(57)【要約】  標的種のメンバーに対する化学剤または生物剤への閾値曝露量限界を確立するための方法であって、その種のメンバー間の応答のばらつきが起こる可能性を考慮する、方法が提供される。例示的な曝露量には、毒性剤に対する最大安全曝露量、または医薬品に対する最小有効用量が含まれる。本方法は、作用剤への応答性のばらつきが、標的種のメンバーを作用剤に直接曝露することによっては確認することができない状況下では、特に有用である。
2018516083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の標的種のメンバー間における、作用の閾値レベルを生じる化学剤または生物剤への曝露量の分布を推定するためのインビトロでの方法であって、
ａ）  作用剤への曝露に応答する、試験種と標的種との両方において起こる、対象となる作用を特定するステップと、
ｂ）  試験種における作用の閾値限界の点推定をもたらす、作用剤への曝露量を決定するステップと、
ｃ）  標的種の参照標準メンバーにおいて作用の等価な閾値限界を生じる曝露量を外挿して、標的種と等価な用量（ＴＳＥＤ）を求めるステップと、
ｄ）  適度な曝露量であると決定されたＴＳＥＤと等価な曝露量をアッセイに使用して、標的種の参照標準メンバーの試料からの組織もしくは細胞、または標的種の参照標準メンバーの試料からの組織もしくは細胞に由来する組織もしくは細胞に対して、インビトロでのアッセイを実施するステップと、
ｅ）  参照標準メンバーに関して、エンドポイントでの作用を測定し、そのエンドポイントに対する点数を決定するステップと、
ｆ）  必要に応じて様々な曝露量を使用して、標的種の追加のメンバーの試料からの組織もしくは細胞、または標的種の追加のメンバーの試料からの組織もしくは細胞に由来する組織もしくは細胞に対して、インビトロでのアッセイを実施して、参照標準メンバーについてｅ）において得られたものと同じ点数をそのメンバーにおいて生じる曝露量を、各追加のメンバー試料について推定するステップ
とを含む、方法。
【請求項２】
作用剤が、工業化学物質、医薬剤、細菌、ウイルスもしくは他の疾患を生じる作用剤、放射線剤、または美容剤もしくは化粧剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
作用剤が、催涙剤、嘔吐剤、臭気剤、無能化剤、ブリスター剤、神経剤、発赤剤、掻痒剤または窒息剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アッセイが、多能性幹細胞アッセイ、心筋細胞アッセイ、肝細胞アッセイ、神経細胞アッセイ、呼吸上皮アッセイまたは胚様体アッセイである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞が、人工多能性幹細胞、または多能性幹細胞に直接的もしくは間接的に由来する細胞もしくは組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
所望のエンドポイントが、毒性作用が起こらないと予期される最大曝露量である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
所望のエンドポイントが、所望の有益な効果が起こると予期される最小曝露量である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
複数の標的種のメンバー間における、毒性作用の閾値レベルを生じる化学剤または生物剤への曝露量の分布を推定するためのインビトロでの方法であって、
ａ）  作用剤への曝露に応答する、試験種と標的種との両方において起こる、対象となる毒性作用を特定するステップと、
ｂ）  試験種における毒性作用の閾値限界の点推定をもたらす、作用剤への曝露量を決定するステップと、
ｃ）  標的種の参照標準メンバーにおいて作用の等価な閾値限界を生じる曝露量を外挿して、標的種と等価な用量（ＴＳＥＤ）を求めるステップと、
ｄ）  適度な曝露量であると決定されたＴＳＥＤと等価な曝露量をアッセイに使用して、標的種の参照標準メンバーの試料からの組織もしくは細胞、または標的種の参照標準メンバーの試料からの組織もしくは細胞に由来する組織もしくは細胞に対して、インビトロでのアッセイを実施するステップと、
ｅ）  参照標準メンバーに関して、エンドポイントでの作用を測定し、そのエンドポイントに対する点数を決定するステップであって、点数が、毒性作用が検出されない最大曝露量に相当する、ステップと、
ｆ）  必要に応じて様々な曝露量を使用して、標的種の追加のメンバーの試料からの組織もしくは細胞、または標的種の追加のメンバーの試料からの組織もしくは細胞に由来する組織もしくは細胞に対して、インビトロでのアッセイを実施して、参照標準メンバーについてｅ）において得られたものと同じ点数をそのメンバーにおいて生じる曝露量を、各追加のメンバー試料について推定するステップ
とを含む、方法。
【請求項９】
