(57)【要約】  対象の骨欠損を治療する方法であって、治療を必要とする対象の骨欠損部位に有効量の単離した体性幹細胞（約２μｍ〜８．０μｍの大きさの、Ｌｇｒ５＋又はＣＤ３４９＋である）を投与することを含む、方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の骨欠損を治療する方法であって、治療が必要な対象の骨欠損部位に有効量の単離した体性幹細胞を投与することを含み、該体性幹細胞は２μｍ〜８．０μｍの大きさであり、Ｌｇｒ５＋又はＣＤ３４９＋である、方法。
【請求項２】
前記体性幹細胞がＣＤ１３３−、ＣＤ３４−、ＣＤ９０−、ＣＤ６６ｅ−、ＣＤ３１−、Ｌｉｎ１−、ＣＤ６１−、Ｏｃｔ４＋、Ｎａｎｏｇ＋及びＳｏｘ２−である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記体性幹細胞がＬｇｒ５＋である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記体性幹細胞は以下の手法：
ドナー由来のサンプルが上層及び下層に分離するまで、容器内で該サンプルをＥＤＴＡ又はヘパリンとともにインキュベーションすること、
該上層を回収すること、及び
２μｍ〜８．０μｍの大きさの、Ｌｇｒ５＋又はＣＤ３４９＋である体性幹細胞集団を該上層から単離すること、
により得られる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルが血液又は骨髄サンプルである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ドナーから前記サンプルを得る前に、前記ドナーに顆粒球コロニー刺激因子又はフコイダンを投与する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記体性幹細胞が対象に対して自己又は異種のものである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
投与工程の前に、
ドナー由来のサンプルが上層及び下層に分離するまで、容器内で該サンプルをＥＤＴＡ又はヘパリンとともにインキュベーションすること、
該上層を回収すること、及び
約２μｍ〜８．０μｍの大きさの、Ｌｇｒ５＋又はＣＤ３４９＋である体性幹細胞集団を該上層から単離すること
を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルが血液又は骨髄サンプルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記上層からＬｉｎ＋細胞及びＣＤ６１＋細胞を取り除くことを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ドナーから前記サンプルを得る前に、前記ドナーに顆粒球コロニー刺激因子又はフコイダンを投与する、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ドナーが骨欠損の対象又は別の対象である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
骨移植片又は骨移植片代替物を前記骨欠損部位に投与することを更に含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記体性幹細胞を足場に移植する、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
対象の骨欠損の治療に使用される、２μｍ〜８．０μｍの大きさの、Ｌｇｒ５＋又はＣＤ３４９＋である、単離した体性幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１４年１１月１９日出願の米国仮特許出願第６２／０８１，８８０号の優先権を主張するものであり、その内容全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて多くの又は全ての細胞系譜に分化することができる多能性又は全能性の細胞である。その多能性により、胚性幹（ＥＳ）細胞は種々の疾患の治療に対してかなり有望視されている。今のところ、倫理上の概念がヒトＥＳ細胞の使用の妨げとなっている。非胚由来の幹細胞ではこの問題は回避されると思われる。このような成体幹細胞はＥＳ細胞と同様の分化能を有する。
【０００３】
外胚葉、中胚葉及び内胚葉に分化することができる、骨髄由来の多能性成体前駆細胞が単離されてきた。骨髄から単離した成体の多系譜誘導性細胞及び骨髄由来の単一の細胞クローンを含む他の種類の細胞も、分化に対して同じ多能性能を有する。このような多能性体性細胞を獲得し、培養し、拡大させることは困難である。
【発明の概要】
【０００４】
