(57)【要約】本開示は、間質幹細胞を富化させ、単離するための方法および生成物に関する。本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団から、ＨＳＣ７０結合剤を用いて間質幹細胞を富化させるステップを含む、方法を提供する。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団から、ＨＳＣ７０結合剤を用いて間質幹細胞を富化させるステップを含む、方法。
【請求項２】
前記未熟で中立的な間質幹細胞は、未熟で中立的な間葉系幹細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞集団は、胎盤、臍帯、臍帯血、歯芽組織、象牙質／歯髄組織、歯根膜、歯肉、皮膚、髪、卵胞、羊水、脂肪組織、平滑筋、骨格筋、腱、靱帯、骨、軟骨、骨髄、および／または末梢血より得られる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞集団は、多能性幹細胞から生じた間質幹細胞、人工多能性幹細胞、体細胞核移植から生じた細胞、および／または成体幹細胞を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＨＳＣ７０結合剤の細胞表面ＨＳＣ７０への結合を含む、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＨＳＣ７０結合剤は、細胞表面ＨＳＰ７０に実質的に結合しない、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＨＳＣ７０結合剤は、抗体および／もしくはその抗原結合部、小分子、核酸、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、リガンド、またはリガンドミメティックのうち１つまたは複数を含む、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＨＳＣ７０結合剤は、抗体および／またはその抗原結合部を含む、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＳＣ７０結合剤は、ＨＳＣ７０リガンドを含む、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０を発現する細胞を富化させるステップを含む、請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０を発現し、細胞表面マーカとしてＨＳＰ７０を実質的に発現しない細胞を富化させるステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
フローサイトメトリーを含む、請求項１〜１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＨＳＣ７０＋かつＨＳＰ７０−である細胞を富化させるステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＨＳＣ７０ｂｒｉｇｈｔかつＨＳＰ７０ｄｉｍである細胞を富化させるステップを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１５】
前記富化された細胞はクローン原性細胞を含む、請求項１〜１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記富化された未熟で中立的な間質幹細胞は、未熟で中立的なＭＳＣを含む、請求項１〜１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団から、細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０を発現する間質細胞を富化させることにより、未熟で中立的な間質幹細胞を富化させるステップを含む、方法。
【請求項１８】
未熟で中立的な間質幹細胞を富化させる方法であって：
間質幹細胞を含む細胞集団を提供するステップと；
前記細胞集団をＨＳＣ７０結合剤にさらすステップと；
細胞に結合した前記ＨＳＣ７０結合剤を用いて前記細胞集団から間質細胞を富化させるステップとを含む、方法。
【請求項１９】
未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団から、細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０を発現する細胞を検出することにより間質細胞を富化させるステップを含む、方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９の何れか一項に記載の方法により富化された間質幹細胞。
【請求項２１】
クローン原性細胞を含む、請求項２０に記載の間質幹細胞。
【請求項２２】
未熟で中立的なＭＳＣを含む、請求項２０または２１に記載の間質幹細胞。
【請求項２３】
未熟で中立的な間葉系幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団から、ＨＳＣ７０結合剤を用いて間葉系幹細胞を富化させるステップを含む、方法。
【請求項２４】
未熟で中立的な間葉系幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団から、細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０を発現する間葉系幹細胞を富化させることにより、未熟で中立的な間質幹細胞を富化させるステップを含む、方法。
【請求項２５】
請求項２３または２４に記載の方法により富化された間葉系幹細胞。
【請求項２６】
未熟で中立的な間質幹細胞を富化させ、単離し、および／または特定するためのマーカとしてのＨＳＣ７０の使用。
【請求項２７】
未熟で中立的な間質幹細胞を富化させ、単離し、および／または特定するためのＨＳＣ７０結合剤の使用。
【請求項２８】
未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から単離する方法であって、前記細胞集団から、ＨＳＣ７０結合剤を用いて間質幹細胞を単離するステップを含む、方法。
【請求項２９】
未熟で中立的な間質幹細胞を単離する方法であって：
間質幹細胞を含む細胞集団を提供するステップと；
前記細胞集団をＨＳＣ７０結合剤にさらすステップと； 
細胞に結合した前記ＨＳＣ７０結合剤を用いて、前記細胞集団から間質細胞を単離するステップを含む、方法。
【請求項３０】
未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から単離する方法であって、前記細胞集団から、細胞表面ＨＳＣ７０を発現する間質幹細胞を単離するステップを含む、方法。
【請求項３１】
請求項２８〜３０の何れか一項に記載の方法により単離された間質幹細胞。
【請求項３２】
細胞表面マーカとしてＨＳＰ７０を実質的に発現しない、請求項３１に記載の間質幹細胞。
【請求項３３】
ＨＳＰ７０−またはＨＳＰ７０ｄｉｍである、請求項３２に記載の間質幹細胞。
【請求項３４】
未熟で中立的なＭＳＣを含む、請求項３１〜３３の何れか一項に記載の間質幹細胞。
【請求項３５】
未熟で中立的な間葉系幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から単離する方法であって、前記細胞集団から、ＨＳＣ７０結合剤を用いて間葉系幹細胞を単離するステップを含む、方法。
【請求項３６】
未熟で中立的な間葉系幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から単離する方法であって、前記細胞集団から、細胞表面ＨＳＣ７０を発現する間葉系幹細胞を単離するステップを含む、方法。
【請求項３７】
細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０を発現し、細胞表面マーカとしてＨＳＰ７０を実質的に発現しない、１つまたは複数の単離間質幹細胞。
【請求項３８】
ＨＳＣ７０＋細胞表面マーカおよびＨＳＰ７０−細胞表面マーカを含む、１つまたは複数の単離間質幹細胞。
【請求項３９】
ＨＳＣ７０ｂｒｉｇｈｔ細胞表面マーカおよびＨＳＰ７０ｄｉｍ細胞表面マーカを含む、１つまたは複数の単離間質幹細胞。
【請求項４０】
細胞表面マーカとしてＳＴＲＯ−１抗原を発現しており、細胞表面マーカとしてＨＳＰ７０は実質的に発現していない、１つまたは複数の単離間質幹細胞。
【請求項４１】
ＳＴＲＯ−１＋細胞表面マーカおよびＨＳＰ７０−細胞表面マーカを含む、１つまたは複数の単離間質幹細胞。
【請求項４２】
ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞表面マーカおよびＨＳＰ７０ｄｉｍ細胞表面マーカを含む、１つまたは複数の単離間質幹細胞。
【請求項４３】
１つまたは複数の未熟で中立的なＭＳＣを含む、請求項３７〜４２の何れか一項に記載の１つまたは複数の単離間質幹細胞。
【請求項４４】
１つまたは複数のクローン原性細胞を含む、請求項３７〜４３の何れか一項または複数に記載の、１つまたは複数の単離間質幹細胞。
【請求項４５】
請求項３７〜４４の何れか一項に記載の１つまたは複数の単離細胞を含む、細胞集団。
【請求項４６】
未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団から、細胞表面マーカとしてＳＴＲＯ−１抗原を発現し、細胞表面マーカとしてＨＳＰ７０を実質的に発現しない間質幹細胞を富化させるステップを含む、方法。
【請求項４７】
間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団から、ＳＴＲＯ−１＋ＨＳＰ７０−間質幹細胞を富化させるステップを含む、方法。
【請求項４８】
未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から単離する方法であって、前記細胞集団から、細胞表面マーカとしてＳＴＲＯ−１抗原を発現し、細胞表面マーカとしてＨＳＰ７０を実質的に発現しない間質幹細胞を単離するステップを含む、方法。
【請求項４９】
未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から単離する方法であって、前記細胞集団から、ＳＴＲＯ−１＋ＨＳＰ７０−間質細胞を単離するステップを含む、方法。
【請求項５０】
未熟で中立的な間質幹細胞を特定する方法であって、ＨＳＣ７０細胞表面マーカを発現する間質幹細胞を特定するステップを含む、方法。
【請求項５１】
ＨＳＰ７０細胞表面マーカを実質的に発現しない細胞を特定するステップをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
未熟で中立的な間質幹細胞を富化させ、単離し、および／または特定するための薬剤を特定する方法であって：
候補薬剤が間質幹細胞のＨＳＣ７０に結合するか否かを判断するステップと；
前記候補薬剤を、未熟で中立的な間質幹細胞を富化させ、単離し、および／または特定するための薬剤として特定するステップとを含む、方法。
【請求項５３】
前記候補薬剤が間質細胞のＨＳＰ７０に実質的に結合しないか否かを判断するステップをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ＨＳＣ７０結合剤を特定する方法であって、ＨＳＣ７０には結合するが、ＨＳＰ７０には実質的に結合しない薬剤を特定するステップを含む、方法。
【請求項５５】
請求項１〜１９、２３、２４、２８〜３０、３５、３６、および４６〜５４の何れか一項に記載の方法を行うためのキット。
【請求項５６】
ＨＳＣ７０結合剤を含み、未熟で中立的な間質幹細胞を富化させおよび／または単離するためのキット。
【請求項５７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４のアミノ酸配列および／またはその変異体を含む、天然に存在しないポリペプチド。
【請求項５８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４のアミノ酸配列および／またはその機能的変異体を含む、ＳＴＲＯ−１アンタゴニスト。
【請求項５９】
ＳＴＲＯ−１結合を阻害する方法であって、請求項５７に記載のポリペプチドの使用および／または請求項５８に記載のアンタゴニストの使用を含む、方法。
【請求項６０】
細胞へのＳＴＲＯ−１結合を阻害する方法であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４のアミノ酸配列および／またはその機能的変異体を含む薬剤を用いてＳＴＲＯ−１の細胞への結合を阻害するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【優先権の主張】
【０００１】
本出願は、２０１５年６月１日に出願された米国仮特許出願２０１５９０２０３２号の優先権を主張するものであり、この文献の内容は参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、間質幹細胞を富化させ、単離するための方法および生成物に関する。本開示は、また、富化させ、単離した間質幹細胞に関する。
【背景技術】
【０００３】
間質幹細胞の臨床使用は、いくつかの病的状態の処置向けの発展中の方法である。種々の異なるタイプの間質幹細胞が存在し、これらの多くが、幹細胞をベースにした治療で用いられる可能性を秘める。
【０００４】
しかしながら、間質幹細胞の完全な臨床的可能性は、主に、細胞単離、培養、および特徴付けで用いられる方法の均一性の欠如、ならびに、選択技法が不均質な細胞集団を生成するという事実により、妨げられてきた。
【０００５】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、かなりの臨床的可能性を秘める間質幹細胞の１種である。臨床的に用いられるＭＳＣは、組織培養プラスチックに付着する機能、限られた数の細胞表面抗原の有無、および三系列分化能を有するという限定された基準に基づき、単離される。これらのプラスチック付着性（ＰＡ−ＭＳＣ）培養物はいくらか臨床的有効性を示しているが、ＰＡ−ＭＳＣ細胞集団は非常に不均質であり、より有効な未熟細胞はわずかに含まれるにすぎない。こうした理由で、ＰＡ−ＭＳＣの臨床的有用性には限界があった。
【０００６】
いくらかの間質幹細胞の免疫選択も利用されてきた。例えば、単クローン性抗体ＳＴＲＯ−１は、ＭＳＣ前駆体の見込み免疫選択のためのツールである。これは、この単クローン性抗体が、成人骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）（前記成人骨髄単核細胞はある割合でクローン原性である）の小集団（〜１０％）の表面に発現した抗原に結合するためである。
【０００７】
しかしながら、ＳＴＲＯ−１を用いて選択された細胞集団が非常に不均質であることも明らかになってきた。加えて、ＳＴＲＯ−１抗体はＧＭＰコンプライアンスで求められるウイルス不活性ステップで変性し、そのため、臨床的用途のためのＭＳＣ単離に容易に用いることはできない。
【０００８】
これらの理由により、現在可能な間質幹細胞集団よりもより治療的に強力な間質幹細胞集団を生じさせる、新しいマーカを特定する必要性がある。
【発明の概要】
【０００９】
本開示は、間質幹細胞を富化させ、単離するための方法および生成物に関する。
【００１０】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団から、ＨＳＣ７０結合剤を用いて間質幹細胞を富化させるステップを含む、方法を提供する。
【００１１】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団から、細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０を発現する間質細胞を富化させることにより、未熟で中立的な間質幹細胞を富化させるステップを含む、方法を提供する。
【００１２】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を富化させる方法であって：
間質幹細胞を含む細胞集団を提供するステップと；
前記細胞集団をＨＳＣ７０結合剤にさらすステップと；
細胞に結合した前記ＨＳＣ７０結合剤を用いて、前記細胞集団から間質細胞を富化させるステップとを含む、方法を提供する。
【００１３】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０を発現する細胞を検出することにより、前記細胞集団から間質細胞を富化させるステップを含む、方法を提供する。
【００１４】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間葉系幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団からＨＳＣ７０結合剤を用いて間葉系幹細胞を富化させるステップを含む、方法を提供する。
【００１５】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間葉系幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団から細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０を発現する間葉系幹細胞を富化させることにより、未熟で中立的な間質幹細胞を富化させるステップを含む、方法を提供する。
【００１６】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を富化させ、単離し、および／または特定するためのマーカとしてＨＳＣ７０を使用することを提供する。
【００１７】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を富化させ、単離し、および／または特定するためにＨＳＣ７０結合剤を使用することを提供する。
【００１８】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から単離する方法であって、前記細胞集団からＨＳＣ７０結合剤を用いて間質幹細胞を単離するステップを含む、方法を提供する。
【００１９】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を単離する方法であって：
間質幹細胞を含む細胞集団を提供するステップと；
前記細胞集団をＨＳＣ７０結合剤にさらすステップと；
細胞に結合した前記ＨＳＣ７０結合剤を用いて前記細胞集団から間質細胞を単離するステップとを含む、方法を提供する。
【００２０】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から単離する方法であって、前記細胞集団からＨＳＣ７０を発現する間質幹細胞を単離するステップを含む、方法を提供する。
【００２１】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間葉系幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から単離する方法であって、前記細胞集団からＨＳＣ７０結合剤を用いて間葉系幹細胞を単離するステップを含む、方法を提供する。
【００２２】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間葉系幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から単離する方法であって、前記細胞集団からＨＳＣ７０を発現する間葉系幹細胞を単離するステップを含む、方法を提供する。
【００２３】
本開示のある実施形態は、細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０を発現し、細胞表面マーカとしてＨＳＰ７０を実質的に発現しない、１つまたは複数の単離間質幹細胞を提供する。
【００２４】
本開示のある実施形態は、ＨＳＣ７０＋細胞表面マーカおよびＨＳＰ７０−細胞表面マーカを含む、１つまたは複数の単離間質幹細胞を提供する。
【００２５】
本開示のある実施形態は、ＨＳＣ７０ｂｒｉｇｈｔ細胞表面マーカおよびＨＳＰ７０ｄｉｍ細胞表面マーカを含む、１つまたは複数の単離間質幹細胞を提供する。
【００２６】
本開示のある実施形態は、細胞表面マーカとしてＳＴＲＯ−１抗原を発現し、細胞表面マーカとしてＨＳＰ７０を実質的に発現しない、１つまたは複数の単離間質幹細胞を提供する。
【００２７】
本開示のある実施形態は、ＳＴＲＯ−１＋細胞表面マーカおよびＨＳＰ７０−細胞表面マーカを含む、１つまたは複数の単離間質幹細胞を提供する。
【００２８】
本開示のある実施形態は、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞表面マーカおよびＨＳＰ７０ｄｉｍ細胞表面マーカを含む、１つまたは複数の単離間質幹細胞を提供する。
【００２９】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団から、細胞表面マーカとしてＳＴＲＯ−１抗原を発現し、細胞表面マーカとしてＨＳＰ７０を実質的に発現しない間質幹細胞を富化させるステップを含む、方法を提供する。
【００３０】
本開示のある実施形態は、間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団からＳＴＲＯ−１＋ＨＳＰ７０−間質幹細胞を富化させるステップを含む、方法を提供する。
【００３１】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から単離する方法であって、前記細胞集団から、細胞表面マーカとしてＳＴＲＯ−１抗原を発現し、細胞表面マーカとしてＨＳＰ７０を実質的に発現しない間質幹細胞を単離するステップを含む、方法を提供する。
【００３２】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から単離する方法であって、前記細胞集団から、ＳＴＲＯ−１＋ＨＳＰ７０−間質細胞を単離するステップを含む、方法を提供する。
