(57)【要約】  コアおよび複数のプローブ要素を含むプローブであって、複数のプローブ要素内の各プローブ要素はコアから伸長しており、フルオロフォアおよび結合部分を含む、プローブが提供される。プローブの使用の方法およびプローブを含むキットも提供される。
2018501780.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コアおよび複数のプローブ要素を含むプローブであって、複数のプローブ要素内の各プローブ要素はコアから伸長しており、フルオロフォアおよび結合部分を含む、プローブ。
【請求項２】
複数のプローブ要素が、少なくとも３つのプローブ要素を含む、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
結合部分が、細菌結合部分であり、少なくとも一部の細菌と選択的に結合するが、哺乳動物細胞などの動物細胞とは結合しないか、または極めて弱くしか結合しない、請求項１または２のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項４】
結合部分が、真菌結合部分である、請求項１または２のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項５】
結合部分が、少なくとも一部の細菌および少なくとも一部の真菌と選択的に結合するが、哺乳動物細胞などの動物細胞とは結合しないか、または極めて弱くしか結合しない場合もある、請求項１から４のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項６】
１つまたは複数のプローブ要素の結合部分が、完全長ユビキシジン（配列番号１）などのユビキシジン部分またはそのフラグメントもしくはバリアントである、請求項３または５に記載のプローブ。
【請求項７】
結合部分が、アミノ酸２９から４１のユビキシジンフラグメント（ＵＢＩ２９〜４１、配列番号２）である、請求項６に記載のプローブ。
【請求項８】
結合部分が、元のメチオニンアミノ酸に対するノルロイシンアミノ酸の置換を含むＵＢＩ２９〜４１（ＵＢＩ２９〜４１Ｎｌｅ、配列番号３）である、請求項６に記載のプローブ。
【請求項９】
１つまたは複数のプローブ要素の結合部分が、グラム陰性細菌と選択的に結合するが、実質的にグラム陽性細菌とは結合しない、請求項１から８のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項１０】
１つまたは複数のプローブ要素の結合部分が、完全長ポリミキシン（配列番号４）などのポリミキシン部分またはそのフラグメントもしくはバリアントである、請求項９に記載のプローブ。
【請求項１１】
複数のプローブ要素内の各プローブ要素が、同じフルオロフォアを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項１２】
各プローブ要素が、異なるフルオロフォアを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項１３】
複数のプローブ要素内の各プローブ要素のフルオロフォアが、フルオロフォアの蛍光の強度または量子収率がフルオロフォアの周囲環境に依存するような環境感受性フルオロフォアである、請求項１から１２のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項１４】
フルオロフォアの量子収率または強度が、細胞膜内などの疎水性環境においてより高い、請求項１３に記載のプローブ。
【請求項１５】
複数のプローブ要素内の１つまたは複数のプローブ要素のフルオロフォアが、７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、マラカイトグリーン、スチリルベースの染料、カスケードイエロー、プロダン（別名１−プロパノン、１−（６−（ジメチルアミノ）−２−ナフタレニル）、ダンシル（別名５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホニル）、Ｄａｐｏｘｙｌ、ＰｙＭＰＯ（別名１−（３−（スクシンイミジルオキシカルボニル）ベンジル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウム）、ピレンおよびジエチルアミノクマリンまたはその誘導体もしくはバリアントである、請求項１から１４のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項１６】
複数のプローブ要素内の少なくとも１つのプローブ要素のフルオロフォアが、ＮＢＤ部分である、請求項１５に記載のプローブ。
【請求項１７】
複数のプローブ要素内の各プローブ要素のフルオロフォアが、ＮＢＤ部分である、請求項１６に記載のプローブ。
【請求項１８】
複数のプローブ要素内のプローブ要素のうち１つまたは複数のフルオロフォアが、長い蛍光寿命を有し、フルオロフォアの長い蛍光寿命が、バックグラウンドの自家蛍光を上回ってプローブの検出を可能にする、請求項１から１２のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項１９】
フルオロフォアが、アザジオキサトリアングレン（ＡＤＯＴＡ）染料もしくはジアザオキサトリアングレン（ＤＡＯＴＡ）またはその誘導体である、請求項１８に記載のプローブ。
【請求項２０】
第１および／または第２のフルオロフォアが、近赤外または赤外領域のスペクトルで光を発する、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
フルオロフォアが、光音響イメージングにより検出可能である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
複数のプローブ要素内の隣接するプローブ要素の１つまたは複数のフルオロフォアが、プローブの１つまたは複数の他のフルオロフォアの蛍光を消光することができる、請求項１から２１のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項２３】
プローブの環境が変化するとき、自己消光が妨げられるか、または低減される、請求項２２に記載のプローブ。
【請求項２４】
結合部分が、コアから最も遠いプローブ要素の遠位端にある、請求項１から２３のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項２５】
結合部分が、プローブ要素の近位端にあり、コアに隣接し、プローブ要素のフルオロフォアが、結合部分を介してコアと連結する、請求項１から２３のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項２６】
結合部分およびプローブ要素のフルオロフォアが、一般的な連結部によってコアと連結され、結合部分およびフルオロフォアのそれぞれは、連結部から離れるように伸長している、請求項１から２５のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項２７】
フルオロフォアが、結合部分と直接連結されている、請求項２５に記載のプローブ。
【請求項２８】
フルオロフォアが、スペーサーによって結合部分と連結されている、請求項２５に記載のプローブ。
【請求項２９】
スペーサーが、ペプチド、飽和もしくは不飽和炭化水素鎖、エーテル、ポリマー、ポリエチルグリコール（ＰＥＧ）、ポリグリコール、ポリエーテルまたは類似物である、請求項２８に記載のプローブ。
【請求項３０】
プローブが、切断可能なリンカーによってコアと連結されたクエンチャーを含み、複数のプローブ要素内の１つまたは複数のプローブ要素のフルオロフォアは、コアが切断可能なリンカーによってクエンチャーと連結されている場合、クエンチャーによって実質的に蛍光消光され、切断可能なリンカーが切断されると、コアはクエンチャーから分離され、それにより複数のプローブ要素も分離される、請求項１から２９のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項３１】
リンカーが、複数のプローブ要素のうちの少なくとも１つのフルオロフォアに、クエンチャーがフルオロフォアを消光する程度に十分に近くになるような寸法を有する、請求項３０に記載のプローブ。
【請求項３２】
プローブが、コアと連結されたクエンチャーを含み、複数のプローブ要素が、切断可能なリンカーによってコアと連結され、複数のプローブ要素内の１つまたは複数のプローブ要素のフルオロフォアが、複数のプローブ要素内のそのまたは各々のプローブ要素が切断可能なリンカーによってコアと、それによりクエンチャーと連結されている場合、クエンチャーによって実質的に蛍光消光され、コアは、切断可能なリンカーが切断されると複数のプローブ要素から分離され、それによりクエンチャーも分離される、請求項１から２９のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項３３】
切断可能なリンカーが、酵素切断可能なペプチド配列を含み、リンカーは、切断酵素が酵素切断可能なペプチド配列を切断すると切断される、請求項１から３２のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項３４】
切断酵素がエラスターゼであり、酵素切断可能なペプチド配列の切断がエラスターゼの存在を示す、請求項３３に記載のプローブ。
【請求項３５】
エラスターゼの存在が、好中球の存在を示す、請求項３４に記載のプローブ。
【請求項３６】
酵素切断可能なペプチドリンカーが、切断酵素のある切断部位であるかまたは特定の切断部位であるペプチド配列である、請求項３３から３５のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項３７】
切断酵素が、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、プロテイナーゼ３、カテプシンＧまたはカスパーゼである、請求項３３に記載のプローブ。
【請求項３８】
切断可能なリンカーが、反応性酸素種によって切断される、請求項１から３２のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項３９】
クエンチャーが、ダーククエンチャーである、請求項３０から３８のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項４０】
クエンチャーが、メチルレッド、ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸（ＤＡＢＳＹＬ）、Ｉｏｗａ  ｂｌａｃｋ  ＦＱもしくはＩｏｗａ  ｂｌａｃｋ  ＲＱ、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２またはＢＨＱ３である、請求項３９に記載のプローブ。
【請求項４１】
クエンチャーが、蛍光クエンチャーである、請求項３０から３８のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項４２】
クエンチャーが、ローダミン、テトラメチルローダミンもしくはその誘導体（例えば、カルボキシテトラメチルローダミンすなわちＴＡＭＲＡ）、フルオレセインもしくはその誘導体、シアニンフルオロフォアまたはボロンジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）フルオロフォアである、請求項４１に記載のプローブ。
【請求項４３】
クエンチャーが、好中球を標識するように適合される、請求項４１または４２に記載のプローブ。
【請求項４４】
プローブが、二次標識を含む、請求項１から４３のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項４５】
二次標識が、フルオロフォア、放射性標識または磁気共鳴標識である、請求項４４に記載のプローブ。
【請求項４６】
標的種によって内部に取り入れられるように適合されたターゲティング要素を含む、請求項１から４５のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項４７】
標的種が、好中球である、請求項４６に記載のプローブ。
【請求項４８】
ターゲティング要素が、Ｃｙ５もしくはその誘導体またはフルオレセインもしくはその誘導体を含む、請求項４６または４７に記載のプローブ。
【請求項４９】
プローブが、以下の構造：
【化１】
2018501780.tif 000025
のうちの１つを有し、式中、
Ｌ＝スペーサー基（例えば、Ｃ３〜Ｃ１０アルキル、（（ＣＨ２）２Ｏ）ｘであり、ここでｘ＝１〜６である）
Ｆ＝フルオロフォア（例えば、ＮＢＤ、フルオレセイン）
Ｂ＝結合部分（例えば、ユビキシジン部分、ポリミキシン部分）
Ｃ＝コア（例えば、炭素、−Ｃ（ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）３）３、ＮＨ２ＣＯＮＨＣ（ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）３）３）
である、請求項１から４８のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項５０】
プローブが、コアに連結された３つのプローブ要素を含み、各プローブ要素が、ＮＢＤ−（ＣＨ２）５ＣＯ−ＵＢＩＮｌｅを含む、請求項４９に記載のプローブ。
【請求項５１】
プローブが、コアに連結された３つのプローブ要素を含み、３つのプローブ要素のそれぞれが、ＮＢＤ−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ２−ＰＭＸを含む、請求項４９に記載のプローブ。
【請求項５２】
プローブが、構造：
【化２】
2018501780.tif 000026
を有する、請求項４９に記載のプローブ。
【請求項５３】
標的領域において細菌および／または真菌を検出する方法であって、
（１）請求項１から５２のいずれか一項に記載の第１のプローブを準備するステップと、
（２）第１のプローブを標的領域に送達するステップと、
（３）適した波長の光を標的領域に照射して、第１のプローブのフルオロフォアを励起するステップと、
（４）第１のプローブが標的領域内の細菌および／または真菌を標識したかどうかを判定するステップと
を含む、方法。
【請求項５４】
標的領域が、患者内の組織であり、方法がインビボにおいて行われる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
標的領域は、細胞培養物、生検サンプルなどの組織サンプル、体液サンプルなどの液体サンプルまたはカテーテルもしくはインプラントなどの医療機器の一部であり、方法がインビトロにおいて行われる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
第１のプローブが切断可能なリンカーを含み、切断因子が切断酵素である、請求項５３から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
切断酵素が、エラスターゼである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
細菌または真菌の標識化を伴わない第１のプローブの有意な蛍光が、無菌性炎症を示し、細菌または真菌の標識化を伴うプローブの有意な蛍光が、それぞれ細菌性炎症または真菌性炎症を示す、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
方法が、臨床医によってその場（インサイチュ）でポイントオブケアにおいて行われてもよく、細菌および／または真菌が標的領域に存在するかどうかを判定する、請求項５３から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
請求項１から５２のいずれか一項に記載の、細菌の亜集団と特異的に結合する結合部分を含む第２のプローブを準備するステップと、第２のプローブを標的領域に送達するステップと、適した波長の光を標的領域に照射して、第２のプローブの、そのまたは各々のフルオロフォアを励起するステップとを含む、請求項５３から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
第１のプローブが、結合部分として完全長ユビキシジンなどのユビキシジン部分またはそのフラグメントもしくはバリアントを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
第２のプローブが、結合部分として完全長ポリミキシンなどのポリミキシン部分またはそのフラグメントもしくはバリアントを含み、第２のプローブが、グラム陰性細菌と選択的に結合してもよい、請求項６０または６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
第１のプローブが、ユビキシジン部分を含み、方法が、無菌性炎症、細菌性炎症および／または真菌性炎症ならびにグラム陰性細菌感染（および推測によって、グラム陽性細菌感染）の同定を可能にする、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
蛍光下において標的領域を観察して、標的領域において同定されたいずれかの感染体（細菌または真菌）の形態を判定するステップを含む、請求項５３から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
標的領域において細菌および／または真菌を同定または標識するための、請求項１から５２のいずれか一項に記載のプローブの使用。
【請求項６６】
請求項１から５２のいずれか一項に記載の第１のプローブが、標的領域において細菌および／または真菌を同定または標識するために使用され、請求項１から５２のいずれか一項に記載の第２のプローブが、同定または標識された細菌がグラム陰性細菌であるか、またはグラム陽性細菌であるかを判定するために使用され、第１のプローブの少なくとも１つの結合部分が、細菌および／または真菌と特異的に結合し、第２のプローブの少なくとも１つの結合部分が、グラム陰性細菌またはグラム陽性細菌と特異的に結合する、請求項６５に記載の使用。
【請求項６７】
請求項１から５２のいずれか一項に記載の１つまたは複数のプローブおよびプローブを分散させることが可能な適した緩衝剤を含む、キットオブパーツ。
【請求項６８】
請求項１から５２のいずれか一項に記載の、細菌および／または真菌と特異的に結合する少なくとも１つの結合部分を含む第１のプローブ、ならびに請求項１から５２のいずれか一項に記載の、グラム陰性細菌またはグラム陽性細菌と特異的に結合する少なくとも１つの結合部分を含む第２のプローブを含む、請求項６７に記載のキットオブパーツ。
【請求項６９】
第１のプローブが少なくとも１つのユビキシジン部分を含み、第２のプローブは少なくとも１つのポリミキシン部分を含む、請求項６８に記載のキットオブパーツ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子プローブの分野に関し、より詳細には、細菌および真菌などの微生物の検出のための分子プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
世界中で細菌による感染症の負担が増大しており、正確な診断が、正確な治療を提供することに対する土台であり続けている。
【０００３】
病院内の患者、広範には医療を受けている患者は、細菌による感染症のリスクがある。院内感染症（院内感染症（ＨＡＩ））は、さらに一般的になってきており、そのような感染症に速やかに、正確に反応する能力がより重要になりつつある。患者が有効で健康な免疫系を有する場合、院内感染症（ＨＡＩ）によって引き起こされる危険性は低減される。しかしながら、重症な患者の免疫系は少なくとも部分的に損なわれていることが多く、そのため患者は特に院内感染症（ＨＡＩ）にかかりやすくなる。
【０００４】
救命医療において人工呼吸されている患者および実際にすべての免疫不全患者は特に院内感染症（ＨＡＩ）にかかりやすく、最も甚大な被害をもたらす院内感染症（ＨＡＩ）のうちの１つは、依然として人工呼吸器関連肺炎（人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ））である。人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）は依然として正確に診断するのが難しいことで知られており、不適切な治療が患者にとって有害であることも示されている。それゆえに、人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）は、高い死亡率、著しい罹患率を有し、医療資源にとって負担であり続けている。診断に関して、肺生検が依然として最も認められた手段であり、これは、侵襲的で、検査の固有の侵襲的な性質によりめったに利用されない検査である。気管支肺胞洗浄などの他の方法が依然として議論の余地があると同時に、非培養法はいかなる顕著な影響または強い確証も得られていない。発熱、酸素依存の増加および頻脈の臨床徴候が依然として炎症または急性肺傷害を検出する非特異的な手段であるため、速やかな医療決断が行われるのを可能にし、適切な療法により患者の転帰を向上させる、正確で適時の人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）の診断を可能にする代替的なアプローチが必要とされる。