対象の骨欠損を治療する方法を本明細書に記載する。本方法は、本方法を必要とする対象の骨欠損部位に有効量の単離した体性幹細胞を投与することを含む。体性幹細胞は約２μｍ〜８．０μｍの大きさの、Ｌｇｒ５＋又はＣＤ３４９＋である。
【０００５】
単離した体性幹細胞は、以下の手法により得ることができる：ドナー対象由来のサンプルが上層及び下層に分離するまで、容器内で該サンプルをＥＤＴＡ又はヘパリンとともにインキュベーションし、上層を回収し、約２μｍ〜８．０μｍの大きさの、Ｌｇｒ５＋又はＣＤ３４９＋である体性幹細胞集団を上層から単離する。
【０００６】
１つ又は複数の実施形態の詳細を、添付の図面及び本明細書の以下に記載する。実施形態の他の特徴、目的及び利点は、明細書及び図面並びに特許請求の範囲から明らかであるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ＳＢ細胞を用いた頭蓋欠損の修復を示す一連の画像である。（Ａ）：陽性対照及び陰性対照、（Ｂ）：ＳＢ細胞。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
予期せぬことに、小型の成体幹細胞、すなわちＳＢ細胞を対象由来のサンプルから単離することができることを発見した。ＳＢ細胞は、３つの胚葉、すなわち外胚葉、内胚葉及び中胚葉に関連する細胞型に分化することができる多能性又は全能性幹細胞である。米国特許出願公開第２０１２／００３４１９４号を参照のこと。
【０００９】
生物学的サンプル（例えば、骨髄サンプル）から単離したＳＢ細胞は、約２μｍ〜６．０μｍの大きさの、ＣＤ１３３−、ＣＤ３４−、ＣＤ９０−、ＣＤ６６ｅ−、ＣＤ３１−、Ｌｉｎ１−、ＣＤ６１−、Ｏｃｔ４＋、Ｎａｎｏｇ＋及びＳｏｘ２−である。ＳＢ細胞集団には、ＣＤ９−及びＬｇｒ５＋である細胞に特有の亜集団（「Ｌｇｒ５＋  ＳＢ細胞」）がある。別にＣＤ９＋及びＣＤ３４９＋であるＳＢ細胞の亜集団（「ＣＤ３４９＋  ＳＢ細胞」）がある。
【００１０】
以下の手法を用いてＳＢ細胞をサンプルから単離することができる。サンプルが上層及び下層に分離するまで、容器内（例えば、ＥＤＴＡチューブ内）でサンプルをＥＤＴＡ又はヘパリンとともにインキュベーションする。４℃にて６時間〜４８時間インキュベーションを行うことができる。上記のインキュベーション工程により生成された上層は、ＳＢ細胞（例えばＬｇｒ５＋  ＳＢ細胞及びＣＤ３４９＋  ＳＢ細胞）を含有し、この細胞を、細胞の大きさに基づく方法（例えば、遠心分離及び濾過）又は細胞表面マーカーに基づく方法（例えば、フローサイトメトリー、抗体及び磁気選別）を用いて単離することができる。
【００１１】
ＳＢ細胞を富化するために、Ｌｉｎ＋細胞及びＣＤ６１＋細胞を上層の細胞集団から取り出すことができる。代替法として、Ｌｉｎ−細胞及びＣＤ６１−細胞を、細胞集団から選抜することができる。Ｌｉｎ＋細胞及びＣＤ６１＋細胞を、当該技術分野において既知の方法、例えばＥａｓｙＳｅｐビオチン選択キット及びＥａｓｙＳｅｐ  ＰＥ選択キットを用いて取り出し、又は選抜することができる。
【００１２】
ＳＢ細胞を更に富化するために、対象に顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）又はフコイダンを投与した後に、対象からサンプルを得ることができる。例えば、サンプルを得る前に、対象に５μｇ／ｋｇ／日のＧＣＳＦを１日〜５日間注射することができる。以下に記載のデータは、ＧＣＳＦがＳＢ細胞を動員することができることを示す。ＧＣＳＦが動員するＳＢ細胞はわずかに大きく、すなわち約４μｍ〜８μｍのものとなる。
【００１３】
ＳＢ細胞を、血液、骨髄、骨格筋又は脂肪組織サンプル等のサンプルから単離することができる。一実施形態において、サンプルが骨格筋又は脂肪組織サンプルである場合、インキュベーション工程の前に、組織サンプルをまずコラゲナーゼで消化し、細胞外マトリクスから個々の細胞を放出させることができる。サンプルはヒト対象から得ることができる。
【００１４】
単離したＳＢ細胞、Ｌｇｒ５＋  ＳＢ細胞又はＣＤ３４９＋  ＳＢ細胞を非分化培地において１０回、２０回、５０回又は１００回を超える集団倍加を行い更に増殖させることができ、これらの細胞は自発的な分化、老化、形態学的変化、成長率の増加又は分化能の変化を示すことはない。これらの幹細胞を、標準的な方法により使用するまで保存することができる。
【００１５】
「幹細胞」という用語は、全能性又は多能性、すなわち多くの最終分化細胞型に分化することが可能な細胞を指す。全能性幹細胞は通例、どの細胞型にも発達する能力を有する。全能性幹細胞は、由来が胚又は非胚であってよい。多能性細胞は通例、幾つかの様々な最終分化細胞型に分化することが可能な細胞である。単能性幹細胞は、１つの細胞型を産生することしかできないが、非幹細胞とは異なる自己再生能を有する。これらの幹細胞は、血液、神経、筋肉、皮膚、消化管、骨、腎臓、肝臓、膵臓、胸腺等を含む種々の組織又は器官系を由来とすることができる。
