(57)【要約】  本発明は、被験体において免疫応答を生じさせる方法であって、該方法は、抗原分子、光感作性薬剤、およびチェックポイント阻害剤を被験体に投与することと、光感作性薬剤を活性化するのに有効な波長の光を前記被験体に照射して、免疫応答を生じさせる、方法に関する。好ましくは、本方法は、予防接種の方法である。また、本発明は、関連した方法、組成物、細胞、使用、製品およびキットも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において免疫応答を生じさせる方法であって、該方法は、抗原分子、光感作性薬剤、およびチェックポイント阻害剤を前記被験体に投与することと、前記光感作性薬剤を活性化するのに有効な波長の光を前記被験体に照射することと、を含み、免疫応答を生じる、方法。
【請求項２】
前記チェックポイント阻害剤は、抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−１から選択され、好ましくは（ｉ）抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−１または（ｉｉ）抗ＣＴＬＡ４である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法は、前記被験体をＴＬＲリガンドに接触させることをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＴＬＲリガンドは、ＴＬＲ３のリガンドであり、好ましくは二本鎖ＲＮＡ分子であり、好ましくはポリ（Ｉ：Ｃ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗原分子は、免疫応答を刺激することができる分子であり、好ましくはワクチン抗原またはワクチン成分であり、好ましくは２つ以上の抗原を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記光感作性薬剤は、ＴＰＣＳ2a、ＡｌＰｃＳ2a、ＴＰＰＳ4、およびＴＰＢＳ2aから選択され、好ましくはＴＰＣＳ2aである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗原分子は、ペプチドであり、好ましくは黒色腫ペプチドまたはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ペプチドである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記方法は、予防接種の方法である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
疾患、障害、または感染を治療または予防するための、好ましくは癌を治療または予防するための、好ましくは黒色腫またはパピローマウイルスに関連する癌を治療または予防するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記被験体は、哺乳類であり、好ましくはネコ、イヌ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットであり、最も好ましくは前記被験体はヒトである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗原分子、光感作性薬剤、チェックポイント阻害剤、および場合によっては前記ＴＬＲリガンドは、前記被験体に、同時に投与されるか、別々に投与されるか、または順次投与される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１、６または８のいずれか１項に記載の抗原分子、請求項１または７に記載の光感作性薬剤、請求項１〜３のいずれか１項に記載のチェックポイント阻害剤、および場合によっては請求項４または５に記載のＴＬＲリガンド、ならびに１つ以上の薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
細胞の表面に抗原分子または抗原分子の一部を発現させる方法であって、該方法は、
ａ）同じ細胞であってもよいし異なる細胞であってもよい、前記抗原分子または前記抗原分子の一部を発現させる第１の細胞およびチェックポイント阻害剤が結合し得る第２の細胞を提供することと、
ｂ）少なくとも前記第１の細胞を、前記抗原分子、光感作性薬剤、および場合によってはＴＬＲリガンドに接触させることと、
ｃ）少なくとも前記第２の細胞を、チェックポイント阻害剤に接触させることと、
ｄ）前記抗原分子が前記細胞のサイトゾルに放出され、その後、前記抗原分子または抗原分子の一部が前記第１の細胞の表面に提示されるように、少なくとも前記第１の細胞に、前記光感作性薬剤を活性化するのに有効な波長の光を照射することと、
を含み、
前記照射の前、前記照射中、および／または前記照射後に、前記第１の細胞および前記第２の細胞を互いに接触させる、方法。
【請求項１５】
前記抗原分子は、請求項６または８に記載の抗原分子であり、前記光感作性薬剤は、請求項７に記載の光感作性薬剤であり、前記チェックポイント阻害剤は、請求項２または３に記載のチェックポイント阻害剤であり、かつ／または前記ＴＬＲリガンドは、請求項４または５に記載のＴＬＲリガンドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗原分子は、請求項６に記載の抗原分子であり、前記抗原提示によって、免疫応答が刺激される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法は、インビトロまたはエキソビボで行われる、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の細胞は、抗原提示細胞であり、好ましくは樹状細胞またはマクロファージである、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の細胞は、Ｔ細胞である、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法を行っている間に、前記第１の細胞および第２の細胞を互いに接触させ、前記方法を行っている間に、前記抗原分子、光感作性薬剤、チェックポイント阻害剤、および場合によっては前記ＴＬＲリガンドを、前記第１の細胞および第２の細胞の両方と接触させる、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１の細胞および第２の細胞を、前記抗原分子、光感作性薬剤、およびチェックポイント阻害剤、ならびに場合によっては前記ＴＬＲリガンドと、同時に接触させるか、別々に接触させるか、または順次接触させる、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
細胞表面に抗原分子または抗原分子の一部を発現する細胞またはその集団であって、細胞は、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の方法によって得ることができ、好ましくは樹状細胞である、細胞。
【請求項２３】
請求項２２に記載の細胞または細胞の集団、および１つ以上の薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項２４】
予防または治療に用いられる、請求項２２に記載の細胞または細胞集団、または請求項１３または２３に記載の組成物。
【請求項２５】
被験体の免疫応答を刺激するのに用いられる、好ましくは前記被験体の疾患、障害、または感染を治療または予防するための、好ましくは予防接種および／または癌の治療または予防のための、請求項２２に記載の細胞または細胞集団、または請求項１３または２３に記載の組成物。
【請求項２６】
被験体の免疫応答を刺激する薬物の調製のための、好ましくは前記被験体の疾患、障害、または感染を治療または予防するための、好ましくは予防接種および／または癌の治療または予防のための、請求項２２に記載の細胞集団、または請求項１３〜２３に記載の組成物の使用。
【請求項２７】
前記刺激、治療、または予防は、前記被験体に前記薬物を投与することを含む、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
予防または治療に用いる、請求項１、６または８のいずれか１項に記載の抗原分子、請求項１または７に記載の光感作性薬剤、請求項１〜３のいずれか１項に記載のチェックポイント阻害剤、および場合によっては請求項４または５に記載のＴＬＲリガンド。
【請求項２９】
被験体の免疫応答を刺激するのに用いられる、好ましくは前記被験体の疾患、障害、または感染を治療または予防するための、好ましくは予防接種および／または癌の治療または予防のための、請求項２８に記載の使用のための抗原分子、光感作性薬剤、チェックポイント阻害剤、および場合によってはＴＬＲリガンドであって、好ましくは、前記使用は、請求項１〜１２または請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の方法を含む、抗原分子、光感作性薬剤、チェックポイント阻害剤、およびＴＬＲリガンド。
【請求項３０】
請求項２８または２９に記載の使用のための、請求項１〜６、７または８のいずれか１項に記載の前記抗原分子、光感作性薬剤、チェックポイント阻害剤、および場合によってはＴＬＲリガンドであって、前記使用は、抗原分子または抗原分子の一部を細胞表面に発現する細胞の集団を調製するために請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の方法を含み、好ましくは前記細胞は樹状細胞である、前記抗原分子、光感作性薬剤、チェックポイント阻害剤、およびＴＬＲリガンド。
【請求項３１】
前記細胞の集団は、前記被験体に投与されるものである、請求項３０に記載の使用のための前記抗原分子、光感作性薬剤、チェックポイント阻害剤、および場合によってはＴＬＲリガンド。
【請求項３２】
被験体の免疫応答を刺激するための、好ましくは前記被験体の疾患、障害、または感染を治療または予防するための、好ましくは予防接種および／または癌の治療または予防のための薬物の製造における、請求項１〜６または８のいずれか１項に記載の抗原分子、および／または請求項１または７に記載の光感作性薬剤、および／または請求項１〜３のいずれか１項に記載のチェックポイント阻害剤、および場合によっては請求項４または５に記載のＴＬＲリガンドの使用であって、好ましくは前記免疫応答は、請求項１〜１２に記載の方法で刺激される、使用。
【請求項３３】
前記薬物は、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の方法によって得ることができる、前記被験体に投与するための、抗原分子または抗原分子の一部を細胞の表面に発現する細胞集団を含む、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の方法において、前記抗原分子、および／または光感作性薬剤、および／またはチェックポイント阻害剤、および場合によっては前記ＴＬＲリガンドを用いて、前記薬物の製造のための前記細胞の集団を得る、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
被験体の免疫応答を刺激するのに同時に、別々に、または順次用いられる、好ましくは前記被験体の疾患、障害、または感染を治療するまたは予防するための、好ましくは予防接種および／または癌の治療または予防のための、あるいは請求項１〜１２または１４〜２１のいずれか１項に記載の方法において、細胞表面に抗原分子または抗原分子の一部を発現させるための、組み合わせ製剤として、請求項１、６または８のいずれか１項に記載の抗原分子、請求項１または７に記載の光感作性薬剤、請求項１〜３のいずれか１項に記載のチェックポイント阻害剤、および場合によっては請求項４または５に記載のＴＬＲリガンドを含む、製品。
【請求項３６】
被験体の免疫応答を刺激するのに用いられる、好ましくは前記被験体の疾患、障害、または感染を治療するまたは予防するための、好ましくは予防接種および／または癌の治療または予防のための、あるいは請求項１〜１２または１４〜２１のいずれか１項に記載の方法において、細胞表面に抗原分子または抗原分子の一部を発現させる、キットであって、該キットは、
請求項１または７に記載の光感作性薬剤を含む第１の容器と、
請求項１、６または８のいずれか１項に記載の前記抗原分子を含む第２の容器と、
請求項１〜３のいずれか１項に記載のチェックポイント阻害剤を含む第３の容器と、場合によっては
請求項４または５に記載のＴＬＲリガンドを含む第４の容器と、
を含む、キット。
【請求項３７】
被験体の免疫応答を引き起こす、好ましくは前記被験体の疾患、障害、または感染を治療するまたは予防する、好ましくは予防接種および／または癌の治療または予防のための、方法であって、該方法は、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の方法にしたがって細胞の集団を調製することと、その後に前記細胞を前記被験体に投与することとを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本明細書で定義される光感作性薬剤、ワクチン成分などの抗原分子、およびチェックポイント阻害剤（ならびに、場合によってはＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）に対するリガンド）を用い、前記光感作性薬剤を活性化するのに有効な波長の光を照射する、予防接種方法または免疫化方法に関する。本発明は、また、このような方法に有用なワクチン組成物などの抗原組成物に関する。本発明は、また、例えば予防接種のために、免疫応答を起こすのに用いられ得る抗原提示細胞を産生する方法であって、上述したものと同じ組成物を用いてワクチン成分などの抗原分子を細胞に導入し抗原提示を達成する方法、およびこのような方法に有用な抗原組成物を提供する。本発明は、また、このような方法によってインビトロで産生された細胞の使用であって、例えば予防接種を達成するために、インビボで患者に投与して免疫応答を誘起させる細胞の使用を提供する。抗原分子を細胞内に内在化する方法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
予防接種は、免疫系を刺激して病原体に対する適応免疫の獲得を促進するために、抗原分子を投与することを含む。ワクチンは、感染による罹患状態を予防または改善することができる。予防接種は、感染症を予防する最も有効な方法であり、予防接種による免疫の普及が、天然痘の世界的な根絶ならびにポリオ、はしか、および破傷風などの疾患を世界の多くの地域で制限することに大いに貢献している。
【０００３】
ワクチンの作用剤は、原因となる病原体の完全だが不活化された（感染しない）または弱められた（感染性が減じられた）形態であってもよく、免疫性であることが見出されている病原体の精製成分（例えば、ウイルスの外被タンパク質など）であってもよい。毒素による疾患に対する免疫化のために、例えば毒性作用は除くが免疫原性作用は保持するようにした破傷風のテタノスパスミン毒素の改変体などの、トキソイドが生産される。
【０００４】
ワクチンは、たいてい、エンドサイトーシスにより抗原提示細胞によって取り込まれ、ＭＨＣクラスＩＩ経路を介した抗原の切断および提示のために、エンドソームを介してリソソームに輸送されるので、予防接種によって、主にＣＤ４ Ｔヘルパー細胞およびＢ細胞が活性化される。癌などの障害または疾患、さらには細胞内感染と闘うためには、細胞障害性ＣＤ８ Ｔ細胞応答を刺激することが重要である。しかしながら、サイトゾルおよび抗原提示のＭＨＣクラスＩ経路に抗原を送達することが困難であるために、通常、細胞障害性ＣＤ８ Ｔ細胞は誘導されない。光化学的内在化（ＰＣＩ）は、サイトゾルへの分子の送達を改善するため、ＰＣＩを採用する予防接種方法が知られている。ＰＣＩは、光感作性薬剤を、該薬剤を活性化する照射工程と組み合わせて用いる技術であり、細胞に同時投与された分子を該細胞のサイトゾルへ放出させることが知られている。この技術により、細胞によってエンドソームなどの細胞小器官に取り込まれた分子が、照射後に、これら細胞小器官からサイトゾルへ放出される。ＰＣＩは、広範な細胞の破壊または細胞死を招かない様式で、本来膜不透過性（または、難透過性）の分子を細胞のサイトゾルに導入する機構を提供する。
【０００５】
光化学的内在化（ＰＣＩ）の基本的方法は、国際公開第９６／０７４３２号および国際公開第００／５４８０２号に記述されており、これらは参照により本明細書に援用される。このような方法においては、内在化される分子（本発明においては、抗原分子）および光感作性薬剤を、細胞と接触させる。光感作性薬剤および内在化される分子は、細胞内の細胞膜結合性サブコンパートメントに取り込まれる、すなわち、細胞内小胞（例えば、リソソームまたはエンドソーム）にエンドサイトーシスされる。細胞を適切な波長の光に曝露すると、細胞内小胞の膜を破壊する反応性種を直接的または間接的に生成する光感作性薬剤が活性化される。これによって、内在化された分子がサイトゾルに放出される。
【０００６】
このような方法においては、たいていの細胞は、機能性または生存率に有害な影響を受けないということが見出された。したがって、「光化学的内在化」と名付けられたこのような方法の有用性が、治療薬を含む様々な異なる分子の、サイトゾル、すなわち細胞の内部への輸送に対して提案された。
【０００７】
国際公開第００／５４８０２号では、このような一般的な方法を利用して、細胞表面に輸送分子を提示または発現している。このように、細胞のサイトゾルへ分子が輸送され放出された後、その分子（または分子の一部）は、細胞の表面へ輸送され、そこで細胞の外側、すなわち細胞表面に提示されてもよい。このような方法は、予防接種の分野において特に有用であり、免疫応答を誘導、促進、または増強させるために、抗原または免疫原などのワクチン成分が細胞に導入され、細胞の表面で提示されてもよい。
【発明の概要】
【０００８】
予防接種は、いくつかの注目すべき成功をおさめてきているが、改善された別の予防接種方法がいまだ必要とされている。本発明は、この必要性に応えるものである。
【０００９】
驚くべきことに、本発明者らは、本明細書で定義される光感作性薬剤、ワクチン成分などの抗原分子、およびチェックポイント阻害剤（ならびに、場合によってはＴＬＲリガンド）を用い、前記光感作性薬剤を活性化するのに有効な波長の光を照射する、方法によって、有利に予防接種が改善される、または免疫応答が改善されることを見出した。
【００１０】
下記実施例においてより詳細に述べるように、本発明の方法によって、抗原特異的Ｔ細胞の産生量が増加するなど、予防接種が改善される、または免疫応答が改善されることが実証された。さらに、癌予防接種に関していうと、本発明に係る方法によって、腫瘍の体積が減少する。
【００１１】
理論に拘束されることを望むものではないが、本発明の方法によって、ＭＨＣクラスＩ分子に対する抗原提示が増大して、ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答が増大し、これによって予防接種方法が改善されると考えられる。
【００１２】
本発明の方法の結果は、抗原特異的Ｔ細胞数の増加、およびＴ細胞によるＴＮＦ−αおよびＩＦＮγ産生量の増加を示し、これは抗原提示の増大または改善と相関している。
【００１３】
このように、本発明は、第一の態様において、被験体において免疫応答を生じさせる方法であって、該方法は、抗原分子、光感作性薬剤、およびチェックポイント阻害剤を前記被験体に投与することと、前記光感作性薬剤を活性化するのに有効な波長の光を前記被験体に照射することと、を含み、免疫応答を生じる、方法を提供する。
【００１４】
本発明は、さらなる態様において、細胞の表面に抗原分子または抗原分子の一部を発現させる方法であって、該方法は、
ａ）同じ細胞であってもよいし異なる細胞であってもよい、前記抗原分子または前記抗原分子の一部を発現させる第１の細胞およびチェックポイント阻害剤が結合し得る第２の細胞を提供することと、
ｂ）少なくとも前記第１の細胞を、前記抗原分子、光感作性薬剤、および場合によってはＴＬＲリガンドに接触させることと、
ｃ）少なくとも前記第２の細胞を、チェックポイント阻害剤に接触させることと、
ｄ）前記抗原分子が前記細胞のサイトゾルに放出され、その後、前記抗原分子または抗原分子の一部が前記第１の細胞の表面に提示されるように、少なくとも前記第１の細胞に、前記光感作性薬剤を活性化するのに有効な波長の光を照射することと、
を含み、
前記照射の前、前記照射中、および／または前記照射後に、前記第１の細胞および前記第２の細胞を互いに接触させる、方法を提供する。
