(57)【要約】種々の標的化部分ペプチドエピトープ複合体（ＴＰＥＣ）を、異なる実施形態において説明する。しかしながら、実施形態の各々において、標的化部分を使用して、ＴＰＥＣを望ましくない細胞の領域へ送達して、治療効果を局所的に送達させ得る。ＴＰＥＣは、複数のＴ細胞エピトープも含有する。ＴＰＥＣはさらに、Ｔ細胞エピトープを標的化作用因子から、及びいくつかの実施形態においては、望ましくない細胞の微小環境にある場合、お互いから放出する切断部位を含む。Ｔ細胞エピトープの配置及び数は、本明細書に説明する異なる実施形態において異なるが、いったん標的化作用因子（及び任意の隣接するＴ細胞エピトープ）から切断されると、望ましくない細胞に対する免疫応答を刺激することによって、Ｔ細胞エピトープは機能する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＰＥＣを含む、望ましくない細胞に対する免疫応答を再標的化するための組成物であって、
ａ．Ｔが、望ましくない細胞を標的化することのできる標的化部分である、
ｂ．Ｌが、Ｔへ結合できる少なくとも１つのリンカーであり、ここで、Ｌは、ペプチド結合、少なくとも１つのペプチド、あるいは化学的リンカーであり得る、
ｃ．Ｃが、
ｉ．前記望ましくない細胞によって発現する酵素によって切断される、
ｉｉ．前記望ましくない細胞の内側でｐＨ感受性切断反応を通じて切断される、
ｉｉｉ．補体依存性切断反応によって切断される、または
ｉｖ．ＴＰＥＣにおける標的化部分と同じである若しくは異なる前記標的化部分によって前記望ましくない細胞へ共存するプロテアーゼによって切断される、
少なくとも１つの結合部位である、かつ
ｄ．Ｅが、少なくとも１つのＴ細胞エピトープである、
ＴＰＥＣを含み、この中で、前記Ｌ部分、Ｃ部分、ならびにＥ部分は、以下のパターン、すなわち、
ｉ．Ｔへ個別に各々結合する複数のＬ−Ｃ−Ｅ、
ｉｉ．ｎが少なくとも２の整数（任意に約２〜５０）であり、かつ各Ｃ−Ｅが前記Ｌへ並列に結合したＬ−（Ｃ−Ｅ）ｎのうちの少なくとも１つ、及び／または
ｉｉｉ．ｎが少なくとも２の整数（任意に約２〜５０）であり、かつ各Ｃ−Ｅが前記Ｌへ直列に結合したＬ−（Ｃ−Ｅ）ｎのうちの少なくとも１つ
のうちの少なくとも１つにおいて配置される、前記組成物。
【請求項２】
望ましくない細胞に対する免疫応答を再標的化するための組成物であって、
ａ．望ましくない細胞を標的化することのできる標的化部分、
ｂ．少なくとも１つの切断部位を有する前記標的化部分へ結合した１０個を超える複数のＴ細胞エピトープ（この中で、前記切断部位は、
ｉ．前記望ましくない細胞によって発現する酵素によって切断される、
ｉｉ．前記望ましくない細胞の内側でｐＨ感受性切断反応を通じて切断される、
ｉｉｉ．補体依存性切断反応によって切断される、または
ｉｖ．前記ＴＰＥＣにおける標的化部分と同じであるまたは異なる前記標的化部分によって前記望ましくない細胞へ共存するプロテアーゼによって切断される）
を有するＴＰＥＣを含む、前記組成物。
【請求項３】
前記複数のＴ細胞エピトープは、前記標的化部分、すなわち切断部位による各Ｔ細胞エピトープへ個々に各Ｔ細胞エピトープが結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記複数のＴ細胞エピトープは、少なくとも１つの束として前記標的化部分へ１つの切断部位によって結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
束内の前記Ｔ細胞エピトープは、前記Ｔ細胞エピトープ間に切断部位を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記複数のＴ細胞エピトープは、すべてが同一であるというわけではない、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１つの切断部位及び前記複数のＴ細胞エピトープは、スルホ−ＳＭＣＣ結合、ＳＭＣＣ結合、またはマレイミド結合を通じて、前記標的化作用部分へ結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも１つのＴ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩに制限されたペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
少なくとも１つのＴ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩに制限されたペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記複数のＴ細胞エピトープは、長さ約７〜約１４のアミノ酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記作用因子は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のＴ細胞エピトープを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記Ｔ細胞エピトープは、ＣＭＶ、インフルエンザ、ＥＢＶ、肝炎、水痘、流行性耳下腺炎、麻疹、ジフテリア、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、風疹、百日咳、ポリオ、肺炎球菌、ロタウイルス、破傷風、ワクシニア、及び黄熱病のＴ細胞エピトープから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物は、少なくとも２つの異なる感染性作用因子由来のＴ細胞エピトープを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記Ｔ細胞エピトープは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１ｄ、及びＭＲ１から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記Ｔ細胞エピトープは、ＨＬＡ−Ａ＊０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２、ＨＬＡ−Ａ＊０３、ＨＬＡ−Ａ＊１１、ＨＬＡ−Ｂ＊４４、ＨＬＡ−Ｂ＊０７、ＨＬＡ−Ｂ＊０８、ＨＬＡ−Ｂ＊１５、ＨＬＡ−Ｂ＊３５、ＨＬＡ−Ｂ＊４０、ＨＬＡ−Ｃ＊０７、ＨＬＡ−Ｃ＊０３、ＨＬＡ−Ｃ＊０５、ＨＬＡ−Ｃ＊０４、ＨＬＡ−Ｃ＊０６、及びＨＬＡ−Ｅ＊０１０１に制限された抗原から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物は、少なくとも以下のＴ細胞エピトープ、すなわちＨＬＡ−Ａ＊０２、ＨＬＡ−Ａ＊０１、及びＨＬＡ−Ａ＊０３を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記Ｔ細胞エピトープは、配列番号１〜２、５〜７、１５〜５７のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記標的部分は、抗体またはその機能的部分である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記Ｔ細胞エピトープは、少なくとも１つのヒトタンパク質ドメインによって片端または両端において隣接する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記切断部位は、前記望ましくない細胞の外側で切断されることができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記望ましくない細胞によって発現する酵素は、プロテアーゼである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記望ましくない細胞は、癌細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１に記載の組成物を、望ましくない細胞の存在を特徴とする患者へ投与することを含む、前記患者における疾患の治療方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の組成物を、患者へ投与することを含む、望ましくない細胞に対する前記患者の免疫応答の再標的化方法。
【請求項２５】
前記抗体またはその機能的部分は、抗ＣＥＡもしくは抗ＣＥＡＣＡＭ抗体またはその機能的部分である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２６】
前記標的化部分は、抗体またはその機能的部分である、請求項２に記載の組成物。
【請求項２７】
前記抗体またはその機能的部分は、抗ＣＥＡもしくは抗ＣＥＡＣＡＭ抗体またはその機能的部分である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記標的化部分は、抗体またはその機能的部分であり、前記抗体またはその機能的部分は、任意に抗ＣＥＡもしくは抗ＣＥＡＣＡＭ抗体またはその機能的部分である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記標的化部分は、抗体またはその機能的部分であり、前記抗体またはその機能的部分は、任意に抗ＣＥＡもしくは抗ＣＥＡＣＡＭ抗体またはその機能的部分である、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、複数のＴ細胞エピトープを採用する免疫治療薬に関する。特に、本出願は、癌または他の疾患原因細胞のような、望ましくない細胞の存在を特徴とする容態を治療するために使用することのできる作用因子に関する。
【背景技術】
【０００２】
望ましくない細胞の存在を原因とする癌及び他の疾患は、重大な生命喪失、苦痛、及び経済的な影響を生じる。癌を標的化するための免疫治療戦略は今日まで、橋渡しする臨床研究の活発な領域である。
【０００３】
ＷＯ２０１２／１２３７５５は、方向づけを直された免疫療法の概念を考察している。当該出願において、望ましくない細胞の存在を特徴とする容態を予防または治療するための作用因子には、望ましくない細胞を及び、望ましくない細胞の近傍において作用因子中の切断部位の選択的切断によって標的化部分から放出されることのできるＴ細胞エピトープを標的化することのできる標的化部分を含む。
【０００４】
ＷＯ２０１４／０４３５２３は、次の２つの配置、すなわち、Ｔ−ｃ−Ｅｎ−ｃ−ＦｃｎまたはＴ−ｃ−Ｆｃｎ−ｃ−Ｅｎのうちの１つにおける１〜１０個の免疫原性ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープを含む癌細胞に方向づけられたＳｃＦＶを基にした作用因子を教示しており、ここで、ＴはＳｃＦｖであり、Ｅｎは１〜１０個のＣＤ８  Ｔ細胞エピトープであり、ｃはプロテアーゼ切断部位であり、かつＦｃｎはＩｇＧ抗体の１〜１０個のＦｃ部分である。この参照において、１〜１０個の免疫原性ＣＤ８  Ｔ細胞は、なおも互いに共有結合している一本鎖ポリペプチドにおける作用因子のＳｃＦｖ部分及びＦｃ部分から放出される。
【０００５】
いくつかの陽性検査データを先行アプローチとともに示してきたが、臨床上有効な治療戦略は、癌のような疾患に罹患している個体における強い免疫応答を惹起することができなければならない。加えて、有効な療法は、異なる人種群及び民族群に由来する患者の広範な横断切片において十分に作用すべきである。最大効果のある療法は、複数回の治療がある期間にわたって投与されることができるよう、治療薬自体に対する阻害性免疫応答を生じることなく、望ましくない細胞に対する免疫応答も生じるであろう。それゆえ、方向づけを直された免疫療法に関する本分野における追加的な開発が必要とされる。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書に従って、種々の標的化部分ペプチドエピトープ複合体（ＴＰＥＣ）を、異なる実施形態において説明する。しかしながら、実施形態の各々において、標的化部分を使用して、ＴＰＥＣを望ましくない細胞の領域へ送達して、治療効果を限局的に送達させ得る。ＴＰＥＣは、複数のＴ細胞エピトープも含有する。ＴＰＥＣはさらに、Ｔ細胞エピトープを標的化作用因子から、及びいくつかの実施形態においては、望ましくない細胞の微小環境にある場合、お互いから放出する切断部位を含む。Ｔ細胞エピトープの配置及び数は、本明細書に説明する異なる実施形態において異なるが、いったん標的化作用因子（及び任意の隣接するＴ細胞エピトープ）から切断されると、望ましくない細胞に対する免疫応答を刺激することによって、Ｔ細胞エピトープは機能する。いくつかの実施形態において、最大の利益は、標的化作用因子と切断過程におけるお互いとの両方に由来するＴ細胞エピトープをすべて放出することによって達成され、各Ｔ細胞エピトープを構造上自由にさせ、免疫応答を望ましくない細胞へと引き寄せ得る。
【０００７】
以下に詳細に考察するように、複数のＴ細胞エピトープを有することは、所与の患者におけるより強い免疫応答を刺激することによって、またはＴＰＥＣに、異なる人種群及び民族群における広範な種々の患者にわたって免疫応答を刺激させることによってのいずれかで、望ましくない細胞に対する免疫応答を亢進する。
【０００８】
一実施形態において、望ましくない細胞に対する免疫応答を再標的化するための組成物は、ＴＰＥＣを含み、この中で、
ａ．Ｔが、望ましくない細胞を標的化することのできる標的化部分である、
ｂ．Ｌが、Ｔへ化学的に結合できる少なくとも１つのリンカーであり、ここで、Ｌは、ペプチド結合、少なくとも１つのペプチド、あるいは化学的リンカーであり得る、
ｃ．Ｃが、
ｉ．望ましくない細胞によって発現する酵素によって切断される、
ｉｉ．望ましくない細胞の内側でｐＨ感受性切断反応を通じて切断される、
ｉｉｉ．補体依存性切断反応によって切断される、または
ｉｖ．ＴＰＥＣにおける標的化部分と同じである若しくは異なる標的化部分によって望ましくない細胞へ共存するプロテアーゼによって切断される、
少なくとも１つの切断部位である、かつ
ｄ．Ｅが、少なくとも１つのＴ細胞エピトープである、
ＴＰＥＣを含み、この中で、Ｌ部分、Ｃ部分、ならびにＥ部分は、以下のパターン、すなわち、
ｉ．Ｔへ個別に各々結合する複数のＬ−Ｃ−Ｅ、
ｉｉ．各Ｃ−ＥがＬへ並列に結合したＬ−（Ｃ−Ｅ）ｎのうちの少なくとも１つ、及び／または
ｉｉｉ．各Ｃ−ＥがＬへ直列に結合したＬ−（Ｃ−Ｅ）ｎのうちの少なくとも１つ
のうちの少なくとも１つにおいて配置される。
【０００９】
一実施形態において、望ましくない細胞に対する免疫応答を再標的化するための組成物は、式Ｔ−（Ｌ−Ｃ−Ｅ）ｎあるいはＴ−（Ｌ−Ｃｉ−Ｅｊ）ｎを含む標的化部分へ個別に結合した複数のＴ細胞エピトープを有するＴＰＥＣを含み、式中、
ａ．Ｔが、望ましくない細胞を標的化することのできる標的化部分である、
ｂ．Ｌが、Ｔへ化学的に結合できる１つのリンカーである、
ｃ．Ｃが、
ｉ．望ましくない細胞によって発現する酵素によって切断される、
ｉｉ．望ましくない細胞の内側でｐＨ感受性切断反応を通じて切断される、
ｉｉｉ．補体依存性切断反応によって切断される、または
ｉｖ．ＴＰＥＣにおける標的化部分と同じである若しくは異なる標的化部分によって望ましくない細胞へ共存するプロテアーゼによって切断される、
少なくとも１つの切断部位である、かつ
ｂ．Ｅが、少なくとも１つのＴ細胞エピトープである、
ＴＰＥＣを含み、この中で、ｎは、少なくとも２の整数であり（任意に約２〜５０）、ｉは、少なくとも２の整数であり（任意に約１〜５０）、かつｊは、少なくとも２の整数である（任意に約１〜５０）。「ｎ」という整数は、標的化部分上のＬ−Ｃ−Ｅ部分の数を指し、かつ「ｉ」及び「ｊ」という整数は、どのくらい多くのタイプの切断部位及びエピトープがコンストラクト内にあるのかを指す。
【００１０】
いくつかの実施形態において、望ましくない細胞に対する免疫応答を再標的化するための組成物は、（ｉ）線形ならびに／あるいは束になったポリトープか（ｉｉ）分枝鎖ポリトープかのいずれかを有するＴＰＥＣを含む。このようなＴＰＥＣは、式Ｔ−Ｌ−（Ｃｉ−Ｅｊ）ｎを含み得、式中、
ａ．Ｔが、望ましくない細胞を標的化することのできる標的化部分であり、
ｂ．Ｌが、Ｔへ化学的に結合できるまたはペプチド結合できる任意のリンカーであり、
ｃ．Ｃが、
ｉ．望ましくない細胞によって発現する酵素によって切断される、
