(57)【要約】  デキストラン硫酸またはその塩は、ＮＭＲ分光測定法によって測定される数平均分子量（Ｍｎ）が１８５０〜３５００Ｄａの区間内にある。デキストラン硫酸またはその塩はこのほか、グルコース単位当たりの平均硫酸塩数が２．５〜３．０の区間内にある。さらに、デキストラン硫酸またはその塩のグルコース単位のＣ２位の平均硫酸化度が少なくとも９０％である。デキストラン硫酸は、市販されている類似のデキストラン硫酸分子と比較して生物学的効果が改善され、かつ／または毒性が低下している。【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
デキストラン硫酸であって、
核磁気共鳴ＮＭＲ分光測定法によって測定される数平均分子量Ｍｎが１８５０〜３５００Ｄａの区間内にあり、
グルコース単位当たりの平均硫酸塩数が２．５〜３．０の区間内にあり、かつ
前記デキストラン硫酸のグルコース単位のＣ２位の平均硫酸化度が少なくとも９０％である
ことを特徴とするデキストラン硫酸またはその塩。
【請求項２】
前記ＮＭＲ分光測定法によって測定されるＭｎが、１８５０〜２５００Ｄａの区間内にある、請求項１に記載のデキストラン硫酸。
【請求項３】
前記ＮＭＲ分光測定法によって測定されるＭｎが、１８５０〜２３００Ｄａの区間内にある、請求項２に記載のデキストラン硫酸。
【請求項４】
前記グルコース単位当たりの平均硫酸塩数が、２．５〜２．８の区間内にある、請求項１〜３のいずれかに記載のデキストラン硫酸。
【請求項５】
前記グルコース単位当たりの平均硫酸塩数が、２．６〜２．７の区間内にある、請求項４に記載のデキストラン硫酸。
【請求項６】
前記Ｃ２位の前記平均硫酸化度が少なくとも９５％である、請求項１〜５のいずれかに記載のデキストラン硫酸。
【請求項７】
前記グルコース単位のＣ２位、Ｃ３位およびＣ４位の平均硫酸塩数が、２．２〜２．６の区間内にある、請求項１〜６のいずれかに記載のデキストラン硫酸。
【請求項８】
前記Ｃ２位、Ｃ３位およびＣ４位の前記平均硫酸塩数が、２．３〜２．５の区間内にある、請求項７に記載のデキストラン硫酸。
【請求項９】
平均グルコース単位数が、４．０〜６．０の区間内にある、請求項１〜８のいずれかに記載のデキストラン硫酸。
【請求項１０】
前記平均グルコース単位数が、４．５〜５．５の区間内にある、請求項９に記載のデキストラン硫酸。
【請求項１１】
前記平均グルコース単位数が、５．０〜５．２の区間内にある、請求項１０に記載のデキストラン硫酸。
【請求項１２】
グルコース単位の平均分岐度が３．０％未満である、請求項１〜１１のいずれかに記載のデキストラン硫酸。
【請求項１３】
前記平均分岐度が１．５％未満である、請求項１２に記載のデキストラン硫酸。
【請求項１４】
前記デキストラン硫酸の塩が、ナトリウム塩であり、Ｎａ＋対イオンを含む前記デキストラン硫酸のナトリウム塩のＮＭＲ分光測定法によって測定されるＭｎが、２０００〜２５００Ｄａの区間内にある、請求項１〜１３のいずれかに記載のデキストラン硫酸。
【請求項１５】
前記Ｎａ＋対イオンを含む前記デキストラン硫酸のナトリウム塩のＮＭＲ分光測定法によって測定されるＭｎが、２１００〜２３００Ｄａの区間内にある、請求項１４に記載のデキストラン硫酸。
【請求項１６】
末端基Ｃ１位が、硫酸化されているか、−ＯＨと結合している、請求項１〜１５のいずれかに記載のデキストラン硫酸。
【請求項１７】
薬物として使用する、請求項１〜１６のいずれかに記載のデキストラン硫酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の諸実施形態は、全般的にはデキストラン硫酸、具体的には、生物学的効果が改善された低毒性の新規なデキストラン硫酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
デキストランは、複雑な分岐鎖グルカン、すなわち、通常１０００ないし数千ダルトン（Ｄａ）から数十万Ｄａまでの様々な長さの鎖で構成されるグルコース単位からなる多糖である。
【０００３】
デキストランの直鎖は、グルコース単位間のα−１，６グリコシド結合からなり、分岐は通常、α−１，３結合から始まる。デキストランは、特定の乳酸菌、例えばリューコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）およびラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）などによってスクロースから合成される。
【０００４】
デキストラン硫酸は、デキストランのポリアニオン誘導体であり、Ｃ２〜Ｃ４位ならびに末端基のＣ１位およびＣ６位の一部が硫酸化されている。デキストラン硫酸は数十年前から知られており、特に、抗凝固薬療法でヘパリンの代替物となる可能性を秘めているものとして知られている。
【０００５】
デキストラン硫酸分子には、様々な分子量、様々な分岐レベルのほか、様々な硫酸塩エステル含有量および硫酸化パターンのものがある。このようなデキストラン硫酸分子の物理的および化学的差によって様々な生物学的効果および毒性効果が生じる。
【０００６】
生物学的効果が改善されているが、薬学的に重要な投与量でも毒性を示さないデキストラン硫酸が必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
生物学的効果が改善されているが、薬学的に重要な投与量でも毒性を示さないデキストラン硫酸を提供することが全般的な目的である。
【０００８】
上記のものをはじめとする目的は、本明細書に開示される諸実施形態によって満たされる。
【０００９】
諸実施形態の一態様は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光測定法によって測定される数平均分子量（Ｍｎ）が１８５０〜３５００Ｄａの区間内にあるデキストラン硫酸またはその塩に関する。デキストラン硫酸またはその塩はこのほか、グルコース単位当たりの平均硫酸塩数が２．５〜３．０の区間内にある。さらに、デキストラン硫酸またはその塩のグルコース単位のＣ２位の平均硫酸化度は少なくとも９０％である。
【００１０】
諸実施形態のデキストラン硫酸は、市販されている類似のデキストラン硫酸分子と比較して生物学的効果が改善されており、かつ／または毒性低下している。
【００１１】
諸実施形態は、以下の説明を添付図面とともに参照することによって、そのさらなる目的および利点とともに最もよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】出発物質デキストランの一次元１Ｈ  ＮＭＲスペクトルのデキストランシグナルを有する領域に対象を絞って拡大した図である。
【図２】出発物質デキストランと諸実施形態のデキストラン硫酸（バッチ番号３）の一次元１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを比較した図である。
【図３】諸実施形態のデキストラン硫酸（バッチ番号１）の２５℃での二次元１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトルに出発物質デキストラン硫酸の対応するスペクトルを重ねた図である。
【図４】諸実施形態のデキストラン硫酸（バッチ番号３）の２５℃での一次元１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図５】諸実施形態のデキストラン硫酸（バッチ番号３）の２５℃での二次元１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトルを示す図である。各ピークは様々な化学的環境のＣ−Ｈ結合に対応する。ピーク面積は各Ｃ−Ｈ結合の数にほぼ比例する。
【図６】諸実施形態によるデキストラン硫酸分子（上−バッチ番号１、中央−バッチ番号２、下−バッチ番号３）の一次元１Ｈ  ＮＭＲスペクトルのデキストラン硫酸領域を比較した図である。
【図７】諸実施形態のデキストラン硫酸（バッチ番号３）の２５℃での二次元１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトルを示す図である。
【図８】末梢血中の白血球に対するデキストラン硫酸の効果を示す図である。マウスに様々な平均分子量のデキストラン硫酸を５０ｍｇ／ｋｇの用量で単回ｉ．ｖ．注射した。溶媒対照として緩衝生理食塩水（ＮａＣｌ）を用いた。麻酔方法の違いによる効果を比較するため、一部の個体は、イソフルランの代わりにペントバルビタールナトリウム（ＰＮＢ）を用いて鎮静させた。エラーバーは平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。スチューデントｔ検定を用いて、対照群と比較した統計的有意差を評価した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図９】末梢血への造血前駆細胞動員に対するデキストラン硫酸の効果を示す図である。マウスに様々な平均分子量のデキストラン硫酸の単回ｉ．ｖ．注射または溶媒（ＮａＣｌ）による処置を実施した。エラーバーはＳＥＭを表す。スチューデントｔ検定を用いて、対照群と比較した統計的有意差を評価した（＊ｐ＜０．０５）。
【図１０】末梢血中のＨＧＦレベル増大に対するデキストラン硫酸の効果を示す図である。マウスに様々な平均分子量のデキストラン硫酸の単回ｉ．ｖ．注射または溶媒（ＮａＣｌ）による処置を実施した。エラーバーはＳＥＭを表す。スチューデントｔ検定を用いて、対照群と比較した統計的有意差を評価した（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１１】デキストラン硫酸５ＨＳ（３０．０ｍｇ／ｋｇ）、諸実施形態のデキストラン硫酸（バッチ番号３、３０ｍｇ／ｋｇ）および溶媒の投与が累積疾患指数に及ぼす効果を示す図である。
【図１２】諸実施形態のデキストラン硫酸を製造する製造工程を示す流れ図である。
