(57)【要約】Ｓ−アルキル化ヘプシジンペプチドならびにその作製及び使用方法が本明細書に開示されている。一部の実施形態では、本発明は、以下の構造式ＩＡまたはＩＢを有するＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドを対象とする。一部の実施形態では、本発明は、本発明における少なくとも１つのＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドを含む組成物を対象とする。一部の実施形態では、本発明は、フェロポルチンを結合させるかまたはフェロポルチンの内部移行及び分解を誘導する方法を対象とし、この方法はフェロポルチンを本発明における少なくとも１つのＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドと接触させることを含む。一部の実施形態では、本発明は少なくとも１つのＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドを含むキットを対象とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造式ＩＡまたはＩＢ：
【化１】
2018508466.tif 000049
を含むまたはそれからなる、Ｓ−アルキル化ヘプシジンペプチドであって、
式中、Ａ１は、Ａｓｐ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｄ−Ｇｌｕ、ピログルタメート、Ｄ−ピログルタメート、Ｇｌｎ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｄ−Ａｓｎ、またはこれらの代用として一般に使用されている、ｂｈＡｓｐ、Ｉｄａ、Ｉｄａ（ＮＨＰａｌ）、及びＮ−ＭｅＡｓｐ、好ましくはＩｄａ及びＮ−ＭｅＡｓｐ、などの非天然アミノ酸であり、
Ａ２は、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、またはこれらの代用として一般に使用されている、Ｔｌｅ、Ｉｎｐ、Ｃｈｇ、ｂｈＴｈｒ、及びＮ−ＭｅＴｈｒなどの非天然アミノ酸であり、
Ａ３は、Ｈｉｓ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｄ−Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、またはこれらの代用として一般に使用されている、Ｌ−Ｈｉｓ（π−Ｍｅ）、Ｄ−Ｈｉｓ（π−Ｍｅ）、Ｌ−Ｈｉｓ（τ−Ｍｅ）、またはＤ−Ｈｉｓ（τ−Ｍｅ）などの非天然アミノ酸であり、
Ａ４は、Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｄ−Ｔｙｒ、またはこれらの代用として一般に使用されている、Ｐｈｇ、ｂｈＰｈｅ、Ｄｐａ、Ｂｉｐ、１Ｎａｌ、２Ｎａｌ、ｂｈＤｐａ、Ａｍｃ、ＰｈｅＦ５、ｈＰｈｅ、Ｉｇｌ、またはシクロヘキシルアラニン、好ましくはＤｐａ、などの非天然アミノ酸であり、
Ａ５は、Ｐｒｏ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、またはこれらの代用として一般に使用されている、Ｏｉｃ、ｂｈＰｒｏ、ｔｒａｎｓ−４−ＰｈＰｒｏ、ｃｉｓ−４−ＰｈＰｒｏ、ｃｉｓ−５−ＰｈＰｒｏ、及びＩｄｃ、好ましくはｂｈＰｒｏ、などの非天然アミノ酸であり、
Ａ６は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、またはこれらの代用として一般に使用されている、Ｄ−Ｎω，ω−ジメチル−アルギニン、Ｌ−Ｎω，ω−ジメチル−アルギニン、Ｄ−ホモアルギニン、Ｌ−ホモアルギニン、Ｄ−ノルアルギニン、Ｌ−ノルアルギニン、シトルリン、修飾Ａｒｇ（ここで、グアニジニウム基は修飾されているかまたは置換されている）、ノルロイシン、ノルバリン、ｂｈＩｌｅ、Ａｃｈ、Ｎ−ＭｅＡｒｇ、及びＮ−ＭｅＩｌｅ、好ましくはＡｒｇ、などの非天然アミノ酸であり、
Ａ７は、Ｃｙｓ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、またはこれらの代用として一般に使用されている、Ｃｙｓ（Ｓ−ｔＢｕｔ）、ホモＣｙｓ、Ｐｅｎ、（Ｄ）Ｐｅｎ、好ましくはＳ−三級ブチル−システイン、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−Ｐａｌ）、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−システアミン−Ｐａｌ）、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−ＮＨＰａｌ）、及びＣｙｓ（Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ）などの非天然アミノ酸であり、
Ａ８は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、またはこれらの代用として一般に使用されている、Ｄ−Ｎω，ω−ジメチル−アルギニン、Ｌ−Ｎω，ω−ジメチル−アルギニン、Ｄ−ホモアルギニン、Ｌ−ホモアルギニン、Ｄ−ノルアルギニン、Ｌ−ノルアルギニン、シトルリン、修飾Ａｒｇ（ここで、グアニジニウム基は修飾されているかまたは置換されている）、ノルロイシン、ノルバリン、ｂｈＩｌｅ、Ａｃｈ、Ｎ−ＭｅＡｒｇ、及びＮ−ＭｅＩｌｅ、好ましくはＡｒｇ、などの非天然アミノ酸であり、
Ａ９は、Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｄ−Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｐｈｅ−Ｒａ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｒａ、Ｄｐａ−Ｒａ、Ｄ−Ｄｐａ−Ｒａ、Ｔｒｐ−Ｒａ、ｂｈＰｈｅ−Ｒａ、またはこれらの代用として一般に使用されており、かつＲａと結合していても結合していなくてもよい非天然アミノ酸、例えば、ＰｈｅＦ５、Ｎ−ＭｅＰｈｅ、ベンジルアミド、２−アミノインダン、ｂｈＰｈｅ、Ｄｐａ、Ｂｉｐ、１Ｎａｌ、２Ｎａｌ、ｂｈＤｐａ、及びシクロヘキシルアラニン、好ましくはｂｈＰｈｅ及びｂｈＰｈｅ−Ｒａであり（式中Ｒａは、ＰＥＧがＰＥＧ１１またはミニＰＥＧ３であるパルミトイル−ＰＥＧ−、ＰＥＧがＰＥＧ１１またはミニＰＥＧ３であるパルミトイル−ＰＥＧ−ＰＥＧ、ブタノイル（Ｃ４）−ＰＥＧ１１−、オクタノイル（Ｃ８、カプリル酸）−ＰＥＧ１１−、パルミトイル（Ｃ１６）−ＰＥＧ１１−、またはテトラコサノイル（Ｃ２４、リグノセリン酸）−ＰＥＧ１１−である）、
Ａ１０は、Ｃｙｓ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、またはＩｄａ、Ｉｄａ（ＮＨＰａｌ）Ａｈｘ、及びＩｄａ（ＮＢｚｌ２）Ａｈｘなどの非天然アミノ酸であり、
アミノ酸残基Ａ１〜Ａ１０のうちの少なくとも１つは構造式Ａ：
【化２】
2018508466.tif 000050
（Ａ）
を有し、
式中、ｎは１または２であり、Ｃｎ原子（複数可）に結合している水素の１つまたは複数は（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルで置換されていてもよく、
Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アシル、スルホニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、カルボキシル、及びカルバモイルからなる群から選択され、
前記カルボキシ末端アミノ酸はアミドまたはカルボキシの形態をとり、
Ａ１、Ａ１〜Ａ２、Ａ１０、またはこれらの組合せは任意選択で存在しない、前記Ｓ−アルキル化ヘプシジンペプチド。
【請求項２】
少なくとも１つのアミノ酸置換を伴う、配列番号１〜１０１から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなるＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドであって、前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、構造式
【化３】
2018508466.tif 000051
（Ａ）
を有し、
式中、ｎは１または２であり、Ｃｎ原子（複数可）に結合している水素の１つまたは複数は（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルで置換されていてもよく、
Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アシル、スルホニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、カルボキシル、及びカルバモイルからなる群から選択され、
前記カルボキシ末端アミノ酸はアミドまたはカルボキシ形態をとる、前記Ｓ−アルキル化ヘプシジンペプチド。
【請求項３】
構造式Ａを有する前記アミノ酸残基がＡ７である、請求項１に記載のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチド。
【請求項４】
Ａ１がＩｄａであり、Ａ２がＴｈｒであり、Ａ３がＨｉｓであり、Ａ４がＤｐａであり、Ａ５がｂｈＰｒｏであり、Ａ６がＡｒｇであり、Ａ８がＡｒｇであり、Ａ９がｂｈＰｈｅであり、Ａ１０がＡｈｘ−Ｉｄａ（ＮＨＰａｌ）である、請求項３に記載のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチド。
【請求項５】
構造式Ａを有する前記アミノ酸残基が、配列番号１〜１０１のチオール含有アミノ酸に対応している、請求項２に記載のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチド。
【請求項６】
Ｘ１及びＸ２がそれぞれ独立して、Ｈ、フェニル、
2018508466.tif 000052
、
2018508466.tif 000053
、
2018508466.tif 000054
、及び
2018508466.tif 000055
からなる群から選択される、請求項１から５のいずれか１項に記載のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチド
（式中、Ｒ１及びＲ１’はそれぞれ独立してＨ、メチル、（Ｃ２）アルキル、（Ｃ３）アルキル、（Ｃ４）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル、（Ｃ６）アルキル、（Ｃ７）アルキル、（Ｃ８）アルキル、（Ｃ９）アルキル、及び（Ｃ１０）アルキルからからなる群から選択され、
Ｒ２は、−ＮＲ１Ｒ１’、メチル、（Ｃ２）アルキル、（Ｃ３）アルキル、（Ｃ４）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル、（Ｃ６）アルキル、（Ｃ７）アルキル、（Ｃ８）アルキル、（Ｃ９）アルキル、及び（Ｃ１０）アルキルである）。
【請求項７】
Ｒ１及びＲ１’がそれぞれ独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、及びｔｅｒｔ−ブチルからなる群から選択される、請求項６に記載のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチド。
【請求項８】
Ｘ１及びＸ２がそれぞれ独立して、Ｈ、フェニル、
2018508466.tif 000056
、
2018508466.tif 000057