ｉｉ．望ましくない細胞の内側でｐＨ感受性切断反応を通じて切断される、
ｉｉｉ．補体依存性切断反応によって切断される、または
ｉｖ．ＴＰＥＣにおける標的化部分と同じである若しくは異なる標的化部分によって望ましくない細胞へ共存するプロテアーゼによって切断される、
少なくとも１つの切断部位であり、かつ
ｄ．Ｅが、Ｔ細胞エピトープであり、
この中で、ｎは、少なくとも２の整数であり（任意に約２〜５０）、ｉは、少なくとも２の整数であり（任意に約１〜５０）、かつｊは、少なくとも２の整数である（任意に約１〜５０）。「ｎ」という整数は、標的化部分上のＣ−Ｅ部分の数を指し、かつ「ｉ」及び「ｊ」という整数は、どのくらい多くのタイプの切断部位及びエピトープがコンストラクト内にあるのかを指す。
【００１１】
さらに、いくつかの実施形態において、望ましくない細胞に対する免疫応答を再標的化するための組成物は、
ａ．望ましくない細胞を標的化することのできる標的化部分、
ｂ．少なくとも１つの切断部位を有する標的化部分へ結合した１０個を超える複数のＴ細胞エピトープ（この中で、切断部位は、
ｉ．望ましくない細胞によって発現する酵素によって切断される、
ｉｉ．望ましくない細胞の内側でｐＨ感受性切断反応を通じて切断される、
ｉｉｉ．補体依存性切断反応によって切断される、または
ｉｖ．ＴＰＥＣにおける標的化部分と同じである若しくは異なる標的化部分によって望ましくない細胞へ共存するプロテアーゼによって切断される）
を有するＴＰＥＣを含む。
【００１２】
追加の目的及び利点は、以下に続く本明細書の一部において示されるであろうし、一部は本明細書から明らかであろうし、または実施によって学習され得る。目的及び利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘されている要素及び組み合わせによって具現化及び達成されるであろう。
【００１３】
上述の一般的な説明及び以下の詳細な説明が両方とも例示的でありかつ説明的にのみであって、特許請求の範囲を制限するものではないことは理解されることになっている。
【００１４】
本明細書の一部に組み込まれかつ本明細書の一部を構成する添付の図面は、１つの（いくつかの）実施形態（複数可）を示しており、本明細書とともに、本明細書に説明する原理を説明するよう機能している。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１のＡ〜Ｂは、ＴＰＥＣのある特定の実施形態を示す。図１のＡにおいて、標的化部分、任意に抗体は、化学的リンカー及び切断部位を用いて当該標的化部分へ固定した、同じＴ細胞エピトープの複数のコピーを有する。図１のＢにおいて、標的化部分、任意に抗体は、化学的リンカー及び切断部位を用いて当該標的化部分へ固定した、複数の異なるＴ細胞エピトープを有する。リンカー切断部位−Ｔ細胞エピトープは、無作為な位置でかつ無作為な量で、標的化部分へ固定され得、ＴＰＥＣの異種性集団を作り得る。これらの実施形態において、ＴＰＥＣは、Ｔへ個別に各々結合した複数のＬ−Ｃ−Ｅを含み、式中、Ｌはリンカーであり、Ｃは切断部位であり、Ｅはエピトープであり、かつＴは標的化部分である。
【図２Ａ−Ｂ】ＴＰＥＣのある特定の実施形態を示す。図２のＡにおいて、標的化部分、任意に抗体は、化学的リンカーまたはペプチドリンカーを用いて当該標的化部分へ固定した、複数の異なるＴ細胞エピトープを有し、この中で、複数のＴ細胞エピトープは、切断部位によって分離され、束における標的化部分へ固定される。図２のＢは、ある特定のドメインに隣接する免疫グロブリンフレームワーク領域を有するＴ細胞エピトープの束を示す。図２のＡ及びＢの両方には、線形立体配置を有するポリトープを含む。図２のＡ及びＢの実施形態において、ＴＰＥＣは、各Ｃ−ＥがＬへ（束になった及び／または線形立体配置において）直列に結合したＬ−（Ｃ−Ｅ）ｎのうちの少なくとも１つを含み、かつ、この中でｎは、少なくとも２の整数（任意に約２〜５０）であり、及び式中Ｌはリンカーであり、Ｃは切断部位であり、Ｅはエピトープであり、かつＴは標的化部分である。
【図２Ｃ】ＴＰＥＣのある特定の実施形態を示す。分枝鎖立体配置を有するポリトープを含むＴＰＥＣの一実施形態を示す。非表示の別の実施形態において、分枝鎖立体配置を有するポリトープは、同一のＴ細胞エピトープを有し得る。図２のＣの実施形態において、ＴＰＥＣは、各Ｃ−ＥがＬへ並列に（分枝鎖立体配置において）結合したＬ−（Ｃ−Ｅ）ｎのうちの少なくとも１つを含み、及びこの中で、ｎは少なくとも２の整数（任意に約２〜５０）であり、及び式中、Ｌはリンカーであり、Ｃは切断部位であり、Ｅはエピトープであり、かつＴは標的化部分である。
【図３Ａ−Ｂ】方向づけを直されたウイルス特異的なＴ細胞のインビトロでの活性を示す（多重ペプチドＴＰＥＣアプローチ）。抗ＣＤ２０抗体リツキシマブへの２つの異なるウイルスペプチドであるＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ（配列番号２）及びＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１）の結合を通じての、ＣＤ８＋サイトメガロウイルス特異的細胞毒性Ｔリンパ球によるリンパ芽球様リンパ腫細胞株の認識。抗体は、スルホＳＭＣＣを用いてペプチドＮＬＶＰＭＶＡＴＶＡＳＧＶ｛ＣＩＴ｝ＧＣ（配列番号３）及びペプチドＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬＡＳＧＦＫＧＣ（配列番号４）へ、１００％ＮＬＶ：０％ＲＰＨから０％ＮＬＶ：１００％ＲＰＨまでの異なる比で結合する。ＴＰＥＣで標識した標的リンパ腫細胞は、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶＡＳＧＶ｛ＣＩＴ｝ＧＣ（配列番号３）である結合したペプチドの１０％までに至るすべての比において、ＮＬＶペプチド（Ａ）に対して特異的なリンパ球によって認識される。同様に、標的リンパ腫細胞は、ＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬＡＳＧＦＫＧＣ（配列番号４）である結合したペプチドの１０％までに至るすべての比において、ＲＰＨペプチド（Ｂ）に対して特異的なリンパ球によって認識される。（Ａ）及び（Ｂ）の両方において、Ｔ細胞によって認識される結合したペプチドの比が０％である場合、ペプチド特異的Ｔ細胞によるＴ細胞認識はない。
【図３Ｃ】方向づけを直されたウイルス特異的なＴ細胞のインビトロでの活性を示す（多重ペプチドＴＰＥＣアプローチ）。当該２つの異なるペプチドと結合したリツキシマブＴＰＥＣを用いたＮＬＶ及びＲＰＨの両方に特異的なＴ細胞の活性を実証する（Ａ）及び（Ｂ）の重なったプロット。
【図４】抗ＣＤ２０抗体リツキシマブへの３つの異なるウイルスペプチドＶＬＥＥＴＳＶＭＬ（配列番号５）、ＣＲＶＬＣＣＹＹＬ（配列番号１７）及びＹＩＬＥＥＴＳＶＭ（配列番号７）の結合を通じてのＣＤ８＋サイトメガロウイルス特異的細胞毒性Ｔリンパ球によるリンパ芽球様リンパ腫細胞株の認識を示す。抗体は、スルホＳＭＣＣを用いて等量のペプチドＶＬＥＥＴＳＶＭＬＡＳＧＦＫＧＣ（配列番号８）、ペプチドＢＲＶＬＢＢＹＶＬＡＳＧＦＫＧＣ（配列番号９）へ結合し、ここで、Ｂはアミノ酪酸、システインについての相同体及びＹＩＬＥＥＴＳＶＭＡＳＧＦＫＧＣ（配列番号１０）である。ＴＰＥＣで標識した標的リンパ腫細胞は、当該抗体へ結合した当該３つのペプチドの各々に特異的なＴ細胞によって認識される。未処理の標的細胞は、当該ペプチド特異的Ｔ細胞によって認識されず（陰性対照）、遊離ペプチドで刺激される標的細胞は、Ｔ細胞によって強く認識される（陽性対照）。
【図５】ポリトープペプチドの結合を通じてのＣＤ８＋サイトメガロウイルス特異的細胞毒性Ｔリンパ球によるリンパ芽球様リンパ腫細胞株の認識を実証する。抗体は、スルホＳＭＣＣを用いてペプチド（ｉ）ＣＧＶＡＮＬＶＰＭＶＡＴＶＡＶＡＶＬＥＥＴＳＶＭＬ（配列番号１１）、ペプチド（ｉｉ）ＣＶＡＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬＶＡＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１２）及びペプチド（ｉｉｉ）ＣＧＶＡＮＬＶＰＭＶＡＴＶＡＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ（配列番号１３）へ結合する。ＴＰＥＣで標識した標的リンパ腫細胞は、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１）に特異的なＴ細胞によって認識される。未処理の標的細胞は、当該ペプチド特異的Ｔ細胞によって認識されず（陰性対照）、遊離ペプチドで刺激される標的細胞は、Ｔ細胞によって強く認識される（陽性対照）。
【図６】４つのアジドノルロイシン残基を含有する主鎖ペプチドアミノ末端にプロパルギルグリシンを含有するペプチド（分枝鎖）を用いる分枝鎖ペプチドの一実施形態のタンパク質結合の化学的性質を実証する（図６のＡ）。４ｍｌ中の１０ｍｇのアスコルビン酸と混合した４ｍｌ中の１０ｍｇのＣｕＳＯ４５Ｈ２Ｏ触媒の存在下でＤＭＳＯ中の等モル濃度の分枝鎖を主鎖ペプチドとともに一晩インキュベートした結果、結合に使用される分枝鎖ペプチドの形成が生じた。当該反応のためのＤＭＳＯの終濃度は５０％であった。当該分枝鎖ペプチドを、ＨＰＬＣを用いて精製し、質量分析を用いて確認した（図６のＢ）。当該ペプチドは、通常のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）と比較されるペプチド安定性において有用なＮ末端アミド基（−ｎｈ２）を含有する。
【図７】分枝鎖ペプチドフォーマットにおけるポリトープペプチドの結合を通じてのＣＤ８＋サイトメガロウイルス特異的細胞毒性Ｔリンパ球によるリンパ芽球様リンパ腫細胞株の認識を実証する。抗体は、以下のペプチドを用いた図６Ｂにおける実施形態を用いて結合する。  主鎖：ＳＥＥＺＳＥＥＺＳＥＥＺＳＥＥＺ（Ｚ：アジドノルロイシン）（配列番号１６６）、  分枝鎖１ＴＰＥＣに対する分枝鎖１−１：ＢＫＰＡＫＦＦＲＬＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭ−ｎｈ２（Ｂ：プロパルギルグリシン）（配列番号１６７）  分枝鎖１−２：ＢＫＰＡＫＦＦＲＬＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ−ｎｈ２（Ｂ：プロパルギルグリシン）（配列番号１６８）、  分枝鎖１−３：ＢＫＰＡＫＦＦＲＬＲＥＬＲＲＫＭＭＹＭ−ｎｈ２（Ｂ：プロパルギルグリシン）（配列番号１６９）、及び  分枝鎖１−４：ＢＫＰＡＫＦＦＲＬＮＬＶＰＭＶＡＴＶ−ｎｈ２（Ｂ：プロパルギルグリシン）（配列番号１７０）、ならびに  分枝鎖３ＴＰＥＣに対する分枝鎖３−１：ＢＡＩＰＶＳＬＲＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭ−ｎｈ２（Ｂ：プロパルギルグリシン）（配列番号１７１）、  分枝鎖３−２：ＢＡＩＰＶＳＬＲＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ−ｎｈ２（Ｂ：プロパルギルグリシン）（配列番号１７２）、  分枝鎖３−３：ＢＡＩＰＶＳＬＲＥＬＲＲＫＭＭＹＭ−ｎｈ２（Ｂ：プロパルギルグリシン）（配列番号１７３）及び  分枝鎖３−４：ＢＡＩＰＶＳＴＶＴＥＨＤＴＬＬＹ−ｎｈ２（Ｂ：プロパルギルグリシン）（配列番号１７４）。  分枝鎖ペプチドＴＰＥＣを用いて標識した標的リンパ腫細胞は、ＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ（配列番号２）ペプチド及びＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭ（配列番号４９）ペプチドに特異的なＴ細胞によって認識される。未処理の標的細胞は、当該ペプチド特異的Ｔ細胞によって認識されず（陰性対照）、遊離ペプチドで刺激される標的細胞は、Ｔ細胞によって強く認識される（陽性対照）。
【図８】分枝鎖ペプチドフォーマットにおけるポリトープペプチドの結合を通じてのＣＤ８＋サイトメガロウイルス特異的細胞毒性Ｔリンパ球による卵巣癌細胞株の認識を実証する。抗体は、ペプチド  主鎖：ＳＥＥＺＳＥＥＺＳＥＥＺＳＥＥＺ（Ｚ：アジドノルロイシン）（配列番号１６６）、  分枝鎖１ＴＰＥＣに対する分枝鎖１−１：ＢＫＰＡＫＦＦＲＬＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭ−ｎｈ２（Ｂ：プロパルギルグリシン）（配列番号１６７）、  分枝鎖１−２：ＢＫＰＡＫＦＦＲＬＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ−ｎｈ２（Ｂ：プロパルギルグリシン）（配列番号１６８）、  分枝鎖１−３：ＢＫＰＡＫＦＦＲＬＲＥＬＲＲＫＭＭＹＭ−ｎｈ２（Ｂ：プロパルギルグリシン）（配列番号１６９）、  分枝鎖１−４：ＢＫＰＡＫＦＦＲＬＮＬＶＰＭＶＡＴＶ−ｎｈ２（Ｂ：プロパルギルグリシン）（配列番号１７０）、ならびに  分枝鎖３ＴＰＥＣに対する分枝鎖３−１：ＢＡＩＰＶＳＬＲＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭ−ｎｈ２（Ｂ：プロパルギルグリシン）（配列番号１７１）、  分枝鎖３−２：ＢＡＩＰＶＳＬＲＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ−ｎｈ２（Ｂ：プロパルギルグリシン）（配列番号１７２）、  分枝鎖３−３：ＢＡＩＰＶＳＬＲＥＬＲＲＫＭＭＹＭ−ｎｈ２（Ｂ：プロパルギルグリシン）（配列番号１７３）、及び  分枝鎖３−４：ＢＡＩＰＶＳＬＶＴＥＨＤＴＬＬＹ−ｎｈ２（Ｂ：プロパルギルグリシン）を用いる図６のＢにおける実施形態を用いて結合する。  分枝鎖ペプチドＴＰＥＣを用いて標識した標的リンパ腫細胞は、ＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＴ（配列番号２）ペプチド及びＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭ（配列番号４９）ペプチドに特異的なＴ細胞によって認識される。未処理の標的細胞は、当該ペプチド特異的Ｔ細胞によって認識されず（陰性対照）、遊離ペプチドで刺激される標的細胞は、Ｔ細胞によって強く認識される（陽性対照）。
【図９Ａ−Ｂ】束になったドメインＴＰＥＣの実施形態を提供する。図９のＡは、束になったドメインＴＰＥＣに用いる足場（フィブロネクチン１型タンパク質由来のフィブロネクチン３型ドメイン）を実証する。束になったドメインの配列（図９のＡ）は、当該ドメインの外側ループにおいて生じる突然変異を実証し、ＭＭＰ２に特異的なプロテアーゼ認識配列によって両側にあるフィブロネクチン配列から分離されたウイルスエピトープを含有する。プロテアーゼ切断部位には下線を付し、ウイルスエピトープは太字及び斜字で示す。図９のＢは、束になったドメインならびにウイルスエピトープを含有する「ＢＣ」ループ、「ＤＥ」ループ及び「ＦＧ」ループの構造を実証する。
【図９Ｃ】束になったドメインＴＰＥＣの実施形態を提供する。図９のＣは、ＣＤ８＋サイトメガロウイルス特異的細胞毒性Ｔリンパ球による卵巣癌細胞株の認識を実証する。ＣＭＶエピトープは、セツキシマブの重鎖へ連結した追加のタンパク質ドメイン内に含有される。当該ウイルスエピトープは、標的細胞株によって産生される、ＭＭＰ２の存在下でウイルスエピトープの放出を許容するであろうＭＭＰ２プロテアーゼ認識配列によって隣接される。束になったドメインＴＰＥＣは、Ｅｘｐｉ２９３細胞において産生され、プロテインＡセファロースビーズを用いて精製される。  束になったドメインＴＰＥＣを用いて標識される標的卵巣癌細胞は、ＩＦＮ−γの放出によってウイルスエピトープＮＬＶＰＭＶＡＴＶに特異的なＴ細胞によって認識される。束になったドメインの４つの異なる調製物（異なる濃度のＤＮＡを用いて２日間の各々において生じる２つのＴＰＥＣ）を使用し、当該調製物はすべて、ペプチド特異的Ｔ細胞によって、類似の量の束になったドメインＴＰＥＣを産生され、標的細胞の類似の認識を生じる。未処理の標的細胞は、ペプチド特異的Ｔ細胞によって認識されず（陰性対照）、遊離ペプチドで刺激される標的細胞は、Ｔ細胞によって強く認識される（陽性対照）。
【００１６】
（配列の説明）
