(57)【要約】本明細書の開示によって、必要に応じてＨ２の存在下で、ＣＯ及び／もしくはＣＯ２ガスを生物学的に利用するか、またはメチオニンに変換し得る改変された水素資化微生物を使用するための組成物及び方法が提供される。本開示の親または出発の水素資化微生物は、野生型（天然）株、変異（非天然）株（例えば、増殖速度の増大、調節解除または抑制解除された生合成酵素）または組換え株であり得、これらはそれぞれ、親水素資化微生物よりも高レベルでメチオニンを産生するようにさらに改変されてもよい。特定の実施形態では、水素資化生物は、メタン生成古細菌であってもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非自然の遺伝子操作型の水素資化微生物であって、ここで前記遺伝子操作型の水素資化微生物は、ＣＯｘ基質を、必要に応じて、Ｈ２の存在下で代謝して、親の水素資化微生物よりも高レベルでメチオニンを生成し、ここで前記遺伝子操作型の水素資化微生物は、遺伝子的に操作された内因性ポリペプチドを発現し、前記ポリペプチドは以下：
（ａ）配列番号４及び８のうちの少なくとも１つに示されるアミノ酸配列を有する遺伝子的に操作されたポリペプチド；
（ｂ）配列番号４及び８のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列を有する遺伝子的に操作されたポリペプチドであって、ここで前記遺伝子操作型のポリペプチドが、１つ以上のフィードバック阻害因子について調節解除される、前記ポリペプチド；
（ｃ）配列番号２及び６のうちの少なくとも１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を含む核酸分子によってコードされる遺伝子的に操作されたポリペプチドであって、ここで前記遺伝子操作型のポリペプチドが、１つ以上のフィードバック阻害因子について調節解除される、前記ポリペプチド；
または
（ｄ）配列番号２及び６の全長相補体に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる遺伝子的に操作されたポリペプチドであって、ここで前記遺伝子操作型のポリペプチドが、１つ以上のフィードバック阻害因子について調節解除される、前記ポリペプチド
、を含む、前記非自然の遺伝子操作型の水素資化微生物。
【請求項２】
前記遺伝子操作型のポリペプチドが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２  ＤＳＭ１４２６６のＭＭＰ１３５９のホモログまたはオーソログである、請求項１に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項３】
前記ホモログまたはオーソログが、残基Ｄ４３９で変異を含み、ここで前記残基のナンバリングが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２  ＤＳＭ１４２６６由来のＭＭＰ１３５９の残基位置に相当する、請求項２に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項４】
前記変異が、Ｄ４３９Ｎ置換であり、かつ前記残基ナンバリングがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２  ＤＳＭ１  ４２６６由来のＭＭＰ１３５９の残基位置に相当する、請求項２または３に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項５】
前記遺伝子操作型のポリペプチドが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２  ＤＳＭ１４２６６のＭＭＰ１３５８のホモログまたはオーソログである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項６】
前記ホモログまたはオーソログが、残基Ｇ１１４で変異を含み、かつ前記残基のナンバリングが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２  ＤＳＭ１４２６６由来のＭＭＰ１３５８の残基位置に相当する、請求項５に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項７】
前記変異が、Ｇ１１４Ｅ置換であり、かつ前記残基のナンバリングが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２  ＤＳＭ１４２６６由来のＭＭＰ１３５８の残基位置に相当する、請求項５または６に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項８】
前記非自然の水素資化微生物がさらに、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性、メチオニンシンターゼ、またはその両方を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項９】
前記調節解除されたアスパルトキナーゼ活性が、内因性アスパルトキナーゼ、外因性アスパルトキナーゼ、またはその両方である、請求項８に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項１０】
前記調節解除されたアスパルトキナーゼ活性が、リシン、トレオニン、またはメチオニンのうちの１つ以上によるフィードバック阻害に対して耐性であるアスパルトキナーゼ変異体である、請求項８または９のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項１１】
前記調節解除されたアスパルトキナーゼ活性が、変異体ｔｈｒＡ遺伝子、ｍｅｔＬ遺伝子、ｌｙｓＣ遺伝子またはそれらの組み合わせによってコードされ、各々が、自然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異、またはそれらの任意の組み合わせを含んでいる、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項１２】
前記調節解除されたアスパルトキナーゼ活性が、トレオニン結合部位で変異を含んでいる変異体ｌｙｓＣ遺伝子によってコードされる、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項１３】
前記トレオニン結合部位の変異が、残基Ｉ２７２、Ｄ２７４、Ｇ２７７、Ｅ２７８、Ａ２７９、Ｄ２９４、Ｑ２９８、Ｎ３７２、Ｎ３７４、Ｉ３７５、またはそれらの任意の組み合わせであり、ここで前記残基のナンバリングが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２のｌｙｓＣによってコードされる残基位置に相当する、請求項１２に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項１４】
前記調節解除されたアスパルトキナーゼ活性が、リシン結合部位で変異を含んでいる変異体ｌｙｓＣ遺伝子によってコードされる、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項１５】
前記リシン結合部位の変異が、残基Ｉ２９１、Ｉ２９３、Ｄ２９４、Ｔ３６１、Ｓ３８１、Ｅ３８２またはそれらの任意の組み合わせであり、ここで前記残基のナンバリングが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２のｌｙｓＣによってコードされる残基位置に相当する、請求項１４に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項１６】
前記調節解除された内因性のアスパルトキナーゼ活性が、リシン及びトレオニン結合部位で変異を含んでいる変異体ｌｙｓＣ遺伝子によってコードされる、請求項８〜１５のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項１７】
前記リシン及びトレオニン結合部位の変異が、残基Ｄ２９４であり、ここで前記残基のナンバリングが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２のｌｙｓＣによってコードされる残基位置に相当する、請求項１６に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項１８】
前記調節解除されたアスパルトキナーゼ活性が、リシンまたはトレオニン結合部位以外の部位で変異を含んでいる変異体ｌｙｓＣ遺伝子によってコードされる、請求項８〜１７のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項１９】
前記リシン及びトレオニン結合部位以外の部位での変異が、残基Ｆ２８３、Ｎ２９９、Ｓ３０１、Ｓ３０２、Ｔ３０８、Ｔ３１１、Ｔ３３６、Ｇ３５９、Ｆ３６４、Ｍ３６５、Ｔ３８０、Ｒ３８４、Ｓ３８６、またはそれらの任意の組み合わせであり、ここで前記残基のナンバリングが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２のｌｙｓＣによってコードされる残基位置に相当する、請求項１８に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項２０】
前記非自然の水素資化微生物がさらに、メチオニン生合成経路由来の１つ以上のポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項２１】
メチオニン生合成経路由来の１つ以上のポリペプチドが、アスパルトキナーゼ、アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンＯ−トランススクシニルトランスフェラーゼ、Ｏ−スクシニルホモセリンリアーゼ、シスタチオニンγ−シンターゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼ（コバラミン依存性または非依存性）、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項２０に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項２２】
前記外因性核酸分子が、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼもしくはその両方をコードするか、または外因性核酸分子がホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、もしくはその両方をコードする、請求項２０に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項２３】
前記ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、もしくはその両方が、過剰発現されるか、またはホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、もしくはその両方が過剰発現される、請求項２２に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項２４】
前記ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、もしくはその両方が調節解除されるか、または前記ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼもしくはその両方が調節解除される、請求項２２または２３のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項２５】
前記外因性核酸分子がメチオニンシンターゼをコードする、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項２６】
前記メチオニンシンターゼが、メチオニンシンターゼをコードする外因性核酸分子を欠いている親の水素資化微生物と比較して過剰発現される、請求項２５に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項２７】
リシン生合成経路由来のポリペプチドをコードする１つ以上の核酸分子がノックアウトされるか、または活性が低下している、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項２８】
トレオニン生合成経路由来のポリペプチドをコードする１つ以上の核酸分子が、ノックアウトされるか、または活性が低下している、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項２９】
ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンデヒドラターゼ、トレオニンアルドラーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼもしくはそれらの任意の組み合わせをコードする核酸分子がノックアウトされるか、または活性の低下したジヒドロジピコリン酸シンターゼ変異体、ホモセリンキナーゼ変異体、トレオニンデヒドラターゼ変異体、トレオニンアルドラーゼ変異体、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ変異体、もしくはそれらの任意の組み合わせをコードする、請求項２７または２８のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項３０】
前記外因性核酸分子が、非自然の水素資化微生物のゲノムに組み込まれる、請求項９〜２９のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項３１】
前記外因性核酸分子が、非自然の水素資化微生物における自己複製ベクターである、請求項９〜２９のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項３２】
前記非自然の水素資化微生物が、リシン栄養要求株、トレオニン栄養要求株、グリシン栄養要求株、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項３３】
前記非自然の水素資化微生物が、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性の低下、ピルビン酸キナーゼ活性の増大、またはその両方を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項３４】
前記非自然の水素資化微生物が、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増大、５−メチルテトラヒドロ葉酸コリノイド／鉄硫黄タンパク質メチルトランスフェラーゼ活性の増大、ピルビン酸シンターゼの増大、アセチル−ＣｏＡシンターゼの増大、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性の増大、またはそれらの任意の組み合わせを有する、先行請求項のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項３５】
前記ＣＯｘ基質が、Ｈ２、ＣＯ、及びＣＯ２からなるＨ２／ＣＯｘ基質である、先行請求項のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項３６】
前記ＣＯｘ基質が、合成ガスまたは水性ガスシフトの合成ガスからなる、Ｈ２／ＣＯｘ基質である、先行請求項のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項３７】
前記ＣＯ２対Ｈ２の比が、それぞれ、約１：５０〜約１０：１におよぶ、請求項３５または３６に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項３８】
前記ＣＯ２対Ｈ２の比が、それぞれ、約１：２〜約１：４におよぶ、請求項３５または３６に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項３９】
前記ＣＯの総量が、約１％以下である、請求項３５〜３８のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項４０】
前記水素資化微生物がメタン生成古細菌である、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項４１】
前記メタン生成古細菌が、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｃｕｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｆｏｌｌｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｌａｃｉｎｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｌｏｂｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｌｓｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ、またはＭｅｔｈａｎｏｔｏｒｒｉｓから選択される、請求項４０に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項４２】
前記メタン生成古細菌が、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｙａｎｔｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｆｌｕｖｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｓｐａｎｏｌａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｌｕｓｔｒｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｉｄｉｄｕｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ａｒｂｏｒｉｐｈｉｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｏｌｌｅｙａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｗｏｅｓｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｗｏｌｉｎｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ａｒｖｏｒｙｚａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｆｌｅｘｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｗｏｌｆｅｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｏｃｉａｂｉｌｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｂａｖａｒｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｃｈｉｋｕｏｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｓｕｂｍａｒｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｆｒｉｇｉｄｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｌｉｍｉｎａｔａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｌａｔｔｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｅｎｄｏｓｙｍｂｉｏｓｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｌｉｍｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｐｅｔｒｏｌｅａｒｉｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ  ｂｏｏｎｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｃｏｎｃｉｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｈａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｐｅｌａｇｉｃａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｍｏｂｉｌｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｎｎｉｅｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｏｌｔａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｉｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｖｅｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆｅｒｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、及びＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｕｌｃａｎｉｕｓからなる群より選択される、請求項４０に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項４３】
前記メタン生成古細菌が、シトクロムを生じない、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項４４】
シトクロムを生成しない前記メタン生成古細菌が、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓまたはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｎｎｉｅｌｉｉである、請求項４３に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項４５】
前記メタン生成古細菌がシトクロムを生じる、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項４６】
シトクロムを生成する前記メタン生成古細菌が、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉまたはＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉである、請求項４５に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項４７】
前記非自然の水素資化微生物がメチオニンのエクスポーターを発現するか、または過剰発現する、先行請求項のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項４８】
前記非自然の水素資化微生物がさらに、メチオニンのエクスポーターをコードする外因性核酸分子を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項４９】
前記エクスポーターがｂｒｎＦＥまたはｍｅｔＴ遺伝子である、請求項４７または４８に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項５０】
前記組み換え水素資化微生物であって、ＣＯｘ基質を、必要に応じて、Ｈ２の存在下で代謝して、親の水素資化微生物よりも高レベルのメチオニンを生成し、ここで前記組み換え水素資化微生物が、外因性ポリペプチドを発現し、前記ポリペプチドは以下：
（ａ）配列番号３、４、７及び８のうちの少なくとも１つに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号３、４、７もしくは８のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、ここで前記ポリペプチドが、必要に応じて１つ以上のフィードバック阻害因子について調節解除される、前記ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１、２、５もしくは６のうちの少なくとも１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、ここで前記ポリペプチドが、必要に応じて１つ以上のフィードバック阻害因子について調節解除される、前記ポリペプチド；
または
（ｄ）配列番号１、２、５もしくは６の全長相補体に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、ここで前記ポリペプチドが、必要に応じて１つ以上のフィードバック阻害因子について調節解除される、前記ポリペプチド
、を含む、前記組み換え水素資化微生物。
【請求項５１】
前記ポリペプチドが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２  ＤＳＭ１４２６６由来のＭＭＰ１３５９のホモログまたはオーソログである、請求項５０に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項５２】
前記ホモログまたはオーソログが、残基Ｄ４３９で変異を含み、ここで前記残基のナンバリングが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２  ＤＳＭ１４２６６由来のＭＭＰ１３５９の残基位置に相当する、請求項５１に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項５３】
前記変異が、Ｄ４３９Ｎ置換であり、かつ前記残基のナンバリングが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２  ＤＳＭ１４２６６のＭＭＰ１３５９によってコードされる残基位置に相当する、請求項５１または５２のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項５４】
前記微生物が、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２  ＤＳＭ１４２６６由来のＭＭＰ１３５８のオーソログである遺伝子中に変異を含む、請求項４８〜５１のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項５５】
前記変異が、残基Ｇ１１４であり、かつ前記残基のナンバリングが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２  ＤＳＭ１４２６６のＭＭＰ１３５８によってコードされる残基位置に相当する、請求項５４に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項５６】
前記変異が、Ｇ１１４Ｅ置換であり、かつ前記残基のナンバリングが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２  ＤＳＭ１４２６６のＭＭＰ１３５８によってコードされる残基位置に相当する、請求項５４または５５のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項５７】
請求項５０〜５６のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物であって、ここで前記組み換え水素資化微生物が、遺伝子操作型の調節解除された内因性ポリペプチドを発現し、前記ポリペプチドは以下：
（ａ）配列番号４及び８のうちの少なくとも１つに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号４及び８のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、ここで前記ポリペプチドが、１つ以上のフィードバック阻害因子について調節解除される、前記ポリペプチド；
（ｃ）配列番号２及び６のうちの少なくとも１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、ここで前記ポリペプチドが、１つ以上のフィードバック阻害因子について調節解除される、前記ポリペプチド；
または
（ｄ）配列番号２及び６の相補体に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、ここで前記ポリペプチドが、１つ以上のフィードバック阻害因子について調節解除される、前記ポリペプチド
、を含む、前記組み換え水素資化微生物。
【請求項５８】
前記組み換え水素資化微生物がさらに、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性、メチオニンシンターゼ、またはその両方を含む、請求項５０〜５７のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項５９】
前記微生物が、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性、調節解除された外因性アスパルトキナーゼ活性、またはその両方を発現する、請求項５８に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項６０】
前記調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性が、１つ以上のリシン、トレオニン、及びメチオニンにより、フィードバック阻害に耐性であるアスパルトキナーゼ変異体である、請求項５９に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項６１】
アスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記核酸分子が、調節解除されたアスパルトキナーゼ変異体をコードする、請求項５８〜６０のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項６２】
前記調節解除されたアスパルトキナーゼ変異体が、１つ以上のリシン、トレオニン、及びメチオニンにより、フィードバック阻害に耐性である、請求項６１のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項６３】
前記核酸分子が、アスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドを過剰発現する、請求項５８〜６２のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項６４】
前記外因性、内因性もしくはその両方のアスパルトキナーゼ活性が、個々に変異体ｌｙｓＣ遺伝子によってコードされるか、または外因性アスパルトキナーゼ活性が個々に変異体ｔｈｒＡ遺伝子、ｍｅｔＬ遺伝子、ｌｙｓＣ遺伝子もしくはそれらの組み合わせによってコードされ、各々が自然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異、もしくはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項５８〜６３のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項６５】
前記外因性、内因性またはその両方のアスパルトキナーゼ活性が、個々に、トレオニン結合部位で変異を含んでいる変異体ｌｙｓＣ遺伝子によってコードされる、請求項５８〜６４のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項６６】
前記トレオニン結合部位の変異が、残基Ｉ２７２、Ｄ２７４、Ｇ２７７、Ｅ２７８、Ａ２７９、Ｄ２９４、Ｑ２９８、Ｎ３７２、Ｎ３７４、Ｉ３７５、またはそれらの任意の組み合わせであり、かつ前記残基のナンバリングが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２のｌｙｓＣによってコードされる残基位置に相当する、請求項６５に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項６７】
前記外因性、内因性またはその両方のアスパルトキナーゼ活性が、リシン結合部位で変異を含む変異体ｌｙｓＣ遺伝子によって個々にコードされる、請求項５８〜６４のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項６８】
前記リシン結合部位の変異が、残基Ｉ２９１、Ｉ２９３、Ｄ２９４、Ｔ３６１、Ｓ３８１、Ｅ３８２、またはそれらの任意の組み合わせであり、ここで前記残基のナンバリングが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２のｌｙｓＣによってコードされる残基位置に相当する、請求項６７に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項６９】
前記外因性、内因性またはその両方のアスパルトキナーゼ活性が、リシン及びトレオニン結合部位で変異を含む変異体ｌｙｓＣ遺伝子によって個々にコードされる、請求項５８〜６４のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項７０】
前記リシン及びトレオニン結合部位の変異が、残基Ｄ２９４であり、ここで残基のナンバリングが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２のｌｙｓＣによってコードされる残基位置に相当する、請求項６９に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項７１】
前記外因性、内因性またはその両方のアスパルトキナーゼ活性が、リシンまたはトレオニン結合部位以外の部位での変異を含む変異体ｌｙｓＣ遺伝子によって個々にコードされる、請求項５８〜６４のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項７２】
リシン及びトレオニン結合部位以外の部位の前記変異が、残基Ｆ２８３、Ｎ２９９、Ｓ３０１、Ｓ３０２、Ｔ３０８、Ｔ３１１、Ｔ３３６、Ｇ３５９、Ｆ３６４、Ｍ３６５、Ｔ３８０、Ｒ３８４、Ｓ３８６、またはそれらの任意の組み合わせであり、かつここで前記残基のナンバリングが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２のｌｙｓＣによってコードされる残基位置に相当する、請求項７１に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項７３】
前記組み換え水素資化微生物がさらに、メチオニン生合成経路由来の１つ以上のポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含み、かつ前記組み換え水素資化微生物が、メチオニンを、親の水素資化微生物よりも高レベルで生成する、請求項５０〜７２のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項７４】
メチオニン生合成経路由来の前記１つ以上のコードされたポリペプチドが、アスパルトキナーゼ、アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンＯ−トランススクシニルトランスフェラーゼ、Ｏ−スクシニルホモセリンリアーゼ、シスタチオニンγ−シンターゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼ（コバラミン依存性または非依存性）、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項７３に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項７５】
前記外因性核酸分子が、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼもしくはその両方をコードするか、または前記第２の外因性核酸分子が、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼもしくはその両方をコードする、請求項７３に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項７６】
前記ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、またはその両方をコードする前記外因性核酸分子が、核酸発現制御配列に対して作動可能に連結されている、請求項７５に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項７７】
