(57)【要約】  本発明は、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。【化１】2018508544.tif 000036 【選択図】  なし
2018508544.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【化１】
2018508544.tif 000033
【請求項２】
下記式で表される、請求項１に記載の化合物または塩。
【化２】
2018508544.tif 000034
【請求項３】
下記式で表される、請求項１または請求項２のいずれかに記載の化合物または塩。
【化３】
2018508544.tif 000035
【請求項４】
Ｎ−［３−［（４ａＲ，６Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（シクロプロポキシ）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物または塩。
【請求項５】
Ｎ−［３−［（４ａＲ，６Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（シクロプロポキシ）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミドである、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
患者におけるアルツハイマー病を治療する方法であって、そのような治療を必要としている患者に、有効量の請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法。
【請求項７】
患者における軽度認知障害のアルツハイマー病への進行を予防する方法であって、そのような治療を必要としている患者に、有効量の請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法。
【請求項８】
療法で使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項９】
アルツハイマー病の治療で使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１０】
軽度認知障害のアルツハイマー病への進行を予防するのに使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本発明は、新規の選択的ＢＡＣＥ１阻害剤、この化合物を含む医薬組成物、この化合物を使用して生理障害を治療する方法、ならびにこの化合物の合成に有用な中間体及びプロセスに関する。
【０００２】
本発明は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の神経毒性かつ高度に凝集性のペプチドセグメントであるアミロイドβ（Ａｂｅｔａ）ペプチドが関与する、アルツハイマー病ならびに他の疾患及び障害の治療の分野である。アルツハイマー病は、世界中で何百万人もの患者に影響を及ぼす破壊的な神経変性障害である。疾患を停止、遅延、または回復させるのではなく、患者に一時的な対症利益のみを提供する、市場で現在承認されている薬剤を考慮すると、アルツハイマー病の治療における満たされていない重大な必要性がある。
【０００３】
アルツハイマー病は、脳内のＡｂｅｔａの生成、凝集、及び沈着を特徴とする。β−セクレターゼ（β部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素；ＢＡＣＥ）の完全または部分的阻害は、マウスモデルにおいてプラーク関連及びプラーク依存性病理に対して有意な効果を有することが示されており、Ａｂｅｔａペプチドレベルの小さな低減でさえ、プラーク断面積及びシナプス欠損の長期間の有意な低減をもたらす可能性があり、したがって特にアルツハイマー病の治療において、有意な治療効果を提供することを示唆する。加えて、ＢＡＣＥ１及びＢＡＣＥ２と称されるＢＡＣＥの２つの相同体が同定されており、ＢＡＣＥ１がアルツハイマー病の発症に最も臨床的に重要であると考えられる。ＢＡＣＥ１がニューロン内で主に発現する一方で、ＢＡＣＥ２は、主に末梢で発現することが示されている。（Ｄ．Ｏｅｈｌｒｉｃｈ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２４，２０３３−２０４５（２０１４）を参照されたい）。加えて、ＢＡＣＥ２は、それが色素細胞特異的メラニン細胞タンパク質のプロセシングにおいて役割を果たすと特定されているため、色素沈着に重要であり得る（Ｌ．Ｒｏｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１１０（２６），１０６５８−１０６６３（２０１３）を参照されたい）。中枢神経系（ＣＮＳ）透過を伴うＢＡＣＥ阻害剤、特にＢＡＣＥ２よりもＢＡＣＥ１に対して選択的である阻害剤が、アルツハイマー病などのＡｂｅｔａペプチド媒介性障害のための治療を提供するために所望される。
【０００４】
米国特許第８，１５８，６２０号は、ＢＡＣＥ１阻害活性を有し、アルツハイマー型認知症などのＡｂｅｔａペプチドによって引き起こされる神経変性病のための有用な治療薬としてさらに開示される、縮合アミノジヒドロチアジン誘導体を開示する。加えて、米国特許第８，２７８，４４１号は、アルツハイマー病などのＡｂｅｔａペプチドを伴う疾患及び障害の治療のためのＢＡＣＥ阻害剤を開示する。
【０００５】
本発明は、ＢＡＣＥの阻害剤である、ある特定の新規の化合物を提供する。加えて、本発明は、ＢＡＣＥ２よりもＢＡＣＥ１の選択的阻害剤である、ある特定の新規の化合物を提供する。さらに、本発明は、ＣＮＳに透過する、ある特定の新規の化合物を提供する。本発明はまた、例えば、ＢＡＣＥ２よりもＢＡＣＥ１の選択的阻害を通じて、改善された副作用プロファイルの可能性を有する、ある特定の新規の化合物を提供する。
【０００６】
したがって、本発明は、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【化１】
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【０００７】
加えて、本発明は、式Ｉａの化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【化２】
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【０００８】
本発明はまた、患者におけるアルツハイマー病を治療する方法であって、そのような治療を必要としている患者に、有効量の式ＩもしくはＩａの化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、患者における軽度認知障害のアルツハイマー病への進行を予防する方法であって、そのような治療を必要としている患者に、有効量の式ＩもしくはＩａの化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法を提供する。本発明はまた、患者におけるＢＡＣＥを阻害する方法であって、そのような治療を必要としている患者に、有効量の式ＩもしくはＩａの化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法を提供する。本発明はまた、アミロイド前駆体タンパク質のＢＡＣＥ媒介性切断を阻害するための方法であって、そのような治療を必要としている患者に、有効量の式ＩもしくはＩａの化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法を提供する。本発明はさらに、Ａｂｅｔａペプチドの産生を阻害するための方法であって、そのような治療を必要としている患者に、有効量の式ＩもしくはＩａの化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法を提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、療法で、特に、アルツハイマー病の治療のために、または軽度認知障害のアルツハイマー病への進行を予防するために使用するための、式ＩもしくはＩａの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。さらに、本発明は、アルツハイマー病の治療のための薬剤の製造のための、式ＩもしくはＩａの化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に、式ＩもしくはＩａ化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む、医薬組成物を提供する。本発明はさらに、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に、式ＩもしくはＩａ化合物、またはその薬学的に許容される塩を混和することを含む、医薬組成物を調製するためのプロセスを提供する。本発明はまた、式Ｉ及びＩａの化合物の合成のための新規の中間体及びプロセスも包含する。
【００１２】
軽度認知障害は、経時的に軽度認知障害からアルツハイマー認知症までを呈する患者の臨床所見及び進行に基づき、アルツハイマー病と関連した認知症の潜在的な前駆期として定義されている。（Ｍｏｒｒｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５８，３９７−４０５（２００１）、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５６，３０３−３０８（１９９９））。「軽度認知障害のアルツハイマー病への進行を予防すること」という用語は、患者における軽度認知障害のアルツハイマー病への進行を抑制する、遅延させる、停止させる、または回復させることを含む。
【００１３】
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」という用語は、既存の症状または障害の進行または重症度を抑制する、遅延させる、停止させる、または回復させることを含む。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、ヒトを指す。
【００１５】
「Ａｂｅｔａペプチドの産生の阻害」という用語は、患者におけるＡｂｅｔａペプチドのインビボレベルの減少を意味すると見なされる。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、患者への単回または複数回用量投与後に、診断または治療下の患者において所望の効果を提供する、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩の量または用量を指す。
【００１７】
有効量は、既知の技術によって、かつ類似の状況下で得られる結果を観察することによって、当業者のような担当診断医によって容易に決定され得る。患者にとっての有効量を決定するときに、以下が挙げられるがこれらに限定されない多くの要因が、担当診断医によって考慮される。患者の人種；そのサイズ、年齢、及び全般的な健康状態；関与する特定の疾患または障害；疾患または障害の関与の程度または重症度；個々の患者の応答；投与される特定の化合物；投与方法；投与される調製物の生物学的利用能特徴；選択される投与方式；併用医薬の使用；ならびに他の関連した状況。