表１は、本明細書に参照するある特定の配列の一覧表を提供する。
【００１７】
【表１−１】
2018508481.tif 000002
【００１８】
【表１−２】
2018508481.tif 000003
【００１９】
【表１−３】
2018508481.tif 000004
【００２０】
【表１−４】
2018508481.tif 000005
【００２１】
【表１−５】
2018508481.tif 000006
【００２２】
【表１−６】
2018508481.tif 000007
【発明を実施するための形態】
【００２３】
Ｉ．複数のＴ細胞エピトープを有する標的化部分ペプチドエピトープ複合体
種々の標的化部分ペプチドエピトープ複合体（ＴＰＥＣ）は、異なる実施形態において説明する。しかしながら、実施形態の各々において、標的化部分は、望ましくない細胞の領域へＴＰＥＣを送達するために使用され得、治療効果を局所的に送達させ得る。ＴＰＥＣはまた、複数のＴ細胞エピトープを含有する。ＴＰＥＣはさらに、標的化作用因子から、いくつかの実施形態においては、望ましくない細胞の微小環境にある場合、お互いからＴ細胞エピトープを放出する切断部位を含む。Ｔ細胞エピトープの配置及び数は、本明細書に説明する異なる実施形態において異なり、いったん標的化作用因子（及び任意の隣接するＴ細胞エピトープ）から切断されると、Ｔ細胞エピトープは、望ましくない細胞に対する免疫応答を刺激することによって機能する。いくつかの実施形態において、最大限の利益は、標的化作用因子から及び切断過程におけるお互いからの両方に由来するＴ細胞エピトープをすべて放出して、各Ｔ細胞エピトープが望ましくない細胞に対する免疫応答を誘引されることによって達成され得る。
【００２４】
複数のＴ細胞エピトープを有することは、先に詳細に論議したように、望ましくない細胞に対する免疫応答を、所与の患者におけるより強い免疫応答を刺激することによって、またはＴＰＥＣに、異なる民族群及び種族群における広範な種々の患者にわたって免疫応答を刺激させることによってのいずれかで亢進する。一実施形態において、及び理論によって結び付けられることはないが、切断部位における切断によって、Ｔ細胞エピトープは、片端または両端で、ＨＬＡクラスＩのペプチド結合溝にぴったり合うことのできるペプチドを生成し、免疫応答を惹起するようＴ細胞によって認識されるのに適切な長さに整えられる。
【００２５】
これらのエピトープの切断なしで、先行技術は、十分なＴ細胞応答を刺激し損ね、その理由は、互いに融合したＴ細胞エピトープが、患者のＴ細胞によって適切に認識されず、癌細胞に対する免疫応答を惹起しなかったからであろう。
【００２６】
Ａ．個別に結合した複数のＴ細胞エピトープを有するＴＰＥＣ
一実施形態において、ＴＰＥＣは、標的化部分へ個別に結合した複数のＴ細胞エピトープを含む。Ｔ細胞エピトープは、標的化部分へ個別に結合するので、２つの例示的な実施形態を図１のＡ及びＢにおいて示すように、本実施形態は、人間の皮膚からの個々の毛髪のような標的化部分からＴ細胞エピトープが突出しているので、「毛様」実施形態と呼ぶことがある。言い換えれば、いくつかの実施形態において、望ましくない細胞に対する免疫応答を再標的化するための組成物は、式Ｔ−（Ｌ−Ｃ−Ｅ）ｎを含むＴＰＥＣを含み得る。このような実施形態において、複数のＬ−Ｃ−Ｅは、各々個別にＴへ結合し、この中で、
【００２７】
（ａ）Ｔは、望ましくない細胞を標的化することのできる標的化部分である、
【００２８】
（ｂ）Ｌは、Ｔへ化学的に結合できるリンカーである、
【００２９】
（ｃ）Ｃは、（ｉ）望ましくない細胞によって発現する酵素によって切断される、（ｉｉ）望ましくない細胞の内側でのｐＨ感受性切断反応を通じて切断される、（ｉｉｉ）補体依存性切断反応によって切断される、または（ｉｖ）ＴＰＥＣにおける標的化部分と同じである若しくは異なる標的化部分によって望ましくない細胞へ共存するプロテアーゼによって切断される、切断部位である、及び
【００３０】
（ｄ）Ｅは、Ｔ細胞エピトープである。
【００３１】
Ｎは、少なくとも２（任意に約２〜５０）の整数である。同じ切断部位は任意に、ＴＰＥＣにおいて複数回使用され得、同じエピトープは任意に、ＴＰＥＣにおいて複数回使用され得る。
【００３２】
Ｃ部分及びＥ部分は、単一のＴへ固定される複数のＬ−Ｃ−Ｅ部分において同じであり得、または単一のＴは、複数のＬ−Ｃ−Ｅ部分における異なるＣ部分及びＥ部分を有し得る。したがって、１つを超えるタイプの切断部位またはたった１つのタイプの切断部位があり得る。また、独立して、１つを超えるタイプのＴ細胞エピトープまたはたった１つのタイプのＴ細胞エピトープがあり得る。
【００３３】
本節において論議する実施形態に関するある特定の態様において、Ｌ−Ｃ−Ｅ複合体は、無作為様式で標的化部分へ固定され得る。したがって、標的化部分へ個別に結合した複数のＴ細胞エピトープを有するＴＰＥＣの調製物において、いくつかのＴＰＥＣは、より多数のＴ細胞エピトープを有し得、いくつかは、より少ない数を有し得る。加えて、標的化部分へ個別に結合した複数のＴ細胞エピトープを有するＴＰＥＣの調製物において、ＴＰＥＣの位置は、当該調製物のいたるところで異なり得る。この傾向において、これらの化合物が、癌のような疾患に罹患している患者へ投与される場合、当該患者の身体は、ＴＰＥＣの調製物に対する阻害性免疫応答を開始する非常により多大な困難な時間を有するであろう。このことによって患者は、以下の第ＩＩＩ．Ｂ節において以下にさらに論議するように、有意な時間にわたって複数回用量のＴＰＥＣ調製物を受容でき得る。
【００３４】
Ｂ．少なくとも１つのポリトープを有するＴＰＥＣ
別の実施形態において、ＴＰＥＣは、（ポリエピトープのための）ポリトープとしての標的化部分へ結合した複数のＴ細胞エピトープを含むが、当該ポリトープ内での及び当該標的化部分への結合は、望ましくない細胞の微小環境における個々のＴ細胞エピトープの放出を可能にする切断部位を通じて生じる。この配置に関するいくつかの実施形態は、図２のＡ、Ｂ、及びＣに示す。したがって、ポリトープ自体は、線状及び／若しくは束になった立体配置（図２のＡ及びＢのような）、または剛毛を有するヘアブラシのような分枝鎖立体配置（図２のＣのような）を有することができる。
【００３５】
図２のＡ〜Ｂにおいて、望ましくない細胞に対する免疫応答を再標的化するための組成物は、Ｌへ直列に各々結合したＣ−ＥとＴへ結合したＬとを有するＬ−（Ｃ−Ｅ）ｎのうちの少なくとも１つを有するＴＰＥＣを含む。当該組成物は、Ｔへ結合した１個または複数のＬ−（Ｃ−Ｅ）ｎを有し得る。図２のＡ〜Ｂの実施形態において、リンカーは、化学的リンカー、ペプチド結合、または少なくとも１つのペプチドのいずれかであり得る。
【００３６】
図２のＣにおいて、望ましくない細胞に対する免疫応答を再標的化するための組成物は、Ｌへ並列結合した各Ｃ−ＥとＴへ結合したＬとを有するＬ−（Ｃ−Ｅ）ｎのうちの少なくとも１つを有するＴＰＥＣを含む。当該組成物は、Ｔへ結合した１個または複数のＬ−（Ｃ−Ｅ）ｎを有し得る。実施形態２のＣにおいて、リンカーは、化学的リンカーであり得る。
【００３７】
図２のＡ〜Ｃの実施形態すべてにおいて、
【００３８】
（ａ）Ｔは、望ましくない細胞を標的化することのできる標的化部分である、
【００３９】
（ｂ）Ｌは、Ｔに対する化学的結合またはペプチド結合（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）（ペプチド結合（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｏｎｄ）を含む）をすることのできるリンカーである、
【００４０】
（ｃ）Ｃは、（ｉ）望ましくない細胞によって発現する酵素によって切断される、（ｉｉ）望ましくない細胞の内側でｐＨ感受性切断反応を通じて切断される、（ｉｉｉ）補体依存的切断反応によって切断される、または（ｉｖ）ＴＰＥＣにおける標的化部分と同じである若しくは異なる標的化部分によって望ましくない細胞へ共存するプロテアーゼによって切断される、切断部位である、かつ
【００４１】
（ｄ）Ｅは、Ｔ細胞エピトープである
【００４２】
（この中で、ｎは、少なくとも２（任意に約２〜５０）の整数である）。
【００４３】
Ｃ部分及びＥ部分は、単一のＴへＬを通じて固定した複数のＣ−Ｅ部分において同じであり得、または単一のＴは、複数のＣ−Ｅ部分において異なるＣ部分及びＥ部分を有し得る。したがって、１つを超えるタイプの切断部位またはたった１つのタイプの切断部位があり得る。また、独立して、１つを超えるタイプのＴ細胞エピトープまたはたった１つのタイプのＴ細胞エピトープがあり得る。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ポリトープにおいて結合している複数のＴ細胞エピトープは、標準的な群、数、及び配置のＴ細胞エピトープを含有する均一な生成物を生成させるが、望ましくない細胞の微小環境におけるＴ細胞エピトープすべての放出をなおも可能にしている。微小環境は、物理的、化学的、及び生物学的条件が、細胞に及ぼす効果を有するまたは細胞によって感知されることができる距離内で細胞の近くでのこれらの条件の特定のセットを意味する。
【００４５】
いくつかの実施形態において、１つを超えるポリトープは、標的化部分へ結合している。いくつかの実施形態において、約１〜３０、１〜２０、または１〜１０のポリトープは、標的化部分へ結合している。いくつかの実施形態において、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のポリトープは、標的化部分へ、１つの切断部位によって各群、結合している。これらの実施形態において、ポリトープは、同じであり得るまたは異なり得る。
【００４６】
いくつかの実施形態において、ＴＰＥＣは、第Ｉ．Ａ節及び第Ｉ．Ｂ節それぞれによると、少なくとも１つの個別に結合したＴ細胞エピトープ及び少なくとも１つのポリトープを両方有し得る。
【００４７】
Ｃ．１０を超えるＴ細胞エピトープを有するＴＰＥＣ
別の実施形態において、ＴＰＥＣは、複数のＴ細胞エピトープが標的部分上にどのように配置されているかにかかわらず、１０個を超えるＴ細胞エピトープを含む当該複数のＴ細胞エピトープを含む。これらの実施形態において、Ｔ細胞エピトープは、個別に結合し得、またはポリトープの中で結合し得る。言い換えれば、望ましくない細胞に対する免疫応答を再標的化するための組成物は、以下を有するＴＰＥＣを含み得る。
【００４８】
（ａ）望ましくない細胞を標的化することのできる標的化部分、
【００４９】
（ｂ）少なくとも１つの切断部位を有する標的化部分へ結合した１０個を超える複数のＴ細胞エピトープであり、この中で、当該切断部位は、（ｉ）望ましくない細胞によって発現する酵素によって切断される、（ｉｉ）望ましくない細胞の内側でｐＨ感受性切断反応を通じて切断される、（ｉｉｉ）補体依存性切断反応によって切断される、または（ｉｖ）ＴＰＥＣにおける標的化部分と同じである若しくは異なる標的化部分によって望ましくない細胞へ共存するプロテアーゼによって切断される。
【００５０】
１０個を超えるＴ細胞エピトープを有するＴＰＥＣを含むいくつかの実施形態において、望ましくない細胞に対する免疫応答は、顕著により強い。１０個を超えるＴ細胞エピトープを有するＴＰＥＣを含むいくつかの実施形態において、ＴＰＥＣは、望ましくない細胞を特徴とする容態に罹患しているより大きな比率の患者を治療するために使用することができる。
【００５１】
１０個を超えるＴ細胞エピトープを有するＴＰＥＣを用いるいくつかの組成物において、Ｔ細胞エピトープは、標的部分へ、各Ｔ細胞エピトープが切断部位によって個別に結合し得る。１０個を超えるＴ細胞エピトープを有するＴＰＥＣを用いるいくつかの実施形態において、Ｔ細胞エピトープは、標的部分へ少なくとも１つのポリトープとして結合し得、切断部位によって標的部分へ各ポリトープが結合し得る。いくつかの実施形態において、ポリトープ内のＴ細胞エピトープは、当該Ｔ細胞エピトープ間に切断部位を有する。
【００５２】
Ｄ．ＴＰＥＣを含む組成物
組成物は、複数のＴＰＥＣを含み得る。いくつかの実施形態において、組成物中のＴＰＥＣはすべて同じである。いくつかの実施形態において、組成物中のＴＰＥＣの少なくともいくつかは同一ではない。
【００５３】
いくつかの実施形態において、各ＴＰＥＣは、複数の同一のＴ細胞エピトープへ結合している。
【００５４】
いくつかの実施形態において、組成物中のＴＰＥＣの少なくともいくつかは、同一ではない複数のＴ細胞エピトープへ結合している。
【００５５】
いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、またはそれより多数の異なるＴＰＥＣを含み得る。
【００５６】
Ｅ．Ｔ細胞エピトープ
Ｔ細胞エピトープは、ＴＰＥＣにおいて機能して、患者自身の免疫応答を誘引して、望ましくない細胞を、感染性因子由来の抗原性Ｔ細胞エピトープを用いて当該望ましくない細胞を標識することによって攻撃する。
【００５７】
療法の所望の態様により、Ｔ細胞エピトープを選択する場合に種々の任意の因子が考えられ得る。どの人間も、コーカサス人集団の約４５％において認められるＨＬＡ−Ａ２０１のようなその他のタイプよりも集団において優勢ないくつかのＨＬＡタイプを有するＣＤ８  Ｔ細胞に対して提示するようペプチドを結合することのできる６個のＨＬＡクラスＩ分子を有する。立体配置について選択されるエピトープが、集団の比率において認められるのみである限定されたセットのＨＬＡ分子へ結合することができる状況において、ＴＰＥＣは、当該集団の他のセグメントにおいてまったく有効性を有していないことがあり、または非常に有効性があるものとして有してはいないことがある。例としてＨＬＡ−Ａ２０１を用いる場合、標的化部分がＨＬＡ−Ａ２０１へ結合するＴ細胞エピトープと結合していれば、ＨＬＡ−Ａ２０１を発現する患者のみがエピトープを結合して当該エピトープをＴ細胞へ提示して、免疫応答を惹起するであろう。しかしながら、ＨＬＡ−Ａ２０１陰性である患者において、当該エピトープは当該ＨＬＡ分子へ結合することができないかもしれず、免疫応答が全くないまたはより低いであろう。療法が異なるＨＬＡ分子を有する広範なセグメントの集団へ提供され得る状況において、より多くのＨＬＡ分子へ結合する異なるエピトープを用いることは、当該集団にわたってＴＰＥＣの有効性を亢進し得る。
【００５８】
熟考するための追加の因子として、いくつかの実施形態において、Ｔ細胞エピトープは、特定の人間が曝露された、広範な種々の人間が曝露された、またはワクチンが投与された若しくは投与できる、当該Ｔ細胞エピトープから選択され得る。Ｔ細胞は概して、患者が既にエピトープに由来するウイルスですでに感染している場合（または患者が当該エピトープを含有するワクチンを既に受けている場合）、ＨＬＡ分子を有する複合体においてエピトープを認識する。ワクチンは、先行目的（幼少期のワクチンなど）のためにすでに投与されていてもよく、または同じエピトープを用いて先行ＴＰＥＣ治療を投与されてもよい。
【００５９】
ある特定の状況において、Ｔ細胞エピトープは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、水痘帯状疱疹、流行性耳下腺炎、麻疹、風疹、アデノウイルス、ポリオ、ワクシニア、ＲＳＶ、ロタウイルス、破傷風、ワクシニア、及び黄熱病のＴ細胞エピトープから選択される。エピトープは、問題の集団にわたって流行している、または規則的に投与される若しくは併用療法アプローチの一部として投与され得るワクチンがある、感染性作用因子から選択され得る。
【００６０】
ある特定の実施形態において、Ｔ細胞エピトープは、少なくとも２、３、４、または５の異なる感染性作用因子から選択される。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞エピトープの少なくともいくつかはＣＭＶエピトープである。
【００６１】
本明細書に説明する種々のＴＰＥＣのうちのいずれにおいても、いくつかの実施形態において、複数のＴ細胞エピトープはすべてが同一というわけではない。いくつかの実施形態において、複数のＴ細胞エピトープは同じである。ある特定の実施形態において、複数のＴ細胞エピトープは、同じであるいくつか及び異なるいくつかを含む。
【００６２】
Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩに制限したペプチド全部、ＭＨＣクラスＩＩに制限したペプチド全部、またはクラスＩ及びクラスＩＩの両方の組み合わせであり得る。