【０００５】
現在、臨床医は、いつ抗生物質治療を開始するか、および開始するか否か、使用する薬剤の選択ならびに治療を開始した場合、いつ療法を徐々に減らすのかに関して著しい不確実さに直面している。これらの問題は、抗生物質療法の遅れおよび不十分さと、臨床転帰の悪さとの間に関連性が証明されたため、有効な抗生物質管理に対して障害となる。
【０００６】
分子イメージング技術は、細菌の特異的なトレーサーの使用を可能にし、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）などのイメージング様式と組み合わされた場合、無菌部位から感染部位を視覚的に示す能力を有する可能性がある。しかしながら、このアプローチは、ポイントオブケア診断検査が必要とされると予想される集中治療コホートなどの一部の患者群には適用できず、放射性薬剤の投与が問題となり、制限される場合がある。これらの技術はまた放射線を伴い、病院外の環境でのイメージングに容易に適用できない。
【０００７】
当該技術分野における代替的なアプローチは、内視鏡の使用により患者の標的領域の直接的な可視化を可能にする光プローブの適用である。Ｖｉｓｅｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．名義のＷＯ２００３／０７９０１５は、変化した代謝活動に関して正常組織および患部組織を同定し、特徴づけるための光学イメージングプローブについて開示している。
【０００８】
本出願人名義のＷＯ２０１２／１３６９５８は、特定の細胞タイプに染料が内在化すると蛍光の増加によりインビボで細胞を視覚化することが可能な分岐染料（ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｄｙｅ）について開示している。
【０００９】
しかしながら、患者の状態が感染症によるものであるかどうか、そうである場合、何が感染症の原因因子であるかのその場（インサイチュ）でのポイントオブケア判定を可能にする改良された光プローブおよびイメージング方法が依然として必要とされている。
【００１０】
さらに、例えば、サーファクタントの存在下においてなど厳しい条件の間に標的細胞膜に保持される改良された光プローブが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、本発明の目的は、迅速で正確なポイントオブケア診断に適した改良されたプローブおよびイメージング方法を提供すること、およびその標的によってさらに良好に保持される光プローブを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第１の態様によると、コアおよび複数のプローブ要素を含むプローブであって、複数のプローブ要素内の各プローブ要素はコアから伸長しており、フルオロフォアおよび結合部分を含む、プローブが提供される。
【００１３】
使用中、本発明のプローブは、一般に標的領域に送達され、標的領域内のいずれかの細菌と結合する。好ましくは、各々の複数のプローブ要素結合部分は、細菌と結合するために利用することができ、その結果、標的領域に細菌が存在する場合、プローブは、それぞれの、もしくは少なくとも大部分の複数のプローブ要素の結合部分によって細菌と結合する。
【００１４】
当該技術分野において公知の光プローブは、一般に厳しい条件のためにプローブの分解もしくは酸化および／またはプロテアーゼの破壊を引き起こす可能性があるインビボの標的領域において十分に保持されず、結果として、プローブは、標的の確実な検出を可能にするそれらの標的と結合した状態を保つことができない。例えば、サーファクタント濃度が高い肺内のイメージングに使用される光プローブは、一般にそれらの標的を検出させることができない。肺内のさらなる問題としては、そのなかの循環体液によってプローブが「洗い流されること」が挙げられる。
【００１５】
驚くべきことに、本発明者らは、本発明のプローブが当該技術分野において公知のプローブよりも酸化、分解およびプロテアーゼ活性に対してより安定であり、そのようなプローブは、肺で見られる条件などの厳しい条件であってもインビボにおいて細菌を確実に検出可能にすることを発見した。
【００１６】
「コア」という用語は、単一のユニットを形成するために複数のプローブ要素をつなぐ共有部分を指す。それゆえに、コアは、単原子であってもよく、あるいは官能基、飽和もしくは不飽和炭化水素鎖またはポリグリゴール（直鎖、分岐もしくは環式）、ペプチド配列またはポリマーを含んでいてもよい。
【００１７】
好ましくは、複数のプローブ要素は、少なくとも２つのプローブ要素、少なくとも３つのプローブ要素、少なくとも４つのプローブ要素または少なくとも５つのプローブ要素を含む。例えば、複数のプローブ要素は、３つのプローブ要素を含んでもよい。
【００１８】
結合部分は、少なくとも一部の細菌と選択的に結合するが、例えば、哺乳動物細胞などの動物細胞とは結合しないか、または極めて弱くしか結合しない場合もある。それゆえに、結合部分は、細菌結合部分であってもよい。細菌結合部分は、実質的にすべての細菌と結合するが、動物細胞とは結合しないか、または極めて弱くしか結合しない場合もある。細菌結合部分は、実質的にグラム陰性細菌と選択的に結合するが、グラム陽性細菌もしくは哺乳動物細胞などの動物細胞とは結合しないか、または極めて弱くしか結合しない場合もある。
【００１９】
結合部分は、真菌と選択的に結合するが、例えば、哺乳動物細胞などの動物細胞とは結合しない。それゆえに、結合部分は、真菌結合部分であってもよく、真菌糸と結合してもよい。
【００２０】
結合部分は、少なくとも一部の細菌および少なくとも一部の真菌と選択的に結合するが、哺乳動物細胞などの動物細胞とは結合しい場合もある。それゆえに、プローブは、標的領域において真菌および／または細菌の検出を可能にすることができる。例えば、結合部分は、アスペルギルス・フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の真菌糸と結合するように適合されていてもよい。
【００２１】
１つまたは複数のプローブ要素の結合部分は、完全長ユビキシジン（配列番号１）などのユビキシジン部分またはそのフラグメントもしくはバリアントであってもよい。結合部分は、ユビキシジンの少なくとも１０個の連続したアミノ酸または少なくとも１２個の連続したアミノ酸を含むユビキシジンのフラグメントであってもよい。例えば、結合部分は、アミノ酸２９から４１のユビキシジンフラグメントであってもよい（ＵＢＩ２９〜４１、配列番号２）。結合部分は、１つまたは複数の置換を含むユビキシジン部分であってもよい。そのまたは各々の置換は、保存的置換であってもよく、ユビキシジンの細菌結合性への影響がほとんどないか、または好ましくはまったくない。そのまたは各々の置換は、分解または酸化に対するユビキシジン部分の安定性をもたらす可能性がある。例えば、結合部分は、元のメチオニンアミノ酸に対するノルロイシンアミノ酸の置換を含むＵＢＩ２９〜４１であってもよい（ＵＢＩ２９〜４１Ｎｌｅ、配列番号３）。
【００２２】
ユビキシジンは、気管上皮細胞、腸粘膜およびマクロファージに存在する哺乳動物の抗菌性ペプチドである。ユビキシジンは、細菌などの原核生物の細胞膜と特異的に結合するが、哺乳動物細胞とは結合しない。
【００２３】
１つまたは複数のプローブ要素の結合部分は、グラム陽性細菌と選択的に結合してもよく、実質的にグラム陰性細菌と結合しなくてもよい。好ましくは、１つまたは複数のプローブ要素の結合部分は、グラム陰性細菌と選択的に結合するが、実質的にグラム陽性細菌とは結合しない。それゆえに、１つまたは複数のプローブ要素の結合部分がグラム陰性細菌と選択的に結合する実施形態において、本発明のプローブは、グラム陰性細菌を含まない標的領域にランダムに分散させてもよく、標的領域に存在するあらゆるグラム陰性細菌の細胞膜に局在させてもよい。したがって、本発明のプローブは、標的領域におけるグラム陰性細菌の存在または不在を選択的に示すように適合されてもよい。
【００２４】
例えば、１つまたは複数のプローブ要素の結合部分は、完全長ポリミキシン（配列番号４）などのポリミキシン部分またはそのフラグメントもしくはバリアントであってもよい。ポリミキシンはグラム陰性細菌と選択的に結合するため、ポリミキシン部分を含む細菌結合部分は、選択的にそれぞれのプローブ要素をグラム陰性細菌のみと結合させることになり、それにより標的領域内のあらゆるグラム陰性細菌の検出を可能にする。結合部分は、ポリミキシンの少なくとも６個の連続したアミノ酸または少なくとも８個の連続したアミノ酸を含むポリミキシンのフラグメントであってもよい。結合部分は、１つまたは複数の置換を含むポリミキシン部分であってもよい。そのまたは各々の置換は、保存的置換であってもよく、ポリミキシン部分のグラム陰性細菌結合性に対する影響がほとんどないか、好ましくはまったくない。そのまたは各々の置換は、分解または酸化に対するポリミキシン部分の安定性の増加をもたらす可能性がある。
【００２５】
結合部分は、少なくとも一部の真菌と結合するように適合されてもよい。結合部分は、真菌糸と結合するように適合されてもよい。例えば、結合部分は、アスペルギルス・フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の真菌糸と結合するように適合されてもよい。
【００２６】
したがって、本発明のプローブは、真菌を標識するために使用されてもよい。例えば、本発明のプローブは、標的領域に送達されてもよく、プローブは、標的領域のあらゆる細菌または真菌糸と結合してもよい。標的領域が複数の細菌結合プローブのそのまたは各フルオロフォアを励起するのに適した波長の光で照射するとき、標的領域内のあらゆる細菌および／または真菌が標識されることになる。細菌は、例えば、真菌糸と視覚的に区別されてもよい。
【００２７】
したがって、本発明のプローブは、例えば、細菌感染または真菌感染を判定するために使用されてもよい。
【００２８】
複数のプローブ要素内の各プローブ要素は、同じフルオロフォアを含むことが好ましい。
【００２９】
しかしながら、本発明の代替的実施形態は、異なるフルオロフォアを有するプローブ要素を含んでもよい。例えば、本発明のプローブは３つのプローブ要素を含んでもよく、第１のプローブ要素は第１のフルオロフォアを含んでもよく、第２のプローブ要素は第２のフルオロフォアを含んでもよく、第３のプローブ要素は第３のフルオロフォアを含んでもよい。
【００３０】
好ましくは、複数のプローブ要素内の各プローブ要素のフルオロフォアは、環境感受性フルオロフォアであり、その結果、フルオロフォアの蛍光の強度または量子収率はフルオロフォアの環境に依存する。例えば、遊離の水性環境におけるフルオロフォアの量子収率または強度は、フルオロフォアが細胞膜内などの疎水性環境にある場合と異なる場合もある。好ましくは、フルオロフォアの量子収率または強度は、細胞膜内などの疎水環境においてより高い。それゆえに、フルオロフォアによって発される光の強度は、例えば、プローブ要素が細菌の細胞膜内で結合している場合などの、フルオロフォアが少なくとも部分的に細胞膜内にある場合に増加する。したがって、フルオロフォアは、細胞膜を介して細胞を蛍光標識するために使用されてもよい。
【００３１】
複数のプローブ要素内の１つまたは複数のプローブ要素のフルオロフォアは、７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、マラカイトグリーン、スチリルベースの染料、カスケードイエロー、プロダン（別名１−プロパノン、１−（６−（ジメチルアミノ）−２−ナフタレニル）、ダンシル（別名５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホニル）、Ｄａｐｏｘｙｌ、ＰｙＭＰＯ（別名１−（３−（スクシンイミジルオキシカルボニル）ベンジル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウム、ピレンおよびジエチルアミノクマリンまたはその誘導体もしくはバリアントであってもよい。
【００３２】
複数のプローブ要素内の少なくとも１つのプローブ要素のフルオロフォアは、ＮＢＤ部分であることが好ましい。複数のプローブ要素内の各プローブ要素のフルオロフォアは、ＮＢＤ部分であることがさらに好ましい。ＮＢＤは、本発明のプローブに特に適したフルオロフォアであることを本発明者らが発見し、プローブが細菌と結合したときの強い蛍光および低いバックグラウンドの蛍光をもたらし、試験された他のフルオロフォアと比較して細菌をはっきりと確実に標識することを可能にする。
【００３３】
複数のプローブ要素内のプローブ要素のうち１つまたは複数のフルオロフォアは、長い蛍光寿命を有してもよく、フルオロフォアの長い蛍光寿命は、バックグラウンドの自家蛍光を上回ってプローブの検出を可能にする。例えば、使用中、フルオロフォアの蛍光は、フルオロフォアからの蛍光がバックグラウンドの蛍光と容易に区別できるように標的領域のバックグラウンドの自家蛍光よりも有意に長い寿命を有してもよい。
【００３４】
例えば、フルオロフォアは、アザジオキサトリアングレニウム（ａｚａｄｉｏｘａｔｒｉａｎｇｕｌｅｎｅ）（ＡＤＯＴＡ）染料もしくはジアザオキサトリアングレニウム（ｄｉａｚａｏｘａｔｒｉａｎｇｕｌｅｎｅ）（ＤＡＯＴＡ）またはそれらの誘導体である。
【００３５】
適切には、複数のプローブ要素内の隣接するプローブ要素の１つまたは複数のフルオロフォアは、プローブの１つまたは複数の他のフルオロフォアの蛍光を消光することができる。したがって、プローブのフルオロフォアは、自己消光することができる。
【００３６】
好ましくは、複数のプローブ要素内の隣接するプローブ要素の１つまたは複数のフルオロフォアが自己消光する実施形態において、プローブの環境が変化するとき、自己消光は、妨げられるか、または低減される。例えば、驚くべきことに、本発明者らは、複数のプローブ要素の各プローブ要素のフルオロフォアがＮＢＤである実施形態において、本プローブは、ＮＢＤ部分の自己消光のために水性環境では弱い蛍光を発するか、またはほとんど蛍光を発しないが、驚くべきことに、プローブが細胞膜内などの疎水性環境にある場合、ＮＢＤ部分はもはや自己消光することができず、プローブの蛍光が高くなることを発見した。それゆえに、本発明のプローブは、細菌と結合したときにだけ選択的に蛍光を発することができるため、比較的に低いバックグラウンド蛍光をもたらす。有利にも、プローブ内のフルオロフォアのこの選択的な自己消光は、標的領域内におけるシグナル対ノイズ比を向上させ、はっきりとさらに確実に細菌を検出させる。さらに、プローブ上のフルオロフォアのより高い濃度のために（単一のフルオロフォアと比較した複数のフルオロフォア）、結合したときにプローブによって生成される蛍光シグナルはさらに高く、シグナル対ノイズ比をさらに向上する。
【００３７】
結合部分は、コアから最も遠いプローブ要素の遠位端にあってもよい。
【００３８】
結合部分は、プローブ要素の近位端にあり、コアと隣接していてもよく、プローブ要素のフルオロフォアは結合部分を介してコアと連結してもよい。あるいは、結合部分およびプローブ要素のフルオロフォアは、一般的な連結部によってコアと連結されてもよく、結合部分およびフルオロフォアのそれぞれは、連結部から離れるように伸長していてもよい。
【００３９】
フルオロフォアは、結合部分に直接連結されてもよい。あるいは、フルオロフォアは、スペーサーによって結合部分に連結されてもよい。スペーサーは、飽和もしくは不飽和炭化水素鎖、エーテル、ポリマー、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｇｌｙｃｏｌ）（ＰＥＧ）、ポリグリコール、ポリエーテルまたは類似物であってもよい。スペーサーは、ペプチドであってもよい。スペーサーがペプチドである実施形態において、ペプチドは、１〜１０アミノ酸長、１〜２０アミノ酸長または１〜３０アミノ酸長であってもよい。
【００４０】
プローブは、切断可能なリンカーによってコアと連結されたクエンチャーを含んでもよく、複数のプローブ要素内の１つまたは複数のプローブ要素のフルオロフォアは、コアが切断可能なリンカーによってクエンチャーと連結されている場合、クエンチャーによって実質的に蛍光消光されてもよく、その場合、切断可能なリンカーが切断されると、コアはクエンチャーから分離され、それにより複数のプローブ要素も分離される。
【００４１】
プローブのフルオロフォアが自己消光しない実施形態において、リンカーの切断によってフルオロフォアから分離され得るクエンチャーの提供は、リンカーを切断する切断因子が存在しない限り、フルオロフォアを消光させることが可能である。それゆえに、本プローブは、プローブのフルオロフォアの有意な蛍光によって切断因子の存在の検知を可能にする。
【００４２】
好ましくは、リンカーは、複数のプローブ要素のうちの少なくとも１つのフルオロフォアに、クエンチャーがフルオロフォアを消光する程度に十分に近くになるような寸法を有する。一般に、クエンチャーは、プローブ要素のうちの少なくとも１つのフルオロフォアから１０ｎｍ未満で離れている。好ましくは、クエンチャーは、プローブ要素のうちの少なくとも１つのフルオロフォアから５ｎｍ未満で離れている。
【００４３】
好ましくは、切断可能なリンカーは、酵素切断可能なペプチド配列を含み、切断酵素が酵素切断可能なペプチド配列を切断するときに、リンカーが切断される。
【００４４】
したがって、酵素切断可能なペプチド配列の切断は、一般にリンカーの切断に相当し、これによりプローブ要素からクエンチャーが切断される。それゆえに、切断可能なリンカーが酵素切断可能なペプチド配列を含む実施形態において、「リンカーの切断」という用語は、別に指定されない限り、酵素切断可能なペプチド配列の切断を指す。
【００４５】
切断酵素は、標的領域内に元々ある細胞によって産生または発現されてもよい。切断酵素は、標的領域に移動した、患者により産生された、白血球など、例えば、好中球の付加的な細胞によって産生または発現されてもよい。切断酵素は、例えば、細菌細胞または真菌細胞などの標的領域の感染体によって産生または発現されてもよい。
【００４６】
切断酵素はエラスターゼであることが好ましく、酵素切断可能なペプチド配列の切断はエラスターゼの存在を示す。一般に、エラスターゼは好中球エラスターゼであり、エラスターゼは好中球によって産生または発現される。一般に、エラスターゼは、タンパク質分解的な切断が可能な活性型の酵素である。好中球は、一般に病態生理学的なまたは正常な機能の一部のいずれかの炎症反応を起こしている体内の部位を標的とする。したがって、患者内の標的領域における好中球の存在は、標的領域内の組織または組織の一部が炎症を起こしていることを示す。
【００４７】
したがって、リンカーの切断によるクエンチャーとフルオロフォアの分離の結果として生じるプローブ要素のうちの少なくとも１つのフルオロフォアの蛍光の増加または蛍光は、好中球エラスターゼの存在を示す。好中球エラスターゼは、好中球によって産生されるため、好中球エラスターゼの存在は好中球の存在を示し、したがって、標的領域内の組織の炎症を示す。それに応じて、本発明のプローブは、標的領域内の組織の炎症を示すように適合されてもよい。
【００４８】
ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）などのヒトエラスターゼおよびその他のエラスターゼまたはプロテアーゼなどのその他の酵素は、一般にそれらが結合し、切断する１つまたは複数の標的配列を有する。それゆえに、酵素切断可能なペプチド配列は、一般に検出される切断酵素の、そのまたはある標的ペプチド配列を含むことになり、当業者は、所与の切断酵素に適したペプチド配列を選択することができるであろう。
【００４９】
一般に、酵素切断可能なペプチドリンカーは、切断酵素のある切断部位であるかまたは特定の切断部位であるペプチド配列である。好ましくは、切断酵素のそのまたは各々の切断部位は、複数のアミノ酸を含む。切断酵素がエラスターゼである実施形態において、好ましくは、酵素切断可能なペプチド配列は、アミノ酸配列ＡＡＰＶ（すなわち、アラニン−アラニン−プロリン−バリンもしくはＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）またはＥＥＩＮｌｅＲＲを含む。酵素切断可能なペプチド配列は、例えば、ｘＡＡＰＶｙ、ｘＡＡＰＶもしくはＡＡＰＶｙなどの位置ｘおよび／またはｙの配列ＡＡＰＶのいずれかの側に１つまたは複数の追加のアミノ酸を含んでもよい。
【００５０】
あるいは、切断酵素は、ＭＭＰ−９などのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）であってもよく、酵素切断可能なペプチド配列は、Ｇ−Ｐ−Ｋ−Ｇ−Ｌ−Ｋ−Ｇを含んでもよい。切断酵素は、プロテイナーゼ３であってもよく、酵素切断可能なペプチド配列は、Ｖ−Ａ−Ｄ−Ｃ−Ａ−Ｄ−Ｙを含んでもよい。切断酵素は、カテプシンＧであってもよく、酵素切断可能なペプチド配列は、Ａ−Ａ−Ｐ−ＦまたはＦ−Ｖ−Ｔ−Ｇｎｆ−Ｓ−Ｗを含んでもよい（ここで、Ｇｎｆ＝４−グアニジン−Ｌ−フェニルアラニン）。切断酵素は、カスパーゼであってもよく、酵素切断可能なペプチド配列は、Ｄ−Ｅ−Ｖ−Ｄを含んでもよい。
【００５１】
