(57)【要約】本明細書で提供されるものは、ペプチドリンカーまたはジスルフィド架橋によって第２のＶＥＧＦモノマーに連結した第１のＶＥＧＦモノマーを含む、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド及びＦｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド融合体である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、式：Ａ−Ｌ−Ｂを含み、式中、Ａは、第１のＶＥＧＦモノマーサブユニットであり、Ｂは、第２のＶＥＧＦモノマーサブユニットであり、Ｌは、１４〜２０アミノ酸を有するペプチドリンカーである。ある特定の実施形態にて、本明細書で開示されるものは、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドまたはＦｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド融合体を個体に投与することを含む、それを必要とする個体における血管新生障害の処理方法である。ある特定の実施形態にて、本明細書で開示されるものは、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドまたはＦｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含むキットである。
2018507181.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ａ−Ｌ−Ｂを含むＶＥＧＦ変異体ポリペプチドであって、
式中、
Ａは、第１のＶＥＧＦモノマーサブユニットであり、
Ｂは、第２のＶＥＧＦモノマーサブユニットであり、並びに、
Ｌは、（ＧＳ）n （ｎは、６〜１５の整数である）、（Ｇ２Ｓ）n （ｎは、４〜１０の整数である）、（Ｇ３Ｓ）n （ｎは、３〜８の整数である）、（Ｇ４Ｓ）n （ｎは、２〜６の整数である）、（Ｇ）n （ｎは、１２〜３０の整数である）、及び（Ｓ）n （ｎは、１２〜３０の整数である）から選択される式を有するペプチドリンカーである
ことを特徴とするＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項２】
式Ａ−Ｌ1 −Ｂ−（Ｌ2 −Ａ−Ｌ1 −Ｂ）n −Ｌ2 −Ａ−Ｌ1 −Ｂを含み、
式中、
Ａは、第１のＶＥＧＦモノマーサブユニットであり、
Ｂは、第２のＶＥＧＦモノマーサブユニットであり、
Ｌ1 は、１４〜２０アミノ酸を有するペプチドリンカーであり、
Ｌ2 は、ペプチドリンカーであり、及び、
ｎは、０〜４の整数である
ことを特徴とする請求項１に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項３】
Ｌ1 は、（ＧＳ）n （ｎは、６〜１５の整数である）、（Ｇ2 Ｓ）n （ｎは、４〜１０の整数である）、（Ｇ3Ｓ）n （ｎは、３〜８の整数である）、（Ｇ4Ｓ）n （ｎは、２〜６の整数である）、（Ｇ）n （ｎは、１２〜３０の整数である）、及び（Ｓ）n （ｎは、１２〜３０の整数である）から選択される式を有するペプチドリンカーである
ことを特徴とする請求項２に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項４】
ＬまたはＬ1 は、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧＧＧＧＧＳ（配列番号４２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号４３）、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４４）からなる群から選択される
ことを特徴とする請求項１または２に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項５】
Ｌ2 は、（ＧＳ）n （ｎ＝１０〜３０）、（Ｇ2Ｓ）n （ｎ＝６〜２０）、（Ｇ3Ｓ）n （ｎ＝５〜１５）、（Ｇ4Ｓ）n （ｎ＝４〜１２）、（Ｇ）n （ｎ＝２０〜６０）、及び（Ｓ）n （ｎ＝２０〜６０）からなる群から選択される
ことを特徴とする請求項２または３に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項６】
前記ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、二官能性アンタゴニストである
ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項７】
前記ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ、インテグリン、またはそれらの組み合わせに拮抗する
ことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項８】
前記ＶＥＧＦＲは、ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ２である
ことを特徴とする請求項７に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項９】
前記インテグリンは、αv β3 、αv β5 、またはα5 β1 インテグリン、またはそれらの任意の組み合わせである
ことを特徴とする請求項７に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項１０】
前記ＶＥＧＦモノマーサブユニットの少なくとも１つは、ＶＥＧＦ−Ａモノマーである
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項１１】
前記ＶＥＧＦ−Ａモノマーは、ＶＥＧＦ165 、ＶＥＧＦ165b、ＶＥＧＦ121 、ＶＥＧＦ145 、ＶＥＧＦ189 、ＶＥＧＦ206 の１つである
ことを特徴とする請求項１０に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項１２】
前記ＶＥＧＦモノマーサブユニットの少なくとも１つは、ＶＥＧＦ−Ｂサブユニット、ＶＥＧＦ−Ｃサブユニット、ＶＥＧＦ−Ｄサブユニット、ＰＩＧＦである
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項１３】
前記第１のＶＥＧＦモノマーサブユニット及び前記第２のＶＥＧＦモノマーサブユニットは、互いに独立して、ＶＥＧＦ−Ａモノマーである
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項１４】
１つのＶＥＧＦモノマーサブユニットは、Ｖ１４Ａ、Ｖ１４Ｉ、Ｖ１５Ａ、Ｋ１６Ｒ、Ｆ１７Ｌ、Ｍ１８Ｒ、Ｄ１９Ｇ、Ｑ２２Ｒ、Ｒ２３Ｋ、Ｉ２９Ｖ、Ｌ３２Ｓ、Ｉ３５Ｖ、Ｆ３６Ｌ、Ｆ３６Ｓ、Ｄ４１Ｎ、Ｅ４２Ｋ、Ｅ４４Ｇ、Ｙ４５Ｈ、Ｆ４７Ｓ、Ｋ４８Ｅ、Ｐ４９Ｌ、Ｓ５０Ｐ、Ｐ５３Ｓ、Ｇ５８Ｓ、Ｃ６０Ｙ、Ｄ６３Ｈ、Ｄ６３Ｎ、Ｄ６３Ｇ、Ｉ７６Ｔ、Ｍ７８Ｖ、Ｍ８１Ｔ、Ｍ８１Ｖ、Ｒ８２Ｇ、Ｈ８６Ｙ、Ｑ８７Ｒ、Ｑ８９Ｈ、Ｈ９０Ｒ、Ｉ９１Ｔ、Ｉ９１Ｖ、Ｎ１００Ｄ、及びＫ１０１Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む
ことを特徴とする請求項１３に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項１５】
１つのＶＥＧＦモノマーサブユニットは、Ｆ３６Ｌ、Ｅ４４Ｇ、Ｄ６３Ｇ、及びＱ８７Ｒからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む
ことを特徴とする請求項１４に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項１６】
１つのＶＥＧＦモノマーサブユニットは、Ｆ３６Ｌ、Ｅ４４Ｇ、及びＱ８７Ｒからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む
ことを特徴とする請求項１４に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項１７】
１つのＶＥＧＦモノマーサブユニットは、Ｖ１４Ａ、Ｖ１４Ｉ、Ｖ１５Ａ、Ｋ１６Ｒ、Ｆ１７Ｌ、Ｍ１８Ｒ、Ｄ１９Ｇ、Ｑ２２Ｒ、Ｒ２３Ｋ、Ｉ２９Ｖ、Ｌ３２Ｓ、Ｉ３５Ｖ、Ｆ３６Ｌ、Ｆ３６Ｓ、Ｄ４１Ｎ、Ｅ４２Ｋ、Ｅ４４Ｇ、Ｙ４５Ｈ、Ｆ４７Ｓ、Ｋ４８Ｅ、Ｐ４９Ｌ、Ｓ５０Ｐ、Ｐ５３Ｓ、Ｇ５８Ｓ、Ｃ６０Ｙ、Ｄ６３Ｈ、Ｄ６３Ｎ、Ｄ６３Ｇ、Ｉ７６Ｔ、Ｍ７８Ｖ、Ｍ８１Ｔ、Ｍ８１Ｖ、Ｒ８２Ｇ、Ｈ８６Ｙ、Ｑ８７Ｒ、Ｑ８９Ｈ、Ｈ９０Ｒ、Ｉ９１Ｔ、Ｉ９１Ｖ、Ｎ１００Ｄ、及びＫ１０１Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む
ことを特徴とする請求項１４に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項１８】
前記ＶＥＧＦモノマーサブユニットは、Ｋ１６Ｒ、Ｄ４１Ｎ、及びＤ６３Ｎからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む
ことを特徴とする請求項１４に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項１９】
前記ＶＥＧＦモノマーサブユニットは、Ｄ６３Ｎ突然変異を含む
ことを特徴とする請求項１４に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項２０】
前記第１もしくは第２の、または両方のＶＥＧＦモノマーサブユニットは、ＲＧＤループを含む
ことを特徴とする請求項１〜１９のいずれか１項に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項２１】
前記ＲＧＤループは、配列番号１〜４０、６６〜７２からなる群から選択される配列に少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一である
ことを特徴とする請求項２０に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項２２】
前記ＲＧＤループを、前記第１または前記第２のＶＥＧＦモノマーサブユニットのループ１、ループ２、またはループ３、またはそれらの任意の組み合わせに置き換える
ことを特徴とする請求項２０または２１に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項２３】
ｍＥ７Ｉ（配列番号７５）、ｍＡ７Ｉ（配列番号７６）、ｍＪ７Ｉ（配列番号７７）、またはｍＥ７Ｉ−Ｒ１ｎｕｌｌ（配列番号７８）の配列に少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一である
ことを特徴とする請求項１または２に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項２４】
毒素をさらに含む
ことを特徴とする請求項１〜２３のいずれか１項に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項２５】
（ａ）Ｆ３６Ｌ、Ｅ４４Ｇ、及びＱ８７Ｒの突然変異を有する第１のＶＥＧＦ−Ａモノマーサブユニット、
（ｂ）Ｄ６３Ｎの突然変異を有する第２のＶＥＧＦ−Ａモノマーサブユニット、並びに、
（ｃ）前記第１及び前記第２のＶＥＧＦ−Ａモノマーサブユニットを連結するペプチドリンカーまたはジスルフィド架橋
を含む
ことを特徴とするＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項２６】
ＬまたはＬ1 は、約１４〜２０の長さのアミノ酸である
ことを特徴とする請求項１〜２５のいずれか１項に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項２７】
ＬまたはＬ1 は、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号４１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４４）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧＧＧＧＧＳ（配列番号４２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号４３）に少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％同一な配列を有する
ことを特徴とする請求項２６に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項２８】
Ｌ2 は、（ＧＳ）n （ｎ＝１０〜３０）、（Ｇ2 Ｓ）n （ｎ＝６〜２０）、（Ｇ3Ｓ）n （ｎ＝５〜１５）、（Ｇ4Ｓ）n （ｎ＝４〜１２）、（Ｇ）n （ｎ＝２０〜６０）、及び（Ｓ）n （ｎ＝２０〜６０）からなる群から選択される
ことを特徴とする請求項２〜２７のいずれか１項に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の変異体ポリペプチドが、免疫グロブリンＦｃ領域に融合している
ことを特徴とするＦｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド融合体。
【請求項３０】
それを必要とする個体における血管新生障害の処理方法であって、
請求項１〜２８のいずれか１項に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド、または請求項２９に記載のＦｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド融合体を前記個体に投与することを含む
ことを特徴とする方法。
【請求項３１】
前記血管新生障害は、翼状片である
ことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記血管新生障害は、眼の血管新生、脈絡膜新生血管、虹彩血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、瞼裂斑、パンヌス、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜剥離、後部ぶどう膜炎、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、例えば、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、特に滲出型黄斑変性症、ケロイド、緑内障、白内障、部分的失明、完全な失明、近視、近視性変性、中心視力の劣化、変視症、色覚障害、血管の出血、またはそれらの組み合わせである
ことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記血管新生障害は、癌である
ことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記癌は、前立腺癌、乳癌、肺癌、食道癌、大腸癌、直腸癌、肝癌、尿路癌（例えば、膀胱癌）、腎臓癌、肺癌（例えば、非小細胞性肺癌）、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、膵癌、胃癌、甲状腺癌、皮膚癌（例えば、黒色腫）、リンパ系または骨髄系統の造血癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、神経膠芽腫、奇形癌、神経芽細胞腫、腺癌、間葉起源の癌、例えば、線維肉腫、または横紋筋肉腫、軟部組織肉腫及び癌腫、絨毛膜癌腫、肝芽腫、カポシ肉腫、またはウィルムス腫瘍である
ことを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記血管新生障害は、炎症性疾患である
ことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記炎症性疾患は、炎症性関節炎、変形性関節症、乾癬、慢性炎症、過敏性腸疾患、肺の炎症、または喘息である
ことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記血管新生障害は、自己免疫疾患である
ことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、または全身性エリテマトーデスである
ことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記血管新生障害は、アテローム性動脈硬化症、水晶体後線維増殖症、甲状腺過形成（グレーブス病を含む）、ネフローゼ症候群、プレクラムパシア、腹水、心嚢液貯留（心膜炎に関連するものなど）、及び胸水である
ことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
それを必要とする対象の角膜及び眼球結膜を含む、眼の外表面の血管新生によって特徴付けられる障害を非外科的に処理する方法であって、
請求項１〜２９のいずれか１項に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチドまたはＦｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド融合体の組成物を含む医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む
ことを特徴とする方法。
【請求項４１】
それを必要とする対象の角膜及び眼球結膜を含む、眼の外表面の血管新生の再発を予防する方法であって、
請求項１〜２９のいずれか１項に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチドまたはＦｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド融合体の組成物を含む医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む
ことを特徴とする方法。
【請求項４２】
前記医薬組成物は、眼科的に許容される溶液、ゲル、クリーム、または軟膏として処方される
ことを特徴とする請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記眼の外表面の血管新生によって特徴付けられた障害が、翼状片である
ことを特徴とする請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４４】
検出可能な部分をさらに含む
ことを特徴とする請求項１〜２９のいずれか１項に記載のＶＥＧＦ変異体ポリペプチドまたはＦｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド融合体の組成物。
【請求項４５】
組織を画像化する方法であって、
組織を請求項４４に記載の組成物と接触させることを含む
ことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００１】
本明細書で開示されるものは、ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーまたはジスルフィド架橋によって第２のＶＥＧＦモノマーに連結した第１のＶＥＧＦモノマーを含む、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、式：Ａ−Ｌ−Ｂを含み、
式中、
Ａは、第１のＶＥＧＦモノマーサブユニットであり、
Ｂは、第２のＶＥＧＦモノマーサブユニットであり、及び、
Ｌは、１４〜２０アミノ酸を有するペプチドリンカーである。
いくつかの実施形態では、Ｌは、（ＧＳ）n （ｎは、６〜１５の整数である）、（Ｇ２Ｓ）n （ｎは、４〜１０の整数である）、（Ｇ３Ｓ）n （ｎは、３〜８の整数である）、（Ｇ４Ｓ）n （ｎは、２〜６の整数である）、（Ｇ）n （ｎは、１２〜３０の整数である）、及び（Ｓ）n （ｎは、１２〜３０の整数である）から選択される式を有するペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、Ｌは、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧＧＧＧＧＳ（配列番号４２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号４３）、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４４）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、式：Ａ−Ｌ1 −Ｂ−（Ｌ2 −Ａ−Ｌ1 −Ｂ）n −Ｌ2 −Ａ−Ｌ1 −Ｂを含み、
式中、
Ａは、第１のＶＥＧＦモノマーサブユニットであり、
Ｂは、第２のＶＥＧＦモノマーサブユニットであり、
Ｌ1 は、１４〜２０アミノ酸を有するペプチドリンカーであり、
Ｌ2 は、ペプチドリンカーであり、及び、
ｎは、０〜４の整数である。
いくつかの実施形態では、Ｌ1 は、（ＧＳ）n （ｎは、６〜１５の整数である）、（Ｇ2Ｓ）n （ｎは、４〜１０の整数である）、（Ｇ3Ｓ）n （ｎは、３〜８の整数である）、（Ｇ4Ｓ）n （ｎは、２〜６の整数である）、（Ｇ）n （ｎは、１２〜３０の整数である）、及び（Ｓ）n （ｎは、１２〜３０の整数である）から選択される式を有するペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、Ｌ1 は、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧＧＧＧＧＳ（配列番号４２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号４３）、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４４）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｌ2 は、（ＧＳ）n （ｎ＝１０〜３０）、（Ｇ2Ｓ）n （ｎ＝６〜２０）、（Ｇ3Ｓ）n （ｎ＝５〜１５）、（Ｇ4Ｓ）n （ｎ＝４〜１２）、（Ｇ）n （ｎ＝２０〜６０）、及び（Ｓ）n （ｎ＝２０〜６０）からなる群から選択される。
【０００２】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、二官能性アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ、インテグリン、またはそれらの組み合わせに拮抗する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲは、ＶＥＧＦＲ１である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲは、ＶＥＧＦＲ２である。いくつかの実施形態では、インテグリンは、αv β3 、αv β5 、またはα5 β1 インテグリン、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦモノマーサブユニットの少なくとも１つは、ＶＥＧＦ−Ａモノマーである。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ−Ａモノマーは、ＶＥＧＦ165 である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ−Ａモノマーは、ＶＥＧＦ165bである。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ−Ａモノマーは、ＶＥＧＦ121 である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ−Ａモノマーは、ＶＥＧＦ145 である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ−Ａモノマーは、ＶＥＧＦ189 である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ−Ａモノマーは、ＶＥＧＦ206 である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦモノマーサブユニットの少なくとも１つは、ＶＥＧＦ−Ｂサブユニットである。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦモノマーサブユニットの少なくとも１つは、ＶＥＧＦ−Ｃサブユニットである。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦモノマーサブユニットの少なくとも１つは、ＶＥＧＦ−Ｄサブユニットである。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦモノマーサブユニットの少なくとも１つは、ＰＩＧＦである。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦモノマーサブユニット及び第２のＶＥＧＦモノマーサブユニットは、互いに独立して、ＶＥＧＦ−Ａモノマーである。