【００１８】
本発明の化合物は概して、幅広い投与量範囲にわたって有効である。例えば、１日当たりの投与量は通常、体重の約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇの範囲内に入る。場合によっては、上記の範囲の下限を下回る投与量レベルで十分すぎる可能性がある一方で、他の場合においては、さらに高い用量が、許容できる副作用を伴って用いられ得、したがって、上記の投与量範囲は、いかなる方法においても本発明の範囲を制限するよう意図されていない。
【００１９】
本発明の化合物は、好ましくは、経口及び経皮経路を含む、本化合物を生物学的に利用可能にする任意の経路によって投与される、医薬組成物として製剤化される。最も好ましくは、そのような組成物は、経口投与用である。そのような医薬組成物及びそれを調製するためのプロセスは、当該技術分野において周知である。（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｄ．Ｂ．Ｔｒｏｙ，Ｅｄｉｔｏｒ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００６を参照されたい）。
【００２０】
式Ｉ及びＩａの化合物またはその薬学的に許容される塩は、本発明の治療方法において特に有用であるが、ある特定の基、置換基、及び立体配置が好ましい。以下の段落は、そのような好ましい基、置換基、及び立体配置を記載する。これらの選好が、本発明の治療方法及び新規の化合物の両方に適用可能であることが理解されるであろう。
【００２１】
したがって、縮合二環式環がＣＩＳ立体配置である、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩が好ましい。例えば、当業者は、式Ｉａの化合物が、以下のスキームＡに示される１及び２と標示された中心に対してＣＩＳ相対立体配置にあることを理解するであろう。加えて、式Ｉａの化合物は、矢印によって示される１、２、及び３と標示された、炭素原子における３つのキラル中心を含有するコアからなる。式Ｉａの３つのキラル中心のための好ましい相対立体配置は、スキームＡに示される。
スキームＡ
【化３】
2018508544.tif 000005
【００２２】
本発明のさらなる化合物は、
【化４】
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及び
【化５】
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ならびにその薬学的に許容される塩である。
【００２３】
本発明が全ての個々の鏡像異性体及びジアステレオマー、ならびにラセミ化合物を含む該化合物の鏡像異性体の混合物を企図するが、以下に記載される絶対立体配置を有する化合物が好ましい。
【００２４】
Ｎ−［３−［（４ａＲ，６Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（シクロプロポキシ）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド、及びその薬学的に許容される塩。
【００２５】
より好ましい化合物は、Ｎ−［３−［（４ａＲ，６Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（シクロプロポキシ）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミドである。
【００２６】
当業者は、本発明の化合物が、概してスキームＢに示されるような互変異性型で存在することができることを理解するであろう。本願において本発明の化合物の特定の互変異性体のうちの１つへの任意の参照が示されるとき、互変異性型及びこれらの全ての混合物の両方を包含することが理解される。
スキームＢ
【化６】
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【００２７】
加えて、以下のスキームに記載されるある特定の中間体は、１つ以上の窒素保護基を含有してもよい。可変保護基は、特定の反応条件及び実施される特定の変換に応じて各発生において同じであっても、または異なっていてもよい。保護及び脱保護条件は当業者に周知であり、文献に記載されている（例えば、“Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｂｙ  Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．２００７を参照されたい）。
【００２８】
ある特定の立体化学中心が不明のまま残されており、ある特定の置換基が明確にするために以下のスキームにおいて除外されており、いかなる方法においてもスキームの教示を制限するよう意図されていない。さらに、個々の異性体、鏡像異性体、及びジアステレオマーは、選択的結晶化技術またはキラルクロマトグラフィなどの方法によって、本発明の化合物の合成における任意の好都合な時点において、当業者によって分離または分解されてもよい（例えば、Ｊ．Ｊａｃｑｕｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，''Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ''，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８１、及びＥ．Ｌ．Ｅｌｉｅｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ，”Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４を参照されたい）。「異性体１」及び「異性体２」という表記は、キラルクロマトグラフィ１及び２のそれぞれから溶出する化合物を指し、キラルクロマトグラフィが合成において初期に開始される場合、同じ表記が後続の中間体及び実施例に適用される。
【００２９】
ある特定の略語が以下の通り定義される。「ＣＤＩ」は１，１’−カルボニルジイミダゾールを指し、「ＣＳＦ」は脳脊髄液を指し、「ＤＣＣ」は１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドを指し、「ＤＣＭ」はジクロロメタンまたはメチレンジクロライドを指し、「ＤＩＣ」はジイソプロピルカルボジイミドを指し、「ＤＩＰＥＡ」はジイソプロピルエチルアミンまたはＮ−エチル−Ｎ−イソプロピル−プロパン−２−アミンを指し、「ＡＣＮ」はアセトニトリルを指し、「ＤＭＡＰ」はジメチルアミノピリジンを指し、「ＤＭＥＭ」はダルベッコ改変イーグル培地を指し、「ＤＭＦ」はジメチルホルムアミドを指し、「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指し、「ＥＤＣＩ」は１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩を指し、「ｅｅ」は鏡像体過剰率を指し、「Ｅｘ」は実施例を指し、「Ｆ１２」はＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地を指し、「ＦＢＳ」はウシ胎児血清を指し、「ＦＲＥＴ」は蛍光共鳴エネルギー移動を指し、「ＨＡＴＵ」は（ジメチルアミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル（３Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルオキシ）メタンイミニウムヘキサフルオロホスフェートを指し、「ＨＥＫ」はヒト胎児由来腎臓を指し、「ＨＯＡｃ」は酢酸を指し、「ＨＯＡｔ」は１−ヒドロキシ−７−アゾベンゾトリアゾールを指し、「ＨＯＢｔ」は１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物を指し、「ＨＢＴＵ」は２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートを指し、「ＨＰＬＣ」は高性能液体クロマトグラフィを指し、「ＩＣ５０」はその薬剤に関して考えられる最大阻害応答の５０％を生じさせる薬剤の濃度を指し、「ｍｉｎ」は分（単数または複数）を指し、「ＭｅＯＨ」はメタノールまたはメチルアルコールを指し、「ＭＴＢＥ」はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを指し、「ＯＲ」は旋光を指し、「ＰＤＡＰＰ」は血小板由来アミロイド前駆体タンパク質を指し、「ＰＧ」は保護基を指し、「Ｐｒｅｐ」は調製物を指し、「ＰｙＢＯＰ」はベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートを指し、「ＰｙＢｒｏｐ」はブロモ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェートを指し、「ＲＦＵ」は相対蛍光単位を指し、「Ｒｔ」は保持時間を指し、「ＳＦＣ」は超臨界流体クロマトグラフィを指し、「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを指す。
【００３０】
本発明の化合物またはその塩は、当該技術分野において既知の様々な手順によって調製され得、それらのうちのいくつかが、以下のスキーム、調製物、及び実施例に例示される。当業者は、記載される方法のそれぞれの特定の合成ステップが、本発明の化合物またはその塩を調製するために異なる方法で、または異なるスキームからのステップと併せて組み合わされ得ることを認識する。以下のスキームの各ステップの生成物は、抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィ、濾過、粉砕、及び結晶化を含む、当該技術分野において周囲の従来の方法によって回収され得る。以下のスキームにおいて、別途記載のない限り、全ての置換基は先に定義された通りである。試薬及び出発物質は、当業者にとって容易に入手可能である。以下のスキーム、調製物、及び実施例は、本発明をさらに例示する。
スキーム１
【化７】
2018508544.tif 000009
【００３１】