【００６３】
いくつかの実施形態において、複数のＴ細胞エピトープは、長さ約７〜１４アミノ酸、約８〜１３、約９〜１２、約９、または約１０のアミノ酸である。
【００６４】
いくつかの実施形態において、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の異なるＴ細胞エピトープを、ＴＰＥＣが同じであろうと異なっていようと、ＴＰＥＣにおいて用いる。いくつかの実施形態において、複数の異なるＴ細胞エピトープを用いることは、当該作用因子にＴ細胞応答をヒトの集団の少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％において刺激させる。
【００６５】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞エピトープは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ―Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１ｄ、及びＭＲ１から選択される。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞エピトープは、ＨＬＡ−Ａ＊０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２、ＨＬＡ−Ａ＊０３、ＨＬＡ−Ａ＊１１、ＨＬＡ−Ａ＊２４、ＨＬＡ−Ｂ＊４４、ＨＬＡ−Ｂ＊０７、ＨＬＡ−Ｂ＊０８、ＨＬＡ−Ｂ＊１５、ＨＬＡ−Ｂ＊３５、ＨＬＡ−Ｂ＊４０、ＨＬＡ−Ｃ＊０７、ＨＬＡ−Ｃ＊０３、ＨＬＡ−Ｃ＊０５、ＨＬＡ−Ｃ＊０４、ＨＬＡ−Ｃ＊０６、及びＨＬＡ−Ｅ＊０１０１に制限された抗原から選択される。
【００６６】
ある特定の実施形態において、当該組成物は、少なくとも以下のＴ細胞エピトープ、すなわちＨＬＡ−Ａ＊０２、ＨＬＡ−Ａ＊０１、及びＨＬＡ−Ａ＊０３を含む。
【００６７】
所望の場合、より免疫優勢なＴ細胞エピトープが選択され得る。免疫優勢によって、本発明者らは、所与の患者における最強の免疫応答を誘引する当該エピトープ及び／または人間の広範な横断面にわたって免疫原性であることが公知の当該エピトープを意味する。
【００６８】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞エピトープは、表２に提供するエピトープの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞エピトープは、表２に提供するエピトープから選択される。
【００６９】
【表２−１】
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【００７０】
【表２−２】
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【００７１】
【表２−３】
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【００７２】
【表２−４】
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【００７３】
【表２−５】
2018508481.tif 000012
【００７４】
Ｆ．標的化部分
標的化部分は、望ましくない細胞の局所的環境へＴＰＥＣを送達することによって、ＴＰＥＣにおいて機能し、限局性治療戦略を可能にする。ある特定の実施形態において、標的化部分は、望ましくない細胞へ特異的に結合することによって、望ましくない細胞を標的にする。いくつかの場合、標的化部分は、複数のＴ細胞エピトープが当該標的化部分へ結合していながらでさえ、望ましくない細胞を特異的に結合する。
【００７５】
ある特定の実施形態において、標的化部分は、抗体またはその機能的部分である。
【００７６】
ある特定の抗体標的（丸括弧内に望ましくない細胞タイプの例を伴う）には、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ（上皮悪性）、ＣＤ２２（Ｂ細胞、自己免疫または悪性）、ＥｐＣＡＭ（ＣＤ３２６）（上皮悪性）、ＥＧＦＲ（上皮悪性）、ＰＭＳＡ（前立腺癌）、ＣＤ３０（Ｂ細胞悪性）、ＣＤ２０（Ｂ細胞、自己免疫、アレルギー性または悪性）、ＣＤ３３（骨髄性悪性）、膜ＩｇＥ（アレルギー性Ｂ細胞）、ＩｇＥ受容体（ＣＤ２３）（アレルギー性疾患におけるマスト細胞またはＢ細胞）、ＣＤ８０（Ｂ細胞、自己免疫、アレルギー性または悪性）、ＣＤ８６（Ｂ細胞、自己免疫、アレルギー性または悪性）、ＣＤ２（Ｔ細胞またはＮＫ細胞リンパ腫）、ＣＡ１２５（卵巣癌を含む複数の癌）、炭酸脱水酵素ＩＸ（腎細胞癌を含む複数の癌）、ＣＤ７０（Ｂ細胞、自己免疫、アレルギー性または悪性）、ＣＤ７４（Ｂ細胞、自己免疫、アレルギー性または悪性）、ＣＤ５６（Ｔ細胞またはＮＫ細胞リンパ腫）、ＣＤ４０（Ｂ細胞、自己免疫、アレルギー性または悪性）、ＣＤ１９（Ｂ細胞、自己免疫、アレルギー性または悪性）、ｃ−ｍｅｔ／ＨＧＦＲ（消化管悪性及び肝悪性）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（卵巣癌及び大腸癌を含む複数の悪性）、ＤＲＳ（卵巣癌及び大腸癌を含む複数の悪性）、ＰＤ−１（Ｂ細胞、自己免疫、アレルギー性または悪性）、ＰＤ１Ｌ（上皮腺癌を含む複数の悪性）、ＩＧＦ−１Ｒ（上皮腺癌を含むほとんどの悪性）、ＶＥＧＦ−Ｒ２（上皮腺癌を含む悪性の大部分と関係する脈管系）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）（前立腺癌）、ＭＵＣ１（上皮悪性）、ＣａｎＡｇ（結腸及び膵臓の癌腫のような腫瘍）、メソテリン（中皮腫ならびに卵巣及び膵臓の腺癌を含む多くの腫瘍）Ｐ−カドヘリン（乳腺癌を含む上皮悪性）、ミオスタチン（ＧＤＦ８）（肉腫ならびに卵巣及び膵臓の腺癌を含む多くの腫瘍）、クリプト（ＴＤＧＦ１）（結腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、及び膵癌を含む上皮悪性）、ＡＣＶＲＬ１／ＡＬＫ１（白血病及びリンパ腫を含む複数の悪性）、ＭＵＣ５ＡＣ（乳腺癌を含む上皮悪性）、ＣＥＡＣＡＭ（乳腺癌を含む上皮悪性）、ＣＤ１３７（Ｂ細胞またはＴ細胞、自己免疫、アレルギー性または悪性）、ＣＸＣＲ４（Ｂ細胞またはＴ細胞、自己免疫、アレルギー性または悪性）、ニューロピリン１（肺癌を含む上皮悪性）、グリピカン（肝癌、脳癌及び乳癌を含む複数の癌）、ＨＥＲ３／ＥＧＦＲ（上皮悪性）、ＰＤＧＦＲａ（上皮悪性）、ＥｐｈＡ２（神経芽腫、黒色腫、乳癌、及び小細胞肺癌を含む複数の癌）、ＣＤ３８（骨髄腫）、ＣＤ１３８（骨髄腫）、α４−インテグリン（ＡＭＬ、骨髄腫、ＣＬＬ、及びほとんどのリンパ腫）を含み得る。
【００７７】
ある特定の様式において、抗体には、セツキシマブのような抗表皮成長因子受容体抗体、抗Ｈｅｒ２抗体、リツキシマブのような抗ＣＤ２０抗体、イノツズマブのような抗ＣＤ２２抗体、Ｇ５４４またはＢＵ５９、抗ＣＤ７０抗体、ｈｐ６７．６またはゲムツズマブのような抗ＣＤ３３抗体、ＧＰ１．４及びＳＭ３のような抗ＭＵＣ１抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ７４抗体、抗Ｐカドヘリン抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗ＣＤ１３８抗体、抗Ｅ−カドヘリン抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗ＦＧＦＲ３抗体、及びナタリズマブのような抗α４−インテグリン抗体を含む。
【００７８】
Ｇ．切断部位
切断部位は、標的化部分からＴ細胞エピトープを放出するために、いくつかの実施形態において、Ｔ細胞エピトープを互いから放出するために機能する。Ｔ細胞エピトープを単一のエピトープへと放出することによって、当該単一のエピトープは、免疫攻撃に対して望ましくない細胞を最も有効に標識することができる。
【００７９】
いくつかの場合、切断部位は、個別の配列であり得、他の場合において、切断部位は、Ｔ細胞エピトープへと統合され得、それにより１つの配列は、両方のエレメントの機能を供する。このことは、本明細書に説明する実施形態のうちのいずれにも適用され得、当該エピトープ配列の選別によって決定する。
【００８０】
切断部位は、望ましくない細胞の微小環境においてＴ細胞エピトープを放出するために異なる方法で機能することができる。切断は、採用する戦略に応じて、望ましくない細胞の内側でまたは望ましくない細胞の外側で生じ得る。切断が望ましくない細胞の外側で生じる場合、Ｔ細胞エピトープペプチドは、最初に細胞へと内部移行することなく、かつ従来の抗原加工経路において関与することなく提示することができる。切断が望ましくない細胞の外側で生じる場合、当該切断は、細胞表面を含む、細胞を取り囲んでいる微小環境において生じ得る。例えば、望ましくない細胞が癌細胞である場合、切断は、癌細胞の表面を含む腫瘍微小環境において（癌細胞の近隣の外側で）生じ得る。
【００８１】
ある特定の実施形態において、少なくとも１つの切断部位は、望ましくない細胞によって発現する酵素によって切断され得る。例えば、癌細胞は、プロテアーゼのような、ある特定の酵素を発現することが公知であり、当該酵素は、ＴＰＥＣ戦略において採用されて、ＴＰＥＣの切断部位を切断し得る。非限定例として、カテプシンＢは、とりわけ、ＦＲ、ＦＫ、ＶＡ及びＶＲを切断し、カテプシンＤは、ＰＲＳＦＦＲＬＧＫ（配列番号１７９）を切断し、ＡＤＡＭ２８は、ＫＰＡＫＦＦＲＬ（配列番号１８０）、ＤＰＡＫＦＦＲＬ（配列番号１８１）、ＫＰＭＫＦＦＲＬ（配列番号１８２）及びＬＰＡＫＦＦＲＬ（配列番号１８３）を切断し、ならびにＭＭＰ２は、ＡＩＰＶＳＬＲ（配列番号１８４）を切断する。
【００８２】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの切断部位は、望ましくない細胞の内側でのｐＨ感受性切断反応を通じて切断され得る。ＴＰＥＣが細胞の中へと内部移行する場合、切断反応は細胞内で生じ得、望ましくない細胞の外側の微小環境と当該細胞の内側の間のｐＨの変化によって惹起され得る。具体的には、いくつかの癌タイプは、癌細胞の内部において酸性環境を有していることが公知である。このようなアプローチは、内部の望ましくない細胞タイプが、特に糖衣のような、細胞外微小環境とは特徴として異なるｐＨを有する場合、採用され得る。ｐＨ切断は、リゾチームにおけるすべての細胞において生じることができるので、ｐＨ感受性切断部位を用いる場合の標的化作用因子の選択は、所望の場合、より大きな具体性を必要とし得る。例えば、ｐＨ感受性切断部位を使用する場合、癌細胞へのみまたは癌細胞へ非常に好ましく結合する標的化作用因子は望ましくあり得る（例えば、肺癌の治療のためのメソテリンに対して結合する抗体など）。
【００８３】
ある特定の実施形態において、少なくとも１つの切断部位は、補体依存性切断反応によって切断され得る。一旦、ＴＰＥＣが望ましくない細胞へ結合すると、患者の補体カスケードは惹起され得る。このような場合、補体カスケードは、補体プロテアーゼに対して感受性のある切断部位を用いることによって、標的化作用因子からＴ細胞エピトープを切断するためにも使用され得る。例えば、Ｃ１ｒ及びＣ１ｓ及びＣ３コンバターゼ（Ｃ４Ｂ，２ａ及びＣ３ｂ，Ｂｂ）は、セリンプロテアーゼである。Ｃ３／Ｃ５及びＣ５も補体プロテアーゼである。補体カスケードにも関与する、かつＣ４及びＣ２をＣ４ｂ２ｂへと切断すること（Ｃ３コンバターゼ）の原因となるセリンプロテアーゼであるマンノース随伴結合タンパク質（ＭＡＳＰ）も使用され得る。例えば、制限なしで、Ｃ１ｓは、ＹＬＧＲＳＹＫＶ（配列番号１７５）及びＭＱＬＧＲＸ（配列番号１７６）を切断する。ＭＡＳＰ２は、ＳＬＧＲＫＩＱＩ（配列番号１７７）を切断すると考えられている。補体成分Ｃ２ａ及び補体因子Ｂｂは、ＧＬＡＲＳＮＬＤＥ（配列番号１７８）を切断すると考えられている。
【００８４】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの切断部位は、ＴＰＥＣにおける標的化部分と同じであるまたは異なる標的部分によって望ましくない細胞へと共存するプロテアーゼによって切断され得る。例えば、任意のプロテアーゼは、望ましくない細胞の微小環境へプロテアーゼを送達する標的化作用因子へプロテアーゼを結合させることによって、当該位置へと同時に向かわせられ得る。標的化作用因子は、本明細書に説明する何らかの標的化作用因子であり得る。プロテアーゼは、ペプチドリンカーまたは化学リンカーを通じて標的化作用因子へ固定され得、標的化作用因子へ結合した時、十分な酵素活性を維持し得る。
【００８５】
いくつかの実施形態において、ＴＰＥＣは、同じである複数の切断部位を有する。他の実施形態において、ＴＰＥＣは、先に説明したように、配列中で及び／またはタイプにおいてのいずれかで、すべてが同一というわけではない複数の切断部位を有する。
【００８６】
Ｈ．Ｔ細胞エピトープ及び切断部位の調製
１．標的化作用因子へ個別に結合させるための個々のＴ細胞エピトープ及び切断部位の調製
切断部位へ結合した個々のＴ細胞エピトープは、入ってくるアミノ酸のカルボキシル基を、伸長するペプチド鎖のＮ末端へ、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｏｎｙｌ）（Ｂｏｃ）及び９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）のようなＮ末端保護基付加戦略を、それらの個々の脱保護剤ＴＦＡ及びピペリジンとともに用いてカップリングすることなどによって、標準的なペプチド合成の化学的性質を通じて調製され得る。ペプチド合成は、手動によってまたは自動化した機械において生じ得る。あるいは、注文中のペプチドを調製するサービスを採用し得る。
【００８７】
２．線形ポリトープの調製
最多約５０個のアミノ酸のポリトープは、標準的なペプチド合成によって作製され得る。このことによって、最多約５のエピトープを当該ポリトープへ組み込めるであろう。当該ポリトープ中により多数のエピトープが所望である場合、またはヒトタンパク質ドメインが当該ポリトープ中のエピトープに隣接する場合、当該ポリトープの組換え生成が生じ得る。当該ポリトープについてのＤＮＡ配列は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような細胞株にタンパク質を発現させるであろうベクターへと組み込まれるであろう。タンパク質は、細胞株によって分泌されるであろうし、細胞培養上清から精製され得る。次に、精製したポリトープは、本明細書に説明するように、化学的リンカーを通じて標的化部分へ結合し得る。別の実施形態において、ポリトープをコードする核酸は、標的化部分をコードするＤＮＡ配列の末端へ付加され、標的化部分及びポリトープを組み込む１つの連続したポリペプチド鎖を作製し得る。当該ポリペプチド鎖は次に、先行実施形態と同じ方法で細胞株において発現し得る。
【００８８】
３．分枝鎖ポリトープの調製
図２のＣに示すような分枝鎖ポリトープも調製され得る。分枝鎖ポリトープへ適用されることになっている個々のＴ細胞エピトープは、接続主鎖へ結合する前に第Ｉ．Ｈ．１節により調製され得る。いくつかの実施形態において、接続主鎖は、アミノ酸から構成され得、ペプチド主鎖であり得る。
【００８９】
ペプチド主鎖は、架橋試薬によって標的化することのできる反応特性を有するアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態において、システイン及びリジンは、これらのアミノ酸において使用され得る多数の架橋試薬があるので、使用され得る。一実施形態において、接続主鎖は、多数のリジン残基またはシステイン残基を含むペプチドであり得、例えば、スルホＳＭＣＣによる連結反応を容易にし得る。別の実施形態において、接続主鎖は、セリンまたはトレオニン上のヒドロキシル基へ連結するであろう架橋剤と対形成するよう、これらのアミノ酸を含み得る。
【００９０】
別の実施形態において、スペーサーアミノ酸は、主鎖へ結合した他のペプチドによって遮断されることなく、プロテアーゼの攻撃を可能にするために、架橋試薬に対する反応特性を有するものの間において使用され得る。ある特定の態様において、塩基性スペーサーにはグリシン及びセリンを含み得る。いくつかの実施形態において、反応性アミノ酸の間へのプロリンの組み込みは、プロリンが、さらに離れた主鎖へ結合した、プロテアーゼで切断可能なペプチドを保持するのに役立ちうるペプチドのわずかな回転を誘導するので有用であり得る。
