(57)【要約】  本発明は、ＰＤ−１に特異的に結合する抗体、それをコードする核酸、及びその治療用組成物を提供する。この作用物質は、新生物疾患及び感染性疾患の治療のために、ＰＤ−１媒介免疫抑制を阻害し、また細胞及びサイトカイン媒介免疫を向上させる。【選択図】図１
2018506280.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表１に記述するＣＤＲ−１Ｈ、ＣＤＲ−２Ｈ、及びＣＤＲ−３Ｈを有する重鎖可変ドメインを含む、ＰＤ−１に結合する抗体またはその断片。
【請求項２】
表１に記述するＣＤＲ−１Ｌ、ＣＤＲ−２Ｌ、及びＣＤＲ−３Ｌを有する軽鎖可変ドメインを含む、ＰＤ−１に結合する抗体またはその断片。
【請求項３】
表１に記述するＣＤＲ−１Ｌ、ＣＤＲ−２Ｌ、及びＣＤＲ−３Ｌを有する軽鎖可変ドメインを含む、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項４】
表１に記述する重鎖可変領域配列、または、表１に記述する前記重鎖可変領域配列に少なくとも８０％同一であるような保存的置換を有する、表１に記述する重鎖可変領域配列を含む、ＰＤ-１に結合する抗体またはその断片。
【請求項５】
表１に記述する前記重鎖可変領域配列と少なくとも８５％同一であるような保存的置換を有する、表１に記述する重鎖可変領域配列を含む、請求項４に記載の抗体またはその断片。
【請求項６】
表１に記述する前記重鎖可変領域配列と少なくとも９０％同一であるような保存的置換を有する、表１に記述する重鎖可変領域配列を含む、請求項４に記載の抗体またはその断片。
【請求項７】
表１に記述する前記重鎖可変領域配列と少なくとも９５％同一であるような保存的置換を有する、表１に記述する重鎖可変領域配列を含む、請求項４に記載の抗体またはその断片。
【請求項８】
表１に記述する軽鎖可変領域配列、または、表１に記述する前記軽鎖可変領域配列に少なくとも８０％同一であるような保存的置換を有する、表１に記述する軽鎖可変領域配列を含む、ＰＤ-１に結合する抗体またはその断片。
【請求項９】
表１に記述する前記軽鎖可変領域配列と少なくとも８５％同一であるような保存的置換を有する、表１に記述する軽鎖可変領域配列を含む、請求項８に記載の抗体またはその断片。
【請求項１０】
表１に記述する前記軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％同一であるような保存的置換を有する、表１に記述する軽鎖可変領域配列を含む、請求項８に記載の抗体またはその断片。
【請求項１１】
表１に記述する前記軽鎖可変領域配列と少なくとも９５％同一であるような保存的置換を有する、表１に記述する重鎖可変領域配列を含む、請求項８に記載の抗体またはその断片。
【請求項１２】
表１に記述する軽鎖可変領域配列、または表１に記述する前記軽鎖可変領域配列と少なくとも８０％同一であるような保存的置換を有する、表１に記述する軽鎖可変領域を含む、請求項４に記載の抗体またはその断片。
【請求項１３】
表１に記述する前記軽鎖可変領域配列と少なくとも８５％同一であるような保存的置換を有する、表１に記述する軽鎖可変領域配列を含む、請求項１２に記載の抗体またはその断片。
【請求項１４】
表１に記述する前記軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％同一であるような保存的置換を有する、表１に記述する軽鎖可変領域配列を含む、請求項１２に記載の抗体またはその断片。
【請求項１５】
表１に記述する前記軽鎖可変領域配列と少なくとも９５％同一であるような保存的置換を有する、表１に記述する軽鎖可変領域配列を含む、請求項１２に記載の抗体またはその断片。
【請求項１６】
造影剤、治療薬、または細胞傷害性剤をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体または断片のコンジュゲート。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体可変ドメインまたは断片をコードする単離された核酸。
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸を含む核酸ベクター。
【請求項１９】
請求項１７に記載の核酸を含む原核または真核宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体または断片と、製薬上許容し得る担体とを含む組成物。
【請求項２１】
有効量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体または断片を投与することを含む、対象における、ＰＤ-１のＰＤ-Ｌ１との相互作用の阻害方法。
【請求項２２】
有効量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体または断片を投与することを含む、対象における、ＰＤ-１により媒介される免疫抑制の阻害方法。
【請求項２３】
有効量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体または断片を対象に投与することを含む、ＰＤ-１を発現する細胞に対する免疫応答の刺激方法。
【請求項２４】
ＰＤ-１を発現する前記細胞が腫瘍細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＰＤ-１を発現する前記細胞がウイルスに感染している、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＤ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体及びその治療用組成物を提供する。この作用物質は、癌及び感染性疾患を含める様々な免疫機能不全関連疾患の治療のために、Ｔ細胞及びＮＫ細胞機能を向上させて細胞及びサイトカイン媒介免疫を増加させる。
関連出願の相互参照
【０００２】
本出願は、本明細書にその内容の全体が参照として組み込まれる、２０１５年２月６日に出願された米国仮出願第６２／１１３，１３２号の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００３】
プログラム死１（ＰＤ−１）は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、及びＢＴＬＡを含む、受容体のＣＤ２８ファミリーの一員である（Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２：１０２７−３４；Ｌａｔｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：２６１−８）。ＰＤ−１は、免疫病理学的状態の進行中に活性化Ｔ細胞及びＢ細胞上で主に上方制御される、誘導性免疫抑制受容体である。ＰＤ−１が、そのリガンドであるＰＤ−Ｌ１との相互作用することにより、ＴＣＲ及びＢＣＲが媒介する増殖、及びサイトカイン産生の阻害、ならびに固有のＰＤ-１が媒介する、免疫レセプターチロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）の陰性シグナル伝達による、抗原特異的Ｔ細胞のアポトーシスの誘発がもたらされる（Ａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：７６５、Ｕｎｋｅｌｅｓｓ  ａｎｄ  Ｊｉｎ．（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：３３８−３４３、Ｏｋｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）ＰＮＡＳ  ９８：１３８６６−７１、Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：７９３−８００）。ＰＤ−Ｌ１は、細胞表面糖タンパク質であり、ＰＤ−１に対する主要なリガンドである。ＰＤ−Ｌ１はまた、細胞活性化の後に、リンパ組織及び非リンパ抹消組織上でも誘導可能である。ＰＤ−Ｌ１は、免疫細胞に加えて、癌細胞及びストローマ細胞を含む様々な病的細胞型において上方制御され、疾患の悪化の過程における免疫抑制に積極的な役割を果たす(Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ（２００２）ＰＮＡＳ  ９９：１２２９３−７、Ｏｈｉｇａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：２９４７−５３)。