スキーム１、ステップ１において、保護されたシアノ酢酸メチルは、ＴＨＦなどの溶媒中の塩化アルミニウム及び亜鉛末を使用して、３−ブロモプロプ−１−エンを有するメチル３−オキソヘクス−５−エノアートに変換されて、対応するケトン生成物を提供する。次いで、スキーム１、ステップ２において、ケトンは、ＭｅＯＨなどの溶媒中の水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤を使用して、当該技術分野において周知の条件下で還元される。適切な反応時間の後、アセトンが滴加され、反応物は濃縮されて、スキーム１、ステップ２のヒドロキシ生成物を得る。使用され得る他の一般的な還元剤は、酢酸などの触媒量の酸を有するＬｉＢＨ４またはトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムである。スキーム１、ステップ３において、ヒドロキシル基は、例えば、イミダゾール及びｔｅｒｔ−ブチル−クロロ−ジメチル−シランなどの有機塩基を使用して、ＤＭＦなどの溶媒中のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基を用いて保護され得る。「ＰＧ」は、アミン、エステル、またはヒドロキシ基のために開発された保護基である。そのような保護基は、当該技術分野において周知であり、認識されている。加えて、次いで、エステルは、水酸化ナトリウムなどの水性塩基を使用して、当該技術分野において周知の条件下で加水分解されて、スキーム１、ステップ３の対応するカルボン酸を提供することができる。スキーム１、ステップ４において、カルボン酸は、小分けしたＣＤＩなどのカップリング剤、続いて、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩の添加を使用して、標準化された条件下でワインレブアミドに変換され得る。スキーム１、ステップ５において、ワインレブアミドは、約−３０〜−６０℃の温度でＴＨＦなどの溶媒中の水素化ジイソブチルアルミニウムを用いて、アルデヒドに変換した。ワインレブアミドをアルデヒドに変換するための水素化リチウムアルミニウムなどの他の還元剤が、当該技術分野において周知である。スキーム１、ステップ６において、アルデヒドは、エタノール中のヒドロキシルアミン塩酸塩及びピリジンなどの有機塩基を用いて、当該技術分野において周知の条件下で、オキシムに変換され得る。スキーム１、ステップ７において、対応するオキシムは、次亜塩素酸ナトリウムの水溶液またはＮ−クロロコハク酸イミドなどの代替酸化剤を使用することなどのいくつかの周知の方法による３＋２環化において、かつ約０℃の温度でまたは加熱しながら、ＤＣＭ、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、トルエン、またはキシレンなどの溶媒中で、二環式４，５−ジヒドロイソオキサゾールに変換され得る。スキーム１、ステップ８において、２−フルオロ，５−ブロモフェニル基が、ｎ−ブチルリチウムまたはイソプロピルマグネシウムクロリド塩化リチウム錯体などの試薬を用いたハロゲン−金属交換を使用して、４−ブロモ−１−フルオロ−２−ヨード−ベンゼンから有機金属試薬を生成することによって、ジヒドロイソオキサゾールに添加され得る。撹拌しながらのＴＨＦなどの溶媒中の約−１０〜−１５℃の温度での有機金属試薬の滴加、続けて三フッ化ホウ素ジエチルエーテラートの添加は、アルキル化生成物を得る。次いで、アルキル化粗生成物は、ＴＨＦ中の１Ｍフッ化テトラブチルアンモニウム溶液を使用して、ヒドロキシにおいて脱保護されて、スキーム１、ステップ８のシス及びトランスアルコールのジアステレオマー混合物を提供することができる。スキーム１、ステップ９において、アルコールのジアステレオマーシス／トランス混合物は、シリカゲルクロマトグラフィなどの当該技術分野において周知の標準的な技術を使用して分離されて、精製されたラセミトランスアルコール（及び精製されたラセミシスアルコール）を提供することができる。必要に応じて、ラセミトランスアルコールは、例えば、ＭＴＢＥ中のラセミトランスアルコールへの２−プロパノール中の１．２５Ｍ  ＨＣＬの添加、続いて、得られたＨＣｌ塩を回収するための濾過によって、当該技術分野において周知の条件下で、その対応するＨＣｌ塩に変換され得る。スキーム１、ステップ１０において、ラセミトランスアルコールの遊離塩基は、キラルクロマトグラフィを使用してその対応する鏡像異性体に分離されて、好ましい精製された鏡像異性体を提供することができる。
スキーム２
【化８】
2018508544.tif 000010
【００３２】
スキーム２、ステップ１において、スキーム１、ステップ１０の生成物は、加熱しながら、ＤＣＭなどの溶媒中のＤＭＡＰ、ピリジンなどの塩基、及び無水酢酸を使用して、テトラヒドロイソオキサゾール窒素及びヒドロキシにおいて保護されて、二重保護生成物を得る。保護されたヒドロキシは、ＭｅＯＨなどの溶媒中の水酸化ナトリウム水溶液を使用して、当該技術分野において周知の条件下で、選択的に脱保護されて、スキーム２、ステップ２の単保護された生成物を得る。スキーム２、ステップ３において、パラジウムカップリングを使用して、対応するビニルエーテルを形成することができる。例えば、還流条件下で加熱しながらの、ＤＣＭ及びエチルビニルエーテルなどの溶媒中の触媒量の酢酸パラジウム及び１，１０−フェナントロリンは、スキーム２、ステップ３の生成物をもたらす。次いで、得られたビニルエーテルは、ＤＣＭなどの溶媒中のジエチル亜鉛及びクロロヨードメタン、ならびに約０℃の温度を用いて、シモンズ・スミス条件下でシクロプロパンに変換されて、スキーム２、ステップ４の生成物を得ることができる。スキーム２、ステップ５において、テトラヒドロイソオキサゾール窒素は、最初にＭｅＯＨ、次いで塩酸水溶液で反応停止処理されて、約−４５℃の温度で、水素化ジイソブチルアルミニウムを含むＴＨＦなどの溶媒中で脱保護され得る。テトラヒドロイソオキサゾール環は、約４０℃の温度で酢酸中の亜鉛を用いて処理されて、スキーム２、ステップ５の開環生成物を形成することができる。テトラヒドロイソオキサゾール環を開環するための代替方法は、水素化を伴う圧力条件下で、エタノールなどの極性溶媒中のラネーニッケルを使用する。次いで、スキーム２、ステップ５の開環生成物は、約０℃〜室温の温度でＴＨＦまたはＤＣＭなどの溶媒中のベンゾイルイソチオシアネートと反応させられ、続いて、約７０℃まで加熱しながら室温でのＣＤＩを添加されて、スキーム２、ステップ６のチアジン生成物を得ることができる。次いで、臭化物は、約１００〜１１０℃まで加熱しながら、トリフルオロアセトアミド、ヨウ化銅、トランス、ラセミ−Ｎ１，Ｎ２−ジメチルシクロヘキサン−１，２−ジアミンなどのジアミンまたは関連リガンド、炭酸カリウムなどの無機塩基、及びヨウ化ナトリウムを使用して、アミドに変換されて、スキーム２、ステップ７のアミド生成物を得ることができる。次いで、アミド及びチアジンアミドは、ＭｅＯＨなどの溶媒中の水酸化ナトリウムなどの水性塩基を使用して、当該技術分野において周知の条件下で脱保護されて、スキーム２、ステップ８の脱保護アニリンを得ることができる。次いで、脱保護アニリンは、当該技術分野において周知のカップリング条件を利用して、ヘテロ芳香族カルボン酸と結合され得る。当業者は、カルボン酸及びアミンの反応によって生じるアミド形成のための多くの方法及び試薬があることを認識するであろう。例えば、スキーム２、ステップ９において、カップリング試薬の存在下での適切なカルボン酸との適切なアニリンの反応は、式Ｉａのアミドを提供する。カップリング試薬は、ＨＡＴＵまたはＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＣＩなどのカルボジイミド、ならびにＨＯＢｔ及びＨＯＡｔなどの芳香族オキシムを含む。加えて、ＨＢＴＵ、ＰｙＢＯＰ、及びＰｙＢｒＯＰなどの非求核性アニオンのウロニウムまたはホスホニウム塩が、より伝統的なカップリング試薬の代わりに使用され得る。反応を強化するために、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、またはＤＭＡＰなどの有機塩基が使用され得る。あるいは、アニリンは、トリエチルアミンまたはピリジンなどの塩基の存在下で置換塩化ベンゾイルを使用してアシル化されて、式Ｉａの化合物を提供することができる。
【００３３】
塩酸塩などの本発明の化合物の薬学的に許容される塩は、例えば、当該技術分野において周知の標準的な条件下で、式ＩまたはＩａの適切な遊離塩基、ジエチルエーテルなどの好適な溶媒中の塩酸などの適切な薬学的に許容される酸の反応によって、形成され得る。加えて、そのような塩の形成は、窒素保護基の脱保護と同時に生じることができる。そのような塩の形成は、当該技術分野において周知であり、かつ認識されている。例えば、Ｇｏｕｌｄ，Ｐ．Ｌ．，“Ｓａｌｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｂａｓｉｃ  ｄｒｕｇｓ，”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，３３：２０１−２１７（１９８６）、Ｂａｓｔｉｎ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｓａｌｔ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｎｅｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｔｉｔｉｅｓ，”Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４：４２７−４３５（２０００）、及びＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６６：１−１９，（１９７７）を参照されたい。
【００３４】
以下の調製物及び実施例は、本発明をさらに例示する。
調製物１
メチル３−オキソヘクス−５−エノアート
【化９】
2018508544.tif 000011
【００３５】
スキーム１、ステップ１：シアノ酢酸メチル（２７００ｇ、２７．２ｍｏｌ）及びＴＨＦ（３２Ｌ）を、窒素雰囲気下で、機械撹拌器、添加漏斗、及び温度プローブを備えた７２Ｌ丸底フラスコに充填する。５℃まで冷却し、２８℃未満の内部温度を維持しながら、塩化アルミニウム（ＩＩＩ）（３６３ｇ、２．７２ｍｏｌ）及び亜鉛末（２３２０ｇ、３５．４２ｍｏｌ）を小分けに添加する。２５分間窒素下で撹拌し、反応混合物の内部温度が２１℃未満のままであるような速度で、添加漏斗によって３−ブロモプロプ−１−エン（３９６０ｇ、３５１０ｍＬ、３２．７０ｍｏｌ）を添加する。周囲温度で一晩撹拌する。ＴＨＦ（４Ｌ）で洗い流しながら珪藻土を通じて濾過し、減圧下で濾液を蒸発させる。ＭＴＢＥ（８Ｌ）に残渣を溶解し、１Ｎ塩酸水溶液（１２Ｌ）の撹拌した溶液に添加する。０℃まで冷却し、４０℃未満の内部温度を維持しながら、ｐＨ１〜２が得られるまで、６Ｎ塩酸水溶液（３Ｌ）を添加し、続いて、濃縮塩酸（２．３Ｌ）を添加する。有機相を分離し、食塩水（６Ｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ＭＴＢＥ（８Ｌ）で溶出するシリカゲルのプラグを通じて濾過する。減圧下で濾液を濃縮して、暗色の油として表題化合物を得る（４５００ｇ、９９％、７４％純度（ＧＣＭＳによる））。ＥＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １４２．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００３６】
調製物２
メチル３−ヒドロキシへクス−５−エノアート
【化１０】
2018508544.tif 000012
