(57)【要約】本発明は、ヒトＰＤ−１に高親和性で特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。本発明の抗体をコードする核酸分子、本発明の抗体を発現させるための発現ベクター、宿主細胞、および方法も提供される。本発明のＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を阻害することによって一般的な免疫応答ならびに特にＴｃＲおよびＣＤ２８の介在する免疫応答を調節する。加えて本発明は、本発明のＰＤ−１抗体を用いて感染性疾患および癌を含むさまざまな疾患を処置するための方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＰＤ−１モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体は配列番号１（重鎖ＣＤＲ１）、配列番号２（重鎖ＣＤＲ２）、配列番号３（重鎖ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域と、配列番号４（軽鎖ＣＤＲ１）、配列番号５（軽鎖ＣＤＲ２）、および配列番号６（軽鎖ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域とを含む、モノクローナル抗体。
【請求項２】
前記重鎖可変領域は配列番号８または配列番号１６のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号１０または配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記抗原結合フラグメントはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、またはＦ（ａｂ’）２である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
前記抗体はマウス、キメラ、またはヒト化抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体をコードする単離核酸分子。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容できる担体とを含む組成物。
【請求項９】
治療薬剤に結合された請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、イムノコンジュゲート。
【請求項１０】
前記治療薬剤は細胞毒または放射性同位元素である、請求項９に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１１】
対象における免疫応答を調節する方法であって、前記対象における前記免疫応答が調節されるように請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分を前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項１２】
対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、前記腫瘍細胞の増殖を阻害するために有効な量の請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項１３】
対象における感染性疾患を処置する方法であって、前記感染性疾患に対して前記対象が処置されるように、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項１４】
対象における免疫応答を修正するための薬物の製造における、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分の使用。
【請求項１５】
対象における腫瘍細胞の増殖を阻害するための薬物の製造における、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分の使用。
【請求項１６】
対象における感染性疾患を処置するための薬物の製造における、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に、ヒト疾患の処置における免疫療法に関する。より特定的には、本発明は癌を処置するための抗ＰＤ−１抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
適応免疫応答は、Ｔ細胞およびＢ細胞と名付けられた２つの主要なクラスのリンパ球の活性化、選択、およびクローン増殖を伴う。抗原に遭遇した後、Ｔ細胞は増殖して抗原特異的エフェクター細胞に分化するのに対し、Ｂ細胞は増殖して抗体分泌細胞に分化する。
【０００３】
Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ：ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）との間のいくつかのシグナル伝達事象を必要とする多段階プロセスである。Ｔ細胞活性化を起こすためには、休止Ｔ細胞に２つのタイプのシグナルを送達する必要がある。第１のタイプは抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ：Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に仲介され、免疫応答に特異性を与えるものである。第２の同時刺激タイプは応答の大きさを制御するものであり、Ｔ細胞上の補助受容体を通じて送達される。
【０００４】
主要な同時刺激シグナルは活性化ＣＤ２８受容体を通じて、そのリガンドＢ７−１またはＢ７−２の結合の際に送達される。これに対し、同じＢ７−１またはＢ７−２リガンドによる抑制性ＣＴＬＡ−４受容体の結合は、Ｔ細胞応答の減弱をもたらす。よってＣＴＬＡ−４シグナルは、ＣＤ２８の介在する同時刺激に拮抗する。高抗原濃度においては、ＣＤ２８同時刺激がＣＴＬＡ−４の抑制効果を無効にする。ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４発現の時間的制御によって、活性化および抑制シグナルのバランスが維持されて効果的な免疫応答の発達が確実にされ、一方で自己免疫の発達から保護する。
【０００５】
ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の分子ホモログ、ならびにそれらのＢ−７様リガンドが近年同定されている。ＩＣＯＳはＣＤ２８様の同時刺激受容体である。ＰＤ−１（プログラム死（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ）１）は受容体のＣＤ２８ファミリーの抑制性メンバーであり、このＣＤ２８ファミリーはＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、およびＢＴＬＡも含む。ＰＤ−１は活性化されたＢ細胞、Ｔ細胞、および骨髄細胞において発現する。このファミリーの最初のメンバーであるＣＤ２８およびＩＣＯＳは、モノクローナル抗体の添加に続くＴ細胞増殖増加に対する機能的効果によって発見された（非特許文献１、非特許文献２）。ＰＤ−１は、アポトーシス（ａｐｏｔｏｔｉｃ）細胞における発現差異に対するスクリーニングを通じて発見された（非特許文献３）。ファミリーのその他のメンバーであるＣＴＬＡ−４およびＢＴＬＡは、それぞれ細胞傷害性Ｔリンパ球およびＴＨ１細胞における発現差異に対するスクリーニングを通じて発見された。ＣＤ２８、ＩＣＯＳおよびＣＴＬＡ−４はすべて、ホモ二量体化を可能にする不対システイン残基を有する。これに対し、ＰＤ−１は他のＣＤ２８ファミリーメンバーの不対システイン残基の特徴を欠いており、モノマーとして存在することが示唆されている。
【０００６】
ＰＤ−１遺伝子は、Ｉｇ遺伝子スーパーファミリーの一部である５５ｋＤａのタイプＩ膜貫通タンパク質である（非特許文献４）。ＰＤ−１は膜近位の免疫受容体チロシン抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ：ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｍｏｔｉｆ）と、膜遠位のチロシンベーススイッチモチーフ（ＩＴＳＭ：ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｓｗｉｔｃｈ  ｍｏｔｉｆ）とを含む。ＣＴＬＡ−４と構造的に類似であるが、ＰＤ−１はＢ７−１およびＢ７−２結合のために重要なＭＹＰＰＰＹモチーフを欠いている。ＰＤ−１に対する２つのリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２が同定されており、これらはＰＤ−１に結合する際にＴ細胞活性化をダウンレギュレートすることが示されている（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２はどちらもＰＤ−１に結合するＢ７ホモログであるが、他のＣＤ２８ファミリーメンバーには結合しない。ＰＤ−１は、活性化されたＢ細胞、Ｔ細胞、および骨髄細胞において発現するＣＤ２８ファミリーの抑制性メンバーである。ＰＤ−１に対するリガンドの１つであるＰＤ−Ｌ１は、さまざまなヒト癌において豊富である（非特許文献８）。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用によって、腫瘍浸潤性リンパ球の減少、Ｔ細胞受容体の介在する増殖の減少、および癌性細胞による免疫回避がもたらされる（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１）。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との局所的相互作用を阻害することによって免疫抑制を逆転させることができ、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との相互作用も遮断したとき、この効果は付加的である（非特許文献１２、非特許文献１３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈｕｔｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ３９７：２６３−２６６
【非特許文献２】Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｓ  １０：２４７−２６０
【非特許文献３】Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＥＭＢＯ  Ｊ  １１：３８８７−９５
【非特許文献４】Ａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８：７６５−７２
【非特許文献５】Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２：１０２７−３４
【非特許文献６】Ｌａｔｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：２６１−８
【非特許文献７】Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２：６３４−４３
【非特許文献８】Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：７８７−９
【非特許文献９】Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８１：２８１−７
【非特許文献１０】Ｂｌａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５４：３０７−３１４
【非特許文献１１】Ｋｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：５０９４−１００
【非特許文献１２】Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１２２９３−７
【非特許文献１３】Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１２５７−６６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＰＤ−１に結合し、かつ多数の望ましい特性を示すモノクローナル抗体を提供する。これらの特性は、たとえばヒトＰＤ−１に対する高親和性結合などを含む。
【０００９】
本発明は、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、前記モノクローナル抗体はヒトＰＤ−１と高親和性で結合する。本発明のモノクローナル抗体はマウス、キメラ、またはヒト化抗体である。本発明の抗原結合フラグメントはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、またはＦ（ａｂ’）２である。
【００１０】
加えて本発明は、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体をコードする単離核酸分子を提供する。
【００１１】
加えて本発明は、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体をコードする核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
【００１２】
加えて本発明は、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体をコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１３】
加えて本発明は、抗ＰＤ−１抗体を用いて免疫応答を調節する方法を提供する。特に、本発明は抗ＰＤ−１抗体を用いて腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。
【００１４】
