(57)【要約】  アントラサイクリン誘導体薬物部分のヒドロキシメチルケトン部分がヒドラジドまたはヒドロキサメート部分に置換した、改善された安全性および細胞死滅効果を提供するアントラサイクリン誘導体薬物部分を有する抗体薬物コンジュゲートを開示する。開示される細胞毒性物質（すなわち薬物部分）はＣｙｓまたはＬｙｓ残基のいずれか一方を介して抗体に接合される。Ｌｙｓ接合について、大部分のＡＤＣのＤＡＲ（薬物抗体比）は２であるが、接合がＣｙｓ上で起こるとき、大部分のＡＤＣのＤＡＲは４である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2018507844.tif 000041
〔式中、
Ａｂは抗体であり；
Ｌ１はコネクターであり；
Ｌ２はアミノ酸、ペプチド、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−、ＰＡＢ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ、Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢおよびそれらの組合せから選択されるリンカーであり；
ここで、−Ｌ１−Ｌ２は
【化２】
2018507844.tif 000042
から成る群から選択され、
Ｄは式II：
【化３】
2018507844.tif 000043
（式中、
Ｚ＝Ｏ、ＮＨまたはＣＨ２であり；
Ｒ１＝Ｈ、ＯＨ、またはＯＭｅであり；そして
Ｒ２はＣ１〜Ｃ５アルキル基である）
の構造を有する薬物部分であり、
ｎは１〜１０の整数である〕
の構造を有する抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
式Ｉが
【化４】
2018507844.tif 000044
【化５】
2018507844.tif 000045
【化６】
2018507844.tif 000046
から成る群から選択される組成物である、請求項１に記載のＡＤＣ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、塩基性アントラサイクリンファーマコフォアにおいてヒドロキシメチルケトン部分をヒドラジドまたはヒドロキサメートに置換することにより、改善された安全性および細胞死滅効果を提供するアントラサイクリン誘導体活性物質（薬物部分）抗体コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。開示された修飾はＣｙｓまたはＬｙｓのいずれか一方を介して抗体に接合した細胞毒性物質を提供する。Ｌｙｓ接合体について、大部分のＡＤＣのＤＡＲ（薬物抗体比）は２であるが、接合がＣｙｓ上で起こるとき、大部分のコンジュゲートのＤＡＲは４である。
【背景技術】
【０００２】
抗体療法は、がん、免疫学的疾患および血管新生疾患の患者の、標的処置のために確立されている（Carter (2006) Nature Reviews Immunology 6:343-357）。細胞毒性物質または細胞増殖抑制物質、すなわちがんの処置において腫瘍細胞を死滅させるまたは抑制する薬物の局所送達のための抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、すなわち免疫コンジュゲートの使用は、腫瘍への薬物部分の送達、およびその中での細胞内蓄積を標的とするが、これらの非接合薬物の全身投与は、排除することが求められる腫瘍細胞だけでなく、正常細胞にも許容できないレベルの毒性をもたらし得る（Xie et al 2006 Expert. Opin. Biol. Ther. 6(3):281-291; Kovtun et al (2006) Cancer Res. 66(6):3214-3121; Law et al (2006) Cancer Res. 66(4):2328-2337; Wu et al (2005) Nature Biotech. 23(9):1137-1145; Lambert (2005) Current Opin. in Pharmacol. 5:543-549; Hamann (2005) Expert Opin. Ther. 15(9):1087-1103; Payne (2003) Cancer Cell 3:207-212; Trail et al (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614）。従って最小毒性での最大効果が求められる。