(57)【要約】本発明は、５ＦＵ及び／又はその前駆体が搭載されたアルブミンのナノ粒子に関する。さらに本発明は、上記ナノ粒子を含む医薬組成物もしくは５ＦＵ及び／又はその前駆体の送達システムに関する。本発明はまた、上記ナノ粒子を製造する方法に関し、またナノ粒子、医薬組成物、もしくは５ＦＵ及び／又はその前駆体の送達システムの、薬剤としての使用、具体的には腫瘍の治療用である使用に関する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
５ＦＵ及び／又はその前駆体が搭載されたアルブミンのナノ粒子であって、
５ＦＵ及び／又はその前駆体の量が１０〜５００μｇ／ｍｌの範囲であることを特徴とする
ナノ粒子。
【請求項２】
前記５ＦＵ及び／又はその前駆体の量が、５０〜２５０μｇ／ｍｌ、好ましくは７０〜２００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１５０〜２００μｇ／ｍｌの範囲内である、
請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記ナノ粒子の平均粒径が、５０〜２２０ｎｍ、好ましくは８０〜１８０ｎｍ、より好ましくは１００〜１５０ｎｍ、さらに好ましくは１１０〜１３０ｎｍの範囲内であり、さらに好ましくは約１２０ｎｍであることを特徴とする、
請求項１又は２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ粒子を含む医薬組成物であって、
前記５ＦＵ及び／又はその前駆体と前記アルブミンとの重量比が０．０５〜０．６であることを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項５】
前記重量比が０．０５〜０．４である、
請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記重量比が約０．２である、
請求項４又は５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ粒子又は請求項４〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む、
５ＦＵ及び／又はその前駆体を輸送するシステム。
【請求項８】
前記前駆体が、カペシタビン、ＵＦＴ、Ｓ−１、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ阻害剤、及び葉酸から選択される、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ粒子、請求項４〜６のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項７に記載の５ＦＵ及び／もしくはその前駆体を輸送するシステム。
【請求項９】
前記ナノ粒子が、２０〜８０ｍＶ、好ましくは３０〜６０ｍＶ、より好ましくは３５〜５０ｍＶのゼータ電位を特徴とする、
請求項４〜６及び８のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項７もしくは８に記載の５ＦＵ及び／もしくはその前駆体を輸送するシステム。
【請求項１０】
前記ナノ粒子が、０．０１〜１、好ましくは０．０５〜０．５、より好ましくは０．０７〜０．３の多分散性指標を特徴とする、
請求項４〜６及び８〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物、又は請求項７〜９のいずれか一項に記載の５ＦＵ及び／もしくはその前駆体を輸送するシステム。
【請求項１１】
前記アルブミンがヒト血清アルブミンである、
請求項１〜３及び８のいずれか一項に記載のナノ粒子、請求項４〜６及び８〜１０のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項７〜１０のいずれか一項に記載の５ＦＵ及び／もしくはその前駆体を輸送するシステム。
【請求項１２】
前記アルブミンの分子量が、５００００〜１０００００Ｄａ、好ましくは６００００〜７００００Ｄａの範囲内である、
請求項１１に記載のナノ粒子又は組成物又は５ＦＵ及び／もしくはその前駆体を輸送するシステム。
【請求項１３】
請求項１〜３、８、及び１１〜１２のいずれか一項に記載のナノ粒子又は請求項４〜６及び８〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物の、５ＦＵ及び／もしくはその前駆体を輸送するシステムとしての使用。
【請求項１４】
薬剤用である、
請求項１〜３、８、及び１１〜１２のいずれか一項に記載のナノ粒子、又は請求項４〜６及び８〜１２のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項７〜１２のいずれか一項に記載の５ＦＵを輸送するシステム。
【請求項１５】
腫瘍の治療用である、
請求項１〜３、８、及び１１〜１２のいずれか一項に記載のナノ粒子、又は請求項４〜６及び８〜１２のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項７〜１２のいずれか一項に記載の５ＦＵ及び／もしくはその前駆体を輸送するシステム。
【請求項１６】
前記腫瘍が、結腸癌、直腸癌、胃腺癌、頭頸部腫瘍、肝癌、膵癌、腹膜癌腫症、食道癌、乳癌、卵巣癌、小細胞肺腫瘍、非小細胞肺腫瘍、膀胱の非侵襲性表面癌、カポジ肉腫、及び軟部組織の肉腫から選択され、好ましくは、前記腫瘍が、結腸癌、直腸癌、胃腺癌、膵癌、乳癌、小細胞肺腫瘍、非小細胞肺腫瘍、膀胱の非侵襲性表面癌から選択される、
請求項１５に記載の用法の、ナノ粒子又は医薬組成物又は５ＦＵ及び／もしくはその前駆体を輸送するシステム。
【請求項１７】
非経口投与用である、
請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のナノ粒子又は医薬組成物又は５ＦＵを輸送するためのシステム。
【請求項１８】
前記非経口投与が、静脈内投与、好ましくはボーラス投与による静脈内投与である、
