(57)【要約】本開示は、腫瘍溶解性ウイルス、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）、治療的または免疫調節性モノクローナル抗体、標的チミジンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、または改変Ｔ細胞受容体を組み込んだ養子移入細胞を含む組成物と、腫瘍関連抗原に融合された切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ配列ペプチドの融合タンパク質を含む生きた弱毒化組み換え型リステリア株とを対象とする。本開示は、腫瘍を治療する、腫瘍から保護する、および腫瘍に対する免疫応答を誘発する方法であって、これを投与する工程を含み、追加的な放射線療法を伴う場合と伴わない場合がある方法をさらに対象としている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物であって、前記核酸分子が融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドが異種抗原またはその断片に融合された切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ配列ペプチドを含み、前記組成物がさらに追加的な活性薬剤を含む、組成物。
【請求項２】
前記追加的な活性薬剤が、弱毒化腫瘍溶解性ウイルス、キメラ抗原受容体改変Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）、治療的または免疫調節性抗体、標的化チミジンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、またはＴ細胞受容体改変Ｔ細胞（受容体改変Ｔ細胞）、またはその任意の組み合わせを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記弱毒化腫瘍溶解性ウイルスが、水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、レトロウイルス、レオウイルス、麻疹ウイルス、シンビスウイルス、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノウイルスを含む群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記腫瘍溶解性ウイルスがプログラム細胞死受容体（ＰＤ−１）結合作動薬または拮抗薬を発現する、請求項２〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記免疫調節性抗体が、抗体またはその断片、ＰＤ−１拮抗薬、またはＰＤ−１部分拮抗薬、またはその任意の組み合わせを含む群から選択されるＰＤ−１拮抗薬である、請求項２〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＣＡＲ  Ｔ細胞が抗原結合ドメインをコードする核酸を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗原結合ドメインが抗体またはその抗原結合断片である、請求項６に記載の組成物。  
【請求項８】
前記その抗原結合断片がＦａｂまたはｓｃＦｖである請求項７に記載の組成物。  
【請求項９】
前記抗原結合ドメインが前立腺特異抗原（ＰＳＡ）ドメイン、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原ドメインまたはキメラhｅｒ２／ｎｅｕ抗原ドメインに結合する、請求項６〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗体が、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）エピトープ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原エピトープまたはキメラｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原エピトープを認識する、請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
前記受容体改変Ｔ細胞が細胞表面腫瘍リガンドに対する選択的結合特異性を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項１２】
前記リガンドが、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）細胞表面腫瘍リガンド、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）細胞表面腫瘍リガンドまたはキメラｈｅｒ２／ｎｅｕ細胞表面腫瘍リガンドを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記チミジンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）が、メシル酸イマチニブ（ＩＭ）、ダサチニブ（Ｄ）、ニロチニブ（Ｎ）、ボスチニブ（Ｂ）、ＩＮＮＯ  ４０６、ｚｅｌｂｏｒａｆｉｎｉｂ、ゲフィチニブ、エルロチニブまたはスニチニブを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項１４】
融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む前記核酸分子が前記リステリアゲノムに組み込まれる、請求項１〜１３に記載の組成物。
【請求項１５】
融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む前記核酸分子が前記組み換え型リステリア株内のプラスミド内にある、請求項１〜１３に記載の組成物。
【請求項１６】
リステリア抗生物質選択が無いときに前記プラスミドが前記組み換え型リステリア株内で安定して維持される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記プラスミドが前記組み換え型リステリアに抗生物質抵抗性を与えない、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ配列ペプチド組成物  前記異種抗原が腫瘍関連抗原である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記腫瘍関連抗原が前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原またはキメラｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ＰＳＡ抗原が配列番号：２６に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ＨＰＶ抗原が配列番号：５４に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ｃＨｅｒ２抗原が配列番号：５７に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
前記腫瘍関連抗原が血管形成抗原である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２４】
前記腫瘍関連抗原が前立腺特異抗原（ＰＳＡ）である時、かつ存在する場合、前記抗原結合ドメインが、ＰＳＡドメインに結合される、および／または前記モノクローナル抗体がＰＳＡエピトープを認識する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２５】
前記腫瘍関連抗原がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原である時、かつ存在する場合、前記抗原結合ドメインがＨＰＶ抗原に結合される、および／または前記モノクローナル抗体がＨＰＶエピトープを認識する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２６】
前記腫瘍関連抗原がキメラｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原である時、かつ存在する場合、前記抗原結合ドメインがキメラｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原ドメインに結合される、および／または前記モノクローナル抗体がｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原を認識する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組み換え型リステリア株が弱毒化されている、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記弱毒化リステリアが少なくとも１つの内因性遺伝子内に突然変異を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記突然変異が不活性化、切断、欠失、置換または分裂を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記内因性遺伝子がＡｃｔＡ病毒性遺伝子、ｐｒｆＡ病毒性遺伝子、ｄａｌ遺伝子、ｉｎｌＢ遺伝子、ｄａｔ遺伝子またはその組み合わせである、請求項２８〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記内因性遺伝子が前記ｄａｌ／ｄａｔおよびＡｃｔＡ遺伝子を含む、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
第１のオープンリーディングフレームを含む前記核酸が、第２のオープンリーディングフレームをさらに含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記第２のオープンリーディングフレームがＤ１３３Ｖ突然変異を含むｐｒｆＡタンパク質をコードし、また前記ｐｒｆＡタンパク質が前記ｐｒｆＡ遺伝子内の前記突然変異、欠失、分裂、不活性化、置換、または切断を補完する、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記第２のオープンリーディングフレームが代謝酵素をコードし、また前記代謝酵素が前記ｄａｌおよびｄａｔ遺伝子内の前記突然変異、欠失、分裂、不活性化、置換、または切断を補完する、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
前記第２のオープンリーディングフレームによってコードされた前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
アジュバントをさらに含む、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記アジュバントが、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、またはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記リステリアがリステリア・モノサイトゲネスである、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３９】
被験者における抗腫瘍Ｔ細胞応答の強化を誘発する方法であって、前記方法が、核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む有効量の免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程であって、前記核酸分子が融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドが異種抗原またはその断片に融合された切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ配列ペプチドまたはＰＥＳＴ配列ペプチドを含み、また
（ａ）前記組成物はさらに、追加的な活性薬剤を含むか、
（ｂ）前記方法はさらに、追加的な活性薬剤を含む有効量の組成物を前記被験者に投与する工程を含むか、または
（ｃ）前記方法はさらに、標的放射線療法を前記被験者に実施する工程を含むか、または（ａ）〜（ｃ）の任意の組み合わせである。
【請求項４０】
前記追加的な活性薬剤が、弱毒化腫瘍溶解性ウイルス、キメラ抗原受容体改変Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）、治療的または免疫調節性モノクローナル抗体、標的化チミジンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、またはＴ細胞受容体改変Ｔ細胞（受容体改変Ｔ細胞）、またはその任意の組み合わせを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記弱毒化腫瘍溶解性ウイルスが、水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、レトロウイルス、レオウイルス、麻疹ウイルス、シンビスウイルス、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノウイルスを含む群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記腫瘍溶解性ウイルスがプログラム細胞死受容体（ＰＤ−１）結合作動薬または拮抗薬を発現する、請求項４０〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記免疫調節性抗体が、抗体またはその断片、ＰＤ−１拮抗薬、またはＰＤ−１部分拮抗薬、またはその任意の組み合わせを含む群から選択されるＰＤ−１拮抗薬である、請求項４０〜４１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ＣＡＲ  Ｔ細胞が抗原結合ドメインをコードする核酸を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗原結合ドメインが抗体またはその抗原結合断片である、請求項４４に記載の方法。  
【請求項４６】
前記その抗原結合断片がＦａｂまたはｓｃＦｖである請求項４５に記載の方法。  
【請求項４７】
前記抗原結合ドメインが前立腺特異抗原（ＰＳＡ）ドメイン、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原ドメインまたはキメラｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原ドメインに結合する、請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記モノクローナル抗体が、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）エピトープ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原エピトープまたはキメラｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原エピトープを認識する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
前記受容体改変Ｔ細胞が細胞表面腫瘍リガンドに対する選択的結合特異性を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
前記リガンドが、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）細胞表面腫瘍リガンド、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）細胞表面腫瘍リガンドまたはキメラｈｅｒ２／ｎｅｕ細胞表面腫瘍リガンドを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記チミジンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）が、メシル酸イマチニブ（ＩＭ）、ダサチニブ（Ｄ）、ニロチニブ（Ｎ）、ボスチニブ（Ｂ）、ＩＮＮＯ  ４０６、ｚｅｌｂｏｒａｆｉｎｉｂ、ゲフィチニブ、エルロチニブまたはスニチニブを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５２】
融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む前記核酸分子が前記リステリアゲノムに組み込まれる、請求項３９〜５１に記載の方法。
【請求項５３】
融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む前記核酸分子が前記組み換え型リステリア株内のプラスミド内にある、請求項３９〜５２に記載の方法。
【請求項５４】
抗生物質選択が無いときに前記プラスミドが前記組み換え型リステリア株内で安定して維持される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記プラスミドが前記組み換え型リステリアに抗生物質抵抗性を与えない、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記異種抗原が腫瘍関連抗原である、請求項３９〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記腫瘍関連抗原が前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原またはキメラｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＰＳＡ抗原が配列番号：２６に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＨＰＶ抗原が配列番号：５４に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記ｃＨｅｒ２抗原が配列番号：５７に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記腫瘍関連抗原が血管形成抗原である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
前記腫瘍関連抗原が前立腺特異抗原（ＰＳＡ）である時、かつ存在する場合、前記抗原結合ドメインが、ＰＳＡドメインに結合される、および／または前記モノクローナル抗体がＰＳＡエピトープを認識する、請求項５６に記載の方法。
【請求項６３】
前記腫瘍関連抗原がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原である時、かつ存在する場合、前記抗原結合ドメインがＨＰＶ抗原に結合される、および／または前記モノクローナル抗体がＨＰＶエピトープを認識する、請求項５６に記載の方法。
【請求項６４】
前記腫瘍関連抗原がキメラｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原である時、かつ存在する場合、前記抗原結合ドメインがキメラｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原ドメインに結合される、および／または前記モノクローナル抗体がｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原を認識する、請求項５６に記載の方法。
【請求項６５】
前記組み換え型リステリア株が弱毒化されている、請求項３９〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記弱毒化リステリアが少なくとも１つの内因性遺伝子内に突然変異を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記突然変異が不活性化、切断、欠失、置換または分裂を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記内因性遺伝子がＡｃｔＡ病毒性遺伝子、ｐｒｆＡ病毒性遺伝子、ｄａｌ遺伝子、ｉｎｌＢ遺伝子、ｄａｔ遺伝子またはその組み合わせである、請求項６６〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記内因性遺伝子が前記ｄａｌ／ｄａｔおよびＡｃｔＡ遺伝子を含む、請求項６６〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
第１のオープンリーディングフレームを含む前記核酸が、第２のオープンリーディングフレームをさらに含む、請求項６６〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記第２のオープンリーディングフレームがＤ１３３Ｖ突然変異を含むｐｒｆＡタンパク質をコードし、また前記ｐｒｆＡタンパク質が前記ｐｒｆＡ遺伝子内の前記突然変異を補完する、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
前記第２のオープンリーディングフレームが代謝酵素をコードし、また前記代謝酵素が前記ｄａｌおよびｄａｔ遺伝子内の前記突然変異、欠失、分裂、不活性化、置換、または切断を補完する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記第２のオープンリーディングフレームによってコードされた前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
アジュバントをさらに含む、請求項３９〜７３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７５】
前記アジュバントが、顆粒球性／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、またはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
リステリア追加的な活性薬剤を含む前記組成物が、前記組み換え型弱毒化リステリア株を含む前記組成物の投与の前に、それと同時に、またはその後で投与される、請求項４０〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記標的放射線療法が、ナノ粒子、ミクロスフェア、ウイルスまたは抗体、またはその任意の組み合わせを含む、標的化送達システムの使用を含む、請求項４０〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記標的放射線療法が、前記組成物の投与の前に、それと同時に、またはその後で投与される、請求項４０〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＣＡＲ  Ｔ細胞が、自己または単一供給源のＨＬＡでマスクされたＣＡＲ  Ｔ細胞である、請求項４０〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記免疫応答がインターフェロンガンマ産生細胞のレベルを増加することを含む、請求項４０〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記免疫応答がＴエフェクター細胞による腫瘍浸潤の増加を含む、請求項４０〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記Ｔエフェクター細胞がＣＤ４５＋ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｆｏｘ３Ｐ−Ｔ細胞である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記免疫応答が脾臓および腫瘍微小環境内での制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の頻度の減少を含む、請求項４０〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記免疫応答が、脾臓および腫瘍微小環境内での骨髄系由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の頻度の減少を含む、請求項４０〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記方法が、対象の切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ配列ペプチド  切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ配列ペプチドにおける、腫瘍媒介免疫抑制の阻害を含む、請求項４０〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記方法が、対象の切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ配列ペプチド  切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ配列ペプチドにおける腫瘍またはガンの治療を含む、請求項４０〜８４のいずれか１項に記載の方法。前記腫瘍が胸部腫瘍、頭頸部腫瘍、子宮頸部腫瘍、前立腺腫瘍である、請求項８５〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記ガンが乳ガン、頭頸部ガン、子宮頸ガン、前立腺ガン、肛門ガン、食道ガン、肺ガン、メラノーマ、または卵巣ガンである、請求項８５〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、腫瘍関連抗原に融合された切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ配列ペプチドの融合タンパク質を含む生きた弱毒化組み換え型リステリア株を含む組成物の使用を含む併用療法を対象とするもので、ここで組成物はさらに追加的な活性薬剤を含むかまたはそれと共に同時投与される。本開示はさらに、腫瘍の治療、腫瘍に対する保護、および／または腫瘍に対する免疫応答の誘発のために、生きた弱毒化組み換え型リステリア菌株を含むこれらの組成物を、標的放射線療法と併せて使用する併用療法を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）は、リステリア症の原因となるグラム陽性の通性細胞内病原体である。宿主細胞に侵入すると、Ｌｍは、血管膜を溶解し、細胞質の中に入ることを可能にして、そこで複製してアクチン重合化タンパク質（ＡｃｔＡ）の移動度に基づいて隣接する細胞に拡散する孔形成タンパク質、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）の生成を通してファゴリソソームから脱出しうる。細胞質内では、Ｌｍ−分泌タンパク質はプロテアソームによって分解され、そして小胞体内のＭＨＣクラスＩ分子と関連するペプチドへと処理される。この特有の特徴により、これは大変魅力的ながん免疫療法的ベクターとされ、この中で腫瘍抗原は腫瘍に特異的な細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を活性化するためにＭＨＣクラスＩ分子を提示されうる。
【０００３】
さらに、いったん貪食されると、その後ＬｍはＬｍ特異的ＣＤ４−Ｔ細胞応答の活性化用のＭＨＣクラスＩＩ上に提供されたファゴリソソーム区画およびペプチド内で処理されうる。あるいは、Ｌｍは、ファゴソームを逃れてサイトゾルに入ることがあり、そこで核オリゴマー形成ドメイン様受容体によるペプチドグリカンの認識、およびＤＮＡセンサー（ＡＩＭ２）によるＬｍ  ＤＮＡが、炎症カスケードを活性化する。この炎症性応答とＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩ経路への抗原の効率的な送達との組み合わせは、Ｌｍを腫瘍の治療、腫瘍に対する保護、および腫瘍に対する免疫応答の誘発における強力な免疫療法的ベクターとしている。
【０００４】
ところが、腫瘍細胞は免疫抑制微小環境を誘発することがよくあり、骨髄由来抑制細胞および制御性Ｔ細胞など、免疫抑制の免疫細胞母集団の発生を助ける。腫瘍による免疫調節の複雑さを理解することは、免疫療法の発展にとって重要である。抗腫瘍免疫応答を高め、「免疫チェックポイント」を克服するための様々な戦略が開発中である。さらに、組み合わせ免疫療法の投与はより有効かつ持続的な応答を提供しうる。
【０００５】
例えば、腫瘍媒介性免疫抑制のいくつかの機構のうちの１つは、腫瘍によるＴ細胞共阻害分子の発現である。それらのリガンドに結合すると、これらの分子は末梢内および腫瘍微小環境内のエフェクターリンパ球を抑制することができる。
【０００６】
現在のところ、腫瘍の成長およびガンを除去することができる腫瘍標的化方法のための効果的な併用療法を提供する必要性が依然としてある。本開示は、リステリアベースの免疫療法を、腫瘍溶解性ウイルス、キメラ抗原受容体改変細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）、治療的または免疫調節性モノクローナル抗体、標的チミジンキナーゼ阻害剤、および／または改変Ｔ細胞受容体を組み込みうる養子移入細胞などの活性薬剤の添加を含む、様々な療法と組み合わせて、それがさらに標的放射線療法などの追加的な療法と組み合わせて使用されうるものを提供することによって、この必要性に対処する。
【０００７】
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は、インビボでがん細胞に優先的に感染して殺すように選択または改変された自己増幅性生物治療剤である。アデノウイルス、レオウイルス、アルファウイルス、単純ヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、コクサッキーＢウイルス、コクサッキーＡ２１ウイルス、シンドビスウイルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、水疱性口炎ウイルス、粘液腫ウイルス、ワクシニアウイルスおよびその他のポックスウイルス、センダイウイルス、およびインフルエンザウイルスを含む、多数のウイルス種から生成される。ＯＶは、突然変異および後成的再プログラミングを含む遺伝的摂動によって発生するがん関連の細胞欠陥を利用する。何よりも、これらの細胞欠陥は、機能障害性抗ウイルス応答および免疫回避、細胞増殖および代謝の増大、および漏出性の腫瘍血管系につながる。これらの特性はさらに、ウイルス複製およびその後の腫瘍細胞溶解のための肥沃な下地を提供し、正常な細胞に対して無害な遺伝学的弱毒化ＯＶの繁殖を許容する。
【０００８】
がん細胞を直接殺すことに加え、ＯＶは強力な抗腫瘍免疫応答をも誘発する。感染した腫瘍細胞は炎症促進性サイトカインの放出を誘発し、かつウイルスおよび腫瘍の両方に関連した抗原を巡回中の免疫細胞に晒し、抗原提示細胞の分化およびＴ細胞の活性化を促進する。これらの応答を誘発するためにどれだけの腫瘍感染および溶解が必要かは依然として議論の的であるが、直接的な腫瘍溶解および抗腫瘍免疫性活性化の組み合わせが、ガンの前臨床マウスモデルにおける耐久性のある治癒につながる可能性があることは明らかである。
【０００９】
別の免疫療法標的化アプローチには、患者の自己免疫細胞をその腫瘍を認識して攻撃するように改変することが関与する。このアプローチは、養子細胞移入としてもよく知られている。例えば、当該技術で周知の組み換え型技術を使用すると、Ｔ細胞上に提示された受容体は、選択された特異性を持つように改変された両方のポリペプチド鎖を持ちうる（受容体改変Ｔ細胞）。一定の例では、Ｔ細胞はキメラ抗原受容体を持つように改変され、そこで、一方のポリペプチド鎖はＴ細胞受容体に由来し、他方のポリペプチド鎖は抗体に由来する。これらの細胞は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）として知られている。養子細胞移入には、改変受容体を含むＴ細胞の投与が関与し、ここで、細胞は受容体改変Ｔ細胞またはＣＡＲ  Ｔ細胞を含みうるが、それぞれの改変は、その表面上に特殊の受容体、すなわち改変Ｔ細胞受容体、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と呼ばれるキメラＴ細胞受容体のいずれかを生成する。ＣＡＲは、Ｔ細胞が腫瘍細胞上の特異的タンパク質抗原を認識するようにするタンパク質である。ＣＡＲ  Ｔ細胞は患者に投与されるが、ここでこれらの改変Ｔ細胞はその表面上に特異的抗原を有するガン細胞を認識して殺すことができる。ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与およびリステリアベースの免疫療法の併用療法は、腫瘍増殖およびガンを除去する別の療法を提供しうる。これらの２つの治療を実施するための投与量および予定を最適化する必要性が残っている。本開示は、この必要性に、リステリアベースの免疫療法と、標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞投与との組み合わせを提供することでさらに対処する。
【００１０】
別の免疫療法標的化アプローチには、ガン細胞の表面上にある抗原発現を特異的に標的化するように開発されたモノクローナル抗体の使用が関与する。免疫寛容により、ヒトの免疫系は、必ずしも外来性標的としてガン細胞を認識しない。モノクローナル抗体は、ガン細胞の表面上にある抗原に付着するように向けることができる。このように、抗体はガン細胞に印をつけて、免疫系が見つけやすいようにする。あるいは、増殖信号を標的化する抗体は、腫瘍が増殖しないかまたは小さいままに残るように、腫瘍への血液供給の防止に役立ちうる。既に確立された血管網を持つ腫瘍の場合には、増殖信号を遮断することで、血管の死および腫瘍の縮小の原因となりうる。治療的および／または免疫調節性抗体の投与およびリステリアベースの免疫療法の併用療法は、腫瘍増殖およびガンを除去する別の療法を提供しうる。これらの２つの治療を実施するための投与量および予定を最適化する必要性が残っている。本開示は、リステリアベースの免疫療法と、治療的および／または免疫調節性抗体の投与との組み合わせを提供することで、この必要性にさらに対処する。
【００１１】
別の免疫療法標的化アプローチは、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）抗がん療法の実施である。ＴＫＩは、体内でのチロシンキナーゼ酵素の活性を阻害する化学物質である。よく、チロシンキナーゼは腫瘍の増殖および転移に役立つ活性を提供する。したがって、ＴＫＩの組み込みは、ガンの増殖および伝搬を阻止しうる。ＴＫＩの投与およびリステリアの併用療法は、腫瘍増殖およびガンを除去する別の療法を提供しうる。これらの２つの治療を実施するための投与量および予定を最適化する必要性が残っている。本開示は、リステリアベースの免疫療法と、ＴＫＩ投与との組み合わせを提供することで、この必要性にさらに対処する。
【００１２】
抗腫瘍性応答を誘発する標的放射線療法（ＲＴ）の能力を明らかにする証拠が最近になって現れ、ＲＴをリステリアベースの免疫療法と組み合わせて腫瘍特異的免疫性を促進する潜在的な併用療法を示唆している。ＲＴおよびＬｍワクチン療法はそれぞれ抗腫瘍免疫の異なる側面を誘発するため、これらの療法の組み合わせは、腫瘍内の活性化されたＴ細胞、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞の数およびエフェクター分子レベル（インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）およびグランザイムＢ）の全体的な増加につながりうる。これらの２つの治療を実施するための投与量および予定を最適化する必要性が残っている。本開示は、リステリアベースの免疫療法と、  標的放射線療法との組み合わせを提供することで、この必要性にさらに対処する。
【００１３】
ガンを含むある一定の疾患の複雑な性質を考えると、その治療において組み合わせられたアプローチの必要性が存在する。以下の本発明を実施するための形態に示されるように、これらの併用療法は免疫療法の全体的な抗腫瘍有効性を改善しうる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
一態様では、本発明は、核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物に関し、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴ配列ペプチドを含み、前記組成物はさらに追加的な活性薬剤を含む。
【００１５】
関連する態様では、本開示は、被験者内で腫瘍媒介性免疫抑制を阻害する方法に関連し、前記方法は核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む有効量の免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ配列ペプチドを含み、
（ａ）前記組成物はさらに、追加的な活性薬剤を含むか、
（ｂ）前記方法はさらに、追加的な活性薬剤を含む有効量の組成物を前記被験者に投与する工程を含むか、または
（ｃ）前記方法はさらに、標的放射線療法を前記被験者に実施する工程を含むか、または
（ａ）〜（ｃ）の任意の組み合わせである。
【００１６】
関連する別の態様では、本開示は、被験者内で強化された抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘発する方法に関連し、前記方法は核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む有効量の免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ配列ペプチドを含み、
（ａ）前記組成物はさらに、追加的な活性薬剤を含むか、
（ｂ）前記方法はさらに、追加的な活性薬剤を含む有効量の組成物を前記被験者に投与する工程を含むか、または
（ｃ）前記方法はさらに、標的放射線療法を前記被験者に実施する工程を含むか、または（ａ）〜（ｃ）の任意の組み合わせである。
【００１７】
関連する別の態様では、本開示は、被験者内で腫瘍またはガンを治療する方法に関連し、前記方法は核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む有効量の免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ配列ペプチドを含み、
（ａ）前記組成物はさらに、追加的な活性薬剤を含むか、
（ｂ）前記方法はさらに、追加的な活性薬剤を含む有効量の組成物を前記被験者に投与する工程を含むか、または
（ｃ）前記方法はさらに、標的放射線療法を前記被験者に実施する工程を含むか、または
（ａ）〜（ｃ）の任意の組み合わせである。
【００１８】
関連する別の態様では、本明細書で開示した追加的な活性薬剤は、腫瘍溶解性ウイルス、Ｔ細胞受容体改変Ｔ細胞（受容体改変Ｔ細胞）、キメラ抗原受容体改変Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）、治療的または免疫調節性モノクローナル抗体、標的化チミジンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、もしくは改変Ｔ細胞受容体を組み込んだ養子移入細胞、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
本開示に関する主題は、本明細書の結論部分に特定的に指摘され、かつ明瞭に主張されている。しかしながら、本開示の構成および運用方法の両方については、その目的、特徴、および利点とともに、添付図面と併せて読んだとき、以下の発明を実施するための形態を参照することによって最も良好に理解され得る。
【００２０】
【図１】（図１Ａ）ｋｌｋ３統合およびＡｃｔＡ欠失の後でのＬｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３の染色体領域の概略図を示す。（図１Ｂ）ｋｌｋ３遺伝子がＬｍｄｄおよびＬｍｄｄＡ染色体に統合されている。ｋｌｋ３特異的プライマーを使用した、それぞれの構築体からの染色体ＤＮＡ調製物からのＰＣＲでは、ｋｌｋ３遺伝子に対応する７１４  ｂｐの帯域が増幅され、野生型タンパク質の分泌シグナル配列が欠失している。
【図２】（図２Ａ）ｐＡＤＶ１３４プラスミドのマップである。（図２Ｂ）ＬｍｄｄＡ−１３４培養上清からのタンパク質を沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＬＬＯ−Ｅ７タンパク質が抗Ｅ７モノクローナル抗体を使用したウエスタンブロットにより検出された。抗原発現カセットは、ｈｌｙプロモーター、切断ＬＬＯのためのＯＲＦおよびヒトＰＳＡ遺伝子（ｋｌｋ３）から構成される。（図２Ｃ）ｐＡＤＶ１４２プラスミドのマップである。（図２Ｄ）抗ＰＳＡおよび抗ＬＬＯ抗体を使用してＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の発現を示したウエスタンブロットである。
【図３】（図３Ａ）選択圧のある場合とない場合とで培養した場合の、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのインビトロでのプラスミド安定性を示す（Ｄ−アラニン）。株および培養条件が先にリストされ、ＣＦＵ決定に使用されたプレートが後でリストされている。（図３Ａ）インビボでのＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの除去、およびこの間の潜在的なプラスミド損失を評価したものである。細菌は静脈内に注入され、示された時点で脾臓から隔離された。ＣＦＵは、ＢＨＩおよびＢＨＩ＋Ｄ−アラニンの各プレート上で決定された。
【図４】（図４Ａ）１０８のＣＦＵをＣ５７ＢＬ／６マウスに投与した後での、株ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのインビボでの除去を示す。ＣＦＵの数は、ＢＨＩ／ｓｔｒプレート上でのプレーティングにより決定された。この方法での検出限界は１００  ＣＦＵであった。（図４Ａ）１０４０３Ｓ、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡおよびＸＦＬ７菌株を用いたＪ７７４細胞の細胞感染アッセイ。
【図５−１】（図５Ａ）ブースター投与後６日目における無処置およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化マウスの脾細胞内のＰＳＡ四量体特異的な細胞を示す。（図５Ｂ）無処置およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化マウスの脾細胞内のＩＦＮ−γについての細胞内サイトカイン染色が、ＰＳＡペプチドで５ｈにわたり刺激された。異なるエフェクター／標的比での、カスパーゼをベースにしたアッセイ（図５Ｃ）およびユーロピウムをベースにしたアッセイ（図５Ｄ）を使用して、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化マウスおよび無処置マウスからのインビトロで刺激したエフェクターＴ細胞を含むＰＳＡペプチドでパルスしたＥＬ４細胞の特異的溶解である。ＰＳＡペプチドの存在下またはペプチドなし（図５Ｅ）で、刺激後２４時間にわたり取得した、無処置および免疫化の脾細胞内のＩＦＮγスポット数。
【図５−２】（図５Ａ）ブースター投与後６日目における無処置およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化マウスの脾細胞内のＰＳＡ四量体特異的な細胞を示す。（図５Ｂ）無処置およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化マウスの脾細胞内のＩＦＮ−γについての細胞内サイトカイン染色が、ＰＳＡペプチドで５ｈにわたり刺激された。異なるエフェクター／標的比での、カスパーゼをベースにしたアッセイ（図５Ｃ）およびユーロピウムをベースにしたアッセイ（図５Ｄ）を使用して、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化マウスおよび無処置マウスからのインビトロで刺激したエフェクターＴ細胞を含むＰＳＡペプチドでパルスしたＥＬ４細胞の特異的溶解である。ＰＳＡペプチドの存在下またはペプチドなし（図５Ｅ）で、刺激後２４時間にわたり取得した、無処置および免疫化の脾細胞内のＩＦＮγスポット数。
【図６−１】ＬｍｄｄＡ−１４２での免疫化が、Ｔｒａｍｐ−Ｃ１−ＰＳＡ（ＴＰＳＡ）腫瘍の退行の誘発。マウスは、未処置のまま（ｎ＝８）（図６Ａ）または７日目、１４日目および２１日目にＬｍｄｄＡ−１４２（１×１０８ＣＦＵ／マウス）（ｎ＝８）（図６Ｂ）もしくはＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（ｎ＝８）（図６Ｃ）で腹腔内で免疫化した。腫瘍のサイズが個別の各腫瘍について測定され、および値はミリメートル単位での平均直径で表現している。それぞれの線は個別のマウスを示す。
【図６−２】ＬｍｄｄＡ−１４２での免疫化が、Ｔｒａｍｐ−Ｃ１−ＰＳＡ（ＴＰＳＡ）腫瘍の退行の誘発。マウスは、未処置のまま（ｎ＝８）（図６Ａ）または７日目、１４日目および２１日目にＬｍｄｄＡ−１４２（１×１０８ＣＦＵ／マウス）（ｎ＝８）（図６Ｂ）もしくはＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（ｎ＝８）（図６Ｃ）で腹腔内で免疫化した。腫瘍のサイズが個別の各腫瘍について測定され、および値はミリメートル単位での平均直径で表現している。それぞれの線は個別のマウスを示す。
【図７−１】（図７Ａ）未処置マウスおよびＬｍ対照株またはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（ＬｍｄｄＡ−１４２）のいずれかで免疫化したマウスの脾臓および浸潤性Ｔ−ＰＳＡ−２３腫瘍内のＰＳＡ−四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の分析を示す。（図７Ｂ）未処置マウスおよびＬｍ対照株またはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのいずれかで免疫化したマウスの脾臓および浸潤性Ｔ−ＰＳＡ−２３腫瘍内での、ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋として定義されたＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の分析。
【図７−２】（図７Ａ）未処置マウスおよびＬｍ対照株またはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（ＬｍｄｄＡ−１４２）のいずれかで免疫化したマウスの脾臓および浸潤性Ｔ−ＰＳＡ−２３腫瘍内のＰＳＡ−四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の分析を示す。（図７Ｂ）未処置マウスおよびＬｍ対照株またはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのいずれかで免疫化したマウスの脾臓および浸潤性Ｔ−ＰＳＡ−２３腫瘍内での、ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋として定義されたＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の分析。
【図８】（図８Ａ）ｋｌｋ３統合およびＡｃｔＡ欠失の後でのＬｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３の染色体領域の概略図を示す。（図８Ｂ）ｋｌｋ３遺伝子がＬｍｄｄおよびＬｍｄｄＡ染色体に統合されている。ｋｌｋ３特異的プライマーを使用した各構築体からの染色体ＤＮＡ調製物からのＰＣＲでは、ｋｌｋ３遺伝子に対応する７６０  ｂｐの帯域が増幅されている。
【図９】（図９Ａ）Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３がＬＬＯ−ＰＳＡタンパク質を分泌することを示す。細菌培養上清からのタンパク質を沈殿させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離させ、抗ＬＬＯおよび抗ＰＳＡ抗体を使用してウエスタンブロットにより検出したＬＬＯおよびＬＬＯ−ＰＳＡタンパク質。（図９Ｂ）Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３により生成されたＬＬＯでは溶血活性が保持された。ヒツジ赤血球が細菌培養上清の段階希釈で培養され、溶血活性が５９０ｎｍでの吸光度により測定された。（図９Ｂ）Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３がマクロファージ様のＪ７７４細胞内部で成長した。Ｊ７７４細胞が、ゲンタマイシン治療によって細胞外細菌を殺した後１時間にわたり、細菌と共に培養された。表示した時点で獲得したＪ７７４溶菌液の段階希釈のプレーティングにより、細胞内増殖が測定された。これらの実験でＬｍ  １０４０３Ｓが対照として使用された。
【図１０】Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３でのマウスの免疫化がＰＳＡ特異的な免疫応答を誘発する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスが、１×１０８ＣＦＵのＬｍｄｄ−１４３、ＬｍｄｄＡ−１４３またはＬｍｄｄＡ−１４２で１週間間隔で２回免疫化され、７日後に脾臓が収穫された。脾細胞が、モネンシンの存在下で、１  μＭのＰＳＡ６５−７４ペプチドで、５時間にわたり刺激された。細胞はＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ６２Ｌおよび細胞内ＩＦＮ−γについて染色され、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ血球計算器で分析された。
【図１１】腫瘍内でのＭＤＳＣおよびＴｒｅｇの減少を示す。Ｌｍワクチン接種（ＬｍｄｄＡＰＳＡおよびＬｍｄｄＡＥ７）の後に続く、右側パネル上のＭＤＳＣの数および左側パネル上のＴｒｅｇの数。
【図１２−１】リステリアワクチン接種後、ＴＰＳＡ２３腫瘍（ＰＳＡ発現腫瘍）からの単球性ＭＤＳＣがより抑制的でなくなることを実証する抑制因子アッセイデータを示す。ＰＳＡ抗原特異的なＴ細胞および非特異的に刺激されているＴ細胞でも同一の抑制減少が見られるので、ＭＤＳＣの抑制能力の変化は抗原特異的ではない。図１２Ａおよび図１２Ｂでは、ホルボールミリステートアセテートおよびイオノマイシン（ＰＭＡ／Ｉ）は非特異的な刺激を表す。図１２Ｃおよび図１２Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図１２Ａおよび図１２Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図１２Ｂおよび図１２Ｄは、プールした分裂サイクルを示す。
【図１２−２】リステリアワクチン接種後、ＴＰＳＡ２３腫瘍（ＰＳＡ発現腫瘍）からの単球性ＭＤＳＣがより抑制的でなくなることを実証する抑制因子アッセイデータを示す。ＰＳＡ抗原特異的なＴ細胞および非特異的に刺激されているＴ細胞でも同一の抑制減少が見られるので、ＭＤＳＣの抑制能力の変化は抗原特異的ではない。図１２Ａおよび図１２Ｂでは、ホルボールミリステートアセテートおよびイオノマイシン（ＰＭＡ／Ｉ）は非特異的な刺激を表す。図１２Ｃおよび図１２Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図１２Ａおよび図１２Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図１２Ｂおよび図１２Ｄは、プールした分裂サイクルを示す。
【図１３−１】リステリアが脾臓の単球性ＭＤＳＣには効果がなく、またこれらは単に抗原特異的な様式で抑制的であるのにすぎないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図１３Ａおよび図１３Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図１３Ｃおよび図１３Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図１３Ａおよび図１３Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図１３Ｂおよび図１３Ｄは、プールした分裂サイクルを示す。
【図１３−２】リステリアが脾臓の単球性ＭＤＳＣには効果がなく、またこれらは単に抗原特異的な様式で抑制的であるのにすぎないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図１３Ａおよび図１３Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図１３Ｃおよび図１３Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図１３Ａおよび図１３Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図１３Ｂおよび図１３Ｄは、プールした分裂サイクルを示す。
【図１４−１】リステリアワクチン接種の後、腫瘍からの顆粒球性のＭＤＳＣがＴ細胞を抑制する能力の減少を有することを実証する抑制因子アッセイデータを示す。ＰＳＡ抗原特異的なＴ細胞および非特異的に刺激されているＴ細胞でも同一の抑制減少が見られるので、ＭＤＳＣの抑制能力の変化は抗原特異的ではない。図１４Ａおよび図１４Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図１４Ｃおよび図１４Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図１４Ａおよび図１４Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図１４Ｂおよび図１４Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図１４−２】リステリアワクチン接種の後、腫瘍からの顆粒球性のＭＤＳＣがＴ細胞を抑制する能力の減少を有することを実証する抑制因子アッセイデータを示す。ＰＳＡ抗原特異的なＴ細胞および非特異的に刺激されているＴ細胞でも同一の抑制減少が見られるので、ＭＤＳＣの抑制能力の変化は抗原特異的ではない。図１４Ａおよび図１４Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図１４Ｃおよび図１４Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図１４Ａおよび図１４Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図１４Ｂおよび図１４Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図１５−１】リステリアが脾臓の顆粒球性ＭＤＳＣには効果がなく、またこれらは単に抗原特異的な様式でのみ抑制的であることを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図１５Ａおよび図１５Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図１５Ｃおよび図１５Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図１５Ａおよび図１５Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図１５Ｂおよび図１５Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図１５−２】リステリアが脾臓の顆粒球性ＭＤＳＣには効果がなく、またこれらは単に抗原特異的な様式でのみ抑制的であることを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図１５Ａおよび図１５Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図１５Ｃおよび図１５Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図１５Ａおよび図１５Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図１５Ｂおよび図１５Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図１６−１】腫瘍からのＴｒｅｇがまだ抑制的であることを実証する抑制因子アッセイデータを示す。この腫瘍モデルでは、非抗原特異的な様式でのＴｒｅｇの抑制能力にはわずかに減少がある。図１６Ａおよび図１６Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図１６Ｃおよび図１６Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。Ｔｒｅｇの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＴｒｅｇ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図１６Ａおよび図１６Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図１６Ｂおよび図１６Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図１６−２】腫瘍からのＴｒｅｇがまだ抑制的であることを実証する抑制因子アッセイデータを示す。この腫瘍モデルでは、非抗原特異的な様式でのＴｒｅｇの抑制能力にはわずかに減少がある。図１６Ａおよび図１６Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図１６Ｃおよび図１６Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。Ｔｒｅｇの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＴｒｅｇ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図１６Ａおよび図１６Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図１６Ｂおよび図１６Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図１７−１】脾臓のＴｒｅｇがまだ抑制的であることを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図１７Ａおよび図１７Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図１７Ｃおよび図１７Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。Ｔｒｅｇの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＴｒｅｇ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図１７Ａおよび図１７Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図１７Ｂおよび図１７Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図１７−２】脾臓のＴｒｅｇがまだ抑制的であることを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図１７Ａおよび図１７Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図１７Ｃおよび図１７Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。Ｔｒｅｇの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＴｒｅｇ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図１７Ａおよび図１７Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図１７Ｂおよび図１７Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図１８−１】それらがマウスの腫瘍で見出されたのか、または脾臓で見出されたのかに関わらず、従来のＣＤ４＋Ｔ細胞が細胞分裂には効果がないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図１８Ａおよび図１８Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図１８Ｃおよび図１８Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。Ｔｒｅｇの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＴｒｅｇ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図１８Ｃ〜図１８Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分からのデータを示す。
【図１８−２】それらがマウスの腫瘍で見出されたのか、または脾臓で見出されたのかに関わらず、従来のＣＤ４＋Ｔ細胞が細胞分裂には効果がないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図１８Ａおよび図１８Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図１８Ｃおよび図１８Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。Ｔｒｅｇの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＴｒｅｇ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図１８Ｃ〜図１８Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分からのデータを示す。
【図１９−１】リステリアワクチン接種後、４Ｔ１腫瘍（Ｈｅｒ２発現腫瘍）からの単球性ＭＤＳＣが、抑制能力の減少を有することを実証する抑制因子アッセイデータを示す。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原特異的なＴ細胞および非特異的に刺激されているＴ細胞でも同一の抑制減少が見られるので、ＭＤＳＣの抑制能力の変化は抗原特異的ではない。図１９Ａおよび図１９Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図１９Ｃおよび図１９Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図１９Ａおよび図１９Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図１９Ｂおよび図１９Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図１９−２】リステリアワクチン接種後、４Ｔ１腫瘍（Ｈｅｒ２発現腫瘍）からの単球性ＭＤＳＣが、抑制能力の減少を有することを実証する抑制因子アッセイデータを示す。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原特異的なＴ細胞および非特異的に刺激されているＴ細胞でも同一の抑制減少が見られるので、ＭＤＳＣの抑制能力の変化は抗原特異的ではない。図１９Ａおよび図１９Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図１９Ｃおよび図１９Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図１９Ａおよび図１９Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図１９Ｂおよび図１９Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２０−１】脾臓の単球性ＭＤＳＣにはリステリア特異的な効果がないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図２０Ａおよび図２０Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図２０Ｃおよび図２０Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図２０Ａおよび図２０Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図２０Ｂおよび図２０Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２０−２】脾臓の単球性ＭＤＳＣにはリステリア特異的な効果がないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図２０Ａおよび図２０Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図２０Ｃおよび図２０Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図２０Ａおよび図２０Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図２０Ｂおよび図２０Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２１−１】リステリアワクチン接種後、４Ｔ１腫瘍（Ｈｅｒ２発現腫瘍）からの顆粒球性ＭＤＳＣが、抑制能力の減少を有することを実証する抑制因子アッセイデータを示す。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原特異的なＴ細胞および非特異的に刺激されているＴ細胞でも同一の抑制減少が見られるので、ＭＤＳＣの抑制能力の変化は抗原特異的ではない。図２１Ａおよび図２１Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図２１Ｃおよび図２１Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図２１Ａおよび図２１Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図２１Ｂおよび図２１Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２１−２】リステリアワクチン接種後、４Ｔ１腫瘍（Ｈｅｒ２発現腫瘍）からの顆粒球性ＭＤＳＣが、抑制能力の減少を有することを実証する抑制因子アッセイデータを示す。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原特異的なＴ細胞および非特異的に刺激されているＴ細胞でも同一の抑制減少が見られるので、ＭＤＳＣの抑制能力の変化は抗原特異的ではない。図２１Ａおよび図２１Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図２１Ｃおよび図２１Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図２１Ａおよび図２１Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図２１Ｂおよび図２１Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２２−１】脾臓の顆粒球性ＭＤＳＣにはリステリア特異的な効果がないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図２２Ａおよび図２２Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図２２Ｃおよび図２２Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図２２Ａおよび図２２Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図２２Ｂおよび図２２Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２２−２】脾臓の顆粒球性ＭＤＳＣにはリステリア特異的な効果がないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図２２Ａおよび図２２Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図２２Ｃおよび図２２Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図２２Ａおよび図２２Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図２２Ｂおよび図２２Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２３−１】リステリアワクチン接種後、４Ｔ１腫瘍（Ｈｅｒ２発現腫瘍）からのＴｒｅｇの抑制能力の減少を有することを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図２３Ａおよび図２３Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図２３Ｃおよび図２３Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。この減少は、Ｔｒｅｇの抑制能力の変化はＨｅｒ２／ｎｅｕ特異的なレスポンダーＴ細胞と非特異的なレスポンダーＴ細胞との両方で見られるので、抗原特異的ではない。図２３Ａおよび図２３Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図２３Ｂおよび図２３Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２３−２】リステリアワクチン接種後、４Ｔ１腫瘍（Ｈｅｒ２発現腫瘍）からのＴｒｅｇの抑制能力の減少を有することを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図２３Ａおよび図２３Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図２３Ｃおよび図２３Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。この減少は、Ｔｒｅｇの抑制能力の変化はＨｅｒ２／ｎｅｕ特異的なレスポンダーＴ細胞と非特異的なレスポンダーＴ細胞との両方で見られるので、抗原特異的ではない。図２３Ａおよび図２３Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図２３Ｂおよび図２３Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２４−１】脾臓のＴｒｅｇにはリステリアに特異的な効果がないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。レスポンダーＴ細胞は、抗原特異的であるかどうかに関わらず、すべてが分裂の能力を有する。図２４Ａおよび図２４Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図２４Ｃおよび図２４Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。図２４Ａおよび図２４Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図２４Ｂおよび図２４Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２４−２】脾臓のＴｒｅｇにはリステリアに特異的な効果がないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。レスポンダーＴ細胞は、抗原特異的であるかどうかに関わらず、すべてが分裂の能力を有する。図２４Ａおよび図２４Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図２４Ｃおよび図２４Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。図２４Ａおよび図２４Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図２４Ｂおよび図２４Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２５−１】顆粒球性ＭＤＳＣの抑制能力がｔＬＬＯの過剰発現に起因し、融合抗原の組合せとは関係が無いことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。左側のパネル（図２５Ａおよび図２５Ｃ）は、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。右側のパネル（図２５Ｂおよび図２５Ｄ）は、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２５−２】顆粒球性ＭＤＳＣの抑制能力がｔＬＬＯの過剰発現に起因し、融合抗原の組合せとは関係が無いことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。左側のパネル（図２５Ａおよび図２５Ｃ）は、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。右側のパネル（図２５Ｂおよび図２５Ｄ）は、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２６−１】単球性ＭＤＳＣの抑制能力もｔＬＬＯの過剰発現に起因し、融合抗原の組み合わせとは関係が無いことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。左側のパネル（図２６Ａおよび図２６Ｃ）は、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。右側のパネル（図２６Ｂおよび図２６Ｄ）は、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２６−２】単球性ＭＤＳＣの抑制能力もｔＬＬＯの過剰発現に起因し、融合抗原の組み合わせとは関係が無いことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。左側のパネル（図２６Ａおよび図２６Ｃ）は、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。右側のパネル（図２６Ｂおよび図２６Ｄ）は、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２７−１】Ｌｍワクチン接種の後、脾臓から精製された顆粒球性のＭＤＳＣがその抗原特異的なレスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力を保持することを実証する抑制因子アッセイデータを示す（図２７Ａおよび図２７Ｂ）。しかしながら、非特異的な刺激後、活性化したＴ細胞（ＰＭＡ／イオノマイシンを用いて）は、依然として分裂の能力を有している（図２７Ｃおよび図２７Ｄ）。左側のパネルは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。右側のパネルは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２７−２】Ｌｍワクチン接種の後、脾臓から精製された顆粒球性のＭＤＳＣがその抗原特異的なレスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力を保持することを実証する抑制因子アッセイデータを示す（図２７Ａおよび図２７Ｂ）。しかしながら、非特異的な刺激後、活性化したＴ細胞（ＰＭＡ／イオノマイシンを用いて）は、依然として分裂の能力を有している（図２７Ｃおよび図２７Ｄ）。左側のパネルは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。右側のパネルは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２８−１】Ｌｍワクチン接種の後、脾臓から精製された単球性のＭＤＳＣがその抗原特異的なレスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力を保持することを実証する抑制因子アッセイデータを示す（図２８Ａおよび図２８Ｂ）。しかしながら、非特異的な活性化（ＰＭＡ／イオノマイシンによって刺激された）後、Ｔ細胞は、依然として分裂の能力を有している（図２８Ｃおよび図２８Ｄ）。左側のパネルは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。右側のパネルは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２８−２】Ｌｍワクチン接種の後、脾臓から精製された単球性のＭＤＳＣがその抗原特異的なレスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力を保持することを実証する抑制因子アッセイデータを示す（図２８Ａおよび図２８Ｂ）。しかしながら、非特異的な活性化（ＰＭＡ／イオノマイシンによって刺激された）後、Ｔ細胞は、依然として分裂の能力を有している（図２８Ｃおよび図２８Ｄ）。左側のパネルは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。右側のパネルは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２９−１】レスポンダー細胞が抗原特異的（図２９Ａおよび図２９Ｂ）に活性化されるか、または非特異的（図２９Ｃおよび図２９Ｄ）に活性化されるかに関わらず、Ｌｍで処置した群のいずれかの腫瘍から精製したＴｒｅｇのレスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力がわずかに減退したことを実証するための抑制因子アッセイデータを示す。左側のパネルは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。右側のパネルは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２９−２】レスポンダー細胞が抗原特異的（図２９Ａおよび図２９Ｂ）に活性化されるか、または非特異的（図２９Ｃおよび図２９Ｄ）に活性化されるかに関わらず、Ｌｍで処置した群のいずれかの腫瘍から精製したＴｒｅｇのレスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力がわずかに減退したことを実証するための抑制因子アッセイデータを示す。左側のパネルは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。右側のパネルは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図３０−１】脾臓から精製したＴｒｅｇがまだ抗原特異的（図３０Ａ〜図３０Ｂ）、および非特異的（図３０Ｃおよび図３０Ｄ）の両方で活性化したレスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力を有することを実証する抑制因子アッセイデータを示す。