ＡＤＣをデザインおよび改良する努力は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の選択性だけではなく、薬物作用機序、薬物結合、薬物／抗体比（量）および薬物放出特性にも焦点が当てられている（McDonagh (2006) Protein Eng. Design & Sel.; Doronina et al (2006) Bioconj. Chem. 17:114-124; Erickson et al (2006) Cancer Res. 66(8):1-8; Sanderson et al (2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852; Jeffrey et al (2005) J. Med. Chem. 48:1344-1358; Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070）。薬物部分は、チューブリン結合阻害、ＤＮＡ結合阻害またはトポイソメラーゼ阻害を含む機序により、それらの細胞毒性および細胞増殖抑制効果を与えることができる。いくつかの細胞毒性薬物は、大きな抗体またはタンパク質受容体リガンドに接合されたとき、不活性になるまたは活性が低下する傾向がある。アントラサイクリン類縁体であるドキソルビシン（アドリアマイシン）は、転写のためにＤＮＡをほどく酵素であるトポイソメラーゼIIの進行への介入および阻害により、ＤＮＡと相互作用すると考えられている。ドキソルビシンは複製のためにＤＮＡ鎖を壊した後にトポイソメラーゼII複合体を安定化させ、ＤＮＡ二重らせんが再度閉じることを阻止し、それにより複製の過程を停止させる。ドキソルビシンおよびダウノルビシン（ダウノマイシン）はプロトタイプ細胞毒性天然物アントラサイクリン化学療法薬である（Sessa et al.（2007）Cardiovasc. Toxicol. 7:75-79）。ダウノルビシンおよびドキソルビシンの免疫コンジュゲートおよびプロドラッグが調製および研究されている（Kratz et al. (2006) Current Med. Chem. 13:477-523; Jeffrey et al. (2006) Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362; Torgov et al. (2005) Bioconj. Chem. 16:717-721; Nagy et al.（2000）Proc. Natl. Acad. Sci. 97:829-834; Dubowchik et al. (2002) Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532; King et al. (2002) J. Med. Chem. 45:4336-4343; 米国特許第6,630,579号）。抗体−薬物コンジュゲートであるＢＲ９６−ドキソルビシンは腫瘍関連抗原であるＬｅｗｉｓ−Ｙと特異的に反応する（Tolcher et al. (1999) J. Clin. Oncology 17:478-484）。
【０００３】
ネモルビシンは、ドキソルビシンおよびイダルビシンのような、通常使用されるいくつかのアントラサイクリン類よりも強力な殺細胞特性を示す半合成アントラサイクリン誘導体である。その高い細胞毒性のため、それは現在、がんの処置について臨床評価中である。肝臓ミクロソームからのネモルビシンの主要代謝物であるＰＮＵ−１５９６８２は、ネモルビシンよりも著しく細胞毒性が高く、抗体標的がん処置のための理想的な活性物質である。
【０００４】
グリコシドアミノ基上の環化によって形成されるドキソルビシンおよびダウノルビシンのモルホリノ類縁体は、はるかに高い有効性を有する（Acton et al. (1984) J. Med. Chem. 638-645；米国特許第4,464,529号；第4,672,057号；および第5,304,687号）。ネモルビシンは、ドキソルビシンのグリコシドアミノ上に２−メトキシモルホリノ基を有するドキソルビシンの半合成類縁体である（Grandi et al. (1990) Cancer Treat. Rew. 17:133；Ripamonti et al. (1992) Brit. J. Cancer 65:703）。
【０００５】
ネモルビシンは、（８Ｓ，１０Ｓ）−６，８，１１−トリヒドロキシ−１０−（（２Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｓ）−５−ヒドロキシ−４−（（Ｓ）−２−メトキシモルホリノ）−６−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）−８−（２−ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−７，８，９，１０−テトラヒドロテトラセン−５，１２−ジオンと命名され、ＣＡＳ登録番号は１０８８５２−９０−０であり、そして以下の構造：
【化１】
2018507844.tif 000002
を有する。
【０００６】
