(57)【要約】  本明細書に提供されるのは、繋留型ムチンタンパク質であるMUC16のグリコシル化形態に免疫特異的に結合する抗体に関する組成物、方法、及び使用である。また本明細書に提供されるのは、癌などの障害を管理、治療、又は予防するための使用及び方法である。【選択図】図１Ａ
2018509907.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体が、
(a)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し、
(b)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ
(c)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する、
前記抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
前記抗体が、MUC16の第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠く、請求項1記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体が、
(a)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し、
(b)MUC16の第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ
(c)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する、
前記抗体又はその抗原結合断片であり、
(i)MUC16の前記第一の形態を組換え発現する細胞がSKOV3細胞であり;(ii)MUC16の前記第二の形態を組換え発現する細胞がSKOV3細胞であり;かつ(iii)工程(c)の前記細胞がSKOV3細胞である、請求項1記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
(i)MUC16の前記第一の形態を組換え発現する細胞がSKOV3細胞であり;(ii)MUC16の前記第三の形態を組換え発現する細胞がSKOV3細胞であり;かつ(iii)工程(c)の該細胞がSKOV3細胞である、請求項3記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
(i)MUC16の前記第一の形態を組換え発現する細胞がSKOV3細胞であり;(ii)MUC16の前記第二の形態を組換え発現する細胞がSKOV3細胞であり;(iii)MUC16の前記第三の形態を組換え発現する細胞がSKOV3細胞であり;かつ(iv)工程(c)の前記細胞がSKOV3細胞である、請求項2記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗体又はその抗原結合断片が、アミノ酸配列
【化１】
2018509907.tif 000239
に免疫特異的に結合し、ここで、
【化２】
2018509907.tif 000240
のアミノ酸残基番号4(N4)及びアミノ酸残基番号10(N10)がグリコシル化されている、請求項1〜5のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号150のN-グリコシル化アスパラギン1806を含むエピトープに免疫特異的に結合する、請求項1〜6のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
前記抗体又はその抗原結合断片が、アミノ酸配列
【化３】
2018509907.tif 000241
に免疫特異的に結合し、ここで、
【化４】
2018509907.tif 000242
のアミノ酸残基番号7(N7)がグリコシル化されている、請求項1〜7のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項９】
前記グリコシル化がN-結合型キトビオースからなる、請求項6〜8のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記抗体又はその抗原結合断片が、MUC16の前記第一の形態を発現する細胞を該抗体又は抗原結合断片と接触させたとき、該細胞に内在化される、請求項1〜9のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１１】
前記細胞がMUC16の前記第一の形態を組換え発現するSKOV3細胞である、請求項10記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１２】
前記抗体が、MUC16のグリコシル化形態を発現する腫瘍の成長を阻害する、請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１３】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項1〜12のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１４】
前記抗体又はその抗原結合断片が、
(a)アミノ酸配列
【化５】
2018509907.tif 000243
(ここで、X1は、L又はVである)を含むVH相補性決定領域(CDR)1;
(b)アミノ酸配列
【化６】
2018509907.tif 000244
(ここで、X2は、E又は非存在であり、かつX3は、Y又はNである)を含むVH CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化７】
2018509907.tif 000245
を含むVH CDR3
を含む、重鎖可変領域(VH)を含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１５】
前記抗体又はその抗原結合断片が、
(a)アミノ酸配列
【化８】
2018509907.tif 000246
(ここで、X8は、N又はSであり、かつX9は、L又はVである)を含むVH CDR1;
(b)アミノ酸配列
【化９】
2018509907.tif 000247
(ここで、X10は、E又は非存在である)を含むVH CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化１０】
2018509907.tif 000248
を含むVH CDR3
を含む、VHを含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１６】
前記抗体又はその抗原結合断片が、
(a)アミノ酸配列
【化１１】
2018509907.tif 000249
(ここで、X15は、N又はSであり、かつX16は、V又はLである)を含むVH CDR1;
(b)アミノ酸配列
【化１２】
2018509907.tif 000250
(ここで、X17は、E又は非存在である)を含むVH CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化１３】
2018509907.tif 000251
(ここで、X18は、T、A、又はSである)を含むVH CDR3
を含むVHを含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１７】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号3のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１８】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号9のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号11のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、請求項1〜13又は15のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１９】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号15のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号16のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、請求項1〜13又は16のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２０】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号23のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号24のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２１】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号29のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号31のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、請求項1〜13又は15のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２２】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号35のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号37のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、請求項1〜13又は16のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２３】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号43のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号44のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２４】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号49のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号50のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号51のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、請求項1〜13又は15のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２５】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号55のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号56のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号57のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、請求項1〜13又は16のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２６】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号63のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号64のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号65のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２７】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号69のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号70のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号71のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、請求項1〜13又は15のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２８】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号75のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号76のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号77のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、請求項1〜13又は16のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２９】
前記抗体が、配列番号83のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号84のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号85のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３０】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号89のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号90のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号91のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、請求項1〜13又は15のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３１】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号95のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号96のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号97のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、請求項1〜13又は16のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３２】
前記抗体又はその抗原結合断片が、
【化１４】
2018509907.tif 000252
(ここで、X21は、T又はNであり、X22は、I又はKであり、X23は、N又はSであり、X24は、V又はLであり、X25は、S又はIであり、X26は、P又はSであり、X27は、E又は非存在であり、X28は、N又はYであり、X29は、K又はRであり、X30は、A又はDであり、X31は、T又はSであり、X32は、V又はAであり、X33は、G又はDであり、X34は、T、I、又はSであり、かつX35は、T、S、又はAである)というアミノ酸配列を含むVHを含む、請求項1〜31のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３３】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号1のアミノ酸配列を含むVHを含む、請求項1〜19、又は32のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３４】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号21のアミノ酸配列を含むVHを含む、請求項1〜16、20〜22、又は32のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３５】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号41のアミノ酸配列を含むVHを含む、請求項1〜16、23〜25、又は32のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３６】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号61のアミノ酸配列を含むVHを含む、請求項1〜16、26〜28、又は32のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３７】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号81のアミノ酸配列を含むVHを含む、請求項1〜16又は29〜32のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３８】
前記抗体又はその抗原結合断片が、
(a)アミノ酸配列
【化１５】
2018509907.tif 000253
(ここで、X4は、R又はLであり、かつX5は、K又はHである)を含むVL CDR1;
(b)アミノ酸配列
【化１６】
2018509907.tif 000254
を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化１７】
2018509907.tif 000255
(ここで、X6は、G又はSであり、かつX7は、H又はYである)を含むVL CDR3
を含む、軽鎖可変領域(VL)を含む、請求項1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３９】
前記抗体又はその抗原結合断片が、
(a)アミノ酸配列
【化１８】
2018509907.tif 000256
(ここで、X11は、L又はRであり、かつX12は、H又はKである)を含むVL CDR1;
(b)アミノ酸配列YMS (配列番号:113)を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化１９】
2018509907.tif 000257
(ここで、X13は、G又はSであり、かつX14は、H又はYである)を含むVL CDR3
を含む、VLを含む、請求項1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４０】
前記抗体又はその抗原結合断片が、
(a)アミノ酸配列
【化２０】
2018509907.tif 000258
(ここで、X19は、V又はLであり、かつX20は、H又はKである)を含むVL CDR1;
(b)アミノ酸配列YMS (配列番号:119)を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化２１】
2018509907.tif 000259
を含むVL CDR3
を含む、VLを含む、請求項1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４１】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号26のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号27のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号28のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、軽鎖可変領域(VL)を含む、請求項1〜38のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４２】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号32のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号34のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む、請求項1〜37又は39のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４３】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号38のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号39のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号40のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む、請求項1〜37又は40のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４４】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号46のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号47のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、軽鎖可変領域(VL)を含む、請求項1〜38のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４５】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号52のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号53のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号54のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む、請求項1〜37又は39のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４６】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号58のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号59のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む、請求項1〜37又は40のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４７】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号86のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号87のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号88のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、軽鎖可変領域(VL)を含む、請求項1〜38のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４８】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号92のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号93のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号94のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む、請求項1〜37又は39のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４９】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号98のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号99のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号100のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む、請求項1〜37又は40のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５０】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号6のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、軽鎖可変領域(VL)を含む、請求項1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５１】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号12のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号14のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む、請求項1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５２】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号18のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号19のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む、請求項1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５３】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号66のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号67のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号68のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、軽鎖可変領域(VL)を含む、請求項1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５４】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号72のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号73のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号74のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む、請求項1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５５】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号78のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号79のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号80のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む、請求項1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５６】
前記抗体又はその抗原結合断片が、
【化２２】
2018509907.tif 000260
(ここで、X36は、I又はVであり、X37は、P又はSであり、X38は、R又はLであり、X39は、K又はHであり、X40は、R又はKであり、X41は、E又はGであり、X42は、S又はGであり、かつX43は、Y又はHである)というアミノ酸配列を含むVLを含む、請求項1〜49のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５７】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号22のアミノ酸配列を含むVLを含む、請求項1〜43のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５８】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号42のアミノ酸配列を含むVLを含む、請求項1〜40、又は44〜46のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５９】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号82のアミノ酸配列を含むVLを含む、請求項1〜40、又は47〜49のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６０】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号2のアミノ酸配列を含むVLを含む、請求項1〜37、又は50〜52のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６１】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号62のアミノ酸配列を含むVLを含む、請求項1〜37、又は53〜55のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６２】
MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体又はその抗原結合断片がVHを含み、このVHが:
(a)アミノ酸配列
【化２３】
2018509907.tif 000261
(ここで、X1は、LもしくはVである)を含むVH CDR1;アミノ酸配列
【化２４】
2018509907.tif 000262
(ここで、X2は、Eもしくは非存在であり、かつX3は、YもしくはNである)を含むVH CDR2;及びアミノ酸配列
【化２５】
2018509907.tif 000263
を含むVH CDR3;又は
(b)アミノ酸配列
【化２６】
2018509907.tif 000264
(ここで、X8は、NもしくはSであり、かつX9は、LもしくはVである)を含むVH CDR1;アミノ酸配列
【化２７】
2018509907.tif 000265
(ここで、X10は、Eもしくは非存在である)を含むVH CDR2;及びアミノ酸配列
【化２８】
2018509907.tif 000266
を含むVH CDR3;又は
(c)アミノ酸配列
【化２９】
2018509907.tif 000267
(ここで、X15は、NもしくはSであり、かつX16は、VもしくはLである)を含むVH CDR1;アミノ酸配列
【化３０】
2018509907.tif 000268
(ここで、X17は、Eもしくは非存在である)を含むVH CDR2;及びアミノ酸配列
【化３１】
2018509907.tif 000269
(ここで、X18は、T、A、もしくはSである)を含むVH CDR3;又は
(d)配列番号3のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(e)配列番号9のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号11のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(f)配列番号15のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号16のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(g)配列番号23のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号24のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(h)配列番号29のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号31のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(i)配列番号35のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号37のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(j)配列番号43のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号44のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(k)配列番号49のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号50のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号51のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(l)配列番号55のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号56のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号57のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(m)配列番号63のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号64のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号65のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(n)配列番号69のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号70のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号71のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(o)配列番号75のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号76のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号77のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(p)配列番号83のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号84のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号85のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(q)配列番号89のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号90のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号91のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(r)配列番号95のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号96のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号97のアミノ酸配列を含むVH CDR3
を含む、前記MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６３】
MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体又はその抗原結合断片がVLを含み、このVLが:
(a)アミノ酸配列
【化３２】
2018509907.tif 000270
(ここで、X4は、RもしくはLであり、かつX5は、KもしくはHである)を含むVL CDR1;アミノ酸配列
【化３３】
2018509907.tif 000271
を含むVL CDR2;及びアミノ酸配列
【化３４】
2018509907.tif 000272
(ここで、X6は、GもしくはSであり、かつX7は、HもしくはYである)を含むVL CDR3;又は
(b)アミノ酸配列
【化３５】
2018509907.tif 000273
(ここで、X11は、LもしくはRであり、かつX12は、HもしくはKである)を含むVL CDR1;アミノ酸配列YMS (配列番号:113)を含むVL CDR2;及びアミノ酸配列
【化３６】
2018509907.tif 000274
(ここで、X13は、GもしくはSであり、かつX14は、HもしくはYである)を含むVL CDR3;又は
(c)アミノ酸配列
【化３７】
2018509907.tif 000275
(ここで、X19は、VもしくはLであり、かつX20は、HもしくはKである)を含むVL CDR1;アミノ酸配列YMS (配列番号:119)を含むVL CDR2;及びアミノ酸配列
【化３８】
2018509907.tif 000276
を含むVL CDR3;又は
(d)配列番号26のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号27のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号28のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(e)配列番号32のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号34のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(f)配列番号38のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号39のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号40のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(g)配列番号46のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号47のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(h)配列番号52のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号53のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号54のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(i)配列番号58のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号59のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(j)配列番号86のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号87のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号88のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(k)配列番号92のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号93のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号94のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(l)配列番号98のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号99のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号100のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(m)配列番号6のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(n)配列番号12のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号14のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(o)配列番号18のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号19のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(p)配列番号66のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号67のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号68のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(q)配列番号72のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号73のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号74のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(r)配列番号78のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号79のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号80のアミノ酸配列を含むVL CDR3
を含む、前記MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６４】
MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体又はその抗原結合断片が:
(a)(i)アミノ酸配列
【化３９】
2018509907.tif 000277
(ここで、X1は、LもしくはVである)を含むVH CDR1;アミノ酸配列
【化４０】
2018509907.tif 000278
(ここで、X2は、Eもしくは非存在であり、かつX3は、YもしくはNである)を含むVH CDR2;及びアミノ酸配列
【化４１】
2018509907.tif 000279
を含むVH CDR3を含むVH;並びに(ii)アミノ酸配列
【化４２】
2018509907.tif 000280
(ここで、X4は、RもしくはLであり、かつX5は、KもしくはHである)を含むVL CDR1;アミノ酸配列
【化４３】
2018509907.tif 000281
を含むVL CDR2;及びアミノ酸配列
【化４４】
2018509907.tif 000282
(ここで、X6は、GもしくはSであり、かつX7は、HもしくはYである)を含むVL CDR3
を含むVL;又は
(b)(i)アミノ酸配列
【化４５】
2018509907.tif 000283
(ここで、X8は、NもしくはSであり、かつX9は、LもしくはVである)を含むVH CDR1;アミノ酸配列
【化４６】
2018509907.tif 000284
(ここで、X10は、Eもしくは非存在である)を含むVH CDR2;及びアミノ酸配列
【化４７】
2018509907.tif 000285
を含むVH CDR3
を含むVH;並びに(ii)アミノ酸配列
【化４８】
2018509907.tif 000286
(ここで、X11は、LもしくはRであり、かつX12は、HもしくはKである)を含むVL CDR1;アミノ酸配列YMS (配列番号:113)を含むVL CDR2;及びアミノ酸配列
【化４９】
2018509907.tif 000287
(ここで、X13は、GもしくはSであり、かつX14は、HもしくはYである)を含むVL CDR3
を含むVL;又は
(c)(i)アミノ酸配列
【化５０】
2018509907.tif 000288
(ここで、X15は、NもしくはSであり、かつX16は、VもしくはLである)を含むVH CDR1;アミノ酸配列
【化５１】
2018509907.tif 000289
(ここで、X17は、Eもしくは非存在である)を含むVH CDR2;及びアミノ酸配列
【化５２】
2018509907.tif 000290
(ここで、X18は、T、A、もしくはSである)を含むVH CDR3;並びに(ii)アミノ酸配列
【化５３】
2018509907.tif 000291
(ここで、X19は、VもしくはLであり、かつX20は、HもしくはKである)を含むVL CDR1;アミノ酸配列YMS (配列番号:119)を含むVL CDR2;及びアミノ酸配列
【化５４】
2018509907.tif 000292
を含むVL CDR3
を含むVL;又は
(d)(i)配列番号23のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号24のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号26のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号27のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号28のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(e)(i)配列番号29のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号31のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号32のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号34のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(f)(i)配列番号35のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号37のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号38のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号39のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号40のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(g)(i)配列番号43のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号44のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号47のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(h)(i)配列番号49のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号50のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号51のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号52のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号53のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号54のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(i)(i)配列番号55のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号56のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号57のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号58のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号59のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(j)(i)配列番号83のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号84のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号85のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号86のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号87のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号88のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(k)(i)配列番号89のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号90のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号91のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号92のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号93のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号94のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(l)(i)配列番号95のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号96のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号97のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH、及び(ii)配列番号98のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号99のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号100のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(m)(i)配列番号3のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号6のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(n)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号11のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号12のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号14のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(o)(i)配列番号15のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号16のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号18のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号19のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(p)(i)配列番号63のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号64のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号65のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号66のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号67のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号68のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(q)(i)配列番号69のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号70のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号71のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号72のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号73のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号74のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(r)(i)配列番号75のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号76のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号77のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号78のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号79のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号80のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL
を含む、前記MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６５】
MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体又はその抗原結合断片が:
(a)(i)
【化５５】
2018509907.tif 000293
(ここで、X21は、TもしくはNであり、X22は、IもしくはKであり、X23は、NもしくはSであり、X24は、VもしくはLであり、X25は、SもしくはIであり、X26は、PもしくはSであり、X27は、Eもしくは非存在であり、X28は、NもしくはYであり、X29は、KもしくはRであり、X30は、AもしくはDであり、X31は、TもしくはSであり、X32は、VもしくはAであり、X33は、GもしくはDであり、X34は、T、I、もしくはSであり、かつX35は、T、S、もしくはAである)というアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)
【化５６】
2018509907.tif 000294
(ここで、X36は、IもしくはVであり、X37は、PもしくはSであり、X38は、RもしくはLであり、X39は、KもしくはHであり、X40は、RもしくはKであり、X41は、EもしくはGであり、X42は、SもしくはGであり、かつX43は、YもしくはHである)というアミノ酸配列を含むVL;又は
(b)(i)配列番号1のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号2のアミノ酸配列を含むVL;
(c)(i)配列番号21のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号22のアミノ酸配列を含むVL;又は
(d)(i)配列番号41のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号42のアミノ酸配列を含むVL;又は
(e)(i)配列番号61のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号62のアミノ酸配列を含むVL;又は
(f)(i)配列番号81のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号82のアミノ酸配列を含むVL
を含む、前記MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６６】
前記抗体がヒト由来重鎖及び軽鎖定常領域を含む、請求項14〜65のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６７】
前記重鎖定常領域が、ガンマ1、ガンマ2、ガンマ3、及びガンマ4からなる群から選択されるアイソタイプを有する、請求項66記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６８】
前記軽鎖定常領域が、カッパ及びラムダからなる群から選択されるアイソタイプを有する、請求項66又は67記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６９】
前記抗体又はその抗原結合断片がヒト化されている、請求項1〜31、38〜55、又は62〜64のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７０】
前記抗体又はその抗原結合断片が齧歯類抗体のヒト化形態である、請求項69記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７１】
前記抗体が、2つの同一の重鎖及び2つの同一の軽鎖を含む免疫グロブリンである、請求項1〜70のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７２】
前記免疫グロブリンがIgGである、請求項71記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７３】
薬剤にコンジュゲートされている、請求項1〜72のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片を含む抗体コンジュゲート。
【請求項７４】
前記薬剤が、イメージング剤又は細胞毒性剤である、請求項73記載の抗体コンジュゲート。
【請求項７５】
前記抗体又はその抗原結合断片が二重特異性抗体である、請求項1〜70のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７６】
前記二重特異性抗体がCD3に免疫特異的に結合する、請求項75記載の二重特異性抗体。
【請求項７７】
前記二重特異性抗体が、MUC16に免疫特異的に結合する免疫グロブリンを含み、ここで、該免疫グロブリンの軽鎖が、ペプチドリンカーを介して、CD3に免疫特異的に結合する単鎖可変断片(scFv)にコンジュゲートされている、請求項75又は76記載の二重特異性抗体。
【請求項７８】
薬剤にコンジュゲートされた、請求項75〜77のいずれか一項記載の二重特異性抗体を含む二重特異性抗体コンジュゲート。
【請求項７９】
前記薬剤が、イメージング剤又は細胞毒性剤である、請求項78記載の二重特異性抗体コンジュゲート。
【請求項８０】
前記その抗原結合断片がscFvである、請求項1〜70のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８１】
薬剤にコンジュゲートされた、請求項80記載のscFvを含むscFvコンジュゲート。
【請求項８２】
前記薬剤が、イメージング剤又は細胞毒性剤である、請求項81記載のscFvコンジュゲート。
【請求項８３】
請求項1〜72のいずれか一項記載の抗体もしくは抗原結合断片;又は請求項80記載のscFv又は請求項81もしくは82記載のscFvコンジュゲートを含む、キメラ抗原受容体(CAR)。
【請求項８４】
抗体重鎖もしくはその抗原結合部分であって、該重鎖もしくはその抗原結合部分がVHを含み、このVHが:
(I)(a)アミノ酸配列
【化５７】
2018509907.tif 000295
(ここで、X1は、LもしくはVである)を含むVH相補性決定領域(CDR)1;
(b)アミノ酸配列
【化５８】
2018509907.tif 000296
(ここで、X2は、Eもしくは非存在であり、かつX3は、YもしくはNである)を含むVH CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化５９】
2018509907.tif 000297
を含むVH CDR3;ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する;
又は
(II)(a)アミノ酸配列
【化６０】
2018509907.tif 000298
(ここで、X8は、NもしくはSであり、かつX9は、LもしくはVである)を含むVH CDR1;
(b)アミノ酸配列
【化６１】
2018509907.tif 000299
(ここで、X10は、Eもしくは非存在である)を含むVH CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化６２】
2018509907.tif 000300
を含むVH CDR3;ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する;
又は
(III)(a)アミノ酸配列
【化６３】
2018509907.tif 000301
(ここで、X15は、NもしくはSであり、かつX16は、VもしくはLである)を含むVH CDR1;
(b)アミノ酸配列
【化６４】
2018509907.tif 000302
(ここで、X17は、Eもしくは非存在である)を含むVH CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化６５】
2018509907.tif 000303
(ここで、X18は、T、A、もしくはSである)を含むVH CDR3;ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する;
又は
