(57)【要約】  本発明は、部位特異的コンジュゲーションのための置換されたシステインを含むポリペプチド、抗体およびその抗原結合性断片に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って２９０位に操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチド。
【請求項２】
前記定常ドメインが、ＩｇＧ重鎖のＣＨ２ドメインを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
定常ドメインを配列番号６１とアラインしたときに、配列番号６１の残基６０に対応する位置に操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチド。
【請求項４】
操作されたシステイン残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、ＩｇＧのＣＨ２ドメインの２９０位に位置する、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記定常ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、１１８、２４６、２４９、２６５、Ｓ２６７、２７０、２７６、２７８、２８３、２９２、２９３、２９４、３００、３０２、３０３、３１４、３１５、３１８、３２０、３３２、３３３、３３４、３３６、３４５、３４７、３５４、３５５、３５８、３６０、３６２、３７０、３７３、３７５、３７６、３７８、３８０、３８２、３８６、３８８、３９０、３９２、３９３、４０１、４０４、４１１、４１３、４１４、４１６、４１８、４１９、４２１、４２８、４３１、４３２、４３７、４３８、４３９、４４３、４４４、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置に操作されたシステイン残基をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記定常ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、１１８、３３４、３４７、３７３、３７５、３８０、３８８、３９２、４２１、４４３、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置に操作されたシステイン残基をさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記定常ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って３３４位に操作されたシステイン残基をさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項９】
（ａ）請求項１から７のいずれか一項に記載のポリペプチド、および
（ｂ）（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付けに従って１８３位に操作されたシステイン残基を含む、または（ｉｉ）定常ドメインを配列番号６３とアラインしたときに、配列番号６３の残基７６に対応する位置に操作されたシステイン残基を含む、抗体軽鎖定常領域
を含む抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１０】
前記軽鎖定常領域が、カッパ軽鎖定常ドメイン（ＣＬκ）を含む、請求項９に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１１】
前記軽鎖定常領域が、ラムダ軽鎖定常ドメイン（ＣＬλ）を含む、請求項９に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１２】
請求項１から７のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項８から１１のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片を含む化合物であって、前記ポリペプチドまたは抗体が、前記操作されたシステイン部位を介して治療剤にコンジュゲートされている、化合物。
【請求項１３】
前記治療剤が、細胞傷害剤、細胞分裂停止剤、化学療法剤、毒素、放射性核種、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ペプチド核酸、非天然アミノ酸、ペプチド、酵素、蛍光タグ、ビオチン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
前記治療剤が、リンカーを介して前記ポリペプチドまたは前記抗体もしくは抗原結合性断片にコンジュゲートされている、請求項１２または１３に記載の化合物。
【請求項１５】
前記リンカーが切断可能である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
前記リンカーが、ｖｃ、ｍｃ、ＭａｌＰｅｇ６、ｍ（Ｈ２０）ｃ、ｍ（Ｈ２０）ｃｖｃ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１４または１５に記載の化合物。
【請求項１７】
前記リンカーがｖｃである、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
前記治療剤が、オーリスタチンまたはツブリシンである、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
前記治療剤がオーリスタチンである、請求項１２から１８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
前記オーリスタチンが、０１０１、８２６１、６１２１、８２５４、６７８０、０１３１、ＭＭＡＤ、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦからなる群から選択される、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
請求項１２から２０のいずれか一項に記載の化合物と薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１２から２０のいずれか一項に記載の化合物または請求項２１に記載の組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患または感染性疾患を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、部位特異的コンジュゲーションのためのアミノ酸を導入するために操作された抗体およびその抗原結合性断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、ＤＮＡをアルキル化する低分子（例えば、デュオカルマイシンおよびカリチアマイシン）、微小管を破壊する低分子（例えば、マイタンシノイドおよびオーリスタチン）またはＤＮＡを結合する低分子（例えば、アントラサイクリン）を含む、種々の細胞傷害性薬物にコンジュゲートされてきた。カリチアマイシンにコンジュゲートされたヒト化抗ＣＤ３３抗体を含む１つのかかる抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であるＭｙｌｏｔａｒｇ（商標）（ゲムツズマブオゾガマイシン）は、急性骨髄性白血病を処置するために承認されている。オーリスタチンモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）にコンジュゲートされた、ＣＤ３０に対するキメラ抗体を含むＡＤＣであるＡｄｃｅｔｒｉｓ（商標）（ブレンツキシマブベドチン）は、ホジキンリンパ腫および未分化大細胞リンパ腫の処置のために承認されている。
【０００３】
ＡＤＣはがん治療に有望であるが、細胞傷害性薬物は一般に、リジン側鎖を介して、または活性化されたシステインスルフヒドリル基を提供するために抗体中に存在する鎖間ジスルフィド結合を還元することによって、抗体にコンジュゲートされる。しかし、この非特異的コンジュゲーションアプローチは、多くの欠点を有する。例えば、抗体リジン残基への薬物コンジュゲーションは、抗体中にコンジュゲーションのために利用可能な多くのリジン残基（約３０個）が存在するという事実によって複雑になる。薬物対抗体比（ＤＡＲ）の最適な数はかなり低い（例えば、およそ４：１）ので、リジンコンジュゲーションは、非常に不均質なプロファイルを生じる場合が多い。さらに、多くのリジンは、ＣＤＲ領域の重要な抗原結合性部位中に位置し、薬物コンジュゲーションは、抗体親和性の低減をもたらし得る。他方で、チオール媒介性コンジュゲーションは、ヒンジジスルフィド結合に関与する８個のシステインを主に標的化するが、８個のシステインのうちのどの４個が異なる調製間で一貫してコンジュゲートされるかを予測および同定することは、なおも困難である。
【０００４】
最近、遊離システイン残基の遺伝子操作により、チオールベースの化学を用いた部位特異的コンジュゲーションが可能になっている。部位特異的ＡＤＣは、均一なプロファイルおよび十分に規定されたコンジュゲーション部位を有し、強力なｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性および強いｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示した。
【０００５】
ＷＯ２０１３／０９３８０９は、コンジュゲーションのためのシステイン残基を導入するために特異的部位にアミノ酸置換を含む、操作された抗体定常領域（Ｆｃ、Ｃγ、Ｃκ、Ｃλ）、またはそれらの断片を開示している。ＩｇＧ重鎖およびラムダ／カッパ軽鎖定常領域中のいくつかのＣｙｓ変異部位が開示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
部位特異的コンジュゲーションのために導入されたＣｙｓ残基を使用することの成功は、Ｃｙｓ置換がタンパク質の構造も機能も変更しない適切な部位を選択する能力に依存する。さらに、異なるコンジュゲーション部位を使用することで、ＡＤＣの生物学的安定性、またはコンジュゲート可能性などの異なる特徴が生じる。従って、規定されたコンジュゲーション部位および所望のＡＤＣ特徴を有するＡＤＣを生成する部位特異的コンジュゲーション戦略は、高度に有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、部位特異的コンジュゲーションのための置換されたシステインを含むポリペプチド、抗体およびその抗原結合性断片に関する。
【０００８】
当業者は、本明細書に記載される発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識する、または慣用に過ぎない実験を使用してそれを確認できる。かかる均等物は、以下の実施形態（Ｅ）によって包含されることを意図する。
【０００９】
Ｅ１．ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って２９０位に操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチド。
【００１０】
Ｅ２．前記定常ドメインが、ＩｇＧ重鎖のＣＨ２ドメインを含む、Ｅ１のポリペプチド。
【００１１】
Ｅ３．前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である、Ｅ２のポリペプチド。
【００１２】
Ｅ４．定常ドメインを配列番号６１とアラインしたときに、配列番号６１の残基６０に対応する位置に操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチド。
【００１３】
Ｅ５．操作されたシステイン残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、ＩｇＧのＣＨ２ドメインの２９０位に位置する、Ｅ４のポリペプチド。
【００１４】
Ｅ６．前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である、Ｅ５のポリペプチド。
【００１５】
Ｅ７．前記定常ドメインが、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）重鎖ＣＨ２ドメインを含む、Ｅ１またはＥ４のポリペプチド。
【００１６】
Ｅ８．前記定常ドメインが、ＩｇＤ重鎖ＣＨ２ドメインを含む、Ｅ１またはＥ４のポリペプチド。
【００１７】
Ｅ９．前記定常ドメインが、ＩｇＥ重鎖ＣＨ２ドメインを含む、Ｅ１またはＥ４のポリペプチド。
【００１８】
Ｅ１０．前記定常ドメインが、ＩｇＭ重鎖ＣＨ２ドメインを含む、Ｅ１またはＥ４のポリペプチド。
【００１９】
Ｅ１１．前記定常ドメインが、ヒト抗体定常ドメインである、Ｅ１〜Ｅ１０のいずれか１つのポリペプチド。
【００２０】
Ｅ１２．前記定常ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、１１８、２４６、２４９、２６５、２６７、２７０、２７６、２７８、２８３、２９２、２９３、２９４、３００、３０２、３０３、３１４、３１５、３１８、３２０、３３２、３３３、３３４、３３６、３４５、３４７、３５４、３５５、３５８、３６０、３６２、３７０、３７３、３７５、３７６、３７８、３８０、３８２、３８６、３８８、３９０、３９２、３９３、４０１、４０４、４１１、４１３、４１４、４１６、４１８、４１９、４２１、４２８、４３１、４３２、４３７、４３８、４３９、４４３、４４４、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置に操作されたシステイン残基をさらに含む、Ｅ１〜Ｅ１１のいずれか１つのポリペプチド。
【００２１】
Ｅ１３．前記定常ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、１１８、３３４、３４７、３７３、３７５、３８０、３８８、３９２、４２１、４４３、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置に操作されたシステイン残基をさらに含む、Ｅ１〜Ｅ１２のいずれか１つのポリペプチド。
【００２２】
Ｅ１４．前記定常ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って３３４位に操作されたシステイン残基をさらに含む、Ｅ１〜Ｅ１３のいずれか１つのポリペプチド。
【００２３】
Ｅ１５．Ｅ１〜Ｅ１４のいずれか１つのポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性断片。
【００２４】
Ｅ１６．
（ａ）Ｅ１〜Ｅ１４のいずれか１つのポリペプチド、および
（ｂ）（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付けに従って１８３位に操作されたシステイン残基を含む；または（ｉｉ）定常ドメインを配列番号６３とアラインしたときに、配列番号６３の残基７６に対応する位置に操作されたシステイン残基を含む、抗体軽鎖定常領域
を含む、抗体またはその抗原結合性断片。
【００２５】
Ｅ１７．
（ａ）Ｅ１〜Ｅ１４のいずれか１つのポリペプチド、および
（ｂ）（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付けに従って、１１０位、１１１位、１２５位、１４９位、１５５位、１５８位、１６１位、１８５位、１８８位、１８９位、１９１位、１９７位、２０５位、２０６位、２０７位、２０８位、２１０位、もしくはそれらの任意の組み合わせに操作されたシステイン残基を含む；（ｉｉ）定常ドメインを配列番号６３（カッパ軽鎖）とアラインしたときに、配列番号６３の残基４、４２、８１、１００、１０３、もしくはそれらの任意の組み合わせに対応する位置に操作されたシステイン残基を含む；または（ｉｉｉ）定常ドメインを配列番号６４（ラムダ軽鎖）とアラインしたときに、配列番号６４の残基４、５、１９、４３、４９、５２、５５、７８、８１、８２、８４、９０、９６、９７、９８、９９、１０１、もしくはそれらの任意の組み合わせに対応する位置に操作されたシステイン残基を含む、抗体軽鎖定常領域
を含む抗体またはその抗原結合性断片。
【００２６】
Ｅ１８．前記軽鎖定常領域が、カッパ軽鎖定常ドメイン（ＣＬκ）を含む、Ｅ１６またはＥ１７の抗体またはその抗原結合性断片。
【００２７】
Ｅ１９．前記軽鎖定常領域が、ラムダ軽鎖定常ドメイン（ＣＬλ）を含む、Ｅ１６またはＥ１７の抗体またはその抗原結合性断片。
【００２８】
Ｅ２０．Ｅ１〜Ｅ１４のいずれかのポリペプチド、またはＥ１５〜Ｅ１９のいずれかの抗体もしくはその抗原結合性断片を含む化合物であって、ポリペプチドまたは抗体が、前記操作されたシステイン部位を介して１つまたは複数の治療剤にコンジュゲートされている、化合物。
【００２９】
Ｅ２１．治療剤が、リンカーを介してポリペプチドまたは抗体もしくは抗原結合性断片にコンジュゲートされている、Ｅ２０の化合物。
【００３０】
Ｅ２２．ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、３３４、３７５、３９２、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置に操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチド。
【００３１】
Ｅ２３．定常ドメインが、ＩｇＧ重鎖のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその両方を含む、Ｅ２２のポリペプチド。
【００３２】
Ｅ２４．定常ドメインを配列番号６２とアラインしたときに、配列番号６２の残基１０４、１４５、１６２、またはそれらの任意の組み合わせに対応する位置に操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチド。
【００３３】
Ｅ２５．操作されたシステイン残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、ＩｇＧのＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその両方の３３４位、３７５位、３９２位、またはそれらの任意の組み合わせに位置する、Ｅ２４のポリペプチド。
【００３４】
Ｅ２６．前記定常ドメインが、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ重鎖のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその両方を含む、Ｅ２２またはＥ２４のポリペプチド。
【００３５】
Ｅ２７．ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、３４７、３８８、４２１、４４３、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置に操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチド。
【００３６】
Ｅ２８．定常ドメインが、ＩｇＧのＣＨ３ドメインを含む、Ｅ２７のポリペプチド。
【００３７】
Ｅ２９．定常ドメインを配列番号６２とアラインしたときに、配列番号６２の１１７、１５８、１９１、２１３、またはそれらの任意の組み合わせに対応する位置に操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチド。
【００３８】
Ｅ３０．操作されたシステイン残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、ＩｇＧのＣＨ３ドメインの３４７位、３８８位、４２１位、４４３位、またはそれらの任意の組み合わせに位置する、Ｅ２９のポリペプチド。
【００３９】
Ｅ３１．前記定常ドメインが、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ重鎖のＣＨ３ドメインを含む、Ｅ２７またはＥ２９のポリペプチド。
【００４０】
Ｅ３２．ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、３４７、３８８、４２１、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置に操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチド。
【００４１】
Ｅ３３．定常ドメインが、ＩｇＧ重鎖のＣＨ３ドメインを含む、Ｅ３２のポリペプチド。
【００４２】
Ｅ３４．定常ドメインを配列番号６２とアラインしたときに、配列番号６２の残基１１７、１５８、１９１、またはそれらの任意の組み合わせに対応する位置に操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチド。
【００４３】
Ｅ３５．操作されたシステイン残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、ＩｇＧのＣＨ３ドメインの３４７位、３８８位、４２１位、またはそれらの任意の組み合わせに位置する、Ｅ３４のポリペプチド。
【００４４】
Ｅ３６．前記定常ドメインが、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ重鎖のＣＨ３ドメインを含む、Ｅ３２またはＥ３４のポリペプチド。
【００４５】
Ｅ３７．ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、２９０、３３４、３９２、４４３、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置に操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチド。
【００４６】
Ｅ３８．定常ドメインが、ＩｇＧ重鎖のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその両方を含む、Ｅ３７のポリペプチド。
【００４７】
Ｅ３９．定常ドメインを配列番号６２とアラインしたときに、配列番号６２の残基６０、１０４、１６２、２１３、またはそれらの任意の組み合わせに対応する位置に操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチド。
【００４８】
Ｅ４０．操作されたシステイン残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、ＩｇＧのＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその両方の２９０位、３３４位、３９２位、４４３位、またはそれらの任意の組み合わせに位置する、Ｅ３９のポリペプチド。
【００４９】
Ｅ４１．前記定常ドメインが、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ重鎖のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその両方を含む、Ｅ３７またはＥ３９のポリペプチド。
【００５０】
Ｅ４２．ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、３３４、３８８、４２１、４４３、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置に操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチド。
【００５１】
Ｅ４３．定常ドメインが、ＩｇＧ重鎖のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその両方を含む、Ｅ４２のポリペプチド。
【００５２】
Ｅ４４．定常ドメインを配列番号６２とアラインしたときに、配列番号６２の１０４、１５８、１９１、２１３、またはそれらの任意の組み合わせに対応する位置に操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチド。
【００５３】
Ｅ４５．操作されたシステイン残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、ＩｇＧのＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその両方の３３４位、３８８位、４２１位、４４３位、またはそれらの任意の組み合わせに位置する、Ｅ４４のポリペプチド。
【００５４】
Ｅ４６．前記定常ドメインが、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ重鎖のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその両方を含む、Ｅ４２またはＥ４４のポリペプチド。
【００５５】
Ｅ４７．ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、３３４、３９２、４２１、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置に操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチド。
【００５６】
Ｅ４８．定常ドメインが、ＩｇＧ重鎖のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその両方を含む、Ｅ４７のポリペプチド。
【００５７】
Ｅ４９．定常ドメインを配列番号６２とアラインしたときに、配列番号６２の１０４、１６２、１９１、またはそれらの任意の組み合わせに対応する位置に操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチド。
【００５８】
Ｅ５０．操作されたシステイン残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、ＩｇＧのＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその両方の３３４位、３９２位、４２１位、またはそれらの任意の組み合わせに位置する、Ｅ４９のポリペプチド。
【００５９】
Ｅ５１．前記定常ドメインが、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ重鎖のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその両方を含む、Ｅ４７またはＥ４９のポリペプチド。
【００６０】
Ｅ５２．ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って３９２位に操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチド。
【００６１】
Ｅ５３．ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、２９０位、４４３位、またはその両方に操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチド。
【００６２】
Ｅ５４．定常ドメインが、ＩｇＧ重鎖のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその両方を含む、Ｅ５２またはＥ５３のポリペプチド。
【００６３】
Ｅ５５．定常ドメインを配列番号６２とアラインしたときに、配列番号６２の残基１６２に対応する位置に操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチド。
【００６４】
Ｅ５６．操作されたシステイン残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、ＩｇＧのＣＨ３ドメインの３９２位に位置する、Ｅ５５のポリペプチド。
【００６５】
Ｅ５７．定常ドメインを配列番号６２とアラインしたときに、配列番号６２の残基６０、２１３、またはその両方に対応する位置に操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチド。
【００６６】
Ｅ５８．操作されたシステイン残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、ＩｇＧのＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその両方の２９０位、４４３位、またはその両方に位置する、Ｅ５７のポリペプチド。
【００６７】
Ｅ５９．前記定常ドメインが、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ重鎖のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその両方を含む、Ｅ５２、Ｅ５３、Ｅ５５およびＥ５７のいずれか１つのポリペプチド。
【００６８】
Ｅ６０．ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、２９０、３８８、４４３、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置に操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチド。
【００６９】
Ｅ６１．定常ドメインが、ＩｇＧ重鎖のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその両方を含む、Ｅ６０のポリペプチド。
【００７０】
Ｅ６２．定常ドメインを配列番号６２とアラインしたときに、配列番号６２の残基６０、１５８、２１３、またはそれらの任意の組み合わせと対応する位置に操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチド。
【００７１】
Ｅ６３．操作されたシステイン残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、ＩｇＧのＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその両方の残基２９０、３８８、４４３、またはそれらの任意の組み合わせに位置する、Ｅ６２のポリペプチド。
【００７２】
Ｅ６４．前記定常ドメインが、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ重鎖のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその両方を含む、Ｅ６０またはＥ６２のポリペプチド。
【００７３】
Ｅ６５．ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、３３４、３７５、３９２、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置に操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチド。
【００７４】
Ｅ６６．定常ドメインが、ＩｇＧ重鎖のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその両方を含む、Ｅ６５のポリペプチド。
【００７５】
Ｅ６７．定常ドメインを配列番号６２とアラインしたときに、配列番号６２の残基１０４、１４５、１６２、またはそれらの任意の組み合わせに対応する位置に操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチド。
【００７６】
Ｅ６８．操作されたシステイン残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、ＩｇＧのＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその両方の３３４位、３７５位、３９２位、またはそれらの任意の組み合わせに位置する、Ｅ６７のポリペプチド。
【００７７】
Ｅ６９．前記定常ドメインが、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ重鎖のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその両方を含む、Ｅ６５またはＥ６７のポリペプチド。
【００７８】
Ｅ７０．ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、３３４、３４７、３７５、３８０、３８８、３９２、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置に操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチド。
【００７９】
Ｅ７１．定常ドメインが、ＩｇＧ重鎖のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその両方を含む、Ｅ７０のポリペプチド。
【００８０】
Ｅ７２．定常ドメインを配列番号６２とアラインしたときに、配列番号６２の残基１０４、１１７、１４５、１５０、１５８、１６２、またはそれらの任意の組み合わせに対応する位置に操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチド。
【００８１】
Ｅ７３．操作されたシステイン残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、ＩｇＧのＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその両方の３３４位、３４７位、３７５位、３８０位、３８８位、３９２位、またはそれらの任意の組み合わせに位置する、Ｅ７２のポリペプチド。
【００８２】
Ｅ７４．定常ドメインが、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ重鎖のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその両方を含む、Ｅ７０またはＥ７２のポリペプチド。
【００８３】
Ｅ７５．前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である、Ｅ２３、Ｅ２５、Ｅ２８、Ｅ３０、Ｅ３３、Ｅ３５、Ｅ３８、Ｅ４０、Ｅ４３、Ｅ４５、Ｅ４８、Ｅ５０、Ｅ５４、Ｅ５６、Ｅ５８、Ｅ６１、Ｅ６３、Ｅ６６、Ｄ６８、Ｅ７１およびＥ７３のいずれか１つのポリペプチド。
【００８４】
Ｅ７６．Ｅ２１〜Ｅ７５のいずれか１つから選択されるポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性断片。
【００８５】
Ｅ７７．
（ａ）Ｅ２１〜Ｅ７５のいずれか１つのポリペプチド、および
（ｂ）（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付けに従って１８３位に操作されたシステイン残基を含む；または（ｉｉ）定常ドメインを配列番号６３とアラインしたときに、配列番号６３の残基７６に対応する位置に操作されたシステイン残基を含む、抗体軽鎖定常領域
を含む抗体またはその抗原結合性断片。
【００８６】
Ｅ７８．
（ａ）Ｅ２１〜Ｅ７５のいずれか１つのポリペプチド、および
（ｂ）（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付けに従って、１１０位、１１１位、１２５位、１４９位、１５５位、１５８位、１６１位、１８５位、１８８位、１８９位、１９１位、１９７位、２０５位、２０６位、２０７位、２０８位、２１０位、もしくはそれらの任意の組み合わせに操作されたシステイン残基を含む；（ｉｉ）定常ドメインを配列番号６３（カッパ軽鎖）とアラインしたときに、配列番号６３の残基４、４２、８１、１００、１０３、もしくはそれらの任意の組み合わせに対応する位置に操作されたシステイン残基を含む；または（ｉｉｉ）定常ドメインを配列番号６４（ラムダ軽鎖）とアラインしたときに、配列番号６４の残基４、５、１９、４３、４９、５２、５５、７８、８１、８２、８４、９０、９６、９７、９８、９９、１０１、もしくはそれらの任意の組み合わせに対応する位置に操作されたシステイン残基を含む、抗体軽鎖定常領域
を含む抗体またはその抗原結合性断片。
【００８７】
Ｅ７９．Ｅ２１〜Ｅ７５のいずれか１つのポリペプチドまたはＥ７６〜Ｅ７８のいずれか１つの抗体もしくはその抗原結合性断片を含む化合物であって、ポリペプチドまたは抗体が、操作されたシステイン部位を介して治療剤にコンジュゲートされている、化合物。
【００８８】
Ｅ８０．治療剤が、リンカーを介してポリペプチドまたは抗体もしくは抗原結合性断片にコンジュゲートされている、Ｅ７９の化合物。
【００８９】
Ｅ８１．
ａ）重鎖定常ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、３３４、３７５、３９２、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置に操作されたシステイン残基を含む；または定常ドメインを配列番号６２とアラインしたときに、配列番号６２の残基１０４、１４５、１６２、もしくはそれらの任意の組み合わせに対応する位置に操作されたシステイン残基を含む；および
ｂ）ＨＩＣ相対保持時間によって測定した、ポリペプチドまたはコンジュゲートされていない抗体に関連する化合物の疎水性度変化が、約１．０〜約１．５の間、約１．０〜約１．４の間、約１．０〜約１．３の間または約１．０〜約１．２の間である、
Ｅ７９またはＥ８０の化合物。
【００９０】
Ｅ８２．
（ａ）重鎖定常ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、３４７、３８８、４２１、４４３、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置に操作されたシステイン残基を含む；または定常ドメインを配列番号６２とアラインしたときに、配列番号６２の残基１１７、１５８、１９１、２１３、もしくはそれらの任意の組み合わせに対応する位置に操作されたシステイン残基を含む；および
（ｂ）ＨＩＣ相対保持時間によって測定した、ポリペプチドまたはコンジュゲートされていない抗体に関連する化合物の疎水性度変化が、約１．５以上、約１．６以上、約１．７以上、約１．８以上、約１．９以上または約２．０以上である、
Ｅ７９またはＥ８０の化合物。
【００９１】
Ｅ８３．
（ａ）重鎖定常ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、３４７、３８８、４２１、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置に操作されたシステイン残基を含む；または定常ドメインを配列番号６２とアラインしたときに、配列番号６２の残基１１７、１５８、１９１、もしくはそれらの任意の組み合わせに対応する位置に操作されたシステイン残基を含む；
（ｂ）リンカーが、スクシンイミド基を含む；および
（ｃ）７２時間の時点での５％ＣＯ２下で３７℃における血漿中でのスクシンアミド加水分解のパーセントが、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％または少なくとも約９０％である、
Ｅ８０の化合物。
【００９２】
Ｅ８４．
（ａ）重鎖定常ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、３４７、３８８、４２１、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置に操作されたシステイン残基を含む；または定常ドメインを配列番号６２とアラインしたときに、配列番号６２の残基１１７、１５８、１９１、もしくはそれらの任意の組み合わせに対応する位置に操作されたシステイン残基を含む；
（ｂ）リンカーが、スクシンイミド基を含む；および
（ｃ）７２時間の時点での３７℃における０．５ｍＭグルタチオン（ｐＨ７．４）中でのスクシンアミド加水分解のパーセントが、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％または少なくとも約９０％である、
Ｅ８０の化合物。
【００９３】
Ｅ８５．
（ａ）重鎖定常ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、２９０、３３４、３９２、４４３、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置に操作されたシステイン残基を含む；または定常ドメインを配列番号６２とアラインしたときに、配列番号６２の残基６０、１０４、１６２、２１３、もしくはそれらの任意の組み合わせに対応する位置に操作されたシステイン残基を含む；
（ｂ）リンカーが、スクシンイミド基を含む；および
（ｃ）７２時間の時点での５％ＣＯ２下で３７℃における血漿中でのスクシンアミド加水分解のパーセントが、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下または約３０％以下である、
Ｅ８０の化合物。
【００９４】
Ｅ８６．
（ａ）重鎖定常ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、２９０、３３４、３９２、４４３、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置に操作されたシステイン残基を含む；または定常ドメインを配列番号６２とアラインしたときに、配列番号６２の残基６０、１０４、１６２、２１３、またはそれらの任意の組み合わせに対応する位置に操作されたシステイン残基を含む；
（ｂ）リンカーが、スクシンイミド基を含む；および
（ｃ）７２時間の時点での３７℃における０．５ｍＭグルタチオン（ｐＨ７．４）中でのスクシンアミド加水分解のパーセントが、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下または約３０％以下である、
Ｅ８０の化合物。
【００９５】
Ｅ８７．
（ａ）重鎖定常ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、３３４、３８８、４２１、４４３、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置に操作されたシステイン残基を含む；または定常ドメインを配列番号６２とアラインしたときに、配列番号６２の残基１０４、１５８、１９１、２１３、またはそれらの任意の組み合わせに対応する位置に操作されたシステイン残基を含む；および
（ｂ）７２時間の時点での５％ＣＯ２下で３７℃における血漿中での薬物対抗体比（ＤＡＲ）喪失のパーセントが、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下である、
Ｅ７９またはＥ８０の化合物。
【００９６】
Ｅ８８．
（ａ）重鎖定常ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、３３４、３９２、４２１、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置に操作されたシステイン残基を含む；または定常ドメインを配列番号６２とアラインしたときに、配列番号６２の残基１０４、１６２、１９１、もしくはそれらの任意の組み合わせに対応する位置に操作されたシステイン残基を含む；および
（ｂ）７２時間の時点での３７℃における０．５ｍＭグルタチオン（ｐＨ７．４）中でのＤＡＲ喪失のパーセントが、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下である、
Ｅ７９またはＥ８０の化合物。
【００９７】
Ｅ８９．
（ａ）重鎖定常ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、２９０、３８８、４４３、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置に操作されたシステイン残基を含む；または定常ドメインを配列番号６２とアラインしたときに、配列番号６２の残基６０、１５８、２１３、もしくはそれらの任意の組み合わせに対応する位置に操作されたシステイン残基を含む；および
（ｂ）２０分の時点での３７℃におけるカテプシン媒介性リンカー切断（２００〜２００００ｎｇ／ｍＬカテプシン）のパーセントが、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％または少なくとも約９０％である、
Ｅ８２の化合物。
【００９８】
Ｅ９０．
（ａ）重鎖定常ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、３３４、３７５、３９２、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置に操作されたシステイン残基を含む；または定常ドメインを配列番号６２とアラインしたときに、配列番号６２の残基１０４、１４５、１６２、もしくはそれらの任意の組み合わせに対応する位置に操作されたシステイン残基を含む；および
（ｂ）４時間の時点での３７℃におけるカテプシン媒介性（２００〜２００００ｎｇ／ｍＬカテプシン）リンカー切断のパーセントが、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下または約１５％以下である、
Ｅ８０の化合物。
【００９９】
Ｅ９１．
（ａ）重鎖定常ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、３３４、３４７、３７５、３８０、３８８、３９２、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置に操作されたシステイン残基を含む；または定常ドメインを配列番号６２とアラインしたときに、配列番号６２の残基１０４、１１７、１４５、１５０、１５８、１６２、もしくはそれらの任意の組み合わせに対応する位置に操作されたシステイン残基を含む；および
（ｂ）２１日目の時点での４５℃における５ｍｇ／ｍＬ濃度のモノマー形態の化合物のパーセントが、約９６．０％以上、約９６．５％以上、約９７．０％以上、約９７．５％以上、約９８．０％以上である、
Ｅ７９またはＥ８０の化合物。
【０１００】
Ｅ９２．リンカーが切断可能である、Ｅ２１およびＥ８０〜Ｅ９１のいずれか１つの化合物。
【０１０１】
Ｅ９３．リンカーが、ｖｃ、ｍｃ、ＭａｌＰｅｇ６、ｍ（Ｈ２０）ｃ、ｍ（Ｈ２０）ｃｖｃ、またはそれらの組み合わせを含む、Ｅ２１およびＥ８０〜Ｅ９２のいずれか１つの化合物。
【０１０２】
Ｅ９４．リンカーがｖｃを含む、Ｅ２１およびＥ８０〜Ｅ９３のいずれか１つの化合物。
【０１０３】
Ｅ９５．治療剤が、細胞傷害剤、細胞分裂停止剤、化学療法剤、毒素、放射性核種、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ペプチド核酸、非天然アミノ酸、ペプチド、酵素、蛍光タグ、ビオチン、ツブリシン（tubulysin）、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、Ｅ２０〜Ｅ２１およびＥ７９〜Ｅ９４のいずれか１つの化合物。
【０１０４】
Ｅ９６．治療剤が、オーリスタチン、マイタンシノイド、カリチアマイシン、ツブリシン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、Ｅ２０〜Ｅ２１およびＥ７９〜Ｅ９５のいずれか１つの化合物。
【０１０５】
Ｅ９７．治療剤がオーリスタチンである、Ｅ２０〜Ｅ２１およびＥ７９〜Ｅ９６のいずれか１つの化合物。
【０１０６】
Ｅ９８．オーリスタチンが、０１０１、８２６１、６１２１、８２５４、６７８０、０１３１、ＭＭＡＤ、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、Ｅ９７の化合物。
【０１０７】
Ｅ９９．治療剤がツブリシンである、Ｅ２０〜Ｅ２１およびＥ７９〜Ｅ９６のいずれか１つの化合物。
【０１０８】
Ｅ１００．（ａ）Ａｂが、Ｅ７６〜Ｅ７８のいずれか１つの抗体であり；（ｂ）Ｌ−Ｄがリンカー−薬物部分であり、Ｌがリンカーであり、Ｄが薬物である、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の抗体薬物コンジュゲート。
【０１０９】
Ｅ１０１．Ｌ−Ｄが、スクシンイミド基、マレイミド基、加水分解されたスクシンイミド基または加水分解されたマレイミド基を含む、Ｅ１００の抗体薬物コンジュゲート。
【０１１０】
Ｅ１０２．Ｌ−Ｄが、マレイミド基または加水分解されたマレイミド基を含む、Ｅ１００またはＥ１０１の抗体薬物コンジュゲート。
【０１１１】
Ｅ１０３．Ｌ−Ｄが、６−マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロパノイル（ＭＰ）、バリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｌａ−ｐｈｅ）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジル  ４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）または６−マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ）を含む、Ｅ１００〜Ｅ１０２のいずれか１つの抗体薬物コンジュゲート。
【０１１２】
Ｅ１０４．式Ｉの化合物：
【０１１３】
【化１】
2018538283.tif 000002
またはその薬学的に許容できる塩もしくは溶媒和物を含む、Ｅ１００〜Ｅ１０２のいずれか１つの抗体薬物コンジュゲートであって、
式中、各存在について独立して、
Ｗは、
【０１１４】
【化２】
2018538283.tif 000003
であり；
Ｒ１は、水素またはＣ１〜Ｃ８アルキルであり；
Ｒ２は、水素またはＣ１〜Ｃ８アルキルであり；
Ｒ３ＡおよびＲ３Ｂは、以下のうちいずれかであり：
（ｉ）Ｒ３Ａは、水素またはＣ１〜Ｃ８アルキルであり；
Ｒ３Ｂは、Ｃ１〜Ｃ８アルキルである；
（ｉｉ）Ｒ３ＡおよびＲ３Ｂは一緒になって、Ｃ２〜Ｃ８アルキレンまたはＣ１〜Ｃ８ヘテロアルキレンである；
Ｒ５は、
【０１１５】
【化３】
2018538283.tif 000004
であり；
Ｒ６は、水素または−Ｃ１〜Ｃ８アルキルである、
抗体薬物コンジュゲート。
【０１１６】
Ｅ１０５．式ＩＩａの化合物：
【０１１７】
【化４】
2018538283.tif 000005
またはその薬学的に許容できる塩もしくは溶媒和物を含む、Ｅ１００〜Ｅ１０２のいずれか１つの抗体薬物コンジュゲートであって、
式中、各存在について独立して、
Ｗは、
【０１１８】
【化５】
2018538283.tif 000006
であり；
Ｒ１は、
【０１１９】
【化６】
2018538283.tif 000007
であり；
Ｙは、−Ｃ２〜Ｃ２０アルキレン−、−Ｃ２〜Ｃ２０ヘテロアルキレン−、−Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ−、−アリーレン−、−Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ−、−Ｃｌ〜Ｃ１０アルキレン−アリーレン−、−アリーレン−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−、−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−（Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ）−、−（Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ）−Ｃｌ〜Ｃ１０アルキレン−、−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−（Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ）−または−（Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ）−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−、−Ｃ１〜６アルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜１０−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜１０−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜１０−Ｃ１〜６アルキル、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜６アルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜６−、−Ｃ１〜６アルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜６−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ１〜６アルキル−（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜６−ＮＲＣ（Ｏ）ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜６アルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜６−ＮＲＣ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜６アルキル−（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜６−ＮＲＣ（Ｏ）Ｃ１〜６アルキル−から選択される基のうちの１つまたは複数であり；
Ｚは、
【０１２０】
【化７】
2018538283.tif 000008
または−ＮＨ２であり；
Ｇは、ハロゲン、−ＯＨ、−ＳＨまたは−Ｓ−Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ２は、水素またはＣ１〜Ｃ８アルキルであり；
Ｒ３ＡおよびＲ３Ｂは、以下のうちいずれかであり：
（ｉ）Ｒ３Ａは、水素またはＣ１〜Ｃ８アルキルであり；
Ｒ３Ｂは、Ｃ１〜Ｃ８アルキルである；または
（ｉｉ）Ｒ３ＡおよびＲ３Ｂは一緒になって、Ｃ２〜Ｃ８アルキレンまたはＣ１〜Ｃ８ヘテロアルキレンである；
Ｒ５は、
【０１２１】
【化８】
2018538283.tif 000009
であり；
Ｒ６は、水素または−Ｃ１〜Ｃ８アルキルであり；
Ｒ１０は、水素、−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキル、−Ｃ３〜Ｃ８カルボシクリル、−アリール、−Ｃｌ〜Ｃ１０ヘテロアルキル、−Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ、−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−アリール、−アリーレン−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキル、−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−（Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ）、−（Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ）−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキル、−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−（Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ）または−（Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ）−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキルであり、アリールを含むＲ１０上のアリールは、［Ｒ７］ｈで置換されていてもよい；
Ｒ７は、各存在について、Ｆ、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＣＮおよびＣＦ３からなる群から独立して選択され；
ｈは、１、２、３、４または５である、
抗体薬物コンジュゲート。
【０１２２】
Ｅ１０６．式ＩＩｂの化合物：
【０１２３】
【化９】
2018538283.tif 000010
またはその薬学的に許容できる塩もしくは溶媒和物を含む、Ｅ１００〜Ｅ１０２のいずれか１つの抗体薬物コンジュゲートであって、
式中、各存在について独立して、
Ｗは、
【０１２４】
【化１０】
2018538283.tif 000011
であり；
Ｒ１は、
【０１２５】
【化１１】
2018538283.tif 000012
であり；
Ｙは、−Ｃ２〜Ｃ２０アルキレン−、−Ｃ２〜Ｃ２０ヘテロアルキレン−、−Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ−、−アリーレン−、−Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ−、−Ｃｌ〜Ｃ１０アルキレン−アリーレン−、−アリーレン−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−、−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−（Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ）−、−（Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ）−Ｃｌ〜Ｃ１０アルキレン−、−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−（Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ）−または−（Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ）−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−であり；
Ｚは、
【０１２６】
【化１２】
2018538283.tif 000013
または−ＮＨ−Ａｂであり；
Ａｂは抗体であり；
Ｒ２は、水素またはＣ１〜Ｃ８アルキルであり；
Ｒ３ＡおよびＲ３Ｂは、以下のうちいずれかであり：
（ｉ）Ｒ３Ａは、水素またはＣ１〜Ｃ８アルキルであり；
Ｒ３Ｂは、Ｃ１〜Ｃ８アルキルである；
（ｉｉ）Ｒ３ＡおよびＲ３Ｂは一緒になって、Ｃ２〜Ｃ８アルキレンまたはＣ１〜Ｃ８ヘテロアルキレンである；
Ｒ５は、
【０１２７】
【化１３】
2018538283.tif 000014
であり；
Ｒ６は、水素または−Ｃ１〜Ｃ８アルキルである、
抗体薬物コンジュゲート。
【０１２８】
Ｅ１０７．Ｅ２０〜Ｅ２１およびＥ７９〜Ｅ９９のいずれか１つの化合物またはＥ１００〜Ｅ１０７のいずれか１つの抗体薬物コンジュゲートと薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
【０１２９】
Ｅ１０８．Ｅ２０〜Ｅ２１およびＥ７９〜Ｅ９９のいずれか１つの化合物、Ｅ１００〜Ｅ１０７のいずれか１つの抗体薬物コンジュゲートまたはＥ１０８の組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患または感染性疾患を処置する方法。
【０１３０】
Ｅ１０９．がん、自己免疫疾患、炎症性疾患または感染性疾患を処置する際の使用のための、Ｅ２０〜Ｅ２１およびＥ７９〜Ｅ９９のいずれか１つの化合物、Ｅ１００〜Ｅ１０７のいずれか１つの抗体薬物コンジュゲートまたはＥ１０８の組成物。
【０１３１】
Ｅ１１０．がん、自己免疫疾患、炎症性疾患または感染性疾患を処置するための、Ｅ２０〜Ｅ２１およびＥ７９〜Ｅ９９のいずれか１つの化合物、Ｅ１００〜Ｅ１０７のいずれか１つの抗体薬物コンジュゲートまたはＥ１０８の組成物の使用。
【０１３２】
Ｅ１１１．がん、自己免疫疾患、炎症性疾患または感染性疾患を処置するための医薬の製造における、Ｅ２０〜Ｅ２１およびＥ７９〜Ｅ９９のいずれか１つの化合物、Ｅ１００〜Ｅ１０７のいずれか１つの抗体薬物コンジュゲートまたはＥ１０８の組成物の使用。
【０１３３】
Ｅ１１２．式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の抗体薬物コンジュゲートであって、
（ａ）Ａｂが、ＨＥＲ２に結合し、
（１）配列番号２、３および４を含む３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域；
（２）配列番号１７、５、１３、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７または３９のいずれかの重鎖定常領域；
（３）配列番号８、９および１０を含む３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域；
（４）配列番号４１、１１または４３のいずれかの軽鎖定常領域
を含む抗体であり；
（ｂ）Ｌ−Ｄがリンカー−薬物部分であり、Ｌがリンカーであり、Ｄが薬物であり、
ただし、重鎖定常領域が配列番号５である場合、軽鎖定常領域は配列番号１１ではないことを条件とする、抗体薬物コンジュゲート。
【０１３４】
Ｅ１１３．
（ａ）重鎖定常領域が配列番号１７であり、軽鎖定常領域が配列番号４１である；
（ｂ）重鎖定常領域が配列番号５であり、軽鎖定常領域が配列番号４１である；
（ｃ）重鎖定常領域が配列番号１７であり、軽鎖定常領域が配列番号１１である；
（ｄ）重鎖定常領域が配列番号２１であり、軽鎖定常領域が配列番号１１である；
（ｅ）重鎖定常領域が配列番号２３であり、軽鎖定常領域が配列番号１１である；
（ｆ）重鎖定常領域が配列番号２５であり、軽鎖定常領域が配列番号１１である；
（ｇ）重鎖定常領域が配列番号２７であり、軽鎖定常領域が配列番号１１である；