ＰＮＵ（１５９６８２）を含む、肝臓ミクロソームからのネモルビシン（ＭＭＤＸ）の数種の代謝物が特徴付けられている（Quintieri et al. (2005) Clinical Cancer Research, 11(4):1608-1617; Beulz-Riche et al. (2001) Fundamental & Clinical Pharmacology, 15(6):373-378；欧州特許第0889898号；国際公開2014/082689号；および国際公開2004/082579号）。ＰＮＵ（１５９６８２）はインビトロでネモルビシンおよびドキソルビシンより細胞毒性が高く、インビボで腫瘍モデルに効果的であった。ＰＮＵ（１５９６８２）は３’−デアミノ−３’’，４’−アンヒドロ−［２’’（Ｓ）−メトキシ−３’’（Ｒ）−オキシ−４’’−モルホリニル］ドキソルビシンと命名され、そして以下の構造：
【化２】
2018507844.tif 000003
を有する。
【０００７】
従って当分野において、この構造について改善された効力特性を求めて、化合物をさらに合成する必要性が存在する。本発明は驚くほどに改善された効力特性を示す、一連の新規誘導体化合物を提供する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、式Ａ：
【化３】
2018507844.tif 000004
〔式中、
ＺはＯ、ＮＨまたはＣＨ２である〕
の構造を有する修飾三環性モルホリノアントラサイクリン誘導体である薬物部分に接合した抗体を含む、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。薬物部分は、塩基性アントラサイクリンファーマコフォアにおけるヒドロキシメチルケトンのヒドラジドまたはヒドロキサメートへの置換を用いて修飾される。開示された修飾は、ＣｙｓまたはＬｙｓのいずれか一方を介して抗体と接合する細胞毒性物質を提供する。Ｌｙｓ接合については、大部分のコンジュゲートのＤＡＲ（薬物抗体比）は２であるが、Ｃｙｓで接合が起こるとき、大部分のコンジュゲートのＤＡＲは４である。
【０００９】
本発明は式Ｉ：
【化４】
2018507844.tif 000005
〔式中、
Ａｂは抗体であり；
Ｌ１はコネクターであり；
Ｌ２はアミノ酸、ペプチド、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−、ｐ−アミノベンジル（ＰＡＢ）、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ、Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢおよびそれらの組合せから選択されるリンカーであり、
Ｄは式II：
【化５】
2018507844.tif 000006
（式中、
Ｚ＝Ｏ、ＮＨまたはＣＨ２であり、
Ｒ１＝Ｈ、ＯＨまたはＯＭｅであり、
Ｒ２はＣ１〜Ｃ５アルキル基である）
の構造を有する活性物質の薬物部分であり、そして
ｎは１〜１０の整数である〕
の構造を有する抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）または薬学的に許容されるその塩を提供する。
【００１０】
好ましくは、Ｃｙｓ接合について、−Ｌ１−Ｌ２は、
【化６】
2018507844.tif 000007
から成る群から選択される。
【００１１】
好ましくは、Ｌｙｓ接合について、−Ｌ１−Ｌ２は、
【化７】
2018507844.tif 000008
から成る群から選択される。
【００１２】
本発明はさらに、式Ｉ：
【化８】
2018507844.tif 000009
〔式中、
Ａｂは抗体であり、
Ｌ１はコネクターであり、
Ｌ２はアミノ酸、ペプチド、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−、ｐ−アミノベンジル（ＰＡＢ）、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ、Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢおよびそれらの組合せから成る群から選択されるリンカーであり、
Ｄは式II：
【化９】
2018507844.tif 000010
（式中、
Ｚ＝Ｏ、ＮＨまたはＣＨ２であり、
Ｒ１＝Ｈ、ＯＨ、またはＯＭｅであり、
Ｒ２はＣ１〜Ｃ５アルキル基である）
の構造を有する薬物部分であり、そして
ｎは１〜１０の整数である〕
の構造またはその薬学的に許容される塩を合成するための合成方法を提供する。好ましくは、Ａｂ−Ｌ１−Ｌ２は
【化１０】
2018507844.tif 000011
である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１はＮ８７異種移植モデルにおけるＡＤＣ２０（抗Ｈｅｒ２抗体）のインビボ有効性を示す。
【図２】図２は異種移植モデルにおけるＮ８７細胞におけるＡＤＣ２０（抗Ｈｅｒ２抗体）のインビボ安全性を示す。
【図３】図３はＮ８７異種移植モデルにおけるＡＤＣ３５（抗Ｈｅｒ２抗体）のインビボ有効性を示す。