代替的実施形態において、切断可能なリンカーは、細菌の存在により生成するスーパーオキシド（Ｏ２−）もしくは過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）などの反応性酸素種または活性化好中球などの炎症プロセスによって切断されてもよい。したがって、反応性酸素種が切断因子であってもよい。例えば、リンカーは、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、２０１４、８７４ページＲｏｇｅｒ  Ｙ．Ｔｓｉｅｎに記載されているものなどの変性されたボロン酸ベースのリンカーであってもよい。
【００５２】
当該技術分野において公知の光プローブは、一般に常に蛍光であり（いわゆる「常時オン」のフルオロフォア）、判定されるのがプローブの位置であるか、あるいはクエンチャーの除去もしくは分離（例えば、プローブベースの蛍光共鳴エネルギー移動すなわちＦＲＥＴのため）または細胞により内部に取り入れられたということである、その環境の変化時に、プローブがそれらの蛍光を変化させるかのいずれかである。
【００５３】
しかしながら、複数のプローブ要素の複数のフルオロフォアが自己消光せず、プローブが切断可能なリンカーを含む実施形態において、本発明のプローブは、切断可能なリンカーが切断因子によって切断されたかどうかにより、その蛍光を有利に変化させ、観察されたときのプローブの位置が細菌の存在を示すことができる。したがって、本発明のプローブは、当該技術分野において公知の光プローブよりも具体的でより詳細な情報を提供することができる。例えば、プローブは、切断因子が存在するかどうか（プローブが蛍光を発するか、または蛍光の色が変化した場合、切断可能なリンカーが切断因子によって切断された）および、切断因子が存在した場合、例えば、プローブの細菌および／または真菌糸への局在化およびプローブの蛍光の増加によって示される細菌および／または真菌が存在するかどうかを示すように適合される。
【００５４】
クエンチャーは、ダーククエンチャーであってもよい。ダーククエンチャーは、励起されたフルオロフォアからエネルギーを受け取り、そのエネルギーを非放射的に、一般に、例えば、熱または音響エネルギーとして消散することができる部分である。したがって、フルオロフォア／クエンチャー対が十分に近くにあり、フルオロフォアの励起スペクトル内の波長の光が照射されると、クエンチャーは、非放射的な様式でフルオロフォアが光から吸収したエネルギーを消散し、蛍光が観察されない。このように、ダーククエンチャーは、フルオロフォアの蛍光を抑制する。
【００５５】
クエンチャーがダーククエンチャーである実施形態において、クエンチャーは、例えば、メチルレッド、ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸（ＤＡＢＳＹＬ）、Ｉｏｗａ  ｂｌａｃｋ  ＦＱもしくはＩｏｗａ  ｂｌａｃｋ  ＲＱ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．アイオワ州、米国）、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２またはＢＨＱ３であってもよい。
【００５６】
クエンチャーは、蛍光クエンチャーであってもよい。蛍光クエンチャーは、励起されたフルオロフォアからエネルギーを受け取り、そのエネルギーを放射することができる部分である。したがって、蛍光クエンチャーは一般にフルオロフォアであり、エネルギーを受け取ったフルオロフォアによって放射される光とは異なる波長でクエンチャーが光を発する。このように、蛍光の色の変化は、クエンチャーのフルオロフォアに対する相対的な近接を示す。
【００５７】
クエンチャーが蛍光クエンチャーである実施形態において、クエンチャーは、ローダミン、例えば、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）などのテトラメチルローダミンもしくはその誘導体、フルオレセインもしくはその誘導体、シアニンフルオロフォアまたはホウ素ジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）フルオロフォアであってもよい。
【００５８】
クエンチャーが蛍光クエンチャーである実施形態において、クエンチャーは、好中球を標識するように適合されてもよい。それゆえに、切断可能なリンカーが酵素切断可能なペプチド配列を含む実施形態において、本発明のプローブは、エラスターゼなどの切断酵素の存在を示すよう、酵素を産生している好中球を標識するよう、および存在する可能性があるいずれかの細菌を標識するように適合されてもよい。
【００５９】
例えば、切断酵素が好中球エラスターゼである実施形態において、蛍光クエンチャーは、細菌の存在によって、または例えば、カルシウムイオノフォアなどの刺激によって活性化された好中球により取り込まれてもよい。それゆえに、蛍光クエンチャーは、標的領域内の好中球を選択的に標識することができる。本発明者らは、ＴＡＭＲＡなどの蛍光クエンチャーが、好中球により選択的に取り込まれるが、細菌によって、および単球などの他の炎症細胞によっては取り込まれないか、または最大でもはるかに少ない程度で取り込まれることを観察した。本発明者らは、この観察された蛍光クエンチャーの取り込みの差は、好中球などの極めて食細胞のより高いエンドサイトーシスおよび飲作用による可能性があると推測する。
【００６０】
プローブ要素のフルオロフォアは、クエンチャーとＦＲＥＴ対を形成してもよい。一般に、フルオロフォアとクエンチャーは、確実にフルオロフォアからクエンチャーへのエネルギーの移動のための適切な励起および発光スペクトルを有するように対として選択される（すなわち、それらはＦＲＥＴ対を形成する）。例えば、一般的なフルオロフォア／クエンチャー対としては、Ｃｙ３／Ｃｙ５、Ｃｙ３／ＱＳＹ２１、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、フルオレセイン／メチルレッド、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）／黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）などが挙げられる。ＦＲＥＴ対のさらなる例は、当業者が容易に同定することができる。
【００６１】
複数のプローブ要素内のプローブ要素のうちの少なくとも１つのフルオロフォアがＮＢＤである実施形態において、クエンチャーは、ＮＢＤからのエネルギーを受け取ってＮＢＤとＦＲＥＴ対を形成することができる部分であることが好ましい。クエンチャーは、メチルレッドもしくはテトラメチルローダミンまたはその誘導体であることが好ましい。例えば、クエンチャーは、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）であってもよい。
【００６２】
切断可能なリンカーを含む実施形態において、結合部分は、切断可能なリンカーの切断の前に細菌および／または真菌と結合してもよい。あるいは、結合部分は、切断可能なリンカーの切断後に細菌および／または真菌と結合してもよい。
【００６３】
例えば、本発明のプローブは、標的領域に送達されてもよく、プローブは、標的領域のあらゆる細菌または真菌糸と結合してもよい。プローブ要素のフルオロフォアを励起するのに適した波長の光を標的領域に照射すると、標的領域内のあらゆる細菌および／または真菌が標識されることになる。細菌は、例えば、真菌糸と視覚的に区別されてもよい。
【００６４】
一般に、本発明のプローブは、標的領域において細菌および／または炎症を検出するために使用されるよう操作可能である。標的領域は、患者内の組織の一部であってもよく、本方法は、インビボで行われてもよい。例えば、標的領域は、患者の肺の一部であってもよく、本方法は、プローブを標的領域に送達し、光を標的領域に送達し、標的領域から蛍光を検出するために気管支鏡を使用して行われてもよい。あるいは、プローブを標的領域に送達し、光を標的領域に送達し、標的領域から蛍光を検出するために別個の器具が使用されてもよい。
【００６５】
例えば、ファイバー共焦点蛍光顕微鏡（ｆｉｂｅｒ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（ＦＣＦＭ）などの発光顕微鏡（ｏｐｔｉｃａｌ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（ＯＥＭ）を使用して患者の組織から蛍光が検出されてもよい。
【００６６】
標的領域は、患者の皮膚上、関節中、循環器系中、消化器系もしくは生殖器系であってもよく、プローブは、例えば、内視鏡を介して送達および／または観察されてもよい。
【００６７】
あるいは、標的領域は、細胞培養物、生検サンプルなどの組織サンプルまたは体液サンプルなどの液体サンプルの一部であってもよく、本方法はインビトロで行われてもよい。
【００６８】
患者はヒト患者であることが好ましい。しかしながら、患者は、例えば、ウマ、ヒツジ、ウシまたはげっ歯類などの非ヒト動物であってもよい。
【００６９】
プローブは、二次標識を含んでもよい。例えば、プローブのコアは、二次標識を含んでもよく、または複数のプローブ要素の１つもしくは複数が二次標識を含んでもよい。二次標識は、フルオロフォアであってもよい。二次標識のフルオロフォアは、そのまたは各プローブ要素のフルオロフォアとは異なってもよい。二次標識は、放射性標識であってもよい。放射性標識は、放射性ヌクレオチドを含んでもよい。放射性標識は、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、１１Ｃ、１４Ｃ、３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅまたは８６Ｚｒのうちの１つまたは複数を含んでもよい。二次標識は、磁気共鳴標識またはコアであってもよい。磁気共鳴標識またはコアは、例えば、Ｆｅ、ＭｎまたはＧｄであってもよい。
【００７０】
したがって、プローブは、デュアルまたはマルチモダリティを有してもよく、光学イメージング、放射性イメージングまたは磁気共鳴イメージングに使用されてもよい。
【００７１】
さらなる実施形態において、プローブは、標的種によって内部に取り入れられるように適合されたターゲティング要素を含んでもよい。ターゲティング要素は、フルオロフォアを含んでもよい。ターゲティング要素のフルオロフォアは、標的種によって内部に取り入れられるように適合されてもよい。例えば、プローブは、Ｃｙ５を含んでもよく、Ｃｙ５を含むプローブまたはプローブの一部は、リンカーが切断されると、標的領域のあらゆる好中球の内部に取り入れられて、それらを標識してもよい。一般に、プローブは、ターゲティング要素に対するクエンチャーを含み、ターゲティング要素は、リンカーによってクエンチャーから離される。一部の実施形態において、プローブは、リンカーによって連結された第１の部分および第２の部分を含んでもよい。第１の部分は、プローブ要素およびターゲティング要素のクエンチャーを含んでもよく、第２の部分は、ターゲティング要素およびプローブ要素に対するクエンチャーを含んでもよい。それゆえに、リンカーが切断されると、プローブ要素およびターゲティング要素はともに、それらのそれぞれのクエンチャーから分離される。
【００７２】
例えば、プローブ要素は、ＮＢＤ（フルオロフォア）およびＱＳＹ２１、ＢＨＱ３またはＢＢＱ６５０（クエンチャー）を含んでもよく、ターゲティング要素は、Ｃｙ５またはスルホン酸化Ｃｙ５（フルオロフォア）およびメチルレッドまたはＢＨＱ１（クエンチャー）を含んでもよい。
【００７３】
複数のプローブ要素の各プローブ要素は、各プローブ要素がプローブの別個の分岐を形成する分岐プローブまたは多価プローブであるように、プローブがコアから伸長していてもよい。例えば、プローブは、以下の構造：
【００７４】
【化１】
2018501780.tif 000003
のうちの１つを有してもよく、式中、
Ｌ＝スペーサー基（例えば、Ｃ３〜Ｃ１０アルキル、（（ＣＨ２）２Ｏ）ｘであり、ここでｘ＝１〜６である）
Ｆ＝フルオロフォア（例えば、ＮＢＤ、フルオレセイン）
Ｂ＝結合部分（例えば、ユビキシジン部分、ポリミキシン部分）
Ｃ＝コア（例えば、炭素、−Ｃ（ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）３）３、ＮＨ２ＣＯＮＨＣ（ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）３）３）
である。
【００７５】
例えば、好適な実施形態において、プローブは、コアに連結された３つのプローブ要素を含み、一般式ＮＨ２ＣＯＮＨＣ（ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）３−ＮＢＤ−（ＣＨ２）５−ＵＢＩＮｌｅ）３を有し、式中、コアはＮＨ２ＣＯＮＨＣ（ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）３）３であり、各プローブ要素は、
ＮＢＤ−（ＣＨ２）５ＣＯ−ＵＢＩＮｌｅ；
【００７６】
【化２】
2018501780.tif 000004
である。
【００７７】
代替的な実施形態では、３つのプローブ要素のそれぞれは、ＮＢＤ−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ２−ＰＭＸ；
【００７８】
【化３】
2018501780.tif 000005
である。
【００７９】
プローブは、以下の構造：
【００８０】
【化４】
2018501780.tif 000006
を有してもよい。
【００８１】
プローブの好適な実施形態は、以下の構造：
【００８２】
【化５】
2018501780.tif 000007
を有する。
【００８３】
本発明の第２の態様によると、標的領域において細菌および／または真菌を検出する方法であって、
（１）本発明の第１の態様による第１のプローブを準備するステップと、
（２）第１のプローブを標的領域に送達するステップと、
（３）適した波長の光を標的領域に照射して、第１のプローブのフルオロフォアを励起するステップと、
（４）第１のプローブが標的領域内の細菌および／または真菌を標識したかどうかを判定するステップと
を含む、方法が提供される。
【００８４】
標的領域内における第１のプローブによる細菌および／または真菌の標識化は、標的領域における細菌および／または真菌の存在を示す。
【００８５】
標的領域は、患者内の組織であってもよく、本方法は、インビボにおいて行われてもよい。例えば、標的領域は、患者の肺組織であってもよく、本方法は、プローブを標的領域に送達するため、光を標的領域に送達するための双方に、および標的領域から蛍光を検出するために気管支鏡を使用して行われてもよい。あるいは、第１のプローブを標的領域に送達するため、光を標的領域に送達するため、および標的領域からの蛍光を検出するために別個の器具が使用されてもよい。
【００８６】
標的領域は、細胞培養物、生検サンプルなどの組織サンプルまたは体液サンプルなどの液体サンプルであってもよく、本方法はインビトロにおいて行われてもよい。
【００８７】
患者はヒト患者であることが好ましい。しかしながら、患者は、例えば、ウマ、ヒツジ、ウシまたはげっ歯類などの非ヒト動物であってもよい。
【００８８】
第１の態様によるプローブが切断可能なリンカーを含む本発明の実施形態において、切断因子は、切断酵素であってもよい。切断酵素は、エラスターゼであってもよく、第１のプローブのプローブ要素のフルオロフォアの有意な蛍光によりリンカーを切断する切断酵素の存在を示すことができる。患者がヒト患者である実施形態において、切断酵素は、好ましくはヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）である。ＨＮＥは、一般に組織炎症の部位にある好中球によって産生または発現される。それゆえに、ＨＮＥの存在は、周辺組織の炎症を示す。したがって、切断酵素がＨＮＥである実施形態において、第１のプローブの複数のプローブ要素のフルオロフォアの有意な蛍光は、標的領域内の炎症を示す。例えば、標的領域が患者の肺組織内である場合、フルオロフォアの有意な蛍光は肺組織の炎症を示す。
【００８９】
本方法は、無菌性炎症（すなわち、感染が原因ではない炎症）および感染性炎症（すなわち、例えば、細菌または真菌などの異物が原因の炎症）の両方の検出を可能にすることができる。一般に、細菌または真菌の標識化を伴わない第１のプローブの有意な蛍光は、無菌性炎症を示し、細菌の標識化を伴うプローブの有意な蛍光は、細菌性炎症を示す。真菌糸の標識化を伴うプローブの有意な蛍光は、真菌性炎症を示す。
【００９０】
「有意な蛍光」という用語は、本発明者らは、クエンチャーがフルオロフォアの蛍光を消光するのを防ぐのに十分な第１のプローブのクエンチャーからのフルオロフォアの分離の結果として生じ得る、バックグラウンドまたは存在する場合、標的領域における自家蛍光を上回るフルオロフォアの蛍光を指す。標的領域内に元々ある細胞または組織の自家蛍光は、第１のプローブのフルオロフォアよりも短い蛍光寿命を有してもよい。標的領域内に元々ある細胞または組織の自家蛍光は、プローブのフルオロフォアのものより速い速度で経時的に減少してもよい。それゆえに、標的領域において観察される経時的によりゆっくりと減少する蛍光は、第１のプローブを示す可能性があり、標的領域において観察される経時的により速く減少する蛍光が自家蛍光を示す可能性がある。
【００９１】
救命医療または集中治療などの医療の多くの領域において、特に、それらの患者が人工呼吸されている場合、患者は、安全に動かすことができないため、例えば、肺の炎症が無菌性または感染性であるかを同定するためにＰＥＴスキャンなどの標準的な方法を使用することは一般に不可能である。したがって、臨床医は、炎症を、自信を持って診断するためおよび治療の適切な補正方針を指示するための十分な情報を有していない場合がある。例えば、炎症が無菌性である場合、患者に抗生物質を投与することは、助けにならず、有害な副作用がある可能性もある。
【００９２】
本発明の方法は、臨床医によってその場（インサイチュ）でポイントオブケアにおいて行うことができ、患者の肺または肺の一部内などの標的領域に細菌および／または真菌が存在するかどうかを判定する。したがって、本発明の方法は、臨床医が任意の炎症の原因を、自信を持って判定するため、および例えば、抗生物質を患者に与えることなど治療の最良の方針を判断するために必要な情報を臨床医に提供する。
【００９３】
標的領域において細菌が検出され、適切な抗生物質が患者に投与された場合、本方法は、抗生物質の効果を判定するために行われてもよい。例えば、標的領域における細菌の数の減少または細菌の不在は、治療の方針が細菌感染を効果的に排除していることを一般に示す。同様に、標的領域において真菌が検出され、適切な抗真菌剤が患者に投与された場合、本方法は、抗真菌薬の効果を判定するために行われてもよい。
【００９４】
本方法は、第１の態様による、細菌の亜集団と特異的に結合する結合部分を含む第２のプローブを準備するステップを含んでもよい。例えば、第２のプローブの結合部分は、グラム陰性細菌と特異的に結合してもよく、またはグラム陽性細菌と特異的に結合してもよい。
【００９５】
本方法は、（５）第２のプローブを標的領域に送達するステップを含んでもよい。本方法は、（６）適した波長の光を標的領域に照射して、第２のプローブの、そのまたは各フルオロフォアを励起するステップをさらに含んでもよい。ステップ（５）およびステップ（６）は、ステップ（４）の後に行われてもよく、第１のプローブは、ステップ（４）とステップ（５）との間に標的領域から消失させられてもよく、またはそうでなければ、除去されてもよい。このように、ステップ（６）において標的に照射するとき、実質的に第２のプローブのみが標的領域にあることになるため、観察される蛍光はいずれも第２のプローブによるものである可能性がある。ゆえに、第２のプローブのそのまたは各フルオロフォアは、第１のプローブのフルオロフォアと同じフルオロフォアであってもよく、または異なるフルオロフォアであってもよい。
【００９６】
あるいは、ステップ（５）は、ステップ（２）とステップ（３）との間に行われてもよく、ステップ（３）は、ステップ（６）に対応する。それゆえに、標的領域に照射するとき、第１のプローブおよび第２のプローブの両方が標的領域に存在する。したがって、第２のプローブの、あるまたは各フルオロフォアは、第１のプローブからの蛍光と第２のプローブからの蛍光が異なる波長のものであるため、互いに区別することができるよう、第１のプローブのフルオロフォアと異なることが好ましい。第１のプローブおよび第２のプローブのそれぞれに対する異なるフルオロフォアの提供は、標的領域におけるあらゆる細菌および／または真菌の存在（細菌または真菌糸の細胞壁への第１のプローブの局在化によって示される）、ならびにいずれかの細菌がグラム陰性であるか、またはグラム陽性であるか（第２のプローブが細菌の細胞壁に局在したかどうかによって示される）を判定することを可能にする。プローブが、クエンチャーをプローブのコアと連結する酵素切断可能なペプチドリンカーを含む実施形態において、本発明の方法は、判定されるべき炎症の存在（第１および／または第２のプローブの有意な蛍光によって示される）、標的領域におけるあらゆる細菌および／または真菌の存在（細菌もしくは真菌糸への第１のプローブの局在化によって示される）、および細菌がグラム陰性であるか、またはグラム陽性であるか（第２のプローブが細菌を標識したかによって示される）の判定を可能にする。
【００９７】
したがって、本発明の本態様の方法は、有利にも１つの試験において炎症の原因が同定されることを可能にし、一部の実施形態では、無菌性炎症の存在の判定を可能にすることができ、それにより、医療専門家にその患者に対する処置の適切な方針を決定するために彼らが必要とする情報を提供する。