【００１６】
本明細書に開示の幹細胞は実質的に純粋である。「実質的に純粋」という用語は、幹細胞又はそれ由来の細胞（例えば、分化細胞）に関連して用いられるとき、特定の細胞が作製中の細胞の大部分を構成する（すなわち、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％超）ことを意味する。一般に、実質的に精製された細胞集団が作製中の細胞の少なくとも約７０％、通常作製中の細胞の約８０％、特に作製中の細胞の少なくとも約９０％（例えば、９５％、９７％、９９％又は１００％）を構成する。
【００１７】
細胞に関連して本明細書において同義に使用される「増殖」及び「拡大」という用語は、同じ型の細胞の数を分裂により増大させることを指す。「分化」という用語は、細胞が特定の機能に特化し、例えば細胞が最初の細胞型のものと異なる１つ又は複数の形態学的特徴及び／又は機能を獲得するといった発達のプロセスを指す。「分化」という用語には、分化系列決定及び最終分化プロセスの両方が含まれる。分化を、例えば免疫組織化学又は当業者に既知の他の手法を用いて分化系列マーカーの有無をモニタリングすることによって評価することができる。前駆細胞由来の分化子孫細胞は、幹細胞の起源組織と同じ胚葉又は組織に関連し得るが、必ずしもその必要はない。例えば、神経前駆細胞及び筋前駆細胞は、造血細胞系譜に分化することができる。
【００１８】
本明細書において同義に使用される「分化系列決定」及び「特定（specification：形質の獲得）」という用語は、幹細胞が特定の限定された範囲の分化細胞型を形成するよう分化決定（committed）された前駆細胞を生じるといった幹細胞が行うプロセスを指す。分化決定された前駆細胞は多くの場合、自己再生又は細胞分裂が可能である。
【００１９】
「最終分化」という用語は、細胞の成熟した、完全に分化した細胞への最終的な分化を指す。例えば、神経前駆細胞及び筋前駆細胞は、造血細胞系譜に分化することができ、その最終分化により特定の細胞型の血液細胞に成熟する。通常、最終分化は細胞周期から外れ、増殖を停止することに関連する。本明細書において使用される「前駆細胞」という用語は、特定の細胞系譜に分化決定された細胞を指し、その細胞が一連の細胞分裂によりこの系譜の細胞を生じる。前駆細胞の一例は筋芽細胞であり、これは１つの細胞型にのみ分化することが可能であるが、それ自体は完全に成熟又は完全に分化していない。
【００２０】
Ｌｇｒ５＋  ＳＢ細胞又はＣＤ３４９＋  ＳＢ細胞を使用し、患者の骨欠損を治療又は修復することができる。患者の骨欠損を治療するために、Ｌｇｒ５＋  ＳＢ細胞又はＣＤ３４９＋  ＳＢ細胞を単独で対象の欠損部位に投与することができる。細胞を骨移植片（例えば、自家移植片又は同種移植片）又は骨移植片代替物（例えば、脱灰した骨マトリクス、コラーゲン系マトリクス、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム及び硫酸カルシウム）と合わせて投与することもできる。
【００２１】
Ｌｇｒ５＋  ＳＢ細胞又はＣＤ３４９＋  ＳＢ細胞をまず、足場又はマトリクスに移植することもできる。次いで、足場又はマトリクスを欠損部位に移植することができる。１つ又は複数の材料（例えば、コラーゲン、アガロース、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、キトサン、ＰＬＧＡ及びＰＥＧ）で構成される幹細胞の足場は、当該技術分野において知られている。
【００２２】
「骨欠損」は、骨の一領域の骨組織（すなわち、骨の石灰化したマトリクス）の欠如又は欠損を指す。骨欠損は外傷、癌又は先天的病態等の種々の原因により生じるおそれがある。
【００２３】
異種及び自己の両方のＬｇｒ５＋  ＳＢ細胞又はＣＤ３４９＋  ＳＢ細胞を使用して、患者を治療することができる。異種細胞を使用する場合、ＨＬＡマッチングを行い、宿主応答を回避又は最小限にしなくてはならない。自己細胞を対象から富化し、精製し、後に使用するため保存することができる。細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで宿主又は移植片のＴ細胞とともに培養し、宿主に再導入することができる。これは、宿主が自己として細胞を認識し、Ｔ細胞の活性をより好都合に低下させる利点を有し得る。
【００２４】
