(57)【要約】  ポリ−２−オキサゾリン両親媒性ポリマーおよびコポリマーの調製を記載する。また、このような両親媒性ポリマーを含み、治療用および診断用薬剤の標的化送達に有用な自己集合型粒子も記載する。【選択図】図１Ａ
2018506515.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
Ｂ−（Ｌ０−Ａ−Ｚ）ｎ
（式中
ｎは１または２であり；
Ｂは疎水性ポリシロキサンセグメントであり；
Ｌ０は二価のリンカーセグメントであり；
Ａは親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントであり；
Ｚは末端基であるか、またはリガンドにコンジュゲートさせたリンカーである）
で表される両親媒性ポリマーを含む自己集合型粒子。
【請求項２】
さらに、式（ＩＩ）：
Ｂ−（Ｌ０−Ｃ−Ｚ）ｎ
（式中、Ｂ、Ｌ０、Ｚおよびｎは請求項１に規定のとおりであり、
Ｃは親水性ポリ−２−オキサゾリンホモポリマーセグメントである）
で表される少なくとも１種類の両親媒性ポリマーを含む、請求項１に記載の自己集合型粒子。
【請求項３】
Ｚが末端基である式（ＩＩ）の少なくとも１種類の両親媒性ポリマーを含む自己集合型粒子であって、
ミセルであり；任意で
Ｚがリガンドにコンジュゲートさせたリンカーである式（ＩＩ）の少なくとも１種類の両親媒性ポリマーを含む、
自己集合型粒子。
【請求項４】
Ｚが末端基である式（ＩＩ）の少なくとも１種類の両親媒性ポリマーを含む自己集合型粒子であって、Ｚが、抗体、抗原結合断片（ｆａｂ）、シングルドメイン抗体、オリゴヌクレオチド、ポリペプチドおよび炭水化物から選択されるリガンドにコンジュゲートさせたリンカーであるかまたはリンカーが受容体特異的リガンドに、好ましくはフォレートまたはその誘導体にコンジュゲートされている式（ＩＩ）の少なくとも１種類の両親媒性ポリマーを含む、自己集合型粒子。
【請求項５】
親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントＡに診断用薬剤、治療用薬剤または抗体、抗原結合断片（ｆａｂ）、シングルドメイン抗体、オリゴヌクレオチド、ポリペプチドもしくは炭水化物などのリガンドがコンジュゲートされている、請求項１または２に記載の自己集合型粒子。
【請求項６】
親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントＡが少なくとも２種類の２−置換−２−オキサゾリンモノマーの共重合により得られ得るものであり、該モノマーの少なくとも１種類が２−アルキル−２−オキサゾリンまたは２−アリール−２−オキサゾリンである、請求項１、２または５に記載の自己集合型粒子。
【請求項７】
一般式（Ｉ）の両親媒性ポリマーの疎水性ポリシロキサンセグメントＢがポリジメチルシロキサンセグメントであり；
ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントＡが少なくとも１つのポリ−２−メチル−オキサゾリンブロックを含み、  Ｚが末端基である、
請求項１、２、５または６のいずれかに記載の自己集合型粒子。
【請求項８】
式（ＩＩ）の両親媒性ポリマーの疎水性ポリシロキサンセグメントＢがポリジメチルシロキサンであり、
Ｃがポリ−２−メチル−オキサゾリンである、
請求項２、３、４または７に記載の自己集合型粒子。
【請求項９】
ミセルもしくは小胞であるか、またはミセルである、請求項１〜８のいずれかに記載の自己集合型粒子。
【請求項１０】
独立して、治療用薬剤、診断用薬剤もしくはオリゴヌクレオチドまたはその組合せを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の自己集合型粒子。
【請求項１１】
一般式（Ｉ）
Ｂ−（Ｌ０−Ａ−Ｚ）ｎ
の両親媒性ポリマーであって、
式中、Ｂ、Ｌ０、Ａ、Ｚおよびｎは請求項１に規定のとおりであり、ここで、
（ａ）Ｌ０は式Ｒ８（Ｑ）ｕであり、ここで、
Ｒ８は、１〜２０個の炭素原子を含むアルキレンまたはアリーレン基およびヘテロ原子Ｏ、Ｎ、Ｓのうちの１個以上が介在している１〜２０個の炭素原子を含むアルキレンまたはアリーレン基から選択され；
Ｑは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＲ９−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−、
【化１】
2018506515.tif 000051
（式中、Ｒ９は水素またはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、ｕは０、１または２である）
から選択され；
（ｂ）Ｚは、式−Ｘ１−Ｑ０の末端基であるか、または式−Ｌ３−Ｒ１１のリガンドにコンジュゲートさせたリンカーであり、ここで、
Ｘ１は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＮＲ１０−、
【化２】
2018506515.tif 000052
−Ｎ３、
【化３】
2018506515.tif 000053
2018506515.tif 000054
から選択され；
Ｑ０は存在しないか、またはＨ、非置換もしくは置換されたアルキル、アルケニル、アラルキル、アルキニル、ヘテロシクリル、アリール、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒ１０、−（ＣＨ２）ｑ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒ１０、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｑ−Ｎ３、−（ＣＨ２）ｑ−Ｎ３もしくは−ＳＲ１０から選択され、ここで、Ｒ１０は非置換または置換されたアルキル、アルケニルまたはアラルキル基であり、ｑは整数１〜１０であり；
Ｌ３は−Ｓ−、−Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、
または
【化４】
2018506515.tif 000055
2018506515.tif 000056
であり、ここで、Ｑ１は１個以上の置換基を表し；
Ｒ１１は、小分子、抗体、抗原結合断片（ｆａｂ）、シングルドメイン抗体、オリゴヌクレオチド、炭水化物から選択されるリガンド、特に、フォレート、ビオチンまたはペプチドから選択されるリガンドであり；
（ｃ）Ａは、式（Ｉ−ａ）：
【化５】
2018506515.tif 000057
（式中
Ｒ１およびＲ３は独立して、治療用薬剤、診断用薬剤、リガンドにコンジュゲートさせたリンカーならびにアミン、アジド、アルキン、アルデヒド、アセタール、アルコール、カルボン酸、活性化カルボン酸、オキシアミン、ケトン、ケタール、エステル、マレイミド、ビニルスルホン、オルトピリジルジスルフィドおよびクロロホルメートから選択される官能基を含むリンカーから選択され；
Ｒ２はＣ１〜Ｃ２０アルキルまたはアラルキル基であり；
ｅおよびｆは０〜５００から独立して選択される整数である、ただし、ｅおよびｆが同時に０として選択されることはないものとし；
ｐは２〜５００から選択される整数であり；
ａは、ｒａｎおよびブロックから選択され、ここで、ｒａｎは、整数ｅ、ｆおよびｐによって規定される単位がランダムに存在するランダムコポリマーを示し、ブロックは、整数ｅ、ｆおよびｐによって規定される単位が連続するセグメントであるブロックコポリマーを示す）
の親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントである
両親媒性ポリマー。
【請求項１２】
Ａが、式（Ｉ−ｂ）：
【化６】
2018506515.tif 000058
（式中  Ｌ５、Ｌ６およびＬ７は独立して、Ｃ１〜Ｃ２０アルキレン、Ｃ４〜Ｃ１２アリーレンおよびヘテロ原子Ｏ、Ｎ、Ｓのうちの１個以上が介在しているＣ１〜Ｃ２０アルキレンまたはＣ４〜Ｃ１２アリーレンから選択され；  Ｒ１２は、−Ｈ（Ｈ）、−（Ｈ）Ｒ１３、−（Ｒ１３）２および−（Ｒ１３）２Ｒ１４Ｘから選択され、ここで、Ｒ１３およびＲ１４は独立して、置換または非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキルおよび置換または非置換のアラルキルから選択され、Ｘは負の対イオンであり；
Ｚは、−ＯＨ、−ＮＨ２、
【化７】
2018506515.tif 000059
−ＯＲ１５、−ＮＲ１５Ｒ１６および−ＳＲ１５から選択される末端基であり、ここで、Ｒ１５およびＲ１６は独立して、非置換または置換されたアルキル、アルケニルおよびアラルキルから選択される）
の親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントである、請求項１１に記載の両親媒性ポリマー。
【請求項１３】
ｆが０であり、Ａが、式（Ｉ−ｃ）：
【化８】
2018506515.tif 000060
の親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントである、請求項１２に記載の両親媒性ポリマー。
【請求項１４】
Ａが、式（Ｉ−ｄ）：
【化９】
2018506515.tif 000061
（式中、  Ｒ１８およびＲ１９は独立して、各モノマー単位について、診断用薬剤、治療用薬剤、リガンド、および好ましくは水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ２０アリーレンから選択される置換基から選択される、ただし、少なくとも１つのモノマー単位ではＲ１８および／またはＲ１９が診断用薬剤、治療用薬剤またはリガンドであるものとし；  Ｌ６およびＬ７は独立して、Ｃ１〜Ｃ２０アルキレン、Ｃ４〜Ｃ１２アリーレンおよびヘテロ原子Ｏ、Ｎ、Ｓのうちの１個以上が介在しているＣ１〜Ｃ２０アルキレンまたはＣ４〜Ｃ１２アリーレンから選択され；  Ｌ８は式−Ｒ２０（Ｙ）ｓの二価のリンカーであり、ここで、Ｒ２０は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキレンもしくはアリーレン、またはヘテロ原子Ｏ、Ｎ、Ｓのうちの１個以上が介在しているＣ１〜Ｃ２０アルキレンもしくはアリーレンであり；Ｙは−Ｓ−Ｓ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−、−ＮＨ−および−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｎ＝であり、ｓは０、１または２であり；  ｔは、０または１の整数から選択され；  Ｚは、−ＯＨ、−ＮＨ２、
【化１０】
2018506515.tif 000062
2018506515.tif 000063
−ＯＲ１６、−ＮＲ１６Ｒ１７、−ＳＲ１６から選択される末端基であり、ここで、Ｒ１６およびＲ１７は独立して、非置換または置換されたアルキル、アルケニルおよびアラルキルから選択される）
の親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントである、請求項１１に記載の両親媒性ポリマー。
【請求項１５】
ｆが０であり、Ａが、式（Ｉ−ｅ）：
【化１１】
2018506515.tif 000064
（式中、  Ｒ１８は、各モノマー単位について、好ましくは化学療法剤または抗新生物剤、例えばドキソルビシンまたはタキソールから選択される治療用薬剤；好ましくは蛍光性色素、放射性標識、ＰＥＴイメージング剤、ＭＲＩイメージング剤および増感剤から選択されるか、または光音響イメージング剤から選択される診断用薬剤；好ましくは水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキレンおよびＣ１〜Ｃ２０アリーレンから選択される置換基から独立して選択される；
ただし、少なくとも１つのモノマー単位ではＲ１８が治療用薬剤または診断用薬剤であるものとする）
の親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ｅが０であり、Ａが、式（Ｉ−ｆ）：
【化１２】
2018506515.tif 000065
（式中、  Ｒ１９は、各モノマー単位について、好ましくは化学療法剤もしくは抗新生物剤、例えばドキソルビシンもしくはタキソールから選択される治療用薬剤；好ましくは蛍光性色素、放射性標識、ＰＥＴイメージング剤、ＭＲＩイメージング剤および増感剤から選択されるか、もしくは光音響イメージング剤から選択される診断用薬剤；または好ましくは水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキレンおよびＣ１〜Ｃ２０アリーレンから選択される置換基から独立して選択される；
ただし、少なくとも１つのモノマー単位ではＲ１９が治療用薬剤または診断用薬剤であるものとする）
の親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントである、請求項１４に記載の両親媒性ポリマー。
【請求項１７】
ポリシロキサン開始剤と、少なくとも１種類の２−（アジドアルキル）−２−オキサゾリンモノマーおよび少なくとも１種類の２−アルキル−２−オキサゾリンまたは２−アラルキル−２−オキサゾリンモノマーとのカチオン開環重合の工程を含む、請求項１１に記載の両親媒性ポリマーの調製方法。
【請求項１８】
さらに、アジド還元工程および／またはアルキニル成分との１，３双極子付加環化工程を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ａが、式（Ｉ−ｇ）：
【化１３】
2018506515.tif 000066
（式中、  Ｌ６およびＬ７は独立して、Ｃ１〜Ｃ２０アルキレン、Ｃ４〜Ｃ１２アリーレンおよびヘテロ原子Ｏ、Ｎ、Ｓのうちの１個以上が介在しているＣ１〜Ｃ２０アルキレンまたはＣ４〜Ｃ１２アリーレンから選択され；  Ｒ２１は、Ｈ（Ｈ）、Ｈ（Ｒ２２）、（Ｒ２２）２または（Ｒ２２）２Ｒ２３Ｘから選択され、ここで、Ｒ２２およびＲ２３は独立して、置換または非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキルおよび置換または非置換のアラルキルから選択され、Ｘは負の対イオンである）
の親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントである、請求項１１に記載の両親媒性ポリマー。
【請求項２０】
ｆが０であり；
Ａが、式（Ｉ−ｈ）：
【化１４】
2018506515.tif 000067
の親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントであり、  Ｚが、−ＯＨ、−Ｎ３、−ＮＨ２、
【化１５】
2018506515.tif 000068
−ＯＲ１６、−ＮＲ１６Ｒ１７、−ＳＲ１６、
【化１６】
2018506515.tif 000069
から選択される末端基であり、ここで、Ｒ１６およびＲ１７は独立して、非置換または置換されたアルキル、アルケニルおよびアラルキルから選択される、
請求項１９に記載の両親媒性ポリマー。
【請求項２１】
ｅが０であり、  Ｒ２１がＨ（Ｈ）であり、  Ａが、式（Ｉ−ｉ）
【化１７】
2018506515.tif 000070
の親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントであり、
Ｚが、−ＯＨ、−Ｎ３、−ＮＨ２、
【化１８】
2018506515.tif 000071
−ＯＲ１６、−ＮＲ１６Ｒ１７、−ＳＲ１６、
【化１９】
2018506515.tif 000072
から選択される末端基であり、ここで、Ｒ１６およびＲ１７は独立して、非置換または置換されたアルキル、アルケニルおよびアラルキルから選択される、
