(57)【要約】  本発明は、pGlu-Abeta(pGlu-Aβ)ペプチドの検出のための非常に高感度の方法、及びアルツハイマー病及び軽度認知障害などの神経変性疾患の診断におけるこの方法の使用に関する。本発明は、さらに、pGlu-Aβペプチドのレベルの変化をモニタリングすることによって神経変性疾患の治療の有効性をモニタリングするための新規の方法に関する。【選択図】図2
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中のAβ標的ペプチドの検出のための非常に高感度の方法であって、前記Aβ標的ペプチドに特異的である捕捉試薬;及びAβ標的ペプチド検出複合体を含み、
a)生体試料を、前記捕捉試薬及び前記検出複合体と接触させるステップ;及び
b)前記Aβ標的ペプチドを検出するステップ
を含み、ここで、該検出複合体は、Aβ標的ペプチド特異的抗体と、核酸マーカーとを含む、前記方法。
【請求項２】
前記Aβ標的ペプチドが、pGlu-Aβペプチドである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記検出複合体が、pGlu-Aβペプチドと結合することが可能な検出抗体、あらかじめ決定されたヌクレオチド配列を含む1以上の核酸マーカー、並びに、前記抗体及び核酸マーカーを結合させるように適合された1以上の第1のリンカー分子からなる、本質的にこれらからなる、又はこれらを含む、請求項1又は2記載の方法。
【請求項４】
a)前記生体試料を、前記検出複合体と、Aβ標的ペプチドの前記検出複合体への結合を可能にする条件下で接触させるステップ;及び
b)続いて、検出複合体に結合された前記Aβ標的ペプチドを、Aβ標的ペプチドと結合することが可能な捕捉試薬と、前記捕捉試薬の前記Aβ標的ペプチドへの結合を可能にする条件下で接触させるステップ、を含む、請求項1から3のいずれか1項記載の方法。
【請求項５】
前記捕捉試薬が、pGlu-Aβペプチドに特異的な捕捉抗体である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
a)生体試料を、少なくとも1種の検出複合体と、前記検出複合体の前記Aβ標的ペプチドへの結合を可能にする条件下で接触させるステップであって、前記検出複合体は、Aβ標的ペプチドと結合することが可能な検出抗体、あらかじめ決定されたヌクレオチド配列を含む1以上の核酸マーカー、並びに、前記抗体及び核酸マーカーを結合させるように適合された1以上の第1のリンカー分子からなる、本質的にこれらからなる、又はこれらを含む、前記ステップ;
b)該検出複合体に結合された前記Aβ標的ペプチドを、前記Aβ標的ペプチドと結合することが可能な捕捉抗体と、前記捕捉抗体の前記Aβ標的ペプチドへの結合を可能にする条件下で、さらに接触させるステップ;並びに
c)前記Aβ標的ペプチドを検出するステップ、を含み、
前記Aβ標的ペプチドは、pGlu-Aβペプチドであり;かつ
検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方は、前記pGlu-Aβペプチドのピログルタミン酸保有アミノ末端に特異的に結合する、請求項1から5のいずれか1項記載の方法。
【請求項７】
前記検出抗体と前記捕捉抗体が両方とも、前記pGlu-Aβペプチドのピログルタミン酸保有アミノ末端に特異的に結合する、請求項1から6のいずれか1項記載の方法。
【請求項８】
前記検出抗体が、前記pGlu-Aβペプチドのピログルタミン酸保有アミノ末端に特異的に結合し、かつ前記捕捉抗体が、ピログルタミン酸保有アミノ末端以外の、Aβペプチドの別のエピトープ配列に結合する、請求項1から6のいずれか1項記載の方法。
【請求項９】
前記捕捉抗体が、前記pGlu-Aβペプチドのピログルタミン酸保有アミノ末端に特異的に結合し、かつ前記検出抗体が、ピログルタミン酸保有アミノ末端以外の、Aβペプチドの別のエピトープ配列に結合する、請求項1から6のいずれか1項記載の方法。
【請求項１０】
前記検出複合体が、生体試料と類似のマトリックス中に提供され、かつ、1+1よりも低い比で生体試料に直接的に添加される、請求項1から9のいずれか1項記載の方法。
【請求項１１】
pGlu-Aβペプチドが、モノマーとして及び/又はAβペプチドオリゴマー内に検出される、及び/又は生体試料中のタンパク質に結合されている、請求項1から10のいずれか1項記載の方法。
【請求項１２】
前記pGlu-Aβが、配列番号:26〜37から選択される少なくとも1種のpGlu-Aβペプチドである、請求項1から11のいずれか1項記載の方法。
【請求項１３】
前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体が、配列番号:26〜31から選択される前記少なくとも1種のpGlu-Aβペプチドのピログルタミン酸保有アミノ末端に特異的に結合する、請求項1から12のいずれか1項記載の方法。
【請求項１４】
配列番号:26〜31の前記少なくとも1種のpGlu-Aβペプチドのピログルタミン酸保有アミノ末端に特異的に結合する前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体が、
pGlu3-Aβ抗体クローン2-48(モノクローナル、マウス);Synaptic Systems社、
pGlu3-Aβ抗体(ポリクローナル、ウサギ);Synaptic Systems社、Biotrend社、IBL社、
pGlu3-Aβ抗体クローン8E1(モノクローナル、マウス);Anawa社、
pGlu3-Aβ抗体クローン8E1(モノクローナル、マウス);Biotrend社、
抗ヒトアミロイドβ(N3pE)ウサギIgG(ポリクローナル、ウサギ);IBL社、
Abeta-pE3ウサギポリクローナル、アフィニティ精製済み、Synaptic systems社、
抗ヒトAβ N3pE(8E1)マウスIgG Fab(モノクローナル、マウス);IBL社、
pGlu3-Aβ抗体クローン337.48(モノクローナル、マウス);Biolegend社、
pGlu3-Aβ抗体クローン1-57(モノクローナル、マウス);Synaptic Systems社、
pGlu3-Aβ抗体クローン70D7(モノクローナル、マウス);Synaptic Systems社、及び
オリゴpGlu3-Aβ抗体クローン9D5(モノクローナル、マウス);Synaptic Systems社
からなる群から選択される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体が、エピトープ配列
【化１】
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に特異的に結合する、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体の軽鎖の可変部分が、配列番号:40のヌクレオチド配列又は配列番号:41のアミノ酸配列を有し、かつ前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体の重鎖の可変部分が、配列番号:42のヌクレオチド配列又は配列番号:43のアミノ酸配列を有する、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体の軽鎖の可変部分が、配列番号:44のヌクレオチド配列又は配列番号:45のアミノ酸配列を有し、かつ前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体の重鎖の可変部分が、配列番号:46のヌクレオチド配列又は配列番号:47のアミノ酸配列を有する、請求項13記載の方法。
【請求項１８】
前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体の軽鎖の可変部分が、配列番号:48のヌクレオチド配列又は配列番号:49のアミノ酸配列を有し、かつ前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体の重鎖の可変部分が、配列番号:50のヌクレオチド配列又は配列番号:51のアミノ酸配列を有する、請求項13記載の方法。
【請求項１９】
前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体の軽鎖の可変部分が、配列番号:52のヌクレオチド配列又は配列番号:53のアミノ酸配列を有し、かつ前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体の重鎖の可変部分が、配列番号:54のヌクレオチド配列又は配列番号:55のアミノ酸配列を有する、請求項13記載の方法。
【請求項２０】
前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体が、
Aβ 5-5-6(寄託番号DSM ACC 2923)、
Aβ 6-1-6(寄託番号DSM ACC 2924)、
Aβ 17-4-3(寄託番号DSM ACC 2925)、
Aβ 24-2-3(寄託番号DSM ACC 2926)
からなる群から選択されるハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項1から請求項19のいずれか1項記載の方法。
【請求項２１】
前記pGlu-Aβペプチドが、配列番号:32〜37の少なくとも1種のpGlu-Aβペプチドである、請求項1から請求項11のいずれか1項記載の方法。
【請求項２２】
配列番号:32〜37の前記pGlu-Aβ(11-x)ペプチドpGlu-Aβペプチドのピログルタミン酸保有アミノ末端に特異的に結合する前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体が、
pGlu11-Aβ抗体クローン173D8,(モノクローナル、マウス);Synaptic Systems社、及び
pGlu11-Aβ抗体(ポリクローナルウサギ);Synaptic Systems社
からなる群から選択される、請求項22記載の方法。
【請求項２３】
前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体が、配列番号:39のエピトープ配列pGlu-VHHに特異的に結合する、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体の軽鎖の可変部分が、配列番号:56のヌクレオチド配列又は配列番号:57のアミノ酸配列を有し、かつ前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体の重鎖の可変部分が、配列番号:58のヌクレオチド配列又は配列番号:59のアミノ酸配列を有する、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体が、ハイブリドーマ細胞株Aβ 13-11-6(寄託番号DSM ACC 3100)によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項21記載の方法。
【請求項２６】
前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体が、前記pGlu-Aβペプチドのピログルタミン酸保有アミノ末端以外のAβペプチドのエピトープに結合する、請求項1から請求項25のいずれか1項記載の方法。
【請求項２７】
前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体が、
3D6、エピトープ:1-5(Elan Pharmaceuticals社、Innogenetics社)、
pAb-EL16、エピトープ:1-7、
2H4、エピトープ:1-8(Covance社)、
1E11、エピトープ:1-8(Covance社)、
20.1、エピトープ:1-10(Covance社、Santa Cruz Biotechnology社)、
ウサギ抗Aβポリクローナル抗体、エピトープ:1-14(Abcam社)、
AB10、エピトープ:1-16(Chemicon/Upstate社-Millipore社の一部)、
82E1、エピトープ:1-16(IBL社)、
pAb 1-42、エピトープ:1-11、
NAB228、エピトープ:1-11(Covance社、Sigma-Aldrich社、Cell Signaling社、Santa Cruz Biotechnology社、Zymed/Invitrogen社)、
DE2、エピトープ:1-16(Chemicon/Upstate社-Millipore社の一部)、
DE2B4、エピトープ:1-17(Novus Biologicals社、Abcam社、Accurate社、AbD Serotec社)、
6E10、エピトープ:1-17(Signet Covance社、Sigma-Aldrich社)、
10D5、エピトープ:3-7(Elan Pharmaceuticals社)、
WO-2、エピトープ:4-10(The Genetics Company社)、
1A3、エピトープ5-9(Abbiotec社)、
pAb-EL21、エピトープ5-11、
310-03、エピトープ5-16(Abcam社、Santa Cruz Biotechnology社)、
ニワトリ抗ヒトAβポリクローナル抗体、エピトープ12-28(Abcam社)、
ニワトリ抗ヒトAβポリクローナル抗体、エピトープ25-35(Abcam社)、
ウサギ抗ヒトAβポリクローナル抗体、エピトープ:N末端(ABR社)、
ウサギ抗ヒトAβポリクローナル抗体(Anaspec社)、
12C3、エピトープ10-16(Abbiotec社、Santa Cruz Biotechnology社)、
16C9、エピトープ10-16(Abbiotec社、Santa Cruz Biotechnology社)、
19B8、エピトープ9-10(Abbiotec社、Santa Cruz Biotechnology社)、
pAb-EL26、エピトープ:11-26、
BAM90.1、エピトープ:13-28(Sigma-Aldrich社)、
ウサギ抗β-アミロイド(pan)ポリクローナル抗体、エピトープ:15-30(MBL社)、
22D12、エピトープ:18-21(Santa Cruz Biotechnology社)、
266、エピトープ:16-24(Elan Pharmaceuticals社)、
pAb-EL17; エピトープ:15-24、
4G8、エピトープ:17-24(Covance社)、
ウサギ抗Aβポリクローナル抗体、エピトープ:22-35(Abcam社)、
G2-10;エピトープ:31-40(The Genetics Company社)、
ウサギ抗Aβ、aa 32-40ポリクローナル抗体(GenScript Corporation社)、
EP1876Y、エピトープ:x-40(Novus Biologicals社)、
G2-11、エピトープ:33-42(The Genetics Company社)、
16C11、エピトープ:33-42(Santa Cruz Biotechnology社)、
21F12、エピトープ:34-42(Elan Pharmaceuticals社、Innogenetics社)、
1A10、エピトープ:35-40(IBL社)、
D-17ヤギ抗Aβ抗体、エピトープ:C-末端(Santa Cruz Biotechnology社)、
2C8、エピトープ:1-16(Accurate社)、
BAM-10、エピトープ:1-12(Biotrend社、Sigma-Aldrich社)、
12B2、エピトープ:11-28(IBL社、Biotrend社)、
6F/3D、エピトープ:8-17(Accurate社)、
310-01、エピトープ:10-16,(Accurate社)、
11A5-B10、エピトープ:34-40,(Millipore社)、
12F4、エピトープ:36-42、(Millipore社、Covance社)、
9C4、エピトープ:37-43、(Milipore社)、
7N22、エピトープ:1-20、(Biosource社)、
11A50-B10、エピトープ:35-40)(Covance社)、
G2-13、エピトープ:C-末端Aβ42(Genetics Company社)、
2B9、エピトープ:1-17(Santa Cruz社)、及び
9C4、エピトープ:3-8(Covance社)
からなる群から選択される、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
前記検出複合体が、前記第1のリンカー分子と特異的に結合することが可能な1以上の第2のリンカー分子をさらに含む、請求項1から請求項27のいずれか1項記載の方法。
【請求項２９】
前記pGlu-Aβペプチドの検出が、イムノPCR反応を用いて実施される、請求項1から請求項28のいずれか1項記載の方法。
【請求項３０】
異なるpGlu-Aβペプチドの混合物が、定量化のための基準物質として適用される、請求項1から請求項29のいずれか1項記載の方法。
【請求項３１】
アルツハイマー病及び軽度認知障害などの神経変性障害を診断又はモニタリングする方法における、請求項1から請求項30のいずれか1項記載の方法の使用。
【請求項３２】
被験対象からの生体試料中のpGlu-Aβペプチドのレベルを決定することを含む、アルツハイマー病及び軽度認知障害などの神経変性疾患を診断又はモニタリングする方法であって：
i. 請求項1から30のいずれか1項記載の方法を用いて、前記神経変性疾患に悩まされている疑いがある対象からの生体試料中のpGlu-Aβペプチドの第1のレベルを決定するステップ;
ii. 前記pGlu-Aβペプチドの第1のレベルを、健康な対照対象における前記pGlu-Aβペプチドの第2のレベルと比較するステップ;及び
iii. 前記生体試料中の前記pGlu-Aβペプチドのレベルが、健康な対照対象における前記pGlu-Aβペプチドのレベルと比較して増大している場合に、対象を神経変性疾患と診断するステップ、を含む、前記方法。
【請求項３３】
アルツハイマー病又は軽度認知障害などの神経変性疾患を有する、該疾患を有する疑いがある、又は該疾患に罹患しやすい対象における治療法の有効性をモニタリングする方法であって、請求項1から30のいずれか1項記載の方法を用いて、被験対象からの生体試料中のpGlu-Aβペプチドのレベルを決定することを含む前記方法。
【請求項３４】
被験対象から2回以上採取された生体試料中のpGlu-Aβペプチドのレベルを決定することを含む、請求項32又は33に記載の、診断又はモニタリングする方法。
【請求項３５】
前記生体試料の提供者である前記対象の神経変性疾患の状態が、1以上の心理測定試験で特徴付けられる、請求項32から34のいずれか1項記載の方法。
【請求項３６】
前記心理測定試験が、DemTect検査、ミニメンタルステート検査、時計描画検査、ADAS-Cog、Blessed Test、CANTAB、Cognistat、NPI、BEHAVE-AD、CERAD、CSDD、GDS、及び7 Minute Screenから選択される、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
前記生体試料が、組織、血液、血清、尿、脳脊髄液(CSF)、血漿、リンパ液、唾液、汗、胸水、滑液、涙液、胆汁、及び膵分泌物からなる群から選択される、請求項1から36のいずれか1項記載の方法又は使用。
【請求項３８】
アルツハイマー病又は軽度認知障害などの神経変性疾患を診断するためのキットであって、少なくとも1種の検出複合体、少なくとも1種の捕捉抗体、及び前記キットを使用するための説明書を含み、ここで、前記検出複合体は、Aβ標的ペプチドと結合することが可能な検出抗体、あらかじめ決定されたヌクレオチド配列を含む1以上の核酸マーカー、並びに、前記抗体及び核酸マーカーを結合させるように適合された1以上の第1のリンカー分子を含む、本質的にこれらからなる、又はこれらからなり、かつ、前記検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方が、pGlu-Aβペプチドのピログルタミン酸保有アミノ末端と特異的に結合する、前記キット。
【請求項３９】
前記検出複合体が、前記第1のリンカー分子と特異的に結合することが可能な1以上の第2のリンカー分子をさらに含む、請求項38記載のキット。
【請求項４０】
Aβ標的ペプチドと結合することが可能な検出抗体、あらかじめ決定されたヌクレオチド配列を含む1以上の核酸マーカー、並びに、前記抗体及び核酸マーカーを結合させるように適合された1以上の第1のリンカー分子を含む、本質的にこれらからなる、又はこれらからなる、検出複合体。
【請求項４１】
前記第1のリンカー分子と特異的に結合することが可能な1以上の第2のリンカー分子をさらに含む、請求項40記載の検出複合体。
【請求項４２】
前記検出抗体が、pGlu-Aβペプチドのピログルタミン酸保有アミノ末端に特異的に結合する、請求項40又は41記載の検出複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、pGlu-Abeta(pGlu-Aβ)ペプチドの検出のための非常に高感度の方法、及びアルツハイマー病及び軽度認知障害などの神経変性疾患の診断におけるこの方法の使用に関する。本発明は、さらに、pGlu-Aβペプチドのレベルの変化をモニタリングすることによって神経変性疾患の治療の有効性をモニタリングするための新規の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
(発明の背景)