作用剤が、工業化学物質、医薬剤、細菌、ウイルスもしくは他の疾患を生じる作用剤、放射線剤、または美容剤もしくは化粧剤である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
作用剤が、催涙剤、嘔吐剤、臭気剤、無能化剤、ブリスター剤、神経剤、発赤剤、掻痒剤、または窒息剤である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
アッセイが、多能性幹細胞アッセイ、心筋細胞アッセイ、肝細胞アッセイ、神経細胞アッセイ、呼吸上皮アッセイ、または胚様体アッセイである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
細胞が、人工多能性幹細胞、または多能性幹細胞に直接的もしくは間接的に由来する細胞もしくは組織である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
複数の標的種のメンバー間における、有益な効果の閾値レベルを生じる化学剤または生物剤への曝露量の分布を推定するためのインビトロでの方法であって、
ａ）  作用剤への曝露に応答する、試験種と標的種との両方において起こる、対象となる有益な効果を特定するステップと、
ｂ）  試験種における有益な効果の閾値限界の点推定をもたらす、作用剤への曝露量を決定するステップと、
ｃ）  標的種の参照標準メンバーにおいて効果の等価な閾値限界を生じる曝露量を外挿して、標的種と等価な用量（ＴＳＥＤ）を求めるステップと、
ｄ）  適度な曝露量であると決定されたＴＳＥＤと等価な曝露量をアッセイに使用して、標的種の参照標準メンバーの試料からの組織もしくは細胞、または標的種の参照標準メンバーの試料からの組織もしくは細胞に由来する組織もしくは細胞に対して、インビトロでのアッセイを実施するステップと、
ｅ）  参照標準メンバーに関して、エンドポイントでの効果を測定し、そのエンドポイントに対する点数を決定するステップであって、点数が、有益な効果が検出される最小曝露量に相当する、ステップと、
ｆ）  必要に応じて様々な曝露量を使用して標的種の追加のメンバーの試料からの組織もしくは細胞、または標的種の追加のメンバーの試料からの組織もしくは細胞に由来する組織もしくは細胞にインビトロでのアッセイを実施して、参照標準メンバーについてｅ）において得られたものと同じ点数をそのメンバーにおいて生じる曝露量を、各追加のメンバー試料について推定するステップ
とを含む、方法。
【請求項１４】
作用剤が、医薬剤、美容剤または化粧剤である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
アッセイが、多能性幹細胞アッセイ、心筋細胞アッセイ、肝細胞アッセイ、神経細胞アッセイ、呼吸上皮アッセイまたは胚様体アッセイである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
細胞が、人工多能性幹細胞、または多能性幹細胞に直接的もしくは間接的に由来する細胞もしくは組織である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、薬物開発、および化学的曝露の分析の分野に関する。特に、本出願は、化学剤または生物剤への曝露に対する、用量限界、曝露量限界または濃度限界などの閾値限界を決定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトおよび他の種は、幅広い化学剤および生物剤の曝露に対して反応する。これらの反応は、作用剤に応じて、有益なことがあり、または有害なことがある。さらに、多くの作用剤の場合、反応の程度は、通常、曝露度合いに正に関連する。
【０００３】
しかし、種の個々のメンバーは、該メンバー間の遺伝的ばらつき、それらの年齢、およびそれらの一生涯の間のある種の環境的因子に曝露されてきた度合いを含めた、複数の因子の結果として、応答の度合いが様々となる。したがって、その種のすべてのメンバーに対する、「閾値」限界を表す、単回用量または曝露量は存在しない。
【０００４】
ヒトなどの一部の種では、科学的または倫理的な障壁は、その種の生存メンバーに対する直接的な実験を通じて、集団（またはさらには、集団の標本）に対するある種の閾値限界を、研究者が決定する妨げとなることがある。このような場合、用量は、用量外挿と呼ばれる方法で、他の種から収集された情報から推定されることが多い。例えば、薬物開発の間の、および工業的な化学的曝露の規制における、毒性試験に対する一般的な手法は、薬物開発の場合における、ヒトへの臨床試験の前に行われる、動物実験の実施である。さらに、獣医は、より大きな動物種を処置する用量を推定するために小動物実験を実施することが多い。
【０００５】