請求項１９に記載の両親媒性ポリマー。
【請求項２２】
Ｚが、請求項１１において規定した末端基であるか、または小分子、抗体、抗原結合断片（ｆａｂ）、シングルドメイン抗体、オリゴヌクレオチド、ポリペプチドおよび炭水化物から選択されるリガンドにコンジュゲートさせたリンカーである、請求項１〜１０のいずれかに記載の自己集合型粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、両親媒性ポリマーを含む自己集合型粒子、その調製方法ならびにその治療的および／または診断的使用に関する。また、本発明は、両親媒性ポリマーおよびその調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
標的特異的高分子媒体をベースにした薬物送達系および診断システムは、近年、重要になってきている。
【０００３】
標的化薬物送達、すなわち、特定の組織または罹病細胞への治療用薬物の送達は、いくつかの利点を伴う。標的化アプローチにより、全身毒性が低減または回避され得；また、薬物投与量も低減され得る。また、本来は有効な候補薬物の難溶性の問題も解決され得る。また、ポリマー送達系の使用は、これが長時間、保持および循環され得、したがって体内からの活性薬剤の典型的な高速クリアランスが回避されるという点でも好都合である。診断用薬剤の標的化送達に関して、特定の器官または組織型へのイメージング薬剤の改善された局在により、より確かな診断がもたらされ得る。
【０００４】
高分子薬物送達系の一例は、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）ベースのものである。ＰＥＧポリマーコンジュゲート型の小分子の医薬品または生物製剤が開発されており、実際、このようなコンジュゲートの多くは、改善された特性、例えば、高い薬物溶解性、半減期の長期化、低細胞毒性および免疫原性を有することがわかっている。ＰＥＧは、ある程度は依然として、ポリマーベースの生物医学的用途におけるゴールドスタンダードであるが、この型のポリマーに関して不都合な点および制限がある。例えば、過敏性およびＰＥＧ抗体の形成が、いくつかの場合で観察されている。特に、ＰＥＧは、修飾およびオルトゴナルな官能基化に利用可能な官能部が、やや限定的である。
【０００５】
また、他のポリマー系、例えば、ポリ−２−オキサゾリン（ＰＯＸとも略記される）ベースのものも研究されている。この型のポリマーは、生体適合性であり、さらに、免疫学的「ステルス」、すなわち、免疫防御機構による認識および高速クリアランスが回避されるような非特異的結合特性を有する傾向にあることが同様に一般的にわかっているため、生物医学的用途に有用である。
【０００６】
ポリ−２−オキサゾリンを構造要素として含む両親媒性ポリマー系が開発されている。
【０００７】
例えば、ＵＳ２００８／０３０５１４９には、ポリ−２−メチルオキサゾリンセグメントとポリジメチルシロキサンセグメント（すなわち、ポリ（２−メチルオキサゾリン）−ブロック−ポリ（ジメチルシロキサン）−ブロック−ポリ（２−メチルオキサゾリン）トリブロックポリマー（または、ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡと略記））を含む両親媒性トリブロックセグメント含有コポリマーの調製ならびに粘膜付着性外表面を有する小胞の作製におけるその使用が記載されている。このような小胞は、該小胞内に封入された活性薬剤の送達のために使用され得ると記載されている。しかしながら、かかる小胞は、標的化薬物送達のために容易に修飾することができない。小胞を調製するために使用される両親媒性ポリマーは、さらなる官能基化のための選択肢の点において限定的である。
【０００８】
Ｂｒｏｚ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００５（１０２）４７５−４８８）には、同様にＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡ両親媒性ポリマーベースのナノコンテナが記載されている。この場合、両親媒性ポリマーは末端がビオチンで官能基化されている。このビオチンリガンドは、要としてストレプトアビジンを有するナノコンテナを、受容体特異的リガンド、すなわち、ポリグアニル酸（ポリＧ）オリゴヌクレオチド（これもビオチン化されている）に連結させるための手段として使用される。ビオチン−ストレプトアビジンの結合は強いが不可逆的でなく；この種の連結もまた、インビボ使用に最も適したものではない。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、自己集合型粒子の調製における使用のための、現在使用されているポリマー系の任意の制限および不都合点が解決される新規なポリ−２−オキサゾリン両親媒性ポリマーおよびコポリマーを紹介することである。さらなる目的は、治療用薬剤または診断用薬剤の標的化送達のために使用され得る自己集合型粒子を開発することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００８／０３０５１４９号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｂｒｏｚ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００５（１０２）４７５−４８８）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
第１の態様において、本発明は、一般式（Ｉ）：
Ｂ−（Ｌ０−Ａ−Ｚ）ｎ
（式中、ｎは１または２であり；
Ｂは疎水性ポリシロキサンセグメントであり；
Ｌ０は二価のリンカーセグメントであり；
Ａは親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントであり；
Ｚは末端基であるか、またはリガンドにコンジュゲートさせたリンカーである）
の両親媒性ポリマーを含む自己集合型粒子に関する。
【００１３】
特に、本発明により、治療用薬剤または診断用薬剤の標的化送達に有用な、一般式（Ｉ）の両親媒性ポリマーを含む自己集合型粒子、例えばミセルを提供する。一態様において、自己集合型粒子は、特定の細胞および組織を標的化するのに有用な受容体特異的リガンドを含む一般式（Ｉ）の両親媒性ポリマーを含み得る。別の態様では、自己集合型粒子は、治療用薬剤または診断用薬剤にコンジュゲートさせた一般式（Ｉ）の両親媒性ポリマーを含む。また別の態様では、自己集合型粒子は、遺伝子送達および遺伝子療法における使用に適しており、アミンベース官能部を含む一般式（Ｉ）の両親媒性ポリマーを含む。
【００１４】
さらに、本発明は、式（Ｉ）の両親媒性ポリマーを、式（ＩＩ）：
Ｂ−（Ｌ０−Ｃ−Ｚ）ｎ
（式中、ｎは１または２であり；
Ｂは疎水性ポリシロキサンセグメントであり；
Ｌ０は二価のリンカーセグメントであり；
Ｃは親水性ポリ−２−オキサゾリンホモポリマーセグメントであり；
Ｚは末端基であるか、またはリガンドにコンジュゲートさせたリンカーである）
の両親媒性ポリマーとの組合せで含む自己集合型粒子に関する。また、一態様において、本発明の自己集合型粒子は、Ｚが末端基である式（ＩＩ）の少なくとも１種類の両親媒性ポリマーと、Ｚがリンカーにコンジュゲートさせたリガンドである式（ＩＩ）の少なくとも１種類の両親媒性ポリマーとを含み得る。
【００１５】
さらなる一態様において、本発明は、ミセルまたは小胞の形態の自己集合型粒子に関する。
またさらなる一態様において、本発明は、一般式（Ｉ）の両親媒性ポリマーおよびその調製方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
第１の態様において、本発明は、一般式（Ｉ）：
Ｂ−（Ｌ０−Ａ−Ｚ）ｎ
（式中、ｎは１または２であり；
Ｂは疎水性ポリシロキサンセグメントであり；
Ｌ０は二価のリンカーセグメントであり；
Ａは親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントであり；
Ｚは末端基であるか、またはリガンドにコンジュゲートさせたリンカーである）
の両親媒性ポリマーを含む自己集合型粒子に関する。
【００１７】
自己集合型粒子は、本明細書において理解する場合、１種類以上の両親媒性ポリマーを含み、該ポリマーとバルク水溶液間の引力と反発力の平衡の結果、形成される構造をいう。自己集合は、疎水性水界面効果を最小限にし、最適化するためのかかるポリマーの凝集をいう。この凝集の結果、および両親媒性成分同士間の分子相互作用（例えば、立体反発）のため、定義可能な構造の粒子が形成され得る。典型的には、最低限の濃度の両親媒性物質が、遊離の溶質が凝集して粒子に移行するのに必要とされる（多くの場合、最低凝集濃度と称される）。本明細書において理解する場合、粒子という用語は、両親媒性物質の凝集により形成される任意の種類の定義可能な構造、例えば限定されないが、ミセルおよび小胞ならびにその任意の形態学的バリエーションをいう。特に好ましいのはミセルの形態の自己集合型粒子である。
【００１８】
両親媒性ポリマーという用語は、本明細書で用いる場合、水または水性環境に対して親和性を有する構造要素とともに、非極性の疎水性または脂質性環境に対して親和性を有する構造要素も含むポリマーをいう。典型的には、両親媒性のポリマーまたは化合物は、少なくとも１つの親水性部分と少なくとも１つの疎水性（または親油性）部分を含む。疎水性セグメントは、水よりも非極性溶媒、例えば炭化水素に容易に溶解または湿潤される。他方で、親水性セグメントの特性は、極性環境に対してより高い親和性を有するものであり、一般的に、水によってより容易に湿潤または溶解される。
【００１９】
さらに、ポリマーは、２つ以上の反復単位またはモノマーの化学的結合体から形成された化合物である。本明細書で用いる場合、コポリマーは、２種類以上の異なるモノマーにより得られるポリマーをいい、一方、ホモポリマーは、１種類の反復モノマー単位からなるポリマーをいう。ブロックコポリマーまたはブロックポリマーという用語は、少なくとも２種類の異なるポリマーセグメントを含むポリマーであって、各ポリマーセグメントが典型的には２つ以上の同じ種類の隣接した単位またはモノマーを含むものをいう。
【００２０】
一実施形態において、一般式（Ｉ）の両親媒性ポリマーは１つの疎水性ポリシロキサンセグメントＢと１つの親水性コポリマーセグメントＡを含む；換言すると、ｎが整数１である。より好ましくは、式（Ｉ）の両親媒性ポリマーが疎水性ポリシロキサンセグメントＢと２つの親水性コポリマーＡセグメントを含むものとなるようにｎが整数２、すなわち、（Ｚ−Ａ−Ｌ０）−Ｂ−（Ｌ０−Ａ−Ｚ）である。
【００２１】
より具体的には、疎水性ポリシロキサンセグメントＢは、式（ＩＩＩ）
【化１】
2018506515.tif 000003
のポリシロキサンであり得、式中、ｊは５〜１０００の整数であり；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７のうちの８０〜１００％は、互いに独立してＣ１〜Ｃ１０アルキルであり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７のうちの０〜２０％は、互いに独立してＣ３〜Ｃ１２アルケニル、非置換のＣ１〜Ｃ４アルキル−もしくはＣ１〜Ｃ４アルコキシ置換フェニル、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）またはシアノ（Ｃ１〜Ｃ１２アルキル）である。
【００２２】
好ましくは、ｊは１０〜３００の整数である。特別な一実施形態では、ｊが１０〜１５０の整数である。
【００２３】
好ましくは、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７のうちの９０〜１００％は、独立して、６個までの炭素、特に４個までの炭素を有するアルキルから選択される。
【００２４】
別の実施形態では、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７のうちの０〜１０％が独立して、Ｃ３〜Ｃ８アルケニル、非置換またはメチル−、エチル−、メトキシル−もしくはエトキシル置換フェニル、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）またはシアノ（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）から選択される。
【００２５】
特に好ましい一実施形態では、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７がすべてメチルまたはすべてエチルである、すなわち、疎水性ポリシロキサンセグメントＢが、ポリジメチルシロキサンまたはポリジエチルシロキサンから選択され、ここで、該セグメントは好ましくは１０〜１５０個のモノマー単位を含む。
【００２６】
二価のリンカーセグメントＬ０は、疎水性ポリシロキサンセグメントＢを親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントＡに共有結合させるための手段をもたらす。
【００２７】
リンカーという用語は、ポリマー、リガンドまたは任意の他の化学的実体に関して本明細書で用いる場合、連結（“ｌｉｎｋａｇｅ”）、連結要素またはスペーサーという用語と互換的であり、少なくとも２つの相違する化学的部分間の共有結合をいう。リンカーは、前記の２つの部分間のスペーサーとしての機能を果たす中間部分であり得、また、該中間部分またはスペーサーは、共有結合をもたらす１つ以上の化学反応により形成される。かかる場合では、リンカーは二価であると説明され得る。他の場合では、リンカーは多価であり得る、すなわち、２つより多くの部分の連結手段としての機能を果たすものであり得る。
【００２８】
特に、Ｌ０は式Ｒ８（Ｑ）ｕで表されるものであり、式中、Ｒ８は、２０個までの炭素原子を含むアルキレンまたはアリーレン基であり、Ｑは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＲ９−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−、
【化２】
2018506515.tif 000004
、
2018506515.tif 000005
から選択され、ここで、Ｒ９は水素またはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、ｕは０、１または２である。
【００２９】
親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントＡは、少なくとも２種類の２−置換−２−オキサゾリンモノマーを含む、すなわち、該コポリマーは、少なくとも２種類の２−置換オキサゾリンモノマーの共重合により得られ得る。２−オキサゾリンモノマーは、脂肪族または芳香族部分で置換された２−オキサゾリンモノマー、例えば、２−アルキル−２−オキサゾリン、例えば、２−メチル−２−オキサゾリン、２−エチル−２−オキサゾリン、２−プロピル−２−オキサゾリンまたは２−アリール−２−オキサゾリン、例えば、２−フェニル−２−オキサゾリンから選択され得る。さらに好ましいのは親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントＡの調製に使用され得る２−オキサゾリン単位であり、該セグメントは、２位が、官能基、例えば、アミン、アジド、アルキン、アルデヒド、アセタール、アルコール、カルボン酸、活性化カルボン酸、オキシアミン、ケトン、ケタール、エステル、マレイミド、ビニルスルホン、オルトピリジルジスルフィドまたはクロロホルメート（これらはさらに化学修飾されて、さらなる化学的実体との結合のための手として使用されていてもよい）を含む部分で置換および官能基化されているものである。親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントＡは、このような型の２種類以上の２−オキサゾリンモノマーの共重合により得られ得るものであり得る。
