(57)【要約】さらなる下流分析のため、および／または病状の診断のために、自然に発現された体液（例えば、唾液、痰、尿）中の細胞ならびに／もしくは細胞外成分を保存するための溶液が説明される。溶液は、血液に対して高張性であり得る。自然に発現された体液のサンプルから細胞を濃縮するため、および／または、例えば、癌、肥満、感染症、自閉症、アルツハイマー病、血液疾患、心血管疾患もしくは障害、糖尿病、不安定プラーク、ＬＴＢＩ、ＨＩＶ感染、ＣＯＰＤ、ＡＣＯＳ等の病状を診断するように分析するための技法が説明される。
2018506727.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
病状を診断および／または監視する方法であって、
自然に発現された体液のサンプルを取得するステップと、
前記サンプルを前記サンプル中の細胞および／または細胞外成分を安定させるための保存溶液と接触させるステップと、
前記病状を識別、診断、もしくは監視するために、前記サンプルからの安定化された細胞および／または細胞外成分を分析するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記自然に発現された体液は、口腔液、唾液、痰、尿、肺吸引物の流体から選択される、１つまたはそれを上回るものを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルを前記保存溶液と接触させるステップに先立って、前記サンプルを前処理剤と接触させるステップをさらに含み、前記前処理剤は、病状を示す１つまたはそれを上回る因子の放出を刺激するように構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記方法はさらに、少なくとも特定の細胞外成分から少なくとも特定の細胞を分離するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記分析するステップは、フローサイトメトリを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記分析するステップは、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記分析するステップは、免疫組織化学を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記分析するステップは、分子分析を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記分析するステップは、前記サンプル中の検出可能な抗体の存在に先立ってＨＩＶウイルス感染を識別するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記分析するステップは、Ｔ細胞、随意に、ＣＤ４＋Ｔ細胞内のＨＩＶウイルスを識別するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記分析するステップは、随意に、ＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳを示す、免疫不全症を識別するために、ＣＤ４＋Ｔ細胞の量を査定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記分析するステップは、（ｉ）ＣＯＰＤを示す、および／または（ｉｉ）ＡＣＯＳを示す、ならびに／もしくは（ｉｉｉ）ＣＯＰＤのＡＣＯＳ型と非ＡＣＯＳ型とを区別するためのバイオマーカを識別するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記分析するステップは、電解質測定、脂質測定、ビタミン測定、肝炎検出、鉄欠乏プロファイル測定、肝機能検査、腎臓プロファイル測定、糖尿病スクリーニング検査、血液像測定、甲状腺プロファイル測定のうちの少なくとも１つを行うステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記保存溶液は、血液に対して高張性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルを保存溶液と接触させるステップの後に、前記保存溶液と混合させられた前記サンプルの組み合わせは、略等張性であり、張度は、血液に対して規定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
さらなる下流分析のため、および／または病状の診断のために、自然に発現された体液中の細胞ならびに／もしくは細胞外成分を保存するための溶液であって、血液に対して高張性である溶液。
【請求項１７】
前記自然に発現された体液は、口腔液、唾液、痰、尿、肺吸引物の流体から選択される、１つまたはそれを上回るものを含む、請求項１に記載の溶液。
【請求項１８】
流体サンプル中の細胞および／または細胞外成分の下流分析のための流体サンプルであって、前記流体サンプルは、保存溶液と混合させられる自然に発現された低張性体液を含み、前記サンプル流体は、略等張性であり、張度は、血液に対して規定される、流体サンプル。
【請求項１９】
自然に発現された体液のサンプルを収集するためのサンプル収集デバイスであって、前記サンプル収集デバイスは、前記自然に発現された体液中の細胞および／または細胞外成分を保存するための溶液を含有し、もしくは含み、前記溶液は、血液に対して高張性である、サンプル収集デバイス。
【請求項２０】
流体サンプルを含有する、サンプル収集デバイスであって、前記流体サンプルは、（ｉｉ）保存溶液と混合させられる（ｉ）自然に発現された低張性体液を含み、前記サンプル流体は、略等張性であり、張度は、血液に対して規定される、サンプル収集デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（開示の分野）
本開示は、有害および／または毒性物質、特に、自然に発現された体液（例えば、口腔液、尿）を含む体液または他の物質のサンプルを収集するためのデバイス、溶液、および方法に関する。加えて、または代替として、本開示は、概して、そのような液体からの細胞および／または細胞外成分の保存に関する。加えて、または代替として、本開示は、概して、機能的ゲノム学に関する。加えて、または代替として、本開示は、（例えば）診断、遺伝学、機能的ゲノム、エピジェネティック研究、ならびにバイオマーカ発見のうちのいずれかにおける研究のためのそのような体液からの細胞および／または細胞外成分の単離および／または保存に関する。加えて、または代替として、本開示は、概して、天然に発現する体液を使用することによる疾患または感染症の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
個人化医療は、１つの全体用治療モデルとは対照的な個人への治療のカスタマイズである。個人化医療は、体調に基づいて患者をカテゴライズし、そのカテゴリのためだけに最適な医療解決策を設計することを伴う。個人化医療の進展は、治療のために、ならびにスクリーニングおよび早期疾患検出のための診断の開発のために集団を階層化するためのバイオマーカの発見、検証、および商業化に依存する。
【０００３】
エピジェネティック研究は、医学研究の最先端を担っており、癌、肥満、糖尿病、統合失調症、およびアルツハイマー病を含むいくつかの身体および精神疾患の病因に関与する（Ａｌｉｋａら、２０１０；Ｇｒａｎｔら、２０１０；ＭｃＧｏｗｅｎら、２００９；ＭｃＧｏｗｅｎおよびＳｚｙｆ、２０１０；Ｐｌａｚａｓ−ＭａｙｏｒｃａおよびＶｒａｎａ、２０１１；ならびにＰｏｒｔｅｌａおよびＥｓｔｅｌｌｅｒ、２０１０）。加えて、エピジェネティックスは、癌、糖尿病、薬剤統合、薬剤有効性、小児期攻撃性、自殺行動、加齢、炎症、疼痛、肥満、統合失調症、および他の精神疾患を含むが、それらに限定されない、多くの科学および医療分野で特に有望であり得る（Ａｂｄｏｌｍａｌｅｋｙら、２００５；Ｃｏｓｔａら、２００３；Ｉｗａｍｏｔｏ  ＆  Ｋａｔｏ、２００９；Ｋｕｒａｔｏｍｉら、２００７；ＭｃＧｏｗａｎ  ＆  Ｋａｔｏ、２００７；ＭｃＧｏｗｅｎおよびＳｚｙｆ、２０１０；Ｐｅｅｄｉｃａｙｉｌ、２００７；Ｐｅｔｒｏｎｉｓら、１９９９；ＭｃＧｏｗｅｎおよびＳｚｙｆ、２０１０；Ｐｌａｚａｓ−ＭａｙｏｒｃａおよびＶｒａｎａ、２０１１；ならびにＺａｗｉａら、２００９）。
【０００４】
当該分野内の主な課題は、全ゲノム分析研究を含む、大規模エピジェネティック研究のために十分である、在宅サンプル収集用の適切な原試料の識別を含む。エピジェネティックスは、エピジェネティック機構が環境的体験の分子記憶を提供し得ることを増加しつつある証拠が示唆するように、遺伝子・環境相互作用の機構を理解することの手掛かりであり得る（Ｈｏ，２０１０；Ｋａｐｐｅｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅａｎｅｙ，２０１０：ＭｃＧｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；ＭｃＧｏｗｅｎ  ａｎｄ  Ｓｚｙｆ，２０１０；Ｐｏｒｔｅｌａ  ａｎｄ  Ｅｓｔｅｌｌｅｒ，２０１０；Ｒｉｃｈａｒｄｓ，２００８；Ｒｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；およびＶｌａａｎｄｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。一部のヒトからの予備データは、末梢血液細胞中の明確に異なるメチル化パターンが、小児期攻撃性、自殺行動、および加齢を含む、社会的行動と関連付けられることを示唆する（Ｋａｐｐｅｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅａｎｅｙ，２０１０；ＭｃＧｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；ＭｃＧｏｗｅｎ  ａｎｄ  Ｓｚｙｆ，２０１０；Ｐｏｒｔｅｌａ  ａｎｄ  Ｅｓｔｅｌｌｅｒ，２０１０；Ｒｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｔｉｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．；２０１０およびＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０００５】
ヒトの疾患、特に、精神疾患の異種性質、および寄与する病因的因子の複雑な相互作用に少なくとも部分的に起因して、研究は、信頼性があり、かつ有意な効果を提供するために大型サンプルサイズを必要とする。しかしながら、エピジェネティック研究用のサンプル収集のための現在の研究オプションは、「大型サンプルサイズ」という本要件を満たさない。研究用の大型サンプルサイズの必要性はまた、ヒト・環境相互作用もまた多くの寄与する要因を伴う非常に複雑な性質であるため、これらの相互作用を研究することに関して有意な効果を生じるために当てはまる。大規模な「人口規模」（少なくとも数百から数千の対象サンプル数の）エピジェネティック研究を行う能力は、ヒト・環境相互作用の新しい理解を導入し、現代医学の進歩に不可欠なエピジェネティックベースのスクリーニング診断の開発を促進する、縦断研究の完成を促進することができる。本エピジェネティック研究は、どのようにして環境が我々のエピゲノムに影響を及ぼすか、およびどのようにしてこれが個体の健康転帰に関するかにつながり得、さらに、高リスクと見なされる個体のための予防介入、および診断を含むがそれに限定されない、これらの健康格差のための診断法の開発につながり得る。
【０００６】
ヒト集団内の環境および他の複雑な相互作用を定量化しようとする、いくつかのエピジェネティック研究は、実験のための原試料として血液を使用する。血液は、以下であるため、大集団規模の研究を行う研究者の能力を制約し得る。
１．  概して、医学的監視を必要とする
２．  収集のための侵襲的手技を伴う
３．  参加を制限する悪い印象がある
４．  収集して輸送することが高価である
【０００７】
自然に発現された体液、例えば、唾液および尿は、以下であるため、在宅サンプル収集用の付加的または代替的な適切な原試料であり得る。
１．  侵襲的技法を必要としない
２．  血液と同一の悪い印象がない
３．  専門家の監視を必要としない
４．  収集することが安価であり得る
【０００８】
加えて、少なくとも唾液は、白血球を含有することが示されている（Ｄｏｓ−Ｓａｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。体液、例えば、口腔液、尿の使用は、大規模な「人口規模」エピジェネティック研究を可能にし得る。加えて、口腔液または尿の在宅サンプル収集は、参加者の数を大いに増加させることができ、サンプルが世界中のどこからでも対象によってより容易に出荷／輸送されることができるため、はるかに広い範囲の研究オプションを利用可能にし得る。例えば、世界中のどこからでもサンプルをより容易に出荷する能力は、サンプルが研究室インフラストラクチャを有していない国からであるときに特に有用であり得る。
【０００９】
生物のゲノムは、その遺伝情報を含有し、有機体の全細胞中で同一である、固定配列である。有機体のエピゲノムは、対照的に、細胞型の間で変動し、有機体の生涯にわたって変化する。したがって、エピジェネティック研究は、これらの差異を制御するように、サンプル材料源として単一の細胞型を含んでもよい（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒｉｃｋｅｒ，２０１０；Ｌｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；およびＲａｎｇｗａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。例えば、ヒトの唾液は、上皮細胞、血液中で通常見出される細胞（すなわち、Ｔ細胞およびＢ細胞）、細菌、および残渣（Ｄｏｓ−Ｓａｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９およびＶｉｅｔ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄｔ，２００８）を含む、多数の細胞型を含有する。後成的にプロファイル作成するために最も重要である唾液中の細胞は、これらの細胞が全身からエピジェネティック情報を伝えるため、血流に由来するものである（Ｋａｐｐｅｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅａｎｅｙ，２０１０；ＭｃＧｏｗｅｎ  ａｎｄ  Ｓｚｙｆ，  ２０１０；ＭｃＧｏｗｅｎ  ａｎｄ  Ｓｚｙｆ，２０１０；Ｒｉｇｈｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ，２００７；Ｒｏｓａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｖｌａａｎｄｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０およびＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【００１０】
加えて、唾液中の細胞の圧倒的多数を構成する（Ｄｏｓ−Ｓａｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、上皮細胞等の血液中で見出されない唾液中の細胞が、少数の細胞の影響を弱めることによってＴ細胞（血液中で生じた細胞）で見られるエピジェネティック影響を「隠す」能力を有する（Ｄｏｓ  Ｓａｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、Ｌｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；およびＴｉｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）ため、唾液ＤＮＡ全体を使用することは実用的ではない場合がある。これらの懸念に対処するために、ＡｂｏＧｅｎは、細胞特異的マーカおよび（例えば、磁気的）単離技法を利用することによって、唾液等の体液中で見出される異なる細胞型を分離して抽出する方法を開発した。この方法は、大規模機能的ゲノム研究（例えば、エピゲノム研究）を含む、下流生物学的用途に使用されることができる、濃縮細胞を生じさせるために、唾液等の体液の実用的な量を使用する。例えば、唾液サンプル処理技術は、収集されたサンプルが単一細胞型に処理され、それらのエピゲノムをプロファイル作成させることを可能にする。
【００１１】
さらに、唾液（および他の体液）は、以下等の理由により、下流実験に関する血液細胞用の原試料としての細胞単離について課題を提示し得る。
１．  血液は、輸送体流体である一方で、唾液は、プロテアーゼ、酵素、および分泌された物質が豊富であり得る消化液であり、尿は、所望されない老廃物から成る排泄液である。
２．  細胞は、長期間にわたって唾液中で無傷で生存しない。細胞が数週間も（またはいくつかの細胞型については数年さえも）血液中で生存することができる一方で、唾液中の細胞生存は、典型的には、１時間未満である。１５、４５、および９０分後に生存する唾液中の細胞の割合は、それぞれ、わずか約６６％、３３％、および２７％であることが報告されている。唾液は、その生理学的性質によって、分析または診断のための全細胞保存に適さない環境を提示する。いくつかの研究は、細胞の９５％が６０分まで生存できないことを実証している（Ｂａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
３．  いくつかの流体は、広いｐＨ範囲を有し得、唾液等の報告されたｐＨ値のうちのいくつかは、血液がそのｐＨに達した場合に死をもたらすであろう（唾液は６．２〜７．４、尿は４．５〜８、血液は７．３５〜７．４５である）。
４．  いくつかの流体は、血液より多くの細菌を含有する。
５．  いくつかの流体は、個体の間で変動し、細胞単離に干渉する、非細胞物質を含有する。
６．  いくつかの流体は、血液中で豊富であり得るが、唾液または尿等の他の自然に発現された体液中では希少であり、血液中と異なり、上皮細胞等の他の細胞型が大いに数が上回って、Ｔ細胞等の血液細胞を含む。
７．  唾液等のいくつかの体液中のリンパ球のサブセットは、血液中のこれらの細胞型の集団と大いに異なる。例えば、ＣＤ４＋ＣＤ８−Ｔ細胞のみが、唾液中で見出されることが報告されている。
８．  唾液等のいくつかの流体は、個体あたり１日に約０．５〜１．５リットルの割合で毎日産生される。
【００１２】
したがって、唾液、口腔液、および他の自然に発現された体液から希少な細胞（すなわち、Ｔ細胞）を単離する新しい方法の必要性がある。
【００１３】
広く地理的に分散している人々の大きな集団から唾液サンプルを収集する（例：機能的ゲノム研究または医療診断法）ために、いくつかの要件が、最適なサンプル収集デバイスについて満たされる必要があり得る。例えば、閉鎖チャンバの中に毒性保存溶液をしっかりと収納させるサンプル収集デバイスを有することが有益であり得る。加えて、サンプル収集デバイスは、安全に封入された毒性溶液とともにドナーに発送されることが可能であり得る。サンプル収集デバイスはまた、毒性溶液にドナーを暴露するリスクを伴わずに、ヒトの唾液または尿等のドナー検体の容易かつ安全な収集も可能にし得る。さらに、サンプル収集デバイスは、毒性溶液または任意の他の危険にドナーを暴露するリスクを伴わずに、ドナーが（検体の保存のために）毒性溶液および検体を安全に混合することを可能にし得る。サンプル収集デバイスはまた、ドナーが、サンプル収集デバイスをしっかりと閉鎖した後に、概して「そのまま」処理するために、サンプル収集デバイスに加えてサンプルを研究室に発送することも可能にし得る。最後に、サンプル収集デバイスはさらに、研究室技術者がサンプル収集デバイスを受領し、概して、いかなる危険への暴露のリスクも伴わずに処理するために、それを安全に開くことを可能にし得る。
【００１４】
加えて、精製プロセスは、細胞がそれらの抗原プロファイルを維持することを必要とし、エピゲノムプロファイル作成は、それらのエピゲノムが維持されることを要求する。この目的のために、細胞が、概して、これらの特徴を維持することができるような方法で、細胞を処置する必要がある。現在利用可能な処置は、概して、この必要性を満たさない。例えば、米国特許第７，２６７，９８０号および第７，７４９，７５７号は、血液からの細胞を安定させるためのリシン、グリシン、およびホルムアルデヒドを含有する溶液を開示すると理解される。米国特許第６，９１２，９３２号は、ともに混合させられたときに、血小板を含有する血液サンプルを安定させるためのホルムアルデヒドアンモニウム錯体の複数の種を生成する、反応物質を開示すると理解される。しかしながら、そのような溶液は、主に、血液の生理学的に負担をかけない環境に対処し、唾液の異なる性質に対処できない。唾液中で損傷されていない細胞および細胞外成分を保存することの困難は、過小評価されるべきではない。上記で参照される溶液は、唾液の生理学的に厳しい環境から細胞を保護せず、特に、唾液が現在提案されている様式における分析または診断用の効果的なサンプル媒体であるために十分な数で、すでに唾液中の比較的わずかな量で希少な細胞を保存することができない。したがって、特に、在宅サンプル収集を可能にするように、唾液、口腔液、および他の自然に発現された体液等の体液中の細胞の抗原性ならびにエピゲノムを保存し得る、新しい溶液および方法の必要性がある。
【００１５】
個体化医療は、１つの全体用処置モデルとは対照的な個体への処置のカスタマイズである。個体化医療は、患者の体調に基づいて患者をカテゴリ化し、独占的にそのカテゴリのために最適な医療解決策を設計することを伴う。個体化医療の進展は、処置のために、ならびにスクリーニングおよび早期検出のための診断の開発のために、集団を階層化するためのバイオマーカの発見、検証、および商業化に依存する。
【００１６】
エピジェネティック研究は、医学研究の最先端を担っており、癌、肥満、糖尿病、統合失調症、およびアルツハイマー病を含む、いくつかの身体および精神疾患の病因に関与する。加えて、エピジェネティックスは、癌、糖尿病、薬物統合、薬物有効性、小児期攻撃性、自殺行動、加齢、炎症、疼痛、肥満、統合失調症、および他の精神疾患を含むが、それらに限定されない、多くの科学および医療分野で特に有望であり得る。
【００１７】
上記で議論されるものに対する類似考慮事項はまた、唾液中で運搬される細胞外成分、例えば、タンパク質、ウイルス、および浮遊性ＤＮＡ／ＲＮＡにも適用される。そのような成分はまた、唾液の厳しい環境に起因して、急速に分解する。一般的な血液ベースの保存技法は、実践では唾液にとって効果的ではないであろうし、本理由により、唾液は、そのような細胞外成分を研究するための実用的な代替的媒体としてこれまで使用されておらず、特に、遠隔在宅サンプル収集では使用されていない。例えば、現在の技法を用いて、唾液の細胞外成分を研究するために、唾液は、即時に凍結されなければならない。凍結が即時ではない場合、これは、サイトカイン等の因子の分解に起因して、これらの因子の濃度の変化を引き起し得る。凍結後のみの唾液の細胞外因子の研究の実施例は、タンパク質のインターロイキンファミリーならびに付加的サイトカインを含む。
国際公開第ＷＯ２０１２／１７７６５６号および国際公開第ＷＯ２０１５／１１２４９６号は、エピジェネティック研究のために好適な唾液サンプルの在宅収集および保存のためのデバイス、溶液、ならびに方法を提案する。これらの文書の内容全体は、ここで完全に再現された場合のように参照することによって本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国特許第７，２６７，９８０号明細書
【特許文献２】米国特許第７，７４９，７５７号明細書
【特許文献３】米国特許第６，９１２，９３２号明細書
【特許文献４】国際公開第２０１２／１７７６５６号
【特許文献５】国際公開第２０１５／１１２４９６号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（開示の要旨）
以下は、本開示のいくつかの側面の基本的な非限定的理解を提供するために、本開示の簡略化された概要を提示する。
【００２０】
本開示のいくつかの実施形態は、国際公開第ＷＯ２０１２／１７７６５６号および／または国際公開第ＷＯ２０１５／１１２４９６号内の原理を基礎とする。
【００２１】
本開示のいくつかの実施形態は、添付の請求項で規定される。
【００２２】
本開示のいくつかの実施形態は、口腔液（例えば、唾液または痰もしくは肺吸引物の流体）または尿等の自然に発現された体液のサンプル中の細胞および／または細胞外成分を保存するための溶液を提供する。随意に、溶液は、ドナーから流体サンプルを収集するためのデバイスと組み合わせて規定されてもよい。
【００２３】
本明細書で使用されるように、「細胞外」という用語は、全細胞ではなく、全細胞内に存在しない、任意および／または全ての成分を指し得る。例えば、「細胞外」は、細胞が除去された場合に残留する成分を指し得る。細胞外成分は、例えば、タンパク質、ウイルス、浮遊性ＤＮＡ、および／または浮遊性ＲＮＡのうちのいずれかを含んでもよい。
【００２４】
本開示のいくつかの実施形態は、（例えば、体液と混合することに先立って）血液に対して高張性である保存溶液を提供する。
【００２５】
いかなる具体的理論にも拘束されることを所望するわけではないが、本発明者らは、唾液の張度（またはオスモル濃度）が、唾液を細胞生存のために厳しい環境にする有意な要因であり得ることを理解している。唾液、特に、供与されたサンプル中で収集される唾液は、血液（したがって、細胞）に対して低張性であることが分かっている。個体の唾液の中に入る血液からの細胞は、流体を細胞に引き込む破壊的浸透を受け、細胞を膨張させ、損傷させ、最終的に破裂させる。これは、唾液中で無傷で生存することが報告されている少数の細胞を説明し得る。事実上、唾液は、細胞を溶解し、このことが唾液を生存全細胞のサンプルを取得するための反直感的な媒体にする、天然の溶解溶液である。
【００２６】
血液に対して高張性である保存溶液を提供することによって、この溶液は、唾液サンプルと混合させられたときに、（血液および／または細胞に対する）等張性環境に向かって張度を中和することができる。そのような環境は、収集されたサンプル中の細胞に対する浸透圧を回避するか、または少なくとも有意に低減させることができ、それによって、保存された無傷細胞の有意に向上した収率を可能にする。
【００２７】
