(57)【要約】  本発明は、試料中の逆転写酵素活性を有するウイルス粒子またはウイルス様粒子の存在を検出するための方法及びキット、ならびにレトロウイルス汚染物質を含まない物質を調製するための方法に関する。本発明の１つの態様は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）原薬の試料中のウイルス粒子の存在を検出するための方法であって、プロテアーゼで処理したＶＬＰ原薬の試料に、ＰＣＲに基づく逆転写酵素（ＰＢＲＴ）を行う工程を含む、方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験試料中のウイルス粒子に含まれる逆転写酵素活性の存在を検出するための方法であって、
（１）前記試験試料にプロテアーゼを添加し、前記プロテアーゼが得られた溶液中に存在するいずれかの可溶性逆転写酵素を消化することを可能にする条件下で、前記得られた溶液をインキュベートし、それによって消化溶液を生成する工程と、
（２）前記消化溶液中の前記プロテアーゼを不活性化し、それによって不活性化プロテアーゼ溶液を生成する工程と、
（３）インタクトなウイルス粒子を破壊するのに十分な量の界面活性剤を添加し、それによって界面活性剤を含む溶液を生成する工程と、
（４）前記界面活性剤を含む溶液または前記界面活性剤を含む溶液の画分に、単離されたＲＮＡ分子、前記単離されたＲＮＡ分子の第１の部分に対応する核酸配列にハイブリダイズする第１のプライマー、前記単離されたＲＮＡ分子の第２の部分の相補体にハイブリダイズする第２のプライマー、及びＤＮＡポリメラーゼを添加し、それによってＰＣＲに基づく逆転写酵素（ＰＢＲＴ）アッセイ溶液を調製する工程と、
（５）ウイルス粒子に含まれる逆転写酵素活性が前記試験試料中に存在する場合、逆転写産物が前記単離されたＲＮＡ分子から合成され、ＰＣＲ増幅産物が前記逆転写産物から合成されることを可能にする条件下で、前記ＰＢＲＴアッセイ溶液をインキュベートする工程と、
（６）前記ＰＣＲ増幅産物を同定し、それによって前記試験試料中の前記ウイルス粒子に含まれる逆転写酵素の存在を検出する工程と、を含む、方法。
【請求項２】
前記単離されたＲＮＡ分子に対応する核酸配列にハイブリダイズする単離された核酸プローブが、工程（３）の後または工程（４）の間に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試験試料を緩衝液で希釈する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試験試料を、前記緩衝液で約１倍〜２０倍に希釈する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記試験試料を前記緩衝液で約１０倍に希釈する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記界面活性剤の濃度が約０．００２％未満であるように、インタクトなウイルス粒子を破壊するのに不十分な量で工程（１）の間に界面活性剤を添加する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記界面活性剤を含む溶液または前記ＰＢＲＴアッセイ溶液中の前記界面活性剤の濃度が約０．１％〜０．３％であるように、工程（３）の間に前記界面活性剤が添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記界面活性剤が、Ｂｒｉｊ−３５、Ｂｒｉｊ−５８、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ＮＰ−４０、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ＳＤＳ、デオキシコール酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、Ｔｗｅｅｎ  ２０、及びＴｗｅｅｎ  ８０からなる群から選択される、請求項１、６、または７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記プロテアーゼが、ブロメライン、カスパーゼ、カテプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、エンドプロテイナーゼＡｓｐＮ、エンドプロテイナーゼＧｌｕＣ、エンテロキナーゼ（エンテロペプチダーゼ）、第Ｘａ因子、フューリン、パパイン、ペプシン、プロテイナーゼＫ、スブチリシン、トロンビン、及びトリプシンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記プロテアーゼがプロテイナーゼＫである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プロテアーゼを不活性化する前記工程が、少なくとも１つのプロテアーゼ阻害剤を添加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのプロテアーゼ阻害剤が、ＡＥＢＳＦ−ＨＣｌ、アプロチニン、ベスタチン、Ｅ−６４、ＥＤＴＡ、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記プロテアーゼ阻害剤がＰＭＳＦである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程（３）の前に前記不活性化プロテアーゼ溶液を濃縮する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記不活性化されたプロテアーゼ溶液を濃縮する前記工程が、遠心分離、透析、沈殿、またはカラム通過のうちの１つ以上を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記不活性化プロテアーゼ溶液を濃縮する前記工程が、前記不活性化プロテアーゼ溶液を、スクロースクッションを介した高速遠心分離に供することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも第２の試料を得て、工程（１）〜（６）に従って処理する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも第２の試料を得て、工程（２）〜（６）、（３）〜（６）、または（４）〜（６）に従って処理する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
可溶性逆転写酵素を含む陽性対照試料を得て、工程（１）〜（６）に従って処理する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記陽性対照試料が前記試験試料を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
可溶性逆転写酵素を含む陽性対照試料を得て、工程（２）〜（６）、（３）〜（６）、または（４）〜（６）に従って処理する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記陽性対照試料が前記試験試料を含む、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記可溶性逆転写酵素が組換え逆転写酵素である、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記組換え逆転写酵素がトリ骨髄芽球症ウイルスαβホロ酵素（ＡＭＶ  ＲＴ）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
逆転写酵素を含む粒子が添加された陽性対照試料を得て、工程（１）〜（６）に従って処理する、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記陽性対照試料が前記試験試料を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
逆転写酵素を含む粒子が添加された第４の陽性対照試料を得て、工程（２）〜（６）、（３）〜（６）、または（４）〜（６）に従って処理する、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記陽性対照試料が前記試験試料を含む、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記逆転写酵素を含む前記粒子がマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）である、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