【図４】図４はＮ８７異種移植モデルにおけるＡＤＣ３５（抗Ｈｅｒ２抗体）のインビボ安全性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
本発明は抗体上のＬｙｓまたは抗体上のＣｙｓへの接合について記載されている、以下に開示される抗体コンジュゲートの例を提供する。
【表１−１】
2018507844.tif 000012
【表１−２】
2018507844.tif 000013
【００１５】
【表２−１】
2018507844.tif 000014
【表２−２】
2018507844.tif 000015
【００１６】
【表３−１】
2018507844.tif 000016
【表３−２】
2018507844.tif 000017
【表３−３】
2018507844.tif 000018
【表３−４】
2018507844.tif 000019
Ａｂは好ましくはＩｇＧクラス抗体である。
【００１７】
定義
本明細書で使用される、一般的な有機分野の略語は以下のように定義する：
【表４】
2018507844.tif 000020
【表５】
2018507844.tif 000021
【００１８】
一般的方法−酸からの活性化エステル（例えばＮＨＳ）の形成
酸をＤＣＭに溶解し、必要ならば、溶解を助けるためにＤＭＦを添加した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１．５当量）、続いてＥＤＣ．ＨＣｌ（１．５当量）を添加した。酸の大部分が消費されるまで、反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応の進行をＲＰ−ＨＰＬＣにより観察した。混合物をその後ＤＣＭで希釈し、クエン酸（１０％水溶液）および飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を乾燥させ、濃縮乾固した。粗生成物を任意にＲＰ−ＨＰＬＣまたはシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。
【実施例１】
【００１９】
化合物２の調製
【化１１】
2018507844.tif 000022
化合物４１（７２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、ＤＩＥＡ（６０μＬ、０．３４ｍｍｏｌ）およびヒドロキシルアミン５８（４５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌し、その後ＤＣＭ（３０ｍＬ）で希釈した。混合物を飽和食塩水で洗浄した。有機層を乾燥させ、蒸発乾固させた。残渣をカラム（シリカゲル、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、９：１）により精製し、化合物２（４６ｍｇ、５０％）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  ９１７．４（Ｍ＋Ｈ）。
【実施例２】
【００２０】
化合物３の調製：
【化１２】
2018507844.tif 000023
化合物４１（７２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、ＤＩＥＡ（６０μＬ、０．３４ｍｍｏｌ）およびアミン４２（４２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１６時間撹拌し、その後蒸発させ、カラム（シリカゲル、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、９：１）により精製し、化合物３（７０ｍｇ、６８％）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  １０２９．４（Ｍ＋Ｈ）
【実施例３】
【００２１】
化合物４の調製
【化１３】
2018507844.tif 000024
化合物４１（７２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、ＤＩＥＡ（６０μＬ、０．３４ｍｍｏｌ）およびヒドラジド５９（４３ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌し、その後ＤＣＭ（３０ｍＬ）で希釈した。混合物を飽和食塩水で洗浄した。有機層を乾燥させ、蒸発乾固させた。残渣をカラム（シリカゲル、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、９：１）により精製し、化合物４（５６ｍｇ、６２％）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  ８９９．４（Ｍ＋Ｈ）。
【実施例４】
【００２２】
化合物５の調製
【化１４】
2018507844.tif 000025