【００３３】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を特定する方法であって、ＨＳＣ７０細胞表面マーカを発現する間質幹細胞を特定するステップを含む、方法を提供する。
【００３４】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を富化させ、単離し、および／または特定するための薬剤を特定する方法であって：
候補薬剤が間質幹細胞のＨＳＣ７０に結合するか否かを判断するステップと；
前記候補薬剤を、未熟で中立的な間質幹細胞を富化させ、単離し、および／または特定するための薬剤として特定するステップとを含む、方法を提供する。
【００３５】
本開示のある実施形態は、ＨＳＣ７０結合剤を含む、未熟で中立的な間質幹細胞を富化させおよび／または単離するためのキットを提供する。
【００３６】
本開示のある実施形態は、ＨＳＣ７０結合剤を特定する方法であって、ＨＳＣ７０には結合するが、ＨＳＰ７０には実質的に結合しない薬剤を特定するステップを含む、方法を提供する。
【００３７】
本開示のある実施形態は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４のアミノ酸配列および／またはその変異体を含む、単離した、および／または、天然に存在しないポリペプチドを提供する。
【００３８】
本開示のある実施形態は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４のアミノ酸配列および／またはその機能的変異体を含むＳＴＲＯ−１アンタゴニストを提供する。
【００３９】
本開示のある実施形態は、細胞へのＳＴＲＯ−１結合を阻害する方法であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４のアミノ酸配列および／またはその機能的変異体を含む薬剤を用いて、ＳＴＲＯ−１の細胞への結合を低減させるステップを含む、方法を提供する。
【００４０】
他の実施形態も本明細書で開示する。
【００４１】
ある実施形態は以下の図により例示する。以下の記載は、特定の実施形態のみについて記載することを目的とするものであり、記載に関し限定することを意図するものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ＳＴＲＯ−１抗原が、コレステロールの多いマイクロドメインに局在化していることを示す図である。
【図２】ＳＴＲＯ−１は７０ｋＤａタンパク質に結合することを示す図である。
【図３】ＳＴＲＯ−１は、熱ショック同族７０（ＨＳＣ７０；ＨＳＰＡ８）に結合することを示す図である。
【図４】ＳＴＲＯ−１はＨＳＣ７０およびＨＳＰ７０に結合し、ＳＴＲＯ−１の細胞表面結合はＨＳＣ７０またはＨＳＰ７０のタンパク質発現とは相関しないことを示す図である。
【図５】ＨＳＣ７０はＵＥ７Ｔ−１３細胞の表面に存在し、組み換えＨＳＣ７０を用いたＳＴＲＯ−１のプレインキュベーションがＵＥ７Ｔ−１３細胞へのＳＴＲＯ−１の結合をブロックすることを示す図である。
【図６】ＳＴＲＯ−１がＨＳＣ７０のＡＴＰアーゼドメインに結合することを示す図である。
【図７】ＨＳＣ７０におけるＳＴＲＯ−１エピトープの微細なマッピングを示す図である。
【図８】組み換えＨＳＣ７０は、細胞表面へのＳＴＲＯ−１の結合をブロックすることを示す図である。
【図９】抗サルモネラＩｇＭ陰性対照、１Ａ６．１２（Ａ）、ＧＳＴでプレインキュベーションしたＳＴＲＯ−１（Ｂ）、およびＧＳＴ−Ｌ３９３でプレインキュベーションしたＳＴＲＯ−１（Ｃ）を用いてＵＥ７Ｔ−１３細胞をインキュベーションした後に生成される蛍光シグナルのフローサイトメトリーヒストグラムを示す図である。Ａ〜Ｃの重ね合わせ（Ｄ）。結合したＩｇＭ抗体は、抗ＩｇＭ−ＰＥを用いて検出した。
【図１０】ヒトＢＭＭＮＣのＳＴＲＯ−１＋ｖｅ／ＨＳＰ７０−ｖｅ画分が全てのＣＦＵ−Ｆ活性を含むことを示す図である。
【図１１】２０−２０２ｓおよびＳＴＲＯ−１が異なる抗原特異性を有することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本開示は、前駆体間質幹細胞の富化および／または単離に関する。
【００４４】
本開示は、少なくとも一部分において、熱ショック同族タンパク質７０（ＨＳＣ７０）が、未熟で中立的な表現型を有する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の細胞表面マーカであるという認識に基づく。ＨＳＣ７０がこの前駆体幹細胞集団のみの細胞表面に発現するという認識は、概して、未熟で中立的な間質幹細胞の将来の富化／単離のための、特に研究および／または医療用の特有の識別子を提供する。
【００４５】
ＨＳＣ７０を、間質幹細胞の未熟な表現型に関連した細胞表面抗原として特定することは、また、予測不能である。これは、ＨＳＣ７０が細胞内熱ショック同族タンパク質であり、該タンパク質は、典型的には、細胞表面マーカとは考えられておらず、膜貫通ドメインを持たないためである。
【００４６】
本開示のある実施形態は、１つまたは複数の利点の組み合わせを有する方法および生成物を対象とする。例えば、本明細書に開示する実施形態のいくつかの利点として、以下のうち１つまたは複数が挙げられる：間質幹細胞の富化および／もしくは単離のための新規の細胞表面マーカを提供すること；未熟な幹細胞様表現型に関連する間質幹細胞表面マーカを特定すること；新規の間質幹細胞表面マーカを標的にする結合剤を提供すること；間質幹細胞を、例えば予想される臨床用途のために、将来富化させおよび／もしくは単離するための新規の方法を提供すること；組織培養プラスチックに付着する能力、事前に細胞表面抗原が存在するか否か、および／もしくは確実な分化能などの基準に基づかない、間質幹細胞を富化させおよび／もしくは単離する新規の方法を提供すること；典型的には、異種集合を生成するこれまでの方法の側面を改善すること；より均一でおよび／もしくは機能的に優れた間質幹細胞の集団を単離する新規の方法を提供すること；ＳＴＲＯ−１により認識される細胞表面抗原を決定すること；ＳＴＲＯ−１を利用して単離した間質幹細胞の特徴を改善すること；１つもしくは複数の利点を有する新規の方法および生成物を提供すること、ならびに／または商業的に有用な選択肢を提供すること、である。本開示のある実施形態の他の利点も、本明細書で開示する。
【００４７】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を富化させ、単離し、および／または特定するために、マーカとしてＨＳＣ７０を使用することを提供する。
【００４８】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を富化させ、単離し、および／または特定するために、ＨＳＣ７０結合剤を使用することを提供する。
【００４９】
本開示のある実施形態は、ＨＳＣ７０の表面発現を有する間質幹細胞を富化することにより、未熟で中立的な間質幹細胞を富化する方法を提供する。
【００５０】
本開示のある実施形態は、ＨＳＣ７０結合剤を用いて、未熟で中立的な間質幹細胞を富化する方法を提供する。
【００５１】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団からＨＳＣ７０結合剤を用いて間質幹細胞を富化させるステップを含む、方法を提供する。
【００５２】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団からＨＳＣ７０結合剤を用いて間質幹細胞を富化させて、未熟で中立的な間質幹細胞を富化させるステップを含む、方法を提供する。
【００５３】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、ＨＳＣ７０の表面発現を有する間質幹細胞を富化させるステップを含む、方法を提供する。
【００５４】
用語「間質幹細胞」は、本明細書で用いる場合、組織源の結合組織要素および潜在的には他の組織も生じさせ得る、任意の臓器に存在する自己再生型複能性細胞集団を指す。複能性細胞を指す。前記間質幹細胞としては、例えば、一部の条件下では、骨芽細胞、筋細胞、脂肪細胞、骨髄維持ストロマなどの中胚葉系列の細胞に分化し、一部の条件下では、神経様細胞などの非中胚葉細胞に分化する機能を有する細胞が挙げられる。
【００５５】
本明細書に記載するように、ＨＳＣ７０は、未熟で中立的な間質幹細胞の精製のためのマーカであると認識されてきた。こうして単離された細胞は、未熟な間質細胞および成熟した間質細胞の前駆体であり、限定するわけではないが、間葉系間質細胞、間葉系幹細胞、および骨幹細胞／前駆細胞が含まれる。
【００５６】
間質幹細胞は、当技術分野で既知の方法、例えば、Ｇｒｏｎｔｈｏｓ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１６（Ｐｔ  ９）：１８２７−３５に記載の方法で特定することができる。
【００５７】
例えば、間質幹細胞のマーカとしては、典型的には、レプチン受容体、低親和性ＮＧＦ受容体（ＣＤ２７１）、ＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体（ＣＤ１４０ａ，ｂ）、ＩＧＦ−１受容体、ＦＧＦ−１，２，３，４受容体、ＢＭＰ受容体、ＴＧＦベータ受容体、アルカリホスファターゼ、トロンボモジュリン、ビメチン、インテグリンベータ５、ネスチン、幹細胞因子、コラーゲンＩ型、コラーゲンＶＩ型、ＨＳＰ９０、ＲＡＮＫＬ、ＳＴＲＯ−１抗原、ＣＸＣＬ１２、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ，ｂ，ｄ，ｅ，ｆ、ＣＤ５１、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ６１、ＣＤ７３ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４４、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６、ＣＤ１８４、およびＣＤ２００などの陽性マーカ、ならびに／または、ｃ−ｆｍｓ  Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ−Ａ、ＨＬＡ−ＤＲ、フォンヴィレブランド因子、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）などのマーカの欠如が挙げられる。
【００５８】
ある実施形態では、間質幹細胞は間葉系幹細胞を含む。ある実施形態では、間質幹細胞は骨軟骨性幹細胞を含む。間葉系細胞および骨軟骨性細胞を特定する方法は、当技術分野において既知である。他のタイプの幹細胞についても検討する。
【００５９】
ある実施形態では、細胞集団には、胎盤、臍帯、臍帯血、歯芽組織、象牙質／歯髄組織、歯根膜、歯肉、皮膚、髪、卵胞、羊水、脂肪組織、平滑筋、骨格筋、腱、靱帯、骨、軟骨、骨髄、および／もしくは末梢血より得た、ならびに／または、由来するもしくは生じた間質幹細胞が含まれる。他のタイプの供給源についても検討する。このような細胞を生成する方法は、例えば、Ｇｒｏｎｔｈｏｓ  Ｓ．，Ｚａｎｎｅｔｔｉｎｏ  ＡＣＷ，Ｋｏｒｔｅｓｉｄｉｓ  Ａ，Ｓｈｉ  Ｓ，Ｇｒａｖｅｓ  ＳＥ，Ｈａｙ  ＳＪ，Ｓｉｍｍｏｎｓ  ＰＪ（２００３）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１６：１８２７−１８３５；Ｓｈｉ  Ｓ．ａｎｄ  Ｇｒｏｎｔｈｏｓ  Ｓ．（２００３）  Ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ  Ｎｉｃｈｅ  ｏｆ  Ｐｏｓｔｎａｔａｌ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  ａｎｄ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｐｕｌｐ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８（４）：６９６−７０４；Ｚａｎｎｅｔｔｉｎｏ  ＡＣＷ，Ｐａｔｏｎ  Ｓ，Ｋｏｒｔｅｓｉｄｉｓ  Ａ，Ｋｈｏｒ  Ｆ，Ｉｔｅｓｃｕ  Ｓ，Ｇｒｏｎｔｈｏｓ  Ｓ（２００７）Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｌｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｄｉｓｃｒｅｔｅ  Ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ／ＣＤ３４−／ＣＤ４５−／Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ−Ａ−Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｃｅｌｌｓ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ９２  １７０７−１７０８；ＡＮＤ  Ｚａｎｎｅｔｔｉｎｏ  ＡＣ，Ｐａｔｏｎ  Ｓ，Ａｒｔｈｕｒ  Ａ，Ｋｈｏｒ  Ｆ，Ｉｔｅｓｃｕ  Ｓ，Ｇｉｍｂｌｅ  ＪＭ，Ｇｒｏｎｔｈｏｓ  Ｓ（２００８）Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ａ  ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２１４（２）：４１３−４２１に記載されているように、当技術分野で既知である。
【００６０】
ある実施形態では、細胞集団には、多能性幹細胞から生じた間質幹細胞、人工多能性幹細胞、体細胞核移植から生じた細胞、および／または成体幹細胞が含まれる。このような細胞を生成する方法は当技術分野において既知である。
【００６１】
用語「富化させること（ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ）」ならびに「富化させる（ｅｎｒｉｃｈ）」および「富化させた（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）」などの関連の用語は、本明細書で用いる場合、（他の細胞などの）種の混合物中の、特定の細胞タイプなどの１つまたは複数の特定の種の集団を増加させることを含む。富化には、１つまたは複数の富化ステップが含まれ得る。
【００６２】
ある実施形態では、未熟で中立的な間質幹細胞の富化には、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも１０，０００倍、または少なくとも５０，０００倍の富化が含まれる。他のレベルの富化についても検討する。
【００６３】
ある実施形態では、富化は、未熟で中立的な間質幹細胞が集団の総細胞の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％を占める細胞集団をもたらす。他のレベルの富化についても検討する。ある実施形態では、富化は、未熟で中立的な間質幹細胞が集団の総細胞の約５０％以上を占める細胞集団をもたらす。ある実施形態では、富化は、未熟で中立的な間質幹細胞が集団の総細胞の約９０％以上を占める細胞集団をもたらす。ある実施形態では、富化は、未熟で中立的な間質幹細胞が集団の総細胞の約９５％以上を占める細胞集団をもたらす。ある実施形態では、富化は、未熟で中立的な間質幹細胞が集団の総細胞の約９９％以上を占める細胞集団をもたらす。
【００６４】
ある実施形態では、富化は、間質幹細胞を細胞集団から富化させ、その結果、富化させた未熟で中立的な間質幹細胞が、実質的に、存在する唯一の細胞であるようにすることを含む。
【００６５】
ＨＳＣ７０は、タンパク質のＨＳＰ７０ファミリーのメンバーであり、これには、熱誘導性メンバーおよび恒常的に発現したメンバーの両方が含まれる。ＨＳＣ７０は、ＨＳＰＡ８遺伝子によりコードされる。その機能のうち、ＨＳＣ７０はシャペロンとして機能するようで、新生ポリペプチドに結合して正しい折りたたみを促進する。異なるアイソフォームをコードする選択的にスプライシングされた転写変異体が、ＨＳＰＡ８遺伝子で発見された。
【００６６】
ヒトにおいて、タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ識別子Ｐ１１１４２−ＨＳＰ７Ｃ＿ＨＵＭＡＮを有する。
【００６７】
主なヒトアイソフォームのアミノ酸配列は、以下の通りである（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）：
【００６８】
ＭＳＫＧＰＡＶＧＩＤ  ＬＧＴＴＹＳＣＶＧＶ  ＦＱＨＧＫＶＥＩＩＡ  ＮＤＱＧＮＲＴＴＰＳ  ＹＶＡＦＴＤＴＥＲＬ  ＩＧＤＡＡＫＮＱＶＡ  ＭＮＰＴＮＴＶＦＤＡ  ＫＲＬＩＧＲＲＦＤＤ  ＡＶＶＱＳＤＭＫＨＷ  ＰＦＭＶＶＮＤＡＧＲ  ＰＫＶＱＶＥＹＫＧＥ  ＴＫＳＦＹＰＥＥＶＳ  ＳＭＶＬＴＫＭＫＥＩ  ＡＥＡＹＬＧＫＴＶＴ  ＮＡＶＶＴＶＰＡＹＦ  ＮＤＳＱＲＱＡＴＫＤ  ＡＧＴＩＡＧＬＮＶＬ  ＲＩＩＮＥＰＴＡＡＡ  ＩＡＹＧＬＤＫＫＶＧ  ＡＥＲＮＶＬＩＦＤＬ  ＧＧＧＴＦＤＶＳＩＬ  ＴＩＥＤＧＩＦＥＶＫ  ＳＴＡＧＤＴＨＬＧＧ  ＥＤＦＤＮＲＭＶＮＨ  ＦＩＡＥＦＫＲＫＨＫ  ＫＤＩＳＥＮＫＲＡＶ  ＲＲＬＲＴＡＣＥＲＡ  ＫＲＴＬＳＳＳＴＱＡ  ＳＩＥＩＤＳＬＹＥＧ  ＩＤＦＹＴＳＩＴＲＡ  ＲＦＥＥＬＮＡＤＬＦ  ＲＧＴＬＤＰＶＥＫＡ  ＬＲＤＡＫＬＤＫＳＱ  ＩＨＤＩＶＬＶＧＧＳ  ＴＲＩＰＫＩＱＫＬＬ  ＱＤＦＦＮＧＫＥＬＮ  ＫＳＩＮＰＤＥＡＶＡ  ＹＧＡＡＶＱＡＡＩＬ  ＳＧＤＫＳＥＮＶＱＤ  ＬＬＬＬＤＶＴＰＬＳ  ＬＧＩＥＴＡＧＧＶＭ  ＴＶＬＩＫＲＮＴＴＩ  ＰＴＫＱＴＱＴＦＴＴ  ＹＳＤＮＱＰＧＶＬＩ  ＱＶＹＥＧＥＲＡＭＴ  ＫＤＮＮＬＬＧＫＦＥ  ＬＴＧＩＰＰＡＰＲＧ  ＶＰＱＩＥＶＴＦＤＩ  ＤＡＮＧＩＬＮＶＳＡ  ＶＤＫＳＴＧＫＥＮＫ  ＩＴＩＴＮＤＫＧＲＬ  ＳＫＥＤＩＥＲＭＶＱ  ＥＡＥＫＹＫＡＥＤＥ  ＫＱＲＤＫＶＳＳＫＮ  ＳＬＥＳＹＡＦＮＭＫ  ＡＴＶＥＤＥＫＬＱＧ  ＫＩＮＤＥＤＫＱＫＩ  ＬＤＫＣＮＥＩＩＮＷ  ＬＤＫＮＱＴＡＥＫＥ  ＥＦＥＨＱＱＫＥＬＥ  ＫＶＣＮＰＩＩＴＫＬ  ＹＱＳＡＧＧＭＰＧＧ  ＭＰＧＧＦＰＧＧＧＡ  ＰＰＳＧＧＡＳＳＧＰ  ＴＩＥＥＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）。
【００６９】
ヒト遺伝子のヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＧ＿０２９４７３．１で提供される通りである。
【００７０】
ＨＳＣ７０、そのホモログ、パラログ、および／またはその変異体、ならびに他の種のＨＳＣ７０は、全て容易に特定でき、これらは本開示の範囲内に含まれる。他の種の関連する遺伝子およびタンパク質を含む、関連する遺伝子およびタンパク質を決定する方法は既知であり、該方法としては、例えば、アライメントプログラムのＢＬＡＳＴセットなどの核酸およびタンパク質のアライメントプログラムが挙げられる。
【００７１】
ある実施形態では、富化方法はヒトＨＳＣ７０を用い、および／または、富化方法を用いてヒト対象由来の細胞を富化させる。
【００７２】
ある実施形態では、富化方法は非ヒトＨＳＣ７０を用い、および／または、富化方法を用いて、非ヒト対象由来の細胞を富化させる。例えば、前記方法を用いて、未熟で中立的な間質幹細胞を、哺乳類対象、家畜動物（ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタなど）、飼育動物（イヌまたはネコなど）、ならびに非ヒト霊長類、ウサギ、ラット、マウス、および実験動物などの他のタイプの動物から富化させることができる。本開示を獣医学に適用することについても検討する。
【００７３】
ＨＳＣ７０の発現を検出する方法は当技術分野において既知である。細胞を富化させるためにマーカを使用する方法は、フローサイトメトリーまたはアフィニティ精製など、当技術分野において既知である。
【００７４】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤を用いて、未熟で中立的な間質幹細胞を富化させる。
【００７５】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤を用いて、未熟で中立的な間質幹細胞をヒト対象から富化させる。
【００７６】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤を用いて、未熟で中立的な間質幹細胞を非ヒト対象から富化させる。非ヒト対象は、本明細書で記載の通りである。
【００７７】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、抗体および／もしくはその抗原結合部、小分子、核酸、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、リガンド、またはリガンドミメティックのうち１つまたは複数を含む。他のタイプの薬剤についても検討する。
【００７８】
ある実施形態では、本方法は、細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０を発現する細胞を富化させるステップを含む。
【００７９】
ある実施形態では、本方法は、ＨＳＣ７０結合剤を、細胞表面ＨＳＣ７０に結合させるステップを含む。ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、細胞表面ＨＳＣ７０に結合する。ある実施形態では、本方法は、ＨＳＣ７０結合剤を、細胞膜関連ＨＳＣ７０に結合させるステップを含む。薬剤の細胞表面マーカへの結合を検出する方法は、当技術分野において既知である。
【００８０】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、ＨＳＣ７０タンパク質に対するリガンドを含む。ある実施形態では、前記リガンドは、ＨＳＣ７０に対するリガンドの全てまたは一部を含む。ある実施形態では、前記リガンドは、天然に存在するＨＳＣ７０に対するリガンドの全てまたは一部を含む。ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、ＨＳＣ７０リガンドに対するリガンドの可溶性部分を含む。