【図１３】先行技術によるデキストラン硫酸の一次元１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１４】先行技術によるデキストラン硫酸の二次元１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（詳細な説明）
本発明の諸実施形態は、全般的にはデキストラン硫酸、具体的には、生物学的効果が改善された低毒性の新規なデキストラン硫酸に関する。
【００１４】
本発明の諸実施形態は、デキストラン硫酸分子は化学的特性および物理的特性がかなり類似しているが、その生物学的効果は著しく異なるという驚くべき発見に基づくものである。それにより、市販されている類似のデキストラン硫酸分子と比較して生物学的効果の改善および低毒性をもたらす数平均分子量ならびに硫酸化の含有量およびパターンを有する、デキストラン硫酸を製造した。
【００１５】
デキストラン硫酸分子は従来、ＳＥＣ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（略してＳＥ−ＨＰＬＣ）などのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて、分子量パラメータに関して特徴が明らかにされてきた。ＳＥＣは、当該技術分野では、ゲルろ過クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）または分子ふるいクロマトグラフィーとしても知られている。デキストラン硫酸および類縁グルカンの分子量パラメータを測定するのによく用いられる技術としてはほかにも、静的光散乱（ＳＬＳ）などの光散乱法または粘度法がある。
【００１６】
しかし、デキストラン硫酸の分子量パラメータを求めるこれらの技術は、その分子量ではなく分子の体積および形状関数を報告するものである。このことは、測定中にデキストラン硫酸分子が凝集体または複合体を形成すれば、見かけの分子量が大きくなることを意味する。
【００１７】
さらに、測定に用いる複数の因子および設定、例えばクロマトグラフィーのカラムおよび溶離液の選択、流速の設定、校正方法やそれに用いるデキストラン標準品、デキストラン硫酸分子の電荷などが、デキストラン硫酸分子の見かけの分子量に影響を及ぼす。
【００１８】
さらに、間接的な方法はむしろ、分子の体積および形状を報告するものであり、これらは、例えばデキストラン硫酸原料の保管方法、測定前の調製方法などによって、バッチ間のみならず同じバッチ内の試料間でも大きく異なり得る。
【００１９】
デキストラン硫酸の分子量パラメータを求めるのに、真の分子量パラメータおよびサイズの影響を受けないパラメータが得られる、より精度の高い技術を用いた。さらに、この技術を上に挙げた従来用いられてきた技術と比較した。
【００２０】
様々な方法で分子量／サイズの測定値を直接比較できるようにするには、以下に記載するように、よく用いられる分子サイズを理解することが重要である。パラメータＮｉは、試料またはバッチ中の分子量がＭｉのデキストラン硫酸分子の数を表す。
【００２１】
数平均分子量（Ｍｎ）：
【数１】
2018501332.tif 000003
は通常、末端基のアッセイ、例えば核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光測定法またはクロマトグラフィーによって求められる。正規分布をとる場合、Ｍｎの両側に同数のデキストラン硫酸分子がみられる、すなわち、試料中の分子量Ｍｎ未満のデキストラン硫酸分子の数と、試料中の分子量Ｍｎ超のデキストラン硫酸分子の数が等しい。
【００２２】
重量平均分子量（Ｍｗ）：
【数２】
2018501332.tif 000004
は、分子の数ではなくサイズに感度の高い方法、例えば光散乱法およびＳＥＣ法に典型的なものである。正規分布をとる場合、両側のＭｗは同じである、すなわち、試料中の分子量Ｍｗ未満のデキストラン硫酸分子の総重量と、試料中の分子量Ｍｗ超のデキストラン硫酸分子の総重量は等しい。
【００２３】
平均分子量またはサイズ平均分子量（Ｍｚ）：
【数３】
2018501332.tif 000005
は、拡散法または沈降分離のような分子の運動を測定する方法に典型的なものである。一般に、高分子量ポリマーに対する感度が高い。ｎ＝０のときＭｎとなり、ｎ＝１のときＭｗとなることに留意する。
【００２４】
多分散指数（ＰＤＩ）（Ｍｗ／Ｍｎ）は、分子量分布の広さを測定するのによく用いられる尺度である。数値１は単分散ポリマーを表し、１．０２〜１．１０は十分に制御された合成ポリマーによくみられ、１．５〜２は連鎖反応産物によくみられ、約２は段階重合産物によくみられる。
【００２５】
分子量分布の最頻値（Ｍｐ）は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）クロマトグラムで最も高いピークの分子量を表す。多くの場合、分布が狭い標準的なポリマーに関して記載され、ＧＰＣ／ＳＥＣまたは光散乱によって求められる。
【００２６】
諸実施形態の一態様は、ＮＭＲ分光測定法によって測定される数平均分子量（Ｍｎ）が１８５０〜３５００Ｄａの区間内にあることを特徴とするデキストラン硫酸またはその塩に関する。このほか、デキストラン硫酸またはその塩はグルコース単位当たりの平均硫酸塩数が２．５〜３．０の区間内にあり、デキストラン硫酸またはその塩のグルコース単位のＣ２位の平均硫酸化度は少なくとも９０％である。
【００２７】
諸実施形態のデキストラン硫酸またはその塩は、分子量パラメータ値、すなわち数平均分子量（Ｍｎ）の範囲が極めて狭い。この数平均分子量（Ｍｎ）は、本明細書にさらに記載するように、ＮＭＲ分光測定法に基づく末端基のアッセイによって測定される。ＮＭＲ分光測定では、分子量パラメータの測定値に関して、従来用いられてきたＧＰＣ、ＳＥＣおよび光散乱法よりも一貫した結果が得られる。さらに、ＮＭＲ分光測定では、従来用いられてきた技術に共通する問題点である凝集体または複合体の形成による影響を受けないデキストラン硫酸分子の真のまたは正確な数平均分子量（Ｍｎ）が得られる。
【００２８】
特定の実施形態では、デキストラン硫酸またはその塩は、ＮＭＲ分光測定法によって測定される数平均分子量（Ｍｎ）が１８５０〜２５００Ｄａの区間内、好ましくは１８５０〜２３００Ｄａの区間内にある。特定の実施形態では、デキストラン硫酸またはその塩（あらゆる対イオンを除く）は、ＮＭＲ分光測定法によって測定される数平均分子量（Ｍｎ）が１８５０〜２２００Ｄａの区間内、好ましくは１８５０〜２１００Ｄａの区間内、より好ましくは１８５０〜２０００Ｄａの区間内にある。
【００２９】
一実施形態では、デキストラン硫酸の塩はナトリウム塩またはカリウム塩、好ましくはナトリウムである。塩は好ましくは、デキストラン硫酸の薬学的に許容される塩である。
【００３０】
特定の実施形態では、Ｎａ＋対イオンを含めたデキストラン硫酸のナトリウム塩は、ＮＭＲ分光測定法によって測定される数平均分子量（Ｍｎ）が１８５０〜３５００Ｄａの区間内、好ましくは２０００〜２５００Ｄａの区間内、より好ましくは２０００〜２４００Ｄａの区間内、例えば２１００〜２３００Ｄａなどの区間内にある。
【００３１】
一実施形態では、デキストラン硫酸またはその塩は好ましくは、平均グルコース単位数が４．０〜６．０の区間内にある。好ましい実施形態では、デキストラン硫酸またはその塩は、平均グルコース単位数が４．５〜５．５の区間内、より好ましくは５．０〜５．２の区間内にあり、例えば約５．１などである。
【００３２】
一実施形態では、デキストラン硫酸またはその塩は、グルコース当たりの平均硫酸塩数が２．５〜２．８の区間内、好ましくは２．６〜２．７の区間内にある。
【００３３】
平均グルコース単位数が４．０〜６．０の区間内にあり、グルコース単位当たりの平均硫酸塩数が２．５〜３．０の区間内にあると、デキストラン硫酸またはその塩の硫酸塩原子の総数が１０．０〜１８．０の区間内に収まる。一実施形態では、デキストラン硫酸またはその塩は好ましくは、硫酸塩原子の総数が１１．２５〜１５．４の区間内、好ましくは１３．０〜１４．０の区間内にある。
【００３４】
一般に、平均グルコース単位が５．１であり、グルコース単位当たりの平均硫酸塩数が２．６〜２．７である諸実施形態のデキストラン硫酸分子は通常、ＮＭＲ分光測定法によって測定される数平均分子量（Ｍｎ）が１８５０〜２０００Ｄａの区間内に収まる。
【００３５】
以下の式は、グルコース単位を３つ有するデキストラン硫酸分子を模式的に示したものであり、この構造式では、硫黄原子数が最大である、すなわち、デキストランコアの硫酸化が可能な部位または位置が硫酸化されている。したがって、非末端グルコース単位はＣ２位、Ｃ３位およびＣ４位が硫酸化された形で示されており、遊離Ｃ１位を有する末端グルコース単位はＣ１位、Ｃ２位、Ｃ３位およびＣ４位が硫酸化されており、遊離Ｃ６位を有する末端グルコース単位はＣ２位、Ｃ３位、Ｃ４位およびＣ６位が硫酸化されている。
【化１】
2018501332.tif 000006
【００３６】
デキストラン硫酸またはその塩のグルコース単位のＣ２位の平均硫酸化度は少なくとも９０％である。一実施形態では、Ｃ２位の平均硫酸化度は少なくとも９５％である。
【００３７】
一実施形態では、デキストラン硫酸またはその塩のグルコース単位のＣ２位、Ｃ３位およびＣ４位の平均硫酸塩数は２．０〜２．６の区間内、好ましくは２．２〜２．６の区間内、例えば２．３〜２．５などの区間内にある。
【００３８】
一実施形態では、デキストラン硫酸またはその塩のグルコース単位のＣ３位の平均硫酸化度は８０〜９０％の区間内、好ましくは８４〜８７％の区間内にある。
【００３９】
それにより、諸実施形態のデキストラン硫酸またはその塩は、デキストランコアのグルコース単位のＣ２位、Ｃ３位およびＣ４位の硫酸化度が高くなる。特定の実施形態では、上記の位置の少なくとも７０％、より好ましくは上記の位置の少なくとも７５％が硫酸化されている。特定の実施形態では、デキストランコアのＣ２位、Ｃ３位およびＣ４位の総数の７５〜８５％が硫酸化されている。
