(57)【要約】本明細書中、凝固因子；融合タンパク質；融合タンパク質による結合を可能にし、それによって、変性凝固因子が調製されるように、凝固因子に結合する変性分子；を含み、変性凝固因子及び融合タンパク質が少なくとも２つの独立した部位において相互作用する、凝固因子複合体に関する方法及び組成物が開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．凝固因子；
ｂ．アルブミンまたはアルブミンフラグメントに融合した第１のタンパク質を含む融合タンパク質；及び
ｃ．前記融合タンパク質による結合を可能にし、それによって、変性凝固因子が調製されるように、前記凝固因子に結合する変性分子；
を含み、前記変性凝固因子及び前記融合タンパク質が、少なくとも２つの独立した部位において相互作用する、凝固因子複合体。
【請求項２】
前記変性凝固因子の少なくとも１つの結合部位が、自然発生的な結合部位である、請求項１に記載の凝固因子複合体。
【請求項３】
前記融合タンパク質の少なくとも１つの結合部位が、前記変性分子によって提供される、請求項１または２に記載の凝固因子複合体。
【請求項４】
前記凝固因子が、因子ＶＩＩＩである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の凝固因子複合体。
【請求項５】
前記変性凝固因子が、変性因子ＶＩＩａである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の凝固因子複合体。
【請求項６】
前記融合タンパク質の前記第１のタンパク質が、フォンウィルブランド因子のフラグメントである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の凝固因子複合体。
【請求項７】
前記フォンウィルブランド因子のフラグメントが、Ｄ’Ｄ３フラグメントである、請求項６に記載の凝固因子複合体。
【請求項８】
前記融合タンパク質の前記第１のタンパク質が、組織因子（ＴＦ）である、請求項６に記載の凝固因子複合体。
【請求項９】
前記変性凝固因子及び前記融合タンパク質が、非共有結合を形成する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の凝固因子複合体。
【請求項１０】
前記変性凝固因子及び融合タンパク質が、共有結合的に相互作用する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の凝固因子複合体。
【請求項１１】
前記共有結合がペプチド結合ではない、請求項１０に記載の凝固因子複合体。
【請求項１２】
前記共有結合が核酸の翻訳によって製造されたペプチド結合ではない、請求項１０に記載の凝固因子複合体。
【請求項１３】
前記変性分子が、脂肪酸を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の凝固因子複合体。
【請求項１４】
前記変性分子が、クリックケミストリーによって製造される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の凝固因子複合体。
【請求項１５】
前記凝固因子が、クリックケミストリーによって前記融合タンパク質に結合する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の凝固因子複合体。
【請求項１６】
前記変性分子が、ポリエチレングリコール鎖を通して前記凝固因子に結合される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の凝固因子複合体。
【請求項１７】
前記ポリエチレングリコール鎖が、前記凝固因子上のマレイミドに連結する、請求項１６に記載の凝固因子複合体。
【請求項１８】
前記ポリエチレングリコール鎖が、Ｘがメチルテトラジンであるマレイミド−ＰＥＧＮ−Ｘを含む構造を有するマレイミドに連結する、請求項１７に記載の凝固因子複合体。
【請求項１９】
前記融合タンパク質の前記第１のタンパク質が、リンカーによってアルブミンと一緒に結合する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の凝固因子複合体。
【請求項２０】
前記凝固因子が、変性アミノ酸を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の凝固因子複合体。
【請求項２１】
前記融合タンパク質が、変性アミノ酸を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の凝固因子複合体。
【請求項２２】
前記凝固因子複合体の半減期が、凝固因子単独と比較して少なくとも２０％大きい、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の凝固因子複合体。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組成物を含む、キット。
【請求項２４】
請求項１に記載の凝固因子複合体を対象に投与することを含む、凝固因子注入を必要とする疾患を有する対象を治療する方法。
【請求項２５】
前記対象への前記凝固因子複合体の投与が、前記凝固因子単独の投与時に得られた血中濃度半減期より大きい前記凝固因子複合体の血中濃度半減期をもたらす、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記凝固因子複合体が、注射、吸入、鼻腔内または経口で前記対象に投与される、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記疾患が血友病である、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、全体として参照によって本明細書に組み込まれる、２０１５年８月１２日出願の米国仮特許出願第６２／２０３，９７３号による優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固は、凝固が出血の現象によってのみ誘引されるように、非常に複雑な一連の抑制及び均衡によって制御されている（Ｓｍｉｔｈ，Ｔｒａｖｅｒｓ，＆  Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，２０１５）。外傷によって、これらの酵素の活性化が引き起こされ、そして傷を封鎖するカスケード反応の増幅がもたらされる。血友病は、カスケードが早々に中断され、そして出血が継続するように、これらのタンパク質の１種に関する遺伝子コードにおける欠陥に起因する。血友病、血友病Ａ、血友病Ｂ及びフォンウィルブランド病（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）の最も共通の形態は、長い間、精製された因子濃縮液の注入、欠陥のある酵素の置き換え、及び血液が凝固する能力の復元によって治療されていた。
【０００３】
因子の注入は、驚くほど効果的であり、それによって、子供時代に死亡していたかもしれない患者が、通常の平均寿命を有することが可能になる（Ｈｏｏｔｓ，２００３）。予防使用の増加によって、すなわち、正当なレベルの保護を持続するための因子の定期的に予定された注入によって、これらの患者は、本質的に通常の生活を送ることができる（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。これは、コストなしで、文字通りに、かつ比喩的に行われない。重度の血友病Ａ患者は、この疾患の形態において欠損するタンパク質である因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）の短い循環半減期のため、因子を１日おきに注入する必要がある。これは、継続的な静脈アクセス及び非遵守などの多数の問題をもたらす。
【０００４】
患者が、注入されたＦＶＩＩＩに対して遮断抗体を発達させる場合、別の非常に重大な問題が生じる（Ｋｅｍｐｔｏｎ  ＆  Ｍｅｅｋｓ，２０１４）。全血友病Ａ患者の約３０％が、それらの治療のある時点において抗体を発達させるであろうが、約５％は、ＦＶＩＩＩ注入がもはや有効ではなくなるような重度の阻害薬問題を引き起こす。これには、「バイパス」治療の使用が必要となる。因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）は、凝固カスケードの開始剤の１種であって、かつプロセス中のＦＶＩＩＩまたは因子ＩＸ（ＦＩＸ）のいずれかの必要性のために使用することができる。ＦＶＩＩａは２時間のみの循環半減期を有するため、この場合、ＦＶＩＩａの非常に高い濃度及び非常に頻繁な投与が必要となる。
【０００５】
これら及び他の理由のために、より長半減期の因子が非常に望ましい（Ｐｉｐｅ，２０１０）。それほど頻繁でない投与によって、遵守、静脈アクセス問題が改善され、そしてより小さい質量の精製タンパク質に患者を曝露させ、おそらく、阻害薬形成を減少させるであろう。さらに、より長半減期のタンパク質は、まだ治療を受けていない世界中の血友病患者の推定７０％に治療を拡大することができるであろう。因子のコストは重要問題であるが、血友病患者、特に子供たちのために必要とされる複雑な医学的サービスも重要問題である。因子が、単純に皮下注射されるのではなく、静脈を通して注入される必要があるため、重度疾患の子供たちは、専門的な血友病治療センターで治療されることが多い。彼らの治療に対する明らか障害は、彼らは１週間に数回センターに連れて行かれなければならないことであり、これは、発展途上国において、治療の限界を越える可能性がある。より長い期間で持続する因子は、そのようなセンターに行かなければならない機会を、１週間に１度または１カ月に２度にも減少することができるであろう。
【０００６】
この問題は、しばらくの間、認識されていて、そして因子の半減期を長くする多数の試みがあった。治療タンパク質の半減期を増加させるための２つの一般的戦略がある。第１は、一般に、ＰＥＧ化と呼ばれるポリエチレングリコール鎖によるタンパク質の変性である（Ｇｉｎｎ，Ｋｈａｌｉｌｉ，Ｌｅｖｅｒ，＆  Ｂｒｏｃｃｈｉｎｉ，２０１４）。ＰＥＧ鎖は、タンパク質周囲の水和水を増加させ、特定の受容体及び抗体に対する親和性の減少をもたらす。第２の戦略は、免疫グロブリンのＦｃ部分またはヒト血清アルブミンのいずれかによる標的タンパク質の融合によって新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲＮ）を利用することである（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。免疫グロブリン及びアルブミンは両方とも、ＦｃＲＮとのそれらの相互作用及びＦｃＲＮによる保護のため、長い循環半減期を有する。アルブミンまたは免疫グロブリンが種々の細胞中で内在化される場合、それらはＦｃＲＮに結合し、そして分解するのではなく、表面へとリサイクルされる。これらのタンパク質は両方とも、結果として数週間の半減期を有する。
【０００７】
これらの戦略は、血友病Ｂに関与するタンパク質である、ヒト因子ＩＸの半減期を増加させるために、成功裏に利用された（Ｍａｎｎｕｃｃｉ  ＆  Ｍａｎｃｕｓｏ，２０１４）。それらは、ＦＶＩＩＩの半減期を長くすることにおいては、それほど成功していない（Ｂｕｙｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｓｔｅｎｎｉｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ＦＶＩＩＩ自体は、不安定なタンパク質であり、かつフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）の存在を必要とする。ｖＷＦ不在下のＦＶＩＩＩは、数分のみの半減期を有する。複合体の半減期は、ｖＷＦの半減期によって決定されるため、ＦＶＩＩＩへの変性はわずかな効果のみを有し、１２時間から１８時間まで半減期を増加させる。
【０００８】
ＰＥＧ化、アルブミン及びＦｃへの融合を含む類似の戦略が、ＦＶＩＩａのために試みられた（Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ  ＆  Ａｌｂｅｒｔ，２０１４；Ｓｃｈｕｌｔｅ，２００８；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｆｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。これらの変性のそれぞれによって、半減期は２時間から１０時間以上まで増加したが、ＦＶＩＩａによる別の問題を解決することができなかった。ＦＶＩＩａは、組織因子（ＴＦ）との複合体において最も活性である。ＴＦの不在下、止血をもたらすために、非常に高濃度のＦＶＩＩａが必要とされる。設計されたＦＶＩＩａのいくつかの場合、これは阻害薬形成をもたらした。
【０００９】
したがって、長半減期凝固複合体のための組成物及び方法が必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
本明細書中、凝固因子；アルブミンまたはアルブミンフラグメントに融合した第１のタンパク質を含む融合タンパク質；融合タンパク質による結合を可能にし、それによって、変性凝固因子が調製されるように、凝固因子に結合する変性分子；を含み、変性凝固因子及び融合タンパク質が少なくとも２つの独立した部位において相互作用する、凝固因子複合体が開示される。
【００１１】
本明細書において開示された凝固因子複合体を含むキットが開示される。
【００１２】
凝固因子注入を必要とする疾患を有する対象の治療方法であって、本明細書において開示された凝固因子複合体を対象に投与することを含む方法も開示される。疾患は、例えば、血友病であることが可能である。対象への凝固因子複合体の投与によって、凝固因子のみの投与時に得られた血中濃度半減期より長い、凝固因子複合体の血中濃度半減期をもたらすことができる。凝固因子複合体は、注射、吸入、鼻腔内または経口によって対象に投与することができる。