ＰＤ−Ｌ１の上方制御は、種々の癌及びウイルス感染において臨床転帰不良と関係している（Ｈｏｆｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．  ＢｉｏＭｅｄ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１１：１−９、ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ  ａｎｄ  Ａｔｋｉｎｓ．（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄ．２：６６２−７３）。抗体によるＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の封鎖は、ＣＤ８  Ｔ細胞浸潤、ＣＴＬ活性化を促進し、前臨床及び臨床現場におけるＴｈ１サイトカインＩＦＮ−ガンマの存在を増加させた（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８５：５０８２−９２、Ｎｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：２１５２−７、Ｆｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｙａｌｅ  Ｊ．  Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．４８：４０９−２１、Ｚｉｔｖｏｇｅｌ  aｎｄ  Ｋｒｏｅｍｅｒ．（２０１２）ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌ．１：１２２３−２５）。
【０００４】
本発明のＰＤ−１抗体は、免疫調節剤として使用され、単剤療法として使用されるとき、または他の免疫抑制分子に対する抗体と併用されるときに有効であり得る。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ＰＤ−１に結合する抗体及び結合タンパク質を提供する。本発明のある特定の実施形態において、これらの抗体はＰＤ−１に結合し、ＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断する。ＰＤ−１がＰＤ−Ｌ１と相互作用することを遮断することによって、このような抗体は、免疫抑制を低減または阻害するのに有用である。
【０００６】
一実施形態において、本発明は、ＰＤ−１に結合する抗体または断片を提供し、これは、配列番号６、配列番号１６、配列番号２６、または配列番号３６を含む重鎖可変ドメインを含む。このような実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号６、配列番号１６、配列番号２６、または配列番号３６と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である。これら抗体は、配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２、配列番号５６、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、配列番号７６、配列番号８０、配列番号８４、配列番号８８、配列番号９２、配列番号９６、配列番号１００、配列番号１０４、配列番号１０８、配列番号１１２、配列番号１１６、配列番号１２０、配列番号１２４、配列番号１２８、配列番号１３２、配列番号１３６、配列番号１４０、配列番号１４４、配列番号１４８、配列番号１５２、配列番号１５６、配列番号１６０、配列番号１６４、配列番号１６８、配列番号１７２、配列番号１７６、配列番号１８０、配列番号１８４、配列番号１８８、配列番号１９２、配列番号１９６、配列番号２００、配列番号２０４、配列番号２０８、配列番号２１２、配列番号２１６、配列番号２２０、配列番号２２４、配列番号２２８、配列番号２３２、配列番号２３６、配列番号２４０、配列番号２４４、または配列番号２４８を含む軽鎖可変ドメインをさらに含むことができる。このような実施形態において、軽鎖可変ドメインは、配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２、配列番号５６、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、配列番号７６、配列番号８０、配列番号８４、配列番号８８、配列番号９２、配列番号９６、配列番号１００、配列番号１０４、配列番号１０８、配列番号１１２、配列番号１１６、配列番号１２０、配列番号１２４、配列番号１２８、配列番号１３２、配列番号１３６、配列番号１４０、配列番号１４４、配列番号１４８、配列番号１５２、配列番号１５６、配列番号１６０、配列番号１６４、配列番号１６８、配列番号１７２、配列番号１７６、配列番号１８０、配列番号１８４、配列番号１８８、配列番号１９２、配列番号１９６、配列番号２００、配列番号２０４、配列番号２０８、配列番号２１２、配列番号２１６、配列番号２２０、配列番号２２４、配列番号２２８、配列番号２３２、配列番号２３６、配列番号２４０、配列番号２４４、または配列番号２４８と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である。
【０００７】
別の実施形態において、本発明は、ＰＤ−１に結合する抗体またはその断片を提供し、ここで重鎖は、配列番号１、配列番号１１、配列番号２１、または配列番号３１を有するＣＤＲ−１Ｈ（Ｋａｂａｔ）と、配列番号３、配列番号１３、配列番号２３、または配列番号３３を有するＣＤＲ−２Ｈ（Ｋａｂａｔ）と、配列番号５、配列番号１５、配列番号２５、または配列番号３５を有するＣＤＲ−３Ｈとを含む。別の実施形態において、ＰＤ−１に結合する抗体またはその断片を提供し、ここで重鎖は、配列番号２、配列番号１２、配列番号２２、または配列番号３２を有するＣＤＲ−１Ｈ（Ｃｈｏｔｈｉａ）と、配列番号４、配列番号１４、配列番号２４、または配列番号３４を有するＣＤＲ−２Ｈ（Ｃｈｏｔｈｉａ）と、配列番号５、配列番号１５、配列番号２５、または配列番号３５を有するＣＤＲ−３Ｈとを含む。別の実施形態において、ＰＤ−１に結合する抗体またはその断片を提供し、ここで軽鎖は、配列番号:７、配列番号:１７、配列番号: ２７、配列番号:３７、配列番号:４１、配列番号:４５、配列番号:４９、配列番号:５３、配列番号:５７、配列番号:６１、配列番号:６５、配列番号:６９、配列番号:７３、配列番号:７７、配列番号:８１、配列番号:８５、配列番号:８９、配列番号:９３、配列番号:９７、配列番号:１０１、配列番号:１０５、配列番号:１０９、配列番号:１１３、配列番号:１１７、配列番号:１２１、配列番号:１２５、配列番号:１２９、配列番号:１３３、配列番号:１３７、配列番号:１４１、配列番号:１４５、配列番号:１４９、配列番号:１５３、配列番号:１５７、配列番号:１６１、配列番号:１６５、配列番号:１６９、配列番号:１７３、配列番号:１７７、配列番号:１８１、配列番号:１８５、配列番号:１８９、配列番号:１９３、配列番号:１９７、配列番号:２０１、配列番号:２０５、配列番号:２０９、配列番号:２１３、配列番号:２１７、配列番号:２２１、配列番号:２２５、配列番号:２２９、配列番号:２３３、配列番号:２３７、配列番号:２４１、または配列番号:２４５を有するＣＤＲ−１Ｌと、配列番号:８、配列番号:１８、配列番号:２８、配列番号:３８、配列番号:４２、配列番号:４６、配列番号:５０、配列番号:５４、配列番号:５８、配列番号: ６２、配列番号:６６、配列番号:７０、配列番号:７４、配列番号:７８、配列番号:８２、配列番号:８６、配列番号:９０、配列番号:９４、配列番号:９８、配列番号:１０２、配列番号:１０６、配列番号:１１０、配列番号:１１４、配列番号:１１８、配列番号:１２２、配列番号:１２６、配列番号:１３０、配列番号:１３４、配列番号:１３８、配列番号:１４２、配列番号:１４６、配列番号:１５０、配列番号:１５４、配列番号:１５８、配列番号:１６２、配列番号:１６６、配列番号:１７０、配列番号:１７４、配列番号:１７８、配列番号:１８２、配列番号:１８６、配列番号:１９０、配列番号:１９４、配列番号:１９８、配列番号:２０２、配列番号:２０６、配列番号:２１０、配列番号:２１４、配列番号:２１８、配列番号:２２２、配列番号:２２６、配列番号:２３０、配列番号:２３４、配列番号:２３８、配列番号:２４２、または配列番号:２４６を有するＣＤＲ−２Ｌと、配列番号:９、配列番号:１９、配列番号:２９、配列番号:３９、配列��号:４３、配列番号:４７、配列番号:５１、配列番号:５５、配列番号:５９、配列番号:６３、配列番号:６７、配列番号:７１、配列番号:７５、配列番号:７９、配列番号:８３、配列番号:８７、配列番号:９１、配列番号:９５、配列番号:９９、配列番号:１０３、配列番号:１０７、配列番号:１１１、配列番号:１１５、配列番号:１１９、配列番号:１２３、配列番号:１２７、配列番号:１３１、配列番号:１３５、配列番号:１３９、配列番号:１４３、配列番号:１４７、配列番号:１５１、配列番号:１５５、配列番号:１５９、配列番号:１６３、配列番号:１６７、配列番号:１７１、配列番号:１７５、配列番号:１７９、配列番号:１８３、配列番号:１８７、配列番号:１９１、配列番号:１９５、配列番号:１９９、配列番号: ２０３、配列番号: ２０７、配列番号:２１１、配列番号:２１５、配列番号:２１９、配列番号:２２３、配列番号:２２７、配列番号:２３１、配列番号:２３５、配列番号:２３９、配列番号:２４３、配列番号:２４７を有するＣＤＲ−３Ｌと、を含む。
