(57)【要約】本開示は、とりわけ、ポリカチオンに共有結合によって付着しているアシアロ糖タンパク質と、少なくとも部分的に精製され、ＡｓＧ−ポリカチオン分子に静電的に結合している機能的な哺乳動物ミトコンドリアとを含む組成物およびキット；ならびにそれらの調製方法および使用方法に関する。他の態様では、本開示は、肝疾患など、細胞のミトコンドリア機能の増大から利益を受けることができる疾患または状態を処置または防止する医薬組成物を作製する方法であって、細胞から機能的な哺乳動物ミトコンドリアを少なくとも部分的に精製するステップと；ＡｓＧを、高度に正に帯電したポリカチオンに共有結合によって付着させるステップと；ＡｓＧ／ポリカチオン分子をミトコンドリアと静電的に結合させるステップとを含む方法を提供する。
2018507865.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリカチオンに共有結合によって付着しているアシアロ糖タンパク質（ＡｓＧ）と；
少なくとも部分的に精製された機能的な哺乳動物ミトコンドリアと
を含む医薬組成物であって、
ポリカチオンに共有結合によって付着している該ＡｓＧが該ミトコンドリアに静電的に複合体化している、医薬組成物。
【請求項２】
前記ＡｓＧが、アシアロオロソムコイド（ＡｓＯＲ）を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリカチオンが、高度に正に帯電し、ポリリシン（ＰＬ）、ポリアルギニン、およびポリオルニチンからなるポリカチオンの群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリカチオンが、ポリリシン（ＰＬ）である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
エンドソーム溶解剤をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記エンドソーム溶解剤が、リステリオリシンである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記エンドソーム溶解剤が、エンドソーム溶解活性を有するリステリオリシンの断片、またはエンドソーム溶解活性を有するリステリオリシンペプチドである、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記エンドソーム溶解剤が、エンドソーム内に存在する条件下で切断可能な結合によりＡｓＧに共有結合によって付着している、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
エンドソーム内に存在する条件下で切断可能な前記結合が、ジスルフィド結合および酸不安定性結合である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記酸不安定性結合が、イミノ結合、アセタール結合、またはラクトン結合である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ミトコンドリアが、健常ドナーに由来する細胞から得られるか、または哺乳動物細胞もしくは組織から単離される、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
ドナー哺乳動物細胞が、肝細胞、白血球、幹細胞、または組織である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ミトコンドリアが、ヒトまたはラットミトコンドリアである、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
組成物を作製する方法であって、
細胞から機能的なミトコンドリアを少なくとも部分的に精製するステップと；
ＡｓＧを、高度に正に帯電したポリカチオンに共有結合によって付着させるステップと；
高度に正に帯電したポリカチオンに共有結合によって付着している該ＡｓＧを該ミトコンドリアに静電的に複合体化させるステップと
を含む方法。
【請求項１５】
前記ポリカチオンが、ポリリシン（ＰＬ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＡｓＧが、アシアロオロソムコイド（ＡｓＯＲ）を含む、請求項１４から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
エンドソーム溶解剤を、エンドソーム内の条件で切断可能な結合によりＡｓＧに共有結合によって付着させるステップをさらに含む、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記エンドソーム溶解剤が、リステリオリシンである、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記エンドソーム溶解剤が、リステリオリシン（ＬＬＯ）、エンドソーム溶解活性を有するＬＬＯの断片、およびエンドソーム溶解活性を有するＬＬＯペプチドからなる群から選択される、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ミトコンドリアを肝細胞に移植する方法であって、ＡｓＧ−ＰＬと静電的に複合体化している機能的な哺乳動物ミトコンドリアと、切断可能な結合によりＡｓＧに共有結合によって付着しているエンドソーム溶解剤とを用意するステップと；
前記組成物を肝細胞に送達するステップと
を含む方法。
【請求項２１】
前記ＡｓＧが、アシアロオロソムコイド（ＡｓＯＲ）を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記エンドソーム溶解剤が、リステリオリシンである、請求項２０から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記エンドソーム溶解剤が、リステリオリシン（ＬＬＯ）、エンドソーム溶解活性を有するＬＬＯの断片、およびエンドソーム溶解活性を有するＬＬＯペプチドからなる群から選択される、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ポリカチオンに共有結合によって付着しているアシアロ糖タンパク質（ＡｓＧ）と；少なくとも部分的に精製された機能的な哺乳動物ミトコンドリアとを含む医薬組成物と；該組成物を使用して肝疾患を処置するための指示とを含むキット。
【請求項２５】
前記組成物が、切断可能な結合によりＡｓＧに共有結合によって付着しているエンドソーム溶解剤をさらに含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
肝疾患を有する患者を処置する方法であって、治療有効量の請求項１から１３のいずれか一項に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法。
【請求項２７】
前記患者が、ヒト患者である、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の組込み
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されており、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１６年２月２４日に作製された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１９００−４２２＿ＳＬ．ｔｘｔと称し、１，３２３バイトのサイズである。
【０００２】
本発明は、細胞内のミトコンドリア機能の増大から利益を受けることができる疾患および状態の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
ミトコンドリアは、それ自体のＤＮＡおよび代謝系を含有する、膜により限定される細胞内の小器官であり、哺乳動物細胞の発電所として機能する。代謝活性が最大である臓器は、エネルギーを最も多く必要とし、また、細胞１個当たりのミトコンドリア数も最大である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
機能不全を結果としてもたらす、遺伝的および後天的ミトコンドリア欠損は、肝臓損傷に起因する疾患を引き起こし、しばしば、早死を引き起こす。遺伝的欠損はまれであるが、通例、生涯の早期において致死性である。しかし、薬物毒性に起因する、後天的ミトコンドリア損傷は、比較的一般的であり、成人において、重度の病的状態および死をもたらしうる。現在のところ、ミトコンドリアの欠損または損傷に対する医療は存在しない。
【０００５】
本開示は、ポリカチオンに共有結合によって付着しているアシアロ糖タンパク質（ＡｓＧ）と、少なくとも部分的に精製され、ＡｓＧ−ポリカチオンに静電的に結合している機能的な哺乳動物ミトコンドリアとを含む組成物（医薬組成物など）を提供する。ある特定の実施形態では、組成物は、切断可能な結合によりＡｓＧに共有結合によって付着しているエンドソーム溶解剤をさらに含む。
【０００６】
他の態様では、本開示は、肝疾患など、細胞のミトコンドリア機能の増大から利益を受けることができる疾患または状態を処置または防止する医薬組成物を作製する方法であって、細胞から機能的な哺乳動物ミトコンドリアを少なくとも部分的に精製するステップと；ＡｓＧを、高度に正に帯電したポリカチオンに共有結合によって付着させるステップと；ＡｓＧ／ポリカチオン分子をミトコンドリアと静電的に結合させるステップとを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、エンドソーム溶解剤を用意するステップをさらに含む。さらなる実施形態では、エンドソーム溶解剤は、ＡｓＧに共有結合によって付着している。なおさらなる実施形態では、エンドソーム溶解剤は、切断可能な結合によりＡｓＧに共有結合によって付着している。
【０００７】
他の態様では、本開示は、ミトコンドリアを肝細胞に移植する方法であって、ＡｓＧ−ＰＬと静電的に複合体化している機能的な哺乳動物ミトコンドリアを含む医薬組成物を用意するステップと；前記組成物を肝細胞に送達するステップとを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、組成物は、切断可能な結合によりＡｓＧに共有結合によって付着しているエンドソーム溶解剤をさらに含む。
【０００８】
ある特定の態様では、本開示は、ポリカチオンに共有結合によって付着しているアシアロ糖タンパク質（ＡｓＧ）と；少なくとも部分的に精製された、ＡｓＧ／ポリカチオンに静電的に結合している機能的な哺乳動物ミトコンドリアとを含む医薬組成物と；前記組成物を使用して肝疾患など、細胞のミトコンドリア機能の増大から利益を受けることができる疾患または状態を処置または防止するための指示とを含むキットを提供する。
【０００９】
ある特定の他の態様では、肝疾患など、細胞のミトコンドリア機能の増大から利益を受けることができる疾患または状態を処置または防止する方法であって、治療有効量の本明細書で開示される医薬組成物を、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法が提供される。
【００１０】
本発明のこれらの態様および他の態様に従い、他の多数の態様が提供される。本発明の他の特色および態様は、以下の詳細な記載および付属の特許請求の範囲から、より完全に明らかとなる。
【００１１】
いくつかの図面をカラーからモノクロに転換した。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、アシアロ糖タンパク質（ＡｓＧ）の、アシアロ糖タンパク質受容体による、受容体媒介性エンドサイトーシスについての概略図である。
【００１３】
【図２】図２は、ミトコンドリアに結合させるための、アシアロ糖タンパク質−ポリリシン（ＡｓＧ−ＰＬ）コンジュゲートについての概略図である。
【００１４】
【図３】図３は、分光光度計（ＸＦＬＵＯＲ４ＳＡＦＩＲＥＩＩ  Ｖｅｒｓｉｏｎ：Ｖ  ４．６２ｎ）により測定された、アシアロオロソムコイド（ＡｓＯＲ）コンジュゲートの蛍光を示す図である。ＡｓＧであるアシアロオロソムコイド（ＡｓＯＲ）を、蛍光タグであるｄｙｌｉｇｈｔ  ６５０で標識した。次いで、ポリリシンを、ＡｓＧであるアシアロオロソムコイド（ＡｓＯＲ）に連結した。
【００１５】
【図４】図４は、ＡＳＯＲコンジュゲートについての質量分析の結果を示す図である。ＡｓＧであるアシアロオロソムコイド（ＡｓＯＲ）を、蛍光タグであるｄｙｌｉｇｈｔ  ６５０で標識した。次いで、共有結合リンカーであるカルボジイミドを使用して、ポリリシン（平均ＭＷ：１ｋＤａ）を、ＡｓＧであるアシアロオロソムコイド（ＡｓＯＲ）に連結し、分子篩クロマトグラフィーにより精製した。データは、平均質量がＡｓＯＲは３２．８ｋＤａ；Ｆｌ−ＡｓＯＲは３３．４ｋＤａ；Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬは３５．２ｋＤａであったことを示す。
【００１６】
【図５】図５は、出発材料およびＦｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬについてのアガロースゲル電気泳動を示す図である。タンパク質を、０．８％のアガロースゲル上で泳動させた。タンパク質を、両方向への移動を評価するために、ゲルの中央部の近傍にロードした。
【００１７】
【図６】図６は、アシアロ糖タンパク質−ポリリシン（ＡｓＯＲ−ＰＬ）キャリアの取込みを示す図である。Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬを細胞と共に３７℃で１時間にわたりインキュベートし、蛍光顕微鏡法を実施した。
【００１８】
【図７】図７は、アシアロ糖タンパク質−ポリリシン（ＡｓＯＲ−ＰＬ）コンジュゲート−ミトコンドリア複合体の形成および安定性を示す図である。単離したばかりのラットミトコンドリアを、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬまたはＡｓＯＲ−ＰＬと共にインキュベートし、繰り返し遠心分離し、新鮮培地中に再懸濁させた。図７Ａ：ミトコンドリアペレットにおけるタンパク質関連蛍光レベルを示す図である。図７Ｂ：上清中のタンパク質関連蛍光レベルを示す図である。
【００１９】
【図８】図８は、ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体についての粒子サイズ解析を示す図である。
【００２０】
【図９】図９は、増幅により、ミトコンドリアＤＮＡに対するプライマーの特異性を示す図である。Ｈｕｈ  ７ミトコンドリアＤＮＡまたはＨＴＣおよびラット肝臓ミトコンドリアＤＮＡを、特異的に増幅するように、プライマー３およびプライマー−ＢＬＡＳＴを使用して、プライマーをデザインした。Ｈｕｈ７細胞およびＨＴＣ細胞のミトコンドリアＤＮＡならびにラット肝臓細胞のＤＮＡを使用して、プライマーの特異性を決定した。ゲル上のＰＣＲ増幅産物は、Ｈｕｈ  ７ミトコンドリアプライマーおよびＨＴＣミトコンドリアプライマーが、それぞれ、Ｈｕｈ  ７ミトコンドリアＤＮＡおよびＨＴＣ（ラット）ミトコンドリアＤＮＡだけを特異的に増幅することを示した。
【００２１】
【図１０−１】図１０は、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体の、Ｈｕｈ  ７細胞およびＳＫ  Ｈｅｐ１細胞による取込みであって、蛍光およびｑＰＣＲにより測定される取込みを示す図である。細胞を、ミトコンドリア単独、Ｆｌ−ＡｓＯＲ単独、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体、または複合体化ミトコンドリア＋過剰量のＡｓＯＲと共に、個々に、１時間にわたりインキュベートし、様々な時点において、解析のために回収した。図１０Ａ：Ｈｕｈ  ７細胞における蛍光レベル；図１０Ｂ：複合体化ミトコンドリアまたは対照と共にインキュベートされたＳＫ  Ｈｅｐ  １細胞における蛍光レベルを示す図である。図１０Ｃ：Ｈｕｈ  ７細胞；図１０Ｄ：ＳＫ  Ｈｅｐ１細胞とのインキュベーションの後における、ミトコンドリアＤＮＡレベルを示す図である。
【図１０−２】図１０は、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体の、Ｈｕｈ  ７細胞およびＳＫ  Ｈｅｐ１細胞による取込みであって、蛍光およびｑＰＣＲにより測定される取込みを示す図である。細胞を、ミトコンドリア単独、Ｆｌ−ＡｓＯＲ単独、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体、または複合体化ミトコンドリア＋過剰量のＡｓＯＲと共に、個々に、１時間にわたりインキュベートし、様々な時点において、解析のために回収した。図１０Ａ：Ｈｕｈ  ７細胞における蛍光レベル；図１０Ｂ：複合体化ミトコンドリアまたは対照と共にインキュベートされたＳＫ  Ｈｅｐ  １細胞における蛍光レベルを示す図である。図１０Ｃ：Ｈｕｈ  ７細胞；図１０Ｄ：ＳＫ  Ｈｅｐ１細胞とのインキュベーションの後における、ミトコンドリアＤＮＡレベルを示す図である。
【００２２】
【図１１】図１１は、標的化（targeted）リステリオリシン（ＬＬＯ）に媒介されるエンドソーム破裂についての概略図である。
【００２３】