【００８１】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、ＨＳＣ７０には結合するが、ＨＳＰ７０には実質的に結合しない。ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、ＨＳＣ７０への結合について解離定数（Ｋｄ）を有し、これは、ＨＳＰ７０との結合のＫｄの少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも１０００倍である。結合の親和性を決定する方法は、当技術分野において既知である。
【００８２】
ある実施形態では、本方法は、細胞に結合したＨＳＣ７０結合剤を用いて細胞を富化させるステップを含む。
【００８３】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団から細胞に結合したＨＳＣ７０結合剤を用いて間質幹細胞を富化させるステップを含む、方法を提供する。
【００８４】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、ＥＷＩ−２タンパク質（ＣＤ３１６）および／もしくはその変異体の全てまたは一部を含む。ＥＷＩ−２は、Ｋｅｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２７（２１）：７７１８−２６に記載されているように、ＨＳＣ７０のリガンドである。
【００８５】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、ＥＷＩ−２タンパク質（ＣＤ３１６）および／もしくはその変異体の全てまたは一部を含む。ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、可溶性形態のＥＷＩ−２タンパク質（ＣＤ３１６）および／またはその変異体を含む。ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、Ｋｅｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２７（２１）：７７１８−２６に記載されているように、ＥＷＩ−２タンパク質（ＣＤ３１６）および／またはその変異体、例えば、ｈＩｇＧ重鎖のＪ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインに縮合したアミノ酸１〜５７４を含む、４つの細胞外ドメインを有するｓＥＷＩ−２−ｈＩｇタンパク質などの、細胞外ドメイン／領域の全てまたは一部を含む。
【００８６】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、抗体および／またはその抗原結合部を含む。
【００８７】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、ＨＳＣ７０タンパク質に対する、抗体および／またはその抗原結合部を含む。ＨＳＣ７０タンパク質に対する抗体は、本明細書に記載するように、混雑ＳＴＲＯ−１抗体のように、商業的に生成または獲得することができる。ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、ヒトＨＳＣ７０に対する抗体を含む。
【００８８】
多クローン性および単クローン性の抗ＨＳＣ７０抗体は、例えば、Ａｂｃａｍ  ａｎｄ  ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃなどの供給源から、商業的に生成または獲得することができる。
【００８９】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、ＨＳＣ７０には結合するが、ＨＳＰ７０には実質的に結合しない、抗体およびその抗原結合部を含む。ある実施形態では、抗ＨＳＣ７０抗体は、ＨＳＣ７０との結合について解離定数Ｋｄを有し、これは、ＨＳＰ７０との結合のＫｄの少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも１０００倍である。結合の親和性を決定する方法は、当技術分野において既知である。ある実施形態では、抗ＨＳＣ７０抗体は、ＨＳＰ７０に実質的に結合しない。
【００９０】
ＨＳＣ７０のエピトープに結合する単クローン性抗体およびまたはその抗原結合部は、当技術分野で既知の方法により生成することができる。
【００９１】
ある実施形態では、抗体および／またはその抗原結合部は、ＨＳＣ７０の１つまたは複数のエピトープには結合するが、ＨＳＰ７０には実質的に結合しない。
【００９２】
用語「抗体」は、本明細書で用いる場合、別の分子の抗原領域に結合する機能を有する免疫グロブリン分子を指し、これには、単クローン性抗体、多クローン性抗体、多価抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、および、所望の親和性で別の分子の抗原領域に結合する機能を有し、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、もしくは、特異的抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリン（もしくは免疫グロブリンの変異体）の少なくとも一部を含むポリペプチド、例えば、１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む分子などを含む、免疫グロブリン分子の断片／一部、またはその組み合わせが含まれる。
【００９３】
この点について、免疫グロブリンは四分割分子であり、各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一組からなり、各組は、１つの軽鎖と１つの重鎖を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクタ機能を主に担う定常領域を定義する。ヒト軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖として分類される。重鎖は、μ、Δ、γ、α、またはεとして分類され、抗体のイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとそれぞれ定義する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により結合し、重鎖は、また、さらに約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。各軽鎖／重鎖の対の可変領域は、抗体結合部位を形成し、結果として、無傷の免疫グロブリンは２つの結合部位を有する。可変領域は、さらに、抗原結合部位の形成に直接関係する高度可変領域を含む。これらの高度可変領域は、通常、相補性決定領域（ＣＤＲ）という。介在区分は、フレームワーク領域（ＦＲ）という。軽鎖および重鎖の両方に、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｉ〜ＣＤＲ−３）および４つのＦＲ（ＦＲ−Ｉ〜ＦＲ−４）がある。
【００９４】
ある実施形態では、抗原結合断片／部分には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、二重特異性抗体、または、特異的抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドが含まれる。
【００９５】
Ｆａｂ断片は、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ  Ｉドメインからなる一価断片である。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結した２つのＦａｂ断片を含む二価断片である。Ｆｄ断片は、ＶＨドメインおよびＣＨ  Ｉドメインからなる。Ｆｖ断片は、抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなる。ｄＡｂは、ＶＨドメインからなる。一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対になって、該領域を単一タンパク質鎖とすることを可能にする合成リンカーを介して一価分子を形成した抗体である。二重特異性抗体は二価の二重特異性抗体であり、ここでは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖で発現するが、同一鎖上の２つのドメインの間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることによりドメインを別の鎖の相補的ドメインと対にして、２つの抗原結合部位を作り出す。
【００９６】
特異的結合部位を含む抗体断片または抗体の一部は、既知の方法により生成することができる。抗原結合断片または抗体の部分／一部を生成する方法は、例えば、”Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（２００４）  ｅｄ．  ｂｙ  Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（参照により本明細書に組み込まれるものとする）および”Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”（１９９６）ｅｄ．ｂｙ  Ｊ．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｈ．Ｒ．Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  ＤＪ．Ｃｈｒｉｓｗｅｌｌ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（参照により本明細書に組み込まれるものとする）に記載されているように、当技術分野において既知である。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体分子のペプシン消化により生成することが可能であり、Ｆａｂ断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を減少させることにより生成することが可能である。あるいは、例えば、Ｈｕｓｅ，Ｗ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１２７５−１２８１（参照により本明細書に組み込まれるものとする）に記載されているように、Ｆａｂ発現ライブラリを構築して、所望の特異性を有する単クローン性Ｆａｂ断片を迅速かつ容易に特定することを可能にすることができる。
【００９７】
抗体は、既知の方法を用いて生成することができる。抗体の生成のため、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト、および他を含む種々のホストを、適切な抗原を注射することにより免疫性を与えることができる。ホストの種類に応じ、種々のアジュバントを用いて免疫反応を増大させることができる。このようなアジュバントとしては、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、ならびに、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールなどの界面活性物質が挙げられる。アジュバントは商業的に入手可能である。
【００９８】
ある実施形態では、抗体は多クローン性抗体である。多クローン性抗体は、異なる抗原特異性を有する抗体の混合物である。多クローン性抗体を生成し単離する方法は、当技術分野において既知である。概して、多クローン性抗体は、Ｂリンパ球から生成される。典型的には、多クローン性抗体は、免疫化動物などの免疫化対象から直接得られる。
【００９９】
ある実施形態では、抗体は単クローン性抗体である。単クローン性抗体は、培養下の連続単離細胞により抗体分子の生成を提供する技法を用いて、調製することができる。該技法としては、限定するわけではないが、ハイブリドーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法、およびＥＢＶハイブリドーマ技法が挙げられる。単クローン性抗体を調製する方法としては、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（参照により本明細書に組み込まれるものとする）；Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８１：３１−４２（参照により本明細書に組み込まれるものとする）；Ｃｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２０２６−２０３０（参照により本明細書に組み込まれるものとする）；およびＣｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６２：１０９−１２０（参照により本明細書に組み込まれるものとする）が挙げられる。
【０１００】
ある実施形態では、抗体および／またはその抗原結合断片には、単離した抗体が含まれる。多クローン性抗体および単クローン性抗体を生成し単離する方法は、既知である。ある実施形態では、抗体および／またはその抗原結合部は、精製された抗体および／またはその結合部である。
【０１０１】
ある実施形態では、本明細書に記載する抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、およびＩｇＡからなる群から選択されるイソタイプを有する。抗体のイソタイプの決定は、既知の方法により得る。
【０１０２】
ある実施形態では、抗体および／またはその抗原結合断片／部は、マウス抗体および／もしくはその抗原結合断片／部、ヒト抗体および／もしくはその抗原結合断片／部、または、ヒト化抗体および／もしくはその抗原結合断片／部である。
【０１０３】
ヒト化抗体または他の哺乳類による非拒絶反応向けに適合させた抗体は、例えば、リサーフェシングまたはＣＤＲグラフティングを含む、当技術分野で既知の適切な方法により生成することができる。リサーフェシング技法では、分子モデリング、統計解析、および突然変異誘発を組み合わせて可変領域の非ＣＤＲ表面を調節して、標的ホストの既知の抗体の表面に似せる。抗体をリサーフェシングする戦略および方法、ならびに、異なるホスト内の抗体の免疫原性を低減させる他の方法は、例えば、米国特許第５６３９６４１号明細書に記載されているように、既知である。抗体のヒト化形態は、また、ＣＤＲグラフティングにより、例えば、マウス抗体の相補性決定領域をヒトフレームワークドメインに替えることにより、作成することができる。
【０１０４】
抗体をヒト化させる方法は既知である。例えば、抗体は、米国特許第６１８０３７０号明細書（参照により本明細書に組み込まれるものとする）；国際公開第９２／２２６５３号（参照により本明細書に組み込まれるものとする）；Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（３，４）：１２５−１６８（参照により本明細書に組み込まれるものとする）；およびＧｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍａｔｏｃｙｓｔ  ７７（４）：７５５−７５９）（参照により本明細書に組み込まれるものとする）に記載されているように、生成することができる。
【０１０５】
ヒト化抗体は、典型的には、ヒト抗体に実質的または排他的に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）および対象の非ヒト抗体に実質的または排他的に由来するＣＤＲ以外に、定常領域および可変領域を有する。
【０１０６】
「キメラ抗体」の生成向けに発展した技法、例えば、適切な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るための、マウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシングは、適切な方法により実行することができる。例えば、キメラ抗体は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５（参照により本明細書に組み込まれるものとする）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（参照により本明細書に組み込まれるものとする）；およびＴａｋｅｄａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（参照により本明細書に組み込まれるものとする）に記載されているように、生成することができる。
【０１０７】
イムノアッセイをスクリーニングに用いて、所望の特異性を有する抗体および／またはその抗原結合断片／部を特定することができる。多クローン性抗体または単クローン性抗体の何れかを用いた競争的結合または免疫放射定量測定法についてのプロトコルは既知である。
【０１０８】
抗体分子およびその抗原結合断片／部は、また、当技術分野で既知の方法により、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系における発現により、組み換え的に生成することができる。例えば、組み換え抗体を生成する方法は、米国特許第４８１６５６７号明細書に記載の通りであり、これは参照により本明細書に組み込まれるものとする。抗原結合断片／部は、また、ファージディスプレイ技術により生成することができ、これは既知である。
【０１０９】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、ＳＴＲＯ−１単クローン性抗体をおよび／またはその抗原結合断片／部を含む。ＳＴＲＯ−１抗体は、例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＡＢ１０３８）から得られるように、商業的に入手可能である。ＳＴＲＯ−１抗体は、また、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ，Ｉｏｗａ  ５２２４２−１３２４からも得ることができる。
【０１１０】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤はＨＳＰ７０に実質的に結合しない。ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、ＨＳＣ７０との結合について解離定数Ｋｄを有し、これは、ＨＳＰ７０との結合のＫｄの少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも１０００倍である。結合の親和性を決定する方法は、当技術分野で既知である。
【０１１１】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、細胞表面ＨＳＣ７０には結合し、細胞表面ＨＳＰ７０には実質的に結合しない。
【０１１２】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、以下の遺伝子の１つまたは複数から選択されるＨＳＰ７０ファミリーメンバーによりコードされるタンパク質には実質的に結合しない：ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＨＳＰＡ１Ｌ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ４、ＨＳＰＡ４Ｌ、ＨＳＰＡ５、ＨＳＰＡ６、ＨＳＰＡ７、ＨＳＰＡ９、ＨＳＰＡ１２Ａ、およびＨＳＰＡ１４。
【０１１３】
ある実施形態では、本方法は、細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０を発現し、細胞表面マーカとしてＨＳＰ７０を実質的に発現しない細胞を富化させるステップを含む。ある実施形態では、本方法は、細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０を発現し、細胞表面マーカとしてＨＳＰ７０の発現レベルが低いまた低下した細胞を富化させるステップを含む。
【０１１４】
本開示のある実施形態は、ＨＳＣ７０の表面発現を有する間質幹細胞を富化させることにより未熟で中立的な間質幹細胞を富化させる方法であって、前記富化させた細胞は、細胞表面ＨＳＰ７０を実質的に発現しない、方法を提供する。
【０１１５】
本開示のある実施形態は、ＨＳＣ７０の表面発現を有するが、ＨＳＰ７０の表面発現は実質的に有さない間質幹細胞を富化させることにより、未熟で中立的な間質幹細胞を富化させる方法を提供する。
【０１１６】
本開示のある実施形態は、ＨＳＣ７０結合剤を用いて、未熟で中立的な間質幹細胞を富化させる方法であって、前記富化させた細胞は、細胞表面ＨＳＰ７０を実質的に発現しない、方法を提供する。
【０１１７】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団からＨＳＣ７０結合剤を用いて間質幹細胞を富化させるステップを含み、前記富化させた細胞は、細胞表面ＨＳＰ７０を実質的に発現しない、方法を提供する。
【０１１８】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団から、未熟で中立的な間質幹細胞を富化させるＨＳＣ７０結合剤を用いて間質幹細胞を富化させるステップを含み、前記富化させた細胞は、細胞表面ＨＳＰ７０を実質的に発現しない、方法を提供する。
【０１１９】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、ＨＳＣ７０の表面発現を有し、ＨＳＰ７０の表面発現は実質的に有さない間質幹細胞を富化させるステップを含む、方法を提供する。
【０１２０】