【００３０】
特別な一実施形態では、セグメントＡは、２種類以上の２−置換−２−オキサゾリンモノマーを含み、該モノマーの少なくとも１種類が２−アルキル−２−オキサゾリン（２−メチル−２−オキサゾリンなど）または２−アリール−２−オキサゾリンから選択される。かかる場合では、セグメントＡは少なくとも２種類の２−置換−２−オキサゾリンモノマーの共重合により得られ得るものであり、該モノマーの少なくとも１種類が２−アルキル−２−オキサゾリンまたは２−アリール−２−オキサゾリンである。
【００３１】
一般に、アルキルという用語は、本明細書で用いる場合、主鎖に１〜４０個の炭素を含む直鎖炭化水素基および分枝鎖炭化水素基の両方を包含している。該炭化水素鎖は飽和であっても不飽和（すなわち、二重結合（アルケニル）および／または三重結合（アルキニル）を含むもの）であってもよい。また、該炭化水素鎖は環状、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルであってもよく、環状である部分を含んでもよい（また、多環式のアルキル基には、例えば、限定されないが、コレステリル、アダマンチル、ノルボルニル、二環［２．２．２］オクチルも包含される）。アルキル基の炭化水素鎖に、１個以上の原子、例えば、酸素、窒素、イオウまたはケイ素から選択されるヘテロ原子が介在していてもよい。各アルキル基は任意選択で、利用可能な炭素原子を介して置換基で置換されていてもよく、該置換基としては、例えば、アルキル、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、ハロアルキル（例えば、ＣＣｌ３またはＣＦ３）、アルコキシル、アリールオキシル、アルキルチオ、ヒドロキシル、メトキシ、カルボキシル、エポキシ、アルキルオキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アミノ、カルバモイル（例えば、ＮＨ２Ｃ（＝Ｏ）−またはＮＨＲＣ（＝Ｏ）−、ここで、Ｒはアルキルまたはアリールである）、尿素（−ＮＨＣＯＮＨ２）、チオ尿素（−ＮＨＳＯＮＨ２）、アルキル尿素、アリール、エーテル、エステル、チオエステル、ニトリル、ニトロ、アミド、カルボニル、オキソ、カルボキシレート、チオール、アルキルスルフィド、アリールスルフィド、スルホン、スルホキシド、トリアルキルシリル、ジアルキルアリールシリル、アルキルジアリールシリルおよびトリアリシリル（ｔｒｉａｒｙｓｉｌｙｌ）が挙げられる。単純なアルキルの例としては、限定されないが、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチルおよびノニルが挙げられる。
【００３２】
本明細書で用いる場合、アリールという用語は、環部分に６〜１２個の炭素を含む単環式および二環式の芳香族炭化水素基または５員および６員の芳香族の単環を含む芳香族基をいう。アリール基は、利用可能な炭素原子を介して、上記に規定した置換基で任意選択的に置換されていてもよい。芳香族環系は１〜４個のヘテロ原子、例えば、イオウ、酸素または窒素を含んでもよい。上記のアリールの例としては、限定されないが、フェニル、トリル、ヒドロキシフェニル、ベンジル、ナフチル、ビフェニル、ピロール、フラン、チオフェン、チアゾール、イソチアゾール（ｉｓｏｔｈｉａｏｚｏｌｅ）、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、トリアジン、トリアジン、テトラジン、ピリジン、ピラジン、ピリダジンおよびピリミジンが挙げられる。
【００３３】
さらなる好ましい一実施形態では、セグメントＡは、２−メチル−２−オキサゾリンと、アジド官能基化２−オキサゾリンモノマー、特に２−４−アジドアルキル−２−オキサゾリン、例えば２−（４−アジドブチル）−２−オキサゾリンとの共重合により得られ得る。
【００３４】
別の態様では、ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントＡは、ランダムポリ−２−オキサゾリンコポリマー、ジブロックポリ−２−オキサゾリンコポリマーおよびトリブロックポリ−２−オキサゾリンコポリマーから選択され得る。ランダムポリ−２−オキサゾリンコポリマーは、コポリマー内にランダムに分布している少なくとも２種類の異なる２−オキサゾリンモノマー単位を含み、一方、ブロックポリ−２−オキサゾリンコポリマーは、各々が独立して特定の２−オキサゾリンモノマーを含む少なくとも２種類の異なるポリマーセグメントを含む。２つのセグメントを含むブロックコポリマーが特に好ましく（すなわち、ジブロックポリ−２−オキサゾリンコポリマー）、３つのセグメントを含むブロックコポリマー（すなわち、トリブロックコポリマー）も特に好ましい。ランダムポリ−２−オキサゾリンコポリマーは、共重合プロセス中における少なくとも２種類のポリ−２−オキサゾリンモノマー単位の同時付加によって得られ得る。対照的に、ブロックコポリマーは、共重合プロセス中におけるポリ−２−オキサゾリンモノマーの逐次付加によって得られ得る。
【００３５】
セグメントＡの主鎖はポリ−２−オキサゾリンコポリマーである。しかしながら、一部の実施形態では、ポリ−２−オキサゾリンコポリマーをさらに、例えば、治療機能または診断機能を有する化学的部分にコンジュゲートさせる。特に、自己集合型粒子は、親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントＡに診断用薬剤、治療用薬剤またはリガンド、例えば、抗体、抗原結合断片（ｆａｂ）断片、シングルドメイン抗体、オリゴヌクレオチド、ポリペプチドもしくは炭水化物をコンジュゲートさせた式（Ｉ）の両親媒性ポリマーを含み得る。好ましいリガンドはビオチン、フォレートまたはペプチドである。
【００３６】
好ましい治療用薬剤は医薬活性成分または薬物、例えば、脂質修飾剤、免疫抑制薬、コルチコステロイド、抗炎症剤、抗血栓薬、鎮痛薬、抗菌剤または光線力学療法のための薬剤である。特に好ましいのは、化学療法剤および抗新生物剤、例えば、ドキソルビシンまたはタキソールである。
【００３７】
好ましい診断用薬剤としては、蛍光性色素、例えば、近赤外（ＮＩＲ）蛍光性色素、放射性標識、ＰＥＴイメージング剤、ＭＲＩイメージング剤、増感剤および光音響イメージング剤が挙げられる。診断用薬剤の例としては、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、フタロシアニン、ＢＯＤＩＰＹおよびその誘導体が挙げられる。また、かかる診断用薬剤は治療活性ももたらすもの；例えば、光線力学療法のための薬剤としての機能も果たすものであってもよい。
【００３８】
これとの関連において、コンジュゲートさせるという用語は、薬剤またはリガンドをポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントと共有結合によって連結させることをいう。コンジュゲーションは、好ましくは、生理学的条件下で切断または加水分解され得る共有結合を含む。生理学的条件は、所与の組織、器官または細胞環境の例えばｐＨ、酸化還元環境などに関する局所微小環境に応じて様々であり得るが、一般的に、生理学的条件は、おおむね生理的温度である約２０℃〜約４０℃；特に、３３〜３７℃の温度および約６〜８のｐＨをいうと理解されたい。また、共有結合の加水分解または切断は酵素によるものであってもよい。薬物送達の目的のためには、切断性または加水分解性の結合が、治療用薬剤とコポリマーセグメントとのコンジュゲーションのために特に好ましい。あるいはまた、コンジュゲーションは、非加水分解性結合または生理学的条件下で、もしくは任意の天然の酵素によって切断されにくい結合の形態であってもよい。
【００３９】
本明細書で用いる場合、用語「診断用薬剤」または「治療用薬剤」または「リガンド」は、１つだけ、すなわち、ポリマーにコンジュゲートされた１種類の化合物に限定されない。該ポリマーは反復単位を含むため、１つより多くの単位が診断用もしくは治療用薬剤またはリガンドにコンジュゲートされ得ることは理解される。また、ポリマーのすべての反復単位が診断用薬剤、治療用薬剤またはリガンドにコンジュゲートされ得るわけではないことも理解される。例えば、ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントの反復単位の少なくとも約１％または約１０％または少なくとも約６０％が診断用薬剤、治療用薬剤、リガンドまたはその組合せにコンジュゲートされ得る。一実施形態では、ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントＡが診断用薬剤と治療用薬剤の両方にコンジュゲートされ得る。別の実施形態では、ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントＡが１種類より多くの治療用薬剤にコンジュゲートされ得る。
【００４０】
さらなる特定の一実施形態では、自己集合型粒子が式（Ｉ）の両親媒性ポリマーを含み、ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントＡが、式（Ｉａ）：
【化３】
2018506515.tif 000006
のセグメントを含み、式中、Ｒ１およびＲ３は独立して、アミン、アジド、アルキン、アルデヒド、アセタール、アルコール、カルボン酸、活性化カルボン酸、オキシアミン、ケトン、ケタール、エステル、マレイミド、ビニルスルホン、オルトピリジルジスルフィドおよびクロロホルメートから選択される官能基にコンジュゲートさせたリンカー；ならびに治療薬、診断薬またはリガンドにコンジュゲートさせたリンカーから選択される。Ｒ２は独立して、Ｃ１〜Ｃ２０アルキルおよびアラルキル基から選択される。さらに、ｅ、ｆは、０〜５００から独立して選択される整数である、ただし、ｅおよびｆが同時に０として選択されることはないものとし；ｐは２〜５００から選択される整数であり；ａは、ｒａｎおよびブロックから選択され、ここで、ｒａｎは、ｅ、ｆおよびｐによって規定される単位がランダムに存在するランダムコポリマーを示し、一方、ブロックは、ｅ、ｆおよびｐによって規定される単位が連続するセグメントであるブロックコポリマーを示す。
【００４１】
官能基は、さらなる化学修飾または官能基化のための手として使用されるものであってもよい。他の場合では、これは、最終の両親媒性ポリマー生成物に既に構造的に関連しており、さらなる修飾を必要としない官能基であり得る。特に好ましい一実施形態では、Ｒ１およびＲ３は独立して、アミンまたはアジドにコンジュゲートさせたリンカー、好ましくはＣ１〜Ｃ３０アルキレンまたはアリーレンから選択される。
【００４２】
さらなる好ましい一実施形態では、自己集合型粒子が、Ｚが末端基である式（Ｉ）の両親媒性ポリマーを含む。Ｚは、ポリ−２−オキサゾリンポリマーセグメントＡの末端に直接連結され、ポリ−２−オキサゾリン共重合反応をクエンチまたは終了させるために使用される求核剤から直接誘導（または修飾）されたものであり得る。好ましくは、Ｚは式−Ｘ１−Ｑ０の末端基から選択され、式中、Ｘ１は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＮＲ１０−、
【化４】
2018506515.tif 000007
、
−Ｎ３、 
2018506515.tif 000008
および
【化５】
2018506515.tif 000009
から選択され、ここで、Ｑ０は存在しないか、またはＨ、非置換もしくは置換されたアルキル、アルケニル、アラルキル、アルキニル、ヘテロシクリルもしくはアリール、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒ１０、−（ＣＨ２）ｑ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒ１０、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｑ−Ｎ３、−（ＣＨ２）ｑ−Ｎ３および−ＳＲ１０から選択され、ここで、Ｒ１０は、非置換または置換されたアルキル、アルケニル、アラルキル基から選択され、ｑは整数１〜１０である。最も好ましくは、Ｚがヒドロキシル（−ＯＨ）である。
【００４３】
あるいはまた、自己集合型粒子は式（Ｉ）の両親媒性ポリマーを含み、ここでＺは、特定の細胞および組織を標的化するのに有用なリガンドにコンジュゲートさせたリンカーである。リガンドは好ましくは、自己集合型粒子が特定の型の受容体、細胞または組織を標的化すること、これらと相互作用すること、およびこれらに結合することを可能にする受容体特異的リガンド（例えば、腫瘍受容体特異的リガンド）である。リガンドは、小分子、抗体、抗原結合断片（ｆａｂ）、シングルドメイン抗体、オリゴヌクレオチド、ペプチドおよび炭水化物から選択され得る。特に好ましいリガンドは、フォレートおよびその誘導体、ビオチンならびにペプチドである。
【００４４】
リガンドの例としては、限定されないが、インテグリン発現細胞を標的化するためのＲＧＤ（アルギニン・グリシン・アスパラギン酸）およびＲＧＤ含有ペプチドならびにそのアナログ；ＥＧＦ−受容体発現細胞を標的化するＥＧＦおよびペプチド；ニューロピリン１を標的化するＰＤ１およびペプチド；コクサッキー−アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）発現細胞を標的化するためのアデノウイルス突起タンパク質およびペプチド；ＬＤＬ受容体標的化のためのＡｐｏＥおよびペプチド；露出コラーゲンを標的化するためのフォン・ヴィレブランド因子およびペプチド；腫瘍標的化のためのメラノトロピン（αＭＳＨ）ペプチド、トランスフェリン、ソマトスタチンペプチドおよびＦＧＦ２；内皮細胞を標的化するための血管内皮細胞増殖因子；細胞表面受容体を有する腫瘍細胞を標的化するためのフォレートおよびそのアナログ、炎症領域を標的化するためのシアリルルイスが挙げられる。
【００４５】
リンカーは、リガンドをポリ−２−オキサゾリンポリマーの末端と連結させる手段であること以外に、自己集合型粒子内におけるリガンドのポジショニングを容易にするため、ならびに組織および細胞との結合のためのリガンドの充分な提示を確実するためにも有用であり得る。リンカーは加水分解性共有結合を含んでもよく、あるいはまた加水分解性共有結合を含まないものであってもよい。
【００４６】
特に、Ｚは、式−Ｌ３−Ｒ１１で表されるリガンドにコンジュゲートさせたリンカーであり得、式中、Ｌ３は、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、
【化６】
2018506515.tif 000010
から選択され、ここで、Ｑ１は１個以上の置換基を表し；
Ｒ１１は、小分子、抗体、抗原結合断片（ｆａｂ）、シングルドメイン抗体、オリゴヌクレオチド、ポリペプチドおよび炭水化物から、特に、フォレート、ビオチンおよびペプチドから選択されるリガンドである。
【００４７】
特に好ましい実施形態における主構造成分として式（Ｉ）の両親媒性ポリマーを有する主として形成される自己集合型粒子は、Ｂがポリジメチルシロキサンセグメントであり、ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントＡが少なくとも１つのポリ−２−メチルオキサゾリンブロックを含み、Ｚが末端基である式（Ｉ）の両親媒性ポリマーを含む。
【００４８】