化合物４１（７２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、ＤＩＥＡ（６０μＬ、０．３４ｍｍｏｌ）およびヒドラジド６０（５０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌し、その後ＤＣＭ（３０ｍＬ）で希釈した。混合物を飽和食塩水で洗浄した。有機層を乾燥させ、蒸発乾固させた。残渣をカラム（シリカゲル、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、９：１）により精製し、化合物５（４１ｍｇ、４４％）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  ９４２．５（Ｍ＋Ｈ）。
【実施例５】
【００２３】
化合物６の調製
【化１５】
2018507844.tif 000026
化合物４１（７２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、ＤＩＥＡ（６０μＬ、０．３４ｍｍｏｌ）およびヒドラジド６１（８７ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌し、その後ＤＣＭ（５０ｍＬ）で希釈した。混合物を飽和食塩水で洗浄した。有機層を乾燥させ、蒸発乾固させた。残渣をカラム（シリカゲル、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、９：１）により精製し、化合物６（４７ｍｇ、４０％）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  １１８６．５（Ｍ＋Ｈ）。
【実施例６】
【００２４】
化合物７の調製
【化１６】
2018507844.tif 000027
化合物４１（７２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、ＤＩＥＡ（６０μＬ、０．３４ｍｍｏｌ）およびヒドラジド６２（３０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌し、その後ＤＣＭ（４０ｍＬ）で希釈した。混合物を飽和食塩水で洗浄した。有機層を乾燥させ、蒸発乾固させた。残渣をカラム（シリカゲル、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、９：１）により精製し、化合物７（５７ｍｇ、５６％）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  １０１５．５（Ｍ＋Ｈ）。
【実施例７】
【００２５】
化合物８の調製
【化１７】
2018507844.tif 000028
化合物４１（７２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、ＤＩＥＡ（７５μＬ）およびアミン・ＴＦＡ６３（８６ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で３時間撹拌し、その後ＤＣＭ（４０ｍＬ）で希釈した。混合物を飽和食塩水で洗浄した。有機層を乾燥させ、蒸発乾固させた。残渣をカラム（シリカゲル、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、９：１）により精製し、化合物８（６３ｍｇ、５２％）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  １２１４．５（Ｍ＋Ｈ）。
【実施例８】
【００２６】
化合物９の調製：
【化１８】
2018507844.tif 000029
化合物４４（３．３ｍｇ、７．７μｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に、ＤＩＥＡ（２．６μＬ、１５μｍｏｌ）、ＰｙＢｒＯＰ（２．３ｍｇ、５μｍｏｌ）およびアミン４３（２．５ｍｇ、３μｍｏｌ）を添加した。混合物を１０分間撹拌し、その後カラム（シリカゲル、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、９５：５）により精製し、化合物９（６３ｍｇ、５２％）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  １２２８．３（Ｍ＋Ｈ）。
【実施例９】
【００２７】
化合物１０の調製
【化１９】
2018507844.tif 000030
化合物６４（１０ｍｇ、２３μｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に、ＤＩＥＡ（８μＬ、５０μｍｏｌ）、ＰｙＢｒＯＰ（７ｍｇ、１５μｍｏｌ）およびアミン４３（８ｍｇ、１０μｍｏｌ）を添加した。混合物を１０分間撹拌し、その後カラム（シリカゲル、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、９０：１０）により精製し、化合物１０（５．０ｍｇ、４２％）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  １２０２．３（Ｍ＋Ｈ）。
