(57)【要約】本明細書で急性および慢性の炎症および自己免疫疾患を予防および／または処置するための方法および医薬組成物が提供される。腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）は炎症応答を促進し、それは、炎症および自己免疫障害、例えば関節リウマチ、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患、乾癬、化膿性汗腺炎および難治性喘息と関連する臨床上の問題を引き起こす。ＴＮＦαは、網膜微小血管細胞の減少をもたらす糖尿病網膜症の病因の促進にも関与している。本明細書の方法は、ＴＮＦα阻害剤である組換え可溶性ヒトＴＮＦ受容体またはその部分を含有する医薬組成物の予防用および／または治療用製剤を投与するステップを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体を炎症、自己免疫疾患および代謝疾患のうちの少なくとも１つについて予防または処置するための組成物であって、
ｓＴＮＦ受容体（ｓＴＮＦ−Ｒ）のスーパーファミリーのメンバーである受容体タンパク質の完全長またはトランケート型と；
該被験体において該組成物の半減期を増加させる、該受容体タンパク質に共有結合している付加物とを含み、該受容体タンパク質の該完全長もしくは該トランケート型単独よりも、または対応する該タンパク質のＰＥＧ化形態よりも減少した免疫原性を有する組成物。
【請求項２】
前記受容体タンパク質が、ｓＴＮＦ−ＲＩ、ｓＴＮＦ−ＲＩＩ、ＤＲ６、ＣＤ９５、ＤｃＲ３、ＤＲ３、Ｆｎ１４、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ、ＨＶＥＭ、ＬＴβＲ、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＯＸ４０、４１ＢＢ、ＮＧＦＲ、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、ＢＲ３、ＸＥＤＡＲ、ＥＤＡＲ、ＴＲＯＹおよびＲＥＬＴからなるＴＮＦ受容体スーパーファミリーから選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記受容体タンパク質が、ｐ５５  ＴＮＦαモノマー受容体（ｓＴＮＦ−ＲＩ）タンパク質；ｐ７５  ＴＮＦαモノマー受容体（ｓＴＮＦ−ＲＩＩ）タンパク質；ならびにドメイン１またはその一部、ドメイン２またはその一部、ドメイン３またはその一部およびドメイン４またはその一部のうちの少なくとも１つを含む該受容体タンパク質の該トランケート型からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記被験体においてｉｎ  ｖｉｖｏ生分解性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記被験体の腎臓酵素によって生分解性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記付加物が、プロリンおよびアラニン、および／もしくはセリンを含有するポリペプチド（ＰＡＳポリペプチド）、またはヘパロサン分子を含有する天然に存在する糖である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記付加物が、天然のアミノ酸残基のうちの少なくとも１つまたは天然および非天然アミノ酸残基の組合せを含む線状ポリペプチド鎖である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記付加物が前記タンパク質の半減期を少なくとも約１０倍増加させる、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記付加物が前記タンパク質の半減期を少なくとも約３００倍だけ増加させる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
質量分析を使用して決定するとおり前記ＰＡＳポリペプチドが単分散混合物を形成する、請求項５に記載の組成物。
【請求項１１】
前記付加物が、前記受容体タンパク質のＣ末端または該受容体タンパク質のＮ末端に共有結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記付加物が複数の付加物であり、第１の付加物は前記受容体タンパク質のＮ末端に共有結合しており、第２の付加物はＣ末端に共有結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記付加物が、前記受容体タンパク質にＮ末端およびＣ末端の内側の位置で共有結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記付加物が複数の付加物であり、該複数の各々は、前記受容体タンパク質の異なるドメインに共有結合しており、該ドメインは、ドメイン１、２、３および４からなる該受容体タンパク質の完全長型のドメインの群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記付加物が、抗炎症薬、ステロイド薬および非ステロイド薬からなる薬物群から選択される少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記抗炎症薬がメトトレキセートである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記付加物が前記受容体タンパク質の免疫原性部位に位置し、免疫原性をマスクする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記付加物が少なくとも約２００アミノ酸残基である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記付加物が少なくとも約１２００アミノ酸残基である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記半減期が、ｉｎ  ｖｉｖｏで、少なくとも約２５時間、少なくとも約７５時間、少なくとも約１２５時間、少なくとも約１７５時間、少なくとも約２２５時間または少なくとも約２７５時間である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記受容体タンパク質が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
クロマトグラフィー精製のための親和性タグをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
被験体を炎症または自己免疫疾患のうちの少なくとも１つについて予防または処置する方法であって、
ｓＴＮＦ受容体（ｓＴＮＦ−Ｒ）のスーパーファミリーのメンバーである受容体タンパク質の完全長またはトランケート型を含む組成物を操作するステップであって、該受容体タンパク質は、該被験体において該タンパク質の半減期を増加させる付加物を含有し、該付加物を含有する該組成物は、ＰＥＧ化された該受容体タンパク質よりも免疫原性が低い、ステップと；
該被験体に該組成物を投与するステップと
を含む方法。
【請求項２４】
投与するステップの前に、前記組成物を予防的または治療的使用に有効な形態に製剤化するステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
投与するステップの前に、前記付加物を前記受容体タンパク質に遺伝子的にコンジュゲートするステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
投与するステップの前に、前記付加物を前記受容体タンパク質に化学的にコンジュゲートするステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
投与するステップの前に、ＰＡＳポリペプチドまたはヘパロサンを前記受容体タンパク質にコンジュゲートすることによって該受容体タンパク質の半減期を増加させるステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
投与するステップの前に、前記組成物を原核細胞または真核細胞で発現させる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
被験体を炎症、自己免疫疾患および代謝疾患のうちの少なくとも１つについて予防または処置するための組成物であって、
ｐ５５  ＴＮＦαモノマー受容体（ｓＴＮＦ−ＲＩ）タンパク質のトランケート型であって、配列番号６からなるアミノ酸配列を含むｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質のトランケート型と；
該被験体において該組成物の半減期を増加させる、該タンパク質に共有結合しているＰＡＳポリペプチドであって、少なくとも約６００アミノ酸残基の長さを有するＰＡＳポリペプチドと
を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、その全体が本明細書中に参考として援用される、２０１５年１月２８日提出の米国仮出願第６２／１０８，８２５号の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、代謝および免疫学的疾患の有効で、安全で、便利な処置において使用するための、半減期延長型のバイオ医薬品組成物に関する。本明細書において、糖尿病網膜症および関節炎などの慢性炎症および自己免疫疾患の有効で安全な処置の施行のために、有効性、安全性および患者コンプライアンスの因子を改善する、半減期改変および薬物送達の技術が示される。これらの因子の改善は、本処置に関連した費用および臨床的負荷を低減する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
２つの異なるヒト腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）受容体：５５ｋｄまたはｐ５５受容体Ｉ型（ＴＮＦ−ＲＩ）および７５ｋｄまたはｐ７５受容体ＩＩ型（ＴＮＦ−ＲＩＩ）が同定されている。ＴＮＦ−ＲＩおよびＴＮＦ−ＲＩＩは、細胞表面型および可溶型の両方で存在し、ＴＮＦに異なる親和性で結合する。ＴＮＦα細胞表面受容体は、マクロファージ、リンパ球および好中球を含むほとんどの細胞型に存在する。シグナル伝達が起こるために、ＴＮＦαは２つまたは３つの細胞表面受容体分子に結合しなければならない。ＴＮＦαの多くの生物学的作用は、高親和性ＴＮＦ−ＲＩ受容体の細胞内シグナル伝達によって媒介される。細胞表面受容体の細胞外部分を含有するモノマー断片は、タンパク分解性開裂に起因して天然に存在する形態であり、可溶性ＴＮＦ受容体と呼ばれる。本明細書で引用される参考文献は、参照によりここにその全体が組み込まれる。
【０００４】
約３０年前の腫瘍壊死因子ＴＮＦ−アルファ（ＴＮＦα）の発見以来、３０個以上の受容体を通してシグナル伝達する２０個を超えるさらなるタンパク質が、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーとして同定された。これらのサイトカイン受容体は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を細胞外システインリッチドメインで結合する能力によって特徴付けられる。神経成長因子（ＮＧＦ）を除いては、ＴＮＦは原型ＴＮＦαと相同である。スーパーファミリーのメンバーは広い組織分布を有し、免疫応答、造血および形態形成などの正常な生物学的過程の調節から、腫瘍形成、移植拒絶反応、敗血症性ショック、ウイルスの複製、骨の再吸収および自己免疫などの病態におけるそれらの役割にわたる、重要な役割を演ずる。したがって、ヒトの疾患を処置するために、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーの効力を利用する多くのアプローチが開発された。世界の数カ国で、ヒト使用のためにＴＮＦおよびＴＮＦアゴニスト分子が承認された。多くの他のＴＮＦファミリーメンバーは、がん、感染性疾患、移植および自己免疫への治療適用に有望性が示されている１。用語ＴＮＦ受容体は、ＴＮＦαを認識するスーパーファミリーの原型メンバー、すなわち、ＴＮＦ−ＲＩおよびＴＮＦ−Ｒ２を指すためにしばしば使用される。
【０００５】
ＴＮＦαは、糖尿病の網膜で見られる初期の炎症性変化に関与する多面的サイトカインである。糖尿病の網膜では、星状神経膠細胞およびミュラー細胞が、ＴＮＦαの潜在的供与源である１。さらに、ＴＮＦαは線維血管組織の細胞外マトリックス、内皮および血管壁に見出され、糖尿病網膜症を有する眼の硝子体で上昇する２、３。ラットモデルでは、２週間の糖尿病によりＴＮＦαレベルが２倍を超えて増加した４。ヒトでは、糖尿病網膜症患者から得られた大多数の網膜検体でＴＮＦα免疫反応性が見られる２。第一世代ＴＮＦ阻害剤エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））は、糖尿病の網膜で細胞間接着分子１レベル、内皮一酸化窒素合成酵素遺伝子発現、および核因子カッパＢ（ＮＦ−κＢ）活性を低減することが示された１。研究は、糖尿病で強化されたＴＮＦレベルが、１型および２型糖尿病の網膜の両方における微小血管細胞死で顕著な役割を果たすことを示す。これらのデータは、有効な予防的処置が現在存在しない初期糖尿病網膜症の進行の予防における、ＴＮＦα活性を阻害することの潜在的な治療利益を示す。
【０００６】
過剰なＴＮＦα活性は、特に炎症状態の疾患病因と関連するので、ＴＮＦαアンタゴニストおよび炎症性疾患の処置におけるその使用方法の必要性がある。ＲＡ患者での週１回の初期投薬の後、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）の投薬を約１５０ｍｇまで３倍増加しなければならず、投薬の頻度を初期の週１回から週２〜３回に増加しなければならない、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）を含む現在承認されているタンパク質ベースのＴＮＦαアンタゴニストの副作用に関して懸念が引き起こされている。追加の懸念には、潜伏型結核の増悪、うっ血心不全の悪化、およびリンパ腫のリスクの増加が含まれる４０。さらに、重度に不応性になるか、現在承認されているＴＮＦαアンタゴニストに単に応答しない患者がいる。したがって、さらなるＴＮＦαアンタゴニストを同定する必要性が継続して存在する。
【０００７】