【００９８】
本方法は、白色光または蛍光下において標的領域を観察して、標的領域において同定されたいずれかの感染体（細菌または真菌）の形態を判定するステップを含んでもよい。本方法は、白色光または蛍光下において標的領域を観察して、標的領域内の微生物を同定するステップを含んでもよく、第１および第２のプローブは、それらの微生物の正体を判定するために使用されてもよい。
【００９９】
第１および／または第２のフルオロフォアからの蛍光は、電荷結合素子（ＣＣＤ）または相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）素子などの検出素子に向けられている第１および／または第２のフルオロフォアから発せられる蛍光によって直接イメージングされてもよい。第１および／または第２のフルオロフォアからの蛍光は、間接的にイメージングされてもよい。例えば、蛍光は、光音響イメージングを使用することによって音波に変換されてもよい。光音響イメージングは、標的領域の高分解能イメージが生成されるのを可能にすることもできる。第１および／または第２のフルオロフォアが近赤外または赤外領域の波長（約７００ｎｍ〜１ｍｍ）で光を発する実施形態において、患者の全身または実質的に全身をイメージングすることができる。あるいは、第１および／または第２のフルオロフォアが可視領域の波長（約３９０ｎｍ〜７００ｎｍ）で光を発する実施形態において、患者の特定の標的領域をイメージングすることができ、光は、例えば、光ファイバーにより標的領域に送達されてもよく、標的領域から受け取られてもよい。
【０１００】
本方法は、光超音波（ｐｈｏｔｏａｃｃｏｕｓｔｉｃ  ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）を使用して標的領域を観察して、標的領域において検出された感染体（細菌または真菌）の正体を判定するステップを含んでもよい。本方法は、光音響器具を使用して標的領域を観察して、標的領域内の微生物を同定するステップを含んでもよく、第１および第２のプローブは、直接的な蛍光検出を使用して、それらの微生物の正体を判定するために使用されてもよい。
【０１０１】
第１のプローブは、結合部分として完全長ユビキシジンなどのユビキシジン部分、またはそのフラグメントもしくはバリアントを含んでもよい。
【０１０２】
第２のプローブは、結合部分として完全長ポリミキシンなどのポリミキシン部分またはそのフラグメントもしくはバリアントを含んでもよく、第２のプローブは、グラム陰性細菌と選択的に結合してもよい。
【０１０３】
それゆえに、本方法は、無菌性炎症、細菌性炎症および／または真菌性炎症、ならびにグラム陰性細菌感染（ならびに推測によって、グラム陽性細菌感染）の同定を可能にすることができる。
【０１０４】
本発明は、第３の態様において、標的領域において細菌および／または真菌を同定または標識するための第１の態様のプローブの使用に範囲を広げる。
【０１０５】
プローブは、標的領域において細菌および／または真菌を同定または標識するためにインビボにおいて使用されてもよい。例えば、標的領域が患者の肺組織などの患者内の組織の一部である実施形態において、プローブはインビボにおいて使用されてもよい。
【０１０６】
プローブがインビボにおいて使用される実施形態において、プローブを標的領域に送達するため、光を標的領域に送達するための双方に、および標的領域内のプローブの蛍光を検出するために気管支鏡または内視鏡が使用されてもよい。あるいは、第１のプローブを標的領域に送達するため、光を標的領域に送達するため、および標的領域からの蛍光を検出するために別個の器具が使用されてもよい。
【０１０７】
プローブは、標的領域において細菌および／または真菌を同定または標識するためにインビトロにおいて使用されてもよい。例えば、標的領域が細胞培養物、生検サンプルなどの組織サンプルまたは体液サンプルなどの液体サンプルの一部である実施形態において、プローブはインビトロにおいて使用されてもよい。
【０１０８】
プローブがインビトロにおいて使用される実施形態において、プローブからの蛍光は、例えば、共焦点顕微鏡などの顕微鏡を使用して検出されてもよい。
【０１０９】
第１の態様の第１のプローブは、標的領域において細菌および／または真菌を同定または標識するために使用されてもよく、第１の態様による第２のプローブは、同定または標識された細菌がグラム陰性細菌であるか、またはグラム陽性細菌であるかを判定するために使用されてもよく、この場合、第１のプローブの少なくとも１つの結合部分は、細菌および／または真菌と特異的に結合し、第２のプローブの少なくとも１つの結合部分は、グラム陰性細菌またはグラム陽性細菌と特異的に結合する。例えば、第１のプローブの少なくとも１つの結合部分はユビキシジン部分であってもよく、第２のプローブの少なくとも１つの結合部分はポリミキシン部分であってもよい。
【０１１０】
本発明の第４の態様によると、本発明の第１の態様の１つまたは複数のプローブおよびプローブを分散させることが可能な適した緩衝剤を含むキットオブパーツが提供される。
【０１１１】
キットオブパーツは、第１の態様による、細菌および／または真菌と特異的に結合する少なくとも１つの結合部分を含む第１のプローブならびにグラム陰性細菌またはグラム陽性細菌と特異的に結合する少なくとも１つの結合部分を含む、第１の態様の第２のプローブを含んでもよい。
【０１１２】
例えば、キットオブパーツは、少なくとも１つのユビキシジン部分を含む第１のプローブ、および少なくとも１つのポリミキシン部分を含む第２のプローブを含んでもよい。
【０１１３】
第１の態様の任意のおよび好適な特徴は、第２、第３および第４の態様の任意のおよび好適な特徴である。
【０１１４】
本発明の実施形態をここで、添付の図面を参照して非限定例により次に示す。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】フルオロフォアの選択は標識された細菌をイメージングする能力に影響を及ぼし、ＮＢＤ構築物がフルオレセイン（ＦＡＭ）を上回る改善されたシグナル対ノイズを有することを示すイメージである。Ａ）ＦＭ−４６４で対比染色された細菌（メチシリン感受性ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、ＭＳＳＡ）（赤で示した）およびＦＡＭ−ＵＢＩまたはＮＢＤ−ＵＢＩとともにインキュベートされた細菌（ＭＳＳＡ）は、ＮＢＤが改善されたシグナル対ノイズ比を示し、これが大半の細菌の検出を可能にする（緑で示した）。これを、凝集した細菌の小さな部分集合を検出したＦＡＭ−ＵＢＩと比較した。Ｂ）ＮＢＤ−ＵＢＩはまた、哺乳動物細胞（白の矢印）よりも細菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に対して特異性を示す。
【図２】ＦＡＭ−ＰＭＸが、インビトロにおいて細菌を検出するのに十分なシグナル対ノイズをもたらさないことを示すイメージである。Ａ）ＦＭ−４６４で対比染色されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＰＡ）（赤）およびＡ５４９細胞（紫色のヒト肺上皮細胞）とともにインキュベートされたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＰＡ）は、バックグラウンドを上回る細菌の標識化は見られず、上皮細胞の標識化もなかったことを示している。Ｂ）核対比染色剤Ｓｙｔｏ  ８２（赤）を伴うＮＢＤ−ＰＭＸ（緑）は、細菌の標識化を可能にし、哺乳動物細胞（紫色）を上回る標識化の選択性を保持する。
【図３】プローブの発光スペクトルが疎水性環境における蛍光の増加を裏づけるグラフ図である。Ａ）４８８ｎｍの波長で励起された場合のＰＢＳまたはＤＭＳＯ（疎水性環境）の存在下におけるＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄ（５μＭ）およびＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅ（１５μＭ）に対して示される発光スペクトル。Ｂ）４８８ｎｍの波長で励起された場合のＰＢＳまたはＤＭＳＯ（疎水性環境）の存在下におけるＮＢＤ−ＰＭＸ（１０μＭ）に対して示される発光スペクトル。両プローブの蛍光は、標的細菌への結合時に存在すると予想される疎水条件下において大幅に増加する。
【図４】ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄが、インビトロにおいて哺乳動物細胞よりも細菌を選択的に標識することを示す図である。Ａ）蛍光包括的細胞ＤＮＡ染料（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｇｅｎｅｒｉｃ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＤＮＡ  ｄｙｅ）Ｓｙｔｏ−８２（赤）で対比染色された、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄ（５μＭ、緑）を用いレーザー走査型共焦点顕微鏡によってイメージングされた臨床的に関連する細菌パネルの例のイメージ。Ｂ）ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄ  ５μＭ（最適濃度）標識細菌パネルの定量化。パネルのすべての細菌は、ＭＳＳＡおよびＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅ  １０μＭ（最適濃度）と比較して明るい。Ｃ）未染色細菌（赤）、ＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅ  １５μＭ（青）およびＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄ  ５μＭで標識された細菌（オレンジ）に関するフローサイトメトリーのデータ。Ｄ）Ｓｙｔｏ−８２で対比染色されたＭＳＳＡおよびＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄ（５μＭ、緑）ならびにヒト好中球（赤い矢印）を示す統合図。Ｅ）Ａ５４９細胞（赤い矢印）は哺乳動物細胞を標識しないことを実証している。代表的なイメージを示し、すべての実験に関してｎ≧３である。
【図５】ＮＢＤ−ＰＭＸが、インビトロにおいてグラム陰性細菌を選択的に標識することを示す図である。ＮＢＤ−ＰＭＸを用いレーザー走査型共焦点顕微鏡によってイメージングされた細菌パネルの例のイメージ。Ａ）ＮＢＤ−ＰＭＸ  １μＭ（緑）を用いた、Ｓｙｔｏ−８２（赤）で対比染色された細菌パネル。グラム陽性細菌（赤枠で境界を示した）は、グラム陰性細菌と比較して最小限の標識化である／標識化がないことを示している。Ｂ）白い棒のグラム陽性細菌および黒い棒のグラム陰性細菌に関するＮＢＤ−ＰＭＸ  １μＭによる細菌パネルの定量化は、グラム陽性細菌と比較してグラム陰性細菌の高強度の選択的な標識化を示している。すべてのグラム陰性細菌は、すべてのグラム陽性よりも統計学的に有意な増加を示した。Ｃ）ＮＢＤ−ＰＭＸによる細菌の標識化のフローサイトメトリー評価は、未染色細菌（赤）およびＮＢＤ−ＰＭＸ（青）標識細菌を示している。グラム陽性細菌の著しい標識化はない（赤枠で境界を示した）。Ｄ）Ｓｙｔｏ−８２で対比染色されたＭＳＳＡおよびＮＢＤ−ＰＭＸ  １μＭ（緑）ならびにヒト好中球（赤い矢印）を示す統合図。Ｅ）Ａ５４９細胞（赤い矢印）は哺乳動物細胞を標識しないことを示している（図２から転載）。代表的なイメージを示し、すべての実験に関してｎ≧３である。
【図６】細菌感染症のエクスビボモデル図である。Ａ）ヒツジ肺を採取し、人工呼吸し、３７℃の周囲温度の新生児用保育器に入れた。肺区画にＰＢＳ（対照）または細菌を気管支鏡により注入した。その後、プローブを注入し、区画を４８８ｎｍレーザースキャニングユニット（ＬＳＵ）を使用したファイバー共焦点蛍光顕微鏡（ＦＣＦＭ）によりイメージングした。Ｂ）エクスビボのヒツジモデルは注入後５時間生菌を示した。細菌（ＭＳＳＡ）をヒツジ肺の区画に注入し、１、３および５時間の時点で洗浄し（ｎ＝３）、ＣＦＵ／ｍｌに応じて平板培養し、１６時間のインキュベーション後に計数した。
【図７】ＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅがヒツジ肺にいる細菌を標識できないことを示すイメージである。細菌を対比染色し、スペクトル的に異なるイメージングシステムによりイメージングすることによって確認されるヒツジ肺にいる細菌の一貫した標識化はなかった。Ａ：ＰＫＨ６６０標識ＭＳＳＡを注入後１時間の時点の肺区画。Ｂ：６６０ｎｍでイメージングされた対照区画（ＰＢＳを注入し細菌がいない）。Ｃ）１０μＭのＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅ注入後に４８８ｎｍでイメージングされた同じ区画。ただし、パネルＤに紫色で示されている対比染色されたＰＫＨ６６０標識クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（グラム陰性）を用い、ＮＢＤ−ＰＭＸが添加された同じ実験は同じ点状のシグナルを示している。
【図８】遠位肺の細菌の代表的なＦＣＦＭイメージが特有の点状のパターンを示していることを示す図である。Ａ）ＰＫＨ標識黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、カルセイン標識黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＧＦＰ発現菌株の注入により、区画がＦＣＦＭを使用してイメージングされると蛍光の点状のパターンが生成されている。これらのイメージは、次のその場（インサイチュ）での標識化実験のための陽性対照を形成するために使用された。代表的なイメージを示し、すべての実験に対してｎ＝３である。Ｂ）ＰＫＨ染料はバイスタンダー細胞を染色しない。共焦点イメージは、Ｓｙｔｏ−８２（赤）ならびにＰＫＨ６６０（紫色）で対比染色された細菌（黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））との共培養物中の上皮細胞を示している。バイスタンダー哺乳動物細胞（赤い矢印）は標識された細菌から浸出したＳｙｔｏ−８２で標識されたが、ＰＫＨ６６０の移動はない。
【図９】ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄが、遠位のヒツジ肺においてその場（インサイチュ）で細菌を検出することを示すイメージである。ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄの代表的なＦＣＦＭイメージは、対照区画に点状のシグナルが見られないのに対し、細菌を注入された区画ではバックグラウンドの蛍光を上回って上記図８に記載されている特有の点状のシグナルが見られることを示している。さらに、アガロースビーズ単独では蛍光を示さない（対照ビーズ）が、ビーズが細菌でコーティングされた場合、ヒツジ肺においてその場（インサイチュ）で標識されるとシグナルが見られる。代表的なイメージを示し、すべての実験に関してｎ≧３である。
【図１０】ＮＢＤ−ＰＭＸが、ヒツジ肺にいるグラム陰性細菌をその場（インサイチュ）で選択的に標識することを示すイメージである。Ａ）対照区画およびグラム陽性区画は点状のシグナルを示していないのに対し、グラム陰性注入区画は陽性対照と同一のシグナルを示している。Ｂ）各区画の洗浄液中菌数（ｌａｖａｇｅ  ｃｏｕｎｔ）は、細菌の存在を確認する区画間の菌数に大幅な差がないことを示している。Ｃ）アガロースビーズ単独では蛍光を示さないが、ビーズが細菌でコーティングされた場合、ヒツジ肺においてその場（インサイチュ）で標識されるとシグナルが見られる。代表的なイメージを示し、すべての実験に関してｎ≧３。
【図１１】ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸが、「洗い流すこと」に対して耐性があり、ヒツジ肺にいる細菌の検出を可能にすることを示すイメージである。ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄまたはＮＢＤ−ＰＭＸのいずれかで前標識された細菌は、ヒツジ肺に注入されたときＦＣＦＭによって容易に可視化された。しかしながら、直線的なＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅで前標識された細菌が注入された場合、点状のシグナルは見られなかった。肺への注入の前の細菌懸濁液をイメージングすること（左側パネル）およびＦＣＦＭにより写し出すこと（右側パネル）によって標識化が確認された。懸濁液中のＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅ標識細菌に関する低いシグナル対ノイズ比に留意する。代表的なイメージを示し、各実験に関してｎ＝３である。
【図１２】ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄが、洗浄が行われるとき蛍光を保持することを示すグラフ図である。Ａ）細菌パネルは、レーザー走査型共焦点顕微鏡によってＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄの持続的な存在下で（黒色）およびその後のＰＢＳ洗浄（白色）にイメージングされた。定量化は、プローブの持続的な存在下でＭＳＳＡを伴う直線的なＮＢＤ−ＵＢＩを上回る蛍光の保持を示す（赤線）。３つのランダムな視野を用いてｎ≧３が各実験に関して評価された。Ｂ）プローブの持続的な存在下で（黒色）またはその後のＰＢＳ洗浄（白色）にＮＢＤ−ＰＭＸを用いてイメージングされた細菌パネルは、すべてのグラム陰性細菌がプローブの持続的な存在下で、グラム陽性細菌を伴うＮＢＤ−ＰＭＸよりも高い蛍光の保持を示している。３つのランダムな視野を用いてｎ≧３が各実験に関して評価された。
【図１３】ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄは、急性肺傷害気管支肺胞洗浄液（ＡＬＩ  ＢＡＬＦ）中で安定であることを示す図である。マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）分析は、３０分間コインキュベートされた場合、生理食塩水の存在下ではＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅは安定であるが（矢印は１９４９の質量で見られる補正ピークを示す）、ＡＬＩ洗浄液の存在下では分解すること（質量１９４９でピークが見られないが、矢印は予測できる分解化合物を示す）を実証した。それに反して、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄは、フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）によって評価すると依然として安定したままである（示されるデータは理論上のプロットを表し、実験に基づくピークを示すプロットは化合物の存在を示すことに相当する）。ＮＢＤ−ＰＭＸは、ＡＬＩ  ＢＡＬＦ中で安定である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析は、３０分間コインキュベートされた場合の生理食塩水またはＡＬＩ洗浄液の存在下におけるＮＢＤ−ＰＭＸの安定性を実証した（矢印は、１２９１〜１２９３の質量で見られる補正ピークを示す）。
【図１４】ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄが、ヒツジ洗浄液中の細菌に対して等モルの等価の直線的なものよりも高い蛍光を保持することを示す図である。Ａ）ＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅ（１５μＭ）およびＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄ（５μＭ）を用いてヒツジ洗浄液の存在下または不在下においてレーザー走査型共焦点顕微鏡によってイメージングされたＭＳＳＡ。両ＮＢＤ−ＵＢＩ化合物はヒツジ洗浄液中で蛍光が減少したが、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄはより高い蛍光強度を保持している。Ｂ）対照的に、ＮＢＤ−ＰＭＸ（１μＭ）を用いてヒツジ洗浄液の存在下または不在下においてイメージングされたＰＡ３２８４は、蛍光強度の著しい減少は示していない。代表的なイメージを示し、ｎ＝３である。
【図１５】ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸは、サーファクタントが豊富な環境において細菌を明瞭に写し出した図である。細菌の蛍光強度の比：サーファクタント蛍光強度は、共焦点顕微鏡イメージから数量化される。等モルのＮＢＤ濃度に対して、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸは、ＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅよりも有意に高い細菌の強度：サーファクタント強度を有する。