【００９１】
ある特定の実施形態において、ペプチド主鎖は、約１０〜８０個、２０〜８０個、または４０〜８０個のアミノ酸を含み得る。一実施形態において、ペプチド主鎖は、Ｔ細胞エピトープ及び切断部位へ結合した約２〜２０個のアミノ酸を含む。
【００９２】
個々のＴ細胞エピトープは、以下の第Ｉ．Ｉ節において論議する化学的リンカー技術を用いてペプチド主鎖へ結合し得る。個々のＴ細胞エピトープを含む接続主鎖も、以下の第Ｉ．Ｉ節において論議する化学的リンカー技術を用いて標的化部分へ結合し得る。いくつかの実施形態において、異なる化学的リンカーは、結合過程にわたって追加の制御を有するようこれら２つの結合のために選択され得る。一実施形態において、Ｔ細胞エピトープは、スルホＳＭＣＣによって接続主鎖へ固定され得、当該接続主鎖は、例えば３−ＭＰＡによる標的化部分に対するＴ細胞エピトープを含む。
【００９３】
Ｉ．標的化部分に対する結合方法
異なるアプローチは、切断部位（複数可）及び複数のＴ細胞エピトープ（個別のＴ細胞エピトープ及び切断部位対としてであろうと、ポリトープとしてであろうと）を標的化作用因子へ結合するために採用され得る。いくつかの態様において、複数の切断部位及び複数のＴ細胞エピトープを含むポリトープは、少なくとも１つのペプチド結合を用いて標的化作用因子へ結合する。ある特定の態様において、当該結合は、ペプチド結合以外の少なくとも１つの結合を通じて生じる。このような結合は、化学的リンカーを通じてであり得る。化学的リンカーを用いるなどの非ペプチド結合は、Ｔ細胞エピトープとポリトープ用切断部位とに関して個別に結合した対のために採用され得る。
【００９４】
いくつかの場合、化学的リンカーは、ヘテロ二官能性架橋試薬であり得る。ヘテロ二官能性架橋試薬は、個別のタンパク質上の異なる官能基を標的化することによって、２つのタンパク質を互いに共有結合させる。アミンからスルフヒドリルへの架橋試薬は、試薬の片端でＮＨＳエステルを含有し、当該エステルが、第一のタンパク質／ペプチド上で、優先的にはアミノ酸リジン上で遊離アミン基へ結合する。試薬のもう片端では、マレイミド基が第二のタンパク質／ペプチドのスルフヒドリル基へ結合し、これはアミノ酸システイン上で認めることができる。アミンからスルフヒドリルへの架橋試薬の例としては、（ａ）スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（水中で可溶性であるスルホＳＭＣＣ）若しくはスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（水溶解度が低いＳＭＣＣ）、（ｂ）スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（ＳＭＰＢ）、（ｃ）スクシンイミジル６−［（ベータ−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノアート］（ＳＭＰＨ）、及び（ｄ）スルホスクシンイミジル６−（３’−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノアート（スルホＬＣ−ＳＰＤＰ）、または（ｅ）３−マレイミドプロピオン酸のようなマレイミドが挙げられ得る。
【００９５】
あるいは、別のクラスの架橋試薬は、片端でマレイミド基を、かつもう片端でヒドラジド基を含有する、スルフヒドリルから炭水化物への試薬である。マレイミド基は、アミノ酸システイン上で認められるもののような第一のタンパク質／ペプチド上の遊離スルフヒドリルへ結合し、ヒドラジド基は、第二のタンパク質／ペプチド上の酸化した炭水化物から形成されたアルデヒド基へ結合する。この試薬のファミリーには、（ａ）３，３’−Ｎ−［ε−マレイミドカプロン酸］ヒドラジドのトリフルオロ酢酸塩（ＥＭＣＨ）、及び（ｂ）Ｎ−ベータ−マレイミドプロピオン酸ヒドラジド−トリフルオロ酢酸（ＢＭＰＨ）を含む。
【００９６】
ヘテロ二官能性架橋試薬の第三の群は、スルホスクシンイミジル２−（［４，４’−アジペンタンアミド］エチル）−１，３’−ジチオプロピオナート（ＳＤＡＤ）を含む光切断可能な試薬である。当該試薬は、遊離アミン（リジン）へ連結する片端にあるＮＨＳエステル及び長波長紫外線光（３３０〜３７０ｎｍ）による活性化の際に何らかのアミノ酸側鎖またはペプチド骨格と反応することのできるもう片端にあるジアズリン基を有する。本技術において使用することのできる当該基由来の及び他の架橋基由来の多くの他の試薬がある。
【００９７】
Ｊ．ヒトタンパク質ドメインの挿入
ある特定の実施形態において、Ｔ細胞エピトープは、少なくとも１つのヒトタンパク質ドメインによって片端または両端で隣接する。いくつかの実施形態において、切断部位は、Ｔ細胞エピトープとヒトタンパク質ドメインの間にある。
【００９８】
種々のヒトタンパク質ドメインは、この様式で使用され得る。例えば、少なくとも１つのヒトタンパク質ドメインは、ベータバレルまたは巻かれたコイルであり得る。いくつかの実施形態において、ヒトタンパク質は、ＦＮ３（フィブロネクチンＩＩＩ型）ドメインであり得る。いくつかの実施形態において、ヒトタンパク質は、ベータサンドイッチ、リポカリン、ＥＥＴＩ−ＩＩ／ＡＧＲＰ、クーニッツドメイン（ＢＰＴＩ）、チオレドキシン、プロテインＡ、アンキリン、ガンマ−Ｂ−クリスタリン／ユビキチン、ＣＴＬＤ３／テトラネキシン、または及びＬＤＬＲ−Ａであり得る。いくつかの実施形態において、ヒトタンパク質は、ヒト血清アルブミン、免疫グロブリンＣＨ２部、またはラクダＶＨＨ部であり得る。
【００９９】
ある特定の場合、ヒトタンパク質ドメインは、ＣＬ部、ＣＨ２部、及び／またはＣＨ３部であり得る。例えば、Ｔ細胞エピトープまたは複数のＴ細胞エピトープは、ＣＨ２配列によって隣接され得る。このようなＣＨ２配列は、標的化部分として機能する抗体または機能的部分のＣＨ２部内にあり得る。このようなＣＨ２配列はまた、標的化部分とは異なる追加のＣＨ２部であり得る。いくつかの実施形態において、図２のＢに示すように、フレームワーク領域は、追加の３次元機構をポリトープへ付与するために、ポリトープにおいて採用され得る。
【０１００】
いくつかの態様において、ヒトタンパク質ドメインは、ヒト免疫グロブリンタンパク質ドメインではない。
【０１０１】
いくつかの態様において、ヒトタンパク質ドメインは、その３次元表面上にあるＴ細胞エピトープを示す。
【０１０２】
ＩＩ．医薬組成物
ＴＰＥＣは、医薬組成物として採用され得る。このようなものとして、ＴＰＥＣは、医薬として許容され得る担体と一緒に調製され得る。例えば、非経口投与が所望の場合、ＴＰＥＣは、注射用の滅菌済み発熱物質非含有水中にまたは滅菌済み発熱物質非含有塩類溶液中に提供され得る。あるいは、ＴＰＥＣは、滅菌済み液体担体の添加を用いて再懸濁するために凍結乾燥形態で提供され得る。
【０１０３】
ＩＩＩ．治療方法
Ａ．望ましくない細胞の減少、免疫応答の再標的化、及び癌の治療
本明細書に説明するＴＰＥＣは、ＴＰＥＣ組成物を患者へ投与することを含む、望ましくない細胞の存在を特徴とする患者における疾患の治療方法において使用され得る。このことには、障害を治療すること及び予防することの両方を含み得る。加えて、本明細書に説明するＴＰＥＣは、ＴＰＥＣ組成物を患者へ投与することを含む、望ましくない細胞への患者自身の免疫応答の再標的化方法（すなわち、方向づけの修正方法）においても使用され得る。
【０１０４】
患者へ投与した作用因子の量は、問題の容態を治療するのに有効な量を提供するよう、患者の医師によって選択され得る。
【０１０５】
治療を受けている患者は、ヒトであり得る。患者は、霊長類または何らかの哺乳類動物であり得る。あるいは、患者は、飼いならした動物（例えば、イヌまたはネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、またはウサギのような実験用齧歯類動物）、または農業において重要な動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、またはヤギなど）のような動物であり得る。
【０１０６】
望ましくない細胞を特徴とする容態には、癌を含み得る。癌は、固形悪性または非固形悪性であり得る。癌は、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌、黒色腫、肺癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、脳癌、食道癌、胃癌、膵癌、大腸癌、肝癌、白血病、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、リンパ増殖性疾患、骨髄異形成障害、骨髄増殖性疾患及び前悪性疾患のような何らかの癌であり得る。
【０１０７】
望ましくない細胞を特徴とする容態には、アレルギー性疾患または自己免疫疾患も含み得る。例えば、自己免疫疾患には、アジソン病、セリアック病、皮膚筋炎、グレーヴス病、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、反応性関節炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、及び全身性エリテマトーデスを含み得る。
【０１０８】
ＴＰＥＣは、単独でまたは、手術、放射線、または従来の化学療法を含む他の形態の療法とともに投与され得る。いくつかの実施形態において、ＴＰＥＣの活性はまた、Ｔ細胞エピトープを対象に接種することによる、または免疫刺激剤を投与することによるなど、使用するＴ細胞エピトープのうちの１つ以上に対する患者の免疫応答を追加免疫することによって亢進し得る。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、患者は、複数回用量の組成物を、少なくとも３０日、４５日、６０日、７５日、９０日、１２０日、１５０日、若しくはそれより長い日数にわたって、または進行中の原則を基に受ける。アプローチが、ＴＰＥＣ自体に対する患者の免疫応答を低下させるために採用される場合、追加の利益は、より早期の回の療法のための組成物を受けた再発中の患者へ当該組成物を投与することによって達成され得る。
【０１１０】
Ｂ．ＴＰＥＣ自体に対する免疫応答の低下
本明細書に説明するある特定の態様において、同じＴ細胞エピトープの複数のコピーを有することは、当該作用因子が、患者へ投与されて、多様なＴ細胞エピトープを有することが、異なる人種群及び民族群由来の広範な種々の患者にわたって有効性を確認する場合、望ましくない細胞に対する免疫応答を高める。それにもかかわらず、医師が持続的な期間にわたってＴＰＥＣ治療を使用したい場合、任意のステップをとって、ＴＰＥＣ自体に対する患者自身の免疫応答を低下させ得る。
【０１１１】
ある特定の実施形態において、ＴＰＥＣ上のＴ細胞エピトープの配置または組成は、天然に無作為である。例えば、Ｔ細胞エピトープの混合物が、化学的リンカーを用いて標的化部分へ結合する場合、Ｔ細胞エピトープの異なる組み合わせは、標的化部分へ固定され得る。このことによって、患者がＴＰＥＣ自体に対する免疫応答を開始することは有意により困難となる。複数のＴ細胞エピトープが同じ場合でさえ、当該Ｔ細胞エピトープを個別に標的化部分へ化学的リンカーを通じて固定することはまた、標的部分に沿ったＴ細胞エピトープの無作為な配置を結果として生じ得、その上、ＴＰＥＣに対する患者自身の免疫応答を減弱させ得る。
【０１１２】
このようなアプローチは、その後の投与の際にＴＰＥＣ組成物を失活させるのに十分なＴＰＥＣ組成物に対する免疫応答を発達させないことを確かにし得、組成物の約０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％以下が、ＴＰＥＣに対する患者自身の抗体によって失活することを意味する。
【０１１３】
組成物の免疫原性は、ヒト血清を用いるＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定され得る。例えば、検査組成物は、９６穴プレート上で固定され得、ブロッキングされ得、１時間インキュベートした血清試料を希釈し得る。ヒト血清中に存在する検査組成物に対する抗体は、プレート上の検査組成物へ結合し得る。ストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＴＭＢとの組み合わせにある抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＡ／ＩｇＭのようなまたはビオチン化二次抗体を使用して、シグナルを生じ得る。
【０１１４】
本組成物は、先行組成物よりも少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％低い免疫原性であると期待される。
【実施例】
【０１１５】
実施例１．Ｔ細胞エピトープ及び切断部位からなる調製物
Ｔ細胞エピトープ及び切断部位を含むペプチドは、標準的な固相ペプチド合成において当該ペプチドを合成する外部企業から依頼された。当該ペプチドをＤＭＳＯ中に、結合に使用することになっている１０ｍｇ／ｍｌの終濃度へと溶解した。
【０１１６】
実施例２．スルホＳＭＣＣを用いたポリトープの結合のための標準的な操作プロトコル
ポリトープペプチド（複数のＴ細胞エピトープ及び切断部位を含む）を、標的化部分として機能する抗体へ、スルホＳＭＣＣを用いることによって結合するために、以下の手順を標準的な操作プロトコルとして用いた。
【０１１７】
１．システイン化したペプチドをＤＭＳＯ中に、１０ｍｇ／ｍｌの終濃度になるよう溶解した。
【０１１８】
２．１ｍｇのスルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシラート（スルホＳＭＣＣ）を秤量し、２００μｌのリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）（終濃度５ｍｇ／ｍｌ）中に溶解する。
【０１１９】
３．１００μｌの抗体（１０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ抗体）を１０μｌの溶解したスルホＳＭＣＣ（５ｍｇ／ｍｌ）へ添加し、室温で３０分間インキュベートする。
【０１２０】
４．ゼバスピン脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を、まず当該カラムを１５００ｇで６０秒間回転させてエタノール（保存緩衝液）を除去することによって洗浄する。
【０１２１】
５．３００μｌのＰＢＳを添加し、１５００ｇで６０秒間回転させる。溶離液を取り出し、さらに３回反復する。
【０１２２】
６．最多１２５μｌの抗体−ＳＭＣＣを各カラムへ添加し、１５００ｇで１２０秒間遠心分離し、溶離液を収集する。
【０１２３】
７．１００μｌの抗体−ＳＭＣＣ結合体へ、３μｌのシステイン化ペプチド（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、室温で３０分間インキュベートする。
【０１２４】
８．プロテインＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、まず当該カラムを１００ｇで３０秒間回転させてエタノール（保存緩衝液）を除去することによって洗浄する。
【０１２５】
９．５００μｌのＰＢＳを添加し、１００ｇで３０秒間回転させる。溶離液を取り出し、さらに２回反復する。
【０１２６】
１０．ＰＢＳ中の５００μｌへ抗体−ペプチド結合体を希釈し、これをプロテインＡカラムへ添加し、抗体をビーズと混合する。室温で２０分間振盪しながら放置する。
【０１２７】
１１．カラムを１００ｇで回転させ、溶離液を除去し、抗体−ペプチド複合体は、ビーズへなおも連結されるべきである。
【０１２８】
１２．カラムを、５００μｌのＰＢＳを添加し、ビーズを十分に混合した後１００ｇで３０秒間回転させて溶離液を除去することによって洗浄する。このステップをさらに３回反復する。
【０１２９】
１３．結合した抗体を溶出するために、２００μｌの０．１Ｍクエン酸をビーズへ添加し、室温で５分間インキュベートする。カラムを２５μｌの１ＭトリスｐＨ９を含有する２ｍｌのエッペンドルフへ入れ、１００ｇで３０秒間回転させ、溶離液を収集する。
【０１３０】