可溶性ＴＮＦ受容体（ｓＴＮＦ−Ｒ）は、脊椎動物の生物体に一般的に見出される。関節リウマチ（ＲＡ）患者の循環中で、ｓＴＮＦ−Ｒの濃度の増加が見出された。ｓＴＮＦ−Ｒ濃度は、ＲＡ患者での血漿試料濃度と比較して滑液試料でより高い。ＴＮＦαが細胞表面のＴＮＦ−ＲＩタンパク質またはＴＮＦ−ＲＩＩタンパク質のいずれかの２つまたは３つの受容体に結合して二量体化するとき、シグナル伝達が起こる。ＴＮＦ−ＲＩの細胞外領域の４個のドメイン（４．０Ｄ）またはそのトランケート型（truncated  form）、例えば３個のドメイン（３．０Ｄ）および２．６個のドメイン（２．６Ｄ）を含有する天然に存在するＴＮＦα阻害剤は、ＴＮＦ結合タンパク質（ＴＮＦｂｐ）または可溶性ＴＮＦ受容体（ｓＴＮＦ−Ｒ）と呼ばれる。これらの分子は、活動性ＲＡを有する患者から得た組織、血清、滑液および滑膜外植片培養物で見出された。ｓＴＮＦ−ＲＩの存在は、ＲＡ疾患の活動と相関することが示された。
【０００８】
ＴＮＦαを阻害するために、広範な生物学的薬剤が設計され、商品化された５、６。例には、（１）ＴＮＦαＩＩ型可溶性受容体融合タンパク質（例えば、エタネルセプト、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．）；（２）抗ヒトＴＮＦαキメラ（マウス×ヒト）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（例えば、インフリキシマブ、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ  Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ）；（３）完全ヒト化ｍＡｂ（例えば、アダリムマブ、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、Ａｂｂｖｉｅ  Ｉｎｃ．）；（４）ヒトｍＡｂ（例えば、ゴリムマブ、Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ  Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）および（５）ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）化Ｆａｂ断片抗ＴＮＦα抗体（セルトリズマブペゴル、Ｃｉｍｚｉａ（登録商標）、ＵＣＢ  Ｐｈａｒｍａ  ＳＡ）が含まれる。インフリキサマブのバイオシミラーバージョン、ＣＴＰ−１３（例えば、ヒト化キメラインフリキサマブ（inflixamab）バイオシミラーＩｇＧ１κ  ｍＡＢ、Ｒｅｎｓｉｍａ（登録商標）、Ｃｅｌｌｔｒｉｏｎ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｉｎｃ．）が、韓国で承認されている。
【０００９】
ヒト臨床治験で活性であることが示された他の抗ＴＮＦα生成物候補が存在している。ＴＮＦαＩ型可溶性受容体（ｐ５５）融合タンパク質（レネルセプト、Ｒｏｃｈｅ）は、欧州および北米でのＲＡ患者におけるフェーズ２臨床治験で短期有効性を実証したが、より長期の投薬により高度に免疫原性であることが示された。完全長ｐ５５受容体を融合タンパク質のＦｃ領域に連結するヒンジ領域は、免疫原性の原因となるいくつかの抗原性エピトープを含有するようである３。抗レネルセプト抗体はＦｃ受容体に結合したが、ｓＴＮＦ−ＲＩで検出可能でなく、中和特性もアンタゴニスト特性も有していなかった７〜９。ＴＮＦｂｐ、Ｅ．ｃｏｌｉで生成される完全長ｓＴＮＦ−ＲＩのダイマーＰＥＧ化形態が前臨床で１０および臨床治験で１１、ＴＮＦα阻害剤として活性であることが観察された。ＴＮＦｂｐの免疫原性はこの分子のクリアランス速度を低減し、フェーズＩ／ＩＩ臨床治験で血清中半減期を低減した。ＴＮＦｂｐは、長期適応に不適当であることが観察された１１。しかし、概念実証は、２１日間の期間にわたって腫脹関節数および圧痛関節数の低下によって実証された１２。腫脹関節数の著しい低減（４５％〜６０％）が、１００μｇ／ｋｇおよび３００μｇ／ｋｇの静脈内（ＩＶ）投与の後に見られた１１。
【００１０】
ヒト可溶性腫瘍壊死因子受容体Ｉ型（ｓＴＮＦ−ＲＩ）の組換えＣ末端トランケート型が、Ｅ．ｃｏｌｉで生成された１３。この可溶性受容体は、インタクトなｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質の４個のドメインのうちの最初の２．６個を含有する。このタンパク質のモノＰＥＧ化形態（ＰＥＧｓｕｎｅｒｃｅｐｔ（登録商標））は、３０ｋＤメトキシＰＥＧアルデヒドを使用してＮ末端アミノ基に対して約８５％の選択性で生成された。このタンパク質は、４．０ドメインタンパク質、または異なる部位でＰＥＧ化されたか、もしくは異なる分子量のＰＥＧでＰＥＧ化されたＥ．ｃｏｌｉ由来ｓＴＮＦ−ＲＩの他のバージョンよりも、霊長類で免疫原性が低いことが示された。天然のｓＴＮＦ−ＲＩの第３および第４のドメインの免疫原性の増加の理由は完全には決定されておらず、逸話的な証拠は、精製過程の間のリフォールディングが主要な問題であったことを示す１４。３０ｋＤのＰＥＧ  ｓＴＮＦ−ＲＩは、より小さい分子量のＰＥＧによって改変されたｓＴＮＦ−ＲＩと比較してより長い血清中半減期も有する。製剤化された医薬品の粘度を増加させるために、ＰＥＧポリマーが使用される。このタンパク質は、いくつかのＲＡ動物モデルで炎症応答を低減する。さらに、ヒトにおける臨床治験フェーズＩ／ＩＩおよび前期臨床治験フェーズＩＩデータは、ＰＥＧ−ｓＴＮＦ−ＲＩが非免疫原性であり、この薬物による毎週の投薬がＲＡ患者において圧痛関節数および腫脹関節数を低減することを示す。ＰＥＧ−ｓＴＮＦ−ＲＩは、ＲＡ患者を処置するために現在使用される代替の抗ＴＮＦα分子と同等であるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ有効性スコアを有することが示された１５。Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．によるＰＥＧ  ｓＴＮＦ−ＲＩの開発は、臨床フェーズＩＩｃ治験の成功の後に２００５年頃に停止されたようであり、Ａｍｇｅｎはその時以来このプログラムに関して新しい研究を公表もしていないし、市販製品も出現していない。
【００１１】
腫瘍壊死因子結合タンパク質、ＴＢＰ−１（オネルセプト、Ｓｅｒｏｎｏ）は、ヒトＴＮＦ−ＲＩの細胞外部分に対応する可溶性糖タンパク質である１６、１７。ＴＮＦαおよびＴＮＦβへの４ドメイン結合領域を含有するこの可溶性受容体は、酵素的開裂によって細胞膜から循環に天然に放出される。ＴＢＰ−１は尿に排出されるが、そこでそれは最初に同定され、特徴付けられた１８。受容体ｍＲＮＡのクローニングは、哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）での遺伝子操作による組換えヒトＴＢＰ−１（ｒｈＴＢＰ−１）の製造を可能にした。ｒｈＴＢＰ−１は、尿で特徴付けられた天然形態と同一のアミノ酸配列およびグリコシル化パターンを再生する、２０ｋＤ分子量の糖タンパク質である１９、２０。ＴＮＦαおよびＴＮＦβの両方の生体活性三量体形態に特異的に結合することによって、ｒｈＴＢＰ−１はそれらの生物活性を中和する。動物疾患モデルでのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ両方の前臨床研究ならびに毒物学研究は、ＴＢＰ−１の活性および安全性を示した。
【００１２】
化学的に誘導体化されたトランケートされた多数のｓＴＮＦ−Ｒを作製するために、トランケートされたｓＴＮＦ−Ｒは、多くの水溶性、非生物学的、合成ポリマーによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで化学的に改変される。米国特許第６，９８９，１４７号を参照。これらの合成の生物分解性でないポリマーの中で最も知られているものは、ＰＥＧである。米国特許第６，９８９，１４７号は、ＰＥＧポリマーの平均分子量が好ましくは約５ｋＤａから約５０ｋＤａの間、より好ましくは約１２ｋＤａから約４０ｋＤａの間、最も好ましくは約２０ｋＤａから約４０ｋＤａの間であることを示す。
【００１３】
１９９０年代初期に開発されたＰＥＧ化の現在の支配的な半減期延長技術は、以下の問題と関連している：高い商品費用；さらなる製品損失をもたらす生産後の化学的カップリングおよび処理ステップ；しばしば、薬物ペイロードのかなり低下した生物活性；高い粘度；ならびに、空胞化の問題をもたらす腎尿細管細胞、マクロファージ、脈絡叢上皮細胞などの器官での蓄積の証拠の増加２１。中でもＰＥＧｓｕｎｅｒｃｅｐｔ（登録商標）、ＰＥＧ化αＩＬ１βＦａｂ、グリコＰＥＧ化ＶＩＩａ因子などの様々なＰＥＧ化製品の臨床開発は、終了または延期された。
【００１４】
一般的に、目的のタンパク質にカップリングするＰＥＧの分子量が高いほど、および／またはＰＥＧポリマーの枝が多いほど、ポリマー：タンパク質比は高い。ポリマー：タンパク質比が高いほど、化学的にカップリングした生成物の粘度が高く、それは注射の容易さおよび送達様式の因子に関係する困難を生じさせる（which  is  a  creates  difficulties  related  to  the  ease-of-injection  and  mode-of-delivery  factors）。米国特許第７，７００，７２２号は、タンパク質が、２０ｋＤａから３５ｋＤａの範囲内の分子量および最高４００ｃＰの粘度を有するＰＥＧポリマーに化学的にコンジュゲートしたことを示す。これらの粘度では、注射時間が長い（すなわち約８０秒またはそれ超）だけでなく、より低い粘度の組成物のために使用される針よりかなり太いゲージ針（すなわち、約２３Ｇ）を使用しなければならず、それは極めて痛みを伴う注射となる。
【００１５】
ｓＴＮＦＲ−ＩおよびｓＴＮＦＲ−ＩＩは、神経成長因子受容体（ＮＧＦ）、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ラットＴ細胞抗原ＭＲＣ  ＯＸ４０、Ｆａｓ抗原ならびにＣＤ２７およびＣＤ３０抗原を含む受容体の神経成長因子／ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである２２。細胞表面受容体のこの群の間で最も保存された特徴は、システインリッチ細胞外リガンド結合性ドメインであり、それは、約４０アミノ酸の４つの反復モチーフに存在し、よく保存されている位置で４〜６個のシステイン残基を含有する２２。
【００１６】
組換えで生成されるＴＮＦ阻害剤は、当技術分野で教示されている。例えば、欧州特許（ＥＰ）３９３４３８およびＥＰ４２２３３９は、成熟した組換えヒト３０ｋＤａのＴＮＦ阻害剤（ｐ５５受容体およびｓＴＮＦ−ＲＩとしても知られる）および成熟した組換えヒト４０ｋＤａの阻害剤（ｐ７５受容体およびｓＴＮＦ−ＲＩＩとしても知られる）ならびにその改変形態、例えば、断片、機能的誘導体および変異体のアミノ酸配列および核酸配列を示す。ＥＰ３９３４３８およびＥＰ４２２３３９は、阻害剤のコーディングに関与する遺伝子の単離、適するベクターおよび細胞型での遺伝子のクローニング、ならびに阻害剤を生成するための遺伝子の発現のための方法も示す。成熟した組換えヒト３０ｋＤａのＴＮＦ阻害剤および成熟した組換えヒト４０ｋＤａのＴＮＦ阻害剤は、ＴＮＦを阻害することが可能であることが以前に実証されている（ＥＰ３９３４３８およびＥＰ４２２３３９を参照）。
【００１７】
ＥＰ３９３４３８は４０ｋＤａのＴＮＦ阻害剤Δ５１および４０ｋＤａのＴＮＦ阻害剤Δ５３を示し、それらは成熟したタンパク質のカルボキシル末端のそれぞれ５１または５３アミノ酸残基が除去された、完全長組換え４０ｋＤａのＴＮＦ阻害剤タンパク質のトランケートされたバージョンである。したがって、３０ｋＤａのＴＮＦ阻害剤および４０ｋＤａの阻害剤の各々の第４のドメインがＴＮＦ阻害のために必要でないことを当業者は理解するだろう。３０ｋＤａおよび４０ｋＤａのＴＮＦ阻害剤のドメインが欠失したトランケートされた誘導体が生成された。第４のドメインのないトランケートされた誘導体は完全なＴＮＦ結合活性を保持するが、第１、第２または第３のドメインのない誘導体はＴＮＦ結合活性を保持しない２３、２４、２５。
【００１８】
ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）と呼ばれるポリペプチドをベースとしたランダムコイルドメイン（ＲＣＤ）技術などの半減期延長技術が開発された２６〜２９。ここに参照によりその全体が組み込まれる、２０１１年１１月２４日に公開されたSkerraら、ＷＯ２０１１／１４４７５６および２０１１年１２月２４日に公開されたSkerraら、ＷＯ２００８／１５５１３４を参照。ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）のポリペプチドは、アミノ酸プロリン、アラニン、および任意選択でセリン（セリンが存在することを示すＰＡ／ＳまたはＰＡＳ）残基の配列を含有する。アミノ酸残基の組合せであるポリマーは、安定して無秩序なポリペプチドを形成するために、各アミノ酸残基の別個の二次構造選好性の解除をもたらす。ランダムコイルコンフォメーションを呈するアミノ酸配列を伴うドメインを含有する少なくとも１つのＰＡＳポリペプチドに結合した生物活性タンパク質は、その天然状態でこの付加物を欠くタンパク質と比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性が増加することが観察された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】米国特許第７７００７２２号明細書
【特許文献２】欧州特許出願公開第３９３４３８号明細書
【特許文献３】欧州特許出願公開第４２２３３９号明細書
【特許文献４】国際公開第２００８／１５５１３４号
【特許文献５】国際公開第２０１１／１４４７５６号
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Joussen  AM,  Poulaki  V,  Mitsiades  N,  Kirchhof  B,  Koizumi  K,  Dohmen  S,  Adamis  AP.  Nonsteroidal  anti-inflammatory  drugs  prevent  early  diabetic  retinopathy  via  TNF-alpha  suppression.  FASEB  J.  16:438−440.  2002.