【図１６Ａ】エラスターゼに依存した細菌の標識化スキームを示す図である。細菌結合構成要素にあるフルオロフォアがダーククエンチャーによって消光され、このことは、細菌との結合時に蛍光が観察されないことを意味する。エラスターゼに特異的な配列ＡＡＰＶの切断により細菌結合構成要素（ＰＶ−ＮＢＤ−ＵＢＩ）がダーククエンチャーのメチルレッド（ＭＲ）から遊離される。
【図１６Ｂ】インビトロにおけるエラスターゼに依存した細菌の標識化のイメージである。ＦＭ−４６４（赤）で対比染色され、単離ヒト好中球とともにコインキュベートされたＭＳＳＡは、好中球の存在下で細菌の標識化（緑）を実証し、これは、エラスターゼ阻害剤の存在下では阻害される。
【図１７Ａ】エラスターゼに依存した細菌の標識スキームを示す図である。細菌結合構成要素にあるフルオロフォアがより長い波長の異なるフルオロフォアによって消光され、このことは、細菌への結合時に蛍光が観察されないことを意味する。エラスターゼに特異的な配列ＡＡＰＶの切断により、細菌結合構成要素（ＰＶ−ＮＢＤ−ＵＢＩ）がクエンチャー（ＴＡＭＲＡ）から遊離される。ＴＡＭＲＡは、エンドサイトーシスの取り込みにより活性化好中球の存在をレポートする。
【図１７Ｂ】インビトロにおけるエラスターゼに依存した細菌の標識化のイメージである。ＰＫＨ  ６６０（紫色）で対比染色したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｕｅｒｉｇｉｎｏｓａ（ＰＡ）は、ＴＡＭＲＡ−ＡＡＰＶ−ＮＢＤ−ＰＭＸとともにインキュベートされ、活性化されていない好中球の存在下では標識化を示さず（上段パネル）、エラスターゼに依存的な様式で細菌の標識化（緑で示した）を示し、エラスターゼ非依存的な様式で活性化好中球の標識化（赤で示した）を示した。
【図１７Ｃ】切断後のＴＡＭＲＡのエラスターゼに依存的な蛍光の増加のグラフ図である。ＴＡＭＲＡ−ＡＡＰＶ−ＮＢＤ−ＰＭＸと比較してＴＡＭＲＡ−ＡＡ（切断された化合物）の蛍光がエラスターゼに依存的な様式で増加するという予想外の結果を実証ための分光光度計データおよびエラスターゼ阻害剤により阻害された（励起５２５ｎｍ、蛍光５８０ｎｍ）。
【図１８】イメージ処理アルゴリズムは、ＦＣＦＭデータからの「ポジティブ」および「ネガティブ」画像を視覚的に示すイメージである。（Ａ）ポジティブまたはネガティブと考えられる画像に関する未処理データ。（Ｂ）前処理なし、スポット検出の効果がない。その後のバックグラウンドノイズの推定（Ｃ）、ハイパスフィルタリング（Ｄ）および適切なしきい値処理（Ｅ）、現行のアルゴリズムはネガティブ画像にある最小限の点状のシグナルを検出する（Ｆ）。
【図１９】全ＦＣＦＭビデオの自動イメージ処理（最大３５００画像）は細菌の検出を実証するグラフ図である。Ａ）１画像当たり８０スポットのしきい値処理および１０％の任意のカットオフを用いたＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄのビデオの解析は、ラプラシアガウシアン（ＬｏＧ）およびガウシアン差分（ＤｏＧ）ポジティブ画像の組合せを使用した細菌の客観的検出を可能にする。Ｂ）１画像当たり８０スポットのしきい値処理および１０％の任意のカットオフを用いたＮＢＤ−ＰＭＸのビデオの解析は、ＬｏＧおよびＤｏＧポジティブ画像の組合せを使用してグラム状態の客観的検出を可能にする。ｎ＝３の肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を除いて、すべての分析に対してｎ＝４である。対照と比較される場合の統計分析。
【図２０】ヒト肺組織自家蛍光の存在下で検出された細菌を示す図である。Ａ）ＰＡ３２８４が含まれるヒト肺組織のＦＣＦＭイメージは、エラスチン自家蛍光を示し、細菌のシグナルを示さない（左）。さらに、ＮＢＤ−ＰＭＸとともにコインキュベートされたＰＡ３２８４を含むヒト肺組織は細菌のシグナルを示す（右）。Ｂ）ライブ共焦点顕微鏡イメージ（統合図）は、核酸対比染色（赤）のＮＢＤ−ＰＭＸ標識化なしとの統合イメージを示している。ＮＢＤ−ＰＭＸで標識され、バックグラウンドの蛍光を上回る右パネルの細菌は、はっきりと見ることができる。Ｃ）４８８ｎｍでのレーザー励起および時間分解単一光子計数分光計（ｔｉｍｅ  ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）によって測定されたＮＢＤの蛍光寿命は、肺の元々ある細胞の自家蛍光の蛍光寿命よりも大幅に長く、これは、インビボにおいてプローブを同定し、感知およびイメージングのシグナル対ノイズを増加させるために使用することができる。
【図２１】ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄは、細菌を標識し、アスペルギルス・フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）を不定に標識するが、カンジタ（Ｃ．  ａｌｂｉｃａｎｓ）は共焦点顕微鏡によってイメージングされないことを示すイメージである。ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄ  ５μＭの代表的なイメージは、Ａ：細菌（緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））およびアスペルギルス・フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の真菌糸（青の矢印）の標識化を示しているが、カンジタ（Ｃ．  ａｌｂｉｃａｎｓ）（赤の矢印）の標識化は示していない。パネルＢは、真菌糸の標識化のばらつきを示す。
【図２２】ＮＢＤ−ＰＭＸは、細菌を標識し、アスペルギルス・フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）を不定に標識するが、共焦点顕微鏡によってカンジタ（Ｃ．  ａｌｂｉｃａｎｓ）はイメージングされない。ＮＢＤ−ＰＭＸ  ５μＭの代表的なイメージは、Ａ：細菌（緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））およびアスペルギルス・フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の真菌糸（青の矢印）の標識化を示しているが、カンジタ（Ｃ．  ａｌｂｉｃａｎｓ）（赤の矢印）の標識化は示していない。パネルＢは、真菌糸の標識化のばらつきを示す。５ｕＭに関してデータが示されるが、同様の結果が１ｕＭに関しても見られる。
【図２３】カンジタ（Ｃ．  ａｌｂｉｃａｎｓ）の懸濁液は、ＦＣＦＭでイメージングされたとき、蛍光の増加を示さないことを示すイメージである。図は、Ｓｙｔｏ  ｇｒｅｅｎで標識化し、ＦＣＦＭでイメージングされた懸濁液中のカンジタ（Ｃ．  ａｌｂｉｃａｎｓ）の陽性対照を示すが、プローブを用いない場合、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄまたはＮＢＤ−ＰＭＸを用いた場合、標識化を示さない。
【図２４】アスペルギルス・フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）は、ＦＣＦＭでイメージングされると特有の特徴的な様式の蛍光を示すイメージである。上部パネルはプローブを用いておらず、固有の自家蛍光を示していない。下部パネルは、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸにより異なるパターンを示している。
【図２５】アスペルギルス・フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）は、ヒツジ肺組織の存在下において直線的なパターンの蛍光を示すイメージであり、これは細菌のシグナルとは異なる。上部パネルは、プローブを伴う細菌溶液の蛍光のパターンを示し、下部パネルは、ヒツジ肺におけるＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸによるアスペルギルス・フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）糸状体を示す。
【図２６】ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄまたはＮＢＤ−ＰＭＸは１００μＭまで溶血が見られなかったことを示す図である。溶血アッセイ（ｎ＝３）は、濃度１００μＭまで溶血が起こらないことを示している。陽性対照は０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘとし、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘに対して１００％溶血になるよう値が補正された。
【図２７】Ａ：ＮＢＤ−ＰＭＸはマウスの２週間で１回の注入モデルで臓器毒性を示さないことを示すイメージである。ＮＢＤ−ＰＭＸに関する代表的な組織構造イメージ（×１００）を４８時間および１４日の時点でＰＢＳ対照動物と比較した。どの群においても対照との差が見られなかった（顧問組織病理学者により盲検的にスコア化された）。Ｂ：ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄは、マウスの２週間で１回の注入モデルで臓器毒性を示していない。ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄに関する代表的な組織構造イメージ（×１００）を４８時間および１４日の時点でＰＢＳ対照動物と比較した。どの群においても対照との差が見られなかった（顧問組織病理学者により盲検的にスコア化された）。
【図２８】蛍光寿命イメージングが、肺組織を細菌と容易に区別することを示すイメージである。左パネルは、肺および肺組織にいる細菌（点）の４８８ｎｍ励起での共焦点を示す。ＦＬＩＭ（右パネル）は、肺組織（緑）および細菌（青）のイメージングにおいてはっきりとした相違を示す。イメージングは、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびヒト肺組織の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を使用して行った。
【発明を実施するための形態】
【０１１６】
本発明の各種実施形態の作製および使用について以下に詳細に述べるが、本発明は、多種多様の特定の状況において具現化することができる多くの適用可能な発明性のある概念を提供するものと認識されるべきである。本明細書において述べられている特定の実施形態は、本発明を作製および使用するための特定の方法を単に説明するためのものであり、本発明の範囲の限界を定めるものではない。
【０１１７】
本発明の理解を容易にするために、多くの用語が以下に定義される。本明細書において定義される用語は、本発明に関連した領域の当業者が一般的に理解するとおりの意味を有する。「１つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」などの用語は、単数の要素を指すだけでなく、特定の例が説明のために使用され得る一般的なクラスも含むことが意図される。本明細書中の術語は、本発明の特定の実施形態を説明するために使用されるが、それらの使用は、特許請求の範囲において境界を明らかにしている場合を除いて本発明の境界を定めるものではない。
【０１１８】
以下の本発明例の実施形態の説明において、ポリミキシン部分を含む結合部分は符号「ＰＭＸ」と示され、ユビキシジン部分を含む結合部分は符号「ＵＢＩ」と示される。例えば、ＮＢＤおよび変性されたユビキシジンフラグメントＵＢＩＮｌｅを含む複数のプローブ要素を含む本発明の実施形態（「デンドロンプローブ」）は、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄと言及される。
【０１１９】
プローブ要素のフルオロフォアの選択
細菌のレポートのために、本発明者らは、プローブ要素のみを含み、ユビキシジンフラグメントＵＢＩ２９〜４１のメチオニンをノルロイシンで置換したプローブ「ＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅ」を合成した。このプローブは、別の「常時オン」のフルオロフォアであるフルオレセイン（ＦＡＭ）、「ＦＡＭ−ＵＢＩＮｌｅ」を有する同じ細菌検出部分と比較され、レポートされたＮＢＤに対してライブベンチトップ共焦点顕微鏡により改善されたシグナル対ノイズを示した（図１）。さらに、標識化は、一般に細菌に特異的であり、細胞膜に特異的ではないことが確認された。例えば、図１は、単離ヒト好中球がＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅプローブによって標識されなかった一方で、細菌はＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅプローブによって標識されたことを示している。
【０１２０】
ＰＭＸ細菌検出部分に対して同じことが観察されると予想されることを確認するために、本発明者らは、ＮＢＤ−ＰＭＸおよびＦＡＭ−ＰＭＸを構築し、これはＮＢＤ−ＰＭＸに関してＦＡＭ−ＰＭＸよりも改善されたシグナル対ノイズを示し、この構築物は哺乳動物細胞に対しても特異的であることを確認している（図２）。
【０１２１】
「分岐／デンドロン」または「多価」プローブ
コアおよびコアに連結された３つのプローブ要素を含むプローブ（「三分岐」プローブ）であって、各プローブ要素がＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅ部分を含むプローブを調製した（ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄ）。
【０１２２】
本発明者らのペプチド部分と結合したときにＮＢＤがその特徴を保持する蛍光レポーターを確認するために、本発明者らは、化合物の蛍光を、疎水性環境（ＤＭＳＯ）を模倣する条件において測定した。直線的なＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅ、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸは４８８ｎｍにおいて励起され（Ｂｉｏｔｅｋ蛍光プレートリーダー）、プローブがジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下（疎水性環境）にあるとき、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と比較して蛍光の著しい増加を示し（図３）、このことは、環境感受性蛍光レポートを裏づけている。ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄは、等モル濃度のＮＢＤを使用する場合、直線的なものと同じ蛍光の増加を示した。
【０１２３】
人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）の原因病原体の７０％超に相当する細菌のパネル（Ｃｈａｓｔｒｅ  Ｊら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２００２年４月１日；１６５（７）：８６７〜９０３ページ）（グラム陰性：緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（２つの菌株）、アシネトバクター・バウマニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）。グラム陽性：メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＳＳＡ）および肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））（下記表３の菌株リスト）をＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄで標識した。標識化は、多様な強度で観察された（図４ＡおよびＢ）。それにもかかわらず、すべての細菌が直線的なＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅで標識したＭＳＳＡよりも明るく（図４Ｂ）、フローサイトメトリーによりＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄは直線的なＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅよりも標識化の増加を示した（図４Ｃ）。さらに、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄは、ヒト好中球またはＡ５４９細胞を標識せず、このことは原核生物に対する選択性を裏づけている。（図４ＤおよびＥ）。
【０１２４】
細菌とともにインキュベートしたＮＢＤ−ＰＭＸは、共焦点分析においてグラム陰性細菌（緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、大腸菌およびインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））に対してグラム陽性細菌（ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡおよび肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））よりも有意に高い蛍光を示し（ｐ＜０．０５）（図５ＡおよびＢ）、これがフローサイトメトリーによって確認された（図５Ｃ）。さらに、ヒト好中球またはＡ５４９細胞の標識化はなかった。（図５ＤおよびＥ）。
【０１２５】
ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸを、細菌感染症のエクスビボのヒツジモデルにおいてその場（インサイチュ）での特異性および感受性に関して評価した（図６）。このモデルにおいて、ＰＫＨ蛍光色素標識した細菌の遠位のヒツジ肺への注入、およびＦＣＦＭでのイメージングは、それぞれの視野において点状の蛍光の特徴的で特有のパターンを明らかにする（図８）。本発明者らは、肺に注入し、ＦＣＦＭでイメージングしたカルセイン標識細菌および緑蛍光タンパク質発現黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に関して同一のパターンを確認した（図８）。このパターンは、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸで「前標識した」細菌を肺区画に注入することによって同様に再現される。
【０１２６】
モデルおよび陽性対照のこの完全な特徴づけに続いて、本発明者らは、ＰＢＳまたは人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）関連細菌をエクスビボ肺モデル内の異なる区画に注入し、続いて本発明におけるプローブのマイクロドーズ送達を行った。本発明者らは、直線的なＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅは、インビトロでの能力にもかかわらずその場（インサイチュ）で細菌を標識することができないことを実証した（図７）。これらの実験に対して、このアッセイを対比染色したグラム陰性細菌（クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））を用いて繰り返し、これがＮＢＤ−ＰＭＸによる標識化を実証した（図７）。しかしながら、細菌を注入した区画では、本発明者らは、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄを注入したとき「陽性対照」（緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌およびＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）で見られたのと同じシグナルを実証したが、ＰＢＳ対照を用いると最小限のシグナル／シグナルがないことを実証し、このことは、その場（インサイチュ）で細菌を標識する能力およびＦＣＦＭシステムを使用してイメージングする能力を裏づけている（図９）。
【０１２７】
グラム陰性細菌緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（実験室株ＰＡ０１および臨床人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）分離株Ｊ３２８４）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）および大腸菌を注入した区画において、本発明者らは、ＮＢＤ−ＰＭＸを注入したときに「陽性対照」においてと同じシグナルを実証したが、ＰＢＳまたはグラム陽性細菌ＭＳＳＡ、ＭＲＳＡおよび肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を注入した区画ではシグナルがないことを実証した（図１０）。これらの実験において、本発明者らは、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸを用いてイメージングされたすべての区画において気管支肺胞洗浄（区画間でＣＦＵ／ｍｌに差がないことを実証する）によっておよび６６０ｎｍでＬＳＵによりイメージングされた対比染色した細菌により、等しい密度のグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌を確認した。
