(57)【要約】  本発明は、機能障害性または非機能性Ｐ２Ｘプリン受容体７を発現する細胞に方向付けられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。機能障害性または非機能性Ｐ２Ｘプリン受容体７を発現する新生物細胞および腫瘍を標的とする方法、ならびに対象におけるがんを治療および予防する方法が、さらに提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原認識ドメインとシグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体であって、抗原認識ドメインが、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を認識する、キメラ抗原受容体。
【請求項２】
抗原認識ドメインが、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）結合部位と関連するエピトープを認識する、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３】
機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体が、野生型（機能性）Ｐ２Ｘ７受容体のＡＴＰ結合能力と比較して低減されたＡＴＰに結合する能力を有する、請求項１または２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４】
機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体が、受容体を機能障害性にする立体配置の変化を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項５】
立体配置の変化が、アミノ酸のトランス配置からシス配置への変化である、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項６】
トランス配置からシス配置へ変化したアミノ酸が、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体のアミノ酸２１０位のプロリンである、請求項５に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項７】
抗原認識ドメインが、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体のアミノ酸２１０位のプロリンを含むエピトープを認識する、請求項１から６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項８】
抗原認識ドメインが、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体のアミノ酸２００位のグリシンからアミノ酸２１６位システインにわたる１つまたは複数のアミノ酸残基を含むエピトープを認識する、請求項１から７のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項９】
抗原認識ドメインが、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体またはそのフラグメントのアミノ酸配列に対するアミノ酸配列相同性を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１０】
抗原認識ドメインが、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体の抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）部分のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列相同性を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１１】
前記抗体が、ヒト化抗体である、請求項９または１０に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１２】
抗原認識ドメインが、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列相同性を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１３】
抗原認識ドメインが、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合する多価一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列相同性を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１４】
多価一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が、二価ｓｃＦｖまたは三価ｓｃＦｖである、請求項１３に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１５】
抗原認識ドメインが、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合する単一抗体ドメイン（ｓｄＡｂ）のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列相同性を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１６】
シグナル伝達ドメインが、活性化受容体に由来する部分を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１７】
活性化受容体が、ＣＤ３共受容体複合体のメンバーである、請求項１６に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１８】
ＣＤ３共受容体複合体に由来する部分が、ＣＤ３−ζである、請求項１７に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１９】
活性化受容体が、Ｆｃ受容体である、請求項１６に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２０】
Ｆｃ受容体に由来する部分が、ＦｃεＲＩまたはＦｃγＲＩである、請求項１９に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２１】
シグナル伝達ドメインが、共刺激性受容体に由来する部分を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２２】
シグナル伝達ドメインが、活性化受容体に由来する部分と、共刺激性受容体に由来する部分とを含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２３】
共刺激性受容体が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、およびＩＣＯＳからなる群から選択される、請求項２１または２２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２４】
請求項１から２３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項２５】
請求項２４に記載の核酸分子を含む、核酸コンストラクト。
【請求項２６】
核酸分子の発現が、転写制御配列の制御下にある、請求項２５に記載の核酸コンストラクト。
【請求項２７】
転写制御配列が、構成的プロモーターである、請求項２６に記載の核酸コンストラクト。
【請求項２８】
転写制御配列が、誘導性プロモーターである、請求項２６に記載の核酸コンストラクト。
【請求項２９】
内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む、請求項２５から２８のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
【請求項３０】
核酸コンストラクトが、ベクターである、請求項２５から２９のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
【請求項３１】
ベクターが、ウイルスベクターである、請求項３０に記載の核酸コンストラクト。
【請求項３２】
請求項１から２３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を含む、遺伝子改変された細胞。
【請求項３３】
２つまたはそれ以上の異なるキメラ抗原受容体を含む、請求項３２に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項３４】
請求項２４に記載の核酸分子、または請求項２５から３１のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、または前記核酸コンストラクトのゲノム組込み形態を含む、遺伝子改変された細胞。
【請求項３５】
核酸分子または核酸コンストラクトが、２つまたはそれ以上の異なるキメラ抗原受容体をコードする、請求項３４に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項３６】
２つまたはそれ以上の異なるキメラ抗原受容体が、異なるシグナル伝達ドメインを有する、請求項３３または３５に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項３７】
活性化受容体に由来する部分を含むシグナル伝達ドメインを有する第１のキメラ抗原受容体と、共刺激性受容体に由来する部分を含むシグナル伝達ドメインを有する第２のキメラ抗原受容体とを含む、請求項３２から３６のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項３８】
活性化受容体が、ＣＤ３共受容体複合体のメンバーであるか、またはＦｃ受容体である、請求項３７に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項３９】
共刺激性受容体が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、およびＩＣＯＳからなる群から選択される、請求項３７または３８に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項４０】
共刺激性受容体を構成的に発現するようにさらに改変される、請求項３２から３６のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項４１】
共刺激性受容体のリガンドを発現し、それによって細胞の自己刺激が促進されるように、さらに改変される、請求項４０に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項４２】
サイトカインを分泌するようにさらに改変される、請求項３２から４１のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項４３】
サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、およびＩＬ−２１、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４２に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項４４】
白血球である、請求項３２から４３のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項４５】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項３２から４４のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項４６】
リンパ球である、請求項３２から４５のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項４７】
Ｔ細胞である、請求項３２から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項４８】
Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項４７に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項４９】
Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項４７に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項５０】
ナチュラルキラー細胞である、請求項３２から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項５１】
ナチュラルキラーＴ細胞である、請求項３２から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項５２】
機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を殺滅させる方法であって、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変された細胞に曝露するステップを含み、キメラ抗原受容体が、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に方向付けられている、方法。
【請求項５３】
キメラ抗原受容体が、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を直接的に認識する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
キメラ抗原受容体が、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を、仲介物を介して認識する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
仲介物が、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合するプローブであり、キメラ抗原受容体が、プローブを認識する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を、プローブに曝露するステップをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
プローブが、抗体またはアプタマーである、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５８】
プローブが、タグを含み、キメラ抗原受容体が、タグを認識する、請求項５５から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を殺滅させる方法であって、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を、請求項３２から５１のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞に曝露するステップを含む、方法。
【請求項６０】
機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を、外因性サイトカインに曝露するステップをさらに含む、請求項５２から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
遺伝子改変された細胞が、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞にとって自己である遺伝子改変された細胞である、請求項５２から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞が、対象の体内にある、請求項５２から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞が、がん細胞である、請求項５２から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
がん細胞が、脳のがん、食道がん、口腔がん、舌がん、甲状腺がん、肺がん、胃がん、膵臓がん、腎臓がん、結腸がん、直腸がん、前立腺がん、膀胱がん、子宮頸がん、上皮細胞がん、皮膚がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、および精巣がんのうちの１つまたは複数から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
がん細胞が、肺がん、食道がん、胃がん、結腸がん、前立腺がん、膀胱がん、子宮頸がん、膣がん、上皮細胞がん、皮膚がん、血液関連のがん、乳がん、子宮内膜がん、子宮がん、および精巣がんのうちの１つまたは複数から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
がんが、転移性である、請求項６３から６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
がんが、ステージＩＩＩのがんである、請求項６３から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
がんが、ステージＩＶのがんである、請求項６３から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
請求項３２から５１のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞を、インビトロで増殖させる方法であって、前記細胞を、キメラ抗原受容体の抗原に曝露するステップを含む、方法。
【請求項７０】
前記細胞を、サイトカインに曝露するステップをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
請求項３２から５１のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞を、インビトロで増殖させる方法であって、前記細胞を、キメラ抗原受容体の抗原に曝露し、同時に前記細胞をサイトカインに曝露するステップを含む、方法。
【請求項７２】
サイトカインが、ＩＬ−２サブファミリー、インターフェロンサブファミリー、ＩＬ−１０サブファミリー、ＩＬ−１サブファミリー、ＩＬ−１７サブファミリー、またはＴＧＦ−βサブファミリーのメンバーである、請求項７０または７１に記載の方法。
【請求項７３】
サイトカインが、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、およびＧＭ−ＣＳＦ、またはこれらの組合せからなる群から選択される、請求項７０または７１に記載の方法。
【請求項７４】
請求項３２から５１のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞を、インビトロで増殖させる方法であって、前記細胞を、固定化された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体に曝露するステップを含む、方法。
【請求項７５】
請求項３２から５１のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項７６】
サイトカインをさらに含む、請求項７５に記載の医薬組成物。
【請求項７７】
サイトカインが、ＩＬ−２サブファミリー、インターフェロンサブファミリー、ＩＬ−１０サブファミリー、ＩＬ−１サブファミリー、ＩＬ−１７サブファミリー、またはＴＧＦ−βサブファミリーのメンバーである、請求項７６に記載の医薬組成物。
【請求項７８】
サイトカインが、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、およびＧＭ−ＣＳＦ、またはこれらの組合せからなる群から選択される、請求項７６に記載の医薬組成物。
【請求項７９】
仲介物をさらに含む、請求項７５から７８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８０】
仲介物が、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合するプローブであり、キメラ抗原受容体が、プローブを認識する、請求項７９に記載の医薬組成物。
【請求項８１】
プローブが、抗体またはアプタマーである、請求項８０に記載の医薬組成物。
【請求項８２】
プローブが、タグを含み、キメラ抗原受容体が、タグを認識する、請求項８０または８１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
[0001]本出願は、２０１５年９月１１日に出願されたオーストラリア仮特許出願第２０１５９０３７１９号の優先権を主張し、その内容は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０００２】
[0002]本発明は、キメラ抗原受容体、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞、ならびにキメラ抗原受容体をがんの予防および／または治療に使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]免疫系は、様々な病因から保護する高度に進化した特異的な機序を有する。これらの病因の中でもとりわけ、細菌感染、ウイルス感染した細胞、および重要なことには、悪性新生物（がん）を引き起こし得る変異細胞など、望ましくない病原体を検出および排除することである。免疫系ががんの形成および成長を予防する能力は、「健常な」細胞と「疾患状態の」（例えば、新生物または前新生物）細胞とを区別する免疫系の細胞の能力に依存する。これは、健常な状態から疾患状態への細胞の移り変わりを示す細胞マーカー（抗原）の認識によって達成される。
【０００４】
[0004]がん細胞抗原を発現する細胞を標的とするように免疫系を操作または方向付けることによってがんを治療するための免疫療法アプローチを開発しようという試みが多数なされている。免疫療法アプローチは、主に、単離抗体もしくは操作抗体を用いて体液性免疫系を利用すること、またはより最近では、免疫系の細胞アームに重点をおいてきた。
【０００５】
[0005]がんの治療に細胞免疫療法を利用しようという初期の試みでは、腫瘍から単離し、エキソビボで増殖させたＴリンパ球を用いていた。このアプローチは、初期の調査では当初ある程度の見込みが得られていたが、このアプローチと関連する多数の技術的問題がある。Ｔ細胞集団を単離し、臨床的に妥当な数に増殖させる能力が、技術的に問題であり、増殖の性質をうまく制御できないことにより、最終的なＴ細胞集団は、明らかに不均一となり、含有しているがん抗原特異的Ｔ細胞の数もわずかとなり得る。結果として、この方法の有効性は、予測不可能であり、変化しやすい。
【０００６】
[0006]エキソビボで増殖させた腫瘍単離Ｔ細胞の使用と関連する不十分な点のいくつかに対処するために、キメラ抗原受容体（ＣＡＲまたは人工Ｔ細胞受容体）が、１９８０年代後半に開発され始めた。キメラ抗原受容体は、所望される抗原に特異的な細胞外領域をシグナル伝達領域に連結させることによって作製され、その結果、Ｔ細胞機能を誘導することができる抗原特異的受容体が得られる。
【０００７】
[0007]単離Ｔ細胞にＣＡＲを形質転換することによって、所与の抗原に特異的なＴ細胞の集団が得られる。結果として、多数の抗原特異的Ｔ細胞集団を生成し、免疫療法に使用することができる。
【０００８】
[0008]ＣＡＲを形質転換した、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞の初期臨床試験は、有望であった。しかしながら、ＣＡＲを形質転換したＴ細胞の有効性は、著しい高サイトカイン血症をもたらし、一部の患者では最終的には死亡を引き起こした。これらの副作用は、主として、健常な非がん性細胞集団におけるＣＡＲの同種抗原の内因性発現の結果として誘導される、ＣＡＲを形質転換したＴ細胞の、標的は合っているが腫瘍は外れている活性によって誘導されると考えられる。
【０００９】
[0009]したがって、がん性細胞によって選択的に発現されるが、非がん性細胞では内因的に発現されない腫瘍関連抗原を標的とするＣＡＲを開発する必要性が存在することは明らかである。