【図１２】図１２は、ＡｓＯＲの、リステリオリシン（ＬＬＯ）への、切断可能な共有結合による連結についての概略図である。
【００２４】
【図１３】図１３は、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅで染色された成分を示す図である。タンパク質を、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動させ、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅで染色した。レーン：１：ＤＴＴで還元されたＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲート；２：ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲート；３：ＬＬＯ；４：ＡｓＯＲ。
【００２５】
【図１４−１】図１４は、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートの存在下における、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体の、Ｈｕｈ  ７細胞およびＳＫ  Ｈｅｐ１細胞による取込みであって、蛍光およびｑＰＣＲにより測定される取込みを示す図である。細胞を、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体、複合体化ミトコンドリアおよびＡｓＯＲ−ＬＬＯ、複合体化ミトコンドリア＋過剰量のＡｓＯＲまたは複合体化ミトコンドリア＋ＡｓＯＲ−ＬＬＯ＋過剰量のＡｓＯＲと共に、個々に、２時間にわたりインキュベートし、様々な時点において、解析のために回収した。複合体化ミトコンドリアまたは対照と共にインキュベートされた、図１４Ａ：Ｈｕｈ  ７細胞における蛍光レベル；図１４Ｂ：ＳＫ  Ｈｅｐ  １細胞における蛍光レベルを示す図である。図１４Ｃ：Ｈｕｈ  ７細胞；図１４Ｄ：ＳＫ  Ｈｅｐ１細胞；図１４Ｅ：コルヒチンで処理されたＨｕｈ７細胞と共に、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートのインキュベーション後；または図１４Ｆ：４℃においてインキュベートした後における、ミトコンドリアＤＮＡレベルを示す図である。
【図１４−２】図１４は、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートの存在下における、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体の、Ｈｕｈ  ７細胞およびＳＫ  Ｈｅｐ１細胞による取込みであって、蛍光およびｑＰＣＲにより測定される取込みを示す図である。細胞を、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体、複合体化ミトコンドリアおよびＡｓＯＲ−ＬＬＯ、複合体化ミトコンドリア＋過剰量のＡｓＯＲまたは複合体化ミトコンドリア＋ＡｓＯＲ−ＬＬＯ＋過剰量のＡｓＯＲと共に、個々に、２時間にわたりインキュベートし、様々な時点において、解析のために回収した。複合体化ミトコンドリアまたは対照と共にインキュベートされた、図１４Ａ：Ｈｕｈ  ７細胞における蛍光レベル；図１４Ｂ：ＳＫ  Ｈｅｐ  １細胞における蛍光レベルを示す図である。図１４Ｃ：Ｈｕｈ  ７細胞；図１４Ｄ：ＳＫ  Ｈｅｐ１細胞；図１４Ｅ：コルヒチンで処理されたＨｕｈ７細胞と共に、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートのインキュベーション後；または図１４Ｆ：４℃においてインキュベートした後における、ミトコンドリアＤＮＡレベルを示す図である。
【図１４−３】図１４は、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートの存在下における、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体の、Ｈｕｈ  ７細胞およびＳＫ  Ｈｅｐ１細胞による取込みであって、蛍光およびｑＰＣＲにより測定される取込みを示す図である。細胞を、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体、複合体化ミトコンドリアおよびＡｓＯＲ−ＬＬＯ、複合体化ミトコンドリア＋過剰量のＡｓＯＲまたは複合体化ミトコンドリア＋ＡｓＯＲ−ＬＬＯ＋過剰量のＡｓＯＲと共に、個々に、２時間にわたりインキュベートし、様々な時点において、解析のために回収した。複合体化ミトコンドリアまたは対照と共にインキュベートされた、図１４Ａ：Ｈｕｈ  ７細胞における蛍光レベル；図１４Ｂ：ＳＫ  Ｈｅｐ  １細胞における蛍光レベルを示す図である。図１４Ｃ：Ｈｕｈ  ７細胞；図１４Ｄ：ＳＫ  Ｈｅｐ１細胞；図１４Ｅ：コルヒチンで処理されたＨｕｈ７細胞と共に、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートのインキュベーション後；または図１４Ｆ：４℃においてインキュベートした後における、ミトコンドリアＤＮＡレベルを示す図である。
【００２６】
【図１５】図１５は、ＧＦＰで標識したミトコンドリアについての蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を示す図である。ＧＦＰで標識したミトコンドリアを安定的に発現させるＨＴＣ細胞を分取して、安定的なｍｉｔｏ−ＧＦＰ細胞系を単離し、選択のために、Ｇ４１８培地中で保存した。
【００２７】
【図１６】図１６は、Ｈｕｈ７細胞と共に、３７℃で２時間にわたりインキュベートされ、次いで、添加剤を含まない培地中で、６時間にわたりインキュベートされた、ミトコンドリア−ＧＦＰの様々な形態の、共焦点顕微鏡下の局在化を示す図である。細胞を、核についてＤＡＰＩで、および早期エンドソームマーカーについてＥＥＡ１−Ａｌｅｘａ  ５９４で染色し、共焦点顕微鏡法により検査した。図１６Ａ：エンドソームマーカー；図１６Ｂ：ＧＦＰを示す図である。
【００２８】
【図１７】図１７は、Ｈｕｈ７細胞と共に、３７℃で２時間にわたりインキュベートされ、次いで、添加剤を含まない培地中で、６時間にわたりインキュベートされた、ミトコンドリア−ＧＦＰの様々な形態の、共焦点顕微鏡下の局在化を示す図である。細胞を、核についてＤＡＰＩで、および早期エンドソームマーカーについてＥＥＡ１−Ａｌｅｘａ  ５９４で染色した。図１７Ｃ：ＤＡＰＩによる核を示す図であり、図１７Ｄ：合体させた図である。
【００２９】
【図１８】図１８は、Ｈｕｈ７細胞と共に、３７℃で２時間にわたりインキュベートされ、次いで、添加剤を含まない培地中で、６時間にわたりインキュベートされた、ミトコンドリア−ＧＦＰ単独の他の例を示す図である。細胞を、核についてＤＡＰＩで、および早期エンドソームマーカーについてＥＥＡ１−Ａｌｅｘａ  ５９４で染色した。図１８Ａ：ＥＥＡ１−Ａｌｅｘａ  ５９４によるエンドソームマーカー；図１８Ｂ：ＧＦＰ；図１８Ｃ：ＤＡＰＩによる核を示す図であり、図１８Ｄ：合体させた図である。
【００３０】
【図１９】図１９は、Ｈｕｈ７細胞と共に、３７℃で２時間にわたりインキュベートされ、次いで、添加剤を含まない培地中で、６時間にわたりインキュベートされた、ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア−ＧＦＰの他の例を示す図である。Ｈｕｈ  ７細胞を、ミトコンドリアを伴わない培地に、６時間にわたり切り換え、次いで、早期エンドソームマーカーＥＥＡ１について染色した。６時間後に、細胞を、共焦点蛍光顕微鏡下でイメージングした。図１９Ａ：エンドソームマーカー（抗ＥＥＡ１−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４）；図１９Ｂ：ＧＦＰを示す図である。
【００３１】
【図２０】図２０は、Ｈｕｈ７細胞と共に、３７℃で２時間にわたりインキュベートされ、次いで、添加剤を含まない培地中で、６時間にわたりインキュベートされた、ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア−ＧＦＰおよびＡＳＯＲ−ＬＬＯの他の例を示す図である。図２０Ａ：ＤＡＰＩによる核を示す図であり；図２０Ｂ：合体させた図である。
【００３２】
【図２１】図２１は、図１９について使用された試料によるスタック番号と対比した、共焦点顕微鏡画像の蛍光強度についてのプロットを示す図である。早期エンドソームマーカーＥＥＡ１およびＧＦＰ−ミトコンドリアの蛍光強度を、ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア−ＧＦＰ複合体と共に、３７℃で６時間インキュベートした後の、Ｈｕｈ  ７細胞の共焦点顕微鏡画像の、深度であるスタック番号に従いプロットした。
【００３３】
【図２２】図２２は、ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）で処理された、Ｈｕｈ  ７細胞およびＳＫ  Ｈｅｐ１細胞内のミトコンドリアＤＮＡレベルを示す図である。Ｈｕｈ  ７細胞およびＳＫ  Ｈｅｐ１細胞を、ｄｄＣで、３週間にわたり処理し、ミトコンドリアＤＮＡレベルを、時間と共に、ｑＰＣＲにより決定した。
【００３４】
【図２３−１】図２３は、複合体化ミトコンドリアおよび対照の、Ｈｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞およびＳＫ  Ｈｅｐ１−Ｍｉｔｏ（−）細胞内の共投与であって、蛍光およびｑＰＣＲにより測定される共投与を示す図である。細胞を、培地単独、ミトコンドリア単独、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体、ＡｓＯＲ−ＬＬＯを加えた複合体化ミトコンドリア、過剰量のＡｓＯＲを加えた複合体化ミトコンドリア、または過剰量のＡｓＯＲを加えたＡｓＯＲ−ＬＬＯを加えた複合体化ミトコンドリアと共に、個々に、３７℃で２時間にわたりインキュベートし、栄養補助剤非含有細胞培養培地中で維持した。図２３Ａ：１２０分での；図２３Ｂ：１０日、Ｈｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞における蛍光レベル；および図２３Ｃ：１２０分での；図２３Ｄ：４日、ＳＫ  Ｈｅｐ１−Ｍｉｔｏ（−）細胞における蛍光レベルを示す図である。図２３Ｅ：１０日での、Ｈｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞内；および図２３Ｆ：４日での、ＳＫ  Ｈｅｐ１−Ｍｉｔｏ（−）細胞内のミトコンドリアＤＮＡレベルを示す図である。バーは、等しい数の細胞当たりの任意の蛍光単位についての平均±Ｓ．Ｅ．に対応する。
【図２３−２】図２３は、複合体化ミトコンドリアおよび対照の、Ｈｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞およびＳＫ  Ｈｅｐ１−Ｍｉｔｏ（−）細胞内の共投与であって、蛍光およびｑＰＣＲにより測定される共投与を示す図である。細胞を、培地単独、ミトコンドリア単独、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体、ＡｓＯＲ−ＬＬＯを加えた複合体化ミトコンドリア、過剰量のＡｓＯＲを加えた複合体化ミトコンドリア、または過剰量のＡｓＯＲを加えたＡｓＯＲ−ＬＬＯを加えた複合体化ミトコンドリアと共に、個々に、３７℃で２時間にわたりインキュベートし、栄養補助剤非含有細胞培養培地中で維持した。図２３Ａ：１２０分での；図２３Ｂ：１０日、Ｈｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞における蛍光レベル；および図２３Ｃ：１２０分での；図２３Ｄ：４日、ＳＫ  Ｈｅｐ１−Ｍｉｔｏ（−）細胞における蛍光レベルを示す図である。図２３Ｅ：１０日での、Ｈｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞内；および図２３Ｆ：４日での、ＳＫ  Ｈｅｐ１−Ｍｉｔｏ（−）細胞内のミトコンドリアＤＮＡレベルを示す図である。バーは、等しい数の細胞当たりの任意の蛍光単位についての平均±Ｓ．Ｅ．に対応する。
【図２３−３】図２３は、複合体化ミトコンドリアおよび対照の、Ｈｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞およびＳＫ  Ｈｅｐ１−Ｍｉｔｏ（−）細胞内の共投与であって、蛍光およびｑＰＣＲにより測定される共投与を示す図である。細胞を、培地単独、ミトコンドリア単独、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体、ＡｓＯＲ−ＬＬＯを加えた複合体化ミトコンドリア、過剰量のＡｓＯＲを加えた複合体化ミトコンドリア、または過剰量のＡｓＯＲを加えたＡｓＯＲ−ＬＬＯを加えた複合体化ミトコンドリアと共に、個々に、３７℃で２時間にわたりインキュベートし、栄養補助剤非含有細胞培養培地中で維持した。図２３Ａ：１２０分での；図２３Ｂ：１０日、Ｈｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞における蛍光レベル；および図２３Ｃ：１２０分での；図２３Ｄ：４日、ＳＫ  Ｈｅｐ１−Ｍｉｔｏ（−）細胞における蛍光レベルを示す図である。図２３Ｅ：１０日での、Ｈｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞内；および図２３Ｆ：４日での、ＳＫ  Ｈｅｐ１−Ｍｉｔｏ（−）細胞内のミトコンドリアＤＮＡレベルを示す図である。バーは、等しい数の細胞当たりの任意の蛍光単位についての平均±Ｓ．Ｅ．に対応する。
【００３５】
【図２４】図２４は、栄養補助剤非含有培地への切換え後の、細胞内の細胞ＤＮＡレベルを示す図である。Ｍｉｔｏ（−）細胞を、補充培地中で成長させ、次いで、栄養補助剤非含有培地に切り換えた。ＤＮＡレベルは、ｑＰＣＲにより、時間の関数として測定した。
【００３６】
【図２５】図２５は、移植されたＨｕｈ  ７ミトコンドリアの、Ｍｉｔｏ（−）細胞内の細胞ＤＮＡレベルに対する効果を示す図である。図２５Ａ：Ｈｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞；および図２５Ｂ：ＳＫ  Ｈｅｐ１−Ｍｉｔｏ（−）細胞を示す図である。ミトコンドリア単独、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートを加えた複合体化ミトコンドリア、過剰量のＡｓＯＲを加えた複合体化ミトコンドリア、または過剰量のＡｓＯＲを加えたＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートを加えた複合体化ミトコンドリアと共に、３７℃でのインキュベーション後の、細胞内の総細胞ＤＮＡである。細胞ＤＮＡレベルは、栄養補助剤非含有培地中に存在する細胞数についての推定値として、時間の関数として測定した。
【００３７】
【図２６−１】図２６は、ミトコンドリア呼吸についての特徴付けを示す図である。ミトコンドリア呼吸を測定する１日前に、細胞を、ＸＦ２４細胞培養マイクロプレートに播種した。酸素消費速度（ＯＣＲ）を、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒで測定して、図２６Ａ：Ｈｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞、ＳＫ  Ｈｅｐ１−Ｍｉｔｏ（−）細胞、ならびに親Ｈｕｈ  ７細胞、および親ＳＫ  Ｈｅｐ１細胞におけるミトコンドリア呼吸を決定した。オリゴマイシン、カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニル−ヒドラゾン（ＦＣＣＰ）、またはロテノンの逐次的添加の後で、ＯＣＲを測定して、細胞におけるミトコンドリア呼吸について評価した。複合体化ミトコンドリアまたは対照の共投与の、図２６Ｂ：１２時間後；および図２６Ｃ：１０日後のＨｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞におけるミトコンドリア呼吸による酸素消費速度およびミトコンドリア呼吸の阻害剤の影響を示す図である。
【図２６−２】図２６は、ミトコンドリア呼吸についての特徴付けを示す図である。ミトコンドリア呼吸を測定する１日前に、細胞を、ＸＦ２４細胞培養マイクロプレートに播種した。酸素消費速度（ＯＣＲ）を、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒで測定して、図２６Ａ：Ｈｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞、ＳＫ  Ｈｅｐ１−Ｍｉｔｏ（−）細胞、ならびに親Ｈｕｈ  ７細胞、および親ＳＫ  Ｈｅｐ１細胞におけるミトコンドリア呼吸を決定した。オリゴマイシン、カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニル−ヒドラゾン（ＦＣＣＰ）、またはロテノンの逐次的添加の後で、ＯＣＲを測定して、細胞におけるミトコンドリア呼吸について評価した。複合体化ミトコンドリアまたは対照の共投与の、図２６Ｂ：１２時間後；および図２６Ｃ：１０日後のＨｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞におけるミトコンドリア呼吸による酸素消費速度およびミトコンドリア呼吸の阻害剤の影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本明細書で使用される場合、名詞の前の「ａ（１つの、ある）」または「複数」という語は、特定の名詞の１または複数を表す。例えば、「哺乳動物細胞」という語句は、「１または複数の哺乳動物細胞」を表す。
