(57)【要約】  ヒアルロン酸製品は、架橋ヒアルロン酸および１個以上のシクロデキストリン分子を含んでいる。ヒアルロン酸はエーテル結合によって架橋されており、１個以上のシクロデキストリン分子は、好ましくはトリアジン系カップリング試薬を用いて、アミド結合によって架橋ヒアルロン酸にグラフト化されている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋ヒアルロン酸および１個以上のアミノシクロデキストリン分子を含むヒアルロン酸製品であって、前記ヒアルロン酸はエーテル結合によって架橋されており、前記１個以上のアミノシクロデキストリン分子は、前記アミノシクロデキストリン分子のアミノ基と前記架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基との間の直接的アミド結合によって前記架橋ヒアルロン酸にグラフト化されている、ヒアルロン酸製品。
【請求項２】
前記アミノシクロデキストリン分子が６〜８個のグルコピラノシド単位によって構成されている、請求項１に記載のヒアルロン酸製品。
【請求項３】
前記アミノシクロデキストリン分子が、２−アミノシクロデキストリン、３−アミノシクロデキストリン、および６−アミノシクロデキストリンからなる群から選択される、請求項２に記載のヒアルロン酸製品。
【請求項４】
結果として生じる前記ヒアルロン酸製品の前記アミノシクロデキストリン分子と前記架橋ヒアルロン酸の二糖類とのモル比が、２％を超えている、請求項１〜３の何れか１項に記載のヒアルロン酸製品。
【請求項５】
前記ヒアルロン酸製品が、平均サイズが０．０１〜５ｍｍ、好ましくは０．１〜０．８ｍｍの範囲であるゲル粒子の形態である、請求項１〜４の何れか１項に記載のヒアルロン酸製品。
【請求項６】
ホストの役割を果たす前記アミノシクロデキストリン分子と共にゲスト−ホスト複合体を形成する能力があるゲスト分子をさらに含み、前記ゲスト分子が、皮膚科学、美容学、眼科学、婦人科学、腫瘍学、脈管学、神経学、整形外科学、リウマチ学、または美容皮膚科学の分野の障害の治療において使用されている薬物および／または生物活性物質、たとえば、抗感染剤、抗菌剤、抗炎症剤、細胞増殖抑制剤、細胞障害剤、抗ウイルス剤、麻酔剤、止血剤、血管収縮剤、または増殖因子から選択される、請求項１〜５の何れか１項に記載のヒアルロン酸製品。
【請求項７】
（ａ）（ｉ）ヒアルロン酸および（ｉｉ）１個以上のシクロデキストリン分子を用意する工程、
（ｂ）二官能性または多官能性の架橋剤を用いて、エーテル結合によって前記ヒアルロン酸を架橋する工程、ならびに
（ｃ）アミド結合によって前記１個以上のシクロデキストリン分子を前記架橋ヒアルロン酸にグラフト化する工程
を含む、架橋ヒアルロン酸および１個以上のシクロデキストリン分子を含むヒアルロン酸製品を調製する方法。
【請求項８】
前記シクロデキストリン分子がアミノシクロデキストリン分子であり、前記アミノシクロデキストリン分子のアミノ基が、前記架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基と前記アミド結合を形成する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記工程（ｃ）のグラフト化が、
（ｉ）前記架橋ヒアルロン酸上の前記カルボキシル基をトリアジン系カップリング試薬で活性化して、活性化された架橋ヒアルロン酸を形成させること、および
（ｉｉ）前記活性化された架橋ヒアルロン酸の前記カルボキシル基に、前記１個以上のシクロデキストリン分子をアミド結合によってカップリングさせること
を含む、請求項７〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記トリアジン系カップリング試薬が、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記二官能性または多官能性の架橋剤が、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、１，２−ビス（２，３−エポキシプロポキシ）エチレン（ＥＧＤＧＥ）、およびエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）、１，２−エタンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＤＥ）、ならびにジエポキシオクタンからなる群から選択される、請求項７〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記二官能性または多官能性の架橋剤が、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
平均サイズが０．０１〜５ｍｍ、好ましくは０．１〜０．８ｍｍの範囲である前記ヒアルロン酸製品の粒子を用意することをさらに含む、請求項７〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）（ｉ）ヒアルロン酸および（ｉｉ）ゲスト分子と共にゲスト−ホスト複合体を形成する能力がある１個以上のシクロデキストリンホスト分子を用意する工程、
（ｂ）二官能性または多官能性の架橋剤を用いて、前記ヒアルロン酸をエーテル結合によって架橋する工程、
（ｃ）アミド結合によって前記１個以上のシクロデキストリンホスト分子を前記架橋ヒアルロン酸にグラフト化する工程、ならびに
ｄ）前記シクロデキストリンホスト分子と前記ゲスト分子の間でのゲスト−ホスト複合体の形成を可能にする条件下で、前記ゲスト分子の溶液を、前記架橋ヒアルロン酸にグラフト化された前記シクロデキストリンホスト分子と接触させる工程、ならびに任意に、
ｅ）前記架橋ヒアルロン酸に結合した前記ゲスト−ホスト複合体を回収する工程
を含む、シクロデキストリンホスト分子と共にゲスト−ホスト複合体を形成する能力があるゲスト分子の製剤を調製する方法。
【請求項１５】
シクロデキストリン分子がアミノシクロデキストリン分子であり、前記アミノシクロデキストリン分子のアミノ基が、前記架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基と前記アミド結合を形成する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程（ｃ）のグラフト化が、
（ｉ）前記架橋ヒアルロン酸上の前記カルボキシル基をトリアジン系カップリング試薬で活性化して、活性化された架橋ヒアルロン酸を形成させること、および
（ｉｉ）前記活性化された架橋ヒアルロン酸の前記カルボキシル基に、前記１個以上のシクロデキストリン分子をアミド結合によってカップリングさせること
を含む、請求項１４〜１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記トリアジン系カップリング試薬が、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項７〜１７の何れか１項に記載の方法によって取得可能である製品。
【請求項１９】
前記ゲスト分子を含む請求項１〜６または１８の何れか１項に記載のヒアルロン酸製品の治療有効量を患者に投与することによる、ゲスト分子による治療に感受性である症状に罹患している患者を治療する方法。
【請求項２０】
請求項１〜６または１８の何れか１項に記載のヒアルロン酸製品を皮膚に塗布することを含む、皮膚を美容的に処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の技術分野】
【０００１】
本発明は、架橋多糖類を含有しているヒドロゲルの分野、ならびに医学的および／または美容的用途におけるそのようなヒドロゲルの使用に関する。より具体的には、本発明は、シクロデキストリンを用いて機能付与した架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルを扱う。
【発明の背景】
【０００２】