【００１０】
[0010]文書、動作、材料、デバイス、物品などに関する考察は、単に本発明の文脈を提供する目的で、本明細書に含まれる。これらの問題のいずれかもしくはすべては、本出願のそれぞれの特許請求の優先権の日付よりも前に存在していたため、先行技術の基盤の一部をなしていたこと、または本発明に関連する分野における共通の一般知識であったことは、示唆されるものではなく、またはそのように示されるものでもない。
【発明の概要】
【００１１】
[0011]本発明は、ＣＡＲを発現する免疫細胞の著しい「標的は合っている」が「腫瘍は外れている」活性に起因して、様々な新生物（がん性）または前新生物（前がん性）細胞と特異的に関連するマーカーを標的とする、ＣＡＲおよびそれを発現する遺伝子改変された細胞を開発する必要性があるという認識に、部分的に基づいている。本発明者らは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体が、ＣＡＲを用いて標的化するのに好適なマーカーであることを認識している。
【００１２】
[0012]したがって、第１の態様において、本発明は、抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体であって、抗原認識ドメインが、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を認識する、キメラ抗原受容体を提供する。
【００１３】
[0013]一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）結合部位と関連するエピトープを認識する。一部の実施形態において、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体は、ＡＴＰ結合部位において、野生型（機能性）Ｐ２Ｘ７受容体のＡＴＰ結合能力と比較して低減されたＡＴＰに結合する能力を有する。一部の実施形態において、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体は、ＡＴＰ結合部位でＡＴＰに結合することができない。
【００１４】
[0014]一部の実施形態において、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体は、受容体を機能障害性にする立体配置の変化を有する。一部の実施形態において、立体配置の変化は、アミノ酸のトランス配置からシス配置への変化である。一部の実施形態において、トランス配置からシス配置へ変化したアミノ酸は、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体のアミノ酸２１０位のプロリンである。
【００１５】
[0015]一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体のアミノ酸２１０位のプロリンを含むエピトープを認識する。一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体のアミノ酸２００位のグリシンからアミノ酸２１６位のシステイン（両端を含む）にわたる１つまたは複数のアミノ酸残基を含むエピトープを認識する。
【００１６】
[0016]ＣＡＲの抗原認識ドメインは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体と相互作用し、それを特異的に認識することができる、任意の好適な分子であり得る。しかしながら、一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体またはそのフラグメントのアミノ酸配列に対するアミノ酸配列相同性を含む。一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体の抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列相同性を含む。一部の実施形態において、抗体は、ヒト化抗体である。
【００１７】
[0017]一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）または多価ｓｃＦｖのアミノ酸配列に対するアミノ酸配列相同性を含む。一部の実施形態において、多価ｓｃＦｖは、二価ｓｃＦｖまたは三価ｓｃＦｖである。
【００１８】
[0018]一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合する単一抗体ドメイン（ｓｄＡｂ）に対するアミノ酸配列相同性を含む。
[0019]一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体の１つまたは複数のＣＤＲ領域に対するアミノ酸配列相同性を含む結合ペプチドを含む。一部の実施形態において、結合ペプチドは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体のＶＨ鎖および／またはＶＬ鎖のＣＤＲ１、２、および３ドメインに対するアミノ酸配列相同性を含む。一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、配列番号１０、３２、３３、または３４に記載される配列の３０位から３５位、５０位から６７位、または９８位から１０８位にわたる領域のうちのいずれか１つに少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９４％同一である１つまたは複数のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、配列番号１０、３２、３３、または３４に記載される配列の３０位から３５位、５０位から６７位、または９８位から１０８位にわたる配列のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、配列番号１０、３２、３３、または３４に記載される配列のうちの１つまたは複数を含む。
【００１９】
[0020]一部の実施形態において、シグナル伝達ドメインは、活性化受容体に由来する部分を含む。一部の実施形態において、活性化受容体は、ＣＤ３共受容体複合体のメンバーであるか、またはＦｃ受容体である。一部の実施形態において、ＣＤ３共受容体複合体に由来する部分は、ＣＤ３−ζである。一部の実施形態において、Ｆｃ受容体に由来する部分は、ＦｃεＲＩまたはＦｃγＲＩである。
【００２０】
[0021]一部の実施形態において、シグナル伝達ドメインは、共刺激性受容体に由来する部分を含む。一部の実施形態において、シグナル伝達ドメインは、活性化受容体に由来する部分および共刺激性受容体に由来する部分を含む。一部の実施形態において、共刺激性受容体は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、およびＩＣＯＳからなる群から選択される。
【００２１】
[0022]第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様によるキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
[0023]第３の態様において、本発明は、本発明の第２の態様による核酸分子を含む核酸コンストラクトを提供する。一部の実施形態において、核酸分子の発現は、転写制御配列の制御下にある。一部の実施形態において、転写制御配列は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得る。
【００２２】
[0024]本発明の第３の態様の一部の実施形態において、核酸コンストラクトは、核酸コンストラクトから発現されると、ｍＲＮＡ内での転写開始を可能にする、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む。
【００２３】
[0025]本発明の第３の態様の一部の実施形態において、核酸コンストラクトは、ウイルスベクターなどのベクターであり、これを使用して、ＣＡＲの発現を誘導するようにＴ細胞を形質転換することができる。
【００２４】
[0026]第４の態様において、本発明は、本発明の第１の態様によるＣＡＲを含む遺伝子改変された細胞を提供する。一部の実施形態において、この細胞は、２つまたはそれ以上の異なるＣＡＲを含む。
【００２５】
[0027]第５の態様において、本発明は、本発明の第２の態様による核酸分子、または本発明の第３の態様による核酸コンストラクト、またはコンストラクトのゲノム組込み形態を含む、遺伝子改変された細胞を提供する。一部の実施形態において、核酸分子または核酸コンストラクトは、２つまたはそれ以上の異なるＣＡＲをコードする。
【００２６】
[0028]本発明の第４および第５の態様の一部の実施形態において、２つまたはそれ以上の異なるＣＡＲは、異なるシグナル伝達ドメインを有する。
[0029]本発明の第４および第５の態様の一部の実施形態において、細胞は、活性化受容体に由来する部分を含むシグナル伝達ドメインを有する第１のＣＡＲと、共刺激性受容体に由来する部分を含むシグナル伝達ドメインを有する第２のＣＡＲとを含む。一部の実施形態において、活性化受容体は、ＣＤ３共受容体複合体のメンバーであるか、またはＦｃ受容体である。一部の実施形態において、共刺激性受容体は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、およびＩＣＯＳからなる群から選択される。
【００２７】
[0030]本発明の第４および第５の態様の一部の実施形態において、細胞は、共刺激性受容体を構成的に発現するように、さらに改変される。一部の実施形態において、細胞は、共刺激性受容体のリガンドを発現し、それによって細胞の自己刺激が促進されるように、さらに改変される。
【００２８】
[0031]本発明の第４および第５の態様の一部の実施形態において、細胞は、サイトカインを分泌するように、さらに改変される。一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、およびＩＬ−２１、またはそれらの組合せからなる群から選択される。
【００２９】
[0032]本発明の第４および第５の態様の一部の実施形態において、細胞は、白血球である。一部の実施形態において、細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、リンパ球、Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む）、ナチュラルキラー細胞、またはナチュラルキラーＴ細胞である。
【００３０】
[0033]第６の態様において、本発明は、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を殺滅させる方法であって、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変された細胞に曝露するステップを含み、キメラ抗原受容体は、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に方向付けられている、方法を提供する。
【００３１】
[0034]本発明の第６の態様の一部の実施形態において、ＣＡＲは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を直接的に認識するか、または仲介物（intermediate）を介して機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を認識する。一部の実施形態において、仲介物は、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合するプローブであり、ＣＡＲは、プローブを認識する。一部の実施形態において、プローブは、抗体またはアプタマーである。一部の実施形態において、プローブは、タグを含み、ＣＡＲは、タグを認識する。
【００３２】
[0035]第７の態様において、本発明は、機能障害性Ｐ２Ｘ７を発現する細胞を殺滅させる方法であって、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を、本発明の第４または第５の態様による遺伝子改変された細胞に曝露するステップを含む、方法を提供する。
【００３３】
[0036]本発明の第６および第７の態様の一部の実施形態において、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞は、外因性サイトカインとともに、遺伝子改変された細胞に曝露される。一部の実施形態において、遺伝子改変された細胞は、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞にとって自己である遺伝子改変された細胞である。
【００３４】
本発明の第６および第７の態様の一部の実施形態において、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞は、がん細胞である。一部の実施形態において、がんは、脳のがん、食道がん、口腔がん、舌がん、甲状腺がん、肺がん、胃がん、膵臓がん、腎臓がん、結腸がん、直腸がん、前立腺がん、膀胱がん、子宮頸がん、上皮細胞がん、皮膚がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、および精巣がんからなる群から選択される。一部の実施形態において、がんは、肺がん、食道がん、胃がん、結腸がん、前立腺がん、膀胱がん、子宮頸がん、膣がん、上皮細胞がん、皮膚がん、血液関連のがん、乳がん、子宮内膜がん、子宮がん、および精巣がんからなる群から選択される。
【００３５】
[0037]本発明の第６および第７の態様の一部の実施形態において、がんは、転移性である。一部の実施形態において、がんは、ステージＩＩＩのがんであるか、またはステージＩＶのがんである。
【００３６】
[0038]第８の態様において、本発明は、本発明の第４または第５の態様による遺伝子改変された細胞をインビトロで増殖させる方法であって、細胞を、ＣＡＲの抗原に曝露するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、細胞を、サイトカインに曝露するさらなるステップを含む。
【００３７】
[0039]第９の態様において、本発明は、本発明の第４または第５の態様による遺伝子改変された細胞をインビトロで増殖させる方法であって、細胞を、ＣＡＲの抗原に曝露し、同時に、細胞をサイトカインに曝露するステップを含む、方法を提供する。
【００３８】
[0040]本発明の第８および第９の態様の一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ−２サブファミリー、インターフェロンサブファミリー、ＩＬ−１０サブファミリー、ＩＬ−１サブファミリー、ＩＬ−１７サブファミリー、またはＴＧＦ−βサブファミリーのメンバーである。
【００３９】
[0041]本発明の第８および第９の態様の一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、およびＧＭ−ＣＳＦ、またはこれらの組合せからなる群から選択される。
【００４０】
[0042]第１０の態様において、本発明は、本発明の第４または第５の態様による遺伝子改変された細胞をインビトロで増殖させる方法であって、細胞を、固定化された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体に曝露するステップを含む、方法を提供する。本発明の第１０の態様の一部の実施形態において、抗体は、ビーズ基板（例えば、「ヒト活性化因子」Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））に固定化される。本発明の第１０の態様の一部の実施形態において、抗体は、培養フラスコ、プレート、またはバイオリアクターの表面など、組織培養容器の表面に固定化される。
【００４１】
[0043]第１１の態様において、本発明は、本発明の第４または第５の態様による遺伝子改変された細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。一部の実施形態において、医薬組成物は、サイトカインからなり得る好適なアジュバントを含む。一部の実施形態において、医薬組成物はまた、本明細書に記載される仲介物を含んでもよい。
【００４２】
[0044]本発明の態様および利点のさらなる理解のために、添付の図面と併せて、以下の詳細な説明への参照がなされるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】[0045]本発明の実施形態による抗非機能性（ｎｆ）Ｐ２Ｘ７受容体キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の配置を示す概略図である。
【図２】[0046]図１の抗ｎｆ  Ｐ２Ｘ７受容体ＣＡＲの発現に使用されるＢＬＩＶプラスミドを示す概略図である。
【図３】[0047]ＢＬＩＶプラスミドを形質転換した大腸菌クローンから単離した、ＢａｍＨＩで制限酵素処理したＤＮＡに由来する制限酵素処理フラグメントを示す電気泳動ゲルである。
【図４】[0048]ＢＬＩＶプラスミドを形質導入した選択された大腸菌クローンから単離した、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、およびＰｓｔＩで制限酵素処理したＤＮＡに由来する制限酵素処理フラグメントを示す電気泳動ゲルである。
【図５】[0049]ＢＬＩＶ−ＣＡＲ−短ヒンジコンストラクトを含有するレンチウイルスベクターの構築に必要とされるプラスミドをトランスフェクト下２９３Ｔ細胞およびレンチウイルスベクターを含有する上清を形質導入した２９３Ｔ細胞の顕微鏡画像を示す図である。
【図６】[0050]ＢＬＩＶ−ＣＡＲ−長ヒンジコンストラクトを含有するレンチウイルスベクターの構築に必要とされるプラスミドをトランスフェクト下２９３Ｔ細胞およびレンチウイルスベクターを含有する上清を形質導入した２９３Ｔ細胞の顕微鏡画像を示す図である。
【図７】[0051]ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒトＣＤ８＋Ｔ細胞エンリッチメントキットで精製したＴ細胞の細胞純度のＦＡＣＳ分析である。
【図８】[0052]ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＢＴ５４９細胞の共培養を含む、殺滅アッセイのＦＡＣＳ分析である。
【図９】[0053]ＢＬＩＶ−ＣＡＲ−短ヒンジプラスミドおよびＢＬＩＶ−ＣＡＲ−短ヒンジプラスミドを含有するレンチウイルスベクターを形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞の４８時間の共培養後に消失した色素標識した標的細胞の割合を、形質導入していないＣＤ８＋Ｔ細胞および空のＢＬＩＶプラスミドを形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して図示するグラフである。
【図１０】[0054]ＰＥＰ２−２−１−１、ＰＥＰ２−４７２−２、およびＰＥＰ２−２−１２結合ペプチドと、ｎｆ−Ｐ２Ｘ７受容体に方向付けられた抗体とのアライメントである。
【図１１】[0055]本発明のさらなる実施形態による抗ｎｆ  Ｐ２Ｘ７受容体ＣＡＲの配置を示す概略図である。
【図１２】[0056]図１１の抗ｎｆ  Ｐ２Ｘ７受容体ＣＡＲの発現に使用されるｐＣＤＨプラスミドを示す概略図である。
【図１３】[0057]ｐＣＤＨプラスミドを形質転換した選択されたＳｕｒｅ  ２クローンから単離した、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔ  Ｉで制限酵素処理したＤＮＡに由来する制限酵素処理フラグメントを示す電気泳動ゲルの図である。
【図１４】[0058]ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション効率のＦＡＣＳ分析である。
【図１５】[0059]レンチウイルス形質導入効率のＦＡＣＳ分析の代表的なヒストグラムである。
【図１６】[0060]ＧＦＰを発現する形質転換したＣＤ８細胞の割合のＦＡＣＳ分析である。
【図１７】[0061]非機能性Ｐ２Ｘ７受容体および機能性Ｐ２Ｘ７受容体の生成のための融合タンパク質の骨格の図である。
【図１８】[0062]ｐＤＯＮＲ−１０７ベクターを含有するＥＸＤ２＿Ｋ１９３ＡまたはＥＸＤ２＿ＷＴを形質転換した選択されたＥ．ｃｌｏｎｉ（登録商標）１０Ｇクローンから単離した、Ｂａｍ  ＨＩおよびＰｍｅＩで制限酵素処理したＤＮＡに由来する制限酵素処理フラグメントを示す電気泳動ゲルの図である。
【図１９】[0063]ｐＬＶ−４１６ベクターを含有するＥＸＤ２＿Ｋ１９３ＡまたはＥＸＤ２＿ＷＴを形質転換した選択されたＥ．ｃｌｏｎｉ（登録商標）１０Ｇクローンから単離した、Ｂａｍ  ＨＩで制限酵素処理したＤＮＡに由来する制限酵素処理フラグメントを示す電気泳動ゲルの図である。
【図２０】[0064]ＨＥＫ２９３細胞への、ｐＬＶ−４１６−ＥＸＤ２＿Ｋ１９３ＡおよびｐＬＶ−４１６−ＥＸＤ２＿ＷＴのレンチウイルスパッケージングの形質導入のＦＡＣＳ分析である。
【図２１】[0065]ＨＥＫ２９３への、ｐＬＶ−４１６−ＥＸＤ２＿Ｋ１９３ＡコンストラクトまたはｐＬＶ−４１６−ＥＸＤ２＿ＷＴコンストラクトのいずれかを含有するレンチウイルスの形質導入のＦＡＣＳ分析である。
【図２２】[0066]ＰＥＰ２−２−１−１、ＰＥＰ２−４７２−２  ＣＡＲを発現するＴ細胞による、ｎｆＰ２Ｘ７を発現するＨＥＫ標的細胞および２３１乳がん細胞の殺滅を図示するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
[0067]本明細書において言及されるヌクレオチド配列およびポリペプチド配列は、配列識別子番号（配列番号）によって表される。配列識別子の概要を、表１に提供する。配列表はさらに、本明細書の最後に提供される。
【００４５】
【表１−１】
2018526033.tif 000003
【００４６】
【表１−２】
2018526033.tif 000004
【００４７】
[0068]本発明者らは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞の著しい「標的は合っている」が「腫瘍は外れている」活性に起因して、新生物（がん性）細胞または前新生物（前がん性）細胞と特異的に関連するマーカーを標的とする、ＣＡＲおよびそれを発現する遺伝子改変された細胞を開発する必要性があることを認識している。本発明者らは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体が、様々ながんにおいて、ＣＡＲを発現する免疫細胞を用いて標的化するのに好適なマーカーであることを認識している。
【００４８】
[0069]したがって、第１の態様において、本発明は、抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、抗原認識ドメインが、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を認識する、キメラ抗原受容体を提供する。
【００４９】
[0070]キメラ抗原受容体は、細胞の表面上に発現すると、抗原特異的細胞応答を誘導することができる、人工的に構築されたタンパク質である。ＣＡＲは、少なくとも２つのドメイン、すなわち、抗原を特異的に認識する抗原認識ドメインまたはより具体的には抗原のエピトープ部分である第１のドメイン、ならびに細胞内シグナル伝達経路を誘導することができるかまたはその誘導に関与することができるシグナル伝達ドメインである第２のドメインを含む。
【００５０】
[0071]これらの２つのドメインの組合せにより、ＣＡＲの抗原特異性および所望される細胞応答を誘導するＣＡＲの能力が決定され、後者は、ＣＡＲの宿主細胞にも依存する。例えば、Ｔヘルパー細胞において発現され、ＣＤ３活性化ドメインを含むシグナル伝達ドメインを有する、ＣＡＲの活性化は、その同種抗原に遭遇することによって活性化されると、様々なサイトカインを分泌するようにＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞を誘導することができる。さらなる例において、同じＣＡＲは、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞において発現される場合、同種抗原を発現する細胞によって活性化されると、サイトカインの放出を誘導することができ、これが、最終的には抗原発現細胞のアポトーシスの誘導をもたらす。
【００５１】