細胞を富化させる方法は当技術分野において既知である。ある実施形態では、細胞を富化させる方法には、フローサイトメトリー、セルソーティング、磁気活性化セルソーティング（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＭＡＣＳ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙまたはＤｙｎａｌ磁気ビーズ選択で商業的に用いられるような）、抗体パニング、および赤血球細胞ロゼッティングが含まれる。他の富化方法についても検討する。
【０１２１】
ある実施形態では、本方法は、フローサイトメトリーを用いた多数のソーティングステップなど、１つまたは複数のステップを含む。
【０１２２】
ある実施形態では、本方法は、異なるＨＳＣ７０結合剤の使用を含む。例えば、細胞を、最初にＳＴＲＯ−１結合についてソートし、続いて、異なるＨＳＣ７０結合剤を用いてソートすることができ、例えば、ソートした細胞のＳＴＲＯ−１集団を、ＨＳＣ７０結合剤を用いて、さらにソートする。
【０１２３】
ある実施形態では、本方法は、マーカの発現が低減した、または、実質的にマーカを発現しない細胞を富化させるステップを含む。ある実施形態では、本方法は、細胞表面マーカの発現が低減した、または細胞表面マーカを実質的に発現しない細胞を富化させるステップを含む。例えば、フローサイトメトリーを用いて、１つのマーカ（例えば、ＨＳＣ７０；ＳＴＲＯ−１）については陽性であり、別のマーカ（ＨＳＰ７０）については陰性である細胞を富化させることができる。
【０１２４】
ある実施形態では、本方法は、ＨＳＣ７０＋かつＨＳＰ７０−である細胞を富化させるステップを含む。
【０１２５】
この点について、ＨＳＰ７０−である細胞としては、例えば、実質的に検出可能な細胞表面ＨＳＰ７０を発現しない細胞、および、ＨＳＰ７０の発現が、細胞表面に発現する通常レベルのＨＳＰ７０まで実質的に低下した細胞が挙げられる。
【０１２６】
ある実施形態では、本方法は、ＨＳＣ７０ｂｒｉｇｈｔかつＨＳＰ７０ｄｉｍである細胞を富化させるステップを含む。
【０１２７】
ある実施形態では、本方法は、レプチン受容体、低親和性ＮＧＦ受容体（ＣＤ２７１）、ＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体（ＣＤ１４０ａ，ｂ）、ＩＧＦ−１受容体、ＦＧＦ−１，２，３，４受容体、ＢＭＰ受容体、ＴＧＦベータ受容体、アルカリホスファターゼ、トロンボモジュリン、ビメチン、インテグリンベータ５、ネスチン、幹細胞因子、コラーゲンＩ型、コラーゲンＶＩ型、ＨＳＰ９０、ＲＡＮＫＬ、ＳＴＲＯ−１抗原、ＣＸＣＬ１２、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ，ｂ，ｄ，ｅ，ｆ、ＣＤ５１、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ６１、ＣＤ７３ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４４、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６、ＣＤ１８４、およびＣＤ２００からなる群から選択される１つまたは複数のマーカを発現する細胞を富化させるステップを含む。このようなマーカを検出する方法は、当技術分野において既知である。
【０１２８】
ある実施形態では、本方法は、ｃ−ｆｍｓ Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ−Ａ、ＨＬＡ−ＤＲ、フォンヴィレブランド因子、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）からなる群から選択される１つまたは複数のマーカを実質的に発現しない細胞を富化させるステップを含む。このようなマーカの欠如を確認する方法は、当技術分野で既知である。
【０１２９】
ある実施形態では、本方法は、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔかつＨＳＰ７０ｄｉｍである細胞を富化させるステップを含む。
【０１３０】
ある実施形態では、本方法は、ＳＴＲＯ−１＋かつＨＳＰ７０−である細胞を富化させるステップを含む。
【０１３１】
ある実施形態では、富化間質幹細胞はクローン原性である細胞を含む。ある実施形態では、富化間質幹細胞は、クローン原性細胞を含む。ある実施形態では、富化間質幹細胞は、かなり大きな割合のクローン原性細胞を含む。ある実施形態では、富化間質幹細胞は、全て実質的にクローン原性である。
【０１３２】
ある実施形態では、本方法は、間質幹細胞を含む細胞集団を提供するステップを含む。間質幹細胞を含む細胞集団は、本明細書に記載の通りである。
【０１３３】
ある実施形態では、細胞集団には、対象から得られるまたは対象に由来する細胞が含まれる。ある実施形態では、細胞集団には、ヒト対象から得られるまたはヒト対象に由来する細胞が含まれる。ある実施形態では、細胞集団には、哺乳類対象、家畜動物（ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタなど）、飼育動物（イヌまたはネコなど）などの非ヒト対象、ならびに非ヒト霊長類、ウサギ、ラット、マウス、および実験動物などの他のタイプの動物から得られるまたはそれに由来する細胞が含まれる。
【０１３４】
ある実施形態では、細胞集団には、多能性幹細胞から生じた細胞、人工多能性幹細胞から生じた細胞、体細胞核移植から生じた細胞、および／または成体幹細胞などの供給源から得られるまたはそれに由来するまたはそれから生じる細胞が含まれる。
【０１３５】
ある実施形態では、対象または別の供給源から得られるまたはそれに由来する細胞を処理して、間質幹細胞の富化を可能にする。
【０１３６】
ある実施形態では、本方法は、細胞集団をＨＳＣ７０結合剤にさらすステップを含む。ある実施形態では、本方法は、細胞集団を、ＨＳＣ７０には結合するがＨＳＰ７０には実質的に結合しない結合剤にさらすステップを含む。細胞を結合剤にさらす方法は、当技術分野において既知である。
【０１３７】
ある実施形態では、本方法は、細胞に結合したＨＳＣ７０結合剤を用いて、間質細胞を細胞集団から富化させるステップを含む。
【０１３８】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を富化させる方法であって：
間質幹細胞を含む細胞集団を提供するステップと；
前記細胞集団をＨＳＣ７０結合剤にさらすステップと；
細胞に結合した前記ＨＳＣ７０結合剤を用いて前記細胞集団から間質細胞を富化させるステップとを含む、方法を提供する。
【０１３９】
ある実施形態では、間質幹細胞の富化は、細胞表面ＨＳＣ７０を発現する細胞を検出するステップを含む。ある実施形態では、本方法は、ＨＳＣ７０を発現する細胞を検出することにより、間質細胞を細胞集団から富化させるステップを含む。ある実施形態では、本方法は、ＨＳＣ７０結合剤を用いて、細胞表面ＨＳＣ７０を発現する細胞を検出するステップを含む。
【０１４０】
ある実施形態では、間質幹細胞の富化は、細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０を発現する細胞を検出するステップを含む。ある実施形態では、本方法は、細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０を発現する細胞を検出することにより間質幹細胞を細胞集団から富化させるステップを含む。ある実施形態では、本方法は、ＨＳＣ７０結合剤を用いて、細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０を発現する細胞を検出するステップを含む。ある実施形態では、本方法は、ＨＳＣ７０結合剤に結合した細胞を検出することにより、間質細胞を細胞集団から富化させるステップを含む。
【０１４１】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団から、細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０を発現する細胞を検出することにより間質細胞を富化させるステップを含む、方法を提供する。
【０１４２】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団から、細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０を発現する間質細胞を富化させることにより、未熟で中立的な間質幹細胞を富化させるステップを含む、方法を提供する。
【０１４３】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団から、ＨＳＣ７０結合剤に結合した細胞を検出することにより間質細胞を富化させるステップを含む、方法を提供する。
【０１４４】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を富化させる方法を提供する。
【０１４５】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的なＭＳＣを富化させる方法であって、ＨＳＣ７０結合剤を用いて間質幹細胞を富化させるステップを含む、方法を提供する。
【０１４６】
間質幹細胞を富化させる方法は、本明細書に記載の通りである。ＨＳＣ７０結合剤および結合剤を使用する方法は、本明細書に記載の通りである。
【０１４７】
本開示のある実施形態は、本明細書に記載の方法により富化させた間質幹細胞を提供する。
【０１４８】
ある実施形態では、富化間質幹細胞は、クローン原性細胞を含む。
【０１４９】
ある実施形態では、富化間質幹細胞は、ＨＳＣ７０＋かつＨＳＰ７０−である。ある実施形態では、富化間質幹細胞は、ＨＳＣ７０ｂｒｉｇｈｔかつＨＳＰ７０ｄｉｍである。ある実施形態では、富化間質幹細胞はＳＴＲＯ−１＋かつＨＳＰ７０−である。ある実施形態では、富化間質細胞はＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔかつＨＳＰ７０ｄｉｍである。
【０１５０】
ある実施形態では、富化間質幹細胞は、未熟で中立的なＭＳＣを含む。
【０１５１】
ある実施形態では、富化間質幹細胞はＨＳＣ７０＋かつＨＳＰ７０−である。ある実施形態では、富化間質細胞はＨＳＣ７０ｂｒｉｇｈｔかつＨＳＰ７０ｄｉｍである。
【０１５２】
本開示のある実施形態は、本明細書に記載の方法により富化させた間質幹細胞を含む細胞集団を提供する。
【０１５３】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間葉系幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団から、ＨＳＣ７０結合剤を用いて未熟なおよび／または前駆体間葉系幹細胞を富化させるステップを含む、方法を提供する。
【０１５４】
本開示のある実施形態は、本明細書に記載の方法を用いて富化させた未熟で中立的な間葉系幹細胞を提供する。
【０１５５】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を単離する方法を提供する。
【０１５６】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から単離する方法であって、前記細胞集団から細胞表面ＨＳＣ７０を発現する間質幹細胞を単離するステップを含む、方法を提供する。
【０１５７】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から単離する方法であって、前記細胞集団からＨＳＣ７０結合剤を用いて間質幹細胞を単離するステップを含む、方法を提供する。
【０１５８】
用語「単離すること（ｉｓｏｌａｔｉｎｇ）」、または関連用語「単離する（ｉｓｏｌａｔｅ）」もしくは「単離した（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」は、細胞、核酸、またはポリペプチドなどの種が、その天然環境または元の環境から（部分的にまたは完全に）分離されるプロセスを指す。
【０１５９】
例えば、単離細胞は、実質的に精製された状態にあるか、または、他の細胞集団内の細胞とすることができる。
【０１６０】
細胞を単離する方法は、当技術分野において既知である。ある実施形態では、細胞を単離する方法には、フローサイトメトリー、セルソーティング、磁気活性化セルソーティング（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＭＡＣＳ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙまたはＤｙｎａｌ磁気ビーズ選択で商業的に用いられるような）、抗体パニング、および赤血球細胞ロゼッティングのうち１つまたは複数が含まれる。細胞を単離する他の方法についても検討する。
【０１６１】
ある実施形態では、間質幹細胞は、間葉系幹細胞を含む。他のタイプの細胞についても検討する。
【０１６２】
ある実施形態では、細胞集団には、胎盤、臍帯、臍帯血、歯芽組織、象牙質／歯髄組織、歯根膜、歯肉、皮膚、髪、卵胞、羊水、脂肪組織、平滑筋、骨格筋、腱、靱帯、骨、軟骨、骨髄、および／もしくは末梢血より得た、由来する、および／または生じた間質幹細胞が含まれる。他のタイプの供給源についても検討する。幹細胞をこのような供給源から得る方法は、当技術分野において既知である。
【０１６３】
ある実施形態では、細胞集団には、多能性幹細胞から生じた間質幹細胞、人工多能性幹細胞、体細胞核移植から生じた細胞、および／または成体幹細胞が含まれる。幹細胞をこのような供給源から得る方法は当技術分野において既知である。
【０１６４】
ある実施形態では、間質幹細胞の単離は、未熟で中立的な間質幹細胞が、集団の総細胞の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％を占める細胞集団をもたらす。ある実施形態では、間質幹細胞の単離は、未熟で中立的な間質幹細胞が、集団の総細胞の約５０％を占める細胞集団をもたらす。他のレベルについても検討する。
【０１６５】
ある実施形態では、単離は、間質幹細胞を細胞集団から単離し、その結果、単離した未熟で中立的な間質幹細胞が、実質的に、存在する唯一の細胞であるようにすることを含む。
【０１６６】
細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０を発現する細胞を単離することは、本明細書に記載の通りである。例えば、ＨＳＣ７０結合剤およびその使用は、本明細書に記載の通りである。
【０１６７】
ある実施形態では、単離には、未熟で中立的な間質幹細胞をヒト対象から単離することを含む。ある実施形態では、単離には、未熟で中立的な間質幹細胞を非ヒト対象から単離することを含む。
【０１６８】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤を用いて、未熟で中立的な間質幹細胞を単離する。
【０１６９】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤を用いて、未熟で中立的な間質幹細胞をヒト対象から単離する。ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤を用いて、未熟で中立的な間質幹細胞を非ヒト対象から単離する。
【０１７０】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、抗体および／もしくはその抗原結合部、小分子、核酸、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、リガンド、またはリガンドミメティックのうち１つまたは複数を含む。他のタイプの薬剤についても検討する。
【０１７１】
ある実施形態では、本方法は、細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０を発現する細胞を単離するステップを含む。ある実施形態では、本方法は、表面発現ＨＳＣ７０を有する細胞を単離するステップを含む。
【０１７２】
ある実施形態では、本方法は、ＨＳＣ７０結合剤を、細胞表面ＨＳＣ７０に結合させるステップを含む。ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、細胞表面ＨＳＣ７０に結合する。薬剤の細胞表面マーカへの結合を検出する方法は、当技術分野において既知である。
【０１７３】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、ＨＳＣ７０タンパク質に対するリガンドを含む。ＨＳＣ７０に対するリガンドの例については、本明細書で記載する。
【０１７４】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、抗ＨＳＣ７０抗体および／またはその抗原結合部を含む。ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、ＨＳＣ７０タンパク質に対する可溶部分を含む。
【０１７５】
ある実施形態では、本方法は、細胞に結合したＨＳＣ７０結合剤を用いて細胞を富化させるステップを含む。
【０１７６】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、ＥＷＩ−２タンパク質（ＣＤ３１６）および／もしくはその変異体の全てまたは一部を含む。ある実施形態では、ＨＳＣ７０リガンドは、ＥＷＩ−２タンパク質（ＣＤ３１６）および／もしくはその変異体の全てまたは一部を含む。ある実施形態では、ＨＳＣ７０リガンドは、ＥＷＩ−２タンパク質（ＣＤ３１６）および／もしくはその変異体の細胞外ドメイン／領域の全てまたは一部を含む。ある実施形態では、ＨＳＣ７０リガンドは、Ｋｅｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２７（２１）：７７１８−２６に記載されているように、ＥＷＩ−２タンパク質（ＣＤ３１６）および／またはその変異体、例えば、ｈＩｇＧ重鎖のＪ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインに縮合したアミノ酸１〜５７４を含む、４つの細胞外ドメインを有するｓＥＷＩ−２−ｈＩｇタンパク質などの、細胞外ドメイン／領域の全てまたは一部、ならびに検出可能タグを含む。
【０１７７】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、ＳＴＲＯ−１などの、抗体および／またはその抗体結合部を含む。抗体およびその抗原結合部は、本明細書に記載の通りである。
【０１７８】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、ＨＳＣ７０タンパク質に対する、抗体および／またはその抗原結合部を含む。ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、ヒトＨＳＣ７０に対する抗体を含む。
【０１７９】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、ＳＴＲＯ−１単クローン性抗体をおよび／またはその抗原結合部／断片を含む。ＳＴＲＯ−１抗体は商業的に入手可能である。
【０１８０】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、ＨＳＰ７０に実質的に結合しない。ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、細胞表面ＨＳＣ７０には結合するが、細胞表面ＨＳＰ７０には実質的に結合しない。
【０１８１】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、以下の遺伝子の１つまたは複数から選択されるＨＳＰ７０ファミリーメンバーによりコードされるタンパク質に実質的に結合しない：ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＨＳＰＡ１Ｌ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ４、ＨＳＰＡ４Ｌ、ＨＳＰＡ５、ＨＳＰＡ６、ＨＳＰＡ７、ＨＳＰＡ９、ＨＳＰＡ１２Ａ、およびＨＳＰＡ１４。
【０１８２】
ある実施形態では、本方法は、細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０を発現し、細胞表面マーカとしてＨＳＰ７０を実質的に発現しない細胞を単離するステップを含む。ある実施形態では、本方法は、細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０を発現し、細胞表面マーカとしてＨＳＰ７０の発現レベルが低いかまた低下した細胞を単離するステップを含む。
【０１８３】
ある実施形態では、本方法は、ＨＳＣ７０＋かつＨＳＰ７０−である細胞を単離するステップを含む。
【０１８４】
ある実施形態では、本方法は、ＨＳＣ７０ｂｒｉｇｈｔかつＨＳＰ７０ｄｉｍである細胞を単離するステップを含む。
【０１８５】
ある実施形態では、本方法は、レプチン受容体、低親和性ＮＧＦ受容体（ＣＤ２７１）、ＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体（ＣＤ１４０ａ，ｂ）、ＩＧＦ−１受容体、ＦＧＦ−１，２，３，４受容体、ＢＭＰ受容体、ＴＧＦベータ受容体、アルカリホスファターゼ、トロンボモジュリン、ビメチン、インテグリンベータ５、ネスチン、幹細胞因子、コラーゲンＩ型、コラーゲンＶＩ型、ＨＳＰ９０、ＲＡＮＫＬ、ＳＴＲＯ−１抗原、ＣＸＣＬ１２、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ，ｂ，ｄ，ｅ，ｆ、ＣＤ５１、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ６１、ＣＤ７３ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４４、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６、ＣＤ１８４、およびＣＤ２００からなる群から選択される１つまたは複数のマーカを発現する細胞を単離するステップを含む。このようなマーカを検出する方法は、当技術分野において既知である。