【００１３】
本発明の１つまたはそれ以上の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の説明において明らかにされる。本発明の他の特徴、目的及び利点は、説明及び図面から、ならびに請求の範囲から明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】長半減期凝固因子ＶＩＩＩ（変性凝固因子を含む、凝固因子複合体）の構成のためのスキームを示す。
【図２】長半減期の高活性凝固因子ＶＩＩａ（変性凝固因子を含む、凝固因子複合体）の構成のためのスキームを示す。
【図３Ａ】図３Ａ及びＢは、ＦＶＩＩＩへの変性分子の結合が、その活性を妨げないことを示す。図３Ａは、マレイミド−ＰＥＧ１０００−ラウレートまたはマレイミド−ＰＥＧ１０００−フルオレセインイソチオシアネートのいずれかによって変性されたＦＶＩＩＩが、未変性ＦＶＩＩＩと同活性を示すことを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、未処理のＦＶＩＩＩ、同実験条件を受けたが、変性分子を有さないＦＶＩＩＩ、及び変性分子のマレイミド−ＰＥＧ１０００−ラウレートによって処理されたＦＶＩＩＩが、同活性を有することを示す。
【図４Ａ】図４Ａ及びＢは、ＦＶＩＩＩの重質鎖への変性分子の結合を示す。図４Ａは、未処理のＦＶＩＩＩ（対照）及び変性ＦＶＩＩＩ（変性ＦＶＩＩＩ）による、銀染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（４〜２０％）を示す。変性分子は、マレイミド−ＰＥＧ１０００−ビオチンである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、類似ゲルの電気ブロットを示す。ブロットは、アビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）でプローブされ、次いで、ＨＲＰに関して、変性分子を視覚化するために染色された。
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｃは、アルブミンが変性ＦＶＩＩＩに結合することを示す。図５Ａは、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０中、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅにおいてクロマトグラフされ、そしてＦＶＩＩＩ活性に関して分析されたＦＶＩＩＩを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、同一緩衝液中でのクロマトグラフィーの前に、１０μｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンで前もってインキュベーションされた変性ＦＶＩＩＩ（マレイミド−ＰＥＧ１０００−ラウレート）を示す。アルブミンは、分子量をより高くシフトする。
【図５Ｃ】図５Ｃは、アルブミンが変性ＦＶＩＩＩの活性に影響を与えないことを示す。
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｄは、融合タンパク質の構造及び変性因子複合体の形成を示す。図６Ａは、融合タンパク質モノマー、ＣＭ１１０の構造及びＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、融合タンパク質ダイマー、ＣＭ２１０の構造及びＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０中、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅにおけるクロマトグラフィーの前に、１０μｇ／ｍｌの融合タンパク質モノマー（ＣＭ１１０）で前もってインキュベーションされた変性ＦＶＩＩＩ（マレイミド−ＰＥＧ１０００−ラウレートまたはマレイミド−ＰＥＧ１０００−ミリステートによる変性）を示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ＣＭ１１０の添加が、変性ＦＶＩＩＩの活性に対する影響を与えないことを示す。
【図７Ａ】図７Ａ〜Ｄは、融合タンパク質に変性ＦＶＩＩＩを結合させるクリックケミストリーを示す。図７Ａは、ＦＶＩＩＩを変性するために使用されたクリックケミストリー試薬の構造を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、マレイミド−ＰＥＧ４−６メチルテトラジン（ＭＰＴ）が、ＦＶＩＩＩの活性に影響を与えないことを示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、マレイミド−ＰＥＧ３−トランスシクロオクテンによって変性された融合タンパク質ＣＭ１１０とのＭＰＴ変性ＦＶＩＩＩのインキュベーションが、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０中、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅにおけるクロマトグラフィー後もＦＶＩＩＩ活性を維持する高分子量複合体をもたらすことを示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、複合体の形成がＦＶＩＩＩ活性に影響を与えないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書に記載される材料、組成物及び方法は、開示された主題の特定の態様の以下の詳細な説明、ならびに本明細書に含まれる実施例及び図面を参照することによって、より容易に理解されることができる。
【００１６】
本材料、組成物及び方法が開示及び記される前に、下記の態様が、特定の合成方法及び特定の試薬に限定されず、実際には、もちろん、変化し得ることは理解されるはずである。本明細書で使用される専門用語は、特定の態様を説明することのみを目的としており、かつ限定するように意図されないことも理解されるべきである。
【００１７】
また、本明細書全体で、種々の刊行物が参照される。それら全体でのこれらの刊行物の開示は、開示された主題が関連する技術状態をより完全に説明するため、本出願中に参照することによって本明細書に組み込まれる。開示された参照は、参照が依拠される文中で論じられる部分に含まれる材料に関して本明細書で参照することによって、個々に、そして特に含まれる。
【００１８】
定義
本明細書中、及びそれに続いて、請求の範囲中、多くの用語が参照されるが、これらは、以下の意味を有するものとして定義される：
【００１９】
本明細書及び請求の範囲全体で、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの他の形態は、含むが、それに限定されないことを意味し、かつ例えば、他の添加剤、成分、整数またはステップを排除することは意図されない。
【００２０】
記載及び添付の請求の範囲において使用される場合、単数形の形態「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他を規定しない限り、複数形の指示対象を含む。したがって、例えば、「酵素（ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ）」への参照は、２種以上のそのような酵素の混合物を含み、「善玉菌（ｔｈｅ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）」への参照は、２種以上のそのような善玉菌の混合物などを含む。
【００２１】
「任意の」または「任意に」は、その後記載された現象または状況が、生じることが可能であるか、または生じることが可能ではないこと、ならびに記載には、現象または状況が生じる例及びそれが生じない例が含まれることを意味する。
【００２２】
範囲は、本明細書中、「約」１つの特定値から、及び／または「約」別の特定値までとして表現することができる。「約」は、明記された値の５％以内を意味することができる。そのような範囲が表現される場合、別の態様は、１つの特定値から、及び／または他の特定値までを含む。同様に、値が近似として表される場合、前置詞「約」の使用によって、特定値が別の態様を形成することは理解されるであろう。範囲のそれぞれの終末点が、他の終末点と関係している場合及び他の終末点とは無関係である場合の両方において重要であるとは、さらに理解されるであろう。多数の値が本明細書に開示され、かつそれぞれの値が、本明細書中、その値自体の他に、「約」その特定値として開示されていることも理解されている。例えば、値「５」が開示される場合、「約５」も開示される。
【００２３】
ポリペプチドのフラグメントまたは変異体及びそのいずれの組合せも、本明細書に開示される。本発明のポリペプチド結合領域または結合分子を参照する場合の「フラグメント」または「変異体」という用語は、参照ポリペプチドの少なくともいくつかの特性（例えば、ＦＶＩＩＩ変異体またはフラグメントに関する凝固活性、またはｖＷＦフラグメントに関するＦＶＩＩＩ結合活性、またはアルブミンフラグメントによるリサイクリング活性）を維持するいずれのポリペプチドも含む。ポリペプチドのフラグメントには、本明細書の別の部分で論じられる特定の抗体フラグメントに加えて、タンパク分解フラグメント、ならびに削除フラグメントが含まれるが、自然発生した全長ポリペプチド（または成熟したポリペプチド）を含まない。本発明のポリペプチド結合領域または結合分子の変異体には、上記のフラグメントが含まれ、また、アミノ酸置換、欠失または挿入による異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。変異体は、自然発生または非自然発生型であることが可能である。非自然発生変異体は、当該技術において既知の変異誘発技術を使用して製造することができる。変異体ポリペプチドは、保存または非保存アミノ酸置換、欠失または付加を含むことができる。
【００２４】
「フォンウィルブランド因子」は、本明細書中、「ｖＷＦ」とも記載され、止血に関与する血液糖タンパク質である。基本的なｖＷＦモノマーは、２０５０アミノ酸タンパク質である。全てのモノマーは、因子ＶＩＩＩに結合するＤ’Ｄ３領域（フォンウィルブランド因子型Ｄ領域）を含む、特定の機能を有する多数の特定の領域を含む。
【００２５】
「内在性ｖＷＦ」という用語は、本明細書で使用される場合、血漿中に自然に存在するｖＷＦ分子を示す。内在性ｖＷＦ分子は、マルチマーであることが可能であるが、モノマーまたはダイマーであることも可能である。血漿中の内在性ｖＷＦは、ＦＶＩＩＩに結合し、そしてＦＶＩＩＩとの非共有結合型複合体を形成する。
【００２６】
「アルブミンフラグメント」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載の通り、融合タンパク質の半減期を延長する能力を維持する全長アルブミンのいずれのアルブミンフラグメントまたは変異体を意味する。そのようなアルブミンフラグメント及び変異体は、当業者に知られている。例えば、Ｏｔａｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ（２００９），Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ，Ｂｕｌｌ．３２（４），５２７−５３４は、７７種のアルブミン変異体が知らており、これらの２５種が領域ＩＩＩにおいて突然変異を有することを開示する。カルボキシ終点においてＣ末端１７５アミノ酸が欠けている自然変異体は、減少した半減期を有することが示された（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１０），Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３，３６７−３７２）。Ｉｗａｏ  ｅｔ  ａｌ（２００７）は、マウスモデルを使用して、自然発生ヒトアルブミン変異体の半減期を調査し、そしてＫ５４１  Ｅ及びＫ５６０  Ｅが、減少した半減期を有し、Ｅ５０１  Ｋ及びＥ５７０  Ｋが、増加した半減期を有し、そしてＫ５７３  Ｅが、半減期にほとんど影響を与えなかったことを見出した（Ｉｗａｏ，ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｂ．Ｂ．Ａ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １７７４，１５８２−１５９０）。Ｇａｌｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２２５，２７−３２は、自然変異体Ｅ５０５Ｋを開示する。Ｍｉｎｃｈｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）は、自然変異体Ｋ５３６Ｅを開示する。Ｍｉｎｃｈｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９１６，４１１−４１８は、自然変異体Ｋ５７４Ｎを開示する。Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，４４１３−４４１７は、自然変異体Ｄ５５０Ｇを開示する。Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，８２２５−８２２９は、自然変異体Ｄ５５０Ａを開示する。これらは全て、アルブミンフラグメント及び変異体に関するそれらの教示に関して、全体として参照によって組み込まれる。
【００２７】