【００４０】
一実施形態では、末端基Ｃ６の平均硫酸化度は少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％である。
【００４１】
末端基Ｃ１はα−立体配置またはβ−立体配置をとり得る。一般に、末端基のこの２つの立体配置の間には平衡状態が存在する。
【００４２】
末端基Ｃ１は、α−立体配置よりもβ−立体配置をとるときの方が硫酸化しやすいものと思われる。したがって、特定の実施形態では、α−立体配置よりもβ−立体配置のときのほうが末端基Ｃ１の硫酸化度が高い。一実施形態では、β−立体配置の末端基Ｃ１の平均硫酸化度は、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％または少なくとも８５％である。これに対応して、一実施形態では、α−立体配置の末端基Ｃ１の平均硫酸化度は、好ましくは少なくとも１５％であり、好ましくは１５〜７５％の区間内、より好ましくは１５〜５０％の区間内、例えば１５〜４５％などの区間内にある。
【００４３】
一実施形態では、末端基Ｃ１位は硫酸化されているか、−ＯＨと結合している。したがって、デキストラン硫酸またはその塩は好ましくは、硫酸化（−ＳＯ３）以外の末端修飾が一切ない。
【００４４】
発明の背景の節で述べたように、デキストランの直鎖はグルコース単位間のα−１，６グリコシド結合からなる。デキストラン分子は、非分岐鎖の形のグルコース単位のみからなる直鎖であり得る。デキストラン分子はこのほか、通常α−１，３結合を介した分岐鎖であり得る。
【００４５】
一実施形態では、デキストラン硫酸またはその塩は、グルコース単位の平均分岐度が５．０％未満、例えば３．０％未満など、好ましくは１．５％未満、例えば１．０％未満などである。したがって、諸実施形態のデキストラン硫酸またはその塩は好ましくは、分岐が存在しても少数である直鎖性の高い分子である。
【００４６】
特定の実施形態は、ＮＭＲ分光測定法によって測定される数平均分子量（Ｍｎ）が２１００〜２３００Ｄａの区間内にあるＮａ＋対イオンを含めたデキストラン硫酸のナトリウム塩に関する。デキストラン硫酸の塩は、平均５．０〜５．２個のグルコース単位を有し、グルコース単位当たりの平均硫酸塩数が２．５〜２．８の区間内にある。特定の実施形態では、Ｃ２位の平均硫酸化度は少なくとも９５％である。グルコース単位のＣ２位、Ｃ３位およびＣ４位の平均硫酸塩数はさらに好ましくは、２．２〜２．６の区間内にある。
【００４７】
諸実施形態のデキストラン硫酸は、のちの実験で示すように、市販の類似のデキストラン硫酸分子と比較して生物学的効果が改善されており、かつ／または毒性が低い。このような生物学的効果および毒性の差は、デキストラン硫酸分子の分子量および硫酸化のパラメータがかなり類似していることを考えれば、極めて驚くべきことである。したがって、分子パラメータ値および硫酸化パラメータ値にある特定の範囲があり、これがデキストラン硫酸分子に、分子量パラメータ値および／または硫酸化パラメータ値が諸実施形態の特定の範囲または区間外にある他のデキストラン硫酸分子よりも有利な効果をもたらすものと思われる。
【００４８】
デキストラン硫酸は、エステル化反応で出発物質デキストランが硫酸化されることによって製造される。デキストラン硫酸の製造には、先行技術で様々な製造工程が開示されている。このような製造工程を開示している文書の例としては、Ｒｉｃｋｅｔｔｓ，Ｂｉｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，５１：１２９−１３３（１９５２）；スウェーデン特許第１６５０９０号；米国特許第２，７１５，０９１号；同第３，１４１，０１４号；同第３，４９８，９７２号および同第４，８５５，４１６号が挙げられる。様々な製造工程で、濃硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、三酸化硫黄（ＳＯ３）またはクロロスルホン酸（ＣｌＳＯ３Ｈ）などの様々な硫酸化剤；ピリジン（Ｃ５Ｈ５Ｎ）、ホルムアミド（ＮＨ２ＣＯＨ）またはアセトアミド（ＣＨ３ＣＯＮＨ２）などの様々な溶媒；および様々な工程パラメータが用いられる。このような相違は、最終生成物であるデキストラン硫酸の化学的および物理的特性に影響を及ぼし得る。
【００４９】
現時点で好ましい製造工程について、図１２を参照しながら以下に記載する。デキストラン硫酸は出発物質デキストランを硫酸化することによって製造する。分子量が最も大きい分子が最初に沈殿するエタノール分画法によって、しかるべき分子量を有するデキストラン硫酸を分離する。
【００５０】
第一の段階では、攪拌している溶媒のホルムアミドに出発物質デキストランを加える。容器の内容物を攪拌して穏やかに加熱した後、混合物をスクラバーに移しながら冷却する。
【００５１】
エステル化反応では、ブラインで冷却しながらクロロスルホン酸を５〜６時間にわたって加える。温度を３４℃以下で一定に保ち、必要に応じて圧力１ａｔｍ（約１０１ｋＰａ）の水蒸気で加熱する。混合物をスクラバーから別の容器に移した後、精製水で洗浄する。攪拌した後、１回目のエタノール沈殿を実施する。
【００５２】
別の実施形態では、ブラインで冷却しながらコロロスルホン酸（ｃｈｏｌｏｒｏｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）を約３時間にわたってホルムアミドの一部に加える。次いで、温度を３４℃以下に維持しながら、デキストランと残留ホルムアミドとの混合物をクロロスルホン酸とホルムアミドの混合物の入った容器に移す。
【００５３】
沈殿段階では、デキストラン硫酸混合物にエタノール−水混合物をポンプで送り込み、それを攪拌する。混合物をブラインで冷却しながら一晩置く。翌日、最上相の上清（エタノール相）を除去する。下相をエタノールで洗浄し、攪拌し、沈殿させ、上清を除去する。この手順を５回実施する。ブラインで冷却し、ｐＨが９．５になるまで水酸化ナトリウムを加える。２回目および４回目の沈殿段階の後、沈殿物を水に溶かす。３回目の沈殿段階の後、沈殿物を水ならびに任意選択でリン酸水素二ナトリウムおよびリン酸二水素ナトリウムに溶かす。無水エタノールで５回目の沈殿段階を実施する。ブラインまたは冷却水（約１０℃）で冷却しながら、デキストラン硫酸混合物をフィルターに通してエタノール容器にポンプで送り込む。ポンプを精製水で洗浄し、攪拌し、沈降分離させる。エタノール上清をタンクに取り出し、攪拌しながら生成物に無水エタノールを加える。混合物を冷却水で冷却する。
【００５４】
上に記載した沈殿手順は、諸実施形態によるデキストラン硫酸の製造に好ましい手順の１つである。だだし、沈殿段階の数を増減させるなど、この沈殿手順に変更を加えることも可能である。エタノールはこの沈殿手順に使用する好ましいアルコールであるが、メタノールなどの他のアルコールを使用することも可能である。
【００５５】
遠心分離段階では、混合物を遠心分離機に移す。遠心分離後、遠心物を取り出す。これを二重のプラスチック袋で内側を覆ったプラスチック容器に入れる。遠心物をエタノールに溶かす。次いで、これをもう一度遠心分離し、遠心分離機を用いて遠心物をエタノールで洗浄する。
【００５６】
ＬＡＦ５でフィルターを被せたビーカーに遠心物を入れ、次いで、ビーカーを真空乾燥キャビネット内に置く。乾燥後、デキストラン硫酸粉末を７１０μｍのふるいに通し、ＰＥバッグで内側を覆ったプラスチック容器の中に入れる。
【００５７】
諸実施形態のデキストラン硫酸を約１０〜１３ｋｇ製造するには通常、以下の原料および量を用いる。
【表１】
2018501332.tif 000007
【００５８】
合成過程の主要な反応：
ＮＨ２ＣＯＨ＋ＣｌＳＯ３Ｈ←→Ｈ３Ｎ＋ＣＯＨ＋ＣｌＳＯ３−
（Ｃ６Ｈ１０Ｏ６）ｎ＋ＮＨ２ＣＯＨ→（Ｃ６Ｈ１０Ｏ６）ｎ．．．．ＮＨ２ＣＯＨ
（Ｈ３Ｎ＋ＣＯＨ＋ＣｌＳＯ３−）＋（Ｃ６Ｈ１０Ｏ６）ｎ．．．．ＮＨ２ＣＯＨ→（Ｃ６Ｈ１０Ｏ６）ｎ−ＳＯ３−＋Ｈ３Ｎ＋ＣＯＨ＋Ｃｌ−
（Ｃ６Ｈ１０Ｏ６）ｎ−ＳＯ３−＋Ｈ３Ｎ＋ＣＯＨ＋Ｎａ＋ＯＨ−→（Ｃ６Ｈ１０Ｏ６）ｎ−ＳＯ３−Ｎａ＋＋ＮＨ２ＣＯＨ＋Ｎａ＋→（Ｈ２Ｏ＋Ｃ２Ｈ５ＯＨ）→（Ｃ６Ｈ１０Ｏ６）ｎ−ＳＯ３−Ｎａ＋
（Ｃ６Ｈ１０Ｏ６）ｎ−ＳＯ３−Ｎａ＋＋Ｎａ２ＨＰＯ４＋ＮａＨ２ＰＯ４→（Ｃ６Ｈ１０Ｏ６）ｎ−ＳＯ３−Ｎａ＋＋ＰＯ４２−
【００５９】
諸実施形態の別の態様は、薬物として使用する諸実施形態によるデキストラン硫酸に関する。
【００６０】
諸実施形態のさらなる態様は、造血幹細胞（ＨＳＣｓ）および／または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の動員を含めた対象の末梢血中への前駆細胞および／または幹細胞動員への使用；対象の血流中への標的白血球、特にリンパ球動員への使用；対象の静脈内に注射した細胞の肺取込みの軽減への使用；対象の肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）誘導への使用ならびに抗凝固剤として使用を含めた様々な医療用途に使用する諸実施形態によるデキストラン硫酸に関する。諸実施形態によるデキストラン硫酸はほかにも、ＣＮＳ脱髄性疾患を含めた様々な脱髄性疾患、例えば髄鞘破壊性障害など、例えば多発性硬化症（ＭＳ）およびデビック病、急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、白質萎縮症、例えばＣＮＳニューロパチー、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄症、白質脳症および白質ジストロフィーならびに末梢脱髄性疾患、例えばギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパチーおよび末梢性ニューロパチーなどの治療、抑制または予防に使用するのに適している。
【００６１】