現在利用可能な手順は、特定の閾値投与量を確立するために、１種の種または複数の種内の１匹または複数の動物を試験することを含む。例えば、未処置対照群と比べた場合に、特定の種において、有害作用の深刻な増大を引き起こさない最高観察用量である、無有害作用量（ＮＯＡＥＬ）尺度などの様々な尺度を、試験種における閾値用量として利用することができる。さらに、最低有効用量（ＭＥＤ）尺度は、未処置対照群と比べた、特定の種における、有意な有益な効果を生じることができる、最低用量である。閾値投与量を確立するために慣用的に選択される試験種は、以下に限定されないが、特定の作用剤の作用に関する、生物剤もしくは化学剤へのその感受性により決定される種、または標的種への種の生物的関連性によって決定される種を含む。言いかえると、ヒトまたは標的動物によって予期される反応に類似した、有益剤または有害剤のどちらかに対する反応を有することが予期される試験種が選択される。例えば、ラット、イヌまたは霊長類は、ヒトまたはウマと同じ作用剤の最終曝露の典型的な試験種である。
【０００６】
閾値を決定する間、試験種からの１匹の動物または一連の動物は、増量用量または減量用量に曝露される。次に、試験用量、または複数の用量から数理的に選択された用量が、その特定の種における閾値用量であると研究者により確立される。次に、研究者は、分析を実施し、用量外挿またはスケーリングの既知の方法を使用して、試験種における用量を、その標的種における等価な用量に変換する。例には、以下に限定されないが：身体の表面積に基づく相対成長率（ａｌｌｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｃａｌｉｎｇ）、ならびにクリアランスおよび分布体積を利用する、薬物動態により導かれる用量外挿が含まれる。
【０００７】
明示的または暗示的に、外挿された用量は、標的種の代表的な（または、参照標準）メンバーの推定される応答に関連しており、これは、メジアン、平均、モード、または中心度についての他のある尺度として定義することができる（例えば、動物からヒトに用量を外挿する場合、参照標準ヒトは、体重が６０キログラムの成人男性と見なされることが多い）。標的種のこの参照標準はまた、種の最小応答、最大応答または任意の階層応答、および種内の複数の中心度または階層応答に関連することがある。
【０００８】
現在の手法では、種のすべてのメンバーが等しく反応し得るとは限らない、ということを受け入れるよう適用される調整係数を求めることが多い。多くの場合、この調整係数は極度に単純化され、任意的なものとなり得る。例えば、工業的化学分析およびファーストインヒューマン（ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−ｈｕｍａｎ）臨床試験設計における現在の手法は、多くの場合、「１０×」（この用量が１０分の１に減量されることを意味する）という安全域を、「ヒト等価用量（ＨＥＤ）」と呼ばれる算出閾値用量に適用して、最大推奨初期投与量（ＭＲＳＤ）を得ることである。安全試験のこの例では、全体として、標的種における毒性の増加が疑われる理由がある場合、調整係数を高くすることができ、追加データが全体として標的種における安全性を強力に示唆する場合、この係数は小さくすることができる。
【０００９】
以前は未試験であった化学物質に関する状況では、調整係数は、現在試験されている化学物質の代表となり得るか、または代表となり得ない、他の化学物質の分析によって得られる係数に基づくことが多い。したがって、具体的なスケールアップ、またはそれらの任意の組合せに含まれる集団または化学物質の特定の状況に対して調整係数を誤って割り当てることが発生する可能性があり得る。
【００１０】
「真の」調整係数を過大評価または過小評価すると、安全閾値または有効閾値を開発する際に、コストがかかるおそれがある。例えば、薬物の安全閾値決定では、調整係数の過小評価は、ファーストインヒューマン臨床試験において有害作用が観察されるおそれがあり、このことは、薬物開発において、そうでなければ有益である薬物のさらなる進展の妨げとなるおそれがある。対照的に、最小有効用量が、推奨ＭＲＳＤに対して決定された用量をはるかに超える場合、調整係数を過大評価すると、臨床試験を継続するためにより多くの資源を必要とすることによって、大きなコストおよび効率性の悪さを招くおそれがある。工業的化学安全性閾値の決定では、調整係数が過小評価される場合、「臨床試験」がない場合、これらの化学物質に対する、ヒトにおける有害な曝露の可能性が高くなる。一方、調整係数が過大評価される場合、そうでなければ工業プロセスにおける有用化学物質となり得るものが不適格になるおそれがある。
【００１１】
有効閾値を決定するための調整係数の過大評価または過小評価に関与する類似の損失が存在する。過大評価は、有害作用を生じることがある一方、過小評価は、標的種が受容することが可能なことほど有益な用量を選択できないことがある。
【００１２】
したがって、標的集団における本来の多様性をよりよく説明する調整係数は、安全かつ有効な閾値レベルの決定に非常に有益となり得る。
【発明の概要】
【００１３】
