(57)【要約】  抗原特異的T細胞性免疫反応の向上を誘導する必要がある対象において、それを誘導するのに用いるワクチン組成物を開示する。上記組成物は、(a)少なくとも病原体の抗原を含む治療上有効量の免疫原性タンパク質と、(b)GPI-0100、Quil A、QS-21からなる群より選択されるサポニン系アジュバントと、(c)モノホスホリルリピドA(MPL)及びCpG1826からなる群より選択されるToll様受容体(TLR)アゴニストアジュバントと、を含む。【選択図】図11
2018507860.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)少なくとも病原体の抗原を含む治療上有効量の免疫原性タンパク質と、
(b)GPI-0100、Quil A、QS-21からなる群より選択されるサポニン系アジュバントと、
(c)モノホスホリルリピドA(MPL)及びCpG1826からなる群より選択されるToll様受容体(TLR)アゴニストアジュバントと、を含む組成物。
【請求項２】
マンニトール、スクロース、トレハロース、ヒスチジン、グリシン、アルギニン、ソルビトール、ポリソルベート80、グルコース、ラクトース、マルトース、マルトデキストリン、クエン酸塩、トリス及びリン酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも一つの添加物を更に有する、請求項1の組成物。
【請求項３】
前記免疫原性タンパク質は、融合タンパク質であり、
前記融合タンパク質は、
(a)前記融合タンパク質のN末端に位置する、抗原提示細胞(APC)-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインと、
(b)前記APC-結合ドメイン又は前記CD91受容体-結合ドメインのC末端に位置するタンパク質トランスダクションドメインと、
(c)前記タンパク質トランスダクションドメインのC末端に位置する病原体の抗原と、を含み、
(b)上記タンパク質トランスダクションドメインは、
(i)融合ポリペプチド、
(ii)長さが28-53個のアミノ酸残基からなるT細胞-感作シグナル伝達ペプチド、及び
(iii)長さが34-46のアミノ酸残基のトランスロケーションペプチド、からなる群より選択され、
(i)上記融合ポリペプチドは、
(1)長さが28-53個のアミノ酸残基からなるT細胞感作シグナル伝達ペプチドと、
(2)長さが34-112個のアミノ酸残基からなるトランスロケーションペプチドと、
(3)リンカーと、を有し、
(1)上記T細胞感作シグナル伝達ペプチドは、配列番号: 31のアミノ酸配列を含み、上記融合ポリペプチドのN末端に位置し、
Xaa8は、I又はLであり、
Xaa10は、V、F又はAであり、
Xaa11は、M又はLであり、
Xaa17は、L又はIであり、
(2)上記トランスロケーションペプチドは、配列番号: 3、20又は4と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、
(3)上記リンカーは、上記T細胞感作シグナル伝達ペプチドと上記トランスロケーションペプチドとを連結する配列番号: 15を含み、
(ii)上記T細胞-感作シグナル伝達ペプチドは、配列番号: 31のアミノ酸配列を含み、
Xaa8は、I又はLであり、
Xaa10は、V、F又はAであり、
Xaa11は、M又はLであり、
Xaa17は、L又はIであり、
(iii)上記トランスロケーションペプチドは、配列番号: 3又は20と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、
前記APC-結合ドメイン又は前記CD91受容体-結合ドメインは、前記タンパク質トランスダクションドメインが(b)(iii)の長さが34-46個のアミノ酸残基のトランスロケーションペプチドである場合、シュードモナスエキソトキシンA(PE)結合ドメインIのアミノ酸配列がない、請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
前記タンパク質トランスダクションドメインは、配列番号: 30の配列を含む、請求項3に記載の組成物。
【請求項５】
前記APC-結合ドメイン又は前記CD91受容体-結合ドメインは、配列番号: 5、9、6、7、および8からなる群より選択される配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項3に記載の組成物。
【請求項６】
前記T細胞感作シグナル伝達ペプチドは、配列番号:1及び2からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項3に記載の組成物。
【請求項７】
前記トランスロケーションペプチドは、配列番号: 3のアミノ酸配列を含む、請求項3に記載の組成物。
【請求項８】
前記病原体は、ヒトパピローマウイルス(HPV)、豚繁殖呼吸障害症候群ウイルス(PRRSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV-１)、インフルエンザウイルス、デング熱ウイルス、C型肝炎ウイルス(HCV)、B型肝炎ウイルス(HBV)及びブタサーコウイルス2(PCV2)からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項3に記載の組成物。
【請求項９】
病原体の前記抗原は、ヒトパピローマウイルス(HPV) E7タンパク質、B型肝炎ウイルス(HBV) HBxタンパク質、C型肝炎ウイルス(HCV)コア抗原、インフルエンザウイルスM2抗原、及び 腫瘍関連抗原からなる群より選択される、請求項3に記載の組成物。
【請求項１０】
腫瘍関連抗原は、SSX2、MAGE-A3、NY-ESO-1、iLRP、WT12-281、RNF43(2-116 + 696-783)、及び CEA-NE3からなる群より選択される、請求項9に記載の組成物。
【請求項１１】
前記HPV E7タンパク質は、配列番号: 21と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項9に記載の組成物。
【請求項１２】
前記融合タンパク質は、前記融合タンパク質のC末端に位置する小胞体リテンション配列を更に有する、請求項3に記載の組成物。
【請求項１３】
前記免疫原性タンパク質は、融合タンパク質であり、
上記融合タンパク質は、
(a)上記融合タンパク質のN末端に位置する抗原提示細胞(APC)-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインと、
(b)長さが34-112個のアミノ酸残基のトランスロケーションペプチドと、
(c)病原体の抗原と、
(d)配列番号:44のアミノ酸配列を含む核外移行シグナルと、
(e)上記融合タンパク質のC末端に位置する小胞体リテンション配列と、を含み、
上記トランスロケーションペプチドは、上記APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインのC末端に位置する、配列番号: 3、4、20、または41と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、