【００３９】
「哺乳動物細胞」という用語は、当技術分野で公知であり、例えば、ヒト、ハムスター、マウス、グリーンモンキー、ラット、ブタ、ウシ、ハムスター、またはウサギを含む、任意の哺乳動物に由来するか、またはこれから得られた任意の細胞を指す場合がある。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、不死化細胞、分化細胞、未分化細胞、幹細胞などでありうる。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「被験体」および「患者」という用語は、互換的に使用される。患者または被験体は、ヒト患者またはヒト被験体でありうる。
【００４１】
「例えば」および「など」という用語、ならびにそれらの文法的同等物については、そうでないことが明示的に言明されない限りにおいて、「限定せずに述べると（and without limitation）」という語句が後続すると理解される。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、実験の誤差に起因するばらつきを説明することを意図する。本明細書で報告される全ての測定値は、そうでないことが明示的に言明されない限りにおいて、用語が明示的に使用されているのであれ、されていないのであれ、「約」という用語により修飾されていると理解される。本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、そうでないことが文脈により明確に指示されない限りにおいて、複数の指示対象を含む。
【００４２】
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書では、本発明における使用のための方法および材料が記載され、また、当技術分野で公知の、他の適切な方法および材料も使用することができる。材料、方法、および例は、例示的であるだけであり、限定することを意図するものではない。本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベース項目、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体において組み込まれる。対立する場合は、定義を含む本明細書により管理する。
【００４３】
肝臓細胞（肝細胞）は、ガラクトース残基を露出させた、アシアロ糖タンパク質（ＡｓＧ）として公知のタンパク質を認識し、これに結合する、固有の細胞表面受容体を有する。ＡｓＧの、その受容体への結合は、細胞表面膜の陥入を誘発し、最終的には、受容体−糖タンパク質複合体を細胞内膜により限定される小胞であるエンドソーム内に隔離する。エンドソームは、分解酵素を含有するリソソームと融合する結果として、糖タンパク質の分解をもたらす。アシアロ糖タンパク質受容体系は、細胞外の物質が、細胞の内部へのアクセスを獲得しうる天然の機構を表し、例えば、図１を参照されたい。
【００４４】
哺乳動物の肝細胞は、高度な分化細胞である。しかし、大半の分化細胞と異なり、肝細胞は、臓器が損傷されると、分裂することが可能である。ミトコンドリアは、それら自身のＤＮＡを有するため、宿主細胞が分裂すると、複製が可能である。宿主細胞の分裂中に、ミトコンドリアの数は、娘細胞が、元の親細胞と同じ数のミトコンドリアを含有するように増大する。ミトコンドリアが欠損しているか、または損傷されている肝細胞への、健常ミトコンドリアのターゲティングは、これらの細胞に、選択的生存の利点を付与する。結果として、これらの細胞は、増殖し、最終的に、欠損性細胞に置きかわる。
【００４５】
ミトコンドリア損傷に起因する肝不全を有する患者の処置は、支持医療または肝臓移植に限られている。現在のところ、他の処置は存在しない。
【００４６】
本開示は、ポリカチオンに共有結合によって付着しているアシアロ糖タンパク質（ＡｓＧ）と；少なくとも部分的に精製され、ＡｓＧ−ポリカチオンに静電的に結合している機能的な哺乳動物ミトコンドリアとを含む医薬組成物を含む組成物を提供する。
【００４７】
他の態様では、本開示は、肝疾患（例えば、肝不全）など、細胞のミトコンドリア機能の増大から利益を受けることができる疾患または状態を処置または防止する医薬組成物を作製する方法であって、細胞から機能的なミトコンドリアを少なくとも部分的に精製するステップと；ＡｓＧをポリカチオンに共有結合によって付着させるステップと；高度に正に帯電したポリカチオンに共有結合によって結合しているＡｓＧをミトコンドリアと静電的に複合体化させるステップとを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、エンドソーム溶解剤を用意するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、エンドソーム溶解剤は、切断可能な結合によりＡｓＧに共有結合によって付着させることができる。
【００４８】
他の態様では、本開示は、ミトコンドリアを、肝細胞に移植する方法であって、ＡｓＧ−ＰＬと静電的に複合体化している機能的な哺乳動物ミトコンドリアを用意するステップと；前記組成物を肝細胞に送達するステップとを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、組成物は、エンドソーム溶解剤をさらに含む。さらなる実施形態では、エンドソーム溶解剤は、切断可能な結合によりＡｓＧに共有結合によって付着している。
【００４９】
ある特定の実施形態では、ＡｓＧは、肝細胞などの細胞上のその受容体に結合しうる、任意のＡｓＧである。一部の実施形態では、ＡｓＧは、アシアロオロソムコイド（ＡｓＯＲ）を含む。
【００５０】
ポリカチオンは、任意の適切なポリカチオンでありうる。ある特定の実施形態では、ポリカチオンは、高度に正に帯電している。ある特定の実施形態では、高度に正に帯電したポリカチオンは、ポリリシン（ＰＬ）、ポリアルギニン、またはポリオルニチンである。
【００５１】
ある特定の実施形態では、組成物は、エンドソーム溶解剤をさらに含む。さらなる実施形態では、エンドソーム溶解剤は、ＡｓＧに付着している。なおさらなる実施形態では、エンドソーム溶解剤は、ＡｓＧに共有結合によって付着している。なおさらなる実施形態では、エンドソーム溶解剤は、切断可能な結合によりＡｓＧに共有結合によって付着している。任意の適切なエンドソーム溶解剤を使用することができる。ある特定の実施形態では、エンドソーム溶解剤は、リステリオリシンである。本明細書で使用される「リステリオリシン」という用語は、リステリオリシン、エンドソーム溶解活性を有するリステリオリシンの断片、エンドソーム溶解活性を有するリステリオリシンペプチド、リステリオリシン、エンドソーム溶解活性を有するその断片またはペプチドを含む融合タンパク質を含む。例えば、米国特許第５，７２８，３９９号を参照されたい。ある特定の実施形態では、エンドソーム溶解剤は、エンドソーム溶解活性を有するリステリオリシンの断片、エンドソーム溶解活性を有するリステリオリシンペプチドである。切断可能な結合は、例えば、ジスルフィド結合（還元条件により切断または分離される）；酸切断性のチオマレアミド酸（thiomaleamic acid）、イミン、アセタールリンカーなどを含む、任意の切断可能な結合でありうる。切断可能な結合は、化学リンカーにより形成することもでき、タンパク質により形成することもでき、エンドソーム内の条件下で切断可能な任意の結合により形成することもできる。エンドソーム溶解剤に結合しているＡｓＧ分子は、ポリカチオンに共有結合によって結合しているＡｓＧ分子の場合もあり、ポリカチオンに共有結合によって結合していないＡｓＧ分子の場合もある。ある特定の実施形態では、エンドソーム内に存在する条件下で切断可能な結合は、エンドソーム内に存在する条件下で切断可能な結合はジスルフィド結合であり、エンドソーム内に存在する条件下の結合であって（is one under conditions that exist in endosome）、ジスルフィド結合、および、例えば、イミノ結合、アセタール結合、またはラクトン結合を含む、酸不安定性結合でありうる。
【００５２】
当技術分野で公知の任意の方法を使用して、ＡｓＧをカチオンに共有結合によって付着させことができ；ＡｓＧ／ポリカチオンをミトコンドリアに静電的に付着させことができ；エンドソーム溶解剤を、切断可能な結合により共有結合でＡｓＧに共有結合によって付着させることができる。
【００５３】
ミトコンドリアは、ヒト細胞およびラット細胞を含む、任意の哺乳動物供給源から得ることができる。ミトコンドリアは、健常ドナーに由来する細胞から得ることもでき、哺乳動物細胞または組織から単離することもできる。ある特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、肝細胞、白血球、幹細胞、または組織である。ある特定の実施形態では、ミトコンドリアは、ラットまたはヒトミトコンドリアである。
【００５４】
少なくとも部分的に精製されたミトコンドリアは、肝細胞などの別の細胞への移植の際に、機能を保持し、正常なミトコンドリアとしての機能を保持する。移植されたミトコンドリアが、それらの新たな宿主細胞内で機能的であるかどうかについての任意のアッセイを使用して、ミトコンドリアが、機能的であるかどうかを評価することができる。
【００５５】
ミトコンドリアは、細胞から、ミトコンドリアが機能を保持することを可能とする任意の方法により単離および精製する。ミトコンドリアは、細胞または核が存在しないように、少なくとも部分的に精製する。ミトコンドリアは、例えば、米国特許公開第２０１４／０１９３５１１号において開示されている通りに精製することができる。
【００５６】
任意の適切な医薬組成物および製剤のほか、製剤化に適する方法、ならびに適切な投与経路（複数可）および適切な投与部位（複数可）も、本発明の範囲内にある。またそうでないことが言明されない限りにおいて、任意の適切な投与量（複数可）および投与頻度も想定される。
【００５７】
医薬組成物は、薬学的に許容されるキャリア（すなわち、賦形剤）を含みうる。「薬学的に許容されるキャリア」は、ありとあらゆる溶媒、ありとあらゆる液体ビヒクル、例えば、水、緩衝液など、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、希釈剤、流動促進剤などを指し、これらを含む。組成物は、薬学的に許容される塩、例えば、酸付加塩または塩基付加塩（例えば、Bergeら（１９７７年）、J Pharm Sci、６６巻：１〜１９頁を参照されたい）を含みうる。
【００５８】
「治療有効量」もしくは「治療有効用量」という用語、または本明細書で使用される同様の用語は、例えば、ミトコンドリア機能が弱いことで引き起こされる肝疾患の処置の成功など、所望の生物学的または医学的応答を誘発する、開示される医薬組成物の量を意味することを意図する。このような応答は、当技術分野で公知の方法により確認することができる。
【００５９】
ある特定の態様では、本開示は、本明細書で開示される医薬組成物と、前記組成物を使用して肝疾患など、細胞のミトコンドリア機能の増大から利益を受けることができる疾患または状態を処置または防止するための指示とを含むキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、アシアロ糖タンパク質（ＡｓＧ）、ポリカチオン、およびエンドソーム溶解剤を、それぞれ個々の容器内の滅菌溶液中に含み、また、凍結保存されたミトコンドリアであって、健常ドナーの細胞に由来するミトコンドリア、またはヒト白血球もしくはヒト幹細胞など、適切な哺乳動物細胞型から単離されたミトコンドリアのバイアルも含む。治療用キットは、使用前は、冷凍庫内に保管しうる。ある特定の実施形態では、必要な場合、溶液およびミトコンドリアを、注意深く解凍し、速やかかつ完全に混合し、ミトコンドリア損傷および肝不全を含む肝疾患を有する患者の末梢静脈に静脈内注射する。
【００６０】
ある特定の他の態様では、肝疾患など、細胞のミトコンドリア機能の増大から利益を受けることができる疾患または状態を処置または防止する方法であって、治療有効量の本明細書で開示される医薬組成物を、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法が提供される。
【００６１】
ある特定の実施形態では、開示される組成物および方法は、遺伝的欠損に起因する、ミトコンドリアの機能不全および肝不全を有する患者のための治療として使用することができる。ある特定の実施形態では、開示される組成物および方法は、例えば、薬物療法に起因する、後天的なミトコンドリアの機能不全および肝不全を有する患者のための治療として使用することができる。
【実施例】
【００６２】
本発明をよりよく理解するために、以下の実施例を明示する。これらの実施例は、例示だけを目的とするものであり、いかなる形でも、本発明の範囲を限定するものとみなさないものとする。
【００６３】
（実施例１）
ミトコンドリアの、肝細胞へのターゲティング、およびＡｓＧＲ経路による取込み
【００６４】
方法：アシアロ糖タンパク質である、アシアロオロソムコイド（ＡｓＯＲ）を蛍光標識して、Ｆｌ−ＡｓＯＲを作製した。Ｆｌ−ＡｓＯＲを、ポリリシンに共有結合によって連結して、負に帯電したミトコンドリアに結合することが可能な、正に帯電したコンジュゲートであるＦｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬを作製した。ＧＦＰで標識したラットミトコンドリアを、ＨＴＣ  ｍｉｔｏ−ＧＦＰ細胞から単離し、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬと混合して、安定的な静電結合複合体を形成させた。ミトコンドリアの、肝細胞への標的化送達を評価するため、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体を、ヒトヘパトーマ細胞系である、ＡｓＧ受容体（＋）のＨｕｈ７細胞およびＡｓＧ受容体（−）のＳＫ  Ｈｅｐ１細胞と、個々に、３７℃でインキュベートし、細胞を、様々な時点でサンプリングした。十分な洗浄の後で、ラットミトコンドリアの、細胞内への取込みを、ラットミトコンドリアＤＮＡに対して特異的なプライマーを使用するｑＰＣＲにより、ＧＦＰを検出する二光子共焦点蛍光顕微鏡法により、および早期エンドソームを検出するための抗ＥＥＡ抗体、続いてＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ５９４によりアッセイした。
【００６５】
結果：蛍光データは、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬコンジュゲートが、複数回の遠心および再懸濁のサイクル後に、ミトコンドリアへの安定的な結合を維持することを示した。
【００６６】
Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体の、細胞とのインキュベーションは、Ｈｕｈ７［ＡｓＧ受容体（＋）］細胞のみが、有意なＦｌ−ＡｓＯＲ蛍光を示すが、ＳＫ  Ｈｅｐ１［ＡｓＧ受容体（−）］細胞は、これを示さないこと、および、蛍光は、時間と共に増大することを示した。ｑＰＣＲは、ラットミトコンドリアＤＮＡは、Ｈｕｈ７細胞では、時間と共に増大するが、ＳＫ  Ｈｅｐ１細胞ではそうではないことを確認した。Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体の、大モル過剰量の遊離ＡｓＯＲの存在下における、Ｈｕｈ７細胞とのインキュベーションは、蛍光の、これらの細胞との会合を遮断した。共焦点顕微鏡法は、細胞内のミトコンドリアの存在を確認した。ＧＦＰとＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ５９４とをオーバーラップさせることにより、エンドソーム内の、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリアの存在が示された。エンドソーム溶解剤の共ターゲティングは、エンドソーム内のミトコンドリアの初期共局在化のほか、エンドソームと会合していない、細胞内のラットミトコンドリアも確認した。
【００６７】
こうして、ポリリシンの、ＡｓＯＲへのカップリングは、強く正に帯電したコンジュゲートであるＦｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬであって、安定的な非共有結合による相互作用によりミトコンドリアに結合しているＦｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬを結果としてもたらす。Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体は、受容体媒介性エンドサイトーシスにより、肝細胞により取り込まれ、エンドサイトーシスされた複合体のレベルは、時間と共に増大した。エンドソーム溶解剤の共ターゲティングは、エンドソーム内のミトコンドリアの共局在化を増大させ、また、エンドソームと会合していない、細胞内のラットミトコンドリアの数も増大させた。
