうる。
【０１７１】
代表的なｍｉＲＮＡは、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞など、造血系の免疫細胞、ならびに内皮細胞および血小板など、ＴＬＲ７／ＴＬＲ８を発現させることが公知であり、かつ／またはサイトカインを分泌することが可能な細胞内の発現および存在度に基づき選択した。したがって、対応するｍｉＲ部位の、ｍＲＮＡへの組込みが、特異的細胞型内の、ｍＲＮＡの不安定化および／またはこれらのｍＲＮＡの翻訳の抑制をもたらしうるように、ｍｉＲＮＡのセットは、これらの細胞の免疫原性の部分的な一因となりうるｍｉＲを含んだ。非限定的な代表例は、造血細胞の多くに特異的な、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、およびｍｉＲ−２２３；Ｂ細胞内で発現する、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ−１６、およびｍｉＲ−２２３；造血前駆細胞内で発現する、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−１６；ならびに形質細胞様樹状細胞内、血小板内、および内皮細胞内で発現する、ｍｉＲ−１２６を含む。組織によるｍｉＲの発現のさらなる議論については、例えば、Ｔｅｒｕｅｌ−Ｍｏｎｔｏｙａ，  Ｒ．ら（２０１４年）、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、９巻：ｅ１０２２５９頁；Ｌａｎｄｇｒａｆ，  Ｐ．ら（２００７年）、Ｃｅｌｌ、１２９巻：１４０１〜１４１４頁；Ｂｉｓｓｅｌｓ，  Ｕ．ら（２００９年）、ＲＮＡ、１５巻：２３７５〜２３８４頁を参照されたい。証拠立てられる通り、任意の１つのｍｉＲ部位の、３’ＵＴＲ内および／または５’ＵＴＲ内への組込みは、目的の複数の細胞型内で、このような効果を媒介しうる（例えば、ｍｉＲ−１４２は、Ｂ細胞内および樹状細胞内のいずれでも夥多である）。
【０１７２】
複数のｍｉＲを伴う同じ細胞型をターゲティングし、３ｐアームおよび５ｐアームの各々に対する結合部位を組み込むことは、これらのいずれもが夥多である（例えば、造血幹細胞内では、ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ１４２−５ｐのいずれも夥多である）場合、有益である。こうして、例えば、ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、２つまたはそれよりも多い（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多い）ｍｉＲ結合部位であって、（ｉ）ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５およびｍｉＲ−２２３（多くの造血細胞内で発現する）からなる群；または（ｉｉ）ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ−１６およびｍｉＲ−２２３（Ｂ細胞内で発現する）からなる群；またはｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−１６（造血前駆細胞内で発現する）からなる群に由来するｍｉＲ結合部位を含有する。
【０１７３】
また、複数の、目的の細胞型を、同時にターゲティングするように、多様なｍｉＲを組み合わせる（例えば、造血系の多くの細胞および内皮細胞をターゲティングするように、ｍｉＲ−１４２とｍｉＲ−１２６とを組み合わせる）ことも有益である。こうして、例えば、ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、２つまたはそれよりも多い（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多い）ｍｉＲ結合部位であって、（ｉ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つが、造血系の細胞（例えば、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、またはｍｉＲ−２２３）をターゲティングし、ｍｉＲのうちの少なくとも１つが、形質細胞様樹状細胞、血小板、または内皮細胞（例えば、ｍｉＲ−１２６）をターゲティングするか；または（ｉｉ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つが、Ｂ細胞（例えば、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ−１６、またはｍｉＲ−２２３）をターゲティングし、ｍｉＲのうちの少なくとも１つが、形質細胞様樹状細胞、血小板、または内皮細胞（例えば、ｍｉＲ−１２６）をターゲティングするか；または（ｉｉｉ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つが、造血前駆細胞（例えば、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−２６ａ、またはｍｉＲ−１６）をターゲティングし、ｍｉＲのうちの少なくとも１つが、形質細胞様樹状細胞、血小板、または内皮細胞（例えば、ｍｉＲ−１２６）をターゲティングするか；または（ｉｖ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つが、造血系の細胞（例えば、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、またはｍｉＲ−２２３）をターゲティングし、ｍｉＲのうちの少なくとも１つが、Ｂ細胞（例えば、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ−１６、またはｍｉＲ−２２３）をターゲティングし、ｍｉＲのうちの少なくとも１つが、形質細胞様樹状細胞、血小板、もしくは内皮細胞（例えば、ｍｉＲ−１２６）をターゲティングするｍｉＲ結合部位；あるいはｍｉＲ結合部位の前出の４つのクラス（すなわち、造血系をターゲティングするｍｉＲ結合部位、Ｂ細胞をターゲティングするｍｉＲ結合部位、造血前駆細胞をターゲティングするｍｉＲ結合部位、および／または形質細胞様樹状細胞／血小板／内皮細胞をターゲティングするｍｉＲ結合部位）の、他の任意の可能な組合せを含有する。
【０１７４】
したがって、一実施形態では、免疫応答をモジュレートするように、ｍＲＮＡは、従来の免疫細胞内、またはＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現させ、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する任意の細胞内で（例えば、末梢リンパ系器官および／または脾細胞および／または内皮細胞の免疫細胞内で）発現する、１または複数のｍｉＲに結合する、１または複数のｍｉＲ結合性配列を含みうる。今や、従来の免疫細胞内、またはＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現させ、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する任意の細胞内で（例えば、末梢リンパ系器官および／または脾細胞および／または内皮細胞の免疫細胞内で）発現する、１または複数のｍｉＲの、ｍＲＮＡへの組込みは、免疫細胞の活性化（例えば、活性化Ｂ細胞の頻度により測定される、Ｂ細胞の活性化）、および／またはサイトカインの産生（例えば、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦαの産生）を低減または阻害することが発見されている。今やさらに、従来の免疫細胞内、またはＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現させ、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する任意の細胞内で（例えば、末梢リンパ系器官および／または脾細胞および／または内皮細胞の免疫細胞内で）発現する、１または複数のｍｉＲの、ｍＲＮＡへの組込みは、ｍＲＮＡによりコードされる目的のタンパク質に対する、抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を低減または阻害しうることも発見されている。
【０１７５】
別の実施形態では、脂質を含む化合物または組成物に送達されるｍＲＮＡの、血中クリアランスの加速化をモジュレートするように、ｍＲＮＡは、従来の免疫細胞内、またはＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現させ、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する任意の細胞内で（例えば、末梢リンパ系器官および／または脾細胞および／または内皮細胞の免疫細胞内で）発現する、１または複数のｍｉＲに結合する、１または複数のｍｉＲ結合性配列を含みうる。今や、ｍＲＮＡへの、１または複数のｍｉＲ結合部位の組込みは、脂質を含む化合物または組成物であって、ｍＲＮＡの送達における使用のための化合物または組成物の、血中クリアランスの加速化（ＡＢＣ）を低減または阻害することが発見されている。今やさらに、１または複数のｍｉＲ結合部位の、ｍＲＮＡへの組込みは、抗ＰＥＧ抗ＩｇＭの血清レベルを低減し（例えば、Ｂ細胞による、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭの急速な産生を低減または阻害し）、かつ／または、脂質を含む化合物または組成物であって、ｍＲＮＡを含む化合物または組成物の投与後における、形質細胞様樹状細胞の成長および／もしくは活性化を低減もしくは阻害することも発見されている。
【０１７６】
このようなｍｉＲ配列は、任意の公知の、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡであって、それらの内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国公開第ＵＳ２００５／０２６１２１８号および米国公開第ＵＳ２００５／００５９００５号において教示されているマイクロＲＮＡを含むがこれらに限定されないマイクロＲＮＡに対応しうる。免疫細胞内で発現するｍｉＲの非限定的な例は、脾臓細胞内、骨髄系細胞内、樹状細胞内、形質細胞様樹状細胞内、Ｂ細胞内、Ｔ細胞内、および／またはマクロファージ内で発現するｍｉＲを含む。例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、およびｍｉＲ−２７は、骨髄系細胞内で発現し、ｍｉＲ−１５５は、樹状細胞内、Ｂ細胞内、およびＴ細胞内で発現し、ｍｉＲ−１４６は、ＴＬＲにより刺激されると、マクロファージ内で上方調節され、ｍｉＲ−１２６は、形質細胞様樹状細胞内で発現する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲは、免疫細胞内で、夥多に、または優先的に発現する。例えば、ｍｉＲ−１４２（ｍｉＲ−１４２−３ｐおよび／またはｍｉＲ−１４２−５ｐ）、ｍｉＲ−１２６（ｍｉＲ−１２６−３ｐおよび／またはｍｉＲ−１２６−５ｐ）、ｍｉＲ−１４６（ｍｉＲ−１４６−３ｐおよび／またはｍｉＲ−１４６−５ｐ）、およびｍｉＲ−１５５（ｍｉＲ−１５５−３ｐおよび／またはｍｉＲ１５５−５ｐ）は、免疫細胞内で、夥多に発現する。当技術分野では、これらのマイクロＲＮＡ配列が公知であるので、当業者は、これらのマイクロＲＮＡが、ワトソン−クリック型相補性に基づき結合する結合性配列または標的配列をたやすくデザインすることができる。
【０１７７】
したがって、多様な実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、およびｍｉＲ−２７からなる群から選択されるｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含む。多様な実施形態では、ｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、１つ〜４つ、１つ、２つ、３つ、または４つのｍｉＲ結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、３つのｍｉＲ結合部位を含む。これらのｍｉＲ結合部位は、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７、およびこれらの組合せからなる群から選択されるマイクロＲＮＡに対するものでありうる。一実施形態では、ｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現する、同じｍｉＲ結合部位の、２つまたはそれよりも多い（例えば、２つ、３つ、４つの）コピー、例えば、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７からなるｍｉＲの群から選択されるｍｉＲ結合部位の、２つまたはそれよりも多いコピーを含む。
【０１７８】
例えば、一実施形態では、ｍＲＮＡは、同じｍｉＲ結合部位の３つのコピーを含む。実施例８で記載する通り、ある特定の実施形態では、同じｍｉＲ結合部位の３つのコピーの使用は、単一のｍｉＲ結合部位の使用と比較して、有益な特性を呈示しうる。３つのｍｉＲ結合部位を含有する３’ＵＴＲの配列の非限定的な例を、配列番号３８（３つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位）、配列番号４０（３つのｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位）、および配列番号５４（３つのｍｉＲ−１２２結合部位）に示す。
【０１７９】
別の実施形態では、ｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現する、少なくとも２つの異なるｍｉＲ結合部位の、２つまたはそれよりも多い（例えば、２つ、３つ、４つの）コピーを含む。２つまたはそれよりも多い、異なるｍｉＲ結合部位を含有する３’ＵＴＲの配列の非限定的な例を、配列番号３３（１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、および１つのｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位）、配列番号４７（１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、および１つのｍｉＲ−１２２−５ｐ結合部位）、配列番号４１（２つのｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、および１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位）、および配列番号４４（２つのｍｉＲ−１５５−５ｐ結合部位、および１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位）に示す。
【０１８０】
別の実施形態では、ｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、この場合、ｍｉＲ結合部位のうちの１つは、ｍｉＲ−１４２−３ｐに対するものである。多様な実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１５５（ｍｉＲ−１５５−３ｐまたはｍｉＲ−１５５−５ｐ）、ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１４６（ｍｉＲ−１４６−３またはｍｉＲ−１４６−５ｐ）、またはｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１２６（ｍｉＲ−１２６−３ｐまたはｍｉＲ−１２６−５ｐ）に対する結合部位を含む。
【０１８１】
別の実施形態では、ｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、この場合、ｍｉＲ結合部位のうちの１つは、ｍｉＲ−１２６−３ｐに対するものである。多様な実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１２６−３ｐおよびｍｉＲ−１５５（ｍｉＲ−１５５−３ｐまたはｍｉＲ−１５５−５ｐ）、ｍｉＲ−１２６−３ｐおよびｍｉＲ−１４６（ｍｉＲ−１４６−３ｐまたはｍｉＲ−１４６−５ｐ）、またはｍｉＲ−１２６−３ｐおよびｍｉＲ−１４２（ｍｉＲ−１４２−３ｐまたはｍｉＲ−１４２−５ｐ）に対する結合部位を含む。
【０１８２】
別の実施形態では、ｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、この場合、ｍｉＲ結合部位のうちの１つは、ｍｉＲ−１４２−５ｐに対するものである。多様な実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２−５ｐおよびｍｉＲ−１５５（ｍｉＲ−１５５−３ｐまたはｍｉＲ−１５５−５ｐ）、ｍｉＲ−１４２−５ｐおよびｍｉＲ−１４６（ｍｉＲ−１４６−３またはｍｉＲ−１４６−５ｐ）、またはｍｉＲ−１４２−５ｐおよびｍｉＲ−１２６（ｍｉＲ−１２６−３ｐまたはｍｉＲ−１２６−５ｐ）に対する結合部位を含む。
【０１８３】
さらに別の実施形態では、ｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、この場合、ｍｉＲ結合部位のうちの１つは、ｍｉＲ−１５５−５ｐに対するものである。多様な実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１５５−５ｐおよびｍｉＲ−１４２（ｍｉＲ−１４２−３ｐまたはｍｉＲ−１４２−５ｐ）、ｍｉＲ−１５５−５ｐおよびｍｉＲ−１４６（ｍｉＲ−１４６−３またはｍｉＲ−１４６−５ｐ）、またはｍｉＲ−１５５−５ｐおよびｍｉＲ−１２６（ｍｉＲ−１２６−３ｐまたはｍｉＲ−１２６−５ｐ）に対する結合部位を含む。
【０１８４】
例示的な実施形態では、１または複数のｍｉＲ結合部位は、ｍＲＮＡが、所望の特性を有するように、３’ＵＴＲ内に位置し、５’ＵＴＲ内に位置し、３’ＵＴＲ内および５’ＵＴＲ内のいずれにも位置する。ｍｉＲ結合部位は、ｍＲＮＡ構築物内のコード領域の終止コドンの直後（または構築物内に、終止コドンの複数のコピーが存在する場合、最後の終止コドンの直後）の３’ＵＴＲ内に位置する場合もあり、ｍｉＲ結合部位は、終止コドンのさらに下流に位置する場合もあるが、この場合、終止コドンとｍｉＲ結合部位との間には、３’ＵＴＲ塩基が存在する。例えば、３’ＵＴＲ内の、ｍｉＲのための、可能な挿入部位の、３つの非限定的な例を、配列番号４８、４９、および５０に示すが、これは、ｍｉＲ−１４２−３ｐ部位を、それぞれ、３’ＵＴＲ内の、３つの異なる可能な挿入部位のうちの１つの中に挿入した３’ＵＴＲ配列を示す。さらに、１または複数のｍｉＲ結合部位は、５’ＵＴＲ内の、１または複数の可能な挿入部位に位置しうる。例えば、５’ＵＴＲ内の、ｍｉＲのための、可能な挿入部位の、３つの非限定的な例を、さらに実施例９に記載し、配列番号５５、５６、および５７に示すが、これは、ｍｉＲ−１４２−３ｐ部位を、それぞれ、５’ＵＴＲ内の、３つの異なる可能な挿入部位のうちの１つの中に挿入した５’ＵＴＲ配列を示す。加えて、配列番号５８、５９、および６０は、ｍｉＲ−１２２部位を、それぞれ、５’ＵＴＲ内の、３つの異なる可能な挿入部位のうちの１つの中に挿入した５’ＵＴＲ配列も示す。
【０１８５】
一実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの１〜１００ヌクレオチドの中に配置される。一実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの３０〜５０ヌクレオチドの中に配置される。別の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの少なくとも５０ヌクレオチドの中に配置される。他の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、終止コドンの直後の３’ＵＴＲ内、または終止コドンの後の、３’ＵＴＲの１５〜２０ヌクレオチドの中、または終止コドンの後の、３’ＵＴＲの７０〜８０ヌクレオチドの中に配置される。他の実施形態では、３’ＵＴＲは、１つを超えるｍｉＲ結合部位（例えば、２つ〜４つのｍｉＲ結合部位）を含み、この場合、各ｍｉＲ結合部位の間には、スペーサー領域（例えば、１０〜１００、２０〜７０、または３０〜５０ヌクレオチドの長さの）が存在しうる。別の実施形態では、３’ＵＴＲは、ｍｉＲ結合部位の末端と、ポリＡテールのヌクレオチドとの間のスペーサー領域を含む。例えば、１０〜１００、２０〜７０または３０〜５０ヌクレオチドの長さのスペーサー領域は、ｍｉＲ結合部位の末端と、ポリＡテールの始端との間にありうる。
【０１８６】
一実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドンの前の（上流の）、５’ＵＴＲの１〜１００ヌクレオチドの中に配置される。一実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドンの前の（上流の）、５’ＵＴＲの１０〜５０ヌクレオチドの中に配置される。別の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドンの前の（上流の）、５’ＵＴＲの少なくとも２５ヌクレオチドの中に配置される。他の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドンの直前の５’ＵＴＲ内、または開始コドンの前の、５’ＵＴＲの１５〜２０ヌクレオチドの中、または開始コドンの前の、５’ＵＴＲの７０〜８０ヌクレオチドの中に配置される。他の実施形態では、５’ＵＴＲは、１つを超えるｍｉＲ結合部位（例えば、２つ〜４つのｍｉＲ結合部位）を含み、この場合、各ｍｉＲ結合部位の間には、スペーサー領域（例えば、１０〜１００、２０〜７０、または３０〜５０ヌクレオチドの長さの）が存在しうる。
【０１８７】
一実施形態では、３’ＵＴＲは、１つを超える終止コドンを含み、この場合、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位は、終止コドンの下流に位置する。例えば、３’ＵＴＲは、１つ、２つ、または３つの終止コドンを含みうる。使用しうる三重終止コドンの非限定的な例は、ＵＧＡＵＡＡＵＡＧ、ＵＧＡＵＡＧＵＡＡ、ＵＡＡＵＧＡＵＡＧ、ＵＧＡＵＡＡＵＡＡ、ＵＧＡＵＡＧＵＡＧ、ＵＡＡＵＧＡＵＧＡ、ＵＡＡＵＡＧＵＡＧ、ＵＧＡＵＧＡＵＧＡ、ＵＡＡＵＡＡＵＡＡおよびＵＡＧＵＡＧＵＡＧを含む。３’ＵＴＲ内には、例えば、１つ、２つ、３つ、または４つのｍｉＲ結合部位、例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位は、終止コドンと直に隣接して位置する場合もあり、最後の終止コドンの任意の数のヌクレオチド下流に位置する場合もある。３’ＵＴＲが、複数のｍｉＲ結合部位を含む場合、これらの結合部位が、構築物内で互いと直接隣り合わせで（すなわち、順々に）位置する場合もあり、代替的に、スペーサーヌクレオチドが、各結合部位の間に位置する場合もある。
【０１８８】
一実施形態では、３’ＵＴＲは、単一のｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位が、第３の終止コドンの下流に配置される、３つの終止コドンを含む。３つの終止コドンと、最後の終止コドンの下流の、異なる位置に配置される単一のｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位とを有する、３’ＵＴＲの配列の非限定的な例を、配列番号３１および４８〜５０に示す。
【０１８９】
一実施形態では、ｍｍＲＮＡは、５’ＵＴＲ、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレーム、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ、および連結されるヌクレオシドの３’テーリング領域を含む。多様な実施形態では、３’ＵＴＲは、免疫細胞内で発現する、好ましくは免疫細胞内で、夥多に、または優先的に発現するｍｉＲに対する、１つ〜４つ、少なくとも２つ、１つ、２つ、３つ、または４つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。
【０１９０】
一実施形態では、免疫細胞内で発現する少なくとも１つのｍｉＲは、ｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位である。一実施形態では、ｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号３に示される配列を含む。一実施形態では、ｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含むｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、配列番号２に示される配列を含む。
【０１９１】
一実施形態では、免疫細胞内で発現する少なくとも１つのｍｉＲは、ｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位である。一実施形態では、ｍｉＲ−１２６結合部位は、ｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位である。一実施形態では、ｍｉＲ−１２６−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号２６に示される配列を含む。一実施形態では、ｍｉＲ−１２６−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含むｍｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、配列番号２７に示される配列を含む。
【０１９２】
本開示のマイクロＲＮＡ結合部位が結合しうるｍｉＲの、非限定的な例示的配列は、以下：ｍｉＲ−１４２−３ｐ（配列番号８）、ｍｉＲ−１４２−５ｐ（配列番号９）、ｍｉＲ−１４６−３ｐ（配列番号１０）、ｍｉＲ−１４６−５ｐ（配列番号１１）、ｍｉＲ−１５５−３ｐ（配列番号１２）、ｍｉＲ−１５５−５ｐ（配列番号１３）、ｍｉＲ−１２６−３ｐ（配列番号１４）、ｍｉＲ−１２６−５ｐ（配列番号１５）、ｍｉＲ−１６−３ｐ（配列番号１６）、ｍｉＲ−１６−５ｐ（配列番号１７）、ｍｉＲ−２１−３ｐ（配列番号１８）、ｍｉＲ−２１−５ｐ（配列番号１９）、ｍｉＲ−２２３−３ｐ（配列番号２０）、ｍｉＲ−２２３−５ｐ（配列番号２１）、ｍｉＲ−２４−３ｐ（配列番号２２）、ｍｉＲ−２４−５ｐ（配列番号２３）、ｍｉＲ−２７−３ｐ（配列番号２４）、およびｍｉＲ−２７−５ｐ（配列番号２５）を含む。当技術分野では、免疫細胞内で発現する（例えば、免疫細胞内で、夥多に、または優先的に発現する）、他の適するｍｉＲ配列が公知であり、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＭａｎｃｈｅｓｔｅｒによるマイクロＲＮＡデータベースである、ｍｉＲＢａｓｅにおいて利用可能である。前述のｍｉＲのうちのいずれかに結合する部位は、ｍｉＲに対する、ワトソン−クリック型相補性、典型的に、ｍｉＲに対する、１００％の相補性に基づきデザインし、本明細書で記載される、本開示のｍＲＮＡ構築物へと挿入することができる。
【０１９３】
さらに他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位の、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡへの組込みにより、本開示のポリペプチドの治療ウィンドウおよび／または示差的発現（例えば、組織特異的発現）を変更することができる。マイクロＲＮＡが、ｍＲＮＡを調節し、これにより、タンパク質の発現を調節することが公知である組織の例は、肝臓（例えば、ｍｉＲ−１２２）、筋肉（例えば、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２０６、およびｍｉＲ−２０８）、内皮細胞（例えば、ｍｉＲ−１７〜９２およびｍｉＲ−１２６）、骨髄系細胞（例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、およびｍｉＲ−２７）、脂肪組織（例えば、ｌｅｔ−７およびｍｉＲ−３０ｃ）、心臓（例えば、ｍｉＲ−１ｄおよびｍｉＲ−１４９）、腎臓（例えば、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９４、およびｍｉＲ−２０４）、および肺上皮細胞（例えば、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３、およびｍｉＲ−１２６）を含むがこれらに限定されない。したがって、多様な実施形態では、ｍＲＮＡは、単独または組合せの、前述のｍｉＲのうちのいずれかに対する、１または複数の結合部位を含み、これにより、コードされる目的のタンパク質の、組織における発現をモジュレートしうる。
【０１９４】
例えば、ｍＲＮＡは、別の組織型内と比較して、１つの組織型内の発現が高度なｍｉＲＮＡが結合する、１または複数のｍｉＲＮＡ結合部位を含みうる。別の例では、ｍＲＮＡは、由来する組織が同じ非がん性細胞内と比較して、がん細胞内の発現が低度なｍｉＲＮＡが結合する、１または複数のｍｉＲＮＡ結合部位を含みうる。低レベルの、このようなｍｉＲＮＡを発現させるがん細胞内に存在する場合、ｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドは、発現の増大を示すことが典型的であろう。ポリペプチドが、アポトーシスを誘導することが可能である場合、これは、正常細胞と比較した、がん細胞の優先的な細胞殺滅を結果としてもたらしうる。
【０１９５】
例えば、肝がん細胞（例えば、肝細胞癌細胞）は、正常肝細胞と比較して、低レベルのｍｉＲ−１２２を発現させることが典型的である。したがって、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡであって、少なくとも１つのｍｉＲ−１２２結合部位（例えば、ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ内の）を含むｍＲＮＡは、正常肝細胞内では、比較的低レベルのポリペプチドを発現させ、肝がん細胞内では、比較的高レベルのポリペプチドを発現させることが典型的であろう。ポリペプチドが、アポトーシスを誘導することが可能である場合、これは、正常肝細胞と比較した、肝がん細胞（例えば、肝細胞癌細胞）の優先的な細胞殺滅を引き起こしうる。
【０１９６】
したがって、組織による、コードされる目的のタンパク質の発現をモジュレートする、ｍｉＲ結合部位の、ｍＲＮＡへの組込みの非限定的な例として、本開示のｍＲＮＡは、少なくとも１つのｍｉＲ−１２２結合部位を含みうる。例えば、本開示のｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１２２シード配列と、部分的または完全に相補的な配列を含む、ｍｉＲ−１２２結合部位を含みうる。一部の実施形態では、ｍｉＲ−１２２シード配列は、ｍｉＲ−１２２のヌクレオチド２〜７に対応しうる。一部の実施形態では、ｍｉＲ−１２２シード配列は、５’−ＧＧＡＧＵＧ−３’でありうる。一部の実施形態では、ｍｉＲ−１２２シード配列は、ｍｉＲ−１２２のヌクレオチド２〜８でありうる。一部の実施形態では、ｍｉＲ−１２２シード配列は、５’−ＧＧＡＧＵＧＵ−３’でありうる。一部の実施形態では、ｍｉＲ−１２２結合部位は、５’−ＵＡＵＵＵＡＧＵＧＵＧＡＵＡＡＵＧＧＣＧＵＵ−３’（配列番号４５）もしくは５’−ＣＡＡＡＣＡＣＣＡＵＵＧＵＣＡＣＡＣＵＣＣＡ−３’（配列番号４６）のヌクレオチド配列、またはこれらの相補体を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのｍｉＲ−１２２結合部位の、ｍＲＮＡへの組入れは、ｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドの発現であって、低レベルのｍｉＲ−１２２を発現させる、他の細胞型と比較した、正常肝細胞内の発現を減殺しうる。他の実施形態では、少なくとも１つのｍｉＲ−１２２結合部位の、ｍＲＮＡへの組入れは、ｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドの発現であって、正常肝細胞と比較した、肝がん細胞（例えば、肝細胞癌細胞）内の発現の増大を可能としうる。
【０１９７】
さらに別の実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、その３’ＵＴＲ）は、それにより、ｉｎ  ｖｉｖｏの核酸送達時における免疫の活性化（例えば、Ｂ細胞の活性化、サイトカインの産生、ＡＤＡ応答）を低減または阻害するように、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位を含むことが可能であり、組織による、コードされる目的のタンパク質の発現をモジュレートするための、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位を含みうる。例えば、一実施形態では、ｍＲＮＡは、それにより、正常肝細胞と比較した、肝がん細胞（例えば、肝細胞癌細胞）内の、ｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドの発現の増大を可能とするように、ｍｉＲ−１２２結合部位を含み、また、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、１または複数のｍｉＲ結合部位であって、例えば、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７からなる群から選択されるｍｉＲ結合部位も含む。