、
2018508466.tif 000058
、
2018508466.tif 000059
、
2018508466.tif 000060
、
2018508466.tif 000061
、及び
2018508466.tif 000062
からなる群から選択される、請求項１から５のいずれか１項に記載のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチド。
【請求項９】
Ｘ１及びＸ２が、（ａ）両方とも
2018508466.tif 000063
、（ｂ）両方とも
2018508466.tif 000064
、（ｃ）両方とも
2018508466.tif 000065
、（ｃ）それぞれＨ及び
2018508466.tif 000066
、（ｄ）それぞれフェニル及び
2018508466.tif 000067
、（ｅ）両方とも
2018508466.tif 000068
、または（ｆ）両方とも
2018508466.tif 000069
である、請求項１から５のいずれか１項に記載のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチド。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドを含む組成物。
【請求項１１】
フェロポルチンを結合するかまたはフェロポルチンの内部移行及び分解を誘導する方法であって、請求項１から９のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドまたは請求項１０に記載の組成物に前記フェロポルチンを接触させることを含む、前記方法。
【請求項１２】
対象の鉄代謝疾患を治療する方法であって、請求項１から９のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドまたは請求項１０に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１３】
前記鉄代謝疾患が鉄過剰疾患である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
試薬、デバイス、指示文書、またはこれらの組合せと共に梱包された、請求項１から９のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドまたは請求項１０に記載の組成物を含むキット。
【請求項１５】
フェロポルチンまたは抗体に結合している請求項１から９のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドを含む複合体。
【請求項１６】
治療を必要としている対象の鉄代謝疾患を治療するためのかつ／または鉄の量を低下させるための医薬製造用の、請求項１から９のいずれか１項に記載の１つまたは複数のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドまたは請求項１０に記載の組成物の使用。
【請求項１７】
治療を必要としている対象の鉄代謝疾患を治療するためにかつ／または鉄の量を低下させるために使用するための、請求項１から９のいずれか１項に記載の１つまたは複数のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドまたは請求項１０に記載の組成物。
【請求項１８】
治療を必要としている対象の鉄代謝疾患を治療するためのかつ／または鉄の量を低下させるための医薬製造用の、請求項１から９のいずれか１項に記載の１つまたは複数のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドまたは請求項１０に記載の組成物の使用であって、前記医薬が、単回の１日用量または分割された１日用量として、有効１日用量で投与されるように調製される、前記使用。
【請求項１９】
前記有効１日用量が約１０〜５００μｇ／ｋｇ／日であり、前記医薬が皮下注射用に処方される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記有効１日用量が約１０〜１０００μｇ／ｋｇ／日であり、前記医薬が経口、肺、または粘膜の投与用に処方される、請求項１８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１２月２９日出願の米国特許出願第６２／０９７，４２９号の利益を主張し、その開示内容全体が参照により本出願に組み込まれる。
【０００２】
政府支援の承認
本発明は国立衛生研究所によって授与されたＤＫ０９０５５４の下、政府支援を伴って行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
ＥＦＳ−ＷＥＢを介して提出された配列表への言及
２０１５年１２月２７日に作成され、本出願と共にＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出された、サイズ４１．７ｋｂの「２０１５１２２７＿０３４０４４＿１５５ＷＯ１＿ｓｅｑ＿ＳＴ２５」という名称の配列表のＡＳＣＩＩテキストファイルの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている。
【０００４】
本発明は、概して、Ｓ−アルキル化ヘプシジンペプチドならびにその作製及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
肝臓が生成するペプチドホルモンであるヘプシジンは、ヒト及び他の哺乳動物における鉄恒常性の制御因子である。ヘプシジンは、その受容体である鉄送出チャネルフェロポルチンに結合して内部移行及び分解を起こすことによって作用する。ヒトヘプシジンは、２５−アミノ酸ペプチド（Ｈｅｐ２５）である。Ｋｒａｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４８０：１４７−１５０、及びＰａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：７８０６−７８１０を参照。ヘプシジンの生理活性２５−アミノ酸形態の構造は、Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８４：２４１５５−６７に記載のように、４つのジスルフィド結合を形成する８つのシステインを有する単純なヘアピンである。Ｎ末端領域は鉄制御機能に必要であり、５つのＮ末端アミノ酸残基が欠失すると、鉄制御機能が失われることになる。Ｎｅｍｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｂｌｏｏｄ  １０７：３２８−３３を参照。
【０００６】
ヘプシジン活性の異常は、遺伝性ヘモクロマトーシス及び鉄負荷性貧血及び脊髄形成異常症を含めた鉄過剰疾患に関連している。遺伝性ヘモクロマトーシス（ＨＨ）は、主としてヘプシジン欠乏によって、ごくまれにヘプシジン耐性によって、引き起こされる遺伝性鉄過剰疾患である。この疾患は、食事からの過度な鉄吸収及び鉄過剰の発生をもたらす。ＨＨの臨床的所見には、肝疾患（肝硬変、肝細胞がん）、糖尿病及び心臓麻痺が含まれ得る。現状、ＨＨの唯一の治療は定期的な静脈切開であり、有効ではあるものの患者にとっては負担が大きい。
【０００７】
鉄負荷性貧血は、β−地中海貧血症などの、無効造血を有する遺伝性貧血であり、重度の鉄過剰を伴う。鉄過剰からの合併症はこれらの患者に関する罹患率及び死亡率の主原因である。ヘプシジン欠乏は、非輸血患者における鉄過剰の主原因であり、輸血患者における鉄過剰にも寄与する。これらの患者の鉄過剰のために現状存在する治療は鉄キレート化であるが、負担が大きく、効果がない場合及び頻繁な副作用を伴う場合もある。
【０００８】
ＷＯ２０１０／０６５８１５に開示されているミニヘプシジンペプチド及びＷＯ２０１３／０８６１４３に開示されている修飾ミニヘプシジンペプチドは、ヘプシジン活性を示し、鉄代謝の調節及び鉄代謝疾患の治療に使用することができる。これらのミニヘプシジンペプチドの多くは、例えばＡ７アミノ酸位置に、非保護の遊離システイン残基を含有する。残念ながら、遊離スルフヒドリル基（複数可）を含有及び／または放出するペプチド系療法は、（１）遊離チオール固有の反応性（Ｓ−アルキル化／酸化）に関連する安定性低下及び／または（２）皮膚科学的副作用（例えば、皮疹）を呈するために、問題をはらみ得る。
【発明の概要】
【０００９】
一部の実施形態では、本発明は、以下の構造式ＩＡまたはＩＢ：
【化１】
2018508466.tif 000002
を有するＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドを対象とし、
式中、Ａ１は、Ａｓｐ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｄ−Ｇｌｕ、ピログルタメート、Ｄ−ピログルタメート、Ｇｌｎ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｄ−Ａｓｎ、またはこれらの代用として一般に使用されている、ｂｈＡｓｐ、Ｉｄａ、Ｉｄａ（ＮＨＰａｌ）、及びＮ−ＭｅＡｓｐ、好ましくはＩｄａ及びＮ−ＭｅＡｓｐ、などの非天然アミノ酸であり、
Ａ２は、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、またはこれらの代用として一般に使用されている、Ｔｌｅ、Ｉｎｐ、Ｃｈｇ、ｂｈＴｈｒ、及びＮ−ＭｅＴｈｒなどの非天然アミノ酸であり、
Ａ３は、Ｈｉｓ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｄ−Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、またはこれらの代用として一般に使用されている、Ｌ−Ｈｉｓ（π−Ｍｅ）、Ｄ−Ｈｉｓ（π−Ｍｅ）、Ｌ−Ｈｉｓ（τ−Ｍｅ）、またはＤ−Ｈｉｓ（τ−Ｍｅ）などの非天然アミノ酸であり、
Ａ４は、Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｄ−Ｔｙｒ、またはこれらの代用として一般に使用されている、Ｐｈｇ、ｂｈＰｈｅ、Ｄｐａ、Ｂｉｐ、１Ｎａｌ、２Ｎａｌ、ｂｈＤｐａ、Ａｍｃ、ＰｈｅＦ５、ｈＰｈｅ、Ｉｇｌ、またはシクロヘキシルアラニン、好ましくはＤｐａ、などの非天然アミノ酸であり、
Ａ５は、Ｐｒｏ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、またはこれらの代用として一般に使用されている、Ｏｉｃ、ｂｈＰｒｏ、ｔｒａｎｓ−４−ＰｈＰｒｏ、ｃｉｓ−４−ＰｈＰｒｏ、ｃｉｓ−５−ＰｈＰｒｏ、及びＩｄｃ、好ましくはｂｈＰｒｏ、などの非天然アミノ酸であり、
Ａ６は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、またはこれらの代用として一般に使用されている、Ｄ−Ｎω，ω−ジメチル−アルギニン、Ｌ−Ｎω，ω−ジメチル−アルギニン、Ｄ−ホモアルギニン、Ｌ−ホモアルギニン、Ｄ−ノルアルギニン、Ｌ−ノルアルギニン、シトルリン、修飾Ａｒｇ（ここで、グアニジニウム基は修飾されているかまたは置換されている）、ノルロイシン、ノルバリン、ｂｈＩｌｅ、Ａｃｈ、Ｎ−ＭｅＡｒｇ、及びＮ−ＭｅＩｌｅ、好ましくはＡｒｇ、などの非天然アミノ酸であり、