「ｖＷＦフラグメント」という用語は、本明細書で使用される場合、ＦＶＩＩＩと相互作用し、かつ全長ｖＷＦによってＦＶＩＩＩに通常提供される特徴、例えば、ＦＶＩＩＩａへの早期活性化の防止、早期タンパク質分解の防止、早期クリアランスに導く可能性のあるリン脂質膜への会合の防止、裸ＦＶＩＩＩを結合するが、ｖＷＦ結合ＦＶＩＩＩを結合する可能性はないＦＶＩＩＩクリアランス受容体への結合の防止、及び／またはＦＶＩＩＩ重質鎖及び軽質鎖相互作用の安定化の少なくとも１つまたはそれ以上を維持する、いずれのｖＷＦフラグメントも意味する。「ｖＷＦフラグメント」という用語は、本明細書で使用される場合、全長または成熟ｖＷＦタンパク質を含まない。特定の実施形態において、「ｖＷＦフラグメント」は、本明細書で使用される場合、ＶＷＦタンパク質Ｄ’領域及びのＤ３領域を含むが、ｖＷＦタンパク質のＡ１領域、Ａ２領域、Ａ３領域、Ｄ４領域、Ｂ１領域、Ｂ２領域、Ｂ３領域、Ｃ１領域、Ｃ２領域及びＣＫ領域を含まない。ｖＷＦフラグメント及び変異体は、当業者に知られており、かつ本明細書に開示される。
【００２８】
「融合」または「キメラ」タンパク質は、それが本質的に自然に連結しない第２のアミノ酸配列に連結する第１のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、「融合タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、一例において、フォンウィルブラン因子フラグメント、例えば、Ｄ’Ｄ３のアルブミンまたはアルブミンフラグメントへの融合を意味する。因子ＶＩＩａに関して、組織因子（ＴＦ）に連結するアルブミンも開示される。
【００２９】
本明細書中、「変性分子」が開示される。変性分子は、凝固因子、例えば、因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）の凝固強化活性を維持しながら、融合タンパク質と相互作用するように、凝固因子を変性することができるいずれの分子でもある。例えば、ＦＶＩＩＩは、ポリエチレングリコール鎖によって変性され、かつ脂肪酸によってキャップされることが可能である。本明細書中、変性分子の種々の例が論じられる。
【００３０】
「変性凝固因子」は、それが十分な凝固活性を維持しながら、融合タンパク質と相互作用することができるように、変性分子によって変性されている凝固因子を意味する。変性凝固因子は、本明細書中、誘導ＦＶＩＩＩまたはＦ８Ｆと記載することもできる。変性凝固因子は、例えば、変性凝固因子複合体、例えば、本発明の因子ＶＩＩＩまたは因子ＶＩＩａ複合体を形成するように、変性ＦＶＩＩＩに結合した脂肪酸を結合することができるような様式でヒトアルブミンに適切なサイズのリンカーによって結合したＤ’Ｄ３の融合タンパク質に結合することが可能である。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「半減期」という用語は、生体内の特定のポリペプチドの生物的半減期を意味する。半減期が、対象に投与された量の半分が、動物において循環及び／または他組織からクリアにされるための所要時間によって表されてよい。
【００３２】
「半減期限定因子」または「ＦＶＩＩＩ半減期限定因子」という用語は、本明細書で使用される場合、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期が、野生型ＦＶＩＩＩと比較して、１．５倍または２倍より長くなることを阻止する因子を示す。例えば、全長または成熟ｖＷＦは、ＦＶＩＩＩ及びｖＷＦ複合体が１つまたはそれ以上のｖＷＦクリアランス経路によって系からクリアにされることを誘発することによって、ＦＶＩＩＩ半減期限定因子の役割を果たすことができる。一例において、内在性ｖＷＦは、ＦＶＩＩＩ半減期限定因子である。別の例において、ＦＶＩＩＩタンパク質に非共有結合した全長組換型ｖＷＦ分子は、ＦＶＩＩＩ−半減期限定因子であることが可能である。
【００３３】
「相互作用」または「連結」という用語は、本明細書で使用される場合、一実施形態において、共有結合または非共有結合を意味する。「共有結合」という用語は、例えば、共有結合、例えば、ジスルフィド結合、ペプチド結合、あるいは１つまたはそれ以上のアミノ酸を意味する。別の実施形態において、「相互作用」または「連結」は、本明細書に開示されたタンパク質またはタンパク質フラグメントが、一緒に連結する２種のタンパク質またはタンパク質フラグメントの間で、例えば、ＦＶＩＩＩ及びアルブミンの間及び／またはＤ’Ｄ３及びアルブミンの間で、リンカーによって連結されることを意味する。第１のアミノ酸は、第２のアミノ酸に直接結合するか、または並置されることができ、あるいは代わりに、介在配列が第１の配列を第２の配列に共有結合することができる。「連結」という用語は、Ｃ末端またはＮ末端における第２のアミノ酸配列への第１のアミノ酸配列の融合のみを意味するのではなく、第２のアミノ酸配列（または、それぞれ、第１のアミノ酸配列）におけるいずれか２個のアミノ酸中への第１のアミノ酸配列（または、第２のアミノ酸配列）全体の挿入も含む。一実施形態において、第１のアミノ酸配列は、ペプチド結合またはリンカーによって第２のアミノ酸配列に結合することが可能である。リンカーは、ペプチドまたはポリペプチドまたはいずれかの化学部分、例えば、クリックケミストリーであることが可能である。
【００３４】
本明細書に開示される凝固因子複合体は、予防のために使用することができる。「予防的治療」という用語は、本明細書で使用される場合、出血エピソードの前、または出血エピソードを防ぐ通常の活動の間に一貫して分子を投与することを意味する。一実施形態において、一般的な止血剤を必要とする対象は、外科手術を経験しているか、または外科手術を経験しようとしている。凝固因子複合体は、外科手術の前または後に予防薬として投与することができる。凝固因子複合体は、急性出血エピソードを制御するために、外科手術の間または後に投与することができる。外科手術としては、限定されないが、肝臓移植、肝臓切除術、歯科治療または茎細胞移植が含まれる。
【００３５】
本発明の凝固因子複合体は、オンデマンド（「断続的」とも記載される）治療のために使用することも可能である。「オンデマンド治療」または「断続的治療」という用語は、出血エピソードの症候に応じて、または出血を引き起こし得る活動の前のキメラ分子の投与を意味する。一態様において、オンデマンド（断続的）治療は、外傷の後などの出血の開始時、または外科手術の前などの出血が予想される場合に、対象に与えることができる。別の態様において、オンデマンド治療は、接触スポーツなどの出血のリスクを増加させる活動の前に与えることができる。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「急性出血」という用語は、根本的な原因にかかわらず、出血エピソードを意味する。例えば、対象は、外傷、尿毒症、遺伝性出血疾患（例えば、因子ＶＩＩ欠失）、血小板疾患、または凝固因子に対する抗体の発達に起因する耐性を有し得る。
【００３７】
治療（ｔｒｅａｔ）、治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、疾患の重症度または状態の減少；疾患コースの継続時間の減少；疾患または状態と関連する１つまたはそれ以上の症候の改善；必ずしも疾患または状態を治すことなく、疾患または状態を有する対象への有益な作用の提供、あるいは疾患または状態と関連する１つまたはそれ以上の症候の予防を意味する。
【００３８】
一実施形態において、「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、本発明の凝固因子複合体を投与することによって、対象において、少なくとも約１ＩＵ／ｄＬ、２ＩＵ／ｄＬ、３ＩＵ／ｄＬ、４ＩＵ／ｄＬ、５ＩＵ／ｄＬ、６ＩＵ／ｄＬ、７ＩＵ／ｄＬ、８ＩＵ／ｄＬ、９ＩＵ／ｄＬ、１０ＩＵ／ｄＬ、１１ＩＵ／ｄＬ、１２ＩＵ／ｄＬ、１３ＩＵ／ｄＬ、１４ＩＵ／ｄＬ、１５ＩＵ／ｄＬ、１６ＩＵ／ｄＬ、１７ＩＵ／ｄＬ、１８ＩＵ／ｄＬ、１９ＩＵ／ｄＬまたは２０ＩＵ／ｄＬのＦＶＩＩＩトラフ濃度を維持することを意味する。別の実施形態において、治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）または治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）は、約１〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約２〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約３〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約４〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約５〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約６〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約７〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約８〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約９〜約２０ＩＵ／ｄＬまたは約１０〜約２０ＩＵ／ｄＬのＦＶＩＩＩトラフ濃度を維持することを意味する。疾患または状態の治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）または治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）は、非血友病患者の対象のＦＶＩＩＩ活性の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％に相当するレベルにおいて、対象のＦＶＩＩＩ活性を維持することも含むことができる。治療に必要とされる最低トラフ濃度は、１つまたはそれ以上の既知の方法によって測定することができて、そして各自に対して調整（増加または減少）が可能である。
【００３９】
凝固因子複合体
ヒトアルブミンは、本明細書中に記載される融合タンパク質の構成において有用な一連の特性を有する。それは、新生児Ｆｃ受容体に結合することによって融合タンパク質の半減期を延長する能力を有し、かつそれは、脂肪酸及びビリルビンを含む多数の小分子を結合する。加えて、それは、種々のリガンドを結合するために利用することができる単一暴露スルフヒドリル基を有する。本明細書で利用される場合、これらの特性は、長半減期ＦＶＩＩＩ、ならびにＦＶＩＩａの長半減期、高活性バージョンの構成を可能にする。本明細書に開示される凝固因子複合体は、凝固因子；アルブミンまたはアルブミンフラグメントに融合した第１のタンパク質を含む融合タンパク質；融合タンパク質による結合を可能にし、それによって、変性凝固因子が調製されるように、凝固因子に結合する変性分子；を含み、変性凝固因子及び融合タンパク質が少なくとも２つの独立した部位において相互作用する。変性分子は、凝固因子への融合タンパク質の結合を可能にするか、または凝固因子と融合タンパク質との間の化学反応を引き起こすように、融合タンパク質に結合することも可能である。凝固因子と変性分子との組合せは、本明細書中、変性凝固因子、例えば、変性因子ＶＩＩＩ及びＶＩＩａと記載することができる。変性凝固因子及び融合タンパク質は、少なくとも２つの独立した部位において相互作用する。凝固因子は、例えば、因子ＶＩＩａであることが可能である。別の実施形態において、凝固因子は、因子ＶＩＩＩであることが可能である。
【００４０】
凝固因子
ｖＷＦは非常に大きい分子であり、かつこれらの大分子の大マルチマー複合体として循環する（Ｌｅｎｔｉｎｇ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ，＆  Ｄｅｎｉｓ，２０１５）。それは非常に大きいので、マクロファージ中に摂取されて、そして粒子として消化される。ＦＶＩＩＩを保護するＤ’Ｄ３と呼ばれるｖＷＦのより小さいフラグメントを設計する試みは成功しており、そしてこのフラグメントをＦｃ領域に融合することによって、劇的にその半減期が増加する（Ｙｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ｖＷＦ不足マウスにおいて、このＤ’Ｄ３−Ｆｃ融合は、約１５時間から７日間以上までＦＶＩＩＩの半減期を増加する。
【００４１】
ｖＷＦ及びＦＶＩＩＩの結合定数は、約０．３ｎＭである（Ｏｒｌｏｖａ，Ｋｏｖｎｉｒ，Ｖｏｒｏｂｉｅｖ，Ｇａｂｉｂｏｖ，＆  Ｖｏｒｏｂｉｅｖ，２０１３）。Ｙｅｅ，ｅｔ  ａｌ．（Ｙｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）によって調製されたＤ’Ｄ３−Ｆｃ融合の測定された結合定数は、１．５ｎＭである。溶液中に約１〜２パーセントの遊離ＦＶＩＩＩが常に存在するように、ＦＶＩＩＩは強く、しかしながら、逆戻り可能なように、ｖＷＦに結合する。マウス及びヒトの両方において、ｖＷＦは、ＦＶＩＩＩよりも約５０倍高い濃度で存在する。より低い結合定数及びｖＷＦのより高い濃度の間で、ＦＶＩＩＩは、Ｄ’Ｄ３−Ｆｃ融合から離れて急速に競争することが可能である。
【００４２】
これらの問題に対する１つの潜在的な解決策は、本明細書に記載されるように、Ｄ’Ｄ３をアルブミンに融合して、それによって、「融合タンパク質」を調製することによって見出される。アルブミンは、血液中の最も豊富なタンパク質である（Ｐｅｔｅｒｓ，１９９５）。前記の通り、循環においてその１９日半減期は、ＦｃＲＮに結合するその能力によって決定される。それは２つの主要な役割を果たす：１つは、血液のオスモル濃度を維持すること、そして第２は疎水性分子を輸送することである。アルブミンは、脂肪酸の主要輸送体である。インスリンの半減期を成功裏に増加させるために使用された戦略は、例えば、ミリスチン酸、１４炭素脂肪酸へのインスリンの抱合である。この分子は、インスリンデテミルと呼ばれる（Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＆  Ｓｃｈｅｅｎ，２００６）。注射時に、脂肪酸は迅速にアルブミンに結合し、４分から５時間までインスリンの半減期を増加する。