アルツハイマー病は、認知症の最も一般的な形態であり、全認知症障害の中で約65〜70％の罹患率を有する(Blennowらの文献, 2006)。平均寿命の延長に起因して、この疾患は、日本及び中国のような高度先進工業国、並びに米国及び欧州で特別な問題になっている。アルツハイマー患者の数は、2001年の2400万人から2040年には8100万人に増加すると推定されている(Ferriらの文献, 2005)。現在、全世界のAD患者の治療及び介護の費用は、年間約2500億米ドルに達する。
【０００３】
孤発型のアルツハイマー病の進行は比較的緩徐であり、アルツハイマー病は、最初の症状の発症後、通常約10〜12年間持続することとなる。現在、ADの信頼できる早期診断を行い、それを他の形態の認知症と区別することは極めて困難である。信頼度が90％を上回る正確な診断は、この疾患の後期にのみ可能となる。それ以前は、アルツハイマー病の可能性がある又はその可能性が高いことを予測することしかできず、その場合の診断は、Knopmanらの文献, 2001;Waldemarらの文献, 2007、又はDuboisらの文献, 2007による特定の基準の使用に頼っている。しかし、神経変性は、最初の臨床症状が認められる20から30年前に始まる(Blennowらの文献, 2006;Jellinger KAの文献, 2007)。臨床期の開始は、通常、いわゆる「軽度認知障害」(MCI)によって特徴付けられる。この場合、患者は、測定可能な認知欠陥を示すこととなるが、この欠陥は、明確な様式での認知症疾患の診断を可能にするほど十分でない(Petersenらの文献, 1999;Chetkowらの文献, 2008)。MCIを有する多くの患者は、ADに典型的であり、かつADの初期段階の可能性はあるが断定はできないことを意味する、神経病理学的変化を有することとなる(Scheffらの文献, 2006;Markesberyらの文献, 2006;Bouwmanらの文献, 2007)。しかし、アルツハイマー病に進行しない多くのMCI症例が存在し、こうした症例では、他の因子が認知欠陥の原因である(Saitoらの文献, 2007;Jichaらの文献, 2006、及びPetersenらの文献, 2006)。一部のMCI患者は、その状態の悪化を少しも示さない又はある種の改善すら示すこととなるが、ほとんどのMCI症例については、認知欠陥は臨床的認知症に進むこととなる。この転換の年率は、約10〜19％である(Gauthierらの文献, 2006;Fischerらの文献, 2007)。現在、軽度認知障害の様々な亜型を識別することが可能である、臨床過程、神経心理学的過程、及び画像診断過程の組み合わせが存在する(Devanandらの文献, 2007;Rossiらの文献, 2007;Whitwellらの文献, 2007;Panzaらの文献, 2007)。しかし、認知症のさらなる進行に関して、これらの亜型間に顕著な違いはない(Fischerらの文献, 2007)。したがって、早期段階で、好適にはその発症時に又はMCIの間に、アルツハイマー病の明確かつ信頼できる診断を可能にする方法を開発することが最も重要である。
【０００４】
(先行技術のバイオマーカー)
アルツハイマー病のためのバイオマーカーは、先行技術で既に記載されている。バイオマーカーは、例えば、ADAS-cog、MMSE、DemTect、SKT、又は時計描画検査などの周知の心理テストとともに、最初の診断のための、また、疾患の進行をモニタリングするための、診断感度及び特異性を改善すると考えられている。AD/MCIのためのバイオマーカーの開発の現状に関しては、将来の疾患を他の診断基準と関連付けることが提案された(Whitwellらの文献, 2007;Panzaらの文献, 2007;Hyman SEの文献, 2007)。バイオマーカーは、将来、古典的な神経-心理テストを支援すると考えられている。これらが、アルツハイマー病に対する薬剤の開発の代用マーカーとして非常に重要となるという一般認識が存在する(Blennow Kの文献, 2004;Blennow Kの文献, 2005;Hampelらの文献, 2006;Lewczukらの文献, 2006;Irizarry MC, 2004)。
【０００５】
(構造的バイオマーカー)
「磁気共鳴画像法」(MRI)は、脳内の変性萎縮の検出を可能にする画像診断法である(Barnes Jらの文献, 2007;Vemuriらの文献, 2008)。そのため、内側側頭葉の萎縮(MTA)は、高齢患者の脳内の海馬領域の変性による影響を受けやすく、MRIによって非常に明確に可視化させることができるが、これはアルツハイマー病に特異的ではない。軽度のMTAは、他の認知症ではそれほど頻繁には見られないが(Barkhofらの文献, 2007)、確かにMCIと相関する(Mevelらの文献, 2007)。このため、神経変性がアルツハイマー病であるのかアルツハイマー病の早期段階であるのかをMRIデータのみから判定するのは不可能である。さらなる画像診断法は、アミロイド沈着物上の検出分子(PIB)の蓄積を可視化する陽電子放出断層撮影法(PET)である。チオフラビンT-類似体(11C)PIBが、MCI又は軽度アルツハイマー病をそれぞれ有する患者の脳の特定の領域において、次第に蓄積することとなることが見出されている(Kemppainenらの文献, 2007;Klunkらの文献, 2004;Roweらの文献, 2007);残念ながら、これは、認知症を有しない対象においても検出され得る(Pikeらの文献, 2007)。しかしこれはおそらく、PETによるアミロイド沈着物の検出によってアルツハイマー病の前臨床段階の検出が可能になることを示すであろう;しかし、これは、さらなる研究によって確認される必要がある。最もよく利用されるプロセスであるMRI及びPET以外に、ADのためのさらなる構造的バイオマーカーが存在する:CBF-SPECT、CMRg1-PET(グルコース代謝プロトン分光法(H-1 MRS)、高磁場強度の機能MRI、ボクセルに基づく形態計測法(voxel-based morphometry)、(fMRIによって検出される)内側基底側頭葉の増強された活性化、ミクログリア細胞の検出のための(R)-[(11)C]PK11195 PET(Huangらの文献, 2007;Kantarciらの文献, 2007;Petrellaらの文献, 2007;Hamalainenらの文献, 2007;Kircherらの文献, 2007;Krophollerらの文献, 2007)。
【０００６】
(CSFバイオマーカー)
老人斑は、アルツハイマー病の病理学的特徴の1つである。これらの斑は、主にAβ(1-42)ペプチドからなる(Attems J, 2005)。いくつかの研究では、MCI患者のCSF中の低レベルのAβ(1-42)が、その進行において、アルツハイマー病の更なる進行と特異的に相関することが示された(Blennow及びHampelの文献, 2003;Hanssonらの文献, 2006及び2007)。CSF中の減少は、おそらく、脳内のAβ(1-42)の凝集の増強が原因である(Faganらの文献, 2006;Princeらの文献, 2004;Strozykらの文献, 2003)。別の可能性は、CSF中の、より低いレベルの検出をもたらすこととなる半可溶性Aβ(1-42)オリゴマー(Walshらの文献, 2005)の出現である。特に、アルツハイマー病の早期段階では、Aβ(1-42)の濃度の低下が検出されることとなるのに対して、CSF中のタウタンパク質及びホスホ-タウタンパク質の量の増大がそれぞれ検出され得る(Ewersらの文献, 2007;Lewczukらの文献, 2004)。バイオマーカーのより良好な予測可能性を提供するために、通常、タウ/Aβ(1-42)比を使用し、これを、認知症を有しない高齢者において(Faganらの文献, 2007;Gustafsonらの文献, 2007;Hanssonらの文献, 2007;Liらの文献, 2007;Stomrudらの文献, 2007)、また、MCI患者において(Hampelらの文献, 2004;Maccioniらの文献, 2006;Schonknechtらの文献, 2007)、認知欠陥の予測と関連付けることが試みられる。Aβ(1-42)、タウ、ホスホ-タウ-Thr231の生前のCSFレベルと、死後の脳の組織病理学的変化とのさらなる相関を、AD患者において検出することができた(Clarkらの文献, 2003;Buergerらの文献, 2006)。しかし、他の研究では、CSFバイオマーカーと、Aβ(1-42)、APOE ε4-アレルを伴う総タウ及びホスホ-タウ、剖検後の斑及び神経原線維濃縮体量との間に相関を検出することはできなかった(Engelborghsらの文献, 2007;Buergerらの文献, 2007)。多施設共同研究では、興味深い側面が見出された。総タウ及びホスホ-タウ(181)のレベルの増大は、Aβ(1-42)/Aβ(1-40)の比の低下と相関するが、Aβ(1-42)単独とは相関しないようである(Wiltfangらの文献, 2007)。しかし、CSFタウのレベルの増大は、クロイツヘルト-ヤコブ病、脳梗塞、及び脳血管認知症(これらはすべてニューロンの喪失と関連する)などの他のCNS疾患でも検出された(Buergerらの文献, 2006(2);Biblらの文献, 2008)。見込みのあるさらなるバイオマーカーは、MCIの指標としてのCSF中のBACE 1活性の増大である(Zhongらの文献, 2007)。BACE 1活性の増大が、Aβ産生の増大、したがって、ペプチドの凝集の増大をもたらすことも論じられている。アルツハイマー病は、神経炎症過程を伴う。したがって、CSFの抗ミクログリア細胞抗体は、ADにおけるこれらの炎症過程のための、見込みのあるバイオマーカーである(McReaらの文献, 2007)。
【０００７】
アルツハイマー病の早期診断を可能にすると考えられる多数のバイオマーカーがあるにもかかわらず、信頼できる明確な診断を保証する単一のバイオマーカーは存在しない。これは、通常、ほとんどの研究が、それぞれのバイオマーカーと臨床診断との比較を使用するからである。より良い手法は、バイオマーカーとアルツハイマー病の病理学的原因との相関であろう。
【０００８】
見込みのある手法は、Aβ(1-40)及びAβ(1-42)が実際に好適な神経化学的認知症マーカーであるかどうかを明らかにするための、明確に特定及び定義された神経病理学的認知症疾患の、免疫沈降させたCSF試料の繰り返し解析であろう(Jellingerらの文献, 2008)。アルツハイマー病のためのこれまで知られていない新規のバイオマーカーを発見するために、通常、CSF試料を比較プロテオミクス解析によって解析し、これによって、感度が増強されたAD診断がもたらされ、また、他の変性認知症障害との区別も可能になる(Finehoutらの文献, 2007;Castanoらの文献, 2006;Zhangらの文献, 2005;Simonsenらの文献, 2007;Lescuyerらの文献, 2004;Abdiらの文献, 2006)。プロテオミクス解析の後、潜在的な新しいバイオマーカーは、その好適性及び病理学的原因との相関について詳細に解析されるべきである。プロテオミクス解析によって発見されたバイオマーカーの典型的な例は、多発性硬化症のためのバイオマーカーとしての切断されたシスタチンCである;このバイオマーカーは、後に、貯蔵アーティファクトであることが証明された(Iraniらの文献, 2006;Hanssonらの文献, 2007(2))。
【０００９】
(血漿バイオマーカー)
しばしば使用される血漿バイオマーカー、すなわち、Aβペプチド以外に、さらなる炎症血漿マーカーが、認知症の早期診断のために(Ravagliaらの文献, 2007;Engelhartらの文献, 2004)、特にアルツハイマー病のために(Mottaらの文献, 2007)使用される。これらのすべては、依然として審議中である。今なお議論されている。さらなる見込みのあるバイオマーカーはまた、AD患者及び健康な対照由来の血漿の比較プロテオミクス解析によって発見された(Germanらの文献, 2007;Rayらの文献, 2007)。この特徴は、これらの生体分子が実際にアルツハイマー病に特異的であり、かつバイオマーカーとして好適であるかどうかを示すこととなる。先に論じたバイオマーカーのいずれも、その特異性又は適合性のいずれかを示すであろう説得力のある又は好適なデータは存在しない。
【００１０】
CSF中のアミロイドβの解析とは対照的に、血漿中の好適なAβバイオマーカーに関する今までの結果は、信頼できない又は明確ではない。いくつかの研究では、血漿中のAβ(1-42)/Aβ(1-40)の比の低下と、認知健常者からMCI又はアルツハイマー患者それぞれへの転換の増大との間の相関が認められた(Graff-Radfordらの文献, 2007;van Oijenらの文献, 2006;Sundelofらの文献, 2008)。しかし、他の研究では、Aβ(1-42)血漿レベルの低下はMCIからADへの転換のためのマーカーである可能性が高く(Songらの文献, 2007)、アルツハイマー病の場合に見られる神経変性のためのマーカーとしては適さない(Pesaresiらの文献, 2006)ことが見出された。しかし、これらの研究のほとんどは、健康な対照と孤発性アルツハイマー病を有する患者とのAβ血漿レベルの違いを示していない(Fukumotoらの文献, 2003;Kosakaらの文献, 1997;Scheunerらの文献, 1996;Sobowらの文献, 2005;Tamaokaらの文献, 1996;Vandersticheleらの文献, 2000)。いくつかの研究はまた、血漿中のAβのレベルが、脳で見られるレベルと相関せず(Faganらの文献, 2006;Freemanらの文献, 2007)、CSFで見られるレベルとも相関しないことを示した(Mehtaらの文献, 2001;Vandersticheleらの文献, 2000)。最近の研究では、CSFと血漿との間で、Aβ(1-40)及びAβ(1-42)に関する相関が検出されたが、これは健康な対照においてのみであった。この相関は、MCI及びADでは検出することができなかったが、これは、脳内のAβ沈着物によるCSF Aβと血漿Aβとの間のバランスの破壊によって説明される(Giedraitisらの文献, 2007)。一般に、血漿Aβ(1-42) レベルが、MCI又はADのための信頼できるバイオマーカーではないと考えられている(Blaskoらの文献, 2008;Mehtaらの文献, 2000;Brettschneiderらの文献, 2005)のに対し、血漿Aβ(1-38)/Aβ(1-40)比の低下は、血管性認知症のためのバイオマーカーと考えられ、CSFマーカーの予測可能性に近づいている(Biblらの文献, 2007)。
【００１１】
さらに、Aβオリゴマーは、神経変性過程の開始時に決定的役割を果たすと考えられている(Walsh及びSelkoeの文献、2007)。いくつかの研究では、8kDaを有するAβ二量体から100kDa超を有する前原線維の時点について、神経毒性の影響が示された(Lambertらの文献, 1998;Walshらの文献, 2002;Keayedらの文献, 2004;Clearyらの文献, 2005)。さらに、こうしたAβオリゴマーは、ヒト体液(human liquor)に見出されている(Pitschkeらの文献, 1998;Santosらの文献, 2007;Klyubinらの文献, 2008)。オリゴマーはまた、その神経毒性以外に、ヒト試料中のAβ濃度の決定に影響を与える。オリゴマー化は、AβペプチドのC末端エピトープの遮蔽をもたらし(Roherらの文献, 2000)、C末端特異的ELISAによって検出されるAβレベルの過小見積もりを招く(Stenhらの文献, 2005)。Englundらの文献, 2009は、ELISAによって非変性条件下で、及びSDS-PAGE、それに続いてウェスタンブロット分析を使用して変性条件下で、Aβ1-42濃度を測定することによって、ヒトCSF試料中のAβ1-42オリゴマー比を決定した。より一般的な別の手法は、Aβオリゴマーの直接測定である。しかし、バイオマーカーとして特に血漿Aβオリゴマーを用いるこうした方法は、Aβペプチドが非常に疎水性であるので、確立するのが極めて困難である。現在記載されているアッセイシステムは、ELISAシステムにおいて、Aβオリゴマー特異的抗体を使用している(Englundらの文献, 2007;Schupfらの文献, 2008)。しかし、こうしたオリゴマー特異的抗体に基づくELISAの使用は、従来のAβELISAシステムと同様の問題を有する。これらの方法は、非常に不十分な分析感度しか達成せず、また、分析物とマトリックス(すなわち血漿)との間の非常に複雑な相互作用を伴う大きな問題と直面する。通常、血漿中のAβ(近年ではAβオリゴマーも)の定量化のためにELISA又はELISA型システム(マルチプレックス)が使用されている。こうした検出システムの詳細は、通常、不十分に分析されるだけである、又は完全に無視される。例えば、回収率のような重要な項目が、刊行物において、分析されない、又は十分に検討されていない。しかし、回収率は、血漿中で生じるAβペプチド又はオリゴマーの全体像を与えるための決め手となる。研究間の相違も、これらの回収率の違いに起因し得る。ELISA又はマルチプレックスシステムのさらなる重要な特徴は、その線形性である。したがって、血漿中の分析物について決定される濃度は、非常に低い程度又は少しもない程度までの、測定に使用された希釈にのみ依存するはずである。しかしこれは、血漿中のAβの定量化について、ELISAについてもマルチプレックスシステムについても可能ではない。したがって、1〜20倍の希釈についての算出される血漿Aβ(1-42)濃度の間の相違は、同じ試料の1〜2倍希釈よりも3倍高かった(Hanssonらの文献, 2008)。この例単独で、いくつかの研究における血漿試料の異なる希釈の使用によって、同物の比較が不可能となることを示す。
【００１２】
ADを診断するために使用される現在の方法は、死後の患者から得られる脳脊髄液(CSF)又は脳組織の分析を含む。したがって、マーカーの中で、現在検討中なのは、死後のアルツハイマー脳に見られる特徴の原因となるタンパク質に関連するものである。神経原線維濃縮体は、主として過剰リン酸化されたタウタンパク質、すなわち細胞骨格タンパク質からなる。老人斑は、より大きな前駆体タンパク質のタンパク質分解的切断から得られる、その多くは42-アミノ酸ペプチド(Aβ42)である、アミロイドタンパク質の核を含有する。同じ前駆体から得られる、このタンパク質の別の形態は、40アミノ酸(Aβ40)しか含有しない。このタンパク質の沈着物は、AD犠牲者の脳内に見られる。しかし、タウ及び前述のベータアミロイドペプチドの変化は、診断価値をもたらすような十分な頻度及び大きさでは起こらず、したがって、これらのタンパク質に基づく血液検査は、ADと十分には相関しないように思われる。C-末端可変性に加えて、N末端が修飾されたAβペプチドが豊富である(Saido, T.C.らの文献、「老人斑における特徴的なベータ-アミロイドペプチド種、Aβ N3(pE)の優勢かつ特異な沈着(Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, Aβ N3(pE), in senile plaques)」Neuron 14, 457-466(1995); Russo, C.らの文献、「アルツハイマー病におけるプレセニリン-1変異(Presenilin-1 mutations in Alzheimer’s disease)」Nature 405, 531-532(2000); Saido, T.C.、Yamao, H.、Iwatsubo, T.、及びKawashima, S.らの文献、「ヒト脳に沈着したベータ-アミロイドペプチドのアミノ-及びカルボキシル-末端不均一性(Amino- and carboxyl-terminal heterogeneity of beta-amyloid peptides deposited in human brain)」Neurosci. Lett. 215, 173-176(1996))。大部分のAβペプチドは、２アミノ酸によるN末端切断を受け、グルタミン酸残基に曝露され、これはその後、環化されてピログルタミン酸(pGlu又はpE)となり、pGlu-Aβ(3-42)ペプチドがもたらされるようである(Saido, T.C.らの文献、「老人斑における特徴的なベータ-アミロイドペプチド種、Aβ N3(pE)の優勢かつ特異な沈着(Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, Aβ N3(pE), in senile plaques)」Neuron 14, 457-466(1995); Saido, T.C.、Yamao, H.、Iwatsubo, T.、及びKawashima, S.らの文献、「ヒト脳に沈着したベータ-アミロイドペプチドのアミノ-及びカルボキシル-末端不均一性(Amino- and carboxyl-terminal heterogeneity of beta-amyloid peptides deposited in human brain)」Neurosci. Lett. 215, 173-176(1996))。或いは、pGluは、BACE1によるβ’-切断後に形成され得、pGlu-Aβ(11-42)がもたらされる(Naslund, J.らの文献、「アルツハイマー病と正常な老化におけるアルツハイマーAβアミロイドペプチドバリアントの相対的存在量(Relative abundance of Alzheimer Aβ amyloid peptide variants in Alzheimer disease and normal aging)」Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 8378-8382(1994); Liu, K.らの文献、「アルツハイマー病及び若年ダウン症候群脳におけるAβ(11-40/42)ペプチド沈着の特徴付け:アルツハイマー病の病因におけるN末端が切断されたAbeta種の意義(Characterization of Aβ(11-40/42) peptide deposition in Alzheimer’s disease and young Down’s syndrome brains:implication of N-terminally truncated Abeta species in the pathogenesis of Alzheimer’s disease)」Acta Neuropathol. 112, 163-174(2006))。特にpGlu-Aβ(3-42)は、孤発性及び家族性ADにおけるAβ沈着物の主な構成要素であることが示されている(Saido, T.C.らの文献、「老人斑における特徴的なベータ-アミロイドペプチド種、Aβ N3(pE)の優勢かつ特異な沈着(Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, Aβ N3(pE), in senile plaques)」Neuron 14, 457-466(1995); Miravalle, L.らの文献、「アミノ末端が切断されたAβペプチド種は綿花様の(cotton wool)斑の主成分である(Amino-terminally truncated Aβ peptide species are the main component of cotton wool plaques)」Biochemistry 44, 10810-10821(2005))。