Ａ７は、Ｃｙｓ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、またはこれらの代用として一般に使用されている、Ｃｙｓ（Ｓ−ｔＢｕｔ）、ホモＣｙｓ、Ｐｅｎ、（Ｄ）Ｐｅｎ、好ましくはＳ−三級ブチル−システイン、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−Ｐａｌ）、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−システアミン−Ｐａｌ）、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−ＮＨＰａｌ）、及びＣｙｓ（Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ）などの非天然アミノ酸であり、
Ａ８は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、またはこれらの代用として一般に使用されている、Ｄ−Ｎω，ω−ジメチル−アルギニン、Ｌ−Ｎω，ω−ジメチル−アルギニン、Ｄ−ホモアルギニン、Ｌ−ホモアルギニン、Ｄ−ノルアルギニン、Ｌ−ノルアルギニン、シトルリン、修飾Ａｒｇ（ここで、グアニジニウム基は修飾されているかまたは置換されている）、ノルロイシン、ノルバリン、ｂｈＩｌｅ、Ａｃｈ、Ｎ−ＭｅＡｒｇ、及びＮ−ＭｅＩｌｅ、好ましくはＡｒｇ、などの非天然アミノ酸であり、
Ａ９は、Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｄ−Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｐｈｅ−Ｒａ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｒａ、Ｄｐａ−Ｒａ、Ｄ−Ｄｐａ−Ｒａ、Ｔｒｐ−Ｒａ、ｂｈＰｈｅ−Ｒａ、またはこれらの代用として一般に使用されており、かつＲａと結合していても結合していなくてもよい非天然アミノ酸、例えば、ＰｈｅＦ５、Ｎ−ＭｅＰｈｅ、ベンジルアミド、２−アミノインダン、ｂｈＰｈｅ、Ｄｐａ、Ｂｉｐ、１Ｎａｌ、２Ｎａｌ、ｂｈＤｐａ、及びシクロヘキシルアラニン、好ましくはｂｈＰｈｅ及びｂｈＰｈｅ−Ｒａであり（式中Ｒａは、ＰＥＧがＰＥＧ１１またはミニＰＥＧ３であるパルミトイル−ＰＥＧ−、ＰＥＧがＰＥＧ１１またはミニＰＥＧ３であるパルミトイル−ＰＥＧ−ＰＥＧ、ブタノイル（Ｃ４）−ＰＥＧ１１−、オクタノイル（Ｃ８、カプリル酸）−ＰＥＧ１１−、パルミトイル（Ｃ１６）−ＰＥＧ１１−、またはテトラコサノイル（Ｃ２４、リグノセリン酸）−ＰＥＧ１１−である）、
Ａ１０は、Ｃｙｓ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、またはＩｄａ、Ｉｄａ（ＮＨＰａｌ）Ａｈｘ、及びＩｄａ（ＮＢｚｌ２）Ａｈｘなどの非天然アミノ酸であり、
アミノ酸残基Ａ１〜Ａ１０のうちの少なくとも１つは以下の構造式Ａ：
【化２】
2018508466.tif 000003
（Ａ）
を有し、
式中、ｎは１または２であり、Ｃｎ原子（複数可）に結合している水素の１つまたは複数は（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルで置換されていてもよく、
Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アシル、スルホニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、カルボキシル、及びカルバモイルからなる群から選択され、
カルボキシ末端アミノ酸は、アミドまたはカルボキシ形態をとり、
Ａ１、Ａ１〜Ａ２、Ａ１０、またはこれらの組合せは任意選択で存在しない。一部の実施形態では、Ｓ−アルキル化ヘプシジンペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸置換を伴う、配列番号１〜１０１から選択されるアミノ酸配列を有し、前記少なくとも１つのアミノ酸置換は、構造式Ａを有する。一部の実施形態では、構造式Ａを有するアミノ酸残基は、配列番号１〜１０１のチオール含有アミノ酸に対応している。一部の実施形態では、構造式Ａを有するアミノ酸残基は、Ａ７である。一部の実施形態では、Ａ１はＩｄａであり、Ａ２はＴｈｒであり、Ａ３はＨｉｓであり、Ａ４はＤｐａであり、Ａ５はｂｈＰｒｏであり、Ａ６はＡｒｇであり、Ａ８はＡｒｇであり、Ａ９はｂｈＰｈｅであり、Ａ１０はＡｈｘ−Ｉｄａ（ＮＨＰａｌ）である。一部の実施形態では、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立して、Ｈ、フェニル、
2018508466.tif 000004
、
2018508466.tif 000005
、
2018508466.tif 000006
、及び
2018508466.tif 000007
からなる群から選択される
（式中、Ｒ１及びＲ１’はそれぞれ独立して、Ｈ、メチル、（Ｃ２）アルキル、（Ｃ３）アルキル、（Ｃ４）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル、（Ｃ６）アルキル、（Ｃ７）アルキル、（Ｃ８）アルキル、（Ｃ９）アルキル、及び（Ｃ１０）アルキルからからなる群から選択され、
Ｒ２は、−ＮＲ１Ｒ１’、メチル、（Ｃ２）アルキル、（Ｃ３）アルキル、（Ｃ４）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル、（Ｃ６）アルキル、（Ｃ７）アルキル、（Ｃ８）アルキル、（Ｃ９）アルキル、及び（Ｃ１０）アルキルである）。一部の実施形態では、Ｒ１及びＲ１’はそれぞれ独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、及びｔｅｒｔ−ブチルからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立して、Ｈ、フェニル、
2018508466.tif 000008
、
2018508466.tif 000009
、
2018508466.tif 000010
、
2018508466.tif 000011
、
2018508466.tif 000012
、
2018508466.tif 000013
、及び
2018508466.tif 000014
からなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｘ１及びＸ２は、（ａ）両方とも
2018508466.tif 000015
、（ｂ）両方とも
2018508466.tif 000016
、（ｃ）両方とも
2018508466.tif 000017
、（ｃ）それぞれＨ及び
2018508466.tif 000018
、（ｄ）それぞれフェニル及び
2018508466.tif 000019
、（ｅ）両方とも
2018508466.tif 000020
、または（ｆ）両方とも
2018508466.tif 000021
である。
【００１０】
一部の実施形態では、本発明は、本発明における少なくとも１つのＳ−アルキル化ヘプシジンペプチド、例えば上の段落［０００９］で説明されているＳ−アルキル化ヘプシジンペプチド、を含む組成物を対象とする。
【００１１】
一部の実施形態では、本発明は、フェロポルチンを結合させるまたはフェロポルチンの内部移行及び分解を誘導する方法を対象とし、この方法はフェロポルチンを本発明における少なくとも１つのＳ−アルキル化ヘプシジンペプチド、例えば上の段落［０００９］で説明されているＳ−アルキル化ヘプシジンペプチド、またはその組成物と接触させることを含む。
【００１２】
一部の実施形態では、本発明は、試薬、デバイス、指示文書、またはこれらの組合せと共に梱包された、本発明における少なくとも１つのＳ−アルキル化ヘプシジンペプチド、例えば上の段落［０００９］で説明されているＳ−アルキル化ヘプシジンペプチド、またはその組成物を含むキットを対象とする。
【００１３】
一部の実施形態では、本発明は、本発明における少なくとも１つのＳ−アルキル化ヘプシジンペプチド、例えば上の段落［０００９］で説明されている、フェロポルチンまたは抗体に結合しているＳ−アルキル化ヘプシジンペプチド、を含む複合体を対象とする。
【００１４】
一部の実施形態では、本発明は、対象の鉄代謝疾患を治療する方法を対象とし、この方法は本発明における少なくとも１つのＳ−アルキル化ヘプシジンペプチド、例えば上の段落［０００９］で説明されているＳ−アルキル化ヘプシジンペプチド、またはその組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、鉄代謝疾患は鉄過剰疾患である。一部の実施形態では、本発明は、治療を必要としている対象の鉄代謝疾患を治療するためのかつ／または鉄の量を低下させるための医薬製造用の、本発明における１つまたは複数のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチド、例えば上の段落［０００９］で説明されているＳ−アルキル化ヘプシジンペプチド、またはその組成物の使用を対象とする。一部の実施形態では、本発明は、治療を必要としている対象の鉄代謝疾患を治療するためのかつ／または鉄の量を低下させるために使用するための、本発明における１つまたは複数のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチド、例えば上の段落［０００９］で説明されているＳ−アルキル化ヘプシジンペプチド、またはその組成物を対象とする。一部の実施形態では、本発明は、鉄代謝疾患を治療するためのかつ／または鉄の量を低下させるための医薬製造用の、本発明における１つまたは複数のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチド、例えば上の段落［０００９］で説明されているＳ−アルキル化ヘプシジンペプチド、またはその組成物の使用を対象とし、この医薬は、単回の１日用量または分割された１日用量として、有効１日用量で投与されるように調製される。一部の実施形態では、有効１日用量は約１０〜５００μｇ／ｋｇ／日であり、この医薬は皮下注射用に処方される。一部の実施形態では、有効１日用量は約１０〜１０００μｇ／ｋｇ／日であり、この医薬は経口、肺、または粘膜の投与用に処方される。一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。一部の実施形態では、対象はヒトである。
【００１５】
以上の概要及び以下の発明を実施するための形態は、いずれも例示的かつ説明的なものに過ぎず、特許請求の対象となる本発明についてのさらなる説明の提供を意図するものである。付属の図面は、本発明のさらなる理解をもたらすために含まれ、本明細書に組み込まれて本明細書の一部を構成し、本発明のいくつかの実施形態を例示し、そして発明を実施するための形態と共に本発明の原理を説明する役割を果たす。
【００１６】
本発明は、図面の参照によってさらに理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＰＲ７３を例に用いてヘプシジンペプチドのＳ−アルキル化合成スキームを概略的に示す図である。
【図２】Ｓ−誘導体化ＰＲ７３類似体の一般的構造を示す図である。上の行の構造は、下の構造（ＰＲ７３（配列番号９０））が示す円に囲まれた構造を置き換える構造である。
【図３Ａ】ＰＲ７３及びＰＲ７３ＳＨのインビトロ活性を比較するグラフである。フェロポルチン分解アッセイを用いてＰＲ７３及びＰＲ７３ＳＨ類似体について取得したインビトロ用量の反応曲線の代表例である。