スキーム１、ステップ２：ＭｅＯＨ（３０Ｌ）中メチル３−オキソヘクス−５−エノアート（４２７１ｇ、３０．０５ｍｏｌ）の溶液を、窒素雰囲気下で、機械撹拌器及び温度プローブを備えた７２Ｌ丸底フラスコに充填する。５℃の内部温度まで冷却し、次いで、１６℃未満の内部温度を維持しながら、水素化ホウ素ナトリウム（１１３７ｇ、３０．０５ｍｏｌ）を小分けに添加する。周囲温度で一晩撹拌する。アセトン（３２５ｍＬ）を滴加し、得られた混合物を減圧下で濃縮する。ＭＴＢＥ（２０Ｌ）と、食塩水（７Ｌ）と、水（７Ｌ）との間で、残渣を分割する。層を分離し、食塩水（１×１０Ｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で乾燥するまで蒸発させて、暗色の油として表題化合物（３２３０ｇ、７５％、７４％純度（ＧＣ／ＭＳによる））を得る。ＥＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １４４．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００３７】
調製物３
メチル３−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝へクス−５−エノアート
【化１１】
2018508544.tif 000013
スキーム１、ステップ３（アルコールの保護）：ＤＭＦ（２４５Ｌ）にメチル３−ヒドロキシヘクス−５−エノアート（２４．５ｋｇ、１７０．１ｍｏｌ、１．０当量）を溶解し、０℃まで冷却する。０〜７℃の内部温度を維持しながら、イミダゾール（２３．１ｋｇ、３４０．２ｍｏｌ）を一度に添加し、続いて、ｔｅｒｔ−ブチル−クロロ−ジメチル−シラン（５１．４ｋｇ、３４０．２ｍｏｌ）を３０分にわたって小分けに添加する。この温度で２０分間反応混合物を撹拌し、次いで、一晩または反応が完了するまで、４０℃まで加熱する。次いで、撹拌しながらＭＴＢＥ（１５０Ｌ）及び水（１２０Ｌ）を添加し、層を分離する。有機層を水（１００Ｌ）及び食塩水（６０Ｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮して、暗褐色の油として表題化合物（４０ｋｇ、９１％）を得る。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ  ２５９．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００３８】
調製物４
３−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝へクス−５−エン酸
【化１２】
2018508544.tif 000014
スキーム１、ステップ３（カルボン酸の脱保護）：メタノール（１６０Ｌ）にメチル３−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝へクス−５−エノアート（４０ｋｇ、１５４．８ｍｏｌ）を溶解し、３〜５℃まで冷却する。１５℃未満の内部温度を維持しながら、２時間にわたって、水（２２５Ｌ）中水酸化ナトリウム（１８．６ｋｇ、４６４．３ｍｏｌ、３．０当量）の溶液を添加する。反応物を６０℃まで加熱し、４時間撹拌する。同じスケールでこの手順を繰り返し、２つの反応混合物を組み合わせる。５５℃で、真空下でメタノールを除去する。ＤＣＭ（６０Ｌ）で得られた水溶液を洗浄し、３〜５℃まで水層を冷却する。ｐＨ１〜２が到達されるまで濃縮ＨＣｌを添加すると同時に、２０℃未満の内部温度を維持する。ＤＣＭ（７０Ｌ）で混合物を抽出する。層を分離し、有機層を食塩水（５０％、６０Ｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮して、暗褐色の油として表題化合物（４８ｋｇ、６３％）を得る。ＥＩ  ＭＳ：ｍ／ｚ  ２０３．０［Ｍ−アリル］。
【００３９】
調製物５
３−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝−Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチルへクス−５−エナミド
【化１３】
2018508544.tif 000015
スキーム１、ステップ４：ＤＣＭ（２５Ｌ）中３−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝へクス−５−エン酸（６．３ｋｇ、２５．８ｍｏｌ）の溶液を撹拌し、窒素下で、５〜１０℃まで冷却する。ＣＤＩ（４．６ｋｇ、２８．４ｍｏｌ）を小分けに添加すると同時に、１０℃未満の内部温度を維持する。２時間この温度で撹拌する。Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（４．０５ｋｇ、４１．３ｍｏｌ）を小分けに添加し、２４時間、反応混合物を４０℃まで加熱する。反応混合物を周囲温度まで冷却し、撹拌しながら１Ｎ塩酸（３０Ｌ）に注入する。有機相を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２０Ｌ）、食塩水（１０Ｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させる。反応を２回繰り返し、粗ＤＣＭ溶液を組み合わせ、真空下で濃縮して、残渣を得る。混合物を真空蒸留して（６５〜９５℃、２〜５Ｐａ）、黄色油として表題化合物（９．０２ｋｇ、４０％）を得る。ＥＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ２８７［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００４０】
調製物６
３−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝へクス−５−エナル
【化１４】
2018508544.tif 000016
スキーム１、ステップ５：５０Ｌ丸底フラスコに水素化ジイソブチルアルミニウム（ヘキサン中１Ｍ、１８．３Ｌ）を充填し、撹拌し、ドライアイス／アセトン槽を使用して、−５０〜−６０℃の内部温度まで冷却する。ＴＨＦ（１５Ｌ）中３−［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ−Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル−へクス−５−エナミド（５．００ｋｇ、１７．３９ｍｏｌ）の溶液を、１．５〜２時間にわたって添加すると同時に、−５０℃未満の内部温度を維持し、−３０〜−５０℃で２時間、反応溶液を撹拌する。内部温度が２０℃を超えないことを確実にしながら、水（３００ｍＬ）、続いて希塩酸（３Ｍ、１Ｌ）をゆっくりと添加する。この混合物を希塩酸（３Ｍ、３６Ｌ）の冷却溶液に注入し、内部温度が２０℃を超えないことを確実にする。有機相を分離し、水（２×８Ｌ）及び食塩水（５Ｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮して、茶色油として表題化合物（２．９０ｋｇ、７３％）を得る。ＥＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １８７．２［Ｍ−アリル］。
【００４１】
調製物７
３−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝−Ｎ−ヒドロキシへクス−５−エン−１−イミン
【化１５】
2018508544.tif 000017
スキーム１、ステップ６：エタノール（９．３Ｌ）中ピリジン（１．６１ｋｇ、２０．３６ｍｏｌ）及び塩酸ヒドロキシルアミン（１．２３ｋｇ、１７．６４ｍｏｌ）の懸濁液を、１５℃で３０分間撹拌する。エタノール（３．１Ｌ）中３−［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシへクス−５−エナル（３．１０ｋｇ、１３．５７ｍｏｌ）の溶液を添加し、１５〜２０℃で２時間撹拌する。減圧下でエタノールを除去し、残渣にＭＴＢＥ（４Ｌ）及び食塩水（４Ｌ）を添加する。得られた懸濁液を分離し、０．５Ｎ塩酸（２×３Ｌ）、次いで食塩水（３Ｌ）で有機相を洗浄する。無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮して、茶色油として表題化合物（Ｅ／Ｚ異性体の混合物、３．００ｋｇ、９１％）を得る。ＥＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ２０２．０［Ｍ−アリル］。
【００４２】
調製物８
５−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝−３ａ，４，５，６−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｃ］［１，２］オキサゾール
【化１６】
2018508544.tif 000018
スキーム１、ステップ７：５０Ｌ丸底フラスコ中で、ＤＣＭ（２０Ｌ）に３−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝−Ｎ−ヒドロキシへクス−５−エン−１−イミン（２．００ｋｇ、８．２２ｍｏｌ）を溶解し、撹拌し、氷／エタノール槽を用いて−７℃まで冷却する。添加漏斗を介して７〜８重量％の強度の水性次亜塩素酸ナトリウム（１５．５Ｌ）の溶液を添加すると同時に、０℃未満の内部温度を維持する。０℃で３０分間撹拌する。層を分離し、飽和亜硫酸ナトリウム水溶液（２×１０Ｌ）、次いで食塩水（５Ｌ）で有機相を洗浄する。無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮し、イソヘキサン中２．５％〜９％の酢酸エチルの勾配で溶出する、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィによって精製して、黄色油（１．０１ｋｇ、５１％）として、かつジアステレオマーの混合物として、表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ  ２４２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００４３】
調製物９
ｒｅｌ−（３ａＲ，５Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）ヘキサヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ｃ］［１，２］オキサゾール−５−オール塩酸塩（トランスアルコール）
【化１７】
2018508544.tif 000019
【００４４】
調製物１０
ｒｅｌ−（３ａＲ，５Ｒ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）ヘキサヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ｃ］［１，２］オキサゾール−５−オール塩酸塩（シスアルコール）
【化１８】
2018508544.tif 000020