試料を得て、工程（１）〜（６）に従うが、工程（４）において単離されたＲＮＡ分子を添加することなく処理し、それによって陰性対照試料を生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記陰性対照試料が前記試験試料を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
第６の試料を得て、工程（２）〜（６）、（３）〜（６）、または（４）〜（６）に従うが、工程（４）において単離されたＲＮＡ分子を添加することなく処理し、それによって陰性対照試料を生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記陰性対照試料が前記試験試料を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記単離された核酸プローブが検出可能な標識を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３６】
前記検出可能な標識が、ビオチン、コロイド粒子、ジゴキシゲニン、高電子密度試薬、酵素、蛍光色素、ハプテン、磁気ビーズ、金属ビーズ、及び放射性同位体からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記検出可能な標識が蛍光色素である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記蛍光色素が、６−ＦＡＭ、ＡＢＹ（登録商標）、アクリジン、アレクサフルーア（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）４８８、アレクサフルーア５３２、アレクサフルーア５９４、アレクサフルーア６３３、アレクサフルーア６４７、バイオサーチブルー（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ  Ｂｌｕｅ）、クマリン、Ｃｙ（登録商標）３、Ｃｙ（登録商標）３．５、Ｃｙ（登録商標）５、Ｃｙ（登録商標）５．５、ＦＡＭ（商標）、ＦＩＴＣ（登録商標）、ＧＰＦ（及びその変種）、ＨＥＸ（商標）、ＪＯＥ（商標）、ＪＵＮ（登録商標）、マリーナブルー（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ）、ＮＥＤ（商標）、オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ）４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）、ＰＥＴ（登録商標）、パルサー（Ｐｕｌｓａｒ）（登録商標）、クエザー（Ｑｕａｓａｒ）（登録商標）５７０、クエザー（登録商標）６７０、クエザー（登録商標）７０５、ローダミングリーン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ）、ローダミンレッド（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ）、ＲＯＸ（商標）、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン、ＴＡＭＲＡ（商標）、ＴＥＴ（商標）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）（登録商標）、ＴＲＩＴＣ、及びＶＩＣ（登録商標）からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記単離されたＲＮＡ分子が、インビトロで転写されたＲＮＡ分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記インビトロで転写されたＲＮＡ分子が工程（４）において添加される場合、実質的にＤＮＡは同時に添加されない、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記インビトロで転写されたＲＮＡ分子を、工程（４）の前にＤＮアーゼと接触させる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記試験試料がウイルス様粒子（ＶＬＰ）原薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＶＬＰ原薬がノロウイルスＶＬＰ原薬である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ノロウイルスがノーウォークウイルスである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記単離されたＲＮＡ分子が、配列番号１の配列を有するデング熱ウイルス４型ゲノムの断片と少なくとも約９５％同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
前記単離されたＲＮＡ分子が、配列番号５の配列と少なくとも約９５％同一である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記第１のプライマーが配列番号３の配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
前記第２のプライマーが配列番号２の配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
前記単離された核酸プローブが配列番号４の配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５０】
工程（４）が、ｄＮＴＰ、反応緩衝液、水、Ｍｇ２＋、及びＭｎ２＋のうちの１つ以上を添加することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼまたは高忠実度（ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）原薬中のエンベロープウイルス粒子の存在を検出するための方法であって、
（１）ＶＬＰ原薬の試料を得る工程と、
（２）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００界面活性剤を補ったプロテイナーゼＫ緩衝液で前記試料を希釈し、それにより希釈試料を得る工程であって、
前記Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００がインタクトなウイルス粒子を破壊するのに不十分な量で存在する、工程と、
（３）前記希釈試料にプロテイナーゼＫを添加し、前記プロテイナーゼＫが得られた溶液中に存在するいずれかの可溶性逆転写酵素を消化することを可能にするが、ウイルス粒子に含まれる逆転写酵素のすべては消化しない条件下で、前記得られた溶液をインキュベートし、それによって消化溶液を生成する工程と、
（４）フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を添加することにより前記消化溶液中の前記プロテイナーゼＫを不活性化し、それによって不活性化プロテアーゼ溶液を生成する工程と、
（５）前記不活性化プロテアーゼ溶液を、スクロースクッションを介した高速遠心分離により遠心分離し、それによって濃縮溶液を生成する工程と、
（６）インタクトなウイルス粒子を破壊するのに十分な量の界面活性剤を添加し、それによって界面活性剤を含む濃縮溶液を生成する工程と、
（７）前記界面活性剤を含む濃縮溶液または前記界面活性剤を含む濃縮溶液の画分に、単離されたＲＮＡ分子、前記単離されたＲＮＡ分子に対応する核酸配列の５’末端にハイブリダイズする第１のプライマー、前記単離されたＲＮＡ分子の３’末端にハイブリダイズする第２のプライマー、前記単離されたＲＮＡ分子にハイブリダイズする単離された核酸プローブ、及びＤＮＡポリメラーゼを添加し、それによってＰＣＲに基づく逆転写酵素（ＰＢＲＴ）アッセイ溶液を調製する工程と、
（８）逆転写酵素を含むウイルス粒子が前記ＰＢＲＴアッセイ溶液中に存在する場合、前記単離されたＲＮＡ分子から逆転写産物が合成され、かつ前記逆転写産物からＰＣＲ増幅産物が合成されることを可能にする条件下で、前記ＰＢＲＴアッセイ溶液をインキュベートする工程と、
（９）前記ＰＣＲ増幅産物を同定し、それによって前記ＶＬＰ原薬中の前記エンベロープウイルス粒子の存在を検出する工程と、を含む、方法。
【請求項５３】
試料中のウイルス粒子の存在を検出するための方法であって、プロテアーゼで処理した前記試料に、ＰＣＲに基づく逆転写酵素（ＰＢＲＴ）を行う工程を含む、方法。
【請求項５４】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）原薬の試料中のウイルス粒子の存在を検出するための方法であって、プロテアーゼで処理した前記ＶＬＰ原薬の試料に、ＰＣＲに基づく逆転写酵素（ＰＢＲＴ）を行う工程を含む、方法