請求項１７に記載のナノ粒子又は医薬組成物又は５ＦＵを輸送するためのシステム。
【請求項１９】
少なくとも１つの化学療法剤の投与及び／又は放射線療法及び／又は外科手術と組み合わせて使用するための、
請求項１５〜１８のいずれか一項に記載のナノ粒子又は医薬組成物又は５ＦＵを輸送するためのシステム。
【請求項２０】
（ｉ）５ＦＵ／アルブミンのｗ／ｗ％比が２．５〜６０、かつｐＨが８〜１０の範囲であるアルブミンならびに５ＦＵ及び／又はその前駆体の溶液、好ましくは水溶液を調製し、１〜７２時間わたって前記２成分を反応させるステップと、
（ｉｉ）前記ステップ（ｉ）で得られた前記水溶液に有機溶媒を滴下して、好ましくは撹拌下で滴下して添加するステップ（滴下ステップ）と、
（ｉｉｉ）前記ステップ（ｉｉ）で得られた組成物を超音波処理するステップと、
（ｉｖ）架橋結合を、好ましくはグルタルアルデヒドを添加して誘導するステップと、
（ｖ）前記ステップ（ｉｉ）から得られたナノ粒子を、好ましくは遠心分離によって単離するステップと
を含む、
アルブミンならびに５ＦＵ及び／又はその前駆体を含むナノ粒子を製造する方法。
【請求項２１】
前記ステップ（ｉ）が、約２５℃、約６００ｒｐｍで実施される、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記５ＦＵ／アルブミンのｗ／ｗ％比が５〜４０である、
請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ステップ（ｉ）に係る前記溶液の前記ｐＨが約８．６である、
請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記アルブミンと５ＦＵ又はその前駆体との前記反応時間が、１〜４８時間、好ましくは約２４時間である、
請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記溶媒が、アルコール溶媒、好ましくはエタノールである、
請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ｉｉｉ）が、約２５℃、約６００ｒｐｍで５〜１０分間、好ましくは約５分間実施される、
請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記アルブミンに対する架橋剤の量が、アルブミン１ｍｇ当たり５０〜１５０ｍｇ、好ましくは８０〜１２０ｍｇ、より好ましくはアルブミン１ｍｇ当たり９０〜１００ｍｇ、さらに好ましくはアルブミン１ｍｇ当たり約９４ｍｇである、
請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ステップ（ｖ）の遠心分離が約１００００ｒｐｍで、好ましくは約１０〜１５分間、約１０℃の温度にて実施される、
請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ｐＨが、好ましくは約０．０１Ｍである、ＮａＯＨ溶液で調整される、
請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ｉｉ）が、約０．５〜２ミル／分、好ましくは約１ｍｌ／分の滴下速度で行われる、
請求項２０〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２０〜３０のいずれか一項に記載の方法を使用して得る／得ることができる、
５ＦＵ及び／又はその前駆体が搭載されたナノ粒子。
【請求項３２】
前記５ＦＵ及び／又はその前駆体の量が、１０〜５００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜２５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは７０〜２００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１５０〜２００μｇ／ｍｌである、
請求項３１に記載の５ＦＵ及び／又はその前駆体が搭載されたナノ粒子。
【請求項３３】
前記ナノ粒子の平均粒径が、５０〜２２０ｎｍ、好ましくは８０〜１８０ｎｍ、より好ましくは１００〜１５０ｎｍ、さらに好ましくは１１０〜１３０ｎｍの範囲内であり、さらに好ましくは約１２０ｎｍであることを特徴とする、
請求項３１又は３２に記載の５ＦＵ及び／又はその前駆体が搭載されたナノ粒子。
【請求項３４】
請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のナノ粒子及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項３５】
請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のナノ粒子又は請求項３４に記載の医薬組成物を含む、５ＦＵ及び／又はその前駆体を送達するシステム。
【請求項３６】
薬剤用である、
請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のナノ粒子、又は請求項３４に記載の医薬組成物、又は請求項３５に記載の５ＦＵ及び／又はその前駆体の送達システム。
【請求項３７】
腫瘍の治療用である、
請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のナノ粒子、又は請求項３４に記載の医薬組成物、又は請求項３５に記載の５ＦＵ及び／又はその前駆体の送達システム。
【請求項３８】
前記腫瘍が、結腸癌、直腸癌、胃腺癌、頭頸部腫瘍、肝癌、膵癌、腹膜癌腫症、食道癌、乳癌、卵巣癌、小細胞肺腫瘍、非小細胞肺腫瘍、膀胱の非侵襲性表面癌、カポジ肉腫、及び軟部組織の肉腫から選択され、好ましくは、前記腫瘍が、結腸癌、直腸癌、胃腺癌、膵癌、乳癌、小細胞肺腫瘍、非小細胞肺腫瘍、膀胱の非侵襲性表面癌から選択される、
請求項３７に記載の用法用である、ナノ粒子、又は医薬組成物、又は５ＦＵ及び／もしくはその前駆体の送達システム。
【請求項３９】