【実施例１０】
【００２８】
化合物１１の調製
【化２０】
2018507844.tif 000031
化合物４７の調製：
化合物４５（１７．７ｍｇ、２８μｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に、ＤＩＥＡ（５μＬ、５０μｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１１ｍｇ、２９μｍｏｌ）およびアミン４６（４８ｍｇ、２８μｍｏｌ）を添加した。混合物を３０分間撹拌し、その後１００μＬのピペリジンを添加した。１５分後、混合物を蒸発させ、ＨＰＬＣにより精製し、化合物４７（１８ｍｇ、３０％）を得た。
【００２９】
化合物１１の調製：
化合物４８（１３．６ｍｇ、４０μｍｏｌ）のＤＣＭ（２ｍＬ）溶液に、ＤＩＣ（２．５ｍｇ、２０μｍｏｌ）およびアミン４７（１８ｍｇ、９μｍｏｌ）を添加した。混合物を３０分間撹拌し、その後ＨＰＬＣにより精製し、化合物１１（９ｍｇ、４３％）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  ２２９６．８（Ｍ＋Ｈ）。
【実施例１１】
【００３０】
化合物１２の調製：
【化２１】
2018507844.tif 000032
化合物４５（４５ｍｇ、７２μｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に、ＤＩＥＡ（１３μＬ、８０μｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（２８ｍｇ、７４μｍｏｌ）およびアミン４９（３６ｍｇ、７２μｍｏｌ）を添加した。混合物を３０分間撹拌し、その後１００μＬのピペリジンを添加した。１５分後、混合物を蒸発させ、ＨＰＬＣにより精製し、化合物５０（１６ｍｇ、２５％）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  ８８９．４（Ｍ＋Ｈ）。
【００３１】
化合物４８（１３．６ｍｇ、４０μｍｏｌ）のＤＣＭ（２ｍＬ）溶液に、ＤＩＣ（２．５ｍｇ、２０μｍｏｌ）およびアミン５０（１６ｍｇ、１８μｍｏｌ）を添加した。混合物を３０分間撹拌し、その後ＨＰＬＣにより精製し、化合物１２（７ｍｇ、３２％）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  １２１２．３（Ｍ＋Ｈ）。
【実施例１２】
【００３２】
化合物１３の調製：
【化２２】
2018507844.tif 000033
化合物４５（４５ｍｇ、７２μｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に、ＤＩＥＡ（１３μＬ、８０μｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（２８ｍｇ、７４μｍｏｌ）およびアミン５１（４９ｍｇ、７２μｍｏｌ）を添加した。混合物を３０分間撹拌し、その後１００μＬのピペリジンを添加した。１５分後、混合物を蒸発させ、ＨＰＬＣにより精製し、化合物５２（２７ｍｇ、３５％）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  １０７４．４（Ｍ＋Ｈ）。
【００３３】
化合物５３（１５ｍｇ、４０μｍｏｌ）のＤＣＭ（２ｍＬ）溶液に、ＤＩＣ（２．５ｍｇ、２０μｍｏｌ）およびアミン５２（２１ｍｇ、２０μｍｏｌ）を添加した。混合物を３０分間撹拌し、その後ＨＰＬＣにより精製し、化合物１３（１３ｍｇ、４７％）を得た。
【実施例１３】
【００３４】
化合物１４の調製：
【化２３】
2018507844.tif 000034
化合物５０（１８ｍｇ、０．０２ｍｏｌ）のＤＣＭ（２ｍＬ）溶液に、化合物６５（１５ｍｇ）を添加し、続いてＤＩＥＡ（５μＬ）を添加した。混合物を室温で１０分間撹拌した。反応物をその後ＤＣＭ（３０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄した。有機層を濃縮し、残渣をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、凍結乾燥後、化合物１４（７ｍｇ、２９％）を赤色固体として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  １２３１．３（Ｍ＋Ｈ）。
【実施例１４】
【００３５】
化合物１５の調製：
【化２４】
2018507844.tif 000035