医学的利用のために最も広く使用されている生体適合性ポリマーの１つは、ヒアルロン酸（ＨＡ）である。これは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のグループに属する天然多糖類である。ヒアルロン酸および他のＧＡＧは、負電荷を持ったヘテロ多糖鎖であり、多量の水を吸収する能力を有している。ヒアルロン酸およびヒアルロン酸に由来する製品は、生物医学的および美容的分野において、たとえば、粘弾性手術中に、また皮膚充填剤として、広く使用されている。
【０００３】
吸水性ゲルまたはヒドロゲルは、生物医学的分野で広く使用されている。これらは通常、ポリマーを化学的に架橋して非常に大きな網状構造にすることによって調製される。天然のヒアルロン酸およびある種の架橋ヒアルロン酸製品は、完全に溶解するまで水を吸収するのに対し、架橋ヒアルロン酸ゲルは、典型的には、飽和するまで一定量の水を吸収する。すなわち、架橋ヒアルロン酸ゲルの液体保持容量または膨潤度には限界がある。
【０００４】
ヒアルロン酸は、その分子量以外は同一である化学構造で、ほとんどの生物中に存在するため、最小限の反応しか起こさず、高度な医学的利用が可能になる。ヒアルロン酸分子の架橋および／または他の修飾は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの持続期間を向上させるために必要である。さらに、そのような修飾は、ヒアルロン酸分子の液体保持容量に影響を及ぼす。その結果として、ヒアルロン酸は、修飾が数多く試みられる対象であった。
【０００５】
シクロデキストリン（シクロアミロースと呼ばれることがある）は、本明細書ではＣＤまたはＣＤｘとも呼ばれ、相互に結合した糖分子から構成される環状の化合物のファミリー（環状オリゴ糖）である。シクロデキストリンは、酵素変換を用いてデンプンから製造される。典型的には、シクロデキストリンは、６〜８個のグルコピラノシド単位によって構成されており、トロイドに似た構造形態を有しており、グルコピラノシド単位の第１級ヒドロキシル基がトロイドの小さい方の開口部に沿って並んでおり、グルコピラノシド単位の第２級ヒドロキシル基がトロイドの大きい方の開口部に沿って並んでいる。この配置が理由となって、トロイドの内側は、水性環境よりも親水性がかなり低く、したがって、他の疎水性分子を迎え入れる（host）ことができる。対照的に、外側は十分に親水性であり、シクロデキストリン（またはそれらの複合体）に水溶性を与えている。
【０００６】
疎水性分子（ゲスト）がシクロデキストリン（ホスト）の内部に全面的または部分的に含まれる場合、これは、包接複合体またはゲスト／ホスト複合体と呼ばれる。ゲスト／ホスト複合体の形成によって、主に水溶性の点でゲスト分子の物理的および化学的諸特性を大きく変更することができる。このため、シクロデキストリンは、薬学的用途において大きな関心を引いてきた。シクロデキストリンと疎水性分子との包接化合物は、体組織に侵入することができるため、これらを用いて、生物活性のある化合物を特定の条件下で放出することができる。たいていの場合は、このような複合体の制御された分解の機序は、ホスト分子とゲスト分子との水素結合またはイオン結合の切断をもたらすｐＨの変化に基づいている。複合体を破壊するための他の機序としては、加熱またはグルコースモノマー間のα−１，４結合を切断することができる酵素の作用が挙げられる。
【０００７】
ＵＳ２０１４／００９４４３３は、ＨＡの架橋およびシクロデキストリンのグラフト化を同時に行う一工程の方法を開示している。グラフト化は、ＨＡとシクロデキストリンとの直接的な共有結合、たとえばエステル結合によって、またはＨＡとシクロデキストリンの両方に共有結合された連結基によって、たとえばエステル、エーテル、アミン、アミドもしくは他の共有結合によって、起こってもよい。
【０００８】
ＪＰ３８４７４０５Ｂ２は、オリゴ糖を酵素的に分解するエンドグルコシダーゼの存在下で単糖類をシクロデキストリンにカップリングさせることに関する。
【発明の概要】
【０００９】
薬学的および／または美容的物質を投与するための改良製剤を提供することが、本発明の目的である。
【００１０】
特に、かなりの量のグラフト化されたシクロデキストリンを有している、安定な架橋ヒアルロン酸ゲル製品を提供することが、本発明の目的である。
【００１１】
また、薬学的および／または美容的物質を投与するための改良製剤を調製するための方法を提供することも、本発明の目的である。
【００１２】
特に、かなりの量のグラフト化されたシクロデキストリンを有している、安定な架橋ヒアルロン酸ゲル製品を提供するための方法が、本発明の目的である。
【００１３】
本開示から明らかになるであろうこれらおよび他の目的のために、本発明は、第１の側面によれば、架橋ヒアルロン酸および１個以上のシクロデキストリン分子を含むヒアルロン酸製品であって、ヒアルロン酸はエーテル結合によって架橋されており、１個以上のシクロデキストリン分子がアミド結合によって架橋ヒアルロン酸にグラフト化されている、ヒアルロン酸製品を提供する。
【００１４】
既に架橋されたヒアルロン酸にシクロデキストリン分子をグラフト化することは、このヒアルロン酸が、定められた物理化学的諸特性を有している望ましい形態で先に調製されていてもよいため、有利である。これにより、架橋ＨＡの脱重合を制限しつつ、シクロデキストリンを用いて架橋ＨＡを大幅に修飾することが可能になる。
【００１５】
好ましい態様によれば、架橋ヒアルロン酸製品は、平均サイズが０．０１〜５ｍｍ、好ましくは０．１〜０．８ｍｍの範囲であるゲル粒子の形態である。
【００１６】
１つの好ましい態様によれば、ヒアルロン酸鎖は、二官能性または多官能性の架橋剤、たとえばジグリシジルエーテル、たとえば１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）に由来する連結基を介して互いに架橋している。
【００１７】
好ましい態様によれば、シクロデキストリン分子は、アミノ基を有している連結基を含み、シクロデキストリン分子のこの連結基が、架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基と前記アミド結合を形成している。ある種の連結基は、Ｃ1〜6アルキルまたはＣ1〜6アルキルリンカーを含んでいる。
【００１８】
別の好ましい態様によれば、シクロデキストリン分子は、アミノシクロデキストリン、たとえば、α−、β−、またはγ−シクロデキストリンであり、このうちで、２−アミノシクロデキストリン、３−アミノシクロデキストリン、および６−アミノシクロデキストリンが好ましい。本明細書において使用される場合、アミノシクロデキストリンという用語は、シクロデキストリンの骨格上にアミノ基を有している、すなわち、シクロデキストリンの骨格とアミン基の間に連結基がまったくない、シクロデキストリンを意味する。結果として生じる、そのアミノ基を介したヒアルロン酸とシクロデキストリンとの直接的アミド結合は、グラフト化シクロデキストリンからの徐放プロファイルを実現するために有利である。
【００１９】
また、アミノシクロデキストリンをヒドロキシル位置において、小型アルキル（Ｃ1〜4）基で官能化することもできる。メチル基またはヒドロキシプロピル基で官能化されたアミノシクロデキストリンが好ましい。
【００２０】
１つの好ましい態様によれば、ヒアルロン酸製品は、ホストの役割を果たすシクロデキストリン分子と共にゲスト−ホスト複合体を形成する能力があるゲスト分子をさらに含んでいる。ゲスト分子は、皮膚科学、美容学、眼科学、婦人科学、腫瘍学、脈管学、神経学、整形外科学、リウマチ学、または美容皮膚科学の分野の障害の治療において使用されている薬物および／または生物活性物質から選択されてもよい。
【００２１】
別の側面によれば、本発明は、
（ａ）（ｉ）ヒアルロン酸および（ｉｉ）１個以上のシクロデキストリン分子を用意する工程、
（ｂ）二官能性または多官能性の架橋剤を用いて、エーテル結合によってヒアルロン酸を架橋する工程、ならびに
（ｃ）アミド結合によって１個以上のシクロデキストリン分子を架橋ヒアルロン酸にグラフト化する工程