【００６８】
（実施例２）
ミトコンドリアの、肝細胞へのターゲティング、およびＡｓＧＲ経路による取込み
【００６９】
アシアロ糖タンパク質（ＡｓＧ）は、送達される物質に結合することができる場合、その物質を肝臓に送達するようにターゲティング可能なキャリアとして使用することができる。しかし、ミトコンドリアの場合、それらは化学物質により損傷されうる、脆弱な小器官である。したがって、ＡｓＧを、非損傷性相互作用により、ミトコンドリアに結合させうる方法を開発することが重要であった。ミトコンドリアは、負に帯電しているので、アシアロ糖タンパク質を、高度に正に帯電した分子に転換する方法を考案した。次いで、このタンパク質コンジュゲートを、ミトコンドリアと混合することにより、コンジュゲートは、強力であるが非損傷性の静電（電荷間）相互作用により、ミトコンドリアに結合して、タンパク質−ミトコンドリア複合体を形成することができた（図２）。ＡｓＧを、正に帯電したアミノ酸であるリシンのポリマーからなる、ペプチドであるポリリシン（ＰＬ）に、化学的に連結することにより、正に帯電した分子に転換した。
【００７０】
アシアロ糖タンパク質−ポリリシン（ＡｓＯＲ−ＰＬ）コンジュゲートの調製および蛍光標識付け
【００７１】
ＡｓＧであるアシアロオロソムコイド（ＡｓＯＲ）を、蛍光タグであるｄｙｌｉｇｈｔ  ６５０で標識した。次いで、ポリリシン（平均ＭＷ：１ｋＤａ）を、共有結合リンカーであるカルボジイミドを使用して、ＡｓＧであるアシアロオロソムコイド（ＡｓＯＲ）に連結し、分子篩クロマトグラフィーにより精製した。
【００７２】
各タンパク質１μｇずつを使用して、ｄｙｌｉｇｈｔ  ６５０で標識されたタンパク質の蛍光強度を決定した。図３は、ＡｓＯＲ自体が、予期される通り、蛍光を有さなかったことを示す。しかし、蛍光タグで標識されたＡｓＯＲおよびＡｓＯＲ−ポリリシンコンジュゲートの両方が、蛍光を有し、比蛍光（１ｍｇ当たりの）は、Ｆｌ−ＡｓＯＲおよびＦｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬについて同様であった。
【００７３】
結論：ＡｓＯＲ−ＰＬコンジュゲートを、蛍光タグで標識することに成功した。
【００７４】
蛍光アシアロ糖タンパク質−ポリリシン（Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ）コンジュゲートの質量の測定
【００７５】
ＡｓＯＲの、ＰＬへのカップリングの後、精製されたコンジュゲートを、質量スペクトル解析にかけた。図４は、ＡｓＯＲの平均質量が、３２．８ｋＤａであったことを指し示す質量分析データを示す。Ｆｌ−ＡｓＯＲの平均質量は、わずかに大きく、３３．４ｋＤａであり、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬの平均質量は、大幅に大きく、３５．２ｋＤａであった。
【００７６】
結論：ＦＬ−ＡｓＯＲを、ＰＬに共有結合によって連結した。質量スペクトルデータの計算は、平均で、ＡｓＯＲ分子１つ当たり、２つのｄｙｌｉｇｈｔ  ６５０タグが共有結合によって結合し、ＦＬ−ＡｓＯＲ−ＰＬ分子１つ当たり、２つのＰＬ鎖が結合していることを明らかにした。
【００７７】
アシアロ糖タンパク質−ポリリシン（ＡｓＯＲ−ＰＬ）コンジュゲート上の電荷の評価
【００７８】
アガロースゲル電気泳動を行って、ＡｓＯＲ−ＰＬコンジュゲートが、正に帯電しているかどうかを決定した。図５は、ＡｓＯＲおよびＦｌ−ＡｓＯＲの両方が、正極に向かって移動したことを示し、これらが、負に帯電していることを指し示す。対照的に、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬは、ＰＬと同様に、負極に向かって移動した。Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬコンジュゲートは、単一のバンドとして泳動した。遊離ＡｓＯＲまたは遊離ＰＬはなかった。
【００７９】
結論：ＡｓＯＲを、ＰＬに共有結合によって連結して、ＡｓＯＲ−ＰＬコンジュゲートを形成し、精製工程により、全ての出発材料を消失させた。ＡｓＯＲとは対照的に、ＡｓＯＲ−ＰＬコンジュゲートは、正に帯電していた。
【００８０】
ＡｓＯＲ−ＰＬコンジュゲートの取込みについての評価
【００８１】
ＰＬの、ＡｓＯＲへの化学的連結が、ＡｓＧ受容体によるＡｓＯＲの認識を変更しえたかどうかについて調べるため、［ＡｓＧ受容体（＋）］細胞、ＳＫ  Ｈｅｐ１［ＡｓＧ受容体（−）］細胞を使用して、ＡｓＯＲ−ＰＬの、ＡｓＧ受容体への結合について研究した。Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬを、細胞と共に、３７℃で１時間（ｈ）にわたりインキュベートし、蛍光顕微鏡法を実施した。ＤＡＰＩを使用して、核を、ＡｓＯＲの色（赤）と比較して異なる色（緑）に染色した。図６は、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬと共にインキュベートされたＨｕｈ７［ＡｓＧ受容体（＋）］細胞が、多数の小型で赤色の斑点状構造を結果としてもたらしたことを示す（図６上左パネル）。一部の構造が、下パネルに示された核を取り囲んでいたことから、これらの構造は、細胞内にあり、サイズは、エンドソーム小胞を示唆したことが指し示された（図６下左パネル）。これに対し、ＳＫ  Ｈｅｐ１［ＡｓＧ受容体（−）］細胞は、検出可能な小型で赤色の斑点状構造を欠いた（図６上パネル；また、図６下右パネルも参照されたい）（ＤＡＰＩ染色）。
【００８２】
結論：ＡｓＯＲ−ＰＬコンジュゲートは、内部移行が可能であった。結果として得られる斑点状パターンの出現は、ＡｓＯＲ−ＰＬの、エンドソーム内への移入と符合する。蛍光が、Ｈｕｈ７［ＡｓＧ受容体（＋）］細胞内においてのみ出現し、ＳＫ  Ｈｅｐ１［ＡｓＧ受容体（−）］細胞では出現しなかったという事実は、ＡｓＯＲ−ＰＬの、ＡｓＧ受容体による取込みと符合する。ＡｓＯＲ−ＰＬは、ＡｓＧ（＋）細胞により特異的に取り込まれる。
【００８３】
アシアロ糖タンパク質−ポリリシン（ＡｓＯＲ−ＰＬ）コンジュゲート−ミトコンドリア複合体の形成および安定性
【００８４】
ＡｓＯＲ−ＰＬが、ミトコンドリアに安定的に結合しうるかどうかを決定するために、ラット肝細胞であるＨＴＣ細胞からミトコンドリアを単離した。ミトコンドリアの供給源としてのこの非ヒト種は、移植されたミトコンドリアを、既存のヒト宿主細胞のミトコンドリアから識別することを可能とするために選択した。単離したばかりのラットミトコンドリアを、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬと共にインキュベートし、繰り返し遠心分離し、新鮮培地中に再懸濁させた。図７Ａは、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬの蛍光が、１回目の遠心の後で約１５％減少し、次いで、３回目の遠心（3rd spin）を通して、ペレット化したミトコンドリア中、約２７，０００単位で一定のままであったことを示す。さらに、図７Ｂに示される通り、上清中の蛍光はほとんど残っておらず、また、ほとんど存在しない蛍光は一定のままであった。これに対し、ＰＬを欠き、したがって、ミトコンドリアに強く結合することが予期されないＦｌ−ＡｓＯＲ単独は、図７Ａに示される通り、１回目の遠心の後で、３０，０００単位から３，０００単位に９０％を超えて減少し、次いで、後続の遠心の後におけるペレット化したミトコンドリアについてはもはや検出されなかった。
【００８５】
結論：ＡｓＯＲ−ＰＬコンジュゲートは、遠心分離の反復にも拘らず、ミトコンドリアとの会合を維持した。ＰＬを伴わないＡｓＯＲは、依然として上清中にあり、ミトコンドリアペレットと会合しなかった。その小型のサイズのために、ＡｓＯＲ−ＰＬ単独を、この遠心分離工程により、ペレット化させることはできなかった。ミトコンドリアペレットと会合したＡｓＯＲ−ＰＬについての知見は、ＡｓＯＲ−ＰＬの、ミトコンドリアへの結合であって、洗浄および遠心の条件に対して安定的な結合を裏付ける。
【００８６】
ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体の平均サイズの測定
【００８７】
タンパク質−ミトコンドリア複合体のサイズは、粒子サイズ解析により決定した。図８は、ＡｓＯＲ−ＰＬと複合体化させたときに、ミトコンドリアの平均直径が、約３００ｎｍ増大したことを示す。ミトコンドリア単独の平均直径が、７００＋５７．８ｎｍであったのに対し、ＡｓＯＲ−ＰＬと複合体化させたミトコンドリアは、１０００＋６２ｎｍの平均直径を有した。
【００８８】
結論：ＡｓＯＲ−ＰＬとの複合体（AsOR-PL complexes）の形成は、サイズの増大と関連する。平均直径が、７００ｎｍの倍数として増大しなかったという事実は、サイズの増大が単に、ミトコンドリアの凝集に起因したものではなかったことを示唆する。
【００８９】
蛍光により測定される、ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体の取込み
【００９０】
取込みを測定するため、Ｈｕｈ７［ＡｓＧ受容体（＋）］細胞およびＳＫ  Ｈｅｐ１［ＡｓＧ受容体（−）］細胞を、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬミトコンドリア複合体、ミトコンドリア単独、Ｆｌ−ＡｓＯＲタンパク質単独と共に個々にインキュベートし、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬミトコンドリア複合体と競合するように、過剰量のＡｓＯＲを添加し、３７℃で、時間の関数として測定した。図１０Ａは、Ｈｕｈ７細胞におけるＡｓＯＲに由来する蛍光が、１５分（ｍｉｎ）で２０，０００単位に達し、１時間で３５，０００単位に増大したことを示す。これは、１５分で１５，０００単位に達し、１時間で２０，０００単位に増大したＦｌ−ＡｓＯＲのレベルと類似している。これに対し、ミトコンドリア単独は、蛍光を有さなかった。さらに、大モル過剰量のＡｓＯＲの、複合体化ミトコンドリアへの添加は、１５分および１時間の両方において、２５００単位未満を結果としてもたらした。Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬミトコンドリア複合体の存在下における、ＳＫ  Ｈｅｐ１細胞による蛍光の取込みは、２５００単位を超えなかった（図１０Ｂ）。ＡｓＧ受容体（−）細胞による取込みの欠如、および過剰量の遊離ＡｓＧによる取込みの競合阻害は、Ｈｕｈ７細胞での取込みが、ＡｓＧ受容体により媒介されたという考えを裏付ける。Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体と共にインキュベートされたＨｕｈ  ７細胞は、１５分での無処理細胞と比較して、ＨＴＣミトコンドリアＤＮＡレベルの９９０倍である、細胞１個当たり約６〜１４個のＨＴＣミトコンドリア（ミトコンドリア１個当たりのミトコンドリアＤＮＡの報告コピー数に基づく）という有意な（ｐ＜０．００４）増大を結果としてもたらし、６０分で、これを、２倍超（細胞１個当たり約１４〜３６個のＨＴＣミトコンドリア）に増大させた（ｐ＜０．００１）（図１０Ｃ）。ミトコンドリア単独またはＦｌ−ＡｓＯＲ単独と共にインキュベートされたＨｕｈ  ７細胞は、有意なＨＴＣミトコンドリアＤＮＡレベルを有さなかった。Ｈｕｈ  ７細胞の、過剰量の遊離ＡｓＯＲを有するＦｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体への曝露は、過剰量のＡｓＯＲを伴わない複合体より７６％（ｐ＜０．００１）低いＨｕｈ  ７細胞内のＨＴＣミトコンドリアＤＮＡレベルを結果としてもたらした。これに対し、ＳＫ  Ｈｅｐ１細胞内のＨＴＣミトコンドリアＤＮＡレベルは、いかなる条件下でも、ほとんど検出可能でなかった（図１０Ｄ）。データは、複合体化ミトコンドリアが、ＡｓＧＲにより特異的に媒介されるＨｕｈ  ７細胞により取り込まれることを示唆した。
【００９１】
結論：ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体は、ＡｓＧ受容体を有する細胞によって取り込まれうるが、ＡｓＧ受容体を有さない細胞によっては取り込まれえない。ミトコンドリア単独は、測定可能な取込みを有さないことから、観察される取込みは、ミトコンドリアの、細胞への、非特異的な結合には起因しなかったことが指し示される。過剰量のＡｓＯＲとの競合は、取込みの特異性が、ＡｓＧ受容体の特異性と符合することを確認する。
【００９２】
ミトコンドリアＤＮＡにより測定される、ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体の取込み
【００９３】
観察される蛍光結果が、蛍光の、細胞への何らかの非特異的会合に起因しなかったことを確認するために、複合体化ミトコンドリアの取込みを、ラットミトコンドリアＤＮＡについてのＰＣＲにより測定した。表１は、ラットミトコンドリアＤＮＡに対する特異性を達成するのに使用されるプライマーを示す。Ｈｕｈ７細胞と共にインキュベートされた複合体化ミトコンドリアは、１５分で、無処理細胞の１０００倍のＤＮＡレベルを結果としてもたらし、１時間後で、これを、２５００倍に増大させた（図１０Ｃ）。ＳＫ  Ｈｅｐ１細胞を伴う、ミトコンドリア単独も、ＡｓＯＲ−ＰＬ単独も（図１０Ｃ）、複合体化ミトコンドリアも（図１０Ｃ）、非処置対照の２５０倍を超えるＤＮＡレベルを結果としてもたらさなかった。
【００９４】
【表１】
2018507865.tif 000003
【００９５】
ＦＷ：フォワード；ＲＶ：リバース；ＬＤＨＡ：ヒト乳酸デヒドロゲナーゼＡ；ｍｉｔｏ：ミトコンドリア。
【００９６】
結論：細胞と会合したミトコンドリアＤＮＡは、Ｈｕｈ７［ＡｓＧ受容体（＋）］細胞でのみ、時間と共に増大した。ミトコンドリア単独のインキュベーションは、いずれの細胞系とも、有意な会合を有さなかったことから、ＡｓＯＲ−ＰＬとの複合体の形態にあるラットミトコンドリアＤＮＡの会合が、ＡｓＧ受容体（＋）細胞だけと関連し、時間と共に増大したという蛍光データが確認される。
【００９７】
エンドサイトーシス経路に入る物質の通例の運命は、エンドソームの、リソソームとの融合に続く分解である。これは、ミトコンドリアを含む、標的物質の破壊を結果としてもたらす。エンドソームからの放出は生じうるが、まれなイベントである。しかし、いくつかの生物は、リソソームとの融合の前に、エンドソームからの脱出のための機構を進化させていることが公知である。例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓという細菌は、エンドソーム内に取り込まれた場合に分泌する、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）というタンパク質を発生させている。酸性環境では、リステリオリシンは、膜に小孔を作り出すという特性を有する。エンドソーム形成の直後、ｐＨは通常低下する。ＬＬＯが存在する場合、ｐＨの降下は、エンドソーム膜の穿孔を結果としてもたらし、エンドソームの破裂は、リステリア菌を放出する。
【００９８】
ミトコンドリア複合体およびＬＬＯコンジュゲートの両方を、同じエンドソームに入るように作製できた場合、ＬＬＯは、エンドソームを破裂させ、リステリア菌の様式と類似の様式で、複合体化ミトコンドリアを放出しうる（図１１）。しかし、ＬＬＯの、ＡｓＯＲへの化学的連結はＬＬＯを不活化させうる。したがって、ＬＬＯを、ＡｓＯＲに、ジスルフィド結合を介して、共有結合によって連結した。この結合は、エンドソーム環境下で切断されることが公知であり、エンドソーム内に無傷のＬＬＯを放出することが予期される（図１２）。
【００９９】
ＡＳＯＲの、リステリオリシン（ＬＬＯ）への、切断可能な共有結合による連結
【０１００】
ＬＬＯを、その天然の非改変状態で送達するために、ＡｓＯＲを、エンドソーム内に存在するようなおよびジチオトレイトール（dithiotheitol）（ＤＴＴ）の存在下の還元条件下で切断されることが公知のジスルフィドリンカーであるＳＰＤＰにより、ＬＬＯに連結した。図１３は、ポリアクリルアミドゲルにより、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートが、ＡｓＯＲまたはＬＬＯより大きな、７５ｋＤａの質量と符合する位置に移動することが見出されたことを示す。この試料中には、大量の遊離ＡｓＯＲは存在するが、遊離ＬＬＯは存在しなかった。還元剤であるＤＴＴの存在下では、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートは消滅し、ＡｓＯＲバンドが増大し、ＬＬＯバンドが再出現した。これらのデータは、ＡｓＯＲを、ＳＰＤＰにより、ＬＬＯに、安定的にカップリングさせたところ、還元条件下では、ＬＬＯが、ＡｓＯＲへの結合から放出されることを指し示す。
【０１０１】
ＬＬＯの膜溶解特性の保持
【０１０２】
ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートが、膜活性特性を保持するかどうかを決定するために、溶血アッセイを実施した。低ｐＨでＬＬＯに曝露された赤血球は、小孔形成に起因して破裂し、ヘモグロビンを放出することが公知である。新鮮なヒト赤血球を、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートおよび対照と共に、３７℃で、中性ｐＨまたは低ｐＨで、ＤＴＴを含むかまたはこれを含まずにインキュベートして、溶血を測定した。表２は、低濃度（０．１μｇ／２００μｌを下回る）では、ＬＬＯが１８％未満であったことを示す。０．１μｇ／２００μｌでは、溶血活性は、ｐＨ５．６において、ｐＨ７．４における０．８７％と比較して高く、３２．８％であった。還元剤であるＤＴＴの存在下では、溶血活性は、ＤＴＴを伴わない場合の３２．８％と比較してはるかに高度な、８８．６％であった。同様に、１．５を下回る濃度における、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートの溶血活性は、１４％未満であった。１．５であり、かつ、ＤＴＴの存在下で、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートは、ｐＨ５．６において、ｐＨ７．４における３２．７％と比較して、より大きな活性の５５．３％であった。コレステロールは、ＬＬＯおよびＡｓＯＲ−ＬＬＯ複合体の両方の活性を阻害した。ＬＬＯおよびＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートの両方の５０％溶血補体（ＣＨ５０）活性を計算した。
【０１０３】
【表２】
2018507865.tif 000004
【０１０４】
結論：ＬＬＯの、ＡｓＯＲへのコンジュゲーションは、溶血活性の保持およびｐＨ依存性を結果としてもたらした。しかし、溶血活性は、濃度依存的であった。
【０１０５】
ＡｓＯＲ−ＬＬＯの、ターゲティング可能なミトコンドリア複合体の取込みに対する効果
【０１０６】
ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートが、ミトコンドリアの、肝細胞への送達を増強しうるかどうかを決定するために、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートを、ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体と混合し、Ｈｕｈ７細胞およびＳＫ  ＨＥＰ１細胞と共に、３７℃でインキュベートした。ラットミトコンドリアＤＮＡレベルを、リアルタイムＰＣＲにより、時間の関数として測定した。図１４Ｃは、ミトコンドリア複合体単独に曝露されたＨｕｈ７細胞内のミトコンドリアＤＮＡレベルが、１時間での４，０００から、２時間での７，０００に増大したことを示す。ＡｓＯＲ−ＬＬＯを、複合体化ミトコンドリアと混合したところ、ミトコンドリアＤＮＡは、１時間での６，０００から、２時間での２４，０００に増大した。取込みについて、複合体化ミトコンドリアと競合するように、大モル過剰量のＡｓＯＲを添加したときに、Ｈｕｈ７細胞における、有意なＨＴＣミトコンドリアＤＮＡレベルは存在しなかった。図１４Ｄは、３７℃で複合体化ミトコンドリアと共にインキュベートされたＳＫ  Ｈｅｐ１細胞においてもまた、有意なレベルのＨＴＣミトコンドリアＤＮＡは存在しなかったことを示す。エンドサイトーシスによる取込みは、０℃およびアルカロイドであるコルヒチンの存在下で停止することが公知である。０℃におけるＨｕｈ７細胞（図１４Ｅ）およびコルヒチンで処理されたＨｕｈ７細胞（図１４Ｆ）は、有意なレベルのミトコンドリアＤＮＡを有さなかった。
【０１０７】
結論：ＡｓＯＲ−ＰＬとの複合体の形態にあるミトコンドリアは、Ｈｕｈ７細胞上のＡｓＧ受容体により、特異的に取り込まれることが可能であり、その取込みは、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートと混合した場合、少なくとも４倍に増強されうる。０℃およびコルヒチンの存在下における取込みの欠如は、取込みが、受容体に媒介されたものであるという結論を裏付ける。
【０１０８】
ＨＴＣ  ｍｉｔｏ−ＧＦＰ細胞系
【０１０９】
ミトコンドリア複合体が、細胞に確かに入り、単に細胞表面に接着しているのでないことを検証するために、共焦点顕微鏡法を使用して、細胞を通るＺ−ｓｔａｃｋスライス内のミトコンドリアの場所について検査した。この研究を容易とするために、抗生剤選択圧下、そのミトコンドリア内で、ＧＦＰを安定的に発現させるＨＴＣ細胞系である、ＨＴＣ  ｍｉｔｏ−ＧＦＰを開発した。蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して、蛍光細胞を同定および分取した。図１５に示される通り、ＦＡＣＳは、蛍光細胞を単離することが可能であった。
【０１１０】
標的化ｍｉｔｏ−ＧＦＰミトコンドリアの細胞内局在化
【０１１１】
ＨＴＣ  ｍｉｔｏ−ＧＦＰを、取込み実験のための、ミトコンドリアの供給源として使用した。Ｈｕｈ  ７細胞を、複合体および対照と共に、１２０分間にわたりインキュベートし、ＥＤＴＡ−ＰＢＳで洗浄し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で維持した。６時間後、細胞を、早期エンドソームマーカー（ＥＥＡ１−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４）で染色した。ＧＦＰで標識したＨＴＣミトコンドリア単独と共にインキュベートされたＨｕｈ  ７細胞は、エンドソーム（赤）染色（図１６Ａ１）を示したが、ＧＦＰ染色（図１６Ｂ１）は示さなかった。ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体と共にインキュベートされた細胞は、エンドソーム染色（図１６Ａ２）および一部のＧＦＰ蛍光（図１６Ｂ２）を示した。存在するＧＦＰ染色構造が、合体させた図（図１７Ｄ２）においてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４とオーバーラップしていたことから、ミトコンドリアとエンドソームとの共局在化が示唆された。ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体およびＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートの両方と共にインキュベートされた細胞もまた、エンドソーム染色（図１６Ａ３）と、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４染色にオーバーラップしている（図１７Ｄ３）、かなりのＧＦＰ染色（図１６Ｂ３）とを示した。しかし、合体させた図ではまた、核を取り囲む、大量の非重複ＧＦＰも存在した（図１７Ｄ３）ことから、エンドソームと共局在化しないミトコンドリアの存在が示唆された。
【０１１２】
結論：Ｈｕｈ７細胞と共にインキュベートされたミトコンドリア単独は、検出可能な取込みが明らかではなかった。Ｈｕｈ７細胞と共にインキュベートされたＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体は、ミトコンドリアの、エンドソームとの共局在化を結果としてもたらした。データは、複合体化ミトコンドリアが、細胞内コンパートメントに位置していたことを確実にする。
【０１１３】
ミトコンドリアが、エンドソーム内に存在するなら、蛍光のピークは、細胞内の同じ場所で生じるはずである。細胞を通る平面の深さの関数としての蛍光の２つの波長の強度を測定することにより、ピークの場所を、図２１に示される通りに決定することができた。ミトコンドリアのピーク蛍光、およびエンドソームのピーク蛍光の両方が、同じスタックである、スタック１０で生じたことから、ミトコンドリアとエンドソームとは、共局在化したという結論が裏付けられた。
【０１１４】
（実施例３）
ミトコンドリアの、肝細胞へのターゲティング：ミトコンドリアの、栄養補助剤非含有培地中で成長させた、Ｈｕｈ−７受容体（＋）Ｍｉｔｏ（−）細胞への取込み
【０１１５】
Ｈｕｈ  ７ミトコンドリアＤＮＡまたはＨＴＣおよびラット肝臓ミトコンドリアＤＮＡを、特異的に増幅するように、プライマー３およびプライマー−ＢＬＡＳＴを使用して、プライマーをデザインした（図９）。
【０１１６】
ミトコンドリア毒性についてのモデルを作製するために、２０％の集密度のＨｕｈ  ７細胞およびＳＫ  Ｈｅｐ１細胞を、１０μＭの２’，３’−ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に、３週間にわたり曝露した。ｑＰＣＲにより決定されるミトコンドリアＤＮＡレベルは、時間と共に着実に低下した（図２２）。検出可能なミトコンドリアを欠く細胞を、補充培地中で繁殖させ、ミトコンドリア移植のためのモデルであって、バックグラウンドの宿主ミトコンドリアＤＮＡが存在しないモデルとして使用した。
【０１１７】
アシアロ糖タンパク質であるＡｓＯＲを、ポリリシンに連結して、コンジュゲートであるＡｓＯＲ−ＰＬを作製し、健常ミトコンドリアと複合体化させた。Ｈｕｈ  ７［ＡｓＧＲ（＋）］細胞およびＳＫ  Ｈｅｐ１［ＡｓＧＲ（−）］細胞を、ミトコンドリア毒素で処理して、検出可能なミトコンドリアＤＮＡを欠く、Ｈｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞およびＳＫ  Ｈｅｐ１−Ｍｉｔｏ（−）細胞を形成させた。エンドソーム溶解性ペプチドであるＬＬＯを、ＡｓＯＲにカップリングさせて、ＡｓＯＲ−ＬＬＯを形成させた。複合体化ミトコンドリアおよびＡｓＯＲ−ＬＬＯの、Ｈｕｈ７−ｍｉｔｏ（−）細胞との共インキュベーションは、７日目に、ミトコンドリアＤＮＡを、対照の＞９，７００倍に増大させ（ｐ＜０．００１）、１０日目までに、ミトコンドリアの酸素消費速度を、対照の＞９０％に増大させた。
【０１１８】
ミトコンドリア損傷肝細胞のレスキューは、受容体媒介性エンドサイトーシスを介する、正常なミトコンドリアの標的化取込みにより達成することができる。
【０１１９】
ミトコンドリアＤＮＡを欠くＨｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞およびＳＫ  Ｈｅｐ１−Ｍｉｔｏ（−）細胞を、ミトコンドリア損傷を有する細胞のモデルとして使用した。これらの細胞は、生存するのに、補充培地を必要とする。Ｈｕｈ７  ＡｓＧＲ（＋）細胞の、ターゲティング可能なエンドソーム溶解剤であるＡｓＯＲ−ＬＬＯを加えたＦｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリアへの曝露は、細胞における蛍光レベルおよびミトコンドリアＤＮＡレベルを増大させたが、対照では、そうならなかった（図２３Ａ〜Ｆ）。Ｈｕｈ７  ＡｓＧＲ（＋）細胞の、ターゲティング可能なエンドソーム溶解剤であるＡｓＯＲ−ＬＬＯを加えたＦｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリアへの曝露は、Ｈｕｈ７  Ｍｉｔｏ（−）細胞をレスキューする結果として、栄養補助剤非含有培地中の増殖をもたらした（図２５Ａ）。細胞１個当たりのミトコンドリアＤＮＡの含量および比は、曝露後急速に上昇し、一定を維持したが、対照ではそうならなかった。ＳＫ  Ｈｅｐ１  Ｍｉｔｏ（−）細胞では、レスキューが観察されなかった（図２５Ｂ）。
【０１２０】
実験手順
【０１２１】
タンパク質の調製
【０１２２】
オロソムコイド（ＯＲ）を、既に記載されている（Whitehead PH、Sammons HG.、Biochim Biophys Acta、１９６６年、１２４巻：２０９〜２１１頁）通りに、ヒト血清（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ）から単離した。ＯＲを、ノイラミニダーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）（１２）で脱シアル酸化して、アシアロオロソムコイド（ＡｓＯＲ）を作製し、製造元の指示に従い、ＮＨＳエステル反応（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ  ＵＳＡ）を使用して、蛍光標識であるｄｙｌｉｇｈｔ  ６５０で標識した。ＡｓＯＲおよび蛍光で標識したＡｓＯＲ（Ｆｌ−ＡｓＯＲ）を、カルボジイミド架橋剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）と、個々に反応させた後、２５℃で、２４時間にわたり、０．１Ｍの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ｐＨ６  １ｍｌ中のポリＬ−リシン（ＰＬ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を添加した。過剰量のＰＬは、排除カラム（１０，０００ＭＷＣＯ）（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して除去した。１００μｌのリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）中、１μｇずつのＦｌ−ＡｓＯＲおよびＦｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬの蛍光強度を、ＸＦＬＵＯＲ４ＳＡＦＩＲＥＩＩ  Ｖｅｒｓｉｏｎ：Ｖ  ４．６２ｎ分光光度計により測定した。
【０１２３】
質量分析
【０１２４】
ＡｓＯＲ、Ｆｌ−ＡｓＯＲ、およびＦｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬを、それぞれ、１、０．１、０．０２５、および０．００１ｍｇ／ｍｌに希釈した。製造元の指示に従い、マトリックスである３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸（シナピン酸）（Ｓｅｑｕａｚｙｍ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍａｓｓ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｋｉｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を、対照有りまたは無しで、様々な濃度のタンパク質と混合し、質量分析（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＭＡＬＤＩ）にかけた。
【０１２５】
ミトコンドリアの調製および精製
【０１２６】
哺乳動物細胞用のミトコンドリア単離キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、製造元の指示に従い、ＨＴＣ細胞またはＨｕｈ  ７細胞からミトコンドリアを単離した。ミトコンドリアペレットを、単離キット試薬Ｃで洗浄し、さらなる使用まで、単離キット試薬Ｃ中、氷上で保存した。
【０１２７】
Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体の調製および安定性
【０１２８】
ラット（ＨＴＣ）細胞ミトコンドリア８００μｌ（１．６μｇ／μｌの総ミトコンドリアタンパク質）を、１００μｇのＦｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬまたはＦｌ−ＡｓＯＲタンパク質（５２μｌのＰＢＳ中）と共に、氷上で４５分間にわたりインキュベートした。試料を、４℃、４０００ｒｐｍで、８〜１０分間にわたり、繰り返し遠心し、ミトコンドリア単離キット試薬Ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）中に再懸濁させた。各遠心の後で、ミトコンドリアペレットおよび上清を回収し、蛍光を、６８５ｎｍで測定した。実験は、３連で行い、３回ずつ反復した。結果は、等しい数の細胞当たりの任意の蛍光単位の平均±標準誤差として表した。
【０１２９】
リステリオリシンの調製
【０１３０】