上記核外移行シグナルは、上記抗原と上記小胞体リテンション配列との間に、又は、上記トランスロケーションペプチドと上記抗原との間に位置する、請求項1に記載の組成物。
【請求項１４】
前記免疫原性タンパク質は、融合タンパク質であり、
上記融合タンパク質は、
(a)上記融合タンパク質のN末端に位置する抗原提示細胞(APC)-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインと、
(b)長さが34-61個のアミノ酸残基のトランスロケーションペプチドと、
(c)病原体の抗原と、
(d)配列番号: 44のアミノ酸配列を含む核外移行シグナルと、
(e)上記融合タンパク質のC末端に位置する小胞体リテンション配列と、を含み、
上記トランスロケーションペプチドは、上記APC-結合ドメイン又は上記CD91受容体-結合ドメインのC末端に位置する、配列番号: 3、20又は41と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、
上記核外移行シグナルは、上記抗原と上記小胞体リテンション配列との間に、又は、上記トランスロケーションペプチドと上記抗原との間に位置する、請求項1に記載の組成物。
【請求項１５】
抗原特異的T細胞性免疫反応の向上を誘発する必要がある対象において、それを誘発するための医薬品の製造における、請求項1から14のいずれかに記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、ワクチン製剤に関する。特に、本発明は、アジュバントの組み合わせを含むワクチン製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アジュバントは、多くのワクチンの重要な成分である。既存の大多数のワクチンは、一つのアジュバントを含んでいる。それらには固有の限界が存在するため、一つのアジュバントでは、様々なワクチンに必要とされる全ての防御免疫反応を誘導することができない。従って、ワクチンにおいて複数のアジュバントを含む製剤を使用する可能性を探査するニーズある。
【発明の概要】
【０００３】
一つの態様では、本発明は、
(a)少なくとも病原体の抗原を含む治療上有効量の免疫原性タンパク質と、
(b)GPI-0100、Quil A、QS-21からなる群より選択されるサポニン系アジュバントと、
(c)モノホスホリルリピドA(MPL)及びCpG1826からなる群より選択されるToll様受容体(TLR)アゴニストアジュバントと、を含むワクチン組成物に関する。
【０００４】
本発明の別の実施形態において、上記組成物は、マンニトール、スクロース、トレハロース、ヒスチジン、グリシン、アルギニン、ソルビトール、ポリソルベート80、グルコース、ラクトース、マルトース、マルトデキストリン、クエン酸塩、トリス及びリン酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも一つの添加物を更に含む。
【０００５】
本発明の別の実施形態において、免疫原性タンパク質は、融合タンパク質であり、
上記融合タンパク質は、
(a)上記融合タンパク質のN末端に位置する、抗原提示細胞(APC)-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインと、
(b)上記APC-結合ドメイン又は上記CD91受容体-結合ドメインのC末端に位置するタンパク質トランスダクションドメインと、
(c)上記タンパク質トランスダクションドメインのC末端に位置する病原体の抗原と、を含み、
(b)上記タンパク質トランスダクションドメインは、
(i)融合ポリペプチド、
(ii)長さが28-53個のアミノ酸残基からなるT細胞-感作シグナル伝達ペプチド、及び
(iii)長さが34-61個のアミノ酸残基のトランスロケーションペプチド、からなる群より選択され、
(i)上記融合ポリペプチドは、
(1)長さが28-53個のアミノ酸残基からなるT細胞感作シグナル伝達ペプチドと、
(2)長さが34-112個のアミノ酸残基からなるトランスロケーションペプチドと、
(3)リンカーと、を有し、
(1)上記T細胞感作シグナル伝達ペプチドは、配列番号: 31のアミノ酸配列を含み、上記融合ポリペプチドのN末端に位置し、
Xaa8は、I又はLであり、
Xaa10は、V、F又はAであり、
Xaa11は、M又はLであり、
Xaa17は、L又はIであり、
(2)上記トランスロケーションペプチドは、配列番号: 3、20、4、または41と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、
(3)上記リンカーは、上記T細胞感作シグナル伝達ペプチドと上記トランスロケーションペプチドとを連結する配列番号: 15を含み、
(ii)上記T細胞-感作シグナル伝達ペプチドは、配列番号: 31のアミノ酸配列を含み、
Xaa8は、I又はLであり、
Xaa10は、V、F又はAであり、
Xaa11は、M又はLであり、
Xaa17は、L又はIであり、
(iii)上記トランスロケーションペプチドは、配列番号: 3、20又は41と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、
上記APC-結合ドメイン又は上記CD91受容体-結合ドメインは、上記タンパク質トランスダクションドメインが(biii)のトランスロケーションペプチドである場合、シュードモナスエキソトキシンA(PE)結合ドメインIaのアミノ酸配列がない。
【０００６】
本発明の別の実施形態において、上記タンパク質トランスダクションドメインは、配列番号: 30の配列を含む。
【０００７】
本発明の別の実施形態において、上記APC-結合ドメイン又は上記CD91受容体-結合ドメインは、配列番号: 5、9、6、7、および8からなる群より選択される配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【０００８】
本発明の別の実施形態において、上記APC-結合ドメイン又は上記CD91受容体-結合ドメインは、配列番号: 5、9、6、7、および8からなる群より選択される配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む。
【０００９】
本発明の別の実施形態において、上記APC-結合ドメイン又は上記CD91受容体-結合ドメインは、配列番号: 5、9、6、7、および8からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００１０】
或いは、上記APC-結合ドメインは、受容体関連タンパク質-1(RAP1)ドメインIII、アルファ-2-マクログロブリン受容体関連タンパク質(A2M)、HIV-Tat及びヒートショックタンパク質(HSP)及びシュードモナスエキソトキシンA(PE)結合ドメインIaからなる群より選択される。
【００１１】
本発明の別の実施形態において、上記融合タンパク質は、シュードモナスエキソトキシンA(PE)結合ドメインIaのアミノ酸配列を有していない。
【００１２】
本発明の別の実施形態において、上記融合タンパク質は、上記融合タンパク質のC末端に位置する小胞体リテンション配列を更に含む。
【００１３】