例えば、唾液中の細胞を保存するための高張性非溶解保存溶液は、血液サンプル中の全細胞を保存するか、または安定させるために意図される保存溶液からの明確な区別を表すことが留意され得る。これは、たとえ血液を保存することに焦点を当てる従来技術の教示で確認されていなくても、唾液および血液の張度の間の有意差を反映する。非溶解血液保存剤は、血液の中性の等張性環境を変化させないよう、かつ細胞に対する浸透圧を上昇させることを回避するよう、等張性であるべきである。高張保存溶液が血液と混合させられた場合、これは、血液の張度を変化させ、細胞への損傷という危険を生じるであろう。同様に、唾液サンプル中の細胞を保存するために使用される従来の等張性血液保存剤は、唾液の低張性環境に対して十分に細胞を保護できず、従来技術の教示の不足として以前に記述されたように、保存された細胞の不十分な収率を生じるであろう。
【００２８】
いくつかの実施形態では、自然に発現された体液は、例えば、細胞にとって自然に低張性であるタイプであってもよいが、（例えば、唾液を含有する）口腔液に限定されず、特に、唾液自体に限定されない。
【００２９】
本明細書で使用されるように、流体が、概して、１リットルにつき２４０〜３２０ミリオスモル（ｍＯｓｍ／Ｌ）を含めた範囲内のオスモル濃度を有するときに、流体は、血液に対して等張性と見なされ得る。血液の実際のオスモル濃度は、概して、２７５〜２９５ｍＯｓｍ／Ｌを含めた範囲内、随意に、約２９０ｍＯｓｍ／Ｌであってもよい。したがって、本明細書で使用されるような「等張性」という用語は、オスモル濃度、したがって、浸透圧の差異が有意ではない、限界を含む。流体は、２４０ｍＯｓｍ／Ｌ未満のオスモル濃度を有するときに、血液に対して低張性と見なされ得る。流体は、３２０ｍＯｓｍ／Ｌより大きいオスモル濃度を有するときに、血液に対して高張性と見なされ得る。
【００３０】
本明細書で開示される、いくつかの実施形態では、（例えば、体液と混合することに先立った）溶液のオスモル濃度は、随意に、約または少なくとも（いずれの場合も）２４０Ｏｓｍ／Ｌの「ｎ」倍であるものとして規定され得、「ｎ」は、２〜１５を含めた自然数である。例えば、「ｎ」は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１３、１４、または１５であってもよい。
【００３１】
本明細書で開示される、いくつかの実施形態では、（例えば、体液と混合することに先立った）溶液のオスモル濃度は、随意に、約または少なくとも（いずれの場合も）２７５Ｏｓｍ／Ｌの「ｎ」倍であるものとして規定され得、「ｎ」は、２〜１５を含めた自然数である。例えば、「ｎ」は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１３、１４、または１５であってもよい。
【００３２】
本明細書で開示される、いくつかの実施形態では、（例えば、体液と混合することに先立った）溶液のオスモル濃度は、随意に、約または少なくとも（いずれの場合も）２９０Ｏｓｍ／Ｌの「ｎ」倍であるものとして規定され得、「ｎ」は、２〜１５を含めた自然数である。例えば、「ｎ」は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１３、１４、または１５であってもよい。
【００３３】
加えて、または代替として、（例えば、体液と混合することに先立った）溶液における凝集物塩イオンオスモル濃度は、随意に、約または少なくとも（いずれの場合も）２９０Ｏｓｍ／Ｌの「ｎ」倍であり得、「ｎ」は、２〜１５を含めた自然数である。例えば、「ｎ」は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５であってもよい。
【００３４】
本明細書で開示される、いくつかの実施形態では、（例えば、体液と混合することに先立った）血液と比べた溶液のオスモル濃度は、随意に、約または少なくとも（いずれの場合も）血液の「ｎ」倍であるものとして規定され得、「ｎ」は、２〜１５を含めた自然数である。例えば、「ｎ」は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５であってもよい。
【００３５】
加えて、または代替として、（例えば、体液と混合することに先立った）溶液における塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の濃度は、随意に、約または少なくとも（いずれの場合も）濃度「ｍ」の「ｎ」倍であり得、「ｍ」は、１リットル当たり８．０〜９．０グラム(g/L)を含めた範囲の値であり、「ｎ」は、２〜１５を含めた自然数である。例えば、「ｎ」は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５であってもよい。
【００３６】
加えて、または代替として、溶液は、随意に、約または少なくとも（いずれの場合も）血液等張ＰＢＳ濃度の「ｎ」倍である（例えば、体液と混合することに先立った）濃度のリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）を含み得、「ｎ」は、２〜１５を含めた自然数である。例えば、「ｎ」は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５であってもよい。
【００３７】
いくつかの実施形態では、流体の張度／オスモル濃度を測定するための技法は、その電気伝導度を測定することである。伝導度は、オスモル濃度と関連付けられ得る、イオンの存在を示す。いくつかの実施形態では、溶液は、少なくとも１５ミリジーメンス／センチメートル（ｍＳ／ｃｍ）の伝導度、随意に、約または少なくとも（いずれの場合も）１５．５ｍＳ／ｃｍ、１６ｍＳ／ｃｍ、１６．５ｍＳ／ｃｍ、１７ｍＳ／ｃｍ、１７．５ｍＳ／ｃｍ、１８ｍＳ／ｃｍ、１８．５ｍＳ／ｃｍの群から選択される値を有する。
【００３８】
電気伝導度は、単独で、または随意に、溶液の特性を定量化するための１つまたはそれを上回る他の実験的パラメータ、例えば、以下の一つもしくは両方と組み合わせて、規定されてもよい。
（ｉ）ｐＨ−例えば、約６．４〜約８．４を含めた、いくつかの実施形態では、約７．２〜約７．６を含めた、随意に、約７．３〜７．６を含めた範囲内の値、および／または
（ｉｉ）密度−例えば、１〜１．０１５Ｋｇ／リットルを含めた、いくつかの実施形態では、１．００９０〜１．０１１２ｋｇ／リットルを含めた範囲内の値。
【００３９】
いくつかの実施形態では、（低張性の自然に発現された体液のサンプルと混合することに先立った）溶液は、体液の収集されたサンプルと混合する際に、溶液と体液との一緒の混合物が等張性であるように、高張度を有し、張度は、血液に対して規定される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、（唾液サンプルと混合することに先立った）溶液は、収集された唾液サンプルと混合する際に、溶液と唾液の一緒の混合物が等張性であるように、張度を有し、張度は、血液に対して規定される。
【００４１】
等張性溶液を取得することは、唾液サンプルの保存（例えば、固定）の間だけではなく、保存された細胞が処理または分析を待って貯蔵される期間の間でも有利であり得る。例えば、保存および／または固定された細胞は、細胞壁を通した流体移動に影響を及ぼす浸透圧条件に応じて、細胞を膨張させて破裂させ、ならびに／もしくは圧潰させて内破させ得る、浸透圧効果を依然として受けやすくあり得る。
【００４２】
上記のうちのいずれかに加えて、または代替として、いくつかの実施形態では、溶液は、少なくとも１週間、随意に、少なくとも２週間、随意に、少なくとも３週間、随意に、少なくとも１ヶ月、随意に、少なくとも２ヶ月、随意に、少なくとも３ヶ月の周期にわたって、少なくとも所定の有効性まで、自然に発現された体液サンプル（例えば、唾液、痰、肺吸引物の流体、もしくは尿）中の細胞および／または細胞外成分を保存することができる。
【００４３】
本開示の目的で、「保存する」とは、例えば、細胞がそれらの抗原に基づいて精製または濃縮されることができるように、細胞がそれらの抗原を分解させることを防止することと、細胞エピゲノムの変化を防止することとを指す。「エピゲノム」とは、ＤＮＡまたはＤＮＡに結合したタンパク質の共有結合修飾による、ゲノムＤＮＡの変化の状態もしくはパターンを指す。そのような変化の実施例は、ＣｐＧジヌクレオチド中のシトシンの第５位におけるメチル化、ヒストンのリジン残基のアセチル化、および根本的ＤＮＡ配列の変化に起因しない他の遺伝的または非遺的変化を含む。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「有効性」という用語は、元の体液サンプル中の少なくとも所定の割合の細胞が保存されることを意味し得る。所定の割合は、随意に、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、随意に、少なくとも７５％、随意に、少なくとも８０％、随意に、少なくとも８５％、随意に、少なくとも９０％、随意に、少なくとも９５％であり得る。（保存溶液との元のサンプルの混合が混合物の正味体積を増加させ、それによって、細胞濃度を希釈するため、単位体積あたりの細胞濃度は、元の体液サンプルと比較して低減させられ得る。）
【００４５】
加えて、または代替として、有効性は、単位体積あたりの細胞（例えば、ある型の、例えば、Ｔ細胞）の数を指し得る。例えば、（例えば、そのような）細胞の数は、１ｍｌあたり少なくとも約５０００、随意に、１ｍｌあたり少なくとも約１００００、随意に、１ｍｌあたり少なくとも約１２０００であり得る。
【００４６】
加えて、または代替として、いくつかの実施形態では、溶液は、室温において少なくとも１ヶ月、随意に、少なくとも２ヶ月、随意に、少なくとも３ヶ月、随意に、少なくとも４ヶ月の保存期間を有し得る。
【００４７】
加えて、または代替として、いくつかの実施形態では、口腔液（例えば、唾液および／または痰）ならびに尿等の体液中の細胞および／または細胞外成分（例えば、タンパク質、ウイルス、浮遊性ＤＮＡ、および／または浮遊性ＲＮＡのうちのいずれか）を保存するための溶液が、細胞型および細胞外成分へのさらなる分離のために、ならびに下流分析のために提供される。随意に、細胞に関して、溶液は、唾液中の細胞が貯蔵の間にそれらの抗原性および細胞構造を保持することを可能にし得る。加えて、または代替として、随意に、細胞外成分に関して、溶液は、細胞外成分（例えば、タンパク質）が、分解に対して、および／または細胞外タンパク質の生物反応性を保存することなく、保存されることを可能にし得る。いくつかの実施形態では、溶液は、唾液サンプル中の細胞および細胞外成分を両方とも保存し得る。
【００４８】
溶液は、限定されないが、パラホルムアルデヒド等の少なくとも１つの化学固定剤と、少なくとも１つのプロテアーゼ阻害剤とを含むことができる。いくつかの実施形態では、溶液はさらに、例えば、少なくとも１つの抗菌剤、ヒトおよび／または他の動物種からの血清タンパク質のうちの１つ以上のものを含み得る。加えて、または代替として、溶液は、約６．４〜約８．４、いくつかの実施形態では、約７．２〜約７．６のｐＨで緩衝され得る。
【００４９】
保存剤による細胞の化学的固定は、細胞の機械的強度を増加させることができ、細胞が無傷で保存され、時間とともに、自然分解および浸透圧により良く耐えることを可能にする。具体的には、数分を上回って固定剤中で細胞を貯蔵すること（いわゆる「過固定」）は、細胞の耐溶解性を増加させることが報告されている。
【００５０】
タンパク質等の細胞外成分の化学的固定は、タンパク質を他の物質、例えば、他のタンパク質またはＤＮＡと架橋することによって、これらタンパク質を結合することができる。例えば、他の物質に生物学的に結合されたタンパク質は、架橋によって、同じ物質とより堅く化学的に結合され得る。他の材料と単に近接していたタンパク質は、架橋によってその物質に結合されてもよい。架橋は、より小さいセグメント（例えば、ペプチド）への望ましくない分解に対してタンパク質を補強することによって、タンパク質を保存し得る。
【００５１】
架橋は、少なくとも部分的に可逆的であり得る。架橋を逆転させることは、例えば、タンパク質等の細胞外成分の分析のための、例えば、以降の下流処理におけるステップであり得る。
【００５２】
上記のうちのいずれかに加えて、または代替として、いくつかの実施形態では、溶液は、実質的に洗剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を含まない。洗剤は、時として、細胞材料を通した透過を促進するために、生物学的サンプルの特定の処理で使用されるが、本明細書では、増加した細胞損傷および細胞損失を犠牲にすると考えられる。本開示のいくつかの実施形態によると、洗剤の存在を回避することは、保存された細胞の数を増進することができ、これは、特定の着目細胞の唾液サンプル中の比較的わずかな量を念頭に置いて、特に有利であり得る。
【００５３】
前述のように、溶液は、随意に、血液に対して高張性であり得る。
【００５４】
上記のうちのいずれかに加えて、または代替として、いくつかの実施形態では、自然に発現された体液（例えば、唾液、痰、または他の口腔液、もしくは尿）の保存されたサンプルを含有する、サンプル収集デバイスが提供され、保存されたサンプルは、血液に対して等張性である。随意に、保存されたサンプルは、（ｉ）自然に発現された体液の収集されたサンプルおよび（ｉｉ）保存溶液の混合物であってもよい。
【００５５】
上記のうちのいずれかに加えて、または代替として、本開示のいくつかの実施形態は、結果として生じる混合物の張度を等張性にするように、低張性の自然に発現された体液のサンプルと混合するための高張性保存溶液の使用を提供し、張度は、血液に対して規定される。実施例のみとして、体液は、唾液であってもよいか、または唾液を含有してもよい。
【００５６】
いくつかの実施形態では、１つ以上の体液中の細胞を保存する方法は、例えば、細胞がそれらの抗原性およびエピゲノムを保持することを可能にする、本開示の１つおよび／または別の実施形態による、収集された細胞を溶液と接触させることを含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、１つまたはそれを上回る体液中の細胞外成分を保存するための方法は、特定の細胞外成分、例えば、タンパク質が、随意に、生物反応性を保持することなく、それらの構造を保持することを可能にする、本開示の一実施形態および／または別の実施形態による溶液と体液の収集されたサンプルとを接触させるステップを含む。
【００５８】
例えば、口腔液、唾液、痰、肺吸引物の流体、尿のうちの１つまたはそれを上回るものを含む、体液は、自然に発現されてもよい。いくつかの場合には、肺吸引物はまた、人工的に吸引されてもよい、または促されてもよい。
【００５９】
いくつかの実施形態では、化学的に固定された体液（例えば、唾液または別の口腔液、もしくは尿）中の細胞から特定の細胞外成分（例えば、タンパク質、ウイルス、浮遊性ＤＮＡ、および／または浮遊性ＲＮＡのうちのいずれか）を分離するための方法は、サンプルを液体形態の上記特定の細胞外成分と、例えば、細胞のペレットとに分離させるように、サンプルを遠心分離するステップを含む。ペレットおよび液体成分は、別個に処理されてもよい。例えば、液体成分は、特定の細胞外成分の分析のために処理されてもよい。加えて、または代替として、ペレットは、細胞分析のために処理されてもよい。随意に、同じサンプルは、（ｉ）細胞および（ｉｉ）上記細胞外成分（例えば、タンパク質、ウイルス、浮遊性ＤＮＡ、および／または浮遊性ＲＮＡのうちのいずれか）の両方の分析のための材料を提供してもよい。
【００６０】
いくつかの実施形態では、体液、例えば、唾液または尿から収集される、化学的に固定された細胞から細胞を単離する方法は、細胞、細菌、および破片のペレットから、例えば、ＤＮＡおよび／または他の可溶性物質を分離するように、細胞を遠心分離することと、ペレットの他の内容物から白血球を濃縮するステップと、細胞特異的マーカに標的化された磁気ビーズに結合した抗体を使用して、具体的細胞（例えば、白血球）を単離することとを含む。
【００６１】
いくつかの実施形態では、１つ以上の体液（例えば、唾液および／または尿）から、特定のタイプの細胞、例えば、一種の白血球（例えば、リンパ球）を単離する方法は、以下のステップのうちの１つ以上のもの（および実施形態に応じて、以下のステップのうちのいくつかまたは全て）を含む：化学的に固定された細胞を含む体液のサンプルを提供するステップ、随意に、細胞を含むペレットを得るように体液サンプルを遠心分離するステップ、随意に、緩衝液中にペレットを再懸濁させるステップ、（リンパ球を含む）白血球型の混合物の層を得るように、再懸濁したペレットに密度勾配分離を受けさせるステップ、特定のタイプの白血球上で見出されるエピトープのための具体的結合剤を含む溶液と細胞型の混合物を接触させるステップ、白血球型の混合物から（リンパ球を含む）特定のタイプの白血球を分離するステップ。
【００６２】
いくつかの実施形態では、具体的結合剤は、特定のタイプの白血球上で見出されるエピトープに特異的な抗体に連結される磁気ビーズであり得、次いで、分離ステップにおいて、例えば、（他の細胞分離技法が本開示の範囲内であるが）白血球型の混合物から（リンパ球を含む）特定のタイプの白血球を磁気的に分離することを含み得る。
【００６３】
いくつかの実施形態では、体液（例えば、唾液、痰（または他の口腔液）、または尿）は、化学固定溶液と混合させられることができ、混合物は、ペレットから除去されることができる。次いで、ペレットは、緩衝液中に再懸濁させられることができる。再懸濁したペレットは、随意に、遠心分離され、緩衝液中で１回以上洗浄され得る。次いで、洗浄されたペレットは、勾配を形成するように親水性多糖類混合物に適用され得る。保存のための化学固定後の他の体液（例えば、唾液、尿）中の細胞の密度が、密度勾配を通して処理される細胞のために勾配の時間、温度、および／または密度の変化を必要とする、保存された細胞の異なる密度により、異なり得るため、この勾配は、血液に使用されるものと異なり得る。
【００６４】
加えて、いくつかの実施形態では、白血球は、勾配に層を形成することができる。白血球層は、勾配から抽出され、残りの勾配混合物を除去するように緩衝液中で洗浄されて再ペレット化され得る、別の遠心分離管の中に配置されることができる。次いで、ペレットは、磁気ビーズに結合され、単離される細胞型に特異的である抗原に特異的である抗体を含む、緩衝液中で再懸濁させられ、培養され得る。いくつかの実施形態では、単離される細胞型は、Ｔ細胞であり、抗原は、Ｔ細胞特異的抗原である。いくつかの実施形態では、抗原は、ＣＤ４である。緩衝液中の再懸濁した細胞は、抗体によって結合され、抗体結合磁気ビーズに結合した細胞を管の側面に磁気的に引き付ける磁場を受けることができる。次いで、残りの液体は、管から除去され得、管は、緩衝液中で洗浄される。次いで、単離されたＴ細胞は、管の側面に誘引されたままであり、（例えば）以降の下流実験のための凍結等のさらなる処理の準備ができている。
【００６５】
いくつかの実施形態では、自然に発現された体液中の細胞および／または細胞外成分を保存する方法は、開示される実施形態のうちのいずれかによる保存溶液と体液を接触させることを含む。
【００６６】
（ｉ）希少な、すなわち、わずかな数の細胞、および／または（ｉｉ）細胞外成分（例えば、タンパク質、ウイルス、浮遊性ＤＮＡ、ならびに／もしくは浮遊性ＲＮＡのうちのいずれか）の使用に適した収率を提供するように保存される、自然に発現された体液のサンプルを取得する能力は、（ｉ）患者の病状の診断のため、および／または（ｉｉ）処置の効果を監視するために、採血の代替的技法を提供し得る。処置される病状を診断するための診断ツールとして使用されるとき、本プロセス／製品は、時として、本明細書では「コンパニオン診断」と称され得る。例えば、ＭＧＭＴプロモータメチル化を測定するＭＧＭＴ唾液ベースのアッセイが、コンパニオン診断として使用されてもよい。処置の効果（例えば、特定の処置が功を奏しているかどうか、または投与量の増加もしくは減少が効果的であるかどうか、または処置が完全に功を奏するであろうかどうか）を監視するための監視ツールとして使用されるとき、本プロセス／製品は、時として、本明細書では「コンパニオンバリデータ」と称され得る。
【００６７】
そのような技法はさらに、患者または研究対象からサンプルを取得することの容易性を促進し、サンプルの在宅収集を可能にし得、ひいては、研究、診断、もしくは監視プログラムに参加することができる患者または研究対象の数を大いに拡張し得る。
【００６８】
血液サンプル中の特異的細胞型または他のバイオマーカを識別するために使用される技法もまた、自然に発現された体液中のそのような細胞または他のバイオマーカを識別するために（修正を伴って、または伴わずにのいずれかで）使用されてもよい。
【００６９】
一例のみとして、細胞または細胞外物質は、以下のうちの１つまたはそれを上回るものを示すか、もしくは識別するように分析されてもよい。
（ａ）  疾患の退行または攻撃性を識別するマーカ（細胞もしくは分子）を伴う細胞。疾患は、例えば、癌（随意に、限定されないが白血病）であり得る。痰であるか、または痰を含有する流体の場合、疾患は、肺癌、肺癌腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺炎、もしくは結核のうちのいずれか１つまたはそれを上回るものであり得る。
（ｂ）  出生前細胞。
（ｃ）  （例えば、転移性または別様の）循環腫瘍細胞。
（ｄ）  正常な細胞の希少な形態、例えば、以下のうちのいずれか１つまたはそれを上回るもの：
−骨髄異形成症候群のような未熟細胞
−疾患を示し、口から生じない上皮細胞亜型
−例えば（限定されないが）、血液疾患の診断のためのランゲルハンス細胞
（ｅ）  肥満を示す、１つまたはそれを上回るバイオマーカ。
（ｆ）  （抗生物質の不必要かつ不適切な処方を回避するために有用な）細菌感染症対ウイルス感染症を示す、１つまたはそれを上回るバイオマーカ。
（ｇ）  自閉症を示す、１つまたはそれを上回るバイオマーカ。
（ｈ）  アルツハイマー病を示す、１つまたはそれを上回るバイオマーカ。
（ｉ）  血液（ｈｅｔｏｔｏｌｏｇｉｃａｌ）疾患を示す、１つまたはそれを上回るバイオマーカ。
（ｊ）  心血管疾患もしくは障害を示す、１つまたはそれを上回るバイオマーカ。
（ｋ）  糖尿病を示す、１つまたはそれを上回るバイオマーカ。
（ｌ）  例えば、免疫細胞活性に関する、不安定プラーク（ｐｌａｃｋ）を示す１つまたはそれを上回るバイオマーカ、および／もしくは免疫細胞バイオマーカ。
（ｍ）  疾患または感染症の休眠および／または潜伏ならびに／もしくは隠密形態を示す、１つまたはそれを上回るバイオマーカならびに／もしくは１つまたはそれを上回る放出された因子。例えば、そのような疾患は、ＬＴＢＩであり得る。加えて、または代替として、そのような因子は、ペプチドおよび／またはサイトカインであり得る。
（ｎ）  随意に、細胞内ＨＩＶウイルスを検出することによる、細胞中のＨＩＶ感染の存在。
（ｏ）  癌を示す、１つまたはそれを上回るバイオマーカ。
（ｐ）  慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を示す、１つまたはそれを上回るバイオマーカ。
（ｑ）  薬物耐性結核を示す、１つまたはそれを上回るバイオマーカ。
（ｒ）  血液検査、電解質レベル、脂質プロファイル検査、ビタミンレベル、肝炎検査、鉄欠乏検査、肝機能検査、腎臓プロファイル検査、糖尿病スクリーニング検査、血液像検査、甲状腺プロファイル検査というカテゴリから、１つまたはそれを上回る検査を複製および／もしくは代用するために好適な１つまたはそれを上回るバイオマーカ。
（ｓ）  「喘息ＣＯＰＤオーバーラップ症候群（ＡＣＯＳ）」のタイプを示す、１つまたはそれを上回るバイオマーカ。随意に、そのようなバイオマーカは、ＣＯＰＤがＡＣＯＳであることを検出するために、コンパニオン診断をＣＯＰＤの一般診断に提供することができる。加えて、または代替として、そのようなバイオマーカは、ＡＣＯＳを処置標的にすることの有効性を監視するように、コンパニオンバリデータを提供することができる。加えて、または代替として、ＣＯＰＤの一般診断は、例えば、上記の（ｐ）で参照されるバイオマーカを使用して行われてもよいか、そして／またはＣＯＰＤの一般診断は、他の従来の診断検査を使用して行われてもよい。
【００７０】
いくつかの実施形態では、自然に発現された体液（例えば、唾液、痰、尿）中の希少な細胞の診断に独占的に限定されないが、随意に、患者の病状を診断するために使用される技法は、以下のうちの１つまたはそれを上回るものを含んでもよい。
（ａ）  フローサイトメトリ
（ｂ）  蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）
（ｃ）  免疫組織化学
（ｄ）  分子分析（例えば、限定されないが、エピジェネティック；遺伝子；翻訳；翻訳後のうちのいずれか）
（ｅ）  細胞学
（ｆ）  タンパク質レベル（翻訳後）分析技法
（ｇ）  遺伝子発現を測定するためのＲＮＡレベル（翻訳後）分析
（ｈ）  例えば、エピジェネティック、および／またはＤＮＡメチル化ならびにヒストン修飾を含む、ＤＮＡ。
【００７１】
本明細書に開示されるサンプル収集デバイスのいくつかの実施形態が、体液の収集を伴う用途について記載されるが、同デバイスはまた、有害および／または毒性流体を含む、任意の他の物質の収集を伴う特定の用途も有することが注目に値する。
【００７２】
実施形態のいくつかは、全細胞および／または細胞外物質を保存するための保存剤を使用することに関するが、他の実施形態は、収集されたサンプル中の核酸を抽出および保存することに関し得る。核酸は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡであってもよい。
【００７３】
例えば、核酸を抽出するように収集されたサンプル中の細胞を溶解し、核酸を保存する溶液が、使用されてもよい。
【００７４】
一例のみとして、その内容全体が本開示の一部として本明細書に組み込まれる、本説明に添付される付属書類１が参照される。
【００７５】
本開示を限定することなく、本明細書に開示される、特定の特徴および／または側面の番号付けされた項目別リストが、以下に続く。
【００７６】
項目別番号：
１．  さらなる下流分析のため、および／または病状の診断のために、自然に発現された体液中の細胞ならびに／もしくは細胞外成分を保存するための溶液であって、血液に対して高張性である溶液。
２．  前記自然に発現された体液は、口腔液、唾液、痰、尿、肺吸引物の流体から選択される、１つまたはそれを上回るものを含む、項目１に記載の溶液。
３．  自然に発現された体液は、本来低張性である、項目１または２に記載の溶液。
4.  溶液のオスモル濃度が、約または少なくとも２４０ｍＯｓｍ／Ｌの「ｎ」倍であり、「ｎ」は、２〜１５を含めた自然数である、項目１、２または３に記載の溶液。
5.  溶液のオスモル濃度が、約または少なくとも２７５ｍＯｓｍ／Ｌの「ｎ」倍であり、「ｎ」は、２〜１５を含めた自然数である、項目１、２、３または４に記載の溶液。