（ｈ）重鎖定常領域が配列番号２３であり、軽鎖定常領域が配列番号４１である；
（ｉ）重鎖定常領域が配列番号２５であり、軽鎖定常領域が配列番号４１である；
（ｊ）重鎖定常領域が配列番号２７であり、軽鎖定常領域が配列番号４１である；
（ｋ）重鎖定常領域が配列番号２９であり、軽鎖定常領域が配列番号１１である；
（ｌ）重鎖定常領域が配列番号３１であり、軽鎖定常領域が配列番号１１である；
（ｍ）重鎖定常領域が配列番号３３であり、軽鎖定常領域が配列番号４３である；
（ｎ）重鎖定常領域が配列番号３５であり、軽鎖定常領域が配列番号１１である；
（ｏ）重鎖定常領域が配列番号３７であり、軽鎖定常領域が配列番号１１である；
（ｐ）重鎖定常領域が配列番号３９であり、軽鎖定常領域が配列番号１１である；または
（ｑ）重鎖定常領域が配列番号１３であり、軽鎖定常領域が配列番号４３である
Ｅ１１２の抗体薬物コンジュゲート。
【０１３５】
Ｅ１１４．
（ａ）重鎖が、配列番号１８、６、１４、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８または４０のいずれかを含み；
（ｂ）軽鎖が、配列番号４２、１２または４４のいずれかを含み、
ただし、重鎖が配列番号６である場合、軽鎖は配列番号１２ではないことを条件とする、Ｅ１１２の抗体薬物コンジュゲート。
【０１３６】
Ｅ１１５．
（ａ）重鎖が配列番号１８であり、軽鎖が配列番号４２である；
（ｂ）重鎖が配列番号６であり、軽鎖が配列番号４２である；
（ｃ）重鎖が配列番号１８であり、軽鎖が配列番号１２である；
（ｄ）重鎖が配列番号２２であり、軽鎖が配列番号１２である；
（ｅ）重鎖が配列番号２４であり、軽鎖が配列番号１２である；
（ｆ）重鎖が配列番号２６であり、軽鎖が配列番号１２である；
（ｇ）重鎖が配列番号２８であり、軽鎖が配列番号１２である；
（ｈ）重鎖が配列番号２４であり、軽鎖が配列番号４２である；
（ｉ）重鎖が配列番号２６であり、軽鎖が配列番号４２である；
（ｊ）重鎖が配列番号２８であり、軽鎖が配列番号４２である；
（ｋ）重鎖が配列番号３０であり、軽鎖が配列番号１２である；
（ｌ）重鎖が配列番号３２であり、軽鎖が配列番号１２である；
（ｍ）重鎖が配列番号３４であり、軽鎖が配列番号４４である；
（ｎ）重鎖が配列番号３６であり、軽鎖が配列番号１２である；
（ｏ）重鎖が配列番号３８であり、軽鎖が配列番号１２である；
（ｐ）重鎖が配列番号４０であり、軽鎖が配列番号１２である；または
（ｑ）重鎖が配列番号１４であり、軽鎖が配列番号４４である
Ｅ１１４の抗体薬物コンジュゲート。
【０１３７】
Ｅ１１６．リンカーが、ｖｃ、ｍｃ、ＭａｌＰｅｇ６、ｍ（Ｈ２０）ｃおよびｍ（Ｈ２０）ｃｖｃからなる群から選択される、Ｅ１１２〜Ｅ１１５のいずれか１つの抗体薬物コンジュゲート。
【０１３８】
Ｅ１１７．リンカーが切断可能である、Ｅ１１６の抗体薬物コンジュゲート。
【０１３９】
Ｅ１１８．リンカーがｖｃである、Ｅ１１６またはＥ１１７の抗体薬物コンジュゲート。
【０１４０】
Ｅ１１９．薬物が膜透過性である、Ｅ１１２〜Ｅ１１８のいずれか１つの抗体薬物コンジュゲート。
【０１４１】
Ｅ１２０．薬物がオーリスタチンである、Ｅ１１２〜Ｅ１１９のいずれか１つの抗体薬物コンジュゲート。
【０１４２】
Ｅ１２１．オーリスタチンが、
２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド；
２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド；
２−メチル−Ｌ−プロリル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−３−｛［（２Ｓ）−１−メトキシ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル］アミノ｝−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド、トリフルオロ酢酸塩；
２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−３−｛［（２Ｓ）−１−メトキシ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル］アミノ｝−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド；
２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド；
２−メチル−Ｌ−プロリル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド、トリフルオロ酢酸塩；
Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド；
Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド；および
Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド、
またはその薬学的に許容できる塩もしくは溶媒和物からなる群から選択される、Ｅ１２０の抗体薬物コンジュゲート。
【０１４３】
Ｅ１２２．オーリスタチンが、２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミドまたはその薬学的に許容できる塩もしくは溶媒和物である、Ｅ１２０の抗体薬物コンジュゲート。
【０１４４】
Ｅ１２３．式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の抗体薬物コンジュゲートであって、
（ａ）Ａｂが、ＨＥＲ２に結合し、配列番号１８を含む重鎖と配列番号４２を含む軽鎖とを含む抗体であり；
（ｂ）Ｌ−Ｄがリンカー−薬物部分であり、Ｌがｖｃのリンカーであり、Ｄが、２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミドまたはその薬学的に許容できる塩もしくは溶媒和物であるオーリスタチンである、
抗体薬物コンジュゲート。
【０１４５】
Ｅ１２４．Ｅ１１２〜Ｅ１２３のいずれか１つの抗体薬物コンジュゲートと薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
【０１４６】
Ｅ１２５．式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の抗体薬物コンジュゲートであって、Ａｂが、フィブロネクチン（ＦＮ）のエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）に結合する抗体であり、Ｌ−Ｄがリンカー−薬物部分であり、Ｌがリンカーであり、Ｄが薬物である、抗体薬物コンジュゲート。
【０１４７】
Ｅ１２６．前記抗体が、
（ｉ）
（ａ）配列番号６６または６７のアミノ酸配列を含むＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ−Ｈ１）、
（ｂ）配列番号６８または６９のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ−Ｈ２；および
（ｃ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ−Ｈ３
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
（ｉｉ）
（ａ）配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬ相補性決定領域１（ＣＤＲ−Ｌ１）、
（ｂ）配列番号７４のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ−Ｌ２；および
（ｃ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ−Ｌ３
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、Ｅ１２５の抗体薬物コンジュゲート。
【０１４８】
Ｅ１２７．リンカーが、ｖｃ、ｍｃ、ＭａｌＰｅｇ６、ｍ（Ｈ２０）ｃおよびｍ（Ｈ２０）ｃｖｃからなる群から選択される、Ｅ１２５またはＥ１２６の抗体薬物コンジュゲート。
【０１４９】
Ｅ１２８．リンカーが切断可能である、Ｅ１２７の抗体薬物コンジュゲート。
【０１５０】
Ｅ１２９．リンカーがｖｃである、Ｅ１２７またはＥ１２８の抗体薬物コンジュゲート。
【０１５１】
Ｅ１３０．薬物が膜透過性である、Ｅ１２５〜Ｅ１２９のいずれか１つの抗体薬物コンジュゲート。
【０１５２】
Ｅ１３１．薬物がオーリスタチンである、Ｅ１２５〜Ｅ１３０のいずれか１つの抗体薬物コンジュゲート。
【０１５３】
Ｅ１３２．オーリスタチンが、
２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド；
２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド；
２−メチル−Ｌ−プロリル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−３−｛［（２Ｓ）−１−メトキシ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル］アミノ｝−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド、トリフルオロ酢酸塩；
２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−３−｛［（２Ｓ）−１−メトキシ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル］アミノ｝−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド；
２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド；
２−メチル−Ｌ−プロリル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド、トリフルオロ酢酸塩；
Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド；
Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド；および
Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド、
またはその薬学的に許容できる塩もしくは溶媒和物からなる群から選択される、Ｅ１３１の抗体薬物コンジュゲート。
【０１５４】
Ｅ１３３．オーリスタチンが、２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミドまたはその薬学的に許容できる塩もしくは溶媒和物である、Ｅ１３２の抗体薬物コンジュゲート。
【０１５５】
Ｅ１３４．Ｅ１２５〜Ｅ１３３のいずれか１つの抗体薬物コンジュゲートと薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
【０１５６】
Ｅ１３５．Ｅ１〜Ｅ１４およびＥ２２〜Ｅ７５のいずれか１つのポリペプチドをコードする核酸。
【０１５７】
Ｅ１３６．Ｅ１５〜Ｅ１９およびＥ７６〜Ｅ７８のいずれか１つの抗体をコードする核酸。
【０１５８】
Ｅ１３７．Ｅ２０、Ｅ２１およびＥ７９〜Ｅ９９のいずれか１つの化合物の抗体部分をコードする核酸。
【０１５９】
Ｅ１３８．Ｅ１００〜Ｅ１０６、Ｅ１１２〜Ｅ１２３およびＥ１２５〜Ｅ１３３のいずれか１つの抗体薬物コンジュゲートの抗体部分をコードする核酸。
【０１６０】
Ｅ１３９．抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸であって、前記重鎖定常ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って２９０位に操作されたシステイン残基を含む、核酸。
【０１６１】
Ｅ１４０．抗体またはその抗原結合性断片をコードする単離された核酸であって、前記抗体またはその抗原結合性断片が、
（ｉ）
（ａ）配列番号６６または６７のアミノ酸配列を含むＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ−Ｈ１）、
（ｂ）配列番号６８または６９のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ−Ｈ２；および
（ｃ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ−Ｈ３
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
（ｉｉ）
（ａ）配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬ相補性決定領域１（ＣＤＲ−Ｌ１）、
（ｂ）配列番号７４のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ−Ｌ２；および
（ｃ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ−Ｌ３
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、単離された核酸。
【０１６２】
Ｅ１４１．Ｅ１３５〜Ｅ１４０のいずれか１つの核酸を含む宿主細胞。
【０１６３】
Ｅ１４２．ポリペプチドまたは抗体を発現させるのに適切な条件下でＥ１４１の宿主細胞を培養するステップ、および前記ポリペプチドまたは抗体を単離するステップを含む、ポリペプチドまたは抗体を産生する方法。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】（Ａ）Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１  ＡＤＣおよび（Ｂ）Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１  ＡＤＣを描写する図である。それぞれの黒丸は、モノクローナル抗体にコンジュゲートされたリンカー／ペイロードを表す。１つのそのようなリンカー／ペイロードの構造をそれぞれのＡＤＣに関して示す。下線部は、それを通してコンジュゲーションが起こる抗体上のアミノ酸残基によってもたらされる。
【図２】異なるリンカーペイロードに対するトラスツズマブ誘導抗体のコンジュゲーション時の保持時間の変化を示す、選択されたＡＤＣの疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）のスペクトルを示す図である。
【図３】ＨＥＲ２に対するＡＤＣ結合のグラフを示す図である。（Ａ）ＨＥＲ２陽性ＢＴ４７４細胞に対する直接結合、および（Ｂ）ＢＴ４７４細胞に対するＰＥ標識トラスツズマブとの競合的結合。これらの結果は、これらのＡＤＣにおける抗体の結合特性がコンジュゲーションプロセスによって変化しなかったことを示している。
【図４】トラスツズマブ誘導ＡＤＣのＡＤＣＣ活性を示す図である。
【図５】異なるレベルのＨＥＲ２発現を有する多数の細胞株に対する、多数のトラスツズマブ誘導ＡＤＣのｎＭペイロード濃度で報告するｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性データ（ＩＣ５０）を示す図である。
【図６】異なるレベルのＨＥＲ２発現を有する多数の細胞株に対する、多数のトラスツズマブ誘導ＡＤＣのｎｇ／ｍＬ抗体濃度で報告するｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性データ（ＩＣ５０）を示す図である。
【図７】腫瘍体積を経時的にプロットした、Ｎ８７異種移植片に対する９個のトラスツズマブ誘導ＡＤＣの抗腫瘍活性を示す図である。（Ａ）Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｂ）Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｃ）Ｔ（Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｄ）Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；（Ｅ）Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｆ）Ｔ（Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｇ）Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；（Ｈ）Ｔ−ｖｃ０１０１；（Ｉ）Ｔ−ＤＭ１。Ｎ８７胃がん細胞は、高レベルのＨＥＲ２を発現する。
【図８】腫瘍体積を経時的にプロットした、ＨＣＣ１９５４異種移植片に対する６個のトラスツズマブ誘導ＡＤＣの抗腫瘍活性を示す図である。（Ａ）Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；（Ｂ）Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｃ）Ｔ（Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｄ）Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；（Ｅ）Ｔ−ＤＭ１。ＨＣＣ１９５４乳がん細胞は、高レベルのＨＥＲ２を発現する。
【図９】腫瘍体積を経時的にプロットした、ＪＩＭＴ−１異種移植片に対する７個のトラスツズマブ誘導ＡＤＣの抗腫瘍活性を示す図である。（Ａ）Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｂ）Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；（Ｃ）Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｄ）Ｔ（Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｅ）Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；（Ｆ）Ｔ−ｖｃ０１０１；（Ｇ）Ｔ−ＤＭ１。ＪＩＭＴ−１乳がん細胞は、中等度／低レベルのＨＥＲ２を発現する。
【図１０】腫瘍体積を経時的にプロットした、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（ＤＹＴ２）異種移植片に対する５個のトラスツズマブ誘導ＡＤＣの抗腫瘍活性を示す図である。（Ａ）Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；（Ｂ）Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；（Ｃ）Ｔ−ｖｃ０１０１；（Ｄ）Ｔ−ＤＭ１。ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（ＤＹＴ２）乳がん細胞は、中等度／低レベルのＨＥＲ２を発現する。
【図１１】腫瘍体積を経時的にプロットした、ＰＤＸ−１４４５８０患者由来異種移植片に対する５個のトラスツズマブ誘導ＡＤＣの抗腫瘍活性を示す図である。（Ａ）Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｂ）Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；（Ｃ）Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；（Ｄ）Ｔ−ｖｃ０１０１；（Ｅ）Ｔ−ＤＭ１。ＰＤＸ−１４４５８０患者由来細胞はＴＮＢＣ  ＰＤＸモデルである。
【図１２】腫瘍体積を経時的にプロットした、ＰＤＸ−３７６２２患者由来異種移植片に対する４個のトラスツズマブ誘導ＡＤＣの抗腫瘍活性を示す図である。（Ａ）Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｂ）Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；（Ｃ）Ｔ（Ｋ２９７Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｄ）Ｔ−ＤＭ１。ＰＤＸ−３７６２２患者由来細胞は、中等度のレベルのＨＥＲ２を発現するＮＳＣＬＣＰＤＸモデルである。
【図１３】（Ａ）Ｔ−ＤＭ１または（Ｂ）Ｔ−ｖｃ０１０１のいずれかによって処置し、ホスホヒストンＨ３およびＩｇＧ抗体に関して染色したＮ８７腫瘍異種移植片の免疫組織化学を示す図である。Ｔ−ｖｃ０１０１に関してバイスタンダー効果が観察される。
【図１４】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ−ＤＭ１に対して抵抗性にした細胞（Ｎ８７−ＴＭ１およびＮ８７−ＴＭ２）またはＴ−ＤＭ１に対して感受性の親細胞（Ｎ８７細胞）に対する、多数のトラスツズマブ誘導ＡＤＣおよび遊離のペイロードをｎＭペイロード濃度およびｎｇ／ｍＬ抗体濃度で報告するｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性データ（ＩＣ５０）を示す図である。Ｎ８７胃がん細胞は、高レベルのＨＥＲ２を発現する。
【図１５】Ｔ−ＤＭ１感受性（Ｎ８７細胞）および抵抗性（Ｎ８７−ＴＭ１およびＮ８７−ＴＭ２）胃がん細胞に対する７個のトラスツズマブ誘導ＡＤＣの抗腫瘍活性を示す図である。（Ａ）Ｔ−ＤＭ１；（Ｂ）Ｔ−ｍｃ８２６１；（Ｃ）Ｔ（２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；（Ｄ）Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；（Ｅ）Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｆ）Ｔ（Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｇ）Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１。
【図１６】Ｔ−ＤＭ１感受性（Ｎ８７細胞）および抵抗性（Ｎ８７−ＴＭ１およびＮ８７−ＴＭ２）胃がん細胞に対する（Ａ）ＭＲＰ１薬物排出ポンプおよび（Ｂ）ＭＤＲ１薬物排出ポンプのタンパク質発現を示すウェスタンブロットを示す図である。
【図１７】Ｔ−ＤＭ１感受性（Ｎ８７細胞）および抵抗性（Ｎ８７−ＴＭ１およびＮ８７−ＴＭ２）胃がん細胞のＨＥＲ２発現およびトラスツズマブに対する結合を示す図である。（Ａ）ＨＥＲ２タンパク質発現を示すウェスタンブロットおよび（Ｂ）細胞表面ＨＥＲ２に対するトラスツズマブの結合。
【図１８】Ｔ−ＤＭ１感受性（Ｎ８７細胞）および抵抗性（Ｎ８７−ＴＭ１およびＮ８７−ＴＭ２）胃がん細胞におけるタンパク質発現レベルの特徴を示す図である。（Ａ）５２３個のタンパク質におけるタンパク質発現レベルの変化；（Ｂ）ＩＧＦ２Ｒ、ＬＡＭＰ１、およびＣＴＳＢのタンパク質発現を示すウェスタンブロット；（Ｃ）ＣＡＶ１のタンパク質発現を示すウェスタンブロット；（Ｄ）Ｎ８７細胞およびＮ８７−ＴＭ２細胞の移植によりｉｎ  ｖｉｖｏで生成された腫瘍におけるＣＡＶ１タンパク質発現のＩＨＣ。
【図１９】（Ａ）Ｔ−ＤＭ１感受性Ｎ８７親細胞；（Ｂ）Ｔ−ＤＭ１抵抗性Ｎ８７−ＴＭ１細胞；（Ｃ）Ｔ−ＤＭ１抵抗性Ｎ８７−ＴＭ２細胞の移植後ｉｎ  ｖｉｖｏで生成された腫瘍のトラスツズマブおよび様々なトラスツズマブ誘導ＡＤＣに対する感受性を示す図である。
【図２０】Ｔ−ＤＭ１感受性Ｎ８７親細胞およびＴ−ＤＭ１抵抗性Ｎ８７−ＴＭ２またはＮ８７−ＴＭ１細胞の移植によりｉｎ  ｖｉｖｏで生成された腫瘍のトラスツズマブおよび様々なトラスツズマブ誘導ＡＤＣに対する感受性を示す図である。（Ａ）Ｎ８７腫瘍サイズを、トラスツズマブまたは２つのトラスツズマブ誘導ＡＤＣの存在下で経時的にプロットした；（Ｂ）Ｎ８７−ＴＭ２腫瘍サイズを、トラスツズマブまたは２つのトラスツズマブ誘導ＡＤＣの存在下で経時的にプロットした；（Ｃ）トラスツズマブまたは２つのトラスツズマブ誘導ＡＤＣの存在下でのＮ８７細胞の腫瘍サイズ倍加時間；（Ｄ）トラスツズマブまたは２つのトラスツズマブ誘導ＡＤＣの存在下でのＮ８７−ＴＭ２細胞の腫瘍サイズ倍加時間；（Ｅ）Ｎ８７−ＴＭ２腫瘍サイズを、７個の異なるトラスツズマブ誘導ＡＤＣの存在下で経時的にプロットした；（Ｆ）トラスツズマブ誘導ＡＤＣを１４日目に添加して、Ｎ８７−ＴＭ１腫瘍サイズを経時的にプロットした。
【図２１】ｉｎ  ｖｉｖｏ生成Ｔ−ＤＭ１抵抗性細胞の生成および特徴付けを示す図である。（Ａ）Ｎ８７胃がん細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで移植した当初はＴ−ＤＭ１に対して感受性であった。（Ｂ）時間と共に、移植したＮ８７細胞は、Ｔ−ＤＭ１に対して抵抗性となったが、（Ｃ）Ｔ−ｖｃ０１０１、（Ｄ）Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１、および（Ｅ）Ｔ（ｋＫ１８３＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１に対しては感受性のままであった。
【図２２】腫瘍体積を経時的にプロットした、Ｔ−ＤＭ１感受性親Ｎ８７細胞と比較したｉｎ  ｖｉｖｏ生成Ｔ−ＤＭ１抵抗性細胞（Ｎ８７−ＴＤＭ）に対する４個のトラスツズマブ誘導ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す図である。（Ａ）Ｔ−ＤＭ１；（Ｂ）Ｔ（ｋＫ１８３＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｃ）Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；（Ｄ）Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１。
【図２３】Ｔ−ＤＭ１感受性親Ｎ８７細胞と比較したｉｎ  ｖｉｖｏ生成Ｔ−ＤＭ１抵抗性細胞（マウス２、１７、および１８からのＮ８７−ＴＤＭ１）のＨＥＲ２タンパク質発現レベルを示す図である。（Ａ）ＦＡＣＳ分析および（Ｂ）ウェスタンブロット分析。ＨＥＲ２タンパク質発現の有意差は観察されなかった。
【図２４】Ｎ８７−ＴＤＭ１におけるＴ−ＤＭ１抵抗性（マウス２、７および１７）が薬物排出ポンプによるものではないことを示す図である。（Ａ）ＭＤＲ１タンパク質発現を示すウェスタンブロット。遊離の薬物（Ｂ）０１０１、（Ｃ）ドキソルビシン、（Ｄ）Ｔ−ＤＭ１の存在下でのＴ−ＤＭ１抵抗性細胞（Ｎ８７−ＴＤＭ１）およびＴ−ＤＭ１感受性Ｎ８７親細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性。
【図２５】（Ａ）カニクイザルに用量を投与後の総ＡｂおよびトラスツズマブＡＤＣ（Ｔ−ｖｃ０１０１）またはＴ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）部位特異的ＡＤＣの、ならびに（Ｂ）カニクイザルに用量を投与後のトラスツズマブのＡＤＣ検体（Ｔ−ｖｃ０１０１）または様々な部位特異的ＡＤＣの、濃度対時間プロファイルおよび薬物動態／毒性動態を示す図である。
【図２６】疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）による相対的保持の値とラットにおける曝露（ＡＵＣ）との比較を示す図である。Ｘ軸は、ＨＩＣによる相対的保持時間を表し、Ｙ軸は、ラットにおける薬物動態の用量標準化曝露（０〜３３６時間までの抗体の「曲線下面積」、ＡＵＣを１０ｍｇ／ｋｇの薬物用量で除算したもの）を表す。記号はおおよその薬物担持（ＤＡＲ）を指し：菱形＝ＤＡＲ２；丸＝ＤＡＲ４である。矢印は、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１を示す。
【図２７】Ｔ−ｖｃ０１０１の従来のコンジュゲートＡＤＣおよびＴ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１部位特異的ＡＤＣを使用した毒性試験を示す図である。Ｔ−ｖｃ０１０１は、５ｍｇ／ｋｇで重度の好中球減少症を惹起したが、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１は、９ｍｇ／ｋｇで好中球数の軽微な減少を引き起こした。
【図２８】（Ａ）Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｂ）Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１；および（Ｃ）Ｔ（Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１の結晶構造を示す図である。図２８Ｃに示すように、ペイロードの幾何学を考慮すると、Ｋ２９０、Ｋ３３４、Ｋ３９２部位のいずれかでのコンジュゲーションは、おそらくＣＨ２表面から離れたグリカンの全体的な軌道を乱し、グリカンおよびＣＨ２構造そのもの、および結果としてＣｈ２−Ｃｈ３界面を不安定化し得る。
【図２９】様々なｖｃ０１０１部位変異体ＡＤＣの３ｍｐｋ投与に関する腫瘍成長プロット（Ｎ８７）を示す図である。
【図３０】ＬＰ＃２とコンジュゲートした場合の様々な部位変異体の挙動を示す生のＳＥＣトレースを示す図である。
【図３１】実施例２２のＡＤＣの血漿中安定性を示す図である。アセチル化産物（質量シフト＝９９３）を含む重鎖または軽鎖を、ＤＡＲ計算に関して「担持」として計数し、脱アセチル化産物（質量シフト＝９５１）を含む重鎖または軽鎖を「非担持」として計数した。
【図３２】ＤＡＲによって測定した、実施例２２のＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を示す図である。
【図３３】ウェスタンブロットによるＷＩ３８−ＶＡ１３およびＨＴ−２９細胞におけるＥＤＢ＋ＦＮ発現を示す図である。
【図３４】図３４Ａ〜３４Ｆは、ＰＤＸ−ＮＳＸ−１１１２２ヒトがんの高度ＥＤＢ＋ＦＮ発現ＮＳＣＬＣ患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルにおける、（Ａ）ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１の０．３、０．７５、１．５、および３ｍｇ／ｋｇ；（Ｂ）ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１の３ｍｇ／ｋｇおよびジスルフィド連結ＥＤＢ−Ｌ１９−ｄｉＳ−ＤＭ１の１０ｍｇ／ｋｇ；（Ｃ）ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１の１および３ｍｇ／ｋｇならびにジスルフィド連結ＥＤＢ−Ｌ１９−ｄｉＳ−Ｃ２ＯＣＯ−１５６９の５ｍｇ／ｋｇ；（Ｄ）部位特異的コンジュゲートＥＤＢ−（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１および従来のコンジュゲートＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ１）のそれぞれ、０．３、１、および３ｍｇ／ｋｇ、ならびに１．５ｍｇ／ｋｇ；（Ｅ）部位特異的コンジュゲートＥＤＢ−ｍｕｔ１（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１の０．３、１、および３ｍｇ／ｋｇ用量；ならびに（Ｆ）３ｍｇ／ｋｇを投与したＥＤＢ−ｍｕｔ１（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１群の抗腫瘍有効性を、それぞれの個々の担癌マウスの腫瘍成長阻害曲線として示す図である。
【図３５】図３５Ａ〜３５Ｆは、Ｈ−１９７５ヒトがんの中等度から高度ＥＤＢ＋ＦＮ発現ＮＳＣＬＣ細胞株異種移植片（ＣＬＸ）モデルにおける、（Ａ）ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１の０．３、０．７５、１．５および３ｍｇ／ｍｇ；（Ｂ）ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１およびＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−１５６９の０．３、１、および３ｍｇ／ｋｇ；（Ｃ）ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１およびＥＤＢ−（Ｈ１６−Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓ−ｖｃ−ＣＰＩのそれぞれ、０．５、１．５、および３ｍｇ／ｋｇ、ならびに０．１、０．３、および１ｍｇ／ｋｇ；（Ｄ）部位特異的コンジュゲートＥＤＢ−（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１および従来のコンジュゲートＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１の０．５、１．５、および３ｍｇ／ｋｇ；（Ｅ）ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１およびＥＤＢ−（Ｋ９４Ｒ）−ｖｃ−０１０１の１および３ｍｇ／ｋｇ；ならびに（Ｆ）ＥＤＢ−（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１およびＥＤＢ−ｍｕｔ１（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１の１および３ｍｇ／ｋｇの抗腫瘍有効性を示す図である。
【図３６】ＨＴ２９ヒトがんの中等度ＥＤＢ＋ＦＮ発現結腸ＣＬＸモデルにおける、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１およびＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−９４１１の３ｍｇ／ｋｇの抗腫瘍有効性を示す図である。
【図３７】図３７Ａ〜３７Ｂは、（Ａ）ＰＤＸ−ＰＡＸ−１３５６５中等度から高度ＥＤＢ＋ＦＮ発現膵臓ＰＤＸ；および（Ｂ）ＰＤＸ−ＰＡＸ−１２５３４低度から中等度ＥＤＢ＋ＦＮ発現膵臓ＰＤＸにおける、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１の０．３、１、および３ｍｇ／ｋｇの抗腫瘍有効性を示す図である。
【図３８】Ｒａｍｏｓヒトがんの中等度ＥＤＢ＋ＦＮ発現リンパ腫ＣＬＸモデルにおける、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１の１および３ｍｇ／ｋｇの抗腫瘍有効性を示す図である。
【図３９】図３９Ａ〜３９Ｂは、ＥＭＴ−６マウス同系乳がんモデルにおける、（Ａ）ＥＤＢ−ｍｕｔ１ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１の４．５ｍｇ／ｋｇ；および（Ｂ）４．５ｍｇ／ｋｇで投与したＥＤＢ−（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１群の抗腫瘍有効性を、それぞれの個々の担癌マウスの腫瘍成長阻害曲線として示す図である。
【図４０】部位特異的コンジュゲートＥＤＢ−ｍｕｔ１（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ４）の６ｍｇ／ｋｇと比較した従来のコンジュゲートＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１の５ｍｇ／ｋｇに関する好中球の絶対数を示す図である。
【図４１】抗体Ｘおよびｃｙｓ変異体Ｘ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）の標的抗原に対する競合的結合を示す図である。標的抗原をプレート上に固定した競合的ＥＬＩＳＡにおいてＸおよびＸ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）を試験し、抗体Ｘおよびｃｙｓ変異体Ｘ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）の両方を、一定濃度のビオチン化親抗体の存在下、連続希釈液でアプライした。ＥＬＩＳＡプレート上の標的抗原に結合したままであるビオチン化親抗体の量を、西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートしたストレプトアビジンをアプライすることによって決定した（方法を参照されたい）。
【図４２】ＡＤＣまたはビヒクルによって処置した雌性無胸腺マウスにおけるＣａｌｕ−６ヒトＮＳＣＬＣ異種移植片腫瘍の成長曲線を示す図である。各処置群における個々のマウスの平均腫瘍体積（ｍｍ３、平均値±ＳＥＭ）を、初回投与後の日数に対してプロットした。
【発明を実施するための形態】
【０１６５】
本発明は、部位特異的コンジュゲーションのための置換されたシステインを含むポリペプチド、抗体およびその抗原結合性断片に関する。特に、抗体重鎖定常領域中の２９０位（ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って）が、種々の標的（ＨＥＲ２が含まれるがこれに限定されない）に対する抗体との抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を作製するための部位特異的コンジュゲーションに使用できることが発見された。本明細書に例示するデータは、２９０位においてコンジュゲートされたＡＤＣ構築物が、他のコンジュゲーション部位と比較して、優れたｉｎ  ｖｉｖｏ特性を示すことを実証している。
【０１６６】
例えば、実施例に示すように、種々のコンジュゲーション部位におけるコンジュゲーションは、異なるＡＤＣ特徴、例えば、生物物理学的特性（例えば、疎水性度）、生物学的安定性、コンジュゲート可能性およびＡＤＣ有効性（例えば、ペイロード放出速度論およびＡＤＣ代謝）を生じ得る。
【０１６７】
実施例で使用されるｖｃ−１０１などの疎水性リンカー−ペイロードは、ＡＤＣに特定の課題をもたらす。血漿クリアランス速度は、リンカー−ペイロードの疎水性度が増加するにつれて増加して、低減されたｉｎ  ｖｉｖｏ有効性をもたらすことが報告されている。従って、全体的な疎水性度の低減はｉｎ  ｖｉｖｏ  ＰＫを改善できると提唱されてきた（Ｌｙｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３３、７３３〜７３５（２０１５））。しかし、本発明者らは、低減された疎水性度が改善されたＰＫと必ずしも相関しないことを、一連の実験を通じて観察した。事実、多くの状況において、疎水性度は、好ましいＰＫプロファイルについての信頼性のある予測因子ではない。さらに、Ｃｙｓベースの部位特異的コンジュゲートについてのＰＫプロファイルは、トランスグルタミナーゼコンジュゲートのような挙動は示さない。従って、新たな設計スキームおよび基準が、望ましいコンジュゲーション部位を評価するために必要であった。
【０１６８】
本発明者らによる構造研究により、所望のコンジュゲーション部位の選択に対するいくつかの最初の洞察が提供された。例えば、ある特定の部位におけるＡＤＣコンジュゲーションは、Ｆｃドメインの構造を変更し得る、またはこの部位におけるペイロードの幾何学に起因して、抗体のグリコシル化を妨げ得る。さらに、ある特定の部位は、表面露出の適切なバランスを提供し得る：この部位は、薬物がコンジュゲートされるのに十分なほど露出されているが、薬物があまりに迅速にｉｎ  ｖｉｖｏで代謝され、血漿からクリアされるほどには露出されていない。構造研究に基づいて、いくつかの候補部位が、潜在的コンジュゲーション部位として同定された（例えば、重鎖２９０、３９２、軽鎖１８３）。
【０１６９】
構造研究後、さらなるアッセイを設計および実施した。特に、本発明者らが評価したいくつかのコンジュゲーション部位のうち、２９０位は最初、他のコンジュゲーション部位と比較して優れた特性を示さなかった。例えば、マウスモデルに基づくｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態（ＰＫ）データは、２９０位が特に望ましいことを示唆することができなかった。しかし、カニクイザルからのｉｎ  ｖｉｖｏ  ＰＫデータは、２９０位においてコンジュゲートされたＡＤＣ分子が、このコンジュゲーション部位を臨床的使用にとってより有利なものにする優れたＰＫプロファイルを有することを、驚くべきことに示した。部位２９０の利点は、リンカー−ペイロードの疎水性度に基づいては予測できなかったのである。
【０１７０】
優れたｉｎ  ｖｉｖｏ  ＰＫプロファイルをこれもまた提供した他のコンジュゲーション部位には、３９２（重鎖）および１８３（軽鎖）が含まれる。
【０１７１】
好ましいｉｎ  ｖｉｖｏ  ＰＫに加えて、Ｃｙｓ−２９０コンジュゲートは、非常に低いレベルの高分子量（ＨＭＷ）凝集および好ましい抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）もまた示している。特に、コンジュゲーション事象は、ＡＤＣＣ機能の喪失を生じる場合が多いことが報告されている。例えば、ＳＧＮ−７０Ａ  ＡＤＣの抗体構成要素である抗ＣＤ７０は、ＡＤＣＣ、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）機能を示している。それにもかかわらず、抗ＣＤ７０−ＭＭＡＦコンジュゲートは、ＦｃγＲ結合を欠く（Ｋｉｍら、Ｂｉｏｍｏｌ  Ｔｈｅｒ（Ｓｅｏｕｌ）．２０１５  Ｎｏｖ；２３（６）：４９３〜５０９）。対照的に、ＡＤＣＣ機能は、本明細書に開示されるＣｙｓ−２９０  ＡＤＣコンジュゲートでは損なわれていない。
【０１７２】
さらに、本明細書に例示される血液学的および顕微鏡データは、Ｃｙｓ−２９０を使用する部位特異的コンジュゲーションが、従来のコンジュゲートと比較して、ＡＤＣ（例えば、Ａｂ−ｖｃ０１０１）誘導性の毒性（例えば、好中球減少症および骨髄毒性）を改善したこともまた示している。
【０１７３】
最後に、本明細書に提供される実施例は、ＡＤＣ分子の具体的な適用に応じて、いくつかの候補コンジュゲーション部位が特定の問題を解決するために使用できることもまた示した。例えば、ある特定の部位は、より良いペイロード代謝を提供し、一部の部位は、分子の全体的疎水性度を低減させ、一部の部位は、より速いまたはより遅いリンカー切断を可能にする。これらの好ましいコンジュゲーション部位は、ＡＤＣ分子の最適化のために使用され得る。実施例２１および２２を参照のこと。
【０１７４】
１．抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
ＡＤＣは、通常リンカーの使用を介して薬物ペイロードにコンジュゲートされた抗体構成要素を含む。ＡＤＣのための従来のコンジュゲーション戦略は、抗体の重鎖および／または軽鎖上に内因性に見出されるリジンまたはシステインを介して、薬物ペイロードを抗体にランダムにコンジュゲートすることに依存する。従って、かかるＡＤＣは、異なる薬物：抗体比（ＤＡＲ）を示す分子種の不均質な混合物である。対照的に、本明細書に開示されるＡＤＣは、抗体の重鎖および／または軽鎖上の特定の操作された残基において薬物ペイロードを抗体にコンジュゲートする部位特異的ＡＤＣである。このように、部位特異的ＡＤＣは、規定された薬物：抗体比（ＤＡＲ）を有する分子種から構成されるＡＤＣの均一な集団である。従って、部位特異的ＡＤＣは、コンジュゲートの改善された薬物動態、体内分布および安全性プロファイルを生じる、一様な化学量論を示す。本発明のＡＤＣは、リンカーおよび／またはペイロードにコンジュゲートされた本発明の抗体およびポリペプチドを含む。
【０１７５】
本発明は、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の抗体薬物コンジュゲートを提供し、（ａ）Ａｂは、抗原に結合する抗体またはその抗原結合性断片であり、（ｂ）Ｌ−Ｄはリンカー−薬物部分であり、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物である。
【０１７６】
式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐの抗体薬物コンジュゲートもまた本発明によって包含され、（ａ）Ａｂは、ＨＥＲ２に結合する抗体またはその抗原結合性断片であり、（ｂ）Ｌ−Ｄはリンカー−薬物部分であり、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物であり、（ｃ）ｐは、抗体に結合されるリンカー／薬物部分の数である。部位特異的ＡＤＣについて、ｐは、ＡＤＣの均一な性質に起因する整数である。一部の実施形態では、ｐは４である。他の実施形態では、ｐは３である。他の実施形態では、ｐは２である。他の実施形態では、ｐは１である。他の実施形態では、ｐは４よりも大きい。
【０１７７】
Ａ．抗体およびコンジュゲーション部位
本発明のポリペプチドおよび抗体は、部位特異的様式でペイロードにコンジュゲートされる。この型のコンジュゲーションを提供するために、定常ドメインは、１つまたは複数の特異的部位において操作された反応性システイン残基のいずれかを提供するために改変される（「Ｃｙｓ」変異体と呼ばれる場合がある）。アシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンが、トランスグルタミナーゼおよびアミンの存在下でのポリペプチド操作によって反応性にされる、トランスグルタミナーゼベースのコンジュゲーションのために使用され得る抗体もまた開示される。
【０１７８】
一般に、抗体重鎖または軽鎖の領域は、種々のクラスメンバーの領域内の配列変動の相対的な欠如に基づいて、「定常」（Ｃ）領域または「可変」（Ｖ）領域と定義される。抗体の定常領域は、単独または組み合わせてのいずれかの、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を指し得る。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、種々のエフェクター機能、例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、オプソニン化、補体依存性細胞傷害の開始および肥満細胞脱顆粒における抗体の関与を示す。
【０１７９】
抗体の重鎖および軽鎖の定常および可変領域は、ドメインへと折り畳まれる。免疫グロブリンの軽鎖上の定常領域は一般に、「ＣＬドメイン」と呼ばれる。重鎖上の定常ドメイン（例えば、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン）は、「ＣＨドメイン」と呼ばれる。本発明のポリペプチドまたは抗体（もしくはその断片）の定常領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはそれらの任意のアイソタイプのいずれか１つならびにそれらのサブクラスおよび変異バージョンの定常領域に由来し得る。
【０１８０】
ＣＨ１ドメインは、例えば、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って約１１８位〜２１５位にわたる免疫グロブリン重鎖の第１の（最もアミノ末端側の）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインは、免疫グロブリン重鎖分子のＶＨドメインに隣接し、そのヒンジ領域に対してアミノ末端側であり、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の一部を形成しない。
【０１８１】
ヒンジ領域は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに接続する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は、およそ２５残基を含み、可撓性であるので２つのＮ末端抗原結合性領域が独立して動くのを可能にする。ヒンジ領域は、３つの別個のドメインへと下位分割され得る：上部、中間および下部ヒンジドメイン。
【０１８２】
ＣＨ２ドメインは、例えば、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って約２３１位〜３４０位にわたる重鎖免疫グロブリン分子の部分を含む。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対形成しないという点で、独自である。むしろ、２つのＮ結合型分岐鎖炭水化物鎖が、インタクトなネイティブＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に置かれる。ある特定の実施形態では、本発明のポリペプチドまたは抗体（もしくはその断片）は、ＩｇＧ分子、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来するＣＨ２ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＩｇＧはヒトＩｇＧである。
【０１８３】
ＣＨ３ドメインは、ＣＨ２ドメインのＮ末端からおよそ１１０残基、例えば、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って約３４１位〜４４７位にわたる重鎖免疫グロブリン分子の部分を含む。ＣＨ３ドメインは典型的に、抗体のＣ末端部分を形成する。しかし、一部の免疫グロブリンでは、さらなるドメインがＣＨ３ドメインから延びて、分子のＣ末端部分を形成し得る（例えば、ＩｇＭのμ鎖およびＩｇEのε鎖中のＣＨ４ドメイン）。ある特定の実施形態では、本発明のポリペプチドまたは抗体（もしくはその断片）は、ＩｇＧ分子、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来するＣＨ３ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＩｇＧはヒトＩｇＧである。
【０１８４】
ＣＬドメインは、例えば、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って約１０８位〜２１４位にわたる免疫グロブリン軽鎖の定常領域ドメインを含む。ＣＬドメインは、ＶＬドメインに隣接する。ある特定の実施形態では、本発明のポリペプチドまたは抗体（もしくはその断片）は、カッパ軽鎖定常ドメイン（ＣＬκ）を含む。ある特定の実施形態では、本発明のポリペプチドまたは抗体（もしくはその断片）は、ラムダ軽鎖定常ドメイン（ＣＬλ）を含む。ＣＬκは、公知の多型遺伝子座ＣＬκ−Ｖ／Ａ４５およびＣＬκ−Ｌ／Ｖ８３（Ｋａｂａｔ番号付けを使用する）を有し、従って、多型Ｋｍ（１）：ＣＬκ−Ｖ４５／Ｌ８３；Ｋｍ（１，２）：ＣＬκ−Ａ４５／Ｌ８３；およびＫｍ（３）：ＣＬκ−Ａ４５／Ｖ８３を可能にする。本発明のポリペプチド、抗体およびＡＤＣは、これらの軽鎖定常領域のいずれかを有する抗体構成要素を有し得る。
【０１８５】
Ｆｃ領域は一般に、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基からまたはＰｒｏ２３０（ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従う）から、そのカルボキシル末端まで及ぶと規定される。本発明のＦｃ領域は、ネイティブ配列Ｆｃ領域またはバリアントＦｃ領域であり得る。
【０１８６】
一態様では、本発明は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って２９０位に置換されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常ドメインを含むポリペプチドを提供する。本明細書に開示および例示されるように、２９０位におけるコンジュゲーションは、望ましいｉｎ  ｖｉｖｏ  ＰＫプロファイルを驚くべきことに提供した。
【０１８７】
例えば、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、１１８位、２４６位、２４９位、２６５位、２６７位、２７０位、２７６位、２７８位、２８３位、２９２位、２９３位、２９４位、３００位、３０２位、３０３位、３１４位、３１５位、３１８位、３２０位、３３２位、３３３位、３３４位、３３６位、３４５位、３４７位、３５４位、３５５位、３５８位、３６０位、３６２位、３７０位、３７３位、３７５位、３７６位、３７８位、３８０位、３８２位、３８６位、３８８位、３９０位、３９２位、３９３位、４０１位、４０４位、４１１位、４１３位、４１４位、４１６位、４１８位、４１９位、４２１位、４２８位、４３１位、４３２位、４３７位、４３８位、４３９位、４４３位、４４４位、またはそれらの任意の組み合わせなど、さらなるシステイン置換が導入され得る。特に、１１８位、３３４位、３４７位、３７３位、３７５位、３８０位、３８８位、３９２位、４２１位、４４３位、またはそれらの任意の組み合わせが使用され得る。残基１１８は、この部位の初期の刊行物が、ＥＵインデックス（１１８）の代わりにＫａｂａｔ番号付け（１１４）を使用し、従って、当該分野で１１４部位と一般に呼ばれてきたので、実施例ではＡ１１４、Ａ１１４Ｃ、Ｃ１１４または１１４Ｃとも呼ばれる。
【０１８８】
別の態様では、本発明は、（ａ）本明細書に開示されるポリペプチドと、（ｂ）（ｉ）ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って１８３位に操作されたシステイン残基を含む；または（ｉｉ）定常ドメインを配列番号６３とアラインしたときに、配列番号６３の残基７６に対応する位置に操作されたシステイン残基を含む、抗体軽鎖定常領域とを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【０１８９】
別の態様では、本発明は、（ａ）本明細書に開示されるポリペプチドと、（ｂ）（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付けに従って、１１０位、１１１位、１２５位、１４９位、１５５位、１５８位、１６１位、１８５位、１８８位、１８９位、１９１位、１９７位、２０５位、２０６位、２０７位、２０８位、２１０位、もしくはそれらの任意の組み合わせに操作されたシステイン残基を含む；（ｉｉ）定常ドメインを配列番号６３（カッパ軽鎖）とアラインしたときに、配列番号６３の残基４、４２、８１、１００、１０３、もしくはそれらの任意の組み合わせに対応する位置に操作されたシステイン残基を含む；または（ｉｉｉ）定常ドメインを配列番号６４（ラムダ軽鎖）とアラインしたときに、配列番号６４の残基４、５、１９、４３、４９、５２、５５、７８、８１、８２、８４、９０、９６、９７、９８、９９、１０１、もしくはそれらの任意の組み合わせに対応する位置に操作されたシステイン残基を含む、抗体軽鎖定常領域とを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【０１９０】
別の態様では、本発明は、（ａ）本明細書に開示されるポリペプチドと、（ｂ）（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付けに従って、１１１位、１４９位、１８８位、２０７位、２１０位、もしくはそれらの任意の組み合わせ（好ましくは１１１位もしくは２１０位）に操作されたシステイン残基を含む；または（ｉｉ）定常ドメインを配列番号６３とアラインしたときに、配列番号６３の残基４、４２、８１、１００、１０３、もしくはそれらの任意の組み合わせ（好ましくは残基４もしくは１０３）に対応する位置に操作されたシステイン残基を含む、抗体カッパ軽鎖定常領域とを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【０１９１】
別の態様では、本発明は、（ａ）本明細書に開示されるポリペプチドと、（ｂ）（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付けに従って、１１０位、１１１位、１２５位、１４９位、１５５位、１５８位、１６１位、１８５位、１８８位、１８９位、１９１位、１９７位、２０５位、２０６位、２０７位、２０８位、２１０位、もしくはそれらの任意の組み合わせ（好ましくは１１０位、１１１位、１２５位、１４９位もしくは１５５位）に操作されたシステイン残基を含む；または（ｉｉ）定常ドメインを配列番号６４とアラインしたときに、配列番号６４の残基４、５、１９、４３、４９、５２、５５、７８、８１、８２、８４、９０、９６、９７、９８、９９、１０１、もしくはそれらの任意の組み合わせ（好ましくは残基４、５、１９、４３もしくは４９）に対応する位置に操作されたシステイン残基を含む、抗体ラムダ軽鎖定常領域とを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【０１９２】
アミノ酸改変は、当該分野で公知の任意の方法によってなされ得、多くのかかる方法は、当業者に周知であり、慣用的である。例えば、限定するものではないが、アミノ酸の置換、欠失および挿入は、任意の周知のＰＣＲベースの技術を使用して達成され得る。アミノ酸置換は、部位指定変異誘発によってなされ得る（例えば、ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ、１９８２、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７〜６５００；ならびにＫｕｎｋｅｌ、１９８５、ＰＮＡＳ  ８２：４８８を参照のこと）。
【０１９３】
抗原結合の保持が必要とされる適用では、かかる改変は、抗体の抗原結合能を破壊しない部位においてであるべきである。好ましい実施形態では、１つまたは複数の改変が、重鎖および／または軽鎖の定常領域においてなされる。
【０１９４】
典型的には、標的に関する抗体のＫＤは、例えば、無関係の材料または環境中の付随する材料であるがこれらに限定されない別の非標的分子に関するＫＤよりも、２分の１、好ましくは５分の１、より好ましくは１０分の１の低さである。より好ましくは、ＫＤは、非標的分子に関するＫＤよりも、５０分の１の低さ、例えば、１００分の１の低さまたは２００分の１の低さ；さらにより好ましくは５００分の１の低さ、例えば、１，０００分の１の低さまたは１０，０００分の１の低さである。
【０１９５】
この解離定数の値は、周知の方法によって直接決定され得、例えば、Ｃａｃｅｃｉら、１９８４、Ｂｙｔｅ  ９：３４０〜３６２に示されるものなどの方法によって、複雑な混合物についても計算され得る。例えば、ＫＤは、ＷｏｎｇおよびＬｏｈｍａｎ、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５４２８〜５４３２によって開示されるものなどの二重フィルターニトロセルロースフィルター結合アッセイを使用して確立され得る。例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＲＩＡおよびフローサイトメトリー分析を含む、標的に対する抗体などのリガンドの結合能を評価するための他の標準的なアッセイが、当該分野で公知である。抗体の結合速度論および結合親和性は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムを使用することによって、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの当該分野で公知の標準的なアッセイによっても評価され得る。
【０１９６】
標的への抗体の結合が、その標的の別のリガンド、例えば、別の抗体による標的の結合と比較される、競合的結合アッセイが実施され得る。５０パーセント結合阻害が生じる濃度は、Ｋｉとして公知である。理想的な条件下では、ＫｉはＫＤと等価である。Ｋｉ値は、決してＫＤ未満になることはなく、従って、Ｋｉの測定値は、ＫＤの上限を提供するために簡便に置き換えられ得る。
【０１９７】
本発明の抗体は、約１×１０−３Ｍ以下、例えば、約１×１０−３Ｍ以下、約９×１０−４Ｍ以下、約８×１０−４Ｍ以下、約７×１０−４Ｍ以下、約６×１０−４Ｍ以下、約５×１０−４Ｍ以下、約４×１０−４Ｍ以下、約３×１０−４Ｍ以下、約２×１０−４Ｍ以下、約１×１０−４Ｍ以下、約９×１０−５Ｍ以下、約８×１０−５Ｍ以下、約７×１０−５Ｍ以下、約６×１０−５Ｍ以下、約５×１０−５Ｍ以下、約４×１０−５Ｍ以下、約３×１０−５Ｍ以下、約２×１０−５Ｍ以下、約１×１０−５Ｍ以下、約９×１０−６Ｍ以下、約８×１０−６Ｍ以下、約７×１０−６Ｍ以下、約６×１０−６Ｍ以下、約５×１０−６Ｍ以下、約４×１０−６Ｍ以下、約３×１０−６Ｍ以下、約２×１０−６Ｍ以下、約１×１０−６Ｍ以下、約９×１０−７Ｍ以下、約８×１０−７Ｍ以下、約７×１０−７Ｍ以下、約６×１０−７Ｍ以下、約５×１０−７Ｍ以下、約４×１０−７Ｍ以下、約３×１０−７Ｍ以下、約２×１０−７Ｍ以下、約１×１０−７Ｍ以下、約９×１０−８Ｍ以下、約８×１０−８Ｍ以下、約７×１０−８Ｍ以下、約６×１０−８Ｍ以下、約５×１０−８Ｍ以下、約４×１０−８Ｍ以下、約３×１０−８Ｍ以下、約２×１０−８Ｍ以下、約１×１０−８Ｍ以下、約９×１０−９Ｍ以下、約８×１０−９Ｍ以下、約７×１０−９Ｍ以下、約６×１０−９Ｍ以下、約５×１０−９Ｍ以下、約４×１０−９Ｍ以下、約３×１０−９Ｍ以下、約２×１０−９Ｍ以下、約１×１０−９Ｍ以下、約１×１０−３Ｍ〜約１×１０−１３Ｍ、１×１０−４Ｍ〜約１×１０−１３Ｍ、１×１０−５Ｍ〜約１×１０−１３Ｍ、約１×１０−６Ｍ〜約１×１０−１３Ｍ、約１×１０−７Ｍ〜約１×１０−１３Ｍ、約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１３Ｍ、約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１３Ｍ、１×１０−３Ｍ〜約１×１０−１２Ｍ、１×１０−４Ｍ〜約１×１０−１２Ｍ、約１×１０−５Ｍ〜約１×１０−１２Ｍ、約１×１０−６Ｍ〜約１×１０−１２Ｍ、約１×１０−７Ｍ〜約１×１０−１２Ｍ、約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１２Ｍ、約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１２Ｍ、１×１０−３Ｍ〜約１×１０−１１Ｍ、１×１０−４Ｍ〜約１×１０−１１Ｍ、約１×１０−５Ｍ〜約１×１０−１１Ｍ、約１×１０−６Ｍ〜約１×１０−１１Ｍ、約１×１０−７Ｍ〜約１×１０−１１Ｍ、約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１１Ｍ、約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１１Ｍ、１×１０−３Ｍ〜約１×１０−１０Ｍ、１×１０−４Ｍ〜約１×１０−１０Ｍ、約１×１０−５Ｍ〜約１×１０−１０Ｍ、約１×１０−６Ｍ〜約１×１０−１０Ｍ、約１×１０−７Ｍ〜約１×１０−１０Ｍ、約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１０Ｍまたは約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１０Ｍの、その標的に対するＫＤを有し得る。