スキーム１、ステップ８及び９（調製物９及び１０のため）：窒素雰囲気下で、−１０℃で、無水ＴＨＦ（６００ｍＬ）中４−ブロモ−１−フルオロ−２−ヨード−ベンゼン（１４９．６ｇ、４９７．１ｍｍｏｌ）の溶液を撹拌し、ＴＨＦ中イソプロピルマグネシウムクロリド塩化リチウム錯体（３８２ｍＬ、４９７ｍｍｏｌ）の１．３Ｍ溶液を滴加する。−１５℃で１時間撹拌する。−５℃未満の内部温度を維持しながら、無水トルエン（３００ｍＬ）中５−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝−３ａ，４，５，６−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｃ］［１，２］オキサゾール（６０ｇ、２４８．５４ｍｍｏｌ）の溶液を添加する。２０分後、三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート（６３ｍＬ、４９７．１ｍｍｏｌ）を添加し、０℃〜１０℃で１時間撹拌する。飽和塩化アンモニウム水溶液（５００ｍＬ）を添加し、水（２００ｍＬ）と酢酸エチル（３００ｍＬ）との間で分割する。食塩水溶液（５００ｍＬ）で有機層を洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、暗橙色油を得る。ＴＨＦ（２４０ｍＬ）に残渣を溶解し、撹拌し、氷／水槽中で冷却する。ＴＨＦ（５４６ｍＬ）中１Ｍフッ化テトラブチルアンモニウム溶液を添加し、周囲温度まで温める。ＬＣＭＳが、完全な脱シリル化及び水（５００ｍＬ）と酢酸エチル（５００ｍＬ）との間の分割を示すまで撹拌し、相を分離する。酢酸エチル（５００ｍＬ）で水層を抽出し、水（５００ｍＬ）及び食塩水（５００ｍＬ）で、組み合わされた有機抽出物を洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、シス／トランスジアステレオマーの混合物を得る。イソヘキサン中３０％〜７０％の酢酸エチルで溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィによって、シス／トランスジアステレオマーを分離して、別々のシス及びトランスジアステレオマーを得る（スキーム１、ステップ９を参照されたい）。ＭＴＢＥ（２００ｍＬ）に、ｒｅｌ−（３ａＲ，５Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）ヘキサヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ｃ］［１，２］オキサゾール−５−オール（２２．１９ｇ、７３ｍｍｏｌ、トランスアルコール）を添加し、４５℃で、２−プロパノール中１．２５Ｍ塩酸（６０ｍＬ、７５ｍｍｏｌ）を添加する。１０分間撹拌し、濾過、ＭＴＢＥ（２×５０ｍＬ）での洗浄によって、得られた白色固体を回収する。窒素下で乾燥させて、白色粉末として調製物９の表題化合物（２０．８８ｇ、２５％）を得る。Ｒｔ  ０．９９ｍｉｎ、ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｅ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）３０２．０／３０４．０［Ｍ＋Ｈ］。
【００４５】
ＭＴＢＥ（３００ｍＬ）と水（３００ｍＬ）との間で、ｒｅｌ−（３ａＲ，５Ｒ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）ヘキサヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ｃ］［１，２］オキサゾール−５−オール（６７．７ｇ、フッ化テトラブチルアンモニウム（ｔｅｔｒａｂｕｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）で汚染、（シスアルコール）を分割し、飽和塩化アンモニウム水溶液（３００ｍＬ）、水（３００ｍＬ）、及び２Ｎ塩酸水溶液（３×２００ｍＬ）で有機層を洗浄する。ｐＨがｐＨ１０に達するまで５０％水酸化ナトリウム水溶液を添加し、ＭＴＢＥ（３×１５０ｍＬ）で抽出する。水（３００ｍＬ）及び食塩水（３００ｍＬ）で、組み合わされた有機抽出物を洗浄する。２−プロパノール中１．２５Ｍ塩酸（１８０ｍＬ、２２５ｍｍｏｌ）で有機層を処理し、１０分間撹拌する。溶液を蒸発乾燥固し、酢酸エチル（２００ｍＬ）中で残渣を粉砕し、濾過し、風乾させて、白色粉末として調製物１０の表題化合物（１６．７１ｇ、２０％）を得る。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｅ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）３０１．８／３０３．８［Ｍ＋Ｈ］、Ｒｔ  ０．８５ｍｉｎ、分析逆相条件：５０ｍｍの長さ、２．１ｍｍの内径、及び３μｍの粒径のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｇｅｍｉｎｉ−ＮＸ  Ｃ１８カラム。移動相：Ａ１＝０．１％ギ酸を有する水／Ｂ１＝０．１％ギ酸を有するＡＣＮ、５０℃の温度、１．２ｍＬ／ｍｉｎの流速、１．５ｍｉｎにわたって５％〜９５％（Ｂ１）、続いて９５％で保持された０．５ｍｉｎの勾配溶出（Ｂ１）。
【００４６】
調製物１１
（３ａＲ，５Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）ヘキサヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ｃ］［１，２］オキサゾール−５−オール
【化１９】
2018508544.tif 000021
スキーム１、ステップ１０：ＭＴＢＥ（６Ｌ）中にｒｅｌ−（３ａＲ，５Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）ヘキサヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ｃ］［１，２］オキサゾール−５−オール塩酸塩（２００．０ｇ、６６ｍｍｏｌ、トランスアルコール）を懸濁させ、水（４Ｌ）及び２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（４００ｍＬ）を添加する。２０分間撹拌し、層を分離し、ＭＴＢＥ（２×５００ｍＬ）で水層を抽出する。有機抽出物を組み合わせ、水（２Ｌ）及び食塩水で洗浄する。硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮して、ラセミ遊離塩基（１８２．５ｇ）を得る。キラルＳＦＣ（超臨界流体クロマトグラフィー）によって、鏡像異性体を分離する（カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ（５μ）、５０×２５０ｍｍ、溶離剤：ＣＯ２中２２％ＥｔＯＨ（０．２％ジエチルメチルアミン）、流量：ＵＶ  ２２０ｎｍで３５０ｇ／ｍｉｎ）。第１の溶出鏡像異性体は、表題化合物（８３．９４ｇ、４７％）である。ＯＲ［α］Ｄ２０＝＋７３°（Ｃ＝０．２４７、ＤＣＭ）、ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｅ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）３０２．０／３０４．０［Ｍ＋Ｈ］、Ｒｔ  ０．８８ｍｉｎ。
【００４７】
調製物１２
５−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボン酸
【化２０】
2018508544.tif 000022
１００℃で１５時間、ＤＭＦ（１０００ｍＬ）中のメチル５−クロロピラジン−２−カルボキシレート（１２４ｇ、７１８．５５ｍｍｏｌ）、１Ｈ−１，２，４−トリアゾール（１９８．５ｇ、２８７４．２ｍｍｏｌ）、及び炭酸カリウム（２９７．９２ｇ、２１５５．６ｍｍｏｌ）の混合物を撹拌する。周囲温度まで冷却し、水（２Ｌ）に注入する。濃縮塩酸水溶液（約５００ｍＬ）を使用してｐＨ２〜３に調節し、３０分間撹拌する。濾過によって得られた固体を回収し、水で洗浄する。水（５００ｍＬ）及びエタノール（５００ｍＬ）を添加し、４時間、５０〜６０℃まで加熱し、周囲温度まで冷却する。濾過によって固体を回収し、４０℃で真空下で乾燥させて、白色固体として表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ  １９０．０（Ｍ−Ｈ）。
【００４８】
調製物１３
（３ａＲ，５Ｓ，６ａＳ）−１−アセチル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）ヘキサヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ｃ］［１，２］オキサゾール−５−イルアセテート
【化２１】
2018508544.tif 000023
スキーム２、ステップ１：窒素下で、ＤＣＭ（３６２ｍＬ）中（３ａＲ，５Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）ヘキサヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ｃ］［１，２］オキサゾール−５−オール（３６．１６ｇ、１１９．７ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（３．６９ｇ、２９．９ｍｍｏｌ）、及びピリジン（３８．７ｍＬ、４７８．７ｍｍｏｌ）の溶液を撹拌し、無水酢酸（４５．３ｍＬ、４７８．７ｍｍｏｌ）を滴加する。１８時間、反応混合物を加熱還流する。不完全な変換がＬＣＭＳによって観察される場合、さらなる無水酢酸を充填し、加熱し続ける。周囲温度まで冷却し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（６５０ｍＬ）をゆっくりと添加する。ＤＣＭ（２×２００ｍＬ）で水層を抽出し、硫酸ナトリウム上で、組み合わされた有機抽出物を乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮する。イソヘキサン中０％〜５０％の酢酸エチルで溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィによって、残渣を精製して、白色固体（５７．７ｇ、酢酸で汚染）として表題化合物を得る。さらなる精製なしでこの材料を続けて使用する。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｅ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）３８６．０／３８８．０［Ｍ＋Ｈ］。
【００４９】
調製物１４
１−［（３ａＲ，５Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−５−ヒドロキシ−３ａ，４，５，６−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｃ］イソキサゾール−１−イル］エタノン
【化２２】
2018508544.tif 000024