【００１５】
好ましくは、本方法（および続いて述べる方法）は、該方法において、上述した３つの有効成分（薬剤）のみを用い、該薬剤は、本方法の効能に影響を及ぼす（すなわち、ＰＣＩ予防接種／抗原提示／免疫応答刺激を増強するのに能動的な役割を果たす）ように、本方法において適切なレベル（例えば、以下で述べる最小レベル）で存在する。したがって、薬剤は、好ましくは、他の有効成分を含まないバッファー中に存在する。しかしながら、以下で述べるように、ＴＬＲリガンドなどの薬剤がさらに添加されてもよい。
【００１６】
このような方法においては、本明細書で定義される前記抗原分子、前記光感作性薬剤、および場合によっては前記チェックポイント阻害剤（ならびに、用いるのであれば、場合によっては前記ＴＬＲリガンド）は、それぞれ細胞内小胞に取り込まれ、細胞に照射を行うと、細胞内小胞の膜が破壊されて、抗原分子が細胞のサイトゾルに放出される。
【００１７】
取り込まれる種々の薬剤は、同一の細胞内小胞に取り込まれてもよいし、互いに異なる細胞内小胞に取り込まれてもよい。光増感剤によって産生される活性種は、それらが包含されている小胞を越えて広がり得ること、および／または小胞は合体し得、そのため、破壊された小胞との合体によって小胞の内容物が放出されることが見出されている。本明細書で言及される「取り込まれる」とは、取り込まれた分子が小胞内に完全に包含されていることを意味する。細胞内小胞は、膜によって区切られており、例えばエンドソームまたはリソソームなどの、エンドサイトーシス後に生じる小胞であればどのようなものでもよい。
【００１８】
本明細書で用いられる「破壊された」区画とは、その区画の膜の完全性が、永久にまたは一時的に、その区画に包含されている抗原分子を放出できるほど十分に壊されていることを意味する。
【００１９】
本明細書で言及される「光感作性薬剤」は、該薬剤が適切な波長および強度の照射で活性化して活性種を生成する際に、吸収した光エネルギーを化学反応へ転換することができる化合物である。このプロセスにおける高反応性最終生成物は、細胞毒性および血管毒性を生じ得る。好都合には、このような光感作性薬剤は、細胞内区画、特にエンドソームまたはリソソームに局在するものであってもよい。
【００２０】
光増感剤は、様々な機構により、直接的または間接的に、その効果を発揮してもよい。したがって、例えば、ある光増感剤は、光によって活性化された際に直接的な毒性を有し、他の光増感剤は、細胞材料ならびに脂質、タンパク質、および核酸などの生体分子にとって極めて有害な、一重項酸素または他の活性酸素種のような酸化剤などの毒性種を生成する。
【００２１】
このような光感作性薬剤として、様々なものが当該技術分野において知られており、参照により本明細書に援用される国際公開第９６／０７４３２号を含む文献に記載がある。本発明の方法において、このような薬剤を用いてもよい。ポルフィリン、フタロシアニン、プルプリン、クロリン、ベンゾポルフィリン、リソソーム作用性弱塩基、ナフタロシアニン、カチオン系染料、およびテトラサイクリン、またはこれらの誘導体を含む、多くの光感作性薬剤が知られている（Ｂｅｒｇら、（１９９７）、Ｊ． Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ、６５、４０３〜４０９）。他の光感作性薬剤として、テキサフィリン、フェオホルビド、ポルフィセン、バクテリオクロリン、ケトクロリン、ヘマトポルフィリン誘導体、および５−アミノレブリン酸およびその誘導体によって誘導される内因性光増感剤、フォトフリン、光増感剤の二量体またはその他の抱合体などが挙げられる。
【００２２】
ポルフィリンは、最も広く研究されている光感作性薬剤である。その分子構造は、メチン架橋を介して連結されたピロール環を４つ含む。ポルフィリンは、金属錯体を形成可能であることが多い、天然化合物である。例えば、酸素輸送タンパク質であるヘモグロビンの場合、ヘムＢのポルフィリン中心に鉄原子が導入される。
【００２３】
クロリンは、中心が４つのメチン結合によって連結した３つのピロールと１つのピロリンからなる、大きな芳香族複素環である。したがって、クロリンは、ポルフィリンとは異なり、おおむね芳香族性であるが、環の外周全体でみると芳香族性をもたない。
【００２４】
当業者は、どの光増感剤が本発明での使用に適しているかを理解するであろう。特に、細胞のエンドソームまたはリソソームに位置する光感作性薬剤が好ましい。したがって、光感作性薬剤は、好ましくはリソソームまたはエンドソームの内部区画に取り込まれる薬剤である。好ましくは、光感作性薬剤は、エンドサイトーシスによって細胞内区画に取り込まれる。好ましい光増感剤は、ジスルホン化アルミニウムフタロシアニンおよびテトラスルホン化アルミニウムフタロシアニン（例えば、ＡｌＰｃＳ2a）、スルホン化テトラフェニルポルフィン（ＴＰＰＳn）、スルホン化テトラフェニルバクテリオクロリン（例えば、ＴＰＢＳ2a）、ナイルブルー、クロリンｅ6誘導体、ウロポルフィリンＩ、フィロエリスリン、ヘマトポルフィリン、およびメチレンブルーである。本発明での使用に適したさらなる光増感剤は、参照により本明細書に援用される国際公開第０３／０２０３０９号に記載があり、すなわち、スルホン化メソ−テトラフェニルクロリンであり、好ましくはＴＰＣＳ2aである。好ましい光感作性薬剤は、両親媒性のフタロシアニン、ポルフィリン、クロリン、および／またはバクテリオクロリンなどの両親媒性光増感剤（例えば、ジスルホン化光増感剤）であり、特に、ＴＰＰＳ2a（ジスルホン酸テトラフェニルポルフィン）、ＡｌＰｃＳ2a（ジスルホン酸アルミニウムフタロシアニン）、ＴＰＣＳ2a（ジスルホン酸テトラフェニルクロリン）、およびＴＰＢＳ2a（ジスルホン酸テトラフェニルバクテリオクロリン）、またはこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。また、例えば、ＴＰＰＳ4（テトラスルホン酸メソ−テトラフェニルポルフィン）などの親水性光感作性薬剤も好ましい。特に好ましい光感作性薬剤は、スルホン化アルミニウムフタロシアニン、スルホン化テトラフェニルポルフィン、スルホン化テトラフェニルクロリン、およびスルホン化テトラフェニルバクテリオクロリンであり、好ましくはＴＰＣＳ2a、ＡｌＰｃＳ2a、ＴＰＰＳ4、およびＴＰＢＳ2aである。本発明の特に好ましい実施形態において、光感作性薬剤は、クロリンＴＰＣＳ2a（例えば、アンフィネックス（Amphinex）（登録商標）などのジスルホン化テトラフェニルクロリン）である。
【００２５】
光増感剤を担体に結合させて、光感作性薬剤を提供してもよい。したがって、本発明の本実施形態の好ましい態様において、光感作性薬剤は、光増感剤と式（Ｉ）で定義されるキトサンとの抱合体である：
【化１】
2018508533.tif 000002
ここで、ｎは３以上の整数であり、
Ｒは該化合物においてｎ回現れ、
全Ｒｎ基の０．１％〜９９．９％（好ましくは０．５％〜９９．５％）において、各ＲはＡ基であって、該Ａ基は、
【化２】
2018508533.tif 000003
で表され、
各Ｒ1は、同一であっても異なっていてもよいが、Ｈ、ＣＨ3、および−（ＣＨ2）b−ＣＨ3から選択され、ａは１、２、３、４、または５であり、ｂは０、１、２、３、４、または５であって（対イオンは、例えば、Ｃｌ-であってもよい）、好ましくは、Ｒ1はＣＨ3でありｂは１である、基、
および
【化３】
2018508533.tif 000004
で表され、
ＹはＯ、Ｓ、ＳＯ2、−ＮＣＨ3、または−Ｎ（ＣＨ2）dＣＨ3であり、ｃは１、２、３、４、または５であり、ｄは１、２、３、４、または５であって、好ましくは、ＹはＮＣＨ3でありｃは１である、基
から選択される基であり、
各Ｒ基は同一であっても異なっていてもよく、
全Ｒｎ基の０．１％〜９９．９％（好ましくは０．５％〜９９．５％）において、各ＲはＢ基であって、該Ｂ基は
【化４】
2018508533.tif 000005
および
【化５】
2018508533.tif 000006
で表され、
ｅは０、１、２、３、４、または５であり、ｆは１、２、３、４、または５であって、好ましくはｅおよびｆは１である、基
から選択される基であり、
Ｒ2は
【化６】
2018508533.tif 000007
【化７】
2018508533.tif 000008
および
【化８】
2018508533.tif 000009
から選択され、
ＷはＯ、Ｓ、ＮＨ、またはＮ（ＣＨ3）から選択される基であり、好ましくはＮＨである、基であり
Ｒ3は
【化９】
2018508533.tif 000010
【化１０】
2018508533.tif 000011
および
【化１１】
2018508533.tif 000012
から選択され、
ＶはＣＯ、ＳＯ2、ＰＯ、ＰＯ2Ｈ、またはＣＨ2から選択される基であって、好ましくはＣＯであり、
Ｒ4は、同一であっても異なっていてもよいが、Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ3、−ＣＨ3、−ＣＯＣＨ3、Ｃ（ＣＨ3）4、−ＮＨ2、−ＮＨＣＨ3、−Ｎ（ＣＨ3）2、および−ＮＣＯＣＨ3から選択される基（ｏ位、ｍ位、またはｐ位が置換されている）であって、好ましくはＨである、基であって、
各Ｒ基は同一であっても異なっていてもよい。
【００２６】
キトサンポリマーは、構成単位を少なくとも３つ有する（ｎ＝３）。しかしながら、好ましくは、ｎは、少なくとも１０、２０、５０、１００、５００、１０００であり、例えば１０〜１００または１０〜５０である。
【００２７】
好ましい実施形態において、Ｒ2は、
【化１２】
2018508533.tif 000013
【化１３】
2018508533.tif 000014
および
【化１４】
2018508533.tif 000015
から選択される。
【００２８】
さらに好ましい実施形態において、Ｒ3は、
【化１５】
2018508533.tif 000016
【化１６】
2018508533.tif 000017
および
【化１７】
2018508533.tif 000018
から選択される。
【００２９】
好ましくは、Ｒ2またはＲ3は、ＴＰＰa、ＴＰＣa1、またはＴＰＣc1である。
【００３０】
Ａ基は、全Ｒｎ基の７０〜９５％であってもよく、Ｂ基は、全Ｒｎ基の５〜３０％であってもよい。
【００３１】
最も好ましい実施形態において、光増感剤およびキトサンの抱合体は、
１７：  Ｂ:２５％、Ａ:７５％
【化１８】
2018508533.tif 000019
１９：  Ｂ:２５％、Ａ:７５％
【化１９】
2018508533.tif 000020
３３：  Ｂ:１０％、Ａ:９０％
【化２０】
2018508533.tif 000021
および
３７：  Ｂ:１０％、Ａ:９０％
【化２１】
2018508533.tif 000022
から選択される。
【００３２】
上記の構造において、与えられているＡ／Ｂ％の値は、Ａ基またはＢ基であるＲｎ基の割合を示す。アステリスクは、キトサンポリマーの残部を表す。
【００３３】
これらの化合物は、当該技術分野において標準的な手順を利用する合成法によって合成されてもよい。これらは、当業者によく知られたものであり、また、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１３／１８９６６３号で詳述されている。
【００３４】
本明細書で言及される「抗原」分子は、適切に免疫系または免疫細胞に提示された際に、それ自体、またはその一部が免疫応答を刺激することができる分子である。したがって、有利には、抗原分子は、ポリペプチド包含体などのワクチン抗原またはワクチン成分とされる。以下で述べるように、抗原分子は、２つ以上の抗原、例えば２つ以上の抗原ペプチドを含んでいてもよい。
【００３５】
当該技術分野において、このような抗原または抗原ワクチン成分が多く知られており、あらゆる種類の細菌性抗原またはウイルス抗原、あるいは、実際には、原生動物または高等生物を含むあらゆる病原種の抗原または抗原成分が含まれる。従来は、ワクチンの抗原成分は、生物全体（生物は生きているか、死んでいるか、あるいは弱毒化されている）を含む、すなわち全細胞ワクチンであったが、それに加えて、サブユニットワクチン、すなわちタンパク質またはペプチド、さらには炭水化物などの生物の特定の抗原成分に基づくワクチンが広く研究され、文献にて報告されてきている。本発明の抗原分子としては、どのような「サブユニット」系ワクチン成分を用いてもよい。
【００３６】
しかしながら、本発明は、ペプチドワクチンの分野において特に有用である。したがって、本発明に係る好ましい抗原分子は、ペプチドである（本明細書において、ペプチドとは、短鎖ペプチドおよび長鎖ペプチドの両方、すなわちペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチド、およびタンパク質分子またはその断片も含むものであると定義され、例えば、５〜５００アミノ酸からなるペプチドであり、１０〜２５０アミノ酸からなるペプチドや１５〜７５または８〜２５アミノ酸からなるペプチドなどである）。
【００３７】
例えば、ＡＩＤＳ／ＨＩＶ感染、またはインフルエンザ、イヌパルボウイルス、ウシ白血病ウイルス、肝炎などのウイルス性疾患およびウイルス感染の治療において、膨大な数のペプチドワクチンの候補が文献にて提案されている（例えば、Ｐｈａｎｕｐｈａｋら、Ａｓｉａｎ Ｐａｃ． Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７、１５（１）、４１〜８；Ｎａｒｕｓｅ、北海道医学雑誌、１９９４、６９（４）、８１１〜２０；Ｃａｓａｌら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、１９９５、６９（１１）、７２７４〜７；Ｂｅｌｙａｋｏｖら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１９９８、９５（４）、１７０９〜１４；Ｎａｒｕｓｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１９９４、９１（２０）、９５８８〜９２；Ｋａｂｅｙａら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９６、１４（１２）、１１１８〜２２；Ｉｔｏｈら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１９８６、８３（２３）、９１７４〜８を参照）。同様に、細菌ペプチドを用いてもよく、また実際は、他の生物または種由来のペプチド抗原を用いてもよい。
【００３８】
病原生物由来の抗原に加えて、癌またはそれ以外の多発性硬化症などの疾患に対するワクチンとして、ペプチドを用いることが提案されている。例えば、変異型癌遺伝子ペプチドは、細胞障害性Ｔリンパ球を刺激する際に抗原として作用する癌ワクチンとして大いに有望である（Ｓｃｈｉｒｒｍａｃｈｅｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、１９９５、１２１、４４３〜４５１；Ｃｕｒｔｉｓ、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ、１９９７、１７、３１６〜３２７）。また、合成ペプチドワクチンも、転移性黒色腫の治療において検討されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．、１９９８、４（３）、３２１〜７）。多発性硬化症治療用のＴ細胞受容体ペプチドワクチンについては、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７、７６（１〜２）、１５〜２８で述べられている。本発明の抗原分子としては、どのようなペプチドワクチン成分を用いてもよく、また実際は、文献にてペプチドワクチンとして述べられている、または提案されているいずれのペプチドを用いてもよい。このように、ペプチドは、合成してもよく、生物から単離あるいは抽出してもよい。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態において、抗原は黒色腫抗原である。「黒色腫抗原」は、１つ以上の異なる抗原を含み得る。
【００４０】
例えば、一態様において、黒色腫抗原は、黒色腫タンパク質または黒色腫ペプチドであり、例えば抗原性ペプチドまたはＴ細胞のエピトープであり、例えばｇｐ１００、メラン−Ａ、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、およびチロシナーゼ関連タンパク質−２（ＴＲＰ−２）、またはこれらのペプチドエピトープから選択される１つ以上である。これらの黒色腫抗原およびさらに適切な黒色腫抗原の詳細が、Ｒｅｎｋｖｉｓｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、５０：３〜１５、２００１（およびその参考文献）およびＨｏｄｉ、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ． Ｒｅｓ．、１２：６７３〜６７８、２００６に開示されており、これらは参照により本明細書に援用される。特に、ｇｐ１００、メラン−２、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、およびＴＲＰ−２、またはこれらのペプチドエピトープについては、上記Ｒｅｎｋｖｉｓｔらの文献に述べられている通りである。このように、本発明は、ｇｐ１００、メラン−２、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、またはＴＲＰ−２の使用、あるいは上記Ｒｅｎｋｖｉｓｔらの文献に開示されているペプチドエピトープを含む、またはそのペプチドエピトープからなる抗原の使用、あるいは当該技術分野において公知の標準的な比較技術またはその任意の組み合わせによる配列同一性が、それらの配列に対して少なくとも９５％（関連する比較窓にわたって）である配列の使用に及ぶものである。好ましい実施形態において、抗原は、ＴＲＰ−２および／またはｇｐ１００であり、好ましくはＴＲＰ−２である。
【００４１】
例えば、少なくとも２００アミノ酸までのペプチド抗原は、ユナイテッド・バイオシステムズ社（United BioSystems Inc）（旧ユナイテッド・ペプチド社（United Peptide Corp）、ハーンドン、ヴァージニア州、米国）などのペプチドを受注合成する会社から入手されてもよい。
【００４２】
別の好ましい実施形態において、抗原分子は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）から抽出される。パピローマウイルスゲノムは、宿主細胞への一次感染直後に発現される読み枠（ＯＲＦ）を６つ（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、およびＥ７）コードする初期領域（Ｅ）と、主要カプシドタンパク質Ｌ１および副カプシドタンパク質Ｌ２をコードする後期領域（Ｌ）とに分割される。ウイルスのＯＲＦは、全て一本のＤＮＡ鎖にコードされている。
【００４３】
好ましい実施形態において、抗原分子は、タンパク質またはペプチド、あるいはこれらの断片、すなわち、好ましくは本明細書で言及される初期タンパク質または後期タンパク質のうちの１つのタンパク質またはその一部であるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）由来の（例えば、該ウイルスから抽出された）抗原を含む。したがって、ＨＰＶ抗原は、１つ以上の公知の抗原性ペプチドまたはＴ細胞エピトープであり得、例えば任意の種類のＨＰＶ由来の、任意の公知の抗原から選択される１つ以上の抗原である。ＨＰＶの種類および抗原についての詳細は、Ｍａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、６：８１〜１０３、２０１０で見ることができる。
【００４４】
例えば、抗原性ペプチドは、ＨＰＶ−１６型ＨＰＶおよび／またはＨＰＶ−１８型ＨＰＶ、あるいは３１型ＨＰＶまたは４５型ＨＰＶに由来するものであってもよい。例えば、抗原は、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、Ｅ４タンパク質、Ｅ５タンパク質、Ｅ６タンパク質、およびＥ７タンパク質のいずれか、またはＬ１タンパク質およびＬ２タンパク質のいずれかに由来するものであってもよい。抗原性ペプチドは、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８のＥ２タンパク質、Ｅ６タンパク質、およびＥ７タンパク質のうち１つ以上のタンパク質に由来するものであってもよい。好ましい実施形態において、抗原分子は、ＨＰＶ−１６のＥ７配列、ＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲ（ＣＤ８エピトープを太字で示す）を含む。このように、ＨＰＶ抗原は、３５アミノ酸のペプチドであってもよい。あるいは、抗原分子は、ＣＤ８エピトープであるＲＡＨＹＮＩＶＴＦのみ、すなわち、より短いペプチドであってもよい。