【図３０−２】脾臓から精製したＴｒｅｇがまだ抗原特異的（図３０Ａ〜図３０Ｂ）、および非特異的（図３０Ｃおよび図３０Ｄ）の両方で活性化したレスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力を有することを実証する抑制因子アッセイデータを示す。
【図３１−１】レスポンダー細胞が抗原特異的に活性化した（図３１Ａおよび図３１Ｂ）か、または非特異的に活性化した（図３１Ｃおよび図３１Ｄ）かに関わらず、腫瘍Ｔｃｏｎ細胞がＴ細胞の分裂を抑制する能力を有しないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。
【図３１−２】レスポンダー細胞が抗原特異的に活性化した（図３１Ａおよび図３１Ｂ）か、または非特異的に活性化した（図３１Ｃおよび図３１Ｄ）かに関わらず、腫瘍Ｔｃｏｎ細胞がＴ細胞の分裂を抑制する能力を有しないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。
【図３２−１】レスポンダー細胞が抗原特異的に活性化した（図３２Ａおよび図３２Ｂ）か、または非特異的に活性化した（図３２Ｃおよび図３２Ｄ）かに関わらず、脾臓Ｔｃｏｎ細胞がＴ細胞の分裂を抑制する能力を有しないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。
【図３２−２】レスポンダー細胞が抗原特異的に活性化した（図３２Ａおよび図３２Ｂ）か、または非特異的に活性化した（図３２Ｃおよび図３２Ｄ）かに関わらず、脾臓Ｔｃｏｎ細胞がＴ細胞の分裂を抑制する能力を有しないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。
【図３３−１】ＡＤＸＳ３１−１６４の構築。（図３３Ａ）構造性のリステリアｐ６０プロモーターの制御下で、ＬｍｄｄＡ株内の染色体のｄａｌ−ｄａｔ欠失の相補のために、バシラスサチリスｄａｌ遺伝子を寄生するｐＡｄｖ１６４のプラスミドのマップ。これは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの３つの断片：ＥＣ１（ａａ  ４０−１７０）、ＥＣ２（ａａ  ３５９−５１８）およびＩＣＩ（ａａ  ６７９−８０８）の直接融合によって構造化された、切断ＬＬＯ（１−４４１）のキメラ型ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子への融合も含有する。（図３３Ｂ）抗ＬＬＯ抗体でブロットしたＴＣＡ沈殿した細胞培養上清のウエスタンブロット解析によって、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８）およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（ＡＤＸＳ３１−１６４）内でｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌が検出された。〜１０４  ＫＤの差を示す帯はｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２に対応する。内因性のＬＬＯは、５８  ＫＤ帯として検出される。リステリア対照はＣｈＨｅｒ２発現を欠いている。
【図３３−２】ＡＤＸＳ３１−１６４の構築。（図３３Ａ）構造性のリステリアｐ６０プロモーターの制御下で、ＬｍｄｄＡ株内の染色体のｄａｌ−ｄａｔ欠失の相補のために、バシラスサチリスｄａｌ遺伝子を寄生するｐＡｄｖ１６４のプラスミドのマップ。これは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの３つの断片：ＥＣ１（ａａ  ４０−１７０）、ＥＣ２（ａａ  ３５９−５１８）およびＩＣＩ（ａａ  ６７９−８０８）の直接融合によって構造化された、切断ＬＬＯ（１−４４１）のキメラ型ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子への融合も含有する。（図３３Ｂ）抗ＬＬＯ抗体でブロットしたＴＣＡ沈殿した細胞培養上清のウエスタンブロット解析によって、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８）およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（ＡＤＸＳ３１−１６４）内でｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌が検出された。〜１０４  ＫＤの差を示す帯はｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２に対応する。内因性のＬＬＯは、５８  ＫＤ帯として検出される。リステリア対照はＣｈＨｅｒ２発現を欠いている。
【図３４−１】ＡＤＸＳ３１−１６４の免疫原性特性（図３４Ａ）ＮＴ−２細胞を刺激薬として使用し、かつ３Ｔ３／ｎｅｕ細胞を標的として使用して、免疫化マウスからの脾細胞内でＨＥＲ２／ｎｅｕリステリアベースのワクチンによって引き出された細胞毒性Ｔ細胞応答を試験した。Ｌｍ−対照は、すべてのやり方で同一であるが、無関連の抗原（ＨＰＶ１６−Ｅ７）が発現される、ＬｍｄｄＡバックグラウンドに基づく。（図３４Ｂ）脾細胞によって免疫化ＦＶＢ／Ｎマウスから細胞培地の中へと分泌されたＩＦＮ−ｇが、ＮＴ−２細胞によって処置されたマイトマイシンＣを用いたインビトロの刺激の２４時間後、ＥＬＩＳＡによって測定された。（図３４Ｃ）インビトロでのタンパク質の異なる領域からのペプチドを用いたインキュベーションに応答する、キメラワクチンを用いて免疫化したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスからの脾細胞によるＩＦＮ−ｇ分泌。図の凡例にリスト表示したように、組み換え型ＣｈＨｅｒ２タンパク質が正の対照として使用され、無関連ペプチドまたはペプチドを含まない群が負の対照を構成要素とした。コインキュベーションの７２時間後に採取した細胞培養上清を使用するＥＬＩＳＡアッセイによって、ＩＦＮ−γ分泌が検出された。各々のデータ点は、３倍のデータ＋／−標準誤差の平均であった。＊Ｐ値＜０．００１。
【図３４−２】ＡＤＸＳ３１−１６４の免疫原性特性（図３４Ａ）ＮＴ−２細胞を刺激薬として使用し、かつ３Ｔ３／ｎｅｕ細胞を標的として使用して、免疫化マウスからの脾細胞内でＨＥＲ２／ｎｅｕリステリアベースのワクチンによって引き出された細胞毒性Ｔ細胞応答を試験した。Ｌｍ−対照は、すべてのやり方で同一であるが、無関連の抗原（ＨＰＶ１６−Ｅ７）が発現される、ＬｍｄｄＡバックグラウンドに基づく。（図３４Ｂ）脾細胞によって免疫化ＦＶＢ／Ｎマウスから細胞培地の中へと分泌されたＩＦＮ−ｇが、ＮＴ−２細胞によって処置されたマイトマイシンＣを用いたインビトロの刺激の２４時間後、ＥＬＩＳＡによって測定された。（図３４Ｃ）インビトロでのタンパク質の異なる領域からのペプチドを用いたインキュベーションに応答する、キメラワクチンを用いて免疫化したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスからの脾細胞によるＩＦＮ−ｇ分泌。図の凡例にリスト表示したように、組み換え型ＣｈＨｅｒ２タンパク質が正の対照として使用され、無関連ペプチドまたはペプチドを含まない群が負の対照を構成要素とした。コインキュベーションの７２時間後に採取した細胞培養上清を使用するＥＬＩＳＡアッセイによって、ＩＦＮ−γ分泌が検出された。各々のデータ点は、３倍のデータ＋／−標準誤差の平均であった。＊Ｐ値＜０．００１。
【図３５】リステリア−ＣｈＨｅｒ２／ｎｅｕワクチンのための腫瘍防止研究。Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスに各々組み換え型リステリア−ＣｈＨｅｒ２または対照リステリア株を６回注射した。生後６週で免疫化を開始し、２１週目まで３週ごとに継続した。腫瘍の外観を毎週観察して、腫瘍を有しないマウスのパーセンテージで表現した。＊ｐ＜０．０５、グループ当たりＮ＝９。
【図３６】脾臓中のＴｒｅｇの％で示したＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化の効果。ＦＶＢ／Ｎマウスに１×１０６ＮＴ−２細胞を用いて皮下で接種し、各々のワクチンを用いて一週間間隔で３回免疫化した。第２の免疫化の７日後、脾臓を採取した。免疫細胞の分離後、Ｔｒｅｇの検出のためにこれらを抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦｏｘＰ３抗体によって染色した。代表的な実験からのＴｒｅｇのドットプロットは、異なる治療群の間での全ＣＤ３＋またはＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するパーセンテージとして表されるＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度を示す。
【図３７−１】ＮＴ−２腫瘍内の腫瘍浸潤Ｔｒｅｇの％で示したＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化の効果。ＦＶＢ／Ｎマウスに１×１０６ＮＴ−２細胞を用いて皮下で接種し、各々のワクチンを用いて一週間間隔で３回免疫化した。第２の免疫化の７日後に腫瘍を採取した。免疫細胞の分離後、Ｔｒｅｇの検出のために、抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦｏｘＰ３抗体によってこれらを染色した。（図３７Ａ）代表的な実験からのＴｒｅｇのドットプロット。図３７Ｂ。異なる投与群にわたって全ＣＤ３＋またはＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（左のパネル）、および腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比（右のパネル）に対するパーセンテージとして表される、ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度。データは、２つの独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示される。
【図３７−２】ＮＴ−２腫瘍内の腫瘍浸潤Ｔｒｅｇの％で示したＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化の効果。ＦＶＢ／Ｎマウスに１×１０６ＮＴ−２細胞を用いて皮下で接種し、各々のワクチンを用いて一週間間隔で３回免疫化した。第２の免疫化の７日後に腫瘍を採取した。免疫細胞の分離後、Ｔｒｅｇの検出のために、抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦｏｘＰ３抗体によってこれらを染色した。（図３７Ａ）代表的な実験からのＴｒｅｇのドットプロット。図３７Ｂ。異なる投与群にわたって全ＣＤ３＋またはＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（左のパネル）、および腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比（右のパネル）に対するパーセンテージとして表される、ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度。データは、２つの独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示される。
【図３８−１】ＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種は乳ガン細胞株の脳内での増殖を遅延することができる。Ｂａｌｂ／ｃマウスにＡＤＸＳ３１−１６４または対照リステリア株を用いて３回免疫化した。ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞（５，０００）を麻酔をかけたマウスの頭蓋内に注射した。（図３８Ａ）示された日にＸｅｎｏｇｅｎ  Ｘ−１００  ＣＣＤカメラを使用してマウスのエクスビボ撮像を遂行した。（図３８Ｂ）ピクセルの輝度は、１秒当たり表面積１平方ｃｍ当たりの光子数としてグラフ表示され、平均放射輝度として提示される。（図３８Ｃ）ウエスタンブロットによって、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体を使用して、ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞、４Ｔ１−Ｌｕｃ、およびＮＴ−２細胞株によるＨＥＲ２／ｎｅｕの発現が検出された。Ｊ７７４．Ａ２細胞、マウスのマクロファージ様細胞株を負の対照として使用した。
【図３８−２】ＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種は乳ガン細胞株の脳内での増殖を遅延することができる。Ｂａｌｂ／ｃマウスにＡＤＸＳ３１−１６４または対照リステリア株を用いて３回免疫化した。ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞（５，０００）を麻酔をかけたマウスの頭蓋内に注射した。（図３８Ａ）示された日にＸｅｎｏｇｅｎ  Ｘ−１００  ＣＣＤカメラを使用してマウスのエクスビボ撮像を遂行した。（図３８Ｂ）ピクセルの輝度は、１秒当たり表面積１平方ｃｍ当たりの光子数としてグラフ表示され、平均放射輝度として提示される。（図３８Ｃ）ウエスタンブロットによって、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体を使用して、ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞、４Ｔ１−Ｌｕｃ、およびＮＴ−２細胞株によるＨＥＲ２／ｎｅｕの発現が検出された。Ｊ７７４．Ａ２細胞、マウスのマクロファージ様細胞株を負の対照として使用した。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
図示の単純化および明瞭化のために図に示される要素は必ずしも実寸に比例していないことを理解されたい。例えば、一部の要素の寸法は、明瞭化のために他の要素に対して相対的に誇張されている場合がある。さらに、適切と考えられる場合には、参照番号は対応するかまたは類似する要素を示す図の間で繰り返される場合がある。
【００２２】
以下の発明を実施するための形態では、本開示の完全な理解を提供するために多数の具体的な詳細が示される。しかしながら、本開示はこれらの具体的な詳細を含まずに実施されてもよいことが当業者によって理解されるであろう。他の事例では、本開示を不明瞭にしないために周知の方法、手順、および構成成分は詳細には記述されていない。
【００２３】
本開示は一実施形態において、核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を提供しており、核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴ配列ペプチドを含み、また組成物はさらに追加的な活性薬剤を含む。別の実施形態では、本明細書で開示されている免疫原性組成物に含まれる追加的な活性薬剤は、弱毒化腫瘍溶解性ウイルス、Ｔ細胞受容体改変Ｔ細胞（受容体改変Ｔ細胞）、キメラ抗原受容体改変Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）、治療的または免疫調節性モノクローナル抗体、標的化チミジンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【００２４】
別の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルス、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物が本明細書に開示され、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ配列ペプチドを含む。
【００２５】
一実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞内では消耗可能であるが正常な細胞ではそうでないウイルス機能を除去するために弱毒化され、こうしてウイルスをより安全かつより腫瘍特異的なものとする。よって、別の実施形態では、弱毒化された腫瘍溶解性ウイルス、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物が本明細書に開示され、核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ配列ペプチドを含む。
【００２６】
別の実施形態では、キメラ抗原受容体改変Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物が本明細書に開示され、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ配列ペプチドを含む。
【００２７】
別の実施形態では、治療的または免疫調節性の抗体、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物が本明細書に開示され、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ配列ペプチドを含む。別の実施形態では、免疫調節性抗体はモノクローナル抗体である。別の実施形態では、モノクローナル抗体は、ガン細胞にある前記異種抗原のエピトープを認識する。
【００２８】
別の実施形態では、標的化チミジンキナーゼ（ＴＫＩ）、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物が本明細書に開示され、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ配列ペプチドを含む。
【００２９】
別の実施形態では、Ｔ細胞受容体改変Ｔ細胞（受容体改変Ｔ細胞）、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物が本明細書に開示され、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ配列ペプチドを含む。
【００３０】
一実施形態では、本開示は、被験者内で強化された抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘発する方法に関連し、方法は核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む有効量の免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含み、核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ配列ペプチドを含み、（ａ）組成物はさらに追加的な活性薬剤を含むか、（ｂ）方法はさらに追加的な活性薬剤を含む効果的な量の組成物を被験者に投与する工程を含むか、または（ｃ）方法はさらに標的放射線療法を被験者に実施する工程を含むか、または（ａ）〜（ｃ）の任意の組み合わせである。
【００３１】
別の実施形態では、本明細書で開示されている方法は、被験者内で腫瘍媒介性免疫抑制を阻害するためであり、方法は核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む有効量の免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含み、核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ配列ペプチドを含み、（ａ）組成物はさらに追加的な活性薬剤を含むか、（ｂ）方法はさらに追加的な活性薬剤を含む効果的な量の組成物を被験者に投与する工程を含むか、または（ｃ）方法はさらに標的放射線療法を被験者に実施する工程を含むか、または（ａ）〜（ｃ）の任意の組み合わせである。
【００３２】
別の実施形態では、本明細書で開示されている方法は、被験者の脾臓および腫瘍内のＴエフェクター細胞の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増大する方法のためであり、方法は核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含み、核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ配列ペプチドを含み、（ａ）組成物はさらに追加的な活性薬剤を含むか、（ｂ）方法はさらに追加的な活性薬剤を含む効果的な量の組成物を被験者に投与する工程を含むか、または（ｃ）方法はさらに標的放射線療法を実施する工程を含むか、または（ａ）〜（ｃ）の任意の組み合わせである。
【００３３】
組み換え型リステリア株
一実施形態では、組み換え型リステリア株は核酸分子を含み、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ配列ペプチドを含む。一実施形態では、組み換え型リステリア株は、弱毒化されている。
【００３４】
一実施形態では、切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ配列ペプチド切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ配列ペプチドは、切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質または切断ＡｃｔＡタンパク質を含む。一実施形態では、切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ配列ペプチドは切断ＬＬＯタンパク質である。別の実施形態では、切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ配列ペプチドは切断ＡｃｔＡタンパク質である。一実施形態では、切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ配列ペプチドは全長ＬＬＯタンパク質である。別の実施形態では、切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ配列ペプチドは全長ＡｃｔＡタンパク質である。
【００３５】
一実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸（ＡＡ）配列は切断ＬＬＯ配列を含む。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列はＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫ（配列番号：１）である。別の実施形態では、リステリアから他のＬＭ  ＰＥＳＴ  ＡＡ配列への抗原の融合は、抗原の免疫原性も強化することになる。
【００３６】
別の実施形態では、本開示の方法および組成物のＮ末端ＬＬＯタンパク質断片は配列番号：３を含む。別の実施形態では、断片はＬＬＯシグナルペプチドを含む。別の実施形態では、断片は配列番号：４を含む。別の実施形態では、断片は配列番号：４からほぼ構成される。別の実施形態では、断片は配列番号：４から本質的に構成される。別の実施形態では、断片は配列番号：４に対応する。別の実施形態では、断片は配列番号：４と相同である。別の実施形態では、断片は配列番号：４の断片と相同である。いくつかの実施例で使用されるΔＬＬＯは、システイン４８４を含有する活性化ドメインを含むアミノ末端からの８８個の残基が切断されたので、４１６  ＡＡ長さ（シグナル配列を含まない）であった。活性化ドメインを有しない、そして特にシステイン４８４を有しない任意のΔＬＬＯは本開示の方法および組成物のために好適であることが当業者には明らかであろう。別の実施形態では、ＰＥＳＴ  ＡＡ配列、配列番号：１を含む、異種抗原の任意のΔＬＬＯへの融合は、媒介される細胞、および抗原の抗腫瘍免疫性を強化する。
【００３７】
「ＰＥＳＴ配列ペプチド」または「ＰＥＳＴ配列含有タンパク質」という用語は、切断ＬＬＯタンパク質（一実施形態ではこれはＮ末端ＬＬＯである）、および切断ＡｃｔＡタンパク質（一実施形態ではこれはＮ末端ＬＬＯまたはその断片である）を包含する場合があることを当業者は理解するであろう。「ＰＥＳＴ配列ペプチド」という用語は、ＰＥＳＴ配列ペプチドまたはそのＬＬＯタンパク質もしくはＡｃｔＡタンパク質のペプチド断片を包含する場合があることを当業者は理解するであろう。ＰＥＳＴ配列ペプチドは、当該技術分野で既知であり、また米国特許第７，６３５，４７９号、および米国特許公開整理番号第２０１４／０１８６３８７号に記述され、これらの両方はその全体を本明細書組み込まれる。
【００３８】
別の実施形態では、原核生物のＰＥＳＴ配列は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対してＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ（ＴＢＳ  ２１：２６７−２７１，１９９６）によって記述されたものなどの方法を用いてルーチン的に同定することができる。あるいは、この方法に基づいて他の原核生物由来のＰＥＳＴアミノ酸配列を同定することもできる。ＰＥＳＴアミノ酸配列が期待される他の原核生物には、他のリステリア種を含むが、これに限定されない。例えば、Ｌ．モノサイトゲネスタンパク質ＡｃｔＡは４つのかかる配列を含有する。これらは、ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ（配列番号：５）、ＫＡＳＶＴＤＴＳＥＧＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫ（配列番号：６）、ＫＮＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号：７）、およびＲＧＧＩＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号：８）である。また、ストレプトコッカス株由来のストレプトリジンＯもＰＥＳＴ配列を含有する。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスストレプトリジンＯはアミノ酸３５〜５１にＰＥＳＴ配列ＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号：９）を含み、ストレプトコッカス・エクイシミリスストレプトリジンＯはアミノ酸３８〜５４にＰＥＳＴ様配列ＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号：１０）を含む。さらに、ＰＥＳＴ配列を抗原性タンパク質の中に埋め込むことができると考えられる。したがって、本開示においては、ＰＥＳＴ配列融合に関する場合、「融合」とは、抗原タンパク質が抗原の一端にリンクするかまたは抗原の中に埋め込まれるかのいずれかで抗原とＰＥＳＴアミノ酸配列との両方を含むことを意味する。
【００３９】
別の実施形態では、構築体または核酸分子は、切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ配列ペプチドをコードする核酸配列を用いてエピソーム性ベクターまたはプラスミドベクターから発現される。別の実施形態では、抗生物質選択が無い状態で、プラスミドは組み換え型リステリア株内で安定して維持される。別の実施形態では、プラスミドは組み換え型リステリア上に抗生物質抵抗性を与えない。別の実施形態では、断片は機能的断片である。別の実施形態では、断片は免疫原性断片である。
【００４０】
本開示のワクチンを構築するために利用されるＬＬＯタンパク質は、別の実施形態では、以下の配列を有する：
【００４１】
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＰＥＧＮＥＩＶＱＨＫＮＷＳＥＮＮＫＳＫＬＡＨＦＴＳＳＩＹＬＰＧＮＡＲＮＩＮＶＹＡＫＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲＴＶＩＤＤＲＮＬＰＬＶＫＮＲＮＩＳＩＷＧＴＴＬＹＰＫＹＳＮＫＶＤＮＰＩＥ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｐ１３１２８、配列番号：２、核酸配列はＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ１５１２７に示される）。この配列に対応するプロタンパク質の最初の２５個のＡＡはシグナル配列であり、細菌によって分泌されるときにＬＬＯから分割される。したがって、この実施形態では、全長の活性ＬＬＯタンパク質は５０４残基長である。別の実施形態では、上記のＬＬＯ断片は本開示の免疫療法に組み込まれるＬＬＯ断片の供給源として使用される。別の実施形態では、本開示の組成物および方法で利用されるＬＬＯタンパク質のＮ末端断片は、以下の配列を有する：
【００４２】
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤ（配列番号：３）。
【００４３】
一実施形態では、「ワクチン」および「免疫療法」という用語またはそれらの複数形は、本開示の目的では同じ意味および資格を持ち、本明細書では互換的に使用される。
【００４４】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は本明細書で利用されるＡＡ２０〜４４２のＬＬＯタンパク質にほぼ対応する。
【００４５】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、以下の配列を有する：
【００４６】
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤ（配列番号：４）。
【００４７】
別の実施形態では、「切断ＬＬＯ」または「ΔＬＬＯ」はＰＥＳＴ様ドメインを含むＬＬＯの断片を指す。別の実施形態では、これらの用語はＰＥＳＴ配列を含むＬＬＯ断片を指す。
【００４８】
別の実施形態では、この用語はアミノ末端において活性化ドメインを含有せず、システイン４８４を含まないＬＬＯ断片を指す。別の実施形態では、これらの用語は溶血性でないＬＬＯ断片を指す。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、活性化ドメインの欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、システイン４８４の欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、別の場所における欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態では、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，７７１，７０２号に詳細に述べられるように、ＬＬＯは、コレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）の欠失または突然変異によって非溶血性にされる。
【００４９】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質のおよそ最初の４４１  ＡＡから構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯのおよそ最初の４２０  ＡＡから構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質の非溶血性の形態である。
【００５０】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜４００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜４２５から構成される。各々の可能性は本開示の別個の実施形態を表す。
【００５１】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は上記のＡＡ範囲のうちの１つに対応する相同ＬＬＯタンパク質の残基を含有する。別の実施形態では、残基番号は上記に列挙した残基番号と必ずしも正確に対応する必要はなく、例えば、相同ＬＬＯタンパク質が本明細書で利用されるＬＬＯタンパク質に対して挿入または欠失を有する場合、残基番号を適宜調節することができる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は当該技術分野で既知の任意の他のＬＬＯ断片である。
【００５２】
別の実施形態では、相同ＬＬＯは、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が７０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同ＬＬＯは、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が７２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が７５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が７８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が８０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が８２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が８３％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が８５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が８７％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が８８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が９０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が９２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が９３％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が９５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が９６％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が９７％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が９８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が９９％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が１００％であることを指す。各々の可能性は本開示の別個の実施形態を表す。
【００５３】
別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１１に示される配列を含む。
【００５４】
ＭＧＬＮＲＦＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧＰＮＩＮＮＮＮＳＥＱＴＥＮＡＡＩＮＥＥＡＳＧＡＤＲＰＡＩＱＶＥＲＲＨＰＧＬＰＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＶＮＫＫＫＶＡＫＥＳＶＡＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＳＰＱＰＬＫＡＮＱＱＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＩＲＥＴＡＳＳＬＤＳＳＦＴＲＧＤＬＡＳＬＲＮＡＩＮＲＨＳＱＮＦＳＤＦＰＰＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲＬＡＤＬＲＤＲＧＴＧＫＨＳＲＮＡＧＦＬＰＬＮＰＦＡＳＳＰＶＰＳＬＳＰＫＶＳＫＩＳＤＲＡＬＩＳＤＩＴＫＫＴＰＦＫＮＰＳＱＰＬＮＶＦＮＫＫＴＴＴＫＴＶＴＫＫＰＴＰＶＫＴＡＰＫＬＡＥＬＰＡＴＫＰＱＥＴＶＬＲＥＮＫＴＰＦＩＥＫＱＡＥＴＮＫＱＳＩＮＭＰＳＬＰＶＩＱＫＥＡＴＥＳＤＫＥＥＭＫＰＱＴＥＥＫＭＶＥＥＳＥＳＡＮＮＡＮＧＫＮＲＳＡＧＩＥＥＧＫＬＩＡＫＳＡＥＤＥＫＡＫＥＥＰＧＮＨＴＴＬＩＬＡＭＬＡＩＧＶＦＳＬＧＡＦＩＫＩＩＱＬＲＫＮＮ．  この配列に対応するプロタンパク質の最初の２９個のＡＡはシグナル配列であり、細菌によって分泌されるときにＡｃｔＡタンパク質から分割される。一実施形態では、ＡｃｔＡポリペプチドまたはペプチドは、シグナル配列、上記の配列番号：１１のＡＡ  １〜２９を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡポリペプチドまたはペプチドは、シグナル配列、上記の配列番号：１１のＡＡ  １〜２９を含まない。
【００５５】
一実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質はＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片を含む。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質はＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片である。一実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１２に示される配列を含む。
【００５６】
ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧＰＮＩＮＮＮＮＳＥＱＴＥＮＡＡＩＮＥＥＡＳＧＡＤＲＰＡＩＱＶＥＲＲＨＰＧＬＰＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＶＮＫＫＫＶＡＫＥＳＶＡＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＳＰＱＰＬＫＡＮＱＱＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＩＲＥＴＡＳＳＬＤＳＳＦＴＲＧＤＬＡＳＬＲＮＡＩＮＲＨＳＱＮＦＳＤＦＰＰＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰ。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は配列番号：１２に示される配列を含む。
【００５７】
別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１３に示される配列を含む。ＭＧＬＮＲＦＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥ
ＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧ．  
【００５８】
一実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は、追加的にＡｃｔＡシグナル配列、上記配列番号：１１のＡＡ  １〜２９のすべてまたは一部を欠失したＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片を含む。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は、追加的にＡｃｔＡシグナル配列、上記配列番号：１１のＡＡ  １〜２９のすべてまたは一部を欠失したＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片である。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は、上記配列番号：１１のＡｃｔＡシグナル配列であるＡＡ  １−２９を欠失する。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は少なくとも一つのＰＥＳＴ配列を含む。
【００５９】
一実施形態では、完全長ＡｃｔＡタンパク質は、ＰＥＳＴ領域、配列番号：１４に規定されている配列を含む。一実施形態では、本明細書に開示された融合タンパク質は、配列番号：１４を含む。一実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１４に示される配列を含む。
Ａ  Ｔ  Ｄ  Ｓ  Ｅ  Ｄ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｎ  Ｔ  Ｄ  Ｅ  Ｗ  Ｅ  Ｅ  Ｅ  Ｋ  Ｔ  Ｅ  Ｅ  Ｑ  Ｐ  Ｓ  Ｅ  Ｖ  Ｎ  Ｔ  Ｇ  Ｐ  Ｒ  Ｙ  Ｅ  Ｔ  Ａ  Ｒ  Ｅ  Ｖ  Ｓ  Ｓ  Ｒ  Ｄ  Ｉ  Ｅ  Ｅ  Ｌ  Ｅ  Ｋ  Ｓ  Ｎ  Ｋ  Ｖ  Ｋ  Ｎ  Ｔ  Ｎ  Ｋ  Ａ  Ｄ  Ｌ  Ｉ  Ａ  Ｍ  Ｌ  Ｋ  Ａ  Ｋ  Ａ  Ｅ  Ｋ  Ｇ  Ｐ  Ｎ  Ｎ  Ｎ  Ｎ  Ｎ  Ｎ  Ｇ  Ｅ  Ｑ  Ｔ  Ｇ  Ｎ  Ｖ  Ａ  Ｉ  Ｎ  Ｅ  Ｅ  Ａ  Ｓ  Ｇ  （配列番号：１４）。一実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１４に示される配列である。
【００６０】
一実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は、４つのＰＥＳＴ配列のうちの１つを含む。一実施形態では、完全長ＡｃｔＡタンパク質は、４つのＰＥＳＴ配列のうちの１つを含むＰＥＳＴ領域を含み、その配列は配列番号：１５に示す。一実施形態では、本明細書に開示された融合タンパク質は、配列番号：１５を含む。一実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１５に示される配列を含む。
【００６１】
Ａ    Ｔ    Ｄ    Ｓ    Ｅ    Ｄ    Ｓ    Ｓ    Ｌ    Ｎ    Ｔ    Ｄ    Ｅ    Ｗ    Ｅ    Ｅ    Ｅ    Ｋ    Ｔ    Ｅ    Ｅ    Ｑ    Ｐ    Ｓ    Ｅ    Ｖ    Ｎ    Ｔ    Ｇ    Ｐ    Ｒ    Ｙ    Ｅ    Ｔ    Ａ    Ｒ    Ｅ    Ｖ    Ｓ    Ｓ    Ｒ    Ｄ    Ｉ    Ｅ    Ｅ    Ｌ    Ｅ    Ｋ    Ｓ    Ｎ    Ｋ    Ｖ    Ｋ    Ｎ    Ｔ    Ｎ    Ｋ    Ａ    Ｄ    Ｌ    Ｉ    Ａ    Ｍ    Ｌ    Ｋ    Ａ    Ｋ    Ａ    Ｅ    Ｋ    Ｇ    Ｐ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｇ    Ｅ    Ｑ    Ｔ    Ｇ    Ｎ    Ｖ    Ａ    Ｉ    Ｎ    Ｅ    Ｅ    Ａ    Ｓ    Ｇ    Ｖ    Ｄ    Ｒ    Ｐ    Ｔ    Ｌ    Ｑ    Ｖ    Ｅ    Ｒ    Ｒ    Ｈ    Ｐ    Ｇ    Ｌ    Ｓ    Ｓ    Ｄ    Ｓ    Ａ    Ａ    Ｅ    Ｉ    Ｋ    Ｋ    Ｒ    Ｒ    Ｋ    Ａ    Ｉ    Ａ    Ｓ    Ｓ    Ｄ    Ｓ    Ｅ    Ｌ    Ｅ    Ｓ    Ｌ    Ｔ    Ｙ    Ｐ    Ｄ    Ｋ    Ｐ    Ｔ    Ｋ    Ａ    Ｎ    Ｋ    Ｒ    Ｋ    Ｖ    Ａ    Ｋ    Ｅ    Ｓ    Ｖ    Ｖ    Ｄ    Ａ    Ｓ    Ｅ    Ｓ    Ｄ    Ｌ    Ｄ    Ｓ    Ｓ    Ｍ    Ｑ    Ｓ    Ａ    Ｄ    Ｅ    Ｓ    Ｔ    Ｐ    Ｑ    Ｐ    Ｌ    Ｋ    Ａ    Ｎ    Ｑ    Ｋ    Ｐ    Ｆ    Ｆ    Ｐ    Ｋ    Ｖ    Ｆ    Ｋ    Ｋ    Ｉ    Ｋ    Ｄ    Ａ    Ｇ    Ｋ    Ｗ    Ｖ    Ｒ    Ｄ    Ｋ  （配列番号：１５）。一実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１５に示される配列である。
【００６２】
一実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は、４つのＰＥＳＴ配列のうちの１つを含む。一実施形態では、完全長ＡｃｔＡタンパク質は、４つのＰＥＳＴ配列のうちの１つを含むＰＥＳＴ領域を含み、その配列は配列番号：１６に示す。一実施形態では、本明細書に開示された融合タンパク質は、配列番号：１６を含む。一実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１６に示される配列を含む。
【００６３】
Ａ    Ｔ    Ｄ    Ｓ    Ｅ    Ｄ    Ｓ    Ｓ    Ｌ    Ｎ    Ｔ    Ｄ    Ｅ    Ｗ    Ｅ    Ｅ    Ｅ    Ｋ    Ｔ    Ｅ    Ｅ    Ｑ    Ｐ    Ｓ    Ｅ    Ｖ    Ｎ    Ｔ    Ｇ    Ｐ    Ｒ    Ｙ    Ｅ    Ｔ    Ａ    Ｒ    Ｅ    Ｖ    Ｓ    Ｓ    Ｒ    Ｄ    Ｉ    Ｅ    Ｅ    Ｌ    Ｅ    Ｋ    Ｓ    Ｎ    Ｋ    Ｖ    Ｋ    Ｎ    Ｔ    Ｎ    Ｋ    Ａ    Ｄ    Ｌ    Ｉ    Ａ    Ｍ    Ｌ    Ｋ    Ａ    Ｋ    Ａ    Ｅ    Ｋ    Ｇ    Ｐ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｇ    Ｅ    Ｑ    Ｔ    Ｇ    Ｎ    Ｖ    Ａ    Ｉ    Ｎ    Ｅ    Ｅ    Ａ    Ｓ    Ｇ    Ｖ    Ｄ    Ｒ    Ｐ    Ｔ    Ｌ    Ｑ    Ｖ    Ｅ    Ｒ    Ｒ    Ｈ    Ｐ    Ｇ    Ｌ    Ｓ    Ｓ    Ｄ    Ｓ    Ａ    Ａ    Ｅ    Ｉ    Ｋ    Ｋ    Ｒ    Ｒ    Ｋ    Ａ    Ｉ    Ａ    Ｓ    Ｓ    Ｄ    Ｓ    Ｅ    Ｌ    Ｅ    Ｓ    Ｌ    Ｔ    Ｙ    Ｐ    Ｄ    Ｋ    Ｐ    Ｔ    Ｋ    Ａ    Ｎ    Ｋ    Ｒ    Ｋ    Ｖ    Ａ    Ｋ    Ｅ    Ｓ    Ｖ    Ｖ    Ｄ    Ａ    Ｓ    Ｅ    Ｓ    Ｄ    Ｌ    Ｄ    Ｓ    Ｓ    Ｍ    Ｑ    Ｓ    Ａ    Ｄ    Ｅ    Ｓ    Ｔ    Ｐ    Ｑ    Ｐ    Ｌ    Ｋ    Ａ    Ｎ    Ｑ    Ｋ    Ｐ    Ｆ    Ｆ    Ｐ    Ｋ    Ｖ    Ｆ    Ｋ    Ｋ    Ｉ    Ｋ    Ｄ    Ａ    Ｇ    Ｋ    Ｗ    Ｖ    Ｒ    Ｄ    Ｋ    Ｉ    Ｄ    Ｅ    Ｎ    Ｐ    Ｅ    Ｖ    Ｋ    Ｋ    Ａ    Ｉ    Ｖ    Ｄ    Ｋ    Ｓ    Ａ    Ｇ    Ｌ    Ｉ    Ｄ    Ｑ    Ｌ    Ｌ    Ｔ    Ｋ    Ｋ    Ｋ    Ｓ    Ｅ    Ｅ    Ｖ    Ｎ    Ａ    Ｓ    Ｄ    Ｆ    Ｐ    Ｐ    Ｐ    Ｐ    Ｔ    Ｄ    Ｅ    Ｅ    Ｌ    Ｒ    Ｌ    Ａ    Ｌ    Ｐ    Ｅ    Ｔ    Ｐ    Ｍ    Ｌ    Ｌ    Ｇ    Ｆ    Ｎ    Ａ    Ｐ    Ｔ    Ｐ    Ｓ    Ｅ    Ｐ    Ｓ    Ｓ    Ｆ    Ｅ    Ｆ    Ｐ    Ｐ    Ｐ    Ｐ    Ｔ    Ｄ    Ｅ    Ｅ    Ｌ    Ｒ    Ｌ    Ａ    Ｌ    Ｐ    Ｅ    Ｔ    Ｐ    Ｍ    Ｌ    Ｌ    Ｇ    Ｆ    Ｎ    Ａ    Ｐ    Ａ    Ｔ    Ｓ    Ｅ    Ｐ    Ｓ    Ｓ  （配列番号：１６）。一実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１６に示される配列である。
【００６４】
一実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は、４つのＰＥＳＴ配列のうちの１つを含む。一実施形態では、完全長ＡｃｔＡタンパク質は、４つのＰＥＳＴ配列のうちの１つを含むＰＥＳＴ領域を含み、その配列は配列番号：１７に示す。一実施形態では、本明細書に開示された融合タンパク質は、配列番号：１７を含む。一実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１７に示される配列を含む。
【００６５】
Ａ    Ｔ    Ｄ    Ｓ    Ｅ    Ｄ    Ｓ    Ｓ    Ｌ    Ｎ    Ｔ    Ｄ    Ｅ    Ｗ    Ｅ    Ｅ    Ｅ    Ｋ    Ｔ    Ｅ    Ｅ    Ｑ    Ｐ    Ｓ    Ｅ    Ｖ    Ｎ    Ｔ    Ｇ    Ｐ    Ｒ    Ｙ    Ｅ    Ｔ    Ａ    Ｒ    Ｅ    Ｖ    Ｓ    Ｓ    Ｒ    Ｄ    Ｉ    Ｅ    Ｅ    Ｌ    Ｅ    Ｋ    Ｓ    Ｎ    Ｋ    Ｖ    Ｋ    Ｎ    Ｔ    Ｎ    Ｋ    Ａ    Ｄ    Ｌ    Ｉ    Ａ    Ｍ    Ｌ    Ｋ    Ａ    Ｋ    Ａ    Ｅ    Ｋ    Ｇ    Ｐ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｇ    Ｅ    Ｑ    Ｔ    Ｇ    Ｎ    Ｖ    Ａ    Ｉ    Ｎ    Ｅ    Ｅ    Ａ    Ｓ    Ｇ    Ｖ    Ｄ    Ｒ    Ｐ    Ｔ    Ｌ    Ｑ    Ｖ    Ｅ    Ｒ    Ｒ    Ｈ    Ｐ    Ｇ    Ｌ    Ｓ    Ｓ    Ｄ    Ｓ    Ａ    Ａ    Ｅ    Ｉ    Ｋ    Ｋ    Ｒ    Ｒ    Ｋ    Ａ    Ｉ    Ａ    Ｓ    Ｓ    Ｄ    Ｓ    Ｅ    Ｌ    Ｅ    Ｓ    Ｌ    Ｔ    Ｙ    Ｐ    Ｄ    Ｋ    Ｐ    Ｔ    Ｋ    Ａ    Ｎ    Ｋ    Ｒ    Ｋ    Ｖ    Ａ    Ｋ    Ｅ    Ｓ    Ｖ    Ｖ    Ｄ    Ａ    Ｓ    Ｅ    Ｓ    Ｄ    Ｌ    Ｄ    Ｓ    Ｓ    Ｍ    Ｑ    Ｓ    Ａ    Ｄ    Ｅ    Ｓ    Ｔ    Ｐ    Ｑ    Ｐ    Ｌ    Ｋ    Ａ    Ｎ    Ｑ    Ｋ    Ｐ    Ｆ    Ｆ    Ｐ    Ｋ    Ｖ    Ｆ    Ｋ    Ｋ    Ｉ    Ｋ    Ｄ    Ａ    Ｇ    Ｋ    Ｗ    Ｖ    Ｒ    Ｄ    Ｋ    Ｉ    Ｄ    Ｅ    Ｎ    Ｐ    Ｅ    Ｖ    Ｋ    Ｋ    Ａ    Ｉ    Ｖ    Ｄ    Ｋ    Ｓ    Ａ    Ｇ    Ｌ    Ｉ    Ｄ    Ｑ    Ｌ    Ｌ    Ｔ    Ｋ    Ｋ    Ｋ    Ｓ    Ｅ    Ｅ    Ｖ    Ｎ    Ａ    Ｓ    Ｄ    Ｆ    Ｐ    Ｐ    Ｐ    Ｐ    Ｔ    Ｄ    Ｅ    Ｅ    Ｌ    Ｒ    Ｌ    Ａ    Ｌ    Ｐ    Ｅ    Ｔ    Ｐ    Ｍ    Ｌ    Ｌ    Ｇ    Ｆ    Ｎ    Ａ    Ｐ    Ｔ    Ｐ    Ｓ    Ｅ    Ｐ    Ｓ    Ｓ    Ｆ    Ｅ    Ｆ    Ｐ    Ｐ    Ｐ    Ｐ    Ｔ    Ｄ    Ｅ    Ｅ    Ｌ    Ｒ    Ｌ    Ａ    Ｌ    Ｐ    Ｅ    Ｔ    Ｐ    Ｍ    Ｌ    Ｌ    Ｇ    Ｆ    Ｎ    Ａ    Ｐ    Ａ    Ｔ    Ｓ    Ｅ    Ｐ    Ｓ    Ｓ    Ｆ    Ｅ    Ｆ    Ｐ    Ｐ    Ｐ    Ｐ    Ｔ    Ｅ    Ｄ    Ｅ    Ｌ    Ｅ    Ｉ    Ｍ    Ｒ    Ｅ    Ｔ    Ａ    Ｐ    Ｓ    Ｌ    Ｄ    Ｓ    Ｓ    Ｆ    Ｔ    Ｓ    Ｇ    Ｄ    Ｌ    Ａ    Ｓ    Ｌ    Ｒ    Ｓ    Ａ    Ｉ    Ｎ    Ｒ    Ｈ    Ｓ    Ｅ    Ｎ    Ｆ    Ｓ    Ｄ    Ｆ    Ｐ    Ｌ    Ｉ    Ｐ    Ｔ    Ｅ    Ｅ    Ｅ    Ｌ    Ｎ    Ｇ    Ｒ    Ｇ    Ｇ    Ｒ    Ｐ    Ｔ    Ｓ    Ｅ  （配列番号：１７）。一実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１７に示される配列である。
【００６６】
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は当該技術分野で既知の任意の他のＡｃｔＡ断片である。各々の可能性は本開示の別個の実施形態を表す。
【００６７】
別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質をコードする組み換え型ヌクレオチドは、配列番号：１８に示される配列を含む。
【００６８】
Ａｔｇｃｇｔｇｃｇａｔｇａｔｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃａｔｔａｃｔｇｃｃａａｔｔｇｃａｔｔａｃｇａｔｔａａｃｃｃｃｇａｃａｔａａｔａｔｔｔｇｃａｇｃｇａｃａｇａｔａｇｃｇａａｇａｔｔｃｔａｇｔｃｔａａａｃａｃａｇａｔｇａａｔｇｇｇａａｇａａｇａａａａａａｃａｇａａｇａｇｃａａｃｃａａｇｃｇａｇｇｔａａａｔａｃｇｇｇａｃｃａａｇａｔａｃｇａａａｃｔｇｃａｃｇｔｇａａｇｔａａｇｔｔｃａｃｇｔｇａｔａｔｔａａａｇａａｃｔａｇａａａａａｔｃｇａａｔａａａｇｔｇａｇａａａｔａｃｇａａｃａａａｇｃａｇａｃｃｔａａｔａｇｃａａｔｇｔｔｇａａａｇａａａａａｇｃａｇａａａａａｇｇｔｃｃａａａｔａｔｃａａｔａａｔａａｃａａｃａｇｔｇａａｃａａａｃｔｇａｇａａｔｇｃｇｇｃｔａｔａａａｔｇａａｇａｇｇｃｔｔｃａｇｇａｇｃｃｇａｃｃｇａｃｃａｇｃｔａｔａｃａａｇｔｇｇａｇｃｇｔｃｇｔｃａｔｃｃａｇｇａｔｔｇｃｃａｔｃｇｇａｔａｇｃｇｃａｇｃｇｇａａａｔｔａａａａａａａｇａａｇｇａａａｇｃｃａｔａｇｃａｔｃａｔｃｇｇａｔａｇｔｇａｇｃｔｔｇａａａｇｃｃｔｔａｃｔｔａｔｃｃｇｇａｔａａａｃｃａａｃａａａａｇｔａａａｔａａｇａａａａａａｇｔｇｇｃｇａａａｇａｇｔｃａｇｔｔｇｃｇｇａｔｇｃｔｔｃｔｇａａａｇｔｇａｃｔｔａｇａｔｔｃｔａｇｃａｔｇｃａｇｔｃａｇｃａｇａｔｇａｇｔｃｔｔｃａｃｃａｃａａｃｃｔｔｔａａａａｇｃａａａｃｃａａｃａａｃｃａｔｔｔｔｔｃｃｃｔａａａｇｔａｔｔｔａａａａａａａｔａａａａｇａｔｇｃｇｇｇｇａａａｔｇｇｇｔａｃｇｔｇａｔａａａａｔｃｇａｃｇａａａａｔｃｃｔｇａａｇｔａａａｇａａａｇｃｇａｔｔｇｔｔｇａｔａａａａｇｔｇｃａｇｇｇｔｔａａｔｔｇａｃｃａａｔｔａｔｔａａｃｃａａａａａｇａａａａｇｔｇａａｇａｇｇｔａａａｔｇｃｔｔｃｇｇａｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃａｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃａｇａａｃｃｇａｇｃｔｃａｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃｇｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃｇｇａａｃｃｇａｇｃｔｃｇｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃｇｃｃｔｃｃａａｃａｇａａｇａｔｇａａｃｔａｇａａａｔｃａｔｃｃｇｇｇａａａｃａｇｃａｔｃｃｔｃｇｃｔａｇａｔｔｃｔａｇｔｔｔｔａｃａａｇａｇｇｇｇａｔｔｔａｇｃｔａｇｔｔｔｇａｇａａａｔｇｃｔａｔｔａａｔｃｇｃｃａｔａｇｔｃａａａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｔｔｔｃｃｃａｃｃａａｔｃｃｃａａｃａｇａａｇａａｇａｇｔｔｇａａｃｇｇｇａｇａｇｇｃｇｇｔａｇａｃｃａ。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは配列番号：１８に示される配列を有する。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする任意の他の配列を含む。
【００６９】
別の実施形態では、「切断ＡｃｔＡ」または「ΔａｃｔＡ」はＰＥＳＴ様ドメインを含むＡｃｔＡの断片を指す。別の実施形態では、これらの用語はＰＥＳＴ配列を含むＡｃｔＡ断片を指す。
【００７０】
したがって、他の原核生物に由来する他のＬＭ  ＰＥＳＴアミノ酸配列およびＰＥＳＴアミノ酸配列は、抗原の免疫原性を強化する。一実施形態では、ＰＥＳＴ配列はＬＭ  ＡｃｔＡタンパク質由来のＰＥＳＴ配列である。別の実施形態では、「ＰＥＳＴ配列ペプチド」および「ＰＥＳＴ配列」という用語は、本明細書では互換的に使用される。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ（配列番号：１９）、ＫＡＳＶＴＤＴＳＥＧＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫ（配列番号：２０）、ＫＮＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号：２１）、またはＲＧＧＩＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号：２２）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ストレプトコッカス種のストレプトリジンＯタンパク質由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ストレプトコッカス・ピオゲネスストレプトリジンＯ、例えば、ＡＡ  ３５〜５１においてＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号：２３）由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ストレプトコッカス・エクイシミリスストレプトリジンＯ、例えば、ＡＡ  ３８〜５４においてＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号：２４）由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、原核生物に由来する別のＰＥＳＴ  ＡＡ配列である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、当該技術分野で既知の任意の他のＰＥＳＴ配列である。
【００７１】
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はＡｃｔＡタンパク質のおよそ最初の１００  ＡＡから構成される。
【００７２】
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜７５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜１００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜１２５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜１５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２２５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２７５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜３００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜３２５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜３３８から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜３５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜３７５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜４００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜４５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜５００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜５５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜６００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜６３９から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜１００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜１２５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜１５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜１７５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜２００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜２２５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜２５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜２７５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜３００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜３２５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜３３８から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜３５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜３７５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜４００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜４５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜５００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜５５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜６００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜６０４から構成される。
【００７３】
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は上記のＡＡ範囲のうちの１つに対応する相同ＡｃｔＡタンパク質の残基を含有する。別の実施形態では、残基番号は上記に列挙した残基番号と必ずしも正確に対応する必要はなく、例えば、相同ＡｃｔＡタンパク質が本明細書で利用されるＡｃｔＡタンパク質に対して挿入または欠失を有する場合、残基番号を適宜調節することができる。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は当該技術分野で既知の任意の他のＡｃｔＡ断片である。
【００７４】
別の実施形態では、相同ＡｃｔＡは、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が７０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同ＡｃｔＡは、ＡｃｔＡ配列に対する同一性が７２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、ＡｃｔＡ配列に対する同一性が７５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が７８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が８０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が８２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が８３％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が８５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が８７％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が８８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が９０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１１のうちの１つに対する同一性が９２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が９３％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が９５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が９６％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が９７％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が９８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１１のうちの１つに対する同一性が９９％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、ＡｃｔＡ配列に対する同一性が１００％であることを指す。
【００７５】
本明細書で使用される「相同性」という用語は、本明細書で開示された任意の核酸配列を参照するとき、対応する未変性核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセンテージを同様に示す。
【００７６】
一実施形態では、当該技術分野において適切に記述される方法によって、相同性は配列アライメントに対してコンピューターアルゴリズムによって決定される。例えば、核酸配列相同性のコンピューターアルゴリズム解析は入手可能な任意の数のソフトウェアパッケージの利用を含む場合があり、これらは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＤＯＭＡＩＮ、ＢＥＡＵＴＹ（ＢＬＡＳＴ増強アラインメントユーティリティ）、ＬＡＬＩＧＮ、ＧＥＮＰＥＰＴ、およびＴＲＥＭＢＬパッケージなどである。
【００７７】
別の実施形態では、「相同性」は本明細書に開示された配列から選択された配列との同一性が６８％より大きいことを指す。別の実施形態では、「相同性」は本明細書に開示された配列から選択された配列との同一性が７０％より大きいことを指す。別の実施形態では、「相同性」は本明細書に開示された配列から選択された配列との同一性が７２％より大きいことを指す。別の実施形態では、同一性は７５％より大きい。別の実施形態では、同一性は７８％より大きい。別の実施形態では、同一性は８０％より大きい。別の実施形態では、同一性は８２％より大きい。別の実施形態では、同一性は８３％より大きい。別の実施形態では、同一性は８５％より大きい。別の実施形態では、同一性は８７％より大きい。別の実施形態では、同一性は８８％より大きい。別の実施形態では、同一性は９０％より大きい。別の実施形態では、同一性は９２％より大きい。別の実施形態では、同一性は９３％より大きい。別の実施形態では、同一性は９５％より大きい。別の実施形態では、同一性は９６％より大きい。別の実施形態では、同一性は９７％より大きい。別の実施形態では、同一性は９８％より大きい。別の実施形態では、同一性は９９％より大きい。別の実施形態では、同一性は１００％である。
【００７８】
別の実施形態では、相同性は、候補配列ハイブリダイゼーションの決定を介し決定され、その方法は当業者によりよく記述されている（例えば、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”  Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．  Ｊ．，  Ｅｄｓ．（１９８５）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．；  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎ．Ｙを参照）。例えば、ハイブリダイゼーションの方法は、ネイティブカスパーゼペプチドをコードするＤＮＡの補体に対して中程度からストリンジェントな条件下で実行される場合がある。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、１０〜２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍＬの変性断片化サケ精子ＤＮＡを含む溶液中４２℃にて一晩のインキュベーションである。
【００７９】
一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は、抗生物質耐性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は抗生物質耐性遺伝子をコードする核酸を含むプラスミドを含む。
【００８０】
一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリアは、ファゴリソソームを避ける能力を有する。
【００８１】
一実施形態では、リステリアゲノムは、一実施形態では病原性因子である内在性ＡｃｔＡ遺伝子の欠失を含む。一実施形態では、異種抗原または抗原性ポリペプチドは、リステリア染色体のＬＬＯとフレーム内に組み込まれる。別の実施形態では、統合核酸分子は、ＡｃｔＡを持つフレーム内のＡｃｔＡ遺伝子座へと統合される。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードする染色体の核酸は、抗原をコードする核酸分子によって置き換えられる。
【００８２】
一実施形態では、異種抗原は腫瘍関連抗原である。別の実施形態では、腫瘍関連抗原は天然起源の腫瘍関連抗原である。別の実施形態では、腫瘍関連抗原は合成腫瘍関連抗原である。別の実施形態では、腫瘍関連抗原はキメラ腫瘍関連抗原である。
【００８３】
一実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、異種抗原またはその断片を含む組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む。別の実施形態では、組み換え型ポリペプチドは、切断ＬＬＯタンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質または異種抗原に融合したＰＥＳＴ配列ペプチドをさらに含む。別の実施形態では、切断ＬＬＯタンパク質はＮ末端ＬＬＯまたはその断片である。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質はＮ末端ＡｃｔＡタンパク質またはその断片である。
【００８４】
一実施形態では、「抗原性ポリペプチド」という用語は、本明細書で説明したとおり、被験者の細胞内に存在し、宿主内に存在するとき、または、別の実施形態では、宿主によって検出されるとき、免疫応答の載置をもたらすＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子上で加工および提示される、ポリペプチド、ペプチド、または組み換え型ペプチドを指すために本明細書で使用される。一実施形態では、抗原は宿主に対して異質でありうる。別の実施形態では、抗原は、宿主内に存在するが、免疫寛容のために宿主はこれに対する免疫応答を引き出さない場合がある。
【００８５】
一実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含む。別の実施形態では、代謝酵素は、組み換え型リステリア株の染色体を欠いている内因性遺伝子を相補する。別の実施形態では、第２のオープンリーディングフレームによってコードされる代謝酵素はアラニンラセマーゼ酵素（ｄａｌ）である。別の実施形態では、第２のオープンリーディングフレームによってコードされる代謝酵素はＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素（ｄａｔ）である。別の実施形態では、本明細書に開示されたリステリア株は内因性ｄａｌ／ｄａｔ遺伝子内の突然変異を含む。別の実施形態では、リステリアはｄａｌ／ｄａｔ遺伝子を欠いている。
【００８６】