非経口投与用である、
請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の用法の、ナノ粒子又は医薬組成物又は５ＦＵを輸送するためのシステム。
【請求項４０】
前記非経口投与が、静脈内投与、好ましくはボーラス投与による静脈内投与である、
請求項３９に記載のナノ粒子又は医薬組成物又は５ＦＵを輸送するためのシステム。
【請求項４１】
少なくとも１つの化学療法剤の投与及び／又は放射線療法及び／又は外科手術と組み合わされる、
請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の用法の、ナノ粒子又は医薬組成物又は５ＦＵを輸送するためのシステム。
【請求項４２】
前記５ＦＵ及び／又はその前駆体が、１０〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１５〜３０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１７〜２２ｍｇ／ｍｌの一定量で放出される、
請求項１５〜１９及び３７〜４１のいずれか一項に記載の用法の、ナノ粒子又は医薬組成物又は５ＦＵを輸送するためのシステム。
【請求項４３】
前記放出が、少なくとも２４時間にわたって一定である、
請求項４２に記載の用法の、ナノ粒子又は医薬組成物又は５ＦＵを輸送するためのシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５ＦＵ及び／又はその前駆体が搭載されたアルブミンのナノ粒子に関する。さらに、本発明は、上記ナノ粒子を含む医薬組成物、もしくは５ＦＵ及び／又はこの前駆体の送達システムに関する。
【０００２】
本発明はまた、上記ナノ粒子を製造する方法、ならびに上記ナノ粒子、上記医薬組成物、もしくは上記５ＦＵ及び／又はこの前駆体の送達システムの、薬剤としての使用、具体的には腫瘍の治療用である使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
５−フルオロウラシル（５ＦＵ）及びその経口プロドラッグ（カペシタビン）は、腫瘍の治療のために最も一般的に処方される抗腫瘍薬の１つである。５ＦＵで治療されるのは、特に消化管、乳房、頭部、及び頚部の腫瘍である。
【０００４】
５ＦＵの投与に関連する有効性及び副作用は、個人内及び個人間で変動する。５ＦＵの薬物動態（ＰＫ：pharmacokinetic）変動は、様々な要因、例えば年齢、性別、疾患の状態、及び器官の機能などに関連している。
【０００５】
具体的には、分解酵素のジヒドロピリミジン脱水素酵素（ＤＰＤ）の活性が５ＦＵの薬物動態に影響を及ぼし得る主な要因の１つであることが最近実証された。実際、ＤＰＤが欠乏している被験者は多臓器毒性を示し、これが場合によっては５ＦＵによる治療後の死因となっている。
【０００６】
５ＦＵは低い治療指標を特徴としており、５ＦＵの治療薬物モニタリング（ＴＤＭ）（ＰＫ／ＰＤデータに基づく投与量の採用）には、非最適投薬量又は５ＦＵへの過剰曝露の影響を緩和する有益な効果がある。
【０００７】
５ＦＵの有害作用はプログラムに依存する。例えば骨髄毒性は、５ＦＵのボーラス投与の主要な毒作用であり、手足症候群、口内炎、神経毒性、及び心毒性は主として持続注入に付随して起こる。現時点では、５ＦＵの持続注入は、安全性及び薬力学の観点からボーラス投与よりも好ましいと考えられている。
【０００８】
５ＦＵの毒性を克服するため、プロドラッグの開発など数多くの努力がなされてきた。しかしながら、患者内及び患者間の、薬物動態パラメータの変動性の故に安全性の問題が生じており、これらの化合物の前提と相関する医薬品モニタリング（ＴＤＭ）の必要性がある
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、今日でも、５ＦＵの薬物動態的特性及び薬力学的特性（ＰＫ／ＰＤ）を改善する必要がある。具体的には、標的特異的であり、かつ制御された薬物放出を可能にする新しい５ＦＵ製剤が必要とされている。
【００１０】
上記難題を克服する試みにおいて、５ＦＵ送達の調節を可能にする様々なシステム（例えば、マイクロスフェア、リポソーム、及びナノ粒子の使用に基づくシステム）が研究され製造されている。最近では、５ＦＵは、ゼインのナノ粒子にカプセル化して製剤化されているが、これは肝臓薬物送達に限定された製剤化である。
【００１１】
したがって、反復投与又は低速注入に頼ることなく５ＦＵ薬物の一定の治療濃度の放出を保証することができる５ＦＵ送達システム、具体的には、薬物の非経口投与に適したシステムの開発の必要性は依然として大きい。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上に報告した必要性は、本出願人によって、５ＦＵ及び／もしくはその前駆体が搭載されたアルブミンナノ粒子又はこの搭載ナノ粒子を含む医薬組成物もしくは送達システムにより解決されている。このナノ粒子は、２００未満〜２２０ｎｍの平均直径を特徴とし、治療上有効な投与量の薬物を長期にわたって一定に放出することができる。さらにその小さな寸法のおかげで、特に腫瘍の治療用に、効果的に非経口投与される。
【００１３】
本発明はまた、５ＦＵ及び／又はその前駆体搭載ナノ粒子を調製する方法に関し、この方法は、アルブミン及び薬物の溶液を調製するステップと、溶媒を滴下付加して、その溶液を脱溶媒和するステップと、脱溶媒和した溶液を超音波処理するステップと、架橋結合を誘導するステップと、得られたナノ粒子を単離するステップと、可能ならば単離したナノ粒子を凍結乾燥させるステップとを含む。
【００１４】
本発明のナノ粒子又は医薬組成物／送達システムには、ゼータ電位の高い測定値によって実証されるように、有利に高い安定性がある。さらにこれらは、低い多分散性指標を示すため、単分散均質システムである。すなわち、システム／組成物の各ナノ粒子が平均的な同様の寸法を有している。したがって、本発明のナノ粒子又は医薬組成物／送達システムは、長期間にわたって一定量の薬物を含み、これを放出する。最後に、ナノ粒子の寸法は２００未満〜２２０ｎｍであるため、５ＦＵ及び／又はその前駆体の非経口注入による投与に理想的なシステムであることを示している。