諸実施形態のデキストラン硫酸はこのほか、超急性血液媒介炎症反応（ＩＢＭＩＲ）および臓器、組織、特に細胞埋植物、例えばランゲルハンス島などの移植片拒絶反応の治療、抑制および／または予防に有用であり得る。
【００６２】
諸実施形態のデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は注射、特に静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射または（ｉ．ｐ．）腹腔内注射、好ましくはｉ．ｖ．注射またはｓ．ｃ．注射によって対象に投与するのが好ましい。用い得る非経口投与経路としてはほかにも、筋肉内注射および関節内注射が挙げられる。
【００６３】
諸実施形態のデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、選択した溶媒または補形剤を用いた水性注射液として製剤化するのが好ましい。溶媒は水性溶媒、特に緩衝溶液であるのが有利である。このような緩衝溶液の非限定的な例には、クエン酸・一水和物（ＣＡＭ）緩衝液などのクエン酸緩衝液またはリン酸緩衝液がある。例えば、諸実施形態のデキストラン硫酸を０．９％ＮａＣｌなどの生理食塩水に溶かし、次いで任意選択で、７５ｍＭ  ＣＡＭで緩衝し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨを約５．９に調整することができる。このほか、生理食塩水、すなわちＮａＣｌ（ａｑ）などの水性注射液を含めた非緩衝溶液も可能である。さらに、緩衝溶液が望まれる場合、ＣＡＭ緩衝液またはリン酸緩衝液以外の緩衝液系を使用することも可能である。
【００６４】
諸実施形態は、注射に限定されるわけではなく、別法として、経口、経鼻、バッカル、直腸内、経皮、気管内、気管支内または局所を含めた他の投与経路を用いることができる。次いで、具体的な投与経路に基づいて選択する適切な補形剤または担体を用いて活性化合物のデキストラン硫酸を製剤化する。
【００６５】
諸実施形態のデキストラン硫酸の適切な用量は、対象の大きさおよび体重、治療する対象の状態をはじめとする考慮事項に応じて異なり得る。具体的には、ヒト対象に考え得る用量範囲は、１μｇ／ｋｇ体重〜１５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１０μｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。
【００６６】
好ましい実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される誘導体が対象の体重１ｋｇ当たり０．０５〜５０ｍｇ、好ましくは対象の体重１ｋｇ当たり０．１〜４０ｍｇ、より好ましくは対象の体重１ｋｇ当たり０．１〜３０ｍｇまたは０．１〜１５ｍｇの範囲の用量で投与されるよう製剤化する。
【００６７】
デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩の投与は、必ずしも現存する医学的状態の治療に限定する必要はなく、これに代えて、または加えて、予防に用いることも可能である。
【００６８】
諸実施形態のデキストラン硫酸は、単回ボーラス注射などの形態で単回投与で投与することができる。このボーラス用量は、極めて短時間で患者に注射してもよいが、デキストラン硫酸溶液が５〜１０分など数分の時間にわたって患者に注入されるよう時間をかけて注入するのが有利である。
【００６９】
あるいは、諸実施形態のデキストラン硫酸を治療期間中に複数回、すなわち少なくとも２回投与してもよい。一般に、急性疾患には、治療期間の継続期間は単回投与であってもよいが、例えば１週間、数週間または１か月の治療期間中に数回投与する形であるのが好ましい。最大３か月または場合によっては１年まで治療期間を長くすれば、治癒および回復をさらに改善することができる。
【００７０】
対象は動物対象、好ましくは哺乳動物対象、より好ましくはヒト対象である。
【００７１】
実験
デキストランおよびデキストラン硫酸の特徴付け
試験の主要な目的は、新規なデキストラン硫酸の特徴を明らかにし、デキストラン硫酸と他の類似のデキストラン硫酸分子との間で物理的および化学的な差を比較することである。
【００７２】
ＮＭＲ分光測定法
ＮＭＲ実験の実施には、５ｍｍ１Ｈ／１３Ｃ／１５Ｎ三重共鳴プローブを備えた５００ＭＨｚ  Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｏｖａ分光計を用いた。標準型の一次元１Ｈ，２Ｄ１Ｈ勾配−ＣＯＳＹ（相関分光法）、１Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣ（異核種単一量子コヒーレンス分光法）、１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＢＣ（異核間多結合相関分光法）および二次元１Ｈ−１Ｈ  ＲＯＥＳＹ（回転座標系オーバーハウザー効果分光法）に混合時間２００ミリ秒に対応する断熱スピンロックを用いて以下のタイプのスペクトルを記録した。一次元１３Ｃスペクトルの記録には、５ｍｍ１Ｈ／１３Ｃ切替え可能勾配プローブ（１３Ｃ内部コイル）を備えた４００ＭＨｚ  Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｏｖａ分光計を用いた。スペクトルは室温（２５℃）で記録した。スキャン間の総緩和遅延６０秒、収集時間３秒およびスペクトル幅１４．５ｐｐｍを用いて定量的一次元１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを取得した。１Ｈ次元の残存ＨＤＯシグナルは４．７５ｐｐｍを基準とし、１３Ｃと１Ｈの磁気回転比を用いた１３Ｃ次元には、間接的化学シフト基準を用いた。
【００７３】
ＮＭＲスペクトルはいずれも、ＭｅｓｔｒｅＮｏｖａ  ９．０．０を用いて処理および分析した。１Ｈｚのローレンツ線幅およびベースライン補正（自動Ｗｈｉｔａｋｅｒまたは三次多項式関数）を用いて一次元１Ｈ  スペクトルの処理を実施した。一次元スペクトルのＭｅｓｔｒｅＮｏｖａの「ピークモード」を使用し、様々な構造要素のレポーターとして以下の領域を用いて積分を実施した：
【表２】
2018501332.tif 000008
【００７４】
二次元ＨＳＱＣスペクトルを両次元の純正弦二乗関数に供し、選択した長方形のスペクトル領域の積分（図５を参照されたい）を実施した。
【００７５】
【表３】
2018501332.tif 000009
【００７６】
【表４】
2018501332.tif 000010
【００７７】
実験的検証
ＮＭＲに基づく末端基アッセイの性能を評価するため、全定量分析のパラメータセット（繰り返し遅延時間６０秒）を用いて、１組の市販のデキストラン分子量標準品に一次元１Ｈ  ＮＭＲ実験を実施した。デキストラン硫酸分子サイズの標準品で市販されているものはないため、デキストラン標準品はデキストラン硫酸の分子サイズの決定にもよく用いられることが留意される。
【００７８】
リューコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）から得たＤｅｘｔｒａｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １０００（製品番号３１４１６、Ｆｌｕｋａ社、バッチ番号ＢＣＢＭ６７９４Ｖ、ＣＡＳ番号９００４−５４−０）；ＧＰＣの分析標準品、Ｍｗ１０００Ｄａ。
【００７９】
リューコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）から得たＤｅｘｔｒａｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ５０００（製品番号３１４１７、Ｆｌｕｋａ社、バッチ番号ＢＣＢＬ９３９８Ｖ、ＣＡＳ番号９００４−５４−０）；ＧＰＣの分析標準品、Ｍｗ５０００Ｄａ。
【００８０】
リューコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）から得たＤｅｘｔｒａｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １２０００（製品番号３１４１８、Ｆｌｕｋａ社、バッチ番号ＢＣＢＮ００３２Ｖ、ＣＡＳ番号９００４−５４−０）；ＧＰＣの分析標準品、Ｍｗ１２０００Ｄａ。
【００８１】
下の表１は、ＮＭＲ分光測定から得たＭｎ値（Ｄａ）と、供給業者から得たＭｎ値とを比較したものである。表には、供給業者から得たＭｗおよびＭｐの値（Ｄａ）も記載されている。
【００８２】
【表５】
2018501332.tif 000011
【００８３】
ＮＭＲ分光測定法を用いて測定したＭｎ値と、供給業者から得たデータとはよく一致している。ＮＭＲ分光測定法によって測定したＭｎ値は、３種類のデキストラン標準品のそれぞれ６．４、１７．４および４９．９グルコース単位に対応する。
【００８４】
ＮＭＲによる出発物質デキストランの特徴付け
諸実施形態のデキストラン硫酸の製造に用いた出発物質デキストランに関するＮＭＲ分光測定試験を実施した。デキストラン（Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ社、Ｄｅｘｔｒａｎ  １、バッチ番号３４５３４９）は、リューコノストック・メセントロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  Ｍｅｓｅｎｔｏｒｏｉｄｅｓ）Ｂ５１２Ｆ由来の酵素デキストランスクロースによって製造される。
【００８５】
デキストランのＮＭＲ試料をＤ２Ｏで調製し、二次元１Ｈ／１３ＣＮＭＲ分光測定法によって詳細に分析した。Ｄ２Ｏ中２５℃で取得した１組の二次元ＮＭＲスペクトルからほぼ完全な１Ｈ／１３Ｃ化学シフト帰属が得られた（表２を参照されたい）。この結果から、デキストランは基本的に非分岐である、すなわち、ほぼα−（１→６）−グリコシド結合で互いに結合したグルコース環のみからなることがわかる。α−（１→３）−グリコシド分岐は一切観察されず、そのような分岐があったとしても０．５％未満であることがわかった。さらに、データから、α−（１→２）−分岐、α−（１→３）−分岐およびα−（１→４）−分岐を含めた全体の分岐は１％未満であることがわかる。