6.  溶液のオスモル濃度が、約または少なくとも２９０ｍＯｓｍ／Ｌの「ｎ」倍であり、「ｎ」は、２〜１５を含めた自然数である、項目１、２、３、４または５に記載の溶液。
7.  血液と比べた溶液の張度は、約または少なくとも血液の「ｎ」倍であり、「ｎ」は、２〜１５を含めた自然数である、先行項目のうちのいずれかに記載の溶液。
8.  溶液における凝集物塩イオンオスモル濃度は、約または少なくとも２９０ｍＯｓｍ／Ｌの「ｎ」倍であり、「ｎ」は、２〜１５を含めた自然数である先行項目のうちのいずれかに記載の溶液。
9.  溶液における塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の濃度は、約または少なくとも濃度「ｍ」の「ｎ」倍であり、「ｍ」は、１リットル当たり８．０〜９．０グラム(g/L)を含めた範囲の値であり、「ｎ」は、２〜１５を含めた自然数である、先行項目のうちのいずれかに記載の溶液。
10.  溶液は、約または少なくとも血液等張ＰＢＳ濃度の「ｎ」倍である濃度のリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）を含み、「ｎ」は、２〜１５を含めた自然数である、先行項目のうちのいずれかに記載の溶液。
１１．  溶液は、体液の収集されたサンプルと混合する際に、溶液と体液との混合物が一緒に略等張性であるように、高張度を有し、張度は、血液に対して規定される、先行項目のうちのいずれかに記載の溶液。
１２．  溶液は、少なくとも１５ｍＳ／ｃｍの電気伝導度を有する、先行項目のうちのいずれかに記載の溶液。
１３．  溶液は、以下のさらなるパラメータのうちの少なくとも１つ、すなわち、
（ｉ）  ６．４〜約８．４を含めた範囲内のｐＨ値、および／または
（ｉｉ）  １〜１．０１５ｋｇ／リットルを含めた範囲内の密度
を有する、項目１２に記載の溶液。
１４．  溶液は、少なくとも２週間、または少なくとも３週間、または少なくとも１ヶ月、または少なくとも２ヶ月、または少なくとも３ヶ月から選択される持続時間にわたって細胞を保存するために効果的である、先行項目のうちのいずれかに記載の溶液。
１５．  溶液は、以下の温度または温度範囲のうちの少なくとも１つ、すなわち、４℃〜４０℃、４℃〜３０℃、ほぼ室温、約４℃、約３０℃、約４０°Ｃとして選択される温度で保たれるときに、細胞を保存するために効果的である、先行項目のうちのいずれかに記載の溶液。
１６．  溶液は、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月のうちの少なくとも１つから選択される、保存可能期間を有する、先行項目のうちのいずれかに記載の溶液。
１７．  保存可能期間は、室温での保存可能期間である、項目１１に記載の溶液。
１８．  溶液は、体液の当初のサンプルから少なくとも所定の割合の細胞を保存するために効果的であり、所定の割合は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％から選択される、先行項目のうちのいずれかに記載の溶液。
１９．  １ｍｌあたりの保存された細胞または所定の細胞型の数は、少なくとも約５，０００、または少なくとも約１０，０００、もしくは少なくとも約１２，０００個である、先行項目のうちのいずれかに記載の溶液。
２０．  細胞は、Ｔ細胞である、先行項目のうちのいずれかに記載の溶液。
２１．  溶液は、約６．４〜約８．４のｐＨで緩衝される、少なくとも１つの化学的固定剤と、少なくとも１つのプロテアーゼ阻害剤とを含む、先行項目のうちのいずれかに記載の溶液。
２２．  さらなる下流分析のため、および／または病状の診断のために、自然に発現された体液中の少なくとも細胞外成分を保存するための、随意の先行項目のうちのいずれかに記載の溶液であって、溶液は、随意に、約６．４〜約８．４のｐＨで緩衝される、少なくとも１つの化学的固定剤を含む、溶液。
２３．  化学的固定剤は、アルデヒドから成る群から選択される、項目２１または２２に記載の溶液。
２４．  化学的固定剤は、パラホルムアルデヒドである、項目２３に記載の溶液。
２５．  化学的固定剤は、約１％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、項目２１、２２、２３、または２４に記載の溶液。
２６．  少なくとも１つの抗菌剤ならびにヒトおよび／または他の動物種からの血清タンパク質のうちの１つもしくはそれを上回るものをさらに含む、項目２１〜２５のうちのいずれかに記載の溶液。
２７．  抗菌剤は、抗菌性および抗真菌性抗生物質から成る群から選択される、項目２６に記載の溶液。
２８．  上記または特定のプロテアーゼ阻害剤は、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、メタロプロテアーゼ阻害剤、セリンプロテアーゼ阻害剤、トレオニンプロテアーゼ阻害剤、トリプシン阻害剤、クニッツＳＴＩプロテアーゼ阻害剤、および前述のうちのいずれかの組み合わせから成る群から選択される、項目２１〜２７のうちのいずれかに記載の溶液。
２９．  上記または特定のプロテアーゼ阻害剤は、アジ化ナトリウム、ＰＭＳＦ、アプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチン、天然もしくは合成プロテアーゼ阻害剤、天然および合成の両方のプロテアーゼ阻害剤の混合物、ならびに前述の任意の組み合わせから成る群から選択される、項目２１〜２８のうちのいずれかに記載の溶液。
３０．  上記または特定のプロテアーゼ阻害剤は、アジ化ナトリウムである、項目２１〜２９のうちのいずれかに記載の溶液。
３１．  溶液は、約７．２〜約７．６のｐＨで緩衝される、先行項目のうちのいずれかに記載の溶液。
３２．  緩衝液は、バルビタール、トリスリン酸、クエン酸、カコジル酸、他の非リン酸緩衝液、および前述の任意の組み合わせから成る群から選択される、項目２１〜３１のうちのいずれかに記載の溶液。
３３．  緩衝液は、リン酸緩衝液である、項目２１〜３１のうちのいずれかに記載の溶液。
３４．  体液を先行項目のうちのいずれかによる保存溶液と接触させるステップを含む、自然に発現された体液中の細胞および／または細胞外成分を保存するための方法。
３５．  体液を高張性保存溶液と接触させるステップを含む、低張性の自然に発現された体液中の細胞および／または細胞外成分を保存するための方法であって、張度は、血液に対して規定される、方法。
３６．  自然に発現された体液の収集のためのサンプル収集デバイスであって、項目１〜３３のうちのいずれかに記載の保存溶液を含有する、サンプル収集デバイス。
３７．  項目１〜３３のうちのいずれかに記載の溶液を含む、サンプル収集キット。
３８．  流体サンプル中の細胞および／または細胞外成分の下流分析のための流体サンプルであって、前記流体サンプルは、保存溶液と混合させられる自然に発現された低張性体液を含み、前記サンプル流体は、略等張性であり、張度は、血液に対して規定される、流体サンプル。
３９．  自然に発現された体液は、唾液である、項目３８に記載の流体サンプル。
４０．  項目３８または３９に記載の流体サンプルを含有する、サンプル収集デバイス。
４１．  病状を診断および／または監視する方法であって、
自然に発現された体液のサンプルを取得するステップと、
サンプルをサンプル中の細胞および／または細胞外成分を安定させるための保存溶液と接触させるステップと、
病状を識別、診断、もしくは監視するために、サンプルからの安定化細胞および／または細胞外成分を分析するステップと、
を含む、方法。
４２．  自然に発現された体液は、口腔液、唾液、痰、尿、肺吸引物の流体から選択される、１つまたはそれを上回るものを含む、項目４１に記載の方法。
４３．  自然に発現された体液は、唾液である、項目４１または４２に記載の方法。
４４．  サンプルを保存溶液と接触させるステップに先立って、サンプルを前処理剤と接触させるステップをさらに含み、前処理剤は、病状を示す１つまたはそれを上回る因子の放出を刺激するように構成される、項目４１、４２、または４３に記載の方法。
４５．  前処理剤は、病状と関連付けられる１つまたはそれを上回る抗原を含む、項目４４に記載の方法。
４６．  上記方法がさらに、少なくとも特定の細胞外成分から少なくとも特定の細胞を分離するステップを含む、項目４１〜４５のうちのいずれかに記載の方法。
４７．  上記少なくとも特定の細胞外成分は、タンパク質、ウイルス、浮遊性ＤＮＡ、および／または浮遊性ＲＮＡから選択される、１つもしくはそれを上回るものを含む、項目４６に記載の方法。
４８．  分析のステップに先立って、安定化細胞を濃縮するステップをさらに含む、項目４１〜４７のうちのいずれかに記載の方法。
４９．  分析のステップに先立って、安定化細胞から１つまたはそれを上回る細胞型を単離するステップをさらに含む、項目４１〜４８のうちのいずれかに記載の方法。
５０．  分析するステップは、疾患の退行または攻撃性を識別する細胞マーカもしくは分子マーカを用いて細胞および／または細胞外成分を識別するステップを含む、項目４１〜４９のうちのいずれかに記載の方法。
５１．  疾患は、癌、白血病、肺癌、肺炎、および／または結核から成る群から選択される、１つもしくはそれを上回るものである、項目５０に記載の方法。
52.  分析するステップが循環腫瘍細胞を識別することを含む、項目４１〜５１のいずれかに記載の方法。
53.  分析するステップが出生前細胞を識別することを含む、項目４１〜５２のいずれかに記載の方法。
54.  分析するステップが正常な細胞の希少な形態を識別することを含む、項目４１〜５３のいずれかに記載の方法。
５５  正常な細胞の希少な形態は、未熟細胞、骨髄異形成症候群を示す未熟細胞、疾患を示し、そして口から生じない上皮細胞亜型、および／またはランゲルハンス細胞から成る群から選択される、１つもしくはそれを上回るものを含む、項目５４に記載の方法。
56.  分析するステップがフローサイトメトリを含む、項目４１〜５５のいずれかに記載の方法。
57.  分析するステップが蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を含む、項目４１〜５６のいずれかに記載の方法。
58.  分析するステップが免疫組織化学を含む、項目４１〜５７のいずれかに記載の方法。
59.  分析するステップが分子分析を含む、項目４１〜５８のいずれかに記載の方法。
６０．  分子分析は、エピジェネティック分析、遺伝子分析、翻訳分析、および／または翻訳後分析から成る群から選択される、いずれか１つまたはそれを上回るものを含む、項目５９に記載の方法。
61.  分析するステップが細胞学を含む、項目４１〜６０のいずれかに記載の方法。
62.  分析するステップが肥満を示すバイオマーカを識別することを含む、項目４１〜６１のいずれかに記載の方法。
63.  分析するステップが肥満を示すバイオマーカを識別することを含む、項目４１〜６２のいずれかに記載の方法。
64.  分析するステップが細菌感染症を示すバイオマーカを識別することを含む、項目４１〜６３のいずれかに記載の方法。
65.  分析するステップが自閉症を示すバイオマーカを識別することを含む、項目４１〜６４のいずれかに記載の方法。
66.  分析するステップがアルツハイマー病を示すバイオマーカを識別することを含む、項目４１〜６５のいずれかに記載の方法。
67.  分析するステップが血液疾患を示すバイオマーカを識別することを含む、項目４１〜６６のいずれかに記載の方法。
68.  分析するステップが心血管疾患もしくは障害を示すバイオマーカを識別することを含む、項目４１〜６７のいずれかに記載の方法。
69.  分析するステップが糖尿病を示すバイオマーカを識別することを含む、項目４１〜６８のいずれかに記載の方法。
70.  分析するステップが不安定プラークを示すバイオマーカを識別することを含む、項目４１〜６９のいずれかに記載の方法。
71.  分析するステップが潜伏結核感染を示すバイオマーカを識別することを含む、項目４１〜７０のいずれかに記載の方法。
72.  分析するステップが、保存溶液と接触させるステップの前のサンプルの抗原による処理によって放出された因子を識別することを含む、項目４１〜７０のいずれかに記載の方法。
７３．      抗原は、結核菌のペプチドを含み、因子は、インターフェロンガンマを含む、項目７２に記載の方法。
74.  分析するステップがＨＩＶ感染を示すバイオマーカを識別することを含む、項目４１〜７３のいずれかに記載の方法。
75.  分析するステップが、サンプル中の検出可能な抗体の存在に先立ってＨＩＶウイルス感染を識別することを含む、項目４１〜７４のいずれかに記載の方法。
76.  分析するステップがサンプル中の細胞内ＨＩＶウイルスを識別することを含む、項目４１〜７５のいずれかに記載の方法。
77.  分析するステップが、Ｔ細胞、随意に、ＣＤ４＋Ｔ細胞内のＨＩＶウイルスを識別することを含む、項目４１〜７６のいずれかに記載の方法。
78.  分析するステップが、随意に、ＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳを示す、免疫不全症を識別するために、ＣＤ４＋Ｔ細胞の量を査定することを含む、項目４１〜７７のいずれかに記載の方法。
79.  分析するステップが、（ｉ）ＣＯＰＤを示す、および／または（ｉｉ）ＡＣＯＳを示す、ならびに／もしくは（ｉｉｉ）ＣＯＰＤのＡＣＯＳ型と非ＡＣＯＳ型とを区別するためのバイオマーカを識別することを含む、項目４１〜７８のいずれかに記載の方法。
８０．  ＨＩＶ感染を診断する方法であって、
個体からの自然に発現された体液、随意に、唾液の保存されたサンプルを提供するステップと、
個体におけるＨＩＶ感染を診断するためにサンプル中の細胞内ＨＩＶウイルスを識別するステップと、
を含む、方法。
８１．  細胞内ＨＩＶウイルスを識別するステップは、サンプルのＴ細胞、随意に、ＣＤ４＋Ｔ細胞内のＨＩＶウイルスを識別するステップを含む、項目８０に記載の方法。
８２．  提供するステップは、自然に発現された体液の固定されたサンプルを提供するステップを含む、項目８１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
非限定的実施形態が、付随の図面を参照して、一例のみとして以下に説明される。
【００７８】
【図１】図１は、自然に発現された体液のサンプルの収集および処理のためのステップを図示する、概略フロー図である。
【００７９】
【図２】図２は、いくつかの実施形態による、０、１、２、および７日後の室温で化学的固定溶液中に貯蔵されたサンプル内のＤＮＡ収率の時間経過、ならびに各サンプルからのＴ細胞から抽出されたＤＮＡを示す。
【００８０】
【図３】図３は、保存溶液によって接触された唾液サンプル中の細胞の保存を実証するグラフである。
【００８１】
【図４】図４は、第１の例示的サンプル収集デバイスを通る概略断面図である。
【００８２】
【図５】図５は、第２の例示的サンプル収集デバイスを通る概略断面図である。
【００８３】
【図６】図６は、血液からのＴ細胞の収率と比較した、１ｍｌの開始材料（例えば、体液のサンプル）あたりの抽出されたＴ細胞の相対収率を図示する、チャートである。
【００８４】
【図７】図７は、いくつかの実施形態による、１ｍｌの唾液あたりの単離されたＴ細胞ＤＮＡのマイクログラム量の唾液用量曲線を示す。
【００８５】
【図８】図８は、添加される保存組成物の体積に依存する、単位体積あたりのサンプル濃度の変動を図示する概略グラフである（付属書類１）
【００８６】
サンプル収集、保存、単離、および分析のデバイス、溶液、および方法は、以下の図面、発明を実施するための形態、および請求項を踏まえて、さらに理解されるであろう。種々の図面中の類似参照記号は、類似要素を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
（実施形態の詳細な説明）
いくつかの実施形態では、本開示が仕上げ得る、国際公開第ＷＯ２０１２／１７７６５６号および／または国際公開第ＷＯ２０１５／１１２４９６号の開示が参照される。
【００８８】
いくつかの実施形態では、唾液、痰、肺吸引物の流体、口腔液、および／または尿等の１つまたはそれを上回る自然に発現された体液中の細胞ならびに／もしくは細胞外成分（例えば、タンパク質、ウイルス、浮遊性ＤＮＡ、および／または浮遊性ＲＮＡのうちのいずれか）を保存するための溶液が開示される。溶液は、細胞型および／または細胞外成分へのさらなる分離、ならびに体液中の細胞および／または細胞外成分の貯蔵を可能にする下流分析のために有益であり得る。細胞は、それらの抗原性および細胞構造を保持するように保存されてもよい。細胞外成分は、劣化および分解を回避するように保存されてもよい。タンパク質は、それらの生物反応性を保存することなく保存されてもよい。
【００８９】
いくつかの実施形態では、溶液は、随意に、家庭での使用に好適であるか、または少なくとも医学研究室を訪問する必要がない、サンプル収集デバイスと組み合わせて開示される。いくつかの実施形態では、溶液は、収集された体液サンプルと混合することに先立って「供給されたままの」状態で参照される。いくつかの実施形態では、溶液は、収集された体液サンプルと混合した後のその状態で参照される。
【００９０】
図１を参照すると、自然に発現された体液を収集して処理するための技法が図示される。本プロセスは、最も困難な例として、唾液を含有する口腔液に関して説明される。しかしながら、同一の原理が他の自然に発現された体液の収集および処理に適用され得ることが理解され得る。唾液の言及は、そのような自然に発現された体液、具体的には、口腔液全般、および／または痰、ならびに／もしくは肺吸引物の流体、および／または尿のうちのいずれか他のものによって置換されてもよい。
【００９１】
図１を参照すると、第１のステップ３０は、ドナーが、流体、例えば、唾液のサンプルを提供することであってもよい。提供は、収集デバイスの中へ唾を吐くことによって、または綿棒を使用することによる等の任意の他の技法により唾液を収集することによって、達成されてもよい。
【００９２】
第２のステップ３２は、収集された唾液サンプル中の全細胞を保存するため、および／または収集された唾液サンプル中の細胞外成分を保存するための保存溶液と、収集された唾液サンプルを接触させる、ならびに／もしくは混合することであってもよい。細胞および／または細胞外成分を保存するための溶液は、細胞型および／または細胞外成分へのさらなる分離、ならびに下流分析のために有益であり得る。本明細書で以前に議論されたように、唾液は、着目細胞にとって、かつ細胞外成分にとって生理学的に厳しい環境を提示する。着目細胞は、サンプルが収集される数分以内に損傷されて破壊され始め得る。いくつかの実施形態では、ステップ３２は、収集されたサンプル中の無傷細胞および保存された細胞外成分の収率に対する唾液の悪影響を回避するか、または低減させるために、ステップ３０の比較的すぐ後に実行されてもよい。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「細胞を保存する」とは、細胞がそれらの抗原に基づいて精製または濃縮されることができるように、細胞が、それらの抗原が分解させられることを防止することと、細胞エピゲノムの変化を防止することとを指す。「エピゲノム」とは、ＤＮＡまたはＤＮＡに結合したタンパク質の共有結合修飾による、ゲノムＤＮＡの変化の状態もしくはパターンを指す。そのような改変の例は、ＣｐＧジヌクレオチド中のシトシンの第５位におけるメチル化、ヒストンのリシン残基のアセチル化、および基礎的ＤＮＡ配列の変化に起因しない他の遺伝的または非遺伝的変化を含む。加えて、または代替として、「細胞を保存すること」は、唾液中の細胞が貯蔵中にそれらの抗原性および細胞構造を保持することを意味し得る。
【００９４】
本明細書で使用される場合、保存の「有効性」という用語は、元の体液サンプル中の少なくとも所定の割合の細胞が保存されることを意味し得る。所定の割合は、随意に、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、随意に、少なくとも７５％、随意に、少なくとも８０％、随意に、少なくとも８５％、随意に、少なくとも９０％、随意に、少なくとも９５％であり得る。（保存溶液との元のサンプルの混合が混合物の正味体積を増加させ、それによって、細胞濃度を希釈するため、単位体積あたりの細胞濃度は、元の体液サンプルと比較して低減させられ得る。）
【００９５】
加えて、または代替として、有効性は、単位体積あたりの細胞（例えば、ある型の、例えば、Ｔ細胞）の数を指し得る。例えば、（例えば、そのような）細胞の数は、１ｍｌあたり少なくとも約５０００、随意に、１ｍｌあたり少なくとも約１００００、随意に、１ｍｌあたり少なくとも約１２０００であり得る。
【００９６】
加えて、または代替として、タンパク質等の細胞外成分を保存することは、タンパク質がより小さい断片（例えば、ペプチド）に分解もしくは切断されることを防止することを意味する。タンパク質を保存することはまた、タンパク質を、保存に先立ってタンパク質が生物学的に結合され得たあらゆる材料に、および／または保存後にそれらが結合する近接近している他の材料に結合することによって、タンパク質を固定化することを含んでもよい。タンパク質の生物反応性は、例えば、質量分光法によって、タンパク質が以降の下流ステップで分析されることを可能にするように、中和されてもよい。
【００９７】
いくつかの実施形態では、第２のステップ３２に先立って、唾液を前処理剤、例えば、溶液、粉末、または固体作用物質と混合するように、随意の前処理ステップ４２が実行されてもよい。前処理は、いくつかの実施形態では、生物学的作用物質または非生物学的作用物質、もしくは生物学的作用物質および非生物学的作用物質の混合物であってもよい。前処理剤は、いくつかの実施形態では、唾液中の特定の１つまたは複数の因子と反応する、および／またはその放出を刺激する、ならびに／もしくは別様にその産生を引き起こすために使用されてもよい。加えて、または代替として、前処理剤は、唾液の生物反応的応答を刺激してもよい。
【００９８】
そのような生物反応的応答は、例えば、固定によって、唾液が保存された後に、あまり効果的ではない場合がある（または全く効果的ではない場合がある）。
【００９９】
前処理剤の一例は、唾液が関連疾患および／または感染症に感染した個体に由来するかどうかを判定するように、リンパ球等の細胞からの特定の因子の放出を刺激するか、もしくは引き起こすための抗原であってもよい。例えば、前処理剤は、ペプチドを含んでもよい。以降で説明される潜伏結核感染（ＬＴＢＩ）の検出で使用される１つの具体的な例では、ペプチドは、リンパ球によって認識され、唾液がＬＴＢＩに感染した個体に由来する場合に、インターフェロンガンマ等の因子の放出の形態で生物応答を刺激する、結核菌からのペプチドであってもよい。前処理剤は、随意に、１つより多くの抗原および／または１つより多くのペプチドを含んでもよい。
【０１００】
本開示のいくつかの実施形態は、（例えば、体液と混合することに先立って）血液に対して高張性であるそのような保存溶液を提供する。
【０１０１】
いかなる具体的理論にも拘束されることを所望するわけではないが、本明細書において前述で説明されるように、唾液の張度（またはオスモル濃度）が、唾液を細胞生存のために厳しい環境にする有意な要因であり得ると考えられる。唾液、特に、供与されたサンプル中で収集される唾液は、血液に対して低張性であることが分かっている。個体の唾液の中に入る血液からの細胞は、流体を細胞に引き込む破壊的浸透圧を受け、細胞を膨張させ、損傷させ、最終的に破裂させる。これは、唾液中で損傷されずに生存することが報告されている少数の細胞を説明し得る。これはまた、例えば、ＨＩＶが他の体液によってよりも唾液によってあまり伝染しない理由も説明し得、血液から唾液の中へ入るＨＩＶ感染細胞を含む細胞は、浸透の結果として細胞が破裂するため、長く生存することができない。類似の破壊および細胞損傷が、一般に、血液から唾液の中へ入る細胞に付与される。身体は、高速の血流を唾液腺に提供し、口の中で死滅する細胞の補充を可能にすることによって、そのような細胞破壊を補償する。唾液腺への血流は、弛緩筋状態の骨格筋への血流を約１００倍上回ると報告されている。運動する骨格筋への血流は、最大で約１０倍増加するが、その時でさえ、唾液腺への血流は依然として、運動する筋肉の血流の優に約１０倍を超える。これは、唾液の厳しい環境および唾液中の急速な細胞死へのさらなる証拠を提供し、したがって、細胞の一定の補充を必要とする。
【０１０２】
血液に対して高張性である保存溶液を提供することによって、この溶液は、唾液サンプルと混合させられたときに、唾液の低張度を中和し、等張性環境に向かって張度を平衡化することができる。そのような環境は、収集されたサンプル中の細胞に対する浸透圧を回避するか、または少なくとも有意に低減させることができ、それによって、保存のために細胞が損傷されずに生存することを可能にし、分析または診断のために保存された細胞の有意に向上した収率を可能にする。
【０１０３】
等張性溶液を取得することは、唾液サンプルの保存（例えば、固定）の間だけではなく、保存された細胞が処理または分析を待って貯蔵される期間の間でも有利であり得る。例えば、保存および／または固定された細胞は、細胞壁を通した流体移動に影響を及ぼす浸透圧条件に応じて、細胞を膨張させて破裂させ、ならびに／もしくは圧潰させて内破させ得る、浸透圧効果を依然として受けやすくあり得る。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、自然に発現された体液は、例えば、自然に低張性であるタイプであってもよいが、（例えば、唾液を含有する）口腔液に限定されず、特に、唾液自体に限定されない。
【０１０５】
本明細書で開示される、いくつかの実施形態では、（例えば、体液と混合することに先立った）溶液のオスモル濃度は、随意に、約または少なくとも（いずれの場合も）２４０ｍＯｓｍ／Ｌの「ｎ」倍であるものとして規定され得、「ｎ」は、２〜１５を含めた自然数である。例えば、「ｎ」は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１３、１４、または１５であってもよい。
【０１０６】
本明細書で開示される、いくつかの実施形態では、（例えば、体液と混合することに先立った）溶液のオスモル濃度は、随意に、約または少なくとも（いずれの場合も）２７５ｍＯｓｍ／Ｌの「ｎ」倍であるものとして規定され得、「ｎ」は、２〜１５を含めた自然数である。例えば、「ｎ」は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１３、１４、または１５であってもよい。
【０１０７】
本明細書で開示される、いくつかの実施形態では、（例えば、体液と混合することに先立った）溶液のオスモル濃度は、随意に、約または少なくとも（いずれの場合も）２９０ｍＯｓｍ／Ｌの「ｎ」倍であるものとして規定され得、「ｎ」は、２〜１５を含めた自然数である。例えば、「ｎ」は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１３、１４、または１５であってもよい。