【００１５】
本発明を、添付図面を補助として以下に詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】以下の溶液、すなわち、６μＭのＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）、６μＭのＨＳＡ＋０．５μＭの５ＦＵ、６μＭのＨＳＡ＋１μＭの５ＦＵ、及び６μＭのＨＳＡ＋５００μＭの５ＦＵの蛍光消光研究の結果を示す。
【図２】３種類のモル比のＨＳＡ−５ＦＵ複合体、すなわち、ＨＳＡ＋０．５μＭ、１μＭ、及び５００μＭの薬物のＵＶスペクトル分析の結果を示す。
【図３】（Ａ）ＰＢＳ中の遊離薬物の溶解曲線、及び（Ｂ）アルブミンナノ粒子に組み込まれた５ＦＵ、すなわち本発明の送達システムの放出曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の第１の態様は、１０〜５００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜２５０μｇ／ｍｌの量の５ＦＵ及び／又はその前駆体が搭載されたアルブミンナノ粒子に関する。より好ましくは、アルブミンナノ粒子に搭載される５ＦＵ及び／又はその前駆体の量は、７０〜２００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１５０〜２００μｇ／ｍｌである。
【００１８】
本発明のナノ粒子は、好ましくは５０〜２２０ｎｍ、より好ましくは８０〜１８０ｎｍ、さらに好ましくは１００〜１５０ｎｍ、さらに好ましくは１１０〜１３０ｎｍ、さらに好ましくは約１２０ｎｍの平均粒径を特徴とする。
【００１９】
平均粒径、すなわち平均粒子寸法は、Ｚ平均としても示される。これは、具体的には５ＦＵ及び／又はその前駆体などの抗腫瘍作用を有する薬物など薬物の非経口投与にとって、非常に重要なパラメータである。
【００２０】
本発明の文脈において、非経口投与は、血管内投与（例えばボーラス投与による静脈内投与もしくは動脈内投与）、筋肉内投与、又は皮膚投与（皮下投与もしくは皮内投与）を意味する。
【００２１】
本発明のさらなる態様は、上記のナノ粒子及び許容される医薬賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００２２】
本発明のさらなる態様は、本発明のナノ粒子又は医薬組成物を含む、５ＦＵ及び／又はその前駆体の送達（又は輸送）システムに関する。したがって、本発明の別の態様は、５ＦＵ及び／又はその前駆体の送達システムとしての、本発明のナノ粒子又は医薬組成物の使用に関する。具体的には、この薬物の送達は、治療上有効な投与量の薬物の一定の送達であることが好ましい。さらに、この送達は、好ましくは部位特異的であり、好ましくは腫瘍領域に関する。
【００２３】
一部の実施形態では、前記５ＦＵ及び／又はその前駆体と前記アルブミンとの重量比は、好ましくは０．００５〜４、より好ましくは０．０１〜１、さらに好ましくは０．０２５〜０．８、さらに好ましくは０．０５〜０．４、さらに好ましくは約０．２である。換言すれば、ナノ粒子／医薬組成物／送達システムの５ＦＵ及び／又は前駆体／アルブミンの重量百分率濃度（ｗ／ｗ％）は、０．５〜４００、より好ましくは１〜１００、さらに好ましくは２．５〜８０、さらに好ましくは５〜４０、さらに好ましくは約２０である。
【００２４】
有利なことに、本発明のナノ粒子／医薬組成物／送達システムには非常に安定性がある。実際、これらのゼータ電位は、好ましくは２０〜８０ｍＶ、好ましくは３０〜６０ｍＶ、さらに好ましくは３５〜５０ｍＶである。
【００２５】
本発明の文脈において、ゼータ電位は、ナノ粒子の拡散手段とナノ粒子の溶媒和物の電気二重層との電位差を意味する。ゼータ電位は、ナノ粒子の安定性（すなわち、より低い凝集性）の指標である。一般に３０〜４０ｍＶの電位が中程度の安定性の指標である。４０〜６０ｍＶの電位が良好な安定性の指標である。
【００２６】
有利なことに、本発明のナノ粒子／医薬組成物／送達システムはまた、非常に均質なシステムであり、したがって高品質である。実際、これらの多分散性指標は、好ましくは０．０１〜１、より好ましくは０．０５〜０．５、さらに好ましくは０．０７〜０．３である。
【００２７】
多分散性指標（すなわちＰＤＩ）は、ナノ粒子の次元分布（dimensional distribution）を考慮するパラメータである。ＰＤＩが低いほど、試料はより均質である。
【００２８】
本発明の好ましい一実施形態では、５ＦＵの前駆体は、カペシタビン、ＵＦＴ、S−１、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ阻害剤、及び葉酸から選択される。
【００２９】
本発明のさらに好ましい一実施形態では、アルブミンは、タンパク全体であってもその断片であってもよい。アルブミンは、好ましくはヒトのアルブミンであり、具体的には、好ましくはヒトの血清から抽出される。アルブミンは、５００００〜１０００００Ｄａ、好ましくは６００００〜７００００Ｄａの分子量を特徴とすることが好ましい。
【００３０】
本発明に使用するアルブミンは、ＥＣ規則の手順(EC regulated procedure)に従って、すなわちＧＭＰで抽出されることが好ましく、また以下のタンパク質、すなわち、Ｂ型肝炎（ＨＢｓＡｇ）及び／又はヒト免疫不全症（ＨＩＶ）の抗ウイルス抗体及び／又はＣ型肝炎抗ウイルス抗体（ＨＣＶ）の少なくとも１つに対して陰性であることが好ましい。本発明のアルブミンはプラズママスターファイル(Plasma Master File)に準拠することが好ましい。
【００３１】
本発明のさらなる態様は、薬剤として使用するためのナノ粒子／医薬組成物／送達システムに関する。
【００３２】
本発明のさらなる態様は、腫瘍の治療に使用するためのナノ粒子／医薬組成物／送達システムに関する。
【００３３】