【図３Ｂ】ＰＲ７３及びＰＲ７３ＳＨのインビボ活性を比較するグラフである。腹腔内注射による投与から６時間、２４時間及び４８時間後の時間ポイントにおけるＰＲ７３及びＰＲ７３ＳＨのインビボ活性を比較する棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書で使用される場合、「ヘプシジンペプチド」は、ＷＯ２０１０／０６５８１５に開示されているミニヘプシジンペプチド及びＷＯ２０１３／０８６１４３に開示されている修飾ミニヘプシジンペプチドを指す。本明細書で使用される場合、「チオール含有ヘプシジンペプチド」は、遊離チオール基（−ＳＨ）を含有するアミノ酸残基を有するヘプシジンペプチドを指す。チオール含有ヘプシジンペプチドには、ＷＯ２０１０／０６５８１５及びＷＯ２０１３／０８６１４３の構造式で説明されている、アミノ酸７位に非保護の遊離システイン残基を有するものが含まれる。ＷＯ２０１０／０６５８１５及びＷＯ２０１３／０８６１４３は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている。
【００１９】
本発明は、Ｓ−アルキル化ヘプシジンペプチドならびにその作製及び使用方法を提供する。本明細書で使用される場合、「Ｓ−アルキル化ヘプシジンペプチド」は、チオール含有ヘプシジンペプチドの遊離チオール基（−ＳＨ）の水素がＳ−アルキル化によって置換されているペプチドを指す。
【００２０】
本明細書に開示されているように、水性媒体中の対応する電子不足アルキン及び非保護の遊離システイン含有ペプチドから効率的に合成することができる１，２−二重置換ビニル−スルフィドを、保護部分として使用した。図１を参照。具体的には、Ｓ−アルキル化ヘプシジンペプチドＰＲ７３ＳＡ〜ＰＲ７３ＳＨを、代表的なチオール含有ヘプシジンペプチドとしての親ペプチドＰＲ７３から一段階反応で誘導した。ＰＲ７３は過去に記載された通りに合成した。Ｐｒｅｚａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  １２１，  ４８８０を参照。簡潔に述べると、ＰＲ７３は、ＣＥＭ  Ｌｉｂｅｒｔｙ自動マイクロ波ペプチドシンセサイザー（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．，  Ｍａｔｔｈｅｗｓ，  ＮＣ）を使用して固相法によって構築し、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学及び市販されているアミノ酸誘導体及び試薬（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ及びＣｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．，  Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ，  ＩＬ）を適用した。リンクアミド−ＭＢＨＡ樹脂（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を固体支持体として使用した。ペプチドを、修飾試薬Ｋ（ＴＦＡ  ９４％（ｖ／ｖ）；フェノール、２％（ｗ／ｖ）；水、２％（ｖ／ｖ）；ＴＩＳ、１％（ｖ／ｖ）；ＥＤＴ、１％（ｖ／ｖ）；２時間）を用いて樹脂から切断し、氷冷したジエチルエーテルの添加によって沈殿させた。ペプチドを分取逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって精製し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）及び分析的ＲＰ−ＨＰＬＣによってその純度を評価した。
【００２１】
ＰＲ７３をＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）（約２ｍｇ／ｍＬ）５０ｍＭを含有する水中８０％の１，４−ジオキサンに可溶化させ、次に所与の電子不足アルキンを添加した（２等量）。本明細書で例示のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチド及び、例示のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドの生成に用いられる所与の電子不足アルキンは、以下のものである：（１）ＰＲ７３ＳＡ（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルアセチレンジカルボキシレート）、（２）ＰＲ７３ＳＢ（ジエチルアセチレンジカルボキシレート）、（３）ＰＲ７３ＳＣ（ジメチルアセチレンジカルボキシレート）、（４）ＰＲ７３ＳＤ（アセチレンジカルボン酸）、（５）ＰＲ７３ＳＥ（２−フェニルエチレンスルホンアミド（ピフィスリン−μ））、（６）ＰＲ７３ＳＦ（１，２−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルスルホニル）アセチレン）、（７）ＰＲ７３ＳＧ（アセチレンジカルボキサミド）、及び（８）ＰＲ７３ＳＨ（ビス（ジエトキシホスホリル）アセチレン）。図２は、例示のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドの化学的構造を図示している。混合物を室温で２５分間勢いよく撹拌し、次に凍結乾燥した。取得した固体の残渣を分取逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって精製し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）及び分析的ＲＰ−ＨＰＬＣによってその純度を評価した。表１を参照。
【表１】
2018508466.tif 000022
【００２２】
Ｓ−アルキル化ヘプシジンペプチドは、過去に記載されたＦｐｎ分解に基づいた細胞アッセイを用いてインビトロで試験した。例えば、Ｎｅｍｅｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｂｌｏｏｄ  １０７：  ３２８を参照。簡潔に述べると、ドキシサイクリン誘発性プロモーターの制御下でヒトフェロポルチン−ＧＦＰコンストラクトで安定的にトランスフェクトされた細胞株ＨＥＫ２９３：ＴＲＥＸ−Ｆｐｎ−ＧＦＰを、ＦＡＣ  ２０μＭの存在下でポリ−Ｄ−リシン被覆プレート上に蒔いた。ドキシサイクリン５００ｎｇ／ｍＬの処理を２４時間行うことでＦｐｎ発現を誘発した。次に、ドキシサイクリンを洗い流し、細胞をペプチドで２４時間処理した。次に細胞をトリプシン処理し、１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させ、ＦＡＣＳｃａｎ（蛍光活性化細胞スキャナー）であるＡｎａｌｙｔｉｃ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）をＣｅｌｌＱｕｅｓｔバージョン３．３ソフトウェアと共に用いて、流動細胞計測法によって緑色蛍光の強度を分析した。ドキシサイクリンでＦｐｎ−ＧＦＰ発現誘発されない細胞を使用して、バックグラウンド蛍光を除外するゲートを確立した。ドキシサイクリンで誘発されるがいずれのペプチドでも処理されない細胞を陽性対照として使用した。各ペプチド処理を３〜６回独立して繰り返した。結果は、式１、（Ｆｘ−ＦＨｅｐ２５）／（Ｆ未処理−ＦＨｅｐ２５）（式中、Ｆはゲート処理された緑色蛍光であり、ｘはペプチドである）に従ったＨｅｐ２５活性の割合として表された。結果を表１に概括する。概して、Ｓ−アルキル化ヘプシジンペプチドは低いナノモル範囲で高い力価を示した。しかし、ＰＲ７３ＳＨは、親のＰＲ７３（ＥＣ５０＝４．２±０．３ｎＭ）より高い生理活性（ＥＣ５０＝１．１±０．１ｎＭ）を示した。興味深いことに、Ｓ−アルキル化ヘプシジンペプチドの化学合成が生理活性に際立った影響を及ぼすようには思われず、むしろ、最も嵩高い置換基がＨｅｐ２５と同じかまたはそれより良好なヘプシジン活性を有することから、全体的な立体障害が際立った役割を果たしている。カルボキシ−エステル−置換基（複数可）の順で、−ＣＨ３＜−Ｃ２Ｈ５＜−Ｃ４Ｈ９（ＰＲ７３ＳＣ＜ＰＲ７３ＳＢ＜ＰＲ７３ＳＡ）というように、活性が増大するに従って、疎水性も１つの役割を果たし得る。
【００２３】
加えて、ビニル置換基の幾何構造（平面対四面体）は、平面の類似体ＰＲ７３ＳＡが正方晶の対応物（ＰＲ７３ＳＦ）にかなり類似した力価を有するため、活性に際立って影響するようには思われない。残る正方晶の類似体ＰＲ７３ＳＨが最も高い活性を示すことと、３つの類似体全て（例えば、ＰＲ７３ＳＡ、ＰＲ７３ＳＦ及びＰＲ７３ＳＨ）が同じ数の置換基（複数可）−炭素原子（２×４＝８）を有し化学的にかなり類似しているという事実とを考慮すると、最も小型（ＰＲ７３ＳＦ）の置換基から最も嵩高い（ＰＲ７３ＳＨ）置換基にかけて活性が増大していることからしても、Ｓ−付着部分によって占有される全体容積／スペースはやはり重要な因子であると思われる。このことに矛盾なく、最も親水性で最も嵩の小さい置換基を有するＰＲ７３ＳＤは最も低い力価（ＥＣ５０＝２１８．１±１３．４ｎＭ）を示している。
【００２４】
インビトロの結果に基づき、動物実験に好適な候補としてＰＲ７３ＳＨを選択し、過去に記載された内容に従って実験を実施した。Ｐｒｅｚａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １２１：４８８０；Ｒａｍｏｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｂｌｏｏｄ  １２０：３８２９；及びＮｅｍｅｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｂｌｏｏｄ  １０７：３２８を参照。動物実験は、ＵＣＬＡのＡｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を受けた。簡潔に述べると、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＭＥ）から入手し、ＮＩＨ３１げっ歯類用食餌（鉄含量３３６ｍｇ／ｋｇ；Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＡ）で飼育した。ＰＢＳ  １００μＬ（対照）またはＰＢＳ  １００μＬ中ペプチド５０ｎモルもしくは１００ｎモルのいずれかをマウスの腹腔内に注入した。６、２４、及び４８時間後にマウスを屠殺し、心臓穿刺によって血液を収集し、Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，  ＮＪ）を用いて血清を分離した。測定毎に血清５０μＬが使用されるようにマイクロプレート型式を修正した比色定量アッセイ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ＣＴ）を用いて血清鉄を測定した。Ｎｅｍｅｔｈ、ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１３（９）：  １２７１−１２７６を参照。ＰＢＳ注入マウスの血清鉄レベルの平均値と比較するときは、結果を血清鉄のパーセンテージ減少として表した。
【００２５】
３つの時点（６時間、２４時間、及び４８時間）での血清鉄レベルをアッセイすること及び、ＰＲ７３が強力な生理活性（５０〜１００ｎモル／マウス）を発揮するのに十分であることが先に示された濃度をアッセイすることによって、ＰＲ７３ＳＨ及びＰＲ７３のインビボ活性を比較した。ＰＲ７３ＳＨ活性は親のＰＲ７３の活性プロフィールに類似しており、６時間及び２４時間の時点では血清鉄の減少が観察されたが、４８時間時点では減少が観察されなかった（図３Ｂ）。インビボ実験及びインビトロ実験のいずれにおいても、ＰＲ７３とＰＲ７３ＳＨとの間に際立った活性差は観察されなかったため、Ｓ−アルキル化ヘプシジンペプチドは、対象の鉄過剰疾患などの鉄代謝疾患に使用され得る。
【００２６】