スキーム２、ステップ２：メタノール（９２３ｍＬ）に（３ａＲ，５Ｓ，６ａＳ）−１−アセチル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）ヘキサヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ｃ］［１，２］オキサゾール−５−イルアセテート（５７．７ｇ、１４９．４ｍｍｏｌ）を溶解し、２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（１５０ｍＬ、２９８．９ｍｍｏｌ）を添加し、周囲温度で２時間撹拌する。減圧下で有機溶媒の大部分を除去し、次いで、酢酸エチル（３００ｍＬ）及び水（３００ｍＬ）で希釈する。層を分離し、酢酸エチル（２×２００ｍＬ）で水層を抽出し、食塩水で組み合わされた有機抽出物を洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮して、白色固体（３９．４５ｇ、７７％）として表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｅ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）３４４．０／３４６．０［Ｍ＋Ｈ］。
【００５０】
調製物１５
１−［（３ａＲ，５Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−５−ビニルオキシ−３ａ，４，５，６−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｃ］イソキサゾール−１−イル］エタノン
【化２３】
2018508544.tif 000025
スキーム２、ステップ３：窒素下で、ＤＣＭ（１９２ｍＬ）に、酢酸パラジウム（ＩＩ）（２．５０ｇ、１１．１６ｍｍｏｌ）及び１，１０−フェナントロリン（２．２８ｇ、１２．２８ｍｍｏｌ）を溶解し、１０分間撹拌する。エチルビニルエーテル（８５５ｍＬ）を添加し、真空／窒素サイクルで混合物を脱気する。周囲温度で１５分間撹拌し、カニューレを介して、無水ＤＣＭ（４６１ｍＬ）中１−［（３ａＲ，５Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−５−ヒドロキシ−３ａ，４，５，６−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｃ］イソキサゾール−１−イル］エタノン（３８．４１ｇ、１１１．６ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、得られた混合物を再び脱気する。窒素下で１８時間加熱還流する。反応が完了しない場合、反応を完了させるために、酢酸パラジウム（ＩＩ）及び１，１０−フェナントロリンのさらなる充填が追加されるべきである。周囲温度まで冷却し、水（１００ｍＬ）及びＤＣＭ（５０ｍＬ）で希釈し、５分間撹拌する。珪藻土を通じて濾過し、層を分離する。ＤＣＭ（３×５０ｍＬ）で水層を抽出し、水（１５０ｍＬ）、次いで食塩水（１００ｍＬ）で、組み合わされた有機抽出物を洗浄する。硫酸ナトリウム上で溶液を乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮して、残渣を得る。イソヘキサン中０％〜４０％の酢酸エチルで溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィによって、残渣を精製して、淡黄色油（３２．５２ｇ、７９％）として表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｅ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）３７０．０／３７２．０［Ｍ＋Ｈ］。
【００５１】
調製物１６
１−［（３ａＲ，５Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−５−（シクロプロポキシ）−３ａ，４，５，６−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｃ］イソキサゾール−１−イル］エタノン
【化２４】
2018508544.tif 000026
スキーム２、ステップ４：窒素下で、無水ＤＣＭ（３３３ｍＬ）を０℃まで冷却し、カニューレを介してヘキサン（１９８．０ｍＬ、１９８ｍｍｏｌ）中１Ｍジエチル亜鉛を添加する。クロロヨードメタン（３３．４５ｍＬ、４４９．９ｍｍｏｌ）を滴加し、０℃で１０分間撹拌する。無水ＤＣＭ（２００ｍＬ）中１−［（３ａＲ，５Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−５−ビニルオキシ−３ａ，４，５，６−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｃ］イソキサゾール−１−イル］エタノン（３３．３１ｇ、８９．９８ｍｍｏｌ）の溶液を滴加し、０℃で１時間撹拌する。０℃で、飽和塩化アンモニウム水溶液（５００ｍＬ）をゆっくりと添加し、珪藻土を通じて二相混合物を濾過する。層を分離し、ＤＣＭ（２×２００ｍＬ）で水層を抽出し、水（２５０ｍＬ）で、組み合わされた有機抽出物を洗浄する。硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮して、残渣を得る。イソヘキサン中０％〜３０％のＭＴＢＥで溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィによって、残渣を精製して、無色油（２７．６７ｇ、８０％）として表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｅ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）３８４．０／３８６．０［Ｍ＋Ｈ］。
【００５２】
調製物１７
（３ａＲ，５Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−５−（シクロプロポキシ）−１，３，３ａ，４，５，６−ヘキサヒドロシクロペンタ［ｃ］イソキサゾール
【化２５】
2018508544.tif 000027
スキーム２、ステップ５（脱保護）：無水ＴＨＦ（３３２ｍＬ）に１−［（３ａＲ，５Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−５−（シクロプロポキシ）−３ａ，４，５，６−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｃ］イソキサゾール−１−イル］エタノン（２７．６７ｇ、７２ｍｍｏｌ）を溶解し、−４５℃まで冷却する。−４０℃未満の内部温度を維持しながら、ヘキサン中１Ｍ水素化ジイソブチルアルミニウム（１０８ｍＬ、１０８ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加し、−４０℃〜−４５℃で１時間を撹拌する。低温メタノール（−４５℃、９ｍＬ）を低温反応混合物に添加し、冷却槽を除去する。５℃未満の内部温度を維持しながら、２Ｎ塩酸水溶液（３６ｍＬ、７２ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加する。混合物が周囲温度に到達した後、水（１５０ｍＬ）及び酢酸エチル（１５０ｍＬ）を添加し、５分間撹拌し、層を分離し、酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出する。硫酸ナトリウム上で組み合わされた有機抽出物を乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮して、淡黄色油（２３．１６ｇ、９４％）として表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｅ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）３４２．０／３４４．０［Ｍ＋Ｈ］。
【００５３】
調製物１８
［（１Ｒ，２Ｓ，４Ｓ）−２−アミノ−２−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−４−（シクロプロピルオキシ）シクロペンチル］メタノール
【化２６】
2018508544.tif 000028
スキーム２、ステップ５（開環）：酢酸（３０１ｍＬ）中に（３ａＲ，５Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−５−（シクロプロポキシ）−１，３，３ａ，４，５，６−ヘキサヒドロシクロペンタ［ｃ］イソキサゾール（２３．１６ｇ、６７．７ｍｍｏｌ）及び亜鉛粉末（２６．５５ｇ、４０６．１ｍｍｏｌ）を懸濁させ、窒素下で３時間、４０℃で撹拌する。周囲温度まで冷却し、酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈する。酢酸エチルで洗浄しながら、珪藻土を通じて濾過し、真空下で濾液を濃縮する。水（２００ｍＬ）、酢酸エチル（２５０ｍＬ）、及び２７％クエン酸水溶液（１２８ｍＬ）で希釈する。飽和炭酸ナトリウム水溶液（約５５０ｍＬ）でｐＨをｐＨ９〜１０に調節し、層を分離する。酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で水層を抽出し、硫酸ナトリウム上で組み合わされた有機抽出物を乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮して、淡黄色油（２４．５１ｇ、酢酸で汚染）として表題化合物を得る。さらなる精製なしで生成物を使用する。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｅ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）３４４．０／３４６．０（Ｍ＋Ｈ）。
【００５４】
調製物１９
Ｎ−［（４ａＲ，６Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−６−（シクロプロポキシ）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド
【化２７】
2018508544.tif 000029