本出願は種の複数のメンバーにおける、作用の閾値レベルを生じる化学剤または生物剤の用量分布、濃度もしくは曝露量を確立するか、または推定するインビトロでの方法を提供する。本方法は、以下のステップ：ａ）化学剤または生物剤に応答する試験種に起こる、および研究者が標的種において理解することが望ましい、対象となる作用を選択するステップ、ｂ）その試験種における作用の閾値レベルをもたらす、化学剤または生物剤の用量、濃度、それらへの曝露量を決定するステップ、ｃ）用量外挿方法を使用して、標的種の参照標準メンバーにおいて、作用の等価な閾値レベルを生じる、用量、濃度または曝露量を推定するステップ、ｄ）標的種のメンバーを起源とする組織、または上記のメンバーを起源とする組織に由来する組織に対して実施することができるインビトロでのアッセイであって、標的種における対象となる作用に類似しているか、またはそれに関連するエンドポイントを定量的に測定するアッセイを選択するステップ、ｅ）ステップｃ）からの用量、濃度または曝露量を使用して、標的種の参照標準メンバーに対して選択されたアッセイを実施するステップ、ｆ）エンドポイントを測定して、参照標準メンバーのそのエンドポイントに対する、閾値点数を決定するステップ、ｇ）標的種の複数の追加のメンバーを選択するステップ、ならびにｈ）ステップｆ）において決定された参照標準メンバーとほぼ同一の所望のエンドポイントを生じる化学剤または生物剤の用量、濃度または曝露量を決定するために、追加のメンバーの各々を起源とする組織、または上記の追加のメンバーを起源とする組織に由来する組織に対して、選択したアッセイを実施するステップであって、ステップｆ）における参照標準メンバーの閾値点数であることが既に決定されたのと同じ（または、ほぼ同じ）エンドポイント点数をそのメンバーに対して生じる化学剤または生物剤の用量、濃度または曝露量を必要に応じて使用してアッセイを実施する、ステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本発明の方法の非制限的な実施形態が、以下の図に例示されている。
【００１５】
【図１】図１は、表１における１９種の細胞系に関する、濃度応答曲線を示すグラフである。使用される試験化合物の濃度は、ｘ軸に示されており、対照細胞系の百分率として測定される細胞増殖は、ｙ軸に示されている。ｘ軸は、対数目盛で示されている。
【００１６】
【図２】図２は、１４種の肝細胞の細胞系に関する、濃度応答曲線を示すグラフである。使用した試験化合物（化合物Ｂ）の濃度は、ｘ軸に示されており、アッセイのエンドポイントは、ｙ軸に示されている。Ｘ軸は、算術目盛で表されている。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
種のメンバー間の応答にばらつきがある可能性を考慮して、化学剤または生物剤（例えば、毒性剤への最大安全曝露量、または医薬品の場合の最小有効用量）に曝露された場合の、上記の種のメンバー（本明細書において、標的種と称される）に対する閾値限界を確立または推定するための方法が提供される。本方法は、標的種の生存メンバーを作用剤に直接曝露することによっては応答性のばらつきを科学的または倫理的に確認することができない状況下では、特に有用である。
【００１８】
本明細書に記載されている方法により、薬物開発および別の種（試験種）における閾値限界（毒性の場合、最大安全曝露量）を確認する化学毒性の分野において、ならびに標的種（標的種の規定されている「代表的な」メンバーに暗示的に関連するもの）における単一の推定閾値限界を決定するための点推定用量（または、曝露量）外挿式を使用する、現在の手法が改善される。
【００１９】
本明細書において提供されている方法は、標的種の複数のメンバーに由来する組織または細胞に関する関連アッセイのインビトロでの実験を実施し、現在の手法で現在、算出されている閾値限界用量／濃度／曝露量に曝露された場合に、「代表的な」メンバーの体験と同じ測定影響または作用をもたらす、用量／濃度／曝露量の分布を確立するステップを含む。
【００２０】
特許請求されている方法は、以下の詳細な説明に基づいて、よりよく理解することができる。
【００２１】
（定義）
以下の用語が本出願において使用される通り、本明細書において定義される。
【００２２】
本明細書において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、明確かつ明白に１つの指示物に限定していない限り、複数の指示物を含む。
【００２３】
「閾値限界」は、個々の試験対象による、または対象となる種もしくは集団の参照メンバーによる対象となる応答が、有意に変化する際の、定義される用量、濃度または曝露量として本明細書において使用される。例えば、「閾値」は、ある反応が開始または終了する際の曝露量を指すことができる。さらに、「閾値」は、対象に対して有害であることが知られているレベル未満にある、メンバーの生物的反応によって定義される、「最大安全」用量、濃度または曝露量と見なされる、曝露量を指すことができる。反対に、「閾値」は、有益と見なされる化合物の場合、「最小有効」用量、濃度または曝露量を指すことができる。用語「用量」、「曝露量」および「濃度」は、本明細書において互換的である。