別の実施形態では、本開示の方法および組成物の核酸分子は、プロモーター／調節性配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、本開示の方法および組成物の第１のオープンリーディングフレームは、プロモーター／調節性配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、本開示の方法および組成物の第２のオープンリーディングフレームは、プロモーター／調節性配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、オープンリーディングフレームの各々はプロモーター／調節配列に動作可能にリンクする。
【００８７】
別の実施形態では、「代謝酵素」は、宿主細菌によって要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌によって要求される栄養素の合成のために要求される酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌によって利用される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌の増殖の保持のために要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この酵素は栄養素の合成のために要求される。
【００８８】
別の実施形態では、組み換え型リステリアは、弱毒化栄養要求性株である。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、米国特許第８，１１４，４１４号に記述されるＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７株であり、この特許はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８９】
一実施形態では、弱毒化株は、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）である。別の実施形態では、弱毒化株は、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）ΔａｃｔＡ（ＬｍｄｄＡ）である。ＬｍｄｄＡは、リステリアベクターに基づき、これは病毒性遺伝子ａｃｔＡの欠失に起因して弱毒化され、かつインビボおよびインビトロでの望ましい異種抗原または切断ＬＬＯ発現のためにｄａｌ遺伝子の相補によってプラスミドを保持する。
【００９０】
別の実施形態では、弱毒化株はＬｍｄｄＡである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍΔａｃｔＡである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍΔＰｒｆＡである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍΔＰｌｃＢである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍΔＰｌｃＡである。別の実施形態では、株は上述の株のいずれかの二重変異体または三重変異体である。別の実施形態では、この株は、リステリアベースのワクチンの先天的な特性である強いアジュバント効果を発揮する。別の実施形態では、この株はＥＧＤリステリアバックボーンから作られる。別の実施形態では、本開示で使用される株は非溶血性ＬＬＯを発現するリステリア株である。
【００９１】
別の実施形態では、リステリア株は、栄養要求性突然変異体である。別の実施形態では、リステリア株はビタミン合成遺伝子をコードする遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はパントテン酸シンターゼをコードする遺伝子が欠損している。
【００９２】
一実施形態では、Ｄ−アラニンを欠損したリステリアのＡＡ株の生成は、例えば、欠失突然変異生成、挿入突然変異生成、およびフレームシフト突然変異の発生の結果として生じる突然変異生成、タンパク質の中途終始を生じる突然変異、または遺伝子発現に影響を与える調節性配列の突然変異を含む、当業者には周知の数多くの方法で達成されうる。別の実施形態では、組み換え型ＤＮＡ技法を使用して、または変異原性化学薬品もしくは放射、およびそれに続く突然変異体の選択を使用する従来の突然変異生成技術を使用して突然変異生成を達成することができる。別の実施形態では、栄養要求性表現型の復帰をともなう可能性が低いため、欠失変異体が好ましい。別の実施形態では、本明細書に提示されるプロトコルに従って生成されるＤ−アラニンの変異体は、単純な実験室の培養アッセイでＤ−アラニンの非存在下で成長する能力を試験される場合がある。別の実施形態では、この化合物の非存在下で成長することができない変異体がさらなる研究のために選択される。
【００９３】
別の実施形態では、本明細書に開示されるとおり、リステリアの突然変異生成のための標的として上述のＤ−アラニンに関連する遺伝子に加えて、代謝酵素の合成に関与する他の遺伝子が使用されてもよい。
【００９４】
別の実施形態では、代謝酵素は、組み換え型細菌株の染色体の残りのものに欠けている内在性代謝遺伝子を相補する。一実施形態では、内在性代謝遺伝子は、染色体内で突然変異する。別の実施形態では、内在性代謝遺伝子は染色体から欠失される。別の実施形態では、代謝酵素はアミノ酸代謝酵素である。別の実施形態では、代謝酵素は組み換え型リステリア株内で細胞壁合成のために使用されるアミノ酸の形成を触媒する。別の実施形態では、代謝酵素はアラニンラセマーゼ酵素である。別の実施形態では、代謝酵素はＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。
【００９５】
一実施形態では、栄養要求性リステリア株は、栄養要求性リステリア株の栄養要求性を相補する代謝酵素を含むエピソームの発現ベクターを含む。別の実施形態では、構成物はエピソームの様式でリステリア株内に含有される。別の実施形態では、外来抗原は組み換え型リステリア株が抱えるベクターから発現される。別の実施形態では、エピソームの発現ベクターは抗生物質耐性マーカーを欠いている。一実施形態では、本明細書に開示された方法および組成物の抗原はＰＥＳＴ配列を含むポリペプチドに融合される。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列を含むポリペプチドは切断ＬＬＯである。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列を含むポリペプチドはＡｃｔＡである。
【００９６】
別の実施形態では、リステリア株はアミノ酸（ＡＡ）代謝酵素が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はＤグルタミン酸シンターゼ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はｄａｔ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はｄａｌ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はｄｇａ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株は、ジアミノピメリン酸の合成に関与する遺伝子が欠損している。ＣｙｓＫ。別の実施形態では、遺伝子はビタミンＢ１２に依存しないメチオニンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｐＡである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｐＢである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｐＥである。別の実施形態では、遺伝子はａｓｎＢである。別の実施形態では、遺伝子はｇｌｔＤである。別の実施形態では、遺伝子はｇｌｔＢである。別の実施形態では、遺伝子はｌｅｕＡである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｇＧである。別の実施形態では、遺伝子はｔｈｒＣである。別の実施形態では、リステリア株は上述の遺伝子のうちの１つ以上が欠損している。
【００９７】
別の実施形態では、リステリア株はシンターゼ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、遺伝子は、ＡＡ合成遺伝子である。別の実施形態では、遺伝子は、ｆｏｌＰである。別の実施形態では、遺伝子はジヒドロウリジンシンターゼファミリータンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＤである。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＦである。別の実施形態では、遺伝子はホスホエノールピルビン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｈｉｓＦである。別の実施形態では、遺伝子はｈｉｓＨである。別の実施形態では、遺伝子はｆｌｉＩである。別の実施形態では、遺伝子はリボソームの大型サブユニットシュードウリジンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＤである。別の実施形態では、遺伝子は二機能性ＧＭＰシンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はｃｏｂＳである。別の実施形態では、遺伝子はｃｏｂＢである。別の実施形態では、遺伝子はｃｂｉＤである。別の実施形態では、遺伝子はウロポルフィリン−ＩＩＩＣ−メチルトランスフェラーゼ／ウロポルフィリノゲン−ＩＩＩシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｃｏｂＱである。別の実施形態では、遺伝子はｕｐｐＳである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｕＢである。別の実施形態では、遺伝子はｄｘｓである。別の実施形態では、遺伝子はｍｖａＳである。別の実施形態では、遺伝子はｄａｐＡである。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＧである。別の実施形態では、遺伝子はｆｏｌＣである。別の実施形態では、遺伝子は、クエン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｇＪである。別の実施形態では、遺伝子は３−デオキシ−７−ホスホヘプツロン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はインドール−３−グリセロール−リン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はアントラニル酸シンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼ構成成分である。別の実施形態では、遺伝子はｍｅｎＢである。別の実施形態では、遺伝子はメナキノン特異的イソコリスミ酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼＩまたはＩＩである。別の実施形態では、遺伝子はホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミドシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｃａｒＢである。別の実施形態では、遺伝子はｃａｒＡである。別の実施形態では、遺伝子はｔｈｙＡである。別の実施形態では、遺伝子はｍｇｓＡである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＢである。別の実施形態では、遺伝子はｈｅｐＢである。別の実施形態では、遺伝子はｒｌｕＢである。別の実施形態では、遺伝子はｉｌｖＢである。別の実施形態では、遺伝子はｉｌｖＮである。別の実施形態では、遺伝子はａｌｓＳである。別の実施形態では、遺伝子はｆａｂＦである。別の実施形態では、遺伝子はｆａｂＨである。別の実施形態では、遺伝子はシュードウリジンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｐｙｒＧである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｕＡである。別の実施形態では、遺伝子はｐａｂＢである。別の実施形態では、遺伝子はａｔｐシンターゼ遺伝子（例えば、ａｔｐＣ、ａｔｐＤ−２、ａｐｔＧ、ａｔｐＡ−２、等々）である。
【００９８】
別の実施形態では、遺伝子はｐｈｏＰである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＡである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＣである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＤである。別の実施形態では、遺伝子はｐｌｃＢである。
【００９９】
別の実施形態では、リステリア株はペプチド輸送体が欠損している。別の実施形態では、遺伝子はＡＢＣ輸送体／ＡＴＰ結合／パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はオリゴペプチドＡＢＣ輸送体／オリゴペプチド結合タンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はオリゴペプチドＡＢＣ輸送体／パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子は亜鉛ＡＢＣ輸送体／亜鉛結合タンパク質である。別の実施形態では、遺伝子は糖ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はリン酸輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＺＩＰ亜鉛輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＥｍｒＢ／ＱａｃＡファミリーの薬剤耐性輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は硫酸塩輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はプロトン依存性オリゴペプチド輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマグネシウム輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は蟻酸塩／亜硝酸塩輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はスペルミジン／プトレシンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＮａ／Ｐｉ共輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は糖リン酸輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はグルタミンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はメジャーファシリテイターファミリー輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はグリシンベタイン／Ｌ−プロリンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はモリブデンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はテイコ酸ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はコバルトＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はアンモニウム輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はアミノ酸ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は細胞分裂ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマンガンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は鉄化合物ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマルトース／マルトデキストリンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＢｃｒ／ＣｆｌＡファミリーの薬剤耐性輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は上記のタンパク質のうちの１つのサブユニットである。
【０１００】
一実施形態では、組み換え型リステリアに到達するために、リステリアを形質転換するために使用される核酸分子が本明細書に開示されている。別の実施形態では、リステリア株を形質転換するために使用される本明細書に開示された核酸は病毒性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、核酸分子はリステリアゲノムの中へと組み込まれ、非機能性病毒性遺伝子を担持する。別の実施形態では、病毒性遺伝子は組み換え型リステリア内で突然変異する。さらに別の実施形態では、核酸分子はリステリアゲノム内に存在する内因性の遺伝子を不活性化するために使用される。また別の実施形態では、病毒性遺伝子は、ａｃｔＡ遺伝子、ｉｎｌＡ遺伝子、ならびにｉｎｌＢ遺伝子、ｉｎｌＣ遺伝子、ｉｎｌＪ遺伝子、ｐｌｂＣ遺伝子、ｂｓｈ遺伝子、またはｐｒｆＡ遺伝子である。病毒性遺伝子は、組み換え型リステリア内で、病毒性と関連付けられる当該技術分野で既知の任意の遺伝子とすることができることが当業者によって理解されるべきである。
【０１０１】
また別の実施形態では、リステリア株は、ｉｎｌＡ突然変異体、ｉｎｌＢ突然変異体、ｉｎｌＣ突然変異体、ｉｎｌＪ突然変異体、ｐｒｆＡ突然変異体、ＡｃｔＡ突然変異体、ｄａｌ／ｄａｔ突然変異体、ｐｒｆＡ突然変異体、ｐｌｃＢ欠失突然変異体、またはｐｌｃＡおよびｐｌｃＢの両方を欠いている二重変異体である。別の実施形態では、リステリアはこれらの遺伝子の個別または組み合せでの欠失または突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示されたリステリアは、遺伝子のそれぞれ１つずつを欠いている。別の実施形態では、本明細書に開示されたリステリアは、ａｃｔＡ、ｐｒｆＡ、およびｄａｌ／ｄａｔ遺伝子を含む本明細書に開示されたいずれかの遺伝子のうちの少なくとも１個かつ最高１０個を欠いている。別の実施形態では、ｐｒｆＡ突然変異体はＤ１３３Ｖ  ＰｒｆＡ突然変異体である。
【０１０２】
一実施形態では、弱毒化生リステリアは、組み換え型リステリアである。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ゲノムインターナリンＣ（ｉｎｌＣ）遺伝子の突然変異または欠失を含む。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ゲノムａｃｔＡ遺伝子およびゲノムインターナリンＣ遺伝子の突然変異または欠失を含む。一実施形態では、リステリアの隣接するＴ細胞への転座は、プロセス中に関与するａｃｔＡ遺伝子および／またはｉｎｌＣ遺伝子の欠失によって阻害され、これはプロセスに関与するので、それによって、免疫原性の増加およびワクチンバックボーンとしての有用性によって結果として予想外に高いレベルの弱毒化が得られる。
【０１０３】
一実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子などが、リステリア株の染色体で欠けている。別の実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子などが、リステリア株の染色体および何らかのエピソームの遺伝要素で欠けている。別の実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子などが、病毒性株のゲノムで欠けている。一実施形態では、病毒性遺伝子は、染色体内で突然変異する。別の実施形態では、病毒性遺伝子は染色体から欠失される。
【０１０４】
一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は弱毒化されている。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ａｃｔＡ病毒性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ｐｒｆＡ病毒性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、組み換え型リステリアはｉｎｌＢ遺伝子を欠いている。別の実施形態では、組み換え型リステリアはａｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子の両方を欠いている。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ａｃｔＡ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ｉｎｌＢ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ＡｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ＡｃｔＡおよびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ＡｃｔＡ、ｉｎｌＢおよびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ＡｃｔＡ、ｉｎｌＢおよびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ＡｃｔＡ、ｉｎｌＢおよびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は以下の遺伝子：ａｃｔＡ、ｄａｌ、ｄａｔ、ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣ、ｐｒｆＡ、ｐｌｃＡ、ｐｌｃＢのうちの任意の単一遺伝子または遺伝子の組み合わせの不活性化突然変異を含む。
【０１０５】
「突然変異」という用語およびその文法的な同等物は、配列（核酸またはアミノ酸配列）に対する任意のタイプの突然変異または修飾を含み、これには欠失突然変異、切断、不活性化、妨害、置換突然変異、または転座を含むことを当業者は理解するであろう。突然変異のこれらのタイプは当該技術分野でよく知られている。
【０１０６】
一実施形態では、本明細書に開示された代謝酵素または相補する遺伝子をコードするプラスミドを含む栄養要求性細菌を選択するために、形質転換した栄養要求性細菌をアミノ酸代謝遺伝子または相補遺伝子の発現を選択する培地上で成長させる。別の実施形態では、Ｄ−グルタミン酸合成のための栄養要求性の細菌は、Ｄ−グルタミン酸合成のための遺伝子を含むプラスミドを用いて形質転換され、また栄養要求性細菌はＤ−グルタミン酸無しで増殖することになり、一方でＤ−グルタミン酸合成のためにプラスミドを用いて形質転換されていない栄養要求性細菌、またはタンパク質をコードするプラスミドを発現していない栄養要求性細菌は、増殖しないことになる。別の実施形態では、Ｄ−アラニン合成のための栄養要求性の細菌は、プラスミドがＤ−アラニン合成のためのアミノ酸代謝酵素をコードする孤立核酸を含む場合、本開示のプラスミドを形質転換し、かつ発現するときＤ−アラニン無しで増殖することになる。必要な増殖因子、サプリメント、アミノ酸、ビタミン、抗生物質、およびこれに類するものを含んでいる、または欠いている適切な培地を作成するためのかかる方法は当該技術分野で既知であり、また市販されている（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ）。
【０１０７】
別の実施形態では、本開示のプラスミドを含む栄養要求性細菌が一旦選択されると、この細菌は適切な培地上で選択的な圧力の存在の中で繁殖する。かかる繁殖は、栄養要求性因子を有しない培地内での細菌の増殖を含む。栄養要求性細菌内でのアミノ酸代謝酵素を発現するプラスミドの存在は、細菌とともにプラスミドの複製を確保し、したがって継続的にプラスミドが規制する細菌を選択する。本開示および本明細書の方法を備えるとき、プラスミドを含む栄養要求性細菌が増殖する培地の体積を調節することによって、当業者は、リステリアベクターの生産を容易にスケールアップすることができる。
【０１０８】
別の実施形態では、他の栄養要求性株および相補系が本開示の使用に適合されることを当業者は理解するであろう。
【０１０９】
一実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原は、相互に直接融合している。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原をコードする遺伝子は相互に直接融合している。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原はリンカーペプチドを介して動作可能に付着している。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原は異種ペプチドを介して付着している。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片は異種抗原へのＮ末端である。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片は単独で、すなわち融合されていない形態で発現および使用される。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片は、融合タンパク質のＮ最末端部分である。別の実施形態では、切断ＬＬＯはＮ末端ＬＬＯに到達するＣ末端において切断される。
【０１１０】
一実施形態では、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片および異種抗原は、相互に直接融合している。別の実施形態では、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片および異種抗原をコードする遺伝子は相互に直接融合している。別の実施形態では、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片および異種抗原はリンカーペプチドを介して動作可能に付着している。別の実施形態では、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片および異種抗原は異種ペプチドを介して付着している。別の実施形態では、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片は異種抗原へのＮ末端である。別の実施形態では、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片は単独で、すなわち融合されていない形態で発現および使用される。別の実施形態では、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片は、融合タンパク質のＮ最末端部分である。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡはＮ末端Ａｃｔに到達するＣ末端において切断される。
【０１１１】
本明細書で開示したとおり、顆粒球性のＭＤＳＣの抑制能力に予期されなかった変化があり、これはｔＬＬＯの過剰発現に起因し、かつ融合抗原のパートナリングとは無関係である（実施例１３を参照）。
【０１１２】
別の実施形態では、本明細書で開示された組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドをコードするプラスミドを含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型核酸は、本明細書に開示された組み換え型リステリア株のプラスミド中にある。別の実施形態では、プラスミドは、組み換え型リステリア株の染色体の中へと統合されないエピソーム性プラスミドである。別の実施形態では、プラスミドはリステリア株の染色体の中へと組み込まれる組み込みプラスミドである。別の実施形態では、プラスミドはマルチコピープラスミドである。
【０１１３】
一実施形態では、異種抗原は腫瘍関連抗原である。一実施形態では、本明細書で開示される組成物および方法の組み換え型リステリア株は腫瘍細胞によって発現される異種抗原性ポリペプチドを発現する。一実施形態では、腫瘍関連抗原は前立腺特異抗原（ＰＳＡ）である。別の実施形態では、腫瘍関連抗原はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原である。なお別の実施形態では、腫瘍関連抗原は、米国特出願公開第第ＵＳ２０１１／０１４２７９号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記述されているキメラＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原である。なお別の実施形態では、腫瘍関連抗原は血管形成抗原である。
【０１１４】
一実施形態では、本明細書に開示された組成物および方法の組み換え型リステリア株は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）をコードする第１または第２の核酸分子を含み、これは一実施形態では、前立腺腫瘍によって高度に発現される前立腺ガンのマーカーである。一実施形態では、ＰＳＡは前立腺上皮細胞によって分泌されるカリクレインセリンプロテアーゼ（ＫＬＫ３）であり、これは一実施形態では、前立腺ガンのマーカーとして広く使用される。本明細書で使用されるＰＳＡおよびｋｌｋ３という用語は互換性があり、すべて同一の意味および質を有する。
【０１１５】
一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は、腫瘍関連抗原をコードする核酸分子を含む。一実施形態では、腫瘍関連抗原はＫＬＫ３ポリペプチドまたはその断片を含む。一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は、ＫＬＫ３タンパク質をコードする核酸分子を含む。
【０１１６】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：
【０１１７】
ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号：２５；  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ３２９１５）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２５の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２５の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２５の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２５の断片である。
【０１１８】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：
【０１１９】
ＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＹＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号：２６）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２６の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２６の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２６の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２６の断片である。各々の可能性は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【０１２０】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：ＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号：２７  ；  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ５９９９５．１）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２７の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２７の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２７の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２７の断片である。
【０１２１】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つヌクレオチド分子によってコードされる：      ｇｇｔｇｔｃｔｔａｇｇｃａｃａｃｔｇｇｔｃｔｔｇｇａｇｔｇｃａａａｇｇａｔｃｔａｇｇｃａｃｇｔｇａｇｇｃｔｔｔｇｔａｔｇａａｇａａｔｃｇｇｇｇａｔｃｇｔａｃｃｃａｃｃｃｃｃｔｇｔｔｔｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇｇｇｃａｔｇｔｃｔｃｃｔｃｔｇｃｃｔｔｔｇｔｃｃｃｃｔａｇａｔｇａａｇｔｃｔｃｃａｔｇａｇｃｔａｃａａｇｇｇｃｃｔｇｇｔｇｃａｔｃｃａｇｇｇｔｇａｔｃｔａｇｔａａｔｔｇｃａｇａａｃａｇｃａａｇｔｇｃｔａｇｃｔｃｔｃｃｃｔｃｃｃｃｔｔｃｃａｃａｇｃｔｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｇａｇｇｇｇｇｔｔｇｔｃｃａｇｃｃｔｃｃａｇｃａｇｃａｔｇｇｇｇａｇｇｇｃｃｔｔｇｇｔｃａｇｃｃｔｃｔｇｇｇｔｇｃｃａｇｃａｇｇｇｃａｇｇｇｇｃｇｇａｇｔｃｃｔｇｇｇｇａａｔｇａａｇｇｔｔｔｔａｔａｇｇｇｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇａｇｇｃｔｃｃｃｃａｇｃｃｃｃａａｇｃｔｔａｃｃａｃｃｔｇｃａｃｃｃｇｇａｇａｇｃｔｇｔｇｔｃａｃｃａｔｇｔｇｇｇｔｃｃｃｇｇｔｔｇｔｃｔｔｃｃｔｃａｃｃｃｔｇｔｃｃｇｔｇａｃｇｔｇｇａｔｔｇｇｔｇａｇａｇｇｇｇｃｃａｔｇｇｔｔｇｇｇｇｇｇａｔｇｃａｇｇａｇａｇｇｇａｇｃｃａｇｃｃｃｔｇａｃｔｇｔｃａａｇｃｔｇａｇｇｃｔｃｔｔｔｃｃｃｃｃｃｃａａｃｃｃａｇｃａｃｃｃｃａｇｃｃｃａｇａｃａｇｇｇａｇｃｔｇｇｇｃｔｃｔｔｔｔｃｔｇｔｃｔｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃａｃｔｔｃａａｇｃｃｃａｔａｃｃｃｃｃａｇｔｃｃｃｃｔｃｃａｔａｔｔｇｃａａｃａｇｔｃｃｔｃａｃｔｃｃｃａｃａｃｃａｇｇｔｃｃｃｃｇｃｔｃｃｃｔｃｃｃａｃｔｔａｃｃｃｃａｇａａｃｔｔｔｃｔｔｃｃｃａｔｔｔｇｃｃｃａｇｃｃａｇｃｔｃｃｃｔｇｃｔｃｃｃａｇｃｔｇｃｔｔｔａｃｔａａａｇｇｇｇａａｇｔｔｃｃｔｇｇｇｃａｔｃｔｃｃｇｔｇｔｔｔｃｔｃｔｔｔｇｔｇｇｇｇｃｔｃａａａａｃｃｔｃｃａａｇｇａｃｃｔｃｔｃｔｃａａｔｇｃｃａｔｔｇｇｔｔｃｃｔｔｇｇａｃｃｇｔａｔｃａｃｔｇｇｔｃｃａｔｃｔｃｃｔｇａｇｃｃｃｃｔｃａａｔｃｃｔａｔｃａｃａｇｔｃｔａｃｔｇａｃｔｔｔｔｃｃｃａｔｔｃａｇｃｔｇｔｇａｇｔｇｔｃｃａａｃｃｃｔａｔｃｃｃａｇａｇａｃｃｔｔｇａｔｇｃｔｔｇｇｃｃｔｃｃｃａａｔｃｔｔｇｃｃｃｔａｇｇａｔａｃｃｃａｇａｔｇｃｃａａｃｃａｇａｃａｃｃｔｃｃｔｔｃｔｔｔｃｃｔａｇｃｃａｇｇｃｔａｔｃｔｇｇｃｃｔｇａｇａｃａａｃａａａｔｇｇｇｔｃｃｃｔｃａｇｔｃｔｇｇｃａａｔｇｇｇａｃｔｃｔｇａｇａａｃｔｃｃｔｃａｔｔｃｃｃｔｇａｃｔｃｔｔａｇｃｃｃｃａｇａｃｔｃｔｔｃａｔｔｃａｇｔｇｇｃｃｃａｃａｔｔｔｔｃｃｔｔａｇｇａａａａａｃａｔｇａｇｃａｔｃｃｃｃａｇｃｃａｃａａｃｔｇｃｃａｇｃｔｃｔｃｔｇａｇｔｃｃｃｃａａａｔｃｔｇｃａｔｃｃｔｔｔｔｃａａａａｃｃｔａａａａａｃａａａａａｇａａａａａｃａａａｔａａａａｃａａａａｃｃａａｃｔｃａｇａｃｃａｇａａｃｔｇｔｔｔｔｃｔｃａａｃｃｔｇｇｇａｃｔｔｃｃｔａａａｃｔｔｔｃｃａａａａｃｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃａｇｃａａｃｔｇａａｃｃｔｃｇｃｃａｔａａｇｇｃａｃｔｔａｔｃｃｃｔｇｇｔｔｃｃｔａｇｃａｃｃｃｃｔｔａｔｃｃｃｃｔｃａｇａａｔｃｃａｃａａｃｔｔｇｔａｃｃａａｇｔｔｔｃｃｃｔｔｃｔｃｃｃａｇｔｃｃａａｇａｃｃｃｃａａａｔｃａｃｃａｃａａａｇｇａｃｃｃａａｔｃｃｃｃａｇａｃｔｃａａｇａｔａｔｇｇｔｃｔｇｇｇｃｇｃｔｇｔｃｔｔｇｔｇｔｃｔｃｃｔａｃｃｃｔｇａｔｃｃｃｔｇｇｇｔｔｃａａｃｔｃｔｇｃｔｃｃｃａｇａｇｃａｔｇａａｇｃｃｔｃｔｃｃａｃｃａｇｃａｃｃａｇｃｃａｃｃａａｃｃｔｇｃａａａｃｃｔａｇｇｇａａｇａｔｔｇａｃａｇａａｔｔｃｃｃａｇｃｃｔｔｔｃｃｃａｇｃｔｃｃｃｃｃｔｇｃｃｃａｔｇｔｃｃｃａｇｇａｃｔｃｃｃａｇｃｃｔｔｇｇｔｔｃｔｃｔｇｃｃｃｃｃｇｔｇｔｃｔｔｔｔｃａａａｃｃｃａｃａｔｃｃｔａａａｔｃｃａｔｃｔｃｃｔａｔｃｃｇａｇｔｃｃｃｃｃａｇｔｔｃｃｃｃｃｔｇｔｃａａｃｃｃｔｇａｔｔｃｃｃｃｔｇａｔｃｔａｇｃａｃｃｃｃｃｔｃｔｇｃａｇｇｃｇｃｔｇｃｇｃｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｃｔｃｇｇａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｇｔｇａｇｔａｇｇｇｇｃｃｔｇｇｇｇｔｃｔｇｇｇｇａｇｃａｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｔｃｃｃａｇａｇｇａａｔａａｃａｇｃｔｇｇｇｃａｔｔｔｔｃｃｃｃａｇｇａｔａａｃｃｔｃｔａａｇｇｃｃａｇｃｃｔｔｇｇｇａｃｔｇｇｇｇｇａｇａｇａｇｇｇａａａｇｔｔｃｔｇｇｔｔｃａｇｇｔｃａｃａｔｇｇｇｇａｇｇｃａｇｇｇｔｔｇｇｇｇｃｔｇｇａｃｃａｃｃｃｔｃｃｃｃａｔｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｇｔｃｔｃｃａｔｃｔｇｔｇｔｃｃｃｔｃｔａｔｇｔｃｔｃｔｔｔｇｔｇｔｃｇｃｔｔｔｃａｔｔａｔｇｔｃｔｃｔｔｇｇｔａａｃｔｇｇｃｔｔｃｇｇｔｔｇｔｇｔｃｔｃｔｃｃｇｔｇｔｇａｃｔａｔｔｔｔｇｔｔｃｔｃｔｃｔｃｔｃｃｃｔｃｔｃｔｔｃｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｇｔｃｔｃｃａｔａｔｃｔｃｃｃｃｃｔｃｔｃｔｃｔｇｔｃｃｔｔｃｔｃｔｇｇｔｃｃｃｔｃｔｃｔａｇｃｃａｇｔｇｔｇｔｃｔｃａｃｃｃｔｇｔａｔｃｔｃｔｃｔｇｃｃａｇｇｃｔｃｔｇｔｃｔｃｔｃｇｇｔｃｔｃｔｇｔｃｔｃａｃｃｔｇｔｇｃｃｔｔｃｔｃｃｃｔａｃｔｇａａｃａｃａｃｇｃａｃｇｇｇａｔｇｇｇｃｃｔｇｇｇｇｇａｃｃｃｔｇａｇａａａａｇｇａａｇｇｇｃｔｔｔｇｇｃｔｇｇｇｃｇｃｇｇｔｇｇｃｔｃａｃａｃｃｔｇｔａａｔｃｃｃａｇｃａｃｔｔｔｇｇｇａｇｇｃｃａａｇｇｃａｇｇｔａｇａｔｃａｃｃｔｇａｇｇｔｃａｇｇａｇｔｔｃｇａｇａｃｃａｇｃｃｔｇｇｃｃａａｃｔｇｇｔｇａａａｃｃｃｃａｔｃｔｃｔａｃｔａａａａａｔａｃａａａａａａｔｔａｇｃｃａｇｇｃｇｔｇｇｔｇｇｃｇｃａｔｇｃｃｔｇｔａｇｔｃｃｃａｇｃｔａｃｔｃａｇｇａｇｃｔｇａｇｇｇａｇｇａｇａａｔｔｇｃａｔｔｇａａｃｃｔｇｇａｇｇｔｔｇａｇｇｔｔｇｃａｇｔｇａｇｃｃｇａｇａｃｃｇｔｇｃｃａｃｔｇｃａｃｔｃｃａｇｃｃｔｇｇｇｔｇａｃａｇａｇｔｇａｇａｃｔｃｃｇｃｃｔｃａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａｇａａａａｇａａａａｇａａａａｇａａａａｇｇａａｇｔｇｔｔｔｔａｔｃｃｃｔｇａｔｇｔｇｔｇｔｇｇｇｔａｔｇａｇｇｇｔａｔｇａｇａｇｇｇｃｃｃｃｔｃｔｃａｃｔｃｃａｔｔｃｃｔｔｃｔｃｃａｇｇａｃａｔｃｃｃｔｃｃａｃｔｃｔｔｇｇｇａｇａｃａｃａｇａｇａａｇｇｇｃｔｇｇｔｔｃｃａｇｃｔｇｇａｇｃｔｇｇｇａｇｇｇｇｃａａｔｔｇａｇｇｇａｇｇａｇｇａａｇｇａｇａａｇｇｇｇｇａａｇｇａａａａｃａｇｇｇｔａｔｇｇｇｇｇａａａｇｇａｃｃｃｔｇｇｇｇａｇｃｇａａｇｔｇｇａｇｇａｔａｃａａｃｃｔｔｇｇｇｃｃｔｇｃａｇｇｃａｇｇｃｔａｃｃｔａｃｃｃａｃｔｔｇｇａａａｃｃｃａｃｇｃｃａａａｇｃｃｇｃａｔｃｔａｃａｇｃｔｇａｇｃｃａｃｔｃｔｇａｇｇｃｃｔｃｃｃｃｔｃｃｃｃｇｇｃｇｇｔｃｃｃｃａｃｔｃａｇｃｔｃｃａａａｇｔｃｔｃｔｃｔｃｃｃｔｔｔｔｃｔｃｔｃｃｃａｃａｃｔｔｔａｔｃａｔｃｃｃｃｃｇｇａｔｔｃｃｔｃｔｃｔａｃｔｔｇｇｔｔｃｔｃａｔｔｃｔｔｃｃｔｔｔｇａｃｔｔｃｃｔｇｃｔｔｃｃｃｔｔｔｃｔｃａｔｔｃａｔｃｔｇｔｔｔｃｔｃａｃｔｔｔｃｔｇｃｃｔｇｇｔｔｔｔｇｔｔｃｔｔｃｔｃｔｃｔｃｔｃｔｔｔｃｔｃｔｇｇｃｃｃａｔｇｔｃｔｇｔｔｔｃｔｃｔａｔｇｔｔｔｃｔｇｔｃｔｔｔｔｃｔｔｔｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｇｔａｔｔｔｔｃｇｇｃｔｃａｃｃｔｔｇｔｔｔｇｔｃａｃｔｇｔｔｃｔｃｃｃｃｔｃｔｇｃｃｃｔｔｔｃａｔｔｃｔｃｔｃｔｇｃｃｃｔｔｔｔａｃｃｃｔｃｔｔｃｃｔｔｔｔｃｃｃｔｔｇｇｔｔｃｔｃｔｃａｇｔｔｃｔｇｔａｔｃｔｇｃｃｃｔｔｃａｃｃｃｔｃｔｃａｃａｃｔｇｃｔｇｔｔｔｃｃｃａａｃｔｃｇｔｔｇｔｃｔｇｔａｔｔｔｔｇｇｃｃｔｇａａｃｔｇｔｇｔｃｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｔｇｔｔｔｔｃｔｃａｃｔｇｔｔｔｃｔｔｔｔｔｃｔｃｔｔｔｔｇｇａｇｃｃｔｃｃｔｃｃｔｔｇｃｔｃｃｔｃｔｇｔｃｃｃｔｔｃｔｃｔｃｔｔｔｃｃｔｔａｔｃａｔｃｃｔｃｇｃｔｃｃｔｃａｔｔｃｃｔｇｃｇｔｃｔｇｃｔｔｃｃｔｃｃｃｃａｇｃａａａａｇｃｇｔｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｇｇｃａｃａｇｃｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃａｇｇｃｃａｇｇｔａｔｔｔｃａｇｇｔｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｔｃｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔｇａｇｃｃｔｃｃｔｇａａｇａａｔｃｇａｔｔｃｃｔｃａｇｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃｃａｃｇａｃｃｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃｃｔｇｃｃｇａｇｃｔｃａｃｇｇａｔｇｃｔｇｔｇａａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃａｇｇａｇｃｃａｇｃａｃｔｇｇｇｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｇｔａｃｇｃｃｔｇｇｇｃｃａｇａｔｇｇｔｇｃａｇｃｃｇｇｇａｇｃｃｃａｇａｔｇｃｃｔｇｇｇｔｃｔｇａｇｇｇａｇｇａｇｇｇｇａｃａｇｇａｃｔｃｃｔｇｇｇｔｃｔｇａｇｇｇａｇｇａｇｇｇｃｃａａｇｇａａｃｃａｇｇｔｇｇｇｇｔｃｃａｇｃｃｃａｃａａｃａｇｔｇｔｔｔｔｔｇｃｃｔｇｇｃｃｃｇｔａｇｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｇｔｇａｇｔｃａｔｃｃｃｔａｃｔｃｃｃａａｇａｔｃｔｔｇａｇｇｇａａａｇｇｔｇａｇｔｇｇｇａｃｃｔｔａａｔｔｃｔｇｇｇｃｔｇｇｇｇｔｃｔａｇａａｇｃｃａａｃａａｇｇｃｇｔｃｔｇｃｃｔｃｃｃｃｔｇｃｔｃｃｃｃａｇｃｔｇｔａｇｃｃａｔｇｃｃａｃｃｔｃｃｃｃｇｔｇｔｃｔｃａｔｃｔｃａｔｔｃｃｃｔｃｃｔｔｃｃｃｔｃｔｔｃｔｔｔｇａｃｔｃｃｃｔｃａａｇｇｃａａｔａｇｇｔｔａｔｔｃｔｔａｃａｇｃａｃａａｃｔｃａｔｃｔｇｔｔｃｃｔｇｃｇｔｔｃａｇｃａｃａｃｇｇｔｔａｃｔａｇｇｃａｃｃｔｇｃｔａｔｇｃａｃｃｃａｇｃａｃｔｇｃｃｃｔａｇａｇｃｃｔｇｇｇａｃａｔａｇｃａｇｔｇａａｃａｇａｃａｇａｇａｇｃａｇｃｃｃｃｔｃｃｃｔｔｃｔｇｔａｇｃｃｃｃｃａａｇｃｃａｇｔｇａｇｇｇｇｃａｃａｇｇｃａｇｇａａｃａｇｇｇａｃｃａｃａａｃａｃａｇａａａａｇｃｔｇｇａｇｇｇｔｇｔｃａｇｇａｇｇｔｇａｔｃａｇｇｃｔｃｔｃｇｇｇｇａｇｇｇａｇａａｇｇｇｇｔｇｇｇｇａｇｔｇｔｇａｃｔｇｇｇａｇｇａｇａｃａｔｃｃｔｇｃａｇａａｇｇｔｇｇｇａｇｔｇａｇｃａａａｃａｃｃｔｇｃｇｃａｇｇｇｇａｇｇｇｇａｇｇｇｃｃｔｇｃｇｇｃａｃｃｔｇｇｇｇｇａｇｃａｇａｇｇｇａａｃａｇｃａｔｃｔｇｇｃｃａｇｇｃｃｔｇｇｇａｇｇａｇｇｇｇｃｃｔａｇａｇｇｇｃｇｔｃａｇｇａｇｃａｇａｇａｇｇａｇｇｔｔｇｃｃｔｇｇｃｔｇｇａｇｔｇａａｇｇａｔｃｇｇｇｇｃａｇｇｇｔｇｃｇａｇａｇｇｇａａｃａａａｇｇａｃｃｃｃｔｃｃｔｇｃａｇｇｇｃｃｔｃａｃｃｔｇｇｇｃｃａｃａｇｇａｇｇａｃａｃｔｇｃｔｔｔｔｃｃｔｃｔｇａｇｇａｇｔｃａｇｇａａｃｔｇｔｇｇａｔｇｇｔｇｃｔｇｇａｃａｇａａｇｃａｇｇａｃａｇｇｇｃｃｔｇｇｃｔｃａｇｇｔｇｔｃｃａｇａｇｇｃｔｇｃｇｃｔｇｇｃｃｔｃｃｔａｔｇｇｇａｔｃａｇａｃｔｇｃａｇｇｇａｇｇｇａｇｇｇｃａｇｃａｇｇｇａｔｇｔｇｇａｇｇｇａｇｔｇａｔｇａｔｇｇｇｇｃｔｇａｃｃｔｇｇｇｇｇｔｇｇｃｔｃｃａｇｇｃａｔｔｇｔｃｃｃｃａｃｃｔｇｇｇｃｃｃｔｔａｃｃｃａｇｃｃｔｃｃｃｔｃａｃａｇｇｃｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｃａｇｔｃｔｃｔｃｃｃｃｔｃｃａｃｔｃｃａｔｔｃｔｃｃａｃｃｔａｃｃｃａｃａｇｔｇｇｇｔｃａｔｔｃｔｇａｔｃａｃｃｇａａｃｔｇａｃｃａｔ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ｔｇｇａａｇｇｔｇｇｃｃｔｃｔｇｔｇａｇｇａｇｃｃａｃｇｇｇｇａｃａｇｃａｔｃｃｔｇｃａｇａｔｇｇｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｔｇｔｃｃｃａｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｔａｃａａｇｇａｃｔｇｔｃｃｔｃｇｔｇｇａｃｃｃｔｃｃｃｃｔｃｔｇｃａｃａｇｇａｇｃｔｇｇａｃｃｃｔｇａａｇｔｃｃｃｔｔｃｃｔａｃｃｇｇｃｃａｇｇａｃｔｇｇａｇｃｃｃｃｔａｃｃｃｃｔｃｔｇｔｔｇｇａａｔｃｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｔｔｃｔｔｃｔｇｇａａｇｔｃｇｇｃｔｃｔｇｇａｇａｃａｔｔｔｃｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃａａａｇｃｔｇｇｇａａｃｔｇｃｔａｔｃｔｇｔｔａｔｃｔｇｃｃｔｇｔｃｃａｇｇｔｃｔｇａａａｇａｔａｇｇａｔｔｇｃｃｃａｇｇｃａｇａａａｃｔｇｇｇａｃｔｇａｃｃｔａｔｃｔｃａｃｔｃｔｃｔｃｃｃｔｇｃｔｔｔｔａｃｃｃｔｔａｇｇｇｔｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｃｔｔｇｔｃｔｇｔａａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃａａｇｇｔａｔｃａｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｔｇａａｃｃａｔｇｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇａａａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｔａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｔａｃｃｇｇａａｇｔｇｇａｔｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃｔｇａｇｃａｃｃｃｃｔａｔｃａａｇｔｃｃｃｔａｔｔｇｔａｇｔａａａｃｔｔｇｇａａｃｃｔｔｇｇａａａｔｇａｃｃａｇｇｃｃａａｇａｃｔｃａａｇｃｃｔｃｃｃｃａｇｔｔｃｔａｃｔｇａｃｃｔｔｔｇｔｃｃｔｔａｇｇｔｇｔｇａｇｇｔｃｃａｇｇｇｔｔｇｃｔａｇｇａａａａｇａａａｔｃａｇｃａｇａｃａｃａｇｇｔｇｔａｇａｃｃａｇａｇｔｇｔｔｔｃｔｔａａａｔｇｇｔｇｔａａｔｔｔｔｇｔｃｃｔｃｔｃｔｇｔｇｔｃｃｔｇｇｇｇａａｔａｃｔｇｇｃｃａｔｇｃｃｔｇｇａｇａｃａｔａｔｃａｃｔｃａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｇｇａｃａｃａｇｔｔａｇｇａｔｇｇｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｔｔａｔｔｔｇｔｇｇｇａｔａｃａｇａｇａｔｇａａａｇａｇｇｇｇｔｇｇｇａｔｃｃ（配列番号：２８；  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ１４８１０）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号：２８の残基４０１．．４４６、１６８８．．１８４７、３４７７．．３７６３、３９０７．．４０４３、および５４１３．．５５６８によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２８の相同体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２８の変異体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２８の異性体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２８の断片によってコードされる。
【０１２２】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＷＶＩＬＩＴＥＬＴＭＰＡＬＰＭＶＬＨＧＳＬＶＰＷＲＧＧＶ（配列番号：２９；  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１０２５２１８）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２９の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２９の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２９の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２９の断片である。
【０１２３】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つヌクレオチド分子によってコードされる：      ａｇｃｃｃｃａａｇｃｔｔａｃｃａｃｃｔｇｃａｃｃｃｇｇａｇａｇｃｔｇｔｇｔｃａｃｃａｔｇｔｇｇｇｔｃｃｃｇｇｔｔｇｔｃｔｔｃｃｔｃａｃｃｃｔｇｔｃｃｇｔｇａｃｇｔｇｇａｔｔｇｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｃｔｃｇｇａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｃａａａａｇｃｇｔｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｇｇｃａｃａｇｃｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃａｇｇｃｃａｇｇｔａｔｔｔｃａｇｇｔｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｔｃｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔｇａｇｃｃｔｃｃｔｇａａｇａａｔｃｇａｔｔｃｃｔｃａｇｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃｃａｃｇａｃｃｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃｃｔｇｃｃｇａｇｃｔｃａｃｇｇａｔｇｃｔｇｔｇａａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃａｇｇａｇｃｃａｇｃａｃｔｇｇｇｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｔｇｇｇｔｃａｔｔｃｔｇａｔｃａｃｃｇａａｃｔｇａｃｃａｔｇｃｃａｇｃｃｃｔｇｃｃｇａｔｇｇｔｃｃｔｃｃａｔｇｇｃｔｃｃｃｔａｇｔｇｃｃｃｔｇｇａｇａｇｇａｇｇｔｇｔｃｔａｇｔｃａｇａｇａｇｔａｇｔｃｃｔｇｇａａｇｇｔｇｇｃｃｔｃｔｇｔｇａｇｇａｇｃｃａｃｇｇｇｇａｃａｇｃａｔｃｃｔｇｃａｇａｔｇｇｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｔｇｔｃｃｃａｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｔａｃａａｇｇａｃｔｇｔｃｃｔｃｇｔｇｇａｃｃｃｔｃｃｃｃｔｃｔｇｃａｃａｇｇａｇｃｔｇｇａｃｃｃｔｇａａｇｔｃｃｃｔｔｃｃｃｃａｃｃｇｇｃｃａｇｇａｃｔｇｇａｇｃｃｃｃｔａｃｃｃｃｔｃｔｇｔｔｇｇａａｔｃｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｔｔｃｔｔｃｔｇｇａａｇｔｃｇｇｃｔｃｔｇｇａｇａｃａｔｔｔｃｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃａａａｇｃｔｇｇｇａａｃｔｇｃｔａｔｃｔｇｔｔａｔｃｔｇｃｃｔｇｔｃｃａｇｇｔｃｔｇａａａｇａｔａｇｇａｔｔｇｃｃｃａｇｇｃａｇａａａｃｔｇｇｇａｃｔｇａｃｃｔａｔｃｔｃａｃｔｃｔｃｔｃｃｃｔｇｃｔｔｔｔａｃｃｃｔｔａｇｇｇｔｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｃｔｔｇｔｃｔｇｔａａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃａａｇｇｔａｔｃａｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｔｇａａｃｃａｔｇｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇａａａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｔａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｔａｃｃｇｇａａｇｔｇｇａｔｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃｔｇａｇｃａｃｃｃｃｔａｔｃａａｃｃｃｃｃｔａｔｔｇｔａｇｔａａａｃｔｔｇｇａａｃｃｔｔｇｇａａａｔｇａｃｃａｇｇｃｃａａｇａｃｔｃａａｇｃｃｔｃｃｃｃａｇｔｔｃｔａｃｔｇａｃｃｔｔｔｇｔｃｃｔｔａｇｇｔｇｔｇａｇｇｔｃｃａｇｇｇｔｔｇｃｔａｇｇａａａａｇａａａｔｃａｇｃａｇａｃａｃａｇｇｔｇｔａｇａｃｃａｇａｇｔｇｔｔｔｃｔｔａａａｔｇｇｔｇｔａａｔｔｔｔｇｔｃｃｔｃｔｃｔｇｔｇｔｃｃｔｇｇｇｇａａｔａｃｔｇｇｃｃａｔｇｃｃｔｇｇａｇａｃａｔａｔｃａｃｔｃａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｇｇａｃａｃａｇａｔａｇｇａｔｇｇｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｔｔａｔｔｔｇｔｇｇｇｇｔａｃａｇａｇａｔｇａａａｇａｇｇｇｇｔｇｇｇａｔｃｃａｃａｃｔｇａｇａｇａｇｔｇｇａｇａｇｔｇａｃａｔｇｔｇｃｔｇｇａｃａｃｔｇｔｃｃａｔｇａａｇｃａｃｔｇａｇｃａｇａａｇｃｔｇｇａｇｇｃａｃａａｃｇｃａｃｃａｇａｃａｃｔｃａｃａｇｃａａｇｇａｔｇｇａｇｃｔｇａａａａｃａｔａａｃｃｃａｃｔｃｔｇｔｃｃｔｇｇａｇｇｃａｃｔｇｇｇａａｇｃｃｔａｇａｇａａｇｇｃｔｇｔｇａｇｃｃａａｇｇａｇｇｇａｇｇｇｔｃｔｔｃｃｔｔｔｇｇｃａｔｇｇｇａｔｇｇｇｇａｔｇａａｇｔａａｇｇａｇａｇｇｇａｃｔｇｇａｃｃｃｃｃｔｇｇａａｇｃｔｇａｔｔｃａｃｔａｔｇｇｇｇｇｇａｇｇｔｇｔａｔｔｇａａｇｔｃｃｔｃｃａｇａｃａａｃｃｃｔｃａｇａｔｔｔｇａｔｇａｔｔｔｃｃｔａｇｔａｇａａｃｔｃａｃａｇａａａｔａａａｇａｇｃｔｇｔｔａｔａｃｔｇｔｇ（配列番号：３０；  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１０３００４７）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３０の残基４２〜７５８によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３０の相同体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３０の変異体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３０の異性体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３０の断片によってコードされる。
【０１２４】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＫ（配列番号：３１；  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１０２５２２１）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３１の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３１の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質の配列は配列番号：３１を含む。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３１の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３１の断片である。
【０１２５】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つヌクレオチド配列によってコードされる：      ａｇｃｃｃｃａａｇｃｔｔａｃｃａｃｃｔｇｃａｃｃｃｇｇａｇａｇｃｔｇｔｇｔｃａｃｃａｔｇｔｇｇｇｔｃｃｃｇｇｔｔｇｔｃｔｔｃｃｔｃａｃｃｃｔｔｃｃｇｔｇａｃｇｔｇｇａｔｔｇｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｃｔｃｇｇａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｇｔｇａｇｔａｇｇｇｇｃｃｔｇｇｇｇｔｃｔｇｇｇｇａｇｃａｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｔｃｃｃａｇａｇｇａａｔａａｃａｇｃｔｇｇｇｃａｔｔｔｔｃｃｃｃａｇｇａｔａａｃｃｔｃｔａａｇｇｃｃａｇｃｃｔｔｇｇｇａｃｔｇｇｇｇｇａｇａｇａｇｇｇａａａｇｔｔｃｔｇｇｔｔｃａｇｇｔｃａｃａｔｇｇｇｇａｇｇｃａｇｇｇｔｔｇｇｇｇｃｔｇｇａｃｃａｃｃｃｔｃｃｃｃａｔｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｇｔｃｔｃｃａｔｃｔｇｔｇｔｔｃｃｔｃｔａｔｇｔｃｔｃｔｔｔｇｔｇｔｃｇｃｔｔｔｃａｔｔａｔｇｔｃｔｃｔｔｇｇｔａａｃｔｇｇｃｔｔｃｇｇｔｔｇｔｇｔｃｔｃｔｃｃｇｔｇｔｇａｃｔａｔｔｔｔｇｔｔｃｔｃｔｃｔｃｔｃｃｃｔｃｔｃｔｔｃｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｇｔ（配列番号：３２）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３２の残基４２〜７５８によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３２の相同体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３２の変異体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３２の異性体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３２の断片によってコードされる。
【０１２６】
別の実施形態では、ＫＬＫ３ペプチドの供給源であるＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：      ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号：３３）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３３の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３３の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３３の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３３の断片である。
【０１２７】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つヌクレオチド分子によってコードされる：       ａｇｃｃｃｃａａｇｃｔｔａｃｃａｃｃｔｇｃａｃｃｃｇｇａｇａｇｃｔｇｔｇｔｃａｃｃａｔｇｔｇｇｇｔｃｃｃｇｇｔｔｇｔｃｔｔｃｃｔｃａｃｃｃｔｇｔｃｃｇｔｇａｃｇｔｇｇａｔｔｇｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｃｔｃｇｇａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｃａａａａｇｃｇｔｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｇｇｃａｃａｇｃｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃａｇｇｃｃａｇｇｔａｔｔｔｃａｇｇｔｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｔｃｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔｇａｇｃｃｔｃｃｔｇａａｇａａｔｃｇａｔｔｃｃｔｃａｇｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｇｇｔｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｃｔｔｇｔｃｔｇｔａａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃａａｇｇｔａｔｃａｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｔｇａａｃｃａｔｇｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇａａａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｔａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｔａｃｃｇｇａａｇｔｇｇａｔｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃｔｇａｇｃａｃｃｃｃｔａｔｃａａｃｃｃｃｃｔａｔｔｇｔａｇｔａａａｃｔｔｇｇａａｃｃｔｔｇｇａａａｔｇａｃｃａｇｇｃｃａａｇａｃｔｃａａｇｃｃｔｃｃｃｃａｇｔｔｃｔａｃｔｇａｃｃｔｔｔｇｔｃｃｔｔａｇｇｔｇｔｇａｇｇｔｃｃａｇｇｇｔｔｇｃｔａｇｇａａａａｇａａａｔｃａｇｃａｇａｃａｃａｇｇｔｇｔａｇａｃｃａｇａｇｔｇｔｔｔｃｔｔａａａｔｇｇｔｇｔａａｔｔｔｔｇｔｃｃｔｃｔｃｔｇｔｇｔｃｃｔｇｇｇｇａａｔａｃｔｇｇｃｃａｔｇｃｃｔｇｇａｇａｃａｔａｔｃａｃｔｃａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｇｇａｃａｃａｇａｔａｇｇａｔｇｇｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｔｔａｔｔｔｇｔｇｇｇｇｔａｃａｇａｇａｔｇａａａｇａｇｇｇｇｔｇｇｇａｔｃｃａｃａｃｔｇａｇａｇａｇｔｇｇａｇａｇｔｇａｃａｔｇｔｇｃｔｇｇａｃａｃｔｇｔｃｃａｔｇａａｇｃａｃｔｇａｇｃａｇａａｇｃｔｇｇａｇｇｃａｃａａｃｇｃａｃｃａｇａｃａｃｔｃａｃａｇｃａａｇｇａｔｇｇａｇｃｔｇａａａａｃａｔａａｃｃｃａｃｔｃｔｇｔｃｃｔｇｇａｇｇｃａｃｔｇｇｇａａｇｃｃｔａｇａｇａａｇｇｃｔｇｔｇａｇｃｃａａｇｇａｇｇｇａｇｇｇｔｃｔｔｃｃｔｔｔｇｇｃａｔｇｇｇａｔｇｇｇｇａｔｇａａｇｔａａｇｇａｇａｇｇｇａｃｔｇｇａｃｃｃｃｃｔｇｇａａｇｃｔｇａｔｔｃａｃｔａｔｇｇｇｇｇｇａｇｇｔｇｔａｔｔｇａａｇｔｃｃｔｃｃａｇａｃａａｃｃｃｔｃａｇａｔｔｔｇａｔｇａｔｔｔｃｃｔａｇｔａｇａａｃｔｃａｃａ��ａａａｔａａａｇａｇｃｔｇｔｔａｔａｃｔｇｔｇ（配列番号：３４）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３４の残基４２〜７５８によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３４の相同体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３４の変異体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３４の異性体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３４の断片によってコードされる。
【０１２８】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＫＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号：３５；  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１０２５２１９）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３５の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３５の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３５の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３５の断片である。
【０１２９】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つヌクレオチド分子によってコードされる：      ａｇｃｃｃｃａａｇｃｔｔａｃｃａｃｃｔｇｃａｃｃｃｇｇａｇａｇｃｔｇｔｇｔｃａｃｃａｔｇｔｇｇｇｔｃｃｃｇｇｔｔｇｔｃｔｔｃｃｔｃａｃｃｃｔｇｔｃｃｇｔｇａｃｇｔｇｇａｔｔｇｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｃｔｃｇｇａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃｃａｃｇａｃｃｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃｃｔｇｃｃｇａｇｃｔｃａｃｇｇａｔｇｃｔｇｔｇａａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃａｇｇａｇｃｃａｇｃａｃｔｇｇｇｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｇｇｔｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｃｔｔｇｔｃｔｇｔａａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃａａｇｇｔａｔｃａｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｔｇａａｃｃａｔｇｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇａａａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｔａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｔａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃｔｇａｇｃａｃｃｃｃｔａｔｃａａｃｃｃｃｃｔａｔｔｇｔａｇｔａａａｃｔｔｇｇａａｃｃｔｔｇｇａａａｔｇａｃｃａｇｇｃｃａａｇａｃｔｃａａｇｃｃｔｃｃｃｃａｇｔｔｃｔａｃｔｇａｃｃｔｔｔｇｔｃｃｔｔａｇｇｔｇｔｇａｇｇｔｃｃａｇｇｇｔｔｇｃｔａｇｇａａａａｇａａａｔｃａｇｃａｇａｃａｃａｇｇｔｇｔａｇａｃｃａｇａｇｔｇｔｔｔｃｔｔａａａｔｇｇｔｇｔａａｔｔｔｔｇｔｃｃｔｃｔｃｔｇｔｇｔｃｃｔｇｇｇｇａａｔａｃｔｇｇｃｃａｔｇｃｃｔｇｇａｇａｃａｔａｔｃａｃｔｃａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｇｇａｃａｃａｇａｔａｇｇａｔｇｇｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｔｔａｔｔｔｇｔｇｇｇｇｔａｃａｇａｇａｔｇａａａｇａｇｇｇｇｔｇｇｇａｔｃｃａｃａｃｔｇａｇａｇａｇｔｇｇａｇａｇｔｇａｃａｔｇｔｇｃｔｇｇａｃａｃｔｇｔｃｃａｔｇａａｇｃａｃｔｇａｇｃａｇａａｇｃｔｇｇａｇｇｃａｃａａｃｇｃａｃｃａｇａｃａｃｔｃａｃａｇｃａａｇｇａｔｇｇａｇｃｔｇａａａａｃａｔａａｃｃｃａｃｔｃｔｇｔｃｃｔｇｇａｇｇｃａｃｔｇｇｇａａｇｃｃｔａｇａｇａａｇｇｃｔｇｔｇａｇｃｃａａｇｇａｇｇｇａｇｇｇｔｃｔｔｃｃｔｔｔｇｇｃａｔｇｇｇａｔｇｇｇｇａｔｇａａｇｔａａｇｇａｇａｇｇｇａｃｔｇｇａｃｃｃｃｃｔｇｇａａｇｃｔｇａｔｔｃａｃｔａｔｇｇｇｇｇｇａｇｇｔｇｔａｔｔｇａａｇｔｃｃｔｃｃａｇａｃａａｃｃｃｔｃａｇａｔｔｔｇａｔｇａｔｔｔｃｃｔａｇｔａｇａａｃｔｃａｃａｇａａａｔａａａｇａｇｃｔｇｔｔａｔａｃｔｇｔｇ（配列番号：３６；  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１０３００４８）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３６の残基４２〜７５８によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３６の相同体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３６の変異体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３６の異性体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３６の断片によってコードされる。
【０１３０】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号：３７；  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１６３９）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３７の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３７の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３７の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３７の断片である。
【０１３１】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つヌクレオチド分子によってコードされる：      ａｇｃｃｃｃａａｇｃｔｔａｃｃａｃｃｔｇｃａｃｃｃｇｇａｇａｇｃｔｇｔｇｔｃａｃｃａｔｇｔｇｇｇｔｃｃｃｇｇｔｔｇｔｃｔｔｃｃｔｃａｃｃｃｔｇｔｃｃｇｔｇａｃｇｔｇｇａｔｔｇｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｃｔｃｇｇａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｃａａａａｇｃｇｔｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｇｇｃａｃａｇｃｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃａｇｇｃｃａｇｇｔａｔｔｔｃａｇｇｔｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｔｃｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔｇａｇｃｃｔｃｃｔｇａａｇａａｔｃｇａｔｔｃｃｔｃａｇｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃｃａｃｇａｃｃｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃｃｔｇｃｃｇａｇｃｔｃａｃｇｇａｔｇｃｔｇｔｇａａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃａｇｇａｇｃｃａｇｃａｃｔｇｇｇｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｇｇｔｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｃｔｔｇｔｃｔｇｔａａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃａａｇｇｔａｔｃａｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｔｇａａｃｃａｔｇｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇａａａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｔａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｔａｃｃｇｇａａｇｔｇｇａｔｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃｔｇａｇｃａｃｃｃｃｔａｔｃａａｃｃｃｃｃｔａｔｔｇｔａｇｔａａａｃｔｔｇｇａａｃｃｔｔｇｇａａａｔｇａｃｃａｇｇｃｃａａｇａｃｔｃａａｇｃｃｔｃｃｃｃａｇｔｔｃｔａｃｔｇａｃｃｔｔｔｇｔｃｃｔｔａｇｇｔｇｔｇａｇｇｔｃｃａｇｇｇｔｔｇｃｔａｇｇａａａａｇａａａｔｃａｇｃａｇａｃａｃａｇｇｔｇｔａｇａｃｃａｇａｇｔｇｔｔｔｃｔｔａａａｔｇｇｔｇｔａａｔｔｔｔｇｔｃｃｔｃｔｃｔｇｔｇｔｃｃｔｇｇｇｇａａｔａｃｔｇｇｃｃａｔｇｃｃｔｇｇａｇａｃａｔａｔｃａｃｔｃａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｇｇａｃａｃａｇａｔａｇｇａｔｇｇｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｔｔａｔｔｔｇｔｇｇｇｇｔａｃａｇａｇａｔｇａａａｇａｇｇｇｇｔｇｇｇａｔｃｃａｃａｃｔｇａｇａｇａｇｔｇｇａｇａｇｔｇａｃａｔｇｔｇｃｔｇｇａｃａｃｔｇｔｃｃａｔｇａａｇｃａｃｔｇａｇｃａｇａａｇｃｔｇｇａｇｇｃａｃａａｃｇｃａｃｃａｇａｃａｃｔｃａｃａｇｃａａｇｇａｔｇｇａｇｃｔｇａａａａｃａｔａａｃｃｃａｃｔｃｔｇｔｃｃｔｇｇａｇｇｃａｃｔｇｇｇａａｇｃｃｔａｇａｇａａｇｇｃｔｇｔｇａｇｃｃａａｇｇａｇｇｇａｇｇｇｔｃｔｔｃｃｔｔｔｇｇｃａｔｇｇｇａｔｇｇｇｇａｔｇａａｇｔａａｇｇａｇａｇｇｇａｃｔｇｇａｃｃｃｃｃｔｇｇａａｇｃｔｇａｔｔｃａｃｔａｔｇｇｇｇｇｇａｇｇｔｇｔａｔｔｇａａｇｔｃｃｔｃｃａｇａｃａａｃｃｃｔｃａｇａｔｔｔｇａｔｇａｔｔｔｃｃｔａｇｔａｇａａｃｔｃａｃａｇａａａｔａａａｇａｇｃｔｇｔｔａｔａｃｔｇｔｇ（配列番号：３８；  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１６４８）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３８の残基４２〜８２７によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３８の相同体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３８の変異体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３８の異性体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３８の断片によってコードされる。