【０１８６】
ある実施形態では、本方法は、ｃ−ｆｍｓ Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ−Ａ、ＨＬＡ−ＤＲ、フォンヴィレブランド因子、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）からなる群から選択される１つまたは複数のマーカを実質的に発現しない細胞を単離するステップを含む。このようなマーカの欠如を確認する方法は、当技術分野において既知である。
【０１８７】
ある実施形態では、単離間質幹細胞は、クローン原性である。ある実施形態では、単離間質幹細胞はクローン原性である１つまたは複数の細胞を含む。ある実施形態では、単離間質幹細胞はクローン原性細胞を含む。ある実施形態では、単離間質幹細胞は、かなり大きな割合でクローン原性細胞を含む。ある実施形態では、単離間質幹細胞は、全て実質的にクローン原性である。
【０１８８】
ある実施形態では、本方法は、間質幹細胞を含む細胞集団を提供するステップを含む。間質幹細胞を含む細胞集団は、本明細書に記載の通りである。
【０１８９】
ある実施形態では、集団は、対象から得られるまたは対象に由来する細胞を含む。ある実施形態では、細胞集団は、ヒト対象から得られるまたはヒト対象に由来する細胞を含む。ある実施形態では、細胞集団は非ヒト対象、哺乳類対象、家畜動物（ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタなど）、飼育動物（イヌまたはネコなど）、ならびに非ヒト霊長類、ウサギ、ラット、マウス、および実験動物などの他のタイプの動物から得られるまたはそれに由来する細胞を含む。このような供給源から細胞を得る方法は、当技術分野において既知である。他のタイプの対象についても検討する。
【０１９０】
ある実施形態では、集団には、多能性幹細胞から生じた細胞、人工多能性幹細胞から生じた細胞、体細胞核移植から生じた細胞、および／または成体幹細胞などの供給源から得られるまたはそれに由来する細胞が含まれる。このような供給源から細胞を得る方法は当技術分野において既知である。
【０１９１】
ある実施形態では、対象または別の供給源から得られるまたはそれに由来する細胞を処理して、間質幹細胞の単離を可能にする。
【０１９２】
ある実施形態では、本方法は、細胞集団をＨＳＣ７０結合剤にさらすステップを含む。細胞を結合剤にさらす方法は当技術分野において既知である。
【０１９３】
ある実施形態では、本方法は、未熟で中立的な間質幹細胞を、細胞に結合したＨＳＣ７０結合剤を用いて、細胞集団から単離するステップを含む。
【０１９４】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から単離する方法であって、前記細胞集団から、細胞に結合したＨＳＣ７０結合剤を用いて間質細胞を単離するステップを含む、方法を提供する。
【０１９５】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を単離する方法であって：
間質幹細胞を含む細胞集団を提供するステップと；
前記細胞集団をＨＳＣ７０結合剤にさらすステップと；
細胞に結合した前記ＨＳＣ７０結合剤を用いて、前記細胞集団から間質細胞を単離するステップを含む、方法を提供する。
【０１９６】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から単離する方法であって、前記細胞集団から、細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０を発現する細胞を検出することにより、間質細胞を単離するステップを含む、方法を提供する。
【０１９７】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から単離する方法であって、前記細胞集団から、ＨＳＣ７０結合剤に結合した細胞を検出することにより、間質細胞を単離するステップを含む、方法を提供する。
【０１９８】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を単離する方法であって、ＨＳＣ７０結合剤を用いて間質幹細胞を単離するステップを含む、方法を提供する。
【０１９９】
本開示のある実施形態は、本明細書に記載の方法により単離した、１つまたは複数の、未熟で中立的な間質幹細胞を提供する。
【０２００】
ある実施形態では、前記１つまたは複数の細胞は、細胞表面マーカとしてＨＳＰ７０を実質的に発現しない。ある実施形態では、前記１つまたは複数の細胞はＨＳＰ７０−である。
【０２０１】
ある実施形態では、前記１つまたは複数の間質幹細胞は、ＨＳＰ７０−またはＨＳＰ７０ｄｉｍである。
【０２０２】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から単離する方法であって、前記細胞集団から、細胞に結合したＨＳＣ７０結合剤を用いて間質細胞を単離するステップを含み、単離した細胞は、細胞表面ＨＳＰ７０を実質的に発現しない、方法を提供する。
【０２０３】
本開示のある実施形態は、１つまたは複数の単離した未熟で中立的な間質幹細胞を提供する。
【０２０４】
ある実施形態では、前記１つまたは複数の間質幹細胞は、１つまたは複数の未熟で中立的なＭＳＣを含む。
【０２０５】
ある実施形態では、前記１つまたは複数の単離間質細胞は、１つまたは複数のクローン原性細胞を含む。
【０２０６】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間葉系幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から単離する方法であって、前記細胞集団から、ＨＳＣ７０結合剤を用いて、未熟な幹細胞および／または前駆体間葉系幹細胞を単離するステップを含む、方法を提供する。
【０２０７】
本開示のある実施形態は、細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０を発現し、細胞表面マーカとしてＨＳＰ７０を実質的に発現しない、１つまたは複数の単離間質幹細胞を提供する。
【０２０８】
間質幹細胞を特定する方法は本明細書に記載の通りであり、細胞を示唆するマーカの有無を特定することを含む。
【０２０９】
細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０およびＨＳＰ７０を検出する方法は、本明細書に記載の通りである。
【０２１０】
ある実施形態では、前記１つまたは複数の間質幹細胞は、本明細書に記載するように、細胞集団などの、１つまたは複数の他の細胞の混合物の一部である。ある実施形態では、前記１つまたは複数の間質幹細胞は、複数の細胞を含む。
【０２１１】
細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０を発現し、細胞表面マーカとしてＨＳＰ７０を実質的に発現しない間質幹細胞を生成する方法は、本明細書に記載の通りである。
【０２１２】
本開示のある実施形態は、ＨＳＣ７０＋細胞表面マーカおよびＨＳＰ７０−細胞表面マーカを含む、１つまたは複数の単離間質幹細胞を提供する。
【０２１３】
間質幹細胞を特定する方法は本明細書に記載の通りであり、細胞を示唆するマーカの有無を特定することを含む。
【０２１４】
細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０およびＨＳＰ７０を検出する方法は、本明細書に記載の通りである。細胞がＨＳＣ７０＋およびＨＳＰ７０−であるか否かを判断する方法は、本明細書に記載の通りである。
【０２１５】
ある実施形態では、前記１つまたは複数の間質幹細胞は、本明細書に記載するように、細胞集団などの１つまたは複数の他の細胞の混合物の一部である。ある実施形態では、前記１つまたは複数の間質幹細胞は、複数の細胞を含む。
【０２１６】
ＨＳＣ７０＋かつＨＳＰ７０−である間質幹細胞を生成する方法は、本明細書に記載の通りである。
【０２１７】
本開示のある実施形態は、ＨＳＣ７０ｂｒｉｇｈｔ細胞表面マーカおよびＨＳＰ７０ｄｉｍ細胞表面マーカを含む、１つまたは複数の単離間質幹細胞を提供する。
【０２１８】
間質幹細胞を特定する方法は本明細書に記載の通りであり、細胞を示唆するマーカの有無を特定することを含む。
【０２１９】
細胞表面マーカとしてＨＳＣ７０およびＨＳＰ７０を検出する方法は、本明細書に記載の通りである。細胞がＨＳＣ７０ｂｒｉｇｈｔおよびＨＳＰ７０ｄｉｍであるか否かを決定する方法は、本明細書に記載の通りである。
【０２２０】
ある実施形態では、前記１つまたは複数の間質幹細胞は、本明細書に記載するように、細胞集団などの１つまたは複数の他の細胞の混合物の一部である。ある実施形態では、前記１つまたは複数の間質幹細胞は、複数の細胞を含む。
【０２２１】
ＨＳＣ７０ｂｒｉｇｈｔかつＨＳＰ７０ｄｉｍである間質幹細胞を生成する方法は、本明細書に記載の通りである。
【０２２２】
本開示のある実施形態は、細胞表面マーカとしてＳＴＲＯ−１抗原を発現し、細胞表面マーカとしてＨＳＰ７０を実質的に発現しない、１つまたは複数の単離間質幹細胞を提供する。
【０２２３】
この点について、用語「ＳＴＲＯ−１＋」または「ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ（強陽性）」、「ＳＴＲＯ−１ｄｉｍ（弱陽性）」、および「ＳＴＲＯ−１−」などの変異体は、ＳＴＲＯ−１抗体が間質幹細胞の細胞表面に結合する程度を指す。ＳＴＲＯ−１抗体結合の程度は、ＳＴＲＯ−１抗体により認識される細胞表面抗原の密度直接関係する。
【０２２４】
この点については、ＳＴＲＯ−１を用いて単離した細胞集団には、細胞表面にＨＳＰ７０も発現する細胞が含まれることと、ＣＦＵ−Ｆ活性は、ＳＴＲＯ−１＋／ＨＳＰ７０−集団に限定されることが分かっている。したがって、このような細胞のＳＴＲＯ−１＋細胞に対するクローン原性活性は改善されている。
【０２２５】
間質幹細胞を特定する方法は本明細書に記載の通りであり、細胞を示唆するマーカの有無を特定することを含む。
【０２２６】
ＳＴＲＯ−１抗体およびその使用は、本明細書に記載の通りである。
【０２２７】
細胞表面マーカとしてＳＴＲＯ−１抗原およびＨＳＰ７０を用いる方法は、本明細書に記載の通りである。
【０２２８】
ある実施形態では、前記１つまたは複数の間質幹細胞は、本明細書に記載するように、細胞集団などの１つまたは複数の他の細胞の混合物の一部である。ある実施形態では、前記１つまたは複数の間質幹細胞は、複数の細胞を含む。
【０２２９】
細胞表面マーカとしてＳＴＲＯ−１抗原を発現し、細胞表面マーカとしてＨＳＰ７０を実質的に発現しない間質幹細胞を生成する方法は、本明細書に記載の通りである。
【０２３０】
本開示のある実施形態は、ＳＴＲＯ−１＋細胞表面マーカおよびＨＳＰ７０−細胞表面マーカを含む、１つまたは複数の単離間質幹細胞を提供する。
【０２３１】
間質幹細胞を特定する方法は本明細書に記載の通りであり、細胞を示唆するマーカの有無を特定することを含む。
【０２３２】
細胞表面マーカとしてＳＴＲＯ−１抗原およびＨＳＰ７０を検出する方法は、本明細書に記載の通りである。細胞がＳＴＲＯ−１＋およびＨＳＰ７０−であるか否かを判断する方法は、本明細書に記載の通りである。
【０２３３】
ある実施形態では、前記１つまたは複数の間質幹細胞は、本明細書に記載するように、細胞集団などの１つまたは複数の他の細胞の混合物の一部である。ある実施形態では、前記１つまたは複数の間質幹細胞は、複数の細胞を含む。
【０２３４】
ＳＴＲＯ−１＋かつＨＳＰ７０−である間質幹細胞を生成する方法は、本明細書に記載の通りである。
【０２３５】
本開示のある実施形態は、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞表面マーカおよびＨＳＰ７０ｄｉｍ細胞表面マーカを含む、１つまたは複数の単離間質幹細胞を提供する。
【０２３６】
間質幹細胞を特定する方法は本明細書に記載の通りであり、細胞を示唆するマーカの有無を特定することを含む。
【０２３７】
細胞表面マーカとしてＳＴＲＯ−１抗原およびＨＳＰ７０を検出する方法は、本明細書に記載の通りである。細胞がＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔおよびＨＳＰ７０ｄｉｍであるか否かを判断する方法は、本明細書に記載の通りである。
【０２３８】
ある実施形態では、前記１つまたは複数の間質幹細胞は、本明細書に記載するように、細胞集団などの１つまたは複数の他の細胞の混合物の一部である。ある実施形態では、前記１つまたは複数の間質幹細胞は、複数の細胞を含む。
【０２３９】
ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔかつＨＳＰ７０ｄｉｍである間質幹細胞を生成する方法は、本明細書に記載の通りである。
【０２４０】
本開示のある実施形態は、本明細書に記載のように１つまたは複数の単離した間質幹細胞を含む細胞集団を提供する。
【０２４１】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団から、細胞表面マーカとしてＳＴＲＯ−１抗原を発現し、細胞表面マーカとしてＨＳＰ７０を実質的に発現しない間質幹細胞を富化させるステップを含む、方法を提供する。
【０２４２】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団からＳＴＲＯ−１＋ＨＳＰ７０−間質幹細胞を富化させるステップを含む、方法を提供する。
【０２４３】
間質幹細胞を富化させる方法は、本明細書に記載の通りである。ＳＴＲＯ−１抗体およびその使用は、本明細書に記載の通りである。
【０２４４】
ＨＳＰ７０−である細胞を検出し富化させる方法は、本明細書に記載の通りである。
【０２４５】
本開示のある実施形態は、間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団からＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔＨＳＰ７０ｄｉｍ間質幹細胞を富化させるステップを含む、方法を提供する。
【０２４６】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から単離する方法であって、前記細胞集団から、細胞表面マーカとしてＳＴＲＯ−１抗原を発現し、細胞表面マーカとしてＨＳＰ７０を実質的に発現しない間質幹細胞を単離するステップを含む、方法を提供する。
【０２４７】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から単離する方法であって、前記細胞集団から、ＳＴＲＯ−１＋ＨＳＰ７０−間質細胞を単離するステップを含む、方法を提供する。
【０２４８】
間質幹細胞を単離する方法は、本明細書に記載の通りである。ＳＴＲＯ−１抗体およびその使用は、本明細書に記載の通りである。
【０２４９】
ＨＳＰ７０−である細胞を検出し単離する方法は、本明細書に記載の通りである。
【０２５０】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から単離する方法であって、前記細胞集団から、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔＨＳＰ７０ｄｉｍ間質幹細胞を単離するステップを含む、方法を提供する。
【０２５１】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を特定する方法を提供する。
【０２５２】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞のマーカとしてＨＳＣ７０の使用を提供する。
【０２５３】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を特定する方法であって、ＨＳＣ７０細胞表面マーカを発現する間質幹細胞を特定するステップを含む、方法を提供する。
【０２５４】
特定の細胞表面マーカを有する間質幹細胞を特定する方法は、本明細書に記載の通りである。
【０２５５】
ある実施形態では、本方法は、ＨＳＰ７０細胞表面マーカを実質的に発現しない細胞を特定するステップをさらに含む。
【０２５６】
ＨＳＰ７０細胞表面マーカおよびその特定は、本明細書に記載の通りである。
【０２５７】
ある実施形態では、本方法は、未熟で中立的なＭＳＣを特定するステップを含む。
【０２５８】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的なＭＳＣを特定する方法であって、ＨＳＣ７０細胞表面マーカを発現する間葉系幹細胞を特定するステップを含む、方法を提供する。
【０２５９】
本開示のある実施形態は、間質幹細胞を富化させ、単離し、および／または特定するための薬剤を特定する方法を提供する。
【０２６０】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を富化させ、単離し、および／または特定するための薬剤を特定する方法であって：
候補薬剤が間質幹細胞上のＨＳＣ７０に結合するか否かを判断するステップと；
前記候補薬剤を、未熟で中立的な間質幹細胞を富化させ、単離し、および／または特定するための薬剤として特定するステップとを含む、方法を提供する。
【０２６１】
ＨＳＣ７０への薬剤の結合を判断する方法は、当技術分野において既知であり、この例は、また、本明細書に記載の通りである。
【０２６２】
ある実施形態では、候補薬剤はＨＳＣ７０のリガンドである。ある実施形態では、候補薬剤は抗体および／またはその抗原結合部である。
【０２６３】
候補薬剤が未熟で中立的な間質細胞を富化させ、単離し、または特定する機能があるか否かを判断する方法は、本明細書に記載の通りである。
【０２６４】
ある実施形態では、本方法は、候補薬剤が間質幹細胞のＨＳＰ７０に実質的に結合しないか否かを判断するステップをさらに含む。
【０２６５】
ＨＳＰ７０への薬剤の結合を判断する方法は当技術分野において既知であり、この例は、または本明細書に記載されている。
【０２６６】
ある実施形態では、本方法は、未熟で中立的なＭＳＣを富化させ、単離し、および／または特定するステップを含む。
【０２６７】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間葉系幹細胞を富化させ、単離し、および／または特定するための薬剤を特定する方法であって：
候補薬剤が間質幹細胞のＨＳＣ７０に結合するか否かを判断するステップと；
前記候補薬剤を、未熟で中立的な間葉系幹細胞を富化させ、単離し、および／または特定するための薬剤として特定するステップとを含む、方法を提供する。
【０２６８】
本開示のある実施形態は、単離したおよび／または天然に存在しないポリペプチド、ならびに、このようなポリペプチドを含む薬剤を提供する。
【０２６９】
本開示のある実施形態は、以下のアミノ酸配列のうち１つまたは複数を含む、単離したおよび／または天然に存在しないポリペプチドを提供する：（ｉ）ＫＤＩＳＥＮＫＲＡＶＲＲＬＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）、ＩＳＥＮＫＲＡＶＲＲＬＡＲＴＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３）、ＩＳＥＮＫＲＡＶＲＲＬＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４）および／または、前記アミノ酸配列の何れかの変異体。ある実施形態では、単離したおよび／または天然に存在しないポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２〜４のうち１つのアミノ酸配列および／または前記配列の何れかの変異体、例えば、ＮＨ２末端またはＣＯＯＨ末端の何れかまたは両方から１つまたは複数のアミノ酸が欠失した変異体などからなる。
【０２７０】
本開示のある実施形態は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４のアミノ酸配列および／またはその変異体を含む、単離したおよび／または天然に存在しないポリペプチドを提供する。
【０２７１】
ある実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４のアミノ酸配列、または、前記アミノ酸配列の変異体からなる。
【０２７２】
ある実施形態では、ポリペプチドには、ｈＨＳＣ７０のアミノ酸２０４〜３９３および／またはその変異体を含むポリペプチドが含まれる。他の種におけるＨＳＣ７０の同等の領域は、当業者により容易に求められ得る。
【０２７３】
ある実施形態では、ポリペプチドには、ｈＨＳＣ７０の領域スパニングアミノ酸２０４〜３９３に存在するＳＴＲＯ−１結合エピトープが含まれる。他の種における同等のエピトープは、当業者により容易に求められ得る。
【０２７４】
このようなポリペプチドは、例えば、ＳＴＲＯ−１抗体が標的に結合するのをブロックする、および／または、抗体を産生するのに有用であり得る。
【０２７５】
オリゴペプチドおよびポリペプチドを生成する方法は、例えば、概して、Ｇｒｅｅｎ  ＭＲ  ＡＮＤ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０１２（参照により本明細書に組み込まれるものとする）およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１１），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＩＮＣ．に記載されているような化学合成または組み換えＤＮＡ技術など、当技術分野において既知である。
【０２７６】
本開示のある実施形態は、ＳＴＲＯ−１の結合を阻害するまたはブロックする方法を提供する。結合を評価する方法は、当技術分野において既知である。
【０２７７】