(IV)配列番号3のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(V)配列番号9のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号11のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VI)配列番号15のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号16のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VII)配列番号23のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号24のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VIII)配列番号29のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号31のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(IX)配列番号35のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号37のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(X)配列番号43のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号44のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XI)配列番号49のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号50のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号51のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XII)配列番号55のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号56のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号57のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XIII)配列番号63のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号64のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号65のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XIV)配列番号69のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号70のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号71のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XV)配列番号75のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号76のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号77のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XVI)配列番号83のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号84のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号85のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XVII)配列番号89のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号90のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号91のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XVIII)配列番号95のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号96のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号97のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する)
を含む、前記抗体重鎖もしくはその抗原結合部分。
【請求項８５】
抗体重鎖又はその抗原結合部分であって、該重鎖又はその抗原結合部分が:
(I)
【化６６】
2018509907.tif 000304
(ここで、X21は、TもしくはNであり、X22は、IもしくはKであり、X23は、NもしくはSであり、X24は、VもしくはLであり、X25は、SもしくはIであり、X26は、PもしくはSであり、X27は、Eもしくは非存在であり、X28は、NもしくはYであり、X29は、KもしくはRであり、X30は、AもしくはDであり、X31は、TもしくはSであり、X32は、VもしくはAであり、X33は、GもしくはDであり、X34は、T、I、もしくはSであり、かつX35は、T、S、もしくはAである)というアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(II)配列番号1のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(III)配列番号21のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(IV)配列番号41のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(V)配列番号61のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VI)配列番号81のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する)
を含むVHを含む、前記抗体重鎖もしくはその抗原結合部分。
【請求項８６】
前記抗体重鎖又はその抗原結合部分がヒト由来重鎖定常領域を含む、請求項84又は85記載の抗体重鎖又はその抗原結合部分。
【請求項８７】
前記重鎖又はその抗原結合部分の定常領域が、ガンマ1、ガンマ2、ガンマ3、及びガンマ4からなる群から選択されるアイソタイプを有する、請求項86記載の抗体重鎖又はその抗原結合部分。
【請求項８８】
前記抗体重鎖又はその抗原結合部分がヒト化されている、請求項85記載の抗体重鎖又はその抗原結合部分。
【請求項８９】
前記抗体重鎖又はその抗原結合部分が齧歯類重鎖のヒト化形態である、請求項88記載の抗体重鎖又はその抗原結合部分。
【請求項９０】
請求項84〜89のいずれか一項記載の抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体重鎖コンジュゲートであって、該抗体重鎖又はその抗原結合部分が薬剤にコンジュゲートされている、前記抗体重鎖コンジュゲート。
【請求項９１】
前記薬剤が、イメージング剤又は細胞毒性剤である、請求項90記載の抗体重鎖コンジュゲート。
【請求項９２】
抗体軽鎖又はその抗原結合部分であって、該軽鎖又はその抗原結合部分が:
(I)(a)アミノ酸配列
【化６７】
2018509907.tif 000305
(ここで、X4は、RもしくはLであり、かつX5は、KもしくはHである)を含むVL CDR1;
(b)アミノ酸配列
【化６８】
2018509907.tif 000306
を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化６９】
2018509907.tif 000307
(ここで、X6は、GもしくはSであり、かつX7は、HもしくはYである)を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(II)(a)アミノ酸配列
【化７０】
2018509907.tif 000308
(ここで、X11は、LもしくはRであり、かつX12は、HもしくはKである)を含むVL CDR1;
(b)アミノ酸配列YMS (配列番号:113)を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化７１】
2018509907.tif 000309
(ここで、X13は、GもしくはSであり、かつX14は、HもしくはYである)を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(III)(a)アミノ酸配列
【化７２】
2018509907.tif 000310
(ここで、X19は、VもしくはLであり、かつX20は、HもしくはKである)を含むVL CDR1;
(b)アミノ酸配列YMS (配列番号:119)を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化７３】
2018509907.tif 000311
を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(IV)配列番号6のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(V)配列番号12のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号14のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VI)配列番号18のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号19のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VII)配列番号26のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号27のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号28のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VIII)配列番号32のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号34のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VIX)配列番号38のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号39のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号40のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(X)配列番号46のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号47のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XI)配列番号52のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号53のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号54のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XII)配列番号58のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号59のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XIII)配列番号66のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号67のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号68のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XIV)配列番号72のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号73のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号74のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XV)配列番号78のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号79のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号80のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XVI)配列番号86のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号87のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号88のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XVII)配列番号92のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号93のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号94のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XVIII)配列番号98のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号99のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号100のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する)
を含む、VLを含む、前記抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分。
【請求項９３】
抗体軽鎖であって、該軽鎖が:
(I)
【化７４】
2018509907.tif 000312
(ここで、X36は、IもしくはVであり、X37は、PもしくはSであり、X38は、RもしくはLであり、X39は、KもしくはHであり、X40は、RもしくはKであり、X41は、EもしくはGであり、X42は、SもしくはGであり、かつX43は、YもしくはHである)というアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(II)配列番号2のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(III)配列番号22のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(IV)配列番号42のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(V)配列番号62のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VI)配列番号82のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する)
を含むVLを含む、前記抗体軽鎖。
【請求項９４】
前記抗体軽鎖又はその抗原結合部分がヒト由来軽鎖定常領域を含む、請求項92又は93記載の抗体軽鎖又はその抗原結合部分。
【請求項９５】
前記軽鎖又はその抗原結合部分の定常領域が、カッパ及びラムダからなる群から選択されるアイソタイプを有する、請求項94記載の抗体軽鎖又はその抗原結合部分。
【請求項９６】
前記抗体軽鎖又はその抗原結合部分がヒト化されている、請求項92記載の抗体軽鎖又はその抗原結合部分。
【請求項９７】
前記抗体軽鎖又はその抗原結合部分が齧歯類抗体のヒト化形態である、請求項96記載の抗体軽鎖又はその抗原結合部分。
【請求項９８】
薬剤にコンジュゲートされた、請求項92〜97のいずれか一項記載の抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体軽鎖コンジュゲート。
【請求項９９】
前記薬剤が、イメージング剤又は細胞毒性剤である、請求項98記載の抗体軽鎖コンジュゲート。
【請求項１００】
ペプチドリンカーを介してscFvにコンジュゲートされた、請求項92〜99のいずれか一項記載の抗体軽鎖を含む融合タンパク質。
【請求項１０１】
前記scFvがCD3に結合する、請求項100記載の融合タンパク質。
【請求項１０２】
請求項83記載のCARを組換え発現するT細胞。
【請求項１０３】
請求項80記載のscFvをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１０４】
請求項81もしくは82記載のscFvコンジュゲートをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１０５】
請求項83記載のCARをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１０６】
請求項84〜89のいずれか一項記載の抗体重鎖をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１０７】
請求項90又は91記載の抗体重鎖コンジュゲートをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１０８】
請求項92〜97のいずれか一項記載の抗体軽鎖をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１０９】
請求項98又は99記載の抗体軽鎖コンジュゲートをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１１０】
請求項100又は101記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１１１】
(a)請求項84〜89のいずれか一項記載の抗体重鎖又は請求項90もしくは91記載の抗体重鎖コンジュゲート;及び(b)請求項92〜97のいずれか一項記載の抗体軽鎖、請求項98もしくは99記載の抗体軽鎖コンジュゲート、又は請求項100もしくは101記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１１２】
プロモーターに動作可能に連結された請求項103〜110のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１１３】
(a)第一のプロモーターに動作可能に連結された請求項106又は107記載のポリヌクレオチド;及び(b)第二のプロモーターに動作可能に連結された請求項108〜110のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１１４】
プロモーターに動作可能に連結された請求項103〜105のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含むエクスビボ細胞。
【請求項１１５】
プロモーターに動作可能に連結された請求項106又は107記載のポリヌクレオチドを含むエクスビボ細胞。
【請求項１１６】
プロモーターに動作可能に連結された請求項108〜110のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含むエクスビボ細胞。
【請求項１１７】
請求項112記載のベクターを含むエクスビボ細胞。
【請求項１１８】
請求項113記載のベクターを含むエクスビボ細胞。
【請求項１１９】
プロモーターに動作可能に連結された請求項1〜72のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする1以上のポリヌクレオチドを含むエクスビボ細胞。
【請求項１２０】
抗体重鎖を産生する方法であって、請求項115記載の細胞を、前記ポリヌクレオチドが該細胞によって発現されて、該ポリヌクレオチドによってコードされる該抗体重鎖又は抗体重鎖コンジュゲートを産生するような条件下で培養することを含む、前記方法。
【請求項１２１】
抗体軽鎖を産生する方法であって、請求項116記載の細胞を、前記ポリヌクレオチドが該細胞によって発現されて、該ポリヌクレオチドによってコードされる前記抗体軽鎖、抗体軽鎖コンジュゲート、又は融合タンパク質を産生するような条件下で培養することを含む、前記方法。
【請求項１２２】
抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であって、請求項118記載のエクスビボ細胞を、前記第一のプロモーターに動作可能に連結されたポリヌクレオチド及び前記第二のプロモーターに動作可能に連結されたポリヌクレオチドが該細胞によって発現されて、(i)該ポリヌクレオチドによってコードされる前記抗体重鎖又は前記抗体重鎖コンジュゲート;及び(ii)該ポリヌクレオチドによってコードされる前記抗体軽鎖、前記抗体軽鎖コンジュゲート、又は前記融合タンパク質を産生するような条件下で培養することを含む、前記方法。
【請求項１２３】
請求項1〜72のいずれか一項記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項73もしくは74記載の抗体コンジュゲート、請求項75〜77のいずれか一項記載の二重特異性抗体、請求項78もしくは79記載の二重特異性抗体コンジュゲート、請求項80記載のscFv、請求項81もしくは82記載のscFvコンジュゲート、請求項83記載のCAR、請求項84〜89のいずれか一項記載の抗体重鎖、請求項90もしくは91記載の抗体重鎖コンジュゲート、請求項92〜97のいずれか一項記載の抗体軽鎖、請求項98もしくは99記載の抗体軽鎖コンジュゲート、請求項100もしくは101記載の融合タンパク質、又は請求項102記載のT細胞の治療有効量;及び医薬として許容し得る担体:を含む医薬組成物。
【請求項１２４】
それを必要としている患者の癌を治療する方法であって、該患者に請求項123記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１２５】
前記癌が、肺、膵臓、乳房、子宮、卵管、又は原発性腹膜の癌である、請求項124記載の方法。
【請求項１２６】
前記癌が卵巣の癌である、請求項124又は125記載の方法。
【請求項１２７】
前記患者がヒト患者である、請求項124〜126のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２８】
前記方法が、追加の治療剤の治療有効量を前記患者に投与することをさらに含む、請求項124〜127のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２９】
前記医薬組成物が、請求項1〜72のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片である第一の抗体の治療有効量を含み、ここで、該抗体又はその抗原結合断片が、配列番号150のN-グリコシル化Asn1806を含むが、配列番号150のN-グリコシル化Asn1800を含まないMUC16中のエピトープを認識し;ここで、前記追加の治療剤が、第二の抗体又はその抗原結合断片であり、ここで、該第二の抗体又はその抗原結合断片が、配列番号150のN-グリコシル化Asn1806を含み、かつ配列番号150のN-グリコシル化Asn1800も含むMUC16中のエピトープを認識する、請求項128記載の方法。
【請求項１３０】
前記第一の抗体又はその抗原結合断片が、(i)MUC16の第一の形態(このMUC16の第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;(ii)MUC16の第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如;及び(iii)MUC16の第四の形態(この第四の形態はグリコシル化されており、ここで、該第四の形態のアミノ酸配列は配列番号152である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力によって同定され;ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞、MUC16の該第三の形態を組換え発現する細胞、及びMUC16の該第四の形態を組換え発現する細胞が同じ細胞型のものであり、かつ
前記第二の抗体又はその抗原結合断片が、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;及び(ii)MUC16の第五の形態(この第五の形態はグリコシル化されており、ここで、該第五の形態のアミノ酸配列は配列番号172である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如によって同定され、ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞がMUC16の該第五の形態を組換え発現する細胞と同じ型の細胞である、請求項129記載の方法。
【請求項１３１】
前記医薬組成物が、請求項1〜72のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片である第一の抗体又はその抗原結合断片の治療有効量を含み、ここで、該抗体又はその抗原結合断片が、配列番号150のN-グリコシル化Asn1806を含むが、配列番号150のN-グリコシル化Asn1800を含まないMUC16中のエピトープを認識し;ここで、前記追加の治療剤が、第二の抗体又はその抗原結合断片の治療有効量であり、ここで、該第二の抗体又はその抗原結合断片が、配列番号150のN-グリコシル化Asn1800を含むが配列番号150のN-グリコシル化Asn1806を含まないMUC16中のエピトープを認識する、請求項128記載の方法。
【請求項１３２】
前記第一の抗体又はその抗原結合断片が、(i)MUC16の第一の形態(このMUC16の第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;(ii)MUC16の第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如;及び(iii)MUC16の第四の形態(この第四の形態はグリコシル化されており、ここで、該第四の形態のアミノ酸配列は配列番号152である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力によって同定され、ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞、MUC16の該第三の形態を組換え発現する細胞、及びMUC16の該第四の形態を組換え発現する細胞が同じ細胞型のものであり、かつ
前記第二の抗体又はその抗原結合断片が、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;(ii)MUC16の第三の形態(MUC16のこの第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;及び(iii)MUC16の第四の形態(この第四の形態はグリコシル化されており、ここで、該第四の形態のアミノ酸配列は配列番号152である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如によって同定され;ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞、MUC16の該第三の形態を組換え発現する細胞、及びMUC16の該第四の形態を組換え発現する細胞が同じ細胞型のものである、請求項131記載の方法。
【請求項１３３】
1以上のグリコシル化部位を含む免疫原性糖ペプチドであって、(i)該免疫原性糖ペプチドが、10〜60アミノ酸残基、10〜30アミノ酸残基、15〜25アミノ酸残基、15〜20アミノ酸残基、又は15〜18アミノ酸残基の長さであり、かつ(ii)該1以上のグリコシル化部位のうちの少なくとも1つが炭水化物と結合している、前記免疫原性糖ペプチド。
【請求項１３４】
1つ、2つ、又は3つのグリコシル化部位を含む、請求項133記載の免疫原性糖ペプチド。
【請求項１３５】
炭水化物と結合しているグリコシル化部位を含む、請求項133記載の免疫原性糖ペプチド。
【請求項１３６】
炭水化物と各々結合している2つのグリコシル化部位を含む、請求項133記載の免疫原性糖ペプチド。
【請求項１３７】
前記炭水化物がN-又はO-結合型炭水化物である、請求項133〜136のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
【請求項１３８】
前記炭水化物が、単糖、二糖、三糖、四糖、又は五糖である、請求項133〜137のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
【請求項１３９】
前記炭水化物が二糖である、請求項133〜137のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
【請求項１４０】
前記二糖がキトビオースである、請求項139記載の免疫原性糖ペプチド。
【請求項１４１】
前記免疫原性糖ペプチドのN末端がアセチル化されている、請求項133〜140のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
【請求項１４２】
前記糖ペプチドのC末端がN-メチルカルボキサミド誘導体の形態である、請求項133〜141のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
【請求項１４３】
免疫原性キャリアタンパク質にコンジュゲートされている、請求項133〜142のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
【請求項１４４】
前記免疫原性キャリアタンパク質がキーホールリンペットヘモシアニンである、請求項143記載の免疫原性糖ペプチド。
【請求項１４５】
15〜18アミノ酸残基の長さである、請求項133〜144のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
【請求項１４６】
キトビオースと結合しているグリコシル化部位を含む、請求項145記載の免疫原性糖ペプチド。
【請求項１４７】
キトビオースと各々結合している2つのグリコシル化部位を含む、請求項145記載の免疫原性糖ペプチド。
【請求項１４８】
18アミノ酸残基の長さである、請求項133〜144のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
【請求項１４９】
キトビオースと各々結合している2つのグリコシル化部位を含む、請求項148記載の免疫原性糖ペプチド。
【請求項１５０】
15アミノ酸残基の長さである、請求項133〜144のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
【請求項１５１】
キトビオースと結合しているグリコシル化部位を含む、請求項150記載の免疫原性糖ペプチド。
【請求項１５２】
配列番号150のアミノ酸配列の少なくとも10アミノ酸部分を含み、ここで、前記1以上のグリコシル化部位のうちの少なくとも1つが該アミノ酸配列の部分にある、請求項133〜151のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
【請求項１５３】
配列番号129のアミノ酸配列を含む、請求項152記載の免疫原性糖ペプチド。
【請求項１５４】
キトビオースと結合している配列番号129の30番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む、請求項153記載の免疫原性糖ペプチド。
【請求項１５５】
Man3GlcNAc2部分と結合している配列番号129の30番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む、請求項153記載の免疫原性糖ペプチド。
【請求項１５６】
配列番号130のアミノ酸配列を含む、請求項152記載の免疫原性糖ペプチド。
【請求項１５７】
キトビオースと各々結合している配列番号130の4番目の残基(Asn)及び10番目の残基(Asn)における2つのグリコシル化部位を含む、請求項156記載の免疫原性糖ペプチド。
【請求項１５８】
配列番号131のアミノ酸配列を含む、請求項152記載の免疫原性糖ペプチド。
【請求項１５９】
キトビオースと結合している配列番号131の7番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む、請求項158記載の免疫原性糖ペプチド。
【請求項１６０】
糖タンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を作製する方法であって、対象を、1以上のグリコシル化部位を含む免疫原性糖ペプチドで免疫することを含み、ここで、(i)該免疫原性糖ペプチドが、10〜60アミノ酸残基、10〜30アミノ酸残基、15〜25アミノ酸残基、15〜20アミノ酸残基、又は15〜18アミノ酸残基の長さであり;(ii)該免疫原性糖ペプチドが、該糖タンパク質アミノ酸配列の少なくとも10アミノ酸部分を含み;(iii)該1以上のグリコシル化部位のうちの少なくとも1つが炭水化物と結合しており;かつ(iv)該1以上のグリコシル化部位のうちの少なくとも1つが該アミノ酸配列の部分にある、前記方法。
【請求項１６１】
前記抗体又はその抗原結合断片が、前記糖タンパク質の非グリコシル化形態に対する特異的結合を欠いている、請求項160記載の方法。
【請求項１６２】
前記対象が、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ニワトリ、モルモット、ラット、ウサギ、又はマウスである、請求項160又は161のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６３】
前記対象が、ラット、ウサギ、又はマウスである、請求項160又は161のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６４】
前記対象がマウスである、請求項160又は161のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６５】
前記免疫原性糖ペプチドが、1つ、2つ、又は3つのグリコシル化部位を含む、請求項160〜164のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６６】
前記免疫原性糖ペプチドが、炭水化物と結合しているグリコシル化部位を含む、請求項160〜164のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６７】
前記免疫原性糖ペプチドが、炭水化物と各々結合している2つのグリコシル化部位を含む、請求項160〜164のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６８】
前記炭水化物がN-又はO-結合型炭水化物である、請求項160〜167のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６９】
前記炭水化物が、単糖、二糖、三糖、四糖、又は五糖である、請求項160〜168のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７０】
前記炭水化物が二糖である、請求項160〜168のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７１】
前記二糖がキトビオースである、請求項170記載の方法。
【請求項１７２】
前記免疫原性糖ペプチドのN末端がアセチル化されている、請求項160〜171のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７３】
前記糖ペプチドのC末端がN-メチルカルボキサミド誘導体の形態である、請求項160〜172のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７４】
免疫原性キャリアタンパク質にコンジュゲートされている、請求項160〜173のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７５】
前記免疫原性キャリアタンパク質がキーホールリンペットヘモシアニンである、請求項174記載の方法。
【請求項１７６】
前記免疫原性糖ペプチドが、15〜18アミノ酸残基の長さである、請求項160〜175のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７７】
前記免疫原性糖ペプチドが、キトビオースと結合しているグリコシル化部位を含む、請求項176記載の方法。
【請求項１７８】
前記免疫原性糖ペプチドが、キトビオースと各々結合している2つのグリコシル化部位を含む、請求項176記載の方法。
【請求項１７９】
前記免疫原性糖ペプチドが18アミノ酸残基の長さである、請求項160〜175のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８０】
前記免疫原性糖ペプチドが、キトビオースと各々結合している2つのグリコシル化部位を含む、請求項179記載の方法。
【請求項１８１】
前記免疫原性糖ペプチドが15アミノ酸残基の長さである、請求項160〜175のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８２】
前記免疫原性糖ペプチドが、キトビオースと結合しているグリコシル化部位を含む、請求項181記載の方法。
【請求項１８３】
前記糖タンパク質が配列番号150のアミノ酸配列を含む、請求項160〜182のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８４】
前記免疫原性糖ペプチドが配列番号129のアミノ酸配列を含む、請求項183記載の方法。
【請求項１８５】
前記免疫原性糖ペプチドが、キトビオースと結合している配列番号129の30番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む、請求項184記載の方法。
【請求項１８６】
前記免疫原性糖ペプチドが、Man3GlcNAc2部分と結合している配列番号129の30番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む、請求項184記載の方法。
【請求項１８７】
前記免疫原性糖ペプチドが配列番号130のアミノ酸配列を含む、請求項183記載の方法。
【請求項１８８】
前記免疫原性糖ペプチドが、キトビオースと各々結合している配列番号130の4番目の残基(Asn)及び10番目の残基(Asn)における2つのグリコシル化部位を含む、請求項187記載の方法。
【請求項１８９】
前記免疫原性糖ペプチドが配列番号131のアミノ酸配列を含む、請求項183記載の方法。
【請求項１９０】
前記免疫原性糖ペプチドが、キトビオースと結合している配列番号131の7番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む、請求項189記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、2015年3月17日に出願された米国仮特許出願第62/134,402号の恩典を主張する。
【０００２】
本出願は、2016年3月14日に作成された、375Kバイトのサイズを有する「Sequence_Listing_13542-016-228.txt」というタイトルのテキストファイルとして本出願とともに提出された配列表を引用により組み込んでいる。
【０００３】
(1.分野)
本明細書に提供されるのは、癌などの障害を管理、治療、又は予防するための、繋留型ムチンタンパク質であるMUC16に免疫特異的に結合し、かつMUC16の発現及び/又は活性を調節する抗体に関する組成物、方法、及び使用である。
【背景技術】
【０００４】
(2.背景)
ムチンは、細胞の恒常性及び上皮表面の保護にとって重要な生体分子である。卵巣癌におけるムチンの発現の変化は、診断、予後判定、及び治療において利用することができる(Singh APらの文献、Lancet Oncol 2008;9(11):1076-85)。MUC16は、ほとんどの卵巣癌で過剰発現される1つのそのようなムチンであり、卵巣癌の検出及び進行の確立された代用血清マーカー(CA-125)である(Badgwell Dらの文献、Dis Markers 2007;23(5-6):397410; Bast RC, Jrらの文献、Int J Gynecol Cancer 2005;15 Suppl 3:274-81; Fritsche HAらの文献、Clin Chem 1998;44(7):1379-80;及びKrivak TCらの文献、Gynecol Oncol 2009;115(1):81-5)。MUC16は、多数のリピート配列からなる、CA-125と呼ばれる、切断され、放出される大ドメインと、残りの非反復細胞外断片、膜貫通ドメイン、及び細胞質テールを含む保持ドメイン(MUC-CD)とから構成される高度にグリコシル化されたムチンである(O'Brien TJらの文献、Tumour Biol 2001;22(6):348-66)。この抗原は、それ以外の場合は、子宮、子宮内膜、卵管、卵巣、並びに腹腔及び胸腔の漿膜で低レベルで発現されるのみであるので、MUC16は、免疫ベースの療法の潜在的に魅力のある標的である。
【０００５】
しかしながら、MUC16の細胞外ドメインの大部分が切断され、分泌されるという事実により、卵巣癌上の標的抗原としてのMUC16の有用性は制限される。実際、今日まで、報告されているほとんどのMUC16モノクローナル抗体は、この糖タンパク質の大きい分泌CA-125画分に存在するエピトープに結合し、この抗原の保持される細胞外画分(MUC-CD)に結合することが知られているものはない(Bellone Sの文献、Am J Obstet Gynecol 2009;200(1):75 el-10、Berek JSの文献、Expert Opin Biol Ther 2004;4(7):1159-65; O'Brien TJらの文献、Int J Biol Markers 1998;13(4):188-95)。したがって、MUC16の非放出領域に対する新たな抗体の作製が診断的及び治療的アプローチに必要とされる。
【発明の概要】
【０００６】
(3.概要)
提供されるのは、抗体及びその抗原結合断片、並びにそのような抗体又は抗原結合断片を含むポリペプチド、例えば、融合タンパク質、コンジュゲート、及び/又はキメラ抗原受容体、並びにこれらを発現する細胞である。該抗体及び抗原結合断片の中に、MUC16タンパク質のエピトープに特異的に結合するものがある。そのような抗体は、本明細書において「MUC16グリコシル化抗体」と呼ばれる。そのようなエピトープは、典型的には、MUC16分子、通常、MUC16の非放出形態の細胞外部分の内部又は実質的に内部のエピトープであり;いくつかの実施態様において、該エピトープは、MUC16及び/もしくはMUC16の分泌形態のタンデムリピート領域内になく、又は該抗体もしくは断片は、MUC16及び/もしくはMUC16の分泌形態のタンデムリピート領域に結合しない。いくつかの実施態様において、該エピトープは、MUC16c114の内部にあるか、又はMUC16c114の内部の残基を含み、典型的には、その中の1以上のグリコシル化残基又はグリコシル化部位を含む。いくつかの実施態様において、該エピトープは、1以上のグリコシル化部位、例えば、N-グリコシル化の部位を含む。いくつかの態様において、該エピトープは、配列番号150に示されるMUC16配列(及び/又はそのグリコシル化形態)のAsn1806又はAsn1800に対応するアスパラギン残基を含み;いくつかの態様において、該エピトープは、配列番号150のAsn1806に対応するアスパラギン残基を含むが、配列番号150のAsn1800に対応するアスパラギン残基を含まず;いくつかの態様において、該エピトープは、配列番号150のAsn1800に対応するアスパラギン残基を含むが、配列番号150のAsn1806に対応するアスパラギン残基を含まない。そのような実施態様のいずれかのいくつかにおいて、そのような1以上のアスパラギンは、グリコシル化、例えば、N-グリコシル化されている。いくつかの実施態様において、該抗体又は抗原結合断片は、配列番号131の内部のエピトープもしくは配列番号131の内部の残基を含むエピトープに結合し;配列番号130の内部のエピトープもしくは配列番号130の内部の残基を含むエピトープに結合するか、又はこれらの組合せであり;いくつかの実施態様において、該抗体又は断片は、配列番号168に対応するMUC16の領域内でも、配列番号168の残基2〜19の内部でも免疫特異的に結合しない。
【０００７】
いくつかの実施態様において、提供される抗体又は抗原結合断片は、本明細書に記載される抗体配列、例えば、MUC16-グリコシル化部位標的化抗体配列、例えば、18C6と表記される抗体、10C6と表記される抗体、及び/又は19C11と表記される抗体の重鎖及び/又は軽鎖のCDRに対応する1以上の相補性決定領域(CDR)を含む。いくつかの実施態様において、該抗体又は断片は、本明細書に提供される重鎖配列のうちの1つ、例えば、18C6と表記される抗体、10C6と表記される抗体、19C11と表記される抗体、及び/又は7B12と表記される抗体の重鎖配列のHCDR3に対応する配列を有する重鎖CDR3(HCDR3)を有する。いくつかの態様において、該HCDR3は、
【化１】
2018509907.tif 000003
(ここで、X18は、T、A、又はSである);配列番号5;配列番号25;配列番号45;配列番号65;及び配列番号85;配列番号31、51、71、及び91;配列番号17;配列番号37;配列番号57;配列番号77;並びに配列番号97の中から選択される配列を有する。
【０００８】
いくつかの実施態様において、提供される抗体又は抗原結合断片は、本明細書に提供される重鎖配列のうちの1つ、例えば、18C6と表記される抗体、10C6と表記される抗体、19C11と表記される抗体、及び/又は7B12と表記される抗体の重鎖配列のCDR1(HCDR1)に対応する配列を有する重鎖HCDR1を含む。いくつかの態様において、該HCDR1は、
【化２】
2018509907.tif 000004
(ここで、X1は、L又はVである)、配列
【化３】
2018509907.tif 000005
(ここで、X8は、N又はSであり、かつX9は、L又はVである)、
【化４】
2018509907.tif 000006
(ここで、X15は、N又はSであり、かつX16は、V又はLである)、並びに配列番号3として示されている配列;並びに配列番号9として示されている配列;並びに配列番号15として示されている配列;並びに配列番号23、43、63、83のうちのいずれかに示されている配列;並びに配列番号29、49、69、及び89のうちのいずれかに示されている配列;並びに配列番号35、55、75、及び95のうちのいずれかに示されている配列の中から選択される配列を有する。
【０００９】
いくつかの実施態様において、提供される抗体又は抗原結合断片は、本明細書に提供される重鎖配列のうちの1つ、例えば、18C6と表記される抗体、10C6と表記される抗体、19C11と表記される抗体、及び/又は7B12と表記される抗体の重鎖配列のCDR2(HCDR2)に対応する配列を有する重鎖HCDR2を含む。いくつかの態様において、該HCDR2は、
【化５】
2018509907.tif 000007
(ここで、X2は、E又は非存在であり、かつX3は、Y又はNである);
【化６】
2018509907.tif 000008
(ここで、X10は、E又は非存在である);
【化７】
2018509907.tif 000009
(ここで、X17は、E又は非存在である);配列番号4として示されている配列;配列番号10として示されている配列;及び配列番号16として示されている配列;及び配列番号24、44、64、84のうちのいずれかに示されている配列;及び配列番号30、50、70、90のうちのいずれかに示されている配列;及び配列番号36、56、76、96のうちのいずれかに示されている配列の中から選択される配列を有する。
【００１０】
前述の実施態様のいずれかを含む、いくつかの実施態様において、提供される抗体又は抗原結合断片は、本明細書に提供される軽鎖配列のうちの1つ、例えば、18C6と表記される抗体、10C6と表記される抗体、19C11と表記される抗体、及び/又7B12と表記される抗体の軽鎖配列のCDR3(LCDR3)に対応する配列を有する軽鎖LCDR3を含む、例えば、さらに含む。いくつかの態様において、該LCDR3は、
【化８】
2018509907.tif 000010
(ここで、X6は、G又はSであり、かつX7は、H又はYである);
【化９】
2018509907.tif 000011
(ここで、X13は、G又はSであり、かつX14は、H又はYである);及び
【化１０】
2018509907.tif 000012
;配列番号8、28、48、68、及び88の中から選択される配列;配列番号14、34、54、74、及び94の中から選択される配列;並びに配列番号20、4、60、80、及び100の中から選択される配列の中から選択される配列を有する。
【００１１】
前述の実施態様のいずれかを含む、いくつかの実施態様において、提供される抗体又は抗原結合断片は、本明細書に提供される軽鎖配列のうちの1つ、例えば、18C6と表記される抗体、10C6と表記される抗体、19C11と表記される抗体、及び/又7B12と表記される抗体の軽鎖配列のCDR1(LCDR1)に対応する配列を有する軽鎖LCDR1を含む、例えば、さらに含む。いくつかの態様において、該LCDR1は、
【化１１】
2018509907.tif 000013
(ここで、X11は、L又はRであり、かつX12は、H又はKである);
【化１２】
2018509907.tif 000014
(ここで、X19は、V又はLであり、かつX20は、H又はKである);配列番号6、26、46、66、及び86の中から選択される配列;配列番号12、32、52、72、及び92の中から選択される配列;並びに配列番号18、38、58、78、及び98の中から選択される配列の中から選択される配列を有する。
【００１２】
前述の実施態様のいずれかを含む、いくつかの実施態様において、提供される抗体又は抗原結合断片は、例えば、本明細書に提供される軽鎖配列のうちの1つ、例えば、18C6と表記される抗体、10C6と表記される抗体、19C11と表記される抗体、及び/又7B12と表記される抗体の軽鎖配列のCDR2(LCDR2)に対応する配列を有する軽鎖LCDR2を含む、例えば、さらに含む。いくつかの態様において、該LCDR2は、
【化１３】
2018509907.tif 000015
;及び配列番号7、27、47、67、87; 13、33、53、73、93、19、39、59、79、99、119のうちのいずれかに示されている配列の中から選択される配列を有する。
【００１３】
該実施態様のいずれかの抗体及び抗原結合断片の中に、(a)アミノ酸配列
【化１４】
2018509907.tif 000016
(ここで、X1は、L又はVである)を含むVH相補性決定領域(CDR)1;(b)アミノ酸配列
【化１５】
2018509907.tif 000017
(ここで、X2は、E又は非存在であり、かつX3は、Y又はNである)を含むVH CDR2;及び(c)アミノ酸配列
【化１６】
2018509907.tif 000018
を含むVH CDR3を有するものがある。
【００１４】
該実施態様のいずれかの抗体及び抗原結合断片の中に、(a)アミノ酸配列
【化１７】
2018509907.tif 000019
(ここで、X8は、N又はSであり、かつX9は、L又はVである)を含むVH CDR1;(b)アミノ酸配列
【化１８】
2018509907.tif 000020
(ここで、X10は、E又は非存在である)を含むVH CDR2;及び(c)アミノ酸配列
【化１９】
2018509907.tif 000021
を含むVH CDR3を有するものがある。
【００１５】
該実施態様のいずれかの抗体及び抗原結合断片の中に、(a)アミノ酸配列
【化２０】
2018509907.tif 000022
(ここで、X15は、N又はSであり、かつX16は、V又はLである)を含むVH CDR1;(b)アミノ酸配列
【化２１】
2018509907.tif 000023
(ここで、X17は、E又は非存在である)を含むVH CDR2;及び(c)アミノ酸配列
【化２２】
2018509907.tif 000024
(ここで、X18は、T、A、又はSである)を含むVH CDR3を有するものがある。
【００１６】
該実施態様のいずれかの抗体及び抗原結合断片の中に、配列番号3のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を含むVH CDR3;配列番号9のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号11のアミノ酸配列を含むVH CDR3;配列番号15のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号16のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むVH CDR3;配列番号23のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号24のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVH CDR3;配列番号29のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号31のアミノ酸配列を含むVH CDR3;配列番号35のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号37のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;配列番号43のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号44のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVH CDR3;配列番号49のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号50のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号51のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;配列番号55のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号56のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号57のアミノ酸配列を含むVH CDR3;配列番号63のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号64のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号65のアミノ酸配列を含むVH CDR3;配列番号69のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号70のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号71のアミノ酸配列を含むVH CDR3;配列番号75のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号76のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号77のアミノ酸配列を含むVH CDR3;配列番号83のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号84のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号85のアミノ酸配列を含むVH CDR3;配列番号89のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号90のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号91のアミノ酸配列を含むVH CDR3;配列番号95のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号96のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号97のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを有するものがある。
【００１７】
該実施態様のいずれかの抗体及び抗原結合断片の中に、(a)アミノ酸配列
【化２３】
2018509907.tif 000025
(ここで、X4は、R又はLであり、かつX5は、K又はHである)を含むVL CDR1;(b)アミノ酸配列
【化２４】
2018509907.tif 000026
を含むVL CDR2;及び(c)アミノ酸配列
【化２５】
2018509907.tif 000027
(ここで、X6は、G又はSであり、かつX7は、H又はYである)を含むVL CDR3
を有するものがある。
【００１８】
該実施態様のいずれかの抗体及び抗原結合断片の中に、(a)アミノ酸配列
【化２６】
2018509907.tif 000028
(ここで、X11は、L又はRであり、かつX12は、H又はKである)を含むVL CDR1;(b)アミノ酸配列YMS (配列番号:113)を含むVL CDR2;及び(c)アミノ酸配列
【化２７】
2018509907.tif 000029
(ここで、X13は、G又はSであり、かつX14は、H又はYである)を含むVL CDR3を有するものがある。
【００１９】
該実施態様のいずれかの抗体及び抗原結合断片の中に、アミノ酸配列
【化２８】
2018509907.tif 000030
(ここで、X19は、V又はLであり、かつX20は、H又はKである)を含むVL CDR1;(b)アミノ酸配列YMS (配列番号:119)を含むVL CDR2;及び(c)アミノ酸配列
【化２９】
2018509907.tif 000031
を含むVL CDR3を有するものがある。
【００２０】
該実施態様のいずれかの抗体及び抗原結合断片の中に、配列番号26のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号27のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号28のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は配列番号32のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号34のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は配列番号38のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号39のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号40のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は配列番号46のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号47のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は配列番号52のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号53のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号54のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は配列番号58のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号59のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は配列番号86のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号87のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号88のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は配列番号92のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号93のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号94のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は配列番号98のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号99のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号100のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は配列番号6のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は配列番号12のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号14のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は配列番号18のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号19のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は配列番号66のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号67のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号68のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は配列番号72のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号73のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号74のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は配列番号78のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号79のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号80のアミノ酸配列を含むVL CDR3を有するものがある。
【００２１】
該実施態様のいずれかの抗体及び抗原結合断片の中に、(a)(i)アミノ酸配列
【化３０】
2018509907.tif 000032
(ここで、X1は、LもしくはVである)を含むVH CDR1;アミノ酸配列
【化３１】
2018509907.tif 000033