[0072]抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインに加えて、ＣＡＲは、追加の構成要素または部分をさらに含んでもよい。例えば、ＣＡＲは、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインの一部分を含み得るかまたはそれと関連し得る、膜貫通ドメインを含んでもよい。膜貫通ドメインは、典型的には、１つまたは複数の疎水性ヘリックスであり、これが、細胞の脂質二重層に及び、ＣＡＲを細胞膜内に埋め込む。ＣＡＲの膜貫通ドメインは、細胞と結合したときのＣＡＲの発現パターンの１つの決定因子であり得る。例えば、ＣＤ３共受容体関連の膜貫通ドメインを使用することにより、ナイーブＴ細胞におけるＣＡＲの発現を可能にすることができ、一方でＣＤ４共受容体由来の膜貫通ドメインの使用により、Ｔヘルパー細胞におけるＣＡＲの発現を誘導することができるが、細胞傷害性Ｔ細胞においては誘導し得ない。
【００５２】
[0073]ＣＡＲのさらなる構成要素または部分は、リンカードメインであり得る。リンカードメイン（スペーサーまたはヒンジドメインとしても知られる）は、膜貫通ドメインの細胞外の側から抗原認識ドメインにわたり、それによって、抗原認識ドメインを膜貫通ドメインに連結させることができる。一部の事例においては、機能性ＣＡＲにリンカードメインは必要ない（すなわち、抗原認識ドメインは、膜貫通ドメインに直接接続することができる）が、一部の状況においては、リンカードメインの使用により、ＣＡＲの有効性を高めることが可能となる。リンカードメインは、抗原に結合するのに必要なＣＡＲの抗原認識ドメインの配向を許容するようなＣＡＲの可動性を可能にすることを含む、様々な機能性を有し得る。結果として、リンカードメインは、この機能を行う任意のアミノ酸配列であり得る。リンカードメインの１つの非限定的な例は、ＩｇＧ抗体のヒンジ領域、例えば、ＩｇＧ１ヒンジ領域に対するアミノ酸配列相同性を有するドメインである。別の例としては、抗体のＣＨ２ＣＨ３領域、またはＣＤ３共受容体複合体、ＣＤ４共受容体もしくはＣＤ８共受容体の部分に対する配列相同性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
【００５３】
[0074]Ｐ２Ｘ７受容体（プリン受容体Ｐ２Ｘ、リガンド開口型イオンチャネル７）は、ヒトを含むいくつかの種において発現されるＡＴＰ開口型イオンチャネルである。この受容体は、ある遺伝子によってコードされるが、この遺伝子の公式の符号は、Ｐ２ＲＸ７である。この遺伝子は、Ｐ２Ｘプリン受容体７、ＡＴＰ受容体、Ｐ２Ｚ受容体、Ｐ２Ｘ７受容体、およびプリン受容体Ｐ２Ｘ７バリアントＡとも称されている。本開示の目的で、この遺伝子およびコードされる受容体は、本明細書において、それぞれ、Ｐ２Ｘ７およびＰ２Ｘ７と称する。
【００５４】
[0075]ヒトＰ２Ｘ７遺伝子のｍＲＮＡ配列、コーディング（ｃＤＮＡ）配列、およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１から３に記載されている。ヒトＰ２Ｘ７遺伝子のｍＲＮＡ配列およびアミノ酸配列はまた、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２５６２．５およびＮＰ＿００２５５３．３によっても表される。Ｐ２Ｘ７遺伝子はチンパンジー、アカゲザル、イヌ、ウシ、マウス、ラット、ブタ、ニワトリ、ゼブラフィッシュ、およびカエルにおいて保存されている。ヒトおよび他の種におけるＰ２Ｘ７遺伝子のさらなる詳細は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）において、ＧｅｎＢａｎｋデータベースからアクセスすることができる。例えば、ヒトＰ２Ｘ７のＧｅｎｅ識別子番号は５０２７であり、チンパンジーのものは４５２３１８であり、サルのものは６９９４５５であり、イヌのものは４４８７７８であり、ウシのものは２８６８１４であり、マウスのものは１８４３９であり、ゼブラフィッシュのものは３８７２９８であり、カエルのものは３９８２８６である。さらに、少なくとも７３種類の生物が、ヒトＰ２Ｘ７遺伝子とのオルソログを有する。
【００５５】
[0076]ヒトおよび他の種におけるＰ２Ｘ７遺伝子に関するさらなる詳細は、ＮＣＢＩのＵｎｉＧｅｎｅポータルにおいても見出すことができる（例えば、ヒトＰ２Ｘ７についてはＵｎｉＧｅｎｅ  Ｈｓ．７２９１６９−ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅｎｅ／ｃｌｕｓｔ．ｃｇｉ？ＵＧＩＤ＝４５４０７７０＆ＴＡＸＩＤ＝９６０６＆ＳＥＡＲＣＨを参照されたい）。あるいは、Ｐ２Ｘ７遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の詳細は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）からアクセスすることができ、その場合、ヒトＰ２Ｘ７遺伝子のＵｎｉＰｒｏｔ識別子は、Ｑ９９５７２である。ＧｅｎＢａｎｋおよびＵｎｉＰｒｏｔの記録の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５６】
[0077]Ｐ２Ｘ７受容体は、３つのタンパク質サブユニット（モノマー）から形成され、ここで、ヒトにおける天然の受容体においては、これらのモノマーのうちの少なくとも１つが、配列番号３に記載されるアミノ酸配列を有する。本明細書において言及される「Ｐ２Ｘ７受容体」は、スプライスバリアントを含めてこの受容体の天然に存在する変化形、この受容体の天然に存在する切断形態およびアレルバリアントも含むことを理解されたい。Ｐ２Ｘ７受容体はまた、改変されたアミノ酸配列を有するサブユニット、例えば、配列番号３に記載されるアミノ酸の切断、アミノ酸欠失、または修飾を含むものも含み得る。
【００５７】
[0078]Ｐ２Ｘ７遺伝子またはコードされるタンパク質の「バリアント」は、それぞれ、例えば、天然のＰ２Ｘ７受容体に少なくとも８０％同一である、少なくとも９０％同一である、少なくとも９５％同一である、少なくとも９８％同一である、少なくとも９９％同一である、または少なくとも９９．９％同一である、核酸配列またはアミノ酸配列を呈し得る。
【００５８】
[0079]Ｐ２Ｘ７受容体は、ＡＴＰが、受容体のＡＴＰ結合部位に結合することによって、活性化される。これにより、チャネルの急速な開口（数ミリ秒以内）が引き起こされ、これは、小さなカチオンが膜を横切って移動することを選択的に可能にする。短時間（数秒以内）後に、細胞膜に大きな孔が形成され、これにより、最大で９００Ｄａのサイズの分子による細胞膜の透過が可能となる。この孔形成が、最終的に、細胞の脱分極化をもたらし、多くの場合には、細胞傷害性および細胞死滅をもたらす。この役割は、Ｐ２Ｘ７受容体が、様々な細胞型においてアポトーシスに関与しているという考えにつながっている。
【００５９】
[0080]Ｂｃｌ２およびＢａｘなど、アポトーシスに関与する他の分子と同様に、Ｐ２Ｘ７受容体の機能の低下または消失は、誘導されるアポトーシスに比較的耐性である細胞をもたらし得る。多くの事例において、アポトーシスに対するこの耐性は、正常な「健常」細胞から変異した前がん性細胞またはがん性細胞への移り変わりにおいて重要である。結果として、低下した機能または機能の消失を有する細胞を標的とするＰ２Ｘ７受容体の能力が、がん療法の有望な標的をもたらす。
【００６０】
[0081]したがって、本発明の第１の態様において、ＣＡＲは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を認識する。Ｐ２Ｘ７受容体に関して、本明細書全体を通じて使用される「機能障害性」という用語は、正常な非腫瘍細胞におけるその相当する機能と比べた、受容体の機能の低下を含む。一部の実施形態において、Ｐ２Ｘ７受容体の機能は、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９９％を上回って低下している可能性がある。一部の実施形態において、「機能障害性」という用語は、非機能性であるＰ２Ｘ７受容体を含み得る。これは、Ｐ２Ｘ７受容体が、細胞膜を横切ったカチオンまたは他の分子の透過を許容するように誘導することができないことを意味する。
【００６１】
[0082]Ｐ２Ｘ７機能障害性受容体をもたらす、受容体の野生型または天然形態における任意の変化が、本明細書に包含される。例えば、機能障害性受容体は、受容体へのＡＴＰの結合と関連する、受容体の１つまたは複数のアミノ酸における変異または改変の結果であり得る。実際に、Ｐ２Ｘ７受容体は、ＡＴＰ結合部位においてＡＴＰに結合する能力が低減されている場合、またはそれに結合できない場合、機能障害性である。この事例において、キメラ抗原受容体の抗原認識ドメインは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体のＡＴＰ結合部位と関連するエピトープを認識すると予想される。結果として、本発明の第１の態様の一部の実施形態において、キメラ抗原受容体の抗原認識ドメインは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体のＡＴＰ結合部位と関連するエピトープを認識する。一部の実施形態において、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体は、野生型（機能性）Ｐ２Ｘ７受容体のＡＴＰ結合能力と比較して低減されたＡＴＰに結合する能力を有する。一部の実施形態において、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体は、ＡＴＰに結合することができない。
【００６２】
[0083]Ｐ２Ｘ７受容体の１つまたは複数のアミノ酸における改変は、この受容体の１つまたは複数のアミノ酸における立体配置の変化を含み得る。したがって、本発明の第１の態様の一部の実施形態において、キメラ抗原受容体は、受容体を機能障害性にする立体配置の変化を有する機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合する。具体的には、この立体配置の変化は、Ｐ２Ｘ７受容体の１つまたは複数のアミノ酸の、トランス配置からシス配置への変化であり得る。一部の実施形態において、Ｐ２Ｘ７受容体の２１０位のプロリンが、トランス配置からシス配置に変化する。この事例において、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、Ｐ２Ｘ７受容体のアミノ酸２１０位のプロリンを含むエピトープを認識し得る。本発明の第１の態様の一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体のアミノ酸２００位のグリシンからアミノ酸２１６位のシステイン（両端を含む）にわたる１つまたは複数のアミノ酸を含むエピトープを認識する。本発明の第１の態様の一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体の２１０位のプロリン、および機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体のアミノ酸２００位のグリシンからアミノ酸２１６位のシステイン（両端を含む）にわたるアミノ酸残基のうちの１つまたは複数を含む、エピトープを認識する。
【００６３】
[0084]理論によって束縛されることを望むものではないが、Ｐ２Ｘ７受容体の２１０位のプロリンの立体配置の変化の結果として、受容体の３次元構造が改変され得る。この３次元構造の改変により、ＣＡＲの抗原認識ドメインが、これまでＰ２Ｘ７受容体の天然の３次元構造ではアクセスできなかったアミノ酸またはエピトープに結合することが可能となる。したがって、一部の実施形態において、ＣＡＲは、配列番号３の２１０位のプロリンのトランスからシスへの立体配置の変化の結果として抗原認識ドメインに曝露される、Ｐ２Ｘ７受容体の１つまたは複数のエピトープを認識する。これらのエピトープには、Ｐ２Ｘ７受容体の２００位から２１０位、または２９７位から３０６位（両端を含む）のアミノ酸のうちの１つまたは複数が含まれ得る。したがって、本発明の第１の態様の一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、Ｐ２Ｘ７受容体の２００位から２１０位および／または２９７位から３０６位のアミノ酸のうちの１つまたは複数を含むエピトープを認識する。
【００６４】
[0085]本明細書全体を通じて使用される「認識する」という用語は、抗原認識ドメインが機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体、その一部分、またはそのエピトープと結合する能力に関連する。一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体、またはそのエピトープに直接結合してもよい。他の実施形態において、抗原認識ドメインは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体のプロセシングされた形態に結合してもよい。この文脈で使用されるとき、「プロセシングされた形態」という用語は、細胞内プロセシングの結果として切断または消化されているＰ２Ｘ７受容体の形態に関連する。結果として、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体の「プロセシングされた形態」の認識は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と結合して提示される結果であり得る。
【００６５】
[0086]抗原認識ドメインは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体またはそのエピトープを認識することができる、任意の好適なドメインであり得る。本明細書全体を通じて使用される「抗原認識ドメイン」という用語は、ＣＡＲの機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に対する特異性を提供するＣＡＲの部分を指す。抗原認識ドメインは、ＣＡＲの細胞外領域のすべてであってもよく、または単にその一部であってもよい。好適な抗原認識ドメインとしては、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体またはそのフラグメントの抗原結合部位に対する配列相同性を有するポリペプチドが挙げられるがこれに限定されない。したがって、本発明の第１の態様の一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体またはそのフラグメントに対する相同性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、抗原認識ドメインの一部分は、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体またはそのフラグメントに対する相同性を有するアミノ酸配列を含む。起源となる相同性抗体配列は、Ｐ２Ｘ７受容体に対する親和性を有する抗体の任意の好適な配列であり得る。例えば、配列は、以下の種；ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、フェレット、イヌ、ニワトリ、ネコ、モルモット、ハムスター、ウマ、ウシ、またはブタのうちの１つまたは複数を起源とする抗体と配列相同性を共有し得る。抗原認識ドメインは、ハイブリドーマ細胞株から産生されたモノクローナル抗体の配列と配列相同性を共有し得る。相同性抗体配列の起源となる種が、ヒトでない場合、抗体は、ヒト化抗体であることが好ましい。相同性抗体配列はまた、軟骨魚類などの非哺乳動物種に由来してもよい（例えば、サメＩｇＮＡＲ抗体、国際公開第２０１２／０７３０４８号を参照されたい）。あるいは、抗原結合ドメインは、サメＩｇＮＡＲ抗体に基づく結合部分を有するｉボディなど、サメ抗体に類似の機能性を提供する改変されたタンパク質骨格を含み得る（国際公開第２００５／１１８６２９号を参照されたい）。加えて、抗原認識ドメインは、ＣＡＲシグナル伝達ドメインを活性化するのに十分な親和性で、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体と選択的に相互作用することができる任意の他の好適な結合分子またはペプチドであってもよく、それに由来してもよく、またはそれと配列相同性を共有してもよい。抗原結合タンパク質を特定するための方法、とりわけ、ファージディスプレイライブラリーのパンニング、タンパク質親和性クロマトグラフィー、共免疫沈降、および酵母ツーハイブリッドシステムなどが、当該技術分野で公知である（Ｓｒｉｎｉｖａｓａ  Ｒａｏ，Ｖ．ら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１４；論文番号１４７６４８を参照されたい）。
【００６６】
[0087]一部の実施形態において、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体の抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）部分のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列相同性を含む。当該技術分野では理解されるように、抗体のＦａｂ部分は、抗体の重鎖および軽鎖のそれぞれの１つの定常領域および１つの可変領域から構成される。Ｆａｂは、抗体の抗原決定基領域であり、抗体からＦｃ領域を酵素的に切断することによって生成することができる。
【００６７】
[0088]本発明の第１の態様の一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）のアミノ酸配列に相同性のアミノ酸配列を含む。当該技術分野では理解されるように、ｓｃＦｖは、抗体の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）と相同性を共有し得るかまたはそれらと同一であり得る２つの部分を含み、これらの２つの部分が、リンカーペプチドによって一緒に接続された、融合タンパク質である。例えば、ｓｃＦｖは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を認識する抗体に由来するＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含み得る。この文脈において、「に由来する」という用語は、ポリペプチドの起源そのものに言及するのではなく、むしろ、抗原結合領域の一部分を構成するアミノ酸配列の由来を指すことが理解されると予想される。結果として、「に由来する」という用語は、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体と配列同一性を共有する、合成により、人工的に、またはそれ以外の方法で作製されたポリペプチドを含む。
【００６８】
[0089]本発明の第１の態様の一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合する多価ｓｃＦｖのアミノ酸配列に対するアミノ酸配列相同性を含む。一部の実施形態において、多価ｓｃＦｖは、二価ｓｃＦＶまたは三価ｓｃＦｖである。
【００６９】
[0090]本発明の第１の態様の一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合する一本鎖抗体ドメイン（ｓｄＡｂ）のアミノ酸配列を有する。
[0091]一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、配列番号１０、配列番号３２、配列番号３３、もしくは配列番号３４に記載されるアミノ酸配列、またはそれらの機能性バリアントを含む。
【００７０】
[0092]一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体の１つまたは複数のＣＤＲ領域と相同性のアミノ酸配列を含む、結合ペプチドを含む。一部の実施形態において、結合ペプチドは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体のＶＨ鎖および／またはＶＬ鎖のＣＤＲ１、２、および３ドメインと配列相同性を有する１つまたは複数の領域を含む。一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、配列番号１０、３２、３３、または３４に記載される配列の３０位から３５位、５０位から６７位、または９８位から１０８位にわたるＣＤＲ領域のうちのいずれか１つに少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９４％同一である１つまたは複数の配列を含む。一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、配列番号１０、３２、３３、または３４に記載される配列の３０位から３５位、５０位から６７位、または９８位から１０８位にわたる配列のうちの１つまたは複数を含む。配列番号１０、３２、３３、または３４に記載される抗原結合ペプチドのＣＤＲ領域の間には、ＣＤＲ領域の適切な形成および配置を可能にする任意の公的な配列が存在し得る。一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、配列番号１０、３２、３３、または３４に記載される配列のうちの１つに５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％、９５％、または９９％同一な配列を含む。
【００７１】
[0093]好適なアミノ酸配列が由来し得る、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に方向付けられた抗体、およびそのような抗体を産生するための方法は、当該技術分野で説明されている（例えば、国際公開第２００１／０２０１５５号、同第２００３／０２０７６２号、同第２００８／０４３１４５号、同第２００８／０４３１４６号、同第２００９／０３３２３３号、同第２０１１／０２０１５５号、および同第２０１１／０７５７８９号を参照されたい）。特定のエピトープ（前述のものなど）に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を生成するための方法は、当業者には公知であると予想される。概要として、所望されるエピトープ（２１０位のプロリンを含む機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体のセグメントなど）を、適切な免疫原性担体タンパク質およびアジュバントの存在下において、好適な宿主動物に注射する。次いで、血清を、免疫付与した動物から採取し、抗体を、その抗体クラスまたはその抗原特異性に基づいて単離することができる。精製した抗体の適合性および特異性の評価の後に、抗体を、さらにプロセシングして抗原結合フラグメントを単離するか、または配列決定を行って関連するＶＨおよびＶＬドメインを特定することができる。機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に方向付けられた抗体の産生に好適なエピトープは、当該技術分野で公知である（例として、国際公開第２００８／０４３１４６号、同第２０１０／００００４１号、および同第２００９／０３３２３３号を参照されたい）。
【００７２】
[0094]ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＡＲの抗原認識ドメインによる抗原の認識の結果として、ＣＡＲが活性化されると、細胞内シグナル伝達カスケードを誘導することができるか、またはその誘導に関与することができる、任意の好適なドメインであり得る。ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＡＲの活性化後に所望される細胞内結果に応じて、特異的に選択されることになる。可能性のあるシグナル伝達ドメインは多数あるが、免疫療法およびがん療法において使用される場合、シグナル伝達ドメインは、それらが由来する受容体に基づいて、２つの一般的なカテゴリー、すなわち、活性化受容体および共刺激性受容体に分類することができる（以下のさらなる詳述を参照されたい）。したがって、本発明の第１の態様の一部の実施形態において、シグナル伝達ドメインは、活性化受容体に由来する部分を含む。一部の実施形態において、シグナル伝達ドメインは、共刺激性受容体に由来する部分を含む。
【００７３】