従って、一部の実施形態では、本発明によるＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドは、構造式Ｉに記されている角括弧で囲まれた構造を有するＳ−アルキル化システイン残基を含む：
【化３】
2018508466.tif 000023
（Ｉ）
式中、ｎは１または２であり、Ｃｎ原子（複数可）に結合している水素のうちの１つまたは複数が（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルで置換されていてもよく、ＡＡは角括弧で囲まれたＳ−アルキル化システイン残基（角括弧内）の側面に位置するアミノ酸残基を表し、同じであっても異なっていてもよいＸ１及びＸ２は、式
2018508466.tif 000024
を有する電子不足アルキンのＸ１及びＸ２基である）。一部の実施形態では、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アシル、スルホニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、カルボキシル、及びカルバモイルからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立して、Ｈ、フェニル、
2018508466.tif 000025
、
2018508466.tif 000026
、
2018508466.tif 000027
、及び
2018508466.tif 000028
からなる群から選択される（式中、Ｒ１及びＲ１’はそれぞれ独立して、Ｈ、メチル、（Ｃ２）アルキル、（Ｃ３）アルキル、（Ｃ４）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル、（Ｃ６）アルキル、（Ｃ７）アルキル、（Ｃ８）アルキル、（Ｃ９）アルキル、及び（Ｃ１０）アルキルからからなる群から選択され、Ｒ２は、−ＮＲ１Ｒ１’、メチル、（Ｃ２）アルキル、（Ｃ３）アルキル、（Ｃ４）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル、（Ｃ６）アルキル、（Ｃ７）アルキル、（Ｃ８）アルキル、（Ｃ９）アルキル、または（Ｃ１０）アルキルである）。一部の実施形態では、Ｒ１及びＲ１’はそれぞれ独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、及びｔｅｒｔ−ブチルからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｓ−アルキル化システイン残基は、ＷＯ２０１０／０６５８１５及びＷＯ２０１３／０８６１４３の構造式に対応してアミノ酸７位にある。
【００２７】
一部の実施形態では、本発明によるＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドは、以下の構造式ＩＡまたはＩＢ：
【化４】
2018508466.tif 000029
を有し、
式中、Ａ１は、Ａｓｐ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｄ−Ｇｌｕ、ピログルタメート、Ｄ−ピログルタメート、Ｇｌｎ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｄ−Ａｓｎ、またはこれらの代用として一般に使用されている、ｂｈＡｓｐ、Ｉｄａ、Ｉｄａ（ＮＨＰａｌ）、及びＮ−ＭｅＡｓｐ、好ましくはＩｄａ及びＮ−ＭｅＡｓｐ、などの非天然アミノ酸であり、
Ａ２は、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、またはこれらの代用として一般に使用されている、Ｔｌｅ、Ｉｎｐ、Ｃｈｇ、ｂｈＴｈｒ、及びＮ−ＭｅＴｈｒなどの非天然アミノ酸であり、
Ａ３は、Ｈｉｓ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｄ−Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、またはこれらの代用として一般に使用されている、Ｌ−Ｈｉｓ（π−Ｍｅ）、Ｄ−Ｈｉｓ（π−Ｍｅ）、Ｌ−Ｈｉｓ（τ−Ｍｅ）、またはＤ−Ｈｉｓ（τ−Ｍｅ）などの非天然アミノ酸であり、
Ａ４は、Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｄ−Ｔｙｒ、またはこれらの代用として一般に使用されている、Ｐｈｇ、ｂｈＰｈｅ、Ｄｐａ、Ｂｉｐ、１Ｎａｌ、２Ｎａｌ、ｂｈＤｐａ、Ａｍｃ、ＰｈｅＦ５、ｈＰｈｅ、Ｉｇｌ、またはシクロヘキシルアラニン、好ましくはＤｐａ、などの非天然アミノ酸であり、
Ａ５は、Ｐｒｏ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、またはこれらの代用として一般に使用されている、Ｏｉｃ、ｂｈＰｒｏ、ｔｒａｎｓ−４−ＰｈＰｒｏ、ｃｉｓ−４−ＰｈＰｒｏ、ｃｉｓ−５−ＰｈＰｒｏ、及びＩｄｃ、好ましくはｂｈＰｒｏ、などの非天然アミノ酸であり、
Ａ６は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、またはこれらの代用として一般に使用されている、Ｄ−Ｎω，ω−ジメチル−アルギニン、Ｌ−Ｎω，ω−ジメチル−アルギニン、Ｄ−ホモアルギニン、Ｌ−ホモアルギニン、Ｄ−ノルアルギニン、Ｌ−ノルアルギニン、シトルリン、修飾Ａｒｇ（ここで、グアニジニウム基は修飾されているかまたは置換されている）、ノルロイシン、ノルバリン、ｂｈＩｌｅ、Ａｃｈ、Ｎ−ＭｅＡｒｇ、及びＮ−ＭｅＩｌｅ、好ましくはＡｒｇ、などの非天然アミノ酸であり、
Ａ７は、Ｃｙｓ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、またはこれらの代用として一般に使用されている、Ｃｙｓ（Ｓ−ｔＢｕｔ）、ホモＣｙｓ、Ｐｅｎ、（Ｄ）Ｐｅｎ、好ましくはＳ−三級ブチル−システイン、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−Ｐａｌ）、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−システアミン−Ｐａｌ）、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−ＮＨＰａｌ）、及びＣｙｓ（Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ）などの非天然アミノ酸であり、
Ａ８は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、またはこれらの代用として一般に使用されている、Ｄ−Ｎω，ω−ジメチル−アルギニン、Ｌ−Ｎω，ω−ジメチル−アルギニン、Ｄ−ホモアルギニン、Ｌ−ホモアルギニン、Ｄ−ノルアルギニン、Ｌ−ノルアルギニン、シトルリン、修飾Ａｒｇ（ここで、グアニジニウム基は修飾されているかまたは置換されている）、ノルロイシン、ノルバリン、ｂｈＩｌｅ、Ａｃｈ、Ｎ−ＭｅＡｒｇ、及びＮ−ＭｅＩｌｅ、好ましくはＡｒｇ、などの非天然アミノ酸であり、
Ａ９は、Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｄ−Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｐｈｅ−Ｒａ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｒａ、Ｄｐａ−Ｒａ、Ｄ−Ｄｐａ−Ｒａ、Ｔｒｐ−Ｒａ、ｂｈＰｈｅ−Ｒａ、またはこれらの代用として一般に使用されており、かつＲａと結合していても結合していなくてもよい非天然アミノ酸、例えば、ＰｈｅＦ５、Ｎ−ＭｅＰｈｅ、ベンジルアミド、２−アミノインダン、ｂｈＰｈｅ、Ｄｐａ、Ｂｉｐ、１Ｎａｌ、２Ｎａｌ、ｂｈＤｐａ、及びシクロヘキシルアラニン、好ましくはｂｈＰｈｅ及びｂｈＰｈｅ−Ｒａであり（式中Ｒａは、ＰＥＧがＰＥＧ１１またはミニＰＥＧ３であるパルミトイル−ＰＥＧ−、ＰＥＧがＰＥＧ１１またはミニＰＥＧ３であるパルミトイル−ＰＥＧ−ＰＥＧ、ブタノイル（Ｃ４）−ＰＥＧ１１−、オクタノイル（Ｃ８、カプリル酸）−ＰＥＧ１１−、パルミトイル（Ｃ１６）−ＰＥＧ１１−、またはテトラコサノイル（Ｃ２４、リグノセリン酸）−ＰＥＧ１１−である）、
Ａ１０は、Ｃｙｓ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、またはＩｄａ、Ｉｄａ（ＮＨＰａｌ）Ａｈｘ、及びＩｄａ（ＮＢｚｌ２）Ａｈｘなどの非天然アミノ酸であり、
アミノ酸残基Ａ１〜Ａ１０のうちの少なくとも１つは以下の構造式Ａ：
【化５】
2018508466.tif 000030
（Ａ）
を有し、
式中、ｎは１または２であり、Ｃｎ原子（複数可）に結合している水素の１つまたは複数は（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルで置換されていてもよく、
Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アシル、スルホニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、カルボキシル、及びカルバモイルからなる群から選択され、
カルボキシ末端アミノ酸は、アミドまたはカルボキシの形態をとり、
Ａ１、Ａ１〜Ａ２、Ａ１０、またはこれらの組合せは任意選択で存在しない。一部の実施形態では、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立して、Ｈ、フェニル、
2018508466.tif 000031
、
2018508466.tif 000032
、
2018508466.tif 000033
、及び
2018508466.tif 000034
からなる群から選択される
（式中、Ｒ１及びＲ１’はそれぞれ独立して、Ｈ、メチル、（Ｃ２）アルキル、（Ｃ３）アルキル、（Ｃ４）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル、（Ｃ６）アルキル、（Ｃ７）アルキル、（Ｃ８）アルキル、（Ｃ９）アルキル、及び（Ｃ１０）アルキルからからなる群から選択され、
Ｒ２は、−ＮＲ１Ｒ１’、メチル、（Ｃ２）アルキル、（Ｃ３）アルキル、（Ｃ４）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル、（Ｃ６）アルキル、（Ｃ７）アルキル、（Ｃ８）アルキル、（Ｃ９）アルキル、または（Ｃ１０）アルキルである）。一部の実施形態では、Ｒ１及びＲ１’はそれぞれ独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、及びｔｅｒｔ−ブチルからなる群から選択される。一部の実施形態では、構造式Ａを有するアミノ酸残基は、Ａ７である。
【００２８】
本明細書で示される場合、「Ｃｎ原子（複数可）」は本明細書の構造式Ｉ及びＡの挿入句における炭素原子（複数可）を指す。従って、「Ｃｎ原子（複数可）に結合している１つまたは複数の水素は、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルで置換されていてもよい」構造式Ａの一例は、
【化６】
2018508466.tif 000035
ｎが１でありかついずれの水素もメチルで置き換えられている場合である。
【００２９】
一部の実施形態では、本発明によるＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドは、上に示した構造式Ａを有する残基に置換されている少なくとも１つのアミノ酸残基を有するヘプシジンペプチドであり、このヘプシジンペプチドは表２、表３及び表４から選択される。
【００３０】