【０００８】
本発明はまた、例えば、造影剤、治療薬、または細胞傷害性剤が挙げられるが、これらに限定されない、抗体のコンジュゲートも提供する。
【０００９】
本発明は、抗体及びコンジュゲート、ならびに製薬上許容し得る担体を含む組成物をさらに提供する。
【００１０】
本発明は、本発明の抗体または断片の有効量を投与することを含む、対象においてＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１との相互作用を阻害する方法を提供する。本発明は、本発明の抗体または断片の有効量を投与することを含む、ＰＤ−１によって媒介される免疫抑制を阻害する方法をさらに提供する。
【００１１】
本発明は、対象に本発明の抗体または断片の有効量を投与することを含む、ＰＤ−１を発現する細胞または組織に対して免疫応答を刺激する方法をさらに提供する。ある特定の実施形態において、ＰＤ−１を発現する細胞または組織は、新生細胞または感染細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】抗体Ｒ３Ａ１、Ｒ３Ａ２、Ｒ４Ｂ３、Ｒ３Ｂ７、及びＲ３Ｄ６の抗ｈＦｃへの結合を示す。
【図２】抗体Ｒ３Ａ１、Ｒ３Ａ２、Ｒ４Ｂ３、Ｒ３Ｂ７、及びＲ３Ｄ６のＥＧＦＲ−Ｆｃへの結合を示す。
【図３】抗体Ｒ３Ａ１、Ｒ３Ａ２、Ｒ４Ｂ３、Ｒ３Ｂ７、及びＲ３Ｄ６のｃｋｉｔ−Ｆｃへの結合を示す。
【図４】抗体Ｒ３Ａ１、Ｒ３Ａ２、Ｒ４Ｂ３、Ｒ３Ｂ７、及びＲ３Ｄ６のＫＤＲ−Ｆｃへの結合を示す。
【図５】抗体Ｒ３Ａ１、Ｒ３Ａ２、Ｒ４Ｂ３、Ｒ３Ｂ７、及びＲ３Ｄ６のｈＰＤ−１−Ｆｃへの結合を示す。
【図６】抗体Ｒ３Ａ１、Ｒ３Ａ２、Ｒ４Ｂ３、Ｒ３Ｂ７、及びＲ３Ｄ６によるＰＤ−Ｌ１のｈＰＤ−１への遮断を示す。
【図７】抗体Ｒ３Ａ１、Ｒ３Ａ２、Ｒ４Ｂ３、Ｒ３Ｂ７、及びＲ３Ｄ６のｍＰＤ−１−Ｆｃへの結合を示す。
【図８】抗体Ａ２＿＃１及びＡ２＿＃２のＰＤ−１−Ｆｃへの結合を示す。
【図９】抗体Ａ２＿＃１及びＡ２＿＃２によるＰＤ−Ｌ１のｈＰＤ−１への遮断を示す。
【図１０】抗体Ａ２＿＃１及びＡ２＿＃２によるＰＤ−Ｌ２のｈＰＤ−１への遮断を示す。
【図１１】抗体Ａ２＿＃１及びＡ２＿＃２のフローサイトメトリーによって測定される場合のｈＰＤ−１を発現するＨＥＫ２９３細胞への結合活性を示す。
【図１２】抗体Ａ２＿＃１及びＡ２＿＃２のフローサイトメトリーによって測定される場合のｈＰＤ−１を発現するＣＤ４  Ｔ細胞への結合活性を示す。
【図１３】抗体Ａ２＿＃１及びＡ２＿＃２のフローサイトメトリーによって測定される場合のｈＰＤ−１を発現するＣＤ８  Ｔ細胞への結合活性を示す。
【図１４】抗体Ａ２＿＃１及びＡ２＿＃２と共に培養されたＳＥＢ刺激ＰＢＭＣ中のＩＬ２分泌を示す。
【図１５】抗体Ａ２＿＃１及びＡ２＿＃２と共に培養されたＳＥＢ刺激ＰＢＭＣ中のＩＮＦγ分泌を示す。
【図１６】抗体Ａ２＿＃１及びＡ２＿＃２と共に培養されたＣＤ４  Ｔ細胞の増殖を示す。
【図１７】抗体Ａ２＿＃１及びＡ２＿＃２と共に培養された混合リンパ球反応中のＩＮＦγ分泌を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ＰＤ−１の免疫細胞上でのＰＤ−Ｌ１との相互作用は、免疫細胞による増殖及びサイトカイン産生が阻害される。ＰＤ−Ｌ１はまた、癌を含む種々の組織において誘導可能でありかつ上方制御される。ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１は共に、免疫抑制において役割を果たす。本発明は、ＰＤ−１に結合し、ＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断する新規の抗体、またはこのような抗体の抗原結合断片を提供する。本発明の実施形態において、抗体は免疫抑制を低下させるかまたは阻害する。
【００１４】
本発明の新規の抗体は、表１及び添付の配列表に記述されており、これらは、重鎖及び軽鎖ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの識別システムに従って識別）、ならびに完全な重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を説明している。最初の２つの重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの一般的なシステムに従って識別され、その結果、区別できるが重なり合う、ＣＤＲの位置が提供される。多数の重鎖及び軽鎖の比較することで、多くのＣＤＲ配列の中で著しい類似性が示される。したがって、多くのＣＤＲを混合し、配列内でマッチングさせることができると予想される。
【００１５】
抗体は、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、挿入、及び／または付加を有することができる。ある特定の実施形態において、これらの抗体は、上述した重鎖可変ドメインのうちの１つと、上述した軽鎖可変ドメインのうちの１つとを含む。ある特定の実施形態において、ＰＤ−１抗体またはその結合断片は、表１で説明したＣＤＲ及び可変ドメイン配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する、１つ以上のＣＤＲまたは１つ以上の可変ドメインを含む。
【００１６】
「同一性」とは、ギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮に入れた、２つのアミノ酸または核酸配列により共有されている、同一の位置の数または割合を指し、２つの配列の最適アライメントのために導入される必要がある。「実質的に同一である」は、保存的アミノ酸置換、例えば、同一クラスの別のアミノ酸に対するアミノ酸置換（例えば、グリシンに対するバリンに、リシンに対するアルギニン等）によって、またはタンパク質の機能を破壊しないアミノ酸配列の位置における１つ以上の非保存的置換、欠失、もしくは挿入によってのみ異なるアミノ酸配列を意味する。アミノ酸置換は、場合によっては、（ａ）置換の領域におけるペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩を維持することで効果がそれ程大きく異ならない置換を選択することによって行うことができる。例えば、天然の残基は、側鎖の性質に基づいてグループ：（１）疎水性アミノ酸（ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン）；（２）中性親水性アミノ酸（ステイン、セリン、及びスレオニン）；（３）酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）；（４）塩基性アミノ酸（アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、及びアルギニン）；（５）鎖配向に影響を及ぼすアミノ酸（グリシン及びプロリン）；ならびに（６）芳香族アミノ酸（トリプトファン、チロシン、及びフェニルアラニン）に分けることが可能である。これらのグループ内で行われる置換は保存的置換と見なすことができる。置換の例としては、アラニンに対するバリン、アルギニンに対するリジン、アスパラギンに対するグルタミン、アスパラギン酸に対するグルタミン酸、システインに対するセリン、グルタミンに対するアスパラギン、グルタミン酸に対するアスパラギン酸、グリシンに対するプロリン、ヒスチジンに対するアルギニン、イソロイシンに対するロイシン、ロイシンに対するイソロイシン、リジンに対するアルギニン、メチオニンに対するロイシン、フェニルアラニンに対するロイシン、プロリンに対するグリシン、セリンに対するスレオニン、スレオニンに対するセリン、トリプトファンに対するチロシン、チロシンに対するフェニルアラニン、及び／またはバリンに対するロイシンの置換が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