(ここで、X2は、Eもしくは非存在であり、かつX3は、YもしくはNである)を含むVH CDR2;及びアミノ酸配列
【化３２】
2018509907.tif 000034
を含むVH CDR3を含むVH;並びに(ii)アミノ酸配列
【化３３】
2018509907.tif 000035
(ここで、X4は、RもしくはLであり、かつX5は、KもしくはHである)を含むVL CDR1;アミノ酸配列
【化３４】
2018509907.tif 000036
を含むVL CDR2;及びアミノ酸配列
【化３５】
2018509907.tif 000037
(ここで、X6は、GもしくはSであり、かつX7は、HもしくはYである)を含むVL CDR3を含むVL;又は(b)(i)アミノ酸配列
【化３６】
2018509907.tif 000038
(ここで、X8は、NもしくはSであり、かつX9は、LもしくはVである)を含むVH CDR1;アミノ酸配列
【化３７】
2018509907.tif 000039
(ここで、X10は、Eもしくは非存在である)を含むVH CDR2;及びアミノ酸配列
【化３８】
2018509907.tif 000040
を含むVH CDR3を含むVH;並びに(ii)アミノ酸配列
【化３９】
2018509907.tif 000041
(ここで、X11は、LもしくはRであり、かつX12は、HもしくはKである)を含むVL CDR1;アミノ酸配列YMS (配列番号:113)を含むVL CDR2;及びアミノ酸配列
【化４０】
2018509907.tif 000042
(ここで、X13は、GもしくはSであり、かつX14は、HもしくはYである)を含むVL CDR3を含むVL;又は(c)(i)アミノ酸配列
【化４１】
2018509907.tif 000043
(ここで、X15は、NもしくはSであり、かつX16は、VもしくはLである)を含むVH CDR1;アミノ酸配列
【化４２】
2018509907.tif 000044
(ここで、X17は、Eもしくは非存在である)を含むVH CDR2;及びアミノ酸配列
【化４３】
2018509907.tif 000045
(ここで、X18は、T、A、もしくはSである)を含むVH CDR3;並びに(ii)アミノ酸配列
【化４４】
2018509907.tif 000046
(ここで、X19は、VもしくはLであり、かつX20は、HもしくはKである)を含むVL CDR1;アミノ酸配列YMS (配列番号:119)を含むVL CDR2;及びアミノ酸配列
【化４５】
2018509907.tif 000047
を含むVL CDR3を含むVL;又は(d)(i)配列番号23のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号24のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号26のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号27のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号28のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は(e)(i)配列番号29のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号31のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号32のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号34のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は(f)(i)配列番号35のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号37のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号38のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号39のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号40のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は(g)(i)配列番号43のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号44のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号47のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は(h)(i)配列番号49のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号50のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号51のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号52のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号53のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号54のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は(i)(i)配列番号55のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号56のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号57のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号58のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号59のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は(j)(i)配列番号83のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号84のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号85のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号86のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号87のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号88のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は(k)(i)配列番号89のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号90のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号91のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号92のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号93のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号94のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は(l)(i)配列番号95のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号96のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号97のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH及び(ii)配列番号98のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号99のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号100のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は(m)(i)配列番号3のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号6のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は(n)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号11のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号12のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び���列番号14のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は(o)(i)配列番号15のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号16のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号18のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号19のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は(p)(i)配列番号63のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号64のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号65のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号66のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号67のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号68のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は(q)(i)配列番号69のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号70のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号71のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号72のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号73のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号74のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は(r)(i)配列番号75のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号76のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号77のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号78のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号79のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号80のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVLを有するものがある。
【００２２】
該実施態様のいずれかの抗体及び抗原結合断片の中に、(a)(i)
【化４６】
2018509907.tif 000048
(ここで、X21は、TもしくはNであり、X22は、IもしくはKであり、X23は、NもしくはSであり、X24は、VもしくはLであり、X25は、SもしくはIであり、X26は、PもしくはSであり、X27は、Eもしくは非存在であり、X28は、NもしくはYであり、X29は、KもしくはRであり、X30は、AもしくはDであり、X31は、TもしくはSであり、X32は、VもしくはAであり、X33は、GもしくはDであり、X34は、T、I、もしくはSであり、かつX35は、T、S、もしくはAである)というアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)
【化４７】
2018509907.tif 000049
(ここで、X36は、IもしくはVであり、X37は、PもしくはSであり、X38は、RもしくはLであり、X39は、KもしくはHであり、X40は、RもしくはKであり、X41は、EもしくはGであり、X42は、SもしくはGであり、かつX43は、YもしくはHである)というアミノ酸配列を含むVL;又は(b)(i)配列番号1のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号2のアミノ酸配列を含むVL;又は(c)(i)配列番号21のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号22のアミノ酸配列を含むVL;又は(d)(i)配列番号41のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号42のアミノ酸配列を含むVL;又は(e)(i)配列番号61のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号62のアミノ酸配列を含むVL;又は(f)(i)配列番号81のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号82のアミノ酸配列を含むVL:を有するものがある。
【００２３】
また、提供される抗体又は抗原結合断片の中に、任意のそのような抗体並びに/又は表1及び2に示される抗体のいずれかのVH及び/又はVL配列と少なくとも90、95、96、97、98、99、又は100％の同一性を有するものがある。また、提供される抗体又はその断片の中に、MUC16及び/又はそのエピトープに対する結合をそのような抗体のいずれかと競合するものがある。
【００２４】
また提供されるのは、融合タンパク質、例えば、該抗体のいずれかを含むキメラ分子及び/又はコンジュゲート、例えば、そのような抗体又は断片を含有するキメラ抗原受容体(CAR)、並びにそのような分子を発現する細胞である。また提供されるのは、任意のそのような抗体のヒト化バージョンである。
【００２５】
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、抗体又はその抗原結合断片であり、ここで、該抗体は、(a)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(b)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(c)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。ある実施態様において、(i)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞はSKOV3細胞であり;(ii)MUC16の該第二の形態を組換え発現する細胞はSKOV3細胞であり;かつ(iii)工程(c)の細胞はSKOV3細胞である。具体的な実施態様において、該抗体は、MUC16の第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠く。ある実施態様において、(i)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞はSKOV3細胞であり;(ii)MUC16の該第二の形態を組換え発現する細胞はSKOV3細胞であり;かつ(iii)工程(c)の細胞はSKOV3細胞である。ある実施態様において、(i)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞はSKOV3細胞であり;(ii)MUC16の該第二の形態を組換え発現する細胞はSKOV3細胞であり;(iii)MUC16の該第三の形態を組換え発現する細胞はSKOV3細胞であり;かつ(iv)工程(c)の細胞はSKOV3細胞である。
【００２６】
また本明細書に提供されるのは、抗体又はその抗原結合断片であり、ここで、該抗体は、(a)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(b)MUC16の第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(c)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。ある実施態様において、(i)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞はSKOV3細胞であり;(ii)MUC16の該第三の形態を組換え発現する細胞はSKOV3細胞であり;かつ(iii)工程(c)の細胞はSKOV3細胞である。
【００２７】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号150のN-グリコシル化アスパラギン1806を含むエピトープに免疫特異的に結合する。
【００２８】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列
【化４８】
2018509907.tif 000050
(ここで、
【化４９】
2018509907.tif 000051
のアミノ酸残基番号4(N4)及びアミノ酸残基番号10(N10)はグリコシル化されている)に免疫特異的に結合する。ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列
【化５０】
2018509907.tif 000052
(ここで、
【化５１】
2018509907.tif 000053
のアミノ酸残基番号7(N7)はグリコシル化されている)に免疫特異的に結合する。ある実施態様において、該グリコシル化は、N-結合型キトビオースからなる。
【００２９】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、MUC16の第一の形態を発現する細胞を該抗体又は抗原結合断片と接触させたとき、該細胞に内在化される。ある実施態様において、該細胞は、MUC16の該第一の形態を組換え発現するSKOV3細胞である。
【００３０】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、MUC16のグリコシル化形態を発現する腫瘍の成長を阻害する。
【００３１】
ある実施態様において、該抗体は、モノクローナル抗体である。
【００３２】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、(a)アミノ酸配列
【化５２】
2018509907.tif 000054
(ここで、X1は、L又はVである)を含むVH相補性決定領域(CDR)1;(b)アミノ酸配列
【化５３】
2018509907.tif 000055
(ここで、X2は、E又は非存在であり、かつX3は、Y又はNである)を含むVH CDR2;及び(c)アミノ酸配列
【化５４】
2018509907.tif 000056
を含むVH CDR3を含む重鎖可変領域(VH)を含む。
【００３３】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、(a)アミノ酸配列
【化５５】
2018509907.tif 000057
(ここで、X8は、N又はSであり、かつX9は、L又はVである)を含むVH CDR1;(b)アミノ酸配列
【化５６】
2018509907.tif 000058
(ここで、X10は、E又は非存在である)を含むVH CDR2;及び(c)アミノ酸配列
【化５７】
2018509907.tif 000059
を含むVH CDR3を含む、VHを含む。
【００３４】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、(a)アミノ酸配列
【化５８】
2018509907.tif 000060
(ここで、X15は、N又はSであり、かつX16は、V又はLである)を含むVH CDR1;(b)アミノ酸配列
【化５９】
2018509907.tif 000061
(ここで、X17は、E又は非存在である)を含むVH CDR2;及び(c)アミノ酸配列
【化６０】
2018509907.tif 000062
(ここで、X18は、T、A、又はSである)を含むVH CDR3を含む、VHを含む。
【００３５】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号3のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。
【００３６】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号9のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号11のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。
【００３７】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号15のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号16のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。
【００３８】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号23のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号24のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。
【００３９】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号29のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号31のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。
【００４０】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号35のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号37のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。
【００４１】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号43のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号44のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。
【００４２】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号49のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号50のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号51のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。
【００４３】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号55のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号56のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号57のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。
【００４４】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号63のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号64のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号65のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。
【００４５】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号69のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号70のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号71のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。
【００４６】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号75のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号76のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号77のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。
【００４７】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号83のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号84のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号85のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含む。
【００４８】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号89のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号90のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号91のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。
【００４９】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号95のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号96のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号97のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。
【００５０】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、
【化６１】
2018509907.tif 000063
(ここで、X21は、T又はNであり、X22は、I又はKであり、X23は、N又はSであり、X24は、V又はLであり、X25は、S又はIであり、X26は、P又はSであり、X27は、E又は非存在であり、X28は、N又はYであり、X29は、K又はRであり、X30は、A又はDであり、X31は、T又はSであり、X32は、V又はAであり、X33は、G又はDであり、X34は、T、I、又はSであり、かつX35は、T、S、又はAである)というアミノ酸配列を含むVHを含む。
【００５１】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号1のアミノ酸配列を含むVHを含む。
【００５２】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号21のアミノ酸配列を含むVHを含む。
【００５３】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号41のアミノ酸配列を含むVHを含む。
【００５４】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号61のアミノ酸配列を含むVHを含む。
【００５５】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号81のアミノ酸配列を含むVHを含む。
【００５６】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、(a)アミノ酸配列
【化６２】
2018509907.tif 000064
(ここで、X4は、R又はLであり、かつX5は、K又はHである)を含むVL CDR1;(b)アミノ酸配列
【化６３】
2018509907.tif 000065
を含むVL CDR2;及び(c)アミノ酸配列
【化６４】
2018509907.tif 000066
(ここで、X6は、G又はSであり、かつX7は、H又はYである)を含むVL CDR3を含む、軽鎖可変領域(VL)を含む。
【００５７】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、(a)アミノ酸配列
【化６５】
2018509907.tif 000067
(ここで、X11は、L又はRであり、かつX12は、H又はKである)を含むVL CDR1;(b)アミノ酸配列YMS (配列番号:113)を含むVL CDR2;及び(c)アミノ酸配列
【化６６】
2018509907.tif 000068
(ここで、X13は、G又はSであり、かつX14は、H又はYである)を含むVL CDR3を含む、VLを含む。
【００５８】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、(a)アミノ酸配列
【化６７】
2018509907.tif 000069
(ここで、X19は、V又はLであり、かつX20は、H又はKである)を含むVL CDR1;(b)アミノ酸配列YMS (配列番号:119)を含むVL CDR2;及び(c)アミノ酸配列
【化６８】
2018509907.tif 000070
を含むVL CDR3を含む、VLを含む。
【００５９】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号26のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号27のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号28のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、軽鎖可変領域(VL)を含む。
【００６０】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号32のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号34のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む。
【００６１】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号38のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号39のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号40のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む。
【００６２】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号46のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号47のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む。
【００６３】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号52のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号53のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号54のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む。
【００６４】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号58のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号59のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む。
【００６５】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号86のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号87のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号88のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む。
【００６６】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号92のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号93のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号94のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む。
【００６７】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号98のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号99のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号100のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む。
【００６８】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号6のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む。
【００６９】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号12のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号14のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む。
【００７０】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号18のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号19のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む。
【００７１】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号66のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号67のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号68のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む。
【００７２】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号72のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号73のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号74のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む。
【００７３】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号78のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号79のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号80のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む。
【００７４】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、
【化６９】
2018509907.tif 000071
(ここで、X36は、I又はVであり、X37は、P又はSであり、X38は、R又はLであり、X39は、K又はHであり、X40は、R又はKであり、X41は、E又はGであり、X42は、S又はGであり、かつX43は、Y又はHである)というアミノ酸配列を含むVLを含む。
【００７５】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号22のアミノ酸配列を含むVLを含む。
【００７６】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号42のアミノ酸配列を含むVLを含む。
【００７７】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号82のアミノ酸配列を含むVLを含む。
【００７８】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号2のアミノ酸配列を含むVLを含む。
【００７９】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号62のアミノ酸配列を含むVLを含む。
【００８０】
ある実施態様において、該抗体は、ヒト由来重鎖及び軽鎖定常領域を含む。ある実施態様において、該重鎖定常領域は、ガンマ1、ガンマ2、ガンマ3、及びガンマ4からなる群から選択されるアイソタイプを有する。ある実施態様において、該軽鎖定常領域は、カッパ及びラムダからなる群から選択されるアイソタイプを有する。
【００８１】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、ヒト化されている。ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、齧歯類抗体のヒト化形態である。
【００８２】
ある実施態様において、該抗体は、2つの同一の重鎖及び2つの同一の軽鎖を含む免疫グロブリンである。ある実施態様において、該免疫グロブリンは、IgGである。
【００８３】
また本明細書に提供されるのは、薬剤にコンジュゲートされた本明細書に提供される抗体又はその抗原結合断片を含む抗体コンジュゲートである。ある実施態様において、該薬剤は、イメージング剤又は細胞毒性剤である。
【００８４】
ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、二重特異性抗体である。ある実施態様において、該二重特異性抗体は、CD3に免疫特異的に結合する。ある実施態様において、該二重特異性抗体は、MUC16に免疫特異的に結合する免疫グロブリンを含み、ここで、該免疫グロブリンの軽鎖は、ペプチドリンカーを介して、CD3に免疫特異的に結合する単鎖可変断片(scFv)にコンジュゲートされている。また本明細書に提供されるのは、薬剤にコンジュゲートされた本明細書に提供される二重特異性抗体を含む二重特異性抗体コンジュゲートである。ある実施態様において、該薬剤は、イメージング剤又は細胞毒性剤である。
【００８５】
ある実施態様において、該その抗原結合断片は、単鎖可変断片(scFv)である。また本明細書に提供されるのは、薬剤にコンジュゲートされた本明細書に提供されるscFvを含むscFvコンジュゲートである。ある実施態様において、該薬剤は、イメージング剤又は細胞毒性剤である。
【００８６】
また本明細書に提供されるのは、該抗体及び抗原結合断片を含む融合タンパク質、キメラ分子、及びコンジュゲートである。提供される抗体又はその抗原結合断片のいずれかのうちの1つ又は複数を含むキメラ抗原受容体(CAR)、例えば、本明細書に提供されるscFvもしくは本明細書に提供されるscFvコンジュゲートのいずれかを含むCAR;及び/又はMUC16に対する結合をそれと競合する抗原結合ドメインを含むCARが提供される。
【００８７】
また本明細書に提供されるのは、抗体重鎖又はその抗原結合部分である。提供される抗体及びその抗原結合断片の中に、重鎖及び/又はその抗原結合部分、例えば、そのVH領域を有するものがあり;そのような重鎖及びその抗原結合部分も提供される。いくつかの実施態様において、該重鎖又はその抗原結合部分は、(a)アミノ酸配列
【化７０】
2018509907.tif 000072
(ここで、X1は、L又はVである)を含むVH CDR1;(b)アミノ酸配列
【化７１】
2018509907.tif 000073
(ここで、X2は、E又は非存在であり、かつX3は、Y又はNである)を含むVH CDR2;及び(c)アミノ酸配列
【化７２】
2018509907.tif 000074
を含むVH CDR3を含む、VHを含み;ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【００８８】
いくつかの実施態様において、該重鎖又はその抗原結合部分は、(a)アミノ酸配列
【化７３】
2018509907.tif 000075
(ここで、X8は、N又はSであり、かつX9は、L又はVである)を含むVH CDR1;(b)アミノ酸配列
【化７４】
2018509907.tif 000076
(ここで、X10は、E又は非存在である)を含むVH CDR2;及び(c)アミノ酸配列
【化７５】
2018509907.tif 000077
を含むVH CDR3を含む、VHを含み;ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【００８９】
いくつかの実施態様において、該重鎖又はその抗原結合部分は、(a)アミノ酸配列
【化７６】
2018509907.tif 000078
(ここで、X15は、N又はSであり、かつX16は、V又はLである)を含むVH CDR1;(b)アミノ酸配列
【化７７】
2018509907.tif 000079
(ここで、X17は、E又は非存在である)を含むVH CDR2;及び(c)アミノ酸配列
【化７８】
2018509907.tif 000080
(ここで、X18は、T、A、又はSである)を含むVH CDR3を含む、VHを含み;ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【００９０】
いくつかの実施態様において、該重鎖又はその抗原結合部分は、配列番号3のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【００９１】
いくつかの実施態様において、該重鎖又はその抗原結合部分は、配列番号9のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号11のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【００９２】
いくつかの実施態様において、該重鎖又はその抗原結合部分は、配列番号15のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号16のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【００９３】
いくつかの実施態様において、該重鎖又はその抗原結合部分は、配列番号23のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号24のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【００９４】
いくつかの実施態様において、該重鎖又はその抗原結合部分は、配列番号29のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号31のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【００９５】
いくつかの実施態様において、該重鎖又はその抗原結合部分は、配列番号35のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号37のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【００９６】
いくつかの実施態様において、該重鎖又はその抗原結合部分は、配列番号43のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号44のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【００９７】
いくつかの実施態様において、該重鎖又はその抗原結合部分は、配列番号49のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号50のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号51のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【００９８】
いくつかの実施態様において、該重鎖又はその抗原結合部分は、配列番号55のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号56のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号57のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【００９９】
いくつかの実施態様において、該重鎖又はその抗原結合部分は、配列番号63のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号64のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号65のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１００】
いくつかの実施態様において、該重鎖又はその抗原結合部分は、配列番号69のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号70のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号71のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１０１】
いくつかの実施態様において、該重鎖又はその抗原結合部分は、配列番号75のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号76のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号77のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１０２】
いくつかの実施態様において、該重鎖又はその抗原結合部分は、配列番号83のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号84のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号85のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１０３】
いくつかの実施態様において、該重鎖又はその抗原結合部分は、配列番号89のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号90のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号91のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１０４】
いくつかの実施態様において、該重鎖又はその抗原結合部分は、配列番号95のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号96のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号97のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１０５】
いくつかの実施態様において、該重鎖又はその抗原結合部分は、
【化７９】
2018509907.tif 000081
(ここで、X21は、T又はNであり、X22は、I又はKであり、X23は、N又はSであり、X24は、V又はLであり、X25は、S又はIであり、X26は、P又はSであり、X27は、E又は非存在であり、X28は、N又はYであり、X29は、K又はRであり、X30は、A又はDであり、X31は、T又はSであり、X32は、V又はAであり、X33は、G又はDであり、X34は、T、I、又はSであり、かつX35は、T、S、又はAである)というアミノ酸配列を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１０６】
いくつかの実施態様において、該重鎖又はその抗原結合部分は、配列番号1のアミノ酸配列を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１０７】
いくつかの実施態様において、該重鎖又はその抗原結合部分は、配列番号21のアミノ酸配列を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１０８】
いくつかの実施態様において、該重鎖又はその抗原結合部分は、配列番号41のアミノ酸配列を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１０９】
いくつかの実施態様において、該重鎖又はその抗原結合部分は、配列番号61のアミノ酸配列を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１１０】
いくつかの実施態様において、該重鎖又はその抗原結合部分は、配列番号81のアミノ酸配列を含むVHを含み、ここで、任意に、該抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１１１】
ある実施態様において、該抗体重鎖又はその抗原結合部分は、ヒト由来重鎖定常領域を含む。ある実施態様において、該重鎖定常領域は、ガンマ1、ガンマ2、ガンマ3、及びガンマ4からなる群から選択されるアイソタイプを有する。ある実施態様において、該抗体重鎖は、ヒト化されている。ある実施態様において、該抗体重鎖は、齧歯類重鎖のヒト化形態である。
【０１１２】
また本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される抗体重鎖を含む抗体重鎖コンジュゲートであり、ここで、該抗体重鎖は、薬剤にコンジュゲートされている。ある実施態様において、該薬剤は、イメージング剤又は細胞毒性剤である。
【０１１３】
提供される抗体及びその抗原結合断片の中に、軽鎖及び/又はその部分、例えば、そのVL領域を有するものがあり;そのような軽鎖及びその抗原結合部分も提供される。いくつかの実施態様において、該軽鎖又はその抗原結合部分は、(a)アミノ酸配列
【化８０】
2018509907.tif 000082
(ここで、X4は、R又はLであり、かつX5は、K又はHである)を含むVL CDR1;(b)アミノ酸配列
【化８１】
2018509907.tif 000083
を含むVL CDR2;及び(c)アミノ酸配列
【化８２】
2018509907.tif 000084
(ここで、X6は、G又はSであり、かつX7は、H又はYである)を含むVL CDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１１４】
いくつかの実施態様において、該軽鎖又はその抗原結合部分は、(a)アミノ酸配列
【化８３】
2018509907.tif 000085
(ここで、X11は、L又はRであり、かつX12は、H又はKである)を含むVL CDR1;(b)アミノ酸配列YMS (配列番号:113)を含むVL CDR2;及び(c)アミノ酸配列
【化８４】
2018509907.tif 000086
(ここで、X13は、G又はSであり、かつX14は、H又はYである)を含むVL CDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１１５】
いくつかの実施態様において、該軽鎖又はその抗原結合部分は、(a)アミノ酸配列
【化８５】
2018509907.tif 000087
(ここで、X19は、V又はLであり、かつX20は、H又はKである)を含むVL CDR1;(b)アミノ酸配列YMS (配列番号:119)を含むVL CDR2;及び(c)アミノ酸配列
【化８６】
2018509907.tif 000088
を含むVL CDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１１６】
いくつかの実施態様において、該軽鎖又はその抗原結合部分は、配列番号6のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１１７】
いくつかの実施態様において、該軽鎖又はその抗原結合部分は、配列番号12のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号14のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１１８】
いくつかの実施態様において、該軽鎖又はその抗原結合部分は、配列番号18のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号19のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１１９】
いくつかの実施態様において、該軽鎖又はその抗原結合部分は、配列番号26のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号27のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号28のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１２０】
いくつかの実施態様において、該軽鎖又はその抗原結合部分は、配列番号32のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号34のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１２１】
いくつかの実施態様において、該軽鎖又はその抗原結合部分は、配列番号38のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号39のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号40のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１２２】
いくつかの実施態様において、該軽鎖又はその抗原結合部分は、配列番号46のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号47のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１２３】
いくつかの実施態様において、該軽鎖又はその抗原結合部分は、配列番号52のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号53のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号54のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１２４】
いくつかの実施態様において、該軽鎖又はその抗原結合部分は、配列番号58のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号59のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１２５】
いくつかの実施態様において、該軽鎖又はその抗原結合部分は、配列番号66のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号67のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号68のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１２６】
いくつかの実施態様において、該軽鎖又はその抗原結合部分は、配列番号72のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号73のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号74のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１２７】
いくつかの実施態様において、該軽鎖又はその抗原結合部分は、配列番号78のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号79のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号80のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１２８】
いくつかの実施態様において、該軽鎖又はその抗原結合部分は、配列番号86のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号87のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号88のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１２９】
いくつかの実施態様において、該軽鎖又はその抗原結合部分は、配列番号92のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号93のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号94のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１３０】
いくつかの実施態様において、該軽鎖又はその抗原結合部分は、配列番号98のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号99のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号100のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１３１】
いくつかの実施態様において、該軽鎖又はその抗原結合部分は、
【化８７】
2018509907.tif 000089
(ここで、X36は、I又はVであり、X37は、P又はSであり、X38は、R又はLであり、X39は、K又はHであり、X40は、R又はKであり、X41は、E又はGであり、X42は、S又はGであり、かつX43は、Y又はHである)というアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１３２】
いくつかの実施態様において、該軽鎖又はその抗原結合部分は、配列番号2のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１３３】
いくつかの実施態様において、該軽鎖又はその抗原結合部分は、配列番号22のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１３４】
いくつかの実施態様において、該軽鎖又はその抗原結合部分は、配列番号42のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１３５】
いくつかの実施態様において、該軽鎖又はその抗原結合部分は、配列番号62のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１３６】
いくつかの実施態様において、該軽鎖又はその抗原結合部分は、配列番号82のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、任意に、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。
【０１３７】
ある実施態様において、該抗体軽鎖又はその抗原結合部分は、ヒト由来軽鎖定常領域を含む。ある実施態様において、該軽鎖定常領域は、カッパ及びラムダからなる群から選択されるアイソタイプを有する。ある実施態様において、該抗体軽鎖は、ヒト化されている。ある実施態様において、該抗体軽鎖は、齧歯類抗体のヒト化形態である。
【０１３８】
また本明細書に提供されるのは、薬剤にコンジュゲートされた本明細書に提供される抗体軽鎖を含む抗体軽鎖コンジュゲートである。ある実施態様において、該薬剤は、イメージング剤又は細胞毒性剤である。
【０１３９】
また本明細書に提供されるのは、ペプチドリンカーを介してscFvにコンジュゲートされた本明細書に提供される抗体軽鎖を含む融合タンパク質である。ある実施態様において、scFvは、CD3に結合する。
【０１４０】
また本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される分子のうちの1つ又は複数、例えば、本明細書に提供されるCARを組換え発現する、細胞、例えば、免疫細胞、例えば、T細胞である。
【０１４１】