【００１３】
pGluAβ(3-42)ペプチドは、Aβ(1-40/1-42)ペプチドと共存し(Saido, T.C.らの文献、「老人斑における特徴的なベータ-アミロイドペプチド種、Aβ N3(pE)の優勢かつ特異な沈着(Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, Aβ N3(pE), in senile plaques)」Neuron 14, 457-466(1995); Saido, T.C.、Yamao, H.、Iwatsubo, T.、及びKawashima, S.らの文献、「ヒト脳に沈着したベータ-アミロイドペプチドのアミノ-及びカルボキシル-末端不均一性(Amino- and carboxyl-terminal heterogeneity of beta-amyloid peptides deposited in human brain)」Neurosci. Lett. 215, 173-176(1996))、いくつかの知見に基づくと、ADの病因において顕著な役割を果たす可能性がある。例えば、pGluAβ(3-42)ペプチドの、ある特定の神経毒性が概説されており(Russo, C.らの文献、「ピログルタミン酸修飾されたアミロイドベータ-ペプチド--AbetaN3(pE)--は、培養されたニューロン及びアストロサイト生存に強く影響を与える(Pyroglutamate-modified amyloid beta-peptides--AbetaN3(pE)--strongly affect cultured neuron and astrocyte survival)」J. Neurochem. 82, 1480-1489(2002)、また、N-切断型AβペプチドのpGlu修飾は、大抵のアミノペプチダーゼ並びにAβ-分解性エンドペプチダーゼによる分解に対する抵抗性を付与する(Russo, C.らの文献、「ピログルタミン酸修飾されたアミロイドベータ-ペプチド--AbetaN3(pE)--は、培養されたニューロン及びアストロサイト生存に強く影響を与える(Pyroglutamate-modified amyloid beta-peptides--AbetaN3(pE)--strongly affect cultured neuron and astrocyte survival)」J. Neurochem. 82, 1480-1489(2002); Saido, T.C.の文献、「タンパク質分解障害としてのアルツハイマー病:ベータ-アミロイドの同化及び異化(Alzheimer’s disease as proteolytic disorders:anabolism and catabolism of beta-amyloid)」Neurobiol. Aging 19, S69-S75(1998))。グルタミン酸のpGluへの環化は、N末端電荷の喪失をもたらし、そのN末端にpGlu残基を有するAβペプチドの、非修飾Aβペプチドと比較して加速された凝集がもたらされる(He, W.及びBarrow, C.J.の文献、「老人斑に見られるAβ 3-ピログルタミル及び11-ピログルタミルペプチドは、インビトロで、完全長Aβよりも高い、βシート形成及び凝集傾向を有する(The Aβ 3-pyroglutamyl and 11-pyroglutamyl peptides found in senile plaque have greater beta-sheet forming and aggregation propensities in vitro than full-length Aβ)」Biochemistry 38, 10871-10877(1999); Schilling, S.らの文献、「pGlu-アミロイドペプチドのシーディング及びオリゴマー化(インビトロ)に関して(On the seeding and oligomerization of pGlu-amyloid peptides (in vitro))」Biochemistry 45, 12393-12399(2006))。したがって、pGlu-Aβ(3-42)形成の減少は、ペプチドを、より分解されやすくすることによって、ペプチドを不安定化させるはずであり、ひいては、より高い分子量のAβ凝集体の形成を防止し、ニューロンの生存を高めるであろう。
【００１４】
しかし、長い間、AβペプチドのpGlu-修飾がどのように起こるのかということは公知ではなかった。本出願人は、グルタミニルシクラーゼ(QC)が弱酸性条件下でpGlu-Aβ(3-42)形成を触媒する能力があること、特定のQC阻害剤がインビトロでpGlu-Aβ(3-42)産生を防止すること、したがって、グルタミニルシクラーゼの阻害がアルツハイマー病の原因治療のための新規の治療概念であることを発見した(Schilling, S.、Hoffmann, T.、Manhart, S.、Hoffmann, M.、及びDemuth, H.-U.らの文献、「グルタミニルシクラーゼは弱酸条件下でグルタミルシクラーゼ活性を表す(Glutaminyl cyclases unfold glutamyl cyclase activity under mild acid conditions)」FEBS Lett. 563, 191-196(2004); Cynis, H.らの文献、「グルタミニルシクラーゼの阻害は、哺乳類細胞におけるピログルタミン酸形成を変化させる(Inhibition of glutaminyl cyclase alters pyroglutamate formation in mammalian cells)」Biochim. Biophys. Acta 1764, 1618-1625(2006); Schillingらの文献、「グルタミニルシクラーゼの阻害-アルツハイマー病の原因治療のための新規の治療概念(Inhibition of glutaminyl cyclase - a novel therapeutic concept for the causative treatment of Alzheimer’s disease)」Nature Medicine 14, 1106-1111(2008))。
【００１５】
AD、MCI、及びNDSのためのバイオマーカーとしてpGlu-Aβペプチドを使用することに関する主要な問題は、これらのペプチドが、患者の老人斑において、高濃度で生じることである。すなわち、pGlu-Aβペプチドのレベル及び/又はそのレベルの変化は、死後の脳組織分析によってのみ決定することができる。対照的に、CSF、血液、血漿、血清、又は尿などの他の生体液中に、わずかな痕跡量又は非常に低レベルのpGlu-Aβペプチドを見出すことができ、これは、疾患の発症の前の時点からの、患者の生存期間中のpGlu-Aβペプチドの継続的モニタリングを可能にするであろう。しかし、pGlu-Aβペプチドのための現在の分析法は、これらの痕跡量の確実な検出及び定量化にとって十分に感度が高くない。したがって、今のところ、顕在化したAD又はMCIのための、又は、正常な認知反応を呈するが、必然的に又は高い可能性でADを発症する疑いがある対象のための、満足のいくような診断マーカーは存在しないようである。
【００１６】
加齢に伴う認知機能低下(AACD)及び軽度認知障害(MCI)は、認知症には至らない認知機能低下を受けている個人を特定するために使用される用語である。これらの用語は、同等であり(MCIが、より最近採用された用語である)、本出願全体を通して互換的に使用される。この診断のための基準(世界保健機関(World Health Organization))を満たすことは、漸進的でありかつ少なくとも6ケ月存在する認知機能の低下の、個人又は家族による報告を必要とする。あらゆる認知領域にわたって困難が存在する可能性があり(圧倒的多数の場合では記憶が損なわれるが)、これらは、比較的に健康な個人のための年齢及び教育の基準が利用できる(すなわち、患者が、同年齢の健常な対象と比較される)定量的な認知機能評価に関する能力の異常を根拠にしなければならない。能力は、こうした試験に対する適切な集団についての平均値の少なくとも1SD未満でなければならない。認知症も、重度のうつ病又は薬物の影響も、存在する可能性はない。脳性の認知機能障害を引き起こすことが公知である脳又は全身の疾患又は状態も、存在する可能性はない。本出願人の経験では、臨床認知症評価尺度でCDR.5(「認知症の疑い」)と分類され、かつこれらの除外を満たしたすべての患者は、AACD/MCIについての基準も満たした。約1/3のアルツハイマー患者は、彼らのより広範囲の認知機能低下に先行する、単発的な記憶欠損の明確に限定できる期間を経験している。(Haxby J. V.らの文献、「アルツハイマー型の認知症を有する患者における認知機能低下の個々の軌跡(Individual trajectories of cognitive decline in patients with dementia of the Alzheimer type)」、J. Clin. Exp. Neuropsychology 14:575-592, 1992)。記憶に加えて他の領域に注目するAACD/MCI基準を使用すると、確認できる前駆症状を有する割合は、より高い可能性が高い。幸運なことに、すべてのAACD/MCI個人が退行するわけではないと思われる。かなりの数のこれらの対象は、試験時に安定的な非進行性の記憶欠損を示すようである。
【００１７】
AD、MCI、若しくはNDSの発症を予測すること、又はその進行をモニタリングすることへの試みは、限られた成果を伴って達成されている。本出願の発明者らによって、対照人物における基準量から外れた、対象から得られる生体試料中のpGlu-Aβペプチドの量が、神経疾患状態と、正に相関し得ることが発見されている。したがって、pGlu-Aβペプチドの存在と疾患状態との相関は、先に記載した神経変性疾患の１つを患う患者における診断のための、正のかつより直接的な試験に相当する。本発明は、特に、生体試料中のpGlu-Aβペプチドの検出のための、劇的に改善された感度を示す新規の分析方法の開発に基づいている。
【００１８】
したがって、診断マーカーとしてのpGlu-Aβペプチドを使用して、AD及びMCIを予測する、診断する、又は予知するための、容易に適用可能な生体試料試験を提供することが、本発明の一目的である。この容易に適用可能な生体試料試験はまた、AD及びMCIのための新規の治療の有効性をモニタリングするのに適している。
【００１９】
さらに、本発明は、信頼できる方法を用いて測定することができる、また、AD及びMCIの信頼できる明確な予測のために使用することができる、診断マーカーとしてのpGlu-Aβペプチドを提供することを目的とする。
【発明の概要】
【００２０】
本発明の第1の態様によれば、生体試料中のAβ標的ペプチドの検出のための、前記Aβ標的ペプチドに特異的である捕捉試薬;及びAβ標的ペプチド検出複合体を含む非常に高感度の方法であって、以下のステップを含む前記方法が提供される:
a)生体試料を、前記捕捉試薬及び前記検出複合体と接触させるステップ;及び
b)前記Aβ標的ペプチドを検出するステップ
(ここでは、該検出複合体は、Aβ標的ペプチド特異的抗体と、核酸マーカーとを含む)。
【００２１】
好ましくは、Aβ標的ペプチドは、pGlu-Aβペプチドである。
【００２２】
第２の態様によれば、本発明は、アルツハイマー病及び軽度認知障害などの神経変性障害を診断又はモニタリングする方法における、生体試料中のpGlu-AβペプチドなどのAβ標的ペプチドの検出のための新規の方法の使用を提供する。
【００２３】
本発明の第3の態様によれば、被験対象からの生体試料中のpGlu-Aβペプチドのレベルを決定することを含む、アルツハイマー病及び軽度認知障害などの神経変性疾患を診断又はモニタリングする方法であって、次のステップを含む前記方法が提供される:
i. 本発明による方法を用いて、前記神経変性疾患に悩まされている疑いがある対象からの生体試料中のpGlu-Aβペプチドの第1のレベルを決定するステップ;
ii. pGlu-Aβペプチドの第1のレベルを、健康な対照対象における前記pGlu-Aβペプチドの第２のレベルと比較するステップ;及び
iii. 前記生体試料中の前記pGlu-Aβペプチドのレベルが、健康な対照対象における前記pGlu-Aβペプチドのレベルと比較して増大している場合に、対象を神経変性疾患と診断するステップ。
【００２４】
第4の態様では、本発明による方法を用いて、本発明は、アルツハイマー病又は軽度認知障害などの神経変性疾患を有する、該疾患を有する疑いがある、又は該疾患に罹患しやすい対象における治療法の有効性をモニタリングする方法であって、被験対象からの生体試料中のpGlu-Aβペプチドのレベルを決定することを含む前記方法を提供する。
【００２５】
第5の態様では、本発明は、少なくとも1種の検出複合体及びキットを使用するための説明書を含む、アルツハイマー病又は軽度認知障害などの神経変性疾患を診断するためのキットを提供し、ここでは、前記検出複合体は、Aβペプチドと結合することが可能な検出抗体、あらかじめ決定されたヌクレオチド配列を含む1以上の核酸マーカー、並びに、前記抗体及び核酸マーカーを特異的に結合させることが可能な1以上の第1のリンカー分子を含み、かつ、検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方が、pGlu-Aβペプチドのピログルタミン酸保有(carrying)アミノ末端と特異的に結合する。
【００２６】
(定義)
本明細書中で使用される「オリゴマー」とは、限定された数の凝集されたAβペプチド単量体ユニットをいう。こうしたオリゴマーの例としては、二量体、三量体、及び四量体が挙げられる。用語「脱凝集」とは、オリゴマー形態のAβペプチドを単量体形態のAβペプチドに変換する過程をいう。
【００２７】
本出願の意味での「捕捉抗体」及び「検出抗体」は、分析物としてのAβペプチド又はpGlu-Aβペプチドに結合する抗体を包含することが意図される。
【００２８】
好適には、捕捉抗体及び検出抗体は、高親和性でAβペプチドに結合する。本発明の状況では、高親和性は、10-7M又はそれよりも優れたKD値、例えば10-8M又はそれよりも優れたKD値、一層さらに具体的には10-9M〜10-12MのKD値を伴う親和性を意味する。
【００２９】
用語「抗体」は、最も広範な意味で使用され、具体的には、それが所望の生物学的活性を示す限り、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つの無傷の抗体から形成された多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及び抗体断片を包含する。抗体は、例えばIgM、IgG(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、若しくはIgG4)、IgD、IgA、又はIgEであり得る。しかし、好適には、抗体はIgM抗体ではない。「所望の生物学的活性」は、標的Aβペプチドへの結合である。
【００３０】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部分、一般に、無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例としては、Fab、Fab’、F(ab’)2、及びFv断片:ダイアボディ;単鎖抗体分子;並びに抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
【００３１】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体をいう、すなわち、その集団を構成している個々の抗体は、微量で存在し得る天然に生じる突然変異以外は同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原性部位に方向付けられており、高度に特異的である。さらに、様々な抗原決定基(エピトープ)に方向付けられた様々な抗体が一般的に含まれる「ポリクローナル抗体」調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の抗原決定基に方向付けられている。モノクローナル抗体は、その特異性に加えて、他の免疫グロブリンが夾雑しないハイブリドーマ培養によって合成される点で、しばしば有利であり得る。「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られるものとしての抗体の性質を示し、任意の特定の方法による抗体産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されることとなるモノクローナル抗体は、Kohlerらの文献(Nature, 256:495 (1975))によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製することもできるし、一般に周知である組換えDNA法によって作製することもできる。「モノクローナル抗体」は、例えば、Clacksonらの文献(Nature, 352:624-628 (1991))及びMarksらの文献(J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991))に記載された技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００３２】
モノクローナル抗体には、本明細書では特に、重鎖及び/又は軽鎖の一部分が、特定の種に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一又は相同であるが、これらの鎖(1又は複数)の残部は、別の種に由来する又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一又は相同である、キメラ抗体(免疫グロブリン)、並びにさらには所望の生物学的活性を示す限りはこうした抗体の断片が含まれる。
【００３３】
非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はその断片(Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、又は抗体の他の抗原結合性の部分配列など)である。ヒト化抗体は、大部分について、レシピエントの相補性決定領域(CDR)由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、又はウサギなどの非ヒト種(ドナー抗体)のCDR由来の残基によって置き換えられている、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にも、移入されたCDR又はフレームワーク配列中にも見られない残基を含むことができる。
【００３４】
これらの修飾は、抗体能力をさらに改善及び最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、一般的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含むこととなり、ここでは、CDR領域のすべて又は実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に対応し、かつFR領域のすべて又は実質的にすべては、ヒト免疫グロブリン配列のFR領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域(Fc)の、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分も含むこととなる。さらなる詳細については、Jonesらの文献, Nature, 321:522-525(1986)、Reichmannらの文献, Nature, 332:323-329(1988):及びPrestaの文献, Curr. Op. Struct. Biel., 2:593-596(1992)を参照されたい。ヒト化抗体には、抗体の抗原結合領域が、関心対象の抗原でマカクザルを免疫化することによって産生された抗体に由来する、Primatized(商標)抗体、又は「ラクダ化」抗体が含まれる。