【００８６】
【表６】
2018501332.tif 000012
【００８７】
観察された１Ｈ／１３Ｃ化学シフトに基づけば、α−立体配置（４２％）およびβ−立体配置（５８％）の両方に遊離アノマー炭素を有する末端グルコース環（Ｃ１末端環）が存在するのは注目すべきことである。一次元１Ｈスペクトルの様々なＨ１基の積分値を用いて、各デキストラン分子の平均グルコース単位数が５．１グルコース単位であるがわかり、平均分子量は８５２Ｄａであることがわかった。分岐度は１％未満であることがわかった。図１に、デキストランシグナルの領域に対象を絞って拡大した一次元１Ｈスペクトルを示す。
【００８８】
ＮＭＲによるデキストラン硫酸の特徴付け
本試験では、諸実施形態のデキストラン硫酸の３種類のバッチ（バッチ番号１、２および３）と、ＴｄＢ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｃｙ社から入手した３種類のデキストラン硫酸製品：デキストラン硫酸５ＬＳ（製品番号ＤＢ００５、バッチ番号２０２８８、低硫酸化、分子量５ｋＤａ）、デキストラン硫酸５ＨＳ（製品番号ＤＢ００４、バッチ番号２０２８１および２０３００、高硫酸化、分子量５ｋＤａ）およびデキストラン硫酸３（バッチ番号２０３４１、高硫酸化、分子量３ｋＤａ）とを比較した。
【００８９】
ＮＭＲ試料
ＰＮ００４−８３−０１  バッチ番号１の諸実施形態のデキストラン硫酸３３．９１ｍｇをＤ２Ｏ  ５００μｌに溶かして調製したＮＭＲ試料。
ＰＮ００４−８３−０２  バッチ番号２の諸実施形態のデキストラン硫酸４９．８０ｍｇをＤ２Ｏ  ５００μｌに溶かして調製したＮＭＲ試料。
ＰＮ００４−８３−０３  バッチ番号３の諸実施形態のデキストラン硫酸３５．４５ｍｇをＤ２Ｏ  ５００μｌに溶かして調製したＮＭＲ試料。
ＰＮ００４−９５−０１  ＴｄＢ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｃｙ社のデキストラン硫酸３（バッチ番号２０３４１）３４ｍｇをＤ２Ｏ  ５２０μｌに溶かして調製したＮＭＲ試料。
ＰＮ００４−９５−０２  ＴｄＢ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｃｙ社のデキストラン硫酸５ＬＳ（バッチ番号２０２２８）５４．４ｍｇをＤ２Ｏ  ５２０μｌに溶かして調製したＮＭＲ試料。
ＰＮ００４−３３−０３  ＴｄＢ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｃｙ社のデキストラン硫酸５ＨＳ（バッチ番号２０２８１）５４．４ｍｇをＤ２Ｏ  ５２０μｌに溶かして調製したＮＭＲ試料。
ＰＮ００４−３３−０２  ＴｄＢ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｃｙ社のデキストラン硫酸５ＨＳ（バッチ番号２０３００）５４．４ｍｇをＤ２Ｏ  ５２０μｌに溶かして調製したＮＭＲ試料。
【００９０】
ＮＭＲ全般に関する解説
デキストラン硫酸は、類似しているが同一ではない分子が分布して構成されており、様々な硫酸塩パターン、分岐およびサイズを有するほか、末端基の立体配置および化学的性質も異なっている。このため、構造解析が困難である。デキストラン硫酸のＮＭＲスペクトルは複雑なものである（出発物質デキストランとデキストラン硫酸の一次元１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを比較した図２を参照されたい）。このような理由から、二次元スペクトルの定量的データも用いる必要があると考えられるが、二次元ＮＭＲの定量性能は通常、定量的一次元１Ｈ  ＮＭＲ法と比較して確度も精度も低い。
【００９１】
ＮＭＲに関する刊行物でこの主題を扱ったものは少ない（Ｎｅｖｉｌｌｅら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８０（３）：２３９−２４４（１９９１）およびＬｕｄｗｉｇ−Ｂａｘｔｅｒら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８０（７）：６５５−６６０（１９９１））。硫酸化グルコースでは一般に、導入された各硫酸基までの距離に合わせて１Ｈ化学シフトが低磁場側に大きく移動する（化学シフトが大きくなる）。これに対して、１３Ｃ化学シフトは挙動が異なり、その効果は炭素と硫酸基（１つまたは複数）との間の共有結合の数に左右される。炭素の１３Ｃ化学シフトは、硫酸基がその炭素と結合している場合、４〜１０ｐｐｍ増大し、硫酸基が隣接する炭素と結合している場合、化学シフト効果はこれより小さくなるが、反対側になる。離れた位置にある炭素と結合した硫酸基では、その効果は通常、ごくわずかである。分岐していても１３Ｃ化学シフトに対して同様の効果が予想される。以上をまとめると、１３Ｃ化学シフトは、主として二面角などの局所形状および近辺にある共有結合原子の種類（通常、結合２〜４個分離れている）によって決まるため、１３Ｃ化学シフトの方がレポーターとして有用である。
【００９２】
末端基の特徴付け
デキストランと比較すると、デキストラン硫酸のＮＭＲスペクトルの方が、硫酸化／非硫酸化Ｃ２、Ｃ３およびＣ４ならびにＣ１およびＣ６末端基のあらゆる組合せの様々な化学的環境からはるかに多数のＮＭＲシグナルが発生するため、複雑なものとなる。
【００９３】
Ｃ１末端基（遊離アノマー炭素）は、例えば、β−立体配置の硫酸化Ｃ１と硫酸化Ｃ２を有さない非末端基Ｃ１との間でピークが重複することによって複雑化しているとしても、そのスペクトル特性により、Ｃ６末端基よりも分析が容易である。ほかにも、１ＨスペクトルのＣ１領域にある大きな残存水シグナルが分析を複雑なものにする。
【００９４】
図３に、バッチ番号１のデキストラン硫酸の２５℃での二次元１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトルに出発物質デキストラン（デキストラン１）の対応するスペクトルを重ねたものを示す。図では、各Ｈ１／Ｃ１基を仮の形で特定の硫酸化状態に帰属させている。図には、Ｃ１末端グルコース単位に属するピークならびに多数存在する中央およびＣ６末端のグルコース環に属するピークが示されている。Ｃ６末端グルコース環のＣ６に考えられる硫酸化による効果は無視している。
【００９５】
図４に、バッチ番号３のデキストラン硫酸の２５℃での一次元１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。この図では、各Ｈ１ピークを仮の形で特定の硫酸化状態に帰属させている。図には、Ｃ１末端グルコース単位に属するピークならびに多数存在する中央およびＣ６末端グルコース環に属するピークが示されている。この帰属は、特にＣ３およびＣ４の硫酸化に関しては仮のものであり、Ｃ６末端グルコース環のＣ６に考えられる硫酸化による効果は無視している。
【００９６】
図６に、バッチ番号１〜３のデキストラン硫酸について、２５℃での一次元１Ｈ  ＮＭＲスペクトルのデキストラン硫酸領域を比較したものを示す。
【００９７】
低硫酸化デキストラン硫酸を除くＴｄＢ試料はいずれも、Ｃ１末端が修飾されている。Ｃ１の１３Ｃ  ＮＭＲ化学シフトは約７４〜８０ｐｐｍである。このことから、修飾はヒドロキシル基の置換を含むはずであること、また、置換基は酸素を介して結合しているのではないことがわかる。したがって、化学シフトから考えれば、このＣ１修飾は硫酸塩でもリン酸塩でもなく、塩素であるともいえない。
【００９８】
【表７】
2018501332.tif 000013
【００９９】
分岐
データは、デキストラン硫酸試料中にデキストラン分岐が存在することを除外するものではない。しかし、そのような分岐が存在するとしても、１〜２％未満の極めて低いレベルである。
【０１００】
デキストラン硫酸の硫酸化度をはじめとする化学修飾度
一次元１Ｈ  ＮＭＲデータで補完した予備的二次元１Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣデータを用いて硫酸化を明らかにした。Ｃ２、Ｃ３およびＣ４の総硫酸化度に関しては、１Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣスペクトルの二次元ピークの積分から推定値が得られる。これらの近接する３つのレポーターとしてＣ１ピークを用い、一次元データと二次元データとを組み合わせて、個々のＣ２およびＣ３の硫酸塩レベルの平均値が推定される。Ｃ４の硫酸化は求められなかったが、Ｃ２〜Ｃ４全体の硫酸化のデータを用いると、Ｃ４の平均硫酸化度ははるかに低いはずであり、７０％未満であることに間違いない。
【０１０１】
【表８】
2018501332.tif 000014
【０１０２】
上の表４には、Ｃ２〜Ｃ４の硫酸化の検討に加えて、末端基の硫酸化度の特徴付けについても概要を記載した。注目すべきことに、末端基β−Ｃ１が存在する場合、硫酸化がはるかに多くなり、赤道位の硫酸塩による立体障害が少ないことと一致する。
【０１０３】
α−立体配置とβ−立体配置は自由アルデヒド状態を介して平衡状態にあり、これを観察するのは容易ではないが、ごく低レベルで常に存在することに留意されたい。
【０１０４】
分子量および分子サイズ
検討した様々なバッチのデキストラン硫酸の分析証明書にはいずれも、分子サイズの尺度としてＭｗが報告されている。さらに、バッチ番号１〜３のデキストラン硫酸に関しては光散乱データを測定しており（添付資料１を参照されたい）、ＭｗおよびＭｎを報告する。現時点でのＮＭＲデータから、主として末端基分析、すなわち、末端基のピーク面積と中央の基のピーク面積（ＮＭＲピーク面積）との間の比に基づいて出力したＭｎが得られる。出発物質デキストランの平均グルコース単位数を求め、対応するデキストラン硫酸バッチのＮＭＲデータと完全に一致することを確認する。