また本明細書に提供されるのは、本明細書に提供されるscFvをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドである。また本明細書に提供されるのは、本明細書に提供されるscFv又はそのコンジュゲートをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドである。また本明細書に提供されるのは、本明細書に提供されるCARをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドである。また本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される抗体重鎖又はその抗原結合部分をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドである。また本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される抗体重鎖コンジュゲートをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドである。また本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される抗体軽鎖又はその抗原結合部分をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドである。また本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される抗体軽鎖コンジュゲートをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドである。また本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される融合タンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドである。(a)本明細書に提供される抗体重鎖もしくはその抗原結合部分又は本明細書に提供される抗体重鎖コンジュゲート;及び(b)本明細書に提供される抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分、本明細書に提供される抗体軽鎖コンジュゲート、又は本明細書に提供される融合タンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【０１４２】
また本明細書に提供されるのは、プロモーターに動作可能に連結された本明細書に提供されるポリヌクレオチドを含むベクターである。また本明細書に提供されるのは、(a)第一のプロモーターに動作可能に連結された本明細書に提供される第一のポリヌクレオチド;及び(b)第二のプロモーターに動作可能に連結された本明細書に提供される第二のポリヌクレオチドを含むベクターである。
【０１４３】
また本明細書に提供されるのは、プロモーターに動作可能に連結された本明細書に提供されるポリヌクレオチドを含むエクスビボ細胞である。また本明細書に提供されるのは、プロモーターに動作可能に連結された本明細書に提供されるポリヌクレオチドを含むエクスビボ細胞である。また本明細書に提供されるのは、本明細書に提供されるベクターを含むエクスビボ細胞である。また本明細書に提供されるのは、プロモーターに動作可能に連結された本明細書に提供される抗体又はその抗原結合断片をコードする1以上のポリヌクレオチドを含むエクスビボ細胞である。
【０１４４】
また本明細書に提供されるのは、抗体重鎖又はその抗原結合部分を産生する方法であって、本明細書に提供される細胞を、ポリヌクレオチドが該細胞によって発現されて、該ポリヌクレオチドによってコードされる該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分又は抗体重鎖コンジュゲートを産生するような条件下で培養することを含む、方法である。
【０１４５】
また本明細書に提供されるのは、抗体軽鎖又はその抗原結合部分を産生する方法であって、本明細書に提供される細胞を、ポリヌクレオチドが該細胞によって発現されて、該ポリヌクレオチドによってコードされる該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分、抗体軽鎖コンジュゲート、又は融合タンパク質を産生するような条件下で培養することを含む、方法である。
【０１４６】
また本明細書に提供されるのは、抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であって、本明細書に提供されるエクスビボ細胞を、第一のプロモーターに動作可能に連結されたポリヌクレオチド及び第二のプロモーターに動作可能に連結されたポリヌクレオチドが該細胞によって発現されて、(i)該ポリヌクレオチドによってコードされる抗体重鎖又は抗体重鎖コンジュゲート;及び(ii)該ポリヌクレオチドによってコードされる抗体軽鎖、抗体軽鎖コンジュゲート、又は融合タンパク質を産生するような条件下で培養することを含む、方法である。
【０１４７】
また本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される抗体又はその抗原結合断片、本明細書に提供される抗体コンジュゲート、本明細書に提供される二重特異性抗体、本明細書に提供される二重特異性抗体コンジュゲート、scFv、本明細書に提供されるscFvコンジュゲート、本明細書に提供されるCAR、本明細書に提供される抗体重鎖もしくはその抗原結合部分、本明細書に提供される抗体重鎖コンジュゲート、本明細書に提供される抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分、本明細書に提供される抗体軽鎖コンジュゲート、本明細書に提供される融合タンパク質、又は本明細書に提供されるT細胞の治療有効量;及び医薬として許容し得る担体:を含む医薬組成物である。
【０１４８】
また本明細書に提供されるのは、それを必要としている患者の癌を治療する方法であって、該患者に、本明細書に提供される医薬組成物を投与することを含む、方法である。ある実施態様において、癌は、肺、膵臓、乳房、子宮、卵管、又は原発性腹膜の癌である。ある実施態様において、癌は、卵巣の癌である。ある実施態様において、患者は、ヒト患者である。具体的な実施態様において、該方法は、追加の治療剤の治療有効量を患者に投与することをさらに含む、組合せ治療法である。
【０１４９】
組合せ治療法の具体的な実施態様において、該医薬組成物は、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片である第一の抗体の治療有効量を含み、ここで、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号150のN-グリコシル化Asn1806を含むが、配列番号150のN-グリコシル化Asn1800を含まないMUC16中のエピトープを認識し、ここで、該追加の治療剤は、第二の抗体又はその抗原結合断片であり、ここで、該第二の抗体又はその抗原結合断片は、配列番号150のN-グリコシル化Asn1806を含み、かつ配列番号150のN-グリコシル化Asn1800も含むMUC16中のエピトープを認識する。具体的な実施態様において、該第一の抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(このMUC16の第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;(ii)MUC16の第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如;及び(iii)MUC16の第四の形態(この第四の形態はグリコシル化されており、ここで、該第四の形態のアミノ酸配列は配列番号152である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力によって同定され、ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞、MUC16の該第三の形態を組換え発現する細胞、及びMUC16の該第四の形態を組換え発現する細胞は同じ細胞型のものであり、かつ該第二の抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;及び(ii)MUC16の第五の形態(この第五の形態はグリコシル化されており、ここで、該第五の形態のアミノ酸配列は配列番号172である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如によって同定され、ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞はMUC16の該第五の形態を組換え発現する細胞と同じ型の細胞である。
【０１５０】
組合せ治療法の具体的な実施態様において、該医薬組成物は、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片である第一の抗体又はその抗原結合断片の治療有効量を含み、ここで、該抗体又はその抗原結合断片は、配列番号150のN-グリコシル化Asn1806を含むが、配列番号150のN-グリコシル化Asn1800を含まないMUC16中のエピトープを認識し、ここで、該追加の治療剤は、第二の抗体又はその抗原結合断片の治療有効量であり、ここで、該第二の抗体又はその抗原結合断片は、配列番号150のN-グリコシル化Asn1800を含むが、配列番号150のN-グリコシル化Asn1806を含まないMUC16中のエピトープを認識する。具体的な実施態様において、該第一の抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(このMUC16の第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;(ii)MUC16の第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如;及び(iii)MUC16の第四の形態(この第四の形態はグリコシル化されており、ここで、該第四の形態のアミノ酸配列は配列番号152である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力によって同定され、ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞、MUC16の該第三の形態を組換え発現する細胞、及びMUC16の該第四の形態を組換え発現する細胞は同じ細胞型のものであり、かつ該第二の抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;(ii)MUC16の第三の形態(MUC16のこの第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;及び(iii)MUC16の第四の形態(該第四の形態のアミノ酸配列は配列番号152である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如によって同定され;ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞、MUC16の該第三の形態を組換え発現する細胞、及びMUC16の該第四の形態を組換え発現する細胞は同じ細胞型のものである。
【０１５１】
また本明細書に提供されるのは、1以上のグリコシル化部位を含む免疫原性糖ペプチドであり、ここで、(i)該免疫原性糖ペプチドは、10〜60アミノ酸残基、10〜30アミノ酸残基、15〜25アミノ酸残基、15〜20アミノ酸残基、又は15〜18アミノ酸残基の長さであり、かつ(ii)該1以上のグリコシル化部位のうちの少なくとも1つは、炭水化物と結合している。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、1つ、2つ、又は3つのグリコシル化部位を含む。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、炭水化物と結合しているグリコシル化部位を含む。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、炭水化物と各々結合している2つのグリコシル化部位を含む。ある実施態様において、該炭水化物は、N-又はO-結合型炭水化物である。ある実施態様において、該炭水化物は、単糖、二糖、三糖、四糖、又は五糖である。ある実施態様において、該炭水化物は、二糖である。ある実施態様において、該二糖は、キトビオースである。
【０１５２】
ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドのN末端は、アセチル化されている。ある実施態様において、該糖ペプチドのC末端は、N-メチルカルボキサミド誘導体の形態である。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、免疫原性キャリアタンパク質にコンジュゲートされている。ある実施態様において、該免疫原性キャリアタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニンである。
【０１５３】
ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、15〜18アミノ酸残基の長さである。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと結合しているグリコシル化部位を含む。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと各々結合している2つのグリコシル化部位を含む。
【０１５４】
ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、18アミノ酸残基の長さである。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと各々結合している2つのグリコシル化部位を含む。
【０１５５】
ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、15アミノ酸残基の長さである。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと結合しているグリコシル化部位を含む。
【０１５６】
ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、配列番号150のアミノ酸配列の少なくとも10アミノ酸部分を含み、ここで、該1以上のグリコシル化部位のうちの少なくとも1つは、該アミノ酸配列の部分にある。
【０１５７】
ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、配列番号129のアミノ酸配列を含む。
【０１５８】
ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと結合している配列番号129の30番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む。
【０１５９】
ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、Man3GlcNAc2部分と結合している配列番号129の30番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む。
【０１６０】
ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、配列番号130のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと各々結合している配列番号130の4番目の残基(Asn)及び10番目の残基(Asn)における2つのグリコシル化部位を含む。
【０１６１】
ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、配列番号131のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと結合している配列番号131の7番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む。
【０１６２】
また本明細書に提供されるのは、グリコール-タンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を作製する方法であって、対象を、1以上のグリコシル化部位を含む免疫原性糖ペプチドで免疫することを含み、ここで、(i)該免疫原性糖ペプチドが、10〜60アミノ酸残基、10〜30アミノ酸残基、15〜25アミノ酸残基、15〜20アミノ酸残基、又は15〜18アミノ酸残基の長さであり、(ii)該免疫原性糖ペプチドが該糖タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも10アミノ酸部分を含み、(iii)該1以上のグリコシル化部位のうちの少なくとも1つが炭水化物と結合しており、かつ(iv)該1以上のグリコシル化部位のうちの少なくとも1つが該アミノ酸配列の部分にある、方法である。ある実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、糖タンパク質の非グリコシル化形態に対する特異的結合を欠いている。ある実施態様において、対象は、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ニワトリ、モルモット、ラット、ウサギ、又はマウスである。ある実施態様において、対象は、ラット、ウサギ、又はマウスである。ある実施態様において、対象は、マウスである。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、1つ、2つ、又は3つのグリコシル化部位を含む。該免疫原性糖ペプチドが、炭水化物と結合しているグリコシル化部位を含む、請求項190〜195のいずれか一項記載の方法。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、炭水化物と各々結合している2つのグリコシル化部位を含む。ある実施態様において、該炭水化物は、N-又はO-結合型炭水化物である。ある実施態様において、該炭水化物は、単糖、二糖、三糖、四糖、又は五糖である。ある実施態様において、該炭水化物は、二糖である。ある実施態様において、該二糖は、キトビオースである。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドのN末端は、アセチル化されている。ある実施態様において、該糖ペプチドのC末端は、N-メチルカルボキサミド誘導体の形態である。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、免疫原性キャリアタンパク質にコンジュゲートされている。ある実施態様において、該免疫原性キャリアタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニンである。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、15〜18アミノ酸残基の長さである。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと結合しているグリコシル化部位を含む。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと各々結合している2つのグリコシル化部位を含む。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、18アミノ酸残基の長さである。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと各々結合している2つのグリコシル化部位を含む。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、15アミノ酸残基の長さである。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと結合しているグリコシル化部位を含む。ある実施態様において、該糖タンパク質は、配列番号150のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、配列番号129のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと結合している配列番号129の30番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む。ある実施態��において、該免疫原性糖ペプチドは、Man3GlcNAc2部分と結合している配列番号129の30番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、配列番号130のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと各々結合している配列番号130の4番目の残基(Asn)及び10番目の残基(Asn)における2つのグリコシル化部位を含む。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、配列番号131のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと結合している配列番号131の7番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む。
【０１６３】
また本明細書に提供されるのは、MUC16に免疫特異的に結合する抗体及びその抗原結合断片であって、本明細書に記載される抗体(例えば、10C6、7B12、19C11、16C5、又は18C6)のVH、VL、VH CDR、及び/又はVL CDR配列を有するもの、並びにその(例えば、イメージング剤又は細胞毒性剤との)コンジュゲートである。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
(4.図面の簡単な説明)
【図１】図1A〜図1I。MUC16コンストラクト。図1A: MUC16の略図。図1B:上: MUC16c344の略図。下:切断されたMUC16c344コンストラクトの線形表示。第一のタンデムリピートのN末端のアミノ酸配列は、配列番号155に示されている通りである。第一のタンデムリピートのC末端のアミノ酸配列は、配列番号156に示されている通りである。エクトドメインのN末端のアミノ酸配列は、配列番号157に示されている通りである。エクトドメインのC末端のアミノ酸配列は、配列番号158に示されている通りである。図1C:上: MUC16c114の略図。下: MUC16c114の線形表示。エクトドメインのアミノ酸配列は、配列番号161に示されている通りである。膜貫通部のアミノ酸配列は、配列番号159に示されている通りである。細胞質テールのアミノ酸配列は、配列番号159に示されている通りである。図1D:上: MUC16c80の略図。下: MUC16c80の線形表示。エクトドメインのアミノ酸配列は、配列番号162に示されている通りである。膜貫通部のアミノ酸配列は、配列番号159に示されている通りである。細胞質テールのアミノ酸配列は、配列番号159に示されている通りである。図1E:上: MUC16c86の略図。下: MUC16c86の線形表示。エクトドメインのアミノ酸配列は、配列番号163に示されている通りである。膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、配列番号164に示されている通りである。細胞質ドメインのアミノ酸配列は、配列番号165である。図1F: MUC16c114-N123の線形表示。3つの(N→A)突然変異があるエクトドメイン58aaのアミノ酸配列は、配列番号166に示されている通りである。膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、配列番号159に示されている通りである。細胞質ドメインのアミノ酸配列は、配列番号160に示されている通りである。図1G、図1H、及び図1Iは、FACS解析で4H11により検出された細胞のパーセントを示しており、ここで、該細胞株は、表示されたMUC16コンストラクトを発現する。
【０１６５】
【図２】図2A〜図2C。MUC16トランスフェクタントのインビトロ成長曲線。図2Aは、3T3細胞における、対照細胞株(phrGFP)と比較したときの、MUC16c114及びMUC16c344細胞株のインビトロ成長曲線を示している。図2Bは、A2780細胞における、対照細胞株(phrGFP)と比較したときの、MUC16c114及びMUC16c344細胞株のインビトロ成長曲線を示している。図2Cは、3T3細胞における、対照細胞株(phrGFP)と比較したときの、MUC16c114、MUC16c80、及びMUC16c86細胞株のインビトロ成長曲線を示している。
【０１６６】
【図３】図3A〜図3E。3T3細胞におけるMUC16の効果。図3Aは、60mmディッシュ中での3T3トランスフェクタントの軟寒天成長を示している。14日後、コロニーをカウントし、プロットした。表に示されたデータは、phrGFP対照ベクターを発現する細胞の軟寒天成長と比較した3回の類似の実験のうちの1つを表している(*** p＜0.0001)。図3Bは、phrGFP対照ベクター又はMUC16c114もしくはMUC16c344カルボキシ末端コンストラクトによる安定トランスフェクション後の3T3細胞株のマトリゲル浸潤アッセイを示している。各々のアッセイを3つ組で2回以上実施し、手でカウントした。MUC16c114細胞株とMUC16c344細胞株はどちらも、phrGFPベクター対照を発現する細胞の浸潤と比較して有意に浸潤性が高く(*** p＜0.0001)、MUC16c344細胞株での結果は、MUC16c114細胞株での結果と有意に異なっていた(# p＝0.0354)。図3Cは、MUC16c114及びMUC16c344発現によって誘導される転移及び浸潤遺伝子の発現を示している。80種の浸潤/転移遺伝子転写物のSuperArrayパネルをMUC16コンストラクト陽性細胞株及びベクターのみの細胞株について調べた。選択された走化性、接着、及び浸潤転写物の発現を3T3 MUC16c114又は3T3-MUC16c344細胞株で測定した(3つの3つ組の各々を2回反復で調べ、χ二乗検定によりphrベクターのみの対照と比較した)。反復測定について調整された各々の転写物のp値を表に示す。p＜0.05又はそれ未満のレベルの変化を有する全ての遺伝子が含まれている。図3D:トランスフェクトされた3T3細胞を、ベクターのみの対照と比較したERK/AKTシグナル伝達経路の活性化について調べた。ERK1/2(pT202/Y204)及びAKT(S473)のリン酸化は、phrベクターの発現と比較して、MUC16c114及びMUC16c344コンストラクトの発現後に増大していた。両方の経路の活性化が該細胞株の各々で見られた。B-アクチン標準化デンシトメトリー定量値を図の各々のウェスタンブロットの下に示す。図3Eは、無胸腺ヌードマウスにおけるMUC16コンストラクト陽性腫瘍成長を示している。200万個の腫瘍細胞を15匹のnu/nuマウスの側腹に導入し、マウスを腫瘍形成について観察した。腫瘍をノギスで週に2回測定した。平均腫瘍体積の差は、MUC16コンストラクト陽性腫瘍を担持するマウスで有意により大きかった(phrGFP対照ベクターを発現する細胞と比較して、どちらの株もp＜0.0001)。
【０１６７】
【図４】図4A〜図4C。MUC16断片の発癌特性。図4Aは、phrGFP対照ベクターか又はMUC16カルボキシ末端発現ベクターのMUC16c114もしくはMUC16c344かのいずれかでトランスフェクトされたA2780細胞株のマトリゲル浸潤アッセイを示している。各々のアッセイを3つ組で2回以上実施し、手でカウントした。結果を、phrGFP対照ベクター又はMUC16c114を発現する細胞のマトリゲル浸潤と比較した。MUC16c114又はMUC16c34細胞株は、phrGFPベクター対照と比べて有意なマトリゲル浸潤を示し、MUC16c344細胞株での結果は、MUC16c114細胞株での結果と有意に異なっていた(## p＝0.0018)。図4Bは、ERK/AKTシグナル伝達に対するMUC16発現の効果を示している。A2780細胞をERK/AKTシグナル伝達経路の活性化について調べた。ERK1/2(pT202/Y204)及びAKT(S473)のリン酸化は、MUC16発現コンストラクトの各々の発現後に増大していた。両方の経路が該細胞株の各々で活性化された。β-アクチン標準化デンシトメトリー定量値を図の各々のウェスタンブロットの下に示す。図4Cは、無胸腺ヌードマウスにおけるMUC16コンストラクト陽性腫瘍成長を示している。200万個の腫瘍細胞を15匹のnu/nuマウスの側腹に導入し、マウスを腫瘍形成について観察した。腫瘍をノギスで週に2回測定した。平均腫瘍体積の差は、図に示されているように、28日目で、MUC16c114又はMUC16c344陽性腫瘍のいずれかを担持するマウスで有意により大きかった。
【０１６８】
【図５】図5A〜図5D:切断型MUC16c114変異体の効果。図5A:軟寒天成長。MUC16c114の内部ドメイン部分又は外部ドメイン部分のいずれかを発現する3T3トランスフェクタントを、第6.1.2節に記載されている通りに、軟寒天に重層した。コロニーをカウントし、プロットした。示したデータは、3回の実験のうちの1つを表している。MUC16c80及びMUC16c86の軟寒天成長速度は、MUC16c114の成長速度と比較して有意に異なっていたが(それぞれ、# p＝0.0111及び## p＝0.0258)、より大きい有意水準が、MUC16c86トランスフェクタントの成長速度と比較したMUC1680トランスフェクタントの成長速度で見られた(### p＜0.0001)。図5Bは、phrGFP対照ベクター又はMUC16カルボキシ末端コンストラクトのいずれかでトランスフェクトされた3T3細胞株のマトリゲル浸潤アッセイを示している。各々のアッセイを3つ組で2回以上実施し、手でカウントした。MUC16c80トランスフェクタント細胞の浸潤は、MUC16c114細胞株の浸潤と比較して有意であった(# p＝0.0172)。図5Cは、ERK/AKTシグナル伝達に対するMUC16発現の効果を示している。トランスフェクトされた3T3細胞をERK/AKTシグナル伝達経路の活性化について調べた。ERK1/2(pT202/Y204)及びAKT(S473)のリン酸化は、MUC16c114の後に増大していたが;そのシグナルは、MUC16c80又はMUC16c86コンストラクトでトランスフェクトされた細胞でより低かった。β-アクチン標準化デンシトメトリー定量値を図の各々のウェスタンブロットの下に示す。図5Dは、無胸腺ヌードマウスにおけるMUC16コンストラクト陽性腫瘍成長を示している。200万個の腫瘍細胞を20匹のnu/nuマウスの側腹に導入し、マウスを腫瘍形成について観察した。腫瘍をノギスで週に2回測定した。平均腫瘍体積の差は、MUC16+腫瘍を担持するマウスで有意により大きかった。3T3 MUC16c114及び3T3 MUC16c86トランスフェクタントは、MUC16c80トランスフェクタントと比較して有意に異なっていた(### p＜0.0001)。
【０１６９】
【図６】図6A〜図6B。MUC16c114(アミノ酸残基1777〜1890(配列番号133)、図6A)及びMUC16c344(アミノ酸残基1547〜1890(配列番号132)、図6B)のアミノ酸配列。N-及びO-グリコシル化部位は強調表示され、膜貫通ドメイン(アミノ酸残基1835〜1859)は下線が引かれ、「膜貫通ドメイン」と表示されている。アミノ酸残基1857〜1884は、MUC16c86コンストラクトに存在する28アミノ酸の内部ドメイン欠失に相当する(図1参照)。アミノ酸残基1798〜1831は、MUC16c80コンストラクトに存在する34アミノ酸のエクトドメイン欠失に相当する(図1参照)。
【０１７０】
【図７】図7A〜図7H。MUC16形質転換に対するN-グリコシル化の効果。図7Aは、phrGFP対照ベクター又はMUC16c114又はMUC16c114-N123でトランスフェクトされた3T3細胞株及びMUC16c114でトランスフェクトされ、0.1μg/mLツニカマイシンで処理された3T3細胞株のマトリゲル浸潤アッセイを示している。MUC16c114細胞株での結果は、phrGFPベクター対照細胞株での結果と有意に異なっていた(### p＜0.0001)。MUC16c114-N123細胞株での結果は、phrGFPベクター対照細胞株での結果と比較して有意に異なっていた(** p＝0.007)。N-グリコシル化阻害剤のツニカマイシンによる処理は、未処理のMUC16c114と比較して、マトリゲル浸潤を有意に阻害した(p＝0.004)。図7Bは、phrGFP対照ベクターと比較した、3T3トランスフェクト細胞株のマトリゲル浸潤アッセイを示している。MUC16c114でトランスフェクトされた3T3細胞を、図8に詳述されているように、培地のみで処理するか、又は5μg/mLの対照pFUSE hIgG1-Fc2融合タンパク質で、もしくは5μg/mLのMUC16c57-c114-pFUSE hIgG1-Fc2融合タンパク質で、もしくは5μg/mLの117-244LGALS3-pFUSE hIgG1-Fc2融合タンパク質で処理した。MUC16c114細胞株は、phrGFPベクター対照を発現する対照3T3細胞よりもはるかに浸潤性が高く(*** p＜0.0001)、これは、pFUSEベクターのみのタンパク質への曝露によって影響を受けなかった。対照的に、MUC16c57-c114-pFUSE hIgG1-Fc2融合タンパク質又は117-244LGALS3-pFUSE hIgG1-Fc2融合タンパク質で処理されたMUC16c114細胞株は、MUC16c114対照細胞と比較してマトリゲル浸潤の有意な阻害を示した。図7Cは、ERK/AKTシグナル伝達に対するMUC16発現の効果を示している。トランスフェクトされた3T3細胞をERK/AKTシグナル伝達経路の活性化についても調べた。ERK1/2(pT202/Y204)及びAKT(S473)のリン酸化は、MUC16c114でトランスフェクトされた3T3で増大していたが;その効果は、MUC16c114-N123ベクターでトランスフェクトされた3T3細胞で減少していた(「MUC16c114-N123」及び「MUC163(N-->A)c114」は、本明細書において互換的に使用される)。アスパラギンからアラニンへの3つの突然変異という突然変異にもかかわらず、抗MUC16抗体(4H11 mAb)を用いたウェスタンブロットは、phrGFPベクター対照又はネイティブのMUC16c114のいずれかがトランスフェクトされた細胞よりも高いシグナルを示し、高レベルのMUC163(N-->A)c114タンパク質が、トランスフェクトされた3T3細胞で発現されることが示された。本明細書で使用される場合、「4H11」は、Raoらの文献、Appl. Immunohistochem Mol Morphol, 2010, 18(5):462-72及び国際特許出願公開WO 2011/119979号で4H11と表記されているモノクローナル抗MUC16抗体を指す。図7Dは、無胸腺ヌードマウスにおけるMUC16コンストラクト陽性腫瘍成長を示している。200万個の腫瘍細胞を20匹のnu/nuマウスの側腹に導入し、マウスを腫瘍形成について観察した。腫瘍をノギスで週に2回測定した。平均腫瘍体積の差は、MUC16c114腫瘍を担持するマウスで有意により大きかった(p＜0.0001)。3T3-MUC16c114トランスフェクタントでの結果は、phrGFP対照ベクター細胞株での結果と比較して極めて有意であった(*** p＜0.0001)。しかしながら、MUC16c114-N123 3T3トランスフェクタントは、phrGFPベクター対照3T3細胞に対する有意性を示さず、N-グリコシル化の突然変異が腫瘍成長及び浸潤を劇的に減少させることを示した。図7Eは、MUC16c57-114-pFUSE-ヒト-IgG1-Fc2コンストラクトの線形表示を示している。エクトドメインのアミノ酸配列は、配列番号161に示さ���ている通りである。図7Fは、表示された抗体によって決定されたMUC16c57-114-pFUSE-ヒト-IgG1-Fc2コンストラクトのタンパク質レベルを示している。図7Gは、117-244LGALS3-pFUSE-ヒト-IgG1-Fc2コンストラクトの線形表示を示している。糖結合ドメインのアミノ酸配列は、配列番号167に示されている通りである。図7Hは、表示された抗体によって決定された17-244LGALS3-pFUSE-ヒト-IgG1-Fc2コンストラクトのタンパク質レベルを示している。
【０１７１】
【図８】図8。擬似受容体としてのMUC16c57-c114pFUSEを構築するためにpFUSE-hIgG1-Fc2ベクターに挿入されたエクトドメイン-MUC16c57->c114(配列番号161; MUC16のアミノ酸残基1777〜1834)アミノ酸配列、及び117-244LGALS3pFUSEベクターを生じさせる、pFUSE-hIgG1-Fc2に挿入された117-244LGALS3アミノ酸配列(配列番号167)の配列。
【０１７２】
【図９】図9A〜図9E。MUC16c354トランスジェニックマウス。図9Aは、MUC16c354コンディショナルコンストラクトの戦略を示している。CMV初期エンハンサー＋ニワトリβアクチンプロモーター(CAG)を用いて、2つのloxPの間のhrGFP及び下流のMUC16c354配列の転写を導いた。図9B:サザンブロットは、顕微注射処置後の99匹の動物の中の12匹のMUC16c354陽性ファウンダー候補を示している。図9C:抗MUC16抗体4H11によるウェスタンブロットを用いて、MUC16c354マウスコロニー発生のためのファウンダー9(〜50コピー)及び36(〜10コピー)を特定した; A5は、MUC16c354で安定にトランスフェクトされたSKOV3由来の陽性細胞である。図9D: MUC16c354:p53+/-二重トランスジェニックマウス由来の腫瘍の組織学的解析。多発性肉腫及びリンパ腫をMUC16c354:p53+/-二重トランスジェニックマウスで確認した。切片をヘマトキシリン及びエオシン(H&E)で染色した。腫瘍には、子宮(I、スケールバー:100μm)、肝臓(II、スケールバー:50μm)、卵巣(III、スケールバー:50μm)、及び骨髄(IV、スケールバー:50μm)の組織球肉腫、並びに卵巣(V、スケールバー:50μm)、腎臓(VI、スケールバー:50μm)、及び肺(VII、スケールバー:50μm)のリンパ腫が、肺(VIII、スケールバー:50μm)の癌腫とともに含まれる。図9E:トランスジェニックマウスの癌特異的カプラン-マイヤー生存曲線: MUC16c354マウスは、野生型(WT)と同様、最初の18カ月にわたって自然発生的な腫瘍発生を示さなかった。しかしながら、MUC16c354マウスをp53+/-マウスと交配させたとき、二重トランスジェニックMUC16c354:p53+/-マウスは、自然発生的な腫瘍発生のために、p53+/-マウス(p＜0.014)又はMUC16c354マウスのいずれかと比較して有意に悪い全生存を示した。
【０１７３】
【図１０】図10。12カ月齢の雄及び雌MUC16c354トランスジェニックマウス由来の代表的な組織学的組織。組織切片をヘマトキシリン及びエオシン(H&E、スケールバー: 50μm)で染色した。子宮内膜増殖症が両方の遺伝子型で同様の発生率及び重症度で観察された(ここでは、トランスジェニック動物のみ示されている)。トランスジェニック動物(Tg)の卵巣、肺、結腸、及び肝臓は、親株(野生型、WT)と類似していた。
【０１７４】
【図１１】図11A〜図11C。ヒト卵巣癌におけるMUC16の影響。図11Aは、MUC16転写物の数を示している。図11B:同定されたMUC16突然変異を有する18人の患者と合わせた、最大のMUC16発現を有する患者の五分位数は、より低いMUC16発現を有する患者と比較したとき、カプラン-マイヤー解析において有意に(p＝0.02117)悪い生存率を有している。図11Cは、卵巣癌におけるMUC16遺伝子変化とPI3K突然変異事象との関係を示している。
【０１７５】
【図１２】図12A〜図12C。MUC16マトリゲル浸潤のグリコシル化要求性。図12Aは、SKOV3がトランスフェクトされた細胞株のマトリゲル浸潤アッセイを示している。phrGFPは、対照ベクターを発現するSKOV3細胞を指す。MUC16c114は、MUC16c114を発現するSKOV3細胞を指す。N3は、MUC16c114-N3を発現するSKOV3細胞を指す。N1-2は、MUC16c114-N12を発現するSKOV3細胞を指す。N1-2-3は、MUC16c114-N123を発現するSKOV3細胞を指す。MUC16c114-shControlは、MUC16c114及び対照shRNAを発現するSKOV-3細胞を指す。phrGFP shRNA MGAT集団#4は、対照ベクターとMGAT5に対するshRNAとを発現するSKOV3細胞を指す。phrGFP shRNA LGALS3集団#15は、対照ベクターとLGALS3に対するshRNAとを発現するSKOV3細胞を指す。MUC16c114-shMGAT5は、MUC16c114とMGAT5に対するshRNAとを発現するSKOV3細胞を指す。MUC16c114-shLGALS3は、MUC16c114とLGALS3に対するshRNAとを発現するSKOV3細胞を指す。図12Bは、対照ベクター、phrGFP、又は表示されたMUC16c114コンストラクトを発現する3T3細胞のマトリゲル浸潤アッセイを示している。図12Cは、腫瘍体積により決定された、表示されたコンストラクトを発現するSKOV3細胞が移植された無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍成長を示している。
【０１７６】
【図１３】図13A〜図13D。MUC16グリコシル化パターン及びペプチド。図13Aは、MUC16c114-N12を発現するSKOV3細胞のN-結合型プロファイリングを示している。三角は、フコースを表している。四角は、N-アセチルグルコサミンを表している。灰色の丸は、マンノースを表している。白丸は、ガラクトースを表している。菱形は、N-アセチルノイラミン酸を表している。図13Bは、55-mer(配列番号129)の免疫原を示している。図13Cは、15-mer(配列番号131)の免疫原を示している。図13Dは、18-mer(配列番号130)の免疫原を示している。
【０１７７】
【図１４】図14は、MUC16グリコシル化抗体を含む生体反応性上清と免疫原及びスクリーニング抗原標的として使用される15merと18merの両方のグリコシル化及び非グリコシル化抗原との相対的反応性の詳細なELISA解析を提供している。
【０１７８】
【図１５】図15A〜図15B。MUC16グリコシル化抗体はマトリゲル浸潤を阻害する。図15Aは、MUC16グリコシル化抗体の作製からの生体反応性上清の存在下又は非存在下でのphrGFP対照ベクター又はMUC16c114を発現するSKOV3細胞のマトリゲル浸潤を示している。線は、200という相対数を表す基準線である。図15Bは、精製MUC16グリコシル化抗体の存在下又は非存在下でのphrGFP対照ベクター又はMUC16c114を発現するSKOV3細胞のマトリゲル浸潤を示している。線は、90という相対数を表す基準線である。
【０１７９】
【図１６】図16A〜図16E。MUC16グリコシル化抗体はマトリゲル浸潤を阻害する。図16Aは、(i)対照抗体;(ii)4H11;又は(iii)MUC16グリコシル化抗体クローン10C6.E4の存在下におけるphrGFP対照ベクター又は表示されたMUC16c114コンストラクトを発現するSKOV3細胞のマトリゲル浸潤を示している。図16Bは、(i)対照抗体;(ii)4H11;又は(iii)MUC16グリコシル化抗体クローン10C6.E4の存在下における、4H11を用いた3回目のFACs選別後の、phrGFP対照ベクター又は表示されたMUC16c344コンストラクトを安定発現するSKOV3細胞のマトリゲル浸潤を示している。図16Cは、(i)対照抗体;(ii)4H11;又は(iii)MUC16グリコシル化抗体クローン10C6.E4の存在下における、phrGFP対照ベクター又は表示されたMUC16c114コンストラクトを発現する3T3細胞のマトリゲル浸潤を示している。図16Dは、MUC16c344を発現するSKOV3細胞が移植され、かつ模擬処置された(MUC16c344)又はMUC16グリコシル化抗体10C6.E4で処置された(MUC16c344＋10C6.E4)無胸腺ヌードマウスにおける、腫瘍体積によって示された、腫瘍成長を示している。矢印は、100μgのMUC16グリコシル化抗体が投与された日を示している。図16Eは、表示された抗体によるヒト卵巣腫瘍試料の染色を示している。
【０１８０】
【図１７】図17は、標識されたMUC16グリコシル化抗体が表示された温度及び時点で内在化される細胞のパーセントを示している。
【０１８１】
【図１８】図18Aは、MUC16トランスフェクタントのインビトロ成長曲線を示している。96ウェル平底プレート中の1000個のSKOV3細胞/ウェルを、phrGFPベクター対照、MUC16c114(配列番号133)を発現するphrGFPベクター、又はMUC16c344(配列番号132)を発現するphrGFPベクターとともに培養し、37℃、5％CO2で、5日間インキュベートした。毎日、プレートをAlamar Blueで染色し、37℃、5％CO2で、4時間インキュベートした。プレートをCytoFluor Fluorescentプレートリーダーで読み取った。曲線間で有意差は見られなかった。図18Bは、SKOV3 phrGFP細胞、SKOV3 MUC16c114-GFP細胞、又はSKOV3-MUC16c344-GFP細胞のマトリゲル浸潤アッセイを示している。各々のアッセイを3つ組で2回以上実施し、手でカウントした。結果は、浸潤細胞の相対数として表されている。c114及びc344は、phrGFPと比較して統計的に有意であった。図18Cは、無胸腺雌ヌードマウスにおけるSKOV3トランスフェクタント腫瘍成長を示している。200万個の腫瘍細胞を10匹のnu/nuマウスの側腹に導入し、マウスを腫瘍形成について観察した。腫瘍をノギスで週に2回測定した。平均腫瘍体積の差は、phrGFP腫瘍と比較したとき、MUC16c344腫瘍を担持するマウス(p＜0.0001)及びMUC16c114腫瘍を担持するマウス(p＝0.002)について統計的に有意に大きかった。図18A〜図18Cの略語:「SKOV3 phrGFP」及び「phrGFP」は、対照phrGFPベクターを発現するSKOV3細胞を指し;「SKOV3 MUC16c114-GFP」及び「c114」は、MUC16c114(配列番号133)を発現するSKOV3細胞を指し;「SKOV3 MUC16c344-GFP」及び「c344」は、MUC16c344(配列番号132)を発現するSKOV3細胞を指す。
【０１８２】
【図１９】図19A〜図19Fは、SKOV3卵巣癌細胞に対するMUC16発現の効果を示している。図19Aは、以下のもの:(1) 5μg/mLのツニカマイシン;(2) 5μg/mLの対照pFUSEタンパク質;(3) 5μg/mLのMUC16c57-114-pFUSE融合タンパク質;もしくは(4) 5μg/mLの117-244LGALS3-pFUSE融合タンパク質で又はこれらなしで処理された対照phrGFP対照ベクター(「phrGFP」)又はMUC16c114(配列番号133;「c114」)を発現するphrGFPベクターを発現するSKOV3細胞のマトリゲル浸潤アッセイを示している。結果は、処理から48時間後の浸潤細胞の相対数として表されている。c114細胞は、phrGFP細胞よりも浸潤性が高かった(p＜0.0001)。c114細胞の浸潤特性は、pFUSEベクターのみのタンパク質による処理では影響を受けなかった。ツニカマイシン(N-グリコシル化阻害剤)による処理は、c114細胞の浸潤特性を減少させた。MUC16c57-114-pFUSE融合タンパク質又は117-244LGALS3-pFUSEによる処理は、c114細胞の浸潤特性を減少させた(p＜0.0001)。図19Bは、lamelli対照shRNA、MGAT5特異的shRNA、又はLGALS3特異的shRNAの存在下又は非存在下における、phrGFPベクター対照(「phrGFP」)又はMUC16c114(配列番号133)(「c114」)を発現するphrGFPベクターでトランスフェクトされたSKOV3細胞のマトリゲル浸潤アッセイを示している。MGAT5特異的shRNA又はLGALS3特異的shRNAで処理されたc114細胞は、これらのshRNAで処理されたphrGFP細胞と比較して、浸潤が減少していた。対照shRNAは、c114細胞浸潤に対して影響を及ぼさなかった。各々のアッセイを3つ組で2回以上実施し、手でカウントした。図19Cは、SKOV3-MUC16c114マトリゲル浸潤のグリコシル化依存性を示している。SKOV3細胞をphrGFP対照ベクター又は以下のMUC16突然変異体:c114(配列番号133)、N1 mut c114(配列番号151)、N24 muc c114(配列番号152)、N30 mut c114(配列番号139)、N1-N24 mut c114(配列番号153)、N1-N24-N30 mut c114(配列番号154)を発現するphrGFPベクターでトランスフェクトした。c114発現細胞は、対照phrGFP細胞と比較したとき、浸潤の増大を示した。c114発現細胞の浸潤特性の増大は、MUC16c114(配列番号133)のアミノ酸位置24及び30におけるアスパラギンのN-グリコシル化に依存的であった。N24部位とN30部位はどちらも重要であったが、この効果に関しては、N30位置がN24部位よりも重要であるように思われた。各々のアッセイを3つ組で2回以上実施し、手でカウントした。結果は、phrGFPベクター対照と比較した％として表されている。図19Dは、SKOV3-MUC16c344マトリゲル浸潤のグリコシル化依存性を示している。SKOV3細胞を、phrGFP対照ベクター又は以下のMUC16突然変異体:c344(配列番号132)、N24 mut c344(配列番号173)、N30 mut c344(配列番号174)、又はN24-N30 mut c344(配列番号175)を発現するphrGFPベクターでトランスフェクトした。c344発現細胞は、対照phrGFP細胞と比較したとき、浸潤の増大を示した。c344発現細胞の浸潤特性の増大は、MUC16c114(配列番号133)のアミノ酸位置24及び30に対応するアスパラギンのN-グリコシル化に依存的であった。各々のアッセイを3つ組で2回以上実施し、手でカウントした。図19Eは、選択されたシグナル伝達経路に対するMUC16発現の効果を示している。MUC16c114(配列番号133)でトランスフェクトされたSKOV3細胞を、対照shRNA(「shLamelli」)又はMGAT5に対するshRNA(「shMGAT5」)又はLGALS3に対するshRNA(「shLGALLS3」)で又はこれらなしで処理し、phrGFPベクター対照(「phrGFP」)又はMUC16c114-N30mut(配列番号139)(「N30 mut」)を発現するphrGFPベクターでトランスフェクトされたSKOV3細胞��比較し、細胞を、pAKT、pERK1/2、pSRC、及びpEGF受容体(pEGFR)シグナル伝達経路の活性化について調べた。AKT(S473)及びERK1/2(pT202/Y204)のリン酸化は、MUC16c114細胞で増大していた。MGAT5のノックダウン(shMGAT5)、ガレクチン-3のノックダウン(shLGALLS3)、及びN30A突然変異は、各々、SKOV3細胞株におけるMUC16c114誘導性癌遺伝子活性化を低下させた。図19Fは、無胸腺雌ヌードマウスにおけるSKOV3トランスフェクタント腫瘍成長を示している。200万個の腫瘍(下記)細胞を、各々の条件について、10匹のnu/nuマウスの側腹に導入し、マウスを腫瘍形成について観察した。腫瘍をノギスで週に2回測定した。c114腫瘍細胞のインビボ成長は、phrGFP腫瘍細胞と比較してはるかにより攻撃的であった(p＜0.0001)。N1-N24-N30-mut c114、c114-sh-MGAT5、及びc114-sh-LGALS3腫瘍細胞は、phrGFP腫瘍細胞と比較したとき、成長の増強を示さなかった。腫瘍細胞の説明:「phrGFP」は、phrGFPベクター対照でトランスフェクトされたSKOV3細胞を指し;「c114」は、MUC16c114(配列番号133)を発現するphrGFPベクターでトランスフェクトされたSKOV3細胞を指し;「N1-N24-N30-mut c114」は、MUC16c114-N1-N24-N30-mut(配列番号154)を発現するphrGFPベクターでトランスフェクトされたSKOV3細胞を指し;「c114-sh-MGAT5」は、MUC16c114(配列番号133)を発現するphrGFPベクターでトランスフェクトされ、MGAT5に対するshRNAで処理されたSKOV3細胞を指し;かつ「c114-sh-LGALS3」は、MUC16c114(配列番号133)を発現するphrGFPベクターでトランスフェクトされ、かつLGALS3に対するshRNAで処理されたSKOV3細胞を指す。
【０１８３】
【図２０】図20Aは、EGFR表面発現に対するMUC16発現の効果を示している。SKOV3-phrGFP及びSKOV3-MUC16c114トランスフェクタントを、24時間のシクロヘキシミド(CHX)による処理の存在下又は非存在下で調べた。基礎レベル及びCHX処理後レベルでのEGFR及びMUC16発現の幾何平均蛍光が示されている。SKOV3-phrGFP試料中のEGFRは、CHXによる処理から24時間後、未処理レベルの58％にまで低下した。顕著なMUC16発現は、これらの細胞で存在しなかった。対照的に、SKOV3-MUC16c114細胞では、EGFR幾何平均蛍光のおおよそ25％の増加があり、これは、CHX曝露後、対照のEGFR幾何平均蛍光の83％にまで減少した。MUC16c114の平均蛍光は、CHXによって顕著には低下しなかった。図20Bは、全細胞EGFRのウェスタンブロットからのEGFR/β-アクチン比のデンシトメトリーを示しており、CHXで処理されたSKOV3-phrGFP細胞で時間とともにEGFRが着実に消失したことを示している。対照的に、SKOV3-MUC16c114細胞におけるEGFRの総レベルは維持され、MUC16(-)対照細胞株(「phrGFP(-)」)と比較したEGFRの安定化を示した。図20Cは、対照細胞浸潤の割合として表される、phrGFP対照ベクターでトランスフェクトされたSKOV3細胞(「安定phrGFP」)、SKOV3-MUC16c114、及びSKOV3-MUC16c114(tet)テトラサイクリン誘導性細胞株のマトリゲル浸潤アッセイを示している。SKOV3-MUC16c114(tet)細胞のテトラサイクリン誘導が安定なSKOV3-MUC16c114(SKOV3c114)と類似した浸潤表現型をもたらした一方、未誘導の細胞は、MUC16-phrGFP対照細胞と一致した。このMUC16誘導性のマトリゲル浸潤の増大は、EGFRに完全に依存していた。EGFRのヘアピンRNAノックダウン(shEGFR)をSKOV3細胞に導入したとき、テトラサイクリンは、MUC16の発現を誘導したが(ウェスタンブロットの4H11陽性タンパク質)、マトリゲル浸潤を増大させなかった。各々のアッセイを3つ組で実施し、手でカウントした。図20D: MUC16c114(+)及びMUC16c114(-)細胞におけるEGFR安定性。CHXで24時間処理され、全細胞EGFRについて調べられた未誘導の又はテトラサイクリン誘導性のSKOV3-MUC16c114(tet)細胞株の細胞抽出物は、デンシトメトリー比として表され、β-アクチンで標準化されている。テトラサイクリン誘導性SKOV3-MUC16c114細胞におけるEGFR減少の傾きは、MUC16c114(-)株と比較したMUC16c114発現のEGFR安定化効果を再現している。この結果は、上の図20Bで示された安定トランスフェクションの効果と類似している。
【０１８４】
【図２１】図21は、シクロヘキシミドで24時間処理された未誘導のSKOV3c114細胞株又はテトラサイクリン誘導性SKOV3c114細胞株(それぞれ、「未誘導のMUC16c114」及び「Tet誘導性MUC16c114」)の細胞抽出物のウェスタンブロット解析のデンシトメトリーを示している。ウェスタンブロットをpEGFRについて調べ、タンパク質レベルをβ-アクチンレベルに対して標準化した。テトラサイクリン誘導性SKOV3c114 pEGFRシグナルの傾きは、未誘導のSKOV3c114細胞株と比較したpEGFRの安定化を示した。
【０１８５】
【図２２】図22A〜図22Cは、MUC16エクトドメインN-グリコシル化種の同定及び化学合成を示している。図22A: N1-N24突然変異型MUC16c114(配列番号153)を発現するphrGFPでトランスフェクトされたSKOV3細胞のN-グリカンプロファイリング。グリカンは、ジョージア大学の複合糖質研究センター(Complex Carbohydrate Research Center)での全イオンマッピングにより検出され、特徴解析された。三角:フコース;四角: N-アセチルグルコサミン;黒塗りの丸:マンノース;白抜きの丸:ガラクトース;菱形: N-アセチルノイラミン酸。図22Bは、N30位置に単一のキトビオース(GlcNAc2)グリカンを有する55-merのMUC16抗原の模式的構造を示している。このN-糖ペプチド抗原を用いて、マウスを免疫して、抗体を産生させた。アミノ酸配列は、配列番号129に示されている通りである。四角はN-アセチルグルコサミンを表し;丸はマンノースを表している。図22Cは、それぞれ、N30位置においてキトビオースでモノ-グリコシル化された15-merのKLHコンジュゲートMUC16抗原並びにN24及びN30位置において2つのキトビオース単位でビス-グリコシル化された18-merのKLHコンジュゲートMUC16抗原の模式的構造を示している。これらのN-糖ペプチド-KLHコンストラクトは、後に、マウスを免疫して、MUC16エクトドメイン内のGlcNAc2-ペプチドエピトープに対するモノクローナル抗体を産生させるために使用された。4H11モノクローナル抗体を誘発させるMUC16非関連糖ペプチド及び非グリコシル化MUC16ペプチド2の配列も同様に含まれている。KLH-15-mer(キトビオース)[C-G25-V38]のアミノ酸配列は、配列番号131に示されている通りである。KLH-18-mer(キトビオース)2[C-T22-V38]のアミノ酸配列は、配列番号130に示されている通りである。MUC16非グリコシル化ペプチド2のアミノ酸配列は、配列番号168に示されている通りである。MUC16非関連ペプチド18mer及びMUC16非関連ペプチド18mer＋GlcNAc2のアミノ酸配列は、配列番号169に示されている通りである。四角はN-アセチルグルコサミンを表している。
【０１８６】
【図２３】図23A〜図23Hは、MUC16グリコシル化抗体の特徴解析を示している。図23Aは、サンドイッチELISAによる様々なMUC16及びGlcNAc2-グリコシル化ペプチドに対する4H11及び4つの主要なGlcNAc2-MUC16-エクトドメインモノクローナル抗体(MUC16グリコシル化抗体)の反応性を示している。グリカン-MUC16エクトドメイン交差反応性は、非グリコシル化MUC16ペプチド2(配列番号168)でも、どちらの非関連ペプチド(配列番号169)でも見られなかった。同様に、4H11は、GlcNAc2-MUC16 15-mer(配列番号131) N-糖ペプチドに対しても、(GlcNAc2)2-18-mer(配列番号130) N-糖ペプチドに対しても本質的に親和性を有していなかった。四角はN-アセチルグルコサミンを表し;三角はフコースを表し;丸はマンノースを表している。図23B、図23C、及び図23Dは、MUC16によって増強されたマトリゲル浸潤に対するMUC16グリコシル化抗体の効果を示している。結果は、対照と比較した％として表されている。精製4H11又は4つのグリカン-MUC16-エクトドメイン抗体18C6、10C6、19C22、もしくは7B12を5μg/mLで使用したか、或いはこれらを使用しなかった(対照)、MUC16c114(配列番号133)を発現するphrGFPでトランスフェクトされたSKOV3細胞(図23B)、CAOV3細胞(図23C)、及びOVCA-433細胞(図23D)のマトリゲルアッセイ。4つの抗グリカン-MUC16-エクトドメイン抗体(MUC16グリコシル化抗体)の各々は、3つの異なるMUC16(+)卵巣癌細胞株(CAOV3及びOVCA-433)の浸潤を阻害したが、4H11は、SKOV3-MUC16c114細胞の浸潤の阻害に対してあまり効果がなかった。図23Eは、MUC16グリコシル化抗体のモノクローナル抗体(「MAB」)10C6によるEGFR安定化の阻害を示している。CHXで処理され、その後、シクロヘキサミンド（cyclohexamind）処理後の表示された時間(hrs)で総EGFRについて調べられた、未誘導のSKOV3-MUC16c114(tet)細胞株、テトラサイクリン誘導性SKOV3-MUC16c114(tet)細胞株、又はモノクローナルMUC16グリコシル化抗体10C6で処理されたテトラサイクリン誘導性SKOV3-MUC16c114(tet)細胞株の細胞抽出物のウェスタンブロット解析のデンシトメトリー。図20Aに見られるように、デンシトメトリー曲線の傾きは、細胞表面におけるMUC16c114の存在がEGFRを安定化することを示した。MUC16グリコシル化抗体10C6は、MUC16c114による全EGFRタンパク質の安定化を無効化し、それをMUC16(-)未誘導対照と同じようにした。図23Fは、4H11、OC125(市販)、又はモノクローナルMUC16グリコシル化抗体(10C6及び19C11)で染色されたヒト卵巣組織マイクロアレイを示している。OC125及び4H11を用いると、漿液性卵巣癌におけるMUC16の発現は一定でありかつ重複していた。図23G及び図23Hは、無胸腺雌ヌードマウスにおける腫瘍成長に対するMUC16グリコシル化抗体の効果を示している。200万個の腫瘍細胞(phrGFPベクター(「phrGFP」)又はMUC16c344(配列番号132;「c344」)を発現するphrGFPベクターでトランスフェクトされたSKOV3細胞)を20匹のnu/nuマウスの側腹に導入した。10匹のマウスを、0日目から、100μg/マウスの精製モノクローナルMUC16グリコシル化抗体10C6で、週2回、4週間、静脈内処置した。全てのマウスを腫瘍形成について観察した。腫瘍をノギスで週に2回測定した。図23Gは、同じ細胞を用いて、10μg/mLの精製モノクローナルMUC16グリコシル化抗体10C6の存在下及び非存在下で行われたマトリゲル浸潤アッセイを示している。図23Hは、平均腫瘍体積の差が、未処置のMUC16c344腫瘍と比較して、MUC16c344腫瘍を担持するモノクローナルMUC16グリコシ��化抗体10C6処置マウスで有意に減少し(p＝0.0004)、腫瘍成長に対するMUC16の効果に対する防御を示したことを示している。
【０１８７】
【図２４】図24A〜図24Dは、ガレクチン媒介性のMUC16タンパク質-タンパク質相互作用を示している。図24Aは、3つのグリコシル化タンパク質(EGFR DDK-His; MUC16c57-114-pFUSE;及びLGALS3Myc-DDK)の免疫ブロット(IB)及び免疫沈降(IP)を示している。MUC16c57-114-pFUSEグリコシル化タンパク質をLGALS3タンパク質(0.13μg)及びEGFR(0.13μg)と合わせ、その後、4℃で1時間回転させた。予めブロッキングしておいたプロテインA/G PLUSアガロースビーズを添加し、4℃で一晩回転させた。IPペレットを徹底洗浄し、ローディングバッファー中でボイルし、10％SDS-PAGEゲル電気泳動によって分離し、その後、ニトロセルロース膜に転写した。この膜を、抗EGFR-v3、抗4H11-HRP、又はポリクローナル抗LGALS3抗体で調べた。示されているように、4H11結合は、MUC16c57-114-pFUSEが常に存在していることを示した。LGALS3は、MUC16c57-114-pFUSEについて陽性のレーンで結合したが、EGFRは、LGALS3とMUC16c57-114-pFUSEの両方が存在するときにしか検出されなかった。モノクローナルMUC16グリコシル化抗体18C6の存在は、これらのLGALS3とEGFRとMUC16タンパク質の複合体の形成を妨げた(右側のレーン)。図24Bは、MUC16タンパク質とEGFRタンパク質の共局在を示している。EGFR-A647及びMUC16に対する4H11-PE、又はEGFR-A647とMUC16に対する4H11-PEという両試薬の組合せによる、野生型OVCAR3細胞又はMUC16c344を発現するphrGFPでトランスフェクトされたSKOV3細胞(配列番号132;「SKOV3c344」)又はMUC16c114を発現するphrGFPでトランスフェクトされたSKOV3細胞(配列番号133;「SKOV3c114」)の免疫蛍光染色。顕微鏡画像(50μmスケール)は、3つ全ての細胞株におけるEGFRとMUC16c114の共局在を示した(矢印参照)。図24Cは、3つのグリコシル化タンパク質(インテグリンβ1Myc-DDK; MUC16c57-114-pFUSE、及びLGALS3Myc-DDK)の免疫ブロット(IB)及び免疫沈降(IP)を示している。通常、図24Aに見られるのと同じ方法を用いた。免疫ブロットをウェスタンブロット解析し、全ての免疫沈降試料を10％SDS-PAGEゲル上で泳動させ、ニトロセルロース膜上に転写し、インテグリンβ1に対する抗4C5-DDK抗体、又は抗4H11-HRP抗体、又はLGALS3に対する抗4C5-DDK抗体のいずれかで調べた。EGFRの場合と同様、3つ全てのタンパク質がインテグリンβ1タンパク質と共沈する必要があった。右側の3つのレーンに示されているように、MUC16グリコシル化抗体18C6は、MUC16とLGALS3とインテグリンβ1の組合せも遮断した。図24Dは、MUC16とインテグリンβ1タンパク質の共局在を示している。インテグリンβ1-A647又はMUC16に対する4H11-PE又はインテグリンβ1-A647もしくはMUC16に対する4H11-PEという両試薬の組合せによる、野生型OVCAR3細胞又はMUC16c344を発現するphrGFPでトランスフェクトされたSKOV3細胞(配列番号132;「SKOV3c344」)又はMUC16c114を発現するphrGFPでトランスフェクトされたSKOV3細胞(配列番号133;「SKOV3c114」)の免疫蛍光染色。顕微鏡画像(50μmスケール)は、OVCAR3、SKOV3c344、及びSKOV3c114細胞におけるインテグリンβ1とMUC16の共局在を示した(矢印参照)。