【０１９８】
別の実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、その３’ＵＴＲ）は、それにより、例えば、Ｂ細胞による、例えば、ＰＥＧに対するＩｇＭの産生を低減もしくは阻害し、かつ／またはｐＤＣの成長および／もしくは活性化を低減もしくは阻害することにより、血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位を含むことが可能であり、組織による、コードされる目的のタンパク質の発現をモジュレートするための、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位を含みうる。例えば、一実施形態では、ｍＲＮＡは、それにより、正常肝細胞と比較した、肝がん細胞（例えば、肝細胞癌細胞）内の、ｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドの発現の増大を可能とするように、ｍｉＲ−１２２結合部位を含み、また、１または複数のｍｉＲ結合部位であって、例えば、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７からなる群から選択されるｍｉＲ結合部位も含む。
【０１９９】
一実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１２２結合部位およびｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１２２結合部位およびｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１２２結合部位およびｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１２２結合部位およびｍｉＲ−１５５−５ｐ結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１２２結合部位およびｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１２２結合部位、ｍｉＲ−１４２（ｍｉＲ−１４２−３ｐまたは１４２−５ｐ）結合部位、およびｍｉＲ−１２６（ｍｉＲ−１２６−３ｐまたはｍｉＲ−１２６−５ｐ）結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１２２結合部位、ｍｉＲ−１４２（ｍｉＲ−１４２−３ｐまたは１４２−５ｐ）結合部位、およびｍｉＲ−１５５（ｍｉＲ−１５５−３ｐまたはｍｉＲ−１５５−５ｐ）結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１２２結合部位、ｍｉＲ−１２６（ｍｉＲ−１２６−３ｐまたは１２６−５ｐ）結合部位、およびｍｉＲ−１５５（ｍｉＲ−１５５−３ｐまたはｍｉＲ−１５５−５ｐ）結合部位を含む。さらに別の実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１２２結合部位、ｍｉＲ−１４２（ｍｉＲ−１４２−３ｐまたはｍｉＲ−１４２−５ｐ）結合部位、ｍｉＲ−１２６（ｍｉＲ−１２６−３ｐまたは１２６−５ｐ）結合部位、およびｍｉＲ−１５５（ｍｉＲ−１５５−３ｐまたはｍｉＲ−１５５−５ｐ）結合部位を含む。これらの実施形態のうちのいずれかでは、ｍｉＲ−１２２結合部位は、ｍｉＲ−１２２−５ｐ結合部位でありうる。
【０２００】
ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位およびｍｉＲ−１２２−５ｐ結合部位の両方を含む、３’ＵＴＲ配列の非限定的な例を、配列番号４７に示す。配列番号４７の３’ＵＴＲの構造は、その５’末端における３つの終止コドンと、これに直に後続する、単一のｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位と、この下流に後続するスペーサーヌクレオチドと、次いで、単一のｍｉＲ−１２２−５ｐ結合部位とを含む。ｍｉＲ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐと、ｍｉＲ−１２２−５ｐと）の間の距離は、大幅に変動させることができ、多数の異なる構築物が、２つのｍｉＲ結合部位の異なる配置について調べられているが、全ての構築物が機能的であった。ある特定の実施形態では、ヌクレオチドスペーサーが、ＲＩＳＣの、各結合部位への結合を可能とするのに十分な長さの、２つのｍｉＲ結合部位の間に位置する。一実施形態では、２つのｍｉＲ結合部位は、互いから約４０塩基隔てて位置し、３’ＵＴＲの全長を、約１００〜１１０塩基とする。
【０２０１】
目的のタンパク質
本開示のｍＲＮＡは、目的のタンパク質、典型的に、被験体における使用のための治療的特性を有するタンパク質をコードしうる。目的のタンパク質は、ｍＲＮＡによりコードされうる、本質的に任意のタンパク質でありうる。特に、目的のタンパク質は、被験体における抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を誘発するなど、免疫細胞の活性化（例えば、Ｂ細胞の活性化）を刺激し、したがって、被験体における免疫細胞の活性化を低減または阻害すること（例えば、ＡＤＡ応答を低減すること）が望ましいタンパク質でありうる。多様な実施形態では、目的のタンパク質は、例えば、治療用タンパク質、サイトカイン、増殖因子、抗体、または融合タンパク質でありうる。治療用タンパク質の非限定的な例は、例えば、血液因子（因子ＶＩＩＩおよび因子ＶＩＩなど）、補体因子、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、およびＭＵＴ１を含む。サイトカインの非限定的な例は、例えば、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、リンホカインなどを含む。増殖因子の非限定的な例は、エリスロポエチン、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＩＧＦ、ＴＮＦ、ＣＳＦ、ＭＣＳＦ、ＧＭＣＳＦなどを含む。抗体の非限定的な例は、例えば、アダリムマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、イピリムマブ、トシリズマブ、カナキヌマブ、イトリズマブ、トラロキヌマブを含む。融合タンパク質の非限定的な例は、例えば、エタネルセプト、アバタセプト、およびバラタセプトを含む。
【０２０２】
一実施形態では、目的のタンパク質は、ヒトエリスロポエチンである。一実施形態では、ｍＲＮＡは、ヒトエリスロポエチンをコードし、配列番号１に示される配列を有するｍＲＮＡなど、ｍｉＲ−１４２−３ｐに結合するマイクロＲＮＡ結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、ヒトエリスロポエチンをコードし、配列番号２８に示される配列を有するｍＲＮＡなど、ｍｉＲ−１２６に結合するマイクロＲＮＡ結合部位を含む。さらに別の実施形態では、ｍＲＮＡは、ヒトエリスロポエチンをコードし、配列番号２９に示される配列を有するｍＲＮＡなど、ｍｉＲ−１４２−３ｐに結合するマイクロＲＮＡ結合部位と、ｍｉＲ−１２６に結合するマイクロＲＮＡ結合部位とを含む。別の実施形態では、目的のタンパク質は、ＬＤＬＲ（コレステロールの阻害における使用のための）である。別の実施形態では、目的のタンパク質は、ＭＵＴ１（メチルマロン酸血症（ＭＭＡ）の処置における使用のための）である。さらに他の実施形態では、ｍｍＲＮＡによりコードされる目的のタンパク質は、上記で列挙した抗体を含むがこれらに限定されない治療用抗体である。
【０２０３】
ナノ粒子
本開示のｍＲＮＡは、例えば、被験体へと送達された場合に、それらを分解から保護するように、ナノ粒子内または他の送達ビヒクル内に製剤化することができる。例示的なナノ粒子については、Ｐａｎｙａｍ，  Ｊ．およびＬａｂｈａｓｅｔｗａｒ，  Ｖ．（２００３年）、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．、５５巻、３２９〜３４７頁；ならびにＰｅｅｒ，  Ｄ．ら（２００７年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ．、２巻、７５１〜７６０頁において記載されている。ある特定の実施形態では、本開示のＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡを、ナノ粒子内に封入する。特定の実施形態では、ナノ粒子とは、１０００ｎＭ未満であるかもしくはこれと等しいか、５００ｎＭ未満であるかもしくはこれと等しいか、または１００ｎＭ未満であるかもしくはこれと等しい、少なくとも１つの大きさ（例えば、直径）を有する粒子である。特定の実施形態では、ナノ粒子は、脂質を含む。脂質ナノ粒子は、リポソームおよびミセルを含むがこれらに限定されない。カチオン性脂質および／またはイオン化脂質、アニオン性脂質、中性脂質、両親媒性脂質、ＰＥＧ化脂質、および／または構造的脂質を含む、多数の脂質のうちのいずれも存在しうる。このような脂質を、単独で使用することもでき、組合せで使用することもできる。特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書で記載される、１または複数のＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、例えば、目的のポリペプチドをコードし、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含むｍｍＲＮＡを含む。
【０２０４】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるｍＲＮＡの脂質ナノ粒子製剤は、１または複数の（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つの）カチオン性脂質および／またはイオン化脂質を含みうる。このようなカチオン性脂質は、３−（ジドデシルアミノ）−Ｎ１，Ｎ１，４−トリドデシル−１−ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１−［２−（ジドデシルアミノ）エチル］−Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４−トリドデシル−１，４−ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５−ジトリデシル−１５，１８，２１，２４−テトラアザオクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（Ｏｃｔｙｌ−ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）−２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（Ｏｃｔｙｌ−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、（２Ｓ）−２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（Ｏｃｔｙｌ−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））；Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ−Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジステアリール−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）；１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（「ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ」）；３−β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ｔｒｉｆｌｕｏｒａｃｅｔａｔｅ）（「ＤＯＳＰＡ」）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（「ＤＯＧＳ」）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（「ＤＯＤＭＡ」）、およびＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウ���ブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）を含むがこれらに限定されない。加えて、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから市販されている、ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含む）、およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから市販されている、ＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む）など、カチオン性脂質および／またはイオン化脂質の、多数の市販の調製物も使用することができる。ＫＬ１０、ＫＬ２２、およびＫＬ２５については、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６９１，７５０号において記載されている。特定の実施形態では、脂質は、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡまたはＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡである。
【０２０５】
本開示の脂質ナノ粒子における使用に適するアニオン性脂質は、中性脂質へと接続された、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン（ｅｔｈａｎｏｌｏａｍｉｎｅ）、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリールホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、および他のアニオン性修飾基を含むがこれらに限定されない。
【０２０６】
本開示の脂質ナノ粒子における使用に適する天然脂質は、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、およびセレブロシドを含むがこれらに限定されない。鎖長および飽和度を変動させる、様々なアシル鎖基を有する脂質が利用可能であるか、または周知の技法により単離もしくは合成することができる。加えて、飽和脂肪酸鎖と不飽和脂肪酸鎖との混合物を有する脂質も使用することができる。一部の実施形態では、本開示で使用される中性脂質は、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、または任意の類縁のホスファチジルコリンである。一部の実施形態では、中性脂質は、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、またはセリンおよびイノシトールなど、他のヘッド基を伴うリン脂質から構成されうる。
【０２０７】
一部の実施形態では、両親媒性脂質を、本開示のナノ粒子内に組み入れる。本開示のナノ粒子における使用に適する、例示的な両親媒性脂質は、スフィンゴ脂質、リン脂質、およびアミノ脂質を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、リン脂質は、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０  Ｄｉｅｔｈｅｒ  ＰＣ）、１−オレオイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ１６  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＥ  １６．０  ＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、およびスフィンゴミエリンからなる群から選択される。スフィンゴ脂質、糖スフィンゴ脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、およびβ−アシルオキシ酸など、他のリン非含有化合物もまた、使用することができる。加えて、このような両親媒性脂質は、トリグリセリドおよびステロールなど、他の脂質とたやすく混合することもできる。
【０２０８】
一部の実施形態では、本開示のナノ粒子の脂質成分は、１または複数のＰＥＧ化脂質を含みうる。ＰＥＧ化脂質（ＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質としてもまた公知である）とは、ポリエチレングリコールで修飾された脂質である。脂質成分は、１または複数のＰＥＧ化脂質を含みうる。ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、およびＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールからなる、非限定的な群から選択することができる。例えば、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ脂質、ＰＥＧ−ＤＭＧ脂質、ＰＥＧ−ＤＬＰＥ脂質、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ脂質、ＰＥＧ−ＤＰＰＣ脂質、またはＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質でありうる。
【０２０９】
本開示の脂質ナノ粒子は、１または複数の構造的脂質を含みうる。本開示の脂質ナノ粒子内に存在しうる、例示的で非限定的な構造的脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、またはアルファ−トコフェロールを含む。
【０２１０】
一部の実施形態では、本開示の１または複数のｍＲＮＡは、約１ｎｍ〜約９００ｎｍ、例えば、約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１ｎｍ〜約２００ｎｍ、約１ｎｍ〜約３００ｎｍ、約１ｎｍ〜約４００ｎｍ、約１ｎｍ〜約５００ｎｍ、約１ｎｍ〜約６００ｎｍ、約１ｎｍ〜約７００ｎｍ、約１ｎｍ〜８００ｎｍ、約１ｎｍ〜約９００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子内に製剤化することができる。一部の実施形態では、ナノ粒子は、約１０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約３０ｎｍ〜約１００ｎｍ、または約４０ｎｍ〜約８０ｎｍの直径を有しうる。一部の実施形態では、ナノ粒子は、約３０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約４０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約７０〜約１１０ｎｍ、または約８０ｎｍ〜約１２０ｎｍの直径を有しうる。一実施形態では、ｍＲＮＡは、約１０〜約２０ｎｍ、約１０〜約３０ｎｍ、約１０〜約４０ｎｍ、約１０〜約５０ｎｍ、約１０〜約６０ｎｍ、約１０〜約７０ｎｍ、約１０〜約８０ｎｍ、約１０〜約９０ｎｍ、約２０〜約３０ｎｍ、約２０〜約４０ｎｍ、約２０〜約５０ｎｍ、約２０〜約６０ｎｍ、約２０〜約７０ｎｍ、約２０〜約８０ｎｍ、約２０〜約９０ｎｍ、約２０〜約１００ｎｍ、約３０〜約４０ｎｍ、約３０〜約５０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約３０〜約７０ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、約３０〜約９０ｎｍ、約３０〜約１００ｎｍ、約４０〜約５０ｎｍ、約４０〜約６０ｎｍ、約４０〜約７０ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍ、約４０〜約９０ｎｍ、約４０〜約１００ｎｍ、約５０〜約６０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ、約５０〜約８０ｎｍ、約５０〜約９０ｎｍ、約５０〜約１００ｎｍ、約６０〜約７０ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約６０〜約９０ｎｍ、約６０〜約１００ｎｍ、約７０〜約８０ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約７０〜約１００ｎｍ、約８０〜約９０ｎｍ、約８０〜約１００ｎｍ、および／または約９０〜約１００ｎｍなどであるがこれらに限定されない間の範囲を含む、約１０〜約１００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子内に製剤化することができる。一実施形態では、ｍＲＮＡは、間の範囲を含む、約３０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約４０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約７０〜約１１０ｎｍ、または約８０ｎｍ〜約１２０ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子内に製剤化することができる。
【０２１１】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、１００ｎｍを超える、１５０ｎｍを超える、２００ｎｍを超える、２５０ｎｍを超える、３００ｎｍを超える、３５０ｎｍを超える、４００ｎｍを超える、４５０ｎｍを超える、５００ｎｍを超える、５５０ｎｍを超える、６００ｎｍを超える、６５０ｎｍを超える、７００ｎｍを超える、７５０ｎｍを超える、８００ｎｍを超える、８５０ｎｍを超える、９００ｎｍを超える、または９５０ｎｍを超える直径を有しうる。
【０２１２】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子の粒子サイズは、増大させることもでき、かつ／または減少させることもできる。粒子サイズを変化させて、炎症などであるがこれらに限定されない、生物学的反応に対抗する一助とすることも可能であり、患者または被験体へと送達されるｍＲＮＡの生物学的効果を増大させることもできる。
【０２１３】
ある特定の実施形態では、細胞型および／または組織型に特異的なターゲティング部分を使用して、本開示のナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子をターゲティングすることが望ましい。一部の実施形態では、ターゲティング部分を使用して、ナノ粒子を、特定の細胞、組織、および／または器官へとターゲティングすることができる。特定の実施形態では、ナノ粒子は、本明細書で記載される、１または複数のｍＲＮＡと、ターゲティング部分とを含む。例示的で非限定的なターゲティング部分は、リガンド、細胞表面受容体、糖タンパク質、ビタミン（例えば、リボフラビン）、および抗体（例えば、全長抗体、抗体断片（例えば、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ’）２断片）、単一ドメイン抗体、ラクダ科動物抗体およびその断片、ヒト抗体およびその断片、モノクローナル抗体、ならびに多特異性抗体（例えば、二特異性抗体））を含む。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ポリペプチドでありうる。ターゲティング部分は、全ポリペプチド（例えば、ペプチドまたはタンパク質）またはその断片を含みうる。ターゲティング部分は、ターゲティング部分が、標的、例えば、細胞表面受容体との相互作用に利用可能であるように、ナノ粒子の外部表面上に位置することが典型的である。当技術分野では、様々な、異なるターゲティング部分およびターゲティング法であって、例えば、Ｓａｐｒａら、Ｐｒｏｇ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．、４２巻（５号）：４３９〜６２頁、２００３年；およびＡｂｒａら、Ｊ．  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．、１２巻：１〜３頁、２００２年において記載されているターゲティング部分およびターゲティング法を含むターゲティング部分およびターゲティング法が公知であり、利用可能である。
【０２１４】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子（例えば、リポソーム）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖など、親水性ポリマー鎖の表面コーティングを含みうる（例えば、Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１２３７巻：９９〜１０８頁、１９９５年；ＤｅＦｒｅｅｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１１８巻：６１０１〜６１０４頁、１９９６年；Ｂｌｕｍｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１１４９巻：１８０〜１８４頁、１９９３年；Ｋｌｉｂａｎｏｖら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２巻：３２１〜３３４頁、１９９２年；米国特許第５，０１３，５５６号；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４巻：２９６〜２９９頁、１９９３年；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３５３巻：７１〜７４頁、１９９４年；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｓｔｅａｌｔｈ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、９章（ＬａｓｉｃおよびＭａｒｔｉｎ編）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  Ｆｌａ．、１９９５年を参照されたい）。１つの手法では、脂質ナノ粒子をターゲティングするためのターゲティング部分を、ナノ粒子を形成する脂質の極性ヘッド基へと連結する。別の手法では、ターゲティング部分を、親水性ポリマーコーティングを形成するＰＥＧ鎖の遠位末端へと接合させる（例えば、Ｋｌｉｂａｎｏｖら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２巻：３２１〜３３４頁、１９９２年；Ｋｉｒｐｏｔｉｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３８８巻：１１５〜１１８頁、１９９６年を参照されたい）。
【０２１５】
１または複数のターゲティング部分をカップリングするための標準的な方法を使用することができる。例えば、ターゲティング部分、または脂質誘導体化ブレオマイシンなど、誘導体化親油性化合物を接合させるために活性化させうる、ホスファチジルエタノールアミンを使用することができる。例えば、プロテインＡを組み込むリポソームを使用して、抗体ターゲティングリポソームを構築することができる（例えば、Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら、Ｊ．  Ｂｉｏ．  Ｃｈｅｍ．、２６５巻：１６３３７〜１６３４２頁、１９９０年およびＬｅｏｎｅｔｔｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）、８７巻：２４４８〜２４５１頁、１９９０年を参照されたい）。抗体コンジュゲーションの他の例は、米国特許第６，０２７，７２６号において開示されている。ターゲティング部分の例はまた、新生物または腫瘍と関連する抗原を含む、細胞内構成要素に特異的である、他のポリペプチドも含みうる。ターゲティング部分として使用されるポリペプチドは、共有結合を介して、リポソームへと接合させることができる（例えば、Ｈｅａｔｈ、Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、１４９巻、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１１１〜１１９頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、１９８７年）を参照されたい）。他のターゲティング法は、ビオチン−アビジン系を含む。
【０２１６】
一部の実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子を、肝細胞、結腸細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞、心臓細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、ベータ細胞、下垂体細胞、滑膜表層細胞、卵巣細胞、精巣細胞、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、および腫瘍細胞（原発性腫瘍細胞および転移性腫瘍細胞を含む）を含むがこれらに限定されない細胞へとターゲティングするターゲティング部分を含む。特定の実施形態では、ターゲティング部分は、脂質ナノ粒子を、肝細胞へとターゲティングする。他の実施形態では、ターゲティング部分は、脂質ナノ粒子を、結腸細胞へとターゲティングする。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、脂質ナノ粒子を、肝がん細胞（例えば、肝細胞癌細胞）または結腸直腸がん細胞（例えば、原発性腫瘍および転移性腫瘍）へとターゲティングする。
【０２１７】
医薬組成物
本開示は、本明細書で記載されるｍＲＮＡまたはナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）を含む医薬組成物であって、１または複数の薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤と組み合わせた医薬組成物を含む。特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、ナノ粒子内、例えば、脂質ナノ粒子内に存在する。特定の実施形態では、ｍＲＮＡまたはナノ粒子は、医薬組成物中に存在する。多様な実施形態では、医薬組成物中に存在するｍＲＮＡを、ナノ粒子内、例えば、脂質ナノ粒子内に封入する。
【０２１８】
医薬組成物は任意選択で、１または複数のさらなる活性物質、例えば、治療的活性物質および／または予防的活性物質を含みうる。本開示の医薬組成物は、滅菌および／または発熱物質非含有でありうる。医薬薬剤の製剤化および／または製造における一般的な検討事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５年（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）において見出すことができる。特定の実施形態では、医薬組成物は、ｍＲＮＡおよび脂質ナノ粒子、またはこれらの複合体を含む。
【０２１９】
本明細書で記載される医薬組成物による製剤は、薬理学の技術分野で公知であるかまたは今後開発される任意の方法により調製することができる。一般に、このような調製法は、有効成分を、賦形剤および／または１もしくは複数の他のアクセサリー成分と会合させるステップと、次いで、必要および／または望ましい場合、生成物を、所望の単回投与または複数回投与の用量単位へと、分割、成形、および／またはパッケージングするステップとを含む。
【０２２０】
本開示に従う医薬組成物中の有効成分、薬学的に許容される賦形剤、および／または任意のさらなる成分の相対量は、処置される被験体の識別、サイズ、および／または状態に応じて変動するが、組成物を投与する経路に応じてもさらに変動するであろう。例として、組成物は、０．１％〜１００％の間、例えば、０．５％〜７０％の間、１％〜３０％の間、５％〜８０％の間、または少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の有効成分を含みうる。一部の実施形態では、活性薬剤は、目的のタンパク質と、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位であって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位などのマイクロＲＮＡ結合部位とをコードするｍＲＮＡである。