本発明の別の態様では、自己集合型粒子は、式（ＩＩ）：
Ｂ−（Ｌ０−Ｃ−Ｚ）ｎ
（式中、ｎは１または２であり；
Ｂは疎水性ポリシロキサンセグメントであり；
Ｌ０は二価のリンカーセグメントであり；
Ｃは親水性ポリ−２−オキサゾリンホモポリマーセグメントであり；
Ｚは、末端基またはリガンドにコンジュゲートさせたリンカーから選択される）
の両親媒性ポリマーを含む。
【００４９】
疎水性ポリシロキサンＢ、二価のリンカーセグメントＬ０およびＺである末端基またはリガンドにコンジュゲートさせたリンカーは、式（Ｉ）について上記に規定したとおりである。
【００５０】
親水性ポリ−２−オキサゾリンホモポリマーセグメントＣは、任意の２−置換−２−オキサゾリンモノマーの重合により得られ得るポリマーを含み；特に好ましいのは、２−アルキルまたは２−アリール置換２−オキサゾリンモノマーである。特に好ましい一実施形態では、式（ＩＩ）の両親媒性ポリマーはポリ−２−メチル−オキサゾリンセグメントを含む。さらに、ポリ−２−オキサゾリンホモポリマーセグメントＣは任意選択で、少なくとも５個から５０個までまたはそれ以上の２−オキサゾリンモノマー単位を含み得る。好ましくは、ポリ−２−オキサゾリンホモポリマーＣセグメントは５〜３０個のモノマー単位を含む。
【００５１】
式（ＩＩ）の両親媒性ポリマーは、式（ＩＩ−ａ）：
【化７】
2018506515.tif 000011
（式中、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキルまたはアラルキル基から選択され；ｐは２〜５００から選択される整数である）
のセグメントＣを含み得る。
【００５２】
式（ＩＩ−ａ）のセグメントＣを含む式（ＩＩ）の両親媒性ポリマーの特別な一実施形態では、Ｚが、特にＬ３がトリアゾールリンカーである上記の式−Ｌ３−Ｒ１１のものである。かかる場合では、トリアゾールリンカーは、リガンドまたはリガンド誘導体と式（ＩＩ）または（ＩＩａ）の両親媒性ポリマーの末端とのアジド−アルキン１，３−双極子付加環化によるコンジュゲーションの結果物である。
【００５３】
一実施形態では、自己集合型粒子が、式（ＩＶ）：
【化８】
2018506515.tif 000012
のポリマーを含み、式中、Ｌ４は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキレンもしくはアリーレン基またはヘテロ原子Ｏ、ＮもしくはＳのうちの１個以上が介在していてもよいＣ１〜Ｃ２０アルキレンもしくはアリーレン基（例えば、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）を含む連結基であり；ｐは好ましくは５〜１００、特に２０〜４０の範囲であり；Ｂ、Ｌ０、Ｒ２およびＲ１１は上記のとおりである。好ましくは、Ｒ１１は、小分子、抗体、抗原結合断片（ｆａｂ）、シングルドメイン抗体、オリゴヌクレオチド、炭水化物から、および特に、フォレート、ビオチンまたはペプチドから選択されるリガンドである。
【００５４】
本発明の別の特別な実施形態では、自己集合型粒子が、Ｚが末端基である式（ＩＩ）の少なくとも１種類の両親媒性ポリマーを含むミセルである。
【００５５】
また別の実施形態では、自己集合型粒子は好ましくはミセルであり、Ｚが末端基である式（ＩＩ）の少なくとも１種類の両親媒性ポリマーと、Ｚがリガンドにコンジュゲートさせたリンカーである式（ＩＩ）の少なくとも１種類の両親媒性ポリマーとを含む。
【００５６】
Ｚがリガンドにコンジュゲートさせたリンカーである式（ＩＩ）の少なくとも１種類の両親媒性ポリマー上にフィーチャリング（ｆｅａｔｕｒｅ）される該リガンドは、抗体、抗原結合断片（ｆａｂ）、シングルドメイン抗体、オリゴヌクレオチド、ポリペプチドおよび炭水化物から選択され得る。かかるリガンドは好ましくは受容体特異的リガンドであり、すなわち、かかるリガンドは、細胞または組織の受容体に直接、特異的におよび／または選択的に結合し得るもの、例えば、腫瘍受容体特異的リガンドである。中でも、好ましい受容体特異的リガンドはフォレート受容体リガンドである。
【００５７】
また、このような式（ＩＩ）の両親媒性ポリマーの受容体特異的リガンドは小分子であってもよい。小分子リガンドは天然のものであってもよく、半合成または完全合成の有機化合物であってもよい。中でも、好ましい小分子リガンドはフォレート受容体リガンド、例えば、フォレート（葉酸）もしくはその誘導体、またはメトトレキサートである。
【００５８】
好ましい一実施形態では、本発明は、Ｚが末端基である式（ＩＩ）の少なくとも１種類の両親媒性ポリマーを含む自己集合型粒子であって、ここで自己集合型粒子はミセルであり；Ｚが、フォレート受容体リガンド、好ましくはフォレートまたはその誘導体にコンジュゲートさせたリンカーである式（ＩＩ）の少なくとも１種類の両親媒性ポリマーを含む自己集合型粒子に関する。
【００５９】
別の実施形態では、ミセルがさらに、Ｚが治療用または診断用薬剤にコンジュゲートさせたリンカーである式（ＩＩ）の両親媒性ポリマーを含み得る。
【００６０】
本発明の別の実施形態では、自己集合型粒子が、Ｚが末端基である式（ＩＩ）の少なくとも１種類の両親媒性ポリマーと、Ｚがリガンドにコンジュゲートさせたリンカーである式（ＩＩ）の少なくとも１種類の両親媒性ポリマーとを含み、該リガンドが受容体特異的リガンド、例えば、フォレートまたはその誘導体、ペプチド、また、受容体特異的リガンド他の小分子であるか；または抗体、抗原結合断片（ｆａｂ）、シングルドメイン抗体、オリゴヌクレオチド、ポリペプチドおよび炭水化物から選択されるリガンドである。
【００６１】
上記の任意の実施形態において、Ｚが末端基である式（ＩＩ）の少なくとも１種類の両親媒性ポリマーと、Ｚがリガンドにコンジュゲートさせたリンカーである式（ＩＩ）の少なくとも１種類の両親媒性ポリマーとを含むこのようなミセルまたは自己集合型粒子は、疎水性セグメントＢがポリジメチルシロキサンであり、親水性セグメントＣがポリ−２−メチル−オキサゾリンである前記のポリマーを含むことがさらに好ましい。好ましくは、ポリ−２−オキサゾリンホモポリマーＣセグメントは５〜３０個のモノマー単位を含む。
【００６２】
一実施形態において、上記の一般式（Ｉ）の両親媒性ポリマーを含む自己集合型粒子はさらに、式（ＩＩ）の少なくとも１種類の両親媒性ポリマーを含む。このような、および他の実施形態において、式（ＩＩ）の両親媒性ポリマーを含む自己集合型粒子は、Ｂがポリジメチルシロキサンであり、Ｃがポリ−２−メチル−オキサゾリンであるようなポリマーを含むことが特に好ましい。
【００６３】
またさらなる一実施形態では、自己集合型粒子が独立して、治療用薬剤、診断用薬剤またはオリゴヌクレオチドを含む。換言すると、自己集合型粒子には治療用薬剤、診断用薬剤、オリゴヌクレオチドまたはその組合せ（これらは、物理的に独立している、すなわち、自己集合型粒子自体に共有結合されていない）が組み込まれているか、または負荷されている。
【００６４】
本発明の自己集合型粒子を形成するために式（Ｉ）と式（ＩＩ）の両親媒性ポリマーの種々の組合せが使用され得ることは本発明の範囲内である。特に好ましいのは、両親媒性ポリマーの以下の組合せにより調製される自己集合型粒子である：
【００６５】
（Ａ１）Ｚが末端基である式（Ｉ）の両親媒性ポリマーと同様にＺが末端基である式（ＩＩ）の両親媒性ポリマーとの組合せ。式（Ｉ）ポリマーの重量パーセンテージは約１％〜約９９％の範囲であり得る。
【００６６】
（Ｂ１）Ｚがリガンドにコンジュゲートさせたリンカーである式（Ｉ）または式（ＩＩ）のいずれかの両親媒性ポリマーをさらに含む上記の両親媒性ポリマー（Ａ１）の組合せ。リガンドがコンジュゲートされたこのさらなる両親媒性ポリマーの重量パーセンテージは好ましくは、両親媒性ポリマーの総重量に対して約１％〜２０％である。
【００６７】
（Ｃ１）得られる自己集合型粒子が、いずれの両親媒性ポリマーにも共有結合されていない治療用薬剤および／または診断用薬剤を含む上記の両親媒性ポリマー（Ａ１）の組合せ。自己集合型粒子組成物の総重量に対する治療用薬剤の重量パーセンテージは好ましくは約１〜５０％である。自己集合型粒子組成物の総重量に対する診断用薬剤の重量パーセンテージは好ましくは約１〜１０％である。
【００６８】
（Ｄ１）得られる自己集合型粒子がさらに、いずれの両親媒性ポリマーにも共有結合されていない治療用薬剤および／または診断用薬剤を含む上記の組合せＢ１。両親媒性ポリマーの総重量に対するリガンドがコンジュゲートされた両親媒性ポリマーの重量パーセンテージは好ましくは約１％〜２０％である。自己集合型粒子組成物の総重量に対する治療用薬剤の重量パーセンテージは好ましくは約１〜５０％である。自己集合型粒子組成物の総重量に対する診断用薬剤の重量パーセンテージは好ましくは約１〜１０％である。
【００６９】
上記のすべての実施形態に記載の自己集合型粒子は、好ましくはミセルまたは小胞から選択される。特に好ましいのはミセルである。小胞と比べて、ミセルの方が容易に調製され得、また、薬物封入後、特に、疎水性および／または低水溶性もしくは難水溶性の治療用薬剤の封入において安定であることがわかっている。
【００７０】
ミセルは、疎水性内部と親水性外部を含む自己集合型粒子であることは理解され得る。逆ミセル、すなわち、親水性内部と疎水性外部のものは疎水性溶媒中で形成され得る。バルク溶媒としての水中で所与の濃度（すなわち、臨界ミセル濃度またはＣＭＣ）で、本発明の両親媒性ポリマーは凝集および自己集合し始め、規定のミセル構造を形成する。このプロセスは可逆的であり；この濃度より下では、両親媒性ポリマーは大部分が非会合状態となる。種々の形状および幾何的配列が実現可能であり得る（例えば、層状、柱状）が、本発明のミセルは好ましくは、回転楕円体または長円体である。
【００７１】
小胞は、本明細書において理解する場合、二重層膜閉鎖構造と水性封入コンパートメントを含む自己集合型粒子である。小胞の外側の溶媒対向表面と小胞の内側コンパートメント対向表面は、通常、両親媒性ポリマーの親水性セグメントをフィーチャリングする。小胞は単層であってもよい、すなわち、１つの二重層を含んでもよく、多層であってもよい、すなわち、１つより多くの二重層膜を含んでもよい。
【００７２】
記載のように、本発明のミセルおよび小胞は好ましくは、形状が実質的に回転楕円体である。かかるミセルの平均直径は一般的に約２０ｎｍ〜約１５０ｎｍの範囲である。両親媒性ポリマーで形成された小胞の平均直径は一般的に４０ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲である。ミセルのサイズ、形状および幾何構造は当該技術分野で知られた通常の特性評価法、例えば、ＤＬＳまたはＴＥＭ解析によって調べられ得る。
【００７３】
また、ミセルおよび小胞は、当該技術分野で一般的に知られた方法、例えば、膜水和またはナノ沈殿（これらは以下に実施例のセクションでさらに詳細に記載している）などの方法によっても調製され得る。さらなる一実施形態では、自己集合型粒子は、凍結乾燥またはコロイド分散液から固形粒子を調製するための当該技術分野で一般的に知られた他の方法によって固形粒子またはナノ粒子に変換される。
【００７４】
別の態様では、本発明は、式（Ｉ）の両親媒性ポリマーおよびその調製方法、すなわち、一般式（Ｉ）
Ｂ−（Ｌ０−Ａ−Ｚ）ｎ
の両親媒性ポリマーであって、式中、ｎが１または２であり、Ｂが疎水性ポリシロキサンセグメントであり；Ｌ０、ＺおよびＡが以下のとおりであるものに関する：
【００７５】
二価のリンカーセグメントＬ０は式：Ｒ８（Ｑ）ｕで表され、式中、Ｒ８は、１〜２０個の炭素原子を含むアルキレンまたはアリーレン基およびヘテロ原子Ｏ、Ｎ、Ｓのうちの１個以上が介在している１〜２０個の炭素原子を含むアルキレンまたはアリーレン基から選択され；Ｑは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＲ９−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−、
【化９】
2018506515.tif 000013
から選択され、ここで、Ｒ９は水素またはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、ｕは０、１または２である。
【００７６】
Ｚは式−Ｘ１−Ｑ０の末端基であり、式中、Ｘ１は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＮＲ１０−、
【化１０】
2018506515.tif 000014
、−Ｎ３、
【化１１】
2018506515.tif 000015
から選択され；
Ｑ０は存在しないか、またはＨ、非置換もしくは置換されたアルキル、アルケニル、アラルキル、アルキニル、ヘテロシクリルもしくはアリール、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒ１０、−（ＣＨ２）ｑ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒ１０、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｑ−Ｎ３、−（ＣＨ２）ｑ−Ｎ３もしくは−ＳＲ１０から選択され、ここで、Ｒ１０は、非置換または置換されたアルキル、アルケニル、アラルキル基から選択され、ｑは整数１〜１０である。
【００７７】
あるいはまた、Ｚが、式−Ｌ３−Ｒ１１のリガンドにコンジュゲートさせたリンカーであり、式中、Ｌ３は、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、
【化１２】
2018506515.tif 000016
2018506515.tif 000017
から選択され、ここで、Ｑ１は１個以上の置換基を表し；Ｒ１１は、小分子、抗体、抗原結合断片（ｆａｂ）、シングルドメイン抗体、オリゴヌクレオチド、炭水化物から、特に、フォレート、ビオチンまたはペプチドから選択されるリガンドである。
【００７８】
親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントＡは式（Ｉ−ａ）：
【化１３】
2018506515.tif 000018
のものであり、式中、Ｒ１、Ｒ３は独立して、治療薬、診断薬またはリガンドにコンジュゲートさせたリンカー；およびアミン、アジド、アルキン、アルデヒド、アセタール、アルコール、カルボン酸、活性化カルボン酸、オキシアミン、ケトン、ケタール、エステル、マレイミド、ビニルスルホン、オルトピリジルジスルフィドまたはクロロホルメートから選択される官能基を含むリンカーから選択され；
Ｒ２は独立して、Ｃ１〜Ｃ２０アルキルまたはアラルキル基から選択され；
ｅ、ｆは、０〜５００から独立して選択される整数である、ただし、ｅおよびｆが同時に０として選択されることはないものとし；
ｐは２〜５００から選択される整数であり；
ａは、整数ｅ、ｆおよびｐによって規定される単位がランダムに存在するランダムコポリマーを示すｒａｎから、または整数ｅ、ｆおよびｐによって規定される単位が連続するセグメントであるブロックコポリマーを示すブロックから選択される。
【００７９】
かかる両親媒性ポリマーの疎水性ポリシロキサンＢは好ましくは、式（ＩＩＩ）について上記のポリシロキサンまたは関連化合物である。
【００８０】
基Ｒ１およびＲ３に関して、これらは好ましくは、治療用薬剤、診断用薬剤またはリガンドにコンジュゲートさせたリンカーを含む。一実施形態では、リンカーは、加水分解性である共有結合、すなわち、加水分解により、好ましくは生理学的条件下で切断され得る共有結合を含む。別の実施形態では、リンカーは、非加水分解性共有結合のみを含む。あるいはまた、Ｒ１およびＲ３は、さらに化学修飾され得（すなわち、求核剤または求電子剤との一般的な反応条件下で）、別の化学的実体、例えば、治療用もしくは診断用薬剤またはリガンドとの結合または連結を可能にする官能基を含むリンカーであり得る。好ましい実施形態では、Ｒ１およびＲ３部分が、アミン（これは第２級もしくは第３級もしくは第４級）およびアジドから選択される官能基を含む。