【０１８８】
【図２５】図25Aは、EGFR-A647又はMUC16に対する4H11-PE又は両試薬の組合せによる、野生型OVCAR3細胞、又はMUC16c344を発現するphrGFPでトランスフェクトされたSKOV3細胞(配列番号132;「SKOV3c344」)もしくはMUC16c114を発現するphrGFPでトランスフェクトされたSKOV3細胞(配列番号133;「SKOV3c114」)、すなわち、SKOV3c344細胞株もしくはSKOV3c114細胞株の免疫蛍光染色を示している。顕微鏡画像(スケール100μm)は、EGFRとMUC16の共局在を明瞭に示した(矢印参照)。図25B:インテグリンβ1-A647もしくはMUC16に対する4H11-PE又は両試薬の組合せによる野生型OVCAR3細胞株又はSKOV3c344細胞株の免疫蛍光染色。顕微鏡画像(スケール100μm)は、インテグリンβ1とMUC16の共局在を明瞭に示した(矢印参照)。
【０１８９】
【図２６】図26A〜図26Dは、MUC16腫瘍促進のモデルを示している。図26Aは、EGFR-LGALS3-MUC16とLGALS3-インテグリンβ1-MUC16の関係の図を示している。EGFRによるSRC/ERK/AKTのシグナル伝達又はインテグリンβ1によるSRC/FAKのシグナル伝達は、MUC16及びシグナル伝達分子とLGALS3五量体との相互作用に依存した。図26Bは、グリコシル化消失のモデルを示している: shMGAT5トランスフェクト細胞株において、MUC16、EGFR、及びインテグリンβ1上の部位におけるN-グリコシル化は、四本鎖構造の消失によって低下し、LGALS3に対する結合をもたらさなかった。図26Cは、ガレクチン-3消失のモデルを示している: shLGALS3トランスフェクト細胞株において、MUC16上のN-グリコシル化部位は存在していたが、LGALS3に対する結合の欠如により、MUC16/EGFR又はMUC16/インテグリンβ1会合の消失及び内から外へのシグナルの低下が生じた。図26Dは、MUC16/LGALS3相互作用の潜在的阻害剤のモデルを示している。MUC16グリコシル化抗体又は「ダミー」の擬似受容体(抗MUC16c57-114pFUSEもしくは抗117-244LGALS3-pFUSE)に曝露されたMUC16(+)細胞は、LGALS3ゲルに結合することができず、また、その後、EGFRにもインテグリンβ1にも結合することができなかった。
【０１９０】
【図２７】図27Aは、側鎖が保護されたN-アセチル化55-merペプチドアミド(配列番号129)を示している。図27Bは、糖ペプチドp55-mer[N1-S55]についてのESI-MSとUPLC分析からのUVトレースとを示している。C486H760N84O111S8、9812.25(平均同位体)[M+5H]5+の計算値m/z 1963.45、実測値1963.20;[M+6H]6+の計算値m/z 1636.38、実測値1636.24;[M+7H]7+の計算値m/z 1402.75、実測値1402.74。BEH C4カラム、勾配:80-99％アセトニトリル/水、0.3mL/分の流速で6分かける。
【０１９１】
【図２８】図28Aは、キトビオースを担持する55-mer糖ペプチド:「55-mer(キトビオース)[N1-S55]」(GlcNAc2-55-mer)(配列番号129)を示している。図28Bは、糖ペプチド「55mer(キトビオース)[N1-S55]」(GlcNAc2-55-mer)についてのESI-MSとUPLC分析からのUVトレースとを示している。C291H463N87O97S、6764.38(平均同位体)[M+4H]4+の計算値m/z 1692.10、実測値1692.01;[M+5H]5+の計算値m/z 1353.88、実測値1353.86;[M+6H]6+の計算値m/z 1128.40、実測値1128.41;[M+7H]7+の計算値m/z 967.34、実測値967.45;[M+8H]8+の計算値m/z 846.55、実測値846.27。BEH C4カラム、勾配:20-40％アセトニトリル/水、0.3mL/分の流速で6分かける。
【０１９２】
【図２９】図29Aは、Man3GlcNAc2を担持する55-mer糖ペプチド:「55-mer(Man3GlcNAc2)[N1-S55]」(Man3GlcNAc2-55-mer)(配列番号129)を示している。図29Bは、糖ペプチド「55mer(Man3GlcNAc2)[N1-S55]」(Man3GlcNAc2-55-mer)についてのESI-MSと分析的HPLC分析からのUVトレースとを示している。C309H493N87O112S、7250.80(平均同位体)[M+4H]4+の計算値m/z 1813.70、実測値1813.52;[M+5H]5+の計算値m/z 1451.16、実測値1451.02;[M+6H]6+の計算値m/z 1209.47、実測値1209.33;[M+7H]7+の計算値m/z 1036.83、実測値1036.74。Waters X-Bridge C18カラム、勾配:25-35％アセトニトリル/水、0.2mL/分の流速で30分かける。
【０１９３】
【図３０】図30Aは、側鎖が保護された15-merペプチド(p15-mer[C-G25-V38])(配列番号131)を示している。図30Bは、キトビオース-モノグリコシル化15-mer糖ペプチド: 15-mer(キトビオース)[C-G25-V38](GlcNAc2-15-mer)(配列番号132)を示している。図30Cは、糖ペプチド「15mer(キトビオース)[C-G25-V38]」(GlcNAc2-15-mer)についてのESI-MSと分析的HPLC分析からのUVトレースとを示している。C87H142N24O35S、2116.26(平均同位体)[2M+3H]3+の計算値m/z 1411.84、実測値1412.02;[M+2H]2+の計算値m/z 1059.13、実測値1059.15;[M+3H]3+の計算値m/z 706.42、実測値706.46。Varian Microsorb 300-5 C18カラム、勾配:15-30％アセトニトリル/水、0.2mL/分の流速で30分かける。
【０１９４】
【図３１】図31Aは、側鎖が保護された18-merペプチド(p18-mer[C-G22-V38])(AF-I-165)(配列番号130)を示している。図31Bは、キトビオース-ビスグリコシル化18-mer糖ペプチド:「18-mer(キトビオース)2[C-T22-V38]」[(GlcNAc2)2-18-mer](配列番号130)を示している。図31Cは、糖ペプチド「18mer(キトビオース)2[C-T22-V38]」[(GlcNAc2)2-18-mer]についてのESI-MSと分析的HPLC分析からのUVトレースとを示している。C117H193N33O50S、2894.04(平均同位体)[2M+3H]3+の計算値m/z 1930.36、実測値1930.22;[M+2H]2+の計算値m/z 1448.02、実測値1447.65;[M+3H]3+の計算値m/z 965.68、実測値965.25。Varian Microsorb 300-5 C8カラム、勾配:15-30％アセトニトリル/水、0.2mL/分の流速で30分かける。
【０１９５】
【図３２】図32Aは、KLHにコンジュゲートされた糖ペプチド「15-mer(キトビオース)[C-G25-V38]」(配列番号131)を示している。図32Bは、KLHにコンジュゲートされた糖ペプチド「18-mer(キトビオース)2[C-T22-V38]」(配列番号130)を示している。
【発明を実施するための形態】
【０１９６】
(5.詳細な説明)
提供されるのは、抗体及びその抗原結合断片、並びにそのような抗体もしくは断片を含むポリペプチド、例えば、融合タンパク質、コンジュゲート、及び/又はキメラ抗原受容体、並びにこれら発現する細胞である。該抗体及び断片の中に、MUC16タンパク質のエピトープに特異的に結合するものがある。そのような抗体は、本明細書において、「MUC16グリコシル化抗体」と呼ばれる。そのようなエピトープは、典型的には、MUC16分子、通常、MUC16の非放出形態の細胞外部分の内部又は実質的に内部にあるエピトープであり;いくつかの実施態様において、該エピトープは、MUC16のタンデムリピート領域及び/もしくはMUC16の分泌形態の内部にあることも、該抗体もしくは断片が、MUC16のタンデムリピート領域及び/もしくはMUC16の分泌形態に結合することもない。いくつかの実施態様において、該エピトープは、MUC16c114の内部にあるか、又はMUC16c114の内部の残基を含み、典型的には、その中に1以上のグリコシル化残基又はグリコシル化部位を含む。いくつかの実施態様において、該エピトープは、1以上のグリコシル化部位、例えば、N-グリコシル化の部位を含む。いくつかの態様において、該エピトープは、配列番号150に示されるMUC16配列(及び/又はそのグリコシル化形態)のAsn1806又はAsn1800に対応するアスパラギン残基を含み;いくつかの態様において、該エピトープは、配列番号150のAsn1806に対応するアスパラギン残基を含むが、配列番号150のAsn1800に対応するアスパラギン残基を含まず;いくつかの態様において、該エピトープは、配列番号150のAsn1800に対応するアスパラギン残基を含むが、配列番号150のAsn1806に対応するアスパラギン残基を含まない。そのような実施態様のいずれかのいくつかにおいて、そのような1以上のアスパラギンは、グリコシル化されており、例えば、N-グリコシル化されている。いくつかの実施態様において、該抗体又は断片は、配列番号131の内部のエピトープもしくは配列番号131の内部の残基を含むエピトープに結合するか;配列番号130の内部のエピトープもしくは配列番号130の内部の残基を含むエピトープに結合するか、又はこれらの組合せであり;いくつかの実施態様において、該抗体又は断片は、配列番号168に対応するMUC16の領域内でも、配列番号168の残基2〜19の内部にあるMUC16の領域内でも免疫特異的に結合しない。
【０１９７】
一態様において、本明細書に提供されるのは、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する抗体(例えば、モノクローナル抗体)及びその抗原結合断片である。別の態様において、本明細書に提供されるのは、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する抗体(例えば、モノクローナル抗体)及びその抗原結合断片である。好ましい実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体及びその抗原結合断片は、配列番号150のアミノ酸残基1806(Asn1806)を含むエピトープに免疫特異的に結合し、ここで、Asn1806はN-グリコシル化されている(本明細書において「Asn1806グリコシル化」と呼ばれる)。本明細書の第6節の実施例で示されているように、Asn1806グリコシル化は、MUC16によって媒介される腫瘍細胞の浸潤及び成長にとって不可欠である。したがって、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体及びその抗原結合断片は、そのような腫瘍細胞の浸潤及び成長を結合遮断することができる。
【０１９８】
一実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、MUC16に結合するのに、N-グリコシル化Asn1806の他に、N-グリコシル化Asn1800を必要とする(すなわち、両方のN-グリコシル化部位は、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片によって認識されるエピトープの一部である)。「Asn1800」は、配列番号150のアミノ酸残基1800を指す。そのようなMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;及び(ii)MUC16の第五の形態(この第五の形態はグリコシル化されており、ここで、該第五の形態のアミノ酸配列は配列番号172である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如によって同定されることができ、ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞は、MUC16の該第五の形態を組換え発現する細胞と同じ細胞型である。
【０１９９】
一実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、MUC16に結合するのに、N-グリコシル化Asn1806を必要とするが、N-グリコシル化Asn1800を必要としない(すなわち、N-グリコシル化Asn1806は、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片によって認識されるエピトープの一部であるが、N-グリコシル化Asn1800は、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片によって認識されるエピトープの一部ではない)。そのようなMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;(ii)MUC16の第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如;及び(iii)MUC16の第四の形態(この第四の形態はグリコシル化されており、ここで、該第四の形態のアミノ酸配列は配列番号152である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力によって同定されることができ;かつ(iii)ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞、MUC16の該第三の形態を組換え発現する細胞、及びMUC16の該第四の形態を組換え発現する細胞は、同じ細胞型のものである。
【０２００】
配列番号133のアミノ酸配列によってコードされるタンパク質は、本明細書においてMUC16c114とも呼ばれ、成熟MUC16のC末端の114アミノ酸残基からなる(配列番号150は成熟MUC16の配列である)。MUC16c114は、配列番号133の位置1、24、及び30のアスパラギンアミノ酸残基(配列番号150のアミノ酸位置Asn1777、Asn1800、及びAsn1806に対応する)でN-グリコシル化されることができる。
【０２０１】
配列番号139のアミノ酸配列によってコードされるタンパク質は、本明細書においてMUC16c114-N3とも呼ばれる。MUC16c114-N3は、アミノ酸位置30のアスパラギン(配列番号150のアミノ酸位置1806に対応する)がアラニンに突然変異させられていることを除いて、成熟MUC16(配列番号150は成熟MUC16の配列である)のC末端の114アミノ酸残基からなる。したがって、MUC16c114-N3は、配列番号139のアミノ酸位置30(配列番号150のアミノ酸位置Asn1806に対応する)でN-グリコシル化されることができない。
【０２０２】
配列番号152のアミノ酸配列によってコードされるタンパク質は、本明細書においてMUC16c114-N2とも呼ばれる。MUC16c114-N2は、アミノ酸位置24のアスパラギン(配列番号150のアミノ酸位置Asn1800に対応する)がアラニンに突然変異させられていることを除いて、成熟MUC16(配列番号150は成熟MUC16の配列である)のC末端の114アミノ酸残基からなる。したがって、MUC16c114-N2は、配列番号152のアミノ酸位置24(配列番号150のアミノ酸位置Asn1800に対応する)でN-グリコシル化されることができない。
【０２０３】
配列番号172のアミノ酸配列によってコードされるタンパク質は、本明細書においてMUC16c114-N23とも呼ばれる。MUC16c114-N23は、アミノ酸位置24及び30のアスパラギン(配列番号150のアミノ酸位置Asn1800及びAsn1806に対応する)がアラニンに突然変異させられていることを除いて、成熟MUC16(配列番号150は成熟MUC16の配列である)のC末端の114アミノ酸残基からなる。したがって、MUC16c114-N23は、配列番号157のアミノ酸位置24及び30(配列番号150のアミノ酸位置Asn1800及びAsn1806に対応する)でN-グリコシル化されることができない。
【０２０４】
また本明細書に提供されるのは、重鎖及び軽鎖であり、ここで、該重鎖及び軽鎖を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。また本明細書に提供されるのは、そのような抗体及びその抗原結合断片、重鎖、又は軽鎖をコードする核酸配列(例えば、相補的DNA(cDNA))を含むポリヌクレオチド(例えば、単離されたポリヌクレオチド)である。さらに提供されるのは、そのような抗体及びその抗原結合断片、重鎖、又は軽鎖をコードする核酸配列(例えば、相補的DNA(cDNA))を含むポリヌクレオチド(例えば、単離されたポリヌクレオチド)を含むベクター(例えば、発現ベクター)及び細胞(例えば、単離された細胞又はエクスビボ細胞)である。また提供されるのは、そのような抗体、その抗原結合断片、重鎖、軽鎖、ベクター、及び細胞を作製する方法である。他の態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16活性及び/もしくはMUC16駆動性腫瘍成長のための、又は本明細書に記載される特定の疾病もしくは障害を治療もしくは管理する、例えば、癌を治療もしくは管理するための方法及び使用である。関連組成物(例えば、医薬組成物)、キット、及び診断方法も提供される。
【０２０５】
本明細書で使用される場合、「MUC16」又は「MUC16ポリペプチド」又は「MUC16ペプチド」という用語は、Yin BW及びLloyd KOの文献、2001, J Biol Chem. 276(29):27371-5に記載されているようなMUC16繋留型ムチンタンパク質を指す。GenBank(商標)アクセッション番号NM_024690.2(配列番号137)は、例示的なヒトMUC16核酸配列を提供している。GenBank(商標)アクセッション番号NP_078966.2(配列番号136)は、例示的なヒトMUC16アミノ酸配列を提供している。ネイティブのMUC16は、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、推定切断部位の近位にあるエクトドメイン、及び各々156アミノ酸長の12〜20回反復する大きい高度グリコシル化領域を含む(図1A)。「未成熟」MUC16は、配列番号136を指し、これは、MUC16シグナル配列(配列番号136のアミノ酸残基1〜60)を含む。「成熟MUC16」は、細胞表面に発現される、すなわち、シグナル配列が細胞プロセシングによって除去されている、ネイティブのMUC16、例えば、配列番号150を指し、この場合、配列番号136の最初の60アミノ酸残基は除去されている(すなわち、配列番号136はMUC16の「未成熟」形態である)。
【０２０６】
抗体名に関して、(i)18C6と18C6.D12は互換的に使用され、(ii)10C6と10C6.E4は互換的に使用され、(iii)19C11と19C11.H6は互換的に使用され、(iv)7B12と7B12.B3は互換的に使用される。抗体サブクローン(すなわち、18C6.D12、10C6.E4、19C11.H6、及び7B12.B3)は、第6節に記載される実験で使用された。
【０２０７】
(5.1  抗体)
MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片としては、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え産生抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体(二重特異性抗体を含む)、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、免疫グロブリン、合成抗体、2つの重鎖分子と2つの軽鎖分子を含む四量体抗体、抗体軽鎖単量体、抗体重鎖単量体、抗体軽鎖二量体、抗体重鎖二量体、抗体軽鎖−抗体重鎖対、イントラボディ、単一ドメイン抗体、一価抗体、単鎖抗体もしくは単鎖可変断片(scFv)、ラクダ化抗体、アフィボディ、及びジスルフィド連結Fv(dsFv)、又はこれらの断片を挙げることができる。そのような抗体は、当技術分野で公知の方法によって作製することができる。
【０２０８】
多重特異性抗体又はその断片は、異なる構造のものである少なくとも2つの標的、例えば、2つの異なる抗原、同じ抗原上の2つの異なるエピトープ、又はハプテンと抗原もしくはエピトープに同時に結合することができる抗体又はその断片を指す。1つの特異性は、例えば、B細胞、T細胞、骨髄細胞、形質細胞、又は肥満細胞の抗原又はエピトープ、例えば、CD3などに対するものであり得る。別の特異性は、同じ又は異なる細胞型上の異なる抗原、例えば、MUC16などに対するものであり得る。多重特異性多価抗体は、複数の結合部位を有するコンストラクトであり、これらの結合部位は異なる特異性のものであり、これには、例えば、一方の結合部位が1つの抗原と反応し、他方が別の抗原と反応する二重特異性ダイアボディがある。
【０２０９】
二重特異性抗体は、異なる構造のものである2つの標的に同時に結合することができる抗体である。二重特異性抗体(bsAb)及び二重特異性抗体断片(bsFab)は、第一の標的、例えば、MUC16に免疫特異的に結合する少なくとも1つのアームと、第二の標的、例えば、CD3などに免疫特異的に結合する少なくとも1つの他のアームを有する。種々の二重特異性融合タンパク質を、分子工学を用いて産生することができる。1つの形態において、二重特異性融合タンパク質は二価であり、例えば、(i)1つの抗原に対する単一の結合部位を有するscFv及び(ii)第二の抗原に対する単一の結合部位を有する抗体又はFab断片からなる。別の形態において、二重特異性融合タンパク質は四価であり、例えば、1つの抗原に対する2つの結合部位を有するIgG及び第二の抗原に対する2つの同一のscFvからなる。例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、国際公開WO 2011/1160119号を参照されたい。
【０２１０】
二重特異性モノクローナル抗体を産生する最近の方法は、より一般的な免疫グロブリンアイソタイプよりも強く架橋するように、追加のシステイン残基を有する人為的に作製された組換えモノクローナル抗体の使用を含む。例えば、FitzGeraldらの文献、Protein Eng. 10(10):1221-1225, 1997を参照されたい。別の手法は、必要とされる二重特異性を有する2以上の異なる単鎖抗体又は抗体断片セグメントを連結している組換え融合タンパク質を人為的に作製することである。例えば、Colomaらの文献、Nature Biotech. 15:159-163, 1997を参照されたい。種々の二重特異性融合タンパク質を、分子工学を用いて産生することができる。
【０２１１】
2以上の異なる単鎖抗体又は抗体断片を連結している二重特異性融合タンパク質を同様の方法で産生することができる。組換え法を用いて、種々の融合タンパク質を産生することができる。ある態様において、柔軟なリンカーは、scFv(例えば、CD3を標的とするscFv)をモノクローナル抗体(例えば、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体;第5.1節を参照)の軽鎖の定常領域に接続する。重鎖FcとscFvとのインフレーム接続に必要な適当なリンカー配列をPCR反応を介してVL及びVカッパドメインに導入する。その後、scFvをコードするDNA断片を、CHIドメインをコードするDNA配列を含むステージングベクターにライゲーションする。得られるコンストラクトを切り出し、抗体(例えば、MUC16グリコシル化抗体)のVH領域をコードするDNA配列を含むベクターにライゲーションする。得られるベクターを用いて、二重特異性融合タンパク質の発現のための適当な宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞をトランスフェクトすることができる。
【０２１２】
ある実施態様における、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体(第5.1節を参照)及びその断片を用いて、ダイアボディとも呼ばれる機能的な二重特異性単鎖抗体(bscAb)を調製することもでき、かつ組換え法を用いて哺乳動物細胞で産生することができる。例えば、引用により本明細書中に組み込まれる、Mackらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 7021-7025, 1995を参照されたい。例えば、bscAbは、組換え法を用いてグリシン-セリンリンカーを介して2つの単鎖Fv断片を繋げることにより産生することができる。対象となる2つの抗体のVL及びVHドメインは、当技術分野で公知の標準的なPCR法を用いて単離される。二重特異性単鎖抗体及び二重特異性融合タンパク質は、本発明の範囲内に含まれる。
【０２１３】
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片はscFvを指す。scFvは、当技術分野で認められている用語である。scFvは、免疫グロブリンの重鎖の可変領域(VH)及び軽鎖の可変領域(VL)の融合タンパク質を含み、ここで、該融合タンパク質は、全免疫グロブリンと同じ抗原特異性を保持している。VHは、ペプチドリンカーを介してVLに融合している。ある実施態様において、ペプチドリンカーは、5〜25、5〜15、10〜20、10〜15、又は15〜25アミノ酸残基の長さである。ある実施態様において、scFvペプチドリンカーは、当業者に公知のペプチドリンカーに好適な1以上の特徴を示す。ある実施態様において、scFvペプチドリンカーは、該scFvペプチドリンカーの可溶性を可能にする、例えば、セリン及びトレオニンなどのアミノ酸を含む。ある実施態様において、scFvペプチドリンカーは、該scFvペプチドリンカーの柔軟性を可能にする、例えば、グリシンなどのアミノ酸を含む。ある実施態様において、scFvペプチドリンカーは、VHのN末端をVLのC末端に接続する。ある実施態様において、scFvペプチドリンカーは、VHのC末端をVLのN末端に接続することができる。
【０２１４】
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、キメラ抗原受容体(CAR)を指す。CARは、当技術分野で認められている用語である。CARは、腫瘍関連抗原(例えば、MUC16)を標的とすることができる。本明細書に提供されるCARは、典型的には、MUC16グリコシル化抗体に由来するscFv、いくつかの実施態様において、T細胞共刺激分子由来膜貫通ドメイン(例えば、CD28、CD8、CD38、OX-40、又は4-1BBに由来する膜貫通ドメイン)である膜貫通ドメイン、及び一次シグナル伝達ドメイン、例えば、T細胞受容体(TCR)ゼータ(ζ)鎖の細胞質シグナル伝達ドメインから構成される。いくつかの実施態様において、CARは、1以上の追加の領域又はドメイン、例えば、1以上のスペーサー又はリンカーをさらに含み、これには、細胞外スペーサー、例えば、抗体又は他の細胞表面分子に由来するスペーサー、例えば、抗体のCH2、CH3、及び/もしくはヒンジ領域のうちの1つもしくは複数を含有するスペーサー、又はCD28分子もしくはCD8分子に由来するスペーサー、又は他のスペーサーが含まれる。また本明細書に提供されるのは、細胞、例えば、そのようなCARを発現するように改変されたT細胞、例えば、そのようなCARを組換え発現するものである。CARを発現するT細胞は、MUC16発現腫瘍を認識したとき、好ましくは、T細胞の活性化、増殖、及び/又はそのような腫瘍の細胞の溶解を誘導する。
【０２１５】
MUC16グリコシル化抗体は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、もしくはIgY)、任意のクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、もしくはIgA2)、又は任意のサブクラス(例えば、IgG2aもしくはIgG2b)のものであることができる。ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、IgG抗体又はそのクラスもしくはサブクラスである。ある実施態様において、本明細書に記載される抗体はIgG1抗体である。ある実施態様において、本明細書に記載される抗体はIgG2抗体である。ある実施態様において、本明細書に記載される抗体はIgG2a抗体である。ある実施態様において、本明細書に記載される抗体はIgG2b抗体である。ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、IgG2a抗体とIgG2b抗体の混合物である。具体的な実施態様において、該抗体は、齧歯類モノクローナル抗体のヒト化形態である。
【０２１６】
具体的な実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片が結合する抗原は、グリコシル化されているMUC16の形態であり、例えば、ここで、MUC16の該形態のアミノ酸配列は配列番号133である。配列番号133のアミノ酸配列によってコードされるタンパク質は、本明細書において、MUC16c114とも呼ばれ、成熟MUC16のC末端の114アミノ酸残基からなる。MUC16c114は、配列番号133の位置1、24、及び30のアスパラギンアミノ酸(配列番号150のアミノ酸位置Asn1777、Asn1800、及びAsn1806に対応する)でN-グリコシル化されることができる。成熟MUC16(配列番号150)は、シグナル配列が除去されており、かつ該シグナル配列が配列番号136の最初の60アミノ酸残基からなる全長MUC16を指す(すなわち、配列番号136はMUC16の「未成熟」形態である)。
【０２１７】
MUC16グリコシル化抗体の抗原結合断片は、Fab断片、F(ab')2断片、又は抗原に対するその特異性をMUC16グリコシル化抗体に付与するアミノ酸残基(例えば、相補性決定領域(CDR))を含むMUC16グリコシル化抗体の部分であることができる。MUC16グリコシル化抗体は、任意の動物種、例えば、齧歯類(例えば、マウス、ラット、又はハムスター)及びヒトに由来することができる。
【０２１８】
本明細書で使用される場合、「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は互換的に使用され、かつ当技術分野で一般的である。可変領域は、典型的には、抗体間で配列が広範囲にわたって異なり、かつその特定の抗原に対する特定の抗体の結合及び特異性において使用される、抗体の部分、通常、軽鎖又は重鎖の部分、典型的には、成熟重鎖のほぼアミノ末端の110〜120アミノ酸及び成熟軽鎖のほぼアミノ末端の90〜100アミノ酸を指す。配列のばらつきは、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる領域に集中しており、一方、可変ドメイン中のより高度に保存された領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる。CDRの両側に、FRが配置されている。通常、CDR及びFRの空間的配向は、N末端からC末端の方向に、次の通りである: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。任意の特定の機構又は理論に束縛されることを望むものではないが、軽鎖及び重鎖のCDRは、抗原との抗体の相互作用及び特異性に主に関与していると考えられる。ある実施態様において、可変領域は、齧歯類(例えば、マウス又はラット)可変領域である。ある実施態様において、可変領域は、ヒト可変領域である。ある実施態様において、可変領域は、齧歯類(例えば、マウス又はラット)CDR及びヒトフレームワーク領域(FR)を含む。特定の実施態様において、可変領域は、霊長類(例えば、非ヒト霊長類)可変領域である。ある実施態様において、可変領域は、齧歯類又はマウスCDR及び霊長類(例えば、非ヒト霊長類)フレームワーク領域(FR)を含む。
【０２１９】
CDRは、当技術分野における様々な方法で定義され、これには、Kabat、Chothia、及びIMGT、並びに例示的定義が含まれる。Kabat定義は、配列のばらつきに基づくものである(Kabat、Elvin A.らの文献、免疫学的対象となるタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest). Bethesda: National Institutes of Health, 1983)。Kabat付番体系に関して、(i)VH CDR1は、典型的には、アミノ酸位置35に続く1つ又は2つの追加のアミノ酸(Kabat付番スキームにおいて35A及び35Bと呼ばれる)を任意に含むことができる重鎖のアミノ酸位置31〜35に存在し;(ii)VH CDR2は、典型的には、重鎖のアミノ酸位置50〜65に存在し;かつ(iii)VH CDR2は、典型的には、重鎖のアミノ酸位置95〜102に存在する(Kabat, Elvin A.らの文献、免疫学的対象となるタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest). Bethesda: National Institutes of Health, 1983)。Kabat付番体系に関して、(i)VL CDR1は、典型的には、軽鎖のアミノ酸位置24〜34に存在し;(ii)VL CDR2は、典型的には、軽鎖のアミノ酸位置50〜56に存在し;かつ(iii)VL CDR3は、典型的には、軽鎖のアミノ酸位置89〜97に存在する(Kabat, Elvin A.らの文献、免疫学的対象となるタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest). Bethesda: National Institutes of Health, 1983)。当業者には周知であるように、Kabat付番体系を用いると、抗体可変ドメインの実際の直線的アミノ酸配列は、FR及び/又はCDRの短縮又は延長が原因で、より少ない又は追加のアミノ酸を含むことがあり、したがって、アミノ酸のKabat番号は、その直線的アミノ酸番号と必ずしも同じではない。
【０２２０】
Chothia定義は、構造上のループ領域の位置に基づくものである(Chothiaらの文献(1987) J Mol Biol 196: 901-917;及び米国特許第7,709,226号)。「Chothia CDR」という用語及び同様の用語は当技術分野で認識されており、本明細書において「Chothia CDR」とも呼ばれる、Chothia及びLeskの文献(1987, J. Mol. Biol., 196:901-917)の方法に従って決定されるような抗体CDR配列を指す(例えば、米国特許第7,709,226号及びKontermann及びDubel編、抗体エンジニアリング(Antibody Engineering)、第31章、422-439頁、Springer-Verlag, Berlin(2001)のMartin, A.の文献、「抗体可変ドメインのタンパク質配列及び構造解析(Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains)」も参照されたい)。Chothia付番体系に関して、VH領域中のアミノ酸残基を付番するKabat付番体系を用いると、(i)VH CDR1は、典型的には、重鎖のアミノ酸位置26〜32に存在し;(ii)VH CDR2は、典型的には、重鎖のアミノ酸位置53〜55に存在し;かつ(iii)VH CDR3は、典型的には、重鎖のアミノ酸位置96〜101に存在する。具体的な実施態様において、Chothia付番体系に関して、VH領域中のアミノ酸残基を付番するKabat付番体系を用いると、(i)VH CDR1は、典型的には、重鎖のアミノ酸位置26〜32又は34に存在し;(ii)VH CDR2は、典型的には、重鎖のアミノ酸位置52〜56に存在し(一実施態様において、CDR2は、位置52A〜56(ここで、52Aは位置52の次に位置する)にある);かつ(iii)VH CDR3は、典型的には、重鎖のアミノ酸位置95〜102に存在する(一実施態様において、96〜100の番号の位置にアミノ酸はない)。Chothia付番体系に関して、VL領域中のアミノ酸残基を付番するKabat付番体系を用いると、(i)VL CDR1は、典型的には、軽鎖のアミノ酸位置26〜33に存在し;(ii)VL CDR2は、典型的には、軽鎖のアミノ酸位置50〜52に存在し;かつ(iii)VL CDR3は、典型的には、軽鎖のアミノ酸位置91〜96に存在する。具体的な実施態様において、Chothia付番体系に関して、VL領域中のアミノ酸残基を付番するKabat付番体系を用いると、(i)VL CDR1は、典型的には、軽鎖のアミノ酸位置24〜34に存在し;(ii)VL CDR2は、典型的には、軽鎖のアミノ酸位置50〜56に存在し;かつ(iii)VL CDR3は、典型的には、軽鎖のアミノ酸位置89〜97に存在する(一実施態様において、96〜100の番号の位置にアミノ酸はない)。これらのChothia CDR位置は、抗体によって異なる場合があり、当技術分野で公知の方法に従って決定することができる。
【０２２１】
IMGT定義は、IMGTによるものである(「IMGT(登録商標)、international ImMunoGeneTics information system(登録商標) website imgt.org、設立者兼責任者: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, France;例えば、どちらも引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Lefranc, M.-P.の文献、1999, The Immunologist, 7:132-136及びLefranc, M.-P.らの文献、1999, Nucleic Acids Res., 27:209-212を参照)。IMGT付番体系に関して、(i)VH CDR1は、典型的には、重鎖のアミノ酸位置25〜35に存在し;(ii)VH CDR2は、典型的には、重鎖のアミノ酸位置51〜57に存在し;かつ(iii)VH CDR2は、典型的には、重鎖のアミノ酸位置93〜102に存在する。IMGT付番体系に関して、(i)VL CDR1は、典型的には、軽鎖のアミノ酸位置27〜32に存在し;(ii)VL CDR2は、典型的には、軽鎖のアミノ酸位置50〜52に存在し;かつ(iii)VL CDR3は、典型的には、軽鎖のアミノ酸位置89〜97に存在する。
【０２２２】
(5.1.1  配列及び構造)
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、例えば、表1、3、及び5に示される、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体のいずれかのVH CDRを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、表1、3、又は5に示されるMUC16グリコシル化抗体のVH CDR1を含む。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、表1、3、又は5に示されるMUC16グリコシル化抗体のVH CDR2を含む。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、表1、3、又は5に示されるMUC16グリコシル化抗体のVH CDR3を含む。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、表1、3、又は5に示されるMUC16グリコシル化抗体のVH CDRのうちの1つ、2つ、又は3つ全て(例えば、表1の2列目のVL CDR、例えば、抗体10C6のVH CDRの全て)を含む。
【０２２３】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、例えば、表2、4、及び6に示される、本明細書に提供される抗MUC16抗体のいずれかのVL CDRを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、表2、4、又は6に示されるMUC16グリコシル化抗体のVH CDR1を含む。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、表2、4、又は6に示されるMUC16グリコシル化抗体のVH CDR2を含む。ある実施態様において、本明細書に提供される抗MUC16抗体又はその抗原結合断片は、表2、4、又は6に示されるMUC16グリコシル化抗体のVH CDR3を含む。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、表2、4、又は6に示されるMUC16グリコシル化抗体のVL CDRのうちの1つ、2つ、又は3つ全て(例えば、表2の2列目のVL CDR、例えば、抗体10C6のVH CDRの全て)を含む。
【０２２４】
表1. VH CDRアミノ酸配列(Kabat)。
【表１】
2018509907.tif 000090
【０２２５】
表2. VL CDRアミノ酸配列(Kabat)。
【表２】
2018509907.tif 000091
【０２２６】
表3. VH CDRアミノ酸配列(Chothia)。
【表３】
2018509907.tif 000092
【０２２７】
表4. VL CDRアミノ酸配列(Chothia)。
【表４】
2018509907.tif 000093
【０２２８】
表5. VH CDRアミノ酸配列(IMGT)。
【表５】
2018509907.tif 000094
【０２２９】
表6. VL CDRアミノ酸配列(IMGT)。
【表６】
2018509907.tif 000095
【０２３０】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は:
(a)アミノ酸配列
【化８８】
2018509907.tif 000096
(ここで、X1は、L又はVである)を含むVH CDR1;
(b)アミノ酸配列
【化８９】
2018509907.tif 000097
(ここで、X2は、E又は非存在であり、かつX3は、Y又はNである)を含むVH CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化９０】
2018509907.tif 000098
を含むVH CDR3
を含むVHを含む。
【０２３１】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は:
(a)アミノ酸配列
【化９１】
2018509907.tif 000099
(ここで、X8は、N又はSであり、かつX9は、L又はVである)を含むVH CDR1;
(b)アミノ酸配列
【化９２】
2018509907.tif 000100
(ここで、X10は、E又は非存在である)を含むVH CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化９３】
2018509907.tif 000101
を含むVH CDR3
を含むVHを含む。
【０２３２】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は:
(a)アミノ酸配列
【化９４】
2018509907.tif 000102
(ここで、X15は、N又はSであり、かつX16は、V又はLである)を含むVH CDR1;
(b)アミノ酸配列
【化９５】
2018509907.tif 000103
(ここで、X17は、E又は非存在である)を含むVH CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化９６】
2018509907.tif 000104
(ここで、X18は、T、A、又はSである)を含むVH CDR3
を含むVHを含む。
【０２３３】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号3のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号9のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号11のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号15のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号16のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。
【０２３４】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号23のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号24のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号29のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号31のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号35のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号37のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。
【０２３５】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号43のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号44のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号49のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号50のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号51のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号55のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号56のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号57のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。
【０２３６】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号63のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号64のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号65のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。特定の実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号69のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号70のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号71のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号75のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号76のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号77のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。
【０２３７】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号83のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号84のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号85のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号89のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号90のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号91のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号95のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号96のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号97のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む。
【０２３８】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は:
(a)アミノ酸配列
【化９７】
2018509907.tif 000105
(ここで、X4は、R又はLであり、かつX5は、K又はHである)を含むVL CDR1;
(b)アミノ酸配列
【化９８】
2018509907.tif 000106
を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化９９】
2018509907.tif 000107
(ここで、X6は、G又はSであり、かつX7は、H又はYである)を含むVL CDR3
を含むVLを含む。
【０２３９】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は:
(a)アミノ酸配列
【化１００】
2018509907.tif 000108
(ここで、X11は、L又はRであり、かつX12は、H又はKである)を含むVL CDR1;
(b)アミノ酸配列YMS (配列番号:113)を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化１０１】
2018509907.tif 000109
(ここで、X13は、G又はSであり、かつX14は、H又はYである)を含むVL CDR3
を含むVLを含む。
【０２４０】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は:
(a)アミノ酸配列
【化１０２】
2018509907.tif 000110
(ここで、X19は、V又はLであり、かつX20は、H又はKである)を含むVL相補性決定領域(CDR)1;
(b)アミノ酸配列YMS (配列番号:119)を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化１０３】
2018509907.tif 000111
を含むVL CDR3
を含むVLを含む。
【０２４１】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号6のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号12のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号14のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号18のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号19のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む。
【０２４２】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号26のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号27のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号28のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号32のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号34のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号38のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号39のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号40のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む。
【０２４３】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号46のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号47のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号52のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号53のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号54のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号58のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号59のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVLを含む。
【０２４４】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号66のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号67のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号68のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号72のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号73のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号74のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号78のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号79のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号80のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVLを含む。
【０２４５】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号86のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号87のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号88のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号92のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号93のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号94のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号98のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号99のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号100のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVLを含む。
【０２４６】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は:
(i)
(a)アミノ酸配列
【化１０４】
2018509907.tif 000112
(ここで、X1は、L又はVである)を含むVH CDR1;
(b)アミノ酸配列
【化１０５】
2018509907.tif 000113
(ここで、X2は、E又は非存在であり、かつX3は、Y又はNである)を含むVH CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化１０６】
2018509907.tif 000114
を含むVH CDR3;
を含むVH;並びに
(ii)
(a)アミノ酸配列
【化１０７】
2018509907.tif 000115
(ここで、X4は、R又はLであり、かつX5は、K又はHである)を含むVL CDR1;
(b)アミノ酸配列
【化１０８】
2018509907.tif 000116
を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化１０９】
2018509907.tif 000117
(ここで、X6は、G又はSであり、かつX7は、H又はYである)を含むVL CDR3
を含むVL
を含む。
【０２４７】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、
(i)
(a)アミノ酸配列
【化１１０】
2018509907.tif 000118
(ここで、X8は、N又はSであり、かつX9は、L又はVである)を含むVH CDR1;
(b)アミノ酸配列
【化１１１】
2018509907.tif 000119
(ここで、X10は、E又は非存在である)を含むVH CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化１１２】
2018509907.tif 000120
を含むVH CDR3;
を含むVH;並びに
(ii)
(a)アミノ酸配列
【化１１３】
2018509907.tif 000121
(ここで、X11は、L又はRであり、かつX12は、H又はKである)を含むVL CDR1;
(b)アミノ酸配列YMS (配列番号:113)を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化１１４】
2018509907.tif 000122
(ここで、X13は、G又はSであり、かつX14は、H又はYである)を含むVL CDR3;
を含むVL
を含む。
【０２４８】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、
(i)
(a)アミノ酸配列
【化１１５】
2018509907.tif 000123
(ここで、X15は、N又はSであり、かつX16は、V又はLである)を含むVH CDR1;
(b)アミノ酸配列
【化１１６】
2018509907.tif 000124
(ここで、X17は、E又は非存在である)を含むVH CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化１１７】
2018509907.tif 000125
(ここで、X18は、T、A、又はSである)を含むVH CDR3;
を含むVH、並びに
(ii)
(a)アミノ酸配列
【化１１８】
2018509907.tif 000126
(ここで、X19は、V又はLであり、かつX20は、H又はKである)を含むVL CDR1;
(b)アミノ酸配列YMS (配列番号:119)を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化１１９】
2018509907.tif 000127
を含むVL CDR3;
を含むVL
を含む。
【０２４９】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は:
(i)
(a)アミノ酸配列
【化１２０】
2018509907.tif 000128
(ここで、X1は、L又はVである)を含むVH CDR1;
(b)アミノ酸配列
【化１２１】
2018509907.tif 000129
(ここで、X2は、E又は非存在であり、かつX3は、Y又はNである)を含むVH CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化１２２】
2018509907.tif 000130
を含むVH CDR3;
を含むVH、並びに
(ii)
(a)配列番号6のアミノ酸配列を含むVL CDR1;
(b)配列番号7のアミノ酸配列を含むVL CDR2;及び
(c)配列番号8のアミノ酸配列を含むVL CDR3;
を含むVL
を含む。
【０２５０】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、
(i)
(a)アミノ酸配列
【化１２３】
2018509907.tif 000131
(ここで、X8は、N又はSであり、かつX9は、L又はVである)を含むVH CDR1;
(b)アミノ酸配列
【化１２４】
2018509907.tif 000132
(ここで、X10は、E又は非存在である)を含むVH CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化１２５】
2018509907.tif 000133
を含むVH CDR3;
を含むVH;並びに
(ii)
(a)配列番号12のアミノ酸配列を含むVL CDR1;
(b)配列番号13のアミノ酸配列を含むVL CDR2;及び
(c)配列番号14のアミノ酸配列を含むVL CDR3;
を含むVL
を含む。
【０２５１】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、
(a)アミノ酸配列
【化１２６】
2018509907.tif 000134
(ここで、X15は、N又はSであり、かつX16は、V又はLである)を含むVH CDR1;