【０１９８】
一般に、ナノモル濃度範囲のＫＤが所望されるが、ある特定の実施形態では、例えば、区画中の高度に発現された受容体を標的化し、オフターゲット結合を回避するために、低い親和性の抗体が好まれ得る。さらに、一部の治療適用は、抗体のリサイクルを促進するために、より低い結合親和性を有する抗体から利益を得うる。
【０１９９】
本開示の抗体は、それらのネイティブ対応物の抗原結合能を保持すべきである。一実施形態では、本開示の抗体は、Ｃｙｓ置換前の抗体と比較して、本質的に同じ親和性を示す。別の実施形態では、本開示の抗体は、Ｃｙｓ置換前の抗体と比較して、低減された親和性を示す。別の実施形態では、本開示の抗体は、Ｃｙｓ置換前の抗体と比較して、増強された親和性を示す。
【０２００】
一実施形態では、本開示の抗体は、Ｃｙｓ置換前の抗体のＫＤとおよそ等しい解離定数（ＫＤ）を有し得る。一実施形態では、本開示の抗体は、Ｃｙｓ置換前の抗体のＫＤと比較して、その同族抗原に対する約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約１５０倍、約２００倍、約２５０倍、約３００倍、約４００倍、約５００倍、約６００倍、約７００倍、約８００倍、約９００倍または約１０００倍より高い解離定数（ＫＤ）を有し得る。
【０２０１】
さらに別の実施形態では、本開示の抗体は、Ｃｙｓ置換前の抗体のＫＤと比較して、その同族抗原に対する約１分の１、約２分の１、約３分の１、約４分の１、約５分の１、約１０分の１、約２０分の１、約５０分の１、約１００分の１、約１５０分の１、約２００分の１、約２５０分の１、約３００分の１、約４００分の１、約５００分の１、約６００分の１、約７００分の１、約８００分の１、約９００分の１または約１０００分の１の低さのＫＤを有し得る。
【０２０２】
本発明のＡＤＣを作製するために使用される抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸は、発現または伝播のためにベクター中にクローニングされ得る。目的の抗体をコードする配列は、宿主細胞においてベクター中に維持され得、次いで、宿主細胞は拡大増殖され得、将来の使用のために凍結され得る。
【０２０３】
表１は、本発明の部位特異的ＡＤＣを構築する際に使用されるヒト化ＨＥＲ２抗体のアミノ酸（タンパク質）配列を提供する。示されるＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けによって規定される。
【０２０４】
表１に示される抗体の重鎖および軽鎖は、トラスツズマブの重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する。重鎖定常領域および軽鎖定常領域は、トラスツズマブから誘導体化され、本発明のＡＤＣを作製する場合の部位特異的コンジュゲーションを可能にするための１つまたは複数の改変を含む。
【０２０５】
部位特異的コンジュゲーションを可能にするための抗体定常領域中のアミノ酸配列に対する改変は、下線かつ太字である。トラスツズマブから誘導体化された抗体についての命名法は、Ｔ（トラスツズマブの代わり）、ならびに次いで、野生型残基の一文字アミノ酸コードが隣接する改変のアミノ酸の位置、および誘導体化された抗体中のその位置に今ある残基の一文字アミノ酸コードである。この命名法に対する２つの例外は、軽（カッパ）鎖上の１８３位がリジンからシステインに改変されたことを示す「ｋＫ１８３Ｃ」と、８つのアミノ酸グルタミン含有タグが軽鎖定常領域のＣ末端に結合されていることを示す「ＬＣＱ０５」である。
【０２０６】
表１に示される改変の１つは、コンジュゲーションには使用されない。重鎖上の２２２位の残基（ＫａｂａｔのＥＵインデックスを使用する）は、より均質な抗体およびペイロードコンジュゲート、抗体とペイロードとの間のより良好な分子間架橋、および／または鎖間架橋における顕著な減少を生じるように変更され得る。
【０２０７】
【表１−１】
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【０２０８】
【表１−２】
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【０２０９】
【表１−３】
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【０２１０】
【表１−４】
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【０２１１】
【表１−５】
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【０２１２】
【表１−６】
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【０２１３】
ＡＤＣは、単独または他の位置と組み合わせてのいずれかで２９０位（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う）における操作されたシステインを介した部位特異的コンジュゲーションを使用して、任意の抗原に対する抗体構成要素を用いて作製され得る。
【０２１４】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメイン（即ち、６つ全てのＣＤＲを有する可変領域、または抗体可変領域に対して少なくとも９０パーセント同一である等価な領域）：アバゴボマブ（abagovomab）、アバタセプト（ＯＲＥＮＣＩＡ（登録商標））、アブシキシマブ（ＲＥＯＰＲＯ（登録商標）、ｃ７Ｅ３  Ｆａｂ）、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、アデカツムマブ（adecatumumab）、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）、ＭａｂＣａｍｐａｔｈまたはＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ）、アルツモマブ（altumomab）、アフェリモマブ、アナツモマブマフェナトクス（anatumomab
mafenatox）、アネツムマブ（anetumumab）、アンルキズマブ（anrukizumab）、アポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ（aselizumab）、アトリズマブ、アトロリムマブ（atorolimumab）、バピネオズマブ、バシリキシマブ（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（登録商標））、バビツキシマブ、ベクツモマブ（bectumomab）（ＬＹＭＰＨＯＳＣＡＮ（登録商標））、ベリムマブ（ＬＹＭＰＨＯ−ＳＴＡＴ−Ｂ（登録商標））、ベルチリムマブ（bertilimumab）、ベシレソマブ、βｃｅｐｔ（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ビシロマブブラロバルビタール（biciromab brallobarbital）、ビバツズマブメルタンシン（bivatuzumab
mertansine）、ブレンツキシマブベドチン（ＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標））、カナキヌマブ（ＡＣＺ８８５）、カンツズマブメルタンシン、カプロマブ（ＰＲＯＳＴＡＳＣＩＮＴ（登録商標））、カツマキソマブ（ＲＥＭＯＶ  ＡＢ（登録商標））、セデリズマブ（cedelizumab）（ＣＩＭＺＩＡ（登録商標））、セルトリズマブペゴール、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、クレノリキシマブ、ダセツズマブ、ダクリキシマブ（dacliximab）、ダクリズマブ（ＺＥＮＡＰ  ＡＸ（（登録商標））、デノスマブ（ＡＭＧ  １６２）、デツモマブ（detumomab）、ドルリモマブアリトクス（dorlimomab aritox）、ドルリキシズマブ（dorlixizumab）、ダンツムマブ（duntumumab）、ドゥリムルマブ（durimulumab）、ドゥルムルマブ（durmulumab）、エクロメキシマブ（ecromeximab）、エクリズマブ（ＳＯＬＩＲＩＳ（登録商標））、エドバコマブ（edobacomab）、エドレコロマブ（Ｍａｂｌ７−１Ａ、ＰＡＮＯＲＥＸ（登録商標））、エファリズマブ（ＲＡＰＴＩＶＡ（登録商標））、エファングマブ（efungumab）（ＭＹＣＯＧＲＡＢ（登録商標））、エルシリモマブ（elsilimomab）、エンリモマブペゴール（enlimomab pegol）、エピツモマブシツキセタン（epitumomab
cituxetan）、エファリズマブ、エピツモマブ（epitumomab）、エプラツズマブ、エルリズマブ（erlizumab）、エルツマキソマブ（ertumaxomab）（ＲＥＸＯＭＵＮ（登録商標））、エタラシズマブ（etaracizumab）（エタラツズマブ（etaratuzumab）、ＶＩＴＡＸＩＮ（登録商標）、ＡＢＥＧＲＩＮ（商標））、エクスビビルマブ（exbivirumab）、ファノレソマブ（fanolesomab）（ＮＥＵＴＲＯＳＰＥＣ（登録商標））、ファラリモマブ（faralimomab）、フェルビズマブ（felvizumab）、フォントリズマブ（ＨＵＺＡＦ（登録商標））、ガリキシマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ（gavilimomab）（ＡＢＸ−ＣＢＬ（Ｒ））、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標））、ゴリムマブ（ＣＮＴＯ  １４８）、ゴミリキシマブ（gomiliximab）、イバリズマブ（ＴＮＸ−３５５）、イブリツモマブチウキセタン（ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標））、イゴボマブ（igovomab）、イミシロマブ（imciromab）、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤ  Ｅ（登録商標））、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）、ＭＤＸ−０１０）、イラツムマブ（iratumumab）、ケリキシマブ、ラベツズマブ、レマレソマブ（lemalesomab）、レブリリズマブ（lebrilizumab）、レルデリムマブ（lerdelimumab）、レクサツムマブ（ＨＧＳ−ＥＴＲ２、ＥＴＲ２−ＳＴ０１）、レキシツムマブ（lexitumumab）、リビビルマブ（libivirumab）、リンツズマブ、ルカツムマブ（lucatumumab）、ルミリキシマブ、マパツズマブ（ＨＧＳ−ＥＴＲｌ、ＴＲＭ−Ｉ）、マスリモマブ（maslimomab）、マツズマブ（ＥＭＤ７２０００）、メポリズマブ（ＢＯＳＡＴＲＩＡ（登録商標））、メテリムマブ（metelimumab）、ミラツズマブ、ミンレツモマブ（minretumomab）、ミツモマブ（mitumomab）、モロリムマブ（morolimumab）、モタビズマブ（ＮＵＭＡＸ（商標））、ムロモナブ（ＯＫＴ３）、ナコロマブタフェナトクス（nacolomab tafenatox）、ナプツモマブエスタフェナトクス、ナタリズマブ（ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標）、ＡＮＴＥＧＲＥＮ（登録商標））、ネバクマブ、ネレリモマブ（nerelimomab）、ニモツズマブ（ＴＨＥＲＡＣＩＭ  ｈＲ３（登録商標）、ＴＨＥＲＡ−ＣＩＭ−ｈＲ３（登録商標）、ＴＨＥＲＡＬＯＣ（登録商標））、ノフェツモマブメルペンタン（nofetumomab merpentan）（ＶＥＲＬＵＭＡ（登録商標））、オクレリズマブ、オジュリモマブ（odulimomab）、オファツムマブ、オマリズマブ（ＸＯＬＡＩＲ（登録商標））、オレゴボマブ（ＯＶＡＲＥＸ（登録商標））、オテリキシズマブ、パギバキシマブ、パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））、パニツムマブ（ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、パスコリズマブ（pascolizumab）、ペムツモマブ（pemtumomab）（ＴＨＥＲＡＧＹＮ（登録商標））、ペルツズマブ（２Ｃ４、ＯＭＮＩＴＡＲＧ（登録商標））、パキセリズマブ、ピンツモマブ（pintumomab）、ポネズマブ、プリリキシマブ（priliximab）、プリツムマブ（pritumumab）、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、ラキシバクマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）、ＭａｂＴＨＥＲＡ（登録商標））、ロベリズマブ（rovelizumab）、ルプリズマブ（ruplizumab）、サツモマブ（satumomab）、セビルマブ（sevirumab）、シブ���ツズマブ（sibrotuzumab）、シプリズマブ（ＭＥＤＩ−５０７）、ソンツズマブ（sontuzumab）、スタムルマブ（stamulumab）（Ｍｙｏ−０２９）、スレソマブ（sulesomab）（ＬＥＵＫＯＳＣＡＮ（登録商標））、タカツズマブテトラキセタン（tacatuzumab tetraxetan）、タドシズマブ（tadocizumab）、タリズマブ、タプリツモマブパプトクス（taplitumomab paptox）、テフィバズマブ（tefibazumab）（ＡＵＲＥＸＩＳ（登録商標））、テリモマブアリトクス（telimomab aritox）、テネリキシマブ（teneliximab）、テプリズマブ、チシリムマブ（ticilimumab）、トシリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標））、トラリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレメリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６）、ツコツズマブセルモロイキン（tucotuzumab celmoleukin）、ツビルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ（ＣＮＴＯ  １２７５）、バパリキシマブ（vapaliximab）、ベルツズマブ、ベパリモマブ（vepalimomab）、ビジリズマブ（ＮＵＶＩＯＮ（登録商標））、ボロシキシマブ（Ｍ２００）、ボツムマブ（votumumab）（ＨＵＭＡＳＰＥＣＴ（登録商標））、ザルツムマブ、ザノリムマブ（ＨｕＭＡＸ−ＣＤ４）、ジラリムマブ（ziralimumab）またはゾリモマブアリトクス（zolimomab aritox）からなる群。
【０２１５】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、６つのＣＤＲを有する重鎖および軽鎖可変ドメインを含み、ならびに／または先行するリストから選択される抗体と結合について競合する。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、先行するリスト中の抗体と同じエピトープに結合する。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、合計６つのＣＤＲを有する重鎖および軽鎖可変ドメインを含み、先行するリスト中の抗体と同じ抗原に結合する。
【０２１６】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、合計６つのＣＤＲを有する重鎖および軽鎖可変ドメインを含み、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ−Ｆ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＦＧＦ、ＦＧＦ２、ＨＧＦ、ＫＤＲ、ＦＬＴ−１、ＦＬＫ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−１、ＰＬＧＦ、ＣＥＡ、ＣＸＣＬ１３、ＢＡＦＦ、ＩＬ−２１、ＣＣＬ２１、ＴＮＦ−α、ＣＸＣＬ１２、ＳＤＦ−Ｉ、ｂＦＧＦ、ＭＡＣ−Ｉ、ＩＬ２３ｐ１９、ＦＰＲ、ＩＧＦＢＰ４、ＣＸＣＲ３、ＴＬＲ４、ＣＸＣＲ２、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ４、エフリンＢ２、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢｌ）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２またはｐｌ８５ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、ＨＥＲ４  ＥｒｂＢ４またはｔｙｒｏ２）、ＳＣｌ、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＲＡＧＥ、ｓ１００Ａ８、ｓ１００Ａ９、Ｎａｖｌ．７、ＧＬＰｌ、ＲＳＶ、ＲＳＶ  Ｆタンパク質、インフルエンザＨＡタンパク質、インフルエンザＮＡタンパク質、ＨＭＧＢｌ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ６４、ＣＤ７９、ＣＤ２２、ＩＣＡＭ−Ｉ、ＦＧＦＲｌ、ＦＧＦＲ２、ＨＤＧＦ、ＥｐｈＢ４、ＧＩＴＲ、β−アミロイド、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ−Ｉ、ＰＩＶ−２、ＯＸ４０Ｌ、ＩＧＦＢＰ３、ｃＭｅｔ、ＰＤ−Ｉ、ＰＬＧＦ、ネプリライシン、ＣＴＤ、ＩＬ−１８、ＩＬ−６、ＣＸＣＬ−１３、ＩＬ−ＩＲｌ、ＩＬ−１５、ＩＬ−４Ｒ、ＩｇＥ、ＰＡＩ−Ｉ、ＮＧＦ、ＥｐｈＡ２、ｕＰＡＲｔ、ＤＬＬ−４、αｖβ５、αｖβ６、α５β１、α３β１、インターフェロン受容体Ｉ型およびＩＩ型、ＣＤ１９、ＩＣＯＳ、ＩＬ−１７、第ＩＩ因子、Ｈｓｐ９０、ＩＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＣＤ１９、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＰＩＶ−３、ＣＭＶ、ＩＬ−１３、ＩＬ−９ならびにＥＢＶからなる群から選択される抗原に特異的に結合する。
【０２１７】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー（受容体またはリガンド）に特異的に結合する。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーは、腫瘍壊死因子−α（「ＴＮＦ−α」）、腫瘍壊死因子−β（「ＴＮＦ−β」）、リンホトキシン−α（「ＬＴ−α」）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、４−１  ＢＢリガンド、Ａｐｏ−１リガンド（ＦａｓリガンドまたはＣＤ９５リガンドとも呼ばれる）、Ａｐｏ−２リガンド（ＴＲＡＩＬとも呼ばれる）、Ａｐｏ−３リガンド（ＴＷＥＡＫとも呼ばれる）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、ＡＰＲＩＬ、ＲＡＮＫリガンド（ＴＲＡＮＣＥとも呼ばれる）、ＴＡＬＬ−Ｉ（ＢＩｙＳ、ＢＡＦＦまたはＴＨＡＮＫとも呼ばれる）、ＤＲ４、ＤＲ５（Ａｐｏ−２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ−６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２またはＫＩＬＬＥＲとしても公知）、ＤＲ６、ＤｃＲｌ、ＤｃＲ２、ＤｃＲ３（ＴＲ６またはＭ６８としても公知）、ＣＡＲｌ、ＨＶＥＭ（ＡＴＡＲまたはＴＲ２としても公知）、ＧＩＴＲ、ＺＴＮＦＲ−５、ＮＴＲ−Ｉ、ＴＮＦＬｌ、ＣＤ３０、ＬＴＢｒ、４−１ＢＢ受容体およびＴＲ９が含まれるがこれらに限定されない群から選択され得る。
【０２１８】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、５Ｔ４、ＡＢＬ、ＡＢＣＢ５、ＡＢＣＦｌ、ＡＣＶＲｌ、ＡＣＶＲｌＢ、ＡＣＶＲ２、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＣＶＲＬｌ、ＡＤ０ＲＡ２Ａ、アグリカン、ＡＧＲ２、ＡＩＣＤＡ、ＡＩＦＩ、ＡＩＧｌ、ＡＫＡＰｌ、ＡＫＡＰ２、ＡＭＨ、ＡＭＨＲ２、アンジオゲニン（ＡＮＧ）、ＡＮＧＰＴｌ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４、アネキシンＡ２、ＡＮＰＥＰ、ＡＰＣ、ＡＰＯＣｌ、ＡＲ、アロマターゼ、ＡＴＸ、ＡＸｌ、ＡＺＧＰｌ（亜鉛−ａ−糖タンパク質）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７−Ｈ１、ＢＡＤ、ＢＡＦＦ、ＢＡＧ１、ＢＡＩｌ、ＢＣＲ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＢＤＮＦ、ＢＬＮＫ、ＢＬＲｌ（ＭＤＲ１５）、ＢＩｙＳ、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦｌＯ）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１１、ＢＭＰ１２、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＢＭＰＲ２、ＢＰＡＧｌ（プレクチン）、ＢＲＣＡｌ、Ｃ１９ｏｒｆｌＯ（ＩＬ２７ｗ）、Ｃ３、Ｃ４Ａ、Ｃ５、Ｃ５Ｒ１、ＣＡＮＴｌ、ＣＡＳＰｌ、ＣＡＳＰ４、ＣＡＶｌ、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＬｌ（１−３０９）、ＣＣＬＩ１（エオタキシン）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ−４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ−Ｉｄ）、ＣＣＬ１６（ＨＣＣ−４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＩＰ−３ｂ）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＭＣＡＦ、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３ａ）、ＣＣＬ２１（ＭＥＰ−２）、ＳＬＣ、エクソダス−２（exodus-2）、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ−Ｉ）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ−１）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン−３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−Ｉａ）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−Ｉｂ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２）、ＣＣＮＡｌ、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＤｌ、ＣＣＮＥｌ、ＣＣＮＥ２、ＣＣＲｌ（ＣＫＲｌ／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ−ＩＲＢ／ＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ−Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩ１）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲｌ／ＣＫＲ−Ｌｌ）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ−９−６）、ＣＣＲＬｌ（ＶＳＨＫｌ）、ＣＣＲＬ２（Ｌ−ＣＣＲ）、ＣＤ１６４、ＣＤ１９、ＣＤｌＣ、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ−２２、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ３５、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１３７、ＣＤＨｌ（Ｅ−カドヘリン）、ＣＤＣＰ１ＣＤＨ１０、ＣＤＨ１２、ＣＤＨ１３、ＣＤＨ１８、ＣＤＨ１９、ＣＤＨ２０、ＣＤＨ５、ＣＤＨ７、ＣＤＨ８、ＣＤＨ９、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７、ＣＤＫ９、ＣＤＫＮｌＡ（ｐ２１Ｗａｐｌ／Ｃｉｐｌ）、ＣＤＫＮｌＢ（ｐ２７Ｋｉｐｌ）、ＣＤ���ＮｌＣ、ＣＤＫＮ２Ａ（ｐｌ６ＩＮＫ４ａ）、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＫＮ３、ＣＥＢＰＢ、ＣＥＲｌ、ＣＨＧＡ、ＣＨＧＢ、キチナーゼ、ＣＨＳＴｌＯ、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ７（クローディン−７）、ＣＬＮ３、ＣＬＵ（クラスタリン）、ＣＭＫＬＲｌ、ＣＭＫＯＲｌ（ＲＤＣｌ）、ＣＮＲｌ、ＣＯＬｌ８Ａｌ、ＣＯＬ１Ａ１．ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＲ２、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＲＰ、ＣＳＦ１（Ｍ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）、ＣＴＬＡ４、ＣＴＬ８、ＣＴＮＮＢｌ（ｂ−カテニン）、ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤｌ）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＬｌ（ＧＲＯｌ）、ＣＸＣＬｌＯ（ＩＰ−ＩＯ）、ＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ／ＩＰ−９）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦｌ）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ２（ＧＲ０２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲ０３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８／ＬＩＸ）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ−２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ−Ｌ２）、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）、ＣＹＢ５、ＣＹＣｌ、Ｃｙｒ６１、ＣＹＳＬＴＲｌ、ｃ−Ｍｅｔ、ＤＡＢ２ＩＰ、ＤＥＳ、ＤＫＦＺｐ４５１Ｊ０１１８、ＤＮＣＬｌ、ＤＰＰ４、Ｅ２Ｆ１、ＥＣＧＦｌ５ＥＤＧｌ、ＥＦＮＡｌ、ＥＦＮＡ３、ＥＦＮＢ２、ＥＧＦ、ＥＬＡＣ２、ＥＮＧ、エンドグリン、ＥＮＯｌ、ＥＮ０２、ＥＮ０３、ＥＰＨＡｌ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＡｌＯ、ＥＰＨＢｌ、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、エフリン−Ａｌ、エフリン−Ａ２、エフリン−Ａ３、エフリン−Ａ４、エフリン−Ａ５、エフリン−Ａ６、エフリン−Ｂｌ、エフリン−Ｂ２、エフリン−Ｂ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＧ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ−２）、ＥＲＥＧ、ＥＲＫ８、エストロゲン受容体、ＥＳＲｌ、ＥＳＲ２、Ｆ３（ＴＦ）、ＦＡＤＤ、ファルネシルトランスフェラーゼ、ＦａｓＬ、ＦＡＳＮｆ、ＦＣＥＲ１Ａ、ＦＣＥＲ２、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＧＦ、ＦＧＦ１（ａＦＧＦ）、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１（例えば、ｍｉｍＡｂ１）、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３、ＦＧＦ３（ｉｎｔ−２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ−２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦＲ３、ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＦＩＬｌ（ＥＰＳＩＬＯＮ）、ＦＢＬｌ（ＺＥＴＡ）、ＦＬＪ１２５８４、ＦＬＪ２５５３０、ＦＬＲＴｌ（フィブロネクチン）、ＦＬＴｌ、ＦＬＴ−３、ＦＯＳ、ＦＯＳＬｌ（ＦＲＡ−Ｉ）、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＡＢＲＰ（ＧＡＢＡａ）、ＧＡＧＥＢｌ、ＧＡＧＥＣｌ、ＧＡＬＮＡＣ４Ｓ−６ＳＴ、ＧＡＴＡ３、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ８、ＧＦＩｌ、ＧＧＴｌ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＮＡＳｌ、ＧＮＲＨｌ、ＧＰＲ２（ＣＣＲｌＯ）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ���４、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＧＲＣＣｌＯ（ＣｌＯ）、グレムリン、ＧＲＰ、ＧＳＮ（ゲルゾリン）、ＧＳＴＰｌ、ＨＡＶＣＲ２、ＨＤＡＣ、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７Ａ、ＨＤＡＣ９、ヘッジホッグ、ＨＧＦ、ＨＩＦｌＡ、ＨＩＰｌ、ヒスタミンおよびヒスタミン受容体、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＭ７４、ＨＭＯＸｌ、ＨＳＰ９０、ＨＵＭＣＹＴ２Ａ、ＩＣＥＢＥＲＧ、ＩＣＯＳＬ、ＩＤ２、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮＡｌ、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＥＦＮＡ６、ＢＦＮＡ７、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮガンマ、ＩＦＮＷｌ、ＩＧＢＰｌ、ＩＧＦ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ６、ＤＬ−Ｉ、ＩＬｌＯ、ＩＬｌＯＲＡ、ＩＬｌＯＲＢ、ＩＬ−１、ＩＬｌＲｌ（ＣＤ１２１ａ）、ＩＬｌＲ２（ＣＤ１２１ｂ）、ＩＬ−ＩＲＡ、ＩＬ−２、ＩＬ２ＲＡ（ＣＤ２５）、ＩＬ２ＲＢ（ＣＤ１２２）、ＩＬ２ＲＧ（ＣＤ１３２）、ＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒ（ＣＤ１２３）、ＩＬ−５、ＩＬ５ＲＡ（ＣＤ１２５）、ＩＬ３ＲＢ（ＣＤ１３１）、ＩＬ−６、ＩＬ６ＲＡ（ＣＤ１２６）、ＩＲ６ＲＢ（ＣＤ１３０）、ＩＬ−７、ＩＬ７ＲＡ（ＣＤ１２７）、ＩＬ−８、ＣＸＣＲｌ（ＩＬ８ＲＡ）、ＣＸＣＲ２（ＩＬ８ＲＢ／ＣＤ１２８）、ＩＬ−９、ＩＬ９Ｒ（ＣＤ１２９）、ＩＬ−１０、ＩＬ１０ＲＡ（ＣＤ２１０）、ＩＬ１０ＲＢ（ＣＤＷ２１０Ｂ）、ＩＬ−１１、ＩＬｌＩＲＡ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２Ａ、ＩＬ−１２Ｂ、ＩＬ−１２ＲＢ１、ＩＬ−１２ＲＢ２、ＩＬ−１３、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１５ＲＡ、１Ｌ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１７Ｃ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ１９、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｆ１０、ＩＬ１Ｆ５、ＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ７、ＩＬ１Ｆ８、ＤＬ１Ｆ９、ＩＬ１ＨＹｌ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ２、ＩＬ２０、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＩＬ２３、ＤＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３、ＩＬ３０、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６ＳＴ（糖タンパク質１３０）、ＩＬＫ、ＩＮＨＡ、ＩＮＨＢＡ、ＩＮＳＬ３、ＩＮＳＬ４、ＩＲＡＫＩ、ＩＲＡＫ２、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡ６（α６インテグリン）、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＢ４（β４インテグリン）、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、ＪＴＢ、ＪＵＮ、Ｋ６ＨＦ、ＫＡＩｌ、ＫＤＲ、ＫＩＭ−１、ＫＩＴＬＧ、ＫＬＦ５（ＧＣボックスＢＰ）、ＫＬＦ６、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、ＫＬＫ１５、ＫＬＫ３、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ９、ＫＲＴ１、ＫＲＴ１９（ケラチン１９）、ＫＲＴ２Ａ、ＫＲＴＨＢ６（毛髪特異型ＩＩ型ケラチン）、ＬＡＭＡ５、ＬＥＰ（レプチン）、Ｌｉｎｇｏ−ｐ７５、Ｌｉｎｇｏ−Ｔｒｏｙ、ＬＰＳ、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＴＡ（ＴＮＦ−ｂ）、ＬＴＢ、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＬＴＢ４Ｒ２、ＬＴＢＲ、ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＧまたはＯｍｇｐ、ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ−Ｊｕｎ）、ＭＣＰ−Ｉ、ＭＤＫ、ＭＩＢｌ、ミッドカイン、ＭＩＦ、ＭＩＳＲＩＩ、ＭＪＰ−２、ＭＫ、ＭＫＩ６７（Ｋｉ−６７）、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＳ４Ａ１、ＭＳＭＢ、ＭＴ３（メタロチオネクチン−Ｕｉ（metallothionectin-Ui））、ｍＴＯＲ、ＭＴＳＳｌ、ＭＵＣｌ（ムチン）、ＭＹＣ、ＭＹＤ８８、ＮＣＫ２、ニューロカン、ニューレグリン−１、ニューロピリン−１、ＮＦＫＢｌ、ＮＦＫＢ２、ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）、ＮＧＦＲ、ＮｇＲ−Ｌｉｎｇｏ、ＮｇＲ−Ｎｏｇｏ６６（Ｎｏｇｏ）、ＮｇＲ−ｐ７５、ＮｇＲ−Ｔｒｏｙ、ＮＭＥｌ（ＮＭ２３Ａ）、ＮＯＴＣＨ、ＮＯＴＣＨ１、Ｎ０Ｘ５、ＮＰＰＢ、ＮＲＯＢｌ、ＮＲ０Ｂ２、ＮＲｌＤｌ、ＮＲ１Ｄ２、ＮＲ１Ｈ２、ＮＲ１Ｈ３、ＮＲ１Ｈ４、ＮＲ１Ｉ２、ＮＲ１Ｉ３、ＮＲ２Ｃ１、ＮＲ２Ｃ２、ＮＲ２Ｅ１、ＮＲ２Ｅ３、ＮＲ２Ｆ１、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ２Ｆ６、ＮＲ３Ｃ１、ＮＲ３Ｃ２、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ６Ａ１、ＮＲＰｌ、ＮＲＰ２、ＮＴ５Ｅ、ＮＴＮ４、ＯＣＴ−１、ＯＤＺ１、ＯＰＮ１、ＯＰＮ２、ＯＰＲＤｌ、Ｐ２ＲＸ７、ＰＡＰ、ＰＡＲＴｌ、ＰＡＴＥ、ＰＡＷＲ、ＰＣＡ３、ＰＣＤＧＦ、ＰＣＮＡ、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＥＣＡＭｌ、ｐｅｇ−アスパラギナーゼ、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、プレキシンＢ２（ＰＬＸＮＢ２）、ＰＧＦ、ＰＧＲ、ホスファカン、ＰＩＡＳ２、ＰＩ３キナーゼ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）、ＰＬＧ５ＰＬＸＤＣｌ、ＰＫＣ、ＰＫＣ−β、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＰＰＩＤ、ＰＲｌ、ＰＲＫＣＱ、ＰＲＫＤｌ、ＰＲＬ、ＰＲＯＣ、ＰＲＯＫ２、プロ−ＮＧＦ、プロサポシン、ＰＳＡＰ、ＰＳＣＡ、ＰＴＡＦＲ、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ−２）、ＰＴＮ、ＲＡＣ２（Ｐ２１Ｒａｃ２）、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＲＡＲＢ、ＲＧＳｌ、ＲＧＳ１３、ＲＧＳ３、ＲＮＦＩ１０（ＺＮＦ１４４）、Ｒｏｎ、Ｒ０Ｂ０２、ＲＸＲ、セレクチン、Ｓ１００Ａ２、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＳＣＧＢ１Ｄ２（リポフィリンＢ（lipophilin B））、ＳＣＧＢ２Ａ１（マンマグロビン２）、ＳＣＧＢ２Ａ２（マンマグロビン１）、ＳＣＹＥｌ（内皮単球活性化サイトカイン）、ＳＤＦ２、ＳＥＲＰＥＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＲＰＩＮＢ５（マスピン）、ＳＥＲＰＩＮＥｌ（ＰＡＩ−Ｉ）、ＳＥＲＰＩＮＦｌ、Ｓ
ＨＩＰ−Ｉ、ＳＨＩＰ−２、ＳＨＢｌ、ＳＨＢ２、ＳＨＢＧ、ＳｆｃＡＺ、ＳＬＣ２Ａ２、ＳＬＣ３３Ａ１、ＳＬＣ４３Ａ１、ＳＬＩＴ２、ＳＰＰｌ、ＳＰＲＲｌＢ（Ｓｐｒｌ）、ＳＴ６ＧＡＬ１、ＳＴＡＢｌ、ＳＴＡＴ６、ＳＴＥＡＰ、ＳＴＥＡＰ２、ＳＵＬＦ−１、Ｓｕｌｆ−２、ＴＢ４Ｒ２、ＴＢＸ２１、ＴＣＰｌＯ、ＴＤＧＦｌ、ＴＥＫ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢｌＩｌ、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲｌ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＨｌＬ、ＴＨＢＳｌ（トロンボスポンジン−１）、ＴＨＢＳ２／ＴＨＢＳ４、ＴＨＰＯ、ＴＩＥ（Ｔｉｅ−１）、ＴＩＭＰ３、組織因子、ＴＩＫＩ２、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６ＪＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＭ４ＳＦ１、ＴＮＦ、ＴＮＦ−ａ、ＴＮＦＡＩＰ２（Ｂ９４）、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦＩｌＡ、ＴＮＦＲＳＦｌＡ、ＴＮＦＲＳＦｌＢ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）、ＴＮＦＲＳＦ７、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＳＦｌＯ（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦｌ１（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰ０３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ−Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド）、ＴＯＬＬＩＰ、Ｔｏｌｌ様受容体、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ９、Ｔ０Ｐ２Ａ（トポイソメラーゼＩｉａ）、ＴＰ５３、ＴＰＭｌ、ＴＰＭ２、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦｌ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、ＴＲＫＡ、ＴＲＥＭｌ、ＴＲＥＭ２、ＴＲＰＣ６、ＴＲＯＹ、ＴＳＬＰ、ＴＷＥＡＫ、チロシナーゼ、ｕＰＡＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、バーシカン、ＶＨＬＣ５、ＶＬＡ−４、Ｗｎｔ−１、ＸＣＬｌ（リンホタクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ−Ｉｂ）、ＸＣＲｌ（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲｌ）、ＹＹｌならびにＺＦＰＭ２が含まれるがこれらに限定されない群から選択される１つまたは複数の標的に結合することが可能である。
【０２１９】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、フィブロネクチン（ＦＮ）のエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）に結合する。ＦＮ−ＥＤＢは、選択的スプライシングの機構によってフィブロネクチン分子中に挿入され得る、９１アミノ酸の小さいドメインである。ＦＮ−ＥＤＢのアミノ酸配列は、ヒト、カニクイザル、ラットおよびマウス間で１００％保存されている。ＦＮ−ＥＤＢは、胚発生の間に過剰発現され、ヒトがんにおいて広く発現されるが、女性の生殖組織以外、正常成人では事実上検出不能である。
【０２２０】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合性断片は、（ｉ）以下の重鎖ＣＤＲ配列：配列番号６６もしくは６７と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％もしくは少なくとも９５％の同一性を共有するＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号６８もしくは６９と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％もしくは少なくとも９５％の同一性を共有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号７０と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％もしくは少なくとも９５％の同一性を共有するＣＤＲ−Ｈ３；ならびに／または（ｉｉ）以下の軽鎖ＣＤＲ配列：配列番号７３と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％もしくは少なくとも９５％の同一性を共有するＶＬ相補性決定領域１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号７４と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％もしくは少なくとも９５％の同一性を共有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号７５と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％もしくは少なくとも９５％の同一性を共有するＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【０２２１】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合性断片は、（ｉ）配列番号６５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および／または（ｉｉ）配列番号７２に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。これらのＶＬおよびＶＨ配列の任意の組み合わせもまた、本発明によって包含される。
【０２２２】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合性断片は、Ｆｃドメインを含む。Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＧ、ＩｇＥまたはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）に由来し得る。
【０２２３】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合性断片は、（ｉ）配列番号７１もしくは７７に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および／または（ｉｉ）配列番号７６もしくは７８に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。これらの重鎖および軽鎖配列の任意の組み合わせもまた、本発明によって包含される。
【０２２４】
ＥＤＢへの結合について、本明細書に記載される抗ＥＤＢ抗体またはその抗原結合性断片のいずれか、例えば、表３３に列挙される抗体またはその抗原結合性断片のいずれか１つと競合する抗体またはその抗原結合性断片もまた、本発明によって提供される。
【０２２５】
本発明は、本明細書に記載される操作されたポリペプチドをコードする核酸を提供する。本発明は、本明細書に記載される操作されたポリペプチドを含む抗体をコードする核酸もまた提供する。
【０２２６】
本発明は、本明細書に記載される操作されたポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞もまた提供する。本発明は、本明細書に記載される操作されたポリペプチドを含む抗体をコードする核酸を含む宿主細胞もまた提供する。
【０２２７】
本発明は、本明細書に開示されるＨＥＲ２抗体のいずれか１つの抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸、およびかかる核酸を含む宿主細胞を提供する。
【０２２８】
本発明は、本明細書に開示される抗ＥＤＢ抗体のいずれか１つの抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸、およびかかる核酸を含む宿主細胞を提供する。
【０２２９】
本発明は、本明細書に記載される操作されたポリペプチド、またはかかる操作されたポリペプチドを含む抗体もしくはその抗原結合性部分を産生する方法を提供する。この方法は、ポリペプチド、抗体またはその抗原結合性部分を発現させるのに適切な条件下で宿主細胞を培養するステップ、およびポリペプチドまたは抗体もしくはその抗原結合性断片を単離するステップを含む。
【０２３０】
Ｂ．薬物
本発明の部位特異的ＡＤＣの調製において有用な薬物には、細胞傷害剤、細胞分裂停止剤、免疫調節性剤および化学療法剤が含まれるがこれらに限定されない、がんの処置において有用な任意の治療剤が含まれる。細胞傷害効果とは、標的細胞（即ち、腫瘍細胞）の枯渇、排除および／または死滅を指す。細胞傷害剤とは、細胞に対して細胞傷害効果を有する薬剤を指す。細胞分裂停止効果とは、細胞増殖の阻害を指す。細胞分裂停止剤とは、細胞に対して細胞分裂停止効果を有し、それによって、細胞（即ち、腫瘍細胞）の特定のサブセットの成長および／または拡大増殖を阻害する薬剤を指す。免疫調節性剤とは、サイトカインおよび／もしくは抗体の産生ならびに／またはＴ細胞機能をモジュレートすることを介して免疫応答を刺激し、それによって、直接的、または別の薬剤をより効果的にすることによって間接的のいずれかで、細胞（即ち、腫瘍細胞）のサブセットの成長を阻害するまたは低減させる薬剤を指す。化学療法剤とは、がんの処置において有用な化学化合物である薬剤を指す。薬物は、薬物誘導体であってもよく、薬物は、本発明の抗体とのコンジュゲーションを可能にするために官能化されている。
【０２３１】
一部の実施形態では、薬物は膜透過性薬物である。かかる実施形態では、ペイロードは、バイスタンダー効果を惹起し得、最初にＡＤＣを内在化した細胞の周囲の細胞は、ペイロードによって死滅される。これは、ペイロードが（即ち、切断可能リンカーの切断によって）抗体から放出され、細胞膜を横切り、拡散の際に、周囲の細胞の死滅を誘導する場合に生じる。
【０２３２】
開示された方法によれば、薬物は、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の抗体薬物コンジュゲートを調製するために使用され、（ａ）Ａｂは、特異的標的に結合する抗体であり；（ｂ）Ｌ−Ｄはリンカー−薬物部分であり、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物である。
【０２３３】
薬物対抗体比（ＤＡＲ）または薬物担持量は、抗体１つ当たりのコンジュゲートされている薬物（Ｄ）分子の数を示す。本発明の抗体薬物コンジュゲートは、ＡＤＣの組成物中に、１のＤＡＲを有するＡＤＣの均一な集団が本質的に存在するように、部位特異的コンジュゲーションを使用する。一部の実施形態では、ＤＡＲは１である。一部の実施形態では、ＤＡＲは２である。他の実施形態では、ＤＡＲは３である。他の実施形態では、ＤＡＲは４である。他の実施形態では、ＤＡＲは４よりも大きい。
【０２３４】
従来のコンジュゲーション（部位特異的コンジュゲーションではなく）を使用することは、その各々が異なる個々のＤＡＲを有する、異なる分子種のＡＤＣの不均質な集団を生じる。この方法で調製されるＡＤＣの組成物は、複数の抗体を含み、各抗体は、特定の数の薬物分子にコンジュゲートされる。このように、組成物は平均ＤＡＲを有する。Ｔ−ＤＭ１（Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標））は、リジン残基上での従来のコンジュゲーションを使用し、０、１、２、３、４、５、６、７または８個の薬物分子が担持されたＡＤＣを含む広い分布を伴って、およそ４の平均ＤＡＲを有する（Ｋｉｍら、２０１４、Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ  ２５（７）：１２２３〜３２）。
【０２３５】
ＤＡＲは、種々の従来の手段、例えば、ＵＶ分光法、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、放射測定法、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、電気泳動およびＨＰＬＣによって決定され得る。
【０２３６】
一実施形態では、本発明のＡＤＣの薬物構成要素は、抗有糸分裂薬物である。ある特定の実施形態では、抗有糸分裂薬物は、オーリスタチン（例えば、０１０１、８２６１、６１２１、８２５４、６７８０および０１３１；以下の表２を参照のこと）であってもよい。より具体的な実施形態では、オーリスタチン薬物は、２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（０１０１としても公知）である。
【０２３７】
オーリスタチンは、チューブリン重合の阻害を介して有糸分裂の間に微小管の形成を阻害することによって、細胞増殖を阻害する。その全体が参照によって組み込まれるＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０１３／０７２８１３は、本発明のＡＤＣの製造において有用なオーリスタチンを開示しており、それらのオーリスタチンを産生する方法を提供している。
【０２３８】
【表２−１】
2018538283.tif 000021
【０２３９】
【表２−２】
2018538283.tif 000022
【０２４０】
本発明の一部の態様では、細胞傷害剤は、リポソームまたは生体適合性ポリマーを使用して作製され得る。本明細書に記載される抗体は、血清半減期および生物活性を増加させるため、ならびに／またはｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長させるために、生体適合性ポリマーにコンジュゲートされ得る。生体適合性ポリマーの例には、水溶性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体、および双性イオン含有生体適合性ポリマー（例えば、ホスホリルコリン含有ポリマー）が含まれる。
【０２４１】
Ｃ．リンカー
本発明の部位特異的ＡＤＣは、薬物を抗体に連結またはコンジュゲートするためのリンカーを使用して調製される。リンカーは、薬物と抗体とを連結して抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成するために使用され得る二官能性化合物である。かかるコンジュゲートは、薬物の腫瘍細胞への選択的送達を可能にする。適切なリンカーには、例えば、切断可能および切断不能リンカーが含まれる。切断可能リンカーは、典型的には、細胞内条件下での切断に対して感受性である。コンジュゲートされた薬物が抗体から切断される主要な機構には、リソソームの酸性ｐＨ中での加水分解（ヒドラゾン、アセタールおよびｃｉｓ−アコニテート様アミド）、リソソーム酵素（カテプシンおよび他のリソソーム酵素）によるペプチド切断、およびジスルフィドの還元が含まれる。切断のためのこれらの機構が様々であることの結果として、薬物を抗体に連結する機構もまた非常に様々であり、任意の適切なリンカーが使用され得る。
【０２４２】
適切な切断可能リンカーには、細胞内プロテアーゼ、例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカー、例えば、ｖｃ、およびｍ（Ｈ２０）ｃ−ｖｃ（以下の表３）が含まれるがこれらに限定されない。具体的な実施形態では、リンカーが切断されたときにペイロードがバイスタンダー効果を誘導できるように、リンカーは切断可能リンカーである。バイスタンダー効果は、膜透過性薬物が（即ち、切断可能リンカーの切断によって）抗体から放出され、細胞膜を横切り、拡散の際に、最初にＡＤＣを内在化した細胞の周囲の細胞の死滅を誘導する場合に生ずる。
【０２４３】
適切な切断不能リンカーには、ｍｃ、ＭａｌＰｅｇ６、Ｍａｌ−ＰＥＧ２Ｃ２、Ｍａｌ−ＰＥＧ３Ｃ２およびｍ（Ｈ２０）ｃ（以下の表３）が含まれるがこれらに限定されない。
【０２４４】
他の適切なリンカーには、特定のｐＨまたはｐＨ範囲で加水分解可能なリンカー、例えば、ヒドラゾンリンカーが含まれる。さらなる適切な切断可能リンカーには、ジスルフィドリンカーが含まれる。リンカーは、例えば、ｍｃリンカーなど、薬物が放出されるために抗体が細胞内で分解されるような程度まで、抗体に共有結合され得る。
【０２４５】
本発明の特定の態様では、本発明の部位特異的ＡＤＣ中のリンカーは、切断可能であり、ｖｃであり得る。
【０２４６】
抗体にコンジュゲートされる治療剤の多くは、水中での可溶性が、あったとしてもほとんどなく、コンジュゲートの凝集に起因して、コンジュゲート上の薬物担持量を制限し得る。これを克服するための１つのアプローチは、リンカーに可溶化基を付加することである。抗体に結合したＰＥＧ二酸（di-acid）、チオール酸（thiol-acid）またはマレイミド酸（maleimide-acid）、ジペプチドスペーサー、およびアントラサイクリンまたはデュオカルマイシンアナログのアミンへのアミド結合を有するものを含む、ＰＥＧおよびジペプチドからなるリンカーを用いて作製されたコンジュゲートが使用され得る。別の例は、細胞傷害剤に結合したＰＥＧ含有リンカージスルフィドおよび抗体に結合したアミドを用いて調製されたコンジュゲートである。ＰＥＧ基を取り込むアプローチは、凝集、および薬物担持量における制限を克服するのに有益であり得る。
【０２４７】
【表３】
2018538283.tif 000023
【０２４８】
リンカーは、表３に示されるように、分子の左側を介してモノクローナル抗体に結合され、分子の右側を介して薬物に結合される。
【０２４９】
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、反応性基が、例えば、マレイミド、ヨードアセトアミド、ピリジルジスルフィドまたは他のチオール反応性コンジュゲーションパートナーである、チオール反応性薬剤にコンジュゲートされる（Ｈａｕｇｌａｎｄ、２００３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｒｉｎｋｌｅｙ、１９９２、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：２；Ｇａｒｍａｎ、１９９７、Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ；Ｍｅａｎｓ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１：２；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ｐｐ．４０〜５５、６４３〜６７１）。
【０２５０】
ある特定の実施形態では、本発明は、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の抗体薬物コンジュゲートを提供し、（ａ）Ａｂは、特異的標的に結合する抗体であり；（ｂ）Ｌ−Ｄはリンカー−薬物部分であり、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物である。
【０２５１】
ある特定の実施形態では、Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）は、スクシンイミド基、マレイミド基、加水分解されたスクシンイミド基または加水分解されたマレイミド基を含む。
【０２５２】
ある特定の実施形態では、Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）は、マレイミド基または加水分解されたマレイミド基を含む。Ｎ−エチルマレイミドなどのマレイミドは、特に、他の基がプロトン化される、７を下回るｐＨで、スルフヒドリル基に対して特異的であるとみなされる。
【０２５３】
ある特定の実施形態では、Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）は、６−マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロパノイル（ＭＰ）、バリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｌａ−ｐｈｅ）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジル  ４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）または６−マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ）を含む。
【０２５４】
ある特定の実施形態では、Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）は、式Ｉの化合物：
【０２５５】
【化１４】
2018538283.tif 000024
またはその薬学的に許容できる塩もしくは溶媒和物を含み、
式中、各存在について独立して、
Ｗは、
【０２５６】
【化１５】
2018538283.tif 000025
であり；
Ｒ１は、水素またはＣ１〜Ｃ８アルキルであり；
Ｒ２は、水素またはＣ１〜Ｃ８アルキルであり；
Ｒ３ＡおよびＲ３Ｂは、以下のうちいずれかであり：
（ｉｉｉ）Ｒ３Ａは、水素またはＣ１〜Ｃ８アルキルであり；
Ｒ３Ｂは、Ｃ１〜Ｃ８アルキルである；
（ｉｖ）Ｒ３ＡおよびＲ３Ｂは一緒になって、Ｃ２〜Ｃ８アルキレンまたはＣ１〜Ｃ８ヘテロアルキレンである；
Ｒ５は、
【０２５７】
【化１６】
2018538283.tif 000026
であり；
Ｒ６は、水素またはＣ１〜Ｃ８アルキルである。
【０２５８】
ある特定の実施形態では、Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）は、式ＩＩａの化合物：
【０２５９】
【化１７】
2018538283.tif 000027
またはその薬学的に許容できる塩もしくは溶媒和物を含み、
式中、各存在について独立して、
Ｗは、
【０２６０】
【化１８】
2018538283.tif 000028
であり；
Ｒ１は、
【０２６１】
【化１９】
2018538283.tif 000029
であり；