【０００３】
いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦモノマーサブユニットは、Ｖ１４Ａ、Ｖ１４Ｉ、Ｖ１５Ａ、Ｋ１６Ｒ、Ｆ１７Ｌ、Ｍ１８Ｒ、Ｄ１９Ｇ、Ｑ２２Ｒ、Ｒ２３Ｋ、Ｉ２９Ｖ、Ｌ３２Ｓ、Ｉ３５Ｖ、Ｆ３６Ｌ、Ｆ３６Ｓ、Ｄ４１Ｎ、Ｅ４２Ｋ、Ｅ４４Ｇ、Ｙ４５Ｈ、Ｆ４７Ｓ、Ｋ４８Ｅ、Ｐ４９Ｌ、Ｓ５０Ｐ、Ｐ５３Ｓ、Ｇ５８Ｓ、Ｃ６０Ｙ、Ｄ６３Ｈ、Ｄ６３Ｎ、Ｄ６３Ｇ、Ｉ７６Ｔ、Ｍ７８Ｖ、Ｍ８１Ｔ、Ｍ８１Ｖ、Ｒ８２Ｇ、Ｈ８６Ｙ、Ｑ８７Ｒ、Ｑ８９Ｈ、Ｈ９０Ｒ、Ｉ９１Ｔ、Ｉ９１Ｖ、Ｎ１００Ｄ、及びＫ１０１Ｅからなる群から選択される突然変異を含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦモノマーサブユニットは、Ｆ３６Ｌ、Ｅ４４Ｇ、Ｄ６３Ｇ、及びＱ８７Ｒからなる群から選択される突然変異を含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦモノマーサブユニットは、Ｆ３６Ｌ、Ｅ４４Ｇ、及びＱ８７Ｒからなる群から選択される突然変異を含む。いくつかの実施形態では、第２のＶＥＧＦモノマーサブユニットは、Ｖ１４Ａ、Ｖ１４Ｉ、Ｖ１５Ａ、Ｋ１６Ｒ、Ｆ１７Ｌ、Ｍ１８Ｒ、Ｄ１９Ｇ、Ｑ２２Ｒ、Ｒ２３Ｋ、Ｉ２９Ｖ、Ｌ３２Ｓ、Ｉ３５Ｖ、Ｆ３６Ｌ、Ｆ３６Ｓ、Ｄ４１Ｎ、Ｅ４２Ｋ、Ｅ４４Ｇ、Ｙ４５Ｈ、Ｆ４７Ｓ、Ｋ４８Ｅ、Ｐ４９Ｌ、Ｓ５０Ｐ、Ｐ５３Ｓ、Ｇ５８Ｓ、Ｃ６０Ｙ、Ｄ６３Ｈ、Ｄ６３Ｎ、Ｄ６３Ｇ、Ｉ７６Ｔ、Ｍ７８Ｖ、Ｍ８１Ｔ、Ｍ８１Ｖ、Ｒ８２Ｇ、Ｈ８６Ｙ、Ｑ８７Ｒ、Ｑ８９Ｈ、Ｈ９０Ｒ、Ｉ９１Ｔ、Ｉ９１Ｖ、Ｎ１００Ｄ、及びＫ１０１Ｅからなる群から選択される突然変異を含む。当業者であれば、ＶＥＧＦモノマーに対する「第１」及び「第２」を通じた呼称は、任意の区別であり、いずれの鎖が「第１」または「第２」であってもよいことが理解されるであろう。
【０００４】
いくつかの実施形態では、第２のＶＥＧＦモノマーサブユニットは、Ｋ１６Ｒ、Ｄ４１Ｎ、及びＤ６３Ｎからなる群から選択される突然変異を含む。いくつかの実施形態では、第２のＶＥＧＦモノマーサブユニットは、Ｄ６３Ｎからなる群から選択される突然変異を含む。
【０００５】
いくつかの実施形態では、第１もしくは第２の、または両方のＶＥＧＦモノマーサブユニットは、ＲＧＤループを含む。いくつかの実施形態では、ＲＧＤループは、配列番号１〜４０、６６〜７２からなる群から選択される配列に少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、ＲＧＤループを、第１または第２のＶＥＧＦモノマーサブユニットのループ１、ループ２、またはループ３、またはそれらの任意の組み合わせに置き換える。
【０００６】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ｍＥ７Ｉ（配列番号７５）の配列に少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ｍＡ７Ｉ（配列番号７６）の配列に少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ｍＪ７Ｉ（配列番号７７）の配列に少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ｍＥ７Ｉ−Ｒ１ｎｕｌｌ（配列番号７８）の配列に少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一である。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドが、毒素をさらに含む。いくつかの実施形態では、毒素は、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、リシン毒素、アブリン毒素、炭疽菌毒素、志賀毒素、ボツリヌス毒素、破傷風毒素、コレラ毒素、マイトトキシン、パリトキシン、シガトキシン、テクスチロトキシン、バトラコトキシン、アルファコノトキシン、タイポキシン、テトロドトキシン、アルファチチューストキシン、サキシトキシン、アナトキシン、ミクロシスチン、アコニチン、エクスフォリアチン毒素Ａ、エクスフォリアチンＢ、エンテロトキシン、毒物ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−Ｉ）、ペスト菌（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）毒素、及びガス壊疽毒素からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、毒素は、ＶＥＧＦ変異体のＮ末端に付着する。いくつかの実施形態では、毒素は、ＶＥＧＦ変異体のＣ末端に付着する。いくつかの実施形態では、毒素は、第１または第２のＶＥＧＦモノマーサブユニットに付着する。
【０００８】
本明細書で開示されるものは、ある特定の実施形態では、（ａ）以下の突然変異：Ｆ３６Ｌ、Ｅ４４Ｇ、及びＱ８７ＲまたはＦ３６Ｌ、Ｅ４４Ｇ、Ｄ６３Ｇ、及びＱ８７Ｒを有する第１のＶＥＧＦ−Ａモノマーサブユニット、（ｂ）突然変異：Ｄ６３Ｎを有する第２のＶＥＧＦ−Ａモノマーサブユニット、及び（ｃ）第１及び第２のＶＥＧＦ−Ａモノマーを連結するペプチドリンカーまたはジスルフィド架橋を含む、上記で定義したような式Ａ−Ｌ−ＢのＶＥＧＦ変異体ポリペプチドである。
【０００９】
本明細書で開示されるものは、ある特定の実施形態では、式：Ａ−Ｌ1 −Ｂ−（Ｌ2 −Ａ−Ｌ1 −Ｂ）n −Ｌ2 −Ａ−Ｌ1 −Ｂを含むＶＥＧＦ変異体ポリペプチドであり、
式中、Ａは、以下の突然変異：Ｆ３６Ｌ、Ｅ４４Ｇ、及びＱ８７Ｒを有する第１のＶＥＧＦ−Ａモノマーであり、Ｂは、突然変異：Ｄ６３Ｎを有する第２のＶＥＧＦ−Ａモノマーであり、Ｌ1 は、ペプチドリンカーであり、Ｌ2 は、ペプチドリンカーであり、ｎは、０〜４の整数であり、Ａ及びＢの各々は、上記で定義した通りである。いくつかの実施形態では、Ｌ1 は、１４の長さのアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｌ1 は、１５の長さのアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｌ1 は、１６の長さのアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｌ1 は、１７の長さのアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｌ1 は、１８の長さのアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｌ1 は、１９の長さのアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｌ1 は、２０の長さのアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｌ1 は、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号４１）に少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％同一な配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｌ1 は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４４）に少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％同一な配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｌ1 は、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧＧＧＧＧＳ（配列番号４２）に少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％同一な配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｌ1 は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号４３）に少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％同一な配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｌ2 は、（ＧＳ）n （ｎ＝１０〜３０）、（Ｇ2Ｓ）n （ｎ＝６〜２０）、（Ｇ3Ｓ）n （ｎ＝５〜１５）、（Ｇ4Ｓ）n （ｎ＝４〜１２）、（Ｇ）n （ｎ＝２０〜６０）、及び（Ｓ）n （ｎ＝２０〜６０）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ｍＥ７Ｉ（配列番号７５）の配列に少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一である。
【００１０】
ある特定の実施形態では、上記で定義したようなＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域に融合して、Ｆｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを生成する。Ｆｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド融合体は、式：Ｆｃ−（Ａ−Ｌ−Ｂ）、または（Ａ−Ｌ−Ｂ）−Ｆｃを含んでもよく、
式中、
Ｆｃは、免疫グロブリンＦｃ領域であり、
Ａ及びＢは、互いに独立して、ＶＥＧＦモノマーであり、及び、
Ｌは、ペプチドリンカーアミノ酸であり、Ａ、Ｂ、及びＬの各々は、上記で定義した通りである。
【００１１】
本明細書で開示されるものは、ある特定の実施形態では、式：Ｆｃ−［Ａ−Ｌ1 −Ｂ−（Ｌ2 −Ａ−Ｌ1 −Ｂ）n −Ｌ2 −Ａ−Ｌ1 −Ｂ］、またはＦｃ−［Ａ−Ｌ1 −Ｂ−（Ｌ2 −Ａ−Ｌ1 −Ｂ）n −Ｌ2 −Ａ−Ｌ1 −Ｂ］を含むＦｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド融合体であり、
式中、
Ｆｃは、免疫グロブリンＦｃ領域であり、
Ａは、第１のＶＥＧＦモノマーであり、
Ｂは、第２のＶＥＧＦモノマーであり、
Ｌ1 及びＬ2 は、互いに独立して、ペプチドリンカーであり、Ａ、Ｂ、Ｌ1 、及びＬ2 の各々は、上記で定義した通りであり、並びに、
ｎは、０〜４の整数である。
【００１２】
組成物は、本発明の１つ以上の変異体ＶＥＧＦポリペプチド（複数可）を含み、これは、単一種として、または、薬学的に許容される賦形剤と通常組み合わせた２つ以上のポリペプチドのカクテルとして提供され得る。そのような組成物は、１つ以上のさらなる治療剤を任意に含む。薬理学的組成物は、本発明の１つ以上のポリペプチド、及び薬学的に許容される賦形剤を含む。組成物は、局所または全身使用のために提供してもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所組成物である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、皮膚、眼組織、脳脊髄液、腫瘍、関節腔などに局所的に注射される組成物である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、経口または静脈内送達される全身組成物である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、点眼薬である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、眼科的に許容される溶液、クリーム、または軟膏として処方される。本発明の眼科組成物は、それを必要とする対象における角膜及び眼球結膜を含む、眼の外表面の血管新生によって特徴付けられる障害を非外科的に治療するために処方してもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、それを必要とする対象の角膜及び眼球結膜を含む、眼の外表面の血管新生によって特徴づけられる障害の再発を予防するために処方される。いくつかの実施形態では、組成物は、眼内注射、結膜下注射、または眼周囲注射のために処方される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、官能部分、例えば、蛍光標識などの検出可能な標識、同位体標識などの検出可能な標識、細胞毒性部分などにコンジュゲートされ、画像化、定量、治療目的などでの使用を見出してもよい。いくつかの実施形態では、本発明のハイブリッドポリペプチドは、毒素をさらに含む。いくつかの実施形態では、毒素は、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、リシン毒素、アブリン毒素、炭疽菌毒素、志賀毒素、ボツリヌス毒素、破傷風毒素、コレラ毒素、マイトトキシン、パリトキシン、シガトキシン、テクスチロトキシン、バトラコトキシン、アルファコノトキシン、タイポキシン、テトロドトキシン、アルファチチューストキシン、サキシトキシン、アナトキシン、ミクロシスチン、アコニチン、エクスフォリアチン毒素Ａ、エクスフォリアチンＢ、エンテロトキシン、毒物ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−Ｉ）、ペスト菌（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）毒素、及びガス壊疽毒素からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、毒素は、ポリペプチドのＮ末端に付着する。いくつかの実施形態では、毒素は、ポリペプチドのＣ末端に付着する。いくつかの実施形態では、毒素は、ＰＤＧＦ鎖、ＶＥＧＦ鎖、または両方に付着する。
【００１４】
本明細書で開示されるものは、ある特定の実施形態では、本明細書に開示のＶＥＧＦ変異体ポリペプチドまたは本明細書に開示のＦｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド融合体を個体に投与することを含む、それを必要とする個体における血管新生障害の治療方法である。いくつかの実施形態では、血管新生障害は、翼状片である。いくつかの実施形態では、血管新生障害は、角膜血管新生である。いくつかの実施形態では、血管新生障害は、黄斑変性症である。いくつかの実施形態では、血管新生障害は、網膜静脈閉塞である。いくつかの実施形態では、血管新生障害は、眼の血管新生、脈絡膜新生血管、虹彩血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、瞼裂斑、パンヌス、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜剥離、後部ぶどう膜炎、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、例えば、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、特に滲出型黄斑変性症、ケロイド、緑内障、白内障、部分的失明、完全な失明、近視、近視性変性、中心視力の劣化、変視症、色覚障害、血管の出血、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、対象は、限定されないが、翼状片を含む線維性血管増殖を有する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、血管新生障害は、癌である。いくつかの実施形態では、癌は、前立腺癌、乳癌、肺癌、食道癌、大腸癌、直腸癌、肝癌、尿路癌（例えば、膀胱癌）、腎臓癌、肺癌（例えば、非小細胞性肺癌）、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、膵癌、胃癌、甲状腺癌、皮膚癌（例えば、黒色腫）、リンパ系または骨髄系統の造血癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、神経膠芽腫、奇形癌、神経芽細胞腫、腺癌、間葉起源の癌、例えば、線維肉腫、または横紋筋肉腫、軟部組織肉腫及び癌腫、絨毛膜癌腫、肝芽腫、カポシ肉腫、またはウィルムス腫瘍である。いくつかの実施形態では、血管新生障害は、炎症性疾患である。いくつかの実施形態では、炎症性疾患は、炎症性関節炎、変形性関節症、乾癬、慢性炎症、過敏性腸疾患、肺の炎症、または喘息である。いくつかの実施形態では、血管新生障害は、自己免疫疾患である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、または全身性エリテマトーデスである。いくつかの実施形態では、血管新生障害は、アテローム性動脈硬化症、水晶体後線維増殖症、甲状腺過形成（グレーブス病を含む）、ネフローゼ症候群、プレクラムパシア、腹水、心嚢液貯留（心膜炎に関連するものなど）、及び胸水である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明のハイブリッドポリペプチドを含む医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象の角膜及び眼球結膜を含む、眼の外表面の血管新生によって特徴付けられる障害を非外科的に治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明のハイブリッドポリペプチドを含む医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象の角膜及び眼球結膜を含む、眼の外表面の血管新生の再発を予防する方法を提供する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、方法は、さらなる治療剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、抗体、ポリペプチド、ヌクレオチド、小分子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、ＶＥＧＦの阻害剤、ＰＤＧＦの阻害剤、ＡＮＧの阻害剤、またはＦＧＦの阻害剤、または関連受容体である。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、インテグリンの阻害剤、またはＭＭＰの阻害剤、または前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の阻害剤である。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロテプレドノールエタボネート（ＬＥ）、経口ドキシサイクリン、ジピリダモール、及びドベシル酸からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、抗炎症性ステロイドである。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、非ステロイド性抗炎症薬である。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、抗体、またはＶＥＧＦシグナル伝達の小分子阻害剤である。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、すでに作製されているＶＥＧＦの効果を縛り、捕捉し、スカベンジし、あるいは阻止する。さらなる治療剤は、本発明のハイブリッドポリペプチドと共に、眼科組成物を含む医薬組成物中に処方してもよく、または別の製剤で投与してもよい。
【００１８】
いくつかの実施形態では、眼の外表面の血管新生によって特徴付けられる障害は、翼状片である。いくつかの実施形態では、翼状片は、慢性翼状片である。いくつかの実施形態では、翼状片は、再発翼状片である。いくつかの実施形態では、眼の外表面の血管新生によって特徴付けられる障害は、パンヌスである。いくつかの実施形態では、眼の外表面の血管新生によって特徴付けられる障害は、角膜血管新生である。いくつかの実施形態では、眼の外表面の血管新生によって特徴付けられる障害は、瞼裂斑である。いくつかの実施形態では、障害は、コンタクトレンズの過剰着用によって引き起こされる角膜の縁での血管新生によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、障害は、外科的介入の１カ月内に治癒していない。いくつかの実施形態では、本発明のハイブリッドポリペプチドは、外科的介入または創傷清拭の最中または後に投与される。
【００１９】
本明細書に記載される新規の特徴は、添付される特許請求の範囲に具体的に記載される。本明細書に記載される特徴及び特徴の利点のより良い理解は、本明細書に記載される特徴の原理を利用する例示の実施例、及び添付図面に記載される以下の詳細な説明を参照にして得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】異なるペプチドリンカー（Ｌ１Ａ、Ｌ２Ａ、及びＬ３Ａ）をもつコンストラクトのタンパク質収量を示すゲルの画像を示す。
【図２】元のリンカーと比較して、ペプチドリンカーＬ３Ａを含有するコンストラクトの標的結合親和性を比較するために実施した、ヒト内皮細胞の細胞結合アッセイの結果のプロットを示す。
【図３】ｓｃＶＥＧＦMUT −Ｅ由来のＶＥＧＦ変異体ポリペプチドのライブラリーのＶＥＧＦＲ結合対発現のプロットを示す。
【図４】ｓｃＶＥＧＦコンストラクトのＦｃ融合体の結合のプロットを示す。
【図５】ＨＵＶＥＣのリン酸化アッセイの結果のプロットを示す。
【図６】角膜血管新生の実験モデルにおける血管新生を遮断する単鎖ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを例示する。
【図７】ヒト翼状片におけるフォンウィレブランド因子（ｖＷＦ）及びＶＥＧＦＲ２の免疫組織化学的染色を例示する。
【図８】ヒト翼状片におけるｖＷＦ及びＶＥＧＦＲ１の免疫組織化学的染色を例示する。
【図９】ヒト翼状片におけるαv β3 インテグリン及びＶＥＧＦＲ２の免疫組織化学的染色を例示する。
【図１０】ヒト翼状片におけるＣＤ３１及びα5 β1 インテグリンの免疫組織化学的染色を例示する。
【図１１】ヒト翼状片におけるＣＤ３１及びαv β5 インテグリンの免疫組織化学的染色を例示する。
【図１２】ヒト翼状片におけるＭＭＰ２、ｐｒｏ−ＭＭＰ２、及びＣＤ３１の免疫組織化学的染色を例示する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
いくつかの実施形態は、例証のために適用例を参照しながら以下に記載される。多くの具体的な詳細、関係、及び方法は、本明細書に記載される特徴の十分な理解を提供するために示されることを理解すべきである。しかしながら、関連分野の当業者は、本明細書に記載される特徴が、いくつかの実施形態では、１つ以上の具体的な詳細を伴わずに、または他の方法を用いて本発明が実施されることを容易に認識するであろう。いくつかの作用は、異なる順序で、及び／または他の作用もしくは事象と同時に起こり得るため、本明細書に記載される特徴は、作用もしくは事象の例証された順序によって限定されない。さらに、全ての例証される作用もしくは事象が、本明細書に記載される特徴に従う方法論を実施するために必要とされるわけではない。
【００２２】
定義
本明細書で使用される専門用語は、特定の場合を説明する目的のためにすぎず、限定的であることは意図されない。本明細書で使用する場合、単数形である「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に示さない限り、複数の形態も含むことを意図する。さらに、用語「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、「ｈａｖｉｎｇ」、「ｈａｓ」、「ｗｉｔｈ」またはその変形が、詳細な説明及び／または特許請求の範囲のいずれかにおいて使用される範囲内では、そのような用語は、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」と同様に包括的であることが意図される。
【００２３】
用語「約」または「およそ」は、当業者に決定される特定の値についての許容される誤差範囲内を意味し、それは、該値がどのように測定または決定されるか、例えば、測定系の限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当該技術分野における慣行に従って、１以内または１より大きい標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物システムもしくは生物学的過程について、該用語は、値の一桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。特定の値が本出願及び特許請求の範囲に記載される場合、特に断りがなければ、用語「約」は、特定の値についての許容される誤差範囲内を意味することを想定すべきである。