【００４５】
ＨＰＶペプチド抗原は、ユナイテッド・バイオシステムズ社（旧ユナイテッド・ペプチド社、ハーンドン、ヴァージニア州、米国）などのペプチドを受注合成する会社から入手されてもよい。
【００４６】
上述したように、本発明に係る抗原分子は、１つ以上の抗原（別々の分子として）、例えば２つ以上の抗原を含んでいてもよい。例えば、抗原分子が抗原ペプチドである場合、１つ以上の抗原ペプチドが含まれる。したがって、抗原分子として、抗原の混合物が用いられてもよい。これは、例えば、異なるペプチドの混合物であってもよく、異なるペプチドとは、例えば、同じタンパク質抗原の異なる領域（およびエピトープ）を表すものであってもよいし、異なるタンパク質抗原（例えば、これらは同じ腫瘍種で発現する）の選択された領域（エピトープ）を表すものであってもよい。別々の抗原を用いる場合は、本発明の使用または方法において、別々に用いられてもよいし、同時に用いられてもよいし、順次用いられてもよい。例えば、本明細書で述べる方法または使用において、用いる抗原は２つでもよいし、３つでもよいし、４つでもよい。同様に、本明細書で述べる本発明の他の実施形態、例えば本明細書で述べる組成物、使用、製品およびキットにおいて、一態様を形成する抗原分子も、１つ以上の抗原を含んでいてもよい。あるいは、抗原分子は、１つ以上のエピトープを含む単一分子であってもよい。
【００４７】
抗原分子は、光化学的内在化プロセスによって一旦細胞のサイトゾルに放出されると、細胞の抗原処理機構によって処理されてもよい。したがって、細胞の表面に発現または提示された抗原分子は、内在化された（エンドサイトーシスされた）抗原分子の一部または断片であってもよい。提示または発現された抗原分子の「一部」は、好ましくは、細胞内部の抗原処理機構によって生成された一部を含む。しかしながら、一部は、適切な抗原設計（例えば、ｐＨ感受性結合）によって達成されてもよい他の手段、または他の細胞処理手段によって生成されてもよい。好都合には、このような一部は、ペプチドの大きさが５アミノ酸よりも大きい場合、例えば１０アミノ酸または２０アミノ酸よりも大きい場合などに、免疫応答を起こすのに十分な大きさを有する。
【００４８】
本明細書で定義される「チェックポイント阻害剤」は、免疫チェックポイントを標的とする薬剤、すなわちチェックポイント阻害剤である。免疫チェックポイントは、例えば、チェックポイントタンパク質およびチェックポイント脂質を含む。チェックポイントタンパク質は、どの細胞が健常で、どの細胞が免疫システムによって破壊されるべきなのかを識別することによって、免疫システムを調節する。細胞が、その表面または関連するT細胞の表面に、十分な（または十分に活性化された）チェックポイントタンパク質を有していない場合は、免疫システムによって破壊され得、したがって、チェックポイントタンパク質は、免疫システムの「ブレーキ」として作用する。
【００４９】
最もよく知られているチェックポイントタンパク質のうちの１つは、細胞障害性Ｔ−リンパ球抗原−４、すなわちＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２（分化抗原群１５２）としても知られる）である。この分子は、免疫応答を下方制御するタンパク質受容体である。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞の表面に見られ、抗原に対する細胞性免疫攻撃を導く。「オフ」スイッチとして作用するＣＴＬＡ４受容体を刺激することによって、Ｔ細胞による攻撃を止めることができる。細胞障害性Ｔ細胞が一旦活性化すると、その表面にＣＴＬＡ４を発現し、その後、ＣＴＬＡ４は、共刺激分子であるＣＤ２８と、相互に共通するリガンドである抗原提示細胞上のＢ７−１およびＢ７−２に対して競合する。このバランスによって、Ｔ細胞の機能が自己限定的に進行することが可能になりつつ、細胞障害活性が抑制される。
【００５０】
チェックポイントタンパク質のさらなる例としては、ＰＤ−Ｌ１（プログラム死リガンド１）が挙げられ、これは、４０ｋＤａの１型膜貫通タンパク質である。ＰＤ−Ｌ１の受容体はＰＤ−１であり、これは、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する細胞表面受容体であって、Ｔ細胞およびプロＢ細胞で発現される。ＰＤ−１受容体／ＰＤ−Ｌ１リガンド複合体が形成されることによって、リンパ節におけるＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖を抑制する抑制シグナルが伝達され、それに加えて、ＰＤ−１は、アポトーシスによって、リンパ節に異種抗原特異的なＴ細胞が蓄積するのを抑制することもできる。したがって、Ｔ−細胞の健常細胞への攻撃が、ＰＤ−Ｌ１によって防止される。ＰＤ−Ｌ１によってＴ−細胞表面のＰＤ−１受容体が活性化されると、Ｔ−細胞は自身を破壊するシグナルを受ける。
【００５１】
他のチェックポイントタンパク質としては、共刺激性チェックポイントタンパク質であるＣＤ−１３７（４−１ＢＢ）、自己寛容性Ｔ細胞においてＰＤ−１と共発現されるＣＤ−４関連阻害性受容体であるリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３、ＣＤ２２３）、Ｂ７スーパーファミリータンパク質であるＢ７−Ｈ３およびＢ７−Ｈ４、ならびにＴ細胞タンパク質であるＴＩＭ３などが挙げられる。アポトーシス中に外部表面に転位する正常細胞のリン脂質であるホスファチジルセリン（ＰＳ）などのリン脂質も、チェックポイント分子として作用し得、抑制されない場合は、崩壊しつつある細胞の内容物を処理および除去する間に生じるであろう過剰な免疫活性化を抑制する。ＰＳの外在化によって、マクロファージが間接的に刺激され、樹状細胞の抗原提示が抑制される。ＰＤ−Ｌ１と同様に、外在化したＰＳは、ある種の腫瘍細胞および腫瘍由来の微小胞によって異常発現される。
【００５２】
本発明に係るチェックポイント阻害剤は、チェックポイント分子自体、またはリガンドなどのチェックポイント分子の結合相手と相互作用することによって、これらのチェックポイント分子（チェックポイントタンパク質またはチェックポイント脂質など）のいずれかの活性を標的とし、または阻害してもよい。
【００５３】
チェックポイント阻害剤（免疫チェックポイントモジュレーター、すなわちＣＰＭとしても知られる）は、Ｔ／Ｂ細胞の活性化による細胞死の防止に及ぼすチェックポイント分子の影響を低減する。チェックポイント分子に対する阻害能は、適切なモデル、例えば、Ｂ７−１もしくはＢ７−２（ＣＴＬＡ−４の場合）またはＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−１の場合）などの結合パートナーへの結合を防ぐことによって、評価され得る。
【００５４】
例えば、参照により本明細書に援用されるＣｒｅｅｌａｎ（２０１４）、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ ２１：８０〜８９に記載の阻害剤などのチェックポイント阻害剤がいくつか知られており、これらを本発明において用いることができる。
【００５５】
チェックポイント阻害剤は抗体であってもよく、適した抗体が市販されている。好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体である。
【００５６】
例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＰＤ−１抗体は、バイオＸセル社（Bio X Cell）（ウェスト・レバノン、米国）から入手することができる。チェックポイント阻害剤であるその他特定の抗体としては、例えば、ＣＴＬＡ−４に対する親和性が高いヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体であるトレメリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６）、ＣＴＬＡ−４に対するヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体であるイピリムマブ（ＭＤＸ−０１０）、検出可能な抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を本質的に欠く抗ＰＤ１ヒトモノクローナルＩｇＧ４抗体であるニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８）、Ｆｃ媒介性ＡＤＣＣを防止するように設計されたＣ２２８Ｐ変異を含む抗ＰＤ−１ヒト化ＩｇＧ４抗体であるＭＫ−３４７５（旧ランブロリズマブ）、完全長抗ＣＤ１３７ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体であるウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）、抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体（ＢＭＳ−９８６０１６）、およびＰＳに対するキメラＩｇＧ３抗体であるバビツキシマブ（キメラ化３Ｇ４）などが挙げられる。本明細書で述べる適したチェックポイント阻害剤またはその他利用可能なものは、いずれも本発明において用いることができる。
【００５７】
好ましい実施形態において、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１を標的とする。好ましい実施形態において、ＣＴＬＡ−４を標的とするチェックポイント阻害剤、およびＰＤ−１を標的とするチェックポイント阻害剤（例えば、これらの標的に対する抗体）が用いられてもよい。好ましくは、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１に対する抗体であり、ＣＴＬＡ−４のＢ７−１／Ｂ７−２への結合、および／またはＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合を防止または阻害する。本明細書で述べるように、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１は、それぞれ、好ましくは、ユニプロット・データベース登録番号Ｐ１６４０のバージョン３の配列（２００３年１月１０日）および登録番号Ｑ１５１１６のバージョン３の配列（２００７年４月１７日）に記載の配列、または当該技術分野において常用される方法を用いて配列全長にわたって評価した場合に、これらの配列に対する配列同一性が、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である配列を有する。
【００５８】
別の方法としては、腫瘍細胞表面において、ＰＤ−１に対するリガンドであるＰＤ−Ｌ１を阻害することが挙げられ、したがって、チェックポイント阻害剤として、ＰＤ−Ｌ１の阻害剤も本発明に包含される。例えば、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＲＧ７４４６）は、抗ＰＤ−Ｌ１ヒトＩｇＧ１カッパモノクローナル抗体であり、本発明にしたがって用いられてもよい。ＭＥＤＩ４７３６は、別のＩｇＧ１カッパＰＤ−Ｌ１抗体である。
【００５９】
また別の方法としては、Ｂ７−Ｄｃ−Ｆｃ融合タンパク質を用いて、ＰＤ−１受容体を競合的に阻害することが挙げられ、したがって、このような融合タンパク質も本発明において用いることができる。さらなる別の方法において、キラー細胞免疫グロブリン様受容体を、免疫療法剤として用いてもよい。キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）は、ＮＫの細胞障害活性を下方制御する、ＮＫ細胞上の受容体である。ＨＬＡクラスＩアリル特異的ＫＩＲ受容体は、細胞溶解性（ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋）ＮＫ細胞において発現されるが、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＣＤ１６−ＮＫサブセットは、これらのＫＩＲを欠いている。この線に沿うと、阻害性ＫＩＲは、腫瘍周囲のＮＫ細胞浸潤物において選択的に発現されていると考えられ、したがって、ＰＤ−Ｌ１と同様に、腫瘍によって取り込まれるチェックポイント経路であると考えられる。したがって、抗体を用いて特定のＫＩＲを阻害することによって、インビボにおいてＮＫ細胞の活性化が維持されるはずである。例えば、リリルマブ（ＩＰＨ２１０２）は、ＫＩＲに対する全長ヒトモノクローナル抗体であり、本発明にしたがって、これを用いることができる。
【００６０】
本発明の方法において、１つ以上（例えば、２つ以上）のチェックポイント阻害剤を用いてもよく、これらは別々に用いられてもよいし、同時に用いられてもよいし、順次用いられてもよい。本方法において、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１に対するチェックポイント阻害剤、例えば抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−１などのチェックポイント阻害剤を、例えば、２つ用いてもよいし、３つ用いてもよいし、４つ用いてもよい。同様に、本明細書で述べる組成物、使用、製品、およびキットなどの、本明細書で述べる本発明の他の実施形態に、１つ以上のチェックポイント阻害剤を加えてもよい。したがって、本明細書で述べる本発明の実施形態において、チェックポイント阻害剤についての言及は、１つ以上のチェックポイント阻害剤を包含する。
【００６１】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、さらに、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）に対するリガンドの使用を含む。本発明の全ての態様において、１つ以上（例えば、２つ以上）のＴＬＲリガンドを用いてもよく、これらは別々に用いられてもよいし、同時に用いられてもよいし、順次用いられてもよい。したがって、本明細書で述べる本発明の実施形態において、ＴＬＲリガンドについての言及は、１つ以上のＴＬＲリガンドを包含する。
【００６２】
Ｔｏｌｌ様受容体は、先天性免疫および消化系において重要な役割を果たすタンパク質の一群である。ＴＬＲおよびインターロイキン−１受容体は、インターロイキン−１受容体／Ｔｏｌｌ様受容体スーパーファミリーと名付けられた受容体スーパーファミリーを形成する。このファミリーのメンバーは、全てＴｏｌｌ−ＩＬ−１受容体ドメイン（ＴＩＲ）を有する。インターロイキン−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）ファミリーのメンバーは、細胞外免疫グロブリン様ドメインおよび細胞内Ｔｏｌｌ／インターロイキン−１Ｒ（ＴＩＲ）ドメインによって特徴付けられる。サブグループ２ ＴＩＲドメインを有する受容体は、ＴＬＲであると考えられる。
【００６３】
ＴＬＲは、通常は、マクロファージおよび樹状細胞などのセンチネル細胞で発現される、単量体膜貫通型非触媒性受容体であり、構造が保存されている微生物由来の分子を認識する。これら微生物が、皮膚または腸管粘膜などの物的障壁を一旦突破すると、ＴＬＲがこれらを認識し、免疫細胞応答を活性化する。病原体の機能に不可欠で、突然変異によって変化し難いと考えられる、病原体関連分子などの分子を、これらの受容体が認識する。そのような分子は、細菌の細胞表面のリポ多糖（ＬＰＳ）、リポタンパク質、リポペプチド、およびリポアラビノマンナン；細菌の鞭毛由来のフラジェリンなどのタンパク質；ウイルスの二重鎖ＲＮＡ；または細菌ＤＮＡおよびウイルスＤＮＡの非メチル化ＣｐＧアイランドを含んでいてもよく、また、真核生物のＤＮＡのプロモーターに見られるＣｐＧアイランド、さらには別のＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子を含んでいてもよい。これまでに、遺伝子ターゲティングによって、たいていのＴＬＲに対してリガンド認識特異性が確認されている。
【００６４】
たいていの哺乳動物種は、１０種〜１５種のＴｏｌｌ様受容体を有すると推定されている。ヒトおよびマウスを合わせて、１３のＴＬＲ（単にＴＬＲ１〜ＴＬＲ１３と名付けられている）が同定されている（マウスでは１３種、ヒトでは１０種）。
ＴＬＲ受容体に対するリガンドは、全て本発明に包含される。「リガンド」なる語は、生体分子と複合体を形成し、生物学的目的をはたす物質を意味することが意図される。ＴＬＲリガンドとの関連において、リガンドは、シグナル誘因分子であり、標的ＴＬＲ上のある部位に結合する。リガンドが、その同種受容体に結合する際に、受容体の化学構造を変えてもよい。受容体タンパク質の立体構造は、その機能状態を決定する。
【００６５】
したがって、本発明に係るＴＬＲリガンドは、少なくとも１つ、すなわち１つ以上のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）に結合し、ＴＬＲの活性化、例えばＴＬＲ媒介性細胞シグナル伝達の活性化をもたらす分子である。
【００６６】
ＴＬＲシグナル伝達は、ＭｙＤ８８−依存性経路およびＴＲＩＦ−依存性経路の２つの異なるシグナル伝達経路に分割される。本発明に係るＴＬＲリガンドは、これら２つの経路のうちの１つまたは両方を活性化する。したがって、本発明に係るリガンドは、１つ以上のＴＬＲに結合し、ＴＬＲの活性化、例えばリガンドが結合した際の受容体の構造変化を介したＴＬＲシグナル伝達の活性化をもたらす分子である。
【００６７】
ＴＬＲ受容体が二量化すると、ＭｙＤ８８依存性応答が起こり、この応答は、ＴＬＲ３を除く全てのＴＬＲに利用される。その一次作用は、ＮＦKＢおよびマイトジェン活性化タンパク質キナーゼの活性化である。受容体で起こるリガンドの結合および構造変化によって、ＴＩＲファミリーのメンバーであるアダプタータンパク質ＭｙＤ８８がリクルートされる。次いで、ＭｙＤ８８が、ＩＲＡＫ４、ＩＲＡＫＩ、およびＩＲＡＫ２をリクルートする。次いで、ＩＲＡＫキナーゼが、タンパク質ＴＲＡＦ６をリン酸化して活性化し、ひいてはＩＫＫβへの結合を容易にするために、ＴＲＡＦ６がタンパク質ＴＡＫ１およびそれ自身をポリユビキチン化する。ＴＡＫ１は、ＩＫＫβに結合するとこれをリン酸化し、次いでＩＫＫβがＩKＢをリン酸化して分解させ、またＮＦKＢを細胞核へ拡散させ、炎症性サイトカインの転写およびその後の誘導を活性化する。
【００６８】
もう一方の経路は、ＴＲＩＦ依存性経路であり、ＴＬＲ３およびＴＬＲ４の両方に用いられる。ＴＬＲ３については、ｄｓＲＮＡ（または類似のもの−以下参照）が受容体の活性化をもたらし、アダプターであるＴＲＩＦをリクルートする。ＴＲＩＦは、キナーゼであるＴＢＫ１およびＲＩＰ１を活性化し、これによってシグナル伝達経路に分岐を設ける。ＴＲＩＦ／ＴＢＫ１シグナル伝達複合体は、ＩＲＦ３をリン酸化して核内に移行させ、インターフェロンＩ型を産生させる。一方、ＲＩＰ１の活性化によって、ＭｙＤ８８依存性経路と同様に、ＴＡＫ１がポリユビキチン化および活性化を受け、ＮＦKＢが転写される。
【００６９】
ＴＬＲシグナル伝達の活性化を調べる標準的な方法は、当該技術分野において知られており、例えば、適切なシグナル伝達タンパク質のリン酸化状態を調べる。あるいは、例えば、特定のＴＬＲをコードする遺伝子を遺伝学的に欠失させてリガンドの効果が維持されるかどうかを調べるなど、当該技術分野において周知の方法によって、リガンドがＴＬＲを通して作用しているかどうかを調べてもよい。この方法は、市販のトランスジェニックノックアウトマウス（ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、およびＴＬＲ４のノックアウトはジャクソン・ラボラトリー社（The Jackson Laboratory）から、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ９のノックアウトはオリエンタル・バイオサービス社（OrientalBioService Inc）から入手可能）において、インビトロおよびインビボの両方で用いることができる。さらに、ＮＦ−κＢ／ＡＰ１の活性化を分析することでＴＬＲの刺激を調べるように設計された、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞（インビボジェン社（Invivogen）、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）が利用できる。このような細胞は、ＴＬＲ２〜ＴＬＲ９およびＴＬＲ１３に対して利用できる。また、推定上のリガンドの作用が、ＴＬＲの拮抗作用によって阻害されるかどうかを調べるために、例えばインビボジェン社から入手可能なＴＬＲアンタゴニストを用いることもできる。このように、ある分子がＴＬＲリガンドであるかどうか、例えばある特定のＴＬＲリガンドであるかどうかを調べる方法は、当該技術分野においてよく知られている。