Ｙは、−Ｃ２〜Ｃ２０アルキレン−、−Ｃ２〜Ｃ２０ヘテロアルキレン−、−Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ−、−アリーレン−、−Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ−、−Ｃｌ〜Ｃ１０アルキレン−アリーレン−、−アリーレン−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−、−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−（Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ）−、−（Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ）−Ｃｌ〜Ｃ１０アルキレン−、−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−（Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ）−または−（Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ）−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−、−Ｃ１〜６アルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜１０−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜１０−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜１０−Ｃ１〜６アルキル、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜６アルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜６−、−Ｃ１〜６アルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜６−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ１〜６アルキル−（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜６−ＮＲＣ（Ｏ）ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜６アルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜６−ＮＲＣ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜６アルキル−（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜６−ＮＲＣ（Ｏ）Ｃ１〜６アルキル−から選択される基のうちの１つまたは複数であり；
Ｚは、
【０２６２】
【化２０】
2018538283.tif 000030
または−ＮＨ２であり；
Ｇは、ハロゲン、−ＯＨ、−ＳＨまたは−Ｓ−Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ２は、水素またはＣ１〜Ｃ８アルキルであり；
Ｒ３ＡおよびＲ３Ｂは、以下のうちいずれかであり：
（ｉｉｉ）Ｒ３Ａは、水素またはＣ１〜Ｃ８アルキルであり；
Ｒ３Ｂは、Ｃ１〜Ｃ８アルキルである；または
（ｉｖ）Ｒ３ＡおよびＲ３Ｂは一緒になって、Ｃ２〜Ｃ８アルキレンまたはＣ１〜Ｃ８ヘテロアルキレンである；
Ｒ５は、
【０２６３】
【化２１】
2018538283.tif 000031
であり；
Ｒ６は、水素または−Ｃ１〜Ｃ８アルキルであり；
Ｒ１０は、水素、−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキル、−Ｃ３〜Ｃ８カルボシクリル、−アリール、−Ｃｌ〜Ｃ１０ヘテロアルキル、−Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ、−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−アリール、−アリーレン−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキル、−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−（Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ）、−（Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ）−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキル、−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−（Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ）または−（Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ）−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキルであり、アリールを含むＲ１０上のアリールは、［Ｒ７］ｈで置換されていてもよい；
Ｒ７は、各存在について、Ｆ、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＣＮおよびＣＦ３からなる群から独立して選択され；
ｈは、１、２、３、４または５である。
【０２６４】
好ましくは、Ｙは、−Ｃ２〜Ｃ２０アルキレン−、−Ｃ２〜Ｃ２０ヘテロアルキレン−；−Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ−、−アリーレン−、−Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ−、−Ｃｌ〜Ｃ１０アルキレン−アリーレン−、−アリーレン−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−、−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−（Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ）−、−（Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ）−Ｃｌ〜Ｃ１０アルキレン−、−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−（Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ）−または−（Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ）−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−；−Ｃ１〜６アルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜１０−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜１０−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜１０−Ｃ１〜６アルキル、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜６アルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜６−および−Ｃ１〜６アルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜６−Ｃ（Ｏ）−から選択される基のうちの１つまたは複数であり；
【０２６５】
好ましくは、Ｚは、
【０２６６】
【化２２】
2018538283.tif 000032
または−ＮＨ２である。
【０２６７】
ある特定の実施形態では、Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）は、式ＩＩｂの化合物：
【０２６８】
【化２３】
2018538283.tif 000033
またはその薬学的に許容できる塩もしくは溶媒和物を含み、
式中、各存在について独立して、
Ｗは、
【０２６９】
【化２４】
2018538283.tif 000034
であり；
Ｒ１は、
【０２７０】
【化２５】
2018538283.tif 000035
であり；
Ｙは、−Ｃ２〜Ｃ２０アルキレン−、−Ｃ２〜Ｃ２０ヘテロアルキレン−、−Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ−、−アリーレン−、−Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ−、−Ｃｌ〜Ｃ１０アルキレン−アリーレン−、−アリーレン−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−、−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−（Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ）−、−（Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ）−Ｃｌ〜Ｃ１０アルキレン−、−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−（Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ）−または−（Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ）−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−であり；
Ｚは、
【０２７１】
【化２６】
2018538283.tif 000036
または−ＮＨ−Ａｂであり；
Ａｂは抗体であり；
Ｒ２は、水素またはＣ１〜Ｃ８アルキルであり；
Ｒ３ＡおよびＲ３Ｂは、以下のうちいずれかであり：
（ｉｉｉ）Ｒ３Ａは、水素またはＣ１〜Ｃ８アルキルであり；
Ｒ３Ｂは、Ｃ１〜Ｃ８アルキルである；
（ｉｖ）Ｒ３ＡおよびＲ３Ｂは一緒になって、Ｃ２〜Ｃ８アルキレンまたはＣ１〜Ｃ８ヘテロアルキレンである；
Ｒ５は、
【０２７２】
【化２７】
2018538283.tif 000037
であり；
Ｒ６は、水素または−Ｃ１〜Ｃ８アルキルである。
【０２７３】
好ましくは、Ｚは、
【０２７４】
【化２８】
2018538283.tif 000038
または−ＮＨ−Ａｂである。
【０２７５】
ある特定の実施形態では、Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）は、ｍｃＶａｌＣｉｔＰＡＢＣ＿ＭＭＡＥ（「ｖｃＭＭＡＥ」）：
【０２７６】
【化２９】
2018538283.tif 000039
を含む。
【０２７７】
ある特定の実施形態では、Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）は、ｍｃＶａｌＣｉｔＰＡＢＣ＿ＭＭＡＤ（「ｖｃＭＭＡＤ」）：
【０２７８】
【化３０】
2018538283.tif 000040
を含む。
【０２７９】
ある特定の実施形態では、Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）は、ｍｃＭＭＡＤ（「マレイミドカプロイルＭＭＡＤ）：
【０２８０】
【化３１】
2018538283.tif 000041
を含む。
【０２８１】
ある特定の実施形態では、Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）は、ｍｃＭＭＡＦ（「マレイミドカプロイルＭＭＡＦ」）：
【０２８２】
【化３２】
2018538283.tif 000042
を含む。
【０２８３】
式Ｉ、ＩＩａおよびＩＩｂにおいて使用される一般的用語、例えば、アルキル、アルケニル、ハロアルキル；ヘテロシクリルの定義は、これらの用語の通常の慣習的な意味に従って理解すべきである。具体的には、これらの用語は、ＷＯ２０１３／０７２８１３（その全体が本明細書で参照によって組み込まれる）の第１５頁２１行目から第１８頁１４行目に定義されている。
【０２８４】
Ｄ．部位特異的ＨＥＲ２  ＡＤＣを調製する方法
本発明の抗体薬物コンジュゲートを調製するための方法もまた提供される。例えば、本明細書に開示される部位特異的ＡＤＣを産生するためのプロセスは、（ａ）リンカーを薬物に連結するステップ；（ｂ）リンカー−薬物部分を抗体にコンジュゲートするステップ；および（ｃ）抗体薬物コンジュゲートを精製するステップを含み得る。
【０２８５】
本発明のＡＤＣは、抗体を薬物ペイロードにコンジュゲートするために、部位特異的方法を使用する。
【０２８６】
一実施形態では、部位特異的コンジュゲーションは、抗体定常領域中に操作された１つまたは複数のシステイン残基を介して生じる。システイン残基を介した部位特異的コンジュゲーションのために抗体を調製する方法は、その全体が参照によって組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１３／０９３８０９に記載されるように実施され得る。以下の位置のうち１つまたは複数が、システインに変更され得、従って、コンジュゲーションのための部位として機能し得る：ａ）重鎖定常領域上の、残基２４６、２４９、２６５、２６７、２７０、２７６、２７８、２８３、２９０、２９２、２９３、２９４、３００、３０２、３０３、３１４、３１５、３１８、３２０、３２７、３３２、３３３、３３４、３３６、３４５、３４７、３５４、３５５、３５８、３６０、３６２、３７０、３７３、３７６、３７８、３８０、３８２、３８６、３８８、３９０、３９２、３９３、４０１、４０４、４１１、４１３、４１４、４１６、４１８、４１９、４２１、４２８、４３１、４３２、４３７、４３８、４３９、４４３および４４４（重鎖についてはＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う）、ならびに／またはｂ）軽鎖定常領域上の、残基１１１、１４９、１８３、１８８、２０７および２１０（軽鎖についてはＫａｂａｔ番号付けに従う）。
【０２８７】
ある特定の実施形態では、システインに変更され得る１つまたは複数の位置は、ａ）重鎖定常領域上では、２９０、３３４、３９２および／もしくは４４３（重鎖についてはＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う）であり、ならびに／またはｂ）軽鎖定常領域上では、１８３（軽鎖についてはＫａｂａｔ番号付けに従う）である。
【０２８８】
より具体的な実施形態では、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う重鎖定常領域上の２９０位、およびＫａｂａｔ番号付けに従う軽鎖定常領域上の１８３位は、コンジュゲーションのためにシステインに変更される。
【０２８９】
別の実施形態では、部位特異的コンジュゲーションは、抗体定常領域中に操作された１つまたは複数のアシルドナーグルタミン残基を介して生じる。グルタミン残基を介した部位特異的コンジュゲーションのために抗体を調製する方法は、その全体が参照によって組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／０５９８８２に記載されるように実施され得る。抗体は、３つの異なる方法で、部位特異的コンジュゲーションに使用されるグルタミン残基を発現するように操作され得る。
【０２９０】
グルタミン残基を含む短いペプチドタグは、軽鎖および／または重鎖のいくつかの異なる位置中に（即ち、Ｎ末端で、Ｃ末端で、内部で）取り込まれ得る。第１の実施形態では、グルタミン残基を含む短いペプチドタグは、重鎖および／または軽鎖のＣ末端に結合され得る。以下のグルタミン含有タグのうち１つまたは複数が、薬物コンジュゲーションのためのアシルドナーとして機能するために結合され得る：ＧＧＬＬＱＧＰＰ（配列番号４５）、ＧＧＬＬＱＧＧ（配列番号４６）、ＬＬＱＧＡ（配列番号４７）、ＧＧＬＬＱＧＡ（配列番号４８）、ＬＬＱ、ＬＬＱＧＰＧＫ（配列番号４９）、ＬＬＱＧＰＧ（配列番号５０）、ＬＬＱＧＰＡ（配列番号５１）、ＬＬＱＧＰ（配列番号５２）、ＬＬＱＰ（配列番号５３）、ＬＬＱＰＧＫ（配列番号５４）、ＬＬＱＧＡＰＧＫ（配列番号５５）、ＬＬＱＧＡＰＧ（配列番号５６）、ＬＬＱＧＡＰ（配列番号５７）、ＬＬＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５、式中、Ｘ１は、ＧもしくはＰであり、Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｐであるもしくは存在しない、Ｘ３は、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｐであるもしくは存在しない、Ｘ４は、Ｇ、Ｋであるもしくは存在しない、Ｘ５は、Ｋであるもしくは存在しない（配列番号５８）、またはＬＬＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５、式中、Ｘ１は、任意の天然に存在するアミノ酸であり、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は、任意の天然に存在するアミノ酸であるもしくは存在しない（配列番号５９）。
【０２９１】
ある特定の実施形態では、ＧＧＬＬＱＧＰＰ（配列番号８１）は、軽鎖のＣ末端に結合され得る。
【０２９２】
ある特定の実施形態では、重鎖および／または軽鎖上の残基は、部位指定変異誘発によってグルタミン残基に変更され得る。ある特定の実施形態では、重鎖上の２９７位の残基（ＫａｂａｔのＥＵインデックスを使用する）は、グルタミン（Ｑ）になるように変更され得、従って、コンジュゲーションのための部位として機能し得る。
【０２９３】
ある特定の実施形態では、重鎖または軽鎖上の残基が変更されて、１つまたは複数の内因性グルタミンが、コンジュゲーションのためにアクセス可能／反応性になるような位置で、脱グリコシル化（aglycosylation）を生じ得る。ある特定の実施形態では、重鎖上の２９７位の残基（ＫａｂａｔのＥＵインデックスを使用する）は、アラニン（Ａ）に変更され得る。かかる場合、重鎖上の２９５位のグルタミン（Ｑ）は、コンジュゲーションにおける使用が可能になる。
【０２９４】
コンジュゲートの形成のための最適な反応条件は、温度、ｐＨ、リンカー−ペイロード部分のインプット、および添加剤濃度などの反応変数の変動によって経験的に決定され得る。他の薬物のコンジュゲーションに適切な条件は、過度の実験なしに当業者によって決定され得る。操作されたシステイン残基を介した部位特異的コンジュゲーションは、以下の実施例５Ａに例示される。グルタミン残基を介した部位特異的コンジュゲーションは、以下の実施例５Ｂに例示される。
【０２９５】
抗体薬物コンジュゲート１つ当たりの薬物分子の数をさらに増加させるために、薬物は、直鎖または分岐鎖ポリエチレングリコールポリマーおよびモノマーを含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされ得る。ＰＥＧモノマーは、式：−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−のものである。薬物および／またはペプチドアナログは、直接的に、または間接的に、即ち、糖などの適切なスペーサー基を介して、ＰＥＧに結合され得る。ＰＥＧ−抗体薬物組成物は、薬物安定性および標的部位へのｉｎ  ｖｉｖｏ送達を促進するために、さらなる親油性および／または親水性部分もまた含み得る。ＰＥＧ含有組成物を調製するための代表的な方法は、例えば、米国特許第６，４６１，６０３号；同第６，３０９，６３３号；および同第５，６４８，０９５号に見出すことができる。
【０２９６】
コンジュゲーション後、コンジュゲートは、従来の方法によって、コンジュゲートされていない反応物および／または凝集形態のコンジュゲートから分離および精製され得る。これは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、限外濾過／ダイアフィルトレーション、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）、等電点電気泳動（ＣＦ）、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、またはＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００クロマトグラフィーなどのプロセスを含み得る。分離は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によっても達成され得る。適切なＨＩＣ媒体には、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗクロマトグラフィー媒体、Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗクロマトグラフィー媒体、Ｏｃｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗクロマトグラフィー媒体、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｅｔｈｅｒ−６５０Ｍクロマトグラフィー媒体、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ｍｅｔｈｙｌ  ＨＩＣ媒体またはＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ｔ−Ｂｕｔｙｌ  ＨＩＣ媒体が含まれる。
【０２９７】
表４は、実施例のセクションにおいてデータを生成するために使用したＨＥＲ２  ＡＤＣを示す。表４に示される部位特異的ＨＥＲ２  ＡＤＣ（列１〜１７中）は、本発明の部位特異的ＡＤＣの例である。
【０２９８】
本発明の部位特異的ＡＤＣを作製するために、本明細書に開示される任意の抗体は、本明細書に開示される任意のリンカーを介して、本明細書に開示される任意の薬物に、部位特異的技術を使用してコンジュゲートされ得る。ある特定の実施形態では、リンカーは、切断可能（例えば、ｖｃ）である。ある特定の実施形態では、薬物は、オーリスタチン（例えば、０１０１）である。
【０２９９】
本発明のポリペプチド、抗体およびＡＤＣは、２９０位（ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従う）における操作されたシステインを介して、部位特異的コンジュゲートされ得る。ＩｇＧ１抗体重鎖ＣＨ２領域は、配列番号６１または配列番号６２に示される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けを使用するＫ２９０は、太字かつ下線である）。
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED
PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY
RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK（配列番号６１、ＣＨ２ドメイン）
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED
PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY
RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK
GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK
GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL
TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS
LSLSPGK（配列番号６２、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）
【０３００】
操作されたシステインは、単独または以下の位置における１つもしくは複数の操作されたシステイン残基と組み合わせて、２９０位にあり得る：ａ）重鎖定常領域上では、残基２４６、２４９、２６５、２６７、２７０、２７６、２７８、２８３、２９２、２９３、２９４、３００、３０２、３０３、３１４、３１５、３１８、３２０、３２７、３３２、３３３、３３４、３３６、３４５、３４７、３５４、３５５、３５８、３６０、３６２、３７０、３７３、３７６、３７８、３８０、３８２、３８６、３８８、３９０、３９２、３９３、４０１、４０４、４１１、４１３、４１４、４１６、４１８、４１９、４２１、４２８、４３１、４３２、４３７、４３８、４３９、４４３および４４４（ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従う）、ならびに／またはｂ）軽鎖定常領域上では、残基１１１、１４９、１８３、１８８、２０７および２１０（Ｋａｂａｔ番号付けに従う）。
【０３０１】
ある特定の実施形態では、本発明のポリペプチド、抗体およびＡＤＣは、（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付けに従って１８３位に操作されたシステイン残基を含む；または（ｉｉ）定常ドメインを配列番号６３とアラインしたときに、配列番号６３の残基７６に対応する位置に操作されたシステイン残基を含む、抗体カッパ軽鎖定常領域をさらに含み得る。この操作されたシステインは、Ｋａｂａｔの番号付けを使用して「Ｋ１８３Ｃ」とも呼ばれ、以下に太字かつ下線で示される。本発明のペプチド、抗体およびＡＤＣは、以下に示される「Ｋ１８３Ｃ」残基と呼ばれるヒトカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸残基１８３に対応するアミノ酸位置に操作されたシステイン残基を含むラムダ軽鎖定常領域を含み得る。
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ
WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS
TLTLSKADYE KHKVYACEVT
HQGLSSPVTK SFNRGEC（配列番号６３、Ｃκ定常ドメイン）
【０３０２】
別の態様では、本発明は、（ａ）本明細書に開示されるポリペプチドと、（ｂ）（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付けに従って、１１１位、１４９位、１８８位、２０７位、２１０位、もしくはそれらの任意の組み合わせ（好ましくは１１１位もしくは２１０位）に操作されたシステイン残基を含む；または（ｉｉ）定常ドメインを配列番号６３とアラインしたときに、配列番号６３の残基４、４２、８１、１００、１０３、もしくはそれらの任意の組み合わせ（好ましくは残基４もしくは１０３）に対応する位置に操作されたシステイン残基を含む、抗体カッパ軽鎖定常領域とを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【０３０３】
別の態様では、本発明は、（ａ）本明細書に開示されるポリペプチドと、（ｂ）（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付けに従って、１１０位、１１１位、１２５位、１４９位、１５５位、１５８位、１６１位、１８５位、１８８位、１８９位、１９１位、１９７位、２０５位、２０６位、２０７位、２０８位、２１０位、もしくはそれらの任意の組み合わせ（好ましくは１１０位、１１１位、１２５位、１４９位もしくは１５５位）に操作されたシステイン残基を含む；または（ｉｉ）定常ドメインを配列番号６４とアラインしたときに、配列番号６４の残基４、５、１９、４３、４９、５２、５５、７８、８１、８２、８４、９０、９６、９７、９８、９９、１０１、もしくはそれらの任意の組み合わせ（好ましくは残基４、５、１９、４３もしくは４９）に対応する位置に操作されたシステイン残基を含む、抗体ラムダ軽鎖定常領域とを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
GQPKANPTVT LFPPSSEELQ ANKATLVCLI SDFYPGAVTV
AWKADGSPVK AGVETTKPSK QSNNKYAASS
YLSLTPEQWK SHRSYSCQVT HEGSTVEKTV APTECS（配列番号６４、Ｃλ定常ドメイン）
【０３０４】
【表４】
2018538283.tif 000043
【０３０５】
２．製剤および使用
本明細書に記載されるポリペプチド、抗体およびＡＤＣは、医薬製剤として製剤化され得る。医薬製剤は、薬学的に許容できる担体、賦形剤または安定剤をさらに含み得る。さらに、組成物は、本明細書に開示されるＡＤＣのうち１つよりも多くを含み得る。
【０３０６】
本発明において使用される組成物は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、薬学的に許容できる担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２１版、２００５、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ編）をさらに含み得る。許容できる担体、賦形剤または安定剤は、投薬量および濃度でレシピエントにとって非毒性であり、それには、バッファー、例えば、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジン；グルコース、マンノースもしくはデキストランを含む、単糖、二糖および他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれ得る。「薬学的に許容できる塩」とは、本明細書で使用する場合、分子または高分子の薬学的に許容できる有機または無機塩を指す。薬学的に許容できる賦形剤は、本明細書にさらに記載される。
【０３０７】
１つまたは複数の薬学的に許容できる賦形剤を含む製剤が含まれるがこれらに限定されない、本発明の１つまたは複数のＡＤＣの種々の製剤が、投与のために使用され得る。薬学的に許容できる賦形剤は、当該分野で公知であり、薬理学的に有効な物質の投与を促進する比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形態もしくは堅牢性を与え得、または希釈剤として作用し得る。適切な賦形剤には、安定化剤、湿潤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変動させるための塩、カプセル化剤、バッファーおよび皮膚浸透増強剤が含まれるがこれらに限定されない。非経口および経口（nonparenteral）薬物送達のための賦形剤ならびに製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２０版  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００に示されている。
【０３０８】
本発明の一部の態様では、これらの薬剤は、注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）による投与のために製剤化される。従って、これらの薬剤は、薬学的に許容できるビヒクル、例えば、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液などと組み合わされ得る。特定の投薬レジメン、即ち、用量、タイミングおよび反復は、特定の個体およびその個体の病歴に依存する。
【０３０９】
本発明のＡＤＣの治療的製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、所望の程度の純度を有するＡＤＣを、任意選択による薬学的に許容できる担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２１版  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２００５）と混合することによって、貯蔵のために調製される。許容できる担体、賦形剤または安定剤は、使用される投薬量および濃度でレシピエントにとって非毒性であり、それには、バッファー、例えば、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸；塩、例えば、塩化ナトリウム；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジン；グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む、単糖、二糖および他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれ得る。
【０３１０】
本発明のＡＤＣを含むリポソームは、例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、１９８５、ＰＮＡＳ  ８２：３６８８〜９２；Ｈｗａｎｇら、１９０８、ＰＮＡＳ  ７７：４０３０〜４；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載される、当該分野で公知の方法によって調製され得る。増強された循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって生成され得る。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを得るために、規定された孔サイズのフィルターを介して押し出される。
【０３１１】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中、またはマクロエマルジョン中に捕捉され得る。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２１版  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２００５に開示されている。
【０３１２】
徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の適切な例には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、これらのマトリックスは、成形物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸および７エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）、イソ酪酸酢酸スクロース、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【０３１３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、例えば、無菌濾過メンブレンを介した濾過によって容易に達成される。治療的なＡＤＣ組成物は一般に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアル中に配置される。
【０３１４】
適切な表面活性剤には、特に、非イオン性薬剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン（例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）および他のソルビタン（例えば、Ｓｐａｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）が含まれる。表面活性剤を含む組成物は、０．０５％と５％との間の表面活性剤を簡便には含み、０．１％と２．５％との間であり得る。必要に応じて、他の成分、例えば、マンニトールまたは他の薬学的に許容できるビヒクルが添加され得ることが理解される。
【０３１５】
適切なエマルジョンは、市販の脂肪エマルジョン、例えば、ＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤ（商標）、ＬＩＰＯＳＹＮ（商標）、ＩＮＦＯＮＵＴＲＯＬ（商標）、ＬＩＰＯＦＵＮＤＩＮ（商標）およびＬＩＰＩＰＨＹＳＡＮ（商標）を使用して調製され得る。活性成分は、予め混合されたエマルジョン組成物中に溶解され得る、または代替的に、油（例えば、ダイズ油、ベニバナ油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油またはアーモンド油）、ならびにリン脂質（例えば、卵リン脂質、ダイズリン脂質またはダイズレシチン）および水との混合の際に形成されるエマルジョン中に溶解され得る。エマルジョンの浸透圧を調整するために、他の成分、例えば、グリセロールまたはグルコースが添加され得ることが理解される。適切なエマルジョンは、典型的には、最大で２０％の油、例えば、５％と２０％との間の油を含む。脂肪エマルジョンは、０．１μｍと１．０μｍとの間、特に、０．１μｍと０．５μｍとの間の脂肪滴を含み得、５．５〜８．０の範囲のｐＨを有し得る。エマルジョン組成物は、ＡＤＣをＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤ（商標）またはその構成要素（ダイズ油、卵リン脂質、グリセロールおよび水）と混合することによって調製されたものであり得る。
【０３１６】
本発明は、本方法における使用のためのキットもまた提供する。本発明のキットは、本明細書の１つまたは複数のＡＤＣを含む１つまたは複数の容器と、本明細書に記載される本発明の方法のいずれかに従う使用についての指示とを含む。一般に、これらの指示は、治療的処置のためのＡＤＣの投与の説明を含む。
【０３１７】
本明細書のＡＤＣの使用に関する指示は、一般に、意図した処置のための投薬量、投薬スケジュールおよび投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、多用量パッケージ）またはサブ単位用量であり得る。本発明のキット中に提供される指示は、典型的には、ラベルまたは添付文書（例えば、キット中に含まれる紙シート）上の書面による指示であるが、機械可読指示（例えば、磁気または光学記憶ディスク上に保持される指示）もまた許容できる。
【０３１８】
本発明のキットは、適切な包装中にある。適切な包装には、バイアル、ビン、ジャー、可撓性包装（例えば、密封Ｍｙｌａｒまたはプラスチックバッグ）などが含まれるがこれらに限定されない。特定のデバイス、例えば、ミニポンプなどの注入デバイスと組み合わせた使用のためのパッケージもまた企図される。キットは、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。容器もまた、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１種の活性薬剤は、本発明のＡＤＣである。容器は、第２の薬学的に活性な薬剤をさらに含み得る。
【０３１９】
キットは、さらなる構成要素、例えば、バッファーおよび説明情報を、任意選択により提供し得る。通常、キットは、容器、および容器上のまたは容器と関連するラベルまたは添付文書（複数可）を含む。
【０３２０】
本発明のＡＤＣは、治療的、診断的または非診断的目的のために使用され得る。例えば、抗体またはその抗原結合性断片は、親和性精製剤として（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ精製のため）、診断剤として（例えば、特定の細胞、組織または血清中の目的の抗原の発現を検出するため）使用され得る。
【０３２１】
治療適用のために、本発明のＡＤＣは、従来の技術、例えば、静脈内（ボーラスとして、または一定期間にわたる持続注入によって）、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内（intrasynovially）、髄腔内、経口、外用または吸入によって、哺乳動物、特にヒトに投与され得る。抗体または抗原結合性断片は、腫瘍内、腫瘍周囲、病変内または病変周囲経路によっても、適切に投与される。本発明のＡＤＣは、予防的処置または治療的処置において使用され得る。
【０３２２】
３．定義
本明細書で特に定義しない限り、本発明と併せて使用される科学技術用語は、当業者が一般に理解する意味を有するものとする。さらに、文脈が他を要求しない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションと併せて使用される命名法、ならびにそれらの技術は、当該分野で周知であり、一般に使用される。
【０３２３】
用語「Ｌ−Ｄ」とは、リンカー（Ｌ）に連結された薬物（Ｄ）から生じるリンカー−薬物部分を指す。用語「薬物（Ｄ）」とは、疾患を処置する際に有用な任意の治療剤を指す。薬物は、細胞傷害剤、化学療法剤、細胞分裂停止剤または免疫調節剤など、生物学的または検出可能な活性を有する。がん処置に関して、治療剤は、腫瘍細胞の枯渇、排除および／または死滅を含む、腫瘍に対する細胞傷害効果を有する。用語、薬物、ペイロードおよび薬物ペイロードは、相互交換可能に使用される。ある特定の実施形態では、治療剤は、腫瘍細胞の枯渇、排除および／または死滅を含む、腫瘍に対する細胞傷害効果を有する。ある特定の実施形態では、薬物は抗有糸分裂剤である。ある特定の実施形態では、薬物はオーリスタチンである。ある特定の実施形態では、薬物は、２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（０１０１としても公知）である。ある特定の実施形態では、薬物は、好ましくは膜透過性である。
【０３２４】
用語「リンカー（Ｌ）」は、薬物ペイロードへの抗体の直接的または間接的な連結を記述する。抗体へのリンカーの結合は、表面リジン、酸化型炭水化物への還元的カップリング、鎖間ジスルフィド連結を還元することによって遊離したシステイン残基、特異的部位において操作された反応性システイン残基、ならびにトランスグルタミナーゼおよびアミンの存在下でのポリペプチド操作によって反応性にされたアシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンを介するものなどの、種々の方法で達成され得る。本発明は、抗体を薬物ペイロードに連結するために、部位特異的方法を使用する。一実施形態では、コンジュゲーションは、抗体定常領域中に操作されたシステイン残基を介して生じる。別の実施形態では、コンジュゲーションは、ａ）ペプチドタグを介して抗体定常領域に付加された、ｂ）抗体定常領域中に操作された、またはｃ）周囲の残基を操作することによってアクセス可能／反応性にされた、アシルドナーグルタミン残基を介して生じる。リンカーは、切断可能（即ち、細胞内条件下での切断に対して感受性）または切断不能であり得る。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能リンカーである。
【０３２５】
抗体の「抗原結合性断片」とは、（好ましくは、実質的に同じ結合親和性で）抗原に特異的に結合する能力を保持する全長抗体の断片を指す。抗原結合性断片の例には以下が含まれる：Ｆａｂ断片；Ｆ（ａｂ’）２断片；Ｆｄ断片；Ｆｖ断片；ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６）；単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；ジスルフィド連結されたＦｖ（ｄｓＦｖ）；抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体；イントラボディ（intrabody）；単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ、例えば、Ｂｉｒｄら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６（１９８８）およびＨｕｓｔｏｎら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３（１９８８）を参照のこと）；およびディアボディ（diabody）（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８（１９９３）；Ｐｏｌｊａｋら、１９９４、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１〜１１２３を参照のこと）。本発明の抗原結合性断片は、本明細書に記載される操作された抗体定常ドメインを含むが、ネイティブ抗体の全長Ｆｃ領域を含む必要はない。例えば、本発明の抗原結合性断片は、「ミニボディ（minibody）」（ＶＬ−ＶＨ−ＣＨ３または（ｓｃＦｖ−ＣＨ３）２；Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９６；５６（１３）：３０５５〜６１、およびＯｌａｆｓｅｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．２００４；１７（４）：３１５〜２３を参照のこと）であり得る。
【０３２６】
抗体の可変ドメイン中の残基は、抗体の収集の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用される番号付けシステムであるＫａｂａｔに従って番号付けされる。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．（１９９１）を参照のこと。この番号付けシステムを使用して、実際の一次アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＣＤＲの短縮またはそれらの中への挿入に対応する、より少ないまたはさらなるアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従って残基５２ａ）を含み得、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従って残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃ）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、抗体の配列の相同性の領域における、「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付けされた配列とのアラインメントによって、所与の抗体について決定され得る。Ｋａｂａｔ番号付けを割り当てる種々のアルゴリズムが利用可能である。Ａｂｙｓｉｓ（ｗｗｗ．ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ）の２０１２年リリースに実装されたアルゴリズムは、特記しない限り、Ｋａｂａｔ番号付けを可変領域に割り当てるために、本明細書で使用される。
【０３２７】
特記しない限り、抗体のＩｇＧ重鎖定常ドメイン中のアミノ酸残基は、「ＫａｂａｔのＥＵインデックス」と本明細書で呼ばれる、Ｋａｂａｔら、１９９１に記載されるように、Ｅｄｅｌｍａｎら、１９６９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６３（１）：７８〜８５のＥＵインデックスに従って番号付けされる。典型的には、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１定常ドメインの約アミノ酸残基２３６から約４４７までを含む。Ｃ番号付け間の対応は、例えば、ＩＧＭＴデータベースにおいて見出すことができる。軽鎖定常ドメインのアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔら、１９９１に従って番号付けされる。抗体定常ドメインアミノ酸残基の番号付けは、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１３／０９３８０９にも示される。
【０３２８】
ＩｇＧ重鎖定常ドメインにおけるＫａｂａｔのＥＵインデックスの使用に対する唯一の例外は、実施例に記載される残基Ａ１１４である。Ａ１１４とは、Ｋａｂａｔ番号付けを指し、対応するＥＵインデックス番号は１１８である。これは、この部位における部位特異的コンジュゲーションの初期の刊行物が、Ｋａｂａｔ番号付けを使用し、この部位をＡ１１４Ｃと呼び、それ以降当該分野で「１１４」部位として広く使用されてきたからである。Ｊｕｎｕｔｕｌａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６、９２５〜９３２（２００８）を参照のこと。当該分野におけるこの部位の一般的な用法と一致するように、「Ａ１１４」、「Ａ１１４Ｃ」、「Ｃ１１４」または「１１４Ｃ」が、実施例において使用される。
【０３２９】
特記しない限り、抗体の軽鎖定常ドメイン中のアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔら、１９９１に従って番号付けされる。
【０３３０】
クエリー配列のアミノ酸残基は、クエリーアミノ酸配列を参照配列とアラインすることによって、残基の位置が指定された位置と一致する場合、参照配列の指定された位置（例えば、配列番号６１もしくは６２の６０位または配列番号６３の７６位）「に対応する」。かかるアラインメントは、手動で、またはデフォルトパラメーターを使用してＣｌｕｓｔａｌＷ２もしくは「ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」などの周知の配列アラインメントプログラムを使用して、実施され得る。
【０３３１】
「Ｆｃ融合」タンパク質は、１つまたは複数のポリペプチドがＦｃポリペプチドに作動可能に連結されたタンパク質である。Ｆｃ融合物は、免疫グロブリンのＦｃ領域を融合パートナーと組み合わせる。
【０３３２】
用語「約」とは、本明細書で使用する場合、ある値の＋／−１０％を指す。
【０３３３】
本明細書で使用する場合、用語「操作された」（操作されたシステインなどでの）および「置換された」（置換されたシステインなどでの）は、相互交換可能に使用され、ポリペプチドまたは抗体に別の部分を結合させるためのコンジュゲーション部位を創出するために、アミノ酸をシステインに変異させることを指す。
【０３３４】
生物学的寄託
本発明の代表的な材料は、２０１５年１１月１７日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９、ＵＳＡに寄託された。ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２２６７２を有するベクターＴ（Ｋ２９０Ｃ）−ＨＣは、配列番号１８の重鎖配列をコードするＤＮＡ挿入物を含み、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２２６７３を有するベクターＴ（ｋＫ１８３Ｃ）−ＬＣは、配列番号４２の軽鎖配列をコードするＤＮＡ挿入物を含む。寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約およびその規則（ブダペスト条約）の規定の下でなされた。これは、寄託の日から３０年間にわたる寄託物の生存可能な培養物の維持を保証する。寄託物は、ブダペスト条約の条項の下でＡＴＣＣによって入手可能にされ、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．とＡＴＣＣとの間での同意の制約下にあり、この同意は、関連する米国特許の発行の際または任意の米国もしくは外国特許出願が公衆の閲覧に付された際のいずれか早い方の、公衆に対する、寄託物の培養物の子孫の恒久的かつ無制限の入手可能性を保証し、米国特許法第１２２条およびそれに準ずる長官規則（８８６  ＯＧ  ６３８への特定の言及を伴う米国特許法施行規則第１．１４条を含む）に従って権利付与されると米国特許商標庁長官によって決定された者への子孫の入手可能性を保証する。
【０３３５】
本出願の譲受人は、万一、寄託にかかる材料の培養物が適切な条件下でカルチベートした場合に死んだまたは失われたまたは破壊された場合、それらの材料が、通知により、別の同一物で遅滞なく置き換えられることに同意している。寄託された材料の入手可能性は、その特許法に従って任意の政府の権限の下で付与された権利に違反して発明を実施するための許可と解釈すべきではない。
【実施例】
【０３３６】
本発明を、以下の実験的実施例を参照してさらに詳細に記載する。これらの実施例は、説明目的のみのために提供され、特記しない限り、制限的でないことが意図される。このため、本発明は、以下の実施例に限定されると決して解釈してはならず、むしろ本明細書において提供される教示の結果として明らかとなったありとあらゆる変更を包含すると解釈すべきである。
【０３３７】
（実施例１）
コンジュゲーションのためのトラスツズマブ誘導抗体の調製
Ａ．システインを介したコンジュゲーション
システイン残基を通しての部位特異的コンジュゲーションのためのトラスツズマブ誘導体を調製する方法は、一般的にＰＣＴ出願国際公開第２０１３／０９３８０９号（全体が本明細書に組み込まれている）に記載されるように実施した。軽鎖（Ｋａｂａｔ番号付けスキームを使用して１８３位）または重鎖（ＫａｂａｔのＥＵインデックスを使用して２９０、３３４、３９２、および／または４４３位）のいずれかの１つまたは複数の残基を、部位指定変異誘発によってシステイン（Ｃ）残基に変更した。
【０３３８】
Ｂ．トランスグルタミナーゼを介したコンジュゲーション
グルタミン残基を通しての部位特異的コンジュゲーションのためのトラスツズマブ誘導体を調製する方法は、一般的にＰＣＴ出願国際公開第２０１２／０５９８８２号全体が本明細書に組み込まれている）に記載されるように実施した。トラスツズマブを、３つの異なる方法で、コンジュゲーションのために使用されるグルタミン残基を発現するように操作した。
【０３３９】
第一の方法に関して、グルタミン残基を含む８アミノ酸残基のタグ（ＬＣＱ０５）を軽鎖のＣ末端に結合させた。
【０３４０】
第二の方法に関して、重鎖上の残基（ＫａｂａｔのＥＵインデックスを使用して２９７位）を、部位指定変異誘発によって、アスパラギン（Ｎ）からグルタミン（Ｑ）残基に変更した。
【０３４１】
第三の方法に関して、重鎖上の残基（ＫａｂａｔのＥＵインデックスを使用して２９７位）を、アスパラギン（Ｎ）からアラニン（Ａ）残基に変更した。これによって、２９７位での脱グリコシル化が起こり、２９５位でアクセス可能な／反応性の内因性グルタミンが得られる。
【０３４２】
加えて、トラスツズマブ誘導体のいくつかは、コンジュゲーションのために使用されない変更を有する。重鎖の２２２位（ＫａｂａｔのＥＵインデックスを使用して２９７位）での残基をリジン（Ｋ）からアルギニン（Ｒ）残基に変更した。Ｋ２２２Ｒ置換によって、より均質な抗体およびペイロードコンジュゲート、抗体とペイロードとの間のより良好な分子間架橋、および／または抗体軽鎖のＣ末端でのグルタミンタグとの鎖間架橋の有意な減少が得られることが見出された。
【０３４３】
（実施例２）
トラスツズマブ誘導抗体を発現する安定にトランスフェクトされた細胞の産生
一重および二重システイン操作トラスツズマブ誘導抗体バリアントが、細胞において安定に発現され、大規模に産生され得ることを決定するために、ＣＨＯ細胞に、９個のトラスツズマブ誘導抗体バリアント（Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ）、Ｔ（Ｋ２９０Ｃ）、Ｔ（Ｋ３３４Ｃ）、Ｔ（Ｋ３９２Ｃ）、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）、Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）、Ｔ（Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）およびＴ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ））をコードするＤＮＡをトランスフェクトして、安定な高い産生プールを、当技術分野で周知の標準的な手順を使用して単離した。コンジュゲーション試験のためにＴ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）を産生するために、ＨＥＫ−２９３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５７３）に、標準的な方法を使用してこの二重システイン操作抗体バリアントをコードする重鎖および軽鎖ＤＮＡを一過性に同時トランスフェクトした。２カラムプロセス、即ち、プロテインＡ親和性による捕捉の後にＴＭＡＥカラム、または３カラムプロセス、即ちプロテインＡ親和性による捕捉の後にＴＭＡＥカラム、次いでＣＨＡ−ＴＩカラムを使用して、濃縮ＣＨＯプール出発材料からこれらのトラスツズマブバリアントを単離した。これらの精製プロセスを使用すると、全てのシステイン操作トラスツズマブ誘導抗体バリアント調製物は、分析的サイズ排除クロマトグラフィーによって決定した場合に＞９７％の目的のピーク（ＰＯＩ）を含んだ（表５）。表５に示すこれらの結果は、１０個全てのトラスツズマブ誘導システインバリアントに関して、プロテインＡ樹脂からの溶出後に許容可能なレベルの高分子量（ＨＭＷ）凝集種が検出されたこと、およびこの望ましくないＨＭＷ種を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して除去することができることを証明する。加えて、データは、ヒトＩｇＧ１定常領域におけるプロテインＡ結合部位が、システイン操作残基の存在によって変更されないことを証明した。
【０３４４】
【表５】
2018538283.tif 000044
【０３４５】
（実施例３）
トラスツズマブ誘導抗体の完全性
トラスツズマブ野生型抗体と比較して重要な生物物理的特性を評価するため、およびバリアントが標準的な抗体製造プラットフォームプロセスに従うことを確実にするために、システイン操作およびトランスグルタミナーゼバリアントの分子評価を実施した。
【０３４６】
安定なＣＨＯ発現を介して産生された精製システイン操作抗体バリアント調製物の完全性を決定するために、非還元キャピラリーゲル電気泳動（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩ：Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用してピークのパーセント純度を計算した。結果から、システイン操作抗体バリアントＴ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）およびＴ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）が、トラスツズマブ野生型抗体と類似のように、断片および高分子量種（ＨＭＭＳ）の両方を低レベルで含むことが示される。これに対し、Ｔ（Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）は、評価した他の二重操作システインバリアントと比較して高レベルの断片化抗体ピークを含んだ（表６）。これらの結果は、操作されるシステインの特定の組合せが、部位特異的コンジュゲーションに関して意図される抗体の完全性に影響を及ぼし得ることを示唆している。
【０３４７】
【表６】
2018538283.tif 000045
【０３４８】
（実施例４）
ペイロード薬物化合物の生成
オーリスタチン薬物化合物０１０１、０１３１、８２６１、６１２１、８２５４および６７８０を、ＰＣＴ出願国際公開第２０１３／０７２８１３号（全体が本明細書に組み込まれている）に記載の方法に従って作製した。公開された出願において、オーリスタチン化合物は、表７に示される番号付けシステムによって示される。
【０３４９】
【表７】
2018538283.tif 000046
【０３５０】
ＰＣＴ出願国際公開第２０１３／０７２８１３号に従って、薬物化合物０１０１を以下の手順に従って作製した。
【０３５１】
【化３３】
2018538283.tif 000047
【０３５２】
ステップ１．Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（＃５３）の合成。一般手順Ｄに従って、ジクロロメタン（２０ｍＬ、０．１Ｍ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中の＃３２（２．０５ｇ、２．８３ｍｍｏｌ、１当量）、アミン＃１９（２．５ｇ、３．４ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＨＡＴＵ（１．２９ｇ、３．３８ｍｍｏｌ、１．２当量）、ならびにトリエチルアミン（１．５７ｍＬ、１１．３ｍｍｏｌ、４当量）から、粗製の所望の材料を合成し、これをシリカゲルクロマトグラフィー（勾配：ヘプタン中の０％〜５５％アセトン）によって精製し、＃５３（２．４２ｇ、７４％）を固体として得た。ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ９６５．７［Ｍ＋Ｈ＋］、９８７．６［Ｍ＋Ｎａ＋］、保持時間＝１．０４分；ＨＰＬＣ（プロトコールＡ）：ｍ／ｚ９６５．４［Ｍ＋Ｈ＋］、保持時間＝１１．３４４分（純度＞９７％）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）、回転異性体の混合物と思われる、特徴的シグナル：δ 7.86-7.91 (m, 2H), [7.77 (d, J=3.3 Hz)および7.79 (d, J=3.2 Hz), 計1H], 7.67-7.74 (m, 2H),
[7.63 (d, J=3.2 Hz)および7.65 (d, J=3.2 Hz), 計1H], 7.38-7.44 (m, 2H), 7.30-7.36 (m, 2H), 7.11-7.30 (m, 5H), [5.39
(ddd, J=11.4, 8.4, 4.1 Hz)および5.52 (ddd, J=11.7, 8.8,
4.2 Hz), 計1H], [4.49 (dd, J=8.6, 7.6 Hz)および4.59 (dd, J=8.6, 6.8 Hz), 計1H], 3.13, 3.17,
3.18および3.24 (4 s, 計6H), 2.90および3.00 (2 br s, 計3H), 1.31および1.36 (2 br s, 計6H), [1.05 (d, J=6.7 Hz)および1.09 (d, J=6.7 Hz), 計3H].