化合物５５（９ｍｇ、２０μｍｏｌ）のＤＣＭ（２ｍＬ）溶液に、ＰｙＢｒＯＰ（９ｍｇ、２０μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（８μＬ、８０μｍｏｌ）およびアミン５４（１５ｍｇ、２０μｍｏｌ）を添加した。混合物を３０分間撹拌し、その後蒸発させ、ＨＰＬＣにより精製し、化合物１５（９ｍｇ、３７％）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  １２５３．２（Ｍ＋Ｈ）。
【実施例１５】
【００３６】
化合物１６の調製：
【化２５】
2018507844.tif 000036
化合物５５（９ｍｇ、２０μｍｏｌ）のＤＣＭ（２ｍＬ）溶液に、ＰｙＢｒＯＰ（９ｍｇ、２０μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（８μＬ、８０μｍｏｌ）およびアミン５６（１５ｍｇ、２０μｍｏｌ）を添加した。混合物を３０分間撹拌し、その後蒸発させ、ＨＰＬＣにより精製し、化合物１６（８ｍｇ、３３％）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  １１９６．２（Ｍ＋Ｈ）。
【実施例１６】
【００３７】
化合物１７の調製
【化２６】
2018507844.tif 000037
化合物５７（１２ｍｇ、２０μｍｏｌ）のＤＣＭ（２ｍＬ）溶液に、ＰｙＢｒＯＰ（９ｍｇ、２０μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（８μＬ、８０μｍｏｌ）およびアミン５４（１５ｍｇ、２０μｍｏｌ）を添加した。混合物を３０分間撹拌し、その後蒸発させ、ＨＰＬＣにより精製し、化合物１７（１３ｍｇ、３３％）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  １４１９．３（Ｍ＋Ｈ）。
【実施例１７】
【００３８】
化合物１８の調製
【化２７】
2018507844.tif 000038
化合物４５（６３ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、化合物６６（７５ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＤＩＥＡ（７０μＬ）およびＨＡＴＵ（４０ｍｇ）を添加した。混合物を室温で５分間撹拌し、その後ＤＣＭ（５０ｍＬ）を添加した。混合物を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および飽和食塩水で洗浄した。有機層を乾燥させ、濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ：１／１９，ｖ／ｖ）により精製し、化合物６７（８１ｍｇ、６１％）を赤色固体として得た。
【００３９】
化合物６７（６６ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解した。ピペリジン（１００μＬ）を添加した。混合物を室温で３０分間撹拌し、その後減圧下で濃縮乾固した。残渣をＤＣＭ（３ｍＬ）に再溶解した。無水物６５（４２ｍｇ）、続いてＤＩＥＡ（１８μＬ）を添加した。３０分後、反応物を濃縮し、粗生成物をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、化合物１８（５２ｍｇ、７２％）を赤色固体として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  １４４４．５（Ｍ＋Ｈ）。
【実施例１８】
【００４０】
本実施例は、特定の細胞においてインビトロで測定した、指定した薬物接合抗体のＥＣ５０アッセイの結果を提供する。比較として、ＡＤＣ７０は抗Ｈｅｒ２抗体に接合した非修飾ＰＮＵ−１５９６８２（国際公開２０１０／０９９１２４Ａ２号）から合成した。本明細書に開示されるＡＤＣの多くは大幅に改善された安全特性を示し（ＡＤＣ２１〜２９、３１および３５）、そしていくつかのＡＤＣは改善された殺細胞有効性を示した（ＡＤＣ２６、３０、３１および３４）。
【表６】
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【化２８】
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【実施例１９】
【００４１】
本実施例は、Ｎ８７皮下異種移植モデルにおけるＡＤＣ２０（抗Ｈｅｒ２抗体コンジュゲート）のインビボ有効性を示す。図１は静脈内投与によりＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに投与されたコンジュゲート２０の単回投与を示す。各群に８匹のマウスが存在し、合計３群のマウスを試験した：１群のマウスはＴ−ＤＭ１（トラスツズマブ−ＤＭ１コンジュゲート）を注射され；１群のマウスはＡＤＣ２０を注射され；そして１群は溶媒対照群であった。全ての薬物は同一の方法（単回投与）で投与した。１ｍｇ／ｋｇでのＡＤＣ−２０静脈注射の単回投与は、２ｍｇ／ｋｇでのＴ−ＤＭ１より優れ、かつ５８日まで腫瘍増殖を完全に阻害した。
【実施例２０】
【００４２】