を含む、架橋ヒアルロン酸および１個以上のシクロデキストリン分子を含むヒアルロン酸製品を調製する方法を提供する。
【００２２】
驚くべきことに、既に架橋されたヒアルロン酸にアミド結合によってシクロデキストリン分子をグラフト化することは、架橋ヒアルロン酸の脱重合の程度が低いことに関連していることが理解されている。
【００２３】
好ましい態様によれば、シクロデキストリン分子は、アミノ基を有している連結基を含み、シクロデキストリン分子のこの連結基が、架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基と前記アミド結合を形成している。ある種の連結基は、Ｃ1〜6アルキルまたはＣ1〜6アルキルリンカーを含んでいる。
【００２４】
別の好ましい態様によれば、シクロデキストリン分子は、アミノシクロデキストリン、たとえば、α−、β−、またはγ−シクロデキストリンであり、このうちで、２−アミノシクロデキストリン、３−アミノシクロデキストリン、および６−アミノシクロデキストリンが好ましい。結果として生じる、そのアミノ基を介したヒアルロン酸とシクロデキストリンとの直接的アミド結合は、グラフト化シクロデキストリンからの徐放プロファイルを実現するために有利である。
【００２５】
また、アミノシクロデキストリンを、ヒドロキシル位置において小型アルキル（Ｃ1〜4）基で官能化することもできる。メチル基またはヒドロキシプロピル基で官能化されたアミノシクロデキストリンが好ましい。
【００２６】
好ましい態様において、工程（ｃ）のグラフト化は、
（ｉ）架橋ヒアルロン酸上のカルボキシル基をペプチドカップリング試薬で活性化して、活性化された架橋ヒアルロン酸を形成させること、および
（ｉｉ）活性化された架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基に、１個以上のシクロデキストリン分子の連結基をアミド結合によってカップリングさせること
を伴う。
【００２７】
１つの好ましい態様において、ペプチドカップリング試薬は、トリアジン系カップリング試薬、カルボジイミドカップリング試薬、イミダゾリウムに由来するカップリング試薬、Ｏｘｙｍａ、およびＣＯＭＵからなる群から選択される。ペプチドカップリング試薬は、好ましくは、トリアジン系カップリング試薬、たとえば、第３級アミン塩基の存在下の２−クロロ−４，６−二置換−１，３，５−トリアジンまたはその対応する第４級アンモニウム塩、たとえば、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）を加えた２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）、または４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）、好ましくはＤＭＴＭＭである。
【００２８】
関係する側面によれば、本発明は、以下の工程：
（ａ）（ｉ）ヒアルロン酸および（ｉｉ）ゲスト分子と共にゲスト−ホスト複合体を形成する能力がある１個以上のシクロデキストリンホスト分子を用意する工程、
（ｂ）二官能性または多官能性の架橋剤を用いて、ヒアルロン酸をエーテル結合によって架橋する工程、
（ｃ）アミド結合によって１個以上のシクロデキストリンホスト分子を架橋ヒアルロン酸にグラフト化する工程、ならびに
ｄ）シクロデキストリンホスト分子とゲスト分子の間でのゲスト−ホスト複合体の形成を可能にする条件下で、ゲスト分子の溶液を、架橋ヒアルロン酸にグラフト化されたシクロデキストリンホスト分子と接触させる工程、ならびに任意に、
ｅ）架橋ヒアルロン酸に結合したゲスト−ホスト複合体を回収する工程
を含む、シクロデキストリンホスト分子と共にゲスト−ホスト複合体を形成する能力があるゲスト分子の製剤を調製する方法を提供する。
【００２９】
ゲスト分子は、皮膚科学、美容学、眼科学、婦人科学、腫瘍学、脈管学、神経学、整形外科学、リウマチ学、または美容皮膚科学の分野の障害を治療する際に使用されている薬物および／または生物活性物質から選択されてもよい。
【００３０】
本発明の他の側面および好ましい態様は、本発明の下記の詳細な開示内容および添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、ペプチドカップリング試薬ＤＭＴＭＭを用いた、架橋ＨＡへのアミノシクロデキストリンのグラフト化を示す。
【発明の詳細な説明】
【００３２】
本発明は、全体として、シクロデキストリン分子がグラフト化された架橋ヒアルロン酸ゲルを提供する。ヒアルロン酸製品は、架橋ヒアルロン酸および１個以上のシクロデキストリン分子を含んでおり、その際、ヒアルロン酸はエーテル結合によって架橋されており、１個以上のシクロデキストリン分子はアミド結合によって架橋ヒアルロン酸にグラフト化されている。これは、架橋ヒアルロン酸の大規模な脱重合を回避するのに有利である二工程の方法によって実現される。
【００３３】
他に規定されない限り、「ヒアルロン酸」という用語は、様々な鎖長および荷電状態の、ならびに様々な化学修飾を有している、ヒアルロン酸、ヒアルロナート、またはヒアルロナンの変形体および変形体の組合せをすべて包含する。すなわち、この用語は、ヒアルロン酸と様々な対イオンからなる様々なヒアルロン酸塩、たとえばヒアルロン酸ナトリウムも包含する。また、ヒアルロン酸の様々な修飾も、この用語によって包含され、これらの修飾は、たとえば、酸化、たとえば−ＣＨ2ＯＨ基の−ＣＨＯおよび／もしくは−ＣＯＯＨへの酸化；隣接するヒドロキシル基の過ヨウ素酸酸化と、任意にそれに続く還元、たとえば−ＣＨＯの−ＣＨ2ＯＨへの還元、またはイミンを形成させるアミンとのカップリングとそれに続く第２級アミンへの還元；硫酸化；脱アミド化と、任意にそれに続く、脱アミノ化または新しい酸とのアミド形成；エステル化；ならびに脱アセチル化である。修飾の他の例は、イソ尿素、ヒドラジド、ブロモシアン、モノエポキシド、およびモノスルホンのカップリングである。
【００３４】
ヒアルロン酸は、動物および非動物由来の様々な供給源から得ることができる。非動物由来の供給源としては、酵母および好ましくは細菌が挙げられる。典型的には、１つのヒアルロン酸分子の分子量は、０．１〜１０ＭＤａの範囲であるが、他の分子量も可能である。
【００３５】
特定の態様において、架橋ヒアルロン酸の濃度は、１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの態様において、架橋ヒアルロン酸の濃度は、２〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲である。特定の態様において、架橋ヒアルロン酸の濃度は、５〜３０ｍｇ／ｍｌの範囲または１０〜３０ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００３６】
架橋ヒアルロン酸は、ヒアルロン酸の鎖間に架橋を含み、これにより、ヒアルロン酸分子からなる連続的な網状構造を作り出しており、この網状構造は、共有結合的架橋、ヒアルロン酸鎖の物理的絡み合い、および様々な相互作用、たとえば、静電的相互作用、水素結合、およびファンデルワールス力によってまとまっている。
【００３７】
架橋ヒアルロン酸製品は、好ましくは生体適合性である。これは、処置された個体において免疫応答がまったく起こらないか、またはごく軽い免疫応答しか起こらないことを意味する。すなわち、処置された個体において、望ましくない局所的または全身的作用がまったく起こらないか、またはごく軽いものしか起こらない。
【００３８】
本発明による架橋ヒアルロン酸製品は、ゲルまたはヒドロゲルであってもよい。すなわち、液体、典型的には水性液体に供された場合に、非水溶性であるが実質的に希薄な、ヒアルロン酸分子の架橋した系とみなすことができる。
【００３９】
ゲルは、主に液体を含有し、たとえば、９０〜９９．９重量％の水を含有することができるが、その液体内部に三次元の架橋ヒアルロン酸網があるため、固体のように挙動する。液体含有量がかなり多いため、ゲルは構造的に柔軟で、天然組織に類似しており、それによりこのゲルは、組織工学における足場として、また組織増強のために、非常に有用となる。