本発明の別の実施形態において、小胞体(ER)リテンション配列は、Lys-Asp-Glu-Leuのアミノ酸配列(配列番号: 14)を含む。上記ERリテンション配列は、配列番号: 14、16-19からなる群より選択される配列を含む。
【００１４】
或いは、上記ERリテンション配列は、配列番号: 16-19からなる群より選択される配列からなっていてもよい。
【００１５】
本発明の別の実施形態において、上記融合タンパク質は、上記抗原が10又は11個以上のエピトープを含む場合、そのC末端に小胞体リテンション配列を有さない。
【００１６】
本発明の別の実施形態において、上記タンパク質トランスダクションドメインは、(bi)の融合ポリペプチドである。
【００１７】
本発明の別の実施形態において、タンパク質トランスダクションドメインは、(bii)のT細胞-感作シグナル伝達ペプチドである。
【００１８】
本発明の別の実施形態において、上記融合タンパク質は、上記タンパク質トランスダクションドメインと抗原との間に追加のリンカーを更に含み、上記追加のリンカーは、配列番号: 15を含む。
【００１９】
本発明の別の実施形態において、上記タンパク質トランスダクションドメインは、(biii)のトランスロケーションペプチドである。
【００２０】
本発明の別の実施形態において、上記融合タンパク質は、上記APC-結合ドメイン又は上記CD91受容体-結合ドメインと上記トランスロケーションペプチドとの間に追加のリンカーを更に含み、上記追加のリンカーは、配列番号: 15を含む。
【００２１】
本発明の別の実施形態において、上記タンパク質トランスダクションドメインは、配列番号: 30の配列を含む。
【００２２】
本発明の別の実施形態において、上記T細胞感作シグナル伝達ペプチドは、配列番号: 1又は2と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
本発明の別の実施形態において、上記T細胞感作シグナル伝達ペプチドは、配列番号: 1及び2からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２４】
本発明の別の実施形態において、上記トランスロケーションペプチドは、配列番号: 3、20、4、および41からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２５】
本発明の別の実施形態において、上記トランスロケーションペプチドは、長さが34-61個のアミノ酸残基を含む。
【００２６】
本発明の別の実施形態において、上記融合タンパク質の上記タンパク質トランスダクションドメインは、以下の特徴を含む:(i) 上記T細胞-感作シグナル伝達ペプチドは、配列番号: 1又は2のアミノ酸配列を含む、及び(ii) 上記トランスロケーションペプチドは、配列番号: 3と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２７】
T細胞感作シグナル伝達ペプチドは、T細胞上のCD28受容体のK1X2E3X4X5Y6P7P8P9Y10(配列番号: 32)のアミノ酸配列を認識しそれに結合する抗体を誘導する特徴を示し、X2は、I又はLであり、X4は、V、F又はAであり、X5は、M又はLである。
【００２８】
抗原提示細胞(APC)は、樹状細胞、マクロファージ、B細胞及び単核細胞からなる群より選択されてもよい。
【００２９】
本発明の一実施形態において、上記APCの細胞膜は、CD91受容体を含む。
【００３０】
本発明の別の実施形態において、上記病原体は、ヒトパピローマウイルス(HPV)、豚繁殖呼吸障害症候群ウイルス(PRRSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV-１)、インフルエンザウイルス、デング熱ウイルス、肝炎Cウイルス(HCV)、肝炎Bウイルス(HBV)及びブタサーコウイルス2(PCV2)からなる群より選択される少なくとも1つである。
【００３１】
本発明の一実施形態において、上記病原体の抗原は、ヒトパピローマウイルス(HPV) E7タンパク質、肝炎Bウイルス(HBV) HBxタンパク質、肝炎Cウイルス(HCV)コア抗原、インフルエンザウイルスM2抗原及び腫瘍関連抗原からなる群より選択される。
【００３２】
本発明の一実施形態において、上記HPV E7タンパク質は、配列番号: 21と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む。
【００３３】
本発明の別の実施形態において、上記腫瘍関連抗原は、SSX2、MAGE-A3、NY-ESO-1、iLRP、WT12-281、RNF43(2-116 + 696-783)及びCEA-NE3からなる群より選択される。
【００３４】
本発明の別の実施形態において、上記抗原は、配列番号: 21及び22をからなる群より選択される配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むHPV E7抗原である。本発明の好ましい実施形態において、上記抗原は、配列番号: 21のアミノ酸配列を含むHPV E7抗原である。
【００３５】
本発明の別の実施形態において、融合タンパク質は、上記融合タンパク質のC末端に位置する小胞体リテンション配列を更に含む。
【００３６】
本発明の一実施形態において、上記免疫原性タンパク質は、配列番号: 54の配列を含む融合タンパク質である。例えば、上記免疫原性タンパク質は、融合タンパク質PE407-E7-K3(配列番号: 54)である。
【００３７】
本発明の別の実施形態において、上記免疫原性タンパク質は、配列番号: 55の配列を含む融合タンパク質である。例えば、上記免疫原性タンパク質は、融合タンパク質RAP1-CD28convPEt-E7-K3(配列番号: 55)である。
【００３８】
本発明の別の実施形態において、免疫原性タンパク質は、融合タンパク質であり、
上記融合タンパク質は、
(a)上記融合タンパク質のN末端に位置する抗原提示細胞(APC)-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインと、
(b)長さが34-112個のアミノ酸残基のトランスロケーションペプチドと、
(c)病原体の抗原と、
(d)配列番号:44のアミノ酸配列を含む核外移行シグナルと、
(e)上記融合タンパク質のC末端に位置する小胞体リテンション配列と、を含み、
上記トランスロケーションペプチドは、上記APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインのC末端に位置する、配列番号: 3、4、20、または41と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、
上記核外移行シグナルは、上記抗原と上記小胞体リテンション配列との間に、又は、上記トランスロケーションペプチドと上記抗原との間に位置する。
【００３９】
本発明の別の実施形態において、免疫原性タンパク質は、融合タンパク質であり、
上記融合タンパク質は、
(a)上記融合タンパク質のN末端に位置する抗原提示細胞(APC)-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインと、
(b)長さが34-61個のアミノ酸残基のトランスロケーションペプチドと、