【０１０８】
加えて、または代替として、（例えば、体液と混合することに先立った）溶液における凝集物塩イオンオスモル濃度は、随意に、約または少なくとも（いずれの場合も）２９０ｍＯｓｍ／Ｌの「ｎ」倍であり得、「ｎ」は、２〜１５を含めた自然数である。例えば、「ｎ」は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５であってもよい。
【０１０９】
本明細書で開示される、いくつかの実施形態では、（例えば、体液と混合することに先立った）血液と比べた溶液のオスモル濃度は、随意に、約または少なくとも（いずれの場合も）血液の「ｎ」倍であるものとして規定され得、「ｎ」は、２〜１５を含めた自然数である。例えば、「ｎ」は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５であってもよい。
【０１１０】
加えて、または代替として、（例えば、体液と混合することに先立った）溶液における塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の濃度は、随意に、約または少なくとも（いずれの場合も）濃度「ｍ」の「ｎ」倍であり得、「ｍ」は、１リットル当たり８．０〜９．０グラムを含めたの範囲の値であり、「ｎ」は、２〜１５を含めた自然数である。例えば、「ｎ」は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５であってもよい。
【０１１１】
加えて、または代替として、溶液は、随意に、約または少なくとも（いずれの場合も）血液等張ＰＢＳ濃度の「ｎ」倍である（例えば、体液と混合することに先立った）濃度のリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）を含み得、「ｎ」は、２〜１５を含めた自然数である。例えば、「ｎ」は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５であってもよい。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、（低張性の自然に発現された体液のサンプルと混合することに先立った）溶液は、体液の収集されたサンプルと混合する際に、溶液と体液との一緒の混合物が等張性であるように、高張度を有し、張度は、血液に対して規定される。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、（唾液サンプルと混合することに先立った）溶液は、収集された唾液サンプルと混合する際に、溶液と唾液の一緒の混合物が等張性であるように、張度を有し、張度は、血液に対して規定される。
【０１１４】
保存溶液は、限定されないが、パラホルムアルデヒド等の少なくとも１つの化学固定剤と、少なくとも１つのプロテアーゼ阻害剤とを含み得る。いくつかの実施形態では、溶液はさらに、少なくとも１つの抗菌剤、ヒトおよび／または他の動物種からの血清タンパク質のうちの１つ以上のものを含み得る。溶液は、約６．４〜約８．４、好ましくは、約７．２〜約７．６のｐＨで緩衝されることができる。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、以下の説明における作用物質の濃度は、サンプル保存溶液自体の濃度であり得る。体液に応じて、そして唾液の場合、溶液および体液のほぼ等しい体積が、ともに混合させられることができる。これは、好ましくは、体液からの細胞に、室温で少なくとも１週間にわたってそれらの抗原性およびＤＮＡを保持させる。
【０１１６】
本開示のいくつかの実施形態では、デバイス内で保持され、展開される保存溶液の体積は、例えば、尿中の細胞の保存のために関連する、約１００〜約５００ｍｌであり得る。したがって、尿のための保存溶液は、尿に対して約１０倍（１０ｘ）濃縮溶液〜１．５倍（１．５ｘ）溶液のいずれかであり得る。
【０１１７】
いくつかの実施形態による「化学固定剤」は、細胞が分解に抵抗するように、細胞成分を変化させるために使用される化学架橋結合化合物である。化学固定剤はまた、ヒストンおよび他のＤＮＡ結合タンパク質をＤＮＡに架橋結合する役割を果たすこともできる。そのような作用物質は、当技術分野で公知であり、限定ではないが、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、ホルマリン、アルデヒド、アルコール、酸化剤、水銀剤、ピクリン酸塩、ヘペスグルタミン酸緩衝液介在有機溶媒保護効果（ＨＯＰＥ）、Ｚａｍｂｏｎｉｓ固定剤等の固定剤の組み合わせ、アルデヒドの組み合わせ、および合成架橋結合試薬を含み得る。いくつかの実施形態では、化学固定剤は、パラホルムアルデヒドである。いくつかの実施形態では、化学固定剤は、約１％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する。
【０１１８】
タンパク質等の細胞外成分の化学的固定は、タンパク質を他の物質、例えば、他のタンパク質またはＤＮＡと架橋することによって、これらタンパク質を結合することができる。例えば、他の物質に生物学的に結合されたタンパク質は、架橋によって、同じ物質とより堅く化学的に結合され得る。他の材料と単に近接していたタンパク質は、架橋によってその物質に結合されてもよい。架橋は、より小さいセグメントへの望ましくない分解に対してタンパク質を補強することによって（例えば、ペプチドに分解されるのを避ける）、タンパク質を保存し得る。
【０１１９】
例えば、パラホルムアルデヒドのアルデヒド基は、タンパク質の窒素および他の原子と反応する。本反応は、接近しているタンパク質の間にメチレン橋の形成を引き起こす。これは、ＤＮＡを「捕捉する」（例えば、固定が、固定剤との反応に起因して、ＤＮＡに結合されたタンパク質（例えば、転写因子）を定位置で固定化させる）。ＤＮＡがこれらのメチレン橋の間で捕捉され得るだけではなく、脂質、炭水化物、ＤＮＡ、およびＲＮＡも捕捉され得る。
【０１２０】
架橋は、少なくとも部分的に可逆的であり得る。架橋を逆転させることは、例えば、タンパク質等の細胞外成分の分析のための、例えば、以降の下流処理におけるステップであり得る。例えば、細菌タンパク質およびヒトタンパク質は、相互に、または浮遊性ＤＮＡと架橋してもよい。以降に下流で架橋結合を逆転させることが、分析を可能にする。
【０１２１】
体液中に存在するプロテアーゼによる分解から細胞を保護するために、いくつかの実施形態では、溶液は、少なくとも１つのプロテアーゼ阻害剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤は、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、メタロプロテアーゼ阻害剤、セリンプロテアーゼ阻害剤（例えば、セルピン）、トレオニンプロテアーゼ阻害剤、トリプシン阻害剤、およびクニッツＳＴＩプロテアーゼ阻害剤から成る群から選択されることができる。いくつかの具体的な非限定的実施例は、アジ化ナトリウム、ＰＭＳＦ、アプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチン、天然または合成プロテイナーゼ阻害剤、およびプロテアーゼ阻害剤のカクテル混合物を含む。これらの阻害剤の好適な濃度は、限定ではないが、約０．１〜１ｍＭにおけるＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）セリンプロテアーゼ、約１ｍＭにおけるベンズアミジンセリンプロテアーゼ、約１μｇ／ｍｌにおけるペプスタチンＡ酸プロテアーゼ、約１μｇ／ｍｌにおけるロイペプチンチオールプロテアーゼ、約５μｇ／ｍｌにおけるアプロチニンセリンプロテアーゼ、および約１μｇ／ｍｌにおけるアンチパインチオールプロテアーゼを含むことができる。ある実施形態では、プロテアーゼ阻害剤は、約０．０１％（ｗ／ｖ）の濃度におけるアジ化ナトリウムである。
【０１２２】
微生物汚染からの細胞への損傷を防止するために、溶液のいくつかの実施形態は、少なくとも１つの抗菌剤を含む。好適な抗菌剤は、限定ではないが、抗菌性または抗真菌性抗生物質を含む。
【０１２３】
細胞構造の保存は、随意に、いくつかの実施形態では溶液に添加され得る、血清タンパク質の存在によって増進される。加えて、血清タンパク質は、細胞と溶液との間の浸透圧差を中和するために使用され得る。これらは、ヒトまたは他の動物源に由来し得る。ある場合には、全血清が使用され得る。例えば、ウシ胎仔血清が、いくつかの実施形態では約１％（ｖ／ｖ）で添加され得る。
【０１２４】
上記のうちのいずれかに加えて、または代替として、いくつかの実施形態では、溶液は、実質的に洗剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を含まない。洗剤は、時として、細胞材料を通した透過を促進するために、（例えば、蛍光染料と結合された抗体）生物学的サンプルの特定の処理で使用されるが、本明細書では、増加した細胞損傷および細胞損失を犠牲にすると考えられる。本開示のいくつかの実施形態によると、洗剤の存在を回避することは、保存された細胞の数を増進することができ、これは、特定の着目細胞の唾液サンプル中の比較的わずかな量を念頭に置いて、特に有利であり得る。
【０１２５】
本開示による溶液は、前述の実施形態の任意の組み合わせを含み得る。
【０１２６】
本開示のいくつかの実施形態では、１つ以上の体液中の細胞および／または細胞外成分を保存する方法が開示される。細胞および／または細胞外成分を保存する方法は、本開示による溶液と体液を接触させることを含むことができる。体液は、種々の細胞型および／または細胞外成分を含むことができ、体液中の細胞および／または細胞外成分は、本開示による溶液によって保存されることができる。本開示にとって重要ではないが、約１対１の溶液対体液の比が、典型的に使用される。
【０１２７】
以下の実施例は、体液中の細胞および／または細胞外成分を保存するための溶液および方法のいくつかの実施形態をさらに例証することを意図しており、本開示の範囲を限定すると解釈されるものではない。
【０１２８】
例えば、ｐＨ７．４のＰＢＳ、１％パラホルムアルデヒド、１％ＦＢＳ、および０．０１％ＮａＮ３の溶液が、唾液と１：１の比で添加されることができ、次いで、Ｔ細胞が、精製されてＤＮＡ抽出されることができる。そのようなプロセスの結果は、図２に示されている。これらの結果は、Ｔ細胞の抗原性およびＤＮＡの完全性が少なくとも１週間にわたって維持されたことを実証することができる。
【０１２９】
図３に示されるように、さらなる試験は、長期持続時間にわたって、高温でさえも、かつ長期保存期間後でさえも、唾液サンプル中のＴ細胞を保存することにおいて溶液の有効性を実証している。
【０１３０】
図３では、水平軸は、分析によって実証されるような１：１の比で保存溶液と混合させられた唾液サンプルの１ｍｌあたりのＴ細胞の数を（千単位で）表す。細胞濃度は、保存溶液との１：１混合の結果として、元の唾液サンプルと比較して効果的に半分にされる。
【０１３１】
第１の（最左）円柱は、サンプル収集および保存溶液との混合後に数時間にわたって室温で貯蔵された３つのサンプル中の細胞の数を示す。第１の円柱は、他のサンプル中の細胞数を査定するための基準の役割を果たす。
【０１３２】
第２、第３、および第４の円柱は、サンプル収集および保存溶液との混合後に、各々が１日、２日、および１ヶ月にわたって室温でそれぞれ貯蔵された、３つのサンプルの３つの群の中の細胞の数を比較する。第２から第３の円柱は、互いまたは第１の円柱との変動をほとんど示さない。
【０１３３】
第５、第６、第７、および第８の円柱は、サンプル収集および保存溶液との混合後に３ヶ月の期間にわたって各々が貯蔵され、それぞれ、４℃、室温、３０℃、および４０℃で保たれた、１０個のサンプルの群の中の細胞の数を比較する。試験が長期保存に焦点を合わせられたため、（３つのサンプルの代わりに）１０個のサンプルが使用された。第５から第８の円柱は、互いまたは第１の円柱との変動をほとんど示さない。
【０１３４】
最後の円柱は、１０個のサンプルのサンプル群を使用して、および４ヶ月にわたって貯蔵された（使用前保存期間）保存溶液を使用して、第２の円柱について試験を繰り返す。上記のように、試験が長期保存期間を実証することに焦点を合わせられたため、（３つのサンプルの代わりに）１０個のサンプルが使用された。
【０１３５】
グラフは、保存溶液が、長期持続時間にわたって、広範囲の温度条件にわたって、かつ長期保存期間後でさえも、唾液中のＴ細胞を保存するのに極めて効果的であることを図示する。溶液は、他のタイプの細胞のための類似または対応する保存能力を有し得る。異なる円柱における細胞数の間の偏差は、少なくとも、サンプルを提供する異なる人々および／または同一の個対からでも異なるサンプルからの細胞数の通常の差によって説明されることができる。１ｍｌあたりの細胞の数はまた、下流細胞分析を可能にするために著しく十分である。
【０１３６】
再度、図１を参照すると、ステップ３０および３２、ならびに随意のステップ４２は、任意の好適な装置またはデバイスを使用して実行されてもよい。単純な技法では、ステップ３２および／またはステップ４２は、保存溶液ならびに／もしくは前処理剤を含有する別個のコンテナを開くこと、保存溶液ならびに／もしくは前処理剤を収集されたサンプルに手動で添加すること、および／または溶液を収集されたサンプルと手動で混合することによって、実行されてもよい。しかしながら、いくつかの実施形態では、ステップ３０および３２、随意に、ステップ４２は、図４または５に図示される専用サンプル収集デバイス１０を使用して、（３４で）ともに実行されてもよい。デバイス１０は、家庭での使用に好適であり得るか、または少なくとも研究室を訪問する必要がない、タイプであってもよい。サンプル収集デバイス１０は、例えば、ユーザが自然に発現された体液のサンプルを提供するために、携帯用であり得るか、そして／または（例えば、郵便配達もしくは宅配を介して）家にいるユーザに提供されてもよい。代替として、サンプル収集デバイス１０はまた、研究室または病院での使用のために便利であり得る。
【０１３７】
図４および５は、収集デバイス１０の２つの代替実施例を図示する。デバイス１０は、概して、口１８を有し、口１８を通してデバイスに導入される自然に発現された体液のための収集領域２０を画定する、第１の本体（例えば、管）１６を備えてもよい。デバイス１０はさらに、提供されたサンプルが導入された後にデバイス１０を密閉するように、口１８に取り付け可能であるか、またはその上の第２の本体（例えば、密封装置）２２を備えてもよい。保存溶液１２および／または前処理剤は、随意に、デバイスの少なくとも１つの内部チャンバ１４の中に貯蔵され、例えば、ユーザがデバイスを密閉するか、またはデバイス１０の特定の他の操作を行うときに、収集された体液サンプルと混合するように放出されてもよい。図４の実施例では、保存溶液１２を含有するチャンバ１４は、第２の本体（例えば、密封装置）２２の中に提供される。図５の実施例では、保存溶液１２を含有するチャンバ１４は、第１の本体（例えば、管）１６の中に提供される。いずれの実施例でも、チャンバ１４は、収集領域２０と連通するために、機構（２４で概略的に示される）によって開放されるように構成される。開放機構２４は、第１の本体（例えば、管）１６への第２の本体（例えば、密封装置）２２の嵌合、またはデバイス１０の特定の他の手動操作に応答し得る。内部閉鎖またはキャップの解放、タップの開放、壊れやすい壁の断裂、内部カバーの除去もしくは変位、キャップまたはナットの相対的回転から選択される、１つまたはそれを上回るものを含むが、それに限定されない、種々の機構２４が構想される。
【０１３８】
図示される実施例では、例えば、保存溶液用の単一のチャンバ１４のみが図示されている。所望に応じて、さらなるチャンバ（図示せず）が、使用される場合、随意の前処理剤のために提供されてもよい。さらなるチャンバは、上記の開放機構または第２の開放機構によって開放されるように構成されてもよい。さらなるチャンバは、例えば、保存溶液を含有するチャンバの前に開放されてもよい。いくつかの実施形態では、逐次的開放機構が、前処理剤が最初に放出された後のみに保存溶液を放出するように構成されてもよい。
【０１３９】
随意に、デバイス１０および開放機構２４の例示的構造のさらなる詳細が、参照することによって本明細書に組み込まれる前述の国際公開第ＷＯ２０１２／１７７６５６号で提供される。
【０１４０】
デバイス１０は、自然に発現された体液の所定のサンプル体積「Ｖｓ」の収集のために構成されてもよい。本デバイスは、例えば、所定のサンプル体積Ｖｓが達成されたときを示すように、視覚充填スケールまたは充填線（例えば、２６で示される）もしくは他の印を含んでもよい。いくつかの実施形態では、サンプル収集空間は、所定の体積Ｖｓに等しいサイズを有してもよいか、またはサンプル収集空間は、体積がより大きくてもよい。一例のみとして、所定の体積Ｖｓは、いくつかの実施形態では、少なくとも約１ｍｌ、または少なくとも約２ｍｌ、または少なくとも約３ｍｌ、または少なくとも約４ｍｌ、または少なくとも約５ｍｌ、またはより多くであり得る。一例のみとして、所定の体積Ｖｓは、いくつかの実施形態では、約５ｍｌ以下、または約４ｍｌ以下、または約３ｍｌ以下、または約２ｍｌ以下、または約１ｍｌ以下であり得る。一例のみとして、いくつかの実施形態では、所定の体積Ｖｓは、いくつかの実施形態では、約１ｍｌ〜約５ｍｌ、随意に、約１ｍｌ〜約４ｍｌ，随意に、約１ｍｌ〜約３ｍｌ，随意に、約１ｍｌ〜約２ｍｌであり得る。一例のみとして、所定の体積Ｖｓは、いくつかの実施形態では、約１ｍｌ、または約２ｍｌ、または約３ｍｌ、または約４ｍｌ、または約５ｍｌであり得る。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、保存溶液１２の体積「Ｖｃ」は、所定のサンプル体積Ｖｓより実質的に大きくなくてもよい、または随意に、それより小さくてもよい。保存溶液体積Ｖｃは、チャンバ１４を充填するためにチャンバ１４の内部空間と同一であってもよいか、または保存溶液体積Ｖｃは、より小さくあってもよく、チャンバ１４を部分的に充填する。
【０１４２】
保存溶液体積Ｖｃを所定のサンプル収集体積Ｖｓより実質的に大きくしないか、または随意に、それより小さくすることによって、保存溶液１２を収集されたサンプルと混合するときの体積増加は、等しく小さくあり得る。体積増加は、単位体積あたりの細胞濃度に関してサンプルの希釈と等価であり得る。
【０１４３】
再度、図１を参照すると、ステップ３６では、収集されたサンプルは、（随意に、仲介人を介して）処理のために、貯蔵され、そして／または研究室に輸送されてもよい。例えば、家庭で提供されたサンプルの場合、収集デバイス１０は、宅配または郵便サービスを介して研究室に、もしくは以降の輸送のために仲介人に発送されてもよい。研究室による分析に先立った輸送および／または貯蔵のための時間は、数分、数時間、数日、数週間、もしくは数ヶ月にさえ及んでもよい。長期に、かつ広範囲の温度にわたって、体液サンプル中の全細胞および／または細胞外成分を安定させて保存する保存溶液の能力は、患者の血液をサンプリングする実行可能な代替案として、広範囲の分析および診断ツールが自然に発現された体液を処理するために使用されることを可能にする。また、希少な、すなわち、わずかな数の細胞を保存する能力を含む、サンプル中の保存された細胞の収率、および細胞外成分の収率は、新しい医学分析、診断、および処置監視用途のために自然に発現された体液を使用することの機会を与える。
【０１４４】
随意のステップ３８では、保存されたサンプルは、細胞濃度を濃縮するように、および／または選択された細胞型を単離するように、ならびに／もしくは特定の細胞外成分（例えば、タンパク質、ウイルス、浮遊性ＤＮＡ、および／または浮遊性ＲＮＡのうちのいずれか）を分離するように、処理されてもよい。
【０１４５】
本開示のいくつかの実施形態では、化学的に固定された細胞および／または化学的に固定された細胞外成分を含む、唾液もしくは尿等の１つまたはそれを上回る体液のサンプルを提供し、随意に、体液サンプルを遠心分離する、方法が開示される。遠心分離することは、細菌および残渣を含む、細胞のペレットから、特定の細胞外成分（例えば、タンパク質、ウイルス、浮遊性ＤＮＡ、および／または浮遊性ＲＮＡのうちのいずれか）を分離してもよい。
【０１４６】
特定の着目物質に応じて、ペレットまたは液体細胞外成分のいずれか一方、もしくは両方が、さらに処理または分析されてもよい。
【０１４７】
例えば、本方法はさらに、ペレットの他の内容物から、リンパ球を含む白血球を濃縮するステップを含むことができる。加えて、特異的細胞が、細胞特異的マーカを標的にする磁気ビーズに結合された抗体を使用して、単離されてもよい。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、本開示は、体液（すなわち、唾液、尿など）から、特定のタイプの白血球（限定されないが、特にリンパ球を含む）を単離する方法であって、例えば、以下のうちの１つ以上のもの（およびいくつかの実施形態では、以下のステップのうちのいくつかまたは全て）を含む：化学的に固定された細胞を含むサンプル体液を提供するステップ、随意に、細胞を含むペレットを得るように体液サンプルを遠心分離するステップ、随意に、緩衝液中にペレットを再懸濁させるステップ、（リンパ球を含む）白血球型の混合物の層を得るように、再懸濁したペレットに密度勾配分離を受けさせるステップ、特定のタイプの白血球上で見出されるエピトープのための具体的結合剤を含む溶液と細胞型の混合物を接触させるステップ、白血球型の混合物から（リンパ球を含む）特定のタイプの白血球を分離するステップ。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、特異的結合剤は、特定のタイプの白血球上で見出されるエピトープに特異的な抗体に結合される磁気ビーズを含むことができ、分離するステップは、白血球型の混合物から特定のタイプの白血球（リンパ球を含む）を磁気により分離するステップを含んでもよいが、相互から細胞型を分離するための任意の方法（および対応するシステム／デバイス）が、本開示の範囲内である。磁気分離は、そうするための１つの方法にすぎない。
【０１５０】
細胞は、本開示による方法を受けることに先立って、化学的に固定されることができる。細胞は、例えば、唾液のサンプルを化学的固定溶液と接触させることによって、化学的に固定されることができる。これは、周囲温度で細胞を経時的に保存するために行われる。これはまた、ヒストン修飾および他のタンパク質−ＤＮＡ相互作用が堆積した体液サンプルから研究されることを可能にするため、エピゲノムの完全な研究を可能にすることもできる。ヒストンは、研究されるためにＤＮＡに化学的に固定されなければならない。固定がないと、ヒストンは、概して、ＤＮＡに結合されたままであることができず、タンパク質は、経時的に分解する。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、アジ化ナトリウムを含むことができ、緩衝液は、リン酸緩衝化食塩水と、アジ化ナトリウムとを含むことができる。いくつかの実施形態では、緩衝液はさらに、ウシ胎仔血清を含んでもよい。いくつかの実施形態では、緩衝液は、約７．２〜約７．６のｐＨである。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、細胞は、緩衝液中で１回洗浄される。これは、実践では、可溶性物質を除去し、唾液の場合、「頬」層（Ｄｏｓ−Ｓａｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ，２００９）として分類されているものを除去する。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、白血球の混合物は、分離することに先立って緩衝液中で１回またはそれを上回って洗浄される。これは、好ましくは、細胞型の混合物から任意の残存密度勾配溶液を除去するように行われる。
【０１５４】
本プロセスでは、抗体は、特定のタイプの白血球に結合し、したがって、特定のタイプの白血球を磁気ビーズに結合してもよい。次いで、特定のタイプの白血球は、磁気ビーズを磁場に配置すること、および特定のタイプの白血球の単離された細胞を取得するように任意の残存液体を除去することによって、任意の他の細胞型から分離されることができる。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、特定のタイプの白血球は、リンパ球であり得、リンパ球は、Ｔ細胞であってもよい。そのような実施形態では、使用される抗体は、Ｔ細胞に特異的な抗原（例えば、ＣＤ４である抗原）に特異的であり得る。いくつかの実施形態では、次いで、単離された血液細胞は、エピジェネティック分析に先立って等、さらなる処理に先立って、凍結させられてもよい。
【実施例】
【０１５６】
以下の実施例は、本開示の例示的な方法の実施形態をさらに例証することを意図し、本開示の範囲を限定することを意図しない。
（実施例１）
【０１５７】
実施例１：体液（例えば、唾液）からＴ細胞を単離する。唾液が収集され、唾液が保存溶液と混合させられる。次いで、細胞が遠心分離によってペレット化され、処理溶液が除去される。次いで、細胞は、約６ｍｌ緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、１％ＦＢＳ、０．０１％ＮａＮ３）中で再懸濁させられ、次いで、緩衝液中で１回洗浄され、再びペレット化される。ペレットは、約６ｍＬのＰＢＳ−１５  ＦＢＳ−０．０１％ＮａＮ３中で再懸濁させられ、１．０８２〜１．０７２ｇ／ｍｌのＦｉｃｏｌｌ＜登録商標＞（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する密度勾配遠心分離を受ける。白血球は、細菌、残渣、および任意の他の粒子状物質が管の底部でペレット化されている間に、多糖類と緩衝液との界面に遠心分離される。細胞は、管から抽出され、新しい管に入れられる。次いで、細胞は、ハンクス平衡食塩水中で１回洗浄され、次いで、界面から白血球を抽出する間に取り込まれるかも知れない残存密度勾配溶液を除去するために、ＰＢＳ−ＮａＮ３−ＦＢＳ緩衝液で１回洗浄される。
【０１５８】