[0095]本明細書全体を通じて使用される「部分」という用語は、活性化受容体または共刺激性受容体に関して使用されるとき、受容体とその同種抗原またはリガンドとの相互作用後に細胞内シグナル伝達カスケードの開始／誘導を担うかまたはそれに関与する配列を含む、受容体の任意のセグメントに関連する。ＣＤ３を介したＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞内シグナル伝達カスケードの開始／誘導の例を、以下に概説する。
【００７４】
[0096]理論によって束縛されることを望むものではないが、ＴＣＲの細胞外部分は、主に、クローン形質のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖（ＴＣＲα／β受容体）またはＴＣＲγ鎖およびＴＣＲδ鎖（ＴＣＲγδ受容体）のいずれかのヘテロ二量体で構成される。これらのＴＣＲヘテロ二量体は、一般に、本質的なシグナル伝達能力を欠き、したがって、それらは、ＣＤ３の複数のシグナル伝達サブユニット（主に、ＣＤ３−ゼータ、ＣＤ３−ガンマ、ＣＤ３−デルタ、およびＣＤ３−イプシロン）と非共有結合で結合する。ＣＤ３のガンマ鎖、デルタ鎖、およびイプシロン鎖のそれぞれは、単一の免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む細胞内（細胞質）部分を有し、一方で、ＣＤ３−ゼータ鎖は、３つのタンデムＩＴＡＭを含む。ＭＨＣの存在下におけるＴＣＲとその同種抗原との結合、およびＣＤ４またはＣＤ８などの必須共受容体の結合が生じると、シグナル伝達が開始され、その結果、チロシンキナーゼ（すなわち、Ｌｃｋ）によるＣＤ３鎖の細胞内ＩＴＡＭ内の２つのチロシン残基のリン酸化が生じる。結果として、第２のチロシンキナーゼ（ＺＡＰ−７０、これ自体が、Ｌｃｋリン酸化によって活性化される）が、ＩＴＡＭを二リン酸化（ｂｉｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅ）するように動員される。結果として、複数の下流標的タンパク質が活性化され、これが、最終的に、細胞内立体配置の変化、カルシウム動員、およびアクチン細胞骨格再構成を引き起こし、こられは、組み合わされると、最終的に、転写因子の活性化およびＴ細胞免疫応答の誘導を引き起こす。
【００７５】
[0097]本明細書全体を通じて使用される「活性化受容体」という用語は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の構成要素を形成するかもしくはＴＣＲの形成に関与する受容体もしくは共受容体、または抗原性刺激もしくは他の免疫原性刺激の認識の結果として免疫細胞の特異的な活性化に関与する受容体に関連する。
【００７６】
[0098]そのような活性化受容体の非限定的な例としては、Ｔ細胞受容体−ＣＤ３複合体の構成要素（ＣＤ３−ゼータ、ＣＤ３−ガンマ、ＣＤ３−デルタ、およびＣＤ３−イプシロン）、ＣＤ４共受容体、ＣＤ８共受容体、ＦＣ受容体、またはＬＹ−４９（ＫＬＲＡ１）、天然の細胞傷害性受容体（ＮＣＲ、好ましくはＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、もしくはＮＫＧ２、もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２ヘテロ二量体）などのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞関連活性化受容体が挙げられる。結果として、本発明の第１の態様の一部の実施形態において、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３共受容体複合体のメンバー（好ましくは、ＣＤ３−ζ鎖もしくはその一部分）、ＣＤ４共受容体、ＣＤ８共受容体、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）（好ましくは、ＦｃεＲＩもしくはＦｃγＲＩ）、またはＬＹ−４９などのＮＫ関連受容体のうちのいずれか１つまたは複数に由来する部分を含む。
【００７７】
[0099]ＣＤ３鎖のそれぞれの具体的な細胞内シグナル伝達部分は、当該技術分野で公知である。例として、ＣＤ３ζ鎖の細胞内細胞質領域は、配列番号４に記載される配列のアミノ酸５２からアミノ酸１６４にわたり、３つのＩＴＡＭ領域は、配列番号４のアミノ酸６１から８９、１００から１２８、および１３１から１５９にわたる。さらに、ＣＤ３ε鎖の細胞内部分は、配列番号５に記載される配列のアミノ酸１５３から２０７にわたり、単一のＩＴＡＭ領域は、配列番号５のアミノ酸１７８から２０５にわたる。ＣＤ３γ鎖の細胞内部分は、配列番号６に記載される配列のアミノ酸１３８から１８２にわたり、単一のＩＴＡＭ領域は、配列番号６のアミノ酸１４９から１７７にわたる。ＣＤ３δの細胞内部分は、配列番号７に記載される配列のアミノ酸１２７から１７１にわたり、単一のＩＴＡＭ領域は、配列番号７のアミノ酸１３８から１６６にわたる。
【００７８】
[0100]本発明の第１の態様の一部の実施形態において、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３（ＣＤ３−ζ鎖もしくはその一部分）またはＦＣ受容体（好ましくは、ＦｃεＲＩもしくはＦｃγＲＩ）のうちのいずれか１つに由来する部分を含む。一部の実施形態において、ＣＤ３−ζ共受容体複合体の部分は、配列番号２２に記載されるアミノ酸配列またはその機能性バリアントを含む。
【００７９】
[0101]ＦＣ受容体の細胞内部分は、当該技術分野で公知である。例えば、ＦｃεＲ１の細胞内部分は、配列番号８に記載される配列のアミノ酸１から５９、１１８から１３０、および２０１から２４４にわたる。さらに、ＦｃγＲＩの細胞内部分は、配列番号９に記載される配列のアミノ酸３１４から３７４にわたる。
【００８０】
[0102]活性化受容体の部分の様々な組合せを用いて、ＣＡＲの膜貫通（ＴＭ）部分および細胞内（ＩＣ）部分、例えば、ＣＤ３ζ  ＴＭおよびＣＤ３ζ  ＩＣ（Ｌａｎｄｍｅｉｅｒ  Ｓ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７；６７：８３３５−４３、Ｇｕｅｓｔ  ＲＤ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００５，２８：２０３−１１、Ｈｏｍｂａｃｈ  ＡＡ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；１７８：４６５０−７）、ＣＤ４  ＴＭおよびＣＤ３ζ  ＩＣ（Ｊａｍｅｓ  ＳＥ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；１８０：７０２８−３８）、ＣＤ８  ＴＭおよびＣＤ３ζ  ＩＣ（Ｐａｔｅｌ  ＳＤ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９９；６：４１２−９）、ならびにＦｃεＲＩγ  ＴＭおよびＦｃεＲＩγ  ＩＣ（Ｈａｙｎｅｓ  ＮＭ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１６６：１８２−７、Ａｎｎｅｎｋｏｖ  ＡＥ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１６１：６６０４−１３）を形成することができる。
【００８１】
[0103]本明細書全体を通じて使用される「共刺激性受容体」という用語は、活性化受容体の抗原特異的誘導が起こると、免疫細胞の活性化を補助する受容体または共受容体に関連する。理解されるように、共刺激性受容体は、抗原の存在を必要とせず、抗原特異的でもないが、典型的に、２つのシグナルのうちの１つであり、他方が免疫細胞応答の誘導に必要な活性化シグナルである。免疫応答の文脈において、共刺激受容体は、典型的に、樹状細胞またはマクロファージなどの抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に発現されるそのリガンドの存在によって活性化される。Ｔ細胞に関して具体的に述べると、共刺激は、細胞の活性化、増殖、分化、および生存（これらのすべては、通常、Ｔ細胞活性化の傘下にあると称される）をもたらすために必要であるが、共刺激の不在下において抗原がＴ細胞に提示されると、アネルギー、クローン除去、および／または抗原特異的寛容性の発生が生じ得る。重要なことに、共刺激性分子は、Ｔ細胞応答を、同時に遭遇した抗原に伝えることができる。一般に、「正の」共刺激性分子の状況において遭遇した抗原は、Ｔ細胞の活性化をもたらし、その抗原を発現する細胞を排除することを目的とする細胞免疫応答を引き起こすと予想される。一方で、「負の」共受容体の状況において遭遇した抗原は、同時に遭遇した抗原に対する寛容状態の誘導をもたらすと予想される。
【００８２】
[0104]Ｔ細胞共刺激性受容体の非限定的な例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳが挙げられる。具体的には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、およびＩＣＯＳは、すべてが、Ｔ細胞応答の活性化を増強させる、「正の」共刺激性分子を表す。したがって、本発明の第１の態様の一部の実施形態において、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、およびＩＣＯＳのうちのいずれか１つまたは複数に由来する部分を含む。
【００８３】
[0105]本発明の第１の態様の一部の実施形態において、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、または４−１ＢＢ共刺激性受容体に由来する部分を含む。一部の実施形態において、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８共刺激性受容体の一部分を含む。一部の実施形態において、シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０共刺激性受容体の一部分を含む。一部の実施形態において、ＯＸ４０共刺激性受容体の部分は、配列番号２０に記載されるアミノ酸配列またはその機能性バリアントを含む。
【００８４】
[0106]共刺激性受容体の部分の様々な組合せを用いて、ＣＡＲの膜貫通（ＴＭ）部分および細胞内（ＩＣ）部分を形成することができる。例えば、ＣＤ８  ＴＭおよびＤＡＰ１０  ＩＣまたはＣＤ８  ＴＭおよび４−１ＢＢ  ＩＣ（Ｍａｒｉｎ  Ｖ．ら、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００７；３５：１３８８−９７）、ＣＤ２８  ＴＭおよびＣＤ２８  ＩＣ（Ｗｉｌｋｉｅ  Ｓ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００８；１８０：４９０１−９、Ｍａｈｅｒ  Ｊ．ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２；２０：７０−５）、ならびにＣＤ８  ＴＭおよびＣＤ２８  ＩＣ（Ｍａｒｉｎ  Ｖ．ら、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００７；３５：１３８８−９７）。
【００８５】
[0107]上記で言及した活性化受容体および共刺激性受容体の配列の情報は、様々なデータベースにおいて容易にアクセス可能である。例えば、これらの受容体に関するヒトのアミノ酸、遺伝子、およびｍＲＮＡ配列の実施形態は、表２に提供される。
【００８６】
【表２】
2018526033.tif 000005
【００８７】
[0108]表２は、ヒトの活性化受容体および共刺激性受容体に関連して提供されるが、当業者であれば、それぞれの受容体のホモログ形およびオルソログ形が、哺乳動物種および脊椎動物種の大半に存在することを理解すると予想される。したがって、上記で言及した配列は、本発明の第１の態様のＣＡＲに含まれ得る受容体配列、ならびに所与の種に好適なＣＡＲを生成するために使用され得る任意の所望される種に由来するホモログ配列およびオルソログ配列の非限定的な例として提供されるに過ぎない。
【００８８】
[0109]本発明の第１の態様の一部の実施形態において、シグナル伝達ドメインは、活性化受容体に由来する部分および共刺激性受容体に由来する部分を含む。理論によって束縛されることを望むものではないが、この文脈において、ＣＡＲの抗原認識ドメインによる抗原の認識は、細胞内活性化シグナルおよび細胞内共刺激性シグナルの両方を同時に誘導すると予想される。結果として、これにより、共刺激性リガンドを発現するＡＰＣによる抗原の提示が刺激されると予想される。あるいは、ＣＡＲは、活性化受容体または共刺激性受容体のいずれかに由来する部分を誘導するシグナル伝達ドメインを有してもよい。この代替的な形態において、ＣＡＲは、活性化細胞内シグナル伝達カスケードまたは共刺激性細胞内シグナル伝達カスケードのいずれかを誘導するだけである。
【００８９】
[0110]本発明の第１の態様の一部の実施形態において、ＣＡＲは、単一の活性化受容体に由来する１つの部分および複数の共刺激性受容体に由来する複数の部分を含む、シグナル伝達ドメインを有すると予想される。一部の実施形態において、ＣＡＲは、複数の活性化受容体に由来する複数の部分および単一の共刺激性受容体に由来する１つの部分を含む、シグナル伝達ドメインを有すると予想される。一部の実施形態において、ＣＡＲは、複数の活性化受容体に由来する複数の部分および複数の共刺激性受容体に由来する複数の部分を含む、シグナル伝達ドメインを有すると予想される。一部の実施形態において、ＣＡＲは、単一の活性化受容体に由来する１つの部分および２つの共刺激性受容体に由来する複数の部分を含む、シグナル伝達ドメインを有すると予想される。一部の実施形態において、ＣＡＲは、単一の活性化受容体に由来する１つの部分および３つの共刺激性受容体に由来する複数の部分を含む、シグナル伝達ドメインを有すると予想される。一部の実施形態において、ＣＡＲは、２つの活性化受容体に由来する複数の部分および１つの共刺激性受容体に由来する１つの部分を含む、シグナル伝達ドメインを有すると予想される。一部の実施形態において、ＣＡＲは、２つの活性化受容体に由来する複数の部分および２つの共刺激性受容体に由来する複数の部分を含む、シグナル伝達ドメインを有すると予想される。理解されるように、シグナル伝達ドメインが由来し得る活性化受容体および共刺激性受容体の数のさらなる変化形が存在し、上述の例は、本明細書に含まれる可能な組合せを限定しないものとみなされる。
【００９０】
[0111]本発明の第１の態様の一部の実施形態において、キメラ抗原受容体は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号５２、配列番号５３、もしくは配列番号５４に記載されるアミノ酸配列、または配列番号２６、配列番号２７、配列番号５２、配列番号５３、もしくは配列番号５４の機能性バリアントを含む。一部の実施形態において、機能性バリアントは、配列番号２６、配列番号２７、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００９１】
[0112]上記に示されるように、本発明は、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のうちのいずれか１つの機能性バリアントを含む。本発明の文脈において、「機能性バリアント」は、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のうちのいずれか１つの機能を維持する限り、任意のアミノ酸配列を含み得る。
【００９２】
[0113]したがって、機能性バリアントが、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のうちの１つの機能を維持する限り、機能性バリアントは、例えば、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のうちの１つに対する１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換；配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のうちの１つの変異体形態またはアレルバリアント；配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のうちの１つのオルソログ；配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のうちの１つのホモログ（homeologue）；配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のうちの１つのアナログなどを有し得る。
【００９３】
[0114]例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４に関して、配列番号２６、配列番号２７、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４を含むキメラ抗原受容体の機能は、機能性Ｐ２Ｘ７受容体の有意な認識を伴うことなく、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を認識し、ＣＡＲを発現するＴ細胞の活性化をもたらす細胞内シグナルを誘導することである。当業者には理解されるように、配列番号２６、配列番号２７、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４に記載されるキメラ抗原受容体のアミノ酸配列の部分に対する変化は、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体の認識および／またはＣＡＲを発現するＴ細胞の活性化の有意な改変を伴わずに行うことができる。そのような変化には、キメラ抗原受容体のヒンジ領域における変化、膜貫通ドメインにおける変化、ならびにキメラ抗原受容体の細胞内ドメインを構成する活性化受容体および／または共刺激性受容体の部分における変化が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００９４】
[0115]上記に示されるように、機能性バリアントは、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のうちの１つと比べて、個別のアミノ酸置換、欠失、または挿入を含み得る。例えば、当業者であれば、任意のアミノ酸が、化学的に（機能的に）類似のアミノ酸と置換され得、ポリペプチドの機能を保持し得ることを認識すると予想される。そのような保存的アミノ酸置換は、当該技術分野で周知である。以下の表３の群は、それぞれ、互いに保存的置換である、アミノ酸を含む。
【００９５】
【表３】
2018526033.tif 000006
【００９６】
[0116]さらに、所望される場合、非天然のアミノ酸または化学的アミノ酸アナログを、置換または付加として、本明細書に包含されるポリペプチドに導入することができる。そのようなアミノ酸としては、一般的なアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、ならびに一般のアミノ酸アナログが挙げられるがこれらに限定されない。
【００９７】
[0117]上述のように、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のうちのいずれか１つの機能性バリアントは、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のうちのいずれか１つに少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態において、機能性バリアントは、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９１％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９２％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９４％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９６％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９７％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、もしくは９９．９％のアミノ酸配列同一性を含み得る。
【００９８】
[0118]アミノ酸配列を比較するとき、配列はポリペプチドの長さによって決定される比較枠にわたって、比較すべきである。例えば、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号５２、配列番号５３、もしくは配列番号５４のうちのいずれか１つの少なくとも２０アミノ酸残基、少なくとも５０アミノ酸残基、少なくとも７５アミノ酸残基、少なくとも１００アミノ酸残基、少なくとも２００アミノ酸残基、少なくとも３００アミノ酸残基、少なくとも４００アミノ酸残基、少なくとも５００アミノ酸残基、少なくとも６００アミノ酸残基、または全長にわたる比較枠が、奥底される。比較枠は、２つの配列の最適なアライメントのために、基準配列（付加または欠失を含まない）と比較して、約２０％またはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。比較枠をアライメントするのに最適な配列のアライメントは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２によって開示されるＢＬＡＳＴファミリーのプログラムなどのアルゴリズムのコンピューターによる実装によって実行することができる。グローバルアライメントプログラムもまた、サイズがほぼ同等の類似の配列をアライメントするのに使用され得る。グローバルアライメントプログラムの例としては、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（Ｒｉｃｅ  Ｐら、２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，１６：２７６−２７７）の一部であるＮＥＥＤＬＥ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／で入手可能）、およびＦＡＳＴＡパッケージ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＷおよびＬｉｐｍａｎ  Ｄ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８）の一部であるＧＧＳＥＡＲＣＨプログラム（ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ．ｃｇｉ？ｒｍ＝ｃｏｍｐａｒｅ＆ｐｇｍ＝ｇｎｗで入手可能）が挙げられる。これらのプログラムはいずれも、２つの配列の最適なアライメント（ギャップを含める）をそれらの全長に沿って見出すために使用されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムに基づく。配列分析の詳細な考察はまた、Ａｕｓｕｂｅｌら（“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ，１９９４−１９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，１９９８）のユニット１９．３に見出すことができる。
【００９９】
[0119]第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様によるキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。一部の実施形態において、核酸分子は、非天然の核酸分子である。
【０１００】
[0120]本発明の第２の態様の一部の実施形態において、核酸分子は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号５２、配列番号５３、もしくは配列番号５４に記載されるアミノ酸配列をコードするか、または配列番号２６、配列番号２７、配列番号５２、配列番号５３、もしくは配列番号５４の機能性バリアントをコードする、ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、機能性バリアントは、配列番号２６、配列番号２７、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１０１】