【００２４】
「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸、非天然に存在するアミノ酸、及びアミノ酸アナログ、及び各々のＤまたはＬ立体異性体を指す。
【００２５】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「アミノ酸配列」という用語は、アミノ酸の鎖を指す。「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「アミノ酸配列」は、交換可能に使用される。
【００２６】
「ペプチドリンカー」、「ポリペプチドリンカー」、または「アミノ酸」という用語は、１つのＶＥＧＦモノマーサブユニットを別のＶＥＧＦモノマーサブユニットに連結するアミノ酸の鎖を指す。用語は、交換可能に使用される。
【００２７】
ＶＥＧＦまたは血管内皮増殖因子は、血管新生、脈管及びリンパ管新生を刺激するシグナル伝達タンパク質のファミリーを指す。ＶＥＧＦファミリーのメンバーとしては、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、及びＰＩＧＦ（胎盤成長因子）が挙げられる。ＶＥＧＦの特定のメンバーが指定されていない場合、ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、及びＰＩＧＦのいずれかを意味する。本出願内で、任意のＶＥＧＦモノマーのアミノ酸残基ナンバリングは、成熟ヒト野生型ＶＥＧＦ−Ａ配列に対して残基１３で開始する。配列番号７３は、ＶＥＧＦ１２１の成熟全長配列である。配列番号７４は、最初の１２アミノ酸残基（結果として、ナンバリングは１３で始まる）のＮ末端切断と、最後の１２アミノ酸残基のＣ末端切断の両方を含有する成熟全長ＶＥＧＦ１２１の断片である。本明細書で言及する場合、ＶＥＧＦ−Ａのループ１は、（成熟ヒト野生型ＶＥＧＦ−Ａ配列に対する）アミノ酸残基６２〜６７を意味し、ループ２は、（成熟ヒト野生型ＶＥＧＦ−Ａ配列に対する）アミノ酸残基３９〜４６を意味し、及び、ループ３は、（成熟ヒト野生型ＶＥＧＦ−Ａ配列に対する）アミノ酸残基８３〜８９を意味する。他のＶＥＧＦファミリーメンバーのループ１、２及び３は、同様に定義することができ、または相同性によって推測することができる。
【００２８】
「ＶＥＧＦモノマーサブユニット」は、ＶＥＧＦモノマーアミノ酸配列を意味する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦモノマーサブユニットは、配列番号７３の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦモノマーサブユニットは、配列番号７４の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦモノマーサブユニットは、配列番号７３の配列を有し、配列番号７３の配列は、１つ以上の突然変異（例えば、交換、付加、挿入、省略、置換、または欠失、またはそれらの組み合わせ）で改変される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦモノマーサブユニットは、配列番号７４の配列を有し、配列番号７４の配列は、突然変異（例えば、交換、付加、挿入、省略、置換、または欠失、またはそれらの組み合わせ）で改変される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦモノマーサブユニットは、配列番号７３の配列を有し、配列番号７３のループ１、ループ２、もしくはループ３、またはそれらの任意の組み合わせは、異種モチーフ（例えば、ＲＧＤ認識モチーフ）で交換されている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦモノマーサブユニットは、配列番号７４の配列を有し、配列番号７４のループ１、ループ２、もしくはループ３、またはそれらの任意の組み合わせは、異種モチーフ（例えば、ＲＧＤ認識モチーフ）で交換されている。
【００２９】
「ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド」とは、例えば、リンカーまたはジスルフィド架橋によって一緒に関連付けられた少なくとも２つのＶＥＧＦモノマーサブユニットを含む分子を指す。いくつかの実施形態では、１つまたは両方の連結したＶＥＧＦモノマーサブユニットは、１つ以上の突然変異を含有する。
【００３０】
「ｓｃＶＥＧＦ変異体」は、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドの単鎖バージョン、すなわち、２つのＶＥＧＦモノマーサブユニットが、例えば、ペプチドリンカーによって連結する単鎖分子を記載する。本明細書で使用する場合、「単鎖ＶＥＧＦ変異体」及び「ｓｃＶＥＧＦ変異体」という用語は、交換可能に使用される。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「ポール」または「フェース」は、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドのＶＥＧＦＲ結合界面を指す。「ポール」または「フェース」は、第１のＶＥＧＦモノマーサブユニット及び第２のＶＥＧＦモノマーサブユニットからのアミノ酸残基を含む。各ポールは、１つのＶＥＧＦＲ分子に結合する。「ポール」及び「フェース」は、交換可能に使用される。
【００３２】
「ミュータント」は、基準野生型ポリペプチドとはいくらか異なるポリペプチドを指す。ポリペプチドは、基準野生型（例えば、天然に存在する）ポリペプチドの生物学的特性を保持する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、基準野生型ポリペプチドとは異なる生物学的特性を有する。いくつかの実施形態では、ミュータントは、ポリペプチド鎖がアミノ酸残基の交換、付加、挿入、省略、置換、または欠失、またはそれらの組み合わせを有する突然変異を有する。
【００３３】
「抗ＶＥＧＦ剤」は、ＶＥＧＦシグナル伝達の阻害剤、例えば、競合的アンタゴニスト、非競合的（ｎｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）アンタゴニスト、非競合的（ｕｎｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）アンタゴニスト、サイレントアンタゴニスト、部分アゴニスト、または逆アゴニストを意味する。
【００３４】
「精製した」、または「実質的に精製した」は、示された分子が、他の生物学的マクロ分子、例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質などの実質的な不在下で存在することを示す。いくつかの実施形態では、分子は、存在する示された生物学的マクロ分子の少なくとも９５重量％、例えば、少なくとも９９重量％を構成するように精製される。いくつかの実施形態では、水、緩衝液、及び１０００ダルトン未満の分子量をもつ他の小分子は、任意の量で存在する。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「単離された」とは、その天然供給源において分子で存在する少なくとも１つの他の成分から分離された分子を指す。いくつかの実施形態では、分子は、存在する示された生物学的マクロ分子の５０重量％、例えば、少なくとも７５重量％を超えて構成するように単離される。
【００３６】
「個体」、「患者」、または「対象」という用語は、交換可能に使用される。本明細書で使用する場合、それらは、任意の哺乳動物（すなわち系統学的分類の動物界：脊索動物門：脊椎動物亜門：哺乳類内の任意の目、科及び属の種）を意味する。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。用語はどれも、医療の専門家（例えば、医者、正看護婦、実地看護婦、医師助手、看護助手、またはホスピス職員）の監督（例えば、持続的または断続的な）によって特徴付けられた状況を必要としない、またはその状況に限定されない。
【００３７】
状態、障害、または症状（例えば、翼状片）を「治療する」またはその「治療」は、以下を含む。（１）状態、障害、または症状に罹患しているかまたは罹患しやすいかもしれないが、該状態、障害、または症状の臨床的または亜臨床的症候を未だ経験していないまたは呈していない、哺乳動物において発症する状態、障害、もしくは症状の臨床的または亜臨床的症候の発現を予防しまたは遅らせること、及び／または、（２）状態、障害、または症状を阻害すること、すなわち、該状態、障害、もしくは症状の発症、またはそれらの再発（維持療法の場合に）、または少なくとも１つのそれらの臨床的もしくは亜臨床的症候を停止し、減少させ、または遅らせること、（３）疾患を緩和すること、例えば、状態、障害、もしくは症状、または少なくとも１つのその臨床的または亜臨床的症候の退行を引き起こすこと、及び／または、（４）疾患の１つ以上の症状の重篤度の減少を引き起こすこと。治療される対象に対する利益は、統計的に有意であるか、あるいは患者または医師に少なくとも認知できるかのいずれかである。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「血管新生障害」は、病理学的血管新生に関連するかまたはそれからもたらされる、または血管新生によって促進される（例えば、血管新生に依存する腫瘍）任意の症状または障害を意味する。
【００３９】
ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド
本明細書で開示されるものは、いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、Ｆｃ融合体である。いくつかの実施形態では、そのようなＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、血管新生障害、例えば、血管新生関連の眼障害を診断し、治療する方法で使用される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、翼状片を治療するために使用される。
【００４０】
本明細書に開示されるＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、例えば、リンカーによって連結する少なくとも２つのＶＥＧＦモノマーサブユニットを含む分子である。いくつかの実施形態では、１つまたは両方連結したＶＥＧＦモノマーサブユニットは、１つ以上の突然変異、例えば、アミノ酸残基の交換、付加、挿入、省略、置換、または欠失、またはそれらの組み合わせを含有する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、インテグリン受容体アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、インテグリン受容体アンタゴニスト及びＶＥＧＦ受容体アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ビトロネクチン受容体アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ビトロネクチン受容体アンタゴニスト及びＶＥＧＦ受容体アンタゴニストである。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドの１つのポールは、このポールがＶＥＧＦＲに結合できるような無傷のＶＥＧＦＲ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドの少なくとも１つのポールは、ＶＥＧＦＲに結合できない。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドのＶＥＧＦＲへの結合時に、ＶＥＧＦＲは活性化されない。それによって、ＶＥＧＦ刺激受容体自己リン酸化、及び下流シグナル伝達の伝播を拮抗し、血管新生の阻害をもたらす。いずれか１つの理論に束縛されるものではないが、本明細書に開示のＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドの１つのポールが無傷のＶＥＧＦＲ結合部位を有するため、ＶＥＧＦＲ、及びＶＥＧＦＲ活性化により誘発されたその後のシグナル伝達を拮抗することができる。ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドのこのポールは、ＶＥＧＦＲに結合できるが、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドの他のポールは、第２のＶＥＧＦＲに結合できないような少なくとも１つの突然変異を含有し、これによりＶＥＧＦＲ二量化及び活性化を防止する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦモノマーサブユニットの少なくとも１つは、ＶＥＧＦ−Ａである。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦモノマーサブユニットの少なくとも１つは、ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームである。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームは、１２１、１４５、１４８、１６５、１８３、１８９、または２０６アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームは、ＶＥＧＦ165bアイソフォームである。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦモノマーサブユニットの少なくとも１つは、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、またはＰＩＧＦである。任意の適当なＶＥＧＦモノマーサブユニットは、本明細書に開示の方法での使用が考えられる。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、モノマーＶＥＧＦ−Ａ121 由来であるが、ＶＥＧＦ−Ａ121 の９７アミノ酸コア領域のみを含有する（配列番号７４を参照）。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ＶＥＧＦモノマーサブユニットに対して、切断されたＮ末端、Ｃ末端、または両方を有する。
【００４５】
ＶＥＧＦ変異体融合体ポリペプチド
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドが、限定されないが、 他のシステインノット成長因子、または糖タンパク質を含む少なくとも１つの他の分子をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、融合体ペプチドは、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ−Ｆ、ＰＤＧＦ、またはＰＩＧＦモノマーに融合しているＶＥＧＦ−Ａモノマーを含み、ＶＥＧＦ−Ｂモノマーは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ−Ｆ、ＰＤＧＦ、またはＰＩＧＦモノマーに融合しており、ＶＥＧＦ−Ｃモノマーは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ−Ｆ、ＰＤＧＦ、またはＰＩＧＦモノマーに融合しており、ＶＥＧＦ−Ｄモノマーは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ−Ｆ、ＰＤＧＦ、またはＰＩＧＦモノマーに融合しており、またはＰＩＧＦモノマーは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ−Ｆ、またはＰＤＧＦモノマーに融合している。
【００４６】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、例えば、共有またはイオン結合によって毒素に付着する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ペプチド結合によって毒素に付着する。いくつかの実施形態では、毒素は、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドのＮ末端に付着する。いくつかの実施形態では、毒素は、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドのＣ末端に付着する。いくつかの実施形態では、毒素は、第１または第２のＶＥＧＦモノマーサブユニットに付着する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、毒素は、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、リシン毒素、アブリン毒素、炭疽菌毒素、志賀毒素、ボツリヌス毒素、破傷風毒素、コレラ毒素、マイトトキシン、パリトキシン、シガトキシン、テクスチロトキシン、バトラコトキシン、アルファコノトキシン、タイポキシン、テトロドトキシン、アルファチチューストキシン、サキシトキシン、アナトキシン、ミクロシスチン、アコニチン、エクスフォリアチン毒素Ａ、エクスフォリアチンＢ、エンテロトキシン、毒物ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−Ｉ）、ペスト菌（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）毒素及びガス壊疽毒素からなる群から選択される。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、Ｆｃ融合体を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＶＥＧＦのＣ末端は、ＦｃのＮ末端に連結する。いくつかの実施形態では、ＦｃのＣ末端は、ｓｃＶＥＧＦのＮ末端に融合している。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合体は、天然に存在する、または遺伝子操作されている。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合体は、ヒト、マウス、ネズミ、及びウサギ由来である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合体を含むＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、免疫細胞の関与を誘発する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合体を含むＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、Ｆｃ受容体に結合する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合体を含むＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、免疫細胞の関与を誘発する。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｂリンパ球、濾胞性樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、及びマスト細胞である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合体を含むＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ、またはＦｃ融合体を持たないＶＥＧＦ変異体ポリペプチド由来のインテグリンへの結合親和性が改変されていない。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合体を含むＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ、またはＦｃ融合体を持たないＶＥＧＦ変異体ポリペプチド由来のインテグリンへの拮抗活性が改変されていない。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合体を含むＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ、またはＦｃ融合体を持たないＶＥＧＦ変異体ポリペプチド由来のインテグリンへの結合親和性が強化されている。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合体を含むＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ、またはＦｃ融合体を持たないＶＥＧＦ変異体ポリペプチド由来のインテグリンへの拮抗活性が強化されている。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドとＦｃ融合体の融合接合部でＧｌｙ4 ＳｅｒリンカーによってＦｃ融合体に連結される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、Ｇｌｙ4 Ｓｅｒリンカー無しでＦｃ融合体に連結される。いくつかの実施形態では、Ｇｌｙ4 Ｓｅｒリンカーは、１つのＧｌｙ4 Ｓｅｒ反復を含む。いくつかの実施形態では、Ｇｌｙ4 Ｓｅｒリンカーは、２つのＧｌｙ4 Ｓｅｒ反復を含む。いくつかの実施形態では、Ｇｌｙ4 Ｓｅｒリンカーは、３つのＧｌｙ4 Ｓｅｒ反復を含む。
【００４９】
異種モチーフをもつＶＥＧＦ変異体ポリペプチド
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、非ＶＥＧＦＲタンパク質に結合する異種モチーフを含む。いくつかの実施形態では、第１または第２のＶＥＧＦペプチドモノマーサブユニットは、非ＶＥＧＦＲタンパク質に結合する異種モチーフを含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＶＥＧＦペプチドモノマーサブユニットは、各々独立して、非ＶＥＧＦＲタンパク質に結合する異種モチーフを含む。いくつかの実施形態では、単一異種モチーフは、第１及び第２のＶＥＧＦペプチドモノマーサブユニット間で分割される。いくつかの実施形態では、非ＶＥＧＦＲタンパク質は、受容体である。いくつかの実施形態では、非ＶＥＧＦＲタンパク質は、血管タンパク質である。いくつかの実施形態では、異種モチーフを含むＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、野生型ＶＥＧＦと比較して、ＶＥＧＦＲ２に対する親和性が増している。
【００５０】
いくつかの実施形態では、非ＶＥＧＦタンパク質は、インテグリンである。インテグリンは、細胞外マトリクスリガンドへの細胞接着に関与する多様なクラスのヘテロ二量体（α／β）受容体である。特に、インテグリンαv β3 は、腫瘍増殖、転移、及び血管新生に決定的に関与しているとして示されているため、インテグリンαv β3 を標的とする抗癌療法の開発に多くの努力がなされてきた。ヒト翼状片の組織試料は、αv β3 、αv β5 、及びα5 β1 に対して陽性である。
【００５１】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ２とαv β3 インテグリンの両方を標的にする二重特異性タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、及びαv β3 インテグリンを標的にする多重特異性アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、変異した受容体結合部位におけるαv β3 インテグリンの結合のためのインテグリン認識ＲＧＤ配列を担持するループを含むことによって、内皮細胞のＶＥＧＦ刺激増殖だけでなく、αv β3 インテグリンの活性化も拮抗する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、１つの無傷ＶＥＧＦ受容体結合ポールと、１つの変異したＶＥＧＦ受容体結合ポールを含み、変異した結合ポールは、インテグリン、例えば、αv β3 、αv β5 、またはα5 β1 インテグリンの結合のためのインテグリン認識ＲＧＤ配列をもつループを含有する。いくつかの実施形態では、インテグリン認識ＲＧＤ配列は、ＶＥＧＦモノマーサブユニットのループ１、ループ２、またはループ３を交換する。いくつかの実施形態では、ループ１配列は、ＲＧＤモチーフで交換される。いくつかの実施形態では、ループ２配列は、ＲＧＤモチーフで交換される。いくつかの実施形態では、ループ３配列は、ＲＧＤモチーフで交換される。いくつかの実施形態では、ループ３配列（配列番号６４）ＩＫＰＨＱＧＱは、ＲＧＤモチーフで交換される。表１は、例示のインテグリン結合ループペプチドの配列を示す。
【００５３】
【表１】
2018507181.tif 000003
【００５４】