【０１３２】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号：３９  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＸ２９４０７．１）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３９の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３９の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３９の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質の配列は配列番号：３９を含む。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３９の断片である。
【０１３３】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つヌクレオチド分子によってコードされる：      ｇｇｇｇｇａｇｃｃｃｃａａｇｃｔｔａｃｃａｃｃｔｇｃａｃｃｃｇｇａｇａｇｃｔｇｔｇｔｃａｃｃａｔｇｔｇｇｇｔｃｃｃｇｇｔｔｇｔｃｔｔｃｃｔｃａｃｃｃｔｇｔｃｃｇｔｇａｃｇｔｇｇａｔｔｇｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｃｔｃｇｇａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｃａａａａｇｃｇｔｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｇｇｃａｃａｇｃｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃａｇｇｃｃａｇｇｔａｔｔｔｃａｇｇｔｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｔｃｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔｇａｇｃｃｔｃｃｔｇａａｇａａｔｃｇａｔｔｃｃｔｃａｇｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃｃａｃｇａｃｃｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃｃｔｇｃｃｇａｇｃｔｃａｃｇｇａｔｇｃｔｇｔｇａａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃａｇｇａｇｃｃａｇｃａｃｔｇｇｇｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｇｇｔｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｃｔｔｇｔｃｔｇｔａａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃａａｇｇｔａｔｃａｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｔｇａａｃｃａｔｇｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇａａａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｔａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｔａｃｃｇｇａａｇｔｇｇａｔｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃｔｇａｇｃａｃｃｃｃｔａｔｃａａｃｔｃｃｃｔａｔｔｇｔａｇｔａａａｃｔｔｇｇａａｃｃｔｔｇｇａａａｔｇａｃｃａｇｇｃｃａａｇａｃｔｃａｇｇｃｃｔｃｃｃｃａｇｔｔｃｔａｃｔｇａｃｃｔｔｔｇｔｃｃｔｔａｇｇｔｇｔｇａｇｇｔｃｃａｇｇｇｔｔｇｃｔａｇｇａａａａｇａａａｔｃａｇｃａｇａｃａｃａｇｇｔｇｔａｇａｃｃａｇａｇｔｇｔｔｔｃｔｔａａａｔｇｇｔｇｔａａｔｔｔｔｇｔｃｃｔｃｔｃｔｇｔｇｔｃｃｔｇｇｇｇａａｔａｃｔｇｇｃｃａｔｇｃｃｔｇｇａｇａｃａｔａｔｃａｃｔｃａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｇｇａｃａｃａｇａｔａｇｇａｔｇｇｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｔｔａｔｔｔｇｔｇｇｇｇｔａｃａｇａｇａｔｇａａａｇａｇｇｇｇｔｇｇｇａｔｃｃａｃａｃｔｇａｇａｇａｇｔｇｇａｇａｇｔｇａｃａｔｇｔｇｃｔｇｇａｃａｃｔｇｔｃｃａｔｇａａｇｃａｃｔｇａｇｃａｇａａｇｃｔｇｇａｇｇｃａｃａａｃｇｃａｃｃａｇａｃａｃｔｃａｃａｇｃａａｇｇａｔｇｇａｇｃｔｇａａａａｃａｔａａｃｃｃａｃｔｃｔｇｔｃｃｔｇｇａｇｇｃａｃｔｇｇｇａａｇｃｃｔａｇａｇａａｇｇｃｔｇｔｇａｇｃｃａａｇｇａｇｇｇａｇｇｇｔｃｔｔｃｃｔｔｔｇｇｃａｔｇｇｇａｔｇｇｇｇａｔｇａａｇｔａｇｇｇａｇａｇｇｇａｃｔｇｇａｃｃｃｃｃｔｇｇａａｇｃｔｇａｔｔｃａｃｔａｔｇｇｇｇｇｇａｇｇｔｇｔａｔｔｇａａｇｔｃｃｔｃｃａｇａｃａａｃｃｃｔｃａｇａｔｔｔｇａｔｇａｔｔｔｃｃｔａｇｔａｇａａｃｔｃａｃａｇａａａｔａａａｇａｇｃｔｇｔｔａｔａｃｔｇｃｇａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａ（配列番号：４０；  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＣ０５６６６５）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４０の残基４７〜８３２によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４０の相同体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４０の変異体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４０の異性体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４０の断片によってコードされる。
【０１３４】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡ（配列番号：４１；  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＪ４５９７８２）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４１の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４１の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４１の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４１の断片である。
【０１３５】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＶＳＨＰＹＳＱＤＬＥＧＫＧＥＷＧＰ（配列番号：４２、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＪ５１２３４６）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４２の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４２の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４２の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質の配列は配列番号：４２を含む。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４２の断片である。
【０１３６】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＥＲＧＨＧＷＧＤＡＧＥＧＡＳＰＤＣＱＡＥＡＬＳＰＰＴＱＨＰＳＰＤＲＥＬＧＳＦＬＳＬＰＡＰＬＱＡＨＴＰＳＰＳＩＬＱＱＳＳＬＰＨＱＶＰＡＰＳＨＬＰＱＮＦＬＰＩＡＱＰＡＰＣＳＱＬＬＹ（配列番号：４３、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＪ４５９７８４）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４３の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４３の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質の配列は配列番号：４３を含む。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４３の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４３の断片である。
【０１３７】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号：４４  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＪ４５９７８３）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４４の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４４の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４４の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４４の断片である。
【０１３８】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つヌクレオチド分子によってコードされる：      ａａｇｔｔｔｃｃｃｔｔｃｔｃｃｃａｇｔｃｃａａｇａｃｃｃｃａａａｔｃａｃｃａｃａａａｇｇａｃｃｃａａｔｃｃｃｃａｇａｃｔｃａａｇａｔａｔｇｇｔｃｔｇｇｇｃｇｃｔｇｔｃｔｔｇｔｇｔｃｔｃｃｔａｃｃｃｔｇａｔｃｃｃｔｇｇｇｔｔｃａａｃｔｃｔｇｃｔｃｃｃａｇａｇｃａｔｇａａｇｃｃｔｃｔｃｃａｃｃａｇｃａｃｃａｇｃｃａｃｃａａｃｃｔｇｃａａａｃｃｔａｇｇｇａａｇａｔｔｇａｃａｇａａｔｔｃｃｃａｇｃｃｔｔｔｃｃｃａｇｃｔｃｃｃｃｃｔｇｃｃｃａｔｇｔｃｃｃａｇｇａｃｔｃｃｃａｇｃｃｔｔｇｇｔｔｃｔｃｔｇｃｃｃｃｃｇｔｇｔｃｔｔｔｔｃａａａｃｃｃａｃａｔｃｃｔａａａｔｃｃａｔｃｔｃｃｔａｔｃｃｇａｇｔｃｃｃｃｃａｇｔｔｃｃｔｃｃｔｇｔｃａａｃｃｃｔｇａｔｔｃｃｃｃｔｇａｔｃｔａｇｃａｃｃｃｃｃｔｃｔｇｃａｇｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｃｔｃｇｇａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔａｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔａｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｃａａａａｇｃｇｔｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｇｇｃａｃａｇｃｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃａｇｇｃｃａｇｇｔａｔｔｔｃａｇｇｔｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｔｃｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔｇａｇｃｃｔｃｃｔｇａａｇａａｔｃｇａｔｔｃｃｔｃａｇｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃｃａｃｇａｃｃｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃｃｔｇｃｃｇａｇｃｔｃａｃｇｇａｔｇｃｔａｔｇａａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃａｇｇａｇｃｃａｇｃａｃｔｇｇｇｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｇｇｔｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｃｔｔｇｔｃｔｇｔａａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃａａｇｇｔａｔｃａｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｔｇａａｃｃａｔｇｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇａａａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｔａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｔａｃｃｇｇａａｇｔｇｇａｔｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃｔｇａｇｃａｃｃｃｃｔａｔｃａａｃｔｃｃｃｔａｔｔｇｔａｇｔａａａｃｔｔｇｇａａｃｃｔｔｇｇａａａｔｇａｃｃａｇｇｃｃａａｇａｃｔｃａｇｇｃｃｔｃｃｃｃａｇｔｔｃｔａｃｔｇａｃｃｔｔｔｇｔｃｃｔｔａｇｇｔｇｔｇａｇｇｔｃｃａｇｇｇｔｔｇｃｔａｇｇａａａａｇａａａｔｃａｇｃａｇａｃａｃａｇｇｔｇｔａｇａｃｃａｇａｇｔｇｔｔｔｃｔｔａａａｔｇｇｔｇｔａａｔｔｔｔｇｔｃｃｔｃｔｃｔｇｔｇｔｃｃｔｇｇｇｇａａｔａｃｔｇｇｃｃａｔｇｃｃｔｇｇａｇａｃａｔａｔｃａｃｔｃａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｇｇａｃａｃａｇａｔａｇｇａｔｇｇｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｔｔａｔｔｔｇｔｇｇｇｇｔａｃａｇａｇａｔｇａａａｇａｇｇｇｇｔｇｇｇａｔｃｃａｃａｃｔｇａｇａｇａｇｔｇｇａｇａｇｔｇａｃａｔｇｔｇｃｔｇｇａｃａｃｔｇｔｃｃａｔｇａａｇｃａｃｔｇａｇｃａｇａａｇｃｔｇｇａｇｇｃａｃａａｃｇｃａｃｃａｇａｃａｃｔｃａｃａｇｃａａｇｇａｔｇｇａｇｃｔｇａａａａｃａｔａａｃｃｃａｃｔｃｔｇｔｃｃｔｇｇａｇｇｃａｃｔｇｇｇａａｇｃｃｔａｇａｇａａｇｇｃｔｇｔｇａａｃｃａａｇｇａｇｇｇａｇｇｇｔｃｔｔｃｃｔｔｔｇｇｃａｔｇｇｇａｔｇｇｇｇａｔｇａａｇｔａａｇｇａｇａｇｇｇａｃｔｇａｃｃｃｃｃｔｇｇａａｇｃｔｇａｔｔｃａｃｔａｔｇｇｇｇｇｇａｇｇｔｇｔａｔｔｇａａｇｔｃｃｔｃｃａｇａｃａａｃｃｃｔｃａｇａｔｔｔｇａｔｇａｔｔｔｃｃｔａｇｔａｇａａｃｔｃａｃａｇａａａｔａａａｇａｇｃｔｇｔｔａｔａｃｔｇｔｇａａ（配列番号：４５；  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ０７７３０）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４５の残基６７〜１０８８によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４５の相同体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４５の変異体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４５の異性体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４５の断片によってコードされる。
【０１３９】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：
【０１４０】
ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＫ（配列番号：４６；  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１０３００５０）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４６の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４６の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質の配列は配列番号：４６を含む。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４６の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４６の断片である。
【０１４１】
別の実施形態では、ＫＬＫ３ペプチドの供給源であるＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：
【０１４２】
ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号：４７；  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１０６４０４９）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４７の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４７の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４７の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４７の断片である。
【０１４３】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：
【０１４４】
ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＫＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号：４８；  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１０３００４８）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４８の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４８の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４８の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：４８の断片である。
【０１４５】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次のＧｅｎＢａｎｋ受入番号のうちの１つに示される配列によってコードされる：ＢＣ００５３０７、ＡＪ３１０９３８、ＡＪ３１０９３７、ＡＦ３３５４７８、ＡＦ３３５４７７、Ｍ２７２７４、およびＭ２６６６３。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は上記ＧｅｎＢａｎｋ受入番号のうちの１つに示される配列によってコードされる。
【０１４６】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次のＧｅｎＢａｎｋ受入番号のうちの１つに示される配列によってコードされる：ＮＭ＿００１０３００５０、ＮＭ＿００１０３００４９、ＮＭ＿００１０３００４８、ＮＭ＿００１０３００４７、ＮＭ＿００１６４８、ＡＪ４５９７８２、ＡＪ５１２３４６、またはＡＪ４５９７８４。各々の可能性は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。一つの実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列がＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲ（配列番号：４９）を欠いている、本明細書に記述された配列のいずれかの変異体によってコードされる。
【０１４７】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次のＧｅｎＢａｎｋ受入番号のうちの１つに示される配列を含む：Ｘ１３９４３、Ｘ１３９４２、Ｘ１３９４０、Ｘ１３９４１、およびＸ１３９４４。
【０１４８】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は当該技術分野で既知の任意の他のＫＬＫ３タンパク質である。
【０１４９】
別の実施形態では、ＫＬＫ３ペプチドは当該技術分野で既知の任意の他のＫＬＫ３ペプチドである。別の実施形態では、ＫＬＫ３ペプチドは当該技術分野で既知の任意の他のＫＬＫ３ペプチドの断片である。
【０１５０】
「ＫＬＫ３ペプチド」とは、別の実施形態では、全長ＫＬＫ３タンパク質を指す。別の実施形態では、この用語はＫＬＫ３タンパク質の断片を指す。別の実施形態では、この用語は、ＫＬＫ３シグナルペプチドを欠くＫＬＫ３タンパク質の断片を指す。別の実施形態では、この用語は、ＫＬＫ３シグナルペプチドを除いてＫＬＫ３配列全体を含むＫＬＫ３タンパク質を指す。「ＫＬＫ３シグナル配列」とは、別の実施形態では、本質的にＫＬＫ３タンパク質上に見られる任意のシグナル配列を指す。別の実施形態では、本明細書に開示された方法および組成物のＫＬＫ３タンパク質はいずれのシグナル配列も含まない。
【０１５１】
別の実施形態では、本明細書に開示された方法および組成物で使用するためのＫＬＫ３ペプチダーゼの供給源であるカリクレイン関連ペプチダーゼ３（ＫＬＫ３タンパク質）は、ＰＳＡタンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はＰ−３０抗原タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はガンマセミノプロテインタンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はカリクレイン３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はセメノゲラーゼタンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はセミニンタンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は当該技術分野で既知のＫＬＫ３タンパク質の任意の他のタイプである。
【０１５２】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はスプライス変異体１  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はスプライス変異体２  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はスプライス変異体３  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は転写変異体１  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は転写変異体２  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は転写変異体３  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は転写変異体４  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は転写変異体５  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は転写変異体６  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はスプライス変異体ＲＰ５  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は当該技術分野で既知の任意の他のスプライス変異体ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は当該技術分野で既知の任意の他の転写変異体ＫＬＫ３タンパク質である。
【０１５３】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は成熟ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はプロＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、リーダー配列は、本明細書に開示された方法および組成物の成熟ＫＬＫ３タンパク質から除去されている。
【０１５４】
別の実施形態では、本明細書に開示された方法および組成物のＫＬＫ３ペプチドの供給源であるＫＬＫ３タンパク質は、ヒトＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は霊長類ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は当該技術分野で既知の任意の他の種のＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、上記ＫＬＫ３タンパク質の１つは、「ＫＬＫ３タンパク質」と当技術分野では呼ばれる。
【０１５５】
一実施形態では、本明細書に開示されたＰＳＡタンパク質に融合された切断ＬＬＯを含む組み換え型ポリペプチドは、次の配列によりコードされる：
【０１５６】
ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＧＣＴＡＧＴＴＴＴＴＡＴＴＡＣＡＣＴＴＡＴＡＴＴＡＧＴＴＡＧＴＣＴＡＣＣＡＡＴＴＧＣＧＣＡＡＣＡＡＡＣＴＧＡＡＧＣＡＡＡＧＧＡＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＴＴＣＡＡＴＡＡＡＧＡＡＡＡＴＴＣＡＡＴＴＴＣＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＴＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴＣＣＴＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣＡＣＧＣＧＧＡＴＧＡＡＡＴＣＧＡＴＡＡＧＴＡＴＡＴＡＣＡＡＧＧＡＴＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＡＴＧＴＡＴＴＡＧＴＡＴＡＣＣＡＣＧＧＡＧＡＴＧＣＡＧＴＧＡＣＡＡＡＴＧＴＧＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＴＧＡＡＴＡＴＡＴＴＧＴＴＧＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＣＣＡＴＣＡＡＴＣＡＡＡＡＴＡＡＴＧＣＡＧＡＣＡＴＴＣＡＡＧＴＴＧＴＧＡＡＴＧＣＡＡＴＴＴＣＧＡＧＣＣＴＡＡＣＣＴＡＴＣＣＡＧＧＴＧＣＴＣＴＣＧＴＡＡＡＡＧＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＡＴＴＡＧＴＡＧＡＡＡＡＴＣＡＡＣＣＡＧＡＴＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＴＡＡＡＡＣＧＴＧＡＴＴＣＡＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＧＣＡＴＴＧＡＴＴＴＧＣＣＡＧＧＴＡＴＧＡＣＴＡＡＴＣＡＡＧＡＣＡＡＴＡＡＡＡＴＡＧＴＴＧＴＡＡＡＡＡＡＴＧＣＣＡＣＴＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＴＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＴＡＡＡＴＡＣＡＴＴＡＧＴＧＧＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＴＧＡＡＡＡＡＴＡＴＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＡＡＡＴＧＴＡＡＧＴＧＣＡＡＡＡＡＴＴＧＡＴＴＡＴＧＡＴＧＡＣＧＡＡＡＴＧＧＣＴＴＡＣＡＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＡＡＡＴＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＡＴＴＴＡＡＡＧＣＴＧＴＡＡＡＴＡＡＴＡＧＣＴＴＧＡＡＴＧＴＡＡＡＣＴＴＣＧＧＣＧＣＡＡＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＧＡＡＡＡＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＴＴＡＡＡＣＡＡＡＴＴＴＡＣＴＡＴＡＡＣＧＴＧＡＡＴＧＴＴＡＡＴＧＡＡＣＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＴＴＣＣＡＧＡＴＴＴＴＴＣＧＧＣＡＡＡＧＣＴＧＴＴＡＣＴＡＡＡＧＡＧＣＡＧＴＴＧＣＡＡＧＣＧＣＴＴＧＧＡＧＴＧＡＡＴＧＣＡＧＡＡＡＡＴＣＣＴＣＣＴＧＣＡＴＡＴＡＴＣＴＣＡＡＧＴＧＴＧＧＣＧＴＡＴＧＧＣＣＧＴＣＡＡＧＴＴＴＡＴＴＴＧＡＡＡＴＴＡＴＣＡＡＣＴＡＡＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＣＴＡＡＡＧＴＡＡＡＡＧＣＴＧＣＴＴＴＴＧＡＴＧＣＴＧＣＣＧＴＡＡＧＣＧＧＡＡＡＡＴＣＴＧＴＣＴＣＡＧＧＴＧＡＴＧＴＡＧＡＡＣＴＡＡＣＡＡＡＴＡＴＣＡＴＣＡＡＡＡＡＴＴＣＴＴＣＣＴＴＣＡＡＡＧＣＣＧＴＡＡＴＴＴＡＣＧＧＡＧＧＴＴＣＣＧＣＡＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＡＴＣＡＴＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＣＴＣＧＧＡＧＡＣＴＴＡＣＧＣＧＡＴＡＴＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＧＧＣＧＣＴＡＣＴＴＴＴＡＡＴＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡＧＧＡＧＴＴＣＣＣＡＴＴＧＣＴＴＡＴＡＣＡＡＣＡＡＡＣＴＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＣＡＡＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＣＡＡＣＴＣＡＧＡＡＴＡＴＡＴＴＧＡＡＡＣＡＡＣＴＴＣＡＡＡＡＧＣＴＴＡＴＡＣＡＧＡＴＧＧＡＡＡＡＡＴＴＡＡＣＡＴＣＧＡＴＣＡＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＴＡＣＧＴＴＧＣＴＣＡＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴＴＣＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＧＴＡＡＡＴＴＡＴＧＡＴＣＴＣＧＡＧａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｃａａａａｇｃｇｔｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｇｇｃａｃａｇｃｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃａｇｇｃｃａｇｇｔａｔｔｔｃａｇｇｔｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｔｃｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔｇａｇｃｃｔｃｃｔｇａａｇａａｔｃｇａｔｔｃｃｔｃａｇｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃｃａｃｇａｃｃｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃｃｔｇｃｃｇａｇｃｔｃａｃｇｇａｔｇｃｔｇｔｇａａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃａｇｇａｇｃｃａｇｃａｃｔｇｇｇｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｇｇｔｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｃｔｔｇｔｃｔｇｔｔａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃａａｇｇｔａｔｃａｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｔｇａａｃｃａｔｇｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇａａａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｔａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｔａｃｃｇｇａａｇｔｇｇａｔｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃ  （配列番号：  ５０）。別の実施形態では、融合タンパク質は配列番号：５０の相同体によってコードされる。別の実施形態では、融合タンパク質は配列番号：５０の変異体によってコードされる。別の実施形態では、融合タンパク質は配列番号：５０の異性体によってコードされる。一実施形態では、融合タンパク質内の「ｃｔｃｇａｇ」配列は、腫瘍抗原をプラスミド内の切断ＬＬＯに結合するために使用されるＸｈｏ  Ｉ制限部位を表す。
【０１５７】
別の実施形態では、本明細書に開示されたＰＳＡタンパク質に融合された切断ＬＬＯを含む組み換え型ポリペプチドは、次の配列を含む：
【０１５８】
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＬＥＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＹＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（ＰＳＡ配列は下線付き）（配列番号：５１）。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質は配列番号：５１の相同体である。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質は配列番号：５１の変異体である。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質は配列番号：５１の異性体である。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質は配列番号：５１の断片である。
【０１５９】
一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は、腫瘍関連抗原をコードする核酸分子を含むが、ここで抗原はＨＰＶ−Ｅ７タンパク質を含む。一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は、ＨＰＶ−Ｅ７タンパク質をコードする核酸分子を含む。
【０１６０】
一実施形態では、Ｅ７タンパク質全体またはその断片のいずれかが、ＬＬＯタンパク質またはその切断部またはペプチド、ＡｃｔＡタンパク質またはその切断部またはペプチド、またはＰＥＳＴ様配列を含むペプチドに融合され、本開示の組成物および方法の組み換え型ポリペプチドまたはペプチドを生成する。別の実施形態では、（全体でまたは断片の供与源としてのいずれかで）利用されるＥ７タンパク質の配列は、
【０１６１】
ＭＨＧＤＴＰＴＬＨＥＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤＬＹＣＹＥＱＬＮＤＳＳＥＥＥＤＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲＴＬＥＤＬＬＭＧＴＬＧＩＶＣＰＩＣＳＱＫＰ（配列番号：５２）。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：５２の相同体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：５２の変異体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：５２の異性体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：５２の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：５２の相同体の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：５２の変異体の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：５２の異性体の断片である。
【０１６２】
別の実施形態では、Ｅ７タンパク質の配列は、
【０１６３】
ＭＨＧＰＫＡＴＬＱＤＩＶＬＨＬＥＰＱＮＥＩＰＶＤＬＬＣＨＥＱＬＳＤＳＥＥＥＮＤＥＩＤＧＶＮＨＱＨＬＰＡＲＲＡＥＰＱＲＨＴＭＬＣＭＣＣＫＣＥＡＲＩＥＬＶＶＥＳＳＡＤＤＬＲＡＦＱＱＬＦＬＮＴＬＳＦＶＣＰＷＣＡＳＱＱ（配列番号：５３）。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：５３の相同体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：５３の変異体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：５３の異性体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：５３の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：５３の相同体の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：５３の変異体の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：５３の異性体の断片である。
【０１６４】
別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は以下のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つに示される配列を有する：Ｍ２４２１５、ＮＣ＿００４５００、Ｖ０１１１６、Ｘ６２８４３、またはＭ１４１１９。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の相同体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の変異体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の異性体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の相同体の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の変異体の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の異性体の断片である。
【０１６５】
一実施形態では、ＨＰＶ抗原はＨＰＶ１６である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−１８である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８から選択される。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−３１である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−３５である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−３９である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−４５である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−５１である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−５２である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−５８である。別の実施形態では、ＨＰＶは高リスクＨＰＶタイプである。別の実施形態では、ＨＰＶは粘膜ＨＰＶタイプである。
【０１６６】
一実施形態では、ＨＰＶ  Ｅ６はＨＰＶ−１６由来である。別の実施形態では、ＨＰＶ  Ｅ７はＨＰＶ−１６由来である。別の実施形態では、ＨＰＶ−Ｅ６はＨＰＶ−１８由来である。別の実施形態では、ＨＰＶ−Ｅ７はＨＰＶ−１８由来である。別の実施形態では、ＨＰＶ  Ｅ６抗原が、本開示の組成物または方法でのＥ７抗原の代わりにまたはＥ７抗原に加えて、ＨＰＶ媒介性疾患、障害、または症状を治療もしくは軽快するために利用される。別の実施形態では、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７は、ＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７の代わりにまたはこれと組み合せて利用される。かかる実施形態では、組み換え型リステリアはＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７を染色体から、ならびにＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７をプラスミドから発現してもよく、またはその反対であってもよい。別の実施形態では、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７抗原ならびにＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７抗原は、本明細書に開示された組み換え型リステリア内に存在するプラスミドから発現される。別の実施形態では、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７抗原ならびにＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７抗原は、本明細書に開示された組み換え型リステリアの染色体から発現される。別の実施形態では、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７抗原ならびにＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７抗原は上記の実施形態の任意の組み合せで発現され、これには各々のＨＰＶ株由来の各々のＥ６およびＥ７抗原がプラスミドまたは染色体のいずれかから発現されるものを含む。
【０１６７】
別の実施形態では、Ｅ７タンパク質全体またはその断片のいずれかは、ＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列含有ペプチドに融合され、本明細書で開示された組み換え型ポリペプチドを生成する。一実施形態では、利用されるＥ７タンパク質（全体または断片の供給源としてのいずれか）は配列番号：５４に記載されたアミノ酸配列を含む。
【０１６８】
Ｈ    Ｇ    Ｄ    Ｔ    Ｐ    Ｔ    Ｌ    Ｈ    Ｅ    Ｙ    Ｍ    Ｌ    Ｄ    Ｌ    Ｑ    Ｐ    Ｅ    Ｔ    Ｔ    Ｄ    Ｌ    Ｙ    Ｃ    Ｙ    Ｅ    Ｑ    Ｌ    Ｎ    Ｄ    Ｓ    Ｓ    Ｅ    Ｅ    Ｅ    Ｄ    Ｅ    Ｉ    Ｄ    Ｇ    Ｐ    Ａ    Ｇ    Ｑ    Ａ    Ｅ    Ｐ    Ｄ    Ｒ    Ａ    Ｈ    Ｙ    Ｎ    Ｉ    Ｖ    Ｔ    Ｆ    Ｃ    Ｃ    Ｋ    Ｃ    Ｄ    Ｓ    Ｔ    Ｌ    Ｒ    Ｌ    Ｃ    Ｖ    Ｑ    Ｓ    Ｔ    Ｈ    Ｖ    Ｄ    Ｉ    Ｒ    Ｔ    Ｌ    Ｅ    Ｄ    Ｌ    Ｌ    Ｍ    Ｇ    Ｔ    Ｌ    Ｇ    Ｉ    Ｖ    Ｃ    Ｐ    Ｉ    Ｃ    Ｓ    Ｑ    Ｋ    Ｐ（配列番号：５４）。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：１１７の相同体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：５４の変異体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：５４の異性体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：５４の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：５４の相同体の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：５４の変異体の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：５４の異性体の断片である。
【０１６９】
別の実施形態では、Ｅ７タンパク質に融合される切断ＬＬＯのアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列を含む：
【０１７０】
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＬＥＨＧＤＴＰＴＬＨＥＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤＬＹＣＹＥＱＬＮＤＳＳＥＥＥＤＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲＴＬＥＤＬＬＭＧＴＬＧＩＶＣＰＩＣＳＱＫＰ（配列番号：５５）。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−Ｅ７の融合タンパク質は配列番号：５５の相同体である。別の実施形態では、タンパク質は配列番号：５５の変異体である。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−Ｅ７融合タンパク質は配列番号：５５の異性体である。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−Ｅ７融合タンパク質は配列番号：５５の断片である。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−Ｅ７の融合タンパク質は配列番号：５５の相同体の断片である。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−Ｅ７融合タンパク質は配列番号：５５の変異体である。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−Ｅ７融合タンパク質は配列番号：５５の異性体である。
【０１７１】
一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は、腫瘍関連抗原をコードする核酸分子を含むが、ここで腫瘍関連抗原はＨｅｒ−２／ｎｅｕペプチドを含む。一実施形態では、腫瘍関連抗原はＨｅｒ−２／ｎｅｕ抗原を含む。一実施形態では、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕペプチドはキメラＨｅｒ−２／ｎｅｕ抗原（ｃＨｅｒ−２）を含む。
【０１７２】
一実施形態では、弱毒化栄養要求性リステリア株は、リステリアベクターに基づき、これは病毒性遺伝子ＡｃｔＡの欠失に起因して弱毒化され、かつインビボおよびインビトロでのＨＥＲ２／ｎｅｕ発現のためにｄａｌ遺伝子の相補によってプラスミドを保持する。一実施形態では、リステリア株はリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）の最初の４４１のアミノ酸を融合したキメラ型Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質を発現および分泌する。別の実施形態では、リステリアは、ｄａｌ、ｄａｔおよびＡｃｔＡ内因性遺伝子内に突然変異を有するｄａｌ／ｄａｔ／ＡｃｔＡリステリアである。別の実施形態では、突然変異は、突然変異遺伝子の欠失、切断または不活性化である。別の実施形態では、リステリア株は、耐性を破壊する能力を有する強くかつ抗原特異的な抗腫瘍応答をトランスジェニック動物内のＨＥＲ２／ｎｅｕに対して行使する。別の実施形態では、免疫化したマウスの脾臓からより迅速に除去されるので、ｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ株は高度に弱毒化され、以前のリステリア世代より良好な安全性プロファイルを有する。別の実施形態では、トランスジェニック動物で、このワクチンの抗生剤耐性でかつより病毒性のバージョンであるＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２よりも長い腫瘍発症の遅延を、リステリア株はもたらす（米国公開番号２０１１／０１４２７９１参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、リステリア株は、腫瘍内の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の著しい減少を生じる。別の実施形態では、ＬｍｄｄＡワクチンで処理した腫瘍内のＴｒｅｇのより低い頻度は、腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の増加をもたらし、ＬｍｄｄＡワクチンを用いた免疫化後により好ましい腫瘍の微小環境を得ることができることを示唆する。一実施形態では、本開示は、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質に融合したまたはその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドを提供する。一実施形態では、本開示は、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質に融合したまたはその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片から成る組み換え型ポリペプチドを提供する。その実施形態では、異種抗原はＨｅｒ−２キメラタンパク質またはその断片である。
【０１７３】
別の実施形態では、本開示の方法および組成物のＨＥＲ２キメラタンパク質はヒトＨｅｒ−２キメラタンパク質である。別の実施形態では、Ｈｅｒ−２タンパク質はマウスのＨｅｒ−２キメラタンパク質である。別の実施形態では、Ｈｅｒ−２タンパク質はラットのＨｅｒ−２キメラタンパク質である。別の実施形態では、Ｈｅｒ−２タンパク質は霊長類のＨｅｒ−２キメラタンパク質である。別の実施形態では、Ｈｅｒ−２タンパク質は当該技術分野で既知のヒトもしくは任意の他の動物種のＨｅｒ−２キメラタンパク質またはその組み合わせである。各々の可能性は本開示の別個の実施形態を表す。
【０１７４】
別の実施形態では、Ｈｅｒ−２タンパク質は、「Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ」、「Ｅｒｂｂ２」、「ｖ−ｅｒｂ−ｂ２」、「ｃ−ｅｒｂ−ｂ２」、「ｎｅｕ」、または「ｃＮｅｕ」と称されるタンパク質である。
【０１７５】
一実施形態では、Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質は、ガン遺伝子のＭＨＣクラスＩエピトープのクラスターを示すＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原の２つの細胞外および１つの細胞内の断片を寄生し、一方別の実施形態では、キメラタンパク質は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原の３つのＨ２Ｄｑおよび少なくとも１７のマッピングしたヒトＭＨＣクラスＩエピトープ（断片ＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１）を寄生する（図２１参照）。別の実施形態では、キメラタンパク質は少なくとも１３のマッピングしたヒトＭＨＣクラスＩエピトープ（断片ＥＣ２およびＩＣ１）を寄生する。別の実施形態では、キメラタンパク質は少なくとも１４のマッピングしたヒトＭＨＣクラスＩエピトープ（断片ＥＣ１およびＩＣ１）を寄生する。別の実施形態では、キメラタンパク質は少なくとも９のマッピングしたヒトＭＨＣクラスＩエピトープ（断片ＥＣ１およびＩＣ２）を寄生する。別の実施形態では、Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質は非溶血性リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）に融合する。別の実施形態では、Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質はリステリア−モノサイトゲネスリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質の最初の４４１のアミノ酸に融合し、リステリア・モノサイトゲネス弱毒化栄養要求性株ＬｍｄｄＡによって発現および分泌される。別の実施形態では、キメラ型ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原／ＬＬＯ融合タンパク質を発現する本明細書に開示された弱毒化栄養要求性株からの融合タンパク質ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌は、インビトロで８時間増殖した後ＴＣＡ沈殿させた細胞培養上清内のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２のものと同等である（図２１Ｂ参照）。
【０１７６】
一実施形態では、無処置の動物、または無関連のリステリアを注射したマウスではＣＴＬ活性は検出されなかった（図２２Ａ）。一方で別の実施形態では、本明細書に開示された弱毒化栄養要求性株は、野生型ＦＶＢ／Ｎマウスからの脾細胞によるＩＦＮ−γの分泌を刺激することができる（図２２Ｂ）。
【０１７７】
一実施形態では、抗原は米国特出願公開第２０１１／０１４２７９１号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記述されるキメラＨｅｒ２抗原である。
【０１７８】
別の実施形態では、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕキメラタンパク質は、配列番号：５６に示される以下の核酸配列によってコードされる。
【０１７９】
ｇａｇａｃｃｃａｃｃｔｇｇａｃａｔｇｃｔｃｃｇｃｃａｃｃｔｃｔａｃｃａｇｇｇｃｔｇｃｃａｇｇｔｇｇｔｇｃａｇｇｇａａａｃｃｔｇｇａａｃｔｃａｃｃｔａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃａａｔｇｃｃａｇｃｃｔｇｔｃｃｔｔｃｃｔｇｃａｇｇａｔａｔｃｃａｇｇａｇｇｔｇｃａｇｇｇｃｔａｃｇｔｇｃｔｃａｔｃｇｃｔｃａｃａａｃｃａａｇｔｇａｇｇｃａｇｇｔｃｃｃａｃｔｇｃａｇａｇｇｃｔｇｃｇｇａｔｔｇｔｇｃｇａｇｇｃａｃｃｃａｇｃｔｃｔｔｔｇａｇｇａｃａａｃｔａｔｇｃｃｃｔｇｇｃｃｇｔｇｃｔａｇａｃａａｔｇｇａｇａｃｃｃｇｃｔｇａａｃａａｔａｃｃａｃｃｃｃｔｇｔｃａｃａｇｇｇｇｃｃｔｃｃｃｃａｇｇａｇｇｃｃｔｇｃｇｇｇａｇｃｔｇｃａｇｃｔｔｃｇａａｇｃｃｔｃａｃａｇａｇａｔｃｔｔｇａａａｇｇａｇｇｇｇｔｃｔｔｇａｔｃｃａｇｃｇｇａａｃｃｃｃｃａｇｃｔｃｔｇｃｔａｃｃａｇｇａｃａｃｇａｔｔｔｔｇｔｇｇａａｇａａｔａｔｃｃａｇｇａｇｔｔｔｇｃｔｇｇｃｔｇｃａａｇａａｇａｔｃｔｔｔｇｇｇａｇｃｃｔｇｇｃａｔｔｔｃｔｇｃｃｇｇａｇａｇｃｔｔｔｇａｔｇｇｇｇａｃｃｃａｇｃｃｔｃｃａａｃａｃｔｇｃｃｃｃｇｃｔｃｃａｇｃｃａｇａｇｃａｇｃｔｃｃａａｇｔｇｔｔｔｇａｇａｃｔｃｔｇｇａａｇａｇａｔｃａｃａｇｇｔｔａｃｃｔａｔａｃａｔｃｔｃａｇｃａｔｇｇｃｃｇｇａｃａｇｃｃｔｇｃｃｔｇａｃｃｔｃａｇｃｇｔｃｔｔｃｃａｇａａｃｃｔｇｃａａｇｔａａｔｃｃｇｇｇｇａｃｇａａｔｔｃｔｇｃａｃａａｔｇｇｃｇｃｃｔａｃｔｃｇｃｔｇａｃｃｃｔｇｃａａｇｇｇｃｔｇｇｇｃａｔｃａｇｃｔｇｇｃｔｇｇｇｇｃｔｇｃｇｃｔｃａｃｔｇａｇｇｇａａｃｔｇｇｇｃａｇｔｇｇａｃｔｇｇｃｃｃｔｃａｔｃｃａｃｃａｔａａｃａｃｃｃａｃｃｔｃｔｇｃｔｔｃｇｔｇｃａｃａｃｇｇｔｇｃｃｃｔｇｇｇａｃｃａｇｃｔｃｔｔｔｃｇｇａａｃｃｃｇｃａｃｃａａｇｃｔｃｔｇｃｔｃｃａｃａｃｔｇｃｃａａｃｃｇｇｃｃａｇａｇｇａｃｇａｇｔｇｔｇｔｇｇｇｃｇａｇｇｇｃｃｔｇｇｃｃｔｇｃｃａｃｃａｇｃｔｇｔｇｃｇｃｃｃｇａｇｇｇｃａｇｃａｇａａｇａｔｃｃｇｇａａｇｔａｃａｃｇａｔｇｃｇｇａｇａｃｔｇｃｔｇｃａｇｇａａａｃｇｇａｇｃｔｇｇｔｇｇａｇｃｃｇｃｔｇａｃａｃｃｔａｇｃｇｇａｇｃｇａｔｇｃｃｃａａｃｃａｇｇｃｇｃａｇａｔｇｃｇｇａｔｃｃｔｇａａａｇａｇａｃｇｇａｇｃｔｇａｇｇａａｇｇｔｇａａｇｇｔｇｃｔｔｇｇａｔｃｔｇｇｃｇｃｔｔｔｔｇｇｃａｃａｇｔｃｔａｃａａｇｇｇｃａｔｃｔｇｇａｔｃｃｃｔｇａｔｇｇｇｇａｇａａｔｇｔｇａａａａｔｔｃｃａｇｔｇｇｃｃａｔｃａａａｇｔｇｔｔｇａｇｇｇａａａａｃａｃａｔｃｃｃｃｃａａａｇｃｃａａｃａａａｇａａａｔｃｔｔａｇａｃｇａａｇｃａｔａｃｇｔｇａｔｇｇｃｔｇｇｔｇｔｇｇｇｃｔｃｃｃｃａｔａｔｇｔｃｔｃｃｃｇｃｃｔｔｃｔｇｇｇｃａｔｃｔｇｃｃｔｇａｃａｔｃｃａｃｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇａｃａｃａｇｃｔｔａｔｇｃｃｃｔａｔｇｇｃｔｇｃｃｔｃｔｔａｇａｃｔａａ（配列番号：５６）。
【０１８０】
別の実施形態では、ＨＥＲ２キメラタンパク質は以下の配列を持つ。
【０１８１】
Ｔ    Ｈ    Ｌ    Ｄ    Ｍ    Ｌ    Ｒ    Ｈ    Ｌ    Ｙ    Ｑ    Ｇ    Ｃ    Ｑ    Ｖ    Ｖ    Ｑ    Ｇ    Ｎ    Ｌ    Ｅ    Ｌ    Ｔ    Ｙ    Ｌ    Ｐ    Ｔ    Ｎ    Ａ    Ｓ    Ｌ    Ｓ    Ｆ    Ｌ    Ｑ    Ｄ    Ｉ    Ｑ    Ｅ    Ｖ    Ｑ    Ｇ    Ｙ    Ｖ    Ｌ    Ｉ    Ａ    Ｈ    Ｎ    Ｑ    Ｖ    Ｒ    Ｑ    Ｖ    Ｐ    Ｌ    Ｑ    Ｒ    Ｌ    Ｒ    Ｉ    Ｖ    Ｒ    Ｇ    Ｔ    Ｑ    Ｌ    Ｆ    Ｅ    Ｄ    Ｎ    Ｙ    Ａ    Ｌ    Ａ    Ｖ    Ｌ    Ｄ    Ｎ    Ｇ    Ｄ    Ｐ    Ｌ    Ｎ    Ｎ    Ｔ    Ｔ    Ｐ    Ｖ    Ｔ    Ｇ    Ａ    Ｓ    Ｐ    Ｇ    Ｇ    Ｌ    Ｒ    Ｅ    Ｌ    Ｑ    Ｌ    Ｒ    Ｓ    Ｌ    Ｔ    Ｅ    Ｉ    Ｌ    Ｋ    Ｇ    Ｇ  Ｖ    Ｌ    Ｉ    Ｑ  Ｒ    Ｎ    Ｐ    Ｑ    Ｌ    Ｃ    Ｙ    Ｑ    Ｄ    Ｔ    Ｉ    Ｌ    Ｗ    Ｋ    Ｎ    Ｉ    Ｑ    Ｅ    Ｆ    Ａ    Ｇ    Ｃ    Ｋ  Ｋ    Ｉ    Ｆ    Ｇ    Ｓ    Ｌ    Ａ    Ｆ    Ｌ    Ｐ    Ｅ    Ｓ    Ｆ    Ｄ    Ｇ    Ｄ    Ｐ    Ａ    Ｓ    Ｎ    Ｔ    Ａ    Ｐ    Ｌ    Ｑ    Ｐ    Ｅ    Ｑ    Ｌ    Ｑ    Ｖ    Ｆ    Ｅ    Ｔ    Ｌ    Ｅ    Ｅ    Ｉ    Ｔ    Ｇ    Ｙ    Ｌ    Ｙ    Ｉ    Ｓ    Ａ    Ｗ    Ｐ    Ｄ    Ｓ    Ｌ    Ｐ    Ｄ    Ｌ    Ｓ    Ｖ    Ｆ    Ｑ  Ｎ    Ｌ    Ｑ    Ｖ    Ｉ    Ｒ    Ｇ    Ｒ    Ｉ    Ｌ    Ｈ    Ｎ    Ｇ    Ａ    Ｙ    Ｓ    Ｌ    Ｔ    Ｌ    Ｑ    Ｇ    Ｌ    Ｇ    Ｉ    Ｓ    Ｗ    Ｌ    Ｇ    Ｌ    Ｒ    Ｓ    Ｌ    Ｒ    Ｅ  Ｌ    Ｇ    Ｓ    Ｇ    Ｌ    Ａ    Ｌ    Ｉ    Ｈ    Ｈ    Ｎ    Ｔ    Ｈ    Ｌ    Ｃ    Ｆ    Ｖ    Ｈ    Ｔ    Ｖ    Ｐ    Ｗ    Ｄ    Ｑ    Ｌ    Ｆ    Ｒ    Ｎ    Ｐ    Ｈ    Ｑ    Ａ    Ｌ    Ｌ    Ｈ    Ｔ    Ａ    Ｎ    Ｒ    Ｐ    Ｅ    Ｄ    Ｅ    Ｃ    Ｖ    Ｇ    Ｅ    Ｇ    Ｌ    Ａ    Ｃ    Ｈ    Ｑ    Ｌ    Ｃ    Ａ    Ｒ    Ｇ    Ｑ    Ｑ    Ｋ    Ｉ    Ｒ    Ｋ    Ｙ    Ｔ    Ｍ    Ｒ    Ｒ    Ｌ    Ｌ    Ｑ    Ｅ    Ｔ    Ｅ    Ｌ    Ｖ    Ｅ    Ｐ    Ｌ    Ｔ    Ｐ    Ｓ    Ｇ    Ａ    Ｍ    Ｐ    Ｎ    Ｑ    Ａ    Ｑ    Ｍ    Ｒ    Ｉ    Ｌ    Ｋ    Ｅ    Ｔ    Ｅ    Ｌ    Ｒ    Ｋ    Ｖ    Ｋ    Ｖ    Ｌ    Ｇ    Ｓ    Ｇ    Ａ    Ｆ    Ｇ    Ｔ    Ｖ    Ｙ    Ｋ    Ｇ    Ｉ    Ｗ    Ｉ    Ｐ    Ｄ    Ｇ    Ｅ    Ｎ    Ｖ    Ｋ    Ｉ    Ｐ    Ｖ    Ａ    Ｉ    Ｋ  Ｖ    Ｌ    Ｒ    Ｅ    Ｎ    Ｔ    Ｓ    Ｐ    Ｋ    Ａ    Ｎ  Ｋ  Ｅ  Ｉ    Ｌ  Ｄ  Ｅ    Ａ    Ｙ  Ｖ    Ｍ    Ａ    Ｇ    Ｖ    Ｇ    Ｓ  Ｐ  Ｙ    Ｖ    Ｓ    Ｒ    Ｌ  Ｌ  Ｇ    Ｉ    Ｃ    Ｌ    Ｔ    Ｓ    Ｔ    Ｖ    Ｑ    Ｌ    Ｖ    Ｔ    Ｑ    Ｌ    Ｍ    Ｐ    Ｙ    Ｇ    Ｃ    Ｌ    Ｌ    Ｄ（配列番号：５７）。
【０１８２】
一実施形態では、本明細書に開示された方法および組成物のＨＥＲ２キメラタンパク質またはその断片はそのシグナル配列を含まない。別の実施形態では、シグナル配列の高い疎水性により、シグナル配列の削除はＨＥＲ２断片がリステリア内で順調に発現できるようにする。各々の可能性は本開示の別個の実施形態を表す。
【０１８３】
別の実施形態では、本開示の方法および組成物のＨＥＲ２キメラタンパク質の断片はその膜貫通領域（ＴＭ）を含まない。一実施形態では、ＴＭの高い疎水性により、ＴＭの削除はＨｅｒ−２断片がリステリア内で順調に発現できるようにする。一実施形態では、ＬｍｄｄＡ１６４は、ｃＨｅｒ２に融合されたｔＬＬＯをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸配列を含み、ここで、前記核酸配列は配列番号：５８を含む。
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【０１８４】
一実施形態では、ｃＨｅｒ２に融合されたｔＬＬＯを含む組み換え型タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：５９を含む。
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＬＥＴＨＬＤＭＬＲＨＬＹＱＧＣＱＶＶＱＧＮＬＥＬＴＹＬＰＴＮＡＳＬＳＦＬＱＤＩＱＥＶＱＧＹＶＬＩＡＨＮＱＶＲＱＶＰＬＱＲＬＲＩＶＲＧＴＱＬＦＥＤＮＹＡＬＡＶＬＤＮＧＤＰＬＮＮＴＴＰＶＴＧＡＳＰＧＧＬＲＥＬＱＬＲＳＬＴＥＩＬＫＧＧＶＬＩＱＲＮＰＱＬＣＹＱＤＴＩＬＷＫＮＩＱＥＦＡＧＣＫＫＩＦＧＳＬＡＦＬＰＥＳＦＤＧＤＰＡＳＮＴＡＰＬＱＰＥＱＬＱＶＦＥＴＬＥＥＩＴＧＹＬＹＩＳＡＷＰＤＳＬＰＤＬＳＶＦＱＮＬＱＶＩＲＧＲＩＬＨＮＧＡＹＳＬＴＬＱＧＬＧＩＳＷＬＧＬＲＳＬＲＥＬＧＳＧＬＡＬＩＨＨＮＴＨＬＣＦＶＨＴＶＰＷＤＱＬＦＲＮＰＨＱＡＬＬＨＴＡＮＲＰＥＤＥＣＶＧＥＧＬＡＣＨＱＬＣＡＲＧＱＱＫＩＲＫＹＴＭＲＲＬＬＱＥＴＥＬＶＥＰＬＴＰＳＧＡＭＰＮＱＡＱＭＲＩＬＫＥＴＥＬＲＫＶＫＶＬＧＳＧＡＦＧＴＶＹＫＧＩＷＩＰＤＧＥＮＶＫＩＰＶＡＩＫＶＬＲＥＮＴＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧＩＣＬＴＳＴＶＱＬＶＴＱＬＭＰＹＧＣＬＬＤ（配列番号：５９）。一実施形態では、切断ＬＬＯ−ｃＨｅｒ２融合は配列番号：５９の相同体である。別の実施形態では、切断ＬＬＯ−ｃＨｅｒ２融合は配列番号：５９の変異体である。別の実施形態では、切断ＬＬＯ−ｃＨｅｒ２融合は配列番号：５９の異性体である。
【０１８５】
一実施形態では、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子の核酸配列は：
【０１８６】
ＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＴＴＧＴＧＣＣＧＣＴＧＧＧＧＧＣＴＣＣＴＣＣＴＣＧＣＣＣＴＣＴＴＧＣＣＣＣＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＧＡＧＣＡＣＣＣＡＡＧＴＧＴＧＣＡＣＣＧＧＣＡＣＡＧＡＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＣＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＣＡＧＴＣＣＣＧＡＧＡＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＡＣＣＡＡＴＧＣＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＣＴＣＡＴＣＧＣＴＣＡＣＡＡＣＣＡＡＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣＧＧＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＡＧＧＡＣＡＡＣＴＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＧＡＧＡＣＣＣＧＣＴＧＡＡＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＣＡＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴＧＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＣＧＡＴＴＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＴＣＴＣＡＣＡＣＴＧＡＴＡＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＧＣＴＣＴＣＧＧＧＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＴＣＴＣＣＧＡＴＧＴＧＴＡＡＧＧＧＣＴＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＧＡＧＴＴＣＴＧＡＧＧＡＴＴＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＣＧＣＧＣＡＣＴＧＴＣＴＧＴＧＣＣＧＧＴＧＧＣＴＧＴＧＣＣＣＧＣＴＧＣＡＡＧＧＧＧＣＣＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡＣＴＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＣＴＴＣＡＡＣＣＡＣＡＧＴＧＧＣＡＴＣＴＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＡＣＡＧＡＣＡＣＧＴＴＴＧＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＣＡＡＴＣＣＣＧＡＧＧＧＣＣＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＣＧＧＣＧＣＣＡＧＣＴＧＴＧＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＣＧＧＡＣＧＴＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＣＣＣＴＣＧＴＣＴＧＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＧＡＴＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＧＴＧＴＧＡＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＣＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＴＴＧＣＧＡＧＡＧＧＴＧＡＧＧＧＣＡＧＴＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＴＴＴＧＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＡＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＧＡＣＣＴＣＡＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＴＡＡＴＣＣＧＧＧＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＣＧＣＣＴＡＣＴＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＡＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＣＴＧＧＣＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＣＡＴＡＡＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＧＴＧＣＡＣＡＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＣＧＧＡＡＣＣＣＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＡＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＧＡＧＴＧＴＧＴＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＧＴＧＣＧＣＣＣＧＡＧＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＧＧＧＴＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧＴＧＣＧＴＧＧＡＧＧＡＡＴＧＣＣＧＡＧＴＡＣＴＧＣＡＧＧＧＧＣＴＣＣＣＣＡＧＧＧＡＧＴＡＴＧＴＧＡＡＴＧＣＣＡＧＧＣＡＣＴＧＴＴＴＧＣＣＧＴＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＧＴＧＴＣＡＧＣＣＣＣＡＧＡＡＴＧＧＣＴＣＡＧＴＧＡＣＣＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＣＧＧＡＧＧＣＴＧＡＣＣＡＧＴＧＴＧＴＧＧＣＣＴＧＴＧＣＣＣＡＣＴＡＴＡＡＧＧＡＣＣＣＴＣＣＣＴＴＣＴＧＣＧＴＧＧＣＣＣＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧＴＧＴＧＡＡＡＣＣＴＧＡＣＣＴＣＴＣＣＴＡＣＡＴＧＣＣＣＡＴＣＴＧＧＡＡＧＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＡＧＧＡＧＧＧＣＧＣＡＴＧＣＣＡＧＣＣＴＴＧＣＣＣＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＣＣＣＡＣＴＣＣＴＧＴＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＧＣＣＣＣＧＣＣＧＡＧＣＡＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＣＣＴＣＴＧＡＣＧＴＣＣＡＴＣＧＴＣＴＣＴＧＣＧＧＴＧＧＴＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＣＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＣＴＴＧＧＧＧＧＴＧＧＴＣＴＴＴＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣＡＡＧＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＴＡＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＣＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＡＣＡＣＣＴＡＧＣＧＧＡＧＣＧＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＧＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＡＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＧＴＴＧＡＧＧＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＴＴＡＧＡＣＧＡＡＧＣＡＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＣＣＣＧＣＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＴＴＡＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＧＧＡＡＡＡＣＣＧＣＧＧＡＣＧＣＣＴＧＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＧＴＡＴＧＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＣＧＧＣＴＣＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＴＴＧＧＣＣＧＣＴＣＧＧＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＴＡＣＡＧＡＣＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＴＣＣＡＴＴＣＴＣＣＧＣＣＧＧＣＧＧＴＴＣＡＣＣＣＡＣＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＴＴＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＧＣＣＡＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＴＧＡＡＴＴＣＴＣＣＣＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＣＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＴＧＡＧＧＡＣＴＴＧＧＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＣＣＣＴＴＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＧＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＴＧＣＴＧＡＧＧＡＧＴＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧＧＣＡＣＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＴＡＣＣＡＧＧＡＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＧＧＡＣＣＴＧＡＣＡＣＴＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＣＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＣＧＡＴＧＴＡＴＴＴＧＡＴＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＧＡＡＴＧＧＧＧＧＣＡＧＣＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＣＣＣＣＡＣＡＣＡＴＧＡＣＣＣＣＡＧＣＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＧＧＴＡＣＡＧＴＧＡＧＧＡＣＣＣＣＡＣＡＧＴＡＣＣＣＣＴＧＣＣＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧＣＴＡＣＧＴＴＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＡＴＧＴＧＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＡＴＧＴＴＣＧＧＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＧＧＣＣＣＴＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＣＡＣＴＣＴＧＧＡＡＡＧＧＧＣＣＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＣＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧＧＧＴＣＧＴＣＡＡＡＧＡＣＧＴＴＴＴＴＧＣＣＴＴＴＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＴＧＧＡＧＡＡＣＣＣＣＧＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＡＣＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＴＣＡＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＣＧＡＣＡＡＣＣＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＡＣＣＡＧＡＧＣＧＧＧＧＧＧＣＴＣＣＡＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＡＡＡＧＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＧＡＧＴＡＣＣＴＧＧＧＴＣＴＧＧＡＣＧＴＧＣＣＡＧＴＧＴＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＡＧＴＣＣＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＴＧＡ（配列番号：６０）。