ここで、サンプルは、最小限の細菌および最小限の残渣とともに高度に濃縮された白血球を含む。本ステップはまた、上皮細胞等の他の細胞型を大いに減少させることもできる。次いで、細胞は、磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））に結合されたＣＤ４を標的にする抗体と緩衝液（ＰＢＳ−ＮａＮ３−ＦＢＳ）中でインキュベートされることができる。次いで、サンプルは、磁場に配置されることができ、ビーズが管の側面に運ばれ、液体が除去される。液体は、抗体を通じてビーズに結合されない全てを含有してもよい。Ｔ細胞は、抗体に結合されることができ、磁場に起因して除去されることができない。ビーズおよび付着細胞は、唾液または尿等の体液中で見出される他の細胞、細菌、もしくは他の残渣の任意の非特異的または弱い結合を排除するように、緩衝液中で洗浄されることができる。次いで、細胞は、以降の下流処理および分析のために凍結させられることができる。Ｔ細胞の単離は、光学顕微鏡検査によって確認されることができる（Ｔ細胞は、上皮細胞および細菌と比較して非常に明確である）（図６参照）。加えて、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８に対する抗体を使用するフローサイトメトリならびにＦ．Ａ．Ｃ．Ｓ．分析が、単離された細胞の視覚査定を確認することができる。次いで、Ｔ細胞は、下流実験のための十分な数の細胞について、唾液または尿等の体液の量を判定するために、体液の単位（ｍｌ）あたりのＴ細胞の数を判定するように、体液から滴定されてもよい（図６および７参照）。単離された細胞は、分解がなく、下流使用のために適切なＤＮＡを有することが示され得る（図２参照）。
【０１５９】
再度、図１を参照すると、ステップ４０では、着目サンプル（随意に、濃縮されるか、もしくはステップ３８から分離および／または単離された細胞型を伴う）は、分析または診断のためにさらに処理される。上記のように、ステップ４０は、分離された細胞について、または分離された細胞外成分について実行されてもよい。随意に、収集されたサンプルは、全細胞サンプルおよび細胞外成分サンプルの両方を提供してもよく、ステップ４０は、それぞれについて別個に行われてもよい。ステップ４０は、それぞれについて同一もしくは類似分析を含んでもよいか、または異なる分析を含んでもよい。
【０１６０】
希少な、すなわち、わずかな数の細胞および／または細胞外成分の使用可能な収率を提供するために保存される、自然に発現された体液のサンプルを取得する能力は、患者の病状の診断ならびに／もしくは監視のために、採血への代替的技法を提供し得る。細胞および細胞外分析は、コンパニオン診断として、および／またはコンパニオンバリデータとして使用されてもよい。
【０１６１】
血液サンプル中の特異的細胞型または他のバイオマーカを識別するために使用される技法もまた、自然に発現された体液中のそのような細胞または他のバイオマーカを識別するために（修正を伴って、または伴わずにのいずれかで）使用されてもよい。
【０１６２】
一例のみとして、細胞および／または細胞外成分は、以下のうちの１つまたはそれを上回るものを診断する、示す、識別する、および／または監視するよう分析であり得る。
（ａ）  疾患の退行または攻撃性を識別するマーカ（細胞もしくは分子）を伴う細胞。疾患は、例えば、癌（随意に、限定されないが白血病）であり得る。痰であるか、または痰を含有する流体の場合、疾患は、肺癌、肺癌腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺炎、もしくは結核のうちのいずれか１つまたはそれを上回るものであり得る。
（ｂ）  出生前細胞。
（ｃ）  （例えば、転移性または別様の）循環腫瘍細胞。
（ｄ）  正常な細胞の希少な形態、例えば、以下のうちのいずれか１つまたはそれを上回るもの：
−骨髄異形成症候群のような未熟細胞
−疾患を示し、口から生じない上皮細胞亜型
−例えば（限定されないが）、血液疾患の診断のためのランゲルハンス細胞
（ｅ）  肥満を示す、１つまたはそれを上回るバイオマーカ。（下で考察される）
（ｆ）  （抗生物質の不必要かつ不適切な処方を回避するために有用な）細菌感染症対ウイルス感染症を示す、１つまたはそれを上回るバイオマーカ。例えば、
・  ＴＲＡＩＬタンパク質（ＴＮＦ関連アポトーシス誘発リガンド）は、感染症（細菌対ウイルス）を判別するために使用されることができる。これは、抗生物質耐性菌に対抗するために非常に有用である。
・  ＴＲＡＩＬタンパク質は、殆どの細胞によって分泌され、リガンドとしてアポトーシスのプロセスを誘発する、サイトカインである。
（ｇ）  自閉症を示す、１つまたはそれを上回るバイオマーカ。例えば、
オキシトシン−親和結合の確立に影響を及ぼす。負の影響として、ＡＳＤ中のオキシトシンは、５−ＨＴと負に相関する。オキシトシン受容体をコードするＯＸＴＲ遺伝子の多型は、自閉症、対結合（ｐａｉｒ−ｃｏｎｄｉｎｇ）、社会的行動、情動的影響、およびＡＳＤ形質と関連付けられる。
メラトニン−２４時間周期および季節リズム、ならびに免疫応答および神経可塑性の変調で良好に役割を果たすように確立されている。メラトニンは、酵素、すなわち、アセチルセロトニンメチルトランスフェラーゼ（ＡＳＭＴ）を介して、Ｎ−アセチルセロトニン、次いで、メラトニンに変換される、５−ＨＴから合成される。プロセスは、日中／光によって阻害される。ＡＳＤ患者の血漿中の低いレベルのメラトニンは、本ＡＳＭＴ酵素の欠如に起因すると考えられる（エピジェネティック（ＤＮＡ、タンパク質、およびＲＮＡ適用可能分析））。ＡＳＭＴ遺伝子バリアントは、ＡＳＤと関連付けられる。同じ遺伝子はまた、４３７人の対照のいずれにも認められなかったのに対して、３９８（１．５１％）人のＡＳＤ個体のうちの６人において破壊的コーディング変異を宿している。
自閉症の免疫学的バイオマーカ（細胞外および細胞内）：
−上昇したＩＬ−１（インターロイキン１）
−上昇したＩＦＮ−γ（インターフェロンガンマ）
−抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−１０（インターロイキン１０）の過剰産生
−増加したネイティブおよび減少した分化（すなわち、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）Ｔ細胞数を伴うＴリンパ球の異常な成熟（ｐｏｓｔ−ｔｈｙｍｉｃ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）
（ｈ）  アルツハイマー病を示す、１つまたはそれを上回るバイオマーカ。
（ｉ）  血液（ｈｅｔｏｔｏｌｏｇｉｃａｌ）疾患を示す、１つまたはそれを上回るバイオマーカ。
（ｊ）  心血管疾患もしくは障害を示す、１つまたはそれを上回るバイオマーカ。
（ｋ）  糖尿病を示す、１つまたはそれを上回るバイオマーカ。
（ｌ）  例えば、免疫細胞活性に関する、不安定プラーク（ｐｌａｃｋ）を示す１つまたはそれを上回るバイオマーカ、および／もしくは免疫細胞バイオマーカ。
（ｍ）  疾患または感染症の休眠および／または潜伏ならびに／もしくは隠密形態を示す、１つまたはそれを上回るバイオマーカならびに／もしくは１つまたはそれを上回る放出された因子。例えば、そのような疾患は、ＬＴＢＩであり得る。加えて、または代替として、そのような因子は、ペプチドおよび／またはサイトカインであり得る。
【０１６３】
いくつかの実施例では、前処理剤が、保存ステップの前に唾液に添加されてもよい（上記で説明される図１のステップ４２）。前処理剤は、例えば、疾患または感染症がある個体に由来する場合、唾液中に特定の因子の放出を引き起こすか、もしくは刺激するために、検出される疾患または感染症への抗原を含んでもよい。ＬＴＢＩは、リンパ球によって認識され、感染した個体からの唾液中のインターフェロンガンマ等の因子の放出を引き起こす、抗原（例えば、結核菌のペプチド）の前処理剤を使用することによって、検出されてもよい。インターフェロンガンマ等の放出された因子は、次いで、保存された唾液から（例えば、定量的または定性的に）アッセイされることができ、診断が行われることができる。
【０１６４】
加えて、または代替として、いくつかの実施例では、リンパ球、例えば、Ｔ細胞は、結核菌からのペプチドが細胞に添加されるときに細胞にインターフェロンガンマを放出させる変化に基づいて、ＬＴＢＩについて後成的に分析されてもよい（転写および／または翻訳分析を含む）。これは、例えば、抗原とともに前処理剤を使用する、添加ステップ４２を伴って、または伴わずに行われてもよい。
【０１６５】
（ｎ）  細胞中のＨＩＶ感染の存在。
【０１６６】
ここで、ＨＩＶ感染に対する非限定的議論が続く。付加的および／または代替実施例もまた、以下でさらに説明される。
【０１６７】
現在の唾液ベースの放出抗体／因子検査のうちのいずれかが、本開示の保存技法の使用によって増進されてもよい。
【０１６８】
しかしながら、現在の唾液ベースの技法は、概して、少なくとも６週間の遅延を伴う、検出されることができる抗体／因子を生成するようにヒト免疫系に依拠するという欠点を抱えている。そのような技法は、細胞外因子に基づいて分類され得る。本時間中に、既存の唾液ベースの検査は、個体におけるＨＩＶ感染の存在を診断することができず、特定の場合には、誤解を招く恐れの特定の結果につながり得、および／または個体が無意識に感染を他人に広げることにつながり得る。
【０１６９】
本開示はまた、（ｉ）身体の免疫系が検出されることができる抗体／因子を生成する前の期間に、および／または（ｉｉ）個体の感染後に少なくとも６週間の遅延を伴わずに、ＨＩＶ感染の検出を可能にするように、唾液（または別の自然に発現された体液）の使用も提案する。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本開示は、唾液（または別の自然に発現された体液）の保存された感染細胞内のＨＩＶウイルスの分析を可能にする。血液細胞、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含むＴ細胞は、細胞内のＨＩＶウイルスの存在を識別するように、保存および／または単離ならびに／もしくは分析されてもよい。したがって、本開示は、例えば、唾液からの細胞内分析を可能にし、感染後に上記の細胞外検査よりもはるかに早く、例えば、少なくとも６週間またはそれを上回って早く、ＨＩＶウイルスの検出を可能にする。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞内で、ウイルスＲＮＡまたは逆転写されたＤＮＡ、もしくはウイルスがそれとともに運ぶタンパク質（例えば、逆転写酵素、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、およびインテグレラーゼのうちのいずれか）が、分析されてもよい。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、例えば、唾液の保存およびＣＤ４＋Ｔ細胞の単離後、細胞が、溶解させられてもよく、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡならびに／もしくは細胞内タンパク質が、取得および／または単離されてもよい。随意に、ＰＣＲが、ＨＩＶウイルスに特有の配列を標的にするプローブを用いて行われてもよい。加えて、または代替として、診断プラットフォームは、初期感染中にＨＩＶがＤＮＡゲノムに組み込むために使用する、タンパク質を検査し得る。そのような分析は、本質的にプロテオミクスであり得、例として、質量分光法、ＥＬＩＳＡ、または他の抗体媒介分析等のアッセイを含み得る。抗体分析は、（上記で説明されるような免疫細胞によって放出されるものではなく）ＨＩＶウイルスのタンパク質に関して行われてもよい。
【０１７３】
加えて、または代替として、ＨＩＶが身体の免疫レパートリからＣＤ４＋細胞を積極的に排除し、ＡＩＤＳを引き起こすため、サンプル（例えば、唾液）中のＣＤ４＋細胞の数の測定は、それ自体がＨＩＶ感染を示し得る。本開示のいくつかの実施形態では、ＣＤ４＋細胞の数は、保存されたサンプルからそのような指標を提供するように、例えば、フローサイトメトリおよび／またはＦＡＣＳによって査定されてもよい。
【０１７４】
（ｏ）  癌を示す、１つまたはそれを上回るバイオマーカ。
【０１７５】
（ｐ）  慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を示す、１つまたはそれを上回るバイオマーカ。
【０１７６】
（ｑ）  薬物耐性結核を示す、１つまたはそれを上回るバイオマーカ。
【０１７７】
（ｒ）  血液検査、電解質レベル、脂質検査、ビタミンレベル、肝炎検査、鉄欠乏検査、肝機能検査、腎臓プロファイル検査、糖尿病スクリーニング検査、血液像検査、甲状腺プロファイル検査というカテゴリから、１つまたはそれを上回る検査を複製および／もしくは代用するために好適な１つまたはそれを上回るバイオマーカ。
【０１７８】
（ｓ）  「喘息ＣＯＰＤオーバーラップ症候群（ＡＣＯＳ）」のタイプを示す、１つまたはそれを上回るバイオマーカ。随意に、そのようなバイオマーカは、ＣＯＰＤがＡＣＯＳであることを検出するために、コンパニオン診断をＣＯＰＤの一般診断に提供することができる。加えて、または代替として、そのようなバイオマーカは、ＡＣＯＳを処置標的にすることの有効性を監視するように、コンパニオンバリデータを提供することができる。加えて、または代替として、ＣＯＰＤの一般診断は、例えば、上記の（ｐ）で参照されるバイオマーカを使用して行われてもよいか、そして／またはＣＯＰＤの一般診断は、他の従来の診断検査を使用して行われてもよい。
【０１７９】
上記の（ａ）に関して、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）についてのさらなる情報が、一例のみとしてここで説明される。全ての肺癌の約８０％が、ＮＳＣＬＣ（５）である。ＮＳＣＬＣに対する早期診断および処置が、転帰を最適化する（１２）。従来の診断の主要な構成要素は、顕微鏡による疑わしい癌細胞の直接視覚化を伴う（６）。これは、肺生検材料を伴う確立された研究室用途である。
【０１８０】
対照的に、本開示の技法を使用する口腔液のサンプル収集は、呼吸器癌細胞源へのより容易なアクセスを提供してもよい。口腔液検査は、現在の臨床実践（３、４、７）を少なくとも支援し、増進することさえ可能な「液体生検」を提供し得ると考えられる。口腔液診断法は、他の癌（４８）、ならびに本マトリクスに適しているいくつかの他の疾患（４９）に拡張し得ると考えられる。
【０１８１】
推定癌細胞、具体的には、癌幹細胞（ＣＳＣ）の検出および識別は、現在の癌研究ならびに患者管理の活動中の部分である（８）。近年の科学研究データ所見に依拠して、（すでに診断された患者における）ＮＳＣＬＣ／ＣＳＣの識別を可能にする適度なバイオマーカパネルが、有意な利点を提供し得ると考えられる。
【０１８２】
例示的バイオマーカは、ＣＤ１３３および／またはＥｐＣＡＭを含んでもよい（１０，１１）。加えて、または代替として、例示的バイオマーカは、ＥＧＦＲおよび／またはＡＬＫを含んでもよい。
【０１８３】
いくつかのバイオマーカは、例えば、体液サンプルの保存された全細胞中で検出されることができる。加えて、または代替として、いくつかのバイオマーカは、例えば、（例えば、本開示のいくつかの実施形態で核酸にアクセスする保存溶液を使用して（随意に付属書類１参照））収集された体液からの溶解細胞の保存されたサンプル中で検出されてもよい。
【０１８４】
ＣＤ１３３は、不死化細胞（幹細胞）と強く関連付けられるバイオマーカであり、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）は、上皮または上皮由来新生物において独占的に発現される周知のバイオマーカである。ＥｐＣＡＭは、種々の固形組織癌に対する診断マーカとして使用されることができる。これは、腫瘍の発生および癌腫の転移において役割を果たすようである。したがって、これはまた、潜在的な予後マーカおよび免疫療法方略のための潜在的標的の役割を果たすこともできる。ＥｐＣＡＭ捕捉／検出は、すでに臨床実践されている、全血における既存の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）アッセイの重要な構成要素である。
【０１８５】
本開示の技法を介して反射および監視臨床アッセイとしてともに使用され、医師は、患者の進行および予後について貴重な情報を取得し得る。検査に適しているそのような付加的標的のレパートリ（遺伝子再構成、ＳＮＰ等）は、任意の腫瘍および積極的研究の対象のために広範であり得る（５、６、１３）。
【０１８６】
利点としては、本開示の技法は、患者サンプル調達および安定化が他のアプローチを用いるよりも容易に達成されることを可能にし得る。後続のアッセイが、「液体生検」提案を介して、保持された患者材料を用いて促進されてもよい（１４）。反射検査によって評価され得る、無数の魅力的なバイオマーカがある（５、６、１３）。例えば、ＮＳＣＬＣと診断された患者では、残念ながら薬物耐性がゲノム配列変異を介して発生し、薬物処置に先立った、またはその間の任意の時間に起こり得るため、早期薬物処置および後続のオプションを判定できることが高度に有利である。
【０１８７】
患者管理に関連し得る２つのアッセイは、処置薬物耐性および監視に関与することが公知であるいくつかの遺伝子のうちのいずれかにおける変異の検査を伴う（５、６、１５、１６）。進行した症例では、上皮成長因子受容体遺伝子（ＥＧＦＲ）の変異およびＡＬＫ遺伝子の染色体再配列が、薬物選択のために重要であり得る。より細かいレベルで、いくつかの他の遺伝子もまた、ＶＥＧＦ等の疾患処置にとって重要であるが、ＥＧＦＲ／ＡＬＫが、処置的調節の主要な直接焦点である（５０）。
【０１８８】
ＥＧＦＲ特異的薬物、すなわち、ゲフィチニブ（（Ｉｒｅｓｓａ）−Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）、エルロチニブ（（Ｔａｒｃｅｖａ）−Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、アファチニブ（（Ｇｉｌｏｔｒｉｆ）−Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）は、ＥＧＦＲ配列変化の分析および監視を必要とする。ＡＬＫに焦点を当てた薬物、すなわち、クリゾチニブ（（Ｘａｌｋｏｒｉ）−Ｐｆｉｚｅｒ）およびセリチニブ（（Ｚｙｋａｄｉａ）−Ｎｏｖａｒｔｉｓ）もまた、患者遺伝子再構成の監視を必要とする。
【０１８９】
重要な利点が、初期および継続中の患者遺伝子配列の安全性情報管理（ｖｉｇｉｌａｎｃｅ）に関して達成され得る。これらの検査は、例えば、保存された溶解体液サンプルを使用する（例えば、付属書類１の技法を使用する）腫瘍細胞調査を介して、促進され得る。
【０１９０】
アッセイが、保存された全細胞サンプルに基づく先進的な細胞学的方法（例えば、ＩＨＣ、ＦＩＳＨ）（９、１８）を介して、または保存された溶解サンプルを使用する（例えば、核酸を単離するように最適化される付属書類１の技法を使用する（１９））核酸ハイブリダイゼーション検査によってより直接的に行われてもよい。
【０１９１】
随意に、（限定されないが）ＥＧＦＲ／ＡＬＫ等の薬物耐性関連遺伝子の反射アッセイが後に続く、口腔液が運ぶ細胞のＣＤ１３３／ＥｐＣＡＭ調査を使用する検査が構想される。ＮＳＣＬＣ腫瘍の約１０％が、ＥＧＦＲまたはＡＬＫ変異を呈し得る（５０）。
【０１９２】
上記の（ｅ）に関して、さらなる情報が、一例のみとしてここで説明される。エピジェネティックスの大域的かつ遺伝子特異的な変化（ＤＮＡメチル化およびヒストンアセチル化）は、肥満と相関性がある。発現が肥満と因果関係がある可能性が高い、選択された遺伝子（タンパク質およびＲＮＡレベルの分析）：
・  レプチン（ＬＥＰ）
・  レプチン受容体（ＬＥＰＲ）
・  脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）
・  プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）
・  シングルマインディドホモログ１（ＳＩＭ１）
・  神経栄養チロシンキナーゼ受容体２型（ＮＴＲＫ２）
・  ＦＴＯ（脂肪塊および肥満）
肥満と関連することが示される、選択されたエピジェネティックバイオマーカ：
【表Ａ−１】
2018506727.tif 000003
【表Ａ−２】
2018506727.tif 000004
【０１９３】
上記の（ｎ）を参照すると、以下は、付加的および／または代替的な例示的情報を提供する。核酸の増幅、検出、ならびに配列決定に関して、過去１０年に大幅な進歩があった（一般論評２７、３７、３８）。試薬、プライマ配列、およびプロトコルが存在し、容易に入手可能である。高いスループットおよび難解な検査以外に、別様に慣用的な用途における簡易サンプル取扱い、ならびに処理の必要性が存在し続ける。唾液および口腔液全般は、近年、核酸検査のための新規のマトリクスとして進歩が見られる（３９、４０、４１）。種々の遺伝子／配列検出方法のために、この比較的「使いやすい」流体を利用することに大きな関心が寄せられている（４２）。
【０１９４】
ＢＲＡＣＡ１遺伝子配列（乳癌体質）に対する唾液ベースの検査が、開発中であると発表され（Ｃｏｌｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、既存の細胞血液ベースの検査の代わりとして初期有用性を示した。遺伝子配列プラットフォームの殆どの確立された提供者は、唾液マトリクスのための具体的プロトコルに適応しており（４３）、したがって、唾液が、将来、他の感染性病原体、被分析物、および核酸配列改変の検出に使用されることが可能であることを予期する正当な理由がある（４４、４５）。
【０１９５】
今後の参照のために、本明細書の資料リンクの関連コレクション（４７、４８）が、使用可能な技法に関して提供される。
【０１９６】
ＨＩＶ配列検出のための例示的バイオマーカは、例えば、ＦＩＳＨ／ＩＨＣ方法を介した分析のためのＣＤ４細胞であり得る。ＰＣＲを介したさらなるバイオマーカ検出もまた、以降に以下で議論される。
【０１９７】
本明細書に開示される技法は、唾液または誘発された痰からの細胞のスペクトルの保存および単離を可能にする、唾液サンプル収集デバイスを提供する。これらの細胞は、いくつかの顕微鏡方法によって視覚化されてもよい（９）。ＮＳＣＬＣについて上記で説明されるように、本既存のシステムはまた、無数の免疫組織化学的方法（ＩＨＣ）による固定された細胞の調査も可能にする（１８）。本分析は、いくつかのＨＩＶタンパク質バイオマーカのうちのいずれかを示す、ＣＤ４細胞の検出を含んでもよい。豊富なＩＨＣ適格検出抗体が、本目的で市販されている（９）。本明細書に開示されるサンプル収集技法は、遺伝子特異的ＦＩＳＨ（蛍光原位置ハイブリダイゼーション）等の配列特異的核酸増幅および検出方法に適し得る（５１）。これは、一般的な顕微鏡検査および撮像技法による固定された細胞内のＤＮＡ／ＲＮＡ配列（天然ゲノムおよびウイルスの両方）の検出を可能にする、細胞学的分析に類似する広く受け入れられている重要な方法である。本方法に利用可能な広く受け入れられており、かつ有効なプロトコルがある。ＨＩＶウイルスの種々のゲノム領域を対象とする、最適化されたハイブリダイゼーションプローブおよびＰＣＲプライマの選択が、広く理解されており、容易に利用可能である（５２）。
【０１９８】
組み込まれたプロウイルスならびにビリオン粒子の両方としての特異的ＨＩＶウイルス配列の検出は、周知のＨＩＶゲノム配列に特異的な「標識」ハイブリダイゼーションプローブを用いた、保存された口腔液細胞を含有する、顕微鏡スライドガラスの処理を伴う。具体的には、ウイルスのライフサイクルが最も良く理解されている、ＣＤ４細胞では、染色体に組み込まれた「プロウイルス」配列が、化学的に標識されたプローブにハイブリダイズされ、次いで、視覚化され得る（５３）。低いコピーウイルス負荷についても正当性が立証されている、高感度プロトコルが存在する（５４）。これらのプローブは、ウイルスゲノム配列への合成合致であり、「標識」部分（ビオチン／ストレプトアビジン、フェリチン、ＨＲＰ酵素、蛍光体等）を生成する、いくつかの利用可能なシグナルのうちのいずれかを担持し得る。
【０１９９】
ＨＩＶ配列検出のためのさらなるまたは代替的な例示的バイオマーカは、ＰＣＲを伴ってもよい。ＰＣＲによるＨＩＶ配列の検出は、技術的に複雑ではなく、多くの試薬システムおよび増幅検出オプションが利用可能である。配列、プローブ、およびプライマが、広く理解されており、かつ入手可能である。多くの確立されたプロトコルが存在する（論評３７、３８、４７）。
【０２００】
ＨＩＶウイルスおよび抗ＨＩＶ抗体が両方とも、唾液中で検出されることができ、ＨＩＶ抗体を検出してＨＩＶ感染を診断するように、血液の代替物を提供する（４２、４３）。適切な唾液検体収集のための専用デバイスを用いた唾液ＨＩＶ抗体検査が、近年、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって許可されている（例えば、ＯｒａＳｕｒｅ）。これらの検査は、資源が限定された設定、ならびに迅速な検査および使用しやすさが好まれる国内公共診療所で使用されている。
【０２０１】
疾患管理センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ；ＣＤＣ）は、ＨＩＶ予防プログラムのためのその方針推奨の一部として、迅速かつ頻繁なＨＩＶ検査を含んでいる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｈｉｖ／ｔｅｓｔｉｎｇ／ｃｌｉｎｉｃａｌ／）。ビリオン粒子の場合、限定されたデータは、横断的感染性が低くあり得る一方で、それでもなお、ウイルスゲノム配列が敏感なＰＣＲ「ウイルス負荷」アッセイによって検出可能であり得ることを示す。これは、感染症の初期段階中、おそらく、抗体が最初に出現する「ウインドウ」期間中に、特に当てはまるようである（３９、４０、５５）。
【０２０２】
初期の研究は、初期ＨＩＶ感染がある個体の４２％〜９１％が、唾液マトリクスを使用する敏感なＰＣＲアッセイによって陽性であったことを示した（４１、５５）。実際に、ＨＩＶ  ＲＮＡの劇的な低減が、併用薬物療法を開始した患者で見られた。したがって、十分にフォーマットされたＨＩＶ特異的ＰＣＲ検出システムとシームレスに統合することが可能な口腔液／唾液サンプル収集デバイスは、臨床および監視設定で多大な利点を提供する可能性を有する。
【０２０３】
上記の（ｐ）を参照すると、さらなる情報が、一例のみとしてここで説明される。ＣＯＰＤは、明白に診断することが極めて困難である複雑な呼吸器炎症性疾患である（２０、２１、２２）。これは、他の呼吸器症候群に類似する臨床症状を提示し、体系全体の「炎症」の指標として以外に、それら自体では特異的ではない複雑な血清バイオマーカ変化につながる。しかしながら、これは、世界中で４番目に高い死因であると理解される。これは現在、治癒可能ではないが、寿命を延長する処置がある。
【０２０４】
本開示の原理を使用して、以下のバイオマーカのうちの１つまたはそれを上回るもの、すなわち、ＶＡＰ−１、ＣＤ４４、ＣＤ１１ｂ、好酸球レベル（例えば、口腔液好酸球レベルおよび／または痰好酸球レベル）が、収集された体液サンプル中でＣＯＰＤを検出するために好適であり得る。