遺伝子操作し、組織適合させた万能ドナーＬｇｒ５＋  ＳＢ細胞又はＣＤ３４９＋  ＳＢ細胞を当該技術分野において既知の方法を用いて作製することもできる。より詳細には、本明細書に記載の幹細胞をその表面にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現させないよう遺伝子操作することができる。実質的に全ての細胞表面のＭＨＣクラスＩ分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子を発現させないよう細胞を操作することもできる。本明細書において使用される「発現しない」という用語は、細胞表面に発現する量が応答を惹起するには不十分であること、又は発現するタンパク質が欠失しているため、応答を惹起しないことのいずれかを意味する。
【００２５】
「治療する」とは、障害、障害の症状、その障害に続発する疾患状態又は損傷／障害となる傾向を治癒し、軽減し、緩和し、救済し、それらの発症を遅らせ、予防し、又は改善するために、その障害に罹患し、又は発症の危険のある対象に組成物（例えば、細胞組成物）を投与することを指す。「有効量」は、受療対象において医学的に望ましい結果を与えることができる組成物の量を指す。治療方法は、単独又は他の薬剤若しくは療法と併用して行うことができる。
【００２６】
以下の特定の実施例は単なる例示と解釈され、それ以外の開示を決して限定するものではない。更に詳述しなくても、当業者であれば本明細書における説明に基づき、最大限に本開示を使用することができると思われる。本明細書に引用した全ての刊行物の全体を引用することにより本明細書の一部をなす。
【実施例】
【００２７】
骨髄サンプルをヒト対象から採取し、抗凝固ＥＤＴＡチューブに入れた。チューブを４℃にて６時間〜４８時間インキュベーションした後、サンプルを２層に分離した。上層は体性幹細胞集団（ＳＢ細胞）を含有し、これをＣ６  ａｃｃｕｒｉフローサイトメトリー、免疫細胞化学及びＲＴ−ＰＣＲによって更に分析した。下層は６．０μｍ以上の赤血球細胞及び白血球細胞を含有する。
【００２８】
サイジング用ビーズを用いて、フローサイトメトリーを試行し、ＳＢ細胞の大きさを求めた。ＳＢ細胞の大きさは２ミクロン〜６ミクロンであった。ＳＢ細胞はＬｇｒ５＋又はＣＤ３４９＋のいずれかであった。ゲートＰ２において、細胞集団の３２％にＬｇｒ５を発現した。
【００２９】
ＧＣＳＦを注射することによりＳＢ細胞を動員することができることがわかった。同じヒト対象に５μｇ／ｋｇ／日のＧＣＳＦを５日間注射した。末梢血液サンプルを最後の注射から約３．５時間後に採取した。ＳＢ細胞を上記の通り血液サンプルから単離し、フローサイトメトリーによって分析した。ＧＣＳＦ注射の前に対象から単離したＳＢ細胞に比べ、細胞の大きさは４ミクロン〜８ミクロンに増大し、Ｌｇｒ５＋細胞の割合も増加した。
【００３０】
正常なヒト血液（AllCellから購入）を抗凝固ＥＤＴＡチューブに入れ、それにＨｅｔａＳｔａｒｃｈ（StemCellから購入）を添加した。血液サンプルを２層に分離した。ＣＤ６１＋血小板及びＬｉｎ＋細胞（赤血球細胞及び白血球細胞を含む）を製造業者の説明書に従い、ＥａｓｙＳｅｐビオチン選択キット及びＥａｓｙＳｅｐ  ＰＥ選択キットをそれぞれ用いて上層から除去した。Ｌｉｎ＋細胞及びＣＤ６１＋細胞を取り出した後、Ｌｇｒ５＋  ＳＢ細胞又はＣＤ３４９＋  ＳＢ細胞の精製集団を得た。
【００３１】
コラーゲンスポンジとともに１００万個の上記精製ＳＢ細胞をＳＣＩＤマウスの、頭蓋骨から骨の一部を外科手術により除去することによって作製した頭蓋欠損部位に移植した。欠損部位にＳＢ細胞を移植して３カ月又は５カ月後に、マイクロトモグラフィー（microcomputed tomography：マイクロＣＴ）画像によりマウスを分析した。図１に示すように、ＳＢ細胞は、欠損部位を修復する骨構造体を形成することができた。ヒト骨形成タンパク質７（ｈＢＭＰ７）を過剰発現するヒト骨髄細胞を用いて処置したマウスを陽性対照として使用した。コラーゲンスポンジ及びＰＢＳのみを用いて処置したマウスを陰性対照として使用した。
【００３２】
他の実施形態
本明細書に開示の特徴は全て、任意に組み合わせて併用することができる。本明細書に開示のそれぞれの特徴は、同じ、同等又は同様の目的に役立つ代替の特徴によって置き換えることができる。したがって、他に明記されない限り、開示のそれぞれの特徴は、一般的な一連の同等又は同様の特徴の一例に過ぎない。
【００３３】
上記の説明から、当業者であれば記載の実施形態の本質的な特徴を容易に解明することができ、その趣旨及び範囲を逸脱することなく、実施形態の種々の変化及び変更を適用させることができる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内である。
【図１】
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【国際調査報告】
2018501189.tif 000004
2018501189.tif 000005