【０１８７】
別の実施形態では、ヒトｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＥＣ１断片をコードする核酸配列は、ヒトのＥＣ１領域の１２０〜５１０ｂｐにわたるキメラの中へと実装され、（配列番号：６１）で示される。
【０１８８】
ＧＡＧＡＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＡＣＣＡＡＴＧＣＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＣＴＣＡＴＣＧＣＴＣＡＣＡＡＣＣＡＡＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣＧＧＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＡＧＧＡＣＡＡＣＴＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＧＡＧＡＣＣＣＧＣＴＧＡＡＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＣＡＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴＧＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＣＧＡＴＴＴＴＧＴＧＧＡＡＧ（配列番号：６１）。
【０１８９】
一実施形態では、完全なＥＣ１ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ断片は（ヒトのｈｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子の５８〜９７９ｂｐ）にわたり、（配列番号：６２）で示される。
【０１９０】
ＧＣＣＧＣＧＡＧＣＡＣＣＣＡＡＧＴＧＴＧＣＡＣＣＧＧＣＡＣＡＧＡＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＣＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＣＡＧＴＣＣＣＧＡＧＡＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＡＣＣＡＡＴＧＣＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＣＴＣＡＴＣＧＣＴＣＡＣＡＡＣＣＡＡＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣＧＧＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＡＧＧＡＣＡＡＣＴＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＧＡＧＡＣＣＣＧＣＴＧＡＡＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＣＡＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴＧＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＣＧＡＴＴＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＴＣＴＣＡＣＡＣＴＧＡＴＡＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＧＣＴＣＴＣＧＧＧＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＴＣＴＣＣＧＡＴＧＴＧＴＡＡＧＧＧＣＴＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＧＡＧＴＴＣＴＧＡＧＧＡＴＴＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＣＧＣＧＣＡＣＴＧＴＣＴＧＴＧＣＣＧＧＴＧＧＣＴＧＴＧＣＣＣＧＣＴＧＣＡＡＧＧＧＧＣＣＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡＣＴＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＣＴＴＣＡＡＣＣＡＣＡＧＴＧＧＣＡＴＣＴＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＡＣＡＧＡＣＡＣＧＴＴＴＧＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＣＡＡＴＣＣＣＧＡＧＧＧＣＣＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＣＧＧＣＧＣＣＡＧＣＴＧＴＧＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＣＧＧＡＣＧＴＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＣＣＣＴＣＧＴＣＴＧＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＧＡＴ（配列番号：６２）。
【０１９１】
別の実施形態では、ヒトのｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＥＣ２断片をコードする核酸配列は、ヒトのＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＥＣ２断片の１０７７〜１５５４ｂｐにわたるキメラの中へと実装されかつ５０ｂｐの延長部を含み、（配列番号：６３）で示される。
【０１９２】
ＡＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＴＴＴＧＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＡＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＧＡＣＣＴＣＡＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＴＡＡＴＣＣＧＧＧＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＣＧＣＣＴＡＣＴＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＡＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＣＴＧＧＣＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＣＡＴＡＡＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＧＴＧＣＡＣＡＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＣＧＧＡＡＣＣＣＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＡＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＧＡＧＴＧＴＧＴＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＧＴＧＣＧＣＣＣＧＡＧＧＧ（配列番号：６３）。
【０１９３】
一実施形態では、完全なＥＣ２ヒトｈｅｒ２／ｎｅｕ断片は、ヒトのｈｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子の９０７〜１５０４ｂｐ）にわたり、（配列番号：６４）で示される。
【０１９４】
ＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＣＧＧＡＣＧＴＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＣＣＣＴＣＧＴＣＴＧＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＧＡＴＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＧＴＧＴＧＡＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＣＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＴＴＧＣＧＡＧＡＧＧＴＧＡＧＧＧＣＡＧＴＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＴＴＴＧＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＡＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＧＡＣＣＴＣＡＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＴＡＡＴＣＣＧＧＧＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＣＧＣＣＴＡＣＴＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＡＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＣＴＧＧＣＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＣＡＴＡＡＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＧＴＧＣＡＣＡＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＣＧＧＡＡＣＣＣＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＡＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧ（配列番号：６４）。
【０１９５】
別の実施形態では、ヒトのｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＩＣ１断片をコードする核酸配列は（配列番号：６５）で示されるキメラの中へと実装される。
【０１９６】
ＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＴＡＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＣＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＡＣＡＣＣＴＡＧＣＧＧＡＧＣＧＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＧＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＡＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＧＴＴＧＡＧＧＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＴＴＡＧＡＣＧＡＡＧＣＡＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＣＣＣＧＣＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＴＴＡＧＡＣＴ（配列番号：６５）。
【０１９７】
別の実施形態では、完全なヒトのｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＩＣ１断片をコードする核酸配列はヒトのｈｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子の２０３４〜３２４３にわたり、（配列番号：６６）で示される。
【０１９８】
ＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＴＡＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＣＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＡＣＡＣＣＴＡＧＣＧＧＡＧＣＧＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＧＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＡＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＧＴＴＧＡＧＧＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＴＴＡＧＡＣＧＡＡＧＣＡＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＣＣＣＧＣＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＴＴＡＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＧＧＡＡＡＡＣＣＧＣＧＧＡＣＧＣＣＴＧＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＧＴＡＴＧＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＣＧＧＣＴＣＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＴＴＧＧＣＣＧＣＴＣＧＧＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＴＡＣＡＧＡＣＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＴＣＣＡＴＴＣＴＣＣＧＣＣＧＧＣＧＧＴＴＣＡＣＣＣＡＣＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＴＴＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＧＣＣＡＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＴＧＡＡＴＴＣＴＣＣＣＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＣＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＴＧＡＧＧＡＣＴＴＧＧＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＣＣＣＴＴＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＧＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＴＧＣＴＧＡＧＧＡＧＴＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧＧＣＡＣＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＴＡＣＣＡＧＧＡＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＧＧＡＣＣＴＧＡＣＡＣＴＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＣＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＧＡＡＧＧＧＧＣＴ（配列番号：６６）。
【０１９９】
小さい断片リステリアベースのワクチンまたはトラスツズマブ（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原の細胞外領域に位置するエピトープに対するモノクローナル抗体）によってこれらの腫瘍が標的化されたとき、ガン遺伝子タンパク質Ｈｅｒ２／ｎｅｕ内での点突然変異またはアミノ酸欠失が耐性腫瘍細胞の処置を媒介することが報告されている。ガン遺伝子のＭＨＣクラスＩエピトープのクラスターを示すＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原の２つの細胞外断片および１つの細胞内断片を寄生するキメラ型Ｈｅｒ２／ｎｅｕベースの組成物が本明細書に記述される。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原の３個のＨ２Ｄｑおよび少なくとも１７個のマッピングしたヒトのＭＨＣクラスＩエピトープを寄生する、このキメラタンパク質は、リステリア・モノサイトゲネスリステリオリシンＯタンパク質の最初の４４１のアミノ酸に融合し、リステリア・モノサイトゲネス弱毒化株ＬｍｄｄＡによって発現および分泌した。
【０２００】
別の実施形態では、対象抗原はＫＬＫ９ポリペプチドである。
【０２０１】
別の実施形態では、腫瘍関連抗原はＨＰＶ−Ｅ７である。別の実施形態では、抗原はＨＰＶ−Ｅ６である。別の実施形態では、抗原はＨｅｒ−２である。別の実施形態では、抗原はＮＹ−ＥＳＯ−１である。別の実施形態では、抗原はテロメラーゼである。別の実施形態では、抗原はＳＣＣＥである。別の実施形態では、抗原はＷＴ−１である。別の実施形態では、抗原はＨＩＶ−１Ｇａｇである。別の実施形態では、抗原はプロテイナーゼ３である。別の実施形態では、抗原はチロシナーゼ関連タンパク質２である。別の実施形態では、抗原はＰＳＡ（前立腺特異抗原）である。別の実施形態では、抗原はＥ７、Ｅ６、Ｈｅｒ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼ、ＳＣＣＥ、ＷＴ−１、ＨＩＶ−１Ｇａｇ、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）から選択される。別の実施形態では、抗原は腫瘍関連抗原である。別の実施形態では、抗原は感染性疾病抗原である。
【０２０２】
別の実施形態では、腫瘍関連抗原は血管形成抗原である。別の実施形態では、血管形成抗原は活性化した周皮細胞と腫瘍血管形成血管系内の周皮細胞との両方の上で発現され、これは別の実施形態では、インビボでの新血管形成と関連付けられる。別の実施形態では、血管形成抗原はＨＭＷ−ＭＡＡである。別の実施形態では、血管形成抗原は当該技術分野で既知のものであり、国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／１０２１４０号で提供され、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０３】
別の実施形態では、抗原は、菌類病原体、細菌、寄生虫、蠕虫、またはウイルスに由来する。別の実施形態では、抗原は、破傷風トキソイド、インフルエンザウイルスからの血球凝集素分子、ジフテリアトキソイド、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質、ＩｇＡプロテアーゼ、インシュリンペプチドＢ、粉状そうか病菌抗原、ビブリオ症菌抗原、サルモネラ抗原、肺炎球菌抗原、呼吸器合胞体ウイルス抗原、インフルエンザ菌外膜タンパク質、ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ、髄膜炎菌ピリン、淋菌ピリン、メラノーマ−関連抗原（ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ）、タイプＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−３３、−３５、または−４５からのヒトパピローマウイルス抗原Ｅ１およびＥ２、腫瘍抗原ＣＥＡ、突然変異したまたはしていないｒａｓタンパク質、突然変異したまたはしていないｐ５３タンパク質、Ｍｕｃ１、メソテリン、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、またはｐＳＡから選択される。
【０２０４】
他の実施形態では、抗原は以下の疾患のうちの１つと関連付けられる。コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、麻疹、髄膜炎、おたふく風邪、百日咳、天然痘、肺炎球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、結核、腸チフス、水痘帯状疱疹、百日咳、黄熱病、アジソン病由来のイムノゲンおよび抗原、アレルギー、アナフィラキシー、ブルートン症候群、固形および血液由来の腫瘍を含むガン、湿疹、橋本甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、後天性免疫不全症候群、腎臓、心臓、すい臓、肺、骨、および肝臓などの移植拒否反応、グレーブス病、多内分泌自己免疫疾患、肝炎、顕微鏡的多発性動脈炎、結節性多発動脈炎、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変症、悪性貧血、セリアック病、抗体媒介性腎炎、糸球体腎炎、リウマチ性疾患、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、血清反応陰性脊椎関節症、鼻炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、硬化性胆管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、疱疹状皮膚炎、乾癬、白斑、多発性硬化症、脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、ランバート・イートン筋無力症候群、強膜、上強膜、ブドウ膜炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、じんましん、乳児一過性低ガンマグロブリン血症、骨髄腫、Ｘ連鎖高Ｉｇｍ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、アミロイド症、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、マラリアのスポロゾイト周囲タンパク、微生物抗原、ウイルス抗原、自己抗原、およびリステリア症。
【０２０５】
別の実施形態では、本明細書に開示された異種抗原は腫瘍関連抗原であり、これは、一実施形態では、ＭＡＧＥ（メラノーマ関連抗原Ｅ）タンパク質、例えば、ＭＡＧＥ  １、ＭＡＧＥ  ２、ＭＡＧＥ  ３、ＭＡＧＥ  ４、チロシナーゼ；突然変異ｒａｓタンパク質；突然変異ｐ５３タンパク質；進行ガンと関連付けられたｐ９７メラノーマ抗原、ｒａｓペプチドもしくはｐ５３ペプチド；子宮頸ガンと関連付けられたＨＰＶ１６／１８抗原、乳ガンと関連付けられたＫＬＨ抗原、大腸ガンと関連付けられたＣＥＡ（ガン胎児抗原）、ｇｐ１００、メラノーマと関連付けられたＭＡＲＴ１抗原、または前立腺ガンと関連付けられたＰＳＡ抗原といった腫瘍抗原のうちの１つである。別の実施形態では、本明細書に開示された組成物および方法のための抗原はメラノーマ−関連抗原であり、これは、一実施形態では、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ、またはこれらの組み合わせである。別の実施形態では、腫瘍関連抗原は血管形成抗原である。
【０２０６】
別の実施形態では、異種抗原は感染性疾患抗原である。一実施形態では、抗原は自己抗原（ａｕｔｏ  ａｎｔｉｇｅｎ）または自己抗原（ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｇｅｎ）である。
【０２０７】
別の実施形態では、異種抗原は、真菌病原体、細菌、寄生生物、蠕虫、またはウイルスに由来する。他の実施形態では、抗原は、破傷風トキソイド、インフルエンザウイルスからの血球凝集素分子、ジフテリアトキソイド、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質、ＩｇＡプロテアーゼ、インシュリンペプチドＢ、粉状そうか病菌抗原、ビブリオ症菌抗原、サルモネラ抗原、肺炎球菌抗原、吸器合胞体ウイルス抗原、インフルエンザ菌外膜タンパク質、ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ、髄膜炎菌ピリン、淋菌ピリン、タイプＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−３３、−３５、または−４５ヒトパピローマウイルスからのヒトパピローマウイルス抗原Ｅ１およびＥ２、またはこれらの組み合せから選択される。
【０２０８】
別の実施形態では、異種抗原は以下の疾患のうちの１つと関連付けられる。コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、麻疹、髄膜炎、おたふく風邪、百日咳、天然痘、肺炎球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、結核、腸チフス、水痘帯状疱疹、百日咳３、黄熱病、アジソン病由来のイムノゲンおよび抗原、アレルギー、アナフィラキシー、ブルートン症候群、固形および血液由来の腫瘍を含むガン、湿疹、橋本甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、後天性免疫不全症候群、腎臓、心臓、すい臓、肺、骨、および肝臓などの移植拒否反応、グレーブス病、多内分泌自己免疫疾患、肝炎、顕微鏡的多発性動脈炎、結節性多発動脈炎、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変症、悪性貧血、セリアック病、抗体媒介性腎炎、糸球体腎炎、リウマチ性疾患、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、血清反応陰性脊椎関節症、鼻炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、硬化性胆管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、疱疹状皮膚炎、乾癬、白斑、多発性硬化症、脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、ランバート・イートン筋無力症候群、強膜、上強膜、ブドウ膜炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、じんましん、乳児一過性低ガンマグロブリン血症、骨髄腫、Ｘ連鎖高Ｉｇｍ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、アミロイド症、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、マラリアのスポロゾイト周囲タンパク、微生物抗原、ウイルス抗原、自己抗原、およびリステリア症。
【０２０９】
本明細書に開示されるように、方法および組成物の別の実施形態では、「核酸」または「ヌクレオチド」という用語は少なくとも２つの塩基−糖−リン酸塩の組み合せのストリングを指す。一実施形態では、この用語はＤＮＡおよびＲＮＡを含む。一実施形態では、「ヌクレオチド」は核酸高分子の単量体単位を指す。一実施形態では、ＲＮＡは、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびリボザイムの形態をとる。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの使用が記述される（Ｃａｕｄｙ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌ  １６：２４９１−９６およびそこに引用された参考文献）。ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、線状ＤＮＡ、もしくは染色体ＤＮＡの形態、またはこれらの群の誘導体であってもよい。さらに、ＤＮＡおよびＲＮＡのこれらの形態は、１本鎖、２本鎖、３本鎖、または４本鎖であってもよい。別の実施形態では、この用語は他の種類のバックボーンであるが同一の塩基を含有する人工核酸も含む。一実施形態では、この人工核酸はＰＮＡ（ペプチド核酸）である。ＰＮＡはペプチドバックボーンおよびヌクレオチド塩基を含有し、一実施形態では、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子に結合することができる。別の実施形態では、このヌクレオチドはオキセタン修飾される。別の実施形態では、ヌクレオチドは１つ以上のホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合で置き換えることによって修飾される。別の実施形態では、人工核酸は当該技術分野で既知の未変性の核酸のリン酸バックボーンの任意の他の変異体を含有する。ホスホロチオエート核酸およびＰＮＡの使用は、当業者に既知であり、また例えば、Ｎｅｉｌｓｅｎ  ＰＥ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９：３５３−５７、およびＲａｚ  ＮＫ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２９７：１０７５−８４に記述される。核酸の生産および使用は、当業者には既知であり、また例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，（２００１），Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  ｅｄｓ．およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ（２００３）Ｐｕｒｃｈｉｏ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｃ．  Ｆａｒｅｅｄに記述される。
【０２１０】
一実施形態では、「オリゴヌクレオチド」という用語は「核酸」という用語と互換的であり、また原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも挙げられる場合があるがこれに限定されない分子を指す場合がある。この用語は既知のＤＮＡおよびＲＮＡの塩基類似体のいずれかを含む配列も指す。
【０２１１】
本明細書に列挙された任意のアミノ酸配列に対するタンパク質および／またはペプチド相同性は、一実施形態では、免疫ブロット解析を含む当該技術分野において適切に記述される方法によって、または確立された方法を介して利用可能な任意の数のソフトウェアパッケージを利用したアミノ酸配列のコンピューターアルゴリズム解析を介して決定される。これらのパッケージのうちのいくつかはＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＭＰｓｒｃｈ、またはＳｃａｎｐｓパッケージを含んでもよく、また例えば、スミス−ウォーターマンアルゴリズムの使用、および／または解析のための広範囲／局所的もしくはＢＬＯＣＫＳアラインメントを採用してもよい。
【０２１２】
別の実施形態では、本明細書に開示された構築体または核酸分子は相同的組み換えを使用してリステリア染色体の中へと組み込まれる。相同的組み換えのための技法は当該技術分野で周知であり、また例えば以下の文献に記述されている。Ｂａｌｏｇｌｕ  Ｓ、Ｂｏｙｌｅ  ＳＭ、ｅｔ  ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｔｏ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｅｉｔｈｅｒ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｐａｒｔｉａｌ  ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ  ｏｒ  Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｌ７／Ｌ１２  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００５，  １０９（１−２）：１１−７）；およびＪｉａｎｇ  ＬＬ，  Ｓｏｎｇ  ＨＨ，  ｅｔ  ａｌ．，  （Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｔｒａｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｓｉｎ  （Ｓｈａｎｇｈａｉ）  ２００５，  ３７（１）：１９−２４）。別の実施形態では、相同的組み換えを米国特許第６，８５５，３２０号に記述されるように実施した。この場合、Ｅ７を発現する組み換え型Ｌｍ株は、ｈｌｙプロモーターの制御下で、また遺伝子産物の分泌を確保するためにｈｌｙシグナル配列を含めることによって、Ｅ７遺伝子の染色体組み込みによって作成され、Ｌｍ−ＡＺ／Ｅ７と称される組み換え型を得る。別の実施形態では、温度感受性プラスミドは、組み換え型を選択するために使用される。
【０２１３】
別の実施形態では、構築体または核酸分子はトランスポゾン挿入を使用してリステリア染色体の中へと組み込まれる。トランスポゾン挿入の技法は当該技術分野で周知であり、とりわけ以下のＳｕｎらの文献  ＤＰ−Ｌ９６７の構造における（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９０，  ５８：  ３７７０−３７７８）に記載されている。トランスポゾン突然変異生成は、別の実施形態では、安定したゲノム挿入変異体を形成することができるという有利点を有するが、外来性遺伝子が挿入されるゲノム内の位置が未知であるという不利点を有する。
【０２１４】
別の実施形態では、構築体または核酸分子は、ファージ組み込み部位を使用してリステリアの染色体の中へと組み込まれる（Ｌａｕｅｒ  Ｐ，Ｃｈｏｗ  ＭＹ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈａｇｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２００２；１８４（１５）：４１７７−８６）。この方法のある特定の実施形態では、異種遺伝子を、ゲノム内の任意の適切な部位であってもよい、対応する付着部位（例えば、ｃｏｍＫまたはａｒｇ  ｔＲＮＡ遺伝子の３‘端）の中へとインサートするために、バクテリオファージ（例えば、Ｕ１５３またはＰＳＡリステリオファージ）のインテグラーゼ遺伝子および付着部位が使用される。別の実施形態では、内因性のプロファージは構築体または異種遺伝子組込の前に利用された付着部位から回復した。別の実施形態では、この方法は結果として単一コピー組み込み体をもたらす。別の実施形態では、本開示は、臨床用途のためのファージベースの染色体組み込み系をさらに含み、ここでｄ−アラニンラセマーゼを含むがこれに限定されない必須酵素のための栄養要求性である宿主株を使用することができ、例えば、Ｌｍｄａｌ（−）ｄａｔ（−）である。別の実施形態では、「ファージキュアリング工程」を避けるためにＰＳＡに基づくファージ組み込み系を使用する。別の実施形態では、これは組み込まれた遺伝子を維持するために抗生物質による継続的な選択を必要とする。したがって、別の実施形態では、本開示は、抗生物質を用いた選択を必要としないファージベースの染色体組み込み系の確立を可能にする。代わりに、栄養要求性宿主株を相補することができる。
【０２１５】
本明細書で開示される方法および組成物の一実施形態では、「組み換え部位」または「部位特異的な組み換え部位」という用語は、組み換え部位に隣接する核酸区分の交換または切除を媒介するリコンビナーゼによって（いくつかの事例では、関連するタンパク質とともに）識別される核酸分子内の塩基の配列を指す。リコンビナーゼおよび関連するタンパク質は「組み換え型タンパク質」と総称される（例えば、Ｌａｎｄｙ，Ａ．，（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）３：６９９−７０７；１９９３）を参照のこと）。
【０２１６】
「ファージ発現ベクター」または「ファージミド」とは、本明細書で開示されるような方法および組成物の核酸配列をインビトロまたはインビボで、任意の細胞（原核生物細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳類の細胞を含む）内で構造的にまたは誘導的に発現する目的の任意のファージベースの組み換え型発現系を指す。ファージ発現ベクターは、典型的には、細菌細胞内で再生すること、および適切な条件下でファージ粒子を生成することの両方を可能にすることができる。この用語は線形または円形の発現系を含み、またエピソームのまま、または宿主細胞ゲノムの中へと組込まれた両方のファージベースの発現ベクターを包含する。
【０２１７】
一実施形態では、本明細書で使用される場合、「動作可能にリンクした」という用語は、転写および翻訳調節性核酸が、任意のコード配列に対して転写が開始されるような様式で位置することを意味する。一般的にこれは、プロモーターおよび転写開始配列または始動配列がコ−ド化領域に５’に位置されることを意味することになる。
【０２１８】
一実施形態では、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、潜在的にタンパク質をコードする可能性がある塩基の配列を含有する生命体のゲノムの部分である。別の実施形態では、ＯＲＦの開始端および停止端はｍＲＮＡの端部と同等でないが、通常のｍＲＮＡ中に含まれる。一実施形態では、ＯＲＦは、遺伝子の開始コード配列（開始コドン）と停止コドン配列（終止コドン）との間に位置する。したがって、一実施形態では、内因性のポリペプチドとともにオープンリーディングフレームとして動作可能にゲノムの中へと組込まれる核酸分子は、内因性のポリペプチドと同一のオープンリーディングフレーム内でゲノムの中へと組込まれた核酸分子である。
【０２１９】
一実施形態では、本開示はリンカー配列を含む融合ポリペプチドを提供する。一実施形態では、「リンカー配列」は２つの異種ポリペプチドまたはその断片もしくはドメインを結合するアミノ酸配列を指す。一般的に、本明細書で使用される場合、リンカーは融合ポリペプチドを形成するためにポリペプチドを共有的にリンクするアミノ酸配列である。リンカーは、典型的には、オープンリーディングフレームおよび表示タンパク質によってコードされたアミノ酸配列を含む融合タンパク質を作り出すために、表示ベクターからのレポーター遺伝子の除去後の残りの組み換え型信号から翻訳されたアミノ酸を含む。当業者によって理解されるように、リンカーはグリシンおよび他の小さい中性アミノ酸などの追加的なアミノ酸を含むことができる。
【０２２０】
一実施形態では、本明細書で使用される場合、「内因性」は、参照生命体内で発生もしくは創出された、または参照生命体の中生じたものから発生してきた物品を記述する。別の実施形態では、内因性は、天然であることを指す。
【０２２１】
別の実施形態では、「安定して維持される」とは、選択（例えば、抗生物質選択）無しで検出可能な損失を伴わずに、核酸分子またはプラスミドを１０世代の間、維持することを指す。別の実施形態では、期間は１５世代である。別の実施形態では、期間は２０世代である。別の実施形態では、期間は２５世代である。別の実施形態では、期間は３０世代である。別の実施形態では、期間は４０世代である。別の実施形態では、期間は５０世代である。別の実施形態では、期間は６０世代である。別の実施形態では、期間は８０世代である。別の実施形態では、期間は１００世代である。別の実施形態では、期間は１５０世代である。別の実施形態では、期間は２００世代である。別の実施形態では、期間は３００世代である。別の実施形態では、期間は５００世代である。別の実施形態では、期間は世代を超えるものである。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロで（例えば、培養液内で）安定して維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビボで安定して維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロおよびインビトロの両方で安定して維持される。各々の可能性は本開示の別個の実施形態を表す。
【０２２２】
別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物の組み換え型リステリア株は、リステリアゲノムにオープンリーディングフレームとして内因性ＡｃｔＡ配列とともに動作可能に組み込まれる核酸分子を含む。別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物の組み換え型リステリア株は、ＡｃｔＡまたは切断ＡｃｔＡに融合される抗原を含む融合タンパク質をコードする核酸分子を含むエピソーム性の発現ベクターを含む。一実施形態では、抗原の発現および分泌は、ａｃｔＡプロモーターおよびＡｃｔＡシグナル配列制御下にあり、またこれはＡｃｔＡ（切断ＡｃｔＡまたはｔＡｃｔＡ）の１〜２３３アミノ酸への融合として発現される。別の実施形態では、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，６５５，２３８号に記述されるように、切断ＡｃｔＡは野生型ＡｃｔＡタンパク質の最初の３９０のアミノ酸から成る。別の実施形態では、米国特許公開番号第２０１４／０１８６３８７号に記述されるように、切断ＡｃｔＡは、ＡｃｔＡ−Ｎ１００またはその修正版（ＡｃｔＡ−Ｎ１００＊と称される）であり、この中でＰＥＳＴモチーフを欠失しており、非保存的なＱＤＮＫＲ置換を含有する。
【０２２３】
別の実施形態では、「機能的断片」は免疫原性断片であり、単独でまたは本明細書に開示されたワクチン組成物内で被験者に投与されるとき、免疫応答を引き出す。別の実施形態では、当業者は理解するであろうとおり、また本明細書にさらに開示されるように、機能的断片は生物活性を有する。
【０２２４】
別の実施形態では、本開示の方法および組成物の組み換え型リステリア株は組み換え型リステリア・モノサイトゲネス株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・シーリゲリ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・グレイ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・イバノビ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・ムライ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・ウェルシメリ株である。別の実施形態では、リステリア株は、当該技術分野で既知の任意の他のリステリア種の組み換え型株である。
【０２２５】
別の実施形態では、本開示の組み換え型リステリア株は、動物宿主を通して継代されている。別の実施形態では、継代は株のワクチンベクターとしての有効性を最大化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の病毒性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を増加する。別の実施形態では、継代はリステリア株の病毒性を増加する。別の実施形態では、継代はリステリア株の不安定な亜系を除去する。別の実施形態では、継代はリステリア株の不安定な亜系の有病率を減少する。別の実施形態では、リステリア株は抗原含有組み換え型ペプチドをコードする遺伝子のゲノム挿入を含有する。別の実施形態では、リステリア株は抗原含有組み換え型ペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドを担持する。別の実施形態では、継代は本明細書に記述されるように実施される。別の実施形態では、当該技術分野で既知の任意の他の方法によって継代を実施する。
【０２２６】
別の実施形態では、本開示の組み換え型核酸は、リステリア株内のコードしたペプチドの発現を駆動するプロモーター／調節性配列に動作可能にリンクしている。遺伝子の構造性の発現を駆動するために有用なプロモーター／調節性配列が当該技術分野で周知であり、これらとしては、例えば、リステリアのＰｈｌｙＡプロモーター、ＰＡｃｔＡプロモーター、およびｐ６０プロモーター、ストレプトコッカスｂａｃプロモーター、ストレプトマイセス・グリセウスｓｇｉＡプロモーター、およびバシルス・チューリンゲンシスｐｈａＺプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２７】
別の実施形態では、本開示のペプチドをコードする核酸の誘発性でかつ組織に特異的な発現は、ペプチドをコードする核酸を誘発性または組織特異的プロモーター／調節性配列の制御下に置くことによって遂行される。この目的のために有用な組織特異的または誘発性プロモーター／調節性配列の実施例としては、ＭＭＴＶ  ＬＴＲ誘発性プロモーター、およびＳＶ４０後期エンハンサー／プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、金属、グルココルチコイド、およびこれに類するものなどの誘発剤に応答して誘発されたプロモーターが利用される。こうして、本開示は、既知または未知のいずれかで、かつこれらに動作可能にリンクする所望のタンパク質の発現を駆動する能力を有する、任意のプロモーター／調節性配列の使用を含むことが理解されるであろう。「異種」という用語が、参照種とは異なる種に由来する核酸、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を包含することが当業者によって理解されるであろう。したがって、例えば、異種ポリペプチドを発現するリステリア株は、一実施形態では、天然ではないかもしくはリステリア株に対して内因性のリペプチドを発現することになり、または別の実施形態では、リステリア株によって通常発現されるポリペプチドを発現することになり、または別の実施形態では、リステリア株以外の供給源からのポリペプチドを発現することになる。別の実施形態では、異種という用語は同一の種の中の異なる生命体に由来するものを記述するために使用される。別の実施形態では、異種抗原はリステリアの組み換え型株によって発現され、かつ哺乳類細胞の感染に際して組み換え型株によって細胞毒性Ｔ細胞に加工および提示される。別の実施形態では、リステリア種によって発現される異種抗原は、結果として哺乳類内に自然に発現される修飾されていない抗原またはタンパク質を識別するＴ細胞応答をもたらす限り、腫瘍細胞または感染性薬剤の中で対応する修飾されていない抗原またはタンパク質に厳密に適合する必要はない。「異種抗原」という用語は、本明細書では「抗原性ポリペプチド」、「異種タンパク質」、「異種タンパク質抗原」、「タンパク質抗原」、「抗原」、およびこれに類するものを指す場合がある。
【０２２８】
「エピソーム性の発現ベクター」という用語が、直線状または円形状であってもよく、また通常二本鎖の形態であり、その中に細菌のゲノムまたは細胞のゲノムに組み込まれるのと反対に宿主細菌の細胞質または細胞内に存在する染色体外である核酸ベクターを包含することを当業者は理解するであろう。一実施形態では、エピソーム性の発現ベクターは対象となる遺伝子を含む。別の実施形態では、エピソーム性ベクターは細菌性の細胞質の中の複数のコピー内で持続し、結果として対象となる遺伝子の増幅をもたらし、また別の実施形態では、必要なときにウイルス性トランス作用因子が供給される。別の実施形態では、本明細書ではエピソーム性の発現ベクターはプラスミドと称される場合がある。別の実施形態では、「組み込みプラスミド」はその挿入または宿主ゲノムの中に担持される対象となる遺伝子の挿入を標的化する配列を含む。別の実施形態では、挿入された対象となる遺伝子は中断されない、または細胞ＤＮＡへの組み込みからしばしば生じる調節性の制約を受けない。別の実施形態では、挿入された異種遺伝子の存在は細胞自身の重要な領域の再配列または中断につながらない。別の実施形態では、安定したトランスフェクション手順で、エピソーム性ベクターの使用は、染色体を組み込むプラスミドの使用より高いトランスフェクション効率をしばしばもたらす（Ｂｅｌｔ，Ｐ．Ｂ．Ｇ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（ＨＰＲＴ２）ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，４８６１−４８６６；Ｍａｚｄａ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｌｙｍｐｈｏ−ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０４，１４３−１５１）。一実施形態では、本明細書で開示される方法および組成物のエピソーム性の発現ベクターは、ＤＮＡ分子を細胞に送達するために採用される様々な方法のいずれかによってインビボ、エクスビボ、またはインビトロで細胞に送達される場合がある。ベクターも単独でまたは被験者の細胞への送達を強化する医薬組成物の形態で送達される場合がある。
【０２２９】
一実施形態では、「融合される」という用語は共有結合による動作可能な連鎖を指す。一実施形態では、この用語は組み換え型融合（その核酸配列またはオープンリーディングフレームの）を含む。別の実施形態では、この用語は化学的結合を含む。
【０２３０】
一実施形態では「形質転換」という用語は、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子を取り上げるために細菌細胞を改変することを指す。別の実施形態では、「形質転換」は、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子の遺伝子を発現するために細菌細胞を改変することを指す。
【０２３１】
別の実施形態では、遺伝物質および／またはプラスミドを細菌の中へと導入するために結合が使用される。結合の方法は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｎｉｋｏｄｉｎｏｖｉｃ  Ｊ．ら（Ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｎｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ  ｂｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｐｌａｓｍｉｄ．２００６  Ｎｏｖ；５６（３）：２２３−７）およびＡｕｃｈｔｕｎｇ  ＪＭら（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｍｏｂｉｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００５  Ａｕｇ  ３０；１０２（３５）：１２５５４−９）に記述されている。
【０２３２】
一実施形態では、「弱毒化」という用語は、細菌が動物の中に疾患を生じさせる能力の減退を意味する。つまり、弱毒化されたリステリア株の病原性特徴は野生型リステリアと比較すると低下しているが、弱毒化されたリステリアは培養物中で成長および維持する能力を有する。実施例として弱毒化されたリステリアを用いたＢａｌｂ／ｃマウスの静脈内接種を使用すると、接種した動物の５０％が生存する致死量（ＬＤ５０）は、野生型リステリアのＬＤ５０より少なくとも約１０倍増加するのが好ましく、少なくとも約１００倍増加するのがより好ましく、少なくとも約１，０００倍増加するのがより好ましく、少なくとも約１０，０００倍増加するのがなおより好ましく、および少なくとも約１００，０００倍増加するのが最も好ましい。したがってリステリアの弱毒化された株は、投与された動物を殺さないものであるか、または投与された細菌の数が同じ動物を殺すのに必要な野生型の弱毒化されていない細菌の数より非常に多いときのみ動物を殺すものである。弱毒化された細菌は、その成長のために必要な栄養素がその中に存在しないために一般的な環境内では複製する能力を有しないものを意味するとも解釈されるべきである。したがって、細菌は必要な栄養素がその中で提供される制御された環境に複製が限定される。したがって、本開示の弱毒化された株は制御されていない複製の能力がないという点で、環境的に安全である。
【０２３３】
組成物
一実施形態では、本開示の組成物は免疫原性組成物である。一実施形態では、本開示の組成物はインターフェロンガンマの強い先天的な刺激を誘発し、一実施形態では、これは抗血管形成特性を有する。一実施形態では、本開示のリステリアはインターフェロンガンマの強い先天的な刺激を誘発し、一実施形態では、これは抗血管形成特性を有する（Ｄｏｍｉｎｉｅｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００５  Ｍａｙ；５４（５）：４７７−８８．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｏｃｔ  ６、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｅａｔｔｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  Ｆｅｂ  １５；１６６（４）：２２７６−８２、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。一実施形態では、リステリアの抗血管形成特性は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって媒介される（Ｂｅａｔｔｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，  ２００１）。別の実施形態では、リステリアの抗血管形成特性は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介される。別の実施形態では、リステリアワクチン接種の結果としてのＩＦＮ−γ分泌は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔｈ１  ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＣ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはこれらの組み合せによって媒介される。
【０２３４】
別の実施形態では、本開示の組成物の投与は１つ以上の抗血管形成タンパク質または因子の生産を誘発する。一実施形態では、抗血管形成タンパク質はＩＦＮ−γである。別の実施形態では、抗血管形成タンパク質は、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、アンジオスタチン、エンドスタチン、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ（ｓＦｌｔ）−１、または可溶性エンドグリン（ｓＥｎｇ）である。一実施形態では、本開示のリステリアは、抗血管形成因子の放出に関与し、したがって一実施形態では、抗原を被験者に導入するためのベクターとしての役割に加えて、治療的な役割を有する。本明細書に開示された方法および組成物によって誘発される免疫応答は、別の実施形態ではＴ細胞応答である。別の実施形態では、免疫応答はＴ細胞応答を含む。別の実施形態では、応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む。
【０２３５】
全体を通して使用される「組成物」、および「免疫原性組成物」という用語はすべて同一の意味と質を有して交換可能である。いくつかの実施形態では、「医薬組成物」という用語は、例えば、必要な被験者に投与するなど、医薬用途に好適な組成物を指す。
【０２３６】
被験者内に強化した抗腫瘍Ｔ細胞応答を引き出すため、被験者内で腫瘍を薬物治療した免疫抑制を阻害するため、もしくは被験者の脾臓および腫瘍のＴエフェクター細胞の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加するため、またはこれらの任意の組み合わせの目的で、本明細書で開示された組成物を本明細書で開示された方法で使用してもよい。
【０２３７】
別の実施形態では、本開示のリステリア株を含む組成物はアジュバントをさらに含む。一実施形態では、本開示の組成物はアジュバントをさらに含む。別の実施形態では、本開示の方法および組成物で使用されるアジュバントは顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質である。別の実施形態では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦタンパク質を含む。別の実施形態では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、アジュバントはサポニンＱＳ２１である。別の実施形態では、アジュバントはサポニンＱＳ２１を含む。別の実施形態では、アジュバントは、モノホスホリルリピドＡである。別の実施形態では、アジュバントはモノホスホリルリピドＡを含む。別の実施形態では、アジュバントはＳＢＡＳ２である。別の実施形態では、アジュバントはＳＢＡＳ２を含む。別の実施形態では、アジュバントはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、アジュバントはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインである。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインを含む。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、アジュバントはクイルグリコシドであるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは細菌マイトジェンであるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは細菌毒素であるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは当該技術分野で既知の任意の他のアジュバントであるか、またはこれを含む。
【０２３８】
一実施形態では、本明細書で開示された免疫原性組成物は、核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含み、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ配列ペプチドを含む。一実施形態では、本明細書に開示された免疫原性組成物は、核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物に関し、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴ配列ペプチドを含み、前記組成物はさらに追加的な活性薬剤を含む。一実施形態では、前記追加的な活性薬剤は腫瘍溶解性ウイルスを含む。別の実施形態では、追加的な活性薬剤はＴ細胞受容体改変Ｔ細胞（受容体改変Ｔ細胞）を含む。別の実施形態では、追加的な活性薬剤はキメラ抗原受容体改変Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）を含む。別の実施形態では、追加的な活性薬剤は、治療的なまたは免疫調節性モノクローナル抗体を含む。別の実施形態では、追加的な活性薬剤は標的化チミジンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を含む。別の実施形態では、追加的な活性薬剤は改変Ｔ細胞受容体を組み込んだ養子移入細胞を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された追加的な活性薬剤は、弱毒化腫瘍溶解性ウイルス、Ｔ細胞受容体改変Ｔ細胞（受容体改変Ｔ細胞）、キメラ抗原受容体改変Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）、治療的または免疫調節性モノクローナル抗体、標的化チミジンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、もしくは改変Ｔ細胞受容体を組み込んだ養子移入細胞、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【０２３９】
一実施形態では、受容体改変Ｔ細胞は、選択された特異性を持つように改変された受容体を含む。別の実施形態では、改変された受容体の両方のポリペプチドは、選択された特異性を持つように組換えによって改変されたものである。一実施形態では、選択された特異性は細胞表面腫瘍リガンドに対するものである。
【０２４０】
一実施形態では、受容体改変Ｔ細胞は自己由来である。別の実施形態では、受容体改変Ｔ細胞は同種異系である。
【０２４１】
一実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は自己ＣＡＲ  Ｔ細胞である。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は同種異系である。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は単一供給源のＣＡＲ  Ｔ細胞である。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は自己ＨＬＡでマスクされたＣＡＲ  Ｔ細胞である。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は自己ＨＬＡが欠損したＣＡＲ  Ｔ細胞である。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は単一供給源のＨＬＡでマスクされたＣＡＲ  Ｔ細胞である。別の実施形態では、ＣＡＲＴ  Ｔ細胞は、単一供給源のＨＬＡが欠損したＣＡＲ  Ｔ細胞である。
【０２４２】
一実施形態では、追加的な活性薬剤は腫瘍溶解性ウイルスである。「腫瘍溶解性ウイルス」という用語は、一実施形態では、インビトロまたはインビボのいずれかで、ガン性細胞または増殖過剰細胞内で選択的に複製し、その増殖を遅くするかまたはその死を誘発する能力を持ち、その一方で正常な細胞に対しては全くあるいは最小限の影響しか持たない、遺伝学的改変ウイルスを意味する。
【０２４３】
一実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、レトロウイルス、レオウイルス、麻疹ウイルス、シンビスウイルス、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノウイルスを含む群から選択される。一実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍細胞に感染する。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは前立腺腫瘍細胞に感染する。その他の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは子宮頸ガン腫瘍細胞に感染する。一実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、異種抗原をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、異種抗原は腫瘍関連抗原またはその断片である。一実施形態では、異種抗原は、ＰＳＡ抗原もしくはその断片、ＨＰＶ抗原もしくはその断片またはキメラＨｅｒ−２／ｎｅｕ抗原もしくはその断片である。別の実施形態では、異種抗原はプログラム細胞死受容体（ＰＤ−１）結合作動薬または拮抗薬である。
【０２４４】
一実施形態では、治療的または免疫調節性モノクローナル抗体は、ガン細胞の表面に存在する前記異種抗原のエピトープを認識する。一実施形態では、異種抗原は腫瘍関連抗原である。一実施形態では、異種抗原はＰＳＡ抗原、ＨＰＶ抗原、またはキメラＨｅｒ−２／ｎｅｕ抗原である。一実施形態では、モノクローナル抗体はＰＳＡエピトープを認識する。一実施形態では、モノクローナル抗体はＨＰＶエピトープを認識する。一実施形態では、モノクローナル抗体はＨｅｒ−２／ｎｅｕエピトープを認識する。別の実施形態では、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕエピトープを認識するモノクローナル抗体は、トラスツズマブ（Ｈｅｃｅｐｔｉｎ（登録商標）として商標済み）、パニツムマブ、またはＨｅｒ−２／ｎｅｕエピトープを認識することが当該技術分野で既知のその他の任意のものを含む。別の実施形態では、治療的または免疫調節性モノクローナル抗体は、前記異種抗原上に存在しないエピトープを認識する。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、「抗体」という用語は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖなど、本明細書に記述される所望の標的と特異的に相互作用する（例えば、食作用を有する細胞と結合することなどの）能力を有する無傷の分子ならびにその機能的断片を指す。いくつかの実施形態では、抗体断片は以下のものを含む。
（１）Ｆａｂ、抗体分子の一価抗原結合断片を含有する断片で、これは無傷の軽鎖および１つの重鎖の一部分を得るために酵素パパインを用いた抗体全体の消化によって生成できる。
（２）Ｆａｂ’、無傷の軽鎖および重鎖の一部分を得るためにペプシンを用いて抗体全体を処理し、引き続いて還元することによって得られる抗体分子の断片、抗体分子当たり２つのＦａｂ’断片が得られる。
（３）（Ｆａｂ’）２、酵素ペプシンを用いて、引き続いて還元を行わずに抗体全体を処理することによって得られる抗体の断片、Ｆ（ａｂ’）２は２つのジスルフィド結合によって一緒に保持される２つのＦａｂ’断片の二量体である。
（４）Ｆｖ、２つの鎖として発現される軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された断片。
（５）一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）、遺伝子学的に融合した一本鎖分子として好適なポリペプチドリンカーによってリンクされた、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された分子。
【０２４６】
これらの断片を作製する方法は当該技術分野で既知である。（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８を参照。参照により本明細書に組み込む）。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、抗体断片は、抗体のタンパク質加水分解、または大腸菌もしくは哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養または他のタンパク質発現系）内での断片をコードするＤＮＡの発現によって調製される場合がある。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、抗体断片は、従来の方法による抗体全体のペプシンまたはパパイン消化によって得られる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２で表される５Ｓ断片を提供するためにペプシンを用いた抗体の酵素的開裂によって、抗体断片を生成することができる。チオール還元剤、および任意選択的にジスルフィド結合の開裂の結果として得られるスルフヒドリル基の保護基を使用して、この断片をさらに開裂して３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価断片を生成することができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素的開裂は、２つの一価Ｆａｂ’断片および１つのＦｃ断片を直接的に生成する。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許  第４，０３６，９４５号および同第４，３３１，６４７号、およびその中に含有される参考文献によって記述され、これらの特許はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，７３：１１９−１２６，１９５９も参照のこと。断片が無傷の抗体によって識別される抗原に結合する限り、一価の軽重鎖断片を形成するための重鎖の分離、断片のさらなる開裂、または他の酵素的、化学的、または遺伝子学的な技法など、抗体を開裂する他の方法を使用してもよい。
【０２４９】
Ｆｖ断片はＶＨ鎖およびＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、Ｉｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６９：２６５９−６２，１９７２に記述されるように非共有結合性である場合がある。あるいは、可変鎖を分子間ジスルフィド結合によってリンクする、またはグルタルアルデヒドなどの化学薬品によって架橋することができる。Ｆｖ断片はペプチドリンカーによって接続されたＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含むことが好ましい。これらの単一鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって接続されるＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造的遺伝子は発現ベクター内へと挿入され、これはその後大腸菌などの宿主細胞の中へと導入される。組み換え型宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを用いて単一のポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを生成するための方法は、例えば、ＷｈｉｔｌｏｗおよびＦｉｌｐｕｌａによる方法、２：９７−１０５，１９９１；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９８８；Ｐａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１２７１−７７，１９９３；およびＬａｄｎｅｒらの米国特許  第４，９４６，７７８号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、に記述されている。
【０２５０】
抗体断片の別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。対象となる抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって、ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）を得ることができる。かかる遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して抗体生成細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって調製される。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｆｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２：１０６−１０，１９９１を参照のこと。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記述される抗体または断片は、抗体の「ヒト化形態」を含む。いくつかの実施形態では、「抗体のヒト化形態」という用語は、非ヒト（例えば、マウスの）抗体を指し、これは非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する免疫グロブリンのキメラ型分子、免疫グロブリン鎖、またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２、または抗体の他の抗原結合部分配列など）である。ヒト化抗体は、その中でレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、非ヒト種（ドナー抗体）（所望の特異性、親和性、および容量を有するマウス、ラット、またはウサギなど）のＣＤＲからの残基によって置き換えられる、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。いくつかの事例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体は、レシピエント抗体でも移入したＣＤＲまたはフレームワーク配列でも見られない残基も含む場合がある。一般に、ヒト化抗体は少なくとも１つの、そして典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むことになり、ここでＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてはヒト免疫グロブリン共通配列のものである。最適にはヒト化抗体は、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含むことになる［Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）］。