【００４３】
これらの２つのアイデアの組合せは、長い間存在する半減期問題を解決し、そして大いに必要とされる解決策を提供するために、新規分子において本明細書に開示される（図１）。例えば、第１に、ＦＶＩＩＩは、ポリエチレングリコール鎖によって変性され、そして例えば、脂肪酸によってキャップされることが可能である。「変性分子」のこの例は、本明細書に記載される場合、「変性凝固因子」の一例を調製する。したがって、脂肪酸は、変性凝固因子を調製するために、一実施形態において、ＦＶＩＩＩ分子から突出する。変性凝固因子は、本明細書中、誘導ＦＶＩＩＩまたはＦ８Ｆと記載することもできる。変性凝固因子は、変性凝固因子複合体、例えば、本発明の因子ＶＩＩＩまたは因子ＶＩＩａ複合体を形成するように、変性ＦＶＩＩＩに結合した脂肪酸を結合することができるような様式でヒトアルブミンに適切なサイズのリンカーによって結合した、ｖＷＦから誘導されたＤ’Ｄ３の融合タンパク質に結合することが可能である。Ｄ’Ｄ３フラグメントは、変性ＦＶＩＩＩ上のその同族部位に結合することができ、そして脂肪酸は、アルブミンに結合することができる。変性凝固因子は、両方とも強い結合定数を有する、２つの部位において融合タンパク質と結合可能である。加えて、融合タンパク質においてアルブミンへとＤ’Ｄ３を結合するリンカーの長さは、最適な半減期延長のために、Ｄ’Ｄ３が、因子ＶＩＩＩ結合部位に対して適切に、または最適に方向づけられることができるように異なって、より長いか、またはより短いことが可能である。このようにして、本来のｖＷＦが変性ＦＶＩＩＩに対して効果的に競争することが可能であろうこと、そしてアルブミンへの結合が実質的に半減期を増加させることは、可能性が低い。
【００４４】
変性凝固因子及び融合タンパク質は、１、２、３、４またはそれ以上の部位において相互作用することが可能である。一実施形態において、変性凝固因子及び融合タンパク質は、両分子上で２つの独立した部位において相互作用する。「独立した部位」とは、分子の一方または両方の非オーバーラップ、または異なる領域を意味する。少なくとも変性凝固因子の１つの結合部位は、自然発生的な結合部位であることが可能である。換言すれば、結合部位は、凝固因子において自然に発生して、そしてその変性の一部ではない。その部位における１つまたはそれ以上のアミノ酸が、凝固因子に対して、自然発生的でも、本来のものでもないように、変性凝固因子における他の結合部位は変性されることが可能である。
【００４５】
融合タンパク質は、２種、３種、４種またはそれ以上の一緒に融合したタンパク質を含むことができる。例えば、第１の融合タンパク質は、フォンウィルブランド因子のＤ’ Ｄ３フラグメントを含むことができる。ｖＷＦの変形及びフラグメントは当業者に知られており、そして本明細書中に考察される。そのようなものの例は、米国特許第９，１２５，８９０号、ならびに米国特許出願公開第２０１４／０３５７５６４号及び同第２０１３／１２０９３９号に見ることができる。代わりに、第１の融合タンパク質は、組織因子（ＴＦ）を含むことが可能である。第２のタンパク質は、アルブミン、または免疫グロブリンＦｃフラグメントを含むことができる。一例において、免疫グロブリンＦｃフラグメントは、変性凝固因子に特異的な単一鎖可変領域（ｓｃＦｖ）を含むことができる。ｓｃＦｖは、変性凝固因子の変性部位に特異的であることが可能である。
【００４６】
図５は、アルブミンが変性ＦＶＩＩＩに結合することができ、そしてそれが再びＦＶＩＩＩ活性に影響を与えないことを明示する。パネルＡは、ＦＶＩＩＩ活性によって分析された、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００サイズ排除カラム上で、マレイミド−ＰＥＧ１０００−ラウレートによって変性されたＦＶＩＩＩのクロマトグラフィーを示す。パネルＢは、誘導ＦＶＩＩＩへのアルブミンの付加が、予期されたように、分子量をより高くシフトさせることを示す。パネルＣは、誘導ＦＶＩＩＩに結合したアルブミンがＦＶＩＩＩ活性を損なわないことを明示する。
【００４７】
融合タンパク質の２つのバージョンが、Ｃ３Ａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０７４１）、ヒト肝細胞株中への移入によって製造された。図６、パネルＡのＣＭ１１０は、フォンウィルブランド因子のＤ’Ｄ３フラグメント、５６アミノ酸グリシン、セリンリッチリンカー及び全長ヒトアルブミンからなる。ＣＭ２１０（図６、パネルＢ）は、Ｄ’Ｄ３領域を通してのスルフヒドリル結合によって連結された、この分子のダイマーである。マレイミド−ＰＥＧ１０００−ラウレートまたはマレイミド−ＰＥＧ１０００−ミリステートによって変性されたＦＶＩＩＩがＣＭ１１０と一緒にインキュベーションされる場合、図６、パネルＣで示されるように、それらは、自然発生的にＦＶＩＩＩの活性をより高分子量にシフトする変性凝固因子複合体を形成する。ＣＭ１１０がこの実験において過剰量で存在する場合、全てのＦＶＩＩＩ活性がより高分子量にシフトすることに留意することは重要である。ＣＭ１１０及びＣＭ２１０のいずれも、変性ＦＶＩＩＩの活性に影響を与えない（図６、パネルＤ）。
【００４８】
このような二重結合戦略は、多くの他の方法によって達成可能であるが、なお、必要とされるＦｃＲＮサイクリングを維持することを当業者は本開示から判断して認識するであろう。アルブミンは、ビリルビンなどの多種多様なリガンドを結合することが知られているため、他のリガンドが、変性分子において脂肪酸を置き換えることができる（Ｐｅｔｅｒｓ，１９９５）。
【００４９】
別の実施形態は、アルブミン／脂肪酸対を抗体／小分子の組合せに置き換えることである。同族モノクローナル抗体を有する多くの小分子があり、そしてこれらは、しばしば、生物学試験片において小分子の検出に使用される（Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ｓｉｄｈｕ，Ｄｉｉｂｅｌ，＆  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，２０１１）。Ｄ’Ｄ３、アミノ酸スペーサー、免疫グロブリンのＦｃ領域、及び小分子、例えば、ニトロチロシンに特異的な単一鎖可変領域を有する分子を構成することができる。次いで、変性分子は、マレイミド−ＰＥＧ１０００−ニトロチロシンの形態をとることができた。これは、同一の二重結合効果及びＦｃＲＮサイクリングを有するが、免疫グロブリンベースｍを使用する。
【００５０】
変性ＦＶＩＩＩの類似の戦略を使用する別の選択肢は、凝固因子及び融合タンパク質の間に共有結合を形成するために使用することができる。クリックケミストリーまたはバイオ直交型ケミストリーは、複合体化学環境において互いにのみ反応するよう意図される分子を説明する。図７中のパネルＡは、一般構造マレイミド−ＰＥＧＮ−Ｘの２種のそのような分子を示し、この場合、Ｘは、一方ではメチルテトラジンであり、他方ではトランスシクロオクテン（ＴＣＯ）である。上記の通り、メチルテトラジン含有分子によるＦＶＩＩＩの変性は、活性に影響を与えない（図７、パネルＢ）。本明細書に記載される融合タンパク質であるＣＭ１１０及びＣＭ２１０上の唯一の遊離スルフヒドリルは、アルブミン中のシステイン３４に相当するものである。マレイミド−ＰＥＧ３−ＴＣＯによってＣＭ１１０またはＣＭ２１０、及びマレイミド−ＰＥＧ４−メチルテトラジンによってＦＶＩＩＩを変性し、次いで混合することによって、ＴＣＯがメチルテトラジンと反応した時に、共有結合した複合体が形成する。パネルＣは、マレイミド−ＰＥＧ４−メチルテトラジン変性ＦＶＩＩＩへのマレイミド−ＰＥＧ３−ＴＣＯ変性ＣＭ１１０の付加によって、なおＦＶＩＩＩ活性を維持する高分子量複合体がもたらされることを示す。パネルＤは、再び、共有結合複合体の形成が活性に影響を与えないことを明示する。
【００５１】
分子内結合の数学は、Ｋｒａｍｅｒ及びＫａｒｐｅｎ（Ｋｒａｍｅｒ  ＆  Ｋａｒｐｅｎ，１９９８）によって、より詳細に、Ｚｈｏｕ（Ｚｈｏｕ，２００６）によって説明されている。結合は、個々の解離定数及び有効な局部濃度の関数である。融合タンパク質におけるアルブミン及び変性ＦＶＩＩＩの間の結合は、例えば、変性ＦＶＩＩＩへとＤ’Ｄ３フラグメントを結合する。次いで、Ｄ’Ｄ３フラグメントの局部濃度は非常に高くなり、内在性ｖＷＦの結合を妨げる。ＦＶＩＩＩへのＤ’Ｄ３結合またはアルブミンへの脂肪酸結合のいずれかのための解離定数がナノモル範囲であるため、変性ＦＶＩＩＩへの融合タンパク質の結合は強いべきである。クリックケミストリー変性複合体に関しては、連結は共有結合である。
【００５２】
この二重結合戦略は、Ｙｅｅ，ｅｔ  ａｌ．２（Ｙｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）が遭遇した少なくとも２つの問題を克服する。第１は、融合タンパク質に対するＦＶＩＩＩの結合親和性を増加し、そして既存の高濃度の血清中ｖＷＦによる希釈を防ぐことである。結合は、今や、結合定数及び有効濃度の両方の生成物であるべきであり、遊離ｖＷＦまたは遊離脂肪酸が結合のために効果的に競争することが不可能である。
【００５３】
本明細書中、変性凝固因子複合体とも記載されるこの分子は、ＦＶＩＩＩまたは他の長半減期ＦＶＩＩＩ分子によって与えられない、いくつかの望ましい特徴を有する。第１に、非常に強い、または共有結合は、融合タンパク質からの変性ＦＶＩＩＩの解離が非常に少ないことを保証し、通常のｖＷＦの大プール中への投与されたＦＶＩＩＩの損失を防ぐ。第２に、内在性ｖＷＦから変性凝固因子複合体を分離し、そして半減期を延長するために融合タンパク質を使用することによって、７日間以上であったＤ’Ｄ３−Ｆｃタンパク質に関するＹｅｅ，ｅｔ  ａｌ．（Ｙｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）によって示されたものと類似の半減期が得られる。第３に、遊離ＦＶＩＩＩではなく、変性凝固複合体を投与することによって、阻害薬形成の発生率を減少することができる。第４に、アルブミンを、ＦＶＩＩＩに直接ではなく、融合タンパク質に結合することによって、ＦＶＩＩＩ活性が保存される。ＦＶＩＩＩへのアルブミンの直接融合は、不活性分子をもたらす｛Ｐｏｗｅｌｌ：２０１５ｇｕ｝。アルブミンをＦＶＩＩＩと直接接触させずに離れて配置することは、ＦｃＲＮによる効率的なリサイクルを補助するであろう。最終的に、これは、ヒト細胞系において製造された全ヒトタンパク質であり、これは、さらに阻害薬形成の発生率を減少することができる。
【００５４】
変性凝固因子ＶＩＩＩを含む凝固因子複合体の半減期は、凝固因子単独と比較して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％またはそれより高くなることが可能である。凝固因子複合体は、未変性の凝固因子と比較して、２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍またはそれより長い半減期を有することができる。より特に、凝固因子複合体の半減期は、ＦＶＩＩＩタンパク質単独の半減期よりも少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍または少なくとも約１２倍またはそれより長くなることが可能である。一実施形態において、ＦＶＩＩＩの半減期は、野生型ＦＶＩＩＩの半減期より約１．５倍〜約２０倍、約１．５倍〜約１５倍または約１．５倍〜約１０倍長い。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩの半減期は、凝固因子複合体中にある場合、野生型ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩタンパク質単独と比較して、約２倍〜約１０倍、約２倍〜約９倍、約２倍〜約８倍、約２倍〜約７倍、約２倍〜約６倍、約２倍〜約５倍、約２倍〜約４倍、約２倍〜約３倍、約２．５倍〜約１０倍、約２．５倍〜約９倍、約２．５倍〜約８倍、約２．５倍〜約７倍、約２．５倍〜約６倍、約２．５倍〜約５倍、約２．５倍〜約４倍、約２．５倍〜約３倍、約３倍〜約１０倍、約３倍〜約９倍、約３倍〜約８倍、約３倍〜約７倍、約３倍〜約６倍、約３倍〜約５倍、約３倍〜約４倍、約４倍〜約６倍、約５倍〜約７倍または約６倍〜約８倍長い。他の実施形態において、凝固因子複合体の半減期は、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間または少なくとも約１０８時間である。なお他の実施形態において、凝固因子複合体の半減期は、約１５時間〜約２週間、約１６時間〜約１週間、約１７時間〜約１週間、約１８時間〜約１週間、約１９時間〜約１週間、約２０時間〜約１週間、約２１時間〜約１週間、約２２時間〜約１週間、約２３時間〜約１週間、約２４時間〜約１週間、約３６時間〜約１週間、約４８時間〜約１週間、約６０時間〜約１週間、約２４時間〜約６日間、約２４時間〜約５日間、約２４時間〜約４日間、約２４時間〜約３日間または約２４時間〜約２日間である。
【００５５】
いくつかの実施形態において、対象あたりの凝固因子複合体の平均半減期は、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間（１日間）、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約３２時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約４０時間、約４４時間、約４８時間（２日間）、約５４時間、約６０時間、約７２時間（３日間）、約８４時間、約９６時間（４日間）、約１０８時間、約１２０時間（５日間）、約６日間、約７日間（１週間）、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間または約１４日間である。