[0121]核酸分子は、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを含み得、これは、修飾されていなくても修飾されていてもよいＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。例えば、核酸分子としては、一本鎖および／または二本鎖のＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、ならびに一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖であってもよく、より典型的には二本鎖であってもよく、または一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であってもよい、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられる。加えて、核酸分子は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む、三本鎖領域を含んでもよい。核酸分子はまた、１つもしくは複数の修飾塩基、または安定性もしくは他の理由のために修飾を受けたＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含んでもよい。様々な修飾が、ＤＮＡおよびＲＮＡになされ得、したがって、「核酸分子」という用語は、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態を包含する。
【０１０２】
[0122]本発明の第２の態様の一部の実施形態において、核酸分子は、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３５、配列番号３６、または配列番号３７に記載されるヌクレオチド配列を含む。
【０１０３】
[0123]配列番号２６、配列番号２７、配列番号３５、配列番号３６、もしくは配列番号３７に記載されるアミノ酸配列、または配列番号２６、配列番号２７、配列番号３５、配列番号３６、もしくは配列番号３７の機能性バリアントを有するキメラ抗原受容体をコードするいずれのヌクレオチド配列も、本発明によって企図されることが、当業者には理解されると予想される。例えば、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３５、配列番号３６、または配列番号３７とは異なる１つまたは複数の核酸を含むが、依然として同一のアミノ酸配列をコードする、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３５、配列番号３６、または配列番号３７のバリアントが、企図される。遺伝子コードの縮重のため、多数の核酸が、任意の所与のタンパク質をコードし得る。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべてが、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３５、配列番号３６、または配列番号３７におけるアラニンがコドンによって指定されているすべての位置で、コドンは、コードされるポリペプチドを改変することなく、記載された対応するコドンのいずれかに改変されてもよい。したがって、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３５、配列番号３６、もしくは配列番号３７に記載されるアミノ酸配列、または配列番号２６、配列番号２７、配列番号３５、配列番号３６、もしくは配列番号３７の機能性バリアントを有するキメラ抗原受容体をコードする本明細書のあらゆるヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列のあらゆる可能性のあるサイレント変化を示す。当業者であれば、核酸のそれぞれのコドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧは除く）を改変して、機能的に同一の分子を得ることができることを理解すると予想される。したがって、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のあらゆるサイレント変化が、それぞれの記載の配列で黙示される。
【０１０４】
[0124]第３の態様において、本発明は、本発明の第２の態様による核酸分子を含む核酸コンストラクトを提供する。核酸コンストラクトは、１つもしくは複数の宿主の複製起点、１つもしくは複数の宿主において活性な選択可能なマーカー遺伝子、および／または１つもしくは複数の転写制御配列のうちの１つまたは複数のさらに含んでもよい。
【０１０５】
[0125]本明細書に使用されるとき、「選択可能なマーカー遺伝子」という用語は、コンストラクトがトランスフェクトまたは形質転換された細胞の特定および／または選択を容易にするように、遺伝子が発現される細胞に、表現型を付与する任意の遺伝子を含む。
【０１０６】
[0126]「選択可能なマーカー遺伝子」は、コンストラクトが形質転換された細胞によって発現されると、これらの形質転換された細胞の特定および／または選択を容易にする表現型を細胞に付与する、任意のヌクレオチド配列を含む。好適な選択可能なマーカーをコードする様々なヌクレオチド配列が、当該技術分野で公知である（例えば、Ｍｏｒｔｅｓｅｎ，ＲＭ．およびＫｉｎｇｓｔｏｎ  ＲＥ．Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２００９；Ｕｎｉｔ  ９．５）。選択可能なマーカーをコードする例示的なヌクレオチド配列としては、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）遺伝子；シトシンデアミナーゼ（ＣＤＡ）遺伝子；ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子；ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ｈｉｓＤ）遺伝子；ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＣ）遺伝子；チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子；キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）遺伝子、または抗生物質耐性遺伝子、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、およびアンピシリン耐性遺伝子、蛍光レポーター遺伝子、例えば、緑色、赤色、黄色、もしくは青色の蛍光タンパク質コーディング遺伝子；ならびに中でもとりわけ、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）などの技法を使用して細胞の光学的選択を可能にする、発光に基づくレポーター遺伝子、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子が挙げられる。
【０１０７】
[0127]さらに、選択可能なマーカー遺伝子は、コンストラクト中の異なるオープンリーディングフレームであってもよく、または別のポリペプチド（例えば、ＣＡＲ）との融合タンパク質として発現してもよいことに留意されたい。
【０１０８】
[0128]上述のように、核酸コンストラクトはまた、１つまたは複数の転写制御配列を含んでもよい。「転写制御配列」という用語は、作動可能に接続されている核酸の転写を実行する任意の核酸配列を含むと理解されるべきである。転写制御配列には、例えば、リーダー、ポリアデニル化配列、プロモーター、エンハンサーまたは上流活性化配列、および転写終結因子が含まれ得る。典型的には、転写制御配列は、少なくとも、プロモーターを含む。「プロモーター」という用語は、本明細書に使用されるとき、細胞における核酸の発現を付与、活性化、または増強する、任意の核酸を表す。
【０１０９】
[0129]一部の実施形態において、少なくとも１つの転写制御配列は、本発明の第２の態様の核酸分子に作動可能に接続されている。本明細書の目的では、転写制御配列が、核酸分子の転写を促進、阻害、またはそれ以外では調節することができる場合に、転写制御配列は、所与の核酸分子に「作動可能に接続されている」と称される。したがって、一部の実施形態において、核酸分子は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターなどの転写制御配列の制御下にある。
【０１１０】
[0130]「核酸コンストラクト」は、適切な制御エレメントと結合すると複製が可能であり、コンストラクト内に含まれている遺伝子配列を細胞間で移動させることができる、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ベクターといった形態など、任意の好適な形態であり得る。したがって、この用語には、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターが含まれる。一部の実施形態において、核酸コンストラクトは、ベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。
【０１１１】
[0131]プロモーターは、発現が生じる細胞、組織、または器官に対して、作動可能に接続されている核酸分子の発現を、構成的に、または差次的に、制御することができる。そのため、プロモーターには、例えば、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが含まれ得る。「構成的プロモーター」は、ほとんどの環境的条件下および生理学的条件下において活性であるプロモーターである。「誘導性プロモーター」は、特定の環境的条件下および生理学的条件下において活性であるプロモーターである。本発明は、目的の細胞において活性である任意のプロモーターの使用を企図する。したがって、広範なプロモーターが、当業者によって容易に確認されると予想される。
【０１１２】
[0132]哺乳動物の構成的プロモーターとしては、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｐ−アクチン、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）、伸長因子−１アルファ（ＥＦ１Ａ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、およびＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧＧ）を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１１３】
[0133]誘導性プロモーターとしては、化学的誘導性プロモーターおよび物理的誘導性プロモーターを挙げることができるが、これらに限定されない。化学的誘導性プロモーターとしては、アルコール、抗生物質、ステロイド、金属イオン、または他の化合物など、化合物によって制御される活性を有するプロモーターが挙げられる。化学的誘導性プロモーターの例としては、とりわけ、テトラサイクリン制御性プロモーター（例えば、米国特許第５，８５１，７９６号および米国特許第５，４６４，７５８号を参照されたい）；ステロイド応答性プロモーター、例えばグルココルチコイド受容体プロモーター（例えば、米国特許第５，５１２，４８３号を参照されたい）、エクジソン受容体プロモーター（例えば、米国特許第６，３７９，９４５号を参照されたい）など；ならびに金属応答性プロモーター、例えば、メタロチオネインプロモーター（例えば、米国特許第４，９４０，６６１号、米国特許第４，５７９，８２１号、および同第４，６０１，９７８号を参照されたい）が挙げられる。
【０１１４】
[0134]上述のように、制御配列はまた、終結因子も含み得る。「終結因子」という用語は、転写の終結をシグナル伝達する、転写単位の最後にあるＤＮＡ配列を指す。終結因子は、一般にポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳ＤＮＡ配列であり、これは、一次転写産物の３’末端へのポリアデニル化配列の付加を促進する。プロモーター配列と同様に、終結因子は、使用が意図される細胞、組織、または器官において作動性である任意の終結因子配列であり得る。好適な終結因子は、当業者に公知であると予想される。
【０１１５】
[0135]理解されるように、本発明の第３の態様の核酸コンストラクトは、追加の配列、例えば、発現、細胞質または膜輸送、および位置シグナルの増強を可能にする配列をさらに含み得る。非限定的な具体例としては、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）が挙げられる。
【０１１６】
[0136]本発明は、本質的に本明細書に記載されるように、すべての遺伝子コンストラクトまでに及ぶ。これらのコンストラクトは、真核生物における遺伝子コンストラクトの維持および／もしくは複製、ならびに／または真核生物細胞のゲノムへの遺伝子コンストラクトもしくはその一部の組込みが意図されるヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。
【０１１７】
[0137]本発明の第３の態様の核酸コンストラクトなど、外因性遺伝子材料の、真核生物細胞への導入（トランスフェクション／形質導入）を検討するための方法が、当該技術分野で公知である。理解されるように、核酸コンストラクトを所望される宿主細胞に導入するのに最も適した方法は、多数の要因、例えば、核酸コンストラクトのサイズ、宿主細胞の種類、所望されるトランスフェクション／形質導入の効率、および所望されるかまたは必要であれば、トランスフェクト／形質導入される細胞の最終的な生存率に依存する。そのような方法の非限定的な例としては、カチオン性ポリマーなどの化学物質、リン酸カルシウム、またはリポソームおよびデンドリマーなどの構造体の化学的トランスフェクション；非化学的方法、例えば、エレクトロポレーション、ソノポレーション、熱ショックもしくは光学的トランスフェクション；粒子に基づく方法、例えば、「遺伝子銃」送達、マグネトフェクション、もしくはインペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、またはウイルス形質導入が挙げられる。
【０１１８】
[0138]核酸コンストラクトは、所望されるトランスフェクション／形質導入方法に応じて選択されると予想される。本発明の第３の態様の一部の実施形態において、核酸コンストラクトは、ウイルスベクターであり、核酸コンストラクトを宿主細胞に導入するための方法は、ウイルス形質導入である。ＰＢＭＣにおいてＣＡＲの発現を誘起するためにウイルス形質導入を用いる方法（Ｐａｒｋｅｒ，ＬＬ．ら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０００；１１：２３７７−８７）、およびより一般的には、哺乳動物細胞の形質導入のためにレトロウイルス系を用いる方法（Ｃｅｐｋｏ，Ｃ．およびＰｅａｒ，Ｗ．Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００１，ｕｎｉｔ  ９．９）が、当該技術分野で公知である。他の実施形態において、核酸コンストラクトは、プラスミド、コスミド、人工的染色体などであり、当該技術分野で公知の任意の好適な方法によって、細胞にトランスフェクトすることができる。
【０１１９】
[0139]第４の態様において、本発明は、本発明の第１の態様によるキメラ抗原受容体を含む遺伝子改変された細胞を提供する。
[0140]本発明の第４の態様の一部の実施形態において、遺伝子改変された細胞は、２つまたはそれ以上の異なるＣＡＲを含む。
【０１２０】
[0141]第５の態様において、本発明は、本発明の第２の態様による核酸分子、または本発明の第３の態様による核酸コンストラクト、または核酸コンストラクトのゲノム組込み形態を含む、遺伝子改変された細胞を提供する。
【０１２１】
[0142]本発明の第５の態様の一部の実施形態において、遺伝子改変された細胞は、２つまたはそれ以上の異なるＣＡＲをコードする核酸分子または核酸コンストラクトを含む。本発明の第５の態様の一部の実施形態において、遺伝子改変された細胞は、それぞれが異なるＣＡＲをコードする、２つもしくはそれ以上の核酸分子または２つもしくはそれ以上の核酸コンストラクトを含む。
【０１２２】
[0143]本明細書に言及されるとき、「遺伝子改変された細胞」には、本発明によって包含される、天然に存在しないおよび／もしくは導入された核酸分子または核酸コンストラクトを含む任意の細胞が含まれる。導入された核酸分子または核酸コンストラクトは、細胞において別個のＤＮＡ分子として維持され得るか、または細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれ得る。
【０１２３】
[0144]細胞のゲノムＤＮＡは、細胞の遺伝的相補性をなすあらゆる内因性ＤＮＡを含む幅広い意味で理解されるべきである。そのため、細胞のゲノムＤＮＡは、染色体、ミトコンドリアＤＮＡなどを含むように理解されるべきである。したがって、「ゲノム組込み」と言う用語は、染色体組込み、ミトコンドリアＤＮＡ組込みなどを企図する。コンストラクトの「ゲノム組込み形態」は、コンストラクトのすべてまたは一部であり得る。しかしながら、一部の実施形態において、コンストラクトのゲノム組込み形態とは、少なくとも、本発明の第２の態様の核酸分子を含む。
【０１２４】
[0145]本明細書に使用されるとき、「異なるＣＡＲ」または「異なるキメラ抗原受容体」という用語は、同一でない抗原認識ドメインおよび／または同一でないシグナル伝達ドメインのいずれかを有する任意の２つまたはそれ以上のＣＡＲを指す。一実施例において、「異なるＣＡＲ」には、同じ抗原認識ドメインを有する（例えば、両方のＣＡＲが、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を認識し得る）が、一方のＣＡＲが活性化受容体の一部分を有するシグナル伝達ドメインを有し、他方のＣＡＲが共刺激性受容体の一部分を有するシグナル伝達ドメインを有するなど、異なるシグナル伝達ドメインを有する２つのＣＡＲが含まれる。理解されるように、この実施形態内の２つまたはそれ以上のＣＡＲのうちの少なくとも１つは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を認識する抗原認識ドメインを有し、他のＣＡＲは、任意の好適な形態をとってもよく、任意の好適な抗原に方向付けられてもよい。
【０１２５】
[0146]したがって、本発明の第４および第５の態様の一部の実施形態において、２つまたはそれ以上の異なるＣＡＲは、異なるシグナル伝達ドメインを有し、同一または異なる抗原認識ドメインを有し得る。具体的には、本発明の第４または第５の態様による遺伝子改変された細胞は、活性化受容体に由来する部分を含むシグナル伝達ドメインを有する第１のキメラ抗原受容体と、共刺激性受容体に由来する部分を含むシグナル伝達ドメインを有する第２のキメラ抗原受容体とを含み得る。
【０１２６】
[0147]本発明の第４または第５の態様の一部の実施形態において、活性化受容体（シグナル伝達ドメインの一部分が由来する）は、ＣＤ３共受容体複合体またはＦｃ受容体である。
【０１２７】
[0148]本発明の第４または第５の態様の一部の実施形態において、共刺激性受容体（シグナル伝達部分の一部分が由来する）は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ−３０、ＣＤ４０、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、およびＩＣＯＳからなる群から選択される。
【０１２８】
[0149]本発明の第４または第５の態様の一部の実施形態において、共刺激性受容体（シグナル伝達部分ドメインの一部分が由来する）は、ＣＤ２８、ＯＸ４０、または４−１ＢＢからなる群から選択される。
【０１２９】
[0150]本発明の第４および第５の態様の一部の実施形態において、遺伝子改変された細胞は、共刺激性受容体を構成的に発現するようにさらに改変される。
[0151]上述のように、細胞の免疫応答は、典型的には、活性化シグナル（典型的には抗原に応答して）および共刺激性シグナルが同時に経験される場合にのみ誘導される。したがって、２つまたはそれ以上のＣＡＲが組み合わさって、細胞内活性化シグナルおよび細胞内共刺激シグナルの両方を提供する２つまたはそれ以上のＣＡＲを含む、上述の実施形態の一部による遺伝子改変された細胞を有することにより、十分な免疫応答が、ＣＡＲによる同種抗原の認識に応答して誘導され得ることを確実にする。あるいは、遺伝子改変された細胞は、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を認識する抗原認識ドメインを有する１つのＣＡＲのみを含み得、共刺激性受容体を構成的に発現し、それによって、ＣＡＲが活性化されたときに同時に共刺激がもたらされる可能性を増大させてもよい。あるいは、遺伝子改変された細胞は、共刺激性受容体およびそのリガンドの両方を構成的に発現するようにさらに改変してもよい。この場合には、細胞は、共刺激を継続的に受け、細胞の免疫活性化のためには、活性化受容体に由来する部分を含むシグナル伝達ドメインを有するＣＡＲの活性化のみが必要となる。
【０１３０】
[0152]したがって、本発明の第４または第５の態様の一部の実施形態において、遺伝子改変された細胞は、共刺激性受容体を構成的に発現するようにさらに改変される。さらなる実施形態において、遺伝子改変された細胞は、共刺激性受容体のリガンドを発現し、それによって細胞の自己刺激を促進するように、さらに改変される。共刺激性受容体およびそれらの同種リガンドを両方とも発現する（自己刺激を誘導できるように）ＣＡＲ発現Ｔ細胞の例は、当該技術分野で公知であり、とりわけ、Ｓｔｅｐｈｅｎ  ＭＴ．ら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ，２００７；１３：１４４０−９に開示されているものが挙げられる。
【０１３１】
[0153]ＣＡＲを含む遺伝子改変された細胞の能力は、細胞を、サイトカイン、好ましくは、炎症促進性サイトカインまたは増殖促進性サイトカインを分泌するようにさらに改変することによって、増強することができる。このサイトカインの分泌により、ＣＡＲを発現する細胞の自己分泌支持をもたらすこと、ならびに免疫系の他の細胞が動員および活性化されるようにＣＡＲ発現細胞を取り巻く局所環境を変化させることの両方が行われる。結果として、本発明の第４または第５の態様の一部の実施形態において、遺伝子改変された細胞は、サイトカインを分泌するようにさらに改変される。この分泌は、構成的であってもよく、またはＣＡＲのその同種リガンド抗原認識時に誘導可能なものであってもよい。
【０１３２】
[0154]任意の１つまたは複数のサイトカインが、所望される免疫応答に応じて選択され得るが、好ましいサイトカインとしては、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、およびＩＬ−２１、またはこれらの組合せが挙げられる。
【０１３３】
[0155]本発明の第４または第５の態様の遺伝子改変された細胞は、任意の好適な免疫細胞であり得るか、または均一もしくは不均一な細胞集団であってもよい。一部の実施形態において、細胞は、白血球、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、リンパ球、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、またはナチュラルキラーＴ細胞である。
【０１３４】
[0156]第６の態様において、本発明は、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を殺滅させる方法であって、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変された細胞に曝露することを含み、キメラ抗原受容体が、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に方向付けられている、方法を提供する。
【０１３５】
[0157]したがって、本発明の第６の態様の一部の実施形態において、ＣＡＲは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を直接的に認識する。他の実施形態において、ＣＡＲは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を間接的に認識する。
【０１３６】