【０１２８】
その場（インサイチュ）での細菌の検出をさらに実証するためおよび細菌凝集体をイメージングするプローブの能力を評価するため、本発明者らは、細菌をアガロースビーズに埋め込み、その後、それを肺に注入した。マイクロドーズのプローブ注入およびＦＣＦＭイメージングは、細菌ビーズがはっきりと排他的に検出されるのに対し、対照ビーズ（細菌を伴わないビーズ）は検出されないことを示した（図９および１０）。
【０１２９】
遠位肺において、送達直後にプローブの著しい急速な消失がある可能性がある。よって、これらの条件下でプローブによる細菌標識化が依然とし持続していることが重要である。ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄ標識細菌は、ＮＢＤ−ＰＭＸに対して見られるようにプローブを「洗い流す」ときに標識化を保持する。ヒツジ肺に注入されたとき、ＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅで前標識した細菌はＦＣＦＭによって検出できないのに対し、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄまたはＮＢＤ−ＰＭＸで前標識した細菌は容易に可視化される（図１１）。したがって、「洗い流すこと」に対するこの耐性は、プローブと細菌の親和性の代替の指標に相当し、これは、遠位肺のその場（インサイチュ）での標識化に対する絶対要件のようである。現在、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸの両方が洗い流すことに対して耐性がある一方で、その他の構造的バリアントの大半は耐性がない。したがって、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸの両方で標識した細菌は、遠位肺において起こるプローブの消失時に十分な強度の蛍光を保持する（図１２）。
【０１３０】
第二に、本発明者らは、ＦＴＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによってＡＬＩの患者からのＢＡＬＦ中のプローブの安定性を評価した。ＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅ、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸをＢＡＬＦとともに３０分間インキュベートした（図１３）。ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸは安定性を示し、ピークは生理食塩水およびＢＡＬＦとインキュベートしたサンプルの両方において容易に同定される、完全なプローブの予測される理論上のスペクトルと厳密に対応している。分解産物の予測されるスペクトルも見られなかった。それに反して、ＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅの分解産物は洗浄液中で不安定性を示すことが確認された。したがって、「炎症を起こした」極めて酵素的に活性な遠位肺環境の状況においてプローブの安定性および機能の保持は、インビボにおける有用性の重要な決定要因である。これは、ヒツジ洗浄液の存在下でイメージングすることによって確認し、これは、ヒツジ洗浄液においてイメージングされると、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄが直線的な化合物よりも高い蛍光強度を示し、ＮＢＤ−ＰＭＸに関しては強度の低減を示さなかった（図１４）。
【０１３１】
大量のサーファクタントの存在下で細菌を優先的に検出するプローブの能力を調査するために、肺サーファクタント成分を使用してインビトロにおいて実験を行った。ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸに組み込まれる蛍光レポーター（ＮＢＤ）の性質は、サーファクタントが「豊富な」疎水性環境における蛍光活性化の可能性を示唆した。緩衝生理食塩水中のサーファクタント成分の懸濁液を調製し（２０ｍｇ／ｍｌ、６５％ジパルミトイルホスファチジルコリン、３０％ホスファチジルグリセロール、５％パルミチン酸さらに展着剤として１ｍｇ／ｍｌチロキサポール）、Ａ５４９上皮細胞単層とともにおよびそれを伴わずにインキュベートした。上皮細胞表面をコーティングするように見えるサーファクタント成分の粒子は蛍光性であり、このことは、この疎水性溶液中でＮＢＤの蛍光が増加することを示唆している。本発明者らは、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸはともに肺サーファクタント成分よりも細菌の標識化に対して選択性があることを明確に実証する。等モル濃度において、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄは、サーファクタント成分の存在下で直線的なＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅよりも著しく改善された細菌の選択性を有する（図１５）。ＮＢＤによる疎水性環境における蛍光の増加に依存したメカニズムにもかかわらず、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸの両方が、遠位肺において細菌をイメージングするその能力に従って精製されたサーファクタント成分よりも細菌に対して優先的に蛍光を増加させる。肺におけるサーファクタント成分の比較分布および相対的存在量はわかっていないが、もっぱらこれがプローブ注入時に観察されるバックグラウンドの蛍光をもたらし、プローブが分解に対して十分に耐性があり、洗い流したときに標識化を保持する場合には、サーファクタントの存在下でインビトロで標識化を保持することが、明瞭に写しだすためにプローブに必要とされる可能性が高い。
【実施例１】
【０１３２】
エラスターゼ（ＨＮＥ）感受性プローブ
エラスターゼ感受性プローブの第１の実施例（図１６Ａにおいて模式的に示されている）は、ペプチド配列ＡＡＰＶ（切断可能なリンカーの酵素切断可能なペプチド配列として働く）により７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）およびユビキシジンフラグメントＵＢＩ２９〜４１（プローブ要素としてともに働く）と連結されたメチルレッド（ダーククエンチャーとして働く）を含む。それゆえに、ＮＢＤ蛍光は、メチルレッドにより消光され、蛍光シグナルが観察されないことになり（すなわち、メチルレッドとＮＢＤがＦＲＥＴ対として働いている）、ゆえに、プローブはＵＢＩ２９〜４１により標的領域に存在する可能性があるいかなる細菌と結合しても、しなくても、共焦点顕微鏡を使用してシグナルは観察されない。
【０１３３】
炎症組織においてなどプローブがヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）の存在下にある場合、ＨＮＥはリンカーのペプチド配列を切断して、それによりメチルレッドクエンチャーからプローブ要素を遊離させる。それに応じて、ＮＢＤフルオロフォアはもはや消光されず、蛍光シグナルを生成する。さらに、ＮＢＤの環境感受性のため、ＮＢＤが細胞膜内などの疎水性環境にある場合、生成されるシグナルは大幅に増幅される。
【０１３４】
図１６Ｂは、細菌および好中球の共培養物とともにインキュベートしたプローブを含むサンプルに関する共焦点イメージを示す。これらのイメージは、好中球由来のＨＮＥによって切断され、細菌を標識するプローブの能力を裏づける。エラスターゼ阻害剤であるシベレスタットを培地に添加したとき、プローブは依然として切断されないままである（よって、ＮＢＤはメチルレッドにより消光されている）ため標識化は観察されなかった。
【実施例２】
【０１３５】
第２の実施例において、プローブは、ペプチド配列ＡＡＰＶ（切断可能なリンカーの酵素切断可能なペプチド配列として働く）によりＮＢＤおよびポリミキシン（プローブ要素として働く）と連結されたカルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ、蛍光クエンチャーとして働く）を含む。それゆえに、ＮＢＤ蛍光はＴＡＭＲＡにより消光されて、ＴＡＭＲＡからの蛍光シグナルが生じる（すなわち、ＴＡＭＲＡは、ＮＢＤが吸収したエネルギーを受け取って、それ自体が蛍光を発しており、ＴＡＭＲＡとＮＢＤはＦＲＥＴ対として働いている）。それゆえ、存在する可能性があるいかなる細菌とポリミキシンが結合していようが、してなかろうが、ＴＡＭＲＡからのシグナルのみが観察される。
【０１３６】
プローブがエラスターゼによって切断されたら、ＮＢＤの蛍光のため細菌はプローブ要素によって標識される（図１７Ａ）のに対し、好中球は活性化されるとＴＡＭＲＡ部分によって標識される（図１７Ｂ）。さらに、本発明者らは、切断されたＴＡＭＲＡ化合物の蛍光がエラスターゼに依存的な様式で増加し、シベレスタットなどのエラスターゼ阻害剤（「Ｓ」、図１７Ｃ）により阻害されることを実証している。
【０１３７】
データ分析
本発明者らは、プローブ／ＦＣＦＭプラットフォームによって生成された大きなデータセットの高速なリアルタイム客観分析を実施するためのカスタムメイドのイメージ分析／処理戦略を開発し始めた。明確な細菌の検出およびそのグラム状態の描写が、これらのイメージ処理アルゴリズムをリアルタイムで用いることによって達成されると予想される。単一の画像分析に基づく処理アルゴリズムを全ビデオシーケンス（最大３５００画像）に適用し、この初期の段階でも本発明者らは、細菌の存在およびグラム状態を明確に視覚的に示すことができる。これらのシグナルおよびイメージ処理アルゴリズムは、臨床適用のための準備を整えて速やかに繰り返され、本発明者らは、ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸデータセットのさらなる最適化に組み込まれるべき機械学習の重要な要素を予想する。
【０１３８】
図１８は、モデルを開発するために初めに選択した１つのポジティブ画像および１つのネガティブ画像に対する、蛍光顕微鏡イメージの明るいスポットを検出するために対物レンズのコンピューターによる手法において一般的に使用される２つのイメージ処理アルゴリズム（ラプラシアンガウシアン（ＬｏＧ）およびガウシアン差分（ＤｏＧ））に基づく段階的な処理を示す。ＬｏＧまたはＤｏＧフィルターによりたたみ込むことによってイメージにあるスポットを強調する。イメージにあるノイズの影響を取り除くことによって精度を向上させるために前処理が必要である。まず、イメージを小さなウィンドウに分割し（１画像当たり１００）、その後、ピクセル強度の標準偏差を算出することによってバックグラウンドノイズを推定する。低周波数ノイズを減少するためにハイパスフィルタリングが使用される。３×標準偏差での得られたイメージのしきい値処理は、バックグラウンドノイズを除去し、より高いピクセル強度値のみを維持する。最後に、ＬｏＧまたはＤｏＧによりスポットが検出される。
【０１３９】
本発明者らは、全ＦＣＦＭイメージのビデオ（最大３５００画像）を分析するために上記の方法を用いたした。ポジティブ画像を示すために１画像当たり８０スポットの初期の閾値限界を用いて、本発明者らは、１ビデオ当たりのポジティブ画像のパーセンテージを求め、はい／いいえの二値結果のためのしきい値として２０％の任意の「カットオフ」を設定した。これは、それぞれＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄおよびＮＢＤ−ＰＭＸを使用して明確な細菌の検出およびグラム状態を示す（図１９）。
【０１４０】
確実に化合物が正常なヒト肺の自家蛍光を上回って細菌を標識するように、細菌をヒト肺組織とともにインキュベートし、ＦＣＦＭを使用してベンチトップ共焦点によりイメージングし（図２０）、これは、一旦標識されると、自家蛍光のレベルを上回って細菌を検出することができることを実証している。
【０１４１】
本発明者らは、プローブによる遠位肺のその場（インサイチュ）での標識化の多くの決定要因を同定した。これらは、なぜ直線的なＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅプローブに関する有望なインビトロのデータが、ヒツジ肺において再現性のあるその場（インサイチュ）での標識化に変換されなかったかを明らかにする。構造的バリアントを合成し、評価して、構造活性相関を探った。最初の目標は、分解に対する耐性を向上させ、シグナル対ノイズを向上させることであった。安定性（Ｄ−アミノ酸／Ｎ−メチルの挿入もしくは限定されたＤ−アミノ酸バリアントを含むバリアントなど）または標識化強度などの１つの機能面を大幅に改善した特定の改変は、遠位肺にいる細菌の再現性のある視覚化を可能にできなかった。本発明者らは、ＡＬＩ  ＢＡＬＦ中における安定性、３７℃においてライブベンチトップ共焦点イメージングを使用した細菌のインビトロでの標識化およびヒツジ肺におけるその場（インサイチュ）での標識化に関してＵＢＩ類似体を広範囲にわたって評価した。
【０１４２】
多くの構造的改変に着手し、これは、大ざっぱに２つのグループに分けられる。
【０１４３】
（ａ）さまざまな環境感受性フルオロフォアを調べるか、またはＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅペイロードを増加させることによってシグナル対ノイズ比を増加させる。
【０１４４】
本発明者らは、それぞれのＵＢＩフラグメントに関して２つのＮＢＤフルオロフォアを含むことの有用性を評価し、これを、安定性を向上させるために設計されたＮ−メチル化アミノ酸バリアントとともにも評価した。本発明者らは、より低いレベルの細菌の検出またはより低いプローブ有効濃度での検出を可能にする可能性があるより高いシグナル対ノイズ比をもたらすことを目的として、マラカイトグリーンおよびスチリルベースの染料を含む一連の代替的な環境感受性フルオロフォアを評価した。
【０１４５】
（ｂ）タンパク質分解に対する耐性を向上させる。
【０１４６】
本発明者らは、親ＮＢＤ−ＵＢＩ化合物のＭＡＬＤＩ分析によってタンパク質分解を受けやすい部位と特定された選択位置にＤ−アミノ酸およびＮ−メチル化アミノ酸を組み込んだバリアントを含む多くの化合物を評価した。アミノ酸成分を変えることなく分解を低減するために、本発明者らは、ペプチド配列の末端からの分解をブロックすべくアミノ末端および／またはカルボキシ末端にＰＥＧ単位を含むバリアントを合成した。本発明者らはまた、ブロッキングＰＥＧ単位を含むか、または含まない、Ｄ−アミノ酸および配列の逆位を有するＤ−アミノ酸からすべてが成るバリアントを合成し、評価した。さらに、ＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅの環式バリアントならびにＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅの環式バリアントのＭＡＬＤＩ分析によってタンパク質切断を受けやすいままだと特定された選択位置にＮ−メチル化アミノ酸を組み込んだこの化合物のさらなるバリアントも評価した。
【０１４７】
【化６】
2018501780.tif 000008
【０１４８】
すべての化合物を生物学的評価した。安定性に関して、本発明者らは、０．９％のＮａＣｌ（生理食塩水）または急性肺傷害の患者からプールした洗浄液の存在下でそれぞれの化合物を評価し、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化法（ＭＡＬＤＩ）またはフーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）によって分析した。インビトロでの標識化を、化合物の存在下で細菌を用いてベンチトップ共焦点のものにより評価し、標識化を細菌の標識化の基準対照として機能するＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅと比較した。必要に応じて、本発明者らはまた、単離ヒト好中球およびヒト初代細胞株（Ａ５４９ヒト肺腺癌細胞株）に対する化合物の標識化も評価した。エクスビボおよびインビボでのヒツジ肺実験に関して、対照肺区画（２ｍｌのＰＢＳを注入した）または細菌区画（２ｍｌの２光学密度の細菌を注入した）において、それぞれの化合物を評価した。細菌注入後、その化合物を目的とする区画に投与し、これをプローブベースのＦＣＦＭによってイメージングした。
【０１４９】
さまざまなＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅバリアントの評価により、本発明者は肺環境においてプローブの機能に影響を及ぼすさまざまな機構的要因をより明確に理解し、具体的には、すべてのＵＢＩバリアントのうちＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄのみが肺における細菌をイメージングすることの理由を明らかにした。
【０１５０】
代替的なフルオロフォアは、本出願のＮＢＤより劣っていた。マラカイトグリーンバリアントは細菌に対してはるかに低い標識化強度をもたらし、スチリル染料化合物は細菌に対して増加した標識化強度を示したが、これらの化合物は哺乳動物細胞を上回る選択性が低下した。これは、ユビキシジン部分のターゲティングに打ち勝って脂溶性膜に入るそれらの染料自体の傾向による可能性が最も高い。それゆえに、スチリル染料バリアントは、エクスビボの肺においてオフターゲットの標識化が大幅に増加し、細菌のシグナルは観察されなかったことを呈示した。
【０１５１】
Ｄ−アミノ酸バリアントならびにペプチド配列の末端にＰＥＧブロッキング基を有するバリアントは、インビトロにおいて低減された標識化を示し、エクスビボにおいて標識化が示されなかった。向上した安定性にもかかわらず、インビトロにおいて機能を保持した直線的なＵＢＩバリアントのうちどれも肺にいる細菌をイメージングすることができなかった。本発明者らは、プローブの洗い流される特性がプローブを肺で首尾よくイメージングするために使用可能か否かに影響を与えるという証拠を得、これは、親和性および／または続いて起こる細菌細胞膜への挿入の性質に関連する可能性が最も高い。プローブ溶液の除去時の標識化の保持を、共焦点によってインビトロで調査した。すべての直線的なＵＢＩバリアントによる標識化は、洗い流したときに完全に失われた。これは、流体消散の結果として細菌の周りのプローブ濃度が低下すると、肺では標識化が速やかに失われることを示唆する。細菌をこれらの直線的なＮＢＤ−ＵＢＩＮｌｅ化合物で前標識し、注入前の細菌懸濁液をイメージングすることによって上首尾の標識化を確認した。これらの懸濁液をエクスビボの肺に注入した後、ＦＣＦＭによりその区画をイメージングしても、細菌のシグナルが検出されなかった（注入カテーテルから同じ区画へのＦＣＦＭファイバー通路の挿入への切り換えに特有の時間遅延がある）。しかしながら、インビトロで共焦点のものによって評価した場合に洗い流したときに標識化が失われなかったＮＢＤ−ＰＭＸで前標識した細菌を注入すると、細菌のシグナルが検出された。ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄ構築物は、等モル濃度で増加した細菌のシグナルをもたらすだけでなく、洗い流したときに標識化を保持した。予測されるとおり、これらの化合物で前標識した細菌をエクスビボの肺に注入すると細菌が明瞭に写し出された。
【０１５２】
本発明者らは、真菌を含む非細菌肺病原体を標識する化合物の能力を試験した。免疫正常患者内における真核生物の真菌による人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）の発症は一般的ではなく、人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）症例の２％未満を占める。最も一般的に分離される病原体は、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（カンジタ（Ｃ．  ａｌｂｉｃａｎｓ））およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ（アスペルギルス・フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ））である。カンジタ（Ｃ．  ａｌｂｉｃａｎｓ）は、ＩＣＵの最大５０％の患者に定着しており、抗生物質の使用に伴い定着が増加する。しかしながら、人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）の原因として侵襲性カンジダ症の発症はまれで、依然として議論の余地がある。実際に、いくつかの大きな臨床試験は、人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）に対するそれらの診断アルゴリズムにおいてカンジダの分離を排除し、事後の試験により、ＢＡＬからのカンジダの増殖が免疫正常患者におけるカンジダ感染症の確実なマーカーではないことが実証された。時として重篤な患者の呼吸器サンプルの１〜２％においてアスペルギルス・フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）も分離される。しかしながら、この１〜２％のうちのわずか２０％が病原であると考えられ、残りの８０％は定着であると考えられる。