【００３５】
「単鎖Fv」又は「sFv」抗体断片は、抗体のVHドメイン及びVLドメインを含み、ここでは、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Fvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このリンカーによって、sFvは、抗原結合のための望ましい構造を形成することができる。sFvの総説については、Pluckthunの文献、「モノクローナル抗体の薬理学(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)」, 第113巻, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, ニューヨーク, 269-315頁(1994)を参照されたい。
【００３６】
用語「ダイアボディ」とは、その断片が、同じポリペプチド鎖内の軽鎖可変ドメイン(VD)に接続された重鎖可変ドメイン(VH)を含む、2つの抗原結合部位を伴う小型の抗体断片(VH-VD)をいう。同じ鎖上の2つのドメインを対合させるには短すぎるリンカーを使用することによって、これらのドメインが、別の鎖の相補ドメインと対合し、2つの抗原結合部位を形成するようにさせる。ダイアボディは、Hollingerらの文献, Proc. Natl. Acad. Sol. USA, 90:6444-6448 (1993)に、より十分に記載されている。
【００３７】
「単離された」抗体は、同定され、その天然の環境の構成要素から分離及び/又は回収されているものである。その天然の環境の夾雑成分は、その抗体の診断的又は治療的使用を妨げる物質であり、これには、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質が含まれ得る。好適な実施態様では、抗体は、(1)Lowry法によって決定された場合に抗体の95重量％を上回るまで、最も具体的には99重量％を上回るまで、(2)スピニングカップ配列決定装置(spinning cup sequenator)の使用によって、N末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程度まで、又は(3)クマーシーブルー若しくは好適には銀染色を使用する還元若しくは非還元条件下でのSDS-PAGEによる均質まで、精製されることとなる。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイチュの抗体が含まれる。なぜなら、抗体の天然環境の少なくとも1つの成分が存在しないこととなるからである。しかし、通常、単離された抗体は、少なくとも1つの精製ステップによって調製されることとなる。
【００３８】
本明細書で使用する場合、表現「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」は、互換的に使用され、すべてのこうした呼称には、後代が含まれる。したがって、語句「形質転換体」及び「形質転換された細胞」には、継代の数とは関係なく、初代の対象細胞及びそこから派生した培養物が含まれる。すべての後代は、意図的又は偶発性の突然変異が原因で、DNA含有量が厳密には同一でない可能性があることも理解されよう。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能又は生物学的活性を有する、変異体の後代が含まれる。異なる呼称が意図される場合、これは文脈から明らかになるであろう。
【００３９】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書で使用する場合、互換性があり、かつ、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸で構成される生体分子を意味すると定義される。
【００４０】
本明細書で使用される用語「a」、「an」、及び「the」は、「1以上」を意味するように定義され、文脈が不適切でない限りは、複数が含まれる。
【００４１】
「アミロイドβ、Aβ、又はβ-アミロイド」は、当技術分野で認識された用語であり、アミロイドβタンパク質及びペプチド、アミロイドβ前駆体タンパク質(APP)、ならびにその修飾物、断片、及び任意の機能的等価物をいう。特に、本明細書で使用されるアミロイドβは、APPのタンパク分解性の切断によって生じる任意の断片を意味するが、特に、限定はされないが配列番号:1のAβ(1-38)、配列番号:2のAβ(1-39)、配列番号:3のAβ(1-40)、配列番号:4のAβ(1-41)、配列番号:5のAβ(1-42)、及び配列番号:6のAβ(1-43)を含めた、アミロイド病変に関与又は関連する断片を意味する。
【００４２】
本発明の状況では、「Aβペプチドの断片」は、配列番号19のAβ(11-38)のコア・アミロイドβ配列を含む、すべてのアミロイドβペプチドである。本発明の目的のためにさらに好適なものは、配列番号25のAβ(15-38)のコア配列を含む、すべてのアミロイドβペプチドである。配列番号19のAβ(11-38)の、又は配列番号:25のAβ(15-38)のアミノ酸配列を含むこうしたAβ断片は、アルツハイマー病及び軽度認知障害などの神経変性疾患の結果として、対象において蓄積することが示されている。
【００４３】
Aβ断片のさらなる好適な例は、以下である
Aβ(2-38)(配列番号:7)、
Aβ(2-39)(配列番号:8)、
Aβ(2-40)(配列番号:9)、
Aβ(2-41)(配列番号:10)、
Aβ(2-42)(配列番号:11)、
Aβ(2-43)(配列番号:12)、
Aβ(3-38)(配列番号:13)、
Aβ(3-39)(配列番号:14)、
Aβ(3-40)(配列番号:15)、
Aβ(3-41)(配列番号:16)、
Aβ(3-42)(配列番号:17)、
Aβ(3-43)(配列番号:18)、
Aβ(11-38)(配列番号:19)、
Aβ(11-39)(配列番号:20)、
Aβ(11-40)(配列番号:21)、
Aβ(11-41)(配列番号:22)、
Aβ(11-42)(配列番号:23)、及び
Aβ(11-43)(配列番号:24。
【００４４】
「修飾されたアミロイドβ、Aβ、又はβ-アミロイド」は、アミロイドβタンパク質及びペプチド、アミロイドβ前駆タンパク質(APP)、その断片及び機能的等価物内の様々なアミノ酸位置でのすべての修飾を包含する。本発明の状況において有用なのは、前記アミロイドβタンパク質及びペプチド、アミロイドβ前駆体タンパク質(APP)、断片及び機能的等価物の、N-及び/又はC-末端アミノ酸での修飾である。特に有用なのは、N末端グルタミン又はグルタミン酸残基の、ピログルタミン酸への環化などの、グルタミン及びグルタミン酸残基での修飾である。本発明による好適例は、N末端でグルタミン酸残基から開始する、配列番号13〜24のアミロイドβペプチドであり、ここでは、前記N末端グルタミン酸残基は、ピログルタミン酸に修飾される。したがって、特に有用な修飾されたAβペプチドは、「pGlu-Aβペプチド」である。
【００４５】
本発明の状況での「pGlu-Aβペプチド」は、N末端がピログルタミン酸化された形態の、次のAβ及びAβ断片に関する:
pGlu-Aβ(3-38)(配列番号:26)、
pGlu-Aβ(3-39)(配列番号:27)、
pGlu-Aβ(3-40)(配列番号:28)、
pGlu-Aβ(3-41)(配列番号:29)、
pGlu-Aβ(3-42)(配列番号:30)、
pGlu-Aβ(3-43)(配列番号:31)、
pGlu-Aβ(11-38)(配列番号:32)、
pGlu-Aβ(11-39)(配列番号:33)、
pGlu-Aβ(11-40)(配列番号:34)、
pGlu-Aβ(11-41)(配列番号:35)、
pGlu-Aβ(11-42)(配列番号:36)、及び
pGlu-Aβ(11-43)(配列番号:37)。
【００４６】
「機能的等価物」は、本発明によって記載されている通りの検出のための方法又は診断のための方法を受けるために選択されている患者群において天然に生じる可能性があるAβペプチド又はpGlu-Aβペプチドのすべての突然変異体又はバリアントを包含する。より具体的には、本発明の状況での「機能的等価物」は、Aβペプチド又はpGlu-Aβペプチドの機能的等価物が、その突然変異体又はバリアントであり、かつアルツハイマー病において蓄積することが示されていることを意味する。機能的等価物は、それぞれのAβペプチド又はpGlu-Aβペプチドと比較して、多くとも30個、例えば20個、例えば10個、特に5個、最も具体的には2個、又は1個のみの突然変異(1又は複数)を有する。
【００４７】
本発明の状況における特に有用な等価物は、Aβ(1-40)(配列番号2)及びAβ(1-42)(配列番号1)のものであり、これらは、Irieらの文献, 2005によって記載されているもの、すなわち、Aβの鳥取型、フランドル型、オランダ型、イタリア型、北極型、及びアイオワ型突然変異である。機能的等価物はまた、スウェーデン型、オーストリア型、フランス型、ドイツ型、フロリダ型、ロンドン型、インディアナ型、及びオーストラリア型変異体などの、β-又はγ-セクレターゼ切断部位に隣接する突然変異を有するアミロイド前駆体タンパク質に由来するAβペプチドも包含する(Irieらの文献, 2005)。
【００４８】
用語「Aβ標的ペプチド」には、「アミロイドβ、Aβ、又はβ-アミロイド」、「Aβペプチドの断片」、「修飾されたアミロイドβ、Aβ、又はβ-アミロイド」、「pGlu-Aβペプチド」、及びこれらのうちのすべての「機能的等価物」が含まれる。好ましくは、「Aβ標的ペプチド」は、「pGlu-Aβペプチド」、すなわちその機能的等価物の断片である。
【００４９】
「サンドイッチELISA」は、通常、検出されることとなるタンパク質の異なる免疫原性部分又はエピトープにそれぞれが結合することが可能な2種の抗体の使用を含む。サンドイッチアッセイでは、被験試料分析物が、固体支持体に固定された第1の抗体に結合し、その後、第2の抗体が検体に結合し、したがって、不溶性の3部構成の複合体が形成される。第2の抗体それ自体は、検出可能な部分を用いて標識されていてもよいし(直接サンドイッチアッセイ)、検出可能な部分を用いて標識された抗免疫グロブリン抗体を使用して測定されてもよい(間接サンドイッチアッセイ)。例えば、ある好適な型のサンドイッチアッセイは、ELISAアッセイであり、その場合、検出可能な部分は酵素である。
【００５０】
用語「核酸マーカー」又は「核酸レポーター」とは、PCR反応、好ましくはリアルタイムPCR反応などの核酸増幅反応において適切に設計されたオリゴヌクレオチドプライマーと共に使用される場合に、予測されるサイズ又は他の選択された特徴の検出産物を産生することとなる核酸分子をいう。当業者は、PCRのための好適なオリゴヌクレオチドプライマーの設計を熟知しているであろう。また、本発明のこの態様を容易にするための、例えばインターネットを通じたプログラムが利用可能である(例えば、http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher2/を参照のこと)。核酸マーカーは、線状又は環状であり得る。具体的実施態様では、核酸マーカーは、各末端に位置する又は各末端の近くの選択されたプライマーのための結合部位を伴う、あらかじめ決定された線状の核酸配列を含むこととなる。環状DNA核酸分子では、プライマーは、末端ではなく内部となり、例えばローリングサークル増幅(Rolling Circle Amplification)のための、単一のプライマーを使用することができる。増幅されたDNAは、限定はされないが、標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、SYBR Green若しくは臭化エチジウム染色、又は電気化学的方法などの技術を含めた、任意の利用可能な方法を使用して検出することができる。ある種の実施態様では、プライマー結合部位の間に位置するDNA配列は、PCR反応中に検出することが可能な「特徴識別配列」を含む。蛍光シグナル産生は、例えば、配列特異的(分子ビーコン(Molecular Beacon)、Taq Man、Scorpions、蛍光発生プライマー(LUXプライマー(Invitrogen社、Carlsbad, CA.)など))又は質量依存性(SYBR Green、臭化エチジウム)であり得る。当業者は、本発明の方法における使用に適した代替マーカーを知っているであろうから、提供した例は、可能な核酸検出スキームの網羅的なリストであることを意図しない。
【００５１】
用語「特徴識別配列」とは、放射性同位体、色素(蛍光色素など)、又は当技術分野で知られることとなる他の種などの検出可能なマーカーで標識されているオリゴヌクレオチド又は他の核酸へのハイブリダイゼーションによって特異的に検出することができる核酸配列をいう。いくつかの実施態様では、特徴識別配列は、「分子ビーコン」プローブと結合することが可能である。用語「分子ビーコン」とは、Operon Technologies社(Alameda, CA, USA)及びSynthetic Genetics(San Diego, CA, USA)によって販売されているものなどのオリゴヌクレオチドをいう。(Tyagi及びKramerの文献(1996)、Nat. Biotechnol, 14 :303-308;及びTyagiらの文献(2000)、Nat Biotechnol, 18 :1191-96も参照されたい)。別の具体的実施態様では、識別配列は、Scorpionと結合することが可能である。「Scarpions」は、プローブと共有結合されるPCRプライマーを含有する二官能性分子である。プローブ内のフルオロフォアは、蛍光を弱めるクエンチャーと相互作用する。PCR反応中、フルオロフォアとクエンチャーは離れており、これは、反応管から出力される光の増大をもたらす。Scorpionsは、DxS社(Manchester, UK)によって販売されている。本明細書に記述した通り、シグナルは、様々な技術及び試薬を使用して産生することができる。
【００５２】
用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸(分子)」は、天然に存在する及び天然に存在しない核酸を含めて、あらゆる長さの重合形態のヌクレオチドを指すために、互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び/又はそれらの類似体を含有することができる。核酸の選択及び調製のための方法は、多様であり、標準の生体分子プロトコルに十分に記載されている。典型的な方式は、既存の鋳型DNAから開始する調製用PCR及びクロマトグラフィー精製、又は人工核酸の段階的合成であろう。
【００５３】
ヌクレオチドは、任意の3次元構造を有することができ、公知又は非公知の任意の機能を果たすことができる。用語「核酸分子」には、一本鎖、二本鎖、及び三重らせん状分子が含まれる。「オリゴヌクレオチド」とは、一本鎖又は二本鎖核酸、一般的にはDNAの、3から約100、例えば3〜50、5〜30、又は5〜20ヌクレオチドのポリヌクレオチドをいう。
【００５４】
オリゴヌクレオチドはまた、オリゴマー又はオリゴとしても公知であり、遺伝子から単離することもできるし、当技術分野で公知の方法によって化学的に合成することもできる。「プライマー」とは、酵素によって媒介される核酸合成の開始のための3’-ヒドロキシル末端を提供する、通常は一本鎖の、オリゴヌクレオチドをいう。
【００５５】
次のものは、核酸の非限定的な実施態様である:遺伝子又は遺伝子断片、エクソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ及びプライマー。核酸分子はまた、メチル化された核酸分子及び核酸分子類似体などの、修飾された核酸分子を含むことができる。プリン及びピリミジンの類似体は、当技術分野で公知であり、限定はされないが、アジリジニルシトシン、4-アセチルシトシン、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチル-アミノメチルウラシル、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルアデニン、1-メチルシュードウラシル、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、シュードウラシル、5-ペンチニルウラシル、及び2,6-ジアミノプリンが挙げられる。デオキシリボ核酸中のチミンの代替としてのウラシルの使用はまた、ピリミジンの類似形と考えられる。核酸はまた、ホスホジエステル結合がホスホロチオエート又はホスホン酸メチルで置き換えられる、骨格修飾を含むことができる。
【００５６】
用語「リンカー」又は「リンカー分子」とは、核酸マーカーを非核酸受容体に連結させ、それによって、核酸マーカーを検出することを介して非核酸受容体に特異的に結合した分析物の検出を容易にする、又は、他のリンカー分子を相互連結させる分子をいう。本発明によるリンカー分子は、非核酸受容体及び核酸マーカーとは化学的に異なり、非核酸受容体及び核酸マーカー及び/又は他の化学的に異なるリンカー分子と結合することが可能である。本発明による検出複合体の形成を実現するために、本発明のリンカー分子は、少なくとも二価、好ましくは三価、四価、五価、六価、又は多価である。これに関連して、用語「多価」は、2よりも多い、好ましくは3よりも多い他の分子と結合することができるリンカー分子に関する。リンカー分子に結合する複数の分子は、同じであっても異なってもよい。例えば、リンカー分子は、核酸マーカー、非核酸受容体、及び/又は別の化学的に異なるリンカー分子のための結合部位、或いはある特異的結合パートナーのための2、3、4、又はそれ以上の結合部位を有することができる。後者の場合では、複合体形成は、1以上の結合パートナー(1又は複数)を、核酸マーカー、非核酸受容体、及び別の化学的に異なるリンカー分子などの検出複合体の他の成分に結合させることによって実現される。これに関連して、表現「結合パートナー」は、リンカー分子によって特異的に認識及び結合される分子に関する。したがって、結合パートナーは、小さな有機分子であり得るが、例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖、多糖、又は脂質、又は抗原、又はハプテンなどの任意の他の分子でもあり得る。こうした一対のリンカー分子と結合パートナーについての具体例は、ストレプトアビジン/ビオチン及びアビジン/ビオチン結合対である。リンカー分子が、ストレプトアビジン/アビジンであり、かつ結合パートナーが、ビオチンであるならば、ビオチンは、非核酸受容体、核酸マーカー、及び第2のリンカー分子の1つ又はすべてと結合して、検出複合体形成を容易にすることができる。リンカー分子の、その結合パートナー及び/又は核酸マーカー、非核酸受容体及び/又は他の化学的に異なるリンカー分子への結合は、非共有結合性であることが好ましい。本発明によるリンカー分子は、多糖、有機ポリマー、ポリペプチド、及び核酸マーカーとは異なる核酸からなる群から選択される1以上の分子を含むことができる。本発明によるリンカー分子が、核酸マーカーとは異なる核酸を含む場合、リンカー分子は、核酸部分と化学的に結合した多糖、有機ポリマー、又はポリペプチドをさらに含むことができる。
【００５７】
用語「有機ポリマー」とは、本明細書で使用する場合、ヒドロキシ、アミノ、イミノ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルボニル、カルバミド、ハロ、アシルハロ、アルデヒド、エポキシ、及び/又はチオール基などの官能基を好ましくは含む、有機分子のポリマーをいう。ポリマーの例は、例えば、ポリエチレンイミン、ポリ(メタ)アクリルアミド、ポリアミン、ポリアミドアミン、ポリエチレングリコール、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ(メタ)アクリレート、ポリウレタン、ポリスチレン、及びポリエステルである。好ましいのは、アミノ又はイミノ基を有するものなどのカチオン性ポリマー、例えば例として、ポリエチレンイミン、ポリ(メタ)アクリルアミド、ポリアミン、及びポリアミドアミンである。有機ポリマーは、線状、分枝、又は樹枝状であり得る。
【００５８】
用語「多糖」とは、グリコシド結合によって連結された少なくとも2つの単糖からなる分子をいい、二糖及びオリゴ糖が挙げられる。多糖の例は、デンプン、グリコーゲン、デキストラン、セルロース、及びキチンである。本発明による多糖は、線状、分枝、又は樹枝状の多糖であり得る。
【００５９】
用語「接触させること」又は「インキュベートすること」は、本明細書では互換的に使用され、一般に、ある成分、試薬、分析物、又は試料の、別のものへの接触を提供すること試料をいう。例えば、接触させることは、非核酸受容体を含む溶液を、試料と混合することを含むことができる。ある成分、試薬、分析物、又は試料を含む溶液はまた、成分、試薬、分析物、及び/又は試料間の接触に有利な、混合、相互作用、取り込み、又は他の物理的若しくは化学的事象を容易にする、ジメチルスルホキシド(DMSO)若しくは界面活性剤などの別の成分又は試薬も含むことができる。本発明の一実施態様では、接触させることは、非核酸受容体を含む溶液を、ピペットに基づく装置又はシリンジに基づく装置などの送達器械を利用して、試料に添加することを含む。
【００６０】