本実施例は、Ｎ８７皮下異種移植モデルにおけるＡＤＣ２０（抗Ｈｅｒ２抗体コンジュゲート）のインビボ安全性を示す。図２は静脈内投与によりＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに投与されたコンジュゲート２０の単回投与を示す。各群に８匹のマウスが存在し、合計３群のマウスを試験した：１群のマウスはＴ−ＤＭ１（トラスツズマブ−ＤＭ１コンジュゲート）を注射され；１群のマウスはＡＤＣ２０を注射され；そして１群は溶媒対照群であった。全ての薬物は同一の方法（単回投与）で投与した。１ｍｇ／ｋｇでのＡＤＣ−２０静脈注射の単回投与は、体重増加を遅らせず、かつＴ−ＤＭ１の体重増加と同等であった。
【実施例２１】
【００４３】
本実施例は、Ｎ８７皮下異種移植モデルにおけるＡＤＣ３５（抗Ｈｅｒ２抗体コンジュゲート）のインビボ有効性を示す。図３は静脈内投与によりＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに投与されたコンジュゲート３０の単回投与を示す。各群に８匹のマウスが存在し、合計３群のマウスを試験した：１群のマウスはＴ−ＤＭ１（トラスツズマブ−ＤＭ１コンジュゲート）を注射され；１群のマウスはＡＤＣ２０を注射され；そして１群は溶媒対照群であった。全ての薬物は同一の方法（単回投与）で投与した。１ｍｇ／ｋｇでのＡＤＣ−３５静脈注射の単回投与は、２ｍｇ／ｋｇでのＴ−ＤＭ１より優れ、かつ５８日まで腫瘍増殖を完全に阻害した。
【実施例２２】
【００４４】
本実施例は、Ｎ８７皮下異種移植モデルにおけるＡＤＣ３５（抗Ｈｅｒ２抗体コンジュゲート）のインビボ安全性を示す。図４は静脈内投与によりＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに投与されたコンジュゲート３０の単回投与を示す。各群に８匹のマウスが存在し、合計３群のマウスを試験した：１群のマウスはＴ−ＤＭ１（トラスツズマブ−ＤＭ１コンジュゲート）を注射され；１群のマウスはＡＤＣ２０を注射され；そして１群は溶媒対照群であった。全ての薬物は同一の方法（単回投与）で投与した。１ｍｇ／ｋｇでのＡＤＣ−３５静脈注射の単回投与は、体重増加を遅らせず、かつＴ−ＤＭ１の体重増加と同等であった。
【実施例２３】
【００４５】
本実施例は抗体薬物コンジュゲート１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５（上記表３）を合成するための一般的な接合方法を示す。０〜３０％の有機溶媒を含むｐＨ６．０〜９．０の緩衝液中の０．５〜５０ｍ／ｍＬ抗体溶液に、０．１〜１０当量の活性薬物リンカーコンジュゲート（２、または３、または４、または５、または６、または７、または８）を少しずつまたは連続流の方法で添加した。反応を０〜４０℃で０．５〜５０時間、穏やかに撹拌または振盪しながら実施し、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにより観察した。得られた粗ＡＤＣ生成物は最先端の方法を使用して、必要な脱塩、緩衝液の交換／配合、および任意に、精製の下流工程に付した。ＡＤＣ生成物はＨＩＣ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、および任意にＬＣ−ＭＳにより特徴付けた。
【実施例２４】
【００４６】
本実施例は抗体薬物コンジュゲート２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４および３５（上記表３）を合成するための一般的な接合方法を示す。ＰＢＳのようなｐＨ５．０〜９．０のある緩衝液中の０．５〜５０ｍｇ／ｍＬの抗体溶液に、０．５〜１００当量のＴＣＥＰおよびＤＴＴのような還元剤を添加した。還元を０〜４０℃で０．５〜４０時間、穏やかに撹拌または振盪しながら実施し、その後還元剤をカラムまたは限外ろ過によって除去した。ＤＭＡのような有機共溶媒を０〜３０％含む、ＰＢＳのようなｐＨ５．０〜９．０の、ある緩衝液中の０．５〜５０ｍｇ／ｍＬの還元された抗体に、０．５〜１０当量の（化合物９から選択される）薬物−リンカー反応剤を添加した。反応を０〜４０℃で０．５〜４０時間、穏やかに撹拌または振盪しながら実施し、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにより観察した。得られた粗ＡＤＣ生成物は最先端の方法を使用して、必要な下流の脱塩、緩衝液の交換／配合、および任意に、精製の下流工程に付した。最終ＡＤＣ生成物はＨＩＣ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、および任意にＬＣ−ＭＳにより特徴付けた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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