１つの局面において、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが提供され、前記抗体は配列番号１（重鎖ＣＤＲ１）、配列番号２（重鎖ＣＤＲ２）、配列番号３（重鎖ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域と、配列番号４（軽鎖ＣＤＲ１）、配列番号５（軽鎖ＣＤＲ２）、および配列番号６（軽鎖ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００１５】
別の局面においては、本明細書に記載されるモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容できる担体とを含む組成物が提供される。
【００１６】
別の局面においては、治療薬剤に結合された本明細書に記載されるモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含むイムノコンジュゲートが提供される。
【００１７】
別の局面においては、対象における免疫応答を調節する方法が提供され、この方法は、対象における免疫応答が調節されるように本明細書に記載される抗体またはその抗原結合部分を対象に投与するステップを含む。
【００１８】
別の局面においては、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法が提供され、この方法は、腫瘍細胞の増殖を阻害するために有効な量の本明細書に記載される抗体またはその抗原結合フラグメントを対象に投与するステップを含む。
【００１９】
別の局面においては、対象における感染性疾患を処置する方法が提供され、この方法は、感染性疾患に対して対象が処置されるように本明細書に記載される抗体またはその抗原結合フラグメントを対象に投与するステップを含む。
【００２０】
非限定的な実施例および添付の図面とともに考慮されるときの詳細な説明を参照して、本発明はよりよく理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、ＰＤ−１トランスフェクトＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＰＤ−１）へのＰＤ−Ｌ１−Ｆｃの結合を示す図である。
【図２】ＰＤ−１−Ｆｃ−ビオチンのＰＤ−Ｌ１−Ｆｃへの結合を示す図である。
【図３】６７Ｄ９およびｈｕ６７Ｄ９の重鎖（Ａ）および軽鎖（Ｂ）可変領域のアミノ酸配列を示す図である。６７Ｄ９ＶＨおよび６７Ｄ９ＶＬは、それぞれ６７Ｄ９の重鎖および軽鎖可変領域を示す。ヒト化重鎖に対するフレームワークとしてｈｕｍＩＩＩが選択され、ヒト化軽鎖に対してｈｕｍκＩＩＩが選択された。ｈｕ６７Ｄ９ＶＨおよびｈｕ６７Ｄ９ＶＬは、それぞれｈｕ６７Ｄ９の重鎖および軽鎖可変領域を示す。ダッシュは、ヒト抗体フレームワークの対応する残基と同じアミノ酸を表す。ＣＤＲは角括弧で囲まれている。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、３つの抗ＰＤ−１抗体６７Ｄ９、ｃ６７Ｄ９、およびｈｕ６７Ｄ９のすべてが、トランスフェクトＣＨＯ−Ｋ１細胞上に発現したＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１−Ｆｃの結合を有効に阻害することを示す実験の結果を示す図である。
【図５】図５Ａ〜５Ｄは、抗ＰＤ−１抗体６７Ｄ９（マウスＡｂ）、ｃ６７Ｄ９（キメラＡｂ）、およびｈｕ６７Ｄ９（ヒト化Ａｂ）の各々がＰＤ−Ｉ（Ａ）には結合するが、ＩＣＯＳ（Ｂ）、ＣＴＬＡ−４（Ｃ）、およびＣＤ２８（Ｄ）には結合しないことを示す実験の結果を示す図である。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、３つの抗ＰＤ−１抗体６７Ｄ９（マウスＡｂ）、ｃ６７Ｄ９（キメラＡｂ）、およびｈｕ６７Ｄ９（ヒト化Ａｂ）の各々が、混合リンパ球反応アッセイにおいてＴ細胞増殖（Ａ）、ＩＬ−２（Ｂ）分泌、およびＩＦＮ−ガンマ（Ｃ）分泌を促進することを示す実験の結果を示す図である。
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、抗ＰＤ−１抗体６７Ｄ９（マウスＡｂ）、ｃ６７Ｄ９（キメラＡｂ）、およびｈｕ６７Ｄ９（ヒト化Ａｂ）の各々がヒトＰＤ−１−Ｆｃ（Ａ）およびカニクイザルＰＤ−１−Ｆｃ（Ｂ）には結合するが、マウスＰＤ−１−Ｆｃ（Ｃ）には結合しないことを示す実験の結果を示す図である。
【図８】ＰＢＳ中のニボルマブ、ペムブロリズマブ、およびｈｕ６７Ｄ９（ヒト化６７Ｄ９）のＤＳＣサーモグラムを示す図である。
【図９】ニボルマブおよびｈｕ６７Ｄ９の動力学および親和性測定の結果を示す図である。
【図１０】細胞表面に発現したＰＤ−１へのニボルマブおよびｈｕ６７Ｄ９の結合を示す図である。
【図１１】可溶性ＰＤ−１へのニボルマブおよびｈｕ６７Ｄ９の結合を示す図である。
【図１２】ＦＩＴＣ標識ニボルマブの存在下での細胞表面に発現したＰＤ−１へのニボルマブおよびｈｕ６７Ｄ９の競合的結合を示す図である。
【図１３】ビオチン標識ニボルマブの存在下での可溶性ＰＤ−１へのニボルマブおよびｈｕ６７Ｄ９の競合的結合を示す図である。
【図１４】ビオチン標識ＰＤＬ１−Ｆｃの存在下での可溶性ＰＤ−１へのニボルマブおよびｈｕ６７Ｄ９の競合的結合を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、ヒトＰＤ−１に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。特定の実施形態において、本発明の抗体はたとえばＰＤ−１への高親和性結合、他のＣＤ２８ファミリーメンバーとの交差反応性の欠如、混合リンパ球反応におけるＴ細胞増殖ならびにＩＬ−２およびＩＦＮ−ガンマ分泌を刺激できること、１つもしくはそれ以上のＰＤ−１リガンド（例、ＰＤ−Ｌ１および／もしくはＰＤ−Ｌ２）の結合を阻害できること、ならびに／またはカニクイザルＰＤ−１と交差反応できることなどの、１つまたはそれ以上の望ましい機能的特性を示す。別の局面において、本発明は、ＰＤ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体と、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合するモノクローナル抗体とを組み合わせた使用に関する。
【００２３】
本発明は、ヒトＰＤ−１に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、およびこうした抗体を作製する方法を提供する。
【００２４】
別の局面において、本発明は、抗ＰＤ−１抗体を用いて対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法に関する。本明細書に示されるとおり、抗ＰＤ−１抗体はインビボで腫瘍細胞増殖を阻害できる。加えて本発明は、免疫応答を修正するため、およびたとえば癌または感染性疾患などの疾患を処置するために抗体を用いる方法に関する。
【００２５】
本発明がより容易に理解され得るようにするために、最初に特定の用語を定義する。詳細な説明の全体にわたって、追加の定義が示される。
【００２６】
「プログラム死１」、「プログラム細胞死１」、「ＰＤ−１」、「ＰＤ１」、「ＰＤＣＤ１」、「ｈＰＤ−１」、および「ｈＰＤ−Ｉ」という用語は交換可能に用いられ、ヒトＰＤ−１の変異体、アイソフォーム、種ホモログ、および少なくとも１つのＰＤ−１と共通のエピトープを有する類似体を含む。
【００２７】
「細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４」、「ＣＴＬＡ−４」、「ＣＴＬＡ４」、「ＣＴＬＡ−４抗原」、および「ＣＤ１５２」という用語は交換可能に用いられ、ヒトＣＴＬＡ−４の変異体、アイソフォーム、種ホモログ、および少なくとも１つのＣＴＬＡ−４と共通のエピトープを有する類似体を含む。
【００２８】
「免疫応答」という用語は、たとえばリンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および上記細胞または肝臓で生成される可溶性高分子（抗体、サイトカイン、および補体を含む）などによる作用であって、侵入した病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌性細胞、または自己免疫もしくは病的炎症の場合には正常なヒト細胞もしくは組織の選択的損傷、破壊、またはヒトの身体からの排除をもたらすものを示す。
【００２９】
本明細書において示される「抗体」という用語は、抗体全体およびその任意の抗原結合フラグメント（すなわち「抗原結合部分」）または単鎖を含む。「抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ：ｈｅａｖｙ）鎖および２つの軽（Ｌ：ｌｉｇｈｔ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分を示す。各重鎖は重鎖可変（ｖａｒｉａｂｌｅ）領域（本明細書においてはＶＨと略記する）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書においてはＶＬと略記する）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域をさらに細分して、相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ）と名付けられた高頻度可変性の領域と、そこに散在するフレームワーク領域（ＦＲ：ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎｓ）と名付けられたよりよく保存された領域とにできる。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、それらはアミノ末端からカルボキシ末端へと次の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系のさまざまな細胞（例、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合に介在してもよい。
【００３０】
本明細書において用いられる抗体の「抗原結合フラグメント」という用語は、抗原（例、ＰＤ−１）に特異的に結合する能力を保持した抗体の１つまたはそれ以上のフラグメントを示す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントによって行われ得ることが示されている。抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に包含される結合フラグメントの例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、すなわちＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、すなわちヒンジ領域のジスルフィド架橋によって結合された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００３１】
本明細書において用いられる「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を示す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
【００３２】
「ヒト化抗体」という用語は、たとえばマウスなどの別の哺乳動物種の生殖系に由来するＣＤＲ配列がヒトのフレームワーク配列につながれた抗体を示すことが意図される。ヒトフレームワーク配列内で付加的なフレームワーク領域の修正が行われてもよい。
【００３３】
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列が１つの種に由来しており、かつ定常領域配列が別の種に由来している抗体、たとえば可変領域配列がマウス抗体に由来しており、かつ定常領域配列がヒト抗体に由来している抗体などを示すことが意図される。
【００３４】
ＩｇＧ抗体に対する「高親和性」という用語は、標的抗原に対して１０−８Ｍ以下、より好ましくは１０−９Ｍ以下、さらにより好ましくは１０−１０Ｍ以下のＫＤを有する抗体を示す。しかし、「高親和性」結合は他の抗体アイソタイプに対して変動し得る。たとえば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高親和性」結合は、１０−７Ｍ以下、より好ましくは１０−８Ｍ以下、さらにより好ましくは１０−９Ｍ以下のＫＤを有する抗体を示す。
【００３５】
本明細書において用いられる「対象」という用語は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語はすべての脊椎動物、たとえば哺乳動物および非哺乳動物、たとえば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。注記されるときを除き、「患者」または「対象」という用語は交換可能に用いられる。
【００３６】
以下のサブセクションにおいて、本発明のさまざまな局面をさらに詳細に説明する。
【００３７】
抗ＰＤ−１抗体
本発明の抗体は、抗体の特定の機能的特徴または特性によって特徴付けられる。たとえば、この抗体はＰＤ−１に特異的に結合する（例、ヒトＰＤ−１に結合し、かつたとえばカニクイザルなどの他の種のＰＤ−１と交差反応し得る）。好ましくは、本発明の抗体はＰＤ−１に、たとえば１×１０−７Ｍ以下のＫＤなどの高親和性で結合する。本発明の抗ＰＤ−１抗体は、好ましくは次の特徴のうちの１つまたはそれ以上を示す。
（ａ）ヒトＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、またはＩＣＯＳに実質的に結合しない、
（ｂ）混合リンパ球反応（ＭＬＲ：Ｍｉｘｅｄ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）アッセイにおいて、Ｔ細胞増殖を増加させる、