本明細書で使用される用語「検出すること」とは、所与の分子の存在を確認する任意の方法をいう。これを実現するために使用される技術には、限定はされないが、PCR、配列決定、PCR配列決定、分子ビーコン技術、Scorpions技術、ハイブリダイゼーション、及びハイブリダイゼーションに続くPCRが含まれ得る。検出のために使用される可能性がある試薬の例としては、限定はされないが、放射標識された及び蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブ及び色素、例えばDNAインターカレーター色素が挙げられる。
【００６１】
本明細書で使用される用語「検出」とは、共に連結されている2以上の分子をいう。互いの連結は、共有結合性又は非共有結合性であり得る。本発明による検出の一例は、第1のリンカー分子を用いて互いに非共有結合的に連結される非核酸受容体と核酸マーカーとからなる検出である。特定の実施態様では、該検出は、ストレプトアビジン分子を介して分析物特異的なビオチン標識された抗体と結合された、ビオチン標識されたDNA分子を含む、又は本質的に該DNA分子からなる、又は該DNA分子からなる。こうした検出は、オリゴマー検出であり得る、すなわち、2種以上の核酸マーカー、及び/又は2種以上の非核酸受容体、及び/又は2種以上の第1のリンカー分子を含む。
【００６２】
用語「検出複合体」とは、本明細書で使用する場合、1以上の非核酸受容体、1以上の核酸マーカー、第1の種類の1以上のリンカー分子、及び第2の種類の1以上のリンカー分子の複合体をいう。一実施態様では、本発明による検出複合体は、上で定義した通りの2以上の検出、及びさらに1以上の第2のリンカー分子(1又は複数)を含むことができる。本発明のある具体的実施態様では、本発明によるこうした検出複合体は、少なくとも2つの第1のリンカー分子及び少なくとも2つの第2のリンカー分子を用いて互いに非共有結合的に連結された、少なくとも2つの非核酸受容体と少なくとも2つの核酸マーカーを含む。特定の実施態様では、該検出は、少なくとも1つの、好ましくは2以上のストレプトアビジン分子(1又は複数)及び少なくとも1つの、好ましくは2以上のビオチン標識された有機ポリマー又はタンパク質分子(BSA、ポリエチレンイミン、ポリ(メタ)アクリルアミド、ポリアミン、又はポリアミドアミンなど)を介して、少なくとも1つの、好ましくは2以上の分析物特異的なビオチン標識された抗体に結合された、少なくとも1つの、例えば2以上ビオチン標識されたDNA分子(1又は複数)を含む、又は本質的に該DNA分子からなる、又は該DNA分子からなる。特定の実施態様では、該検出複合体は、1以上の、好ましくは少なくとも2つのストレプトアビジン分子(1又は複数)及び1以上の、好ましくは少なくとも2つのポリ-ビオチン標識された有機ポリマー(1又は複数)又はタンパク質(1又は複数)/ポリペプチド(1又は複数)(BSA、ポリエチレンイミン、ポリ(メタ)アクリルアミド、ポリアミン、又はポリアミドアミンなど)を介して、1以上の、好ましくは少なくとも2つの分析物特異的なポリ-ビオチン標識された抗体に結合された、1以上の、好ましくは少なくとも2つの(ビス-)ビオチン標識されたDNAマーカー分子(1又は複数)を含む、又は本質的に該DNA分子からなる、又は該DNA分子からなる。これに関連して、「ポリ-ビオチン標識された」とは、2以上のビオチン部分での共有結合性修飾をいう。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】様々な捕捉抗体(クローン6-1-6、17-4-3、24-2-3(3つすべてProbiodrug AG社)、及びクローン2-48(Synaptic Systems社)を用いる、3種のpan特異的β-アミロイド抗体(6E10、13-28、12F4)の研究の結果を示す図である。  1 検出抗体6E10、300pg/ml pGlu-Aβ(3-42)ペプチド(配列番号:30)の陽性対照、  2 検出抗体6E10、陰性対照、  3 検出抗体13-28(BAM 90.1、Sigma社)、300pg/ml pGlu-Aβ(3-42)ペプチド(配列番号:30)の陽性対照、  4 検出抗体13-28、陰性対照、  5 検出抗体12F4(Covance社)、300pg/ml pGlu-Aβ(3-42)ペプチド(配列番号:30)の陽性対照、  6 検出抗体12F4、陰性対照。
【図２】pGlu-Aβ(3-42)ペプチド(配列番号:30)の確認において使用された、高及び低濃度の標準のpGlu-Aβ(3-42)ペプチド(配列番号:30)混合物についての回収プロットを示す図である。
【図３】DemTect検査を示す図である。DemTectスケールによるAD患者と健康な対象(第I群:18〜30歳;第II群:31〜45歳;第III群:46〜65歳)の分類の違いの結果の平均値(平均±SD)。
【図４】ミニメンタルステート検査を示す図である。ミニメンタルステート検査によるAD患者及び健康な対象(第I群:18〜30歳;第II群:31〜45歳;第III群:46〜65歳)の分類の違いの結果の平均値(平均±SD)。
【図５】時計描画検査を示す図である。時計描画検査によるAD患者及び健康な対象(第I群:18〜30歳;第II群:31〜45歳;第III群:46〜65歳)の分類の違いの結果の平均値(平均±SD)。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
(発明の詳細な説明)
本発明の第1の態様によれば、生体試料中のAβ標的ペプチドの検出のための、前記Aβ標的ペプチドに特異的である捕捉試薬;及びAβ標的ペプチド検出複合体を含む非常に高感度の方法であって、以下のステップを含む前記方法が提供される:
a)生体試料を、前記捕捉試薬及び前記検出複合体と接触させるステップ;及び
b)前記Aβ標的ペプチドを検出するステップ
(ここでは、該検出複合体は、Aβ標的ペプチド特異的抗体と、核酸マーカーとを含む)。
【００６５】
好ましくは、前記Aβ標的ペプチドは、pGlu-Aβペプチドである。
【００６６】
好適には、前記検出複合体は、pGlu-Aβペプチドと結合することが可能な検出抗体、あらかじめ決定されたヌクレオチド配列を含む1以上の核酸マーカー、並びに、前記抗体及び核酸マーカーを結合させるように適合された1以上の第1のリンカー分子からなる、本質的にこれらからなる、又はこれらを含む。
【００６７】
好ましい実施態様では、本発明による方法は、以下のステップを含む:
a)生体試料を、検出複合体と、Aβ標的ペプチドの前記検出複合体への結合を可能にする条件下で接触させるステップ;及び
b)続いて、検出複合体に結合された前記Aβ標的ペプチドを、Aβ標的ペプチドと結合することが可能な捕捉試薬と、前記捕捉試薬の前記Aβ標的ペプチドへの結合を可能にする条件下で接触させるステップ。
【００６８】
好適には、捕捉試薬は、pGlu-Aβペプチドに特異的な捕捉抗体である。
【００６９】
本発明のさらなる好ましい態様によれば、生体試料中のpGlu-Aβペプチドの検出のための方法であって、以下のステップを含む前記方法が提供される:
a)生体試料を、少なくとも1種の検出複合体と、前記検出複合体の前記Aβ標的ペプチドへの結合を可能にする条件下で接触させるステップであって：前記検出複合体は、Aβ標的ペプチドと結合することが可能な検出抗体、あらかじめ決定されたヌクレオチド配列を含む1以上の核酸マーカー、並びに、前記抗体及び核酸マーカーを結合させるように適合された1以上の第1のリンカー分子からなる、本質的にこれらからなる、又はこれらを含む、前記ステップ；
b)検出複合体に結合された前記Aβ標的ペプチドを、前記Aβ標的ペプチドと結合することが可能な捕捉抗体と、前記捕捉抗体の前記Aβ標的ペプチドへの結合を可能にする条件下で、さらに接触させるステップ;並びに
c)前記Aβ標的ペプチドを検出するステップ;
(ここでは、前記Aβ標的ペプチドは、pGlu-Aβペプチドであり;検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方は、前記pGlu-Aβペプチドのピログルタミン酸保有アミノ末端に特異的に結合する)。
【００７０】
本明細書で提供されたデータは、驚いたことに、生体試料中のpGlu-Aβペプチドの検出の感度が、本発明の方法によって著しく増大した、すなわち、4.2fg/mlに至るまでの痕跡量を、高い信頼度で検出することができたことを示す。pGlu-Aβペプチドの検出の定量下限界(LOQ)は、従来の技術における既存の分析方法と比較して、少なくとも1000倍向上させることができた。
【００７１】
本発明に関する生体試料は、通常、様々なAβペプチド、その断片又は機能性誘導体、並びに様々なpGlu-Aβペプチド、その断片又は機能性誘導体の混合物を含む。例えば、生体試料は、配列番号:1〜37に記載のペプチドの混合物を含むことができる。
【００７２】
本発明の方法の一実施態様では、検出抗体と捕捉抗体は両方とも、前記pGlu-Aβペプチドのピログルタミン酸保有アミノ末端に特異的に結合する。この実施態様の利点は、生体試料を少なくとも1種の検出複合体(ここでは、前記検出複合体は、検出抗体を含む)と接触させる(i)のステップにおいて既に、pGlu-Aβペプチド(例えば、配列番号:26〜37の少なくとも1種のpGlu-Aβペプチド)のみが、検出抗体によって結合されることである。その結果、本発明の方法の第1のステップにおいて、前記pGlu-Aβペプチドの選択的濃縮が、既に行われている。本発明の方法のこの実施態様は、特に、Aβオリゴマーに含まれるpGlu-Aβペプチドの検出に適している。
【００７３】
本発明の方法の代替実施態様では、捕捉抗体は、前記pGlu-Aβペプチドのピログルタミン酸保有アミノ末端に特異的に結合し、検出抗体は、Aβペプチドの別のエピトープ配列に結合する。この実施態様の利点は、生体試料を少なくとも1種の検出複合体(ここでは、前記検出複合体は、検出抗体を含む)と接触させる(i)のステップにおいて、前記生体試料中に存在するすべてのAβペプチド、pGlu-Aβペプチド、並びにその断片及び機能性バリアントが、検出抗体によって結合され、したがって、この方法ステップにおいて濃縮されることである。次いで、AβペプチドとpGlu-Aβペプチドとの間の高度に選択的な識別が、検出複合体に結合されたAβペプチドを、pGlu-Aβペプチドと結合することが可能な捕捉抗体と、前記捕捉抗体の前記pGlu-Aβペプチドへの結合を可能にする条件下で、さらに接触させる方法ステップii)において実施される。この代替実施態様は、pGlu-AβペプチドがAβオリゴマーに含まれる場合だけでなく、pGlu-Aβペプチドが遊離のモノマーとして、又は生体試料中に含有されるタンパク質に結合したモノマーとして生体試料に含まれる場合に、特に好都合である。この代替実施態様は、たった1つのpGlu-Aβモノマーが、生体試料中に含有されるタンパク質に結合される場合に、特に好都合である。検出抗体と捕捉抗体が両方とも、同じエピトープに、例えば前記pGlu-Aβペプチドのピログルタミン酸保有アミノ末端に特異的に結合する場合、結合されたpGlu-Aβペプチドモノマーは、ひょっとすると捕捉抗体によって検出されない可能性がある。何故なら、前記pGlu-Aβペプチドのピログルタミン酸保有アミノ末端は、検出複合体中の検出抗体によって、既に遮蔽又は占拠されているからである。
【００７４】
本発明の方法のさらなる代替実施態様では、検出抗体は、前記pGlu-Aβペプチドのピログルタミン酸保有アミノ末端に特異的に結合し、捕捉抗体は、Aβペプチドの別のエピトープ配列に結合する。この実施態様は、遊離の又はタンパク質が結合されたpGlu-Aβペプチドモノマー、及びpGlu-Aβ含有オリゴマーの検出について前に記述した通りに好都合である。
【００７５】
捕捉抗体及び/又は検出抗体がそれに結合する、Aβペプチドの「他のエピトープ配列」は、捕捉抗体及び/又は検出抗体が、pGlu-Aβペプチドのピログルタミン酸保有アミノ末端に結合しない場合、配列番号:1のAβ(1-38)、配列番号:2のAβ(1-39)、配列番号:3のAβ(1-40)、配列番号:4のAβ(1-41)、配列番号:5のAβ(1-42)、及び配列番号:6のAβ(1-43)などの、完全長Aβペプチドのアミノ酸配列の一部であり得る。ピログルタミン酸保有アミノ末端に結合しない捕捉抗体及び/又は検出抗体は、Aβペプチドの切断されていないかつ/又は修飾されていないN末端又はC-末端を特異的に検出することができる。さらに好適には、他のエピトープ配列は、配列番号:7〜37のうちの一つのアミノ酸配列の一部であり得る。
【００７６】
本発明の方法の好ましい実施態様では、捕捉抗体及び/又は検出抗体が結合するAβペプチドの他のエピトープ配列は、捕捉抗体及び/又は検出抗体が、pGlu-Aβペプチドのピログルタミン酸保有アミノ末端に結合しない場合、3位のN末端pGlu残基から開始するpGlu-Aβペプチド、最も好ましくは配列番号:26〜31のpGlu-Aβペプチドが検出及び/又は定量化されるべきである場合には、配列番号:19のAβ(11-38)のコア・アミロイドβ配列に含まれる。
【００７７】
本発明の方法の好ましい実施態様では、捕捉抗体及び/又は検出抗体が結合するAβペプチドの他のエピトープ配列は、捕捉抗体及び/又は検出抗体が、pGlu-Aβペプチドのピログルタミン酸保有アミノ末端に結合しない場合、11位のN末端pGlu残基から開始するpGlu-Aβペプチド、最も好ましくは配列番号:32〜37のpGlu-Aβペプチドが検出及び/又は定量化されるべきである場合には、配列番号:25のAβ(15-38)のコア・アミロイドβ配列に含まれる。
【００７８】
好適には、他のエピトープ配列は、配列番号:1〜25のうちの一つのAβペプチドのアミノ酸配列全体からなる。より好適には、他のエピトープ配列は、配列番号:1〜25のうちの一つのAβペプチドの30、25、20、又は15アミノ酸からなる。最も好ましくは、他のエピトープ配列は、配列番号:1〜25のうちの一つのAβペプチドの10、9、8、7、6、5、4、又は3アミノ酸からなる。
【００７９】
検出複合体が、生体試料と類似のマトリックス中に提供される場合、本発明の方法を用いて、特に良好かつ信頼できる結果が達成される。さらに好適には、生体試料と類似のこうしたマトリックスに含まれる検出複合体は、生体試料に直接的に添加される。驚いたことに、検出複合体が、生体試料と類似のマトリックス中に提供され、かつ、＜1+1の比で生体試料に直接的に添加される場合に、最も良い結果を得ることができる。
【００８０】
本発明の方法は、生体試料の一晩のインキュベーション、及び検出複合体(これは生体試料と類似のマトリックス中に含有される)の、1+0.03の比での生体試料への直接的な添加の組み合わせを含む、分析プロトコルにおける新しい驚くべき戦略に基づく。この分析プロトコルは、典型的な試料希釈が1+1〜1+9及びさらに高い従来の技術において使用される方法と比較して、全く予想外かつ慣例に従わないものである。このインキュベーション戦略のみが、Aβ標的ペプチドの、意図する非常に高感度の検出を可能にした。
【００８１】
様々なpGlu-Aβペプチドの混合物が、定量化のための基準物質として、ヒトCSF又は人工ヒトCSFに適用される場合、本発明の方法の感度及び信頼度のさらなる増大が実現される。好ましい実施態様では、pGlu-Aβ(x-40)とpGlu-Aβ(x-42)との1+1混合物が、定量化のための基準物質として、ヒトCSF又は人工ヒトCSFに適用される(ここでは、xは、3及び11から選択される整数である)。最も好ましくは、Aβ標的ペプチドが、配列番号:1から25から選択される場合、pGlu-Aβ(3-40)とpGlu-Aβ(3-42)との1+1混合物が、定量化のための基準物質として、ヒトCSF又は人工ヒトCSFに適用される。さらに最も好ましくは、Aβ標的ペプチドが、配列番号:32〜37から選択される場合、pGlu-Aβ(11-40)とpGlu-Aβ(11-42)との1+1混合物が、定量化のための基準物質として、ヒトCSF又は人工ヒトCSFに適用される。参照標準としての2種のAβ標的ペプチドの混合物のこうした使用が、新しい革新的な戦略である。
【００８２】
pGlu-Aβペプチドのピログルタミン酸保有アミノ末端に結合しない検出及び/又は捕捉抗体の好適な例は、以下である:
3D6、エピトープ:1〜5(Elan Pharmaceuticals社、Innogenetics社)、
pAb-EL16、エピトープ:1-7、
2H4、エピトープ:1-8(Covance社)、
1E11、エピトープ:1-8(Covance社)、
20.1、エピトープ:1-10(Covance社、Santa Cruz Biotechnology社)、
ウサギ抗Aβポリクローナル抗体、エピトープ:1-14(Abcam社)、
AB10、エピトープ:1-16(Chemicon/Upstate社-Millipore社の一部)、
82E1、エピトープ:1-16(IBL社)、
pAb 1-42、エピトープ:1-11、
NAB228、エピトープ:1-11(Covance社、Sigma-Aldrich社、Cell Signaling社、Santa Cruz Biotechnology社、Zymed/Invitrogen社)、
DE2、エピトープ:1-16(Chemicon/Upstate社-Millipore社の一部)、
DE2B4、エピトープ:1-17(Novus Biologicals社、Abcam社、Accurate社、AbD Serotec社)、
6E10、エピトープ:1-17(Signet Covance社、Sigma-Aldrich社)、
10D5、エピトープ:3-7(Elan Pharmaceuticals社)、
WO-2、エピトープ:4-10(Genetics社)、
1A3、エピトープ5-9(Abbiotec社)、
pAb-EL21、エピトープ5-11、
310-03、エピトープ5-16(Abcam社、Santa Cruz Biotechnology社)、
ニワトリ抗ヒトAβポリクローナル抗体、エピトープ12-28(Abcam社)、
ニワトリ抗ヒトAβポリクローナル抗体、エピトープ25-35(Abcam社)、
ウサギ抗ヒトAβポリクローナル抗体、エピトープ:N末端(ABR社)、
ウサギ抗ヒトAβポリクローナル抗体(Anaspec社)、
12C3、エピトープ10-16(Abbiotec社、Santa Cruz Biotechnology社)、
16C9、エピトープ10-16(Abbiotec社、Santa Cruz Biotechnology社)、
19B8、エピトープ9-10(Abbiotec社、Santa Cruz Biotechnology社)、
pAb-EL26、エピトープ:11-26、
BAM90.1、エピトープ:13-28(Sigma-Aldrich社)、
ウサギ抗ベータ-アミロイド(pan)ポリクローナル抗体、エピトープ:15-30(MBL社)、
22D12、エピトープ:18-21(Santa Cruz Biotechnology社)、
266、エピトープ:16-24(Elan Pharmaceuticals社)、
pAb-EL17; エピトープ:15-24、
4G8、エピトープ:17-24(Covance社)、
ウサギ抗Aβポリクローナル抗体、エピトープ:22-35(Abcam社)、
G2-10;エピトープ:31-40(The Genetics Company社)、
ウサギ抗Aβ、aa 32-40ポリクローナル抗体(GenScript Corporation社)、
EP1876Y、エピトープ:x-40(Novus Biologicals社)、
G2-11、エピトープ:33-42(The Genetics Company社)、
16C11、エピトープ:33-42(Santa Cruz Biotechnology社)、
21F12、エピトープ:34-42(Elan Pharmaceuticals社、Innogenetics社)、
1A10、エピトープ:35-40(IBL社)、
D-17ヤギ抗Aβ抗体、エピトープ:C-末端(Santa Cruz Biotechnology社)、
2C8、エピトープ:1-16(Accurate社)、
BAM-10、エピトープ:1-12(Biotrend社、Sigma-Aldrich社)、
12B2、エピトープ:11-28(IBL社、Biotrend社)、
6F/3D、エピトープ:8-17(Accurate社)、
310-01、エピトープ:10-16,(Accurate社)、
11A5-B10、エピトープ:34-40,(Millipore社)、
12F4、エピトープ:36-42、(Millipore社、Covance社)、
9C4、エピトープ:37-43、(Milipore社)、
7N22、エピトープ:1-20、(Biosource社)、
11A50-B10、エピトープ:35-40)(Covance社)、
G2-13、エピトープ:C-末端Aβ42(Genetics Company社)、
2B9、エピトープ:1-17(Santa Cruz社)、及び
9C4、エピトープ:3-8(Covance社)。
【００８３】
本発明の方法によって好ましくは検出されるpGlu-Aβペプチドは、配列番号:26〜37からなる群から選択される少なくとも1種のpGlu-Aβペプチドである。
【００８４】
本発明の好ましい実施態様では、前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体は、モノクローナル抗体、より好ましくはヒト化モノクローナル抗体である。本発明によるさらなる好ましいものは、高親和性を保持するダイアボディ又は単鎖抗体である、検出抗体及び/又は捕捉抗体である。
【００８５】
本発明の一実施態様によれば、配列番号:26〜31の前記pGlu-Aβペプチドのピログルタミン酸保有アミノ末端に特異的に結合する捕捉及び/又は検出抗体は、
pGlu3-Aβ抗体クローン2-48(モノクローナル、マウス);Synaptic Systems社、