【請求項５５】
請求項１または５２〜５４に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項５６】
使用説明書を含む、請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
請求項１、５２、５３、または５４に記載の方法の工程を介して同定された、レトロウイルス汚染物質を含まないウイルス様粒子（ＶＬＰ）原薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年１月１６日に出願された米国仮出願第６２／１０４，２５２号の優先権及び利益を主張する。前記特許出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出されたシーケンスリストを含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１６年１月１３日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＬＩＧＯ−０２７０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称で、サイズは１５，１３１バイトである。
【背景技術】
【０００３】
レトロウイルスは、ヒト及び動物において重要な感染性因子であり、多数の疾患の原因となる。レトロウイルスは、生物学的試料、例えば、臓器移植、輸血、及びワクチンとの接触を介して、被験体に移り得る。逆転写酵素（ＲＴ）活性は、レトロウイルスの特徴であり、したがって、生物学的試料中でのその存在は、該試料中のレトロウイルス粒子の存在を意味するといえる。
【０００４】
細胞株は、生物由来物質、例えばワクチンの産生のための組換えウイルスの増殖のために一般的に使用される。組込レトロウイルス様の要素を含むことが多いこのような細胞株は、細胞溶解後にＲＴを放出する。したがって、そのような細胞株から得られた生物由来物質がＲＴ活性を有する場合、ＲＴ活性が細胞によって放出されるＲＴに起因するのか、ＲＴを含むウイルス粒子による生物由来物質の汚染に起因するのかは不明であり、生物由来物質中の遊離ＲＴの存在は、インタクトなレトロウイルス粒子の存在よりも重要ではないので、ウイルス粒子が持つＲＴ活性と遊離ＲＴ活性とを区別することが重要である。
【０００５】
したがって、ウイルス粒子汚染を原因とする試料中のＲＴ活性を同定することができる方法及びキットの満たされていない必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書において、試料中の逆転写酵素活性を有するウイルス粒子またはウイルス様粒子の存在を検出するための方法及びキット、ならびにレトロウイルス汚染物質のない物質の調製方法を提供する。
【０００７】
本発明の１つの態様は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）原薬（ｄｒｕｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）の試料中のウイルス粒子の存在を検出するための方法であって、プロテアーゼで処理されたＶＬＰ原薬の試料においてＰＣＲに基づく逆転写酵素（ＰＢＲＴ）を行う工程を含む、方法である。
【０００８】
本発明の別の態様は、試験試料中のウイルス粒子に含まれる逆転写酵素活性の存在を検出するための方法に関する。該方法は、（１）前記試験試料にプロテアーゼを添加し、前記プロテアーゼが得られた溶液中に存在するいずれかの可溶性逆転写酵素を消化することを可能にする条件下で、前記得られた溶液をインキュベートし、それによって消化溶液を生成する工程と、（２）前記消化溶液中の前記プロテアーゼを不活性化し、それによって不活性化プロテアーゼ溶液を生成する工程と、（３）インタクトなウイルス粒子を破壊するのに十分な量の界面活性剤を添加し、それによって界面活性剤を含む溶液を生成する工程と、（４）前記界面活性剤を含む溶液または前記界面活性剤を含む溶液の画分に、単離されたＲＮＡ分子、前記単離されたＲＮＡ分子の第１の部分に対応する核酸配列にハイブリダイズする第１のプライマー、前記単離されたＲＮＡ分子の第２の部分の相補体にハイブリダイズする第２のプライマー、及びＤＮＡポリメラーゼを添加し、それによってＰＣＲに基づく逆転写酵素（ＰＢＲＴ）アッセイ溶液を調製する工程と、（５）ウイルス粒子に含まれる逆転写酵素が前記試験試料中に存在する場合、逆転写産物が前記単離されたＲＮＡ分子から合成され、ＰＣＲ増幅産物が前記逆転写産物から合成されることを可能にする条件下で、前記ＰＢＲＴアッセイ溶液をインキュベートする工程と、（６）前記ＰＣＲ増幅産物を同定し、それによって前記試験試料中の前記ウイルス粒子が持つ逆転写酵素の存在を検出する工程と、を含む。前記単離されたＲＮＡ分子に対応する核酸配列にハイブリダイズする単離された核酸プローブは、工程（４）の間または工程（４）の前に添加され得る。
【０００９】
上記態様において、工程（４）において単離されたＲＮＡ分子が添加される場合、単離されたＲＮＡ分子に対するＤＮＡ鋳型は実質的に全く添加されない。これを確実にするために、ＤＮアーゼを工程（４）の前に単離ＲＮＡ分子に添加してもよく、加えた場合、ＤＮアーゼは工程（４）の前に不活性化される。上記態様の工程（４）は、さらに、ｄＮＴＰ、反応緩衝液、水、Ｍｇ２＋及びＭｎ２＋のうちの１つ以上の添加を含むことができる。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ、高忠実度（ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＤＮＡポリメラーゼ、または当技術分野で既知の別のポリメラーゼであり得る。いくつかの実施形態においては、インタクトなウイルス粒子を破壊するのに不十分な量で、界面活性剤を上記態様の工程（１）の間に添加する。
【００１０】
上記態様のいくつかの実施形態は、例えば、遠心分離、透析、沈殿、またはカラム通過のうちの１つ以上によって、工程（３）の前に不活性化プロテアーゼ溶液を濃縮する工程を含む。例えば、この工程は、不活性化されたプロテアーゼ溶液を、スクロースクッションを介した高速遠心分離に供することを含み得る。
【００１１】
上記態様の実施形態において、少なくとも１つの試料を得て、工程（１）〜（６）、（２）〜（６）、（３）〜（６）、または（４）〜（６）に従って処理する。ある実施形態では、可溶性逆転写酵素、例えば組換え逆転写酵素（例えば、トリ骨髄芽球症ウイルスαβホロ酵素（ＡＭＶ  ＲＴ））を含む陽性対照試料を得て、工程（１）〜（６）、（２）〜（６）、（３）〜（６）または（４）〜（６）に従って処理し；これらの陽性対照試料は試験試料を含むことができる。ある実施形態では、逆転写酵素を含む粒子、例えばマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）粒子が添加された陽性対照試料を得て、工程（１）〜（６）、（２）〜（６）、（３）〜（６）、または（４）〜（６）に従って処理し；これらの陽性対照試料は試験試料を含むことができる。ある実施形態では、少なくとも１つの試料を得て、工程（１）〜（６）、（２）〜（６）、（３）〜（６）、または（４）〜（６）に従うが、工程（４）において単離されたＲＮＡ分子を添加することなく処理し、それにより陰性対照試料を生成し；これらの陰性対照試料は試験試料を含むことができる。
【００１２】
本発明のさらに別の態様は、プロテアーゼにより処理された試料にＰＣＲに基づく逆転写酵素（ＰＢＲＴ）を行う工程を含む、試料中のＲＴを持つウイルス粒子の存在を検出するための方法である。
【００１３】