遠心分離デバイス（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ−７０  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔｓ、膜ＮＭＷＬ：３０，０００）を使用して、上清を濃縮し、３リットル（Ｌ）の氷冷蒸留水で洗浄し、４００〜６００ｍｌに濃縮したことを除き、既に記載されている（Walton CM、Wu CH、WuGY.、Protein Expr Purif、１９９９年、１５巻：２４３〜２４５頁）通りに、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）を、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｄ．Ａ．Ｐｏｒｔｎｏｙ、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から精製した。上清を、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラムに通し、精製されたＬＬＯを洗浄し、次いで、ＰＤ−１０カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５Ｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で脱塩した。精製されたＬＬＯは、さらなる使用まで、−２０℃で保管した。ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートは、製造元の指示に従い、ＳＰＤＰ架橋剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して合成した。ＬＬＯ−ＳＰＤＰを、ＤＴＴで還元し、ＰＢＳで平衡化させたＰＤ−１０カラムにより、過剰量のＤＴＴから分離した。還元ＬＬＯ−ＳＰＤＰを、ＡｓＯＲ−ＳＰＤＰと混合し、４℃で、１８時間にわたりインキュベートして、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートを形成させた。タンパク質の最終濃度は、製造元の指示に従い、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ（ＢＩＯ  ＲＡＤ）を使用して測定した。タンパク質の純度およびサイズは、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した。
【０１３１】
溶血アッセイ
【０１３２】
溶血活性を測定するために、様々な濃度のＬＬＯおよびＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートを、ＤＴＴを含むかまたはこれを含まず、および、ｐＨ７．４または５．６の１０μｌ中、約５００万個のヒトＲＢＣと共に、３７℃で、３０分間にわたりインキュベートした。コレステロールの、溶血活性に対する影響は、既に記載されている（Jacobs Tら、Mol Microbiol、１９９８年、２８巻：１０８１〜１０８９頁）通りに決定した。５０％の溶血（ＣＨ５０）に必要とされるタンパク質の量を計算した（Costabile M.、J Vis Exp、２０１０年３月２９日（３７巻）、pii: 1923. doi: 10.3791/1923）。アッセイを、４回の独立した反復（4 independent replicates）で実施し、結果を、蒸留水中のＲＢＣの溶血と比べたパーセントとして表す。
【０１３３】
細胞培養物
【０１３４】
ヒト肝細胞癌細胞である、Ｈｕｈ  ７  ＡｓＧＲ（＋）細胞、ＳＫ  Ｈｅｐ１  ＡｓＧＲ（−）細胞、およびラットＨＴＣ細胞を、抗生剤／抗真菌剤溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）（Choi Jら、Hepatology、２００４年、３９巻：８１〜８９頁）中で維持した。ＧＦＰで標識したミトコンドリアを作製するために、製造元の指示に従い、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＨＴＣ細胞に、ｐＡｃＧＦＰ１−Ｍｉｔｏプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をトランスフェクトした。ｐＡｃＧＦＰ１−ｍｉｔｏプラスミドは、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓに由来する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（ＡｃＧＦＰ）のＮ末端に融合させた、ミトコンドリアターゲティング配列（ヒトチトクロームＣオキシダーゼのサブユニットＶＩＩＩの前駆体に由来する）をコードする。蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して、ＧＦＰで標識した細胞を分離した。ＨＴＣ  ＧＦＰ細胞を、抗生剤／抗真菌剤溶液、１０％のＦＢＳ、および１．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を補充したＤＭＥＭ中で維持した。ＧＦＰによる標識付けは、製造元の指示に従い、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  ＲＥＤ  ＦＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用して決定した。略述すると、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、２００ｎＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  ｒｅｄプローブを、ＨＴＣ  ｍｉｔｏ−ＧＦＰ細胞と共にインキュベートした。細胞を、ＰＢＳで洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドおよびＰＢＳで固定した。標識された細胞を、ＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にマウントし、蛍光顕微鏡イメージングに使用した。
【０１３５】
Ｍｉｔｏ（−）細胞の調製
【０１３６】
ミトコンドリア毒性についてのモデルを作製するために、２０％の集密度のＨｕｈ  ７細胞およびＳＫ  Ｈｅｐ１細胞を、１０μＭの２’，３’−ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に、３週間にわたり曝露した（Chariot P、Drogou Iら、JHepatol、１９９９年、３０巻：１５６〜１６０頁）。細胞を、抗生剤／抗真菌剤溶液、１０％の透析ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ｍｇ／ｍｌのピルビン酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および５０ｍｇ／ｍｌのウリジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＤＭＥＭ（Hashiguchi K、Zhang-Akiyama QM、Methods Mol Biol、２００９年、５５４巻：３８３〜３９１頁）中で維持した。ミトコンドリアＤＮＡレベルは、ｑＰＣＲにより、様々な時点で決定し、検出可能なミトコンドリアＤＮＡを欠く細胞を、Ｍｉｔｏ（−）と名づけた。Ｈｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞およびＳＫ  Ｈｅｐ１−Ｍｉｔｏ（−）細胞は、必要とされるまで、−８０℃で凍結させた。
【０１３７】
ＡｓＧＲ取込みアッセイ
【０１３８】
細胞は、アッセイの２〜３日前に、組織培養プレート上または滅菌カバースリップ上に、５０％の集密度で播種した。９５％集密度になったら、細胞を、ＰＢＳ（Ｍｇ２＋−およびＣａ２＋  −非含有）で洗浄し、高グルコースを含む、リン酸塩非含有ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、１６時間にわたり維持した。製造元の指示に従い、哺乳動物細胞用のミトコンドリア単離キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ミトコンドリアを、ドナー細胞（ＨＴＣ細胞またはＨｕｈ７細胞またはＨＴＣ  ｍｉｔｏ−ＧＦＰ細胞）から単離し、ミトコンドリア単離キット試薬Ｃ中、氷上で保存した。取込みアッセイは、２０μｇ／ｍｌのミトコンドリア単独、４μｇ／ｍｌのＦｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ単独、２５μｌ／ｍｌのＦｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体、２５μｌ／ｍｌのＦｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体＋０．１５μｇ／ｍｌのＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲート、２５μｌ／ｍｌのＦｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体＋２００μｇ／ｍｌのＡｓＯＲ（取込みの４分前に１００倍のモル過剰量を添加）、または２５μｌ／ｍｌのＦｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体＋０．１５μｇ／ｍｌのＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲート＋２００μｇ／ｍｌのＡｓＯＲ（取込みの４分前に１００倍のモル過剰量を添加）のいずれかを添加したＤＭＥＭ、２．８ｍＭのＣａ２＋（Hui Eら、Cell、２００９年、１３８巻：７０９〜７２１頁）中、３７℃または４℃で行った。細胞を、各時点で、または、長時間にわたる実験では２時間後で、氷冷ＰＢＳ（Ｍｇ２＋およびＣａ２＋非含有）中の１０ｍＭのＥＤＴＡ、続いて、氷冷ＰＢＳで、３回洗浄した。細胞を、０．０５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でトリプシン処理し、８００ｒｐｍ、４℃で４分間にわたる遠心分離により回収するか、または２００μｌの溶解緩衝液（緩衝液Ａ、ミトコンドリア単離キット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解させた。溶解させた細胞における、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬの蛍光強度は、ＸＦＬＵＯＲ４ＳＡＦＩＲＥＩＩ  Ｖｅｒｓｉｏｎ：Ｖ  ４．６２ｎ分光光度計を使用して測定した。ｑＰＣＲにより、ドナーミトコンドリアＤＮＡレベルを決定および定量するのに、トリプシン処理した細胞または細胞溶解物を使用した。実験は、３連で、少なくとも３回ずつ反復して行い、平均±標準誤差は、等しい数の細胞当たりの任意の蛍光単位として表した。
【０１３９】
エンドサイトーシスの阻害剤
【０１４０】
コルヒチンの影響を決定するために、細胞を、１μＭのコルヒチンと共に、取込みの前および取込みアッセイ中、２時間にわたりインキュベートした（Piasek A、Thyberg J.、JCell Biol、１９７９年、８１巻：４２６〜４３７頁）。低温の影響を決定するために、氷冷のリン酸塩および重炭酸塩非含有ＤＭＥＭを使用して、４℃で、取込み研究を実施した。
【０１４１】
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
【０１４２】
ミトコンドリアの取込みを測定するために、プライマー３（Untergasser Aら（et al., a, al,）、Nucleic Acids Res、２０１２年、４０巻：ｅ１１５頁）およびプライマー−ＢＬＡＳＴ（Ye Jら、BMC Bioinformatics、２０１２年、１３巻：１３４頁）を使用し、ヒトＨｕｈ  ７ミトコンドリアＤＮＡまたはラット肝臓（ＨＴＣ）ミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅して、ドナーミトコンドリアを、宿主細胞ミトコンドリアから識別するように、プライマー（表１）をデザインした。プライマーの特異性は、製造元の指示に従い、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて、Ｈｕｈ  ７細胞およびＨＴＣ細胞から抽出されたＤＮＡを使用して、ＰＣＲにより決定した。
【０１４３】
ｑＰＣＲによる、ミトコンドリアおよび核ＤＮＡの定量
【０１４４】
取込み研究のために、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、全細胞ＤＮＡを単離し、製造元の指示に従い、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いるｑＰＣＲにより、ミトコンドリアＤＮＡレベルを定量した。ヒト乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨＡ）特異的プライマーを使用して、ヒトＬＤＨＡのＤＮＡレベルを定量し、結果を使用して、ミトコンドリアＤＮＡレベルを正規化した（表１）。ｑＰＣＲ条件は、５０℃で２分間および９５℃で１０分間の１サイクル；９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の４０サイクルに続く、５５℃で１０分間の１サイクルであった。溶融曲線は、各ｑＰＣＲ後に得、反応の特異性は、以下の条件下で解析した：９５℃で１５秒間、６０℃で１５秒間、および９５℃で１５秒間。アッセイは、３回の独立した反復を繰り返し（repeated with 3 independent replicates）、結果は、非処置対照と比較した、細胞内のミトコンドリアＤＮＡレベルの倍数変化としての平均±標準誤差、および細胞１個当たりのミトコンドリアＤＮＡコピー数の推定値として表した。
【０１４５】
細胞増殖アッセイ
【０１４６】
細胞を、取込み後、２時間にわたり、抗生剤／抗真菌剤溶液、１％の透析ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で維持した。ＤＮＡレベルは、各時点において、製造元の指示に従い、ＣｙＱＵＡＮＴ細胞増殖アッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で決定した。実験は、３連で行い、２回ずつ反復した。結果は、等しい数の細胞当たりの任意の蛍光強度単位についての平均±標準誤差として表した。
【０１４７】
共焦点顕微鏡法
【０１４８】
ＡｓＯＲ−ＰＬ−Ｍｉｔｏ−ＧＦＰ複合体、Ｍｉｔｏ−ＧＦＰ、およびＡｓＯＲ−ＰＬ−Ｍｉｔｏ−ＧＦＰ複合体＋ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートを、細胞と共に、個々に、３７℃で、２時間にわたりインキュベートした。細胞を、ＥＤＴＡ−ＰＢＳで洗浄し、抗生剤／抗真菌剤溶液および１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で、６時間にわたり維持した。細胞を、４％のパラホルムアルデヒドで、３０分間にわたり固定し、ＰＢＳ中０．２５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、１０分間にわたり透過性を上げた後、２５℃で、１時間にわたりブロッキング溶液（１％のヤギ血清、５％のＢＳＡ、０．３Ｍのグリシン）で処理した。細胞を、抗ＥＥＡ１抗体［１Ｇ１１］（早期エンドソームマーカー）（Ａｂｃａｍ  Ｉｎｃ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）と共に、４℃で、一晩にわたりインキュベートした。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４ヤギ抗マウス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）二次抗体を、１時間にわたり添加した。核を、ＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、２０分間にわたり染色した。細胞をマウントし、共焦点顕微鏡下でイメージングし、画像を、Ｉｍａｇｅ  Ｊで解析した。一次抗体を伴わない細胞を、対照として用いた。Ｚ平面内の、エンドソームおよびミトコンドリアの局在化を決定するために、４つの領域を、共焦点顕微鏡法で撮影された画像上で、ランダムに選択し、ＧＦＰおよびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４の強度を、画像のＺ−ｓｔａｃｋの各スライスから測定した。強度を、スライス番号に対してプロットした。ＧＦＰおよびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４の両方が近接することによる高蛍光強度は、Ｚ平面内の、ＨＴＣミトコンドリアと、早期エンドソームとの共局在化を表すと理解された。
【０１４９】
３７℃で、１時間にわたる、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬの取込みの後、細胞を、４％のパラホルムアルデヒドで、１０分間にわたり固定し、ＤＡＰＩで、２０分間にわたり染色した。細胞をマウントし、蛍光顕微鏡下でイメージングし、単一の波長として提示し、波長画像として合体させた。
【０１５０】
ミトコンドリア呼吸アッセイ
【０１５１】