【００７０】
ＴＬＲの構造は、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）外部ドメイン、らせん状膜貫通ドメイン、および細胞内Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１受容体相同（ＴＩＲ）シグナル伝達ドメインからなる。外部ドメインは、様々な数のＬＲＲを含み、馬蹄形に曲げられたソレノイドに似ている。両端には、馬蹄の疎水性コアを覆う末端ＬＲＲが存在する。この外部ドメインは、高度に可変的である。このドメインは、リポ多糖、リポペプチド、シトシン−リン酸−グアニン（ＣｐＧ）ＤＮＡ、フラジェリン、イミダゾキノリン、およびｄｓ／ｓｓＲＮＡを含む様々な病原体関連モチーフの認識に、直接関わっている。受容体が活性化すると、受容体とアダプターＴＩＲドメインとの間に、ＴＩＲシグナル伝達複合体が形成される。
【００７１】
受容体ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９は、他のＴＬＲよりもアミノ酸配列が長いファミリーである。これらは、細胞内に局在し、非自己核酸に反応してシグナルを送る。これらは、また、ＬＲＲ１４とＬＲＲ１５との間に不規則な部位を含む。
ＴＬＲ受容体の配列は公知であり、本明細書で述べるリガンドのこれらの受容体への結合は、例えば上述したように評価されてもよい。例として、公知のＴＬＲアミノ酸配列を下記表１に示す。
【００７２】
【表１】
2018508533.tif 000023
【００７３】
ＴＬＲ１は、そのリガンドが、例えば細菌由来のリガンドであって、リポタンパク質および複数のトリアシルリポペプチドを含んでいる、細胞表面受容体である。ＴＬＲ１は、単独ではリガンドを認識せず、むしろＴＬＲ２との複合体で働く。したがって、リガンドは、ＴＬＲ１とＴＬＲ２との複合体を認識する。ＴＬＲ１は、ＴＬＲ２と結合して（ヘテロダイマーとして）ペプチドグリカンおよび（トリアシル）リポタンパク質を認識する。
【００７４】
リポタンパク質／リポペプチドは、タンパク質／ペプチドに結合した脂質からなる分子である。細菌が、このような分子を発現する。トリアシルリポタンパク質／トリアシルリポペプチドは、アシル基を３つ含む。好ましくは、本発明にしたがって用いられるＴＬＲ１リガンドは、トリアシルリポペプチドである。
【００７５】
ＴＬＲ１リガンドは、インビボジェン社およびエンゾ・ライフ・サイエンス社（Enzo Life Sciences）（ファーミングデール、ニューヨーク州、米国）から購入することができる。例えば、Ｐａｍ３ＣＳＫ４（インビボジェン社）は、アシル化された細菌のリポペプチド（ＬＰ）のアミノ末端を模した合成トリアシル化リポペプチド（ＬＰ）である。
あるいは、ＴＬＲ２と複合体を形成したＴＬＲ１の選択的アゴニストであるＰａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−(Ｌｙｓ)４三塩酸塩（エンゾ・ライフ・サイエンス社）を用いてもよい。
【００７６】
ＴＬＲ２は、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方、さらにはマイコプラズマや酵母など、幅広い種の集団を代表する多数の微生物分子によって刺激される細胞表面受容体である。ＴＬＲ２は、ペプチドグリカン、リポテイコ酸、およびリポタンパク質などのグラム陽性細菌の細胞壁成分、マイコバクテリアのリポアラビノマンナン、ならびに酵母細胞壁のザイモサンを認識する。
【００７７】
好ましいＴＬＲ２リガンドは、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）由来のリポアラビノマンナンおよびリポマンナンなどのリポグリカンである。特に好ましいリポグリカンは、ＴＬＲ２に特異的なリポ多糖（ＬＰＳ）である。これらの分子は、共有結合によって結びついた脂質および多糖を有し、グラム陰性細菌の外部構成要素に見出され、内毒素として働く。好ましい特徴において、ＬＰＳは、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas Gingivalis）由来である。ＬＰＳは、リピドＡと呼ばれる特定の炭化水素の脂質部によって細菌の外膜に固定されている多糖領域からなる。リピドＡは、内毒素としても知られ、ＬＰＳの免疫賦活活性を司る。
【００７８】
【化２２】
2018508533.tif 000024
【００７９】
リピドＡの最も活性のある形態は、脂肪族アシル基を６つ含み、大腸菌（Escherichia coli）およびサルモネラ属（Salmonella）の種などの病原細菌で見出される。
【００８０】
他の好ましいＴＬＲ２リガンドは、例えば枯草菌および黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）などの異なる細菌種由来のリポテイコ酸；例えば枯草菌、大腸菌（E. coli）株（０１１１：Ｂ４またはＫ１２など）、黄色ブドウ球菌、およびその他の細菌由来のペプチドグリカン；合成ジアシル化リポタンパク質または合成トリアシル化リポタンパク質などの合成リポタンパク質、ならびにβ−１，３−グリコシド結合によって結合されたグルコースの繰り返しユニットを有するグルカンであるザイモサン（例えば、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来）である。ＴＬＲ２リガンドは、インビボジェン社から市販されている。
【００８１】
ＴＬＲ３は、細胞区画に見出される。本発明に係る好ましいリガンドは、ポリアデニル酸−ポリウリジル酸（ポリ（Ａ：Ｕ））またはポリイノシン酸−ポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））などの、ウイルスｄｓＲＮＡを模した二重鎖ＲＮＡ分子である。ポリ（Ｉ：Ｃ）が特に好ましい。
【００８２】
二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、２本の相補鎖を有するＲＮＡであり、全ての細胞で見られるＤＮＡに類似している。ｄｓＲＮＡは、ある種のウイルス（二重鎖ＲＮＡウイルス）の遺伝物質を形成する。ウイルスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡなどの二重鎖ＲＮＡは、真核生物におけるＲＮＡ干渉、さらには脊椎動物においてインターフェロン応答を引き起こし得る。
【００８３】
好ましい特徴において、リガンドはポリ（Ｉ：Ｃ）である。ポリＩ：Ｃは、一方の鎖がイノシン酸ポリマーであり、もう一方の鎖がシチジン酸ポリマーである、ミスマッチ二重鎖ＲＮＡである。このような分子は、周知の技術によって生成され得る。様々な商業的供給源が存在し、例えば、以下に示すものがインビボジェン社から購入され、好ましい実施形態を形成してもよい：
−ポリ（Ｉ：Ｃ）（ＨＭＷ）：高分子量、平均サイズは１．５〜８ ｋｂ；および
−ポリ（Ｉ：Ｃ）（ＬＭＷ）：低分子量、平均サイズは０．２〜１ ｋｂ。
高分子量の形態および低分子量の形態の両方が、本発明によって用いられるのに好ましい形態である。
【００８４】
ＴＬＲ４も細胞表面に見出され、そのリガンドは数種類あり、中でもリポ多糖（ＬＰＳ）、いくつかの熱ショックタンパク質、フィブリノゲン、ヘパリン硫酸塩断片、ヒアルロン酸断片、ニッケル、および様々なオピオイド薬を含む。好ましい態様において、リガンドはＬＰＳである。ＬＰＳは、大腸菌０１１１：Ｂ４または大腸菌Ｋ１２、あるいはサルモネラ菌などの様々な細菌種由来（フェノール−水混合物で抽出）であってもよく、好ましい特徴において、ＬＰＳは、大腸菌由来、またはサルモネラ・ミネソタ（Salmonella minnesota）の、例えばＲ５９５株由来である。別の好ましい態様において、ＴＬＲ４リガンドは、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）であり、これは、細菌（例えばサルモネラ・ミネソタＲ５９５）から単離されたものであっても、合成されたものであってもよい。通常、ＴＬＲ４リガンドは、インビボジェン社などから市販されている。
【００８５】
ＴＬＲ５は、枯草菌（Bacillus subtilis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）などのグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方に由来するフラジェリンをリガンドとして結合する。フラジェリンは、自身を中空の筒状に配置して細菌鞭毛の線条組織を形成する球状タンパク質である。その質量は、約３０，０００〜６０，０００ダルトンである。フラジェリンは、細菌鞭毛の主要な構成成分であり、鞭毛のある細菌のほぼ全てにおいて大量に存在する。したがって、好ましいＴＬＲ５リガンドはフラジェリンであり、好ましくは上述の細菌由来のフラジェリンである。ＴＬＲ５リガンドは、インビボジェン社などから市販されている。
【００８６】
ＴＬＲ６は、複数のジアシルリポペプチドに結合する。前述の通り、リポペプチドは、細菌中に見出され、ペプチドに結合した脂質を含む。ジアシルリポペプチドは、アシル基を２つ有し、本発明で用いられる好ましいＴＬＲ６リガンドを形成する。ＴＬＲ６リガンドは、インビボジェン社から市販されている。例えば、ＦＳＬ−１（Ｐａｍ２ＣＧＤＰＫＨＰＫＳＦ）は、マイコプラズマ・サリバリウム（Mycoplasma salivarium）由来の合成リポタンパク質であり、Ｍ．ファーメンタンス（M. fermentans）由来のリポペプチド（ＬＰ）であるＭＡＬＰ−２に類似している。ＦＳＬ−１などのマイコプラズマのＬＰは、ジアシル化システイン残基を含み、細菌のＬＰは、トリアシル化システイン残基を含む。ＦＳＬ−１は、ＴＬＲ２と結合したＴＬＲ６によって認識され、細菌のＬＰは、上述したように、ＴＬＲ２およびＴＬＲ１の組み合わせによって認識される。
【００８７】
ＴＬＲ７リガンドは、小型の合成化合物であるイミダゾキノリン、アデニン類似体およびグアノシン類似体などの塩基類似体（例えばロキソリビン）、およびブロピリミンを含み、また一本鎖ＲＮＡも含む。
【００８８】
イミダゾキノリン化合物は、二重環式有機分子であり、好ましくは、Ｒ1およびＲ2位の基は変更されてもよい下記に示す分子である。
【００８９】
好ましくは、イミダゾキノリン化合物は、化学式１：
【化２３】
2018508533.tif 000025
で表される化合物またはその薬学的に許容される塩であり、ここで、
Ｒ1は、場合によってはヒドロキシル基などで置換されていてもよいアミノアルキル基であり、Ｒ2は、場合によっては酸素族または窒素族が挿入されたアルキル基であって、好ましくは、
Ｒ1は、Ｎ−ＣＨ2−Ｃ（ＣＨ3）2−Ｒ3であり、
Ｒ2は、−ＣＨ2−Ｘ−ＣＨ2ＣＨ3または水素原子であり、
Ｒ3は、ＯＨまたは水素原子、Ｘは、ＯまたはＮＨである。
上記化学式において、アルキル基は、Ｃ1−Ｃ10基であってもよい。
【００９０】
これら化合物の例は、当該技術分野において公知であり、例えば、レシキモド（すなわち、Ｒ８４８）（１−［４−アミノ−２−（エトキシメチル）イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−２−メチルプロパン−２−オル）、イミキモド（３−（２−メチルプロピル）−３，５，８−トリアザトリシクロ［７．４．９．０2,6］トリデカ−１（９），２（６），４，７，１０，１２−ヘキサエン−７−アミン）、およびガーディキモド（Ｒ1は、Ｎ−ＣＨ2−Ｃ（ＣＨ3）2ＯＨであり、Ｒ2は、−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ3である；１−［４−アミノ−２−（エチルアミノメチル）イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−２−メチルプロパン−２−オル）（これらは全てインビボジェン社（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）から入手可能）などが挙げられる。好ましい実施形態において、化合物は、レシキモドおよびイミキモドから選択される。
【００９１】
これらの化合物の薬学的に許容される塩も、本発明に包含される。適切な塩としては、例えば、酢酸塩、臭化物、塩化物、クエン酸塩、塩酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、硝酸塩、リン酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、ステアリン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カルシウム塩、メグルミン塩、カリウム塩、およびナトリウム塩などが挙げられる。
【００９２】
ロキソリビンは、Ｎ7位およびＣ8位を誘導体化したグアノシン類似体である。このヌクレオシドは、免疫系に対する大変強力な刺激物質である。ブロピリミンは、抗癌性および抗ウイルス性を有する実験薬であり、以下に示す構造を有する。
【化２４】
2018508533.tif 000026
【００９３】
ｓｓＰｏｌｙＵなどの一本鎖ＲＮＡは、好ましいＴＬＲ７リガンドであり、好ましくは、該一本鎖分子は、長さが２０〜２００ヌクレオチドである。合成によって、このような分子を容易に生成することができる。
【００９４】
ＴＬＲ８リガンドは、一般的に、小さい合成化合物または一本鎖ＲＮＡである。好ましくは、前記ＴＬＲ８リガンドは、上述したようなｓｓＰｏｌｙＵ分子である。
【００９５】
ＴＬＲ９リガンドは、非メチル化ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドＤＮＡを含む。「ＣｐＧ」オリゴヌクレオチド（すなわち、ＣｐＧ ＯＤＮ）は、このようなリガンドの一例であり、シトシン三リン酸デオキシヌクレオチド（「Ｃ」）をグアニン三リン酸デオキシヌクレオチド（「Ｇ」）に結合して得られる短い一本鎖合成ＤＮＡ分子である。「ｐ」は、連続したヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合を示しているが、ＯＤＮの中には、その代わりとして、修飾されたチオリン酸エステル（ＰＳ）骨格を有するものもある。本明細書で言及されるＣｐＧヌクレオチドは、ＣｐＧモチーフと記される。ＣｐＧモチーフは、メチル化されていない。ＣｐＧモチーフを含む配列は、微生物ゲノムには豊富だが脊椎動物ゲノムではまれであることから、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と考えられている。ＣｐＧ ＰＡＭＰは、パターン認識受容体（ＰＲＲ）であるＴｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）によって認識される。ＴＬＲ９は、微生物ＤＮＡと哺乳類ＤＮＡとを区別する、特定の非メチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）配列を認識する。
【００９６】
刺激性ＯＤＮは、主に、Ａ型、Ｂ型、およびＣ型の３種類について述べられてきている。Ａ型ＣｐＧ ＯＤＮは、リン酸ジエステル／チオリン酸エステルの混合骨格から構成されており、回文配列の一部として、１つ以上のＣｐＧモチーフを含んでいる。Ａ型ＣｐＧ ＯＤＮは、３’末端および５’末端にポリＧテールを有する（コンカテマーの形成を容易にする構造モチーフである）。Ａ型ＣｐＧ ＯＤＮは、典型的には、ヌクレアーゼによる分解に抵抗し、ＯＤＮの安定性を増す７〜１０個のチオリン酸エステル修飾された塩基を、一方の末端、または両末端に含んでいる。例えば、内部回文配列は、長さが８〜１６（好ましくは１０、１２、または１４）塩基対であり、塩基の順番が異なっているものであり得るが、「：」で示された回文中心から等距離にあるＰｕ塩基、Ｐｙ塩基が相補的になっているパターン、５’−Ｐｕ Ｐｕ ＣＧ Ｐｕ：Ｐｙ ＣＧ Ｐｙ Ｐｙ−３’が好ましい。ＤＮＡ鎖のどちらかの末端に見出されるポリＧテールは、長さが異なり得る。
【００９７】
Ｂ型ＣｐＧ ＯＤＮは、ＣｐＧモチーフを含む６ｍｅｒの共通配列を１つ以上有していてもよい。ヒトの共通配列は、５’−Ｐｕ Ｐｙ Ｃ Ｇ Ｐｙ Ｐｕ−３’配列を含んでいてもよい（マウスの配列は異なっている場合がある）。Ｂ型ＣｐＧ ＯＤＮは、完全にチオリン酸エステル化（ＰＳ修飾された）骨格を有し、一般的に、長さが１８〜２８（例えば１８〜２２）ヌクレオチドである。Ｂ型ＣｐＧ ＯＤＮの一例は、配列が５’−ｔｃｃａｔｇａｃｇｔｔｃｃｔｇａｃｇｔｔ−３’である、ＯＤＮ１８２６である。
【００９８】
Ｃ型ＣｐＧ ＯＤＮは、Ａ型およびＢ型の特徴を併せ持つ。Ｃ型ＣｐＧ ＯＤＮは、全てチオリン酸エステルヌクレオチドからなり、ＣｐＧモチーフを１つ以上含む回文配列を含んでいる。Ｃ型ＣｐＧ ＯＤＮの一例は、配列が５’−ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔｃｇｇｃｇｃ：ｇｃｇｃｃｇ−３’（下線部が回文）であるＯＤＮ２３９５である。
【００９９】
その他に、回文配列を２つ含み、高次構造の形成を可能にするＰ型ＣｐＧ ＯＤＮを用いてもよい。
【０１００】
当該技術分野において公知の標準的なオリゴヌクレオチド合成法によって、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを合成することができる。
【０１０１】
したがって、本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣｐＧモチーフ、ならびに該モチーフの３’側および５’側のそれぞれに隣接する少なくとも１つの塩基を含む、６〜５０塩基、好ましくは１８〜２７塩基、好ましくは２０〜２５塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドにまで及び、前記ＣｐＧモチーフは、シトシンの後にリン酸結合またはチオリン酸エステル結合によって結びついたグアニンが続くものであり、シトシンのピリミジン環はメチル化されていない。一実施形態において、１つ以上のモチーフが配列上隣接しており、これは、１つ以上のモチーフとともに回文配列を与える。本明細書で言及される「回文配列」は、例えば、ｃｇｇｃｇｃ：ｇｃｇｃｃｇ（回文中心を「：」で示す）のような、配列がヘアピンを形成するように、相補配列に逆向きに結合された順方向配列を提供する。ＣｐＧモチーフは、配列中心を形成してもよいし、回文配列の他の箇所にあってもよい。好ましくは、回文配列（順方向配列および逆方向配列の両方を含む）は、長さが８〜１６塩基、好ましくは１０〜１２塩基または１０〜１４塩基である。
【０１０２】
さらに好ましい態様において、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、「：」で示された回文中心から等距離にあるＰｕ塩基、Ｐｙ塩基が相補的になっている回文配列
５’−Ｐｕ Ｐｕ ＣＧ Ｐｕ：Ｐｙ ＣＧ Ｐｙ Ｐｙ−３’
および／または、１つ以上の共通配列５’−Ｐｕ Ｐｙ ＣＧ Ｐｙ Ｐｕ−３’を含む。場合によっては、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、３’末端または５’末端に長さが３〜８塩基のポリＧテールを含んでいてもよい。
【０１０３】
本発明の好ましい実施形態において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、１０〜１４塩基の回文配列およびチオリン酸エステル骨格を有する、１８〜２７塩基のＣ型ＣＰＧ ＯＤＮである。特に好ましくは、配列が
５’−ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔｃｇｇｃｇｃ:ｇｃｇｃｃｇ−３’（下線部が回文）
である、ＯＤＮ２３９５である。
【０１０４】
本発明の別の好ましい実施形態において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、チオリン酸エステル骨格を有する、１８〜２２塩基のＢ型ＣＰＧ ＯＤＮである。特に好ましくは、配列が