【非特許文献２】Limb  GA,  Chignell  AH,  Green  W,  LeRoy  F,  Dumonde  DC.  Distribution  of  TNF  alpha  and  its  reactive  vascular  adhesion  molecules  in  fibrovascular  membranes  of  proliferative  diabetic  retinopathy.  Br  J  Ophthalmol.  80:168−173.  1996.
【非特許文献３】Demircan  N,  Safran  BG,  Soylu  M,  Ozcan  AA,  Sizmaz  S.  Determination  of  vitreous  interleukin-1  (IL-1)  and  tumour  necrosis  factor  (TNF)  levels  in  proliferative  diabetic  retinopathy,  Eye.  20:1366−1369.  2006.
【非特許文献４】Palladino,  M.  A.,  et  al.  Nat.  Rev.  Drug  Discov.  2:736-46.  2003.
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【非特許文献６】Sedger  LM  &  McDermott  MF.  TNF  and  TNF-receptors:  From  mediators  of  cell  death  and  inflammation  to  therapeutic  giants  -  past,  present  and  future.  Cytokine  and  Growth  Factor  Reviews  25,  453-472.  2014.
【非特許文献７】Schottelius  A.  et  al.  Biology  of  tumor  necrosis  factor-a  (TNF-a):  Implications  for  psoriasis.  Experimental  Dermatology  13,  193-222.  2004.
【非特許文献８】Christen  U,  Thuerkauf  R,  Stevens  R  &  Lesslauer  W.  Immune  response  to  a  recombinant  human  TNFR55-IgG1  fusion  protein:  Auto-  antibodies  in  rheumatoid  arthritis  (RA)  and  multiple  sclerosis  (MS)  patients  have  neither  neutralizing  nor  agonist  activities.  Human  Immunology  60,  774-790.  1999.
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【非特許文献１１】Solorzano  CC  et  al.  Involvement  of  26-kDa  cell  associated  TNFa  in  experimental  hepatitis  and  exacerbation  of  liver  injury  with  a  matrix  metalloproteinase  inhibitor.  J-Immunol.  158,  414-419.  1997.
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【非特許文献１３】McCabe  D  et  al.  A  phase  I/II  study  to  evaluate  the  safety,  immunogenicity,  pharmacokinetics  and  potential  efficacy  of  IV  rHuTNF  binding  protein  pegylated  dimer  (TNFbp)  in  patients  with  active  RA.  Arthritis  and  Rheumatism  41,  S58.  1998.
【非特許文献１４】Edwards  III  CK.  PEGylated  recombinant  human  soluble  tumour  necrosis  factor  receptor  type  I  (r-Hu-sTNF-RI)  novel  high  affinity  TNF  receptor  designed  for  chronic  inflammatory  diseases.  Annals  of  Rheumatic  Diseases  58,  173-181.  1999.
【非特許文献１５】Jones  MD  et  al.  Determination  of  tumor  necrosis  factor  binding  protein  disulfide  structure:  deviation  of  the  fourth  domain  structure  form  tnfr/ngrf  family  cysteine-rich  region  signature.  Biochemistry.  36,  14914-14923.  1997.
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【非特許文献１７】Glatt  S,  Fuseau  E,  Buraglio  M  &  Nguyen  QTX.  Population  pharmacokinetics  of  onercept  in  healthy  subjects.  Clin  Pharmacokinetics  44[12],  1295-1304.  2005.
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【非特許文献２１】Novick  D,  Engelmann  H,  Wallach  D  &  Rubinstein  M.  Soluble  cytokine  receptors  are  present  in  normal  human  urine.  J-Exp-Med.  170,  1409-1414.  1989.
【非特許文献２２】European  Medicines  Agency.  CHMP  Safety  Working  Party's  rsponse  to  the  PDCO  regarding  theuse  of  PEGylated  drug  products  in  the  pediatric  population.  EMA/CHMP/SWP/647258/2012.  16  Nov.  2012.
【非特許文献２３】Smith  et  al.  Science.  248:1019-1023.  1990.
【非特許文献２４】Corcoran  et  al.  Eur.  J.  Biochem.  223:831-840.  1994.
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【非特許文献２６】Scallon  et  al.  Cytokine,  7(8):759-770.  1995.
【非特許文献２７】Schlapschy  M,  Binder  U,  Borger  C,  Theobald  I,  Wachinger  K,  Kisling  S,  Haller  D  &  Skerra  A.  PASylation:  a  biological  alternative  to  PEGylation  for  extending  the  plasma  half-life  of  pharmaceutically  active  proteins.  Protein  Engineering,  Design  &  Selection  26:8  489−501.  2013.
【非特許文献２８】Morath  V,  Bolze  F,  Schlapschy  M,  Schneider  S,  Sedlmayer  F,  Seyfarth  K,    Klingenspor  M,  &  Skerra  A.  PASylation  of  Murine  Leptin  Leads  to  Extended  Plasma  Half-Life  and  Enhanced  in  Vivo  Efficacy.  pubs.acs.org/molecularpharmaceutics.  2015.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
発明の簡単な要旨
本明細書の本発明の様々な実施形態は、被験体を炎症、自己免疫疾患および代謝疾患のうちの少なくとも１つについて予防または処置するための組成物であって、ｓＴＮＦ受容体（ｓＴＮＦ−Ｒ）のスーパーファミリーのメンバーである受容体タンパク質の完全長またはトランケート型と；被験体において組成物の半減期を増加させる、受容体タンパク質に共有結合している付加物とを含み、受容体タンパク質の完全長もしくはトランケート型単独よりも、または対応する該タンパク質のＰＥＧ化形態よりも減少した免疫原性を有する組成物に関する。
【００２２】
本発明のある特定の実施形態では、受容体タンパク質は、ｓＴＮＦ−ＲＩ、ｓＴＮＦ−ＲＩＩ、死受容体６（ＤＲ６）、分化抗原群９５（ＣＤ９５）、デコイ受容体３（ＤｃＲ３）、死受容体３（ＤＲ３）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１２Ａ（Ｆｎ１４）、死受容体（ＤＲ４）、死受容体（ＤＲ５）、デコイ受容体１（ＤｃＲ１）、デコイ受容体２（ＤｃＲ２）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、核因子κＢの受容体活性化因子（ＲＡＮＫ）、ヘルペスウイルス侵入媒介物（ＨＶＥＭ）、リンフォトキシン−β受容体（ＬＴβＲ）、グルココルチコイド誘導ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、分化抗原群４０（ＣＤ４０）、分化抗原群３０（ＣＤ３０）、分化抗原群２７（ＣＤ２７）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４（ＯＸ４０）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９（４１ＢＢ）、神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、膜貫通活性化因子およびＣＡＭＬインタラクタ（ＴＡＣＩ）、ＢＡＦＦ受容体３（ＢＲ３）、ｘ連鎖外胚葉形成異常受容体（ＸＥＤＡＲ）、エクトディスプラシンＡ受容体（ＥＤＡＲ）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１９（ＴＲＯＹ）および腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１９Ｌ（ＲＥＬＴ）のＴＮＦ受容体スーパーファミリーから選択される少なくとも１つである。例えば、受容体タンパク質は、ｐ５５ＴＮＦαモノマー受容体（ｓＴＮＦ−ＲＩ）タンパク質；ｐ７５ＴＮＦαモノマー受容体（ｓＴＮＦ−ＲＩＩ）タンパク質；ならびにドメイン１またはその一部、ドメイン２またはその一部、ドメイン３またはその一部およびドメイン４またはその一部のうちの少なくとも１つを含む受容体タンパク質のトランケート型の群から選択される少なくとも１つである。
【００２３】
本発明のある特定の実施形態では、組成物は被験体においてｉｎ  ｖｉｖｏ生分解性である。本発明の一態様では、組成物は被験体の腎臓酵素によって生分解性である。ある特定の実施形態では、組成物の付加物は、プロリンおよびアラニンおよび／もしくはセリンを含有するポリペプチド（セリンが存在する場合はＰＡ／ＳまたはＰＡＳ）であるか、またはヘパロサン分子を含有する天然に存在する糖である。ある特定の実施形態では、組成物の付加物は、天然のアミノ酸残基のうちの少なくとも１つまたは天然および非天然アミノ酸残基の組合せを含有する線状ポリペプチド鎖である。ある特定の実施形態では、組成物の付加物は、タンパク質の半減期を少なくとも約１０倍に増加させる。ある特定の実施形態では、付加物は、タンパク質の半減期を少なくとも約３００倍だけ増加させる。ある特定の実施形態では、組成物の付加物は、質量分析を使用して決定するとおり単分散混合物を形成するＰＡＳポリペプチドである。ある特定の実施形態では、組成物の付加物は、ｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質もしくはｓＴＮＦ−ＲＩＩタンパク質のＣ末端で、またはｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質もしくはｓＴＮＦ−ＲＩＩタンパク質のＮ末端で共有結合している。
【００２４】
ある特定の実施形態では、組成物の付加物は複数の付加物であり、第１の付加物はｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質またはｓＴＮＦ−ＲＩＩタンパク質のＮ末端に共有結合しており、第２の付加物はＣ末端に共有結合している。ある特定の実施形態では、組成物の付加物は、ｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質またはｓＴＮＦ−ＲＩＩタンパク質にＮ末端およびＣ末端の内側の位置で共有結合している。ある特定の実施形態では、付加物は複数の付加物であり、各々ｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質またはｓＴＮＦ−ＲＩＩタンパク質の異なる位置にある。ある特定の実施形態では、組成物の付加物は複数の付加物であり、複数の各々は、ｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質またはｓＴＮＦ−ＲＩＩタンパク質の異なるドメインに共有結合しており、ドメインは、ドメイン１、２、３および４を含有するｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質またはｓＴＮＦ−ＲＩＩタンパク質の完全長型のドメインの群から選択される少なくとも１つである。ある特定の実施形態では、組成物の付加物は、抗炎症薬、ステロイド薬および非ステロイド薬からなる薬物群から選択される少なくとも１つをさらに含む。例えば、抗炎症薬は、メトトレキセートである。