（ｃ）ＭＬＲアッセイにおいて、ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２分泌を増加させる、
（ｄ）ヒトＰＤ−１およびカニクイザルＰＤ−１に結合する、
（ｅ）ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を阻害する、
（ｆ）１×１０−７Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ−１に結合する。
【００３８】
好ましくは、抗体は１×１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ−１に結合するか、５×１０−９Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ−１に結合するか、または１×１０−８Ｍから１×１０−１２Ｍもしくはそれ以下のＫＤでヒトＰＤ−１に結合する。より好ましくは、抗体は１×１０−１２Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ−１に結合する。より好ましくは、抗体は３．２０９×１０−１２ＭのＫＤでヒトＰＤ−１に結合する。
【００３９】
本発明の抗体は、上に挙げた特徴の任意の組み合わせ、たとえば上に挙げた特徴のうちの２、３、４、５またはそれ以上などを示してもよい。
【００４０】
ＰＤ−１に対する抗体の結合能力を評価するための標準的アッセイは当該技術分野において公知であり、それはたとえばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、およびＲＩＡなどを含む。加えて、当該技術分野において公知の標準的アッセイ、たとえばＢｉａｃｏｒｅ分析などによって、抗体の結合動力学（例、結合親和性）を評価してもよい。上述の特徴のいずれかを評価するための好適なアッセイを、実施例において詳細に説明している。
【００４１】
１つの局面において、本発明は単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、このモノクローナル抗体は、
（ａ）配列番号１（重鎖ＣＤＲ１）、配列番号２（重鎖ＣＤＲ２）、配列番号３（重鎖ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）配列番号４（軽鎖ＣＤＲ１）、配列番号５（軽鎖ＣＤＲ２）、および配列番号６（軽鎖ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域とを含み、
この抗体はＰＤ−１、好ましくはヒトＰＤ−１に特異的に結合する。
【００４２】
好ましい抗ＰＤ−１抗体は、
（ａ）配列番号８または配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）配列番号１０または配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００４３】
相同抗体
本発明の抗体は、本明細書に記載される好ましい抗体のアミノ酸配列と相同のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含み、この抗体は本発明の抗ＰＤ−１抗体の所望の機能的特性を保持している。
【００４４】
たとえば、本発明は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで
（ａ）重鎖可変領域は、配列番号８および１６からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域は、配列番号１０および１８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列を含み、かつ
この抗体は次の特性のうちの１つまたはそれ以上を示す。
（ｃ）ヒトＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、またはＩＣＯＳに実質的に結合しない、
（ｄ）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、Ｔ細胞増殖を増加させる、
（ｅ）ＭＬＲアッセイにおいて、ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２分泌を増加させる、
（ｆ）ヒトＰＤ−１およびカニクイザルＰＤ−１に結合する、
（ｇ）ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を阻害する、
（ｈ）１×１０−７Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ−１に結合する。
【００４５】
他の実施形態において、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、上に示した配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同であってもよい。
【００４６】
本明細書において用いられる２つのアミノ酸配列のパーセント相同性は、２つの配列のパーセント同一性に等しい。２つの配列のパーセント同一性は、２つの配列の最適な整列のために導入される必要のあるギャップの数および各ギャップの長さを考慮したときの、これらの配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、％相同性＝同一位置の数／位置の総数×１００）。以下の非限定的な実施例に記載されるとおり、２つの配列間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成できる。
【００４７】
イムノコンジュゲート
別の局面において、本発明はたとえば細胞毒、薬物（例、免疫抑制剤）、または放射性毒物などの治療的部分とコンジュゲートされた、抗ＰＤ−１抗体またはそのフラグメントを特徴とする。こうしたコンジュゲートを、本明細書においては「イムノコンジュゲート」と呼ぶ。１つまたはそれ以上の細胞毒を含むイムノコンジュゲートを「イムノトキシン」と呼ぶ。細胞毒または細胞傷害性薬剤は、細胞にとって有害な（例、死滅させる）任意の薬剤を含む。その例はタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそれらの類似体またはホモログを含む。加えて治療薬剤は、たとえば代謝拮抗剤（例、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ：ｃｉｓ−ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉａｍｉｎｅ  ｐｌａｔｉｎｕｍ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例、ダウノルビシン（前ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗菌剤（例、ダクチノマイシン（前アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ：ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ））、ならびに有糸分裂阻害剤（例、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）などを含む。
【００４８】
本発明の抗体にコンジュゲートし得る治療用細胞毒の他の好ましい例は、デュオカルマイシン、カリチアマイシン、マイタンシン、およびオーリスタチン、ならびにそれらの誘導体を含む。
【００４９】
細胞毒（Ｃｙｔｏｘｉｎｓ）は、当該技術分野において利用可能なリンカー技術を用いて、本発明の抗体にコンジュゲートされ得る。抗体に細胞毒をコンジュゲートするために用いられてきたリンカータイプの例は、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィド、およびペプチド含有リンカーを含むが、それらに限定されない。
【００５０】
ラジオイムノコンジュゲートとも呼ばれる細胞傷害性の放射性医薬品を生成するために、本発明の抗体を放射性同位元素にコンジュゲートすることもできる。診断または治療に用いるための抗体にコンジュゲートされ得る放射性同位元素の例は、ヨウ素１３１、インジウム１１１、イットリウム９０、およびルテチウム１７７を含むが、それらに限定されない。ラジオイムノコンジュゲートを調製するための方法は、当該技術分野において確立されている。ラジオイムノコンジュゲートの例は商業的に入手可能であり、それはゼバリン（Ｚｅｖａｌｉｎ）（商標）（ＩＤＥＣファーマシューティカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））およびベクサール（Ｂｅｘｘａｒ）（商標）（コリクサ・ファーマシューティカルズ（Ｃｏｒｉｘａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））を含み、類似の方法を用いて本発明の抗体を用いたラジオイムノコンジュゲートを調製できる。
【００５１】
所与の生物学的応答を修正するために本発明の抗体コンジュゲートを用いることができ、薬物部分は古典的な化学的治療薬剤に限定されるものと解釈されるべきではない。たとえば、薬物部分は所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。こうしたタンパク質は、たとえば酵素活性を有する毒素またはその活性フラグメント、たとえばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素など；たとえば腫瘍壊死因子またはインターフェロンガンマなどのタンパク質；あるいは生物学的応答変更因子、たとえばリンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」：ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」：ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」：ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、またはその他の増殖因子などを含んでもよい。
【００５２】
医薬組成物
別の局面において、本発明は、薬学的に許容できる担体とともに調合された本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分（単数または複数）の１つまたは組み合わせを含有する、たとえば医薬組成物などの組成物を提供する。こうした組成物は、本発明の抗体またはイムノコンジュゲートまたは二特異性分子の１つまたは組み合わせ（例、２つまたはそれ以上の異なるもの）を含んでもよい。たとえば、本発明の医薬組成物は、標的抗原の異なるエピトープに結合するか、または相補的な活性を有する抗体（またはイムノコンジュゲートまたは二特異性体）の組み合わせを含み得る。
【００５３】
本発明の医薬組成物を併用療法において、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。たとえば、その併用療法は本発明の抗ＰＤ−１抗体と、少なくとも１つの他の抗炎症剤または免疫抑制剤とを組み合わせたものを含み得る。併用療法において用いられ得る治療薬剤の例は、以下の本発明の抗体の使用に対するセクションにより詳細に記載されている。
【００５４】
本明細書において用いられる「薬学的に許容できる担体」は、生理学的に適合する任意かつすべての溶剤、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、または上皮投与（例、注射または注入による投与）に対して好適である。投与の経路によっては、活性化合物すなわち抗体、イムノコンジュゲート、または二特異性分子が、その化合物を不活性化し得る酸およびその他の自然条件の作用から化合物を保護するための材料でコートされてもよい。
【００５５】
本発明の医薬化合物は、１つまたはそれ以上の薬学的に許容できる塩を含んでもよい。「薬学的に許容できる塩」とは、親化合物の所望の生物活性を保持し、かつ望ましくない毒物学的影響を何ら与えないような塩を示す。こうした塩の例は、酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は、たとえば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、および亜リン酸などの無毒性無機酸、ならびにたとえば脂肪族モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの無毒性有機酸に由来するものを含む。塩基付加塩は、たとえばナトリウム、カリウム、マグネシウム、およびカルシウムなどのアルカリ金属またはアルカリ土類金属、ならびにたとえばＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、およびプロカインなどの無毒性有機アミンに由来するものを含む。
【００５６】
加えて本発明の医薬組成物は、薬学的に許容できる抗酸化剤を含んでもよい。薬学的に許容できる抗酸化剤の例は、以下を含む。（１）水溶性抗酸化剤、たとえばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および亜硫酸ナトリウムなど、（２）油溶性抗酸化剤、たとえばパルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ：ｂｕｔｙｌａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌｅ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ：ｂｕｔｙｌａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｘｙｔｏｌｕｅｎｅ）、レシチン、没食子酸プロピル、およびアルファトコフェロールなど、ならびに（３）金属キレート剤、たとえばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ：ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ソルビトール、酒石酸、およびリン酸など。