【０２２１】
本開示のｍＲＮＡは、（１）安定性を増大させ；（２）細胞へのトランスフェクションを増大させ；（３）持続放出もしくは遅延放出（例えば、デポ製剤からの、ｍＲＮＡの）を可能とし；（４）生体内分布を変更させ（例えば、ｍＲＮＡを、特異的組織型または細胞型へとターゲティングする）；（５）ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ｍｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドの翻訳を増大させ；かつ／または（６）ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、ｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドの放出プロファイルを変更するように、１または複数の賦形剤を使用して製剤化することができる。任意の溶媒および全ての溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散補助剤または懸濁補助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤など、従来の賦形剤に加えて、本開示の賦形剤は、限定せずに、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子（例えば、リポソームおよびミセル）、ポリマー、リポプレックス、コア−シェル型ナノ粒子、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ｍＲＮＡをトランスフェクトされた細胞（例えば、被験体への移植のための）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣剤、およびこれらの組合せを含みうる。したがって、本開示の製剤は、各々が、併せて、ｍＲＮＡの安定性を増大させ、細胞へのｍＲＮＡによるトランスフェクションを増大させ、ｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドの発現を増大させ、かつ／またはｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドの放出プロファイルを変更する量で、１または複数の賦形剤を含みうる。さらに、本開示のｍＲＮＡは、自己組織化核酸ナノ粒子を使用して製剤化することができる。
【０２２２】
当技術分野では、医薬組成物を製剤化するための多様な賦形剤と、組成物を調製するための技法とが公知である（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１版、Ａ．  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ、２００６年を参照されたい）。従来の賦形剤媒体の使用は、任意の従来の賦形剤媒体が、望ましくない任意の生物学的効果をもたらすか、または、他の有害な形で、医薬組成物の他の任意の成分と相互作用することなどにより、物質またはその誘導体と不適合でありうる場合を除き、本開示の範囲内にあると想定しうる。賦形剤は、例えば、抗付着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング、圧縮補助剤、崩壊剤、色素（着色剤）、軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、薄膜形成剤またはコーティング、流動促進剤（流動増強剤）、滑沢剤、保存剤、印字インキ、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味剤、および水和水を含みうる。例示的な賦形剤は、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、結晶質セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファデンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、滑石、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、およびキシリトールを含むがこれらに限定されない。
【０２２３】
一部の実施形態では、本明細書で記載される製剤は、少なくとも１つの、薬学的に許容される塩を含みうる。本開示の製剤中に組入れうる、薬学的に許容される塩の例は、アミンなど、塩基性残基の、酸添加塩、アルカリ塩もしくはアルカリ土類金属塩、鉱酸塩、または有機酸塩；カルボン酸など、酸性残基の、アルカリ塩または有機塩などを含むがこれらに限定されない。代表的な酸添加塩は、酢酸塩（ａｃｅｔａｔｅ，  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩（ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ，  ｂｅｎｚｅｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などを含む。代表的なアルカリ塩またはアルカリ土類金属塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどのほか、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むがこれらに限定されない、非毒性のアンモニウム、四級アンモニウム、およびアミンカチオンを含む。
【０２２４】
一部の実施形態では、本明細書で記載される製剤は、少なくとも１つの種類のポリヌクレオチドを含有しうる。非限定的な例として、製剤は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または５つを超える、本明細書で記載されるｍＲＮＡを含有しうる。
【０２２５】
例えば、非経口投与のための液体剤形は、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、および／またはエリキシル剤を含むがこれらに限定されない。有効成分に加えて、液体剤形は、当技術分野で一般に使用される、不活性の希釈剤であって、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、およびこれらの混合物など、水または他の溶媒、可溶化剤、および乳化剤などの希釈剤を含みうる。不活性の希釈剤のほか、経口組成物は、保湿剤、乳化剤、および／または懸濁剤などのアジュバントを含みうる。ある特定の実施形態では、非経口投与のために、組成物を、ＣＲＥＭＡＰＨＯＲ（登録商標）、アルコール、油、修飾油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはこれらの組合せなどの可溶化剤と混合する。
【０２２６】
注射用調製物、例えば、滅菌注射用水性懸濁液または滅菌注射用油性懸濁液は、適する分散剤、保湿剤、および／または懸濁剤を使用して、公知の技術に従い製剤化することができる。滅菌注射用調製物は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液としての、非毒性で非経口的に許容可能な希釈剤中および／または溶媒中の、滅菌注射用溶液、滅菌注射用懸濁液、および／または滅菌注射用エマルジョンでありうる。援用されうる、許容可能なビヒクルおよび溶媒には、水、Ｕ．Ｓ．Ｐ．によるリンゲル液、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。従来、滅菌の固定油も、溶媒または懸濁媒体として援用されている。この目的では、合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドを含む、任意の無刺激性固定油を援用することができる。注射剤の調製では、オレイン酸などの脂肪酸も使用することができる。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通す濾過により滅菌することもでき、かつ／または使用の前に、滅菌水中または他の滅菌注射用媒体中に溶解または分散させうる、滅菌固体組成物の形態で、滅菌剤を組み込むことにより滅菌することもできる。
【０２２７】
一部の実施形態では、少なくとも１つの、本明細書で記載されるｍＲＮＡを含む医薬組成物を、哺乳動物（例えば、ヒト）へと投与する。本明細書では、ヒトへの投与に適する医薬組成物を主に被験体とする、医薬組成物についての記載が提示されるが、当業者には、このような組成物は一般に、他の任意の動物、例えば、非ヒト哺乳動物への投与に適することが理解されるであろう。多様な動物への投与に適するものとするために、ヒトへの投与に適する医薬組成物組成物の改変が十分に理解されており、獣医学の薬理技術分野の当業者は、存在する場合でも、規定の実験だけにより、このような改変をデザインおよび／または実施することができる。医薬組成物の投与が想定される被験体は、ヒトおよび／もしくは他の霊長動物；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／もしくはラットなど、商業的に関与性の哺乳動物を含む哺乳動物；ならびに／または家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／もしくはシチメンチョウなど、商業的に関与性の鳥類を含む鳥類を含むがこれらに限定されない。特定の実施形態では、被験体に、２つまたはそれよりも多い、本明細書で記載されるｍＲＮＡ、例えば、第１の目的のポリペプチドをコードし、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む第１のｍＲＮＡと、第２の目的のポリペプチドをコードし、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む第２のｍＲＮＡとを施す。特定の実施形態では、第１のｍｍＲＮＡと、第２のｍｍＲＮＡとを、被験体へと、同時に、または異なる時点に、例えば、逐次的に施す。特定の実施形態では、第１のｍＲＮＡと、第２のｍＲＮＡとを、例えば、同じ細胞による両方のｍＲＮＡの取込みを容易とするために、被験体へと、同じ医薬組成物または製剤で施す。
【０２２８】
免疫細胞の活性化およびサイトカインの産生の阻害
本開示の方法は、少なくとも１つのｍｉＲ−１２６（例えば、ｍｉＲ−１２６−３ｐ）結合部位および／またはｍｉＲ−１４２（例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐ）結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れにより、ｍＲＮＡベースの治療薬によりコードされる、目的のポリペプチド（例えば、治療剤）により刺激される、望ましくない免疫細胞の活性化および／またはサイトカインの産生など、ｍＲＮＡベースの治療薬で処置される被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化、および／または望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害を可能とする。一実施形態では、免疫細胞の活性化は、リンパ球の活性化である。一実施形態では、免疫細胞の活性化は、Ｂ細胞の活性化である。別の実施形態では、免疫細胞の活性化は、Ｔ細胞の活性化である。さらに他の実施形態では、免疫細胞の活性化は、マクロファージの活性化、樹状細胞の活性化、ＮＫ細胞の活性化、好塩基球の活性化、または好酸球の活性化である。
【０２２９】
一実施形態では、望ましくない免疫細胞の活性化の低減または阻害を、少なくとも１つのｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位またはｍｉＲ−１４２マイクロＲＮＡ結合部位を欠く、ｍｍＲＮＡの対照投与と比較して決定する。多様な実施形態では、免疫細胞の活性化を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、約５％〜５０％、約１０％〜５０％、約１５％〜５０％、約２０％〜５０％、約２５％〜５０％、約１０％〜８０％、約１０％〜７０％、約１０％〜６０％、約２０％〜８０％、約２０％〜７０％、約２０％〜６０％、約２０％〜４０％、または約２５％〜７５％減少させる。
【０２３０】
免疫細胞の活性化のレベルは、細胞表面活性化マーカーを発現させる細胞の検出により典型的に評価される、活性化免疫細胞集団の頻度、または免疫細胞の活性化を指し示す、１もしくは複数のサイトカインの産生レベルなど、当技術分野で確立された、免疫細胞の活性化を評価するための、本質的に任意の方法により査定することができる。一実施形態では、免疫細胞の活性化は、Ｂ細胞の活性化であり、この場合、Ｂ細胞の活性化のレベルを、脾臓のＢ細胞集団にわたる活性化Ｂ細胞の頻度など、活性化Ｂ細胞の頻度を測定することにより決定する。当技術分野では、Ｂ細胞の活性化を指し示すＢ細胞表面マーカーが周知である（例えば、Ｍａｄｄａｌａｙ，  Ｒ．ら（２０１０年）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８４巻：４８８３〜４８９４頁を参照されたい）。一実施形態では、Ｂ細胞の活性化を、ＣＤ１９＋ＣＤ８６＋ＣＤ６９＋Ｂ細胞の頻度により決定する。別の実施形態では、免疫細胞の活性化は、Ｂ細胞の活性化であり、この場合、Ｂ細胞の活性化のレベルを、例えば、処置される被験体の血清中の、インターロイキン６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、またはインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の分泌など、サイトカインの分泌により決定する。一実施形態では、Ｂ細胞の活性化を、例えば、処置される被験体の血清中の、ＩＬ−６の分泌により決定する。他の実施形態では、低減または阻害される、望ましくないサイトカインの産生は、例えば、処置される被験体の血清中の、インターロイキン６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、またはインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の産生である。別の実施形態では、低減または阻害される、望ましくないサイトカインの産生は、インターロイキン６（ＩＬ−６）の産生である。
【０２３１】
一実施形態では、免疫細胞の活性化は、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の活性化であり、この場合、ｐＤＣ活性化のレベルは、脾臓のｐＤＣ集団にわたる活性化ｐＤＣの頻度など、活性化ｐＤＣの頻度を測定することにより決定する。当技術分野では、活性化を指し示すｐＤＣ表面マーカーが周知である（例えば、Ｄｚｉｏｎｅｋ，  Ａ．ら（２００２年）、Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６３巻（１２号）：１１３３〜４８頁を参照されたい）。一実施形態では、ｐＤＣの活性化を、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ７０＋ＣＤ８６＋細胞の頻度により決定する。
【０２３２】
一実施形態では、望ましくない免疫細胞の活性化、および／または望ましくないサイトカインの産生を、ｍｍＲＮＡによりコードされる、目的のポリペプチドの発現の、対応する減少を伴わずに減少させる。こうして、本開示の方法は、被験体における治療剤の発現レベルに著明な影響を及ぼさずに、治療剤である、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡで処置された被験体における、免疫細胞の活性化（例えば、Ｂ細胞の活性化、サイトカイン産生）を阻害または低減することを可能とする。
【０２３３】
本開示の方法で使用しうる、標準的な計量は、コードされるポリペプチド（タンパク質）のレベルまたは量であって、細胞、組織、または生物において産生されるレベルまたは量の、その発現が、細胞、組織、または生物において、化学修飾ｍＲＮＡの投与またはこれとの接触の結果として誘発されるサイトカインの１または複数（またはパネル）のレベルまたは量に対する比の尺度である。本明細書では、このような比を、タンパク質：サイトカイン比または「ＰＣ」比と称する。ＰＣ比が大きいほど、化学修飾ｍＲＮＡ（測定されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド）は有効である。サイトカインによる、本開示の好ましいＰＣ比は、１を超える、１０を超える、１００を超える、１０００を超える、１０，０００を超える、またはそれよりも多いＰＣ比でありうる。異なる構築物による修飾ｍＲＮＡまたは非修飾構築物による修飾ｍＲＮＡよりＰＣ比が大きな修飾ｍＲＮＡが好ましい。
【０２３４】
ＰＣ比は、ｍＲＮＡ内に存在する修飾パーセントにより、さらに適格化しうる。例えば、１００％の修飾ｍＲＮＡに照らして標準化したタンパク質産生であって、サイトカインの関数としてのタンパク質産生（または危険性）またはサイトカインプロファイルを決定することができる。
【０２３５】
一実施形態では、本開示は、ｍｉＲ−１２６結合部位および／またはｍｉＲ−１４２結合部位を含む修飾ｍＲＮＡのＰＣ比を、ｍｉＲ−１２６結合部位および／またはｍｉＲ−１４２結合部位を伴わない同じ構築物のＰＣ比と比較することにより、少なくとも１つのｍｉＲ−１２６結合部位および／またはｍｉＲ−１４２結合部位を含む、任意の特定の修飾ｍＲＮＡの相対的効能を、化学反応、サイトカイン、または修飾パーセントにわたり決定するための方法を提示する。
【０２３６】
一実施形態では、哺乳動物（例えば、ヒト）の血清中の、ｍｍＲＮＡによりコードされる目的のポリペプチドの発現レベルは、投与の少なくとも２時間後において、少なくとも５０ｐｇ／ｍｌでありうる。別の実施形態では、哺乳動物（例えば、ヒト）の血清中の、ｍｍＲＮＡによりコードされる目的のポリペプチドの発現レベルは、投与後少なくとも７２時間にわたり、５０ｐｇ／ｍｌを上回るレベルを維持しうる。別の実施形態では、哺乳動物（例えば、ヒト）の血清中の、ｍｍＲＮＡによりコードされる目的のポリペプチドの発現レベルは、投与後少なくとも７２時間にわたり、６０ｐｇ／ｍｌを上回るレベルを維持しうる。
【０２３７】
Ｂ１ａ細胞の阻害／血中クリアランスの加速化の阻害
脾臓は、以前からＡＢＣに関与しているが、ＡＢＣの一因となる正確な機構は、いまだ理解されていない。脾臓は、赤脾髄（赤血球に富む）、白脾髄（リンパ球に富む）、および辺縁帯（赤脾髄と白脾髄との間、および辺縁洞の外側に配置される）から構成される。脾臓に入った抗原は、辺縁帯内に保持され、辺縁帯では、抗原と、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｂ細胞）との間の相互作用を可能とするように、血流が低減される（Ｈａｒｍら、Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎｏ．、６４巻：４２２０〜４２２５頁、１９９６年）。血中クリアランスの加速化における脾臓の役割は、重要であると考えられる。生体内分布データは、脂質を含む化合物または組成物（例えば、ＬＮＰ）が、脾臓により取り込まれたことを裏付ける（データは示さない）。組織学的査定は、投与（例えば、ＩＶ投与）後、急速な、ＬＮＰの、辺縁帯への取込みを示す。脾臓内で、ＬＮＰは、脾臓Ｂ細胞と相互作用し、ＬＮＰに対する免疫応答の多様な要素に寄与しうる。例えば、ＬＮＰのある特定の成分（例えば、ＰＥＧ成分）は、脾臓内のＣＤ１９＋  Ｂ細胞と相互作用する結果として、結合、内部化、膜融合、および／またはこのような細胞の活性化をもたらす結果として、ＬＮＰの成分に特異的なＩｇＧ分子および／またはＩｇＭ分子の産生もたらすことから、例えば、ＬＮＰによる、２回目または後続の投与時における血中クリアランスの加速化をもたらしうる。
【０２３８】
驚くべきことに、本明細書ではまた、免疫系の特定の細胞、すなわち、ｐＤＣもまた、ＡＢＣ現象に寄与することも裏付けられている。本明細書では、ｍｉＲ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２６結合部位）の組入れが、ＬＮＰに封入されたｍＲＮＡ、例えば、修飾ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質に対する、望ましくない免疫応答（例えば、ＡＤＡ）の低減をもたらしうることが裏付けられている。今や、驚くべきことに、ｍｉＲ結合部位、特に、ｍｉＲ−１２６結合部位の組入れが、ｍＲＮＡを封入するＬＮＰに対する、さらなる、望ましくない免疫応答の低減をもたらしうることも裏付けられている。ｍｉＲ−１２６（例えば、ｍｉＲ−１２６−３ｐ）は、ｐＤＣ内で高度に発現し、実際、ｐＤＣの活性化時に上方調節される。ｐＤＣは、核酸に応答して、Ｂ細胞の活性化を相乗作用的に増大させ、サイトカインの分泌および形質細胞の活性化を介して、活性化の他の形態を増大させる。さらに、「ｍｉＲ−１２６−３ｐが低度な」ｐＤＣ（例えば、ｍｉＲ−１２６がノックダウンまたはノックアウトされたｐＤＣ）は、活性化が損なわれている（例えば、核酸に対する有効な免疫応答を発し、ＩＦＮ−α／β分泌、ＩＬ−６分泌などをもたらすことができず、活性化時に、脾臓へと遊走できないことなど）。本明細書で裏付けられる通り、ｍｉＲ−１２６結合部位の、ｍＲＮＡへの組入れは、数週間にわたる、ＬＮＰに封入されたｍＲＮＡの反復投与において、低度なＢ細胞の活性化および低血清ＩＬ−６を結果としてもたらす。タンパク質の発現は、同様の投与スケジュールにわたり維持される。驚くべきことに、抗ＰＥＧ  ＩｇＭ応答は、数週間にわたる反復投与において、劇的に低下する。こうして、ｍｉＲ−１２６結合部位の、ｍＲＮＡ、特に、ＬＮＰに封入されたｍＲＮＡへの組入れの、予測されない有益性は、ＡＢＣの低減である。
【０２３９】
脾臓内、例えば、脾臓の辺縁帯内では、これらの鍵となる免疫細胞のうちのいくつかは、例えば、サイトカイン産生（例えば、ＩＬ−６）の結果として、直接的にまたは間接的に相互作用しうる。
【０２４０】
理論により束縛されることを望まずに、本開示は、辺縁帯内に存在する免疫細胞内で発現するｍｉＲが、血中クリアランスの加速化に参与するという証拠を提示する。本開示のｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現する、１または複数のｍｉＲに結合する、１または複数のｍｉＲ結合部位を含む場合、目的のｍｉＲは、下方調節される（例えば、アンタゴナイズされ、かつ／または分解される）。免疫細胞内で発現する、少なくとも１つのｍｉＲに結合する、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位の組入れは、脂質成分（例えば、ＰＥＧ脂質）に結合することが可能なＩｇＭ分子の産生の減少であって、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位を伴わないｍＲＮＡと比較した減少を結果としてもたらす。ＩｇＭ分子の、血中クリアランスの加速化における公知の役割を踏まえると、免疫細胞内で発現するｍｉＲに結合するｍｉＲ結合部位が、ＩｇＭ分子の産生を阻害または低減する能力は、具体的には、脾臓の辺縁帯内の免疫細胞内で発現するｍｉＲの、血中クリアランスの加速化における重要な役割を指し示す。
【０２４１】
本開示の方法は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害することを可能とし、方法は、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、この場合、反復投与後の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む。
【０２４２】
他の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与することであって、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、実施することと；被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与することとにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する。
【０２４３】
一部の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、１回または複数回の後続の投与の実施時の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の複数回の投与を実施された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する。
【０２４４】
他の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、ｍＲＮＡの後続の投与の実施時の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する。
【０２４５】
さらなる実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、反復投与後の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含み、ＬＮＰが、Ｂ細胞を活性化させず、かつ／またはＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しない、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する。
【０２４６】
さらなる実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与することであって、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、実施することと；被験体へと、ＬＮＰ内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与することであって、被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、ＬＮＰが、Ｂ細胞を活性化させず、かつ／またはＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しない、実施することとにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する。
【０２４７】
他の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、１回または複数回の後続の投与の実施時の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含み、ＬＮＰが、Ｂ細胞を活性化させず、かつ／またはＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しない、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の複数回の投与を実施された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する。
【０２４８】
一部の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、ｍＲＮＡの後続の投与の実施時の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含み、ＬＮＰが、Ｂ細胞を活性化させず、かつ／またはＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しない、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する。
【０２４９】
一部の実施形態では、本開示は、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、反復投与後の被験体における、ＰＥＧを認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害する方法を提示する。
【０２５０】
一部の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与することであって、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、実施することと；被験体における、ＰＥＧを認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与することとにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害する。
【０２５１】
一部の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、１回または複数回の後続の投与の実施時の被験体における、ＰＥＧを認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の複数回の投与を実施された被験体における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害する。
【０２５２】
他の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、後続のｍＲＮＡの投与の実施時の被験体における、ＰＥＧを認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害する。
【０２５３】
さらなる実施形態では、本開示は、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、反復投与後の被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害する方法を提示する。
【０２５４】
一部の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与することであって、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、実施することと；被験体においてＢ１ａ細胞の活性化を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与することとにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害する。
【０２５５】
他の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、１回または複数回の後続の投与の実施時の被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の複数回の投与を実施された被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害する。
【０２５６】
一部の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、後続のｍＲＮＡの投与の実施時の被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害する。
【０２５７】
さらなる実施形態では、本開示は、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、反復投与後の被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害する方法を提示する。
【０２５８】
一部の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与することであって、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、実施することと；被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与することとにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害する。
【０２５９】
一部の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、１回または複数回の後続の投与の実施時の被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の複数回の投与を実施された被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害する。
【０２６０】
一部の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、後続のｍＲＮＡの投与の実施時の被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害する。
【０２６１】