好ましくは、アミノ酸配列は、本明細書に開示されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である。配列類似性を決定するための方法及びコンピュータプログラムは一般に入手可能であり、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７，１９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０））、及びＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）が挙げられるが、これらに限定されない。周知のスミス・ウォーターマンアルゴリズムもまた、類似性を決定するために使用されてもよい。ＢＬＡＳＴプログラムは、ＮＣＢＩ及び他のソースから公開されている（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；ＢＬＡＳＴ  ２．０  ａｔ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）。配列の比較において、これらの方法は、様々の置換、欠失、及び他の修飾を調査する。保存的置換は、通常、以下の郡内の置換が挙げられる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。
【００１８】
本発明の抗体はまた、その結合特性が、直接変異、親和性成熟法、ファージディスプレイ、または鎖シャフリングの方法によって改善されたものも含む。親和性及び特異性は、ＣＤＲを突然変異させて、所望の特性を有する抗原結合部位をスクリーニングすることによって修正または向上されてもよい。ＣＤＲは様々な方法で突然変異される。１つの方法は、個々の残基または残基の組み合わせをランダム化することで、別様においては同一である抗原結合部位の母集団において、２０個のアミノ酸全てが特定の位置に見出されるようにすることである。あるいは、エラープローンＰＣＲ法によって、突然変異がＣＤＲ残基の一連の範囲にわたって誘導される（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９−８９６（１９９２）を参照のこと）。例えば、重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子を含有するファージディスプレイベクターを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異誘発株中で増殖させてもよい。（例えば、Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０：３５９−３６８（１９９６）を参照のこと）。これらの突然変異誘発の方法は、当業者に既知の多くの方法を例証するものである。
【００１９】
免疫原性を最小限に抑えるために、ヒト定常ドメイン配列を含む抗体が好ましい。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥなどの任意の免疫グロブリンクラス、及びそれらのサブクラスの一員であってもよく、またはこれらを組み合わせてもよい。抗体のクラスは、自然抗体のエフェクター機能（例えば、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ））を最適化するように選択されてもよい。
【００２０】
本発明のある特定の実施形態は、ＰＤ−１結合抗体断片の使用を伴う。Ｆｖは、全ての６つの超可変ループ（ＣＤＲ）を含む完全な重鎖及び軽鎖可変ドメインを含有する最少の断片である。定常ドメインを欠如するために、可変ドメインは、非共有結合である。ＶＨ及びＶＬドメインを結合させて抗原結合部位を形成するリンカーを使用して、重鎖及び軽鎖を結合し、単一ポリペプチド鎖（「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」）にしてもよい。本発明の一実施形態において、リンカーは（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３である。ｓｃＦｖ断片は、全抗体の定常ドメインを欠如するために、これらは全抗体よりも大幅に小さい。ｓｃＦｖ断片はまた、通常の重鎖定常ドメインと他の生体分子との相互作用がなく、ある特定の実施形態において望ましくない場合がある。
【００２１】
ＶＨ、ＶＬ、及び任意にＣＬ、ＣＨ１、または他の定常ドメインを含有する抗体の断片も使用することができる。パパイン分解によって生成された抗体一価の断片は、Ｆａｂと称され、重鎖ヒンジ領域を欠如する。ペプシン分解によって生成された断片は、Ｆ（ａｂ’）２と称され、重鎖ヒンジを保持し、二価である。このような断片も、組換え的に作製されてもよい。多くの他の有用な抗原結合抗体断片が当該技術分野において既知であり、二重特異性抗体、三重特異性抗体、単一ドメイン抗体、ならびに他の一価及び多価の形態が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
本発明は、多価抗原結合タンパク質をさらに提供し、これらは、抗体、それらの抗原結合断片、及び抗体の抗原結合部分の全てまたは一部を含むタンパク質の形態とすることができるが、これらに限定されない。多価の抗原結合タンパク質は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であってもよい。用語特異性とは、特定の分子が結合することができる抗原決定基の異なる種類の数を指す。免疫グロブリン分子が１種類のみの抗原決定基に結合する場合、その免疫グロブリン分子は単一特異性である。免疫グロブリン分子が、異なる種類の抗原決定基に結合するならば、そのときはこの免疫グロブリンは、多重特異性である。
【００２３】
本発明の一実施形態において、ＰＤ−１結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴によって測定されるとき、少なくとも約１０２Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０３Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０５Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも約１０６Ｍ−１ｓ−１の結合速度定数（Ｋｏｎ）を有する。一実施形態において、ＰＤ−Ｌ１結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴によって測定されるとき、１０２Ｍ−１ｓ−１〜１０３Ｍ−１ｓ−１、１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０４Ｍ−１ｓ−１、１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０５Ｍ−１ｓ−１、または１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０６Ｍ−１ｓ−１の結合速度定数（Ｋｏｎ）を有する。
【００２４】
別の実施形態において、ＰＤ−１結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴によって測定されるとき、最大で約１０−３ｓ−１、最大で約１０−４ｓ−１、最大で約１０−５ｓ−１、または最大で約１０−６ｓ−１の解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を有する。一実施形態において、ＰＤ−Ｌ１結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴によって測定されるとき、１０−３ｓ−１〜１０−４ｓ−１の、１０−４ｓ−１〜１０−５ｓ−１の、または１０−５ｓ−１〜１０−６ｓ−１の解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を有する。
【００２５】