【００５７】
本発明の医薬組成物に使用され得る好適な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物、植物油、たとえばオリーブ油など、ならびに注射可能な有機エステル、たとえばオレイン酸エチルなどを含む。たとえばレシチンなどのコーティング材料の使用、分散の場合に必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用などによって、適切な流動性が維持され得る。
【００５８】
加えてこれらの組成物は、たとえば保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントを含有してもよい。微生物の存在の防止は、前の滅菌手順、およびたとえばパラベン、クロロブタノール、およびフェノールソルビン酸などのさまざまな抗菌および抗真菌剤を含ませることの両方によって確実にされてもよい。加えて、組成物にたとえば糖および塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが望ましくてもよい。加えて、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤を含むことによって、注射用医薬品形の吸収延長がもたらされてもよい。
【００５９】
薬学的に許容できる担体は、無菌水溶液または分散物、および無菌注射溶液または分散物の即時調製のための無菌粉末を含む。薬学的活性物質に対してこうした媒体および薬剤を用いることは、当該技術分野において公知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除き、それらを本発明の医薬組成物に用いることが予期される。加えて、補助的な活性化合物が組成物に取り込まれ得る。
【００６０】
典型的に、治療用組成物は製造および保存の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高薬物濃度に対して好適なその他の秩序ある構造として調合され得る。担体は、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物などを含む溶剤または分散媒体であり得る。たとえばレシチンなどのコーティングの使用、分散の場合に必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用などによって、適切な流動性が維持され得る。多くの場合、組成物にたとえば糖、多価アルコール、たとえばマンニトール、ソルビトールなど、または塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましいだろう。組成物にたとえばモノステアリン酸塩およびゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤を含むことによって、注射用組成物の吸収延長がもたらされ得る。
【００６１】
必要な量の活性化合物を必要に応じて上に列挙した成分の１つまたは組み合わせとともに適切な溶剤中に取り込み、その後滅菌精密ろ過を行うことによって、無菌注射溶液を調製できる。一般的に、分散物は、基本分散媒体および上に列挙されたもののうちの必要とされるその他の成分を含有する無菌媒介物に、活性化合物を取り込むことによって調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌ろ過した溶液から活性成分と任意の付加的な所望の成分との粉末をもたらす、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【００６２】
単一剤形を生成するために担体材料と組み合わされ得る活性成分の量は、処置される対象および投与の特定のモードに依存して変動する。単一剤形を生成するために担体材料と組み合わされ得る活性成分の量は、一般的には治療効果を生じる組成物の量となる。一般的に、この量は１００パーセントのうち約０．０１パーセントから約９９パーセントの範囲の活性成分、好ましくは約０．１パーセントから約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセントから約３０パーセントの活性成分と薬学的に許容できる担体との組み合わせとなる。
【００６３】
用量投与計画は、最適な所望の応答（例、治療的応答）を提供するように調整される。たとえば、単一のボーラスが投与されてもよいし、いくつかに分けられた用量が時間をおいて投与されてもよいし、治療状況の緊急性によって示されるとおりに用量が比例的に低減または増加されてもよい。投与の容易さおよび用量の均一性のためには、用量単位形の非経口組成物を調合することが特に有利である。本明細書において用いられる用量単位形とは、処置される対象に対する単位用量として適した物理的に別々の単位を示す。各単位は、必要な医薬担体に関連して所望の治療効果を生じるように算出された予め定められた量の活性化合物を含有する。本発明の用量単位形に対する仕様は（ａ）活性化合物の一意の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体の感受性の処置のためにこうした活性化合物を調合する技術分野において固有の制限によって定められ、かつそれらに直接依存する。
【００６４】
抗体の投与のための用量は、宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲、より一般的には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇである。たとえば、用量は０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、または１０ｍｇ／ｋｇ体重、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。例示的な処置投与計画は、週１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、月１回、３ヵ月に１回、または３〜６ヵ月に１回の投与を必要とする。本発明の抗ＰＤ−１抗体に対する好ましい用量投与計画は、静脈内投与を介した１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重を含み、抗体は次の投与スケジュールの１つを用いて与えられる。（ｉ）４週間ごとに６用量、次いで３ヵ月ごと、（ｉｉ）３週間ごと、（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、その後３週間ごとに１ｍｇ／ｋｇ体重。
【００６５】
代替的に、抗体を徐放調合物として投与することができ、この場合には必要とされる投与の頻度が少なくなる。用量および頻度は、患者における抗体の半減期に依存して変動する。一般的に、ヒト抗体は最長の半減期を示し、その後にヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体が続く。投与の用量および頻度は、その処置が予防であるか治療であるかに依存して変動し得る。予防的適用においては、長期間にわたって比較的長い間隔で比較的低い用量が投与される。患者によっては、生涯にわたって処置を受け続ける。治療的適用においては、疾患の進行が低減または終止するまで、かつ好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な寛解を示すまで、比較的短い間隔の比較的高い用量がしばしば必要とされる。その後、患者には予防的投与計画が投与され得る。
【００６６】
本発明の医薬組成物における活性成分の実際の用量レベルは、患者に対して毒性になることなく特定の患者、組成物、および投与モードに対して所望の治療的応答を達成するために有効な活性成分の量を得るように変動されてもよい。選択される用量レベルは、使用される本発明の特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排出速度、処置の持続時間、使用される特定の組成物と組み合わせて用いられる他の薬物、化合物および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、身体全体の健康、および過去の病歴、ならびに医療分野において周知の類似の因子を含むさまざまな薬物動態学的因子に依存する。
【００６７】
本発明の抗ＰＤ−１抗体の「治療上有効な用量」は、好ましくは結果として疾患症状の重症度の減少、疾患無症状期間の頻度および持続時間の増加、または疾患による機能障害もしくは能力障害の防止をもたらす。たとえば、腫瘍の処置のための「治療上有効な用量」は、好ましくは細胞増殖または腫瘍増殖を未処置対象と比べて少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％だけ阻害する。ある化合物が腫瘍増殖を阻害する能力は、ヒト腫瘍における効力を予測する動物モデル系において評価され得る。代替的に、組成物のこの特性は、熟練した実務家に公知のアッセイによって、インビトロでこうした阻害を阻害する化合物の能力を調べることによって評価され得る。治療用化合物の治療上有効な量は、腫瘍サイズを減少させるか、または別様に対象の症状を回復させることができる。通常の当業者は、たとえば対象のサイズ、対象の症状の重症度、および選択される特定の組成物または投与経路などの因子に基づいて、こうした量を決定できるだろう。
【００６８】
別の局面において、この開示は本明細書に記載される抗ＰＤ−１抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体を含む部分の医薬品キットを提供する。加えてこのキットは、過剰増殖疾患（たとえば本明細書に記載される癌など）の処置に用いるための説明書をさらに含んでもよい。別の実施形態において、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４抗体は、単位剤形にともにパッケージングされてもよい。
【００６９】
特定の実施形態においては、異なる結合特異性を有する２つまたはそれ以上のモノクローナル抗体（例、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４）が同時に投与され、この場合に投与される各抗体の用量は、示された範囲内である。抗体は単一用量として投与されてもよいし、より一般的には複数の機会に投与されてもよい。単一用量間の間隔は、たとえば毎週、毎月、３ヵ月ごと、または毎年などであり得る。加えて、患者における標的抗原に対する抗体の血中レベルを測定することによって示されるとおりに、間隔を不規則にしてもよい。いくつかの方法においては約１〜１０００μｇ／ｍｌ、いくつかの方法においては約２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成するように用量が調整される。
【００７０】
本発明の組成物は、当該技術分野において公知のさまざまな方法の１つまたはそれ以上を用いて、１つまたはそれ以上の投与経路を介して投与され得る。当業者に認識されるとおり、投与の経路および／またはモードは所望の結果に依存して変動する。本発明の抗体に対する好ましい投与経路は、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、またはその他の非経口投与経路、たとえば注射または注入による投与を含む。本明細書において用いられる「非経口投与」という語句は、通常は注射による、腸内および局所投与以外の投与モードを意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内の注射および注入を限定なしに含む。
【００７１】
代替的に、本発明の抗体は、たとえば局所、上皮、または粘膜の投与経路など、たとえば鼻腔内、経口、膣内、直腸内、舌下、または局所などの非経口でない経路を介して投与され得る。
【００７２】
活性化合物は、たとえば移植片、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達系を含む徐放調合物などの、化合物を迅速な放出から保護する担体とともに調製され得る。たとえばエチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーが用いられ得る。こうした調合物の調製のための多くの方法が特許を取得するか、または当業者に一般的に公知である。たとえばＳｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８などを参照。
【００７３】
治療用組成物は、当該技術分野において公知の医療用デバイスによって投与され得る。
【００７４】
本発明の使用および方法
本発明の抗体、抗体組成物、および方法は、たとえばＰＤ−１の検出またはＰＤ−１の遮断による免疫応答の増強などを含む、多数のインビトロおよびインビボの有用性を有する。好ましい実施形態において、本発明の抗体はヒト抗体である。たとえば、さまざまな状況における免疫を増強するために、これらの分子をインビトロまたはエクスビボで培養物中の細胞に投与するか、またはたとえばインビボでヒト対象に投与できる。したがって１つの局面において、本発明は対象における免疫応答を修正する方法を提供し、この方法は、対象における免疫応答が修正されるように本発明の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与するステップを含む。好ましくは、その応答は増強されるか、刺激されるか、またはアップレギュレートされる。
【００７５】