前記ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、もしくはその両方が、過剰発現されるか、または前記ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼもしくはその両方が過剰発現される、請求項７６に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項７８】
前記ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、もしくはその両方が調節解除されるか、または前記ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼもしくはその両方が調節解除される、請求項７５〜７７のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項７９】
前記外因性核酸分子が、メチオニンシンターゼをコードする、請求項７３〜７８のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項８０】
前記メチオニンシンターゼが、メチオニンシンターゼをコードする外因性の核酸分子を欠いている親の水素資化微生物と比較して過剰発現される、請求項７９に記載の非自然の水素資化微生物。
【請求項８１】
リシン生合成経路由来のポリペプチドをコードする１つ以上の核酸分子がノックアウトされるか、または活性が低下している、請求項５０〜８０のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項８２】
トレオニン生合成経路由来のポリペプチドをコードする１つ以上の核酸分子がノックアウトされるか、または活性が低下している、請求項５０〜８１のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項８３】
ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、トレオニンキナーゼ、トレオニンデヒドラターゼ、トレオニンアルドラーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、またはそれらの任意の組み合わせをコードする核酸分子がノックアウトされるか、または活性の低下したジヒドロジピコリン酸シンターゼ変異体、トレオニンキナーゼ、トレオニンデヒドラターゼ変異体、トレオニンアルドラーゼ変異体、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ変異体、またはそれらの任意の組み合わせをコードする、請求項８１または８２に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項８４】
前記外因性核酸分子が、前記組み換え水素資化微生物のゲノムに組み込まれている、請求項５０〜８３のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項８５】
前記外因性核酸分子が、前記組み換え水素資化微生物中の自己複製ベクター中にある、請求項５０〜８３のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項８６】
前記組み換え水素資化微生物がリシン栄養要求株、トレオニン栄養要求株、もしくはその両方である、請求項５０〜８５のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項８７】
前記組み換え水素資化微生物が、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性の低下、ピルビン酸キナーゼ活性の増大、またはその両方を有する、請求項５０〜８６のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項８８】
前記組み換え水素資化微生物が、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増大、ピルビン酸シンターゼの増大、アセチル−ＣｏＡシンターゼの増大、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性の増大、またはそれらの任意の組み合わせを有する、請求項５０〜８７のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項８９】
前記ＣＯｘ基質がＨ２、ＣＯ、及びＣＯ２からなるＨ２／ＣＯｘ基質である、請求項５０〜８８のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項９０】
前記ＣＯｘ基質が合成ガスまたは水性ガスシフトの合成ガスからなるＨ２／ＣＯｘ基質である、請求項５０〜８９のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項９１】
前記ＣＯ２対Ｈ２の比が、それぞれ、約１：５０〜約１０：１におよぶ、請求項８９または９０のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項９２】
前記ＣＯ２対Ｈ２の比が、それぞれ、約１：２〜約１：４におよぶ、請求項８９または９０のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項９３】
前記ＣＯの総量が、約１％以下である、請求項８９〜９２のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項９４】
前記水素資化微生物がメタン生成古細菌である、請求項５０〜９３のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項９５】
前記メタン生成古細菌が、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｃｕｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｆｏｌｌｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｌａｃｉｎｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｌｏｂｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｌｓｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ、またはＭｅｔｈａｎｏｔｏｒｒｉｓから選択される、請求項９４に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項９６】
前記メタン生成古細菌が、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｙａｎｔｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｆｌｕｖｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｓｐａｎｏｌａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｌｕｓｔｒｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｉｄｉｄｕｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ａｒｂｏｒｉｐｈｉｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｏｌｌｅｙａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｗｏｅｓｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｗｏｌｉｎｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｆｌｅｘｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｗｏｌｆｅｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｏｃｉａｂｉｌｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｂａｖａｒｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｃｈｉｋｕｏｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｓｕｂｍａｒｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｆｒｉｇｉｄｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｌｉｍｉｎａｔａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｌａｔｔｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｅｎｄｏｓｙｍｂｉｏｓｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｌｉｍｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｐｅｔｒｏｌｅａｒｉｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ  ｂｏｏｎｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｃｏｎｃｉｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｈａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｐｅｌａｇｉｃａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｍｏｂｉｌｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｎｎｉｅｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｏｌｔａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｉｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｖｅｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆｅｒｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、及びＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｕｌｃａｎｉｕｓからなる群より選択される、請求項９５に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項９７】
前記メタン生成古細菌が、シトクロムを生じない、請求項９４〜９６のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項９８】
前記シトクロムを生成しないメタン生成古細菌が、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓまたはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｎｎｉｅｌｉｉである、請求項９７に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項９９】
前記メタン生成古細菌がシトクロムを生じる、請求項９４〜９６のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項１００】
前記シトクロムを生成するメタン生成古細菌が、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉまたはＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉである、請求項９９に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項１０１】
前記組み換え水素資化微生物が、メチオニンのエクスポーターを発現するか、または過剰発現する、請求項５０〜１００のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項１０２】
前記組み換え水素資化微生物がさらに、メチオニンのエクスポーターをコードする外因性核酸分子を含む、請求項５２〜１０１のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項１０３】
前記エクスポーターがｂｒｎＦＥまたはｍｅｔＴ遺伝子である、請求項１０１または１０２に記載の組み換え水素資化微生物。
【請求項１０４】
メチオニンを生成するための方法であって、メチオニンを生成するために十分な時間、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物を培養するステップを包含し、ここで、前記非自然の水素資化微生物が：（ａ）親の水素資化微生物と比較した場合活性が増大している１つ以上の硫黄同化ポリペプチドを発現するか；（ｂ）１つ以上の硫黄同化ポリペプチドを過剰発現するか；または（ｃ）１つ以上の硫黄同化ポリペプチドの調節の変化を含み、ここで前記非自然の水素資化微生物が親の水素資化微生物よりも高レベルでメチオニンを生成する、前記方法。
【請求項１０５】
メチオニンまたはメチオニン含有飼料添加物を作製するためのプロセスであって、請求項５０〜１０３のいずれか１項に記載の組み換え、メチオニン排出性水素資化微生物を、硫黄同化ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下でかつそれに十分な時間、Ｈ２／ＣＯｘ基質の存在下で培養するステップを包含し、ここでメチオニンが、親の水素資化微生物によって生成される前記メチオニンよりも高レベルで生成されて前記培養培地中で蓄積する、前記プロセス。
【請求項１０６】
メチオニンを生成するためのシステムであって：
（ａ）必要に応じてＨ２の存在下において、ＣＯｘ基質を含むガスの供給源と、
（ｂ）硫黄同化ポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含む、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の非自然の水素資化微生物を含むバイオリアクターと；
（ｃ）前記バイオリアクターへのガスの流れを可能にするための、前記ガス供給源と前記バイオリアクターとの間に配置されるコネクターと；
を備え、
ここで、前記非自然の水素資化微生物が、前記Ｈ２／ＣＯｘ基質を代謝して、親の水素資化微生物と比較した場合メチオニンを過剰発現する、前記システム。
【請求項１０７】
メチオニンを生成するためのシステムであって：
（ａ）必要に応じてＨ２の存在下において、ＣＯｘ基質を含むガスの供給源と、
（ｂ）硫黄同化ポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含む、請求項５０〜１０３のいずれか１項に記載の組み換え水素資化微生物を含むバイオリアクターと；
（ｃ）前記バイオリアクターへのガスの流れを可能にするための、前記ガス供給源と前記バイオリアクターとの間に配置されるコネクターと；
を備え、
ここで、前記非自然の水素資化微生物が、前記ＣＯｘ基質を、必要に応じてＨ２の存在下で代謝して、親の水素資化微生物と比較した場合メチオニンを過剰発現する、前記システム。
【請求項１０８】
前記バイオリアクターが、液相、バブルカラム、またはトリクルベッドバイオリアクターである、請求項１０６または１０７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１０９】
前記ＣＯｘ基質が、合成ガスまたは水性ガスシフトの合成ガスからなるＨ２／ＣＯｘ基質である、請求項１０６または１０７のいずれか１項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（配列表に関する声明）
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、それによって明細書中に参照によって援用される。配列表を含むテキストファイルの名称は、９１０２１５＿４０７ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔ．である。テキストファイルは、３０．５ＫＢであって、２０１６年５月６日に創出され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電気的に提出されている。
【背景技術】
【０００２】
メチオニンは、硫黄含有の必須アミノ酸であって、食品及び医療産業において種々の適用で利用される。例えば、メチオニンは動物のエサ及び食物の添加物として、ならびに多くの医薬における成分として用いられる。従って、メニオニンには産業上の需要が高い。
【０００３】
この高い需要を満たすために、メチオニンは、メチルメルカプタン、プロピレン及びシアン化水素などの取り扱い困難な原料を含む複雑な化学合成を介して合成的に製造された。メチオニンの合成的な産生には苛酷な産生環境を必要とするか、または環境的に有害な副産物を生じる。
【０００４】
高コストの出発材料及び合成産生の環境への影響のせいで、発酵によるメチオニンの製造方法が好ましい。しかし、メチオニン中の硫黄原子の存在により、効率的なメチオニンの発酵による生成は複雑になっている。さらに、現在の発酵方法は、出発炭素源として糖及び炭水化物を利用する。炭水化物の使用は、一貫産生と環境問題のための信頼できる原料を見つけることによって複雑になる。一例として、多くの炭水化物廃棄物源（例えば、残留作物バイオマス）を発酵させることができるが、季節性である。あるいは、いくつかの作物は、産業上の発酵反応のために炭水化物を産生するために栽培してもよい。しかし、これらの方法は、食料産生のために利用可能な耕地を減少させ、かつ費用がかさむ。
【０００５】
メチオニンの需要が高く、発酵性炭水化物が比較的高価でかつ信頼性が低いことを考えれば、メチオニンを生物学的に費用対効果の高い方法で産生するための代替的でかつ改良された方法が必要である。本開示は、このような必要性を満たし、さらに他の関連する利点を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
詳細な説明
本開示は、野生型または親の生物体と比較してより高いレベルのメチオニンを産生するように、水素資化微生物の代謝工学（例えば、遺伝子、遺伝子発現、遺伝子発現調節を変更する）のための組成物及び方法を提供する。
【０００７】
背景として、古細菌及び水素資化微生物に分類される微生物を含む多くの微生物は、アスパラギン酸経路のアミノ酸のような他のアミノ酸の産生に関与するいくつかの酵素を共有する生合成経路を介してメチオニンを産生する。これらのアミノ酸生合成酵素の１つ以上は、フィードバック調節、遺伝子発現の抑制、またはその両方に供される。例えば、工業的に重要なアミノ酸（例えば、メチオニン）の生合成に炭素フラックスを指し向けることに関与する最初の関与する酵素であるアスパルトキナーゼは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中のトレオニン及びリシンによって、リン酸化アスパラギン酸からアロステリックに阻害される（Ｓａｎｏ及びＳｈｉｉｏ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６：３７３，１９７０；Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６８：５２１，２００７）。別の酵素であるホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼは、メチオニン及びＳ−アデノシルメチオニンによるフィードバック調節を受ける（Ｂｏｒｎ及びＢｌａｎｃｈａｒｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。３８：１４４１６、１９９９）。ホモセリンデヒドロゲナーゼは、メチオニン／トレオニン生合成経路における最初の関与する酵素であるが、リシン生合成経路であるジヒドロジピコリン酸シンターゼに関与する最初の酵素とアスパルチルセミアルデヒドに関して競合しなければならない。したがって、炭素フラックスがメチオニンまたはリシンに向かうかどうかは、どの酵素が基質を得るかに依存する。
【０００８】
本開示は、本明細書中でＭＭＰ１３５９及びＭＭＰ１３５８と呼ばれる、１つ以上の改変硫黄同化関連オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する水素資化微生物が、野生型（親）水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）と比較してメチオニンを過剰産生し得るという驚くべき発見に関する。さらなる背景として、Ｒａｕｃｈら（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９４：１３３０，２０１４）は、（それぞれＭＭＰ１３５９及びＭＭＰ１３５８  ＯＲＦのホモログである）ＭＡ１８２１及びＭＡ１８２２  ＯＲＦと呼ばれるＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ  ＯＲＦの二重ノックアウト変異によって、ホモシステイン生合成に関してＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ活性を欠いている遺伝的バックグラウンドにおけるホモシステイン形成に関与していることを見出し；特に、バイオインフォマティクス技術によって特定されたこれらのＯＲＦは、嫌気性菌におけるホモシステインへの硫化物の取り込み過程に関与しているようである。Ｒａｕｃｈら（２０１４）は、ＭＡ１８２１及びＭＡ１８２２のＯＲＦが、ゲノム上でメチオニン生合成（ホモシステイン生合成に関与する遺伝子では稀ではない）に共存することを見出し、メチオニン生合成におけるこれらのＯＲＦの役割は探究されなかった。理論によって縛られることを望まないが、本開示は、ＭＭＰ１３５９及びＭＭＰ１３５８のＯＲＦが、メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニンによるフィードバック阻害を受けること、及び本開示の変更されたＯＲＦが、メチオニンフィードバック阻害に耐性のポリペプチドをコードすることを実証すると考えられる。したがって、特定の態様において、本開示は、ガス供給原料（例えば、水素及びＣＯ、ＣＯ２などの酸化炭素を含むガス）の代謝を促進して親の水素資化微生物よりも高いレベルでメチオニンを生成するために、調節解除されるか、または遺伝子改変されたＭＭＰ１３５９、ＭＭＰ１３５８、もしくはその両方を発現する修飾水素資化微生物（例えば、古細菌）を使用するための組成物及び方法を提供する。
【０００９】
本開示をより詳細に説明する前に、本明細書で使用される特定の用語の定義を提供することが本開示の理解に役立ち得る。さらなる定義は、本開示を通して説明される。
【００１０】
本明細書では、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、または整数範囲は、列挙された範囲内の任意の整数の値を含み、かつ別段示さない限り、適宜、それらの分数（例えば、１０分の１及び１００分の１整数）を含むことが理解されるべきである。また、ポリマーサブユニット、サイズまたは厚さのような任意の物理的特徴に関する、本明細書に記載された任意の数の範囲は、別段示さない限り、列挙した範囲内の任意の整数を含むと理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、別段示さない限り、示された範囲、値または構造の±２０％を意味する。「本質的に〜からなる」という用語は、特許請求の範囲を、請求される発明の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を与えない特定の材料またはステップ、またはものに限定する。本明細書中で使用される場合、「ある、１つ（「ａ」及び「ａｎ」：不定冠詞）」という用語は、列挙された構成要素の「１つ以上の」を指すことが理解されるべきである。代替（例えば、「または」）の使用は、その代替物の１つ、両方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味することが理解されるべきである。本明細書において用いる場合、「含む、包含する、〜が挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する、持つ、備える（ｈａｖｅ）」及び「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は同義語として使用され、その用語及び変化型は非限定的であると解釈されるものとする。
【００１１】
本明細書中で使用される場合、「アスパラギン酸経路アミノ酸」または「アミノ酸のアスパラギン酸ファミリー」とは、アスパラギン酸から合成された、リシン、トレオニン及びメチオニンを含む１つ以上のアミノ酸を指す。アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸のそれぞれについての生合成経路におけるステップは分岐し、枝分かれするが、それらは全て、アスパラギン酸キナーゼ（アスパルトキナーゼとも称される）によるアスパラギン酸のリン酸化から始まる。特定の実施形態では、アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸の生合成経路におけるアスパラギン酸キナーゼは、リシン、トレオニン、及びメチオニンのうちの１つ以上によるフィードバック阻害を受ける。
【００１２】
本明細書で使用する場合「メチオニン生合成経路」または「メチオニン経路」とは、メチオニンの生合成に使用されるメチオニン及び前駆体代謝産物（例えば、システイン、ホモセリン）の生合成に直接的または間接的に関与する１つ以上の酵素を指す。メチオニン生合成経路を含み得る例示的な酵素としては、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンＯ−トランススクシニルトランスフェラーゼ、Ｏ−スクシニルホモセリンリアーゼ、シスタチオニンγ−シンターゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼ（コバラミン依存性または非依存性）、ＭＭＰ１３５８、ＭＭＰ１３５９、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００１３】
本明細書で使用される場合「Ｈ２／ＣＯｘ基質」または「Ｈ２／ＣＯｘ供給原料」は、水素（Ｈ２）と二酸化炭素（ＣＯ２）または一酸化炭素（ＣＯ）またはその両方の混合物を指し、また種々の他の成分、例えば、アンモニア（ＮＨ３）、炭化水素（例えばメタン（ＣＨ４））、ＣＯ２、ＣＯ、ホルムアルデヒド（ＣＨ２Ｏ）、硫化水素（Ｈ２Ｓ）、硫化カルボニル（ＣＯＳ）、シアン化水素（ＨＣＮ）、水蒸気、不活性ガス、または他のガスも含んでもよい。特定の実施形態では、本開示の微生物は、ＣＯｘ基質または供給原料を利用し、これは必要に応じて、Ｈ２の存在下であり、また上記したような種々の他の成分も含んでもよい。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「合成ガス」または「合成ガス」とは、例えば、水蒸気改質、乾燥またはＣＯ２改質、自己熱改質、天然ガスまたは液化炭化水素の接触部分酸化または部分酸化によって、水素合成において、アンモニア合成において、メタノール合成において、製鋼によって、または石炭、バイオマスもしくは廃棄物のガス化よって生成され得る、一酸化炭素と水素との混合物を指す。特定の実施形態では、合成ガスは、水性ガスシフト反応によってさらに調整してもよい。合成ガスはまた、メタン、ＣＯ２、Ｈ２Ｓ、または他のガスをＣＯ及びＨ２に対して少量含んでもよい。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、「宿主」という用語は、変異によって、目的のポリペプチドを産生する外因性核酸分子（例えば、調節解除されたＭＭＰ１３５８、調節解除されたＭＭＰ１３５９）を使用して、ノックアウトまたはそれらの組み合わせにより、遺伝子改変されて、修飾されていない宿主細胞よりもメチオニンの産生を改善し得る細胞または微生物（例えば、古細菌）を指す。特定の実施形態では、宿主細胞は、発現されている変異したかまたは外因性のポリペプチドに関連するかまたは関連しない所望の特性（例えば、調節解除）を付与する他の遺伝子改変を必要に応じて既に有していてもよい。例えば、宿主細胞は、メチオニン経路への付加的もしくは増強された炭素フラックス活性、競合するアミノ酸の産生の減少、高い増殖、汚染物質もしくは特定の培養条件への耐性、追加の炭素基質を代謝する能力、または所望の生成物もしくは中間体を合成する能力を付与する遺伝子修飾を保有してもよいし、または保有するように変更されてもよい。
【００１６】
本明細書で使用する「水素資化生物、水素栄養生物（ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｒｏｐｈ）」または「水素資化、水素化栄養性、水素栄養性（ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｒｏｐｈｉｃ）」とは、Ｈ２を消費するか、Ｈ２を酸化するか、またはＨ２を別の化合物にその代謝の一部として変換することができる微生物を指す。特定の実施形態では、水素資化生物は、偏性もしくは通性の水素資化生物、偏性もしくは通性の嫌気性菌、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。例えば、通例の水素資化生物は、エネルギー源として水素の存在下でもまたは非存在下でも成長し得、炭水化物、酢酸塩、ギ酸塩、メタノール、メチルアミンまたは酸化炭素などの１つ以上の種々の炭素源を使用し得る（例えば、酢酸生成菌（Ａｃｅｔｏｇｅｎ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）はＨ２の非存在下で生育し得、酢酸塩をエネルギー源及び炭素源の両方として使用することができる；Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉは、Ｈ２の非存在下で、例えばアセテート、メチルアミンまたはメタノールを使用することによって、メタン生成の代替代謝経路を使用して生存し得る）。例示的な水素資化生物としては、メタン生成菌、酢酸生成菌、Ｋｎａｌｌ−ｇａｓ細菌などが挙げられる。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、「メタン生成菌（ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎ）」または「メタン生成古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｃ  ａｒｃｈａｅａ）」という用語は、（ａ）任意の種々の１つまたは２つの炭素基質（例えば、二酸化炭素、酢酸塩、ギ酸、ホルムアルデヒド、一酸化炭素、メタノール、メチルアミン類（例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミンなど））及び水素ガスを使用すること；（ｂ）酢酸資化経路でアセテートを使用すること、ならびに（ｃ）メチル栄養性メタン生成経路における炭素間の結合を欠く、還元された１つの炭素化合物または多炭素化合物の使用、を含む、任意の１つ以上のメタン生成経路を使用して、無酸素条件下でメタンを生成し得る古細菌の微生物を指す。例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ種は、メタン生成について公知の３つ全ての経路を保有し、これは、少なくとも９つのメタン生成基質（例えば、メタノール、メチルアミン類、メチルチオール類、アセテート）を利用することができる古細菌であるが、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓは、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉとは異なり、機能的なＨ２還元因子を欠くので、Ｈ２／ＣＯ２還元では存続できない（Ｍａｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８：７９２２、２００６）。しかし、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓは、ＣＯを酢酸塩及びギ酸塩に代謝することによって、ＣＯをＣＯ２に酸化することによって、またはメタンを生成する際に電子受容体として酢酸塩を使用することによって、成長し得る。当該技術分野では、細菌は古細菌ではなく、古細菌は細菌ではないことが理解されている。本明細書で使用される場合、メタン生成古細菌は、メタン（例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉ）を生成するために水素ガスを必要とする「偏性水素資化生物（ｏｂｌｉｇａｔｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｒｏｐｈｓ）」であってもよい。メタン生成古細菌は、水素ガスの非存在下でメタンを生成することができる「通性の水素資化生物（ｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｒｏｐｈｓ）」であってもよい（例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）。さらに、メタン生成古細菌は、中温性であっても、好熱性であってもまたは超好熱性であってもよい。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、「バイオマス」とは、生物起源を有する有機物質を指し、これには、全細胞、溶解細胞、細胞外物質、産生産物またはその一部分などを含み得る。例えば、培養された微生物（例えば、細菌または古細菌培養物）から採取された材料は、バイオマスとみなしてもよく、これは、分泌された生成物を含んでもよく、または分泌された生成物であってもよい。
【００１９】
本明細書で使用する「核酸分子」とはまた、ポリヌクレオチドとしても知られ、ヌクレオチドと呼ばれる共有結合したサブユニットからなる高分子化合物を指す。核酸分子としては、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）、ポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が挙げられ、これらは両方とも一本鎖であっても、または二本鎖であってもよい。ＤＮＡとしては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、半合成ＤＮＡなどが挙げられる。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「内因性の」または「天然の」という用語は、宿主細胞中に通常存在する遺伝子、タンパク質、化合物または活性を指す。さらに、親の遺伝子、タンパク質または活性と比較して、変異されるか、過剰発現されるか、シャッフルされるか、複製されるか、または他の形で変更される遺伝子、タンパク質または活性は、依然としてその特定の宿主細胞にとって内因性または天然であると考えられる。例えば、第１の遺伝子由来の内因性制御配列（例えば、プロモーター、翻訳減衰配列）を使用して、第２の天然遺伝子または核酸分子の発現を改変または調節してもよく、ここで、第２の天然遺伝子または核酸分子の発現または調節は、親細胞における正常な発現または調節とは異なる。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「異種」または「外因性」の核酸分子、構築物または配列とは、宿主細胞に対して天然ではないが、宿主細胞由来の核酸分子または核酸分子の一部に相同であり得る、核酸分子または核酸分子の一部を指す。異種または外因性の核酸分子、構築物または配列の供給源は、異なる属または種由来のものであってもよい。特定の実施形態では、異種または外因性核酸分子は、例えば、結合、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションなどによって、宿主細胞または宿主ゲノムに追加され（すなわち、内因性でも天然でもない）、ここでこの追加された分子は、宿主ゲノムに組み込まれてもよいし、または染色体外遺伝物質として（例えば、プラスミドまたは他の形態の自己複製ベクターとして）存在してもよく、複数のコピーで存在してもよい。さらに、「異種」とは、たとえ宿主細胞が相同なタンパク質または活性をコードしているとしても、宿主細胞に導入された外因性核酸分子によってコードされる非天然の酵素、タンパク質または他の活性を指す。