(c) 病原体の抗原と、
(d)配列番号: 44のアミノ酸配列を含む核外移行シグナルと、
(e) 上記融合タンパク質のC末端に位置する小胞体リテンション配列と、を含み、
上記トランスロケーションペプチドは、上記APC-結合ドメイン又は上記CD91受容体-結合ドメインのC末端に位置する、配列番号: 3、20又は41と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、
上記核外移行シグナルは、上記抗原と上記小胞体リテンション配列との間に、又は、上記トランスロケーションペプチドと上記抗原との間に位置する。
【００４０】
本発明の別の実施形態において、配列番号: 44のC末端アミノ酸は、アラニンである。
【００４１】
本発明の別の実施形態において、上記核外移行シグナルは、配列番号: 45のアミノ酸配列を含む。
【００４２】
本発明の別の実施形態において、上記小胞体リテンション配列は、配列番号: 14のアミノ酸配列を含む。
【００４３】
本発明の別の実施形態において、上記核外移行シグナル及び上記ERリテンション配列は、配列番号: 43と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む融合ペプチドを形成する。
【００４４】
本発明の別の実施形態において、上記トランスロケーションペプチドは、長さが34-61個のアミノ酸残基を含む。
【００４５】
本発明の別の実施形態において、上記トランスロケーションペプチドは、長さが34-46のアミノ酸残基を含む。
【００４６】
本発明の別の実施形態において、上記APC-結合ドメイン又は上記CD91受容体-結合ドメインは、シュードモナスエキソトキシンA(PE)結合ドメインIaのアミノ酸配列を有さない。
【００４７】
本発明の別の実施形態において、上記APC-結合ドメイン又は上記CD91受容体-結合ドメインは、配列番号: 5のアミノ酸配列を含む。
【００４８】
本発明の別の実施形態において、上記APC-結合ドメイン又は上記CD91受容体-結合ドメインのアミノ酸配列は、配列番号: 9である。
【００４９】
本発明の別の実施形態において、上記抗原は、病原体由来の2又は3以上の抗原ペプチドの融合抗原である。
【００５０】
本発明の別の実施形態において、上記ERリテンション配列は、長さが4個を超えるアミノ酸残基を含む。
【００５１】
本発明の別の実施形態において、上記トランスロケーションペプチドは、配列番号: 3、4、20、または41と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む。
【００５２】
本発明の別の実施形態において、上記APC-結合ドメイン又は上記CD91受容体-結合ドメインは、樹状細胞、単核細胞、B細胞及びリンパ球からなる群より選択される抗原提示細胞(APC)上の受容体を認識してそれに結合する特性を示す。
【００５３】
本発明の別の実施形態において、上記病原体は、豚繁殖呼吸障害症候群ウイルス(PRRSV)、ブタサーコウイルス2(PCV2)、口蹄疫ウイルス(FMDV)、ブタコレラウイルス(CSFV)、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)、ブタ伝染性下痢ウイルス(PEDV)、インフルエンザウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルス属、仮性狂犬病ウイルス、豚水胞症ウイルス(SVDV)、ポックスウイルス、ロタウイルス、マイコプラズマ肺炎、ヘルペスウイルス、感染性気管支炎及び感染性ファブリーキウス嚢病ウイルスからなる群より選択される。
【００５４】
上記組成物は、非経口のための(例えば皮下又は筋肉内注射のための)投与形態であってもよい。
【００５５】
別の態様においては、本発明は、抗原特異的T細胞性免疫反応の向上を誘導する必要がある対象において、それを誘導するための医薬品の製造における上記組成物の使用に関する。
【００５６】
或いは、別の態様においては、本発明は、抗原特異的T細胞性免疫反応の向上を誘導する必要がある対象において、それを誘導するのに用いる上記組成物に関する。
【００５７】
或いは、本発明は、抗原特異的T細胞性免疫反応の向上を誘導する必要があり対象において、それを誘導する方法に関するものであって、上記方法は、その必要がある対象に治療上有効量の上記組成物を投与することで、抗原特異的T細胞性免疫反応の向上を誘導する必要がある対象に、それを誘導する投与ステップを有する。
【００５８】
これらの態様及び他の態様は、以下の図面に関連する好適な実施形態に関する以下の記述から明らかになるだろう。但し、その変更形態及び修正形態は、開示する新規の概念の精神と範囲から逸脱することなく作用し得るものである。
【００５９】
添付の図面は、本発明の1又は複数の実施形態を例示して、明細書と共に本発明の原理を説明するのに役立つ。可能限り、同じ参照番号を図面の全体にわたって使用して、実施形態における同一又は類似の構成要素を指す。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図1は、構築物の略図を示している。
【図２】図2は、様々なワクチンの組成物によって誘導された細胞性免疫を示している表である。
【図３】図3は、様々なワクチンの組成物によって誘導された液性免疫を示している表である。
【図４】図4は、免疫化スケジュールを示している。
【図５Ａ】図5Aは、免疫原性タンパク質PE407-E7-K3によって誘導されるT細胞性免疫反応の刺激に関するサポニン系アジュバントGPI-0100とTLRアゴニストアジュバントとの相互作用を示しているグラフである。
【図５Ｂ】図5Bは、GPI-0100(50μg/用量)対して正規化した図5Aのデータのグラフを示している。
【図６】図6は、図5Aの動物群からの抗体価を示しているグラフである。
【図７Ａ】図7Aは、免疫原性タンパク質PE407-E7-K3によって誘導されるT細胞性免疫反応の刺激に関するサポニン系アジュバントQS-21とTLRアゴニストアジュバントとの相互作用を示しているグラフである。
【図７Ｂ】図7Bは、QS-21(10μg/用量)に関して正規化した図7Aのデータのグラフを示している。
【図７Ｃ】図7Cは、GPI-0100(100μg/用量)に関して正規化した図7Aのデータのグラフを示している。
【図８】図8は、図7Aの動物群からの抗体価を示しているグラフである。
【図９】図9は、明示されている様々なワクチン製剤によって誘導されるT細胞性免疫反応を示しているグラフである。
【図１０Ａ】図10Aは、免疫原性タンパク質及び1つ又は2つのアジュバントを含む様々なワクチン製剤を示している表である。
【図１０Ｂ】図10Bは、腫瘍マウスモデルの免疫化スケジュールを示している。
【図１１】図11は、様々なアジュバントと組み合わせてPE407-E7-K3でワクチン接種を受けた動物群由来の腫瘍サイズ曲線を示しているグラフである(n=4)。プラセボ群は、PBS(即ち、アジュバント及びPE407-E7-K3を含まないもの)で治療した。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
発明の詳細な説明