本明細書において用いられる「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むことが意図される。非ヒト動物はすべての脊椎動物、たとえば哺乳動物および非哺乳動物、たとえば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、および爬虫類などを含むが、哺乳動物、たとえば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、およびウマなどが好ましい。好ましい対象は、免疫応答の増強を必要とするヒト患者を含む。この方法は、Ｔ細胞の介在する免疫応答を増大させることによって処置され得る障害を有するヒト患者を処置するために特に好適である。特定の実施形態において、この方法はインビボの癌細胞の処置に対して特に好適である。免疫の抗原特異的増強を達成するために、抗ＰＤ−１抗体を目的の抗原と一緒に投与できる。ＰＤ−１に対する抗体が別の薬剤と一緒に投与されるとき、これら２つはいずれの順序で投与されても、同時に投与されてもよい。
【００７６】
本発明はさらに、サンプル中のヒトＰＤ−１抗原の存在を検出するか、またはヒトＰＤ−１抗原の量を測定するための方法を提供し、この方法は、抗体またはその一部分とヒトＰＤ−１との複合体の形成を可能にする条件下で、サンプルおよび対照サンプルを、ヒトＰＤ−１に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と接触させるステップを含む。次いで複合体の形成が検出され、ここで対照サンプルと比べたときのサンプルの複合体形成の差が、サンプル中のヒトＰＤ−１抗原の存在を示す。
【００７７】
本発明の抗体はＣＤ２８、ＩＣＯＳおよびＣＴＬＡ−４に比べてＰＤ−１に対して特異的に結合するため、本発明の抗体は細胞表面のＰＤ−１発現を特異的に検出するために使用でき、さらには免疫親和性精製を介してＰＤ−１を精製するために使用できる。
【００７８】
別の局面において、本発明は、対象における免疫応答を修正するための薬物の製造における、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合部分の使用を提供する。
【００７９】
癌
抗体によるＰＤ−１の遮断によって、患者の癌性細胞に対する免疫応答を増強できる。ＰＤ−１に対するリガンドであるＰＤ−Ｌ１は正常なヒト細胞では発現していないが、さまざまなヒト癌においては豊富である（非特許文献８）。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用の結果として、腫瘍浸潤リンパ球の減少、Ｔ細胞受容体が介在する増殖の減少、および癌性細胞による免疫回避がもたらされる（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１）。ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１に対する局所的相互作用を阻害することによって免疫抑制を逆転でき、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ２に対する相互作用も遮断したときの効果は付加的なものである。過去の研究では、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１に対する相互作用を阻害することによってＴ細胞増殖を回復できることが示されていたが、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を遮断することによるインビボでの癌腫瘍増殖に対する直接的効果の報告はなかった。１つの局面において、本発明は、癌性腫瘍の増殖が阻害されるような、抗ＰＤ−１抗体を用いたインビボでの対象の処置に関する。癌性腫瘍の増殖を阻害するために、抗ＰＤ−１抗体が単独で用いられてもよい。代替的には、以下に記載されるとおり、抗ＰＤ−１抗体が他の免疫原性薬剤、標準的な癌処置、または他の抗体とともに用いられてもよい。
【００８０】
したがって１つの実施形態において、本発明は対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供し、この方法は治療上有効な量の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分を対象に投与するステップを含む。
【００８１】
本発明の抗体を用いて増殖が阻害され得る好ましい癌は、典型的に免疫療法に応答性である癌を含む。処置のための好ましい癌の非限定的な例は、メラノーマ（例、転移性悪性メラノーマ）、腎臓癌（例、明細胞癌）、前立腺癌（例、ホルモン不応性前立腺癌）、乳癌、結腸癌、および肺癌（例、非小細胞肺癌）を含む。加えて本発明は、本発明の抗体を用いて増殖が阻害され得る抵抗性または反復性の悪性腫瘍を含む。
【００８２】
本発明の方法を用いて処置され得るその他の癌の例は、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部の癌、皮膚または眼内の悪性メラノーマ、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管の細胞腫、子宮内膜の細胞腫、子宮頸癌、膣の細胞腫、外陰部の細胞腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、慢性または急性白血病、そこには急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病が含まれる、小児期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管の癌、腎盂の細胞腫、中枢神経系（ＣＮＳ：ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘導される癌を含む環境的に誘導される癌、および前記癌の組み合わせを含む。加えて本発明は、転移性癌、特にＰＤ−Ｌ１を発現する転移性癌の処置に対して有用である（Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１３３−１４４）。
【００８３】
任意には、ＰＤ−１に対する抗体を、たとえば癌性細胞、精製腫瘍抗原（組み換えタンパク質、ペプチド、および炭水化物分子を含む）、細胞、および免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子によってトランスフェクトした細胞などの免疫原性薬剤と組み合わせることができる（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：４９１９−２８）。使用され得る腫瘍ワクチンの非限定的な例は、メラノーマ抗原のペプチド、たとえばｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１、および／もしくはチロシナーゼのペプチドなど、またはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞を含む。
【００８４】
ヒトにおいて、たとえばメラノーマなどのいくつかの腫瘍は免疫原性であることが示されている。ＰＤ−１遮断によってＴ細胞活性化の閾値を上げることによって、宿主における腫瘍応答を活性化することを期待し得ることが予測される。
【００８５】
宿主免疫応答性を活性化するために用いられ得るその他の抗体が、抗ＰＤ−１と組み合わせて用いられ得る。これらの抗体は、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する樹状細胞の表面上の分子を含む。抗ＣＤ４０抗体は、Ｔ細胞ヘルパー活性の代わりを効果的に行うことができ（Ｒｉｄｇｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７４−４７８）、ＰＤ−１抗体とともに用いられ得る（Ｉｔｏ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１（５）５２７−４０）。たとえばＣＴＬＡ−４、ＯＸ−４０（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：２１６０−２１６９）、４−１ＢＢ（Ｍｅｌｅｒｏ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３：６８２−６８５（１９９７）、およびＩＣＯＳ（Ｈｕｔｌｏｆｆ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ３９７：２６２−２６６）などのＴ細胞同時刺激分子に対する抗体を活性化することも、Ｔ細胞活性化のレベル増加を提供し得る。
【００８６】
別の実施形態において、本発明は、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害するための薬物の製造における、治療上有効な量の本明細書に開示される抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分の使用を提供する。
【００８７】
感染性疾患
特定の毒素または病原体に露出した患者を処置するために、本発明の他の方法が用いられる。したがって、本発明の別の局面は対象における感染性疾患を処置する方法を提供し、この方法は、対象が感染性疾患に対して処置されるように抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分を対象に投与するステップを含む。
【００８８】
病原体、毒素、および自己抗原に対する免疫応答を刺激するために、抗体の介在するＰＤ−１遮断は単独で用いられても、アジュバントとしてワクチンと組み合わせて用いられてもよい。この治療アプローチが特に有用であり得る病原体の例は、現在有効なワクチンが存在しない病原体、または従来のワクチンが完全に有効ではない病原体を含む。これらの病原体はＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ、およびＣ）、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）、マラリア、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含むが、それらに限定されない。たとえばＨＩＶなどの感染過程で変化した抗原を提示する病原体によって確立された感染症に対して、ＰＤ−１遮断は特に有用である。これらの新規のエピトープは抗ヒトＰＤ−１投与の時点で外来性と認識されるため、ＰＤ−１による負のシグナルによって減衰されない強力なＴ細胞応答を誘発する。
【００８９】
本発明の方法によって処置可能な感染症を引き起こす病原性ウイルスのいくつかの例は、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ、またはＣ）、ヘルペスウイルス（例、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩ、およびＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コルノウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、およびアルボウイルス脳炎ウイルスを含む。
【００９０】
本発明の方法によって処置可能な感染症を引き起こす病原性バクテリアのいくつかの例は、クラミジア、リケッチアバクテリア、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｎｏｃｏｃｃｉ）、髄膜炎菌およびコノコッカス、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、テタヌス、ボツリヌス中毒、炭疽、ペスト、レプトスピラ症、ならびにライム病バクテリアを含む。
【００９１】
本発明の方法によって処置可能な感染症を引き起こす病原性真菌のいくつかの例は、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）（アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）、クルセイ（ｋｒｕｓｅｉ）、グラブラタ（ｇｌａｂｒａｔａ）、トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）など）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（フミガーツス（ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、クロコウジカビ（ｎｉｇｅｒ）など）、ケカビ属（Ｇｅｎｕｓ  Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）（ケカビ（ｍｕｃｏｒ）、アブシディア（ａｂｓｉｄｉａ）、クモノスカビ（ｒｈｉｚｏｐｈｕｓ））、スポロトリクス・シェンキー（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｋｉｉ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、南アメリカ分芽菌（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、およびヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）を含む。
【００９２】
本発明の方法によって処置可能な感染症を引き起こす病原性寄生体のいくつかの例は、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、大腸バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉ）、ネグレリアフォーレリ（Ｎａｅｇｌｅｒｉａｆｏｗｌｅｒｉ）、アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）種、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｉａ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）種、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、プラスモディウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、ネズミバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉ）、およびブラジル鉤虫（Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）を含む。