【００５６】
長半減期、高活性ＦＶＩＩａ
長半減期、高活性ＦＶＩＩａを調製するために、類似戦略を適用することができる（図３）。標準的な凝固条件下、ＦＶＩＩは、最初に、タンパク質分解によってＦＶＩＩａへと活性化される。しかしながら、ＦＶＩＩａは、因子Ｘ（ＦＸ）を活性化するその機能を実行することに対して、非常に低い活性を有する。ＦＶＩＩａが、外傷の部位において、膜結合組織因子に出会う時、それは結合して、１００倍より高いＦＸａ製造活性を有する複合体を形成する（Ｖａｄｉｖｅｌ  ＆  Ｂａｊａｊ，２０１２）。通常、ＦＶＩＩａは、極低濃度で存在し、そして血液凝固の増幅カスケードを引き起こすことのみに機能する。バイパス剤として、ＦＶＩＩａは、それがフィブリンクロットを形成するために必要とされるトロンビンバーストを提供するために十分なＦＸからＦＸａへの活性化ができるように、非常に高い濃度で投与される。
【００５７】
上記で開示された長半減期ＦＶＩＩＩの例と類似して、ＴＦは、約１ｎＭのＦＶＩＩａに対する解離定数を有する（Ｖａｄｉｖｅｌ  ＆  Ｂａｊａｊ，２０１２）。最初に水溶性脂肪酸によってＦＶＩＩａを誘導化し、次いで、それを、可溶性組織因子−アルブミン融合タンパク質に結合させることによって、いくつかの望ましい特性を有する複合体が調製されるであろう。複合体は、ＦＸの活性化に関して、２、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００倍またはそれより高い、増加した活性を有する。これによって、現在使用されているよりも実質的に少ない量のタンパク質を用いての効果的なバイパス治療が可能となり、それによって、コスト及び免疫原性チャンスの両方が減少する。複合体の半減期は、アルブミン融合の結果としてＦｃＲＮを経由してリサイクルすることによって増加させることができ、それによって、それほど頻繁でない投与がもたらされる。これは、その非常に短い２時間の半減期のため、ＦＶＩＩａに関する重要な考慮である。控えめな延長さえ有用であるが、この分子は、特に長い半減期を与えることができる。ＦＶＩＩａへのアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）の結合は、ＦＶＩＩａ活性のクリアランスの主要経路の１つである（Ｌａｗｓｏｎ，Ｂｕｔｅｎａｓ，Ｒｉｂａｒｉｋ，＆  Ｍａｎｎ，１９９３）。ＡＴＩＩＩは、ヘパリンの存在下において、及びＴＦが膜結合された場合、ＦＶＩＩａを非活性化することにおいて最も有効である。ＦＶＩＩａのＡＴＩＩＩ介在非活性化の研究によって、ＡＴＩＩＩがＦＶＩＩａをＴＦから取り外し、次いで、再結合を防ぐことが示された。強く結合したＴＦの存在は、膜結合ＴＦへの誘導ＦＶＩＩａＦの結合を防ぎ、そしておそらく、ＡＴＩＩＩ非活性化を防ぐであろう。
【００５８】
変性分子
「変性分子」は、本明細書に開示される場合、凝固因子を変性し、そしてそれが融合タンパク質と相互作用することを可能にさせるいずれの分子も含むことができる。変性分子は、例えば、脂肪酸を含むことができる。変性分子は、例えば、ポリエチレングリコール鎖を通して変性凝固因子に結合することができる。融合タンパク質の第１及び第２のタンパク質は、例えば、リンカーによって一緒に結合することができる。変性凝固因子は、１つまたはそれ以上の変性アミノ酸を含むことができる。さらに、あるいは代わりに、融合タンパク質は、変性アミノ酸を含むことができる。例えば、本発明の凝固因子複合体は、いくつかの実施形態において、ペプチド結合または変性ペプチド結合、すなわち、ペプチドイソスターによって互いに結合したアミノ酸から構成されることが可能であり、かつ２０の遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。ポリペプチドは、翻訳後加工などの天然プロセス、または当該技術において周知の化学変性技術のいずれかによって変性されてもよい。そのような変性は、基本テキストに十分に説明されており、より詳細には、特定主題論文で、ならびに多数の研究文献で説明される。
【００５９】
変性は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミノまたはカルボキシル末端を含む、ポリペプチドのいずれにおいても生じることができる。同種の変性が、所与のポリペプチドの様々な部位において、同一または様々な度合で存在し得ることは理解されるであろう。また、所与のポリペプチドが多くの種類の変性を含んでもよい。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン結合の結果として分枝していてもよく、かつそれらは、分枝の有無にかかわらず、環式であってもよい。環式、分枝及び分枝環式ポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスの結果として生じ得、または合成法によって製造されてもよい。変性には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボース化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、ｐｅｇ化、タンパク分解プロセス、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ介在付加、例えば、アルギニル化及びユビキチン結合が含まれる。（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ｐｇｓ．１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
【００６０】
ＦＶＩＩＩは、表１に示される一般構造マレイミド−ＰＥＧｎ−Ｘの多数の変性分子によって変性されることができる。種々のそのような変性分子を使用することができる。例えば、マレイミド−ＰＥＧの種々の変性は、ＰＥＧ−マレイミド誘導体に関するその開示に関して全体として参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第６，８２８，４０１号に提示されるものなど、当業者に既知である。本発明の例において、この変性は、ＦＶＩＩＩの活性に対する影響は観察されなかった。図３は、Ｍａｌ−ＰＥＧ−ラウレートまたはＭａｌ−ＰＥＧ−ＦＩＴＣによる変性の前及び後のＦＶＩＩＩ活性を示す。図４は、ＳＤＳ含有ポリアクリルアミドゲルを示す。パネルＡは、誘導体化が、ＦＶＩＩＩの分子量または構造に対して影響を有さないことを示す銀染色ゲルである。パネルＢは、変性分子、この場合、マレイミド−ＰＥＧ５０００−ビオチンを視覚化するために、ストレプトアビジン−ＨＲＰによってプローブされた別のゲルのタンパク質ブロットを示す。結果は、Ｍａｌ−ＰＥＧ−ビオチン分子がＦＶＩＩＩの重質鎖と反応することを示す。変性分子の例を表１に見ることができる。
表１．ＦＶＩＩＩを変性するために使用される分子
マレイミド−ＰＥＧ５０００−ビオチン
マレイミド−ＰＥＧ１０００フルオレセインイソチオシアネート
マレイミド−ＰＥＧ１０００−ラウレート
マレイミド−ＰＥＧ１０００−ミリステート
マレイミド−ＰＥＧ４−６−メチルテトラジン
マレイミド−ＰＥＧ３−トランスシクロオクテン
【００６１】
凝固因子の変性のための化学部分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどの水溶性ポリマーから選択されてもよい。凝固因子は、分子内のランダムな位置で、または分子内のあらかじめ決められた位置で変性されてよく、かつ１、２、３またはそれ以上の結合した化学部分を含んでもよい。
【００６２】
ポリマーは、いずれの分子量のものであってもよく、かつ分枝していても、または分枝していなくてもよい。ポリエチレングリコールに関して、好ましい分子量は、取扱い及び製造の容易さのため、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａである（「約」という用語は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつかの分子が、記載された分子量より多く、いくつかは少なくなるであろうことを示している）。所望の治療プロフィール（例えば、所望の徐放期間、もしあるとすれば、生物学的活性に対する影響、取扱いの容易さ、抗原性の度合または欠如、及び治療タンパク質または類似体へのポリエチレングリコールの他の既知の効果）次第で、他のサイズが使用されてもよい。例えば、ポリエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００または１００，０００ｋＤａの平均分子量を有し得る。
【００６３】
上記のとおり、ポリエチレングリコールは、分枝構造を有し得る。分枝ポリエチレングリコールは、例えば、米国特許第５，６４３，５７５号；Ｍｏｒｐｕｒｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５６：５９−７２（１９９６）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖ  ｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １８：２７４５−２７５０（１９９９）；及びＣａｌｉｃｅｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：６３８−６４６（１９９９）に記載されている。上記文献のそれぞれの開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６４】
ポリエチレングリコール分子（または他の化学部分）は、タンパク質の機能的または抗原性領域に対する影響を考慮して、タンパク質に結合するべきである。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、欧州特許第０４０１３８４号（Ｇ−ＣＳＦへのＰＥＧのカップリング）に開示される方法などの多数の結合方法が当業者に利用可能である。また、塩化トレシルを使用するＧＭ−ＣＳＦのｐｅｇ化を報告する、Ｍａｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−１０３５（１９９２）も参照のこと。例えば、ポリエチレングリコールは、遊離アミノまたはカルボキシル基などの反応性基を経由してアミノ酸残基を通って共有結合されてもよい。反応性基は、活性化ポリエチレングリコール分子が結合し得るものである。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基としては、リシン残基及びＮ末端アミノ酸残基が含まれ得；遊離カルボキシル基を有するものとしては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基及びＣ末端アミノ酸残基が含まれ得る。スルフヒドリル基も、ポリエチレングリコール分子を結合するための反応性基として使用されてよい。Ｎ末端またはリシン基における結合など、アミノ基における結合が治療目的では好ましい。
【００６５】
上記で示唆されるように、ポリエチレングリコールは、多数のアミノ酸残基のいずれにも、連結によってタンパク質に結合し得る。例えば、ポリエチレングリコールは、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはシステイン残基への共有結合によって、タンパク質に連結されることができる。ポリエチレングリコールをタンパク質の特定のアミノ酸残基（例えば、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはシステイン）に、またはタンパク質のアミノ酸残基（例えば、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン及びその組合せ）の２つ以上の種類に結合させるために、１つまたはそれ以上の反応化学が使用されてもよい。
【００６６】
Ｎ末端において化学的に変性させたタンパク質が特に望まれてもよい。本組成物の一例として、ポリエチレングリコールを使用して、（分子量、分岐などによる）様々なポリエチレングリコール分子、反応混合物中のポリエチレングリコール分子対タンパク質（ポリペプチド）分子の割合、実行されるｐｅｇ化反応の種類、及び選択されたＮ末端ｐｅｇ化タンパク質の入手方法から選択されてもよい。Ｎ末端ｐｅｇ化調製物の入手方法（すなわち、必要であれば、他のモノｐｅｇ化部分からこの部分を分離すること）は、ｐｅｇ化タンパク質分子の個体群からのＮ末端ｐｅｇ化材料の精製によるものであってよい。Ｎ末端変性において化学的に変性された選択的タンパク質は、特定のタンパク質における誘導体化のために利用可能な種々の種類の主要アミノ基の微分反応度（リシン対Ｎ末端）を利用する還元アルキル化によって達成されてもよい。適切な反応条件下、カルボニル基含有ポリマーによるＮ末端におけるタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【００６７】
上記で示されるように、本発明の凝固因子のｐｅｇ化は、いずれかの数の手段によっても達成されてよい。例えば、ポリエチレングリコールは、直接または介入リンカーによって分子に結合され得る。ポリエチレングリコールをタンパク質に結合するためのリンカーなしの系は、Ｄｅｌｇａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌ．６８：１−１８（１９９８）；米国特許第４，００２，５３１号；米国特許第５，３４９，０５２号；ＷＯ９５／０６０５８；及びＷＯ９８／３２４６６に記載されており、これらの文献のそれぞれ開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６８】