本発明は、その多数の修正及び変更が当業者にとって明らかであるため、例示のためだけに示している以下の実施例を用いて、より詳しく説明している。以下、本発明の様々な実施形態の詳細について説明する。図面の参酌において、同じ数字は、図全体にわたって同じ要素を指す。本願明細書の記述及び添付の特許請求の範囲全体にわたって用いられている通り、「a」、「an」及び「the」の意味は、別途明確に示されない限り、複数形を含む。また、本願明細書の記述及び添付の特許請求の範囲全体にわたって用いられている通り、「in」の意味は、別途明確に示されない限り、「in」及び「on」を含む。さらに、表題又は副題は、読み手の便宜のために明細書において用いており、本発明の範囲に対して影響を及ぼすものではない。加えて、この明細書において使用するいくつかの用語は、以下でより詳しく規定する。
【００６２】
定義
この明細書において使用する用語は、本発明の文脈の中で、及び、それぞれの用語が使われている特定の文脈において、一般的な従来技術での通常の意味を有する。本発明を記述するために用いるある種の用語は、明細書の以下に、又は他の箇所に記述して、本発明の記述に関して実践者に追加のガイダンスを提供する。便宜上、ある種の用語は、強調することができ、例えばイタリックおよび/または引用符を使用することができる。強調表示の使用は、用語の範囲及び意味に影響を及ぼすものではなく、それが強調されようとも、用語の範囲及び意味は、同じ文脈において、同じである。同じことを複数の方法で述べることができることはいうまでもない。その結果、他の言葉及び同義語は、任意の1又は複数の用語として用いてもよく、用語が本願明細書に詳しく述べられているか記載されているかにかかわらず特別な意味は有さない。ある種の用語の同義語が提供される。1又は複数の同義語の記述は、他の同義語の使用を排除しない。本明細書中に記載されている任意の用語の例を含む例の使用は、例示的なものに過ぎず、決して本発明または例示される用語の範囲および意味を限定するものではない。同様に、本発明は、この明細書において与えられている様々な実施形態に限定されない。
【００６３】
別途規定されない限り、本願明細書において用いられる全ての技術的および科学的な用語は一般的に、本発明が関係する当業者が理解するのと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本書を優先する。
【００６４】
免疫原性タンパク質(例えば抗原特異的T細胞反応を誘導するための免疫原エンハンサーとして使用する融合タンパク質)は、米国特許出願公開公報第20140154285A1及び第20140154280A1に開示されており、それぞれは完全に本願明細書に引用したものとする。
【００６５】
Toll様受容体(TLR) 4リガンド、特にアゴニスト、例えば、リピドA誘導体、特にモノホスホリルリピドA、又は、更には3脱アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)。
3D-MPLは、GlaxoSmithKline Biologicals N.A.によってMPLという名前で販売されており、MPL又は3D-MPLとして本書全体で用いている。
【００６６】
Quil A(南米原産の木、キラヤサボンソウモリナの樹皮から得られるもの)及びその画分は、米国特許第5,057,540号及び「Saponins as vaccine adjuvants、Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55; and EP 0 362 279 B1に記載されている。
【００６７】
QS-21は、キラヤサボンソウモリナの樹皮から得られる天然サポニンである。QS-21は、Quil AのHPLC精製非毒性画分であり、米国特許第5,057,540号に開示されている。
【００６８】
「抗原提示細胞(APC)又はアクセサリー細胞」という用語は、それらの表面上の主要組織適合複合体(MHC)と複合体化した外来抗原を示す細胞を指す。T細胞は、それらのT細胞受容体(TCR)を使用して、これらの複合体を認識することができる。これらの細胞は、抗原を処理して、それらをT細胞に提示する。主なタイプの抗原提示細胞は、樹状細胞(DC)、マクロファージ、単核細胞及びある種のB細胞である。
【００６９】
抗原提示細胞(APC)-結合ドメインという用語は、抗原提示細胞(APC)に結合することができるドメインを指す。APC-結合ドメインは、配列番号: 5、6、7、8、および9をからなる群より選択される配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。APC-結合ドメインは、APC上の受容体を認識しそれに結合するリガンドである。
【００７０】
分化抗原群91(CD91)は、細胞膜の受容体を形成し、受容体依存性エンドサイトーシスに関係するタンパク質である。
【００７１】
「タンパク質トランスダクションドメイン」という用語は、T細胞を感作して、抗原特異的T細胞反応を向上する、および/または抗原提示のクラスI主要組織適合複合体(MHC-I)経路(すなわち、細胞障害性T細胞経路)に抗原をガイド又は向ける(即ち、標的にする)機能を有するポリペプチド又は融合ポリペプチドを指す。
【００７２】
「T細胞を感作」という用語は、一般的に、CD8+及びCD4+ T細胞が感作され、その結果、抗原チャレンジに対するCD8+(CTL)及びCD4+ T細胞反応を高めることを意味する。抗原特異的細胞性免疫反応は、抗原に反応して抗原特異的に誘導されたγ-インターフェロンの生産を定量化することによって測定される。例えば、感作シグナルなしの場合(即ち、タンパク質トランスダクションドメインなしの場合)、抗原単独では、細胞性免疫反応を弱く誘導するか、全く誘導しない、即ち、CD8+及びCD4+ T細胞から抗原特異的γ-インターフェロンを弱く誘導するか、全く誘導しない可能性がある一方で、感作シグナル(タンパク質トランスダクションドメイン)が存在する場合、抗原は、向上した細胞性免疫反応を誘導することができる。したがって、感作シグナル(タンパク質トランスダクションドメイン)の機能は、宿主のCD4+及びCD8+ T細胞を感作することであり、後ほど抗原で宿主をチャレンジする場合、その抗原は、従来のCD4+及びCD8+ T細胞感作よりも向上した抗原特異的T細胞性免疫反応を誘導することができる。
【００７３】
タンパク質トランスダクションドメインは、「融合ポリペプチド」であってもよく、 上記融合ポリペプチドは、T細胞感作シグナル伝達ペプチド、リンカー及びトランスロケーションペプチドを含む。例えば、融合ポリペプチドは、ポリペプチド「CD28convPEt」であってもよい。
【００７４】
「CD28conv」という用語は、CD28保存領域を指し、「T細胞感作シグナル伝達ペプチド」である。それは、CD28アゴニスト抗体を誘導するエピトープである。
【００７５】
「PEt」または「PEtCore」という用語は、長さが34個のアミノ酸残基を有するPEトランスロケーションドメインコアを指す。
【００７６】