さらに、いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、２つ以上の特異的インテグリンへの結合、及び該インテグリンを阻害することができる、２つ以上のＲＧＤループを含む。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、非ＶＥＧＦＲタンパク質に結合する異種モチーフを含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、血管タンパク質に結合する異種モチーフを含む。いくつかの実施形態では、血管タンパク質は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）などからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、（ｉ）ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の活性を阻害し、（ｉｉ）腫瘍細胞及び内皮細胞の両方のインビトロでの移動を抑制し、（ｉｉｉ）腫瘍血管系にインビボで帰巣し、及び（ｉｖ）マウス中の腫瘍の成長及び浸潤を防止する環状デカペプチドＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ（配列番号６５）を含む。配列番号６５  ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ提示ファージは、血管新生血管をインビボで特異的に標的にすることも可能であった。
【００５６】
アミノ酸置換
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドの第１のＶＥＧＦモノマーサブユニットは、１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドの第２のＶＥＧＦモノマーサブユニットは、１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドの第１及び第２のＶＥＧＦモノマーサブユニットは、各々独立して、１つ以上の突然変異を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、少なくとも１つのＶＥＧＦモノマーサブユニット中に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ＶＥＧＦモノマーサブユニットの少なくとも１つまたは両方において少なくとも２つのアミノ酸置換、少なくとも３つのアミノ酸置換、少なくとも４つのアミノ酸置換、または少なくとも５つのアミノ酸置換を含む。天然に存在するアミノ酸に加えて、非天然に存在するアミノ酸または改変アミノ酸も考えられ、範囲内である。
【００５８】
いくつかの実施形態では、置換は、置換アミノ酸が、参照配列中で相当するアミノ酸と同様の構造的または化学的特性を有する、保存的なアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、置換は非保存的である。例えば、保存アミノ酸置換には、１つの脂肪族または疎水性アミノ酸、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンを別のものへの置換、１つのヒドロキシル含有アミノ酸、例えば、セリン及びスレオニンを別のものへの置換、１つの酸性残基、例えば、グルタミン酸、またはアスパラギン酸を別のものへの置換、１つのアミド含有残基、例えば、アスパラギン及びグルタミンを別のものへの交換、１つの芳香族残基、例えば、フェニルアラニン及びチロシンを別のものへの交換、１つの塩基性残基、例えば、リジン、アルギニン、及びヒスチジンを別のものへの交換、及び１つの小アミノ酸、例えば、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン、及びグリシンを別のものへの交換を伴う。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、全長活性モノマーの一部、例えば、全長タンパク質ではないペプチドを含む。いくつかの実施形態では、全長活性モノマーの一部は、これらのアミノ酸配列のアミノ酸の置換、交換、付加、挿入、省略、及び／または欠失によって得られる。いくつかの実施形態では、全長活性モノマーの一部は、他のペプチド、またはポリペプチド、またはグリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基などのさらなる化学基と連結する。
【００６０】
いくつかの実施形態では、１つまたは両方のＶＥＧＦモノマーサブユニットは、哺乳類ＶＥＧＦペプチドである。いくつかの実施形態では、１つまたは両方のＶＥＧＦモノマーサブユニットは、鳥類ＶＥＧＦペプチドである。いくつかの実施形態では、１つまたは両方のＶＥＧＦモノマーサブユニットは、霊長類ＶＥＧＦペプチドである。いくつかの実施形態では、１つまたは両方のＶＥＧＦモノマーサブユニットは、イヌＶＥＧＦペプチドである。いくつかの実施形態では、１つまたは両方のＶＥＧＦモノマーサブユニットは、ネコＶＥＧＦペプチドである。いくつかの実施形態では、１つまたは両方のＶＥＧＦモノマーサブユニットは、ウシＶＥＧＦペプチドである。いくつかの実施形態では、１つまたは両方のＶＥＧＦモノマーサブユニットは、ウマＶＥＧＦペプチドである。いくつかの実施形態では、１つまたは両方のＶＥＧＦモノマーサブユニットは、ブタＶＥＧＦペプチドである。いくつかの実施形態では、１つまたは両方のＶＥＧＦモノマーサブユニットは、ヒツジＶＥＧＦペプチドである。いくつかの実施形態では、１つまたは両方のＶＥＧＦモノマーサブユニットは、ネズミＶＥＧＦペプチドである。いくつかの実施形態では、１つまたは両方のＶＥＧＦモノマーサブユニットは、ラットＶＥＧＦペプチドである。いくつかの実施形態では、１つまたは両方のＶＥＧＦモノマーサブユニットは、ウサギＶＥＧＦペプチドである。いくつかの実施形態では、１つまたは両方のＶＥＧＦモノマーサブユニットは、ヒトＶＥＧＦペプチドである。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、第１のＶＥＧＦ−Ａモノマー及び第２のＶＥＧＦ−Ａモノマーを含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦ−Ａモノマーは、Ｖ１４Ａ、Ｖ１４Ｉ、Ｖ１５Ａ、Ｋ１６Ｒ、Ｆ１７Ｌ、Ｍ１８Ｒ、Ｄ１９Ｇ、Ｑ２２Ｒ、Ｒ２３Ｋ、Ｉ２９Ｖ、Ｌ３２Ｓ、Ｉ３５Ｖ、Ｆ３６Ｌ、Ｆ３６Ｓ、Ｄ４１Ｎ、Ｅ４２Ｋ、Ｅ４４Ｇ、Ｙ４５Ｈ、Ｆ４７Ｓ、Ｋ４８Ｅ、Ｐ４９Ｌ、Ｓ５０Ｐ、Ｐ５３Ｓ、Ｇ５８Ｓ、Ｃ６０Ｙ、Ｄ６３Ｈ、Ｄ６３Ｎ、Ｄ６３Ｇ、Ｉ７６Ｔ、Ｍ７８Ｖ、Ｍ８１Ｔ、Ｍ８１Ｖ、Ｒ８２Ｇ、Ｈ８６Ｙ、Ｑ８７Ｒ、Ｑ８９Ｈ、Ｈ９０Ｒ、Ｉ９１Ｔ、Ｉ９１Ｖ、Ｎ１００Ｄ、及びＫ１０１Ｅからなる群から選択される突然変異を含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦ−Ａモノマーは、Ｆ３６Ｌ、Ｅ４４Ｇ、Ｄ６３Ｇ、及びＱ８７Ｒからなる群から選択される突然変異を含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＥＧＦ−Ａモノマーは、Ｆ３６Ｌ、Ｅ４４Ｇ、及びＱ８７Ｒの突然変異を含む。いくつかの実施形態では、第２のＶＥＧＦ−Ａモノマーは、Ｖ１４Ａ、Ｖ１４Ｉ、Ｖ１５Ａ、Ｋ１６Ｒ、Ｆ１７Ｌ、Ｍ１８Ｒ、Ｄ１９Ｇ、Ｑ２２Ｒ、Ｒ２３Ｋ、Ｉ２９Ｖ、Ｌ３２Ｓ、Ｉ３５Ｖ、Ｆ３６Ｌ、Ｆ３６Ｓ、Ｄ４１Ｎ、Ｅ４２Ｋ、Ｅ４４Ｇ、Ｙ４５Ｈ、Ｆ４７Ｓ、Ｋ４８Ｅ、Ｐ４９Ｌ、Ｓ５０Ｐ、Ｐ５３Ｓ、Ｇ５８Ｓ、Ｃ６０Ｙ、Ｄ６３Ｈ、Ｄ６３Ｎ、Ｄ６３Ｇ、Ｉ７６Ｔ、Ｍ７８Ｖ、Ｍ８１Ｔ、Ｍ８１Ｖ、Ｒ８２Ｇ、Ｈ８６Ｙ、Ｑ８７Ｒ、Ｑ８９Ｈ、Ｈ９０Ｒ、Ｉ９１Ｔ、Ｉ９１Ｖ、Ｎ１００Ｄ、及びＫ１０１Ｅからなる群から選択される突然変異を含む。いくつかの実施形態では、第２のＶＥＧＦ−Ａモノマーは、Ｋ１６Ｒ、Ｄ４１Ｎ、及びＤ６３Ｎからなる群から選択される突然変異を含む。いくつかの実施形態では、第２のＶＥＧＦ−Ａモノマーは、Ｄ６３Ｎの突然変異を含む。
【００６２】
ペプチドリンカー
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ペプチドリンカーによって分離された２つ以上のＶＥＧＦモノマーサブユニットを含む。ペプチドリンカーは、単鎖立体配座中でＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを形成するために使用される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、単鎖分子がＶＥＧＦ受容体に結合する能力を妨げない。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、単鎖分子がインテグリン受容体に結合する能力を妨げない。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約２〜約５０またはそれ以上の長さの範囲のアミノ酸である。例えば、いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０〜１５、または１５〜２０アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、１４〜２０アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、１４アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、１５アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、１６アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、１７アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、１８アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、１９アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、２０アミノ酸である。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ−ＳｅｒであるかまたはＧｌｙ−Ｓｅｒを含有する。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、グリシン過剰ポリペプチド鎖である。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカー配列は、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号４１）である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカー配列は、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧＧＧＧＧＳ（配列番号４２）である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカー配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号４３）である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカー配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４４）である。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（ＧＳ）n （ｎは、６〜１５の整数である）、（Ｇ2Ｓ）n （ｎは、４〜１０の整数である）、（Ｇ3Ｓ）n （ｎは、３〜８の整数である）、（Ｇ4Ｓ）n （ｎは、２〜６の整数である）、（Ｇ）n （ｎは、１２〜３０の整数である）、及び（Ｓ）n （ｎは、１２〜３０の整数である）からなる群から選択される式を有するペプチドを含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ4 −Ｓｅｒ）3 （配列番号４５）である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号４６）である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号４７）である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ（配列番号４８）である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ９−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号４９）である。
【００６８】
鎖
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、式Ａ−Ｌ−Ｂによって表され、式中、Ａ及びＢは、互いに独立して、ＶＥＧＦモノマーサブユニットであり、Ｌは、ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、Ｌは、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号４１）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧＧＧＧＧＳ（配列番号４２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号４３）、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４４）からなる群から選択される。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、式Ａ−Ｌ1 −Ｂ−（Ｌ2 −Ａ−Ｌ1 −Ｂ）n −Ｌ2 −Ａ−Ｌ1 −Ｂによって表され、式中、Ａ及びＢは、互いに独立して、ＶＥＧＦモノマーサブユニット、Ｌ1 及びＬ2 は、互いに独立して、ペプチドリンカーであり、ｎは、０〜４の整数である。いくつかの実施形態では、Ｌ1 は、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号４１）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧＧＧＧＧＳ（配列番号４２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号４３）、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４４）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｌ2 は、（ＧＳ）n （ｎ＝１０〜３０）、（Ｇ2Ｓ）n （ｎ＝６〜２０）、（Ｇ3Ｓ）n （ｎ＝５〜１５）、（Ｇ4Ｓ）n （ｎ＝４〜１２）、（Ｇ）n （ｎ＝２０〜６０）、及び（Ｓ）n （ｎ＝２０〜６０）からなる群から選択される。
【００７０】
半減期の増加
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、野生型ＶＥＧＦホモ二量体と比較して血漿及び／または眼の半減期が増加している。タンパク質の半減期は、タンパク質安定性及びそのクリアランス速度の測定値であり、タンパク質の濃度が１／２に減少するために必要な時間を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＶＥＧＦ分子の血清半減期は、対象由来の試料中のＶＥＧＦレベルを経時的に測定するための任意の適当な方法、例えば、改変ＶＥＧＦの投与後の一定時間にわたって採取した血清試料中のＶＥＧＦレベルを測定するために抗ＶＥＧＦ抗体を用いる免疫測定法、または改変ＶＥＧＦの投与後に対象から採取した試料中の標識ＶＥＧＦ分子、例えば、放射性標識分子を検出することによって決定される。
【００７１】
任意の適当な改変を使用して、本明細書に開示のＶＥＧＦ変異体ポリペプチドの半減期を増加させる。いくつかの実施形態では、半減期の増加は、Ｆｃ融合体の使用によってもたらされる。いくつかの実施形態では、半減期の増加は、アルブミン融合体の使用によってもたらされる。いくつかの実施形態では、半減期の増加は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のカルボキシ末端延長ペプチド（ＣＴＥＰ）などのペプチド延長の使用によってもたらされる。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体のモノマーは、例えば、ペプチド結合によって、または、限定されないが、ペプチドリンカーを含むタンパク質のアミノ末端とカルボキシル末端の間で共有結合を形成することが可能なヘテロ二機能性試薬によって、ＣＴＥＰに共有結合する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体は、１つ以上のタンパク質分解切断部位を排除することによって安定性を高め、血清半減期を増加させる１つ以上のアミノ酸置換と連結したアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、さらなるアミノ酸置換は、タンパク質分解切断を減少させる。いくつかの実施形態では、さらなるアミノ酸置換は、タンパク質分解切断を防止する。いくつかの実施形態では、半減期の増加は、限定されないが、ペグ化、または他の適切な化学基の共役を含む架橋によってもたらされる。いくつかの実施形態では、半減期は、分子内の負帯電残基の数、例えば、グルタミン酸及び／またはアスパラギン酸残基の数が増加することによって増加する。いくつかの実施形態では、そのような変化は、部位特異的突然変異誘発、または１つ以上の負帯電残基を含有するアミノ酸配列の挿入によって達成される。
【００７２】
例示のＶＥＧＦ変異体ポリペプチド
本明細書で開示されるものは、ある特定の実施形態では、リンカー、例えば、ペプチドリンカーによって一緒に連結した２つのＶＥＧＦモノマーサブユニットを含むＶＥＧＦ変異体ポリペプチドである。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧＧＧＧＧＳ（配列番号４２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号４３）、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４４）からなる群から選択されるペプチドリンカーによって連結された第１及び第２のＶＥＧＦ−Ａモノマーサブユニットを含み、（ａ）第１及び第２のＶＥＧＦ−Ａモノマーサブユニットは、Ｖ１４Ａ、Ｖ１４Ｉ、Ｖ１５Ａ、Ｋ１６Ｒ、Ｆ１７Ｌ、Ｍ１８Ｒ、Ｄ１９Ｇ、Ｑ２２Ｒ、Ｒ２３Ｋ、Ｉ２９Ｖ、Ｌ３２Ｓ、Ｉ３５Ｖ、Ｆ３６Ｌ、Ｆ３６Ｓ、Ｄ４１Ｎ、Ｅ４２Ｋ、Ｅ４４Ｇ、Ｙ４５Ｈ、Ｆ４７Ｓ、Ｋ４８Ｅ、Ｐ４９Ｌ、Ｓ５０Ｐ、Ｐ５３Ｓ、Ｇ５８Ｓ、Ｃ６０Ｙ、Ｄ６３Ｈ、Ｄ６３Ｎ、Ｄ６３Ｇ、Ｉ７６Ｔ、Ｍ７８Ｖ、Ｍ８１Ｔ、Ｍ８１Ｖ、Ｒ８２Ｇ、Ｈ８６Ｙ、Ｑ８７Ｒ、Ｑ８９Ｈ、Ｈ９０Ｒ、Ｉ９１Ｔ、Ｉ９１Ｖ、Ｎ１００Ｄ、及びＫ１０１Ｅからなる群から選択される任意の突然変異を含み、（ｂ）第１及び／または第２のＶＥＧＦ−Ａモノマーサブユニットのループ１、ループ２、またはループ３、またはそれらの任意の組み合わせは、表１の任意のＲＧＤ配列と交換される。
【００７４】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２）とインテグリン（例えば、αv β3 インテグリン）の両方の二官能性アンタゴニストである。例示の二官能性アンタゴニストであるＶＥＧＦ変異体ポリペプチドとしては、ｍＥ７Ｉ（配列番号７５）、（配列番号７６）、ｍＪ７Ｉ（配列番号７７）、ｍＥ７Ｉ−Ｒ１ｎｕｌｌ（配列番号７８）が挙げられる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ｍＥ７Ｉ（配列番号７５）のタンパク質配列に少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ｍＡ７Ｉ（配列番号７６）のタンパク質配列に少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ｍＪ７Ｉ（配列番号７７）のタンパク質配列に少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ｍＥ７Ｉ−Ｒ１ｎｕｌｌ（配列番号７８）のタンパク質配列に少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一である。
【００７６】
ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドの産生
ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、当業者に公知の組み換え方法または化学合成方法を介して産生することができる。さらに、機能的に等価なポリペプチドは、等価なポリペプチドがサイレント変化をもたらすことによって、経路遺伝子産物上で示差的に発現した機能的等価物を産生するアミノ酸残基の欠失、付加、または置換を含有し得る場合に、使用を見い出し得る。アミノ酸置換は、関連する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性の性質の類似性に基づいて行ってもよい。本明細書で使用する場合、「機能的等価物」とは、実質的に同様のインビボ活性を呈することが可能なタンパク質を指す。
【００７７】
ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、当該技術分野で周知の技術を用いた組み換えＤＮＡ技術によって産生してもよい。当業者に周知の方法を使用して、コーディング配列及び適切な転写／翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ組み換え／遺伝子組み換えが挙げられる。あるいは、対象ポリペプチドをコードすることができるＲＮＡを化学合成してもよい。
【００７８】
組み換え方法の選択肢の１つとして、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、化学合成することができる。そのような方法には、通常、固体状態のアプローチが含まれるが、溶液ベースの化学及び組み合わせ、または固体状態アプローチと溶液アプローチの組み合わせを利用することもできる。タンパク質を合成する固体状態の方法論の例は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９、及びＨｏｕｇｈｔｅｎ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８２：５１３１に記載されている。本発明のポリペプチドタンパク質の断片は、合成した後に、一緒に連結することができる。そのような反応を行う方法は、Ｇｒａｎｔ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．；ａｎｄ  ｉｎ  “Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”（Ｂｏｄａｎｓｋｙ  ａｎｄ  Ｔｒｏｓｔ，ｅｄ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．，（１９９３）に記載されている。本発明のタンパク質またはペプチドは、１つ以上の非天然に存在するアミノ酸または改変アミノ酸を含んでもよい。「非天然に存在するアミノ酸残基」とは、ポリペプチド鎖中の隣接アミノ酸残基（複数可）に共有結合することができる、上に列挙した天然に存在するアミノ酸残基以外の残基を指す。非天然アミノ酸としては、ホモ−リジン、ホモ−アルギニン、ホモ−セリン、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、第三ブチルグリシン、２，４−ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２′−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルペンチルグリシン、Ｎ−メチルバリン、ナフタラニン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、シトルリン、ペンチルグリシン、ピペコリン酸、及びチオプロリンが挙げられるが、これらに限定されない。改変アミノ酸には、天然及び非天然アミノ酸が含まれ、これらは、例えば、側鎖の官能基が別の官能基に化学的に改変されたＮ−メチル化Ｄ及びＬアミノ酸、可逆的もしくは不可逆的に化学的に遮断され、またはＮ末端アミノ基もしくはそれらの側鎖基が改変される。例えば、改変アミノ酸としては、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、アスパラギン酸の改変アミノ酸であるアスパラギン酸−（β−メチルエステル）、グリシンの改変アミノ酸であるＮ−エチルグリシン、またはアラニンの改変アミノ酸であるアラニンカルボキサミドが挙げられる。タンパク質及びペプチドにそれらを組み込むさらなる非天然及び改変アミノ酸、及び方法は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｓａｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，（���９９８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１：２４８１−９１、Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００５）  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：５４８−５５４、Ｈｏｄｇｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ（２００４）  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．３３：４２２−４３０を参照されたい）。