【００４０】
ヒアルロン酸の架橋は、架橋剤を用いた修飾によって実現してよい。ヒアルロン酸の濃度および架橋の程度は、機械的諸特性、たとえば、ゲルの弾性率Ｇ’および安定性特性に影響を及ぼす。架橋ヒアルロン酸ゲルは、しばしば、「修飾の程度」の観点から特徴付けられる。通常、ヒアルロン酸ゲルの修飾の程度は、０．１〜１５モル％の範囲である。修飾の程度（モル％）とは、ＨＡに結合している架橋剤の量、すなわち、繰り返しＨＡ二糖類単位の全モル量に対する、結合した架橋剤のモル量を説明するものである。修飾の程度は、ＨＡが架橋剤によって化学的に修飾された程度を表す。架橋のための反応条件および修飾の程度を測定するための適切な解析技術はすべて、当業者に周知であり、当業者は、これらおよび他の関連因子を容易に調整し、それによって、０．１〜２％の範囲の修飾の程度を得るための適切な条件を提供し、また結果として生じる製品の特徴を修飾の程度に関して検証することができる。ＢＤＤＥ（１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）架橋ヒアルロン酸ゲルは、たとえば、公開されている国際特許出願ＷＯ９７０４０１２の実施例１および２に記載されている方法に従って調製されてもよい。
【００４１】
好ましい態様において、架橋ヒアルロン酸は、架橋剤によって架橋されているゲルの形態で存在しており、前記ヒアルロン酸の濃度は１０〜３０ｍｇ／ｍｌの範囲であり、また前記架橋剤を用いた修飾の程度は０．１〜２モル％の範囲である。
【００４２】
また、ヒアルロン酸ゲルは、架橋されていない、すなわち、三次元の架橋ヒアルロン酸網に結合していないヒアルロン酸からなる部分を含んでいてもよい。しかし、ゲル組成物中の少なくとも５０重量％、好ましくは少なくとも６０重量％、より好ましくは少なくとも７０重量％、最も好ましくは少なくとも８０重量％のヒアルロン酸が、架橋ヒアルロン酸網の部分を形成することが好ましい。
【００４３】
ヒアルロン酸製品は、粒子、糸、円盤などの形態で存在する。好ましい態様において、架橋ヒアルロン酸は、ゲル粒子の形態である。ゲル粒子は、好ましくは、平均サイズが０．０１〜５ｍｍ、好ましくは０．１〜０．８ｍｍ、たとえば、０．２〜０．５ｍｍまたは０．５〜０．８ｍｍの範囲である。
【００４４】
ヒアルロン酸製品は、水溶液中に存在していてもよいが、また、乾燥形態で、またはたとえばエタノール中に沈殿した形態で存在していてもよい。ヒアルロン酸製品は、好ましくは注射可能である。
【００４５】
ヒアルロン酸鎖は、二官能性または多官能性の架橋剤に由来する連結基を介して互いに架橋している。ヒアルロン酸組成物の二官能性または多官能性の架橋剤は、ヒアルロン酸鎖を互いに連結する。さらに、二官能性または多官能性の架橋剤は、ヒアルロン酸の鎖間のスペーサーの役割も果たす。
【００４６】
二官能性または多官能性の架橋剤は、ヒアルロン酸の官能基と反応する能力があり、共有結合の形成をもたらす、２個またはそれ以上の官能基を含む。二官能性または多官能性の架橋剤は、たとえば、ジビニルスルホン、マルチエポキシド、およびジエポキシドからなる群から選択されてもよい。
【００４７】
好ましいタイプの二官能性または多官能性の架橋剤は、ビスエポキシドまたはポリエポキシド、たとえばジグリシジルエーテルである。ある態様によれば、二官能性または多官能性の架橋剤は、２個またはそれ以上のグリシジルエーテル官能基を含む。グリシジルエーテル官能基は、ヒアルロン酸の第１級ヒドロキシル基と反応して、中性または塩基性条件下でエーテル結合の形成をもたらす。その結果として、ジグリシジルエーテル架橋剤がヒアルロナンの第１級ヒドロキシル基と反応すると、架橋剤からの中間スペーサーが残って、２つのエーテル結合が形成される。
【００４８】
ヒアルロン酸鎖を架橋するための好ましい二官能性または多官能性の架橋剤としては、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、１，２−ビス（２，３−エポキシプロポキシ）エチレン（ＥＧＤＧＥ）、およびエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）、１，２−エタンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＤＥ）、ならびにジエポキシオクタンが挙げられる。特に好ましい二官能性または多官能性の架橋剤は、ＢＤＤＥである。
【００４９】
本発明の決定的に重要な特徴は、シクロデキストリン分子がアミド結合によって架橋ヒアルロン酸にグラフト化されるということである。したがって、本発明は、シクロデキストリンと、定められた物理化学的諸特性を有している、たとえば粒子の形態の架橋ヒアルロン酸とのアミド結合をもたらす穏やかなカップリング反応を可能にする。結果として生じる架橋ヒアルロン酸製品は、有用な安定性特性を有しており、したがって、徐放用途に適している。本発明の別の利点は、エーテル架橋ヒアルロン酸にアミド結合を介してシクロデキストリン分子をグラフト化することにより、架橋ヒアルロン酸の大規模な脱重合を引き起こさずにシクロデキストリンを用いて架橋ヒアルロン酸を大幅に修飾することが可能になることである。シクロデキストリン分子と架橋ヒアルロン酸の二糖類とのモル比は、０．１〜５０％、好ましくは１〜３０％、たとえば１〜２０％であることが好ましい。また、シクロデキストリン分子と架橋ヒアルロン酸の二糖類とのモル比は、２％を超えている、たとえば５％を超えていることも好ましい。
【００５０】
シクロデキストリン分子は、医薬品（ゲスト）のための担体（ホスト）として有用である。医薬品（ゲスト）がシクロデキストリン（ホスト）の内部に全面的または部分的に含まれる場合、これは、包接複合体またはゲスト／ホスト複合体と呼ばれる。その場合、シクロデキストリンは、特定の条件下で、たとえば、ホスト分子とゲスト分子との水素結合またはイオン結合の切断を招くｐＨ変化によって、医薬品を放出してもよい。
【００５１】
シクロデキストリン分子は、投与、たとえば注射の部位からのシクロデキストリン（またはゲスト／ホスト複合体）の移動を減らすために、ヒアルロン酸に取り付けられる。こうして、シクロデキストリンからの医薬品の放出部位を調節することができる。
【００５２】
また、医薬品の放出の時間的調節を強めるためには、シクロデキストリン（またはゲスト／ホスト複合体）とヒアルロン酸との結合が切断されることによる影響を最小限に抑えるべきであることが判明している。言い換えると、医薬品の放出が、化学的分解ではなく、シクロデキストリンからの物理的放出にできるだけ依存することが望ましい。
【００５３】
開示されるヒアルロン酸製品において、シクロデキストリン分子は、アミド結合によってヒアルロン酸に取り付けられている。シクロデキストリン−ヒアルロン酸結合（グラフト）におけるアミド結合の使用は、たとえばエステル結合と比べて有利であることが判明しており、アミド結合の方がｉｎ  ｖｉｖｏで分解に対して安定性が高いことがその理由である。ヒアルロン酸とシクロデキストリン分子の間で安定性が低い結合を使用すると、注射部位からシクロデキストリン（またはゲスト／ホスト複合体）が時期尚早に失われることになり得る。
【００５４】
ヒアルロン酸製品のシクロデキストリンは、実際上は、医薬品と一緒になったゲスト／ホスト複合体中のホスト分子の役割を果たす能力がある任意のシクロデキストリンであってもよい。通常、シクロデキストリンは、５〜３２個のグルコピラノシド単位によって構成されていてもよい。しかし、通常は、６〜８個のグルコピラノシド単位によって構成されているシクロデキストリンが、医薬品とのゲスト／ホスト複合体を形成させるには好ましい。６、７、および８個のグルコピラノシド単位によって構成されているシクロデキストリンは、しばしば、それぞれα−、β−、およびγ−シクロデキストリンと呼ばれる。ある態様によれば、シクロデキストリン分子は、６個のグルコピラノシド単位によって構成されている（α−シクロデキストリン）。ある態様によれば、シクロデキストリン分子は、７個のグルコピラノシド単位によって構成されている（β−シクロデキストリン）。ある態様によれば、シクロデキストリン分子は、８個のグルコピラノシド単位によって構成されている（γ−シクロデキストリン）。