【０２５２】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該技術分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトの供給源からその中に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば移入残基と称され、これらは典型的には移入可変ドメインから取られる。ヒト化は本質的にウィンターおよびその協力者の方法［Ｊｏｎｅｓｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］に従って、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応配列の代わりに用いることによって遂行できる。したがって、こうしたヒト化抗体はキメラ型抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、無傷のヒト可変ドメインより大幅に少ないものが非ヒト種からの対応配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は典型的にはヒト抗体であり、この中でいくつかのＣＤＲ残基および場合によってはいくつかのＦＲ残基は齧歯類の抗体の類似部位からの残基によって置換されている。
【０２５３】
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む、当該技術分野で既知の様々な技法を使用しても生産することができる［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１（１９９１）］．Ｃｏｌｅらの技法およびＢｏｅｒｎｅｒらの技法もヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）、およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６−９５（１９９１）］。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、マウスの中へと導入することによってヒトを作製することができ、この中で内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的にまたは完全に無効化されている。チャレンジに際して、ヒト抗体の生成が観察され、これは遺伝子の再配列、組立、および抗体レパートリーを含むすべてに関してヒトの中で見られるものと酷似している。この取り組みは、例えば、米国特許  第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６、および以下の科学出版物：Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，  ８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３  ６５−９３（１９９５）に記述されている。
【０２５４】
「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、免疫グロブリンまたは抗体、またはその断片がこれに特異的に結合する抗原上の部位を指す。タンパク質の３次折り畳みによって並置された連続アミノ酸または不連続アミノ酸の両方から、エピトープを形成することができる。連続的なアミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には変性溶剤への曝露に対して保持されるが、３次折り畳みによって形成されたエピトープは典型的には変性溶剤を用いた処理で失われる。エピトープは固有の空間的配座にある典型的に少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的配座を決定する方法としては、例えば、Ｘ線結晶構造解析、および２次元核磁気共鳴が挙げられる。
【０２５５】
一実施形態では、本明細書に開示された組成物は治療的モノクローナル抗体または免疫調節性モノクローナル抗体を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組成物はＬｍ株および治療的モノクローナル抗体または免疫調節性モノクローナル抗体を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組成物は治療的モノクローナル抗体または免疫調節性モノクローナル抗体を含み、組成物は本明細書に開示されたリステリア株を含まない。
【０２５６】
一実施形態では、チミジンキナーゼ阻害剤は、メシル酸イマチニブ（ＩＭ）、ダサチニブ（Ｄ）、ニロチニブ（Ｎ）ボスチニブ（Ｂ）またはＩＮＮＯ  ４０６、またはその任意の組み合わせを含む。
【０２５７】
一実施形態では、本明細書で開示した組成物は、標的チミジンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を含む。別の実施形態では、本明細書で開示した組成物はＬｍ株および標的チミジンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を含む。別の実施形態では、本明細書で開示した組成物は標的チミジンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を含み、ここで組成物には本明細書に開示されたリステリア株は含まれない。
【０２５８】
一実施形態では、本明細書に開示される疾患はガンまたは腫瘍である。一実施形態では、本開示の方法で治療されるガンは乳ガンである。別の実施形態では、このガンは子宮頸ガンである。別の実施形態では、このガンはＨｅｒ２を含有するガンである。別の実施形態では、このガンはメラノーマである。別の実施形態では、このガンは膵臓ガンである。別の実施形態では、このガンは卵巣ガンである。別の実施形態では、このガンは胃ガンである。別の実施形態では、このガンは膵臓のガンの病巣である。別の実施形態では、このガンは肺腺ガンである。別の実施形態では、これは多形性膠芽腫である。別の実施形態では、このガンは結腸直腸腺ガンである。別の実施形態では、このガンは肺扁平上皮腺ガンである。別の実施形態では、このガンは胃腺ガンである。別の実施形態では、このガンは卵巣表面の上皮性新生物（例えば、その良性の、増殖性の、または悪性の変種）である。別の実施形態では、このガンは口腔扁平上皮ガンである。別の実施形態では、このガンは非小細胞肺ガンである。別の実施形態では、このガンは子宮内膜ガンである。別の実施形態では、このガンは膀胱ガンである。別の実施形態では、このガンは頭頸部ガンである。別の実施形態では、このガンは前立腺ガンである。別の実施形態では、このガンは口腔咽頭ガンである。別の実施形態では、このガンは肺ガンである。別の実施形態では、このガンは肛門ガンである。別の実施形態では、このガンは大腸ガンである。別の実施形態では、このガンは食道ガンである。別の実施形態では、このガンは中皮腫である。
【０２５９】
一実施形態では、異種抗原はＰＤ−１またはその免疫原性断片である。別の実施形態では、異種抗原はＰＤ−１拮抗薬である。一実施形態では、ＰＤ−１拮抗薬は、抗体もしくはその断片、ＰＤ−１拮抗薬もしくはその断片、またはＰＤ−１部分拮抗薬もしくはその断片、またはその任意の組み合わせを含む群から選択される。
【０２６０】
別の実施形態では、抗原はＨＰＶ−Ｅ７である。別の実施形態では、抗原はＨＰＶ−Ｅ６である。別の実施形態では、抗原はＨＥＲ２／ｎｅｕである。別の実施形態では、抗原はＮＹ−ＥＳＯ−１である。別の実施形態では、抗原はテロメラーゼ（ＴＥＲＴ）である。別の実施形態では、抗原はＳＣＣＥである。別の実施形態では、抗原はＣＥＡである。別の実施形態では、抗原はＬＭＰ−１である。別の実施形態では、抗原はｐ５３である。別の実施形態では、抗原は炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）である。別の実施形態では、抗原はＰＳＭＡである。別の実施形態では、抗原は前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）である。別の実施形態では、抗原はＨＭＷ−ＭＡＡである。別の実施形態では、抗原はＷＴ−１である。別の実施形態では、抗原はＨＩＶ−１Ｇａｇである。別の実施形態では、抗原はプロテイナーゼ３である。別の実施形態では、抗原はチロシナーゼ関連タンパク質２である。別の実施形態では、抗原はＰＳＡ（前立腺特異抗原）である。別の実施形態では、抗原は、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＰＶ−Ｅ６、Ｈｅｒ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ）、ＳＣＣＥ、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＥＧＦＲ−ＩＩＩ、サバイビン、アポトーシス反復含有のバキュロウイルス阻害剤５（ＢＩＲＣ５）、ＷＴ−１、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、ＣＥＡ、ＬＭＰ−１、ｐ５３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２、Ｍｕｃ１、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）またはこれらの組み合わせから選択される。
【０２６１】
別の実施形態では、「免疫原性断片」は、単独でまたは本明細書に開示されたワクチン組成物内で被験者に投与されるとき、免疫応答を引き出す免疫原性断片である。別の実施形態では、かかる断片は、体液性免疫応答および／または適応免疫応答を引き出すために必要なエピトープを含有する。
【０２６２】
一実施形態では、腫瘍溶解性ウイルス内で発現される異種抗原は、本明細書に開示されたＬｍ株内で発現されるものと同じかまたはほぼ同じ異種抗原またはその断片を含む。例えば、異種抗原またはその断片を含む融合ポリペプチドを含む本明細書に開示されたＬｍ株は、本明細書に開示された腫瘍溶解性ウイルスから発現されるものと同じ異種抗原またはその断片を含みうる。別の実施形態では、異種抗原は同じでありつつも、異種抗原の断片は異なっていてもよく、異種抗原の異なるドメインを含んでもよい。例えば、Ｌｍ株が抗原のＮ末端領域を発現し、腫瘍溶解性ウイルスが同じ抗原のＣ末端領域を発現してもよく、またはその逆でもよい。
【０２６３】
一実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍細胞に感染する。
【０２６４】
一実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスはＰＳＡ過剰発現腫瘍細胞に感染する。一実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは前立腺腫瘍細胞に感染する。別の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは前立腺腫瘍細胞の前駆体に感染する。別の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスはＨＰＶ過剰発現腫瘍細胞に感染する。別の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは子宮頸ガン腫瘍細胞に感染する。別の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは子宮頸ガン細胞の前駆体に感染する。なお別の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスはＨｅｒ２／ｎｅｕ過剰発現腫瘍細胞に感染する。なお別の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは骨肉腫またはユーイング肉腫肉腫（ＥＳ）細胞に感染する。
【０２６５】
一実施形態では、本明細書に開示された腫瘍溶解性ウイルスは、プログラム細胞死受容体（ＰＤ−１）結合作動薬または拮抗薬を発現する。一実施形態では、ＰＤ−１拮抗薬は、抗体もしくはその断片、ＰＤ−１拮抗薬、またはＰＤ−１部分拮抗薬、またはその任意の組み合わせを含む群から選択される。当業者には、「ＰＤ−１」という用語は、もともとはアポトーシス処置を受けたマウスＴ細胞株のサブトラクティブハイブリダイゼーションによって識別される５０〜５５  ｋＤａタイプＩ膜貫通受容体である、プログラム細胞死１タンパク質の頭字語であることが十分に理解される（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２、Ｅｍｂｏ  Ｊ．  １  １  ：３８８７−９５）。ＰＤ−１は、活性化されたＴ、Ｂ、および骨髄系細胞（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ  ｅｆ  ａｌ．、２００５、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３：５１５−４８；Ｓｈａｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００７、Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ８：２３９−４５）で発現する。ヒトＰＤ−１のアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００５００９．２である。マウスＰＤ−１のアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＩ  １９１８０．１である。
【０２６６】
一実施形態では、腫瘍細胞を標的化した腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍細胞死を引き起こす。
【０２６７】
一実施形態では、本明細書で開示した組成物は腫瘍溶解性ウイルスを含む。別の実施形態では、本明細書で開示した組成物は、Ｌｍ株および腫瘍溶解性ウイルスを含む。別の実施形態では、本明細書で開示した組成物は腫瘍溶解性ウイルスを含み、ここで組成物には本明細書に開示されたリステリア株は含まれない。
【０２６８】
別の実施形態では、本明細書で開示した組成物の追加的な活性薬剤はＴ細胞受容体改変Ｔ細胞（受容体改変Ｔ細胞）を含む。別の実施形態では、Ｔ細胞は形質導入され、選択された特異性を持つように改変された受容体を発現する。受容体改変Ｔ細胞の受容体は、特定の腫瘍特異性を示す分子である。一実施形態では、受容体改変Ｔ細胞の遺伝学的に修飾された受容体は、ヒトＨＰＶ腫瘍リガンド、ＰＳＡ腫瘍リガンドまたはＨｅｒ−２／ｎｅｕ腫瘍リガンドに対する選択された特異性を持つ。
【０２６９】
本開示の受容体改変細胞は、望ましい遺伝学的に修飾されたＴ細胞受容体を安定して発現するように遺伝学的に修飾される。    一実施形態では、Ｔ細胞はその表面上で修飾された受容体を安定して発現し、新しい腫瘍特異性を与えるように遺伝学的に修飾される。
【０２７０】
一実施形態では、受容体改変Ｔ細胞は、腫瘍細胞表面リガンドを認識することになる受容体をコードする核酸を含む。一実施形態では、受容体改変Ｔ細胞は、腫瘍細胞表面リガンドを認識する受容体を発現する。一実施形態では、受容体改変Ｔ細胞は、腫瘍細胞表面リガンドに結合される受容体を発現する。一実施形態では、腫瘍細胞表面リガンドは、ＨＰＶ腫瘍細胞表面リガンドまたはその一部分を含む。別の実施形態では、腫瘍細胞表面リガンドは、ＰＳＡ腫瘍細胞表面リガンドまたはその一部分を含む。別の実施形態では、腫瘍細胞表面リガンドはＨｅｒ−２／ｎｅｕ腫瘍細胞表面リガンドまたはその一部分を含む。
【０２７１】
一実施形態では、受容体改変Ｔ細胞の遺伝学的に修飾された受容体は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）細胞表面リガンドドメインまたはその断片、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）細胞表面リガンドドメインまたはその断片、またはキメラｈｅｒ２／ｎｅｕ細胞表面リガンドドメインまたはその断片に結合する。別の実施形態では、受容体改変Ｔ細胞の遺伝学的に修飾された受容体は、本明細書に開示されたＬｍ株内で発現される腫瘍細胞表面リガンドまたはその断片に対して、異種抗原と同じかまたはほぼ同じ選択的結合特異性を持つ。例えば、異種抗原またはその断片を含む融合ポリペプチドを含む本明細書に開示されたＬｍ株は、本明細書に開示された受容体改変Ｔ細胞によって特異的に認識されるものと同じ異種抗原またはその断片を含みうる。本明細書に開示されたＬｍ株の異種抗原は本明細書に開示された受容体改変Ｔ細胞によって認識されるものと同じ抗原を含みうる一方、受容体改変Ｔ細胞の受容体によって認識される実際の結合特異性は、Ｌｍ株からの異種抗原発現の範囲内に含まれなくてもよい。例えば、Ｌｍ株が抗原のＮ末端領域を発現し、受容体改変Ｔ細胞が同じ抗原のＣ末端領域に対する選択的特異性を持ってもよく、またはその逆でもよい。
【０２７２】
一実施形態では、本明細書で開示した組成物は受容体改変Ｔ細胞を含む。一実施形態では、本明細書で開示した組成物は、Ｌｍ株および受容体改変Ｔ細胞を含む。別の実施形態では、本明細書で開示した組成物は受容体改変Ｔ細胞を含み、ここで組成物には本明細書に開示されたリステリア株は含まれない。
【０２７３】
一実施形態では、本明細書で開示された組成物は、組み換え型リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）株を含む。
【０２７４】
一実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書に開示された受容体改変Ｔ細胞、および本明細書に開示された組み換え型弱毒化リステリア株を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された免疫原性組成物の各々の構成成分を、本明細書に開示された免疫原性組成物の別の構成成分の前に、別の構成成分と同時に、または別の構成成分の後に投与する。一実施形態では、投与が同時になされる時でも、Ｌｍを含む組成物と受容体改変Ｔ細胞を含む組成物は２つの別個の組成物として投与されてもよい。別の実施形態では、投与が同時になされる時でも、Ｌｍ組成物と受容体改変Ｔ細胞組成物は２つの別個の組成物として投与されてもよい。なお別の実施形態では、Ｌｍ組成物は受容体改変Ｔ細胞を含みうる。
【０２７５】
別の実施形態では、本明細書に開示された組成物の追加的な活性薬剤はキメラ抗原受容体改変Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）である。一実施形態では、Ｔ細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように形質導入される。ＣＡＲは、望ましい抗原（例えば、腫瘍抗原）のための抗体ベースの特異性と、Ｔ細胞受容体を活性化する細胞内ドメインとを組み合わせて、特異的抗腫瘍細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成する分子である。
【０２７６】
本開示のＣＡＲ  Ｔ細胞は、望ましいＣＡＲを安定して発現するように遺伝学的に修飾される。一実施形態では、Ｔ細胞は、その表面上に抗体結合を安定的に発現し、ＭＨＣに依存しない新しい抗原特異性を与えるように、遺伝学的に修飾される。
【０２７７】
一実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞によって認識される抗原は腫瘍関連抗原である。一実施形態では、抗原特異性は、ＰＳＡ抗原またはその免疫原性断片のためである。別の実施形態では、抗原特異性は、ＨＰＶ抗原またはその免疫原性断片のためである。別の実施形態では、抗原特異性は、本明細書で開示した腫瘍関連抗原またはその免疫原性断片のためである。
【０２７８】
なお別の実施形態では、抗原特異性は、キメラＨｅｒ−２／ｎｅｕ抗原またはその断片のためである。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、腫瘍関連抗原を特異的に認識するポリペプチドをコードする核酸を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは抗原結合ドメインを含む。別の実施形態では、抗原結合ドメインは抗体またはその抗原結合ドメインを含む。
【０２７９】
「抗体断片」という用語は、特異的に抗原に結合する能力を有する無傷の抗体の部分を指す。抗体断片の実施例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、およびＦｖ断片、線状抗体、ｓｃＦｖ抗体、および抗体断片から形成される多選択性抗体が挙げられるがこれに限定されない。、
【０２８０】
本明細書で使用される「抗体重鎖」は、すべての抗体分子にそれらの自然発生的な配座で存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうち長い方を意味する。
【０２８１】
本明細書で使用される「抗体軽鎖」は、すべての抗体分子にそれらの自然発生的な配座で存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうち短い方を意味し、κおよびλ軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを意味する。
【０２８２】
本明細書で使用される「合成抗体」という用語は、例えば、本明細書で説明したとおりバクテリオファージによる抗体発現など、組み換え型ＤＮＡ技術を使用して生成された抗体を意味する。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成され、かつＤＮＡ分子が抗体タンパク質を発現する抗体、あるいは抗体を特定するアミノ酸配列を意味するようにも解釈されるべきであり、ここで、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当該技術分野で入手可能でありかつ周知の合成ＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して取得したものである。
【０２８３】
一実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗原結合領域をコードする拡散を含む。一実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は抗原結合領域を発現する。一実施形態では、抗原結合領域は抗体またはその抗原結合ドメインである。一実施形態では、その抗原結合ドメインはＦａｂまたはｓｃＦｖである。
【０２８４】
抗体に関して「特異的に結合する」という用語は、特異的な抗原を認識するが、実質的にサンプル内の他の分子を認識もしくは結合しない抗体を包含することを当業者は理解するであろう。例えば、１つの種からの抗原に特異的に結合する抗体は、１つ以上の種からその抗原にも結合する場合があるが、かかる異種間の反応性それ自体は抗体の分類を特異的なものとして変更することはなく、別の実施例では、抗原に特異的に結合される抗体は抗原の異なる対立形質にも結合されうる。しかしながら、かかる交差反応は、それ自体抗体の分類を特異的なものとして変更することはない。いくつかの事例では、「特異的な結合」または「特異的に結合する」という用語を、抗体、タンパク質、またはペプチドの第２の化学種との相互作用に関連して使用することができ、相互作用が化学種の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味し、例えば、抗体は、特異的なアミノ酸配列ではなく、特異的なタンパク質構造を認識および結合する。
【０２８５】
一実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）ドメインまたはその断片、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原ドメインまたはその断片、またはキメラｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原ドメインまたはその断片に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、本明細書に開示されたＬｍ株内で発現されたものと同じかまたはほぼ同じ異種抗原またはその断片を特異的に認識する。例えば、異種抗原またはその断片を含む融合ポリペプチドを含む本明細書に開示されたＬｍ株は、本明細書に開示されたＣＡＲ  Ｔ細胞によって特異的に認識されるものと同じ異種抗原またはその断片を含みうる。本明細書に開示されたＬｍ株の異種抗原は本明細書に開示されたＣＡＲ  Ｔ細胞によって認識されるものと同じ抗原を含みうる一方、ＣＡＲ  Ｔ細胞の受容体によって認識される実際の抗原エピトープは、Ｌｍ株からの異種抗原発現の範囲内に含まれなくてもよい。例えば、Ｌｍ株が抗原のＮ末端領域を発現し、ＣＡＲ  Ｔ細胞が同じ抗原のＣ末端領域内のエピトープを特異的に認識してもよく、またはその逆でもよい。
【０２８６】
一実施形態では、本明細書で開示した組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含む。一実施形態では、本明細書で開示した組成物は、Ｌｍ株およびＣＡＲ  Ｔ細胞を含む。別の実施形態では、本明細書で開示した組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、ここで組成物には本明細書に開示されたリステリア株は含まれない。
【０２８７】
一実施形態では、本明細書で開示された組成物は、組み換え型リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）株を含む。
【０２８８】
一実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書に開示された腫瘍溶解性ウイルスおよび／または本明細書に開示されたキメラ抗原受容体改変細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）、ならびに本明細書に開示された組み換え型弱毒化リステリアを含む。別の実施形態では、本明細書に開示された免疫原性組成物の各々の構成成分を、本明細書に開示された免疫原性組成物の別の構成成分の前に、別の構成成分と同時に、または別の構成成分の後に投与する。一実施形態では、投与が同時になされる時でも、Ｌｍ組成物とＣＡＲ  Ｔ細胞は２つの別個の組成物として投与されてもよい。別の実施形態では、投与が同時になされる時でも、Ｌｍ組成物とＣＡＲ  Ｔ細胞は２つの別個の組成物として投与されてもよい。あるいは、別の実施形態では、Ｌｍ組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含みうる。なお別の実施形態では、Ｌｍ組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含みうる。
【０２８９】
別の実施形態では、非経口的に、癌近傍に、経粘膜的に、経皮的に、筋肉内に、静脈内に、皮内に、皮下に、腹腔内に、脳室内に、頭蓋内に、腟内に、または腫瘍内になどの当業者に既知の任意の方法によって、本明細書で開示された組成物を被験者に投与する。
【０２９０】
別の実施形態では、組成物は経口で投与され、したがってこれは経口投与に好適な形態、すなわち固形調製物または液状調製物で処方される。好適な固形の経口剤形としては、錠剤、カプセル、丸薬、顆粒、ペレット、およびこれに類するものが挙げられる。好適な液状の経口剤形としては、溶液、懸濁液、分散剤、エマルション、オイル、およびこれに類するものが挙げられる。本開示の別の実施形態では、活性成分はカプセルで処方される。この実施形態によると、本開示の組成物は活性化合物および不活性担体または希釈剤に加えて、硬いゼラチンカプセルを含む。
【０２９１】
別の実施形態では、組成物は、液状調製物の静脈内、動脈内、または筋肉内注射によって投与される。好適な液体剤形としては、溶液、懸濁液、分散剤、エマルション、オイルおよびこれに類するものが挙げられる。一実施形態では、医薬組成物は静脈内に投与され、したがって静脈内投与に好適な形態で処方される。別の実施形態では、医薬組成物は動脈内に投与され、したがって動脈内投与に好適な形態で処方される。別の実施形態では、医薬組成物は筋肉内に投与され、したがって筋肉内投与に好適な形態で処方される。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスが組み換え型Ｌｍ株を含む組成物から別個に投与されるとき、腫瘍溶解性ウイルスは、静脈内で、皮下で、または腫瘍もしくは腫瘍床の中へと直接的に注射されてもよい。一実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物は、腫瘍を外科手術的に除去した後に残された空間、例えば、前立腺腫瘍の除去後の前立腺内の空間の中へと注射される。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、受容体改変Ｔ細胞が組み換え型Ｌｍ株を含む組成物から別個に投与されるとき、受容体改変Ｔ細胞は、静脈内で、皮下で、または腫瘍もしくは腫瘍床の中へと直接的に注射されてもよい。一実施形態では、受容体改変Ｔ細胞を含む組成物は、腫瘍を外科手術的に除去した後に残された空間、例えば、前立腺腫瘍の除去後の前立腺内の空間の中へと注射される。
【０２９４】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞が組み換え型Ｌｍ株を含む組成物から別個に投与されるとき、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、静脈内で、皮下で、または腫瘍もしくは腫瘍床の中へと直接的に注射されてもよい。一実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞を含む組成物は、腫瘍を外科手術的に除去した後に残された空間、例えば、前立腺腫瘍の除去後の前立腺内の空間の中へと注射される。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体が組み換え型Ｌｍ株を含む組成物から別個に投与されるとき、モノクローナル抗体は、静脈内で、皮下で、または腫瘍もしくは腫瘍床の中へと直接的に注射されてもよい。一実施形態では、モノクローナル抗体を含む組成物は、腫瘍を外科手術的に除去した後に残された空間、例えば、前立腺腫瘍の除去後の前立腺内の空間の中へと注射される。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、ＴＫＩが組み換え型Ｌｍ株を含む組成物から別個に投与されるとき、ＴＫＩは、静脈内で、皮下で、または腫瘍もしくは腫瘍床の中へと直接的に注射されてもよい。一実施形態では、ＴＫＩを含む組成物は、腫瘍を外科手術的に除去した後に残された空間、例えば、前立腺腫瘍の除去後の前立腺内の空間の中へと注射される。
【０２９７】
一実施形態では、「免疫原性組成物」という用語は、本明細書に開示された組み換え型リステリア、およびアジュバント、腫瘍溶解性ウイルス、キメラ抗原受容体改変細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）、治療的または免疫調節性モノクローナル抗体、標的チミジンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、または受容体改変Ｔ細胞、またはその任意の組み合わせを包含する。別の実施形態では、免疫原性組成物は本明細書に開示された組み換え型リステリアを含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は当該技術分野で既知のまたは本明細書に開示されたアジュバントを含む。本明細書にさらに開示されているとおり、かかる組成物の投与が免疫応答を強化する、またはＴエフェクター細胞に対する制御性Ｔ細胞の比を増加するもしくは抗腫瘍免疫応答を引き出すことも理解されるべきである。
【０２９８】
一実施形態では、本開示は、説明したリステリア株を含み、かつ腫瘍溶解性ウイルス、ＣＡＲ  Ｔ細胞、治療的または免疫調節性モノクローナル抗体、標的チミジンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、または受容体改変Ｔ細胞などの追加的な薬剤をさらに含む組成物の投与を含めた使用方法を提供する。一実施形態では、「医薬組成物」という用語は、リステリア株、腫瘍溶解性ウイルス、ＣＡＲ  Ｔ細胞）、治療的または免疫調節性モノクローナル抗体、標的チミジンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、または受容体改変Ｔ細胞を医薬的に許容される担体または希釈剤と共に含む、治療的に有効な量の活性成分または成分を包含する。「治療的に有効な量」という用語が、所与の病状および投与レジメンに対して治療的効果を提供する量を指すことが理解されるであろう。
【０２９９】
「投与する」という用語は被験者に本開示の組成物との接触をもたらすことを包含することを当業者は理解するであろう。一実施形態では、投与はインビトロで、すなわち、試験管内で、またはインビボで、すなわち、生命体、例えば、ヒトの細胞または組織の中で遂行することができる。一実施形態では、本開示は、本開示のリステリア株およびその組成物を被験者に投与することを包含する。
【０３００】
本明細書で使用される時、「約」という用語は定量的な用語プラスもしくはマイナス５％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス１０％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス１５％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス２０％を意味する。「被験者」という用語は、状態もしくはその後遺症に対する療法を必要とするまたはその状態になりやすい、成人のヒト、またはヒトの子ども、ティーンエージャー、もしくは青年を含む哺乳類を包含することができ、これはイヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびマウスなどのヒト以外の哺乳類を含みうることを当業者は理解するべきである。この用語が家畜を包含してもよいことも理解されるであろう。「被験者」という用語はあらゆる点で正常な個体を除外しない。
【０３０１】
本明細書に開示された免疫原性組成物の投与に続いて、本明細書に開示された方法は末梢リンパ器官内でのＴエフェクター細胞の増殖を誘発し、腫瘍部位におけるＴエフェクター細胞の存在の強化をもたらす。別の実施形態では、本明細書に開示された方法は末梢リンパ器官におけるＴエフェクター細胞の増殖を誘発し、Ｔエフェクター細胞の末梢における存在の強化をもたらす。Ｔエフェクター細胞のかかる増殖は、Ｔｒｅｇの数に影響を与えずに、末梢内および腫瘍部位におけるＴエフェクター細胞の制御性Ｔ細胞に対する比の増加をもたらす。末梢リンパ器官としては、脾臓、パイエル板、リンパ節、アデノイド等が挙げられるが、これに限定されないことを当業者は理解するであろう。一実施形態では、Ｔｒｅｇの数に影響を与えずに、Ｔエフェクター細胞の制御性Ｔ細胞に対する比の増加が末梢で生じる。別の実施形態では、末梢、リンパ器官、および腫瘍部位で、これらの部位でのＴｒｅｇの数に影響を与えずに、Ｔエフェクター細胞の制御性Ｔ細胞に対する比の増加が生じる。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞の比の増加はＴｒｅｇの頻度を減少するが、この部位におけるＴｒｅｇの総数は減少しない。
【０３０２】
併用療法およびその使用方法
一実施形態では、本開示は被験者内での抗腫瘍Ｔ細胞応答の向上を誘発する方法を提供し、この方法は、核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む有効な量の免疫原性組成物を被験者に投与するステップを含むが、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、ここで、融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ配列ペプチドを含み、また（ａ）前記組成物が追加的な活性薬剤をさらに含むか、（ｂ）前記方法が追加的な活性薬剤を含む有効な量の組成物を前記被験者に投与するステップをさらに含むか、または（ｃ）前記方法は標的放射線療法を前記被験者に施すステップをさらに含むか、またはその（ａ）〜（ｃ）の任意の組み合わせを含む。
【０３０３】
一実施形態では、本明細書で説明したリステリア株を含む任意の組成物を、本明細書で開示した方法で使用されうる。一実施形態では、例えば、本明細書で説明した、腫瘍溶解性ウイルス、キメラ抗原受容体改変細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）、治療的または免疫調節性モノクローナル抗体、標的チミジンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、または改変Ｔ細胞受容体を組み込んだ養子移入細胞またはその任意の組み合わせなど、リステリア株および追加的な活性薬剤を含む任意の組成物が、本明細書で開示した方法で使用されうる。一実施形態では、本明細書で説明した追加的薬剤を含む任意の組成物を、本明細書で開示した方法で使用されうる。リステリア株を含む組成物で、追加的薬剤を含むものと含まないものを上記に詳細に説明してきた。追加的薬剤を含む組成物についても上記に詳細に説明してきた。一部の実施形態では、本明細書で開示した方法において、例えば、腫瘍溶解性ウイルス、ＣＡＲ  Ｔ細胞、治療的または免疫調節性モノクローナル抗体、標的チミジンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、または改変Ｔ細胞受容体を組み込んだ養子移入細胞などの、追加的な活性薬剤を含む組成物は、リステリア株を含む組成物の投与の前に、それと同時に、またはその後で投与しうる。
【０３０４】
放射線療法（ＲＴ）は局所療法であり、化学療法の全身毒性および免疫抑制の効果を示さない。腫瘍細胞表面上でのＭＨＣ  Ｉにおける腫瘍の新抗原提示の増大により、カルレティキュリンの転座の増加により、およびＨＭＧＢ１の分泌の誘発により、ＲＴが免疫原性細胞死を誘発することを示す十分な前臨床証拠がある。
【０３０５】
一実施形態では、「放射線療法」は、内部および外部放射線療法、放射免疫療法、ならびにＸ線、ガンマ線、アルファ粒子、ベータ粒子、光子、電子、中性子、放射性同位元素、放射性同位元素およびその他の形態の電離放射線の移植片を含めた様々なタイプの放射線の使用を含む複数のタイプの放射線療法を意味するために、当該技術分野で一般的に使用されている用語である。最近の実験的な療法では、放射性同位元素を腫瘍部位に直接届けるための、悪性腫瘍に特異的なモノクローナル抗体が採用されているが、放射免疫療法と呼ばれる。最も一般的なタイプの放射線治療は、新生腫瘍を含む身体部位を対象にする放射線で、これは局所または局部放射線療法として知られている。
【０３０６】
一実施形態では、放射線療法の実施には、内部および外部放射線療法など、当該技術分野で周知の方法が含まれる。別の実施形態では、外部療法には、腫瘍部位への局所的（局部的）な投与かまたは全身照射のいずれかでの高エネルギー外部ビーム放射線による放射線の投与が含まれる。別の実施形態では、内部放射線（近接照射療法）の例には、永久的、一時的、密閉式、非密閉式、体腔内または組織内の移植片での放射性同位元素の移植が含まれる。一実施形態では、移植片の選択は、腫瘍の場所および範囲を含めた新形成の特性によって決定される。別の実施形態では、外部または内部どちらの放射線治療を選択するか、および外部放射線治療のタイプの選択も、新形成の特性によって決定され、また当業者によって決定されうる。
【０３０７】
一実施形態では、「放射線療法（ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）」または「放射線療法（ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）」は腫瘍細胞を制御するガン治療の一部としての電離放射線の医学的使用を指す。放射線療法は、治癒的、アジュバント、または対症療法のために使用されてもよい。放射線療法の適切な型として、従来の体外照射療法、定位放射線治療（例えば、Ａｘｅｓｓｅ、Ｃｙｂｅｒｋｎｉｆｅ、Ｇａｍｍａ  Ｋｎｉｆｅ、Ｎｏｖａｌｉｓ、Ｐｒｉｍａｔｏｍ、Ｓｙｎｅｒｇｙ、Ｘ−Ｋｎｉｆｅ、ＴｏｍｏＴｈｅｒａｐｙまたはＴｒｉｌｏｇｙ）、強度変調放射線療法、重粒子線がん治療、（例えば、陽子線治療）、密封小線源治療、放射性同位元素の送達等が挙げられる。このリストは制限的であることを意図しない。一実施形態では、放射線療法は標的放射線療法を含み、ここで処置ではできるだけ正確に腫瘍の標的化をするためにコンピュータを使用して腫瘍の三次元写真が作成され、可能な限り高い放射線投与量を与えつつ、できる限り多くの正常な組織を残す。これは３Ｄ等角（または立体配置）として知られている。ガン治療のために使用される放射線は、体外の機械からのものでもよく、または体内の腫瘍細胞付近に配置されたかまたは血流内に注入された放射性物質からのものでもよい。一実施形態では、標的放射線療法は、ガン細胞を標的にし、ガン細胞によって細胞が殺されるのを制限しつつ、正常な組織を残すために、放射性物質が体内の特定の場所、例えば、腫瘍細胞付近を標的化する方法を含む。
【０３０８】
一実施形態では、標的放射線療法は内部放射線療法で、近接照射療法としても知られており、これは体内または身体に配置された放射線源（放射性物質）から送達される放射線である。いくつかの近接照射療法がガン治療で使用されている。組織内近接照射療法は、前立腺腫瘍内など、腫瘍組織内に配置された放射線源を使用する。体腔内近接照射療法は、腫瘍の近くの胸腔など、外科的空洞内または体腔内に配置される線源を使用する。強膜上近接照射療法は、眼内のメラノーマの治療に使用され、眼に取り付けられた線源を使用する。
【０３０９】
近接照射療法では、放射性同位元素は小さなペレットまたは「シード」内に密封される。これらのシードは、針、カテーテル、またはその他何らかのタイプの担体など、送達装置を使用して患者内に配置される。同位元素は自然に崩壊しながら、付近のガン細胞にダメージを与える放射線を出す。所定場所に放置した場合、数週間または数か月後に同位元素は完全に崩壊し、放射線は出さなくなる。シードは体内に放置した場合でも害にならない（後述の永久的近接照射療法を参照）。
【０３１０】
近接照射療法は、一部のガンに対して外部ビーム放射線療法よりも高い放射線の投与量を送達できると共に、正常な組織に与えるダメージは少ない。
【０３１１】
近接照射療法は、低線量率または高線量率治療として実施されうる：
【０３１２】
低線量率治療では、ガン細胞は、線源から数日間にわたり連続的な低線量放射線を受ける。高線量率治療では、体内に配置された導管に取り付けられたロボット機械が１つ以上の放射線源を腫瘍内またはその付近に案内し、毎回の治療セッション終わりに線源を除去する。高線量率治療は、単回または複数回の治療セッションで実施されうる。一実施形態では、標的放射線療法の実施は、腫瘍内またはその付近に近接照射療法線源を配置することを含む。一実施形態では、線源の配置は一時的なものである。別の実施形態では、線源の配置は永久的なものである。
【０３１３】
永久的な近接照射療法では、線源は外科的に体内に密封され、すべての放射線が出尽くした後でもその場に放置される。（その中に放射性同位元素が密封された）残存する材料は、患者に対して不快感や害を全く与えない。永久的な近接照射療法は、一つのタイプの低線量率近接照射療法である。一次的な近接照射療法では、放射線源を送達するために管（カテーテル）またはその他の担体が使用され、担体および放射線源のどちらも治療後に除去される。一次的な近接照射療法は、低線量率治療または高線量率治療のどちらの場合もある。
【０３１４】
一実施形態では、患者は、治療対象のガンのタイプに応じて本明細書で開示した組成物の投与の前、途中、または後で放射線療法を受けうる。一実施形態では、本明細書で開示した方法は、組み換え型リステリアを含む本明細書で開示した組成物の投与、および標的放射線療法の投与を含む。一実施形態では、本明細書で開示した方法は、組み換え型リステリアおよび追加的な活性薬剤を含む本明細書で開示した組成物の投与、および標的放射線療法の投与を含む。一実施形態では、本明細書で開示した方法は、組み換え型リステリアを含む本明細書で開示した組成物の投与、追加的な活性薬剤を含む組成物の投与、および標的放射線療法の投与を含む。一実施形態では、追加的な活性薬剤は腫瘍溶解性ウイルスである。別の実施形態では、追加的な活性薬剤はＣＡＲ  Ｔ細胞である。別の実施形態では、追加的な活性薬剤は、治療的なまたは免疫調節性モノクローナル抗体である。別の実施形態では、追加的な活性薬剤は標的化チミジンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）である。別の実施形態では、追加的な活性薬剤は改変Ｔ細胞受容体を組み込んだ養子移入細胞である。
【０３１５】
一実施形態では、個体への物理的なエネルギー投与の量／コースは、療法を実施する臨床医によって決定される。別の実施形態では、放射線療法中の個体への物理的なエネルギー投与の量／コースは、個人の疾患の特性、送達方法のほか、個体の体重、年齢、全般的な健康および応答によって決定される。特に、放射線療法では、腫瘍および周辺組織の放射線感受性は、組織タイプ、酸素供給およびその他の因子に応じた変数であるため、投与において腫瘍の場所は決定要因である。別の実施形態では、放射線投与の量は、当該技術分野で所定の個体および疾患の特性に対して有効であることが既知の投与量である。その他の実施形態では、物理的エネルギー投与の量は、当該技術分野で特定の個体および疾患の特性について有効であるとされる値の約２倍、約５倍、約１０倍、または約１５倍少ない。別の実施形態では、物理的エネルギー投与の量は、当該技術分野で特定の個体および疾患の特性について有効であるとされる値の約２０倍、約５０倍、約１００倍、または約１０００倍少ない。別の実施形態では、投与量は致死量以下または毒性水準下の投与量である。
【０３１６】
一実施形態では、本明細書で開示されている被験者への放射線投与量は約１．０〜１０  ｃＧｙ／分である。別の実施形態では、本明細書で開示されている被験者への放射線投与量は約１１〜２０  ｃＧｙ／分である。別の実施形態では、本明細書で開示されている被験者への放射線投与量は約２１〜３０  ｃＧｙ／分である。別の実施形態では、本明細書で開示されている被験者への放射線投与量は約３１〜４０  ｃＧｙ／分である。別の実施形態では、本明細書で開示されている被験者への放射線投与量は約４１〜５０  ｃＧｙ／分である。別の実施形態では、本明細書で開示されている被験者への放射線投与量は約６１〜７０  ｃＧｙ／分である。別の実施形態では、本明細書で開示されている被験者への放射線投与量は約７１〜８０  ｃＧｙ／分である。別の実施形態では、本明細書で開示されている被験者への放射線投与量は約８１〜９０  ｃＧｙ／分である。別の実施形態では、本明細書で開示されている被験者への放射線投与量は約９１〜１００  ｃＧｙ／分である。別の実施形態では、本明細書で開示されている被験者への放射線投与量は約１００〜１５０  ｃＧｙ／分である。別の実施形態では、本明細書で開示されている被験者への放射線投与量は約１５１〜２００  ｃＧｙ／分である。別の実施形態では、本明細書で開示されている被験者への放射線投与量は約２００〜５００  ｃＧｙ／分である。別の実施形態では、本明細書で開示されている被験者への放射線投与量は約５０１〜１０００  ｃＧｙ／分である。別の実施形態では、本明細書で開示されている被験者への放射線投与量は約１００１〜１００００  ｃＧｙ／分である。
【０３１７】
別の実施形態では、本明細書で開示されている被験者への放射線投与量は、約１１〜２０  ｃＧｙの範囲の分割合計線量である。別の実施形態では、被験者への放射線投与量の範囲は約２１〜３０  ｃＧｙである。別の実施形態では、被験者への放射線投与量の範囲は約３１〜４０  ｃＧｙである。別の実施形態では、被験者への放射線投与量の範囲は約４１〜５０  ｃＧｙである。別の実施形態では、被験者への放射線投与量の範囲は約５１〜６０  ｃＧｙである。別の実施形態では、被験者への放射線投与量の範囲は約６１〜７０  ｃＧｙである。別の実施形態では、被験者への放射線投与量の範囲は約７１〜８０  ｃＧｙである。別の実施形態では、被験者への放射線投与量の範囲は約８１〜９０  ｃＧｙである。別の実施形態では、被験者への放射線投与量の範囲は約９１〜１００  ｃＧｙである。別の実施形態では、被験者への放射線投与量の範囲は約１０１〜２００  ｃＧｙである。別の実施形態では、被験者への放射線投与量の範囲は約２０１〜５００  ｃＧｙである。別の実施形態では、被験者への放射線投与量の範囲は約５０１〜１０００  ｃＧｙである。別の実施形態では、被験者への放射線投与量の範囲は約１００１〜１００００  ｃＧｙである。
【０３１８】
一実施形態では、腫瘍の退行を達成するために、初回の治療過程にすぐ引き続いて、または数日、数週間、もしくは数か月の間隔の後、繰返し（投薬）を行ってもよい。別の実施形態では、腫瘍増殖の抑制を達成するために、第１の処置の過程にすぐ引き続いて、または数日、数週間、または数か月の間隔の後、繰返し投与を行ってもよい。上述の方法による特定の治療コース、例えばリステリアおよび物理的エネルギー治療の組み合わせなどの後に、化学療法およびリステリア治療を組み合わせたコースを続けてもよい。撮像技法、血清腫瘍マーカーの解析、生検、または腫瘍に伴う症状の存在、不在、または寛解などの診断方法を含む当該技術分野で既知の任意の技法によって評価を決定してもよい。
【０３１９】
一実施形態では、放射線治療は、治療を促進するために放射性増感剤の投与または放射線防護を伴う。最近の証拠では、抗悪性腫瘍薬ＴＡＸＯＬ（商標）（パクリタキセル）が放射線増感剤としての機能をしうることが示唆されている。Ｌｉｅｂｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ８６：４４１，  １９９４．  類似した証拠がＴＡＸＯＴＥＲＥ（商標）（ドセタキセル）でも見つかっている。Ｃｒｅａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｒａｄｉａｔ．  Ｂｉｏｌ．  ７５：７３１，  １９９９；  Ｓｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｒｏｎｔ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｍａｙ  １：  ２２１，  １９９７．  その他の放射線増感剤には、Ｅ２Ｆ−１、抗Ｒａｓ短鎖抗体、ｐ５３、ＧＭ−ＣＳＦ、およびシトシンデアミナーゼが含まれる。腫瘍特異的アデノウイルスは、例えばｐ５３などの放射線増感剤、または化学療法増感剤をさらに含みうる。  
【０３２０】
一実施形態では、組み換え型リステリアを含む組成物に、追加的な活性薬剤および放射線療法を加えたり差し引いたりした併用療法が集学的治療の構成要素として使用され、また追加的な活性薬剤や、放射線療法治療のタイプやコースは、一般に個別のガンの特性および個人の応答によって支配される。標的細胞特異的なリステリア株は、放射線療法と、あるいは腫瘍溶解性ウイルス、ＣＡＲ  Ｔ細胞、治療的または免疫調節性モノクローナル抗体、標的チミジンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）および／または受容体改変Ｔ細胞などの追加的な活性薬剤とを、別個の治療コースとして併用することもできる一方、それらは同じ療法コースで両方の治療方法を組み合わせることもできる。したがって、本開示は上記で考察した方法の組み合わせも包含する。
【０３２１】
したがって、本開示は、以下のステップを任意の順序で含む、個体において腫瘍増殖を抑制するための方法を含む。すなわち、ａ）標的細胞特異的なリステリア株と、随意に少なくとも１つの追加的な活性薬剤を含む有効な量の組成物を固体に投与するステップと、ｂ）有効量の適切なコースの放射線療法を個体に実施するステップとを含む。    
【０３２２】
一実施形態では、方法はさらに、ｃ）追加的な投与量のリステリアと、随意に、腫瘍溶解性ウイルス、ＣＡＲ  Ｔ細胞、治療的または免疫調節性モノクローナル抗体、ＴＫＩ、または受容体改変Ｔ細胞などの追加的な活性薬剤を含む組成物とを投与し、個人の新形成を治療するための必要に応じて放射線療法を施すステップをさらに含みうる。
【０３２３】
別の実施形態では、方法はさらにステップａ）、ｂ）およびｃ）どれか一つの後での時間遅延を含みうる。時間遅延間隔は、時間単位、日単位、週単位または月単位としうる。
【０３２４】
一実施形態では、上述の方法には、リステリア株、および放射線療法、および随意に腫瘍溶解性ウイルス、ＣＡＲ  Ｔ細胞、治療的または免疫調節性モノクローナル抗体、ＴＫＩ、または受容体改変Ｔ細胞などの、追加的な活性薬剤を任意の順序で投与することが含まれ、構成要素のすべてまたは一部の逐次投与または同時投与を含みうる（すなわち物理的エネルギーおよびリステリア株の同時投与の後で、放射線療法を続けるか、または第一にリステリア株、第二に放射線療法の後で、第三に腫瘍溶解性ウイルス、ＣＡＲ  Ｔ細胞、治療的または免疫調節性モノクローナル抗体、ＴＫＩ、および／または受容体改変Ｔ細胞などを投与する逐次投与）。
【０３２５】
一実施形態では、本明細書には、異種抗原を発現する腫瘍の予防、治療およびそれに対するワクチン接種のための、および異種抗原の準優占エピトープに対する免疫応答を誘発しつつ、腫瘍のエスケープ変異を防止するための方法および組成物が開示されている。
【０３２６】
一実施形態では、異種抗原を発現する腫瘍の予防、治療およびそれに対するワクチン接種のための方法および組成物は、リステリオリシン（ＬＬＯ）アジュバントの使用を含む。別の実施形態では、本明細書で開示した方法および組成物は、ＬＬＯを過剰発現する組み換え型リステリア株を含む。一実施形態では、ＬＬＯは、リステリア株の染色体から発現される。別の実施形態では、ＬＬＯはリステリア株内のプラスミドから発現される。
【０３２７】
別の実施形態では、被験者内で腫瘍媒介性免疫抑制を阻害する方法が本明細書に提供され、この方法はプログラム細胞死受容体−１（ＰＤ−１）シグナル伝達経路阻害剤、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含み、核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ配列ペプチドを含む。
【０３２８】
別の実施形態では、被験者内での腫瘍増殖またはガンを予防または治療するための方法が本明細書に提供され、この方法はプログラム細胞死受容体−１（ＰＤ−１）シグナル伝達経路阻害剤、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含み、核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断ＬＬＯ、切断ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ配列ペプチドを含む。
【０３２９】
一実施形態では、「治療する」という用語は疾患を治癒することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患を防止することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患の発生率を減少することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患の症状を軽快することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは患者のパフォーマンスのない生存率または全体的な生存率が増加することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患の進行を安定させることを指す。別の実施形態では、「治療する」とは寛解を誘発することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患の進行を減速することを指す。別の実施形態では、「減少する」、「抑制する」、および「阻害する」という用語は、より少なくすることまたは減らすことを指す。
【０３３０】
一実施形態では、被験者の脾臓および腫瘍微小環境内で、Ｔエフェクター細胞の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加する方法が本明細書に提供され、方法は本明細書に開示された免疫原性組成物を投与することを含む。別の実施形態では、被験者内の脾臓および腫瘍微小環境内のＴエフェクター細胞の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加することは、被験者内のより著明な抗腫瘍応答を可能にする。
【０３３１】
別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞を含む。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞である。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、制御性Ｔ細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞である。
【０３３２】
一実施形態では、本開示は、腫瘍またはガンを治療する、腫瘍またはガンから保護する、および腫瘍またはガンに対する免疫応答を誘発する方法を提供し、これには本明細書に開示された免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。
【０３３３】
一実施形態では、本開示はヒト被験者内の腫瘍またはガンを予防または治療する方法を提供し、これには被験者に本明細書に開示された免疫原性組成物の株を投与する工程を含み、この組み換え型リステリア株はＬＬＯタンパク質のＮ末端断片および腫瘍関連抗原を含む組み換え型ポリペプチドを含み、それによってこの組み換え型リステリア株が腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘発し、これによってヒト被験者内の腫瘍またはガンを治療する。別の実施形態では、免疫応答はＴ細胞応答である。別の実施形態では、Ｔ細胞応答はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、Ｔ細胞応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、Ｔ細胞応答はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、本開示は腫瘍またはガンから被験者を保護する方法を提供し、これには本明細書に開示された免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本開示は被験者内の腫瘍の退行を誘発する方法を提供し、これには本明細書に開示された免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本開示は腫瘍またはガンの発生または再発を減少させる方法を提供し、これには本明細書に開示された免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本開示は被験者内の腫瘍の形成を抑制する方法を提供し、これには本明細書に開示された免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本開示は被験者内のガンの寛解を誘発する方法を提供し、これには本明細書に開示された免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。一実施形態では、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸分子はリステリアゲノムに組み込まれる。別の実施形態では、核酸分子は組み換え型リステリア株内のプラスミドの中にある。別の実施形態では、核酸分子は組み換え型リステリア株内の細菌人工染色体の中にある。
【０３３４】
一実施形態では、方法は組み換え型リステリアを追加的な療法とともに同時投与する工程を含む。別の実施形態では、追加的な療法は、外科手術、化学療法、免疫療法、放射線療法、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法、腫瘍溶解性ウイルスベースの療法、治療的または免疫調節性モノクローナル抗体療法、標的ＴＫＩ療法、または受容体改変Ｔ細胞療法、またはその組み合わせである。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与より追加的療法を先に行う。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与に続いて追加的療法を行う。別の実施形態では、追加的療法は抗体療法である。別の実施形態では、抗体療法は、抗ＰＤ１、抗ＣＴＬＡ４である。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞に対する調節性Ｔ細胞の比を増加し、より強力な抗腫瘍免疫応答を生成するために、組み換え型リステリアは漸増用量で投与される。細胞の免疫応答を強化するために、腫瘍を有する被験者にＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、および当該技術分野で既知の他のサイトカインを含むがこれに限定されないサイトカインを提供することによって、抗腫瘍免疫応答をさらに強化することができることが当業者によって理解されるであろう。これらのうちのいくつかは米国特許第６，９９１，７８５号に記載されており、この特許は参照により本明細書に組み込まれる。
【０３３５】
一実施形態では、本明細書に開示された方法は、本明細書に提供される免疫原性組成物を前記被験者内で抗腫瘍免疫応答を強化する腫瘍溶解性ウイルスと同時投与する工程をさらに含む。
【０３３６】
一実施形態では、本明細書に開示された方法は、本明細書に開示された免疫原性組成物をインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）経路阻害剤と同時投与する工程をさらに含む。本開示で使用するためのＩＤＯ経路阻害剤としては、１−メチルトリプトファン（１ＭＴ）、１−メチルトリプトファン（１ＭＴ）、ネクロスタチン−１、ピリドキサールイソニコチノイルヒドラゾン、エブセレン、５−メチルインドール−３−カルボキサルデヒド、ＣＡＹ１０５８１、抗ＩＤＯ抗体、または小分子ＩＤＯ阻害剤が挙げられるがこれに限定されない当該技術分野で既知の任意のＩＤＯ経路阻害剤を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組成物および方法は、化学療法または放射線療法レジメンと併せて、その前に、またはそれに続いても使用される。別の実施形態では、ＩＤＯ阻害は化学療法剤の効率を強化する。
【０３３７】
一部の実施形態では、本明細書に開示された併用療法に対する投与レジメン（本明細書では実施レジメンとも呼ばれる）の選択は、実在物の血清または組織代謝回転率、症状のレベル、実在物の免疫原性、および治療される個人の標的細胞、組織または器官のアクセス性を含む、いくつかの因子に依存する。投与レジメンは、許容可能なレベルの副作用と一致して、患者に送達される各治療薬の量を最大化することが好ましい。従って、併用の各生物学的薬物および化学療法剤の用量および投薬頻度は、特定の治療薬、治療されるガンの重症度、および患者特性に部分的に依存する。適切な用量の抗体、サイトカイン、および小分子の選択のガイダンスが利用可能である。例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ  （１９９６）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂ．  Ｌｔｄ，  Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，  ＵＫ；  Ｋｒｅｓｉｎａ  （ｅｄ．）  （１９９１）  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ；  Ｂａｃｈ  （ｅｄ．）  （１９９３）  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ；  Ｂａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４８：６０１−６０８；  Ｍｉｌｇｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４１：１９６６−１９７３；  Ｓｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４４：７８３−７９２；  Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４２：６１３−６１９；  Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４８：２４−３２；  Ｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４３：１５９４−１６０２；  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ２００３  （Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，  ５７ｔｈ  Ｅｄ）；  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ；  ＩＳＢＮ：  １５６３６３４４５７；  ５７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００２）を参照。適切な投与レジメンの決定は、例えば、治療に影響することが当技術分野で知られているかまたは疑われた、または治療に影響することが予測されたパラメータまたは因子を使用して、臨床医によってなされる場合があり、例えば、患者の臨床履歴（例えば、以前の療法）、治療されるガンのタイプおよびステージ、ならびに併用療法の治療薬の一つ以上に対する奏功のバイオマーカーに依存することになる。
【０３３８】
当業者であれば、「相乗効果」または「相乗的」という用語は、２つ以上の本明細書で開示した組成物の組み合わせの結果として、個別の投与の結果としての各組成物の個別の免疫応答の和よりも強力な免疫応答を含むものと理解される。より具体的には、インビトロ状況では、相乗作用の一つの尺度は「Ｂｌｉｓｓ相乗作用」として知られる。Ｂｌｉｓｓ相乗効果は、上記で定義されるＢｌｉｓｓ値によって決定される「Ｂｌｉｓｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅを超えること」を含みうる。Ｂｌｉｓｓ値がゼロ（０）より大きい時、またはより好ましくは０．２より大きい時、相乗効果を示すと見なされる。当然、本明細書での「相乗効果」の使用は、追加的および／または代替的方法によって測定されるインビトロ相乗効果も包含する。併用の成分個別の和より大きい、または同じである抗ガン効果、を含むがこれに限定されない、本明細書での併用のインビトロ生物学的効果への言及は、Ｂｌｉｓｓ値に相関する場合がある。繰り返しになるが、成分の併用が、成分個別の和と同じ、またはそれより大きい活性を示すかどうかを含む、本明細書での「相乗作用」の使用は、追加的および／または代替え的方法によって測定される場合があり、当業者に知られているか、または明らかとなる。
【０３３９】
一実施形態では、開示された併用療法は、触診、またはＭＲＩ、超音波、またはＣＡＴスキャンなど、当技術分野でよく知られた撮像技術で見つけるのに十分大きな腫瘍を治療するために使用される。一部の実施形態では、本明細書に開示された併用療法は、少なくとも約２００  ｍｍ３、３００  ｍｍ３、４００  ｍｍ３、５００  ｍｍ３、７５０  ｍｍ３、または最大１０００  ｍｍ３の寸法を持つ進行ステージ腫瘍を治療するために使用される。
【０３４０】
一実施形態では、開示された併用療法は、ＰＤ−Ｌ１発現について検査で陽性のガンを診断された患者に投与される。一部の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１発現は、患者から取り出した腫瘍サンプルのＦＦＰＥまたは凍結組織切片についてのＩＨＣアッセイで、診断抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体、またはその抗原結合断片を使用して検出される。一般に、患者の医師は、本明細書に提供されているＰＤ−１拮抗薬またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬および生きた弱毒化リステリア株で治療を開始する前に患者から取り出した腫瘍組織標本でのＰＤ−Ｌ１発現を判断するために診断テストを命令することになるが、医師は、治療の開始後の任意の時点で、例えば、治療サイクルの完了後などに、第１回目またはその後の診断テストを命令できることが想定される。
【０３４１】
一実施形態では、開示された併用療法は、ＣＴＬＡ−４発現について検査で陽性のガンを診断された患者に投与される。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ−４発現は、患者から取り出した腫瘍サンプルのＦＦＰＥまたは凍結組織切片についてのＩＨＣアッセイで、診断抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体、またはその抗原結合断片を使用して検出される。一般に、患者の医師は、本明細書に提供されているＣＴＬＡ−４拮抗薬および生きた弱毒化リステリア株で治療を開始する前に患者から取り出した腫瘍組織標本でのＣＴＬＡ−４発現を判断するために診断テストを命令することになるが、医師は、治療の開始後の任意の時点で、例えば、治療サイクルの完了後などに、第１回目またはその後の診断テストを命令できることが想定される。
【０３４２】
併用療法で１つ以上の開示された免疫調節性抗体を用いる一部の実施形態では、投与レジメンは、治療過程全体を通して約１４日（±  ２日）または約２１日（±  ２日）または約３０日（±  ２日）の間隔で、１００〜５００  ｍｇの均一用量または１〜１０  ｍｇ／ｋｇの体重ベース用量で前記１つ以上の免疫調節性抗体を投与する工程を含むことになる。
【０３４３】
併用療法のＰＤ−１拮抗薬として抗ヒトＰＤ−１  ｍＡｂを用いるその他の実施形態では、投与レジメンは、患者内用量漸増により、約０．００５  ｍｇ／ｋｇ〜約１０  ｍｇ／ｋｇの用量で免疫調節性抗体を投与する工程を含むことになる。その他の漸増用量の実施形態では、用量間の間隔は、例えば、第１の用量と第２の用量の間が約３０日（±  ２日）、第２の用量と第３の用量との間が約１４日（±  ２日）など、進行的に短くなることになる。特定の実施形態では、第２の用量に続く用量に対する投薬間隔は約１４日（±  ２日）となる。
【０３４４】
一実施形態では、「治療レジメン」、「投与プロトコル」および「投与レジメン」は本明細書では互換的に使用され、かつ本明細書で開示された併用療法での各治療薬の投与の用量およびタイミングを含む。
【０３４５】
特定の実施形態では、被験者は、本明細書に記述された免疫調節性抗体のいずれかを含む薬剤の静脈内（ＩＶ）注入を投与されることになる。
【０３４６】
一実施形態では、併用療法での免疫調節性抗体は拮抗薬抗体である。別の実施形態では、併用療法での免疫調節性抗体は拮抗薬抗体である。
【０３４７】
別の実施形態では、免疫調節性抗体は、以下の群から選択した投与量での静脈内投与である：１  ｍｇ／ｋｇ、２週毎に１回投与（Ｑ２Ｗ）、２  ｍｇ／ｋｇ  Ｑ２Ｗ、３  ｍｇ／ｋｇ  Ｑ２Ｗ、５  ｍｇ／ｋｇ  Ｑ２Ｗ、１０  ｍｇ  Ｑ２Ｗ、１  ｍｇ／ｋｇ  ３週毎に１回投与（Ｑ３Ｗ）、２  ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、３  ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、５  ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、および１０  ｍｇ  Ｑ３Ｗ。
【０３４８】
本発明の別の実施形態では、併用療法の免疫調節性抗体は２００  ｍｇ  Ｑ３Ｗ、１  ｍｇ／ｋｇ  Ｑ２Ｗ、２  ｍｇ／ｋｇ  Ｑ２Ｗ、３  ｍｇ／ｋｇ  Ｑ２Ｗ、５  ｍｇ／ｋｇ  Ｑ２Ｗ、１０  ｍｇ  Ｑ２Ｗ、１  ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、２  ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、３  ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、５  ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ、および１０  ｍｇ  Ｑ３Ｗまたはこれらの用量のいずれかの同等物から構成される用量の液体薬剤で投与される（例えば、免疫調節性抗体のＰＫモデルでは、２００  ｍｇ  Ｑ３Ｗの固定用量は２  ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗで得られるものと一致する暴露を提供することが予測される）。一部の実施形態では、免疫調節性抗体は、ｐＨ  ５．５の１０  ｍＭヒスチジン緩衝液中に、抗体２５  ｍｇ／ｍｌ、７％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含む液体薬剤として投与され、薬剤の選択用量は３０分＋／−１０分の時間にわたってＩＶ注入により投与される。
【０３４９】
別の実施形態では、併用療法での弱毒化細菌性または弱毒化リステリアは、本明細書に開示された生きた弱毒化リステリア株であり、これが液体薬剤で、１×１０９、５×１０９および１×１０１０  ＣＦＵから成る群から選択された投与量で投与される。一部の実施形態では、投与量範囲は、約１×１０９  ＣＦＵ〜３．３１×１０１０  ＣＦＵ、約５×１０８  ＣＦＵ〜５×１０１０  ＣＦＵ、約７×１０８  ＣＦＵ〜５×１０１０  ＣＦＵ、約１×１０９  ＣＦＵ〜５×１０１０  ＣＦＵ、約２×１０９  ＣＦＵ〜５×１０１０  ＣＦＵ、約３×１０９  ＣＦＵ〜５×１０１０  ＣＦＵ、約５×１０９  ＣＦＵ〜５×１０１０  ＣＦＵ、約７×１０９  ＣＦＵ〜５×１０１０  ＣＦＵ、約１×１０１０  ＣＦＵ〜５×１０１０  ＣＦＵ、約１．５×１０９  ＣＦＵ〜５×１０１０  ＣＦＵ、約５×１０８  ＣＦＵ〜３×１０１０  ＣＦＵ、約５×１０８  ＣＦＵ〜２×１０１０  ＣＦＵ、約５×１０８  ＣＦＵ〜１．５×１０９  ＣＦＵ、約５×１０８  ＣＦＵ〜１×１０１０  ＣＦＵ、約５×１０８  ＣＦＵ〜７×１０９  ＣＦＵ、約５×１０８  ＣＦＵ〜５×１０９  ＣＦＵ、約５×１０８  ＣＦＵ〜３×１０９  ＣＦＵ、約５×１０８  ＣＦＵ〜２×１０９  ＣＦＵ、約１×１０９  ＣＦＵ〜３×１０１０  ＣＦＵ、約１×１０９  ＣＦＵ〜２ｘ  １０１０ＣＦＵ、約２×１０９  ＣＦＵ〜３×１０１０  ＣＦＵ、約１×１０９  ＣＦＵ〜１ｘ  １０１０  ＣＦＵ、約  ２×１０９  ＣＦＵ〜１×１０１０  ＣＦＵ、約３×１０９  ＣＦＵ〜１×１０１０  ＣＦＵ、約２×１０９  ＣＦＵ〜７×１０９  ＣＦＵ、約２×１０９  ＣＦＵ〜５×１０９  ＣＦＵである。
【０３５０】
その他の実施形態では、組み換え型リステリアの投与量の範囲は約１×１０７  生物体〜約１．５×１０８  生物体である。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与量の範囲は約１×１０８  生物体〜約１．５×１０９  生物体である。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与量の範囲は約１×１０９  生物体〜約２×１０９  生物体である。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与量の範囲は約２×１０９  生物体〜約５×１０９  生物体である。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与量の範囲は約２×１０９  生物体〜約１×１０１０  生物体である。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与量の範囲は約３×１０９  生物体〜約１×１０１０  生物体である。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与量の範囲は約４×１０９  生物体〜約１×１０１０  生物体である。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与量の範囲は約５×１０９  生物体〜約１×１０１０  生物体である。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与量の範囲は約６×１０９  生物体〜約１×１０１０  生物体である。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与量の範囲は約７×１０９  生物体〜約１×１０１０  生物体である。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与量の範囲は約１×１０９  生物体〜約５×１０９  生物体である。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与量の範囲は約１×１０９  生物体〜約４×１０９  生物体である。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与量の範囲は約１×１０９  生物体〜約３×１０９  生物体である。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与量の範囲は約５×１０９  生物体〜約８×１０９  生物体である。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与量の範囲は約５×１０９  生物体〜約１．５×１０１０  生物体である。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与量の範囲は約５×１０９  生物体〜約２×１０１０  生物体である。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与量の範囲は約５×１０９  生物体〜約２．５×１０１０  生物体である。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与量の範囲は約５×１０９  生物体〜約３×１０１０  生物体である。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与量の範囲は約５×１０９  生物体〜約３．５×１０１０  生物体である。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与量の範囲は約５×１０９  生物体〜約４×１０１０  生物体である。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与量の範囲は約５×１０９  生物体〜約５×１０１０  生物体である。別の実施形態では、投与量範囲は１×１０７  生物体〜５×１０１０  生物体である。