【００２５】
ある特定の実施形態では、組成物の付加物は、ｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質またはｓＴＮＦ−ＲＩＩタンパク質の免疫原性部位に位置し、免疫原性をマスクする。ある特定の実施形態では、組成物の付加物は、少なくとも約２００アミノ酸残基である。例えば、付加物は、少なくとも約１２００アミノ酸残基である。ある特定の実施形態では、組成物の半減期は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、少なくとも約２５時間、少なくとも約７５時間、少なくとも約１２５時間、少なくとも約１７５時間、少なくとも約２２５時間または少なくとも約２７５時間である。ある特定の実施形態では、ｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質のトランケート型は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群から選択される少なくとも１つの配列からなるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、組成物の付加物はＰＥＧではない。
【００２６】
本明細書の本発明の様々な実施形態は、被験体を炎症または自己免疫疾患のうちの少なくとも１つについて予防または処置する方法であって、ｐ５５  ＴＮＦαモノマー受容体（ｓＴＮＦ−ＲＩ）またはｐ７５  ＴＮＦαモノマー受容体（ｓＴＮＦ−ＲＩＩ）タンパク質のトランケート型を含有する組成物を操作するステップであって、ｓＴＮＦ−ＲＩまたはｓＴＮＦ−ＲＩＩタンパク質は、被験体においてタンパク質の半減期を増加させる付加物を含有し、付加物を含有するｓＴＮＦ−ＲＩまたはｓＴＮＦ−ＲＩＩタンパク質は、ＰＥＧ化されたｓＴＮＦ−ＲＩまたはｓＴＮＦ−ＲＩＩタンパク質よりも免疫原性が低い、ステップと；被験体に組成物を投与するステップとを含む方法に関する。
【００２７】
ある特定の実施形態では、この方法は、投与するステップの前に、ｓＴＮＦ−ＲＩまたはｓＴＮＦ−ＲＩＩタンパク質を予防的または治療的使用に有効な形態に製剤化するステップ（fthe  step）をさらに含む。ある特定の実施形態では、この方法は、投与するステップの前に、ｓＴＮＦ−ＲＩまたはｓＴＮＦ−ＲＩＩタンパク質に付加物を遺伝子的にコンジュゲートするステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、この方法は、投与するステップの前に、ｓＴＮＦ−ＲＩまたはｓＴＮＦ−ＲＩＩタンパク質に付加物を化学的にコンジュゲートするステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、この方法は、投与するステップの前に、ｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質またはｓＴＮＦ−ＲＩＩタンパク質の半減期を、ＰＡＳポリペプチドまたはヘパロサン分子を含有する天然に存在する糖をタンパク質にコンジュゲートすることによって増加させるステップをさらに含む。
【００２８】
本明細書の本発明の様々な実施形態は、被験体を炎症、自己免疫疾患および代謝疾患のうちの少なくとも１つについて予防または処置するための組成物であって、ｐ５５  ＴＮＦαモノマー受容体（ｓＴＮＦ−ＲＩ）タンパク質のトランケート型であって、配列番号６からなるアミノ酸配列を含む、ｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質のトランケート型と；被験体において組成物の半減期を増加させる、該タンパク質に共有結合しているＰＡＳポリペプチドであって、少なくとも約６００アミノ酸残基の長さを有するＰＡＳポリペプチドとを含む組成物に関する。例えば、組成物の半減期は、約２００時間から約２５０時間の範囲内にある。
【００２９】
本発明の実施形態は、生成後の化学的カップリング方法および技術を使用するよりも分子生物学アプローチを使用して半減期の増加のために改変した、機能的に活性なトランケートされたｓＴＮＦＲを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、バイオ医薬品薬物の半減期延長および効果的な送達の問題および最適な解決法の図である。
【図２】図２は、バイオ医薬品組成物の半減期を増加させるためのＰＥＧ残基の高度多分散性を示すゼロ電荷にデコンボリューションした質量スペクトルのグラフである。Bagalら、Anal.  Chem.、８０巻：２４０８〜２４１８頁（２００８年）を参照。
【図３】図３は、線状ポリペプチドを生じさせる特異的長さ「ｎ」を有する天然のアミノ酸または天然および非天然アミノ酸の組合せによって形成される構造の図である。
【図４】図４は、複数の反復単位「ｎ」のヘパロサンを含有する糖分子によって形成される構造の図である。
【図５】図５は、図３のポリペプチド構造のサイズ分布および高度単分散性の質量分析データのグラフである。
【図６】図６は、図３の反復構造によって例示される様々な長さのアミノ酸残基および好ましい分子量範囲内のＰＥＧポリマーの間の粘度を比較するグラフである。
【図７】図７は、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドおよび各々の公知の受容体の図である。１
【図８】図８は、組換え可溶性ヒトｐ５５またはｐ７５可溶性ＴＮＦ受容体の生物活性形態、１３、の三次元構造を表すＸ線結晶学の結果である。Naismithら、Structure、４巻（１１号）：１２５１〜１２６２頁（１９９６年）；Bannerら、Cell、７３巻：４３１〜４４５頁（１９９３年）を参照。
【図９】図９は、図７のタンパク質と図３のＰＡＳポリペプチド、１０、およびその変異体の組合せからの、半減期が延長されたバイオ医薬品組成物および変異体の形成のプロセスの図である。ＰＡＳポリペプチド、１０、は、図８に例示するようにバイオ医薬品組成物変異体のいずれかの末端に、１つの末端だけに、もしくは両末端に、またはタンパク質変異体の中にあってもよい。
【図１０】図１０は、図７のタンパク質を図４のヘパロサン分子およびその変異体と組み合わせることによって、半減期の延長されたバイオ医薬品組成物およびその変異体の形成を示す。ヘパロサン分子、１１、は、図９に例示するようにバイオ医薬品組成物のいずれかの末端に、１つの末端だけに、もしくは両末端に、またはタンパク質の中にあってもよい。
【図１１】図１１は、図７の少なくとも１つのタンパク質を、図３のＰＡＳポリペプチド１０およびその変異体ならびに／または図４のヘパロサン分子、１１、およびその変異体と一緒に含有する半減期の延長されたバイオ医薬品組成物の図である。ＰＡＳポリペプチド、１０、またはヘパロサン分子、１１、は、タンパク質のいずれかの末端に、１つの末端だけに、両末端に、またはタンパク質の中に、個々におよび独立して位置することができる。
【図１２】図１２は、図３のＰＡＳポリペプチド、１０、に適切に結合しているとき、ＰＡＳポリペプチド、１０、のピコ秒からフェムト秒の振動のために、図７に示すようなｓＴＮＦ−Ｒの生物活性形態、１３、の有効な分子容の増加を示す図である。
【図１３】図１３は、図３のＰＡＳポリペプチド、１０、の異なる変異体および／または図４のヘパロサン分子、１１、とコンジュゲートした、図７のｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質およびｓＴＮＦ−ＲＩＩタンパク質の生物活性形態の流体力学的体積の増加の図である。
【図１４】図１４は、いくつかの臨床的に関連する種にわたる、図８に示す構造およびその変異体のための種間アロメトリックスケーリングの原理を使用した、排出半減期対体重のプロットである。
【図１５Ａ】図１５Ａは、ｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質の完全長型の核酸配列である（配列番号１）。核酸配列の陰影部は、完全長ｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質の２．６Ｄ変異体である（配列番号２）。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、図１５Ａの核酸配列と対応するアミノ酸配列である（配列番号３）。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、４．０ドメイン（４．０Ｄ）を含有する完全長ｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質（配列番号３）のアミノ酸位置４１からアミノ酸位置２０１までのアミノ酸配列である（配列番号４）。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、３．０ドメイン（３．０Ｄ）を含有する完全長ｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質（配列番号３）のアミノ酸位置４１からアミノ酸位置１６７までのアミノ酸配列である（配列番号５）。
【図１５Ｅ】図１５Ｅは、２．６ドメイン（２．６Ｄ）を含有する完全長ｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質（配列番号３）のアミノ酸位置４１からアミノ酸位置１４８までのアミノ酸配列である（配列番号６）。
【図１５Ｆ】図１５Ｆは、２．３ドメイン（２．３Ｄ）を含有する完全長ｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質（配列番号３）のアミノ酸位置４９からアミノ酸位置１４８までのアミノ酸配列である（配列番号７）。
【図１６】図１６は、ｓＴＮＦ−ＲＩＩタンパク質の完全長型のアミノ酸配列である（配列番号８）。
【図１７Ａ】図１７Ａ〜図１７Ｃは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞での発現のために、ｓＴＮＦ−ＲにＰＡＳポリペプチド配列を遺伝子融合するためのクローニング戦略／構築物およびプラスミドマップの図示である。
【図１７Ｂ】図１７Ａ〜図１７Ｃは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞での発現のために、ｓＴＮＦ−ＲにＰＡＳポリペプチド配列を遺伝子融合するためのクローニング戦略／構築物およびプラスミドマップの図示である。
【図１７Ｃ】図１７Ａ〜図１７Ｃは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞での発現のために、ｓＴＮＦ−ＲにＰＡＳポリペプチド配列を遺伝子融合するためのクローニング戦略／構築物およびプラスミドマップの図示である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
現在市販されている製品は、免疫原性；人体からの迅速なクリアランス；粘度；ならびに投与の経路、方法および頻度の問題を引き起こす。本明細書で引用される参考文献は、参照によりここにその全体が組み込まれる。
【００３２】
ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）は、ＰＥＧ化ができない利点を提供する：それは、高い標的親和性を維持する；それは、現在まで前臨床治験で免疫原性を誘発していない；それは生分解性であり、そのためそれは腎臓酵素によって効率的に分解される；および、それは血流中で安定している。ＰＡＳポリペプチドは、多分散を示さず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのカップリングステップを必要とせず、それにより商品コストの要因（cost  of  goods  factor）にマイナスの影響を及ぼさない。ＰＡＳポリペプチドは、ＰＥＧの同等の分子量でより低い粘度を有し、半減期延長は、１０倍から３００倍を超えて調整可能である。これらの利点は、患者コンプライアンスの向上をもたらす低減された投薬および投与頻度により、ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）によって改変されたタンパク質をより効果的、より安全およびかなりより便利にする。
【００３３】
免疫抑制状態である多くの患者で既存の薬物を使用することに関して懸念がある。これらの薬物は改変されておらず、そのことは体からの薬物の迅速なクリアランスをもたらし、次により高い量および／またはより高頻度の投薬レジメンによって補償されなければならず、臨床負荷の増加をもたらす。
【００３４】
本明細書の本発明のある特定の実施形態は、バイオ医薬品薬物の免疫抑制的性質をマスクし、体内でのその半減期を増加させる。その結果として、薬物は体によって拒絶されず、免疫反応をもたらさず、より低い量または頻度の投薬をもたらす。
【００３５】
本明細書の本発明のある特定の実施形態は、糖尿病網膜症および関節炎などの生涯続く疾患を患っている患者への処置転帰を改善するために、上で引用した分子の１つまたは複数を改変する。
【００３６】
特異的ドメインを排除するか含むために、および生物活性を保持するために、ｓＴＮＦ−ＲＩおよびｓＴＮＦ−ＲＩＩのサイズが低減される２３〜２５。本明細書の本発明のある特定の実施形態は、ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）を介してポリペプチド鎖に遺伝子融合されたｓＴＮＦ−ＲＩおよびｓＴＮＦ−ＲＩＩのトランケート型または完全長型が、低減された抗原性および大いに増加した半減期を伴って生物活性を保持するとの発見に基づく。これらの分子は１つ少ない潜在的に不安定にする脱アミド部位を有し、より少ないジスルフィド架橋を有する。ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）はリフォールディングおよび精製過程を単純化し、ＰＡＳ化された（PASylated）分子は潜在的抗原性エピトープのための低減された数の部位を有する。
【００３７】
１つまたは複数の選択されたアミノ酸残基を置き換えるか、挿入するか、欠失させるための変異誘発などの技術は、当業者に周知である（例えば、米国特許第４，５１８，５８４号）。一般的に、各アミノ酸配列変異体の構築において２つの主要な変数がある：変異部位の位置および変異の性質。各変異体の設計では、各変異部位の位置および変異の性質は、改変する生化学特性（複数可）に依存した。各変異部位は、（１）結果によって保存的アミノ酸の選択で最初に置換し、次によりラジカルな選択で置換すること、（２）標的アミノ酸残基を欠失させること、または、（３）その部位に隣接してアミノ酸残基を挿入することによって個々にまたは連続的に改変した。これらの技術は、生物活性を保持した様々なトランケート型を作製するためにｓＴＮＦ−Ｒのアミノ酸配列で欠失、挿入および置換を起こさせるために使用された。