１４．任意に、ステップ１３を反復する。
【０１３１】
１５．抗体−ペプチド複合体を４℃で保存する。
【０１３２】
実施例３．個別に結合したエピトープを含むＴＰＥＣに関するスルホＳＭＣＣを用いた生成のための標準的な操作プロトコル
以下の手順を、複数のＴ細胞エピトープ及び当該Ｔ細胞エピトープの対応する切断部位を、標的化部分として機能する抗体へ、スルホＳＭＣＣを用いることによって個別に結合するための標準的な操作プロトコルとして用いた。
【０１３３】
１．システイン化したペプチドをＤＭＳＯ中に、１０ｍｇ／ｍｌの終濃度へと溶解した。
【０１３４】
２．１ｍｇのスルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシラート（スルホＳＭＣＣ）を秤量し、２００μｌのリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）中に溶解する（終濃度５ｍｇ／ｍｌ）。
【０１３５】
３．１００μｌの抗体（１０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ抗体）を１０μｌの溶解したスルホＳＭＣＣ（５ｍｇ／ｍｌ）へ添加し、室温で３０分間インキュベートする。
【０１３６】
４．ゼバスピン脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を、まず当該カラムを１５００ｇで６０秒間回転させてエタノール（保存緩衝液）を除去することによって洗浄する。
【０１３７】
５．３００μｌのＰＢＳを添加し、１５００ｇで６０秒間回転させる。溶離液を取り出し、さらに３回反復する。
【０１３８】
６．最多１２５μｌの抗体−ＳＭＣＣを各カラムへ添加し、１５００ｇで１２０秒間遠心分離し、溶離液を収集する。
【０１３９】
７．合計３０μｇの総ペプチドが存在するように、チューブの中で混合物または必要とされるペプチドを生成させる。このペプチド混合物を１００μｌの抗体−ＳＭＣＣ複合体へ添加し、室温で３０分間放置する。
【０１４０】
８．プロテインＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、まず当該カラムを１００ｇで３０秒間回転させてエタノール（保存緩衝液）を除去することによって洗浄する。
【０１４１】
９．５００μｌのＰＢＳを添加し、１００ｇで３０秒間回転させる。溶離液を取り出し、さらに２回反復する。
【０１４２】
１０．ＰＢＳ中の５００μｌへ抗体−ペプチド結合体を希釈し、これをプロテインＡカラムへ添加し、抗体をビーズと混合する。室温で２０分間振盪しながら放置する。
【０１４３】
１１．カラムを１００ｇで回転させ、溶離液を除去し、抗体−ペプチド複合体は、ビーズへなおも連結されるべきである。
【０１４４】
１２．カラムを、５００μｌのＰＢＳを添加し、ビーズを十分に混合した後１００ｇで３０秒間回転させて溶離液を除去することによって洗浄する。このステップをさらに３回反復する。
【０１４５】
１３．結合した抗体を溶出するために、２００μｌの０．１Ｍクエン酸をビーズへ添加し、室温で５分間インキュベートする。カラムを２５μｌの１ＭトリスｐＨ９を含有する２ｍｌのエッペンドルフへ入れ、１００ｇで３０秒間回転させ、溶離液を収集する。
【０１４６】
１４．任意に、ステップ１３を反復する。
【０１４７】
１５．抗体−ペプチド複合体を４℃で保存する。
【０１４８】
実施例４．３−マレイミドプロピオン酸を連結したペプチドを用いたポリトープＴＰＥＣの生成のための標準的な操作プロトコル
以下の手順を、ポリトープを、標的化部分として機能する抗体へ、３−ＭＰＡを用いることによって個別に結合するための標準的な操作プロトコルとして用いた。
【０１４９】
１．３−マレイミドプロピオン酸を連結したペプチドをＤＭＳＯ中に、１０ｍｇ／ｍｌの終濃度になるよう溶解した。
【０１５０】
２．１００μｌの抗体（必要な場合、ＰＢＳ中に希釈）へ、３μｌのポリトープペプチド（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、室温で３０分間インキュベートする。
【０１５１】
３．プロテインＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、まず当該カラムを１００ｇで３０秒間回転させてエタノール（保存緩衝液）を除去することによって洗浄する。
【０１５２】
４．５００μｌのＰＢＳを添加し、１００ｇで３０秒間回転させる。溶離液を取り出し、さらに２回反復する。
【０１５３】
５．ＰＢＳ中の５００μｌへ抗体−ペプチド結合体を希釈し、これをプロテインＡカラムへ添加し、抗体をビーズと混合する。室温で２０分間振盪しながら放置する。
【０１５４】
６．カラムを１００ｇで回転させ、溶離液を除去し、抗体−ペプチド複合体は、ビーズへなおも連結されるべきである。
【０１５５】
７．カラムを、５００μｌのＰＢＳを添加し、ビーズを十分に混合した後１００ｇで３０秒間回転させて溶離液を除去することによって洗浄する。このステップをさらに３回反復する。
【０１５６】
８．結合した抗体を溶出するために、２００μｌの０．１Ｍクエン酸をビーズへ添加し、室温で５分間インキュベートする。カラムを２５μｌの１ＭトリスｐＨ９を含有する２ｍｌのエッペンドルフへ入れ、１００ｇで３０秒間回転させ、溶離液を収集する。
【０１５７】
９．任意に、ステップ８を反復する。
【０１５８】
１０．抗体−ペプチド複合体を４℃で保存する。
【０１５９】
実施例５．個別に結合したエピトープを含むＴＰＥＣを３−マレイミドプロピオン酸を連結したペプチドを用いて生成するための標準的な操作プロトコル
以下の手順を、複数のＴ細胞エピトープ及び当該Ｔ細胞エピトープの対応する切断部位を、標的化部分として機能する抗体へ３−ＭＰＡを用いることによって、個別に結合するための標準的な操作プロトコルとして用いた。
【０１６０】
１．３−マレイミドプロピオン酸を連結したペプチドをＤＭＳＯ中に、１０ｍｇ／ｍｌの終濃度になるよう溶解した。
【０１６１】
２．合計３０μｇの総ペプチドが存在するように、チューブの中で混合物または必要とされるペプチドを生成させ、１００μｌの抗体（必要な場合、ＰＢＳ中に希釈）へ添加し、室温で３０分間インキュベートする。
【０１６２】
３．プロテインＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、まず当該カラムを１００ｇで３０秒間回転させてエタノール（保存緩衝液）を除去することによって洗浄する。
【０１６３】
４．５００μｌのＰＢＳを添加し、１００ｇで３０秒間回転させる。溶離液を取り出し、さらに２回反復する。
【０１６４】
５．ＰＢＳ中の５００μｌへ抗体−ペプチド結合体を希釈し、これをプロテインＡカラムへ添加し、抗体をビーズと混合する。室温で２０分間振盪しながら放置する。
【０１６５】
６．カラムを１００ｇで回転させ、溶離液を除去し、抗体−ペプチド複合体は、ビーズへなおも連結されるべきである。
【０１６６】
７．カラムを、５００μｌのＰＢＳを添加し、ビーズを十分に混合した後１００ｇで３０秒間回転させて溶離液を除去することによって洗浄する。このステップをさらに３回反復する。
【０１６７】
８．結合した抗体を溶出するために、２００μｌの０．１Ｍクエン酸をビーズへ添加し、室温で５分間インキュベートする。カラムを２５μｌの１ＭトリスｐＨ９を含有する２ｍｌのエッペンドルフへ入れ、１００ｇで３０秒間回転させ、溶離液を収集する。
【０１６８】
任意に、ステップ８を反復する。
【０１６９】
抗体−ペプチド複合体を４℃で保存する。
【０１７０】
実施例６．２つのサイトメガロウイルスペプチドを含むＴＰＥＣ組成物及びＢリンパ芽球様細胞における評価
本発明者らは、Ｂリンパ芽球様細胞（Ｂ−ＬＣＬ）を、各々カテプシンＢに対する切断部位を有する２つの異なるサイトメガロウイルスペプチドＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１）及びＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ（配列番号２）へ結合したリツキシマブを含む作用因子と接触させた。ペプチド特異的Ｔ細胞へのその後の曝露は結果として、Ｂ−ＬＣＬに対するＴ細胞応答の発生を生じた。
【０１７１】
リツキシマブは、表３由来の以下の比でペプチドＮＬＶＰＭＶＡＴＶＡＳＧＶ｛ＣＩＴ｝ＧＣ（配列番号３）及びＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬＡＳＧＦＫＧＣ（配列番号４）と結合した（式中、ＣＩＴは、アルギニンと類似のタイプのアミノ酸であるシトルリンを表す）。
【０１７２】
【表３】
2018508481.tif 000013
【０１７３】
細胞を、ペプチドの混合物へ結合したリツキシマブで染色した後、標識した細胞を洗浄し、３７℃でペプチド特異的Ｔ細胞の存在下で一晩培養した。上清を収集し、ＩＦＮ−γの存在についてアッセイした。
【０１７４】
ＮＬＶ特異的Ｔ細胞を用いて、ＴＰＥＣ＃１１は、ＩＦＮ−γの大量生成によってみられるように強く認識されたのに対し、ＴＰＥＣ＃１は、ＩＦＮ−ガンマの生成がなかったので、まったく認識されていない。図３のＡを参照されたい。逆に、ＲＰＨ特異的Ｔ細胞を用いて、ＴＰＥＣ＃１は、ＩＦＮ−γの大量生成によってみられるように強く認識されたのに対し、ＴＰＥＣ＃１１は、ＩＦＮ−γの生成がなかったので、まったく認識されていない。図３のＢを参照されたい。ＴＰＥＣ＃２〜１０に対するＮＬＶ特異的及びＲＰＨ特異的Ｔ細胞の両方によるＩＦＮ−γの生成があり、抗体に対する１つを超えるペプチドを結合させることによって、ペプチド特異的Ｔ細胞の１つを超える特異性に関与することができるという特記事項を実証している。
【０１７５】
実施例７．３つのサイトメガロウイルスペプチドを含むＴＰＥＣ組成物及びＢリンパ芽球様細胞における評価
本発明者らは、Ｂリンパ芽球様細胞（Ｂ−ＬＣＬ）を、各々カテプシンＢに対する切断部位を有する３つの異なるサイトメガロウイルスペプチドＶＬＥＥＴＳＶＭＬ（配列番号５）、ＢＲＶＬＢＢＹＹＬ（配列番号６）及びＹＩＬＥＥＴＳＶＭ（配列番号７）へ結合したリツキシマブを含む作用因子と接触させた。ペプチド特異的Ｔ細胞へのその後の曝露は結果として、Ｂ−ＬＣＬに対するＴ細胞応答の発生を生じた。
【０１７６】
リツキシマブを、ＶＬＥＥＴＳＶＭＬＡＳＧＦＫＧＣ（配列番号８）、ＢＲＶＬＢＢＹＶＬＡＳＧＦＫＧＣ（配列番号９）（式中、Ｂは、システインに対する相同体であるアミノ酪酸である）、及びＹＩＬＥＥＴＳＶＭＡＳＧＦＫＧＣ（配列番号１０）と、等量のペプチドで結合させた。Ｂ−ＬＣＬ細胞は、リツキシマブＴＰＥＣで標識し、インキュベーション後、洗浄して過剰量のＴＰＥＣを除去した。標識した標的細胞は、３７℃でＶＬＥ特異的、ＣＲＶ特異的またはＹＩＬ特異的Ｔ細胞の存在下で一晩インキュベートした。培養物由来の上清を用いて、ＩＦＮ−γの存在を評価した。
【０１７７】
結果を図４に示す。ＴＰＥＣ標識した標的細胞に応じて、異なるペプチド特異的Ｔ細胞全部によって放出されるＩＦＮ−γがあり、このことは、当該３つの結合したペプチドの各々は、抗体から放出されることができ、ペプチド特異的Ｔ細胞を刺激するために使用することができたことを示唆している。
【０１７８】
実施例８．２つの異なるサイトメガロウイルスペプチドを有する単一のペプチドを含むＴＰＥＣ組成物及びＢリンパ芽球様細胞における評価
本発明者らは、Ｂリンパ芽球様細胞（Ｂ−ＬＣＬ）を、各々がお互いからカテプシンＢに対する切断部位によって分離される２つの異なるサイトメガロウイルスペプチド（ｉ）ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１）及びＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ（配列番号２）及びまたは（ｉｉ）ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１）及びＶＬＥＥＴＳＶＭＬ（配列番号５）を含む単一のペプチドへ結合したリツキシマブを含む作用因子と接触させた。ＮＬＶペプチド特異的Ｔ細胞へのその後の曝露は結果的に、Ｂ−ＬＣＬに対するＴ細胞応答の発生を生じた。
【０１７９】
リツキシマブを、ペプチド（ｉ）ＣＧＶＡＮＬＶＰＭＶＡＴＶＡＶＡＶＬＥＥＴＳＶＭＬ（配列番号１１）、（ｉｉ）ＣＶＡＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬＶＡＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１２）及び（ｉｉｉ）ＣＧＶＡＮＬＶＰＭＶＡＴＶＡＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ（配列番号１３）と結合させた。標的細胞をＴＰＥＣで標識し、インキュベーション後に洗浄して、過剰量のＴＰＥＣを除去した。標的細胞を３７℃で、ＮＬＶ特異的Ｔ細胞の存在下で一晩培養し、上清を翌日、ＩＦＮ−γの存在についてアッセイした。
【０１８０】
ＮＬＶ特異的Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γの放出によって判定されるように検査した３つのＴＰＥＣの各々で標識した標的細胞を認識することができた。このことは、プロテアーゼ切断部位によって分離した１つを超えるサイトメガロウイルス由来ペプチドを含有するペプチドの、ペプチド特異的Ｔ細胞を刺激する能力を実証している。さらにポリトープにおけるＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１）ペプチドの位置は、最大の応答を生じる抗体ＣＶＡＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬＶＡＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１２）から最も遠いＮＬＶペプチドを用いた応答の程度に影響するように見える。しかしながら、抗体ＣＧＶＡＮＬＶＰＭＶＡＴＶＡＶＡＶＬＥＥＴＳＶＭＬ（配列番号１１）及びＣＧＶＡＮＬＶＰＭＶＡＴＶＡＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ（配列番号１３）に対して最も近いＮＬＶペプチドを含有するポリトープペプチドは両方とも、背景を上回るＴ細胞応答も実証している。
【０１８１】
結果は図５に示す。
【０１８２】
実施例９．ポリトープ分枝鎖ペプチドを含むＴＰＥＣの調製
ポリトープ分枝鎖ペプチドを含むＴＰＥＣを調製した。４つのアジドノルロイシン残基を含有する主鎖ペプチドは、アミノ末端にプロパルギルグリシンを含有するペプチド（分枝鎖）と一緒に提供された（図６のＡ）。各分枝鎖ペプチドは、ペプチド血清安定性を支援することのできるＣ末端にＮＨ２キャップを有する。主鎖ペプチドの配列は、ＳＥＥＺＳＥＥＺＳＥＥＺＳＥＥＺ（式中、Ｚはアジドノルロイシン（配列番号１６６）である）とした。分枝鎖ＴＰＥＣ１について、分枝鎖ペプチドの配列は、ＢＫＰＡＫＦＦＲＬＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭ−ｎｈ２（式中、Ｂは、プロパルギルグリシン（配列番号１６７）である）、ＢＫＰＡＫＦＦＲＬＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ−ｎｈ２（式中、Ｂは、プロパルギルグリシン（配列番号１６８）である）、ＢＫＰＡＫＦＦＲＬＲＥＬＲＲＫＭＭＹＭ−ｎｈ２（式中、Ｂは、プロパルギルグリシン（配列番号１６９）である）、及びＢＫＰＡＫＦＦＲＬＮＬＶＰＭＶＡＴＶ−ｎｈ２（式中、Ｂは、プロパルギルグリシン（配列番号１７０）である）とした。
【０１８３】
及び分枝鎖ＴＰＥＣ３について、分枝鎖ペプチドの配列は、ＢＡＩＰＶＳＬＲＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭ−ｎｈ２（式中、Ｂは、プロパルギルグリシン（配列番号１７１）である）、ＢＡＩＰＶＳＬＲＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ−ｎｈ２（式中、Ｂは、プロパルギルグリシン（配列番号１７２）である）、ＢＡＩＰＶＳＬＲＥＬＲＲＫＭＭＹＭ−ｎｈ２（式中、Ｂは、プロパルギルグリシン（配列番号１７３）である）、及びＢＡＩＰＶＳＬＶＴＥＨＤＴＬＬＹ−ｎｈ２（式中、Ｂは、プロパルギルグリシン（配列番号１７４）である）とした。