【０３５１】
開示された免疫調節性抗体と開示された生きた弱毒化リステリア株との組み合わせを含む併用療法のための最適な投与量は、これらの薬剤の一方または両方の用量漸増により特定される。開示された免疫調節性抗体と開示された生きた弱毒化リステリア株のいずれかを含む組成物のための最適な投与量は、これらの薬剤の一方または両方の用量漸増により特定される。
【０３５２】
一実施形態では、患者は、１２週サイクルの週１、４および７の第１日に、開始投与量５０、１００、１５０、または２００  ｍｇで投与される少なくとも１つの免疫調節性抗体、および約１×１０７  ＣＦＵ〜約３．５×１０１０  ＣＦＵの範囲の開始投与量での本明細書に開示された生きた弱毒化リステリア株で、本明細書に開示された併用療法で治療を受ける。
【０３５３】
一実施形態では、免疫調節性抗体注入液がまず投与された後、本明細書に提供される生きた弱毒化リステリア株を投与する前の所定の時間内に、ＮＳＡＩＤＳ（例えば、ナプロキセンまたはイブプロフェン）、および経口制吐薬が続く。別の実施形態では、所定の時間は５〜１０分、１１〜２０分、２１〜４０分、４１〜６０分である。別の実施形態では、所定の時間は少なくとも１時間である。別の実施形態では、所定の時間は１〜２時間、２〜４時間、４〜６時間、６〜１０時間である。別の実施形態では、ＮＳＡＩＤＳ（例えば、ナプロキセンまたはイブプロフェン）、および経口制吐薬の被験者への投与は、本明細書に開示された生きた弱毒化リステリア株の投与の前に、必要に応じて繰り返される。
【０３５４】
別の実施形態では、少なくとも１つの免疫調節性抗体は開始投与量５０、１００、１５０または２００  ｍｇ  Ｑ３Ｗで投与され、本明細書に開示された生きた弱毒化リステリア株は１×１０７〜３．５×１０１０  ＣＦＵの開始投与量でＱ３Ｗで投与される。
【０３５５】
一実施形態では、本明細書に開示された生きた弱毒化リステリア株は、少なくとも１つの免疫調節性抗体と組み合わせて投与される。一実施形態では、本明細書に開示された生きた弱毒化リステリア株は、作動薬抗体と組み合わせて投与される。別の実施形態では、本明細書に開示された生きた弱毒化リステリア株は、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される。別の実施形態では、本明細書に開示された生きた弱毒化リステリア株は、１つのタイプの免疫調節性抗体と組み合わせて投与される。別の実施形態では、本明細書に開示された生きた弱毒化リステリア株は、作動薬および免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される。別の実施形態では、本明細書に開示された生きた弱毒化リステリア株は５×１０９  Ｑ３Ｗの開始投与量で投与され、かつ少なくとも１つの免疫調節性抗体は２００  ｍｇ  Ｑ３Ｗの開始投与量で投与されるが、組み合わせの開始投与量が患者によって耐容されない場合には、生きた弱毒化リステリア株の投与量が１×１０９  ＣＦＵ  Ｑ３Ｗに減らされるか、または少なくとも１つの免疫調節性抗体の投与量が１５０  ｍｇ  Ｑ３Ｗに減らされる。当業者には、本明細書に提供されている併用療法の任意の構成要素の投与量は、併用療法に対する被験者の応答に基づき低めまたは高めの投与量に徐々に調節されうることが理解される。
【０３５６】
一部の実施形態では、前述の範囲の下限より低い投薬レベルで十分過ぎる場合がある一方、その他の場合、当業者によって決定される時、まだより大きな用量が用いられる場合がある。
【０３５７】
一部の実施形態では、治療サイクルは兵量治療の最初の日に開始され、少なくとも１２週間、２４週間または４８週間続く。薬物が同時投与される治療サイクルの任意の日において、本明細書に開示された抗ＰＤ１抗体および生きた弱毒化リステリア株の個別の静脈注入の間のタイミングは約１５分〜約４５分である。本開示は、本明細書に開示された免疫調節性抗体および生きた弱毒化リステリア株が、どちらの順序でも、または同時静脈注入によって投与されうることを考慮している。
【０３５８】
一部の実施形態では、併用療法は患者が完全寛解（ＣＲ）を達成してから少なくとも２〜４週間後に投与される。
【０３５９】
一部の実施形態では、本開示の併用療法での治療に対して選択される患者は、転移性ガンと診断されており、患者は過去の２個以下の全身治療レジメンに対して進行しているか、または抵抗性となっている。一部の実施形態では、本開示の併用療法での治療に対して選択される患者は、転移性ガンと診断されており、患者は過去の３個以下の全身治療レジメンに対して進行しているか、または抵抗性となっている。
【０３６０】
本開示は、本明細書の少なくとも１つの免疫調節性抗体および医薬的に許容される賦形剤を含む薬剤も提供する。本明細書に開示された免疫調節性抗体が、生物療法剤（例えば、ｍＡｂ）である時、抗体は、従来的な細胞培養および回収／精製技術を使用して、当該技術分野で既知のＣＨＯ細胞を含むがこれに限定されない産生細胞株内で生成されうる。
【０３６１】
一部の実施形態では、本明細書に開示された免疫調節性抗体は、液剤として提供されるか、または使用前に滅菌注射用蒸留水で凍結乾燥粉末を再構成することにより調製される。ＷＯ  ２０１２／１３５４０８には、液体および、本開示での使用に適した抗ＰＤ−１抗体を含む凍結乾燥薬剤の調製が記述されている。
【０３６２】
本開示は、本明細書に開示された生きた弱毒化リステリア株および医薬的に許容される賦形剤を含む薬剤も提供する。
【０３６３】
免疫調節性抗体薬剤および本明細書に開示された生きた弱毒化リステリア株薬剤は、第１の容器および第２の容器および添付文書インサートを含むキットとして提供されうる。第１の容器は少なくとも１つの免疫調節性抗体を含む少なくとも１回分の投与量の薬剤を含み、第２の容器は本明細書に開示された生きた弱毒化リステリア株を含む少なくとも１回分の投与量の薬剤を含み、薬剤を使用してガン患者を治療するための指図書を含む、添付文書インサートまたはラベルを含む。第１および第２の容器は、同じまたは異なる形状（例えば、バイアル、シリンジおよびボトル）および／または材料（例えば、プラスチックまたはガラス）から成る場合がある。キットは、希釈剤、フィルター、ＩＶバッグおよびライン、針ならびにシリンジなど、薬剤の投与に有用でありうるその他の材料をさらに含む場合がある。本明細書に開示したキットの一部の実施形態で、免疫チェックポイント阻害剤抗体および指図書には、薬剤は、本明細書に開示された標的（例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１）の発現についてＩＨＣアッセイによる試験で陽性であるガン保有患者の治療での使用が意図されている旨が記載される。
【０３６４】
別の実施形態では、開示の方法はさらに、本明細書で開示した、組み換え型リステリア株、腫瘍溶解性ウイルス、ＣＡＲ  Ｔ細胞、治療的または免疫調節性モノクローナル抗体、ＴＫＩ、または受容体改変Ｔ細胞を用いて被験者をブースティングする工程を含む。別の実施形態では、ブースター接種で使用される組み換え型リステリア株は初期の「プライミング」接種で使用される株と同一である。別の実施形態では、ブースター株はプライミング株とは異なる。別の実施形態では、ブースター接種で使用される組み換え型免疫チェックポイント阻害剤は、初期の「プライミング」接種で使用される阻害剤と同一である。別の実施形態では、ブースター阻害剤は、プライミング阻害剤とは異なる。別の実施形態では、プライミング接種とブースティング接種とで同一の用量が使用される。別の実施形態では、ブースターではより大きい用量が使用される。別の実施形態では、ブースターではより小さい用量が使用される。別の実施形態では、本開示の方法は被験者にブースターワクチン接種を実施する工程をさらに含む。一実施形態では、ブースターワクチン接種は単一のプライミングワクチン接種に続いて行われる。別の実施形態では、プライミングワクチン接種の後に単一のブースターワクチン接種を実施する。別の実施形態では、プライミングワクチン接種の後、２回のブースターワクチン接種を実施する。別の実施形態では、プライミングワクチン接種の後、３回のブースターワクチン接種を実施する。一実施形態では、プライム株とブースト株との間の期間は、当業者によって実験的に決定される。別の実施形態では、プライム株とブースト株との間の期間は１週間であり、別の実施形態では、これは２週間であり、別の実施形態では、これは３週間であり、別の実施形態では、これは４週間であり、別の実施形態では、これは５週間であり、別の実施形態では、これは６〜８週間であり、さらに別の実施形態では、ブースト株をプライム株の８〜１０週間後に投与する。
【０３６５】
別の実施形態では、本開示の方法は、本明細書に開示された弱毒化リステリア株を含む免疫原性組成物を用いて被験者をブーストすることをさらに含む。別の実施形態では、本開示の方法は本明細書に開示された弱毒化リステリア株を含む免疫原性組成物のブースター用量を投与する工程を含む。別の実施形態では、ブースター用量は前記免疫原性組成物の代替形態である。別の実施形態では、本開示の方法は被験者にブースター免疫原性組成物を投与する工程をさらに含む。一実施形態では、ブースター用量は前記免疫原性組成物の単一のプライミング用量の後に続く。別の実施形態では、プライミング用量の後に単一のブースター用量を投与する。別の実施形態では、プライミング用量の後に２回のブースター用量を投与する。別の実施形態では、プライミング用量の後に３回のブースター投与量を投与する。一実施形態では、本明細書に開示された弱毒化リステリアを含む免疫原性組成物のプライム用量とブースト用量との間の期間は当業者によって実験的に決定される。別の実施形態では、この用量は当業者によって実験的に決定される。別の実施形態では、プライム用量とブースト用量との間の期間は１週間であり、別の実施形態では、これは２週間であり、別の実施形態では、これは３週間であり、別の実施形態では、これは４週間であり、別の実施形態では、これは５週間であり、別の実施形態では、これは６〜８週間であり、さらに別の実施形態では、ブースト用量を免疫原性組成物のプライム用量の８〜１０週間後に投与する。
【０３６６】
異種「プライムブースト」戦略は免疫応答および多数の病原体に対する保護を強化するために効果的であった。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１７０：２９−３８（１９９９）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２３９−５０（２００２）；Ｇｏｎｚａｌｏ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒａｉｎ  ２０：１２２６−３１（２００２）；Ｔａｎｇｈｅ，Ａ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：３０４１−７（２００１）。プライム注射とブースト注射において異なる形態で抗原を提供すると、抗原に対する免疫応答を最大化するように思われる。ＤＮＡ株プライミングの後にアジュバント中のタンパク質を用いたブースティング、または抗原をコードするＤＮＡのウイルスベクター送達が続くのが、抗原特異的抗体およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答のそれぞれの改善の最も効果的なやり方であるように思われる。Ｓｈｉｖｅｒ  Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：３３１−５（２００２）；Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒａｉｎ  ２０：１０３９−４５（２００２）；Ｂｉｌｌａｕｔ−Ｍｕｌｏｔ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒａｉｎ  １９：９５−１０２（２０００）；Ｓｉｎ，Ｊ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１８：７７１−９（１９９９）。サルのワクチン接種の研究からの最近のデータは、サルにＨＩＶ  ｇａｇ  ＤＮＡをプライムでワクチン接種し、ＨＩＶ  ｇａｇを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ５−ｇａｇ）を用いたブーストを後に続けた場合、ＣＲＬ１００５ポロクサマー（１２ｋＤａ、５％  ＰＯＥ）をＨＩＶ  ｇａｇ抗原をコードするＤＮＡに加えることがＴ細胞応答を強化することを示唆している。ＤＮＡ／ポロクサマーのプライムの後にＡｄ５−ｇａｇブーストを続けることに対する細胞免疫応答は、ＤＮＡ（ポロクサマーを用いない）プライムの後に続くＡｄ５−ｇａｇブーストで、またはＡｄ５−ｇａｇのみで誘発される応答より大きい。Ｓｈｉｖｅｒ、Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：３３１−５（２００２）。米国特許出願  公開第ＵＳ２００２／０１６５１７２Ａ１号は、免疫応答が生成されるような、抗原の免疫原性の部分をコードするベクター構築体と抗原の免疫原性の部分を含むタンパク質との同時投与を記述している。このドキュメントは、Ｂ型肝炎抗原およびＨＩＶ抗原に限られる。さらに、米国特許  第６，５００，４３２号は対象となるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同時投与によって核酸ワクチン接種の免疫応答を強化する方法を対象としている。この特許によると、同時投与は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同一の免疫応答の間の投与を意味し、相互の間が０〜１０日間または３〜７日間であるのが好ましい。この特許によって意図される抗原としては、数ある中でも、肝炎（すべての形態）、ＨＳＶ、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＲＳＶ、ＶＺＶ、ＨＰＶ、ポリオ、インフルエンザ、寄生虫（例えば、プラスモジウム属からの）、および病原性細菌（結核菌、ライ菌、クラミジア、シゲラ、ライム病ボレリア、腸内毒素原性大腸菌、サルモネラ・ティフォサ、ピロリ菌、コレラ菌、百日咳菌等々が挙げられ��がこれに限定されない）が挙げられる。すべての上記の参考文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３６７】
一実施形態では、本開示の治療プロトコルは治療的である。別の実施形態では、プロトコルは予防的である。別の実施形態では、当業者であれば理解するであろうように、本開示の組成物は、家族性遺伝のためまたはこれらのタイプの病気にかかりやすくなる他の状況のために、乳ガンまたは他のタイプの腫瘍などのガンのリスクがある人々を保護するために使用される。別の実施形態では、ワクチンは、外科手術による腫瘍増殖の減量術、従来の化学療法、または放射線治療の後のガン免疫療法として使用される。かかる治療に続いて、本開示のワクチンを投与し、これによってワクチンの腫瘍抗原に対するＣＴＬ応答が残りの転移を破壊し、ガンからの寛解を長持ちさせる。別の実施形態では、本開示のワクチンは、以前に定着した腫瘍の成長に作用し、既存の腫瘍細胞を死滅させるために使用される。各々の可能性は本開示の別個の実施形態を表す。
【０３６８】
一部の実施形態では、「含む」という用語またはその文法的な形は、本明細書に開示されたＬｍ株など示された活性薬剤の包含、同様に腫瘍溶解性ウイルス、ＣＡＲ  Ｔ細胞、治療的または免疫調節性モノクローナル抗体、ＴＫＩ、または改変Ｔ細胞受容体を組み込んだ養子移入細胞、および製薬産業で既知の医薬的に許容される担体、賦形剤、緩和薬、安定剤などの包含を意味する。一部の実施形態では、「本質的に〜から成る」という用語は、唯一の活性成分が示された活性成分である組成物を意味するが、製剤の安定、保存などのためであって、指示された活性成分の治療的効果には直接的に関与しないその他の化合物も含まれることがある。一部の実施形態では、「本質的に〜から成る」という用語は、指示された活性成分の機序とは別個の機序によって治療的効果を発揮する構成要素を意味することがある。一部の実施形態では、「本質的に〜から成る」という用語は、治療的効果を発揮し、かつ指示された活性成分のとは別個の化合物クラスに属する構成要素を意味することがある。一部の実施形態では、「本質的に〜から成る」という用語は、治療的効果を発揮し、かつ例えば、異なる作用機序によって作用することにより、指示された活性成分とは別個の構成要素を意味することがある。一部の実施形態では、「本質的に〜から成る」という用語は、活性成分の放出を促進する構成要素を意味することがある。一部の実施形態では、「から成る」という用語は、活性成分および医薬的に許容される担体または賦形剤を含む組成物を意味する。
【０３６９】
本明細書で使用される時、単数形（「１つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」）は複数形の参照を含むが、その文脈によってそうでないことが明らかに示される場合はその限りではない。例えば、「１つの化合物」または「少なくとも１つの化合物」は、これらの混合物を含む複数の化合物を含む場合がある。
【０３７０】
本出願全体を通して、本明細書に開示された様々な実施形態は範囲形式で提示される場合がある。範囲形式の記述は、単に利便性および簡潔性の目的に過ぎず、本開示の範囲の一定不動の制限として解釈するべきではないことを理解するべきである。したがって、範囲の記述はすべての可能性のある部分的範囲ならびにその範囲内の個別の数値を具体的に開示したものと考えるべきである。例えば、１〜６などのような範囲の記述は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６、等々などの具体的に開示された部分的範囲、ならびにこの範囲内の個別の数、例えば、１、２、３、４、５、および６を有すると考えるべきである。これは、範囲の幅広さに関わらず適用される。
【０３７１】
本明細書に数値的範囲が示されるときはいつも、示される範囲内のあらゆる引用された数値（分数または整数）を含むことを意味する。第１に示す数と第２に示す数と「の間の範囲」という句、および第１に示す数「から」第２に示す数「までの範囲」という句は、本明細書で互換的に使用され、第１に示す数および第２に示す数ならびにそれらの間のすべての分数および整数を含むことを意味する。
【０３７２】
本明細書で使用される時「方法」という用語は、化学技術、薬学技術、生物学技術、生化学技術、および医術の実践者に既知であるか、または既知の様式、手段、技法、および手順からこれらの施術者によって容易に開発される様式、手段、技法、および手順を含むがこれに限定されない、所与の課題を遂行するための様式、手段、技法、および手順を指す。
【０３７３】
以下の実施例では、本開示の完全な理解を提供するために多数の具体的な詳細が示される。しかしながら、本開示はこれらの具体的な詳細を含まずに実施されうることが当業者には理解されるであろう。他の事例では、本開示を不明瞭にしないために周知の方法、手順、および構成成分は詳細には記述されていない。
【実施例】
【０３７４】
材料および方法（実施例１〜８）
ｔＬＬＯに融合されたＰＳＡを分泌する組み換え型Ｌｍ（Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ）が開発されたが、この株は前立腺ガンについてマウスモデルにおける腫瘍の退行に関連した強力なＰＳＡ特異的な免疫応答を誘発し、ここでｔＬＬＯ−ＰＳＡの発現は、ｐＧＧ５５（表１）に基づき、プラスミドに由来し、これはベクターに抗生物質抵抗性を与える。我々は、最近、ｐＡｄｖ１４２プラスミドに基づき、ＰＳＡワクチン用の新株を開発したが、これは、抗生物質抵抗性マーカーを持たず、ＬｍｄｄＡ−１４２（表２）と呼ぶ。この新株は、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡよりも１０倍弱毒化される。さらに、ＬｍｄｄＡ−１４２は、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡよりも、わずかに高い免疫原性があり、またＰＳＡを発現する腫瘍の退行において著しく大きな効果がある。
【表１−１】
2018501243.tif 000002
【表１−２】
2018501243.tif 000003
【表１−３】
2018501243.tif 000004
【０３７５】
プラスミドｐＡｄｖ１４２（６５２３  ｂｐ）の配列は次のとおりであった：
【０３７６】
ｃｇｇａｇｔｇｔａｔａｃｔｇｇｃｔｔａｃｔａｔｇｔｔｇｇｃａｃｔｇａｔｇａｇｇｇｔｇｔｃａｇｔｇａａｇｔｇｃｔｔｃａｔｇｔｇｇｃａｇｇａｇａａａａａａｇｇｃｔｇｃａｃｃｇｇｔｇｃｇｔｃａｇｃａｇａａｔａｔｇｔｇａｔａｃａｇｇａｔａｔａｔｔｃｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｃｔｃａｃｔｇａｃｔｃｇｃｔａｃｇｃｔｃｇｇｔｃｇｔｔｃｇａｃｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇａａａｔｇｇｃｔｔａｃｇａａｃｇｇｇｇｃｇｇａｇａｔｔｔｃｃｔｇｇａａｇａｔｇｃｃａｇｇａａｇａｔａｃｔｔａａｃａｇｇｇａａｇｔｇａｇａｇｇｇｃｃｇｃｇｇｃａａａｇｃｃｇｔｔｔｔｔｃｃａｔａｇｇｃｔｃｃｇｃｃｃｃｃｃｔｇａｃａａｇｃａｔｃａｃｇａａａｔｃｔｇａｃｇｃｔｃａａａｔｃａｇｔｇｇｔｇｇｃｇａａａｃｃｃｇａｃａｇｇａｃｔａｔａａａｇａｔａｃｃａｇｇｃｇｔｔｔｃｃｃｃｃｔｇｇｃｇｇｃｔｃｃｃｔｃｇｔｇｃｇｃｔｃｔｃｃｔｇｔｔｃｃｔｇｃｃｔｔｔｃｇｇｔｔｔａｃｃｇｇｔｇｔｃａｔｔｃｃｇｃｔｇｔｔａｔｇｇｃｃｇｃｇｔｔｔｇｔｃｔｃａｔｔｃｃａｃｇｃｃｔｇａｃａｃｔｃａｇｔｔｃｃｇｇｇｔａｇｇｃａｇｔｔｃｇｃｔｃｃａａｇｃｔｇｇａｃｔｇｔａｔｇｃａｃｇａａｃｃｃｃｃｃｇｔｔｃａｇｔｃｃｇａｃｃｇｃｔｇｃｇｃｃｔｔａｔｃｃｇｇｔａａｃｔａｔｃｇｔｃｔｔｇａｇｔｃｃａａｃｃｃｇｇａａａｇａｃａｔｇｃａａａａｇｃａｃｃａｃｔｇｇｃａｇｃａｇｃｃａｃｔｇｇｔａａｔｔｇａｔｔｔａｇａｇｇａｇｔｔａｇｔｃｔｔｇａａｇｔｃａｔｇｃｇｃｃｇｇｔｔａａｇｇｃｔａａａｃｔｇａａａｇｇａｃａａｇｔｔｔｔｇｇｔｇａｃｔｇｃｇｃｔｃｃｔｃｃａａｇｃｃａｇｔｔａｃｃｔｃｇｇｔｔｃａａａｇａｇｔｔｇｇｔａｇｃｔｃａｇａｇａａｃｃｔｔｃｇａａａａａｃｃｇｃｃｃｔｇｃａａｇｇｃｇｇｔｔｔｔｔｔｃｇｔｔｔｔｃａｇａｇｃａａｇａｇａｔｔａｃｇｃｇｃａｇａｃｃａａａａｃｇａｔｃｔｃａａｇａａｇａｔｃａｔｃｔｔａｔｔａａｔｃａｇａｔａａａａｔａｔｔｔｃｔａｇｃｃｃｔｃｃｔｔｔｇａｔｔａｇｔａｔａｔｔｃｃｔａｔｃｔｔａａａｇｔｔａｃｔｔｔｔａｔｇｔｇｇａｇｇｃａｔｔａａｃａｔｔｔｇｔｔａａｔｇａｃｇｔｃａａａａｇｇａｔａｇｃａａｇａｃｔａｇａａｔａａａｇｃｔａｔａａａｇｃａａｇｃａｔａｔａａｔａｔｔｇｃｇｔｔｔｃａｔｃｔｔｔａｇａａｇｃｇａａｔｔｔｃｇｃｃａａｔａｔｔａｔａａｔｔａｔｃａａａａｇａｇａｇｇｇｇｔｇｇｃａａａｃｇｇｔａｔｔｔｇｇｃａｔｔａｔｔａｇｇｔｔａａａａａａｔｇｔａｇａａｇｇａｇａｇｔｇａａａｃｃｃａｔｇａａａａａａａｔａａｔｇｃｔａｇｔｔｔｔｔａｔｔａｃａｃｔｔａｔａｔｔａｇｔｔａｇｔｃｔａｃｃａａｔｔｇｃｇｃａａｃａａａｃｔｇａａｇｃａａａｇｇａｔｇｃａｔｃｔｇｃａｔｔｃａａｔａａａｇａａａａｔｔｃａａｔｔｔｃａｔｃｃａｔｇｇｃａｃｃａｃｃａｇｃａｔｃｔｃｃｇｃｃｔｇｃａａｇｔｃｃｔａａｇａｃｇｃｃａａｔｃｇａａａａｇａａａｃａｃｇｃｇｇａｔｇａａａｔｃｇａｔａａｇｔａｔａｔａｃａａｇｇａｔｔｇｇａｔｔａｃａａｔａａａａａｃａａｔｇｔａｔｔａｇｔａｔａｃｃａｃｇｇａｇａｔｇｃａｇｔｇａｃａａａｔｇｔｇｃｃｇｃｃａａｇａａａａｇｇｔｔａｃａａａｇａｔｇｇａａａｔｇａａｔａｔａｔｔｇｔｔｇｔｇｇａｇａａａａａｇａａｇａａａｔｃｃａｔｃａａｔｃａａａａｔａａｔｇｃａｇａｃａｔｔｃａａｇｔｔｇｔｇａａｔｇｃａａｔｔｔｃｇａｇｃｃｔａａｃｃｔａｔｃｃａｇｇｔｇｃｔｃｔｃｇｔａａａａｇｃｇａａｔｔｃｇｇａａｔｔａｇｔａｇａａａａｔｃａａｃｃａｇａｔｇｔｔｃｔｃｃｃｔｇｔａａａａｃｇｔｇａｔｔｃａｔｔａａｃａｃｔｃａｇｃａｔｔｇａｔｔｔｇｃｃａｇｇｔａｔｇａｃｔａａｔｃａａｇａｃａａｔａａａａｔａｇｔｔｇｔａａａａａａｔｇｃｃａｃｔａａａｔｃａａａｃｇｔｔａａｃａａｃｇｃａｇｔａａａｔａｃａｔｔａｇｔｇｇａａａｇａｔｇｇａａｔｇａａａａａｔａｔｇｃｔｃａａｇｃｔｔａｔｃｃａａａｔｇｔａａｇｔｇｃａａａａａｔｔｇａｔｔａｔｇａｔｇａｃｇａａａｔｇｇｃｔｔａｃａｇｔｇａａｔｃａｃａａｔｔａａｔｔｇｃｇａａａｔｔｔｇｇｔａｃａｇｃａｔｔｔａａａｇｃｔｇｔａａａｔａａｔａｇｃｔｔｇａａｔｇｔａａａｃｔｔｃｇｇｃｇｃａａｔｃａｇｔｇａａｇｇｇａａａａｔｇｃａａｇａａｇａａｇｔｃａｔｔａｇｔｔｔｔａａａｃａａａｔｔｔａｃｔａｔａａｃｇｔｇａａｔｇｔｔａａｔｇａａｃｃｔａｃａａｇａｃｃｔｔｃｃａｇａｔｔｔｔｔｃｇｇｃａａａｇｃｔｇｔｔａｃｔａａａｇａｇｃａｇｔｔｇｃａａｇｃｇｃｔｔｇｇａｇｔｇａａｔｇｃａｇａａａａｔｃｃｔｃｃｔｇｃａｔａｔａｔｃｔｃａａｇｔｇｔｇｇｃｇｔａｔｇｇｃｃｇｔｃａａｇｔｔｔａｔｔｔｇａａａｔｔａｔｃａａｃｔａａｔｔｃｃｃａｔａｇｔａｃｔａａａｇｔａａａａｇｃｔｇｃｔｔｔｔｇａｔｇｃｔｇｃｃｇｔａａｇｃｇｇａａａａｔｃｔｇｔｃｔｃａｇｇｔｇａｔｇｔａｇａａｃｔａａｃａａａｔａｔｃａｔｃａａａａａｔｔｃｔｔｃｃｔｔｃａａａｇｃｃｇｔａａｔｔｔａｃｇｇａｇｇｔｔｃｃｇｃａａａａｇａｔｇａａｇｔｔｃａａａｔｃａｔｃｇａｃｇｇｃａａｃｃｔｃｇｇａｇａｃｔｔａｃｇｃｇａｔａｔｔｔｔｇａａａａａａｇｇｃｇｃｔａｃｔｔｔｔａａｔｃｇａｇａａａｃａｃｃａｇｇａｇｔｔｃｃｃａｔｔｇｃｔｔａｔａｃａａｃａａａｃｔｔｃｃｔａａａａｇａｃａａｔｇａａｔｔａｇｃｔｇｔｔａｔｔａａａａａｃａａｃｔｃａｇａａｔａｔａｔｔｇａａａｃａａｃｔｔｃａａａａｇｃｔｔａｔａｃａｇａｔｇｇａａａａａｔｔａａｃａｔｃｇａｔｃａｃｔｃｔｇｇａｇｇａｔａｃｇｔｔｇｃｔｃａａｔｔｃａａｃａｔｔｔｃｔｔｇｇｇａｔｇａａｇｔａａａｔｔａｔｇａｔｃｔｃｇａｇａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｃａａａａｇｃｇｔｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｇｇｃａｃａｇｃｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃａｇｇｃｃａｇｇｔａｔｔｔｃａｇｇｔｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｔｃｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔｇａｇｃｃｔｃｃｔｇａａｇａａｔｃｇａｔｔｃｃｔｃａｇｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃｃａｃｇａｃｃｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃｃｔｇｃｃｇａｇｃｔｃａｃｇｇａｔｇｃｔｇｔｇａａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃａｇｇａｇｃｃａｇｃａｃｔｇｇｇｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｇｇｔｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｃｔｔｇｔｃｔｇｔｔａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃａａｇｇｔａｔｃａｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｔｇａａｃｃａｔｇｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇａａａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｔａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｔａｃｃｇｇａａｇｔｇｇａｔｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃＴＡＡｃｃｃｇｇｇｃｃａｃｔａａｃｔｃａａｃｇｃｔａｇｔａｇｔｇｇａｔｔｔａａｔｃｃｃａａａｔｇａｇｃｃａａｃａｇａａｃｃａｇａａｃｃａｇａａａｃａｇａａｃａａｇｔａａｃａｔｔｇｇａｇｔｔａｇａａａｔｇｇａａｇａａｇａａａａａａｇｃａａｔｇａｔｔｔｃｇｔｇｔｇａａｔａａｔｇｃａｃｇａａａｔｃａｔｔｇｃｔｔａｔｔｔｔｔｔｔａａａａａｇｃｇａｔａｔａｃｔａｇａｔａｔａａｃｇａａａｃａａｃｇａａｃｔｇａａｔａａａｇａａｔａｃａａａａａａａｇａｇｃｃａｃｇａｃｃａｇｔｔａａａｇｃｃｔｇａｇａａａｃｔｔｔａａｃｔｇｃｇａｇｃｃｔｔａａｔｔｇａｔｔａｃｃａｃｃａａｔｃａａｔｔａａａｇａａｇｔｃｇａｇａｃｃｃａａａａｔｔｔｇｇｔａａａｇｔａｔｔｔａａｔｔａｃｔｔｔａｔｔａａｔｃａｇａｔａｃｔｔａａａｔａｔｃｔｇｔａａａｃｃｃａｔｔａｔａｔｃｇｇｇｔｔｔｔｔｇａｇｇｇｇａｔｔｔｃａａｇｔｃｔｔｔａａｇａａｇａｔａｃｃａｇｇｃａａｔｃａａｔｔａａｇａａａａａｃｔｔａｇｔｔｇａｔｔｇｃｃｔｔｔｔｔｔｇｔｔｇｔｇａｔｔｃａａｃｔｔｔｇａｔｃｇｔａｇｃｔｔｃｔａａｃｔａａｔｔａａｔｔｔｔｃｇｔａａｇａａａｇｇａｇａａｃａｇｃｔｇａａｔｇａａｔａｔｃｃｃｔｔｔｔｇｔｔｇｔａｇａａａｃｔｇｔｇｃｔｔｃａｔｇａｃｇｇｃｔｔｇｔｔａａａｇｔａｃａａａｔｔｔａａａａａｔａｇｔａａａａｔｔｃｇｃｔｃａａｔｃａｃｔａｃｃａａｇｃｃａｇｇｔａａａａｇｔａａａｇｇｇｇｃｔａｔｔｔｔｔｇｃｇｔａｔｃｇｃｔｃａａａａａａａａｇｃａｔｇａｔｔｇｇｃｇｇａｃｇｔｇｇｃｇｔｔｇｔｔｃｔｇａｃｔｔｃｃｇａａｇａａｇｃｇａｔｔｃａｃｇａａａａｔｃａａｇａｔａｃａｔｔｔａｃｇｃａｔｔｇｇａｃａｃｃａａａｃｇｔｔｔａｔｃｇｔｔａｔｇｇｔａｃｇｔａｔｇｃａｇａｃｇａａａａｃｃｇｔｔｃａｔａｃａｃｔａａａｇｇａｃａｔｔｃｔｇａａａａｃａａｔｔｔａａｇａｃａａａｔｃａａｔａｃｃｔｔｃｔｔｔａｔｔｇａｔｔｔｔｇａｔａｔｔｃａｃａｃｇｇａａａａａｇａａａｃｔａｔｔｔｃａｇｃａａｇｃｇａｔａｔｔｔｔａａｃａａｃａｇｃｔａｔｔｇａｔｔｔａｇｇｔｔｔｔａｔｇｃｃｔａｃｇｔｔａａｔｔａｔｃａａａｔｃｔｇａｔａａａｇｇｔｔａｔｃａａｇｃａｔａｔｔｔｔｇｔｔｔｔａｇａａａｃｇｃｃａｇｔｃｔａｔｇｔｇａｃｔｔｃａａａａｔｃａｇａａｔｔｔａａａｔｃｔｇｔｃａａａｇｃａｇｃｃａａａａｔａａｔｃｔｃｇｃａａａａｔａｔｃｃｇａｇａａｔａｔｔｔｔｇｇａａａｇｔｃｔｔｔｇｃｃａｇｔｔｇａｔｃｔａａｃｇｔｇｃａａｔｃａｔｔｔｔｇｇｇａｔｔｇｃｔｃｇｔａｔａｃｃａａｇａａｃｇｇａｃａａｔｇｔａｇａａｔｔｔｔｔｔｇａｔｃｃｃａａｔｔａｃｃｇｔｔａｔｔｃｔｔｔｃａａａｇａａｔｇｇｃａａｇａｔｔｇｇｔｃｔｔｔｃａａａｃａａａｃａｇａｔａａｔａａｇｇｇｃｔｔｔａｃｔｃｇｔｔｃａａｇｔｃｔａａｃｇｇｔｔｔｔａａｇｃｇｇｔａｃａｇａａｇｇｃａａａａａａｃａａｇｔａｇａｔｇａａｃｃｃｔｇｇｔｔｔａａｔｃｔｃｔｔａｔｔｇｃａｃｇａａａｃｇａａａｔｔｔｔｃａｇｇａｇａａａａｇｇｇｔｔｔａｇｔａｇｇｇｃｇｃａａｔａｇｃｇｔｔａｔｇｔｔｔａｃｃｃｔｃｔｃｔｔｔａｇｃｃｔａｃｔｔｔａｇｔｔｃａｇｇｃｔａｔｔｃａａｔｃｇａａａｃｇｔｇｃｇａａｔａｔａａｔａｔｇｔｔｔｇａｇｔｔｔａａｔａａｔｃｇａｔｔａｇａｔｃａａｃｃｃｔｔａｇａａｇａａａａａｇａａｇｔａａｔｃａａａａｔｔｇｔｔａｇａａｇｔｇｃｃｔａｔｔｃａｇａａａａｃｔａｔｃａａｇｇｇｇｃｔａａｔａｇｇｇａａｔａｃａｔｔａｃｃａｔｔｃｔｔｔｇｃａａａｇｃｔｔｇｇｇｔａｔｃａａｇｔｇａｔｔｔａａｃｃａｇｔａａａｇａｔｔｔａｔｔｔｇｔｃｃｇｔｃａａｇｇｇｔｇｇｔｔｔａａａｔｔｃａａｇａａａａａａａｇａａｇｃｇａａｃｇｔｃａａｃｇｔｇｔｔｃａｔｔｔｇｔｃａｇａａｔｇｇａａａｇａａｇａｔｔｔａａｔｇｇｃｔｔａｔａｔｔａｇｃｇａａａａａａｇｃｇａｔｇｔａｔａｃａａｇｃｃｔｔａｔｔｔａｇｃｇａｃｇａｃｃａａａａａａｇａｇａｔｔａｇａｇａａｇｔｇｃｔａｇｇｃａｔｔｃｃｔｇａａｃｇｇａｃａｔｔａｇａｔａａａｔｔｇｃｔｇａａｇｇｔａｃｔｇａａｇｇｃｇａａｔｃａｇｇａａａｔｔｔｔｃｔｔｔａａｇａｔｔａａａｃｃａｇｇａａｇａａａｔｇｇｔｇｇｃａｔｔｃａａｃｔｔｇｃｔａｇｔｇｔｔａａａｔｃａｔｔｇｔｔｇｃｔａｔｃｇａｔｃａｔｔａａａｔｔａａａａａａａｇａａｇａａｃｇａｇａａａｇｃｔａｔａｔａａａ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【実施例１】
【０３７７】
弱毒化リステリア菌株−ＬｍｄｄΔＡｃｔＡの構築、およびＬｍｄｄおよびＬｍｄｄＡ菌株内のｈｌｙ遺伝子へのフレーム内のヒトｋｌｋ３遺伝子の挿入。
【０３７８】
Ｌｍｄａｌ  ｄａｔ（Ｌｍｄｄ）株は、病毒性因子、ＡｃｔＡの不可逆的な欠失によって弱毒化された。ａｃｔＡのＬｍｄａｌｄａｔ（Ｌｍｄｄ）バックグラウンド内でのインフレーム欠失は、下流遺伝子発現上のあらゆる極性効果を避けるように構造化された。Ｌｍｄａｌ  ｄａｔΔａｃｔＡは、ＡｃｔＡの５９１アミノ酸の欠失によるＮ末端における最初の１９アミノ酸およびＣ末端の２８アミノ酸残基を含有する。
【０３７９】
ＡｃｔＡ欠失突然変異体は、ＡｃｔＡの上流部分（６５７  ｂｐ−ｏｌｉｇｏ’ｓ  Ａｄｖ  ２７１／２７２）および下流部分（６２５  ｂｐ−  ｏｌｉｇｏ’ｓ  Ａｄｖ  ２７３／２７４）に対応する染色体領域を増幅して、ＰＣＲによって結合することにより生成された。この増幅に使用されるプライマーの配列は表２の通りである。ＡｃｔＡの上流および顆粒のＤＮＡ領域が、ｐＮＥＢ１９３内でＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ制限部位でクローン化され、またこのプラスミドから、ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩがさらに、温度感受性プラスミドｐＫＳＶ７内でクローン化され、その結果としてΔＡｃｔＡ／ｐＫＳＶ７（ｐＡｄｖ１２０）が得られた。
【表２−１】
2018501243.tif 000005
【表２−２】
2018501243.tif 000006
【０３８０】
その染色体位置からの遺伝子の欠失は、ＡｃｔＡ欠失領域に外部的に結合されるプライマーを使用して確認されたが、これは図１にプライマー３（Ａｄｖ  ３０５−ｔｇｇｇａｔｇｇｃｃａａｇａａａｔｔｃ、配列番号：７２）およびプライマー４（Ａｄｖ３０４−ｃｔａｃｃａｔｇｔｃｔｔｃｃｇｔｔｇｃｔｔｇ、配列番号：７３）として示されている。ＰＣＲ解析をＬｍｄｄおよびＬｍｄｄΔＡｃｔＡから分離された染色体ＤＮＡ上で実施した。Ｌｍ−ｄｄ染色体のＤＮＡ内のプライマー対１／２および３／４の２つの異なるセットで増幅した後のＤＮＡ断片のサイズは、３．０Ｋｂおよび３．４Ｋｂとなると予想された。一方で、ＬｍｄｄΔＡｃｔＡについて、プライマーの対１／２および３／４を使用するＰＣＲの予想されるサイズは、１．２Ｋｂおよび１．６Ｋｂである。したがって、図１のＰＣＲ解析はａｃｔＡの１．８ｋｂ領域は、ＬｍｄｄΔａｃｔＡ株内では除去されていることを確認する。ＤＮＡ配列決定を、ＬｍｄｄａｃｔＡ株内の領域を含有するΔａｃｔＡの欠失を確認するためにＰＣＲ産物上でも実施した。
【実施例２】
【０３８１】
Ｌｍベクターによる抗原送達のための抗生物質独立的エピソーム発現系の構築。
【０３８２】
Ｌｍベクター（ｐＡｄｖ１４２）による抗原送達のための抗生物質独立的なエピソーム発現系は、次世代の抗生物質を含まないプラスミドｐＴＶ３である（Ｖｅｒｃｈら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ、２００４．  ７２（１１）：６４１８−２５、参照により本明細書に組み込まれる）。病毒性遺伝子転写活性化剤ｐｒｆＡ用の遺伝子は、リステリア株Ｌｍｄｄは、染色体内にｐｒｆＡ遺伝子の複製を含むため、ｐＴＶ３から除去された。さらに、ＮｈｅＩ／ＰａｃＩ制限部位でのｐ６０−リステリアｄａｌ用のカセットは、ｐ６０−枯草菌ｄａｌにより置換され、その結果としてプラスミドｐＡｄｖ１３４が得られた（図２Ａ）。リステリアとバシラスｄａｌ遺伝子の類似性は〜３０％であり、プラスミドとＬｍｄｄ染色体内のｄａｌ遺伝子の残りの断片との間での組み換えの可能性が実質的に除外される。プラスミドｐＡｄｖ１３４は、抗原発現カセットｔＬＬＯ−Ｅ７を含んでいた。ＬｍｄｄＡ株は、ｐＡｄｖ１３４プラスミドで形質転換し、選択したクローンからのＬＬＯ−Ｅ７タンパク質の発現がウエスタンブロットによって確認された（図２Ｂ）。１０４０３Ｓ野生型株に由来するＬｍｄｄ系は、Ｌｍｄｄストレプトマイシン耐性を除き、抗生物質抵抗性マーカーを欠失している。
【０３８３】
さらに、ｐＡｄｖ１３４がＸｈｏＩ／ＸｍａＩでクローンヒトＰＳＡ、ｋｌｋ３に制限され、その結果プラスミド、ｐＡｄｖ１４２が得られた。新しいプラスミド、ｐＡｄｖ１４２（図２Ｃ、表１）は、リステリアｐ６０プロモーターの制御下でバシラスｄａｌ（Ｂ−Ｄａｌ）を含む。シャトルプラスミド、ｐＡｄｖ１４２は、外因性Ｄ−アラニンの不在下で、大腸菌ａｌａ  ｄｒｘ  ＭＢ２１５９とリステリア・モノサイトゲネス株Ｌｍｄｄの両方の増殖を補完した。プラスミドｐＡｄｖ１４２内の抗原発現カセットは、ｈｌｙプロモーターおよびＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質から構成される（図２Ｃ）。
【０３８４】
プラスミドｐＡｄｖ１４２は、リステリア背景株ＬｍｄｄＡｃｔＡ株に形質転換され、その結果としてＬｍ−ｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡが得られた。株Ｌｍ−ｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡによるＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の発現および分泌は、抗ＬＬＯおよび抗ＰＳＡ抗体を使用したウエスタンブロットにより確認された（図２Ｄ）。インビボでの２継代後に株Ｌｍ−ｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡによるＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の安定した発現および分泌があった。
【実施例３】
【０３８５】
株ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのインビトロおよびインビボでの安定性
【０３８６】
プラスミドのインビトロでの安定性が、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡリステリア株を選択圧の存在下または不在下で８日間にわたり培養することにより検査された。株ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのための選択圧は、Ｄ−アラニンである。したがって、株ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、Ｂｒａｉｎ−Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）およびＢＨＩ＋  １００  μｇ／ｍｌ  Ｄ−アラニンで継代培養された。ＣＦＵが、選択的（ＢＨＩ）および非選択的（ＢＨＩ＋Ｄ−アラニン）培地でのプレーティング後に毎日決定された。非選択的培地（ＢＨＩ＋Ｄ−アラニン）にプレーティングされた後で、プラスミドの損失が結果的により高いＣＦＵにつながることが予想された。図３Ａに示すとおり、選択的および非選択的な培地でのＣＦＵ数には差異がなかった。これは、実験が終了した少なくとも５０世代までのあいだ、プラスミドｐＡｄｖ１４２が安定していたことを示唆する。
【０３８７】
インビボでのプラスミド維持が、５×１０７ＣＦＵのＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡをＣ５７ＢＬ／６  マウスに静脈内注入することにより決定された。生存可能な細菌がＰＢＳ中で均質化された脾臓から２４時間および４８時間の時点で分離された。各試料についてのＣＦＵが、ＢＨＩプレートおよびＢＨＩ  ＋  １００  ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−アラニンについて各時点で決定された。選択的および非選択的の培地への脾細胞のプレーティングの後、コロニーは２４時間後に回収された。この株はかなり高く弱毒化されているため、細菌負荷はインビボで２４時間でクリアされた。選択的および非選択的なプレートで有意なＣＦＵの差異は検出されず、これは分離されたすべての細菌内での組み換え型プラスミドの安定した存在を示している（図３Ｂ）。
【実施例４】
【０３８８】
株ＬｍｄｄＡ−１４２（ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ）のインビボでの継代培養、病毒性およびクリアランス
【０３８９】
ＬｍｄｄＡ−１４２は、エピソーム的に発現されたｔＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質を分泌する組み換え型リステリア株である。安全な投与量を決定するために、マウスが様々な投与量でのＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化され、毒性効果が決定された。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、最小限の毒性効果しかもたらさなかった（データ非表示）。結果は、１０８ ＣＦＵのＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの投与量が、マウスによって十分な耐容性を示すことを示唆するものであった。病毒性研究は、株ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは高度に弱毒化されたことを示す。
【０３９０】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに安全な投与量１０８ＣＦＵを腹腔内投与した後での、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのインビボでのクリアランスが決定された。２日後、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化したマウスの肝臓および脾臓内には、検出可能なコロニーはなかった。この株は高度に弱毒化されているため、インビボで４８時間の時点で完全にクリアされた（図４Ａ）。
【０３９１】
ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの弱毒化が、株ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのマクロファージに感染して細胞内で成長する能力を決定するために、細胞感染アッセイが実施された。マウスのマクロファージ様の細胞株（Ｊ７７４Ａ．１など）がリステリア構築体によってインビトロで感染され、細胞内増殖が定量化された。正の対照株の野生型リステリア株１０４０３Ｓは細胞内で成長し、およびｐｒｆＡ変異体である負の対照ＸＦＬ７は、ファゴリソソームを逃れることができず、Ｊ７７４細胞内で成長しない。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの細胞質内での増殖は、この株の細胞から細胞へと蔓延する能力の損失のため、１０４０３Ｓよりも遅かった（図４Ｂ）。結果は、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、マクロファージに感染する能力を持ち、細胞質内で成長することを示す。
【実施例５】
【０３９２】
Ｃ５７ＢＬ／６  マウスにおける株−ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの免疫原性
【０３９３】
Ｃ５７ＢＬ／６  マウス内で構築体ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡにより誘発されたＰＳＡ特異的な免疫応答がＰＳＡ四量体染色を使用して決定された。マウスは、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで１週間間隔で２回免疫化され、ブースト後６日目に脾細胞がＰＳＡ四量体について染色された。ＰＳＡ特異的な四量体での脾細胞の染色によって、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、ＰＳＡ四量体＋ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞の２３％の誘発が示された（図５Ａ）。
【０３９４】
ＰＳＡペプチドでの５時間にわたる刺激後に、ＰＳＡ特異的なＴ細胞のＩＦＮ−γを分泌する機能性能力が、細胞内サイトカイン染色を使用して検査された。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ群でＰＳＡペプチドで刺激したＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｌｏｗＩＦＮ−γを分泌する細胞で、無処置マウスと比較して２００倍の増加があり（図５Ｂ）、これは、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株は非常に免疫原性が高く、また脾臓内のＰＳＡに対して高いレベルの機能的に活性のＰＳＡ  ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を初期刺激することを示している。
【０３９５】
マウスをＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化した後でＰＳＡに対して生成された細胞毒性Ｔ細胞の機能性活性を決定するために、ＰＳＡ特異的なＣＴＬの持つインビトロアッセイでＨ−２ＤｂペプチドによりパルスしたＥＬ４細胞を溶解する能力を試験した。ＦＡＣＳベースのカスパーゼアッセイ（図５Ｃ）およびユーロピウム放出（図５Ｄ）が、細胞溶解を測定するために使用された。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化したマウスの脾細胞は、標的抗原としてＰＳＡペプチドを示す細胞について高い細胞溶解活性を持つＣＴＬを含んでいた。
【０３９６】
抗原で２４時間刺激した後、エフェクターＴ細胞の持つＩＦＮ−γを分泌する機能性能力を決定するためにＥＬＩＳｐｏｔが実施された。ＥＬＩＳｐｏｔを使用して、特異的ペプチドで刺激したＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化したマウスからの脾細胞内で、無処置マウスの脾細胞と比較した時に、ＩＦＮ−γのスポット数に２０倍の増加があったことが観察された（図５Ｅ）。
【実施例６】
【０３９７】
ＬｍｄｄＡ−１４２菌株による免疫化は、ＰＳＡを発現する腫瘍の退行およびＰＳＡ特異的なＣＴＬによる腫瘍の浸潤を誘発する。
【０３９８】
構築体ＬｍｄｄＡ−１４２  （ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ）の治療上の有効性が、ＰＳＡを発現する前立腺腺ガン細胞株の改変を使用して決定された（Ｔｒａｍｐ−Ｃ１−ＰＳＡ（ＴＰＳＡ）；Ｓｈａｈａｂｉら、２００８）。マウスに２×１０６のＴＰＳＡ細胞を皮下移植した。腫瘍接種後６日目に、腫瘍が４〜６ｍｍの触知可能なサイズに達した時、マウスは１週間間隔で３回、１０８ＣＦＵのＬｍｄｄＡ−１４２、１０７ＣＦＵのＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（正の対照）免疫化されたか、または未処置のままとした。無処置マウスは腫瘍を徐々に成長させた（図６Ａ）。ＬｍｄｄＡ−１４２で免疫化したマウスは、すべて３５日目まで腫瘍がなく、８匹のうち３匹のマウスが腫瘍を徐々に成長させたが、無処置マウスと比較してずっと遅い速度で成長した（図６Ｂ）。８匹のうち５匹のマウスが７０日目まで腫瘍のないままであった。予想されたとおり、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡワクチン接種したマウスは、無処置の対照よりも腫瘍が少なく、腫瘍の成長は対照よりもさらに遅かった（図６Ｃ）。したがって、構築体ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、ＴＰＳＡ細胞株によって確定された腫瘍の６０％を退行させることができ、また他のマウスでは腫瘍の増殖を遅らせた。治癒したマウスは腫瘍のないままであったが、６８日目にＴＰＳＡ腫瘍で再チャレンジした。
【０３９９】
ＬｍｄｄＡ−１４２によるマウスの免疫化は、増殖を制御でき、また無処置群（図６Ａ）で無かったのと比較して、６０％を越える実験動物（図６Ｂ）でＰＳＡを発現するよう改変された、確定されたＴｒａｍｐ−Ｃ１腫瘍の７日目の退行を誘発できる。ＬｍｄｄＡ−１４２は、高度に弱毒化されたベクター（ＬｍｄｄＡ）およびプラスミドｐＡｄｖ１４２（表１）を使用して構築された。
【０４００】
さらに、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ構築体によって生成されたＰＳＡ特異的なＣＤ８リンパ球の持つ腫瘍を浸潤する能力が、調査された。マウスには腫瘍およびマトリゲルの混合物が皮下移植された後、未変性または対照（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７）リステリアで、またはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで、７日間隔で２回の免疫化がなされた。腫瘍は、２１日目に切除され、ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ  ＰＳＡ四量体＋と、ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋の母集団で、腫瘍における制御性Ｔ細胞の浸潤性について分析された。
【０４０１】
無処置マウスおよびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７対照免疫化マウスの両方に存在したＰＳＡに特異的な、非常に少数のＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ  ＰＳＡ四量体＋腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）が観察された。ところが、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化したマウスでは、ＰＳＡ特異的なＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ  ＰＳＡ四量体＋  ＴＩＬの割合に１０〜３０倍の増加があった（図７Ａ）。興味深いことに、脾臓内のＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ  ＰＳＡ四量体＋細胞の母集団は、腫瘍内よりも７．５倍少なかった（図７Ａ）。
【０４０２】
さらに、未処置マウスおよびリステリア免疫化マウスの腫瘍内でのＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋調節性Ｔ細胞（ｒｅｇｓ）の存在が確認された。興味深いことに、リステリアでの免疫化によって、結果として、腫瘍内のＣＤ４＋  ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋  Ｔ−ｒｅｇｓの数がかなり減少したが、脾臓内では減少しなかった（図７Ｂ）。ところが、構築体ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、無処置およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７免疫化群と比較した時に、腫瘍内でのＣＤ４＋  ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋  Ｔ−ｒｅｇｓの頻度の減少に強力な影響を及ぼした（図７Ｂ）。
【０４０３】
よって、ＬｍｄｄＡ−１４２ワクチンは、腫瘍部位を浸潤することができるＰＳＡ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発できる（図７Ａ）。興味深いことに、ＬｍｄｄＡ−１４２での免疫化は、腫瘍内での制御性Ｔ細胞数の減少に関連し（図７Ｂ）、おそらく、効率的な抗腫瘍ＣＴＬ活性について、より好ましい環境が創出される。
【実施例７】
【０４０４】
Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３は、ＰＳＡ融合にもかかわらず、機能性ＬＬＯを分泌する。
【０４０５】
Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３は、完全長ヒトｋｌｋ３遺伝子を含み、これはＰＳＡタンパク質をコードし、相同組換えにより染色体内のｈｌｙ遺伝子の下流にインフレームで挿入される。これらの構築体は、ｐＫＳＶ７プラスミド（ＳｍｉｔｈおよびＹｏｕｎｇｍａｎ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．  １９９２；７４（７−８）ｐ７０５−７１１）を使用して相同組換えにより作成されるが、これは温度感受性レプリコンを有し、ｈｌｙ−ｋｌｋ３−ｍｐｌ組み換えカセットを保有する。第２の組み換え事象後のプラスミド切除のため、統合選択に使用される抗生物質抵抗性マーカーは失われる。さらに、ＡｃｔＡ遺伝子は、ＬｍｄｄＡ−１４３株内で除去される（図８Ａ）。ｈｌｙとインフレームのｋｌｋ３の染色体への挿入が、ＰＣＲにより確認され（図８Ｂ）、両方の構築体で配列決定がなされた（データ非表示）。
【０４０６】
これらの染色体構築体の一つの重要な面は、ＬＬＯ−ＰＳＡが生成されても、リステリアがファゴソーム、サイトゾル浸潤およびＬ．モノサイトゲネスによって生成された効率的な免疫から逃れるために必要とされるＬＬＯの機能が完全には消滅しないことである。Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３培養上清からの分泌タンパク質のウエスタンブロットにより、ＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質に対応する〜８１  ｋＤａ帯域および予想されたＬＬＯのサイズである〜６０  ｋＤａ帯域（図９Ａ）が明らかにされるが、これは染色体内の融合遺伝子にもかかわらず、ＬＬＯがＬ．モノサイトゲネスによってＬＬＯ−ＰＳＡ融合から切断されたか、またはなおも単一のタンパク質から生成されたかのいずれかであることを示す。Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３によるＬＬＯ分泌により、野生型Ｌ．モノサイトゲネス１０４０３Ｓと比較して、５０％の溶血活性が保持された（図９Ｂ）。これらの結果と一致して、Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３のどちらも、マクロファージ様のＪ７７４細胞株内で、細胞内での複製ができた（図９Ｃ）。
【実施例８】
【０４０７】
Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３のどちらもＰＳＡ抗原に対する細胞媒介性の免疫応答を誘発する。
【０４０８】
Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３のどちらも、ＬＬＯに融合されたＰＳＡを分泌できることを示した後、これらの菌株がＰＳＡ特異的な免疫応答をインビボで誘発できるかどうかを調査した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスが、未処置のままか、またはＬｍｄｄ−１４３、ＬｍｄｄＡ−１４３またはＬｍｄｄＡ−１４２で２回免疫化された。ＰＳＡ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答が、ＰＳＡ６５−７４ペプチドおよびＩＦＮ−γについての細胞内染色により脾細胞を刺激することで測定された。図１０に示すとおり、染色体およびプラスミドをベースにしたベクターにより誘発された免疫応答は同様であった。
【０４０９】
材料および方法（実施例９〜１３）
ＭＤＳＣおよびＴｒｅｇ機能  
腫瘍がマウスに、腫瘍モデルに依存して脇腹または生理学的部位に移植された。次いで７日後に、マウスはワクチン接種され、初期ワクチン接種日は使用する腫瘍モデルに依存する。次いでワクチンが与えられた一週間後に、マウスはブースターワクチンを投与された。
【０４１０】
次いでブーストの１週間、または浸潤性腫瘍モデルの場合はブーストの３〜４日後にマウスは犠牲にされ、腫瘍および脾臓が採取された。腫瘍を採取する５日前に、レスポンダーＴ細胞の目的で使用するために、腫瘍を持っていないマウスはワクチン接種された。標準的な方法を使用して脾細胞が準備された。
【０４１１】
簡潔に述べると、腫瘍および脾臓の両方の単細胞懸濁液が調製された。脾臓を手作業で潰し、赤血球を溶解した。腫瘍を細かく刻み、コラゲナーゼ／デオキシリボヌクレアーゼを用いてインキュベートした。代替的に、ＧＥＮＴＬＥＭＡＣＳ（商標）解離器を腫瘍解離キットとともに使用した。
【０４１２】
ＭＤＳＣまたはＴｒｅｇは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉキットおよびカラム、またはａｕｔｏＭＡＣｓセパレーターを使用して腫瘍および脾臓から精製された。次いで細胞を計数した。
【０４１３】
単細胞懸濁液を調製し、赤血球を溶解した。次いでＣＦＳＥを用いてレスポンダーＴ細胞にラベルを付けた。
【０４１４】
ウェル当たり１×１０５のＴ細胞密度にて、９６ウェルプレート内に、レスポンダーＴ細胞（すべての分裂サイクルうの段階からの）対ＭＤＳＣまたはＴｒｅｇの比が２：１となるように細胞を一緒にプレーティングした。次いで、適切なペプチド（ＰＳＡまたはＣＡ９）を用いて、または非特異的にＰＭＡ／イオノマイシンを用いてレスポンダーＴ細胞を刺激した。３７℃にて２日間、５％のＣＯ２を用いて、細胞を遮光下でインキュベートした。２日後、細胞をＦＡＣＳのために染色し、ＦＡＣＳマシンで解析した。
【０４１５】
Ｔ細胞応答の解析
ＥＬＩＳＡによるサイトカイン解析のために、脾細胞を採取して、ウェル当たり１５０万細胞にて４８ウェルプレートに培地、ＳＥＡ、またはｃｏｎＡ（正の対照として）の存在中にプレーティングした。７２時間の間のインキュベーションの後、上清を採取して、ＥＬＩＳＡ（ＢＤ）を用いてサイトカインレベルを解析した。抗原特異的なＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔのために、脾細胞を採取して、プレート当たり３０万および１５万細胞にてＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔプレート内に、培地、特異的なＣＴＬペプチド、無関連ペプチド、特異的なヘルパーペプチド、またはｃｏｎＡ（正の対照として）の存在中にプレーティングした。２０時間のインキュベーション後、ＥＬＩＳｐｏｔｓ（ＢＤ）を実施し、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃ．Ｔ．Ｌ．）によってスポットを計数した。１００万脾細胞当たりのスポットの数をグラフにした。
【０４１６】
Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、  Ｚ１を使用して脾細胞を計数した。ｇａｇ−ＣＴＬ、ｇａｇ−ｈｅｌｐｅｒ、培地、無関連抗原、およびｃｏｎ  Ａ（正の対照）を用いた再刺激後のＣＤ８＋  Ｔ細胞を生産するＩＦＮ−γの頻度が、標準的なＩＦＮ−γベースのＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して決定された。
【０４１７】
簡潔に述べると、５ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ  Ｒ４６−Ａ２と、最適な希釈で使用される多クローン性のウサギの抗ＩＦＮ−γ（親切にもＰｈｉｌｌｉｐ  Ｓｃｏｔｔ博士、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、米国ペンシルバニア州Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａによって提供された）とを使用してＩＦＮ−γを検出した。ＩＦＮ−γのレベルは、マウスのｒＩＦＮ−γ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を使用した標準曲線との比較によって計算された。プレートはペルオキシダーゼ−共役ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ａｂ（ＩＦＮ−γ）を使用して開発された。次いでプレートを４０５ｎｍで読み取った。アッセイに対する検出の下限値は３０ｐｇ／ｍＬである。
【実施例９】
【０４１８】
リステリアワクチン処置後の抑制細胞機能
【０４１９】
０日目に腫瘍をマウスに移植した。７日目にマウスにＬｍｄｄａ−Ｅ７またはＬｍｄｄＡ−ＰＳＡを用いてワクチン接種した。１４日目に腫瘍を採取して、ワクチン接種した群および無処置群に対する浸潤性ＭＤＳＣおよびＴｒｅｇの数およびパーセンテージを測定した。リステリア処置したマウスの腫瘍で、ＭＤＳＣとＴｒｅｇとの両方のパーセンテージ、およびＭＤＳＣの絶対数の減少が見出されたが、脾臓または排出リンパ節（ＴＬＤＮ）では同じ効果は観察されなかった（図１１）。
【０４２０】
腫瘍内でＭＤＳＣおよびＴｒｅｇ（両者とも脾臓および腫瘍のＭＤＳＣおよびＴｒｅｇ）の存在中でのＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡおよびＬｍ−ＬＬＯ−ＣＡ９、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｈｅｒ２（図１２〜１４）を用いた免疫化の効果を解明するために、上記の実験での腫瘍を持つマウスから分離された脾細胞および抽出された腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）を、プールし、ＣＤ３およびＣＤ８のために染色した。各々のカラムは特定の細胞分裂段階におけるＴ細胞集団の％を表し、特定の処置群（無処置、ペプチド−ＣＡ９またはＰＳＡ処置、ＭＤＳＣ／Ｔｒｅｇなし、およびＭＤＳＣ＋ＰＭＡ／イオノマイシンなし）の下で下位群にグループ分けした（図１２〜１４参照）。
【０４２１】
提示するＴｒｅｇおよびＭＤＳＣのパーセンテージについて腫瘍を持つマウスからの血液を解析した。Ｌｍワクチン接種後のマウスの血液ではＭＤＳＣとＴｒｅｇとの両方の減少があった。
【実施例１０】
【０４２２】
脾臓以外のＴＰＳＡ２３腫瘍からのＭＤＳＣは、リステリアワクチン接種後に抑制性が低下する。
【０４２３】
非特異的に活性化した無処置マウスの細胞および特異的に活性化した細胞（ＰＳＡ、ＣＡ９、ＰＭＡ／イオノマイシン）を有するＴＰＳＡ２３腫瘍から分離された単球性および顆粒球性のＭＤＳＣを使用して抑制因子アッセイを実行した。結果は、Ｌｍワクチン接種した群からの腫瘍から分離されたＭＤＳＣは、無処置マウスの腫瘍からのＭＤＳＣと比較して活性化したＴ細胞の分裂を抑制する能力が減退していることを実証した。（図１２および図１４のＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡおよびＬｍ−ＬＬＯで処置した群を参照、図中右側のパネルは右側のパネルからのプールした細胞分裂データを表す）。加えて、ＭＤＳＣが存在せずかつ細胞が刺激されていない／活性化している、未処置マウスからのＴレスポンダー細胞は、その親状態（休止状態）のままであるのに対して（図１２および図１４）、ＰＭＡまたはイオノマイシンで刺激されたＴ細胞は複製しているのが観察された（図１２および図１４）。さらに、Ｇｒ＋Ｌｙ６Ｇ＋およびＧｒｄｉｍＬｙ６Ｇ−ＭＤＳＣの両方とも、リステリアを用いた処置後、抑制がより低くなることが観察された。これは、ＰＳＡ特異的なＴ細胞および非特異的な（ＰＭＡ／イオノマイシンで刺激した）Ｔ細胞の両方の分割を抑制するこれらの能力を減少するために適用される。
【０４２４】
さらに、非特異的に活性化した無処置マウスの細胞を用いてＴＰＳＡ２３腫瘍から分離されたＭＤＳＣを使用して実施した抑制因子アッセイは、Ｌｍワクチン接種した群からの腫瘍から分離されたＭＤＳＣが、無処置マウスの腫瘍からのＭＤＳＣと比較して、活性化したＴ細胞の分裂を抑制する能力が減退していることを実証した（図１２および図１４参照）。
【０４２５】
加えて、すぐ上で考察した図１２および図１８に関する観察は、脾臓のＭＤＳＣを使用したときには観察されなかった。後者では、無処置群からの脾細胞／Ｔ細胞、リステリアで処置した群（ＰＳＡ、ＣＡ９）、およびＰＭＡ／イオノマイシンで刺激した群（正の対照）のすべてが同じレベルの複製を実証した（図１３および図１５）。したがって、これらの結果はリステリア媒介性の腫瘍内の抑制因子細胞の阻害が抗原特異的なおよび非特異的な様式で作用するのに対して、これらは抗原特異的な様式でのみ抑制的なので、リステリアは脾臓の顆粒球性のＭＤＳＣには何も効果を有しないことを示す。
【実施例１１】
【０４２６】
腫瘍調節性Ｔ細胞の抑制の減少
【０４２７】
リステリア処置後ＴＰＳＡ２３腫瘍から分離されたＴｒｅｇを使用して、抑制因子アッセイを実施した。リステリアを用いた処置後、腫瘍からのＴｒｅｇの抑制能力の減少が観察されたが（図１６）、しかしながら脾臓のＴｒｅｇはそれでも抑制的なままであることが見出された（図１７）。
【０４２８】
対照として、ＭＤＳＣまたはＴｒｅｇの代わりに従来のＣＤ４＋Ｔ細胞が使用され、細胞分裂には効果を有しないことが見出された（図１８）。
【実施例１２】
【０４２９】
４Ｔ１腫瘍からのＭＤＳＣおよびＴｒｅｇ（ただし脾臓ではない）は、リステリアワクチン接種後、より抑制が低下する。
【０４３０】
４Ｔ１腫瘍を使用して上記と同様に同一の実験を実施したところ、同一の観察を得た。すなわち、リステリアワクチン接種後、ＭＤＳＣは抑制がより少なくなる（図１９および図２１）、リステリアは脾臓の単球性ＭＤＳＣには特異的な効果を有しない（図２０および図２２）、リステリアワクチン接種の後、４Ｔ１腫瘍からのＴｒｅｇの抑制能力の減少がある（図２３）、およびリステリアが脾臓のＴｒｅｇの抑制能力に効果を有しない（図２４）。
【０４３１】
最後にリステリアが脾臓のＴｒｅｇの抑制能力には効果を有しないことが観察された。
【実施例１３】
【０４３２】
顆粒球性および単球性ＭＤＳＣの抑制能力の変化は、ｔＬＬＯの過剰発現に起因する。
【０４３３】
ＬＬＯプラスミドは、ＴＡＡまたは無関連抗原のいずれかを用いたリステリアワクチンと類似の結果を示す（図２５）。これは、顆粒球性のＭＤＳＣの抑制能力の変化がｔＬＬＯの過剰発現に起因し、融合抗原のパートナリングとは無関係であることを意味する。空のプラスミド構築体単独でもＭＤＳＣの抑制能力の変化を導くが、プラスミド上に切断ＬＬＯを含有するワクチンのいずれかとは正確に同一のレベルではない。３つの独立した実験の平均は、空のプラスミドとｔＬＬＯを有する他のプラスミドと（腫瘍抗原を有するものと有しないものと）の間の抑制の差異が有意であることを示す。抗原特異的な刺激されたレスポンダーＴ細胞が使用されるか、または抗原に非特異的な刺激されたレスポンダーＴ細胞が使用されるかという事実に関わらず、ＭＤＳＣ抑制能力の減少は同一である。
【０４３４】
顆粒球性のＭＤＳＣと同様に、３つの独立した実験の平均は、腫瘍から精製した単球性ＭＤＳＣのＬｍが空のプラスミドワクチンを用いたワクチン接種後の抑制能力の観察された差異が、他のワクチン構築体と比較して有意であることを示す（図２６）。
【０４３５】
上記の観察と同様に、脾臓から精製した顆粒球性のＭＤＳＣは、Ｌｍワクチン接種後もそれらの抗原特異的なレスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力を保持する（図２７）。しかしながら非特異的な刺激後、活性化したＴ細胞（ＰＭＡ／イオノマイシンを有する）はまだ分裂する能力を有している。これらの結果のいずれもＬＬＯのみまたは空のプラスミドワクチンの使用によって変更されず、これはＬｍベースのワクチンが脾臓の顆粒球性のＭＤＳＣには影響しないことを示す（図２７）。
【０４３６】
同様に、脾臓から精製した単球性のＭＤＳＣは、Ｌｍワクチン接種後もそれらの抗原特異的なレスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力を保持する。しかしながら、非特異的な活性化（ＰＭＡ／イオノマイシンによって刺激された）後、Ｔ細胞は、まだ分裂の能力を有している。これらの結果のいずれもＬＬＯのみまたは空のプラスミドワクチンの使用によって変更されず、これはＬｍワクチンが脾臓の単球性のＭＤＳＣには影響しないことを示す（図２８）。
【０４３７】
レスポンダー細胞が抗原特異的に活性化されるか、または非特異的に活性化されるかに関わらず、Ｌｍで処置した群のいずれかの腫瘍から精製したＴｒｅｇは、レスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力がわずかに減退している。特に、非特異的に活性化したレスポンダーＴ細胞については、それでも空のプラスミドを有するワクチンがＬＬＯをプラスミドに含有するすべてのワクチンと同じ結果を示す。この実験を他のものと平均化すると、差異が有意でないことを示す（図２９）。
【０４３８】
脾臓から精製したＴｒｅｇは、抗原特異的なおよび非特異的な活性化したレスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力をまだ有する。脾臓のＴｒｅｇの抑制能力にはＬｍ処置の効果はない（図３０）。
【０４３９】
Ｔｃｏｎ細胞は、レスポンダー細胞が抗原特異的に活性化したか、または非特異的に活性化したかに関わらず、Ｔ細胞の分裂を抑制する能力を有しない。これはこれらの細胞が非抑制的であるという事実と一致している。Ｌｍはこれらの細胞には効果を有さず、細胞が腫瘍から精製されても、またはマウスの脾臓から精製されても違いはなかった（図３１〜図３２）。
【０４４０】
実施例１４〜２０用の材料および方法
オリゴヌクレオチドはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）によって合成され、またＤＮＡ配列決定はＧｅｎｅｗｉｚ  Ｉｎｃ（米国ニュージャージー州Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ）によって行われた。フローサイトメトリー試薬はＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＢＤ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）から購入した。細胞培養培地、補助剤および他のすべての試薬は、示されない限りＳｉｇｍａ（米国ミズーリ州Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓｅ）から入手した。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＨＬＡ−Ａ２ペプチドはＥＺｂｉｏｌａｂｓ（米国インディアナ州Ｗｅｓｔｆｉｅｌｄ）によって合成された。完全なＲＰＭＩ  １６４０（Ｃ−ＲＰＭＩ）培地は、２ｍＭグルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、および１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｈｅｐｅｓ（２５ｍＭ）を含有した。多クローン性の抗ＬＬＯ抗体が前述されており、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体はＳｉｇｍａから購入した。
【０４４１】
マウスおよび細胞株
すべての動物実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａまたはＲｕｔｇｅｒｓ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおいてＩＡＣＵＣによって認可されたプロトコルに従って実施した。ＦＶＢ／ＮマウスはＪａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国メーン州Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ）から購入した。ラットＨｅｒ２／ｎｅｕ腫瘍性タンパク質を過剰発現するＦＶＢ／Ｎ  Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａの実験動物コア施設で収容および飼育された。ＮＴ−２腫瘍細胞株は高いレベルのラットＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質を発現し、これはこれらのマウスの自然発生的な乳腺腫瘍に由来し、前述したように増殖した。ＤＨＦＲ−Ｇ８（３Ｔ３／ｎｅｕ）細胞はＡＴＣＣから得られ、ＡＴＣＣの推奨に従って増殖した。ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞株は、Ｊｏｈｎ  Ｏｈｌｆｅｓｔ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、米国ミネソタ州）からの寛大な供与物であり、また完全なＣ−ＲＰＭＩ培地中で増殖した。生物発光の作業は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（米国ペンシルバニア州Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）のＳｍａｌｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＳＡＩＦ）によるガイダンスに従って実行された。
【０４４２】
リステリア構築体および抗原発現
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ−ｐＧＥＭ７Ｚは、親切にもＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのＭａｒｋ  Ｇｒｅｅｎｅ博士によって供与され、これはｐＧＥＭ７Ｚプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）へとクローニングされた全長のヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ（ｈＨｅｒ２）遺伝子を含んでいた。このプラスミドは、ＰＣＲによってｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および表３に示されるオリゴを使用して、ｈＨｅｒ−２／ｎｅｕの３つの区分、すなわちＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１を増幅するためのテンプレートとして使用された。
【表３−１】
2018501243.tif 000007
【表３−２】
2018501243.tif 000008
【０４４３】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕキメラ構築体はＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲ法およびテンプレートとしての各々の別個のｈＨｅｒ−２／ｎｅｕ区分による直接融合によって生成された。プライマーを表４に示す。
【表４−１】
2018501243.tif 000009
【表４−２】
2018501243.tif 000010
【０４４４】