本発明の別の態様は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）原薬中のＲＴを持つウイルス粒子の存在を検出するための方法に関する。該方法は、（１）ＶＬＰ原薬の試料を得る工程と、（２）（インタクトなウイルス粒子を破壊するのに不十分な量で存在する）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００界面活性剤を補ったプロテイナーゼＫ緩衝液で前記試料を希釈し、それにより希釈試料を得る工程と、（３）前記希釈試料にプロテイナーゼＫを添加し、前記プロテイナーゼＫが得られた溶液中に存在するいずれかの可溶性逆転写酵素を消化することを可能にするが、ウイルス粒子が持つ逆転写酵素のすべては消化しない条件下で、前記得られた溶液をインキュベートし、それによって消化溶液を生成する工程と、（４）フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を添加することにより前記消化溶液中のプロテイナーゼＫを不活性化し、それによって不活性化プロテアーゼ溶液を生成する工程と、（５）前記不活性化プロテアーゼ溶液を、スクロースクッションを介した高速遠心分離により遠心分離し、それによって濃縮溶液を生成する工程と、（６）インタクトなウイルス粒子を破壊するのに十分な量の界面活性剤を添加し、それによって界面活性剤を含む濃縮溶液を生成する工程と、（７）前記界面活性剤を含む濃縮溶液または前記界面活性剤を含む濃縮溶液の画分に、単離されたＲＮＡ分子、前記単離されたＲＮＡ分子に対応する核酸配列の５’末端にハイブリダイズする第１のプライマー、前記単離されたＲＮＡ分子に対応する核酸配列の３’末端にハイブリダイズする第２のプライマー、前記単離されたＲＮＡ分子に対応する核酸配列にハイブリダイズする単離された核酸プローブ、及びＤＮＡポリメラーゼを添加し、それによってＰＣＲに基づく逆転写酵素（ＰＢＲＴ）アッセイ溶液を調製する工程と、（８）ウイルス粒子が保護し放出する逆転写酵素が前記ＰＢＲＴアッセイ溶液中に存在する場合、前記単離されたＲＮＡ分子から逆転写産物が合成され及び前記逆転写産物からのＰＣＲ増幅産物が合成され得る条件下で前記ＰＢＲＴアッセイ溶液をインキュベートする工程と、（９）前記ＰＣＲ増幅産物を同定し、それにより前記ＶＬＰ原薬中の前記ＲＴを持つウイルス粒子の存在を検出する工程と、を含む。
【００１４】
本発明の別の態様は、レトロウイルス汚染物質を含まないウイルス様粒子（ＶＬＰ）原薬である。この原薬は、その実施形態を含める上記態様の方法によって同定される。
【００１５】
本発明の態様は、試験試料中のウイルス粒子に含まれる逆転写酵素活性の存在を検出するための方法に関する。該方法は、（１）前記試験試料にプロテアーゼを添加し、前記プロテアーゼが得られた溶液中に存在するいずれかの可溶性逆転写酵素を消化することを可能にする条件下で、前記得られた溶液をインキュベートし、それによって消化溶液を生成する工程と、（２）前記消化溶液中の前記プロテアーゼを不活性化し、それによって不活性化プロテアーゼ溶液を生成する工程と、（３）インタクトなエンベロープウイルス粒子を破壊するのに十分な量の界面活性剤を添加し、それによって界面活性剤を含む溶液を生成する工程と、（４）前記界面活性剤を含む溶液または前記界面活性剤を含む溶液の画分に、単離されたＲＮＡ分子、前記単離されたＲＮＡ分子の第１の部分に対応する核酸配列にハイブリダイズする第１のプライマー、前記単離されたＲＮＡ分子の第２の部分の相補体にハイブリダイズする第２のプライマー、及びＤＮＡポリメラーゼを添加し、それによってＰＣＲに基づく逆転写酵素（ＰＢＲＴ）アッセイ溶液を調製する工程と、（５）ウイルス粒子が保護し及び放出する逆転写酵素が前記ＰＢＲＴアッセイ溶液中に存在する場合、逆転写産物が前記単離されたＲＮＡ分子から合成され、ＰＣＲ増幅産物が前記逆転写産物から合成されることを可能にする条件下で、前記ＰＢＲＴアッセイ溶液をインキュベートする工程と、（６）前記ＰＣＲ増幅産物を同定し、それによって前記試験試料中の前記ウイルス粒子が持つ逆転写酵素の存在を検出する工程と、を含む。前記単離されたＲＮＡ分子に対応する核酸配列にハイブリダイズする単離された核酸プローブは、工程（４）の間または工程（４）の前に添加され得る。
【００１６】
いくつかの実施形態では、界面活性剤濃度が約０．００２％未満であるようにインタクトなエンベロープウイルス粒子を破壊するのに不十分な量で、本発明の上記態様における工程（１）の間に界面活性剤が添加される。いくつかの実施形態において、界面活性剤を含む溶液またはＰＢＲＴアッセイ溶液中の界面活性剤濃度が約０．１％〜０．３％であるように、界面活性剤が工程（３）の間に添加される。
【００１７】
本発明の別の態様は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）原薬中のエンベロープウイルス粒子の存在を検出するための方法に関する。該方法は、（１）ＶＬＰ原薬の試料を得る工程と（（２）（インタクトなウイルス粒子を破壊するのに不十分な量で存在する）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００界面活性剤を補ったプロテイナーゼＫ緩衝液で前記試料を希釈し、それにより希釈試料を得る工程と、（３）前記希釈試料にプロテイナーゼＫを添加し、前記プロテイナーゼＫが得られた溶液中に存在するいずれかの可溶性逆転写酵素を消化することを可能にするが、エンベロープウイルス粒子が持つ逆転写酵素のすべては消化しない条件下で、前記得られた溶液をインキュベートし、それによって消化溶液を生成する工程と、（４）フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を添加することにより前記消化溶液中のプロテイナーゼＫを不活性化し、それによって不活性化プロテアーゼ溶液を生成する工程と、（５）前記不活性化プロテアーゼ溶液を、スクロースクッションを介した高速遠心分離により遠心分離し、それによって濃縮溶液を生成する工程と、（６）インタクトなウイルス粒子を破壊するのに十分な量の界面活性剤を添加し、それによって界面活性剤を含む濃縮溶液を生成する工程と、（７）前記界面活性剤を含む濃縮溶液または前記界面活性剤を含む濃縮溶液の画分に、単離されたＲＮＡ分子、前記単離されたＲＮＡ分子に対応する核酸配列の５’末端にハイブリダイズする第１のプライマー、前記単離されたＲＮＡ分子に対応する核酸の３’末端にハイブリダイズする第２のプライマー、前記単離されたＲＮＡ分子に対応する核酸にハイブリダイズする単離された核酸プローブ、及びＤＮＡポリメラーゼを添加し、それによってＰＣＲに基づく逆転写酵素（ＰＢＲＴ）アッセイ溶液を調製する工程と、（８）エンベロープウイルス粒子が放出した逆転写酵素が前記ＰＢＲＴアッセイ溶液中に存在する場合、前記単離されたＲＮＡ分子から逆転写産物が合成され及び前記逆転写産物からのＰＣＲ増幅産物が合成され得る条件下で前記ＰＢＲＴアッセイ溶液をインキュベートする工程と、（９）前記ＰＣＲ増幅産物を同定し、それにより前記ＶＬＰ原薬中のウイルス粒子の存在を検出する工程と、を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００は、界面活性剤濃度が約０．００２％未満であるように、本発明の上記態様における工程（２）の間に添加される。いくつかの実施形態では、界面活性剤を含む濃縮溶液またはＰＢＲＴアッセイ溶液中の界面活性剤濃度が約０．１％〜０．３％であるように、界面活性剤を工程（６）の間に添加する。
【００１９】
本発明の別の態様は、試料中のウイルス粒子の存在を検出するための方法であって、プロテアーゼで処理した試料においてＰＣＲに基づく逆転写酵素（ＰＢＲＴ）を行う工程を含む方法である。
【００２０】
本発明の別の態様は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）原薬試料中の逆転写酵素を持つエンベロープウイルス粒子の存在を検出するための方法であって、プロテアーゼで処理したＶＬＰ原薬試料においてＰＣＲに基づく逆転写酵素（ＰＢＲＴ）を行う工程を含む。
【００２１】
本発明は、その実施形態を含む上記態様の方法を実施するためのキットを含む。このキットには使用説明書を含む。
【００２２】
本発明の別の態様は、レトロウイルス汚染物質を含まないウイルス様粒子（ＶＬＰ）原薬である。この原薬は、その実施形態を含む上記態様の方法によって同定される。
【００２３】
いくつかの実施形態では、単離されたＲＮＡ分子に対応する核酸配列にハイブリダイズする、例えば検出可能な標識を有する単離された核酸プローブが、不活性化プロテアーゼ溶液に添加される。
【００２４】
いくつかの実施形態では、試験試料を緩衝液で、例えば約１倍〜約２０倍（例えば、約１０倍）に希釈する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、界面活性剤はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【００２６】
いくつかの実施形態では、プロテアーゼはプロテイナーゼＫである。
【００２７】
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤はＰＭＳＦである。
【００２８】
いくつかの実施形態では、試験試料は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）原薬、例えばノロウイルス（例えばノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）ウイルス）ＶＬＰ原薬である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、単離されたＲＮＡ分子は、インビトロで転写されたＲＮＡ分子である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼと共に、ｄＮＴＰ、反応緩衝液、水、Ｍｇ２＋、及びＭｎ２＋のうちの１つ以上が添加される。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ、または当技術分野で既知の別のポリメラーゼであり得る。