５’−ｔｃｃａｔｇａｃｇｔｔｃｃｔｇａｃｇｔｔ−３’
である、ＯＤＮ１８２６である。
【０１０５】
ＴＬＲ１１リガンドおよびＴＬＲ１２リガンドは、アクチン細胞骨格の動的な代謝回転および再構築に関わるアクチン結合タンパク質である、プロフィリンを含む。したがって、好ましいＴＬＲ１１／１２リガンドは、トキソプラズマ症という疾患の原因となる偏性細胞内寄生性原生動物である、トキソプラズマ（Toxoplasma gondii）由来のプロフィリンである。プロフィリンは、例えば、エンゾ・ライフ・サイエンス社から購入することができる。
【０１０６】
ＴＬＲ１３リガンドは、細菌のリボソームＲＮＡ配列「ＣＧＧＡＡＡＧＡＣＣ」を含み、このヌクレオチド配列を含む核酸およびこのリガンドは、本発明の好ましい態様を形成する。５’−ＧＧＡＣＧＧＡＡＡＧＡＣＣＣＣＧＵＧＧ−３’の配列を有するオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ１３リガンドであり、例えばインビボジェン社から購入することができる。
【０１０７】
したがって、好ましくは、前記ＴＬＲリガンドは、ＴＬＲ２リガンド、ＴＬＲ３リガンド、ＴＬＲ４リガンド、ＴＬＲ７リガンド、ＴＬＲ８リガンド、またはＴＬＲ９リガンドであり、好ましくは上述したリガンドである。好ましい実施形態において、ＴＬＲリガンドは、ＴＬＲ３リガンドであり、好ましくは、上述したＴＬＲ３リガンドである。別の好ましい実施形態において、ＴＬＲリガンドは、ＴＬＲ４リガンドであり、好ましくは、上述したＴＬＲ４リガンドである。また、さらに別の好ましい実施形態において、ＴＬＲリガンドは、ＴＬＲ７リガンド〜ＴＬＲ９リガンド、すなわち、ＴＬＲ７リガンド、ＴＬＲ８リガンド、またはＴＬＲ９リガンドであり、好ましくは上述したものである。
【０１０８】
本明細書で用いられる「発現する」または「提示する」は、抗原分子の少なくとも一部が細胞の周囲の環境に露出し、接触可能なように、好ましくは、提示された細胞またはその一部に対して免疫応答を起こしてもよいように、抗原分子またはその一部が細胞表面に存在することをいう。「表面」における発現が成されてもよく、この発現では、細胞膜および／またはその膜に存在してもよい、あるいは存在するようにされてもよい膜成分に、発現される分子が接触する。
【０１０９】
本明細書で用いられる「細胞」なる語は、全ての真核細胞（昆虫細胞および真菌細胞を含む）を含んでいる。したがって、代表的な「細胞」は、全ての種類の哺乳動物細胞および非哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、および原生動物を含む。しかしながら、好ましくは、細胞は、例えばネコ、イヌ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ、モルモットなどの哺乳動物細胞であるが、最も好ましいのはヒト由来の細胞である。
【０１１０】
本発明の方法において、抗原分子またはその一部を、その表面に提示することができる第１の細胞が用いられる。したがって、本発明の方法、使用などに供される第１の細胞は、そのサイトゾルに投与または輸送される分子を、表面に発現または提示することができるのであれば、どのような細胞であってもよい。
【０１１１】
第１の細胞は、好都合には、免疫細胞、すなわち免疫応答に関わる細胞である。しかしながら、他の細胞も、免疫系に対して抗原を提示する場合があり、このような細胞も、本発明の範囲内である。したがって、本発明に係る第１の細胞は、有利には、以下に述べるような抗原提示細胞である。抗原提示細胞は、本明細書で定義される免疫応答のどのような態様または「武器」に関わっていてもよい。
【０１１２】
細胞障害性細胞の刺激には、抗原提示細胞によって、例えばＭＨＣクラスＩ提示などの特定の様式で、刺激される細胞に対して抗原が提示されることが必要である（例えば、ＣＤ８+細胞障害性Ｔ細胞の活性化にはＭＨＣ−１抗原提示が必要である）。抗体産生細胞が、抗原提示細胞による抗原提示によって刺激されてもよい。
【０１１３】
抗原は、エンドサイトーシスによって抗原提示細胞に取り込まれ、エンドサイトーシス小胞内でペプチドまで分解される。これらのペプチドは、エンドソームにおいてＭＨＣクラスＩＩ分子に結合して細胞表面に輸送され、そこで、ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ複合体が、ＣＤ４＋ Ｔヘルパー細胞によって認識され、免疫応答を誘導してもよい。あるいは、サイトゾルのタンパク質が、例えばプロテアソームによって分解されてＴＡＰ（抗原提示に関するトランスポーター）によって小胞体へ輸送され、そこで、ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子に結合して細胞表面に輸送されてもよい（ＹｅｗｄｅｌｌおよびＢｅｎｎｉｎｋ、１９９２、Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５２：１〜１２３）。ペプチドが外部抗原由来である場合、ペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体は、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によって認識される。ＣＴＬは、ペプチド−ＭＨＣ（ＨＬＡ）クラスＩ複合体に結合し、それによって活性化され、増殖を開始し、ＣＴＬのクローンを形成する。標的細胞、および細胞表面に同じペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体を有する他の標的細胞は、ＣＴＬクローンによって殺されてもよい。十分量の抗原をサイトゾルに導入することができた場合に、外部抗原に対する免疫が確立され得る（上記ＹｅｗｄｅｌｌおよびＢｅｎｎｉｎｋ、１９９２；Ｒｏｃｋ、１９９６、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １７：１３１〜１３７）。これが、とりわけ癌ワクチン開発の基礎となっている。実用上最大の問題の１つは、サイトゾルに十分量の抗原（または抗原の一部）を導入することである。この問題は、本発明によって解決され得る。
【０１１４】
上記したように、抗原分子は、光科学的内在化プロセスによって一旦細胞のサイトゾルに放出されると、細胞の抗原処理機構によって処理され、適切な様式、例えばクラスＩ ＭＨＣによって、細胞表面に提示され得る。この処理は、抗原の分解、例えばタンパク質抗原またはポリペプチド抗原のペプチドへの分解を含んでもよく、ペプチドはその後、提示のためのＭＨＣ分子と複合体を形成する。したがって、本発明に係る細胞の表面に発現または提示される抗原分子は、内在化（エンドサイトーシス）された抗原分子の一部または断片であってもよい。
【０１１５】
例えばリンパ球（Ｔ細胞およびＢ細胞の両方）、樹状細胞、マクロファージなどを含む、種類の異なる様々な細胞が、その表面に抗原を提示することができる。他には、例えば黒色腫細胞などの癌細胞がある。これらの細胞を、本明細書において、「抗原提示細胞」という。当該技術分野において、主として免疫系のエフェクター細胞への抗原提示に関わる免疫系の細胞である「プロフェッショナル抗原提示細胞」が公知であって、文献にも記載されており、この細胞は、Ｂリンパ球、樹状細胞、およびマクロファージを含む。好ましくは、細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞である。
【０１１６】
抗原提示細胞による、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に対する抗原提示には、抗原分子が抗原提示細胞のサイトゾルに入ることが必要である（Ｇｅｒｍａｉｎ、Ｃｅｌｌ、１９９４、７６、２８７〜２９９）。
【０１１７】
例えば、インビトロまたはエキソビボの方法に関わる、あるいはインビボの方法に関わる本発明の実施形態において、第１の細胞（すなわち、インビボの方法において抗原を提示する細胞）は、好ましくは樹状細胞である。樹状細胞は、哺乳類の免疫系の一部を形成する免疫細胞である。その主な機能は、抗原性物質を処理し、表面において、免疫系の他の細胞に対して提示することである。樹状細胞は、一旦活性化されると、リンパ節に移動し、そこで、Ｔ細胞およびＢ細胞と相互作用して適応免疫を引き起こす。
【０１１８】
樹状細胞は、造血性骨髄始原細胞由来である。これらの始原細胞は、初めは、高い細胞障害活性および低いＴ細胞活性化能が特徴の未成熟樹状細胞に変化する。一旦、提示可能な抗原と接触すると、成熟樹状細胞へと活性化し、リンパ節への移動を開始する。未成熟樹状細胞は、病原体を貪食してそのタンパク質を小片へと分解し、成熟化すると、ＭＨＣ分子を用いてその断片を細胞表面に提示する。
【０１１９】
樹状細胞は、樹状細胞の適切な供給源であればどのような由来であってもよく、例えば、皮膚、鼻の内層、肺、胃、および腸または血液由来であってもよい。本発明の特に好ましい実施形態において、樹状細胞は骨髄由来である。
【０１２０】
樹状細胞は、天然源から単離されて本発明のインビトロの方法で用いられてもよいし、インビトロで産生されてもよい。樹状細胞は、単球、すなわち、体内を循環し、適切なシグナルに応じて、樹状細胞またはマクロファージに分化することができる白血球から生じる。単球は、ひいては、骨髄の幹細胞から形成される。単球由来の樹状細胞は、インビトロにおいて、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から産生させることができる。組織培養フラスコにＰＢＭＣを平板培養することで、単球が付着する。これらの単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）で処理することにより、約１週間で未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）へ分化する。続いて、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）で処理することにより、ｉＤＣは成熟樹状細胞へとさらに分化する。
【０１２１】
他の好ましい態様において、第１の細胞（すなわちインビボにおいて抗原を提示する細胞）は、マクロファージであってもよい。
【０１２２】
本明細書で述べる第２の細胞は、チェックポイント阻害剤が結合し得る細胞である。このような細胞は、チェックポイントタンパク質もしくはチェックポイント脂質などのチェックポイント分子、またはチェックポイント阻害剤が結合し得るチェックポイント分子の受容体またはリガンドを発現し得る。本明細書における「チェックポイント阻害剤による結合」についての言及は、例えば、第２の細胞に存在する当該エピトープを含む標的分子に対する抗体などの、結合パートナーに対して、特定の結合相互作用を及ぼすことをいう。第１の細胞および第２の細胞は、例えば、その表面に抗原分子または抗原分子の一部を発現することと、チェックポイント阻害剤に結合することとがどちらも可能である単一の細胞であってもよい。しかしながら、好都合には、それらは別々の細胞である。この場合、好ましい特徴において、第２の細胞は、免疫系の細胞であって、特に好ましくはＴ細胞またはＢ細胞であり、好ましくは、第１の細胞で発現された抗原分子またはその一部を特異的に認識する細胞である。理論に拘束されることを望むものではないが、第１の細胞および第２の細胞を用いる本方法において、第１の細胞は、抗原分子またはその一部を発現し、第２の細胞は、前記第１の細胞における発現によって刺激され、この刺激は、チェックポイント阻害剤を用いることによって増強されると考えられる。単一の細胞のみを用いる場合、得られる細胞は、免疫応答を活性化する能力が向上しているか、または免疫応答の影響をより受けやすい。
【０１２３】
本明細書で用いられる「接触させる」とは、細胞への内在化および／またはチェックポイント阻害剤への結合に適した条件下、例えば、２５〜３９℃の適切な栄養培地中で好ましくは３７℃、またはインビボにおいて体温、すなわち３６〜３８℃という条件下で、第１の細胞ならびに光感作性薬剤および／または抗原分子（および場合によってはＴＬＲリガンド）、または第２の細胞およびチェックポイント阻害剤などの本明細書で定義される異なる成分を、物理的に互いに接触させることをいう。同様に、第１の細胞および第２の細胞（異なる場合）を、これらの細胞間において相互作用を可能にするように、例えば、抗原分子を提示している第１の細胞によって第２の細胞が刺激されるように、互いに接触させてもよい。このような接触は、本方法を通じて行ってもよいし、例えば照射後など、本方法の一部においてのみ行ってもよい。
【０１２４】
インビトロにおいて、第１の細胞および第２の細胞を用いる場合は、様々な異なる組み合わせおよびタイミングが用いられ得る。したがって、例えば、異なる薬剤および細胞を全て、本方法を行っている間に互いに接触させてもよいし、細胞および／または薬剤を、異なる時点で添加してもよい。本明細書で言及されるように、「少なくとも」第１の細胞または第２の細胞を１つ以上の薬剤と接触させる場合は、第１の細胞または第２の細胞が存在していなければならないが、それに加えて、もう一方の細胞が存在していてもよい。第１の細胞を、少なくとも光感作性薬剤および抗原分子（ならびに、場合によってはチェックポイント阻害剤）と接触させ、第２の細胞を、少なくともチェックポイント阻害剤と接触させる。これは、別々の容器で行われてもよいし、必要とされる成分を一緒に添加してもよい。第１の細胞および第２の細胞が単一の細胞である場合、同じ細胞に対して、各種薬剤を全て添加するが、添加の順序は多様であってもよい。
【０１２５】
このように、第１の細胞を、本明細書で定義される光感作性薬剤および抗原分子（ならびに、場合によってはＴＬＲリガンド）と、順次接触させてもよいし、同時に接触させてもよい。場合によっては、チェックポイント阻害剤を、第１の細胞に接触させてもよい。好ましくは、また好都合には、これらの成分のうちの１つ以上を、第１の細胞に、同時に（例えば、別々に、または一緒に）接触させる。例えば、少なくとも光感作性薬剤および抗原分子（ならびに、場合によってはＴＬＲリガンド）を、同時に細胞に接触させてもよく、また、チェックポイント阻害剤を同時に添加してもよいし、それらの成分を添加する前または後に添加してもよい（第２の細胞が第１の細胞と同じでない場合は、第２の細胞を添加してもよいし、しなくてもよい）。光感作性薬剤および抗原分子（ならびに、用いるのであれば、場合によってはチェックポイント阻害剤および／またはＴＬＲリガンド）は、細胞によって取り込まれて同じ細胞内区画に入ってもよいし、異なる細胞内区画に入ってもよい（例えば、共転移してもよい）。
【０１２６】
細胞を、適切な波長の光に露光させて光感作性化合物を活性化し、その結果、細胞内区画の膜を破壊する。好都合には、これは、抗原分子および光感作性薬剤を第１の細胞に添加した後に行われるが、その添加後に行われてもよい。
【０１２７】
国際公開第０２／４４３９６号（参照により本明細書に援用される）には、例えば、内在化される分子（この場合は抗原分子）が細胞と接触する前に、光感作性薬剤が細胞と接触し照射によって活性化するように、工程を順序立てた方法が記載されている。この方法は、内在化される分子は、照射時に、光感作性薬剤と同じ細胞サブコンパートメントに存在する必要はないということを利用している。
【０１２８】
このように、一実施形態において、本明細書で定義される前記光感作性薬剤および／または前記抗原分子（ならびに、用いるのであれば、場合によってはチェックポイント阻害剤および／またはＴＬＲリガンド）は、一緒に、または相互に独立して、第１の細胞に与えられる。次いで、少なくとも光感作性薬剤および抗原分子が同じ細胞内区画に現れた時に、照射を行う。これを、「後照射」法という。
【０１２９】
別の実施形態において、前記方法は、前記第１の細胞をまず光感作性薬剤に接触させ、次いで本明細書で定義される抗原分子（ならびに、用いるのであれば、場合によってはチェックポイント阻害剤および／またはＴＬＲリガンド）と接触させることで行うことができ、照射は、光感作性薬剤が細胞内区画に取り込まれた後、抗原分子（ならびに、用いるのであれば、場合によってはチェックポイント阻害剤および／またはＴＬＲリガンド）が細胞によって前記光感作性薬剤を含む細胞内区画に取り込まれる前（例えば、露光時に異なる細胞内区画に存在していてもよい）、好ましくは細胞によっていずれかの細胞内区画に取り込まれる前、例えばいずれかの細胞による取り込みの前に行われる。このように、例えば、光感作性薬剤を投与した後に照射を行い、その後残りの薬剤を投与してもよい。これが、いわゆる「前照射」法である。
【０１３０】
本明細書で用いられる「内在化」とは、細胞内、例えばサイトゾルへの分子の送達をいう。この場合、「内在化」は、細胞内区画／膜結合区画から、細胞のサイトゾルへ分子を放出する工程を含んでいてもよい。
【０１３１】
本明細書で用いられる「細胞による取り込み」または「転移」とは、細胞膜外にある分子が、例えば小胞体、ゴルジ体、リソソーム、エンドソームなどの細胞内の膜制限区画への、またはこれら細胞内の膜制限区画に結合する、エンドサイトーシスまたは他の適切な取り込み機構によって、周辺の細胞膜よりも内側に見出されるように細胞に取り込まれる内在化の工程の１つをいう。
【０１３２】
細胞を、各種薬剤に接触させる工程は、都合のよい方法で行われても、所望の方法で行われてもよい。このように、接触工程がインビトロで行われる場合、好都合には、細胞は、例えば適切な細胞培養培地などの水性媒体中に維持されてもよく、適切な時点において、適切な条件下、例えば適切な濃度で適切な期間、各種薬剤を媒体に容易に加えることができる。例えば、細胞は、血清を含まない培地の存在下で薬剤と接触させてもよいし、血清を含む培地とともに薬剤と接触させてもよい。
【０１３３】
以下のコメントでは、各種薬剤を細胞に別々に与えることを論じている。しかしながら、上述したように、これらの薬剤は、細胞に一緒に与えられてもよいし、別々に与えられてもよいし、同時に与えられてもよいし、順次与えられてもよい。本明細書で言及されるように、本発明の方法で用いられる各種薬剤は、インビトロで細胞に与えられてもよいし、インビボで与えられてもよい。後者の場合、以下でより詳細に述べるように、直接投与（すなわち、局所的投与）によって与えられてもよいし、間接投与（すなわち、全身投与または非局所的投与）によって与えられてもよい。
【０１３４】
用いられる特定の光感作性薬剤ならびに標的細胞の種類および位置などの要因に依存し、常用の技術を用いて当業者が容易に決定することができる適切な濃度および適切な期間、光感作性薬剤を細胞（またはこのような細胞が存在している治療すべき被験体）に接触させる。好都合には、光感作性薬剤の濃度は、光感作性薬剤が、例えば１つ以上の細胞内区画に取り込まれる、またはこれら細胞内区画に結合するなど、細胞に一旦取り込まれて、照射によって活性化した際に、例えば１つ以上の細胞内区画が溶解される、または破壊されるなど、１つ以上の細胞構造が破壊されるような濃度である。例えば、本明細書で言及される光感作性薬剤は、例えば１０〜５０μｇ／ｍｌの濃度で用いられてもよい。
【０１３５】
インビトロでの使用では、その範囲はより広く、例えば０．０００５〜５００μｇ／ｍｌである。インビボでのヒトの治療では、光感作性薬剤は、全身投与の場合、０．０５〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で用いられてもよい。あるいは、全身投与では、０．００５〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で用いられてもよい。より好都合には、光感作性薬剤は、例えば皮内投与、皮下投与、または腫瘍内投与など、局所的に投与され、そのような場合に、用量は、１〜５０００μｇの範囲、例えば、１０〜２５００μｇ、２５〜１０００μｇ、５０〜５００μｇ、１０〜３００μｇ、または１００〜３００μｇであってもよい。好ましくは、用量は、２５μｇ、５０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、および２５０μｇから選択される。好ましくは、用量は、７５〜１２５μｇであり、例えば１００μｇである。与えられた用量は、ヒトの平均体重（すなわち７０ｋｇ）あたりのものである。皮内注射では、１回の用量の光増感剤は、１００μｌ〜１ｍｌに溶解されてもよく、すなわち、その濃度は、１〜５００００μｇ／ｍｌの範囲であってもよい。より小型の動物では、局所的に投与する場合に、異なる動物に対して投与を変化させる必要はほとんどないが、濃度範囲は異なっていてもよく、それなりに調節することができる。