【００２４】
「曝露量」、「用量」および「用量濃度」は、本明細書において互換的に使用され得る。それらはそれぞれ、単回曝露量、反復曝露量または連続曝露量を指すことができる。
【００２５】
「参照標準メンバー」とは、種の実際のまたは仮想上のメンバーであって、そのメンバーの、ある構造的尺度または挙動尺度に対する点数が、その種の集団、または任意のサブ集団の代表と見なされる（しかし、用語「代表」は、研究者によって定義されてもよい）、メンバーを指す。代表は、メジアン、平均、モード、もしくは中心度についての他のある尺度となる、メンバーの任意の数値的な属性もしくは挙動もしくは反応の結果とすることができ、またはメンバーの代表は、実施される実験に対して外因性となる１つもしくは複数の因子に基づいて主張されてもよい。標的種のこの参照標準はまた、種のメンバーの最小応答、最大応答または任意の階層応答、およびその種内の複数の中心度または階層応答に関連することもある。スケールアップが最も緊密に適用される標的集団の任意のメンバーを選択する場合、様々な理由が生じ得る。例えば、安全閾値の決定において最も強い応答を有する標的種のメンバーを選択すると、一般集団が、対象となる作用剤に曝露される場合、後で発生する有害作用に対するリスクを下げてしまうことになると思われる。
【００２６】
「エンドポイント」は、作用の性質または対象となる反応に関連する、定量的に測定可能なパラメータを指す。「所望のエンドポイント」とは、所望の作用または対象となる反応に対する閾値限界または測定されたパラメータを指す。
【００２７】
「標的種」は、本明細書において、種であって、検討されている生物剤または化学剤に対するそのインビボでの反応が、行われている実験の最終目的となる、種として使用される。例示的な標的種は、ヒトである。
【００２８】
「生物剤または化学剤」は、以下に限定されないが、工業化学物質、医薬剤、細菌、ウイルスまたは他の疾患を生じる作用剤、放射線剤、および美容剤または化粧剤を含む。
【００２９】
「試験種」とは、本明細書で使用する場合、その実験が標的種に及ぼす作用またはそれによる反応を直接的または間接的に推定する目的で実施される、標的種以外の任意の種である。例示的な試験種は、同一生物剤または化学剤への標的種による反応に生物学的に類似している、対象となる生物剤または化学剤に対する反応を有する、実験室のラットなどの動物モデルを含む。
【００３０】
「標的種と等価な用量」は、標的種の参照標準メンバーに適用した場合、試験種における類似のエンドポイントに及ぼす閾値限界の作用を引き起こす用量として、標的種の参照標準メンバーにおける特定のエンドポイントに及ぼすものと同じ程度の作用を引き起こすことが推定される、用量を指すために、本明細書において使用される。
【００３１】
「組織」または「細胞」は、本明細書で使用する場合、以下に限定されないが、作製されたまたは動物外部で維持された任意の細胞であるが、対象となる動物と同じＤＮＡプロファイルを有している上記の任意の細胞を含む、ドナー動物から採取された細胞または組織に由来する細胞または細胞構築物を含めた、本明細書に記載されているインビトロでの試験に使用される、任意の細胞、組織、臓器または系を指す。例えば、「組織」は、本明細書で使用する場合、以下に限定されないが、血液、尿、臍帯血など、および従来的な組織試料などの同じ機能を一緒に果たす同じ起源の類似細胞の群などの、生物学的流体または体液に直接的または間接的に由来する生物学的試料を含む。さらに、用語「細胞」は、本明細書で使用する場合、以下に限定されないが、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞、およびそれらに由来する細胞などの、幹細胞を含めた、ヒトおよび動物の細胞を含む。
【００３２】
（詳細な説明）
標的種において、ある化合物に対する閾値用量限界、曝露量限界または濃度限界を確立するためにインビトロでの実験を使用するためのプラットフォームおよび方法が、本明細書において記載されており、調整係数が標的種のために確立され、標的種の作用の閾値レベルは、１つの試験種または複数の試験種に関する実験から以前に得られたものである。
【００３３】
最初に、作用剤の影響の従来的な、種間用量／濃度／曝露量検討を行い、この用量は、当業者に周知のプロトコルを使用して、標的種への従来的な用量外挿方法によりスケールが変更される。この従来の検討には、対象となる化学剤または生物剤、標的種、対象となる作用剤への反応の性質、および試験種の特定が含まれる。次に、試験種のメンバー（単数または複数）を、その実験に適した、どのような用量、濃度または曝露量、およびどのような方法でも作用剤に曝露させる。試験片に及ぼす作用を測定し、その結果を解析して、閾値作用レベル、および関連する用量、濃度または曝露量レベルを決定する。最後に、用量外挿に対するいずれかの既知の方法を使用して、その標的種における、等価な用量（時として、標的種と等価な用量またはＴＳＥＤとも呼ばれる）を決定する。
【００３４】
本方法は、以下のプラットフォームおよび方法を含む。