別の実施形態において、ＰＤ−１結合タンパク質は、最大で約１０−７Ｍ、最大で約１０−８Ｍ、最大で約１０−９Ｍ、最大で約１０−１０Ｍ、最大で約１０−１１Ｍ、最大で約１０−１２Ｍ、または最大で約１０−１３Ｍの解離定数（ＫＤ）を有する。一実施形態において、結合タンパク質は、１０−７Ｍ〜１０−８Ｍの、１０−８Ｍ〜１０−９Ｍの、１０−９Ｍ〜１０−１０Ｍの、１０−１０Ｍ〜１０−１１Ｍの、１０−１１Ｍ〜１０−１２Ｍの、または１０−１２Ｍ〜１０−１３Ｍの、その標的に対する解離定数（ＫＤ）を有する。
【００２６】
本明細書に記載される結合タンパク質は、造影剤、治療薬、または最小傷害性薬をさらに含むコンジュゲートであってもよい。一実施形態において、造影剤は、放射線標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識、またはビオチンである。別の実施形態において、放射線標識は、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、または１５３Ｓｍである。さらに別の実施形態において、治療薬または細胞傷害性剤は、代謝抵抗物質、アルキル化剤、抗生物質、増殖因子、サイトカイン、抗血管新生剤、抗有糸分裂剤、アントラサイクリン、毒素、またはアポトーシス剤である。以下で論じる通り、免疫刺激性サイトカインは、特に重要である。
【００２７】
本明細書で例示するように、分子のＰＤ−１結合部分は、抗体の抗原結合ドメインである。いくつかの新規の抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインならびにこれらを含む抗体が提供される。本発明によれば、ＰＤ−１結合部分は、ＰＤ−１に結合しまた免疫抑制を遮断する任意の作用物質とすることができる。これらとしては、本明細書で開示されるこれらの新規の抗体、ならびにＰＤ―Ｌ１由来のペプチド及びタンパク質（ＰＤ−１の天然リガンド）に限定されない、抗ＰＤ−１抗体及び断片が挙げられる。
【００２８】
本発明の抗ＰＤ−１抗体は、予防または治療の目的で哺乳動物において使用される場合、製薬上許容し得る担体をさらに含む組成物の形態で投与されることが理解される。好適な製薬上許容し得る担体としては、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、スクロース、ポリソルベート、エタノール等、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上が挙げられる。製薬上許容し得る担体は、抗体の貯蔵寿命または有効性を向上させる、湿潤剤もしくは乳化剤、防腐剤もしくは緩衝液などの少量の補助物質をさらに含む。
【００２９】
本発明の方法において、本発明の抗体または抗体断片の治療的有効量が、それを必要とする哺乳動物に投与される。本明細書で使用される場合、用語「投与する」は、求められる結果を得ることができる任意の方法によって、本発明の抗体を哺乳動物に送達することを意味する。これらは、例えば、静脈内または筋肉内で投与されてもよい。本発明の例示された抗体は、ヒトへの投与に特に有用であるが、これらは、他の哺乳動物に同様に投与されてもよい。本明細書で使用される場合、用語「哺乳動物」は、ヒト、実験動物、家庭用ペット及び家畜動物が含むことを目的としているが、これらに限定されない。「治療的有効量」は、哺乳動物に投与されるとき、キナーゼ活性を阻害するなど、所望の治療効果を生じることで有効である、本発明の抗体の量を意味する。
【００３０】
本発明の抗体は、腫瘍または他の新生物疾患を阻害するために、ならびに免疫抑制に関連する他の病態を治療するために有用である。治療可能な腫瘍としては、原発腫瘍、転移性腫瘍、及び難治性腫瘍が含まれる。難治性腫瘍としては、単独の化学療法、単独の抗体療法、単独の放射線療法またはこれらの組み合わせによる治療に対して反応しないか、または耐性がある腫瘍が含まれる。難治性腫瘍はまた、このような作用物質による治療によって阻害されたように見えるが、治療が中断された後、最長５年で、場合によっては最長１０年またはそれ以上で再発する腫瘍も包含する。本抗体は、血管が新生化腫瘍及び血管新生化されていない、または依然として実質的に血管新生化されていない腫瘍を治療するために有効である。
【００３１】
抗体により治療され得る固形腫瘍の例としては、乳癌、肺癌、結直腸癌、膵臓癌、神経膠腫、及びリンパ腫が挙げられる。このような腫瘍のいくつかの例としては、類上皮腫、扁平上皮腫（頭頚部腫など）、結直腸腫瘍、前立腺腫瘍、乳腫瘍、肺腫瘍（小細胞及び非小細胞肺腫瘍を含める）、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍、及び肝臓腫瘍が含まれる。他の例としては、カポジ肉腫、ＣＮＳの新生物、神経芽細胞腫、毛細血管芽腫、髄膜腫ならびに脳転移、メラノーマ、胃腸ならびに腎癌及び肉腫、横紋筋肉腫、神経膠芽腫（好ましくは、多形膠芽腫）、及び平滑筋肉腫が含まれる。本発明の拮抗薬が有効である血管新生皮膚癌の例としては、悪性角化細胞、例えばヒト悪性角化細胞の増殖を抑制することによって治療することができる扁平細胞癌、基底細胞癌及び皮膚癌が挙げられる。
【００３２】
非固形腫瘍の例としては、白血病、多発性骨髄腫、及びリンパ腫が含まれる。いくつかの実施形態において、これらの腫瘍は、ＩＬ１５などのサイトカインに対して非反応性であり得る。白血病のいくつかの例としては、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、赤血球性白血病、または単球性白血病が含まれる。リンパ腫のいくつかの例としては、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫が挙げられる。
【００３３】
本発明のＰＤ−１抗体は、ウイルス感染の治療でも使用される。ＰＤ−１のＴ細胞上の発現は、ＨＩＶのウイルス量及びＨＣＶに感染した患者と相関し、ＰＤ−１の発現は、枯渇したウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞についてのマーカーとして特定されている。例えば、ＰＤ−１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、エフェクター機能障害及びＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を遮断することによって復活され得るＰＤ−１関連Ｔ細胞の枯渇を示す。これは、ウイルス特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞が媒介する免疫の回復をもたらし、このことは、拮抗作用抗体を使用してＰＤ−１シグナル伝達を妨害することが、Ｔ細胞のエフェクター機能を回復させることを示唆している。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の封鎖に基づく免疫療法は、腫瘍抗原に対するＴ細胞寛容の破壊をもたらすのみならず、ウイルス特異的エフェクターＴ細胞を再活性化し、また慢性ウイルス感染における病原体を根絶するための戦略も提供する。したがって、本発明の抗体は、ＨＣＶならびにＨＩＶ、及びリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）が挙げられるが、これらに限定されない慢性ウイルス感染を治療するために有用である。
【００３４】
本発明の抗体は、好都合に、第２の作用物質と共に、それを必要とする患者に投与することができる。例えば、いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、抗新生物剤と共に対象に投与される。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、血管新生阻害剤と共に対象に投与される。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、抗炎症剤または免疫抑制剤と共に投与される。
【００３５】
抗新生物剤としては、細胞傷害性化学療法剤、標的小分子及び生体分子、ならびに放射線が挙げられる。化学療法剤の日限定的な例としては、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、イリノテカン、メクロレタミン（ナイトロジェン・マスタード、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキシルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラスチン、クラドリビン、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、インターフェロンアルファ、ロイプロリド、メガストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペグアスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシル・マスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、タキソール、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００３６】