リンカーは、「CD28conv」と「PEt」との間に存在する。融合ポリペプチド「CD28convPEt」の配向又は配置は、「CD28conv」(または、T細胞感作シグナル伝達ペプチド)がPEt(または、トランスロケーションペプチド)に対して上流に位置していなければならない、すなわち、PEtは、向上したT細胞反応を得るために、「CD28conv」のC末端でなければならない点が重要である。「CD28convPEt」は、逆配向融合ペプチドPEtCD28convよりも、(CD28-特異的アゴニスト抗体と呼ばれる)CD28conv特異的IgG力価を高めることができる。CD28-特異的アゴニスト抗体は、CD4+及びCD8+ T細胞を感作することができる。適切な配向融合ポリペプチドCD28convPEtは、CD28convとPEtドメインとの間にリンカー(R1X2R3X4K5R6)を含む。リンカーは、Lys-Arg(KR)サイトを切断する抗原提示細胞(APC)-特異的プロテアーゼ(カテプシンL)を含む。従って、融合タンパク質RAP1-CD28convPEt-抗原-K3は、2つの断片、RAP1-CD28conv及びPEt-抗原-K3に消化することができる。RAP1-CD28conv断片は、リソソームにおいて更に消化され得る。そして、CD28convのエピトープは、MHC II経路を介してAPC細胞表面に提示され、液性免疫反応を誘導しCD28アゴニスト抗体を生産する。したがって、CD28アゴニスト抗体は、B細胞によって生産される。このCD28アゴニスト抗体は、T細胞表面上のCD28に結合することができ、T細胞(CD4+及びCD8+ T細胞)をプレ活性化することができる。
【００７７】
「T細胞-感作シグナル伝達ペプチド」は、長さが28-53個のアミノ酸残基を有し、配列番号: 31と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、X8は、I又はLであり、X10は、V、F又はAであり、X11は、M又はLであり、X17は、L又はIである。
【００７８】
T細胞-感作シグナル伝達ペプチドは、臨界領域K1X2E3X4X5Y6P7P8P9Y10(配列番号: 32)を含み、X2は、I又はLであり、X4は、V、F又はAであり、X5は、M又はLである。
【００７９】
マウスに特異的なT細胞感作シグナル伝達ペプチド(TDIYFCKIEFMYPPPYLDNEKSNGTIIH;配列番号: 31、X8は、I、X10は、F、X11は、M、X17は、L)は、米国特許公開公報第20140154285A1に示されている。
【００８０】
PEトランスロケーションペプチドは、配列番号: 3、4、20または41と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むことができる。例えば、PEトランスロケーションペプチドのアミノ酸配列は、全長PE(配列番号: 10)のa.a. 280-a.a. 313(配列番号: 3)、a.a. 268-a.a. 313(配列番号: 20)、a.a. 253-a.a. 313(配列番号: 41)又はa.a. 253-a.a. 364(配列番号: 4)であってもよい。すなわち、PEトランスロケーションペプチドのアミノ酸配列は、a.a. 280-a.a. 313(配列番号: 3)必須断片を含む限り、PEドメインII(a.a. 253からa.a. 364;配列番号: 4)の任意の領域を含むことができる。
【００８１】
抗原は、腫瘍細胞特異的に発現しているポリペプチドである腫瘍関連抗原(TAA)若しくは病原体の影響を受けている宿主において免疫反応を誘導することができる又は病原体によって引き起こされる疾患の原因となる、病原性タンパク質、ポリペプチド又はペプチドであってもよい。抗原は、限定するものではないが、ヒトパピローマウイルス(HPV)、豚繁殖呼吸障害症候群ウイルス(PRRSV)、ヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-１)、インフルエンザウイルス、デングウイルス、肝炎Cウイルス(HCV)B型肝炎ウイルス(HBV)、ブタサーコウイルス2(PCV2)、ブタコレラウイルス(CSFV)、口蹄疫ウイルス(FMDV)、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)、ブタ伝染性下痢ウイルス(PEDV)、インフルエンザウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルス、仮性狂犬病ウイルス、豚水胞症ウイルス(SVDV)、ポックスウイルス、ロタウイルス、マイコプラズマ肺炎、ヘルペスウイルス、伝染性気管支炎又は伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、非小細胞肺がん、乳癌、メラノーマ、リンパ腫、結腸癌腫、肝細胞癌腫、及びその任意の組み合わせを含む病原体又はがん細胞から選択することができる。例えば、HPV E7タンパク質(E7)、HCVコアタンパク質(HCVコア)、HBV Xタンパク質(HBx)は、ワクチン開発のための抗原として選ばれた。抗原は、1又は複数の病原性タンパク質から選択される2又は3以上の抗原の融合体由来の融合抗原であってもよい。例えば、PRRSV ORF6及びORF5断片の融合抗原又はPRRSV及びPCV2病原体からの抗原タンパク質の融合体である。
【００８２】
小胞体リテンション配列の機能は、エンドサイトーシスコンパートメントからERへの抗原のトランスロケーションを補助して、その内腔にそれを保持することである。それは、Lys Asp Glu Leu(KDEL)又はRDEL配列を含む。ERリテンション配列は、KKDLRDELKDEL(配列番号: 16)、KKDELRDELKDEL(配列番号: 17)、KKDELRVELKDEL(配列番号: 18)又はKDELKDELKDEL(配列番号: 19)の配列を含んでいてもよく、からなっていてもよく、から実質的になっていてもよい。
【００８３】
分子量が39kDaの受容体関連タンパク質(RAP1)は、LDL受容体関連タンパク質の小胞体タンパク及び分子シャペロンである。それは、CD91に対する高結合親和性(Kd〜3nM)を有し、3つの機能的に類似したドメインによって構成されている。
【００８４】
PE407(配列番号: 40)は、PE(ΔIII)として、特許(米7,335,361のB2)で既に開示されている。
【００８５】
核外移行シグナル(NES)は、核孔複合体を用いた核輸送による細胞核から細胞質への移行を目標とするタンパク質における4つの疎水性残基の短いアミノ酸配列を指す。NESは、エクスポーチンによって認識され結合する。疎水性残基の最も一般的な配置間隔は、L1X2X3K4L5X6X7L8X9L10X11(配列番号: 44)であり、「L」は、ロイシンであり、「K」は、リジンであり、「X2,3,6,7,9,11」は、任意の天然アミノ酸である。例えば、人工NESは、配列Leu Gln Lys Lys Leu Glu Glu Leu Glu Leu Ala(LQKKLEELELA;配列番号: 45)を含んでいてもよい。
【００８６】
「NESK」という用語は、NES及びERリテンションシグナルの融合ペプチド(すなわち、ERリテンションシグナルに融合したNES)をいう。それは、核外移行シグナル(NES)及びERリテンション配列の機能を有する人工ペプチドである。したがって、それは、細胞核から核孔複合体を通って細胞質へ抗原を移行することができ、細胞質からERまでの抗原のトランスロケーションを補助し、ERの内腔に抗原を保持することができる。例えば、NESKのアミノ酸配列は、LQKKLEELELAKDEL(配列番号: 43)であってもよい。