【０１０５】
【表９】
2018501332.tif 000015
【０１０６】
デキストラン硫酸試料（デキストラン硫酸３を除く）のデータは、平均分子サイズがデキストラン硫酸１分子当たり約５グルコース単位で完全に一致している。
【０１０７】
【表１０】
2018501332.tif 000016
【０１０８】
このように、表６に記載したＮＭＲによって求めた分子量パラメータとそれ以外の分子量パラメータとの間には大きな開きがあり、その理由としては、デキストラン硫酸の分子量が通常、ゲル排除／通過クロマトグラフィー、光散乱または粘度などのより間接的な方法を用いて求められることが考えられる。いずれの方法も、むしろ分子サイズを報告するものである。このことは、デキストラン硫酸分子が様々な凝集体または複合体を形成すれば、求められる見かけの分子量が大きくなることを意味する。
【０１０９】
このような間接的な方法はむしろ、分子体積および形状を報告するものであり、これらは、例えばデキストラン硫酸原料の保管方法、測定前の調製方法などによって、バッチ間のみならず同じバッチ内の試料間でも大きく異なり得る。
【０１１０】
デキストラン硫酸の詳細な構造特性解析
バッチ番号３のデキストラン硫酸で取得した一次元ＮＭＲデータおよび二次元ＮＭＲデータのセットの徹底的な解析に基づき、このデキストラン硫酸試料の原子分解での硫酸化パターンをさらに理解するべく本格的に取り組んだ。バッチ番号１と２のデキストラン硫酸の一次元１Ｈおよび二次元１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトルが極めて類似していることを考慮すると、本節で示した観察結果は、諸実施形態のデキストラン硫酸のバッチに関して概ね妥当であると考えられる。
【０１１１】
全体の硫酸化度および試料組成
大局的な観点から始めると、１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトルでは、比較的高い確度で硫酸化度の推定値を求めることができる（図７を参照されたい）。バッチ番号３のデキストラン硫酸は、Ｃ２位、Ｃ３位およびＣ４位でのグルコース単位当たりの硫酸基の平均値が２．４±０．１である。図７の各ピークは、様々な化学的環境のＣ−Ｈ結合に対応する。ピーク面積は各Ｃ−Ｈ結合の数にほぼ対応する。３つの異なる領域が観察され、デキストランの全体の硫酸化度の定量化が可能になる。上部に一次元１Ｈスペクトルの対応する領域を並べた。
【０１１２】
グルコース単位当たりの硫酸塩の平均値２．６６およびグルコース単位数５．１を用いると、硫黄の重量％は約１９％と算出され、試料が１００％デキストラン硫酸からなると推定される。
【０１１３】
Ｃ２、Ｃ３およびＣ４での硫酸化の検討
重複の著しい領域があるため、様々な種類のグルコース単位にあるＨ１／Ｃ１基の１Ｈ／１３Ｃ化学シフトおよび対応するピーク面積をほぼもっぱら用いて、硫酸化パターンを検討する。デキストランの１Ｈ／１３Ｃ化学シフト帰属、文献のデータおよび少なからず取得した二次元ＮＭＲデータに基づき、Ｈ１／Ｃ１シグナルを仮の形で化学的環境および硫酸化度の異なる特定のＣ１基に帰属させた。この帰属を図３および４に示す。
【０１１４】
一次元１Ｈピークの帰属および測定ならびに関連するピーク積分に基づけば、Ｃ１末端グルコースのアノマーＣ１基の立体配置の数は、α立体配置：β立体配置の比がより等しい０．４９：０．５１にシフトしているように思われ、化学的硫酸化法でデキストラン自体の平均の長さは変化しなかったものと考えられる。遊離α−Ｃ１基は約３０％硫酸化されているのに対し、β−Ｃ１の硫酸化度ははるかに高く、約８３％であると推定される。
【０１１５】
Ｃ２、Ｃ３およびＣ４の硫酸化度の決定に関しては、硫酸化度が９５％超と明らかに高いＣ２が最も分析が容易であり、Ｃ１末端グルコースのα立体配置：β立体配置の比が正確に推定されたと仮定すれば、硫酸化度は約９９％と算出される。α（１→６）グリコシド結合に関与するグルコース単位のＣ１、すなわち、中央およびＣ６末端の環ならびに遊離Ｃ１を有するＣ１末端グルコース単位では、Ｃ３が８２％硫酸化されている。硫酸化Ｃ１を有するＣ１末端グルコース単位では、Ｃ３の硫酸化がさらに高く、約８６％である。Ｃ４当たりの硫酸塩数の算出はさらに困難であるが、全体のグルコース環当たりの硫酸塩の比２．４およびＣ２の硫酸化９９％、Ｃ３の硫酸化８２％を用いると、硫酸化度は約６０％と推定される。
【０１１６】
Ｍｅｉｔｏ社のデキストランおよびデキストラン硫酸のＮＭＲによる特徴付け
デキストランおよびデキストラン硫酸の構造特性解析を実施するためにこれまでに確立した一次元１Ｈおよび二次元１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣ  ＮＭＲの方法論を用いて、Ｍｅｉｔｏ  Ｓａｎｇｙｏ社から入手したデキストランおよびデキストラン硫酸の試料を検討した。
【０１１７】
ＮＭＲ試料
ＰＮ００４−９９−０４  Ｍｅｉｔｏ  Ｓａｎｇｙｏ社のデキストラン（バッチ番号ＴＬ−２３８５）４３．４ｍｇをＤ２Ｏ  ５２０μｌに溶かしてＮＭＲ試料を調製した。
ＰＮ００４−９９−０５  Ｍｅｉｔｏ  Ｓａｎｇｙｏ社のデキストラン硫酸Ｓｕｌｆｕｒ１８（バッチ番号Ｎ−３１８８）５８．７ｍｇをＤ２Ｏ  ５２０μｌに溶かしてＮＭＲ試料を調製した。
【０１１８】
ＮＭＲの結果
デキストランの平均グルコース単位数は１１．７であり、Ｍｎは１９２０Ｄａであることがわかった。デキストラン硫酸Ｓｕｌｆｕｒ１８のＭｎは、あらゆるナトリウム対イオンを除けば４１２０〜４２００Ｄａであり、ナトリウム対イオンを含めれば４７１０〜４７９０Ｄａであることがわかった。α−立体配置のＣ１末端基の度合いは５９％であり、分岐度は４．８％であると推定された。
【０１１９】
Ｃ２位〜Ｃ４位の硫酸化度は７６％（グルコース単位当たりの硫酸基は２．２９）であることがわかった。Ｃ２位の硫酸化度は９３％であると推定された。α−立体配置のＣ１末端基の度合いは７１％であり、α−Ｃ１末端基の硫酸化度は８３％であった。β−立体配置のＣ１末端基の硫酸化度は９０％超であった。硫酸化以外にＣ１末端基の化学修飾は検出されなかった。
【０１２０】
様々なデキストラン硫酸分子の生物学的効果の比較
本試験では、様々なデキストラン硫酸分子の様々な生物学的効果を比較し、諸実施形態のデキストラン硫酸が優れた生物学的効果を有すると同時に毒性は示さないことを明らかにする。
【０１２１】
様々な平均分子量の分子量デキストラン硫酸による造血細胞動員の比較
動物
雌ＤＢＡ／２Ｏｌａマウス（Ｈａｒｌａｎ社、オランダ）をウプサラ大学の動物施設で標準条件下で飼育し、食餌および水を自由摂取させた。体重１７〜２２ｇの個体を用いた。
【０１２２】
実験計画
ＤＢＡ／２雌を１）溶媒（ＮａＣｌ水溶液）（ｎ＝８）、２）５０ｍｇ／ｋｇのデキストラン硫酸３、ＤＳ３、（ｎ＝５）、３）５０ｍｇ／ｋｇのバッチ番号３のデキストラン硫酸（ｎ＝５）および４）５０ｍｇ／ｋｇのバッチ番号３のデキストラン硫酸、ＰＮＢ、（ｎ＝５）の４つのグループに分けた。グループ４）は、麻酔プロトコルを変えると動員に影響があるかどうかを評価するため、イソフルランの代わりにペントバルビタールナトリウム（ＰＮＢ）で鎮静させた。
【０１２３】
物質の投与
諸実施形態のデキストラン硫酸（バッチ番号３）およびデキストラン硫酸３（ＴｄＢ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｃｙ社、バッチ番号２０３４１、ＤＳ３）を０．９％ＮａＣｌ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｋａｂｉ社）に溶かして２０ｍｇ／ｍＬとし、２０μｍフィルターでろ過して無菌溶液を得た。マウスに尾静脈から２．５ｍＬ／ｋｇ（約５０μＬ）を静脈内投与した。
【０１２４】
血液学的分析
結果を図８および表７に示す。デキストラン硫酸３では、ＷＢＣにもリンパ球にも全体として有意な変化はみられなかったが、好中球のわずかな減少がみられた。
【０１２５】
【表１１】
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【０１２６】
図９からわかるように、デキストラン硫酸３がＣＦＣ数の有意な増大を引き起こすことはなかった。バッチ番号３のデキストラン硫酸は、麻酔の使用とは関係なくＨＧＦの有意な増大を引き起こしたのに対し、これより分子量の小さい物質である３ではＨＧＦの有意な増大はみられなかった（図１０を参照されたい）。ここに示したデータから、デキストラン硫酸３は、諸実施形態のデキストラン硫酸と比較して動員効果の低い薬剤であることがわかる。デキストラン硫酸３が溶媒よりわずかでもＨＧＦを増大させることはなかった。
【０１２７】
ＭＯＧ１−１２５誘導性慢性ＥＡＥの分子量デキストラン硫酸による予防的処置の比較
本試験の目的は、ＭＯＧ１−１２５誘導性実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の予防的処置について、諸実施形態のデキストラン硫酸（バッチ番号３）とデキストラン硫酸５ＨＳ（ＴｄＢ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｃｙ社、バッチ番号２０３００）とを比較することであった。
【０１２８】
動物
動物実験はいずれも、国立衛生試験所（ＮＩＨ）の実験動物の管理および使用に関するガイドラインに従って実施し、フィンランド国立動物実験委員会（Ｆｉｎｎｉｓｈ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｂｏａｒｄ）によって承認されたものである。体重１２０〜１７０ｇの雌Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉラット計９０をＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（イギリス）から購入し、実験に用いた。マウスは、標準温度（２２±１℃）にて光が管理された環境（午前７から午後８時まで点灯）で飼育し、食餌（Ｈａｒｌａｎ  ２０１６）および水を自由摂取させた。ラットを以下の通りにグループ分けした：