【００３５】
（１）研究者は、（ａ）標的種のメンバーを起源とする細胞もしくは組織、または標的種のメンバーを起源とする細胞に由来する細胞を利用し、（ｂ）上記の通り、インビトロでの反応が、試験種において観察される対象となる反応に有意な程度、類似している標的種において、インビボでの反応またはエンドポイントと非常に関連していることを示すよう実証されているインビトロでの試験または一連の試験を選択する。例えば、試験集団における心臓ミトコンドリアの損傷により、研究者に、標的集団からの心筋細胞に対して実施するためのミトコンドリア健全色素を用いる心筋細胞の細胞健全性アッセイの選択を促すことができる。
【００３６】
インビボでの試験実験において観察される同一作用に対するインビトロでの試験がない場合、研究者は、該研究者が保護または推進のどちらかを試みている生物的作用に対するモデルとして、別のインビトロでの試験を選択してもよい。例えば、試験集団における心臓発作の存在により、研究者に、心筋細胞の細胞健全性アッセイなどの、標的種（例えば、ヒト）において、心不全とインビトロで関連性を示すインビトロでの試験を行うよう促すことができる。本明細書に記載されている方法において使用されている代替的な健全性アッセイとしては、以下に限定されないが、多能性幹細胞健全性アッセイ、心筋細胞健全性アッセイ、肝細胞健全性アッセイ、神経細胞健全性アッセイ、呼吸上皮健全性アッセイ、胚様体健全性アッセイ、および当業者に既知の任意の他の細胞の健全性アッセイが挙げられる。
【００３７】
（２）研究者は、以前に決定された作用剤の標的種と等価な用量（ＴＳＥＤ）を、各ドナー（少なくとも５、好ましくは２０またはそれ超、および最も好ましくは５０またはそれ超）に対して個別に、標的種の複数のメンバーを起源とする（または、標的種の複数のメンバーを起源とする細胞に由来する）細胞または組織に適用する。
【００３８】
（３）研究者は、（２）からの数値結果を昇順で並べ、以前に記載されている任意の方法を使用して、メンバー（単数または複数）を「参照標準メンバー」として選択する。次に、研究者は、参照標準メンバーに対する試験のエンドポイントの数値結果を留意する。
【００３９】
（４）研究者は、（２）において利用したＴＳＥＤを囲む（一端または両端）様々な用量レベルにおいて、（２）に記載されている複数の標的種のメンバーの一部、大部分またはすべてにインビトロでの試験を実施する。
【００４０】
（５）次に、研究者は、そのように試験した各メンバーに対する用量応答曲線を生成することができる。次に、研究者は、（２）において利用したＴＳＥＤにおいて、参照標準メンバーによって生じる、特定のエンドポイントに対する同じ数値結果を生成する各ドナーに対する用量を計算する。一実施形態では、集団の残りの各メンバーに割り当てられた用量は、参照標準メンバーにより経験を受けた閾値作用に最も近い作用を誘発するものである。選択された限定複数用量が参照標準メンバーの閾値作用に十分類似していると見なされる標的集団の残りにおいて作用を生じることがない場合、該集団の残りの各メンバーに割り当てられた用量は、この作用が閾値作用に最も近づいているが、超えない用量と閾値作用を過ぎた最低用量との間に挿入することができる。この挿入は、線形であってもよく、幾何学的であってもよく、または任意の他の方法によってもよいことに留意されたい。さらに別の例では、用量は、明確な数値計算なしに、近似用量から推定される。
【００４１】
（６）次に、研究者は、様々な用量範囲が、ＴＳＥＤ下で生じる参照標準メンバーと同一の数値結果または挿入された数値結果を生じる、頻度に繋がるデータ分布を展開することができる。
【００４２】
重要なことに、本発明は、元々の試験種における複数の作用が対象となる場合、および標的種における複数の作用が対象となる場合のいずれも、試験種において、対象となるいずれか１つの作用と何らかの形で関係しているので、これらの場合も包含する。さらに、本発明は、複数のインビトロでの試験の複数のエンドポイントが対象となる場合は、試験種、標的種の一方、または両方において、インビボでの作用のいずれか１つと関係しているので、この場合を包含する。
【００４３】
特定の数値的結果を引き起こす用量に、複数のエンドポイントのいずれかの数値結果を変換する際には、研究者は、以下に限定されないが、各エンドポイントを個別に考慮することによる表示される用量の最も幅広い範囲を使用する重なり、用量範囲の統合、交線など含めた、これらのエンドポイントを組み合わせる任意の数の方法を利用することができる。
【００４４】
（７）次に、最終結果（ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ）として分布を使用することができる（検討、または予期される応答におけるばらつきの立証のためなど）か、またはこの分布を利用して、標的種における好ましい用量もしくは曝露閾値限界を推定することができる。好ましい用量または曝露閾値限界を推定するために使用する場合、研究者は、（６）において作成した分布を使用して、個体の標本によってモデル化される集団の好ましい一部において、研究者の目的を最良で実現するインビトロ用量を特定する（例えば、毒性の場合、標本の少なくとも９５％において許容される閾値未満の毒性作用を生じる最大用量を選択する）。次に、研究者は、当業者に既知の方法を使用して、選択したインビトロ用量をインビボ用量に変換する。