【００３８】
本明細書の本発明の実施形態は、ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）の工程によって例示される現在の技術の粘度関連の欠点を示さない、遺伝子融合されたＰＡＳ化された部分を含有するｓＴＮＦ−Ｒを企図する。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容されるキャリア」には、所望の特定の剤形に適するものとして、ありとあらゆる溶媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁補助剤、界面活性剤、等張剤、増粘もしくは乳化剤、保存剤、固体結合剤、滑沢剤などが含まれる。Remington's  Pharmaceutical  Sciences、２２版；Gennaro、Mack  Publishing、Easton、PA（２０１２年）は、医薬組成物の製剤化で使用される様々なキャリアおよびそれを調製する公知の技術を提供する。薬学的に許容されるキャリアの役割をする材料の例には、これらに限定されないが、グルコースおよびスクロースなどの糖；カカオ脂および坐薬ワックスなどの賦形剤；油、例えば落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油；プロピレングリコールのようなグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張性食塩水；リンガー液；エチルアルコール；ならびにリン酸緩衝液、ならびに他の無毒の適合する滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムが含まれ、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、保存剤および、抗酸化剤も組成物中に存在してもよく、薬剤の選択および非刺激性の濃度は製剤従事者の判定によって決定される。
【００４０】
治療有効用量
本発明の方法により、組成物は、任意の量を使用して、および被験体を炎症または自己免疫疾患について予防または処置するのに有効な任意の投与経路によって投与することができる。有効量は、疾患または状態の症状を有益に予防または改善するのに十分な組成物の量を指す。
【００４１】
正確な投薬量は、処置される患者を考慮して、個々の医師によって選択される。活性薬剤（複数可）の十分なレベルを提供するようにまたは所望の効果を維持するように、投薬量および投与は調整される。考慮することができる追加の因子には、疾患状態の重症度、例えば、肝機能、がん進行、および／または黄斑変性症の中間もしくは進行した段階；患者の年齢、体重および性別；食事、投与の時間および頻度；投与経路；薬物組合せ；反応感受性；免疫抑制レベル；ならびに療法への忍容性／応答が含まれる。長時間作用性医薬組成物は、特定の組成物の半減期およびクリアランス速度に応じて、１時間ごとに、１時間に２回、３〜４時間ごとに、毎日、１日２回、３〜４日ごとに、毎週または２週ごとに１回投与されてもよい。
【００４２】
本発明の医薬組成物の活性薬剤は、投与の容易さおよび投薬量の均一性のために好ましくは投薬単位形態で製剤化される。本明細書で使用される「投薬単位形態」という表現は、処置される患者に適当である活性薬剤の物理的に別個の単位を指す。本発明の組成物の総１日使用量は、主治医によって健全な医学判断の範囲内で決定される。いかなる活性薬剤の場合も、治療有効用量は、細胞培養アッセイで、または動物モデル、潜在的にマウス、ブタ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、霊長類、サル、イヌ、ラクダまたは高価値動物で最初に推定される。望ましい濃度および全体の投薬範囲および投与経路を達成するために、本明細書で提供される細胞ベース、動物およびｉｎ  ｖｉｖｏのモデルも使用される。そのような情報は、ヒトでの投与のための有用な用量および経路を決定するために使用される。
【００４３】
治療有効用量は、症状もしくは状態を改善するか、または疾患もしくは状態の進行を予防する活性薬剤の量を指す。活性薬剤の治療有効性および毒性は、細胞培養または実験動物での標準の薬学的手順、例えばＥＤ５０（集団の５０％で治療上有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％に致死性の用量）によって決定される。毒性対治療効果の用量比は治療指数であり、それは比ＬＤ５０／ＥＤ５０で表される。大きな治療指数を示す医薬組成物が、好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトでの使用のための投薬量の範囲の処方で使用される。
【００４４】
医薬組成物の投与
適当な薬学的に許容されるキャリアとともに所望の投薬量で製剤化されるとき、本明細書で提供される医薬組成物または方法は、ヒトおよび他の哺乳動物に対して、予防または処置目的ならびにがん関連の障害または状態の重症度および性質によって、例えば皮膚腫瘍の場合は局所的に（例えば、散剤・粉剤（powder）、軟膏剤、クリーム剤または滴剤によって）、経口、直腸、粘膜、舌下、非経口、大槽内、膣内、腹腔内、静脈内、皮下、口内、舌下、眼または鼻腔内に投与される。
【００４５】
医薬組成物の注射には、例えば食道、乳房、脳、頭頸部および前立腺炎症に対して、炎症性領域または疾患領域に直接、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、または眼内注射が含まれる。
【００４６】
液体剤形は、例えば、これらに限定されないが、静脈内、眼、粘膜の薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルジョン、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤である。少なくとも１つの活性薬剤に加えて、液体剤形は、当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤、例えば水または他の溶媒；可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物などを含有することができる。不活性希釈剤の他に、眼、経口または他の全身送達される組成物は、アジュバント、例えば湿潤剤、ならびに乳化および懸濁化剤も含む。
【００４７】
軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤・粉剤、液剤、噴霧剤、吸入剤またはパッチを含む、本明細書の医薬組成物の局所または経皮投与のための剤形。活性薬剤は薬学的に許容されるキャリアと無菌条件下で混合され、保存剤または緩衝剤が必要とされることがある。例えば、眼または皮膚の投与経路は、水性の滴剤、ミスト剤、乳剤またはクリーム剤で達成される。投与は、治療的または予防的形態である。本明細書の本発明のある特定の実施形態は、移植器具、外科用器具または開示される組成物を含有する製品（例えば、ガーゼ包帯またはストリップ）、およびそのような器具または製品を作製または使用する方法を含む。これらの器具は、本明細書に記載される組成物でコーティング、含浸、結合、または別の方法で処理されてもよい。
【００４８】
経皮パッチは、眼および体への有効成分の制御された送達を提供する、さらなる利点を有する。適切な媒体に化合物を溶解または分配することによって、そのような剤形を作製することができる。皮膚を越える化合物の流動を増加させるために、吸収エンハンサーが使用される。速度制御膜を提供することによって、またはポリマーマトリックスもしくはゲルに化合物を分散させることによって、速度を制御することができる。
【００４９】
医薬組成物の注射用調製物、例えば無菌の注射用水性または油性懸濁液は、適する分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用する公知の技術によって製剤化することができる。無菌の注射用調製物は、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液のように、無毒の非経口で許容される希釈剤または溶媒中の無菌の注射用溶液、懸濁液またはエマルジョンであってもよい。用いることができる許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、リンガー液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張性の塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の不揮発性油が、溶媒または懸濁媒として従来用いられている。この目的のために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の刺激の少ない不揮発性油が使用される。さらに、注射剤の調製では、オレイン酸などの脂肪酸が使用される。注射用製剤は、使用前に、例えば、細菌保持フィルターによる濾過によって、照射によって、または無菌水もしくは他の無菌注射用媒体に溶解もしくは分散させた無菌固体組成物の形態に滅菌剤を組み入れることによって滅菌される。皮下または腫瘍内注射からの薬剤の吸収を減速させることにより、活性薬剤の効果を長くすることが観察された。非経口投与される活性薬剤の遅延される吸収は、薬剤を油ビヒクルに溶解または懸濁することによって達成することができる。注射用デポー形態は、生分解性ポリマー、例えばポリラクチド−ポリグリコリドにおいて薬剤のマイクロエンカプセルマトリックス（microencapsule  matrices）を形成することによって作製される。活性薬剤対ポリマーの比および用いられる特定のポリマーの性質に依存して、活性薬剤放出速度が制御される。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルソエステル）およびポリ（酸無水物）が含まれる。デポー注射用製剤は、体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルジョンに薬剤を取り込むことによっても調製される。
【００５０】
経口投与のための固体剤形には、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤・粉剤および顆粒剤が含まれる。固体剤形では、活性薬剤は、少なくとも１つの不活性の薬学的に許容される賦形剤またはキャリア、例えばクエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウムおよび／または充填剤もしくは増量剤、例えばデンプン、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸；結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロースおよびアラビアゴム；グリセロールなどの保湿剤；崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のシリケートおよび炭酸ナトリウム；パラフィンなどの溶解遅延剤；四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；湿潤剤、例えばセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなど；吸収剤、例えばカオリンおよびベントナイト粘土；ならびに滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびそれらの混合物と混合される。
【００５１】
類似の型の固体組成物は、乳糖などの賦形剤ならびに高分子量ＰＥＧなどを使用したソフトおよびハード充填ゼラチンカプセルで、充填剤として用いることもできる。錠剤、糖衣剤、カプセル剤、丸剤および顆粒剤の固体剤形は、腸溶コーティング、放出制御コーティングおよび医薬製剤化の技術分野で公知の他のコーティングなどのコーティングおよびシェルを用いて調製される。これらの固体剤形では、活性薬剤（複数可）は、スクロースまたはデンプンなどの少なくとも１つの不活性希釈剤と混合される。そのような剤形は、標準慣行であるように、不活性希釈剤以外の追加の物質、例えばステアリン酸マグネシウムおよび微結晶性セルロースなどの錠剤化用の滑沢剤および他の錠剤化用補助剤も含む。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、剤形は緩衝剤を含むこともできる。組成物は、好ましくは腸管のある特定の部分で、および任意選択で遅延方式により、活性薬剤（複数可）だけを放出する乳白剤を任意選択で含有する。包埋組成物の例には、ポリマー物質およびワックスが含まれる。
【００５２】
融合ポリヌクレオチドの組換え発現および調製
トランケートされたｓＴＮＦ−Ｒをコードする核酸配列は、化学合成、ｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリースクリーニング、発現ライブラリースクリーニングおよび／またはｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を限定なしに含む、様々な方法で容易に入手できる。そのような核酸配列の単離に有用なこれらの方法などは、Sambrookら３０；Ausubelら３１ならびにBergerおよびKimmel３２に示されている。
【００５３】
トランケートされたｓＴＮＦＲをコードする核酸配列の化学合成は、当技術分野で周知である方法を使用して達成された。Engelsら３３およびWellsら３４を参照。
【００５４】
あるいは、核酸配列を得るのに適する技術は、ＰＣＲである。この方法では、ｃＤＮＡは、酵素逆転写酵素を使用してポリ（Ａ）＋ＲＮＡまたは全ＲＮＡから調製される。トランケートされたｓＴＮＦＲをコードするｃＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）の２つの別個の領域に一般的に相補的である２つのプライマーが、ＴａｑポリメラーゼなどのポリメラーゼとともにｃＤＮＡに加えられる。ポリメラーゼは、２つのプライマーの間でｃＤＮＡ領域を増幅する。
【００５５】
核酸配列を得るための別の技術は、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリー（全ゲノムＤＮＡから調製されるライブラリー）をスクリーニングすることである。一般的に、ｃＤＮＡライブラリーの供与源は、相応な量で所望のタンパク質を発現すると考えられている種からの少なくとも１つの組織である。ゲノムライブラリーの供与源は、短トランケートされたｓＴＮＦＲの形態をコードする遺伝子を抱えると考えられている任意の哺乳動物または他の種からの、任意の組織（複数可）であってよい。