[0158]本明細書に使用されるとき、「直接的に認識する」という用語は、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体またはそのエピトープがその天然の形態で存在する場合に、ＣＡＲの抗原認識ドメインが、そこに直接的に結合することを含む。別の非限定的な例において、抗原認識ドメインは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）などの抗原提示分子によって提示され得る、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体のプロセシングされた形態に直接的に結合してもよい。
【０１３７】
[0159]ＣＡＲによる機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を有する細胞の直接的な認識の代替法として、ＣＡＲは、間接的な手段で、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を有する細胞に方向付けられていてもよい。
【０１３８】
[0160]結果として、本発明の第６の態様の一部の実施形態において、キメラ抗原受容体は、仲介物を介して機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を認識する。仲介物は、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に直接的に結合するか、またはそれと相互作用する、プローブなどの分子であり得る。そのようなプローブの非限定的な例としては、抗体、抗体のＦａｂ、ｓｃＦｖ、可溶性操作ＴＣＲ、またはアプタマーが挙げられる。ＣＡＲは、プローブを直接的に認識してもよく、またはプローブが、ＣＡＲによって認識されるタグを有してもよい。いずれにしても、プローブは、標的細胞（すなわち、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を有する細胞）に対する特異性をもたらし、一方で、ＣＡＲを有する遺伝子改変された細胞は、有効性をもたらし、免疫応答を標的細胞に方向付ける。あるいは、仲介物は、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体と関連するか、またはその発現が機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体と相関する、細胞内因性マーカーであってもよい。マーカーの異常調節は、Ｐ２Ｘ７受容体の機能障害の結果であり得るか、またはその原因であり得る。
【０１３９】
[0161]本発明の第６の態様の一部の実施形態において、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を有する細胞を殺滅させる方法は、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を有する細胞を仲介物に曝露するステップをさらに含む。
【０１４０】
[0162]本発明の第６の態様の一部の実施形態において、仲介物は、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合するプローブであり、キメラ抗原受容体は、プローブを認識する。好ましくは、プローブは、抗体またはアプタマーである。
【０１４１】
[0163]本明細書全体を通じて使用される「アプタマー」という用語は、標的（具体的には、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体）に特異的に結合するか、またはそれと優先的に複合体を形成する、任意のオリゴ核酸、ポリ核酸、ペプチド、またはポリペプチドを指す。
【０１４２】
[0164]本発明の第６の態様の一部の実施形態において、プローブは、タグを含み、キメラ抗原受容体は、タグを認識する。仲介物を用いて細胞を認識するＣＡＲの例は、当該技術分野で公知であり、例えば、欧州特許出願第２６５１４４２号がある。
【０１４３】
[0165]本発明の第６の態様の一部の実施形態において、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を有する細胞は、対象の体内にある。一部の実施形態において、対象は、ヒトである。一部の実施形態において、本方法は、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を、外因性サイトカインとともに、遺伝子改変体に曝露するステップをさらに含む。
【０１４４】
[0166]本発明の第６の態様の一部の実施形態において、遺伝子改変された細胞は、対象に由来する機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞にとって自己である遺伝子改変された細胞である。
【０１４５】
[0167]本発明の第６の態様の一部の実施形態において、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞は、対象の体内にある。本発明の第６の態様の一部の実施形態において、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞は、がん細胞である。
【０１４６】
[0168]第６の態様の一部の実施形態において、本発明は、対象におけるがんを治療または予防する方法であって、対象に、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変された細胞を提供するステップを含み、キメラ抗原受容体は、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を有する標的細胞に方向付けられている、方法を提供する。
【０１４７】
[0169]「治療する」、「治療すること」、または「治療」という用語は、本明細書に使用されるとき、その範囲内に、以下の結果のうちの１つまたは複数を含むことが理解されるべきである：（ｉ）対象における原発性腫瘍の成長をある程度阻害すること（遅延および完全な成長の停止を含み、切除後に原発性腫瘍の成長を低減することを含む）、（ｉｉ）対象における１つまたは複数の二次腫瘍の成長および形成をある程度阻害すること、（ｉｉｉ）対象における腫瘍細胞の数を低減すること、（ｉｖ）対象における腫瘍のサイズを低減すること、（ｖ）腫瘍細胞の末梢器官への浸潤の阻害（すなわち、低減、遅延、または完全な停止を含む）、（ｖｉ）転移の阻害（すなわち、低減、遅延、または完全な停止を含む）、（ｖｉｉ）対象の余命を、治療されていない状態と比較して改善すること、（ｖｉｉｉ）対象の生活の質を、治療されていない状態と比較して改善すること、（ｉｘ）対象におけるがんの少なくとも１つの症状を緩和、減弱、または軽減すること、（ｘ）対象におけるがんの退縮または寛解をもたらすこと、（ｘｉ）がんによって引き起こされる対象における状態を緩和すること、ならびに（ｘｉｉ）対象におけるがんと関連する症状を停止すること。
【０１４８】
[0170]「予防する」または「予防すること」という用語は、本明細書に使用されるとき、その範囲内に、対象における原発性腫瘍の形成を阻害すること、対象における１つもしくは複数の二次腫瘍の形成を阻害すること、または寛解している対象におけるがんの再発を低減もしくは排除することを含むことが理解されるべきである。
【０１４９】
[0171]「阻害すること」という用語は、本明細書に使用されるとき、治療されていない細胞または対象など、対照における成長と比較した場合の、がん、がん性細胞、または腫瘍の成長の減少または低減を意味することとする。一部の実施形態において、成長は、治療されていない対照と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％減少または低減され得る。
【０１５０】
[0172]がん、腫瘍、またはがん性細胞の成長の阻害は、当該技術分野で公知の広範な方法によって評価することができる。例えば、インビトロでのがん性細胞について、細胞の成長は、好適な増殖アッセイによって、または所与の期間にわたる細胞ＤＮＡへのトリチウム化チミジンの組込みの程度を評価する方法によって、判定することができる。インビボで存在する腫瘍細胞またはがん性細胞については、腫瘍または細胞の成長は、例えば、当該技術分野で公知の好適な撮像方法によって、判定することができる。
【０１５１】
[0173]「対象」という用語は、本明細書に使用されるとき、がんを患い得る任意の動物を指し得る。特に目的となる対象は、ヒト、ならびにマウス、ラット、フェレット、モルモット、ハムスター、非ヒト霊長類、イヌ、ブタ、およびヒツジなどの科学関連種、またはウマ、イヌ、ネコ、および畜牛などの経済関連動物である。本発明の第６の態様の好ましい実施形態において、対象は、ヒトである。
【０１５２】
[0174]「対象に〜を提供する」への参照は、対象に遺伝子改変された細胞を投与することに関連する。あるいは、遺伝子改変された細胞は、対象の内部で生成され得る。例えば、遺伝子改変された細胞は、対象が、遺伝子改変された細胞の内因性集団を有するように、インビボで生成され得る。そのようなインビボ生成に好適な手段は、当該技術分野で公知であり、対象の遺伝子療法を含む。
【０１５３】
[0175]本明細書全体を通じて使用される、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を有する標的に「方向付けられた」ＣＡＲへの言及は、免疫応答の標的を、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を有する細胞に基づいて、ある細胞に選択的に定めることを企図する。重要なことに、そのような標的化は、ＣＡＲによる機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体の直接的な認識に限定されない。すなわち、ＣＡＲ自体は、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を直接的に認識するかまたはそれに結合することを必要とするのではなく、単純に、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を選択的に認識することができ、それによって活性化され得る必要がある。
【０１５４】
[0176]したがって、本発明の第６の態様の一部の実施形態において、ＣＡＲは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を直接的に認識する。他の実施形態において、ＣＡＲは、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を間接的に認識する。
【０１５５】
[0177]本明細書に使用されるとき、「直接的に認識する」という用語は、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体またはそのエピトープがその天然の形態で存在する場合に、ＣＡＲの抗原認識ドメインが、そこに直接的に結合することを含む。別の非限定的な例において、抗原認識ドメインは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）などの抗原提示分子によって提示され得る、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体のプロセシングされた形態に直接的に結合してもよい。
【０１５６】
[0178]ＣＡＲによる機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を有する細胞の直接的な認識の代替法として、ＣＡＲは、間接的な手段で、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を有する標的細胞に方向付けてもよい。
【０１５７】
[0179]結果として、本発明の第６の態様の一部の実施形態において、キメラ抗原受容体は、仲介物を介して機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を認識する。仲介物は、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に直接的に結合するか、またはそれと相互作用する、プローブなどの分子であり得る。そのようなプローブの非限定的な例としては、抗体、抗体のＦａｂ、ｓｃＦｖ、可溶性操作ＴＣＲ、またはアプタマーが挙げられる。ＣＡＲは、プローブを直接的に認識してもよく、またはプローブが、ＣＡＲによって認識されるタグを有してもよい。いずれにしても、プローブは、標的細胞（すなわち、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を有する細胞）に対する特異性をもたらし、一方で、ＣＡＲを有する遺伝子改変された細胞は、有効性をもたらし、免疫応答を標的細胞に方向付ける。あるいは、仲介物は、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体と関連するか、またはその発現が機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体と相関する、細胞内因性マーカーであってもよい。マーカーの異常調節は、Ｐ２Ｘ７受容体の機能障害の結果であり得るか、またはその原因であり得る。
【０１５８】
[0180]本発明の第６の態様の一部の実施形態において、対象におけるがんを治療または予防する方法は、対象に仲介物を提供するステップをさらに含む。
[0181]本発明の第６の態様の一部の実施形態において、仲介物は、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に結合するプローブであり、キメラ抗原受容体は、プローブを認識する。好ましくは、プローブは、抗体またはアプタマーである。
【０１５９】
[0182]本明細書全体を通じて使用される「アプタマー」という用語は、標的（具体的には、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体）に特異的に結合するか、またはそれと優先的に複合体を形成する、任意のオリゴ核酸、ポリ核酸、ペプチド、またはポリペプチドを指す。
【０１６０】
[0183]本発明の第６の態様の一部の実施形態において、プローブは、タグを含み、キメラ抗原受容体は、タグを認識する。仲介物を用いて細胞を認識するＣＡＲの例は、当該技術分野で公知であり、例えば、欧州特許出願第２６５１４４２号がある。
【０１６１】
[0184]第７の態様において、本発明は、対象におけるがんを治療または予防する方法であって、対象に、本発明の第４または第５の態様による遺伝子改変された細胞を投与するステップを含む、方法を提供する。
【０１６２】
[0185]機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を有する標的細胞に方向付けられたＣＡＲを発現する遺伝子改変された細胞の提供が、前がん性細胞またはがん性細胞に対する有効な免疫療法を提供するのに十分であり得るとはいえ、遺伝子改変された細胞とともにアジュバントを提供することにより、免疫応答の誘導をさらに増強することができ、免疫療法を増補することができる。サイトカイン、好ましくは、炎症促進性サイトカインが、ＣＡＲを有する遺伝子改変された細胞とともに対象に提供するのに特に好適なアジュバントである。
【０１６３】
[0186]したがって、本発明の第６および第７の態様の一部の実施形態において、遺伝子改変された細胞は、サイトカインとともに対象に投与される。本明細書全体を通じて使用されるとき、「とともに」という用語は、遺伝子改変された細胞が、サイトカインと同時に投与されること、またはサイトカインと組み合わせて投与されることを含むことを理解されたい。結果として、サイトカインとともに投与される場合、これは、組合せ療法を含むと見なすことができ、その場合、対象の免疫療法は、サイトカインによる治療、および機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する標的細胞に方向付けられたＣＡＲを有する遺伝子改変された細胞による治療の両方を含む。一部の形態において、サイトカインは、遺伝子改変された細胞の投与とは別の日（２４時間を上回る）に投与される。他の形態において、サイトカインは、遺伝子改変された細胞と同じ日（２４時間以内）に投与される。さらなる形態において、サイトカインおよび遺伝子改変された細胞は、互いに１８時間、１２時間、６時間、４時間、２時間、１時間、４５分間、３０分間、１５分間、１０分間、５分間、２分間、または１分間以内に投与される。
【０１６４】
[0187]遺伝子改変された細胞とともに投与するのに好適なサイトカインとしては、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦβ、およびＴＮＦαが挙げられる。好ましいサイトカインとしては、ＩＬ−２およびＩＦＮαが挙げられる。さらに、サイトカインは、組換え形態として、天然の形態として、または遺伝子改変された細胞において発現されるかもしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマーとコンジュゲートされた核酸配列として送達される、タンパク質との融合体などの送達系を介して、投与され得る。
【０１６５】
[0188]遺伝子改変しようとする細胞は、任意の好適な供給源から得ることができる。本発明の第６または７の態様の一部の実施形態において、遺伝子改変しようとする細胞は、機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞にとって自己である細胞である、自己細胞である。有利なことに、自己細胞は、対象の免疫系によって「非自己」として認識されず、したがって、対象によって寛容されると予想される。しかしながら、がんの一部の形態において、好適な自己細胞は、容易に利用可能ではない場合がある。したがって、本発明の一部の実施形態において、遺伝子改変しようとする細胞は、同種細胞または異種細胞である。
【０１６６】
[0189]Ｐ２Ｘ７機能障害は、様々ながんにおける一般的な分子改変である。結果として、本発明の第６または第７の態様の方法は、様々ながんの予防および治療に使用することができる。
【０１６７】
[0190]本発明の第６または第７の態様の一部の実施形態において、本方法は、脳のがん、食道がん、口腔がん、舌がん、甲状腺がん、肺がん、胃がん、膵臓がん、腎臓がん、結腸がん、直腸がん、前立腺がん、膀胱がん、子宮頸がん、上皮細胞がん、皮膚がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、精巣がんのうちの１つまたは複数から選択されるがんの予防または治療に使用される。好ましくは、がんは、肺がん、食道がん、胃がん、結腸がん、前立腺がん、膀胱がん、子宮頸がん、膣がん、上皮細胞がん、皮膚がん、血液関連のがん、乳がん、子宮内膜がん、子宮がん、精巣がんのうちの１つまたは複数から選択される。
【０１６８】
[0191]本発明の第６または第７の態様の一部の実施形態において、がんは、転移性がん、例えば、ステージＩＩＩまたはステージＩＶのがんである。
[0192]本発明の第４または第５の態様による遺伝子改変された細胞を作製する際、治療において利用可能な細胞の総数を増加させるように、インビトロで細胞集団を増殖させることが望ましい場合がある。これは、細胞を、ＣＡＲの抗原に曝露するステップを使用して行うことができる。したがって、第８の態様において、本発明は、本発明の第４または第５の態様による遺伝子改変された細胞をインビトロで増殖させる方法であって、細胞を、ＣＡＲの抗原に曝露するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、細胞を、サイトカインに曝露するさらなるステップを含む。
【０１６９】
[0193]第９の態様において、本発明は、本発明の第４または第５の態様による遺伝子改変された細胞をインビトロで増殖させる方法であって、細胞を、ＣＡＲの抗原に曝露し、同時に、細胞をサイトカインに曝露するステップを含む、方法を提供する。
【０１７０】
[0194]本発明の第８または第９の態様において使用される好ましいサイトカインとしては、ＩＬ−２サブファミリー、インターフェロンサブファミリー、ＩＬ−１０サブファミリー、ＩＬ−１サブファミリー、ＩＬ−１７サブファミリー、またはＴＧＦ−βサブファミリーのメンバーを含み得る。本発明の第８または第９の態様の一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、およびＧＭ−ＣＳＦ、またはこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１７１】
[0195]第１０の態様において、本発明は、本発明の第４または第５の態様による遺伝子改変された細胞をインビトロで増殖させる方法であって、細胞を、固定化された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体に曝露するステップを含む、方法を提供する。本発明の第１０の態様の一部の実施形態において、抗体は、ビーズ基板（例えば、「ヒト活性化因子」Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））に固定化される。本発明の第１０の態様の一部の実施形態において、抗体は、組織培養容器、培養フラスコ、プレート、またはバイオリアクターの表面など、代替的な表面に固定化される。
【０１７２】
[0196]当業者によって理解されるように、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインに応じて、ＣＡＲによるその同種抗原の認識は、細胞内シグナル伝達を引き起こし、これが、最終的に、細胞増殖を引き起こし得る。したがって、少数の細胞、または個々の細胞ですら、増殖して（または単一の細胞の場合には、クローン増殖して）、治療的に有意な数を形成することができる。このプロセスは、サイトカインの提供によってさらに増強することができる。
【０１７３】
[0197]本発明の第４または第５の態様による遺伝子改変された細胞の送達または投与は、細胞の単独での送達もしくは投与であってもよく、または好適な医薬組成物に製剤化された細胞の送達もしくは投与であってもよい。したがって、第１１の態様において、本発明は、本発明の第４または第５の態様による遺伝子改変された細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
【０１７４】
[0198]免疫療法のためのＣＡＲを含む細胞を提供するための方法は、当該技術分野で公知である（例えば、Ｋｅｒｓｈａｗ，ＭＨ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６；１２（２０）：６１０６−１５；Ｐａｒｋｅｒ  ＬＬ．ら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０００；１１：２３３７−８７を参照されたい）。さらに、哺乳動物のＣＡＲ発現細胞の調製、増殖、および評価のためのプロトコールおよび方法は、当該技術分野で公知であり（例えば、Ｃｈｅａｄｌｅ，ＥＪ．ら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９０７：６４５−６６）、以下の実施例に概説されている。
【０１７５】
[0199]医薬組成物はまた、投与しようとする細胞の具体的な物理的特徴および化学的特徴を考慮して、薬学的に許容される塩、アミノ酸、ポリペプチド、ポリマー、溶媒、緩衝液、賦形剤、および増量剤を含む、１つまたは複数の薬学的に許容される添加剤を含み得る。一部の実施形態において、医薬組成物は、等張食塩水などの好適な媒体中の、本発明の第４または第５の態様による遺伝子改変された細胞の懸濁液を含む。一部の実施形態において、医薬組成物は、上述の１つまたは複数のサイトカインなど、好適なアジュバントを含み得る。一部の実施形態において、医薬組成物はまた、上述の仲介物を含んでもよい。
【０１７６】
[0200]医薬組成物の投与はまた、静脈内、心室内、腹腔内、筋肉内、もしくは頭蓋内の注射、または腫瘍もしくはがんの塊の部位への局所注射を含む非経口手段を介するものであってもよい。
【０１７７】
[0201]本明細書全体を通じて、文脈により他の意味とすべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、示された要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群の包含を意味するが、任意の他の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の除外を意味するものではないことが理解されると予想される。