【００５５】
シクロデキストリンは、水への溶解性を向上させるため、および／または特定の用途における働きを最適化するために、しばしば化学的に修飾される。また、シクロデキストリン、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、およびγ−シクロデキストリンという用語は、本明細書において使用される場合、それらの機能的に等価な変形体または誘導体も包含するものとする。このような化学的に修飾されたシクロデキストリンの例としては、ヒドロキシプロピルシクロデキストリンおよびメチルシクロデキストリンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【００５６】
ヒアルロン酸組成物と共に使用するための修飾α−シクロデキストリンの例としては、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリンが挙げられるが、それに限定されるわけではない。
【００５７】
ヒアルロン酸組成物と共に使用するための修飾β−シクロデキストリンの例としては、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン；２，６−ジ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン；６−Ｏ−マルトシル−β−シクロデキストリン；２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン；メチル−β−シクロデキストリン；スルホブチル−β−シクロデキストリン；モノクロロトリアジニル−β−シクロデキストリン；ヘプタキス（２−ω−アミノ−Ｏ−オリゴ（エチレンオキシド）−６−ヘキシルチオ）−β−シクロデキストリン；エチレンジアミノまたはジエチレントリアミノで架橋したビス（βシクロデキストリン）；ランダムにメチル化されたβ−シクロデキストリン；スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリン；およびモノクロロトリアジニル−β−シクロデキストリンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【００５８】
ヒアルロン酸組成物と共に使用するための修飾γ−シクロデキストリンの例としては、γ−シクロデキストリンＣ６、および２，３−ジ−Ｏ−ヘキサノイル−γシクロデキストリンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。また、さらに別の修飾シクロデキストリンは、本明細書において表１〜３に示している。
【００５９】
本発明によれば、シクロデキストリン分子は、アミノ基を有している連結基を含むことが好ましい。連結基は、シクロデキストリン骨格に共有結合しており、スペーサー分子、たとえばＣ1〜6アルキルまたはＣ1〜4アルキルを含んでいてもよい。シクロデキストリン分子の連結基は、架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基とアミド結合を形成する。
【００６０】
好ましい態様において、シクロデキストリン分子は、アミノシクロデキストリン分子であり、すなわちシクロデキストリン骨格上にアミノ基を有しており、このアミノシクロデキストリン分子のアミノ基は、架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基とアミド結合を形成する。本明細書において使用される場合、アミノシクロデキストリンという用語は、シクロデキストリンの骨格上にアミノ基を有している、すなわち、シクロデキストリンの骨格とアミン基の間に連結基がまったくない、シクロデキストリンを意味する。その結果、シクロデキストリンとエーテル架橋ＨＡとの間で直接的アミド結合が実現する。結果として生じる、そのアミノ基を介したヒアルロン酸とシクロデキストリンとの直接的アミド結合は、グラフト化シクロデキストリンからの徐放プロファイルを実現するために有利である。
【００６１】
シクロデキストリン分子の好ましいグループは、６〜８個のグルコピラノシド単位、たとえば、６個のグルコピラノシド単位（α−シクロデキストリン）、７個のグルコピラノシド単位（β−シクロデキストリン）、または８個のグルコピラノシド単位（γ−シクロデキストリン）によって構成されているアミノシクロデキストリン分子である。その場合、シクロデキストリン分子が、２−アミノシクロデキストリン、３−アミノシクロデキストリン、および６−アミノシクロデキストリンからなる群、好ましくは、３−アミノシクロデキストリンおよび６−アミノシクロデキストリンからなる群から選択されることがさらに好ましい。
【００６２】
また、アミノシクロデキストリンを、ヒドロキシル位置において小型アルキル（Ｃ1〜4）基で官能化することもできる。メチル基またはヒドロキシプロピル基で官能化されたアミノシクロデキストリンが好ましい。
【００６３】
本明細書において開示されるヒアルロン酸製品は、様々な薬学的または美容的物質の輸送または投与および徐放または制御放出のために有利に使用されてもよい。
【００６４】
また、ヒアルロン酸製品は、ホストの役割を果たすシクロデキストリン分子と共にゲスト−ホスト複合体を形成する能力があるゲスト分子も含んでいてもよい。通常、ゲスト分子は、疎水性もしくは親油性であるか、または疎水性もしくは親油性である部分／成分を有している。ゲスト分子のサイズおよび諸特性によって、どのシクロデキストリンがホストとして適しているかが決まる。様々な薬学的ゲスト分子に対して適切なシクロデキストリンホスト分子を明らかにするために、多くの努力が科学分野においてなされてきた。特定されているゲスト−ホスト複合体の一部を、本明細書において表１〜３に提示している。
【００６５】
ゲスト分子は、好ましくは、皮膚科学、美容学、眼科学、婦人科学、腫瘍学、脈管学、神経学、整形外科学、リウマチ学、または美容皮膚科学の分野の障害を治療する際に使用されている薬物および／または生物活性物質、たとえば、抗感染剤、抗菌剤、抗炎症剤、細胞増殖抑制剤、細胞障害剤、抗ウイルス剤、麻酔剤、止血剤、血管収縮剤、または増殖因子から選択される。
【００６６】
好ましい態様によれば、ゲスト分子はレチノイドである。
【００６７】
したがって、本発明によるヒアルロン酸製品は、たとえば、前記ゲスト分子による治療に感受性である症状を治療する際に、医薬として有用である。
【００６８】
また、ヒアルロン酸製品は、前記ゲスト分子による治療に感受性である症状を治療するための医薬を製造するのにも有用である。
【００６９】
１つの側面によれば、ヒアルロン酸製品は、ゲスト分子を含む本発明によるヒアルロン酸製品を患者に治療有効量投与することにより、前記ゲスト分子による治療に感受性である症状に罹患している患者を治療する方法において、有用である。
【００７０】
別の側面によれば、ヒアルロン酸製品は、本発明によるヒアルロン酸製品を皮膚に塗布することを含む、皮膚を美容的に処置する方法において、有用である。
【００７１】
本発明による方法によって取得可能または得られる製品の性質は複雑であるため、製品は、これらの方法の結果であると定義されてもよい。
【００７２】
本発明は、
（ａ）（ｉ）ヒアルロン酸および（ｉｉ）１個以上のシクロデキストリン分子を用意する工程、
（ｂ）二官能性または多官能性の架橋剤を用いて、エーテル結合によってヒアルロン酸を架橋する工程、ならびに
（ｃ）アミド結合によって１個以上のシクロデキストリン分子を架橋ヒアルロン酸にグラフト化する工程
を含む、架橋ヒアルロン酸および１個以上のシクロデキストリン分子を含むヒアルロン酸ゲルを調製するための有利な方法も、さらに提供する。
【００７３】