さらなる実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、Ｂ細胞を活性化させず、かつ／またはＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しない。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、Ｂ細胞を活性化させない。他の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、ＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しない。
【０２６２】
一部の実施形態では、血中クリアランスの加速化の低減または阻害を、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠く化学修飾ｍＲＮＡの対照投与と比較して決定する。他の実施形態では、化学修飾ｍＲＮＡによりコードされる、目的のポリペプチドの発現の、対応する低下または阻害を伴わずに、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する。
【０２６３】
さらなる実施形態では、２回にわたる連続投与の間の間隔は、２週間未満である。一部の実施形態では、２回にわたる連続投与の間の間隔は、１週間未満である。
【０２６４】
一部の実施形態では、ＩｇＭ分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識する。
【０２６５】
本開示の方法
一態様では、本開示は、被験体における抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、被験体へと、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含み、被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、ｍｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐおよび／またはｍｉＲ−１２６−３ｐ）を含み、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。上記で記載した通り、多様な実施形態では、ｍｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現する１または複数のｍｉＲに対する、例えば、２つまたはそれよりも多い、１つ〜４つ、１つ、２つ、３つ、または４つの結合部位を含みうる。ある特定の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現する少なくとも２つの異なるｍｉＲに対する、少なくとも２つの結合部位を含む。例えば、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２−３ｐに対する第１の結合部位と、免疫細胞内で発現する、異なるｍｉＲであって、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１４６（ｍｉＲ−１４６−３ｐおよび／またはｍｉＲ−１４６−５ｐ）、またはｍｉＲ−１２６などのｍｉＲに対する第２の結合部位とを含みうる。代替的に、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１２６（例えば、ｍｉＲ−１２６−３ｐ）に対する第１の結合部位と、免疫細胞内で発現する、異なるｍｉＲであって、ｍｉＲ−１４２（ｍｉｒ−１４２−３ｐおよび／またはｍｉＲ−１４２−５ｐ）、ｍｉＲ−１５５、またはｍｉＲ−１４６（ｍｉＲ−１４６−３ｐおよび／またはｍｉＲ−１４６−５ｐ）などのｍｉＲに対する第２の結合部位とを含みうる。一実施形態では、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２−３ｐに対する第１の結合部位と、ｍｉＲ−１２６に対する第２の結合部位とを含む。
【０２６６】
関連する実施形態では、被験体に、ｍｍＲＮＡを含むナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）を施すかまたは投与する。さらなる関連する実施形態では、被験体に、本開示の医薬組成物を施すかまたは投与する。特定の実施形態では、医薬組成物は、目的のポリペプチドをコードし、本明細書で記載される、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位を含むｍｍＲＮＡを含むか、またはｍｍＲＮＡを含むナノ粒子を含む。特定の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、ナノ粒子内、例えば、脂質ナノ粒子内に存在する。特定の実施形態では、ｍｍＲＮＡまたはナノ粒子は、医薬組成物中に存在する。
【０２６７】
一実施形態では、ｍｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子内に封入して、静脈内投与する。一実施形態では、ｍｍＲＮＡを、毎週１回の注入（例えば、ポンプを介するものなどの静脈内注入）により投与する。一実施形態では、ｍｍＲＮＡを、毎週１回の注入により、少なくとも４週間にわたり投与する。
【０２６８】
別の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドの、被験体への反復投与後における、抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された、目的のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を静脈内投与するステップであり、ｍｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つの結合部位（例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および／またはｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位）を含み、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップとを含む方法を提示する。
【０２６９】
別の態様では、本開示は、目的のポリペプチドの、被験体への反復投与後における、抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、
（ｉ）被験体へと、ＬＮＰ内に封入された、目的のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を静脈内投与するステップであり、ｍｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および／またはｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位）を含み、
ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；
（ｉｉ）被験体に由来する試料中の抗薬物抗体のレベルを検出するステップと；
（ｉｉｉ）試料中の抗薬物抗体のレベルが低下したら、被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップと
を含む方法を提示する。
【０２７０】
ｍｍＲＮＡが投与される被験体の脾臓内のｍｍＲＮＡによりコードされる目的のタンパク質の発現を低減または阻害する本開示の方法の能力を踏まえ、本開示はさらに、ｍｍＲＮＡベースの治療薬の毒性を低減するための方法も提示する。したがって、別の態様では、本開示は、被験体における薬物関連毒性を低減または阻害する方法であって、被験体へと、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含み、被験体における、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性を低減または阻害するように、ｍｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つの結合部位（例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および／またはｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位）を含み、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法を提示する。一実施形態では、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性は、被験体における血球数の減少（血球減少症）である。一実施形態では、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性は、被験体における自己免疫である。一実施形態では、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性は、被験体における補体媒介作用である。一実施形態では、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性は、被験体における造血の減少である。他の実施形態では、薬物関連毒性は、例えば、腎毒性または肝毒性でありうる。
【０２７１】
別の態様では、本開示は、ＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ（例えば、化学修飾ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含み、被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害するように、ｍＲＮＡ、例えば、化学修飾ＲＮＡまたはｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位、および／またはｍｉＲ−１４２マイクロＲＮＡ結合部位を含み、ｍＲＮＡ、例えば、化学修飾ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。別の態様では、本開示は、ＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害する方法であって、被験体へと、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ（例えば、化学修飾ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含み、被験体における、望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害するように、ｍＲＮＡ、例えば、化学修飾ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位、および／またはｍｉＲ−１４２マイクロＲＮＡ結合部位を含み、ｍＲＮＡ、例えば、化学修飾ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。
【０２７２】
上記で記載した通り、多様な実施形態では、化学修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡと称する）は、免疫細胞内で発現する１または複数のｍｉＲに対する、例えば、２つまたはそれよりも多い、１つ〜４つ、１つ、２つ、３つ、または４つの結合部位を含みうる。ある特定の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現する少なくとも２つの異なるｍｉＲに対する、少なくとも２つの結合部位を含む。例えば、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１２６に対する第１の結合部位と、免疫細胞内で発現する、異なるｍｉＲであって、ｍｉＲ−１４２（ｍｉＲ−１４２−３ｐおよび／またはｍｉＲ−１４２−５ｐ）、ｍｉＲ−１５５またはｍｉＲ−１４６（ｍｉＲ−１４６−３ｐおよび／またはｍｉＲ−１４６−５ｐ）などのｍｉＲに対する第２の結合部位とを含みうる。代替的に、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２（ｍｉＲ−１４２−３ｐおよび／またはｍｉＲ−１４２−５ｐ）に対する第１の結合部位と、免疫細胞内で発現する、異なるｍｉＲであって、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１５５またはｍｉＲ−１４６（ｍｉＲ−１４６−３ｐおよび／またはｍｉＲ−１４６−５ｐ）などのｍｉＲに対する第２の結合部位とを含みうる。一実施形態では、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２−３ｐに対する第１の結合部位と、ｍｉＲ−１２６に対する第２の結合部位とを含む。
【０２７３】
ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、目的のポリペプチド（例えば、治療剤）をコードし、この場合、望ましくない免疫細胞の活性化が、目的のポリペプチドに応答して生じる。
【０２７４】
関連する実施形態では、被験体に、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを含むナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）を施すかまたは投与する。さらなる関連する実施形態では、被験体に、本開示の医薬組成物を施すかまたは投与する。特定の実施形態では、医薬組成物は、目的のポリペプチドをコードし、本明細書で記載される、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位を含むｍｍＲＮＡを含むか、またはｍｍＲＮＡを含むナノ粒子を含む。特定の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、ナノ粒子内、例えば、脂質ナノ粒子内に存在する。特定の実施形態では、ｍｍＲＮＡまたはナノ粒子は、医薬組成物中に存在する。
【０２７５】
一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子内に封入して、静脈内投与する。一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを、毎週１回の注入（例えば、ポンプを介するものなどの静脈内注入）により投与する。一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを、毎週１回の注入により、少なくとも４週間にわたり投与する。
【０２７６】
別の実施形態では、本開示は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化（例えば、リンパ球の活性化、Ｂ細胞の活性化）、または望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害する方法であって、被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡ、例えば、化学修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を、静脈内投与するステップであり、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位、および／またはｍｉＲ−１４２マイクロＲＮＡ結合部位を含み、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化、または望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップとを含む方法を提示する。
【０２７７】
ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、目的のポリペプチド（例えば、治療剤）をコードし、この場合、望ましくない免疫細胞の活性化および／または望ましくないサイトカインの産生が、目的のポリペプチドに応答して生じる。
【０２７８】
別の態様では、本開示は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、被験体へと反復投与した後に、被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化（例えば、リンパ球の活性化、Ｂ細胞の活性化）、または望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害する方法であって、
（ｉ）被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡ、例えば化学修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を、静脈内投与するステップであり、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位、および／またはｍｉＲ−１４２マイクロＲＮＡ結合部位を含み、
ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；
（ｉｉ）被験体に由来する試料中の免疫細胞の活性化のレベルを検出するステップと；
（ｉｉｉ）試料中の免疫細胞の活性化のレベルが低下したら、被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化、または望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップと
を含む方法を提示する。
【０２７９】
ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、目的のポリペプチド（例えば、治療剤）をコードし、この場合、望ましくない免疫細胞の活性化または望ましくないサイトカインの産生が、目的のポリペプチドに応答して生じる。
【０２８０】
ＡＤＡアッセイ
ＡＤＡアッセイ（バイオアッセイ）を使用して、中和抗体（ＮＡＢ）および非中和結合抗体（ＢＡＢ）の両方についてアッセイすることができる。ＮＡＢアッセイは、細胞ベースのアッセイ、例えば、細胞成長アッセイ、バイオマーカーアッセイ、遺伝子発現アッセイ、遺伝子レポーターアッセイ、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイなど、ならびに非細胞ベースのアッセイ、例えば、競合的リガンド結合（ＣＬＢＡ）アッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、電気化学発光（ＥＣＬ）、例えば、電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、Ｇｙｒｏｓ（登録商標）抗薬物抗体（ＡＤＡ）イムノアッセイ、蛍光酵素イムノアッセイ（ＦＥＩＡ）、リストセチン誘導血小板凝集（ＲＩＰＡ）などの両方を含みうる。
【０２８１】
例示的な態様では、治療レジメンは、治療レジメンの前または治療レジメン中に、１または複数のＡＤＡアッセイを行うことを含みうる。例示的な実施形態では、ＡＤＡアッセイは、ＮＡＢアッセイである。このような場合には、バイオアッセイは、生成物の作用機構と関連するものとし、それ以外のアッセイは、ＮＡＢの、臨床薬理学に対する効果について有用ではないであろう。好ましい実施形態では、細胞ベースのＮＡＢを、本開示の治療レジメンの特色とする。細胞ベースの中和アッセイが実施可能／利用可能でない場合、競合リガンド結合アッセイまたは代替法が適する場合がある。しかし、これらを使用する場合、アッセイは、適切な形で、中和能／力を裏付けることが好ましい。
【０２８２】
ＡＤＡ応答の直接的な測定に加えて、免疫細胞の活性化のレベルはまた、抗体応答の発達の尺度としても査定することができる。免疫細胞の活性化のレベルは、細胞表面活性化マーカーを発現させる細胞の検出により典型的に評価される、活性化免疫細胞集団の頻度、または免疫細胞の活性化を指し示す、１もしくは複数のサイトカインの産生レベルなど、当技術分野で確立された、免疫細胞の活性化を評価するための、本質的に任意の方法により査定することができる。一実施形態では、免疫細胞の活性化は、Ｂ細胞の活性化であり、この場合、Ｂ細胞の活性化のレベルを、脾臓のＢ細胞集団にわたる活性化Ｂ細胞の頻度など、活性化Ｂ細胞の頻度を測定することにより決定する。当技術分野では、Ｂ細胞の活性化を指し示すＢ細胞表面マーカーが周知である（例えば、Ｍａｄｄａｌａｙ，  Ｒ．ら（２０１０年）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８４巻：４８８３〜４８９４頁を参照されたい）。一実施形態では、Ｂ細胞の活性化を、ＣＤ１９＋ＣＤ８６＋ＣＤ６９＋Ｂ細胞の頻度により決定する。別の実施形態では、免疫細胞の活性化は、Ｂ細胞の活性化であり、この場合、Ｂ細胞の活性化のレベルを、例えば、処置される被験体の血清中の、インターロイキン６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、またはインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の分泌など、サイトカインの分泌により決定する。一実施形態では、Ｂ細胞の活性化を、例えば、処置される被験体の血清中の、ＩＬ−６の分泌により決定する。他の実施形態では、低減または阻害される、望ましくないサイトカインの産生は、例えば、処置される被験体の血清中の、インターロイキン６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、またはインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の産生である。別の実施形態では、低減または阻害される、望ましくないサイトカインの産生は、インターロイキン６（ＩＬ−６）の産生である。
【０２８３】
医薬組成物の投与
本開示の、１または複数のＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡを含む医薬組成物は、任意の適する経路により、被験体へと投与することができる。一部の実施形態では、本開示の組成物を、非経口経路（例えば、皮下注射法、皮内（ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ）注射法、静脈内注射法、腹腔内注射法、筋内注射法、関節内注射法、動脈内注射法、滑膜内注射法、胸骨下（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）注射法、髄腔内注射法、病変内注射法、または頭蓋内注射法、ならびに任意の適する注入法）、経口経路、経皮経路または皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）経路、皮間経路、直腸内経路、膣内経路、局所経路（例えば、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、および／またはドロップ）、経粘膜経路、経鼻経路、口腔内経路、腸内経路、硝子体内経路、腫瘍内経路、舌下経路、鼻腔内経路を含む、様々な経路のうちの１または複数により；気管内点滴、気管支内点滴、および／または吸入により；経口スプレーおよび／もしくは経口粉末、経鼻スプレー、および／もしくは経鼻エアゾールとして、ならびに／または門脈カテーテルを介して投与する。一部の実施形態では、組成物は、静脈内投与、筋内投与、皮内投与、動脈内投与、腫瘍内投与、皮下投与、または吸入により投与することができる。しかし、本開示は、薬物送達についての科学の起こりうる進歩を考慮して、任意の適切な経路による、本開示の組成物の送達を包摂する。一般に、最も適切な投与経路は、１または複数のｍＲＮＡを含む医薬組成物の性格（例えば、血流および消化管など、多様な体内環境におけるその安定性）、および患者の状態（例えば、患者が、特定の投与経路を忍容することが可能であるのかどうか）を含む、様々な因子に依存するであろう。一実施形態では、組成物を、非経口的に投与する。別の実施形態では、組成物を、静脈内投与する。別の実施形態では、組成物を、腫瘍内投与する。
【０２８４】
ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、所与の用量中、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ（１ｍｇ／ｋｇの用量は、被験体の体重１ｋｇ当たり、１ｍｇのｍＲＮＡまたはナノ粒子をもたらす）を送達するのに十分な投与量レベルで投与することができる。特定の実施形態では、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの用量の、本開示のｍＲＮＡまたはナノ粒子を投与することができる。特定の実施形態では、約０．００２ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇの用量の、本開示のｍＲＮＡまたはナノ粒子を投与することができる。特定の実施形態では、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．２ｍｇ／ｋｇの用量の、本開示のｍＲＮＡまたはナノ粒子を投与することができる。
【０２８５】
投与は、所望のｍＲＮＡレベル、発現、および／または効果（例えば、治療効果）を得るように、同じ量または異なる量で、毎日１回または複数回にわたり実施することができる。所望の投与量を、例えば、毎日３回、毎日２回、毎日１回、隔日、３日ごと、毎週、隔週、３週間ごと、または４週間ごとに送達することができる。ある特定の実施形態では、複数回にわたる投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、またはそれよりも多い回数にわたる投与）を使用して、所望の投与量を送達することができる。一部の実施形態では、単回投与は、例えば、手術の前もしくは後、または急性の疾患、障害、もしくは状態の場合に実施することができる。
【０２８６】
任意の特定の患者に特異的な、治療的に有効な用量レベル、予防的に有効な用量レベル、またはそれ以外の適切な用量レベルは、存在する場合、処置される障害の重症度および識別；援用される、１または複数のｍＲＮＡ；援用される具体的組成物；患者の年齢、体重、全般的な健康、性別、および摂食；援用される具体的な医薬組成物の、投与回数、投与経路、および排出速度；処置の持続期間；援用される具体的な医薬組成物と組み合わせて、または同時に使用される薬物；および医療技術分野で周知の同様の因子を含む、様々な因子に依存するであろう。
【０２８７】
一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、別の薬剤、例えば、別の治療剤、予防的薬剤、および／または診断的薬剤と組み合わせて投与することができる。「〜と組み合わせた」とは、薬剤を同時に投与し、かつ／または送達のために併せて製剤化しなければならないことを含意するように意図するものではないが、これらの送達法も、本開示の範囲内にある。例えば、１または複数の異なるｍＲＮＡを含む、１または複数の組成物は、組み合わせて投与することができる。組成物は、１または複数の、他の所望の治療薬または医療手順と共時的に投与することもでき、これらの前に投与することもでき、これらに後続して投与することもできる。一般に、各薬剤は、その薬剤について決定された、用量および／または時間スケジュールで投与する。一部の実施形態では、本開示は、それらのバイオアベイラビリティーを改善し、それらの代謝を低減および／もしくは修飾し、それらの排出を阻害し、かつ／またはそれらの体内の分布を改変する薬剤と組み合わせた、本開示の組成物、またはイメージング用組成物、診断用組成物、もしくは予防用組成物の送達を包摂する。
【０２８８】
本開示の組成物と組み合わせて投与しうる、例示的な治療剤は、細胞傷害剤、化学療法剤、および他の治療剤を含むがこれらに限定されない。細胞傷害剤は、例えば、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、メイタンシノイド、ラシェルマイシン、およびこれらの類似体を含みうる。放射性イオンもまた、治療剤として使用することができ、例えば、放射性ヨウ素、ストロンチウム、リン、パラジウム、セシウム、イリジウム、コバルト、イットリウム、サマリウム、およびプラセオジムを含みうる。他の治療剤は、例えば、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、および５−フルオロウラシル、およびデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロランブシル、ラシェルマイシン、メルファラン、カルムスチン、ロムスチン、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）、およびシスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシンおよびドキソルビシン）、抗生剤（例えば、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン）、および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、およびメイタンシノイド）を含みうる。
【０２８９】
組合せレジメンを援用する、治療（治療薬または手順）の特定の組合せは、所望の治療薬および／または手順、ならびに達成される所望の治療効果に対する適合性を考慮に入れる。また、援用される治療が、同じ障害に所望の効果を達成する場合もあり（例えば、がんを処置するために有用な組成物は、化学療法剤と共時的に投与しうる）、異なる効果（例えば、任意の有害作用の制御）を達成する場合もあることも察知されるであろう。
【０２９０】
他の実施形態
本開示は、以下の実施形態に関する。
【０２９１】
一部の態様では、本開示は、被験体における抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、被験体へと、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含み、ｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含み、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。
【０２９２】
他の態様では、本開示は、目的のポリペプチドの、被験体への反復投与後における、抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された、目的のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を静脈内投与するステップであり、ｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含み、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップとを含む方法に関する。
【０２９３】
なおさらなる態様では、本開示は、目的のポリペプチドの、被験体への反復投与後における、抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、
（ｉ）被験体へと、ＬＮＰ内に封入された、目的のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を静脈内投与するステップであり、ｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含み、
ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；
（ｉｉ）被験体に由来する試料中の抗薬物抗体のレベルを検出するステップと；
（ｉｉｉ）試料中の抗薬物抗体のレベルが低下したら、被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップと
を含む方法に関する。
【０２９４】
一部の態様では、本開示は、被験体における薬物関連毒性を低減または阻害する方法であって、被験体へと、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含み、被験体における、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性を低減または阻害するように、ｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含み、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。
【０２９５】
他の態様では、本開示は、被験体における薬物関連毒性を低減または阻害する方法であって、被験体へと、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含み、被験体における、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性を低減または阻害するように、ｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位を含み、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。
【０２９６】