【０１８４】
等モル濃度の分枝鎖を主鎖ペプチドとともにＤＭＳＯ中で、４ｍｌ中の１０ｍｇのアスコルビン酸と混合した４ｍｌ中の１０ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ触媒の存在下で一晩インキュベーションした結果、結合に使用する分枝鎖ペプチドの形成を生じた。反応のためのＤＭＳＯの終濃度は、５０％とした。分子鎖ペプチドは、ＨＰＬＣを用いて精製し、質量分析を用いて確認した（図６のＢ）。
【０１８５】
分枝鎖ペプチドは、リツキシマブまたはセツキシマブのいずれかへ、まずおよそ０．１ｍＭの（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ））の存在下で９０分間、抗体を還元することによって結合した。次に、分枝鎖ペプチドを、ＴＣＥＰとして３倍濃度で６０分間添加し、Ｎ−アセチルシステインを添加して、分枝鎖ペプチドと同じ濃度を用いて遊離ペプチドを３０分間急冷する。遊離ペプチドは、プロテインＡセファロースビーズを用いて除去して、ＴＰＥＣを結合するのに対し、遊離ペプチドは洗い流す。次に、ＴＰＥＣは、プロテインＡビーズから、０．１Ｍのグリシンを用いて溶出することによって収集し、１ｍトリスｐＨ８を用いて緩衝する。
【０１８６】
実施例１０．ポリトープ分枝鎖ペプチドを含むＴＰＥＣを用いる、形質転換したＢ細胞株のインビトロターゲティング
２つの作用因子は、各々が単一の主鎖ペプチドへ連結する４つの異なるウイルスエピトープからなる分枝鎖ペプチドと結合したリツキシマブからなった。分枝鎖ＴＰＥＣ１において、４つのペプチドの各々を、主鎖ペプチドからＡＤＡＭ２８プロテアーゼ切断配列によって分離した。分枝鎖ＴＰＥＣ３において、４つのペプチドの各々を、ＭＭＰ２切断配列によって主鎖ペプチドから分離した。標的細胞をリツキシマブ−ＴＰＥＣで標識した後、２つの異なるウイルスエピトープのうちの１つに特異的なＣＤ８  Ｔ細胞とともにインキュベートした。具体的には、ＴＰＲ  Ｔ細胞は、ウイルスエピトープＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭ（配列番号４９）に特異的であり、このエピトープは、分枝鎖１−１及び３−１において存在した。ＲＰＨ  Ｔ細胞は、ウイルスエピトープＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ（配列番号２）に特異的であり、このエピトープは、分枝鎖１−２及び３−２に存在した。
【０１８７】
悪性細胞（形質転換したＢ細胞株）を結合する際、ウイルスエピトープは、ウイルスエピトープＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭ（配列番号４９）、ＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ（配列番号２）、ＥＬＲＲＫＭＭＹＭ（配列番号２４）及びＶＴＥＨＤＴＬＬＹ（配列番号５３）を放出するタンパク質分解性切断によって、主鎖ペプチドから放出された。放出の際、当該ペプチドは、悪性細胞上のＭＨＣクラスＩ分子上に存在し、ここで、当該悪性細胞は、ＣＤ８  Ｔ細胞によって認識することができた。ＣＤ８  Ｔ細胞による悪性細胞の認識は、Ｔ細胞殺滅のための代理として使用することのできるＴ細胞によるＩＮＦ−γの放出によって測定した。
【０１８８】
結果は、図７のＡ及びＢに示す。分子鎖ペプチドＴＰＥＣで標識した標的リンパ腫細胞は、特に分枝鎖１ＴＰＥＣを用いて、ＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ（配列番号２）ペプチド及びＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭ（配列番号４９）ペプチドに特異的なＴ細胞によって認識される。未処理の標的細胞は、ペプチド特異的Ｔ細胞によって認識されなかった（陰性対照）のに対し、遊離ペプチドで刺激した標的細胞は、Ｔ細胞によって強く認識された（陽性対照）。
【０１８９】
これらの結果は、分枝鎖ＴＰＥＣが、Ｔ細胞応答を再標的化するための広く認識されたモデルにおいて正の結果を得ることができることを実証している。
【０１９０】
実施例１１．ポリトープ分枝鎖ペプチドを含むＴＰＥＣを用いた、卵巣癌細胞株のインビトロターゲティング
単一の主鎖ペプチドへすべて連結された４つの異なるウイルスエピトープからなる分枝鎖ペプチドと結合したセツキシマブからなる２つの作用因子を提供した。分枝鎖ＴＰＥＣ１において、４つのペプチドの各々を、ＡＤＡＭ２８プロテアーゼ切断配列によって主鎖ペプチドから分離した。分枝鎖ＴＰＥＣ３において、４つのペプチドの各々を、ＭＭＰ２切断配列によって主鎖ペプチドから分離した。標的細胞をセツキシマブ−ＴＰＥＣで標識した後、２つの異なるウイルスエピトープのうちの１つに特異的なＣＤ８  Ｔ細胞とともにインキュベートした。具体的には、ＴＰＲ  Ｔ細胞は、ウイルスエピトープＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭ（配列番号４９）に特異的であり、このエピトープは、分枝鎖１−１及び３−１に存在した。ＲＰＨ  Ｔ細胞は、ウイルスエピトープＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ（配列番号２）に特異的であり、このエピトープは、分枝鎖１−２及び３−２に存在した。
【０１９１】
悪性細胞（卵巣癌細胞株）を結合する際に、ウイルスエピトープＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭ（配列番号４９）、ＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ（配列番号２）、ＥＬＲＲＫＭＭＹＭ（配列番号２４）及びＶＴＥＨＤＴＬＬＹ（配列番号５３）を放出するタンパク質分解性切断によって主鎖ペプチドからウイルスエピトープを放出した。放出の際、ペプチドは、悪性細胞上のＭＨＣクラスＩ分子上に存在しそこで、悪性腫瘍は、ＣＤ８  Ｔ細胞によって認識することができた。ＣＤ８  Ｔ細胞による悪性細胞の認識は、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの放出によって測定した。
【０１９２】
結果は、図８のＡ及びＢに示す。分子鎖ペプチドＴＰＥＣを用いて標識した標的リンパ腫細胞を、ＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ（配列番号２）ペプチド及びＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭ（配列番号４９）ペプチドに特異的なＴ細胞によって、特に分枝鎖１ＴＰＥＣを用いて認識する。未処理の標的細胞は、ペプチド特異的Ｔ細胞によって認識されなかった（陰性対照）のに対し、遊離ペプチドで刺激した標的細胞は、Ｔ細胞によって強く認識された（陽性対照）。
【０１９３】
これらの結果は、分枝鎖ＴＰＥＣが、Ｔ細胞応答を再標的化するための広く認識されたモデルにおいて正の結果を得ることができることを実証している。
【０１９４】
実施例１２．束になったポリトープドメインを含有するＴＰＥＣを用いた卵巣癌細胞株のインビトロでのターゲティング
各重鎖（図２のＢに図示）へ結合した追加のフィブロネクチン３型ドメイン（フィブロネクチン１タンパク質由来）を含有するセツキシマブを含む作用因子についてのＤＮＡを合成した（図９のＡ）。ウイルスエピトープＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭ（配列番号４９）、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１）、及びＶＬＥＥＴＳＶＭＬ（配列番号５）を含有するよう、フィブロネクチン３型ドメインを「ＢＣ」ループ、「ＤＥ」ループ及び「ＦＧ」ループで突然変異させた。ウイルスエピトープをフィブロネクチン３型ドメインから、図示するようなＣＭＶエピトープの両側にあるＭＭＰ２プロテアーゼ切断配列によって分離した。
セツキシマブ重鎖−ドメイン−ＭＭＰ２−エピトープ−
ＭＭＰ２−ドメイン−ＭＭＰ２−エピトープ−ＭＭＰ２−ドメイン−
ＭＭＰ２−エピトープ
【０１９５】
このことによって、ＭＭＰ２によるタンパク質分解性切断後に、束になったドメイン及び標的化作用因子（セツキシマブ）からのウイルスエピトープの放出が可能となるであろう。束になったドメインＴＰＥＣに対するＤＮＡをＥｘｐｉ２９３細胞へとトランスフェクトし、上清をトランスフェクション１０日後に収集した。束になったＴＰＥＣを上清から、プロテインＡセファロースビーズを用いて精製した。標的細胞である卵巣癌細胞株を、精製したセツキシマブ−ＴＰＥＣで標識し、過剰量の結合していないＴＰＥＣは洗い流した。標識した標的細胞を次に、ＮＬＶ特異的Ｔ細胞の存在下で一晩インキュベートした。
【０１９６】
悪性細胞（卵巣癌細胞株）を結合する際、ウイルスエピトープを、タンパク質分解性切断によって追加のタンパク質ドメインから放出した。放出したペプチドは、悪性細胞上のＭＨＣクラスＩ分子上に存在し、そこで、悪性細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞によって認識されることができた。ＣＤ８＋  Ｔ細胞による悪性細胞の認識は、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの放出によって測定した。
【０１９７】
結果は、図９に示す。束になったドメインＴＰＥＣで標識した標的卵巣癌細胞は、４つの異なる束になったドメインＴＰＥＣ調製物由来のＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１）ペプチドに特異的なＴ細胞によって認識した。未処理の標的細胞は、ペプチド特異的Ｔ細胞によって認識されなかった（陰性対照）のに対し、遊離ペプチドで刺激した標的細胞は、Ｔ細胞によって強く認識された（陽性対照）。
【０１９８】
これらの結果は、束になったドメインＴＰＥＣが、Ｔ細胞応答を再標的化するための広く認識されたモデルにおいて正の結果を得ることができることを実証している。
【０１９９】
実施例１３．個別に結合したＴ細胞エピトープ（すなわち、「ヘアブラシ」）を用いたＢ細胞リンパ腫のインビボでのターゲティング（例えば、慢性リンパ性白血病）
リツキシマブまたは抗ＣＤ２２抗体を含む作用因子を、各々がカテプシンＢに特異的なプロテアーゼ切断部位を含有する５つの異なるサイトメガロウイルス由来ペプチド（ｉ）ＮＬＶＰＭＶＡＴＶＡＳＧＶ｛ＣＩＴ｝ＧＣ（配列番号３）、（ｉｉ）ＶＬＥＥＴＳＶＭＬＡＳＧＦＫＧＣ（配列番号８）、（ｉｉｉ）ＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬＡＳＧＦＫＧＣ（配列番号４）、（ｉｖ）ＹＩＬＥＥＴＳＶＭＡＳＧＦＫＧＣ（配列番号１０）及び（ｖ）ＢＲＶＬＢＢＹＶＬＡＳＧＦＫＧＣ（配列番号９）の等しい部分を含有するペプチド混合物と結合する。患者に当該作用因子を注入し、当該作用因子は、Ｂ細胞を健常及び悪性すべて標的とする。悪性細胞を結合する際、作用因子は、プロテアーゼと接触し、それによりプロテアーゼ認識ドメインの切断は、Ｔ細胞エピトープ（ｉ）ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１）、（ｉｉ）ＶＬＥＥＴＳＶＭＬ（配列番号５）、（ｉｉｉ）ＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ（配列番号２）、（ｉｖ）ＹＩＬＥＥＴＳＹＭ（配列番号７）及び（ｖ）ＢＲＶＬＢＢＹＶＬ（配列番号６）を放出し、当該Ｔ細胞エピトープはその後、悪性Ｂ細胞の表面上のＨＬＡ分子へ結合する。Ｔ細胞エピトープを発現する悪性Ｂ細胞は、Ｔ細胞による細胞溶解のための宿主免疫系によって標的化される。
【０２００】
実施例１４．ポリトープを含むＴＰＥＣを用いたＢ細胞リンパ腫のインビボターゲティング（例えば、慢性リンパ性白血病）
リツキシマブまたは抗ＣＤ２２抗体を含む作用因子を、４つの異なるサイトメガロウイルス由来エピトープを含有するペプチドと結合させる（ｉ）ＣＧＳＦＲＶＴＥＨＤＴＬＬＹＧＳＦＲＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬＧＳＦＲＥＬＫＲＫＭＩＹＭＧＳＦＲＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１４）。４つのエピトープの各々は、立体配座標的化作用因子−Ｃ−Ｅ１−Ｃ−Ｅ２−Ｃ−Ｅ３−Ｃ−Ｅ４（式中、Ｃはプロテアーゼ切断であり、かつＥはエピトープである）におけるカテプシンＢ特異的プロテアーゼ切断部位によって隣のエピトープから分離される。患者に当該作用因子を注入し、当該作用因子は、Ｂ細胞を健常及び悪性すべて標的とする。悪性細胞を結合する際、当該作用因子は、プロテアーゼと接触し、それによりプロテアーゼ認識ドメインの切断は、Ｔ細胞エピトープ（ｉ）ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１）、（ｉｉ）ＶＴＥＨＤＴＬＬＹ（配列番号５３）、（ｉｉｉ）ＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ（配列番号２）、及び（ｉｖ）ＥＬＫＲＫＭＩＹＭ（配列番号２３）を放出し、当該Ｔ細胞エピトープはその後、悪性Ｂ細胞の表面上のＨＬＡ分子へ結合する。Ｔ細胞エピトープを発現する細胞を次に、Ｔ細胞による細胞溶解のための宿主免疫系によって標的化する。
【０２０１】
実施例１５．個別に結合したＴ細胞エピトープ（すなわち、「ヘアブラシ」）を用いたＢ細胞リンパ腫のインビボでのターゲティング（例えば、慢性リンパ性白血病）
リツキシマブまたは抗ＣＤ２２抗体を含む作用因子を、ＡＤＡＭ２８またはカテプシンＤのいずれかに特異的なプロテアーゼ切断部位を各々含有する５つの異なるサイトメガロウイルス由来ペプチド（ｉ）ＣＫＰＡＫＦＦＲＬＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号５８）、（ｉｉ）ＣＫＰＡＫＦＦＲＬＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ（配列番号５９）、（ｉｉｉ）ＣＰＲＳＦＦＲＬＧＫＶＬＥＥＴＳＶＭＬ（配列番号６０）、（ｉｖ）ＣＫＰＡＫＦＦＲＬＥＬＫＲＫＭＩＹＭ（配列番号６１）及び（ｖ）ＣＰＲＳＦＦＲＬＧＫＱＩＫＶＲＶＤＭＶ（配列番号６２）の等しい部分を含有するペプチド混合物と結合させる。患者に当該作用因子を注入し、当該作用因子は、Ｂ細胞を健常及び悪性すべて標的とする。悪性細胞を結合させる際、当該作用因子は、プロテアーゼと接触し、それによりプロテアーゼ認識ドメインの切断は、Ｔ細胞エピトープ（ｉ）ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１）、（ｉｉ）ＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ（配列番号２）、（ｉｉｉ）ＶＬＥＥＴＳＶＭＬ（配列番号５）、（ｉｖ）ＥＬＫＲＫＭＩＹＭ（配列番号２３）及び（ｖ）ＱＩＫＶＲＶＤＭＶ（配列番号３８）を放出し、当該Ｔ細胞エピトープはその後、悪性Ｂ細胞の表面上のＨＬＡ分子へ結合する。細胞表面におけるＴ細胞エピトープのＨＬＡ分子上で当該Ｔ細胞エピトープを発現する悪性Ｂ細胞を、Ｔ細胞による細胞溶解のための宿主免疫系によって標的化する。
【０２０２】
実施例１６．ポリトープを含むＴＰＥＣを用いたＢ細胞リンパ腫のインビボでのターゲティング（例えば、慢性リンパ性白血病）