【０３５３】
ステップ２．２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（＃５４または０１０１）の合成。一般手順Ａに従って、ジクロロメタン（１０ｍＬ、０．０７Ｍ）中の＃５３（７０１ｍｇ、０．７２６ｍｍｏｌ）から、粗製の所望の材料を合成し、これをシリカゲルクロマトグラフィー（勾配：ジクロロメタン中の０％〜１０％メタノール）によって精製した。残基をジエチルエーテルおよびヘプタンで希釈し、減圧下で濃縮して＃５４（または０１０１）（４０６ｍｇ、７５％）を白色固体として得た。ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ７４３．６［Ｍ＋Ｈ＋］、保持時間＝０．７０分；ＨＰＬＣ（プロトコールＡ）：ｍ／ｚ７４３．４［Ｍ＋Ｈ＋］、保持時間＝６．９０３分（純度＞９７％）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）、回転異性体の混合物と思われる、特徴的シグナル：δ [8.64 (br d, J=8.5 Hz)および8.86 (br d, J=8.7 Hz), 計1H], [8.04 (br d,
J=9.3 Hz)および8.08 (br d, J=9.3 Hz), 計1H], [7.77 (d, J=3.3 Hz)および7.80 (d, J=3.2
Hz), 計1H], [7.63 (d, J=3.3 Hz)および7.66 (d, J=3.2 Hz), 計1H], 7.13-7.31 (m, 5H),
[5.39 (ddd, J=11, 8.5, 4 Hz)および5.53 (ddd, J=12, 9, 4
Hz), 計1H], [4.49 (dd, J=9, 8 Hz)および4.60 (dd, J=9, 7 Hz), 計1H], 3.16, 3.20, 3.21および3.25 (4 s, 計6H), 2.93および3.02 (2 br s, 計3H), 1.21 (s, 3H), 1.13および1.13 (2 s, 計3H), [1.05 (d, J=6.7 Hz)および1.10 (d, J=6.7 Hz), 計3H], 0.73-0.80 (m, 3H).
【０３５４】
薬物化合物ＭＭＡＤ、ＭＭＡＥ、およびＭＭＡＦは、ＰＣＴ公開国際公開第２０１３／０７２８１３号に開示の方法に従って、組織内で作製した。
【０３５５】
薬物化合物ＤＭ１は、米国特許第５，２０８，０２０号に概要される手順を介して、購入したメイタンシノールから組織内で作製した。
【０３５６】
（実施例５）
トラスツズマブ誘導抗体のバイオコンジュゲーション
本発明のトラスツズマブ誘導抗体を、リンカーを介してペイロードにコンジュゲートし、ＡＤＣを生成した。使用したコンジュゲーション法は、部位特異的（即ち、特定のシステイン残基または特定のグルタミン残基を介して）であるか、または従来のコンジュゲーションのいずれかであった。
【０３５７】
Ａ．システイン部位特異的
表８のＡＤＣを、以下に記載のシステイン部位特異的方法を介してコンジュゲートした。
【０３５８】
【表８】
2018538283.tif 000048
【０３５９】
５００ｍＭトリス(２-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）溶液（５０〜１００モル当量）を、２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中で最終抗体濃度が５〜１５ｍｇ／ｍＬとなるように、抗体（５ｍｇ）に添加した。反応を３７℃で２．５時間静置した後、抗体を、ゲル濾過カラム（ＰＤ−１０脱塩カラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳに緩衝液交換した。５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中の得られた抗体（５〜１０ｍｇ／ｍＬ）を、１：１  ＰＢＳ／ＥｔＯＨ（ＤＨＡの最終濃度＝１ｍＭ〜４ｍＭ）中で新たに調製した５０ｍＭ  ＤＨＡ溶液によって処置し、４℃で一晩静置した。
【０３６０】
抗体／ＤＨＡ混合物を、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（平衡緩衝液のｐＨを、リン酸を使用して約７．０に調節した）に緩衝液交換し、分子量５０ｋＤａカットオフの遠心濃縮装置を使用して濃縮した。５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（抗体濃度約５〜１０ｍｇ／ｍＬ）中の得られた抗体を、ＤＭＡ中の１０ｍＭマレイミドペイロードの５〜７モル当量によって処置した。１．５〜２．５時間静置した後、材料を緩衝液交換した（ＰＤ−１０）。ＳＥＣによる精製を実施して（必要に応じて）、いかなる凝集材料および残っている遊離のペイロードを除去した。
【０３６１】
Ｂ．トランスグルタミナーゼ部位特異的
表９のＡＤＣを、以下に記載のトランスグルタミナーゼ部位特異的方法を介してコンジュゲートした。
【０３６２】
【表９】
2018538283.tif 000049
【０３６３】
トランスアミド化反応において、抗体上のグルタミンはアシルドナーとして作用し、アミン含有化合物はアシルアクセプター（アミンドナー）として作用した。濃度３３μＭの精製ＨＥＲ２抗体を、特記しない限り、０．３１ｍＭ還元グルタチオンと共に１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよびｐＨ範囲７．５〜８のＴｒｉｓ  ＨＣｌ緩衝液中で２重量体積％ストレプトベルチシリウム・モバラエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ）トランスグルタミナーゼ（ＡＣＴＩＶＡ（商標）、味の素、日本）の存在下、１０〜２５Ｍ過剰量のアシルアクセプター、３３〜８３．３μＭの範囲のＡｃＬｙｓｖｃ−０１０１と共にインキュベートした。反応条件を個々のアシルドナーに関して調整し、Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）は、還元グルタチオンを含まない１０Ｍ過剰量のアシルアクセプターｐＨ８．０を使用し、Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）およびＴ（Ｎ２９７Ｑ）は、２０Ｍ過剰量のアシルアクセプターｐＨ７．５を使用し、ならびにＴ（Ｎ２９７Ａ＋Ｋ２２２Ｒ＋ＬＣＱ０５）は、２５Ｍ過剰量のアシルアクセプターｐＨ７．５を使用した。３７℃で１６〜２０時間インキュベートした後、抗体を、市販のアフィニティクロマトグラフィーおよびＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製疎水性相互作用クロマトグラフィーなどの、当業者に公知の標準的なクロマトグラフィー方法を使用して、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅO樹脂または高性能ブチルセファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）において精製した。
【０３６４】
Ｃ．従来のコンジュゲーション
表１０および１１のＡＤＣを、以下に記載の従来のコンジュゲーション方法を介してコンジュゲートした。
【０３６５】
【表１０】
2018538283.tif 000050
【０３６６】
【表１１】
2018538283.tif 000051
【０３６７】
抗体をダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ、Ｌｏｎｚａ）中で透析した。透析した抗体を５ｍＭ  ２，２’，２’’，２’’’−（エタン−１，２−ジイルジニトリロ）四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ７を含むＰＢＳによって１５ｍｇ／ｍＬに希釈した。得られた抗体を、２〜３当量のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ、蒸留水中で５ｍＭ）によって処置し、３７℃で１〜２時間静置した。室温に冷却後、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）を添加して１０体積％の総有機相を得た。混合物を、ＤＭＡ中の１０ｍＭ保存溶液として８〜１０当量の適切なリンカーペイロードによって処置した。反応を室温で１〜２時間静置した後、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５緩衝液交換カラムを使用して製造元の指示に従って、ＤＰＢＳ（ｐＨ７．４）に緩衝液交換した。
【０３６８】
閉環状態で残すべき材料（表１０のＡＤＣ）を、ＧＥ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを備えるＧＥ  ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステムおよび溶出液としてのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を使用するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。最終試料を約５ｍｇ／ｍＬタンパク質となるように濃縮し、濾過滅菌して、以下に概要する質量分析条件を使用して担持をチェックした。
【０３６９】
スクシンイミド環加水分解のために使用した材料（表１１のＡＤＣ）を、限外濾過装置（５０ｋＤａ分子量カットオフ）を使用して５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）に直ちに緩衝液交換した。得られた溶液を４５℃に４８時間加熱した。得られた溶液を冷却し、ＰＢＳに緩衝液交換し、いかなる凝集材料も除去するためにＳＥＣ（以下に記載）によって精製した。最終試料を約５ｍｇ／ｍＬタンパク質となるように濃縮し、濾過滅菌して、以下に概要される質量分析条件を使用して担持をチェックした。
【０３７０】
Ｄ．Ｔ−ＤＭ１コンジュゲーション
トラスツズマブ−メイタンシノイドコンジュゲート（Ｔ−ＤＭ１）は、トラスツズマブ−エムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標））と構造的に類似である。Ｔ−ＤＭ１は、二機能性リンカーであるスルホスクシンイミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を通してＤＭ１メンタンシノイドに共有結合したトラスツズマブ抗体で構成される。スルホ−ＳＭＣＣを最初に、５０ｍＭリン酸カリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．８中、１０：１の反応化学量論で抗体上の遊離のアミンに２５℃で１時間コンジュゲートし、次に非結合リンカーをコンジュゲート抗体から脱塩する。次に、この抗体−ＭＣＣ中間体を、５０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．８中、１０：１の反応化学量論でＭＣＣリンカー抗体上の遊離のマレイミド末端でＤＭ１スルフィドに２５℃で一晩コンジュゲートする。次に、残っている未反応のマレイミドを、Ｌ−システインでキャッピングし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを通してＡＤＣを分画し、非モノマー種を除去する（Ｃｈａｒｉら、１９９２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５２：１２７〜３１）。
【０３７１】
（実施例６）
ＡＤＣの精製
ＡＤＣを以下に記載のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して一般的に精製および特徴付けした。意図されるコンジュゲーションの部位への薬物の担持を、以下により詳しく記載するように、質量分析（ＭＳ）、逆相ＨＰＬＣ、および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を含む多様な方法を使用して決定した。これら３つの分析方法の組合せは、抗体上のペイロードの担持を確認および定量する多様な方法を提供し、それによってそれぞれのコンジュゲートに関してＤＡＲの正確な決定を提供する。
【０３７２】
Ａ．分取用ＳＥＣ
タンパク質凝集体を除去するため、および反応混合物に残っている微量のペイロード−リンカーを除去するために、Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ＦＰＬＣシステムにおいてＷａｔｅｒｓ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００ＧＬカラムを使用するＳＥＣクロマトグラフィーを使用して、ＡＤＣを一般的に精製した。場合により、ＡＤＣは、ＳＥＣ精製前に凝集体および低分子を含まず、したがって分取用ＳＥＣに供しなかった。使用した溶出液は、流速１ｍＬ／分のＰＢＳであった。これらの条件下で、凝集材料（室温で約１０分で溶出）は、非凝集材料（室温で約１５分で溶出）から容易に分離された。疎水性ペイロード−リンカーの組合せによりしばしば、ＳＥＣピークの「右シフト」が起こった。いかなる特定の理論にも拘束されたくはないが、このＳＥＣピークシフトは、リンカー−ペイロードと静止相との疎水性相互作用によるものであり得る。いくつかの例において、この右シフトにより、コンジュゲートタンパク質を非コンジュゲートタンパク質から部分的に分離することができた。
【０３７３】
Ｂ．分析的ＳＥＣ
分析的ＳＥＣを、溶出液としてＰＢＳを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣで実施し、ＡＤＣの純度およびモノマー状態を評価した。溶出液を、２２０および２８０ｎｍでモニターした。カラムがＴＳＫＧｅｌ  Ｇ３０００ＳＷカラム（７．８×３００ｍｍ、カタログ番号Ｒ８７４８０３Ｐ）である場合、使用した移動相は、流速０．９ｍＬ／分のＰＢＳで３０分間であった。カラムがＢｉｏｓｅｐＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）である場合、使用した移動相は、流速１．０ｍＬ／分のＰＢＳで２５分間であった。
【０３７４】
（実施例７）
ＡＤＣの特徴付け
Ａ．質量分析（ＭＳ）
試料およそ２０μｌ（ＰＢＳ中でおよそ１ｍｇ／ｍＬ  ＡＤＣ）を２０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）２０μｌと混合することによって、ＬＣＭＳ分析のための試料を調製した。混合物を室温で５分間静置した後、試料を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ３００ＳＢ−Ｃ８（２．１×７５ｍｍ）カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１０  ＨＰＬＣシステムに注入した。システムの温度を６０℃に設定した。２０％〜４５％アセトニトリル水溶液（０．１％ギ酸修飾剤を含む）の５分間の勾配を利用した。溶出液を、ＵＶ（２２０ｎｍ）およびＷａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＺＱ質量分析計（ＥＳＩイオン化、コーン電圧：２０Ｖ、イオン源温度：１２０℃；脱溶媒和温度：３５０℃）によってモニターした。多重荷電種を含む粗製スペクトルを、ＭａｓｓＬｙｎｘ４．１ソフトウェアパッケージ内のＭａｘＥｎｔ１を製造元の指示に従って使用して逆畳み込みした。
【０３７５】
Ｂ．抗体あたりの担持のＭＳ定量
ＡＤＣを作製するための抗体へのペイロードの総担持を、薬物抗体比またはＤＡＲと呼ぶ。作製したＡＤＣのそれぞれに関して、ＤＡＲを計算した（表１２）。
【０３７６】
完全な溶出ウィンドウ（通常、５分）のスペクトルを、単一の合計スペクトル（即ち、試料全体のＭＳを表す質量スペクトル）にまとめた。ＡＤＣ試料のＭＳ結果を、同一の非担持対照抗体の対応するＭＳと直接比較した。これによって、担持／非担持重鎖（ＨＣ）ピークおよび担持／非担持軽鎖（ＬＣ）ピークが同定された。様々なピークの比率を使用して、以下の等式（等式１）に基づいて担持を確立することができる。計算は、一般的に有効な仮定であると決定されている、担持および非担持鎖が等しくイオン化するという仮定に基づいている。
【０３７７】
ＤＡＲを確立するために以下の計算を実施した：
等式１：
担持＝２＊［ＬＣ１／（ＬＣ１＋ＬＣ０）］＋２＊［ＨＣ１／（ＨＣ０＋ＨＣ１＋ＨＣ２）］＋４＊［ＨＣ２／（ＨＣ０＋ＨＣ１＋ＨＣ２）］
式中、表記の変数は以下の相対量である：ＬＣ０＝非担持軽鎖、ＬＣ１＝一重担持軽鎖、ＨＣ０＝非担持重鎖、ＨＣ１＝一重担持重鎖、およびＨＣ２＝二重担持重鎖。当業者は、本発明が、ＬＣ２、ＬＣ３、ＨＣ３、ＨＣ４、ＨＣ５などのより高担持種を包含するためにこの計算の拡大を包含することを認識するであろう。
【０３７８】
以下の等式２を使用して、非操作システイン残基への担持量を推定する。操作されたＦｃ変異体に関して、軽鎖（ＬＣ）への担持は、定義により非特異的担持であると考えられた。その上、ＬＣのみの担持は、ＨＣ−ＬＣジスルフィド架橋の意図されない還元の結果である（即ち、抗体は「過剰還元」された）と仮定した。大過剰量のマレイミド求電子剤をコンジュゲーション反応に使用したことを考慮して（一般的に、一重変異体に関しておよそ５当量および二重変異体に関して１０当量）、軽鎖へのいかなる非特異的担持も、重鎖（即ち、切断されたＨＣ−ＬＣジスルフィドの他の「半分」）への対応する量の非特異的担持を伴うと仮定した。これらの仮定を考慮に入れて、以下の等式（等式２）を使用してタンパク質への非特異的担持量を推定した。
等式２
非特異的担持＝４＊［ＬＣ１／（ＬＣ１＋ＬＣ０）］
式中、表記の変数は以下の相対量である：ＬＣ０＝非担持軽鎖、ＬＣ１＝単一担持軽鎖。
【０３７９】
【表１２】
2018538283.tif 000052
【０３８０】
Ｃ．担持部位を確立するためのＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標）によるタンパク質分解
システイン変異体ＡＤＣに関して、抗体への求電子ペイロードのいかなる非特異的担持も、「内部」システイン残基（即ち、典型的に、ＨＣ−ＨＣまたはＨＣ−ＬＣジスルフィド架橋の一部である残基）とも呼ばれる「鎖間」で起こると想定される。Ｆｃドメインにおける操作されたシステインへの求電子剤の担持と、内部システイン残基への担持（そうでなければ典型的にＨＣ−ＨＣまたはＨＣ−ＬＣ間でＳ−Ｓ結合を形成する）とを区別するために、コンジュゲートを、抗体のＦａｂドメインとＦｃドメインの間を切断することが知られているプロテアーゼによって処置した。そのような１つのプロテアーゼは、システインプロテアーゼＩｄｅＳであり、Ｇｅｎｏｖｉｓ社によって「ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標）」として販売され、ｖｏｎ  Ｐａｗｅｌ−Ｒａｍｍｉｎｇｅｎら、２００２，ＥＭＢＯ  Ｊ．２１：１６０７に記載されている。
【０３８１】
簡単に説明すると、製造元が提案する条件に従って、ＡＤＣをＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標）プロテアーゼによって処置し、試料を３７℃で３０分間インキュベートした。試料およそ２０μｌ（ＰＢＳ中でおよそ１ｍｇ／ｍＬ）を２０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）２０μｌと混合して、混合物を室温で５分間静置することによって、試料をＬＣＭＳ分析のために調製した。ヒトＩｇＧ１のこの処置によって、全て約２３〜２６ｋＤａの範囲のサイズである３つの抗体断片、即ち典型的にＬＣ−ＨＣ鎖間ジスルフィド結合を形成する内部システインを含むＬＣ断片、３つの内部システイン（このうち１つは典型的にＬＣ−ＨＣジスルフィド結合を形成し、他の２つのシステインは抗体のヒンジ領域に見出され、典型的に抗体の２つの重鎖の間にＨＣ−ＨＣジスルフィド結合を形成する）を含むＮ末端ＨＣ断片、および本明細書に開示の構築物において変異によって導入されているもの以外の反応性システインを含まないＣ末端ＨＣ断片、が得られた。試料を上記のようにＭＳによって分析した。ＬＣ、Ｎ末端ＨＣ、およびＣ末端ＨＣの担持を定量するために、既に記載した（上記の）方法と同じ様式で担持の計算を実施した。Ｃ末端ＨＣの担持は、「特異的」担持であると考えられるが、ＬＣおよびＮ末端ＨＣへの担持は、「非特異的」担持であると考えられる。
【０３８２】
担持の計算を交差チェックするために、ＡＤＣのサブセットを、以下の節により詳しく説明する代替方法（逆相高速液体クロマトグラフィー［ｒｐＨＰＬＣ］に基づくおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー［ＨＩＣ］に基づく方法）を使用して担持に関しても評価した。
【０３８３】
Ｄ．逆相ＨＰＬＣ分析
試料およそ２０μｌ（ＰＢＳ中でおよそ１ｍｇ／ｍＬ）を２０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）２０μｌと混合することによって、試料を逆相ＨＰＬＣ分析のために調製した。混合物を室温で５分間静置した後、試料を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ３００ＳＢ−Ｃ８（２．１×７５ｍｍ）カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムに注入した。システムの温度を６０℃に設定して、溶出液をＵＶ（２２０ｎｍおよび２８０ｎｍ)によってモニターした。２０％〜４５％のアセトニトリル水溶液（０．１％ＴＦＡ修飾剤を含む）による２０分間の勾配を利用した：Ｔ＝０分、２５％アセトニトリル；Ｔ＝２分、２５％アセトニトリル；Ｔ＝１９分、４５％アセトニトリル；およびＴ＝２０分、２５％アセトニトリル。これらの条件を使用して、抗体のＨＣおよびＬＣをベースラインで分離した。この分析の結果は、ＬＣがほとんど修飾されないままであるが（Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ）およびＴ（ＬＣＱ０５）含有抗体を除く）、ＨＣは修飾される（データは示していない）ことを示している。
【０３８４】
Ｅ．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
試料をＰＢＳでおよそ１ｍｇ／ｍＬに希釈することによって、化合物をＨＩＣ分析のために調製した。試料を、ＴＳＫ−ＧＥＬブチルＮＰＲカラム（４．６×３．５ｍｍ、孔径２．５μｍ；Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、部品番号１４９４７）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣへの１５μｌの自動注入により分析した。システムは、サーモスタットを備えた自動サンプラー、カラムヒーター、およびＵＶ検出器を含む。
【０３８５】
以下のような勾配方法を使用した：移動相Ａ：１．５Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸水素二カリウム（ｐＨ７）；移動相Ｂ：２０％イソプロピルアルコール、５０ｍＭリン酸水素二カリウム（ｐＨ７）；Ｔ＝０分、１００％Ａ；Ｔ＝１２分、０％Ａ。
【０３８６】
保持時間を表１３に示す。選択したスペクトルを図２Ａ〜２Ｅに示す。部位特異的コンジュゲーションを使用したＡＤＣ（Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１、Ｔ（Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１、およびＴ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１）（図１Ａ〜１Ｃ）は、主に１つのピークを示したが、従来のコンジュゲーションを使用したＡＤＣ（Ｔ−ｖｃ０１０１およびＴ−ＤＭ１）（図２Ｄ〜２Ｅ）は、異なる形で担持されたコンジュゲートの混合物を示した。
【０３８７】
【表１３】
2018538283.tif 000053
【０３８８】
Ｆ．熱安定性
示差走査熱量測定（ＤＣＳ）を使用して、操作されたシステインおよびトランスグルタミナーゼ抗体バリアント、ならびに対応するＡｕｒ−０６３８０１０１部位特異的コンジュゲートの熱安定性を決定した。この分析に関して、ＰＢＳ−ＣＭＦ  ｐＨ７．２中で調合した試料を、オートサンプラーを備えたＭｉｃｒｏＣａｌ  ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の試料トレイに分配し、１０℃で５分間平衡にした後、１００℃／時間の速度で１１０℃まで走査した。１６秒間のフィルタリング期間を選択した。生データをベースラインで補正して、タンパク質濃度を標準化した。Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア７．０（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を使用して適切な転移回数でデータをＭＮ２−Ｓｔａｔｅモデルに適合させた。
【０３８９】
全ての一重システインおよび二重システイン操作抗体バリアントならびに操作されたＬＣＱ０５アシルドナーグルタミン含有タグ抗体は、第一の融解転移（Ｔｍ１）が６５℃より高いことによって決定すると、優れた熱安定性を示した（表１４）。
【０３９０】
部位特異的コンジュゲーション方法を使用して０１０１にコンジュゲートしたトラスツズマブ誘導モノクローナル抗体も評価して、優れた熱安定性を同様に有することが示された（表１５）。しかし、Ｔ（Ｋ３９２Ｃ＋Ｌ４４３Ｃ）−ｖｃ０１０１  ＡＤＣのＴｍ１は、非コンジュゲート抗体と比較して−４．３５℃であったことから、ペイロードのコンジュゲーションによって最も影響を受けた。
【０３９１】
まとめると、これらの結果は、操作されたシステインおよびアシルドナーグルタミンを含むタグ抗体バリアントがいずれも熱安定であること、およびｖｃリンカーを介しての０１０１の部位特異的コンジュゲーションが、優れた熱安定性を有するコンジュゲートを生成することを証明した。さらに、非コンジュゲート抗体と比較してＴ（Ｋ３９２Ｃ＋Ｌ４４３Ｃ）−ｖｃ０１０１に関して観察されたより低い熱安定性は、ｖｃリンカーを介しての操作されたシステイン残基の特定の組合せへの０１０１のコンジュゲーションがＡＤＣの安定性に影響を及ぼし得ることを示した。
【０３９２】
【表１４】
2018538283.tif 000054
【０３９３】
【表１５】
2018538283.tif 000055
【０３９４】
（実施例８）
ＨＥＲ２に対するＡＤＣの結合
Ａ．直接結合
ＢＴ４７４細胞（ＨＴＢ−２０）をトリプシン処理して、遠心沈降させ、新しい培地に再懸濁した。次に、細胞を、出発濃度１μｇ／ｍＬのＡＤＣまたは非コンジュゲートトラスツズマブのいずれかの連続希釈液と共に４℃で１時間インキュベートした。次に、細胞を氷冷ＰＢＳによって２回洗浄し、抗ヒトＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ４８８二次抗体（カタログ番号Ａ−１１０１３、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に３０分間インキュベートした。次に、細胞を２回洗浄した後、ＰＢＳに再懸濁した。平均蛍光強度を、Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して読み取った。
【０３９５】
【表１６】
2018538283.tif 000056
【０３９６】
図３Ａおよび表１６に示すように、ＡＤＣ  Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１、Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１、Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１は、直接結合によってＴ−ＤＭ１およびトラスツズマブと類似の結合親和性を有した。このことは、本発明のＡＤＣにおける抗体への修飾およびリンカー−ペイロードの付加が結合に有意な影響を及ぼさなかったことを示している。
【０３９７】
Ｂ．ＦＡＣＳによる競合的結合
ＢＴ４７４細胞をトリプシン処理して、遠心沈降させ、新しい培地に再懸濁した。次に、細胞を、１μｇ／ｍＬトラスツズマブ−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）によりカスタム合成された１：１  ＰＥ標識トラスツズマブ）と混合した、ＡＤＣまたは非コンジュゲートトラスツズマブのいずれかの連続希釈液と共に４℃で１時間インキュベートした。次に、細胞を２回洗浄した後、ＰＢＳに再懸濁した。平均蛍光強度を、Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して読み取った。
【０３９８】
図３Ｂに示すように、ＡＤＣ  Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１、Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１、Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１は、ＰＥ標識トラスツズマブに対する競合結合によって、Ｔ−ＤＭ１およびトラスツズマブと類似の結合親和性を有した。このことは、本発明のＡＤＣにおける抗体への修飾およびリンカー−ペイロードの付加が結合に有意な影響を及ぼさなかったことを示している。
【０３９９】
（実施例９）
ヒトＦｃＲｎに対するＡＤＣの結合
当技術分野において、ＦｃＲｎはサブタイプによらず、ＩｇＧとｐＨ依存的に相互作用し、それが分解されるリソソーム区画に入るのを防止することによって抗体を分解から保護すると考えられている。したがって、反応性システインを野生型ＩｇＧ１−Ｆｃ領域に導入する位置の選択に関して検討したのは、操作されたシステインを含む抗体のＦｃＲｎ結合特性および半減期が変化するのを回避することであった。
【０４００】
ＢｉＡｃｏｒｅ（登録商標）分析を行って、ヒトＦｃＲｎに対する結合に関してトラスツズマブ誘導モノクローナル抗体およびそのそれぞれのＡＤＣの定常状態親和性（ＫＤ）を決定した。ＢｉＡｃｏｒｅ（登録商標）技術は、トラスツズマブ誘導モノクローナル抗体またはそのそれぞれのＡＤＣが、層の上に固定されたヒトＦｃＲｎタンパク質に結合する際のセンサーの表面層での屈折指数の変化を利用する。結合を、表面から屈折するレーザー光の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって検出した。ヒトＦｃＲｎを、ＢｉｒＡ試薬（カタログ番号：ＢＩＲＡ５００，Ａｖｉｄｉｔｙ，ＬＬＣ，Ａｕｒｏｒａ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）を使用して、操作されたＡｖｉ−タグを通して特異的にビオチン化し、センサー上でのＦｃＲｎタンパク質の均一な方向が可能となるように、ストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップ上に固定した。次に、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、０．５％ＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０を含む２０ｍＭ  ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸ｐＨ６．０（ＭＥＳ−ＳＰ）中の様々な濃度のトラスツズマブ誘導モノクローナル抗体またはそのそれぞれのＡＤＣをチップ表面に注入した。注入サイクルの間に、ＨＢＳ−ＥＰ＋０．０５％ＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）ｐＨ７．４を使用して、表面を再生した。定常状態結合親和性を、トラスツズマブ誘導モノクローナル抗体またはそのそれぞれのＡＤＣに関して決定し、これらを野生型トラスツズマブ抗体（ＩｇＧ１  Ｆｃ領域にシステイン変異を含まず、ＴＧアーゼ操作タグまたはペイロードの部位特異的コンジュゲーションを含まない）と比較した。
【０４０１】
これらのデータは、本発明の表記の位置での操作されたシステイン残基のＩｇＧ１−Ｆｃ領域への取り込みがＦｃＲｎに対する親和性を変更しないことを証明した（表１７）。
【０４０２】
【表１７】
2018538283.tif 000057
【０４０３】
（実施例１０）
Ｆｃγ受容体に対するＡＤＣの結合
ヒトＦｃγ受容体に対する部位特異的コンジュゲーションを使用したＡＤＣの結合を、ペイロードに対するコンジュゲーションが抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などの抗体関連機能性特性に影響を及ぼし得る結合を変更するか否かを理解するために評価した。ＦｃγＩＩＩａ（ＣＤ１６）はＮＫ細胞およびマクロファージ上で発現し、抗体結合を介してのこの受容体と標的発現細胞との同時会合がＡＤＣＣを惹起する。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）分析を使用して、トラスツズマブ誘導モノクローナル抗体およびそのそれぞれのＡＤＣの、Ｆｃγ受容体ＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、ＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）、ＩＩＩａ（ＣＤ１６）、およびＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）に対する結合を調べた。
【０４０４】
この表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイに関して、組換え型ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）細胞外ドメインタンパク質（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）をＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上に固定し、トラスツズマブ誘導モノクローナル抗体またはそのそれぞれのＡＤＣのいずれかの約３００〜４００応答ユニット（ＲＵ）を捕捉した。Ｔ−ＤＭ１は、非コンジュゲートトラスツズマブ抗体と同等のＦｃγ受容体に対する結合特性をコンジュゲーション後も保持することが示されていることから、陽性対照としてこの評価に含めた。次に、様々な濃度のＦｃγ受容体、ＦｃγＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）、ＦｃγＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）を表面上に注入して、結合を決定した。
【０４０５】
ＦｃγＲ  ＩＩａ、ＩＩｂ、およびＩＩＩａは、急速なｏｎ／ｏｆｆレートを示し、したがってセンソグラムを定常状態モデルに適合させてＫＤ値を得た。ＦｃγＲＩは、より遅いｏｎ／ｏｆｆレートを示し、このためデータをカイネティックモデルに適合させてＫＤ値を得た。
【０４０６】
操作されたシステイン位置２９０および３３４位でのペイロードのコンジュゲーションにより、その非コンジュゲート相対物の抗体およびＴ−ＤＭ１と比較して、特にＣＤ１６ａ、ＣＤ３２ａ、およびＣＤ６４に対するＦｃγＲ親和性の中等度の喪失が示された（表１８）。しかし、部位２９０、３３４、および３９２位での同時コンジュゲーションによって、Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）−ｖｃ０１０１およびＴ（Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１に関して観察されたように、ＣＤ１６ａ、ＣＤ３２ａ、およびＣＤ３２ｂに対する親和性は実質的に失われたが、ＣＤ６４に対する親和性は失われなかった（表１８）。興味深いことに、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１は、Ｋ２９０Ｃ位で薬物ペイロードを有するにもかかわらず、この試験において評価した全てのＦｃγＲに対して同等の結合を示した（表１８）。予想されたように、トランスグルタミナーゼ媒介コンジュゲートＴ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１は、アシルドナーグルタミン含有タグの位置がＮ−結合グリコシル化を除去することから、評価したＦｃγ受容体のいずれにも結合しなかった。逆に、Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１は、グルタミン含有タグがヒトκ軽鎖定常領域内で操作されていることから、Ｆｃγ受容体に対する完全な結合を保持した。
【０４０７】
まとめると、これらの結果は、コンジュゲートされたペイロードの位置が、ＦｃγＲに対するＡＤＣの結合に影響を及ぼし得ること、およびコンジュゲートの抗体機能性に影響を及ぼし得ることを示唆した。
【０４０８】
【表１８】
2018538283.tif 000058
【０４０９】
（実施例１１）
ＡＤＣＣ活性
ＡＤＣＣアッセイにおいて、Ｈｅｒ２発現細胞株ＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３を標的細胞として使用し、ＮＫ−９２細胞（Ｃｏｎｋｗｅｓｔ社によって５０歳の白人男性の末梢血単核球細胞から誘導されたインターロイキン−２依存的ナチュラルキラー細胞株）または健康なドナー（＃１７９）から新たに採取した血液から単離したヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、エフェクター細胞として使用した。
【０４１０】
標的細胞（ＢＴ４７４またはＳＫＢＲ３）１×１０４個／１００μｌ／ウェルを９６ウェルプレートに入れて、ＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃／５％ＣＯ２で一晩培養した。翌日、培地を除去して、アッセイ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地）６０μｌに交換し、１μｇ／ｍｌ抗体またはＡＤＣ  ２０μｌを添加し、その後１×１０５個（ＳＫＢＲ３に関して）または５×１０５個（ＢＴ４７４に関して）のＰＢＭＣ浮遊液２０μｌ、または両方の細胞株に関して２．５×１０５個のＮＫ９２細胞を各ウェルに添加して、ＰＢＭＣの場合はＢＴ４７４に関してエフェクター対標的比５０：１もしくはＳＫＢＲ３に関して２５：１、またはＮＫ９２の場合は１０：１を得た。試料は全て３回の反復実験で行った。
【０４１１】
アッセイプレートを３７℃／５％ＣＯ２で６時間インキュベートした後、室温で平衡にした。細胞溶解によるＬＤＨ放出を、ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｏｎｅ（商標）試薬を使用して、励起波長５６０ｎｍおよび放射波長５９０ｎｍで測定した。陽性対照として、Ｔｒｉｔｏｎ  ８μＬを添加して、対照ウェルにおいて最大のＬＤＨ放出を生成した。図４に示す特異的細胞傷害性は、以下の式を使用して計算した。
【０４１２】
【数１】
2018538283.tif 000059
「実験」は、上記の条件の１つで測定したシグナルに対応する。
「エフェクター自然放出」は、ＰＢＭＣ単独の存在下で測定したシグナルに対応する。
「標的自然放出」は、標的細胞単独の存在下で測定したシグナルに対応する。
「標的最大」は、洗浄剤溶解標的細胞単独の存在下で測定したシグナルに対応する。
【０４１３】
図４は、トラスツズマブ、Ｔ−ＤＭ１、およびｖｃ０１０１  ＡＤＣコンジュゲートに関して試験したＡＤＣＣ活性を示す。データは、トラスツズマブおよびＴ−ＤＭ１に関して報告されたＡＤＣＣ活性と一致する。Ｎ２９７Ｑの変異はグリコシル化部位に存在することから、Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１は、ＡＤＣＣ活性を有しないと予想され、これもまたアッセイにおいて確認された。一重変異体（Ｋ１８３Ｃ、Ｋ２９０Ｃ、Ｋ３３４Ｃ、ＬＣＱ０５を含むＫ３９２Ｃ）ＡＤＣに関しては、ＡＤＣＣ活性が維持された。意外にも、二重変異体（Ｋ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ、Ｋ１８３Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ、Ｋ１８３Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ、Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ、Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ、Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）ＡＤＣに関して、ＡＤＣＣ活性は、Ｋ３３４Ｃ部位に関連する２つの二重変異体ＡＤＣ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４ＣおよびＫ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）を除き、全て維持された。
【０４１４】
（実施例１２）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害アッセイ
抗体−薬物コンジュゲートを実施例３に記載のように調製した。細胞を９６ウェルプレートに低密度で播種し、翌日にＡＤＣおよび非コンジュゲートペイロードを１０濃度の連続３倍希釈液によって２回の反復実験で処置した。細胞を湿潤３７℃／５％ＣＯ２インキュベータ内で４日間インキュベートした。プレートをＣｅｌｌＴｉｔｅｒ（登録商標）９６  ＡＱｕｅｃｕｓ  Ｏｎｅ  ＭＴＳ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と共に１．５時間インキュベートすることによって採取し、Ｖｉｃｔｏｒプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）において波長４９０ｎｍで吸光度を測定した。ＩＣ５０値を、ＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）による４パラメータロジスティックモデルを使用して計算し、図５にｎＭペイロード濃度で、および図６にｎｇ／ｍＬ抗体濃度で報告した。ＩＣ５０値は、括弧内に独立した測定回数と共に±標準偏差で示す。
【０４１５】
ｖｃ−０１０１またはＡｃＬｙｓｖ−０１０１リンカーペイロードを含むＡＤＣは、基準ＡＤＣであるＴ−ＤＭ１（Ｋａｄｃｙｌａ）と比較して、Ｈｅｒ２陽性細胞モデルに対して非常に強力であり、Ｈｅｒ２陰性細胞に対して選択的であった。
【０４１６】
トラスツズマブに対する部位特異的コンジュゲーションによって合成したＡＤＣは、Ｈｅｒ２細胞モデルに対して高レベルの効力および選択性を示した。特に、いくつかのトラスツズマブ−ｖｃ０１０１  ＡＤＣは、中等度または低いＨｅｒ２発現細胞モデルにおいてＴ−ＤＭ１より強力である。例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ細胞（１＋のＨｅｒ２発現を有する）におけるＴ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害のＩＣ５０は、３５１ｎｇ／ｍｌであり、これに対しＴ−ＤＭ１では３６２６ｎｇ／ｍｌ（約１０倍低い）である。ＭＤＡ−ＭＢ−３６１−ＤＹＴ２およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞などの２＋＋レベルのＨｅｒ２発現を有する細胞に関して、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１のＩＣ５０は１２〜２０ｎｇ／ｍｌであり、これに対しＴ−ＤＭ１では３８〜４０ｎｇ／ｍｌである。
【０４１７】
（実施例１３）
異種移植片モデル
本発明のトラスツズマブ誘導ＡＤＣを、Ｎ８７胃がん異種移植片モデル、３７６２２肺がん異種移植片モデル、および多数の乳がん異種移植片モデル（即ち、ＨＣＣ  １９５４、ＪＩＭＴ−１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（ＤＹＴ２）、および１４４５８０（ＰＤＸ）モデル）で試験した。以下に記載のそれぞれのモデルに関して、最初の用量を１日目に与えた。腫瘍を少なくとも週に１回測定し、その体積を式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５×（腫瘍の幅２）（腫瘍の長さ）によって計算した。最大で８〜１０匹、最少で６〜８匹の動物を含む各処置群の平均腫瘍体積（±Ｓ．Ｅ．Ｍ）を計算した。
【０４１８】
Ａ．Ｎ８７胃がん異種移植片
トラスツズマブ誘導ＡＤＣの効果を、免疫欠損マウスにおいて、高レベルのＨＥＲ２発現を有するＮ８７細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８２２）から確立したヒト腫瘍異種移植片のｉｎ  ｖｉｖｏ成長に関して調べた。異種移植片を生成するために、雌性ヌード（Ｎｕ／Ｎｕ，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）マウスに、５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で７．５×１０６個のＮ８７細胞を皮下移植した。腫瘍の体積が２５０〜４５０ｍｍ３に達すると、様々な処置群における腫瘍量の均一性を確保するために、腫瘍を病期分類した。Ｎ８７胃がんモデルに、ＰＢＳビヒクル、トラスツズマブＡＤＣ（０．３、１、および３ｍｇ／ｋｇ）またはＴ−ＤＭ１（１、３、および１０ｍｇ／ｋｇ）を４日間離して４回（Ｑ４ｄ×４）静脈内投与した（図７）。
【０４１９】
データは、トラスツズマブ誘導ＡＤＣがＮ８７胃がん異種移植片の成長を用量依存的に阻害したことを証明する（図７Ａ〜７Ｈ）。
【０４２０】
図７Ｉに示すように、Ｔ−ＤＭ１は、１および３ｍｇ／ｋｇで腫瘍成長を遅らせ、１０ｍｇ／ｋｇでは腫瘍の完全な縮小を示した。しかし、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１は、１および３ｍｇ／ｋｇで完全な縮小をもたらし、０．３ｍｇ／ｋｇで部分的縮小をもたらした（図７Ａ）。データは、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１が、このモデルにおいてＴ−ＤＭ１より有意に強力（約１０倍）であることを示している。
【０４２１】
ＤＡＲ４を有するＡＤＣ（図６Ｅ、６Ｆ、および６Ｇ）について、１８３＋２９０（図７Ａ）と比較して類似のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性が得られた。加えて、ＤＡＲ２  ＡＤＣである一重変異体を評価した（図７Ｂ、７Ｃ、および７Ｄ）。一般的に、これらのＡＤＣは、ＤＡＲ４  ＡＤＣと比較してあまり有効ではないが、Ｔ−ＤＭ１よりは有効である。ＤＡＲ２  ＡＤＣにおいて、ＬＣＱ０５は、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性データに基づくと最も強力なＡＤＣであるように思われる。
【０４２２】
Ｂ．ＨＣＣ１９５４乳がん異種移植片
ＨＣＣ１９５４（ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ−２３３８）は、高ＨＥＲ２発現乳がん細胞株である。異種移植片を生成するために、雌性ＳＨＯマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）に、５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で５×１０６個のＨＣＣ１９５４細胞を皮下移植した。腫瘍の体積が２００〜２５０ｍｍ３に達すると、様々な処置群における腫瘍量の均一性を確保するために、腫瘍を病期分類した。ＨＣＣ１９５４乳がんモデルに、ＰＢＳビヒクル、トラスツズマブ誘導ＡＤＣ、および陰性対照ＡＤＣをＱ４ｄ×４で静脈内投与した（図８Ａ〜８Ｅ）。
【０４２３】
データは、トラスツズマブＡＤＣがＨＣＣ１９５４乳がん異種移植片の成長を用量依存的に阻害したことを証明している。１ｍｇ／ｋｇ用量の比較では、ｖｃ０１０１コンジュゲートは、Ｔ−ＤＭ１より有効であった。０．３ｍｇ／ｋｇ用量の比較では、ＤＡＲ４担持ＡＤＣ（図８Ｂ、８Ｃ、および８Ｄ）は、ＤＡＲ２担持ＡＤＣより有効である（図８Ａ）。さらに、陰性対照ＡＤＣの１ｍｇ／ｋｇは、ビヒクル対照と比較して腫瘍成長に対する影響は非常にわずかであった（図８Ｄ）。しかし、Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１は、腫瘍を完全に縮小させ、標的特異性を示している。
【０４２４】
Ｃ．ＪＩＭＴ−１乳がん異種移植片
ＪＩＭＴ−１は、中等度／低いＨｅｒ２を発現し、トラスツズマブに対して本質的に抵抗性である乳がん細胞株である。異種移植片を生成するために、雌性ヌード（Ｎｕ／Ｎｕ）マウスに、５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で５×１０６個のＪＩＭＴ−１細胞（ＤＳＭＺ＃ＡＣＣ−５８９）を皮下移植した。腫瘍の体積が２００〜２５０ｍｍ３に達すると、様々な処置群における腫瘍量の均一性を確保するために、腫瘍を病期分類した。ＪＩＭＴ−１乳がんモデルに、ＰＢＳビヒクル、Ｔ−ＤＭ１（図９Ｇ）、部位特異的コンジュゲーションを使用したトラスツズマブ誘導ＡＤＣ（図９Ａ〜９Ｅ）、従来のコンジュゲーションを使用したトラスツズマブ誘導ＡＤＣ（図９Ｆ）、および陰性対照ｈｕＮｅｇ−８．８ＡＤＣをＱ４ｄ×４で静脈内投与した。
【０４２５】
データは、試験した全てのｖｃ０１０１コンジュゲートが腫瘍の縮小を用量依存的に引き起こすことを証明している。これらのＡＤＣは、１ｍｇ／ｋｇで腫瘍の縮小を引き起こすことができる。しかし、Ｔ−ＤＭ１はこの中等度／低いＨｅｒ２発現モデルでは６ｍｇ／ｋｇでも不活性である。
【０４２６】
Ｄ．ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（ＤＹＴ２）乳がん異種移植片
ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（ＤＹＴ２）は、中等度／低Ｈｅｒ２発現乳がん細胞株である。異種移植片を生成するために、雌性ヌード（Ｎｕ／Ｎｕ）マウスに１００ｃＧｙ／分を４分間照射し、３日後に５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で１．０×１０７個のＭＤＡ−ＭＢ−３６１（ＤＹＴ２）細胞（ＡＴＣＣ＃  ＨＴＢ−２７）を皮下移植した。腫瘍の体積が３００〜４００ｍｍ３に達すると、様々な処置群における腫瘍量の均一性を確保するために、腫瘍を病期分類した。ＤＹＴ２乳がんモデルに、ＰＢＳビヒクル、部位特異的コンジュゲーションおよび従来のコンジュゲーションを使用したトラスツズマブ誘導ＡＤＣ、Ｔ−ＤＭ１、および陰性対照ＡＤＣをＱ４ｄ×４で静脈内投与した（図１０Ａ〜１０Ｄ）。
【０４２７】
データは、トラスツズマブＡＤＣがＤＹＴ２乳がん異種移植片の成長を用量依存的に阻害したことを証明している。ＤＹＴ２は中等度／低Ｈｅｒ２発現細胞株であるが、他のＨｅｒ２低／中等度発現細胞株より微小管阻害剤に対して感受性である。
【０４２８】
Ｅ．１４４５８０患者由来乳がん異種移植片