好ましくは医療用の５ＦＵ及び／又はその前駆体の非経口投与、好ましくは血管内投与、より好ましくは静脈内投与（好ましくはボーラス投与による）又は動脈内投与が推奨される。
【００３４】
あるいは、投与は、筋肉内投与又は皮膚投与、好ましくは皮下投与もしくは皮内投与である。
【００３５】
本発明のナノ粒子／医薬組成物／送達システムは、薬物の初期搭載量の約１０％である５ＦＵ及び／又はその前駆体の一定の放出を可能にすることが好ましい。この放出は、好ましくはそれが非経口投与される場合、最長２４時間又はこれを上回る時間にわたって継続されることが好ましい。換言すれば、本発明のナノ粒子／医薬組成物／送達システムの放出効率は、搭載された薬物の約１０％である。
【００３６】
本発明のナノ粒子／医薬組成物／送達システムによって一定に放出される薬物の量は、約１０〜５０μｇ／ｍｌ、好ましくは１５〜３０μｇ／ｍｌ、より好ましくは１７〜２２μｇ／ｍｌである。
【００３７】
本発明の５ＦＵのナノ粒子又は医薬組成物又は送達システムで好ましくは治療可能である腫瘍は、結腸癌、直腸癌、胃腺癌、頭頸部腫瘍、肝癌、膵癌、腹膜癌腫症、食道癌、乳癌、卵巣癌、小細胞肺腫瘍(microcytoma lung tumour)、非小細胞肺腫瘍、膀胱の非侵襲性表面癌(non-invasive surface carcinoma)、カポジ肉腫、及び軟部組織の肉腫から選択され、好ましくは、この腫瘍は、結腸癌、直腸癌、胃腺癌、膵癌、乳癌、小細胞肺腫瘍、非小細胞肺腫瘍、膀胱の非侵襲性表面癌から選択される。
【００３８】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明によるナノ粒子又は医薬組成物又は５ＦＵを輸送するためのシステムは、少なくとも１つの化学療法剤及び／又は放射線療法及び／又は外科手術と組み合わせて投与することができる。
【００３９】
本発明のさらなる一実施形態は腫瘍を治療する方法に関し、この方法は、治療有効量の５ＦＵ及び／もしくはその前駆体が搭載されたナノ粒子を、又はそのナノ粒子を含む組成物もしくは送達システムで患者に投与するステップであって、該ナノ粒子／医薬組成物が上記を特徴とするステップを含む。治療される腫瘍は上記のものであることが好ましい。
【００４０】
本発明のさらに好ましい一態様は、アルブミンならびに５ＦＵ及び／又はその前駆体を含むナノ粒子を製造する方法に関し、この方法は、
（ｉ）アルブミンならびに５ＦＵ及び／又はその前駆体の溶液、好ましくは水溶液を調製するステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で得られた水溶液に有機溶媒、好ましくはアルコール溶媒、より好ましくはエタノールを、好ましくは撹拌下で、滴下により添加するステップ（滴下ステップ）と、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で得られた組成物を超音波処理するステップと、
（ｉｖ）好ましくはグルタルアルデヒドを添加して、架橋結合を誘導するステップと、可能ならば
（ｖ）ステップ（ｉｉ）から得られたナノ粒子を、好ましくは遠心分離／超遠心分離によって単離するステップと
を含む。
【００４１】
あるいは、本発明の方法は、５ＦＵ及び／又はその前駆体が搭載されたアルブミンのナノ粒子を製造する方法として規定することもできる。
【００４２】
アルブミンならびに５ＦＵ及び／又はその前駆体は、好ましくは２．５〜６０、より好ましくは５〜４０の５ＦＵ／アルブミンのｗ／ｗ％比でステップ（ｉ）に係る溶液中に存在することが好ましい。溶液のｐＨは、好ましくは８〜１０、より好ましくは８．５〜９、さらに好ましくは約８．６である。
【００４３】
ステップ（ｉ）に係る２つの成分は、好ましくは１〜７２時間、より好ましくは１〜４８時間、さらに好ましくは約２４時間にわたって反応させ続けることが好ましい。
【００４４】
本発明の好ましい一実施形態では、ステップ（ｉ）は、約２５℃、約６００ｒｐｍで実施される。
【００４５】
本発明のさらに好ましい一実施形態では、ステップ（ｉｉ）で添加される溶媒の量は、ステップ（ｉ）の溶液のｐＨに依存する。
【００４６】
ステップ（ｉｉ）は、約０．５〜２ｍｌ／分、好ましくは約１ｍｌ／分の滴下速度で行われることが好ましい。
【００４７】
本発明の好ましい一実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）は、約２５℃、約６００ｒｐｍで５〜１０分間、好ましくは約５分間実施される。
【００４８】
本発明の好ましい一実施形態では、アルブミンに対するステップ（ｉｖ）の架橋剤、好ましくはグルタルアルデヒドの量は、アルブミン１ｍｇ当たり５０〜１５０ｍｇ、より好ましくはアルブミン１ｍｇ当たり８０〜１２０ｍｇ、さらに好ましくはアルブミン１ｍｇ当たり９０〜１００ｍｇ、さらに好ましくはアルブミン１ｍｇ当たり約９４ｍｇである。
【００４９】
グルタルアルデヒドの代わりに、可能ならば好ましくは１〜１０ｍＭの濃度にてグルコース、マンノース、又はエリトロースなどのポリアルコールの存在下で、ＵＶ照射を架橋剤として使用すること、又はジスルフィド架橋で架橋結合を行うことが可能である。
【００５０】
本発明の好ましい一実施形態では、ステップ（ｖ）の遠心分離／超遠心分離は、好ましくは約１０℃の温度、約１００００ｒｐｍで好ましくは約１０〜１５分間実施されることが好ましい。
【００５１】
本発明の好ましい一実施形態では、溶液のｐＨをＮａＯＨ、好ましくは０．０１ＭのＮａＯＨで調整することが推奨される。
【００５２】
可能ならば、ステップ（ｉｖ）又は（ｖ）の後に、搭載ナノ粒子又は搭載ナノ粒子を含有する医薬組成物もしくは送達システムを凍結乾燥してもよい。
【００５３】
この凍結乾燥ステップは、好ましくは７〜７．６、より好ましくは約７．４の中性ｐＨであるＰＢＳなどの生理食塩水中で、好ましくは遠心分離／超遠心分離によって、単離したナノ粒子を再懸濁することにより行われることが好ましい。
【００５４】