【００８１】
Ｒ２は、他方において、好ましくは化学的に不活性な基である、すなわち、これは例えば、Ｒ１またはＲ３の化学修飾中に容易に化学反応を受けない、また、Ｒ１またはＲ３の潜在的に反応性の官能基（あれば）との化学反応を受けないものである。Ｒ２は好ましくはＣ１〜Ｃ２０アルキルまたはアラルキル基であり；特に、Ｒ２はＣ１〜Ｃ１０アルキル、例えば、メチルまたはエチルであり得る。一実施形態では、上記の式（Ｉ）の両親媒性ポリマーが、式（Ｉ−ｂ）：
【化１４】
2018506515.tif 000019
のポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントＡを含み、
式中、
Ｌ５、Ｌ６およびＬ７は独立して、Ｃ１〜Ｃ２０アルキレン、Ｃ４〜Ｃ１２アリーレンおよびヘテロ原子Ｏ、Ｎ、Ｓのうちの１個以上が介在しているＣ１〜Ｃ２０アルキレンまたはＣ４〜Ｃ１２アリーレンから選択され；
Ｒ１２は、−Ｈ（Ｈ）、−（Ｈ）Ｒ１３、−（Ｒ１３）２または−（Ｒ１３）２Ｒ１４Ｘから選択され、ここで、Ｒ１３、Ｒ１４は独立して、置換または非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキルおよび置換または非置換のアラルキルから選択され、Ｘは負の対イオンである。
【００８２】
この特別な実施形態では、両親媒性ポリマーが、−ＯＨ、−ＮＨ２、
【化１５】
2018506515.tif 000020
−ＯＲ１５、−ＮＲ１５Ｒ１６および−ＳＲ１５から選択される末端基Ｚもまた含み、ここで、Ｒ１５およびＲ１６は独立して、非置換または置換されたアルキル、アルケニルおよびアラルキルから選択される。
【００８３】
好ましくは、Ｌ６およびＬ７は独立して、Ｃ１〜Ｃ２０アルキルから、特にＣ３〜Ｃ１０アルキルから選択される。
【００８４】
さらなる一実施形態では、ｆが０であり、そのため、Ａが、式（Ｉ−ｃ）：
【化１６】
2018506515.tif 000021
の親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントである。
【００８５】
この場合、ポリ−２−オキサゾリンコポリマーは２種類の２−オキサゾリンモノマーから誘導される。
【００８６】
好ましくは、式（Ｉ−ｂ）または式（Ｉ−ｃ）のＲ２はＣ１〜Ｃ２０アルキルまたはアラルキル基であり；特に、Ｒ２置換基はＣ１〜Ｃ１０アルキル、例えば、メチルまたはエチルであり得る。同様に好ましいのは、Ｌ５がＣ１〜Ｃ１０アルキレン、特にメチレンであり、Ｒ１２が−Ｈ（Ｈ）、−（Ｈ）Ｒ１３、−（Ｒ１３）２または−（Ｒ１３）２Ｒ１４Ｘであり、ここで、Ｒ１３、Ｒ１４が独立して非置換のＣ１〜Ｃ５アルキルから選択される；特にメチルである実施形態である。
【００８７】
式（Ｉ−ａ）、（Ｉ−ｂ）または（Ｉ−ｃ）の親水性セグメントを含む両親媒性ポリマーについてさらに好ましいものとしては、ｅが０として選択され、ｆが１〜２０の範囲から選択される実施形態；またはｆが０として選択され、ｅが１〜２０の範囲から選択される実施形態が挙げられる。
【００８８】
式（Ｉ−ｂ）または式（Ｉ−ｃ）のポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントＡを含む両親媒性ポリマーならびに該ポリマーを含む自己集合型粒子および該ポリマーから調製される自己集合型粒子は、特に、遺伝子送達および遺伝子療法に有用であることがわかっている。またさらなる一実施形態では、かかる両親媒性ポリマーを含む自己集合型粒子はさらに、遺伝子または遺伝子断片または誘導体（例えば、ＤＮＡ、プラスミド、ｓｉＲＮＡなど）を含む。かかる両親媒性ポリマー内のペンダントアミノ官能基は、通常の生理学的条件下では正電荷を有する状態になり得、これは、遺伝物質の組込みに有用である。
【００８９】
また別の実施形態では、上記の式（Ｉ）の両親媒性ポリマーは、式（Ｉ−ｄ）：
【化１７】
2018506515.tif 000022
の親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントＡを含み、
式中、
Ｒ１８およびＲ１９は独立して、各モノマー単位について、診断用薬剤、治療用薬剤、リガンド、ならびに好ましくは水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキレンおよびＣ１〜Ｃ２０アリーレンから選択される置換基から選択される；ただし、少なくとも１つのモノマー単位ではＲ１８および／またはＲ１９が診断用薬剤、治療用薬剤またはリガンドであるものとし；
Ｌ６およびＬ７は独立して、Ｃ１〜Ｃ２０アルキレン、Ｃ４〜Ｃ１２アリーレンおよびヘテロ原子Ｏ、Ｎ、Ｓのうちの１個以上が介在しているＣ１〜Ｃ２０アルキレンまたはＣ４〜Ｃ１２アリーレンから選択され；
Ｌ８は式−Ｒ２０（Ｙ）ｓの二価のリンカーであり、ここで、Ｒ２０はＣ１〜Ｃ２０アルキレンもしくはアリーレンまたはヘテロ原子Ｏ、Ｎ、Ｓのうちの１個以上が介在しているＣ１〜Ｃ２０アルキレンもしくはアリーレン基であり；Ｙは−Ｓ−Ｓ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−、−ＮＨ−および−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｎ＝であり、ｓは０、１または２であり；
ｔは、０または１の整数から選択され；
Ｚは、−ＯＨ、−ＮＨ２、
【化１８】
2018506515.tif 000023
2018506515.tif 000024
−ＯＲ１６、−ＮＲ１６Ｒ１７、−ＳＲ１６から選択される末端基であり、ここで、Ｒ１６およびＲ１７は独立して、非置換または置換されたアルキル、アルケニルまたはアラルキルから選択される。
【００９０】
各モノマー単位についてＲ１８およびＲ１９が独立して選択されるという言い回しはまた、診断用薬剤、治療用薬剤、リガンドまたは置換基のＲ１８およびＲ１９部分の各々が独立して選択されることも示していることを理解されたい。モノマー単位のＲ１８およびＲ１９部分はリガンド、診断用薬剤または治療用薬剤以外の置換基であり、特に好ましい置換基は水素（Ｈ）、Ｃ１〜Ｃ２０アルキレンまたはＣ１〜Ｃ２０アリーレンである。
【００９１】
しかしながら、好ましい一実施形態では、整数ｅおよび／またはｆによって規定されるモノマー単位のすべてが、１種類以上の診断用薬剤、治療用薬剤、リガンドまたはその組合せを含み得る。式（Ｉ−ｄ）のさらなる一実施形態では、ｆが０であり、そのため、Ａが、式（Ｉ−ｅ）：
【化１９】
2018506515.tif 000025
の親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントであり、式中、Ｒ１８は、各モノマー単位について、治療用薬剤もしくは診断用薬剤または治療用薬剤もしくは診断用薬剤以外の置換基から独立して選択される、ただし、少なくとも１つのモノマー単位ではＲ１８が診断用薬剤、治療用薬剤またはリガンドであるものとする。置換基は好ましくは、水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキレンおよびＣ１〜Ｃ２０アリーレンから選択される。治療用薬剤は好ましくは、化学療法剤および抗新生物剤、例えば、ドキソルビシンまたはタキソールから選択される。診断用薬剤は好ましくは、蛍光性色素、放射性標識、ＰＥＴイメージング剤、ＭＲＩイメージング剤および増感剤から選択される。一実施形態では、診断用薬剤が光音響イメージング剤から選択される。
【００９２】
一般に、治療用薬剤、例えば薬物と本発明の両親媒性ポリマーとの共有結合またはコンジュゲーションは、ポリマー部分上の活性な化学基と治療用薬剤上の相補的な化学官能基との反応によって行なわれる。選択肢の１つでは、共有結合はリンカー部分（すなわち、Ｌ８）において行なわれる。好ましくは、Ｌ８は、加水分解性結合（これは、多くの場合、インビボ薬物放出に有用である）を含む。好ましい加水分解性結合としては、エステル結合、カルバメート結合、アミド結合、ウレア結合およびチオウレア結合が挙げられる。
【００９３】
式（Ｉ−ｄ）のまたさらなる一実施形態では、ｅが０であり、そのため、Ａが、式（Ｉ−ｆ）：
【化２０】
2018506515.tif 000026
の親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントであり、式中、Ｒ１９は、各モノマー単位について、治療用薬剤、診断用薬剤または好ましくは水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキレンおよびＣ１〜Ｃ２０アリーレンから選択される置換基から独立して選択される、ただし、少なくとも１つのモノマー単位ではＲ１９が診断用薬剤、治療用薬剤またはリガンドであるものとする。治療用薬剤は好ましくは、化学療法剤または抗新生物剤、例えばドキソルビシンまたはタキソールから選択される。診断用薬剤は好ましくは、蛍光性色素、放射性標識、ＰＥＴイメージング剤、ＭＲＩイメージング剤および増感剤から選択される。一実施形態では、診断用薬剤が光音響イメージング剤から選択される。
【００９４】
式（Ｉ−ｄ）または（Ｉ−ｅ）のコポリマーセグメントは例えば、部分Ｒ１８が診断用薬剤であるモノマー単位、および部分Ｒ１８が治療用薬剤であるモノマー単位を含んでもよい。同様に、式（Ｉ−ｄ）または（Ｉ−ｆ）のコポリマーセグメントもまた、部分Ｒ１９が診断用薬剤であるモノマー単位、およびＲ１９が治療用薬剤であるモノマー単位を含んでもよい。式（Ｉ−ｄ）のコポリマーセグメントの他の実施形態では、整数ｅによって規定されるモノマー単位が、Ｒ１８が治療用薬剤であるモノマー単位を含んでもよく、整数ｆによって規定されるモノマー単位が、Ｒ１９が診断用薬剤もしくは治療用薬剤以外の置換基であるか、またはＲ１９が診断用薬剤であるモノマー単位を含んでもよい。別の例では、式（Ｉ−ｄ）または（Ｉ−ｅ）のコポリマーセグメントが、Ｒ１８が第１の治療用薬剤である整数ｅによって規定されるモノマー単位ならびにＲ１８が第２の治療用薬剤であるモノマー単位を含んでもよい。
【００９５】
好ましくは、式（Ｉ−ｄ）のＬ６および式（Ｉ−ｆ）のＬ７は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキルから、特にＣ３〜Ｃ１０アルキルから選択される。式（Ｉ）の両親媒性ポリマーは、２つの一般的な方法に従って調製され得る。第１の方法では、親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントＡと疎水性ポリシロキサンセグメントＢを独立して調製し、次いで、ポリマーのそれぞれの末端上の２つの活性な官能基間の反応によって一体に連結させる。この方法の一例では、親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーは末端にアジド官能基を含み、一方、ポリシロキサンセグメントＢは末端にアルキニル官能基を含み（またはその逆）；セグメントＡとＢを１，３−双極子付加環化反応（アジド−アルキン１，３−双極子もしくは［３＋２］付加環化または「クリック」反応としても知られている）によって連結させる。
【００９６】
式（Ｉ）の両親媒性ポリマーの第２の一般的な調製方法では、親水性セグメントＡまたは疎水性セグメントＢのいずれかを独立して調製し、第２のセグメントの重合において好適な前駆物質および開始剤として使用されるように修飾する。
【００９７】
本発明の一実施形態では、式（Ｉ）の両親媒性ポリマーを、該ポリマー鎖の一端または両端が開始剤基、例えば、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＭｓ（−Ｏ−ＳＯ２ＣＨ３，メシレート）、−ＯＴｓ（−Ｏ−ＳＯ２−Ｃ６Ｈ４−ｐ−ＣＨ３またはトシレート）、−ＯＴｆ（−Ｏ−ＳＯ２−ＣＦ３，トリフレート）で官能基化された疎水性セグメントＢから調製する。最も好ましい開始剤基はトリフレートである。次いで、ポリ−２−オキサゾリンポリマーセグメント（１つまたは複数）Ａを、この前駆物質（本明細書において、マクロ開始剤とも称する）からリビングカチオン重合プロセスによって調製する。かかるプロセスは、２−オキサゾリンモノマーをマクロ開始剤に添加することによる開始の工程と連鎖生長の工程および求核試薬（例えば、ヒドロキシド、ピペラジンまたはアジドなど）の添加などによる終結の工程を含む。触媒を、この重合プロセスを促進させるために添加してもよい。
【００９８】
これらの方法は、一般式（ＩＩ）の両親媒性ポリマーの合成にも適用され得る。
【００９９】
該重合プロセスは好ましくは、実質的に不活性な溶媒（例えば、ヘキサン、トルエン、ベンゼン、クロロホルム）または極性非プロトン性溶媒（例えば、酢酸エチル、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ジクロロメタン）またはその混合物中で行なわれる。該重合のために好ましい溶媒はクロロホルムおよびアセトニトリルである。
【０１００】
上記のように、ポリ−２−オキサゾリンポリマーセグメントを形成するための重合プロセスは、いくつかの様式で行なわれ得る。一実施形態では、２種類以上の適切な２−オキサゾリンモノマーの混合物を疎水性ポリシロキサンマクロ開始剤と反応させ、ランダムコポリマーセグメントを得る。別の実施形態では、ポリ−２−オキサゾリンセグメントＡは、適切なポリシロキサン開始剤を用いて第１の２−オキサゾリンモノマーとの重合を開始した後、第１のブロックの重合が終了したときに第２の２−オキサゾリンモノマーを付加することによってブロック状に合成され得る。第２の２−オキサゾリンモノマーの付加により、ポリマー鎖末端でのリビングカチオンによる重合が再開される。反応条件は各工程で異なり得る。どちらのプロセスでも、重合プロセスは求核試薬の付加によって終結される。
【０１０１】
好ましい一実施形態では、本発明により、ポリシロキサン開始剤と、少なくとも１種類の２−（アジドアルキル）−２−オキサゾリンモノマーおよび少なくとも１種類の２−アルキル−２−オキサゾリンまたは２−アラルキル−２−オキサゾリンモノマーとのカチオン開環重合の工程を含む、式（Ｉ）の両親媒性ポリマーの調製方法を提供する。特に、本発明の親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントＡを含む両親媒性ポリマーは、少なくとも２種類の２−置換−２−オキサゾリン（ｏｘａｚｌｉｎｅ）、好ましくは、２−（アジドアルキル）−２−オキサゾリンと２−アルキル−２−オキサゾリンまたは２−アラルキル−２−オキサゾリンモノマーとの、トリフレート官能基化疎水性ポリジメチルシロキサンセグメントＢをマクロ開始剤として用いた共重合によって調製され得る。
【０１０２】
このような重合プロセスにより得られる両親媒性ポリマーは、さらなる官能基化の点で非常に多用途である。これによりさらに、本発明の自己集合型粒子の調製のため、およびその特性の微調整のための容易なモジュール式アプローチがもたらされる。例えば、ポリ−２−オキサゾリンセグメントは、例えば、リンカーおよび／または活性薬剤、例えば、診断用薬剤、リガンドもしくは治療用薬剤の付加によって修飾され得る。
【０１０３】
上記の式（Ｉ）の両親媒性ポリマーの調製方法はさらに、アジド還元工程および／またはアルキニル化合物を用いた１，３双極子付加環化工程を含んでもよい。
【０１０４】