(b)アミノ酸配列
【化１２７】
2018509907.tif 000135
(ここで、X17は、E又は非存在である)を含むVH CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化１２８】
2018509907.tif 000136
(ここで、X18は、T、A、又はSである)を含むVH CDR3;
を含むVH、並びに
(ii)
(a)配列番号18のアミノ酸配列を含むVL CDR1;
(b)配列番号19のアミノ酸配列を含むVL CDR2;及び
(c)配列番号20のアミノ酸配列を含むVL CDR3;
を含むVL
を含む。
【０２５２】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、
(i)
(a)アミノ酸配列
【化１２９】
2018509907.tif 000137
(ここで、X1は、L又はVである)を含むVH CDR1;
(b)アミノ酸配列
【化１３０】
2018509907.tif 000138
(ここで、X2は、E又は非存在であり、かつX3は、Y又はNである)を含むVH CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化１３１】
2018509907.tif 000139
を含むVH CDR3;
を含むVH、並びに
(ii)
(a)配列番号26のアミノ酸配列を含むVL CDR1;
(b)配列番号27のアミノ酸配列を含むVL CDR2;及び
(c)配列番号28のアミノ酸配列を含むVL CDR3;
を含むVL
を含む。
【０２５３】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、
(i)
(a)アミノ酸配列
【化１３２】
2018509907.tif 000140
(ここで、X8は、N又はSであり、かつX9は、L又はVである)を含むVH CDR1;
(b)アミノ酸配列
【化１３３】
2018509907.tif 000141
(ここで、X10は、E又は非存在である)を含むVH CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化１３４】
2018509907.tif 000142
を含むVH CDR3;
を含むVH;並びに
(ii)
(a)配列番号32のアミノ酸配列を含むVL CDR1;
(b)配列番号33のアミノ酸配列を含むVL CDR2;及び
(c)配列番号34のアミノ酸配列を含むVL CDR3;
を含むVL
を含む。
【０２５４】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、
(i)
(a)アミノ酸配列
【化１３５】
2018509907.tif 000143
(ここで、X15は、N又はSであり、かつX16は、V又はLである)を含むVH CDR1;
(b)アミノ酸配列
【化１３６】
2018509907.tif 000144
(ここで、X17は、E又は非存在である)を含むVH CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
【化１３７】
2018509907.tif 000145
(ここで、X18は、T、A、又はSである)を含むVH CDR3;
を含むVH、並びに
(ii)
(d)配列番号38のアミノ酸配列を含むVL CDR1;
(e)配列番号39のアミノ酸配列を含むVL CDR2;及び
(f)配列番号40のアミノ酸配列を含むVL CDR3;
を含むVL
を含む。
【０２５５】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号3のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;並びに(b)配列番号6のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号9のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号11のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;並びに(b)配列番号12のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号14のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号16のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;並びに(b)配列番号18のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号19のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む。
【０２５６】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号23のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号24のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;並びに(b)配列番号26のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号27のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号28のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号29のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号31のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;並びに(b)配列番号32のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号34のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号35のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号37のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;並びに(b)配列番号38のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号39のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号40のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む。
【０２５７】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号43のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号44のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;並びに(b)配列番号46のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号47のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号49のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号50のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号51のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;並びに(b)配列番号52のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号53のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号54のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号55のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号56のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号57のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;並びに(b)配列番号58のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号59のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVLを含む。
【０２５８】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号63のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号64のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号65のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;並びに(b)配列番号66のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号67のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号68のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号69のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号70のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号71のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;並びに(b)配列番号72のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号73のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号74のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号75のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号76のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号77のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;並びに(b)配列番号78のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号79のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号80のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVLを含む。
【０２５９】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号83のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号84のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号85のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;並びに(b)配列番号86のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号87のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号88のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号89のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号90のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号91のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;並びに(b)配列番号92のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号93のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号94のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVLを含む。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号95のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号96のアミノ酸配列を含むVH CDR2、及び配列番号97のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;並びに(b)配列番号98のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号99のアミノ酸配列を含むVL CDR2、及び配列番号100のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVLを含む。
【０２６０】
表7. VHドメインアミノ酸配列
【表７】
2018509907.tif 000146
【０２６１】
表8. VLドメインアミノ酸配列
【表８】
2018509907.tif 000147
【０２６２】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、
【化１３８】
2018509907.tif 000148
(ここで、X21は、T又はNであり、X22は、I又はKであり、X23は、N又はSであり、X24は、V又はLであり、X25は、S又はIであり、X26は、P又はSであり、X27は、E又は非存在であり、X28は、N又はYであり、X29は、K又はRであり、X30は、A又はDであり、X31は、T又はSであり、X32は、V又はAであり、X33は、G又はDであり、X34は、T、I、又はSであり、かつX35は、T、S、又はAである)を含むVH領域を含む。
【０２６３】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、
【化１３９】
2018509907.tif 000149
(ここで、X36は、I又はVであり、X37は、P又はSであり、X38は、R又はLであり、X39は、K又はHであり、X40は、R又はKであり、X41は、E又はGであり、X42は、S又はGであり、かつX43は、Y又はHである)を含むVL領域を含む。
【０２６４】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、
(a)
【化１４０】
2018509907.tif 000150
(ここで、X21は、T又はNであり、X22は、I又はKであり、X23は、N又はSであり、X24は、V又はLであり、X25は、S又はIであり、X26は、P又はSであり、X27は、E又は非存在であり、X28は、N又はYであり、X29は、K又はRであり、X30は、A又はDであり、X31は、T又はSであり、X32は、V又はAであり、X33は、G又はDであり、X34は、T、I、又はSであり、かつX35は、T、S、又はAである)を含むVH領域;及び
(b)
【化１４１】
2018509907.tif 000151
(ここで、X36は、I又はVであり、X37は、P又はSであり、X38は、R又はLであり、X39は、K又はHであり、X40は、R又はKであり、X41は、E又はGであり、X42は、S又はGであり、かつX43は、Y又はHである)を含むVL領域を含む。
【０２６５】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、
(a)
【化１４２】
2018509907.tif 000152
(ここで、X21は、T又はNであり、X22は、I又はKであり、X23は、N又はSであり、X24は、V又はLであり、X25は、S又はIであり、X26は、P又はSであり、X27は、E又は非存在であり、X28は、N又はYであり、X29は、K又はRであり、X30は、A又はDであり、X31は、T又はSであり、X32は、V又はAであり、X33は、G又はDであり、X34は、T、I、又はSであり、かつX35は、T、S、又はAである)を含むVH領域;及び
(b)配列番号2のアミノ酸配列を含むVL領域を含む。
【０２６６】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、
(a)
【化１４３】
2018509907.tif 000153
(ここで、X21は、T又はNであり、X22は、I又はKであり、X23は、N又はSであり、X24は、V又はLであり、X25は、S又はIであり、X26は、P又はSであり、X27は、E又は非存在であり、X28は、N又はYであり、X29は、K又はRであり、X30は、A又はDであり、X31は、T又はSであり、X32は、V又はAであり、X33は、G又はDであり、X34は、T、I、又はSであり、かつX35は、T、S、又はAである)を含むVH領域;及び
(b)配列番号62のアミノ酸配列を含むVL領域を含む。
【０２６７】
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、表7に示されるアミノ酸配列を含むVHを含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号1のアミノ酸配列(表7)を含む重鎖可変領域配列(例えば、抗体10C6のVH)を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号21のアミノ酸配列(表7)を含む重鎖可変領域配列(例えば、抗体7B12のVH)を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号41のアミノ酸配列(表7)を含む重鎖可変領域配列(例えば、抗体19C11のVH)を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号61のアミノ酸配列(表7)を含む重鎖可変領域配列(例えば、抗体16C5のVH)を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号81のアミノ酸配列(表7)を含む重鎖可変領域配列(例えば、抗体18C6のVH)を含む。
【０２６８】
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、表8に示されるアミノ酸配列を含むVLを含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号2のアミノ酸配列(表8)を含む軽鎖可変領域配列(例えば、抗体10C6のVL)を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号22のアミノ酸配列(表8)を含む軽鎖可変領域配列(例えば、抗体7B12のVL)を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号42のアミノ酸配列(表8)を含む軽鎖可変領域配列(例えば、抗体19C11のVL)を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号62のアミノ酸配列(表8)を含む軽鎖可変領域配列(例えば、抗体16C5のVL)を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号82のアミノ酸配列(表8)を含む軽鎖可変領域配列(例えば、抗体18C6のVL)を含む。
【０２６９】
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)表7に示されるアミノ酸配列を含むVH;及び(b)表8に示されるアミノ酸配列を含むVLを含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号1のアミノ酸配列(表7)を含む重鎖可変領域配列(例えば、抗体10C6のVH);及び(b)配列番号2のアミノ酸配列(表8)を含む軽鎖可変領域配列(例えば、抗体10C6のVL)を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号21のアミノ酸配列(表7)を含む重鎖可変領域配列(例えば、抗体7B12のVH);及び(b)配列番号22のアミノ酸配列(表8)を含む軽鎖可変領域配列(例えば、抗体7B12のVL)を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号41のアミノ酸配列(表7)を含む重鎖可変領域配列(例えば、抗体19C11のVH);及び(b)配列番号42のアミノ酸配列(表8)を含む軽鎖可変領域配列(例えば、抗体19C11のVL)を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号61のアミノ酸配列(表7)を含む重鎖可変領域配列(例えば、抗体16C5のVH);及び(b)配列番号62のアミノ酸配列(表8)を含む軽鎖可変領域配列(例えば、抗体16C5のVL)を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(a)配列番号81のアミノ酸配列(表7)を含む重鎖可変領域配列(例えば、抗体18C6のVH);及び(b)配列番号82のアミノ酸配列(表8)を含む軽鎖可変領域配列(例えば、抗体18C6のVL)を含む。
【０２７０】
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、表7に示されるアミノ酸配列を含むVHのVH CDR(例えば、表1、3、又は5に示されるもの)及び表8に示されるアミノ酸配列を含むVLのVL CDR(例えば、表2、4、又は6に示されるもの)を含む。
【０２７１】
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、そのVHドメインのみもしくはそのVLドメインのみによるか、又はその3つのVH CDRのみによるか、又はその3つのVL CDRのみによって記載されてもよい。例えば、ヒト軽鎖又は重鎖ライブラリーから、それぞれ、相補する軽鎖又は重鎖を同定し、もとの抗体の親和性と同じくらい高いか又はそれよりも高い親和性を有するヒト化抗体変異体を得ることによるマウス抗αvβ3抗体のヒト化を記載している、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Rader Cらの文献(1998) PNAS 95: 8910-8915を参照されたい。特定のVHドメイン(又はVLドメイン)を使用し、相補的な可変ドメインについてライブラリーをスクリーニングすることにより、特定の抗原に結合する抗体を産生する方法を記載している、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Clackson Tらの文献(1991) Nature 352: 624-628も参照されたい。特定のVHドメインを使用し、相補的なVLドメインについてライブラリー(例えば、ヒトVLライブラリー)をスクリーニングすることにより、特定の抗原に結合する抗体を産生し;さらに、選択されたVLドメインを用いて、さらなる相補的な(例えば、ヒトの)VHドメインの選択を導くことができる、方法を記載している、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Kim SJ及びHong HJの文献(2007) J Microbiol 45: 572-577も参照されたい。
【０２７２】
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、ヒト化抗体、例えば、齧歯類抗体のヒト化形態であってもよい。ヒト化抗体は、限定されないが、CDRグラフティング(欧州特許EP 239,400号;国際公開WO 91/09967号;及び米国特許第5,225,539号、第5,530,101号、及び第5,585,089号)、鎖シャッフリング(米国特許第5,565,332号)、ベニアリング又はリサーフェシング(欧州特許EP 592,106号及びEP 519,596号; Padlanの文献、1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnickaらの文献、1994, Protein Engineering 7(6):805-814;及びRoguskaらの文献、1994, PNAS 91:969-973)、並びに例えば、米国特許第6,407,213号、米国特許第5,766,886号、WO 9317105号、Sandhu JSの文献、Gene 150(2):409-10(1994)、Pedersenらの文献、J. Mol. Biol. 235(3):959-73(1994)、Coutoらの文献、Cancer Res. 55(8):1717-22(1995)、Roguskaらの文献、Protein Eng. 9(10):895 904(1996)、Bacaらの文献、J. Biol. Chem. 272(16):10678-84(1997)、Coutoらの文献、Cancer Res. 55(23 Supp):5973s- 5977s(1995)、Caldasらの文献、Protein Eng. 13(5):353-60(2000)、Moreaらの文献、Methods 20(3):267 79(2000)、及びTanらの文献、J. Immunol. 169:1119 25(2002)に開示されている技法を含む、当技術分野で公知の種々の技法を用いて産生することができる。その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、米国特許公開US 2005/0042664 A1号(2005年2月24日)も参照されたい。
【０２７３】
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、合成ヒト抗体であってもよい。合成ヒト抗体は、例えば、T細胞エピトープを回避し、それにより、得られる抗体の免疫原性を最小限に抑える形で多数のヒト抗体可変領域配列の断片から可変領域配列を設計することにより作製することができる(例えば、Bakerらの文献、2010, Self Nonself., 1(4):314-322; Brysonらの文献、2010, BioDrugs, 24(1):1-8;及びJonesらの文献、2009, Methods Mol Biol., 525:405-23を参照)。そのような抗体は、ヒト定常領域配列、例えば、ヒト軽鎖及び/又は重鎖定常領域を含むことができる。
【０２７４】
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、脱免疫化抗体であってもよい。脱免疫化抗体は、T細胞エピトープが除去されている抗体である。脱免疫化抗体を作製する方法は記載されている。例えば、Jonesらの文献、Methods Mol Biol. 2009;525:405-23, xiv、及びDe Grootらの文献、Cell. Immunol. 244:148-153(2006)を参照されたい。
【０２７５】
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ、表1、表2、及び表3、並びに表4、表5、及び表6の抗体のいずれかの3つのVH CDR及び3つのVL CDR(すなわち、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3)とヒト由来フレームワーク領域とヒト由来定常領域とを含むヒト化免疫グロブリンである。ヒトフレームワーク領域の非限定的な例は、当技術分野で記載されており、例えば、Kabatらの文献(1991)、免疫学的対象となるタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)、第5版、U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照されたい。ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、ヒトフレームワーク領域であるか又はヒトフレームワーク領域に由来するフレームワーク領域(例えば、VLドメイン及び/又はVHドメインのフレームワーク領域)を含む。ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、霊長類(例えば、非ヒト霊長類)フレームワーク領域であるか又は霊長類(例えば、非ヒト霊長類)フレームワーク領域に由来するフレームワーク領域(例えば、VLドメイン及び/又はVHドメインのフレームワーク領域)を含む。例えば、典型的には、齧歯類起源(例えば、マウス又はラット)の抗原特異的非ヒト抗体由来のCDRを相同なヒト又は非ヒト霊長類(例えば、旧世界類人猿、例えば、チンパンジー(Pan troglodytes)、ボノボ(Pan paniscus)、もしくはニシゴリラ(Gorilla gorilla)、チンパンジー、例えば、マカク属の旧世界猿、又はマカクザルであるカニクイザル(Macaca cynomolgus))に移植する。非ヒト霊長類フレームワーク配列は、米国特許出願公開US 2005/0208625号に記載されている。
【０２７６】
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片のVH領域中のVH CDR1、VH CDR2、及び/もしくはVH CDR3の位置、並びに/又はVL領域中のVL CDR1、VL CDR2、及び/もしくはVL CDR2の位置は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合が維持され;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合の欠如が維持され;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤の阻害が維持される(例えば、実質的に、例えば、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％維持される)限り、1、2、3、4、5、6、又はそれより多くのアミノ酸位置だけ異なっていてもよい。別の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片のVH領域中のVH CDR1、VH CDR2、及び/もしくはVH CDR3の長さ、並びに/又はVL領域中のVL CDR1、VL CDR2、及び/もしくはVL CDR2の長さは、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合が維持され;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合の欠如が維持され;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤の阻害が維持される(例えば、実質的に、例えば、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％維持される)限り、1、2、3、4、5、6、又はそれより多くのアミノ酸だけ異なっていてもよい(例えば、短くても長くてもよい)。別の実施態様において、本明細書に記載されるVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及び/又はVL CDR3のアミノ末端及び/又はカルボキシ末端は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合が維持され;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合の欠如が維持され;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤の阻害が維持される(例えば、実質的に、例えば、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％維持される)限り、本明細書に記載されるCDRのうちの1つ又は複数と比較して1、2、3、4、5、6、又はそれより多くのアミノ酸だけ伸長されていても、短縮されていてもよい。本明細書で使用される場合、「免疫特異的に結合する」、「免疫特異的に認識する」、「特異的に結合する」、及び「特異的に認識する」という用語は、抗体との関連における類似用語であり、当業者によって理解されているように抗原結合部位を介して���原(例えば、エピトープ又は免疫複合体)に結合する抗体及びその抗原結合断片を指し、該抗体又は抗原結合断片と他の抗原との交差反応性を排除するものではない。当技術分野で公知の任意の方法、例えば、下記の第6節に記載されているようなELISA結合アッセイ又はFACs解析を用いて、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合が維持され;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合の欠如が維持され;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤の阻害が維持されるかどうかを確認することができる。
【０２７７】
具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、抗体重鎖及び/又は軽鎖、例えば、重鎖のみ、軽鎖のみ、又は重鎖と軽鎖の両方を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。重鎖に関して、具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の重鎖は、アルファ(α)、デルタ(δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)、又はミュー(μ)重鎖であることができる。別の具体的な実施態様において、記載されているMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の重鎖は、ヒトアルファ(α)、デルタ(δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)、又はミュー(μ)重鎖を含むことができる。
【０２７８】
特定の実施態様において、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は重鎖を含み、ここで、該重鎖の可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号103、配列番号104、及び配列番号105、それぞれ、配列番号109、配列番号110、及び配列番号111、又はそれぞれ、配列番号115、配列番号116、及び配列番号117のアミノ酸配列を有するVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3を含み、かつ該重鎖の定常領域は、ヒトアルファ(α)、デルタ(δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)、又はミュー(μ)重鎖定常領域である。本明細書で使用される場合、「定常領域」又は「定常ドメイン」という用語は互換的なものであり、当技術分野で共通のその意味を有する。定常領域は、抗原に対する抗体の結合に直接的には関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば、Fc受容体との相互作用を示すことができる抗体部分、例えば、軽鎖及び/又は重鎖のカルボキシル末端部分である。免疫グロブリン分子の定常領域は、通常、免疫グロブリン可変ドメインと比べてより保存されたアミノ酸配列を有する。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は重鎖を含み、ここで、該重鎖の可変領域のアミノ酸配列は、抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は18C6のVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3(すなわち、表1、表3、又は表5に掲載されているもの)を含み、かつ該重鎖の定常領域は、ヒトアルファ(α)、デルタ(δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)、又はミュー(μ)重鎖定常領域である。
【０２７９】
別の特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は重鎖を含み、ここで、該重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号101のアミノ酸配列を含み、かつ該重鎖の定常領域は、ヒトアルファ(α)、デルタ(δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)、又はミュー(μ)重鎖定常領域である。別の特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は重鎖を含み、ここで、該重鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1、配列番号21、配列番号41、配列番号61、又は配列番号81のアミノ酸配列を含み、かつ該重鎖の定常領域は、ヒトアルファ(α)、デルタ(δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)、又はミュー(μ)重鎖定常領域である。
【０２８０】
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は重鎖を含み、ここで、該重鎖の可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号103、配列番号104、及び配列番号105、又はそれぞれ、配列番号109、配列番号110;もしくは配列番号111、又はそれぞれ、配列番号115、配列番号116、もしくは配列番号117のアミノ酸配列を有するVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3を含み、かつ該重鎖の定常領域は、ヒト重鎖定常領域である。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は重鎖を含み、ここで、該重鎖の可変領域のアミノ酸配列は、抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は18C6のVH CDRのいずれか1つのVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3(すなわち、表1、表3、及び表5に掲載されているもの)を含み、かつ該重鎖の定常領域は、ヒト重鎖定常領域である。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は重鎖を含み、ここで、該重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号101のアミノ酸配列を含み、かつ該重鎖の定常領域は、ヒト重鎖定常領域である。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は重鎖を含み、ここで、該重鎖の可変領域のアミノ酸配列は、抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は18C6のVH CDR(すなわち、表7に掲載されているもの)のいずれか1つのアミノ酸配列を含み、かつ該重鎖の定常領域は、ヒト重鎖定常領域である。ヒト定常領域配列の非限定的な例は当技術分野で記載されており、例えば、上記Kabat EAらの文献(1991)を参照されたい。
【０２８１】
軽鎖に関して、具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の軽鎖はカッパ軽鎖である。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の軽鎖はラムダ軽鎖である。また別の具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖又はヒトラムダ軽鎖である。
【０２８２】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は軽鎖を含み、ここで、該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号106、配列番号107、及び配列番号108、又はそれぞれ、配列番号112、配列番号113、及び配列番号114、又はそれぞれ、配列番号118、配列番号119、及び配列番号120の抗体のアミノ酸配列を有するVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含み、かつ該軽鎖の定常領域は、カッパ又はラムダ軽鎖定常領域である。特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は軽鎖を含み、ここで、該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は18C6のVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3(すなわち、表2、表4、又は表6に掲載されているもの)を含み、かつ該軽鎖の定常領域は、カッパ又はラムダ軽鎖定常領域である。
【０２８３】
別の特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は軽鎖を含み、ここで、該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号102のアミノ酸配列を含み、かつ該軽鎖の定常領域は、カッパ又はラムダ軽鎖定常領域である。別の特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は軽鎖を含み、ここで、該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号2、配列番号22、配列番号42、配列番号62、又は配列番号82のアミノ酸配列を含み、かつ該軽鎖の定常領域は、カッパ又はラムダ軽鎖定常領域である。
【０２８４】
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は軽鎖を含み、ここで、該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号106、配列番号107、及び配列番号108、又はそれぞれ、配列番号112、配列番号113、及び配列番号114、又はそれぞれ、配列番号118、配列番号119、及び配列番号120のアミノ酸配列を有するVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含み、かつ該軽鎖の定常領域は、ヒト軽鎖定常領域のアミノ酸を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は軽鎖を含み、ここで、該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は18C6のVL CDRのいずれか1つのアミノ酸配列を有するVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3(すなわち、表2、表4、及び表6に掲載されているもの)を含み、かつ該軽鎖の定常領域は、ヒト軽鎖定常領域である。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は軽鎖を含み、ここで、該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号102のアミノ酸配列を含み、かつ該軽鎖の定常領域は、ヒト軽鎖定常領域である。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は軽鎖を含み、ここで、該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は18C6のVL CDR(すなわち、表8に掲載されているもの)のいずれか1つのアミノ酸配列を含み、かつ該軽鎖の定常領域は、ヒト軽鎖定常領域である。ヒト定常領域配列の非限定的な例は当技術分野で記載されており、例えば、上記のKabat EAらの文献(1991)を参照されたい。
【０２８５】
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載される重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)を含み、ここで、該定常領域は、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、もしくはIgY免疫グロブリン分子、又はヒトIgG、IgE、IgM、IgD、IgA、もしくはIgY免疫グロブリン分子に見られるタイプのものである。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載される任意のアミノ酸配列を含むVH及びVLを含み、ここで、該定常領域は、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、又はIgY免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の任意のクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2)又は任意のサブクラス(例えば、IgG2a及びIgG2b)に見られるタイプのものである。特定の実施態様において、該定常領域は、ヒトIgG、IgE、IgM、IgD、IgA、又はIgY免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の任意のクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2)又は任意のサブクラス(例えば、IgG2a及びIgG2b)に見られるタイプのものである。
【０２８６】
別の特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は重鎖及び/又は軽鎖を含み、ここで、(i)該重鎖は、(a)それぞれ、配列番号103、配列番号104、及び配列番号105、それぞれ、配列番号109、配列番号110、及び配列番号111、又はそれぞれ、配列番号115、配列番号116、及び配列番号117のアミノ酸配列を有するVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3を含む可変領域を含み、かつ(b)ヒトIgG重鎖の定常ドメインである定常重鎖ドメインを含み;並びに/又は(ii)該軽鎖は、(a)それぞれ、配列番号106、配列番号107、及び配列番号108、又はそれぞれ、配列番号112、配列番号113、及び配列番号114、又はそれぞれ、配列番号118、配列番号119、及び配列番号120のアミノ酸配列を有するVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含む可変領域、並びに(b)ヒトIgGの定常ドメインである定常軽鎖ドメインを含む。別の特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は重鎖及び/又は軽鎖を含み、ここで、(i)該重鎖は、(a)抗体10C6、7B12、19C11、16C5、もしくは18C6のVH CDRのうちのいずれか1つのアミノ酸配列を有するVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3(すなわち、表1、表3、及び表5に掲載されているもの)を含む可変領域を含み、かつ(b)ヒトIgG重鎖の定常ドメインである定常重鎖ドメインを含み;並びに/又は(ii)該軽鎖は、(a)抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は18C6のVL CDRのいずれか1つのアミノ酸配列を有するVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3(すなわち、表2、表4、及び表6に掲載されているもの)を含む可変領域、並びに(b)ヒトIgGの定常ドメインである定常軽鎖ドメインを含む。
【０２８７】
別の特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は重鎖及び/又は軽鎖を含み、ここで、(i)該重鎖は、(a)配列番号101のアミノ酸配列を含む可変領域、及び(b)ヒトIgGの定常ドメインである定常重鎖ドメインを含み;並びに/又は(ii)該軽鎖は、(a)配列番号102のアミノ酸配列を含む可変領域、及び(b)ヒトカッパ軽鎖の定常ドメインである定常軽鎖ドメインを含む。別の特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は重鎖及び/又は軽鎖を含み、ここで、(i)該重鎖は、(a)抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は18C6のいずれか1つのVH(すなわち、表7に掲載されているもの)のアミノ酸配列を含む可変領域、及び(b)ヒトIgGの定常ドメインである定常重鎖ドメインを含み;並びに/又は(ii)該軽鎖は、(a)抗体10C6、7B12、19C11、16C5、もしくは18C6のいずれか1つのVL(すなわち、表8に掲載されているもの)のアミノ酸配列を含む可変領域、及び(b)ヒトカッパ軽鎖の定常ドメインである定常軽鎖ドメインを含む。
【０２８８】
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片又はその抗原結合断片は、配列番号1〜100のいずれか1つに対して下記のパーセント同一性を有するアミノ酸配列を含む。数学的アルゴリズムを利用して、2つの配列(例えば、アミノ酸配列又は核酸配列)間のパーセント同一性を決定することができる。2つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin及びAltschulの文献(1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873 5877)に見られるように改変された、Karlin及びAltschulの文献(1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264 2268)のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Altschulらの文献(1990, J. Mol. Biol. 215:403)のNBLAST及びXBLASTプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索を、例えば、スコア＝100、ワード長＝12に設定されたNBLASTヌクレオチドプログラムパラメータを用いて実施し、本明細書に記載される核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索を、例えば、スコア50、ワード長＝3に設定されたXBLASTプログラムパラメータを用いて実施し、本明細書に記載されるタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップのあるアラインメントを得るために、Gapped BLASTをAltschulらの文献(1997, Nucleic Acids Res. 25:3389 3402)に記載されている通りに利用することができる。或いは、分子間の距離関係を検出する反復検索をPSI BLASTによって実施することができる(同上)。BLAST、Gapped BLAST、及びPSI Blastプログラムを利用する場合、(例えば、XBLAST及びNBLASTの)それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを使用することができる(例えば、ワールドワイドウェブ、ncbi.nlm.nih.govにおけるNational Center for Biotechnology Information(NCBI)を参照)。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、Myers及びMillerの文献(1988, CABIOS 4:11 17)のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている。アミノ酸配列の比較のためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120加重残基表、12のギャップ長ペナルティ、及び4のギャップペナルティを使用することができる。さらに、2つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを許容するしないにかかわらず、上記の技法と同様の技法を用いて決定することができる。典型的には、パーセント同一性を計算するときに、正確な一致のみをカウントする。
【０２８９】
ある実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号101のアミノ酸配列との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも98％の配列同一性を有するVHを含む。ある実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は1B5のいずれか1つのVH(すなわち、表7に掲載されているもの)のアミノ酸配列との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも98％の配列同一性を有するVHを含む。ある実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号101のアミノ酸配列との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも98％の配列同一性を有するVHドメインを含み、ここで、該抗体又は抗原結合断片は、表1、表2、表3、表4、表5、又は表6に示されるCDR(例えば、VH CDR及び/又はVL CDR)と同一であるCDR(例えば、VH CDR及び/又はVL CDR)を含む。ある実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は18C6のいずれか1つのVH(すなわち、表7に掲載されているもの)のアミノ酸配列との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも98％の配列同一性を有するVHドメインを含み、ここで、該抗体又は抗原結合断片は、表1、表2、表3、表4、表5、又は表6に示されるCDR(例えば、VH CDR及び/又はVL CDR)と同一であるCDR(例えば、VH CDR及び/又はVL CDR)を含む。
【０２９０】
ある実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号102のアミノ酸配列との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも98％の配列同一性を有するVLを含む。ある実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は1B5のいずれか1つのVL(すなわち、表8に掲載されているもの)のアミノ酸配列との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも98％の配列同一性を有するVLを含む。ある実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号102のアミノ酸配列との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも98％の配列同一性を有するVLドメインを含み、ここで、該抗体又は抗原結合断片は、表1、表2、表3、表4、表5、又は表6に示されるCDR(例えば、VH CDR及び/又はVL CDR)と同一であるCDR(例えば、VH CDR及び/又はVL CDR)を含む。ある実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は18C6のいずれか1つのVL(すなわち、表7に掲載されているもの)のアミノ酸配列との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも98％の配列同一性を有するVLドメインを含み、ここで、該抗体又は抗原結合断片は、表1、表2、表3、表4、表5、又は表6に示されるCDR(例えば、VH CDR及び/又はVL CDR)と同一であるCDR(例えば、VH CDR及び/又はVL CDR)を含む。
【０２９１】
ある実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は:(i)配列番号101のアミノ酸配列との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも98％の配列同一性を有するVHドメイン;及び(ii)配列番号102のアミノ酸配列との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも98％の配列同一性を有するVLドメインを含む。ある実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は:(i)抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は18C6のいずれか1つのVH(すなわち、表8に掲載されているもの)のアミノ酸配列との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも98％の配列同一性を有するVHドメイン;及び(ii)抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は18C6のいずれか1つのVL(すなわち、表7に掲載されているもの)のアミノ酸配列との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも98％の配列同一性を有するVLドメインをそれぞれ含む。ある実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は:(i)配列番号101のアミノ酸配列との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも98％の配列同一性を有するVHドメイン;及び(ii)配列番号102のアミノ酸配列との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも98％の配列同一性を有するVLドメインを含み、ここで、該抗体又は抗原結合断片は、表1、表2、表3、表4、表5、又は表6に示されるCDR(例えば、VH CDR及び/又はVL CDR)と同一であるCDR(例えば、VH CDR及び/又はVL CDR)を含む。ある実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は:(i)抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は18C6のいずれか1つのVH(すなわち、表8に掲載されているもの)のアミノ酸配列との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも98％の配列同一性を有するVHドメイン;及び(ii)抗体10C6、7B12、19C11、16C5、又は18C6のいずれか1つのVL(すなわち、表7に掲載されているもの)のアミノ酸配列との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも98％の配列同一性を有するVLドメインをそれぞれ含み、ここで、該抗体又は抗原結合断片は、表1、表2、表3、表4、表5、又は表6に示されるCDR(例えば、VH CDR及び/又はVL CDR)と同一であるCDR(例えば、VH CDR及び/又はVL CDR)を含む。
【０２９２】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(例えば、10C6、7B12、19C11、16C5、及び/又は16C5)の同じ又は重複するエピトープに結合する抗体である。本明細書で使用される場合、「エピトープ」は当技術分野の用語であり、抗体が免疫特異的に結合することができる抗原の局所領域を指すことができる。エピトープは、例えば、ポリペプチドの隣接するアミノ酸であることができ(線形もしくは隣接エピトープ)、又はエピトープは、例えば、ポリペプチド(単数)もしくはポリペプチド(複数)の2以上の非隣接領域から集合したものであることができる(立体構造的、非線形、不連続、もしくは非隣接エピトープ)。ある実施態様において、抗体のエピトープは、例えば、NMR分光法、X線回折結晶学研究、ELISAアッセイ、質量分析(例えば、MALDI質量分析)と連動した水素/重水素交換、アレイベースのオリゴペプチドスキャニングアッセイ、及び/又は突然変異生成マッピング(例えば、部位特異的突然変異生成マッピング)によって決定することができる。X線結晶学について、結晶化は、当技術分野における公知の方法のいずれかを用いて達成することができる(例えば、Giege Rらの文献(1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson Aの文献(1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NEの文献(1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson Aの文献(1976) J Biol Chem 251: 6300-6303)。抗体:抗原結晶は、周知のX線回折技法を用いて研究することができ、かつX-PLOR(Yale University, 1992, Molecular Simulations社により配布;例えば、Meth Enzymol(1985)、第114巻及び第115巻、Wyckoff HWら編;米国特許出願第2004/0014194号を参照)、並びにBUSTER(Bricogne Gの文献(1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne Gの文献(1997) Meth Enzymol 276A: 361-423、Carter CW編; Roversi Pらの文献(2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323)などのコンピュータソフトウェアを用いて洗練させることができる。突然変異生成マッピング研究は、当業者に公知の任意の方法を用いて達成することができる。アラニンスキャニング突然変異生成技法を含む、突然変異生成技法の説明については、例えば、Champe Mらの文献(1995)並びにCunningham BC及びWells JAの文献(1989)を参照されたい。さらに、同じ又は重複するエピトープを認識し、それに結合する抗体は、例えば、ある抗体が別の抗体の標的抗原に対する結合を阻止する能力を示すことにより、免疫アッセイなどのルーチンの技法、すなわち、競合的結合アッセイを用いて同定することができる。競合結合アッセイを用いて、2つの抗体がエピトープに対する同様の結合特異性を有するかどうかを決定することもできる。競合的結合は、試験下の免疫グロブリンが参照抗体の共通抗原に対する免疫特異的結合を阻害するアッセイで決定することができる。数多くのタイプの競合的結合アッセイが知られており、例えば:固相直接又は間接放射免疫アッセイ(RIA)、固相直接又は間接酵素免疫アッセイ(EIA)、サンドイッチ競合アッセイ(Stahli Cらの文献(1983) Methods Enzymol 9: 242-253を参照);固相直接ビオチン-アビジンEIA(Kirkland TNらの文献(1986) J Immunol 137: 3614-9を参照);固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ(Harlow E及びLane Dの文献(1988)、抗体:実験マニュアル(Antibodies: A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Press); I-125標識を用いる固相直接��識RIA(Morel GAらの文献(1988) Mol Immunol 25(1): 7-15を参照);固相直接ビオチン-アビジンEIA(Cheung RCらの文献(1990) Virology 176: 546-52);及び直接標識RIA(Moldenhauer Gらの文献(1990) Scand J Immunol 32: 77-82)がある。典型的には、そのようなアッセイは、これらの標識されていない試験免疫グロブリン及び標識された参照免疫グロブリンのどちらかを担持する固体表面又はセルに結合した精製抗原の使用を伴う。競合的阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で固体表面又はセルに結合した標識の量を決定することにより測定することができる。通常、試験免疫グロブリンは過剰に存在する。通常、競合する抗体が過剰に存在するとき、それは、参照抗体の共通抗原に対する免疫特異的結合を、少なくとも50〜55％、55〜60％、60〜65％、65〜70％、70〜75％、又はそれより大きく阻害する。競合結合アッセイは、標識抗原又は標識抗体のいずれかを用いる多数の異なるフォーマットで構成されることができる。このアッセイの共通のバージョンでは、抗原を96ウェルプレートに固定する。その後、標識抗体の抗原に対する結合を阻止する標識されていない抗体の能力を放射性標識又は酵素標識を用いて測定する。さらなる詳細については、例えば、Wagener Cらの文献(1983) J Immunol 130: 2308-2315; Wagener Cらの文献(1984) J Immunol Methods 68: 269-274; Kuroki Mらの文献(1990) Cancer Res 50: 4872-4879; Kuroki Mらの文献(1992) Immunol Invest 21: 523-538; Kuroki Mらの文献(1992) Hybridoma 11: 391-407、及び抗体:実験マニュアル(Antibodies: A Laboratory Manual)、Harlow E及びLane D編、上記、pp. 386-389を参照されたい。