【００２２】
「相同な」または「相同体」という用語は、宿主細胞、種または株に見られるかまたはそれに由来する分子または活性に類似する分子または活性を指す。例えば、異種または外因性核酸分子は、天然の宿主細胞遺伝子と相同であり得、必要に応じて、変更された発現レベル、異なる配列、変更された活性、またはそれらの任意の組み合わせを有し得る。相同ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、参照または親の野生型配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一または１００％同一であるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を有し得る。特定の実施形態では、相同ポリペプチドは、参照または親の野生型酵素に対して１つ以上の所定の位置で少なくとも１つのアミノ酸置換（例えば、少なくとも１、２、３、５、６、７、８、９または１０以上または２０、２５または３０個までの置換）または特定の数以下のアミノ酸置換（例えば、１、２、３、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０個以下の置換）を、ただし、相同タンパク質またはポリペプチドが、目的の活性（例えば、カルボキシラーゼ、デカルボキシラーゼ、デヒドロゲナーゼ、エピメラーゼ、キナーゼ、リアーゼ、レダクターゼ、シンターゼ）を保持する条件下で、含む。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「非天然」または「非天然の遺伝子操作型」という用語は、野生型、または親の細胞または分子とは異なる少なくとも１つの遺伝子改変を含むように遺伝子的に操作された生物、微生物、細胞、核酸分子、またはベクターを指す。例えば、非天然のものは、内因性核酸分子もしくは遺伝子の発現、または遺伝子産物の活性が、野性型または親の微生物と比較して変更される（例えば、増大、減少、調節解除、活性化、抑制解除、抑制）ように遺伝子操作された（例えば、自然発生変異体を含む部位特異的突然変異体またはランダム突然変異体）微生物または細胞を指し得る。このような修飾としては、例えば、遺伝子またはオペロンの発現を変化させる（増大または減少させる）非コード調節領域のものが挙げられる。「非天然」生物、微生物、または細胞としては、組換え生物、微生物または細胞が挙げられ得る。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「組換え」という用語は、外因性核酸分子の導入によって改変された微生物、細胞、核酸分子、もしくはベクターを指すか、または改変された微生物もしくは細胞であって、内因性核酸分子もしくは遺伝子の発現が、そのような改変もしくは改変が遺伝子工学によって導入され得る場合、制御されるか、調節解除されるかもしくは構成的であるような微生物または細胞を指す。遺伝的改変は、例えば、１つ以上のタンパク質または酵素をコードする核酸分子（プロモーターなどの発現制御エレメントを含んでもよい）または他の核酸分子の付加、欠失、置換、もしくは細胞の遺伝物質への他の機能的破壊もしくは追加を導入する改変を含んでもよい。例示的な修飾としては、参照または親の微生物由来の異種ポリペプチドまたは同種ポリペプチドのコード領域またはその機能的フラグメントにおける修飾が挙げられる。特定の実施形態では、本開示の生物、微生物または細胞は、非天然生物、微生物または細胞、ならびに組換え生物体、微生物または細胞である。例えば、調節解除された内因性酵素（例えば、ＭＭＰ１３５９、ＭＭＰ１３５８、アスパルトキナーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ）を発現または過剰発現する非自然の水素資化微生物はまた、発現されるかまたは過剰発現して、メチオニンの生合成に関与する特定の酵素活性（例えば、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリン、Ｏアセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、ホモシステインＳメチルトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼデヒドロゲナーゼ）を産生する１つ以上の外因性または異種の核酸分子を含んでもよい。
【００２５】
本明細書で使用する場合「形質転換」とは、核酸分子（例えば、外因性または異種の核酸分子）を宿主細胞に導入することを指す。形質転換された宿主細胞は、外因性または異種性の核酸分子を染色体外で担持してもよいし、または染色体に組み込んでもよい。宿主細胞ゲノム及び自己複製ベクターへの組み込みは、一般に、形質転換された核酸分子の遺伝的に安定した遺伝をもたらす。形質転換された核酸を含む宿主細胞は、「組換え」または「遺伝子操作」または「形質転換された」または「トランスジェニック」細胞（例えば、古細菌）と呼ばれる。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「調節解除された」という用語は、それぞれ親または野性型の微生物における遺伝子の発現または活性と比較して、遺伝子産物（例えば、タンパク質、酵素）の発現の減少もしくは増大、または遺伝子産物の活性の減少もしくは増大を指す。例えば、微生物は、操作の前よりも、親もしくは野性型微生物のものと比べて、遺伝子産物の発現を増加もしくは減少させるため、または遺伝子産物の活性を増大もしくは低下させるために、遺伝子操作（例えば、変異、遺伝子操作）されてもよい。特定の実施形態において、標的遺伝子は、発現された遺伝子産物が増大した活性を有するように変異される。例えば、標的遺伝子のコード領域は、発現された遺伝子産物が活性を増大させるように変更されてもよく、標的遺伝子のコピー数が増大されて活性が増大されてもよく、標的遺伝子が過剰発現されて活性が増大されてもよく、またはそれらの任意の組合せであってもよい。他の実施形態では、標的遺伝子は、発現された遺伝子産物が、フィードバック阻害に対して減少した応答、最小の応答、または検出不可能な応答を有するように変異される（例えば、ＭＭＰ１３５８もしくはＭＭＰ１３５９のようなアミノ酸生合成酵素、またはその両方が、メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニンなどの１つ以上のフィードバック阻害剤の存在下で調節解除される）。さらなる実施形態では、標的遺伝子は、ある遺伝子が、発現の抑制に対して減少、最小または検出不能な応答を有するように変異される（例えば、ホモセリンデヒドロゲナーゼなどのアミノ酸生合成酵素が、フィードバックコリプレッサーであるメチオニンの存在下で調節解除される）。あるいは、微生物は、例えば、上記の遺伝子改変の任意の１つ以上（例えば、自発突然変異体）を有する選択圧下で特定することができる。任意の上述の実施形態の調節解除された遺伝子または遺伝子産物は、自発性、誘導性または遺伝子操作された変異体または改変体であってもよい。
【００２７】
本明細書において使用する場合、「過剰発現された」という用語は、同じ条件下で増殖された場合、親または野性型の微生物で見出される遺伝子発現または遺伝子産物のレベルよりも大きい、天然ではないまたは組み換えの微生物中の遺伝子発現または遺伝子生成物のレベルを指す。特定の実施形態において、過剰発現は、改変された調節制御（例えば、強力なプロモーターの使用）もしくはコピー数の増大またはその両方に起因し得る、転写レベル、翻訳レベル、またはその両方で生じ得る。
【００２８】
２つ以上のポリペプチドまたは核酸分子配列の文脈における「同一の」または「同一性パーセント」という用語は、手動アラインメントによって、または目視検査によって、配列比較アルゴリズムなどの当該技術分野で公知の方法を使用して測定した場合、比較ウインドウまたは指定された領域にわたって、最大一致に関して比較及び整列させた場合、同じであるか、または特定の領域にまたがって同じである特定の割合のアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性）２つ以上の配列または部分配列を意味する。例えば、配列同一性及び配列類似性のパーセントを決定するのに適したアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３に記載のデフォールト設定で用いられるＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。
【００２９】
本開示のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの改変体もまた企図される。改変体ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または９９．９％同一である。いくつかの実施形態では、改変体ポリヌクレオチドとは、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、約６５〜６８℃または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム及び５０％ホルムアミドで約４２℃というストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で規定の配列のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９を参照のこと）。ポリヌクレオチド改変体は、本明細書に記載の機能性を有する生合成酵素またはそのポリペプチドをコードする能力を保持する。
【００３０】
より厳しい条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）もまた使用されてもよい；しかし、ハイブリダイゼーションの速度は影響を受ける。例えば、デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが関係する場合、さらなる例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、６×ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、３７℃（１４塩基のオリゴヌクレオチドについて）、４８℃（１７塩基のオリゴヌクレオチドについて）、５５℃で（２０塩基のオリゴヌクレオチドについて）、及び６０℃（２３塩基のオリゴヌクレオチドについて）での洗浄が挙げられる。
【００３１】
「変異体（ｍｕｔａｎｔ）」とは、参照の核酸分子またはアミノ酸配列と比較した、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列における変化を指す。変異は、放射線、ウイルス、トランスポゾン、変異原性化学物質、減数分裂またはＤＮＡ複製の間に起こるエラー、過剰変異などによって引き起こされ得る。変異は、ヌクレオチドまたはアミノ酸の置換、挿入、欠失またはそれらの任意の組み合わせを含むいくつかの異なるタイプの配列変化をもたらし得る。
【００３２】
「保存的置換」とは、類似の特性を有する別のアミノ酸の１つのアミノ酸の置換として当業界で認識されている。例示的な保存的置換は、当該技術分野で周知である（例えば、ＷＯ９７／０９４３３号の第１０頁；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ，ＮＹ，ｐｐ．７１〜７７，１９７５；Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ｐ．８，１９９０を参照のこと）。
【００３３】
「阻害する」または「阻害された」とは本明細書において使用する場合、対照、内因性または参照の分子に対する、標的遺伝子の発現または標的分子（例えば、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ）の活性における直接的または間接的な改変、低減、下方制御または抑止であって、統計的、生物学的、産業的または臨床的に有意な改変、低減、下方制御または抑止を指す。例えば、阻害された、不活性化された、または低下した活性の（例えば、遺伝子改変）生合成酵素は、野生型または親酵素と比較して３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ未満の活性を有してもよい。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
（水素資化微生物−宿主細胞）
本開示の親または出発の水素資化微生物は、野生型（天然）株、変異（非天然）株（例えば、増殖速度の増大、調節解除または抑制解除された生合成酵素）または組換え株であり得、これらはそれぞれ、親水素資化微生物よりも高レベルでメチオニンを産生するようにさらに改変されてもよい。特定の実施形態では、水素資化生物は、メタン生成古細菌であってもよい。
【００３５】
特定の実施形態では、本開示は、メタン生成古細菌である水素資化微生物、例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｃｕｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｆｏｌｌｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｌａｃｉｎｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｌｏｂｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｌｓｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、ＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓまたはＭｅｔｈａｎｏｔｏｒｒｉｓを提供する。
【００３６】
さらなる実施形態では、水素資化微生物は、特定のメタン生成古細菌種である。例示的なメタン生成古細菌種としては、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｙａｎｔｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｆｌｕｖｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｓｐａｎｏｌａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｌｕｓｔｒｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｉｄｉｄｕｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ａｒｂｏｒｉｐｈｉｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｏｌｌｅｙａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｗｏｅｓｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｗｏｌｉｎｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｌｏｓｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ａｒｖｏｒｙｚａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｆｌｅｘｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｗｏｌｆｅｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｋｉｎａｗｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｏｃｉａｂｉｌｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｂａｖａｒｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｃｈｉｋｕｏｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｓｕｂｍａｒｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｆｒｉｇｉｄｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｌｉｍｉｎａｔａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｌａｔｔｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｅｎｄｏｓｙｍｂｉｏｓｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｌｉｍｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｐｅｔｒｏｌｅａｒｉｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ  ｂｏｏｎｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｏｒｒｉｓ  ｆｏｒｍｉｃｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｏｒｒｉｓ  ｉｇｎｅｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｃｏｎｃｉｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｈａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｐｅｌａｇｉｃａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎ���、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｍｏｂｉｌｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｎｎｉｅｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｏｌｔａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｉｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｖｅｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆｅｒｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ及びＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｕｌｃａｎｉｕｓが挙げられる。
【００３７】
特定の実施形態では、メタン生成古細菌は、シトクロムを産生するか、またはシトクロムを産生しない。例えば、シトクロムを産生しないメタン生成古細菌としては、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓまたはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｎｎｉｅｌｉｉが挙げられる。シトクロムを産生する例示的なメタン生成古細菌は、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉまたはＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉである。
【００３８】
関連の実施形態では、メタン生成古細菌は、中温性であっても、好熱性であっても、または超好熱性であってもよい。例示的な中温性メタン生成菌としては、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｃｕｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ及びＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａといういくつかの種が挙げられる。例示的な好熱性メタン生成菌としては、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ及びＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓといういくつかの種が挙げられる。例示的な超好熱性メタン生成菌としては、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ、及びＭｅｔｈａｎｏｔｏｒｒｉｓが挙げられる。
【００３９】
メチオニン産生性の水素資化微生物
本開示の水素資化微生物は、目的の硫黄同化ポリペプチドをノックアウト、低減、発現または過剰発現するために遺伝子操作（すなわち、遺伝子的に操作）、組換え修飾、またはそれらの組み合わせをしてもよく、その結果、Ｈ２／ＣＯｘ基質の種々の成分をメチオニンまたはメチオニン含有フィードに変換（例えば、利用、変換、同化、酸化、還元）するために有用な組み換え微生物が生じる。
【００４０】
非天然の水素資化微生物を生成するための遺伝子の操作または遺伝子操作としては、ランダム（例えば、化学的に誘発される、自発性の）または部位特異的突然変異誘発（例えば、１つ以上の遺伝子標的）、１つ以上の遺伝子標的の発現に関連する調節配列または部位の変更（例えば、強力な、弱い、誘導性の、抑制可能な、もしくは複数のプロモーターを除去することによって、またはこのようなプロモーターを、異なる特性を有するプロモーターと置き換えることによって）、１つ以上の遺伝子標的の染色体位置を変化するステップ、１つ以上の遺伝子標的に隣接する核酸配列（例えば、リボソーム結合部位または転写ターミネーター）を変更するステップ、１つ以上の遺伝子標的のコピー数の減少または増大、１つ以上の遺伝子標的の転写、もしくは１つ以上の遺伝子産物の翻訳に関与する、調節タンパク質、リプレッサー、サプレッサー、エンハンサー、転写アクチベーターなどの改変、または１つ以上の遺伝子標的の発現を調節する任意の他の方法（アンチセンス核酸分子、短い干渉核酸分子、または標的タンパク質の発現をノックアウトまたはブロックするための他の方法の使用を含む）が挙げられる。
【００４１】
特定の実施形態では、遺伝子操作または遺伝子工学は、親の微生物よりも多くのメチオニンを産生する非自然の水素資化微生物を生じる１つ以上の自然突然変異（例えば、化学的、放射線学的または他の変異誘発的処理）を含む。そのような自然発生変異体は、例えば、所望の表現型を有する変異体のみが増殖する特定の選択圧（例えば、増殖培地中に特定のアミノ酸または毒素が存在しないこと、抗生物質が存在すること、特定の代謝産物の非存在など）の下に微生物を置くことによって産生されて、特定され得る。
【００４２】
さらなる実施形態では、野生型から変化したアミノ酸配列を有するなど、メチオニン生合成酵素をコードする内因性または外因性核酸分子を改変してもよい。これらの方法によって生成される各改変体ポリペプチドは、参照または親の野性型ポリペプチド配列に対して、少なくとも５０％の活性（好ましくは１００％以上の活性）を保持し、かつ少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるポリペプチド配列を有する。特定の実施形態では、改変体ポリペプチドは、改変体が目的の活性（例えば、カルボキシラーゼ、デカルボキシラーゼ、デヒドロゲナーゼ、エピメラーゼ、キナーゼ、リアーゼ、レダクターゼ、シンターゼ）を保持するならば、参照または親の野生型酵素に対して１つ以上の所定の位置で、少なくとも１つのアミノ酸置換（例えば、少なくとも１、２、３、５、６、７、８、９もしくは１０以上または２０、２５または３０個までの置換）または１つ以上の特定の数のアミノ酸置換（例えば、１、２、３、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０個以下の置換）を、含む。
【００４３】
特定の態様では、本開示は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ＭＭＰ１３５９（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＣ＿００５７９１．１（１３３７２４０．．１３３８７８１、相補体）；ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２７６２４４４、配列番号１）、ＭＭＰ１３５８（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＣ＿００５７９１．１（１３３６８２８．．１３３７２２６、相補体）、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２７６２４３３、配列番号５）、またはその両方によってコードされる硫黄同化酵素が、メチオニン生合成経路に関与し、メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニンによるフィードバック阻害を受けるという予期せぬ結果に関する。いくつかの実施形態において、硫黄同化酵素ＭＭＰ１３５９、ＭＭＰ１３５８、またはその両方とも、水素栄養性古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ由来である。さらなる実施形態では、本開示は、メチオニンフィードバック阻害に耐性のＭＭＰ１３５９をコードする変異ＯＲＦ（例えば、配列番号２）；メチオニンフィードバック阻害に耐性のＭＭＰ１３５８をコードする変異したＯＲＦ（例えば、配列番号６）、またはその両方（親、野生型もしくは参照のポリペプチドを発現する宿主細胞と比較して、宿主細胞によって発現される場合、メチオニン産生が増大する）を提供する。集合的に、ＭＭＰ１３５９及びＭＭＰ１３５８ポリペプチド、またはその変異体、改変体、ホモログもしくはオーソログは、本明細書では、「硫黄同化ポリペプチド」または「メチオニン経路ポリペプチド」と総称される。
【００４４】
特定の実施形態では、ＭＭＰ１３５９、ＭＭＰ１３５８、またはその両方のホモログまたはオーソログは、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｏｎｉｌｅ  ｔｉｅｄｊｅｉ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｌｉｐｏｃａｌｉｄｕｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ｔｅｐｉｄａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔａｔｏｘｙｄａｎｓ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｗｏｌｆｅｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂｉｕｍ  ｎａｒｕｇｅｎｓｅ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｔｈｅｒｍａｒｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ｍｅｌａｎｅｓｉｅｎｓｉｓ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ  ｇｌｏｂｏｓａ、またはそれらの任意の組合せから得てもよい。
【００４５】
したがって、本開示は、調節解除されるように内因的に修飾される（例えば、もはやメチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニンによるフィードバック阻害を受けない）、または組み換えにより発現もしくは過剰発現された（野生型または調節解除された）水素資化微生物、メチオニンの生合成に関与するポリペプチド、例えば、本明細書に開示される調節解除された硫黄同化ポリペプチド（例えば、ＭＭＰ１３５９、ＭＭＰ１３５８）を提供する。さらに、本開示の水素資化微生物は、アスパルトキナーゼ、アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ、Ｏ−スクシニルホモセリンリアーゼ、シスタチオニンγ−シンターゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼまたはそれらの組み合わせなど（その活性は、内因性、外因性、またはその両方であってもよい）のメチオニン生合成経路のさらなる酵素をさらに発現または過剰発現することができる。特定の実施形態では、調節解除型または過剰発現のＭＭＰ１３５９及び／またはＭＭＰ１３５８及びアスパルトキナーゼを有する水素資化微生物は、必要に応じて、内因性または組換えにより添加されたホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を有してもよい。特定の実施形態では、水素資化微生物は、メチオニンフィードバック阻害に耐性である変異されたＭＭＰ１３５９をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号２）、メチオニンフィードバック阻害に耐性である変異されたＭＭＰ１３５８をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号６）、またはその両方を含み、必要に応じてメチオニンシンターゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。
【００４６】
フィードバック耐性変異体を遺伝子操作及び特定する方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、リシンアナログＳ−２−アミノエチル−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）またはメチオニンアナログＤＬ−エチオニンなどの毒性アミノ酸アナログの存在下で増殖することができる微生物は、毒性アナログに対応するアミノ酸に対してフィードバック耐性であると考えられている（例えば、Ｓｈｉｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５４：３２７５、１９９０；Ｋｕｍａｒ及びＧｏｍｅｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ２３：４１〜６１，２００５を参照のこと）。
【００４７】
本開示のポリヌクレオチドは、他の生物、特に他の古細菌、より詳細には他のメタン生成菌から対応する配列を単離するために使用してもよい。このようにして、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどの方法を使用して、本明細書に示されるＭＭＰ１３５９またはＭＭＰ１３５８核酸分子配列に対するそれらの配列相同性に基づいて、そのような配列を特定してもよい。本明細書に示されるＭＭＰ１３５９もしくはＭＭＰ１３５８のＯＲＦ全体、またはその変異体及びフラグメントに対するそれらの配列同一性に基づいて単離された核酸分子は、本発明に包含される。そのような配列は、開示された配列のホモログまたはオーソログである配列を含む。「オーソログ」とは、共通の祖先コード配列に由来し、種分化の結果として異なる種に見出されるコード配列を意味するものとする。それらのヌクレオチド配列またはそれらのコードされたタンパク質配列が、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を共有するとき、種々の種で見出されるコード配列は、オーソログとみなされる。オーソログの機能は、種間で高度に保存されていることが多い。したがって、硫黄同化活性を有するか、またはメチオニン生合成を促進し（及び必要に応じては、調節解除され、例えば、メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニンなどの１つ以上の化合物によるフィードバック阻害に耐性である）、ストリンジェントな条件下で、ＭＭＰ１３５９もしくはＭＭＰ１３５８のＯＲＦ、またはその改変体もしくはフラグメントにハイブリダイズするポリペプチドをコードする単離されたポリペプチドは、本開示に包含される。
【００４８】
コドン用法の偏りの変動は、異種宿主での組換えタンパク質発現に影響を及ぼし得る、異なる種の細菌及び古細菌にまたがって観察されている（Ｓｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：１１４１、２００５；Ｅｍｅｒｙ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７：１３１、２０１１）。特定の実施形態では、核酸分子（例えば、硫黄同化ポリペプチドまたはメチオニン生合成酵素をコードする核酸）は、タンパク質発現を改善または最大化するために、本明細書に記載の宿主細胞に導入する前にコドン最適化されてもよい。コドン最適化とは、コドンによってコードされるアミノ酸を変更することなく、宿主細胞のより一般的なコドン用法を反映するための、核酸分子レベルでの遺伝子またはコード領域におけるコドン配列の改変を指す。異種宿主における遺伝子発現のためのコドン最適化法は、以前に記載されている（例えば、Ｗｅｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４９８  ４３、２０１１；Ｈｅｎｒｙ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２４：１０，２００７；米国特許公開第２０１１／０１１１４１３号を参照のこと）。
【００４９】
ＰＣＲ法のアプローチでは、目的の任意の微生物（例えば、古細菌）から抽出されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから対応するＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲ反応における使用のために、オリゴヌクレオチドプライマーを設計してもよい。ＰＣＲプライマー及びＰＣＲクローニングを設計するための方法は、当該技術分野で一般に知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）で開示される。また、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｉｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ、ｅｄｓ．（１９９５）ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；ならびにＩｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ、ｅｄｓ．（１９９９）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）も参照のこと。ＰＣＲの公知の方法としては、対になったプライマー、入れ子状プライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的不一致プライマー等を使用する方法が挙げられる。
【００５０】
ハイブリダイゼーション技術では、選択された生物体由来のクローニングされたゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡフラグメント（すなわち、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー）の集団に存在する他の対応するポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするプローブとして、公知のポリヌクレオチドの全てまたは一部が使用される。ハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、または他のオリゴヌクレオチドに基づくものであってもよく、３２Ｐなどの検出可能な基または任意の他の検出可能なマーカーで標識してもよい。したがって、例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブは、本明細書において特定されたＭＭＰ１３５９またはＭＭＰ１３５８ポリヌクレオチドに基づいて合成オリゴヌクレオチドを標識することによって作製することができる。ｃＤＮＡ及びゲノムライブラリーのハイブリダイゼーションのためのプローブ及び構築のためのプローブの調製方法は、当該技術分野で一般的に公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に開示される。
【００５１】