スキーム２、ステップ６：０℃で、ベンゾイルイソチオシアネート（５．１３ｇ、３１．５ｍｍｏｌ）を、無水ＴＨＦ（１０３ｍＬ）中［（１Ｒ，２Ｓ，４Ｓ）−２−アミノ−２−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−４−（シクロプロピルオキシ）シクロペンチル］メタノール（１０．３１ｇ、２９．９５ｍｍｏｌ）の溶液に滴加する  。１５分間撹拌し、次いで、周囲温度まで１時間温める。１，１'−カルボニルジイミダゾール（５．９５ｇ、３５．９ｍｍｏｌ）を添加し、周囲温度で２時間、かつ７０℃で６時間撹拌する。周囲温度まで冷却し、酢酸エチル（１５０ｍＬ）及び水（１５０ｍＬ）で希釈する。２７％クエン酸水溶液（４５ｍＬ）を使用して、ｐＨをｐＨ＝３．５〜４．０に調節し、層を分離する。酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で水層を抽出し、水（２００ｍＬ）及び食塩水（１００ｍＬ）で、組み合わされた有機抽出物を洗浄する。硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮して、残渣を得る。イソヘキサン中０％〜４０％のＭＴＢＥで溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィによって、残渣を精製して、白色発泡体（１３．８９ｇ、９５％）として表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｅ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）４８９．０／４９１．０［Ｍ＋Ｈ］。
【００５５】
調製物２０
Ｎ−［（４ａＲ，６Ｓ，７ａＳ）−６−（シクロプロポキシ）−７ａ−［２−フルオロ−５−［（２，２，２−トリフルオロアセチル）アミノ］フェニル］−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド
【化２８】
2018508544.tif 000030
スキーム２、ステップ７：無水１，４−ジオキサン（１６７ｍＬ）中Ｎ−［（４ａＲ，６Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−６−（シクロプロポキシ）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（１３．８９ｇ、２８．４ｍｍｏｌ）の脱気溶液を、４オングストローム分子ふるい（２．２２ｇ）、２，２，２−トリフルオロアセトアミド（５．６２ｇ、４８．２ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（７．０６ｇ、５１．１ｍｍｏｌ）、（トランス、ラセミ）−Ｎ１，Ｎ２−ジメチルシクロヘキサン−１，２−ジアミン（１．２７ｇ、８．５ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（１．０８ｇ、５．６７ｍｍｏｌ）、及びヨウ化ナトリウム（７．２３ｇ、４８．２５ｍｍｏｌ）に添加し、得られた混合物を脱気する。混合物を撹拌し、窒素下で２２時間、１００〜１１０℃まで加熱する。完全な変換が達成されない場合、さらなる２，２，２−トリフルオロアセトアミド、炭酸カリウム（トランス、ラセミ）−Ｎ１，Ｎ２−ジメチルシクロヘキサン−１，２−ジアミン、及びヨウ化銅（Ｉ）が添加され得、加熱が継続される。反応混合物を周囲温度まで冷却し、酢酸エチル（１００ｍＬ）及び水（１００ｍＬ）で反応混合物を希釈し、次いで珪藻土を通じて濾過する。層を分離し、水（３×１００ｍＬ）及び食塩水（１００ｍＬ）で有機層を洗浄する。硫酸ナトリウム上で溶液を乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮して、残渣を得る。イソヘキサン中５％〜３５％の酢酸エチルで溶出するシリカゲルクロマトグラフィによって、残渣を精製して、白色固体（１０．０３ｇ、６８％）として表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ  ５２２．０（Ｍ＋Ｈ）。
【００５６】
調製物２１
（４ａＲ，６Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロフェニル）−６−（シクロプロピルオキシ）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロシクロペンタ［ｄ］［１，３］チアジン−２−アミン
【化２９】
2018508544.tif 000031
スキーム２、ステップ８：メタノール（１００ｍＬ）に、Ｎ−［（４ａＲ，６Ｓ，７ａＳ）−６−（シクロプロポキシ）−７ａ−［２−フルオロ−５−［（２，２，２−トリフルオロアセチル）アミノ］フェニル］−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（１０．０３ｇ、１９．２ｍｍｏｌ）を溶解し、５０％水酸化ナトリウム水溶液（５．４６ｍＬ、９６．２ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌し、窒素下で２０時間、４０℃まで加熱する。周囲温度まで冷却し、減圧下で有機溶媒の大部分を除去する。水（２００ｍＬ）及びＤＣＭ（３００ｍＬ）で希釈し、完全な溶解が生じるまで撹拌する。層を分離し、ＤＣＭ（２×１００ｍＬ）で水層を抽出する。水（４×１００ｍＬ）で組み合わされた有機抽出物を洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮して、淡黄色固体（４．６９ｇ、７６％）として表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ  ３２２．０（Ｍ＋Ｈ）。
【００５７】
実施例１
Ｎ−［３−［（４ａＲ，６Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（シクロプロポキシ）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド
【化３０】
2018508544.tif 000032
スキーム２、ステップ９：メタノール（１９ｍＬ）中（４ａＲ，６Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−６−（シクロプロポキシ）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］チアジン−２−アミン（３７０ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）の溶液を、５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボン酸（３５２ｍｇ、１．８４ｍｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（７５９ｍｇ、１．９６ｍｍｏｌ）に添加する。得られたスラリーを７０℃まで加熱し、１時間撹拌する。室温まで冷却し、メタノールで希釈して、１９．６ｍＬの全体積を作る。混合物を濾過し、逆相ＨＰＬＣ（水酸化アンモニウムでｐＨ９に調節される１０ｍＭ重炭酸アンモニウムを有する、ＣＨ３ＣＮ及び水、６０ｍＬ／ｍｉｎで９ｍｉｎにわたって３０％〜１００％のＣＨ３ＣＮ）によって精製して、溶媒蒸発の後に表題化合物（３４１ｍｇ、６０％）を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：１０．８６（ｓ，１Ｈ），９．５８（ｓ，１Ｈ），９．２２（ｓ，１Ｈ），９．２４（ｓ，１Ｈ），８．４９（ｓ，１Ｈ），７．７７−７．８４（ｍ，２Ｈ），７．１４（ｄｄ，Ｊ＝  ８．８，１２．７  Ｈｚ，１Ｈ），５．８４（ｂｒｏａｄ  ｓ，２Ｈ），４．２６（五重項、Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），３．２４−３．２９（ｍ，１Ｈ），２．８０−２．８１（ｍ，２Ｈ），２．３７−２．４５（ｍ，１Ｈ），２．０７−２．１４（ｍ，１Ｈ），１．８６−１．９６（ｍ，２Ｈ），０．４１−０．５０（ｍ，４Ｈ），ＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ  ４９５［Ｍ＋Ｈ］＋；ＯＲ［α］Ｄ２０＋１０９．６２（ｃ＝１０，ＣＨＣｌ３）．
【００５８】
インビトロアッセイ手順：
ＢＡＣＥ２よりもＢＡＣＥ１の選択性を評価するために、試験化合物は、以下に記載されるように、ＢＡＣＥ１及びＢＡＣＥ２に対して特定の基質を使用したＦＲＥＴベース酵素アッセイにおいて評価される。インビトロ酵素及び細胞アッセイのために、試験化合物は、ＤＭＳＯ中で調製されて、１０ｍＭ原液を構成する。原液は、ＤＭＳＯ中で順次に希釈されて、インビトロ酵素及び細胞アッセイを実施する前に、９６ウェル丸底プレート中で、１０μＭ〜０．０５ｎＭの範囲の最終化合物濃度を有する、１０点希釈曲線を得る。
【００５９】
インビトロプロテアーゼ阻害アッセイ：
ｈｕＢＡＣＥ１：Ｆｃ及びｈｕＢＡＣＥ２：Ｆｃの発現。
ヒトＢＡＣＥ１（受託番号：ＡＦ１９０７２５）及びヒトＢＡＣＥ２（受託番号：ＡＦ  ２０４９４４）は、ＲＴ−ＰＣＲによって全脳ｃＤＮＡからクローン化される。アミノ酸配列番号１〜４６０に対応するヌクレオチド配列は、ヒトＩｇＧ１（Ｆｃ）ポリペプチドをコードするｃＤＮＡに挿入される（Ｖａｓｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，７３５−７４２（１９９９））。それぞれｈｕＢＡＣＥ１：Ｆｃ及びｈｕＢＡＣＥ２：Ｆｃと名づけられた、ＢＡＣＥ１（１−４６０）またはＢＡＣＥ２（１−４６０）及びヒトＦｃのこの融合タンパク質は、ｐＪＢ０２ベクターに構成される。ヒトＢＡＣＥ１（１−４６０）：Ｆｃ（ｈｕＢＡＣＥ１：Ｆｃ）及びヒトＢＡＣＥ２（１−４６０）：Ｆｃ（ｈｕＢＡＣＥ２：Ｆｃ）は、ＨＥＫ２９３細胞内で一時的に発現する。各構築物の２５０μｇのｃＤＮＡは、Ｆｕｇｅｎｅ  ６と混合され、１リットルのＨＥＫ２９３細胞に添加される。トランスフェクションの４日後、条件培地は、精製のために採取される。ｈｕＢＡＣＥ１：Ｆｃ及びｈｕＢＡＣＥ２：Ｆｃは、以下に記載されるように、プロテインＡクロマトグラフィによって精製される。酵素は、小アリコートで−８０℃で貯蔵される。（Ｙａｎｇ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９１（６）１２４９−５９（２００４）を参照されたい。）
【００６０】
ｈｕＢＡＣＥ１：Ｆｃ及びｈｕＢＡＣＥ２：Ｆｃの精製。
ｈｕＢＡＣＥ１：ＦｃまたはｈｕＢＡＣＥ２：Ｆｃ  ｃＤＮＡで一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の条件培地は、回収される。細胞残屑は、０．２２μｍの滅菌フィルタを通じて条件培地を濾過することによって除去される。５ｍＬのプロテインＡ−アガロース（ベッド体積）が４リットルの条件培地に添加される。この混合物は、４℃で一晩優しく撹拌される。プロテインＡ−アガロース樹脂が回収され、低圧クロマトグラフィカラムに詰められる。カラムは、１時間当たり２０ｍＬの流速で、２０×ベッド体積のＰＢＳで洗浄される。結合したｈｕＢＡＣＥ１：ＦｃまたはｈｕＢＡＣＥ２：Ｆｃタンパク質は、１時間当たり２０ｍＬの流速で、５０ｍＭの酢酸、ｐＨ３．６で溶出される。溶離剤の１ｍＬの画分が、０．５ｍＬの２００ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ６．５ですぐに中和される。最終生成物の純度は、４〜２０％のＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける電気泳動によって評価される。酵素は、小アリコートで−８０℃で貯蔵される。
【００６１】
ＢＡＣＥ１  ＦＲＥＴアッセイ