一部の実施形態では、構造式Ａを有する残基に置換されている、表２、表３、または表４のヘプシジンペプチドのアミノ酸残基は、アミノ酸７位における残基である。一部の実施形態では、構造式Ａを有する残基に置換されている、表２、表３、または表４のヘプシジンペプチドのアミノ酸残基は、アミノ酸残基を含有するチオールである。
【００３１】
本明細書で言及されている非共通及び非天然アミノ酸を、表５に示す。
【表２−１】
2018508466.tif 000036
【表２−２】
2018508466.tif 000037
【表２−３】
2018508466.tif 000038
【表２−４】
2018508466.tif 000039
【表２−５】
2018508466.tif 000040
【表３−１】
2018508466.tif 000041
【表３−２】
2018508466.tif 000042
【表４−１】
2018508466.tif 000043
【表４−２】
2018508466.tif 000044
【表４−３】
2018508466.tif 000045
【表５−１】
2018508466.tif 000046
【表５−２】
2018508466.tif 000047
【００３２】
本明細書で示される場合、結合は「−」などの線、または符号「
2018508466.tif 000048
」によって表される。線及び符号は、結合が２つの分子のサブユニット間の付着点であることを表す。本明細書で使用される場合、「（Ｃｎ〜Ｃｍ）」の使用は、示されている炭化水素が有し得る炭素原子の範囲を示す。例えば、用語「（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル」は、１〜６個の炭素原子の直鎖状または分枝状の炭化水素を指し、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等が含まれる。同様に、「（Ｃｎ）」の使用は、示されている炭化水素が含有する炭素原子の数を示す。
【００３３】
「アルキル」は、メチル（Ｍｅ）エチル（Ｅｔ）プロピル（Ｐｒ）イソプロピル（ｉ−Ｐｒ）ブチル（ｎ−Ｂｕ）イソブチル（ｉ−Ｂｕ）ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）（ｓｅｃ−Ｂｕ）エテニル、ペンテニル、ブテニル、プロペニル、エチニル、ブチニル、プロピニル、ペンチニル、ヘキシニルなどの、飽和及び／または不飽和炭素原子及び水素原子の直鎖または分枝鎖の一価ラジカルを指し、非置換（すなわち、炭素と水素のみを含有）であっても以下に定義される１つまたは複数の置換基で置換されていてもよい。本明細書で使用される場合、用語「（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル」は１〜６個の炭素原子の直鎖状または分枝状の炭化水素を指し、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、などが含まれる。（Ｃ１〜Ｃ６）基は、任意選択で、以下に定義される１つまたは複数の置換基で置換されていてもよい。本明細書で使用される場合、用語「（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル」は１〜３個の炭素原子の直鎖状または分枝状の炭化水素を指し、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルなどが含まれる。（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル基は、任意選択で、以下に定義される１つまたは複数の置換基で置換されていてもよい。
【００３４】
「アルコキシ」は−ＯＲラジカルを指し、及び式中、Ｒは直鎖または分枝鎖のアルキル基である。例示的なアルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ペントキシなどが挙げられる。「（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ」は、１〜６個の炭素原子を含有する直鎖または分枝鎖のアルコキシ基を指し、「（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシ」は１〜３個の炭素原子を含有する直鎖または分子鎖のアルコキシ基を指す。
【００３５】
「アルコキシカルボニル」は−Ｃ（Ｏ）ＯＲラジカルを指し、式中、Ｒはアルキル基である。
【００３６】
「シクロアルキル」は、非芳香族で一価の、３〜１４の炭素環原子を含む単環式、二環式、または三環式ラジカルを指し、各々は飽和であっても不飽和であってもよく、非置換であっても以下に定義される１つまたは複数の好適な置換基で置換されていてもよく、それ自身が非置換であっても１つまたは複数の置換基で置換されていてもよい１つまたは複数のヘテロシクロアルキル基、アリール基、またはヘテロアリール基と融合していてもよい。用語「（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル」は、３〜８の炭素原子を含有する炭化水素環、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、またはシクロヘキシルを意味する。可能な場合、シクロアルキル基は、例えば３−シクロヘキセン−１−イルのように二重結合を含有することができる。シクロアルキル環は、非置換であってもよく、または任意選択で、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ６）チオアルコキシ、ヒドロキシ、チオール、ハロ、ホルミル、カルボキシル、アミノ、アミノアルキル、−ＣＯ２（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、アリール、及びヘテロアリールから選択される１つまたは複数の置換基で置換されていてもよい。
【００３７】
「アリール」は、５〜１２個の炭素原子を有する環式または多環式の芳香環を指し、アリールは、非置換であっても以下に定義される１つまたは複数の好適な置換基で置換されていてもよく、それ自身が非置換であっても１つまたは複数の好適な置換基で置換されていてもよい１つまたは複数のシクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、またはヘテロアリール基と融合していてもよい。
【００３８】
「ヘテロアリール」は、芳香族で一価の、窒素、酸素、及び硫黄から選択される１〜５個のヘテロ原子を含めた４〜１８個の環員を含む、単環式、二環式、または三環式ラジカルを指し、非置換であっても以下に定義される１つまたは複数の好適な置換基で置換されていてもよく、それ自身が非置換であっても１つまたは複数の好適な置換基で置換されていてもよい１つまたは複数のシクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、またはアリール基と融合していてもよい。
【００３９】
「ヘテロシクロアルキル」は、非芳香族で一価の、窒素、酸素、及び硫黄から選択される１〜５個のヘテロ原子を含めた３〜１８個の環員を含む、飽和または不飽和の単環式、二環式、または三環式ラジカルを指し、このラジカルは非置換であるかまたは以下に定義される１つまたは複数の好適な置換基で置換され、それ自身が非置換であっても１つまたは複数の好適な置換基で置換されていてもよい１つまたは複数のシクロアルキル基、アリール基、またはヘテロアリール基と融合していてもよい。
【００４０】
「アシル」は−Ｃ（Ｏ）−Ｒラジカルを指し、式中、Ｒは以下に定義される好適な置換基である。
【００４１】
「スルホニル」は−ＳＯ２Ｒラジカルを指し、式中、Ｒは以下に定義される好適な置換基である。
【００４２】
「アルキルスルホニル」は−ＳＯ２Ｒラジカルを指し、式中、Ｒはアルキル基である。
【００４３】
「アルキルアミノ」は１つ（すなわち、−ＮＨＲ）または同じであっても異なっていてもよい２つ（すなわち、−ＮＲＲ’）の（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基に置換されているアミノ部分を指す。このようなアルキルアミノ基の例として、アミノメチル、ジメチルアミノ、アミノメチルエチル、アミノメチルプロピルなどが挙げられる。
【００４４】
「アルキルアミノカルボニル」は−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲラジカルを指し、式中、Ｒはアルキル基である。
【００４５】
「ジアルキルアミノカルボニル」は−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’ラジカルを指し、式中、各Ｒは同じアルキル基であっても異なるアルキル基であってもよい。
【００４６】
「カルボキシル」は、−Ｃ（Ｏ）ＯＨラジカルを指す。
【００４７】
「カルバモイル基」は、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２ラジカルを指す。
【００４８】
概して、式における変数の種々の部分または官能基は、１つまたは複数の好適な「置換基」によって「任意選択で置換されて」いてもよい。用語「置換基」または「好適な置換基」は、例えば定期試験などを通して、当業者によって認識され得るまたは選択され得る任意の好適な置換基を指す。一部の実施形態では、置換基はＮ、Ｏ、Ｓｉ、Ｐ、またはＳである。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「鉄代謝疾患」には鉄代謝の異常が直接的に引き起こす疾患、または血中鉄レベルが調節不全となったことで引き起こされる疾患、または鉄の調節不全が別の疾患の結果である場合の疾患、または鉄レベルを調節することによって治療され得る疾患などが含まれる。より具体的には、本開示による鉄代謝疾患には、鉄過剰疾患、鉄欠乏障害、鉄体内分布障害、鉄代謝による他の障害及び鉄代謝に潜在的に関連する他の障害などが含まれる。鉄代謝疾患には、以下のものが含まれる：血色素症、ＨＦＥ変異血色素症、フェロポルチン変異血色素症、トランスフェリン受容体２変異血色素症、ヘモジュベリン変異血色素症、ヘプシジン変異血色素症、若年性血色素症、新生児血色素症、ヘプシジン欠乏、輸血性鉄過剰、地中海貧血症、地中海貧血症中間型、アルファ地中海貧血症、鉄芽球性貧血、真性多血症、脊髄形成異常症候群、ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、アフリカ鉄過剰、高フェリチン血症、セルロプラスミン欠乏、無トランスフェリン血症、先天性赤血球産生異常性貧血、慢性疾患による貧血、炎症による貧血、感染による貧血、低色素性小球性貧血、鉄欠乏性貧血、鉄難治性鉄欠乏性貧血、慢性腎疾患による貧血、エリトロポエチン耐性、肥満症による鉄欠乏、その他の貧血、ヘプシジンを過剰生成するかまたはその過剰生成を誘発する良性または悪性の腫瘍、ヘプシジン過剰状態、フリードライヒ運動失調症、ｇｒａｃｉｌｅ症候群、ハレルフォルデン・スパッツ病、ウィルソン病、肺血鉄症、肝細胞癌、がん、肝炎、肝硬変、異味症、慢性腎不全、インスリン抵抗性、糖尿病、粥状動脈硬化、神経変性障害、多発性硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病及びアルツハイマー病。本明細書で使用される場合、「鉄過剰疾患」及び「鉄過剰の疾患」は、かかっている対象が治療しない場合に異常に高いレベルの鉄をもたらすかまたは引き起こし得る疾患及び障害を指す。
【００５０】