【０１３６】
用いられる抗原の濃度は、用いられる抗原に依存する。好都合には、インビトロでは、濃度が０．００１〜５００μｇ／ｍｌ（例えば、２０〜５００μｇ／ｍｌ、２０〜３００μｇ／ｍｌ、２０〜１００μｇ／ｍｌ、２０〜５０μｇ／ｍｌ、１０〜５０μｇ／ｍｌ、５〜５０μｇ／ｍｌ、１〜５０μｇ／ｍｌ、０．０１〜５０μｇ／ｍｌ、または０．００１〜５０μｇ／ｍｌ）の抗原を用いてもよい。ペプチド抗原では、０．００１〜５００μｇ／ｍｌなどのより低い濃度、例えば０．００１〜１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、または１００μｇ／ｍｌの濃度を用いてもよい。タンパク質抗原では、０．５〜５００μｇ／ｍｌなどのより高い濃度を用いてもよい。インビボでの使用では、タンパク質抗原の用量は、０．５〜５００μｇ、例えば１０〜１００μｇまたは１０〜２００μｇの範囲であってもよい。ペプチド抗原では、インビボでの用量は、０．１〜４０００μｇが用いられてもよく、例えば０．１〜２０００μｇ、０．１〜１０００μｇ、または０．１〜５００μｇ、例えば０．１〜２００μｇが用いられてもよい。このような用量は、局所的投与に適している。上記の濃度は、用いられる全抗原に対して適用されてもよいし、抗原分子が２つ以上の抗原を含んでいる場合は、各抗原に対して適用されてもよい。件の薬剤の件の細胞への取り込み効率、および細胞内で達成されることが望まれる終濃度に応じて、適切な濃度を決定することができる。
【０１３７】
用いられるチェックポイント阻害剤の濃度は、用いられるチェックポイント阻害剤に依存する。好都合には、インビトロでは、０．００１〜５００μｇ／ｍｌ（例えば、２０〜５００μｇ／ｍｌ、２０〜３００μｇ／ｍｌ、２０〜１００μｇ／ｍｌ、２０〜５０μｇ／ｍｌ、１０〜５０μｇ／ｍｌ、５〜５０μｇ／ｍｌ、１〜５０μｇ／ｍｌ、０．０１〜５０μｇ／ｍｌ、または０．００１〜５０μｇ／ｍｌ）の濃度を用いてもよい。インビボでの使用では、チェックポイント阻害剤の用量は、０．５〜５００μｇ、例えば１０〜１００μｇまたは１０〜２００μｇの範囲であってもよい。好ましい実施形態において、１００μｇまたは２００μｇの用量が用いられてもよい。このような用量は、局所的投与に適している。静脈内投与または腹腔内投与などの全身投与では、用量は、０．１〜４５ｍｇ／ｋｇ、例えば１〜４０ｍｇ／ｋｇ、５〜３５ｍｇ／ｋｇ、１０〜３０ｍｇ／ｋｇ、または１５〜２５ｍｇ／ｋｇなど、また５〜１０ｍｇ／ｋｇまたは２〜５ｍｇ／ｋｇなどの範囲であってもよく、例えば３ｍｇ／ｋｇであってもよい。上記の濃度は、用いられる全チェックポイント阻害剤に対して適用されてもよいし、２つ以上のチェックポイント阻害剤を用いる場合は、各チェックポイント阻害剤に対して適用されてもよい。
【０１３８】
件の細胞に対する件のチェックポイント阻害剤の効率、および細胞内で達成されることが望まれる終濃度に応じて、適切な濃度を決定することができる。
【０１３９】
用いるのであれば、本明細書で定義されるＴＬＲリガンドの濃度も、用いられる特定の分子に依存しており、当業者であれば、適切な濃度および用量を認識しているであろう。下記の濃度は、用いられる全ＴＬＲリガンドに対して適用されてもよいし、２つ以上のＴＬＲリガンドを用いる場合は、各ＴＬＲリガンドに対して適用されてもよい。
【０１４０】
下記表２に、インビトロおよびインビボにおける、適切な濃度または用量の例を示す。
【０１４１】
【表２】
2018508533.tif 000027
【０１４２】
したがって、好都合には、例えばインビトロでは１〜１００μｇ／ｍｌ（例えば２０〜１００μｇ／ｍｌまたは２０〜５０μｇ／ｍｌ）の濃度が用いられてもよい。インビボでは、イミダゾキノリン化合物の用量として１０〜１０００μｇが用いられてもよく、例えば、マウスでは２０〜１００μｇ、ヒトでは１０μｇ〜１０ｍｇが用いられてもよい。例えばヒトへのイミキモドの局所的投与では、２．５〜５０ｍｇの用量が用いられてもよく、例えば２．５ｍｇ／ｃｍ2などの１〜５ｍｇ／ｃｍ2などを用いてもよい。レシキモドでは、用量は、例えば１〜５ｍｇなどの０．１〜５０ｍｇであってもよく、例えば１〜５ｍｇ／ｃｍ2であってもよい。同様の用量は、ガーディキモドにも適している。イミダゾキノリン化合物の皮内注射では、例えば少なくとも１０μｇまたは５０μｇなどのより少ない用量が用いられてもよく、例えば１０μｇ〜１ｍｇを用いることができる。ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび他のＴＬＲリガンドについても、同様の用量が用いられてもよい。ポリ（ＩＣ）は、インビボにおいて、マウスでは１〜１００μｇ（例えば、５μｇまたは１０μｇ）、ヒトでは１μｇ〜１０ｍｇの用量で投与されてもよい。
【０１４３】
たいていの場合、光感作性薬剤、抗原分子（ならびに、用いるのであれば、場合によってはチェックポイント阻害剤および／またはＴＬＲリガンド）は、一緒に投与されるが、違っていてもよい。このように、投与（または細胞との接触）の時間、形態、または部位が異なっていることが、異なる成分それぞれに対して意図され、このような方法は、本明細書で述べる本発明の範囲に包含される。
【０１４４】
一実施形態において、特に、インビボにおける本発明の方法および使用においては、光感作性薬剤および抗原分子（および、用いるのであればＴＬＲリガンド）は、チェックポイント阻害剤とは別に、一緒に投与される。別々に投与する場合は、同時（例えば、インビボにおいて用いる場合、異なる投与経路を介して）であってもよいし、連続的であってもよい。インビボにおける一例において、チェックポイント阻害剤は、他の薬剤と比較して、複数回にわたって投与されてもよく、例えば、処理中に、１回、２回または３回投与されてもよい他の薬剤と比較して、３回、４回、５回、６回またはそれ以上投与されてもよい。本発明の方法は、（照射後、関連区画への内在化が可能になるように）関連する薬剤を全て細胞に接触させた（またはインビボにおいて投与した）後（または直前）に、ＰＣＩ法の照射を行う方法を包含する。したがって、チェックポイント阻害剤は、例えば別処方で、他の成分とは別に投与されてもよい。２つ以上のチェックポイント阻害剤（または抗原もしくはＴＬＲリガンド）を用いる場合、異なるチェックポイント阻害剤（抗原もしくはＴＬＲリガンド）をそれぞれ別々に投与してもよいし、同時に投与してもよいし、順次投与してもよい。
【０１４５】
本方法においてＴＬＲリガンドを用いる一実施形態において、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、イミダゾキノリン化合物、ＬＰＳ、またはポリ（ＩＣ）分子などの、本明細書で定義されるＴＬＲリガンドは、抗原とは別に、例えばクリームまたはゲルなどの別処方で投与されるか、または経口投与（例えばレシキモド）などによって全身投与される。このように、一実施形態において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドまたはイミダゾキノリン化合物などのＴＬＲリガンドは、抗原および／または光増感剤の投与よりも先に、例えば２４時間前に、局部的（局所的）前処理などによって投与されてもよい。ポリ（ＩＣ）またはＬＰＳなどのＴＬＲリガンドは、抗原分子よりも前に、または抗原分子と一緒に、または抗原分子よりも後に投与される場合がある。
【０１４６】
ＴＬＲリガンドは、例えば照射の約２時間前に、他の薬剤とは別に投与されてもよい。別の実施形態において、薬剤は、抗原と一緒に、または抗原と同じ時間に、すなわち同時に、投与されてもよい。好ましくは、チェックポイント阻害剤（および、好ましくは、本方法での使用について説明した全ての薬剤）は、照射の前後１２０時間または７２時間以内に、好ましくは４８時間、２４時間、１２時間、６時間、４時間、２時間、１時間、３０分、または１５分以内に（すなわち、照射前または照射後のいずれかにおいて）投与される。
【０１４７】
細胞（適宜、第１の細胞または第２の細胞、あるいはインビボにおける適切な同等の細胞）と光感作性薬剤、および／または抗原分子、および／または本明細書で定義されるチェックポイント阻害剤（および、用いるのであればＴＬＲリガンド）との接触は、好都合には、１５分〜２４時間行われ、例えば３０分〜４時間、好ましくは１．５〜２．５時間行われる。あるいは、時間範囲は、約１時間〜約４８時間であってもよく、例えば約２時間〜約４０時間または約６時間〜約３６時間であり、また１２時間〜３０時間、１６時間〜２０時間などであり、１８時間または約１８時間などである。
【０１４８】
好ましい実施形態において、第１の細胞（またはインビボにおける同等の細胞）は、初めに、光感作性薬剤とともにインキュベートされる。一実施形態において、光感作性薬剤の投与と抗原分子（ならびに、用いるのであれば、場合によってはチェックポイント阻害剤および／またはＴＬＲリガンド）の投与との間の時間は、数時間である。例えば、光感作性薬剤は、照射の１６〜２０時間前、例えば１８時間前に与えられてもよく、抗原分子（ならびに、用いるのであれば、場合によってはチェックポイント阻害剤および／またはＴＬＲリガンド）は、照射の１〜３時間前、例えば２時間前に与えられてもよい。したがって、光感作性薬剤の投与と抗原分子（ならびに、用いるのであれば、場合によってはチェックポイント阻害剤および／またはＴＬＲリガンド）の投与との間の時間は、１５〜２３時間の範囲であってもよい。
【０１４９】
このように、第１の細胞（またはインビボにおける同等の細胞）は、光増感剤とインキュベートされた後、続いて本明細書で定義される抗原（ならびに、用いるのであれば、場合によってはチェックポイント阻害剤および／またはＴＬＲリガンド）とともにインキュベートされる。好都合には、細胞は、光増感剤／抗原との接触後、照射までの間、光増感剤および抗原分子（ならびに、用いるのであれば、場合によってはチェックポイント阻害剤および／またはＴＬＲリガンド）とのインキュベートのタイミングに応じて、３０分〜４時間、例えば１．５時間〜２．５時間、細胞を光増感剤／抗原非含有媒体に入れてもよい。
【０１５０】
第２の細胞が第１の細胞と異なる場合、第２の細胞をチェックポイント阻害剤（および、存在するのであれば他の薬剤）と接触させる時間についても同様に考えられる。したがって、例えば、上記の時間、第２の細胞をチェックポイント阻害剤に接触させてもよいが、第１の細胞とは別に処理を行う場合は、前記第２の細胞への照射は必ずしも行わなくてもよい。
【０１５１】
インビボにおいて、各種薬剤を標的細胞と接触させる適切な方法およびインキュベート時間は、用いられる薬剤の投与形態および種類などの要因に依存する。例えば、治療／照射される腫瘍、組織、または器官に、薬剤を注射する場合、注射地点付近の細胞は、注射地点から遠く離れた細胞よりも速く、薬剤と接触し、薬剤のうちの１つ以上を取り込むか、または結合する傾向があり、これら注射地点から離れた細胞は、より遅い時点で低濃度の薬剤と接触することになる。好都合には、時間としては、６〜２４時間が用いられる。
【０１５２】
さらに、静脈注射によって投与された薬剤、または経口投与された薬剤は、標的細胞に到達するまでに時間がかかる場合があり、したがって、十分な、または最適な量の薬剤が標的細胞内もしくは標的組織内および／または標的細胞上もしくは標的組織上に蓄積するためには、投与後長く、例えば数日、かかる場合がある。このように、インビボにおいて個々の細胞に必要な投与時間は、これらのパラメータおよび他のパラメータに応じて変化しやすい。
【０１５３】
しかしながら、インビボでの状況は、インビトロよりも複雑ではあるけれども、本発明の基本的概念は、なお同じである。すなわち、分子が標的細胞と接触する時間は、照射が行われる前に、適切な量の光感作性薬剤が標的細胞によって取り込まれ、かつ（ｉ）照射前または照射中に、細胞内の、例えば光感作性薬剤と同じまたは異なる細胞内区画などに、抗原分子（ならびに、用いるのであれば、場合によってはチェックポイント阻害剤および／またはＴＬＲリガンド）がすでに取り込まれているか、または標的細胞と十分に接触してから取り込まれる、あるいは（ｉｉ）照射後に、抗原分子（ならびに、用いるのであれば、場合によってはチェックポイント阻害剤および／またはＴＬＲリガンド）が細胞に取り込まれるのに十分な期間、細胞と接触する、ような時間でなければならない。同様に、チェックポイント阻害剤の標的細胞への接触は、チェックポイント阻害剤が結合することができ、好ましくは、抗原分子を取り込んだ細胞が、その分子またはその分子の一部を細胞表面に提示する時間までに、この結合が完全なものとなるようなものでなければならない。
【０１５４】
本明細書で述べる薬剤のインビボでの投与では、当該技術分野において一般的な投与形態または標準的な投与形態であれば、例えば、体内面および体外面両方への、注射、点滴、局所的投与、経皮投与など、どのような形態を用いてもよい。インビボでの使用では、本発明は、光感作性薬剤を含む化合物または内在化される分子が局在化する細胞を含む組織であれば、体液部および固形組織など、どのような組織に対しても用いることができる。標的細胞によって光増感剤が取り込まれ、かつ光を適切に届けることができる限り、全ての組織を治療することができる。例えば、光感作性薬剤（および／または、用いるのであれば、抗原分子およびＴＬＲリガンド）の好ましい投与形態は、皮内投与または皮内注射、皮下投与または皮下注射、局所的投与または局所的注射、あるいは腫瘍内投与または腫瘍内注射であり、好ましくは、該投与は、皮内注射または腫瘍内注射によって行われる。チェックポイント阻害剤の場合、投与は、例えば、静脈などへの全身投与または腫瘍内投与などによって行われてもよい。あるいは、実施例で説明するように、腹腔内投与が用いられてもよい。
【０１５５】
抗原提示、免疫応答の発生、または予防接種など、所望の結果を達成するために、本方法またはその一部が繰り返されてもよく、例えば、「再接種」が行われてもよい。このように、適切な間隔を空けた後、本方法の全体をそのまま複数回（例えば、２回、３回、またはそれ以上）行ってもよいし、例えば本明細書で定義されるチェックポイント阻害剤（および／または、用いるのであればＴＬＲリガンド）をさらに投与する、または照射工程を追加するなど、本方法の一部を繰り返してもよい。例えば、本方法または本方法の一部を、最初に行ってから、数日後、例えば５〜６０日後（７日後、１４日後、１５日後、２１日後、２２日後、４２日後、または５１日後など）、や７〜２０日後、好ましくは１４日後に再び行ってもよいし、数週間後、例えば１〜５週間後（１週間後、２週間後、３週間後、または４週間後など）に、再び行ってもよい。適切な間隔を空けて、例えば２週間毎、つまり１４日毎に、本方法の全てまたは一部を複数回繰り返してもよい。好ましい実施形態において、本方法は、少なくとも１回繰り返される。別の実施形態において、本方法は２回繰り返される。
【０１５６】
一実施形態において、本方法を複数回行うことに加えて、例えば実施例で述べるように、本方法を例えば１回、２回、３回、またはそれ以上行う際に、その各実施の前または後に、チェックポイント阻害剤をさらに別に投与してもよい。
【０１５７】
別の実施形態において、本発明の方法が実施される前に、本発明の方法の一部を実施してもよい。例えば、本発明の方法を実施する前に、チェックポイント阻害剤の非存在下において、本方法を１回以上、例えば２回、実施してもよい。あるいは、本発明の方法を実施する前に、光増感剤がなく照射もしない（場合によってはＴＬＲリガンドが存在しない）状態で、本方法を１回以上、例えば２回、実施してもよい。本発明の方法を実施する数日前、例えば７日前または１４日前に、本方法の一部を実施してもよいし、数週間前、例えば１週間、３週間、または４週間前に、実施してもよい。本発明の方法が実施される前に、このような間隔を空けて、１回以上本方法の一部を繰り返してもよい。したがって、好ましい態様において、抗原分子は、（例えば、上述した間隔を空けて）２回以上（例えば、被験体に）投与され、少なくとも前記抗原分子の投与は、本発明の方法にしたがって行われる。
【０１５８】
換言すると、本発明は、抗原分子、光感作性薬剤、および場合によってはＴＬＲリガンド（チェックポイント阻害剤ではない）を用いる、本明細書で述べる方法を提供し、この方法は、（１回以上の）チェックポイント阻害剤の投与（細胞接触）とともに行われ、該方法は、好ましい実施形態に沿って、本明細書で述べる方法、使用、および使用のための製品において行われてもよい。
【０１５９】
光感作性薬剤を活性化する「照射」とは、以下に述べるように直接的または間接的に光をあてることをいう。このように、被験体または細胞が、例えば、直接的に（例えばインビトロで細胞それぞれに）光源から照射されてもよいし、例えば、インビボにおいて、細胞が皮膚の表面下にある場合、または全ての細胞が直接的に照射されるわけではない、すなわち全ての細胞が他の細胞に遮蔽されているわけではない細胞層の形態である場合など、間接的に光源から照射されてもよい。細胞または被験体の照射は、光感作性薬剤、抗原分子（ならびに、用いるのであれば、場合によってはチェックポイント阻害剤および／またはＴＬＲリガンド）が投与されてから、約１８〜２４時間後に行われてもよい。
【０１６０】
光感作性薬剤を活性化する光照射工程は、当該技術分野において周知である技術および手順にしたがって行われてもよい。用いられる光の波長は、用いられる光感作性薬剤に応じて選択される。当該技術分野において、適切な人工光源がよく知られており、例えば青色波長光（４００〜４７５ｎｍ）または赤色波長光（６２０〜７５０ｎｍ）を用いる。例えば、ＴＰＣＳ2aでは、４００〜５００ｎｍの波長、より好ましくは４００〜４５０ｎｍ、例えば４３０〜４４０ｎｍの波長、さらに好ましくは約４３５ｎｍの波長または４３５ｎｍの波長が用いられてもよい。適切である場合は、ポルフィリンまたはクロリンなどの光増感剤は、緑色光によって活性化されてもよく、例えば、キラーレッド（KillerRed）（エブロゲン社（Evrogen）、モスクワ、ロシア）光増感剤は、緑色光で活性化されてもよい。
【０１６１】
当該技術分野において適切な光源がよく知られており、例えば、ＰＣＩバイオテクＡＳ社（PCI Biotech AS）のルミソース（LumiSource）（登録商標）ランプが挙げられる。あるいは、６０ｍＷ以下の調節可能な出力電源を有し、発光スペクトルが４３０〜４３５ｎｍであるＬＥＤ系照明装置を用いてもよい。赤色光では、適切な光源は、ＰＣＩバイオテクＡＳ社の６５２ｎｍレーザーシステムＳＮ５７６００３ダイオードレーザーであるが、適切な赤色光源であればどのようなものを用いてもよい。
【０１６２】
本発明の方法において、細胞を光にあてる時間は、様々であってよい。そこを超えると細胞障害、ひいては細胞死が増加する最大限までは、光にあてる時間を増加させるにつれて、分子のサイトゾルへの内在化の効率は上昇する。
【０１６３】
照射工程の好ましい時間は、標的、光増感剤、標的細胞または標的組織に蓄積される光増感剤の量、および光増感剤の吸収スペクトルと光源の発光スペクトルとの重なりなどの要因に依存する。一般的には、照射工程の時間は、秒から分のオーダー、または数時間以下（さらには１２時間以下）であり、例えば、好ましくは６０分以下であり、例えば０．２５分〜３０分または１分〜３０分であり、例えば０．５〜３分または１〜５分または１〜１０分であり、例えば３〜７分であり、好ましくは約３分であり、例えば２．５〜３．５分である。より短い照射時間が用いられてもよく、例えば１〜６０秒であり、１０〜５０秒、２０〜４０秒、または２５〜３５秒などである。
【０１６４】
当業者であれば、適切な光照射量を選択することができ、あらためて、光照射量は、用いられる光増感剤、および標的細胞または標的組織に蓄積される光増感剤の量に依存している。可視スペクトルの吸光係数（赤色領域における吸光係数、または青色光を用いる場合は青色領域における吸光係数；用いられる光増感剤による）の高い光増感剤を用いる場合は、光照射量は通常低い。例えば、６０ｍＷ以下の調節可能な出力電源を有し、発光スペクトルが４３０〜４３５ｎｍであるＬＥＤ系照明装置を用いる場合、フルエンスが０．０５〜２０ｍＷ／ｃｍ2の範囲、例えば２．０ｍＷ／ｃｍ2で、０．２４〜７．２Ｊ／ｃｍ2の範囲の光照射量が用いられてもよい。あるいは、例えばルミソース（登録商標）ランプを用いる場合、フルエンスが０．１〜２０ｍＷ／ｃｍ2（例えば、ルミソース（登録商標）では１３ｍＷ／ｃｍ2）の範囲で、０．１〜６Ｊ／ｃｍ2の範囲の光照射量が適切である。赤色光では、フルエンスが０．１〜５ｍＷ／ｃｍ2の範囲、例えば０．８１ｍＷ／ｃｍ2で、０．０３〜１Ｊ／ｃｍ2の範囲、例えば０．３Ｊ／ｃｍ2の光照射量が用いられてもよい。
【０１６５】
さらに、細胞の生存率を維持しようとする場合は、過剰なレベルの毒性種の生成は避けられるべきであり、関連するパラメータがそれに応じて調整されてもよい。