【００３１】
いくつかの実施形態では、単離されたＲＮＡ分子は、配列番号１の配列を有するデングウイルス４型ゲノムの断片と少なくとも約９５％同一である。単離されたＲＮＡ分子は、配列番号５と少なくとも約９５％同一である。第１のプライマーは配列番号３の配列を含むことができ、及び第２のプライマーは配列番号２の配列を含むことができる。単離された核酸プローブは、配列番号４の配列を含むことができる。
【００３２】
例示的な界面活性剤は、Ｂｒｉｊ−３５、Ｂｒｉｊ−５８、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ＮＰ−４０、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ＳＤＳ、デオキシコール酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、Ｔｗｅｅｎ  ２０、及びＴｗｅｅｎ  ８０を含む。好ましくは、界面活性剤はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【００３３】
プロテアーゼの例は、ブロメライン、カスパーゼ、カテプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、エンドプロテイナーゼＡｓｐＮ、エンドプロテイナーゼＧｌｕＣ、エンテロキナーゼ（エンテロペプチダーゼ）、第Ｘａ因子、フューリン、パパイン、ペプシン、プロテイナーゼＫ、スブチリシン、トロンビンまたはトリプシンを含むが、これらに限定されない。好ましくは、プロテアーゼはプロテイナーゼＫである。プロテアーゼを不活性化する工程は、１つ以上のプロテアーゼ阻害剤例えば、ＡＥＢＳＦ−ＨＣｌ、アプロチニン、ベスタチン、Ｅ−６４、ＥＤＴＡ、ロイペプチン、ペプスタチンＡ及び／またはフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を添加することを含む。好ましくは、プロテアーゼ阻害剤はＰＭＳＦである。
【００３４】
検出可能な標識の例は、ビオチン、コロイド粒子、ジゴキシゲニン、高電子密度試薬、酵素、蛍光色素、ハプテン、磁気ビーズ、金属ビーズ及び放射性同位体を含むが、これらに限定されない。好ましくは、検出可能な標識は蛍光色素である。蛍光色素の例には、６−ＦＡＭ、ＡＢＹ（登録商標）、アクリジン、アレクサフルーア（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）４８８、アレクサフルーア５３２、アレクサフルーア５９４、アレクサフルーア６３３、アレクサフルーア６４７、バイオサーチブルー（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ  Ｂｌｕｅ）、クマリン、Ｃｙ（登録商標）３、Ｃｙ（登録商標）３．５、Ｃｙ（登録商標）５、Ｃｙ（登録商標）５．５、ＦＡＭ（商標）、ＦＩＴＣ（登録商標）、ＧＰＦ（及びその変種）、ＨＥＸ（商標）、ＪＯＥ（商標）、ＪＵＮ（登録商標）、マリーナブルー（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ）、ＮＥＤ（商標）、オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ）４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）、ＰＥＴ（登録商標）、パルサー（Ｐｕｌｓａｒ）（登録商標）、クエザー（Ｑｕａｓａｒ）（登録商標）５７０、クエザー（登録商標）６７０、クエザー（登録商標）７０５、ローダミングリーン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ）、ローダミンレッド（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ）、ＲＯＸ（商標）、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン、ＴＡＭＲＡ（商標）、ＴＥＴ（商標）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）（登録商標）、ＴＲＩＴＣ、及びＶＩＣ（登録商標）が含まれる。
【００３５】
本発明は、その実施形態を含む上記態様の方法を実施するためのキットを含む。このキットは使用説明書を含む。
【００３６】
上記の態様、実施形態、特徴、または例のいずれも、他の態様、実施形態、特徴または例と組み合わせることができる。
【００３７】
本発明の他の特徴及び利点は、詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、試料中のレトロウイルス粒子汚染物質を検出するための高感度なＰＣＲに基づく逆転写酵素（ＰＢＲＴ）アッセイを含む方法及びキットに関する。本発明は、プロテイナーゼＫ消化に対する可溶性逆転写酵素（ＲＴ）活性の感度及びウイルス粒子が持つＲＴ活性の実質的な非感受性に依存する。したがって、プロテイナーゼＫ消化に対して感受性のあるＲＴ活性を示す試料は、レトロウイルス汚染のない可能性が高いが、プロテイナーゼＫ消化に対して実質的に感受性がないＲＴ活性を示す試料は、レトロウイルス汚染である可能性が高い。
【００３９】
理論に縛られることなく、本明細書に開示される実験的証拠は、本発明の以下の特徴のうちの１つ以上が、予想外に優れた結果をもたらすことを示す。
１．試料中の高濃度のタンパク質に基づく成分を希釈するために、より大きい容量の緩衝液、例えばプロテイナーゼＫ緩衝液中への被験試料の希釈は、ウイルス粒子が持たないＲＴのより完全なタンパク質消化を可能にする。
２．ウイルス粒子の、例えばプロテイナーゼＫによるタンパク質消化の間にごく少量の界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加は、完全な消化を促進するのに役立つ。さらに、使用される界面活性剤の量は、ウイルス粒子が持つＲＴ活性を減少させない。
３．プロテアーゼ阻害剤、例えばＰＭＳＦの添加によるプロテアーゼ、例えばプロテイナーゼＫの不活性化は、タンパク質消化工程の後に行われる。
４．プロテアーゼ阻害剤の存在下で、プロテアーゼの不活性化後のウイルス粒子の収集及び濃縮、例えばスクロースクッションを介した高速遠心分離を実施して、プロテアーゼ活性がＰＢＲＴ反応中に持続しないことを確実にする。
【００４０】
定義
本明細書で使用される場合、用語「ウイルス」、「エンベロープウイルス」、「ウイルス粒子」は互換的に使用され、ある属性でウイルスに類似するが、感染性及び／または複製能があることが実証されていてもいなくてもよい構造体を指す。一方、「ウイルス様粒子（ＶＬＰ）」は、ある属性でウイルスに類似しているが、遺伝物質がない構造体を指す。したがって、ＶＬＰは感染性ではなく、及び／または複製能を有しない。したがって、ＶＬＰは対象に有害ではない。しかし、対象にＶＬＰをワクチン接種すると、免疫系にウイルスが存在するかのように、免疫応答が生じる。
【００４１】
ヒトレトロウイルスの例には、これらに限定されないが、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１、及びＨＴＬＶ−ＩＩが含まれ；サルレトロウイルスには、これらに限定されないが、ＳＩＶ−１及びＳＩＶ−２が含まれ、；他の哺乳動物レトロウイルスには、これらに限定されないが、ＭＬＶ、ＦｅＬＶ、ＢＬＶ、及びＭＭＴＶが含まれ；鳥類レトロウイルスには、これらに限定されないが、ＡＬＶ及びＡＳＶが含まれる。
【００４２】
ＲＴを含有する任意のウイルス、例えばレトロウイルスは、本発明の方法及びキットによって検出することができる。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、試料は、例えば汚染物質としてウイルス粒子を含むと疑われる任意の試料（例えば、試験試料）である。試料は、タンパク質溶液、ペプチド溶液、塩溶液、静脈内（ＩＶ）溶液、原薬、培養培地、細胞懸濁液、対象由来の外植組織を含む懸濁液（例えば、組織生検または臓器）、血液製剤、生物由来物質、抗体を含む溶液（例えば、モノクローナル抗体）、ワクチン（例えば、不活化ウイルスワクチン及び生ウイルスワクチン）、またはＶＬＰ調製物を含むことができる。
【００４４】