【００７９】
一般に、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドのコーディング配列は、比較的大量の遺伝子産物を産生するために、所望の宿主細胞中で機能的なプロモーターの制御下に置かれる。多種多様なプロモーターがよく知られており、特定の用途に応じて、本発明の発現ベクターで使用することができる。通常、選択されたプロモーターは、プロモーターが活性化される細胞に依存する。リボソーム結合部位、転写終結部位などの他の発現制御配列も任意に含まれる。これらの制御配列の１つ以上を含むコンストラクトは、「発現カセット」と呼ばれる。発現は、特定の宿主細胞に適切なプロモーター及び他の制御因子を利用する原核細胞及び真核細胞で達成することができる。例示の宿主細胞としては、大腸菌、他の細菌宿主、酵母、並びに、ＣＯＳ、ＣＨＯ及びＨｅＬａ細胞株、及び骨髄腫細胞株などの種々のより高い真核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、免疫親和性における分別またはイオン交換カラム、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上の、または陽イオン交換樹脂、例えば、ＤＥＡＥ上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を用いたゲル濾過、疎水性親和性樹脂、マトリクス上で固定化した適当な結合パートナーを用いたリガンド親和性、遠心分離、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣｏｒｅ、ウェスタンブロットアッセイ、アミノ酸及び核酸シークエンシング、及び生物学的活性などの一般に公知の方法を用いて精製し、同定してもよい。
【００８１】
使用
本明細書で開示されるものは、ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、Ｆｃ融合体である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、血管新生障害を診断し、治療する方法に使用される。
【００８２】
いくつかの実施形態では、血管新生障害は、血管新生関連の眼障害である。いくつかの実施形態では、そのようなＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、翼状片を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、血管新生障害は、眼の血管新生、脈絡膜新生血管、虹彩血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、瞼裂斑、またはパンヌスである。いくつかの実施形態では、血管新生障害は、角膜血管新生である。いくつかの実施形態では、血管新生障害は、瞼裂斑である。いくつかの実施形態では、血管新生障害は、パンヌスである。いくつかの実施形態では、血管新生障害は、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜剥離、後部ぶどう膜炎、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、血管新生障害は、糖尿病性網膜症である。いくつかの実施形態では、血管新生障害は、黄斑変性症、例えば、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、特に滲出型黄斑変性症である。いくつかの実施形態では、血管新生障害は、ケロイドである。いくつかの実施形態では、血管新生障害は、網膜静脈閉塞である。いくつかの実施形態では、血管新生障害は、緑内障、白内障、部分的失明、完全な失明、近視、近視性変性、中心視力の劣化、変視症、色覚障害、血管の出血、またはそれらの組み合わせである。
【００８３】
本明細書で開示されるものは、いくつかの実施形態では、それを必要とする対象における血管新生関連の症状を治療する方法である。いくつかの実施形態では、血管新生関連の症状は、翼状片である。いくつかの実施形態では、血管新生関連の症状は、角膜血管新生である。いくつかの実施形態では、血管新生関連の症状は、パンヌスである。いくつかの実施形態では、血管新生関連の症状は、例えば、コンタクトレンズの過剰着用による角膜の縁の血管新生である。いくつかの実施形態では、血管新生関連の症状は、瞼裂斑である。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に開示のポリペプチドを対象に投与することを含む。
【００８４】
翼状片（「サーファーズアイ」としても知られる）は、眼の結膜及び角膜表面にわたる良性の血管成長である。翼状片は、結膜から生じ、場合によっては、角膜の縁及びその外側に広がるくさび状の、血管が多い、肉質成長によって特徴付けられる。翼状片は、一般に、強膜の鼻側から成長し、瞼裂に通常は存在する。紫外線暴露（例えば、日光）、低い湿度、風、及び埃に関連し、これらによって発症すると考えられる。場合によっては、翼状片は、眼瞼交連まわりの強膜外傷で始まる。場合によっては、鼻側の翼状片の優位性は、角膜を通して側面に沿って通過する太陽光の結果であり、この太陽光が屈折して周辺領域に集中するようになる。日光は、眼の側面から妨害されることなく通過し、角膜通過後に縁内側に集中する。しかしながら、反対側（内側）では、鼻の影が側面／側頭部の縁に集中した日光の強度が内側で減少する。
【００８５】
結膜中の翼状片は、コラーゲンの弾性線維様分解（光線性エラストーシス）及び線維性血管増殖によって特徴付けられる。翼状片は、一般的に、血管新生、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）のリモデリング、及び増殖線維芽細胞（ＦＢ）を呈する。これは、翼状片の頭部と呼ばれる進行部分を有し、この頭部は、頸部によって翼様片の本体に連結している。場合によっては、翼様片の頭部に隣接して鉄分の沈着線が認められ、これを、ストッカー線と呼ぶ。場合によっては、線の位置は、成長パターンを示し得る。
【００８６】
翼状片は、いくつかのセグメントであるフックスパッチ（翼状片頭部近くに分散するわずかに灰色の染み）、ストッカー線（鉄分沈着からなる茶色がかった線）、フード（翼状片の繊維状の非血管部）、頭部（翼状片の頂部、通常、隆起し、血管が多い）、本体部（曲がりくねった血管で密集した肉質隆起部分）、上縁（三角形の上縁、または翼状片の翼状部分）、下縁（三角形の下縁、または翼状片の翼状部分）からなる。
【００８７】
場合によっては、翼状片は過度の日光暴露または風への暴露に起因するため、側面が保護された防護サングラス、またはつば広帽の着用、及び眼への人工涙液の適用は、翼状片の形成の防止またはさらなる成長の防止に役立つ。
【００８８】
本明細書に開示のポリペプチドにより治療するためのさらなる血管新生関連の症状としては、瞼裂斑、パンヌス、及び角膜血管新生が挙げられる。瞼裂斑は、眼の結膜変性である。瞼裂斑を持つ個体は、縁に隣接する結膜に黄白色の沈着を呈する。組織学的に、障害は、重なり上皮の菲薄化及び偶発的な石灰化による結膜間質のコラーゲン繊維の変性によって特徴付けられる。パンヌスは、周辺角膜への血管の異常層である。角膜血管新生は、角膜の炎症または角膜への外傷に関連することが多い、輪部血管叢から角膜への血管の過度の内部成長である。
【００８９】
本発明のポリペプチドによる治療は、限定されないが、外科的切除及び／または照射、結膜自家移植、羊膜移植、または治療剤の投与を含む、翼状片の従来の治療と併用してもよい。翼状片が手術後に再発するかまたは視力を脅かすと考えられる場合、ストロンチウム（90Ｓｒ）プラーク治療を使用してもよい。結膜自家移植は、翼状片成長を除去するための侵襲外科技術である。翼状片成長を除去するために羊膜移植を使用してもよい。翼状片を治療するための他の治療剤としては、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロテプレドノールエタボネート（ＬＥ）、経口ドキシサイクリン、ジピリダモール、及びドベシル酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
いくつかの実施形態では、血管新生障害は、癌である。いくつかの実施形態では、癌は、前立腺癌、乳癌、肺癌、食道癌、大腸癌、直腸癌、肝癌、尿路癌（例えば、膀胱癌）、腎臓癌、肺癌（例えば、非小細胞性肺癌）、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、膵癌、胃癌、甲状腺癌、皮膚癌（例えば、黒色腫）、リンパ系または骨髄系統の造血癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、神経膠芽腫、奇形癌、神経芽細胞腫、腺癌、間葉起源の癌、例えば、線維肉腫、または横紋筋肉腫、軟部組織肉腫及び癌腫、絨毛膜癌腫、肝芽腫、カポシ肉腫、またはウィルムス腫瘍である
【００９１】
いくつかの実施形態では、血管新生障害は、炎症性疾患である。いくつかの実施形態では、炎症性疾患は、炎症性関節炎、変形性関節症、乾癬、慢性炎症、過敏性腸疾患、肺の炎症、または喘息である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、血管新生障害は、自己免疫疾患である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、または全身性エリテマトーデスである。
【００９３】
他の血管新生障害としては、アテローム性動脈硬化症、水晶体後線維増殖症、甲状腺過形成（グレーブス病を含む）、ネフローゼ症候群、プレクラムパシア、腹水、心嚢液貯留（心膜炎に関連するものなど）及び胸水が挙げられる。
【００９４】
併用療法
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、さらなる治療剤と併用して個体に投与される。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、アンジオテンシン（ＡＮＧ）、または線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、及び関連受容体の阻害剤である。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の阻害剤である。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、抗体、ポリペプチド、ヌクレオチド、小分子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロテプレドノールエタボネート（ＬＥ）、経口ドキシサイクリン、ジピリダモール、及びドベシル酸からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、抗炎症性ステロイドである。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、非ステロイド性抗炎症薬である。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、抗体、またはＶＥＧＦシグナル伝達の小分子阻害剤である。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、すでに作製されているＶＥＧＦの効果を縛り、捕捉し、スカベンジし、あるいは阻止する。
【００９５】
いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、化学療法剤である。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、アルキル化剤、例えば、シスプラチン、シクロホスファミド、アルトレタミン；ＤＮＡ鎖切断剤、例えば、ブレオマイシン；ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害剤には、以下のインターカレータ、例えば、アムサクリン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、及びミトキサントロン；非挿入型トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、エトポシド及びテニポシド；ＤＮＡ小溝結合剤プリカマイシン；アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、シクロホスファミド、イソファミド、メクロレタミン、メルファラン、ウラシルマスタード；アジリジン、例えば、チオテパ；メタンスルホン酸エステル、例えば、ブスルファン；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン；プラチナ複合体、例えば、シスプラチン、カルボプラチン；バイオ還元アルキル化剤、例えば、マイトマイシン、プロカルバジン、ダカルバジン、及びアルトレタミン代謝拮抗物質、以下の葉酸の拮抗物質、例えば、メトトレキセート及びトリメトレキサート；ピリミジンの拮抗物質、例えば、フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ＣＢ３７１７、アザシチジン、シタラビン；フロクスリジン、プリンの拮抗物質、例えば、メルカプトプリン、６−チオグアニン、フルダラビン、ペントスタチン；糖変性類似体、例えば、シクトラビン、フルダラビン；リボヌクレオチド還元酵素阻害剤、例えば、ヒドロキシウレア；チューブリン相互作用剤、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、及びパクリタキセル；副腎皮質ステロイド、例えば、プレドニゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、及びプレドニゾロン；ホルモン遮断剤、例えば、エストロゲン、共役エストロゲン、及びエチニルエストラジオール及びジエチルスチルベステロール、クロルトリアニセン、及びイデネストロール；プロゲスチン、例えば、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート、メドロキシプロゲステロン、及びメゲストロール；アンドロゲン、例えば、テストステロン、テストステロンプロピオネート；フルオキシメステロン、メチルテストステロンエストロゲン、共役エストロゲン、及びエチニルエストラジオール及びジエチルスチルベステロール、クロルトリアニセン、及びイデネストロールから選択される。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド及びさらなる治療剤は、単一剤形または別個の剤形で投与される。いくつかの実施形態では、方法は、治療手順と組み合わせて本明細書に開示のＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを投与することを含む。追加または相乗的な利益をもたらす手順としては、照射（例えば、90Ｓｒ療法）、結膜自家移植、または羊膜移植、または手術が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
ほんの一例として、本明細書に記載されるＶＥＧＦ変異体ポリペプチドのうちの１つを投与して個体が経験した副作用の１つが吐き気である場合、その場合、制吐剤を初期の治療剤と組み合わせて投与することが適当である。あるいは、ほんの一例として、本明細書に記載される治療剤の１つの治療効果は、アジュバントの投与によって増強される（すなわち、アジュバント単独では、最小限の治療効果であるが、別の治療剤を組み合わせると、患者に対する全体の治療効果は増強される）。あるいは、ほんの一例として、個体が経験した効果は、本明細書に記載される治療剤の１つを治療効果も有する（治療計画も含む）別の治療剤と投与することによって増加される。いずれにしても、治療を受けている疾患または障害に関わらず、患者が経験した全体の効果は、２種の治療剤の単なる相加効果であるかまたは他の実施態様では、患者は相乗効果を経験する。
【００９８】
使用される薬剤の具体的な選択は、顧問医の診断、及び患者の病状のその判断、並びに適当な治療プロトコルに依存するであろう。薬剤は、患者の障害または病状の性質、及び使用される薬剤の実際の選択に依存して、必要に応じて、同時に（例えば、同時に、本質的に同時に、または同一治療プロトコル内で）または連続して任意に投与される。投与順序の決定、及び治療プロトコル中の各治療剤の投与の繰り返し数は、治療を受けている疾患及び患者の症状の評価に基づく。
【００９９】
いくつかの実施形態では、治療的に効果的な投与量は、薬物が治療組み合わせに用いられる場合に変化する。併用治療計画に用いるための薬物及び他の薬剤の治療的に効果的な投与量を実験的に決定する方法は、文献に記載されている。例えば、メトロノームのような投薬の使用、すなわち、毒性副作用を最小にするために頻度を多く、用量を少量にすることは、文献に広く記載されている。併用治療には、患者の臨床管理を支援するために種々の時間で開始及び中断する定期的治療がさらに含まれる。
【０１００】
医薬製剤
いくつかの実施形態では、治療のために本明細書に開示の薬剤を原料として使用することも可能であるが、例えば、意図する投与形路及び標準的な薬務について選択される適当な医薬賦形剤、希釈剤、または担体と混合して、薬剤を医薬製剤として投与することが好ましい。医薬製剤には、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、及び／または担体と関連して少なくとも１つの活性化合物が含まれる。いくつかの実施形態では、用量及び投与頻度は、例えば、本方法で治療した症状の疾患の臨床徴候、病理学的徴候、並びに臨床及び亜臨床的症状、並びに患者の臨床履歴を考慮しながら、治療している医師の判断に基づいて調整される。例えば、より高い用量、投与頻度の増加、またはより長い治療期間は、患者が翼状片の症状、またはケロイド再発（例えば、血管成長）を示している場合、または患者が翼状片の既往歴、またはケロイド再発を有する場合に示される。
【０１０１】
ポリペプチドの製剤は、診断及び治療での使用が見出される。いくつかの実施形態では、製剤は、１つ、２つ、またはそれ以上のポリペプチドまたは薬剤を含む。いくつかの実施形態では、治療製剤は、他の治療方法、例えば、化学療法、放射線治療、手術などを併用して投与される。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、製剤は、標的部位での保持及び安定化のために最適化される。安定化技術には、安定化技術は、分子量の増大を達成するために、架橋する、多量体化する、またはポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、中性タンパク質担体、Ｆｃ融合体などのような基に連結することにより、ポリペプチドのサイズを増大させることが含まれる。保持を増大させるために他の戦略は、ポリペプチドを生分解性、または生腐食性インプラント、またはバイオゲル、または非生体内分解性ポリマーリザーバにより封入することを含む。保持を増大させるためにさらに他の戦略は、ポリペプチドを生分解性、または生腐食性インプラント、またはバイオゲル、または非生体内分解性ポリマーリザーバにより化学封入することを含み、化学結合の劣化によって、ポリペプチドをリザーバに徐放する。治療活性薬剤の放出速度は、ポリマーマトリクスを通過する輸送の速度、及びインプラントの生体内分解によって制御される。ポリマー障壁を通過するポリペプチドの輸送はまた、化合物の溶解度、ポリマーの親水性、ポリマーの架橋の程度、ポリマー障壁を薬物に対してより透過性にするための水吸収後のポリマーの膨張、インプラントの形状などによっても影響される。インプラントは、移植の部位として選択される領域の大きさと形状に相応した寸法である。いくつかの実施形態では、インプラントには、例えば、粒子、シート、パッチ、プラーク、繊維、またはマイクロカプセルが含まれ、選択される挿入部位と適合性の任意の大きさまたは形状である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、所望する製剤に応じて、動物またはヒトへの投与用の医薬組成物を製剤するために一般的に使用されるビヒクルと定義される、医薬的に許容される非毒性の担体または希釈剤を含む。希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ、リンガー液、デキストロース溶液、及びハンクス液である。いくつかの実施形態では、医薬組成物または製剤は、他の担体、アジュバント、または非毒性、非治療性、非免疫原性安定剤、賦形剤などを含む。いくつかの実施形態では、組成物はまた、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤、及び界面活性剤などの、生理的条件に近づけるためのさらなる物質も含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、組成物は、様々な安定剤のいずれか、例えば、抗酸化剤などを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ペプチドのインビボでの安定性を高める、またはさもなければその薬理学的特性を増強する（例えば、ポリペプチドの半減期を延長させる、その毒性を低減する、溶解度または取り込みを増強する）様々な周知の化合物と複合体を形成する。そのような改変または複合体化剤の例としては、硫酸塩、グルコン酸塩、クエン酸塩、及びリン酸塩が挙げられる。いくつかの実施形態では、組成物のペプチドは、それらのインビボでの属性を増強する分子と複合体を形成する。そのような分子としては、例えば、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン）、及び脂質が挙げられる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、予防的及び／または治療的処置のために投与される。いくつかの実施形態では、有効成分の毒性及び治療効果は、例えば、ＬＤ50（集団の５０％に対して致死的な用量）及びＥＤ50（集団の５０％において治療的に有効な用量）を測定することを含む、細胞培養物及び／または実験動物における標準的な医薬的手順に従って決定される。毒性作用と治療効果との間の用量比が治療指数であり、ＬＤ50／ＥＤ50比として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、細胞培養及び／または動物実験から得られたデータを、ヒトについての投与量の範囲を策定する際に使用する。有効成分の投与量は、典型的には、低い毒性でＥＤ50を含む循環濃度範囲内にある。いくつかの実施形態では、投与量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に依存してこの範囲内で変化する。
【０１０７】
本明細書に記載される医薬組成物は、様々な異なる方法で投与される。例としては、経口、鼻内、経直腸、局所、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ、ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）、経皮、髄腔内、及び頭蓋内方法によって医薬的に許容される担体を含有する組成物を投与することを含む。
【０１０８】
例えば、静脈内、病巣内、筋肉内、皮内、腹腔内、及び皮下経路などによる非経口投与に適した製剤は、いくつかの実施形態では、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、及び製剤を意図される受容者の血液と等張にする溶質を含有する、水性及び非水性の等張滅菌注射溶液、並びにいくつかの実施形態では、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び防腐剤を含有する水性及び非水性の滅菌懸濁液を含む。
【０１０９】