場合によっては、「鉄代謝疾患」の定義に含まれている疾患及び障害は、鉄に関連するものとして通常は識別されていないものもある。例えば、マウスのすい臓においてヘプシジンが高度に発現されることは、糖尿病（Ｉ型またはＩＩ型）、インスリン抵抗性、グルコース不耐性、及び他の障害が、根底にある鉄代謝障害を治療することによって回復する可能性があることを示唆している。参照によって本明細書に組み込まれている、Ｉｌｙｉｎ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ５４２  ２２−２６を参照。そのため、これらの疾患も広範な定義の下で包含されている。当業者は、当技術分野で公知の方法（参照によって本明細書に組み込まれているＷＯ２００４０９２４０５のアッセイならびに、参照によって本明細書に組み込まれている米国特許Ｎｏ．７，５３４，７６４に記載されているようなヘプシジン、ヘモジュベリン、または鉄レベル及び発現を監視する当技術分野で公知のアッセイを含めて）を使用して、所与の疾患が本発明による「疾患あるいは鉄代謝」であるかを容易に判定することができる。本発明の一部の実施形態では、鉄代謝疾患は、遺伝性血色素症、鉄負荷性貧血、アルコール肝疾患及び慢性Ｃ型肝炎を含めた鉄過剰疾患である。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「ヘプシジン活性」を有する化合物は、化合物が対象（例えば、マウスまたはヒト）に用量依存的または時間依存的方法で投与（例えば、非経口的注入または経口投与で）されるときに、この化合物が対象の血漿鉄濃度を低下させる能力を有することを意味する。例えば、Ｒｉｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５），  Ｂｌｏｏｄ  １０６：２１９６−９における実証を参照。
【００５２】
一部の実施形態では、本発明のペプチドは、Ｎｅｍｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｂｌｏｏｄ  １０７：３２８−３３で教示されているように、フェロポルチンを発現する細胞株でフェロポルチンの内部移行及び分解をもたらす能力によって、アッセイされるようなインビトロの活性を有する。インビトロ活性は、Ｎｅｍｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｂｌｏｏｄ  １０７：３２８−３３にあるような、緑色蛍光タンパク質と融合したフェロポルチンを示すように操作した細胞における蛍光の用量依存損失によって測定することができる。細胞のアリコートを、段階的濃度のＨｅｐ２５の参照調製物または試験対象のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドで２４時間インキュベートする。本明細書で示される場合、ＥＣ５０値は、参照Ｈｅｐ２５調製物によって産生される蛍光最大損失の５０％を引き出す所与の化合物（例えば、ペプチド）の濃度として提供される。このアッセイにおけるＨｅｐ２５調製物のＥＣ５０は５〜１５ｎＭの範囲であり、いくつかの好ましいＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドはインビトロアッセイにおいて約１，０００ｎＭ以下のＥＣ５０値を有する。
【００５３】
当技術分野で公知の他の方法も、本発明によるヘプシジン活性及びペプチドのインビトロ活性の計算に使用され得る。例えば、化合物のインビトロ活性は、細胞のフェロポルチンを内部移行させる能力によって測定することができ、その能力は、フェロポルチンの細胞外エピトープを認識する抗体を用いた免疫組織化学またはフローサイトメトリーによって決定される。別法として、化合物のインビトロ活性は、Ｎｅｍｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｂｌｏｏｄ  １０７：３２８−３３にあるように、鉄の放射性同位体または安定同位体で前処置されたフェロポルチン発現細胞から鉄の発散を阻害する用量依存の能力によって測定することができる。
【００５４】
本発明による１つまたは複数のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドは、単独で、あるいは１つもしくは複数のミニヘプシジン及び／または１つもしくは複数の修飾ミニヘプシジンとの組合せで、ヒトなどの対象における鉄過剰を治療（例えば、抑制及び／または低減）するために投与することができる。従って、本発明によるＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドは、鉄過剰障害、例えばベータ地中海貧血症及び遺伝性血色素症を、対象の鉄過剰を抑制及び／または低減することによって治療するための医薬及び治療で使用することができる。一部の実施形態では、少なくとも１つのＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドは、鉄過剰の症状が観察されるかつ／または鉄過剰障害を有すると診断される前、最中、後、またはこれらの組合せで、対象に投与される。
【００５５】
一部の実施形態では、１つまたは複数のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドは、単独で、あるいは１つまたは複数のミニヘプシジン及び／もしくは修飾されたミニヘプシジンとの組合せで、使用目的に好適な担体を含む組成物の形態で、提供される。この組成物は、使用目的に好適な１つまたは複数の追加の成分も含めることができる。例えばアッセイ用に、この組成物はリポソーム、ニクロサミド、ＳＬ２２０可溶化剤（ＮＯＦ，  Ｊａｐａｎ）、ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（Ｓｉｇｍａ）、エタノール、及びＤＭＳＯを含んでもよい。鉄過剰疾患の治療については、組成物は異なる吸収促進剤及びプロテアーゼ抑制薬、（キトサン及びヒドロゲルなどの）ペプチドカプセル化用固体微粒子またはナノ粒子、高分子結合、脂肪化及び他の化学修飾を含むことができる。
【００５６】
本発明は、１つまたは複数のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドを、単独で、または１つもしくは複数のミニヘプシジン、１つもしくは複数の修飾ミニヘプシジン、及び／または本発明の組成物との組合せで、試薬、デバイス、指示文書、またはこれらの組合せと共に梱包したキットも提供する。例えば、キットは、アッセイを行うために使用する試薬、薬物、及び鉄代謝障害を診断、治療、または監視するための組成物、アッセイ対象の試料を得るためのデバイス、試薬を混合してアッセイを行うためのデバイス、などを含めることができる。
【００５７】
本発明のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドがヘプシジン活性を呈するので、すなわち、フェロポルチン分解のアゴニストとして作用するので、１つまたは複数のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドを、単独で、または１つもしくは複数のミニヘプシジン及び／もしくは修飾ミニヘプシジンとの組合せで、鉄過剰疾患を治療するために使用することができる。例えば、１つまたは複数のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドは、単独で、または１つもしくは複数のミニヘプシジン及び／もしくは修飾ミニヘプシジンとの組合せで、静脈切開術が禁忌であり鉄キレート化剤が治療の主力であるもののしばしば耐容性が低い場合の鉄負荷性貧血（特にβ−地中海貧血症）における鉄過剰に関連する症状及び／または病態を改善するために対象に投与することができる。１つまたは複数のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドは、単独で、または１つもしくは複数のミニヘプシジン及び／もしくは修飾ミニヘプシジンとの組合せで、特に維持静脈切開術に耐えられない対象の遺伝性血色素症を治療するために使用することができる。１つまたは複数のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドは、単独で、または１つもしくは複数のミニヘプシジン及び／もしくは修飾ミニヘプシジンとの組合せで、急性鉄毒性を治療するために使用することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドを、単独で、または１つもしくは複数のミニヘプシジン及び／もしくは修飾ミニヘプシジンとの組合せで用いる治療は、静脈切開術またはキレート化と組み合わせることができる。
【００５８】
１つまたは複数のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドは、単独で、または１つもしくは複数のミニヘプシジン及び／もしくは修飾ミニヘプシジンとの組合せで、対象に、好ましくはヒトなどの哺乳動物に投与することができる。一部の実施形態では、対象への投与は、対象が鉄レベルの増加及び／または異常に高レベルの鉄を呈する前、最中、及び／または後に行う。一部の実施形態では、治療対象は、高レベルの鉄を有するリスクがありかつ／または鉄過剰疾患にかかる遺伝的体質を有する対象である。一部の実施形態では、このペプチドは医薬組成物の形態で投与される。一部の実施形態では、このペプチドは治療有効量で投与される。本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、プラセボなどの対照との比較で、所与の鉄代謝疾患の症状及び／または病態を改善する量である。
【００５９】
治療有効量は、当技術分野で公知の標準的な方法によって容易に決定することができる。投与される投薬量は、疾患の臨床的重症度、対象の年齢及び体重、または鉄に対する対象の曝露に応じて、当業者によって決定することができる。一部の実施形態では、Ｓ−アルキル化ヘプシジンペプチドの治療有効量は、非経口的製剤用で約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１〜約３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１〜約２ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約１ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１〜約０．５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。一部の実施形態では、経口投与用の治療有効量は約１０倍以下であり得る。さらに、本発明のペプチドまたは組成物を用いた対象の治療には、単回の治療が含まれ得て、あるいは、好ましくは一連の治療も含まれ得る。実際の投薬量が、特定のペプチドまたは組成物、特定の製剤、投与様式、ならびに治療を受けている特定の部位、受容者、及び疾患に応じて変わることになることは理解されよう。治療に使用される有効な投薬量が、特定の治療の経過にわたって増加または減少し得ることも理解されよう。所与の条件に対する最適な投薬量は、従来の投薬量決定試験を用いて所与のペプチドまたは組成物の実験データを考慮しながら当業者によって確認することができる。当技術分野で公知の標準的診断アッセイによって、投薬量の変更が生じ明白となり得る。一部の条件では、長期的投与が必要とされ得る。
【００６０】