異なる区分のヒトＨｅｒ２領域の増幅のためのプライマーの配列
【０４４５】
ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ制限酵素を使用してｐＡｄｖ１３８から切り離され、Ｌｍｄｄシャトルベクター、ｐＡｄｖ１３４で、ＬＬＯの切断非溶血性断片を用いてインフレームでクローニングされた。インサート、ＬＬＯ、およびｈｌｙプロモーターの配列はＤＮＡシークエンシング解析によって確認された。このプラスミドは電子コンピテントＡｃｔＡ、ｄａｌ、ｄａｔ突然変異体リステリア・モノサイトゲネス株、ＬｍｄｄＡへと電気穿孔され、ストレプトマイシン（２５０μｇ／ｍＬ）を含有するブレインハートインフージョン（ＢＨＩ）寒天培養基プレート上で陽性クローンが選択された。いくつかの実験では、ｈＨｅｒ２／ｎｅｕ（Ｌｍ−ｈＨｅｒ２）断片を発現する類似のリステリア株が比較の目的で使用された。すべての研究で、無関連リステリア構築体（Ｌｍ対照）が、免疫系でリステリアの抗原と無関係な効果を説明するために含まれる。Ｌｍ対照は、ＡＤＸＳ３１−１６４（ＬｍｄｄＡ−ＣｈＨｅｒ２）と同一のリステリアプラットフォームに基づくが、ＨＰＶ１６−Ｅ７またはＮＹ−ＥＳＯ−１などの異なる抗原を発現した。融合タンパク質のリステリアからの発現および分泌が試験された。各々の構築体はインビボで２回継代された。
【０４４６】
細胞毒性アッセイ
３〜５匹のＦＶＢ／Ｎマウスの群が、１×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２、ＡＤＸＳ３１−１６４、Ｌｍ−ｈＨｅｒ２  ＩＣＩ、またはＬｍ対照（無関連抗原を発現する）を用いて一週間間隔で３回免疫化されるか、または無処置のままとされた。ＮＴ−２細胞をインビトロで増殖させ、トリプシンで取り出し、マイトマイシンＣ（血清を含まないＣ−ＲＰＭＩ媒体中２５０μｇ／ｍＬ）で３７℃にて４５分間処置した。５回洗浄した後、これらを免疫化した動物または無処置の動物から採取した脾細胞を用いて１：５の比（刺激薬：レスポンダー）で５日間、３７℃および５％ＣＯ２で共インキュベートした。標的として３Ｔ３／ｎｅｕ（ＤＨＦＲ−Ｇ８）細胞のラベルが付いているユーロピウムを使用して、前述した方法により、標準的な細胞毒性アッセイを実施した。４時間のインキュベーションの後、分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｖｉｃｔｏｒ２）を５９０ｎｍにて使用して、死滅した標的細胞から放出されたユーロピウムを測定した。特異的な溶解のパーセントが（実験群での溶解−自然発生的溶解）／（最大溶解−自然発生的溶解）として定義された。
【０４４７】
免疫化マウスからの脾細胞によるインターフェロン−γ分泌
３〜５匹のＦＶＢ／ＮまたはＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスの群が、１×１０８ＣＦＵのＡＤＸＳ３１−１６４、陰性リステリア対照（無関連抗原を発現する）を用いて一週間間隔で３回免疫化されるか、または無処置のままとされた。最後の免疫化の一週間後、ＦＶＢ／Ｎマウスからの脾細胞が分離され、５×１０６細胞／ウェルにて２４ウェルプレートでマイトマイシンＣで処置したＮＴ−２細胞の存在下でＣ−ＲＰＭＩ培地中で共培養された。ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスからの脾細胞は、１μＭのＨＬＡ−Ａ２特異的なペプチドまたは１μｇ／ｍＬの組み換え型Ｈｉｓタグ付きＣｈＨｅｒ２タンパク質（大腸菌内で生産され、ニッケルベースのアフィニティークロマトグラフィーシステムによって精製された）の存在下でインキュベートされた。上清からのサンプルが２４時間または７２時間後に得られ、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の存在について、製造業者の推奨に従ってマウスＩＦＮ−γ酵素にリンクした免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを使用して試験した。
【０４４８】
Ｈｅｒ２トランスジェニック動物での腫瘍研究
生後６週間のＦＶＢ／ＮラットＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウス（９〜１４／群）に５×１０８ＣＦＵのＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２、ＡＤＸＳ３１−１６４、またはＬｍ対照を６回免疫化した。これらを、自然発生的な乳腺腫瘍の出現について週に２回観察し、これらは最高５２週間まで電子カリパスを使用して測定された。平均直径が１ｃｍ２のサイズに達したとき、エスケープした腫瘍を切り離し、後にＲＮＡ内で−２０℃で保存した。これらの腫瘍のエスケープ上のＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質内の突然変異の効果を決定するために、ゲノムＤＮＡ分離キットを使用してゲノムＤＮＡを抽出し、配列決定した。
【０４４９】
脾臓および腫瘍内の調節性Ｔ細胞へのＡＤＸＳ３１−１６４の効果
マウスに１×１０６ＮＴ−２細胞を皮下（ｓ．ｃ．）で移植した。７日目、１４日目、および２１日目に、これらに１×１０８ＣＦＵのＡＤＸＳ３１−１６４、ＬｍｄｄＡ対照で免疫化、または無処置のままにした。２８日目に腫瘍および脾臓を抽出し、ＦＡＣＳ解析によってＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの存在について試験した。簡潔に述べると、Ｃ−ＲＰＭＩ培地中で２枚のガラススライドの間で脾臓を均質化することによって脾細胞を分離した。滅菌したカミソリの刃を使用して腫瘍を細かく刻み、ＰＢＳ中にＤＮａｓｅ（１２Ｕ／ｍＬ）およびコラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍＬ）を含有するバッファーを用いて消化した。室温にて撹拌しながら６０分間インキュベーションした後で、細胞を激しいピペッティングによって分離した。赤血球をＲＢＣ溶解バッファーによって溶解し、続いて１０％ＦＢＳを含有する完全なＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて数回洗浄した。ナイロンメッシュを通した濾過の後、腫瘍細胞および脾細胞をＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳ／ＰＢＳ）中で再懸濁し、抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ２５−ＡＰＣ抗体を用いて染色し、続いて抗Ｆｏｘｐ３−ＰＥを用いて透過処理および染色した。４色ＦＡＣＳキャリバー（ＢＤ）を使用してフローサイトメトリー解析を実施し、ｃｅｌｌ  ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ）を使用してデータを解析した。
【０４５０】
統計的解析
生存データに対して対数順位χ二乗検定を使用し、ＣＴＬおよびＥＬＩＳＡアッセイに対してスチューデントのｔ検定を使用し、これらを３回行った。これらの解析では、０．０５未満（＊印をつけた）のｐ値は統計的に有意であると考えられる。Ｐｒｉｓｍソフトウェア、Ｖ．４．０ａ（２００６）またはＳＰＳＳソフトウェア、Ｖ．１５．０（２００６）のいずれかを用いてすべての統計的な解析が行われた。別段の記載がない限り、すべてのＦＶＢ／ＮラットＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック研究のために、群あたり８〜１４匹のマウスを使用し、すべての野生型ＦＶＢ／Ｎ研究のために、群あたり少なくとも８匹のマウスを使用した。Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスモデルの長期腫瘍研究を除いて、すべての研究を少なくとも１回は繰り返した。
【実施例１４】
【０４５１】
Ｈｅｒ−２断片に融合されたＬＬＯ断片を分泌するＬ．モノサイトゲネス株の発生：ＡＤＸＳ３１−１６４の構築
【０４５２】
キメラＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子（ＣｈＨｅｒ２）の構築については以下の通りであった。簡潔に述べると、ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、ＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲ法によって、Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の２つの細胞外断片（ａａ４０〜１７０およびａａ３５９〜４３３）と１つの細胞内断片（ａａ６７８〜８０８）との直接融合によって生成された。キメラタンパク質は、タンパク質の既知のヒトＭＨＣクラスＩエピトープのほとんどを有する。ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、プラスミド、ｐＡｄｖ１３８（これは構築体Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２に使用される）から切り離され、ＬｍｄｄＡシャトルプラスミドへとクローニングされ、結果としてプラスミドｐＡｄｖ１６４が得られる（図３３Ａ）。これらの２つのプラスミドバックボーンの間には２つの大きい違いがある。１）組み換え型細菌のインビトロでの選択のためにｐＡｄｖ１３８はクロラムフェニコール耐性マーカー（ｃａｔ）を使用しているが、ｐＡｄｖ１６４はバシラスサチリスからのＤ−アラニンラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）を寄生し、これはｄａｌ−ｄａｔ遺伝子を欠いているＬｍｄｄＡ株内でインビトロでの選択のためおよびインビボでのプラスミド保持のために代謝相補経路を使用する。このワクチンプラットフォームは、ＦＤＡによる改変リステリア株の抗生物質抵抗性についての憂慮に対処するために設計および開発された。２）ｐＡｄｖ１３８とは異なり、これはインビボでのＬｍｄｄ株の相補に必要ないので、プラスミド（以下の配列および図３３Ａを参照）中でｐＡｄｖ１６４はｐｒｆＡ遺伝子のコピーを有しない。ＬｍｄｄＡワクチン株も、ａｃｔＡ遺伝子（リステリア細胞内移動、および細胞から細胞への拡散を担当する）を欠いているので、このバックボーンに由来する組み換え型ワクチン株は、その親株であるＬｍｄｄに由来するものより病毒性が１００倍少ない。ＬｍｄｄＡベースのワクチンは、免疫化マウスの脾臓からのＬｍｄｄベースのワクチンよりもずっと速く（４８時間未満の間に）除去される。この株からの融合タンパク質ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌は、インビトロで８時間増殖したＴＣＡ沈殿した細胞培養上清の中のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２のもの（図３３Ｂ）と同等であり、ウエスタンブロット解析を使用して約１０４ＫＤの帯域として抗ＬＬＯ抗体によって検出される。負の対照としてｔＬＬＯのみを発現するリステリアバックボーン株が使用される。
【０４５３】
ｐＡｄｖ１６４配列（７０７５塩基対）（図３３）：
【０４５４】
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【実施例１５】
【０４５５】
ＡＤＸＳ３１−１６４は、ＬＭ−ＬＬＯ−ＣｈＨＥＲ２と同じく免疫原性である
【０４５６】
抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的な細胞毒性Ｔ細胞を発生するうえでのＡＤＸＳ３１−１６４の免疫原性の特性が、標準的なＣＴＬアッセイでＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２ワクチンのものと比較された。両方のワクチンは、３Ｔ３／ｎｅｕ標的細胞によって発現されるＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原に対して強いが同等の細胞毒性Ｔ細胞応答を引き出す。したがって、ＬＬＯに対してＨｅｒ２に融合された細胞内断片のみを発現するリステリアを用いて免疫化されたマウスは、より多くのＭＨＣクラスＩエピトープを含有するキメラより低い溶解活性を示す。無処置の動物、または無関連リステリアを注射したマウスではＣＴＬ活性は検出されなかった（図３４Ａ）。ＡＤＸＳ３１−１６４は、野生型ＦＶＢ／Ｎマウスからの脾細胞によってＩＦＮ−γの分泌を刺激することもできる（図３４Ｂ）。これはマイトマイシンＣで処理されたＮＴ−２細胞と共培養されたこれらの細胞の培養上清の中で検出され、これらは高いレベルのＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原を発現する（図３４Ｃ）。
【０４５７】
ヒトＭＨＣクラスＩエピトープのＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化後の適切な処置および提示は、ＨＬＡ−Ａ２マウスで試験された。免疫化したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックからの脾細胞は、マッピングしたＨＬＡ−Ａ２で制限されたエピトープに対応するペプチドと７２時間の間、共インキュベートされ、このペプチドはＨＥＲ２／ｎｅｕ分子の細胞外（ＨＬＹＱＧＣＱＶＶ配列番号：８７もしくはＫＩＦＧＳＬＡＦＬ配列番号：８８）、または細胞内（ＲＬＬＱＥＴＥＬＶ配列番号：８９）領域に位置する（図３４Ｃ）。組み換え型ＣｈＨｅｒ２タンパク質は、正の対照、および無関連ペプチド、または負の対照としてペプチドなしで使用された。この実験からのデータは、ＡＤＸＳ３１−１６４が抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的な免疫応答を標的化した抗原の異なるドメインに位置するヒトエピトープへと引き出すことができることを示す。
【実施例１６】
【０４５８】
ＡＤＸＳ３１−１６４は、自然発生的な乳腺腫瘍の発症の防止には、ＬＭ−ＬＬＯ−ＣｈＨＥＲ２より有効である
【０４５９】
ＡＤＸＳ３１−１６４の抗腫瘍効果が、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２とＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック動物において比較され、この動物は生後２０〜２５週間で繁殖の遅い自然発生的な乳腺腫瘍を発生した。無関連リステリア対照ワクチンを用いて免疫化されたすべての動物は、２１〜２５週の間に乳房の腫瘍を発生し、３３週の前に犠牲にされた。対照的に、リステリア−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ組み換え型ワクチンは、乳腺腫瘍の形成の著しい遅延を生じた。４５週には、５０％を超えるＡＤＸＳ３１−１６４をワクチン接種したマウス（９匹のうち５匹）は、まだ腫瘍がなく、これはＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２を用いて免疫化したマウスの２５％と比較される。５２週には、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いて免疫化した８匹のうち２匹のマウスは、まだ腫瘍を有しないままであったが、一方で他の実験的な群からのマウスはすべて、すでにこれらの疾患に屈服していた（図３５）。これらの結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４はより弱毒化しているにもかかわらず、Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック動物の自然発生的な乳腺腫瘍の発症の防止ではＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２より有効であることを示す。
【実施例１７】
【０４６０】
ＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化の際のＨＥＲ２／ＮＥＵ遺伝子での突然変異
【０４６１】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕのＭＨＣクラスＩエピトープ内の突然変異は、小さい分量のワクチンまたはトラスツズマブ（ハーセプチン）（Ｈｅｒ２／ｎｅｕの細胞外ドメインでエピトープを標的化するモノクローナル抗体）を用いた免疫化の際にエスケープした腫瘍を担当すると考えられてきた。これを評価するために、トランスジェニック動物内のエスケープした腫瘍からゲノム材料が抽出され、キメラワクチンまたは対照ワクチンを用いて免疫化した腫瘍内のｎｅｕ遺伝子の対応する断片を配列決定した。いかなるワクチン接種した腫瘍サンプルのＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子の中にも突然変異が観察されなかったことは、代替的なエスケープ機構を示唆する（データ示さず）。
【実施例１８】
【０４６２】
ＡＤＸＳ３１−１６４は、腫瘍内の制御性Ｔ細胞の著しい減少を生じる
【０４６３】
脾臓および腫瘍内での制御性Ｔ細胞の頻度に対するＡＤＸＳ３１−１６４の効果を解明するために、マウスにＮＴ−２腫瘍細胞を移植した。３回の免疫化の後、脾細胞および腫瘍内のリンパ球が分離され、Ｔｒｅｇのために染色した。これらは、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋細胞と定義されたが、別個に解析したとき、ＦｏｘＰ３マーカーまたはＣＤ２５マーカーのいずれかを用いて同等の結果が得られた。この結果は、無関連リステリアまたは無処置の動物と比較して、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化は、脾臓内のＴｒｅｇの頻度については効果を有しないことを示した（図３６）。対照的に、リステリアを用いた免疫化は、腫瘍内のＴｒｅｇの存在に少なからぬ影響を生じた（図３７）。処理されていない腫瘍ではすべてのＣＤ３＋Ｔ細胞の平均で１９．０％がＴｒｅｇであったが、この頻度は無関連ワクチンについては４．２％に減少し、ＡＤＸＳ３１−１６４ついては３．４％と腫瘍内のＴｒｅｇの頻度が５分の１に減少した（図３７Ｂ）。いずれかのＬｍｄｄＡワクチンで処置したマウスでの腫瘍内のＴｒｅｇの頻度の減少は、腫瘍のサイズの差異には貢献しなかった。代表的実験では、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いて免疫化したマウスからの腫瘍（平均直径（ｍｍ）±ＳＤ：６．７１±０．４３、ｎ＝５）は、未処置マウス（８．６９±０．９８、ｎ＝５、ｐ＜０．０１）、または無関連ワクチン（８．４１±１．４７、ｎ＝５、ｐ＝０．０４）で処置されたマウスからの腫瘍より著しくより小さかったが、一方で後者のこれら２つの群の比較は腫瘍サイズでは統計的な有意さを示さなかった（ｐ＝０．７３）。ＬｍｄｄＡワクチンで処置した腫瘍内のＴｒｅｇのより低い頻度は、腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の増加をもたらし、ＬｍｄｄＡワクチンを用いた免疫化後により好ましい腫瘍の微小環境を得ることができることを示唆する。しかしながら、標的抗原ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＡＤＸＳ３１−１６４）を発現するワクチンのみが腫瘍増殖を減少することができ、Ｔｒｅｇの減少は腫瘍内で抗原特異的な応答が存在するときのみ効果を有することを示す。
【実施例１９】
【０４６４】
ＨＥＲ−２キメラを発現するリステリアによってエスケープ変異が導入されない
【０４６５】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８、ＬｍｄｄＡ１６４、および無関連ワクチンＬｍ−ＬＬＯ−ＮＹなどの異なるワクチンを用いて免疫化したマウスの腫瘍サンプルを採取した。これらのサンプルからＤＮＡを精製し、ＨＥＲ２／ｎｅｕ領域に対応するＤＮＡ断片、ＩＣ１、ＥＣ１、およびＥＣ２を増幅し、何らかの免疫エスケープ変異があるかどうかを決定するために配列決定した。ＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して各々のＤＮＡからの配列のアラインメントを遂行した。解析の結果腫瘍から採取したＤＮＡ配列内には突然変異がないことを示した。これらの配列の詳細な解析を以下に示す。
【０４６６】
ＥＣ２のアラインメント（９７５−１０２９ｂｐのＨＥＲ２／ｎｅｕ）  
参照        ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ  （配列番号：９０）
【０４６７】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ
【０４６８】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ
【０４６９】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ
【０４７０】
ＬｍｄｄＡ１６４−２    ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ
【０４７１】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ
【０４７２】
ＬｍｄｄＡ１６４−４    ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ
【０４７３】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ
【０４７４】
ＬｍｄｄＡ−１６４−６    ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＣＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ
【０４７５】
参照      ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ  （配列番号：９１）
【０４７６】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ
【０４７７】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ
【０４７８】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ
【０４７９】
ＬｍｄｄＡ１６４−２    ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ
【０４８０】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ
【０４８１】
ＬｍｄｄＡ１６４−４    ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ
【０４８２】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ
【０４８３】
ＬｍｄｄＡ−１６４−６    ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ
【０４８４】
参照    ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ  （配列番号：９２）
【０４８５】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ
【０４８６】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ
【０４８７】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ
【０４８８】
ＬｍｄｄＡ１６４−２    ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ
【０４８９】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ
【０４９０】
ＬｍｄｄＡ１６４−４    ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ
【０４９１】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ
【０４９２】
ＬｍｄｄＡ−１６４−６    ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ                      
【０４９３】
参照  ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ  （配列番号：９３）
【０４９４】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ
【０４９５】
ｔＬｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ
【０４９６】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ
【０４９７】
ＬｍｄｄＡ１６４−２    ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ
【０４９８】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ
【０４９９】
ＬｍｄｄＡ１６４−４    ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ
【０５００】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ
【０５０１】
ＬｍｄｄＡ−１６４−６    ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ                            
【０５０２】
参照      ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣ  （配列番号：９４）
【０５０３】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣ
【０５０４】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣ
【０５０５】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣ
【０５０６】
ＬｍｄｄＡ１６４−２    ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣ
【０５０７】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣ
【０５０８】
ＬｍｄｄＡ１６４−４    ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣ
【０５０９】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＮＡＣＡＧＴＣＴＣ
【０５１０】
ＬｍｄｄＡ−１６４−６    ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴ                          
【０５１１】
参照        ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ  （配列番号：９５）
【０５１２】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ
【０５１３】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ
【０５１４】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ
【０５１５】
ＬｍｄｄＡ１６４−２    ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ
【０５１６】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ
【０５１７】
ＬｍｄｄＡ１６４−４    ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＡＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ
【０５１８】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＡＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ
【０５１９】
ＬｍｄｄＡ−１６４−６    ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＡＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ                    
【０５２０】
参照    ＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧ  （配列番号：９６）
【０５２１】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧ
【０５２２】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧ
【０５２３】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧ
【０５２４】
ＬｍｄｄＡ１６４−３    ＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧ
【０５２５】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧ
【０５２６】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−６  ＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧ                    
【０５２７】
参照    ＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴ  （配列番号：９７）
【０５２８】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴ
【０５２９】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴ
【０５３０】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴ
【０５３１】
ＬｍｄｄＡ１６４−３    ＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴ
【０５３２】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴ
【０５３３】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−６  ＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴ                
【０５３４】
参照    ＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧ  （配列番号：９８）
【０５３５】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧ
【０５３６】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧ
【０５３７】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧ
【０５３８】
ＬｍｄｄＡ１６４−３    ＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧ
【０５３９】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＮＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧ
【０５４０】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−６  ＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧ                                  
【０５４１】
参照    ＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣ  （配列番号：９９）
【０５４２】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣ
【０５４３】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣ
【０５４４】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣ
【０５４５】
ＬｍｄｄＡ１６４−３    ＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣ
【０５４６】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−６  ＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣ                                                                                                                          
【０５４７】
参照    ＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧ  （配列番号：１００）
【０５４８】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧ
【０５４９】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧ
【０５５０】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧ
【０５５１】
ＬｍｄｄＡ１６４−３    ＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧ
【０５５２】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−６  ＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡ−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
【０５５３】
ＩＣ１のアラインメント（２１１４−３０４２ｂｐのＨＥＲ２／ｎｅｕ）
参照        ＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣ  （配列番号：１０１）
【０５５４】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣ
【０５５５】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣ
【０５５６】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣ
【０５５７】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣ
【０５５８】
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６    ＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣ                      
【０５５９】
参照        ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ  （配列番号：１０２）
【０５６０】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
【０５６１】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
【０５６２】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
【０５６３】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
【０５６４】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
【０５６５】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
【０５６６】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
【０５６７】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
【０５６８】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
【０５６９】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４  ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ  
【０５７０】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
【０５７１】
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６    ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ                    
【０５７２】
参照        ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ  （配列番号：１０３）
【０５７３】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
【０５７４】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
【０５７５】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
【０５７６】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
【０５７７】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ  
【０５７８】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
【０５７９】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
【０５８０】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
【０５８１】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
【０５８２】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４  ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
【０５８３】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
【０５８４】
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６    ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ                  
【０５８５】
参照        ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ  （配列番号：１０４）
【０５８６】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
【０５８７】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
【０５８８】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
【０５８９】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
【０５９０】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ  
【０５９１】
ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
【０５９２】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
【０５９３】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
【０５９４】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
【０５９５】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４  ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ  
【０５９６】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
【０５９７】
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６    ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ                    
【０５９８】
参照        ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ  （配列番号：１０５）
【０５９９】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
【０６００】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
【０６０１】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
【０６０２】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
【０６０３】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ  
【０６０４】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
【０６０５】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
【０６０６】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
【０６０７】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
【０６０８】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４  ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
【０６０９】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
【０６１０】
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６    ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ                    
【０６１１】
参照        ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ  （配列番号：１０６）
【０６１２】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ  
【０６１３】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
【０６１４】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ  
【０６１５】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
【０６１６】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
【０６１７】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
【０６１８】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
【０６１９】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
【０６２０】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
【０６２１】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４  ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
【０６２２】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
【０６２３】
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６    ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ                    
【０６２４】
参照        ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ  （配列番号：１０７）
【０６２５】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
【０６２６】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
【０６２７】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ  
【０６２８】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ  
【０６２９】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
【０６３０】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
【０６３１】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
【０６３２】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
【０６３３】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
【０６３４】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４  ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
【０６３５】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
【０６３６】
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６    ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ  
【０６３７】
参照        ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ  （配列番号：１０８）
【０６３８】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ  
【０６３９】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
【０６４０】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ  
【０６４１】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
【０６４２】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ  
【０６４３】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
【０６４４】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ  
【０６４５】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
【０６４６】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４  ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
【０６４７】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
【０６４８】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
【０６４９】
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６    ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ  
【０６５０】
参照        ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ  （配列番号：１０９）
【０６５１】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ  
【０６５２】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
【０６５３】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ  
【０６５４】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ  
【０６５５】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ  
【０６５６】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
【０６５７】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ  
【０６５８】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
【０６５９】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
【０６６０】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４  ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
【０６６１】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
【０６６２】
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６    ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ            
【０６６３】
参照        ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ（配列番号：１１０）
【０６６４】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
【０６６５】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
【０６６６】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
【０６６７】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
【０６６８】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
【０６６９】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ  
【０６７０】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
【０６７１】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
【０６７２】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
【０６７３】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４  ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
【０６７４】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
【０６７５】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−６  ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ  
【０６７６】
参照        ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ  （配列番号：１１１）
【０６７７】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ  
【０６７８】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
【０６７９】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ  
【０６８０】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ  
【０６８１】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ  
【０６８２】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
【０６８３】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ  
【０６８４】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ  
【０６８５】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
【０６８６】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４  ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ  
【０６８７】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
【０６８８】
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６    ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ                                  
【０６８９】
参照        ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ  （配列番号：１１２）
【０６９０】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ  
【０６９１】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
【０６９２】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
【０６９３】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
【０６９４】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＮＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
【０６９５】
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６    ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
【０６９６】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
【０６９７】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
【０６９８】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
【０６９９】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
【０７００】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
【０７０１】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４  ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ  
【０７０２】
参照        ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ  （配列番号：１１３）
【０７０３】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ  
【０７０４】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
【０７０５】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ  
【０７０６】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ  
【０７０７】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ  
【０７０８】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
【０７０９】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
【０７１０】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
【０７１１】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
【０７１２】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４  ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ  
【０７１３】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
【０７１４】
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６    ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ                      
【０７１５】
参照        ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ  （配列番号：１１４）
【０７１６】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ  
【０７１７】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ
【０７１８】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＣＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＡＡＡＴＴＴＴ  
【０７１９】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ  
【０７２０】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ
【０７２１】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ  
【０７２２】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ
【０７２３】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ
【０７２４】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ
【０７２５】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４  ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ
【０７２６】
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６    ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ                                        
【０７２７】
参照        ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ  （配列番号：１１５）
【０７２８】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ  
【０７２９】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ
【０７３０】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ  
【０７３１】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ  
【０７３２】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ
【０７３３】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ  
【０７３４】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ
【０７３５】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ
【０７３６】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ
【０７３７】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−６  ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ                                                  
【０７３８】
ＥＣ１のアラインメント（３９９−７５８ｂｐのＨＥＲ２／ｎｅｕ） 
参照    ＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴ  （配列番号：１１６）
【０７３９】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴ
【０７４０】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴ  
【０７４１】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴ  
【０７４２】
ＬｍｄｄＡ−１６４−２    ＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴ
【０７４３】
ＬｍｄｄＡ−１６４−３    ＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴ
【０７４４】
ＬｍｄｄＡ１６４−４    ＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴ                                                  
【０７４５】
参照    ＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧ  （配列番号：１１７）  
【０７４６】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧ
【０７４７】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧ  
【０７４８】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧ  
【０７４９】
ＬｍｄｄＡ−１６４−２    ＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧ
【０７５０】
ＬｍｄｄＡ−１６４−３    ＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧ
【０７５１】
ＬｍｄｄＡ１６４−４    ＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧ
【０７５２】
参照    ＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣ  （配列番号：１１８）  
【０７５３】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣ
【０７５４】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣ
【０７５５】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣ  
【０７５６】
ＬｍｄｄＡ−１６４−２    ＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣ
【０７５７】
ＬｍｄｄＡ−１６４−３    ＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣ
【０７５８】
ＬｍｄｄＡ１６４−４    ＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣ
【０７５９】
参照    ＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧ  （配列番号：１１９）  
【０７６０】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧ  
【０７６１】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧ  
【０７６２】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧ  
【０７６３】
ＬｍｄｄＡ−１６４−２    ＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧ
【０７６４】
ＬｍｄｄＡ−１６４−３    ＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧ
【０７６５】
ＬｍｄｄＡ１６４−４    ＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧ    
【０７６６】
参照    ＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡ  （配列番号：  １２０）  
【０７６７】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡ
【０７６８】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡ  
【０７６９】
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡ  
【０７７０】
ＬｍｄｄＡ−１６４−２    ＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＴＡ
【０７７１】
ＬｍｄｄＡ−１６４−３    ＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＴＡＬｍｄｄＡ１６４−４      ＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＴＡ
【実施例２０】
【０７７２】
ＡＤＸＳ３１−１６４を用いた末梢の免疫化は転移性乳ガン細胞株の脳内での増殖を遅延することができる
【０７７３】
ＡＤＸＳ３１−１６４または無関連Ｌｍ対照ワクチンを用いてマウスに腹腔内で免疫化し、次いでルシフェラーゼおよび低いレベルのＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するＥＭＴ６−Ｌｕｃ腫瘍細胞を５．０００頭蓋内に移植した（図３８Ｃ）。麻酔をかけたマウスのエクスビボでの撮像によって接種後の異なる時点で腫瘍をモニターした。腫瘍接種後８日目に、すべての対照動物で腫瘍が検出されたが、ＡＤＸＳ３１−１６４群のマウスではいかなる検出可能な腫瘍を示すものもなかった（図３８Ａおよび図３８Ｂ）。ＡＤＸＳ３１−１６４はこれらの腫瘍の発症を明らかに遅延することができ、腫瘍接種後１１日目には負の対照群のマウスはすべてその腫瘍によって死んだが、ＡＤＸＳ３１−１６４群のマウスはすべてまだ生存しており、腫瘍増殖の小さい兆候を示すのみであった。これらの結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４の末梢投与を用いて得られた免疫応答が中枢神経系に到達することができる可能性があり、かつＬｍｄｄＡベースのワクチンがＣＮＳ腫瘍の治療のための使用の可能性を有する場合があることを強く示唆する。
【０７７４】
本開示のある特定の特徴が本明細書に例示され記述されてきたが、今では当業者には数多くの修正、置換、変更、および均等物が生じるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本開示の真の趣旨に含まれるかかるすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。
【図１】
2018501243.tif 000011
【図２】
2018501243.tif 000012
【図３】
2018501243.tif 000013
【図４】
2018501243.tif 000014
【図５−１】
2018501243.tif 000015
【図５−２】
2018501243.tif 000016
【図６−１】
2018501243.tif 000017
【図６−２】
2018501243.tif 000018
【図７−１】
2018501243.tif 000019
【図７−２】
2018501243.tif 000020
【図８】
2018501243.tif 000021
【図９】
2018501243.tif 000022
【図１０】
2018501243.tif 000023
【図１１】
2018501243.tif 000024
【図１２−１】
2018501243.tif 000025
【図１２−２】
2018501243.tif 000026
【図１３−１】
2018501243.tif 000027
【図１３−２】
2018501243.tif 000028
【図１４−１】
2018501243.tif 000029
【図１４−２】
2018501243.tif 000030
【図１５−１】
2018501243.tif 000031
【図１５−２】
2018501243.tif 000032
【図１６−１】
2018501243.tif 000033
【図１６−２】
2018501243.tif 000034
【図１７−１】
2018501243.tif 000035
【図１７−２】
2018501243.tif 000036
【図１８−１】
2018501243.tif 000037
【図１８−２】
2018501243.tif 000038
【図１９−１】
2018501243.tif 000039
【図１９−２】
2018501243.tif 000040
【図２０−１】
2018501243.tif 000041
【図２０−２】
2018501243.tif 000042
【図２１−１】
2018501243.tif 000043
【図２１−２】
2018501243.tif 000044
【図２２−１】
2018501243.tif 000045
【図２２−２】
2018501243.tif 000046
【図２３−１】
2018501243.tif 000047
【図２３−２】
2018501243.tif 000048
【図２４−１】
2018501243.tif 000049
【図２４−２】
2018501243.tif 000050
【図２５−１】
2018501243.tif 000051
【図２５−２】
2018501243.tif 000052
【図２６−１】
2018501243.tif 000053
【図２６−２】
2018501243.tif 000054
【図２７−１】
2018501243.tif 000055
【図２７−２】
2018501243.tif 000056
【図２８−１】
2018501243.tif 000057
【図２８−２】
2018501243.tif 000058
【図２９−１】
2018501243.tif 000059
【図２９−２】
2018501243.tif 000060
【図３０−１】
2018501243.tif 000061
【図３０−２】
2018501243.tif 000062
【図３１−１】
2018501243.tif 000063
【図３１−２】
2018501243.tif 000064
【図３２−１】
2018501243.tif 000065
【図３２−２】
2018501243.tif 000066
【図３３−１】
2018501243.tif 000067
【図３３−２】
2018501243.tif 000068
【図３４−１】
2018501243.tif 000069
【図３４−２】
2018501243.tif 000070
【図３５】
2018501243.tif 000071
【図３６】
2018501243.tif 000072
【図３７−１】
2018501243.tif 000073
【図３７−２】
2018501243.tif 000074
【図３８−１】
2018501243.tif 000075
【図３８−２】
2018501243.tif 000076
【配列表】
2018501243000001.app
【国際調査報告】
2018501243.tif 000077
2018501243.tif 000078
2018501243.tif 000079
2018501243.tif 000080