試験化合物の連続希釈物が、上記の通り調製される。化合物は、ＫＨ２ＰＯ４緩衝液中でさらに２０×希釈される。１０μＬの各希釈物が、反応混合物（２５μＬの５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ４．６、１ｍＭ  ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、及びＡＰＰの配列に基づく１５μＭのＦＲＥＴ基質）を含む対応する低タンパク質結合ブラックプレートの列Ａ〜Ｈで各ウェルに添加される（Ｙａｎｇ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９１（６）１２４９−５９（２００４）を参照されたい）。含有物は、１０分間プレートシェーカー上で十分に混合される。ＫＨ２ＰＯ４緩衝液中１５μＬの２００ｐＭヒトＢＡＣＥ１（１−４６０）：Ｆｃ（Ｖａｓｓｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，７３５−７４１（１９９９）を参照されたい）が、基質及び試験化合物を含むプレートに添加されて、反応を開始する。０時間における混合物のＲＦＵは、プレートシェーカー上での短時間の混合後、励起波長３５５ｎｍ及び放出波長４６０ｎｍで記録される。反応プレートは、アルミホイルで被覆され、１６〜２４時間室温で、暗い加湿オーブン内で保持される。インキュベーションの終わりにおけるＲＦＵは、０時間において使用された同じ励起及び放出設定で記録される。０時間におけるＲＦＵとインキュベーションの終わりの差は、化合物処理下でのＢＡＣＥ１の活性を表す。ＲＦＵの差は、阻害剤濃度に対してプロットされ、曲線は、ＩＣ５０値を得るために、４パラメータロジスティック方程式に適合される。（Ｍａｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，３１，１６５０７−１６５１６（２０１１））。
【００６２】
本明細書の実施例１の化合物は、本質的に上記の通り試験され、０．９５５±０．０９３ｎＭのＢＡＣＥ１に対するＩＣ５０、ｎ＝６、平均±ＳＥＭ、ＳＥＭ＝標準誤差を示す。このデータは、実施例１の化合物が、インビトロで、精製された組み換えＢＡＣＥ１酵素活性を阻害することを実証する。
【００６３】
ＢＡＣＥ２  ＴＭＥＭ２７  ＦＲＥＴアッセイ
膜貫通タンパク質２７（ＴＭＥＭ２７）（受託番号ＮＭ＿０２０６６５）コレクトリンとしても既知）は、ＢＡＣＥ１ではなくＢＡＣＥ２に対する近年記載された基質である（Ｅｓｔｅｒｈａｚｙ，ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，１４，３６５−３７７（２０１１））。ＢＡＣＥ２酵素活性の阻害に関して試験化合物を評価するために、ヒトＴＭＥＭ２７のアミノ酸配列に基づくＦＲＥＴペプチド（ｄａｂｃｙｌ−ＱＴＬＥＦＬＫＩＰＳ−ＬｕｃＹ）が基質として使用される（Ｅｓｔｅｒｈａｚｙ，ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，１４，３６５−３７７（２０１１））。試験化合物の連続希釈物が、上記の通り調製される。化合物は、ＫＨ２ＰＯ４緩衝液中でさらに２０×希釈される。１０μＬの各希釈物が、反応混合物（２５μＬの５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ４．６、１ｍＭ  ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、及び５μＭのＴＭＥＭ  ＦＲＥＴ基質）を含む対応する低タンパク質結合ブラックプレートの列Ａ〜Ｈで各ウェルに添加される。次いで、ＫＨ２ＰＯ４緩衝液中１５μＬの２０μＭヒトＢＡＣＥ２（１−４６０）：Ｆｃ（Ｖａｓｓｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，７３５−７４１（１９９９）を参照されたい）が、基質及び試験化合物を含むプレートに添加されて、反応を開始する。含有物は、１０分間プレートシェーカー上で十分に混合される。０時間における混合物のＲＦＵは、励起波長４３０ｎｍ及び放出波長５３５ｎｍで記録される。反応プレートは、アルミホイルで被覆され、１６〜２４時間室温で、暗い加湿オーブン内で保持される。インキュベーションの終わりにおけるＲＦＵは、０時間において使用された同じ励起及び放出設定で記録される。０時間におけるＲＦＵとインキュベーションの終わりの差は、化合物処理下でのＢＡＣＥ２の活性を表す。ＲＦＵの差は、阻害剤濃度に対してプロットされ、曲線は、ＩＣ５０値を得るために、４パラメータロジスティック方程式に適合される。（Ｍａｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，３１，１６５０７−１６５１６（２０１１））。
【００６４】
本明細書の実施例１の化合物は、本質的に上記の通り試験され、８７．３±１１．１ｎＭのＢＡＣＥ２  ＩＣ５０、、ｎ＝４、平均±ＳＥＭ、ＳＥＭ＝標準誤差を示す。実施例１に関するＢＡＣＥ２（ＴＭＥＭ２７  ＦＲＥＴ  ＩＣ５０アッセイ）に対するＢＡＣＥ１（ＦＲＥＴ  ＩＣ５０酵素アッセイ）の比は、約９１倍であり、ＢＡＣＥ１酵素を阻害するための機能的選択性を示す。上記のデータは、実施例１の化合物がＢＡＣＥ２よりもＢＡＣＥ１に対して選択的であることを実証する。
【００６５】
ＳＨ−ＳＹ５ＹＡＰＰ６９５Ｗｔ全細胞アッセイ
ＢＡＣＥ１活性の阻害の測定のための慣習的な全細胞アッセイは、ヒトＡＰＰ６９５Ｗｔ  ｃＤＮＡを安定的に発現させる、ヒト神経芽腫細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ２２６６）を利用する。細胞は、最大６代まで継代するために慣習的に使用され、次いで廃棄される。
【００６６】
ＳＨ−ＳＹ５ＹＡＰＰ６９５Ｗｔ細胞は、２００μＬの培養培地（１０％ＦＢＳを含有する、５０％ＭＥＭ／ＥＢＳＳ及びＨａｍ’ｓ  Ｆ１２、１×各ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、ならびに重炭酸ナトリウム）中、５．０×１０４細胞／ウェルで、９６ウェル組織培養プレートで平板培養される。翌日、培地を細胞から除去し、新鮮培地が添加され、次いで、所望の濃度範囲において、試験化合物の存在／非存在下で、３７℃で２４時間インキュベートされる。
【００６７】
インキュベーションの終わりに、条件培地は、特異的サンドイッチＥＬＩＳＡによるＡｂｅｔａペプチド１−４０及び１−４２の分析によって、ベータ−セクレターゼ活性の証拠に関して分析される。Ａｂｅｔａのこれらの特異的イソ型を測定するために、モノクローナル２Ｇ３が、Ａｂｅｔａ  １−４０のための捕捉抗体として使用され、モノクローナル２１Ｆ１２が、Ａｂｅｔａ  １−４２のための捕捉抗体として使用される。Ａｂｅｔａ  １−４０及びＡｂｅｔａ  １−４２ＥＬＩＳＡの両方が、レポーティング抗体としてビオチン化３Ｄ６を使用する（抗体の説明のために、Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４，１５５０−１５５５（１９９７）を参照されたい）。化合物処理後に条件培地中に放出されたＡｂｅｔａの濃度は、そのような条件下でＢＡＣＥ１の活性に対応する。１０点阻害曲線がプロットされ、４パラメータロジスティック方程式に適合されて、Ａｂｅｔａ低下効果に対するＩＣ５０値を得る。実施例１の化合物は、本質的に上記の通り試験され、ＳＨ−ＳＹ５ＹＡＰＰ６９５Ｗｔ  Ａ−ｂｅｔａ（１−４０）ＥＬＩＳＡに対して、０．３８±０．１４  ｎＭのＩＣ５０、ｎ＝４、及びＳＨ−ＳＹ５ＹＡＰＰ６９５Ｗｔ  Ａ−ｂｅｔａ（１−４２）  ＥＬＩＳＡに対して、０．４３±０．０８ｎＭのＩＣ５０、ｎ＝３（平均＋ＳＥＭ、ＳＥＭ＝標準誤差）を示す。上記のデータは、実施例１の化合物が全細胞アッセイにおいてＢＡＣＥ１を阻害することを実証する。
【００６８】
ベータ−セクレターゼのインビボ阻害
マウス、モルモット、イヌ、及びサルを含むいくつかの動物モデルが、化合物処理後のインビボでのベータ−セクレターゼ活性の阻害に関してスクリーニングするために使用され得る。本発明で使用される動物は、野生型、トランスジェニック、または遺伝子ノックアウト動物であってもよい。例えば、Ｇａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７３，５２３−５２７（１９９５）に記載されるように調製されたＰＤＡＰＰマウスモデル、及び他の非トランスジェニックまたは遺伝子ノックアウト動物は、阻害化合物の存在下でＡｂｅｔａ及びｓＡＰＰｂｅｔａ産生のインビボ阻害を分析するために有用である。概して、２ヶ月齢のＰＤＡＰＰマウス、遺伝子ノックアウトマウス、または非トランスジェニック動物は、経口、皮下、静脈内、給餌、または他の投与経路を介して、トウモロコシ油、ベータ−シクロデキストリン、リン酸緩衝液、ＰＨＡＲＭＡＳＯＬＶＥ（登録商標）、または他の好適な媒体などの媒体中で製剤化された化合物が投与される。化合物の投与の１〜２４時間後、動物は屠殺され、脳はＡｂｅｔａ  １−ｘの分析のために除去される。本明細書で使用される場合、「Ａｂｅｔａ  １−ｘ」は、残基１で開始し、残基２８よりも大きいＣ末端で終端する、Ａｂｅｔａ種の合計を指す。これは、Ａｂｅｔａ種の過半数を検出し、多くの場合「全Ａｂｅｔａ」と呼ばれる。全Ａｂｅｔａペプチド（Ａｂｅｔａ  １−ｘ）レベルは、モノクローナル２６６を捕捉抗体として、及びビオチン化３Ｄ６をレポーティング抗体として使用した、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定される。（Ｍａｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，３１，１６５０７−１６５１６（２０１１）を参照されたい）。
【００６９】
急性試験のために、化合物または適切な媒体が投与され、動物は投与の約３時間後に屠殺される。脳組織は、選択された動物から得られ、Ａｂｅｔａ  １−ｘの存在に関して分析される。慢性投与後、より高齢のＡＰＰトランスジェニック動物の脳組織はまた、化合物処理後のベータ−アミロイドプラークの量に関して分析され得る。
【００７０】
阻害化合物が投与された動物（ＰＤＡＰＰまたは他のＡＰＰトランスジェニックもしくは非トランスジェニックマウス）は、媒体処理された対照または０時間の対照と比較して、脳組織内でＡｂｅｔａの低減を実証し得る。実施例１に関して、若齢雌ＰＤＡＰＰマウスへの化合物の３、１０、及び３０ｍｇ／ｋｇの経口投与の３時間後、Ａｂｅｔａ  １−ｘペプチドレベルは、媒体処理されたマウスと比較して、脳海馬内で約２２％、４２％、及び５１％、ならびに大脳皮質内で２６％、４３％、及び５９％低減される、ｐ＜０．０１。
【００７１】
インビトロのＢＡＣＥ酵素に対する実施例１の活性を所与として、これらのＡｂｅｔａ低下効果は、インビボのＢＡＣＥ阻害と一致し、実施例１のＣＮＳ透過をさらに実証する。
【００７２】
これらの研究は、本発明の化合物がＢＡＣＥを阻害し、したがってＡｂｅｔａレベルを低減するのに有用であることを示す。
【国際調査報告】
2018508544.tif 000037
2018508544.tif 000038