【０１６６】
本発明の方法は、光化学的処理によって、すなわち、光感作性薬剤が活性化する際に毒性種が生成することによる光力学的な治療効果によって、不可避的にいくらかの細胞障害を引き起こす場合がある。提案された使用によっては、この細胞死は重大ではないかもしれず、ある用途（例えば癌の治療）においては、実際のところ有利であるかもしれない。しかしながら、たいていの実施形態において、提示細胞に免疫応答を起こさせるために、細胞死は回避される。本発明の方法は、生存細胞の割合または比率が、光感作性薬剤の濃度に対応して光照射量を選択することによって調節されるように、変更されてもよい。あらためて、当該技術分野において、このような技術は公知である。
【０１６７】
好ましくは、実質的に全ての細胞、またはかなり大多数の細胞（例えば、少なくとも７５％の細胞、より好ましくは、少なくとも、８０％、８５％、９０％、または９５％の細胞）が殺されない。インビトロでは、ＭＴＳ試験などの、当該技術分野において公知の標準的な技術によって、ＰＣＩ処理後の細胞の生存率を測定することができる。インビボでは、１種類以上の細胞の細胞死を、投与地点の半径１ｃｍ以内で（または組織のある深さにおいて）、例えば顕微鏡によって評価してもよい。細胞死は、直ちには起こらない場合があるので、％細胞死は、照射後数時間以内（例えば照射後４時間以内）に生存している細胞の割合をいうが、好ましくは照射から４時間以上経過後の％生存細胞をいう。
【０１６８】
本明細書で述べる方法は、インビボで行われてもよいし、インビトロで行われてもよいし、エキソビボで行われてもよい。好ましくは、本方法は、インビボでの投与のための細胞を産生するためにインビトロまたはエキソビボで用いられるか、または本方法はインビボで用いられる。したがって、好ましい特徴において、本方法を用いて、被験体の免疫応答を起こしてもよい。
【０１６９】
これまで述べたように、好ましい態様において、本発明は、被験体の免疫応答を起こす方法であって、該方法は、上記定義された抗原分子、光感作性薬剤、チェックポイント阻害剤、および場合によってはＴＬＲリガンドを前記被験体に投与することと、前記光感作性薬剤を活性化させるのに有効な波長の光を前記被験体に照射することと、を含む方法であり、免疫応答が引き起こされる、方法を提供する。
【０１７０】
引き起こされ得る「免疫応答」は、体液性免疫および細胞媒介性免疫であってもよく、例えば、抗体産生の刺激、あるいは表面に「外部」抗原を発現する細胞を認識し破壊（そうでなければ排除）し得る細胞障害性細胞またはキラー細胞の刺激であってもよい。したがって、「免疫応答を刺激する」なる語は、全ての種類の免疫応答、および免疫応答を刺激する全ての種類の機構を含み、本発明の好ましい態様を形成するＣＴＬを刺激することを包含する。好ましくは、刺激される免疫応答は、細胞障害性ＣＤ８ Ｔ細胞である。免疫応答の程度は、免疫応答のマーカー、例えば、ＴＮＦ−αまたはＩＦＮγなどの分泌された分子によって、または抗原特異的Ｔ細胞の産生によって、評価されてもよい（例えば、実施例で述べるように評価されてもよい）。
【０１７１】
細胞障害性細胞または抗体産生細胞の刺激には、抗原提示細胞によって、例えばＭＨＣクラスＩ提示などの特定の様式で、刺激される細胞に対して抗原が提示されることが必要である（例えば、ＣＤ８+細胞障害性Ｔ細胞の活性化にはＭＨＣ−Ｉ抗原提示が必要である）。好ましくは、免疫応答は、ＭＨＣ−Ｉ提示を介して刺激される。
【０１７２】
好ましくは、免疫応答を用いて、例えば、癌などの細胞が異常増殖する病気や、肝炎などのウイルス感染といった感染などの疾患、障害、または感染を治療または予防する。したがって、さらに好ましい実施形態において、本発明は、癌の治療法であって、該方法は、抗原分子、光感作性薬剤、およびチェックポイント阻害剤を前記被験体に投与することと、前記光感作性薬剤を活性化するのに有効な波長の光を前記被験体に照射することと、を含む方法であり、免疫応答が引き起こされる、方法を提供する。
【０１７３】
一実施形態において、癌は、黒色腫である。黒色腫は、黒色素細胞の悪性腫瘍であり、黒色素細胞とは、皮膚の色のもととなる黒色素であるメラニンを産生する細胞である。これらの細胞は、大部分は皮膚に存在するが、腸および目を含む、体の他の部分にも見出される。黒色腫は、黒色素細胞を含むのであれば、体のどの部分でも生じ得る。
【０１７４】
本明細書で言及される「黒色腫」は、全ての種類の黒色腫を含み、例えば、表在性広範黒色腫、結節性黒色腫、黒子悪性黒色腫、線維形成性黒色腫、末端黒子型黒色腫およびメラニン欠乏性黒色腫、ポリープ様黒色腫、小母斑様細胞を有する黒色腫、ならびにスピッツ母斑の特徴を有する黒色腫などが挙げられる。
【０１７５】
黒色腫の大半は、皮膚で発生する（皮膚悪性黒色腫）が、黒色腫は、体内のどこでも発生し得、例えば、粘膜など内臓でも発生し得る。明細胞肉腫は、軟組織の悪性黒色腫である。黒色腫は、眼（ぶどう膜黒色腫）、外陰、膣、または直腸にも発生し得る。これらの黒色腫も、本発明の範囲に含まれる。好ましくは、治療される黒色腫は、皮膚黒色腫である。黒色腫は、転移性黒色腫、すなわち、原発性黒色腫由来であるが、異なる部位に転移して続発性腫瘍を生じた細胞にも及ぶ。本明細書で述べる黒色腫の治療または予防は、原発性黒色腫および／または原発性黒色腫由来の続発性腫瘍の治療に及ぶ。このように、本発明は、転移性黒色腫を治療するのにも有用である。
【０１７６】
別の実施形態において、癌は、パピローマウイルス、特にヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に関連する癌か、あるいはパピローマウイルスが原因であるか誘発する癌である。上述したように、パピローマウイルスゲノムは、宿主細胞への一次感染直後に発現される読み枠（ＯＲＦ）を６つ（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、およびＥ７）コードする初期領域（Ｅ）と、主要カプシドタンパク質Ｌ１および副カプシドタンパク質Ｌ２をコードする後期領域（Ｌ）とに分割される。ウイルスのＯＲＦは、全て一本のＤＮＡ鎖にコードされている。本発明によって用いられてもよいＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ感染が引き起こす癌に関連し得るものであり、本明細書で述べる１つ以上の公知の抗原性ペプチドまたはＴ細胞エピトープであり得る。上述したように、ＨＰＶにはいくつかの種類があり、本発明に係るＨＰＶに関連した癌は、例えばＨＰＶ−１６および／またはＨＰＶ−１８、あるいはＨＰＶ−３１またはＨＰＶ−４５など、どのような種類のＨＰＶに関連していてもよいし、どのような種類のＨＰＶによって引き起こされてもよい。本発明によって用いられる抗原は、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、Ｅ４タンパク質、Ｅ５タンパク質、Ｅ６タンパク質、およびＥ７タンパク質のいずれか、またはＬ１タンパク質およびＬ２タンパク質のいずれかに由来するものであってもよい。このように、抗原分子は、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８のＥ２タンパク質、Ｅ６タンパク質、およびＥ７タンパク質のうち１つ以上に由来するものであってもよい。好ましい実施形態において、抗原分子は、ＨＰＶ−１６のＥ７配列、ＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲ（ＣＤ８エピトープを下線で示す）を包含する。このように、ＨＰＶ抗原は、３５アミノ酸のペプチドであってもよい。あるいは、抗原分子は、ＣＤ８エピトープであるＲＡＨＹＮＩＶＴＦのみ、すなわち、より短いペプチドであってもよい。
【０１７７】
別の実施形態において、疾患、障害、または感染は、ウイルス感染であり、好ましくはパピローマウイルス感染であり、特にヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染である。
【０１７８】
好ましくは、本方法は、予防接種に用いられる。本明細書で言及される「予防接種」は、疾患、障害、または感染の発症（またはさらなる進展）に対して予防効果または治療効果を有する免疫応答を誘起するための抗原（または抗原を含む分子）の使用をいい、その疾患、障害、または感染は、その抗原の異常な発現または異常な存在と関連している。好ましくは、疾患は癌であり、例えば、黒色腫またはＨＰＶなどのパピローマウイルスに関連する癌である。一実施形態において、予防接種は、例えば本明細書で述べる癌の治療において、治療効果を有する。別の実施形態において、予防接種は、例えば、癌を予防する、または治療的接種による初期癌の治療後に癌がさらに進展することを抑制する、予防効果を有する。さらなる実施形態において、感染に対する免疫応答、例えば、ＨＰＶ感染などのウイルス感染に対する免疫応答が引き起こされる場合、予防接種は、実際に予防的である。
【０１７９】
本発明の好ましい実施形態において、本方法、例えば予防接種の被験体は哺乳類であり、好ましくは、ネコ、イヌ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットであるが、最も好ましくは、被験体はヒトである。
【０１８０】
好ましくは、本明細書で述べる方法は、相乗効果を達成する。すなわち、（ｉ）チェックポイント阻害剤（およびＴＬＲリガンド）非存在下で、抗原分子および光感作性薬剤（および照射）を用いて本方法を行うことによって観察される増強、および（ｉｉ）光感作性薬剤非存在下で、かつ／または照射工程も行わない状態で、抗原分子およびチェックポイント阻害剤（ならびに、場合によってはＴＬＲリガンド）を用いて本方法を行うことによって観察される増強、を合わせた分よりも、細胞表面における提示または引き起こされた免疫応答の程度が増強される、つまり、本方法の間で相乗効果が観察される。細胞表面における提示または引き起こされた免疫応答のレベルは、適切な手段、例えば、抗原特異的ＣＤ８＋細胞の数、またはＩＦＮγまたはＴＮＦαなどの免疫応答活性化マーカーのレベルによって、評価されてもよい。
【０１８１】
本明細書で用いられる「相乗効果」とは、単なる相加効果を越える量的な改善をいう。
【０１８２】
本発明の方法で用いられる各種薬剤は、被験体に対して、別々に投与されてもよいし、順次投与されてもよいし、同時に投与されてもよい。
【０１８３】
適切である場合は、抗原分子または抗原分子の一部を細胞表面に発現する、本発明の方法に関する上述した態様および特徴は、上記の免疫応答を起こす方法にも適用することができ、逆の場合も同様である。
【０１８４】
本発明は、細胞のサイトゾルに抗原分子を導入する方法であって、該方法は、
ａ）同じ細胞であってもよいし異なる細胞であってもよい、前記抗原分子または前記抗原分子の一部を発現させる第１の細胞およびチェックポイント阻害剤が結合し得る第２の細胞を提供することと、
ｂ）少なくとも前記第１の細胞を、前記抗原分子、光感作性薬剤、および場合によってはＴＬＲリガンドに接触させることと、
ｃ）少なくとも前記第２の細胞を、チェックポイント阻害剤に接触させることと、
ｄ）前記抗原分子が前記細胞のサイトゾルに放出され、その後、前記抗原分子または抗原分子の一部が前記第１の細胞の表面に提示されるように、少なくとも前記第１の細胞に、前記光感作性薬剤を活性化するのに有効な波長の光を照射することと、
を含み、
前記照射の前、前記照射中、および／または前記照射後に、前記第１の細胞および前記第２の細胞を互いに接触させる、方法を提供する。一旦活性化されると、前記化合物を含む前記細胞内の細胞内区画は、これらの区画に含まれる分子を、サイトゾルへと放出する。
【０１８５】
例えば、インサイチュでの治療またはエキソビボでの治療のいずれかに続いて処理後の細胞を体に投与するために、上記本発明の方法をインビトロで用いてもよいし、インビボで用いてもよい。
【０１８６】
本発明は、さらに、表面に抗原分子または抗原分子の一部を発現する細胞、またはその細胞群を提供し、ここで、細胞は、本明細書で定義される方法のいずれかによって得ることができる（または得られた）ものである。また、以下で述べる予防または治療に用いる細胞または細胞集団も提供される。
【０１８７】
細胞集団は、１つ以上の薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を他に含む医薬組成物に提供されてもよい。
【０１８８】
本発明は、本明細書で定義される抗原分子、光感作性薬剤、チェックポイント阻害剤、ならびに、場合によってはＴＬＲリガンド、および１つ以上の薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含む医薬組成物も提供する。
【０１８９】
これらの組成物（および本発明の製品）は、薬学分野において公知の技術および手順にしたがう簡便な様式であればどのような様式で処方されてもよく、例えば、１つ以上の薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤が用いられる。本明細書で言及される「薬学的に許容される」とは、組成物（または製品）の他の成分と共存し、さらに受容者に生理学的に許容される成分をいう。組成物および担体または賦形剤材料の性質、用量などは、投与の選択肢および所望の経路、治療目的などにしたがって、常用の様式で選択されてもよい。用量は、同様に、常用の様式で決定されてもよいし、分子（あるいは、組成物または製品の成分）の性質、治療目的、患者の年齢、投与形態などによって決定されてもよい。光感作性薬剤に関しては、照射時に膜を破壊する効力／能力も考慮されるべきである。
【０１９０】
例えば抗原提示細胞などの細胞は、インビトロで調製されてもよい。治療法において、これらの細胞は、該細胞が、例えば予防目的または治療目的で、免疫応答を刺激し得るように、インビボで体に投与されてもよいし、エキソビボで体組織に投与されてもよい。
【０１９１】
したがって、本発明は、予防または治療に用いるための、または例えば予防接種の目的で、免疫応答を刺激するのに用いるための、例えば、被験体のＣＴＬを刺激する、好ましくは前記被験体の疾患、障害、または感染を治療または予防する、特に黒色腫およびＨＰＶなどのパピローマウイルスに関連する癌などの癌を治療または予防する、本明細書で定義される細胞集団（もしくはこれを含む組成物）、または本明細書で定義される抗原分子、光感作性薬剤、チェックポイント阻害剤、および、場合によってはＴＬＲリガンドをさらに提供する。別の定義では、本発明は、被験体の免疫応答を刺激するのに用いられる薬物（例えばＣＴＬを刺激する）を調製するための、好ましくは前記被験体の疾患、障害、または感染を治療または予防するための、また好ましくは予防接種のため、かつ／または黒色腫およびＨＰＶなどのパピローマウイルスに関連する癌などの癌を治療または予防するための、（ｉ）細胞集団、（ｉｉ）本明細書で定義される組成物、あるいは（ｉｉｉ）抗原分子、および／または光感作性薬剤、および／またはチェックポイント阻害剤、および場合によってはＴＬＲリガンド、の使用を提供し、好ましくは、前記免疫応答は、本明細書で定義される方法によって刺激される。
【０１９２】
前記刺激、治療、または予防は、好ましくは、前記薬物を前記被験体に投与することを含む。
【０１９３】
抗原分子、光感作性薬剤、およびチェックポイント阻害剤（ならびに、場合によってはＴＬＲリガンド）は、一体にして組成物に提供されてもよい。別の表現では、本発明は、免疫応答を刺激する（例えば、被験体のＣＴＬを刺激する）、好ましくは前記被験体の疾患、障害、感染を治療または予防する、特に予防接種を目的とする薬物の製造における、本明細書で定義される抗原分子および／または光感作性薬剤および／またはチェックポイント阻害剤、および、用いるのであれば、場合によってはＴＬＲリガンドの使用を提供し、前記薬物は、前記被験体への投与のために、細胞表面に抗原分子または抗原分子の一部を発現する、本明細書で定義される方法によって得ることができる細胞の集団を含む。好ましくは、細胞集団は、このような方法で得られる。細胞集団は、被験体へ投与するためのものである。
【０１９４】
別の実施形態において、本発明は、被験体の免疫応答を刺激する（例えば、ＣＴＬを刺激する）ために、好ましくは前記被験体の疾患、障害、または感染を治療または予防するために、抗原分子または抗原分子の一部を細胞表面に発現するのに用いる、本明細書で定義される抗原分子、光感作性薬剤、チェックポイント阻害剤、および場合によってはＴＬＲリガンドを提供し、前記使用は、好ましくは樹状細胞などの細胞の集団を調製するための、本明細書で定義される方法を含む。これらの細胞は、その後、被験体に投与されてもよい。
【０１９５】
本発明は、本明細書で定義される方法において、被験体の免疫応答を刺激する（つまり、抗原分子または抗原分子の一部を細胞表面に発現させる、または抗原分子を細胞のサイトゾルへ内在化させる）のに、同時に、別々に、または順次用いるために、好ましくは被験体の疾患、障害、または感染を治療または予防するために、本明細書で定義される抗原分子、光感作性薬剤、チェックポイント阻害剤、および場合によってはＴＬＲリガンドを含む製品を、複合製剤としてさらに提供する。
【０１９６】
本発明は、また、例えば、本明細書で定義される方法において、予防接種または免疫化に用いるため、あるいは抗原分子または抗原分子の一部を細胞表面に発現させるか、または抗原分子を細胞のサイトゾルへ内在化させるため、好ましくは被験体の疾患、障害、または感染を治療または予防するための、被験体の免疫応答を刺激するのに用いるキットであって、該キットは、
本明細書で定義される光感作性薬剤を含む第１の容器と、
本明細書で定義される上記抗原分子を含む第２の容器と、
本明細書で定義されるチェックポイント阻害剤を含む第３の容器と、場合によっては
本明細書で定義されるＴＬＲリガンドを含む第４の容器と、
を含む、キットも提供する。
【０１９７】
本発明の製品およびキットを用いて、本明細書で定義される細胞表面提示（または治療法）が達成されてもよい。
【０１９８】
またさらなる実施形態において、本発明は、好ましくは被験体の疾患、障害、または感染を治療または予防するために、被験体の免疫応答を起こす（例えばＣＴＬを刺激する）方法を提供し、該方法は、本明細書で定義される方法にしたがって細胞集団を調製することと、それに続いて前記細胞を前記被験体に投与することと、を含む。
【０１９９】
本願発明によって達成される抗原提示は、有利には、処理された細胞がインビボで投与される場合に、免疫応答の刺激をもたらしてもよい。好ましくは、前記抗原分子または抗原分子の一部の含有体または包含体による次の攻撃に対する防御を付与する免疫応答が引き起こされ、その結果、本発明は、予防接種の方法としての特別な有用性を見出した。
【０２００】
疾患、障害、または感染は、免疫応答が引き起こされること、例えば、正常細胞からの区別（および除去）を可能にする抗原（または発現レベル）に基づいて認識され得る異常細胞または外部細胞を除去することによって、治療または予防され得る疾患、障害、または感染である。用いられる抗原分子の選択によって、治療される疾患、障害、または感染が決定される。上述した抗原分子に基づいて、本明細書で述べる方法、使用、組成物、製品、キットなどを用いて、例えば、感染（上述したウイルス感染または細菌感染など）、癌、または多発性硬化症などを治療または予防してもよい。このような疾患、障害、または感染の予防が、予防接種を構成してもよい。
【０２０１】
本明細書で定義される「治療」とは、治療中の疾患、障害、または感染の１つ以上の症状を、治療前の症状に比べて、低減、緩和、または除去することをいう。前記治療は、がんの治療の場合、腫瘍のサイズまたは体積を縮小させること、または、異常な細胞増殖を治療する場合、異常細胞の数を減少させることを含んでいてもよい。「予防」とは、疾患、障害、感染が発症するのを遅らせる、または防止することをいう。予防は、絶対的（疾患が全く発症しない）であってもよいし、一部の個人に対してのみ、または限られた期間においてのみ、有効なものであってもよい。
【０２０２】
インビボでの細胞の投与では、当該技術分野において一般的である、または標準的である、細胞集団の投与形態であれば、どのような形態を用いてもよく、例えば、注射または点滴が適切な経路で用いられる。好都合には、細胞は、リンパ内注射によって投与される。好ましくは、被検体１ｋｇあたり、１×１０4〜１×１０8個の細胞が投与される（例えば、ヒトでは１ｋｇあたり１．４×１０4〜２．８×１０6個）。このように、例えば、ヒトでは、１回の服用で、すなわち、例えば予防接種１回の服用量として１回あたり、０．１×１０7〜２０×１０7個の用量の細胞を投与してもよい。必要であれば、この用量を後で繰り返すこともできる。
【０２０３】