例えば、本明細書中に開示されるＭＭＰ１３５９もしくはＭＭＰ１３５８ポリヌクレオチド全体またはその１つ以上の部分は、対応するＯＲＦ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることができるプローブとして使用され得る。種々の条件下で特異的ハイブリダイゼーションを達成するために、このようなプローブは、ＭＭＰ１３５９またはＭＭＰ１３５８ポリヌクレオチド配列の中で固有であり、かつ必要に応じて長さが少なくとも約１０ヌクレオチド、最も好ましくは長さが少なくとも約２０ヌクレオチドである。そのようなプローブは、ＰＣＲによって選択された微生物由来の対応する硫黄同化ポリヌクレオチドを増幅するために使用され得る。この技術は、水素源化微生物中のコード配列の存在を決定するために、所望の微生物からさらなるコード配列を単離するために使用してもよい。ハイブリダイゼーション技術としては、プレートされたＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニング（プラークまたはコロニーのいずれか；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）が挙げられる。
【００５２】
そのような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で行うことができる。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブがその標的配列と、他の配列よりも検出可能な程度に（例えばバックグラウンドに対して少なくとも２倍）ハイブリダイズする条件とする。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況では異なる。ハイブリダイゼーション及び／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブと１００％の配列同一性を有する標的配列を特定することができる。あるいは、より低い度合いの類似性（例えば、６０％〜９９％の配列同一性）を検出できるように、配列におけるある程度のミスマッチを許容するようにストリンジェンシー条件を調整してもよい。
【００５３】
特定の態様では、本開示は、非自然の水素資化微生物がＨ２／ＣＯｘ基質を代謝して親の水素資化微生物よりも高いレベルでメチオニンを生成し、かつこの非自然の水素資化微生物が調節解除された内因性硫黄同化ポリペプチドを含むポリペプチドを発現する、非自然の水素資化微生物を提供する。いくつかの実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、配列番号４または８に示されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、配列番号４または８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含み、ここでこのポリペプチドは、１つ以上のフィードバック阻害剤（例えば、メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニン）について調節解除されている。さらなる実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、配列番号２または６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、ここでこのコードされたポリペプチドは、１つ以上のフィードバック阻害剤（例えば、メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニン）について調節解除されている。さらなる実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、配列番号２または６の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、ここでこのコードされたポリペプチドは、１つ以上のフィードバック阻害剤（例えば、メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニン）について調節解除される。
【００５４】
いくつかの実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、遺伝子操作された自然突然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異、またはそれらの任意の組み合わせを含む変異体ＭＭＰ１３５９またはそのホモログもしくはオーソログによってコードされる。他の実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、自然突然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異、またはそれらの任意の組み合わせを含む変異体ＭＭＰ１３５８またはそのホモログもしくはオーソログによってコードされる。さらなる実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、遺伝子操作された自発突然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異、またはそれらの任意の組み合わせを含む変異体ＭＭＰ１３５９またはそのホモログもしくはオーソログによって；ならびに遺伝子操作された自発突然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異、またはそれらの任意の組み合わせを含む変異体ＭＭＰ１３５８またはそのホモログもしくはオーソログによってコードされる。
【００５５】
特定の実施形態では、調節解除された内因性または外因性の硫黄同化ポリペプチドは、１つ以上のフィードバック阻害剤（例えば、メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニン）について調節解除されているＭＭＰ１３５９変異体またはそのホモログもしくはオーソログである。他の実施形態では、調節解除された内因性または外因性の硫黄同化ポリペプチドは、１つ以上のフィードバック阻害剤（例えば、メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニン）について調節解除されているＭＭＰ１３５８変異体またはそのホモログもしくはオーソログである。さらなる実施形態において、調節解除された内因性または外因性の硫黄同化ポリペプチドは、１つ以上のフィードバック阻害剤（例えば、メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニン）について調節解除されているＭＭＰ１３５９変異体またはそのホモログもしくオーソログ、ならびに１つ以上のフィードバック阻害剤（例えば、メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニン）について調節解除されているＭＭＰ１３５８変異体またはそのホモログもしくはオーソログである。
【００５６】
本開示のＭＭＰ１３５９変異体について言及する場合、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２（ＡＴＣＣ番号ＤＳＭ１４２６６）ＭＭＰ１３５９タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９８８４７９．１）のアミノ酸位置に対応する残基ナンバリングが参照される。例示的な変異は、残基Ｄ４３９での変異（例えば、Ｄ４３９Ｎ置換）を含む。本開示のＭＭＰ１３５８変異体について言及する場合、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２（ＡＴＣＣ番号ＤＳＭ１４２６６）ＭＭＰ１３５８タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９８８４７８．１）のアミノ酸位置に対応する残基ナンバリングが参照される。例示的な変異は、残基Ｇ１１４での変異（例えば、Ｇ１１４Ｅ置換）を含む。
【００５７】
本明細書で述べるように、アスパラギン酸経路アミノ酸（例えば、メチオニン）の生合成における最初の関与する酵素は、アスパルトキナーゼであり、これはリシン、トレオニン及びメチオニンのうちの１つ以上によるフィードバック調節を受ける場合がある。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、３つのアスパルトキナーゼアイソザイムを有し、２つは、アスパルトキナーゼ及びホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を有して、機能性であり、これらは、アスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩ（ＡＫ／ＨＤ−Ｉ；ｔｈｒＡ）及びアスパルトキナーゼＩＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩＩ（ＡＫ／ＨＤ−ＩＩ；ｍｅｔＬ）と呼ばれ、他方は、アスパルトキナーゼ活性のみを有し、アスパルトキナーゼＩＩＩと呼ばれる（ＡＫ−ＩＩＩ；ｌｙｓＣ）。ＡＫ／ＨＤ−Ｉは、トレオニンによるフィードバック調節（ならびにトレオニン及びロイシンによる発現抑制）を受けるが、ＡＫ／ＨＤ−ＩＩはメチオニンのみによるフィードバック調節を受け、ＡＫ−ＩＩＩは、リシンのみによるフィードバック調節を受ける（Ｐａｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３６：２４５，１９６７；Ｔｈｅｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１７：１３３，１９７４を参照のこと）。対照的に、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのアスパルトキナーゼは、リシン及びトレオニンの両方によってフィードバック阻害される（Ｓａｎｏ及びＳｈｉｉｏ，１９７０；Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。アスパラギン酸経路アミノ酸の生合成に関与する他の酵素、例えばホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、及びホモセリンＯ−トランススクシニルトランスフェラーゼもまた、フィードバック阻害を受ける。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本開示は、調節解除されたＭＭＰ１３５９、ＭＭＰ１３５８、またはその両方を発現する非自然の遺伝子操作された水素資化微生物を提供し、ここでこの非自然の水素資化微生物はさらに、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性またはメチオニンシンターゼをさらに発現または過剰発現し、ここでこの非自然の水素資化微生物は、必要に応じて、Ｈ２の存在下でＣＯｘ基質を代謝して、親の水素資化微生物よりも高いレベルでメチオニンを生成する。特定の実施形態において、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性は、内因性アスパルトキナーゼ、外因性アスパルトキナーゼ、またはその両方である。特定の実施形態では、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性は、リシン、トレオニン、及びメチオニンのうちの１つ以上によるフィードバック阻害に対して耐性であるアスパルトキナーゼ変異体である。いくつかの実施形態において、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性は、自発突然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異、またはそれらの任意の組み合わせを含む変異体ｌｙｓＣ遺伝子によってコードされる。特定の実施形態において、内因性または外因性アスパルトキナーゼは調節解除されず、異種メチオニンシンターゼ（例えば、ＭｅｔＥ）が過剰発現される。
【００５９】
さらなる実施形態では、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性は、トレオニン結合部位、リシン結合部位、リシン及びトレオニン結合部位、リシンもしくはトレオニン結合部位以外の部位、またはそれらの任意の組み合わせにおける変異を含む変異体ｌｙｓＣ遺伝子によってコードされる。特定の実施形態では、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性は、トレオニン結合部位に変異を含む変異ｔｈｒＡ遺伝子によってコードされる。他の実施形態では、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性は、メチオニン結合部位に変異を含む変異ｍｅｔＬ遺伝子によってコードされる。
【００６０】
本開示のｌｙｓＣフィードバック耐性変異体について言及する場合、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２ＬｙｓＣタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＦ１８８２２．１）のアミノ酸位置に対応する残基ナンバリングが参照される。例示的なトレオニン結合部位変異としては、残基Ｉ２７２、Ｄ２７４、Ｇ２７７、Ｅ２７８、Ａ２７９、Ｄ２９４、Ｑ２９８、Ｎ３７２、Ｎ３７４、Ｉ３７５、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例示的なリシン結合部位変異としては、残基Ｉ２９１、Ｉ２９３、Ｄ２９４、Ｔ３６１、Ｓ３８１、Ｅ３８２、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例示的なリシン及びトレオニン結合部位変異は、残基Ｄ２９４にある。リシン及びトレオニン結合部位以外の部位における例示的な変異には、残基Ｆ２８３、Ｎ２９９、Ｓ３０１、Ｓ３０２、Ｔ３０８、Ｔ３１１、Ｔ３３６、Ｇ３５９、Ｆ３６４、Ｍ３６５、Ｔ３８０、Ｒ３８４、Ｓ３８６またはそれらの任意の組合せが挙げられる。アスパルトキナーゼポリペプチドがそのキナーゼ活性を保持していれば、上記の変異のいずれか１つ以上を、本開示のアスパルトキナーゼに含めてもよい。
【００６１】
メチオニンの生合成が効率的に起こるためには、一定量の炭素フラックスがメチオニン経路を通って流れなければならない。メチオニンの産生をブーストまたは増強するための１つの方法は、本開示によって提供されるように、メチオニン経路への炭素フラックスを最大にすることである。
【００６２】
特定の態様では、本開示は、調節解除されたＭＭＰ１３５９、ＭＭＰ１３５８、またはその両方を発現する非自然の水素資化微生物を提供し、ここで、この非自然の水素資化微生物は、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性の低下、ピルビン酸キナーゼ活性の増大、５−メチルテトラヒドロ葉酸コリノイド／鉄硫黄タンパク質メチルトランスフェラーゼ活性の増大、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増大、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性の増大、またはその任意の組み合わせを有し、かつここで非自然の水素資化微生物は、Ｈ２／ＣＯｘ基質を代謝して、親の水素資化微生物よりも高いレベルでメチオニンを生成する。特定の実施形態では、調節解除されたＭＭＰ１３５９、ＭＭＰ１３５８、またはその両方を発現する非自然の水素資化微生物は、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性の低下、ピルビン酸キナーゼ活性の増大、またはその両方を有する。特定の他の実施形態では、調節解除されたＭＭＰ１３５９、ＭＭＰ１３５８、またはその両方を発現する非天然水素資化微生物は、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増大、ピルビン酸シンターゼの増大、アセチル−ＣｏＡシンターゼの増大、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性の増大、またはその任意の組み合わせを有する。
【００６３】
さらなる実施形態では、調節解除された内因性の硫黄同化ポリペプチド（調節解除されたＭＭＰ１３５９、ＭＭＰ１３５８、またはその両方など）を発現する非自然の水素資化微生物はまた、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性の減少、ピルビン酸キナーゼ活性の増大、またはそれらの任意の組み合わせを有する。なおさらなる実施形態では、調節解除された内因性の硫黄同化ポリペプチドを発現する非自然の水素資化微生物はまた、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性、５−メチルテトラヒドロ葉酸コリノイド／鉄硫黄タンパク質メチルトランスフェラーゼ活性の増大、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増大、ピルビン酸シンターゼの増大、アセチルＣｏＡシンターゼの増大、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性の増大、またはそれらの任意の組み合わせを有する。これらの実施形態のそれぞれにおいて、非自然の水素資化微生物は、親の水素資化微生物よりも高いレベルでメチオニンを生成するために、必要に応じてＨ２の存在下でＣＯｘ基質を代謝する。
【００６４】
本明細書において注記するとおり、いくつかのメチオニン生合成経路の酵素は、フィードバック調節を受け（例えば、ＭＭＰ１３５９、ＭＭＰ１３５８、アスパルトキナーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ）、これらの酵素をコードする遺伝子のいくつかは、抑制を受ける（例えば、ホモセリンデヒドロゲナーゼ）か、またはその両方である。したがって、本開示によって提供されるように、メチオニンの生成は、調節、抑制、またはその両方を緩和することによって改善され得る。
【００６５】
さらなる態様では、本開示は、非自然の水素資化微生物を提供し、ここでこの非自然の水素資化微生物が、メチオニンの生合成のための１つ以上の経路由来の１つ以上の調節解除及び／または脱抑制されたポリペプチドを含み、かつここで、この非自然の水素資化微生物が、必要に応じて、Ｈ２の存在下で、ＣＯｘ基質を代謝し、親の水素資化微生物よりも高いレベルでメチオニンを生成する。特定の実施形態では、調節解除されたＭＭＰ１３５９活性、ＭＭＰ１３５８活性、またはその両方を発現する非自然の水素資化微生物はまた、アスパルトキナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ（例えば、ｍｅｔＡ）、Ｏ−スクシニルホモセリンリアーゼ（例えば、ｍｅｔＢ）、または脱抑制されているか、調節解除されているか、もしくはその両方であるそれらの任意の組み合わせを有する。
【００６６】
メチオニンの過剰産生に加えて、微生物からの産生されたメチオニンの抽出または単離を避けることが有利であろう。したがって、本開示は、単離または精製方法が単純化されている培養培地中のメチオニン産生の増強方法を提供する。
【００６７】
さらに別の態様では、本開示は、調節解除されたＭＭＰ１３５９、ＭＭＰ１３５８、またはその両方を発現する非自然の水素資化性微生物を提供し、ここでこの非自然の水素資化微生物は、メチオニンのエクスポーターを発現または過剰発現し、かつここでこの非自然の遺伝子操作型または組み換えの水素資化微生物は、必要に応じてＨ２の存在下でＣＯｘ基質を代謝して、親の水素資化微生物よりも高いレベルでメチオニンを生成する。特定の実施形態では、非自然の水素資化微生物は、強い発現制御配列（例えば、ｎｉｆまたはｔｅｔプロモーター）に作動可能に連結されたＣｏｒｎｅｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｂｒｎＦＥまたはｍｅｔＴなどのメチオニンのエクスポーターを発現または過剰発現する（Ｔｒｏｔｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７：３７８６〜９４、２００５を参照のこと）。他の実施形態では、メチオニンの非自然の水素資化微生物のトランスポーター／インポーターがノックアウトまたは阻害される。
【００６８】
メチオニン生合成経路への炭素フラックスを確実にする別の方法は、他の競合するアミノ酸の産生を除去することである。本開示で提供されるように、水素資化性微生物は、１つ以上のアミノ酸の栄養要求株であり得る。
【００６９】
さらに別の態様では、本開示は、非自然の水素資化微生物を提供し、ここでこの非自然の水素資化微生物は１つ以上のアスパラギン酸経路アミノ酸の栄養要求株であり、かつここでこの非自然の水素資化微生物はＣＯｘ基質を、必要に応じてＨ２の存在下で代謝して、親の水素資化微生物よりも高いレベルでメチオニンを生成する。特定の実施形態において、非自然の水素資化性微生物は、ホモセリン栄養要求株、トレオニン栄養要求株、またはその両方である。特定の他の実施形態では、非自然の水素資化微生物は、リシン栄養要求株、イソロイシン栄養要求株、グリシン栄養要求株、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、非自然の水素資化微生物は、リシン栄養要求株、トレオニン要求株、またはその両方である。特定の実施形態では、調節解除された内因性硫黄同化ポリペプチドを発現する非自然の水素資化微生物はまた、リシン栄養要求株、トレオニン栄養要求株、グリシン栄養要求株、またはそれらの任意の組合せでもある。
【００７０】
さらなる実施形態では、調節解除された内因性の硫黄同化ポリペプチドを発現する非自然の水素資化微生物はまた、１つ以上のアスパラギン酸経路アミノ酸の栄養要求株でもある。なおさらなる実施形態では、調節解除された内因性の硫黄同化ポリペプチドを発現する非自然の水素資化微生物はまた、ホモセリン栄養要求株、トレオニン要求、またはそれらの任意の組合せでもある。さらに別の実施形態では、調節解除された内因性の硫黄同化ポリペプチドを発現する非自然の水素資化微生物はまた、リシン栄養要求株、イソロイシン栄養要求株、グリシン栄養要求株、またはそれらの任意の組み合わせでもある。なおさらなる実施形態では、調節解除された内因性硫黄同化ポリペプチドを発現する非自然の水素資化微生物はまた、リシン栄養要求株、トレオニン栄養要求株、またはその両方でもある。特定の実施形態では、調節解除された内因性の硫黄同化ポリペプチドを発現する非自然の水素資化微生物はまた、リシン栄養要求株、トレオニン栄養要求株、グリシン栄養要求株、またはそれらの任意の組合せでもある。
【００７１】
時には、メチオニン経路の一部である１つ以上の生合成酵素を単に過剰発現させることは、本開示の水素資化微生物において有用であろう。さらなる態様において、本開示は、メチオニンの生合成のための１つ以上の経路からポリペプチドを過剰発現する非自然の水素資化微生物を提供し、ここで非自然の水素資化微生物はＣＯｘ基質を、必要に応じてＨ２の存在下で代謝し、親の水素資化微生物よりも高いレベルでメチオニンを生成する。
【００７２】
さらなる実施形態では、調節解除された内因性の硫黄同化ポリペプチドを発現する非自然の水素資化微生物はまた、メチオニンの生合成のための１つ以上の経路からポリペプチドを過剰発現もする。特定のさらなる実施形態では、調節解除された内因性の硫黄同化ポリペプチドを発現する非自然の水素資化微生物は、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼもしくはその両方を過剰発現するか；またはホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼもしくはその両方を過剰発現するか；またはアスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドを過剰発現する。
【００７３】
微生物の生物体における外因性または異種の核酸の発現のための組換え法は、当該技術分野で周知である。そのような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ（１９９９）の記載に見出され得る。例示的な発現されるべき外因性のタンパク質または酵素としては、メチオニン生合成に関与するもの（例えば、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ、Ｏ−スクシニルホモセリンリアーゼ、シスタチオニンγ−シンターゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ、シンターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼ（コバラミン依存性または非依存性）、もしくはそれらの任意の組み合わせ）、またはメチオニン生合成経路への炭素フアックスに影響する酵素（例えば、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸シンターゼ、アセチル−ＣｏＡシンターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、またはそれらの任意の組み合わせ）が挙げられる。酵素またはその機能的フラグメントをコードする核酸分子に対する遺伝的な改変は、天然に存在する状態から改変されている組換え細胞に生化学的または代謝的能力を付与し得る。
【００７４】
本開示の任意の水素資化微生物を、少なくとも１つの外因性核酸を含むように形質転換して、宿主に新たな活性または増強された活性（例えば、酵素活性）を付与してもよいし、または、当該技術分野で公知の任意の種々の方法を使用して、内因性の遺伝子機能を取り除くか、または実質的に低減するように遺伝子的に改変してもよい。水素資化微生物、例えばメタン生成古細菌における異種核酸分子の転移及び発現のための遺伝的ツールは、当該技術分野で公知である（例えば、Ｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：７４５、２００５；Ｌｅｉｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．３５：５７７、２０１１を参照のこと）。例えば、ＤＮＡ送達のため（Ｄｏｄｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．７６：５６４４、２０１０；Ｍｅｔｃａｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：２６２６，１９９７）、シャトルベクターについて（Ｇａｒｄｎｅｒ及びＷｈｉｔｍａｎ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５２：１４３９、１９９９；Ｍｅｔｃａｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、異種遺伝子の調節された発現について（Ｌｉｅ及びＬｅｉｇｈ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：５３０１、２００２；Ｃｈａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：５９６，２００７；Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈａｅａ  ２：１９３，２００８）、及びノックインまたはノックアウト遺伝子交換について（Ｍｏｏｒｅ及びＬｅｉｇｈ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７：９７２，２００５；Ｐｒｉｔｃｈｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．７０：１４２５，２００４）、ツールが利用可能である。したがって、水素資化微生物において内因性の遺伝子機能を不活性化、ノックアウト、または欠失させるために様々な方法を使用してもよい。
【００７５】
特定の実施形態では、プロモーター、コドン最適化、またはその両方を、宿主の水素資化微生物中のアミノ酸生合成経路酵素をコードする外因性の核酸分子の高い構成的発現のために使用してもよい。宿主の水素資化微生物（例えば、メタン生成古細菌）中の外因性核酸分子の調節された発現もまた利用されてもよい。特定の実施形態では、アミノ酸生合成酵素をコードする外因性核酸分子の調節された発現が、非自然のまたは組換えの水素資化微生物の増殖速度を最適化するために望ましい場合がある。Ｈ２／ＣＯｘ基質の存在に対する応答のためのアミノ酸生合成酵素をコードする核酸分子の制御された発現は、利用可能な様々な異なる供給源または比率のＨ２／ＣＯｘ基質に基づいて増殖を改善し得る。
【００７６】
本明細書に記載する場合、２つ以上の異種または外因性の核酸分子を、宿主細胞中に、別々の核酸分子として、複数の個別に制御される遺伝子として、ポリシストロン性核酸分子として、融合タンパク質をコードする単一の核酸分子として、またはそれらの任意の組み合わせとして導入してもよい。例えば、本明細書に開示されるとおり、ＣＯｘ基質を、必要に応じてＨ２の存在下で代謝する微生物は、メチオニン生合成経路の所望の酵素（例えば、アスパルトキナーゼ、アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ、Ｏ−スクシニルホモセリンリアーゼ、シスタチオニンγ−シンターゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼ）をコードする２つ以上の異種または外因性の核酸分子を発現するように改変してもよい。２つ以上の外因性核酸分子が、宿主Ｈ２／ＣＯｘ代謝微生物に導入される場合、２つ以上の外因性核酸分子は、単一の核酸分子として（例えば、単一のベクター上に）、別個のベクター上に、導入され、単一の部位または複数の部位で宿主染色体に組み込まれてもよい。参照される異種核酸分子またはタンパク質活性の数は、宿主細胞に導入される別個の核酸分子の数ではなく、核酸分子をコードする数またはタンパク質活性の数を指す。
【００７７】
例えば、水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）は、Ｈ２／ＣＯｘ基質（例えば、Ｈ２とＣＯ２、ＣＯまたはその両方）をメチオニンに、親の微生物よりもより高いレベルで利用、転換または代謝することができるポリペプチドを産生するように、組み換え的に形質転換されてもよい。本明細書に記載の任意の実施形態において、水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）は、必要に応じてＨ２の存在下で、ＣＯｘ基質を利用、変換または代謝することができるポリペプチドを産生するように組換え的に形質転換されてもよい。
【００７８】
さらなる実施形態では、調節解除された内因性の硫黄同化ポリペプチドを発現する非自然の水素資化微生物は、メチオニン生合成経路由来の１つ以上のポリペプチドをコードする外因性核酸分子をさらに含み、かつこの非自然の遺伝子操作型水素資化微生物は、本明細書に記載のように、親の水性資化微生物よりも高レベルでメチオニンを生成する。さらなる実施形態では、メチオニン生合成経路由来の１つ以上のポリペプチドは、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ（例えばｍｅｔＡ）、Ｏ−スクシニルホモセリンリアーゼ（例えば、ｍｅｔＢ）、シスタチオニンγ−シンターゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼ（コバラミン依存性または非依存性）、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。特定の実施形態では、第１の外因性核酸分子は、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、またはその両方をコードし、ここでこのホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、またはその両方は必要に応じて過剰発現されるか、調節解除されるか、またはその両方である。
【００７９】
特定の他の実施形態では、外因性核酸分子は、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、またはその両方をコードし、ここでこのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、またはその両方は、必要に応じて過剰発現されるか、調節解除されるか、またはその両方が過剰発現される。さらに別の実施形態では、第１の外因性核酸分子は、Ｅ．ｃｏｌｉのＴｈｒＡ（ＡＫ／ＨＤ−Ｉ）、Ｅ．ｃｏｌｉのＭｅｔＬ（ＡＫ／ＨＤ−ＩＩ）、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、またはそれらの組み合わせをコードし、ここでこのＡＫ／ＨＤ−Ｉ、ＡＫ／ＨＤ−ＩＩ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、またはそれらの組み合わせは、必要に応じて過剰発現されるか、調節解除されるか、または両方が過剰発現される。特定の実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉのＴｈｒＡ（ＡＫ／ＨＤ−Ｉ）は、調節解除変異体であり、ここでこのＡＫ／ＨＤ−Ｉはアミノ酸位置Ｇ３３０、Ｓ３４５、Ｓ３５２、及びＧ４３３のいずれか１つ以上で変異されている。
【００８０】
いくつかの実施形態では、調節解除された内因性の硫黄同化ポリペプチドを発現する非自然の遺伝子操作型水素資化微生物はさらに、メチオニン生合成経路由来の１つ以上のポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含み、さらに（ａ）ノックアウトされているかまたは活性が低下している１つ以上のリシン生合成経路ポリペプチド、（ｂ）ノックアウトされているかまたは活性が低下している１つ以上のトレオニン生合成経路ポリペプチド、（ｃ）ノックアウトされているかまたは活性が低下している１つ以上のグリシン生合成経路ポリペプチド、（ｄ）ノックアウトされているかまたは活性が低下している１つ以上のメチオニン分解経路ポリペプチド（例えば、ｍｅｔＫ）、または（ｅ）それらの任意の組合せを有する。特定の実施形態では、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンデヒドラターゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、またはそれらの任意の組み合わせをコードする核酸分子は、ノックアウトされているか、または低下した活性をコードする。
【００８１】
任意の上記の非自然の遺伝子操作型の水素資化微生物において、外因性核酸分子はゲノムに組み込まれるか、または外因性核酸分子は自己複製ベクター中にある。さらに、前述の任意の非自然の型水素資化性微生物において、非自然の水素資化微生物は、リシン栄養要求株、トレオニン栄養要求株、グリシン栄養要求株、またはそれらの任意の組み合わせである。
【００８２】
特定の態様では、本開示は、組換えの水素資化微生物を提供し、ここでこの組み換え水素資化微生物は、必要に応じてＨ２の存在下でＣＯｘ基質を代謝して、親の水素資化微生物よりも高いレベルでメチオニンを生成し、かつここでこの組換えの水素資化微生物は、外因性の硫黄同化ポリペプチドを含むポリペプチドを発現または過剰発現する。いくつかの実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、配列番号３、４、７または８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、配列番号３、４、７または８のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、ここでこのポリペプチドは、１つ以上のフィードバック阻害剤（例えば、メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニン）について調節解除されている。さらなる実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、配列番号１、２、５または６のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、ここでこのポリペプチドは、１つ以上のフィードバック阻害剤（例えば、メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニン）について調節解除されている。まださらなる実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、配列番号１、２、５または６のいずれか１つの相補体に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、ここでこのコードされたポリペプチドは、１つ以上のフィードバック阻害剤（例えば、メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニン）について調節解除されている。
【００８３】