【０１７８】
[0202]最後に、本発明によって包含される基本的な技法を実行するための方法を含め、分子生物学の標準的な教本への参照がなされる。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ＭＲ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第４版），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０１２を参照されたい。
【０１７９】
[0203]本発明は、明確さおよび理解の目的である程度詳細に記載されているが、本明細書に記載された実施形態および方法への様々な修正および変更が、本明細書に開示されている発明の概念の範囲から逸脱することなくなされ得ることが、当業者には明らかであると予想される。
【０１８０】
[0204]本発明は、以下の実施例においてさらに例証される。これらの実施例は、特定の実施形態を説明する目的のためのものにすぎず、上述の説明に限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１８１】
実施例１
ＰＥＰ２−２−３結合ペプチドキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の設計および発現についてのプロトコール
[0205]本発明の実施形態による抗非機能性（ｎｆ）Ｐ２Ｘ７受容体ＣＡＲの設計およびその発現のプロセスを詳しく示す例示的なプロトコールを、以下に詳述する。
【０１８２】
ＰＥＰ２−２−３（抗ｎｆ  Ｐ２ｘ７）キメラ抗原受容体の設計
[0206]抗ｎｆＰ２ｘ７キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を、図１に図示される概略図に従って設計した。
【０１８３】
[0207]ＰＥＰ２−２−３結合ペプチド（アミノ酸配列が配列番号１０に記載され、ヌクレオチド配列が配列番号１１に記載されている）のアミノ酸配列を含むＣＡＲの抗原認識ドメイン１を、生成した。ＰＥＰ２−２−３配列は、単球またはリンパ球に対する有意な親和性を有することなく、前立腺ＬＮＣａｐ細胞などのがん細胞に発現される機能障害性Ｐ２Ｘ７受容体に対して特定の親和性を有することが示された。
【０１８４】
[0208]ＣＤ８ａシグナル伝達ペプチド２（配列番号１２に記載されるアミノ酸配列および配列番号１３に記載されるヌクレオチド配列を有する）を、ＰＥＰ２−２−３抗原認識ドメイン１のＮ末端に連結させた。ＣＤ８ａシグナル伝達ペプチド２は、配列番号１３の１位から１３位にＫｏｚａｋコンセンサス配列を含む。ＣＤ８ａシグナル伝達ペプチド２は、Ｋｏｚａｋ配列を含め、転写されたＲＮＡのリボソームによる認識を促進するように作用し、翻訳開始部位を提供し、それによって、ＣＡＲの転写されたＲＮＡ配列からタンパク質への翻訳を促進する。
【０１８５】
[0209]ＣＡＲの抗原認識ドメイン１を、長ヒンジ４および短ヒンジ５と称される２つのヒンジ領域のうちの１つを介して、膜貫通ドメイン３に連結させた。長ヒンジ４を提供することで、抗原認識ドメインがその同種リガンド（機能障害性Ｐ２Ｘ７）と相互作用するのに必要とされ得る抗原認識ドメインの可動性が可能となり得る。長ヒンジ４のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号１４および配列番号１５に記載されている。短ヒンジ５のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号１６および配列番号１７に記載されている。
【０１８６】
[0210]ＣＡＲの膜貫通ドメイン３および細胞内ドメイン６の一部分は、ＣＤ２８共刺激性受容体の一部分７（アミノ酸配列が配列番号１８に記載され、ヌクレオチド配列が配列番号１９に記載されている）によって提供される。細胞内ドメインは、共刺激性受容体ＯＸ４０の一部分８（アミノ酸配列が配列番号２０に記載され、ヌクレオチド配列が配列番号２１に記載されている）、および活性化受容体ＣＤ３ゼータの一部分９（アミノ酸配列が配列番号２２に記載され、ヌクレオチド配列が配列番号２３に記載されている）をさらに含む。
【０１８７】
[0211]Ｐ２Ａ配列１０（アミノ酸配列が配列番号２４に記載され、ヌクレオチド配列が配列番号２５に記載されている）を、ＣＡＲのＣ末端に付加し、ＣＡＲのＣ末端に付加された任意のペプチド配列の翻訳後切除を可能にした。構築された抗ｎｆＰ２Ｘ７ＣＡＲ−長ヒンジおよび抗ｎｆＰ２Ｘ７ＣＡＲ−短ヒンジのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２６および２７に記載されている。
【０１８８】
レンチウイルスベクターの設計およびアセンブリ
[0212]設計したＣＡＲを、図２に図示されるＢＬＩＶレンチウイルスプラスミド（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）に組み込んだが、これは、蛍光および生体発光のレポータータンパク質である緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）を含む。ＢＬＩＶプラスミドは、ＧＦＰレポータータンパク質のコーディング配列とＦＬｕｃレポータータンパク質のコーディング配列との間に、Ｔ２Ａコーディング配列をさらに含み、それによって、ＦＬｕｃタンパク質とＧＦＰタンパク質との翻訳後分離が可能となる。
【０１８９】
[0213]ＢＬＩＶベクターのＮｈｅＩ制限部位の上流の配列および下流の配列に対する相同性を有する配列を、設計したＣＡＲの５’末端および３’末端に付加して、配列番号２８（ＣＡＲ−長ヒンジ）および配列番号２９（ＣＡＲ−短ヒンジ）に記載される最終的なヌクレオチド配列を得た。５’および３’の配列を含めることにより、ギブソンクローニングを使用して抗ｎｆ  Ｐ２Ｘ７ＣＡＲをＢＬＩＶベクターに組み込むことが可能となった。
【０１９０】
[0214]抗ｎｆ  Ｐ２Ｘ７ＣＡＲ−長ヒンジおよび抗ｎｆ  Ｐ２Ｘ７ＣＡＲ−短ヒンジのヌクレオチド配列を、遺伝子ブロック技術（ｇＢｌｏｃｋ（商標）Ｇｅｎｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ−Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｏｗａ、ＵＳＡ）を使用して構築し、ギブソンアセンブリクローニングキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ  ＭＡ、ＵＳＡ−カタログ番号Ｅ５５１０Ｓ）を製造業者の説明書に従って使用して、アセンブルした。
【０１９１】
[0215]ＢＬＩＶプラスミドを、ＮｈｅＩクローニング部位で制限酵素処理し、抗ｎｆ  Ｐ２Ｘ７ＣＡＲコーディング配列を、ギブソンアセンブリを使用して組み込んだ。
ＢＬＩＶ−ＣＡＲベクターのクローニングおよび評価
[0216]Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓの５−アルファコンピテント大腸菌細胞（ギブソンアセンブリクローニングキットで提供される）に、生成したＢＬＩＶ−ＣＡＲベクターを、製造業者の説明書に従って形質転換した。概要：
−  ＮＥＢの５−アルファコンピテント大腸菌細胞のチューブを、１０分間氷上で解凍した。
−  １ｐｇ〜１００ｎｇのＢＬＩＶ−ＣＡＲプラスミドＤＮＡを含有する１〜５μｌを、細胞混合物に添加し、チューブを４から５回左右に揺らすことによって、混合した。
−  大腸菌およびプラスミドの混合物を、氷上に３０分間、混合することなく静置した。
−  細胞およびプラスミドの混合物に、４２℃で３０秒間熱ショックを与えた後、氷上に５分間、混合することなく静置した。
−  ９５０μｌのＳＯＣを混合物に添加した後、６０分間３７℃に加熱し、激しく振盪させた。
−  選択プレートを調製し、３７℃に加熱した。
−  細胞の１０倍連続希釈物を、ＳＯＣ溶液中に調製した。
−  各希釈物５０〜１００μｌを、選択プレートに撒き、３７℃で終夜インキュベートした。
【０１９２】
[0217]形質転換した（大腸菌）細胞をインキュベートした後、ＢＬＩＶ−ＣＡＲ−短ヒンジプラスミドを形質転換した細菌のコロニー１０個およびＢＬＩＶ−ＣＡＲ−長ヒンジプラスミドを形質転換した細菌のコロニー１０個を単離し、プラスミドＤＮＡを精製し、ＢａｍＨＩ制限酵素で制限酵素処理した。制限酵素処理したＤＮＡを、適切なサイズの制限酵素処理フラグメントのゲル電気泳動により分析した。図３に示されるように、ＢＬＩＶ−ＣＡＲ−長ヒンジプラスミドを形質転換した細菌クローンのコロニー２から９は、適切なサイズの制限酵素処理フラグメント（７．８ｋｂおよび２．８ｋｂ）を含有していたが、ＢＬＩＶ−ＣＡＲ−短ヒンジプラスミドを形質転換した細菌クローンでは、適切なサイズの制限フラグメント（７．４ｋｂおよび２．８ｋｂ）が得られたのはコロニー４のみであった。
【０１９３】
[0218]ＢＬＩＶ−ＣＡＲ−長ヒンジプラスミドを含有する細菌のクローン２から４（Ｌ２からＬ４）、およびＢＬＩＶ−ＣＡＲ−短ヒンジプラスミドを含有する細菌のクローン４（Ｓ４）を、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、およびＰｓｔＩを使用したプラスミド同一性のさらなる確認に選択した。コロニーはすべてが、表４および図４に記載されるように、予測された長さの制限酵素処理フラグメントを示した。
【０１９４】
【表４】
2018526033.tif 000007
【０１９５】
レンチウイルスベクターの構築および検証
[0219]以下の方法に従って、２９３Ｔ細胞を使用して、３プラスミドプロトコールによりレンチウイルスをパッケージングした。
１日目：２９３Ｔ細胞が、翌日に９０〜９５％コンフルエントになるように、細胞を、Ｔ−２２５フラスコに１０％血清を有する３５ｍｌのＤＭＥＭ培地に播種した。
２日目：生成したＢＬＩＶ−ＣＡＲプラスミド（または未改変のＢＬＩＶプラスミド）のうちのいずれか３０ｕｇ、３０ｕｇのｇａｇ−ｐｏｌプラスミドデルタ８．２、および１５ｕｇのＶＳＶ−Ｇプラスミド（ｐＭＤ２．Ｇ）を、ＯｐｔｉＭＥＭ培地に添加して、最終体積７５０ｕｌにし、混合した。３００ｕｌのＰＥＩ溶液を添加し、室温で少なくとも２０分間インキュベートした。混合物を、次いで、コンフルエントな２９３Ｔ細胞に添加した後、３７℃でインキュベートした。
３日目：プラスミド混合物を添加した２４時間後に、上清を２９３Ｔ細胞からデカンテーションし、４℃で保管した。デカンテーションした混合物を、３５ｍｌの新しい培地と置き換えた後、３７℃でさらにインキュベートした。
４日目：プラスミド混合物を添加した４８時間後に、培地を除去し、２４時間で採取した上清と合わせた。合わせた上清を、１５分間、１５００ｇで回転処理して、残っている細胞残屑をすべて除去した。上清を０．４５ｕｍのフィルターに通して濾過した後、ＷＸ超遠心分離器において１７，０００ｒｐｍで１時間回転処理した。遠心分離した後、上清を、手作業で、チューブに５０〜２００ｕｌを残してデカンテーションした。遠心チューブを、混入および蒸発を防ぐために５０ｍｌのネジ蓋のチューブに入れ、ウイルスを４℃で終夜再懸濁させた。
５日目：ウイルスを、遠心チューブの底部から再懸濁させ、新しい１．５ｍｌのチューブに移した。再懸濁したウイルスを、微小遠心チューブにおいて５０００ｒｐｍで５分間回転処理して、残っている残屑をすべて除去した。
【０１９６】
[0220]ＢＬＩＶ−ＣＡＲ−短ヒンジベクターおよびＢＬＩＶ−ＣＡＲ−長ヒンジベクターの２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションを、ＧＦＰ蛍光体の存在下において２４時間インキュベートした後に評価した（図５Ａおよび図６Ａを参照されたい）。短ヒンジおよび長ヒンジのＢＬＩＶ−ＣＡＲレンチウイルスベクターを含有する５日目に採取した上清（上述のように）を、新しい２９３Ｔ細胞とともにインキュベートし、ＧＦＰ蛍光に関して視覚化して、形質導入能力を試験した（図５Ｂおよび図６Ｂを参照されたい）。
【０１９７】
ＣＡＲ  Ｔ細胞機能に関するスクリーニング
[0221]１０８個のＣＤ８  Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）を製造業者の説明書に従って使用して、５０ｍｌのヒト血液から単離した。純度の分析により、図７に図示されるように、精製された細胞の７６．６％が、ＣＤ８＋であったことが示された。
【０１９８】
[0222]ＣＤ８＋Ｔ細胞を、１ウェル当たり１０５個の細胞で、１：１の比のＴ細胞増殖（ＣＤ３／ＣＤ２８）ビーズとともにインキュベートした。ＣＤ８細胞を、次いで、５またはそれ以上の感染多重度（ＭＯＩ）で、未改変のＢＬＩＶプラスミド、ＢＬＩＶ−ＣＡＲ−短ヒンジプラスミド、またはＢＬＩＶ−ＣＡＲ−長ヒンジプラスミドのいずれかを含有するレンチウイルス調製物とともに終夜インキュベートした。インキュベーション後に、ＣＤ８＋Ｔ細胞を洗浄し、その後、標的細胞とともに共培養した。
【０１９９】
[0223]非機能性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する標的細胞を、哺乳動物のがん細胞株ＢＴ５４９（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１２２）によって得た。これらの細胞を、蛍光膜挿入型色素ｅＦｌｕｏｒ（商標）６７０（ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を製造業者の説明書に従って使用して、色素標識した。概要：
−  ＢＴ５４９細胞を、単一細胞懸濁液として調製し、ＰＢＳ中で２回洗浄して、残留血清をすべて除去した。
−  細胞を、室温のＰＢＳ中に再懸濁させた。
−  細胞増殖色素ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０の１０μＭ溶液を、室温のＰＢＳ中に調製した。
−  等量の１０μＭ色素溶液を、調製したＢＴ５４９細胞に添加して、最終濃度５μＭの色素溶液を得た。
−  色素溶液中のＢＴ５４９細胞を、暗所において３７℃で１０分間インキュベートした後、１０％血清を含有する低温培養培地を４倍量添加することによって標識化を停止した後、暗所において氷上で５分間インキュベートした。
−  最後に、細胞を培養培地中で３回洗浄した後、所望される濃度で培養培地中に再懸濁させた。
【０２００】
[0224]色素標識した後に、標的細胞を、調製したＣＤ８＋Ｔ細胞とともに、１０：１、５：１、１：１、および０：１（Ｔ細胞：標的）の比で共培養した。
[0225]２４時間の共培養後に、細胞を採取し、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を使用して分析した。膜挿入型色素を含有する標的細胞の数を定量して、共培養したＴ細胞が、標的細胞の死滅または細胞増殖の停止をもたらしたかどうかを評価した。ＣＤ８＋Ｔ細胞が標的細胞を殺滅させる有効性を定量するために使用したゲーティングおよび分析の戦略は、図８に図示されており、図９に定量されている。図８Ａは、標識したＣＤ８＋Ｔ細胞のゲーティングおよびヒストグラム分析を図示する。図８Ｂは、標識したＢＴ５４９標的細胞のゲーティングおよびヒストグラム分析を図示する。図８Ｃは、対照ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＢＴ５４９標的を２４時間共培養した後のゲーティングおよびヒストグラム分析を図示する。図８Ｄは、ＢＬＩＶ−ＣＡＲ−長ヒンジを形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞およびＢＴ５４９標的細胞を２４時間共培養した後のゲーティングおよびヒストグラム分析を図示する。図８Ｅは、ＢＬＩＣ−ＣＡＲ−短ヒンジを形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞およびＢＴ５４９標的細胞を２４時間共培養した後のゲーティングおよびヒストグラム分析を図示する。
【０２０１】
[0226]図９において見ることができるように、標的細胞を、ＢＬＩＶ−ＣＡＲ−長ヒンジまたはＢＬＩＶ−ＣＡＲ−短ヒンジのいずれかを含有するレンチウイルスを形質導入したＣＤ８  Ｔ細胞とともに共培養したときに、標的細胞を非形質導入細胞または対照を形質導入した（未改変ＢＬＩＶベクター）ＣＤ８  Ｔ細胞とともに共培養したときと比較して、消失した（殺滅された）ＢＴ５４９標的細胞の数の増加があった。
【０２０２】
[0227]図９に提示された結果を考慮すると、抗ｎｆＰ２Ｘ７ＣＡＲ受容体（短ヒンジまたは長ヒンジを有する）を形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞が、非機能性Ｐ２Ｘ７発現標的細胞に対する細胞傷害活性のレベルの上昇を示すことは、明らかであり、がん細胞標的を殺滅させるＣＡＲ−Ｔ細胞の能力を示す。
【０２０３】
実施例２
代替的な抗ｎｆＰ２Ｘ７キメラ抗原受容体の設計
[0228]本発明の実施形態による抗非機能性（ｎｆ）Ｐ２Ｘ７受容体ＣＡＲの設計およびＴ細胞における発現のプロセスを詳しく示すさらなる例示的なプロトコールを、以下に詳述する。
【０２０４】
[0229]３つの抗非機能性Ｐ２Ｘ７結合ペプチドを用いて、抗ｎｆＰ２Ｘ７ＣＡＲを設計した。具体的には、ペプチドＰＥＰ２−２−１−１、ＰＥＰ２−４７２−２、またはＰＥＰ２−２−１２（それぞれ、配列番号３２、３３、および３４に記載のアミノ酸配列を有する）に対する配列相同性を有する抗原認識ドメインを含むように、ＣＡＲを設計した。これらの結合ペプチドは、非機能性Ｐ２Ｘ７受容体に結合することが示されている（Ｂａｒｄｅｎ，Ｊ．Ａ．，Ｓｌｕｙｔｅｒ，Ｒ．，Ｇｕ，Ｂ．Ｊ．＆Ｗｉｌｅｙ，Ｊ．Ｓ．２００３．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｕｍａｎ  Ｐ２Ｘ（７）ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ＨＥＫ２９３  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５３８，１５９−１６２）。
【０２０５】
[0230]上述の結合ペプチドと、非機能性Ｐ２Ｘ７受容体を認識する抗体の重鎖可変領域とのアライメントを、図１０に示す。相補性決定領域（ＣＤＲ１から３）の配列のアライメントを、四角で示す。
【０２０６】
[0231]ＰＥＰ２−２−１−１配列を有するＣＡＲの構築の具体的な例を、以下に詳述する。同じＣＡＲ構造および配列を、ＰＥＰ２−２−１−１の代わりの代替的な結合ペプチドとして、ＰＥＰ２−４７２−２配列またはＰＥＰ２−２−１２配列を結合ペプチドとして有するＣＡＲに使用した。
【０２０７】
[0232]ＰＥＰ２−２−１−１結合ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、他のＤＮＡ配列とインフレームで合成し、以下に記載される構造を有するＣＡＲを生成した。
[0233]図１１を参照すると、ホモサピエンスＣＤ８ａ分子（ＣＤ８Ａ）転写産物バリアント１（配列番号３０に記載されるアミノ酸配列および配列番号３１に記載されるヌクレオチド配列を有する）のリーダー配列１１を、ＰＥＰ２−２−１−１結合ペプチド１２（配列番号３２に記載されるアミノ酸配列および配列番号３５に記載されるヌクレオチド配列を有する）のＮ末端に連結させることによって、抗原認識ドメインを調製した。
【０２０８】
[0234]抗原認識ドメインを、次いで、上述の実施例１に記載される長ヒンジの配列（すなわち、配列番号１４に記載されるアミノ酸配列および配列番号１５に記載されるヌクレオチド配列）を有する改変されたＩｇＧ４ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ４  １３を介して、膜貫通ドメインに連結させた。
【０２０９】
[0235]ＣＤ８リーダー配列１１およびＰＥＰ２−２−１結合ペプチド１２を含む細胞外ドメインを、ＣＤ２８細胞質ドメインの一部分１６も含むヒトＣＤ２８の一部分１５（配列番号１８に記載されるアミノ酸配列および配列番号１９に記載されるヌクレオチド配列を有する）によって提供される膜貫通ドメイン１４に連結させた。
【０２１０】
[0236]上述のヒトＣＤ２８分子の一部分１４およびホモサピエンス腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４（ＴＮＦＲＳＦ４／ＯＸ４０−配列番号２０に記載されるアミノ酸配列および配列番号２１に記載されるヌクレオチド配列を有する）の細胞質ドメイン１８を、ホモサピエンスＣＤ２４７分子の細胞質ドメイン１９（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖、配列番号２２に記載されるアミノ酸配列および配列番号２３に記載されるヌクレオチド配列を有する）に連結させることによって、ＣＡＲの細胞内部分１７を提供した。
【０２１１】
レンチウイルスベクターの設計およびアセンブリ
[0237]設計したＰＥＰ２−２−１−１、ＰＥＰ２−４７２−２、およびＰＥＰ２−２−１２  ＣＡＲのヌクレオチド配列を、遺伝子ブロック技術（ｇＢｌｏｃｋ（商標）Ｇｅｎｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ−Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｏｗａ、ＵＳＡ）を使用して構築し、ギブソンアセンブリクローニングキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ  ＭＡ、ＵＳＡ−カタログ番号Ｅ５５１０Ｓ）を製造業者の説明書に従って使用して、アセンブルした。クローニングベクター（制限部位を含む）に組み込むためのＰＥＰ２−２−１−１、ＰＥＰ２−４７２−２、またはＰＥＰ２−２−１２  ＣＡＲのヌクレオチドコンストラクトの配列は、それぞれ、配列番号３５、３６、および３７に記載されている。
【０２１２】
[0238]ＣＡＲヌクレオチドコンストラクトを、図１１に図示されるｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−Ｔ２Ａ（ｐＣＤＨ）ベクター（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ、カタログ番号ＣＤ５２４Ａ−１）に組み込んだが、このベクターは、蛍光レポータータンパク質である緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む。ｐＣＤＨベクターは、さらに、クローニング部位とＧＦＰとの間にＴ２Ａコーディング配列を含み、クローニングされたＣＡＲとＧＦＰタンパク質との翻訳後の分離を可能にする。
【０２１３】
[0239]ＰＥＰ２−２−１２およびＰＥＰ２−４７２−２  ＣＡＲのヌクレオチドコンストラクトをｐＣＤＧベクターに組み込むために、ｐＣＤＨベクターを、ＥｃｏＲ１およびＮｏｔＩで制限酵素処理し、ゲル精製した（ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット、ＱＩＡＧＥＮ）。ＰＥＰ２−２−１２およびＰＥＰ２−４７２−２  ＣＡＲヌクレオチドｇＢｌｏｃｋコンストラクトはまた、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ消化酵素で消化させた。制限酵素処理したｇＢｌｏｃｋフラグメントを、次いで、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットで、製造業者の説明書に従って精製した。制限酵素処理したベクターを、インサート対ベクターのモル比３：１で、制限酵素処理したＣＡＲコンストラクトにライゲーションした。ライゲーションミックスを、化学的にコンピテントなＳＵＲＥ２細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ）に形質転換した。
【０２１４】
[0240]ＰＥＰ２−２−１−１  ＣＡＲコンストラクトは、内部ＥｃｏＲ１制限部位を含有しており、したがって、ＰＥＰ２−２−１２およびＰＥＰ２−４７２−２  ＣＡＲヌクレオチドコンストラクトとは異なる様式で、ｐＣＤＨベクターに組み込んだ。ｐＣＤＨベクターを、ＥｃｏＲ１で制限酵素処理し、得られた５’−オーバーハングに、１００ｕＭのｄＮＴＰの存在下でＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを充填した（１２℃で１５分間）。反応を終結させ（１０ｍＭのＥＤＴＡの存在下において７５℃で２０分間）、制限酵素処理したベクターを、カラム精製した（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット、ＱＩＡＧＥＮ）。精製したベクターを、次いで、ＮｏｔＩでさらに制限酵素処理し、ゲル精製した（ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット、ＱＩＡＧＥＮ）。ＰＥＰ２−２−１−１  ＣＡＲコンストラクトフラグメントを、まず、ＳｍａＩで制限酵素処理した後、ＮｏｔＩで消化を行った（いずれも２５℃）。制限酵素処理したｇＢｌｏｃｋフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットで、製造業者の説明書に従って精製した。制限酵素処理したベクターを、インサートとベクターのモル比３：１で、ＣＡＲコンストラクトとライゲーションした。