本開示のある実施形態は、ＳＴＲＯ−１抗体が細胞に結合するのを阻害するまたはブロックする方法であって、本明細書に記載するようにポリペプチドおよび／または薬剤を用いて、ＳＴＲＯ−１の細胞への結合をブロックするステップを含む、方法を提供する。
【０２７８】
結合をブロックするために薬剤を用いる、および／または、抗体アンタゴニストとして薬剤を用いる方法は、当技術分野において、既知である。例えば、ＨＳＣ７０の第１３９３アミノ酸を含むポリペプチドを用いて、ＳＴＲＯ−１結合をブロックすることが可能である。
【０２７９】
本開示のある実施形態は、ＳＴＲＯ−１アンタゴニスト、以下のアミノ酸配列のうち１つまたは複数を含むアンタゴニストを提供する：（ｉ）ＫＤＩＳＥＮＫＲＡＶＲＲＬＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）、ＩＳＥＮＫＲＡＶＲＲＬＡＲＴＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３）、ＩＳＥＮＫＲＡＶＲＲＬＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４）、および／または、前記アミノ酸配列の何れかの機能的変異体。変異体は本明細書に記載の通りである。ある実施形態では、アンタゴニストは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２〜４のうち１つのアミノ酸配列および／または前記配列の何れかの変異体、例えば、ＮＨ２末端またはＣＯＯＨ末端の何れかまたは両方から１つまたは複数のアミノ酸が欠失した変異体などからなる。
【０２８０】
本開示のある実施形態は、細胞へのＳＴＲＯ−１抗体の結合を阻害する方法であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４のアミノ酸配列および／またはその変異体を含む薬剤を用いるステップを含む、方法を提供する。
【０２８１】
本開示のある実施形態は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４のアミノ酸配列および／またはその機能的変異体を含むＳＴＲＯ−１アンタゴニストを提供する。
【０２８２】
ある実施形態では、変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２〜４の１つまたは複数と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する。ある実施形態では、変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２〜４の１つまたは複数と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有する。
【０２８３】
本開示のある実施形態は、ＳＴＲＯ−１結合を阻害する方法であって、本明細書に記載するポリペプチドの使用および／または本明細書に記載するアンタゴニストの使用を含む、方法を提供する。
【０２８４】
ある実施形態では、本方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４のアミノ酸配列および／またはその変異体を含むポリペプチドの使用を含む。
【０２８５】
ある実施形態では、本方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４のアミノ酸配列および／またはその機能的変異体を含むＳＴＲＯ−１アンタゴニストの使用を含む。
【０２８６】
本開示のある実施形態は、細胞へのＳＴＲＯ−１結合を阻害する方法であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４のアミノ酸配列および／またはその機能的変異体を含む薬剤を用いて、ＳＴＲＯ−１の細胞への結合を阻害するステップを含む、方法を提供する。
【０２８７】
本開示のある実施形態は、ＨＳＣ７０結合剤を特定する方法を提供する。このような薬剤は、例えば、細胞を富化させおよび／または単離する際に用いるのに有用である。
【０２８８】
ＨＳＣ７０結合剤は、本明細書に記載の通りである。薬剤の結合を判断する方法は、当技術分野において既知である。
【０２８９】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、ＨＳＰ７０に実質的に結合しない。
【０２９０】
ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、ＨＳＣ７０との結合について解離定数Ｋｄを有し、これは、ＨＳＰ７０との結合のＫｄの少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも１０００倍である。結合の親和性を決定する方法は、当技術分野において既知である。
【０２９１】
本開示のある実施形態は、ＨＳＣ７０結合剤を特定する方法であって、ＨＳＣ７０には結合するが、ＨＳＰ７０には実質的に結合しない薬剤を特定するステップを含む、方法を提供する。
【０２９２】
本開示のある実施形態は、抗体を生成する方法であって、本明細書に記載するようなポリペプチドに対する抗体を産生するステップを含む、方法を提供する。
【０２９３】
抗体を生成する方法は、当技術分野において既知であり、本明細書に記載の通りである。
【０２９４】
本開示のある実施形態は、抗体を産生するために、本明細書で記載するポリペプチドを使用することを提供する。本開示のある実施形態は、動物に免疫性を与えるために、本明細書で記載するポリペプチドを使用することを提供する。
【０２９５】
本開示のある実施形態は、本明細書で記載するようにポリペプチドを含む薬剤を提供する。
【０２９６】
用語「ポリペプチド」は、本明細書で用いる場合、オリゴペプチドおよびポリペプチドを指し、例えば、ペプチド結合により共有結合的に結合した、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、または５０個以上のアミノ酸を含む物質を指す。用語「タンパク質」は、典型的には、大きいポリペプチドを指すが、該して、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は同義語であり、本明細書においては区別なく用いる。
【０２９７】
ある実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、単離されている。例えば、単離ポリペプチドは、部分的に精製された状態にあるか、または、実質的に精製された状態にあり、天然またはｉｎ  ｖｉｖｏでは結合している他の物質を実質的に持たない。ある実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、天然に存在しない。
【０２９８】
本明細書に記載のポリペプチドは、（組織または細胞ホモジェネートなどの）生物学的サンプルから単離され得るか、非常に多数の原核発現系もしくは真核発現系において組み換え的に発現し得るか、または、既知の化学的手段により合成され得る。
【０２９９】
用語ポリペプチドまたはアミノ酸配列の「変異体」は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸欠失変異体、アミノ酸置換変異体、およびアミノ酸修飾変異体（天然および／または合成）のうち１つまたは複数を指す。
【０３００】
例えば、アミノ酸挿入変異体は、アミノ末端融合および／またはカルボキシ末端融合を含み、また、特定のアミノ酸配列では、単一のもしくは２つ以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列変異体の場合、１つまたは複数のアミノ酸残基がアミノ酸配列の特定の部位に挿入され得るが、ただし、結果として生じる生成物の適切なスクリーニングを用いたランダム挿入もまた可能である。
【０３０１】
アミノ酸欠失変異体は、配列からの１つまたは複数のアミノ酸の除去により特徴付けられる。
【０３０２】
アミノ酸融合変異体は、配列への１つまたは複数のアミノ酸の付加により特徴付けられ、これは、特異的には、ＮＨ２末端融合、ＣＯＯＨ末端融合、および／または、内部融合である。
【０３０３】
アミノ酸置換変異体は、配列の少なくとも１つの残基が取り除かれ、１つまたは複数の他の残基がその場所に挿入されることにより特徴付けられる。
【０３０４】
変異体におけるアミノ酸の変化は、非保守的なおよび／または保守的なアミノ酸変化、つまり、同じように変化したまたは変化しないアミノ酸の置換であり得る。保守的なアミノ酸変化は、典型的には、その側鎖に関連したアミノ酸のファミリーの１つの置換を伴う。天然に存在するアミノ酸は、概して、４つのファミリー：酸性（アスパルテート、グルタメート）、塩基性（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、無極性（アラニン、バリン、
ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非電化極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）に区分される。フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンは、時に、芳香族アミノ酸として共に分類される。
【０３０５】
ある実施形態では、所与のアミノ酸配列と、該所与のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列の間の類似性、例えば同一性または相同性の程度は、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であろう。
【０３０６】
ある実施形態では、所与のアミノ酸配列と、該所与のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列の間の同一性の程度は、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であろう。
【０３０７】
ある実施形態では、所与のアミノ酸配列と、該所与のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列の間の相同性の程度は、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であろう。
【０３０８】
類似性または同一性の程度は、少なくとも約１０個、少なくとも２０個、少なくとも４０個、少なくとも６０個、少なくとも８０個、少なくとも１００個、少なくとも１２０個、少なくとも１４０個、少なくとも１６０個、または少なくとも２００個のアミノ酸の領域に対してであり得る。
【０３０９】
本明細書に記載するポリペプチドおよびアミノ酸変異体は、例えば、固相合成および類似の方法または組み換えＤＮＡ操作などの既知のペプチド合成技法を利用して、容易に調製することができる。置換、挿入、または欠失を有するタンパク質およびペプチドを調製するためのＤＮＡ配列の操作は、例えば、Ｇｒｅｅｎ  ＭＲ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０１２（参照により本明細書に組み込まれるものとする）に記載されている。発現、精製、および発現タンパク質の解析は、例えば、“Ｔｈｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，１８−１１４２−７５，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ｅｄｉｔｉｏｎ  ＡＡに記載されているような当技術分野で既知の方法により実行することができる。
【０３１０】
本明細書に記載のポリペプチドには、また、ポリペプチドの修飾形が含まれる。このような修飾としては、任意の化学的修飾が挙げられ、炭水化物、脂質、および／またはタンパク質もしくはペプチドと関連する任意の分子の、単一のまたは多数の置換、欠失、および／または付加が含まれる。
【０３１１】
ある実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、天然に存在しないポリペプチドである。ある実施形態では、天然に存在しないペプチドは、合成ペプチドまたは単離ペプチドである。ある実施形態では、天然に存在しないペプチドは、組み換えＤＮＡ技術により生成される。ある実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、化学合成により生成される。
【０３１２】
ポリペプチドおよびタンパク質を単離するおよび／または精製する方法は既知であり、対して、Ｇｒｅｅｎ  ＭＲ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０１２（参照により本明細書に組み込まれるものとする）およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１１），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＩＮＣ．（参照により本明細書に組み込まれるものとする）に記載されている通りである。
【０３１３】
本開示のある実施形態は、ＨＳＣ７０リガンドを含む単離薬剤を提供し、該薬剤は、ＨＳＰ７０に実質的に結合しない。リガンドがＨＳＣ７０およびＨＳＰ７０に結合する機能があるか否かを判断する方法は、当技術分野において既知である。
【０３１４】
本開示のある実施形態は、ＨＳＣ７０リガンドを含む天然に存在しない薬剤を提供し、該薬剤は、ＨＳＰ７０に実質的に結合しない。
【０３１５】
本開示のある実施形態は、ＨＳＣ７０リガンドを含む単離された天然に存在しない薬剤を提供し、該薬剤は、ＨＳＰ７０に実質的に結合しない。
【０３１６】
薬剤の例としては、抗体および／もしくはその抗原結合部、小分子、核酸、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、リガンド、またはリガンドミメティックのうち１つまたは複数が挙げられる。
【０３１７】
薬剤がＨＳＣ７０およびＨＳＰ７０に結合する機能があるか否かを判断する方法は、当技術分野において既知である。
【０３１８】
ある実施形態では、薬剤は検出可能なタグを含む。検出可能なタグは、本明細書に記載の通りである。
【０３１９】
ある実施形態では、薬剤はポリペプチドを含む。ポリペプチドの変異体を含むポリペプチドを生成する方法は、当技術分野において既知である。例えば、薬剤は、組み換え手段により生成されるポリペプチドを含み得る。
【０３２０】
ある実施形態では、薬剤は、ＥＷＩ−２タンパク質および／もしくはその変異体の細胞外領域の全てまたは一部を含む。ヒトＥＷＩ−２の受入番号は、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣ＿０００００１．１０である。他の種の遺伝子は当業者により特定され得る。ヒトＥＷＩ−２タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）の細胞外ドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである：
ＭＧＡＬＲＰＴＬＬＰＰＳＬＰＬＬＬＬＬＭＬＧＭＧＣＷＡＲＥＶＬＶＰＥＧＰＬＹＲＶＡＧＴＡＶＳＩＳＣＮＶＴＧＹＥＧＰＡＱＱＮＦＥＷＦＬＹＲＰＥＡＰＤＴＡＬＧＩＶＳＴＫＤＴＱＦＳＹＡＶＦＫＳＲＶＶＡＧＥＶＱＶＱＲＬＱＧＤＡＶＶＬＫＩＡＲＬＱＡＱＤＡＧＩＹＥＣＨＴＰＳＴＤＴＲＹＬＧＳＹＳＧＫＶＥＬＲＶＬＰＤＶＬＱＶＳＡＡＰＰＧＰＲＧＲＱＡＰＴＳＰＰＲＭＴＶＨＥＧＱＥＬＡＬＧＣＬＡＲＴＳＴＱＫＨＴＨＬＡＶＳＦＧＲＳＶＰＥＡＰＶＧＲＳＴＬＱＥＶＶＧＩＲＳＤＬＡＶＥＡＧＡＰＹＡＥＲＬＡＡＧＥＬＲＬＧＫＥＧＴＤＲＹＲＭＶＶＧＧＡＱＡＧＤＡＧＴＹＨＣＴＡＡＥＷＩＱＤＰＤＧＳＷＡＱＩＡＥＫＲＡＶＬＡＨＶＤＶＱＴＬＳＳＱＬＡＶＴＶＧＰＧＥＲＲＩＧＰＧＥＰＬＥＬＬＣＮＶＳＧＡＬＰＰＡＧＲＨＡＡＹＳＶＧＷＥＭＡＰＡＧＡＰＧＰＧＲＬＶＡＱＬＤＴＥＧＶＧＳＬＧＰＧＹＥＧＲＨＩＡＭＥＫＶＡＳＲＴＹＲＬＲＬＥＡＡＲＰＧＤＡＧＴＹＲＣＬＡＫＡＹＶＲＧＳＧＴＲＬＲＥＡＡＳＡＲＳＲＰＬＰＶＨＶＲＥＥＧＶＶＬＥＡＶＡＷＬＡＧＧＴＶＹＲＧＥＴＡＳＬＬＣＮＩＳＶＲＧＧＰＰＧＬＲＬＡＡＳＷＷＶＥＲＰＥＤＧＥＬＳＳＶＰＡＱＬＶＧＧＶＧＱＤＧＶＡＥＬＧＶＲＰＧＧＧＰＶＳＶＥＬＶＧＰＲＳＨＲＬＲＬＨＳＬＧＰＥＤＥＧＶＹＨＣＡＰＳＡＷＶＱＨＡＤＹＳＷＹＱＡＧＳＡＲＳＧＰＶＴＶＹＰＹＭ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）
【０３２１】
ある実施形態では、薬剤は、ＨＳＣ７０に結合するＥＷＩ−２タンパク質および／またはその変異体の細胞外領域の一部を含む。ある実施形態では、薬剤は、ＨＳＣ７０に結合するＥＷＩ−２タンパク質および／またはその変異体の細胞外領域の一部を含む。他の種のＥＷＩ−２タンパク質を特定する方法は、当技術分野において既知である。薬剤がＨＳＣ７０に結合する機能があるか否かを判断する方法は、当技術分野において既知である。
【０３２２】
ある実施形態では、薬剤は検出可能タグを含む。例えば、薬剤は、抗体のＦｃ領域および／またはその一部を含み得る。
【０３２３】
ある実施形態では、検出可能タグは、抗体のＦｃ領域などの外生的タグである。ある実施形態では、検出可能タグには、抗体のＦｃ領域および／またはその一部が含まれる。
【０３２４】
ある実施形態では、検出可能タグには、抗体により認識され得るポリペプチドの抗原領域などの、薬剤の全てまたは一部が含まれる。
【０３２５】
ある実施形態では、検出可能タグは、検出可能薬剤と関連しているか、または、検出可能薬剤の一部である。例えば、検出可能薬剤は、融合パートナーである検出可能タグ、標識化アミノ酸、または標識化ヌクレオチドを含み得る。適切な検出可能タグの例としては、抗原、酵素、フルオロフォア、クエンチャ、放射性アイソトープ、および発光化合物または発光標識が挙げられる。検出可能タグは、検出可能シグナルを生成し得るさらなる分子を介して、直接的または間接的に検出することができる。ある実施形態では、検出可能薬剤は、抗原を含む。検出可能タグとして用いることができる抗原の例としては、第２検出可能薬剤により標的化され得る、検出可能薬剤の適切な抗原構成要素が挙げられる。例えば、第２抗体を用いて、検出可能薬剤の抗原を検出することもできる。第２抗体は、例えば、蛍光的にまたは酵素的に標識することができる。
【０３２６】
ある実施形態では、検出可能タグには、フルオロフォアが含まれる。検出タグとして用いることができるフルオロフォアの例としては、例えば、レゾルフィン、フルオレセイン（フルオレセインイソチオシアネート、ＦＩＴＣ）、ローダミン（テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ＴＲＩＴＣ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、フィコビリプロテイン（アロフィコシアニン、フィコシアニン、フィコエリトリンおよびフィコエリトロシアニン、ランタニドイオン、例えば、Ｅｕ３＋、Ｓｍ３＋、Ｔｂ３＋、およびＤｙ３＋、もしくはその複合体、前述のものの適切な誘導体、またはその組み合わせなどが挙げられる。ある実施形態では、検出可能タグは、１つまたは複数の異なる検出可能薬剤（例えば、蛍光アミノ酸を含む融合タンパク質またはタンパク質の形をした）の一部であり得る。
【０３２７】
ある実施形態では、検出可能タグは、発光化合物または発光標識を含む。検出可能タグとして用いることができる発光化合物または発光標識としては、例えば、化学発光化合物および生物発光が挙げられる。これらの化合物を用いて、標識可能薬剤を標識することができる。化学発光タグの存在は、化学反応の過程の間に生じる発光の存在を検出することにより判断することができる。有用な化学発光標識化合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステル、またはその組み合わせである。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を上昇させた生物系で見られる化学発光の一種である。生物発光抗体の存在は、発光の存在を検出することにより判断される。生物発光化合物の例としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンが挙げられる。
【０３２８】
ある実施形態では、検出可能タグは、１つまたは複数のランタニドイオンを含む。ある実施形態では、ランタニドイオンはＥｕ３＋、Ｓｍ３＋、Ｔｂ３＋、およびＤｙ３＋とすることができる。ある実施形態では、検出可能タグの１つはＥｕ３＋を含み、別の検出可能タグはＳｍ３＋を含む。
【０３２９】
ある実施形態では、検出可能タグは、基質を検出可能な生成物に変える１つまたは複数の酵素を含む。検出可能タグとして用いることができる酵素としては、例えば、基質の検出可能な生成物への変換をもたらす（概して、色もしくは蛍光の変化または電気化学的シグナルの生成をもたらす）酵素が挙げられる。このような酵素としては、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ルシフェラーゼ、カタラーゼ、またはその組み合わせが挙げられる。用いる酵素および基質に応じて、分光測光器、蛍光計、照度計、および／または他の電気化学的検出手段を用いて検出を実行することができる。ある実施形態では、酵素はホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼとすることができる。他の酵素も用いることができる。
【０３３０】
ある実施形態では、検出可能タグは、放射性アイソトープを含む、検出可能タグとして用いることができる放射性アイソトープとしては、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１３１Ｉが挙げられる。放射標識したアミノ酸の存在下で検出可能薬剤をコードしているｍＲＮＡを翻訳することにより、放射性同位体を検出可能薬剤に共役させる、または、放射性同位体を検出可能薬剤に組み込むことができる。放射性同位体および放射性アイソトープをタンパク質などの分子に共役させる方法は、既知である。放射性同位体は、ガンマカウンター、ベータカウンター、またはシンチレーションカウンターを用いて検出することができる。