いくつかの実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、自然突然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異、またはそれらの任意の組み合わせを含む変異体ＭＭＰ１３５９またはそのホモログもしくはオーソログである。いくつかの実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、自然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異、またはそれらの任意の組み合わせを含む変異体ＭＭＰ１３５８またはそのホモログまたはオーソログである。特定の実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、１つ以上のフィードバック阻害剤（例えば、メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニン）について調節解除されているＭＭＰ１３５９変異体またはそのホモログもしくはオーソログである。特定の実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、１つ以上のフィードバック阻害剤（例えば、メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニン）について調節解除されているＭＭＰ１３５８変異体またはそのホモログもしくはオーソログである。
【００８４】
いくつかの実施形態では、組み換え水素資化微生物はさらに、調節解除された内因性の硫黄同化ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、内因性の硫黄同化ポリペプチドは、配列番号４及び８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、内因性の硫黄同化ポリペプチドは、配列番号４または８のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含み、ここでこのポリペプチドは、１つ以上のフィードバック阻害剤（例えば、メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニン）について調節解除されている。さらなる実施形態では、内因性の硫黄同化ポリペプチドは、配列番号２または６のいずれか１つに対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、ここでこのポリペプチドは１つ以上のフィードバック阻害剤（例えば、メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニン）について調節解除されている。さらに別の実施形態では、内因性の硫黄同化ポリペプチドは、配列番号２及び６のいずれか１つの相補体に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、ここでこのポリペプチドは、１つ以上のフィードバック阻害剤（例えば、メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニン）について調節解除されている。
【００８５】
特定の実施形態において、組み換え水素資化微生物はさらに、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性、アスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする外因性核酸分子、またはその両方を含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、組み換え水素資化微生物は、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性を発現または過剰発現し、ここでこの組み換え水素資化微生物はＣＯｘ基質を必要に応じてＨ２の存在下で代謝して、親の水素資化微生物よりも高いレベルでメチオニンを生成する。特定の実施形態では、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性は、リシン、トレオニン、及びメチオニンの１つ以上によるフィードバック阻害に対して耐性であるアスパルトキナーゼ変異体である。他の実施形態では、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性は、自然突然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異、またはそれらの任意の組み合わせを含む変異体ｌｙｓＣ遺伝子によってコードされる。
【００８７】
さらなる実施形態では、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性は、トレオニン結合部位、リシン結合部位、リシン及びトレオニン結合部位、リシンまたはトレオニン結合部位以外の部位、またはそれらの任意の組み合わせにおける変異を含む変異体ｌｙｓＣ遺伝子によってコードされる。特定の実施形態では、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性は、トレオニン結合部位に変異を含む変異体ｔｈｒＡ遺伝子によってコードされる。他の実施形態では、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性は、メチオニン結合部位に変異を含む変異体ｍｅｔＬ遺伝子によってコードされる。
【００８８】
本開示のｌｙｓＣフィードバック耐性変異体に言及する場合、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２  ＬｙｓＣタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＦ１８８２２．１）のアミノ酸位置に対応する残基ナンバリングを参照のこと。例示的なトレオニン結合部位の変異としては、残基Ｉ２７２、Ｄ２７４、Ｇ２７７、Ｅ２７８、Ａ２７９、Ｄ２９４、Ｑ２９８、Ｎ３７２、Ｎ３７４、Ｉ３７５またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例示的なリシン結合部位の変異としては、残基Ｉ２９１、Ｉ２９３、Ｄ２９４、Ｔ３６１、Ｓ３８１、Ｅ３８２またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例示的なリシン及びトレオニン結合部位の変異は、残基Ｄ２９４である。例示的な、リシン及びトレオニン結合部位以外の部位の変異としては、残基Ｆ２８３、Ｎ２９９、Ｓ３０１、Ｓ３０２、Ｔ３０８、Ｔ３１１、Ｔ３３６、Ｇ３５９、Ｆ３６４、Ｍ３６５、Ｔ３８０、Ｒ３８４、Ｓ３８６またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。アスパルトキナーゼポリペプチドがそのキナーゼ活性を保持している条件であれば、任意の上述の変異の１つ以上が、本開示のアスパルトキナーゼに含まれてもよい。
【００８９】
いくつかの実施形態では、この組み換え水素資化微生物は、アスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第２の外因性核酸分子を含み、ここでこの組み換え水素資化微生物は、ＣＯｘ基質を、必要に応じてＨ２の存在下で同化して、親の水素資化微生物よりも高レベルでメチオニンを生成し得る。いくつかの実施形態では、第２の外因性核酸分子は、アスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドを過剰発現するか、またはこの第２の外因性核酸分子は、リシン、トレオニン及びメチオニンのうちの１つ以上によるフィードバック阻害に対して耐性の内因性アスパルトキナーゼ変異体などの調節解除された外因性アスパルトキナーゼ活性をコードする。いくつかの実施形態では、調節解除された外因性アスパルトキナーゼ活性は、変異のＥ．ｃｏｌｉのアスパルトキナーゼ遺伝子、例えば変異のアスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９６５７９．２）、変異したアスパルトキナーゼＩＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩＩタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＥ７７３７０．１）または変異したアスパルトキナーゼＩＩＩタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＥ７８０２６．１）によってコードされる。特定の実施形態では、調節解除された外因性アスパルトキナーゼ活性は、アミノ酸位置Ｇ３３０、Ｓ３４５、Ｓ３５２及びＧ４３３のうちの任意の１つ以上の位置において変異されているＥ．ｃｏｌｉアスパルトキナーゼＴｈｒＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９６５７９．２）によって提供されるか、またはアミノ酸位置Ｔ３４２において変異されている変異体Ｅ．ｃｏｌｉアスパルトキナーゼｌｙｓＣタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＥ７８０２６．１）によって提供される。他の実施形態では、調節解除された外因性、内因性またはそれらの両方のアスパルトキナーゼ活性は、自然突然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異またはそれらの任意の組み合わせをそれぞれ含む変異体ｔｈｒＡ遺伝子、ｍｅｔＬ遺伝子、ｌｙｓＣ遺伝子またはそれらの組み合わせによって、個々にコードされる。
【００９０】
さらなる実施形態では、外因性のアスパルトキナーゼ活性は、トレオニン結合部位、リシン結合部位、リシン及びトレオニン結合部位、リシンまたはトレオニン結合部位以外の部位、またはそれらの任意の組み合わせにおいて変異を含む変異体ｌｙｓＣ遺伝子によって個々にコードされる。例示的なトレオニン結合部位の変異体としては、残基Ｉ２７２、Ｄ２７４、Ｇ２７７、Ｅ２７８、Ａ２７９、Ｄ２９４、Ｑ２９８、Ｎ３７２、Ｎ３７４、Ｉ３７５またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。リシン結合部位の例示的な変異体としては、残基Ｉ２９１、Ｉ２９３、Ｄ２９４、Ｔ３６１、Ｓ３８１、Ｅ３８２またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。リシン及びトレオニン結合部位の例示的な変異体は、残基Ｄ２９４である。リシン及びトレオニン結合部位以外の部位の例示的な変異体としては、残基Ｆ２８３、Ｎ２９９、Ｓ３０１、Ｓ３０２、Ｔ３０８、Ｔ３１１、Ｔ３３６、Ｇ３５９、Ｆ３６４、Ｍ３６５、Ｔ３８０、Ｒ３８４、Ｓ３８６またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。アスパルトキナーゼポリペプチドがそのキナーゼ活性を保持することを条件であれば、上記変異のうちのいずれか１つ以上の変異体は、本開示のアスパルトキナーゼに含まれ得る。
【００９１】
他の態様では、本開示は、ピルビン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする外因性核酸分子、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする外因性核酸分子、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする外因性核酸分子、または低いホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性を必要に応じて有するそれらの任意の組み合わせを含む、組み換え水素資化微生物であって、Ｈ２／ＣＯｘ基質を同化して、親の水素資化微生物よりも高レベルでメチオニンを産生することができる組み換え水素資化微生物を提供する。特定の実施形態では、組み換え水素資化微生物は、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性の低下、ピルビン酸キナーゼ活性の増大またはそれらの両方を有する。特定の他の実施形態では、組み換え水素資化微生物は、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増大、ピルビン酸シンターゼの増大、アセチル−ＣｏＡシンターゼの増大、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性の増大またはそれらの任意の組み合わせを有する。
【００９２】
さらなる態様では、本開示は、メチオニンのエクスポーターをコードする外因性核酸分子を含む組み換え水素資化微生物であって、Ｈ２／ＣＯｘ基質を同化して、親の水素資化微生物よりも高レベルでメチオニンを産生することができる組み換え水素資化微生物を提供する。特定の実施形態では、組み換え水素資化微生物は、ｂｒｎＦＥまたはｍｅｔＴエクスポーターのような、メチオニンのエクスポーターをコードする外因性の核酸分子をさらに含む。他の実施形態では、メチオニンの非自然の水素資化微生物トランスポーター／インポーターはノックアウトされるか、または阻害される。
【００９３】
またさらなる態様では、本開示は、１つ以上のアスパラギン酸経路アミノ酸の生合成をノックアウトする遺伝子改変を含む、組み換え水素資化微生物であって、１つ以上のアスパラギン酸経路アミノ酸について栄養要求株であり、かつＨ２／ＣＯｘ基質を同化させて、親の水素資化微生物よりも高いレベルでメチオニンを産生し得るこの組み換え水素資化微生物を提供する。特定の実施形態では、組み換え水素資化微生物は、ホモセリン栄養要求株、トレオニン栄養要求株、グリシン栄養要求株、またはそれらの任意の組合せである。特定の他の実施形態では、組み換え水素資化微生物は、リシン栄養要求株、イソロイシン栄養要求株、グリシン栄養要求株、またはそれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態では、組み換え水素資化微生物は、リシン栄養要求株、トレオニン栄養要求株、グリシン栄養要求株、またはそれらの任意の組合せである。
【００９４】
特定のさらなる態様において、本開示は、メチオニンの生合成のための１つ以上の経路からのポリペプチドをコードする１つ以上の外因性核酸分子を含む組み換え水素資化微生物であって、この１つ以上のコードされたポリペプチドが過剰発現され、かつＣＯｘ基質を、必要に応じてＨ２の存在下で同化させて、親の水素資化微生物よりも高いレベルでメチオニンを生成し得る組み換え水素資化微生物を提供する。
【００９５】
特定の実施形態では、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、もしくはそれらの任意の組み合わせが過剰発現されるか；またはホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼもしくは両方が過剰発現されるか；またはアスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドが過剰発現される。
【００９６】
さらなる実施形態では、硫黄同化ポリペプチドをコードする外因性核酸分子を有する組み換え水素資化微生物はさらに、メチオニン生合成経路由来の１つ以上のポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含み、この組み換え水素資化微生物は、メチオニンを、本明細書に記載のように、親の水素資化微生物よりも高レベルで産生する。さらなる実施形態では、メチオニン生合成経路由来の１つ以上のコードされたポリペプチドは、アスパルトキナーゼ、アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンＯ−トランススクシニルトランスフェラーゼ（例えばｍｅｔＡ）、Ｏ−スクシニルホモセリンリアーゼ（例えば、ｍｅｔＢ）、シスタチオニンγ−シンターゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼ（コバラミン依存性または非依存性）、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。特定の実施形態では、第２の外因性核酸分子は、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、またはその両方をコードし、ここで、このホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、またはその両方は、必要に応じて過剰発現されるか、核酸発現制御配列に作動可能に連結されるか、調節解除されるか、またはそれらの組み合わせである。特定の他の態様において、外因性核酸分子は、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、またはその両方をコードし、ここでこのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、またはその両方は、必要に応じて過剰発現されるか、必要に応じて核酸制御配列に作動可能に連結されるか、調節解除されるか、またはそれらの任意の組み合わせである。
【００９７】
いくつかの実施形態では、硫黄同化ポリペプチドをコードする外因性核酸分子を有する組み換え水素資化微生物は、さらに、メチオニン生合成経路由来の１つ以上のポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含み、かつさらに（ａ）ノックアウトされているか、もしくは活性が低下している１つ以上のリシン生合成経路ポリペプチド（ｂ）ノックアウトされているか、もしくは活性が低下している１つ以上のトレオニン生合成経路ポリペプチド、（ｃ）ノックアウトされているか、もしくは活性が低下している１つ以上のグリシン生合成経路ポリペプチド、または（ｄ）それらの任意の組み合わせを有する。特定の実施形態では、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンデヒドラターゼ、トレオニンアルドラーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、またはそれらの任意の組み合わせをコードする核酸分子は、ノックアウトされるか、または活性の低下したジヒドロジピコリン酸シンターゼ変異体、ホモセリンキナーゼ変異体、トレオニンデヒドラターゼ変異体、トレオニンアルドラーゼ変異体、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ変異体、またはそれらの任意の組み合わせをコードする。
【００９８】
任意の上述の組み換え水素資化微生物において、第１の外因性核酸分子はゲノムに組み込まれているか、またはこの第１の外因性核酸分子は自己複製ベクター中にある。さらに、任意の上述の組み換え型水素資化微生物において、組み換えの水素資化微生物は、リシン栄養要求株、トレオニン栄養要求株、グリシン栄養要求株、またはそれらの任意の組み合わせである。
【００９９】
特定の実施形態において、本明細書に記載の水素資化微生物を遺伝子操作して、ＭＭＰ１３５９活性またはメチオニンフィードバック阻害耐性ＭＭＰ１３５９活性を有する変異体硫黄同化ポリペプチドを発現または過剰産生してもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の水素資化微生物を、遺伝子操作して、ＭＭＰ１３５８活性またはメチオニンフィードバック阻害耐性ＭＭＰ１３５８活性を有する変異体硫黄同化ポリペプチドを発現または過剰産生してもよい。特定の実施形態では、本明細書に記載の水素資化微生物を、遺伝子操作して、メチオニンフィードバック阻害耐性ＭＭＰ１３５９活性を有する変異体硫黄同化ポリペプチド及びメチオニンフィードバック阻害耐性ＭＭＰ１３５８活性を有する変異体硫黄同化ポリペプチドを発現または過剰産生してもよい。任意の上述の実施形態において、遺伝子操作された水素資化微生物はさらに、外因性メチオニンシンターゼ活性をコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで外因性メチオニンシンターゼを欠く親の細胞と比較して、細胞がメチオニンシンターゼ活性を過剰産生する。
【０１００】
例えば、ＭＭＰ１３５９に対応する活性を有する硫黄同化ポリペプチドを発現または過剰産生させるために、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｏｎｉｌｅ  ｔｉｅｄｊｅｉ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｌｉｐｏｃａｌｉｄｕｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ｔｅｐｉｄａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔａｔｏｘｙｄａｎｓ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｗｏｌｆｅｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂｉｕｍ  ｎａｒｕｇｅｎｓｅ、Ｏｒｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ、またはＳｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ  ｇｌｏｂｏｓｅ由来の１つ以上の遺伝子を、水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）に導入して、発現または過剰発現させてもよく、それによってＭＭＰ１３５９またはその機能的なフラグメントに対して相同であるポリペプチドを生成または過剰産生させ、これは、必要に応じて調節解除される（すなわち、メチオニンフィードバック阻害に耐性）。特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法のＭＭＰ１３５９ポリペプチドは、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ（ＮＣ＿０５７９１．１；ＭＭＰ  １３５９）Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ（ＮＣ＿００３５５２．１；ＯＲＦ  １８２１）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ（ＮＣ＿０１３６６５．１；ＯＲＦ  ０１３２）、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｏｎｉｌｅ  ｔｉｅｄｊｅｉ（ＮＣ＿０１８０２５．１；ＯＲＦ２５２５）、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｌｉｐｏｃａｌｉｄｕｓ（ＮＣ＿０１４２２０．１；ＯＲＦ０７３５）、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ（ＮＣ＿０１６８９４．１；ＯＲＦｃ２８０４０）、Ｔｅｐｉｄａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔａｔｏｘｙｄａｎｓ（ＮＣ＿０１９９５４．２；ＯＲＦ２７９４）、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｗｏｌｆｅｉ（ＮＣ＿００８３４６．１；ＯＲＦ１４４１）、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂｉｕｍ  ｎａｒｕｇｅｎｓｅ（ＮＣ＿０１５４９９．１；ＯＲＦ  ０２３０）、Ｏｒｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ（ＮＣ＿０１５１６０．１；ＯＲＦ  ３４１９）、またはＳｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ  ｇｌｏｂｏｓｅ（ＮＣ＿  ０１５１５２．１；ＯＲＦ００３２）由来である。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、硫黄同化ポリペプチドアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２由来のＭＭＰ１３５９アミノ酸配列に基づき、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９８８４７９．１に示される配列、またはその機能的なフラグメントに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一である。他の実施形態では、組み換えによってコードされたＭＭＰ１３５９は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９８８４７９．１に示される配列に対して、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、または同一であるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ＭＭＰ１３５９アミノ酸配列は、アミノ酸位置Ｄ４３９で変異した（例えば、アスパラギンに対して）Ｍ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９８８４７９．１）である。
【０１０２】
例えば、ＭＭＰ１３５８に対応する活性を有する硫黄同化ポリペプチドを発現または過剰産生するために、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｏｎｉｌｅ  ｔｉｅｄｊｅｉ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｌｉｐｏｃａｌｉｄｕｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ｔｅｐｉｄａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔａｔｏｘｙｄａｎｓ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｗｏｌｆｅｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂｉｕｍ  ｎａｒｕｇｅｎｓｅ、Ｏｒｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ、またはＳｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ  ｇｌｏｂｏｓｅ由来の１つ以上の遺伝子を、水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）の中に導入し、発現させるか、または過剰発現させ、それによってＭＭＰ１３５８またはその機能的フラグメントに相同である調節解除されたポリペプチドを産生または過剰産生してもよい。特定の実施形態では、本明細書中に開示される組成物及び方法の硫黄同化ポリペプチドは、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ（ＮＣ＿０５７９１．１；ＭＭＰ１３５８）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ（ＮＣ＿００３５５２．１；ＯＲＦ１８２２）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ（ＮＣ＿０１３６６５．１；ＯＲＦ０１３３）、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｏｎｉｌｅ  ｔｉｅｄｊｅｉ（ＮＣ＿０１８２５．１；ＯＲＦ２５２６）、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｌｉｐｏｃａｌｉｄｕｓ（ＮＣ＿０１４２２０．１；ＯＲＦ０７３６）、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ（ＮＣ＿０１６８９４．１；ＯＲＦｃ２８０３０）、Ｔｅｐｉｄａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔａｔｏｘｙｄａｎｓ（ＮＣ＿０１９９５４．２；ＯＲＦ２７９５）、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｗｏｌｆｅｉ（ＮＣ＿００８３４６．１；ＯＲＦ１４４０）、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂｉｕｍ  ｎａｒｕｇｅｎｓｅ（ＮＣ＿０１５４９９．１；ＯＲＦ  ０２３１）、Ｏｒｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ（ＮＣ  ０１５１６０．１；ＯＲＦ  ３４１８）、またはＳｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ  ｇｌｏｂｏｓｅ（ＮＣ＿０１５１５２．１；ＯＲＦ００３３）由来である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、硫黄同化ポリペプチドのアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２由来のＭＭＰ１３５８アミノ酸配列に基づき、かつＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９８８４７８．１に示される配列またはその機能的なフラグメントに対して、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８同一であるか、少なくとも９９％同一である。他の実施形態では、組み換えによってコードされたＭＭＰ１３５８は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９８８４７８．１に示される配列に対して、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、または同一であるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ＭＭＰ１３５８アミノ酸配列は、アミノ酸位置Ｇ１４で（例えば、グルタミン酸に対して）変異されたＭ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９８８４７８．１）である。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、硫黄同化ポリペプチドは、ＭＭＰ１３５９及びＭＭＰ１３５８の両方に対応する活性を有するように発現または過剰発現される。例えば、Ｔｅｒｍｏｔｏｇａ  ｔｈｅｒｍａｎｒｕｍまたはＴｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ｍｅｌａｎｅｓｉｅｎｓｉｓ由来の１つ以上の遺伝子を、水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）に導入し、発現させるか、または過剰発現させ、それによって、ＭＭＰ１３５９及びＭＭＰ１３５８に相同である調節解除ポリペプチド、またはその機能的なフラグメントを産生するか、または過剰産生させてもよい。その特定の実施形態では、本明細書中に開示される組成物及び方法の硫黄同化ポリペプチドは、Ｔｅｒｍｏｔｏｇａ  ｔｈｅｒｍａｎｒｕｍ（ＮＣ＿０１５７０７．１；ＯＲＦ０５２９）またはＴｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ｍｅｌａｎｅｓｉｅｎｓｉｓ（ＮＣ＿００９６２６．１；ＯＲＦ０７３３）由来である。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、硫黄同化ポリペプチドアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Ｔｅｒｍｏｔｏｇａ  ｔｈｅｒｍａｎｒｕｍまたはＴｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ｍｅｌａｎｅｓｉｅｎｓｉｓ由来のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０１５７０７．１；ＯＲＦ０５２９またはＮＣ＿００９６２６．１；ＯＲＦ０７３３のアミノ酸配列に基づき、かつＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０１５７０７．１；ＯＲＦ０５２９もしくはＮＣ＿００９６２６．１；ＯＲＦ０７３に示される配列、またはその機能的フラグメントと少なくとも７５％、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％である。他の実施形態では、組み換えによってコードされた硫黄同化ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０１５７０７．１；ＯＲＦ０５２９またはＮＣ＿００９６２６．１；ＯＲＦ０７３に示される配列に対して、宿主細胞にとってコドン最適化されるか、または同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１０６】
特定の実施形態では、本明細書に記載の水素資化性微生物は、硫黄同化ポリペプチドを発現または過剰産生するように遺伝子操作してもよく、かつ必要に応じてまたアスパルトキナーゼ（ＥＣ２．７．２．４）、アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．１１）、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．３１、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ（例えば、ｍｅｔＡ；ＥＣ２．３．１．４６）、Ｏ−スクシニルホモセリンリアーゼ（例えば、ｍｅｔＢ；ＥＣ２．５．１．４８）、シスタチオニンγ−シンターゼ（ＥＣ２．５．１．４８）、シスタチオニンβ−リアーゼ（ＥＣ４．４．１．８）、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ（ＥＣ２．５．１．４９）、ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．１．１．１０）、またはそれらの任意の組み合わせを発現または過剰産生するように遺伝子操作されてもよい。
【０１０７】
例えば、アスパルトキナーゼを発現または過剰産生させるために、Ｅ．ｃｏｌｉ（ｔｈｒＡ）、Ｅ．ｃｏｌｉ（ｍｅｔＬ）、Ｅ．ｃｏｌｉ（ｌｙｓＣ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ｌｙｓＣ）由来の１つ以上の遺伝子を、水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）に導入して発現または過剰発現させ、それにより、外因性アスパルトキナーゼまたはその機能的フラグメントを産生または過剰産生させてもよい。特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法に使用するためのアスパルトキナーゼポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＦ１８８２２．１）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＦ３０５７３．１）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉ  ＨＺ２５４（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦＤ００２９１．１）、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ  Ｍ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＤＣ４７５２２．１）、Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２亜株Ｗ３１１０  ｔｈｒＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９６５７９．２）；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２亜株Ｗ３１１０  ｍｅｔＬ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＥ７７３７０．１）；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２亜株Ｗ３１１０  ｌｙｓＣ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＥ７８０２６．１）に由来する。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、アスパルトキナーゼアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２亜株Ｗ３１１０由来のｔｈｒＡ、ｍｅｔＬまたはｌｙｓＣのアミノ酸配列に基づくものである。Ｗ３１１０は、それぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９６５７９．２、ＢＡＥ７７３７０．１またはＢＡＥ７８０２６．１に示される配列またはその機能的フラグメントと少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。他の実施形態では、組み換えによってコードされるアスパルトキナーゼは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９６５７９．２、ＢＡＥ７７３７０．１もしくはＢＡＥ７８０２６．１に示されている配列に対して、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、もしくは同一であるアミノ酸配列を有するか、またはこれらのアスパルトキナーゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の公知のアスパルトキナーゼポリペプチドのコンセンサス配列を含む。特定の実施形態では、アスパルトキナーゼのアミノ酸配列は、アミノ酸位置Ｇ３３０、Ｓ３４５、Ｓ３５２及びＧ４３３のうちのいずれか１つ以上の位置において変異されている（例えば、アスパラギン酸、フェニルアラニンまたはアルギニンに）Ｅ．ｃｏｌｉＴｈｒＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９６５７９．２）であるか、またはアミノ酸位置Ｔ３４２において変異されている（例えば、イソロイシンに）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬｙｓＣタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＥ７８０２６．１）である。