【０２０５】
処置管理のための最も適切な診断バイオマーカ（単数または複数）オプションに関して、重要な継続中の議論がある。近年の研究データは、炎症および疾患進行の付加的な新しいバイオマーカを識別しており、当分野は、より有効な介入を提供し得る、浸潤および炎症の両方のより特異的な細胞マーカを急速に識別している（２３、２４）。本明細書に説明されるサンプル収集および分析技法は、呼吸衰弱の早期細胞診断指標を直接評価し、早期処置介入に寄与する、簡易ツールを提供し得る。
【０２０６】
呼吸／炎症性疾患の現在のバイオマーカのうちの多くは、血液中で容易かつ慣用的に測定される、可溶性被分析物であるが、侵襲性好中球および好酸球が気道衰弱において重要な役割を果たすことを示す新たなデータもある（２５、２６、２７、２８、２９）。
【０２０７】
１つの近年の研究は、結果として、炎症プロセスに関与する浸潤好中球を仲介および緩和することを担う、接着カスケードの初期に分子「ブレーキ」要素として気道内皮細胞上に存在する、新規のバイオマーカＶＡＰ−１を識別している（３０）。本リガンドを阻害する実験的薬物は、呼吸疾患の動物モデル、具体的には、ＣＯＰＤモデルで劇的効果を有することが示されている。
【０２０８】
肺防御における好中球の適切な機能には、微小血管系から退出し、組織を通して標的部位まで移動する、それらの能力が一体化している。器官の損傷に応じて、好中球は、特異的細胞表面受容体の発現（ＣＤ４４およびＣＤ１１ｂの同時発現、ならびにその他）を上方調整し、これらのバイオマーカは、次いで、ＶＡＰ−１等の内皮細胞上の接着分子に結合する（３１、３２、３３）。内皮細胞ライニングを通した下層の実質の中への好中球の移動を可能にすることは、健康のために不可欠であるが、本プロセスが限定されない場合、制御されていない炎症が結果として起こる。好中球ＰＢＭＣ上のＣＤ４４およびＣＤ１１ｂは、そのような上方調整挙動を有することが示されており、ＣＯＰＤ関連気道好中球浸潤の初期インジケータとしての機能を果たすとともに、おそらく、疾患進行または処置の継続的監視を可能にし得る。実際に、（例えば、痰で測定されるような）浸潤好中球の特異的サブセットがＣＯＰＤを伝播またはＣＯＰＤを悪化させ得るという考えが、新規の処置への関心を生成してきた。
【０２０９】
加えて、または代替として、好酸球レベルは、特にＡＣＯＳに対するバイオマーカとして、さらなる指標を提供し得る（（ｓ）については、さらに以下の実施例を参照）。
【０２１０】
上記の（ｑ）に関して、結核についてのさらなる情報が、一例のみとしてここで説明される。結核菌の診断および処置は、発展途上ならびに先進国の両方で主要な健康の懸念であり続ける。過去１０年で、細菌が現在利用可能な限定された軍備または処置薬への耐性を生じ得ることが明確になっている。加えて、耐性関連変異のタイプおよび頻度に関する限り、個々の患者の状態を理解することは、医師が新しい感染性病原体の脅威的シフトおよび大流行をより良好に処置し、予想することさえ可能にするであろう。これは、核酸配列分析および薬物耐性対立遺伝子に関する広範な遺伝子データベースを伴う技術的課題である。感染性生物が明確に気道作用因子であるため、患者管理の容易性および安全性を含む、本開示の技法は、患者管理のための重要な利点を提供し得る。
【０２１１】
いくつかのバイオマーカは、例えば、体液サンプルの保存された全細胞中で検出されてもよい。加えて、または代替として、いくつかのバイオマーカは、例えば、（例えば、本開示のいくつかの実施形態では核酸にアクセスする、保存溶液を使用して（随意に、付属書類１参照））収集された体液からの溶解細胞の保存されたサンプル中で検出されてもよい。
【０２１２】
上記の（ｒ）に関して、これまで、慣用的に行われている血液検査を唾液ベースの検査と置換することは実行可能ではなかった。しかしながら、本開示の技法を使用することによって、殆どの慣用的血液検査（全血算および多くの診断マーカの評価の殆ど）が、現在、唾液を用いて実行可能になり得る。
【０２１３】
以下は、採血を必要とする医師によって一般的に指図される（全てではないが）多くの検査を列挙する表である（第１の列）。本第１の列は、ともに受けると患者の健康および適切な平衡状態を確実にする、血液中の重要な因子の殆どを評価する種々の検査を列挙する。これらの検査の殆どは、具体的な独立型診断法ではないが、診断に寄与して役立つ因子である。中央の列は、現在考えられているような、本開示の技法、ならびに血液サンプルの代わりに唾液サンプルを使用する、代用および／または代替検査を実装することの実行可能性を示す。右の列は、現在入手可能であるかどうかにかかわらず、遺伝分析用の市販の唾液キットが、最良の考えおよび理解に従って、これらの検査を行うために使用され得ることを示す。
【０２１４】
評価される血液因子のカテゴリ：
電解質：血中電解質測定は、患者の一般健康の監視および評価のために慣用的に指図される。電解質測定は、体内の任意の不均衡の検出および酸塩基平衡異常の監視を可能にする。任意の個別の電解質の平衡異常は、さらなる調査ならびに監視の正当な理由となり、および／またはより大きな健康問題を示し得る。
【０２１５】
脂質：血液中に含有される脂質は、患者が心血管疾患を発症する危険性があるかどうかを査定するように、心臓リスク査定スクリーニングの一部として評価される。したがって、これらの検査はまた、患者の薬物および／または薬物の薬量の変更の必要性を判定することにも役立つ。
【０２１６】
ビタミン：ビタミンＤおよびビタミンＢ１２は、多くの場合、欠乏、または欠乏の場合は十分な補給を判定するために測定を必要とする。さらに、ビタミンＢ１２は、多くの場合、神経障害および特定の貧血の診断で検査される。
【０２１７】
肝炎：ＨＢｓＡｇは、Ｂ型肝炎ウイルス上の表面抗原である。血液中の本因子の検出は、Ｂ型肝炎の診断を確定する。
【０２１８】
鉄欠乏プロファイル：これらの検査は、多すぎるまたは少なすぎるかどうか、患者の体内の鉄のレベル、および対応する補給の必要性を評価するために使用される。
【０２１９】
肝機能検査：肝炎および肝疾患について選別し、それを検出して監視すること。急性および慢性肝炎の両方ならびに肝臓障害が、これらの因子および酵素の変動によって評価される。
【０２２０】
腎臓プロファイル：本一連の検査は、腎臓が関係する症状の管理および診断に役立つ。これらの検査は、単純に腎臓の適切な機能を確実にするように、慣用的な血液検査の一部を構成し得る、または腎臓疾患を発症する危険性を有するか、もしくは危険性がある患者を選別および／または追跡する機能する役割を果たし得る。
【０２２１】
糖尿病スクリーニング：これらは、患者が糖尿病であるかどうかを診断するとともに、血糖の制御のレベルを評価することによって、患者の糖尿病を監視および管理することに役立つように指図される検査である。
【０２２２】
血液像：全血算（ＣＢＣ）としても公知であり、患者の一般健康を評価し、貧血、感染症、およびある癌等の多数の疾患を検出する、広いスクリーニングツールである。ＣＢＣは、血液の細胞成分の査定（赤血球、白血球、血小板、およびそれらの比率）、ならびに血液中の種々の側面および因子の測定を含む。
【０２２３】
甲状腺プロファイル：甲状腺の適切な機能を査定するため、または甲状腺疾患を示す平衡異常を診断するための一連の検査。
上記で参照される表が、ここで以下に続く。
【表Ｂ−１】
2018506727.tif 000005
【表Ｂ−２】
2018506727.tif 000006
【表Ｂ−３】
2018506727.tif 000007
【表Ｂ−４】
2018506727.tif 000008
【０２２４】
上記の（ｓ）に関して、「喘息ＣＯＰＤオーバーラップ症候群」（ＡＣＯＳ）についてのさらなる情報が、一例のみとしてここで説明される。ＡＣＯＳは、患者がＣＯＰＤおよび喘息の両方に罹患するときに起こる症状である。上記の（ｐ）についてすでに説明されているように、「慢性閉塞性肺疾患」（ＣＯＰＤ）は、人口のほぼ５％に影響を及ぼし、高い罹患率および死亡率の両方に関連付けられる疾患である。病状は、患者における慢性的に不良な空気流ならびに肺気腫および慢性気管支炎の両方を伴うことによって特徴付けられる。近年、ＣＯＰＤの新しい亜型である「喘息ＣＯＰＤオーバーラップ症候群」（ＡＣＯＳ）が、患者の１０〜４０％を悩ませていることが見出されている（Ｌｅｅｎａ  Ｇｅｏｒｇｅ，  ２０１６）。ＡＣＯＳは、全てＣＯＰＤのより極端な形態につながる、ＣＯＰＤおよび喘息の症状ならびに混合病理を提示する症状である。典型的には、ＡＣＯＳの発症の年齢は、他のＣＯＰＤ患者より早く、これらの患者のための１年あたりの医療費は、３倍高い（喘息患者：＄２，３０７、ＣＯＰＤ患者：＄４，８７９、ＡＣＯＳ患者：＄１４，９１７）（Ｆａｄｉａ  Ｔ．Ｓｈａｙａ，２００９）。
【０２２５】
ＡＣＯＳは、ＧＯＬＤ（Ｇｌｏｂａｌ  ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  ｆｏｒ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｌｕｎｇ  Ｄｉｓｅａｓｅ）およびＧＩＮＡ（Ｇｌｏｂａｌ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  ｆｏｒ  Ａｓｔｈｍａ）によって、「通常は喘息と関連付けられるいくつかの特徴および通常はＣＯＰＤと関連付けられるいくつかの特徴を伴って、持続的空気流制限によって特徴付けられる」として共同で規定されている。本規定の曖昧性に起因して、ＡＣＯＳは、現在、不十分に規定されているだけではなく、診療所での提示に基づいて診断することが困難である。しかしながら、ＡＣＯＳに罹患している患者が通常のＣＯＰＤ処置に準最適的に応答し得ることが理解されるため、正しい診断が重要である。逆に、ＡＣＯＳ処置は、高価であり、大抵は失敗なく処置される可能性が高い症状がある患者で標的化されるはずである。
【０２２６】
本明細書に説明されるサンプル収集、保存、および分析技法は、同一のサンプルからの他の重要な細胞および関連バイオマーカの検出を同時に可能にしながら、保存および患者好酸球数の後続の染色ならびに計測を可能にするために特に適し得る（上記参照）。これらの技法は、ＣＯＰＤ患者の処置を評価して監視する貴重な新しいセラノスティックツールを臨床医に提供し得る。
【０２２７】
さらなる臨床データが発展すると、本出願はまた、例えば、喘息の鑑別診断において役割を果たしてもよい。
【０２２８】
ＡＣＯＳは、安定した状態で患者を管理し、より重要なこととして、悪化を管理して予防することに役立ち得る、特定の薬物により応答することが示されている。１つのそのような薬物群は、吸引および経口コルチコステロイド療法である。ステロイドは、好酸球性気管支粘膜炎症を減少させるそれらの能力に起因して、ＡＣＯＳを管理することへの広域アプローチと見なされる（Ｌｅｅｎａ  Ｇｅｏｒｇｅ，２０１６）。好酸球性／Ｔｈ−２媒介炎症を特異的に標的化するであろう、他の狭域スペクトル処置法が、現在、ＡＣＯＳで使用するために研究されている（Ｌｅｅｎａ  Ｇｅｏｒｇｅ，２０１６）。そのような処置法は、症状および悪化を管理することによって、ＡＣＯＳ患者の生活の質を向上させるだけではなく、医療費および生じた経済負担を減少させる可能性を有する。
【０２２９】
ＡＣＯＳおよび進行中の処置法の本理解に基づいて、ＡＣＯＳの診断に役立ち得るだけではなく、処置法の有効性の正当性を立証するようにコンパニオン診断および／またはコンパニオンバリデータとしての役割も果たし得る、十分かつ効率的な診断ツールが開発されることがさらに重要になる。血液検査および気管支鏡検査の従来のオプションはそれぞれ、それらの制限および不利点を有する。痰検査は、炎症細胞の局所浸潤に起因して、ＣＯＰＤ患者において利点であることが示されており、したがって、より高い濃度の好酸球等の炎症細胞が痰に存在し得ることを示唆する。しかしながら、痰サンプルはまた、取得することが面倒かつ困難でもある。口腔液は、唾液および痰を含有することが示されており、ＣＯＰＤ／ＡＣＯＳ患者における増加した痰産生に起因して、口腔液は、多くの細胞および炎症バイオマーカの診断ならびに評価のための低侵襲手段を提示し得る。口腔液の全ての内容物の保存ならびに好酸球および主要バイオマーカの単離および評価のための本明細書に説明される技法の使用は、これまで達成も構想もされていなかった有意な利点を提供することができる。
【０２３０】
異なる病状について検出または分析され得るバイオマーカについて議論してきたが、以下の説明は、例えば、上記のうちの多くを行うために使用され得る、異なる技法をここで説明する。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、自然に発現された体液（例えば、唾液、痰、尿）中の希少な細胞の分析、および／または細胞外成分の分析に独占的に限定されないが、随意に、患者の病状を診断または監視するために使用される技法は、以下のうちの１つまたはそれを上回るものを含んでもよい。
（ａ）  フローサイトメトリ
（ｂ）  蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）
（ｃ）  免疫組織化学
（ｄ）  分子分析（例えば、限定されて、エピジェネティック；遺伝子；翻訳；翻訳後のうちのいずれか）
（ｅ）  細胞学
（ｆ）  タンパク質レベル（翻訳後）分析技法
（ｇ）  遺伝子発現を測定するためのＲＮＡレベル（翻訳後）分析
（ｈ）  例えば、エピジェネティック、および／またはＤＮＡメチル化ならびにヒストン修飾を含む、ＤＮＡ。
【０２３２】
以下のさらなる実施例は、本開示の例示的な方法の実施形態をさらに例証することを意図し、本開示の範囲を限定することを意図しない。
（実施例１）
【０２３３】
フローサイトメトリが、種々の形態の癌を診断するために使用されてもよい。これは、例えば、白血病およびリンパ腫を診断するために、例えば、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａによって使用される検査である。フローサイトメトリはまた、他のタイプの細胞、例えば、血液中の血小板細胞の分析に使用されてもよい。例えば、Ｑｕｅｓｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓは、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＨＮ）を診断するためにフローサイトメトリを利用する。
（実施例２）
【０２３４】
ＦＡＣＳが、癌に対するマーカを含む、種々の細胞マーカを診断するために使用されてもよい。これは、例えば、ＣＤ５７、ＣＤ８、ＣＤ３等の細胞マーカの診断のためにＱｕｅｓｔによって使用される検査である。ＦＡＣＳ分析はまた、ＣＤ４検査を調査することを介してＨＩＶ／ＡＩＤＳ処置の状態を監視するために有用であり得、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓは、例えば、高信頼ＣＤ４検査のために設計されるシステムである、ＦＡＣＳ  ＣｏｕｎｔＴＭを提供する。ＦＡＣＳ分析はまた、細胞死およびミトコンドリア損傷の形態を査定するためにも使用され、例えば、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅは、細胞健康および完全性を査定するための種々の検査を提供する。
（実施例３）
【０２３５】
免疫組織化学が、癌および他の障害／疾患に対するマーカを含む、種々の細胞マーカを診断するために使用されてもよい。これは、例えば、疾患に関与する多数の細胞マーカの診断のためにＱｕｅｓｔによって使用される検査である。一例のみとして、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｕｅｓｔｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．ｃｏｍ／ｈｏｍｅ／ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ／ｔｅｓｔｉｎｇ−ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔｓ／ｈｏｓｐｉｔａｌｓ−ｌａｂ−ｓｔａｆｆ／ｓｐｅｃｉｍｅｎ−ｈａｎｄｌｉｎｇ／ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．ｈｔｍｌが参照され得る。
【０２３６】
免疫組織化学はまた、サイトケラチンの検出を介した癌腫およびいくつかの肉腫の診断で使用されてもよい。例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎは、サイトケラチンの検出用の免疫組織化学キットを提供する。
（実施例４）
【０２３７】
分子分析（例えば、限定されないが、エピジェネティック、遺伝子、翻訳、翻訳後のうちのいずれか）。分子分析は、例えば、亜硫酸水素塩シークエンシングおよびメチル化ＤＮＡ沈降（ＭＤＩＰ）を含む方法によって、癌等の種々の疾患の診断のためのＤＮＡメチル化および他のエピジェネティックマークを査定するために、Ｑｉａｇｅｎならびに他の企業によって使用される。分子分析は、例えば、腫瘍組織サンプルのＤＮＡで見出される種々のバイオマーカの分子プロファイリングのために、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａによって使用される。そのような検査は、癌、例えば、大腸癌の診断を可能にするだけではなく、個別化処置を促進する。
（実施例５）
【０２３８】
細胞学が、甲状腺癌および他の障害／疾患に対するマーカを含む、種々の細胞マーカを診断するために使用されてもよい。これは、例えば、甲状腺癌の診断のためにＱｕｅｓｔによって使用される検査である。一例のみとして、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｕｅｓｔｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．ｃｏｍ／ｔｅｓｔｃｅｎｔｅｒ／ｔｅｓｔｇｕｉｄｅ．ａｃｔｉｏｎ？ｄｃ＝ＴＧ＿Ｔｈｙｒｏｉｄ＿Ｃａｎｃｅｒが参照され得る。
（実施例６）
【０２３９】
タンパク質レベル（転写後）。下流分析技法の実施例は、質量分析、ウェスタンブロット、およびアレイを使用するプロテオミクスバイオマーカパネルの分析を含み得る。細胞内タンパク質発現（レベル）の分析は、薬物、化学、非化学的阻害剤、またはタンパク質もしくは一連のタンパク質の生物学的阻害剤の効果を分析するために使用され得る。
【０２４０】
これは、ＲＮＡまたはタンパク質もしくは非コーディングＤＮＡ配列を改変し得る、遺伝子に関するノックダウン／ノックアウト／阻害または活性化の効果についての測定を含む。これは、エピゲノムのタンパク質／ＲＮＡ（ＤＮＡメチラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、ヒストンアセチラーゼ、およびヒストンデアセチラーゼ等の酵素（具体的には、これは、酵素ＤＮＭＴ１／２／３および全ての亜型、ＭＢＤ２、ＭｅＣＰ２、ならびにヒストン（デ）アセチラーゼ（デ）メチラーゼ等の全てのヒストン修飾酵素等を含む））を含み、エピジェネティック下流効果の分析（大域的または遺伝子特異的レベルのいずれか一方におけるＤＮＡメチル化もしくはヒストンの修飾、および／またはＲＮＡならびに／もしくはＤＮＡ分析等）と併用され得る。
（実施例７）
【０２４１】
遺伝子発現を測定するＲＮＡレベル（転写）。疾患／障害を判別するために個別に、またはパネル上でのいずれかで使用される、もしくは癌、神経疾患、奇病、および小児の疾患／障害を含む、多数の疾患ならびに障害の薬理学的および／または処置介入のためのコンパニオン診断もしくはバイオマーカとして使用される、文献で識別される多数の候補遺伝子がある。さらに、異なるタイプのＲＮＡが、単離された細胞から分析されることができる（これは、ミクロＲＮＡおよびメッセンジャＲＮＡ等を含む）。分析技法は、（いくつか例を挙げると）ＰＣＲ、全ゲノムアレイ、およびバイオマーカパネルを含む。
【０２４２】
ＲＮＡ下流用途は、ｓｉＲＮＡもしくは他の化学および／または非化学的阻害剤等の阻害剤を使用して、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ干渉について細胞を分析するステップを含んでもよい。これは、種々の形態のＰＣＲ、発現アレイ（実施例は、特定の疾患または障害に対する既知のバイオマーカを含む場合もあり、含まない場合もある、ａｆｆｙｍｅｔｉｒｘまたはａｇｉｌｅｎｔヒトゲノム発現アレイおよびカスタムアレイを含む）によってＲＮＡのレベルを測定するステップを含む。
（実施例８）
【０２４３】
ＤＮＡ（ＤＮＡメチル化およびヒストン修飾を含む、遺伝およびエピジェネティック）。これは、バイオマーカパネル、亜硫酸水素塩シークエンシング分析、メチル化免疫沈降分析、および全ゲノムアレイプラットフォーム（遺伝子パネルに基づくものを含む、ａｇｉｌｅｎｔ、ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、およびカスタマイズされたアレイ）を伴う使用等の技法を含んでもよい。
【０２４４】
ＤＮＡ分析が、大域的および遺伝子特異的の両方でメチル化および脱メチル化の阻害の効果を測定するために使用されてもよい。大域的の場合、阻害剤は、生物学的および化学なものを含み得る（例えば、５ａｚａＣ）。加えて、これは、例えば、アレイ、ウェスタンブロット、および質量分析を使用して、ヒストンへの影響を測定するために使用され得る。
【０２４５】
本願の中で提示される、特許、特許出願、論文、ウェブページ、本等を含むが、それらに限定されない、出版物または他の文書のあらゆる言及は、参照することによってそれらの全体として本明細書に組み込まれる。
【０２４６】
いくつかの変形例が上記で詳細に説明されているが、他の修正も可能である。例えば、付随の図面で描写され、本明細書に説明される任意の論理フローは、望ましい結果を達成するために、示される特定の順序または順番を必要としない。他の実装も、以下の例示的請求項のうちの少なくともいくつかの範囲内であり得る。
【０２４７】
デバイス、システム、および方法の例示的実施形態が、本明細書に説明された。いずれかに記載されるように、これらの実施形態は、例証目的のためだけに説明され、限定ではない。他の実施形態も、本明細書に含まれる教示から明白であろうように、可能性として考えられ、本開示によって網羅される。したがって、本開示の範疇および範囲は、前述の実施形態のいずれかによって限定されるべきではなく、本開示およびそれらの均等物によって支持される請求項に従ってのみ規定されるべきである。また、本開示の実施形態は、体液（例えば、唾液、尿）からの細胞の収集、保存、分離、および単離、ならびに毒性および／または有害物質／流体を含む他の物質の収集（ならびにその成分の保存、分離、および単離）に対応する、ありとあらゆる要素を含む、任意の他の開示される方法、システム、およびデバイスからのありとあらゆる要素をさらに含み得る、方法、システム、およびデバイスを含んでもよい。言い換えると、１つまたは別の開示される実施形態からの要素は、他の開示される実施形態からの要素と置換可能であり得る。
参考文献（参照することによって本明細書に組み込まれる）
【０２４８】
【数１】
2018506727.tif 000009
【数２】
2018506727.tif 000010
【数３】
2018506727.tif 000011
【数４】
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【数５】
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【数６】
2018506727.tif 000014
（上記で参照される）付属書類１が、本開示の一部として以下に続く。
付属書類１
【０２４９】
本開示は、加えて、有害および／または毒性物質を含む、体液もしくは他の物質、具体的には、自然に発現された体液（例えば、唾液、尿）のサンプルを収集するためのデバイス、溶液、ならびに方法に関する。加えて、または代替として、本開示は、概して、機能的遺伝学、および／または（例えば）以降の遺伝研究のためのそのような体液からのＤＮＡの単離ならびに保存に関する。加えて、または代替として、本開示は、概して、家庭での使用に好適であるそのような特徴に関する。
【０２５０】
国際公開第ＷＯ２００３／１０４２５１号（ＤＮＡ  Ｇｅｎｏｔｅｋ  Ｉｎｃ．）は、唾液の収集されたサンプルから核酸を保存および抽出するための組成物ならびに方法を説明する。この組成物は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡのために望ましい範囲内で組成物のｐＨを維持するように、キレート剤、変性剤、緩衝液を含む。組成物はまた、還元剤および／または抗菌剤を含んでもよい。その文書はまた、組成物を含有するチャンバを有する唾液サンプル収集コンテナ、およびキャップがコンテナに嵌合されるときに分離障壁の解体によって組成物を放出するための技法も説明する。
【０２５１】
内蔵型収集および保存デバイスの概念は、ドナーが物理的に研究室を訪問することを要求することなく、多くの異なる遺伝子検査用途の可能性を有するが、そのような可能性は、組成物の有効性、および保存された溶液の質によって厳しく限定され得る。本発明のいくつかの非限定的側面は、そのような問題を少なくとも軽減することを求め得る。
【０２５２】
本明細書では、国際公開第ＷＯ２０１２／１７７６５６号および／または国際公開第ＷＯ２０１５／１１２４９６号で説明される改良型サンプル収集デバイスが参照される。これらの出願の内容は、その全体として本明細書で複製される場合のように、参照することによって本明細書に組み込まれる。
【０２５３】
以下は、本開示の基本的な非限定的理解を提供するために、付属文書１の開示の簡略化された概要を提示する。
【０２５４】
一側面では、例えば、研究室を訪問する必要なく、サンプルドナーによって使用するために好適である、（例えば、携帯用）収集デバイスが説明される。このサンプル収集デバイスは、自然に発現された体液、例えば、唾液または尿を受容するためのコンテナを備える。本デバイスはさらに、収集されたサンプル中の核酸を抽出して保存するための組成物を含有する、チャンバを備え、組成物は、細胞小器官から核酸を抽出して保存することに効果的である。細胞小器官は、（同一の原理が他の細胞小器官に適用され得るが）ミトコンドリアであってもよい。
【０２５５】
加えて、または代替として、一側面では、組成物は、自然に発現された体液のサンプルを収集し、収集されたサンプル中の核酸を抽出して保存するためのサンプル収集デバイスで使用するために説明され、組成物は、細胞小器官から核酸を抽出して保存することに効果的である。細胞小器官は、（同一の原理が他の細胞小器官に適用され得るが）ミトコンドリアであってもよい。
【０２５６】