この生理食塩水に、例えばグルコース、トレハロース、マンニトール、スクロース、エリトロース、又はベータ−シクロデキストリン、好ましくはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンである凍結防止剤を添加することが好ましい。この凍結防止剤の濃度は１〜１０％であることが好ましい。
【００５５】
次にこの溶液を、好ましくは約−２０℃で凍結し、凍結乾燥させる。
【００５６】
本発明のさらなる態様は、本発明に係る方法によって得る／得ることができるナノ粒子、又は、この方法で得たナノ粒子を含む、５ＦＵ及び／もしくはその前駆体の医薬組成物又は送達システムに関する。
【００５７】
上記ナノ粒子は、好ましくは５０〜２２０ｎｍ、より好ましくは８０〜１８０ｎｍ、さらに好ましくは１００〜１５０ｎｍ、さらに好ましくは１１０〜１３０ｎｍ、さらに好ましくは約１２０ｎｍの平均粒径を特徴とする。
【００５８】
本発明のナノ粒子は、５〜４０％、好ましくは７〜２０％の効率で薬物が搭載されることが好ましい。搭載薬物に関してアルブミンと薬物との上記重量比を考えると、薬物量は１０〜５００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜２５０μｇ／ｍｌとなる。より好ましくは、５ＦＵ及び／又はその前駆体の量は、７０〜２００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１５０〜２００μｇ／ｍｌである。
【００５９】
本発明のナノ粒子／医薬組成物／送達システムは、薬物の初期搭載量の好ましくは約１０％である、５ＦＵ及び／又はその前駆体の一定の放出を可能にする。この放出は、好ましくはそれが非経口投与される場合、最長２４時間又はこれを上回る時間にわたって継続されることが好ましい。換言すれば、本発明のナノ粒子／医薬組成物／送達システムの放出効率は、搭載された薬物の量の約１０％である。
【００６０】
本発明のナノ粒子／医薬組成物／送達システムによって一定に放出される薬物の量は、約１０〜５０μｇ／ｍｌ、好ましくは１５〜３０μｇ／ｍｌ、より好ましくは１７〜２２μｇ／ｍｌである。
【実施例】
【００６１】
５ＦＵ−ＨＳＡ結合の研究
ＨＳＡは、様々な結合部位を有する球状タンパク質である。大部分の分子は、部位Ｉ（サブドメインＩＩＡ）及び部位ＩＩ（サブドメインＩＩＩＡ）と呼ばれる２つの部位に結合する。
【００６２】
Ｂｅｒｔｕｃｃｉらにおいて、５ＦＵが優先的にアルブミンの部位Ｉに結合することが実証されている。文献で入手可能な少量のデータを深めるために、ヒト血清アルブミンと５ＦＵの結合に関するインシリコの及び化学物理的な評価を行った。
【００６３】
インシリコ評価
５ＦＵ−ＨＳＡ結合の計算分析を、Ａｕｔｏｄｏｃｋ４．２及びＦＲＥＤ（ＯｐｅｎＥｙｅｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）を予測ソフトウェアとして使用して分子ドッキングにより行った。
【００６４】
一般に、分子ドッキングを研究すると、化合物のその標的への結合様式を予測することができる。結合様式は技術的にはポーズとして知られており、各ポーズはドッキングスコアに関連付けられる。より詳しくは、結合は、このスコアが低い（すなわち、より負である）ほどより好ましいと考えられる。
【００６５】
ＨＳＡの３Ｄ構造を、ウェブサイトＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（タンパク質構造データバンク）(pdb.org)で検索して入手し、リガンドが存在しない２ＢＸＦのＰＤＢ構造を使用した。５ＦＵ、アスピリン、及びパクリタキセルの構造ファイルについては、ウェブサイトＰｕｂＣｈｅｍ(pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)から入手した。
【００６６】
最初に、特定のＨＳＡ部位を考慮せずに５ＦＵのブラインドドッキングを行った。実際は、ブラインドドッキングは近似的な処置である。なぜなら分子ドッキングは、薬理学的標的全体にわたって行われるからである。５ＦＵに関して、ポーズの大部分は、部位Ｉ（サブドメインＩＩＡ）に局在する。
【００６７】
その後、サブドメインＩＩＡにおける５ＦＵのドッキングに限定して、より正確な計算を行った。この計算は、最初にＡｕｔｏｄｏｃｋ４．２を用いて行い、続いてＦＲＥＤを用いて行った。
【００６８】
化学物理的特性評価
ＨＳＡ脂肪（無酸、シグマアルドリッチ（登録商標）製）及び５ＦＵ（分析グレード、シグマアルドリッチ製）を、ｐＨ７．２のＰＢＳ中で可溶化し、ストック溶液（６０μＭのアルブミン、１０ｍＭ、１ｍＭ、１０μＭの５ＦＵ）を調製した。これらのストック溶液を、供給業者指定の様式に従ってアンバーガラスバイアル中で、４℃で保存した。
【００６９】
黒色のＦｌｕｏｒｏ  Ｎｕｎｃ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）のマルチウェルのウェル内に、最大量２００μlの上記分析溶液を調製した。
【００７０】
このマルチウェルを４℃で１２時間インキュベートし、その後、蛍光を測定した。
【００７１】
蛍光発光スペクトルを、λｅｘ＝２９５ｎｍ、帯域幅５ｎｍ、スペクトル範囲３００〜４４０ｎｍ、測定長さ３００ｍｓ、装置温度２４℃にて、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ  Ｆｌａｓｈ  ｍｕｌｔｉｒｅａｄｅｒ（登録商標）を使用して収集した。
【００７２】
５ＦＵは、２９５ｎｍでは励起されず、分析スペクトル範囲では蛍光を発しない。
【００７３】
５ＦＵに関して、より高い濃度において、上記の範囲に非常に低い蛍光を検出した（５００μＭにおいて、相対蛍光単位ＲＦＵ＝４）。
【００７４】
紫外可視吸収分光法に関しては、紫外可視透過マルチウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＵＶ−Ｓｔａｒ（登録商標）製マルチウェル）のウェル内に、最大量２００μlの上記分析溶液を調製した。紫外可視スペクトルを、帯域幅５ｎｍ、スペクトル範囲２００〜４４０ｎｍ、装置温度２４℃にて、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ  Ｆｌａｓｈ  ｍｕｌｔｉｒｅａｄｅｒ（登録商標）を使用して収集した。