医薬組成物を製剤するために使用される成分は、好ましくは高純度であり、潜在的に有害な夾雑物を実質的に含まない（例えば、少なくともナショナルフード（ＮＦ）等級、一般には少なくとも分析等級、より典型的には少なくとも医薬品等級）。さらに、インビボでの使用を意図される組成物は、通常は無菌である。所与の化合物を使用前に合成しなければならない限り、いくつかの実施形態では、得られる生成物は、典型的には、合成または精製工程の間に存在するいかなる潜在的毒性物質、特にいかなる内毒素も実質的に含まない。非経口投与用の組成物もまた無菌で、実質的に等張であり、ＧＭＰ条件下で製造される。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、翼状片を治療するための眼科用製剤である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、翼状片を治療するための眼科用製剤として提供される。いくつかの実施形態では、眼科用製剤は、結膜粘膜に塗布する結膜局所使用のための任意の製剤を含む。いくつかの実施形態では、眼科用製剤は、眼の症状（例えば、翼状片）を治療するための液体製剤（例えば、水性または油性溶液、または懸濁液）、または固体製剤（例えば、軟膏、粉末）である。いくつかの実施形態では、眼科用製剤は、軟膏である。いくつかの実施形態では、眼科用製剤は、クリームである。いくつかの実施形態では、他の物質は、製剤中で賦形剤として存在し、酸化防止剤及び粘弾性化合物、またはビヒクル、防腐剤、緩衝溶液、浸透及び乳化物質（または張力）が挙げられる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、組成物は、耐性をより良くするために使用され得るポリエチレングリコール、またはワセリン及び非イオン乳化物質（または張力）（ポリソルベートなど）などの１つ以上の賦形剤を含む。局所使用のための眼科用製剤は、許容可能なｐＨ（一般的に６．４〜７．８の範囲）の、無菌で、外因性粒子が無く、かつ、３００ｍＯｓｍ／Ｌあたり、または約２００〜約３５０ｍＯｓｍ／Ｌの間のどこかの涙−等張性浸透圧で調製することが好ましい。
【０１１２】
翼状片を治療するための外科手術は、翼状片頭部を剥離及び除去した後、結膜縫合によって、十分な部分の裸強膜を残すかまたは強角膜輪部まで組織を付着させることからなる。いくつかの実施形態では、結膜再構成は、組織のスライド、あるいは結膜の自家移植を介する必要がある。この種の手順後、最も一般的な手術後の合併症としては、感染、結膜嚢胞、または眼球運動を制限する付着傷跡が挙げられる。手術治療後、ケースの１０〜８０％の範囲の罹患率で、より高い増殖指数を持つより侵襲性が強い形態の再発を発症する可能性が残っている。従って、いくつかの実施形態では、本発明による点眼薬の利用は有利である。いくつかの実施形態では、翼状片成長を防止または遅らせ、外科的介入の必要性及び手術後の合併症を減らす。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、眼科化合物は、水性またはハイドロ水溶性溶媒（例えば、アルコール）中の点眼薬、ゲル、クリーム、または軟膏として処方される。例示の水溶性溶媒としては、リン酸、またはリン酸クエン酸塩、またはＴＲＩＳ緩衝液、または、ヒスチジン、トリシン、リジン、グリシン、及び／またはセリンを含有する緩衝液が挙げられる。いくつかの実施形態では、溶媒は、酸性または塩基性成分をもつ正しい生理学的ｐＨに調整される。いくつかの実施形態では、溶解度を増加させる薬剤、防腐剤、粘弾性物質（好ましくは、０．１〜１０％ｖ／ｖの範囲）（ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール、脂肪酸とポリエチレングリコールの混合物など）、またはセルロース（ヒドロキシル−プロピル−メチルセルロースなど）が存在する。潜在的に、酸化防止物質、例えば、１〜１５％ｖ／ｖの範囲のアスコルビン酸、及びＥＤＴＡなどのキレート剤も、製剤中に含有する。
【０１１４】
有効量のポリペプチドを決定するために、投与経路、放出系（例えば、ピル、ゲル、または他のマトリクス）の動態、及び薬剤の効力は、有害な副作用を最小にして所望の効果を達成するように考えられる。本発明のポリペプチドの投与量は、ＶＥＧＦまたはＰＤＧＦアンタゴニストと比較して効力及び／または効果に従って調整される。いくつかの実施形態では、用量は、約０．００１μｇ〜１００ｍｇの範囲であり、１日１〜２０回与え、１日当たりの総用量は、最大で約０．０１μｇ〜１００ｍｇである。いくつかの実施形態では、全身効果の目的のために局所に塗布する場合、パッチまたはクリームは、約０．０１μｇ〜１００ｍｇの範囲で用量の全身送達をもたらすように設計される。いくつかの実施形態では、全身効果の目的のために注射する場合、ポリペプチドを投与するマトリクスは、約０．００１μｇ〜１ｍｇの範囲で用量の全身送達をもたらすように設計される。局所効果の目的のために注射する場合、マトリクスは、約０．００１μｇ〜１００ｍｇの範囲でＶＥＧＦ変異体ポリペプチドの量を局所放出するように設計される。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、治療のために本明細書に開示の薬剤を原料として使用することも可能であるが、例えば、意図する投与形路及び標準的な薬務について選択される適当な医薬賦形剤、希釈剤、または担体と混合して、薬剤を医薬製剤として投与することが好ましい。医薬製剤には、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、及び／または担体と関連して少なくとも１つの活性化合物が含まれる。いくつかの実施形態では、用量及び投与頻度は、例えば、本方法で治療した症状の疾患の臨床徴候、病理学的徴候、並びに臨床及び亜臨床的症状、並びに患者の臨床履歴を考慮しながら、治療している医師の判断に基づいて調整される。例えば、より高い用量、投与頻度の増加、またはより長い治療期間は、患者が翼状片の症状、またはケロイド再発（例えば、血管成長）を示している場合、または患者が翼状片の既往歴、またはケロイド再発を有する場合に示される。
【０１１６】
ポリペプチドの製剤は、診断及び治療での使用が見出される。いくつかの実施形態では、製剤は、１つ、２つ、またはそれ以上のポリペプチドまたは薬剤を含む。いくつかの実施形態では、治療製剤は、他の治療方法、例えば、化学療法、放射線治療、手術などを併用して投与される。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、製剤は、標的部位での保持及び安定化のために最適化される。安定化技術には、安定化技術は、分子量の増大を達成するために、架橋する、多量体化する、またはポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、中性タンパク質担体、Ｆｃ融合体などのような基に連結することにより、ポリペプチドのサイズを増大させることが含まれる。保持を増大させるために他の手法は、ポリペプチドを生分解性、または生腐食性インプラント、またはバイオゲル、または非生体内分解性ポリマーリザーバにより封入することを含む。治療活性薬剤の放出速度は、ポリマーマトリクスを通過する輸送の速度、及びインプラントの生体内分解によって制御される。ポリマー障壁を通過するポリペプチドの輸送はまた、化合物の溶解度、ポリマーの親水性、ポリマーの架橋の程度、ポリマー障壁を薬物に対してより透過性にするための水吸収後のポリマーの膨張、インプラントの形状などによっても影響される。インプラントは、移植の部位として選択される領域の大きさと形状に相応した寸法である。いくつかの実施形態では、インプラントには、例えば、粒子、シート、パッチ、プラーク、繊維、またはマイクロカプセルが含まれ、選択される挿入部位と適合性の任意の大きさまたは形状である。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、眼科用組成物は翼状片を治療するための眼科用製剤である。いくつかの実施形態では、眼科用製剤は、結膜粘膜に塗布する結膜局所使用のための任意の製剤を含む。いくつかの実施形態では、眼科用製剤は、眼の症状（例えば、翼状片）を治療するための液体製剤（例えば、水性または油性溶液、または懸濁液）、または固体製剤（例えば、軟膏、粉末）である。いくつかの実施形態では、眼科用製剤は、軟膏である。いくつかの実施形態では、眼科用製剤は、クリームである。いくつかの実施形態では、他の物質は、製剤中で賦形剤として存在し、酸化防止剤及び粘弾性化合物、またはビヒクル、防腐剤、緩衝溶液、浸透及び乳化物質（または張力）が挙げられる。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、組成物は、耐性をより良くするために使用され得るポリエチレングリコール、またはワセリン及び非イオン乳化物質（または張力）（ポリソルベートなど）などの１つ以上の賦形剤を含む。局所使用のための眼科用製剤は、許容可能なｐＨ（一般的に６．４〜７．８の範囲）の、無菌で、外因性粒子が無く、かつ、３００ｍＯｓｍ／Ｌあたり、または約２００〜約３５０ｍＯｓｍ／Ｌの間のどこかの涙−等張性浸透圧で調製することが好ましい。いくつかの実施形態では、眼科化合物は、水性またはハイドロ水溶性溶媒（例えば、アルコール）中の点眼薬、ゲル、クリーム、または軟膏として処方される。例示の水溶性溶媒としては、リン酸、またはリン酸クエン酸塩、またはＴＲＩＳ緩衝液、または、ヒスチジン、トリシン、リジン、グリシン、及び／またはセリンを含有する緩衝液が挙げられる。いくつかの実施形態では、溶媒は、酸性または塩基性成分をもつ正しい生理学的ｐＨに調整される。いくつかの実施形態では、溶解度を増加させる薬剤、防腐剤、粘弾性物質（好ましくは、０．１〜１０％ｖ／ｖの範囲）（ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール、脂肪酸とポリエチレングリコールの混合物など）、またはセルロース（ヒドロキシル−プロピル−メチルセルロースなど）が存在する。潜在的に、酸化防止物質、例えば、１〜１５％ｖ／ｖの範囲のアスコルビン酸、及びＥＤＴＡなどのキレート剤も、製剤中に含有する。
【０１２０】
本明細書で開示されるものは、いくつかの実施形態では、それを必要とする対象における眼の障害、例えば、翼状片を治療する方法である。いくつかの実施形態では、方法は、本発明のポリペプチド及びさらなる治療剤を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、またはアンジオテンシン（ＡＮＧ）、及び関連受容体の阻害剤である。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、インテグリンの阻害剤、マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、または前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の阻害剤である。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、抗体、ポリペプチド、ヌクレオチド、小分子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロテプレドノールエタボネート（ＬＥ）、経口ドキシサイクリン、ジピリダモール、及びドベシル酸からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、抗炎症性ステロイドである。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、非ステロイド性抗炎症薬である。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、抗体、またはＶＥＧＦシグナル伝達の小分子阻害剤である。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、すでに作製されているＶＥＧＦの効果を縛り、捕捉し、スカベンジし、あるいは阻止する。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド及びさらなる治療剤は、単一剤形または別個の剤形で投与される。いくつかの実施形態では、方法は、治療手順と組み合わせて本明細書に開示のポリペプチドを投与することを含む。追加または相乗的な利益をもたらす手順としては、照射（例えば、90Ｓｒ療法）、結膜自家移植、または羊膜移植、または手術が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
ほんの一例として、本明細書に記載される治療剤の１つの治療効果は、アジュバントの投与によって増強される（すなわち、アジュバント単独では、最小限の治療効果であるが、別の治療剤を組み合わせると、患者に対する全体の治療効果は増強される）。あるいは、ほんの一例として、個体が経験した効果は、本明細書に記載される治療剤の１つを治療効果も有する（治療計画も含む）別の治療剤と投与することによって増加される。いずれにしても、治療を受けている疾患または障害に関わらず、患者が経験した全体の効果は、２種の治療剤の単なる相加効果であるかまたは他の実施態様では、患者は相乗効果を経験する。
【０１２３】
使用される薬剤の具体的な選択は、顧問医の診断、及び患者の病状のその判断、並びに適当な治療プロトコルに依存するであろう。薬剤は、患者の障害または病状の性質、及び使用される薬剤の実際の選択に依存して、必要に応じて、同時に（例えば、同時に、本質的に同時に、または同一治療プロトコル内で）または連続して任意に投与される。投与順序の決定、及び治療プロトコル中の各治療剤の投与の繰り返し数は、治療を受けている疾患及び患者の症状の評価に基づく。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、治療的に効果的な投与量は、薬物が治療組み合わせに用いられる場合に変化する。併用治療計画に用いるための薬物及び他の薬剤の治療的に効果的な投与量を実験的に決定する方法は、文献に記載されている。例えば、メトロノームのような投薬の使用、すなわち、毒性副作用を最小にするために頻度を多く、用量を少量にすることは、文献に広く記載されている。併用治療には、患者の臨床管理を支援するために種々の時間で開始及び中断する定期的治療がさらに含まれる。
【０１２５】
別の態様では、本発明のポリペプチドを含む医薬組成物は、生分解性材料を含む眼科デバイスに組み込まれ、該デバイスは、翼状片などの眼の症状の長期（例えば、約１週間以上、または約１、２、３、４、５、または６ヵ月間以上）治療をもたらすように対象に埋め込まれる。そのようなデバイスは、熟練した医師によって対象の眼組織または眼周囲組織中に埋め込まれる。
【０１２６】
本明細書に記載されるポリペプチドを含む医薬組成物によって症状を治療する方法は、手術治療法及び既存の生物学的薬剤の両方を上回る利点を提供する。非外科的介入は、早期または進行期の翼状片には存在しない。さらに、血管及び線維組織成分の除去に完全に成功した場合であっても、手術は、翼状片の再発を防止できない。翼状片を切除するために侵襲手術を繰り返すことは、著しいリスクをもたらす。従って、既存の翼状片の成長を制御し、及び／または手術切除後の翼状片の再発を防止するポリペプチドを含む医薬組成物は有利である。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドを含む医薬組成物は、翼状片部位またその近くに、例えば、病巣内注射、結膜下注射、または他の直接塗布によって手術中及び／または手術直後に投与される。いくつかの実施形態では、一連の治療は、上記の要素、例えば、注射または他の技術による手術中及び／または手術後の投与と、手術後数日、数週間、及び／または数カ月にわたる在宅（診察室外）投与点眼薬または他の局所投与手段を併用する。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドを含む医薬組成物は、手術の代わりに症状を治療し、進行を止め、または症状の後退を誘発するために使用される。本発明のポリペプチドを含む医薬組成物が特に効果的であることを示す場合には、そうでなければ翼状片手術を選択していたであろう患者及び医師は、手術の代わりに医薬組成物のみの治療を選択して、手術のコスト、時間、痛み、及びリスクを回避することができる。手術せずに医薬組成物から恩恵を受ける他の患者のクラスとしては、手術を受ける資格がない患者、手術する余裕がない患者、及び手術を受ける資格があるが、そうしないことを選択する患者が挙げられる。第２に、過去及び現在の技術では再発率が許容できないほど高く、または眼組織の移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎまたはｔｒａｎｓｆｅｒ）を含む非常に複雑な形態の手術を必要とするため、医薬組成物は、手術中及び／または手術後に、特に再発防止のために使用することができる。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、治療方法は、本発明のポリペプチドを含む医薬組成物の投与と併用した専門的介入を伴う。例えば、いくつかの実施形態では、治療方法は、まず、上皮または表面の線維芽細胞層などの翼状片の表面層を創傷清拭した後に、本発明のポリペプチドを含む医薬組成物の投与を伴う。投与は、局所または病巣内であってもよい。いくつかの実施形態では、創傷清拭は、例えば、内皮細胞、線維芽細胞、または他の細胞をポリペプチドの抗血管新生、抗成長、及び／または抗移動効果に暴露することによって、あるいは病変への侵入を高めることによって医薬組成物の効果を可能にするかまたは増強する、より簡素で、安価で、より短期間で、及びリスクの低い介入である。
【０１２８】
既存の生物製剤は、効果を本質的に制限する血管新生を仲介するリガンド−受容体相互作用のサブセットのみを標的にしている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、多数の受容体を標的にし、いくつかまたは単一の受容体を標的にする薬剤と比較して、優れた効果を示す。さらに、ポリペプチド組成物は、可溶性増殖因子足場を利用し、抗体、抗体断片、または抗体Ｆｃドメインに融合している受容体細胞外ドメインのいずれかである既存の生物製剤（５０〜１５０ｋＤａ）と比較した場合にサイズが著しく小さい（２５ｋＤａ）。従って、既存の生物製剤の大きなサイズは、注射を介する送達（結膜下）を必要とするが、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドを含む医薬組成物は、局所投与される。これは、患者のコンプライアンス負担、及び治療コストの著しい減少を表す。
【０１２９】
理想的には、翼状片の治療は、手術後に再発率を低下させるためであろうと、または手術の代わりに進行を止めるかまたは後退を誘発するためであろうと、簡単かつ安全に投与されるものであり、例えば、局所点眼薬、または粘性ゲルもしくは軟膏などの他の同様の製剤である。好ましい治療方法は、治療期間当たり１回または１カ月に１回の低頻度で自己投与する局所点眼薬である。あまり好ましくないが、それでも十分に満足なものは、注射の時間、コスト、痛み、及びリスクを回避するため、より頻繁な自己投与の局所製剤である。例えば、点眼薬、ゲル、または軟膏は、週１回、週２回、１日１回、または１日２回、または１日３回、または１日４回、診察室外で適用される。
【０１３０】
投与経路
いくつかの実施形態では、本明細書に開示のＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含む医薬組成物は、局所、または非経口、または当該技術分野で知られている任意の他の適当な方法によって投与される。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含む医薬組成物は、眼科局所製剤、眼科注射用製剤として、または眼科インプラントで使用するために処方される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含む医薬組成物は、結膜下注射または病巣内注射を介して投与される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含む医薬組成物は、眼に局所投与される。
【０１３２】
「非経口」という用語には、ビヒクルまたはデバイスを介した注射、または沈着、または徐放（例えば、静脈内、結膜下、テノン嚢下、強膜、強膜内、強膜下、腹腔内、硬膜外、髄腔内、筋肉内、管腔内、気管内、表皮、皮内、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）、または皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ））が挙げられる。さらに、いくつかの実施形態では、本明細書に開示の併用療法で投与される異なる薬剤は、異なる経路によって投与される。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に開示のＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、眼または皮膚に注射され、または局所塗布される。抗炎症性ステロイド及び／またはＮＳＡＩＤは、（例えば、注射によって）全身、経口、及び／または局所、例えば、眼または皮膚に投与される。投与方法の非限定例としては、皮下注射、静脈内注射、及び輸液が挙げられる。いくつかの実施形態では、投与は、皮下投与である。いくつかの実施形態では、投与は、例えば、静脈内注射、ボーラス注射、５分〜約５時間にわたる輸液、ピル、カプセル、経皮パッチ、口腔送達など、またはそれらの組み合わせなどの実用的な任意の経路を介してである。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含む医薬組成物は、局所投与、全身投与、眼周囲注射、または硝子体内注射用の製剤に組み込まれる。いくつかの実施形態では、注射用の硝子体内製剤は、有効成分を、例えば、約１週間以上（または、約１、２、３、４、５、または６ヵ月間以上）の徐放をもたらす担体を含む。いくつかの実施形態では、徐放製剤は、硝子体内で不溶性または難溶性である担体を含むことが望ましい。いくつかの実施形態では、そのような担体は、油性液体、乳剤、ゲル、または半固体である。油性液体の非限定例としては、ヒマシ油、ピーナッツ油、オリーブ油、ヤシ油、ごま油、綿実油、コーン油、ひまわり油、魚肝油、落花生油、及び流動パラフィンが挙げられる。
【０１３４】
１つの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含む医薬組成物は、２５〜３４ゲージなどのファインゲージニードルを用いて、翼状片またはその進行を治療または防止するために、例えば、毛様体の扁平部を介して硝子体内に注射される。
【０１３５】
別の態様では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含む医薬組成物は、生分解性材料を含む眼科デバイスに組み込まれ、該デバイスは、眼の症状の長期（例えば、約１週間以上、または約１、２、３、４、５、または６ヵ月間以上）治療をもたらすように対象に埋め込まれる。そのようなデバイスは、熟練した医師によって対象の眼組織または眼周囲組織中に埋め込まれる。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、治療方法は、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含む医薬組成物の投与と併用した専門的介入を伴う。
【０１３７】