【０１０９】
特定の実施形態では、アスパルトキナーゼのアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２またはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２のアミノ酸配列に基づくものであり、かつそれぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＦ１８８２２．１またはＣＡＦ３０５７３．１に示される配列またはその機能的フラグメントと、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。他の実施形態では、組み換えによってコードされるアスパルトキナーゼは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＦ１８８２２．１、ＣＡＦ３０５７３．１、ＡＦＤ００２９１．１もしくはＡＤＣ４７５２２．１に示されている配列に対して、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、もしくは同一であるアミノ酸配列を有するか、またはこれらのアスパルトキナーゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の公知のアスパルトキナーゼポリペプチドのコンセンサス配列を含む。
【０１１０】
例えば、アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼを発現または過剰産生させるために、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ａｓｄ）またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２（ａｓｄ）由来の１つ以上の遺伝子を水素資化微生物（例えばメタン生成菌）に導入して、発現させるかまたは過剰発現させ、それによって外因性アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはその機能的フラグメントを産生または過剰産生してもよい。特定の実施形態では、本明細書中に開示される組成物及び方法における使用のためのアスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ４０５０４．１）またはＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ２３５１１．１）由来である。
【０１１１】
特定の実施形態では、アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２またはＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２のアミノ酸配列に基づき、かつそれぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ４０５０４．１またはＣＡＡ２３５１１．１に示される配列、またはその機能的フラグメントに対して、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。他の実施形態では、組み換えによってコードされたアスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ４０５０４．１もしくはＣＡＡ２３５１１．１に示される配列に対して宿主細胞にとってコドン最適化されているか、もしくは同一であるアミノ酸配列を有するか、またはこれらのアスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の公知のアスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチドのコンセンサス配列を含む。
【０１１２】
例えば、ホモセリンデヒドロゲナーゼを発現または過剰産生させるために、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ｈｏｍ）またはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ（ｈｏｍ）由来の１つ以上の遺伝子を、水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）に導入して発現または過剰発現させ、それにより、外因性ホモセリンデヒドロゲナーゼまたはその機能的フラグメントを産生または過剰産生させてもよい。特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法に使用するためのホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９８５７６．１）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＦ３１２５８．１）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉ  ＨＺ２５４（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦＤ００６２４．１）またはＭｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ  Ｍ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＤＣ４６９９０．１）に由来する。
【０１１３】
特定の実施形態では、ホモセリンデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２またはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２のアミノ酸配列に基づき、かつそれぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９８５７６．１またはＣＡＦ３１２５８．１に示されている配列またはその機能的フラグメントと、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。他の実施形態では、組み換えによってコードされるホモセリンデヒドロゲナーゼは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９８５７６．１、ＣＡＦ３１２５８．１、ＡＦＤ００６２４．１もしくはＡＤＣ４６９９０．１に示されている配列に対して宿主細胞にとってコドン最適化されているか、もしくは同一であるアミノ酸配列を有するか、またはこれらのホモセリンデヒドロゲナーゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の公知のホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドのコンセンサス配列を含む。
【０１１４】
例えば、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼを発現または過剰産生するために、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ｍｅｔＸ）またはＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ（ｍｅｔＸ）由来の１つ以上の遺伝子を水素資化微生物（例えばメタン生成菌）に導入して、発現させるかまたは過剰発現させ、それによって外因性ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼまたはその機能的フラグメントを産生または過剰産生する。特定の実施形態では、本明細書中に開示される組成物及び方法における使用のためのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＡＴＣＣ１３０３２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０６０３５．１）またはＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９０９６（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ８６２８６．１）由来である。
【０１１５】
特定の実施形態では、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２またはＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓのアミノ酸配列に基づき、かつ、それぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０６０３５．１またはＡＡＢ８６２８６．１に示される配列またはその機能的フラグメントと少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一である。他の実施形態では、組み換えによりコードされるホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０６０３５．１もしくはＡＡＢ８６２８６．１に示される配列に対して、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、もしくは同一であるアミノ酸配列を有するか、またはこれらのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の公知のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼポリペプチドのコンセンサス配列を含む。
【０１１６】
例えば、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼを発現または過剰産生させるために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ｍｅｔＡ）またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ（ｍｅｔＡ）由来の１つ以上の遺伝子を水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）に導入して、発現させるかまたは過剰発現させ、それによって外因性ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼまたはその機能的フラグメントを産生するか、または過剰産生してもよい。特定の実施形態では、本明細書中に開示される組成物及び方法における使用のためのホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼポリペプチドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２株（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ３２６５４．１）またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ株ＮＣＴＣ１１１６８（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＬ３５８２０．１）由来である。
【０１１７】
特定の実施形態では、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２またはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２のアミノ酸配列に基づき、かつそれぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９８５７６．１、またはＣＡＦ３１２５８．１に示される配列、またはその機能的なフラグメントに対して少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一である。他の実施形態では、組み換えによりコードされるホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９８５７６．１、ＣＡＦ３１２５８．１、ＡＦＤ００６２４．１もしくはＡＤＣ４６９９０．１に示される配列に対して、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、もしくは同一であるアミノ酸配列を有するか、またはこれらのホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の公知のホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼポリペプチドのコンセンサス配列を含む。
【０１１８】
例えば、Ｏ−スクシニルホモセリンリアーゼを発現または過剰産生させるために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ｍｅｔＢ）またはＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ（ｍｅｔＢ）由来の１つ以上の遺伝子を、水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）に導入して、発現させるかまたは過剰発現させてもよく、それにより、外因性Ｏ−スクシニルホモセリンリアーゼまたはその機能的フラグメントを産生または過剰産生してもよい。特定の実施形態では、本明細書中に開示される組成物及び方法において使用するためのＯ−スクシニルホモセリンリアーゼポリペプチドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２株（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ２４１６７．１）またはＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ＡＴＣＣ  ７００３９２株（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ０７１７６．１）由来である。
【０１１９】
特定の実施形態において、Ｏ−スクシニルホモセリンリアーゼアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたはＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉのアミノ酸配列に基づき、かつそれぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ２４１６７．１またはＡＡＤ０７１７６．１に示される配列、またはその機能的なフラグメントに対して少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一である。他の実施形態では、組み換えによってコードされたＯ−スクシニルホモセリンリアーゼは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ２４１６７．１もしくはＡＡＤ０７１７６．１に示される配列に対して、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、もしくは同一であるアミノ酸配列を有するか、またはこれらのＯ−スクシニルホモセリンリアーゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の公知のＯ−スクシニルホモセリンリアーゼポリペプチドのコンセンサス配列を含む。
【０１２０】
例えば、シスタチオニンβ−リアーゼを発現または過剰産生させるために、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ｍｅｔＣ）またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ｍｅｔＣ）由来の１つ以上の遺伝子を、水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）に導入して、発現させるかまたは過剰発現させ、それによって外因性シスタチオニンβ−リアーゼまたはその機能的フラグメントを産生するか、または過剰産生してもよい。特定の実施形態では、本明細書中に開示される組成物及び方法における使用のためのシスタチオニンβ−リアーゼポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＫ６９４２５．１）またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ２４１５８．１）由来である。
【０１２１】
特定の実施形態では、シスタチオニンβ−リアーゼアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのアミノ酸配列に基づき、かつそれぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＫ６９４２５．１またはＡＡＡ２４１５８．１に示される配列、またはその機能的なフラグメントと、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一である。他の実施形態では、組み換えによってコードされるシスタチオニンβ−リアーゼは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＫ６９４２５．１もしくはＡＡＡ２４１５８．１に示される配列に対して、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、もしくは同一であるアミノ酸配列を有するか、またはこれらのシスタチオニンβ−リアーゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の公知のシスタチオニンβ−リアーゼポリペプチドのコンセンサス配列を含む。
【０１２２】
特定の実施形態では、水素資化微生物は、直接、Ｈ２Ｓなどの硫黄源をメチオニン生合成経路に直接組み込んでもよい。水素資化微生物によって産生されるか、または水素資化微生物による使用のために存在する任意の硫化物は、ホモシステイン生合成経路に入ってもよく、ここでＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼがＯ−アセチルホモセリンにＨ２Ｓを取り込んでホモシステインを産生し、これはメチオニンシンターゼによってメチオニンにさらに変換されてもよい（コバラミン依存性または非依存性）。
【０１２３】
例えば、本明細書中に記載されるような水素資化微生物を遺伝子操作して、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ（ＥＣ２．５．１．４９）を発現または過剰産生してもよく、これは、Ｈ２ＳをＯ−アセチル−ホモセリンに組み込んで、ホモシステインを産生してもよく、必要に応じて遺伝子操作して、コバリン依存性メチオニンシンターゼ（ＥＣ２．１．１．１３）またはコバリン非依存性メチオニンシンターゼ（ホモシステインメチルトランスフェラーゼとしても知られている）（ＥＣ２．１．１．１４）を発現または過剰産生して、ホモシステインをメチオニンに変換してもよい。
【０１２４】
Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼを発現または過剰産生させるために、本開示の水素資化微生物（例えば、非天然または組み換えのメタン生成物）に、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉまたはＭｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ由来の遺伝子に基づく１つ以上の遺伝子を導入して、発現させるかまたは過剰発現させ、それによって外因性Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼまたはその機能的フラグメントを産生または過剰産生してもよい。特定の実施形態では、本明細書中に開示される組成物及び方法において使用するためのＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドは、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉ  ＨＺ２５４（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦＤ００３５０．１）、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ  Ｍ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＤＣ４７４１９．１またはＡＤＣ４６９９８．１）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｔ１９（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＥＲＭ４８６６４．１）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ａ株、ＡＴＣＣ３５０２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＬ８３４１７．１）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｍｅｙｅｒｉ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｐ９４８９０．１）、またはＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ２．４．１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿３５１９０１．２）由来であり得る。
【０１２５】
特定の実施形態において、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉ  ＨＺ２５４またはＭｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ  Ｍ１のアミノ酸配列に基づき、かつそれぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦＤ００３５０．１またはＡＤＣ４７４１９．１に示される配列、またはその機能的なフラグメントに対して少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一である。他の実施形態では、組み換えによってコードされたＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦＤ００３５０．１、ＡＤＣ４７４１９．１、ＡＤＣ４６９９８．１、ＣＣＬ８３４１５．１、もしくはＣＡＬ８３４１７．１に示される配列に対して、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、もしくは同一であるアミノ酸配列を有するか、またはこれらのＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の公知のＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドのコンセンサス配列を含む。
【０１２６】
任意の前述のＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼにおいて、非自然または組み換えの水素資化微生物は、本明細書に記載のように、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼを発現、過剰発現または過剰産生するようにさらに遺伝子操作される。
【０１２７】
さらなる実施形態では、本明細書に記載の水素資化微生物は、コバラミン依存性メチオニンシンターゼ（ＥＣ２．１．１．１３）またはコバラミン非依存性メチオニンシンターゼ（ホモシステインメチルトランスフェラーゼとしても知られる）（ＥＣ２．１．１．１４）を発現または過剰産生するように遺伝子操作されてもよく、必要に応じてまた、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼを発現または過剰産生するように遺伝子操作されてもよい。
【０１２８】
例えば、コバラミン依存性メチオニンシンターゼを発現または過剰産生させるために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ｍｅｔＨ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ｍｅｔＨ）、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の１つ以上の遺伝子を、水素資化微生物（例えば、非自然のメタン資化細菌）に導入して、発現するかまたは過剰発現させ、それによって、外因性コバラミン依存性メチオニンシンターゼまたはその機能的フラグメントを産生または過剰産生してもよい。特定の実施形態では、本明細書中に開示される組成物及び方法での使用のためのコバラミン依存性メチオニンシンターゼポリペプチドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ７６８３２．１）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９８９００．１）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｆ６６５（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＥＲＭ５１５５９．１）、またはＰｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＧＢ−１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢＹ９７８８５．１）由来である。
【０１２９】
特定の実施形態では、コバラミン依存性メチオニンシンターゼアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２のアミノ酸配列に基づき、かつＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ９８９００．１に示される配列に対して少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一である。他の実施形態では、組み換えによってコードされるコバラミン依存性メチオニンシンターゼは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ７６８３２．１、ＢＡＢ９８９００．１、ＥＲＭ５１５５９．１もしくはＡＢＹ９７８８５．１に示される配列に対して、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、もしくは同一であるアミノ酸配列を有するか、またはこれらのコバラミン依存性メチオニンシンターゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の公知のコバラミン依存性メチオニンシンターゼポリペプチドのコンセンサス配列を含む。
【０１３０】
他の実施形態では、例えば、メチオニンシンターゼを発現または過剰産生するために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ｍｅｔＥまたはｍｅｔＢ１２）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ｍｅｔＥ）またはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ（ｍｅｔＥ）由来の１つ以上の遺伝子を、水素資化微生物（例えば、非自然のまたは組み換えメタン生成菌）に導入して発現または過剰発現させ、それにより、外因性コバラミン非依存性メチオニンシンターゼまたはその機能的フラグメントを産生または過剰産生させてもよい。特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法に使用するためのコバラミン非依存性メチオニンシンターゼポリペプチドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ７６８３２．１）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＦ１９８４５．１）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９８７５２１．１）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉ  ＨＺ２５４（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦＤ００４２１．１）またはＭｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ  Ｍ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＤＣ４７４７０．１）に由来する。
【０１３１】
特定の実施形態では、コバラミン非依存性メチオニンシンターゼのアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２またはＭｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ  Ｍ１のアミノ酸配列に基づくものであり、かつ、それぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９８７５２１．１またはＡＤＣ４７４７０．１に示されている配列またはその機能的フラグメントと少なくとも７５％、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。他の実施形態では、組み換えによってコードされるコバラミン非依存性メチオニンシンターゼは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ７６８３２．１、ＣＡＦ１９８４５．１、ＮＰ＿９８７５２１．１、ＡＦＤ００４２１．１もしくはＡＤＣ４７４７０．１に示される配列に対して、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、もしくは同一であるアミノ酸配列を有するか、またはこれらのコバラミン非依存性メチオニンシンターゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の公知のコバラミン非依存性メチオニンシンターゼポリペプチドのコンセンサス配列を含む。
【０１３２】
上記メチルトランスフェラーゼの実施形態のいずれにおいても、非自然または組み換えの水素資化微生物は、本明細書に記載されるように、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼを発現、過剰発現または過剰産生するようにさらに遺伝子操作される。
【０１３３】
任意の上述の非自然または組み換えの水素資化微生物の実施形態において、本開示は、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｃｕｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｆｏｌｌｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｌａｃｉｎｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｌｏｂｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｌｓｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、ＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓまたはＭｅｔｈａｎｏｔｏｒｒｉｓなどのメタン生成古細菌である水素資化微生物を提供する。
【０１３４】
任意の上述の非自然または組み換えの水素資化微生物の実施形態において、本開示は、特定のメタン生成古細菌種である水素資化微生物を提供する。例示的なメタン生成古細菌種は、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｙａｎｔｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｆｌｕｖｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｓｐａｎｏｌａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｌｕｓｔｒｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｉｄｉｄｕｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ａｒｂｏｒｉｐｈｉｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｏｌｌｅｙａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｗｏｅｓｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｗｏｌｉｎｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ａｒｖｏｒｙｚａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｆｌｅｘｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｗｏｌｆｅｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｏｃｉａｂｉｌｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｂａｖａｒｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｃｈｉｋｕｏｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｓｕｂｍａｒｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｆｒｉｇｉｄｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｌｉｍｉｎａｔａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｌａｔｔｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｅｎｄｏｓｙｍｂｉｏｓｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｌｉｍｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｐｅｔｒｏｌｅａｒｉｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ  ｂｏｏｎｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｃｏｎｃｉｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｈａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｐｅｌａｇｉｃａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｍｏｂｉｌｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｎｎｉｅｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｏｌｔａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｉｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｖｅｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆｅｒｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ及びＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｕｌｃａｎｉｕｓなどである。
【０１３５】
任意の上述の非自然または組み換えの水素資化微生物の実施形態において、本開示は、シトクロムを産生するか、またはシトクロムを産生しないメタン生成古細菌を含む水素資化微生物を提供する。シトクロムを産生しない例示的なメタン生成古細菌としては、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓまたはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｎｎｉｅｌｉｉが挙げられる。シトクロムを産生する例示的なメタン生成古細菌は、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉまたはＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉである。
【０１３６】
Ｈ２／ＣＯｘ基質
水素産生は、一連の改質、コンディショニング及び分離ステップを含み、ここで、これらのステップのいくつか（例えば、水蒸気改質、自己熱改質、高温シフト、低温シフト、ＣＯ２スクラビング及び圧力スイング吸着）は、それ自体で、または１つ以上の他のガス流と組み合わさって、本開示の水素資化微生物及び方法の原料として有用なＨ２／ＣＯｘ基質を提供し得る、原料を提供し得る。特定の実施形態では、本開示の微生物は、必要に応じてＨ２の存在下でＣＯｘ基質を利用し得る。
【０１３７】
背景として、水素産生は、高温水性ガスシフト（ＨＴＳ）反応、低温水性ガスシフト（ＬＴＳ）反応またはそれらの両方と組み合わせて、合成ガスなどのＨ２／ＣＯｘ基質を産生するための単一ステップまたはマルチステップの改質、部分酸化またはガス化を含んでもよい。いくつかの方法では、分子篩と共に圧力スイング吸着（ＰＳＡ）を使用することによって、酸化炭素を除去し、それによって、様々な量の二酸化炭素（ＣＯ２）、一酸化炭素（ＣＯ）及びメタン（ＣＨ４）と一緒にいくらかの残留Ｈ２ガスを含むテールガスから、実質的に純粋な水素（Ｈ２）ガス流が分離される。特定の実施形態では、ガス（例えば、合成ガス）をＰＳＡに供する前に、二酸化炭素を必要に応じてスクラブしてもよい。使用される合成ガス産生プロセス、及び二酸化炭素がスクラブされる否かに応じて、テールガスは、様々な比のＨ２、ＣＯ２、ＣＯ及びＣＨ４を含むであろう。いくつかの実施形態では、本開示の方法に使用するためのＨ２／ＣＯｘ基質は、ＰＳＡテールガス及びＨ２ガスの混合物を含むガス流混合物である。
【０１３８】
例えば、ＨＴＳと組み合わせたメタンの水蒸気改質は、いくらかのＣＨ４（約５％）及びごくわずかのＣＯまたはＣＯなしの状態で、主にＨ２（約７５％）及びＣＯ２（約２０％）を有するガス流を産生するであろう。別の例では、ＬＴＳと組み合わせたメタンの水蒸気改質は、ある程度のＣＯ２（約５％）及びＣＨ４（約１％）と共に、主にＨ２（約７５％）及びＣＯ（約１０％）を有するガス流を産生するであろう。なお別の例では、ＨＴＳ及びＰＳＡと組み合わせたメタンの水蒸気改質は、かなりの量のＣＯ（約１０％）及びＣＨ４（約１５％）と共に、主にＨ２（約３０％）及びＣＯ２（約４５％）を有するテールガスを産生するであろう。この最後の実施形態では、ＣＯ２スクラビングのステップが含まれる場合、テールガスは、わずかなＣＯ２（約１％）と共に、主にＨ２（約５０％）、ＣＨ４（約３０％）及びＣＯ（約２０％）を含むであろう。特定の実施形態では、ＰＳＡテールガスを、ＰＳＡから産生されるパイプラインＨ２と混合して、目的のＨ２／ＣＯｘ基質、例えば約５：１、４：１、３：１、２：１または１：１のＨ２：ＣＯ２比を有するＨ２／ＣＯｘ基質を産生する。
【０１３９】
メタンの水蒸気改質は、それぞれ約１：７〜約１：１５の範囲のＣＯ２とＨ２との原料比を提供し得、ここで他の成分は、ＣＯ、ＣＨ４及びＨ２Ｏを含んでもよい。あるいは、メタンは、ＣＯ２で改質されてもよく、これは、乾燥改質と称される。メタンの乾燥改質は、それぞれ約１：５〜約１：１５の範囲のＣＯ２とＨ２との原料比を提供し得、ここで他の成分は、ＣＯ、ＣＨ４及びＨ２Ｏを含んでもよい。
【０１４０】
部分酸化改質（接触または非接触）及び自己熱改質は、水の代わりに天然ガスの共反応物質として酸素を使用する。部分酸化改質及び自己熱改質は、約１：２０であるＣＯ２とＨ２との原料比を提供し得、ここで他の成分は、ＣＯ、ＣＨ４及びＨ２Ｏを含んでもよい。
【０１４１】
ガス化、すなわち、空気または酸素を有する材料（例えば、天然ガス液、ナフサ、ビチューメン、石炭、バイオマスなど）を含有する炭素の部分酸化は、本開示の水素資化微生物及び方法と共に使用するためのＨ２／ＣＯｘ原料を提供し得る。例えば、石炭のガス化は、それぞれ約１：１．１〜約１：１１の範囲のＣＯ２とＨ２との原料比を提供し、ここで他の成分は、ＣＯ、ＣＨ４、Ｎ２及びＨ２Ｏを含んでもよい。
【０１４２】
アンモニア合成は、一連の改質及びコンディショニングステップを含み、これらのステップの４つ（水蒸気改質、自己熱改質、高温シフト、低温シフト）は、本開示の水素資化微生物及び方法と共に使用するためのＨ２／ＣＯｘ原料を提供し得る。これらの異なる各プロセスでは、それぞれ約１：３〜約１：１０の範囲のＣＯ２とＨ２との原料比が提供され、ここで他の成分は、ＣＯ、ＣＨ４、Ｎ２及びＨ２Ｏを含んでもよい。
【０１４３】
メタノール合成は、低温改質、水蒸気改質及び自己熱改質というステップを含み、これらはすべてが、本開示の水素資化微生物及び方法と共に使用するためのＨ２／ＣＯｘ原料を提供し得る。これらの３つの各プロセスでは、それぞれ約１：７〜約１：１２の範囲のＣＯ２とＨ２との原料比がもたらされ、ここでは、他の成分は、ＣＯ、ＣＨ４及びＨ２Ｏを含んでもよい。
【０１４４】
総合製鋼所は、コークス炉（石炭からコークスを作るため）、高炉（銑鉄を作るため）及び酸素炉（鋼を作るため）を含む様々なプロセスを組み合わせる。特定の実施形態では、総合製鋼所における直接還元は、銑鉄を作るための還元剤として（コークスの代わりに）改質天然ガスを使用する。これらの各炉及び直接還元改質（炉頂ガスを産生する）は、それぞれ約８：１（高炉または酸素炉から）〜約１：３２（コークス炉から）の範囲のＣＯ２とＨ２との原料比を生じ得、ここで他の成分は、ＣＯ、ＣＨ４、Ｃ２Ｈ６、Ｃ３Ｈ８、Ｎ２及びＨ２Ｏを含んでもよい。
【０１４５】
Ｈ２／ＣＯｘ基質の任意の上述の供給源において、このようにして産生されたＨ２／ＣＯｘ原料を、任意の他の産生されたＨ２／ＣＯｘ原料、またはＨ２、ＣＯ２、ＣＯもしくはそれらの任意の組み合わせと混合して、目的のＨ２／ＣＯｘ基質、例えば約４：１または３：１のＨ２：ＣＯ２比を有する基質を産生してもよい。特定の実施形態では、例えば、メタン生成菌と共に使用するためのＨ２／ＣＯｘ基質は、約５：１、４：１、３：１、２：１または１：１のＨ２：ＣＯ２比を含み、必要に応じて、ＣＯの総量は、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．９％、０．９％、１．０％、２．０％、３．０％、４．０％、５．０％、６．０％、７．０％、８．０％、９．０％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％または２０％以下である。他の実施形態では、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍと共に使用するためのＨ２／ＣＯｘ基質は、約５：１、４：１、３：１、２：１または１：１のＨ２：（ＣＯ２＋ＣＯ）比を含み、必要に応じてＣＯの総量は、少なくとも約１．０％、５．０％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える。任意のこれらの実施形態において、Ｈ２／ＣＯｘ基質は、ＰＳＡテールガスとＨ２ガスとの混合物を含んでもよい。
【０１４６】
上述の非自然または組み換えの水素資化微生物の実施形態において、本開示は、Ｈ２と、ＣＯ２またはＣＯまたはそれらの両方と、必要に応じて本明細書に記載される様々な他の成分とからなるＨ２／ＣＯｘ基質を利用、代謝、酸化または変換する水素資化微生物を提供する。特定の実施形態では、Ｈ２／ＣＯｘ基質は、Ｈ２、ＣＯ２及びＣＯ（ＣＯがＣＯ２よりも多い）であり、本明細書に記載される様々な他の成分を必要に応じて含む。さらなる実施形態では、Ｈ２／ＣＯｘ基質は、Ｈ２、ＣＯ２及びＣＯ（ＣＯ２がＣＯよりも多い）であり、本明細書に記載される様々な他の成分を必要に応じて含む。なおさらなる実施形態では、Ｈ２／ＣＯｘ基質は、Ｈ２、ＣＯ２及びＣＯ（ＣＯがＣＯ２及びＨ２の両方よりも多い）であり、本明細書に記載される様々な他の成分を必要に応じて含む。特定の状況では、Ｈ２／ＣＯｘを代謝する微生物は、エネルギー源としてＨ２及び炭素源としてＣＯｘ（ｘは１または２である）を使用し得、またはエネルギー源としてＨ２及びＣＯｘならびに炭素源としてＣＯｘを使用し得る。
【０１４７】
任意の上述の非自然または組み換えの水素資化微生物の実施形態において、本開示は、Ｈ２／ＣＯｘ基質を提供し、これは例えば、天然ガスもしくは液体炭化水素（例えば、エタン、プロパン、ナフサ）の水蒸気改質、乾燥改質、自己熱改質、接触部分酸化もしくは部分酸化によって、水素産生において、アンモニア合成において、メタノール合成において、製鋼によって、または石炭、ナフサ、残油、バイオマスもしくは廃棄物のガス化によって産生されてもよい。特定の実施形態では、任意の上述の改質方法によって産生されるＨ２／ＣＯｘ基質は、水性ガスシフト反応によってさらにコンディショニングされ得る。加えて、任意の上述の方法によって産生される１つ以上のガス流を、水素、一酸化炭素または二酸化炭素の他の供給源と混合して、Ｈ２／ＣＯｘ基質を産生または作製してもよく、これにはパイプライン水素、パイプライン二酸化炭素、二酸化炭素スクラバーオフガス、煙道ガス、エタンクラッカーオフガス、リフォーマーオフガスまたは塩素合成オフガスを含む。いくつかの実施形態では、ＣＯ２とＨ２の原料比は、それぞれ約１：５０〜約１０：１の範囲である。さらなる実施形態では、ＣＯ２とＨ２との原料比は、それぞれ約１：３〜約１：５の範囲である。
【０１４８】
培養方法
様々な培養方法が、本明細書に記載される非自然または組み換えの水素資化微生物（例えば、細菌、メタン生成古細菌）のために使用され得る。例えば、バッチ培養または連続培養法によって、水素資化微生物を増殖させてもよい。特定の実施形態では、制御培養ユニット、例えば発酵槽、バイオリアクター、中空繊維膜バイオリアクター、気泡塔バイオリアクター、トリクルベッドバイオリアクターなどで、培養物を増殖させる。
【０１４９】
古典的なバッチ培養法は、培地の組成を培養開始時に設定し、培養プロセス中に外部改変を受けない閉鎖系である。したがって、培養プロセス開始時に、所望の水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）を培地に接種し、いかなる物質もこの系に追加せずに増殖または代謝の活動を生じさせる。一般に、「バッチ」培養は、炭素源、ガス原料及び培地成分の追加に関してバッチであり、廃ガスが排出可能であり、ｐＨなどの他の因子の制御の試みが多くの場合に行われる。バッチシステムでは、システムの代謝産物及びバイオマス組成物は、培養終了時まで絶えず変化する。バッチ培養物内では、細胞は、静的な遅滞期から高度の対数増殖期へ、そして最終的には増殖速度が低下または停止する静止期へと穏やかになる。未処置の場合、静止期の細胞は、最終的に死滅するであろう。対数成長期の細胞は、多くの場合、いくつかのシステムにおいて最終生成物または中間体の大量産生を担う。他のシステムでは、静止期または対数期後の産生が得られ得る。
【０１５０】
流加（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ）システムは、標準的なバッチシステムの変形である。流加培養プロセスは、培養が進行するにつれて基質及び潜在的な培地成分が漸増量で追加される改変型のバッチシステムを含む。異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向がある場合、及び培地中の基質の量を制限することが望ましい場合、流加システムが有用である。ガス基質の発酵では、システムは、（廃ガスを除去し得るので）ガス基質に関して連続的であり、流加は液体（培地）に関して連続的である。バッチ培養法及び流加培養法は一般的であり、当該技術分野で公知である（例えば、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第２版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ；Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：２２７，１９９２を参照のこと）。
【０１５１】
連続培養は、所定の培養培地をバイオリアクターに連続的に追加し、かつ同時に、処理のために（バイオマスまたは細胞の保持の有無にかかわらず）同量の馴化培地を除去する「開放」系である。連続培養は、一般に、細胞が主に対数増殖期にある、一定の高い液相密度に細胞を維持する。あるいは、連続培養は、原料及び栄養素を連続的に追加し、かつ有益な生成物、副生成物及び廃棄物を細胞集団から連続的に取り出し得る、バイオマス、細胞保持または細胞固定化を含んでもよい。細胞保持は、様々な方法によって、例えば、ろ過、遠心分離または沈降によって実施してもよい。細胞固定化は、天然材料及び／または合成材料から構成される広範な固体支持体を使用して実施してもよい。
【０１５２】
連続培養または半連続培養によって、細胞成長または最終生成物の濃度に影響を及ぼす１つの因子または任意の数の因子の調節が能になる。例えば、１つの方法は、限られた栄養素（例えば、炭素源、窒素レベル、水素レベル、リンレベル）を一定の比に維持して、他のすべてのパラメータの調節を可能にし得る。他のシステムでは、成長に影響を及ぼす多くの因子を連続的に改変し得る一方、培地混濁度によって測定される細胞濃度を一定に維持する。特定の実施形態では、水素資化生物のバイオマス成長を制限して、生成物対バイオマスの比を増大させる。連続培養プロセスのための栄養素及び成長因子を調節する方法、ならびに生成物形成速度を最大化にするための技術は、当該技術分野で周知である（Ｂｒｏｃｋ，１９８９を参照のこと）。
【０１５３】
液相バイオリアクター（例えば、撹拌タンク、充填層、一液相、二液相、中空糸膜）は当該技術分野で周知であり、水素資化微生物の成長に使用され得る。
【０１５４】
多相バイオリアクターを、本開示の方法に使用してもよい（例えば、気泡塔反応器、トリクルベッド反応器（固定床または充填床）、流動床反応器）。気泡塔は、ガスが泡形態で液体と接触するデバイスである。トリクルベッド反応器は、培養物を成長させるために、並流または向流の気体及び液体を使用する。流動床反応器は、固体を懸濁してそれを液体のように作用させるために十分な高速で、流体（気体または液体）を粒状固体材料に通過させることを含む。多相バイオリアクターの目的の１つは、液相及び気相を混合することであり、ここでは、物質移動及び化学反応の強さに応じて、気体は水素資化微生物によって、より多い程度またはより少ない程度まで消費される。様々な種類の多相バイオリアクターが当該技術分野で周知であり、かつ本開示の方法において水素資化微生物の成長に使用され得る。
【０１５５】
本開示に記載される水素資化微生物を、単離された純粋な培養物として、成長を支援し得る異種非水素資化微生物と共に成長させてもよいし、または１つ以上の異なる株もしくは種の水素資化微生物と組み合わせて混合培養物を生成してもよい。
【０１５６】
他の態様では、本開示は、メチオニンまたはメチオニン含有飼料添加物を産生するための方法であって、１つ以上のメチオニンを産生するために十分な時間にわたって、上述の非自然または組み換えの水素資化微生物のいずれかを培養することを含み、前記非自然または組み換えの水素資化微生物が：（ａ）親の水素資化微生物と比較して増大した活性を有する１つ以上の硫黄同化ポリペプチドを発現し；（ｂ）１つ以上の硫黄同化ポリペプチドを過剰発現し；または（ｃ）１つ以上の硫黄同化ポリペプチドの改変された調節を含み、ここでこの非自然の水素資化微生物が、親の水素資化微生物よりも高レベルでメチオニンを産生する方法を提供する。
【０１５７】
特定の実施形態では、本開示は、メチオニンまたはメチオニン含有飼料添加物を作るためのプロセスであって、硫黄同化ポリペプチド由来のポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドの発現を可能にするために十分な条件下及び時間にわたって、Ｈ２／ＣＯｘ基質の存在下で、本開示の組み換えのメチオニン排出水素資化微生物を培養するステップを含み、ここでメチオニンが、親の水素資化微生物によって産生されるメチオニンよりも高レベルで培養培地中に産生されて蓄積するプロセスを提供する。
【０１５８】
任意の上述の方法において、発酵槽またはバイオリアクター、例えば液相バイオリアクター、気泡塔バイオリアクターまたはトリクルベッドバイオリアクター中で、水素資化微生物を培養してもよい。
【０１５９】
非自然または組み換えの水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）を使用して本明細書に開示されるメチオニンを産生するための任意の上述の方法において、ガス原料は、Ｈ２／ＣＯｘ基質であり、ここでこの原料は、Ｈ２とＣＯ２またはＣＯまたはそれらの両方を含み、本明細書に記載される様々な他の成分を必要に応じて含む。特定の実施形態では、Ｈ２／ＣＯｘ基質は、水性ガスシフト反応によってコンディショニングされた、天然ガスもしくは液体炭化水素の水蒸気改質、乾燥改質、自己熱改質、接触部分酸化もしくは部分酸化によって、アンモニア合成によって、メタノール合成によって、製鋼によって、または石炭、バイオマスもしくは廃棄物のガス化によって産生される合成ガスなどの合成ガスである。
【０１６０】
非自然または組み換えの水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）を使用して本明細書に開示されるメチオニンを産生するための任意の上述の方法において、ガス基質は、Ｈ２／ＣＯｘ基質であり、これは、例えば、水性ガスシフト反応によってコンディショニングされた、天然ガスもしくは軽質炭化水素（例えば、エタン、プロパン、ナフサ）の水蒸気改質、乾燥改質、自己熱改質、接触部分酸化もしくは部分酸化によって、水素産生において、アンモニア合成において、メタノール合成において、製鋼によって、または石炭、ナフサ、残油、バイオマスもしくは廃棄物のガス化によって産生され得る。特定の実施形態では、Ｈ２／ＣＯｘ基質は、水素、一酸化炭素、二酸化炭素またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上の他の供給源を使用してこのようにして産生された任意のガス流の混合物であり、これには、パイプライン水素、パイプライン二酸化炭素、二酸化炭素スクラバーオフガス、煙道ガス、エタンクラッカーオフガス、リフォーマーオフガスまたは塩素合成オフガスまたはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１６１】
非自然または組み換えの水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）を使用して本明細書に開示されるメチオニンを産生するための任意の上述の方法において、培養される水素資化微生物は、メタン生成古細菌、例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｃｕｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｆｏｌｌｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｌａｃｉｎｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｌｏｂｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｌｓｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、ＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓまたはＭｅｔｈａｎｏｔｏｒｒｉｓである。
【０１６２】
特定の実施形態では、非自然または組み換えの水素資化微生物は、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｙａｎｔｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｆｌｕｖｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｓｐａｎｏｌａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｌｕｓｔｒｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｉｄｉｄｕｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ａｒｂｏｒｉｐｈｉｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｏｌｌｅｙａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｗｏｅｓｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｗｏｌｉｎｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ａｒｖｏｒｙｚａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｆｌｅｘｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｗｏｌｆｅｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｏｃｉａｂｉｌｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｂａｖａｒｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｃｈｉｋｕｏｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｓｕｂｍａｒｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｆｒｉｇｉｄｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｌｉｍｉｎａｔａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｌａｔｔｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｅｎｄｏｓｙｍｂｉｏｓｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｌｉｍｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｐｅｔｒｏｌｅａｒｉｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ  ｂｏｏｎｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｃｏｎｃｉｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｈａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｐｅｌａｇｉｃａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｍｏｂｉｌｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏ��ｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｎｎｉｅｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｏｌｔａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｉｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｖｅｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆｅｒｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ及びＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｕｌｃａｎｉｕｓであってもよい。
【０１６３】
任意の上述の方法では、水素資化微生物は、中温菌、好熱菌、超好熱菌またはそれらの組み合わせである。任意の上述の方法において、水素資化微生物は、偏性嫌気性生物または通性嫌気性生物である。任意の上述の方法において、水素資化微生物は、偏性水素資化生物または通性水素資化生物である。
【０１６４】
水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）を、親の微生物と比較して、増強したレベルでメチオニンを産生するように遺伝子操作してもよい。特定の実施形態では、本開示の遺伝子操作された水素資化微生物は、ＣＯｘ基質の存在下で、必要に応じてＨ２の存在下で、同じ条件（例えば、血清チューブまたはバイオリアクター）下で培養された場合に、親の水素資化微生物によって産生されるレベルより少なくとも約１０％高いレベル、または親の水素資化微生物によって産生されるレベルの少なくとも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、約１００倍、約５００倍または約１０００倍のレベルでメチオニンを産生する。他の実施形態では、本開示の遺伝子操作された水素資化微生物は、同じ培養条件下で親の水素資化微生物によって産生されるよりも、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％少なくとも約８５％、少なくとも約９０％のレベルで、または少なくとも約９５％大きいレベルでメチオニンを産生する。
【０１６５】
特定の実施形態では、本明細書に提供されるような、ＣＯｘ基質を、必要に応じてＨ２の存在下でメチオニンに変換する方法は、培養物１Ｌあたり約０．００１ｇ〜培養物１Ｌあたり約５００ｇでメチオニンを産生する。いくつかの実施形態において、生成されるメチオニンの量は、培養物１Ｌあたり約１ｇ〜約１００ｇである。さらなる実施形態において、生成されるメチオニンの量は、約０．００１ｇ／Ｌ、０．０１ｇ／Ｌ、０．０２５ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．１５ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．２５ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、０．４ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、０．７ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、０．９ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、７．５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１２．５ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１７５ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２２５ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌ、２７５ｇ／Ｌ、３００ｇ／Ｌ、３２５ｇ／Ｌ、３５０ｇ／Ｌ、３７５ｇ／Ｌ、４００ｇ／Ｌ、４２５ｇ／Ｌ、４５０ｇ／Ｌ、４７５ｇ／Ｌ、または５００ｇ／Ｌである。
【０１６６】
なおさらなる実施形態では、ＣＯｘ基質を、本明細書で提供されるように、必要に応じてＨ２の存在下で、メチオニンに変換するための方法は、１日あたり少なくとも約または最大約１キログラム（ｋｇ）、少なくとも約または最大１０ｋｇ、少なくとも約または最大１００ｋｇ、少なくとも約または最大１，０００ｋｇ、少なくとも約または最大１０，０００ｋｇ、少なくとも約または最大５０，０００ｋｇ、少なくとも約または最大１００，０００ｋｇ、少なくとも約または最大２５０，０００ｋｇ、少なくとも約または最大５００，０００ｋｇまたはそれを超えるメチオニンを産生するであろう。特定の実施形態では、メチオニンは、約１００，０００メートルトン（ＭＴ）／年（すなわち、１億ｋｇ／年または３００，０００ｋｇ／日）、約７５，０００ＭＴ／年（または２２５，０００ｋｇ／日）、約５０，０００ＭＴ／年（または１５０，０００ｋｇ／日）、約２５，０００ＭＴ（または７５，０００ｋｇ／日）または約１０，０００ＭＴ／年（または３０，０００ｋｇ／日）で産生される。
【０１６７】
メチオニンを作るためのシステム
さらなる態様では、本開示は、メチオニンを産生するためのシステムであって、Ｈ２／ＣＯｘ基質を含むガスの供給源と；（ａ）親の水素資化微生物と比較して活性が増大している１つ以上の硫黄同化ポリペプチドを発現するか；（ｂ）１つ以上の硫黄同化ポリペプチドを過剰発現するか；または（ｃ）１つ以上の硫黄同化ポリペプチドの改変された調節を含む、上述の非自然または組み換えの水素資化微生物のうち任意の１つ以上を含むバイオリアクターと；このバイオリアクターへのガスの流入を可能にするように、このガス供給源とバイオリアクターとの間に配置されたコネクターとを備え、ここで非自然の水素資化微生物が、親の水素資化微生物と比較して、前記Ｈ２／ＣＯｘ基質を代謝して１つ以上のメチオニン経路のアミノ酸を過剰産生するシステムを提供する。
【０１６８】
任意の上述のシステムにおいて、Ｈ２／ＣＯｘ基質は、生物学的材料、例えば動物飼料または肥料に変換される。特定の実施形態では、Ｈ２／ＣＯｘ基質は、メチオニンが豊富な生物学的材料に同化される。さらなる実施形態では、得られたメチオニンは精製され、動物飼料、食品添加物または栄養サプリメントとして使用される。また他の実施形態では、メチオニンが豊富なバイオマスは、動物飼料、食品添加物または栄養サプリメントに使用される。
【０１６９】
非自然または組み換えの水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）を使用して本明細書に開示されるメチオニンを産生するための任意の上述のシステムにおいて、ガス原料は、Ｈ２／ＣＯｘ基質であり、ここでこの原料は、Ｈ２とＣＯ２もしくはＣＯまたはそれらの両方とを含み、かつ必要に応じて本明細書に記載される様々な他の成分を含む。特定の実施形態では、Ｈ２／ＣＯｘ基質は、水性ガスシフト反応によってコンディショニングされた、天然ガスもしくは軽質炭化水素（例えば、エタン、プロパン、ナフサ）の水蒸気改質、乾燥改質、自己熱改質、接触部分酸化もしくは部分酸化によって、アンモニア合成において、メタノール合成において、製鋼によって、または石炭、ナフサ、残油、バイオマスもしくは廃棄物のガス化によって産生される合成ガスなどの合成ガスである。特定の実施形態では、Ｈ２／ＣＯｘ基質は、パイプライン水素、パイプライン二酸化炭素、二酸化炭素スクラバーオフガス、煙道ガス、エタンクラッカーオフガス、リフォーマーオフガス  塩素合成オフガスまたはそれらの任意の組み合わせを含む、水素、一酸化炭素、二酸化炭素またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上の他の供給源を使用して、このようにして産生された任意のガス流の混合物である。
【０１７０】
非自然または組み換えの水素資化微生物（例えば、メタン生成菌）を使用して本明細書に開示されるメチオニンを産生するための任意の上述のシステムにおいて、培養される水素資化微生物は、メタン生成古細菌、例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｃｕｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｆｏｌｌｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｌａｃｉｎｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｌｏｂｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｌｓｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、ＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓまたはＭｅｔｈａｎｏｔｏｒｒｉｓである。
【０１７１】
特定の実施形態では、非自然または組み換えの水素資化微生物は、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｙａｎｔｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｆｌｕｖｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｓｐａｎｏｌａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｌｕｓｔｒｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｉｄｉｄｕｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ａｒｂｏｒｉｐｈｉｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｏｌｌｅｙａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｗｏｅｓｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｗｏｌｉｎｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ａｒｖｏｒｙｚａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｆｌｅｘｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｗｏｌｆｅｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｏｃｉａｂｉｌｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｂａｖａｒｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｃｈｉｋｕｏｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｓｕｂｍａｒｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｆｒｉｇｉｄｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｌｉｍｉｎａｔａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｌａｔｔｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｅｎｄｏｓｙｍｂｉｏｓｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｌｉｍｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｐｅｔｒｏｌｅａｒｉｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ  ｂｏｏｎｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｃｏｎｃｉｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｈａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｐｅｌａｇｉｃａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｍｏｂｉｌｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏ��ｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｎｎｉｅｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｏｌｔａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｉｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｖｅｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆｅｒｎｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ及びＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｕｌｃａｎｉｕｓであってもよい。