前出の態様の一部の実施形態では、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性は、被験体における血球数の減少（血球減少症）である。前出の態様の他の実施形態では、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性は、被験体における自己免疫である。前出の態様のさらなる実施形態では、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性は、被験体における補体媒介作用である。前出の態様の一部の実施形態では、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性は、被験体における造血の減少である。前出の態様の他の実施形態では、薬物関連毒性は、腎毒性または肝毒性である。
【０２９７】
一部の態様では、本開示は、被験体における抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、被験体へと、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含み、ｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位を含み、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。
【０２９８】
他の態様では、本開示は、目的のポリペプチドの、被験体への反復投与後における、抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された、目的のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を静脈内投与するステップであり、ｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位を含み、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップとを含む方法に関する。
【０２９９】
なおさらなる態様では、本開示は、目的のポリペプチドの、被験体への反復投与後における、抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、
（ｉ）被験体へと、ＬＮＰ内に封入された、目的のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を静脈内投与するステップであり、ｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位を含み、
ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；
（ｉｉ）被験体に由来する試料中の抗薬物抗体のレベルを検出するステップと；
（ｉｉｉ）試料中の抗薬物抗体のレベルが低下したら、被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップと
を含む方法に関する。
【０３００】
一部の態様では、本開示は、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。
【０３０１】
前出の態様の一部の実施形態では、望ましくない免疫細胞の活性化の低減または阻害を、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠く化学修飾ｍＲＮＡの対照投与と比較して決定する。前出の態様の他の実施形態では、望ましくない免疫細胞の活性化の低減または阻害は、リンパ球の活性化の低減または阻害である。
【０３０２】
前出の態様の一部の実施形態では、リンパ球の活性化の低減または阻害は、Ｂ細胞の活性化の低減または阻害である。前出の態様の他の実施形態では、Ｂ細胞の活性化の低減または阻害を、ＣＤ１９＋ＣＤ８６＋ＣＤ６９＋Ｂ細胞の頻度により決定する。
【０３０３】
前出の態様の一部の実施形態では、望ましくない免疫細胞の活性化の低減または阻害は、サイトカイン産生の低減または阻害を引き起こす。前出の態様の一部の実施形態では、免疫細胞の活性化を、少なくとも１０％減少させる。前出の態様のさらなる実施形態では、免疫細胞の活性化を、少なくとも２５％減少させる。前出の態様の一部の実施形態では、免疫細胞の活性化を、少なくとも５０％減少させる。前出の態様の他の実施形態では、免疫細胞の活性化を、化学修飾ｍＲＮＡによりコードされる、目的のポリペプチドの発現の、対応する減少を伴わずに減少させる。
【０３０４】
一部の態様では、本開示は、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与するステップであり、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップとを含む方法に関する。
【０３０５】
他の態様では、本開示は、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の、被験体への反復投与後の被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、
（ｉ）被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与するステップであり、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、
化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；
（ｉｉ）被験体に由来する試料中の免疫細胞の活性化のレベルを検出するステップと；
（ｉｉｉ）試料中の免疫細胞の活性化のレベルが低下したら、被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップと
を含む方法に関する。
【０３０６】
前出の態様の一部の実施形態では、望ましくない免疫細胞の活性化の低減または阻害は、Ｂ細胞の活性化を低減または阻害する。前出の態様の一部の実施形態では、望ましくない免疫細胞の活性化の低減または阻害は、サイトカイン産生の低減または阻害を引き起こす。
【０３０７】
一部の態様では、本開示は、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害する方法であって、被験体へと、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、被験体における、望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。
【０３０８】
前出の態様の一部の実施形態では、望ましくないサイトカインの産生の低減または阻害を、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠く化学修飾ｍＲＮＡの対照投与と比較して決定する。前出の態様の他の実施形態では、サイトカイン産生の低減または阻害は、インターロイキン６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、またはインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の産生の低減または阻害である。前出の態様の一部の実施形態では、サイトカイン産生の低減または阻害は、インターロイキン６（ＩＬ−６）の産生の低減または阻害である。
【０３０９】
前出の態様の一部の実施形態では、サイトカイン産生を、少なくとも１０％減少させる。前出の態様の一部の実施形態では、サイトカイン産生を、少なくとも２５％減少させる。前出の態様の一部の実施形態では、サイトカイン産生を、少なくとも５０％減少させる。前出の態様の一部の実施形態では、サイトカイン産生を、化学修飾ｍＲＮＡによりコードされる、目的のポリペプチドの発現の、対応する減少を伴わずに減少させる。
【０３１０】
なおさらなる態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、反復投与後の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。
【０３１１】
一部の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与するステップであり、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップとを含む方法に関する。
【０３１２】
他の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の複数回の投与を実施された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、１回または複数回の後続の投与の実施時の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。
【０３１３】
なおさらなる態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、ｍＲＮＡの後続の投与の実施時の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。
【０３１４】
一部の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、反復投与後の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含み、ＬＮＰが、Ｂ細胞を活性化させず、かつ／またはＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しない方法に関する。
【０３１５】
他の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与するステップであり、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；被験体へと、ＬＮＰ内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップであり、被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、ＬＮＰが、Ｂ細胞を活性化させず、かつ／またはＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しないステップとを含む方法に関する。
【０３１６】
なおさらなる態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の複数回の投与を実施された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、１回または複数回の後続の投与の実施時の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含み、ＬＮＰが、Ｂ細胞を活性化させず、かつ／またはＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しない方法に関する。
【０３１７】
一部の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、ｍＲＮＡの後続の投与の実施時の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含み、ＬＮＰが、Ｂ細胞を活性化させず、かつ／またはＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しない方法に関する。
【０３１８】
他の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、反復投与後の被験体における、ＰＥＧを認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。
【０３１９】
一部の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与するステップであり、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；被験体における、ＰＥＧを認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップとを含む方法に関する。
【０３２０】
他の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の複数回の投与を実施された被験体における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、１回または複数回の後続の投与の実施時の被験体における、ＰＥＧを認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。
【０３２１】
一部の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、後続のｍＲＮＡの投与の実施時の被験体における、ＰＥＧを認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。
【０３２２】
なおさらなる態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、反復投与後の被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。
【０３２３】
一部の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与するステップであり、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップとを含む方法に関する。
【０３２４】
他の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の複数回の投与を実施された被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、１回または複数回の後続の投与の実施時の被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。
【０３２５】
一部の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、後続のｍＲＮＡの投与の実施時の被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。
【０３２６】
他の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、反復投与後の被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。
【０３２７】
なおさらなる態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与するステップであり、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップとを含む方法に関する。
【０３２８】
一部の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の複数回の投与を実施された被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、１回または複数回の後続の投与の実施時の被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。
【０３２９】
他の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、後続のｍＲＮＡの投与の実施時の被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。
【０３３０】
前出の態様の一部の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、Ｂ細胞を活性化させず、かつ／またはＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しない。前出の態様の一部の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、Ｂ細胞を活性化させない。前出の態様の一部の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、ＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しない。
【０３３１】
前出の態様の一部の実施形態では、血中クリアランスの加速化の低減または阻害を、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠く化学修飾ｍＲＮＡの対照投与と比較して決定する。前出の態様の一部の実施形態では、化学修飾ｍＲＮＡによりコードされる、目的のポリペプチドの発現の、対応する低下または阻害を伴わずに、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する。前出の態様の一部の実施形態では、２回にわたる連続投与の間の間隔は、２週間未満である。前出の態様の一部の実施形態では、２回にわたる連続投与の間の間隔は、１週間未満である。
【０３３２】
前出の態様の一部の実施形態では、ＩｇＭ分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識する。
【０３３３】
前出の態様のうちのいずれかでは、本明細書で記載されるｍｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子内に封入して、静脈内投与する。前出の態様のうちのいずれかでは、本明細書で記載されるｍｍＲＮＡを、毎週１回の注入により投与する。
【０３３４】
前出の態様のうちのいずれかでは、本明細書で記載されるｍｍＲＮＡは、５’ＵＴＲ、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレーム、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ、および連結されるヌクレオシドの３’テーリング領域を含む。一部の実施形態では、本明細書で記載されるｍｍＲＮＡは、コード領域に対して異種性である、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、本明細書で記載されるｍｍＲＮＡを全修飾する。一部の実施形態では、本明細書で記載されるｍｍＲＮＡを、特定の化学修飾のために全修飾する。
【０３３５】
前出の態様のうちのいずれかでは、本明細書で記載されるｍｍＲＮＡは、シュードウリジン（ψ）、シュードウリジン（ψ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２−チオウリジンおよび５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジンおよび５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、またはＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。
【０３３６】
前出の態様のうちのいずれかでは、本明細書で記載されるｍｍＲＮＡは、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザシュードウリジン、２−チオ−１−メチルシュードウリジン、２−チオ−５−アザウリジン、２−チオジヒドロシュードウリジン、２−チオジヒドロウリジン、２−チオシュードウリジン、４−メトキシ−２−チオシュードウリジン、４−メトキシシュードウリジン、４−チオ−１−メチルシュードウリジン、４−チオシュードウリジン、５−アザウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン、もしくは２’−Ｏ−メチルウリジン、またはこれらの組合せを含む。
【０３３７】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるｍｍＲＮＡは、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、α−チオグアノシン、もしくはα−チオアデノシン、またはこれらの組合せを含む。
【０３３８】
前出の態様のうちのいずれかでは、目的のポリペプチドは、治療用タンパク質、サイトカイン、増殖因子、抗体、または融合タンパク質である。
【０３３９】
前出の態様のうちのいずれかでは、脂質ナノ粒子は、リポソームである。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質および／またはイオン化脂質を含む。一部の実施形態では、カチオン性脂質および／またはイオン化脂質は、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡまたはＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡである。
【０３４０】
前出の態様のうちのいずれかでは、ｍｍＲＮＡは、少なくとも２つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、この場合、マイクロＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１つは、ｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位である。前出の態様のうちのいずれかでは、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位と、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６−３ｐ、ｍｉＲ−１４６−５ｐ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、およびｍｉＲ−２７からなる群から選択される、ｍｉＲに対する第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含む。
【０３４１】
前出の態様のうちのいずれかでは、化学修飾ｍＲＮＡは、５’ＵＴＲ、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレーム、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ、および連結されるヌクレオシドの３’テーリング領域を含む。
【０３４２】
前出の態様のうちのいずれかでは、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの１〜１００ヌクレオチドの中に配置する。一部の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの少なくとも５０ヌクレオチドの中に配置する。
【０３４３】
前出の態様のうちのいずれかでは、化学修飾ｍＲＮＡは、５’ＵＴＲ、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレーム、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ、および連結されるヌクレオシドの３’テーリング領域を含む。
【０３４４】
前出の態様のうちのいずれかでは、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの３０〜５０ヌクレオチドの中に配置する。一部の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの少なくとも５０ヌクレオチドの中に配置する。
【０３４５】
前出の態様のうちのいずれかでは、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、少なくとも１つのｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位を、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの３０〜５０ヌクレオチドの中に配置する。一部の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、少なくとも１つのｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位を、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの少なくとも５０ヌクレオチドの中に配置する。
【０３４６】
前出の態様のうちのいずれかでは、ｍｍＲＮＡは、５’ＵＴＲ、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレーム、少なくとも１つのｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ、および連結されるヌクレオシドの３’テーリング領域を含む。
【０３４７】
前出の態様のうちのいずれかでは、ｍｍＲＮＡは、少なくとも２つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、少なくとも２つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、この場合、マイクロＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１つは、ｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位である。一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１２６結合部位と、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６−３ｐ、ｍｉＲ−１４６−５ｐ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、およびｍｉＲ−２７からなる群から選択される、ｍｉＲに対する第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含む。一部の実施形態では、化学修飾ｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１２６結合部位およびｍｉＲ−１４２結合部位を含む。一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡ構築物は、ｍｉＲ−１２６結合部位およびｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を含む。
【０３４８】
前出の態様のうちのいずれかでは、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位である。一部の実施形態では、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位は、配列番号３に示される配列を含む。
【０３４９】
前出の態様のうちのいずれかでは、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位である。一部の実施形態では、ｍｉＲ−１２６結合部位は、配列番号２６に示される配列を含む。
【０３５０】
前出の態様のうちのいずれかでは、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１５５マイクロＲＮＡ結合部位である。一部の実施形態では、ｍｉＲ−１５５結合部位は、配列番号３５に示される配列を含む。
【０３５１】
前出の態様のうちのいずれかでは、マイクロＲＮＡ結合部位は、骨髄系細胞内で発現するマイクロＲＮＡに結合する。前出の態様のうちのいずれかでは、マイクロＲＮＡ結合部位は、形質細胞様樹状細胞内で発現するマイクロＲＮＡに結合する。前出の態様のうちのいずれかでは、マイクロＲＮＡ結合部位は、マクロファージ内で発現するマイクロＲＮＡに結合する。
【０３５２】
定義
血中クリアランスの加速化（ＡＢＣ）：本明細書で使用される「血中クリアランスの加速化」または「ＡＢＣ」は、ある特定の、外因的に投与される薬剤が、２回目およびその後の投与において、血液から急速にクリアランスされる現象を指す。
【０３５３】
〜を投与すること：本明細書で使用される「〜を投与すること」とは、組成物を、被験体または患者へと送達する方法を指す。投与法は、送達を、体内の特異的領域または系へとターゲティングする（例えば、特異的に送達する）ように選択することができる。例えば、投与は、非経口投与（例えば、皮下注射法、皮内（ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ）注射法、静脈内注射法、腹腔内注射法、筋内注射法、関節内注射法、動脈内注射法、滑膜内注射法、胸骨下注射法、髄腔内注射法、病変内注射法、または頭蓋内注射法、ならびに任意の適する注入法）、経口投与、経皮投与または皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）投与、皮間投与、直腸内投与、膣内投与、局所投与（例えば、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、および／またはドロップ）、経粘膜投与、経鼻投与、口腔内投与、腸内投与、硝子体内投与、腫瘍内投与、舌下投与、鼻腔内投与；気管内点滴、気管支内点滴、および／または吸入による投与；経口スプレーおよび／もしくは経口粉末、経鼻スプレー、および／もしくは経鼻エアゾールとしての投与、ならびに／または門脈カテーテルを介する投与でありうる。
【０３５４】
抗薬物抗体：本明細書で使用される「抗薬物抗体」または「ＡＤＡ」という用語は、被験体において存在する治療用タンパク質に対して、被験体において発生する抗体を指す。当技術分野では、古典的な抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答は、組換え治療用タンパク質の、被験体への全身投与から生じると理解される。さらに、ｍＲＮＡ治療薬に関して本明細書で使用されるＡＤＡ応答とは、本明細書で記載される動物研究において観察される抗体応答も包摂することが意図され、この場合、ｍＲＮＡ治療薬によりコードされる治療用タンパク質に結合する抗体（すなわち、ｍＲＮＡ薬によりコードされるタンパク質に対して発生する抗体）が発生した。ｍＲＮＡ薬によりコードされる治療用タンパク質に対する、このような抗体応答もまた、抗タンパク質抗体（ＡＰＡ）応答と称し、本明細書では、この用語法も、ＡＤＡ応答と互換的に使用することができる。
【０３５５】
アポトーシス：本明細書で使用される「アポトーシス」とは、プログラムされた事象の継起が細胞死をもたらす、細胞死の形態を指す。アポトーシスの顕徴は、形状の変化、細胞の収縮、カスパーゼの活性化、核および細胞質の凝縮、ならびに細胞膜のトポロジーの変更を含む。生化学的にアポトーシス性の細胞は、細胞内カルシウム濃度の増大、染色体ＤＮＡの断片化、および新規の細胞表面成分の発現により特徴付けられる。特定の実施形態では、アポトーシスを経る細胞は、ミトコンドリア外膜の透過化（ＭＯＭＰ）を経る場合がある。
【０３５６】
およそ、約：目的の、１または複数の値へと適用される場合に、本明細書で使用される「およそ」または「約」は、言明された基準値に近似の値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、そうでないことが言明されるか、または文脈からそうでないことが明らかでない限りにおいて（このような数が、可能な値の１００％を超える場合を除き）、言明された基準値に対して、いずれかの向き（基準値を超える向きまたは基準値未満の向き）において、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはこれ未満に収まる値の範囲を指す。
【０３５７】
結合抗体（ＢＡＢ）：本明細書で使用される「結合抗体」または「ＢＡＢ」とは、治療用タンパク質など、標的抗原に結合する、すなわち、これと相互作用することが可能な抗体を指す。結合抗体という用語は、中和抗体（すなわち、標的抗原に結合し、抗原の機能的活性を阻害する抗体）および非中和抗体（すなわち、標的抗原に結合するが、抗原の機能的活性を阻害しない抗体）を包摂することを意図する。
【０３５８】
がん：本明細書で使用される「がん」とは、細胞増殖の異常および／または調節不能を伴う状態である。がんという用語は、良性がんおよび悪性がんを包摂する。例示的で非限定的ながんは、副腎皮質がん、進行がん、肛門がん、再生不良性貧血、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨転移、脳腫瘍、脳がん、乳がん、小児がん、原発不明がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリーの腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間葉系腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭下咽頭がん、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺カルチノイド腫瘍、皮膚リンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、筋異形成症候群、鼻腔副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔がんおよび口腔咽頭がん、口腔肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、成人軟組織内の肉腫、皮膚の基底細胞がんおよび扁平上皮がん、黒色腫、小腸がん、胃がん、精巣がん、咽頭がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトロームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、ならびにがん処置により引き起こされる続発がんを含む。特定の実施形態では、がんは、肝がん（例えば、肝細胞癌）または結腸直腸がんである。他の実施形態では、がんは、血液ベースのがんまたは造血がんである。