標的小分子及び生体分子としては、チロシンキナーゼの調節物質などのシグナル伝達経路の構成成分の阻害剤及び受容体キナーゼの阻害剤、ならびに腫瘍特異的抗原に結合する作用物質が挙げられるが、これらに限定されない。腫瘍形成に関与する増殖因子受容体の非限定的な例としては、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦＲ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦＲ）、神経増殖因子（ＮＧＦＲ）、及び線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦＲ）に対する受容体、ならびに上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ１としても知られる）、ＨＥＲ２（ｅｒｂＢ２）、ｅｒｂＢ３、及びｅｒｂＢ４が含まれる上皮細胞増殖因子受容体ファミリーの受容体が挙げられる。
【００３７】
ＥＧＦＲ拮抗剤としては、ＥＧＦＲに、またはＥＧＦＲリガンドに結合し、またリガンド結合及び／または受容体活性化を阻害する抗体が含まれる。例えば、この作用物質は、他のＥＧＦＲファミリーメンバーとの受容体の二量体またはヘテロ二量体の形成を遮断することができる。ＥＧＦＲに対するリガンドとしては、例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−αアンフィレグリン、ヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）及びβレグルリン（ｂｅｔａｒｅｇｕｌｌｕｌｉｎ）が挙げられる。ＥＧＦＲ拮抗剤はＥＧＦＲの細胞外部分に外的に結合することができ（これはリガンドの結合を阻害し得る、もしくは阻害し得ない）、または、チロシンキナーゼ領域に内的に結合することができる。ＥＧＦＲ拮抗剤としてはさらに、例えば、ＥＧＦＲシグナル伝達経路の成分の機能を阻害することにより、ＥＧＦＲ依存性シグナル伝達を阻害する作用物質が挙げられる。ＥＧＦＲに結合するＥＧＦＲ拮抗剤の例としては、ＥＧＦＲに特異的な抗体（及びその機能的等価物）等の生体分子、ならびに、ＥＧＦＲの細胞質領域に直接作用する合成キナーゼ阻害剤等の小分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
小分子及び生物学的阻害剤としては、ゲフィチニブ、エルロチニブ、及びセツキシマブを含む上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の阻害剤、ＨＥＲ２の阻害剤（例えばトラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン（トラスツズマブ-ＤＭ１；Ｔ-ＤＭ１）及びペルツズマブ）、抗ＶＥＧＦ抗体及び断片（例えばベバシズマブ）、ＣＤ２０を阻害する抗体（例えばリツキシマブ、イブリツモマブ）、抗ＶＥＧＦＲ抗体（例えばラムシルマブ（ＩＭＣ-１１２１Ｂ）、ＩＭＣ-１Ｃ１１、及びＣＤＰ７９１）、抗ＰＤＧＦＲ抗体、ならびにイマチニブが挙げられる。低分子キナーゼ阻害剤は特定のチロシンキナーゼに特異的であることができるか、または２つ以上のキナーゼの阻害剤であることができる。例えば、化合物Ｎ-（３，４-ジクロロ-２-フルオロフェニル）-７-（｛［（３ａＲ，６ａＳ）-２-メチルオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール-５-イル］メチル｝オキシ）-６-（メチルオキシ）キナゾリン-４-アミン（ＸＬ６４７、ＥＸＥＬ-７６４７及びＫＤ-０１９としても知られている）は、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＢ４、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ）、Ｆｌｔ４（ＶＥＧＦＲ３）及びＥｒｂＢ２を含む複数の受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害剤であり、かつ、ＳＲＣキナーゼの阻害剤でもあり、特定のＴＫＩに対して腫瘍が非反応性となる経路に関係する。本発明の一実施形態において、必要な対象の治療には、ｒｈｏキナーゼ阻害剤の投与が含まれる。
【００３９】
ダサチニブ（ＢＭＳ-３５４８２５；Ｂｒｉｓｔｏｌ-Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）は別の、経口の生体利用可能なＡＴＰ部位競合Ｓｒｃ阻害剤である。ダサチニブはまた、Ｂｃｒ-Ａｂｌ（慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）またはフィラデルフィア染色体陽性（Ｐｈ＋）急性リンパ性白血病（ＡＬＬ））を有する患者にて使用するためのもので、ＦＤＡ認可済み）、ならびにｃ-ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲ、ｃ-ＦＭＳ、ＥｐｈＡ２、及びＳＦＫｓも標的とする。Ｓｒｃ及びＢｃｒ-Ａｂｌの他の２つの経口チロシンキナーゼ阻害剤は、ボスチニブ（ＳＫＩ-６０６）及びサラカチニブ（ＡＺＤ０５３０）である。
【００４０】
本発明の一実施形態において、本発明のＰＤ-１抗体は、慢性ウイルス感染症を治療するために抗ウイルス剤と組み合わせて使用される。例えば、ＨＣＶを治療するために、以下の作用物質を使用することができる。ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤としては、ボセプレビル、テラプレビル（ＶＸ-９５０）、ＩＴＭＮ-１９１、ＳＣＨ-９００５１８、ＴＭＣ-４３５、ＢＩ-２０１３３５、ＭＫ-７００９、ＶＸ-５００、ＶＸ-８１３、ＢＭＳ７９００５２、ＢＭＳ６５００３２及びＶＢＹ３７６が挙げられるが、これらに限定されない。ＨＣＶ非構造タンパク質４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）阻害剤としては、クレミゾール、ならびに、非限定的にベンゾイミダゾールＲＢＩ（Ｂ-ＲＢＩ）及びインダゾールＲＢＩ（Ｉ-ＲＢＩ）を含む他のＮＳ４Ｂ-ＲＮＡ結合阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。ＨＣＶ非構造タンパク質５Ａ（ＮＳ５Ａ）阻害剤としては、ＢＭＳ-７９００５２、Ａ-６８９、Ａ-８３１、ＥＤＰ２３９、ＧＳ５８８５、及びＰＰ１４６１が挙げられるが、これらに限定されない。ＨＣＶポリメラーゼ（ＮＳ５Ｂ）阻害剤としては、ヌクレオシド類似体（例えばバロピシタビン、Ｒ１４７９、Ｒ１６２６、Ｒ７１２８）、ヌクレオチド類似体（例えばＩＤＸ１８４、ＰＳＩ-７８５１、ＰＳＩ-７９７７）、及び非ヌクレオシド類似体（例えばフィリブビル（ｆｉｌｉｂｕｖｉｒ）、ＨＣＶ-７９６、ＶＣＨ-７５９、ＶＣＨ-９１６、ＡＮＡ５９８、ＶＣＨ-２２２（ＶＸ-２２２）、ＢＩ-２０７１２７、ＭＫ-３２８１、ＡＢＴ-０７２、ＡＢＴ-３３３、ＧＳ９１９０、ＢＭＳ７９１３２５）が挙げられるが、これらに限定されない。また、リバビリン、またはタリバビリン（ビラミジン；ＩＣＮ  ３１４２）等のリバビリン類似体、ミゾリビン、メリメポジブ（Ｍｅｒｉｍｅｐｏｄｉｂ）（ＶＸ-４９７）、ミコフェノール酸モフェチル、及びミコフェノレートを使用することもできる。
【００４１】
ある特定の実施形態において、本発明の抗体の１回分の用量を、対象に、毎日、１日おき、数日おき、３日に１回、週に１回、週に２回、週に３回、または２週に１回投与する。他の実施形態では、化合物または組成物の２、３または４回分の用量を、毎日、数日おき、３日に１回、週に１回、または２週に１回、対象に投与する。いくつかの実施形態において、化合物または組成物の１回分の用量（または複数回の用量）を２日、３日、５日、７日、１４日、または２１日間投与する。ある種の実施形態において、投与量の化合物または組成物を１ヶ月、１．５ヶ月、２ヶ月、２．５ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月間またはそれ以上投与する。