本発明の医薬組成物は、所望の投与様式に適切な剤形単位に調製することができる。本発明の組成物は経口、直腸、経鼻、局所（頬側及び舌下を含む）、膣及び非経口（皮下、筋肉内、静脈内及び皮内を含む）を含めた任意の好適な経路によって治療用に投与することができる。経口、局所、経鼻、肺、経皮横断（機械的またはエネルギー手段によって皮膚を切断）、直腸、頬側、腟、移植リザーバ経由、または非経口を含めた、様々な投与経路を本発明に従って使用することができる。非経口には、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、関節内、滑液内、胸骨内の、鞘内の、肝臓内、病巣内及び頭蓋内注入または注射手法、ならびに限局性療法の注入用材料（ポリマーを含む）が含まれる。一部の実施形態では、投与経路は皮下である。一部の実施形態では、組成物は密封された滅菌ガラスバイアル中にある。一部の実施形態では、組成物は保存剤を含有する。医薬組成物は、混合散剤、錠剤、液体、ゲル、凍結乾燥などとして処方することができ、投与用にさらに処理することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ．  ２０ｔｈ  ｅｄ．  （２０００）  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ．  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  ＭＤ、及び続版を参照。
【００６１】
好ましい経路は、レシピエントの状態及び年齢、治療対象となる状態の性質、選ばれたペプチド及び組成物によって変わることになることは理解されよう。本発明の医薬組成物は、本明細書で開示されている少なくとも1つのペプチドの治療有効量、及び不活性であり得る、薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という語は、薬学的投与に適合性でかつ当技術分野で公知の任意及び全ての溶媒、分散媒、増量剤、コーティング、抗細菌性及び抗真菌性剤、保存剤、等張及び吸収遅延剤などを含むことが意図されている。任意の従来の媒体または薬剤は、活性化合物と不適合である場合を除き、組成物における使用が見込まれている。
【００６２】
追加の化合物も組成物に組み込むことができる。追加の化合物としては、ニクロサミド、リポソーム、ＳＬ２２０可溶化剤（ＮＯＦ，  Ｊａｐａｎ）、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ  （Ｓｉｇｍａ）、エタノール及びＤＭＳＯが挙げられる。
【００６３】
本発明のペプチド及び組成物の毒性及び治療効果は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順、例えば、ＬＤ５０の判定（個体群の５０％に対する致死的用量）及びＥＤ５０の判定（個体群の５０％に治療有効な用量）、によって判定することができる。有毒と治療効果との間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表すことができる。大きい治療指数を示すペプチドが好ましい。有毒な副作用を呈するペプチドを使用してもよいが、感染していない細胞に対する潜在的損傷を最小化し、それによって副作用を低減するために、患部がこのようなペプチドの標的となる送達系を設計することに注意を払うべきである。
【００６４】
細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投薬量範囲を処方するのに使用することができる。本発明のペプチドの投薬量は、毒性がわずかであるか全くないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内であることが好ましい。投薬量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じてこの範囲内で変動し得る。本発明の方法で用いられる任意のペプチドに関する治療有効用量は、まず細胞培養アッセイから推定することができる。動物モデルにおける用量は、細胞培養で決定されたＩＣ５０（すなわち、最大半量の症状抑制を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように処方することができる。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーまたは質量分析法によって測定することができる。
【００６５】
血漿鉄の結果的な減少は、有毒な非トランスフェリン結合鉄（ＮＴＢＩ）のレベルを低減し、鉄過剰が許容されない心臓及び内分泌器からの鉄の流動を促進し得る。従って、一部の実施形態では、ＮＴＢＩレベルを低減しかつ／または心臓及び内分泌器から他の器官及び組織へ鉄の流動を促進させるために、１つまたは複数のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドを対象に投与することができる。一部の実施形態では、ヒト対象の確立された鉄過剰における１つまたは複数のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドを用いた有効な治療には、１日当たり１用量超、肝臓鉄に有益な効果が認められる前の延長治療が含まれてもよく、または静脈切開術もしくはキレート化による鉄除去と組み合わせてもよい。
【００６６】
米国食品医薬品局の投薬調整ガイドラインによれば、マウスとヒトとの間の代謝速度の差に対し、体表面積への用量を正規化するＫｍ因子に基づく変換が必要である（Ｒｅａｇａｎ−Ｓｈａｗ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２２（３）：６５９−６６１）。ヒト等価用量（ＨＥＤ）は、ＨＥＤ＝動物用量（ｍｇ／ｋｇ）×（動物Ｋｍ／ヒトＫｍ）によって推定することができる（マウス及び成人ヒトのＫｍは、それぞれ３及び３７である）。従って、本発明によれば、Ｓ−アルキル化ヘプシジンペプチドのヒトの皮下用量は、最大約５０〜１００μｇ／ｋｇ／日、約７５〜１２５μｇ／ｋｇ／日、または約９０〜１１０μｇ／ｋｇ／日、好ましくは約１００μｇ／ｋｇ／日であり得る（この用量は、最も広く使用されているペプチド薬である皮下インスリン、これは２型糖尿病において０．７５Ｕ／ｋｇ／日または３３μｇ／ｋｇ／日で一般に使用されているが、この皮下インスリンの基本用量中央値の約３倍であり、容易に投与可能なペプチド量である（Ｒｏｓｅｎｓｔｏｃｋ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２４（４）：６３１−６３６））。もちろん、より低い用量、加えてより高い用量であっても、特定のミニヘプシジン、投与形態、製剤、対象、及び鉄過剰の程度に応じて、対象に投与することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドの治療有効量は、約１０〜５００μｇ／ｋｇ／日の範囲である。繰り返しになるが、より低い用量、加えてより高い用量であっても、特定のミニヘプシジン、投与形態、製剤、対象、及び鉄過剰の程度に応じて、対象に投与することができる。
【００６７】
本明細書で示される場合、本発明によるＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドは、遺伝的欠陥が原因で危険な状態にある対象、またはすでに鉄瀉出治療を受けたがキレート化または瀉血療法に耐えられない対象の鉄過剰を抑制、低減、または治療するために使用することができる。本発明によるＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドは、β−地中海貧血症メジャー型を有する対象及び／またはヘプシジンレベルが正常よりは高いが鉄過剰の程度に適切なレベルよりは低い対象ならびに特定の対象を治療するために使われることができる。例えば、本発明による１つまたは複数のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドは、食物由来の鉄の過吸収に苦しんでいるが正常レベルの鉄を有する対象の鉄の量を低下させ過吸収を相殺するための治療に使用することができる。本発明による１つまたは複数のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドは、無効造血を治療して対象の貧血症を改善するために使用することができる。
【００６８】
本発明によるＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドは比較的サイズが小さいため、Ｓ−アルキル化ヘプシジンペプチドを適切に処方して経口投与用に最適化するか、あるいは、吸入、経皮的送達、または粘膜、経鼻、または頬側送達などの、インスリン投与で用いられているような他の非侵襲的手段（Ｒｏａｃｈ  Ｐ．  （２００８）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ４７（９）：５９５−６１０）による投与用に最適化することができる。
【００６９】
ＰＲ７３ＳＨは、ＤＭＳＯ（１０ｍＭ溶液）中の化合物を室温で３０日間、長期保管したところ、非常に限られたレベルでの分解またはスルフィド酸化を示すにとどまった（９９．５±０．５％安定性、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ実験により判定）ため、穏やかな酸化条件において著しく安定性であると思われる。従って、本発明は１つまたは複数のＳ−アルキル化ヘプシジンペプチドを含む貯蔵安定性の組成物も提供する。
【００７０】
節の見出しは編成上の目的で使用されているに過ぎず、記載されている主題を定義または制限すると解釈すべきではない。明示的にそうではないと示されない限り、単語の単数形には複数形も含まれる。本明細書で使用される場合、文脈による明確な別段の定めがない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には複数の指示対象が含まれる。本明細書で使用される場合、「及び／または」は「及び」または「または」を意味する。例えば、「Ａ及び／またはＢ」は「Ａ、Ｂ、またはＡ及びＢ両方」を意味し、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」は「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはこれらの組合せ」を意味し、この「これらの組合せ」は「Ａ及びＢ、Ａ及びＣ、またはＢ及びＣ」を意味する。本明細書で使用される場合、別段の記述または文脈による明確な別段の定めがない限り、「または」は「及び／または」を意味し得る。
【００７１】
配列表に示されている配列と表との間に矛盾がある場合は、表中の配列が支配的となる。
【００７２】
本発明の開示を理解または完成するために必要な程度で、本明細書で言及している全ての出版物、特許、及び特許出願は、仮に各々が本明細書に個々に組み込まれている場合と同じ程度において、参照によって本明細書に明白に組み込まれている。
【００７３】
本発明の例示的な実施形態をこのように記載してきたが、当業者は、本明細書中の開示は例示に過ぎず、種々の他の代替、適応、及び変更が本発明の範囲内で行われ得ることを留意すべきである。従って、本発明は、本明細書に示されている特定の実施形態に限定されることはなく、以下の請求項によってのみ限定される。
【図１】
2018508466.tif 000070
【図２】
2018508466.tif 000071
【図３Ａ】
2018508466.tif 000072
【図３Ｂ】
2018508466.tif 000073
【配列表】
2018508466000001.app
【国際調査報告】
2018508466.tif 000074
2018508466.tif 000075
2018508466.tif 000076
2018508466.tif 000077