【００５６】
本発明は、本明細書に記載されるｓＴＮＦ−Ｒの生物活性、半減期延長、トランケート型をコードする核酸分子に関する。したがって、核酸分子は、生物活性ｓＴＮＦ−Ｒのトランケート型をコードする核酸配列、ならびにランダムコイルコンフォメーションドメイン（ＲＣＤ）を完全にまたは一部形成および／または取り入れ、特定の生理条件下で所望の半減期延長特性を付与するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含有した。好ましくは、核酸分子はベクターの中にある。
【００５７】
細胞に、本明細書に記載される核酸分子またはベクターをトランスフェクトした。核酸分子を、ポリペプチドの適切な転写および翻訳を確実にするために、適する発現制御配列に融合させただけでなく、細胞分泌またはオルガネラへの標的化を確実にするために、シグナル配列に融合させた。そのようなベクターは、適する宿主細胞でおよび適する条件下で該ベクターの選択を可能にする、マーカー遺伝子などのさらなる遺伝子を含有することができる。
【００５８】
好ましくは、核酸分子は、本明細書に記載される、生物活性、半減期延長、トランケートされたｓＴＮＦ−Ｒタンパク質をコードする核酸分子が発現制御配列に作用的に連結されて、原核または真核細胞での発現を可能にする、組換えベクターの中にある。核酸分子の発現は、翻訳可能なｍＲＮＡへの核酸分子の転写を包含する。原核生物宿主細胞での発現を許す調節エレメントには、Ｅ．ｃｏｌｉのラムダＰＬ、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｅｔまたはＴ７プロモーターが含まれる。真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞または酵母での発現を確実にする潜在的調節エレメントは、当業者に周知である。調節配列は転写の開始を確実にし、任意選択のポリＡシグナルは転写の終止および転写物の安定化を確実にする。追加の調節エレメントには、転写ならびに翻訳エンハンサーおよび／または天然に関連するか異種のプロモーター領域が含まれる。真核生物の宿主細胞での発現のための調節エレメントの例は、酵母のＡＯＸ１もしくはＧＡＬ１プロモーター、または哺乳動物および他の動物細胞におけるＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサーもしくはグロビンイントロンである。転写開始に関与するエレメントとは別に、そのような調節エレメントは、転写終止シグナル、例えばＳＶ４０−ポリＡ部位またはｔｋ−ポリＡ部位もコード領域の下流に含有する２８。
【００５９】
組換えベクターを構築するために、当業者に周知である方法を使用した。Sambrookら３０およびAusubelら３１を参照。適する発現ベクターの例は、Ｏｋａｙａｍａ−ＢｅｒｇのｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３、ｐＰＩＣＺａｌｐｈａ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）である。さらに、発現系によって、ポリペプチドを細胞コンパートメントに誘導するか、培養培地の中にそれを分泌することが可能なリーダー配列が、本発明の核酸分子のコード配列に付加される。
【００６０】
組成物は、固体または液体の形態であり、とりわけ、粉末、錠、溶液、エアゾール、ナノ粒子であるか、ナノ粒子に結合している。医薬組成物の使用目的によっては、本発明の医薬は、さらなる生物活性薬剤を含有した。
【００６１】
医薬組成物は、いくつかの異なる経路のいずれか、例えば、非経口、皮下、腹腔内、局所、気管支内、肺内および鼻腔内投与により、ならびに局所処置のために所望される場合は病巣内投与によって投与される。非経口投与には、腹腔内、筋肉内、皮内、皮下、静脈内または動脈内投与が含まれる。組成物は、また標的部位に直接投与される、例えば、罹患器官などの外部または内部の標的部位への微粒子銃送達。
【００６２】
適する医薬キャリア、賦形剤および／または希釈剤の例は当技術分野で周知であり、リン酸緩衝食塩溶液、水、エマルジョン、例えば油／水エマルジョン、各種の湿潤剤および無菌溶液を含む。そのようなキャリアを含有する組成物は、周知の従来の方法によって製剤化された。キャリアは、生物活性タンパク質と組み合わせたときに生物活性タンパク質の生物活性を保持する材料を含有する（Remington's  Pharmaceutical  Sciencesを参照）３５。非経口投与のための調製物には、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、Ｐ、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性キャリアには、食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、または不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、補液および栄養素補液、電解質補液（例えば、リンガーデキストロースをベースにするもの）などが含まれる。保存剤および他の添加物、例えば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどが存在してもよい。本明細書の医薬組成物は、例えば、好ましくはヒト起源の血清アルブミンまたは免疫グロブリンのようなタンパク性キャリアを含有する。
【００６３】
これらの医薬組成物は、適する用量で被験体に投与された。投薬レジメンは、主治医および臨床因子によって決定された。医学分野で周知であるように、任意の１人の患者のための投薬量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間および経路、一般健康状態ならびに同時に投与される他の薬物を含む多くの因子に依存する。薬学的に活性な組成物は、１用量につき体重１ｋｇあたり１μｇから２０ｍｇの間、例えば体重１ｋｇあたり０．１ｍｇから１０ｍｇの間、例えば体重１ｋｇあたり０．５ｍｇから５ｍｇの間の量で投与された。レジメンが連続的注入である場合は、用量はまた１分あたり体重１ｋｇあたり１μｇから１０ｍｇの範囲内にあるべきである。好ましい治療投薬量は、生物活性融合タンパク質について、１５μｇ／ｍｌから３５μｇ／ｍｌの間の定常状態の血中レベルを達成するものである。前記の因子を考慮して、指示された例示的な範囲より下または上の用量も想定される。
【００６４】
医薬組成物の使用目的によって、医薬組成物は、追加の生物活性薬剤を含有した。これらのさらなる生物活性薬剤は、抗体、抗体断片、ホルモン、成長因子、酵素、結合分子、サイトカイン、ケモカイン、核酸分子および薬物のうちの少なくとも１つである。
【００６５】
本明細書の本発明のある特定の実施形態は、天然アミノ酸または天然および非天然のアミノ酸の組合せをコンジュゲートして特異的長さ「ｎ」の線状ポリペプチドを生じさせることによって改変された、組換えｓＴＮＦ−ＲＩまたはｓＴＮＦ−ＲＩＩタンパク質を含有する予防および／または治療用製剤を投与することによって、急性および慢性の炎症および自己免疫疾患を予防および／または処置する方法を提供する。さらに、組換え可溶性ヒト完全長ｓＴＮＦ−ＲＩまたはｓＴＮＦ−ＲＩＩタンパク質は、タンパク質の異なる領域にヘパロサンの糖分子をコンジュゲートすることによっても改変された。ｓＴＮＦ−Ｒはヒトで通常消去される細胞受容体を本質的に切断するので、天然に存在するｓＴＮＦ−Ｒの使用は、より長く、より有効な処置を可能にする。
【００６６】
本明細書の本発明のある特定の実施形態は、特異的長さ「ｎ」の天然アミノ酸または天然および非天然アミノ酸の組合せによって改変され、関節炎および他の炎症性疾患を処置するためにメトトレキセートなどの抗炎症薬も組み込む線状ポリペプチドを生じさせる標的化剤として、ｓＴＮＦ−ＲＩまたはｓＴＮＦ−ＲＩＩを使用する。特異的長さ「ｎ」の天然アミノ酸または天然および非天然アミノ酸の組合せをコンジュゲートして線状ポリペプチドを生じさせることによって改変されたｓＴＮＦ−Ｒに、様々なステロイド薬、非ステロイド薬および疾患改変薬、および他の抗炎症化合物も組み込んだ。特異的長さ「ｎ」の天然アミノ酸または天然および非天然アミノ酸の組合せをコンジュゲートして線状ポリペプチドを生じさせることによって結合したｓＴＮＦ−Ｒは炎症部位内に蓄積し、そこで薬物は最大治療効果のために放出される。
【００６７】
関節炎および他の炎症性疾患を処置するためにメトトレキセートなどの抗炎症薬も組み込むヘパロサン分子に結合した標的化薬剤としてのｓＴＮＦ−ＲＩまたはｓＴＮＦ−ＲＩＩの使用が、本明細書で示される。ヘパロサン分子によって改変されたｓＴＮＦ−Ｒに、様々なステロイド薬、非ステロイド薬、疾患改変薬および他の抗炎症化合物が組み込まれる。ヘパロサン分子に結合したｓＴＮＦ−Ｒは炎症部位内に蓄積し、そこで薬物は最大治療効果のために放出される。
【００６８】
本明細書の本発明のある特定の実施形態は、バイオ医薬品薬物の半減期を延長させるための新規技術を使用して、その結果、それらが疾患を処置するために体内により長く循環するだけでなく、免疫応答によって身体によって拒絶されないように秘密の方法（stealthy  manner）でそうする。
【００６９】
関節炎および他の炎症性疾患を処置するための既存のバイオ医薬品薬物と対照的に、本明細書の本発明のある特定の実施形態は、バイオ医薬品薬物の免疫抑制的性質をマスクし、体内でのその半減期を同時に増加させた。その結果として、それは身体によって拒絶されず、免疫反応をもたらさず、より低い量または頻度で投薬された。
【００７０】
方法の記載
図１は、先行技術の方法の問題を図式的に同定し、最適な解決法のための所望の作業特性および体系を例示する。解決法は、ヒト様分子、１、単分散性の能力、２、および効率的な薬物カップリング方法、３（遺伝子融合による、または化学的コンジュゲーション技術による）として特徴付けられる。化学的コンジュゲーションは、例えば、Kinstlerら、米国特許第５，８２４，７８４号および米国特許第５，９８５，２６５号によって記載される選択的Ｎ末端化学修飾によって実行される。リシン残基のεアミノ基とタンパク質のＮ末端残基のαアミノ基のそれとの間のｐＫａ差の利用を可能にするｐＨで反応を実行することによって、水溶性ポリマーをタンパク質のＮ末端に結合させる。タンパク質への水溶性ポリマーの結合は、選択的誘導体化によって制御される。ポリマーとのコンジュゲーションはタンパク質のＮ末端で主に起こり、他の反応性基の有意な改変は起こらない。還元アルキル化を使用して、水溶性ポリマーは、タンパク質へのカップリングのための単一の反応性アルデヒドを有する。Ｃ末端へのまたはＣ末端およびＮ末端の両方に対して内側にある残基への化学的コンジュゲーションのために、類似の方法が使用される。追加の方法は、Meansら、Bioconjugsyr  Chem.、１巻、２〜１２頁（１９９０年）でレビューされている。
【００７１】
本明細書で使用されるＰＡＳポリペプチドまたはヘパロサン糖鎖は、当業者に利用可能な任意の手法によって作製される。例えば、ＰＡＳポリペプチドまたはヘパロサン糖鎖は、溶液中でまたは固相合成手法によって、重合のための前駆体として構成成分アミノ酸の所望のモル分率を使用して、縮合条件下で作製される。ＷＯ２０００／００５２５０を参照。前駆体モノマー構成成分の相互の全てのインプットされる所望のモル比は、本明細書においてユーザーの制御下にあると想定される。
【００７２】
ポリペプチドポリマーの溶液相合成のために、縮合条件には、ペプチド結合を形成するために１つのアミノ酸のカルボキシル基を別のアミノ酸のアミノ基と縮合するための、適切な温度、ｐＨ、および溶媒条件が含まれる。縮合剤、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドが、ペプチド結合の形成を促進するために使用される。側鎖部分などの官能基およびアミノまたはカルボキシル基の一部を望ましくない副反応から保護するために、ブロッキング基が使用される。
【００７３】
例えば、プロリン、アラニンおよびセリンのＮ−カルボキシ無水物、γ−ベンジルおよびＮ−トリフルオロアセチルは、開始剤としてジエチルアミンを用い無水ジオキサン中、周囲温度で重合される。１９７４年１１月１９日に発行された米国特許第３，８４９，５５０号を参照。γ−カルボキシル基は、氷酢酸中の臭化水素によって非ブロック化される。トリフルオロアセチル基は、１モルのピペリジンによって除去される。当業者は、所望のアミノ酸、例えば３つのアミノ酸残基のうちの２つを含有するペプチドおよびポリペプチドを作製するために、この方法を調整することができることを理解するはずである。本出願のために、用語「周囲温度」および「室温」は、約２０から約２６℃の範囲の温度を意味する。
【００７４】
結果として生じるポリペプチドポリマーの平均分子量は、合成の間か後に調整することができる。ＷＯ２０００／００５２５０を参照。ポリペプチド合成の間に平均分子量を調整するには、ポリペプチドが所望のおよその長さに到達するときに合成が停止するように、合成条件またはアミノ酸の量が調整される。合成の後、所望の平均分子量を有するポリペプチドポリマーは、任意の利用可能なサイズ選択手法、例えば分子量サイズ処理カラムまたはゲルにおける混合物のクロマトグラフィーおよび所望により平均分子量範囲の回収によって、反応混合物から単離することができる。結果として生じるポリペプチドポリマーは、例えば酸または酵素による加水分解によって部分的に加水分解して高分子量種を除去し、次に精製して酸または酵素を除去することもできる。
【００７５】
固相合成方法の２つの主要な形態は、ＦｍｏｃおよびＢｏｃ前駆体を使用する。ペプチド鎖をその上で構築することができるリンカーを含有する小さいビーズ。アミノ酸モノマーのＮ末端は、脱保護されたアミノ酸鎖の上へ付加されるるＦｍｏｃまたはＢｏｃ基によって保護される。合成ビーズは、トリフルオロ酢酸などの試薬によって切断されるまで、ペプチドへの強力な束縛を保持する。ビーズは合成環境を生じ、そこでは、伸長の過程のペプチド鎖が保持され、すなわち、フィルター材料を通過せず、これらの鎖を、それらを合成するために使用された試薬から分離する。各アミノ酸は実質的に過剰に（すなわち２〜１０倍）存在し、ペプチド結合を形成するためにアミノ酸をカップリングすることは一連のよく特徴付けられた剤によって高度に最適化される。リボソームタンパク質合成と異なって、固相ペプチド合成はＣ末端からＮ末端の方向に進行する。
【００７６】