工程（ａ）および（ｂ）の好ましい態様は、結果として生じる製品に関する上記の説明から明らかである。特に、工程（ｂ）は、架橋ヒアルロン酸のサイズを小さくして粒子、糸、円盤などにすることをさらに含んでもよい。好ましい態様において、架橋ヒアルロン酸は、ゲル粒子の形態にされる。ヒアルロン酸ゲル粒子は、標準的条件下でヒアルロン酸と架橋試薬、たとえばＢＤＤＥとを反応させることによって得られる。結果として生じるヒドロゲルの粒子サイズを小さくし、続いてエタノール中に沈殿させると、そのような粒子の形成が引き起こされる。ゲル粒子は、好ましくは、膨潤時の平均サイズが０．０１〜５ｍｍ、好ましくは０．１〜０．８ｍｍ、たとえば、０．２〜０．５ｍｍまたは０．５〜０．８ｍｍの範囲である。
【００７４】
工程（ａ）の１個以上のシクロデキストリン分子が、アミノ基を有している連結基を含み、シクロデキストリン分子のこの連結基が、架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基と前記アミド結合を形成することが、好ましい。連結基は、スペーサー、たとえば、Ｃ1〜6アルキルまたはＣ1〜4アルキルを含んでいてもよい。
【００７５】
また、１個以上のシクロデキストリン分子は、上記に開示した、すなわち、シクロデキストリンの骨格上にアミノ基を有している、アミノシクロデキストリン分子であることも、好ましい。本明細書において使用される場合、アミノシクロデキストリンという用語は、シクロデキストリンの骨格上にアミノ基を有している、すなわち、シクロデキストリンの骨格とアミン基の間に連結基がまったくない、シクロデキストリンを意味する。好ましい方法において、シクロデキストリン分子はアミノシクロデキストリン分子であり、このアミノシクロデキストリン分子のアミノ基は、架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基と前記アミド結合を形成する。結果として生じる、そのアミノ基を介したヒアルロン酸とシクロデキストリンとの直接的アミド結合は、グラフト化シクロデキストリンからの徐放プロファイルを実現するために有利である。
【００７６】
好ましい方法において、工程（ｃ）のグラフト化は、
（ｉ）架橋ヒアルロン酸上のカルボキシル基をペプチドカップリング試薬で活性化して、活性化された架橋ヒアルロン酸を形成させること、および
（ｉｉ）活性化された架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基に、１個以上のシクロデキストリン分子の連結基をアミド結合によってカップリングさせること
を伴う。
【００７７】
定められた物理化学的諸特性を有している架橋ヒアルロン酸、たとえば前もって形成させたＨＡ粒子に対してトリアジン系カップリング試薬を使用すると、架橋ヒアルロン酸の大規模な脱重合を引き起こさずに、シクロデキストリンを用いてアミド結合を介して架橋ＨＡを大幅に修飾（グラフト化）することが可能になることが、本発明によって理解された。このことは、例１２で検証されており、膨潤容量、すなわち、１グラムのＨＡ当たりの液体総取込み量は、ＭｏＤCDx/HADiが大きくなるにつれ直線的に減少することが観察された。この直線的挙動から、トリアジンカップリング試薬を用いてエーテル架橋ＨＡゲルにシクロデキストリンをグラフト化しても、ＨＡゲルの顕著な分解はまったく引き起こされないことが実証される。このことは、シクロデキストリンでグラフト化されたヒアルロン酸鎖に対して架橋を実施すると、それによって多糖類の大規模な脱重合が引き起こされる場合がある状況とは対照的である。
【００７８】
結果として生じるヒアルロン酸製品の１個以上のシクロデキストリン分子、たとえばアミノシクロデキストリン分子と架橋ヒアルロン酸の二糖類とのモル比は、０．１〜５０％、好ましくは１〜３０％、または１〜２０％であってもよい。また、シクロデキストリン分子と架橋ヒアルロン酸の二糖類とのモル比は、２％を超えている、たとえば５％を超えていることも好ましい。
【００７９】
典型的には、本方法により、架橋ヒアルロン酸の脱重合の程度は低くなる。
【００８０】
本方法において、架橋ヒアルロン酸の活性化および活性化された架橋ヒアルロン酸へのシクロデキストリン分子のカップリングは、工程（ｃ）において同時に起こってもよい。あるいは、架橋ヒアルロン酸の活性化は、工程（ｃ）において、活性化された架橋ヒアルロン酸へのシクロデキストリン分子のカップリングより前に、単独で起こる。
【００８１】
好ましいペプチドカップリング試薬は、トリアジン系カップリング試薬、カルボジイミドカップリング試薬、イミダゾリウムに由来するカップリング試薬、Ｏｘｙｍａ、およびＣＯＭＵからなる群から選択される。他の様々な有用なペプチドカップリング試薬は、当業者に周知である。
【００８２】
ペプチドカップリング試薬の特に好ましいグループは、トリアジン系カップリング試薬、たとえば、第３級アミン塩基の存在下の２−クロロ−４，６−二置換−１，３，５−トリアジンまたはその対応する第４級アンモニウム塩、たとえば、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）を加えた２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）、または４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）である。特に好ましいトリアジン系カップリング試薬は、ＤＭＴＭＭである。
【００８３】
好ましい態様において、アミド結合は、６〜８個のグルコピラノシド単位を有しているアミノシクロデキストリンのアミノ基とエーテル架橋ヒアルロン酸ゲル粒子のカルボン酸基の間で形成される。２つの構成要素の間のこのアミド結合は、ペプチドカップリング剤、たとえばＤＭＴＭＭによって実現する。
【００８４】
本明細書において提示する見識は、以下の工程：
（ａ）（ｉ）ヒアルロン酸および（ｉｉ）ゲスト分子と共にゲスト−ホスト複合体を形成する能力がある１個以上のシクロデキストリンホスト分子を用意する工程、
（ｂ）二官能性または多官能性の架橋剤を用いて、ヒアルロン酸をエーテル結合によって架橋する工程、
（ｃ）アミド結合によって１個以上のシクロデキストリンホスト分子を架橋ヒアルロン酸にグラフト化する工程、ならびに
ｄ）シクロデキストリンホスト分子とゲスト分子の間でのゲスト−ホスト複合体の形成を可能にする条件下で、ゲスト分子の溶液を、架橋ヒアルロン酸にグラフト化されたシクロデキストリンホスト分子と接触させる工程、ならびに任意に、
ｅ）架橋ヒアルロン酸に結合したゲスト−ホスト複合体を回収する工程
を含む、シクロデキストリンホスト分子と共にゲスト−ホスト複合体を形成する能力があるゲスト分子の製剤を調製する方法においても有用である。
【００８５】
ゲスト−ホスト複合体を形成する能力がある医薬品およびシクロデキストリンの非限定的な例を、表１〜３に提供する。
【００８６】
【表１】
2018506603.tif 000003
【００８７】
【表２−１】
2018506603.tif 000004
【００８８】
【表２−２】
2018506603.tif 000005
【００８９】
【表３−１】
2018506603.tif 000006
【００９０】
【表３−２】
2018506603.tif 000007
【００９１】
【表３−３】
2018506603.tif 000008
【００９２】
表１〜３の略語の説明：