pGlu3-Aβ抗体(ポリクローナル、ウサギ);Synaptic Systems社、Biotrend社、IBL社、
pGlu3-Aβ抗体クローン8E1(モノクローナル、マウス);Anawa社、
pGlu3-Aβ抗体クローン8E1(モノクローナル、マウス);Biotrend社、
抗ヒトアミロイドβ(N3pE)ウサギIgG(ポリクローナル、ウサギ);IBL社、
Abeta-pE3ウサギポリクローナル、アフィニティ精製済み、Synaptic systems社、
抗ヒトAβ N3pE(8E1)マウスIgG Fab(モノクローナル、マウス);IBL社、
pGlu3-Aβ抗体クローン337.48(モノクローナル、マウス);Biolegend社、
pGlu3-Aβ抗体クローン1-57(モノクローナル、マウス);Synaptic Systems社、
pGlu3-Aβ抗体クローン70D7(モノクローナル、マウス);Synaptic Systems社、及び
オリゴpGlu3-Aβ抗体クローン9D5(モノクローナル、マウス);Synaptic Systems社
からなる群から選択される。
【００８６】
本発明のさらなる好ましい実施態様では、捕捉及び/又は検出抗体は、エピトープ配列
【化１】
2018501482.tif 000003
に特異的に結合する。
【００８７】
本発明のより好ましい実施態様では、検出及び/又は捕捉抗体は、以下からなる群から選択されるハイブリドーマ細胞株によって産生される:
Aβ 5-5-6(寄託番号DSM ACC 2923)、
Aβ 6-1-6(寄託番号DSM ACC 2924)、
Aβ 17-4-3(寄託番号DSM ACC 2925)、及び
Aβ 24-2-3(寄託番号DSM ACC 2926)
(これらは、WO 2010/009987に開示されている)。
【００８８】
本発明の最も好ましい実施態様では、前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体の軽鎖の可変部分は、配列番号:40のヌクレオチド配列又は配列番号:41のアミノ酸配列を有し、前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体の重鎖の可変部分は、配列番号:42のヌクレオチド配列又は配列番号:43のアミノ酸配列を有する。
【００８９】
本発明のさらなる最も好ましい実施態様では、前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体の軽鎖の可変部分は、配列番号:44のヌクレオチド配列又は配列番号:45のアミノ酸配列を有し、前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体の重鎖の可変部分は、配列番号:46のヌクレオチド配列又は配列番号:47のアミノ酸配列を有する。
【００９０】
本発明のさらなる最も好ましい実施態様では、前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体の軽鎖の可変部分は、配列番号:48のヌクレオチド配列又は配列番号:49のアミノ酸配列を有し、前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体の重鎖の可変部分は、配列番号:50のヌクレオチド配列又は配列番号:51のアミノ酸配列を有する。
【００９１】
本発明のさらなる最も好ましい実施態様では、前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体の軽鎖の可変部分は、配列番号:52のヌクレオチド配列又は配列番号:53のアミノ酸配列を有し、前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体の重鎖の可変部分は、配列番号:54のヌクレオチド配列又は配列番号:55のアミノ酸配列を有する。
【００９２】
本発明の好ましい実施態様では、配列番号:32〜37の前記pGlu-Aβペプチドのピログルタミン酸保有アミノ末端に特異的に結合する捕捉及び/又は検出抗体は、
pGlu11-Aβ抗体クローン173D8,(モノクローナル、マウス);Synaptic Systems社、及び
pGlu11-Aβ抗体(ポリクローナルウサギ);Synaptic Systems社
からなる群から選択される。
【００９３】
本発明のさらなる好ましい実施態様では、捕捉及び/又は検出抗体は、エピトープ配列pGlu-VHH、配列番号:39に特異的に結合する。
【００９４】
より好ましくは、前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体は、WO 2012/123562に開示されているハイブリドーマ細胞株Aβ 13-11-6(寄託番号DSM ACC 3100)によって産生されるモノクローナル抗体である。
【００９５】
本発明の最も好ましい実施態様では、前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体の軽鎖の可変部分は、配列番号:56のヌクレオチド配列又は配列番号:57のアミノ酸配列を有し、前記検出抗体及び/又は前記捕捉抗体の重鎖の可変部分は、配列番号:58のヌクレオチド配列又は配列番号:59のアミノ酸配列を有する。
【００９６】
捕捉抗体が、固体上支持体に固定され、その後、検出抗体と分析物とを含む検出複合体が捕捉抗体に結合し、したがって不溶性の複合体が形成されることが、本発明によるさらなる好ましいことである。
【００９７】
本発明の方法において使用される、検出複合体を調製するための一般的方法は、その開示全体が本明細書に組み込まれるDE 199 41 756 A1及びEP 2 189 539 A1に記載されている。特に、1以上の非核酸受容体(例えば検出抗体などの抗体)、1以上の核酸マーカー、非核酸受容体及び核酸マーカーと結合するように適合された1以上の第1のリンカー分子、並びに第1のリンカー分子と結合するように適合された1以上の第2のリンカー分子からなる、本質的にこれらからなる、又はこれらを含む検出複合体の使用によって、性能、特に、イムノPCR(IPCR)反応の分析感度及びシグナル-バックグラウンド比を著しく向上させることができることが判明している。
【００９８】
本発明のさらなる態様によれば、生体試料中のpGlu-Aβペプチドの検出のための方法であって、以下のステップを含む前記方法が提供される:
i.生体試料を、少なくとも1種の検出複合体と、前記検出複合体のAβペプチドへの結合を可能にする条件下で接触させるステップであって：前記検出複合体は、Aβペプチドと結合することが可能な検出抗体、あらかじめ決定されたヌクレオチド配列を含む1以上の核酸マーカー、並びに、前記抗体及び核酸マーカーを結合させるように適合された1以上の第1のリンカー分子;並びに、第1のリンカー分子と結合するように適合された1以上の第2のリンカー分子からなる、本質的にこれらからなる、又はこれらを含む、前記ステップ；
ii.検出複合体に結合されたAβペプチドを、Aβペプチドと結合することが可能な捕捉抗体と、前記捕捉抗体の前記Aβペプチドへの結合を可能にする条件下で、さらに接触させるステップ;並びに
iii.前記pGlu-Aβペプチドを検出するステップ;
(ここでは、検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方は、前記pGlu-Aβペプチドのピログルタミン酸保有アミノ末端に特異的に結合する)。
【００９９】
したがって、一実施態様では、本発明は、1以上の検出抗体分子、1以上の核酸マーカー、非核酸受容体及び核酸マーカーと結合するように適合された1以上の第1のリンカー分子、並びに第1のリンカー分子と結合するように適合された1以上の第2のリンカー分子を含む検出複合体に関する。本発明のある具体的実施態様では、検出複合体は、複数の検出抗体分子、核酸マーカー、第1のリンカー分子、及び第2のリンカー分子を含む。結合活性の増大を用いて、選択される分析物に対する親和性を高めるために、本発明による検出複合体中のある種のAβペプチド又はpGlu-Aβペプチドに特異的な結合親和性を有する、いくつかの検出抗体を含むことが望ましい。ひいては、このようにして、試料中の分析物の存在を示す陽性のシグナルが増強され、かつシグナル-バックグラウンド比が向上されるので、検出複合体中にいくつかの核酸マーカーを含むことも望ましい。
【０１００】
本発明による検出複合体においては、第1のリンカーと第2のリンカー分子は、検出抗体と核酸マーカーとの超分子凝集体を形成し、したがって、IPCR分析における検出試薬としての該複合体の感度を増大させる目的を果たす。超分子ネットワークの自己集合を実現するために、第1のリンカー分子は、検出抗体、核酸マーカー、及び第2のリンカー分子、と結合するように適合される。
【０１０１】
本発明による超分子検出複合体は、2〜50、好ましくは5〜50分子のそれぞれの検出抗体、核酸マーカー、第1のリンカー分子、及び第2のリンカー分子を含むことができる。本発明の検出複合体の一実施態様では、該複合体は、少なくとも2、好ましくは3、又はそれ以上の検出抗体分子及び/又は核酸マーカーを含む。本発明のいくつかの実施態様では、本発明の検出複合体は、約10〜40個の核酸マーカー及び第1のリンカー分子、約5〜15個の検出抗体分子及び約5〜10個の第2のリンカー分子を含む。
【０１０２】
本発明のさらなる実施態様によれば、検出抗体は、Aβペプチド又はpGlu-Aβペプチドと特異的に結合する能力を保持する、検出抗体又は検出抗体断片の、抗体断片又は機能性バリアントであり得る。検出抗体は、モノクローナル又はポリクローナル抗体であり得、抗体断片は、例えば、例えばFab若しくはF(ab’)2断片、単鎖可変断片(scFv)、Fvダイアボディ、又は線状抗体であり得る。これらの検出抗体、その断片又は機能性バリアントは、ビオチン標識することができる、したがって、1以上のビオチン又はビオチン類似体部分を含むことができる。
【０１０３】
あらかじめ決定されたヌクレオチド配列を含む核酸マーカーは、例えば、二本又は一本鎖DNA、二本又は一本鎖RNA、又はDNAとRNAとの二本鎖ハイブリッドなどの、任意の核酸であり得る。核酸マーカーは、天然に存在する塩基及び糖が塩基類似体若しくは糖類似体によって置き換えられている、又は、リン酸骨格が他の好適な基によって置換されているものなどの、ヌクレオチド類似体を含有することができる。好適な修飾は、先に言及している。前述のすべての核酸マーカー分子は、ビオチン標識することができる、したがって、1以上のビオチン又はビオチン類似体部分を含むことができる。ある特定の例は、モノ-又はビス-ビオチン標識DNA分子である。
【０１０４】
本発明の一実施態様では、検出複合体は、第1のリンカー分子と検出抗体及び/又は核酸マーカーとの間の非共有結合性の相互作用によって形成される。こうした一実施態様では、第1のリンカー分子と第2のリンカー分子との結合も、非共有結合性であり得る。
【０１０５】
本発明のある具体的実施態様によれば、第1のリンカー分子と検出抗体、核酸マーカー、及び/又は第2のリンカー分子との結合は、非核酸受容体、核酸マーカー、及び/又は第2のリンカー分子それぞれを、1以上の、例えば2、3、4、5、又はそれ以上の第1のリンカー分子の結合パートナーに結合させることによって容易にすることができる。これらの結合パートナーは、検出抗体、核酸マーカー、及び第2のリンカー分子によって同じ又は異なり得る。本発明の一実施態様では、これらの第1のリンカー分子の結合パートナーは、検出抗体、核酸マーカー、及び/又は第2のリンカー分子に共有結合される。
【０１０６】
本発明のある具体的実施態様によれば、第1のリンカー分子の結合パートナーは、第1のリンカー分子のリガンドであり得る。第1のリンカー分子が、結合パートナーへの結合に対して、二価、三価、四価、又は多価であることが好ましい。一実施態様では、第1のリンカー分子は、その結合パートナーを特異的に認識し高親和性で結合する。
【０１０７】
本発明の一実施態様では、第1のリンカー分子は、アビジン若しくはストレプトアビジン若しくはビオチン-結合断片又はその変異型であり得る。
【０１０８】
具体的実施態様では、第1のリンカー分子の結合パートナーは、ビオチン又はビオチン類似体である。本発明のビオチン類似体は、アビジン、ストレプトアビジン、若しくはビオチン-結合断片又はその変異型に特異的に結合する能力を保持することが好ましい。
【０１０９】
第1のリンカー分子が、アビジン、ストレプトアビジン、若しくはビオチン-結合断片又はその変異型である場合、第1のリンカー分子の、検出抗体、核酸マーカー、及び/又は第2のリンカー分子への結合は、検出抗体、核酸マーカー、及び/又は第2のリンカー分子を、ビオチン又はビオチン類似体に結合させることによって容易にすることができる。この結合は、共有結合性であり得、検出抗体、核酸マーカー、及び/又は第2のリンカー分子のいずれかを、少なくとも2つのビオチン又はビオチン類似体分子に結合させることができる。
【０１１０】
代替実施態様では、第1のリンカー分子は、検出抗体、核酸マーカー、及び第2のリンカー分子のうちの少なくとも2つと同時に結合するように適合された、融合タンパク質又は少なくとも二価の抗体若しくは抗体様分子であり得る。
【０１１１】
本発明の一実施態様によれば、第2のリンカー分子は、核酸マーカーとは異なる核酸、有機ポリマー、ポリペプチド、及び多糖からなる群から選択することができる。本発明の一実施態様では、第2のリンカー分子は、核酸マーカーとは異なる核酸、有機ポリマー、タンパク質、及び多糖からなる群から選択される少なくとも2個、３個、又は４個の異なる分子を含む。
【０１１２】
第2のリンカー分子が、有機ポリマー分子からなる、本質的に有機ポリマー分子からなる、又は有機ポリマー分子を含む場合、これらは、本発明のある具体的実施態様による、線状、分枝、又は樹枝状のポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド、ポリアミン、及びポリアミドアミンなどのカチオン性ポリマーからなる群から選択することができる。
【０１１３】
第2のリンカー分子が、タンパク質又はポリペプチド分子からなる、本質的にタンパク質又はポリペプチド分子からなる、又はタンパク質又はポリペプチド分子を含む場合、これらは、血清アルブミン及び免疫グロブリン又はその断片からなる群から選択することができる。一実施態様では、第2のリンカー分子は、BSAであり得る。或いは、第2のリンカー分子は、ポリリジン、ポリヒスチジン、又はポリアルギニンなどのカチオン性アミノ酸のホモポリマーであり得る。
【０１１４】
本発明のある代替実施態様では、第2のリンカー分子は、線状、環状、又は分枝デキストランからなる群から選択される多糖からなる、本質的に該多糖からなる、又は該多糖を含む。
【０１１５】
本発明のさらに別の実施態様では、第2のリンカー分子は、核酸マーカーとは異なる核酸分子からなり得る、本質的に該核酸分子からなり得る、又は該核酸分子を含むことができる。核酸分子は、核酸オリゴマー、例えば、オリゴヌクレオチド又は核酸ポリマー、例えばポリヌクレオチドなどであり得る。第2のリンカー分子として使用することができる例示的な核酸オリゴマーは、2つの相補的な核酸鎖からなり、ここでは、これらの鎖はそれぞれ、独立に、第1のリンカー分子に結合するように適合されている。本発明のある具体的実施態様では、第1のリンカー分子への結合は、核酸オリゴマーの各単鎖を1つの第1のリンカー分子に共有結合させる(その結果、これらの2本の鎖のそれぞれが、共有結合によって、第1のリンカー分子に独立に結合されることとなる)ことによって容易になる。
【０１１６】
別の代替実施態様は、1以上の第1のリンカー分子と結合するように適合されたポリヌクレオチドであり得る。
【０１１７】
本発明の一実施態様では、第2のリンカー分子はまた、先に指定した分子の不均一な混合物であり得る。したがって、本発明の一実施態様によれば、第2のリンカー分子は、線状、分枝、又は樹枝状のポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド、ポリアミン、ポリアミドアミン、カチオン性アミノ酸のホモポリマー、例えばポリリジンなど、血清アルブミン、免疫グロブリン又はその断片、線状、環状、又は分枝デキストラン、ポリ-及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択される2以上の異なる分子を含む。本発明のある具体的実施態様では、第2のリンカー分子は、2本の相補的な核酸鎖からなる核酸オリゴマーを含み、ここでは、これらの鎖はそれぞれ、独立に、第1のリンカー分子(場合によっては共有結合を形成する)、及び、有機ポリマー、例えばポリエチレンイミンなど、ポリペプチド、例えばアルブミン又は免疫グロブリンなど、多糖、及び/又は該核酸オリゴマーとは異なるポリヌクレオチド、及び核酸マーカーなどに結合するように適合されている。
【０１１８】
前述の 第2のリンカー分子はすべて、1以上のビオチン又はビオチン類似体分子に結合させることができる。本発明による第2のリンカー分子の具体例は、ポリビオチン標識BSA、ポリビオチン標識ポリエチレンイミン、ポリビオチン標識ポリ(メタ)アクリルアミド、ポリビオチン標識ポリアミン、又はポリビオチン標識ポリアミドアミンである。
【０１１９】
本発明の一実施態様では、本発明の検出複合体は、第1のリンカー分子に結合するように適合された1以上のモジュレーターをさらに含むことができる。これらのモジュレーターは、検出抗体、核酸マーカー、第2のリンカー分子、及び/又は第1のリンカー分子の結合パートナーのための、第1のリンカー分子の非占有結合部位を飽和させるために使用される。モジュレーターが、検出抗体、核酸マーカー、第2のリンカー分子、及び/又は検出抗体、核酸マーカー、及び/又は第2のリンカー分子に結合された第1のリンカー分子の結合パートナーの結合と競合することを回避するために、モジュレーターは、検出抗体、核酸マーカー、第1の及び第2のリンカー分子からの検出複合体の形成後に添加されることが好ましい。モジュレーターは、正電荷を有することができ、また、アミノ-ビオチン、ジアミノ-ビオチン、及びアミノ-置換型ビオチン類似体からなる群から選択することができる。
【０１２０】
さらなる態様では、本発明は、先の検出複合体の調製のための方法に関する。一実施態様では、本発明による検出複合体の調製のためのこうした方法は、以下のステップを含む:
(a)1以上の核酸マーカーを、核酸マーカー及び検出抗体と結合するように適合させた1以上の第1のリンカー分子と接触させて、1以上の核酸マーカーと1以上の第1のリンカー分子との複合体を形成させるステップ;
(b)ステップ(a)の複合体を1以上の検出抗体と接触させて、1以上の検出抗体と、1以上の核酸マーカーと、1以上の第1のリンカー分子との複合体を形成させるステップ;及び
(c)ステップ(b)の複合体を、第1のリンカー分子と結合するように適合された1以上の第2のリンカー分子と接触させて、1以上の検出抗体と、1以上の核酸マーカーと、1以上の第1のリンカー分子と、1以上の第2のリンカー分子との複合体を形成させるステップ。
【０１２１】
この方法は、任意に、以下のステップをさらに含むことができる:
(d)ステップ(c)の複合体を、第1のリンカー分子と結合するように適合された1以上のモジュレーターと接触させて、検出抗体、核酸マーカー、及び第2のリンカー分子のための、第1のリンカー分子の非占有結合部位を飽和させて、1以上の検出抗体と、1以上の核酸マーカーと、1以上の第1のリンカー分子と、1以上の第2のリンカー分子と、1以上のモジュレーターとの複合体を形成させるステップ。
【０１２２】
別の実施態様では、本発明は、
(i)Aβペプチド及び/又はpGlu-Aβペプチドと特異的に結合することが可能な1以上の検出抗体;
(ii)あらかじめ決定されたヌクレオチド配列を含む1以上の核酸マーカー;
(iii)検出抗体及び核酸マーカーと結合するように適合させた1以上の第1のリンカー分子;
(iv)第1のリンカー分子と結合するように適合された1以上の核酸オリゴマー(ここでは、1以上の核酸オリゴマーは、核酸マーカーとは異なる2本の相補的な核酸鎖を含む);及び
(v)第1のリンカー分子と結合するように適合された、1以上の有機ポリマー、核酸マーカーとは異なるポリヌクレオチド、及び1以上の核酸オリゴマー、ポリペプチド、又は多糖;
を含む検出複合体の調製のための方法であって、以下のステップを含む前記方法を包含する:
(a)1以上の核酸オリゴマーの1本の核酸鎖を、1以上の第1のリンカー分子と接触させて、1以上の第1のリンカー分子と、1以上の核酸オリゴマーの1本の核酸鎖との第1の検出物を形成させるステップ;
(b)ステップ(a)において使用されたものと相補的な1以上の核酸オリゴマーの核酸鎖を、1以上の第1のリンカー分子と接触させて、1以上の第1のリンカー分子と、ステップ(a)において使用されたものと相補的な1以上の核酸オリゴマーの1本の核酸鎖との第2の検出物を形成させるステップ;
(c)ステップ(a)の検出物を1以上の核酸マーカーと接触させて、1以上の第1のリンカー分子に検出される1以上の核酸オリゴマーの1本の核酸鎖と、1以上の核酸マーカーとの第1の複合体を形成させるステップ;
(d)ステップ(b)の検出を1以上の検出抗体と接触させて、1以上の第1のリンカー分子に検出されるステップ(a)及び(c)において使用されたものと相補的な1以上の核酸オリゴマーの1本の核酸鎖と、1以上の検出抗体との第2の複合体を形成させるステップ;