介入リンカーを用いずに、ポリエチレングリコールをタンパク質のアミノ酸残基に直接結合するための１つの系は、塩化トレシルを使用するモノメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）の変性によって製造されるトレシル化ＭＰＥＧを利用する。タンパク質とトレシル化ＭＰＥＧとの反応時、ポリエチレングリコールは、タンパク質のアミン基に直接結合される。したがって、本発明は、本発明のタンパク質を、２，２，２−トリフルオロスルホニル基をを有するポリエチレングリコール分子と反応させることによって製造された、タンパク質−ポリエチレングリコール抱合体を含む。
【００６９】
ポリエチレングリコールは、多数の種々の介入リンカーを使用してタンパク質に結合することもできる。例えば、参照によって全開示が本明細書に組み込まれる米国特許第５，６１２，４６０号は、ポリエチレングリコールをタンパク質と結合するためのウレタンリンカーを開示する。ポリエチレングリコールがリンカーによってタンパク質に結合されるタンパク質ポリエチレングリコール抱合体は、タンパク質と、ＭＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート、１，１’−カルボニルジイミダゾールによって活性化されたＭＰＥＧ、ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロぺニルカルボネート、ＭＰＥＧ−ｐ−ニトロフェノールカルボネート及び種々のＭＰＥＧ−スクシネート誘導体などの化合物との反応によっても製造することができる。多数の追加的なポリエチレングリコール誘導体及びポリエチレングリコールをタンパク質に結合するための反応化学については、全開示が参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ９８／３２４６６号に記載されている。本明細書に開示される反応化学を使用して製造されたＰｅｇ化タンパク質生成物は、本発明の範囲内に含まれる。
【００７０】
また、本発明の変性凝固因子と結合するポリエチレングリコール部分の数（すなわち、置換度）は変動し得る。例えば、本発明のｐｅｇ化タンパク質は、平均上、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０またはより多くのポリエチレングリコール分子に連結し得る。同様に、タンパク質分子あたり１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、５〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、１１〜１３、１２〜１４、１３〜１５、１４〜１６、１５〜１７、１６〜１８、１７〜１９または１８〜２０のポリエチレングリコール部分などの範囲内の平均置換度。置換度を決定するための方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）に記載されている。
【００７１】
本発明のポリペプチドは、限定されないが、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む標準方法によって、化学合成及び組換細胞培養物から回収及び精製することができる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために使用される。タンパク質リフォールディングのためのよく知られている技術は、ポリペプチドが単離及び／または精製の間に変性される場合、活性配置を再生させるために使用されてもよい。
【００７２】
本発明の変性凝固因子複合体の存在及び量は、当該技術において周知のイムノアッセイであるＥＬＩＳＡを使用して決定されてよい。本発明の変性分子を検出／定量化するために有用であろう１つのＥＬＩＳＡプロトコルにおいて、抗ヒト血清アルブミン抗体によるＥＬＩＳＡプレートのコーティング、非特異的結合を防ぐためのプレートのブロッキング、ＥＬＩＳＡプレートの洗浄、（１つまたはそれ以上の異なる濃度で）本発明の分子を含有する溶液の添加、（本明細書に記載されるか、当該技術において周知の）検出可能なラベルに結合した第２の非治療タンパク質特異的抗体の添加、及び第２の抗体の存在の検出を含む。このプロトコルの代わりのバージョンにおいて、ＥＬＩＳＡプレートは、抗治療タンパク質特異的抗体でコーティングされてもよく、かつラベル化された第２の試薬は、抗ヒトアルブミンスーパーファミリー特異的抗体であってもよい。
【００７３】
ポリペプチド及びポリヌクレオチドフラグメント及び変異体
本発明は、さらに、本明細書に記載の凝固因子複合体のフラグメント、ならびに変性凝固因子、変性分子または融合タンパク質などの凝固因子複合体の個々の成分のフラグメントに関する。これらの変性は、活性または半減期を増加させるように分子を変性させる、本明細書に開示されたもの、または分子の性質を強化するか、もしくは他の理由でそれを望ましくさせる他の変性を含むことができる。
【００７４】
１つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失が、１つまたはそれ以上の機能の変性または損失をもたらすとしても、複合体の凝固機能はなお維持され得る。したがって、本明細書に開示される分子のフラグメントには、全長タンパク質、ならびに参照ポリペプチドのアミノ酸配列から１つまたはそれ以上の残基が欠失されたポリペプチドが含まれ、本明細書において考察される。  
【００７５】
本出願は、本明細書に明示される参照ポリペプチド配列（例えば、凝固因子、変性分子または融合タンパク質）またはそのフラグメントに対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリペプチドを含有するタンパク質に関する。
【００７６】
「変異体（Variant）」とは、参照核酸またはポリペプチドとは異なるが、その基本的な特性を維持するポリヌクレオチドまたは核酸を意味する。一般に、変異体は、全体的に非常に類似しており、そして、多くの領域において、参照核酸またはポリペプチドとまったく同一である。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「変異体」は、タンパク質の既知の配列とは配列が異なるが、本明細書の他に記載されるか、または当該技術において既知の少なくとも１つのその機能及び／または治療特性（例えば、治療活性及び／または生物学活性、凝固を含むが、それに限定されない）を維持する、本明細書に開示されたタンパク質を意味する。一般に、変異体は、全体的に極めて類似しており、そして、多くの領域において、目的のタンパク質またはアルブミンスーパーファミリータンパク質のアミノ酸配列と同一である。
【００７８】
本発明は、例えば、凝固因子自体、融合タンパク質または変性分子のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、あるいは代わりに、それからなるタンパク質にも関する。これらのポリペプチドのフラグメントも提供される（例えば、本明細書に記載されたフラグメント）。本発明によって包含されるさらなるポリペプチドは、厳しいハイブリッド化条件下（例えば、約４５℃で６倍の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で結合ＤＮＡをフィルターし、それに続いて、約５０〜６５℃で０．２倍のＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回またはそれ以上洗浄するためのハイブリッド化）、非常に厳しい条件下（例えば、約４５℃で６倍の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で結合ＤＮＡをフィルターし、それに続いて、約６８℃で０．１倍のＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで１回またはそれ以上洗浄するためのハイブリッド化）、または当業者に既知の他の厳しいハイブリッド化条件下で本発明のアミノ酸配列をコード化する核酸分子の補体にハイブリッド化する、ポリヌクレオチドによってコード化されたポリペプチドである（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８９  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，及びＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，６．３．１−６．３．６及び２．１０．３頁を参照のこと）。これらのポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドも本発明によって含まれる。
【００７９】
少なくとも、本発明の問題のアミノ酸配列と、例えば、９５％「同一の」アミノ酸配列を有するポリペプチドによって、対象ポリペプチド配列が、問い合わせアミノ酸配列の１００アミノ酸あたり５までのアミノ酸変性を含み得ることを除き、対象ポリペプチドのアミノ酸配列が、問い合わせ配列と同一であることが意図される。換言すれば、問い合わせアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、対象配列中のアミノ酸残基の５％までが挿入、欠失、または別のアミノ酸によって置換されていてもよい。参照配列のこれらの変性は、参照アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端位において生じてもよく、またはこれらの末端位の間で、参照配列の残基の間で個々に分散して、もしくは参照配列内の１つまたはそれ以上の隣接する基において生じてもよい。
【００８０】
実際的な問題として、いずれかの特定のポリペプチドが、例えば、凝固因子またはフラグメントのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％は９８％または９９％同一であるかどうかは、既知のコンピュータプログラムを使用して慣習的に決定することができる。問い合わせ配列（本発明の配列）及び対象配列の間の最良の全体的適合を決定するための好ましい方法は、グローバル配列アライメントとも呼ばれ、Ｂｒｕｔｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づき、ＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定することができる。配列アライメントにおいて、問い合わせ及び対象配列は、両方ともヌクレオチド配列またはアミノ酸配列である。上記グローバル配列アライメントの結果は、パーセント同一性として表される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アライメントで使用される好ましいパラメーターは、以下の通りである：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ  ０，ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２，Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１，Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０，Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０，Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１，Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｌｅｎｇｔｈ，Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５，Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５，Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００またはより短い対象アミノ酸配列の長さ。
【００８１】
本発明のポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非翻訳領域または両方において変性を含有し得る。サイレント置換、付加または欠失を生じるが、コード化されたポリペプチドの特性または活性を変更しない変性を含有するポリヌクレオチド変異体が特に好ましい。遺伝コードの縮重によるサイレント置換によって生じたヌクレオチド変異体が好ましい。さらに、５０未満、４０未満、３０未満、２０未満、１０未満、または５〜５０、５〜２５、５〜１０、１〜５もしくは１〜２のアミノ酸が、いずれかの組合せで置換、欠失または付加されるポリペプチド変異体も好ましい。ポリヌクレオチド変異体は、様々な理由で、例えば、特定のホストのためにコドン発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡのコドンを、酵母またはＥ．ｃｏｌｉなどの細菌ホストに好ましいものに変更する）ために、製造することができる。
【００８２】
自然発生型変異体は「対立遺伝子変異体」と呼ばれ、そして生体の染色体上の所与の位置を占める遺伝子のいくつかの代わりの形態の１つを示す（Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子変異体は、ポリヌクレオチド及び／またはポリペプチドレベルで変化することが可能であり、かつ本発明に含まれる。代わりに、非自然発生型変異体は、突然変異誘発技術によって、または直接的合成によって製造されてもよい。
【００８３】