核酸は、所望に応じて、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡであってもよい。
【０２５７】
ミトコンドリアＤＮＡは、以下の核ＤＮＡと非常に異なる特性を有し得る。
（ｉ）ミトコンドリアＤＮＡは、核ＤＮＡと比較して非常に小さい。これは、１６６００ｂｐから成る、わずか３６個の遺伝子をコードする最小染色体を有する。
（ｉｉ）ミトコンドリアＤＮＡはまた、核ＤＮＡと比較して濃度が比較的わずかである。１つの細胞につき、ミトコンドリアＤＮＡの約１００〜約１０，０００の別個のコピーが存在し得る。
（ｉｉｉ）ミトコンドリアＤＮＡは、母親のみから受け継がれる。
（ｉｖ）ミトコンドリアＤＮＡは、環状である。
（ｖ）ミトコンドリアＤＮＡは、変異の影響を非常に受けやすい。これは、核ＤＮＡよりも変異またはマークされることが可能であるため、ミトコンドリアＤＮＡを研究および分析のために着目させる１つの要因である。例えば、特定の変異は、核ＤＮＡから検出することが困難（または不可能）であり得る、有用な指標または神経疾患であり得ると考えられる。
【０２５８】
しかしながら、本明細書に開示されるタイプのサンプル収集デバイスを用いてミトコンドリアＤＮＡを抽出して保存することは、これまで知られていない。上記の特性は、ミトコンドリアＤＮＡを抽出して保存しにくくする。第１に、変異に対する感受性は、ミトコンドリアＤＮＡが、ＤＮＡを抽出するようにサンプル細胞を溶解させるために使用される従来のプロセスによる損傷および変異の影響を特に受けやすいことを意味する。第２に、ミトコンドリアＤＮＡのわずかな濃度および小さいサイズは、下流分析のための良質なサンプルを提供するために十分な量の損傷されていないミトコンドリアＤＮＡを取得することの困難を悪化させる。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、組成物は、細胞小器官（例えば、ミトコンドリア）を溶解させるように構成されてもよい。例示的組成物が、以降で説明される。
【０２６０】
上記のうちのいずれかに加えて、または代替として、一側面では、組成物が、自然に発現された体液のサンプルを収集し、収集されたサンプル中の核酸を抽出して保存するためのサンプル収集デバイスで使用するために説明され、（ｉ）組成物は、従来の組成物よりも溶解および／または保存剤が有意に高濃度であり、ならびに／もしくは（ｉｉ）組成物は、組成物が意図される体液サンプルの体積より実質的に大きくない体積を有する。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、組成物は、組成物が意図される体液サンプルの体積より小さい体積を有してもよい。
【０２６２】
組成物が意図される体液サンプルの体積より実質的に大きくない組成物体積を使用することによって、組成物を収集されたサンプルと混合するときの体積増加は、同等に小さくあり得る。比較的小さい体積を提供することは、結果として生じる混合物中の核酸の濃度への体積増加の影響を低減させ、および／または単位体積あたりのＤＮＡ濃度に関して組成物体積の希釈効果を低減させる。
【０２６３】
例えば、一実施形態では、収集された体液サンプルの体積に対する組成物の体積の比は、約１：１であってもよい。そのような比を用いると、単位体積あたりの抽出および保存された核酸の濃度は、正味体積が２倍になるため半減される。したがって、濃度は、比較的高いままであり得る。組成物のより小さい体積を使用することによって、体積増加の影響は、さらに低減させられ得ることが考えられる。例えば、組成物の体積が体液サンプルの体積の約半分である場合、単位体積あたりの抽出および保存された核酸の濃度は、半分の代わりに元の濃度の３分の２であり得ることが考えられる。それによって、単位体積あたりの濃度は、１：１の実施形態と比較して、約３３％増進させられる。
【０２６４】
増加した濃度の溶解および／または保存剤を使用することは、低減した体積の組成物を補償することができる。
【０２６５】
加えて、または代替として、増加した濃度の溶解および／または保存剤を使用することは、急速な溶解ならびに／もしくは保存作用、および／または細胞内の細胞小器官の溶解を提供することができ、そのいずれか一方または両方は、細胞小器官ＤＮＡ（例えば、ミトコンドリアＤＮＡ）の変異が起こり得る時間を短縮することができる。
【０２６６】
上記の側面のうちのいずれかに加えて、または代替として、組成物が、自然に発現された体液のサンプルを収集し、収集されたサンプル中の核酸を抽出して保存するためのサンプル収集デバイスで使用するために説明され、組成物は、少なくとも１つの溶解剤および／または少なくとも１つの保存剤を含む。
【０２６７】
随意に、組成物は、少なくとも２つの溶解剤、随意に、少なくとも３つの溶解剤を含んでもよい。
【０２６８】
加えて、または代替として、組成物は、随意に、少なくとも１つの保存剤として、タンパク質および／またはＤＮＡアーゼを遮断するための少なくとも１つの化学阻害剤ならびに／もしくは変性剤を含んでもよい。随意に、組成物は、少なくとも２つのそのような化学阻害剤および／または変性剤、随意に、少なくとも３つのそのような化学阻害剤および／または変性剤を含んでもよい。
【０２６９】
例示的組成物の詳細が、以下でさらに説明される。
【０２７０】
上記の側面のうちのいずれかに加えて、または代替として、いくつかの実施形態では、以下のうちの１つ、または２つもしくは３つ全ての任意の組み合わせを含む、組成物が説明される。
サンプル細胞から核酸を解放するための少なくとも１つの溶解剤であって、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリトン、トリトン−Ｘ、トリトン１００、トリトン−Ｘ１００、デオキシコール酸塩（例えば、デオキシコール酸ナトリウム）、コール酸塩（例えば、コール酸ナトリウム）、ラウロイルサルコシンナトリウム（および／またはサルコシル）、マルトシド（例えば、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシドおよび／またはＤＤＭ）、グリコシド（例えば、ジギトニン）、Ｔｗｅｅｎ（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０および／またはＴｗｅｅｎ  ８０）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（および／またはＣＨＡＰＳ）、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（および／またはＴｅｒｇｉｔｏｌ型ＮＰ−４０および／またはＮＰ−４０）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、もしくは前述のうちのいずれかの誘導体（例えば、市販の誘導体）から選択される、少なくとも１つ、随意に、少なくとも２つ、随意に、少なくとも３つを含む、少なくとも１つの溶解剤。
トリスおよび／またはメチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む、緩衝剤。
タンパク質および／またはＤＮＡアーゼを遮断するための少なくとも１つの化学阻害剤ならびに／もしくは変性剤であって、２−メルカプトエタノール、Ｃａ２＋イオン、エチエレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、メチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ヨード酢酸、尿素から選択される、少なくとも１つ、随意に、少なくとも２つ、随意に、少なくとも３つを含む、少なくとも１つの化学阻害剤ならびに／もしくは変性剤。
【０２７１】
上記の側面のうちのいずれかに加えて、または代替として、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのイオン性界面活性剤（またはイオン性洗剤）と、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤（または非イオン性洗剤）と、塩とを含む、組成物が説明される。組成物は、細胞および／または細胞小器官を溶解させるための溶液であってもよい。
【０２７２】
イオン性および非イオン性界面活性剤の組み合わせは、ミセル形成への相乗安定化効果を有し、ミセル形成を高い塩濃度に対してより耐性にさせ得ることが考えられる。これは、比較的高い界面活性剤濃度および／または高い塩濃度でさえも界面活性剤のうちの１つもしくはそれを上回るものの望ましくない沈降を回避することができる。溶液が高いミセル界面活性剤濃度ならびに高い塩濃度の両方を有することを可能にすることは、溶液の細胞および／または細胞小器官溶解能力を増進させ得る。
【０２７３】
イオン性界面活性剤または洗剤の例は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デオキシコール酸塩（例えば、デオキシコール酸ナトリウム）、コール酸塩（例えば、コール酸ナトリウム）、ラウロイルサルコシンナトリウム（および／またはサルコシル）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（および／またはＣＨＡＰＳ）、前述のうちのいずれかの誘導体（例えば、市販の誘導体）のうちのいずれか１つもしくはそれを上回るものを含む。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、イオン性界面活性剤（または洗剤）は、両性イオン界面活性剤（または洗剤）を含んでもよく、ＣＨＡＰＳが例である。他の実施形態では、イオン性界面活性剤（または洗剤）は、随意に、両性イオン界面活性剤を含み得ない。例えば、イオン性界面活性剤（または洗剤）は、アニオン性もしくはカチオン性界面活性剤（または洗剤）を含んでもよい。
【０２７５】
非イオン性界面活性剤または洗剤の例は、トリトン、トリトン−Ｘ、トリトン１００、トリトン−Ｘ１００、マルトシド（例えば、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシドおよび／またはＤＤＭ）、グリコシド（例えば、ジギトニン）、Ｔｗｅｅｎ（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０および／またはＴｗｅｅｎ  ８０）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（および／またはＣＨＡＰＳ）、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（および／またはＴｅｒｇｉｔｏｌ型ＮＰ−４０および／またはＮＰ−４０）、前述のうちのいずれかの誘導体（例えば、市販の誘導体）のうちのいずれか１つもしくはそれを上回るものを含む。
【０２７６】
塩の例は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）のうちのいずれか１つまたはそれを上回るものを含む。
【０２７７】
別の側面では、付属書類１は、収集されたサンプル中の核酸を抽出して保存するための組成物を備える、自然に発現された体液（例えば、唾液）の収集のための体液サンプル収集デバイスを開示する。いくつかの実施形態では、組成物は、細胞小器官から核酸を抽出して保存することに効果的である。細胞小器官は、ミトコンドリアであってもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、複数の溶解剤を組み合わせる。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つのイオン性洗剤と、少なくとも１つの非イオン性洗剤と、塩とを含む。
【０２７８】
本開示を限定することなく、付属書類１に開示される、特定の特徴および／または側面の番号付けされた項目別リストが、以下に続く。
【０２７９】
項目別番号：
１．  自然に発現された体液サンプルのサンプルを収集するためのサンプル収集デバイスで使用するための組成物であって、収集されたサンプル中の核酸を抽出して保存するために効果的であって、細胞小器官から核酸を抽出して保存することに効果的である、組成物。
２．  細胞小器官は、ミトコンドリアである、項目１に記載の組成物。
３．  核酸は、ＤＮＡを含む、項目１または２に記載の組成物。
４．  組成物は、細胞小器官を溶解させるための少なくとも１つの溶解剤を含む、項目１、２、または３に記載の組成物。
５．  組成物は、少なくとも２つ、随意に、少なくとも３つの溶解剤を含む、項目４に記載の組成物。
６．  組成物および／または溶解剤は、界面活性剤、洗剤、塩から選択される、少なくとも１つを含む、先行項目のうちのいずれかに記載の組成物。
７．  組成物および／または溶解剤は、その誘導体を含め以下；
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリトン、トリトン−Ｘ、トリトン１００、トリトン−Ｘ１００、デオキシコール酸塩（例えば、デオキシコール酸ナトリウム）、コール酸塩（例えば、コール酸ナトリウム）、ラウロイルサルコシンナトリウム（および／またはサルコシル）、マルトシド（例えば、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシドおよび／またはＤＤＭ）、グリコシド（例えば、ジギトニン）、Ｔｗｅｅｎ（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０および／またはＴｗｅｅｎ  ８０）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（および／またはＣＨＡＰＳ）、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（および／またはＴｅｒｇｉｔｏｌ型ＮＰ−４０および／またはＮＰ−４０）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）
から選択される、少なくとも１つ、随意に、少なくとも２つ、随意に、少なくとも３つを含む、先行項目のうちのいずれかに記載の組成物。
８．  組成物は、（ｉ）トリトンまたはその誘導体と、（ｉｉ）ＳＤＳまたはその誘導体と、（ｉｉｉ）塩とを組み合わせて含む、先行項目のうちのいずれかに記載の組成物。
９．  組成物は、タンパク質および／またはＤＮＡアーゼを遮断するための少なくとも１つの化学阻害剤ならびに／もしくは変性剤を含む、先行項目のうちのいずれかに記載の組成物。
１０．  組成物は、２−メルカプトエタノール、Ｃａ２＋イオン、エチエレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、メチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ヨード酢酸、尿素から選択される、少なくとも１つ、随意に、少なくとも２つ、随意に、少なくとも３つを含む、先行項目のうちのいずれかに記載の組成物。
１１．  自然に発現された体液のサンプルのサンプルを収集するためのサンプル収集デバイスで使用するための組成物であって、
組成物は、収集されたサンプル中の核酸を抽出して保存するのに有効であり、
組成物は、以下のうちの少なくとも１つ、または２つもしくは３つ全ての任意の組み合わせを含む、
サンプル細胞から核酸を解放するための少なくとも１つの溶解剤であって、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリトン、トリトン−Ｘ、トリトン１００、トリトン−Ｘ１００、デオキシコール酸塩（例えば、デオキシコール酸ナトリウム）、コール酸塩（例えば、コール酸ナトリウム）、ラウロイルサルコシンナトリウム（および／またはサルコシル）、マルトシド（例えば、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシドおよび／またはＤＤＭ）、グリコシド（例えば、ジギトニン）、Ｔｗｅｅｎ（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０および／またはＴｗｅｅｎ  ８０）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（および／またはＣＨＡＰＳ）、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（および／またはＴｅｒｇｉｔｏｌ型ＮＰ−４０および／またはＮＰ−４０）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）からその誘導体を含めて選択される、少なくとも１つ、随意に、少なくとも２つ、随意に、少なくとも３つを含む、少なくとも１つの溶解剤；
トリスおよび／またはメチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む、緩衝剤；
タンパク質および／またはＤＮＡアーゼを遮断するための少なくとも１つの化学阻害剤ならびに／もしくは変性剤であって、２−メルカプトエタノール、Ｃａ２＋イオン、エチエレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、メチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ヨード酢酸、尿素から選択される、少なくとも１つ、随意に、少なくとも２つ、随意に、少なくとも３つを含む、少なくとも１つの化学阻害剤ならびに／もしくは変性剤。
１２．  ｐＨ緩衝液をさらに含む、先行項目のうちのいずれかに記載の組成物。
１３．  緩衝液は、トリスである、またはそれを含む、項目１２に記載の組成物。
１４．  組成物は、約８を上回るｐＨを有する、先行項目のうちのいずれかに記載の組成物。
１５．  組成物はさらに、プロテイナーゼＫを含む、先行項目のうちのいずれかに記載の組成物。
１６．  組成物は、２４９ｍＭ、２５０ｍＭ、２７５ｍＭ、３００ｍＭ、３２５ｍＭ、３５０ｍＭから選択される、少なくとも１つを上回る総塩濃度を有する、先行項目のうちのいずれかに記載の組成物。
１７．  組成物は、３００ｍＭ、２０００ｍＭ、１０００ｍＭ、７５０ｍＭ、５００ｍＭから選択される、少なくとも１つを上回らない総塩濃度を有する、先行項目のうちのいずれかに記載の組成物。
１８．  組成物は、５ｍｌ、４ｍｌ、３ｍｌ、２ｍｌ、１ｍｌ、７５０μｌ、５００μｌ、２５０μｌ、１００μｌから選択される、少なくとも１つを上回らない体積を有する、先行項目のうちのいずれかに記載の組成物。
１９．  トリス、ＳＤＳ、トリトン、ＮａＣｌ、およびＥＤＴＡを含む、先行項目のうちのいずれかに記載の組成物。
２０  プロテイナーゼＫ、デオキシコール酸ナトリウム、尿素から選択される、１つまたはそれを上回るものをさらに含む、項目１９に記載の組成物。
２１．  組成物中の構成要素の濃度は、
トリス：約（Ｒ＋１）＊１０ｍＭ
ＳＤＳ：約（Ｒ＋１）＊１％（ｖ／ｖ）
トリトン：約（Ｒ＋１）＊１％（ｖ／ｖ）
ＮａＣｌ：約（Ｒ＋１）＊２５０ｍＭを上回るまたはそれに等しい
ＥＤＴＡ：（Ｒ＋１）＊５ｍＭ
によって規定され、
Ｒは、比Ｖｓ／Ｖであり、
Ｖｓは、濃度が使用中に混合させられることを意図している、サンプルＶｓの所定の体積であり、
Ｖｃは、組成物の体積である、
項目１９または２０に記載の組成物。
２２．  随意に、先行項目のうちのいずれかに記載の細胞材料を溶解させるための組成物であって、少なくとも１つのイオン性界面活性剤（またはイオン性洗剤）と、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤（または非イオン性洗剤）と、塩とを含む、組成物。
２３．  少なくとも１つのイオン性界面活性剤または洗剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デオキシコール酸塩（例えば、デオキシコール酸ナトリウム）、コール酸塩（例えば、コール酸ナトリウム）、ラウロイルサルコシンナトリウム（および／またはサルコシル）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（および／またはＣＨＡＰＳ）、前述のうちのいずれかの誘導体のうちのいずれか１つもしくはそれを上回るものとして選択される、項目２２に記載の組成物。
２４．  少なくとも１つのイオン性界面活性剤または洗剤が、トリトン、トリトン−Ｘ、トリトン１００、トリトン−Ｘ１００、マルトシド（例えば、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシドおよび／またはＤＤＭ）、グリコシド（例えば、ジギトニン）、Ｔｗｅｅｎ（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０および／またはＴｗｅｅｎ  ８０）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（および／またはＣＨＡＰＳ）、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（および／またはＴｅｒｇｉｔｏｌ型ＮＰ−４０および／またはＮＰ−４０）、前述のうちのいずれかの誘導体のうちのいずれか１つもしくはそれを上回るものとして選択される、項目２２または２３に記載の組成物。
２５．  塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）から選択される、いずれか１つまたはそれを上回るものである、項目２２、２３、または２４に記載の組成物。
２６．  組成物は、２４９ｍＭ、２５０ｍＭ、２７５ｍＭ、３００ｍＭ、３２５ｍＭ、３５０ｍＭから選択される、少なくとも１つを上回る、総塩濃度を有する、項目２２〜２５のいずれかに記載の組成物。
２７．  イオン性および非イオン性界面活性剤または洗剤は、混合ミセル集団ならびに／もしくは混合ミセルを形成する、項目２２〜２６のいずれかに記載の組成物。
２８．  エタノールをさらに含む、先行項目のうちのいずれかに記載の組成物。
２９．  組成物は、実質的にエタノールを含まない、項目１〜２７のいずれかに記載の組成物。
３０．  自然に発現された体液を受容するためのコンテナと、収集されたサンプル中の核酸を抽出して保存するための組成物を含有するチャンバとを備える、自然に発現された体液の収集のための体液サンプル収集デバイスであって、組成物は、先行項目のうちのいずれかに従って規定される通りである、体液サンプル収集デバイス。
３１．  自然に発現された体液のサンプルを受容するためのコンテナと、収集されたサンプル中の核酸を抽出して保存するための組成物の第２の体積を含有するチャンバを備える、自然に発現された体液の所定の第１の体積の収集のための、随意に、項目３０に記載の体液サンプル収集デバイスであって、第２の体積は、第１の体積を実質的に上回らない、随意に、それより小さい、体液サンプル収集デバイス。
３２．  第２の体積が、第１の体積の約１００％以下；第１の体積の約９０％以下；第１の体積の約８０％以下；第１の体積の約７０％以下；第１の体積の約６０％以下；第１の体積の約５０％以下；第１の体積の約４０％以下；第１の体積の約３０％以下；第１の体積の約２０％以下；第１の体積の約９０％；第１の体積の約８０％；第１の体積の約７０％；第１の体積の約６０％；第１の体積の約５０％；第１の体積の約４０％；第１の体積の約３０％；第１の体積の約２０％；第１の体積の約３の１；第１の体積の約４分の１から選択される少なくとも１つによって規定される、項目３１に記載の体液サンプル収集デバイス。
３３．  第１の体積は、約０．５ｍｌ〜約２．２５ｍｌ、約０．７５ｍｌ〜約２．２５ｍｌ、約１ｍｌ〜約２ｍｌ、約１ｍｌ〜約１．５ｍｌ、約１ｍｌのうちの少なくとも１つによって規定される、項目３１または３２に記載のデバイス。
３４．  第１の体積は、約１ｍｌであり、第２の体積は、約２５０μｌである、項目３１、３２、または３３に記載のデバイス。
３５．  自然に発現された体液のサンプルを受容するためのコンテナと、収集されたサンプル中の核酸を抽出して保存するための組成物を含有するチャンバとを備える、自然に発現された体液のサンプルの収集のための、随意に、項目３０〜３４のいずれかに記載の体液サンプル収集デバイスであって、組成物の体積は、約１００μｌ〜約１ｍｌ、少なくとも約１００μｌおよび１ｍｌ未満、約２５０μｌ〜約７５０μｌ、少なくとも約１００μｌ、少なくとも約２５０μｌ、少なくとも約５００μｌ未満、１ｍｌ未満、約７５０μｌ未満、約５００μｌ未満、約１００μｌ、約２５０μｌ、約５００μｌ、または約７５０μｌから選択される、少なくとも１つによって規定される、体液サンプル収集デバイス。
３６．  自然に発現された体液のサンプル中の核酸を抽出して保存するための項目１〜２９のいずれかに記載の組成物のサンプル収集デバイスにおける使用。
３７．  家庭で使用するためのサンプル収集デバイスを使用する、ミトコンドリアＤＮＡの抽出および保存のためのプロセスにおけるプロテイナーゼＫの使用。
【０２８０】
本開示の種々の側面が上記で強調されているが、これは、本開示の範囲を限定しない。それが強調されているかどうかにかかわらず、保護が、本明細書に説明されるおよび／または図面に図示される任意の新規の特徴ならびに／もしくは概念のために請求される。
【０２８１】
付属書類１に関する非限定的実施形態が、付随の図面の４、５、および８を参照して、一例のみとして以下で説明される。
【０２８２】
図４および５を参照すると、家庭での使用に好適であり得るか、または少なくとも研究室を訪問する必要がないタイプのサンプル収集デバイス１０が、描写されている。サンプル収集デバイス１０は、例えば、ユーザが自然に発現された体液のサンプルを提供するために、携帯用であり得るか、および／または（例えば、郵便配達もしくは宅配を介して）家にいるユーザに提供されてもよい。体液は、例えば、唾液または尿であってもよい。以下の説明は、唾液に焦点を当てるが、同一の原理が、尿に、または別の自然に発現された体液に適用され得ることが理解され得る。
【０２８３】
付属書類１の図示される実施例では、組成物１２が、収集された体液サンプル中の核酸を抽出および／または保存するために提供される。使用時に、組成物は、例えば、本デバイスを密閉するようにそれを閉鎖する際に、収集された体液サンプルと混合させられることを意図している。次いで、デバイス１０は、発送者に返送されてもよいか、または分析、例えば、遺伝分析のために、収集代理人もしくは研究室に発送されてもよい。
【０２８４】