(e)ステップ(c)の第1の複合体を、1以上の有機ポリマー、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は多糖と接触させて、1以上の第1のリンカー分子に検出される1以上の核酸オリゴマーの1本の核酸鎖と、1以上の核酸マーカーと、1以上の有機ポリマー、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は多糖との第3の複合体を形成させるステップ;及び
(f)ステップ(d)の第2の複合体を、ステップ(e)の第3の複合体と接触させて、1以上の第1のリンカー分子に検出される1以上の核酸オリゴマーの1本の核酸鎖と、1以上の核酸マーカーと、1以上の有機ポリマー、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は多糖と、1以上の第1のリンカー分子に検出されるステップ(a)及び(c)において使用されたものと相補的な1以上の核酸オリゴマーの1本の核酸鎖と、1以上の検出抗体との複合体検出物を形成させるステップ。
【０１２３】
本発明の一実施態様では、この方法は、ステップ(f)の前に、ステップ(d)及び(e)の複合体を、第1のリンカー分子と結合するように適合させた1以上のモジュレーターと接触させるステップをさらに含むことができる。
【０１２４】
本発明の方法では、検出抗体、核酸マーカー、第1のリンカー分子、第2のリンカー分子、及びモジュレーターは、上で定義した通りであり得る。特に、検出抗体、核酸マーカー、及び第2のリンカー分子と、第1のリンカー分子との結合は、検出抗体、核酸マーカー、及び第2のリンカー分子に結合させる第1のリンカー分子の1以上の結合パートナー(1又は複数)によって容易にすることができる。一実施態様では、これらの結合パートナーは、ビオチン及び/又はビオチン類似体であり、第1のリンカー分子は、ストレプトアビジン、アビジン、又はそのビオチン-結合断片である。
【０１２５】
本発明はまた、本発明の方法によって得ることが可能な検出複合体である。
【０１２６】
別の態様では、本発明はまた、pGlu-Aβペプチドの量の検出又は決定のためのイムノアッセイにおける、本発明による検出複合体の使用を対象とする。前記pGlu-Aβペプチドは、上で定義した通りであり得、検出抗体によって特異的に認識及び結合される。イムノアッセイは、核酸マーカーを増幅するための核酸増幅反応を含むことができる。増幅反応は、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、より好ましくはリアルタイムPCR反応である。
【０１２７】
さらに別の態様では、本発明は、試料中のpGlu-Aβペプチドを検出するための方法を特徴とし、ここでは、この方法は、以下のステップを含む:
(a)前記pGlu-Aβペプチドと特異的に結合することが可能な1以上の検出抗体を含む本発明による検出複合体を、前記試料と接触させて、前記分析物と前記検出複合体;との複合体を形成させるステップ;
b)前記複合体中の1以上の核酸マーカーの存在を特異的に検出するステップであって、1以上の核酸マーカーの存在は、前記試料中のpGlu-Aβペプチドの存在を示す、前記ステップ。
【０１２８】
本発明の一実施態様では、検出ステップ(b)は、PCR反応、好ましくはリアルタイムPCR反応において、1以上の核酸マーカーを増幅させることを含むことができる。
【０１２９】
一実施態様では、pGlu-Aβペプチドの検出は、pGlu-Aβペプチドの量的決定であるpGlu-Aβペプチドの量の決定を含む。
【０１３０】
pGlu-Aβペプチドの検出、及び具体的実施態様では定量化も、鋳型として核酸マーカーを使用するPCR反応において産生された増幅産物の数の、検出、及び任意に定量化によって実現することができる。検出、及び任意に定量化は、検出可能な標識又は好適な色素で標識された核酸プローブを使用することによって実現することができる。
【０１３１】
本発明の一実施態様では、核酸マーカーは、市販品として入手できる機器内で実施されるリアルタイムPCRによって検出される。リアルタイムPCR増幅は、増幅されたPCR生成物に特異的に結合する蛍光標識されたプローブの存在下で実施される。例えば、プライマーと同じぐらいの長さの、蛍光標識に空間的に近接した別の標識によって消失される蛍光部分を含む、二重標識されたプライマーは、増幅産物には組み込まれず、増幅中のプライマーの伸長により、お互いに分離される。
【０１３２】
別の実施態様では、PCR増幅産物/と特異的に結合する、非プライマー検出可能プローブが使用される。このプローブは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を可能にする、5’末端の共有結合されたレポーター色素と、3’-末端の下流クエンチャー色素を含むことができる。PCR産物の量は、増幅反応のあらゆる段階で、最初の鋳型コピー数に比例するので、増幅されたPCR産物の検出は、各増幅サイクル後に実施することができる。鋳型コピー数は、レポーター色素の検出される蛍光を用いて算出することができる。レポーター色素とクエンチャー色素が極めて近いことにより、元々のプローブでは、蛍光は、消失されている。PCR中に、DNAポリメラーゼのヌクレアーゼ活性が、5’-3’方向にプローブを切断し、したがって、レポーター色素をクエンチャー色素から分離する。その時点で、レポーター色素とクエンチャー色素は、もはやお互いに近接していないので、レポーター色素の蛍光は増大する。PCR中、蛍光の増大は測定され、増幅に正比例している。Heidらの文献(1996)、「リアルタイム定量PCR(Real time quantitative PCR)」Genome Research 6(10):986-994を参照されたい。この検出システムは、現在、リアルタイムPCR検出を可能にするTaqMan.RTM PCRシステムとして、Perkin-Elmer社から、市販品として入手可能である。
【０１３３】
代替実施態様では、レポーター色素とクエンチャー色素は、2つの別のプローブ(これらのプローブは、クエンチャー色素がレポーター色素の蛍光シグナルを消失できるのに十分に近い隣接位置で、増幅されたPCR検出分子とハイブリッド形成する)上に位置することができる(Rasmussenらの文献(1998)、「二本鎖DNA特異的結合色素の連続的蛍光モニタリングによる定量PCR(Quantitative PCR by continuous fluorescence monitoring of a double strand DNA specific binding dye)」Biochemica 2:8-15)。先に記載した検出システムと同様に、ポリメラーゼの5’-3’ヌクレアーゼ活性は、1つの色素を、それを含有するプローブから切断し、レポーター色素を、隣接するプローブに位置しているクエンチャー色素から分離し、レポーター色素の消光を妨げる。先に記載した実施態様にあるように、PCR産物の検出は、レポーター色素の蛍光増大の測定による。
【０１３４】
本発明の他の実施態様では、インターカレーター色素(臭化エチジウム)及び検出のために使用される他の二本鎖DNA結合色素(例えば、SYBR green、FMC Bioproducts社)、二重蛍光プローブ(Wittwerらの文献(1977) BioTechniques 22:130-138及びWittwerらの文献(1997) BioTechniques 22:176-181)、並びにパンハンドル(panhandle)蛍光プローブ(すなわち分子ビーコン;Tyagi及びKramerの文献(1996) Nature Biotechnology 14:303-308)などの公知の技術を含めた、他のリアルタイムPCR検出戦略も使用することができる。インターカレーター色素及び二本鎖DNA結合染料は、リアルタイム適用でのPCR産物蓄積の定量化を可能にするが、これらは、特異性の欠如、プライマー二量体の検出、及びいずれかの非特異的な増幅産物に悩まされる。マトリックス及び夾雑DNAの存在を最小限にするために、また、プライマー二量体形成を防止するために、公知の技術を使用する、慎重な試料調製及び操作、並びに慎重なプライマー設計が不可欠である。適切なPCR機器解析ソフトウェア及び融解温度解析は、ある手段が特異性を引き出すことを可能にし(Ririe, K.らの文献(1977) Anal. Biochem. 245:154-160)、また、これらの実施態様と共に使用することができる。
【０１３５】
本発明のさらに別の実施態様では、Scorpions反応は、リアルタイムPCR検出方法として使用される。Scorpionsは、プローブに共有結合されたPCRプライマーを含有する二官能性分子である。プローブ内のフルオロフォアは、蛍光を減じるクエンチャーと相互作用する。PCR反応中、プライマーは、鋳型に結合し、ポリメラーゼによって伸長される。伸長反応がいったん完了すると、変性ステップにおいて、プライマーと鋳型が分離され、伸長したプライマー配列は、次のアニーリングステップにおいて、プローブ配列と分子内で相互作用することができる。プローブの、伸長されたプライマー配列への結合は、プローブが結合したフルオロフォアとクエンチャーとの相互作用を妨げ、これは、反応管からの光出力の増大をもたらす。現在、Scorpionsについては2つの方式、すなわち二分子Scorpion方式と単分子方式が存在する。二分子方式では、クエンチャーは、プローブ配列と相補的な別の核酸分子に結合されるのに対して、単分子方式では、フルオロフォアとクエンチャーの両方が、同じ分子に付着され、クエンチャーをフルオロフォアに近づけるために、組み込み(integral)ステムループ配列が使用される。
【０１３６】
Scorpions技術は、Whitcombeらの文献(1999)、「自己プローブ化増幅産物及び蛍光を使用するPCR産物の検出(Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence)」、Nature Biotech 17, pages 804-807に、より十分に記載されている。この検出システムは、現在、scorpionsシステムとして、DxS社(Manchester, UK)から、市販品として入手可能である。
【０１３７】
増幅反応のためのプライマー、及び核酸プローブの設計は、当技術分野で十分に確立されており、したがって、当業者にとって日常的な業務である。好適な蛍光レポーター色素も、公知でありかつ市販品として入手可能であり、限定はされないが、6-カルボキシ-フルオレセイン(FAM)、テトラクロロ-6-カルボキシ-フルオレセイン(TET)、2,7-ジメトキシ-4,5-ジクロロ-6-カルボキシ-フルオレセイン(JOE)、及びヘキサクロロ-6-カルボキシ-フルオレセイン(HEX)が挙げられる。別の好適なレポーター色素は、6-カルボキシ-テトラメチルローダミン (TAMRA)である。
【０１３８】
別の態様では、本発明は、キット、すなわち、あらかじめ決定された量の試薬と、本発明の検出方法又は診断方法を実施するための説明書とのパッケージ化された組み合わせに関する。こうしたキットは、本発明による、又は本発明の方法に従って製造された、1以上の検出複合体を含む。こうしたキットは、さらなる成分をさらに含有することができる。本発明のキット内にさらに含めることができる成分の例としては、限定はされないが、安定剤、緩衝液(例えば、ブロック緩衝液又は溶解緩衝液)、色素、オリゴヌクレオチドプライマー又はプローブ(これらは、検出可能な標識で任意に標識することができる)などが挙げられる。本発明による検出複合体の成分は、上で定義した通りであり得る。
【０１３９】
さらに、本発明の方法において使用される抗体も、該キット内に提供することができる。
【０１４０】
種々の試薬の相対量は、分析の感度を実質的に最適化する試薬の溶液中の濃度を提供するために、広く変動し得る。具体的には、試薬は、溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液を提供することとなる賦形剤を含む、通常凍結乾燥された乾燥粉末として提供することができる。
【０１４１】
本発明のさらなる態様によれば、本発明による又は本発明の方法に従って製造された検出複合体、少なくとも1種の捕捉抗体、及び使用のための説明書を含む、アルツハイマー病などの神経変性障害を診断するためのキットが提供される。一実施態様では、該キットは、前記pGlu-Aβペプチドのピログルタミン酸保有アミノ末端に特異的に結合する、少なくとも1種の捕捉抗体をさらに含む。
【０１４２】
さらに別の態様では、本発明はまた、1以上の非核酸受容体、1以上の核酸マーカー、1以上の第1のリンカー分子、及び1以上の有機ポリマー、ポリペプチド、多糖、及び/又はオリゴ-又はポリヌクレオチド分子を含む検出複合体を形成するための、1以上の非核酸受容体、1以上の核酸マーカー、及び1以上の第1のリンカー分子を含む検出における追加のリンカー分子としての、1以上の有機ポリマー、ポリペプチド、多糖、及び/又はオリゴ-又はポリヌクレオチド分子(これらはすべて任意にビオチン標識されていてもよい)の使用を対象とする。
【０１４３】
生体試料は、例えばヒトからの、任意の試料であり得る。ある具体例では、該試料は、組織試料、体液試料、又は細胞試料である。一実施態様では、生体試料は、血液、血清、尿、脳脊髄液(CSF)、血漿、リンパ液、唾液、汗、胸水、滑液、涙液、胆汁、及び膵分泌物からなる群から選択される。さらなる実施態様では、生体試料は、血漿である。好ましい実施態様では、生体試料は、CSFである。
【０１４４】
生体試料は、当業者に周知の方式で、患者から得ることができる。具体的には、血液試料は、対象から得ることができ、また、血液試料は、従来の方法によって、血清と血漿に分離することができる。生体試料が得られる対象は、好ましくは、アルツハイマー病に悩まされている疑いがある、アルツハイマー病を発症するリスクがある、及び/又はその他の種類の認知症のリスクがある若しくはその他の種類の認知症を有する対象である。特に、該試料は、軽度認知障害(MCI)を有する及び/又はアルツハイマー病の早期段階である疑いがある対象から得られる。
【０１４５】
本発明はさらに、アルツハイマー病及び軽度認知障害などの神経変性疾患を診断又はモニタリングする方法における、本発明によるpGlu-Aβペプチドの検出のための方法の使用に関する。
【０１４６】
特に、本発明は、対象からの生体試料中のpGlu-Aβペプチドのレベルを決定することを含む、アルツハイマー病及び軽度認知障害などの神経変性疾患を診断又はモニタリングする方法であって、次のステップを含む前記方法を提供する:
i. 本発明によるpGlu-Aβペプチドの検出のための方法を用いて、前記神経変性疾患に悩まされている疑いがある対象からの生体試料中のpGlu-Aβペプチドの第1のレベルを決定するステップ;
ii. pGlu-Aβペプチドの第1のレベルを、健康な対照対象における前記pGlu-Aβペプチドの第２のレベルと比較するステップ;及び
iii. 前記生体試料中の前記pGlu-Aβペプチドのレベルが、健康な対照対象における前記pGlu-Aβペプチドのレベルと比較して増大される場合に、対象を神経変性疾患と診断するステップ。
【０１４７】
さらなる実施態様では、本発明は、アルツハイマー病又は軽度認知障害などの神経変性疾患を有する、該疾患を有する疑いがある、又は該疾患に罹患しやすい対象における治療法の有効性をモニタリングする方法であって、本発明によるpGlu-Aβペプチドの検出のための方法を用いて、対象からの生体試料中のpGlu-Aβペプチドのレベルを決定することを含む前記方法を提供する。
【０１４８】
特定の実施態様では、アルツハイマー病又は軽度認知障害などの神経変性疾患を有する、該疾患を有する疑いがある、又は該疾患に罹患しやすい対象における治療法の有効性を診断する前記方法又は該有効性をモニタリングする前記方法は、ある対象から2回以上採取された生体試料中のpGlu-Aβペプチドのレベルの決定を含む。
【０１４９】
一実施態様では、生体試料は、ある被験対象から2回以上採取されることとなる。さらなる実施態様では、該方法は、ある被験対象から2回以上採取された生体試料中に存在するpGlu-Aβペプチドのレベルを比較することをさらに含む。一実施態様では、該方法は、試験試料中に存在するpGlu-Aβペプチドのレベルを、治療法の開始前に前記対象から採取された1以上の試料(1又は複数)、及び/又は治療法のより早い段階で前記対象から採取された1以上の試料中に存在する量と比較することをさらに含む。一実施態様では、該方法は、pGlu-Aβペプチドのレベルを1以上の対照と比較することをさらに含む。
【０１５０】
さらなる実施態様では、対象における治療法の有効性を診断する前記方法又は該有効性をモニタリングする前記方法は、生体試料の提供者である対象の神経変性疾患の状態が、1以上の心理測定試験で特徴付けられるステップをさらに含む。対象の神経変性疾患の状態の特徴付けのための好適な心理測定試験は、DemTect検査、ミニメンタルステート検査、時計描画検査、ADAS-Cog、Blessed Test、CANTAB、Cognistat、NPI、BEHAVE-AD、CERAD、CSDD、GDS、及び7 Minute Screenから選択される。
【０１５１】
本発明の方法を用いてその有効性をモニタリングすることができる、アルツハイマー病及び/又は軽度認知障害などの神経変性疾患の好適な治療は、N末端が切断されたAβペプチドの、N末端でのpGlu-残基の形成を抑制する治療である。
【０１５２】
これに関して、特に好適な治療は、酵素グルタミニルシクラーゼの阻害剤である。グルタミニルシクラーゼは、グルタミン残基からだけではなくグルタミン酸残基からのペプチドのN末端でのpGluの形成も触媒することが示されている。したがって、グルトミニルシクラーゼ(glutminyl cyclase)は、Aβペプチドの3又は11位でのグルタミン酸残基のpGluへの翻訳後形成の原因である。
【０１５３】
アルツハイマー病及び/又は軽度認知障害などの神経変性疾患の治療のための好適なグルタミニルシクラーゼ阻害剤は、例えば、WO 2005/075436、WO 2008/055945、WO 2008/055947、WO 2008/055950、WO2008/065141、WO 2008/110523、WO 2008/128981、WO 2008/128982、WO 2008/128983、WO 2008/128984、WO 2008/128985、WO 2008/128986、WO 2008/128987、WO 2010/026212、WO 2010/012828、WO 2011/107530、WO 2011/110613、WO 2011/131748、WO 2012/123563、及びWO 2014/140279に開示されている。
【０１５４】
アルツハイマー病及び/又は軽度認知障害などの神経変性疾患のさらなる好適な治療は、抗体、好ましくはベータ-アミロイド抗体、より好ましくはpGlu-Aβペプチドを特異的に認識する抗体である。好適なpGlu-Aβ抗体は、例えば、WO 2010/009987、WO 2012/123562、US 7 122 374 81、WO 2011/151076、WO 2012/021469; WO 2012/136552、及びWO 2010/129276に開示されている。
【０１５５】
好ましい実施態様では、本発明は、アルツハイマー病及び/又は軽度認知障害などの神経変性疾患の治療における、グルタミニルシクラーゼの阻害剤、及び/又はベータ-アミロイド抗体、最も好ましくはpGlu-Aβペプチドを特異的に認識する抗体の有効性をモニタリングするための方法を提供する。
【０１５６】
本発明の診断方法は、当技術分野で公知の方法に勝るいくつかの利点を有する。すなわち、本発明の方法を使用して、早期段階のアルツハイマー病を検出する、また、アルツハイマー病と他の型の認知症を、疾患発生及び進行の早期段階において識別することができる。ある見込まれる早期段階は、軽度認知障害(MCI)である。現在当技術分野で公知の方法を用いて、早期段階のアルツハイマー病の明確かつ信頼できる診断を行うことは不可能であり、また、特に、アルツハイマー病と他の形態の認知症の発症を、前記早期段階において識別することは不可能である。これは、MCIに悩まされている患者に特に当てはまる。
【０１５７】
対照的に、本発明によって提供される方法は、アルツハイマー病の鑑別診断に適している。特に、本発明は、先に記載した対象のいずれかから得られる生体試料におけるpGlu-Aβペプチドのレベルを、非常に高感度かつ再現性のある方式で検出することができる診断方法を提供する。本発明の方法の高い感度は、本発明の検出複合体、pGlu-Aβペプチドの検出に対して高度に特異的である抗体;及びpGlu-Aβペプチドの検出及び/又は定量化のための免疫-PCR方法を使用することによって実現される。本発明の方法を用いて、血漿又はCSFなどの生体試料中の痕跡量又は非常に少量の、すなわち4.2fg/mlに至るまでのpGlu-Aβペプチドを検出することが初めて可能になった。本発明は、非常に高感度であり、pGlu-Aβペプチドが試料中にモノマーとして存在するか、オリゴマーで存在するか、又はタンパク質に結合して存在するかどうかとは無関係である、pGlu-Aβペプチドの検出のための方法を提供する。これは、アルツハイマー病に既に接近している、又はアルツハイマー病の発症の前の、生体試料中のpGlu-Aβペプチドの存在を検出することが、特別に可能である。
【０１５８】
本発明の方法は、pGlu-Aβペプチド、特に配列番号:26〜37の、好ましくは配列番号:26〜31の、一層好ましくは配列番号:32〜37のペプチド;又はその断片若しくは機能性バリアントを、非常に高感度の方式で検出及び定量化することを初めて可能にする。特に、本発明は、特に疾患の早期段階における、アルツハイマー病の鑑別診断に適している、血漿又はCSFなどの生体液中のバイオマーカーとしてのpGlu-Aβペプチドを提供する。
【０１５９】