【０２９３】
ある態様において、競合結合アッセイを用いて、抗体が、例えば、用量依存的な形で、別の抗体によって競合的に阻止されるかどうかを決定することができ、例えば、2つの抗体が、標識抗原又は標識抗体のいずれかを用いる、全ての数の異なるフォーマットで構成されることができる、競合ELISAアッセイなどの、競合結合アッセイで同一の又は立体的に重複するエピトープを認識するとき、抗体は、参照抗体と本質的に同じエピトープ、又は重複するエピトープに結合する。特定の実施態様において、抗体は、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(例えば、10C6、7B12、19C11、16C5、又は16C5の可変領域を含むマウスIgG抗体)を用いる競合結合アッセイで試験することができる。
【０２９４】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、当業者に公知又は本明細書に記載のアッセイ(例えば、ELISA)を用いて決定したとき、MUC16に対する結合を、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(例えば、10C6、7B12、19C11、16C5、又は16C5の可変領域を含むマウスIgG抗体)と(例えば、用量依存的な形で)競合する抗体である。別の態様において、本明細書に提供されるのは、当業者に公知又は本明細書に記載のアッセイ(例えば、ELISA)を用いて決定したとき、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(例えば、10C6、7B12、19C11、16C5、又は16C5の可変領域を含むマウスIgG抗体)がMUC16に結合するのを(例えば、用量依存的な形で)競合的に阻害する抗体である。
【０２９５】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片がMUC16に対する結合を自己競合するのと同じ程度に結合を本明細書に記載される抗体と競合する抗体である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する結合を本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と競合する第一の抗体であり、ここで、該競合は、第一の抗体のエピトープに対する結合の80％を上回る(例えば、85％、90％、95％、もしくは98％、又は80％〜85％、80％〜90％、85％〜90％、もしくは85％〜95％の)低下として示される。
【０２９６】
具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、表1、表3、又は表5に記載されているようなアミノ酸配列を含むVH CDR1、VH CDR2、及び/又はVH CDR3を含むVHを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、10C6のVH CDR(表1、表3、及び表5を参照)を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、7B12のVH CDR(表1、表3、及び表5を参照)を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、19C11のVH CDR(表1、表3、及び表5を参照)を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、16C5のVH CDR(表1、表3、及び表5を参照)を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、18C6のVH CDR(表1、表3、及び表5を参照)を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。
【０２９７】
具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、表2、表4、又は表6に記載されているようなアミノ酸配列を含むVL CDR1、VL CDR2、及び/又はVL CDR3を含むVLを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、10C6のVL CDR(表2、表4、及び表6を参照)を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、7B12のVL CDR(表2、表4、及び表6を参照)を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、19C11のVL CDR(表2、表4、及び表6を参照)を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、16C5のVL CDR(表2、表4、及び表6を参照)を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、18C6のVL CDR(表2、表4、及び表6を参照)を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。
【０２９８】
具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、(a)表1、表3、又は表5に記載されているようなアミノ酸配列を含むVH CDR1、VH CDR2、及び/又はVH CDR3を含むVH;並びに(b)表2、表4、又は表6に記載されているようなアミノ酸配列を含むVL CDR1、VL CDR2、及び/又はVL CDR3を含むVLを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、(a)10C6のVH CDR(表1、表3、及び表5を参照);並びに(b)10C6のVL CDR(表2、表4、及び表6を参照)を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、(a)7B12のVH CDR(表1、表3、及び表5を参照);並びに(b)7B12のVL CDR(表2、表4、及び表6を参照)を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、(a)19C11のVH CDR(表1、表3、及び表5を参照);並びに(b)19C11のVL CDR(表2、表4、及び表6を参照)を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、(a)16C5のVH CDR(表1、表3、及び表5を参照);並びに(b)16C5のVL CDR(表2、表4、及び表6を参照)を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、(a)18C6のVH CDR(表1、表3、及び表5を参照);並びに(b)18C6のVL CDR(表2、表4、及び表6を参照)を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。
【０２９９】
具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、表7に記載されているようなアミノ酸配列を有するVHドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、配列番号1のアミノ酸配列を有するVHドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、配列番号21のアミノ酸配列を有するVHドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、配列番号41のアミノ酸配列を有するVHドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、配列番号61のアミノ酸配列を有するVHドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、配列番号81のアミノ酸配列を有するVHドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。
【０３００】
具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、表8に記載されているようなアミノ酸配列を有するVLドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、配列番号2のアミノ酸配列を有するVLドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、配列番号22のアミノ酸配列を有するVLドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、配列番号42のアミノ酸配列を有するVLドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、配列番号62のアミノ酸配列を有するVLドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、配列番号82のアミノ酸配列を有するVLドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。
【０３０１】
具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、(a)表7に記載されているようなアミノ酸配列を有するVHドメイン;及び(b)表8に記載されているようなアミノ酸配列を有するVLドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、(a)配列番号1のアミノ酸配列を有するVHドメイン;及び(b)配列番号2のアミノ酸配列を有するVLドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、(a)配列番号21のアミノ酸配列を有するVHドメイン;及び(b)配列番号22のアミノ酸配列を有するVLドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、(a)配列番号41のアミノ酸配列を有するVHドメイン;及び(b)配列番号42のアミノ酸配列を有するVLドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、(a)配列番号61のアミノ酸配列を有するVHドメイン;及び(b)配列番号62のアミノ酸配列を有するVLドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、(a)配列番号81のアミノ酸配列を有するVHドメイン;及び(b)配列番号82のアミノ酸配列を有するVLドメインを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。
【０３０２】
具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、表1、表3、又は表5に記載されているようなアミノ酸配列を含むVH CDR1、VH CDR2、及び/又はVH CDR3を含むVHを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、10C6のVH CDR(表1、表3、及び表5を参照)を含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、7B12のVH CDR(表1、表3、及び表5を参照)を含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に対する免疫特異的結合を、19C11のVH CDR(表1、表3、及び表5を参照)を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と(例えば、用量依存的な形で)競合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、16C5のVH CDR(表1、表3、及び表5を参照)を含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、18C6のVH CDR(表1、表3、及び表5を参照)を含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。
【０３０３】
具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、表2、表4、又は表6に記載されているようなアミノ酸配列を含むVL CDR1、VL CDR2、及び/又はVL CDR3を含むVLを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、10C6のVL CDR(表2、表4、及び表6を参照)を含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、7B12のVL CDR(表2、表4、及び表6を参照)を含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、19C11のVL CDR(表2、表4、及び表6を参照)を含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、16C5のVL CDR(表2、表4、及び表6を参照)を含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、18C6のVL CDR(表2、表4、及び表6を参照)を含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。
【０３０４】
具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、(a)表1、表3、又は表5に記載されているようなアミノ酸配列を含むVH CDR1、VH CDR2、及び/又はVH CDR3を含むVH;並びに(b)表2、表4、又は表6に記載されているようなアミノ酸配列を含むVL CDR1、VL CDR2、及び/又はVL CDR3を含むVLを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)10C6のVH CDR(表1、表3、及び表5を参照);並びに(b)10C6のVL CDR(表2、表4、及び表6を参照)を含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)7B12のVH CDR(表1、表3、及び表5を参照);並びに(b)7B12のVL CDR(表2、表4、及び表6を参照)を含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)19C11のVH CDR(表1、表3、及び表5を参照);並びに(b)19C11のVL CDR(表2、表4、及び表6を参照)を含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)16C5のVH CDR(表1、表3、及び表5を参照);並びに(b)16C5のVL CDR(表2、表4、及び表6を参照)を含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)18C6のVH CDR(表1、表3、及び表5を参照);並びに(b)18C6のVL CDR(表2、表4、及び表6を参照)を含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。
【０３０５】
具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、表7に記載されているようなアミノ酸配列を有するVHドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号1のアミノ酸配列を有するVHドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号21のアミノ酸配列を有するVHドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号41のアミノ酸配列を有するVHドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号61のアミノ酸配列を有するVHドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号81のアミノ酸配列を有するVHドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。
【０３０６】
具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、表8に記載されているようなアミノ酸配列を有するVLドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号2のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号22のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号42のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号62のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号82のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。
【０３０７】
具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、(a)表7に記載されているようなアミノ酸配列を有するVHドメイン;及び(b)表8に記載されているようなアミノ酸配列を有するVLドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、(a)配列番号1のアミノ酸配列を有するVHドメイン;及び(b)配列番号2のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、(a)配列番号21のアミノ酸配列を有するVHドメイン;及び(b)配列番号22のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、(a)配列番号41のアミノ酸配列を有するVHドメイン;及び(b)配列番号42のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、(a)配列番号61のアミノ酸配列を有するVHドメイン;及び(b)配列番号62のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、(a)配列番号81のアミノ酸配列を有するVHドメイン;及び(b)配列番号82のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む抗体の同じ又は重複するエピトープに結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。
【０３０８】
当業者に公知又は本明細書に記載のアッセイ(例えば、X線結晶学、ELISAアッセイなど)を用いて、2つの抗体が同じエピトープに結合するかどうかを決定することができる。親和性を、限定されないが、平衡解離定数(KD)及び平衡会合定数(KA)を含む、当技術分野で公知のいくつかの方法で測定し及び/又は表すことができる。KDは、バイオレイヤー干渉法などの、当業者に公知の技法によって決定することができる。
【０３０９】
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片のエピトープを免疫原として用いて、抗体を産生する。例えば、抗体を産生する方法については、第5.3節及び第6.2節を参照されたい。
【０３１０】
(5.1.2  機能的特徴)
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、0.5×10-3/s、1×10-3/s、1.5×10-3/s、2×10-3/s、2.5×10-3/s、3×10-3/s、4×10-3/s、5×10-3/s、6×10-3/s、7×10-3/s、8×10-3/s、9×10-3/s、1×10-4/s、2×10-4/s、3×10-4/s、4×10-4/s、5×10-4/s、6×10-4/s、7×10-4/s、又は8×10-4/s未満のkdでMUC16に結合する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約0.5×10-3/s、1×10-3/s、1.5×10-3/s、2×10-3/s、2.5×10-3/s、3×10-3/s、4×10-3/s、5×10-3/s、6×10-3/s、7×10-3/s、8×10-3/s、9×10-3/s、1×10-4/s、2×10-4/s、3×10-4/s、4×10-4/s、5×10-4/s、6×10-4/s、7×10-4/s、又は8×10-4/sのkdでMUC16に結合する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約0.5×10-3/s〜8×10-4/sのkdでMUC16に結合する。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約1×10-3/sのkdでMUC16に結合する。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約1.5×10-3/sのkdでMUC16に結合する。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約2×10-3/sのkdでMUC16に結合する。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約2×10-4/sのkdでMUC16に結合する。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約7×10-4/sのkdでMUC16に結合する。
【０３１１】
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、少なくとも2.5×104/s、3×104/s、3.5×104/s、4×104/s、4.5×104/s、5×104/s、5.5×104/s、6×104/s、6.5×104/s、7×104/s、7.5×104/s、8×104/s、9×104/s、又は9×105/sのkaでMUC16に結合する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約2.5×104/s、3×104/s、3.5×104/s、4×104/s、4.5×104/s、5×104/s、5.5×104/s、6×104/s、6.5×104/s、7×104/s、7.5×104/s、8×104/s、9×104/s、又は9×105/sのkaでMUC16に結合する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約4×104/sのkaでMUC16に結合する。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約6×104/sのkaでMUC16に結合する。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約7.5×104/sのkaでMUC16に結合する。
【０３１２】
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、1000nM、500nM、100nM、50nM、25nM、20nM、15nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.1nM、又は0.05nM未満のKDでMUC16に結合する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約1000nM、500nM、100nM、50nM、25nM、20nM、15nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.1nM、又は0.05nMのKDでMUC16に結合する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約500nM〜1000nMのKDでMUC16に結合する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約5nM〜75nMのKDでMUC16に結合する。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約7nMのKDでMUC16に結合する。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約10pMのKDでMUC16に結合する。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約15pMのKDでMUC16に結合する。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約20pMのKDでMUC16に結合する。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約25pMのKDでMUC16に結合する。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約65pMのKDでMUC16に結合する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、数値又は数の範囲を修飾するために使用されるとき、該値又は範囲の5％〜10％を上回る偏差及び5％〜10％を下回る偏差が列挙された値又は範囲の意図された意味の範囲内にとどまっていることを示す。
【０３１３】
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に結合する。ある実施態様において、該細胞は、癌細胞(例えば、卵巣癌細胞、肺癌細胞、膵癌細胞、乳癌細胞、卵管癌細胞、子宮(例えば、子宮内膜)癌細胞、又は原発性腹膜癌細胞)である。ある実施態様において、該細胞は、卵巣癌細胞である。ある実施態様において、該細胞は、肺癌細胞である。ある実施態様において、該細胞は、膵癌細胞である。ある実施態様において、該細胞は、乳癌細胞である。ある実施態様において、該細胞は、子宮(例えば、子宮内膜)癌細胞である。ある実施態様において、該細胞は、卵管癌細胞である。ある実施態様において、該細胞は、原発性腹膜癌細胞である。ある実施態様において、該細胞は、SKOV3細胞である。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に対して、アイソタイプ対照抗体が該細胞に結合するよりも、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、250、500、又は1000倍多く結合する。アイソタイプ対照抗体は、当技術分野で認められている用語である。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に対して、アイソタイプ対照抗体が該細胞に結合するよりも、約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、250、500、又は1000倍多く結合する。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に対して、アイソタイプ対照抗体が該細胞に結合するよりも、10〜50、50〜100、100〜250、250〜500、又は500〜1000倍多く結合する。
【０３１４】
配列番号133のアミノ酸配列によってコードされるタンパク質は、本明細書においてMUC16c114とも呼ばれ、成熟MUC16のC末端の114アミノ酸残基からなる(配列番号150は成熟MUC16の配列である)。MUC16c114は、配列番号133の位置1、24、及び30のアスパラギンアミノ酸(配列番号150のアミノ酸位置Asn1777、Asn1800、及びAsn1806に対応する)でN-グリコシル化されることができる。
【０３１５】
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠く。ある実施態様において、該細胞は、卵巣癌細胞である。ある実施態様において、該細胞は、肺癌細胞である。ある実施態様において、該細胞は、膵癌細胞である。ある実施態様において、該細胞は、乳癌細胞である。ある実施態様において、該細胞は、子宮(例えば、子宮内膜)癌細胞である。ある実施態様において、該細胞は、卵管癌細胞である。ある実施態様において、該細胞は、原発性腹膜癌細胞である。ある実施態様において、該細胞は、SKOV3細胞である。ある実施態様において、MUC16の第二の形態は、例えば、緑色蛍光タンパク質又は赤色蛍光タンパク質などの検出可能なタンパク質に融合される。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対して、アイソタイプ対照抗体が該細胞に結合するよりも、最大でも1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、又は5倍多く結合する。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対して、アイソタイプ対照抗体が該細胞に結合するよりも、約1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、又は5倍多く結合する。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対して、アイソタイプ対照抗体が該細胞に結合するよりも、0〜1.1、1.1〜1.5、1.5〜3、又は3〜5倍多く結合する。
【０３１６】
配列番号139のアミノ酸配列によってコードされるタンパク質は、本明細書においてMUC16c114-N3とも呼ばれる。MUC16c114-N3は、アミノ酸位置30の(配列番号150のアミノ酸位置1806に対応する)アスパラギンがアラニンに突然変異させられていることを除いて、成熟MUC16のC末端の114アミノ酸残基からなる(配列番号150は成熟MUC16の配列である)。したがって、MUC16c114-N3は、配列番号139のアミノ酸位置30(配列番号150のアミノ酸位置Asn1806に対応する)でN-グリコシル化されることができない。
【０３１７】
ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、4H11が該細胞に結合するよりも、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、又は40倍少なく、MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に結合する。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、4H11が該細胞に結合するよりも、約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、又は40倍少なく、MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に結合する。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、4H11が該細胞に結合するよりも、3〜5、5〜10、10〜20、又は20〜40倍少なく、MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に結合する。
【０３１８】
例えば、FACsなどの、細胞に対する本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の結合を決定するためのアッセイは、当業者に公知である。例えば、第6.2節に記載されている方法を参照されたい。
【０３１９】
本明細書で使用される場合、「4H11」は、Raoらの文献、Appl. Immunohistochem Mol Morphol, 2010, 18(5):462-72及び国際特許出願公開WO 2011/119979号において4H11と表記されているモノクローナル抗MUC16抗体を指す。
【０３２０】
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列
【化１４４】
2018509907.tif 000154
を含むペプチドに結合し、ここで、
【化１４５】
2018509907.tif 000155
のアミノ酸残基番号4(N4)及びアミノ酸残基番号10(N10)は、グリコシル化されている。ある実施態様において、該ペプチドは、アミノ酸配列
【化１４６】
2018509907.tif 000156
からなり、ここで、
【化１４７】
2018509907.tif 000157
のアミノ酸残基番号4(N4)及びアミノ酸残基番号10(N10)は、グリコシル化されている。ある実施態様において、該グリコシル化は、N-結合型キトビオースからなる。ある実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列
【化１４８】
2018509907.tif 000158
を含むペプチドに結合し、ここで、
【化１４９】
2018509907.tif 000159
のアミノ酸残基番号7(N7)は、グリコシル化されている。ある実施態様において、該ペプチドは、アミノ酸配列
【化１５０】
2018509907.tif 000160
からなり、ここで、
【化１５１】
2018509907.tif 000161
のアミノ酸残基番号7(N7)は、グリコシル化されている。ある実施態様において、該グリコシル化は、N-結合型キトビオースからなる。ある実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、ペプチドの混合物に結合し、ここで、該ペプチドの混合物は、(a)アミノ酸配列
【化１５２】
2018509907.tif 000162
を含む第一のペプチド(ここで、
【化１５３】
2018509907.tif 000163
のアミノ酸残基番号4(N4)及びアミノ酸残基番号10(N10)は、グリコシル化されている)及び(b)アミノ酸配列
【化１５４】
2018509907.tif 000164
を含む第二のペプチド(ここで、
【化１５５】
2018509907.tif 000165
のアミノ酸残基番号7(N7)はグリコシル化されている)を含む。ある実施態様において、該第一のペプチドは、アミノ酸配列
【化１５６】
2018509907.tif 000166
からなり、ここで、
【化１５７】
2018509907.tif 000167
のアミノ酸残基番号4(N4)及びアミノ酸残基番号10(N10)は、グリコシル化されている。ある実施態様において、該第二のペプチドは、アミノ酸配列
【化１５８】
2018509907.tif 000168
からなり、ここで、
【化１５９】
2018509907.tif 000169
のアミノ酸残基番号7(N7)は、グリコシル化されている。ある実施態様において、該グリコシル化は、N-結合型キトビオースからなる。
【０３２１】
例えば、ELISAなどの、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の細胞に対する結合を決定するためのアッセイは、当業者に公知である。例えば、第6.2節に記載されている方法を参照されたい。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、抗MUC16モノクローナル抗体4H11がペプチドに結合するよりも、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又は30倍多く、該ペプチドに結合する。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、抗MUC16モノクローナル抗体4H11がペプチドに結合するよりも、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又は30倍多く、該ペプチドに結合する。
【０３２２】
ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、0.5×10-3/s、1×10-3/s、1.5×10-3/s、2×10-3/s、2.5×10-3/s、3×10-3/s、4×10-3/s、5×10-3/s、6×10-3/s、7×10-3/s、8×10-3/s、9×10-3/s、1×10-4/s、2×10-4/s、3×10-4/s、4×10-4/s、5×10-4/s、6×10-4/s、7×10-4/s、又は8×10-4/s未満のkdでペプチドに結合する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約0.5×10-3/s、1×10-3/s、1.5×10-3/s、2×10-3/s、2.5×10-3/s、3×10-3/s、4×10-3/s、5×10-3/s、6×10-3/s、7×10-3/s、8×10-3/s、9×10-3/s、1×10-4/s、2×10-4/s、3×10-4/s、4×10-4/s、5×10-4/s、6×10-4/s、7×10-4/s、又は8×10-4/sのkdでペプチドに結合する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約0.5×10-3/s〜8×10-4/sのkdでペプチドに結合する。
【０３２３】
ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、少なくとも2.5×104/s、3×104/s、3.5×104/s、4×104/s、4.5×104/s、5×104/s、5.5×104/s、6×104/s、6.5×104/s、7×104/s、7.5×104/s、8×104/s、9×104/s、又は9×105/sのkaでペプチドに結合する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約2.5×104/s、3×104/s、3.5×104/s、4×104/s、4.5×104/s、5×104/s、5.5×104/s、6×104/s、6.5×104/s、7×104/s、7.5×104/s、8×104/s、9×104/s、又は9×105/sのkaでペプチドに結合する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約2.5×104/s〜9×105/sのkaでペプチドに結合する。
【０３２４】
ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、1000nM、500nM、100nM、50nM、25nM、20nM、15nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.1nM、又は0.05nM未満のKDでペプチドに結合する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約1000nM、500nM、100nM、50nM、25nM、20nM、15nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.1nM、又は0.05nMのKDでペプチドに結合する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約500nM〜1000nMのKDでペプチドに結合する。
【０３２５】
ある実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又は抗原結合断片は、アミノ酸配列
【化１６０】
2018509907.tif 000170
に対する免疫特異的結合を欠いており、ここで、
【化１６１】
2018509907.tif 000171
のアミノ酸残基番号4(N4)及びアミノ酸残基番号10(N10)は、グリコシル化されてない。ある実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列
【化１６２】
2018509907.tif 000172
に対する免疫特異的結合を欠いており、ここで、
【化１６３】
2018509907.tif 000173
のアミノ酸残基番号7(N7)は、グリコシル化されている。ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、ペプチドの混合物に対する免疫特異的結合を欠いており、ここで、該ペプチドの混合物は、(a)アミノ酸配列
【化１６４】
2018509907.tif 000174
からなる第一のペプチド(ここで、
【化１６５】
2018509907.tif 000175
のアミノ酸残基番号4(N4)及びアミノ酸残基番号10(N10)は、グリコシル化されている)及び(b)アミノ酸配列
【化１６６】
2018509907.tif 000176
からなる第二のペプチド(ここで、
【化１６７】
2018509907.tif 000177
のアミノ酸残基番号7(N7)は、グリコシル化されている)を含む。
【０３２６】
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、グリコシル化されているMUC16の形態(ここで、該MUC16の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)(MUC16c114)を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する。ある実施態様において、グリコシル化MUC16c114を組換え発現する細胞は、SKOV3細胞である。ある実施態様において、該MUC16c114のグリコシル化形態は、N-グリコシル化されている。ある実施態様において、該MUC16c114のグリコシル化形態は、アミノ酸残基Asn30(成熟MUC16(配列番号150)のAsn1806に対応する)でN-グリコシル化されている。ある実施態様において、該MUC16c114のグリコシル化形態は、アミノ酸残基Asn24及びAsn30(それぞれ、成熟MUC16(配列番号150)のAsn1800及びAsn1806に対応する)でN-グリコシル化されている。ある実施態様において、該MUC16c114のグリコシル化形態は、アミノ酸残基Asn1、Asn24、及びAsn30(それぞれ、成熟MUC16(配列番号150)のAsn1777、Asn1800、及びAsn1806に対応する)でN-グリコシル化されている。ある実施態様において、該グリコシル化は、N-結合型キトビオースを含む。ある実施態様において、該グリコシル化は、N-結合型キトビオースからなる。ある実施態様において、マトリゲル浸潤は、細胞(ここで、該細胞は、対照抗体(例えば、MUC16を標的としない抗体)又は4H11で処理される)のインビトロでのマトリゲル浸潤と比較して、少なくとも1.25、1.5、1.75、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10倍阻害される。ある実施態様において、マトリゲル浸潤は、細胞(ここで、該細胞は、対照抗体(例えば、MUC16を標的としない抗体)又は4H11で処理される)のインビトロでのマトリゲル浸潤と比較して、約1.25、1.5、1.75、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10倍阻害される。
【０３２７】
MUC16グリコシル化抗体又は抗原結合断片によって媒介されるマトリゲル浸潤の阻害を決定するためのアッセイは、当業者に公知である。例えば、第6.2節に記載されている方法を参照されたい。例えば、BD BioCoat(商標) Matrigel(商標)浸潤インサート又はチャンバー(カタログ# 354480、24ウェルプレート中)及び対照インサート(カタログ# 354578、24ウェルプレート中)は、BD Biosciences, MAから購入することができる。マトリゲル浸潤アッセイは、製造元のプロトコルに従って実施することができる。簡潔に述べると、24ウェルプレート中のマトリゲルチャンバー(-20℃で保存されたもの)及び対照インサート(4℃で保存されたもの)を室温に至らせておく。両方のインサートを、インサート中で、及び24ウェルプレートの外側のウェル中で、37℃の5％CO2加湿インキュベーターにて2時間、0.5mLの無血清培地で再水和させる。培養したSKOV3細胞をトリプシン処理し、培養培地で洗浄する。100万個の細胞を別の遠心分離チューブに分け、無血清培地で3回洗浄する。後に、これらの細胞を調整して、0.5mLの無血清培地中、5,000細胞にする。再水和させたインサート中の培地を除去し、このインサートを、化学誘引物質としての役割を果たすウェル中の0.75mLの10％胎仔ウシ血清(FBS)含有培養培地を含む新しい24ウェルプレートに移した。すぐに、無血清培地中の0.5mLの該細胞(5,000細胞)をインサートに添加する。適切な注意を払って、インサート及び外側のウェルに気泡が閉じ込められないように配慮する。24ウェルプレートを37℃の5％CO2加湿インキュベーターで48時間インキュベートする。インキュベーション後、綿棒をマトリゲル又は対照インサートに挿入して「擦る」ことにより、非浸潤細胞を膜の上表面から除去し、綿棒の先端を膜表面にわたって移動させながら、穏やかに圧力をかける。培地に浸した第二の綿棒で擦ることを繰り返す。その後、蒸留水中の0.5mLの0.5％クリスタルバイオレット染料を含む新しい24ウェルプレート中で30分間、インサートを染色する。染色後、インサートを蒸留水の3つのビーカー中ですすいで、余分な染料を除去する。インサートを新しい24ウェルプレート中で風乾させる。浸潤した細胞を、200倍の倍率の倒立顕微鏡下で、手でカウントする。3つ組の膜のいくつかの視野をカウントし、図に記録した。
【０３２８】
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、マウスモデル研究において、転移を阻害もしくは軽減するか、腫瘍成長を阻害するか、又は腫瘍退縮を誘導することができる。例えば、腫瘍細胞株を無胸腺ヌードマウスに導入することができ、無胸腺マウスに本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体を1回以上を投与することができ、注入された腫瘍細胞の腫瘍進行を数週間及び/又は数カ月にわたってモニタリングすることができる。場合により、無胸腺ヌードマウスへのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の投与は、腫瘍細胞株の導入前に行うことができる。ある実施態様において、MUC16c114を発現するSKOV3細胞を本明細書に記載されるマウス異種移植モデルに利用する。例えば、第6.2節及び第6.3節を参照されたい。
【０３２９】
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載の又は当業者に公知の方法によって評価したとき、模擬処置マウスと比較して、マウスモデルで、少なくとも約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、又は100％腫瘍成長を阻害するか又は腫瘍退縮を誘導する。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載の又は当業者に公知の方法によって評価したとき、模擬処置マウスと比較して、マウスモデルで、少なくとも約25％又は35％、任意に約75％まで腫瘍成長を阻害するか又は腫瘍退縮を誘導する。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載の又は当業者に公知の方法によって評価したとき、模擬処置マウスと比較して、マウスモデルで、少なくとも約1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、又は100倍腫瘍成長を阻害するか又は腫瘍退縮を誘導する。模擬処置マウスは、例えば、リン酸緩衝食塩水又は対照(例えば、抗IgG抗体)で処置することができる。
【０３３０】
腫瘍成長阻害又は腫瘍退縮の決定は、例えば、触診可能な腫瘍の物理的測定、又は他の視覚的検出法によって、例えば、腫瘍サイズを一定期間にわたってモニタリングすることにより評価することができる。例えば、腫瘍細胞株を、緑色蛍光タンパク質(GFP)又はルシフェラーゼなどの可視化物質を組換え発現するように作製することができ、その後、GFPのインビボ可視化を顕微鏡観察により実施することができ、ルシフェラーゼのインビボ可視化を、ルシフェラーゼ基質を異種移植マウスに投与し、かつルシフェラーゼ酵素がルシフェラーゼ基質を処理することによる発光を検出することにより実施することができる。GFP又はルシフェラーゼの検出の程度又はレベルは、異種移植マウスにおける腫瘍のサイズと相関する。
【０３３１】
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、模擬処置マウスと比較して、腫瘍異種移植モデルで、動物の生存を増大させることができる。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載の又は当業者に公知の方法によって評価したとき、模擬処置マウスと比較して、腫瘍異種移植モデルで、マウスの生存を、少なくとも約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％増大させる。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載の又は当業者に公知の方法によって評価したとき、模擬処置マウスと比較して、腫瘍異種移植モデルで、マウスの生存を、少なくとも約25％又は35％、任意に約75％まで増大させる。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載の又は当業者に公知の方法によって評価したとき、模擬処置マウスと比較して、腫瘍異種移植モデルで、マウスの生存を、少なくとも約1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、又は100倍増大させる。生存は、例えば、腫瘍細胞株注入後の時間(例えば、日又は週)に対する生存マウスの数の生存曲線をプロットすることにより決定することができる。模擬処置マウスは、例えば、リン酸緩衝食塩水又は対照(例えば、抗IgG抗体)で処置することができる。
【０３３２】
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、グリコシル化されているMUC16の形態(ここで、該MUC16の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)(MUC16c114)を発現する細胞を該MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と接触させたとき、該細胞に内在化される。「内在化される」又は「内在化」は、細胞によって内在化される分子に関するものであるとき、細胞膜の細胞外表面と接触している分子が細胞膜を横断して細胞膜の細胞内表面に及び/又は細胞質内に移動することを指す。ある実施態様において、グリコシル化MUC16c114を組換え発現する細胞は、SKOV3細胞である。ある実施態様において、MUC16c114のグリコシル化形態は、N-グリコシル化されている。ある実施態様において、MUC16c114のグリコシル化形態は、アミノ酸残基Asn30(成熟MUC16(配列番号150)のAsn1806に対応する)でN-グリコシル化されている。ある実施態様において、MUC16c114のグリコシル化形態は、アミノ酸残基Asn24及びAsn30(それぞれ、成熟MUC16(配列番号150)のAsn1800及びAsn1806に対応する)でN-グリコシル化されている。ある実施態様において、MUC16c114のグリコシル化形態は、アミノ酸残基Asn1、Asn24、及びAsn30(それぞれ、成熟MUC16(配列番号150)のAsn1777、Asn1800、及びAsn1806に対応する)でN-グリコシル化されている。ある実施態様において、該グリコシル化は、N-結合型キトビオースを含む。ある実施態様において、該グリコシル化は、N-結合型キトビオースからなる。
【０３３３】
例えば、放射性標識抗体を使用するものなどの、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の細胞への内在化を決定するためのアッセイは、当業者に公知である。例えば、第6.2節に記載されている方法を参照されたい。例えば、89Zr標識抗体の内在化は、MUC16c114を発現するSKOV3細胞で調べることができる。簡潔に述べると、約1×105個の細胞を12ウェルプレートに播種し、37℃の5％CO2インキュベーターで一晩インキュベートする。ある容量の放射性標識タンパク質を各々のウェルに添加し、プレートを37℃及び4℃で1、5、12、及び24時間インキュベートする。各々のインキュベーション期間の後、培地を回収し、細胞を1mLのリン酸緩衝食塩水(PBS)ですすぐ。細胞を、100mMグリシンを含む1mLの100mM酢酸(1:1、pH 3.5)中、4℃で洗浄することにより、表面結合活性を回収する。その後、接着細胞を1mLの1M NaOHで溶解させる。各々の洗浄液を回収し、活性についてカウントする。最終洗浄液の活性と全ての洗浄液の全活性との比を用いて、内在化された％を決定する。ある実施態様において、アッセイを37℃で実施する。ある実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、該MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片とともにインキュベートされた細胞の少なくとも1、2、3、5、6、7、8、9、又は10パーセントに内在化される。ある実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、該MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片とともにインキュベートされた細胞の約1、2、3、5、6、7、8、9、又は10パーセントに内在化される。ある実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、細胞を該MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と接触させてから1、2、3、4、8、12、16、20、又は24時間以内に内在化される。
【０３３４】
(5.2  抗体コンジュゲート)
好ましい実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節を参照)は、任意の他の分子、例えば、有機部分、検出可能標識、又は同位体にコンジュゲートされていない。代わりの実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節を参照)は、1以上の有機部分にコンジュゲートされている。代わりの実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、1以上の検出可能標識にコンジュゲートされている。代わりの実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、1以上の同位体にコンジュゲートされている。
【０３３５】
(5.2.1  検出可能標識及び同位体)
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節を参照)コンジュゲートであり、ここで、該MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、1以上の薬剤、例えば、イメージング剤又は細胞毒性剤にコンジュゲートされている。また本明細書に提供されるのは、二重特異性抗体コンジュゲートであり、ここで、該二重特異性抗体は、1以上の薬剤、例えば、イメージング剤又は細胞毒性剤にコンジュゲートされている。また本明細書に提供されるのは、抗体重鎖コンジュゲートであり、ここで、該抗体重鎖は、1以上の薬剤、例えば、イメージング剤又は細胞毒性剤にコンジュゲートされている。また本明細書に提供されるのは、抗体軽鎖コンジュゲートであり、ここで、該抗体軽鎖は、1以上の薬剤、例えば、イメージング剤又は細胞毒性剤にコンジュゲートされている。また本明細書に提供されるのは、融合タンパク質コンジュゲートであり、ここで、該融合タンパク質は、薬剤、例えば、イメージング剤又は細胞毒性剤にコンジュゲートされている。ある実施態様において、該薬剤は、共有結合的に又は非共有結合的にコンジュゲートされている。
【０３３６】
ある実施態様において、イメージング剤は、検出可能標識、例えば、発色標識、酵素標識、放射性同位体標識、同位体標識、蛍光標識、毒性標識、化学発光標識、核磁気共鳴造影剤標識、又は他の標識である。
【０３３７】
好適な発色標識の非限定的な例としては、ジアミノベンジジン及び4-ヒドロキシアゾ-ベンゼン-2-カルボン酸が挙げられる。
【０３３８】
好適な酵素標識の非限定的な例としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ-5-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α-グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。
【０３３９】
好適な放射性同位体標識の非限定的な例としては、3H、111In、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc、223Ra、223Ra、89Zr、177Lu、及び109Pdが挙げられる。ある実施態様において、111Inは、それが肝臓での125I又は131I-標識されたMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の脱ハロゲン化の問題を回避するので、インビボイメージングのための好ましい同位体である。さらに、111Inは、イメージングのためのより好都合なガンマ放出エネルギーを有する(Perkinsらの文献、Eur. J. Nucl. Med. 70:296-301(1985); Carasquilloらの文献、J. Nucl. Med. 25:281-287(1987))。例えば、1-(P-イソチオシアナトベンジル)-DPTAとともにモノクローナル抗体にカップリングされた111Inは、非腫瘍性組織、特に、肝臓での取込みをほとんど示さず、それゆえ、腫瘍局在化の特異性を増強する(Estebanらの文献、J. Nucl. Med. 28:861-870(1987))。
【０３４０】
好適な非放射性同位体標識の非限定的な例としては、157Gd、55Mn、162Dy、52Tr、及び56Feが挙げられる。
【０３４１】
好適な蛍光標識の非限定的な例としては、152Eu標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリスリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、緑色蛍光タンパク質(GFP)標識、o-フタルアルデヒド標識、及びフルオレスカミン標識が挙げられる。
【０３４２】
化学発光標識の非限定的な例としては、ルミノール標識、イソルミノール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、及びイクオリン標識が挙げられる。
【０３４３】
核磁気共鳴造影剤の非限定的な例としては、Gd、Mn、及び鉄などの重金属核が挙げられる。
【０３４４】
上記の標識を、該MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、及び融合タンパク質にコンジュゲートするための当業者に公知の技法は、例えば、Kennedyらの文献、Clin. CMm. Acta 70:1-31(1976)、及びSchursらの文献、Clin. CMm. Acta 81:1-40(1977)に記載されている。後者において言及されているカップリング技法は、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸塩法、ジマレイミド法、m-マレイミドベンジル-N-ヒドロキシ-スクシンイミドエステル法であり、これらの方法は全て、引用により本明細書中に組み込まれる。
【０３４５】
細胞毒性剤の非限定的な例としては、細胞増殖抑制剤又は細胞殺傷剤、放射性金属イオン、例えば、α-放射体、並びに毒素、例えば、緑膿菌外毒素、アブリン、コレラ毒素、リシンA、及びジフテリア毒素が挙げられる。
【０３４６】