グループ１：ＥＡＥラット１５匹にＭＯＧ  ＥＡＥを接種した後、第０日から開始し終了時点まで、投与計画に従って１日１回、週３回の溶媒（生理食塩水）でのｓ．ｃ．処置を継続した。
グループ２：ＥＡＥラット１５匹に接種を実施した後、第０日から開始し終了時点まで、投与計画に従って１日１回、週３回のデキストラン硫酸５ＨＳ（ＴｄＢ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｃｙ社、バッチ番号２０３００）（３０．０ｍｇ／ｋｇ）でのｓ．ｃ．処置を継続した。
グループ３：ＥＡＥラット１５匹に接種を実施した後、第０日から開始し終了時点まで、投与計画に従って１日１回、週３回の諸実施形態によるデキストラン硫酸（バッチ番号３）（３０．０ｍｇ／ｋｇ）でのｓ．ｃ．処置を継続した。
【０１２９】
ＥＡＥの誘導および臨床スコアリング
尾の基部の皮内に接種材料１００μＬを投与することによってＥＡＥを誘導した。接種材料は、組換えＭＯＧ１−１２５（ＮｏｒｄｉｃＢｉｏＳｉｔｅ社）２０μｇをＰＢＳ（０．０１Ｍ）に溶かし、加熱不活化した結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｈ３７ＲＡ株；Ｄｉｆｃｏ社、デトロイト、ミシガン州）２００μｇを含有するフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）（Ｓｉｇｍａ  Ｆ５５０６）（１：１）で乳化したもので構成されていた。
【０１３０】
試験の３６日間にわたって臨床スコアリングを毎日実施し、開始は第０日、継続は第３５日の終了時点までとした。試験期間中、臨床スコアリングは、下に記載する臨床スコアリング原則に従って、盲検で実施した。
【０１３１】
【表１２】
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【０１３２】
累積疾患指数（ＣＤＩ）を試験期間中の臨床スコア値の合計である累積疾患量として表す。疾患発症（ＤＯ）は、ＥＡＥの肉眼的症状（臨床スコア値≧０．５）が初めて観察された試験日を表す。
【０１３３】
試験に用いた全ラットに、以下の投与計画に従って第０日〜第３４日にデキストラン硫酸または対応する溶媒を投与した：
グループ１には、週３回（月、水、金）、午前７〜１１時に溶媒（生理食塩水、９ｍｇ／ｍｌ、Ｂａｘｔｅｒ社）を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。溶媒の投与量は５．０ｍｌ／ｋｇとした。ＭＯＧ  ＥＡＥ誘導後第０日に溶媒投与を開始し、接種した曜日および投与計画に応じて試験第３２日または試験第３３日まで継続した。
グループ２には、週３回（月、水、金）、午前７〜１１時に用量３０．０ｍｇ／ｋｇのデキストラン硫酸５ＨＳ（ＴｄＢ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｃｙ社、バッチ番号２０３００）を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。投与量は５．０ｍｌ／ｋｇとした。ＭＯＧ  ＥＡＥ誘導後第０日に投与を開始し、接種した曜日および投与計画に応じて試験第３２日または試験第３３日まで継続した。
グループ３には、週３回（月、水、金）、午前７〜１１時に用量３０．０ｍｇ／ｋｇの諸実施形態によるデキストラン硫酸（バッチ番号３）を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。投与量は５．０ｍｌ／ｋｇとした。ＭＯＧ  ＥＡＥ誘導後第０日に投与を開始し、接種した曜日および投与計画に応じて試験第３２日または試験第３３日まで継続した。
【０１３４】
終了時点での組織および血漿の採取
第３５日の終了時点で、全ラットにペントバルビタール（Ｍｅｂｕｎａｔ（登録商標）、６０ｍｇ／ｍｌ、Ｏｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａ社）による深麻酔を実施した。深麻酔後、心臓穿刺により血液試料を採取した。血液計８００〜１０００μｌをＬｉ−ヘパリンマイクロチューブに採取し、＋４℃、２０００×Ｇで１０分間遠心分離した。血漿２００μｌを２つの別個の血漿採取マトリックスポリプロピレンチューブにそれぞれ採取し、ドライアイスで凍結させ、一方をのちの分析に使用するまで−８０℃で保管した。
【０１３５】
組織学的試料には、ラットに冷ヘパリン処置（２．５ＩＵ／ｍｌ）生理食塩水を１０分間経心潅流した後、０．１Ｍリン酸緩衝液に溶かした冷４％パラホルムアルデヒドを少なくとも１０分間灌流した。小脳および脳の残りの部分ならびに脊髄のＣ領域およびＴ領域（ぞれぞれ１ｃｍ）を切り出し、０．１Ｍリン酸緩衝液に溶かした４％パラホルムアルデヒドに＋４℃で少なくとも２４時間浸漬して後固定した。次いで、保存剤の０．００１％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社）を含有する０．０１Ｍ  ＰＢＳに試料を移し替え、のちの組織学的分析まで＋４℃で保管した。
【０１３６】
全般的健康状態および人道的エンドポイント
ラットは検査室職員が１日２回監視した（午前８時および午後４時）。ラットの全般的健康状態が顕著に悪化した場合、ＣＯ２過剰摂取および頸部脱臼によってラットを安楽死させた。安楽死させたラットまたは死亡していたラットは死後可能な限り迅速に顕微鏡検査に供した。剖検を直ちに実施しない場合、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＤＲＳ（フィンランド）で剖検を実施するまで死体を約４℃で冷蔵保存した。許容される評価項目の定義には、２４時間の観察時間に自発的な運動が全く見られず、飲食も不可能であること、大量出血、自発性炎症、解剖学的形態の喪失、腫脹または腫瘍を含めた。
【０１３７】
ラットを安楽死させる根拠となるモデル（ＥＡＥ）特異的評価項目には、臨床スコアがレベル４（全肢の部分的衰弱または片麻痺）に達していること、正向反射に３０秒超かかることおよび体重減少がベースラインの２５％を上回っていることを含めた。
【０１３８】
統計解析
数値はいずれも平均±標準偏差（ＳＤ）または平均値の標準誤差（ＳＥＭ）で表し、差はＰ＜０．０５レベルで統計的に有意であると見なす。統計解析はＳｔａｔｓＤｉｒｅｃｔ統計ソフトウェアを用いて実施した。一元ＡＮＯＶＡの後にダネット検定（溶媒処置群との比較）を用いて平均値の間の差を解析した。ノンパラメトリックデータをクラスカル・ウォリスＡＮＯＶＡ（グループ間）で解析した。
【０１３９】
体重
ラットの体重を毎日監視し、開始を第０日、継続を終了時点の第３５日までとした。試験期間中、グループ２および３のラットはいずれも、溶媒群１と同程度の体重増加がみられた（ｐ＞０．０５）。
【０１４０】
疾患発症率および生存率
本試験の全ラットのグループごとの死亡率は以下の通りであった：
グループ１：４０％（６／１５）；
グループ２：２０％（４／１５）；および
グループ３：７％（１／１５）。
【０１４１】
累積疾患指数
累積疾患指数（ＣＤＩ）は、３６日間、すなわち接種の第０日から終了時点の第３５日までの臨床スコア値の合計を表す。指数の値が高いことは、疾患が進行していることを表し、指数の値が低いことは、症状が軽度であることを表す。
【０１４２】
皮下投与したデキストラン硫酸化合物および溶媒の累積疾患指数に対する効果を図１１に示す。溶媒群のラット（グループ１）とグループ２との間に累積疾患指数の有意な差はみられなかった。しかし、グループ３では、デキストラン硫酸処置により平均ＣＤＩが溶媒に比して３１％減少した。
【０１４３】
したがって、諸実施形態によるデキストラン硫酸（バッチ番号３）は、ＣＤＩによる評価で、ＥＡＥを有する対象に対する生物学的効果がデキストラン硫酸５ＨＳと比較して改善されていた。
【０１４４】
ＥＡＥは、中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症性脱髄性疾患の動物モデルである。このモデルは、多発性硬化症（ＭＳ）および急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）を含めたヒトＣＮＳ脱髄性疾患の動物モデルとして広く研究されている。したがって、諸実施形態のデキストラン硫酸は、ＭＳおよびＡＤＥＭの症状を治療するか、少なくとも軽減するのに有益な効果があると思われる。
【０１４５】
デキストラン硫酸分子間での毒性の比較
ｉ．ｖ．注射によって投与した単回用量のデキストラン硫酸のＳｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに対する毒性を２週間の観察期間にわたって評価した。この実験に使用した溶媒は、０．９％ＮａＣｌに溶かした７５ｍＭ  ＣＡＭである。
【０１４６】
この試験では、雄ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラットに諸実施形態のデキストラン硫酸（バッチ番号３）およびＭｅｉｔｏ  Ｓａｎｇｙｏ社製デキストラン硫酸（ＤＳ−１８）（バッチ番号Ｎ−３１８８およびＮ−３１９０）を用量レベル７０ｍｇ／ｋｇおよび１４０ｍｇ／ｋｇで単回ボーラス注射により投与し、１４日間の観察期間を設けた。試験には、対照１グループ；ＤＳ−Ｓ１８、バッチ番号Ｎ−３１８８；ＤＳ−Ｓ１８、バッチ番号Ｎ−３１９０；およびバッチ番号３のデキストラン硫酸の計７グループを含めた（表８を参照されたい）。各用量群の個体数は、７０ｍｇ／ｋｇのバッチ番号３のデキストラン硫酸を１０匹とした以外は５匹とした。試験に用いた全個体の肺およびバッチ番号３のデキストラン硫酸で処置したグループの選択した器官（副腎、骨髄含めた大腿骨、心臓、腎臓、肝臓、腸間膜リンパ節、脾臓、胸腺および注射部位）に病理学検査を実施した。