【００７５】
結果
５ＦＵは、好ましくはＨＳＡの部位Ｉに結合し、ＨＳＡの残基Ｌｙｓ１８９、Ａｒｇ２２２、Ｇlｕ２９２との水素結合を形成する。トリプトファン２１４は、これらの残基の近傍にある。これまでの蛍光の消光に関する研究によれば、５ＦＵとＨＳＡのドメインＩとで結合が起こることが実証されている。
【００７６】
図１は、以下の溶液の蛍光スペクトルを示す。
・ＨＳＡ  ６μＭ
・ＨＳＡ  ６μＭ  ＋  ５ＦＵ  ０．５μＭ
・ＨＳＡ  ６μＭ  ＋  ５ＦＵ  １μＭ
・ＨＳＡ  ６μＭ  ＋  ５ＦＵ  ５００μＭ
【００７７】
図１に報告した結果は、薬物の濃度を増加させると蛍光が消光することを実証している。さらに、５ＦＵの濃度が高いと、深色効果（赤色シフト）が生じる。これは、Ｔｒｐ２１４がより極性の高い環境に曝露される（溶媒により一層曝露される）ことを示している。このデータは、（インシリコデータにおいて）５ＦＵの結合が起こるＨＳＡポケットが親水性環境を成すという事実と一致する。
【００７８】
さらに、５ＦＵとの結合に続いて、ＨＳＡの立体構造の変化があり、Ｔｒｐ２１４はより極性の高い環境に曝露され得る。
【００７９】
さらに、濃度５００μＭで５ＦＵに等吸収点が形成されることを観察した。これは、この濃度では５ＦＵ／ＨＳＡ複合体の形成反応が平衡であること、すなわち、この複合体の形成速度がその解離速度と等しいことを示している。
【００８０】
５ＦＵの消光が動的過程、すなわち５ＦＵとフルオロフォアであるＴｒｐ２１４との単純な衝突と、静的過程、すなわち安定的な５ＦＵ／ＨＳＡ結合の形成によるＴｒｐ２１４周囲での安定的な変化とのどちらに起因するのかを評価するために、ＨＳＡ／５ＦＵの２種類の異なるモル比（６μＭ／１μＭ及び６μＭ／５００μＭ）を考慮して、これらの複合体のＵＶスペクトルの分析を行った。
【００８１】
５ＦＵの濃度が低い場合、ＨＳＡスペクトルは影響を受けない。これは、低濃度（平衡から遠い）では、実際のＨＳＡ／５ＦＵ複合体が形成されないことを示している。
【００８２】
一方、高濃度の場合、ＨＳＡスペクトルは、図２に報告するように著しく影響を受ける。これは、５ＦＵがＨＳＡに安定的に結合するということであり、静的な蛍光の消光を示している。
【００８３】
結論として、インシリコデータならびに蛍光及びＵＶの分光法データから、安定的な５ＦＵ／ＨＳＡ結合が形成されることがわかる。この結合は、ＩＩＡサブドメイン（すなわち部位Ｉ）で起こり、高い確率でこの部位の立体構造変化を誘導し、その親水性（深色効果）を増加させる。
【００８４】
アルブミンナノ粒子の調製
２００ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を２ミリリットルの再蒸留水に溶解させて、アルブミンの脱溶媒和液(desolvated solution)（濃度１０％ｐ／ｖ）を調製した。その後、この溶液を、０．０１ＭのＮａＯＨ溶液で異なるｐＨ値にした。
【００８５】
次に、８ミリリットルの無水エタノールを、６００ｒｐｍの撹拌下で、約１．０ミリリットル／秒の滴下速度で滴下して添加した（エタノールの添加量はタンパク質濃度に相関）。
【００８６】
２３５マイクロリットルの８％グルタルアルデヒド（ＨＳＡ１ミリグラム当たり１．１７５マイクロリットルのグルタルアルデヒドに相当）を添加して架橋結合を行った。この試料を、周囲温度で２４時間撹拌し続けた。
【００８７】
このナノ粒子を、１０℃、１００００ｒｐｍで１２分間遠心分離して単離した。
【００８８】
最後に、このナノ粒子を水中に再懸濁させてから５分間超音波処理した。
【００８９】
以下の製剤の変種を実施した。ここでは、ｐＨ、温度、超音波処理モード、グルタルアルデヒド量を変量と見なしている。
【００９０】
具体的には、試験した製剤は、以下の表のバッチ列にまとめた通りである。これらを、表１の実験条件で実施した。
【表１】
2018530613.tif 000003
【００９１】
ナノ粒子の物理化学的特性評価
ナノ粒子の平均粒径（Ｚ平均）、多分散性指標（ＰＤＩ）、及びゼータ電位を測定するため、光子相関分光法を使用するＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ９０を用いてナノキャリアを分析した。
【００９２】
寸法分析を、動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して行った。
【００９３】
上記試料を、再蒸留水で１：１０に希釈して、多重散乱現象を回避した。取得したデータを以下の表ＩＩに報告する。
【表２】
2018530613.tif 000004
表にまとめた結果から分かるように、得られた粒子の直径は、２００ｎｍ未満（平均直径１２５．４５ｎｍ）であり、したがって、これは、長期の持続注入によるナノ粒子（静脈内）注入の可能性を実現させるものである。
【００９４】
薬物の組み込み
タンパク質基質に薬物を組み込むことによって、５ＦＵが搭載されたＨＳＡナノ粒子を調製した。この組み込みを、ナノ粒子を製造するためにタンパク質と共に薬物を可溶化し、次に脱溶媒和することによって実施した。
【００９５】
脱溶媒和ステップ中の組み込み方法
この方法のすべてのステップを、照明から離して(out of the light)行った。
【００９６】
薬物（量は表ＩＩＩに記載）を、ＨＳＡと共に２ミリリットルの水に溶解させる。次に、これを、２５℃、６００ｒｐｍで様々な時間（２〜２４時間の試験時間）にわたり撹拌し続けて、タンパク質への薬物の吸着を可能にする。
【００９７】
次に、この溶液のｐＨ値を制御し、可能ならば０．０１ＭのＮａＯＨで調整する。様々なｐＨ値を試験したところ、ｐＨ８．６で最良の結果を得た。
【００９８】
次に、約８ミリリットルのエタノールで脱溶媒和を行い、バスでの超音波処理を、２５℃、６００ｒｐｍで５分間行う。
【００９９】