本明細書で使用される「生物由来物質」は、細胞または生物によって産生される生成物または物質をいう。生物由来物質は、生物の天然産物であってもよく、または生物由来物質物を産生するように何らかの方法で改変された生物によって産生されてもよい。生物由来物質の例は、ワクチン、抗体（例えば、モノクローナル抗体）、治療用タンパク質、ウイルス（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アデノ関連ウイルス、及びヘルペスウイルスなどの遺伝子治療用組換えウイルス）、酵素、成長因子、多糖類、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む核酸、及び粒子（例えば、ウイルス様粒子）を含むが、これらに限定されない。生物由来物質の他の非限定的な例には、対象から得られた血液（及び血液成分）、精液、尿、唾液、喀痰、及び脳脊髄液が含まれる。血液成分の例は、全血、血清、血漿、血小板が含まれる。
【００４５】
対象は哺乳動物由来のものであってもよい。哺乳動物は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、雌牛、ウマ、ヤギ、ラクダ、雄牛、バッファロー、ヒツジまたはブタであり得る。対象は、鳥や家禽でもあり得る。実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００４６】
本明細書で使用される「原薬（ｄｒｕｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）」という用語は、治療薬を含み、賦形剤と共に医薬組成物または医薬品を製剤化するために使用される物質を指す。
【００４７】
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、天然の状態で見られるように通常それに付随する成分を様々な程度で含まない物質を指す。「単離」は、元の供給源またはその周囲からの分離度を示す。「精製」は単離よりも高い分離度を示す。単離された生成物は、天然源から得ることができ、または合成的に得ることができ；例えば、核酸分子は、遺伝子またはコード配列を発現している細胞から得ることができ（すなわち、インビトロ）、及び／または該分子を合成する機構から得ることができる。言い換えれば、本明細書において使用される核酸は、天然に産生され得るか、または合成的に産生され得る。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「プライマー」は、ＰＣＲ反応または逆転写反応において使用されるのに十分な数の残基を含む連結ヌクレオチド残基のストリングを指す。プライマーは、試料中の同一の、類似の、または相補的なＤＮＡまたはＲＮＡの存在を増幅、コピー、逆転写、確認、または明らかにするために使用され得る。本明細書中で使用される場合、用語「プローブ」は、同一の、類似の、または相補的な核酸配列の検出に使用される核酸配列を指す。プライマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡに結合するために使用することができる。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、試料はウイルス粒子を「実質的に含まない」とは、試料がＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲアッセイなどによって測定されるような検出可能なレベルのウイルス粒子を含まないことを意味する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及びキットは、ＲＮＡを分解する酵素、例えばリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）を利用する。ＲＮアーゼはＲＮＡを分解するヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＲＮアーゼは、そうでなければ凝集による分解に耐性があるかもしれない非カプセル化ＲＮＡを分解する徹底的な手段を提供する。ＲＮアーゼは、ＲＮアーゼＡ、ＲＮアーゼＨ、ＲＮアーゼＩＩＩ、ＲＮアーゼＩなどのエンドリボヌクレアーゼ、またはＲＮアーゼＩＩ、ＲＮアーゼＲ、エキソリボヌクレアーゼＩなどのエキソリボヌクレアーゼであってよい。リボヌクレアーゼＡ（ＲＮアーゼＡ）は研究においてしばしば使用される膵臓リボヌクレアーゼであり、一本鎖ＲＮＡを特異的に切断する。
【００５１】
「ＤＮアーゼ」という用語は、ＤＮＡを分解する酵素を指す。いずれのＤＮアーゼも、本発明の態様において使用することができる。多種多様なＤＮアーゼが知られており、これらに限定されないが、ＤＮアーゼＩ、ＤＮアーゼＩＩ、ＤＮアーゼＩＩＩ、ＤＮアーゼＩＶ、ＤＮアーゼＶ、ＤＮアーゼＶＩ、ＤＮアーゼＶＩＩ、及びＤＮアーゼＶＩＩＩを含めて分類できる。
【００５２】
「９５％同一」または「少なくとも約９５％同一」としての用語「同一％」は、比較ウインドウ上の２つの最適に整列した配列を比較することによって決定され、比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適な整列のために、付加または欠失を含まない参照配列と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両方の配列において同一のヌクレオチドが生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得て、該一致した位置の数を比較のウインドウ内の位置の総数で割り、そして結果に１００を乗じることによって計算し、配列同一性のパーセンテージを得る。
【００５３】
２つ以上の核酸配列の文脈における用語「同一」またはパーセント「同一性」は、同じ配列である２つ以上の配列またはサブシーケンスをいう。以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、または手作業によるアラインメント及び目視検査によって測定された指定の領域または指示されていない場合は配列全体にわたって測定された、比較ウインドウ上で最大の一致のために比較及び整列された場合、２つの配列が、同じ特定のパーセンテージのヌクレオチド（すなわち、指定された領域上に、または、指定されていない場合は、配列全体にわたって６０％の同一性、場合により６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性）を有する場合、配列は「実質的に同一」である。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、特に明記しない限り、または文脈から明らかでない限り、「約」という用語は、例えば平均の２標準偏差以内の当該技術分野における通常の許容範囲内であると理解される。「約」は、記載された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％以内と理解することができる。文脈から特に明白でない限り、本明細書で提供される全ての数値は、用語「約」によって修飾される。
【００５５】
明細書全体を通して、組成物が特定の成分を有する（ｈａｖｉｎｇ）、含まれる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されている場合、組成物は列挙された成分から本質的になるか、またはそれらからなることが企図される。同様に、方法またはプロセスが特定のプロセス工程を有する、含まれる、または含むと記載されている場合、方法またはプロセスは、列挙されたプロセス工程から本質的になるか、またはそれらからなる。さらに、特定の動作を実行するための工程順序またはある動作を行う順序は、本発明が操作可能なままである限り、重要ではないことを理解されたい。さらに、２つ以上の工程または動作を同時に実行することができる。
【００５６】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において、単数形には、文脈上他に明確に指示されない限り、複数形も含まれる。特に明記されていないか、または文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される、用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、単数または複数であると理解される。具体的に述べられていない、または文脈から明らかでない限り、本明細書中で使用される、用語「または」は包括的であると理解される。
【００５７】