トラスツズマブ誘導ＡＤＣの効果を、免疫欠損マウスにおいて、適切な同意手順に従って得た新たに切除した１４４５８０乳房腫瘍の断片から確立したヒト腫瘍異種移植片のｉｎ  ｖｉｖｏ成長に関して調べた。新しい生検を採取した際の１４４５８０の腫瘍特徴付けは、トリプルネガティブ（ＥＲ−、ＰＲ−、およびＨＥＲ２−）乳がん腫瘍であった、１４４５８０乳がん患者由来異種移植片を、雌性ヌード（Ｎｕ／Ｎｕ）マウスにおいて動物から動物への断片としてｉｎ  ｖｉｖｏで皮下に継代した。腫瘍の体積が１５０〜３００ｍｍ３に達すると、様々な処置群における腫瘍サイズの均一性を確保するために、腫瘍を病期分類した。１４４５８０乳がんモデルに、ＰＢＳビヒクル、部位特異的コンジュゲーションを使用したトラスツズマブＡＤＣ、および従来のコンジュゲーションを使用したトラスツズマブ誘導ＡＤＣ、および陰性対照ＡＤＣを４日毎に４回（Ｑ４ｄ×４）静脈内投与した（図１１Ａ〜１１Ｅ）。
【０４２９】
このＨＥＲ２−（臨床での定義により）ＰＤＸモデルにおいて、Ｔ−ＤＭ１は、調べた全ての用量（１．５、３、および６ｍｇ）で無効であった（図１０Ｅ）。ＤＡＲ４  ｖｃ０１０１  ＡＤＣ（図１１Ａ、１１Ｃ、および１１Ｄ）に関して、３ｍｇ／ｋｇは、腫瘍の縮小を引き起こすことができる（図１１Ｃにおいて１ｍｇ／ｋｇであっても）。ＤＡＲ２  ｖｃ０１０１  ＡＤＣ（図１１Ｂ）は、３ｍｇ／ｋｇでＤＡＲ４  ＡＤＣより無効である。しかし、ＤＡＲ２  ｖｃ０１０１  ＡＤＣはＴ−ＤＭ１とは異なり、６ｍｇ／ｋｇで有効である。
【０４３０】
Ｆ．３７６２２患者由来非小細胞肺がん異種移植片
適切な同意手順に従って得た３７６２２の患者由来非小細胞肺がん異種移植片モデルにおいていくつかのＡＤＣを試験した。３７６２２患者由来異種移植片を、雌性ヌード（Ｎｕ／Ｎｕ）マウスにおいて動物から動物への断片としてｉｎ  ｖｉｖｏで皮下に継代した。腫瘍の体積が１５０〜３００ｍｍ３に達すると、様々な処置群における腫瘍サイズの均一性を確保するために、腫瘍を病期分類した。３７６２２ＰＤＸモデルに、ＰＢＳビヒクル、部位特異的コンジュゲーションを使用したトラスツズマブ誘導ＡＤＣ、Ｔ−ＤＭ１、および陰性対照ＡＤＣを、４日毎に４回（Ｑ４ｄ×４）静脈内投与した（図１２Ａ〜１２Ｄ）。
【０４３１】
Ｈｅｒ２の発現を、修飾したＨｅｒｃｅｐｔ試験によってプロファイリングしたところ、細胞株において認められるより多くの不均質性を有する２＋であると分類された。リンカーペイロードとしてｖｃ０１０１をコンジュゲートしたＡＤＣ（図１２Ａ〜１２Ｃ）は、１および３ｍｇ／ｋｇで腫瘍の縮小を引き起こし、有効であった。しかし、Ｔ−ＤＭ１は、１０ｍｇ／ｋｇでいくらかの治療利益を提供したに過ぎなかった（図１２Ｄ）。Ｔ−ＤＭ１の１０ｍｇ／ｋｇでの結果をｖｃ０１０１  ＡＤＣの１ｍｇ／ｋｇと比較すると、ｖｃ０１０１  ＡＤＣは、Ｔ−ＤＭ１より１０倍強力であるように思われる。バイスタンダー効果は、不均質な腫瘍における有効性にとって重要である可能性がある。
【０４３２】
Ｔ−ＤＭ１  ＡＤＣの放出された代謝物は、膜不透過性化合物であるリジンキャップｍｃｃ−ＤＭ１リンカーペイロード（即ち、Ｌｙｓ−ｍｃｃ−ＤＭ１）であることが示されている（Ｋｏｖｔｕｎら、２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：３２１４〜２１；Ｘｉｅら、２００４，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ３１０：８４４）。しかし、Ｔ−ｖｃ０１０１  ＡＤＣから放出された代謝物は、オーリスタチン０１０１であり、Ｌｙｓ−ｍｃｃ−ＤＭ１より膜透過性が高い化合物である。放出されたＡＤＣペイロードが隣接する細胞を死滅させる能力は、バイスタンダー効果として知られている。膜透過性のペイロードの放出により、Ｔ−ｖｃ０１０１は、強いバイスタンダー効果を惹起することができるが、Ｔ−ＤＭ１は惹起することができない。図１３は、Ｔ−ＤＭ１の６ｍｇ／ｋｇ（図ＸＡ）またはＴ−ｖｃ０１０１の３ｍｇ／ｋｇ（図ＸＢ）のいずれかを１回投与した後、採取し、後に９６時間のホルマリン固定で処理したＮ８７細胞株異種移植片腫瘍の免疫組織化学を示す。腫瘍の切片を、両方のＡＤＣのペイロードについて提唱される作用機序の読み出しとして、腫瘍細胞に結合したＡＤＣを検出するためにヒトＩｇＧに関して染色し、分裂細胞を検出するためにホスホ−ヒストンＨ３（ｐＨＨ３）に関して染色した。
【０４３３】
ＡＤＣは、いずれの場合も腫瘍の辺縁部で検出される。Ｔ−ＤＭ１処置腫瘍（図１３Ａ）において、ｐＨＨ３陽性腫瘍細胞の大部分は、ＡＤＣの近くに存在する。しかし、Ｔ−ｖｃ０１０１処置腫瘍（図１３Ｂ）では、ｐＨＨ３陽性腫瘍細胞の大部分は、ＡＤＣの位置を超えて広がっており（黒色の矢印はいくつかの例を強調する）、腫瘍の内部に存在する。これは、切断可能リンカーおよび膜透過性のペイロードを有するＡＤＣが、ｉｎ  ｖｉｖｏで強いバイスタンダー効果を惹起できることを示唆している。
【０４３４】
（実施例１４）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔ−ＤＭ１抵抗性モデル
Ａ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ−ＤＭ１抵抗性細胞の生成
Ｎ８７細胞を２つの個別のフラスコに継代し、生物学的複製実験を可能にするために、それぞれのフラスコを抵抗性生成プロトコールに関して同一に処置した。細胞を、Ｔ−ＤＭ１コンジュゲートのおよそＩＣ８０濃度（１０ｎＭペイロード濃度）に３日間曝露した後、およそ４〜１１日間処置を行わずに回復させることを５サイクル行った。Ｔ−ＤＭ１コンジュゲートの１０ｎＭで５サイクル後、細胞を、１００ｎＭ  Ｔ−ＤＭ１のさらに６回サイクルに同様に曝露した。手順は、診療所で細胞傷害性治療薬に関して典型的に使用される、最大忍容量の後に回復期間を設ける長期的なマルチサイクル（ｏｎ／ｏｆｆ）投与を模倣することを意図した。Ｎ８７から誘導した親細胞をＮ８７と呼び、Ｔ−ＤＭ１に長期的に曝露した細胞をＮ８７−ＴＭと呼ぶ。中等度から高レベルの薬物抵抗性が、Ｎ８７−ＴＭ細胞に関して４カ月以内に発生した。抵抗性レベルが持続的な薬物曝露後にもはや増加しなくなるサイクル処置の３〜４カ月後に、薬物の選択圧を除去した。応答および表現型は、その後およそ３〜６カ月間、培養細胞株において安定なままであった。その後、細胞傷害アッセイによって測定した抵抗性表現型の大きさの低減が時に観察され、この場合には、継代初期に凍結保存したＴ−ＤＭ１抵抗性細胞を追加の試験のために融解した。細胞の安定化を確実にするために、Ｔ−ＤＭ１選択圧の除去後少なくとも２〜８週間の間に、報告された全ての特徴付けを実施した。結果の一貫性を確実に得るためにモデルの作製後およそ１〜２年の間に、１回の選択に由来する融解した様々な凍結保存集団からデータを収集した。
【０４３５】
胃がん細胞株Ｎ８７を、それぞれの細胞株に関しておよそＩＣ８０（約１０ｎＭペイロード濃度）である用量での処置サイクルによって、トラスツズマブ−メイタンシノイド抗体−薬物コンジュゲート（Ｔ−ＤＭ１）に対する抵抗性に関して選択した。親Ｎ８７細胞は、コンジュゲートに対して本質的に感受性であった（ＩＣ５０＝１．７ｎＭペイロード濃度、６２ｎｇ／ｍＬ抗体濃度）（図１４）。親Ｎ８７細胞の２つの集団を処置サイクルに曝露して、１００ｎＭ  Ｔ−ＤＭ１でのおよそ４カ月間の曝露サイクル後、これらの２つの集団（以降、Ｎ８７−ＴＭ−１およびＮ８７−ＴＭ−２と呼ぶ）はそれぞれ、親細胞と比較してＡＤＣに対して１１４倍および１４６倍の不応性となった（図１４および図１５Ａ）。興味深いことに、対応する非コンジュゲートメイタンシノイド遊離薬に対して最小の交差抵抗性（約２．２〜２．５倍）が観察された（図１４）。
【０４３６】
Ｂ．細胞傷害性試験
ＡＤＣを実施例３に記載のように調製した。非コンジュゲートメイタンシンアナログ（ＤＭ１）およびオーリスタチンアナログは、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｇｒｏｔｏｎ，ＣＴ）が調製した。他の標準治療化学療法剤は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。細胞を９６ウェルプレートに低密度で播種した後、翌日、ＡＤＣおよび非コンジュゲートペイロードの１０濃度の３倍連続希釈液によって２回の反復実験で処置した。細胞を湿潤３７℃／５％ＣＯ２インキュベータ内で４日間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ（登録商標）９６ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  ＭＴＳ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａｍ  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と共に１．５時間インキュベートすることによってプレートを採取し、Ｖｉｃｔｏｒプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）において波長４９０ｎｍで吸光度を測定した。ＩＣ５０値を、ＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）による４パラメータロジスティックモデルを使用して計算した。
【０４３７】
他のトラスツズマブ誘導ＡＤＣに対する交差抵抗性プロファイルを決定した。切断不能リンカーおよび送達ペイロードで構成される多くのトラスツズマブ誘導ＡＤＣに対して、抗チューブリン作用機序により有意な交差抵抗性が観察された（図１４）。例えば、Ｎ８７−ＴＭをＮ８７親細胞と比較すると、切断不能マレイミドカプロイルまたはＭａｌ−ＰＥＧリンカーを介してそれぞれトラスツズマブに連結されたオーリスタチンベースのペイロードを表すＴ−ｍｃ８２６１（図１４および図１５Ｂ）およびＴ−ＭａｌＰｅｇ８２６１（図１４）に対して、＞３３０および＞２７２倍の効力の低減が観察された。Ｎ８７−ＴＭ細胞において、モノメチルドラスタチン（ＭＭＡＤ）を送達する異なる切断不能リンカーを有する別のトラスツズマブＡＤＣであるＴ−ｍｃＭａｌＰｅｇＭＭＡＤに対して、２３５倍を超える抵抗性が観察された（図１４）。
【０４３８】
注目すべきことに、これらの薬物は類似の標的を機能的に阻害する（即ち、微小管の脱重合化）が、Ｎ８７−ＴＭ細胞株は切断可能リンカーを介して送達されるペイロードに対しては感受性を保持することが観察された。抵抗性を克服するＡＤＣの例には、限定されないが、Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１（図１４および図１５Ｃ）、Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１（図１４および図１５Ｄ）、Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）−ｖｃ０１０１（図１０および図１１Ｅ）、Ｔ（Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１（図１４および図１５Ｆ）ならびにＴ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１（図１４および図１５Ｇ）が挙げられる。これらは、オーリスタチンアナログ０１０１を送達するがｖｃリンカーのタンパク質分解切断によってペイロードが細胞内に放出される、トラスツズマブベースのＡＤＣを表す。
【０４３９】
これらのＡＤＣ抵抗性がん細胞が他の治療に対して広く抵抗性であるか否かを決定するために、Ｎ８７−ＴＭ細胞モデルを、様々な作用機序を有する標準治療化学療法剤のパネルによって処置した。一般的に、微小管およびＤＮＡ機能の低分子阻害剤は、Ｎ８７−ＴＭ抵抗性細胞株に対して有効なままであった（図１４）。これらの細胞は、微小管脱重合剤であるメイタンシンのアナログを送達するＡＤＣに対して抵抗性となったが、いくつかのチューブリン脱重合化または重合化剤に対しては交差抵抗性が最小であるかまたは交差抵抗性が認められなかった。同様に、両方の細胞株は、トポイソメラーゼ阻害剤、抗代謝剤、およびアルキル化剤／架橋剤を含む、ＤＮＡ機能を妨害する薬剤に対する感受性を保持した。一般的に、Ｎ８７−ＴＭ細胞は、広範囲の細胞障害剤に対して不応性ではないことから、薬物抵抗性を模倣する一般的な成長または細胞周期の欠損は除外される。
【０４４０】
両方のＮ８７−ＴＭ集団は、対応する非コンジュゲート薬（即ち、ＤＭ１および０１０１；図１４）に対しても感受性を保持した。したがって、トラスツズマブ−メイタンシノイドコンジュゲートに対して不応性となったＮ８７−ＴＭ細胞は、切断不能リンカーを介して送達した場合に、他の微小管ベースのＡＤＣに対して交差抵抗性を示したが、非コンジュゲート微小管阻害剤および他の化学療法剤に対しては感受性のままであった。
【０４４１】
Ｎ８７−ＴＭ細胞におけるＴ−ＤＭ１に対する抵抗性の分子メカニズムを決定するために、ＭＤＲ１およびＭＲＰ１薬物排出ポンプのタンパク質発現レベルを決定した。これは。低分子チューブリン阻害剤がＭＤＲ１およびＭＲＰ１薬物排出ポンプの公知の基質であるためであった（Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｃｏｌｅｙ，２００３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  １０（２）：１５９〜１６５）。親Ｎ８７およびＮ８７−ＴＭ抵抗性細胞の総細胞溶解物から、これらの２つのタンパク質のタンパク質発現レベルを決定した（図１６）。イムノブロット分析から、Ｎ８７−ＴＭ抵抗性細胞がＭＲＰ１（図１６Ａ）またはＭＤＲ１（図１６Ｂ）タンパク質を有意に過剰発現しないことが示された。まとめると、これらのデータを、Ｎ８７−ＴＭ細胞において薬物排出ポンプの公知の基質（例えば、パクリタキセル、ドキソルビシン）に対する交差抵抗性がないことと組み合わせると、薬物排出ポンプの過剰発現は、Ｎ８７−ＴＭ細胞におけるＴ−ＤＭ１抵抗性の分子メカニズムではないことを示唆している。
【０４４２】
ＡＤＣの作用機序が、特異的抗原に対する結合を必要としていることから、抗原の枯渇または抗体結合の低減は、Ｎ８７−ＴＭ細胞におけるＴ−ＤＭ１抵抗性を説明し得る。Ｔ−ＤＭ１に関する抗原がＮ８７−ＴＭ細胞において有意に枯渇されているか否かを決定するために、親Ｎ８７およびＮ８７−ＴＭ抵抗性細胞の総細胞溶解物からのＨＥＲ２発現レベルを比較した（図１７Ａ）。イムノブロット分析から、Ｎ８７−ＴＭ１細胞が、親Ｎ８７細胞と比較して顕著に低減された量のＨＥＲ２タンパク質発現を有しないことが示された。
【０４４３】
Ｎ８７−ＴＭ細胞の細胞表面ＨＥＲ２抗原に対する抗体結合量を決定した。蛍光活性化細胞ソーティングを使用する細胞表面結合試験において、Ｎ８７−ＴＭ細胞は、細胞表面抗原に対するトラスツズマブ結合が約５０％減少した（図１７Ｂ）。Ｎ８７細胞は、がん細胞株の中でもＨＥＲ２タンパク質の高い発現体であることから（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ−Ｏｕｃｈｉら、２００７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５９（６）：７９５〜８０５）、これらの細胞におけるＨＥＲ２抗体結合の約５０％低減はおそらく、Ｎ８７−ＴＭ細胞におけるＴ−ＤＭ１に対する抵抗性の促進メカニズムを表すものではない。この解釈を支持する証拠は、Ｎ８７−ＴＭ抵抗性細胞が、異なるリンカーおよびペイロードを有する他のＨＥＲ２結合トラスツズマブ誘導ＡＤＣに対して感受性のままであることである（図１４）。
【０４４４】
偏りのないアプローチでＴ−ＤＭ１抵抗性の潜在的メカニズムを決定するために、親Ｎ８７およびＮ８７−ＴＭ抵抗性細胞モデルを、Ｔ−ＤＭ１抵抗性の原因であり得る膜タンパク質発現レベルの変化を全体的に同定するために、プロテオミックアプローチを介してプロファイルを調べた。両方の細胞株モデルの間で５２３個のタンパク質の有意な発現レベルの変化が観察された（図１８Ａ）。これらの予想されるタンパク質変化の選択をバリデートするために、Ｎ８７およびＮ８７−ＴＭ全細胞溶解物のイムノブロットを、Ｎ８７細胞と比較してＮ８７−ＴＭ細胞において過小発現すると予想されるタンパク質（ＩＧＦ２Ｒ、ＬＡＭＰ１、ＣＴＳＢ）（図１８Ｂ）および過剰発現すると予想されるタンパク質（ＣＡＶ１）（図１８Ｃ）に関して実施した。ｉｎ  ｖｉｖｏで観察されたタンパク質の変化がｉｎ  ｖｉｖｏで認められる変化を模倣するか否かを評価するために、Ｎ８７およびＮ８７−ＴＭ−２細胞をＮＳＧマウスに皮下移植することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍を生成した。Ｎ８７−ＴＭ−２腫瘍は、Ｎ８７腫瘍と比較してＣＡＶ１タンパク質の過剰発現を保持した（図１８Ｄ）。両方のモデルにおいてマウス間質でのＣＡＶ染色が予想されるが、上皮ＣＡＶ１染色はＮ８７−ＴＭ−２モデルのみに認められた。
【０４４５】
Ｃ．ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験
細胞培養において観察された抵抗性がｉｎ  ｖｉｖｏで再現されるか否かを決定するために、親Ｎ８７細胞およびＮ８７−ＴＭ−２細胞を拡大増殖させて、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から得た雌性ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）免疫欠損マウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）の脇腹に注射した。
マウスにＮ８７またはＮ８７−ＴＭ細胞（７．５×１０６個／注射、５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ中）のいずれかの浮遊液を右脇腹に皮下注射した。腫瘍が約０．３ｇ（約２５０ｍｍ３）に達すると、マウスを試験群に無作為化した。Ｔ−ＤＭ１コンジュゲートまたはビヒクルを０日目に食塩水中で静脈内投与し、全体で４用量を４日間離して繰り返した（Ｑ４Ｄ×４）。腫瘍を毎週測定して、量を体積＝（幅×幅×長さ）／２として計算した。ｔｉｍｅ  ｔｏ  ｅｖｅｎｔ分析（腫瘍の倍加）を実施して、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定によって有意性を評価した。これらの試験の全ての処置群のマウスにおいて、体重減少は観察されなかった。
【０４４６】
マウスを以下の薬剤で処置した：（１）ビヒクル対照ＰＢＳ、（２）トラスツズマブ抗体の１３ｍｇ／ｋｇの後に４．５ｍｇ／ｋｇ；（３）Ｔ−ＤＭ１の６ｍｇ／ｋｇ；（４）Ｔ−ＤＭ１の１０ｍｇ／ｋｇ；（５）Ｔ−ＤＭ１の１０ｍｇ／ｋｇ、次いでＴ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１の３ｍｇ／ｋｇ；（６）Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１の３ｍｇ／ｋｇ。腫瘍サイズをモニターして、結果を図２０に示す。Ｎ８７（図１９および図２０Ａ）およびＮ８７−ＴＭ−２（図１９および図２０Ｂ）腫瘍は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害アッセイで認められたプロファイルと類似のＡＤＣ有効性プロファイルを示し（図１９および２０Ｂ）、Ｎ８７−ＴＭ薬物抵抗性細胞は、Ｔ−ＤＭ１に対して不応性であったが、なおも切断可能リンカーを有するトラスツズマブ誘導ＡＤＣには応答した。実際に、Ｔ−ＤＭ１に対して不応性であり、約１ｇまで成長した腫瘍を、Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１による処置に切り替えると、腫瘍は有効に縮小した（図２０Ｂ）。この試験のｔｉｍｅ−ｔｏ−ｅｖｅｎｔ分析において、Ｔ−ＤＭ１の６および１０ｍｇ／ｋｇは、Ｎ８７モデルにおけるマウスの＞５０％において少なくとも６０日間腫瘍の倍加を防止したが、Ｎ８７−ＴＭ−２モデルでは、Ｔ−ＤＭ１は防止することができなかった（図２０Ｃおよび２０Ｄ）。Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１を３ｍｇ／ｋｇで投与すると、試験期間の間（約８０日）、マウスにおけるＮ８７およびＮ８７−ＴＭ腫瘍の両方のいかなる腫瘍倍加も防止した（図２０Ｃおよび２０Ｄ）。
【０４４７】
別の試験において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ−ＤＭ１抵抗性を克服した切断可能に連結されたＡＤＣは全て、Ｔ−ＤＭ１に対して非応答性であったこのＮ８７−ＴＭ２腫瘍モデルにおいて有効なままであった（図１９および図２０Ｅ）。
【０４４８】
次に、Ｔ（ｋＫ１８３＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１  ＡＤＣがＴＤＭ１に対して不応性である腫瘍成長を阻害できるか否かを評価した。ビヒクルまたはＴ−ＤＭ１のいずれかによって処置したＮ８７−ＴＭ腫瘍は、これらの処置下で成長したが、１４日目にＴ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１治療に切り替えた腫瘍は直ちに縮小した（図２０Ｆ）。
【０４４９】
（実施例１５）
ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｔ−ＤＭ１抵抗性モデル
Ａ．ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ−ＤＭ１抵抗性細胞の生成
全ての動物試験は、確立されたガイドラインに従って、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｐｅａｒｌ  Ｒｉｖｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。異種移植片を生成するために、雌性ヌード（Ｎｕ／Ｎｕ）マウスに、５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で７．５×１０６個のＮ８７細胞を皮下移植した。平均腫瘍体積が約３００ｍｍ３に達すると、動物を２つの群に無作為化した：１）ビヒクル対照（ｎ＝１０）および２）Ｔ−ＤＭ１処置（ｎ＝２０）。Ｔ−ＤＭ１  ＡＤＣ（６．５ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（ＰＢＳ）を食塩水中で０日目に静脈内投与した後、動物に６．５ｍｇ／ｋｇを３０週まで毎週投与した。腫瘍を週に２回または週に１回測定して、量を体積＝（幅×幅×長さ）／２として計算した。これらの試験において全ての処置群のマウスにおいて、体重減少は観察されなかった。
【０４５０】
個々の腫瘍体積が約６００ｍｍ３に達すると（無作為化時の腫瘍の当初のサイズの倍加）、動物はＴ−ＤＭ１処置に不応性であるかまたは処置下で再発したと考えられた。図２１Ａに示すように、対照群と比較して、ほとんどの腫瘍は当初Ｔ−ＤＭ１処置に応答した。より具体的には、マウス２０匹中１７匹が初回Ｔ−ＤＭ１処置に応答したが、有意な数の腫瘍（２０例中１３例）が、Ｔ−ＤＭ１処置下で再発した。時間と共に、移植したＮ８７細胞はＴ−ＤＭ１に対して抵抗性となった（図２１Ｂ）。Ｔ−ＤＭ１処置に当初反応しなかった３例の腫瘍を、ＩＨＣによるＨｅｒ２発現決定のために採取したところ、ＨＥＲ２発現の変化がないことが示された。残りの１０例の再発腫瘍を以下に説明する。
【０４５１】
Ｔ−ＤＭ１処置に当初反応し、その後再発した４例の腫瘍を、７７日目（マウス１および１６）、９１日目（マウス１９）、１４０日目（マウス６）にＴ−ｖｃ０１０１の２．６ｍｇ／ｋｇの毎週処置に切り替えた。図１９Ｃに示すように、ｉｎ  ｖｉｖｏで生成したＴ−ＤＭ１抵抗性腫瘍はＴ−ｖｃ０１０１に応答し、Ｔ−ＤＭ１抵抗性を獲得した腫瘍がｖｃ０１０１ＡＤＣ処置に対して感受性であることを示した。
【０４５２】
当初Ｔ−ＤＭ１処置に応答した後、再発した別の３例の腫瘍を、１１０日目（マウス４、１３、および１８）にＴ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１の２．６ｍｇ／ｋｇの毎週処置に切り替えた。図２１Ｄに示すように、ｉｎ  ｖｉｖｏで生成したＴ−ＤＭ１抵抗性細胞もまた、Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１に応答した。Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１を評価するために追加の実験を行ったところ、類似の結果が得られ、ｉｎ  ｖｉｖｏで生成したＴ−ＤＭ１抵抗性腫瘍が、図２１Ｅに示すように、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１処置に対して感受性であることが示された。
【０４５３】
要約すると、追加の処置を行った全てのＴ−ＤＭ１不応性腫瘍は、ｖｃ０１０１  ＡＤＣ処置に対して感受性（７例中７例）であり、ｉｎ  ｖｉｖｏ抵抗性Ｔ−ＤＭ１腫瘍を、切断可能なｖｃ０１０１コンジュゲートによって処置することができることが示された。
【０４５４】
当初Ｔ−ＤＭ１に応答したがその後再発したさらに３例の腫瘍（図２１Ｂに示すマウス７、１７、および２）を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ特徴付けのために切除した。切除した腫瘍をｉｎ  ｖｉｔｒｏで２〜５カ月間培養後、これらの細胞をＴ−ＤＭ１に対する抵抗性に関して評価し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで特徴付けした（本実施例において以下の節ＢおよびＣを参照されたい）。
【０４５５】
Ｂ．細胞傷害性試験
Ｔ−ＤＭ１処置から再発し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した（本実施例の節Ａに記載のように）細胞を９６ウェルプレートに播種して、翌日にＡＤＣまたは非コンジュゲートペイロードの４倍連続希釈液を投与した。細胞を湿潤３７℃／５％ＣＯ２インキュベータ内で９６時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）をプレートに添加して、Ｖｉｃｔｏｒプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）において波長４９０ｎｍで吸光度を測定した。ＩＣ５０値を、ＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）による４パラメータロジスティックモデルを使用して計算した。
【０４５６】
細胞傷害性スクリーニングの結果を、表１９および２０に要約する。細胞は、親細胞と比較してＴ−ＤＭ１（図２２Ａ）に対して抵抗性であったが、切断可能なｖｃ０１０１コンジュゲートＴ−ｖｃ０１０１（データは示していない）、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１（図２２Ｂ）、Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１（図２２Ｃ）、およびＴ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１（図２２Ｄ）に対して感受性であった（表１９）。Ｔ−ＤＭ１抵抗性細胞は、意外にも親ペイロードＤＭ１ならびに０１０１ペイロードに対して感受性であった（表２０）。
【０４５７】
【表１９】
2018538283.tif 000060
【０４５８】
【表２０】
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【０４５９】
Ｃ．ＦＡＣＳおよびウェスタンブロットによるＨｅｒ２発現
Ｔ−ＤＭ１処置から再発し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した（本実施例の節Ａに記載のように）細胞において、Ｈｅｒ２発現を特徴付けした。ＦＡＣＳ分析に関して、細胞をトリプシン処理して遠心沈降させ、新しい培地に再懸濁した。次に細胞を、５μｇ／ｍＬトラスツズマブ−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）によりカスタム合成された１：１ＰＥ標識トラスツズマブ）と共に４℃で１時間インキュベートした。Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して平均蛍光強度を読み取った。
【０４６０】
ウェスタンブロット分析に関して、細胞をＲＩＰＡ溶解緩衝液（プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を含む）を使用して氷中で１５分間溶解した後、ボルテックスミキサーで攪拌し、微量遠心分離機の最高速度で、４℃で遠心沈降させた。上清を採取して、４×試料緩衝液および還元剤を試料に添加し、各試料中の総タンパク質に関して標準化した。試料を４〜１２％ビストリスゲル上で分離して、ニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンを１時間ブロックし、ＨＥＲ２抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ，１：１０００）と共に４℃で一晩インキュベートした。次に、メンブレンを１×ＴＢＳＴで３回洗浄し、抗マウスＨＲＰ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ，１：５０００）と共に１時間インキュベートし、３回洗浄後プロービングした。
【０４６１】
Ｔ−ＤＭ１再発腫瘍のＨＥＲ２発現レベルは、ＦＡＣＳ（図２３Ａ）およびウェスタンブロット（図２３Ｂ）によって評価すると、対照腫瘍（Ｔ−ＤＭ１処置を行わない）と類似であった。
【０４６２】
Ｄ．Ｔ−ＤＭ１抵抗性は薬物排出ポンプの発現によるものではない
細胞株は、ウェスタンブロットによりＭＤＲ１を発現せず（図２４Ａ）、細胞は、ＭＤＲ−１基質である遊離の薬物０１０１に対して抵抗性ではない（図２４Ｂ）。ドキソルビシンに対する抵抗性は観察されず（図２４Ｃ）、抵抗性機構がＭＲＰ１を通して起こるのではないことが示された。しかし、細胞はなおも遊離のＤＭ１に対して抵抗性である（図２４Ｄ）。
【０４６３】
（実施例１６）
薬物動態（ＰＫ）
従来のまたは部位特異的ｖｃ０１０１抗体薬物コンジュゲートに対する曝露を、５または６ｍｇ／ｋｇのいずれかの用量をカニクイザルにＩＶボーラス投与後に決定した。総抗体（総Ａｂ；コンジュゲートｍＡｂおよび非コンジュゲートｍＡｂの両方の測定）およびＡＤＣ（少なくとも１つの薬物分子にコンジュゲートされたｍＡｂ）濃度を、リガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）を使用して測定した。ＡＤＣは、ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１を使用したＴ（ＬＣＱ０５）を除き、全ての例においてｖｃ０１０１を使用して作製した。従来のコンジュゲーション（部位特異的コンジュゲーションではない）を使用してトラスツズマブからＡＤＣを作製した。
【０４６４】
カニクイザルに用量を投与後の総ＡｂおよびトラスツズマブＡＤＣ（Ｔ−ｖｃ０１０１）（５ｍｇ／ｋｇ）またはＴ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）部位特異的ＡＤＣ（６ｍｇ／ｋｇ）の濃度対時間プロファイルおよび薬物動態／毒性動態（図２５Ａおよび表２１）。Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）部位特異的ＡＤＣの曝露は、従来のコンジュゲートと比較して曝露および安定性の両方を増加させた。
【０４６５】
カニクイザルに用量を投与後のトラスツズマブ（Ｔ−ｖｃ０１０１）（５ｍｇ／ｋｇ）またはＴ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）、Ｔ（ＬＣＱ０５）、Ｔ（Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）、Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）、Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）、およびＴ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）部位特異的ＡＤＣ（６ｍｇ／ｋｇ）の濃度対時間プロファイルおよび薬物動態／毒性動態（図２５Ｂおよび表２１）。いくつかの部位特異的ＡＤＣ（Ｔ（ＬＣＱ０５）、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）、Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）、およびＴ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）の曝露は、従来のコンジュゲーションを使用したトラスツズマブＡＤＣと比較して高い。しかし、他の２つの部位特異的ＡＤＣ（Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）およびＴ（Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ））の曝露は、トラスツズマブＡＤＣより高い曝露を有さず、必ずしも全ての部位特異的ＡＤＣが、従来のコンジュゲーションを使用して作製したトラスツズマブＡＤＣより良好な薬物動態特性を有するわけではないことを示している。
【０４６６】
【表２１】
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【０４６７】
（実施例１７）
疎水性相互作用クロマトグラフィーによる相対的保持の値とラットにおける曝露（ＡＵＣ）との比較
疎水性は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって評価することができるタンパク質の物理特性であり、タンパク質試料の保持時間は、その相対的疎水性に基づいて異なる。ＡＤＣのＨＩＣ保持時間をそれぞれの抗体のＨＩＣ保持時間によって除算した比率である相対的保持時間（ＲＲＴ）を計算することによって、ＡＤＣをそのそれぞれの抗体と比較することができる。非常に疎水性が高いＡＤＣは、より高いＲＲＴを有し、これらのＡＤＣはまた、より多くの薬物動態不安定性、特に小さい曲線下面積（ＡＵＣ、または曝露）を有する可能性がある。様々な部位変異を有するＡＤＣのＨＩＣ値を、ラットにおける測定されたＡＵＣと比較すると、図２６の分布が観察された。
【０４６８】
ＲＲＴ≧１．９のＡＤＣは、より低いＡＵＣ値を示したが、より低いＲＲＴを有するＡＤＣは、より高いＡＵＣを有する傾向があり、関係は直接的ではなかった。ＡＤＣ  Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１は、比較的高いＲＲＴ（平均値１．７７）を有することが観察され、したがって比較的低いＡＵＣを有すると予想された。意外にも、観察されたＡＵＣは比較的高く、したがって、疎水性データからこのＡＤＣの曝露を予測することは明白ではなかった。
【０４６９】
（実施例１８）
毒性試験
２つの独立した探索的毒性試験において、全体で１０匹の雄性および雌性カニクイザルを５つの用量群（１／性別／用量）に分類し、３週間毎に１回（試験日１、２２、および４３日）ＩＶ投与した。試験４６日目（３回の用量投与後３日目）に、動物を安楽死させ、プロトコールに明記された血液および組織試料を採取した。臨床所見、臨床病理学、肉眼的および顕微鏡病理評価を、生存時および剖検後に実施した。解剖学的病理評価に関して、組織病理学所見の重症度を主観的、相対的、試験特異的に基づいて記録した。
【０４７０】
カニクイザルにおける３および５ｍｇ／ｋｇでの探索的毒性試験において、Ｔ−ｖｃ０１０１は、初回投与後１１日目に一過性の、しかし顕著（３９０個／μｌ）から重度の（４０個／μｌから検出不能まで）好中球減少症を引き起こした。これに対し、９ｍｇ／ｋｇでは、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１を投与した全てのカニクイザルが、試験したいずれの時点においても５００個／μｌを十分に超える好中球数を有し、好中球減少症は認められないかまたは最小であった（図２７）。実際に、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１を投与した動物は、ビヒクル対照と比較して１１および１４日目で平均的な好中球数（＞１０００個／μＬ）を示した。
【０４７１】
３および５ｍｇ／ｋｇでの骨髄において顕微鏡で調べると、Ｔ−ｖｃ０１０１を投与したカニクイザルは、化合物に関連するＭ／Ｅ比の増加を有した。骨髄／赤芽球（Ｍ／Ｅ）比の増加は、主に成熟顆粒球の増加と組み合わせた赤芽球前駆体の減少からなった。これに対し、６および９ｍｇ／ｋｇでは、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１の６ｍｇ／ｋｇ／用量を投与した雄性動物のみが、最小から軽度の成熟顆粒球の細胞性の増加を有した（データは示していない）。
【０４７２】
したがって、血液学および顕微鏡データは、部位特異的変異技術に基づくＡＤＣコンジュゲート、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０がＴ−ｖｃ０１０によって惹起される骨髄毒性および好中球減少症を明らかに改善することを明白に示した。
【０４７３】
（実施例１９）
ＡＤＣ結晶構造
結晶構造を、Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）−ｖｃ０１０１、Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１、およびＴ（Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１に関して得た。これらの特定のＡＤＣは、Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４ＣおよびＫ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ二重システインバリアントとのコンジュゲーションがＡＤＣＣ活性を消失させるが、Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３９２Ｃとのコンジュゲーションは活性を消失させなかったことから、結晶学のために選択した。
【０４７４】
コンジュゲートしたＦｃ領域を、ＡＤＣのパパイン切断を使用して結晶学のために調製した。同じ条件を使用して３つのコンジュゲートＩｇＧ１−Ｆｃ領域に関して、同じ形態の結晶を得た：１００ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ  ５．０＋１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２＋１５％  ＰＥＧ  ４Ｋ。
【０４７５】
ＰＤＢに寄託された野生型ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ構造は、比較的類似であり、ＣＨ２−ＣＨ２ドメインがＡｓｎ２９７結合グリカン（炭水化物またはグリカンアンテナ）を通して互いに接すること、およびＣＨ３−ＣＨ３ドメインが、構造間で比較的一定である安定な界面を形成することを示している。Ｆｃ構造は、「閉構造」または「開構造」コンフォメーションのいずれかで存在し、脱グリコシル化Ｆｃ構造は「開構造」コンフォメーションをとり、このように、グリカンアンテナがＣＨ２領域を共に保持することを証明している。さらに、非コンジュゲートＰｈｅ２４１Ａｌａ−ＩｇＧ１  Ｆｃ変異体に関して公表された構造（Ｙｕら、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｆｉｎｅ−ｔｕｎｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、ＪＡＣＳ  ２０１３）は、芳香族Ｐｈｅ残基が炭水化物を安定化することができないために、この変異によってＣＨ２グリカン界面およびＣＨ２−ＣＨ２界面の不安定化が起こることから、１つの部分的に乱れたＣＨ２ドメインを示す。
【０４７６】
ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｃγ２」ドメインとも呼ばれる）は通常、約２３１位のアミノ酸から約３４０位のアミノ酸まで達している。ＣＨ２ドメインは、それが別のドメインと厳密に対を形成しないという点において独自である。むしろ、２つのＮ−結合分岐炭水化物鎖が、インタクトのネイティブＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に存在する。炭水化物は、ドメイン−ドメイン対形成の代替を提供して、ＣＨ２ドメインを安定化するために役立ち得ると推測されている（Ｂｕｒｔｏｎら、１９８５，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１〜２０６）。
【０４７７】
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域におけるＣＨ２ドメインに対してＣ末端の一連の残基を含む（即ち、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸残基から約４４７位のアミノ酸残基まで）。
【０４７８】
Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）−ｖｃ０１０１およびＴ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１  Ｆｃ領域の両方の構造の解析により、それらが類似であり、Ｆｃ二量体が、１つのＣＨ２と、高度に秩序化されている両方のＣＨ３を含むことを示した（野生型Ｆｃのように）。しかし、それらはまた、グリカンが結合した乱れたＣＨ２も含む（図２８Ａおよび図２８Ｂ）。１つのＣＨ２ドメインのより高度の不安定化は、グリカンアンテナに対してコンジュゲーション部位が非常に近位であることが原因であった。０１０１ペイロードの幾何学を考慮すると、Ｋ２９０、Ｋ３３４、Ｋ３９２部位のいずれかでのコンジュゲーションはＣＨ２表面から離れたグリカンの全体的な軌道を乱し、グリカンおよびＣＨ２構造そのもの、および結果としてＣＨ２−ＣＨ２界面を不安定化し得る（図２８Ｃ）。ＷＴ−Ｆｃ、Ｐｈｅ２４１Ａｌａ−Ｆｃ、または脱グリコシル化Ｆｃと比較して、これらの０１０１部位特異的にコンジュゲートした二重システイン−Ｆｃバリアントでは、より高度の不均質性が利用可能である。操作されたシステインバリアント位置を、ＦｃγＲタイプＩＩｂと複合体を形成したＷＴ−Ｆｃの構造にマップすると、Ｃ３３４でのコンジュゲーションが、ＦｃγＲＩＩｂに対する結合を直接妨害し得ることが示された（図２８Ｃ）。変異またはコンジュゲーションによって引き起こされたＣＨ２位置のこの不均質性によって、ＦｃＲＩＩｂ結合の有意な減少が起こり得る。したがって、これらの結果は、ＩｇＧ１−Ｆｃ内でのコンフォメーション不均質性、または操作されたシステインの特定の組合せに対する０１０１のコンジュゲーションのいずれか、おそらくは両方が、Ｋ３３４Ｃ部位を含む二重システインバリアントのＡＤＣＣ活性に影響を及ぼし得ることを示唆した。
【０４７９】
（実施例２０）
他の抗体における部位特異的コンジュゲーションの使用
本発明の部位特異的ＨＥＲ２  ＡＤＣを作製するために使用する部位および変更を、他の抗原に対する抗体に使用することができ、それでもなお従来のコンジュゲートＡＤＣと比較して改善された有効性を達成することができる。
【０４８０】
抗体Ａ（腫瘍関連抗原に対する）を、従来のコンジュゲーションならびに部位特異的コンジュゲーションを使用してＡＤＣに作製した。いずれの場合においても、使用したリンカーはｖｃであり、使用した薬物はオーリスタチン０１０１であった。部位特異的コンジュゲーションに関して、リンカー／ペイロードとのコンジュゲーションを可能にするために、抗体軽鎖上の部位Ｋ１８３および抗体重鎖のＣＨ２領域でのＫ２９０（ＫａｂａｔのＥＵインデックスを使用する）をシステイン（Ｃ）に変更した。
【０４８１】
Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１（上記）を作製するために使用した方法と類似の方法を使用して部位特異的ＡＤＣを作製した。コンジュゲーション効率は６１％であり、コンジュゲート抗体は、平均ＤＡＲ  ４を有し、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１と類似のＨＩＣ−ＲＲＴプロファイルを有した。
【０４８２】
部位特異的コンジュゲート（ＳＳＣ）の熱安定性を評価したところ、ＳＳＣの最も低い融点は６５℃であり、十分な安定性を示した。その標的腫瘍抗原に対するＳＳＣの結合も同様に、非コンジュゲート抗体と比較して評価したが、ＥＬＩＳＡベースの結合アッセイにおいて結合能の低減は検出されず、ペイロードリンカーｖｃ０１０１によるコンジュゲーション後に結合親和性が良好に保持されることを示した。
【０４８３】
次に、腫瘍抗原の発現が上昇した腫瘍細胞株においてｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を評価した。ＳＳＣは、多数の腫瘍株を使用する細胞傷害アッセイにおいて従来のＡＤＣと同等の細胞傷害効力を有した。腫瘍抗原を過剰発現する腫瘍細胞を接種した異種移植片腫瘍モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験をさらに実施した。１つのモデルにおいて、ＳＳＣの３ｍｇ／ｋｇの用量レベルを週に２回、４回投与後に完全な腫瘍の縮小が起こった。腫瘍の縮小は、最後の投与後およそ６０日まで維持され、その後腫瘍の再成長が観察された。これに対し、同じスケジュールで投与した従来のＡＤＣによっても４回投与後に腫瘍の縮小が起こったが、最後の投与後約３０日で腫瘍の再成長が観察され、これはＳＳＣの場合よりかなり早かった。腫瘍の縮小の有効性がより良好に維持されることに関する類似の知見は、他の腫瘍モデルでの有効性試験においても観察された。これらのデータは、ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃに基づく抗体Ａの部位特異的コンジュゲートが、投与した動物において、従来のように調製したＡＤＣより曝露を良好に維持し、ＳＳＣの安定性の改善によってより良好な薬物動態パラメータが得られることを示唆していることを示す。
【０４８４】
（実施例２１）
異なるコンジュゲーション部位によって異なるＡＤＣ特性が得られる
Ａ．ｃｙｓ変異体ＡＤＣの合成の一般手順
以下の２つのＬＰを使用した：
【０４８５】
【化３４】
2018538283.tif 000063
【０４８６】
操作されたシステイン残基を組み入れることを含むトラスツズマブ溶液（以下の表に示す）を、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４、ＰＢＳ中で調製し、ＥＤＴＡ（０．５Ｍ保存溶液）およびＴＣＥＰ（０．５Ｍ保存溶液）を、最終タンパク質濃度が１０ｍｇ／ｍＬ、最終ＥＤＴＡ濃度が２０ｍＭ、および最終ＴＣＥＰ濃度がおよそ６．６ｍＭ（１００モル当量）となるように添加した。反応を室温で４８時間静置した後、ＧＥ  ＰＤ−１０  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムを使用して、製造元の指示に従ってＰＢＳに緩衝液交換した。得られた溶液をおよそ５０当量のデヒドロアスコルビン酸塩（１：１ＥｔＯＨ／水中の５０ｍＭ保存溶液）によって処置した。抗体を４℃で一晩静置した後、ＧＥ  ＰＤ−１０  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムを使用して、製造元の指示に従ってＰＢＳに緩衝液交換した。いくつかの変異体について、上記の手順をわずかに変更したものを使用した。
【０４８７】
このように調製した抗体を、１０体積％ＤＭＡを含むＰＢＳ中で約２．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、ＤＭＡ中の１０ｍＭ保存溶液としてＬＰ＃１（１０モル当量）によって処置した。室温で２時間後、混合物をＰＢＳ（上記の通り）に緩衝液交換して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムによるサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。モノマー分画を濃縮して、濾過滅菌し、最終ＡＤＣを得た。産物の特徴に関しては以下の表２２を参照されたい。
【０４８８】
【表２２】
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【０４８９】
Ｂ．コンジュゲーション実施例の一般的分析方法
ＬＣＭＳ：カラム＝Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ３００−Ｃ４、２．１×１００ｍｍ（Ｐ／Ｎ＝１８６００４４９６）；機器＝ＳＱＤ２質量分析検出器を備えたＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ；流速＝０．７ｍＬ／分；温度＝８０℃；緩衝液Ａ＝水＋０．１％ギ酸；緩衝液Ｂ＝アセトニトリル＋０．１％ギ酸。勾配は、３％Ｂから９５％Ｂを２分間、９５％Ｂで０．７５分間保持した後、３％Ｂで再度平衡にした。試料を注入直前にＴＣＥＰまたはＤＴＴによって還元した。溶出液をＬＣＭＳ（４００〜２０００ダルトン）によってモニターし、タンパク質ピークを、ＭａｘＥｎｔ１を使用して逆畳み込みした。ＤＡＲを重量平均担持として報告した。
【０４９０】
ＳＥＣ：カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（５／１５０  ＧＬ）；移動相：２％アセトニトリルを含むリン酸緩衝溶液、ｐＨ７．４；流速＝０．２５ｍＬ／分；温度＝周囲温度；機器：Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣ。
【０４９１】
ＨＩＣ：カラム：ＴＳＫＧｅｌブチルＮＰＲ、４．６ｍｍ×３．５ｃｍ（Ｐ／Ｎ＝Ｓ０５５７−８３５）；緩衝液Ａ＝１０ｍＭリン酸塩を含む１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ  ７；緩衝液Ｂ＝１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ  ７＋２０％イソプロピルアルコール；流速＝０．８ｍＬ／分；温度＝周囲温度；勾配＝０％Ｂから１００％Ｂを１２分間、１００％Ｂで２分間保持した後、１００％Ａで再度平衡にする；機器：Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣ。
【０４９２】
Ｃ．部位特異的ｖｃ０１０１コンジュゲートの疎水性の決定
ＡＤＣ＃１〜ＡＤＣ＃１６を、様々なコンジュゲートの相対的疎水性を決定するために、疎水性相互作用クロマトグラフィー（上記の方法）によって評価した。ＡＤＣの疎水性は、総抗体曝露と相関することが報告されている。
【０４９３】
部位３３４、３７５、および３９２に対するコンジュゲートは、変更されていない抗体と比較して保持時間の最小のシフトを示したが、部位４２１、４４３、および３４７位に対するコンジュゲートは、保持時間の最大のシフトを示した。それぞれのＡＤＣの相対的疎水性を、ＡＤＣの保持時間を変更されていない抗体の保持時間で除算することによって計算し、このようにして「相対的保持時間」または「ＲＲＴ」を得た。約１のＲＲＴは、ＡＤＣが変更されていない抗体とほぼ同じ疎水性を有することを示している。それぞれのＡＤＣのＲＲＴを表２２に示す。