【実施例】
【００４５】
本発明は、以下の非限定例を参照することにより、よく理解することができる。
【００４６】
（実施例１）
医薬品化合物の毒性レベルの決定
新規医薬品化合物（「化合物Ａ」）の開発プログラムの初期において、ヒトで有効な化合物となるのに必要な可能性のある最小用量は、血液中で、０．００２マイクロモル濃度の程度の用量濃度を生じると思われるものである可能性が高いことがわかった。この用量が、毒性の副作用なしに耐容され得るかどうかについて、ある懸念があった。
【００４７】
ラットにおける試験により、低い用量で毒性作用、すなわち、動物の骨髄における細胞増殖速度の著しい低下が起こり、赤血球細胞数の有害な低下に至ることが決定された。ラットにおけるこの作用のＮＯＡＥＬ用量（この化合物が、ラットに経口投与された場合）は、０．０１４６ｍｇで測定した。
【００４８】
単一（および、公に入手可能な）相対成長率アルゴリズムを使用して、ラットにおけるＮＯＡＥＬ用量を、「参照」ヒトにおいて、１ｍｇの用量（やはり、経口投与した場合）に変換した。単一試験および標準技法を使用し、この用量は、「参照」ヒトの血中では、約０．００５マイクロモル濃度の用量濃度レベル（すなわち、０．００５未満の血中濃度を生じる用量未満が安全と見られた）に相当すると決定した。したがって、この参照ヒトは、このレベルが閾値用量未満となるので、最小有効用量（０．００２マイクロモル濃度の用量濃度に関連する）を耐容することができるように思われた。
【００４９】
しかし、「参照」ヒトよりも低い耐容閾値を有し得る任意のヒトに対して、毒性作用がある可能性について、懸念された。この疑問を検討するため、一連の実験を実施し、化合物Ａにより引き起こされる、集団の遺伝的に多様な標本であることを示した１９名のヒトドナーに由来する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の細胞増殖速度の低下を測定した。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＣｙｑｕａｎｔ（登録商標）アッセイをアッセイとして選択し、この実験をアッセイの標準プロトコルに従い実施した。
【００５０】
したがって、２０種の細胞系および対照細胞系にからのｉＰＳＣを、９６ウェルプレートに複数の複製でプレート培養した（余分のウェルは、対照として働く各細胞系用に供給した）。化合物Ａは、上記の相対成長率計算において予期される０．００５マイクロモル濃度レベルに等しい用量濃度となるまで、培地中で希釈した。この化合物を実験の複製ウェルに加え、対照ウェルにはビヒクルのみを加えた。複製を可能にする条件下で４８時間、インキュベートした後、実験の複製ウェルの結果を測定して解析し、次に、これらの結果を、ビヒクル対照ウェルからの結果と比較した。得られたエンドポイントは、ビヒクル対照のみが負荷された同じ細胞系の増殖速度の百分率として表される、０．００５マイクロモル濃度の用量濃度の化合物Ａの負荷下における各ｉＰＳＣ系の増殖速度の尺度から構成された。１９種の細胞系（実験誤差のために、結果を示さなかった１種の細胞系を除外した後）の結果が、以下の表１に示されている。
【表１】
2018516083.tif 000003
【００５１】
メジアン結果を生じた細胞系は、細胞系１０であった。したがって、細胞系１０は、その耐容性が、上記の用量外挿分析により推定された、「代表的な」ヒトと表された。細胞系１０の「増殖点数」（対照の％）は６０％であったので、ヒトが耐容できる細胞増殖の低下の閾値レベルは、Ｃｙｑｕａｎｔ（登録商標）試験において、６０％の点数に相当するものであるという仮定を採用した。
【００５２】
次に、他の１８名のドナーに由来する細胞系において、６０％の増殖点数を生じた用量濃度を決定した。他の方法を使用することができたが、これらの用量は、図１に示されている通り、十分な用量応答曲線に展開することにより決定した。この図から、閾値用量濃度が計算され、以下の表２に示されている。１８種の系のうちの４種（細胞系１０が含まれる場合、１９種の系）すなわちこれらの系の２１％が、０．００２マイクロモル濃度の用量濃度（すなわち、推定最小有効用量に相当する用量濃度）を下回った。
【表２】
2018516083.tif 000004
【００５３】
こうして、後期の臨床試験における有害な毒性所見の可能性が高いものとなった。１０×（薬物動態および薬力学の組合せ効果）という従来的な安全域は、第Ｉ相の投与量は、１９種の細胞系の間で見いだされた最低閾値用量未満（すなわち、０．０００７５マイクロモル濃度）となる０．０００５マイクロモル濃度（すなわち、相対成長率法により示された用量の１０分の１）で開始することを指示しているので、化合物Ａは、第Ｉ相試験に合格し得る。しかし、試験した系のかなりの部分の閾値が最小有効用量を下回ったことを考慮すると、第ＩＩ相は、化合物が有益性を生じる用量よりも少ない用量で、一部の試験参加者に毒性作用があることを明らかにする可能性が高いと思われる。その結果、化合物Ａの開発を縮小することが推奨された。