β−ＣＤ、βシクロデキストリン；ＨＰ−β−ＣＤ、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン；ＤＭ−β−ＣＤ、２，６−ジ−Ｏ−メチルβシクロデキストリン；ＯＭ−β−ＣＤ、６−Ｏ−マルトシルβシクロデキストリン；２ＨＰ−β−ＣＤ、２−ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン；ＨＰ−α−ＣＤ、ヒドロキシプロピルαシクロデキストリン；α−ＣＤ、αシクロデキストリン；γ−ＣＤ、γシクロデキストリン；Ｍ−β−ＣＤ、メチル−β−シクロデキストリン；ＳＢ−β−ＣＤ、スルホブチルβシクロデキストリン；γ−ＣＤＣ６、γシクロデキストリンＣ６または両親媒性２，３−ジ−Ｏ−ヘキサノイルγシクロデキストリン；β−ＣＤＭＣＴ、モノクロロトリアジニルβシクロデキストリン；ヘプタキス−β−ＣＤ、ヘプタキス（２−ｘ−アミノ−Ｏ−オリゴ（エチレンオキシド）−６−ヘキシルチオ）βシクロデキストリン；ビス−ＣＤ、エチレンジアミノまたはジエチレントリアミノ架橋したビス（βシクロデキストリン）；ＲＭβ−ＣＤ、ランダムにメチル化されたβシクロデキストリン；（ＳＢＥ）７ｍ−β−ＣＤ、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリン；ＭＣＴ−β−ＣＤ、モノクロロトリアジニβシクロデキストリン；Ｍｅ−β−ＣＤ、メチルβシクロデキストリン；ＳＢＥ−β−ＣＤ、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリン；ＴＰＰＳ、陰イオン性５，１０，１５，２０−テトラキス（４−スルホナトフェニル）−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィリン；Ｅ−β−ＣＤ、β−シクロデキストリンエピクロロヒドリンポリマー；Ｇｌｕ−β−ＣＤ、グルコシル−β−シクロデキストリン；Ｍａｌ−β−ＣＤ、マルトシル−β−シクロデキストリン。
【００９３】
それらに限定することを望まないが、例として、以下に本発明を例示する。
【００９４】
［実施例］
例１
架橋ＨＡの乾燥粉末への３−アミノ−γ−ＣＤのグラフト化
ＤＭＴＭＭ（０．３ｇ）および３−アミノ−γ−ＣＤ（０．８ｇ）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（２５ｍＬ）に溶解し、この溶液のｐＨを約６．５に調整する（１．２Ｍ  ＨＣｌ）。この溶液を架橋ＨＡ乾燥粉末（０．５ｇ）に添加し、次いで穏やかに撹拌する。反応物を４５℃まで２４時間加熱し、次いで、室温まで放冷する。ゲルをＰＢＳ（１５ｍＬ／ｇゲル）で２回洗浄し、ろ過する。次いで、ゲルをエタノール７０％（１５ｍＬ／ｇゲル）で３回洗浄し、溶液を捨てる。最後に、純エタノールをゲルに添加し、ろ過し、減圧下で乾燥させて、最終的な物質を得る。
【００９５】
例２
架橋ＨＡの乾燥粉末への３−アミノ−β−ＣＤのグラフト化
ＤＭＴＭＭ（０．２ｇ）および３−アミノ−β−ＣＤ（０．３５ｇ）をＰＢＳ（１２．５ｍＬ）に溶解し、この溶液のｐＨを約６．５に調整した（１．２Ｍ  ＨＣｌ）。この溶液をエーテル架橋ＨＡ乾燥粉末（０．３ｇ）に添加し、穏やかに撹拌した。反応物を４５℃まで２４時間加熱し、次いで、室温まで放冷した。ゲルをＰＢＳ（１５ｍＬ／ｇゲル）で２回洗浄し、ろ過した。ゲルをエタノール７０％（１５ｍＬ／ｇゲル）で３回洗浄し、溶液を捨てた。最後に、純エタノールをゲルに添加し、ろ過し、減圧下で乾燥させて、最終的な物質を得た。
【００９６】
このＨＡポリマーをオリゴ糖に分解して、定量ＮＭＲ解析を可能にした。プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）に由来するコンドロイチナーゼＡＢＣを含む溶液４０〜６０μＬをゲル試料に添加し、それをさらに混合し、穏やかに振盪しながら３７℃でのインキュベーションに２４時間供した。インキュベート後、分解したゲル試料を凍結乾燥し、６００μＬのＤ2Ｏ中に再び溶解させた。
【００９７】
一次元（１Ｄ）1Ｈ定量ＮＭＲ実験を実施し、修飾を測定するために、得られたスペクトルを解析した。修飾は、シクロデキストリン÷二糖類、すなわちＭｏＤCDx/HAdiとして測定した。ＭｏＤCDx/HAdiの測定は、シクロデキストリン（ＣＤｘ）に由来するアノマープロトンのシグナルに由来する積分をＨＡのＧｌｃＮＡｃに由来するＮ−アセチルプロトンと比較することによって実施した。修飾（シクロデキストリン÷二糖類；ＭｏＤCDx/HAdi）は、酵素によって分解したゲルの1Ｈ−ＮＭＲによって１１％と測定された。
【００９８】
例３
エーテル架橋ＨＡの乾燥粉末への６−アミノ−β−ＣＤのグラフト化
ＤＭＴＭＭ（０．２４ｇ）および６−アミノ−β−ＣＤ（０．３ｇ）をＰＢＳ（１５ｍＬ）に溶解し、この溶液のｐＨを約６．５に調整した（１．２Ｍ  ＨＣｌ）。この溶液をエーテル架橋ＨＡ乾燥粉末（０．３ｇ）に添加し、穏やかに撹拌した。反応物を４５℃まで２４時間加熱し、次いで、室温まで放冷した。ゲルをＰＢＳ（１５ｍＬ／ｇゲル）で２回洗浄し、ろ過した。ゲルをエタノール７０％（１５ｍＬ／ｇゲル）で３回洗浄し、溶液を捨てた。最後に、純エタノールをゲルに添加し、ろ過し、減圧下で乾燥させて、最終的な物質を得た。
【００９９】
このＨＡポリマーをオリゴ糖に分解して、例２で説明したようにして一次元1Ｈ定量ＮＭＲ実験を実施した。ＭｏＤCDx/HAdiを測定するために、得られたスペクトルを解析した。修飾（シクロデキストリン÷二糖類；ＭｏＤCDx/HAdi）は、酵素によって分解したゲルの1Ｈ−ＮＭＲによって２２％と測定された。
【０１００】
例４
架橋ＨＡゲルへの６−アミノ−γ−ＣＤのグラフト化
ＨＡ乾燥粉末（０．５ｇ）をＰＢＳ（２５ｍｌ）に溶解し、この溶液のｐＨを、ＮａＯＨを用いて約９．０に調整する。架橋試薬ＢＤＤＥを添加し、溶液中でＨＡと反応させて、ゲルを形成させる。ゲルをＰＢＳ（１５ｍＬ／ｇゲル）で２回洗浄し、ろ過する。次いで、ゲルをエタノール７０％（１５ｍＬ／ｇゲル）で３回洗浄し、溶液を捨てる。
【０１０１】
ＤＭＴＭＭ（０．３ｇ）および３−アミノ−γ−ＣＤ（０．８ｇ）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（２５ｍＬ）に溶解し、この溶液のｐＨを約６．５に調整する（１．２Ｍ  ＨＣｌ）。この溶液を架橋ＨＡゲルに添加し、次いで穏やかに撹拌する。反応物を４５度まで２４時間加熱し、次いで、室温まで放冷する。ゲルをＰＢＳ（１５ｍＬ／ｇゲル）で２回洗浄し、ろ過する。次いで、ゲルをエタノール７０％（１５ｍＬ／ｇゲル）で３回洗浄し、溶液を捨てる。最後に、純エタノールをゲルに添加し、ろ過し、減圧下で乾燥させて、最終的な物質を得る。
【０１０２】
例５（比較例）
ヒアルロナンの架橋およびγ−シクロデキストリンのグラフト化を同時に行うことによる、ヒドロゲルの形成
ＨＡ（１．１ＭＤａ）粉末（０．２５ｇ）およびγシクロデキストリン（０．２５ｇ）をビーカーの中に入れた。ＢＤＤＥ（０．０２４ｇ）を３ｇの１％（重量／重量）ＮａＯＨに添加した。ＢＤＤＥ／ＮａＯＨをビーカーに添加した。モル比ＨＡＤｉ：ＢＤＤＥ：ＣＤｘは、１：０．２：０．３であった。これらの成分を３．５分間、勢いよく混合した。反応を進行させ、ペーストを中和し、７０℃で２４時間、リン酸緩衝液ｐＨ７．４中で膨潤させた。３１５ｕｍの網目に通して、粒子サイズを小さくした。ゲルをシリンジに充填し、滅菌した。
【０１０３】
このＨＡポリマーをオリゴ糖に分解して、例２で説明したようにして一次元1Ｈ定量ＮＭＲ実験を実施した。ＭｏＤCDx/HAdiを測定するために、得られたスペクトルを解析した。ＭｏＤCDx/HADiは、酵素によって分解したゲルの1Ｈ−ＮＭＲによって０．５％と測定された。
【０１０４】
例６（比較例）
ヒアルロナンの架橋およびγ−シクロデキストリンのグラフト化を同時に行うことによる、ヒドロゲルの形成
ＨＡ（０．１７ＭＤａ）粉末（０．４ｇ）およびγ−シクロデキストリン（０．８ｇ）を、シリンジ中で３０分間、１．８ｇの１％（重量／重量）ＮａＯＨに溶解した。別のシリンジ中で、ＢＤＤＥ（０．１２ｇ）を０．６ｇの１％（重量／重量）ＮａＯＨと混合した。モル比ＨＡＤｉ：ＢＤＤＥ：ＣＤｘは、１：０．６：０．６であった。これら２つのシリンジを連結し、連結器を２０回通過させることによって成分を混合した。形成したペーストを、５０℃で温めておいたバイアルに移した。５０℃で２．５時間、反応を進行させた。ＨＣｌを含有するＰＢＳ緩衝液９ｇを添加して中和し、ゲルを膨潤させた後、２つのシリンジ間で６０ｕｍの網目に通して、粒子のサイズを小さくした。ゲルを沈殿させ、エタノールを用いて洗浄した。
【０１０５】