一般に、アジド官能基を含む両親媒性ポリマーが、アミノ官能基を有する両親媒性ポリマーの前駆物質として使用され得る。当該技術分野で知られた任意のアジド還元の反応または反応条件がこの目的に使用され得ることが想定されるが、穏やかで、両親媒性ポリマーの構造要素（特に、酸不安定性ポリシロキサンセグメント）と適合性である方法が好ましい。チオールは、本発明の両親媒性ポリマーのアジド官能基の還元に特に好適な試薬であることがわかっている。
【０１０５】
また、アジド官能部は、アルキニル官能基を含む実体を用いた１，３双極子付加環化のためのパートナーとしても使用され得る。得られたトリアゾール付加物は、両親媒性ポリマーを、例えば活性な医薬用薬剤またはリガンドと共有結合させるための選択的手段として使用され得る。このような反応のための反応条件は、典型的には穏やかであり、したがって、両親媒性ポリマーと感受性または反応性の官能部を含む化合物および分子との選択的カップリングに特に適している。一実施形態では、１，３−双極子付加環化反応は銅触媒型である。触媒は、Ｃｕ＋、Ｃｕ＋＋、例えば、ＣｕＩ、ＣｕＢｒ、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ、銅錯体から選択され得る。このような反応のための有用な添加剤としては、限定されないが、アスコルビン酸ナトリウム、トリエチルアミン、ＤＩＰＥＡ、ＴＢＴＡ（トリス［（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾル−４−イル）メチル］アミン）、ＰＭＥＤＴＡ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ペンタメチルジエチレントリアミン）が挙げられる。
【０１０６】
本発明者らは、上記のような官能部を含む２−オキサゾリンモノマーによってアジドを共重合プロセスに導入することにより、一般式（Ｉ），Ｂ−（Ｌ０−Ａ−Ｚ）ｎの両親媒性ポリマーのさらなる官能基化および多様化のための多用途の手がもたらされることを見出した。かかる両親媒性ポリマーのアジド官能基は、上記の還元および／または１，３−双極子付加環化反応に供され得る。例えば、以下の実施例８に例示するように、式（Ｉ−ｄ）のセグメントを含む両親媒性ポリマーを、まず１，３−双極子付加環化工程、次いでアジド還元工程を含む方法に供すると、トリアゾール官能基とアミノ官能基の両方を含む両親媒性ポリマー付加物が得られる。
【０１０７】
さらに、式（Ｉ−ｂ）または式（Ｉ−ｃ）のポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントＡを含む上記の一般式（Ｉ）の両親媒性ポリマーは、式（Ｉ−ｇ）：
【化２１】
2018506515.tif 000027
のポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントＡを含む前駆物質の両親媒性ポリマーから調製され得、
式中、
Ｌ６およびＬ７は独立して、Ｃ１〜Ｃ２０アルキレン、Ｃ４〜Ｃ１２アリーレンおよびヘテロ原子Ｏ、Ｎ、Ｓが介在しているＣ１〜Ｃ２０アルキレンまたはＣ４〜Ｃ１２アリーレンから選択され；
Ｒ２１は、Ｈ（Ｈ）、Ｈ（Ｒ２２）、（Ｒ２２）２および（Ｒ２２）２Ｒ２３Ｘから選択され、ここで、Ｒ２２およびＲ２３は独立して、置換または非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキルおよび置換または非置換のアラルキルから選択され、Ｘは負の対イオンである。
【０１０８】
特別な一実施形態では、両親媒性ポリマーが、式（Ｉ−ｈ）：
【化２２】
2018506515.tif 000028
の親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントを含むものとなるようにｆが０であり、Ｚが、−ＯＨ、−Ｎ３、−ＮＨ２、
【化２３】
2018506515.tif 000029
−ＯＲ１６、−ＮＲ１６Ｒ１７、−ＳＲ１６、
【化２４】
2018506515.tif 000030
から選択される末端基であり、ここで、Ｒ１６およびＲ１７は独立して、非置換または置換されたアルキル、アルケニルおよびアラルキルから選択される。
【０１０９】
この両親媒性ポリマーのアジド官能部は、例えば、式（Ｉ−ｅ）の親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントＡを含む両親媒性ポリマーを得るために、治療用薬剤を本発明の両親媒性ポリマーに共有結合させるための直接的手段としての機能を果たし得る。かかる場合では、含有アルキニル官能基を含むように修飾された治療用薬剤が直接、両親媒性ポリマーに１，３双極子付加環化クリック反応によってコンジュゲートされ得る。
【０１１０】
式（Ｉ−ｇ）のポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントＡを含む両親媒性ポリマーのまたさらなる実施形態では、ｅが０であり、Ｒ２１がＨ（Ｈ）であり、そのため、Ａが、式（Ｉ−ｉ）
【化２５】
2018506515.tif 000031
の親水性ポリ−２−オキサゾリンコポリマーセグメントであり、Ｚが、−ＯＨ、−Ｎ３、−ＮＨ２、
【化２６】
2018506515.tif 000032
−ＯＲ１６、−ＮＲ１６Ｒ１７、−ＳＲ１６、
【化２７】
2018506515.tif 000033
から選択される末端基であり、ここで、Ｒ１６およびＲ１７は独立して、非置換または置換されたアルキル、アルケニルおよびアラルキルから選択される。
【０１１１】
式（Ｉ−ｉ）のセグメントを含む両親媒性ポリマーの遊離のペンダント第１級アミンは、診断用薬剤または光線力学療法剤とのカップリング反応における求核剤として使用され得る。カップリングに適しており、化学修飾が必要とされない市販の薬剤を直接使用してもよく（例えば、フルオレセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソシアネート）、あるいはまた、診断薬または光線力学療法薬を、両親媒性ポリマーのペンダント第１級アミン部分とのカップリングのための手段がもたらされるように化学修飾してもよい。
【０１１２】
上記のように、本発明の両親媒性ポリマーは、基Ｚを該ポリマーの末端に含み得る。この末端基が−ＯＨ、−ＮＨ２または第２級アミンとして選択される場合、これはさらに、リガンドとの試薬補助型カップリング反応における求核パートナーとして使用され得る。あるいはまた、該末端基がアジドである場合、アルキニル官能基を含むように修飾されたリガンドが両親媒性ポリマーの末端に１，３双極子付加環化クリック反応によってコンジュゲートされ得る。
【０１１３】
さらなる実施形態、選択肢および／または好ましいものは、以下の実施例および図面によって実例を示す。
【実施例】
【０１１４】
両親媒性ポリマーの合成
実施例１
２−（４−アジドブチル）−オキサゾリン（１）の調製
【化２８】
2018506515.tif 000034
５−ブロモペンタン酸（５．７ｇ，３２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４０ｍｌ）溶液に固体のアジ化ナトリウム（３．０ｇ，４８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を７０℃まで加熱し、同温度で１２時間撹拌した。溶媒を高真空下で除去し、残渣を得た。この残渣をジクロロメタンで希釈し、０．１Ｎ  ＨＣｌで洗浄した。水相をジクロロメタンで２回抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮し、２．７５ｇの５−アジドペンタン酸を黄色油状物として得た。収率：６１％  1H NMR（400MHz，CDCl３）：δ 9．30（br，1H），3．29（t，2H，J=6．5Hz），2．37（t，2H，J=7．1Hz），1．66（m，4H）ppm．
【０１１５】
５−アジドペンタン酸（２．７５ｇ，１９．２ｍｍｏｌ）と微量の無水ＤＭＦをジクロロメタン（４０ｍｌ）中に含む溶液を０℃〜４℃まで氷バッチ内でアルゴン下にて冷却した。次いで、塩化オキサリル（４．８４ｇ，３８．４ｍｍｏｌ）の乾燥ジクロロメタン（１０ｍｌ）溶液を滴下した。反応混合物を同温度で１時間撹拌した。２−クロロエチル−アミン塩酸塩（６．６８ｇ，５７．６ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（１０ｍｌ）中に含む別の溶液を添加した。添加後、冷却バッチを取り除いた。混合物を分液漏斗に移し、それぞれ１０％ＨＣｌ水と水で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、エバポレーションによって濃縮し、１．９５ｇの５−アジド−Ｎ−（２−クロロエチル）ペンタン−アミドを黄色油状物として得た。収率：５０％  1H NMR（400MHz，CDCl３）δ 5．95（br，1H），3．60（m，4H），3．30（t，2H，J=6．5Hz），2．25（t，2H，J=7．4Hz），1．73（m，2H），1．65（m，2H）ppm．
【０１１６】
５−アジド−Ｎ−（２−クロロエチル）ペンタンアミド（１．９ｇ，９．３ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（２０ｍｌ）溶液に固体の炭酸カリウム（２．５６ｇ，１８．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を５５℃で３０時間撹拌した。溶媒をエバポレーションによって除去し、残渣を得た。この残渣を酢酸エチルに溶解させ、濾過し、固形物を酢酸エチルで数回洗浄した。合わせた有機相をエバポレートし、高真空下で一晩乾燥させ、１．５５ｇの化合物（１）をわずかに黄色の油状物として得た。収率：９９％．1H NMR（400MHz，CDCl３）δ  4．25（t，2H，J=9．4Hz），3．83（t，2H，J=9．4Hz），3．30（t，2H，J=6．4Hz），2．33（t，2H，J=7．2Hz），1．71（m，2H），1．66（m，2H）ppm．
【０１１７】
実施例２
【化２９】
2018506515.tif 000035
の調製
ビス（ヒドロキシアルキル）末端型ポリ（ジメチルシロキサン）（５．６ｇ，１ｍｍｏｌ）のトルエン（２５ｍＬ）溶液に２，６−ルチジン（０．３５ｍＬ，３ｍｍｏｌ）を添加した後、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（０．４ｍＬ，２．４ｍｍｏｌ）のヘキサン（２．５ｍＬ）溶液を氷浴中でアルゴン下にて滴下した。反応混合物を同温度で３時間撹拌した。次いで、溶媒を真空除去し、活性中間体を黄色油状物として得た。この油状物をクロロホルム（１５ｍＬ）とアセトニトリル（２０ｍＬ）の混合溶媒に溶解させた。第１のモノマーの２−（４−アジドブチル）−オキサゾール（１．０３ｇ，６．１ｍｍｏｌ）を室温で添加した。反応混合物を加熱し、６０℃で４３時間撹拌し、次いで、これを室温まで冷却し、第２のモノマーの２−メチル−オキサゾリン（１．７ｍＬ，２０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を再度６０℃まで加熱し、同じ温度で４８時間撹拌し、次いで、トリエチルアミンの水溶液により室温でクエンチした。溶媒をエバポレーションによって除去し、残渣を得た。この残渣を再生セルロース膜（カットオフは５０００ダルトン）での限外濾過により、エタノール／水（８０：２０，ｖ／ｖ，少なくとも４回。最初は、５ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３溶液を添加した）を溶離剤として用いて精製し、６．５ｇの化合物（２）をわずかに黄色の固形物として得た。収率：７８％，1H NMR（400MHz，CDCl３）δ 3．30-3．75（m，128H），2．30-2．50（m，12H），2．05-2．21（m，60H），1．50-1．75（m，28H），0．50（m，4H），0．02-0．09（m，444H）ppm．
【０１１８】
実施例３
【化３０】
2018506515.tif 000036
の調製
化合物（３）を、化合物（２）の合成と同様にして調製した。収率７５％．1H NMR（400MHz，CD３OD）δ 3．40-3．75（m，212H），3．37（m，24H），2．30-2．57（m，20H），2．05-2．19（m，120H），1．58-1．75（m，44H），0．56（m，4H），0．03-0．17（m，444H）ppm．
【０１１９】
実施例４
【化３１】
2018506515.tif 000037
の調製
化合物（２）（８４０ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）のメタノール（５ｍＬ）溶液にトリエチルアミン（０．５６ｍｇ，４．０ｍｍｏｌ）を室温で添加した後、１，３−プロパンジチオール（０．４０ｍＬ，４．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１２時間撹拌した。溶媒を真空除去し、残渣を得た。この残渣を再生セルロース膜（カットオフは５０００ダルトン）での限外濾過により、エタノール／水（８０：２０，ｖ／ｖ，少なくとも４回）を溶離剤として用いて精製し、５６０ｍｇの化合物（２）をわずかに黄色の固形物として得た。収率：６７％．1H NMR（400MHz，CD３OD）δ 3．38-3．79（m，116H），2．68（m，12H），2．30-2．53（m，12H），2．05-2．15（m，60H），1．45-1．70（m，28H），0．57（m，4H），0．03-0．17（m，444H）ppm．
【０１２０】
実施例５
【化３２】
2018506515.tif 000038
の調製
化合物（５）を化合物（３）から、化合物（４）の調製と同様にして調製した。収率：７０％．1H NMR（400MHz，CD３OD）δ 3．38-3．75（m，212H），2．68（m，20H），2．30-2．53（m，20H），2．05-2．15（m，120H），1．45-1．70（m，44H），0．57（m，4H），0．03-0．17（m，444H）ppm．
【０１２１】
実施例６
【化３３】
2018506515.tif 000039
の調製
化合物（２）（８４０ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（６ｍＬ，使用前にアルゴンで脱気）溶液に３−ジメチルアミノ−１−プロピン（８３ｍｇ，１．０ｍＬ）を室温で添加した。混合物を同じ温度で５分間撹拌した。ナトリウム−Ｌ−アスコルベート（１５ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）水溶液（０．５ｍＬ）を添加した後、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（７．５ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）水溶液（０．５ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。溶媒をエバポレーションによって除去し、残渣を得た。この残渣を再生セルロース膜（カットオフは５０００ダルトン）での限外濾過により、エタノール／水（８０：２０，ｖ／ｖ，少なくとも４回）を溶離剤として用いて精製し、７８０ｍｇの化合物（２）をわずかに黄色の固形物として得た。収率：８８％．1H NMR（400MHz，CD３OD）δ 7．93（m，6H），4．45（m，12H），3．38-3．75（m，128H），2．30-2．53（m，12H），2．27（s、36H），2．05-2．15（m，60H），1．95（m，12H），1．59（m，16H），0．59（m，4H），0．05-0．11（m，444H）ppm．
【０１２２】
実施例７