本明細書に記載されるＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含む医薬組成物によって症状を治療する方法は、従来の治療の両方を上回る利点を提供する。例えば、翼状片に対して、非外科的介入は、早期または進行期の翼状片には存在しない。さらに、血管及び線維組織成分の除去に完全に成功した場合であっても、手術は、翼状片の再発を防止できない。翼状片を切除するために侵襲手術を繰り返すことは、著しいリスクをもたらす。従って、既存の翼状片の成長を制御し、及び／または手術切除後の翼状片の再発を防止するＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含む医薬組成物は有利である。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドまたはＦｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド融合体を含む医薬組成物は、手術部位またその近くに、例えば、病巣内注射、結膜下注射、または他の直接塗布によって血管新生障害を治療するために、手術中及び／または手術直後に投与される。いくつかの実施形態では、一連の治療は、上記の要素、例えば、注射または他の技術による手術中及び／または手術後の投与と、手術後数日、数週間、及び／または数カ月にわたる在宅（診察室外）投与点眼薬または他の局所投与手段を併用する。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドまたはＦｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド融合体を含む医薬組成物は、手術の代わりに症状を治療し、進行を止め、または症状の後退を誘発するために使用される。ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドまたはＦｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド融合体を含む医薬組成物が特に効果的であることを示す場合には、そうでなければ手術を選択していたであろう患者及び医師は、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドまたはＦｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド融合体を含む医薬組成物のみの治療を手術の代わりに選択して、手術のコスト、時間、痛み、及びリスクを回避することができる。手術せずにＶＥＧＦ変異体ポリペプチドまたはＦｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド融合体を含む医薬組成物から恩恵を受ける他の患者のクラスとしては、手術を受ける資格がない患者、手術する余裕がない患者、及び手術を受ける資格があるが、そうしないことを選択する患者が挙げられる。第２に、過去及び現在の技術では再発率が許容できないほど高く、または眼組織の移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎまたはｔｒａｎｓｆｅｒ）を含む非常に複雑な形態の手術を必要とするため、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドまたはＦｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド融合体を含む医薬組成物は、手術中及び／または手術後に、特に再発防止のために使用することができる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、治療方法は、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドまたはＦｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド融合体を含む医薬組成物の投与と併用した専門的介入を伴う。例えば、いくつかの実施形態では、治療方法は、まず、翼状片の創傷清拭などの外科的介入した後に、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドまたはＦｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド融合体を含む医薬組成物の投与を伴う。いくつかの実施形態では、外科的介入は、例えば、内皮細胞、線維芽細胞、または他の細胞をＶＥＧＦ変異体ポリペプチドまたはＦｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド融合体の抗血管新生、抗成長、及び／または抗移動効果に暴露することによって、あるいは病変への侵入を高めることによってＶＥＧＦ変異体ポリペプチドまたはＦｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド融合体を含む医薬組成物の効果を可能にするかまたは増強する。
【０１４１】
既存の抗ＶＥＧＦ治療は、投与方法のために理想的ではない。既存の生物製剤は、効果を本質的に制限する血管新生を仲介するリガンド−受容体相互作用のサブセットのみを標的にしている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＶＥＧＦ変異体ポリペプチド及びＦｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド融合体は、多数の受容体を標的にし、いくつかまたは単一の受容体を標的にする薬剤と比較して、優れた効果を示す。さらに、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド及びＦｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド融合体組成物は、可溶性増殖因子足場（ＶＥＧＦ自体）を利用し、抗体、抗体断片、または抗体Ｆｃドメインに融合している受容体細胞外ドメインのいずれかである既存の生物製剤（５０〜１５０ｋＤａ）と比較した場合にサイズが著しく小さい（２５ｋＤａ）。従って、既存の生物製剤の大きなサイズは、注射を介する送達（結膜下）を必要とするが、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＶＥＧＦ変異体ポリペプチドまたはＦｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド融合体を含む医薬組成物は、局所投与される。これは、患者のコンプライアンス負担、及び治療コストの著しい減少を表す。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物は、局所点眼薬、または粘性ゲルもしくは軟膏などの他の同様の製剤として投与される。いくつかの実施形態では、局所点眼薬は、治療期間当たり１回または１カ月に１回の低頻度で自己投与される。いくつかの実施形態では、局所点眼薬は、週１回、週２回、１日１回、または１日２回、または１日３回、または１日４回投与される。
【０１４３】
用量及び治療レジメン
いくつかの実施形態では、対象、特に、ヒトに投与されるＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含む医薬組成物の用量は、合理的な時間枠にわたって対象における血管新生の治療的減少を達成するために十分である。いくつかの実施形態では、用量は、用いられる特定のペプチドの効力及び対象の症状と共に、治療される対象の体重によって決定される。用量の大きさはまた、特定の化合物の投与を伴う任意の有害な副作用の存在、性質、及び程度によって決定されるであろう。
【０１４４】
治療で使用するために必要な本明細書に開示のＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含む医薬組成物の量は、投与経路、治療が必要な症状の性質、及び患者の年齢、体重、及び症状によって異なり、最終的には主治医または獣医の裁量であることが理解されるであろう。組成物は通常、有効量の活性剤（複数可）を単体または組み合わせで含有する。いくつかの実施形態では、予備的用量は、動物試験によって決定され、ヒト投与用の投与量のスケーリングは、技術認可された慣例に従って行われる。
【０１４５】
有効量のＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを決定するために、投与経路、放出系（例えば、ピル、ゲル、または他のマトリクス）の動態、及びアンタゴニストの効力は、有害な副作用を最小にして所望の効果を達成するように考えられる。
【０１４６】
ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドの投与量は、ＶＥＧＦアンタゴニストと比較して効力及び／または効果に従って調整される。いくつかの実施形態では、用量は、約０．００１μｇ〜１００ｍｇの範囲であり、１日１〜２０回与え、１日当たりの総用量は、最大で約０．０１μｇ〜１００ｍｇである。いくつかの実施形態では、全身効果の目的のために局所に塗布する場合、パッチまたはクリームは、約０．０１μｇ〜１００ｍｇの範囲で用量の全身送達をもたらすように設計される。いくつかの実施形態では、全身効果の目的のために注射する場合、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを投与するマトリクスは、約０．００１μｇ〜１ｍｇの範囲で用量の全身送達をもたらすように設計される。局所効果の目的のために注射する場合、マトリクスは、約０．００１μｇ〜１００ｍｇの範囲でＶＥＧＦ変異体ポリペプチドの量を局所放出するように設計される。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含む医薬組成物の投与量範囲は、当業者によって決定され、例えば、当該技術分野で知られている標準方法に従って投与量、安全性、及び効力を決定するために、動物モデルでまず決定される。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含む医薬組成物の治療的有効量は、対象の体重１ｋｇ当たりのＶＥＧＦ変異体ポリペプチドのｍｇとして表される。いくつかの実施形態では、治療的有効量は、１〜１，０００ｍｇ／ｋｇ、１〜５００ｍｇ／ｋｇ、１〜２５０ｍｇ／ｋｇ、１〜１００ｍｇ／ｋｇ、１〜５０ｍｇ／ｋｇ、１〜２５ｍｇ／ｋｇ、または１〜１０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、有効量は、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ、９００ｍｇ／ｋｇ、１，０００ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、約１５０ｍｇ／ｋｇ、約２００ｍｇ／ｋｇ、約２５０ｍｇ／ｋｇ、約３００ｍｇ／ｋｇ、約４００ｍｇ／ｋｇ、約５００ｍｇ／ｋｇ、約６００ｍｇ／ｋｇ、約７００ｍｇ／ｋｇ、約８００ｍｇ／ｋｇ、約９００ｍｇ／ｋｇ、または約１，０００ｍｇ／ｋｇである。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、治療的有効量は、対象の体面積１ｍ2 当たりの化合物のｍｇとして表される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含む医薬組成物は、用量の範囲、例えば、１〜１５００ｍｇ（０．６〜９３８ｍｇ／ｍ2 ）、または２〜８００ｍｇ（１．２５〜５００ｍｇ／ｍ2 ）、または５〜５００ｍｇ（３．１〜３１２ｍｇ／ｍ2 ）、または２〜２００ｍｇ（１．２５〜１２５ｍｇ／ｍ2 ）、または１０〜１０００ｍｇ（６．２５〜６２５ｍｇ／ｍ2 ）で皮下投与され、用量の特定の例としては、１０ｍｇ（６．２５ｍｇ／ｍ2 ）、２０ｍｇ（１２．５ｍｇ／ｍ2 ）、５０ｍｇ（３１．３ｍｇ／ｍ2 ）、８０ｍｇ（５０ｍｇ／ｍ2 ）、１００ｍｇ（６２．５ｍｇ／ｍ2 ）、２００ｍｇ（１２５ｍｇ／ｍ2 ）、３００ｍｇ（１８７．５ｍｇ／ｍ2 ）、４００ｍｇ（２５０ｍｇ／ｍ2 ）、５００ｍｇ（３１２．５ｍｇ／ｍ2 ）、６００ｍｇ（３７５ｍｇ／ｍ2 ）、７００ｍｇ（４３７．５ｍｇ／ｍ2 ）、８００ｍｇ（５００ｍｇ／ｍ2 ）、９００ｍｇ（５６２．５ｍｇ／ｍ2 ）及び１０００ｍｇ（６２５ｍｇ／ｍ2 ）が挙げられる。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含む医薬組成物は、予防的及び／または治療的処置用に投与される。治療的用途では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含む医薬組成物は、障害にすでに苦しんでいる個体に、障害の症状を治癒するかまたは少なくとも部分的に抑えるために十分な量で投与される。この使用に効果的な量は、障害の重症度及び経過、以前の治療、患者の健康状態、体重、及び薬物に対する反応、及び処置を行う医師の判断に依存する。
【０１５１】
予防的用途では、本明細書に記載されるＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含む医薬組成物は、特定の疾患または障害を罹患しやすい、あるいはその危険性のある個体に投与される。そのような量は、「予防的に有効な量または用量」であると定義される。この使用では、正確な量は、患者の健康状態、体重などにも依存する。個体に使用する場合、この使用に効果的な量は、疾患、障害の重症度及び経過、以前の治療、患者の健康状態、及び薬物に対する反応、及び処置を行う医師の判断に依存する。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含む医薬組成物は、例えば、１日３回、１日２回、１日１回、１日おき、または３日おきのように、定期的に患者に投与される。他の実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含む医薬組成物は、例えば、１日２回、その後１日１回、その後１日３回、または毎週の最初の２日、あるいは週の初日、２日目、３日目といったように、断続的に患者に投与される。いくつかの実施形態では、断続的な投薬は、標準の投薬と同様に効果的である。患者の疾病が改善しない場合では、医者の判断に基づき、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含む医薬組成物の投与は、常習的に、すなわち、患者の障害の症状を寛解させる、あるいは制御または制限するために、患者の寿命全体の間などを含む長期間、投与される。
【０１５３】
患者の状態が改善する場合では、医者の判断に基づき、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含む医薬組成物の投与は、連続的に与えられ、あるいは、投与される薬物の用量は、特定の期間、一時的に減らされ、または一時的に中止される（すなわち、「休薬期間」）。いくつかの実施形態では、休薬期間の長さは、２日と１年の間（ほんの一例として、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、１５日、２０日、２８日、３５日、５０日、７０日、１００日、１２０日、１５０日、１８０日、２００日、２５０日、２８０日、３００日、３２０日、３５０日、または３６５日を含む）で異なる。休薬期間中の用量の減少は、１０％〜１００％（ほんの一例として、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％を含む）である。
【０１５４】
一旦患者の疾病の改善が生じると、必要に応じて維持量が投与される。次に、投与量または投与頻度またはその両方は、症状の関数として、疾患または障害の改善が保持されるレベルにまで減らされ得る。いくつかの実施形態では、患者は、任意の症状の再発後、断続的な処置を長期的に必要とする。
【０１５５】
そのような量に相当する所与の薬剤の量は、障害及びその重症度、処置が必要とされている対象または宿主のアイデンティティ（例えば、体重）などの要因次第で異なり、例えば、投与されるＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含む特定の医薬組成物、投与経路、処置される症状、及び処置される対象または宿主を含む、症例を取り囲む特定の状況に従って決定される。所望の用量は、単回投与で、または、同時に（または短時間にわたって）あるいは適切な間隔（例えば、１日に２回、３回、４回、あるいはそれ以上のサブ用量）で投与される分割用量で、都合よく提供されてもよい。
【０１５６】
画像化
本明細書で開示されるものは、ある特定の実施形態では、それを必要とする対象における血管新生障害の診断方法であって、（ａ）対象由来の生物学的試料を、バイオマーカーに結合する本発明の標識されたハイブリッドポリペプチドと接触させること、（ｂ）バイオマーカーに結合した標識されたＶＥＧＦ変異体ポリペプチドの量を測定することによって、生物学的試料中のバイオマーカーの量を決定すること、（ｃ）生物学的試料中のバイオマーカーの決定された量を対照中のバイオマーカーの量と比較すること、（ｄ）比較に基づいて、血管新生障害を有するものとして対象を診断することを含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、標識剤としては、標識、染料、光架橋剤、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、抗体または抗体断片、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、フルオロフォア、金属含有部分、放射性部分、新規な官能基、他の分子と共有結合的にまたは非共有結合的に相互作用する基、フォトケージ部分、化学放射線の励起部分、リガンド、光異性化部分、ビオチン、ビオチン類似体、重原子を包含する部分、化学的に切断可能な基、光切断可能な基、酸化還元活性剤、同位体で標識された部分、生物物理学的プローブ、リン光基、化学発光基、電子密度の高い基、磁性基、挿入基、発色団、エネルギー伝達剤、生理活性物質、検出可能な標識、またはこれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、フルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、２，７−ジクロロフルオレセイン、Ｎ，Ｎ−ビス（２，４，６−トリメチルフェニル）−３，４：９，１０−ペリレンビス（ジカルボキシイミド、ＨＰＴＳ、エチルエオシン、ＤＹ−４９０ＸＬ  ＭｅｇａＳｔｏｋｅｓ、ＤＹ−４８５ＸＬ  ＭｅｇａＳｔｏｋｅｓ、Ａｄｉｒｏｎｄａｃｋ  Ｇｒｅｅｎ  ５２０、ＡＴＴＯ  ４６５、ＡＴＴＯ  ４８８、ＡＴＴＯ  ４９５、ＹＯＹＯ−１、５−ＦＡＭ、ＢＣＥＣＦ、ＢＣＥＣＦ、ジクロロフルオレセイン、ローダミン１１０、ローダミン１２３、ローダミングリーン、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＳＹＴＯＸグリーン、ナトリウムグリーン、ＳＹＢＲグリーンＩ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５００、ＦＩＴＣ、フルオ−３、フルオ−４、フルオロ−エメラルド、ＹｏＹｏ−１  ｓｓＤＮＡ、ＹｏＹｏ−１  ｄｓＤＮＡ、ＹｏＹｏ−１、ＳＹＴＯ  ＲＮＡセレクト、ダイバーサグリーン−ＦＰ、ドラゴングリーン、エバグリーン、サーフグリーンＥＸ、スペクトラムグリーン、オレゴングリーン４８８、ＮｅｕｒｏＴｒａｃｅ  ５００５２５、ＮＢＤ−Ｘ、ミトトラッカーグリーンＦＭ、リソトラッカーグリーンＤＮＤ−２６、ＣＢＱＣＡ、ＰＡ−ＧＦＰ（ポスト活性化）、ＷＥＧＦＰ（ポスト活性化）、フラッシュ−ＣＣＸＸＣＣ、アザミグリーンモノマー、アザミグリーン、ＥＧＦＰ（キャンベルツィン２００３）、ＥＧＦＰ（パターソン２００１）、フルオレセイン、カエデグリーン、７−ベンジルアミノ−４−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール、ベクシル、ドキソルビシン、ルミオグリーン、ＩＲＤｙｅ  ８００、ＩＲＤｙｅ  ７５０、ＩＲＤｙｅ  ７００、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ  ７５５、ＤｙＬｉｇｈｔ  ８００、及びＳｕｐｅｒＧｌｏ  ＧＦＰからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、標識剤は、陽電子放出同位体（例えば、18Ｆ）、ガンマ線同位体（例えば、 99mＴｃ）、常磁性分子またはナノ粒子（例えば、被覆マグネタイトナノ粒子）、ガドリニウムキレート（例えば、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、及び１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ′，Ｎ″−三酢酸（ＮＯＴＡ））、酸化鉄粒子、超常磁性酸化鉄粒子、超小型常磁性粒子、マンガンキレート、ガリウム含有剤、テクネチウムキレート（例えば、ＨＹＮＩＣ、ＤＴＰＡ、及びＤＯＴＡ）、銅キレート、放射性フッ素、放射性ヨウ素、インジウムキレート、または放射性部分（例えば、 211Ａｔ、131Ｉ、 125Ｉ、90Ｙ、186Ｒｅ、 188Ｒｅ、153Ｓｍ、 212Ｂｉ、32Ｐ、64Ｃｕ、Ｌｕの放射性同位体）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、連結部分は、標識剤をＶＥＧＦ変異体ポリペプチドに連結する。いくつかの実施形態では、連結部分は、結合、ペプチド、ポリマー、水溶性ポリマー、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたヘテロアルキル、任意に置換されたヘテロシクロアルキル、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロシクロアルキルアルキル、任意に置換されたヘテロシクロアルキルアルケニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、及び任意に置換されたヘテロシクロアルキルアルケニルアルキルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、連結部分は、４′−ホスホパンテテインである。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、及びＢＯＤＩＰＹ  ＴＲからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬである。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０ではない。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、約５００〜約６００ｎｍの最大励起を有する。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、約５００〜約５５０ｎｍの最大励起を有する。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、約５５０〜約６００ｎｍの最大励起を有する。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、約５２５〜約５７５ｎｍの最大励起を有する。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、約５１０〜約６７０ｎｍの発光極大を有する。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、約５１０〜約６００ｎｍの発光極大を有する。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、約６００〜約６７０ｎｍの発光極大を有する。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、約５７５〜約６２５ｎｍの発光極大を有する。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、フルオレセインまたはインドシアニングリーンである。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、ＡＴＴＯ  ４８８、ＤＹ−５４７、またはＤＹ−７４７である。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、標識剤は、ポジトロン放射型断層撮影法（ＰＥＴ）用の陽電子放出同位体（例えば、18Ｆ）、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）用のガンマ線同位体（例えば、99mＴｃ）、または磁気共鳴画像（ＭＲＩ）用の常磁性分子またはナノ粒子（例えば、Ｇｄ3+キレートまたは被覆マグネタイトナノ粒子）である。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、標識剤は、ガドリニウムキレート、酸化鉄粒子、超常磁性酸化鉄粒子、超小型常磁性粒子、マンガンキレート、またはガリウム含有剤である。ガドリニウムキレートの例としては、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、及び１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ′，Ｎ″−三酢酸（ＮＯＴＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、標識剤は、近赤外（ｎｅａｒ−ＩＲ）画像化用の近赤外フルオロフォア、バイオルミネセンス画像化用のルシフェラーゼ（ホタル、細菌、または腔腸動物）または他の発光分子、または超音波用のパーフルオロカーボン充填小胞である。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、標識剤は、核プローブである。いくつかの実施形態では、造影剤は、ＳＰＥＣＴまたはＰＥＴ放射性核種プローブである。いくつかの実施形態では、放射性核種プローブは、テクネチウムキレート、銅キレート、放射性フッ素、放射性ヨウ素、インジウムキレートから選択される。Ｔｃキレートの例としては、ＨＹＮＩＣ、ＤＴＰＡ、及びＤＯＴＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、標識剤は、放射性部分、例えば、 211Ａｔ、131Ｉ、 125Ｉ、90Ｙ、186Ｒｅ、 188Ｒｅ、153Ｓｍ、 212Ｂｉ、32Ｐ、64Ｃｕ、Ｌｕの放射性同位体、及び他のものなどの放射性同位体である。