【０１５３】
ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄは、カンジタ（Ｃ．  ａｌｂｉｃａｎｓ）の標識化を示さなかったが、イメージング時にアスペルギルス・フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の菌糸のばらつきのある標識化があった（図２１）。さらに、イメージングは、真菌糸は細菌よりも相当大きく、異なる形態的外観を示すことを実証した。ＮＢＤ−ＰＭＸは、共焦点によりイメージングされるとＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄと同一のパターンを示し、グラム陰性細菌の標識化およびアスペルギルス・フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の菌糸のばらつきのある標識化は保持され、カンジタ（Ｃ．  ａｌｂｉｃａｎｓ）は標識されなかった（図２２）。
【０１５４】
最後に、肺組織においてこのパターンが同定されるかどうかを検出するために、アスペルギルス・フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）をヒツジ肺およびプローブとともに共培養し、ＦＣＦＭでイメージングした。これは、再び真菌糸の大きさおよびパターンが細菌のシグナルとは異なることを実証した（図２４）。アスペルギルス・フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の懸濁液を用いて同様の実験を行い、細菌のシグナルとは異なる、別個の特徴的な直線的なパターンの蛍光を実証している（図２５）。
【０１５５】
ＮＢＤ−ＰＭＸおよびＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄを溶血アッセイによって直接赤血球毒性（ｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ）に関して評価し、１００μＭまで赤血球溶血が起こらないことが示された（図２６）。化合物を、げっ歯類の単回投与で毒性に関して評価し、これは気管内毒性評価である。マウスに１００μｇ／２５ｇマウス（１００μｇが７５ｋｇのヒトに送達されるとするヒト用量の３０００倍）のＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄもしくはＮＢＤ−ＰＭＸまたはＰＢＳ対照を１回気管内投与した。その後、４８時間および１４日の時点でマウスを安楽死させた（１群当たりｎ＝３）。データは、ＮＢＤ−ＰＭＸ（表２および図２７Ａ）またはＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄ（表１および図２７Ｂ）に毒性がないことを示している。
【０１５６】
【表１】
2018501780.tif 000009
【０１５７】
【表２】
2018501780.tif 000010
【０１５８】
プローブの合成方法
ユビキシジンベースのエラスターゼプローブの合成（「メチルレッド（ＭＲ）−ＡＡＰＶ−ＮＢＤ−ＵＢＩ２９〜４１」および「ＴＡＭＲＡ−ＡＡＰＶ−ＮＢＤ−ＵＢＩ２９〜４１」）
ＭＲ−ＡＡＰＶ−Ｋ（ＮＢＤ）−ＰＥＧ−ＯＨ（ＡＬ３−７４）フラグメントを、標準的なアミノ酸カップリングサイクル（室温で２×３０分）で約０．１ｍＭの試薬濃度のペプチドグレードＤＭＦ中でＤＩＣおよびオキシマを用いてＦｍｏｃ法を使用して固相上で合成した。Ｆｍｏｃ脱保護工程は、２０％ピペリジン／ＤＭＦ中で行った（２×３０分）。各工程の間に、樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭおよびＭｅＯＨで洗浄した。
【０１５９】
２ｇのクロロトリチルポリスチレン樹脂（約０．３ｍｍｏｌ／ｇロード）を無水ＤＣＭ（２ｍＬ）中のＦｍｏｃ−ＰＥＧ−ＯＨ（３当量）およびＤＩＰＥＡ（６当量）で３時間処理した。洗浄およびＦｍｏｃ脱保護後、Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶＫ（Ｄｄｅ）配列を、上記のとおりＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨを使用して合成した。配列が完成した後、その樹脂の半分を用いて合成を続け（０．３ｍｍｏｌスケール）、Ｄｄｅ保護基をＮＭＰ／ＤＣＭ中のＮＨ２ＯＨ／イミダゾールで直角に取り除いた（２×９０分）。その樹脂を、ＤＭＦ中のＮＤＢ−Ｃｌ（３当量）およびＤＩＰＥＡ（６当量）で処理した（２×４５分）。Ｆｍｏｃ脱保護後、０．１５ｍｍｏｌスケールで合成を続け、上記のとおりＮ末端にメチルレッドを連結した。洗浄後、そのフラグメントを、ＴＦＡ−ＴＩＳ−Ｈ２Ｏ（９５：２．５：２．５）で樹脂から切り取り（３０分間）、冷えたエーテルで沈殿させてＡＬ３−７４を得た（ＥＳＩ−ＭＳ１０４４．４および１０６６．４）。
【０１６０】
【化７】
2018501780.tif 000011
【０１６１】
Ｒｉｎｋ−ａｍｉｄｅ  ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂（１ｍｍｏｌ／ｇロード）上にＵＢＩ２９〜４１配列を合成した、以下に述べる。次に、無水ＤＭＦ（０．６ｍＬ）中のＡＬ３−７４（０．０５５ｍｍｏｌ）をＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂ＡＬ３−６８（０．０３ｍｍｏｌ）上のＵｂｉ２９〜４１に添加し、続いてＨＢＴＵ（０．０５５ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。その反応混合物を、光を防いで一晩振盪した。ろ過後、その樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭおよびＭｅＯＨで洗浄した。その樹脂をＤＣＭで膨張させ、プローブを、ＴＦＡ／チオアニソール／ＥＤＴ／アニソール（９０：５：３：２）を用いて脱保護し、樹脂から切り取った（３時間）。粗製物を冷えたエーテルで沈殿させ、遠心分離によって回収した。生成物ＡＬ３−７９を４９０ｎｍで検出および溶離液として０．１％ギ酸を含むＨ２Ｏ−ＡＣＮの勾配で分取ＨＰＬＣによって精製した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ２７１９．４、＞９５％ＨＰＬＣ純度。
【０１６２】
ＴＡＭＲＡ−ＡＡＰＶ−ＮＢＤ−ＵＢＩ２９〜４１  ＡＬ３−８８（Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ  ＭＳ  ２８８１．５、＞９５％ＨＰＬＣ純度）を、フラグメントＴＡＭＲＡ−ＡＡＰＶ−Ｋ（ＮＢＤ）−ＰＥＧ−ＯＨ（ＡＬ３−７５）が樹脂ＡＬ３−６８上のＵＢＩベースのペプチドのＮ末端側に連結されたことを除いて同様の手法で合成した。
【０１６３】
【化８】
2018501780.tif 000012
【０１６４】
ポリミキシンベースのＮｅＢａｃ−プローブの合成
【０１６５】
【化９】
2018501780.tif 000013
【０１６６】
ＴＡＭＲＡ−ＡＡＰＶ−Ｋ（ＮＢＤ）−ＰＥＧ−ＯＨフラグメント３Ａを、標準的なアミノ酸連結サイクル（室温で２×３０分）で約０．１ｍＭの試薬濃度のペプチドグレードＤＭＦ中でＤＩＣおよびオキシマを用いてＦｍｏｃ法を使用して固相上で合成した。Ｆｍｏｃ脱保護工程は、２０％ピペリジン／ＤＭＦ中で行った（２×３０分）。各工程の間に、樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭおよびＭｅＯＨで洗浄した。
【０１６７】
５００ｍｇのクロロトリチルポリスチレン樹脂（約０．３ｍｍｏｌ／ｇのロード）を、無水ＤＣＭ（２ｍＬ）中のＦｍｏｃ−ＰＥＧ−ＯＨ（３当量）およびＤＩＰＥＡ（６当量）で３時間処理した。洗浄およびＦｍｏｃ脱保護後、Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶＫ（Ｄｄｅ）−配列を上記のとおりＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨを使用して合成した。配列が完成した後、Ｄｄｅ保護基をＮＭＰ／ＤＣＭ中のＮＨ２ＯＨ／イミダゾールで直角に取り除いた（２×９０分）。その樹脂を、ＤＭＦ中のＮＤＢ−Ｃｌ（３当量）およびＤＩＰＥＡ（６当量）で処理した（２×４５分）。Ｆｍｏｃ脱保護後、５（６）−カルボキシＴＡＭＲＡを上記のとおりＮ末端側に連結した。洗浄後、そのフラグメントを、ＴＦＡ−ＴＩＳ−Ｈ２Ｏ（９５：２．５：２．５）で樹脂から切り取り（３０分間）、エーテルで沈殿させた。３Ａ  ＥＳＩ−ＭＳ  １０４４．４および１０６６．４。
【０１６８】
次に、無水ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の３Ａ（０．０１１ｍｍｏｌ）にＨＳＰｙＵ（０．０１１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．０３３ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で１時間撹拌した。Ｂｏｃ保護されたポリミキシン（１５ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ、０．５ｍＬのＤＭＦ中）およびＤＩＰＥＡ（０．０３３ｍｍｏｌ）を添加し、その反応混合物を、光を防いで一晩撹拌した。ＤＭＦを蒸発させ、粗製物を１ｍＬのＴＦＡ−ＤＣＭ（１：１）に溶解させ、９０分間撹拌した。ＴＦＡ−ＤＣＭを蒸発させ、粗製物を冷えたエーテルで沈殿させ、遠心分離によって回収した。その生成物を、４９０ｎｍで検出および溶離液として０．１％ギ酸を含むＨ２Ｏ−ＡＣＮの勾配で分取ＨＰＬＣによって精製した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  ２１５１．６および２１７３．６、１００％ＨＰＬＣ純度。
【０１６９】
ＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄの合成
モノマー（５）の合成
合成は、スキーム１に示されるとおりの６つの工程１で合成されたモノマー（５）の調製を必要とした。アクリロニトリルへの１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンのヒドロキシ基の１，４付加に続く、アミノ基保護（Ｂｏｃ）によってモノマー（５）を調製した。ＰｔＯ２／Ｈ２を用いたニトリル基の水素化分解により（３）を得、これをＤｄｅＯＨで処理してトリス−Ｄｄｅ保護アミン（４）を得た。Ｂｏｃ保護基の除去後、Ｋｎｏｌｋｅｒ２の手順に従ってイソシアネート（５）を調製した。
【０１７０】
【化１０】
2018501780.tif 000014
【０１７１】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂（６）
４−［（２，４−ジメトキシフェニル）−（Ｆｍｏｃ−アミノ）メチル］フェノキシ酢酸（Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅリンカー）をＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂（ＬＶ＝１ｍｍｏｌ／ｇ）に付着させた。このようにＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−ａｍｉｄｅリンカー（０．２ｍｍｏｌ、１当量）をＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解させ、エチルオキシミノシアノアセタート（オキシマ）（０．２ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、その混合物を５分間撹拌した。その後、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（０．２ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、得られた混合物をさらに２分間撹拌した。その溶液をＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂（０．１ｍｍｏｌ、１．０ｍｍｏｌ／ｇ、１当量）に添加し、０．５時間振盪した。得られた樹脂を、ＤＭＦ（３×５ｍＬ）、ＤＣＭ（３×５ｍＬ）およびＭｅＯＨ（３×５ｍＬ）で洗浄した。カップリング反応を定量的なニンヒドリン試験３により監視した。
【０１７２】
【化１１】
2018501780.tif 000015
【０１７３】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ型リンカーを用いて誘導体化されたＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂上にプローブを合成した（スキーム２）。リンカー（６）にモノマー（５）をロードして、トリ分岐スカフォールド（７）を得た。Ｄｄｅ基の除去後（ＤＭＦ中２％ヒドラジン）、適切なＦｍｏｃ−アミノ酸を連続的に連結した後、４−ＰＥＧ−７−ニトロベンゾフラザンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＢＤ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）を結合させ、ＴＦＡ／ＴＩＳ／ＤＣＭ（９０／５／５）を使用して樹脂から切断した。
【０１７４】
Ｆｍｏｃ脱保護のための一般的な手順
（ＤＣＭ中で予め膨張させた）樹脂にＤＭＦ中２０％ピペリジン（５ｍＬ）を添加し、その反応混合物を１０分間振盪した。溶液を排出し、その樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍＬ）、ＤＣＭ（３×１０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（３×１０ｍＬ）で洗浄した。この手順を２回繰り返した。カップリング反応を定量的なニンヒドリン試験３により監視した。
【０１７５】
（７）を得るためのイソシアネートカップリング
ＤＣＭ（１０ｍＬ）中で予め膨張させた樹脂（０．３０ｍｍｏｌ）にイソシアネート（６）（９２０ｇ、０．９３ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．２ｍＬ、０．９３ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（２２ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ／ＤＭＦの混合物（１：１、５ｍＬ）溶液を添加し、その混合物を一晩振盪し、その反応を定量的なニンヒドリン試験によって監視した。溶液を排出し、その樹脂をＤＭＦ（３×２０ｍＬ）、ＤＣＭ（３×２０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（３×２０ｍＬ）ならびにエーテル（３×２０ｍＬ）で洗浄した。（３×２０ｍＬ）。カップリング反応を定量的なニンヒドリン試験３により監視した。
【０１７６】
ＰＥＧカップリング  −  ８−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−アミノ）−３，６−ジオキサオクタン酸（Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ−ＯＨ）カップリング
ＤＭＦ（３ｍＬ）中のＦｍｏｃ−ＰＥＧ−ＯＨ（３．０ｍｍｏｌ、１０当量）溶液およびオキシマ（３．０ｍｍｏｌ、１０当量）を添加し、その混合物を５分間撹拌した。その後、ＤＩＣ（３．０ｍｍｏｌ、１０当量）を添加し、得られた混合物をさらに２分間撹拌した。その溶液をＤＣＭ中で予め膨張させた樹脂（７）に添加し、その反応混合物を０．５時間振盪した。溶液を排出し、その樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍＬ）、ＤＣＭ（３×１０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（３×１０ｍＬ）で洗浄した。カップリング反応を定量的なニンヒドリン試験３により監視した。
【０１７７】
ペプチド合成
ペプチド配列：Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
適切なＦｍｏｃ−アミノ酸（３．０ｍｍｏｌ、１０当量）（Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ）およびオキシマ（３．０ｍｍｏｌ、１０当量）の溶液を添加し、その混合物を５分間撹拌した。その後、ＤＩＣ（３．０ｍｍｏｌ、１０当量）を添加し、得られた混合物をさらに２分間撹拌した。その溶液をＤＣＭ中で予め膨張させた樹脂に添加し、その反応混合物を０．５時間振盪した。溶液を排出し、その樹脂をＤＭＦ（３×２０ｍＬ）、ＤＣＭ（３×２０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（３×２０ｍＬ）で洗浄した。カップリング反応を定量的なニンヒドリン試験３によって監視した。
【０１７８】
７−ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ）カップリング
ＮＢＤ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（３．０ｍｍｏｌ、１０当量）のＤＭＦ中（３ｍＬ）溶液にＤＩＰＥＡ（３．０ｍｍｏｌ、１０当量）を添加した。得られた溶液をＤＣＭ中で予め膨張させた樹脂（１当量）に添加し、その反応混合物を０．５時間振盪した。溶液を排出し、その樹脂をＤＭＦ（×３）、ＤＣＭ（×３）およびＭｅＯＨ（×３）で洗浄した。カップリング反応を定量的なニンヒドリン試験３により監視した。
【０１７９】
レポーターＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄのＴＦＡ切断および精製
ＤＣＭ中で予め膨張させた樹脂（４５ｍｇ）をＴＦＡ／ＴＩＳ／ＤＣＭ（９０／５／５、３００μＬ）の切断カクテルで２．５時間処理した。溶液を排出し、その樹脂を切断カクテルで洗浄し、溶液を真空中で除去した。その粗製材料を最低量の切断カクテル（５０μＬ）に溶解させ、氷冷エーテル（７．５ｍＬ）に添加した。沈殿した固体（２２ｍｇ）を遠心分離によって回収し、デカンテーションによって溶媒を除去し、沈殿物を冷えたエーテル（３×５ｍＬ）で洗浄した。その後、沈殿物を分取逆相ＨＰＬＣによって精製し、必要とされる画分をプールし、凍結乾燥してＮＢＤ−ＵＢＩｄｅｎｄを得た。
【０１８０】
【化１２】
2018501780.tif 000016
【０１８１】
ＮＢＤ−ＰＭＸの合成
前駆体ポリミキシンＢスルファートから４つの工程でＮＢＤ−ＰＭＸプローブを合成した（スキーム６）。このプローブおよび、その中間体を適度な変更を伴い報告された方法１を使用して合成した。フルオロフォアをＮＢＤ−ＰＥＧのＮＨＳエステルとテトラ−ＢｏｃポリミキシンＣとの間のアミドカップリングとして組み込む。ＴＦＡ切断およびＨＰＬＣ精製後にＮＢＤ−ＰＭＸプローブを得る。
【０１８２】
【化１３】
2018501780.tif 000017
【０１８３】
化合物Ｂの調製
ポリミキシンＢスルファート（１０ｇ、７．７ｍｍｏｌ、１当量）をｐＨ６．５の脱イオン化水（２００ｍＬ）に溶解させた（ｐＨを調節するためにＨＣｌ水溶液を使用）。パパイン（１．５ｇ）を水（２５ｍＬ）（同じｐＨ）に溶解させた。その溶液を混合し、トルエン（０．５ｍＬ）を添加し、その混合物を６５℃で一晩穏やかに撹拌した。その後、その混合物を５分間沸騰水中で撹拌し、形成された沈殿物（変性したパパイン）を遠心分離およびろ過によって除去した。ろ液を真空中で濃縮し、フリーズドライして粗生成物Ｂを定量的収率で得た。この工程をさらにいかなる精製も行うことなく次の工程に進めた。ＭＳ  ｍ／ｚ  ９６３．２（１００％、［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【０１８４】
化合物Ｃの調製：
粗製物Ｂ（５．５ｇ、５．７ｍｍｏｌ、１当量）をＨ２Ｏ：ジオキサン：Ｅｔ３Ｎ（１５０ｍＬ、１：１：１）の混合物に溶解し、Ｂｏｃ−ＯＮ（４．５２ｇ、１７．１ｍｍｏｌ、３当量）を添加した。その溶液を室温で２０分間撹拌した後、メタノール性アンモニア（ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃ  ａｍｍｏｎｉａ）（２０ｍＬ、２Ｍのアンモニア、ＭｅＯＨ中）でクエンチした。反応をＥＬＳＤによって追跡した。溶媒を蒸発させ、得られた混合物をシリカゲルクロマトグラフィーカラム（ＭｅＯＨ：ＤＣＭ、１５：８５）に供して、白色固体Ｂ（１．７ｇ、２２％）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  １３６３．７（１００％、［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【０１８５】