次に、この試料を、架橋結合ステップ（２３５マイクロリットルの８％グルタルアルデヒド使用）に供する。
【０１００】
得られたナノ粒子を、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０℃、１０分間）によって単離し、上清の５ＦＵ含有量を特定する。
【０１０１】
カプセル化の効率を、搭載量からナノ粒子中の５ＦＵの量を差し引くことによって上清で間接的に特定した。次に、この試料を、ナノ粒子中の薬物の含有量を特定するためにＨＰＬＣ−ＭＳによって分析した。
（数１）
カプセル化効率％＝ＮＰ中の薬物重量＊１００／搭載薬物重量
（数２）
ナノ粒子中の薬物重量＝搭載薬物重量−上清中の薬物重量
【０１０２】
ナノ粒子の寸法及び面負荷（ｍＶ）ならびに薬物が搭載されたシステムのカプセル化効率％分析及び薬物搭載量を特定するため、ナノ粒子の化学−物理的特性評価をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ９０によって実施した。
【０１０３】
薬物のカプセル化の効率を、上記の実験条件で得られた様々な試料のＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によって特定した。
【０１０４】
要約すると、カプセル化の効率を、１）搭載量からナノ粒子中の５ＦＵの量を差し引くことによって上清で間接的に測定し、２）４℃、１０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して単離したナノ粒子から薬物を直接的に抽出して特定した。そのペレットを、１ｍｌのＭｅＯＨで処理し、２０分間超音波バス内に配置した。これらの試料をＨＰＬＣ−ＭＳによって分析して、薬物の含有量を特定した。すべての試料を１００倍希釈した。
【表３】
2018530613.tif 000005
結果を以下の表４にまとめる。
【表４】
2018530613.tif 000006
＊ 試料は、ｐＨ８．６で２４時間のインキュベーション時間を経ている
【０１０５】
次に、分析を、バッチＮＰ１ＨＳＡ１０−３、ＮＰ１ＨＳＡ１１、及びＮＰ１ＨＳＡ１２に限定した。
【０１０６】
これらの結果から、インキュベーション時間がカプセル化効率を増加させるための決定要因であることがわかる。
【０１０７】
実際、ｐＨ８．６、２４時間のアルブミン及び５ＦＵのインキュベーション時間で調製したバッチＮＰ１ＨＳＡ１０−２とした試料は、これまでに分析したすべての試料よりも高いＥＥ％を示している。
【０１０８】
結論として、本発明の方法は、２０％のカプセル化効率でＨＳＡ／５ＦＵナノ粒子を得ることを可能にし、このナノ粒子は、約１９０μｇ／ｍｌの５ＦＵ量を含有する。
【０１０９】
薬物の放出動態
ＮＰ１ＨＳＡ１０−２試料（カプセル化効率％２０．９及び薬物搭載量１９０μｇ／ｍｌ）の非経口投与のシミュレーションを分析した。
【０１１０】
具体的には、受容ステップとして、ｐＨ７．４のＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）を分析した。使用した方法は、Ｓｐｅｃｔｒａ／ｐｏｒ（登録商標）膜（ＭＷＣＯ＝３５００Ｄａ）と共にＱｕｉｘＳｅｐ（登録商標）として知られるシステムを用いた微小透析である。
【０１１１】
このシステムを、周囲温度で一定の磁気撹拌下に維持し、複数の所定の時間に受容ステップの複数の試料を採取し、収集量分を再統合した。
【０１１２】
遊離薬物の溶解実験も行った（ＰＢＳ中２００μｇ／ｍｌ濃度の５ＦＵ溶液）。
【０１１３】
５ＦＵを含有する薬物試料を、質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）及びλ＝２６５．０ｎｍでの紫外可視分光光度法の両方で分析した。
【０１１４】
試料を分析し、取得した値を、前のステップの個々の収集物及び再統合したものを考慮してプロットし、溶解／放出プロファイルを得た。
【０１１５】
結果を図３に報告する。図３は、ＰＢＳ中の遊離薬物の溶解曲線（Ａ）及びアルブミンナノ粒子に組み込まれた５ＦＵの放出曲線を示す。
【０１１６】
放出パーセンテージに関するこのデータは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によって測定した薬物搭載量に基づいて計算した。
【０１１７】
遊離薬物の溶解プロファイルは、６０分後（図５Ａの５番目の点）までは増加する傾向を示し、７０％の溶解に達している。
【０１１８】
この過程を２時間（１２０分）モニターした。
【０１１９】
ナノ粒子に組み込まれた薬物の場合、このシステムが薬物を放出する量は、２時間後までは増加し、それ以降は、時間が経過しても放出は約１０％で一定である（図５Ｂ）。
【０１２０】
６年後、最大１７％とする、放出パーセンテージのわずかな増加が観察される。
【０１２１】
簡単に言うと、以上の結果は、本発明の目的である５ＦＵの送達システムが約１９μｇ／ｍｌの５ＦＵを２４時間にわたって一定に放出することができることを実証している。
【０１２２】
この計算は、１９０μｇ／ｍｌの薬物搭載量及び１０％の放出パーセンテージを考慮して行った。
【０１２３】
このデータは、文献のシステムのＣｍａxが１．７の体表面を想定した場合に５ＦＵの６００ｍｇのボーラス投与後に約５０μｇ／ｍｌとなることが知られているという事実を考えると、非常に優れている。さらに、これらの条件下では２５分後の５ＦＵの血漿濃度が１０μｇ／ｍｌになることが強調される。
【図１】
2018530613.tif 000007
【図２】
2018530613.tif 000008
【図３】
2018530613.tif 000009
【国際調査報告】
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2018530613.tif 000011
2018530613.tif 000012
2018530613.tif 000013
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