固相合成は収率によって制限され、したがって特定の長さを越えた合成のために使用されず、例えば、一般的に７０〜１００アミノ酸残基の範囲内のペプチドおよびタンパク質が合成到達可能性の限界である。より長い長さは、２つのペプチドを結合するネイティブ化学ライゲーションを使用することによって定量的収率とともに達成することができる。自動化プログラム可能合成装置が利用可能である。
【００７７】
タンパク質の半減期を増加させるための先行技術には、ＰＥＧ、４、ヒドロキシエチルデンプン、５、および／またはポリシアル酸、６、の使用が含まれる。図１に記されたように、これらの各々は、それらが最適な半減期延長解決法を提供することを妨げる特徴を有する。ＰＥＧ、４、の使用は現在、生体分子のための最も普及した半減期延長技術であるが、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  Ａｇｅｎｃｙは、様々な器官および腎尿細管細胞での細胞空胞化の証拠の増加のために、ＰＥＧ、４、を含有する薬物の長期投与に関連した警告を出した２１。ヘパロサン、７、の糖分子を使用する技術およびＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）、８、と呼ばれる技術は、半減期延長／薬物送達フロンティアを前進させた。本明細書の本発明のある特定の実施形態は、先行技術の方法の性能問題を回避するために、ｓＴＮＦ−ＲＩ、ｓＴＮＦ−ＲＩＩおよび４ドメインｐ５５  ｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質などのタンパク質の改変で使用されたＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）、８、によって具体化されたように、ヒト様分子、１、単分散性の能力、２、および効率的な薬物カップリング方法、３、の特徴を最適な方法で組み合わせた。
【００７８】
図２は、バイオ医薬品薬物の半減期を増加させたＰＥＧ残基を使用した、現在利用可能な技術の高度多分散性を示すゼロ電荷にデコンボリューションした質量スペクトルのグラフである。Bagalら、Anal.  Chem.、８０巻：２４０８〜２４１８頁（２００８年）を参照。ＰＥＧの高度多分散性のために、薬物にコンジュゲートしたとき、ＰＥＧは薬物の反応性部位をマスクし、それは薬物の有効度（effectiveness）の劇的な低減をもたらす。
【００７９】
図３はＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）技術の基礎であり、ＰＡ／Ｓを含有し、「ｎ」が変動するような特異的長さ「ｎ」のポリペプチド、１０、を生じさせる天然アミノ酸の構造および配列を表す。ポリペプチドの長さは、１００アミノ酸残基から１，２００アミノ酸残基またはそれを超えて変動した。選択される実際の長さは所望の半減期延長に依存し、アミノ酸残基の数は潜在的に１２００を超える。ＰＡＳポリペプチド、１０、は天然のアミノ酸を含有したので、ＰＥＧ、４の投与の結果とは異なり、身体はそれを異物と認識せず、したがって免疫応答シグナルを誘発しない。特定の機能が所望される場合は、ポリペプチドを非天然アミノ酸と組み合わせることができる。ＰＡＳポリペプチド、１０、の利点は、図１の他の技術とは異なり、同時発現のためにそれをバイオ医薬品薬物に遺伝子融合することができるということ、またはそれを化学的にコンジュゲートすることができるということである。
【００８０】
図４は、ヘパロサン、１１、の糖分子の反復単位によって形成される構造の分子単位を表す。ＰＡＳポリペプチド、１０、と異なって、ヘパロサン分子は薬物に化学的にコンジュゲートされており、遺伝的手段によって発現させることができない。ヘパロサン分子は、いくつかの理由のために、半減期延長および薬物送達改変の目的にとって魅力的であった。ヘパロサンは、ヒト体内の既存物質である。ある特定の細菌は、それらがヒトの体の免疫応答系からカモフラージュされるように、自身をヘパロサンで被覆する。したがって、ヘパロサン分子、１１、は、薬物送達目的のためのステルス分子として作用する潜在性を有する。ヘパロサン分子はＰＡＳポリペプチド、１０、よりも均質性が低いが、糖分子の複数の単位が化学的にコンジュゲートしていたので、それはＰＥＧ、４、よりも優れた多分散の制御を提供する。
【００８１】
図５は、ＰＡＳポリペプチド、１０、の均質性の単一種レベルおよび単分散性を示す質量分析データのグラフである。
【００８２】
図６は、図３の反復構造によって例示される、アミノ酸残基を含有する様々な長さのポリペプチドおよび好ましい分子量範囲内のＰＥＧポリマーの間の粘度を比較する。粘度は、リン酸緩衝食塩水中のＶＲＯＣ（登録商標）チップを有するμＶＩＳＣ（商標）マイクロビスコメータで測定した。ＰＡ／Ｓポリペプチド鎖もＰＥＧポリマーもパートナーとしてタンパク質に融合またはコンジュゲートせず、図６は固有のベースライン粘度を表す。ＰＡＳ化またはＰＥＧ化された薬物の粘度は、融合およびコンジュゲーションのパートナー（複数可）によって影響される。ＰＡ（２００）ポリペプチド鎖の流体力学的体積は、分子量２０ｋＤａのＰＥＧポリマーにおよそ対応するが、ＰＡ（６００）ポリペプチド鎖のそれは分子量４０ｋＤａのＰＥＧポリマーにおよそ対応する。より高い濃度での対応する流体力学的体積の場合は、ＰＡＳポリペプチドはＰＥＧポリマーより１／３から３倍低い粘度を有することを、データは提示する。
【００８３】
図７は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーおよび各々の公知のリガンドの図である。矢印によって示される通り、多くのリガンドが１を超える受容体に結合することが観察された。ＤＲ６、ＴＲＯＹおよびＲＥＬＴに対するリガンドは、まだ発見されていない。受容体の細胞質部分に示される暗色のボックスは、死受容体ドメインの存在を示す。死受容体は、ＴＮＦ−ＲＩ、Ｆａｓ受容体、ＤＲ４およびＤＲ５などのファミリーメンバーによって例示される、死ドメインを含有するＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーを指す。これらの受容体は、他の役割に加えて、アポトーシス（プログラム細胞死）で機能することが観察された。３８
【００８４】
図８は、ヒトｓＴＮＦ−Ｒ−２．６ドメイン、１４、３．０ドメイン、１５、および４．０ドメイン、１６、のタンパク質ドメインおよび変異体を含有する、ｓＴＮＦ−Ｒの生物活性形態、１３、の三次元構造を提供するＸ線結晶学データである。４．０ドメイン、１６、を含有するタンパク質は、ヒト野生型ｓＴＮＦ−Ｒである。
【００８５】
図９は、ＰＡＳポリペプチド、１０、にコンジュゲートしたｓＴＮＦ−Ｒの生物活性形態、１３、を含有する、医薬組成物、１７、の構造図である。ｓＴＮＦ−Ｒの生物活性形態、１３、は、古典的な分子生物学技術または古典的化学反応によってＰＡＳポリペプチド、１０、またはその変異体と組み合わせた。コンジュゲーションは、ｓＴＮＦ−Ｒの生物活性形態、１３、のＮ末端および／またはｓＴＮＦ−Ｒの生物活性形態、１３、のＣ末端のいずれかで実行可能である。
【００８６】
図１０は、新しい生物学的実体：医薬組成物、１８、を形成するためにタンパク質の１つの位置でヘパロサン分子にコンジュゲートしたｓＴＮＦ−Ｒの生物活性形態、１３、および医薬組成物、１９、を形成するためにタンパク質の１を超える位置でヘパロサン分子にコンジュゲートしたｓＴＮＦ−Ｒの生物活性形態、１３、の作製の概略図の描画である。ヘパロサン分子、１１、およびその変異体と、少なくとも１つのｓＴＮＦ−Ｒの生物活性形態、１３、とのコンジュゲーションは、当技術分野で公知である化学的コンジュゲーション技術によって実行された。
【００８７】
図１１は、少なくとも１つのｓＴＮＦ−Ｒの生物活性形態、１３、が、ＰＡＳポリペプチド、１０、およびその変異体ならびにヘパロサン分子、１１、およびその変異体と組み合わされる、本発明のさらなる実施形態を示す。
【００８８】
図１２は、ＰＡＳポリペプチド、１０、に遺伝的または化学的方法のいずれかによってコンジュゲートしたときの、ｓＴＮＦ−Ｒの生物活性形態、１３、の分子容または流体力学的体積の正味の実効増加の複合図、２１、の描画である。そのようなコンジュゲーションは２つの所望の目標を同時に達成する  −  ｓＴＮＦ−Ｒの生物活性形態、１３、の中の反応性部位、２２、は開いたままで妨害されずに残り、ｓＴＮＦ−Ｒの生物活性形態、１３、の免疫原性部位はＰＡＳポリペプチド、１０、および／またはその変異体のピコ秒からフェムト秒の振動によってマスクされる。これらの特徴は、患者に臨床上の利益を提供する。
【００８９】
図１３は、図１１の有益な効果の描画であり、ＰＡＳポリペプチド１０でアミノ酸残基の数を増加させることによる、ｓＴＮＦ−Ｒの生物活性形態、１３、の流体力学的体積に及ぼす正味の影響を含み、円直径の増加はＰＡＳポリペプチドの長さの増加に相関する。
【００９０】
図１４は、医薬組成物、１７、の排出半減期対体重のグラフである。広い分子量範囲（６，０００〜９８，０００ダルトン）にわたるタンパク質医薬の分布容積および血漿クリアランスは、サイズ関連の生理的関係に従った。前臨床薬物動態学的研究は、種間スケーリングの後にヒト素因の合理的な推定値を提供した３６。医薬組成物、１７、についての排出半減期／血漿クリアランスデータをラット、サル、ヒヒおよびチンパンジー、２５、からスケーリングし、ヒト、２６、での薬物動態を予測した。しかし、チンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）は動物の中でヒトに対して最も近縁であり、類似の体重（５０ｋｇ）であるので、チンパンジーでの薬物動態はヒトでのそれらと類似することが予想される。したがって、７０ｋｇのヒトでは、ヘパロサン分子、２０、にコンジュゲートされたｓＴＮＦ−Ｒの生物活性形態を含有する医薬組成物の排出半減期は、約２５０時間であると予測された。実際のデータ、２５、およびヒト、２６、での医薬組成物、１７、の半減期の予測の間の相関係数は、図１３に示す式を使用して計算される。
【００９１】
図１５Ａは、ｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質の完全長型の核酸配列（配列番号１）である。組換えヒトｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質は、１，３６２塩基対（ｂｐ）からなる３７。図１５Ｂは、アミノ酸配列（配列番号３）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＡ３６７５６．１、図１５Ａの核酸配列の翻訳である３７。図１５Ｅは、本明細書の上で詳細に記載された分子生物学技術を用いてｓＴＮＦ−ＲＩ完全長タンパク質から作製された２．６Ｄタンパク質（ａａ４１〜ａａ１４８）のアミノ酸配列（配列番号６）である。このアミノ酸配列は例示的であり、ｓＴＮＦ−Ｒから抽出される特定のドメインに限定されない。例えば、４．０Ｄ  ｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質は、ドメイン、例えば、これらに限定されないが、ドメイン３．０Ｄ、２．０Ｄおよび１．０Ｄを含有する。各主要なドメイン単位は、サブドメイン、例えば、これらに限定されないが、２．９Ｄ、２．８Ｄ、２．１Ｄおよび２．０Ｄを含有する。図１５Ｅは、完全長ｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質（配列番号３）の２．６ドメイン（２．６Ｄ）を含有するアミノ酸配列（配列番号４）である。図１５Ｃは、４．０ドメイン（４．０Ｄ）を含有する完全長ｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質（配列番号３）のアミノ酸位置４１からアミノ酸位置２０１までのアミノ酸配列（配列番号４）である。図１５Ｄは、３．０ドメイン（３．０Ｄ）を含有する完全長ｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質（配列番号３）のアミノ酸位置４１からアミノ酸位置１６７までのアミノ酸配列（配列番号５）である。図１５Ｆは、２．３ドメイン（２．３Ｄ）を含有する完全長ｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質（配列番号４）のアミノ酸位置４９からアミノ酸位置１４８までのアミノ酸配列（配列番号７）である。図１６は、完全長ｓＴＮＦ−ＲＩＩタンパク質、ＮＣＢＩ受託番号：ＮＰ＿００１０５７のアミノ酸配列（配列番号８）である。
【００９２】
これらのドメインの各々は、ＴＮＦαの活性を阻害する能力によって様々なレベルの生物活性を実証し、それによって患者に治療利益を提供する。１．０Ｄから４．０Ｄの範囲のこれらの個々のドメインの各々は、調整可能な半減期を意図的に得るために、ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）の技術を使用してそのＮ末端で、またはそのＣ末端で、または両末端で適切に改変される。
【００９３】
図１７Ａは、一般的なクローン構築物、およびＥ．ｃｏｌｉなどの原核生物系での同時発現のためのｓＴＮＦ−ＲＩタンパク質に融合した２００アミノ酸残基を有するＰＡＳポリペプチドのプラスミドマップ（ｐＲＡＣ１１４−ＰＡＳ２００−ｓＴＮＦ−ＲＩ）の概略図である。少なくとも１００アミノ酸残基から１，２００を優に超えるアミノ酸残基の範囲の様々な長さのＰＡ／Ｓポリペプチドを発現するＰＡ／Ｓ遺伝子カセット。これらのカセットは、ＸＬ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ＧｍｂＨ、Ｌｉｓｅ−Ｍｅｉｔｎｅｒ−Ｓｔｒａｓｓｅ  ３０、８５３５４  Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙから市販されている。ｓＴＮＦ−Ｒの完全長またはトランケートされた生物活性形態、１３、は、本明細書に詳述されている通りに調製された。ｐＲＡＣ１１４−ＰＡＳ２００−ｓＴＮＦ−ＲＩのための構造遺伝子は、以下の官能基を含有する：細菌ＯｍｐＡシグナルペプチド、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩ、２００残基のＰＡ／Ｓポリマー（ＰＡＳ（＃１）２００）およびヒトｓＴＮＦ−ＲＩ。アミノ酸配列全体はテトラサイクリンプロモーター／オペレーター（ｔｅｔｐ／ｏ）の転写制御下にあり、リポタンパク質ターミネーター（ｔｉｐｐ）で終結する。プラスミド骨格、すなわちＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に挟まれた発現カセットの外部は、一般的なクローニングおよび発現ベクターである３８。単独の制限部位を、図１７Ａおよび図１７Ｂに示す。これらが、それぞれ４００アミノ酸残基、６００アミノ酸残基、８００アミノ酸残基、１，０００アミノ酸残基または１，２００アミノ酸残基またはそれを上回るアミノ酸残基を有するＰＡＳ＃１ポリマーを含有し、ＰＡＳ（＃１）２００の代わりに対応する遺伝子カセットによりコードされること以外は、ＰＡＳ４００−ｓＴＮＦ−ＲＩ、ＰＡＳ６００−ｓＴＮＦ−ＲＩ、ＰＡＳ８００−ｓＴＮＦ−ＲＩ、ＰＡＳ１，０００−ｓＴＮＦ−ＲＩまたはＰＡＳ１，２００−ｓＴＮＦ−ＲＩのための発現ベクターは同一である。ＰＡＳ＃１の例示的なアミノ酸配列は、ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ（配列番号９）である。