標的ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を検出または増幅するための方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）またはＰＣＲに基づく逆転写酵素（ＰＢＲＴ））を含む、核酸の単離、増幅または検出するための方法は、当該分野では周知である。
【００５８】
当業者は、本明細書で論じられる既知の技術または同等の技術の詳細な説明についての一般的な参考文献を参照することができる。これらのテキストには、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．（２００５）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００）；Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．；Ｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．；  Ｆｉｎｇｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（１９７５）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、第１８版（１９９０）。もちろん、これらのテキストは、本発明の態様を作成または使用する際にも参照することができる。
【００５９】
本明細書中に引用される全ての刊行物及び特許文書は、あたかもそのような刊行物または文書の各々が、参照により本明細書に組み入れられよう具体的及び個別に示されているように、参照により本明細書に組み込まれる。刊行物及び特許書類の引用は、関連する先行技術であることを認めることを意図するものではなく、またその内容または日付に関する承認を構成するものでもない。本発明は、ここで書かれた記述により説明されてきたが、当業者であれば、本発明は様々な実施形態で実施することができ、前述の説明及び以下の実施例は、説明の目的とするものであり、後述の特許請求の範囲を限定するものではない。
【００６０】
以下の実施例において、本発明の方法は、組換えバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞、すなわち、生物学的生産のための組換えバキュロウイルスの増殖に使用され、統合された昆虫レトロウイルス様エレメントを含み、及びバキュロウイルス誘導溶解後にＲＴ活性を放出することが知られている細胞株、から精製されたノロウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）原薬中の逆転写酵素（ＲＴ）活性を検出するために使用される。ＶＬＰ原薬中に存在する微量のＲＴ活性は、プロテイナーゼＫ消化に対して感受性があり、したがって粒子に関連していないことが実証された。対照的に、Ｓｆ９細胞の産生終了収穫物は、有意な量のＲＴ活性を含むことが示され、この活性のごくわずかな画分のみがプロテイナーゼＫ耐性であり、したがって、この非常に小さな画分は粒子に随伴している。これらのデータは、収穫物中のＲＴ活性の大部分が粒子に随伴していず、精製された原薬中のレトロウイルス粒子汚染の証拠がないことを示している。
【実施例】
【００６１】
実施例１：ＰＣＲベースの逆転写酵素（ＰＢＲＴ）アッセイは、わずか６個のＲＴ分子を有する試料中のＲＴレベルを定量することができる
少量のＲＴ活性を測定するために、非常に感度の高いＰＣＲベースのＲＴ（ＰＢＲＴ）アッセイが必要であった。アルボウイルスＲＴ−ＰＣＲアッセイの開発を含む別の研究では、ＲＴ−ＰＣＲ実験において再現性のある性能を示すデング４型ゲノムの特定の配列が同定された。この配列をＲＮＡ鋳型として含むインビトロ転写ＲＮＡをＰＢＲＴアッセイにおけるＲＴ活性の検出に用いた。表１は、Ｄｅｎ４  ＲＴ−ＰＣＲアッセイに用いたプライマー及びプローブ配列を示す。
【表１】
2018501807.tif 000002
【００６２】
上記Ｄｅｎ４ゲノムの部分を表す１１３ｎｔの合成ＤＮＡ配列を、ＮｏｔＩ部位とＫｐｎＩ部位の間のプラスミドｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。得られたクローンをＰｓｔＩで線状化した。線状化ＤＮＡをインビトロ転写反応に用いて、ＰＢＲＴアッセイのための鋳型ＲＮＡとして役立つ１１３ｎｔ  Ｄｅｎ４合成配列を含むおよそ１．５ｋｂのＲＮＡ分子を生成した。
【００６３】
鋳型ＲＮＡがＰＢＲＴアッセイにおいて有用であるためには、残留ＤＮＡは、添加されたＲＴが存在しない場合に効果的にＰＣＲシグナルを生じるので、インビトロ転写反応において使用される全てのプラスミドＤＮＡ鋳型を排除することが有用である。これは、複数ラウンドのＴｕｒｂｏ（商標）ＤＮａｓｅ処理（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用い、続いてＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖｅｎｌｏ、リンブルグ、ＮＬ）を使用して、最終精製工程を実施することによって達成された。最終的に精製されたＲＮＡ生成物は、グリオキザールアガロースゲル電気泳動によって分析した場合、分解の証拠を示さなかった。
【００６４】
ＰＢＲＴアッセイで使用された陽性対照ＲＴ酵素は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ（Ｓｔ  Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ、ＦＬ、ＵＳＡ）によって供給された分子量１５７，０００ダルトンの鶏骨髄芽球症ウイルスαβホロ酵素であった。これは、６２，６８６単位／ｍｇの比活性を有するヌクレアーゼを含まない高度に精製された酵素調製物である。この酵素の標準曲線を０．１ナノユニット（ｎｕ）〜１０，０００ｎｕ／μＬの範囲で確立し、各標準曲線試料１μＬをＰＢＲＴ標準曲線反応に添加し、その結果、ＰＢＲＴ標準曲線６分子〜６００，０００分子の範囲のＲＴが得られた。全てのＰＢＲＴ反応は、５ｎｇのＤｅｎ４鋳型ＲＮＡならびにＤｅｎ４プライマー及びプローブ及び緩衝液成分を用いた。添加されたＲＴを含まない２つの反応は、ＲＮＡ鋳型調製物中の残留ＤＮＡから生じるバックグラウンドシグナルの対照とされた。Ｄｅｎ４  ＲＮＡを欠く「鋳型なし」対照もまた実行した。表２は、試料を４０サイクルで３回測定した場合、線形ＲＴ標準曲線が、０．９８６のＲ２値で観察されることを示している。Ｒ２値は、０．１ｎｕ標準曲線の３つの試料（１反応当たり６分子の分子）の少量の散乱のために、０．９９よりわずかに小さかった。重要なことに、「ＲＴなし」試料は、残留ＤＮＡによるバックグラウンドシグナルの排除の成功を実証する、４０未満のＣｔ値のみを示した。
【表２】
2018501807.tif 000003
【００６５】
これらのデータは、１試料あたり０．１ｎｕまたは６分子までのＲＴレベルを定量する本方法の能力を検証する。
【００６６】
上記のＰＢＲＴアッセイは、ＴａｑＭａｎ  ＲＮＡ−ｔｏ−ＣＴ  １ステップキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）、カタログ番号４３９２６５３，４３９２９３８、及び４３９２６５６）を用いて行ったが、このアッセイは、ＡＭＶ  ＲＴ及びＭＬＶスパイクに関連する汚染ＲＴまたはＲＴの存在を検出するために使用されていたため、キットからのＲＴ酵素を反応に添加しなかった。サイクル時間及び温度は、キット製造者によって記載されたものとした。
【００６７】
実施例２：ＰＢＲＴアッセイは、試験試料中の粒子関連活性と遊離ＲＴ活性とを区別することができる
粒子が持つＲＴ酵素活性と遊離のＲＴ酵素活性とを区別するための例示的なプロテアーゼとして、プロテイナーゼＫ（ＰＫ）を選択した。適切な条件下では、ＰＫは、所定の試料中の非粒子含有ＲＴ活性を全て効果的に排除するが、インタクトなエンベロープレトロウイルス粒子中のＲＴ活性はタンパク質分解消化から保護されると考えられた。この方法論の条件は、ノロウイルスＶＬＰ原薬試料をモデルとして用いて開発された。ＶＬＰ薬物物質の遊離（非ウイルス粒子含有）酵素活性の対照として、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴを補充した。インタクトなレトロウイルス粒子に含有されるＲＴの対照として、ＶＬＰ原薬の試料にマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）粒子を補充した。アッセイは、ＡＭＶ  ＲＴ補充によるＲＴ活性がＰＫ活性によって排除され、ＭＬＶ粒子補充からのＲＴ活性が保護された（すなわち、ＲＴ活性が持続した）場合に成功したと考えられた。アッセイの極めて重要な部分は、タンパク質分解活性がＰＢＲＴアッセイ工程に引き継がれず、それによってＲＴ−ＰＣＲ性能が低下しないように、ＰＫ処理後のＰＫ活性を完全に不活性化する能力であると思われた。また、ＰＫ抑制剤がＰＢＲＴアッセイを妨害してはならないと決定された。