【０３３１】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から富化させる方法であって、前記細胞集団から、本明細書に記載の薬剤および／または本明細書に記載のポリペプチドを用いて、間質幹細胞を富化させるステップを含む、方法を提供する。
【０３３２】
本開示のある実施形態は、未熟で中立的な間質幹細胞を、間質幹細胞を含む細胞集団から単離する方法であって、前記細胞集団から、本明細書に記載の薬剤および／または本明細書に記載のポリペプチドを用いて、間質幹細胞を単離するステップを含む、方法を提供する。
【０３３３】
本開示のある実施形態は、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸および／または本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを提供する。
【０３３４】
用語「核酸」は、本明細書で用いる場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指し、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡならびに／またはＲＮＡの変異体（例えば、糖−リン酸主鎖および／もしくは１つまたは複数の塩基の変異体、例えば、メチル化）を含み、それの一本鎖形態、二本鎖形態、非メチル化形態、メチル化形態、または他の形態とすることができる。ある実施形態では、核酸は天然に存在しない核酸、天然に存在する核酸、ゲノム起源の核酸、ミトコンドリア核酸、（ｍＲＮＡに由来する）ｃＤＮＡ起源の核酸、ウイルスに由来する核酸、合成起源の核酸、一本鎖ＤＮＡ，二本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ、および／もしくはＲＮＡの類似体、ならびに／または、前記の何れかの誘導体、断片、および／もしくは組み合わせである。誘導体の例としては、また、例えば安定性を向上させるために５’末端および／もしくは３’末端に保護基を有する核酸、ならびに／または、他の分子に縮合した核酸が挙げられる。他のタイプの核酸についても検討する。核酸を生成する方法は既知であり、例えば、組み換えＤＮＡ技術により生成された核酸または化学合成により生産された核酸が含まれる。
【０３３５】
用語「核酸」は、本明細書で用いる場合、特異的な核酸、核酸の相補体であるヌクレオチド配列を含む核酸、特異的な核酸に対し７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、もしくは９５％超の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸、または、特異的な核酸の相補体に対し７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、もしくは９５％超の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を指す。他のレベルの配列同一定についても検討する。
【０３３６】
本開示のある実施形態は、本明細書に記載のベクターを含む原核細胞または真核細胞などの宿主細胞を提供する。
【０３３７】
本開示のある実施形態は、本明細書に記載の方法を実行するためのキットまたは組み合わせ製品を提供する。
【０３３８】
本明細書に記載の方法で用いるキットは、例えば、以下のうち１つまたは複数を含む：例えば、ビオチン化されたまたは蛍光標識されている場合がある、抗ＨＳＣ７０抗体などのＨＳＣ７０結合剤；例えば、ビオチン化されたまたは蛍光標識されている場合がある、ＳＴＲＯ−１抗体；例えば、ビオチン化されたまたは蛍光標識されている場合がある、抗ＨＳＰ７０抗体などのＨＳＰ結合剤；例えば、ビオチン化されたまたは蛍光標識されている場合がある、抗体などの１つまたは複数の第２試薬；緩衝液；培地；基準；対照；試薬および指示／手順；ならびに、実施例に記載の１つまたは複数の試薬。
【０３３９】
本開示のある実施形態は、ＨＳＣ７０結合剤を含み、未熟で中立的な間質幹細胞を富化させおよび／または単離するためのキットを提供する。
【０３４０】
ＨＳＣ７０結合剤は、本明細書に記載の通りである。ある実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、抗体および／またはその抗原結合部を含む。
【０３４１】
本開示のある実施形態は、ＨＳＣ７０結合剤およびＨＳＰ７０結合剤を含む、キットまたは組み合わせ製品を含む。
【０３４２】
本開示のある実施形態は、ＳＴＲＯ−１抗体およびＨＳＰ７０結合剤を含む、キットまたは組み合わせ製品を含む。
【０３４３】
標準的な技法を、組み換えＤＮＡ技術、オリゴヌクレオチド合成、抗体生成、ペプチド合成、組織培養、およびトランスフェクションに用いることができる。酵素反応および精製技法は、製造業者の明細書に従って、または、当技術分野で通常遂行されるように、または本明細書に記載の通りに、行うことができる。前記技法および手順は、概して、当技術分野で周知の従来の方法に従って、本明細書で言及され論じられる一般的でより特異的な種々の参考文献に記載されている通りに、行うことができる。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ＭＲ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０１２（参照によって本明細書に組み込まれるものとする）を参照されたい。
【０３４４】
ある例示的な実施形態を、以下の例のいくつかにより説明する。以下の記載は、特定の実施形態のみについて記載することを目的とするものであり、上記記載に関し限定することを意図するものではないことを理解されたい。
【０３４５】
実施例１−ＳＴＲＯ−１抗原がコレステロールの多いマイクロドメインに位置する
フローサイトメトリー：ＵＥ７Ｔ−１３細胞をトリプシン処理により採取し、ブロッキング緩衝液（ヒト血清（５％））、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（１％）、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（５％）、ペニシリン５０００ｕ／ｍＬ、およびストレプトマイシン５０００ｕ／ｍＬ）に、２ｘ１０７／ｍＬで、氷上で３０分間再懸濁させた。１ｘ１０６細胞を、次に、５０μＬの１Ａ６．１２ハイブリドーマ上清（サルモネラに対し産生されるＩｇＭイソタイプマウス単クローン性抗体（ｍＡＢ））またはＳＴＲＯ−１（ＩｇＭイソタイプ）ハイブリドーマ上清を用いて、氷上で１時間、インキュベーションした。細胞を遠心分離によりペレット化し、二度洗浄し（洗浄緩衝液：Ｈａｎｋｓ緩衝塩類溶液、ＦＣＳ（５％））、次に、蛍光標識したヤギ抗マウスＩｇＭ第２抗体を用いて、氷上で３０分間インキュベーションした。細胞を洗浄し、固定し（０．１％ホルムアルデヒド、０．０２％アジド、１１０ｍＭグルコース）、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて蛍光シグナル検出をした。蛍光免疫染色：ＵＥ７Ｔ−１３細胞をガラス８ウェルチャンバスライド上で増殖させ、細胞染色をｉｎ  ｓｉｔｕでフローサイトメトリーごとに行った。ＳＴＯＲ−１で標識した細胞を、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ４００、Ｚｅｉｓｓ、ドイツ、オーバーコッヘン）を用いて検出した。コレステロールの隔離：ＵＥ７Ｔ−１３細胞を、メチルβ−シクロデキストリン（ＭβＣＤ）を用いて、３７℃で１時間インキュベーションし、次に洗浄緩衝液で２度洗浄した。フローサイトメトリーを上記で詳述したように行った。固定の前に、細胞生死判別色素７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）を、氷上で３０分間、標識化細胞を用いてインキュベーションした。
【０３４６】
データを図１に示す。（Ａ）ＵＥ７Ｔ―１３、間葉系間質細胞株に由来する不死化ヒト骨髄は、フローサイトメトリーを用いてＳＴＲＯ−１標識化細胞で観察される高平均蛍光強度（ＭＦＩ）により証明されるように、細胞表面にＳＴＲＯ−１結合部位が豊富にある（１Ａ６．１２ＭＦＩ＝１１２；ＳＴＲＯ−１ＭＦＩ＝１７１８８）（Ｂ）共焦点顕微鏡を用いて、生きたＵＥ７Ｔ−１３細胞へのＳＴＲＯ−１結合を検出した。矢印は、免疫蛍光による、培養ＵＥ７Ｔ−１３細胞におけるＳＴＲＯ−１の細胞突起または偽足への結合を示す。（Ｃ）メチルβ−シクロデキストリン（ＭβＣＤ）を用いて血漿膜からコレステロールを隔離することは、ＳＴＲＯ−１のＵＥ７Ｔ−１３細胞への結合を低減させ、これは、ＳＴＲＯ−１抗原が、細胞表面のコレステロールの豊富なマイクロドメインに位置することを示唆する。ＭβＣＤでの処理は、７ＡＡＤ染色、生存可能細胞内に入ることのない蛍光色素を用いて判断されるように、細胞の生存能力を低減させなかった。
【０３４７】
実施例２−ＳＴＲＯ−１は７０ｋＤａタンパク質に結合する
タンパク質溶解物を、ＲＩＰＡ緩衝液を用いて、ＵＥ７Ｔ−１３細胞から調製した。等量（５０μｇ）のタンパク質を、非還元条件下および還元（５％２−メルカプトエタノール）条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解した。分解したタンパク質をナイロン膜に電気泳動的に移した（１９２ｍＭグリシン、２５ｍＭＴｒｉｓ、１５％メタノールを２５０ｍＡで２時間）。膜を、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳ―Ｔ）（ブロッキング緩衝液）に溶解した２．５％（ｗ／ｖ）スキムミルクパウダーを用いて保護し、次に、ＳＴＲＯ−１または１Ａ６．１２ハイブリドーマ上清（ブロッキング緩衝液を用いて１：３に希釈）またはブロッキング緩衝液に溶解した１０μｇ／ｍＬ精製ＳＴＲＯ−１（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ；ＭＡＢ１０３８）を用いて、４℃で一晩インキュベーションした。膜をＴＢＳ−Ｔにおいて洗浄し、次に、ブロッキング緩衝液において、アルカリホスファターゼ−共役抗ＩｇＭ第２抗体を用いてインキュベーションした。結合第２抗体を、強化化学蛍光基質の存在下で、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ  Ｉｍａｇｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて視覚化した。
【０３４８】
データを図２に示す。ＳＴＲＯ−１は、７０ｋＤａタンパク質に結合する。非還元条件下（ＮＲ）および還元条件下（Ｒ）でＵＥ７Ｔ−１３より調製したタンパク質溶解物を、ＳＴＲＯ−１ハイブリドーマ上清を用いて精査した。ＳＴＲＯ−１は、タンパク質の還元に関係なく、約７０ｋＤａのタンパク質に結合した。自社のＳＴＲＯ−１ハイブリドーマ上清が商業的に供給されたＳＴＲＯ−１に同様のブロットパターンを提供するか否かを判断するため、精製ＳＴＲＯ−１をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＡＢ１０３８）より購入し、ウェスタンブロッティングを行った。両方の調製物がＵＥ７Ｔ−１３溶解物中の７０ｋＤａのタンパク質に結合した。ＩｇＭ対照抗体１Ａ６．１２を用いてもタンパク質は検出されなかった。これは、ＳＴＲＯ−１抗体結合が、マウスＩｇＭの非特異的結合によるものではないことを示す。
【０３４９】
実施例３−ＳＴＲＯ−１は、熱ショック同族７０（ＨＳＣ７０；ＨＳＰＡ８）に結合する
二次元ゲル電気泳動および質量分析法：ＵＥ７Ｔ−１３からのタンパク質溶解物を、２Ｄ緩衝液（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、および４％ＣＨＡＰＳ）ならびに音波処理を用いて調製した。次に、タンパク質を、５ｍＭのトリブチルホスフィン（ＴＢＰ）および１０ｍＭのアクリルアミドをそれぞれ室温（ＲＴ）で９０分間用いて、還元およびアルキル化した。二次元（２Ｄ）ゲル電気泳動を、重複して行った（一次元等電点電気泳動ｐＨ４〜７ＩＰＧ細片、続いて、４〜２０％Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲル上で電気泳動）。分解したタンパク質は、ナイロン膜に電気泳動的に移すか、または、すぐにＳＹＰＲＯ−ＲＵＢＹ、非特異的タンパク質ステインを用いて染色した。ナイロン膜はＳＴＲＯ−１を用いて（「０２７１」に詳述するように）ウェスタンブロッティングを行い、次に、ＳＹＰＲＯ―ＲＵＢＹ染色複製を用いて整列させた。ＳＴＲＯ−１を用いたウェスタンブロッティングにより検出された、タンパク質に相当するＳＹＰＲＯ−ＲＵＢＹ染色ゲル領域を切除し、トリプシンで消化し、ペプチドを抽出して脱塩した。マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ）を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４８００  Ｐｌｕｓ  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ  Ａｎａｌｙｓｅｒを用いて行った。この解析により、ペプチドピークリストを、ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ、英国、ロンドン）に提出し、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ｄａｔａｂａｓｅに対しペプチドを検索を行った。免疫沈降法：ＲＩＰＡ緩衝液（１ｍｇ）を用いて調製したＵＥ７Ｔ−１３細胞溶解物を、抗ＨＳＣ７０ｍＡＢ  １Ｂ５（Ｅｎｚｏ）または抗ＨＳＰ９０ウサギ多クローン性抗体（Ｓａｎｔｏ  Ｃｒｕｚ）を用いて、一晩４℃でインキュベーションした。免疫沈降した抗体を、１時間４℃でＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて、捕捉した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅおよび結合した抗体／抗原の複合体を遠心分離（２００ｘｇ）によりペレット化し、０．５ｘＲＩＰＡ緩衝液で５回洗浄した。複合体を還元緩衝液において加熱し（１００℃で５分間）、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解した。ＳＴＲＯ−１ウェスタンブロッティングを実施例２に記載するように実行した。ｓｉＲＮＡ：ＨＳＰＡ８転写物を標的にする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＨＳＰＡ８  ｓｉＲＮＡ、４３９０８２４、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および陰性対照ｓｉＲＮＡ（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ♯１、４３９０８４３）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＵＥ７Ｔ−１３に導入した。培養して３日後、タンパク質溶解物を調製し、ＳＴＲＯ−１ウェスタンブロッティングを実施例２に記載のように行った。
【０３５０】
データを図３に示す。（Ａ）ＳＴＲＯ−１が結合したタンパク質を特定するため、２次元ゲル電気泳動をウェスタンブロッティングと組み合わせて行った。ＳＴＲＯ−１が結合したタンパク質を選び、タンデム質量分析法にかけた。この解析により、熱ショック同族７０（ＨＳＣ７０、ＨＳＰＡ８）と同一の配列を有するペプチドをシーケンシングした。ＨＳＣ７０の６０％をカバーするシーケンシングしたペプチドを特定した（下線で示す）。（Ｂ）ＳＴＲＯ−１がＨＳＣ７０に結合することを確かめるため、ＨＳＣ７０を、抗ＨＳＣ７０抗体（１Ｂ５、ＳＴＲＥＳＳＧＥＮ）を用いてＵＥ７Ｔ―１３溶解物から免疫沈降させ、ＳＴＲＯ−１を用いてウェスタンブロッティングを行った。ＳＴＲＯ−１は、免疫沈降ＨＳＣ７０には結合するが、ＨＳＰ９０には結合しないことが分かった。（Ｃ）ＳＴＲＯ−１がＨＳＣ７０に結合することがさらに確認するため、ｓｉＲＮＡを用いてＨＳＣ７０  ＲＮＡ転写物の翻訳を阻害し、ＳＴＲＯ−１により検出されるタンパク質レベルを、ウェスタンブロッティングにより評価した。ブロッティングを行ったタンパク質における著しい還元が、ＨＳＰＡ８  ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトした細胞では観察されたが、スクランブル化ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトしたものでは観察されなかった。まとめると、これらの発見は、ＨＳＣ７０に対するＳＴＲＯ−１の結合と矛盾しない。
【０３５１】
実施例４−ＳＴＲＯ−１はＨＳＣ７０およびＨＳＰ７０に結合し、ＳＴＲＯ−１の細胞表面結合はＨＳＣ７０またはＨＳＰ７０のタンパク質発現とは相関しない
フローサイトメトリーを実施例１に記載のように行った。ウェスタンブロッティングを、ＲＩＰＡ緩衝液を用いて多数の初代細胞および細胞株から得られたタンパク質溶解物に対し、実施例２に記載のように行った。組み換えヒトＨＳＣ７０、ＨＳＰ７０、およびＧＲＰ７８がＥＮＺＯから得た。
【０３５２】
データを図４に示す。（Ａ）ＨＳＣ７０は偏在的に発現するが、ＳＴＲＯ−１細胞表面結合は、フローサイトメトリーにより、限られた数の細胞タイプに生じる。ＳＴＲＯ−１表面結合が、細胞溶解物におけるＳＴＲＯ−１結合と互いに関係しているか否かを判断するため、フローサイトメトリーとウェスタンブロッティングを、いくつかの細胞株および異なる種に由来する初代細胞において行った。ＳＴＲＯ−１の細胞表面結合を、陰性（−）または陽性（＋）の何れかで示す。ＳＴＲＯ−１は、細胞表面結合に関係なく、細胞溶解物においてＨＳＣ７０を検出する。ＨＥＫ−２９３Ｔ、ＨＥＬＡ、およびＨｅｐＧ２などの一部の溶解物では、ＳＴＲＯ−１は、近い分子量の２つのタンパク質を検出した。（Ｂ）ＨＳＣ７０は、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）に対し高度の相同性を示し、これは、ＳＴＲＯ−１が両タンパク質と交差反応し得ることを示唆する。この可能性をテストするため、ウェスタンブロッティングを、精製ヒト組み換えタンパク質を用いて行った。ＳＴＲＯ−１はＨＳＣ７０とＨＳＰ７０の両方に結合した。（Ｃ）ＳＴＲＯ−１がＨＳＰ７０ファミリーメンバーに非特異的に結合するか否かをテストするため、ＧＲＰ７８、別の密接に関係するファミリーメンバーに対するＳＴＲＯ−１結合をテストした。ＳＴＲＯ−１はＨＳＣ７０およびＨＳＰ７０には結合したが、Ｇｒｐ７８には結合しなかった。
【０３５３】
実施例５−ＨＳＣ７０はＵＥ７Ｔ−１３細胞の表面に存在し、組み換えＨＳＣ７０を用いたＳＴＲＯ−１のプレインキュベーションがＵＥ７Ｔ−１３細胞へのＳＴＲＯ−１の結合をブロックする
細胞表面ビオチン化：ＵＥ７Ｔ−１３およびＨＥＫ−２９３Ｔ細胞をトリプシン処理により採取し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、次に、細胞非透過性ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（０．５ｍｇ／ｍＬ）を用いて、氷上で１時間インキュベーションした。１００ｍＭのグリシンの付加で反応をクエンチさせた。細胞溶解物を、ＲＩＰＡ緩衝液を用いて調製した。免疫沈降法：ビオチン化細胞溶解物（１ｍｇ）を、抗ＨＳＣ７０  ｍＡＢ  １Ｂ５（Ｅｎｚｏ）または精製Ｒａｔ  ＩｇＧを用いて、一晩４℃でインキュベーションした。次に、免疫沈降した抗体を、１時間４℃でＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて捕捉した。免疫複合体を遠心分離（２００ｘｇ）によりペレット化し、０．５ｘＲＩＰＡ緩衝液で５回洗浄した。複合体を還元緩衝液において加熱し（１００℃で５分間）、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解した。ビオチン化タンパク質を、ストレプトアビジン共役アルカリホスファターゼを用いて、ウェスタンブロッティングにより検出した。ＨＳＣ７０タンパク質を、ウェスタンブロッティングにより、ＳＴＲＯ−１を用いて検出した。タンパク質ブロッキング：精製ＳＴＲＯ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、ブロッキング緩衝液において、組み換えヒトＨＳＣ７０（Ｅｎｚｏ）を用いておよび用いないで、一晩４℃でインキュベーションした。次に、フローサイトメトリーアッセイを実施例１で詳述したように行った。
【０３５４】
データを図５に示す。（Ａ）ＳＴＲＯ−１がＵＥ７Ｔ−１３細胞に結合するためは、ＨＳＣ７０は細胞表面にさらされなければならない。この問いについて調査するため、ＵＥ７Ｔ−１３およびＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（ＳＴＲＯ−１に結合しない細胞株）の表面に存在するタンパク質を、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン、膜不透過性ビオチン化試薬を用いて標識化した。細胞溶解物を、標識化細胞より調製し、ＨＳＣ７０を、１Ｂ５（抗ＨＳＣ７０抗体、ＳＴＥＳＳＧＥＮ）を用いて免疫沈降させた。次に、ビオチン化ＨＳＣ７０を、ストレプトアビジン−ＡＰを用いて検出した。ＨＳＣ７０は、ＵＥ７Ｔ−１３細胞ではビオチン化されたが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ではビオチン化されず、これは、フローサイトメトリーにより検出されたように、ＳＴＲＯ−１の細胞表面結合と一致する（図４）。ブロットを、ＳＴＲＯ−１を用いて再度精査して、同様のレベルのＨＳＣ７０が両細胞株から免疫沈降することが示された。（Ｂ）ＳＴＲＯ−１がＵＥ７Ｔ−１３細胞の表面においてＨＳＣ７０に結合することをより直接的に実証するため、ＳＴＲＯ−１をｒｈ−ＨＳＣ７０を用いて一晩４℃でプレインキュベーションした。次に、抗体／タンパク質複合体を、ＵＥ７Ｔ−１３細胞を用いてインキュベーションし、細胞表面に結合した任意のＳＴＲＯ−１を、蛍光標識した第２抗体およびフローサイトメトリーを用いて検出した。１Ａ６．１２（ＩｇＭイソタイプ対照）、ＳＴＲＯ−１のみ、およびＳＴＲＯ−１／ｒｈＨＳＣ７０複合体を用いた細胞のインキュベーションから生じる蛍光シグナルを示すヒストグラムを重ね合わせる。ｒｈＨＳＣ７０を用いたＳＴＲＯ−１のプレインキュベーションは、ＵＥ７Ｔ−１３細胞に対するＳＴＲＯ−１結合を低減させた（ＭＦＩにおいて３０％減少）。まとめると、これらのデータは、ＳＴＲＯ−１は、ＵＥ７Ｔ−１３細胞の表面においてＨＳＣ７０に結合することを示唆する。