【００５４】
（実施例２）
有望な化合物の懸濁ビヒクルの選択の支援
医薬品会社は、薬物開発の初期（前臨床）相により、有望に見える化合物（化合物Ｂ）を開発した。この化合物は、懸濁液形態で患者に投与しなければならない（すなわち、単回用量がより大きな回分から抜き取られて、患者に投与される時に、懸濁液中に化合物の分子を保持する液体中に、この分子を溶解する）。
【００５５】
その過程において、懸濁液の機能を果たす好適なビヒクルを特定する時が来た。いくつかの属性は、様々な候補ビヒクル（相対費用、寿命などの）を区別するが、第１の基準は、集団の大部分（ここでは、集団の７５％またはそれ超の場合）にとって有益な効果を生じるのに十分に高い濃度の化合物（分子が、懸濁液から「離脱する」ことなく）を保持する候補ビヒクルの能力である。
【００５６】
研究者は、２つの副次的問題（ｓｕｂ−ｉｓｓｕｅ）を含む基準を認識する：（１）「集団の様々な部分において、有益な効果を実現するのに必要な化合物Ｂの最小の濃度は何か？」および（２）「候補ビヒクルが、必要な期間、首尾よく懸濁することができる、化合物Ｂの最大濃度は何か？」。研究者は、これら２つの副次的問題の１番目に対処するために本発明を使用する。
【００５７】
問題の実験に先んじて、医薬品会社は、イヌにおいて最小有効用量（ＭＥＤ）濃度を確立するため、イヌでインビボでの検討を実施し、典型的な相対成長用量外挿式を使用して、性別および体重を規定した参照標準ヒト（すなわち、一般的な６０ｋｇの男性）に対するＭＥＤを推定し、１３．４マイクロモル濃度の血中用量濃度レベルとなった。しかし、医薬品会社は、ヒトは化合物に対するその応答性にばらつきがあることを認識しており、したがって、この用量は集団の一部、大部分またはほとんどすべてに有益性をもたらすのに十分となり得るか、または十分となり得ないことを認識している。したがって、研究者は、集団の７５％において最小レベルの有益な影響を実現するために必要な化合物Ｂの推定される最小用量（または、用量濃度は最小用量に変換することができるので、用量濃度）を見いだすという課題が与えられる。
【００５８】
有益な効果は、肝臓内での特定のタンパク質生成の増加に関係しているので、研究者は肝細胞によるその特定のタンパク質の生成を検出するインビトロでのアッセイを選択する。次に、研究者は、１４名の健常な成人の標本（性別、人種および体重により規定される）からｉＰＳＣの試料を得て、その健常な成人の１名（体重が６０ｋｇに近い男性）が参照標準ヒトとして選択される。
【００５９】
研究者は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手可能なＣｅｌｌａｒｔｉｓ  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  Ｅｎｄｏｄｅｒｍ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ＫｉｔおよびＣｅｌｌａｒｔｉｓ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔからのプロトコルに従い、それらの物質を使用して、ドナーのすべてに由来するｉＰＳＣを肝細胞に分化させる。
【００６０】
次に、研究者は、予め決定された１３．４マイクロ濃度のＭＥＤ用量濃度、ならびに３．６マイクロモル濃度および５０．０マイクロモル濃度というＭＥＤを囲む２種の用量濃度において、参照標準ヒトに由来する細胞に対して化合物Ｂのアッセイを実施する。ＭＥＤを用いて実施されたアッセイは、選択エンドポイントで５６％の点数となる。
【００６１】
次に、研究者は、上記と同じ用量濃度を使用して、試料の他のメンバーに対してアッセイを繰り返す。結果が、図２に示されている。次に、研究者は、ＭＥＤにおける標準参照ヒトにより示されたものと同じ５６％の点数となった、他の１３名のドナーの場合の用量濃度を挿入する。結果が以下の表３に示されている。
【表３】
2018516083.tif 000005
【００６２】
１４名の試料中の７５パーセンタイルは、１０番目の観察および１１番目の観察の間に起こる。したがって、研究者は、集団の少なくとも７５％において、最小限の有益な効果を生じるのに必要な推定用量濃度として、１１番目の観察に関連する用量、すなわち２６．４マイクロモル濃度と特定する。
【００６３】
その結果、医薬品会社は、候補ビヒクルのリストを、２６．４マイクロモル濃度の用量濃度の化合物Ｂを首尾よく懸濁することができるものに絞り込む。
【図１】
2018516083.tif 000006
【図２】
2018516083.tif 000007
【国際調査報告】
2018516083.tif 000008