【００８７】
「対象」という用語は、ヒト又は非ヒト動物を指す。
【００８８】
「治療」又は「処置」という用語は、がん若しくは感染症又はかかる疾患の症状若しくは傾向を有する、有効量の融合タンパク質を必要とする対象に、疾患、それの症状又はその傾向の回復、軽減、緩和、治癒、改善または防止の目的で、それを投与することを指す。かかる対象は、任意の適切な診断結果に基づいてヘルスケアの専門家が同定することができる。
【００８９】
「有効量」という用語は、治療する対象に治療効果を与えるのに必要な活性化合物の量を指す。当業者が認識している通り、有効用量は、投与ルート、賦形剤の使用及び他の治療との併用の可能性に応じて変えられる。
【００９０】
略称:CD 28、分化抗原群28
【実施例】
【００９１】
本発明の範囲を制限すること意図するものではないが、例示的な機器、装置、方法及び本発明の実施形態によるそれらの関連した結果を以下に示す。表題又は副題は、読み手の便宜のために例として用いているものであり、本発明の範囲を決して限定するものではない点に留意されたい。さらに、ある種の理論は、本願明細書に提唱され開示されているが、それらが正しいかろうが間違っていようが、作用に関する如何なる特定の理論にもスキームにも関係なく、本発明が本発明によって実行される限り、本発明の範囲が限定されることはない。
【００９２】
免疫原性タンパク質調製:
免疫原性タンパク質は、大腸菌発現システムにおいて発現させた。それらは、抗原自体、又は抗原及びERリテンションシグナル(K3)をシュードモナスエキソトキシンAドメインIおよびIIのC末端(即ち、PE407)に融合させたPE407-(抗原)-K3融合タンパク質又は抗原、及びERリテンションシグナルをRAP1-CD28convPEt融合タンパク質のC末端に融合させたRAP1-CD28convPEt-(抗原)-K3融合タンパク質であってもよい(図1)。本願明細書において用いられる抗原は、E7抗原であり、生産した2つの融合タンパク質PE407-E7-K3(配列番号: 54)及びRAP1-CD28convPEt-E7-K3(配列番号: 55)を用いて以下の実験に使用した。
【００９３】
種々の免疫原組成物の免疫原性分析:
E7免疫原性タンパク質、E7抗原、PE407-E7-K3融合タンパク質又はRAP1-CD28convPEt-E7-K3融合タンパク質は、種々のアジュバント(例えばミョウバン、GPI-0100又はQS-21)と組み合わせて、それらの免疫原性をマウスにおいて試験した。全ての免疫原性タンパク質は、ミョウバン、GPI-0100又はQS-21との組み合わせの場合に、E7抗原特異的液性免疫反応を中程度の強度で誘発することができた。E7抗原特異的細胞性免疫反応に関して、E7抗原又はPE407-E7-K3融合タンパク質をGPI-0100又はQS-21と組み合わせた場合、強度が弱い反応が誘発された。一方、ミョウバン、GPI-0100及びQS-21と組み合わせた場合、RAP1-CD28convPEt-E7-K3融合タンパク質は、強度が中程度の細胞性免疫反応を誘発することができた。これらの結果から、GPI-0100及びQS-21が液性免疫反応及び細胞性免疫反応の両方を刺激するより良好なアジュバントであることが明らかになった。更に、PE407-E7-K3又はRAP1-CD28convPEt-E7-K3融合タンパク質は、サポニン系アジュバント(例えばGPI-0100又はQS-21)と組み合わせた場合にだけ、E7抗原より強い反応を誘発することができた。
【００９４】
T細胞性免疫反応に関する動物調査
5週齢の雌マウスC57BL/6をBioLASCO Taiwan Co., Ltdから購入した。ケージあたり5匹のマウスを12時間の昼間/12時間の夜間のサイクルとした。実験前に、食餌と水の摂取は自由にさせてマウスを1週間収容して標準条件下に維持した。実例で使用した免疫原性タンパク質は、TheVax Genetics Vaccine社によって生産された、凍結乾燥されたPE407-E7-K3(配列番号: 54)(各バイアルは0.6mgのタンパク質入り)とした。アジュバント:GPI-0100(Hawaii Biotech);MPL(カタログ番号699800P(Avanti));Poly I:C(カタログ番号tlrl-pic-5(InvivoGen));R837(カタログ番号tlrl-imqs(InvivoGen));R848(カタログ番号tlrl-r848(InvivoGen));CpG1826(カタログ番号tlrl-1826(InvivoGen));及び研究室グレードQS-21(TheVax)。
【００９５】
免疫化スケジュールは、図4に示す通りである。表1及び図5A-B、7A-Cに示すように、ワクチン製剤を用いて3週間のうち1週間に1回ワクチンをマウスに接種した。全てのマウスを最後の免疫化の7日後に屠殺して、脾臓を収集した。脾細胞を分離した。
【００９６】
アジュバント製剤
免疫原組成物の最善の免疫反応を調査するために、表1にリストしているアジュバント製剤を評価した。
【００９７】
【表１】
2018507860.tif 000003
【００９８】
CD8+細胞の細胞内-サイトカイン染色
脾細胞(2*107)を6ウェル平底組織培養プレートに撒いて、1μg/mlのHPV16-E7ペプチド(全長PEのアミノ酸49-57)並びに細胞中のサイトカインの蓄積をさせてサイトカイン生産細胞の検出感度を高めるブレフェルジンA及びモネンシンの有り無しで37℃、2時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を試験チューブに移して300xgで5分間遠心した。上清を廃棄して、プレートに短い時間振動を与えて、細胞を、0.2mg/サンプルのフルオレセインイソチオシアネート共役抗マウスCD8(クローン53-6.7、eBioscience)及び抗マウスCD３(クローン17A2、BioLegend)で30分間表面マーカーを染色した。細胞を、1mlの蛍光標示式細胞分取器(FACS)バッファー(PBS中での1%FBS)及びIC Fixation溶液(eBioscience)で洗浄して、1mlの透過化処理洗浄バッファー(BioLegend)への再懸濁後、暗所で30分間、氷上インキュベーションした。細胞を、Permwash(BD Pharmingen)で二回洗浄して、透過化処理染色バッファーで0.2mg/サンプルに希釈したアロフィコシアニン共役抗マウスIFN-γ(クローンXMG1.2、eBioscience)を用いて、暗所で30分間、氷上で細胞内IFN-γを染色した。細胞を、1mlのFACSバッファーに再懸濁して、FACS Caliburフローサイトメーターで分析した。
【００９９】
免疫原性アッセイにおいて、様々なワクチン製剤によって誘導される抗原特異的T細胞性免疫反応を、脾細胞におけるCD3+/CD8+/IFNγ+ T細胞の数を計量することによって評価した。図5Aは、様々なワクチン製剤で治療した動物グループ由来のCD3+ T細胞/2*107脾細胞におけるE7特異的CD8+/IFNγ+二重ポジティブのパーセントを示している。各グループ由来のデータを、PE407-E7-K3と50μg/用量のGPI-0100との組み合わせで治療した動物グループのデータと比較した(図5B)。データから、MPL又はCpG1826との組み合わせでのGPI-0100は、免疫原性タンパク質によって誘発されるT細胞性免疫反応を2-3倍増強できることが示された。