【０３５９】
コンジュゲートさせた：２つまたはそれよりも多い部分との関連で使用される場合に本明細書で使用される「コンジュゲートさせた」という用語は、部分が物理的に会合するか、あるいは直接的に、または連結剤として用いられる、１もしくは複数のさらなる部分を介して、互いと接続されて、構造が使用される条件下、例えば、生理学的条件下で、部分が依然として物理的に会合しているように、十分に安定的な構造を形成することを意味する。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多い部分を、直接的な共有結合的化学的結合によりコンジュゲートさせることができる。他の実施形態では、２つまたはそれよりも多い部分を、イオン結合または水素結合によりコンジュゲートさせることができる。
【０３６０】
〜を接触させること：本明細書で使用される「〜を接触させること」という用語は、２つまたはそれよりも多い実体の間の物理的接続を確立することを意味する。例えば、細胞を、ｍＲＮＡまたは脂質ナノ粒子組成物と接触させることとは、細胞と、ｍＲＮＡまたは脂質ナノ粒子とに、物理的接続を共有させることを意味する。生物学的技術分野では、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、およびｅｘ  ｖｉｖｏのいずれにおいても、細胞を、外部の実体と接触させる方法が周知である。本開示の例示的な実施形態では、哺乳動物の細胞を、組成物（例えば、本開示の単離ｍＲＮＡ、ナノ粒子、または医薬組成物）と接触させるステップを、ｉｎ  ｖｉｖｏで実施する。例えば、生物（例えば、哺乳動物）内に配置されうる脂質ナノ粒子組成物と、細胞（例えば、哺乳動物細胞）とを接触させることは、任意の適する投与経路（例えば、生物への非経口投与であって、静脈内投与、筋内投与、皮内投与、および皮下投与を含む非経口投与）により実施することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏに存在する細胞では、組成物（例えば、脂質ナノ粒子または単離ｍＲＮＡ）と、細胞とは、例えば、組成物を、細胞の培養培地へと添加することにより接触させることができ、トランスフェクションを伴うか、これを結果としてもたらしうる。さらに、１つを超える細胞に、ナノ粒子組成物を接触させることもできる。
【０３６１】
薬物関連毒性：本明細書で使用される「薬物関連毒性」または単なる「毒性」という用語は、被験体における、ｍＲＮＡによりコードされる治療用タンパク質の発現から生じうる、望ましくないｉｎ  ｖｉｖｏ作用であって、例えば、コードされる治療用タンパク質に結合する（そして、潜在的に中和する）抗体の発生など、コードされる治療用タンパク質に対して刺激される免疫応答の結果として生じうる、望ましくないｉｎ  ｖｉｖｏ作用を指す。したがって、「薬物関連毒性」という用語は、コードされた治療用タンパク質に対する望ましくない免疫応答から生じる、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける有害作用であって、血液学的作用（例えば、血液毒性）、腎作用、自己免疫作用、肝作用などを含むがこれらに限定されない有害作用を包摂することを意図する。
【０３６２】
〜を封入する：本明細書で使用される「〜を封入する」という用語は、囲い込むか、取り囲むか、または包み込むことを意味する。一部の実施形態では、化合物、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、または他の組成物を、十全に封入することもでき、部分的に封入することもでき、実質的に封入することもできる。例えば、一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子、例えば、リポソーム内に封入することができる。
【０３６３】
有効量：本明細書で使用される、薬剤の「有効量」という用語は、有益または所望の結果、例えば、臨床的結果をもたらすのに十分な量であり、したがって、「有効量」は、適用される文脈に依存する。例えば、がんを処置する薬剤を投与する文脈では、薬剤の有効量は、例えば、本明細書で規定される通り、薬剤の投与を伴わずに得られる応答と比較して、がんの処置を達成するのに十分な量である。一部の実施形態では、治療有効量とは、送達される薬剤（例えば、核酸、治療剤、診断剤、または予防剤）の量であって、感染、疾患、障害、および／もしくは状態を患うか、またはこれらを受けやすい被験体へと投与する場合に、感染、疾患、障害、および／または状態を、処置し、これらの症状を改善し、これらを診断し、防止し、かつ／またはこれらの発症を遅延させるのに十分な量である。
【０３６４】
発現：本明細書で使用される核酸配列の「発現」とは、以下の事象：（１）ＲＮＡ鋳型の、ＤＮＡ配列からの産生（例えば、転写による）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、および／または３’末端プロセシングによる）；（３）ＲＮＡの、ポリペプチドまたはタンパク質への翻訳；および（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾のうちの１または複数を指す。
【０３６５】
同一性：本明細書で使用される「同一性」という用語は、ポリマー分子の間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）の間および／またはポリペプチド分子の間の、全体的な類縁性を指す。例えば、２つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの計算は、最適な比較を目的として、２つの配列をアライメントすることにより実施することができる（例えば、最適なアライメントのために、第１の核酸配列および第２の核酸配列の一方または両方に、ギャップを導入することができ、同一でない配列は、比較を目的として無視することができる）。ある特定の実施形態では、比較を目的としてアライメントされる配列の長さは、基準配列の長さの、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次いで、対応するヌクレオチド位置におけるヌクレオチドを比較する。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置と同じヌクレオチドにより占有されていれば、分子は、この位置において同一である。２つの配列の間の同一性パーセントとは、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要がある、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、配列により共有される、同一な位置の数の関数である。２つの配列の間の配列の比較、および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｉ部、Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．  Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４年；ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１年において記載されている方法などの方法を使用して決定することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用する、ＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）へと組み込まれた、ＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、１９８９年、４巻：１１〜１７頁）のアルゴリズムを使用して決定することができる。２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは代替的に、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ���列を使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムを使用して決定することもできる。配列の間の同一性パーセントを決定するのに一般に援用される方法は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｒｉｌｌｏ，  Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ，  Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８巻：１０７３頁（１９８８年）において開示されている方法を含むがこれらに限定されない。同一性を決定するための技法は、一般に利用可能なコンピュータプログラムにおいてコード化されている。２つの配列の間の相同性を決定する、例示的なコンピュータソフトウェアは、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２巻（１号）：３８７頁、１９８４年）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．  Ｆ．ら、Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻、４０３頁、１９９０年）を含むがこれらに限定されない。
【０３６６】
断片：本明細書で使用される「断片」とは、部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離されるか、または組換えＤＮＡ法により得られた、全長タンパク質を消化することにより得られるポリペプチドを含みうる。
【０３６７】
血液毒性：本明細書で使用される「血液毒性」という用語は、造血系において生じる毒性学的事象（例えば、薬物関連毒性から生じる）であって、血球減少症（例えば、網状赤血球減少症、血小板減少症、好中球減少症）、造血の減少、および貧血を含むがこれらに限定されない事象を指す。機構に限定されることを意図するものではないが、被験体における血液毒性は、被験体へと投与されるｍＲＮＡによりコードされる治療用タンパク質に対する免疫応答の発達であって、例えば、治療用タンパク質に対して抗体が発生する結果としての免疫応答の発達から生じる場合があり、したがって、血液毒性は、薬物関連毒性のサブセットでありうる。
【０３６８】
異種：本明細書で使用される「異種」とは、配列（例えば、アミノ酸配列、またはアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド）が通常、所与のポリペプチド内またはポリヌクレオチド内に存在しないことを指し示す。例えば、１つのタンパク質のドメインまたはモチーフに対応するアミノ酸配列は、第２のタンパク質に対して異種性でありうる。
【０３６９】
疎水性アミノ酸：本明細書で使用される「疎水性アミノ酸」とは、非帯電の非極性側鎖を有するアミノ酸である。自然発生の疎水性アミノ酸の例は、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、およびトリプトファン（Ｔｒｐ）である。
【０３７０】
単離された：本明細書で使用される「単離された」という用語は、それが会合していた（天然であれ、実験の設定下であれ）成分の少なくとも一部から分離された物質または実体を指す。単離物質は、それらが会合していた物質との関連で、変動するレベルの純度を有しうる。単離物質および／または単離実体は、それらが初期に会合していた他の成分のうちの少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれよりも多くから分離することができる。一部の実施形態では、単離薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％を超えて、または約９９％を超えて純粋である。本明細書で使用される通り、物質は、他の成分を実質的に含まない場合に「純粋」である。
【０３７１】
リポソーム：本明細書で使用される「リポソーム」とは、水性の内部を囲い込む、脂質含有膜を含む構造を意味する。リポソームは、１または複数の脂質膜を有しうる。リポソームは、単層型リポソーム（当技術分野ではまた、単層リポソームとしても公知である）および多層型リポソーム（当技術分野ではまた、多層リポソームとしても公知である）を含む。
【０３７２】
転移：本明細書で使用される「転移」という用語は、がんが、原発腫瘍として最初に生じた場所から、体内の遠隔の位置へと拡散する過程を意味する。この過程の結果として生じる続発腫瘍を、「転移」と称することができる。
【０３７３】
ｍＲＮＡ：本明細書で使用される「ｍＲＮＡ」とは、メッセンジャーリボ核酸を指す。ｍＲＮＡは、天然の場合もあり、非自然発生の場合もある。例えば、ｍＲＮＡは、１または複数のヌクレオ塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはリンカーなど、修飾構成要素および／または非自然発生の構成要素を含みうる。ｍＲＮＡは、キャップ構造、鎖終結ヌクレオシド、ステムループ、ポリＡ配列、および／またはポリアデニル化シグナルを含みうる。ｍＲＮＡは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有しうる。ｍＲＮＡの翻訳、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、哺乳動物細胞内の、ｍＲＮＡの翻訳は、ポリペプチドを産生しうる。従来、ｍＲＮＡ分子の塩基構成要素は、少なくとも１つのコード領域、５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、５’キャップ、およびポリＡ配列を含む。
【０３７４】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）：本明細書で使用される「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）」とは、遺伝子発現の転写後調節（例えば、ｍＲＮＡの切断、そのポリＡテールの短縮によるｍＲＮＡの不安定化、および／またはリボソームによる、ｍＲＮＡの、ポリペプチドへの翻訳の効率に対する干渉などの、ＲＮＡサイレンシングによって）において機能しうる、小型の非コードＲＮＡ分子である。成熟ｍｉＲＮＡは典型的に、約２２〜２３ヌクレオチド長である。
【０３７５】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）（ｍｉＲ）結合部位：本明細書で使用される「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）（ｍｉＲ）結合部位」とは、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）標的部位もしくはｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）認識部位、またはｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）が結合または会合する任意のヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位とは、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）結合の少なくとも「シード」領域が結合する、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）のヌクレオチド位置またはヌクレオチド領域を表す。「結合」は、従来のワトソン−クリック型ハイブリダイゼーション規則に従う場合もあり、ｍｉＲＮＡの、マイクロＲＮＡ部位における標的配列、またはこれに隣接する標的配列との、任意の安定的な会合を反映する場合もあることを理解されたい。ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位に言及する場合のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）配列とは、ｍｉＲＮＡ結合部位に結合するｍｉＲＮＡと相補性（例えば、部分的、実質的、または完全な（または十全な）相補性）を有すると理解されるものとする。ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位は、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）が、その対応するｍＲＮＡに対して、翻訳の制御および／または転写物安定性の制御を及ぼす場合にそうである通り、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）、例えば、内因性ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）に部分的に相補的でありうる。代替的に、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位は、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）が、その対応するｍＲＮＡに対して、転写後制御および／または翻訳の制御を及ぼす場合にそうである通り、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）、例えば、内因性ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）に十全に相補的（完全に相補的）でありうる。本開示の好ましい態様では、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位は、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）、例えば、内因性ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）に十全に相補的であり、対応するｍｉＲが発現する、例えば、内因的に発現する、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞内および／または組織内の、前記ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）を含むｍＲＮＡの切断を引き起こしうる。
【０３７６】
ｍｉＲＮＡシード：本明細書で使用されるｍｉＲＮＡの「シード」領域とは、成熟ｍｉＲＮＡの２〜８位の領域内の配列であって、典型的に、ｍｉＲＮＡ結合部位に対する完壁なワトソン−クリック型相補性を有する配列を指す。ｍｉＲＮＡシードは、成熟ｍｉＲＮＡの２〜８位または２〜７位を含みうる。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは、７ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜８）を含むことが可能であり、この場合、対応するｍｉＲＮＡ結合部位内のシード相補性部位には、ｍｉＲＮＡの１位と対面するアデニン（Ａ）がフランキングする。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは、６ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜７）を含むことが可能であり、この場合、対応するｍｉＲＮＡ結合部位内のシード相補性部位には、ｍｉＲＮＡの１位と対面するアデニン（Ａ）がフランキングする。ｍｉＲＮＡ結合部位に言及する場合のｍｉＲＮＡシード配列とは、ｍｉＲＮＡ結合部位に結合するｍｉＲＮＡのシード配列と相補性（例えば、部分的、実質的、または完全な（または十全な）相補性）を有すると理解されるものとする。
【０３７７】
修飾された：本明細書で使用される「修飾された」とは、本開示の分子状態または構造の変化を指す。分子は、化学的修飾、構造的修飾、および機能的修飾を含む多くの方式で修飾することができる。一実施形態では、本開示のｍＲＮＡ分子は、例えば、天然リボヌクレオチドであるＡ、Ｕ、Ｇ、およびＣに関する場合の通り、非天然ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの導入により修飾する。キャップ構造など、非カノニカルのヌクレオチドも、リボヌクレオチドであるＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕの化学的構造とは異なるが、「修飾された」と考えられる。
【０３７８】
ナノ粒子：本明細書で使用される「ナノ粒子」とは、約１０００ｎｍ未満のスケールで、任意の１つの構造特色を有する粒子であって、同じ材料のバルク試料と比較して、新規の特性を呈示する粒子を指す。規定では、ナノ粒子は、約５００ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、または約１００ｎｍのスケールで、任意の１つの構造特色を有する。規定ではまた、ナノ粒子は、約５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約２００ｎｍ、または約７０〜約１２０ｎｍのスケールでも、任意の１つの構造特色を有する。例示的な実施形態では、ナノ粒子は、約１〜１０００ｎｍのオーダーの、１または複数の大きさを有する粒子である。他の例示的な実施形態では、ナノ粒子は、約１０〜５００ｎｍのオーダーの、１または複数の大きさを有する粒子である。他の例示的な実施形態では、ナノ粒子は、約５０〜２００ｎｍのオーダーの、１または複数の大きさを有する粒子である。球形のナノ粒子は、例えば、約５０〜１００または７０〜１２０ナノメートルの間の直径を有するであろう。ナノ粒子は、その輸送および特性に関し、単位として挙動することが最も多い。ナノ粒子を、対応するバルク材料から差別化する新規の特性は典型的に、１０００ｎｍを下回るサイズスケール、または約１００ｎｍのサイズで発達するが、ナノ粒子は、例えば、楕円状粒子、管状粒子などでは、より大きなサイズでもありうることが注目される。大半の分子のサイズは、上記の概形に当てはまるが、個々の分子は通例、ナノ粒子とは称さない。
【０３７９】
中和抗体（ＮＡＢ）：本明細書で使用される「中和抗体」または「ＮＡＢ」は、標的抗原（治療用タンパク質など）に結合し（すなわち、これと相互作用し）、抗原の少なくとも１つの機能的活性を阻害することが可能な抗体を指す。中和抗体の、その標的抗原への結合は、抗原の少なくとも１つの機能的活性の部分的阻害を引き起こす場合もあり、抗原の少なくとも１つの機能的活性の完全な阻害を引き起こす場合もある。ある特定の場合には、中和抗体の、その標的抗原への結合は、標的抗原の全ての機能的活性の、部分的阻害を引き起こす場合もあり、完全な阻害を引き起こす場合もある。
【０３８０】
核酸：本明細書で使用される「核酸」という用語は、その最も広い意味で使用され、ヌクレオチドのポリマーを含む、任意の化合物および／または物質を包摂する。これらのポリマーは、ポリヌクレオチドと称することが多い。本開示の例示的な核酸またはポリヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド体、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒性ＤＮＡ、三重螺旋形成を誘導するＲＮＡ、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックト核酸（β−Ｄ−リボ立体配置を有するＬＮＡ、α−Ｌ−リボ立体配置を有するα−ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’−アミノ官能化を有する２’−アミノＬＮＡ、および２’−アミノ官能化を有する２’−アミノ−α−ＬＮＡを含むＬＮＡ）、またはこれらのハイブリッド体を含むがこれらに限定されない。
【０３８１】
患者：本明細書で使用される「患者」とは、処置を求めるかまたは必要としうる被験体、処置を要請する被験体、処置を受けつつある被験体、処置を受ける被験体、または特定の疾患または状態について訓練された従事者によるケア下にある被験体を指す。特定の実施形態では、患者は、ヒト患者である。
【０３８２】
薬学的に許容される：本明細書では、「薬学的に許容される」という語句を、健全な医療判断の範囲内にあり、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適し、妥当な有益性／危険性比に見合う、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すように援用する。
【０３８３】
薬学的に許容される賦形剤：本明細書で使用される「薬学的に許容される賦形剤」という語句は、本明細書で記載される化合物以外の（例えば、活性化合物を懸濁または溶解させることが可能なビヒクル）で、患者において、実質的に非毒性および非炎症性である特性を有する任意の成分を指す。賦形剤は、例えば、抗付着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング、圧縮補助剤、崩壊剤、色素（着色剤）、軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、薄膜形成剤またはコーティング、香味剤、芳香剤、流動促進剤（流動増強剤）、滑沢剤、保存剤、印字インキ、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味剤、および水和水を含みうる。例示的な賦形剤は、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、結晶質セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファデンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、滑石、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、およびキシリトールを含むがこれらに限定されない。
【０３８４】
薬学的に許容される塩：本明細書で使用される「薬学的に許容される塩」とは、開示される化合物の誘導体であって、親化合物を、既存の酸部分または塩基部分を、その塩形態へと転換することにより（例えば、遊離塩基基を、適する有機酸と反応させることにより）修飾した誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例は、アミンなど、塩基性残基の、鉱酸塩または有機酸塩；カルボン酸など、酸性残基の、アルカリ塩または有機塩などを含むがこれらに限定されない。代表的な酸添加塩は、酢酸塩（ａｃｅｔａｔｅ，  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩（ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ，  ｂｅｎｚｅｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などを含む。代表的なアルカリ塩またはアルカリ土類金属塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどのほか、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン塩、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むがこれらに限定されない、非毒性のアンモニウム、四級アンモニウム、およびアミンカチオンを含む。本開示の薬学的に許容される塩は、例えば、非毒性の無機酸または有機酸から形成された親化合物の、従来の非毒性塩を含む。本開示の薬学的に許容される塩を、従来の化学的方法により、塩基性部分または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、このような塩は、これらの化合物の遊離酸形態または遊離塩基形態を、水中もしくは有機溶媒中、またはこれら２つの混合物中の、化学量論量の、適切な塩基または酸と反応させることにより調製することができ、一般に、エーテル、エチルアセテート、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルなどの非水性媒体が好ましい。適する塩のリストは、それらの各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９８５年、１４１８頁、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｕｓｅ、Ｐ．Ｈ．  ＳｔａｈｌおよびＣ．Ｇ．  Ｗｅｒｍｕｔｈ（編）、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００８年；ならびにＢｅｒｇｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、６６巻、１〜１９頁（１９７７年）において見出される。
【０３８５】
ポリペプチド：本明細書で使用される「ポリペプチド」または「目的のポリペプチド」という用語は、典型的に、天然で（例えば、単離または精製された）産生される場合もあり、合成により産生することもできるペプチド結合により接続された、アミノ酸残基のポリマーを指す。
【０３８６】
被験体：本明細書で使用される「被験体」という用語は、本開示に従う組成物を、例えば、実験、診断、予防、および／または治療の目的で投与しうる、任意の生物を指す。典型的な被験体は、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長動物、およびヒトなどの哺乳動物）および／または植物を含む。一部の実施形態では、被験体は、患者でありうる。
【０３８７】
実質的に：本明細書で使用される「実質的に」という用語は、目的の特徴または特性の、全てまたはほぼ全ての広がりまたは程度を呈示する定性的条件を指す。生物学的技術分野の当業者は、生物学的現象および化学的現象が、仮にそうなるとしても、完結に至り、かつ／もしくは完全性へと進行するか、または絶対的な結果を達成もしくは回避することはまれであることを理解するであろう。したがって、本明細書では、「実質的に」という用語を、多くの生物学的現象および化学的現象に固有の完全性の潜在的欠如を捕捉するのに使用する。
【０３８８】
〜を患うこと：疾患、障害、および／または状態「を患う」個体は、疾患、障害、および／または状態の１または複数の症状を伴うか、またはこれらを提示すると診断されている。
【０３８９】
ターゲティング部分：本明細書で使用される「ターゲティング部分」とは、ナノ粒子を、特定の細胞型、組織型、および／または器官型へとターゲティングしうる、化合物または薬剤である。
【０３９０】
治療剤：「治療剤」という用語は、被験体へと投与されると、治療的、診断的、および／もしくは予防的効果を及ぼし、かつ／または所望の生物学的効果および／もしくは薬理学的効果を誘発する、任意の薬剤を指す。
【０３９１】
トランスフェクション：本明細書で使用される「トランスフェクション」という用語は、分子種（例えば、ｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド）を、細胞へと導入する方法を指す。
【０３９２】
〜を処置すること：本明細書で使用される「〜を処置すること」という用語は、特定の感染、疾患、障害、および／または状態を、部分的もしくは完全に緩和し、軽快させ、改善し、和らげ、これらの発症を遅延させ、これらの進行を阻害し、これらの重症度を低減し、かつ／またはこれらの１もしくは複数の症状もしくは特色の発生率を低減することを指す。例えば、がん「を処置すること」とは、腫瘍の生存、増殖、および／または拡大を阻害することを指す場合がある。処置は、疾患、障害、および／または状態と関連する病態を発症する危険性を減少させる目的で、疾患、障害、および／もしくは状態の徴候を呈示しない被験体、ならびに／または疾患、障害、および／もしくは状態の早期の徴候だけを呈示する被験体へと投与することができる。
【０３９３】
〜を防止すること：本明細書で使用される「〜を防止すること」という用語は、特定の感染、疾患、障害、および／または状態の、１または複数の症状または特色の発症を、部分的または完全に阻害することを指す。
【０３９４】
腫瘍：本明細書で使用される「腫瘍」とは、良性であれ、悪性であれ、組織の異常な増殖である。
【０３９５】
非修飾：本明細書で使用される「非修飾」とは、任意の方式で変化させる前の、任意の物質、化合物、または分子を指す。非修飾とは、生体分子の野生型またはナイーブ形態を指す場合もあるが、常にそうであるわけではない。分子は、各修飾分子を、後続の修飾のための、「非修飾」の出発分子として用いうる、一連の修飾を経る場合もある。