【０２１５】
ｐＣＤＨ−ＣＡＲベクターのクローニングおよび評価
[0241]上述の３つのＣＡＲコンストラクトのそれぞれのライゲーションミックスを、製造業者の説明書に従って、化学的にコンピテントなＳＵＲＥ２細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ）に形質転換した。概要：
−  ＳＵＲＥ２細胞を、氷上で解凍した。解凍した後、細胞を、緩徐に混合し、１００μｌの細胞アリコートを、予備冷却した１４ｍｌの丸底チューブに入れた。
−  ２μｌのβ−メルカプトエタノールを、各細胞アリコートに添加した。
−  チューブを混合し、氷上で１０分間インキュベートし、２分ごとに緩徐に旋回させた。
−  ０．１〜５０ｎｇの各ｐＣＤＨ−ＣＡＲベクターを、細胞アリコートに添加した。
−  アリコートを緩徐に混合した後、氷上で３０分間インキュベートした。
−  チューブを、水浴において３０秒間４２℃で熱パルス処理した後、氷上で２分間インキュベートした。
−  ０．９ｍｌの予備加熱した（４２℃）ＮＺＹ＋培養液を、各チューブに添加した後、２２５〜２５０ｒｐｍで激しく混ぜながら３７℃で１時間インキュベートした。
−  最大２００μｌの形質転換混合物を、抗生物質を含有するＬＢ寒天プレートに入れた後、３７℃で終夜インキュベートした。
−  コロニーを採取し、さらに終夜培養した。
−  プラスミドＤＮＡを、Ｑｕｉｃｋｌｙｓｅミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて培養クローンから単離し、ＥｃｏＲＩ／Ｎｏｔ  Ｉ消化により消化させて、適切なサイズのＣＡＲ−ｐＣＤＨベクターを有するクローンを特定した。
【０２１６】
[0242]形質転換した（ＳＵＲＥ２）細胞をインキュベートした後、ＰＥＰ２−２−１−１、ＰＥＰ２−４７２−２、またはＰＥＰ２−２−１２結合ペプチドのそれぞれについて、ｐＣＤＨ−ＣＡＲを形質転換した細胞のコロニー５〜６個を単離し、さらに終夜インキュベートした。Ｑｕｉｃｋｌｙｓｅミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、培養コロニーのそれぞれからプラスミドＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩ／Ｎｏｔ  Ｉ制限酵素で制限酵素処理した。制限酵素処理したＤＮＡを、適切なサイズの制限酵素処理フラグメントのゲル電気泳動により分析した。
【０２１７】
[0243]図１３に示されるように、ＰＥＰ２−２−１−１  ｐＣＤＨ−ＣＡＲコンストラクトのコロニー３、ＰＥＰ２−４７２−２  ｐＣＤＨ−ＣＡＲコンストラクトのコロニー１および３、ならびにＰＥＰ２−２−１２  ｐＣＤＨ−ＣＡＲコンストラクトのコロニー１、３、および５が、適切なサイズの制限酵素処理フラグメントを含有していた。
【０２１８】
[0244]選択された各クローンに配列決定を行って、表５から選択される適切なプライマーを使用して、ＣＡＲの組込みを確認した。
【０２１９】
【表５】
2018526033.tif 000008
【０２２０】
[0245]選択された各コロニーの配列決定データを、コンピューターで導出したＰＥＰ２−２−１−１、ＰＥＰ２−４７２−２、またはＰＥＰ２−２−１２  ＣＡＲコンストラクトのそれぞれの組換えクローンとアライメントし、適切なコンストラクトを、選択したコロニーのそれぞれのうちの少なくとも１つに関して検証した。ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）Ｘｔｒａ  Ｍｉｄｉ  ＥＦキット、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌを製造業者の説明書に従って用いて、検証したクローンの大規模な内毒素除去プラスミド単離を行った。
【０２２１】
ウイルスベクターの構築および検証
[0246]一過的にトランスフェクトしたＨｅｋ２９３Ｔ細胞において、リポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を標準的な研究室プロトコールに従って使用して、レンチウイルスのパッケージングを行った（Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｙ．ら、２０１０．Ｒｏｂｕｓｔ，ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２１，１００５−１０１７）。概要：
−  １２．５ｕｇのレンチウイルスベクターＤＮＡを、Ｔ７５ｃｍフラスコにおいて、トランスフェクション１回当たり、３．７５ｕｇのｐＭＤ２．ｇ（ＶＳＶ−Ｇエンベロープ発現ベクター）、６．２５ｕｇのｐＲＳＶ−Ｒｅｖ、および７．５ｕｇのｐＣＭＶｄｅｌｔａ８．２と、７５ｕｌのリポフェクチンを製造業者のプロトコールに従って使用して混合し、終夜インキュベートした。
−  翌朝、培地を取り替え、ウイルスを含む上清を、４８時間後に採取した。
−  採取した上清を、３００×ｇで５分間遠心分離した後、０．４５ｕｍのフィルターを通して濾過した。
−  濾過した上清からのウイルス粒子を、超遠心分離（６８，０００×ｇで９０分間、４℃、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ３２ローター）によって濃縮した。上清を除去し、ウイルスペレットを、氷上でＤＭＥＭ中に緩徐に再懸濁させた。
−  １００ｕｌのウイルスアリコートを、必要になるまで−７０℃で保管した。
【０２２２】
[0247]ウイルストランスフェクション率を評価するために、トランスフェクトしたＨｅｋ２９３Ｔ細胞を採取し、ＧＦＰ陽性細胞（ｐＣＤＨベクター含有細胞）の割合を、フローサイトメトリーによって判定した。ＬＶ−ＰＥＰ２−４７２−２パッケージングミックスをトランスフェクトしたＨｅｋ２９３Ｔの代表的な結果を、図１４に示す。
【０２２３】
[0248]既知の数のＨｅｋ２９３Ｔ細胞に、濃縮ＬＶストックの連続希釈物（１：５０および１：１００）を形質導入することにより、ウイルス力価を計算した。形質導入は、８ｕｇ／ｍｌのポリブレン（臭化ヘキサジメトリン）の存在下で、終夜行った。翌日、ウイルスおよびポリブレンを含有する培地を、新しい培地と取り替え、細胞を、２４時間後に採取し、ＧＦＰ陽性細胞の割合を、フローサイトメトリーによって判定した。ウイルス力価は、式：形質導入単位／ｍｌ（ＴＵ）＝（ＦｘＣ／Ｖ）ｘＤ（式中、Ｆ＝ＧＦＰ＋細胞の頻度（％ＧＦＰ＋／１００）、Ｃ＝ウイルス添加時の細胞数、Ｖ＝ｍＬ単位の形質導入量、およびＤ＝希釈係数）を使用して、計算した。ＬＶ−ＰＥＰ２−４７２−２形質導入の代表的なフローデータを、図１５に示す。ＰＥＰ２−２−１−１、ＰＥＰ２−１２−２、およびＰＥＰ２−４７２−２  ＣＡＲウイルスベクターのそれぞれのＴＵを、以下の表６に提供する。
【０２２４】
【表６】
2018526033.tif 000009
【０２２５】
ｎｆ−Ｐ２Ｘ７  ＣＡＲ  Ｔ細胞機能に関するスクリーニング
抗ｎｆ−Ｐ２Ｘ７ＣＡＲを発現するＣＤ８  Ｔ細胞の産生
[0249]以下の方法に従って、ヒトＣＤ８細胞を精製し、形質導入した。
【０２２６】
[0250]ヒトＣＤ８  Ｔ細胞を、匿名ドナー由来のＢｕｆｆｙ  Ｃｏａｔｓ（オーストラリア赤十字血液サービス）から単離した単核球（ＭＮＣ）から精製した。ＭＮＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）密度勾配培地を使用して単離した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ（商標）ヒトＣＤ８  Ｔ細胞キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って用いて、ＣＤ８  Ｔ細胞をＭＮＣから精製した。フローサイトメトリーによって評価した単離細胞の純度は、８５％以上であった。
【０２２７】
[0251]２×１０６個の精製細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ビーズ対細胞の比３：１）およびＩＬ２（５００Ｕ／ｍｌ）とともに、３０分間予備インキュベートした後、１から２の感染多重度（ＭＯＩ）単位のウイルス含有ＬＶ−ＰＥＰ２−２−１−１、ＬＶ−ＰＥＰ２−４７２−２、または空のＬＶベクター（ＧＦＰ対照ウイルス）を、８ｕｇ／ｍｌのポリブレンとともに添加した。細胞を、ウイルスとともに１６時間インキュベートした後、ウイルス含有培地を除去した。残った細胞およびビーズを、ＩＬ２を含む新しい培地において４０時間インキュベートした後、ＧＦＰ蛍光レベルを分析した。
【０２２８】
[0252]図１６に図示されるように、形質導入の成功を示すＧＦＰ＋のＣＤ８細胞は、８％から４３％であった。
ｎｆ−Ｐ２Ｘ７受容体または野生型（ＷＴ）Ｐ２Ｘ７受容体を発現する標的細胞の産生
[0253]抗ｎｆ−Ｐ２Ｘ７−ＣＡＲを発現するＣＤ８細胞の有効性を評価するために、非機能性Ｐ２Ｘ７受容体（Ｋ１９３Ａ変異を有する）または野生型のＰ２Ｘ７受容体の細胞外ドメインのいずれかを細胞表面に過剰発現するＨｅｋ２９３Ｔ細胞を、調製した。
【０２２９】
[0254]ＥＸＤ２＿Ｋ１９３Ａ（ｎｆ−Ｐ２Ｘ７）およびＥＸＤ２＿ＷＴ（機能性Ｐ２Ｘ７）のｇＢｌｏｃｋ遺伝子フラグメント（それぞれ、配列番号４７および４８）を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から注文した。ＥＸＤ２ドメインは、ｐＤｉｓｐｌａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、図１７）から、ＩｇＫ−リーダー−ＨＡ−ＭＹＣ−ＰＤＧＦＲ−膜貫通ドメインからなる融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列がインフレームで発現されるように設計した。これらの融合タンパク質は、表面発現するように設計した。ＥＸＤ２＿Ｋ１９３ＡおよびＥＸＤ２＿ＷＴの遺伝子フラグメントを、ＨＡとＭＹＣ−エピトープタグの間にクローニングして、融合遺伝子ブロックを形成した。ＬＶ−４１６−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングするために、Ｇａｔｅｗａｙ  ａｔｔＢ１配列およびａｔｔＢ２配列を、融合遺伝子ブロックの５’末端および３’末端に含んだ。
【０２３０】
[0255]クローニングは、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して行い、すべてのステップは、製造業者のプロトコールに従って行った。概要：
−  まず、ａｔｔＢ隣接ＤＮＡフラグメント（ＥＸＤ２＿Ｋ１９３Ａ、配列番号４７、およびＥＸＤ２＿ＷＴ、配列番号４８）と、ａｔｔＰ含有ｐＤＯＮＲ−１０７ベクターとの間でＢＰ組換え反応を行って、エントリークローンを生成した。ＢＰ組換え反応を使用して、化学的にコンピテントなＥ．ｃｌｏｎｉ（登録商標）１０Ｇ細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ（登録商標））を製造業者のプロトコールに従って形質転換した。
−  形質転換した細胞を、５０ｕｇ／ｍｌのカナマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含有するＬＢ寒天プレートに播種し、３７℃で終夜インキュベートした。
−  各プレートから２つのクローンを選択して、カナマイシン（ＳＩＧＭＡ）（５０ｕｇ／ｍｌ）を有するＬＢ培養液中で微量培養物（２ｍＬ）を調製した。３７℃で終夜インキュベーションの後、撹拌を行った。
−  翌日、ＱＩＡＧＥＮ  ＱｕｉｃｋＬｙｓｅミニプレップキットを使用して、微量培養物からプラスミドＤＮＡを抽出した。
−  診断用Ｂａｍ  Ｈ１−ＨＦ（ＮＥＢ）およびＰｍｅｌ（ＮＥＢ）消化を行って、組換えクローンを特定した。Ｂａｍ  Ｈ１およびＢａｍ  Ｈ１／ＰｍｅＩ消化した後、ゲル電気泳動（図１８）によって、ＥＸＤ２＿Ｋ１９３ＡおよびＥＸＤ２＿ＷＴクローンの両方が、正しく消化されたことを確認した。
【０２３１】
[0256]各コンストラクトから１つのクローン（ＥＸＤ２＿Ｋ１９３ＡおよびＥＸＤ２＿ＷＴ）を、ＥＸＤ２＿Ｋ１９３ＡおよびＥＸＤ２＿ＷＴコンストラクトを目的のｐＬＶ−４１６ベクターに挿入するために、ＬＲ組換え反応（以下に記載される）に選択した。
【０２３２】
[0257]クローンを選択した後、続いて、ＬＲ組換え反応を行って、各ＥＸＤ２インサートをｐＤＯＮＲ−１０７エントリークローンから目的のｐＬＶ−４１６ベクターに移して、発現ベクターを作製した。最終的なＬＲ組換え反応を使用して、化学的にコンピテントなＥ．ｃｌｏｎｉ（登録商標）１０Ｇ細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ（登録商標））を製造業者のプロトコールに従って形質転換した。概要：
−  形質転換した細胞を、１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリン（ＳＩＧＭＡ）を含有するＬＢ寒天プレートに播種し、３７℃で終夜インキュベートした。
−  各プレートから６個のクローンを選択して、アンピシリン（５０ｕｇ／ｍｌ）を有するＬＢ培養液中に微量培養物（２ｍＬ）を調製し、これを、撹拌しながら３７℃で終夜インキュベートした。
−  翌日、プラスミドＤＮＡを単離し、Ｂａｍ  Ｈ１消化を行って、組換えクローンを特定した。組換えクローンは、適切なサイズの３つのバンド（３４３１、１０５６、および５８４４ｂｐ、図１９を参照されたい）の存在によって特定した。図１９において見ることができるように、各プレートから選択された６つすべてのクローンで、適切なサイズの制限酵素処理フラグメントが得られた。
−  ＥＸＤ２＿Ｋ１９３ＡまたはＥＸＤ２＿ＷＴを含有するｐＬＶ−４１６コンストラクトを形質導入した２つのクローンを、表７に記載されるプライマーで配列決定して、コンストラクトが適切であったことを確認した。
【０２３３】
【表７】
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【０２３４】
[0258]ＨＥＫ２９３細胞の形質導入ならびに機能性または非機能性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する好適なＨＥＫ２９３細胞株の生成のためのウイルス粒子を産生するために、以下のプロトコールを使用した。
−  ＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクションの前日に播種した（フラスコ１つ当たり７×１０６個の細胞）。
−  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、レンチウイルスパッケージングベクター、ならびにｐＬＶ−４１６−ＥＸＤ２およびｐＬＶ−４１６−ＥＸＤ２＿ＷＴのいずれかをトランスフェクトした。トランスフェクション効率をモニタリングするために、ＧＦＰ発現プラスミド（１ｕｇ）も含んだ。
−  終夜インキュベートした後、トランスフェクション試薬を含有する培地を除去し、１０ｍｌの新しい培地（１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ）と置き換えた。１０ｍｌの培地を、２４時間後に採取し、必要になるまで−８０℃において２ｍｌのアリコートで保管した。別の１０ｍｌの新しい培地（１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ）をフラスコに添加し、これを、さらに２４時間後に採取した。
−  ウイルス粒子を、１２００ｒｐｍで培地を遠心分離することによって、採取した培地から単離した後、０．４５ｕｍのフィルターに通して濾過した。ウイルス粒子とともに、濾過した培地を、ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションに使用した。
【０２３５】
[0259]トランスフェクション効率を評価するために、２回目の１０ｍｌの培地を除去した後に、細胞を採取し、ＧＦＰ陽性細胞の割合を、フローサイトメトリーによって判定した。図２０は、ＨＥＫ２９３細胞に、９７％および８５％の効率でｐＬＶ−４１６−ＥＸＤ２＿Ｋ１９３ＡおよびｐＬＶ−４１６−ＥＸＤ２＿ＷＴがトランスフェクトされたことを図示する。
【０２３６】
[0260]機能性および非機能性Ｐ２Ｘ７の細胞外ドメインを細胞表面に過剰発現する安定なＨＥＫ２９３細胞を生成するために。以下のプロトコールを使用した。
−  ＨＥＫ２９３細胞を、形質導入の前日に、Ｔ２５フラスコに播種した（フラスコ１つ当たり７×１０５個の細胞）。
−  翌日に、培地を各フラスコから除去し、上述のプロトコールに従って生成したウイルス粒子を含有する新しい培地を、表８に記載される比に従って添加した。
−  ８ｕｇ／ｍＬの最終濃度まで、各フラスコにポリブレンを添加した。
【０２３７】
【表８】
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【０２３８】
−  形質導入の２４時間後に、培地を各フラスコから除去し、１６００ｕｇ／ｍＬのＧ４１８を補充した新しい培地（１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ）を、対照ＧＦＰ発現レンチウイルス（ＬＶ−４１１−ＧＦＰ）を入れたフラスコを除くすべてのフラスコに添加した。
−  対照ｐＬＶ−４１１−ＧＦＰウイルスを形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、形質導入後７２時間、ＧＦＰ発現に関してモニタリングした（図２１を参照されたい）。
−  形質導入していない細胞は、すべてが、Ｇ４１８補充培地で培養した４日後に死滅した。形質導入した細胞株は、Ｇ４１８を含む培地で正常に成長を続けた。
【０２３９】
[0261]トランスフェクトしたＰ２Ｘ７受容体の細胞外ドメインは、ＨＡ−エピトープタグおよびＭＹＣ−エピトープタグを含有する。したがって、これらの細胞を、ＨＡ−およびＭＹＣ−に対するモノクローナル抗体で染色して、フローサイトメトリーによって細胞外ドメインの表面発現を確認することができる。
【０２４０】
ＣＡＲ  Ｔ細胞機能に関するスクリーニング
[0262]ｎｆ−Ｐ２Ｘ７−ＣＡＲの機能性を評価するために、ＰＥＰ２−２−１−１またはＰＥＰ２−４７２−２  ＣＡＲコンストラクト（上述のように調製）のそれぞれを形質導入したＣＤ８細胞を、９６ウェルの丸底培養プレートにおいて、ｎｆ−Ｐ２Ｘ７受容体を発現する１×１０４個の標的細胞（上述のように調製）および非機能性Ｐ２Ｘ７受容体を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞（２３１  Ｐ２Ｘ７細胞）とともに、１：１の比で４時間共培養した。
【０２４１】
[0263]細胞傷害性の割合を、ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）において、製造業者の説明書に従って判定した。概要：
−  ４５分前から４時間、１００μｌの標的細胞につき１０μｌの溶解溶液（１０倍）を各ウェルに添加した。
−  さらに４５分後、プレートを２５０×ｇで４分間遠心分離した。
−  各ウェルから５０μｌのアリコートを採取し、９６ウェルの平底プレートに移した。
−  移したアリコートを含むプレートの各ウェルに、５０μｌのＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）試薬を添加し、プレートを、室温で３０分間、ホイルで覆った。
−  ３０分後に、５０μｌの停止溶液を各ウェルに添加し、４９０ｎｍでの吸光度を各ウェルから読み取った。
【０２４２】
[0264]各ウェルの吸光値を、製造業者の説明書に従って補正し、細胞傷害性の割合を、以下の式を使用して計算し、空のベクターを形質導入したＴ細胞に対して正規化して、細胞殺滅における倍変化を得た。
【０２４３】
【数１】
2018526033.tif 000012
【０２４４】
[0265]図２２Ａに示されるように、ＰＥＰ２−２−１−１  ＣＡＲを発現するＣＤ８  Ｔ細胞およびＰＥＰ２−４７２−２  ＣＡＲを発現するＣＤ８  Ｔ細胞の両方が、空のベクターを形質導入したＣＤ８細胞よりも、およそ１５倍および１１倍（それぞれ）多くの非機能性Ｐ２Ｘ７受容体を発現するＨＥＫ細胞を殺滅させた。さらに、図２２Ｂに示されるように、ＰＥＰ２−２−１−１  ＣＡＲ発現ＣＤ８  Ｔ細胞およびＰＥＰ２−４７２−２  ＣＡＲ発現ＣＤ８  Ｔ細胞は、空のベクターを形質導入したＣＤ８細胞よりも、およそ２．５倍および２．２５倍（それぞれ）多くの２３１  Ｐ２Ｘ７細胞を殺滅させた。
【０２４５】
[0266]本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書で別途示されるか、文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実行することができる。本明細書にて提供されるあらゆる例または例示的な語法（例えば、「など」）の使用は、単に、実施形態の例を良好に示すことを意図するものであり、特許請求される本発明の範囲に対して制限を課すものではない。本明細書におけるいずれの語法も、任意の特許請求されていない要素を必須として示すとして解釈されるべきではない。
【０２４６】
[0267]本明細書に提供される説明は、共通した特性および特徴を共有し得るいくつかの実施形態に関連している。一実施形態の１つまたは複数の特徴が、他の実施形態の１つまたは複数の特徴と組み合わせ可能であり得ることを理解すべきである。加えて、実施形態の単一の特徴または特徴の組合せが、さらなる実施形態を構成してもよい。
【０２４７】
[0268]本明細書に使用される題目は、読者の参照の容易さのみのために含まれるものであり、本開示または特許請求の範囲を通じて見出される主題を制限するために使用されるものではない。題目は、特許請求の範囲または特許請求の制限の解釈に使用されるものではない。
【０２４８】
[0269]当業者であれば、本明細書に記載される本発明が、具体的に記載されたもの以外の変化および修正を受ける可能性を認識すると予想される。本発明が、そのような変化形および修正形を含むことを理解されたい。本発明はまた、個別または集合的に、本明細書に参照されるか、または示されるステップ、特徴、組成物、および化合物のすべて、ならびにステップまたは特徴の任意の２つまたはそれ以上のあらゆる組合せを含む。
【０２４９】
[0270]さらに、本明細書に使用されるとき、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、既に文脈によりそうでないことが示されない限り、複数形の態様を含むことに留意されたい。
【０２５０】
[0271]例えば、本出願による優先権を主張すること、分割状態を請求することによって、および／または継続状態を請求することによって、本出願に基づいて、今後の特許出願が出願されてもよい。以下の特許請求の範囲が、任意のそのような今後の出願において特許出願され得る範囲を制限するように意図するものではないことが理解される。
【図１】
2018526033.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2018526033.tif 000020
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2018526033.tif 000023
【図１２】
2018526033.tif 000024
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2018526033.tif 000027
【図１６】
2018526033.tif 000028
【図１７】
2018526033.tif 000029
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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