このＨＡポリマーをオリゴ糖に分解して、例２で説明したようにして一次元1Ｈ定量ＮＭＲ実験を実施した。ＭｏＤCDx/HAdiを測定するために、得られたスペクトルを解析した。ＭｏＤCDx/HADiは、酵素によって分解したゲルの1Ｈ−ＮＭＲによって１．３％と測定された。
【０１０６】
例７
架橋ＨＡゲルの乾燥粉末への３−モノアミノ−３−モノデオキシ−γ−シクロデキストリンのグラフト化
ＤＭＴＭＭ（０．１７ｇ）および３−モノアミノ−３−モノデオキシ−γ−シクロデキストリン（０．６１ｇ）をＰＢＳ（１２．５ｍＬ）に溶解し、この溶液のｐＨを６．５±２．５に調整した（１．２Ｍ  ＨＣｌ）。モル比ＨＡＤｉ：ＤＭＴＭＭ：ＣＤｘは１：１：０．７５であった。この溶液をエーテル架橋ＨＡ乾燥粉末（０．２６ｇ）に添加し、穏やかに撹拌した。反応物を４５℃まで２４時間加熱し、次いで、室温まで放冷した。ゲルをＰＢＳ（１５ｍＬ／ｇゲル）で２回洗浄し、ろ過した。ゲルをエタノール７０％（１５ｍＬ／ｇゲル）で３回洗浄し、溶液を捨てた。最後に、純エタノールをゲルに添加し、ろ過し、減圧下で乾燥させて、最終的な物質を得た。
【０１０７】
このＨＡポリマーをオリゴ糖に分解して、例２で説明したようにして一次元1Ｈ定量ＮＭＲ実験を実施した。ＭｏＤCDx/HAdiを測定するために、得られたスペクトルを解析した。ＭｏＤCDx/HADiは、酵素によって分解したゲルの1Ｈ−ＮＭＲによって９％と測定された。
【０１０８】
例８
架橋ＨＡゲルの乾燥粉末への３−モノアミノ−３−モノデオキシ−β−シクロデキストリンのグラフト化
ＤＭＴＭＭ（０．１７ｇ）および３−モノアミノ−３−モノデオキシ−β−シクロデキストリン（０．３５ｇ）をＰＢＳ（１２．５ｍＬ）に溶解し、この溶液のｐＨを６．５±２．５に調整した（１．２Ｍ  ＨＣｌ）。モル比ＨＡＤｉ：ＤＭＴＭＭ：ＣＤｘは１：１：０．５であった。この溶液をエーテル架橋ＨＡ乾燥粉末（０．２８ｇ）に添加し、穏やかに撹拌した。反応物を４５℃まで２４時間加熱し、次いで、室温まで放冷した。ゲルをＰＢＳ（１５ｍＬ／ｇゲル）で２回洗浄し、ろ過した。ゲルをエタノール７０％（１５ｍＬ／ｇゲル）で３回洗浄し、溶液を捨てた。最後に、純エタノールをゲルに添加し、ろ過し、減圧下で乾燥させて、最終的な物質を得た。
【０１０９】
このＨＡポリマーをオリゴ糖に分解して、例２で説明したようにして一次元1Ｈ定量ＮＭＲ実験を実施した。ＭｏＤCDx/HAdiを測定するために、得られたスペクトルを解析した。ＭｏＤCDx/HADiは、酵素によって分解したゲルの1Ｈ−ＮＭＲによって１０％と測定された。
【０１１０】
例９
架橋ＨＡゲルの乾燥粉末への６−モノアミノ−６−モノデオキシ−β−シクロデキストリンのグラフト化
ＤＭＴＭＭ（０．２４ｇ）および６−モノアミノ−６−モノデオキシ−β−シクロデキストリン（０．３１ｇ）をＰＢＳ（１５ｍＬ）に溶解し、この溶液のｐＨを６．５±２．５に調整した（１．２Ｍ  ＨＣｌ）。モル比ＨＡＤｉ：ＤＭＴＭＭ：ＣＤｘは１：１．２：０．３５であった。この溶液をエーテル架橋ＨＡ乾燥粉末（０．３４ｇ）に添加し、穏やかに撹拌した。反応物を４５℃まで２４時間加熱し、次いで、室温まで放冷した。ゲルをＰＢＳ（１５ｍＬ／ｇゲル）で２回洗浄し、ろ過した。ゲルをエタノール７０％（１５ｍＬ／ｇゲル）で３回洗浄し、溶液を捨てた。最後に、純エタノールをゲルに添加し、ろ過し、減圧下で乾燥させて、最終的な物質を得た。
【０１１１】
このＨＡポリマーをオリゴ糖に分解して、例２で説明したようにして一次元1Ｈ定量ＮＭＲ実験を実施した。ＭｏＤCDx/HAdiを測定するために、得られたスペクトルを解析した。ＭｏＤCDx/HADiは、酵素によって分解したゲルの1Ｈ−ＮＭＲによって２２％と測定された。
【０１１２】
例１０
架橋ＨＡゲルの乾燥粉末への６−モノアミノ−６−モノデオキシ−２−Ｏ−メチル−ヘキサキス−（２，６−ジ−Ｏ−メチル）−β−シクロデキストリンのグラフト化
ＤＭＴＭＭ（０．２４ｇ）６−モノアミノ−６−モノデオキシ−２−Ｏ−メチル−ヘキサキス−（２，６−ジ−Ｏ−メチル）−β−シクロデキストリン（０．３５ｇ）をＰＢＳ（１５ｍＬ）に溶解し、この溶液のｐＨを６．５±２．５に調整した（１．２Ｍ  ＨＣｌ）。モル比ＨＡＤｉ：ＤＭＴＭＭ：ＣＤｘは１：１．２：０．３５であった。この溶液をエーテル架橋ＨＡ乾燥粉末（０．３４ｇ）に添加し、穏やかに撹拌した。反応物を４５℃まで２４時間加熱し、次いで、室温まで放冷した。ゲルをＰＢＳ（１５ｍＬ／ｇゲル）で２回洗浄し、ろ過した。ゲルをエタノール７０％（１５ｍＬ／ｇゲル）で３回洗浄し、溶液を捨てた。最後に、純エタノールをゲルに添加し、ろ過し、減圧下で乾燥させて、最終的な物質を得た。
【０１１３】
このＨＡポリマーをオリゴ糖に分解して、例２で説明したようにして一次元1Ｈ定量ＮＭＲ実験を実施した。ＭｏＤCDx/HAdiを測定するために、得られたスペクトルを解析した。ＭｏＤCDx/HADiは、酵素によって分解したゲルの1Ｈ−ＮＭＲによって２３％と測定された。
【０１１４】
例１１
架橋ＨＡゲルの乾燥粉末への６−モノヘキサメチレンジアミノ−６−モノデオキシ−β−シクロデキストリンのグラフト化
ＤＭＴＭＭ（０．２４ｇ）６−モノヘキサメチレンジアミノ−６−モノデオキシ−β−シクロデキストリン（０．６５ｇ）をＰＢＳ（１５ｍＬ）に溶解し、この溶液のｐＨを６．５±２．５に調整した（１．２Ｍ  ＨＣｌ）。モル比ＨＡＤｉ：ＤＭＴＭＭ：ＣＤｘは１：１．２：０．７であった。この溶液をエーテル架橋ＨＡ乾燥粉末（０．３０ｇ）に添加し、穏やかに撹拌した。反応物を４５℃まで２４時間加熱し、次いで、室温まで放冷した。ゲルをＰＢＳ（１５ｍＬ／ｇゲル）で２回洗浄し、ろ過した。ゲルをエタノール７０％（１５ｍＬ／ｇゲル）で３回洗浄し、溶液を捨てた。最後に、純エタノールをゲルに添加し、ろ過し、減圧下で乾燥させて、最終的な物質を得た。
【０１１５】
このＨＡポリマーをオリゴ糖に分解して、例２で説明したようにして一次元1Ｈ定量ＮＭＲ実験を実施した。ＭｏＤCDx/HAdiを測定するために、得られたスペクトルを解析した。ＭｏＤCDx/HADiは、酵素によって分解したゲルの1Ｈ−ＮＭＲによって１８％と測定された。
【０１１６】
実施例１２
架橋ＨＡゲルの乾燥粉末への６−モノアミノ−６−モノデオキシ−β−シクロデキストリンのグラフト化
表４に基づいて、各実験においてＤＭＴＭＭおよび６−モノアミノ−６−モノデオキシ−β−シクロデキストリン（ＣＤｘ）を変動させた。これらの試薬をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（１５ｍＬ）に溶解し、この溶液のｐＨを６．５±２．５に調整した（１．２Ｍ  ＨＣｌ）。この溶液をエーテル架橋ＨＡ乾燥粉末に添加し、穏やかに撹拌した。
【０１１７】
各反応物を４５℃まで２４時間加熱し、次いで、室温まで放冷した。ゲルをＰＢＳ（１５ｍＬ／ｇゲル）で２回洗浄し、ろ過した。ゲルをエタノール７０％（１５ｍＬ／ｇゲル）で３回洗浄し、溶液を捨てた。最後に、純エタノールをゲルに添加し、ろ過し、減圧下で乾燥させて、最終的な各物質を得た。
【０１１８】
このＨＡポリマーをオリゴ糖に分解して、例２で説明したようにして一次元1Ｈ定量ＮＭＲ実験を実施した。ＭｏＤCDx/HAdiを測定するために、得られたスペクトルを解析した。得られたＭｏＤCDx/HADi値を表４に提示している。
【０１１９】
【表４】
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【０１２０】
膨潤容量、すなわち、１グラムのＨＡ当たりの液体総取込み量は、ＭｏＤCDx/HADiが大きくなるにつれて増加しないことが観察された。この挙動から、トリアジンカップリング試薬を用いてエーテル架橋ＨＡゲルにシクロデキストリンをグラフト化しても、ＨＡゲルの顕著な分解はまったく引き起こされないことが実証される。
【図１】
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【国際調査報告】
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