【０１７２】
任意の上述のシステムにおいて、水素資化微生物は、中温菌、好熱菌、超好熱菌またはそれらの組み合わせである。任意の上述の方法において、水素資化微生物は、偏性嫌気性生物または通性嫌気性生物である。任意の上述の方法において、水素資化微生物は、偏性水素資化生物または通性水素資化生物である。
【実施例】
【０１７３】
実施例１
Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓのエチオニン耐性変異体の産生
メチオニン産生は、特にフィードバック阻害によって、微生物において高度に調節される。細菌または古細菌をＤＬ−エチオニンのような毒性のあるメチオニンアナログに曝露すると、毒素類似体の存在下で増殖することができる変異体として特定される、メチオニンフィードバック阻害で変異した細胞が得られる（例えば、Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ２３：４１〜６１、２００５を参照のこと）。表１は、野生型と比較したその遺伝的背景とともに、作製された生物体のリストを示しており、これには本明細書に記載された実験で使用されたものを含む。
【０１７４】
【表１】
2018516552.tif 000002
【０１７５】
エチオニン耐性Ｍ．ｍａｎｐａｌｕｄｉｓ変異体の単離
エチオニン耐性変異体を生成するために、Ｔｒｅｌ１０−３３３ＵＲ−ΔｄＡ（リシンフィードバック耐性ｌｙｓＣ及びｄａｐＡ欠失を含むＭ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２、表１）を、３７℃で、１００ｍｇ／Ｌのリシンを補充したカザミノ酸を含まない２５ｍＬのＭｃＣａｓ培地中で約０．５０のＯＤ６００になるまで増殖させ（Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４９４：４４、２０１１、これは培地ＭｃＣＶについて述べており、カザミノ酸または酵母抽出物なしで、本明細書で使用される）、次いで、２つの嫌気的Ｂａｌｃｈチューブ（各５ｍＬの培養液）に分注して、１本のチューブに０．３ｍＬの変異原メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ、ＭｃＣａｓ  ｎｏ  Ｃａｓで１：５０希釈）、もう一方のチューブに０．３ｍＬのＭｃＣａｓ  ｎｏ  Ｃａｓ単独を対照として与えた。チューブをＨ２／ＣＯ２の８０／２０混合物で４０ＰＳＩＧに加圧し、振盪せずに３７℃で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーションの後、圧力を解放して、各チューブから０．５ｍＬの培養物を取り出し、ＭｃＣａｓ寒天プレート上にプレートして殺傷率を決定した。
【０１７６】
培養物の残りを洗浄してＥＭＳを除去し、次いで１０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を除去し、ペレット化した細胞を１ｍＬのＭｃＣａｓ  ｎｏ  Ｃａｓ中に再懸濁し、最後に再び１０００ｇで１５分間遠心分離することによって洗浄した。この洗浄を２回繰り返してＥＭＳを除去した。最終洗浄後、採取した細胞を５００μＬのＭｃＣａｓ  ｎｏ  Ｃａｓに懸濁して、１００μｌを、５ｍＬのＭｃＣａｓ  ｎｏ  Ｃａｓ＋１００ｍｇ／Ｌのリシン（ＥＭＳ処理したもの）を含む３本のＢａｌｃｈチューブに、または１本のチューブ（対照、未処理）に移して回収した。各チューブに２．５％のＮａ２Ｓ×９Ｈ２Ｏを０．１ｍＬ添加し、次いで各チューブを８０／２０Ｈ２／ＣＯ２で４０ＰＳＩＧに加圧し、３７℃で一晩回復させた。翌朝、各培養物を遠心分離により０．１ｍＬまで濃縮して、１００ｍｇ／Ｌのリシン及び３ｇ／Ｌのエチオニンを含むＭｃＣａｓ  ｎｏ  Ｃａｓプレート上にプレートした。このプレートを３７℃で、８０／２０のＨ２／ＣＯ２ガス混合物の１０ＰＳＩＧを含むＯｘｏｉｄ嫌気性ジャー中でインキュベートした。エチオニン選択によって、ＥＭＳに曝露された培養物からのみ生育したコロニーが生じた。すべての作業は、別段明記しない限り、嫌気性条件下で行った。
【０１７７】
個々のプレートからの５つのコロニーを、ＨＰＬＣ分析のために選択してメチオニン産生を測定した。要するに、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ組換え体を、ピューロマイシン（２．５ｍｇ／Ｌ）を補充したＢａｌｃｈチューブ内の５ｍｌのＭｃＣＡＳ培地で増殖させ、一晩振盪しながら、Ｈ２：ＣＯ２（４：１）を使用して３７℃で４０ｐｓｉまでガス化した。２日目に１００μｌの一晩培養物を、種培養物として使用して、Ｂａｌｃｈチューブまたは１００ｍｌの血清培地に５ｍｌの最少培地（ＭＭ）を接種し、Ｈ２：ＣＯ２（４：１）で、それぞれ４０及び２０ｐｓｉの圧量までガス化した。この培養物は、３７℃で７２時間振盪しながら置いた；Ｈ２：ＣＯ２（４：１）ガスを培養開始時に全圧まで再充填した。発酵後、１．８ｍｌの培養物をエッペンドルフチューブに移し、細胞を１２，０００×ｇで除去し、得られた上清を０．２μｍのフィルターに通した。濾液をＨＰＬＣによりアミノ酸含量について分析した。必要に応じて、種子及び発酵培地にピューロマイシン（２．５ｍｇ／Ｌ）を補充してもよい。
【０１７８】
【表２】
2018516552.tif 000003
【０１７９】
エチオニン選択によって特定された５つのコロニーのうち、３つのコロニーは、ＨＰＬＣによって分析したとき、メチオニン力価の増大を示した。増大したメチオニン力価を有する３つのコロニーを、エチオニン耐性変異体１．１、３．１、及び３．３（それぞれ、Ｔｒｅｌ１０−３３３ＵＲ−ΔｄＡ−ｅｒｌ．１、Ｔｒｅｌ１０−３３３ＵＲ−ΔｄＡ−ｅｒ３．１及びＴｒｅｌ１０−３３３ＵＲ−ΔｄＡ−ｅｒ３．３）と命名した。
【０１８０】
エチオニン耐性Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ変異体の単離
エチオニン耐性Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ変異体を選択するために、変異誘発をＴｒｅｌ４２（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ  Ｃ２Ａ、ＤＳＭ  ２８３４）またはＴｒｅｌ  ９（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ  ＧＯ１、ＤＳＭ  ３６４７）に対して行った。要するに、菌株を、２５ｍＬのＭｃＣａｓ培地＋カザミノを含まない５Ｇ／Ｌのメタノール（培地の処方については、Ｓａｒｍｉｅｎｔｏら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４９４：４４、２０１１；これは、培地ＭｃＣＶを述べており、ここでは、カザミノ酸も酵母抽出物もなしで使用している）、またはカシトン（Ｃａｓｉｔｏｎｅ）及び酵母なしのＤＳＭ１２０培地＋５Ｇ／Ｌのメタノール中で、３７℃で約０．５０のＯＤ６００まで増殖させた。５ｍＬの培養液を２つの嫌気性Ｂａｌｃｈチューブに分注した。一方のチューブに０．３ｍＬのメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ、ＭｃＣａｓ  ｎｏ  Ｃａｓ中の１：５０希釈）を添加し、第２のチューブに０．３ｍＬの培地を添加した（対照）。チューブを、３７℃で振盪することなく、Ｎ２／ＣＯ２  ２０  ＰＳＩＧの８０／２０混合物と共に３７℃で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーションの後、圧力を解放し、０．５ｍＬの各チューブを取り出して、寒天プレート上にプレートして殺傷率を決定した。
【０１８１】
残りの培養物を、１０００×ｇで１５分間遠心分離すること、上清を除去すること、及び５ｍＬの培地に再懸濁することにより回収した細胞を洗浄することによって洗浄した。これらの収集及び洗浄のステップをさらに２回繰り返して、ＥＭＳのすべての痕跡を取り除いた。最後の洗浄の後、採取した細胞を５ｍＬの培地に懸濁し、１ｍＬを、５ｍＬの培地を含む３つのＢａｌｃｈチューブに移して回収した。各チューブに０．１ｍＬの２．５％Ｎａ２Ｓ×９Ｈ２Ｏを添加し、次いで各チューブを８０：２０のＮ２／ＣＯ２を使用して２０ＰＳＩＧまで加圧し、３７℃で最低４８時間回復させた。翌日、各培養物を遠心分離により１．０ｍＬまで濃縮し、１．２５ｍｇ／ｍＬのエチオニン及び５ｇ／Ｌのトリメチルアミンを含有する適切な培地の寒天プレート上にプレートするか、または０．４ｍｇ／ｍＬ〜１．６ｍｇ／ｍＬの範囲のエチオニン濃度の液体培地中で富化させた。プレートする前に富化された培養物については、同じ濃度のエチオニンを含有する寒天プレート上にプレートする前に富化（濃縮）を２回行った。プレートを、３７℃で、８０：２０のＮ２／ＣＯ２ガス混合物の１０ＰＳＩＧと共に、Ｏｘｏｉｄ嫌気性ジャー中でインキュベートした。選択は、ＥＭＳ処理細胞を接種したプレート上でのみコロニーが生育するような選択であった。すべての作業は別段示さない限り、嫌気性条件下で行った。
【０１８２】
変異誘発Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ  Ｔｒｅｌ４２の３つのコロニーがエチオニン上で増殖し、これを血清ボトル発酵で試験した（実施例１に記載）。結果を以下の表３にまとめる。
【０１８３】
【表３】
2018516552.tif 000004
【０１８４】
実施例２
Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ及びＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓのエチオニン耐性変異体
Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ：ゲノムＤＮＡを、メチオニンを過剰産生するＭ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ変異体から、同様に、親の株Ｓ２（Ｔｒｅｌ１０）から、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔを使用して、グラム陰性細菌のプロトコールに従って単離した。ＭＭＰ１３５９−ＭＭＰ１３５８オペロンの硫黄同化ＯＲＦのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅は、以下のプライマーを使用して行った：
１３５９ｓｅｑＦ１（５’−ＣＴＡＴＡＧＡＡＣＴＡＡＣＣＣＡＡＴＧ−３’；配列番号９）
１３５９ｓｅｑＲ１（５’−ＧＧＴＧＴＴＧＣＡＧＡＴＡＣＴＡＴ−３’；配列番号１０）
１３５９ＳｅｑＦ３（５’−ＡＧＡＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＴＡ−３’；配列番号１１）
１３５９ｓｅｑＲ３（５’−ＣＧＣＣＡＡＡＡＴＣＴＴＣＣＣＴＧＣ−３’；配列番号１２）。
これらの同じプライマーを、ＭＭＰ１３５９−ＭＭＰ１３５８オペロンのフォワード配列決定プライマー及びリバース配列決定プライマーとして使用して、これらのＯＲＦの完全な重複する配列範囲を得た。
【０１８５】
変異体配列と親株及び以前に公表された配列とのＢｌａｓｔ比較によって、メチオニンプロデューサーのＭＭＰ１３５９−ＭＭＰ１３５８オペロンにおける２つの異なる変異が示された。Ｔｒｅｌ１０−３３３ＵＲ−ΔｄＡ−ｅｒ１．１及びＴｒｅｌ１０−３３３ＵＲ−ΔｄＡ−ｅｒ３．１は、ＭＭＰ１３５８  ＯＲＦのヌクレオチド位置３４１にＧ−Ａトランジションを有し、アミノ酸配列中にＧｌ１４Ｅ置換変異をもたらした。Ｔｒｅｌ１０−３３３ＵＲ−ΔｄＡ−ｅｒ３．３は、ＯＲＦ  ＭＭＰ１３５９の１３１５位にＧ−Ａトランジションを有し、アミノ酸配列中にＤ４３９Ｎ置換変異をもたらした。ＭＭＰ１３５９及びＭＭＰ１３５８のＯＲＦで特定された変異によって、これらの遺伝子は、メチオニンの生合成と関連し、かつメチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニンによるフィードバック阻害を受ける可能性が高いことが示される。
【０１８６】
Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｓｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ：ゲノムＤＮＡを、親株Ｃ２Ａ（Ｔｒｅｌ４２）を含む、各変異体から、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｍａｓｔｕｒｅ  Ｐｕｒｅ  ＤＮＡ精製キットを使用して単離し、ならびに推定のホモシステインシンターゼ遺伝子（ＯＲＦ１８２１（配列番号２９；配列番号３０のアミノ酸配列）、及びＴｒｅｌ４２中の１８２２及びＴｒｅｌ９中の関連のＯＲＦ）を含有する領域をＰＣＲによって増幅した。Ｔｒｅｌ４２中の領域の増幅及び配列決定に使用したプライマーは以下のとおりであった：
Ｃ２Ａ１８２１Ｆ（５’−ＧＴＡＴＴＧＡＡＴＴＧＧＣＡＡＡＣＴ−３’；配列番号２２）
Ｃ２Ａ１８２１Ｒ（５’−ＡＣＣＧＧＣＴＣＡＧＡＣＣＣＧＧＴＧ−３’；配列番号２３）
Ｃ２Ａ１８２１ＳＥＱ１（５’−ＧＧＡＡＡＧＡＡＣＴＣＧＡＣＧＴＧＣ−３’；配列番号２４）  
Ｃ２Ａ１８２１ＳＥＱ２（５’−ＡＣＴＧＡＣＡＴＴＣＴＴＧＡＴＴＡＴＧ−３’；配列番号２５）
Ｃ２Ａ１８２１ＳＥＱ３（５’−ＣＴＴＧＣＡＧＣＧＣＧＣＡＧＧＣＴ−３’；配列番号２６）
Ｇ／ＣからＡ／Ｔへのトランジションが、Ｔｒｅｌ４２ｍｕｔ３において、ＯＲＦ１８２１のヌクレオチド位置１４６６で見出された（配列番号３１）。この変異は、ＯＲＦ１８２１において４８９位置でのＳからＮへのアミノ酸変化を生じる（配列番号３２）。
【０１８７】
実施例３
水素資化微生物のＬｙｓＣ変異体
Ｍ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓのフィードバック耐性ｌｙｓＣ（アスパルトキナーゼ）変異体の単離については以前に記載されている。要するに、野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓのＴｒｅｌ１０を、カザミノ酸を含まない２５ｍＬのＭｃＣａｓ培地（培地処方については、Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４９４：４４、２０１１を参照のこと；これは、ＭｃＣＶ培地を述べており、ここでは、カザミノ酸も酵母抽出物もなしで使用する）中で、３７℃でＯＤ６００がほぼ０．２０まで増殖させた。５ｍＬの培養液を２つの嫌気性Ｂａｌｃｈチューブに分注した。一方のチューブには０．３ｍＬのメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ、ＭｃＣａｓ  ｎｏ  Ｃａｓ中の１：５０希釈）を添加し、第２のチューブには０．３ｍＬのＭｃＣａｓ  ｎｏ  ｃａｓを添加した（対照）。チューブをＨ２／ＣＯ２の８０／２０混合物で４０ＰＳＩＧに加圧し、３７℃で１時間振とうせずにインキュベートした。インキュベーションの１時間後、圧力を解放し、各チューブの０．５ｍＬを取り出し、ＭｃＣａｓ寒天プレート上にプレートして、殺傷率を決定した。
【０１８８】
残りの培養液を、５（ＥＭＳ処理）または２（対照）の１．５滅菌嫌気性微量遠心チューブに分注し、１０００ｇで１５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを、１ｍＬのＭｃＣａｓ  ｎｏ  Ｃａｓに再懸濁すること、そして再び１０００ｇで１５分間遠心分離することによって洗浄した。この洗浄を２回繰り返して、ＥＭＳのすべての痕跡を取り除いた。最後の洗浄の後、採取した細胞を２００μＬのＭｃＣａｓ  ｎｏ  Ｃａｓ中に懸濁し、回収のために５ｍＬのＭｃＣａｓ  ｎｏ  Ｃａｓに移した。１ｍＬの２．５％Ｎａ２Ｓ×９Ｈ２Ｏを各チューブに添加し、各チューブを８０／２０のＨ２／ＣＯ２で４０ＰＳＩＧまで加圧し、３７℃で一晩回復させた。翌朝、各培養物を遠心分離により０．１ｍＬまで濃縮し、０．１Ｍのトレオニン及び０．０２ＭのＡＥＣを含むＭｃＣａｓ  ｎｏ  Ｃａｓプレート上にプレートした。プレートを、３７℃で８０／２０のＨ２／ＣＯ２ガス混合物の１０ＰＳＩＧを含むＯｘｏｉｄ嫌気性ジャー中でインキュベートした。選択は、ＥＭＳ処理細胞を接種したプレート上でのみコロニーが生育するような選択であった。すべての作業は、別段示さない限り、嫌気性条件下で行った。
【０１８９】
Ｇ３３３Ｒ変異（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２のＬｙｓＣアミノ酸位置Ｇ２７７に対応する）を有する、ＥＭＳ生成ｌｙｓＣ変異体Ｔｒｅｌ１０−Ｍｕｔ３３３の増殖速度は、リシン及びトレオニンの存在下で増殖させた場合には影響を受けない（ＯＤ６００は３７℃で７２時間のインキュベーション時間後に測定した；データは示さず）、換言すれば、Ｔｒｅｌ１０−Ｍｕｔ３３３の変異したアスパルトキナーゼは、リシン及びトレオニンによるフィードバック阻害を受けない。Ｔｒｅｌ１０−Ｍｕｔ３３３変異体によって産生されたアスパラギン酸経路のアミノ酸は、ＨＰＬＣによって特定した（データは示していない）。誘導体化剤オルトフタルアルデヒド（ＯＰ  Ａ）を、オートサンプラー上の自動誘導体化反応に使用し、プレカラムを行った。反応混合物をｐＨ１０．２（ホウ酸塩緩衝液を介して）で緩衝し、酸加水分解タンパク質／ペプチドサンプルの直接誘導体化を可能にした。目的のアミノ酸を、最初に３−メルカプトプロピオン酸（３−ＭＰＡ）を用いてＯＰＡと反応させた。インドールへの３−ＭＰＡの取り込みはそれらの疎水性を低下させ、結果として、ＯＰＡ誘導体はクロマトグラフィーで溶出された。親の株と比較したＴｒｅｌ１０−Ｍｕｔ３３３変異体の産生プロファイルは、以下のとおりであった（そして、一般には、特定した全ての変異体で同様（データ示さず））：アラニン（５ｍｇ／Ｌ）、リシン（８ｍｇ／Ｌ）、トレオニン（２１ｍｇ／Ｌ）、及びグリシン（７８ｍｇ／Ｌ）。
【０１９０】
Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  ｌｙｓＣの変異は、グラム陰性細菌のプロトコールに従って、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔを使用してゲノムＤＮＡを抽出することによって確認した。ＬｙｓＣ標的を、フォワードプライマー（ＬｙｓＣｆｏｒ１−５’ＧＧＧＡＣＧＧＣＧＣＡＡＣＡＡＡＴＧＧ３’；配列番号１３）及びリバースプライマー（ＬｙｓＣｒｅｖ１−５’ＧＧＡＧＡＴＡＧＴＧＡＧＡＣＣＣＣＴＧＧＡＧＴ３’；配列番号１４）を有するＥａｓｙ−Ａ高忠実度ポリメラーゼを使用して増幅した。増幅したＤＮＡを、ＬｙｓＣｆｏｒ１またはＬｙｓＣｒｅｖ１のいずれかと混合し、配列決定した（Ｏｐｅｒｏｎ）。１つの自然発生変異体及び８つの化学的に誘導された変異体が特定された。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（この場合、Ｇ２７７Ｒ）において以前に特定された位置Ｇ２７７の変異に加えて、Ｓ３０２Ｐ及びＧ３５９Ｅ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２のＬｙｓＣからのアミノ酸位置によるナンバリング）を含む、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍで以前に特定されなかった新しい変異位置が見出された。
【０１９１】
実施例４
水素資化微生物におけるウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ欠失及びｒｅｐＡ挿入
プラスミド形質転換効率を改善するために、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｕｐｐ）遺伝子（Ｌｏｃｕｓ  ＭＭＰ０６８０）を、複製プロテインＡ（ｒｅｐＡ、それ自身のプロモーターを有する）をコードする遺伝子で置換することにより、ｌｙｓＣ変異体Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｔｒｅｌ１０−Ｍｕｔ３３３をゲノムレベルで改変し、Ｔｒｅｌ１０−３３３ＵＲと呼ぶ。ｒｅｐＡは、ｒｅｐＡを有する任意のプラスミド、例えば、ｒｅｐＡ含有ｐＵＲＢ５００プラスミドに由来するか、またはそれに基づくプラスミド（Ｔｕｍｂｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ。Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：２９７６，１９９７を参照のこと）の効率的な形質転換を可能にする。ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ活性の喪失によって、修飾されたＭ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓに６−アザウラシル耐性表現型が得られる。
【０１９２】
要するに、ｒｅｐＡ遺伝子は、プライマーＴＫＨ＿０３８（５’ａａａｔｔａｔｇａｇｇｃｇｃｇｃｃｔｃｃｃｔｇａａｇａａｇａａｇａｇａｇ３’；配列番号：２７）及びＴＫＨ＿０３９（５’ｔｇｃｔｔａｔｔｃｇｇｃｇｃｇｃｃａｇｔｔｃｃａｔｔｔｔａｃｃａｃｃ３’；配列番号２８）を使用して、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ００１（Ｗａｌｔｅｒｓら、Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７７：２５４９、２０１１）のゲノムＤＮＡから（そのプロモーターとともに）増幅した。増幅されたｒｅｐＡフラグメントを、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ＡｓｃＩで直線化したｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡベクターにクローニングした。最終的なプラスミドを、ｐＫＨ１１と命名した。ｐＫＨ１１由来のＸｂａＩ−ＢａｍＨ１断片を、制限酵素ＮｈｅＩ及びＢｇｌＩＩで直線化したｐＭＥＶ１（Ｇａｒｄｎｅｒ  ＷＬ（２０００）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｅｔｈａｎｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａｒｃｈａｅｏｎ  Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ．Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａ）中にクローニングした。ピューロマイシン耐性遺伝子を有する得られた自殺ベクターをｐＫＨ２０と命名した。
【０１９３】
プラスミドｐＫＨ２０を本質的にＳａｒｍｉｅｎｔｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）によって記載されたようにＴｒｅｌ１０−Ｍｕｔ３３３中に形質転換し、形質転換体を、ピューロマイシン（２．５ｍｇ／Ｌ）を含むＭｃＣＡＳプレート上で選択した。ピューロマイシンの存在下で増殖した形質転換コロニーを、６−アザウラシル（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を補充したＭｃＣＡＳ液体培地に移し、一晩増殖させた。一晩培養の一部を、０．５ｍｇ／ｍｌの６−アザウラシルを補充した新鮮なＭｃＣＡＳ培地に移し、再び一晩増殖させた。培養物を希釈し、０．２５ｍｇ／ｍｌの６−アザウラシルを含むＭｃＣＡＳプレート上に広げた。５日後、個々のコロニーを、ピューロマイシンの有無の状態のＭｃＣＡＳプレート上に複製してプレートした。ピューロマイシンの存在下で増殖できなかったコロニーを、６−アザウラシル（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を補充したＭｃＣＡＳ液体培地に移して耐性を確認した。Ｔｒｅｌ１０−Ｍｕｔ３３３ゲノム上のｒｅｐＡ遺伝子によるｕｐｐ遺伝子の置換は、以下のプライマーを使用してＰＣＲによって確認した：ｕｐｔｄｅｌｃｏｎｆ１（５’−ｃａａｔｔａｃｔｇａａｃｃｃａａａｇａｃｃａｔ−３’；配列番号１４）及びｕｐｔｄｅｌｃｏｎｆ２（５’−ａａｔａｇｔｔａｃｃｇｇｃｇｔｔａｃａａｔｃａ−３’；配列番号１５）。ｒｅｐＡ遺伝子によるｕｐｐ遺伝子の置換が確認された、６−アザウラシル耐性／ピューロマイシン感受性コロニーを、Ｔｒｅｌ１０−３３３ＵＲと命名した。
【０１９４】
実施例５
水素資化微生物におけるＤＡＰＡ欠失
メチオニン産生を増大するためのＴｒｅｌ１０−３３３ＵＲ−ΔｄＡ−ｄａｐＡ欠失の構築は、Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）に記載されたものと本質的に同じマーカーなしの変異誘発法を使用して生成された。プライマーＤａｐＡｆｏｒ２（５’−ｔｃｃｃｔｇａｔｃｇａｔａｇａａａｇｔｇｔａｇｔ−３’；配列番号１６）及びＤａｐＡｆｏｒ２（５’−ｔｔｇｃｃｇａｔｇａａａｔｔａａａｇｔｇａａａ−３’；配列番号１７）を使用するＰＣＲを介して、上流及び下流領域にそってｄａｐＡ遺伝子を含むＭ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２（Ｔｒｅｌ１０）ゲノムからの約２．４ｋｂの断片を合成し、プラスミドｐＴＯＰＯ中にクローニングして、ｐＪＢ０１２を作製した。ｄａｐＡ遺伝子のインフレーム欠失のフラグメントを、プライマーＤａｐＡｄｅｌｆｏｒ２（５’−ｇｃｇｇｇｃｇｃｇｃｃｇｃａｔａａｔｔａｃａｃｃｔｔａｔｇｃｇｔｔｃ−３’；配列番号１８）及びＤａｐＡｄｅｌｒｅｖ２（５’−ｇｃｇｇｇｃｇｃｇｃｃｔａａｔｃａｃｇｇｔｔｃｇｔｇａｔａｃｔａｔ−３’；配列番号１９）（両方とも５’ＡｓｃＩ部位を含む）を使用する外向きＰＣＲを使用することによって、作製した。ＰＣＲ産物を精製し、ＡｓｃＩで消化し、ｐＴＯＰＯに連結してｐＪＢ０１３を作製した。最後に、ｕｐｐ：：ｎｅｏ遺伝子を含む断片を、プライマーｕｐｐｎｅｏＦ（５’−ａｔｔａｃｇｃｃａａｇｃｔｔｇｇｔａｃｃａｃｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｔｔｃａｇｇｇａ−３’；配列番号２０）及びｕｐｐｎｅｏＲ（５’−ｇｔｇｇａｔｃｃｇａｇｃｔｃｇｇｔａｃｃｔｇａｇａｔｃｃｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｇｇ−３’；配列番号２１）を使用して、ｐＫＨ１４からＰＣＲ増幅して、ｐＪＢ０１３のＫｐｎＩ部位にクローニングしてｐＪＢ０１５を作製した。
【０１９５】
寒天プレート上でネオマイシン（５００ｍｇ／ｍｌ）耐性コロニーを選択するために、ｐＪＢ０１５を、Ｔｒｅｌ１０−３３３ＵＲ（上記のとおり）に形質転換した。染色体ｄａｐＡ遺伝子における単一の交差事象が、ＰＣＲによって確認された。単一のクロスオーバを有するコロニーを、非選択培地中で２４時間増殖させて二重交差事象を可能にし、次いで１００ｍｇ／Ｌのリシン及び０．２５ｕｇ／ｍｌの６−アザウラシルを含むＭｃＣＡＳ培地上にプレートした。コロニーは、リシンの有無の状態のＭｃＣＡＳプレートにパッチした。増殖のためにリシンを必要とするコロニーで、ｄａｐＡ欠失のＰＣＲ確認を行った。このようなコロニーの１つをＴｒｅｌ１０−３３３ＵＲ−ΔｄＡと命名した。
【０１９６】
実施例６
メチオニン生合成遺伝子の過剰発現
ｌｙｓＣ、調節解除されたｌｙｓＣ、ａｓｄ、ＭＭＰ１３５８  ＯＲＦ、ＭＭＰ１３５９  ＯＲＦ、調節解除されたＭＭＰ１３５８  ＯＲＦ、調節解除されたＭＭＰ１３５９  ＯＲＦまたはメチオニンシンターゼを含む、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｔｒｅｌ１０メチオニン生合成経路の任意の遺伝子は、天然プロモーターを除去すること、及びそれを強力な構成的プロモーターで置き換えることによって過剰発現され得る。１例では、各々がメチオニンシンターゼ（ＭｅｔＥ）の有無の状態で、調節解除されたＭＭＰ  １３５８  ＯＲＦまたは調節解除されたＭＭＰ１３５９  ＯＲＦを、複製プラスミド上の構成的ヒストン遺伝子ｈｍｖプロモーターに作動可能に連結し、Ｍ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｔｒｅｌ１０に導入した。別の場合には、調節解除されたＯＲＦ１３５８及びＯｒｆ１３５９を、ｈｍｖプロモーターに作動可能に連結して、Ｔｒｅｌ１０−Ｍｕｔ３３３に導入した。血清ボトル（実施例１に記載）及び発酵槽（実施例９に記載）におけるアミノ酸産生を測定して、その結果を表４及び５にまとめる。
【０１９７】
【表４】
2018516552.tif 000005
【０１９８】
【表５】
2018516552.tif 000006
【０１９９】
調節解除されたＭＭＰ１３５８及びＭＭＰ１３５９  ＯＲＦ（Ｔｒｅｌ１０−ｅｒ３．１＋ｅｒ３．３）を構成的に発現するＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｔｒｅｌ１０は、有意な量のメチオニン（１０７ｍｇ／Ｌ、表４）を産生した。調節解除されたＬｙｓＣ（Ｔｒｅｌ１０−Ｍｕｔ３３３＋ｅｒ３．１＋ｅｒ３．３）の添加は、メチオニン産生を改善しなかったが、代わりにより多くのグリシン、トレオニン及びリシンが産生された。これらのデータによって、メチオニンの過剰産生がリシン及びトレオニンレベルの低下をもたらし、したがってこれらのアミノ酸がＬｙｓＣのフィードバック阻害を引き起こすのに十分高い量で存在しないので、野生型Ｔｒｅｌ１０が自然に「調節解除」され得るということが示される。さらに、これらのデータによって、調節解除されたＭＭＰ１３５８及びＭＭＰ１３５９  ＯＲＦの過剰発現が、メチオニンの非常に特異的な過剰産生をもたらすことが示される。
【０２００】
実施例７
水素資化微生物からのメチオニンエクスポート
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来の候補ｂｒｎＦＥまたはｍｅｔＴメチオニンエクスポーター遺伝子を単離し、機能性について検査する。機能を高めるためにさらなる変異を必要に応じて導入するか、または強力なプロモーターに作動可能に連結することによってエクスポート遺伝子を過剰発現させるか、または機能的な外因性ｂｒｎＦＥ遺伝子もしくはｍｅｔＴ遺伝子を、Ｍ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓに導入する。過剰産生されたメチオニンは、培養培地から容易に回収及び／または単離し得る。
【０２０１】
実施例８
水素資化微生物におけるメチオニン産生への交互性炭素フラックス
水素資化微生物（例えば、Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）の主な炭素フラックスは、メチオニン生合成により多くの炭素を供給するために、種々の方法でシフトしてもよい。例えば、ピルビン酸からホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）への炭素の流れを制限することは、ＰＥＰシンターゼ遺伝子を、不活性化または下方制御することによって達成される。さらに、イソロイシン経路（存在する場合）を必要に応じてノックアウトして、この経路によって使用されるピルビン酸及びアセチルＣｏＡを保存する。特定の酵素活性の不活性化または減少は、遺伝子的に操作すること（例えば、遺伝子または遺伝子部分の欠失）、または変異による不活性化（例えば、自発的または誘導）を選択することによって導入してもよい。あるいは、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を必要に応じて過剰発現させて、ピルビン酸からオキサロ酢酸（ＯＡＡ）に多くの炭素を注ぎ込む。さらに、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を、必要に応じて過剰発現させ、より多くのＯＡＡをアスパラギン酸（ａｓｐａｒａｔｅ）に変換する。過剰発現は、例えば、遺伝子の複数のコピーを提供することによって、またはプロモーター領域を改変してより強力な発現を得ることによって、達成され得る。
【０２０２】
実施例９
バイオリアクター中の非自然及び組み換えの水素資化微生物の培養
Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓは、培養物が定常状態に達するまで、嫌気性条件下で、気泡塔バイオリアクター内で７２時間〜１２０時間培養され、これは、極めて大容積の高密度培養物に達するように、漸増容積の一連の連続容器で行ってもよい（例えば５０ｍｌで開始、この培養物を使用して１０Ｌを播種し、次いでこの培養物を使用して３００Ｌ以上を播種する）。この時間の間、このシステムは、合成ガスが発酵ブロスに連続的に供給される流加法モードで運転される。ブロス自体は交換されない。一旦、適切なＯＤ６００に達すれば（分光光度計で測定して）、連続培養プロセスが開始され、ここでは、培地／ブロスの交換が開始される。交換の割合は、発酵槽内の培養物のＯＤ６００を考慮して決定される。例えば、約１．５〜約３．０の全量のブロスが１日に交換される。
【０２０３】
培養物は約３７℃の温度に維持されるが、約３５℃〜約４０℃の範囲で変動してもよく、約７．０〜７．２のｐＨで維持して（必要に応じてＨＣｌ及び／またはＮａＯＨを用いｐＨを調節）、ＯＤ６００が約１．５〜約２．０に維持されてもよい。合成ガスは、約４：１〜約３：１の範囲の比でＨ２：ＣＯ２からなり、これは、約０％〜約５％の範囲の一酸化炭素（最適は多くとも１％）を含んでもよく、その他の微量の混入物を含んでもよい。合成ガス流速は、そのプロセスで使用される気泡または特定の設計の細流カラムによって決定される。
【０２０４】
上述の様々な実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わせてもよい。本明細書で言及されるか、または出願データシートに列挙されている特許及び非特許刊行物の全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、さらなる実施形態を提供するために、必要に応じて様々な特許、出願及び刊行物の概念を使用するように変更してもよい。
【０２０５】
上記及び詳細な説明に照らして、この実施形態にこれらの変更及び他の変更を行ってもよい。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を、明細書及び特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に限定するものと解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲が権利を主張する等価物の全範囲とともに、全ての可能性のある実施形態を含むと解釈されるべきである。従って、この特許請求の範囲は、本開示によって限定されることはない。
【０２０６】
２０１５年５月６日に出願された米国仮特許出願第６２／１５７，７９７号を含む、本明細書で言及される全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許刊行物は、本明細書と矛盾しない程度まで、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【配列表】
2018516552000001.app
【国際調査報告】
2018516552.tif 000007
2018516552.tif 000008
2018516552.tif 000009