【０３５５】
実施例６−ＳＴＲＯ−１はＨＳＣ７０のＡＴＰアーゼドメインに結合する
遺伝子工学トランケーション：ＨＳＰＡ８のトランケーション形を、ＰｆｕＴｕｒｂｏ（高忠実度な熱安定性ポリメラーゼ）を用いたポリメラーゼ連鎖反応を使用して生成し、シーケンシングし、レトロウイルス発現ベクターｐＲＵＦｉＧ２−ＨＡにクローン化した。ｐＲＵＦｉＧ２−ＨＡは、ＮｄｅＩ制限部位のＡＴＧに対しインフレームなＮ末端ヘマグルチニン配列（ＨＡ）を有する。ＨＳＰＡ８のトランケーション形を、レトロウイルス形質導入を［Ｉｓｅｎｍａｎｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２００９，１０：２４５７−６８］に以前記載されたように用いて、ＵＥ７Ｔ−１３に導入した。抗ＨＡ抗体（０５−９０４；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた免疫沈降を、実施例３に記載のように行った。
【０３５６】
データを図６に示す、ＳＴＲＯ−１は、ＨＳＣ７０のＡＴＰアーゼドメインに結合する。ＨＳＣ７０のＳＴＲＯ−１エピトープをマッピングするため、ＨＡ−タグをヒトＨＳＣ７０のＮ末端に付加し、Ｃ末端およびＮ末端の一連のトランケーションを行った。トランケーションをレトロウイルス形質導入により、ＵＥ７Ｔ−１３に導入した。（Ａ）Ｎ末端ＨＡタグ化ＨＳＣ７０トランケーションを免疫沈降させ、ウェスタンブロッティングによりＳＴＲＯ−１結合アッセイを行った（上部パネル）。ＳＴＲＯ−１は、Ｎ末端（Ｎ１、１−５０１）断片に結合するが、Ｃ末端ドメインには結合しない。Ｃ末端トランケーションを、Ｃ末端特異的抗体（中部パネル）および抗ＨＡ（下部パネル）を用いて検出し、トランケーションしたタンパク質が発現することを実証した。（Ｂ）エピトープをさらに調べるため、Ｎ末端ＡＴＰアーゼドメインの２つの追加トランケーションを検査した。ＳＴＲＯ−１はＮＩおよびＬ３９３（１−３９３）には結合したが、Ｔ２０４（１−２０４）は結合しなかった（上部パネル）。タンパク質発現が、抗ＨＡを用いたブロッティングにより確かめられた（下部パネル）。まとめると、このデータは、ＳＴＲＯ−１は、アミノ酸２０４〜３９３にわたる領域において、ＨＳＣ７０のＡＴＰアーゼドメインに結合することを示す。
【０３５７】
実施例７−ＨＳＣ７０におけるＳＴＲＯ−１エピトープの微細なマッピング
ペプチドアレイ：ヒトＨＳＣ７０の最初の３９３個のアミノ酸にわたるペプチドアレイをＩＮＴＡＶＩＳ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＡＧ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）により合成した。二重アレイを２．５％（ｗ／ｖ）のスキムミルクにおいて２時間ブロックし、ＴＢＳ−Ｔにおいてすすぎ、次に、１Ａ６．１２またはＳＴＲＯ−１上清（スキムミルクにおいて１：２に希釈）の何れかを用いて、一晩４℃で精査した。アレイをＴＢＳ−Ｔで洗浄し、次に、アルカリホスファターゼ共役抗ＩｇＭ第２抗体を用いて、室温で１時間インキュベーションした。ＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、結合第２抗体を、強化化学蛍光基質の存在下で、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ  ７０００  ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて視覚化した。欠失ミュータント解析：仮想ＳＴＲＯ−１エピトープの最初の４個のアミノ酸が欠失している（ΔＩＳＥＮ）ＨＳＣ７０の欠失ミュータントを、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを用いて作成した。ΔＩＳＥＮを発現するＵＥ７Ｔ−１３の固定細胞株変異体を、レトロウイルス形質導入を用いて作成した（Ｌ３９３  ΔＩＳＥＮ）。タンパク質溶解物を、Ｌ３９３対照およびＬ３９３  ΔＩＳＥＮ  ＵＥ７Ｔ−１３変異体より、ＲＩＰＡ緩衝液を用いて調製した。次に、免疫沈降（１ｍｇ）を、抗ＨＡ抗体またはイソタイプ適合マウス免疫グロブリンを用いて、実施例３に記載のように行った。免疫沈降タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、ナイロン膜に移し、次に、実施例２に記載のようにＳＴＲＯ−１ハイブリドーマ上清を用いて精査した。ＳＴＲＯ−１抗体結合の視覚化の後、膜を取り除き（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ブロックし、再度精査した。
【０３５８】
データを図７に示す。（Ａ）ＳＴＲＯ−１エピトープをＨＳＣ７０上に微細にマッピングするため、ヒトＨＳＣ７０の最初の３９３個のアミノ酸にわたるペプチドのアレイを合成した。各ペプチドは長さが１４ａａであり、２ａａ分オフセットし、スライドガラス上に二重に配置される１９２個のペプチドのアレイをもたらす。ペプチドアレイを１Ａ６．１２、ＩｇＭイソタイプ対照またはＳＴＲＯ−１を用いて精査した。１Ａ６．１２ではなくＳＴＲＯ−１が結合した２つの連続ペプチドが、二重にアレイ上でシミになる（黒い箱）。これらのペプチドはアミノ酸２５１〜２６６に対応し、欠失マッピング（図６）により特定される領域（２０４〜３９３）内に位置する。（Ｂ）アレイデータを検証するため、仮想ＳＴＲＯ−１エピトープの最初の４ａａが欠失している（Ｌ３９３−ΔＩＳＥＮ）欠失ミュータントを、ＵＥ７Ｔ−１３細胞に導入した。対照Ｌ３９３および細胞を発現するＬ３９３−ΔＩＳＥＮから調製した溶解物を用いて、抗ＨＡ免疫沈殿を行った。ＳＴＲＯ−１結合Ｌ３９３は検出されたが、Ｌ３９３−ΔＩＳＥＮへの結合は検出されなかった。対照的に、ａａ８２−１１０（ＡＢＧＥＮＴ、ＡＰ２８７２ａ）に対応するペプチドに対して産生されたＨＳＣ７０抗体は、Ｌ３９３とＬ３９３−ΔＩＳＥＮの両方に結合した。積載の違いを確かめるため、膜をはがし、抗ＨＡで再度精査した。これらのデータは、ＳＴＲＯ−１がアミノ酸２５１〜２６６に対応する領域においてＨＳＣ７０のＡＴＰアーゼドメインのエピトープに結合することを示唆する。
【０３５９】
エピトープを示唆する連続ペプチドに結合したＳＴＲＯ−１は、１２ａａ連続配列に限定される。ＳＴＲＯ−１は、また、アレイ上で二重ペプチドに結合し、再現性が実証された。ＩｇＭイソタイプ対照抗体１Ａ６．１２は、ＳＴＲＯ−１エピトープに結合せず、特異性が実証された。ＳＴＲＯ−１が結合したペプチドは、欠失ミュータントを用いて特定される領域、つまり、Ｔ２０４−Ｆ２９３内に位置し、これはアレイ実験をさらに支持する。このようなペプチドは、ＳＴＲＯ−１結合をブロックするなど、種々の実現可能な用途を有する。
【０３６０】
ＳＴＲＯ−１が結合するペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである：
ＫＤＩＳＥＮＫＲＡＶＲＲＬＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）
ＩＳＥＮＫＲＡＶＲＲＬＡＲＴＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３）
【０３６１】
したがって、ＳＴＲＯ−１が結合するエピトープは以下の通りである：
ＩＳＥＮＫＲＡＶＲＲＬＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４）
【０３６２】
実施例８−組み換えＨＳＣ７０は、細胞表面へのＳＴＲＯ−１の結合をブロックする
ヒトＨＳＣ７０の最初の３９３個のアミノ酸をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを用いてインフレームでクローン化した構造物を、標準技法を用いて生成して、Ｎ末端ＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ−Ｌ３９３）を作成した。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子融合系は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００８  Ｍａｙ；Ｃｈａｐｔｅｒ  ６：Ｕｎｉｔ  ６．６．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＳＴ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｓ１，Ｓｐｅｉｃｈｅｒ  ＤＷ，ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１１４０８６４に記載されている。
【０３６３】
組み換えＧＳＴおよびＧＳＴ−Ｌ３９３を、グルタチオンセファロースアフィニティクロマトグラフィを用いて、バクテリア溶解物から精製した。精製タンパク質をＰＢＳに対して透析し、量を量った。精製タンパク質の段階希釈液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、図８Ａに示すように、非特異的タンパク質ステインを用いて純度を検査した。
【０３６４】
ＳＴＲＯ−１エピトープがＧＳＴ−Ｌ３９３融合タンパク質に維持されていることを確かめるため、図８Ｂに示すように、ＳＴＲＯ−１を用いてウェスタンブロッティングを行った。ＳＴＲＯ−１が細胞表面上でＨＳＣ７０に結合しているか否かを判断するため、競争結合アッセイを行った。精製したＧＳＴまたはＧＳＴ−Ｌ３９３を、ＰＢＳに異なるモル比で溶解させたＳＴＲＯ−１を用いて、一晩４℃でインキュベーションした。次に、複合体を、ＵＥ７Ｔ−１３細胞を用いて、氷上で４５分間インキュベーションした。細胞を、洗浄緩衝液で２ｘ洗浄し、次に、１：１００の抗ＩｇＭ−ＰＥ複合体を用いてインキュベーションした。細胞を２ｘ洗浄し、ＳＴＲＯ−１結合を、フローサイトメトリーを用いて検出した。ＧＳＴ−Ｌ３９３を用いた、ただしＧＳＴのみではないＳＴＲＯ−１のプレインキュベーションは、ＳＴＲＯ−１の細胞表面への結合の用量依存的現象を引き起こし、これは、ＳＴＲＯ−１が細胞表面においてＨＳＣ７０に結合することを示唆する（図８Ｃ）。
【０３６５】
ＧＳＴ−Ｌ３９３を用いたプレインキュベーションにより引き起こされる抗体ブロックのレベルを、ＧＳＴのみを用いたプレインキュベーションで記録された蛍光シグナルを基準に求めた。ＧＳＴ−Ｌ３９３を用いたプレインキュベーションは、抗体結合を６０％低減させた（図８Ｄ）。
【０３６６】
フローサイトメトリーヒストグラムは、抗サルモネラＩｇＭ陰性対照（１Ａ６．１２）を用いたＵＥ７Ｔ−１３のインキュベーション後に生成される蛍光シグナル（図９Ａ）、ＧＳＴ３００：１を用いてプレインキュベーションしたＳＴＲＯ−１を用いたインキュベーション後に生成される蛍光シグナル（図９Ｂ）、ＧＳＴ−Ｌ３９３ ３００：１を用いてプレインキュベーションしたＳＴＲＯ−１を用いたインキュベーション後に生成される蛍光シグナル（図９Ｃ）、およびＡ〜Ｃを重ねたもの（図９Ｄ）を示す。
【０３６７】
実施例１０−ヒトＢＭＭＮＣのＳＴＲＯ−１＋ｖｅ／ＨＳＰ７０−ｖｅ画分は全てのＣＦＵ−Ｆ活性を含む
骨髄内のＳＴＲＯ−１＋ｖｅ細胞画分が全ての未熟な間質細胞を含み、これが線維芽細胞のコロニー（コロニー形成単位線維芽細胞ＣＦＵ−Ｆ）を生じさせると、当社は予想した。ＳＲＯ−１がＨＳＣ７０とＨＳＰ７０の両方に結合すると仮定すると、ＣＦＵ−Ｆ細胞の免疫表現型は不明確である。
【０３６８】
そのため、ヒト骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）に由来するＳＴＲＯ−１＋ｖｅ画分を生成し、ＨＳＰ７０結合に基づいてＳＴＲＯ−１＋ｖｅ画分を小分けし、集団を分類して単離し、ＣＦＵ−Ｕ活性についてアッセイを行った。
【０３６９】
骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）は、血液学的に正常なドナーの腸骨稜骨髄穿刺液から得た。ＢＭＭＮＣを遠心分離によりペレット化し、上記のようにブロッキング緩衝液に再懸濁した。ＳＴＲＯ−１ハイブリドーマ上清を加え、氷上で１時間、細胞をインキュベーションした。次に、細胞を実施例４に詳述するように洗浄し、ＭＡＣｓ緩衝液（ＰＢＳ、２％ＦＣＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁した。抗ＩｇＭマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を細胞に加え、氷上で３０分間インキュベーションした。ビーズおよび細胞を洗浄し、次に、磁気スタンドに搭載した磁気活性化細胞分離（ＭＡＣｓ）カラム（ＭＳ分離カラム、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に装填した。カラムを洗浄緩衝液で洗浄し、磁気スタンドから取り外し、カラムに結合した細胞を溶出した。次に、ＳＴＲＯ−１＋細胞をフィコエリトリン標識化抗ＩｇＭ抗体およびフルオレセイン標識化ｃｍＨＳＰ７０．１（抗ＨＳＰ７０）を用いて、氷上で１時間インキュベーションした。細胞を洗浄し、分離した細胞集団を蛍光活性化セルソーティング（ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  Ｆｕｓｉｏｎ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により単離した。ソーティングした細胞を数え、次に、２０％ＦＣＳを充填した増殖培地のウェル毎に、１ｘ１０５および３ｘ１０５で６個のウェルプレートに播種した。１４日後、コロニーをトルイジンブルー（１％パラホルムアルデヒドに溶解した０．１％トルイジンブルー）で染色し、数えた。
【０３７０】
データを図１０に示す。これは、ヒトＢＭＭＮＣのＳＴＲＯ−１＋ｖｅ／ＨＳＰ７０−ｖｅ画分が全てのＣＦＵ−Ｆ活性を含むことを示す。
【０３７１】
腸骨稜から単離したＢＭＭＮＣを、ＳＴＲＯ−１およびＳＴＲＯ−１＋ｖｅ細胞（ＭＡＣＳ ＳＴＲＯ−１＋ｖｅ）を、ＳＴＲＯ−１−ｖｅ細胞（ＭＡＣＳ  ＳＴＲＯ−１−ｖｅ）からＭｉｌｔｅｎｙｉマイクロビーズを用いた磁気活性化細胞分離（ＭＡＣｓ）により精製した。（Ａ）ＭＡＣＳ  ＳＴＲＯ−１＋ｖｅ細胞を、次に、（検出された細胞に結合したＳＴＲＯ−１に対する）抗ＩｇＭ−ＰＥと、抗ＨＳＰ７０−ＦＩＴＣ（ｃｍＨＳＰ７０．１）を用いてインキュベーションした。細胞集団を次にフローサイトメトリーにより解析し、細胞集団（図１０Ａに示すＱ１〜Ｑ４）を、蛍光活性セルソーティング（ＦＡＣｓ）を用いて精製した。（Ｂ）次に、精製細胞を数え、プレート化する。コロニー形成単位線維芽細胞（ＣＦＵ−Ｆ）の数を数え、プレート化した細胞数に対して正規化した。
【０３７２】
結論：ＳＴＲＯ−１を用いて単離した細胞集団には、細胞表面上でＨＳＰも発現する細胞が含まれる。しかしながら、ＣＦＵ−Ｆ活性は全て、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ／ＨＳＰ７０−ｖｅ集団に限定される。
【０３７３】
ｐｒｅ−ＭＡＣＳ対ＳＴＲＯ−１＋ｖｅ細胞の平均蛍光強度に基づき、細胞の富化は１２倍超になることが分かった。
【０３７４】
実施例１１−２０−２０２ｓおよびＳＴＲＯ−１は異なる抗原特異性を有する
Ａｂ  ２０−２０２ｓは、マウスの免疫原としてヒト胚性幹細胞株（Ｍｉｚ−ｈＥＳ１）を用いて生成された単クローン性抗体である（Ｓｕｎ  ＹＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００５；２３：１５０２−１５１）。Ａｂ２０−２０２ｓが、免疫沈降法および質量分析法を用いて、Ｍｉｚ−ｈＥＳ１細胞の表面に結合することと、ＨＳＣ７０が２０−２０ｓの標的として特定されることが分かった。
【０３７５】
そのため、Ａｂ２０−２０２ｓを入手し、Ａｂ２０−２０ｓとＳＴＲＯ−１の結合パターンを、フローサイトメトリーおよびウェスタンブロッティングを用いて比較することにした。
【０３７６】
フローサイトメトリーを、２０μｇ／ｍＬの精製２０−２０２ｓを用いて、実施例４に記載のように行った。結合した２０−２０２ｓを、フルオレセイン標識化抗マウスＩｇＧ抗体を用いて検出した。フローアッセイを、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。細胞株に由来する精製組み換えタンパク質およびタンパク質溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分解し、本明細書に記載するようにナイロン膜に移した。２０−２０２ｓおよびＳＴＲＯ−１を用いたウェスタンブロッティングを、結合した２０−２０２ｓが、ヤギ抗マウスアルカリホスファターゼ共役第２抗体を用いて検出されることを期待して、本明細書に記載するように行った。
【０３７７】
データを図１１に示す。（Ａ）フローサイトメトリーを行って、ＳＴＲＯ−１に結合することが以前示された細胞株を用いて、Ａｂ２０−２０２ｓおよびＳＴＲＯ−１をテストした。細胞株への抗体結合に重複がないことが発見され、これは、細胞株依存的であるＡｂ２０−２０２ｓおよびＳＴＲＯ−１が、ＨＳＣ７０上の異なるエピトープに結合することを示唆する。（Ｂ）ウェスタンブロッティングによると、Ａｂ２０−２０２ｓは７２ｋＤａタンパク質に結合するが、これは、表面結合がフローサイトメトリーにより示された細胞株においてのみである。対照的に、ＳＴＲＯ−１は、全ての細胞株において、ＨＳＣ７０とＨＳＰ７０に結合する。（Ｃ）Ａｂ２０−２０２ｓの特異性をテストするため、ウェスタンブロッティングを、精製組み換えＨＳＣ７０およびＨＳＰ７０を用いて行った。Ａｂ２０−２０２ｓは、（還元および非還元条件下で（データは示さない））組み換えＨＳＣ７０にもＨＳＰ７０にも結合しない。
【０３７８】
これらの研究によると、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ（２００５）はＡｂ２０−２０２ｓはＭｉｚ−ｈＥＳ１細胞上でＨＳＣ７０に結合することを示したものの、当社の場合、抗体はＨＳＣ７０に結合せず、したがって、Ｍｉｚ−ｈＥＳ１細胞でのＨＳＣ７０の存在は不確かであることが示される。
【０３７９】
Ａｂ２０−２０２ｓはＨＳＣ７０に結合しないか、または、Ａｂ２０−２０２ｓは、このタンパク質の組み換え型で保存されないＨＳＣ７０上の特異的なエピトープに結合する何れかであると結論づける。
【０３８０】
本明細書で用いる場合、「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」の単数形には、明確に他を明記する場合を除き、複数の物が含まれる。
【０３８１】
本明細書を通し、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含み（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形体は、言及された要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を含むが、任意の他の要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を排除しないことを含意すると理解されたい。
【０３８２】
本明細書に記載の全ての方法は、本明細書において他が支持されない限りまたは文脈において明らかに相反しない限り、任意の適切な順番で実施することができる。本明細書に提供されている任意のおよび全ての例または例示的な言葉（例えば「などの」）は、単に例の実施形態をより良好に説明することが意図され、特に特許請求されていない限り、請求される本発明の範囲に制限を課すものではない。本明細書における言語は、任意の請求項の非記載要素が必須であることを示すと考えられるべきではない。
【０３８３】
本明細書に提供されている記載は、共通の特徴および特質を共有し得るいくつかの実施形態に関係する。１つの実施形態の１つまたは複数の特徴は、他の実施形態の１つまたは複数の特徴と組み合わせ可能であり得ることを理解されたい。加えて、実施形態の単一の特徴または特徴の組み合わせは、追加の実施形態を構成し得る。
【０３８４】
本明細書で用いる見出し語は、読者の参照を容易にするためだけに含まれており、開示または特許請求の範囲に見られる主題を制限するために使用されるべきではない。見出し語は、特許請求の範囲または請求項の限界を解釈するために用いられるべきではない。
【０３８５】
本開示は特定の例を参照して記載されてきたが、本開示は他の多くの形態により具現化されうることが、当業者には理解されよう。
【０３８６】
本出願に基づいて、例えば、本出願の優先権を主張することにより、分割状態を主張することにより、および／または継続状態を主張することにより、将来的な特許出願が出願される可能性がある。以下の特許請求の範囲は、例示の目的で提供するにすぎず、そのような、任意の将来的な出願で請求され得るものの範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。特許請求の範囲が本開示の理解を限定する（または他の理解を除外する）と考えるべきではない。特徴は、例示の特許請求の範囲に後日加えられ得る、または該範囲から省略され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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