【０４９４】
Ｄ．部位特異的ｖｃ０１０１コンジュゲートのＡＤＣ血漿安定性
ＡＤＣ試料（約１．５ｍｇ／ｍＬ）を、マウス、ラット、またはヒト血漿で希釈して、血漿中で５０μｇ／ｍＬ  ＡＤＣの最終溶液を得た。試料を３７℃、５％ＣＯ２下でインキュベートし、アリコートを３回の時点（０、２４時間、および７２時間）で採取した。血漿のインキュベーション（２５μＬ）からのそれぞれの時点のＡＤＣ試料を、ＩｇＧ０によって３７℃で１時間脱グリコシル化した。脱グリコシル化後、捕捉抗体（マウスおよびラット血漿に対して特異的な１ｍｇ／ｍＬのビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃγ断片、またはヒト血漿に関して１ｍｇ／ｍＬのビオチン化抗トラスツズマブ抗体）を添加して、混合物を３７℃で１時間加熱した後、室温でさらに１時間軽く振とうさせた。Ｄｙｎａｂｅａｄ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｔ１磁性ビーズを試料に添加して、室温で軽く振とうさせながら１時間インキュベートした。次に、試料プレートをＰＢＳ  ２００μＬ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＰＢＳ  ２００μＬ、およびＨＰＬＣ等級の水で洗浄した。結合したＡＤＣを、２体積％ギ酸（ＦＡ）５５μＬによって溶出した。各試料の５０μＬアリコートを、新しいプレートに移した後、２００ｍＭ  ＴＣＥＰをさらに５μＬ添加した。
【０４９５】
インタクトタンパク質の分析を、ＢＥＨ３００  Ｃ４、１．７μｍ、０．３×１００ｍｍ  ｉＫｅｙカラムを使用して、ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）に結合させたＸｅｖｏ  Ｇ２  Ｑ−ＴＯＦ質量分析計によって実施した。移動相Ａ（ＭＰＡ）は、０．１体積％ＦＡの水溶液からなり、移動相Ｂ（ＭＰＢ）は、０．１体積％ＦＡのアセトニトリル溶液からなった。クロマトグラフィーによる分離を、ＭＰＢの５％〜９０％で７分間の直線勾配を使用して０．３μＬ／分の流速で行った。ＬＣカラム温度を８５℃に設定した。データ獲得は、ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェアバージョン４．１によって実施した。質量獲得範囲は、７００Ｄａから２４００Ｄａであった。逆畳み込みを含むデータ分析を、Ｂｉｏｐｈａｒｍａｌｙｎｘバージョン１．３３を使用して実施した。
【０４９６】
担持およびスクシンイミド開環（＋１８ダルトンのピーク）を経時的にモニターした。担持データを、０時間のＤＡＲと比較した％ＤＡＲ喪失として報告する。開環データを、７２時間で存在する全分子種と比較した開環種の％として報告する。いくつかの部位変異体によって、非常に安定なＡＤＣ（３３４Ｃ、４２１Ｃ、および４４３Ｃ）が得られ、いくつかの部位は、リンカー−ペイロードの有意な量を失った（３８０Ｃおよび１１４Ｃ）。開環の速度は、部位によってかなり変動した。３９２Ｃ、１８３Ｃ、および３３４Ｃなどのいくつかの部位では、非常にわずかな開環が起こったが、４２１Ｃ、３８８Ｃ、および３４７Ｃなどの他の部位では、迅速で自然発生の開環が起こった。
【０４９７】
迅速で自然発生の開環が起こる部位は、疎水性が低減した、および／またはＰＫ曝露が増加したコンジュゲートを生成するために有用であり得る。この知見は、環の安定性が血漿での安定性と相関するという一般的な理解とは反対である。したがって、一部の態様において、部位４２１Ｃ、３８８Ｃ、および３４７Ｃの１つまたは複数でのコンジュゲーションは、高い疎水性を有するリンカー−ペイロードを使用する場合、特に有利であり得る。一部の態様において、高い疎水性は、相対的保持時間（ＲＲＴ）の値（ＨＩＣによって測定）が１．５またはそれ超である。一部の態様において、高い疎水性はＲＲＴ値が１．７またはそれ超である。一部の態様において、高い疎水性はＲＲＴ値が１．８またはそれ超である。一部の態様において、高い疎水性はＲＲＴ値が１．９またはそれ超である。一部の態様において、高い疎水性はＲＲＴ値が２．０またはそれ超である。
【０４９８】
【表２３】
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【０４９９】
Ｅ．部位特異的ｖｃ０１０１コンジュゲートのグルタチオン安定性
ＡＤＣ試料を、グルタチオン水溶液で希釈して、リン酸緩衝液、ｐＨ７．４中で最終ＧＳＨ濃度０．５ｍＭおよび最終タンパク質濃度約０．１ｍｇ／ｍＬを得た。次に、試料を３７℃でインキュベートし、ＤＡＲ（Ｔ−０、Ｔ−３日、Ｔ−６日）を決定するために、アリコートを３つの時点で除去した。それぞれの時点のアリコートをＴＣＥＰで処理し、実施例２１．Ａに記載の方法に従ってＬＣ−ＭＳによって分析した。
【０５００】
担持およびスクシンイミド開環（＋１８ダルトンのピーク）を経時的にモニターした。担持データを、０時間のＤＡＲと比較した％ＤＡＲ喪失として報告する（表２４）。開環データを、７２時間で存在する全分子種と比較した開環種の％として報告する。いくつかの部位変異体によって、非常に安定なＡＤＣ（３３４Ｃ、４２１Ｃ、および４４３Ｃ）が得られたが、いくつかの部位は、リンカー−ペイロードの有意な量を失った（３８０Ｃおよび１１４Ｃ）。開環速度は、部位によってかなり変動した。３９２Ｃ、１８３Ｃ、および３３４Ｃなどのいくつかの部位では、非常にわずかな開環が起こったが、４２１Ｃ、３８８Ｃ、および３４７Ｃなどの他の部位ではかなりの開環が起こった。このアッセイの結果は、血漿での安定性結果と非常に良好に相関し（実施例２１．Ｄ）、チオールによって媒介される脱コンジュゲーションが血漿中でのペイロード喪失の主要な経路であることを示唆している。まとめると、これらの結果は、チオールによって媒介される脱コンジュゲーションを通して容易に失われる、３３４、４４３、２９０、および３９２などの特定の部位が、ペイロード−リンカーのコンジュゲーションにとって特に有用であり得ることを示唆している。そのようなペイロード−リンカーは、共通のマレイミドカプロイル（ｍｃ）およびマレイミドカプロイル−ＶａｌＣｉｔ（ｖｃ）連結を利用するリンカーを含む（例えば、ｖｃ−１０１、ｖｃ−ＭＭＡＥ、ｍｃ−ＭＭＡＦなど）。
【０５０１】
【表２４】
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【０５０２】
Ｆ．マウスにおける選択した部位特異的ｖｃ０１０１コンジュゲートの薬物動態評価
非担癌無胸腺雌性ｎｕ／ｎｕ（ヌード）マウス（６〜８週齢）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。マウスを使用する手順は全て、確立されたガイドラインに従って施設内動物飼育使用委員会の承認を受けた。マウス（ｎ＝３または４）に、抗体構成要素に基づいてＡＤＣの３ｍｇ／ｋｇ用量を１回静脈内投与した。血液試料を各マウスの尾静脈を介して、投与後０．０８３、６、２４、４８、９６、１６８、および３３６時間に採取した。ヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体を捕捉のために使用し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体をＴａｂの検出のために使用し、または抗ペイロード抗体をＡＤＣの検出のために使用するＬＢＡによって、総抗体（Ｔａｂ）およびＡＤＣ濃度を決定した。各動物の血漿中濃度データを、Ｗａｔｓｏｎ  ＬＩＭＳバージョン７．４（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して分析した。曝露は部位に基づいて変化した。２９０Ｃおよび４４３Ｃ変異体から作製したＡＤＣは、最低の曝露を示したが、カッパ−１８３Ｃおよび３９２Ｃ部位から作製したＡＤＣは、最高の曝露を示した。多くの応用に関して、治療剤の持続の増加に至ることから、高い曝露を有する部位が好ましい場合があり得る。しかし、ある特定の応用に関して、より低い曝露を有するコンジュゲート（２９０Ｃおよび４４３Ｃなど）を使用することが好ましい場合があり得る。特に、より低い曝露（即ち、より低いＰＫ）が望ましい応用は、限定されないが脳、ＣＮＳ、および眼での使用を含み得る。適応は、がん、特に脳、ＣＮＳ、および／または眼のがんを含む。
【０５０３】
【表２５】
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【０５０４】
Ｇ．部位特異的ｖｃ０１０１コンジュゲートのカテプシン切断
カテプシンＢを、１５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２中で６ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を使用して３７℃で１５分間活性化した。次に活性化カテプシンＢ  ５０ｎｇを１ｍｇ／ｍＬ  ＡＤＣ  ２０μＬと、２ｍＭ  ＤＴＴの最終濃度、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２で混合した。反応を、２５０ｍＭホウ酸緩衝液、ｐＨ８．５中での１０μＭ  Ｅ−６４システインプロテアーゼ阻害剤を使用して３７℃で２０分間、１時間、２時間、および４時間インキュベートすることによってクエンチした。アッセイ後、ＴＣＥＰを使用して試料を還元し、実施例２１Ａに記載の条件を使用してＬＣ／ＭＳによって分析した。データは、リンカー切断速度がコンジュゲーションの部位に大きく依存することを示した。４４３Ｃ、３８８Ｃ、および２９０Ｃなどの特定の部位は非常に速やかに切断されるが、３３４Ｃ、３７５Ｃ、および３９２Ｃなどの他の部位は、非常にゆっくりと切断される。一部の態様において、遅い切断を受ける部位にコンジュゲートすることが有利であり得る。他の態様において、急速な切断が好ましい。例えば、エンドソームで費やされる時間を低減させるためにペイロードを急速に放出することが好ましくなり得る。さらなる態様において、急速なペイロード切断によって、特定の固形腫瘍などのように、コンジュゲートした分子が侵入することができない場所で、ペイロードが有利に侵入することが可能となる。さらなる態様において、急速な切断によって、ペイロードを抗体の抗原を発現しない隣接する細胞に送達することができ、このように例えば不均質な腫瘍の処置を可能にする。
【０５０５】
【表２６】
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【０５０６】
Ｈ．部位特異的ｖｃ０１０１コンジュゲートの熱安定性
ＡＤＣを、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で０．２ｍｇ／ｍＬに希釈した。ＡＤＣを密封バイアルに入れて、４５℃に加熱した。経時的に形成される高分子量種（ＨＭＷＳ）および低分子量種（ＬＭＷＳ）のレベルをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価するために、アリコート（１０μＬ）を１週間毎に除去した。ＳＥＣ条件を実施例２１Ａに概要する。これらの条件下で、モノマーは、およそ３．６分で溶出した。モノマーピークの左に溶出するいかなるタンパク質材料もＨＭＷＳとして計数され、モノマーピークの右に溶出するいかなるタンパク質材料もＬＭＷＳとして計数された。結果を以下の表２７に示す。カッパ−１８３Ｃ、３７５Ｃ、および３３４Ｃなどの選択されたＡＤＣは、優れた熱安定性を示したが、４４３Ｃおよび３９２Ｃ＋４４３Ｃなどの他のＡＤＣは、有意な分解を示した。
【０５０７】
【表２７】
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【０５０８】
Ｉ．様々なｖｃ０１０１部位変異体の有効性
抗体−薬物コンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験を、Ｎ８７細胞株を使用する標的発現異種移植片モデルにおいて実施した。５０％ｍａｔｒｉｇｅｌ中でおよそ７．５百万個の腫瘍細胞を６〜８週齢のヌードマウスの皮下に移植し、腫瘍サイズを２５０〜３５０ｍｍ３に達成させる。薬物を、尾静脈注射によりボーラス投与した。動物に１０、３、または１ｍｇ／ｋｇ抗体薬物コンジュゲートを、４日毎に１回、全体で４回（１、５、９および１３日目）注射した。全ての実験動物を体重変化に関して毎週モニターする。腫瘍の体積をキャリパー装置によって最初の５０日間、週に２回測定し、その後は週に１回測定し、以下の式：腫瘍体積＝（長さ×幅２）／２によって計算する。腫瘍体積が２５００ｍｍ３に達すると、動物を人道的に屠殺した。腫瘍サイズは、一般的に処置の最初の１週間後に減少することが観察される。処置の中止後（処置後１００日まで）、腫瘍の再成長に関して動物を継続的にモニターした。３ｍｐｋ投与群からのデータを図２９に示す。３８８Ｃおよび３４７Ｃ変異体から生成したＡＤＣは、３３４Ｃ、カッパ−１８３Ｃ、３９２Ｃ、および４４３Ｃ変異体からのＡＤＣよりわずかに低い効力を示した。
【０５０９】
Ｊ．様々な変異体に対するウンシアラマイシンペイロードのコンジュゲーション
トラスツズマブシステイン変異体のパネルを、実施例１に記載のようにコンジュゲーションのために調製した。得られた変異体（５ｍｇ／ｍＬ）を、１０％ＤＭＡを含むＰＢＳ中でＬＰ＃２（６モル当量）によって処置した。室温で２時間後、反応を、ＬＣＭＳによって評価して担持を決定し、ＳＥＣによって評価してフォールディングが適切であることおよび凝集がないことを決定した。結果を表２８に要約し、生のＳＥＣ結果を図３０に示す。
【０５１０】
認められるように、様々な部位変異体によって、良好な挙動を示すモノマーＡＤＣ（３３４Ｃ、３７５Ｃ、および３９２Ｃ）が得られる。他の部位変異体は、担持することができないか（例えば、２４６Ｃ、ｋ１４９Ｃ、ｋ１１１Ｃ）、凝集するか（例えば、４４３Ｃ、４２１Ｃ、３４７Ｃ）、またはおそらく部分的にアンフォールディングされた遅く溶出するＡＤＣ（例えば、３８０Ｃ、３８８Ｃ、２９０Ｃ、およびｋ１８３Ｃ）となる。まとめると、これらの結果は、生物物理学的に安定で、適切にフォールディングされたＡＤＣが得られる部位を同定するためには、特定のペイロードが最適化を必要とし得ることを示唆している。
【０５１１】
【表２８】
2018538283.tif 000070
【０５１２】
Ｋ．要約
実施例によって証明されるように、コンジュゲーション部位は、ＬＰの脱コンジュゲーション、ＬＰの代謝、ｔＡｂ曝露、リンカー切断速度、ＡＤＣ凝集、ＡＤＣ疎水性、およびｉｎ  ｖｉｖｏ  ＰＫプロファイルに影響を及ぼし得る。
【０５１３】
ＡＤＣ分子の具体的な適用に応じて、多数の候補コンジュゲーション部位を使用して特定の問題を解決することができる。例えばより低い疎水性が望ましい場合、部位３３４、３７５、３９２、またはその組合せは、変更されていない抗体と比較して保持時間の最小のシフトを示したことから、好ましくなり得る。別の例において、急速で自然発生の開環（例えば、４２１Ｃ、３８８Ｃ、３４７Ｃ、またはその組合せ）が起こる部位は、疎水性が低減されたおよび／またはＰＫ曝露が増加したコンジュゲートを生成するために有用であり得る。３３４、４４３、２９０、３９２などの部位、またはその組合せは、チオール媒介脱コンジュゲーションを通して容易に失われるペイロード−リンカーのコンジュゲーションにとって特に有用であり得る。
【０５１４】
（実施例２２）
部位特異的ツブリシンＡＤＣ
Ａ．ｃｙｓ変異体ＡＤＣの合成のための一般手順
以下の２つのＬＰを使用した。ツブリシンベースＬＰの詳細な合成スキームは、２０１６年２月１日に提出され、全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許仮出願第６２／２８９，４８５号に詳細に記載されている。
【０５１５】
【化３５】
2018538283.tif 000071
【０５１６】
方法Ａ：市販のＨＥＲＣＥＰＴＩＮ抗体の内部ジスルフィドを介したリンカーペイロードとのコンジュゲーション。トラスツズマブ抗体溶液（約１５ｍｇ／ｍＬ）を、５０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）中で調製した。トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）を、蒸留水中の５ｍＭ溶液（約２．０モル当量）として添加した。得られた溶液を３７℃で１時間加熱した。冷却時に、反応を適切な容量のＰＢＳおよびジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）で処置し、得られた溶液を、約１０体積％ＤＭＡを含むＰＢＳ中で約５ｍｇ／ｍＬにした。適切なリンカーペイロードをＤＭＡ中の１０ｍＭ保存溶液（約７当量）として添加し、反応を室温で静置するか、または軽く攪拌した。７０分後、ＧＥ−ＰＤ−１０  ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラムを使用して製造元の指示に従って、反応をＰＢＳに緩衝液交換した。得られた材料を軽く濃縮して（限外濾過によって）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。モノマー分画を濃縮し、濾過滅菌して最終ＡＤＣを得た。
【０５１７】
方法Ｂ：操作されたシステイン残基を含むトラスツズマブ抗体に対するリンカー−ペイロードの部位特異的コンジュゲーション。部位１１８、３３４、および３９２位（ＫａｂａｔのＥＵインデックスを使用する、国際公開第２０１３０９３８０９号を参照されたい）などを、操作されたシステイン残基を組み込むことを含むトラスツズマブ溶液を、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４、ＰＢＳ中で調製し、ＥＤＴＡ（０．５Ｍ保存溶液）およびＴＣＥＰ（０．５Ｍ保存溶液）を、最終タンパク質濃度が約１０ｍｇ／ｍＬ、最終ＥＤＴＡ濃度が約２０ｍＭ、および最終ＴＣＥＰ濃度がおよそ６．６ｍＭ（１００モル当量）となるように添加した。反応を室温で２〜４８時間静置した後、ＧＥ  ＰＤ−１０  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムを使用して、製造元の指示に従ってＰＢＳに緩衝液交換した。透析濾過または透析などの代替方法もまた、特定の状況において有用である。得られた溶液をおよそ５０当量のデヒドロアスコルビン酸塩（１：１ＥｔＯＨ／水中で５０ｍＭ保存溶液）によって処置した。抗体を４℃で一晩静置した後、ＧＥ  ＰＤ−１０  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムを使用して、製造元の指示に従ってＰＢＳに緩衝液交換した。この場合も、透析濾過または濾過などの代替方法が特定の状況において有用である。
【０５１８】
このようにして調製した抗体を、１０体積％ＤＭＡを含むＰＢＳ中で約２．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、ＤＭＡ中の１０ｍＭ保存溶液としての適切なリンカー−ペイロード（１０モル当量）によって処置した。室温で２時間後、混合物をＰＢＳ（上記のとおり）に緩衝液交換して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。モノマー分画を濃縮して、濾過滅菌し、最終ＡＤＣを得た。
【０５１９】
【表２９】
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【０５２０】
【表３０】
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【０５２１】
Ｂ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞アッセイ手順
標的発現（ＢＴ４７４（乳がん）、Ｎ８７（胃がん）、ＨＣＣ１９５４（乳がん）、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１−ＤＹＴ２（乳がん））または非発現（ＨＴ−２９）細胞を、処置の２４時間前に９６ウェル細胞培養プレートに播種した。細胞を、３倍連続希釈した抗体−薬物コンジュゲートまたは遊離の化合物（薬物にコンジュゲートされていない抗体）の１０濃度によって２回の反復実験で処置した。処置の９６時間後に、細胞の生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖ＭＴＳアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって決定した。相対的細胞生存率を無処置対照のパーセンテージとして決定した。ＩＣ５０値を、ＸＬｆｉｔ  ｖ４．２による４パラメータロジスティックモデル＃２０３を使用して計算した。結果を表３１に示す。
【０５２２】
【表３１】
2018538283.tif 000074
【０５２３】
Ｃ．ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ血漿中安定性アッセイ
ＡＤＣ試料（約１．５ｍｇ／ｍＬ）をマウス血漿（Ｌａｍｐｉｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で希釈して、１０％  ＡＤＣ、９０％血漿の最終溶液を得た。３つの時点（Ｔ−０、Ｔ−２４時間、およびＴ−４８時間）を分析してそのＤＡＲを決定した。それぞれの時点で、ＡＤＣを濃縮するために免疫沈降プロセスを行った。簡単に説明すると、それぞれのアリコートを２０％  ＭＰＥＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で１：１に希釈し、ビオチン化マウス抗ヒトＦｃおよびヤギ抗ヒトカッパ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）の等量を添加した。試料を４℃で２時間インキュベートした後、ストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した。試料をＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ機器で、１０％ＭＰＥＲ、０．０５％ＴＷＥＥＮ  ２０からなる４回の洗浄ステップ、およびＰＢＳでの２回洗浄により処理した。ＡＤＣを０．１５％ギ酸によってビーズから溶出した。試料のｐＨを２Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ８．５によって７．８に調整し、そのＮ−結合グリカンをＰＮＧアーゼＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によって除去した。試料をＴＣＥＰによって還元し、質量シフトの高さ９９３（親）と９５１（脱アセチル化）の比較によって％酢酸塩加水分解ＡＤＣに関してＬＣ−ＭＳによって分析した。結果を図３１に示す。結果は、Ｋ３３４ＣおよびＫ３９２Ｃなどの好ましい部位にツブリシンＬＰ＃３を結合させることによって、ＡＤＣの血漿中安定性の改善が起こり得ることを説明する。これによって次に、ｉｎ  ｖｉｖｏでの曝露の改善および有効性の改善が起こる可能性がある。これらの部位によって付与される安定性の改善は、代謝を受けやすい他のペイロードクラスにも当てはまると考えられる。
【０５２４】
Ｄ．ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性
血液試料を、Ｎ８７異種移植片試験の特定の担癌マウスからＡＤＣの最後の投与の７２時間後に得た。試料を３ｍｐｋ投与群から採取した。このようにして得たＡＤＣ試料を、ＰＮＧアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によって３７℃で１時間処置することによって脱グリコシル化した。インキュベーション後、捕捉抗体（ビオチン化ヤギ抗ヒトＦｃ、１．０ｍｇ／ｍＬ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加して、混合物を３７℃で１時間加熱後、室温でさらに１時間軽く振とうさせた。Ｄｙｎａｂｅａｄ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｔ１ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を試料に添加して、軽く振とうさせながら室温で少なくとも３０分間インキュベートした。次に、試料プレートをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０  ２００μＬ、ＰＢＳ  ２００μＬ、およびＨＰＬＣ等級の水によって洗浄した。結合したＡＤＣを２体積％ギ酸５５μＬによって溶出した。各試料５０μＬを、新しいプレートに移した後、２００ｍＭ  ＴＣＥＰをさらに５μＬ添加した。
【０５２５】
インタクトタンパク質分析を、Ｎａｎｏ  Ａｃｑｕｉｔｙ（ｗａｔｅｒｓ）およびＢＥＨ３００  Ｃ４、１．７μｍ、０．３×１００ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ）に連結させたＸｅｖｏ  Ｇ２  ＱＴｏｆ質量分析計によって、Ｍａｓｓｌｙｎｘ  ｖ４．１を獲得ソフトウェアとして使用して実施した。カラム温度を８５℃に設定した。移動相Ａは、０．１％ＴＦＡ（ＴＦＡ）水溶液からなった。移動相Ｂは、アセトニトリル：１−プロパノール（１：１、体積）中の０．１％ＴＦＡからなった。移動相Ｂの５〜９０％の７分間の線形勾配を使用して流速１８μＬ／分でクロマトグラフィー分離を実施した。逆畳み込みを含むデータ分析を、Ｂｉｏｐｈａｒｍａｌｙｎｘ  ｖ１．３３（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して実施した。結果を表３２に示す。結果は、３３４部位でのツブリシンコンジュゲート（ＡＤＣ＃Ｔ３）が、ヒンジ（従来の）コンジュゲートＡＤＣ＃１と比較して改善されたｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を有することを示している。
【０５２６】
【表３２】
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【０５２７】
Ｅ．ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｎ８７腫瘍異種移植片モデル
Ｎ８７細胞株を使用して標的発現異種移植片モデルによって抗体−薬物コンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験を実施した。有効性試験に関して、腫瘍細胞７５０万個を５０％ｍａｔｒｉｇｅｌ中で６〜８週齢のヌードマウスの皮下に移植して、腫瘍サイズを２５０〜３５０ｍｍ３に到達させる。尾静脈からのボーラス注射を通して投与を行う。処置に対する腫瘍の応答に応じて、動物に１〜１０ｍｇ／ｋｇの抗体薬物コンジュゲートを注射して４日毎に４回処置した。全ての実験動物を、体重変化に関して毎週モニターする。腫瘍体積を、Ｃａｌｉｐｅｒ装置によって最初の５０日間は週に２回測定し、その後週に１回測定し、以下の式によって計算する：腫瘍体積５＝（長さ×幅）／２。腫瘍体積が２５００ｍｍ３に達する前に、動物を人道的に屠殺する。腫瘍サイズは、処置の最初の１週間後に減少することが観察される。処置の中止後、動物を腫瘍の再成長に関して継続的にモニターしてもよい。Ｎ８７マウス異種移植片ｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングモデルにおけるＡＤＣ＃Ｔ１および＃Ｔ３の試験の結果を図３２に示す。結果は、Ｋ３３４Ｃなどの好ましい部位へのＬＰ＃３の結合によって、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性の改善が起こり得ることを説明している。有効性の改善はおそらく、ＡＤＣ＃Ｔ１（従来のヒンジコンジュゲート）と比較してＡＤＣ＃Ｔ３（３３４Ｃコンジュゲート）のＡＤＣ安定性が改善された結果である。ＡＤＣ＃Ｔ３の有効性は、ＡＤＣ＃Ｔ３がＡＤＣ＃Ｔ１のＤＡＲの半分であるという事実にもかかわらず、ＡＤＣ＃Ｔ１より有意に高いことに注目されたい。
【０５２８】
（実施例２３）
抗ＥＤＢ抗体を使用した部位特異的ＡＤＣ
本実施例において、抗ＥＤＢ抗体に基づくＡＤＣの有効性およびＰＫプロファイルを調べた。例示的な抗ＥＤＢ抗体であるＬ１９の配列を表３３に示す。本実施例に提供するデータはまた、ある特定の変異（Ｌ１９の結合親和性に影響を及ぼさなかった）が導入されたＬ１９変異体も含む。これらの変異体のＣＤＲ配列は、Ｌ１９の配列と同一である。例えば、ＥＤＢ−（Ｈ１６−Ｋ２２２Ｒ）は、トランスグルタミナーゼベースのＡＤＣコンジュゲーションのために使用されるＬ１９変異体である。これらのＡＤＣのさらなる詳細、およびＥＤＢを標的とするＡＤＣは一般的に、２０１６年１０月１７日に提出され、全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許仮出願第６２／４０９，０８１号に詳細に記載されている。
【０５２９】
【表３３】
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【０５３０】
２３．１．  ＥＤＢ  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合
抗ＥＤＢ抗体およびＡＤＣのＥＤＢに対する相対的結合を評価するために、ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６ウェルプレートを０．５または１μｇ／ｍヒト７−ＥＤＢ−８９のＰＢＳ溶液でコーティングし、軽く振とうさせながら４℃で一晩インキュベートした。プレートを空にした後、ＰＢＳ  ２００μｌで洗浄し、ブロッキング緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１００μｌによって室温で３時間ブロックした。ブロッキング緩衝液を除去してウェルをＰＢＳで洗浄し、ＥＬＩＳＡアッセイ緩衝液（ＥＡＢ；０．５％  ＢＳＡ／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ）で連続希釈（４倍）した抗ＥＤＢ抗体またはＡＤＣ  １００μｌと共にインキュベートした。プレートの最初の列は空のままとし、プレートの最後の列をブランク対照としてＥＡＢを満たした。プレートを室温で３時間インキュベートした。試薬を除去し、プレートを０．０３％  Ｔｗｅｅｎ−２０のＰＢＳ溶液（ＰＢＳＴ）２００μｌで洗浄した。ＥＡＢで１：５０００に希釈した抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｐｉｅｒｃｅ）１００μｌをウェルに添加して、室温で１５分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ  ２００μｌで洗浄した後、ＢｉｏＦＸ  ＴＭＢ（Ｆｉｓｈｅｒ）１００μｌを添加して、室温で４分間発色させた。反応を０．２Ｎ硫酸１００μｌによって停止させ、４５０ｎｍでの吸光度をＶｉｃｔｏｒプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で読み取った。
【０５３１】
表３４は、ＥＬＩＳＡフォーマットでの９６ウェルプレートに結合したヒト７−ＥＤＢ−８９タンパク質断片に対する抗ＥＤＢ抗体およびＡＤＣの相対的結合を提供する。抗体およびＥＤＢを標的とするＡＤＣは全て、１９ｐＭ〜５８ｐＭの範囲の類似の親和性で標的タンパク質に結合した。これに対し、非ＥＤＢ標的化抗体およびＡＤＣは、＞１０，０００ｐＭの高いＥＣ５０値を有する。
【０５３２】
【表３４】
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【０５３３】
２３．２：  抗ＥＤＢ  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性
細胞培養。ＷＩ３８−ＶＡ１３は、ＡＴＣＣから得たＳＶ４０形質転換ヒト肺線維芽細胞であり、１０％ＦＢＳ、１％  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１％ピルビン酸ナトリウム、１００単位／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン、および２ｍＭＧｌｕｔａＭａｘを補充したＭＥＭイーグル培地（Ｃｅｌｌ−Ｇｒｏ）中で維持する。ＨＴ２９は、ヒト結腸直腸癌（ＡＴＣＣ）に由来し、１０％ＦＢＳおよび１％グルタミンを補充したＤＭＥＭ培地中で維持する。
【０５３４】
ＥＤＢ＋ＦＮ転写物の検出。ＥＤＢ＋ＦＮの遺伝子発現および転写物分析に関して、接着増殖ＷＩ３８−ＶＡ１３およびＨＴ２９細胞を、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ）によって細胞培養フラスコから解離させた。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、採取した細胞沈降物から総ＲＮＡを精製した。残存ＤＮＡを、ＲＮＡ精製の際にＲＮアーゼフリーＤＮアーゼセット（Ｑｉａｇｅｎ）によって除去した。総ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するために、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＩＩを、ＵＮＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に使用して、定量的リアルタイムＰＣＲによってｃＤＮＡを分析した。ＥＤＢ＋ＦＮ１シグナルを、ＴａｑＭａｎプライマーＨｓ０１５６５２７１＿ｍ１によって検出し、ＡＣＴＢ（ＴａｑＭａｎプライマーＨｓ９９９９９９０３＿ｍ１）およびＧＡＰＤＨ（ＴａｑＭａｎプライマーＨｓ９９９９９９０５＿ｍ１）からの両方のシグナルの平均値によって標準化した。プライマーは全て、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得た。代表的な実験のデータを示す。
【０５３５】
ウェスタンブロッティングによるＥＤＢ＋ＦＮタンパク質検出。ウェスタンブロッティングによるＥＤＢ＋ＦＮの検出に関して、接着増殖ＷＩ３８−ＶＡ１３およびＨＴ２９細胞を、細胞をこすりとることによって採取した。細胞溶解物を、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を含む細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中で調製した。腫瘍溶解物を、ＲＩＰＡ溶解緩衝液、またはプロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を含む２×細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のいずれかにおいて調製した。タンパク質溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した後、ウェスタンブロッティングによって分析した。タンパク質をニトロセルロースメンブレンに転写した後、５％ミルク／ＴＢＳによってブロックし、その後ＥＤＢ−Ｌ１９抗体および抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、抗ＥＤＢブロットをＥＣＬ  ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ二次抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共に室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＥＤＢ＋ＦＮシグナルを、Ｐｉｅｒｃｅ  ＥＣＬ  ２ウェスタンブロッティング基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって現像し、Ｘ線フィルムによって検出した。抗ＧＡＰＤＨブロットを、ブロッキング緩衝液中のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０コンジュゲート抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＧＡＰＤＨシグナルをＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙイメージングシステムによって検出した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＧＳ−８００  Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒを使用して、ＥＤＢウェスタンブロットのデンシトメトリー分析を実施し、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅバージョン４．６．９ソフトウェアを使用して定量した。代表的な実験のデータを示す。
【０５３６】
図３３は、ＷＩ３８−ＶＡ１３およびＨＴ２９細胞におけるウェスタンブロットによるＥＤＢ−ＦＮ１発現を示す。ＥＤＢ＋ＦＮは、ＷＩ３８−ＶＡ１３細胞株において発現されるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長させたＨＴ２９結腸癌細胞株では発現されない。
【０５３７】
フローサイトメトリーによるＥＤＢ＋ＦＮタンパク質検出。ＥＤＢ−Ｌ１９抗体を使用して、ＷＩ３８−ＶＡ１３またはＨＴ２９細胞の細胞表面上のＥＤＢ＋ＦＮの発現をフローサイトメトリーによって測定した。細胞を非酵素的細胞解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）によって解離させ、ブロッキングのために氷中で冷流動緩衝液（ＦＢ、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ＋Ｃａ＋Ｍｇ）と共にインキュベートした。次に、細胞をＦＢ中、氷中で一次抗体と共にインキュベートした。インキュベーション後、細胞を冷ＰＢＳ−Ｃａ−Ｍｇによって洗浄した後、製造元の手順に従って、生細胞染色剤（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共にインキュベートし、生存細胞と死細胞を識別した。シグナルをＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターで分析し、データをＢＤ  ＦＡＣＳ  ＤＩＶＡソフトウェアを使用して分析した。代表的な実験のデータを示す。
【０５３８】
表３５は、ウェスタンブロット、ｑＲＴ−ＰＣＲ、およびフローサイトメトリーの結果を要約する。データは、ＷＩ３８−ＶＡ１３がＥＤＢ＋ＦＮ陽性で、ＨＴ２９がＥＤＢ＋ＦＮ陰性であることを証明している。
【０５３９】
【表３５】
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【０５４０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害アッセイ。増殖中のＷＩ３８−ＶＡ１３またはＨＴ２９細胞を、非酵素的細胞解離緩衝液によって培養フラスコから採取し、湿潤チャンバー（３７℃、５％ＣＯ２）内の９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において細胞１０００個／ウェルで一晩培養した。翌日、細胞を、３×保存溶液５０μｌを１０濃度で２回の反復実験で添加することによって、抗ＥＤＢ  ＡＤＣまたはアイソタイプ対照非ＥＤＢ結合ＡＤＣによって処置した。一部の実験において、細胞を１５００個／ウェルで播種して同じ日に処置した。次に、細胞を抗ＥＤＢ  ＡＤＣまたはアイソタイプ対照の非ＥＤＢ結合ＡＤＣと共に４日間インキュベートした。採取日に、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）５０μｌを細胞に添加して、室温で０．５時間インキュベートした。Ｖｉｃｔｏｒプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）において発光を測定した。相対的細胞生存率を、無処置対照ウェルのパーセンテージとして決定した。ＸＬｆｉｔ  ｖ４．２（ＩＤＢＳ）による４パラメータロジスティックモデル＃２０３を使用してＩＣ５０値を計算した。
【０５４１】
表３６は、ＷＩ３８−ＶＡ１３（ＥＤＢ＋ＦＮ陽性腫瘍細胞株）およびＨＴ２９結腸癌細胞（ＥＤＢ＋ＦＮ陰性腫瘍細胞株）について実施した細胞傷害アッセイにおける抗ＥＤＢ  ＡＤＣ処置のＩＣ５０（ｎｇ／ｍｌ抗体）を示す。抗ＥＤＢ  ＡＤＣは、ＥＤＢ＋ＦＮ発現細胞株において細胞死を惹起した。ＩＣ５０値は、ｖｃ−０１０１リンカーペイロードを有する全ての抗ＥＤＢ  ＡＤＣに関して類似であり、範囲はおよそ１８４ｎｇ／ｍｌ〜２１６ｎｇ／ｍｌ（ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１、ＥＤＢ−（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１、ＥＤＢ−ｍｕｔ１−ｖｃ−０１０１、ＥＤＢ−ｍｕｔ１（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１）であった。陰性対照ｖｃ−０１０１  ＡＤＣは、実質的にこれらより弱く、ＩＣ５０値は、抗ＥＤＢ−ｖｃ−０１０１  ＡＤＣよりおよそ７０〜２００倍高い。全てのｖｃ−０１０１  ＡＤＣが、ＥＤＢ＋ＦＮ陰性腫瘍細胞株であるＨＴ２９では４６〜８３倍高いＩＣ５０値を有した。したがって、抗ＥＤＢ  ＡＤＣは、そのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性がＥＤＢ＋ＦＮ発現に依存した。
【０５４２】
「ｖｃ」プロテアーゼ切断可能リンカーを有する他のオーリスタチンベースの抗ＥＤＢ  ＡＤＣであるＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−９４１１およびＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−１５６９もまた、対応する陰性対照ＡＤＣと比較して約５０〜１８０倍高い選択性で、および非発現細胞株と比較して約２５〜１４０倍の選択性でＷＩ３８−ＶＡ１３細胞において強力な細胞傷害性を示した。ＥＤＢ−Ｌ１９−ｄｉＳ−ＤＭ１  ＡＤＣは、ｖｃ−０１０１  ＡＤＣと類似の効力を有したが、陰性対照ＡＤＣ（約３倍）およびＨＴ２９細胞（約０．９倍）と比較するとはるかに低い選択性を有した。
【０５４３】
【表３６】
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【０５４４】
２３．３：  部位特異的ＥＤＢ  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
抗ＥＤＢ  ＡＤＣを、細胞株異種移植片（ＣＬＸ）、患者由来異種移植片（ＰＤＸ）、および同系の腫瘍モデルにおいて評価した。ＥＤＢ＋ＦＮの発現を、本明細書において既に記載したように免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイを使用して検出した。
【０５４５】
ＣＬＸモデルを生成するために、Ｈ１９７５、ＨＴ２９、またはＲａｍｏｓ腫瘍株の細胞８×１０６個〜１０×１０６個を雌性無胸腺ヌードマウスの皮下に移植した。接種のためにＲａｍｏｓおよびＨ−１９７５細胞をそれぞれ、５０％および１００％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に懸濁させた。Ｒａｍｏｓモデルに関して、腫瘍の確立を促進するため、細胞の接種前に動物に全身放射線照射（４Ｇｙ）を行った。平均腫瘍体積がおよそ１６０〜３２０ｍｍ３に達すると、動物を、各群マウス８〜１０匹の処置群に無作為化した。ＡＤＣまたはビヒクル（ＰＢＳ）を０日目に静脈内投与した後、動物に４日毎に１回、４〜８回投与した。腫瘍を週に１回または２回測定し、腫瘍体積を、体積（ｍｍ３）＝（幅×幅×長さ）／２として計算した。動物の体重を４〜９週間モニターしたが、いずれの処置群においても動物の体重減少は観察されなかった。
【０５４６】
ＰＤＸモデルを生成するために、腫瘍をドナー動物から採取して、およそ３×３ｍｍの腫瘍断片を、１０ゲージのトロッカーを使用して雌性無胸腺ヌードマウス（ＰＤＸ−ＮＳＸ−１１１２２モデルに関して）、またはＮＯＤ  ＳＣＩＤマウス（ＰＤＸ−ＰＡＸ−１３５６５およびＰＤＸ−ＰＡＸ−１２５３４モデルに関して）の脇腹に皮下移植した。平均腫瘍体積がおよそ１６０〜２６０ｍｍ３に達すると、マウスを、各群マウス７〜１０匹の処置群に無作為化した。ＡＤＣまたはビヒクル（ＰＢＳ）投与レジメンおよび投与経路ならびに腫瘍測定手順は、ＣＬＸモデルに関する上記の手順と同じである。動物の体重を５〜１４週間モニターして、いずれの処置群においても動物の体重減少は観察されなかった。腫瘍成長の阻害を、腫瘍サイズの平均値±ＳＥＭとしてプロットする。
【０５４７】
ＥＤＢ＋ＦＮの発現。表３７に示すように、Ｈ−１９７５、ＨＴ２９、およびＲａｍｏｓ  ＣＬＸモデル、ＰＤＸ−ＮＳＸ−１１１２２、ＰＤＸ−ＰＡＸ−１３５６５、およびＰＤＸ−ＰＡＸ−１２５３４  ＰＤＸモデル、およびＥＭＴ−６同系腫瘍モデルにおけるＥＤＢ＋ＦＮの発現を、ＥＤＢ−Ｌ１９抗体の結合およびＩＨＣアッセイにおけるその後の検出によって測定した。ＣＬＸ  ＨＴ−２９は、中等度発現ＣＬＸであるが、ＣＬＸ中のタンパク質発現の大部分が腫瘍間質に由来するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで調べると陰性であった。
【０５４８】
【表３７】
2018538283.tif 000080
【０５４９】
ＰＤＸ−ＮＳＸ−１１１２２  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸ。様々なＡＤＣの効果を、高レベルのＥＤＢ＋ＦＮを発現するＰＤＸ−ＮＳＸ−１１１２２ヒトがんのＮＳＣＬＣ  ＰＤＸモデルにおいて評価した。図３４Ａは、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ０１０１（ＡＤＣ１）の０．３、０．７５、１．５、および３ｍｇ／ｋｇでの抗腫瘍活性を示す。データは、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ１）が、３ｍｇ／ｋｇおよび１．５ｍｇ／ｋｇで用量依存的に腫瘍の縮小を示したことを証明する。
【０５５０】
ｖｃ連結ＡＤＣの抗腫瘍有効性をジスルフィド連結ＡＤＣと比較した。図３４Ｂおよび３４Ｃはそれぞれ、ジスルフィド連結ＥＤＢ−Ｌ１９−ｄｉＳ−ＤＭ１（ＡＤＣ５）の１０ｍｇ／ｋｇと比較したＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ０１０１（ＡＤＣ１）の３ｍｇ／ｋｇ、ならびにジスルフィド連結ＥＤＢ−Ｌ１９−ｄｉＳ−Ｃ２ＯＣＯ−１５６９（ＡＤＣ６）の５ｍｇ／ｋｇと比較したＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ１）の１および３ｍｇ／ｋｇの抗腫瘍活性を示す。図３４Ｂおよび３４Ｃに示すように、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ０１０１（ＡＤＣ１）は、アイソタイプ陰性対照ＡＤＣ、ならびにジスルフィドリンカーを使用して生成したＡＤＣであるＥＤＢ−Ｌ１９−ｄｉＳ−ＤＭ１およびＥＤＢ−Ｌ１９−ｄｉｓ−Ｃ２ＯＣＯ−１５６９と比較してより大きい有効性を証明した。さらに、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ１）で処置した担癌動物は、１ｍｇ／ｋｇで腫瘍成長を遅らせ、３ｍｇ／ｋｇで完全な縮小を示した。データは、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ１）がＰＤＸ−ＮＳＸ−１１１２２  ＮＳＣＬＣ異種移植片の成長を用量依存的に阻害することを証明する。
【０５５１】
部位特異的および従来のコンジュゲートＡＤＣの活性を評価した。図３４Ｄは、従来のコンジュゲートＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ１）と比較した部位特異的コンジュゲートＥＤＢ−（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ２）のそれぞれ、０．３、１、３ｍｇ／ｋｇ、および１．５ｍｇ／ｋｇでの抗腫瘍有効性を示す。用量レベルに基づく有効性は同等であり、ＥＤＢ−（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ２）によって用量依存的に腫瘍の縮小が起こった。
【０５５２】
様々な変異を有するｖｃ−０１０１抗ＥＤＢ  ＡＤＣの活性を評価した。図３４Ｅは、部位特異的コンジュゲートＥＤＢ−ｍｕｔ１（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ４）の０．３、１、および３ｍｇ／ｋｇ用量の抗腫瘍有効性を示す。ＥＤＢ−ｍｕｔ１（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ４）は、１および３ｍｇ／ｋｇで腫瘍の縮小を惹起した。図３４Ｆは、図３４Ｅの３ｍｇ／ｋｇを投与したＥＤＢ−ｍｕｔ１（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ４）群における１０匹の個々の担癌マウスの腫瘍成長阻害曲線を示す。３ｍｇ／ｋｇ群における腫瘍の縮小は完全であり、試験終了時（９５日目）にマウス１０匹中８匹（８０％）において持続的であった。
【０５５３】
Ｈ−１９７５  ＮＳＣＬＣ  ＣＬＸ。様々なｖｃ連結オーリスタチンおよびＣＰＩ  ＡＤＣの効果を、Ｈ−１９７５ヒトがんの中等度から高度ＥＤＢ＋ＦＮ発現ＮＳＣＬＣ  ＣＬＸモデルにおいて評価した。図３５Ａは、０．３、０．７５、１．５、および３ｍｇ／ｋｇで抗腫瘍活性に関して評価したＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ１）を示す。データは、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ０１０１（ＡＤＣ１）が、３ｍｇ／ｋｇ、および１．５ｍｇ／ｋｇもの低い用量で用量依存的に腫瘍の縮小を示したことを証明する。図３５Ｂは、０．３、１、および３ｍｇ／ｋｇで抗腫瘍活性に関して評価したＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ１）およびＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−１５６９（ＡＤＣ１０）を示す。データは、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ０１０１（ＡＤＣ１）およびＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−１５６９（ＡＤＣ１０）が、用量依存的に腫瘍の縮小を示したことを証明する。
【０５５４】
ｖｃ連結オーリスタチンＡＤＣの抗腫瘍活性を、ＣＰＩ  ＡＤＣと比較した。図３５Ｃに示すように、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ１）およびＥＤＢ−（Ｈ１６−Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓ−ｖｃ−ＣＰＩ（ＡＤＣ９）をそれぞれ、０．５、１．５、および３ｍｇ／ｋｇ、ならびに０．１、０．３、および１ｍｇ／ｋｇで評価した。ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ１）およびＥＤＢ−（Ｈ１６−Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓ−ｖｃ−ＣＰＩ（ＡＤＣ９）はいずれも、評価した最高用量で腫瘍の縮小を示した。