【化３４】
2018506515.tif 000040
の調製
化合物（６）（１００ｍｇ，０．０１１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２ｍＬ）溶液にヨウ化メチル（１４．２ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）をアルゴン下で室温にて添加した。混合物を室温で１２時間撹拌した。溶媒をエバポレーションによって除去し、残渣を得た。この残渣をヘキサンで２回洗浄した。次いで、これを高真空下で乾燥させ、１１０ｍｇの化合物（７）を黄色固形物として得た。収率１００％．1H NMR（400MHz，CD３OD）δ 8．30-8．50（m，6H），4．50-4．80（m，24H），3．38-3．75（m，116H），2．94-3．20（m，54H），2．40-2．60（s、12H），2．05-2．18（m，60H），2．00（m，12H），1．60（m，16H），0．56（m，4H），0．05-0．11（m，444H）ppm．
【０１２３】
実施例８
【化３５】
2018506515.tif 000041
の調製
ポリマー（３）（５５０ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４ｍＬ）（これは、事前にアルゴン下で２０分間脱気した）溶液に３−ジメチルアミノ−１−プロピン（１１．４ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）のｔ−ＢｕＯＨ（０．３ｍＬ）溶液を室温で添加した後、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム（５．４ｍｇ，０．０２７ｍｍｏｌ）水溶液（０．２５ｍＬ）とＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（３．４ｍｇ，０．０１４ｍｍｏｌ）水溶液（０．２５ｍＬ）を連続的に添加した。得られた混合物を室温で２４時間撹拌した。次いで、溶媒をエバポレーションによって除去し、残渣を得た。この残渣を再生セルロース膜（カットオフは５０００ダルトン）での限外濾過により、エタノール／水（８０：２０，ｖ／ｖ，少なくとも４回）を溶離剤として用いて精製し、５００ｍｇの中間体をわずかに黄色の固形物として得た。収率：８８％．
【０１２４】
この中間体をＭｅＯＨ（３ｍＬ）に室温で溶解させ、ＴＥＡ（０．２ｍＬ，１．４４ｍｍｏｌ）と１，３−プロパンジチオール（０．１５，１．４４ｍｍｏｌ）を連続的に添加した。得られた混合物を一晩撹拌した。溶媒をエバポレーションによって除去し、残渣を得た。この残渣を再生セルロース膜（カットオフは５０００ダルトン）での限外濾過により、エタノール／水（８０：２０，ｖ／ｖ，少なくとも４回）を溶離剤として用いて精製し、４４５ｍｇの化合物（８）をわずかに黄色の固形物として得た。収率：８９％．1H NMR（400MHz，CD３OD）δ 7．93（m，2H），4．43（m，4H），3．40-3．70（m，216H），2．60-2．80（m，16H），2．30-2．55（m，20H），2．25（s、12H），2．05-2．18（m，120H），1．90-2．00（m，4H），1．50-1．70（m，40H），0．59（m，4H），0．05-0．15（m，444H）ppm．
【０１２５】
実施例９
【化３６】
2018506515.tif 000042
の調製
ポリマー（３）（５５０ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（脱気，４ｍＬ）溶液にペント−４−イン酸メチル（８４ｍｇ，０．７５ｍｇ）のｔ−ＢｕＯＨ（０．５ｍＬ）溶液を添加した。反応混合物を室温で５分間撹拌した。Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム（７．５ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）水溶液（０．２５ｍＬ）と水性ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（３．７５ｍｇ，０．０１５ｍｍｏｌ）を連続的に添加した。得られた混合物を室温で１２時間撹拌した。溶媒をエバポレーションによって除去し、残渣を得た。この残渣を再生セルロース膜（カットオフは５０００ダルトン）での限外濾過により、エタノール／水（８０：２０，ｖ／ｖ，少なくとも４回）を溶離剤として用いて精製し、４３０ｍｇの中間体をわずかに黄色の固形物として得た。収率：７１％．1H NMR（400MHz，CD３OD）δ 7．78（m，10H），4．38（m，20H），3．64（s、30H），3．40-3．70（m，212H），2．97（m，20H），2．70（m，20H），2．30-2．55（m，20H），2．05-2．18（m，120H），1．91（m，20H），1．57（m，24H），0．54（m，4H），0．05-0．15（m，444H）ppm．
【０１２６】
中間体ポリマー（４３０ｍｇ，０．０３６ｍｍｏｌ）のエタノール（５ｍＬ）溶液に水性ＮＨ２ＮＨ２．Ｈ２Ｏ（５０〜６０％，１ｍＬ）を室温で添加した。反応混合物を加熱還流し、１２時間撹拌し続けた。その後、反応を室温まで冷却し（これは限外濾過により、エタノール／水（８０：２０，ｖ／ｖ，少なくとも４回）を溶離剤として用いて直接精製され得る）、３１０ｍｇのヒドラジン中間体をわずかに黄色の固形物として得た。収率７１％．1H NMR（400MHz，CD３OD）δ 7．75（m，10H），4．37（m，20H），3．40-3．70（m，212H），2．98（t，20H，J=7．60Hz），2．50（t，20H，J=7．60Hz），2．30-2．60（m，20H），2．05-2．18（m，120H），1．90（m，20H），1．54（m，24H），0．56（m，4H），0．05-0．14（m，444H）ppm．
【０１２７】
ヒドラジン中間体（５０ｍｇ）のメタノール（１．５ｍＬ）溶液に固体のドキソルビシン（１２ｍｇ）を室温でアルゴン下にて添加した。反応混合物を２分間撹拌した。次いで、触媒量のＴＦＡを添加した。反応混合物を室温で４８時間撹拌した。溶媒をエバポレーションによって除去し、残渣を得た。この残渣をエタノール（１０ｍＬ）に溶解させ、溶液を遠心分離した。上清みを収集し、ＰＰＴ（φ＝０．４５μｍ）フィルターに通して濾過し、未反応のドキソルビシンを除去した。合わせた有機溶媒を真空濃縮し、３０ｍｇのポリマー−ＤＯＸ化合物（９）を暗赤色固形物として得た。ＵＶスペクトル測定値およびＤＯＸのＵＶ吸収の標準曲線による計算によって規定されるドキソルビシンの負荷量（ＤＯＸの重量／ポリマーの重量）は２４％前後である。
【０１２８】
実施例１０
【化３７】
2018506515.tif 000043
の調製
ポリマー（４）（８２．０ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（２ｍＬ）溶液にＤＩＰＥＡ（０．０４ｍＬ，０．３ｍｍｏｌ）を添加した後、化合物（１０Ａ）（６０ｍｇ，０．０９ｍｍｏｌ）
【化３８】
2018506515.tif 000044
を添加した。反応混合物を８０℃まで加熱し、同温度で２時間撹拌した。次いで、溶媒をエバポレーションによって除去し、残渣を得た。この残渣を再生セルロース膜（カットオフは１００００ダルトン）での限外濾過により、エタノール／水（８０：２０，ｖ／ｖ，少なくとも４回）を溶離剤として用いて精製し、７２ｍｇの化合物（１０）を暗緑色固形物として得た。収率：６０％．化合物（１０）の最大蛍光発光波長を測定すると（励起波長は６３５ｎｍ）７０５ｎｍであった。
【０１２９】
実施例１１
【化３９】
2018506515.tif 000045
の調製
ビス（ヒドロキシアルキル）末端型のポリ（ジメチルシロキサン）（５．６ｇ，１ｍｍｏｌ）のトルエン（２５ｍＬ）溶液に２，６−ルチジン（０．３５ｍＬ，３ｍｍｏｌ）を添加した後、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（０．４ｍＬ，２．４ｍｍｏｌ）のヘキサン（２．５ｍＬ）溶液を氷浴中でアルゴン下にて滴下した。反応混合物を同温度で３時間撹拌した。次いで、溶媒を真空除去し、活性中間体を黄色油状物として得た。この油状物をクロロホルム（１５ｍＬ）とアセトニトリル（２０ｍＬ）の混合溶媒に溶解させた。モノマーの２−メチル−オキサゾリン（３．４ｍＬ，４０ｍｍｏｌ）を室温で添加した。反応混合物を再度６０℃まで加熱し、同（ｓｏｍｅ）温度で４８時間撹拌した。次いで、これをアジ化ナトリウム（２．６ｇ，４０ｍｍｏｌ）により室温でクエンチした。溶媒をエバポレーションによって除去し、残渣を得た。この残渣を再生セルロース膜（カットオフは５０００ダルトン）での限外濾過により、エタノール／水（８０：２０，ｖ／ｖ，少なくとも４回。最初は、５ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３溶液を添加した）を溶離剤として用いて精製し、６．５ｇの化合物（１１）をわずかに黄色の固形物として得た。収率：７２％，1H NMR（400MHz，CDCl３）δ 3．25-3．70（m，160H），2．05-2．21（m，120H）,1．56（m，4H），0．50（m，4H），-0．02-0．20（m，444H）ppm．
【０１３０】
実施例１２
【化４０】
2018506515.tif 000046
の調製
ポリマー（１１）（４４０ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液にＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ，１７．３ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）を添加した後、フォレート誘導体（１２ａ）（５９ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）
【化４１】
2018506515.tif 000047
とＣｕＢｒ（１４．３ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）を連続的に室温でアルゴン下にて添加した。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。次いで、これを空気に曝露し、溶液を中性アルミナのカラムに通した。ＤＭＦを真空除去し、残渣を得た。この残渣を再生セルロース膜（カットオフは５０００ダルトン）での限外濾過により、エタノール／水（８０：２０，ｖ／ｖ，少なくとも４回）を溶離剤として用いて精製し、２４５ｍｇの化合物（１２）をわずかに黄色の固形物として得た。収率：５０％．1H NMR（400MHz，CD３OD）δ 8．72（m，2H），7．90（m，2H），7．71（m，4H），6,74（m，4H），4．20-4．90（m，14H），3．35-3．70（m，160H），1．90-2．25（m，128H），1．61（m，4H），0．58（m，4H），0．05-0．14（m，444H）ppm．
【０１３１】
自己集合型粒子の調製
一般的な調製方法
本発明の両親媒性ポリマー、すなわち、式（Ｉ）〜（ＩＩ）は、自己集合型粒子、特に、ミセルおよび小胞の調製のための成分として使用される。一部の実施形態では、自己集合型粒子が独立した治療用もしくは診断用薬剤またはオリゴヌクレオチドを含む。自己集合型粒子は以下の方法によって得られ得る：
【０１３２】
Ａ．ナノ沈殿
１種類以上の両親媒性ポリマー成分を撹拌下で有機溶媒（例えば、エタノール）に溶解させる。次いで、水溶液（例えば、ＰＢＳ）をこの溶液に滴下する。２時間〜２４時間の連続撹拌後、この溶液を規定の孔径のフィルター（例えば、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ，０．２２μｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して濾過し、均一な自己集合型粒子集団を得る。この方法はミセルの調製に特に好ましい。有機溶媒をエバポレーションによって除去する。さらなる精製をサイズ排除カラム（例えば、セファロース２Ｂ）で行なう。
【０１３３】
自己集合型粒子溶液中の両親媒性ポリマー成分の最終濃度はＣＭＣ（臨界ミセル濃度）〜約５０ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【０１３４】
上記の方法に使用される有機溶媒は、限定されないが、水混和性有機溶媒、例えば、極性プロトン性溶媒、例えば、アルコール、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノールまたは極性非プロトン性溶媒、例えば、ＴＨＦ、ＤＭＦ、１，４−ジオキサン、ＤＭＳＯ、アセトン、アセトニトリル、ジメトキシエタンＤＭＥから選択され得る。上記の方法に使用される水溶液は、限定されないが、二回蒸留水；塩化ナトリウム溶液（例えば、９ｗｔ％）；生物学的バッファー、例えば、ＰＢＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー；および他の無機塩溶液、例えば、塩化アンモニウム溶液から選択され得る。
【０１３５】
Ｂ．膜再水和
１種類以上の両親媒性ポリマーを有機溶媒に溶解させる。この溶媒を高真空下で蒸発させ、得られたポリマー膜を水溶液中で再水和させ、次いで、ポリカーボネートフィルター（例えば、０．２ｍｍの孔径）から押出し、次いで、サイズ排除カラム（例えば、セファロース２Ｂ）で精製する。この方法は小胞の調製に特に好ましい。
【０１３６】
自己集合型粒子溶液中の両親媒性ポリマー成分の最終濃度はＣＭＣ（臨界ミセル濃度）〜約５０ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【０１３７】
この方法に使用される有機溶媒は、限定されないが、揮発性有機溶媒、例えば、ジクロロメタン、アセトン、クロロホルム、ＴＨＦ、エタノール、メタノールから選択され得る。この方法に使用される水溶液は、限定されないが、二回蒸留水；塩化ナトリウム溶液（例えば、９ｗｔ％）；生物学的バッファー、例えば、ＰＢＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー；および他の無機塩溶液、例えば、塩化アンモニウム溶液から選択され得る。
【０１３８】
方法ＡおよびＢはどちらにおいても、独立した治療用診断用の薬剤またはオリゴヌクレオチドが自己集合型粒子内に以下のようにして組み込まれ得る：有機溶媒に可溶性である薬剤（例えば、疎水性薬物、例えば、タキソール）を両親媒性ポリマーの溶解に使用したものと同じ溶媒に溶解させる。水溶性薬剤、例えば、オリゴヌクレオチドは水溶液中に予備溶解させる。
【０１３９】
Ｃ．固形物再水和（バルク膨潤法）
バルク粉末の形態の１種類以上の両親媒性ポリマーを直接、水溶液に添加する。混合物を、ポリマーの完全な水和が観察されるまで連続撹拌する。次いで、得られた混合物をポリカーボネートフィルター（例えば、０．２ｍｍの孔径フィルター）から押出し、次いで、サイズ排除カラム（例えば、セファロース２Ｂ）で精製する。
【０１４０】
本発明の自己集合型粒子を、当該技術分野で知られた方法によって特性評価する。動的光散乱（ＤＬＳ）測定および透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）の解析は、例えば、粒子サイズを測定するために使用され得る。粒子の平均直径はＤＬＳにより測定され得、さらにＴＥＭ測定によって確認され得る。ＤＬＳ測定は、自己集合型粒子試料に対して２５℃でＭａｌｅｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＮａｎｏＳ（ＺＥＮ  １６００）にて行なう。ＴＥＭは、２００ｋＶの加速電圧で動作させるＦＥＩ  ＣＭ  ２００顕微鏡を用いて取得する。ＴＥＭ解析のため、自己集合型粒子の試料をまず、蒸留水に溶解させ（水中１ｗｔ％）、次いで、カーボンで被覆したニトログリセリン膜で覆った銅グリッド上に置き、次いで染色剤を添加する（２％酢酸ウラニル）。