Ｎ−（４−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−７−イル）アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ＮＢＤ−ＰＥＧ−ＯＨ）：２
ＤＩＥＡ（８５０μｌ、５．００ｍｍｏｌ）および固体８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ＮＨ２−ＰＥＧ−ＯＨ）（３９２ｍｇ、２．４０ｍｍｏｌ、１当量）をゆっくりと１時間かけて０℃のＮＢＤ−Ｃｌ（４０１ｍｇ、２．０１ｍｍｏｌ）のメタノール（２０ｍＬ）中溶液に添加した。その反応混合物を一晩室温で撹拌した。溶媒を蒸発させ、残っている材料をシリカによる溶離液としてＤＣＭ／ＭｅＯＨ（８：２）を用いたクロマトグラフィーによって精製して、暗赤色の油状物としてＮＢＤ−ＰＥＧ−ＯＨ（４００ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ、５１％）を得た。1H NMR (500 MHz, DMSO): δ 10.9 (s, 1H; COOH), 8.49 (d, J = 8.5 Hz, 1H; CH NBD), 7.1 (s, 1H, NH), 6.23 (d, J = 8.5 Hz, 1H; CH NBD), 4.25 (s, 2H), 3.93 (t, J = 5.3 Hz, 2H; CH2), 3.80 (s, 4H), 3.72 (t, J = 6.8 Hz, 2H; CH2) ppm;ＭＳ  （ＥＳＩ−）：ｍ／ｚ  Ｃ１２Ｈ１４Ｎ４Ｏ７に対する計算値［Ｍ−Ｈ］：３２５．１；実測値：３２５．２。
【０１８６】
Ｎ−（４−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−７−イル）アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸、スクシンイミジルエステル（ＮＢＤ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）：
ＮＢＤ−ＰＥＧ−ＯＨ（２．４ｇ、７．４ｍｍｏｌ、１当量）の無水ＤＣＭ（５００ｍＬ）中溶液にＥＤＣ．ＨＣｌ（１．５６ｇ、８．１８ｍｍｏｌ、１．１当量）およびＤＩＰＥＡ（１．３６ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を１０分間撹拌した後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．９４ｇ、８．１８ｍｍｏｌ）を添加し、１６時間撹拌させた。その反応混合物をＤＣＭ（２５０ｍＬ）で希釈し、５％クエン酸水溶液（２×２００ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液およびブラインで処理した。有機層をＮａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、真空中で還元して、暗褐色の固体として生成物を得た（１．０ｇ、定量的）。この粗製物をさらに精製することなく次の工程に使用した。
【０１８７】
Ｆの調製：
ＮＢＤ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（４６６ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ、１当量）、ＤＩＰＥＡ（３８４μＬ、２．２ｍｍｏｌ、２当量）およびアミンＣ（１．５ｇ、１．１ｍｍｏｌ、１当量）のＤＭＦ中（１５０ｍＬ）溶液を室温で１時間撹拌し、光を防いだ。反応の完了後（ＴＬＣ）、揮発性物質を真空下で除去した。粗製混合物をフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、９０：１０）によって精製して、暗いオレンジ／褐色の固体（１．２ｇ、６５％）を得た。ＨＰＬＣ（２５４ｎｍおよび４９５ｎｍ）Ｒｔ＝７．８０分；ｍ／ｚ  １６７１．７（２５％、［Ｍ＋Ｈ］＋）；１６９３．９（６５％、［Ｍ＋Ｎａ］＋）。
【０１８８】
ＮＢＤ−ＰＭＸプローブの調製：
Ｂｏｃ保護ポリミキシンＦ（１５０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）の２０％ＴＦＡ／ＤＣＭ中（２ｍＬ）溶液を室温で４５分間勢いよく撹拌し、光を防いだ。その反応混合物を真空中で蒸発させ、生じたものをエーテルに溶解させた。遠心分離後にエーテル層をデカントした（３×２ｍＬ）。生じた黄色／褐色の固体（４０ｍｇ、定量的）を真空下で乾燥した。その粗生成物を添加剤として０．１％ギ酸を含む勾配溶媒系としてＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏにおいて分取ＨＰＬＣによって精製した。分取ＨＰＬＣから回収された画分をフリーズドライして、赤色／オレンジ色の固体（３０ｍｇ、ＨＰＬＣからの回収率２６％）を得た。
【０１８９】
特徴づけ：分析的ＨＰＬＣのために、ダイオードアレイ検出器とともにＰｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０  ＳＢ−Ｃ１８、２．７μｍ、４．６×５０ｍｍカラムを使用した。分取ＨＰＬＣ法について：１ｍＬ／分の流速およびＨ２Ｏ／ＭｅＯＨ／ＨＣＯＯＨ（９５／５／０．０５）からＨ２Ｏ／ＭｅＯＨ／ＨＣＯＯＨ（５／９５／０．０５）のＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ１８逆相カラム（５ｃｍ×４．６ｍｍ、５μｍ）で６分間にわたって溶出し、９５％ＭｅＯＨで４分間保持し、２５４および４９５ｎｍでＥＬＳＤによって検出した。ＨＰＬＣ（４９５ｎｍ）：Ｒｔ＝４．１分；ＭＳ  ｍ／ｚ  １２７１．７（９５％、［Ｍ＋Ｈ］＋）；１２９３．７（１００％、［Ｍ＋Ｎａ］＋）；ＦＴＭＳ  計算値６３６．３２８２（［Ｍ＋２Ｈ］／２）＋，実測値６３６．３３４４。
吸収／発光：４６７ｎｍ／５３９ｎｍ。
溶解度：水に完全に溶解できる。
安定性：室温で１週間を超えて安定。
保存：不活性雰囲気下、−２０℃で保存した。光を防ぐ。
【０１９０】
生物学的方法
細菌増殖：アッセイに使用される細菌には、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ０１−参照菌株およびＪ３２８４−人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）患者からの臨床分離株）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＳＳＡ）を含む）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）および肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が含まれる。
【０１９１】
【表３】
2018501780.tif 000018
【０１９２】
すべての細菌を寒天ブロス、チョコレート寒天または血液寒天プレートで増殖させ、４℃で保存した。アッセイのために、１つのコロニーの細菌を、接種ループを使用して取り、５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブ中の１０ｍｌの液体ブロスに添加した。これを３７℃のインキュベーターに１６時間移した（肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に関しては５％ＣＯ２を補充した）。培養物は一晩培養物（固定相）として使用されるか、またはこれらの培養物から一部の培養物が取られ（１：１００）、サンプルを対数増殖中期（ｍｉｄ  ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ）に入るまで増殖させた（５９５ｎｍで分光光度計により０．５〜０．６光学密度（ＯＤ）の読取り）。その後、その培養物を４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ペレットをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁させた。３回の洗浄後、これを、共焦点アッセイのために０．５ＯＤ５９５ｎｍ、フローサイトメトリーのために０．１ＯＤ５９５ｎｍまたはヒツジのエクスビボ肺実験のために２ＯＤ５９５ｎｍに再構成した（別に明記されない限り）。
【０１９３】
細菌の計数：サンプル（調製された細菌またはヒツジ肺区画の洗浄液）を短時間ボルテックスし、その後、希釈液を８回の希釈まで段階希釈（１：１０）を行った。ブロス／血液寒天プレートを、四分割のそれぞれに５×２０ｕｌ滴を含む四分割にした。これらを３７℃で１６時間インキュベートし（肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に関しては５％ＣＯ２を補充した）、プレートを、１ミリリットル当たりコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍｌ）として報告されるデータを用いて計数した。
【０１９４】
サーファクタント成分合成：サーファクタント、５μｇの１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）および２．５μｇのＬ−α−ホスファチジル−ＤＬ−グリセロールナトリウム塩（卵黄レシチン由来；ＰＧ）を５００μｌのクロロホルムに溶解させ、窒素下で蒸発させて、丸底フラスコ中で薄い脂質膜にした。撹拌（７５０ｒｐｍ）しながらこの脂質膜を４８℃のＰＢＳを用いて１時間再水和して、多重膜ベシクル（ＭＬＶ）を形成した。これを、共焦点実験に使用するために１：４希釈した。
【０１９５】
アガロース細菌ビーズ：細菌を４００ｍｌのＴＳＢ中で対数増殖中期まで増殖させ、遠心分離によってペレットにし、２ｍｌのＰＢＳに再懸濁させた。これを、１８ｍｌの融解したトリプシン大豆寒天（５０℃）と混合し、予め５０℃に温めたボルテックスしている鉱油＋０．０１％Ｓｐａｎ  ８０に速やかに注入した。その後、これを、ボルテックスを続けながら速やかに４℃に冷却して、ビーズを固まらせた。細菌寒天ビーズを遠心分離によってペレットにし（２０分、３０００ｇ）、ＰＢＳ中の０．５％デオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）中で（２０分、３０００ｇ）、続いてＰＢＳ中の０．２５％ＳＤＣ中で洗浄し（２０分、３０００ｇ）、ＰＢＳ（１０分、３０００ｇ）中および３×ＰＢＳ（５分間、２００ｇ）中で洗浄した。注入のためにＰＢＳに５０％ｖ／ｖでビーズを再懸濁させた。
【０１９６】
好中球の抽出：好中球を、健康なヒト志願者のデキストラン沈殿の末梢性血から単離した後、不連続のプラズマ−パーコール勾配により遠心分離した。
【０１９７】
Ａ５４９培養物：Ａ５４９細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍＬ  ペニシリンＧおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において８０％集密化するまで増殖させた。トリプシン−ＥＤＴＡを用いて細胞を分散させ、カバーガラスまたは８ウェル共焦点イメージングチャンバー上に植え付け、ＤＭＥＭの存在下で集密化するまで増殖させた。
【０１９８】
共焦点分析：細菌を調製し、３７℃および３５０ｒｐｍで２０分間、振盪ヒート・ブロックにおいてＳｙｔｏ  ８２核酸染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、米国）で対比染色した。その細胞を、密閉ＰＯＣミニチャンバーまたは８ウェル共焦点チャンバー中において必要とされる濃度のプローブとともにコインキュベートした。必要な場合、ＰＯＣチャンバーのためのカバーガラスをフィブロネクチン（好中球実験に対して）またはポリ−ｄ−リシン（細菌および細胞株に対して）でコーティングし、細胞とともに１時間、３７℃でインキュベートして、細菌接種前に接着させた。分析はＩｍａｇｅＪによって行った。簡単にいえば、Ｓｙｔｏチャネルは、自動的にしきい値が決められ（Ｈｕａｎｇ）、これからＲＯＩが生成された。このＲＯＩ内のプローブチャネルに対する平均蛍光強度を数量化した。提示されたデータは、３つの別々の視野の平均を表す。
【０１９９】
フローサイトメトリー：細菌を調製し、３７℃および３５０ｒｐｍで２０分間、振盪付きヒートブロックにおいてＳｙｔｏ  ８２核酸染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、米国）で対比染色した。細菌をＰＢＳ×３中で洗浄し、プローブ（５０μｌ）を５０ｕｌのＯＤ５９５  １ｏｄ細菌に添加した。これを５００ｕＬに希釈し、ＦＬ−１およびＦＬ−２チャネルを使用したＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒを使用して１０，０００イベントで分析した。ＦＬ−２チャネルに関してゲートした後、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析を行った。
【０２００】
肺の採取およびｐＣＬＥ手順：選別を予定した過剰な家畜の雌ヒツジのコホートから、１匹の雌ヒツジを特定し、過量の麻酔薬により最後に安楽死させた。死亡を確かめ、気管を確認し、その場（インサイチュ）でクランプした。その後、胸腔にアクセスし、肺を周辺の組織および臓器から外し、心臓／肺を塊の状態で取り出した。右の肺動脈を確認し、カニューレを挿入し、１０００ｍｌの０．９％ＮａＣｌで灌流した。左心室の充満を確認したら切開を行って自由排水させ、左心房からの排液が透明になるまで灌流を続けた。クランプを外した直後に気管に８．０気管内チューブを挿管した。肺を３７℃の周囲温度および６５％の湿度の新生児用保育器に入れ、Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ（Ｂｒｅａｓ  Ｖｉｖｏ  ＰＶ  ４０３）を使用して人工呼吸した。最大限の実質リクルートメントを助け、１リットル超の一回換気量を達成するよう人工呼吸器の設定を調節した。最適な人工呼吸の１時間後、気管支鏡を始め、個々の区画を同定し、２ｍｌの細菌またはＰＢＳ対照を注入した。注入後、個別のシース（ＥＲＢＥ）を導入し、プローブを注入した。その後、プローブベースの共焦点レーザー顕微内視鏡（ｐＣＬＥ）のファイバーを、ワーキングチャネルを下行させ、その区画をイメージングした。ＢＡＬＦのために、気管支鏡を押し込み、２０ｍｌの０．９％ＮａＣｌを注入し、４０〜５０％の洗浄液収率で注意深く引き抜いた。対照区画は、解剖学的に区別しおよび／または対側肺にあるものとした。気管支鏡は、イメージングするそれぞれの区画間で浄化した。
【０２０１】
溶血アッセイ：新たに抜き、抗凝固処理したヒト血液から赤血球を単離し、２０体積％でＰＢＳ（ｐＨ７．４）に再懸濁させた。９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、１００μｌの赤血球懸濁液を１００μｌのＮＬＬＰのＰＢＳ溶液（１：２段階希釈によって調製）または陰性対照の場合は１００μｌのＰＢＳに添加した。１００パーセント溶血ウェルは、１００μｌの０．２体積％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む１００μｌの赤血球懸濁液を含んでいた。そのプレートを３７℃で１時間インキュベートした後、各ウェルを１５０μｌのＰＢＳで希釈した。その後、そのプレートを１，２００ｇで１５分間遠心分離し、各ウェルから１００μｌの上清を新しいマイクロタイタープレートに移し、Ａ３５０を測定した。溶血の割合を（Ａ−Ａ０）／（Ａｔｏｔａｌ−Ａ０）×１００として求め、この場合、Ａは試験ウェルの吸光度であり、Ａ０は陰性対照の吸光度であり、Ａｔｏｔａｌは１００％溶血ウェルの吸光度であり、すべてＢｉｏｔｅｋプレートリーダーによる３５０ｎｍにおけるものである。
【０２０２】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：プローブを生理食塩水またはＡＬＩの患者からプールしたＢＡＬＦに添加し、３０分間インキュベートした。ＺｉｐＴｉｐ（Ｃ−１８、０．２μＬ）を５μＬのＭｅＣＮ（添加剤として０．１％ＴＦＡを含む）、続いて２０μＬのＨ２Ｏで洗浄した。ＺｉｐＴｉｐをサンプルにロードし、洗浄し、５μＬの８０％ＭｅＣＮ水溶液（添加剤として０．１％ＴＦＡを含む）に溶出させた。そのサンプルをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ（商標）ＳＴＲ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、カリフォルニア州））によって分析した。
【０２０３】
統計分析：別に明記されていない限り、すべての実験を少なくとも３回実施し、結果を平均±ＳＥＭとして表した。データを独立ｔ−検定またはＡＮＯＶＡによって解析し、有意性をｐ＜０．０５として判定した（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）。
【０２０４】
参考文献
1.  M. Ternon, J. J. Diaz-Mochon, A. Belsom, M. Bradley, Tetrahedron, 2004, 60, 8721
2.  H. J. Knoelker, T. Braxmeier, G. Schlechtingen, Angew. Chem. Int. Ed., 1995, 34, 2497
3.  E. Kaiser, R. L. Colescott, C. D. Bossinger and P. I. Cook, Analytical Biochemistry, 1970, 34, 595-598.
【０２０５】
関連する配列の一覧
配列番号1
ユビキシジン(完全)
2018501780.tif 000019
配列番号2
ユビキシジン(UBI29-41)
2018501780.tif 000020
配列番号3
ユビキシジン(UBINle)
2018501780.tif 000021
配列番号4
ポリミキシン
2018501780.tif 000022
配列番号5
ポリミキシンB1
2018501780.tif 000023
配列番号6
ポリミキシンB2
2018501780.tif 000024
【図１】
2018501780.tif 000027
【図２】
2018501780.tif 000028
【図３】
2018501780.tif 000029
【図４Ａ】
2018501780.tif 000030
【図４Ｂ】
2018501780.tif 000031
【図４Ｃ】
2018501780.tif 000032
【図４Ｄ】
2018501780.tif 000033
【図４Ｅ】
2018501780.tif 000034
【図５Ａ】
2018501780.tif 000035
【図５Ｂ】
2018501780.tif 000036
【図５Ｃ】
2018501780.tif 000037
【図５Ｄ】
2018501780.tif 000038
【図５Ｅ】
2018501780.tif 000039
【図６】
2018501780.tif 000040
【図７】
2018501780.tif 000041
【図８】
2018501780.tif 000042
【図９】
2018501780.tif 000043
【図１０】
2018501780.tif 000044
【図１１】
2018501780.tif 000045
【図１２】
2018501780.tif 000046
【図１３】
2018501780.tif 000047
【図１４】
2018501780.tif 000048
【図１５】
2018501780.tif 000049
【図１６Ａ】
2018501780.tif 000050
【図１６Ｂ】
2018501780.tif 000051
【図１７Ａ】
2018501780.tif 000052
【図１７Ｂ】
2018501780.tif 000053
【図１７Ｃ】
2018501780.tif 000054
【図１８】
2018501780.tif 000055
【図１９】
2018501780.tif 000056
【図２０】
2018501780.tif 000057
【図２１】
2018501780.tif 000058
【図２２】
2018501780.tif 000059
【図２３】
2018501780.tif 000060
【図２４】
2018501780.tif 000061
【図２５】
2018501780.tif 000062
【図２６】
2018501780.tif 000063
【図２７】
2018501780.tif 000064
【図２８】
2018501780.tif 000065
【配列表】
2018501780000001.app
【国際調査報告】
2018501780.tif 000066
2018501780.tif 000067
2018501780.tif 000068
2018501780.tif 000069
2018501780.tif 000070