【０５５５】
部位特異的および従来のコンジュゲート抗ＥＤＢ  ＡＤＣの活性を評価した。図３５Ｄは、従来のコンジュゲートＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ０１０１（ＡＤＣ１）と比較した部位特異的コンジュゲートＥＤＢ−（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ２）の０．５、１．５、および３ｍｇ／ｋｇの用量での抗腫瘍有効性を示す。用量レベルに基づく有効性は同等であり、ＥＤＢ−（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ２）は、用量依存的に腫瘍を縮小させた。
【０５５６】
様々な変異を有するｖｃ−０１０１抗ＥＤＢ  ＡＤＣの活性を評価した。図３５Ｅは、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ１）およびＥＤＢ−ｍｕｔ１−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ３）の１および３ｍｇ／ｋｇでの抗腫瘍有効性を示す。図３５Ｆは、部位特異的ＥＤＢ−（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ２）およびＥＤＢ−ｍｕｔ１（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ４）の１および３ｍｇ／ｋｇでの抗腫瘍有効性を示す。４つのＡＤＣは、それらがｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃを含むか否かによらず、Ｈ−１９７５モデルにおいて類似の有効性を証明した。さらに、試験した全てのＡＤＣによって、３ｍｇ／ｋｇでの腫瘍の縮小を含む強い抗腫瘍有効性が得られた。これらのデータは、ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ変異の導入がＡＤＣの有効性に負の影響を及ぼさなかったことを証明している。
【０５５７】
ＨＴ２９結腸ＣＬＸ。様々なｖｃ連結オーリスタチンＡＤＣの効果を、ＨＴ２９ヒトがんの中等度ＥＤＢ＋ＦＮ発現結腸ＣＬＸモデルにおいて評価した。図３６に示すように、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ１）およびＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−９４１１（ＡＤＣ７）を３ｍｇ／ｋｇで抗腫瘍活性に関して試験した。ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ１）およびＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−９４１１（ＡＤＣ７）はいずれも、３ｍｇ／ｋｇ用量で経時的に腫瘍の縮小を示した。
【０５５８】
ＰＤＸ−ＰＡＸ−１３５６５およびＰＤＸ−ＰＡＸ−１２５３４膵臓ＰＤＸ。ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ１）の抗腫瘍有効性を、ヒト膵臓ＰＤＸモデルにおいて評価した。図３７Ａに示すように、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ１）を、ＰＤＸ−ＰＡＸ−１３５６５中等度から高度ＥＤＢ＋ＦＮ発現膵臓ＰＤＸにおいて、０．３、１、および３ｍｇ／ｋｇで評価した。図３７Ｂに示すように、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ１）を、ＰＤＸ−ＰＡＸ−１２５３４低度から中等度ＥＤＢ＋ＦＮ発現膵臓ＰＤＸにおいて、０．３、１、および３ｍｇ／ｋｇで評価した。ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ１）は、評価した両方の膵臓ＰＤＸモデルにおいて用量依存的な腫瘍の縮小を証明した。
【０５５９】
Ｒａｍｏｓリンパ腫ＣＬＸ。ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ０１０１（ＡＤＣ１）の抗腫瘍有効性をＲａｍｏｓ中等度ＥＤＢ＋ＦＮ発現リンパ腫ＣＬＸモデルにおいて評価した。ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ０１０１（ＡＤＣ１）を、１および３ｍｇ／ｋｇで抗腫瘍活性に関して評価した。図３８に示すように、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ０１０１（ＡＤＣ１）は、３ｍｇ／ｋｇ用量で用量依存的に腫瘍の縮小を示した。
【０５６０】
ＥＭＴ−６乳癌同系モデル。ＥＤＢ−ｍｕｔ１（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ４）の抗腫瘍有効性を、免疫コンピテントバックグラウンドのＥＭＴ−６マウス同系乳癌モデルにおいて評価した。図３９Ａに示すように、ＥＤＢ−ｍｕｔ１（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ４）は、４．５ｍｇ／ｋｇで腫瘍成長の阻害を証明した。腫瘍成長阻害を、１１匹の担癌動物における腫瘍サイズの平均値±ＳＥＭとしてプロットした。図３９Ｂは、４．５ｍｇ／ｋｇで投与したＥＤＢ−ｍｕｔ１（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ４）群における１１の個々の担癌マウスの腫瘍成長阻害曲線を示す。４．５ｍｇ／ｋｇ群での腫瘍の縮小は完全であり、試験終了時（３４日目）にマウス１１匹中９匹（８２％）において持続的であった。
【０５６１】
２３．４：  部位特異的ＥＤＢ  ＡＤＣの薬物動態（ＰＫ）
従来のコンジュゲートＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ０１０１（ＡＤＣ１）および部位特異的コンジュゲートＥＤＢ−ｍｕｔ１（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ４）コンジュゲート抗体薬物コンジュゲートの曝露をそれぞれ、カニクイザルに５または６ｍｇ／ｋｇ用量のいずれかを静脈内（ＩＶ）にボーラス投与後に決定した。総抗体（総Ａｂ、コンジュゲートｍＡｂおよび非コンジュゲートｍＡｂの両方の測定）、ＡＤＣ（少なくとも１つの薬物分子にコンジュゲートされたｍＡｂ）の濃度を、リガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）を使用して測定し、放出されたペイロード０１０１の濃度を、質量分析を使用して測定した。総ＡｂおよびＡＤＣ濃度の定量は、蛍光検出を伴うＧｙｒｏｌａｂ（登録商標）ワークステーションを使用するリガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）によって行った。使用したビオチン化捕捉タンパク質はヒツジ抗ｈｌｇＧであり、検出抗体は、総抗体に関してＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７ヤギ抗ｈｌｇＧであったか、またはＡＤＣに関してＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７抗０１０１ｍＡｂであった（データは、Ｗａｔｓｏｎ  ｖ７．４  ＬＩＭＳシステムによって処理した）。非コンジュゲートペイロード分析のためにタンパク質沈殿を使用してｉｎ  ｖｉｖｏ試料を調製し、ポジティブＴｕｒｂｏ  Ｉｏｎｓｐｒａｙエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）および多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードを使用してＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ５５００（ＱＴＲＡＰ）質量分析器に注入した。検体および重水素内部標準に関してそれぞれ、７４３．６→１８８．０および７５１．６→１８８．０のトランジションを使用した。データ獲得および処理は、分析ソフトウェアバージョン１．５．２（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ，Ｃａｎａｄａ）を使用して実施した。
【０５６２】
カニクイザルに投与したＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ０１０１  ＡＤＣ（５ｍｇ／ｋｇ）およびＥＤＢ−ｍｕｔ１（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１  ＡＤＣ（６ｍｇ／ｋｇ）の総Ａｂ、ＡＤＣ、および放出されたペイロードの薬物動態を表３８に示す。部位特異的コンジュゲートＥＤＢ−ｍｕｔ１（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１  ＡＤＣの曝露は、従来のコンジュゲートと比較して曝露の増加（用量標準化ＡＵＣによって測定した場合に約２．３倍）およびコンジュゲーション安定性の増加の両方を示した。コンジュゲーション安定性は、部位特異的コンジュゲートＥＤＢ−ｍｕｔ１（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１  ＡＤＣを従来のＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ０１０１  ＡＤＣと比較してそれぞれ、ＡＤＣ／Ａｂ比が高いこと（８４％対７５％）によって、およびより放出されたペイロードの曝露が小さいこと（用量標準化ＡＵＣ、０．００５８対０．００８２μｇ＊ｈ／ｍＬ）の両方によって評価した。ＮＡ＝適用外。
【０５６３】
【表３８】
2018538283.tif 000081
【０５６４】
２３．５：  部位特異的ＥＤＢ  ＡＤＣの毒性試験
従来のＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ０１０１（ＡＤＣ１）および部位特異的コンジュゲートＥＤＢ−ｍｕｔ１（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ４）の非臨床安全性プロファイルを、Ｗｉｓｔａｒ−Ｈａｎラットおよびカニクイザルにおける探索的反復用量（Ｑ３Ｗ×３）試験において特徴付けした。ラットおよびカニクイザルは、実施例２において証明したように、ヒトＥＤＢ＋ＦＮとの１００％タンパク質配列相同性、ならびに、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによるラット、ヒト、およびサルに対する抗体ＥＤＢ−Ｌ１９（Ａｂ１）および抗体ＥＤＢ−ｍｕｔ１（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）（Ａｂ４）の類似の結合親和性により、毒性評価に関して薬理学的に適切な非臨床種であると考えられた。
【０５６５】
ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ０１０１（ＡＤＣ１）を、Ｗｉｓｔａｒ  Ｈａｎラットおよびカニクイザルにおいてそれぞれ、最高１０および５ｍｇ／ｋｇ／用量で評価し、ＥＤＢ−ｍｕｔ１（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ４）を、カニクイザルにおいて最高１２ｍｇ／ｋｇ／用量で評価した。ラットまたはサルに、３週間毎に１回静脈内投与し（１、２２、および４３日）、４６日目（３回目の投与の３日後）に安楽死させた。動物を、臨床徴候、体重変化、飼料の摂取、臨床病理パラメータ、臓器重量、ならびに肉眼的および顕微鏡所見に関して評価した。死亡または動物の臨床状態の有意な変化は、これらの試験において認められなかった。
【０５６６】
ラットおよびサルにおいてＥＤＢ＋ＦＮ発現組織／臓器における標的依存的毒性は示されなかった。両方の種において、主要な毒性は、関連する血液学的変化を伴う可逆的骨髄抑制であった。サルにおいて、従来のコンジュゲートＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ０１０１（ＡＤＣ１）の５ｍｇ／ｋｇ／用量について、顕著な一過性の好中球減少症が認められたが、表３９および図４０に示すように、部位特異的コンジュゲートＥＤＢ−ｍｕｔ１（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ４）の６ｍｇ／ｋｇ／用量では、認められた好中球数に及ぼす効果はごくわずかであった。点は平均値を表し、エラーバーは、平均値からの±１標準偏差（ＳＤ）を表す。
【０５６７】
データは、部位特異的コンジュゲーションによって骨髄抑制が有意に軽減されることを証明する。ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ０１０１（ＡＤＣ１）およびＥＤＢ−ｍｕｔ１（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ４）の毒性プロファイルは、これらのコンジュゲートの標的非依存的効果と一貫し、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ０１０１（ＡＤＣ１）およびＥＤＢ−ｍｕｔ１（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ４）の重篤な毒性が発現しない最高用量（ＨＮＳＴＤ）はそれぞれ、≧５ｍｇ／ｋｇ／用量および≧１２ｍｇ／ｋｇ／用量であると決定された。
【０５６８】
【表３９】
2018538283.tif 000082
【０５６９】
（実施例２４）
腫瘍抗原を標的とする抗体を有する部位特異的ＡＤＣ
２４．１．  部位特異的ＡＤＣコンジュゲートの生成
２４．１．１  二重ｃｙｓ変異体（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）の生成
二重ｃｙｓ変異体ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ媒介部位特異的薬物コンジュゲーションが従来の抗体−薬物コンジュゲートと比較して有意な利点を付与することを確認するために、腫瘍関連抗原に対する別の抗体、抗体Ｘ（本明細書において以降Ｘ）を調べた。抗体Ｘは、そのマウス親抗体からヒト化された。オーリスタチン０１０１との部位特異的抗体薬物コンジュゲートを調製するために、本発明者らは、カッパ軽鎖においてｋＫ１８３Ｃ変異を有し、ｈｌｇＧ１重鎖定常領域にＫ２９０Ｃ変異を有するＸ−ｈｌｇＧ１／カッパを生成した。抗体Ｘおよびその二重ｃｙｓ変異体型の両方のタンパク質調製物、Ｘ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）を生成し、その標的抗原に対するその相対的結合活性を、競合的ＥＬＩＳＡにおいて評価した。このアッセイにおいて、抗体Ｘおよびｃｙｓ変異体Ｘ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）を、ＥＬＩＳＡプレート上に固定した標的抗原に対する結合に関して共通の親抗体と競合する能力に関して試験した。図４１に示すように、抗体ＸおよびＸ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）は、標的抗原に対して同等の競合的結合活性を有し、重鎖および軽鎖の定常領域におけるｃｙｓ変異が、標的抗原に対する抗体の結合活性に影響を及ぼさないことを示した。
【０５７０】
方法。
競合的ＥＬＩＳＡ。９６ウェルプレート（高結合ＣｏＳｔａｒプレート）を、標的抗原−Ｆｃ融合タンパク質でコーティングした。ブロッキング緩衝液（ＰＢＳＴ中の１％ウシ血清アルブミン）で１〜３倍連続希釈した抗体Ｘおよびｃｙｓ変異体Ｘ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）溶液を、ビオチン化親抗体の一定濃度の存在下でプレートにアプライした。２時間インキュベーション後、プレートを洗浄し、ブロッキング緩衝液で１：５０００希釈したＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）をアプライした。ストレプトアビジンとのインキュベーションを４０分間行った後、プレートをＴＭＢ溶液によって１０分間顕色させた。次に、顕色反応を、０．１８Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加することによって停止させ、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。データのプロッティングおよび分析を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈｐａｄ−Ｐｒｉｓｍソフトウェアによって実施した。
【０５７１】
２４．１．２  Ｘ−ｖｃ０１０１およびＸ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１コンジュゲートの生成
２４．１．２．１    従来のＡＤＣ（Ｘ−ｖｃ０１０１）の生成
従来のＡＤＣを、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）による抗体Ｘの部分的還元を介した後に、還元されたシステイン残基とマレイミド機能性リンカー−ペイロードｖｃ０１０１との反応によって調製した。特に、抗体を、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０中の２．２モル過剰量のＴＣＥＰおよび１ｍＭジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の添加を介して３７℃で２時間、部分的に還元した。次に、ｖｃ０１０１を、反応混合物にリンカー−ペイロード／抗体比７：１で添加し、１５体積％ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）の存在下、２５℃でさらに１時間反応させた。Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を添加して、非反応チオールをキャップした後、Ｌ−システインを添加して、任意の未反応のリンカー−ペイロードをクエンチした。反応混合物をＰＢＳ、ｐＨ７．４中で一晩透析し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ、ＡＫＴＡ  ａｖａｎｔ，Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００樹脂）によって精製した。精製ＡＤＣを２０ｍＭヒスチジン、８５ｍｇ／ｍＬスクロース、ｐＨ５．８に緩衝液交換し、−７０℃で保存した。ＡＤＣを、分析的ＳＥＣを介して純度に関して特徴付けし、薬物抗体比（ＤＡＲ）を計算するために、ＨＩＣおよびＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳを介して特徴付けした。タンパク質濃度を、ＵＶ分光法を介して決定した。
【０５７２】
２４．１．２．２  部位特異的ＡＤＣ  Ｘ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１の生成
操作された二重ｃｙｓ変異体、Ｘ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）を、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０、および１ｍＭ  ＤＴＰＡ中で１２倍モル過剰量のＴＣＥＰによって３７℃で６時間、完全に還元した後、脱塩によって過剰量のＴＣＥＰを除去した。還元した抗体を２ｍＭデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡ）中、４℃で１６時間インキュベートして、鎖間ジスルフィド結合を変化させた。脱塩後、マレイミド機能性リンカー−ペイロードｖｃ０１０１をリンカー−ペイロード／抗体モル比１０：１で添加し、１５体積％ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）の存在下、２５℃でさらに２時間反応させた。反応混合物を脱塩し、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ、ＡＫＴＡ  ａｖａｎｔ、ブチルＨＰ樹脂）を介して精製した。精製ＡＤＣを、２０ｍＭヒスチジン、８５ｍｇ／ｍＬスクロース、ｐＨ５．８に緩衝液交換し、−７０℃で保存した。ＡＤＣを、ＳＥＣを介して純度に関して特徴付けし、ＤＡＲを計算するためにＨＩＣ、逆相ＵＰＬＣおよびＬＣ−ＥＳＩを介して特徴付けした。タンパク質濃度を、ＵＶ分光計を介して決定した。
【０５７３】
２４．１．２．３  ＡＤＣ薬物分布
試料をＰＢＳによっておよそ１ｍｇ／ｍｌに希釈することにより、化合物をＨＩＣ分析のために調製した。試料を、ＴＳＫ−ＧＥＬブチルＮＰＲカラム（４．６×３．５ｍｍ、孔径２．５μｍ；Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、パーツ番号１４９４７）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣに１５μｌを自動注入することによって分析した。システムは、サーモスタットを備えたオートサンプラー、カラムヒーター、およびＵＶ検出器を含む。以下のような勾配方法を使用した：移動相Ａ：１．５Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸水素二カリウム（ｐＨ７）；移動相Ｂ：２０％イソプロピルアルコール、５０ｍＭリン酸水素二カリウム（ｐＨ７）；Ｔ＝０分、１００％Ａ；Ｔ＝１２分、０％Ａ。
【０５７４】
薬物分布プロファイルを表４０に示す。両方のＡＤＣは、類似の平均的なＤＡＲを特徴とするが、部位特異的コンジュゲーション（Ｘ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１）を使用したＡＤＣは、主に１つのピークを示し（９４％が４  ＤＡＲである）、従来のコンジュゲーションを使用したＡＤＣ（Ｘ−ｖｃ０１０１）は、異なる形で担持されたコンジュゲートの混合物（５１％が４  ＤＡＲである）を示した。この均質な薬物分布プロファイルは、従来のＡＤＣと比較して部位特異的ＡＤＣの主な利点である。
【０５７５】
【表４０】
2018538283.tif 000083
【０５７６】
２４．２．  Ｃａｌｕ−６ヒト非小細胞肺がん細胞株異種移植片モデルにおける単剤としてのＪ１４５  ＡＤＣの評価
担癌動物にＡＤＣ  Ｘ−ｖｃ０１０１（従来のコンジュゲート）およびＡＤＣ  Ｘ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１の３ｍｇ／ｋｇを投与すると、候補薬物の最後の投与後１５日まで両方の群において腫瘍の縮小が起こり、平均腫瘍体積はそれぞれ、６０ｍｍ３および５３ｍｍ３であった。ビヒクル群を安楽死させた試験日２６日目まで、両方の処置群は、一貫した腫瘍の縮小を示した。４７〜５８日目では、従来のコンジュゲート群の動物５匹中２匹が処置の効果を受けず、急速な成長を示したが、Ｘ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１は、一貫して腫瘍の縮小を示した。５８日目での従来のコンジュゲートおよびＡＤＣ  Ｘ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１の平均腫瘍体積はそれぞれ、８２５ｍｍ３および２３ｍｍ３であった（表４１および図４２）。
【０５７７】
試験日６１日目までに、従来のＡＤＣ群では、腫瘍体積が３５２０ｍｍ３を超えたことに基づく屠殺により、動物を１匹失った。Ｘ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１群は、８２日目まで一貫した腫瘍の縮小を示し、後に腫瘍の再成長を示し、試験終了時に存在した最大腫瘍塊は、試験日１１１日目で１８８１ｍｍ３であった（表４１および図４２）。
【０５７８】
ＡＤＣ  Ｘ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１は、Ｃａｌｕ−６ヒトＮＳＣＬＣ  ＣＤＸモデルにおいて、試験日８２日目まで３ｍｇ／ｋｇのＱ４ＤＸ４投与レジメンで一貫した抗腫瘍効果を示した。試験の初期の時点でＡＤＣ  Ｘ−ｖｃ０１０１は、同等の腫瘍細胞の死滅を示したが、試験の経過と共に、腫瘍は４７日目では処置の効果を受けず、急速にサイズが増加した。
【０５７９】
結論としては、ＡＤＣ  Ｘ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１は、Ｃａｌｕ−６ヒトＮＳＣＬＣ  ＣＤＸモデルに対してより良好な抗腫瘍活性を有し、１１１日目までより多くの動物が生存した。
【０５８０】
【表４１】
2018538283.tif 000084
【０５８１】
方法。
腫瘍異種移植片を、５〜８週齢の７匹の雌性無胸腺ヌードマウスのコホートにおいて、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ＃ＳＨ３００８８．０３ＨＩ）を含むイーグル最小基本培地（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０−２００３）培養培地により作製し、５０％  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３５６２３４）に懸濁させた５×１０６個のＣａｌｕ−６（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−５６）ヒト肺腫瘍細胞を、０．１ｍｌ／マウスの容量で右脇腹に皮下注射することにより開始した。平均腫瘍サイズが１００〜１５０ｍｍ３に達すると、試験物質の投与を開始し、腫瘍体積は、「ｂ」が短径であり「ａ」が長径である、（ｍｍ３）＝（ａ×ｂ２／２）として計算した。腫瘍体積および体重データを週に２回収集した。血液試料（各１０μｌ）を、初回投与の３０時間後および最後（４回目）の投与の３０時間後に、各群２匹のマウスから採取した。血液をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液１９０μＬ中で希釈し、直ちに−８０℃で保存した。最後（４回目）の投与の３０時間後に、腫瘍塊を、血液を採取した同じ動物において剖検により採取し、瞬間凍結した。
【０５８２】
ＡＤＣ  Ｘ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１を、用量６ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、および０．３ｍｇ／ｋｇのＱ４Ｄ×４の投与スケジュール（４日毎に４回投与）で担癌動物の静脈内に投与した。
【０５８３】
ＡＤＣ  Ｘ−ｖｃ０１０１（従来のコンジュゲート）を、３ｍｇ／ｋｇの用量のＱ４Ｄ×４の投与スケジュール（４日毎に４回投与）で担癌動物の静脈内に投与した。
【０５８４】
２４．３．  薬物動態試験
Ｘ−ｖｃ０１０１およびＸ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１１０１は、６ｍｇ／ｋｇの同じ用量レベルでＣｍａｘ、曝露（ＡＵＣ）、および半減期（ｔ１／２）を含む、同等のＰＫ／ＴＫプロファイルを示した（表４２）。総ＡｂおよびＡＤＣに関して類似の曝露レベル（すなわち、ＡＵＣ）が、Ｘ−ｖｃ０１０１およびＸ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１の両方に関して６ｍｇ／ｋｇで観察され、ならびにＸ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１に関しては、曝露がより高いレベルに達した９および１２ｍｇ／ｋｇのさらに高い用量で観察された。このことは、動物に投与したＡＤＣが、両方の化合物に関して実験の過程を通してほぼ無傷で残ったこと、ならびに両方の化合物がｉｎ  ｖｉｖｏで類似の安定性を有したことを示している。
【０５８５】
【表４２】
2018538283.tif 000085
【０５８６】
方法
従来（Ｘ−ｖｃ０１０１）または部位特異的（Ｘ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１）抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の曝露を、Ｘ−ｖｃ０１０１の６ｍｇ／ｋｇまたはＸ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１）の６、９、および１２ｍｇ／ｋｇのいずれかをカニクイザルにＩＶボーラス投与後に決定した。血漿試料を投与前、各用量のＩＶ投与の０．２５、６、２４、７２、１６８、３３６、および５０４時間後に採取した。総抗体（総Ａｂ、コンジュゲートｍＡｂおよび非コンジュゲートｍＡｂの両方の測定）、およびＡＤＣ（少なくとも１つの薬物分子にコンジュゲートされたｍＡｂ）の濃度を、リガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）を使用して決定した。それぞれの用量の薬物動態（ＰＫ）／毒性動態（ＴＫ）パラメータを、Ｘ−ｖｃ０１０１およびＸ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１の両方に関する総ＡｂおよびＡＤＣの濃度対時間プロファイルから計算した（表４２）。
【０５８７】
２４．４．  毒性試験
２つの独立した探索的毒性試験において、雄性および雌性カニクイザルに、３週間毎に１回ＩＶ投与した（試験日、１、２２、および４３日）。４６日目（３回目の投与の３日後）、動物を安楽死させ、プロトコールに明記された血液および組織試料を採取した。臨床所見、臨床病理学、肉眼的および顕微鏡的病理評価を、生存時および剖検後に実施した。解剖学的病理評価に関して、組織病理学所見の重症度を主観的、相対的、試験特異的に記録した。
【０５８８】
これらの試験の１つにおいて、カニクイザル（２匹／性／群）に、ビヒクルまたはＸ−ｈｌｇＧ１−ｖｃ０１０１を６ｍｇ／ｋｇ／用量で投与した。他の試験において、サル（１匹／性／群）に、ビヒクルまたはＸ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１を６、９、および１２ｍｇ／ｋｇ／用量で投与した。Ｘ−ｈｌｇＧ１−ｖｃ０１０１の６ｍｇ／ｋｇ／用量を投与した雄性１例および雌性１例は、試験日１１日目に、重度の発熱性好中球減少症を示唆する臨床徴候および臨床病理学データにより、待期的に安楽死させた。これに対し、類似の曝露が観察された（前の節を参照されたい）同じ用量レベルで、Ｘ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１を投与した全てのカニクイザルが、試験日４６日目での予定剖検まで生存した。Ｘ−ｈｌｇＧ１−ｖｃ０１０１の６ｍｇ／ｋｇを投与した全てのカニクイザル（全体で４例）の骨髄において、顕微鏡により、化合物関連のわずかから中等度の全ての細胞タイプ（骨髄球および赤芽球）の細胞充実度の減少が起こったが、Ｘ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１を投与したカニクイザル（全体で２例）の骨髄では顕微鏡所見は認められなかった。より高い曝露レベルが観察された９および１２ｍｇ／ｋｇのより高用量では、主に成熟好中球数の増加と、赤芽球系列の細胞数の減少に起因する、ごくわずかから軽度の骨髄球／赤芽球（Ｍ／Ｅ）比の増加が、Ｘ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１の９ｍｇ／ｋｇ／用量を投与したカニクイザル（全体で２例）の骨髄での所見であったが、Ｘ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１の１２ｍｇ／ｋｇ／用量を投与したカニクイザル（全体中で２例）では認められなかった。
【０５８９】
【表４３】
2018538283.tif 000086
【０５９０】
したがって、死亡および顕微鏡データは、部位特異的変異技術に基づくＡＤＣコンジュゲートＸ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１が、Ｘ−ｈｌｇＧ１−ｖｃ０１０１によって惹起された骨髄毒性および好中球減少症を明らかに改善することを証明した。
【０５９１】
（実施例２５）
抗体１．１による部位特異的ＡＤＣ
２５．１．  部位特異的コンジュゲーションのための抗体１．１の調製
反応性システイン残基を通しての部位特異的コンジュゲーションのための１．１抗体を調製する方法は、ＰＣＴ出願国際公開第２０１３／０９３８０９号に記載されるように一般的に実施した。カッパ軽鎖定常領域における１つの残基（Ｋａｂａｔ番号付けスキームを使用してＫ１８３）およびＩｇＧ１重鎖定常領域における１つの残基（ＫａｂａｔのＥＵインデックスを使用してＫ２９０）を、部位指定変異誘発によってシステイン（Ｃ）残基に変更した。
【０５９２】
２５．２．  Ｈｅｒ２−ＰＴ操作システインバリアント抗体を発現する安定にトランスフェクトした細胞の産生
コンジュゲーション試験のための１．１−ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃを産生するために、ＣＨＯ細胞に、１．１−ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０ＣをコードするＤＮＡをトランスフェクトして、安定な高い産生プールを、当技術分野で公知の標準的な手順を使用して単離した。３カラムプロセス、すなわち、プロテインＡアフィニティ捕捉後にＴＭＡＥカラム、次いでＣＨＡ−ＴＩカラムを使用して、濃縮されたＣＨＯプール出発材料から１．１−ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃを単離した。これらの精製プロセスを使用した１．１−ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ調製物は、分析的サイズ排除クロマトグラフィーによって決定すると９８．６％の目的のピーク（ＰＯＩ）を含んだ（表４４）。表４４に示す結果は、プロテインＡ樹脂からの１．１−ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃの溶出後に、許容可能なレベルの高分子量種（ＨＭＭＳ）が検出されたこと、およびこの望ましくないＨＭＭＳ種を、ＴＭＡＥおよびＣＨＡ−ＴＩクロマトグラフィーを使用して除去することができることを証明する。データはまた、ヒトＩｇＧ１定常領域におけるプロテインＡ結合部位が、２９０位（ＥＵインデックス番号付け）での操作されたシステイン残基の存在によって変更されないことも証明した。
【０５９３】
【表４４】
2018538283.tif 000087
【０５９４】
２５．３．  抗体１．１の部位特異的コンジュゲーション
１．１−ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃに対するマレイミド機能性リンカー−ペイロードのコンジュゲーションを、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝液）、ｐＨ７．０中の１５倍モル過剰量のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）および１ｍＭジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）による３７℃で６時間の抗体の完全な還元の後に、脱塩によって過剰量のＴＣＥＰを除去することによって行った。還元された１．１−ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ抗体を１．５ｍＭデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡ）、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０および１ｍＭ  ＤＴＰＡと共に４℃で１６時間インキュベートし、鎖間ジスルフィド結合を変化させた。所望のリンカー−ペイロードを、リンカー−ペイロード／抗体モル比７で反応混合物に添加し、１５体積％のジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）の存在下、２５℃でさらに１時間反応させた。１時間のインキュベーション期間の後、６倍過剰量のＬ−Ｃｙｓを添加して、任意の未反応のリンカー−ペイロードをクエンチした。反応混合物を、ブチル−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を介して精製した。方法は、結合のために１Ｍ  ＫＰＯ４、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０を利用し、ＡＤＣを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０によって１０ＣＶで溶出した。ＡＤＣを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を介して純度に関してさらに特徴付けし、薬物−抗体比（担持またはＤＡＲ）を計算するために疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、および液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析（ＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳ）または逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）を介して特徴付けした。それぞれの抗体のＨＩＣ保持時間で除算したＡＤＣのＨＩＣ保持時間の比である相対的保持時間（ＲＲＴ）を計算することによって、ＡＤＣをそのそれぞれの抗体と比較した。タンパク質濃度を、ＵＶ分光法を介して決定した。表４５に示す結果は、１．１−ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ操作システイン抗体が、マレイミド機能性リンカー−ペイロードｖｃ０１０１に効率的にコンジュゲートされ、予想されたおよび所望の数のペイロードを有する均質なＡＤＣ（すなわち、ＤＡＲ  ３．９）を産生したことを示している。
【０５９５】
【表４５】
2018538283.tif 000088
【０５９６】
２５．４．  １．１−ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ抗体および１．１−ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ−ｖｃ０１０１  ＡＤＣの生物分析特徴付け
２５．４．１  熱安定性
示差走査熱量測定（ＤＣＳ）を使用して、１．１−ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ抗体および対応するＡｕｒ−０６３８０１０１部位特異的コンジュゲートの熱安定性を決定した。この分析に関して、２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ５．８、８．５％スクロース、０．０５ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＴＡ中で調合した試料を、オートサンプラーを備えたＭｉｃｒｏＣａｌ  ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の試料トレイに分配し、１０℃で５分間平衡にした後、１００℃／時間の速度で１１０℃まで走査した。１６秒間のフィルタリング期間を選択した。生データをベースラインで補正して、タンパク質濃度を標準化した。Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア７．０（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を使用して適切な転移数でデータをＭＮ２−Ｓｔａｔｅモデルに適合させた。
【０５９７】
１．１−ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ抗体は、第一の融解転移温度（Ｔｍ１）が７２．７８℃で優れた熱安定性を示し、得られた１．１−ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ−ｖｃ０１０１部位特異的コンジュゲート（ＳＳＣ）は、本明細書において記載されるＴ−ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ−ｖｃ０１０１およびＥＤＢ−（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１  ＳＳＣの両方の第一の融解転移温度（Ｔｍ１）が＞６５℃であることによって決定されるように、良好で同等の安定性を示した（表４６）。まとめると、これらの結果は、操作されたシステイン１．１−（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）抗体が熱安定であること、およびｖｃリンカーを介した０１０１の部位特異的コンジュゲートが良好な熱安定性を有するコンジュゲートを生成したことを証明している。
【０５９８】
【表４６】
2018538283.tif 000089
【０５９９】
２５．４．２  １．１−ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ抗体および対応する部位特異的オーリスタチン０１０１コンジュゲートの完全性
１．１−ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ抗体および対応するｖｃ０１０１部位特異的コンジュゲートの純度および完全性を決定するために、非還元Ｃａｌｉｐｅｒキャピラリーゲル電気泳動（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩ：Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）分析を実施した。結果は、システイン操作抗体１．１−ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ抗体が、％ＩｇＧ＞９６％の良好な完全性を示し、アナログの部位特異的コンジュゲート調製物の断片化ＡＤＣの含有量が＜８％であったことを示している。１．１−ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ−ｖｃ０１０１部位特異的コンジュゲートの完全性は、代替法（すなわち、サイズ排除クロマトグラフィーと、疎水性相互作用クロマトグラフィーの比較）を使用して精製したＥＤＢ−（ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１に関して観察された完全性より高く、表４７に示すように従来のコンジュゲーション方法論を使用して調製したＡＤＣ（すなわち、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ０１０１）と比較して有意に改善された。これらの結果は、ＩｇＧ１およびカッパ定常領域において操作されたシステインＫ２９０ＣおよびＫ１８３Ｃを介する部位特異的コンジュゲーションがそれぞれ、抗体定常領域内の内因性のシステインに対する従来のコンジュゲーション方法論を使用して調製したものと比較して有意に改善された完全性を有するＡＤＣを生じることを確認する。
【０６００】
【表４７】
2018538283.tif 000090
【０６０１】
２５．５．  １．１−ｋＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ−ｖｃ０１０１の薬物動態（ＰＫ）
部位特異的コンジュゲート１．１−ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ−ｖｃ０１０１  ＡＤＣの曝露を、６または１２ｍｇ／ｋｇのいずれかをカニクイザルにＩＶボーラス投与後に決定した。総抗体（総Ａｂ、コンジュゲートＡｂおよび非コンジュゲートＡｂの両方の測定）およびＡＤＣ（少なくとも１つの薬物分子にコンジュゲートされたＡｂ）の濃度を、リガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）を使用して測定した。
【０６０２】
総Ａｂおよび１．１−ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ−ｖｃ０１０１部位特異的ＡＤＣの濃度対時間プロファイルおよび薬物動態／毒性動態を表４８に示す。１．１−ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ−ｖｃ０１０１  ＡＤＣの曝露は、ほぼ用量依存的に増加した。さらに、ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ−ｖｃ０１０１  ＡＤＣの曝露は、いずれも類似であり、従来のコンジュゲートＡＤＣと比較して増加した曝露および安定性を有する本明細書に記載のトラスツズマブ部位特異的コンジュゲートＴ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）と同等であった（表４４）。
【０６０３】
【表４８】
2018538283.tif 000091
【０６０４】
【表４９−１】
2018538283.tif 000092
【０６０５】
【表４９−２】
2018538283.tif 000093
【０６０６】
【表５０−１】
2018538283.tif 000094
【０６０７】
【表５０−２】
2018538283.tif 000095
【０６０８】
上記の個々の節で言及した本発明の様々な特徴および実施形態は、必要に応じて、必要な変更を加えて他の節にも当てはまる。その結果、１つの節で明記した特徴を、必要に応じて他の節で明記した特徴と組み合わせてもよい。特許、特許出願、論文、テキスト、および引用された配列受託番号、および本明細書において引用した参考文献を含む、本明細書において引用した全ての参考文献は、全体が参照により本明細書に組み込まれている。限定されないが、定義された用語、用語の使用、記載の技術などを含む、組み込まれた文献および類似の材料の１つまたは複数が、本出願とは異なるまたは矛盾する場合、本発明が優先する。
【図１】
2018538283.tif 000096
【図２−１】
2018538283.tif 000097
【図２−２】
2018538283.tif 000098
【図２−３】
2018538283.tif 000099
【図３】
2018538283.tif 000100
【図４】
2018538283.tif 000101
【図５−１】
2018538283.tif 000102
【図５−２】
2018538283.tif 000103
【図６−１】
2018538283.tif 000104
【図６−２】
2018538283.tif 000105
【図７−１】
2018538283.tif 000106
【図７−２】
2018538283.tif 000107
【図７−３】
2018538283.tif 000108
【図７−４】
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【図７−５】
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【図８−１】
2018538283.tif 000111
【図８−２】
2018538283.tif 000112
【図８−３】
2018538283.tif 000113
【図９−１】
2018538283.tif 000114
【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
2018538283.tif 000118
【図１０−２】
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【図１１−１】
2018538283.tif 000120
【図１１−２】
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【図１１−３】
2018538283.tif 000122
【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４−１】
2018538283.tif 000126
【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５−１】
2018538283.tif 000129
【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図２０−１】
2018538283.tif 000139
【図２０−２】
2018538283.tif 000140
【図２０−３】
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【図２１−１】
2018538283.tif 000142
【図２１−２】
2018538283.tif 000143
【図２１−３】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
2018538283.tif 000146
【図２３】
2018538283.tif 000147
【図２４−１】
2018538283.tif 000148
【図２４−２】
2018538283.tif 000149
【図２５】
2018538283.tif 000150
【図２６】
2018538283.tif 000151
【図２７】
2018538283.tif 000152
【図２８−１】
2018538283.tif 000153
【図２８−２】
2018538283.tif 000154
【図２８−３】
2018538283.tif 000155
【図２９】
2018538283.tif 000156
【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３４−３】
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【図３４−４】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３５−３】
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【図３５−４】
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【図３６】
2018538283.tif 000170
【図３７】
2018538283.tif 000171
【図３８】
2018538283.tif 000172
【図３９】
2018538283.tif 000173
【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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