【００９４】
追加の実施形態では、配列は保存的なアミノ酸変異を含有し、それらは、アミノ酸を類似の生化学的特性、例えば電荷、疎水性およびサイズの該特性を有する異なるアミノ酸に変える変異である。例えば、ロイシンおよびイソロイシンの両方は、脂肪族、分枝状および疎水性である。同様に、アスパラギン酸およびグルタミン酸の両方は、小さい負荷電の残基である。タンパク質での保存的変異は、非保存的な変異よりも機能に及ぼす影響が少ないことが多い。
【００９５】
アミノ酸は、それらの構造およびそれらのＲ基の一般的な化学的特性に基づいて６つの主要なグループに分類される：
脂肪族−グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）
ヒドロキシルまたは含硫−セリン（Ｓ）、システイン（Ｃ）、トレオニン（Ｔ）、メチオニン（Ｍ）
環式−プロリン（Ｐ）
芳香族−フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）
塩基性−ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）
酸性およびアミド−アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）
【００９６】
図１７Ｂは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核生物系での同時発現のためのｓＴＮＦ−ＲＩ分子に融合した２００アミノ酸残基を有するＰＡＳポリペプチドのプラスミドマップ（ｐＲＡＣ１１４−Ｈｉｓ６−ＰＡ２００−ｓＴＮＦ−ＲＩ）の代替の実施形態である。ＸＬ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ＧｍｂＨ、Ｌｉｓｅ−Ｍｅｉｔｎｅｒ−Ｓｔｒａｓｓｅ  ３０、８５３５４  Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙから市販されているＰＡ／Ｓカセットは、少なくとも６つの残基を有するヒスチジンポリペプチド（例えばＨｉｓ６−ＰＡ＃１（２００））を含有する親和性タグを有し、それは、十分に確立された金属キレート親和性クロマトグラフィー技術を使用したｓＴＮＦ−ＲＩの以降のクロマトグラフィー精製において特に助けるよう機能する４４。追加の実施形態は、精製工程を単純化するための遺伝子融合の一部として、当該技術分野で公知であるいくつかの他のタグを含むことができる。
【００９７】
図１７Ｃは、ＣＨＯ細胞などの真核生物系での同時発現のための、ｓＴＮＦ−Ｒおよび２００アミノ酸残基を有する遺伝子コードされたＰＡ／Ｓポリペプチドの融合生成物の分泌生成のためのプラスミドマップ（ｐＣＨＯ１１４−ＰＡ（２００）−ｓＴＮＦ−ＲＩ）の実施形態である。ｐＣＨＯ１１４−ＰＡ（２００）−ｓＴＮＦ−ＲＩのプラスミドマップは、Ｈｉｓ６−ＰＡ＃１（２００）−ｓＴＮＦ−ＲＩ融合タンパク質をコードする。ＸＬ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ＧｍｂＨ、Ｌｉｓｅ−Ｍｅｉｔｎｅｒ−Ｓｔｒａｓｓｅ  ３０、８５３５４  Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙから市販されているＨｉｓ６−ＰＡ＃１（２００）カセットは、少なくとも６つの残基を有するヒスチジンポリペプチドを含有する親和性タグを有し、それは、金属キレート親和性クロマトグラフィー技術を使用したｓＴＮＦ−ＲＩの以降のクロマトグラフィー精製において助けとなる４４。構造遺伝子は、ｓＴＮＦ−ＲＩシグナルペプチド（Ｓｐ）、Ｈｉｓ６−タグ、２００残基を有するＰＡ＃１ポリマー／ポリペプチド配列（ＰＡ＃１（２００））、ｓＴＮＦ−ＲＩを含有し、真核細胞でペプチドの高い発現レベルを達成するためのウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂｇｈ−ポリＡ）がサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶｐ）の転写制御下にある。米国特許第５，１２２，４５８号を参照。単独の制限部位ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩが示される。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）のための耐性遺伝子は、ＳＶ４０プロモーター（ＳＶ４０ｐ）の制御下にあり、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０  ｐＡ）が続く。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉでのプラスミドの増殖（propagation）および選択を可能にするために、プラスミドは細菌ＣｏｌＥ１複製開始点（ＣｏｌＥ１−ｏｒｉ）、バクテリオファージｆ１複製開始点（ｆ１−ｏｒｉ）およびβラクタマーゼ遺伝子（ｂｌａ）を含有する。
【００９８】
上記のステップに従って、ならびに基本的分子生物学技術（Sambrookら）３０および化学反応（例えば、チオール化学反応またはアルキル化学反応またはアルデヒド化学反応）についての知識から、当業者は、本明細書に記載される本発明の実施形態を作製および使用することができる。
【００９９】
組換えヒトｓＴＮＦ−ＲＩ  ４．０Ｄ、１６、は、市販されている（例えばＳＲＰ４３４８−ｓＴＮＦ−ＲＩヒト、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。４．０Ｄ、１６、の供与源は、タンパク質を忠実に発現することが可能な原核生物に、真核生物に、または植物に基づく宿主ビヒクルであった。発現宿主は、例えば、これらに限定されないが、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞、酵母、バキュロウイルス、タバコモザイクウイルスおよび植物細胞である。少なくとも１００アミノ酸残基の様々な長さのＰＡＳポリペプチドは、ＸＬ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ＧｍｂＨ、Ｌｉｓｅ−Ｍｅｉｔｎｅｒ−Ｓｔｒａｓｓｅ  ３０、８５３５４  Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙから市販され、約２０，０００ダルトンから約６０，０００ダルトンの範囲内の分子量を有するヘパロサン分子、１１、は、Ｃａｉｓｓｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ、から市販されている。あるいは、ヘパロサン分子は、６０，０００ダルトンを超える分子量を有する。ＰＡＳポリペプチド１０は、分子生物学技術に基づく遺伝子融合または化学的コンジュゲーションによって、ｓＴＮＦ−Ｒの生物活性形態、１３、と組み合わされ、ヘパロサン分子、１１、は、化学的コンジュゲーションによってｓＴＮＦ−Ｒの生物活性形態、１３、にコンジュゲートされた。
【０１００】
ドメイン形態のｓＴＮＦ−Ｒの１つのＰＡＳ化形態の発現は、当業者になじみのプロセスである。ｓＴＮＦ−Ｒの形態のいずれか１つとのＰＡＳ配列の遺伝子融合は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主の細胞質空間で、またはＥ．ｃｏｌｉのペリプラズム間隙のいずれかで発現された。あるいは、他の発現宿主（例えばＣＨＯ）も考慮された。ペリプラズム発現のために、目的のｓＴＮＦ−Ｒ遺伝子のＮ末端に「ＡＴＧ」などの核酸配列が開始コドンとして付加された。開始コドンの後にＯｍｐＡペリプラズムシグナル配列などのシグナルペプチドが続き、それの後にｓＴＮＦ−Ｒ遺伝子配列の上流に２つの特異なタイプＩＩＳ  ＳａｐＩ制限部位が続いた。終止コドン、例えば、これに限定されないが、核酸配列「ＴＡＡ」を、ｓＴＮＦ−Ｒ遺伝子のＣ末端に付加した。制限酵素およびリガーゼの組合せを使用して、ＳａｐＩ配列をスプライスアウトし、古典的な「粘着性」末端が残された。ＰＡＳ改変ｓＴＮＦ−Ｒタンパク質の発現のために公知のプラスミド挿入技術によって適当な宿主に挿入されるＰＡＳ−ｓＴＮＦ−Ｒ遺伝子を作製するために、相補的な「粘着性」末端を有するＰＡＳ遺伝子配列カセットをライゲーションによって挿入した。
【０１０１】
本明細書に記載される関係組合せで使用されるｓＴＮＦ−Ｒの生物活性形態、１３、ＰＡＳポリペプチド、１０、および／またはヘパロサン分子、１１、は、本明細書の本発明の実施形態の機能を改善した。特異的長さ「ｎ」のポリペプチド鎖を生じさせる天然アミノ酸もしくは天然および非天然アミノ酸の組合せのいずれかをコンジュゲートすることによって、またはヘパロサン糖分子によって改変されたｓＴＮＦ−Ｒの中に、様々なステロイド薬、非ステロイド薬、疾患改変薬、および他の抗炎症化合物を組み込む。
【０１０２】
本発明の実施形態を使用する方法
本明細書に記載される本発明のある特定の実施形態は、糖尿病網膜症および関節炎などの炎症および免疫（immunology）の生涯続く疾患または状態を患っている患者を処置するために、医師および開業医が使用するはずである。
【実施例】
【０１０３】
（実施例（１〜６））
【表１】
2018508496.tif 000002
【０１０４】
ペイロードの半減期に及ぼすＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）残基の増加の影響
表１のデータは、モデル抗体断片（Ｆａｂ）の半減期に及ぼすＰＡＳ残基の数の増加の影響を提示する。実施例１〜５に示すように、ＰＡＳ残基の数の増加とＦａｂの半減期の増加の間に相関があった。実施例６はわずかに異なる傾向を示し、２００ＰＡＳ残基の２つのポリペプチドは４００残基の１つのポリペプチドより大きなＦａｂ半減期の増加をもたらした。２００残基の２つのポリペプチドをＦａｂの上の２つの異なる位置に各々コンジュゲートし、それは４００ＰＡＳ残基の１つだけのポリペプチドより大きな有効分子容を生成した。抗体タイプのタンパク質は、コンジュゲーションのための複数の位置を提供する。１，２００アミノ酸残基を優に超えてポリペプチドを延長させるためにアミノ酸残基を付加することができるので、表１に示すＰＡＳ残基の範囲は例示的であって限定的でない。ＰＡＳポリペプチドの長さは、各ペイロードに必要とされる特定の臨床結果によって制限される。
【０１０５】
（実施例（７〜１４））
【表２】
2018508496.tif 000003
【０１０６】
異なるペイロードへのＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）の影響
表１では、一般的なペイロードの半減期に及ぼすＰＡＳポリペプチドの様々な長さの影響を評価した。表２の実施例は、異なるペイロードに及ぼすＰＡＳ残基（ＰＡＳ  ６００）の１つのタイプおよび長さの使用の影響を記録した。データは、半減期の増加倍率（右端のカラム）に関してランクを付けた。半減期改変のために考慮したペイロードの性質およびタイプは、結果として生じた改変されたペイロードの半減期に影響した。未改変の非抗体タイプのタンパク質の半減期は、一般的に１時間未満の比較的狭い範囲内にあることが観察された。
【０１０７】
表２の実施例１３および１４は２つの異なる技術−実施例１３はＰＥＧ化および実施例１４はＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）−によって、２．６Ｄ、１４、の半減期改変を提供する。実施例１３（ｓＴＮＦＲＩ＋３０ｋＤａ  ＰＥＧポリマー）はＰＥＧｓｕｎｅｒｃｅｐｔ（登録商標）であり、その開発はプラスのヒト臨床フェーズＩＩデータを達成したにもかかわらず終了または延期されたようである。２．６Ｄ、１４、タンパク質と組み合わせた３０ｋＤａ  ＰＥＧの粘度は、医薬組成物の粘稠度をほとんど糊様（約４００ｃＰ）にし、それによって、注射のためのその調製および製剤化を極めて困難な作業にするだけでなく、関連して高い商品コストの要因有している。これまで示したように、ＰＡＳポリペプチドはＰＥＧ化と同じ粘度問題を有しない。さらに、ＰＡＳポリペプチドの発現のための好ましい様式が融合生成物としてのタンパク質と同時に存在するので、ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）はＰＥＧ化よりも関連する商品コストが低い。
【０１０８】
図１３で例示される種間アロメトリックスケーリングの原理に基づき、実施例１４の医薬組成物は、少なくとも２１６時間の半減期をヒトで有することが予測された。これは実質的な進歩であり、かつ非常に重要な進歩であり、関節炎および関連した自己免疫疾患のための処置の改善と、患者コンプライアンス、処置費用および臨床的負荷の同時改善において、妥当性がある。ＲＡのための現在の確立された処置は、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）；Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ）である。Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）は生物活性形態のｓＴＮＦ−Ｒ、１３、の１つの変異体の融合タンパク質であり、それはＰＥＧ化されておらず、ヒトで約７２時間の半減期を有し３９、それは医薬組成物実施例１３のそれより１０時間短い。
【０１０９】
実施例１４は、ＲＡおよび慢性炎症関連疾患を患っている患者の処置およびコンプライアンスの動態の変化を示すデータを提供する。ヒトでおよそ２１６時間の半減期は２週につき１回だけの低減された投薬頻度を与え、それによって患者に潜在的な長期の（３〜５年を超える）利益を提供する。約６カ月の処置の後に、既存の処置による用量クリープが起こる。本発明の結果として生じる利益は、患者コンプライアンスの増加；臨床的負荷のかなりの低減；および処置費用の低減であり、その各々は健康管理費用の増加の負担を減少させる。
【０１１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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