リツキシマブまたは抗ＣＤ２２抗体を含む作用因子を、４つの異なるサイトメガロウイルス由来エピトープを含有するペプチドと結合させる（ｉ）ＣＧＳＫＰＡＫＦＦＲＬＹＳＥＨＰＴＦＴＳＱＹＧＳＰＲＳＦＦＲＬＧＫＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭＧＳＫＰＡＫＦＦＲＬＱＩＫＶＲＶＤＭＶＧＳＰＲＳＦＦＲＬＧＫＥＬＲＲＫＭＭＹＭ（配列番号６３）。４つのエピトープの各々を、潜在的な立体配座、すなわち標的化作用因子−Ｃｉ−Ｅ１−Ｃｉｉ−Ｅ２−Ｃｉ−Ｅ３−Ｃｉｉ−Ｅ４（式中Ｃはプロテアーゼ切断であり、かつＥはエピトープである）にあるが当該立体配座に限定しないＡＤＡＭ２８またはカテプシンＤのいずれかに特異的なプロテアーゼ切断部位によって、隣のエピトープから分離する。患者に当該作用因子を注入し、当該作用因子は、Ｂ細胞を健常及び悪性すべて標的とする。悪性細胞を結合する際、当該作用因子は、プロテアーゼと接触し、それによりプロテアーゼ認識ドメインの切断はＴ細胞エピトープ（ｉ）ＹＳＥＨＰＴＦＴＳＱＹ（配列番号５５）、（ｉｉ）ＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭ（配列番号４９）、（ｉｉｉ）ＱＩＫＶＲＶＤＭＶ（配列番号３８）、及び（ｉｖ）ＥＬＲＲＫＭＭＹＭ（配列番号２４）を放出し、当該Ｔ細胞エピトープはその後、悪性Ｂ細胞の表面上のＨＬＡ分子へ結合する。次に、Ｔ細胞エピトープを発現する細胞を、Ｔ細胞による細胞溶解のための宿主免疫系によって標的化する。
【０２０３】
実施例１７．本明細書に説明する実施形態
種々の実施形態を以下の非限定項目において説明する。
項目１．ＴＰＥＣを含む、望ましくない細胞に対する免疫応答を再標的化するための組成物であって、
ａ．Ｔが、望ましくない細胞を標的化することのできる標的化部分である、
ｂ．Ｌが、Ｔへ結合できる少なくとも１つのリンカーであり、ここで、Ｌは、ペプチド結合、少なくとも１つのペプチド、あるいは化学的リンカーであり得る、
ｃ．Ｃが、
ｉ．前記望ましくない細胞によって発現する酵素によって切断される、
ｉｉ．前記望ましくない細胞の内側でｐＨ感受性切断反応を通じて切断される、
ｉｉｉ．補体依存性切断反応によって切断される、または
ｉｖ．ＴＰＥＣにおける標的化部分と同じである若しくは異なる前記標的化部分によって前記望ましくない細胞へ共存するプロテアーゼによって切断される、
少なくとも１つの結合部位である、かつ
ｄ．Ｅが、少なくとも１つのＴ細胞エピトープである、
ＴＰＥＣを含み、この中で、前記Ｌ部分、Ｃ部分、ならびにＥ部分は、以下のパターン、すなわち、
ｉ．Ｔへ個別に各々結合する複数のＬ−Ｃ−Ｅ、
ｉｉ．ｎが少なくとも２の整数（任意に約２〜５０）であり、かつ各Ｃ−Ｅが前記Ｌへ並列に結合したＬ−（Ｃ−Ｅ）ｎのうちの少なくとも１つ、及び／または
ｉｉｉ．ｎが少なくとも２の整数（任意に約２〜５０）であり、かつ各Ｃ−Ｅが前記Ｌへ直列に結合したＬ−（Ｃ−Ｅ）ｎのうちの少なくとも１つ
のうちの少なくとも１つにおいて配置される、前記組成物。
項目２．式Ｔ−（Ｌ−Ｃ−Ｅ）ｎあるいはＴ−（Ｌ−Ｃｉ−Ｅｊ）ｎを含むＴＰＥＣを含む、望ましくない細胞に対する免疫応答を再標的化するための組成物であって、式中、
ａ．Ｔが、望ましくない細胞を標的化することのできる標的化部分である、
ｂ．Ｌが、Ｔへ化学的に結合できる少なくとも１つのリンカーである、
ｃ．Ｃが、
ｉ．望ましくない細胞によって発現する酵素によって切断される、
ｉｉ．望ましくない細胞の内側でｐＨ感受性切断反応を通じて切断される、
ｉｉｉ．補体依存性切断反応によって切断される、または
ｉｖ．ＴＰＥＣにおける標的化部分と同じである若しくは異なる標的化部分によって望ましくない細胞へ共存するプロテアーゼによって切断される、切断部位である、かつ
ｄ．Ｅが、Ｔ細胞エピトープである、
ＴＰＥＣを含み、この中で、ｎは、少なくとも２の整数であり（任意に約２〜５０）、ｉは、少なくとも１の整数であり（任意に約１〜５０）、かつｊは、少なくとも２の整数である（任意に約１〜５０）、前記組成物。
項目３．式Ｔ−Ｌ−（Ｃｉ−Ｅｊ）ｎを含むＴＰＥＣを含む、望ましくない細胞に対する免疫応答を再標的化するための組成物であって、
ａ．Ｔが、望ましくない細胞を標的化することのできる標的化部分である、
ｂ．Ｌが、Ｔへ化学的に結合できるまたはペプチド結合できる任意のリンカーである、
ｃ．Ｃが、
ｉ．前記望ましくない細胞によって発現する酵素によって切断される、
ｉｉ．前記望ましくない細胞の内側でｐＨ感受性切断反応を通じて切断される、
ｉｉｉ．補体依存性切断反応によって切断される、または
ｉｖ．ＴＰＥＣにおける標的化部分と同じである若しくは異なる前記標的化部分によって前記望ましくない細胞へ共存するプロテアーゼによって切断される、切断部位である、かつ
ｄ．Ｅが、Ｔ細胞エピトープである、
ＴＰＥＣを含み、この中で、ｎは、少なくとも２の整数であり（任意に約２〜５０）、ｉは、少なくとも１の整数であり（任意に約１〜５０）、かつｊは、少なくとも１の整数である（任意に約１〜５０）、前記組成物。
項目４．ＴＰＥＣを含む、望ましくない細胞に対する免疫応答を再標的化するための組成物であって、
ａ．望ましくない細胞を標的化することのできる標的化部分、
ｂ．少なくとも１つの切断部位を有する標的化部分へ結合した１０個を超える複数のＴ細胞エピトープ（この中で、当該切断部位は、
ｉ望ましくない細胞によって発現する酵素によって切断される、
ｉｉ望ましくない細胞の内側でｐＨ感受性切断反応を通じて切断される、
ｉｉｉ補体依存性切断反応によって切断される、または
ｉｖＴＰＥＣにおける標的化部分と同じである若しくは異なる標的化部分によって望ましくない細胞へ共存するプロテアーゼによって切断される）
を有する、前記ＴＰＥＣを含む前記組成物。
項目５．前記複数のＴ細胞エピトープは、前記標的化部分、すなわち切断部位による各Ｔ細胞エピトープへ個々に結合している、項目１、２、または４のいずれか１つに記載の組成物。
項目６．前記複数のＴ細胞エピトープは、少なくとも１つの束として前記標的化部分へ１つの切断部位によって結合している、項目１、３、または４のいずれか１つに記載の組成物。
項目７．束内の前記Ｔ細胞エピトープは、前記Ｔ細胞エピトープ間に切断部位を有する、項目６に記載の組成物。
項目８．複数のＴ細胞エピトープのうちの少なくとも２つの群は、前記標的化部分、すなわち１つの切断部位による各群へ結合している、項目１、３〜４、６〜７のいずれか１つに記載の組成物。
項目９．前記複数のＴ細胞エピトープは、すべてが同一というわけではない、項目１〜８のいずれか１つに記載の組成物。
項目１０．前記複数のＴ細胞エピトープは、同じである、項目１〜８のいずれか１つに記載の組成物。
項目１１．前記Ｔ細胞エピトープのいくつかは同じであり、かつさらに、いくつかは異なっている、項目１〜８のいずれか１つに記載の組成物。
項目１２．前記作用因子は、同じである複数の切断部位を有する、項目１〜１１のいずれか１つに記載の組成物。
項目１３．前記作用因子は、すべてが同一であるというわけではない複数の切断部位を有する、項目１〜１１のいずれか１つに記載の組成物。
項目１４．前記少なくとも１つの切断部位及び前記複数のＴ細胞エピトープは、少なくとも１つのペプチド結合を用いて前記標的化作用因子へ結合している、項目１、３〜４、及び６〜１３のいずれか１つに記載の組成物。
項目１５．前記少なくとも１つの切断部位及び前記複数のＴ細胞エピトープは、ペプチド結合以外の少なくとも１つの結合を通じて前記標的化作用因子へ結合している、項目１〜１３のいずれか１つに記載の組成物。
項目１６．前記少なくとも１つの切断部位及び前記複数のＴ細胞エピトープは、スルホＳＭＣＣ、ＳＭＣＣまたはマレイミド結合を通じて前記標的化作用因子へ結合している、項目１５に記載の組成物。
項目１７．少なくとも１つのＴ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩに制限したペプチドである、項目１〜１６のいずれか１つに記載の組成物。
項目１８．少なくとも１つのＴ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩに制限したペプチドである、項目１〜１７のいずれか１つに記載の組成物。
項目１９．前記複数のＴ細胞エピトープは、長さ約７〜約１４のアミノ酸である、項目１〜１８のいずれか１つに記載の組成物。
項目２０．前記複数のＴ細胞エピトープは、長さ約８〜１３、約９〜１２、約９、または約１０のアミノ酸である、項目１〜１９のいずれか１つに記載の組成物。
項目２１．前記作用因子は、約または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００のＴ細胞エピトープ、任意に２〜１００のＴ細胞エピトープを含む、項目１〜２０のいずれか１つに記載の組成物。
項目２２．前記Ｔ細胞エピトープは、ＣＭＶ、インフルエンザ、ＥＢＶ、肝炎、水痘、流行性耳下腺炎、麻疹、ジフテリア、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、風疹、百日咳、ポリオ、肺炎球菌、ロタウイルス、破傷風、ワクシニア、及び黄熱病のＴ細胞エピトープから選択される、項目１〜２１のいずれか１つに記載の組成物。
項目２３．前記組成物は、少なくとも２つの異なる感染性作用因子由来のＴ細胞エピトープを含む、項目１〜２２のいずれか１つに記載の組成物。
項目２４．前記ＴＰＥＣは、少なくとも１つのＣＭＶ  Ｔ細胞エピトープを含む、項目１〜２３のいずれか１つに記載の組成物。
項目２５．複数の異なるＴ細胞エピトープを用いることは、前記作用因子にＴ細胞応答をヒトの集団の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％において刺激させる、項目１〜９及び１１〜２４のいずれか１つに記載の組成物。
項目２６．前記Ｔ細胞エピトープは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１ｄ、及びＭＲ１から選択される、項目１〜２５のいずれか１つに記載の組成物。
項目２７．前記Ｔ細胞エピトープは、ＨＬＡ−Ａ＊０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２、ＨＬＡ−Ａ＊０３、ＨＬＡ−Ａ＊１１、ＨＬＡ−Ｂ＊４４、ＨＬＡ−Ｂ＊０７、ＨＬＡ−Ｂ＊０８、ＨＬＡ−Ｂ＊１５、ＨＬＡ−Ｂ＊３５、ＨＬＡ−Ｂ＊４０、ＨＬＡ−Ｃ＊０７、ＨＬＡ−Ｃ＊０３、ＨＬＡ−Ｃ＊０５、ＨＬＡ−Ｃ＊０４、ＨＬＡ−Ｃ＊０６、及びＨＬＡ−Ｅ＊０１０１に制限された抗原から選択される、項目１〜２６のいずれか１つに記載の組成物。
項目２８．前記組成物は、少なくとも以下のＴ細胞エピトープ、すなわちＨＬＡ−Ａ＊０２、ＨＬＡ−Ａ＊０１、及びＨＬＡ−Ａ＊０３を含む、項目１〜９及び項目１１〜２７のいずれか１つに記載の組成物。
項目２９．同じＴ細胞エピトープの複数のコピーを有することは、前記作用因子が、患者へ投与される場合、望ましくない細胞に対する免疫応答を高める、項目１〜２８のいずれか１つに記載の組成物。
項目３０．前記Ｔ細胞エピトープは、配列番号１〜２、５〜７、１５〜５７のうちの少なくとも１つを含む、項目１〜２９のいずれか１つに記載の組成物。
項目３１．前記標的化部分は、望ましくない細胞へ特異的に結合することによって、望ましくない細胞を標的にする、項目１〜３０のいずれか１つに記載の組成物。
項目３２．前記標的化部分は、前記複数のＴ細胞エピトープが前記標的化部分へ結合している場合でさえ、前記望ましくない細胞を特異的に結合する、項目１〜３２のいずれか１つに記載の組成物。
項目３３．前記標的化部分は、抗体またはその機能的部分である、項目１〜３２のいずれか１つに記載の組成物。
項目３４．前記Ｔ細胞エピトープは、少なくとも１つのヒトタンパク質ドメインによって片端または両端で隣接している、項目１〜３３のいずれか１つに記載の組成物。
項目３５．少なくとも１つのヒトタンパク質ドメインは、ベータバレルまたは巻かれたコイルである、項目３４に記載の組成物。
項目３６．前記ヒトタンパク質ドメインは、ＣＬ部、ＣＨ２部、及び／またはＣＨ３部である、項目３４〜３５のいずれか１つに記載の組成物。
項目３７．前記ヒトタンパク質ドメインは、ＦＮ３部、ベータサンドイッチ、リポカリン、ＥＥＴＩ−ＩＩ／ＡＧＲＰ、クーニッツ部（ＢＰＴＩ）、チオレドキシン、プロテインＡ、アンキリン、ガンマ−Ｂ−クリスタリン／ユビキチン、ＣＴＬＤ３／テトラネキシンＬＤＬＲ−Ａ、ヒト血清アルブミン、免疫グロブリンＣＨ２部、またはラクダＶＨＨ部である、項目３４〜３５のいずれか１つに記載の組成物。
項目３８．前記ヒトタンパク質ドメインは、ヒト免疫グロブリンタンパク質ドメインではない、項目３４〜３５または３７のいずれか１つに記載の組成物。
項目３９．前記ヒトタンパク質ドメインは、その３次元表面上に前記Ｔ細胞エピトープを提示する、項目３４〜３８のいずれか１つに記載の組成物。
項目４０．前記切断部位は、前記望ましくない細胞の外側で切断することができる、項目１〜３９のいずれか１つに記載の組成物。
項目４１．前記望ましくない細胞によって発現される酵素は、プロテアーゼである、項目１〜４０のいずれか１つに記載の組成物。
項目４２．前記望ましくない細胞は、癌細胞である、項目１〜４１のいずれか１つに記載の組成物。
項目４３．各標的化作用因子が、複数の同一のＴ細胞エピトープへ結合している、項目１〜４２のいずれか１つに記載の複数の異なるＴＰＥＣを含む組成物。
項目４４．前記組成物中の標的化作用因子の少なくともいくつかは、同一ではない複数のＴ細胞エピトープへ結合している、項目１〜４２のいずれか１つに記載の組成物を含む組成物。
項目４５．前記組成物のうちの少なくともいくつかは同一ではない、項目４４に記載の複数の組成物を含む組成物。
項目４６．前記組成物は、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、またはそれより多数の異なるＴＰＥＣを含む、項目４３〜４５のいずれか１つに記載の複数の組成物を含む組成物。
項目４７．項目１〜４６のいずれか１つに記載の組成物及び医薬として許容され得る担体を含む医薬組成物。
項目４８．項目１〜４７のいずれか１つに記載の組成物を、望ましくない細胞の存在を特徴とする患者へ投与することを含む、前記患者における疾患の治療方法。
項目４９．項目１〜４７のいずれか１つに記載の組成物を、患者へ投与することを含む、望ましくない細胞に対する前記患者の免疫応答の再標的化方法。
項目５０．前記患者は、前記組成物を失活させるのに十分な前記組成物に対する免疫応答を発達させない、項目４８〜４９のいずれか１つに記載の方法。
項目５１．前記患者は、複数回用量の組成物を、少なくとも３０日、４５日、６０日、７５日、９０日、１２０日、１５０日、若しくはそれより長い日数にわたって、または進行中の原則を基に受ける、項目４８〜５０のいずれか１つに記載の方法。
項目５２．前記患者は、複数回用量の組成物を、少なくとも１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、若しくは１２か月にわたって、または進行中の原則を基に受ける、項目４８〜５０のいずれか１つに記載の方法。
項目５３．前記組成物は、より早期の回の療法のための前記組成物を受けた再発中の患者へ投与することができる、項目４８〜５２のいずれか１つに記載の方法。
項目５４．前記患者は、癌に罹患している、項目４８〜５３のいずれか１つに記載の方法。
【０２０４】
等価物
上述の明細書は、当業者が実施形態を実施することができるのに十分であるとみなされる。先の説明及び実施例は、ある特定の実施形態を詳述し、本発明者らによって熟慮された最良の様式を説明する。しかしながら、上述が本文中でいかに詳細に表れ得るかにかかわらず、実施形態は、多くの方法で実施され得、添付の特許請求の範囲及びその何らかの等価物に従って解釈されるべきである。
【０２０５】
本明細書で使用する場合、約という用語は、明白に示されていようとなかろうと、例えば、整数、分数、及び百分率を含む数値を指す。約という用語は概して、当業者が、列挙した値と等価（例えば、同じ機能または結果を有する）とみなすであろう数値の範囲（例えば、列挙した範囲の±５〜１０％）を指す。少なくとも及び約のような用語が、数値または範囲の列挙に先行する場合、当該用語は、当該列挙に提供する値または範囲をすべて修飾する。いくつかの場合、約という用語には、最も近い有効数字へ丸められた数値を含み得る。
【図１】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2018508481.tif 000022
【図８】
2018508481.tif 000023
【図９Ａ−Ｂ】
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【図９Ｃ】
2018508481.tif 000025
【配列表】
2018508481000001.app
【国際調査報告】
2018508481.tif 000026
2018508481.tif 000027
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