組成物１２の機能は、体液サンプルから核酸を抽出すること、および／または抽出された核酸（もしくは体液サンプル）を保存することであってもよい。核酸は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡであってもよい。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、組成物１２は、細胞小器官（例えば、ミトコンドリア）を溶解させ、および／または抽出された細胞小器官核酸を保存するために効果的であり得る。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、組成物１２は、収集されたサンプル中のＤＮＡの変異、損傷、または他の分解を回避し、または低減させ、それによって、分析のためにデバイスが返送されるための十分な時間を提供し得る。組成物１２は、室温、または少なくとも１週間、随意に、少なくとも２週間、随意に、少なくとも３週間、随意に、少なくとも１ヶ月、もしくはさらに長い周期で、抽出された核酸を保存するために効果的であり得る。
【０２８７】
組成物１２は、液体であってもよい。組成物の実施例のさらなる詳細が、以降に以下で議論される。
【０２８８】
組成物１２は、随意に、デバイスの内部チャンバ１４の中に貯蔵され、例えば、ユーザがデバイスを密閉するか、またはデバイス１０の特定の他の操作を行うときに、収集された体液サンプルと混合するように放出されてもよい。
【０２８９】
図４および５は、収集デバイス１０の２つの代替実施例を図示する。デバイス１０は、概して、口１８を有し、口１８を通してデバイスに導入される自然に発現された体液のための収集領域２０を画定する、第１の本体（例えば、管）１６を備えてもよい。デバイス１０はさらに、提供されたサンプルが導入された後にデバイス１０を密閉するように、口１８に取付可能であるか、またはその上の第２の本体（例えば、密封装置）２２を備えてもよい。図４の実施例では、保存溶液１２を含有するチャンバ１４は、第２の本体（例えば、密封装置）２２の中に提供される。図５の実施例では、組成物を含有するチャンバ１４は、第１の本体（例えば、管）１６の中に提供される。いずれの実施例でも、チャンバ１４は、収集領域２０と連通するために、機構（２４で概略的に示される）によって開放されるように構成される。開放機構２４は、第１の本体（例えば、管）１６への第２の本体（例えば、密封装置）２２の嵌合、またはデバイス１０の特定の他の手動操作に応答し得る。内部閉鎖またはキャップの解放、タップの開放、壊れやすい壁の断裂、内部カバーの除去もしくは変位、キャップまたはナットの相対的回転から選択される、１つまたはそれを上回るものを含むが、それに限定されない、種々の機構２４が構想される。
【０２９０】
随意に、デバイス１０および開放機構２４の例示的構造のさらなる詳細が、参照することによって本明細書に組み込まれる、前述の国際公開第ＷＯ２０１２／１７７６５６および国際公開第ＷＯ２０１５／１１２４９６で提供される。
【０２９１】
デバイス１０は、自然に発現された体液の所定のサンプル体積「Ｖｓ」の収集のために構成されてもよい。本デバイスは、例えば、所定のサンプル体積Ｖｓが達成されたときを示すように、視覚充填スケールまたは充填線（例えば、２６で示される）もしくは他の印を含んでもよい。いくつかの実施形態では、サンプル収集空間は、所定の体積Ｖｓに等しいサイズを有してもよいか、またはサンプル収集空間は、体積がより大きくてもよい。一例のみとして、所定の体積Ｖｓは、いくつかの実施形態では、少なくとも約１ｍｌ、または少なくとも約２ｍｌ、または少なくとも約３ｍｌ、または少なくとも約４ｍｌ、または少なくとも約５ｍｌ、またはより多くであり得る。一例のみとして、所定の体積Ｖｓは、いくつかの実施形態では、約５ｍｌ以下、または約４ｍｌ以下、または約３ｍｌ以下、または約２ｍｌ以下、または約１ｍｌ以下であり得る。一例のみとして、いくつかの実施形態では、所定の体積Ｖｓは、いくつかの実施形態では、約１ｍｌ〜約５ｍｌ、随意に、約１ｍｌ〜約４ｍｌ、随意に、約１ｍｌ〜約３ｍｌ、随意に、約１ｍｌ〜約２ｍｌであり得る。一例のみとして、所定の体積Ｖｓは、いくつかの実施形態では、約１ｍｌ、または約２ｍｌ、または約３ｍｌ、または約４ｍｌ、または約５ｍｌであり得る。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、保存溶液１２の体積「Ｖｃ」は、所定のサンプル体積Ｖｓより実質的に大きくなくてもよいか、または随意に、それより小さくてもよい。一例のみとして、組成物体積Ｖｃは、いくつかの実施形態では、Ｖｓの約１００％以下、またはＶｓの約９０％以下、またはＶｓの約８０％以下、またはＶｓの約７０％以下、またはＶｓの約６０％以下、またはＶｓの約５０％以下、またはＶｓの約４０％以下、またはＶｓの約３０％以下、またはＶｓの約２０％以下であり得る。一例のみとして、組成物体積Ｖｃは、いくつかの実施形態では、Ｖｓの約１００％、またはＶｓの約９０％、またはＶｓの約８０％、またはＶｓの約７０％、またはＶｓの約６０％、またはＶｓの約５０％、またはＶｓの約４０％、またはＶｓの約３０％、またはＶｓの約２０％であり得る。一例のみとして、組成物体積Ｖｃは、いくつかの実施形態では、Ｖｓの約３分の１、またはＶｓの約４分の１であり得る。組成物体積Ｖｃは、チャンバ１４を充填するためにチャンバ１４の内部空間と同一であってもよいか、または組成物体積Ｖｃは、より小さくあってもよく、チャンバ１４を部分的に充填する。
【０２９３】
組成物体積Ｖｃを所定のサンプル収集体積Ｖｓより実質的に大きくしないか、または随意に、それより小さくすることによって、保存溶液１２を収集されたサンプルと混合するときの体積増加は、等しく小さくあり得る。体積増加は、単位体積あたりのＤＮＡ濃度に関してサンプルの希釈と等価であり得る。図８は、組成物体積Ｖｃに依存する、単位体積あたりのＤＮＡサンプル濃度への希釈の影響を概略的に図示する。水平軸は、１／１〜５／１の比Ｒ＝Ｖｓ／Ｖｃの範囲（またはＲ＝１〜５）にわたって、組成物体積Ｖｃに対するサンプル体積Ｖｓの比Ｒを表す。垂直軸は、当初のサンプル体積と比較して、組成物体積と混合した後の単位体積あたりのＤＮＡ濃度の割合を表す。値は、関数Ｖｓ／（Ｖｓ＋Ｖｃ）として変動し、組成物体積による希釈と等価である。
【０２９４】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、比Ｖｓ／Ｖｃは、約１／１（またはＲは約１）であってもよい。図８では、そのような組成物体積Ｖｃが、単位体積あたりのＤＮＡ濃度を、著しく十分である当初の量の５０％まで低減させることが分かり得る。しかしながら、（組成物体積Ｖｃに対するサンプル体積Ｖｓのより大きい比と等価である）より小さい組成物体積Ｖｃを使用することによって、単位体積あたりのＤＮＡの濃度が、１／１比の実施形態と比較して増加させられ得ると考えられる。例えば、２／１（Ｒ＝２）のサンプル体積Ｖｓ対組成物体積Ｖｃ比に等しいサンプル体積の半分の組成物体積を使用すると、ＤＮＡの濃度は、例えば、元の量の最大６６％だけ増大させられ得ると考えられ、これは、１／１比の実施形態と比較して３０％の改善である。３／１（Ｒ＝３）のサンプル体積Ｖｓ対組成物体積Ｖｃ比に等しいサンプル体積Ｖｓの３分の１の組成物体積Ｖｃを使用すると、ＤＮＡの濃度は、例えば、元の量の最大７５％だけ増大させられ得ると考えられ、これは、１／１比の実施形態と比較して５０％の改善である。４／１（Ｒ＝４）のサンプル体積Ｖｓ対組成物体積Ｖｃ比に等しいサンプル体積Ｖｓの４分の１の組成物体積Ｖｃを使用すると、ＤＮＡの濃度は、例えば、元の量の最大８０％だけ増大させられ得ると考えられ、これは、１／１比の実施形態と比較して６０％の改善である。
【０２９５】
単位体積あたりの望ましく高いＤＮＡ濃度を達成することは、下流分析のための重要な利点を提供し得る。第１に、現代の自動検査手順は、小さいサンプル体積のみを使用する傾向がある。抽出および保存後に、小さい体積のサンプルさえも良好な濃度のＤＮＡを含有することを確実にすることは、自動検査から利益を得ることができるために重要である。第２に、収集されたサンプルでは、ミトコンドリアＤＮＡは、はるかに優勢な核ＤＮＡと比較して、濃度がはるかにわずかである。単位体積あたりのＤＮＡの全体的濃度を向上させることは、そのようなわずかなＤＮＡに対する自動検査の感度を増加させることに役立つ。これは、現在市販されているデバイスを使用して可能ではないことが理解される、比較的単純な収集デバイスの中で収集されるサンプルの自動検査を使用して、ミトコンドリアＤＮＡの検出を可能にすることに寄与し得る。
【０２９６】
一つの具体的な例では、所定のサンプル体積Ｖｓは約２ｍｌであり得、組成物体積Ｖｃは約２ｍｌであり得る。別の具体的な例では、所定のサンプル体積Ｖｓは約１ｍｌであり得、組成物体積Ｖｃは約１ｍｌであり得る。別の具体的な例では、所定のサンプル体積Ｖｓは約１ｍｌであり得、組成物体積Ｖｃは約２５０μｌであり得る。
【０２９７】
上記のいずれかに対して付加的または代替的に、かつ、一例のみとして、組成物体積Ｖｃは、いくつかの実施形態では、約１００μｌ〜約１ｍｌを含めて（または随意に１ｍｌ未満）あり得る。付加的または代替的に、組成物体積Ｖｃは、随意に、少なくとも約１００μｌ、随意に、少なくとも約２５０μｌ、随意に、少なくとも約５００μｌであり得る。付加的または代替的に、組成物体積は、随意に、約１ｍｌ、随意に、１ｍｌ未満、随意に、約７５０μｌ未満、随意に、約５００μｌ未満であり得る。一例のみとして、組成物体積Ｖｃは、いくつかの実施形態では、約１００μｌ、または約２５０μｌ、または約５００μｌ、または約７５０μｌであり得る。
【０２９８】
組成物１２の活性成分の濃度は、小さい組成物体積Ｖｃを使用することを補償するように、適宜、変動させられてもよい。例えば、基準の約半分の組成物体積Ｖｃを使用するとき、組成物１２の活性成分の濃度は、基準組成物１２の活性成分の濃度と比較して、２倍またはそれを上回ってもよい。活性成分の組成物を変動させることは、より小さい組成物体積Ｖｃにもかかわらず、少なくとも同一の（またはより良好な）抽出および保存能力を提供することができる。成分濃度のさらに詳細な説明が、以降で議論される。
【０２９９】
小さい組成物体積Ｖｃ（例えば、サンプル体積Ｖｓより実質的に大きくないか、または随意に、それより小さい）を使用することによって希釈を低減させる上記の特徴に加えて、または代替として、本開示のさらなる特徴は、組成物１２の構成要素に関し得る。構成要素に関する、これらの特徴は、組成物体積Ｖｃに対するサンプル体積Ｖｓの比に関係なく使用されてもよいが、比は、組成物中の構成要素の好適な濃度を判定するために有用であり得る。
【０３００】
いくつかの実施形態では、組成物は、以下から選択される、いずれか１つまたはそれを上回るものを含んでもよい。
（ｉ）そこから核酸を解放するように細胞および／または細胞小器官を溶解させるための少なくとも１つの細胞ならびに／もしくは細胞小器官溶解剤。好適な溶解剤は、１つまたはそれを上回る界面活性剤、および／もしくは１つまたはそれを上回る洗剤、および／もしくは１つまたはそれを上回る塩を含んでもよい。例示的界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であってもよいが、加えて、または代替として、他の界面活性剤が使用されてもよい。例示的洗剤は、トリトン（例えば、トリトン−Ｘ、トリトン１００、トリトン−Ｘ１００）、および／またはデオキシコール酸塩（例えば、デオキシコール酸ナトリウム）であってもよいが、加えて、または代替として、他の洗剤が使用されてもよい。例示的塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、および／または塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、ならびに／もしくは塩化カリウム（ＫＣｌ）から選択されてもよいが、加えて、または代替として、他の塩が使用されてもよい。付加的界面活性剤および／または洗剤が、以下でさらに説明される。誤解を避けるために、文脈が許可する場合、「界面活性剤」および「洗剤」という用語は、同義的に使用されてもよく、同義的に読み取られることを意図している。また、界面活性剤または洗剤が名前で記述される場合、範囲は、任意の誘導体（例えば、市販の誘導体）を同等に網羅することを意図している。
【０３０１】
界面活性剤および／または洗剤は、膜を破るように細胞ならびに膜成分を可溶化することができる。塩は、オスモル濃度を調整することができる。
【０３０２】
いくつかの実施形態では、（例えば、上記から選択される）少なくとも２つの溶解剤が、組み合わせて使用され、随意に、（例えば、上記から選択される）少なくとも３つの溶解剤が、組み合わせて使用される。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、（組成物１２および／またはサンプルと組み合わせられたときの組成物１２の組み合わせの中の）塩濃度は、少なくとも２５０ｍＭ、随意に、２５０ｍＭを上回り得る。本塩濃度は、総塩濃度、または少なくとも１つもしくはそれを上回る主要塩成分の濃度であってもよい。いくつかの実施形態では、本塩濃度は、少なくとも３００ｍＭ、随意に、３００〜７５０ｍＭの範囲内であってもよい。そのような濃度は、従来使用されるであろうよりも高く、組成物１２の細胞小器官溶解能力に寄与し得る。
【０３０４】
いくつかの実施形態では、イオン性界面活性剤および／または洗剤（例えば、ＳＤＳ）と組み合わせて非イオン性界面活性剤および／または洗剤（例えば、トリトン）を使用することが有益と考えられる。イオン性ならびに非イオン性界面活性剤および／または洗剤は、相互を緩衝し、（例えば、前の段落のように）比較的高い塩濃度でさえも望ましくミセルを形成するように、界面活性剤の凝集を安定させてもよい。例えば、トリトンは、そうでなければ比較的高い塩濃度で起こり得るＳＤＳの沈降の危険性を防止するか、または低減させる、ＳＤＳへの安定化効果を有し得る。加えて、または代替として、例えば、ＳＤＳは、比較的高い塩濃度の存在下でさえもトリトンミセルの形成を安定させ得る。
【０３０５】
イオン性ならびに非イオン性界面活性剤および／または洗剤の組み合わせの安定化効果は、以下によって説明され得るが、これは、本開示の範囲をいかようにも限定することを意図していないと考える。いくつかの実施形態では、組成物は、（ｉ）界面活性剤／洗剤および（ｉｉ）塩成分を両方とも含んでもよい。洗剤は、界面活性剤であり、それらは、細胞膜を破壊するために使用され、したがって、細胞溶解を支援し、可溶形態で細胞内物質の放出を促進する。洗剤は、タンパク質・タンパク質、タンパク質・脂質、および脂質・脂質会合を破壊する。さらに、洗剤は、タンパク質および種々の他の高分子を変性させ、免疫化学アッセイの非特異的結合およびタンパク質結晶化を防止する。
【０３０６】
溶液中で溶解させられた界面活性剤／洗剤は、いわゆるミセルを形成するように凝集する傾向があり得る。特定濃度における全ての洗剤は、ミセルを形成し、この濃度は、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）と称される。いったんＣＭＣに達すると、洗剤単量体がミセルを形成する。ＣＭＣより高い濃度で、ミセルおよび単量体は両方とも、水中で可溶性でないかもしれない、他の非ミセル相とともに溶液中に存在する。
【０３０７】
イオン性界面活性剤／洗剤（例えば、ＳＤＳ）は、イオン性ミセルを形成する。これらのミセルが（単独である場合）、高い塩濃度に暴露されるとき、ミセルが破壊し、ＳＤＳが溶液から凝結して沈降し、溶液内で所望の効果を有さない。
【０３０８】
トリトンＸは、別の洗剤であるが、ＳＤＳが、イオン性である一方で、トリトン−ｘは、非イオン性である。ＳＤＳおよびトリトンが両方とも溶液中で溶解させられるとき、ミセル集団は、イオン性（ＳＤＳ）および非イオン性（トリトン）ミセルの両方のうちの１つであり、混合ミセル集団と見なされる。本混合ミセル集団は、塩濃度へのはるかに高い耐性を有し、非イオン性ミセルは、イオン性ミセルへの塩の影響を緩衝する。
【０３０９】
温度、ｐＨ、および塩濃度はそれぞれ、溶液のＣＭＣに影響を及ぼし得る（それぞれの詳細な説明については以下を参照）。したがって、上記のうちのいずれかを改変することは、沈殿物の形成につながり得る。ミセルを形成するために必要とされる洗剤の濃度は、特異的である。本明細書で議論される例示的緩衝液は、臨界ミセル濃度を減少させ、したがって、ＣＭＣを劇的に超え、相補的イオン性／非イオン性界面活性剤の存在がなければ凝結して沈降するように、ＳＤＳの沈降の危険を冒す、ＮａＣｌの形態で付加的ナトリウムを含有する。
【０３１０】
ＳＤＳおよびトリトンＸの組み合わせは、ＣＭＣを低下させ、より大きい混合イオン性／非イオン性ミセルの形成につながることに関して、相乗的である。２つの洗剤の濃度および比は、ミセルの安定性を判定することに役割を果たす。したがって、これらの混合洗剤ミセルは、高塩濃度塩緩衝液中でより安定し、したがって、ＳＤＳのいかなる沈降も防止し得る。ＳＤＳおよびトリトン−Ｘの組み合わせは、おそらく、増進した安定性を伴う、より大きい混合ミセル、ならびに（ＮａＣｌ濃度に起因する）より優れた水分子会合を形成し、ＳＤＳ沈降の欠如にともに寄与している。
【０３１１】
相乗的に、ＮａＣｌの存在はまた、ＣＭＣを低減させ、形成されるミセルのサイズを増加させること、およびミセルと非特異的に結合される、より多数の水分子によって、トリトン−Ｘのミセル形成を生じさせてもよい。これはまた、本明細書に開示される原理によると、混合ミセル集団（すなわち、イオン性ミセルの付加）によって緩衝され得ることが考えられる。
【０３１２】
使用され得、生物学的活性を改変しない、他の洗剤は、２％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＮＰ４０、デオキシコール酸塩０．１〜１％を含む。
【０３１３】
以下は、例示的洗剤の２つの非限定的な表である。表１は、洗剤のカテゴリを列挙し、表２は、本明細書に説明されるような各洗剤の例示的用途を列挙する。
【表１】
2018506727.tif 000015
【０３１４】
【表２】
2018506727.tif 000016
【０３１５】
（ｉｉ）例えば、トリスおよび／またはメチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むか、もしくはそれから成る、緩衝剤。トリスおよびＥＤＴＡの組み合わせは、溶液を緩衝し、マグネシウムを排除することができる（ＤＮＡアーゼを阻害する）。この組み合わせは、塩基性ＤＮＡ貯蔵緩衝液を提供することができる。ＥＤＴＡは、（所望に応じて）ＲＮＡを分解することができる。
【０３１６】
いくつかの実施形態では、サンプルおよび組成物のｐＨは、ともに混合した後、例えば、約７．４〜約８のわずかに塩基性であり得る。（例えば、サンプルと混合することに先立った）組成物１２単独のｐＨは、より高くあり得る。組成物１２単独のｐＨは、少なくとも約８、随意に、８を上回り、例えば、約８．３であってもよい。
【０３１７】
（ｉｉＩ）タンパク質および／またはＤＮＡアーゼを遮断する少なくとも１つの化学阻害剤ならびに／もしくは変性剤。好適な阻害剤および／または変性剤は、２−メルカプトエタノール、Ｃａ２＋イオン、エチエレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、メチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ヨード酢酸、尿素から選択される、１つまたはそれを上回るものを含んでもよい。
【０３１８】
上記のように、ＥＤＴＡは、ＤＮＡアーゼンクレアーゼの補因子であるＭｇ２＋等の二価陽イオンのキレート剤である。いくつかの実施形態では、ＥＤＴＡは、同時に緩衝剤および変性剤としての機能を果たす。
【０３１９】
（ｉｖ）タンパク質を排除するためのプロテイナーゼＫ。プロテイナーゼＫは、ＳＤＳと組み合わせるて、より効果的であり得る。例えば、プロテイナーゼＫは、変性させられたタンパク質に対して最大約１０倍効果的であり得、ＳＤＳは、タンパク質変性剤として効果的である。プロテイナーゼＫは、ＳＤＳまたはＥＤＴＡ、溶液中のもしくは他の化学物質およびタンパク質阻害剤によって阻害されることを回避し得る。プロテイナーゼＫの長期安定性が問題と見なされる、いくつかの実施例では、これは、概して、組成物１２中のプロテイナーゼＫの量を増加させることによって克服されることができ、それによって、経時的な予期される部分損失を事前に補償する。一例のみとして、組成物１２中、および／またはともに混合した後の組成物１２ならびにサンプルの組み合わせの中のプロテイナーゼＫの量は、約３０〜７０ｍｇ／ｍｌ、随意に、約４０〜６０ｍｇ／ｍｌ、随意に、約５０ｍｇ／ｍｌであってもよい。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、総塩濃度は、約３０００ｍＭ未満、随意に、約２０００ｍＭ未満、随意に、約１０００ｍＭ未満、随意に、約７５０ｍＭ未満、随意に、約５００ｍＭ未満であってもよい。塩濃度は、（例えば、ＥＤＴＡを含む）組成物１２中の全ての塩成分の間で付加的であり得る。過剰に高い総塩濃度は、遺伝分析のための収集および保存されたサンプルの以降の処理においてＤＮＡを単離する能力を制約し得る。塩濃度は、唾液と混合させられたときに参照される濃度、または組成物単独の濃度であってもよい。
【０３２１】
組成物１２の１つの具体的実施例は、トリス、ＳＤＳ、トリトン、ＮａＣｌ、およびＥＤＴＡを含んでもよい。随意に、組成物は、プロテイナーゼＫ、デオキシコール酸ナトリウム、尿素から選択される、１つまたはそれを上回るものを含んでもよい。一実施例では、ともに混合させられた組成物１２および唾液サンプルの両方の組み合わせで判定される、構成要素の相対濃度は、以下の表３の通りであってもよい。
【表３】
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【０３２２】
濃度は、個別に、かつ独立して、本具体的実施例の範囲内で、最大５％、随意に、最大１０％、随意に、最大２０％変動させられてもよい。
【０３２３】
上記のように、濃度は、組成物１２および唾液サンプルを両方とも含有する溶液中の所望の濃度である。組成物１２単独中の構成要素の濃度は、本明細書で以前に説明されたように、組成物体積Ｖｃに対するサンプル体積Ｖｓの比Ｒ（Ｒ＝Ｖｓ／Ｖｃ）に依存し得る。濃度は、（Ｒ＋１）または（（Ｖｓ／Ｖｃ）＋１）の濃度乗数に従って変動してもよい。一般的値およびいくつかの具体的実施例が、以下の表４に図示される。
【表４】
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【０３２４】
再度、濃度は、個別に、かつ独立して、これらの具体的実施例の範囲内で、最大５％、随意に、最大１０％、随意に、最大２０％変動させられてもよい。
【０３２５】
本開示はまた、その範囲内で、以下も企図する。
（ａ）０％まで（ＳＤＳを省略する）を含む、ＳＤＳの割合を変動させるステップ。
（ｂ）０％まで（トリトンを省略する）を含む、トリトンの割合を変動させるステップ。
（ｃ）ＮａＣｌの代用として（ＮａＣｌを省略する）、もしくは相補体としてＮａＣｌと組み合わせてのいずれかで、ＫＣｌおよび／またはＬｉＣｌ（緩衝液のイオン性強度を維持する塩）を添加するステップ。
（ｄ）個別および／または総塩濃度を変動させるステップ。
（ｅ）例えば、上記で説明されるような数量で、プロテイナーゼＫを添加するステップ。
（ｆ）膜および細胞成分を可溶化することが可能な生物学的洗剤であり、細胞小器官溶解を増加させ得る、０．１〜１％のデオキシコール酸ナトリウムを添加するステップ。デオキシコール酸ナトリウムは、ＳＤＳおよび／またはトリトンを代替するために使用されてもよい、もしくは両方と組み合わせて使用されてもよい。ＳＤＳおよび／またはトリトンの相対的割合もまた、変動させられてもよい。（例えば、上記で引用される範囲は、唾液と混合させられたときの組成物を参照し得る。濃度は、本明細書に説明される因数Ｒ＋１に従って、組成物単独中で増加させられてもよい。）
（ｇ）尿素を添加するステップ。尿素は、タンパク質変性を増加させ、細胞溶解を増加させてもよい。ＳＤＳおよび／またはトリトンならびに／もしくは他の変性剤の割合は、変動させられてもよい。
（ｈ）ＳＤＳおよび／またはトリトンに加えて、もしくはそれの代替物として、１つまたはそれを上回る他のイオン性ならびに／もしくは非イオン性界面活性剤および／または洗剤を使用するステップ。
【０３２６】
所望に応じて、意図された用途によると、組成物１２はさらに、エタノールを含んでもよい。代替として、所望に応じて、組成物１２は、実質的にエタノールを含まなくてもよい。
【０３２７】
いくつかの実施形態では、組成物１２は、細胞小器官から核酸を抽出して保存することに効果的である。細胞小器官は、例えば、ミトコンドリアであってもよい。
【０３２８】
ミトコンドリアＤＮＡを抽出して保存することは、困難であることが公知である。ミトコンドリアＤＮＡは、従来の溶解技法による変異の影響を高度に受けやすく、核ＤＮＡと比較して、濃度が非常にわずかである。これは、特に、家庭で使用するためのタイプのサンプル収集デバイスを使用して、下流分析のためにそのようなＤＮＡを十分な数量で抽出して損傷されていない状態で保存しにくくさせる。家庭で使用するためのサンプル収集デバイスと異なる研究室環境では、ミトコンドリアＤＮＡを取得するための一般知識は、ミトコンドリアＤＮＡへの損傷の危険性を低減させるよう、有意な環境的影響を提示しない制御された条件下で、非常にゆっくりと繊細に細胞を溶解させることである。
【０３２９】
本開示のいくつかの実施形態は、異なるアプローチを提示する。それぞれ、提案された用途の高い範囲内で、複数の溶解剤、例えば、少なくとも２つの溶解剤、随意に、少なくとも３つの溶解剤、またはそれを上回る溶解剤を組み合わせて使用することによって、細胞膜だけではなく、細胞小器官膜もまた、細胞小器官から核酸を迅速に解放するように溶解させられ得、それによって、溶解損傷が起こり得る時間を短縮することが考えられる。
【０３３０】
加えて、または代替として、それぞれ、提案された用途の高い範囲内で、複数の化学阻害剤および／または変性剤、例えば、少なくとも２つのそのような薬物、随意に、少なくとも３つのそのような薬物を組み合わせて使用することによって、抽出された核酸が周辺環境物質による損傷から迅速に保護されることができ、それによって、損傷される細胞小器官ＤＮＡの量を低減させることが考えられる。
【０３３１】
上記の技法の両方は、細胞小器官ＤＮＡへの有意な環境的影響を提示しない制御された条件下での低速かつ繊細なアプローチという従来の研究室知識と比較して、驚くべき利点を提供する。上記の技法を組み合わせて使用することは、驚くべき有効性を提供することができる。
【０３３２】
本明細書に説明される組成物は、細胞成分を抽出するように細胞物質を溶解させるための多くの異なる用途で使途を見出し得る。好ましい実施形態が、ＤＮＡ抽出、例えば、細胞小器官ＤＮＡ抽出との関連で説明されるが、組成物は、そのような使途のみに限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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