細胞は、取込みアッセイの２日前に、ＸＦ２４細胞培養マイクロプレート（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｏｒｔｈ  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）に播種した。複合体化ミトコンドリアおよび対照を、細胞と共に、２時間にわたりインキュベートした。細胞を洗浄し、製造元の指示に従い、様々な時点で、ＸＦ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｔｏ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｋｉｔ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｏｒｔｈ  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用して実施される呼吸アッセイのために、抗生剤／抗真菌剤溶液、１％の透析ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で維持した。ＤＮＡレベルに対して正規化された、ウェル１つ当たりの酸素消費速度（ＯＣＲ）を決定した。アッセイは、３連で実施し、結果は、各時点におけるＤＮＡレベル当たりのピコモル／分単位による、群１つ当たりのＯＣＲについての、平均±標準誤差として表した。
【０１５２】
結果
【０１５３】
ミトコンドリアに結合するアシアロ糖タンパク質コンジュゲート
【０１５４】
アシアロオロソムコイド（ＡｓＯＲ）を蛍光標識し（Ｆｌ−ＡｓＯＲ）、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬ）に、共有結合によって連結し、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬを作製した。精製の後、ＡｓＯＲおよびＡｓＯＲ−ＰＬは、蛍光標識されていることが示された（図３）。質量分析データは、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ分子１つ当たり、平均２つの蛍光タグおよび２つのＰＬ鎖が結合していることを示した（図４）。アガロースゲルは、ＡｓＯＲおよびＦｌ−ＡｓＯＲは、負に帯電していることを示した。しかし、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬは、正に帯電していた（図５）。
【０１５５】
結論：ポリリシンなどのポリカチオンの共有結合による連結により、ＡｓＯＲなど、負に帯電した糖タンパク質を、正に帯電した糖タンパク質に転換することができる。
【０１５６】
ＰＬの、ＡｓＯＲへの化学的連結が、ＡｓＧ受容体によるＡｓＯＲの認識を変更しえたかどうかについて調べるため、［ＡｓＧ受容体（＋）］細胞、ＳＫ  Ｈｅｐ１［ＡｓＧ受容体（−）］細胞を使用して、ＡｓＯＲ−ＰＬの、ＡｓＧ受容体への結合について研究した。Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬを、細胞と共に、３７℃で１時間（ｈ）にわたりインキュベートし、蛍光顕微鏡法を実施した。ＤＡＰＩを使用して、核を、ＡｓＯＲの色（赤）と比較して異なる色（緑）に染色した。Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬと共にインキュベートされたＨｕｈ７［ＡｓＧ受容体（＋）］細胞は、多数の小型で赤色の斑点状構造を結果としてもたらした（図６上左パネル）。一部の構造が、下パネルに示された核を取り囲んでいたことから、これらの構造は、細胞内にあり、サイズは、エンドソーム小胞を示唆したことが指し示された（図６下左パネル）。これに対し、ＳＫ  Ｈｅｐ１［ＡｓＧ受容体（−）］細胞は、検出可能な小型で赤色の斑点状構造を欠いた（図６上右および下右パネル）。
【０１５７】
結論：斑点状のパターンは、ＡｓＯＲ−ＰＬの、エンドソームへの侵入と符合する。蛍光は、Ｈｕｈ７［ＡｓＧ受容体（＋）］細胞においてのみ出現し、ＳＫ  Ｈｅｐ１［ＡｓＧ受容体（−）］細胞では出現しなかったが、これは、ＡｓＯＲ−ＰＬの、ＡｓＧ受容体による取込みと符合する。
【０１５８】
単離ＨＴＣ（ラット）ミトコンドリアを、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬと混合して、複合体を形成させた。Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体の安定性は、新鮮培地中での複合体の遠心分離および再懸濁の反復により決定した。図１Ａに示す通り、ペレット化したミトコンドリアと関連するＦｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬの蛍光は、２回目の遠心の後で、約１５％減少し、次いで、３回の遠心を通して、約２７，０００単位で、一定を維持した。これに対し、ミトコンドリアを、Ｆｌ−ＡｓＯＲ（ＰＬを欠く）と混合した後における、ミトコンドリアペレットと関連する蛍光は、有意に低度な４，０００単位であった。上清は、１回目の遠心の後で、Ｆｌ−ＡｓＯＲ単独の蛍光の＞９０％を含有したが、２回目および３回目の遠心の後のペレット化したミトコンドリアでは、もはや、蛍光は検出されなかった（図７Ａ）。ミトコンドリアと混合されたＦｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬの上清中の蛍光は、１回目の遠心後に、上清中で、３２０００単位から７９００単位に、２４％まで減少し、後続の遠心においても、低量のままであった（図７Ｂ）。結論：これらのデータは、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬがミトコンドリアに結合したこと、および結合が再懸濁および遠心分離の条件下で安定的であったことを示唆する。ミトコンドリア単独についての粒子サイズ解析が、７００±５７．８ｎｍの平均直径を明らかにしたのに対し、精製されたＦｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体は、１０００±６２ｎｍの平均直径を有した（図８）。結論：インキュベーションに続く、遠心分離および再懸濁の反復は、平均直径が、ミトコンドリア単独の平均直径より約３０％大きいＦｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体を結果としてもたらした。直径が、７００ｎｍの倍数でなかったという事実は、サイズの増大が、ミトコンドリアの凝集に起因したものではなかったことを示唆する。
【０１５９】
ＡｓＧＲによる、ミトコンドリアの、肝細胞への特異的なターゲティング
【０１６０】
複合体化ミトコンドリアが、ＡｓＧＲにより認識されうるかどうかを決定するために、Ｈｕｈ  ７細胞およびＳＫ  Ｈｅｐ１細胞を、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体、ミトコンドリア単独、Ｆｌ−ＡｓＯＲタンパク質単独、または過剰量のＡｓＯＲを有するＦｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体と共に、個々に、３７℃でインキュベートした。Ｆｌ−ＡｓＯＲ単独と共にインキュベートされたＨｕｈ  ７  ＡｓＧＲ（＋）細胞における蛍光レベルは、１５分で、約１５，０００単位であり、６０分で、２０，０００単位超に、有意に（ｐ＜０．００１）増大した（図１０Ａ）。同様に、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体と共にインキュベートされたＨｕｈ  ７細胞における蛍光は、１５分で、２０，０００単位であり、６０分で、３５，０００単位超に、有意に（ｐ＜０．００１）増大した。予期される通り、ミトコンドリア単独のインキュベーション後のＨｕｈ  ７細胞では、蛍光は検出されなかった。Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体の中の大モル過剰量のＡｓＯＲは、１５分および６０分の両方において、Ｈｕｈ  ７細胞における蛍光レベルを、２，５００単位未満に低下させた（図２Ａ）。ＳＫ  Ｈｅｐ１  ＡｓＧＲ（−）細胞における蛍光は、全ての条件下で、ほとんど検出可能でなかった（図１０Ｂ）。結論：Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体と関連する蛍光は、ＡｓＧＲ（＋）細胞でのみ増大し、ＡｓＧＲ（−）細胞では増大しなかった。過剰量の遊離ＡｓＯＲによる競合は、ＡｓＧＲの関与を裏付ける。
【０１６１】
しかし、蛍光タグを、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬキャリア上に存在していたため、ミトコンドリアなしのキャリア単独を内部移行させることが可能であった。複合体化ミトコンドリアが、Ｈｕｈ  ７細胞により、実際に取り込まれたかどうかを決定するために、プライマーをデザインした（表１）ところ、ラットミトコンドリアＤＮＡを、Ｈｕｈ  ７（ヒト）ミトコンドリアＤＮＡから特異的に識別することが示された（図９）。Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体と共にインキュベートされたＨｕｈ  ７細胞は、１５分で、無処理細胞と比較して、ＨＴＣミトコンドリアＤＮＡレベルの９９０倍である、細胞１個当たり約６〜１４個のＨＴＣミトコンドリア（ミトコンドリア１個当たりのミトコンドリアＤＮＡの報告コピー数に基づく）という有意な（ｐ＜０．００４）増大を結果としてもたらし、６０分で、これを、２倍超（細胞１個当たり約１４〜３６個のＨＴＣミトコンドリア）に増大させた（ｐ＜０．００１）（図１０Ｃ）。ミトコンドリア単独またはＦｌ−ＡｓＯＲ単独のいずれかと共にインキュベートされたＨｕｈ  ７細胞は、有意なＨＴＣミトコンドリアＤＮＡレベルを有さなかった。Ｈｕｈ  ７細胞の、過剰量の遊離ＡｓＯＲを伴う、Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体への曝露は、過剰量のＡｓＯＲを伴わない複合体より７６％（ｐ＜０．００１）低いＨｕｈ  ７細胞におけるＨＴＣミトコンドリアＤＮＡレベルを結果としてもたらした。これに対し、ＳＫ  Ｈｅｐ１細胞におけるＨＴＣミトコンドリアＤＮＡレベルは、いかなる条件下でも、ほとんど検出可能でなかった（図１０Ｄ）。結論：データは、複合体化ミトコンドリアのＡｓＯＲ−ＰＬ成分だけでなく、複合体の形態にあるＨＴＣドナーミトコンドリアＤＮＡにより決定される通り、ミトコンドリア自体も、ＡｓＧＲにより特異的に媒介されるＨｕｈ  ７細胞により取り込まれたことを示唆する。
【０１６２】
エンドソーム溶解剤および肝細胞におけるミトコンドリアの細胞質送達
【０１６３】
ＡｓＧＲ媒介性エンドサイトーシスは、分解経路である。したがって、Ｈｕｈ  ７細胞により内部移行されたミトコンドリアは、リソソーム酵素により消化されることが予期される（図１）。リソソームによる消化の前における、内部移行したミトコンドリアの、エンドソームから細胞質への脱出を容易とするために、エンドソーム内に存在する条件下で、エンドソーム膜に小孔を施す細菌タンパク質であるリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）を利用した。このような小孔は、内容物を細胞質に放出するエンドソームの破裂を結果としてもたらす（図１１）。ＬＬＯを、肝細胞エンドソームにターゲティングするために、ジスルフィドリンカーを使用してＡｓＯＲをＬＬＯに化学的にカップリングさせた、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートの、エンドソームの還元条件下での切断を可能とした（図１２）。エンドソーム内の還元条件を模擬するＤＴＴの存在下で、ＡＳＯＲ−ＬＬＯを、その構成要素に完全に切断した。膜破壊活性の尺度としての溶血を使用したところ、ｐＨ５．６におけるＬＬＯ単独は、赤血球の３２．８％の溶血を結果としてもたらし、これは、還元剤であるＤＴＴの存在下で、８８．６％に、有意に（ｐ＜０．００１）増大した（表２）。
【０１６４】
ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートが、肝細胞への、ミトコンドリアの細胞質内送達を増強しえたかどうかを決定するために、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲート有りまたは無しで、Ｈｕｈ  ７細胞およびＳＫ  Ｈｅｐ１細胞を使用して、複合体化ミトコンドリアの取込みアッセイを実施した。Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体単独とのインキュベーション後、Ｈｕｈ  ７細胞における蛍光レベルは、１５分で、１３，４００単位であり、１２０分で、３０，０００単位超に増大した（図１４Ａ）。しかし、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートの、複合体化ミトコンドリアとの共投与は、Ｈｕｈ  ７細胞における蛍光レベルを、１５分での１３，０００単位から、１２０分で約５０，０００単位に、有意に（ｐ＜０．００１）増大させた。大モル過剰量のＡｓＯＲのプレインキュベーションは、ＡｓＯＲ−ＬＬＯ有りまたは無しで、複合体化ミトコンドリアに曝露されたＨｕｈ  ７細胞における蛍光の＞９０％の低下を結果としてもたらした。これに対し、ＳＫ  Ｈｅｐ１細胞は、いかなる条件下または時点においても、有意なレベルの蛍光を有さなかった（図１４Ｂ）。ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートの、複合体化ミトコンドリアとの共投与はまた、Ｈｕｈ  ７細胞におけるＨＴＣミトコンドリアＤＮＡレベルの、１５分での、非処置対照の１１０倍（細胞１個当たり約１〜２個のＨＴＣミトコンドリア）から、１２０分で約２３，８００倍（細胞１個当たり約１４０〜３４０個のＨＴＣミトコンドリア）への有意な（ｐ＜０．００１）増大も結果としてもたらした（図１４Ｃ）。Ｆｌ−ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体単独のインキュベーションは、Ｈｕｈ  ７細胞内のＨＴＣミトコンドリアＤＮＡレベルの、１５分で、非処置対照の６９０倍（ｐ＜０．００４）（細胞１個当たり約４〜１０個のＨＴＣミトコンドリア）から、１２０分で７，５００倍（ｐ＜０．００１）（細胞１個当たり約４０〜１１０個のＨＴＣミトコンドリア）への、有意であるが低度な増大をもたらした。過剰量のＡｓＯＲとのインキュベーションは、ＡｓＯＲ−ＬＬＯ有りまたは無しで、複合体化ミトコンドリアに曝露されたＨｕｈ  ７細胞におけるＨＴＣミトコンドリアＤＮＡレベルを、７５％低下させた。いかなる条件下でも、ＳＫ  Ｈｅｐ１細胞では、有意なレベルのＨＴＣミトコンドリアＤＮＡは見出されなかった（図１４Ｄ）。０℃におけるＨｕｈ７細胞（図１４Ｅ）およびコルヒチンの存在下におけるＨｕｈ７細胞（図１４Ｆ）は、有意なレベルのミトコンドリアＤＮＡを有さなかった。
【０１６５】
内部移行されたミトコンドリアの局在化
【０１６６】
複合体化ミトコンドリアの細胞内の分布を決定するために、ＧＦＰで標識したミトコンドリアを安定的に発現させる細胞系であるＨＴＣ  Ｍｉｔｏ−ＧＦＰを、取込み実験のための、ミトコンドリアの供給源として使用した。ＧＦＰで標識したミトコンドリアを安定的に発現させるＨＴＣ細胞を、ＦＡＣＳで分取して、ＨＴＣ  ｍｉｔｏ−ＧＦＰ細胞系を確立し、これを、その後、選択のために、１．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８培地中で維持した（図１５）。Ｈｕｈ  ７細胞を、複合体および対照と共に、１２０分間にわたりインキュベートし、ＥＤＴＡ−ＰＢＳで洗浄し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で維持した。６時間後、細胞を、早期エンドソームマーカー（ＥＥＡ１−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４）で染色した。ＧＦＰで標識したＨＴＣミトコンドリア単独と共にインキュベートされたＨｕｈ  ７細胞は、エンドソーム染色（図１６Ａ１）を示したが、ＧＦＰ染色（図１６Ｂ１）は示さなかった。ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体と共にインキュベートされた細胞は、エンドソーム染色（図１６Ａ２）およびある程度のＧＦＰ蛍光（図１６Ｂ２）を示した。存在するＧＦＰ染色構造が、合体させた図において、ＧＦＰおよびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４がオーバーラップすること（黄）を明らかにした（図１７Ｄ２）ことから、ミトコンドリアとエンドソームとの共局在化が示唆された。ＧＦＰとＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４との共局在化は、ランダムな視野からの細胞画像のＺ軸における蛍光プロットの強度により、さらに裏付けられた（図１８）。ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア複合体およびＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートの両方と共にインキュベートされた細胞もまた、エンドソーム染色（図１６Ａ３）と、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４染色にオーバーラップする（図１７Ｄ３）、ある程度のＧＦＰ染色（図１６Ｂ３）とを示した。しかし、合体させた図ではまた、核を取り囲む、大量のオーバーラップしていないＧＦＰも存在した（図１７Ｄ３）ことから、エンドソームと共局在化しないミトコンドリアの存在が示唆された。早期エンドソームマーカーＥＥＡ１およびＧＦＰ−ミトコンドリアの蛍光強度についてのプロットは、ＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア−ＧＦＰ複合体との、３７℃でのインキュベーションの６時間で、Ｈｕｈ  ７細胞の、ＥＥＡ１についての共焦点顕微鏡画像のピークスタック番号と、ＧＦＰについての共焦点顕微鏡画像のピークスタック番号との一致を示した（図１８）。結論：ＡｓＯＲ−ＬＬＯの非存在下では、ミトコンドリアと会合したＧＦＰは、エンドソームマーカーと共局在化した。ＡｓＯＲ−ＬＬＯの、複合体化ミトコンドリアとの共投与が、ＧＦＰとエンドソームマーカーとの分離を結果としてもたらしたことから、ミトコンドリアの、エンドソームからの脱出が裏付けられた。