次に、本発明を、以下の限定されない実施例において、以下の図面を参照してより詳細に説明する。図面は以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１】図１は、チェックポイント阻害剤である抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−１を用いたＰＣＩの、ＨＰＶ誘導性癌に対するＴＣ−１マウスモデルにおける効果を示す。結果は、平均腫瘍体積を、接種時点における体積の％として示す。
【図２】図２は、ＴＲＰ−２ペプチドを用いた脾臓細胞（示したようなインビボにおける処理後にマウスから単離した）の再刺激後にＴＲＰ−２ペンタマーの染色を行った場合の中央値（ＣＤ８＋細胞全体のうちの抗原特異的ＣＤ４４＋細胞の％）を示す。
【図３】図３は、ＴＲＰ−２ペプチドを用いた脾臓細胞（示したようなインビボにおける処理後にマウスから単離した）の再刺激後にインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）の細胞内染色を行った結果を示す。
【図４】図４は、ＴＲＰ−２ペプチドを用いた脾臓細胞（示したようなインビボにおける処理後にマウスから単離した）の再刺激後にＴＮＦ−アルファの細胞内染色を行った結果を示す。
【図５】図５は、チェックポイント阻害剤である抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−１を（一緒に）用いたＰＣＩの、ＨＰＶ誘導性癌に対するＴＣ−１マウスモデルにおける効果を示す。結果は、腫瘍接種後の腫瘍体積の中央値を示す。
【図６】図６は、チェックポイント阻害剤である抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−１を（一緒に）用いたＰＣＩの、ＨＰＶ誘導性癌に対するＴＣ−１マウスモデルにおける効果を示す。結果は、腫瘍接種後の生存動物を示す。
【図７】図７は、チェックポイント阻害剤である抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−１を（一緒に）用いたＰＣＩにおいて、ポリ（ＩＣ）を併用した場合の、ＨＰＶ誘導性癌に対するＴＣ−１マウスモデルにおける効果を示す。結果は、腫瘍接種後の腫瘍体積の中央値を示す。
【図８】図８は、チェックポイント阻害剤である抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−１を（一緒に）用いたＰＣＩにおいて、ポリ（ＩＣ）を併用した場合の、ＨＰＶ誘導性癌に対するＴＣ−１マウスモデルにおける効果を示す。結果は、腫瘍接種後の生存動物を示す。
【図９】図９は、チェックポイント阻害剤である抗ＰＤ−１を用いたＰＣＩの、ＨＰＶ誘導性癌に対するＴＣ−１マウスモデルにおける効果を示す。結果は、腫瘍接種後の腫瘍体積の中央値を示す。
【図１０】図１０は、チェックポイント阻害剤である抗ＰＤ−１を用いたＰＣＩの、ＨＰＶ誘導性癌に対するＴＣ−１マウスモデルにおける効果を示す。結果は、腫瘍接種後の生存動物を示す。
【実施例】
【０２０５】
実施例
実施例１
本研究は、チェックポイント阻害剤である抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−１と組み合わせたＰＣＩの、ＨＰＶ誘導性癌に対するＴＣ−１マウスモデルにおける効果を調べるために行われた。
【０２０６】
材料および方法
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ハーラン社（Harlan）（ホルスト、オランダ）から購入した。全てのマウスは、特定病原体を除去した（ＳＰＦ）条件下で飼育され、行った手順は、スイス家畜当局によって承認された。
【０２０７】
腫瘍接種
０日目に、マウスの右脇腹の皮下へ、２００，０００個のＴＣ−１腫瘍細胞（ジョンズ・ホプキンス大学、３４００Ｎ．チャールズ・ストリート、バルティモア、ＭＤ２１２１８−２６９５より使用許諾を得た）を接種した。
【０２０８】
免疫化のプロトコール
さらなる処理スケジュールの概略を表３に示す。チェックポイント阻害剤である抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−１を、表３に示す時点において腹腔内注射によって投与した。チェックポイント阻害剤の用量は、抗ＣＴＬＡ４の場合は注射１回あたり１００μｇ、抗ＰＤ−１の場合は２００μｇであった。両方のチェックポイント阻害剤を、バイオＸセル社、１０テクノロジー・ドライブ、スイート２Ｂ、ウエスト・レバノン、ＮＨ０３７８４−１６７１、米国（ｍＡｂ抗ｍＣＴＬＡ−４、カタログ番号ＢＥ０１３１、およびｍＡｂ抗ｍＰＤ−１、カタログ番号ＢＥ０１４６）から入手した。
【０２０９】
【表３】
2018508533.tif 000028
【０２１０】
５０μｇのＨＰＶ長鎖ペプチド抗原ＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲ（ユナイテッド・ペプチド社（ハーンドン、ヴァージニア州）、２５μｇのＴＰＣＳ2a（アンフィネックス、ＰＣＩバイオテックＡＳ社）（ＰＣＩ法を行う動物用）、および５μｇの高分子量ポリイノシン酸−ポリシチジン酸（ポリ（ＩＣ））（インビボジェン社（サンディエゴ、米国））の異なる組み合わせの混合物を皮下投与することによって、各免疫化を行った。異なる実験群における組み合わせを、下記表４に示す。
【０２１１】
【表４】
2018508533.tif 000029
【０２１２】
各免疫化の１８時間後に、ルミソース照明装置（ＰＣＩバイオテックＡＳ社）を用いて６分間の照射を行った。
１週間に２回または３回、直交する２本の直径を、デジタルノギスを用いて測定することによって、腫瘍のサイズを測定した。下記式を用いて、腫瘍の体積を計算した。
Ｖ＝（Ｗ2×Ｌ）／２
ここで、Ｗは、測定した腫瘍の幅であり、Ｌは、その長径である。
【０２１３】
図１に結果を示す。図１は、チェックポイント阻害剤をポリ（ＩＣ）、ＨＰＶと共に投与してＰＣＩを行った群において、腫瘍の体積が減少したことを示す。
【０２１４】
実施例２
材料および方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＴＰＣＳ2a、およびポリ（ＩＣ）は、実施例１と同様である。ＴＲＰ−２ペプチド（配列はＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）を、ユナイテッド・ペプチド社（ハーンドン、ヴァージニア州）から入手した。
【０２１５】
正常マウスの皮内光増感および免疫化
マウスの腹部領域（３〜４ｃｍ2）の体毛を剃り、０日目、１４日目、および３５日目に、３０Ｇ注射針を付けた０．３ｍｌのＢＤミクロファイン（Micro-Fine）（登録商標）＋インスリンシリンジ（ＢＤ社、ニュージャージー州、米国）を用いて、以下に詳述する通り、２００μｇのＴＲＰ−２ペプチド、１００μｇのＴＰＣＳ2a、および１０μｇの高分子量ポリ（ＩＣ）で免疫化を行った。ワクチンは、遮光状態を保ち、調製後６０分以内に用いた。ワクチンは、腹部の中心線の左右両側に、各５０μｌを１回ずつ計２回注射した。ワクチン注射後の特定の時点において、ゾレチル（Zoletil）混合物（体重１ｋｇあたり１０ｍｇ、ビルバック社（Virbac）、ノルウェー）を皮下注射することによって、マウスの麻酔を行い、関連する箇所に照射を行った。実験群の一部（下記参照）においては、各免疫化の直前に、抗ＣＴＬＡ４（３ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）を投与した。
【０２１６】
免疫化マウスに対する照射
免疫化してから１８時間後に、ルミソース（ＰＣＩバイオテック社）を用いて、ワクチン接種箇所に対する照射を６分間行った。
【０２１７】
ペンタマー染色および細胞内染色による免疫応答の解析
１回目の免疫化から６０日後に、動物を殺処分して脾臓を取り出し、ＴＲＰ−２ペプチドを用いて脾臓細胞を再刺激した後、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）に対する細胞内染色によって解析を行った。２４穴プレート中、３７℃で、ＴＲＰ−２ペプチドによる脾細胞の刺激を一晩行った後、ＩＦＮ−γに対する細胞内染色を行った。最後の４時間の間に、ブレフェルディンＡ（Brefelding A）を添加した。その後、細胞を洗浄し、４％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳを用いて、氷上で１０分間、固定を行った。抗ＣＤ１６／３２を添加して、Ｆｃ受容体への非特異的な結合を防止した。その後、０．１％のＮＰ４０を含むＰＢＳを用いて、透過処理を３分間行い、洗浄後、抗ＩＦＮ−γ抗体、抗ＣＤ８抗体、および抗ＣＤ４４抗体（ｅバイオサイエンス社（eBioscience）またはＢＤファーミンジェン社（BD Pharmingen））を用いて染色した。ＦＡＣＳカント（FACSCanto）（ＢＤバイオサイエンス社（BD Biosciences）、サンノゼ、米国）を用いて細胞を取得し、ＦｌｏｗＪｏ８．５．２ソフトウェア（ツリー・スター社（Tree Star, Inc.）、アシュランド、オレゴン州）を用いて解析を行った。腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）に対する細胞内染色は、ＩＦＮ−ガンマについて述べたのと同様に、抗ＴＮＦ−アルファ抗体を用いて行った。
【０２１８】
実験群は以下の通りである。
１．未処理：マウスの免疫化または照射を行わなかった。
２．ＴＲＰ−２：全ての免疫化において、ＴＲＰ−２ペプチドを用いてマウスの免疫化を行った。照射は行わなかった。
３．ＴＲＰ−２＋ポリ（ＩＣ）：ＴＲＰ−２ペプチドおよび１０μｇのポリ（ＩＣ）を用いてマウスの免疫化を行った。照射は行わなかった。
４．ＴＲＰ−２＋ＰＣＩ：ＴＲＰ−２ペプチドおよび１００μｇのＴＰＣＳ2aを用いてマウスの免疫化を行い、照射を行った。
５．ＴＲＰ−２＋ポリ（ＩＣ）＋ＰＣＩ：ＴＲＰ−２ペプチド、１０μｇのポリ（ＩＣ）、および１００μｇのＴＰＣＳ2aを用いてマウスの免疫化を行い、照射を行った。
６．ＴＲＰ−２＋ポリ（ＩＣ）＋ＰＣＩ＋抗ＣＴＬＡ４：ＴＲＰ−２ペプチド、１０μｇのポリ（ＩＣ）、および１００μｇのＴＰＣＳ2aを用いてマウスの免疫化を行った。各免疫化の直前に、抗ＣＴＬＡ４（３ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）を投与した。動物に対して照射を行った。
７．ＴＲＰ−２＋ポリ（ＩＣ）＋抗ＣＴＬＡ４：ＴＲＰ−２ペプチドおよび１０μｇのポリ（ＩＣ）を用いてマウスの免疫化を行った。各免疫化の直前に、抗ＣＴＬＡ４（３ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）を投与した。動物に対して照射を行わなかった。
【０２１９】
図２は、ＴＲＰ−２ペプチドを用いた脾臓細胞の再刺激後にＴＲＰ−２ペンタマーの染色を行った場合の中央値（ＣＤ８＋細胞全体のうちの抗原特異的ＣＤ４４＋細胞の％）を示す。ＴＲＰ−２抗原をポリ（ＩＣ）のみと用いた場合（３群）、またはＴＲＰ−２抗原のみを用いてＰＣＩを行った場合（４群）では、抗原のみを用いた場合（２群）よりも、有意だが少量の抗原特異的な細胞の増加が観察されたことがわかる。ＴＲＰ−２ペプチド＋ポリ（ＩＣ）の組み合わせ（７群）に抗ＣＴＬＡ４を添加しても、ＴＲＰ−２ペプチド＋ポリ（ＩＣ）の場合に見られた応答よりも、応答が増強されることはなかったように見える。ＴＲＰ−２ペプチド＋ポリ（ＩＣ）にＰＣＩを組み合わせると（５群）、免疫応答は明らかに増強され、この組み合わせに抗ＣＴＬＡ４を添加すると、応答はさらに２倍よりも高く増強された。このことは、この実験系において、抗原特異的ＣＤ８＋，ＣＤ４４＋Ｔ細胞の増殖に対してＰＣＩおよび抗ＣＴＬＡ４の相乗効果があることを示す。
【０２２０】
図３は、ＴＲＰ−２ペプチドを用いた脾臓細胞の再刺激後にインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）の細胞内染色を行った結果を示す。このマーカーの場合、抗ＣＴＬＡ４をＰＣＩおよびポリ（ＩＣ）と組み合わせても、ＰＣＩ＋ポリ（ＩＣ）の場合に見られたマーカーの発現よりも、マーカーの発現が上昇することはなかったように見える。
【０２２１】
図４は、ＴＲＰ−２ペプチドを用いた脾臓細胞の再刺激後にＴＮＦ−アルファの細胞内染色を行った結果を示す。図２に示す結果によると、ＴＲＰ−２ペプチド＋ポリ（ＩＣ）の組み合わせ（７群）に抗ＣＴＬＡ４を添加しても、ＴＲＰ−２ペプチド＋ポリ（ＩＣ）の場合（３群）に見られた応答よりも、応答が増強されることはなかったように見えることがわかる。しかしながら、ＴＲＰ−２ペプチド＋ポリ（ＩＣ）の組み合わせに抗ＣＴＬＡ４を添加すると、ＴＮＦ−アルファの発現応答が有意に上昇した。このことは、この実験系において、ＣＤ８＋，ＣＤ４４＋Ｔ細胞における抗原誘導性のＴＮＦ−アルファの発現に対して、ＰＣＩおよび抗ＣＴＬＡ４の相乗効果があることを示す。
【０２２２】
実施例３
本研究は、チェックポイント阻害剤である抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−１（一緒に用いる）と組み合わせたＰＣＩ予防接種の、ＨＰＶ誘導性癌に対するＴＣ−１マウスモデルにおける効果を調べるために行われた。
【０２２３】
材料および方法
マウスは、実施例１と同様である。０日目に、マウスの右脇腹の皮下へ、１００，０００個のＴＣ−１腫瘍細胞（ジョンズ・ホプキンス大学、３４００Ｎ．チャールズ・ストリート、バルティモア、ＭＤ２１２１８−２６９５より使用許諾を得た）を接種した。チェックポイント阻害剤である抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−１、光感作性薬剤であるＴＰＣＳ2a、およびＨＰＶ長鎖ペプチド抗原は、実施例１と同様である。
【０２２４】
免疫化プロトコール
処理スケジュールの概略を表５に示す。
【表５】
2018508533.tif 000030
【０２２５】
各免疫化の１８時間後に、ＰＣＩ処理した動物に対して照射を行った。照射は、ルミソース照明装置（ＰＣＩバイオテックＡＳ社）を用いて６分間行った。チェックポイント阻害剤である抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−１を、表５に示す時点において、腹腔内注射によって一緒に投与した。注射１回あたりのチェックポイント阻害剤の用量は、抗ＣＴＬＡ４の場合は１００μｇ、抗ＰＤ−１の場合は２００μｇであった。１週間に２回または３回、直交する２本の直径を、デジタルノギスを用いて測定することによって、腫瘍のサイズを測定した。実施例１と同様に、腫瘍の体積を計算した。
【０２２６】
異なる実験群で用いた組み合わせを、表６に示す。
【表６】
2018508533.tif 000031
【０２２７】
結果を図５に示す。この結果から、チェックポイント阻害剤である抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−１を、腫瘍が発現するＨＰＶ長鎖ペプチド抗原を組み合わせた場合であっても、これらの阻害剤を組み合わせた投与は、腫瘍の増殖に対してあまり効果がないことが分かる。しかしながら、チェックポイント阻害剤を用いる処理計画にＰＣＩを加えた場合は、腫瘍の増殖に対する有意な阻害が観察された。このように、最初のＰＣＩ処理から約１週間後に、明らかな腫瘍の縮小が開始しており、このことは、ＰＣＩに誘導された免疫媒介性抗腫瘍効果を示している。また、図６からわかるように、ＰＣＩの効果によって、動物の生存が改善した。
【０２２８】
実施例４
本研究は、チェックポイント阻害剤である抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−１（一緒に用いる）ならびにＴＬＲリガンドであるポリ（ＩＣ）と組み合わせたＰＣＩ予防接種の、ＨＰＶ誘導性癌に対するＴＣ−１マウスモデルにおける効果を調べるために行われた。
【０２２９】
材料および方法
実施例３と同様に、ＴＣ−１腫瘍細胞をマウスに接種した。チェックポイント阻害剤である抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−１、光感作性薬剤であるＴＰＣＳ2a、ＨＰＶ長鎖ペプチド抗原、およびポリ（ＩＣ）は、実施例１と同様である。
【０２３０】
免疫化プロトコール
処理スケジュールの概略を表７に示す。
【表７】
2018508533.tif 000032
【０２３１】
５０μｇのＨＰＶ長鎖ペプチド抗原、２５μｇのＴＰＣＳ2a（ＰＣＩ処理を行う動物用）、および５μｇのポリ（ＩＣ）の異なる組み合わせからなる混合物を皮下投与することによって、各免疫化を行った。各免疫化の１８時間後に、ＰＣＩ処理した動物に対して照射を行った。照射は、ルミソース照明装置（ＰＣＩバイオテックＡＳ社）を用いて６分間行った。チェックポイント阻害剤である抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−１を、表７に示す時点において、腹腔内注射によって一緒に投与した。注射１回あたりのチェックポイント阻害剤の用量は、抗ＣＴＬＡ４の場合は１００μｇ、抗ＰＤ−１の場合は２００μｇであった。実施例１と同様に、腫瘍のサイズを測定した。
【０２３２】
異なる実験群で用いた組み合わせを、表８に示す。
【表８】
2018508533.tif 000033
【０２３３】
結果を図７に示す。この結果から、チェックポイント阻害剤である抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−１の組み合わせに加えて、ＴＬＲ３のリガンドであるポリ（ＩＣ）を投与すると、腫瘍の増殖に対して有意な阻害効果があるということがわかる。この処理にＰＣＩを加えると、腫瘍体積の中央値が、実験開始時のサイズを下回るサイズまで縮小し、この縮小が少なくとも２週間持続するという、強力に増強された抗腫瘍効果が観察された。また、図８からわかるように、ＰＣＩの効果によって、動物の生存が強力に改善した。
【０２３４】
実施例５
本研究は、チェックポイント阻害剤である抗ＰＤ−１と組み合わせたＰＣＩ予防接種の、ＨＰＶ誘導性癌に対するＴＣ−１マウスモデルにおける効果を調べるために行われた。
【０２３５】
材料および方法
実施例３と同様に、ＴＣ−１腫瘍細胞をマウスに接種した。チェックポイント阻害剤である抗ＰＤ−１、光感作性薬剤であるＴＰＣＳ2a、およびＨＰＶ長鎖ペプチド抗原は、実施例１と同様である。
【０２３６】
免疫化プロトコール
処理スケジュールの概略を表９に示す。
【表９】
2018508533.tif 000034
【０２３７】
５０μｇのＨＰＶ長鎖ペプチド抗原および２５μｇのＴＰＣＳ2a（ＰＣＩ処理を行う動物用）異なる組み合わせからなる混合物を皮下投与することによって、各免疫化を行った。各免疫化の１８時間後に、ＰＣＩ処理した動物に対して照射を行った。照射は、ルミソース照明装置（ＰＣＩバイオテックＡＳ社）を用いて６分間行った。表９に示す時点において、腹腔内注射によって、チェックポイント阻害剤である抗ＰＤ−１を２００μｇ投与した。実施例１と同様に、腫瘍のサイズを測定した。
【０２３８】
異なる実験群で用いた組み合わせを、表１０に示す。
【表１０】
2018508533.tif 000035
【０２３９】
結果を図９に示す。この結果から、チェックポイント阻害剤である抗ＰＤ−１を、ＨＰＶペプチド抗原と一緒に投与すると、腫瘍の増殖に対して少し阻害効果があるということがわかる。しかしながら、この処理計画にＰＣＩを加えた場合は、腫瘍の増殖阻害について、有意な上昇が観察された。このように、チェックポイント（＋抗原）のみの場合には見られなかった、明らかな腫瘍の縮小が観察された。また、図１０からわかるように、ＰＣＩの効果によって、動物の生存が改善した。
【図１】
2018508533.tif 000036
【図２】
2018508533.tif 000037
【図３】
2018508533.tif 000038
【図４】
2018508533.tif 000039
【図５】
2018508533.tif 000040
【図６】
2018508533.tif 000041
【図７】
2018508533.tif 000042
【図８】
2018508533.tif 000043
【図９】
2018508533.tif 000044
【図１０】
2018508533.tif 000045
【配列表】
2018508533000001.app
【国際調査報告】
2018508533.tif 000046
2018508533.tif 000047
2018508533.tif 000048