【０１４７】
【表１３】
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【０１４８】
試験で死亡例はみられなかった。投与日（第１日）、投与から約１０分後、全グループのデキストラン硫酸を投与した個体にある程度用量に相関して呼吸困難が認められた。頻度が最も高かったのは１４０ｍｇ／ｋｇを投与した個体であった。５個体中４個体に中等度の呼吸困難が認められたＤＳ−Ｓ１８（バッチＮ−３１８８）を１４０ｍｇ／ｋｇ投与した個体を除けば、大部分の個体に観察された重症度は軽度のものであった。残りの観察期間（第２日〜第１５日）は、ＤＳ−Ｓ１８（両バッチ）を１４０ｍｇ／ｋｇ投与した個体に大部分に呼吸困難が認められた。バッチ番号３のデキストラン硫酸を投与した１個体に第６日〜第１５日に呼吸困難が認められた。
【０１４９】
組織学的検査では、被験化合物を投与した個体の肺に治療による変化が観察され、それは肺胞組織球症および肺胞中隔の肥厚／細胞増殖からなるものであった。被験化合物ＤＳ−Ｓ１８（両バッチ）を１４０ｍｇ／ｋｇ投与した個体の大部分に上記の変化の頻度および重症度の増大が認められた。バッチ番号３のデキストラン硫酸を７０ｍｇ／ｋｇを投与した１０個体のうち１個体のみ変化が最小限に抑えられ、１４０ｍｇ／ｋｇを投与した５個体のうち３個体に最小限ないし中等度の所見が認められた。肺の所見に加えて、全用量群の脾臓に髄外造血のわずかな増大が認められたが、毒性学的重要性は疑わしいものと考えられた。
【０１５０】
【表１４】
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【０１５１】
本試験で試験した化合物のうち、バッチ番号３のデキストラン硫酸はＤＳ−１８よりも著明な肺毒性の頻度が低かった。
【０１５２】
Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製デキストラン硫酸のＮＭＲ分析
一次元１Ｈおよび二次元１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣ  ＮＭＲ分光測定法を用いて、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製デキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤＳＳ）（製品番号３１４０４）の構造的特徴を明らかにした。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社のデキストラン硫酸（製品番号３１４０４）に関する分析証明書には、分子量（Ｍｒ）５０００Ｄａ、平均硫黄含有量１７％と記載されており、これはグルコシル残基当たりの硫酸基数では約２．３に相当する。
【０１５３】
Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製デキストラン硫酸（製品番号３１４０４）３５．９ｍｇをＤ２Ｏ  ５１０μｌに溶かしてＮＭＲ試料を調製した。
【０１５４】
結果
グルコース単位数：２６〜５０
Ｍｎ：８６００〜１６９００Ｄａ
α−立体配置のＣ１の度合い：決定されなかったが、５０％超である（α−立体配置＞＞β−立体配置）
硫酸化Ｃ２〜Ｃ４の度合い：７４％
硫酸化α−Ｃ１末端基の度合い：４９％
硫酸化β−Ｃ１末端基の度合い：決定されなかった
【０１５５】
デキストラン硫酸分子中のグルコース単位数を求めるのに最も精度の高い方法は、デキストラン硫酸製造の出発物質として用いた対応するデキストランの同時分析を実施することである。対応するデキストランに関するＮＭＲデータがなければ、二次元１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトルの領域４．８〜５．２ｐｐｍのスペクトルの重複（図１４を参照されたい）により、β−アノマー立体配置の末端Ｃ１の割合および硫酸化β−Ｃ１末端基の度合いの定量化ができない。図１３に、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製デキストラン硫酸（製品番号３１４０４）の一次元１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【０１５６】
このため、試料デキストラン硫酸（製品番号３１４０４）中のグルコース単位の計算値は区間で報告され、α−立体配置の末端Ｃ１の度合いは５０％〜１００％の範囲内にある。二次元１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトルのデータには、β−Ｃ１末端基の予想される領域のシグナルがみられず、グルコース単位数は報告した区間の上部にあることが示唆される。
【０１５７】
考察
ＮＭＲの結果から、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社の分子量Ｍｒ５０００Ｄａのデキストラン硫酸（製品番号３１４０４）の分子量は、実際には、ＮＭＲ−分光測定法によって測定される数平均分子量Ｍｎが８６００Ｄａ〜１６９００Ｄａの区間内にあることがわかる。
【０１５８】
様々な製造業者のデキストラン硫酸の機能試験
この試験の目的は、様々な製造業者のデキストラン硫酸が活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）に及ぼす機能的効果をｅｘ  ｖｉｖｏヒトアッセイで検討し比較することであった。
【０１５９】
ＡＰＴＴは、血液凝固の特徴を明らかにする医学的検査の１つである。血液凝固の異常を検出するほか、接触活性化経路および共通凝固経路の両方の効果の成績指標にもなる。
【０１６０】
方法および機器
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ社のＳｔａｒｔ（登録商標）４を製造業者の指示通りに用いて、ヒト血漿でのＡＰＴＴを測定した。デキストラン硫酸を最初のｐＨが５．９の７５ｍＭクエン酸緩衝液に溶かして１ｍｇ／ｍｌとし、次いでヒト血漿を加えて、デキストラン硫酸の最終濃度を１０μｇ／ｍｌとした。
【０１６１】
Ｍｅｉｔｏ  Ｓａｎｇｙｏ社（日本）製デキストラン硫酸のバッチ４種類（Ｎ−３１７８、Ｎ−３１７９、Ｎ−３１８０、Ｎ−３１８１）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国）製デキストラン硫酸のバッチ１種類（平均分子量５０００Ｄａ、製品番号３１４０４）および諸実施形態によるデキストラン硫酸のバッチ２種類（バッチ番号１およびバッチ番号２）を分析した。各バッチから別個に計量した４つの試料を処理し、この４つの試料それぞれについて、二重反復でＡＰＴＴを測定した。試料操作はいずれも、同一日に並行して実施した。翌日、全試料のＡＰＴＴ測定をすべて実施して、同等の結果を得た。
【０１６２】
ＡＰＴＴ分析に全血の代わりに血漿を用いることにより、分析が一層堅固になり、結果のばらつきも少なくなる。
【０１６３】
結果
ＡＰＴＴ分析の結果を下の表１０に示す。ＡＰＴＴのベースラインは、陰性対照として測定した血漿とした。
【０１６４】
【表１５】
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【０１６５】
諸実施形態によるデキストラン硫酸および他の製造業者のデキストラン硫酸について測定したＡＰＴＴには有意な差がみられた。特に、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製のデキストラン硫酸（５０００Ｄａ、製品番号３１４０４）は、諸実施形態によるデキストラン硫酸よりもＡＰＴＴが有意に高かった。
【０１６６】
上記の実施形態は、本発明のいくつかの具体例として理解されるべきである。当業者には、本発明の範囲を逸脱することなく諸実施形態に様々な修正、組合せおよび改変を施し得ることが理解されよう。特に、技術的に可能な場合、様々な実施形態の様々な部分的解決法を別の構成で組合せることができる。ただし、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって定められる。
【０１６７】
添付資料１
Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＩｎｆｉｎｉｔｙシリーズＨＰＬＣシステムとそれに接続されたＭｉｎｉＤＡＷＮ  ＴＲＥＯＳ光散乱検出器（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）とで構成されるサイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ）システムで光散乱実験を実施した。光散乱実験には以下の分析パラメータを用いた：
・流速＝１．００ｍＬ／分
・カラム／ｄＲＩ検出器の温度＝４０℃
・収集間隔＝０．５秒
・注入体積＝１０μＬ
・Ｄｎ／ｄｃ＝０．１４７０ｍＬ／ｇ
・ＭＡＬＬＳの波長＝６５６ｎｍ
・校正定数（ＭＡＬＬＳ）＝４．７３０３×１０−５１／（Ｖ ｃｍ）
移動相（溶離液）として、４００ｐｐｍのアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）を含む０．１Ｍ硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ３）２ｍＬにデキストラン硫酸試料を溶かした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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2018501332.tif 000039
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