【０３９６】
同等物および範囲
当業者は、規定の実験だけを使用して、本明細書で記載される本開示に従う具体的な実施形態の多くの同等物を認識または確認することが可能であろう。本開示の範囲は、以下の記載に限定されることを意図するものではなく、付属の特許請求の範囲で明示される通りである。
【０３９７】
特許請求の範囲では、「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」などの冠詞は、反対のことが指し示されるか、またはそうでないことが文脈から明らかでない限りにおいて、１つまたは１つを超えるを意味する場合がある。反対のことが指し示されるか、またはそうでないことが文脈から明らかでない限りにおいて、群の１または複数のメンバーの間の「または」を含む、特許請求の範囲または記載は、群のメンバーのうちの１つ、１つを超えるメンバー、または全てが、所与の生成物または過程において存在するか、これにおいて援用されるか、または他の形でこれに関与性であれば満たされると考えられる。本開示は、群のうちの正確に１つのメンバーが、所与の生成物または過程において存在するか、これにおいて援用されるか、または他の形でこれに関与性である実施形態を含む。本開示は、群のメンバーのうちの１つを超えるメンバーまたは全てが、所与の生成物または過程において存在するか、これにおいて援用されるか、または他の形でこれに関与性である実施形態を含む。
【０３９８】
「〜を含むこと」という用語は、オープンであることを意図し、さらなる要素またはステップの包含を許容するが要請はしない。したがって、本明細書で、「〜を含むこと」という用語を使用する場合、「〜からなること」という用語もまた、包摂され、開示される。
【０３９９】
範囲を与える場合、端点を含む。さらに、そうでないことが指し示されるか、またはそうでないことが文脈および当業者の理解から明らかでない限りにおいて、範囲として表される値は、本開示の異なる実施形態で言明される範囲内の、文脈によりそうでないことが明確に指示されない限りにおいて、範囲の下限の単位の１０分の１までの、任意の具体的な値または部分範囲を仮定しうることを理解されたい。
【０４００】
全ての引用される情報源、例えば、参考文献、刊行物、データベース、データベース項目、および本明細書で引用される技術は、引用時に明示的に言明されない場合であってもなお、参照により本出願へと組み込まれる。引用される情報源の言明と本出願の言明とで齟齬が生じる場合は、本出願における言明を是とする。
【実施例】
【０４０１】
本開示は、以下の実施例を参照することにより、より十分に理解されるであろう。しかし、これらの実施例は、本開示の範囲を限定するとはみなされないものとする。本明細書で記載される実施例および実施形態は、例示だけを目的とするものであり、当業者には、それに照らした多様な改変または変化が示唆され、本出願の精神および権限内、ならびに付属の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが理解される。
【０４０２】
（実施例１）
ｈＥＰＯをコードする修飾ｍＲＮＡは、非ヒト霊長動物において、抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を誘発する
本実施例では、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）をコードするが、ｍｉＲ結合部位を欠く修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を、４週間の研究において、カニクイザルへと投与して、動物におけるｈＥＰＯの発現について検討した。
【０４０３】
ｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡを、５０％のＭＣ３、１０％のＤＳＰＣ、３８．５％のコレステロール、１．５％のＰＥＧ−ＤＭＧを含み、Ｎ：Ｐを約５．５とする（値は、モル％に基づく）、ＭＣ３脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）へと製剤化した。ｍｍＲＮＡ構築物は、Ｃａｐ  １である５’キャップ構造（７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ）を含有し、５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで全修飾され、１４０ヌクレオチドのポリＡテールを含んだ。ｍｍＲＮＡ構築物は、ｍｉＲ結合部位のいずれの挿入の存在も欠いた。ｍｉＲ結合部位のいずれの挿入も伴わない、このｈＥＰＯコード構築物のヌクレオチド配列を、配列番号７に示す（ポリＡテールは示さない）。
【０４０４】
研究は、７つの動物群を含んだ。陰性対照群は、ＰＢＳで処置した。３つの処置群を、投与１回当たり０．０２ｍｇ／ｋｇ、投与１回当たり０．１ｍｇ／ｋｇ、または投与１回当たり０．２ｍｇ／ｋｇの、３つの異なる用量のｈＥＰＯコードｍｍＲＮＡ  ＬＮＰのうちの１つで処置した。低用量を、ヒトＥＰＯの治療有効曝露量の少なくとも２倍を達成するように選択する一方で、高用量は、治療有効用量の、少なくとも１０倍のｈＥＰＯ曝露レベルを達成するように選択した。陽性対照群は、用量を６０００Ｕ／ｋｇとする組換えｈＥＰＯタンパク質で処置した。他の２つの対照群は、非関与性のｍｍＲＮＡ（非翻訳ｍＲＮＡ形態）を含有するＬＮＰ、またはＬＮＰ単独で処置した。投与スケジュールは、ＩＶ注入による、毎週１回、連続４週間（のべ５回にわたる投与）であった。注入は、ポンプを介して６０分間（ＩＶ）にわたった。４週間の投与期間に、４週間の回収査定期間（対照および高用量だけ）を後続させた。
【０４０５】
カニクイザルにおけるｈＥＰＯの発現レベルは、処置日の各々（１、８、１５、２２、および２９日目）の、注入の６時間後において、ＥＬＩＳＡにより測定した。結果を、図１に示す。結果は、低用量のｍｍＲＮＡ（投与１回当たり０．０２ｍｇ／ｋｇ）で処置されたカニクイザルが、治療有効レベルのｈＥＰＯを呈示し、これが、４週間にわたる研究を通して、ほぼ同じレベルで維持されたことを裏付ける。これに対し、中用量および高用量のｍｍＲＮＡ（投与１回当たり０．１ｍｇ／ｋｇおよび投与１回当たり０．２ｍｇ／ｋｇ）で処置されたカニクイザルでは、ＥＰＯレベルは、研究の８〜１５日目の間から低下し、研究の持続期間にわたり、低レベルを維持した。網状赤血球数は、中用量および高用量のｍｍＲＮＡ（投与１回当たり０．１ｍｇ／ｋｇおよび投与１回当たり０．２ｍｇ／ｋｇ）で処置された動物における、網状赤血球減少症の遷延を明らかにした。さらに、組織学的解析も、中用量または高用量のｍｍＲＮＡで処置された動物の骨髄中の造血の減少を明らかにした。高用量のｍｍＲＮＡで処置された動物における、網状赤血球減少症および造血の減少は、動物において、抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答が時間経過にわたり発達していることを示唆した。
【０４０６】
ヒトＥＰＯに対するＡＤＡ応答が存在したのかどうかを決定するために、動物に由来する血清に対して、ＥＬＩＳＡを実施して、カニクイザル抗ヒトＥＰＯ抗体の存在を検出した。血液を、大腿部静脈穿刺により回収し、血清を、室温で回収し、少なくとも３０分間にわたり凝固させた後で、低温（４℃）遠心分離機内、２７００ｒｐｍで、１０分間にわたり遠心分離にかけた。血清中で抗ヒトＥＰＯ  ＩｇＧを検出するために、標準的なＥＬＩＳＡ法を使用した。試料は、二連で解析した。
【０４０７】
一連の陰性対照結果を使用して、それを上回るレベルが、アッセイにおける「陽性」結果を構成する、閾値レベルを確立した。陰性対照試料についての代表的な定量的ＥＬＩＳＡ結果であって、閾値レベルを設定するのに使用されたＥＬＩＳＡ結果を、下記の表３に示す。
【表３】
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【０４０８】
研究において使用した、７つの異なる動物群についてのＥＬＩＳＡ結果を、下記の表４に示す。
【表４】
2018529738.tif 000011
【０４０９】
結果は、最高用量のｈＥＰＯコードｍｍＲＮＡ（投与１回当たり０．２ｍｇ／ｋｇ）で処置されたカニクイザルの全て、および中レベルの用量（投与１回当たり０．１ｍｇ／ｋｇ）で処置されたカニクイザルのうちの５０％が、ヒトＥＰＯに対するＡＤＡ応答を呈示したことを裏付ける。これは、予測外の知見であり、このために、本発明者らは、非ヒト霊長動物において、コードされるタンパク質に対するＡＤＡ応答を低減しようと試みるのに、さらなるｍｍＲＮＡ構築物をデザインし、これらについて調べた。これらの研究の結果を、実施例２に記載する。
【０４１０】
（実施例２）
ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位の、ｍｍＲＮＡへの組込みは、コードされるタンパク質に対するＡＤＡ応答を阻害する
本実施例では、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を、構築物の３’ＵＴＲへと組み込む、ヒトＥＰＯコードｍｍＲＮＡ構築物を調製した。ｍｍＲＮＡ構築物は、Ｃａｐ  １である５’キャップ（７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ）を含み、５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで全修飾され、およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールを含んだ。構築物の概略図を、図２に示す。このヒトＥＰＯコードｍｍＲＮＡのヌクレオチド配列を、配列番号１（ポリＡテールを伴わない）に示す。ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を含む３’ＵＴＲのヌクレオチド配列を、配列番号２に示す。ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位のヌクレオチド配列を、配列番号３に示す。ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位の付加以外では、ｍｍＲＮＡ構築物およびＬＮＰ調製物は、実施例１のものと同じであった。
【０４１１】
カニクイザルを、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を伴うｈＥＰＯコードｍｍＲＮＡをＬＮＰ中に含む構築物で、用量を１日当たり０．２ｍｇ／ｋｇとして処置した。この用量は、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を欠く構築物を使用して、ｈＥＰＯに対するＡＤＡ応答を誘発することが既に示されていた（実施例１を参照されたい）。実施例１で記載した通り、動物を、１、８、１５、２２、および２９日目において処置する、４週間にわたる研究を行った。静脈内注入（６０分間）は、上腕静脈または伏在静脈への、一時的なカテーテル留置を介して施した。
【０４１２】
ｈＥＰＯに対するＡＤＡ応答が、動物において誘発されたのかどうかを検討するために、実施例１で記載した通りに、動物に由来する血清に対して、ＥＬＩＳＡを実施して、カニクイザル抗ヒトＥＰＯ抗体の存在を検出した。
【０４１３】
用量を０．２ｍｇ／ｋｇとする処置についての、５つの時点の各々における、４匹の動物（１３０１、１３０２、１３０３、および１３０４）の結果を、下記の表５に示す。「陰性」または「陽性」としての試料の状態は、実施例１で記載した通り、陰性対照試料についての結果に基づき設定された閾値と比べて決定した。
【表５】
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【０４１４】
結果は、処置されたサル（１３０３）４匹のうちの１匹だけが、ｈＥＰＯに対するＡＤＡ応答を呈示することを示した。したがって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を、ｈＥＰＯコードｍｍＲＮＡ構築物へと組み込んだところ、高用量（０．２ｍｇ／ｋｇ）の構築物で処置された動物のうちの２５％だけが、コードされるタンパク質に対するＡＤＡを呈示した（表５）のに対し、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を欠く構築物を使用する、同じ用量による処置は、１００％の動物が、コードされるタンパク質に対するＡＤＡを呈示する結果をもたらした（表４）。
【０４１５】
図３は、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を欠く０．２ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡ構築物で処置されたサルについてのＥＬＩＳＡ結果と、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を含有する０．２ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡ構築物で処置されたサルについてのＥＬＩＳＡ結果との比較を示し、動物における抗ｈＥＰＯ抗体のレベルを、時間経過にわたり示す。抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を呈示する動物が指し示される。結果は、ｍｉＲ結合部位を欠く構築物で処置された動物では、ｍｉＲ結合部位を含有する構築物と比較して、著明に大きなＡＤＡ応答が観察されたことを明確に裏付ける。
【０４１６】
カニクイザルにおける追跡研究でも、上記で記載したパイロット研究と全く同様の結果が観察された。ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を欠くｈＥＰＯコードｍｍＲＮＡ構築物の投与は、１００％の動物が、コードされるタンパク質に対するＡＤＡを呈示する結果をもたらしたが、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位の、構築物への組込みは、５０％の動物だけが、コードされるタンパク質に対するＡＤＡを呈示する結果をもたらした。３つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位の、構築物への組込みが、効果の増強をもたらさなかったことから、単一のｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位が、コードされるタンパク質に対するＡＤＡの低減に十分であることが裏付けられる。
【０４１７】
したがって、これらの結果は、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位の、ｍｍＲＮＡ構築物への組込みが、コードされるタンパク質に対するＡＤＡ応答の低減または消失に有効であることを裏付ける。
【０４１８】
（実施例３）
ｍｉＲ−１２６結合部位またはｍｉＲ−１４２結合部位の、ｍｍＲＮＡへの組込みは、Ｂ細胞の活性化およびサイトカインの発現を阻害する
本実施例では、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位もしくはｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位、またはｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位およびｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲへと組み込む、ヒトＥＰＯコードｍｍＲＮＡ構築物を調製した。ｍｍＲＮＡ構築物を、マウスへと投与して、ｍｉＲ結合部位を組み込むことの、マウスにおける多様な免疫パラメータに対する効果を検討した。
【０４１９】
ｍｍＲＮＡ構築物は、Ｃａｐ  １である５’キャップ構造（７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ）を含有し、５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで全修飾され、１４０ヌクレオチドのポリＡテールを含んだ。対照ｍｍＲＮＡ構築物は、ｍｉＲ結合部位のいずれの挿入の存在も欠いた。ｍｉＲ結合部位のいずれの挿入も伴わない、この対照ｈＥＰＯコード構築物のヌクレオチド配列を、配列番号７に示す（ポリＡテールは示さない）。ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を挿入したｈＥＰＯコード構築物のヌクレオチド配列を、配列番号１に示す（ポリＡテールは示さない）。ｍｉＲ−１２６−３ｐ部位を挿入したｈＥＰＯコード構築物のヌクレオチド配列を、配列番号２８に示す（ポリＡテールは示さない）。ｍｉＲ−１４２−３ｐ部位、およびｍｉＲ−１２６−３ｐ部位を挿入したｈＥＰＯコード構築物のヌクレオチド配列を、配列番号２９に示す（ポリＡテールは示さない）。例示的なｍｍＲＮＡ構築物の概略図を、図２に示す。ｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡ構築物を、５０％のＭＣ３、１０％のＤＳＰＣ、３８．５％のコレステロール、１．５％のＰＥＧ−ＤＭＧを含み、Ｎ：Ｐを約５．５とする（値は、モル％に基づく）、ＭＣ３脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）へと製剤化した。
【０４２０】
初期研究では、マウス３０匹ずつの群を、以下の処置群：（ｉ）いずれのｍｉＲ結合部位も伴わないｈＥｐｏ構築物；（ｉｉ）ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を伴うｈＥｐｏ構築物；（ｉｉｉ）ｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位を伴うｈＥｐｏ構築物；および（ｉｖ）ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位およびｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位を伴うｈＥｐｏ構築物へと割り当てた。ｍｍＲＮＡを、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスへと、０．０５ｍｇ／ｋｇの用量で、静脈内投与した。投与レジメンは、１、８、１５、２２、２９、および３６日目であった。各処置群について、群１つ当たり５匹ずつのマウスに、各投与日に、合計６回の投与を実施した。各群内でさらに２５匹のマウスを、５匹ずつのマウスに、８、１５、２２、２９、および３６日目の投与の各々において１回ずつで、マウス１匹当たり合計１回ずつ投与するように、５つのサブセットに分けた。
【０４２１】
処置後、マウスを、（ｉ）ｈＥｐｏ（ｎｇ／ｍｌ単位の）を測定することによる、ｍｍＲＮＡ構築物からのタンパク質発現、（ｉｉ）脾臓ＣＤ１９＋細胞％を測定することによる、Ｂ細胞の頻度、および（ｉｉｉ）脾臓ＣＤ１９＋細胞中の、活性化ＣＤ１９＋細胞％を測定することによる、活性化Ｂ細胞の頻度について検討した。これらの３つのリードアウトの結果を、それぞれ、図４Ａ、Ｂ、およびＣに示す。この初期研究からの結果は、単独または組合せの、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位またはｍｉＲ−１２６結合部位の、ｍｍＲＮＡ構築物への組入れにより、タンパク質の発現に感知可能な差違は見られなかったが、単独で、またはｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位と組み合わせた、ｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位の組入れにより、わずかであるが、統計学的に有意な、Ｂ細胞の活性化の減少が観察されることを裏付けた。
【０４２２】
この初期観察についてさらに研究するために、ｍｍＲＮＡ構築物について、高用量（最高の感度をもたらすように）で、かつ、群１つ当たりのマウスの数を増大させて（統計学的信頼性を増大させるように）調べるように、第２のセットの実験を行った。投与量レジメンは、１および８日目であった。群１つ当たり１２匹ずつのマウスに、１日目に、０．２ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇの、上記で記載した４つの異なるｍｍＲＮＡ構築物（ｈＥｐｏ；ｈＥｐｏ＋ｍｉＲ−１４２−３ｐ；ｈＥＰＯ＋ｍｉＲ−１２６−３ｐ；またはｈＥｐｏ＋ｍｉＲ−１４２−３ｐ／ｍｉＲ−１２６−３ｐ）であって、ＭＣ３  ＬＮＰ中で製剤化したｍｍＲＮＡ構築物のうちの１つを、静脈内投与した。１日目における投与の６時間後に、Ｅｐｏ  ＥＬＩＳＡによるタンパク質レベルの発現についての解析のために、血清を回収した。また、１日目における投与の６時間後に、Ｂ細胞の解析のために、マウスのうちの６匹から、脾臓も採取した。８日目に、残りの群１つ当たり６匹ずつのマウスに再度投与した後、さらなる解析のために、投与の６時間後に、血清の回収および脾臓の採取を行った。
【０４２３】
タンパク質発現についての結果を、図５Ａ〜Ｂ（１回の投与について、図５Ａにおける０．２ｍｇ／ｋｇ、または図５Ｂにおける１ｍｇ／ｋｇ）、および図６Ａ〜Ｂ（２回の投与について、図６Ａの０．２ｍｇ／ｋｇ、または図６Ｂの１ｍｇ／ｋｇ）に示す。結果は、ｍｍＲＮＡ構築物によりコードされる目的のタンパク質の発現のレベルが、ｍｉＲ結合部位（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、またはこれらの両方）の、構築物への組入れの著明な影響を受けないことを裏付けた。タンパク質の発現は、研究の６週目まで、さらにモニタリングした。発現は、４週目までに低減され、５週目における発現は、ほぼベースラインまで低減された（データは示さない）。６週目に、対照群内のほぼ全てのマウスが、発現を欠いたのに対し、ｍｉＲ結合部位の、ｍＲＮＡ構築物（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、またはこれらの両方）への組入れは、著明な発現レベルを維持した（図２９）。
【０４２４】
単回投与による処置の、Ｂ細胞の頻度および活性化Ｂ細胞の頻度についての結果を、それぞれ、図７および８に示す。２回の投与による処置の、Ｂ細胞の頻度および活性化Ｂ細胞の頻度についての結果を、それぞれ、図９および１０に示す。これらの結果は、全Ｂ細胞頻度は、ｍｉＲの、ｍｍＲＮＡ構築物への組入れの著明な影響を受けないが、Ｂ細胞の活性化が、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位の存在下でわずかに減少し、ｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位（単独の、またはｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位と組み合わせた）の存在により、著明に低減されることを示した。Ｂ細胞の頻度および活性化Ｂ細胞の頻度を、研究の６週目まで毎週測定し、研究の経過を通して、同様の結果であって、全Ｂ細胞の頻度は、ｍｉＲ結合部位の組入れの著明な影響を受けないが、活性化Ｂ細胞の頻度は、単独のｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位もしくはｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位、または両方のｍｉＲ結合部位の組合せの存在により阻害される結果を観察した。
【０４２５】
１回の投与で処置されたマウスの、ＩＬ−６の発現についての結果を、図１１Ａ〜Ｂ（図１１Ａの０．２ｍｇ／ｋｇ、および図１１Ｂの１ｍｇ／ｋｇ）に示し、２回の投与で処置されたマウスについての結果を、図１２Ａ〜Ｂ（図１２Ａの０．２ｍｇ／ｋｇ、および図１２Ｂの１ｍｇ／ｋｇ）に示す。これらの結果は、ＩＬ−６の発現が、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位の存在下で減少し、ｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位（単独の、またはｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位と組み合わせた）の存在により、なおさらに低減されることを裏付ける。
【０４２６】
ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γのレベルならびにＩＬ−６のレベルを測定することにより、サイトカインの発現もさらに検討した。０．２ｍｇ／ｋｇの２回の投与で処置されたマウスの、これらの３つのサイトカインについての結果を、図１３Ａ（ＩＬ−６）、１３Ｂ（ＴＮＦ−α）、および１３Ｃ（ＩＦＮ−γ）に示し、１ｍｇ／ｋｇの２回の投与で処置されたマウスについての結果を、図１４Ａ（ＩＬ−６）、１４Ｂ（ＴＮＦ−α）、および１４Ｃ（ＩＦＮ−γ）に示す。これらの結果は、３つのサイトカイン（ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ）全ての発現が、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位の存在下で減少し、ｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位（単独の、またはｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位と組み合わせた）の存在により、なおさらに低減されることを裏付ける。
【０４２７】
サイトカインの発現を、研究の６週目まで、毎週、さらにモニタリングしたところ、血清中の３つのサイトカインである、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−α全てのレベルが、単独のｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位もしくはｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位、または両方のｍｉＲ結合部位の組合せの、ｍＲＮＡ構築物内の存在により著明に阻害されることが裏付けられた。
【０４２８】
したがって、上記で記載した研究は、ｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、または両方のｍｉＲ結合部位の組合せの、ｍＲＮＡ構築物への組込みが、ｍＲＮＡ構築物で処置された動物のｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、Ｂ細胞の活性化の頻度の低減、および異なる免疫刺激性サイトカインのパネル（ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ）の分泌の低減を結果としてもたらす一方で、処置された動物において、ｍＲＮＡ構築物によりコードされる目的のタンパク質の発現に対して及ぼす影響が最小限であることを裏付ける。
【０４２９】
（実施例４）
ｍｉＲ−１２６結合部位および／またはｍｉＲ−１４２結合部位を、ｍｍＲＮＡ構築物へと組み込む、さらなる研究
本実施例では、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位もしくはｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位、またはｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位およびｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲへと組み込む、ルシフェラーゼコードｍｍＲＮＡ構築物を調製した。ｍｍＲＮＡ構築物を、マウスへと投与して、ｍｉＲ結合部位を組み込むことの、マウスにおける多様な免疫パラメータに対する効果を検討した。ｍｍＲＮＡ構築物は、Ｃａｐ  １である５’キャップ構造（７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ）を含有し、５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで全修飾され、１００ヌクレオチドのポリＡテールを含んだ。対照ｍｍＲＮＡ構築物は、いずれの公知のｍｉＲ結合部位の存在も欠いた。ルシフェラーゼ  （Ｌｕｃ）をコードするｍｍＲＮＡ構築物を、５０％のＭＣ３、１０％のＤＳＰＣ、３８．５％のコレステロール、１．５％のＰＥＧ−ＤＭＧを含み、Ｎ：Ｐを約５．５とする（値は、モル％に基づく）、ＭＣ３脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）へと製剤化した。
【０４３０】
初期研究では、マウス２４匹ずつの群を、以下の処置群：（ｉ）いずれのｍｉＲ結合部位も伴わないルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）構築物（その配列を、配列番号３０に示す）；（ｉｉ）ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を伴うＬｕｃ構築物（その配列を、配列番号３１に示す）；（ｉｉｉ）ｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位を伴うＬｕｃ構築物（その配列を、配列番号３２に示す）；および（ｉｖ）ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位およびｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位を伴うＬｕｃ構築物（その配列を、配列番号３３に示す）へと割り当てた。ｍｍＲＮＡを、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスへと、０．２ｍｇ／ｋｇの用量で、静脈内投与した。各群において、１５匹のマウスを、１、８、１５、２２、２９、および３６日目に投与するように選択し、３匹のマウスには、２２日目に１回だけ投与し、３匹のマウスには、３６日目に１回だけ投与した。反復投与のために選択された１５匹のマウスのうち、５匹ずつを、脾臓を回収するために、１日目における投与の６時間後、２２日目における投与の６時間後、および３６日目における投与の６時間後に屠殺した。
【０４３１】
処置後、マウスを、（ｉ）全身の発光を測定することによる、ｍｍＲＮＡ構築物からのルシフェラーゼの発現；（ｉｉ）脾臓ＣＤ１９＋細胞％を測定することによる、Ｂ細胞の頻度；（ｉｉｉ）脾臓ＣＤ１９＋細胞中の、活性化ＣＤ１９＋細胞％を測定することによる、活性化Ｂ細胞の頻度；および（ｉｖ）サイトカインの産生（ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α）について検討した。
【０４３２】
ルシフェラーゼの発現についての結果を、図１５Ａおよび１５Ｂに示す。図１５Ａは、１週目（１回の投与）後の結果を示し、図１５Ｂは、２週目（または２回の投与）後の結果を示す。Ｌｕｃのレベルは、実施例１で論じたｈＥＰＯレベルよりはるかに可変的であった。しかし、結果は、ｍｍＲＮＡ構築物によりコードされる目的のタンパク質（Ｌｕｃ）の発現のレベルが、ｍｉＲ結合部位（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、またはこれらの両方）の、構築物への組入れの著明な影響を受けないことを裏付けた。タンパク質の発現は、研究の６週目まで、さらにモニタリングした。ルシフェラーゼの発現は、６週間を通して、わずかな変化〜無変化を示した。図３０は、５週目における発現を示す。
【０４３３】
Ｂ細胞の頻度および活性化Ｂ細胞の頻度についての結果を、それぞれ、図１６および１７に示す。示される結果は、１週目（１回の投与）のものである。これらの結果は、全Ｂ細胞頻度は、ｍｉＲ結合部位の、Ｌｕｃ  ｍｍＲＮＡ構築物への組入れの著明な影響を受けないが、活性化Ｂ細胞の頻度が、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位の存在下でわずかに減少し、ｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位（単独の、またはｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位と組み合わせた）の存在により、著明に低減されることを示した。（ｉ）本発明者らは、全Ｂ細胞集団内の活性化Ｂ細胞の百分率を測定し、（ｉｉ）Ｂ細胞頻度は、群間で変動しなかったので、活性化Ｂ細胞の頻度の低減は、ＣＤ１９＋細胞の数の低減のためではなかった。Ｂ細胞の頻度および活性化Ｂ細胞の頻度を、研究の６週目まで毎週測定し、研究の経過を通して、同様の結果であって、全Ｂ細胞の頻度は、ｍｉＲ結合部位の組入れの著明な影響を受けないが、活性化Ｂ細胞の頻度は、単独のｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位もしくはｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位、または両方のｍｉＲ結合部位の組合せの存在により阻害される結果を観察した。
【０４３４】