【００４２】
投与方法としては、非経口、皮内、硝子体内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経鼻、硬膜外、経口、舌下、経鼻、脳内、腟内、経皮、経粘膜、直腸、吸入、または局所（特に耳、鼻、目、もしくは皮膚）が挙げられるが、これらに限定されない。投与方法は施術者の裁量に委ねられる。ほとんどの場合、投与により化合物を血流中に放出する。眼疾患の治療には、生物学的作用物質の硝子体内投与が好ましい。
【００４３】
特定の実施形態において、局所的に化合物を投与するのが望ましい場合がある。この投与は例えば、局所注入、局所適用により、注射により、カテ-テルにより、またはインプラント（このインプラントは多孔性、非多孔性、またはゲル状物質であり、シラスティック膜または繊維等が含まれる）により達成され得るが、これらに限定されない。このような例において投与は、化合物を実質的に血流中に放出することなく、選択的に局部組織を標的としてよい。
【００４４】
例えば、吸入器もしくはネブライザを使用、及びエアロゾル化剤を処方して、またはフルオロカーボンもしくは合成肺サーファクタント中での還流により、経肺投与もまた用いることができる。ある特定の実施形態において、従来の結合剤及びトリグリセリド等の賦形剤を用いて化合物を座薬として配合してよい。
【００４５】
別の実施形態において、化合物を小胞、特にリポソームとして送達する（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７-１５３３；Ｔｒｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｌｏｐｅｚ-Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３-３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ  Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，ｉｂｉｄ．，ｐｐ．３１７-３２７；通常同上の箇所を参照のこと）。
【００４６】
別の実施形態において、化合物を制御放出系にて送達する（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５-１３８（１９８４）を参照のこと）。Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７-１５３３の説明にて考察されている制御放出系の例を使用してよい。一実施形態では、ポンプを使用してよい（Ｌａｎｇｅｒ，ｓｕｐｒａ；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照のこと）。別の実施形態では、高分子材料を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照のこと；また、Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５も参照のこと）。
【００４７】
上述の投与スケジュールは、例示の目的のためだけに提供するものであり、これらに限定されるべきではない。当業者は速やかに、あらゆる投与が本発明の範囲内にあることを理解するであろう。
【００４８】
本明細書において開示された発明原理の変形が当業者により行われ得ることが理解及び想定されるべきであり、また、このような変形は本発明の範囲に含まれるべきであることが意図される。
【００４９】
本出願の全体を通して、種々の出版物が参照されている。これらの出版物は、本発明が関係する現況技術をより完全に説明するために、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。以下の実施例において本発明をさらに説明するが、決して本発明の適用範囲を限定するものと解釈してはならない。
【実施例】
【００５０】
ファージディスプレイライブラリーからの、ＰＤ−Ｌ１に対する特異的高親和性抗体
高親和性を有する高ＰＤ−１抗体を、ファージディスプレイライブラリーを使用して入手した。一手順では、Ｄｙａｘライブラリーから増幅したファージＦａｂを、ビオチン−抗ｈＦｃ  Ａｂ及び磁気ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐ）ビーズによって捕捉した可溶性ＰＤ−１−Ｆｃ上でパンニングした。
【００５１】
第２の手順では、Ｄｙａｘライブラリーから増幅したファージＦａｂを、チューブ固定化したＰＤ−１−Ｆｃ上でパンニングした。
【００５２】
第３の手順では、Ｄｙａｘライブラリーから増幅したファージＦａｂを、第１ラウンドでは、チューブ固定化したＰＤ−１−Ｆｃ上でパンニングした。次いで、第２ラウンドでは、ＰＤ−１でトランスフェクトした２９３細胞上でパンニングした。
【００５３】
第４の手順では、Ｄｙａｘライブラリーから増幅したファージＦａｂを、可溶性ＰＤ−１−Ｆｃ上でパンニングし、磁気ストレプトアビジンビーズによって捕捉した。
【００５４】
５つの特有なクローン（Ｒ３Ａ１、Ｒ３Ａ２、Ｒ４Ｂ３、Ｒ３Ｂ７、及びＲ３Ｄ６）を、さらなる特性化のためにＩｇＧに変換した。これらの変異体の４つ（Ｒ３Ａ１、Ｒ３Ａ２、Ｒ４Ｂ３、及びＲ３Ｄ６）のアミノ酸配列を、表１の行１〜４に示す配列表に記載する。
【表１】
2018506280.tif 000003
【００５５】
抗体の特性化
５つの抗体の結合活性を、用量反応ＥＬＩＳＡを用いて検討した。段階希釈した抗体を、固定化ｈＰＤ−１−Ｆｃに添加し、ＨＲＰ結合抗ｈＩｇＧ  Ｆａｂ特異的抗体によって検出した。ＯＤ４５０の読み取りを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６を用いて、対数抗体濃度に対してプロットした。ＥＣ５０を、「用量反応」（刺激）可変勾配（４つのパラメータ）」プログラムを用いて算出した。抗体はまた、固定化ｍＰＤ−１−Ｆｃ及び他のＦｃ−融合物にも添加して、ｈＰＤ−１−Ｆｃに対する特異性を決定し、また抗ヒトＩｇＧ  ｆｃ特異的抗体（抗ｈＦｃ  Ａｂ）に添加し、濃度測定の精度をチェックした。
【００５６】
リガンド及び受容体の相互作用を、用量反応ブロッキングＥＬＩＳＡによって、段階希釈した抗体の存在下で検討した。段階希釈した抗体と受容体ｈＰＤ−１の固定量（最終０．２５μｇ／ｍｌ）の混合物を、リガンドｈＰＤ−Ｌ１を被覆したプレートに添加した。リガンド上に結合したｈＰＤ−１の量を、ビオチン抗ヒトＰＤ−１ポリクローナル抗体（ヤギ）とのインキュベーション、その後のＳｔｒｅｐ−ＨＲＰとのインキュベーションによって定量化した。ＯＤ４５０読み取りを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６を用いて、対数抗体濃度に対してプロットした。ＩＣ５０を、「用量反応」（刺激）可変勾配（４つのパラメータ）」プログラムを用いて算出した。
【００５７】
結果を図１〜７に示す。全ての５つの抗体は、可溶性人ＰＤ−１−Ｆｃに結合することができ（図５）、リガンドＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１に結合することを遮断することができる（図６）。Ｒ４Ｂ３は、ネズミＰＤ−１に結合することができ（図７）、Ｒ３Ｂ７は、他のＦｃ融合物に対して低い結合親和性を有する（図２〜４）。Ｒ３Ａ１、Ｒ３Ａ２、Ｒ４Ｂ３、及びＲ３Ｄ６を、軽鎖シャフリングを通しての親和性成熟に向かって進めた。
【００５８】
親和性成熟
軽鎖シャフリングを用いて、４つの有力候補の抗体の親和性を増大させた。より具体的には、Ｒ３Ａ１、Ｒ３Ａ２、Ｒ４Ｂ３、及びＲ３Ｄ６の重鎖を、κλ軽鎖プールと対を作り、軽鎖シャフリングライブラリーを構築した。このライブラリーをより高い親和性の抗体に対してパンニングした。ＥＬＩＳＡ陽性のクローンを配列決定した。特有なクローンを、競合ＥＬＩＳＡによって比較した。これらの変異体のアミノ酸配列を、表１の行５〜５６に示した配列表に記載する。
【００５９】
有力候補の特性化
ＥＬＩＳＡ
Ｒ３Ａ２シャフリングライブラリーからの２つの有力候補を、固相ＥＬＩＳＡを用いて上記のように特性化した。結果を図８〜１０に示す。Ａ２＿＃１及びＡ２＿＃２は、ｈＰＤ−１に強力に結合することができ（図８）、またリガンドＰＤ−Ｌ１（図９）及びＰＤ−Ｌ２（図１０）がその受容体ＰＤ−１に結合することを遮断する。ＥＣ５０及びＩＣ５０値を、表２に示す。
【表２】
2018506280.tif 000004
【００６０】
ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）
２つの有力候補の結合反応速度を、ビアコアＴ−２００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて評価した。ＣＭ５チップを、ランニングバッファーＨＢＳＥＰ（ランニングバッファー）の１０μｌ／ｍｌで平衡化した。ＣＭ５チップの２つのフローセルを、１：１  ＮＨＳ／ＥＤＣの注入で５分間活性化した。第２のフローセルを、１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５中で希釈したｈＰＤ−Ｌ１ｆｃの５μｇ／ｍｌで固定化し、３０〜５０ＲＵの固定化タンパク質を得た。表面を、エタノールアミンの５分間の注入、続いてＮＳＢレジューサーの５分間の注入で連続的に遮断した。
【００６１】
試料の泳動を、ＨＢＳＥＰランニングバッファー中で、３０μｌ／分にて実行した。試料をランニングバッファー中で１００〜１．３７ｎＭの濃度で段階希釈した。試料を、３分間の結合時間及び１０分間の解離時間で、２つのフローセルにわたって注入した。再生を、２０ｍＭのＨＣｌの３０秒間の注入による各結合サイクル後に行った。センサーグラムを各濃度について取得し、導出曲線を、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて、ブランクフローセルを差し引いた状態で１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに当てはめた。結果を表３に示す。
【表３】
2018506280.tif 000005
【００６２】
抗ＰＤ−１抗体の細胞表面発現されたＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１受容体への結合活性についてのフローサイトメトリー
有力候補抗体の、ＨＥＫ２９３トランスフェクト細胞及びＣＤ４ならびにＣＤ８  Ｔ細胞中で表面発現されたＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１への結合活性を、Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅ（商標）ＨＴサンプリングフローサイトメーター（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、製造元の指示に従って評価した。精製ヒトＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体被覆ビーズにより、１：５のビーズ対Ｔ細胞の比で４日間活性化し、その後、抗ＰＤ−１抗体で染色した。Ｒ−フィコエリスリン結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（カタログ番号１０９−１１６−０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を２次抗体として用いて、一次抗体の結合を検出した。
【００６３】
ＨＥＫ２９３細胞についての結果を図１１に、ＣＤ４  Ｔ細胞については、図１２に、ＣＤ８  Ｔ細胞については図１３に示す。
【００６４】
サイトカイン産生及びＴ細胞増殖についてのＳＥＢ活性化ＰＢＭＣアッセイ
抗ＰＤ−１抗体Ａ２＿＃１及びＡ２＿＃２が、Ｔｈ１サイトカイン分泌を増大させるための同等な活性を有することを確認した。ＰＢＭＣを、ＬｅｕｋｏＰａｋ（単球、リンパ球、血小板、血漿、ならびに赤血球を含む高濃度の血液細胞を含有する濃縮白血球アフェレーシス）から、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ）を用いて、製造元の指示に従って単離した。ＰＢＭＣを、ＩＭＤＭ（２ｍＭのグルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、３．０２４ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムで補充したイスコフ改変ダルベッコ培地、技術カタログ番号３１９８０−０９７）及び１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、カタログ番号ＳＨ３０３９６．０３、ＨｙＣｌｏｎｅ）を含有する９６ウェルプレートのウェル当たり２×１０４個で培養し、０．１ｕｇ／ｍＬのＳＥＢ（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、Ｓｉｇｍａ）で５〜７日間活性化した。有力候補抗ＰＤ−１抗体のＳＥＢ活性化ＰＢＭＣ中でのサイトカイン産生に及ぼす効果を、培地中に放出されたサイトカインの測定によって評価した。７日目に、上清を回収し、ＤｕｏｓｅｔＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて製造元の指示に従ってＩＬ−２及びＩＦＮγの測定を行った。
【００６５】
ＩＬ−２分泌についての結果を図１４にしめし、ＩＦＮγについての結果を図１５に示す。ＩＦＮγのレベルにおける著しい増加を、有力候補抗ＰＤ−１抗体のＡ２＿＃１及びＡ２＿＃２を含む培養物で観察した。
【００６６】
サイトカイン産生及びＴ細胞増殖についての混合リンパ球反応アッセイ
抗ＰＤ−１抗体Ａ２＿＃１及びＡ２＿＃２が、ＣＤ４  Ｔ細胞の増殖を増大させるための同等な活性を有することを確認した。全血から単離されたヒトＣＤ４  Ｔ細胞を、抗ＰＤ−１抗体の存在下で、抗ＣＤ３抗体及びＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ被覆ビーズで４日間刺激した。増殖を、増殖マーカーＫｉ６７染色によって測定した。
【００６７】
結果を図１６に示す。ＣＤ４  Ｔ細胞の増殖における増加を、抗ＰＤ−１抗体のＡ２＿＃１及びＡ２＿＃２を含む培養物で観察した。
【００６８】
抗ＰＤ−１抗体Ａ２＿＃１及びＡ２＿＃２が、混合リンパ球反応におけるＴｈ１サイトカイン分泌を増加させるための同等な活性を有することを確認した。未成熟単球由来樹状細胞（ｍｏ−ＤＣ）を、ＣＤ１４陽性細胞を、１０％のＦＢＳで補充したＩＭＤＭ中で、１５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ及び５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４と共に６〜７日間培養することによって生成した。ＣＤ４陽性細胞は、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒトＣＤ４濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて全血から陰性単離した。ｍｏ−ＤＣ及びＣＤ４陽性細胞を、次いで、ｍｏ−ＤＣ対ＣＤ４細胞の１：１０の比で、それぞれ共培養した。抗ＰＤ−１抗体の遮断機能を判定するために、徐々に増加する量の抗ＰＤ−１抗体を、共培養の開始時に添加した。７日目に、上清を回収し、分泌されたＩＦＮγの測定をＥＬＩＳＡによって行った。
【００６９】
結果を図１７に示す。ＩＦＮγのレベルにおける著しい増加を、抗ＰＤ−１抗体Ａ２＿＃１及びＡ２＿＃２の変異体との培養物中で観察した。
【図１】
2018506280.tif 000006
【図２】
2018506280.tif 000007
【図３】
2018506280.tif 000008
【図４】
2018506280.tif 000009
【図５】
2018506280.tif 000010
【図６】
2018506280.tif 000011
【図７】
2018506280.tif 000012
【図８】
2018506280.tif 000013
【図９】
2018506280.tif 000014
【図１０】
2018506280.tif 000015
【図１１】
2018506280.tif 000016
【図１２】
2018506280.tif 000017
【図１３】
2018506280.tif 000018
【図１４】
2018506280.tif 000019
【図１５】
2018506280.tif 000020
【図１６】
2018506280.tif 000021
【図１７】
2018506280.tif 000022
【配列表】
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【国際調査報告】
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