【０１６７】
Ｈｕｈ７細胞と共に、３７℃で２時間にわたりインキュベートされ、次いで、添加剤を含まない培地中で、６時間にわたりインキュベートされたミトコンドリア−ＧＦＰ単独の別の例を、図１８に示す。細胞を、核についてＤＡＰＩで、および早期エンドソームマーカーについてＥＥＡ１−Ａｌｅｘａ  ５９４で染色した。図１８Ａは、エンドソーム染色を示したが、ＧＦＰ染色を示さなかった（図１８Ｂ）。図１８Ｃは、ＤＡＰＩ核を示し、図１８Ｄは、合体させた図を示す。
【０１６８】
Ｈｕｈ７細胞と共に、３７℃で２時間にわたりインキュベートされ、次いで、添加剤を含まない培地中で、６時間にわたりインキュベートされたＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア−ＧＦＰの別の例を、図１９に示す。エンドソーム染色が認められ（図１９Ａ）（抗ＥＥＡ１−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４）、ある程度のＧＦＰ染色が認められた（図１９Ｂ）。しかし、合体させた図である図１８Ｄは、図１９Ｂにおいて認められるＧＦＰ染色が、ＥＥＡ１−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４と合体している（merged with）ことを示した（図１９Ｄ）。
【０１６９】
Ｈｕｈ７細胞と共に、３７℃で２時間にわたりインキュベートされ、次いで、添加剤を含まない培地中で、６時間にわたりインキュベートされたＡｓＯＲ−ＰＬ−ミトコンドリア−ＧＦＰおよびＡＳＯＲ−ＬＬＯの別の例を、図２０に示す。エンドソーム染色が認められ（図２０Ａ）、かなりのＧＦＰ染色が存在した（図２０Ｂ）。しかし、ＧＦＰ染色の大部分は、ＥＥＡ１−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４と合体しなかった（合体させた図２０Ｄ）。
【０１７０】
複合体化ミトコンドリアの、Ｍｉｔｏ（−）細胞への曝露の後における、ＡｓＧ関連蛍光レベルおよびミトコンドリアＤＮＡレベルの変化
【０１７１】
ミトコンドリアＤＮＡを欠くＨｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞およびＳＫ  Ｈｅｐ１−Ｍｉｔｏ（−）細胞は、細胞の、ｄｄＣとのインキュベーションにより作製した。ミトコンドリアＤＮＡは、低下し、９日目までに、ＰＣＲにより検出不能となった（図２２）。これらの細胞は、生存するための、補完的栄養物質を含有する補充培地を必要とした。複合体化させた、Ｈｕｈ  ７由来のミトコンドリア単独の、Ｈｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞への投与は、蛍光レベルの、６０分での６，４００単位から、１２０分で１１，０００単位超への、有意な（ｐ＜０．０１）増大を結果としてもたらした。複合体化ミトコンドリアの、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートとの共投与の後で、Ｈｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞における蛍光レベルは、６０分での１４，０００単位から、１２０分で３０，０００単位超に、有意に（ｐ＜０．００１）増大した。これらの蛍光レベルは、過剰量のＡｓＯＲとのインキュベーションの後で、＞９０％低下した（図２３Ａ）。しかし、Ｈｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞における蛍光レベルは、安定せず、１２時間での７，０００単位から、７日までに、３００単位に低下し続けた。複合体化ミトコンドリアと、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートとの共投与は、蛍光レベルの、１２時間での２７，０００単位から、１０日で１１，０００単位への低下を結果としてもたらした（図２３Ｂ）。過剰量のＡｓＯＲは、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲート有りまたは無しで、複合体化ミトコンドリアに曝露した後のＨｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞において、有意なレベルの蛍光を結果としてもたらさなかった。ＳＫ  Ｈｅｐ１−Ｍｉｔｏ（−）細胞において、いかなる条件下においても、有意な蛍光が認められなかった（図２３Ｃおよび図２３Ｄ）。結論：ＡｓＯＲ−ＬＬＯの、複合体化ミトコンドリアとの共投与は、タンパク質標識およびミトコンドリアＤＮＡの両方により測定される取込みを増大させた。
【０１７２】
複合体化ミトコンドリアの、Ｍｉｔｏ（−）細胞への曝露の後における、ＡｓＧ関連蛍光レベルおよびＤＮＡレベルの変化
【０１７３】
ミトコンドリアＤＮＡレベルが、蛍光と同様の様式で低下したかどうかを決定するために、Ｈｕｈ  ７のミトコンドリアＤＮＡレベルを、ｑＰＣＲによりアッセイした。蛍光データとは対照的に、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートと共に、Ｈｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞に共投与された複合体化ミトコンドリアは、１２時間で、ミトコンドリアＤＮＡレベルの、対照の５，３００倍（細胞１個当たり３０〜７０個のミトコンドリア）から、７日における、対照の９，７００倍（細胞１個当たり６０〜１４０個のミトコンドリア）超（ｐ＜０．００１）への、有意な（ｐ＜０．００１）増大を結果としてもたらし、栄養補助剤非含有培地中、最大１０日まで、安定を維持した。ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートの非存在下における、複合体化ミトコンドリアへの曝露は、１２時間で、対照の９００倍のミトコンドリアＤＮＡレベル（細胞１個当たり５〜１０個のミトコンドリア）を結果としてもたらし、２４時間では、ほとんど検出可能なレベルをもたらさなかった（図２３Ｅ）。ＳＫ  Ｈｅｐ１−Ｍｉｔｏ（−）細胞におけるミトコンドリアＤＮＡレベルは、いかなる条件下でも、ほとんど検出可能でなかった（図２３Ｆ）。結論：複合体化ミトコンドリアと、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートとの共投与後において、タンパク質マーカーは減少したが、ミトコンドリアＤＮＡレベルは増大したことから、タンパク質キャリアの細胞内運命と、内部移行されたミトコンドリアの細胞内運命とは、内部移行後８時間以内のある時点における、２つの成分の分離におそらく起因して異なることが指し示される。
【０１７４】
複合体化ミトコンドリアに曝露されたＭｉｔｏ（−）細胞の細胞増殖
【０１７５】
Ｍｉｔｏ（−）細胞によるミトコンドリアの取込みが、栄養補助剤非含有培地中の細胞増殖に影響を及ぼしたかどうかを決定するために、細胞数を、複合体化ミトコンドリアへの曝露の後における、時間の関数としての細胞ＤＮＡによりアッセイした。Ｍｉｔｏ（−）細胞からの補充培地の除去は、Ｈｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）およびＳＫ  Ｈｅｐ１−Ｍｉｔｏ（−）の両方について、ミトコンドリアＤＮＡの８５％の低下を結果としてもたらした。Ｍｉｔｏ（＋）細胞は、正常に成長した（図２４）。複合体化ミトコンドリアと、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートとの共投与は、１０日までに、細胞ＤＮＡの、ベースラインの３．５倍の有意な増大（ｐ＜０．００１）を結果としてもたらした（図２５Ａ）。これに対し、無処理細胞では、ＤＮＡは、ベースラインの０．０３倍に減少した（ｐ＜０．００４）。いずれの条件下でも、ＳＫ  Ｈｅｐ１−Ｍｉｔｏ（−）細胞の数は、減少した（図２５Ｂ）。データは、複合体化ミトコンドリアと、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートとの、Ｈｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞への共投与は、栄養補助剤非含有培地中の細胞数を増大させることを示唆した。レスキューされたＨｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞を増殖させ、栄養補助剤非含有培地中で、少なくとも８週間にわたり継代培養した（データは示さない）。
【０１７６】
複合体化ミトコンドリアに曝露されたＭｉｔｏ（−）細胞の好気性呼吸
【０１７７】
移植されたミトコンドリアが、機能的であるとすれば、それらは、レシピエント細胞の酸素消費に影響を及ぼすはずである。したがって、酸素消費速度（ＯＣＲ）を測定して、細胞におけるミトコンドリア呼吸レベルを定量した。Ｈｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞およびＳＫ  Ｈｅｐ１−Ｍｉｔｏ（−）細胞が、測定可能なミトコンドリア呼吸を示さなかったのに対し、Ｈｕｈ  ７細胞およびＳＫ  Ｈｅｐ１細胞は、高度な基礎ＯＣＲを示したが、これは、オリゴマイシン、カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニル−ヒドラゾン（ＦＣＣＰ）、およびロテノンの添加により変化し、ミトコンドリア呼吸と符合した（図２６Ａ）。複合体化ミトコンドリアと、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートとの、Ｈｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞への共投与の１２時間後において、ＯＣＲの、親Ｍｉｔｏ（＋）細胞と比較した７０％への増大が存在した。この増大は、大モル過剰量のＡｓＯＲにより遮断された（図２６Ｂ）。複合体化ミトコンドリアと、ＡｓＯＲ−ＬＬＯコンジュゲートとの共投与の１０日後において、Ｈｕｈ  ７−Ｍｉｔｏ（−）細胞は、親Ｈｕｈ  ７細胞のものと同等な（＞９０％）、細胞１個当たりのミトコンドリア呼吸レベルを有した（図２６Ｃ）。
【０１７８】
考察
【０１７９】
本実施例は、ミトコンドリアを、特異的な細胞型による取込みについてターゲティングすることができること、およびエンドソーム溶解性タンパク質の共内部移行が、機能的なミトコンドリアの細胞内放出を結果としてもたらすことができることを示す。ＡｓＧＲ（＋）細胞の、単離されたミトコンドリア単独への曝露、および複合体化ミトコンドリアの、ＡｓＧＲ（−）細胞への曝露の両方が、同一の条件下における内部移行を結果としてもたらさなかったという事実により、観察されるミトコンドリアの内部移行は、単に食作用に起因するものではなかったことが指し示される。ミトコンドリアの、ＡｓＧＲ（＋）Ｍｉｔｏ（−）細胞への、標的化移植についてのデータは、これらの細胞が、栄養補助剤非含有培地中で生存することが可能であるだけでなく、増殖することも可能であることを示した。細胞１個当たりのミトコンドリアＤＮＡの量もまた、増大した。
【０１８０】
低ｐＨにおける、ミトコンドリアの、ＬＬＯコンジュゲートへの曝露は、還元条件の非存在下では、ミトコンドリア膜の有意な損傷を引き起こさなかった。還元条件と、低ｐＨとの組合せが、試験管内で、ある程度のミトコンドリア膜の損傷を結果としてもたらしたことから、放出されると、ＬＬＯは、濃度依存的な様式で、ミトコンドリア膜を損傷しうることが示唆される。しかし、複合体化ミトコンドリアと、ＬＬＯコンジュゲートとの共内部移行が、酸素消費が正常な内部移行ミトコンドリアを結果としてもたらしたという事実は、標的化ミトコンドリアへの損傷が生じていた場合、影響は、これらのミトコンドリアが、宿主細胞のエネルギー要求を満たすことを妨げるのに十分でなかったことを示唆する。
【０１８１】
バックグラウンドの宿主ミトコンドリアＤＮＡを最小化することに加えて、ｄｄＣの使用は、実薬誘導性ミトコンドリア毒性についてのモデルとしての働きをした。ｄｄＣは、最初はＦＤＡにより承認され、ミトコンドリア損傷に起因する実質的な副作用が観察されるまで、臨床的に使用されていたが、現在では、その使用が大幅に制限されている薬剤である。モデルの限界は、最新の研究におけるミトコンドリア損傷の程度が、臨床的な薬物反応において典型的に観察される程度を超えるということである。しかし、標的化ミトコンドリア移植は、検出可能な既存のミトコンドリアＤＮＡを伴わずに、細胞をレスキューすることが可能であったという事実は、極端な毒性が少ない、細胞内の標的化ミトコンドリア移植であれば、薬物誘導性ミトコンドリア毒性の作用からの、少なくとも同様のレスキューを結果としてもたらしうることを示唆する。
【０１８２】
培養中の肝細胞による、複合体化ミトコンドリアおよび標的化エンドソーム溶解剤の共内部移行は、そのミトコンドリアが、薬物毒性により損傷された細胞をレスキューすることが可能な、機能的なミトコンドリアの内部移行を結果としてもたらしうる。このような移植システムは、正常状態および病理学的状態におけるミトコンドリアの増殖および機能の調節についての研究において有用でありうる。
【０１８３】
他の実施形態
【０１８４】
前出の記載は、本発明の例示的な実施形態だけを開示する。
【０１８５】
本発明について、その詳細な記載と共に記載してきたが、前出の記載は、付属の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を例示することを意図するものであり、限定することを意図するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および改変は、付属の特許請求の範囲内にある。したがって、本発明のある特定の特色だけについて例示および記載してきたが、当業者は、多くの改変および変更に想到する。したがって、付属の特許請求の範囲は、本発明の真の精神の範囲内に収まるものとして全てのこのような改変および変更を包含することを意図することを理解されたい。
【図１】
2018507865.tif 000005
【図２】
2018507865.tif 000006
【図３】
2018507865.tif 000007
【図４】
2018507865.tif 000008
【図５】
2018507865.tif 000009
【図６】
2018507865.tif 000010
【図７】
2018507865.tif 000011
【図８】
2018507865.tif 000012
【図９】
2018507865.tif 000013
【図１０−１】
2018507865.tif 000014
【図１０−２】
2018507865.tif 000015
【図１１】
2018507865.tif 000016
【図１２】
2018507865.tif 000017
【図１３】
2018507865.tif 000018
【図１４−１】
2018507865.tif 000019
【図１４−２】
2018507865.tif 000020
【図１４−３】
2018507865.tif 000021
【図１５】
2018507865.tif 000022
【図１６】
2018507865.tif 000023
【図１７】
2018507865.tif 000024
【図１８】
2018507865.tif 000025
【図１９】
2018507865.tif 000026
【図２０】
2018507865.tif 000027
【図２１】
2018507865.tif 000028
【図２２】
2018507865.tif 000029
【図２３−１】
2018507865.tif 000030
【図２３−２】
2018507865.tif 000031
【図２３−３】
2018507865.tif 000032
【図２４】
2018507865.tif 000033
【図２５】
2018507865.tif 000034
【図２６−１】
2018507865.tif 000035
【図２６−２】
2018507865.tif 000036
【配列表】
2018507865000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成29年10月25日(2017.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018507865000001.app
【国際調査報告】
2018507865.tif 000039
2018507865.tif 000040