【０１００】
図7Aは、様々なワクチン製剤で治療した動物グループ由来のCD3+ T細胞/2*107脾細胞におけるE7特異的CD8+/IFNγ+二重ポジティブのパーセントを示している。各グループ由来のデータを、PE407-E7-K3とQS-21(10μg/用量;図7B)又はGPI-0100(100μg/用量;図7C)との組み合わせで治療した動物グループのデータと比較した。データから、MPL(10μg/用量)又はCpG1826(10μg/用量)との組み合わせでのQS-21は、単一アジュバントQS-21(10μg/用量)を単独で含むワクチン組成物と比較して、免疫原性タンパク質PE407-E7-K3によって誘発されるT細胞性免疫反応を3-4倍増強できることが示された(図7B)。加えて、組み合わせアジュバントQS-21及びMPL又はQS-21及びCpG1826を含むワクチン製剤によって誘発されたT細胞性免疫反応は、単一アジュバントGPI-0100(100μg/用量)を単独で含むワクチン製剤で治療した動物グループの8倍であった(図7C)。
【０１０１】
液性免疫調査
動物にワクチン接種を行って、血清サンプルを上記の通りに回収した。各回収時点での各動物由来の血清サンプルをブロッキングバッファーで10000倍希釈した。HPV16 E7特異的IgGのレベルは、ELISA方法(E7 pet32aを1μg/ウェルでコーティング)によって検出した。
【０１０２】
図6は、単一のTLRアゴニストアジュバントをワクチン組成物に用いた場合、少量の抗体しか誘導されなかったが、TLRアゴニストアジュバントをサポニン系アジュバントGPI-0100(50μg/用量)と共に用いた場合は、大量の抗体が第三免疫化後にマウスに誘発されたことを示している。
【０１０３】
図8は、単一のTLRアゴニストアジュバントをワクチン組成物に用いた場合、少量の抗体しか誘導されなかったが、TLRアゴニストアジュバントがサポニン系アジュバントQS-21(10μg/用量)と共に用いた場合は、第二免疫化の後、2つのアジュバントQS-21+MPL又はQS-21+CpG1826を含む製剤で治療した動物グループは、大量の抗体を生産した(データ不図示)ことを示している。全てのTLRアゴニストアジュバントとの組み合わせでのQS-21は、第三免疫化の後、大量の抗体を生産した。データから、QS-21又はGPI-0100とPoly I:Cとの組み合わせは、QS-21又はGPI-0100の効果を強化しないことが示された。これは、GPI-100又はQS-21がTLR3関連機構を介して作動する可能性を示唆するものである。イミダゾキノリン(imidazolquline)アジュバント(R837、R848)は、CpG1826と同じ経路によって作用するが、完全に異なるT細胞性免疫を示す。イミダゾキノリン(imidazolquline)がK細胞および/またはマクロファージ細胞によって作用するか否かは、調査中である。
【０１０４】
種々のプラットフォームの融合タンパク質によって誘発されるT細胞性免疫原反応
我々は、上記の通り発見した、アジュバントの最善の組み合わせを使用して、種々の免疫原性タンパク質PE407-E7-K3及びRAP1-CD28convPEt-E7-K3によって誘発されるT細胞性免疫原反応を試験し、図5Aにおいて説明したのと同じ免疫原性アッセイを実行した。5週齢のマウス57BL/6を、BioLASCO Taiwan Co., Ltdから購入した。免疫化スケジュールは、図4と同じである。表2は、調査において使用したワクチン製剤を示している。
【０１０５】
図9は、融合タンパク質PE407-E7-K3よりも、融合タンパク質RAP1-CD28convPEt-E7-K3のほうが強いT細胞性免疫反応を誘発したことを示している。しかしながら、いかなるタイプのアジュバントの組み合わせを用いたとしても、2つのプラットフォームは、T細胞性免疫反応と類似のパターンを誘発した。
【０１０６】
【表２】
2018507860.tif 000004
【０１０７】
TC-1腫瘍動物モデルの調査
ワクチン:100μgのPE407-E7-K3を、種々のアジュバント又はその組み合わせと共に調製する。
ワクチン製剤を図10Aに示している。TC-1細胞株(5*104細胞/マウス、s.c.)でのチャレンジの7日後に、マウスを7日ごとに合計3回免疫化した(図10B)。単一のアジュバントGPI-0100(100μg/用量)単独と比較して、組み合わせアジュバントQS-21(10μg/用量)及びMPL(10μg/用量)、QS-21(10μg/用量)及びCpG1826(10μg/用量)、GPI-0100(50μg/用量)及びMPL(50μg/用量)又はGPI-0100(50μg/用量)及びCpG1826(50μg/用量)は、TC-1腫瘍細胞の成長を効果的に阻害することができる結果が示された(図11)。
【０１０８】
表3は、様々な融合タンパク質の構成要素の配列番号を示している。
【０１０９】
表4は、動物におけるT細胞性免疫反応に対する効果について試験した融合タンパク質と抗原の配列を示している。
【０１１０】
【表３】
2018507860.tif 000005
2018507860.tif 000006
2018507860.tif 000007
*太字は、人工核外移行シグナルのアミノ酸配列を表す;下線文字は、小胞体リテンションシグナルのアミノ酸配列を表す。
**VP1-3Aペプチド(配列番号: 50)は、VP1のa.a. 127-a.a. 176及び3Aのa.a. 21-a.a. 35で構成された融合抗原;即ち、FMDV VP1ペプチド(配列番号: 48)とFMDV 3Aペプチド(配列番号: 49)との融合タンパク質である。
***FHNペプチド(配列番号: 53)は、融合タンパク質のa.a. 65-a.a. 82及びヘマグルチニン-ノイラミニダーゼのa.a. 101-a.a. 111で構成された融合抗原;即ち、NDV Fペプチド(配列番号: 51)とNDV HNペプチド(配列番号: 52)との融合タンパク質である
【０１１１】
【表４】
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【０１１２】
実施形態及び実施例は、本発明及びそれらの実用的な応用の原理を説明する目的で選択して記載しており、他の当業者が本発明及び各種実施形態を、予想される特定の用途に適している各種変更形態を伴って利用することができるようにしている。別の実施形態は、その趣旨及び範囲を逸脱しない範囲内で、関係する当業者にとって明らかにだろう。この明細書中で引用され議論されている全ての文献は、それらの全体が本願明細書に引用によって組み込まれており、各文献が引用によって個々に組み込まれているように引用している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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