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドが、ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡのペプチド配列に少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＳｆｐ標識をさらに含む。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、本発明の標識されたハイブリッドポリペプチドは、ハイブリッドポリペプチド、連結部分、及び標識剤を含む。いくつかの実施形態では、連結部分は、標識剤をポリペプチドに連結する。いくつかの実施形態では、連結部分は、結合、ペプチド、ポリマー、水溶性ポリマー、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたヘテロアルキル、任意に置換されたヘテロシクロアルキル、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロシクロアルキルアルキル、任意に置換されたヘテロシクロアルキルアルケニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、及び任意に置換されたヘテロシクロアルキルアルケニルアルキルから選択される。いくつかの実施形態では、連結部分は、任意に置換されたヘテロ環である。いくつかの実施形態では、ヘテロ環は、アジリジン、オキシラン、エピスルフィド、アゼチジン、オキセタン、ピロリン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、ピロリジン、ピラゾール、ピロール、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、オキサゾール、イソキサゾール、オキシレン、チアゾール、イソチアゾール、ジチオラン、フラン、チオフェン、ピペリジン、テトラヒドロピラン、チアン、ピリジン、ピラン、チアピラン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、ピペラジン、オキサジン、チアジン、ジチアン、及びジオキサンから選択される。いくつかの実施形態では、ヘテロ環は、ピペラジンである。さらなる実施形態では、連結部分は、ハロゲン、ＣＮ、ＯＨ、ＮＯ2 、アルキル、Ｓ（Ｏ）、及びＳ（Ｏ）2 で任意に置換される。他の実施形態では、水溶性ポリマーは、ＰＥＧ基である。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、血管新生障害は、眼の血管新生、脈絡膜新生血管、虹彩血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、翼状片、パンヌス、瞼裂斑、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜剥離、後部ぶどう膜炎、黄斑変性症、ケロイド、緑内障、白内障、部分的失明、完全な失明、近視、近視性変性、中心視力の劣化、変視症、色覚障害、血管の出血、または網膜静脈閉塞である。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、血管新生障害は、癌である。いくつかの実施形態では、癌は、前立腺癌、乳癌、肺癌、食道癌、大腸癌、直腸癌、肝癌、尿路癌（例えば、膀胱癌）、腎臓癌、肺癌（例えば、非小細胞性肺癌）、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、膵癌、胃癌、甲状腺癌、皮膚癌（例えば、黒色腫）、リンパ系または骨髄系統の造血癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、神経膠芽腫、奇形癌、神経芽細胞腫、腺癌、間葉起源の癌、例えば、線維肉腫、または横紋筋肉腫、軟部組織肉腫及び癌腫、絨毛膜癌腫、肝芽腫、カポシ肉腫、またはウィルムス腫瘍である。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、血管新生障害は、炎症性疾患である。いくつかの実施形態では、炎症性疾患は、炎症性関節炎、変形性関節症、乾癬、慢性炎症、過敏性腸疾患、肺の炎症、または喘息である。いくつかの実施形態では、血管新生障害は、自己免疫疾患である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、または全身性エリテマトーデスである。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、血管新生障害のバイオマーカーである。いくつかの実施形態では、成長因子受容体は、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦＲは、ＶＥＧＦＲ１、またはＶＥＧＦＲ２である。いくつかの実施形態では、成長因子受容体は、ＰＤＧＦＲ−α、またはＰＤＧＦＲ−βである。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、バイオマーカーの組み合わせである。いくつかの実施形態では、バイオマーカーの組み合わせは、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲ−α、及びＰＤＧＦＲ−βを含む。いくつかの実施形態では、バイオマーカーに結合した標識されたハイブリッドポリペプチドの量を測定することは、検出方法を含む。いくつかの実施形態では、検出方法は、ウェスタンブロット法、免疫沈降法、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学法、及び放射免疫測定法からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、検出方法は、分光、光化学、生化学、Ｘ線撮影、免疫化学、化学、電気、及び光検出方法からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、検出方法は、標識剤の濃度または存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、組織を含む。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、翼状片組織を含む。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、インビボまたはエクスビボである。
【０１７３】
本発明は、血管新生障害を治療するための療法に対する対象の反応を評価する方法も提供する。本方法は、（ａ）対象由来の第１の生物学的試料を、バイオマーカーに結合する本発明の標識されたハイブリッドポリペプチドと接触させて、バイオマーカーに結合した標識されたポリペプチドの量を測定することによって、第１の生物学的試料中のバイオマーカーの量を決定すること、（ｂ）対象に治療剤を投与した後に、対象由来の第２の生物学的試料を、標識されたポリペプチドと接触させて、バイオマーカーに結合した標識されたポリペプチドの量を測定することによって、第２の生物学的試料中のバイオマーカーの量を決定すること、及び（ｃ）第１及び第２の生物学的試料中のバイオマーカーの量の比較に基づいて、対象が、治療に対して陽性、陰性、または中立反応を有するかどうかを決定することを含む。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、第１の生物学的試料中のバイオマーカーの量は、治療剤、例えば、本発明の治療ハイブリッドポリペプチドによる治療前に決定される。いくつかの実施形態では、第２の生物学的試料中のバイオマーカーの量は、治療剤による治療レジメンの完了後、例えば、治療レジメンの完了の１週間後、２週間後、１ヵ月後、２ヵ月後、または６ヵ月後に決定される。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、試料または対照中のバイオマーカーの量を決定することは、インビボ画像化、非侵襲性、または侵襲性を含む。いくつかの実施形態では、試料または対照中のバイオマーカーの量を決定することは、エクスビボ画像化を含む。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、生検試料または吸引試料である。
【０１７６】
診断対照の選択は、対照（陽性、または陰性）の種類、生物学的試料の種類、及び画像化がインビボまたはエクスビボであるかどうかに依存する。例えば、生物学的試料が（血管新生関連の眼の障害をインビボスクリーニングするための）眼である場合、いくつかの実施形態では、陰性対照は、対象の健常な罹患していない眼である。いくつかの実施形態では、陰性対照は、対象が血管新生を伴う任意の疾患または症状に罹患していないことが知られている場合の健常な罹患していない眼の集団に存在するバイオマーカーの平均濃度である。生検試料中のバイオマーカーの量のエクスビボ決定などのバイオマーカー濃度のエクスビボ決定では、いくつかの実施形態では、対照は、早期に採取した生検試料である。いくつかの実施形態では、対照には、生物学的試料として処置を施す。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、血管新生障害、例えば、血管新生関連障害のバイオマーカーの量の診断不在、診断存在、または変化は、治療が効果的であるかどうかまたは治療が効果を有するかどうかの前兆である。個体は、診断に従って本発明のハイブリッドポリペプチドで治療してもよい。
【０１７８】
キット
本明細書で開示されるものは、ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドまたはＦｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含むキットである。
【０１７９】
キットは、種類に関わらず、一般的に、生物学的薬剤を載置し、好ましくは適当にアリコートする１つ以上の容器を含む。いくつかの実施形態では、キットの成分は、水性媒体中または凍結乾燥形態中のいずれかに包装される。
【０１８０】
さらなる実施形態では、本発明は、例えば、治療的用途または非治療的用途で使用されるＶＥＧＦ変異体ポリペプチドまたはＦｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含有するキットを提供する。キットは、ラベル付きの容器を含む。適当な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、及び試験管が挙げられる。いくつかの実施形態では、容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成される。容器は、上述のような治療的用途または非治療的用途に効果的なＶＥＧＦ変異体ポリペプチドまたはＦｃ−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを含む組成物を保持する。容器上のラベルは、組成物が特定の治療または非治療的用途に使用されることを示し、上述のようなものなど、インビボまたはインビトロ使用のいずれかの方向も示す。
【０１８１】
典型的には、キットは、上記の容器と、例えば、緩衝液、希釈液、フィルター、針、注射器、及び使用のための指示書を有する同封物など、商業的及び使用者の観点からみて望ましい材料を含む１つ以上の他の容器とを含む。いくつかの実施形態では、キットは、野生型ＶＥＧＦからなる対照も含む。
【実施例】
【０１８２】
実施例１−一本鎖ＶＥＧＦ変異体の生成
２つの単量体ＶＥＧＦ鎖が柔軟なリンカーを介して物理的に縛られたＶＥＧＦ（ｓｃＶＥＧＦと呼ばれる）の一本鎖変異体を生成した。点突然変異をｓｃＶＥＧＦ（鎖１：Ｆ１７Ａ、Ｅ６４Ｇ、鎖２：Ｉ４６Ａ、Ｉ８３Ａ）に導入し、ＶＥＧＦＲ２の第２分子がこのポールに結合することを遮断することによって、この変異体上に拮抗活性を授与したｓｃＶＥＧＦMUT を生成した。単鎖ＶＥＧＦ変異体を確立すると、９〜１１アミノ酸インテグリン結合ループを、残基８３〜８９（すなわち、ループ３）の代わりにｓｃＶＥＧＦに導入した。これは、上に列挙した点突然変異と同じポール上であり、ＶＥＧＦＲ２の代わりにインテグリン受容体がこのポールで結合することが（潜在的に）できる。
【０１８３】
実施例２−一本鎖ＶＥＧＦアンタゴニストの最適リンカーの遺伝子操作
モノマーＡのＣ末端をモノマーＢのＮ末端に連結するリンカー部分を、ｓｃＶＥＧＦ−ｍＥ７Ｉ（配列番号７５）コンストラクト上で最適化し、タンパク質発現収率、及び内皮細胞への結合親和性を改善させた。長さと組成が異なる３つのリンカーを設計し、元のリンカー配列と共に表２に示す。表２に示すリンカーは、任意の二次構造を形成すると期待されず、かつ、免疫原性がより低いことも知られているグリシン及びセリン残基を利用する。
【０１８４】
【表２】
2018507181.tif 000004
【０１８５】
Ｌ１Ａ、Ｌ２Ａ、またはＬ３Ａのいずれかを含有する小規模発現のコンストラクトを生成した。図１に示すように、より長いリンカーＬ１Ａ及びＬ３Ａにより、所望のタンパク質がより高い収率で得られた（およそ３０ｋＤａで示す）。Ｌ３Ａは、グリシン及びセリン残基のみを含有し、そのため、（Ｌ１Ａと比較して）免疫原性の可能性が低いため、最適化リンカーとして選択された。元のリンカーをもつコンストラクトと比較したＬ３Ａの最終収率の総改善は、約２〜３倍であった。
【０１８６】
ヒト内皮細胞の細胞結合アッセイは、元のリンカー（ｓｃＶＥＧＦｍＥ７Ｉ、配列番号７５）をもつコンストラクトに対して、Ｌ３Ａを含有するコンストラクトの標的結合親和性を比較するために実施した。図２に示すように、元のリンカーを含有するｓｃＶＥＧＦ−ｍＥコンストラクトは、０．３２±０．０７ｎＭのＫD を有したが、Ｌ３Ａリンカーを含有するｓｃＶＥＧＦ−ｍＥコンストラクトは、約２倍の改善を表す０．１６±０．０６ｎＭのＫD を有した。
【０１８７】
実施例３−高親和性結合に対する突然変異の最小セットの同定
ｓｃＶＥＧＦｍｕｔＥコンストラクトは、７つの突然変異を含有する。鎖１は、Ｆ３６Ｌ、Ｅ４４Ｇ、Ｄ６３Ｇ、及びＱ８７Ｒで突然変異を含有し、鎖２は、Ｋ１６Ｒ、Ｄ４１Ｎ、及びＤ６３Ｎで突然変異を含有する。高親和性結合に必要な突然変異の最小セットを同定するため、２7 ミュータントのライブラリーを生成し（７位の各々の残基は、独立して、ｓｃＶＥＧＦｍｕｔＥで見られる残基、または野生型ｓｃＶＥＧＦのいずれかであることが可能であった）、プローブとして適切な量の可溶性ＶＥＧＦＲ２−Ｆｃを用いて、酵母上のＶＥＧＦＲ２結合について試験した。ＶＥＧＦＲ２（図３）への高親和性結合を保持した酵母の集団の分析により、突然変異により、鎖１  Ｆ３６Ｌ、鎖１  Ｅ４４Ｇ、鎖１  Ｑ８７Ｒ、及び鎖２  Ｄ６３Ｎは強化されたが、鎖１  Ｄ６３Ｇ、鎖２  Ｋ１６Ｒ、及び鎖２  Ｄ４１Ｎは強化されないことが示された。鎖１  Ｅ４４Ｇ及び鎖２  Ｄ６３Ｎは普遍的に強化されたが、鎖１  Ｆ３６Ｌ及び鎖１  Ｑ８７Ｒは強く強化された。突然変異のセットとして、鎖１  Ｆ３６Ｌ、鎖１  Ｅ４４Ｇ、鎖１  Ｑ８７Ｒ、及び鎖２  Ｄ６３Ｎは必要であり、高親和性ＶＥＧＦＲ２結合を授与するために十分であることが、これらの結果により暗示される。
【０１８８】
実施例４−ｓｃＶＥＧＦコンストラクトのＦｃ融合体
１）全身投与による循環半減期を改善することによって、治療剤を頻繁に投与しなくてよい腎臓カットオフを超えるサイズに大きくし、２）免疫系補体と、より強力な活性のためのエフェクター機能とを活用するために、ｓｃＶＥＧＦコンストラクトをＦｃ融合体で改変させた。親ｓｃＶＥＧＦと同様の結合親和性の保持、及び親ｓｃＶＥＧＦの拮抗活性の保持について、ｓｃＶＥＧＦ−Ｆｃ融合体を調べた。
【０１８９】
まず、ヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）上の細胞結合アッセイでｓｃＶＥＧＦコンストラクトを評価した。図４に示すように、ｓｃＶＥＧＦ−Ｆｃ融合体の結合親和性は、親ｓｃＶＥＧＦと比較して変化しない（ｍｕｔ．０曲線とｍｕｔ曲線を比較）。さらに、ｓｃＶＥＧＦは、２つの異なる細胞表面受容体（ＶＥＧＦＲ及びインテグリン）に結合するため、二量体である対応するＦｃ融合体は、全部で４つの受容体に結合する。得られた立体的な込み合いが結合に影響を及ぼすか否かを試験するため、ｓｃＶＥＧＦとＦｃドメインの融合接合部で異なる長さのＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーを試験した。０、１、または３のＧｌｙ4 Ｓｅｒ反復（図４に７１．０対７１．１対７１．３として示すように）を持つ３つの異なるリンカー長を試験し、有意差は観察されなかった。したがって、いくつかの実施形態では、ｓｃＶＥＧＦは、Ｆｃ領域に直接融合している。
【０１９０】
次に、ＨＵＶＥＣ上のリン酸化アッセイで、ｓｃＶＥＧＦ−Ｆｃ融合体コンストラクトの拮抗活性について評価した（図５）。陽性対照と陰性対照（それぞれ、列１及び２）と比較した場合に、列４及び５は、Ｆｃ融合体がアゴニストではないことを示す。陽性対照及び陰性対照（それぞれ、列１及び２）と列６及び７の比較により、Ｆｃ融合体がｓｃＶＥＧＦ等価物と同様の拮抗活性を保持することが示された（列６及び７と列５を比較）。
【０１９１】
実施例５−ＶＥＧＦＲ１に結合しているｓｃＶＥＧＦコンストラクトの特徴付け
親コンストラクトｓｃＶＥＧＦＭＵＴ（ｍｕｔ）の結合及びアンタゴニスト特性を、ｓｃＶＥＧＦＭＵＴ−Ｅ（ｍＥ、配列番号５５）の親和性成熟変異体のものと比較した。以下の表３に示すように、ｍｕｔからｍＥへと、Ｒ１／Ｒ２選択性の１２倍変化が観察された。それにも関わらず、親和性成熟変異体であるｓｃＶＥＧＦＭＵＴ−Ｅは、５５０ｐＭの親和性でＶＥＧＦＲ１への結合を保持した。
【０１９２】
【表３】
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【０１９３】
実施例２−ｓｃＶＥＧＦによるｂＦＧＦ新生血管形成の治療
ｂＦＧＦ誘発角膜血管新生モデルは、適当な改変、例えば、１００ｎｇのｂＦＧＦ／ペレットを使用し、ペレットを試験される薬剤と配合し、ペレット移植の６日後に血管新生の程度を測定することによって、Ｋｅｎｙｏｎ  ｅｔ．ａｌ（１９９６）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３７：１６２５にて前述されたように行った。結果を図６に提示する。配列番号７５のｓｃＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、試験した全ての用量で血管新生を阻害することができた。特に、試験した全ての用量で、臨床的に承認された血管新生阻害剤と同等に強力、またはそれよりも強力のいずれかであった。さらに、ｓｃＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ１結合が、ＶＥＧＦＲ２結合を同時に保持することが知られている突然変異の導入を介して排除された、対応する変異体（配列番号７８）よりも強力であった。
【０１９４】
実施例３−眼疾患における抗血管新生治療介入用のバイオマーカーの同定
次いで、臨床的に示された翼状片除去手術を受けることに同意した患者から得られた組織試験片を血管新生血管系のマーカーについて試験した。
【０１９５】
パラフィン処理での包埋前に組織をホルマリン中で固定し、スーパーフロストプラススライド上で５μｍに切片化した。翼状片組織切片をキシレン中で脱パラフィン化し、水への段階的な一連のアルコールを介して再水和した。スライドに、クエン酸ナトリウム緩衝液中の熱媒介による抗原賦活化を施した。スライドをＰＢＳ中で３×５分間洗浄した後、１％ＢＳＡを有するＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清で３時間室温にてインキュベートし、遮断した。その後、各切片を、異なる種で生じた２つの抗体カクテルで１２時間４℃にてインキュベートし、染色オーバーレイを達成した。フォンウィレブランド因子（ｖＷＦ）、ＣＤ３１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、（αv β3 インテグリンをプローブする）β３インテグリン、（αv β5 インテグリンをプローブする）β５インテグリン、（α5 β1 インテグリンをプローブする）α５インテグリン、ｐｒｏ−ＭＭＰ２、及びＭＭＰ２の抗体を使用した。１％ＢＳＡを有するＰＢＳを全ての抗体希釈に使用した。その後、スライドをＰＢＳ中で３×５分間洗浄した後、それぞれマウス及びウサギに対して、ヤギで生じたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４コンジュゲート抗体で１時間室温にてインキュベートした。その後、スライドをＰＢＳ中で３×５分間洗浄した後、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウント用媒体を含有する４′−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）でマウントした。
【０１９６】
適切なフィルターセットを具備するＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ  Ｚ１落射蛍光顕微鏡上の１０×Ｐｌａｎ  Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ対物レンズを用いて、蛍光画像を撮影した。各抗原の露光時間は、試料にわたって一定であった。抗原の全ての画像は、Ｚｅｎ  Ｂｌｕｅソフトウェアを用いて同じリニア輝度及びコントラスト調整を受けた。
【０１９７】
図７〜図１２には、蛍光画像が示されている。図７は、ヒト翼状片におけるフォンウィレブランド因子（ｖＷＦ）及びＶＥＧＦＲ２の免疫組織化学的染色を例示する。図８は、ヒト翼状片におけるｖＷＦ及びＶＥＧＦＲ１の免疫組織化学的染色を例示する。図９は、ヒト翼状片におけるαv β3 インテグリン及びＶＥＧＦＲ２の免疫組織化学的染色を例示する。図１０は、ヒト翼状片におけるＣＤ３１及びα5 β1 インテグリンの免疫組織化学的染色を例示する。図１１は、ヒト翼状片におけるＣＤ３１及びαv β5 インテグリンの免疫組織化学的染色を例示する。図１２は、ヒト翼状片におけるＭＭＰ２、ｐｒｏ−ＭＭＰ２、及びＣＤ３１の免疫組織化学的染色を例示する。全ての場合において、試験した全てのマーカーによる顕著な染色が観察された。重要なことは、全ての場合において、この染色は、内皮細胞（ｖＷＦまたはＣＤ３１）の公知のマーカーと共局在し、これらのマーカーの発現が内皮細胞と関連していることが確認された。さらに、ＭＭＰ２に対して捕捉特異性をもつ抗体を使用することで、ＭＭＰ２の活性形態のみが内皮細胞のマーカーと共局在することを示すことができた。特に、活性ＭＭＰ２及びｐｒｏ−ＭＭＰ２の両方を検出することができる抗体は、顕著な血管染色を示した。（図７、左上パネル）。これに対し、ｐｒｏ−ＭＭＰ２形態を排他的に認識する抗体は、対応する容器に対して何らかの目に見える染色を示さなかった（図７、右上パネル）。
【０１９８】
実施例４−ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを翼状片に用いた臨床試験
本試験の目的は、本明細書に開示のＶＥＧＦ変異体ポリペプチドが翼状片成長を停止またはその後退を引き起こすことができるかどうかを調べることである。ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを、６ヵ月、１日１回、翼状片成長の上に直接局所塗布した。
試験の種類：介入型
試験設計：介入型モデル：単一群割り当て
マスキング：非盲検
主要目的：治療
【０１９９】
主要評価項目：ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド投与前及び投与後の縁から測定した際に拡大または後退した翼状片の面積、時間枠：ベースライン及び３ヵ月
【０２００】
翼状片の成長は、縁から視軸に向かって測定した際の翼状片の面積の増加として定義される。
【０２０１】
翼状片の後退は、縁から視軸に向かって測定した際の翼状片の長さの減少として定義される。
【０２０２】
副次評価項目：翼状片を外科的切除した患者の数、時間枠：１２ヵ月
【０２０３】
資格：試験資格がある年齢：１９歳以上、試験資格がある性別：両方、健康なボランティアの受け入れ：なし
【０２０４】
選択基準：１９歳以上、翼状片の診断、予定された外来通院を行うために十分健康であること
【０２０５】
除外基準：試験に参加中に妊娠する可能性がある女性及び子供をもうける予定がある男性は、試験から除外される。
【０２０６】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１月１６日に出願された米国特許仮出願番号第６２／１０４，５９０号、２０１５年１月１６日に出願された米国特許仮出願番号第６２／１０４，５８８号、及び２０１５年１月１６日に出願された米国特許仮出願番号第６２／１０４，６２１号の利益を主張し、それら各々の内容全体を参照によって本願明細書に引用したものとする。
【０２０７】
配列番号：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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