【０１４１】
実施例１３−両親媒性ポリマー（６）を含むミセル
このミセルを調製するため、５ｍｇの両親媒性ポリマー（６）を撹拌下で５０μＬのエタノールに溶解させる。この溶液に０．９５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を滴下する。２時間の連続撹拌後、この溶液を規定の孔径のフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ，０．２２μｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して濾過し、均一なミセル集団を得る。
【０１４２】
実施例１４−両親媒性ポリマー（６）と（１３）を含むミセル
【化４２】
2018506515.tif 000048
このミセルを調製するため、５ｍｇの両親媒性ポリマー（１３）と５ｍｇの両親媒性ポリマー（６）を撹拌下で５０μＬのエタノールに溶解させる。この溶液に０．９５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を滴下する。４時間の連続撹拌後、この溶液を規定の孔径のフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ，０．２２μｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して濾過し、均一なミセル集団を得る。
【０１４３】
実施例１５−両親媒性ポリマー（６）と（１３）を含む小胞
この小胞を調製するため、１０ｍｇのポリマー（６）と１０ｍｇのポリマー（１３）を１０ｍＬのクロロホルムに溶解させる。溶媒を高真空下で蒸発させて乾燥ポリマー膜を得、得られたポリマー膜を、２０ｍＬの１×ＰＢＳバッファー（ＰＨ＝７．４）中で１２時間、撹拌しながら再水和させ、次いで、ポリカーボネートフィルター（０．２ｍｍの孔径）から押出し、小胞を得る。
【０１４４】
実施例１６−両親媒性ポリマー（１３）と（１２）を含むミセル
このミセルを調製するため、５ｍｇの両親媒性ポリマー（１３）と０．５ｍｇの両親媒性ポリマー（１２）を撹拌下で５０μＬのエタノールに溶解させる。この溶液に０．９５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を滴下する。６時間の連続撹拌後、この溶液を規定の孔径のフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ，０．２２μｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して濾過し、均一なミセル集団を得る。
【０１４５】
実施例１７−両親媒性ポリマー（１３）と（１２）を含むパクリタキセル封入ミセル
このミセルを調製するため、５ｍｇの両親媒性ポリマー（１３）、０．５ｍｇの両親媒性ポリマー（１２）および１．５ｍｇのパクリタキセルを撹拌下で５０μＬのエタノールに溶解させる。０．９５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をこの溶液に滴下する。６時間の連続撹拌後、この溶液を規定の孔径のフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ，０．２２μｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して濾過し、均一なミセル集団を得る。このミセルをサイズ排除カラムでさらに精製し、未封入パクリタキセルを除去する（ＰＢＳバッファーを溶離剤として使用）。得られた溶液を凍結乾燥させ、固形ナノ粒子を得る。
【０１４６】
実施例１８−両親媒性ポリマー（９）と（１２）を含むミセル
このミセルを調製するため、５ｍｇのポリマー（９）（ドキソルビシンがコンジュゲートされている）、０．５ｍｇのポリマー（１２）を撹拌下で５０μＬのエタノールに溶解させる。０．９５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をこの溶液に滴下する。５時間の連続撹拌後、この溶液を規定の孔径のフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ，０．２２μｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して濾過し、均一なミセル集団を得る。
【０１４７】
実施例１９−両親媒性ポリマー（１４）と（１２）を含むドキソルビシン塩酸塩封入ミセル
【化４３】
2018506515.tif 000049
このミセルを調製するため、５ｍｇのポリマー（１４）、０．５ｍｇのポリマー（１２）および１．５ｍｇのドキソルビシン塩酸塩を撹拌下で５０μＬのエタノールに溶解させる。０．９５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をこの溶液に滴下する。６時間の連続撹拌後、この溶液を規定の孔径のフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ，０．２２μｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して濾過し、均一なミセル集団を得る。このミセルをサイズ排除カラムでさらに精製し、未封入ドキソルビシンを除去する（ＰＢＳバッファーを溶離剤として使用）。得られた溶液を次いで、凍結乾燥させ、固形ナノ粒子を得る。
【０１４８】
実施例２０−両親媒性ポリマー（１２）と（１３）を含むローダミンＢ誘導体封入ミセル
このミセルを調製するため、５ｍｇのポリマー（１３）、０．５ｍｇのポリマー（１２）および０．１ｍｇのローダミンＢ誘導体を撹拌下で５０μＬのエタノールに溶解させる。０．９５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をこの溶液に滴下する。６時間の連続撹拌後、この溶液を規定の孔径のフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ，０．２２μｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して濾過し、均一なミセル集団を得る。
【０１４９】
実施例２１−両親媒性ポリマー（４）と（１２）を含み、ｓｉＲＮＡが封入されたミセル
両親媒性ポリマー（４）と（１２）ベースのｓｉＲＮＡ負荷ミセルは水性自己集合によって調製される。ポリマーを各々、撹拌下で２００μｌのエタノールに溶解させ、２．５％（ｗ／ｖ）溶液を得る。次いで、この２つのポリマー溶液を、所望のＮ／Ｐ比（オリゴヌクレオチドのリン酸基のモルに対するポリマー（４）のアミン基のモルの比）が得られるとともに、両親媒性ポリマー混合物が０．５ｍｏｌ％含有量のポリマー（１２）を有するように合わせる。続いて、所望の量のこの混合物を、４０ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡを含む１００μｌの１０ｍＭ  ＰＢＳバッファーに添加する。得られた混合物を２分間ボルテックスした後、室温で１時間、穏やかに撹拌する。
【０１５０】
実施例２２−両親媒性ポリマー（５）と（１２）を含みｓｉＲＮＡが封入されたミセル，標的化遺伝子送達モデル
両親媒性コポリマー（５）と（１２）ベースのｓｉＲＮＡ負荷ミセルを、実施例２１に記載の方法と同様にして調製した。この２種類のポリマーをエタノールに溶解させ、４０ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡを含む１００μｌの１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と穏やかに混合し、所望のＮ／Ｐ比５を得る。得られた混合物を室温で１時間、さらにインキュベートした。
【０１５１】
ミセル負荷に使用したｓｉＲＮＡは、Ｃｙ３−蛍光標識された抗ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ、抗ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡおよびランダム配列のｓｉＲＮＡ（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）であった。ＧＦＰ標的化ｓｉＲＮＡ配列は５−ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＣＧＡ  ＣＵＵ  ＣＵＵ  ＣＡＡ  Ｇ−３’（センス）および５−ＣＧＵ  ＣＧＵ  ＧＣＵ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＧＵＵ  Ｃ−３’（アンチセンス）である。
【０１５２】
得られたミセル（「標的化ミセル」）のゼータ電位を、電気泳動移動度を測定することにより決定した。また、（非標識）ｓｉＲＮＡの添加前に形成されたミセルの粒子表面も測定するとわずかに正であり（＋４ｍＶ）、正電荷のほとんどが外側のＰＭＯＸＡ殻によって遮蔽されていることが示された。ｓｉＲＮＡを含むミセル（Ｎ／Ｐを５で調製）は、わずかに正の電荷（＋４ｍＶ）および小粒径（２１±３ｎｍの直径）を有するものであると測定された。ほぼ中性の表面電荷（−１０〜＋１０ｍＶのゼータ電位）を有するナノ粒子は一般的に、インビボでの免疫学的反応に影響を及ぼしにくい。長時間安定性を評価するため、このようなミセルをＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中で３７℃にて４日間保存し、サイズとゼータ電位を測定した。試験中、ミセルの平均直径に有意な変化は観察されなかった。
【０１５３】
Ｃｙ−３蛍光標識ｓｉＲＮＡ負荷標的化ミセル（両親媒性ポリマー（５）と（１２）を含むミセル）ならびに非標的化ミセル（両親媒性ポリマー（５）のみを含むミセル）の細胞内取込み効率を、癌性のフォレート受容体（ＦＲ）陽性（ＨｅＬａ）または正常なＦＲ陰性（ＨＥＫ２９３）細胞において試験した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現ＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内で、調製したミセルおよび陽性対照としてのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（商標）ＲＮＡｉＭａｘ（製造業者のプロトコルに従って調製）を用いてトランスフェクトした。ウェル内部で複合体を調製した後、細胞（１００００細胞／ウェル）と培地を添加した。２４時間後に細胞をＰＢＳで洗浄し、３７℃でさらに４８時間のインキュベーション後、新鮮増殖培地を添加した。標的遺伝子発現の下方調節の定量をウエスタンブロット解析によって解析した。
【０１５４】
ウエスタンブロット解析の結果により、２４時間のインキュベーション時間後、フォレート受容体標的化ミセルで処理したＨｅＬａ細胞内へのＣｙ３蛍光標識ｓｉＲＮＡの有意な細胞内取込みが示された。非標的化複合体で処理したＨｅＬａ細胞では、Ｃｙ３標識ｓｉＲＮＡの弱いシグナルが観察された（９２±４．２％まで抑制）。正常なＦＲ陰性ＨＥＫ２０３細胞では、２４時間のインキュベーション後であっても、Ｃｙ３標識抗ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡの有意な細胞内取込みは示されなかった。このような標的化ミセルではＧＦＰ発現が６９±５．５％まで抑制されることが測定された（すなわち、約３１％のノックダウン効率）。
【０１５５】
また、ミセルで処理したＨｅＬａ細胞のバイアビリティ評価も、種々の濃度において２４時間および４８時間の期間で調べた。細胞バイアビリティは、５０μｍの濃度のミセルとの４８時間のインキュベーション後、依然として９０％より上（未処理細胞の対照と比べて）、すなわち、細胞内取込み実験に使用したものより１０倍高いことがわかった。
【０１５６】
両親媒性ポリマー（５）にフィーチャリングされた正電荷を有する多数のアミノ基と、負電荷を有するヌクレオチド物質（すなわち、ｓｉＲＮＡ）との存在によってもたらされる相互作用が効率的な封入を可能にし、それにより前記の遺伝子物質が酵素による分解および他の生理学的プロセスから保護されると考えられる。したがって、上記のように正味中性の電荷、血清中での良好なコロイド安定性および低細胞毒性を有するこのようなミセルは、遺伝子送達のための担体としての使用に好適である。同時に、リガンド標識両親媒性ポリマーも含むこのようなミセルは、ｓｉＲＮＡを選択的送達することができ、それによりトランスフェクション効率が改善される。同様の効果が、上記の両親媒性ポリマー（６）、（７）および（８）から調製される自己集合型粒子でも期待され得る。
【０１５７】
実施例２３−マウスのヒト異種移植片腫瘍の標的化
７０ｗｔ％の式（１５）の両親媒性ポリマーと、腫瘍受容体特異的標的化リガンド、すなわちフォレートを末端の位置に含む２０ｗｔ％の式（１６）の両親媒性ポリマーと、ローダミンＢ色素を末端の位置に含む１０ｗｔ％の式（１７）の両親媒性ポリマーとを含む標的化ミセルをナノ沈殿法により、記載の一般的な方法および先の実施例、例えば実施例２０と同様にして調製した。対照として、９０ｗｔ％の（１５）と１０ｗｔ％の（１７）を含む非標的化ミセルも、かかる方法を用いて調製した。得られたミセルのサイズは、ＤＬＳによる測定時、直径がおよそ２０〜１２０ｎｍである。
【化４４】
2018506515.tif 000050
【０１５８】
ヒト腫瘍細胞が移植された実験用マウスの異種移植片がんモデル（ヒト結腸癌ＬＳ１７４マウス異種移植片）を、確立されたプロトコルに従って使用した。異種移植側腹部腫瘍を６〜８週齢のＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスにおいて誘導した。腫瘍細胞を収集し、ＰＢＳバッファー溶液中で洗浄した。２００万個の細胞を含有する１００μＬ容量をマウスの右側腹部に皮下注射した。腫瘤がいずれかの方向において０．５ｃｍの長さに達したら、２００μＬの上記のようにして調製したリガンド含有蛍光標識ミセル（５０ｍｇ／ｋｇ体重）を尾静脈内に注射した。また、対照として、選択したマウスに非フォレート標的化ミセルを注射した。マウスをＮｉｇｈＯＷＬによって１時間、２時間、４時間、８時間および２４時間の間隔でイメージングし（インビボイメージング）、次いで致死させた。また、器官も単離し、イメージングした。
【０１５９】
その結果、両親媒性ポリマー（１６）を含む標的化ミセルでは、強い取込みが腫瘍境界において観察された（図１，１Ａ）；対照的に、葉酸標的化両親媒性ポリマー成分なしで調製した対照ミセルでは弱い取込みしか観察されなかった（図１，１Ｂ）。また、蛍光画像のさらなる解析により、非標的化ミセルでは、蓄積が主に腫瘍の境界ゾーンで起こっていたが、標的化ミセルでは、腫瘍内部の深部の位置で向上した取込みが行なわれ得ることも明らかになった。
【図１Ａ】
2018506515.tif 000073
【図１Ｂ】
2018506515.tif 000074
【国際調査報告】
2018506515.tif 000075
2018506515.tif 000076
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