タンパク質エンジニアリング及び組換ＤＮＡ技術の周知の方法を使用して、本発明のポリペプチドの特徴を改善するか、または変更するために、変異体が調製されてもよい。例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸が、生物学的機能の実質的な損失を伴わずに、本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端から欠失することが可能である。例として、Ｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１９９３））は、３、８または２７のアミノ末端アミノ酸残基が欠失した後でさえも、ヘパリン結合活性を有する変異体ＫＧＦタンパク質を報告した。同様に、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０のアミノ酸残基が欠失した後、インターフェロンガンマは、１０倍まで高い活性を示した。（Ｄｏｂｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：１９９−２１６（１９８８）．）
【００８４】
したがって、本発明は、機能的活性（例えば、生物学的活性及び／または治療的活性）を有するポリペプチド変異体をさらに含む。非常に好ましい実施形態において、本発明は、長期半減期などの機能的活性の増加を可能にする変性を凝固因子に提供する。
【００８５】
凝固因子注入を必要とする疾患を有する対象の治療方法であって、本明細書において開示された凝固因子複合体を対象に投与することを含む方法も開示される。疾患は、例えば、血友病であることが可能である。対象への凝固因子複合体の投与によって、凝固因子のみの投与時に得られた血中濃度半減期より長い、凝固因子複合体の血中濃度半減期をもたらすことができる。凝固因子複合体は、注射、吸入、鼻腔内または経口によって対象に投与することができる。
【００８６】
本発明の変性凝固因子複合体またはその配合物は、非経口（例えば、皮下または筋肉内）注射または静脈内注入を含む、いずれかの従来法によって投与されてよい。治療は、単一投与、またはある期間にわたっての複数回投与からなってもよい。
【００８７】
本明細書に開示された凝固因子複合体は、１つまたはそれ以上の許容可能なキャリアと一緒に、医薬配合物として存在することが可能である。キャリア（複数可）は、凝固因子複合体と適合可能であり、かつその受容体にとって有害ではないという意味で、「許容可能」でなければならない。
【００８８】
配合物は、単位剤形で都合よく提供されてもよく、かつ薬学技術において周知のいずれかの方法によって調製され得る。そのような方法には、１つまたはそれ以上の付属要素を構成するキャリアと凝固因子複合体を会合させるステップが含まれる。一般に、配合物は、活性成分を液体キャリアまたは微粉砕固体キャリアまたは両方と均一かつ密接に会合させ、次いで、必要であれば、製品を形成することによって調製される。
【００８９】
キット
凝固因子複合体を含むキットも本明細書に開示される。本発明の配合物または組成物は、凝固因子複合体の延長された貯蔵寿命を示す取扱説明書もしくは添付文書と一緒に包装されてもよいか、またはそれと一緒にキット内に含まれてもよい。例えば、そのような取扱説明書または添付文書は、本発明の凝固因子複合体の延長されたか、または長期の貯蔵寿命を考慮に入れて、時間、温度及び光などの推薦される貯蔵条件を記載してもよい。そのような取扱説明書または添付文書は、管理された病院、クリニックまたはオフィス条件の以外の現場での使用を必要し得る配合物の貯蔵の容易さなどの本発明の凝固因子複合体の特定の利点も記載してもよい。上記のように、本発明の配合物は水性形態であってもよく、かつ治療活性の有意な損失を伴わずに、理想的状況とはほど遠い状況下で貯蔵されてもよい。
【００９０】
治療方法
本発明の凝固因子複合体及び／またはポリヌクレオチドは、単独で、または他の治療剤との組合せで投与されてもよい。それらは、本発明の他の凝固因子複合体及び／またはポリヌクレオチドとの組合せで投与されてもよい。組合せは、同時に、例えば、混合物として、別個ではあるが、同時に；または連続的に投与されてよい。これには、組み合わせられた薬剤が一緒に治療混合物として投与されるプレゼンテーション、組み合わせられた薬剤が、別個ではあるが、同時に、例えば、別個の静脈路を通して同一個人に投与される手順が含まれる。「組合せの」投与は、最初に与えられ、第２が続く、１種の化合物または薬剤をさらに含む。
【００９１】
特定の態様において、本発明の方法で使用される凝固因子複合体は、緩衝剤、糖及び／または糖アルコール（限定されないが、トレハロース及びマンニトールを含む）、（グリシンなどの）安定剤、ならびに（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０などの）界面活性剤を含有する配合物中に含まれることが可能である。さらなる実施形態において、配合物は、ナトリウム、ヒスチジン、カルシウム及びグルタチオンをさらに含み得る。
【００９２】
一態様において、凝固因子複合体を含む配合物は、、投与前に凍結乾燥される。凍結乾燥は、当該技術において共通の技術を使用して実行され、かつ開発された組成物のために最適化されるべきである（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２１：１９１−２００，（２００４）及びＣｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．１３：２４３−９（１９９６））。
【００９３】
医薬配合物を調製する方法は、次のステップの１つまたはそれ以上を含むことができる：凍結乾燥の前に、上記混合物に、本明細書に記載の安定剤を添加すること、凍結乾燥の前に、上記混合物に、本明細書に記載のバルキング剤、オスモル濃度調節剤、界面活性剤から選択される少なくとも１種の薬剤を添加すること。凍結乾燥された配合物は、一態様において、１種またはそれ以上の緩衝剤、バルキング剤及び安定剤から少なくとも構成される。本態様において、凍結乾燥ステップの間または再構成の間に凝集が問題となる場合、界面活性剤の有益性は評価され、かつ選択される。凍結乾燥の間にｐＨの安定域内に配合物を維持するために、適切な緩衝剤が含まれる。
【００９４】
凍結乾燥された材料の標準的な再構成の実施は、（典型的に凍結乾燥の間に除去された体積と等しい）純水または殺菌注射用蒸留水（ＷＦＩ）の体積を戻して添加することであるが、抗菌剤の希薄溶液が、非経口投与のため医薬品製造において使用されることもある（Ｃｈｅｎ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１８：１３１１−１３５４（１９９２））。
【００９５】
凍結乾燥された材料は、水溶液として再構成されてもよい。種々の水性キャリア、例えば、殺菌注射用蒸留水、複数回投与使用のための防腐剤を含む水または適切な量の界面活性剤を含む水（例えば、水性懸濁液の製造に適切な賦形剤との混合物で活性化合物を含有する水性懸濁液）。種々の態様において、そのような賦形剤は、懸濁剤、例えば、限定されないが、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ガムトラガカント及びアカシアガムであり：分散または湿潤剤は、天然由来ホスファチド、例えば、限定されないが、レシチン、酸化アルキレンと脂肪酸との縮合生成物、例えば、限定されないが、ポリオキシエチレンステアレート、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えば、限定されないが、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、またはエチレンオキシドと、脂肪酸及びヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、またはエチレンオキシドと、脂肪酸及びヘキシトール無水物から誘導された部分エステルとの縮合生成物、例えば、限定されないが、ポリエチレンソルビタンモノオレエートである。種々の態様において、水性懸濁液は、１種またはそれ以上の防腐剤、例えば、限定されないが、エチルまたはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシベンゾエートも含有する。
【００９６】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、シリンジまたは他の貯蔵容器を使用する投与のための液体配合物である。さらなる実施形態において、これらの液体配合物は、水溶液として再構成された、本明細書に記載の凍結乾燥された材料から製造される。さらなる態様において、本発明の組成物は、１種またはそれ以上の薬学的に許容されるキャリアをさらに含む。「薬学的」または「薬理学的に」許容されるという句は、下記の当該技術において周知の経路を使用して投与される場合、安定し、会合及び開裂生成物などのタンパク質分解を抑制し、加えて、アレルギー性または他の不利な反応を生じない分子実体及び組成物を示す。「薬学的に許容されるキャリア」は、上記で開示される薬剤を含めて、いずれか、及び全ての臨床的に有用な溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤などを含む。
【００９７】
凝固因子複合体の単一または複数回投与は、治療する医師によって選択される服用レベル及びパターンで実行される。疾患の予防または治療に関して、適切な用量は、治療される疾患の種類、疾患の重症度及び経過、薬剤が予防または治療目的で投与されるかどうか、以前の治療、患者の病歴及び薬剤への応答ならびに担当医の裁量次第である。
【００９８】
さらなる実施形態において、そして上記のいずれかによって、血友病Ａなどの凝固疾患の治療には、凝固因子複合体単独で、または別の薬剤との組合せでの初期治療、それに続く、凝固因子複合体及び／または別の薬剤の１回またはそれ以上の繰返し投与が含まれてよい。初期及びその後の繰返し投与の特性は、一部、治療される疾患次第であろう。
【００９９】
さらなる態様において、凝固因子複合体は、０．５ＩＵ／ｋｇ〜２００ＩＵ／ｋｇの範囲の用量で対象に投与されることが可能である。いくつかの実施形態において、凝固因子複合体は、１〜１９０、５〜１８０、１０〜１７０、１５〜１６０、２０〜４５０、２５〜１４０、３０〜１３０、３５〜１２０、４０〜１１０、４５〜１００、５０〜９０、５５〜８０または６０〜７０ＩＵ／ｋｇの範囲の用量で投与される。さらなる実施形態において、そして上記のいずれかに従って、凝固因子複合体は、約１ＩＵ／ｋｇ〜約１５０ＩＵ／ｋｇの用量で対象に投与することが可能である。なおさらなる実施形態において、凝固因子複合体は、１．５ＩＵ／ｋｇ〜１５０ＩＵ／ｋｇ、２ＩＵ／ｋｇ〜５０ＩＵ／ｋｇ、５ＩＵ／ｋｇ〜４０ＩＵ／ｋｇ、１０ＩＵ／ｋｇ〜２０ＩＵ／ｋｇ、１０ＩＵ／ｋｇ〜１００ＩＵｋｇ、２５ＩＵ／ｋｇ〜７５ＩＵ／ｋｇ及び４０ＩＵｋｇ〜７５ＩＵ／ｋｇの用量で投与される。なおさらなる実施形態において、凝固因子複合体は、２、５、７．５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ＩＵ／ｋｇで投与される。認識されるであろうように、そしてさらに本明細書に議論されるように、凝固因子複合体の適切な用量は、適切な用量応答データと関連して、血中濃度用量を決定するための確立されたアッセイの使用によって確認されてもよい。
【０１００】
特定の例において、本発明の複合体は、血友病Ａを治療するために、筋肉内に注入または投与することが可能である。凝固因子複合体の組成物は、本明細書に記載の通り医薬品配合物中に含まれることが可能である。そのような配合物は、経口的に、局所的に、経皮的に、非経口的に、吸入スプレーによって、経腟的に、直腸的に、または頭蓋内注射によって投与することができる。非経口的という用語は、本明細書で使用される場合、皮下注射、静脈内、筋肉内、嚢内注射、または注入技術を含む。静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、くも膜下腔内、眼球後、肺内注射による投与、及び／または特定の部位における外科的埋め込みも考慮される。一般に、組成物は、本質的にパイロジェン、ならびに受容体に有害である他の不純物を含まない。
【０１０１】
一態様において、本発明の配合物は、最初のボーラスと、それに続いて、製剤の治療循環レベルを維持するための連続的注入によって投与される。別の例として、本発明の化合物は、一回限りの投与として投与される。当業者は、良好な医療行為及び個々の患者の臨床条件によって決定される有効用量及び投与レジメンを容易に最適化するであろう。投与の経路は、限定されないが、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内投与であることが可能である。投与の頻度は、薬剤の薬物動態剤パラメーター及び投与経路次第である。最適な医薬配合物は、投与経路及び所望の用量次第で、当業者によって決定される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１８０４２  ｐａｇｅｓ  １４３５−１７１２を参照のこと。上記文献の開示は、参照によって、全体として、全ての目的に関して、特に、配合、投与経路及び医薬品の容量に関する全ての教示に関して、本明細書に組み込まれる。そのような配合物は、投与された薬剤の物理的状態、安定性、生体内放出レート、及び生体内クリアランスレートに影響を与える。投与の経路次第で、適切な用量は、体重、体表面積または臓器サイズによって計算される。適切な用量は、適切な用量応答データと関連して、血中濃度用量を決定するための確立されたアッセイの使用によって確認されてもよい。最終投与レジメンは、担当医によって、薬剤の作用を変性する種々の要因、例えば、薬剤の比活性、ダメージの重度及び患者の応答性、年齢、状態、体重、性別及び患者の食事、いずれの感染症の重症度、投与時間及び他の臨床的要因を考慮して決定される。例として、本発明の凝固因子複合体の典型的な用量は、約５００μｇ／ｋｇと等しい、約５０ＩＵ／ｋｇである。研究が実行されると、種々の疾患及び状態に対する治療の適切な服用レベ及び期間に関して、さらなる情報が生じるであろう。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、凝固因子複合体は、対象に単独で投与される。いくつかの実施形態において、凝固因子複合体は、１種またはそれ以上の他の凝固因子との組合せで対象に投与される。