【００９３】
上記方法のすべてにおいて、腫瘍抗原の提示増強を提供する、たとえばサイトカイン処置（例、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２）または二特異性抗体療法などの他の形の免疫療法と、ＰＤ−１遮断とを組み合わせることができる。
【００９４】
本発明の別の実施形態は、対象における感染性疾患を処置するための薬物の製造における、本明細書に開示される抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分の使用を提供する。
【００９５】
本発明のキット
別の局面において、この開示は本明細書に開示される抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分を含むキットを提供する。このキットは、使用のための説明書をさらに含んでもよい。別の局面において、このキットは本明細書に記載される方法または使用の任意のものに用いられてもよい。
【００９６】
本明細書に例示的に記載される本発明は、本明細書に特定的に開示されていない任意の単数または複数の構成要素、単数または複数の制限の不在下で好適に実施されてもよい。よってたとえば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、限定なしに拡張的に読み取られる。加えて、本明細書で用いられる用語および表現は限定ではなく説明のための用語として用いられたものであり、こうした用語および表現の使用には、示され記載された特徴またはその一部の任意の均等物を除外することは意図されておらず、請求される本発明の範囲内でさまざまな修正が可能であることが認識される。よって、好ましい実施形態および任意の特徴によって本発明が特定的に開示されているが、ここで具現化された本明細書に開示される本発明の修正および変更が当業者によって行われてもよく、こうした修正および変更は本発明の範囲内にあるとみなされることが理解されるべきである。
【００９７】
本明細書においては、本発明が広く一般的に説明されている。一般的な開示の範囲内にあるより狭い種および亜属のグループの各々も、本発明の一部を形成する。これは属から任意の主題を除去する条件または負の限定を伴う本発明の一般的記載も含んでおり、削除された材料が本明細書に特定的に述べられているか否かは関係しない。
【００９８】
他の実施形態は、以下の請求項および非限定的な実施例の中にある。加えて、本発明の特徴または局面がマーカッシュグループによって記載されるとき、それによって本発明はマーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関しても記載されるものであることを当業者は認識するだろう。
【実施例】
【００９９】
実験セクション
本発明の異なる特徴をさらに例示する実施例を以下に提供する。加えてこれらの実施例は、本発明を実施するための有用な方法を例示する。これらの実施例は、請求される発明を限定するものではない。
【０１００】
実施例１。ＰＤ−１−ＦｃおよびＰＤ−Ｌ１−Ｆｃの構成および発現
ヒトＦｃと融合したヒトＰＤ−１の細胞外領域をコードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡ（配列番号１１）を合成し、これは５’末端にＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位を、３’末端にＥｃｏＲＩ部位を有した。このＤＮＡをＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで同じ制限酵素で消化したｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングして、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＰＤ−１−Ｆｃを得た。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（インビトロジェン）を用いて、適切なｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＰＤ−１−Ｆｃ発現ベクターをＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ）にトランスフェクトした。５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８の存在下での限界希釈によって、安定なトランスフェクタントを単離した。最大量のＰＤ−１−Ｆｃタンパク質を生成するクローンを選択して、無血清培地で増殖させた。最後に、無血清培養上清からプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによってＰＤ−１−Ｆｃタンパク質を精製した。２８０ｎｍの吸光度によって、タンパク質濃度を定めた。ＰＤ−１−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２３に示した。
【０１０１】
ヒトＦｃと融合したヒトＰＤ−Ｌ１の細胞外領域をコードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡ（配列番号１２）を合成し、これは５’末端にＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位を、３’末端にＥｃｏＲＩ部位を有した。このＤＮＡをＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで同じ制限酵素で消化したｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（インビトロジェン）にクローニングして、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃを得た。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（インビトロジェン）を用いて、適切なｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ発現ベクターをＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ）にトランスフェクトした。５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８の存在下での限界希釈によって、安定なトランスフェクタントを単離した。最大量のＰＤ−Ｌ１−Ｆｃタンパク質を生成するクローンを選択して、無血清培地で増殖させた。最後に、無血清培養上清からプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによってＰＤ−Ｌ１−Ｆｃタンパク質を精製した。２８０ｎｍの吸光度によって、タンパク質濃度を定めた。ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２４に示した。
【０１０２】
実施例２。ＣＨＯ細胞上に発現したＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ結合の特徴付け
細胞表面に組み換えヒトＰＤ−１を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞系を開発し、フローサイトメトリによってＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を定めるために用いた。全長ヒトＰＤ−１をコードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡ（配列番号１３）を合成し、これは５’末端にＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位を、３’末端にＥｃｏＲＩ部位を有した。このＤＮＡをＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで同じ制限酵素で消化したｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（インビトロジェン）にクローニングして、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＰＤ−１を得た。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（インビトロジェン）を用いて、適切なｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＰＤ−１発現ベクターをＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ）にトランスフェクトした。５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８の存在下での限界希釈によって、安定なトランスフェクタントを単離した。全長ヒトＰＤ−１のアミノ酸配列を配列番号１４に示した。ビオチンタンパク質標識キット（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を用いて、ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ組み換えタンパク質をビオチン標識した。ＰＤ−１トランスフェクトＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＰＤ−１）を異なる濃度のビオチン標識ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ（ビオチン−ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ）とインキュベートすることによって、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を評価した。細胞を洗浄し、アビジン−ＦＩＴＣによって結合を検出した。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリ（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いて、フローサイトメトリ分析を行った。図１Ａおよび図１Ｂに示す結果は、ビオチン−ＰＤ−Ｌ１−ＦｃがＣＨＯ／ＰＤ−１細胞に有効に結合できたことを示した。
【０１０３】
実施例３。ＰＤ−Ｌ１−ＦｃへのＰＤ−１−Ｆｃ結合の特徴付け
ビオチンタンパク質標識キット（ロシュ）を用いて、ＰＤ−１−Ｆｃ組み換えタンパク質をビオチン標識した。ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃでコートした９６ウェルプレートに、異なる濃度のビオチン標識ＰＤ−１−Ｆｃ（ＰＤ−１−Ｆｃ−ビオチン）を加えた後、室温にて１ｈインキュベートした。洗浄後にアビジン−ＨＲＰを加え、プレートをさらに１ｈインキュベートした。最後に３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ：３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ：ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）の基質として加え、４５０ｎｍにて吸光度を測定した。図２に示す結果は、ビオチン−ＰＤ−１−ＦｃがＰＤ−Ｌ１−Ｆｃに有効に結合できたことを示した。
【０１０４】
実施例４。ＰＤ−１に対するモノクローナル抗体の産生
ＰＤ−１に対するモノクローナル抗体を産生するために、完全フロイントアジュバント（シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））中の組み換えＰＤ−１−Ｆｃタンパク質によって、６週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスを３回皮下免疫化した。最終ブースターの４日後にマウスを屠殺し、脾細胞をＳＰ２／０細胞と融合した。融合細胞をヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ：ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ／ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ／ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）選択培地に懸濁し、９６ウェルマイクロタイター（ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ）プレートに蒔いた。１２日後に、ヒトＰＤ−１に特異的に結合することに対して、抗ＰＤ−１抗体産生ハイブリドーマクローンを選択した。ヒトＰＤ−１を認識するｍＡｂを分泌する１つのハイブリドーマ細胞系を確立して、６７Ｄ９と名付けた。マウスＡｂアイソタイピングキット（シグマ（Ｓｉｇｍａ））によって、６７Ｄ９抗体のアイソタイプは（ＩｇＧ２ａ，κ）であることを定めた。最後に、ハイブリドーマ細胞培養上清からプロテインＧアフィニティークロマトグラフによって６７Ｄ９抗体を精製した。
【０１０５】
実施例５。６７Ｄ９重鎖および軽鎖可変領域遺伝子のクローニング
ＴＲＩｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン）によって、６７Ｄ９ハイブリドーマ細胞からＲＮＡを単離した。５’ＲＡＣＥシステム（インビトロジェン）によって、製造者の指示に従ってハイブリドーマ細胞から６７Ｄ９の軽鎖および重鎖に対する可変領域ｃＤＮＡをクローニングした。６７Ｄ９重鎖のＰＣＲ増幅のための遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ：ｇｅｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒｓ）は、次のとおりであった。ＧＳＰ１−Ｈ、５’−ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＧＡＡ  ＧＧＴ  ＧＴＧ  ＣＡＣ  ＡＣＣ  ＡＣＴ−３’；ＧＳＰ２−Ｈ、５’−ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＴＣＡ  ＡＧＧ  ＴＣＡ−３’；ＧＳＰ３−Ｈ、５’−ＣＴＴ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＴＣＣ  ＴＡＧ  ＡＧＴ−３’。６７Ｄ９の軽鎖可変領域のＰＣＲ増幅に用いたＧＳＰは、次のとおりであった。ＧＳＰ１−Ｌ、５’−ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＴＣＡ  ＧＴＣ  ＣＡＡ  ＣＴ−３’；ＧＳＰ２−Ｌ、５’−ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＣＡ  ＣＴＧ  ＣＣＡ  ＴＣＡ  ＡＴＣ  ＴＴ−３’；ＧＳＰ３−Ｌ、５’−ＴＴＧ  ＴＴＣ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＣＡＣ  ＡＣＧ  ＡＣＴ  ＧＡ−３’。最終ＰＣＲ産物を、配列決定のためにｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））にクローニングした。６７Ｄ９の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１５および１６に示す。６７Ｄ９の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１７および１８に示す。
【０１０６】
実施例６。６７Ｄ９キメラ抗体の構成および発現
６７Ｄ９キメラ抗体（ｃ６７Ｄ９）重鎖をコードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡ（配列番号１９）を合成し、これは５’末端にＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位を、３’末端にＥｃｏＲＩ部位を有した。このＤＮＡをＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで同じ制限酵素で消化したｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（インビトロジェン）にクローニングして、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｃ６７Ｄ９Ｈを得た。ｃ６７Ｄ９軽鎖をコードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡ（配列番号２０）を合成し、これは５’末端にＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位を、３’末端にＥｃｏＲＩ部位を有した。このＤＮＡをＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで同じ制限酵素で消化したｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（インビトロジェン）にクローニングして、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｃ６７Ｄ９Ｌを得た。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬を用いて、適切なｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｃ６７Ｄ９ＨおよびｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｃ６７Ｄ９Ｌ発現ベクターをＣＨＯ−Ｋ１細胞にコトランスフェクトした。５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８の存在下での限界希釈によって、安定なトランスフェクタントを単離した。最大量のｃ６７Ｄ９を生成するクローンを選択して、無血清培地で増殖させた。最後に、無血清培養上清からプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによってｃ６７Ｄ９を精製した。２８０ｎｍの吸光度によって、抗体濃度を定めた。ｃ６７Ｄ９重鎖のアミノ酸配列を配列番号２１に示し、ｃ６７Ｄ９軽鎖のアミノ酸配列を配列番号２２に示した。
【０１０７】
実施例７。抗ＰＤ−１モノクローナル抗体６７Ｄ９のヒト化
プロテインデータバンク（ＰＤＢ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）で、６７Ｄ９の可変フラグメント（Ｆｖ：ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）と高い配列同一性を有する抗体配列をサーチした。６７Ｄ９の軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）に対して、２つの別々のＢＬＡＳＴＰサーチを行った。抗体１ＨＯＤ（ＰＤＢ  Ｎｏ．１ＨＯＤ）は、６７Ｄ９のＶＨと８３％の同一性、６７Ｄ９のＶＬと９０％の同一性を示す。我々は、６７Ｄ９のＶＨおよびＶＬのテンプレートとして１ＨＯＤを選択した。ホモロジーモデリング（ＩＮＳＩＧＨＴ  ＩＩ  ２００３、アクセルリス（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、ＣＡ）によって６７Ｄ９  Ｆｖの３次元構造を構築するために、６７Ｄ９のＶＬおよびＶＨならびにそれらのテンプレートの配列をそれぞれ整列させた。テンプレートから構造的に保存された領域に対する座標を割り当て、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩのホモロジー（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムによってループ領域を生成した。新たに構築した構造に分子動力学シミュレーションを行い、次いで１０００ステップの最急降下法によってエネルギー最小化した後に、ディスカバー（Ｄｉｓｃｏｖｅｒ）プログラムを用いた共役勾配法を行った。最後に、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ分子モデリングソフトウェアによって、６７Ｄ９の可変領域の分子モデルを得た。
【０１０８】
６７Ｄ９のヒト化バージョンの重鎖および軽鎖に対するヒトフレームワークとして、それぞれ軽鎖サブグループカッパＩＩＩ（ｈｕｍκＩＩＩ）および重鎖サブグループＩＩＩ（ｈｕｍＩＩＩ）のヒトコンセンサス配列を選択した（図３）。ヒト化抗体における相補性決定領域（ＣＤＲ）は、マウス抗体６７Ｄ９のものと同一になるように選択した。６７Ｄ９  Ｆｖの分子モデルは、６７Ｄ９とヒト抗体テンプレートとで異なった８つのフレームワーク領域（ＦＲ）残基がＣＤＲの５Å以内にあり、おそらくＣＤＲの構造に影響したであろうことを示した。したがって、ヒト化６７Ｄ９抗体（ｈｕ６７Ｄ９）におけるこれら８つのＦＲ残基は、ヒト抗体の残基ではなくマウス６７Ｄ９の残基となるように選択した（図３）。ｈｕ６７Ｄ９重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７および配列番号８に示した。ｈｕ６７Ｄ９軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号９および配列番号１０に示した。
【０１０９】
実施例８。抗ＰＤ−１ヒト化抗体ｈｕ６７Ｄ９の発現
ｈｕ６７Ｄ９重鎖をコードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡ（配列番号２５）を合成し、これは５’末端にＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位を、３’末端にＥｃｏＲＩ部位を有した。このＤＮＡをＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで同じ制限酵素で消化したｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（インビトロジェン）にクローニングして、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｈｕ６７Ｄ９Ｈを得た。ｈｕ６７Ｄ９軽鎖をコードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡ（配列番号２７）を合成し、これは５’末端にＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位を、３’末端にＥｃｏＲＩ部位を有した。このＤＮＡをＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで同じ制限酵素で消化したｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（インビトロジェン）にクローニングして、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｈｕ６７Ｄ９Ｌを得た。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬を用いて、適切なｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｈｕ６７Ｄ９ＨおよびｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｈｕ６７Ｄ９Ｌ発現ベクターをＣＨＯ−Ｋ１細胞にコトランスフェクトした。５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８の存在下での限界希釈によって、安定なトランスフェクタントを単離した。最大量のｈｕ６７Ｄ９を生成するクローンを選択して、無血清培地で増殖させた。最後に、無血清培養上清からプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによってｈｕ６７Ｄ９を精製した。２８０ｎｍの吸光度によって、抗体濃度を定めた。ｈｕ６７Ｄ９重鎖のアミノ酸配列を配列番号２６に示し、ｈｕ６７Ｄ９軽鎖のアミノ酸配列を配列番号２８に示した。
【０１１０】
実施例９。結合親和性測定。
ホラッシュ（Ｈｏｌａｓｈ）および同僚の記載する方法と類似の方法を用いて、６７Ｄ９、ｃ６７Ｄ９、およびｈｕ６７Ｄ９の結合親和性を定めた（Ｈｏｌａｓｈ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００２；９９（１７）：１１３９３−８）。簡単にいうと、固定した濃度の抗ＰＤ−１抗体を異なる濃度のＰＤ−１−Ｆｃとともに１時間インキュベートした。次いで、ＰＤ−１−Ｆｃでコートした９６ウェルプレートにこの混合物を加えた後に１ｈインキュベートした。洗浄後、（ｃ６７Ｄ９またはｈｕ６７Ｄ９を検出するための）ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトカッパまたは（６７Ｄ９を検出するための）ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスカッパを加え、プレートをさらに１ｈインキュベートした。最後にＨＲＰの基質としてＴＭＢを加え、４５０ｎｍにて吸光度を測定した。我々の結果は、６７Ｄ９、ｃ６７Ｄ９、およびｈｕ６７Ｄ９の結合親和性（ＫＤ）がそれぞれ１２．４ｐＭ、１６．９ｐＭおよび１５．４ｐＭであることを示した。
【０１１１】
実施例１０。抗ＰＤ−１抗体によるＰＤ−１発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞へのＰＤ−Ｌ１結合の遮断
フローサイトメトリアッセイを用いることによって、トランスフェクトＣＨＯ−Ｋ１（ＣＨＯ／ＰＤ−１）細胞に発現したＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１結合を遮断する能力について、抗ＰＤ−１抗体６７Ｄ９、ｃ６７Ｄ９、およびｈｕ６７Ｄ９をテストした。簡単にいうと、亜飽和濃度のビオチン−ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃを１０μｇ／ｍｌの６７Ｄ９、ｃ６７Ｄ９、またはｈｕ６７Ｄ９とともに１時間インキュベートした。次いで、この混合物をＣＨＯ／ＰＤ−１細胞に加えた。１時間後に細胞を洗浄し、アビジン−ＰＥによって結合を検出した。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリ（ベクトン・ディッキンソン）を用いて、フローサイトメトリ分析を行った。図４Ａ〜４Ｄに示す結果は、３つの抗ＰＤ−１抗体６７Ｄ９、ｃ６７Ｄ９、およびｈｕ６７Ｄ９のすべてが、トランスフェクトＣＨＯ−Ｋ１細胞に発現したＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１−Ｆｃの結合を有効に阻害したことを示した。
【０１１２】
実施例１１。ＣＤ２８ファミリーメンバーへの抗ＰＤ−１抗体の結合