【００６８】
成功した方法は、以下のステップのうちの１以上を含むことが発見された。
１．試料中の高濃度のウイルス様粒子を希釈するための、より大きい容量のプロテイナーゼＫ緩衝液中で試験すべき試料の希釈であって、ウイルス粒子に含まれていないＲＴのより完全なタンパク質分解を可能にする。
２．ウイルス粒子のプロテイナーゼＫ消化中にごく少量のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加すると、完全な消化が促進される。さらに、使用されるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の量は、ウイルス粒子が持つＲＴ活性を減少させない。
３．タンパク質分解消化工程の後に、ＰＭＳＦの添加によるプロテイナーゼＫの不活性化が必要である。
４．プロテイナーゼＫの不活性化後のウイルス粒子のスクロースクッションを介した高速遠心分離による回収及び濃縮は、ＰＭＳＦの存在下で行われ、プロテイナーゼＫ活性がＰＢＲＴ反応中に持続しないことを確実にする。
【００６９】
実施例３：ＰＢＲＴアッセイは、試験試料における、内在性ＲＴによる活性、補足されたＲＴによる活性、及び補充されたウイルス粒子が持つＲＴによる活性を区別することができる
実施例１のＰＢＲＴアッセイに従って、３つのノーウォークＶＬＰ原薬の０．５ｍＬ試料を分析した。試料１は補充されなかった。陽性対照として機能する試料２及び３には、それぞれＡＭＶ  ＲＴまたはＭＬＶが補充された。補充後、２５μＬの各試料を取り置いてベースラインＲＴ活性を、すなわちタンパク質分解消化前のものを測定した。各試料の残りの部分をＰＫ消化に供した後、高速遠心分離によってインタクトなウイルス粒子を回収した。ＲＴ活性をアッセイする前に、すべての試料を２×ＡＭＶ希釈緩衝液（非イオン性界面活性剤の供給源）で１：２に希釈して、いずれかのエンベロープ粒子を溶解（破壊）させ、それによってすべてのＲＴ活性を測定するのを確実にした。実施例１に記載のＰＢＲＴアッセイを用いて、ＰＫ消化され及び取り置いた試料をＲＴ活性についてアッセイした。この実験からのデータを表３に示す。
【表３】
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【００７０】
表３に示されるように、補充されなかった試験試料１は、ＰＫ処理の前に、ベースラインＲＴ活性の小さなレベル（Ｃｔ値＝３３．３）を示した。しかし、ＰＫ処理及び回収後、Ｃｔ値は３９．７に上昇した。これは「ＲＴなし対照」レベルに類似している。これらのデータは、ベースラインのＲＴ活性が粒子に関連せず、ＰＫ消化に感受性であり、高速遠心分離によって回収できないことを示している。ＡＭＶ  ＲＴを補充した試料２は、ＰＫ消化の前に非常に強力なＲＴベースライン活性（Ｃｔ＝１７．６）を示したが、ＰＫ消化及び高速遠心分離後、ＲＴ活性は「ＲＴなし対照」レベルに戻った。これは、内在性及び補足ＲＴ活性の両方がＰＫによって分解されたことを示す。試料２と同様に、ＭＬＶ粒子を補充した試料３は、ベースラインのＲＴ活性（Ｃｔ値＝１８．４）が強かった。しかし、試料２とは異なり、試料３では、遠心分離回収工程によるＰＫ耐性のインタクトなＭＬＶ粒子の濃縮によって、インタクトな粒子のＰＫ消化及び高速回収は、実際にはＲＴ活性（Ｃｔ値＝１６．５）の増加をもたらした。
【００７１】
これらのデータは、少量の測定可能なＲＴ活性が、粒子に関連するものではなく、タンパク質分解に感受性のＮｏｒｗａｌｋ  ＶＬＰ原薬に存在するという前提を支持する。換言すれば、この内在性ＲＴ活性は、インタクトなレトロウイルス粒子の汚染によるものではない。
【００７２】
上記の実験を反復し、類似の結果を認めた。表４を参照。
【表４】
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【００７３】
表３及び４に示すデータの対照実験では、プロテアーゼがＰＢＲＴ反応に持ち越せる可能性を試験するため、ＰＢＲＴ反応で試験したすべての試料を、ＡＭＶ  ＲＴによる補充後に試験した。この場合、全ての「スパイクのついた」試料は、プロテアーゼキャリーオーバーが存在しないことを示すＰＢＲＴ反応の良好な性能を実証する、同様に強力なＲＴシグナルを示した。
【００７４】
実施例４：産生終了収穫物画分は、より早期の収穫画分に対してより高いＲＴ活性を有する
粒子に関連したエルアンチウイルス（ｅｒｒａｎｔｉｖｉｒｕｓ）ＲＮＡ配列は、健常な非バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞から収穫した培地と比較して、産生終了（ＥＯＰ）収穫物画分（すなわち、バキュロウイルス溶解Ｓｆ９細胞）においてより広まっていることが示されている；ＥＯＰ収穫物質画分は、健康なＳｆ９細胞から収穫された培地よりも遊離及び粒子結合ＲＴの両方がより多く含まれていると考えられる。
【００７５】
ＥＯＰ試料をＰＫ緩衝液で１０倍に希釈したことを除いて−これはなぜならば、予備実験が、ＥＯＰ試験試料において例外的に高い初期ＲＴレベルを示し、それは試料間のＲＴ活性を区別するのを妨げる、からである−、ＥＯＰ収穫試験試料を実施例３の試料に記載したと同様に試験した。この実験の結果を表５に示す。
【表５】
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【００７６】
表５に見られるように、補充のない試料であるＥＯＰ試料１は、ベースラインのＲＴ活性が強かった。ＥＯＰ試料２（ＡＭＶ  ＲＴ補充試料）のベースラインＲＴ活性は、約２倍大きいにすぎなかった。ＥＯＰ試料１及び２は、ＰＫの消化及びそれらの回収後に、ＲＴ標準曲線範囲内に含まれる、互いに実質的に同一のＣｔ値を示し、これは、ＥＯＰ収穫物中ＰＫ耐性粒子含有画分のＲＴ活性の存在を示す。一方、ＥＯＰ試料３（ＭＬＶ補充試料）は、強いベースラインＲＴ活性及びＰＫ消化後活性を示し；これは、インタクトなレトロウイルス粒子からのＲＴの首尾良い回収のための対照として機能するＰＫ耐性ＭＬＶスパイクと一致する。
【００７７】
３つのＥＯＰ試料からのデータは、ＥＯＰ収穫物におけるＰＫ耐性の粒子が持つＲＴの存在と一致する。しかしながら、ＲＴ標準曲線と比較した場合にＰＫ前後のシグナルが３桁を超えて異なるため、粒子が持つＲＴは最初の収穫試料中のＲＴ活性の総量に対して明らかに小さい割合である。この観察は、実施例３に記載されているように、精製された原薬中に検出可能な粒子関連ＲＴ活性がないことと一致する。ＶＬＰ精製プロセスにおける界面活性剤工程の使用に始まる、それと一体となった収穫物中の粒子関連ＲＴ活性の低レベルは、おそらく、最終原薬中に検出可能な粒子関連ＲＴ活性が存在しないことをもたらす重要な因子である。
【００７８】
実施例５：別の二価カチオン試験
先の実施例に示されたデータは、ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液中のＭｇ２＋イオンを使用する実験において生成された。Ｍｎ２＋イオンを必要とする酵素から新規のＲＴ活性を検出する可能性を考慮に入れるために、ＲＴ−ＰＣＲマスターミックス緩衝液中に３ｍＭのＭｎＣｌ２を添加して原薬の評価実験を繰り返した。これらの実験の結果を表６に示す。
【表６】
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【００７９】
表６は、すべてのＣｔ値が上方に偏っていることを除いて、結果が表３及び４に示される結果と定性的に類似していることを示す。したがって、Ｍｎ２＋イオンは、まだ同定されていない混入レトロウイルスとして存在していたかもしれない新規なＭｎ２＋依存性ＲＴの検出を刺激しなかった。原薬中のＲＴ活性及びＲＴ及びＭＬＶスパイクは以前に観察されたのと同じパターンで生じた。
【００８０】
均等物
本発明は、その趣旨または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化することができる。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載された本発明を限定するのではなく、すべての点において例示的であるとみなされるべきである。したがって、本発明の範囲は、上記の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の均等物の意味及び範囲内に入るすべての変更は、その中に包含されることが意図される。
【配列表】
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【国際調査報告】
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