サイトカインの発現は、血清中の、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αのレベルを測定することにより検討した。０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで処置されたマウスの、これらの３つのサイトカインについての結果を、図１８Ａ（ＩＬ−６）、１８Ｂ（ＩＦＮ−γ）、および１８Ｃ（ＴＮＦ−α）に示す。示される結果は、２週目についてのものであり、同様の結果は、１週目および３週目においても観察された。ここでもまた、Ｌｕｃで処置された動物では、実施例１で記載した、ｈＥＰＯ処置された動物と比較して、サイトカインの発現の、より大きなばらつきが観察された。しかし、これらの結果は、少なくとも一部のサイトカインの発現が、単独または組合せの、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位および／またはｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位の存在下で減少する（ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αについて最も顕著に）ことを裏付ける。サイトカインの発現を、研究の６週目まで、さらにモニタリングしたところ、血清中の３つのサイトカインである、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−α全てのレベルが、単独のｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位もしくはｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位、または両方のｍｉＲ結合部位の組合せの、ｍＲＮＡ構築物内の存在により著明に阻害されることが裏付けられた。
【０４３５】
したがって、上記で記載した研究は、ｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、または両方のｍｉＲ結合部位の組合せの、ｍＲＮＡ構築物への組込みが、ｍＲＮＡ構築物で処置された動物のｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、Ｂ細胞の活性化の頻度の低減、および異なる免疫刺激性サイトカインのパネル（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ）の分泌の低減を結果としてもたらす一方で、処置された動物において、ｍＲＮＡ構築物によりコードされる目的のタンパク質の発現に対して及ぼす影響が最小限であることを裏付ける。
【０４３６】
（実施例５）
ｍｉＲ−１４２結合部位および／またはｍｉＲ−１５５結合部位を、ｍｍＲＮＡ構築物へと組み込む、さらなる研究
本実施例では、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１５５−５ｐ結合部位、もしくはこれらの組合せ、および／またはこれらの複数のコピーを、構築物の３’ＵＴＲへと組み込む、ＥＰＯコードｍｍＲＮＡ構築物を調製した。それへの結合部位の挿入をデザインしたｍｉＲ−１５５−５ｐ配列は、以下：ｕｕａａｕｇｃｕａａｕｕｇｕｇａｕａｇｇｇｇｕ（配列番号３４）の通りである。３’ＵＴＲへと挿入されるｍｉＲ−１５５−５ｐ結合部位は、以下：ＡＣＣＣＣＴＡＴＣＡＣＡＡＴＴＡＧＣＡＴＴＡＡ（配列番号３５）の通りの配列を有する。
【０４３７】
ｍｍＲＮＡ構築物を、マウスへと投与して、ｍｉＲ結合部位を組み込むことの、マウスにおける多様な免疫パラメータに対する効果を検討した。ｍｍＲＮＡ構築物は、Ｃａｐ  １である５’キャップ構造（７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ）を含有し、５−メチルシトシンおよび１−メチルシュードウリジンで全修飾され、１００ヌクレオチドのポリＡテールを含んだ。対照ｍｍＲＮＡ構築物は、ｍｉＲ結合部位のいずれの挿入の存在も欠いた。ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡ構築物を、５０％のＭＣ３、１０％のＤＳＰＣ、３８．５％のコレステロール、１．５％のＰＥＧ−ＤＭＧを含み、Ｎ：Ｐを約５．５とする（値は、モル％に基づく）、ＭＣ３脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）へと製剤化した。
【０４３８】
この研究では、マウスを、以下の処置群：（ｉ）いずれのｍｉＲ結合部位も伴わないＥＰＯ構築物（その配列を、配列番号３６に示す）；（ｉｉ）１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を伴うＥＰＯ構築物（その配列を、配列番号３７に示す）；（ｉｉｉ）３つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を伴うＥＰＯ構築物（ＥＰＯ＿３Ｘ  ｍｉＲ−１４２−３ｐ）（その配列を、配列番号３８に示す）；（ｉｖ）１つのｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位を伴うＥＰＯ構築物（その配列を、配列番号３９に示す）；（ｖ）３つのｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位を伴うＥＰＯ構築物（ＥＰＯ＿３Ｘ  ｍｉＲ−１４２−５ｐ）（その配列を、配列番号４０に示す）；（ｖｉ）２つのｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位を伴うＥＰＯ構築物、および１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位（ＥＰＯ＿２Ｘ  ｍｉＲ−１４２−５ｐ＿１Ｘ  ｍｉＲ−１４２−３ｐ）（その配列を、配列番号４１に示す）；（ｖｉｉ）１つのｍｉＲ−１５５−５ｐ結合部位を伴うＥＰＯ構築物（その配列を、配列番号４２に示す）；（ｖｉｉｉ）３つのｍｉＲ−１５５−５ｐ結合部位を伴うＥＰＯ構築物（ＥＰＯ＿３Ｘ  ｍｉＲ−１５５）（その配列を、配列番号４３に示す）；（ｉｘ）２つのｍｉＲ−１５５−５ｐ結合部位を伴うＥＰＯ構築物、および１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位（ＥＰＯ＿２Ｘ  ｍｉＲ−１５５−５ｐ＿１Ｘ  ｍｉＲ−１４２−３ｐ）（その配列を、配列番号４４に示す）；ならびに（ｘ）非翻訳対照配列を伴うＬＮＰ（「空」）のうちの１つへと割り当てた。ｍｍＲＮＡを、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスへと、０．２ｍｇ／ｋｇの用量で、静脈内投与した。投与レジメンは、１および８日目であった。
【０４３９】
処置後、マウスを、（ｉ）コードされたＥＰＯレベル（ｎｇ／ｍｌ単位の）を測定することによる、ｍｍＲＮＡ構築物からのタンパク質発現；（ｉｉ）脾臓ＣＤ１９＋細胞％を測定することによる、全Ｂ細胞の頻度；（ｉｉｉ）脾臓ＣＤ１９＋細胞中の、活性化ＣＤ１９＋細胞％を測定することによる、活性化Ｂ細胞の頻度；および（ｉｖ）サイトカインの産生（ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α）について検討した。
【０４４０】
ＥＰＯタンパク質発現についての結果を、図１９Ａが、１週目における結果を示し、図１９Ｂが、２週目についての結果を示す、図１９Ａ〜Ｂに示す。結果は、ｍｍＲＮＡ構築物によりコードされる目的のタンパク質（ＥＰＯ）の発現のレベルが、ｍｉＲ結合部位（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、もしくはこれらの複数のコピー、および／またはこれらの組合せ）の、構築物への組入れの著明な影響を受けないことを裏付けた。
【０４４１】
Ｂ細胞の頻度および活性化Ｂ細胞の頻度についての結果を、１週目については、それぞれ、図２０および２１に示し、２週目については、それぞれ、図２２および２３に示す。これらの結果は、全Ｂ細胞頻度は、ｍｉＲの、ＥＰＯ  ｍｍＲＮＡ構築物への組入れの著明な影響を受けないが、活性化Ｂ細胞の頻度は、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１５５−５ｐ結合部位、もしくはこれらの複数のコピー、および／またはこれらの組合せの存在下で減少することを示した。
【０４４２】
サイトカインの発現は、血清中の、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γのレベルを測定することにより検討した。０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで処置されたマウスの、これらの３つのサイトカインについての結果を、図２４Ａ（ＩＬ−６）、２４Ｂ（ＴＮＦ−α）、および２４Ｃ（ＩＦＮ−γ）に示す。示される結果は、２週目についてのものである。ＥＰＯで処置された動物では、サイトカインの発現のばらつきが観察された。しかし、これらの結果は、少なくとも一部のサイトカインの発現が、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１５５−５ｐ結合部位、もしくはこれらの複数のコピー、および／またはこれらの組合せの存在下で減少することを裏付ける。
【０４４３】
したがって、上記で記載した研究は、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１５５−５ｐ結合部位、もしくはこれらの複数のコピー、および／またはこれらの組合せの、ｍＲＮＡ構築物への組込みが、ｍＲＮＡ構築物で処置された動物のｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、Ｂ細胞の活性化の頻度の低減、および異なる免疫刺激性サイトカインのパネルの分泌の低減を結果としてもたらす一方で、処置された動物において、ｍＲＮＡ構築物によりコードされる目的のタンパク質の発現に対して及ぼす影響が最小限であることを裏付ける。
【０４４４】
（実施例６）
ｍｉＲ結合部位の、特定の免疫細胞集団に対する効果
本実施例では、ｍＲＮＡ構築物への、免疫細胞内で発現するｍｉＲ結合部位（ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１２６、またはｍｉＲ−１４２＋ｍｉＲ−１２６の両方）の組入れの、特定の免疫細胞集団の頻度および活性化に対する効果について検討する研究を実施した。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、上記の実施例３で記載した、ＥＰＯをコードするｍＲＮＡ構築物であって、ｍｉＲ結合部位を欠くか、またはｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位、もしくはｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位およびｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位の両方を含有する構築物で処置した。マウスを、１、８、および１５日目において、ＭＣ３脂質ナノ粒子へと製剤化された、０．２ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡ構築物により、静脈内において処置した。
【０４４５】
第１の実験のセットは、ｍｉＲが、ＣＤ２７＋Ｂ細胞の頻度、またはこれらの細胞内のＣＤ２７発現のレベルに対して何らかの効果を及ぼすのかどうかについて検討した。結果を、図２５Ａ〜Ｂに示す。図２５Ａは、脾臓ＣＤ１９＋Ｂ細胞中の、ＣＤ２７＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞の頻度を示し、ＣＤ２７＋Ｂ細胞集団が、ｍｉＲ結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れの影響を受けなかったことを裏付ける。図２５Ｂは、ＣＤ２７＋Ｂ細胞集団内の、ＣＤ２７の発現レベルを示すが、また、同様に、この発現が、ｍｉＲ結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れの影響を受けなかったことも示す。こうして、この第１の実験のセットは、Ｂ細胞の活性化の阻害、および／またはサイトカインの産生の阻害における、ｍｉＲ結合部位の効果が、ＣＤ２７＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞の頻度、またはこれらの細胞内のＣＤ２７発現のレベルに影響を及ぼす、ｍｉＲ結合部位から生じたのではないことを裏付けた。
【０４４６】
第２の実験のセットは、ｍｉＲが、樹状細胞のマーカーとしてのＣＤ１１ｃ＋細胞の頻度、および／または活性化樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ７０＋ＣＤ８６＋細胞）の頻度に対して何らかの効果を及ぼすのかどうかについて検討した。結果を、図２６Ａ〜Ｂに示す。図２６Ａは、マウスに由来する脾臓細胞中の、ＣＤ１１ｃ＋細胞の百分率を示し、ＣＤ１１ｃ＋細胞の総頻度が、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位、または両方の結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れにより阻害されたことを裏付ける。図２６Ｂは、ＣＤ１１ｃ＋脾臓細胞集団内の、活性化樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ７０＋ＣＤ８６＋細胞）の頻度を示すが、また、同様に、活性化樹状細胞の頻度が、ｍｉＲ結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れにより阻害されたことも示す。こうして、この第２の実験のセットは、ｍｉＲ結合部位の組入れが、樹状細胞の総頻度および活性化樹状細胞の頻度の両方を阻害し、これにより、ｍｉＲ結合部位の組入れが、どのようにして、Ｂ細胞の活性化の阻害およびサイトカインの産生の阻害をもたらすのかについての機構に、この細胞集団を関与させることを裏付けた。機構に限定されることを意図するものではないが、これらの結果は、マウスでは、活性化ＣＤ７０＋樹状細胞のレベルの減少が、ＣＤ２７＋Ｂ細胞との相互作用の減少をもたらし、これにより、Ｂ細胞の活性化の減少、およびサイトカインの産生の減少をもたらすことを示唆する。
【０４４７】
これについてさらに探索するために、第３の実験のセットを実施した。マウスに由来する形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の能力であって、ナイーブＢ細胞の成長を刺激する能力について検討した。これらの実験のために、１０μｇ／ｍｌの抗ＩｇＭの存在下で、ＣＦＳＥで標識されたナイーブＢ細胞２×１０５個を、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡまたはｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ−ｍｉＲ１４２、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ−ｍｉＲ１２６またはｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ−ｍｉＲ１２６＋１４２を注射されたマウスの脾臓から精製されたｐＤＣ  ４×１０４個と共にインキュベートした。５日間にわたる培養の後で、細胞を採取し、ＣＦＳＥの発現について、フローサイトメトリーで解析した。ｐＤＣと共にインキュベートされたナイーブＢ細胞の成長のレベルを、図２７のグラフに示す。結果は、ナイーブＢ細胞の成長が、ｍｉＲ−１４２結合部位、ｍｉＲ−１２６結合部位、または両方の結合部位を含むｍＲＮＡ構築物で処置されたマウスに由来するｐＤＣの存在下では、低下することを裏付ける。これらの実験は、ｍｉＲ含有構築物で処置されたマウスにおいて、活性化ｐＤＣのレベルの減少が、Ｂ細胞の刺激の減少をもたらし、これにより、Ｂ細胞の活性化の阻害と、サイトカインの産生の阻害とをもたらす機構もさらに裏書きする。
【０４４８】
（実施例７）
ｍｉＲ結合部位の、ＩｇＭに対する効果
本実施例では、ｍＲＮＡ構築物への、免疫細胞内で発現するｍｉＲ結合部位（ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１２６、またはｍｉＲ−１４２＋ｍｉＲ−１２６の両方）の組入れの、ＰＥＧに結合するＩｇＭ（抗ＰＥＧ  ＩｇＭ）のレベルに対する効果について検討する研究を実施した。ＰＥＧは、ｍＲＮＡ構築物が封入されるＬＮＰの成分であるので、マウスの血清中の、抗ＰＥＧ  ＩｇＭの存在は、ＬＮＰ／ｍＲＮＡ組成物の血中クリアランスの加速化（ＡＢＣ）に寄与する。
【０４４９】
マウスを、実施例２で記載した通り、ルシフェラーゼコードｍＲＮＡ構築物で処置した。処置の２、３、および４回目の投与の後で、血清を、マウスから回収し、血清中の抗ＰＥＧ  ＩｇＭレベル（ｎｇ／ｍｌ単位の）を測定した。結果を、図２８Ａ〜Ｃのグラフに示す。図２８Ａは、第２の用量後における抗ＰＥＧ  ＩｇＭレベルを示し、図２８Ｂは、３回目の投与後における抗ＰＥＧ  ＩｇＭレベルを示し、図２８Ｃは、４回目の投与後における抗ＰＥＧ  ＩｇＭレベルを示す。結果は、ｍｉＲ結合部位の組入れが、マウスにおける抗ＰＥＧ  ＩｇＭのレベルを著明に減少させたことを裏付ける。この効果は、第２の用量による処置の後で既に観察され、効果は、４回目の投与による処置を通して持続した。ｍｉＲ結合部位含有ｍＲＮＡ構築物で処置されたマウスにおける、抗ＰＥＧ  ＩｇＭのこの低減は、これらのマウスでは、少なくとも部分的に抗ＰＥＧ  ＩｇＭにより媒介されるＡＢＣが、低減されると予測されることを指し示す。
【０４５０】
（実施例８）
複数のｍｉＲ結合部位と対比した、単一のｍｉＲ結合部位の効果
本実施例では、ｍＲＮＡ構築物への、複数のｍｉＲ結合部位（例えば、３つのｍｉＲ結合部位を有する３Ｘ）と対比した、単一のｍｉＲ結合部位（１Ｘ）の組入れの効果について検討する研究を実施した。
【０４５１】
肝細胞内のｍＲＮＡの発現を調節することが公知である、ｍｉＲ−１２２について検討する、第１の研究のシリーズを実施した。３つのｍｉＲ−１２２結合部位と対比した、１つのｍｉＲ−１２２結合部位の組入れの、ｍＲＮＡ構築物によりコードされるタンパク質の発現に対する効果を決定するために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を使用して、初代肝細胞に、ルシフェラーゼｍＲＮＡ構築物（Ｌｕｃ）および増強型緑色蛍光タンパク質ｍＲＮＡ構築物（ｅＧＦＰ）であって、各構築物の３’ＵＴＲが、（ｉ）ｍｉＲ−１２２結合部位を欠く（対照）か；（ｉｉ）１つのｍｉＲ−１２２結合部位を含有するか；または（ｉｉｉ）３つのｍｉＲ−１２２結合部位を含有する、Ｌｕｃ構築物およびｅＧＦＰ構築物を共トランスフェクトした。別の対照は、推定コード配列内に、ＡＴＧを伴わない、Ｌｕｃ様ＲＮＡ配列およびｅＧＦＰ様ＲＮＡ配列のトランスフェクションを含んだ。これら４つのｅＧＦＰ構築物のｍＲＮＡ配列を、それぞれ、配列番号６１〜６４に示す。これら４つのＬｕｃ構築物のｍＲＮＡ配列を、それぞれ、配列番号６５〜６８に示す。３つのｍｉＲ−１２２結合部位を含有する３’ＵＴＲの配列を、配列番号５４に示す。
【０４５２】
細胞に、７．５ｎｇ、１５ｎｇ、５０ｎｇ、または１００ｎｇのｍＲＮＡをトランスフェクトした。緑色の総組入れ強度を、２４時間にわたり経時的に測定した。結果を、図３１Ａ〜Ｄに示すが、これにより、低ｍＲＮＡ用量（それぞれ、図３１Ａおよび３１Ｂの、７．５ｎｇおよび１５ｎｇ）では、１Ｘ  ｍｉＲ−１２２構築物および３Ｘ  ｍｉＲ−１２２構築物のいずれもが、初代肝細胞内のｅＧＦＰの発現の著明な低減をもたらしたのに対し、高ｍＲＮＡ用量（それぞれ、図３１Ｃおよび３１Ｄの、５０ｎｇおよび１００ｎｇ）では、３Ｘ  ｍｉＲ−１２２構築物が、１Ｘ  ×ｍｉＲ−１２２構築物よりより強いｅＧＦＰ発現の阻害を呈示し、高用量では、３Ｘ  ｍｉＲ−１２２構築物が、時間経過にわたり、タンパク質発現のこの喪失を維持することが可能であったことが裏付けられる。また、ルシフェラーゼの発光についても、初代肝細胞内で検討したが、同様の結果：３Ｘ  ｍｉＲ−１２２構築物が、特に、高ｍＲＮＡ用量において、タンパク質発現の高度なノックダウンをもたらすことを観察した。
【０４５３】
３つのｍｉＲ−１２２結合部位と対比した、１つのｍｉＲ−１２２結合部位の組入れの、ｍＲＮＡ構築物によりコードされるタンパク質の発現に対する効果について検討する、第２の実験のシリーズでは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を使用して、初代肝細胞に、カスパーゼをコードするｍＲＮＡ構築物であって、その３’ＵＴＲ内に、（ｉ）ｍｉＲ−１２２結合部位（対照）を有さないか；（ｉｉ）１つのｍｉＲ−１２２結合部位を有するか；または（ｉｉｉ）３つのｍｉＲ−１２２結合部位を有するｍＲＮＡ構築物をトランスフェクトした。別の対照は、推定コード配列内に、ＡＴＧを伴わない、カスパーゼ様ＲＮＡ配列のトランスフェクションを含んだ。これら４つのカスパーゼ構築物のｍＲＮＡ配列を、それぞれ、配列番号６９〜７２に示す。カスパーゼ媒介毒性を、２４時間にわたり経時的に測定した。結果を、図３２Ａ〜Ｄに示すが、これにより、低ｍＲＮＡ用量（図３２Ａの７．５ｎｇ）では、１Ｘ  ｍｉＲ−１２２構築物および３Ｘ  ｍｉＲ−１２２構築物のいずれもが、カスパーゼ媒介毒性を阻害し、３Ｘ  ×ｍｉＲ−１２２構築物が、毒性の阻害にはるかに強力な効果を及ぼすことが裏付けられる。さらに、高ｍＲＮＡ用量（それぞれ、図３２Ｂ、３２Ｃ、および３２Ｄの、１５ｎｇ、５０ｎｇおよび１００ｎｇ）では、３Ｘ  ｍｉＲ−１２２構築物だけが、カスパーゼ媒介毒性を阻害することが可能であった。また、初代肝細胞に、ＭＣ３脂質ナノ粒子内のカスパーゼｍＲＮＡ構築物をトランスフェクトする研究も実施したが、同様の結果：３Ｘ  ｍｉＲ−１２２構築物によるカスパーゼ媒介毒性の緩和が、１Ｘ  ｍｉＲ−１２２構築物によるカスパーゼ媒介毒性の緩和より、著明に強力であることを観察した。
【０４５４】
これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける研究結果を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて確認するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０、１つ、または３つのｍｉＲ−１２２結合部位を含有するＭＣ３ナノ粒子内のＬｕｃ  ｍＲＮＡ構築物およびｅＧＦＰ  ｍＲＮＡ構築物（０．５ｍｇ／ｋｇ）を共投与した。肝臓内のｅＧＦＰ蛍光について検討した結果は、１つのｍｉＲ−１２２結合部位の組入れが、肝臓内のｅＧＦＰ発現のわずかなノックダウンをもたらすのに対し、３つのｍｉＲ−１２２結合部位の組入れは、肝臓内のｅＧＦＰ発現の著明なノックダウンをもたらすことを示した。ルシフェラーゼの発現についても、同様の結果が観察され、１Ｘ  部位も、ルシフェラーゼの発現を低減するが、３Ｘ  部位は、タンパク質発現のより強いノックダウンをもたらした。
【０４５５】
第３の実験のシリーズでは、カニクイザルに、３’ＵＴＲ内に、０、１つ、または３つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を含有するＭＣ３ナノ粒子内のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ構築物（０．２ｍｇ／ｋｇ）を投与した。サルにおけるｈＥＰＯの発現レベル（ｎｇ／ｍｌ単位の）を、ＥＬＩＳＡにより測定したが、その結果を、図３３に示す。結果は、３Ｘ  ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位の、ｈＥＰＯ構築物への組入れが、０または１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を伴う構築物と比較して、ｈＥＰＯの、著明に低度の発現をもたらすことを示す。
【０４５６】
全体的に、上記で記載した研究は、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れの有益性と、３つのｍｉＲ結合部位の、構築物への組入れによる効果の増強とを裏付ける。
【０４５７】
（実施例９）
５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）内のｍｉＲ結合部位の効果
本実施例では、ｍＲＮＡ構築物への、ｍＲＮＡ構築物の５’ＵＴＲ内の、３つの異なる挿入部位のうちの１つの中のｍｉＲ結合部位の組入れの効果について検討する研究を実施した。使用される５’ＵＴＲ配列を、下記に示す。
【０４５８】
ＧＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧ＾ＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡ＾ＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡ＾ＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号５３）［配列中、３つの可能な挿入部位（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）を、キャレット記号（＾）で指し示す］。Ｐ１、Ｐ２、またはＰ３へと挿入されたｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を有する５’ＵＴＲの配列を、それぞれ、配列番号５５〜５７に示す。Ｐ１、Ｐ２、またはＰ３へと挿入されたｍｉＲ−１２２結合部位を有する５’ＵＴＲの配列を、それぞれ、配列番号５８〜６０に示す。
【０４５９】
第１の実験のシリーズでは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を使用して、増強型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）ｍＲＮＡ構築物を、ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ細胞へとトランスフェクトしたが、この場合、構築物は、３’ＵＴＲ内の１Ｘ  ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位または３Ｘ  ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を含有するか、または５’ＵＴＲのＰ１、Ｐ２、もしくはＰ３へと挿入されたｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を含有するか、または３’ＵＴＲ内の単一のｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位と組み合わせた、５’ＵＴＲのＰ１、Ｐ２、もしくはＰ３へと挿入されたｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を含有した。ｅＧＦＰ蛍光は、トランスフェクションの４８時間後において測定した。結果を、図３４に示す。結果は、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を、Ｐ１、Ｐ２、またはＰ３に挿入した構築物であって、単独の、または３’ＵＴＲ内のｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位と組み合わせた構築物を含む被験構築物の全てが、細胞内のタンパク質の発現の著明な低減をもたらしたことを裏付ける。
【０４６０】
ｈＥＰＯを、コードされるタンパク質として使用して、同様の構築物を制作し、ＲＡＷ２６４．７細胞にトランスフェクトして、同様の実験を行った。ｈＥＰＯ構築物による結果は、ｅＧＦＰ構築物による結果と全く同様であり、ｍｉＲ結合部位を、Ｐ１、Ｐ２、またはＰ３に挿入した構築物であって、単独の、または３’ＵＴＲ内のｍｉＲ結合部位と組み合わせた構築物を含む全ての被験構築物は、細胞内のタンパク質発現の著明な低減をもたらした。しかし、ｈＥＰＯ構築物では、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３における５’ＵＴＲ構築物による阻害の程度は、ｅＧＦＰ構築物による阻害の程度（それぞれ、８９％、９６％、および９８％）と比較して、わずかに低度（それぞれ、６０％、７３％、および９３％）であった。
【０４６１】
第２の実験のシリーズでは、構築物が、３’ＵＴＲ内の１Ｘ  ｍｉＲ−１２２結合部位または３Ｘ  ｍｉＲ−１２２結合部位を含有するか、または５’ＵＴＲのＰ１、Ｐ２、もしくはＰ３へと挿入されたｍｉＲ−１２２結合部位を含有するか、または３’ＵＴＲ内の単一のｍｉＲ−１２２結合部位と組み合わせた、５’ＵＴＲのＰ１、Ｐ２、もしくはＰ３へと挿入されたｍｉＲ−１２２結合部位を含有したことを除き、上記で記載した構築物と同様のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ構築物を制作した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を使用して、ｍＲＮＡ構築物を、初代肝細胞へとトランスフェクトした。ｈＥＰＯ発現（ｎｇ／ｍＬ単位の）を、ＥＬＩＳＡにより測定した結果を、図３５に示す。結果は、ｍｉＲ−１２２結合部位を、Ｐ１、Ｐ２、またはＰ３に挿入した構築物であって、単独の、または３’ＵＴＲ内のｍｉＲ−１２２結合部位と組み合わせた構築物を含む被験構築物の全てが、細胞内のタンパク質の発現の著明な低減をもたらしたことを裏付ける。
【０４６２】
これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける研究結果を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて確認するために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を使用して、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＭＣ３ナノ粒子内のｈＥＰＯ／ｍｉＲ−１２２ｍＲＮＡ構築物のパネルを投与するか、またはｈＥＰＯ／ｍｉＲ−１４２−３ｐ構築物のパネルを投与した。結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける観察と同様に、ｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を、Ｐ１、Ｐ２、またはＰ３に挿入した構築物であって、単独の、または３’ＵＴＲ内のｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位と組み合わせた構築物を含む被験構築物の全てが、マウスにおけるタンパク質の発現の著明な低減をもたらしたことを示した。
【０４６３】
全体的に、これらの研究は、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位の、ｍＲＮＡ構築物の３’ＵＴＲもしくは５’ＵＴＲへの組入れ、またはｍｉＲ結合部位の組合せの、３’ＵＴＲおよび５’ＵＴＲの両方への組入れの有益性を裏付ける。
配列表の概要
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
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【表６−７】
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【表６−８】
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【表６−９】
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【表６−１０】
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【表６−１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2018529738.tif 000034
【図１２】
2018529738.tif 000035
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2018529738.tif 000039
【図１７】
2018529738.tif 000040
【図１８Ａ−Ｂ】
2018529738.tif 000041
【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
2018529738.tif 000049
【図２４Ｃ】
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【図２５】
2018529738.tif 000051
【図２６】
2018529738.tif 000052
【図２７】
2018529738.tif 000053
【図２８Ａ−Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
2018529738.tif 000058
【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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