標準的なＥＬＩＳＡを用いて、ＣＤ２８ファミリーメンバーＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２８（アールアンドディーシステム（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ））への抗ＰＤ−１抗体の結合を検出することによって、抗ＰＤ−１抗体の特異性を調べた。簡単にいうと、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８、またはＰＤ−１−Ｆｃでコートした９６ウェルプレートに、異なる濃度の６７Ｄ９、ｃ６７Ｄ９、またはｈｕ６７Ｄ９を加えた後、室温にて２ｈインキュベートした。洗浄後、（ｃ６７Ｄ９またはｈｕ６７Ｄ９を検出するための）ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトカッパまたは（６７Ｄ９を検出するための）ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスカッパを加え、プレートをさらに１ｈインキュベートした。最後にＨＲＰの基質としてＴＭＢを加え、４５０ｎｍにて吸光度を測定した。図５Ａ〜５Ｄに示されるとおり、抗ＰＤ−１抗体６７Ｄ９、ｃ６７Ｄ９、およびｈｕ６７Ｄ９の各々はＰＤ−Ｉに結合したが、その他のＣＤ２８ファミリーメンバー（ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２８）には結合しなかった。
【０１１３】
実施例１２。混合リンパ球反応における細胞増殖およびサイトカイン生成に対する抗ＰＤ−１抗体の影響
リンパ球エフェクター細胞に対するＰＤ−１経路を遮断することの影響を示すために、混合リンパ球反応を用いた。アッセイにおけるＴ細胞の、抗ＰＤ−１抗体の存在下および不在下での増殖、ＩＦＮ−ガンマ分泌、およびＩＬ−２分泌をテストした。簡単にいうと、フィコール・ハイパーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）密度勾配遠心分離によって、健康なボランティアのヘパリン処置血液からヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ）を単離した。ヒトＰＢＭＣを９６ウェル平底プレート内で一晩培養した。異なる抗体濃度の抗ＰＤ−１抗体（６７Ｄ９、ｃ６７Ｄ９、またはｈｕ６７Ｄ９）と、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）と、イオノマイシン（１０ｎｇ／ｍｌ）とを各培養物に加えた。ネガティブコントロールとして、対照ＩｇＧ４抗体を用いた。細胞を３７℃にて３日間培養した。次いで細胞を３Ｈ−チミジンで標識し、さらに６時間培養し、マイクロベータ（ＭｉｃｒｏＢｅｔａ）カウンター（パーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ））を用いることによって細胞増殖を分析した。図６Ａに示した結果は、３つの抗ＰＤ−１抗体６７Ｄ９、ｃ６７Ｄ９、およびｈｕ６７Ｄ９の各々が、濃度依存的な態様でＴ細胞増殖を促進したことを示した。
【０１１４】
ヒトＰＢＭＣを９６ウェル平底プレート内で一晩培養した。異なる抗体濃度の抗ＰＤ−１抗体（６７Ｄ９、ｃ６７Ｄ９、またはｈｕ６７Ｄ９）と、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）と、イオノマイシン（１０ｎｇ／ｍｌ）とを各培養物に加えた。ネガティブコントロールとして、対照ＩｇＧ４抗体を用いた。細胞を３７℃にて３日間培養した。次いで、サイトカイン測定のために各培養物から１００μｌの培地を取った。ＥＬＩＳＡキット（アールアンドディーシステム）を用いて、ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−２のレベルを測定した。その結果は、３つの抗ＰＤ−１抗体６７Ｄ９、ｃ６７Ｄ９、およびｈｕ６７Ｄ９の各々が、濃度依存的な態様でＩＬ−２（図６Ｂ）およびＩＦＮ−ガンマ（図６Ｃ）の分泌を促進したことを示した。
【０１１５】
実施例１３。マウスＰＤ−１およびカニクイザルＰＤ−１への抗ＰＤ−１抗体結合の特徴付け
実施例１のヒトＰＤ−１−Ｆｃと同じ方法を用いて、マウスＰＤ−１およびカニクイザルＰＤ−１をＦｃ融合タンパク質として調製した。ヒトＰＤ−１−Ｆｃ、マウスＰＤ−１−Ｆｃ、またはカニクイザルＰＤ−１−Ｆｃでコートした９６ウェルプレートに、異なる濃度の６７Ｄ９、ｃ６７Ｄ９、またはｈｕ６７Ｄ９を加えた後、室温にて１時間インキュベートした。洗浄後に、（ｃ６７Ｄ９またはｈｕ６７Ｄ９を検出するための）ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトカッパまたは（６７Ｄ９を検出するための）ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスカッパを加え、プレートをさらに１時間インキュベートした。最後にＨＲＰの基質としてＴＭＢを加え、４５０ｎｍにて吸光度を測定した。図７Ａ〜７Ｃに示されるとおり、抗ＰＤ−１抗体６７Ｄ９、ｃ６７Ｄ９、およびｈｕ６７Ｄ９の各々はヒトＰＤ−１−ＦｃおよびカニクイザルＰＤ−１−Ｆｃに結合したが、マウスＰＤ−１−Ｆｃには結合しなかった。
【０１１６】
実施例１４。熱安定性の測定
見かけの中点アンフォールディング温度（Ｔｍ）を識別するために、示差走査熱量測定（ＤＳＣ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｃａｌｏｒｍｅｔｒｙ）の測定を行った。状態の熱容量および温度変化によって誘導され得る遷移に関連する過剰な熱を測定するためにもＤＳＣを用いた。過剰熱容量の積分値は、このプロセスに対するエンタルピーである。主要なアンフォールディング遷移は、顕著な吸熱ピークとして現れる。
【０１１７】
ＰＢＳ（ｐＨ７．０）中のタンパク質濃度０．５ｍｇ／ｍＬのニボルマブ、ペムブロリズマブ、およびｈｕ６７Ｄ９溶液に対して、ＶＰ−ＤＳＣ（マイクロカル（Ｍｉｃｒｏｃａｌ）、ノースハンプトン（Ｎｏｒｔｈｈａｍｐｔｏｎ）、ＭＡ）を用いてＤＳＣ実験を行った。ｍＡｂを０．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度にて個別にテストし、タンパク質を有さない緩衝液対照を基準として用いた。サンプルは、１０℃における最初の１０ｍｉｎの平衡化の後に、１０℃から１２０℃まで１００℃／時間の速度で走査した。ベースライン値を得て熱履歴を確立するために、少なくとも５回の緩衝液−緩衝液走査を行った。オリジン（Ｏｒｉｇｉｎ）７．０（オリジンラボ（Ｏｒｉｇｉｎ−Ｌａｂ）、ノーサンプトン（Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ）、マサチューセッツ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ））を用いてデータを分析した。オリジンにおける非２状態モデルを用いてすべてのサーモグラムをベースライン補正（線形接続）および適合して、アンフォールディングの見かけの中点温度（Ｔｍ）およびアンフォールディングの見かけのエンタルピー（ΔＨ）を得た。図８および表１に示すとおり、ｈｕ６７Ｄ９のアンフォールディング温度はニボルマブおよびペムブロリズマブよりも高く、ｈｕ６７Ｄ９はニボルマブおよびペムブロリズマブよりも良好な熱安定性を有したことを示唆している。
【０１１８】
【表１】
2018529368.tif 000002
【０１１９】
実施例１５。動力学および親和性の測定
Ｂｉａｃｏｒｅシステムが用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）の光学現象は、標識を用いずにタンパク質−タンパク質相互作用をリアルタイムで検出および測定することを可能にする。相互作用の結合動力学を測定することによって、抗原に対する抗体の親和性を定めてもよい。
【０１２０】
動力学および親和性の定数の評価において、ＰＤ−１−Ｆｃ融合タンパク質を固定化し、ｈｕ６７Ｄ９およびニボルマブを泳動用緩衝液に希釈して分析した。
【０１２１】
速度定数の比率から親和性定数を算出した。図９に示すとおり、ｈｕ６７Ｄ９のＫＤは３．２０９Ｅ−１２Ｍであり、一方でニボルマブのＫＤは２．１１６Ｅ−１１Ｍである。これらの結果は、ｈｕ６７Ｄ９がニボルマブよりも高い親和性でＰＤ−１に結合することを示す。
【０１２２】
実施例１６  細胞表面ＰＤ−１による結合活性
標準的なフローサイトメトリアッセイを用いて、Ｈｕ６７Ｄ９がトランスフェクトＣＨＯ−Ｋ１（ＣＨＯ／ＰＤ−１）細胞上に発現したＰＤ−１に結合する能力をテストした。
【０１２３】
ｈｕ６７Ｄ９またはニボルマブの段階希釈物を、それぞれＣＨＯ／ＰＤ−１細胞とともにインキュベートした。１時間インキュベートした後、細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ標識抗ヒト抗体を１時間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリを用いてフローサイトメトリ分析を行った。
【０１２４】
図１０に示すとおり、ｈｕ６７Ｄ９およびニボルマブはどちらも細胞表面に発現したＰＤ−１に結合できた。ｈｕ６７Ｄ９のＥＣ５０値はニボルマブのものよりもかなり低く、これはｈｕ６７Ｄ９がニボルマブよりも高い親和性で細胞表面ＰＤ−１に結合することを示す。
【０１２５】
実施例１７  可溶性ＰＤ−１による結合活性
標準的なＥＬＩＳＡ技術を用いて、抗ＰＤ−１抗体の可溶性ＰＤ−１への結合を検出することによって、抗ＰＤ−１抗体の特異性を調べた。
【０１２６】
ＰＤ−１−Ｆｃでコートした９６ウェルプレートに、異なる濃度のｈｕ６７Ｄ９およびニボルマブを加えた後、室温にて２時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトカッパを加えて、プレートをさらに１時間インキュベートした。最後にＨＲＰの基質としてＴＭＢを加え、４５０ｎｍにて吸光度を測定した。
【０１２７】
図１１に示すとおり、ｈｕ６７Ｄ９およびニボルマブはどちらも可溶性ＰＤ−１に結合できた。ｈｕ６７Ｄ９のＥＣ５０値はニボルマブのものよりもかなり低く、これはｈｕ６７Ｄ９がニボルマブよりも高い親和性で可溶性ＰＤ−１に結合することを示す。
【０１２８】
実施例１８  ニボルマブによる細胞表面ＰＤ−１への競合的結合
フローサイトメトリアッセイによって、Ｈｕ６７Ｄ９がトランスフェクトＣＨＯ−Ｋ１（ＣＨＯ／ＰＤ−１）細胞上に発現したＰＤ−１の結合に競合する能力をテストした。
【０１２９】
亜飽和濃度のＦＩＴＣ標識ニボルマブを、段階希釈したｈｕ６７Ｄ９またはニボルマブとともにそれぞれインキュベートした。１時間インキュベートした後、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリを用いてフローサイトメトリ分析を行った。
【０１３０】
図１２に示すとおり、ｈｕ６７Ｄ９およびニボルマブはどちらも、細胞表面ＰＤ−１の結合に対してＦＩＴＣ標識ニボルマブと競合する。ｈｕ６７Ｄ９のＩＣ５０値はニボルマブのものよりもかなり低く、これはｈｕ６７Ｄ９がニボルマブよりも高い親和性で細胞表面ＰＤ−１に競合的に結合することを示す。
【０１３１】
実施例１９  ニボルマブによる可溶性ＰＤ−１への競合的結合
標準的なＥＬＩＳＡ技術を用いて、抗ＰＤ−１抗体の競合的結合可溶性ＰＤ−１活性を調べた。
【０１３２】
ＰＤ−１−Ｆｃでコートした９６ウェルプレートに、亜飽和濃度のビオチン標識ニボルマブおよび段階希釈したｈｕ６７Ｄ９またはニボルマブを加えた後、室温にて２時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰ−アビジンを加えて、プレートをさらに１時間インキュベートした。最後にＨＲＰの基質としてＴＭＢを加え、４５０ｎｍにて吸光度を測定した。
【０１３３】
図１３に示すとおり、ｈｕ６７Ｄ９およびニボルマブはどちらもビオチン標識ニボルマブと競合して可溶性ＰＤ−１に結合する。ｈｕ６７Ｄ９のＥＣ５０値はニボルマブのものよりもかなり低く、これはｈｕ６７Ｄ９がニボルマブよりも高い親和性で可溶性ＰＤ１に競合的に結合することを示す。
【０１３４】
実施例２０  ＰＤ−Ｌ１による可溶性ＰＤ１への競合的結合
標準的なＥＬＩＳＡ技術を用いて、抗ＰＤ−１抗体のＰＤ−Ｌ１との可溶性ＰＤ１への競合的結合を調べた。
【０１３５】
ＰＤ−１−Ｆｃでコートした９６ウェルプレートに、亜飽和濃度のビオチン標識ＰＤＬ１−Ｆｃおよび段階希釈したｈｕ６７Ｄ９またはニボルマブを加えた後、室温にて２時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰ−アビジンを加えて、プレートをさらに１時間インキュベートした。最後にＨＲＰの基質としてＴＭＢを加え、４５０ｎｍにて吸光度を測定した。
【０１３６】
図１４に示すとおり、ｈｕ６７Ｄ９およびニボルマブはどちらもビオチン標識ＰＤＬ１−Ｆｃと競合して可溶性ＰＤ−１に結合する。ｈｕ６７Ｄ９のＥＣ５０値はニボルマブのものよりもかなり低く、これはｈｕ６７Ｄ９がニボルマブよりも高い親和性で可溶性ＰＤ１に競合的に結合することを示す。
【図１】
2018529368.tif 000003
【図２】
2018529368.tif 000004
【図３Ａ】
2018529368.tif 000005
【図３Ｂ】
2018529368.tif 000006
【図４】
2018529368.tif 000007
【図５】
2018529368.tif 000008
【図６】
2018529368.tif 000009
【図７】
2018529368.tif 000010
【図８】
2018529368.tif 000011
【図９】
2018529368.tif 000012
【図１０】
2018529368.tif 000013
【図１１】
2018529368.tif 000014
【図１２】
2018529368.tif 000015
【図１３】
2018529368.tif 000016
【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年5月30日(2018.5.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
2018529368.tif 000018
【国際調査報告】
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2018529368.tif 000021
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