したがって、一実施態様では、本発明は、アルツハイマー病の診断、例えばアルツハイマー病の鑑別診断のための、特に疾患の早期段階における、pGlu-Aβペプチドを決定する方法の使用を対象とする。好適には、アルツハイマー病の早期段階は、軽度認知障害である。
【０１６０】
さらなる実施態様では、本発明は、アルツハイマー病の診断、例えばアルツハイマー病の鑑別診断のための、特に疾患の早期段階における、pGlu-Aβペプチドの使用を対象とする。好適には、アルツハイマー病の早期段階は、軽度認知障害である。
【０１６１】
特に、アルツハイマー病の診断のために使用されるべきであるpGlu-Aβペプチドが、本発明の方法を用いて検出及び定量化される。
【０１６２】
生体材料の寄託
モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞株5-5-6、6-1-6、17-4-3、及び24-2-3は、ブダペスト条約に従って寄託されており、Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen社(ドイツ微生物細胞培養コレクション(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)), DSMZ, Inhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig, Germanyで入手可能である。寄託日は、2008年6月17日であり、それぞれの寄託番号は、以下である:
(クローン5-5-6):DSM ACC2923
(クローン6-1-6):DSM ACC2924
(クローン17-4-3):DSM ACC2925
(クローン24-2-3):DSM ACC2926。
【０１６３】
モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞株13-11-6は、ブダペスト条約に従って寄託されており、Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen社(ドイツ微生物細胞培養コレクション(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)), DSMZ, Inhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig, Germanyで入手可能である。寄託日は、2010年12月14日であり、寄託番号は、以下である:
(クローン13-11-6):DSM ACC 3100。
【０１６４】
本発明を、次の実施例によってさらに説明するが、これは、いかなる形でも決して本発明を限定するものとみなされるべきではなく、本発明は、本明細書とともに添付される特許請求の範囲によってのみ、その範囲が定義される。
【実施例】
【０１６５】
(本発明の実施例)
(実施例1:pGlu-Aβペプチドの非常に高感度の検出)
マイクロプレートモジュール(Chimera biotec社 C-001)を、5μg/ml(コーティング緩衝液(Chimera biotec社 C-010)中)の濃度の30μl/ウェル捕捉抗体(クローン6、17、又は24、probiodrug社)でコーティングした。コーティングは、4℃で一晩実施した。続いて、コーティングされたモジュールを、洗浄緩衝液A(Chimera biotec社、C-011)で洗浄した。洗浄ステップはすべて、洗浄緩衝液の製造業者の説明書に従って実施した。洗浄したモジュールを、様々な濃度レベルの、試料希釈緩衝液(SDB-9100、Chimera biotec社)で1+9希釈したpGlu-Aβ(3-40)又は(3-42)(Probiodrug社)を添加した人工CSF(Chimera biotec社)からなる30μl/ウェルの試料材料と共にインキュベートした。インキュベーションは、室温で45分間実施し、それに、洗浄緩衝液B(Chimera biotec社、C-012)での洗浄ステップが続いた。続いて、ウェルを、0.2μg/mlの濃度(抗体希釈緩衝液(SDB-6000、Chimera biotec社)中)の30μl/ウェルのビオチン標識された検出抗体(クローン17又はクローン24、Probiodrug社)と共にインキュベートした。インキュベーションは、室温で45分間実施し、それに、洗浄緩衝液Bでの洗浄ステップが続いた。続いて、ウェルを、DNA-マーカー(Chimera biotec社)を含有する30μl/ウェルのCHI-BIOビオチン結合検出コンジュゲート(コンジュゲート希釈緩衝液(CDB-b、Chimera biotec社)での1:200希釈で適用)と共に、室温で30分間インキュベートした。緩衝液B及び緩衝液Aでの最終の洗浄ステップ後、各ウェルに、DNA-マーカーに対応する30μl/ウェルのPCR-マスターミックス(Chimera biotec社、C-022)(CHI-BIO中)を添加する。マイクロプレートを、PCRホイル(Chimera biotec社、C-069)で密封し、Imperacer(登録商標)ワークステーション(Chimera biotec社 25-002)の適用によって、製造業者の説明書に従って、DNA増幅及びデータ読み取りを実施する。
【０１６６】
(結果)
表1:捕捉抗体クローン17又はクローン24を用いるpGlu-Aβ(3-40)の定量化
【表１】
2018501482.tif 000004
表2:捕捉抗体クローン6を用いるpGlu-Aβ(3-42)の定量化
【表２】
2018501482.tif 000005
【０１６７】
(実施例2:生体試料中のpGlu-Aβペプチドの検出のための抗体-DNA検出複合体の適用)
マイクロプレートモジュール(Chimera biotec社 C-001)を、5μg/ml(コーティング緩衝液 (Chimera biotec社 C-010)中)の濃度の30μl/ウェル捕捉抗体(クローン24、Probiodrug社)でコーティングした。コーティングは、4℃で一晩実施した。続いて、コーティングされたモジュールを、洗浄緩衝液A(Chimera biotec社、C-011)で洗浄した。洗浄ステップはすべて、洗浄緩衝液の製造業者の説明書に従って実施した。洗浄したモジュールを、参照標準としての様々な濃度レベルのpGlu-Aβ(40及び42の1+1混合物、Probiodrug社)を添加した人工CSF(Chimera biotec社)、及び分析のための個々のCSFからなる30μl/ウェルの試料材料と共にインキュベートした。この試料材料を、μg/ml以下(人工CSF(Chimera biotec社)中)の抗体-DNA検出複合体(CHI-pGlu、Chimera biotec社、クローン17-24(Probiodrug社)から合成)と、1+0.03(試料1部+試薬0.03部)で、さらに混合した。捕捉コーティングされたモジュール上でのインキュベーションの前に、試料及び検出複合体の予備インキュベーションを、バイアル中で4℃で一晩実施し、それに続いて、捕捉コーティングされたウェル上でのインキュベーションを、それぞれ、室温で60分間実施した。緩衝液B及び緩衝液Aでの最終の洗浄ステップ後、各ウェルに、DNA-マーカーに対応する30μl/ウェルのPCR-マスターミックス(Chimera biotec社、C-022)(CHI-BIO中)を添加する。マイクロプレートを、PCRホイル(Chimera biotec社、C-069)で密封し、Imperacer(登録商標)ワークステーション(Chimera biotec社 25-002)の適用によって、製造業者の説明書に従って、DNA増幅及びデータ読み取りを実施する。
【０１６８】
(結果:)
表3:標準
【表３】
2018501482.tif 000006
【０１６９】
表4:個別
【表４】
2018501482.tif 000007
【０１７０】
(実施例4:pan特異的抗-β-アミロイド抗体を用いるpGlu3-Aβペプチドの検出)
次の修飾を用いて、実施例3の分析プロトコルを繰り返した。
a)pan特異的抗体6E10、BAM90.1(エピトープaa 13-28)、又は12F4(Aβ42 C-末端に特異的)を、検出抗体-DNA-コンジュゲート(ADC)における検出抗体として使用した;かつ
b)pGlu3-Aβペプチド特異的モノクローナル抗体クローン6-1-6、クローン17-4-3、又はクローン24-2-3を、マイクロプレートモジュールをコーティングするための捕捉抗体として使用した。
【０１７１】
抗体-DNA-コンジュゲート(ADC)の調製、及びpGlu3-Aβ40及びpGlu3-Aβ42の検出を、実施例1、2、及び3に記載した通りに実施した。
【０１７２】
300pg/mlのpGlu3-Aβ40及びpGlu3-Aβ42ペプチドを、分析されるCSF試料中で検出した。検出抗体としての抗体クローン6E10は、捕捉抗体としてのpGlu3-Aβペプチド特異的モノクローナル抗体クローン6-1-6又はクローン24-2-3と共に、最良の性能を示した(図1参照)。
【０１７３】
(実施例4:pGlu-Aβペプチドの検出のための抗体-DNA検出複合体の調製)
169bp ビス-ビオチン標識されたDNA(DNA-マーカー「1」(配列番号:60); 63.3.pmol)の30μlの2.11pmol/ml溶液を、組換えSTV(ストレプトアビジン、IBA社)の3.24μlの19.5pmol/μl溶液と共に室温で30分間インキュベートして、STV-DNAコンジュゲート(「SDC」)を形成させた。30μlのこのSDCを、クローン6、17、及び24から選択されたビオチン標識された抗pGlu3-Aβ検出抗体の30μlの500μg/ml溶液と混合し、室温/旋回(orbital)振盪で60分間インキュベートした。抗体-DNA-STVコンジュゲートを、FPLC(Superdex 200)によって精製し、10.5pmol/ml検出抗体-DNA-コンジュゲート(「ADC」)の最終溶液のために、1mlの生成物画分を、2ml NaCl溶液(300mM)と混合した((Niemeyerらの文献、(1999). Nucleic Acids Res 27(23):4553-61を参照のこと)。
【０１７４】
(実施例5:pGlu-Aβ分析の検証)
配列番号:28及び30のpGlu3-Aβ(40/42)の濃縮物を含む標準曲線及び品質管理(QC)試料を、表5に従って調製及び評価した。「低系列」は、4.2fg/mlから9pg/mlまでの(人工ヒトCFS中)範囲内のpGlu3-Aβ(40/42) 配列番号:28及び30を含有していた。「高系列」は、78fg/mlから27pg/mlまでの(人工ヒトCFS中)範囲内のpGlu3-Aβ(40/42) 配列番号:28及び30を含有していた。
【０１７５】
人工ヒトCSFは、以下からなる:
NaCl: 125mM
KCl: 2.5mM
MgCl×6H2O: 1mM
NaH2PO4: 1.25mM
CaCl2×2H2O: 2.0mM
NaHCO3: 25mM
グルコース: 25mM
pHはNaOHで7.3に調整した
ヒト血清アルブミン: 0.3g/l
【０１７６】
配列番号:28及び30のpGlu3-Aβ(40/42)の検出は、実施例3に記載した通りに実施した。
【０１７７】
標準及びQCの、異なる系列(「高」及び「低」)に対する精度(変動係数(%))及び正確度(相対誤差(%))についての受け入れ基準は、定量下限(LLOQ)について<20%及び定量上限(ULOQ)について<25%であった。
【０１７８】
図2は、高濃度及び低濃度の標準についての回収プロットを示す。図2から、開発された該方法が、検量線の広い線形範囲にわたる、高い精度及び正確度でのpGlu-Aβペプチドの検出及び定量化を可能にすることがわかる。この方法は、非常に高感度であり、4.2fg/mlに至るまでのpGlu-Aβペプチドの定量化を可能にする。
【０１７９】
表5:分析間平均:「高い」及び「低い」標準及びQCに対する精度(変動係数(%))及び正確度(相対誤差(%))
【表５】
2018501482.tif 000008
【０１８０】
(実施例5:CSF試料中のpGlu3-Aβ40(配列番号:28)及びpGlu3-Aβ42(配列番号:30)の決定)
CSF試料は、ADと臨床診断された患者、及び健康な対照から、標準の手順に従って入手した。
【０１８１】
標準曲線及び品質管理試料(QC)を、実施例5に記載した通りに作製及び使用した。CSF試料及びQCに対する、精度(変動係数(%))及び正確度(相対誤差(%))についての受け入れ基準は、定量下限(LLOQ)について<20%及び定量上限(ULOQ)について<25%であった。個々のCSF試料(表6中の試料#を参照のこと)を、実施例3に記載した通りに測定した。pGlu3-Aβ濃度を、標準曲線に基づいて算出した。
【０１８２】
表6は、pGlu3-Aβ40(配列番号:28)及びpGlu3-Aβ42(配列番号:30)の定量化の結果を示す。pGlu-Aβ濃度に対する値は、pGlu3-Aβ40(配列番号:28)とpGlu3-Aβ42(配列番号:30)の合計パラメータとしての濃度に相当する。
【０１８３】
表6:分析された試料の濃度(pGlu3-Aβ40(配列番号:28)及びpGlu3-Aβ42(配列番号:30)(pg/ml))及び精度(変動係数(%))
【表６】
2018501482.tif 000009
【０１８４】
精度(変動係数(%))は、バイオマーカーについての受け入れ判断基準として使用される。バイオマーカーについての受け入れまでの精度閾値は、<30%の変動係数(%)である。表6の結果は、すべての測定における精度(変動係数(%))が<30%であり、したがってバイオマーカーについての精度受け入れ判断基準を満たしていたことを示す。
【０１８５】
(実施例7:神経変性疾患を患う対象の特定のための心理測定試験)
(7.1 材料及び方法)
(7.1.1 患者及び健康な対照)
ADと臨床診断された患者及び健康な対照を、CROを介して採用した。研究前の検査では、研究の参加者全員の神経心理学的機能を、いくつかの心理測定試験(DemTect、ミニメンタルステート検査、時計描画検査)によって試験した。
【０１８６】
(DemTect検査)
DemTectスケールは、5つの短い下位検査(10単語のリストの反復、数字の変換、意味的単語の流暢性課題、逆方向数唱、単語リストの遅延再生)を含む、認知症についての簡易スクリーニングである(Kesslerらの文献, 2000)。素点を変換して年齢及び教育に依存しない得点を出し、「認知症が疑われる」(≦8点)、「軽度認知障害」(9〜12点)、及び「年齢相応」(13〜18点)に分類する。
【０１８７】
(MMSE)
ミニメンタルステート検査(MMSE)又はFolstein検査は、認知を評価するために用いられる30点の簡易アンケートテストである(表4参照)。これは、認知症についてスクリーニングするために、医学分野で一般に用いられる。これは、約10分という期間で、計算、記憶、及び見当識を含めた様々な機能を試験する。これは、Folsteinらの文献, 1975によって導入され、少しの修正を伴って広く使用されている。
【０１８８】
MMSEには、以下のいくつかの領域の簡単な質問及び問題が含まれる:検査の時間及び場所、単語リストの反復、計算、言語使用及び理解、並びに基本的な運動能力。例えば、ある質問では、2つの5角形の図を書き写すことが求められる(次表参照)。(30点中)27点以上の得点はいずれも、事実上正常である。これよりも低い、20〜26点は軽度の認知症を示し、10〜19点は中等度の認知症を示し、10点未満は重度の認知症を示す。正常値も、教育の程度及び年齢について補正される。低いないし非常に低い得点は、認知症の存在と密接に相関するが、他の精神障害も、MMST検査で異常所見をもたらす可能性がある。
【０１８９】
(時計描画検査)
時計の採点は、Shulmannらの文献, 1986によって使用された尺度の改変に基づいていた。円はすべて、あらかじめ描かれており、対象への指示は、「11時10分に合わせる」ことであった。採点システム(表5参照)の範囲は1点〜6点であり、より高い得点は、より多くの数の間違いと、より多くの障害を反映する。この採点システムは、経験的に導かれ、臨床診療に基づいて修正される。必然的に、このシステムには個々の判断に任される余地がかなり残されるが、高水準の評価者間信頼度を有するのに十分に簡易である。本発明者らの研究は、3つの主要な要素の分析に役立つ。これらには、時計描画検査と、認知機能の他の尺度との横断的比較;時計描画検査の時間に伴う長期的な説明、及び時計描画検査の悪化と入院決定との関係性が含まれる。
【０１９０】
表7:ミニメンタルステート検査
【表７】
2018501482.tif 000010
【０１９１】
表8:時計描画検査
【表８】
2018501482.tif 000011
【０１９２】
研究前の検査後、2週間後に、すべての参加者からの採血から、研究を開始した。すべての参加者は、1年間にわたり3ケ月間隔でセンターを訪れ、心理測定試験及び血液試料採取を行った。この研究は、「Arztekammer Sachsen-Anhalt」の倫理委員会によって認可されている。すべての患者(又はその近親者)及び対照者から、この研究の参加についてインフォームドコンセントを得た。
【０１９３】
(6.1.2 生体試料)
ヒトにおけるpGlu-Aβ濃度の分析のために、次の体液のすべてを使用することができる:血液、脳脊髄液、尿、リンパ液、唾液、汗、胸水、滑液、房水、涙液、胆汁、及び膵分泌物。
【０１９４】
CSF試料を用いる新規の方法が確立され、これをさらに、血液、脳抽出物、及び尿試料、それに続いて他のすべてのヒト体液に使用することができる。
【０１９５】
ADバイオマーカーの決定のためのCSF試料を、以下の3本のポリプロピレンチューブに収集した:
1. EDTA血漿用のカリウム-EDTAを含有するもの(Sarstedt Monovette, 02.1066.001)
2. ヘパリン血漿用のLi-ヘパリンを含有するもの(Sartstedt Monovette, 02.1065.001)
3. 血清用のブランク(Sarstedt Monovette, 02.1063.001)。
【０１９６】
試料はすべて、静脈穿刺によって、又は挿入された前腕静脈留置カニューレからの反復採血によって収集した。血液は、(先の第1.1章に記載した通りの)時間スケジュールに従って収集した。これを1550g(3000rpm)にて4℃で10分間遠心分離して、血漿を提供した。血漿又は血清をピペットで除去し、1本の5mlポリプロピレンクライオチューブ(Carl-Roth社、E295.1)に充填し、-80℃で凍結保存した。試料は、採血後1時間以内に遠心分離した。研究プロトコルに従う血漿又は血清のチューブの適切なラベル付けは、CROの役割であった。
【０１９７】
(7.2 結果)
(7.2.1 人口統計学的特徴)
全45名、すなわち30名の健康な対照と15名のAD患者が、この研究に参加していた。血漿Aβに対する年齢の影響の可能性を観察するために、幅広い年齢にわたる対照人物を選択し、3群、すなわち第I群: 18から30歳が含まれる、第II群:31から45歳、及び第III群: 46から65歳に亜分類した。人口統計学的特徴を、表9に示す。
【０１９８】
表9:人口統計学的特徴
【表９】
2018501482.tif 000012
【０１９９】
(2.2 心理測定試験)
参加者全員の神経心理学的機能の評価のために、DemTect、ミニメンタルステート検査、及び時計描画検査を実施した。これらの検査は、研究前、研究開始の3ケ月、6ケ月、9ケ月、及び12ケ月後に行われた。
【０２００】
(DemTect検査)
素点を変換して年齢及び教育に依存しない得点を出し、「認知症が疑われる」(≦8点)、「軽度認知障害」(9〜12点)、及び「年齢相応」(13〜18点)に分類する。すべての来診についての検査結果を、図3に示す。図3による結果は、健康な対象の3つの群と、患者との間に明確な差が存在することを示す。
【０２０１】
(ミニメンタルステート検査)
(30点中)27点以上の得点はいずれも、事実上正常である。これよりも低い、20〜26点は軽度の認知症を示し、10〜19点は中等度の認知症を示し、10点未満は重度の認知症を示す。正常値も、教育の程度及び年齢について補正される。低いないし非常に低い得点は、認知症の存在と密接に相関するが、他の精神障害も、MMST検査で異常所見をもたらす可能性がある。検査結果を、図4に示す。図4による結果は、健康な対象の3つの群と、患者との間に明確な差が存在することを示す。
【０２０２】
(時計描画検査)
採点システムの範囲は1点〜6点であり、より高い得点は、より多くの数の間違いと、より多くの障害を反映する。この採点システムは、経験的に導かれ、臨床診療に基づいて修正される。必然的に、このシステムには個々の判断に任される余地がかなり残されるが、高水準の評価者間信頼度を有するのに十分に簡易である。
【０２０３】
本発明者らの研究は、3つの主要な要素の分析に役立つ。これらには、時計描画検査と、認知機能の他の尺度との横断的比較;時計描画検査の時間に伴う長期的な説明、及び時計描画検査の悪化と入院決定との関係性が含まれる。検査結果を、図5に示す。図5による結果は、健康な対象の3つの群と、患者との間に明確な差が存在することを示す。
【０２０４】
(参考文献)
【化２】
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2018501482.tif 000027
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年9月6日(2017.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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