【０１０３】
さらなる実施形態において、凝固因子複合体は、１日に１回以下で対象に投与される。さらなる実施形態において、凝固因子複合体は、隔日に１回以下、３日に１回以下、４日に１回以下、５日に１回以下、１週に１回以下、２週に１回以下、１月にに１回以下で対象に投与される。さらなる実施形態において、凝固因子複合体は、１日に２回以下で対象に投与される。
【０１０４】
本発明が一般的に説明されたが、同様に、実例として提供されて、そして限定するように意図されない以下の実施例を参照することによって、容易に理解されるであろう。
【０１０５】
さらなる説明をしなくても、当業者は、前記及び以下の説明のための実施例を使用して、本発明で認識された変更を実施及び利用することが可能であり、かつ主張された方法を実施することができると考えられる。したがって、次の実施例は、特に、本発明の好ましい実施形態を指摘しており、そしていずれかの様式で本開示の残りの部分を限定するものとして解釈されないべきである。
【実施例】
【０１０６】
凝固因子の変性−ＦＶＩＩＩ及びＦＶＩＩａは、両方とも、血友病Ａの治療におけるそれらの役割のため、十分に研究され、かつ変性された分子である。いくつかの方法及びタンパク質上の部位が、変性のために利用可能である。Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．（Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ，Ｋｏｓｚｅｌａｋ，Ｍａｓｔｒｉ，＆  Ｆａｙ，２００１）は、Ｃｙｓ３１０及びＣｙｓ６９２においてアクリロダン及びフルオレセインでＦＶＩＩＩを変性して、そしてＦＶＩＩＩ活性の２つの異なるアッセイにおいて、これがＦＶＩＩＩの活性に対する影響を有さなかったことを示した。精製されたＦＶＩＩＩは、水性緩衝液中、マレイミド化合物と室温で１時間または４℃で一晩反応することができる。マレイミドは遊離システインと特異的に反応して、そしてタンパク質標識実験のために広く使用される。標識化タンパク質は、次いで、記載される通り、イオン交換によって単離されてよい（Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ  ＆  Ｆａｙ，２０１３）。
【０１０７】
ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩａを変性する別の方法は、所望の分子を、それぞれのタンパク質を変性する炭水化物鎖に結合させることである（Ｓｔｅｎｎｉｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。いずれかの分子を変性させる第３の方法は、所望のアミノ酸標的を、タンパク質のいずれかの末端に結合させることである（Ｐａｓｕｔ  ＆  Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，２０１２）。
【０１０８】
アルブミンは、ビリルビン、インドメタシン、イブプロフェンなどを含む多種多様な小分子を結合することが知られている（Ｐｅｔｅｒｓ，１９９５）。これらのリガンドの大部分の結合は、ｐＨに依存せず、したがって、マレイミド−ポリエチレンスペーサーの端部で脂肪酸部分と置き換えられることができる。
【０１０９】
アルブミン融合タンパク質の構成−ヒトｖＷＦのＤ’Ｄ３フラグメントまたはＴＦの可溶性形態のヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋから入手することができる。プラスミドは、コード配列及び適切な長さのアミノ酸リンカーを含んで構成される。これらの配列は、構成がキャップ部位からＣ３Ａ、ヒト肝細胞株のヒトアルブミン遺伝子へのヌクレオチド１１１における相で挿入することができるように、ヒトアルブミン遺伝子からの適切なＤＮＡによって両側を挾むことができる（Ｋｅｌｌｙ  ＆  Ｓｕｓｓｍａｎ，２０００）。記載の通り、これは、Ｃａｓ／ＣＲＩＳＰＲを使用して達成することができる（Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。さらに、適切な配列を含有するプラスミドを新規合成することが可能である。
【０１１０】
アルブミン融合タンパク質の精製−融合タンパク質は、ヒト血清アルブミンへのモノクローナル抗体によって抱合されたアガロースビーズを使用して、Ｃ３Ａ細胞化アブ上清液から回収できる。次いで、融合タンパク質は、ヒト血清アルブミンで溶出し、そしてサイズ選択クロマトグラフィーによって分離することができる。
【０１１１】
変性凝固因子複合体の形成−溶融タンパク質を、変性ＦＶＩＩＩの限界濃度で、一晩、４℃でインキュベーションし、次いで、サイズ選択クロマトグラフィーを使用して精製することができる。同様に、ＴＦ−アルブミン融合を、誘導ＦＶＩＩａの限界濃度で、一晩、４℃でインキュベーションし、次いで、サイズ選択クロマトグラフィーを使用して精製することができる。
【０１１２】
生体内及び生体外特性決定−記載の通り、治療複合体の活性、薬物動態及び薬力薬理学の生体内及び生体外特性決定を実行することができる（Ｍｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｙｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。他に定義されない限り、本明細書で使用された全ての技術的及び科学的用語は、開示された発明が属する技術の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に引用された刊行物及びそれらが引用した材料は、特に参照によって組み込まれる。
【０１１３】
当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、またはルーチンな実験以上のものを使用することなく、確認することが可能であるであろう。そのような等価物は、以下の請求項によって包括されるように意図される。
【０１１４】
材料及び方法
精製された、Ｂ欠失組換型因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）は、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）から購入された。ＦＶＩＩＩ活性は、Ｄｉａｐｈａｒｍａ（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ  Ｔｏｗｎｓｈｉｐ，ＯＨ）から入手したＣｏａｍａｔｉｃ  ＦＶＩＩＩアッセイを使用して分析された。ＦＶＩＩＩ  ＥＬＩＳＡは、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ａｎｃａｓｔｅｒ，ＯＮ，ＣＡ）から入手された。他の抗体及びＥＬＩＳＡキットは、Ａｂｅａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から入手された。脂肪酸含有マレイミド−ＰＥＧ誘導体は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧＷｏｒｋｓ（Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ，ＮＣ）によって合成された。他のマレイミド−ＰＥＧ誘導体は、Ｎａｎｏｃｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）またはＣｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ，ＡＺ）から入手された。細胞培養、分子生物学及び一般試薬は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）またはＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手された。カラムクロマトグラフィー供給材料及び装置は、ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）から入手された。
【０１１５】
ＣＭ１１０及びＣＭ２１０の合成−合成遺伝子ＣＭ１１０及びＣＭ２１０の発現プラスミドは、Ｇｅｎｅ  Ａｒｔ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成された。タンパク質は、５％定義子ウシ血清を含有する媒体中、ＰＥＩ対ＤＮＡの６／１比を使用して、Ｃ３Ａ細胞のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ベース移入によって製造された。２４時間後、媒体を、Ｇｌｕｔａｍａｘ含有する無血清ＤＭＥＭに変更した。媒体を変更し、そして４日間毎日回収した。上清媒体を１ｍｌ  Ｈｉｓ  ＴＲＡＰカラム上に通し、２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．４、０．５  ＭＮａＣｌ及び３０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液の１０倍カラム体積で洗浄した。３００ｍＭイミダゾールを含有する同一緩衝液を用いて、タンパク質をカラムから溶出させた。タンパク質含有フラクションをプールし、そして濃縮し、次いで、ゲル濾過スピンカラムを通過させることによって、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有する緩衝液に変更した。次いで、タンパク質溶液を、１０×３００ｍｍ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅカラムに適用し、Ａｋｔａ  Ｐｕｒｅクロマトグラフィー装置において、同一緩衝液中、０．５ｍｌ／分で実行した。タンパク質含有フラクションをプールし、そして濃縮した。
【０１１６】
ＦＶＩＩＩまたはＣＭ２１０の変性−因子ＶＩＩＩは、一般構造マレイミド−ＰＥＧｎ−Ｘ（式中、Ｘは、ビオチン、フルオレセインイソチオシアネート、ラウレート、ミリステート、トランスシクロオクテンまたはメチルテトラジンである）の種々の分子によって変性された。因子ＶＩＩＩは、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び４ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有する緩衝液中に溶解し、次いで、１０μΜマレイミド−ＰＥＧ−Ｘ試薬と一緒に１時間、室温でインキュベーションした。より小さいＰＥＧ化合物に関して、ゲル濾過スピンカラム上、または１０００ダルトンより大きいＰＥＧ試薬に関して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ上に通過させることによって、過剰量の試薬を除去した。ＣＭ１１０またはＣＭ２１０は、同一条件を使用して、ｍａｌ−ＰＥＧ−ＴＣＯによって誘導体化された。
【０１１７】
複合体形成−ＦＶＩＩＩ／ＣＭ１１０またはＣＭ２１０複合体は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び４ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する緩衝液中、室温で１時間、変性ＦＶＩＩＩを１０倍過剰量のＣＭ１１０またはＣＭ２１０と一緒にインキュベーションすることによって形成された。複合体は、０．５ｍｌ／分において同一緩衝液中、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＩｎｃｒｅａｓｅまたはＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  Ｉｎｃｒｅａｓｅのいずれか上でのクロマトグラフィーによって精製された。
【０１１８】
共有結合複合体形成のために、マレイミド−ＰＥＧ４−Ｍｅテトラジンによって変性されたＦＶＩＩＩを、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び４ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する緩衝液中、４℃で一晩、マレイミド−ＰＥＧ３−ＴＣＯ変性ＣＭ１１０またはＣＭ２１０の１０倍過剰量と一緒にインキュベーションした。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  Ｉｎｃｒｅａｓｅ上を通過させることによって、複合体を単離した。
【０１１９】
参考文献
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【図１】
2018529760.tif 000003
【図２】
2018529760.tif 000004
【図３Ａ】
2018529760.tif 000005
【図３Ｂ】
2018529760.tif 000006
【図４Ａ】
2018529760.tif 000007
【図４Ｂ】
2018529760.tif 000008
【図５Ａ】
2018529760.tif 000009
【図５Ｂ】
2018529760.tif 000010
【図５Ｃ】
2018529760.tif 000011
【図６Ａ】
2018529760.tif 000012
【図６Ｂ】
2018529760.tif 000013
【図６Ｃ】
2018529760.tif 000014
【図６Ｄ】
2018529760.tif 000015
【図７Ａ】
2018529760.tif 000016
【図７Ｂ】
2018529760.tif 000017
【図７Ｃ】
2018529760.tif 000018
【図７Ｄ】
2018529760.tif 000019
【国際調査報告】
2018529760.tif 000020
2018529760.tif 000021