ある実施態様において、該薬剤は、診断剤である。診断剤は、抗原を含有する細胞を特定することによって疾患を診断又は検出する際に有用な薬剤である。有用な診断剤としては、放射性同位体、色素(例えば、ビオチン-ストレプトアビジン複合体を有するもの)、造影剤、蛍光化合物又は蛍光分子、及び磁気共鳴イメージング(MRI)用の増強剤(例えば、常磁性イオン)が挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第6,331,175号は、MRI技法及びMRI増強剤にコンジュゲートされた抗体の調製を記載しており、引用により完全に組み込まれる。診断剤は、放射性同位体、磁気共鳴イメージングで使用するための増強剤、及び蛍光化合物からなる群から選択されることが好ましい。MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片に放射性金属又は常磁性イオンを担持させるために、それを、イオンに結合させるための多数のキレート基が付着している長い尾部を有する試薬と反応させる必要がある場合がある。そのような尾部は、ポリリジン、多糖、又は例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス-チオセミカルバゾン、ポリオキシム、及びこの目的のために有用であることが知られている同様の基などのキレート基に結合することができるペンダント基を有する、他の誘導体化されたもしくは誘導体化可能な鎖などの、ポリマーであることができる。キレートは、標準的な化学反応を用いて抗体にカップリングされる。キレートは、通常、免疫反応性の最小限の損失並びに最小限の凝集及び/又は内部架橋を伴って、分子への結合の形成を可能にする基によって抗体に連結され、キレートを抗体にコンジュゲートするための他のより珍しい方法及び試薬は、その開示が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、1989年4月25日に発行された「抗体コンジュゲート(Antibody Conjugates)」という表題のHawthorneの米国特許第4,824,659号に開示されている。特に有用な金属-キレート組合せとしては、放射性イメージング用の診断的同位体とともに使用される、2-ベンジル-DTPA並びにそのモノメチル及びシクロヘキシル類似体が挙げられる。同じキレートは、マンガン、鉄、及びガドリニウムなどの非放射性金属とともに錯体を形成させると、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片とともに使用される場合、MRIに有用である。NOTA、DOTA、及びTETAなどの大環状キレートは、種々の金属及び放射性金属と合わせて、最も具体的には、それぞれ、ガリウム、イットリウム、及び銅の放射性核種と合わせて有用である。そのような金属-キレート錯体は、環のサイズを対象となる金属に合わせて調整することにより非常に安定にすることができる。RAIT用の223Raなどの、安定に結合する核種のために対象となる、大環状ポリエーテルなどの他の環型キレートは、本明細書に包含される。
【０３４７】
ある実施態様において、該薬剤は、有機薬剤である。そのような有機薬剤は、薬物動態特性が改善された(例えば、インビボ血清半減期が増大した)コンジュゲートを生じさせることできる。該有機部分は、親水性ポリマー基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基であることができる。本明細書で使用される場合、「脂肪酸」という用語は、モノ-カルボン酸及びジ-カルボン酸を包含する。本明細書で使用される場合、「親水性ポリマー基」は、オクタンによりも水に溶ける有機ポリマー、例えば、ポリリジンを指す。本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を修飾するのに好適な親水性ポリマーは、線状又は分岐状であることができ、これには、例えば、ポリアルカングリコール(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、モノメトキシ-ポリエチレングリコール、及びポリプロピレングリコール)、炭水化物(例えば、デキストラン、セルロース、オリゴ糖、及び多糖)、親水性アミノ酸のポリマー(例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、及びポリアスパラギン酸)、ポリアルカンオキシド(例えば、ポリエチレンオキシド及びポリプロピレンオキシド)、並びにポリビニルピロリドンが含まれる。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、又は融合タンパク質を修飾する親水性ポリマーは、個別の分子実体として、約800〜約150,000ダルトンの分子量を有する。例えば、PEG5000及びPEG20,000(ここで、下付き文字は、ダルトンで示したポリマーの平均分子量である)を使用することができる。該親水性ポリマー基は、1〜約6個のアルキル、脂肪酸、又は脂肪酸エステル基で置換することができる。脂肪酸又は脂肪酸エステル基で置換される親水性ポリマーは、好適な方法を利用することによって調製することができる。例えば、アミン基を含むポリマーは、脂肪酸又は脂肪酸エステルのカルボキシレートにカップリングさせることができ、脂肪酸又は脂肪酸エステル上の活性化カルボキシレート(例えば、N,N-カルボニルジイミダゾールで活性化されたもの)は、ポリマー上のヒドロキシル基にカップリングさせることができる。
【０３４８】
本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、又は融合タンパク質を修飾するのに好適な脂肪酸及び脂肪酸エステルは飽和状態であることができるか、又は1以上の不飽和単位を含むことができる。本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、又は融合タンパク質を修飾するのに好適である脂肪酸としては、例えば、n-ドデカン酸、n-テトラデカン酸、n-オクタデカン酸、n-エイコサン酸、n-ドコサン酸、n-トリアコンタン酸、n-テトラコンタン酸、シス-デルタ-9-オクタデカン酸、全シス-デルタ-5,8,11,14-エイコサテトラエン酸、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などが挙げられる。好適な脂肪酸エステルとしては、線状又は分岐状の低級アルキル基を含むジカルボン酸のモノ-エステルが挙げられる。該低級アルキル基は、1〜約12個の、好ましくは、1〜約6個の炭素原子を含むことができる。
【０３４９】
本明細書に提供されるコンジュゲートは、好適な方法を用いて、例えば、1以上の修飾剤との反応によって調製することができる。本明細書で使用される場合、「活性化基」は、適当な条件下で、第二の化学基と反応し、それにより、修飾剤と第二の化学基の間で共有結合を形成することができる、化学的部分又は官能基である。例えば、アミン反応性の活性化基としては、例えば、トシレート、メシレート、ハロ(クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード)、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル(NHS)などのような求電子基が挙げられる。チオールと反応することができる活性化基としては、例えば、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル(acrylolyl)、ピリジルジスルフィド、5-チオール-2-ニトロ安息香酸チオール(TNB-チオール)などが挙げられる。アルデヒド官能基は、アミン又はヒドラジド含有分子にカップリングさせることができ、アジド基は、三価リン基と反応して、ホスホロアミデート又はホスホルイミド結合を形成することができる。分子に活性化基を導入する好適な方法は、当技術分野で公知である(例えば、Hernanson, G. T.の文献、バイオコンジュゲート技法(Bioconjugate Techniques)、Academic Press: San Diego, Calif.(1996)を参照)。活性化基は、有機基(例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル)に直接的に、又はリンカー部分、例えば、二価C1-C12基(ここで、1以上の炭素原子は、酸素、窒素、もしくは硫黄などのヘテロ原子に置換することができる)を介して結合させることができる。好適なリンカー部分としては、例えば、テトラエチレングリコール、(CH2)3、及びNHが挙げられる。リンカー部分を含む修飾剤は、例えば、モノ-Boc-アルキルジアミン(例えば、モノ-Boc-エチレンジアミン又はモノ-Boc-ジアミノヘキサン)を1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)の存在下で脂肪酸と反応させて、遊離アミンと脂肪酸カルボキシレートの間でアミド結合を形成させることにより生成させることができる。Boc保護基を、トリフルオロ酢酸(TFA)による処理によって生成物から除去して、記載されているような別のカルボキシレートにカップリングさせることができる1級アミンを露出させることができるか、又は無水マレイン酸と反応させ、得られる生成物を環化して、脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を生成させることができる(例えば、その教示の全体が引用により本明細書中に組み込まれる、Thompsonらの文献、WO 92/16221号を参照)。
【０３５０】
「修飾剤」は、活性化基を含む好適な有機基(例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、及び脂肪酸エステル)を指すことができる。例えば、有機部分は、アミン反応性の修飾剤、例えば、PEGのN-ヒドロキシスクシンイミドエステルを利用することにより、部位非特異的な形でMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片に結合させることができる。修飾されたMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、該MUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、又は融合タンパク質のジスルフィド結合(例えば、鎖内ジスルフィド結合)を還元することによって調製することもできる。その後、還元されたMUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、又は融合タンパク質をチオール反応性の修飾剤と反応させて、本明細書に提供されるコンジュゲートを生成させることができる。本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の特定の部位に結合している有機部分を含むコンジュゲートは、好適な方法、例えば、逆タンパク質分解(reverse proteolysis)(Fischらの文献、Bioconjugate Chem., 3:147-153(1992); Werlenらの文献、Bioconjugate Chem., 5:411-417(1994); Kumaranらの文献、Protein Sci. 6(10):2233-2241(1997); Itohらの文献、Bioorg. Chem., 24(1): 59-68(1996); Capellasらの文献、Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463(1997))、及びHermanson, G. T.の文献、バイオコンジュゲート技法(Bioconjugate Techniques)、Academic Press: San Diego, Calif.(1996)に記載されている方法を用いて調製することができる。
【０３５１】
(5.3  抗体産生)
(5.3.1  抗体の産生及びスクリーニング)
別の態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を産生する方法である(第5.1節及び第5.2節を参照)。
【０３５２】
本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、抗体の合成のための当技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、化学合成によって又は組換え発現技法によって産生することができる。本明細書に記載される方法は、別途示されない限り、分子生物学、微生物学、遺伝子解析、組換えDNA、有機化学、生化学、PCR、オリゴヌクレオチド合成及び修飾、核酸ハイブリダイゼーション、並びに当業者の範囲内の関連分野における従来の技法を利用する。これらの技法は、例えば、本明細書に引用される参考文献に記載されており、文献中で十分に説明されている。例えば、Maniatis Tらの文献(1982)、分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook Jらの文献(1989)、分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook Jらの文献(2001)、分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel FMらの文献、分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、John Wiley & Sons(1987年版及び年次改訂版);免疫学の最新プロトコル(Current Protocols in Immunology)、John Wiley & Sons(1987版及び年次改訂版)、Gait(編)(1984)、オリゴヌクレオチド合成:実践的アプローチ(Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach)、IRL Press; Eckstein(編)(1991)、オリゴヌクレオチド及び類似体:実践的アプローチ(Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach)、IRL Press; Birren Bら(編)(1999)、ゲノム解析:実験マニュアル(Genome Analysis: A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。
【０３５３】
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、例えば、DNA配列の合成、遺伝子工学による作出を伴う任意の手段によって調製、発現、作出、又は単離された抗体(例えば、組換え抗体)である。ある実施態様において、そのような抗体は、インビボの動物又は哺乳動物(例えば、ヒト)の抗体生殖系列レパートリー中に天然では存在しないDNA配列によってコードされる配列を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、配列番号129、配列番号130、及び/又は配列番号131のグリコシル化形態を使用することを含む方法によって作製される。具体的な実施態様において、配列番号129、配列番号130、及び/又は配列番号131のグリコシル化形態は、1以上のキトビオースでグリコシル化されている。例えば、本明細書に記載される抗体を産生する方法の詳細な説明については、第6.2節、第6.3節、及び第6.4節を参照されたい。
【０３５４】
ある態様において、本明細書に提供されるのは、1以上のグリコシル化部位を含む免疫原性糖ペプチドであり、ここで、(i)該免疫原性糖ペプチドは、10〜60アミノ酸残基、10〜30アミノ酸残基、15〜25アミノ酸残基、15〜20アミノ酸残基、又は15〜18アミノ酸残基の長さであり、かつ(ii)該1以上のグリコシル化部位のうちの少なくとも1つは、炭水化物と結合している。
【０３５５】
いくつかの実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、1つ、2つ、又は3つのグリコシル化部位を含む。具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、1つのグリコシル化部位を含む。別の具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、2つのグリコシル化部位を含む。
【０３５６】
具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、炭水化物と結合している1つのグリコシル化部位を含む。具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、炭水化物と各々結合している2つのグリコシル化部位を含む。
【０３５７】
該免疫原性糖ペプチドの1以上のグリコシル化部位に結合した炭水化物は、N-結合型炭水化物、O-結合型炭水化物、又はC-結合型炭水化物であることができる。N-結合型炭水化物は、アスパラギン残基に結合しており、かつ天然で見られる最も一般的な形態である。N-結合型炭水化物の大多数は、GlcNAc-β-Asnの形態でペプチドに結合している。O-結合型炭水化物は、アミノ酸ヒドロキシル側鎖(通常、セリン又はトレオニンに由来する)に結合している。O-結合型炭水化物の大多数は、GlcNAc-β-Ser/Thr又はGlcNAc-α-Ser/Thrの形態でペプチドに結合している。C-結合型炭水化物は、トリプトファン残基に結合したマンノースを指し、かつ天然で見られる最も一般的でない形態である。一実施態様において、該免疫原性糖ペプチド中の炭水化物は、N-又はO-結合型炭水化物である。具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチド中の炭水化物は、N-結合型炭水化物である。
【０３５８】
該免疫原性糖ペプチドの1以上のグリコシル化部位に結合した炭水化物は、単糖、二糖、オリゴ糖(例えば、三糖、四糖、もしくは五糖)、又は多糖であることができる。ある実施態様において、該炭水化物は、単糖、二糖、三糖、四糖、又は五糖である。具体的な実施態様において、該炭水化物は、二糖である。特定の実施態様において、二糖は、キトビオースである。別の具体的な実施態様において、該炭水化物は、Man3GlcNAc2である。具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドのN末端は、アセチル化されている。具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドのC末端は、N-メチルカルボキサミド誘導体の形態のものである。
【０３５９】
ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、免疫原性キャリアタンパク質にコンジュゲートされる。ほとんどの場合、小さい抗原(例えば、短いペプチド又は小さいハプテン)は、抗体の産生を誘発するのに十分複雑ではない。該免疫原性キャリアタンパク質は、その大きいサイズ及び複雑な構造が理由で、コンジュゲートされた小さい抗原に対して免疫原性を付与し、小さい抗原及び免疫原性キャリアタンパク質上のエピトープに対して産生される抗体を生じさせることができる。それゆえ、小さい抗原は、常に、抗体の産生の成功に向けて免疫応答を強化するために免疫原性キャリアタンパク質と化学的にコンジュゲートされる。一般的に使用される免疫原性キャリアタンパク質としては、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ロコガイヘモシアニン(CCH)、ウシ血清アルブミン(BSA)、及びオボアルブミン(OVA)が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、KLHにコンジュゲートされる。KLHは、節足動物及び軟体動物に見出されるヘモシアニンと呼ばれる非ヘムタンパク質の群に属する銅含有ポリペプチドである。KLHは、キーホールリンペット(メガトゥーラ・クレヌラータ(Megathura crenulata))から単離される。哺乳動物からのその進化的な距離、大きい分子量、複雑な構造、及びコンジュゲーションの標的としての一級アミンを提供する数百個のリジン基を含有する巨大な表面のために、KLHは、哺乳動物における極めて免疫原性が高くかつ効果的なキャリアタンパク質である。
【０３６０】
ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、10〜60アミノ酸残基の長さである。いくつかの実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、10〜30アミノ酸残基の長さである。いくつかの実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、15〜25アミノ酸残基の長さである。いくつかの実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、15〜20アミノ酸残基の長さである。具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、15〜18アミノ酸残基の長さである。免疫原性糖ペプチドが15〜18アミノ酸残基の長さであるそのような具体的な実施態様の特定の態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと結合しているグリコシル化部位を含む。免疫原性糖ペプチドが15〜18アミノ酸残基の長さであるそのような具体的な実施態様の別の特定の態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと各々結合している2つのグリコシル化部位を含む。具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、55アミノ酸残基の長さである。免疫原性糖ペプチドが55アミノ酸残基の長さであるそのような具体的な実施態様の特定の態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと結合しているグリコシル化部位を含む。具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、18アミノ酸残基の長さである。免疫原性糖ペプチドが18アミノ酸残基の長さであるそのような具体的な実施態様の特定の態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと各々結合している2つのグリコシル化部位を含む。別の具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、15アミノ酸残基の長さである。免疫原性糖ペプチドが15アミノ酸残基の長さである、そのような具体的な実施態様の特定の態様において、該免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと結合しているグリコシル化部位を含む。
【０３６１】
ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、配列番号150のアミノ酸配列の少なくとも10アミノ酸部分を含み、かつ該免疫原性糖ペプチドの該1以上のグリコシル化部位のうちの少なくとも1つは、該アミノ配列の部分にある。ある他の実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、配列番号150のアミノ酸配列の少なくとも15、20、25、又は30アミノ酸部分を含み、かつ該免疫原性糖ペプチドの該1以上のグリコシル化部位のうちの少なくとも1つは、該アミノ配列の部分にある。具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、15〜18アミノ酸残基の長さである。具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、55アミノ酸残基の長さである。具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、配列番号129のアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、55アミノ酸残基の長さであり、かつ配列番号129のアミノ酸配列を含む。特定の実施態様において、配列番号129のアミノ酸配列を含む免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと結合している30番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む。別の特定の実施態様において、配列番号129のアミノ酸配列を含む免疫原性糖ペプチドは、Man3GlcNAc2部分と結合している配列番号129の30番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む。具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、18アミノ酸残基の長さである。具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、配列番号130のアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、18アミノ酸残基の長さであり、かつ配列番号130のアミノ酸配列を含む。特定の実施態様において、配列番号130のアミノ酸配列を含む免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと各々結合している4番目の残基(Asn)及び10番目の残基(Asn)における2つのグリコシル化部位を含む。具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、15アミノ酸残基の長さである。具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、配列番号131のアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、15アミノ酸残基の長さであり、かつ配列番号131のアミノ酸配列を含む。特定の実施態様において、配列番号131のアミノ酸配列を含む免疫原性糖ペプチドは、キトビオースと結合している7番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む。
【０３６２】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、糖タンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を作製する方法であって、対象を、上記のような1以上のグリコシル化部位を含む免疫原性糖ペプチドで免疫することを含む、方法である。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、該糖タンパク質アミノ酸配列の少なくとも10アミノ酸部分を含み、かつ該免疫原性糖ペプチドの該1以上のグリコシル化部位のうちの少なくとも1つは、該アミノ酸配列の部分にある。他のある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドは、糖タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも15、20、25、又は30アミノ酸部分を含み、かつ該免疫原性糖ペプチドの該1以上のグリコシル化部位のうちの少なくとも1つは、該アミノ酸配列の部分にある。特定の実施態様において、該糖タンパク質は、配列番号150のアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、該抗体又はその抗原結合断片は、該糖タンパク質の非グリコシル化形態に対する特異的結合を欠いている。本明細書に記載される方法に従って免疫される対象は、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ニワトリ、モルモット、ラット、ウサギ、又はマウスであることができるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される方法に従って免疫される対象は、ラット、ウサギ、又はマウスである。具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って免疫される対象は、マウスである。対象の免疫付与は、当技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、実施例2及び実施例3に記載されているように該免疫原性糖ペプチド及びアジュバントを該対象に投与することによって実施することができる(第6.2節及び第6.3節を参照)。
【０３６３】
別の態様において、また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される免疫原性糖ペプチドを調製する方法である。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドを調製する方法は、本明細書に記載される免疫原性糖ペプチドの1以上のグリコシル化部位を炭水化物(例えば、キトビオース)と結合させることを含む。ある実施態様において、該免疫原性糖ペプチドを調製する方法は、ペプチド部分を合成することも含む。該免疫原性糖ペプチドのペプチド部分は、当技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、実施例2に記載されているようなFmoc固相ペプチド合成によって合成することができる(第6.2節を参照)。ある実施態様において、該1以上のグリコシル化部位のアミノ酸(例えば、アスパラギン)は、該免疫原性糖ペプチドの合成中、保護基によって保護される。具体的な実施態様において、該ペプチド部分のただ1つのアスパラギン残基を炭水化物(例えば、キトビオース)と結合させ、該アスパラギン上の保護基は、アリル基である。別の具体的な実施態様において、該ペプチド部分の複数の(例えば、2つの)アスパラギン残基を炭水化物(例えば、キトビオース)と各々結合させ、該アスパラギン残基上の保護基は、O-2-フェニルイソプロピルエステル(O-2-Phi Pr、OPp)である。結合させる工程は、当技術分野で公知の任意の方法によって実施することができる。好ましい実施態様において、該炭水化物部分を、実施例2に記載されているような1フラスコアスパラギン酸化(aspartylation)/脱保護手順を用いて、ペプチド部分と結合させる(第6.2.2.1節を参照)。
【０３６４】
本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を産生する方法は、当業者に公知であり、例えば、化学合成によるもの、生物源からの精製によるもの、又は例えば、哺乳動物細胞もしくはトランスジェニック調製物からのものを含む、組換え発現技法によるものがある。本明細書に記載される方法は、別途示されない限り、分子生物学、微生物学、遺伝子解析、組換えDNA、有機化学、生化学、PCR、オリゴヌクレオチド合成及び修飾、核酸ハイブリダイゼーション、並びに当業者の範囲内の関連分野における従来の技法を利用する。これらの技法は、例えば、本明細書に引用される参考文献に記載されており、文献中で十分に説明されている。例えば、Maniatisらの文献(1982)、分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrookらの文献(1989)、分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrookらの文献(2001)、分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubelらの文献、分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、John Wiley & Sons(1987年版及び年次改訂版);免疫学の最新プロトコル(Current Protocols in Immunology)、John Wiley & Sons(1987年版及び年次改訂版)、Gait(編)(1984)、オリゴヌクレオチド合成:実践的アプローチ(Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach)、IRL Press; Eckstein(編)(1991)、オリゴヌクレオチド及び類似体:実践的アプローチ(Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach)、IRL Press; Birrenら(編)(1999)、ゲノム解析:実験マニュアル(Genome Analysis: A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。
【０３６５】
本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の産生のための種々の方法が当技術分野で存在する(第5.1節及び第5.2節を参照)。例えば、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、組換えDNA法、例えば、米国特許第4,816,567号に記載されている組換えDNA法によって作製することができる。本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードする1以上のDNAは、従来の手順を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖、又はヒト、ヒト化、もしくは他の源由来のそのような鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)、容易に単離し、シークエンシングすることができる。ひとたび単離すれば、該DNAを発現ベクター中に入れることができ、その後、これを、形質転換されなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない、NS0細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、酵母細胞、藻類細胞、卵、又は骨髄腫細胞などの宿主細胞に入れて形質転換し、組換え宿主細胞内でのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の合成を得る。該DNAは、例えば、所望の種のヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を相同なヒト配列の代わりに使用することによるか(米国特許第4,816,567号; Morrisonらの文献、上記)、又は免疫グロブリンコード配列を非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てもしくは一部と共有結合させることによって修飾することもできる。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の定常ドメインの代わりに使用することができる。ある実施態様において、該DNAは、第5.3.2節に記載されている通りである。
【０３６６】
本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを用いて、そのような抗体をその乳中に産生する、トランスジェニック動物又は哺乳動物、例えば、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジなどを提供することにより調製することもできる。そのような動物は、公知の方法を用いて提供することができる。例えば、限定されないが、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、米国特許第5,827,690号;第5,849,992号;第4,873,316号;第5,849,992号;第5,994,616号、第5,565,362号;第5,304,489号などを参照されたい。
【０３６７】
ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片はさらに、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを用いて、そのような抗体、特定の部分、又は変異体を、植物部分で又はそれから培養した細胞で産生する、トランスジェニック植物及び培養植物細胞(例えば、限定されないが、タバコ及びトウモロコシ)を提供することにより調製することができる。非限定的な例として、組換えタンパク質を発現するトランスジェニックタバコの葉が、例えば、誘導性プロモーターを用いて大量の組換えタンパク質を提供するためにうまく使用されている。例えば、Cramerらの文献、Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118(1999)及びその中に引用されている参考文献を参照されたい。また、トランスジェニックトウモロコシも、他の組換え系で産生されたもの又は天然源から精製されたものと同等の生物活性を有する哺乳動物タンパク質を商業的生産レベルで発現させるために使用されている。例えば、Hoodらの文献、Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147(1999)及びその中に引用されている参考文献を参照されたい。抗体は、タバコの種及びジャガイモの塊茎を含め、scFvなどの抗体断片を含むトランスジェニック植物の種からも大量に産生されている。例えば、Conradらの文献、Plant Mol. Biol. 38:101-109(1998)及びその中に引用されている参考文献を参照されたい。このように、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、公知の方法に従って、トランスジェニック植物を用いて産生することもできる。例えば、Fischerらの文献、Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108(1999年10月)、Maらの文献、Trends Biotechnol. 13:522-7(1995); Maらの文献、Plant Physiol. 109:341-6(1995); Whitelamらの文献、Biochem Soc. Trans. 22:940-944(1994);及びこれらの中に引用されている参考文献も参照されたい。上記の参考文献の各々は、引用により完全に本明細書中に組み込まれる。
【０３６８】
ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを用いて、そのようなMUC16グリコシル化抗体又は抗原結合断片を産生する細菌を提供することにより調製することができる。非限定的な例として、組換えタンパク質を発現する大腸菌(E. coli)が、大量の組換えタンパク質を提供するためにうまく使用されている。例えば、Vermaらの文献、1998, 216(1-2): 165-181及びその中に引用されている参考文献を参照されたい。
【０３６９】
多重特異性(例えば、二重特異性抗体)を作製する方法は記載されており、例えば、米国特許第7,951,917号;第7,183,076号;第8,227,577号;第5,837,242号;第5,989,830号;第5,869,620号;第6,132,992号、及び第8,586,713号を参照されたい。
【０３７０】
ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)は、二重特異性抗体の作製において利用される。二重特異性抗体は、2つのハイブリドーマを融合させて、2つの結合部位を有するハイブリッド免疫グロブリン分子を作出することにより作製することができる。二重特異性抗体は、腫瘍をT細胞に拘束するだけでなく;それらは、T細胞上のCD3を架橋し、活性化カスケードを開始させる。このようにして、T細胞受容体ベースの細胞傷害性を所望の腫瘍標的に向け直し、MHC拘束性を回避する。ポリクローナルに活性化されたT細胞(ATC)に抗CD3-抗MUC16二重特異性結合分子を装備することにより、MUC16グリコシル化抗体の標的化特異性とパーフォリン/グランザイムによって媒介されるT細胞の非MHC拘束性細胞傷害性とが組み合わされる。二重特異性結合分子BsAb又はBiTEは、患者への注入前に、エクスビボで増殖し、活性化されたT細胞を装備することができる。この戦略によって、全てのATCが特異的CTLに変換される(Thakur及びLumの文献、2010, Curr Opin Mol Ther 12, 340-349; Grabertらの文献、2006, Clin Cancer Res 12, 569-576)。
【０３７１】
二重特異性結合分子は、MUC16グリコシル化抗体から構成されていてもよく、ここで、該MUC16グリコシル化抗体は免疫グロブリンであり、ここで、該免疫グロブリンの各々の軽鎖は融合タンパク質であり、ここで、該融合タンパク質は、ペプチドリンカーによってCD3を標的とするscFvに連結された免疫グロブリン軽鎖である。CH2ドメインにおけるN297A突然変異は非グリコシル化をもたらし、FcR結合もClq結合も生じさせない。
【０３７２】
MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を利用して、CARを作製することができる。CARは、最も一般的には、単鎖可変断片長抗体(scFv)、例えば、所与の腫瘍関連抗原及び/又はその変異体、膜貫通ドメイン(例えば、T細胞表面分子、例えば、共刺激分子、例えば、CD8、CD28、OX-40、及び4-1BBに由来する膜貫通ドメイン)、TCR複合体のシグナル伝達部分、例えば、TCRゼータ(ζ)鎖の細胞内ドメイン及び/又はさらなる部分、例えば、その細胞質シグナル伝達ドメインを標的とするモノクローナル抗体に由来するものから構成される。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるモノクローナルMUC16グリコシル化抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を、モノクローナルMUC16グリコシル化抗体を生成するハイブリドーマ細胞株から単離する。例えば、RNAを該ハイブリドーマ細胞株から抽出し、cDNAを該RNAから逆転写PCRによって生成させる。VH及びVL鎖可変領域を、そのような可変領域に特異的なプライマーを利用する標準的なPCRによってクローニングする。得られるVH及びVL断片を、例えば、TopoTA PCR 2.1クローニングベクター(Invitrogen)などのシャトルベクターにサブクローニングし、シークエンシングする。その後、VH及びVL断片を(Gly4Ser)3スペーサードメインにライゲーションして、MUC16グリコシル化抗体scFvを生じさせ、重複PCR(例えば、Maher Jらの文献、Nat Biotechnol 2002;20(1):70-5.;及びGong MCらの文献、Neoplasia 1999;1(2):123-7を参照)によってヒトCD8リーダーペプチド(CD8L)に融合させる(CD8L-MUC16グリコシル化抗体scFv)。CD8L-MUC16グリコシル化抗体scFvのコード領域を、ヒトCD8ヒンジ及び膜貫通ドメインに、或いはCD28膜貫通及び細胞質シグナル伝達ドメインに融合させ、T細胞受容体CD3-ζシグナル伝達ドメインに融合させる(例えば、Maher Jらの文献、Nat Biotechnol 2002;20(1):70-5.; Brentjens RJらの文献、Nat Med 2003;9(3):279-86;及びBrentjens RJらの文献、Clin Cancer Res 2007;13(18 Pt 1):5426-35を参照)。
【０３７３】
また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるCARを発現するT細胞である。CARを発現するT細胞の作製方法は、当技術分野で公知である。例えば、CARコンストラクトは、改変されたMMLVレトロウイルスベクターSFG(例えば、Riviere Iらの文献、Proc Natl Acad Sci USA 1995;92(15):6733-7を参照)又は他の好適なレトロウイルスベクターにサブクローニングすることができる。いくつかの実施態様において、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、例えば、HIVベースのベクターである。形質導入したgpg29線維芽細胞に由来するVSV-G偽型レトロウイルス上清を用いて、安定なPG13テナガザル白血病ウイルス(GaLV)エンベロープ偽型レトロウイルス産生細胞株を構築することができる(例えば、Gong MCらの文献、Neoplasia 1999;1(2):123-7を参照)。単離された健常ドナー末梢血単核細胞(PBMC)を2μg/m1のフィトヘマグルチニン(PHA)(Sigma. St. Louis, MO)で活性化し、レトロネクチンコーティングされた非組織培養プレート(Quintas-Cardama Aらの文献、Hum Gene Ther 2007;18(12):1253-60)上でレトロウイルスにより形質導入して、CARを組換え発現するT細胞を作製することができる。該T細胞へのCARの遺伝子移入は、FACSにより評価することができる。
【０３７４】
単一ドメイン抗体、例えば、軽鎖を欠く抗体は、当技術分野で周知の方法によって産生することができる。Riechmann L及びMuyldermans Sの文献(1999) J Immunol 231: 25-38; Nuttall SDらの文献(2000) Curr Pharm Biotechnol 1(3): 253-263; Muyldermans Sの文献(2001) J Biotechnol 74(4): 277-302;米国特許第6,005,079号;並びに国際公開WO 94/04678号、WO 94/25591号、及びWO 01/44301号を参照されたい。
【０３７５】
特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体と同じ又は重複するエピトープに結合する本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、ヒトMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、本明細書に記載される抗体のいずれか1つがMUC16に結合するのを(例えば、用量依存的な形で)競合的に阻止する本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、ヒトMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて産生することができる。例えば、機能的な内在性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用することができる。特に、ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体をランダムに又は相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入することができる。或いは、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、及び多様性領域をマウス胚性幹細胞に導入することができる。マウス重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子を、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入によって個別に又は同時に機能しないようにすることができる。特に、JH領域のホモ接合性欠失は内在性抗体の産生を妨げる。修飾された胚性幹細胞を増殖させ、胚盤胞に顕微注入して、キメラマウスを生じさせる。その後、キメラマウスを交配させて、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を生じさせる。トランスジェニックマウスを、選択された抗原、例えば、抗原の全て又は一部を用いて、通常の方法で免疫する。該抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて、免疫されたトランスジェニックマウスから得ることができる。このトランスジェニックマウスが有するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、B細胞分化の間に再編成し、その後、クラススイッチング及び体細胞突然変異を経る。したがって、そのような技法を用いて、治療的に有用なIgG、IgA、IgM、及びIgE抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概説については、例えば、Lonberg N及びHuszar Dの文献(1995) Int Rev Immunol 13:65-93を参照されたい。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を産生するこの技術並びにそのような抗体を産生するためのプロトコルの詳細な議論については、例えば、国際公開WO 98/24893号、WO 96/34096号、及びWO 96/33735号;並びに米国特許第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号、及び第5,939,598号を参照されたい。ヒト抗体を産生することができるマウスの例としては、Xenomouse(商標)(Abgenix社;米国特許第6,075,181号及び第6,150,184号)、HuAb-Mouse(商標)(Mederex社/Gen Pharm;米国特許第5,545,806号及び第5,569,825号)、Trans Chromo Mouse(商標)(Kirin)、並びにKM Mouse(商標)(Medarex/Kirin)が挙げられる。
【０３７６】
MUC16に免疫特異的に結合するヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いて、上記のファージディスプレイ法を含む、当技術分野で公知の種々の方法によって作製することができる。米国特許第4,444,887号、第4,716,111号、及び第5,885,793号;並びに国際公開WO 98/46645号、WO 98/50433号、WO 98/24893号、WO 98/16654号、WO 96/34096号、WO 96/33735号、及びWO 91/10741号も参照されたい。
【０３７７】
いくつかの実施態様において、ヒト抗体は、マウス-ヒトハイブリドーマを用いて産生することができる。例えば、エプスタイン-バーウイルス(EBV)で形質転換されたヒト末梢血リンパ球をマウス骨髄腫細胞と融合させて、ヒトモノクローナル抗体を分泌するマウス-ヒトハイブリドーマを産生することができ、かつこれらのマウス-ヒトハイブリドーマをスクリーニングして、標的抗原に免疫特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を分泌するものを決定することができる。そのような方法は公知であり、当技術分野で記載されており、例えば、Shinmoto Hらの文献(2004) Cytotechnology 46: 19-23; Naganawa Yらの文献(2005) Human Antibodies 14: 27-31を参照されたい。
【０３７８】
具体的な実施態様において、MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を産生する方法は、下記の第6.2節に記載されている通りである。
【０３７９】
具体的な実施態様において、MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片をスクリーニング及び選択する方法は、下記の第6.2節に記載されている通りである。
【０３８０】
ひとたび本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片が産生されれば、それを、免疫グロブリン分子の精製のための当技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、特に、プロテインA後の特異的抗原に対する親和性によるもの、及びサイジングカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、示差溶解度によるか、又はタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技法によって精製することができる。さらに、本明細書に記載される抗体を、本明細書に記載されるか又はさもなければ当技術分野で公知の異種ポリペプチド配列と融合させて、精製を容易にすることができる。
【０３８１】
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、単離又は精製されている。通常、単離された抗体は、該単離された抗体と異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体である。例えば、特定の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の調製物は、細胞材料及び/又は化学的前駆物質を実質的に含まない。「細胞材料を実質的に含まない」という言葉には、抗体が、それが単離される又は組換え産生される細胞の細胞成分から分離されているMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の調製物が含まれる。したがって、細胞材料を実質的に含まないMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片には、(乾燥重量で)約30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％、又は0.1％未満の異種タンパク質(本明細書において「夾雑タンパク質」とも呼ばれる)及び/或いはMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の変異体、例えば、MUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片の異なる翻訳後修飾形態又はMUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片の他の異なるバージョン(例えば、抗体断片)を有する抗体の調製物が含まれる。抗体が組換え産生される場合、それは、通常、培養培地も実質的に含まない、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の容量の約20％、10％、2％、1％、0.5％、又は0.1％未満に相当する。抗体が化学合成によって産生される場合、それは、通常、化学的前駆物質又は他の化学物質を実質的に含まない、すなわち、それは、タンパク質の合成に関与する化学的前駆物質又は他の化学物質から分離されている。したがって、抗体のそのような調製物は、(乾燥重量で)約30％、20％、10％、又は5％未満の化学的前駆物質又は対象となる抗体以外の化合物を有する。具体的な実施態様において、本明細書に記載される抗体は、単離又は精製されている。
【０３８２】
(5.3.2  ポリヌクレオチド)
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである(第5.1節及び第5.2節を参照)。また本明細書に提供されるのは、そのようなポリヌクレオチドを含むベクターである(第5.3.3節を参照)。また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の抗原をコードするポリヌクレオチドである(第5.1節及び第5.2節を参照)。また本明細書に提供されるのは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件又はより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
【０３８３】
「精製された」という言葉は、約15％、10％、5％、2％、1％、0.5％、又は0.1％未満(特に、約10％未満)の他の材料、例えば、細胞材料、培養培地、他の核酸分子、化学的前駆物質、及び/又は他の化学物質を有するポリヌクレオチド又は核酸分子の調製物を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)をコードする核酸分子は、単離又は精製されている。
【０３８４】
本明細書に提供される核酸分子は、RNA、例えば、mRNA、hnRNA、tRNAの形態、もしくは任意の他の形態、又は限定されないが、クローニングによって得られるもしくは合成によって産生されるcDNA及びゲノムDNAを含むDNAの形態のもの、或いはこれらの任意の組合せであることができる。DNAは、三本鎖、二本鎖、もしくは一本鎖、又はその任意の組合せであることができる。DNA又はRNAのうちの少なくとも1つの鎖の任意の部分は、センス鎖としても知られるコード鎖であることができ、又はそれは、アンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であることができる。
【０３８５】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。
【０３８６】
特定の態様において、また本明細書に提供されるのは、MUC16に免疫特異的に結合し、かつ本明細書に記載されるアミノ酸配列を含む、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)、並びにそのようなMUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片とMUC16に対する結合を競合するか、又はそのような抗体のエピトープと同じエピトープに結合する抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。
【０３８７】
本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)をコードするヌクレオチド配列が公知である場合、該MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドは、化学合成されたオリゴヌクレオチド(例えば、Kutmeierらの文献、BioTechniques 17:242(1994)に記載されているもの)から構築することができ、これは、簡潔に述べると、抗体をコードする配列の部分を含む重複するオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリング及びライゲーション、並びにその後、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドのPCRによる増幅を伴う。
【０３８８】
或いは、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)をコードするポリヌクレオチドは、好適な源由来の核酸から作製することができる。特定のMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を含むクローンは利用不可能であるが、該MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の配列が公知である場合、該MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を化学合成するか、或いは好適な源(例えば、抗体cDNAライブラリー、又は抗体を発現する任意の組織もしくは細胞、例えば、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を発現させるべく選択されたハイブリドーマ細胞から作製されたcDNAライブラリー、又は該組織もしくは細胞から単離された核酸、好ましくは、ポリA+ RNA)から、該配列の3'及び5'末端にハイブリダイズする合成プライマーを用いるPCR増幅によるか、又は例えば、該抗体をコードするcDNAライブラリーからcDNAクローンを同定するための、特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いるクローニングによって得ることができる。その後、PCRによって生成された増幅核酸を、当技術分野で周知の任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる(例えば、第5.3.3節を参照)。
【０３８９】
そのような実施態様において、そのようなMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードするポリペプチドを、ヌクレオチド配列の操作のための当技術分野で周知の方法、例えば、組換えDNA技法、部位特異的突然変異生成、PCRなど(例えば、どちらも引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Sambrookらの文献(1990)、分子クローニング、実験マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.及びAusubelら編(1998)、分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、John Wiley & Sons, N.Y.に記載されている技法を参照)を用いて操作して、異なるアミノ酸配列を有するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を生成させ、例えば、アミノ酸の置換、欠失、及び/又は挿入を作り出すことができる。例えば、そのような操作を行って、コードされたアミノ酸を非グリコシル化するか、又はC1q、Fc受容体に結合し、もしくは補体系を活性化させる抗体の能力を破壊することができる。
【０３９０】
本明細書に提供される単離された核酸分子は、任意に1以上のイントロンを有する、オープンリーディングフレーム(ORF)、例えば、限定されないが、少なくとも1つの重鎖又は軽鎖のCDR1、CDR2、及び/又はCDR3のような少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)の少なくとも1つの特定の部分を含む核酸分子; MUC16グリコシル化抗体又は可変領域のコード配列を含む核酸分子;並びに上記のヌクレオチド配列とは実質的に異なるが、遺伝暗号の縮重のために、本明細書に記載される少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を依然としてコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むことができる。
【０３９１】
また本明細書に提供されるのは、選択的なハイブリダイゼーション条件の下で、本明細書に開示されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする単離された核酸である。したがって、この実施態様のポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオチドを含む核酸を単離し、検出し、及び/又は定量するために使用することができる。例えば、本明細書に提供されるポリヌクレオチドを用いて、寄託されたライブラリー中の部分的又は全長クローンを同定し、単離し、又は増幅することができる。いくつかの実施態様において、該ポリヌクレオチドは、ヒトもしくは哺乳動物核酸ライブラリーから単離されたゲノムもしくはcDNA配列、又はさもなければ、該ライブラリー由来のcDNAに相補的なゲノムもしくはcDNA配列である。
【０３９２】
該核酸は、本明細書に提供されるポリヌクレオチドに加えて、他の配列を好都合に含むことができる。例えば、1以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含むマルチクローニング部位を該核酸に挿入して、該ポリヌクレオチドの単離を助けることができる。さらに、翻訳可能な配列を挿入して、本明細書に提供される翻訳されたポリヌクレオチドの単離を助けることができる。例えば、ヘキサ-ヒスチジンマーカー配列は、本明細書に提供されるポリペプチドを精製するための好都合な手段を提供する。本明細書に提供される核酸−コード配列を除く−は、任意に、本明細書に提供されるポリヌクレオチドのクローニング及び/又は発現用のベクター、アダプター、又はリンカーである。
【０３９３】
さらなる配列を、そのようなクローニング及び/又は発現配列に付加して、クローニング及び/又は発現におけるその機能を最適化し、該ポリヌクレオチドの単離を助け、又は該ポリヌクレオチドの細胞への導入を改善することもできる。クローニングベクター、発現ベクター、アダプター、及びリンカーの使用は、当技術分野で周知である(例えば、Ausubelの文献、上記;又はSambrookの文献、上記を参照)。
【０３９４】
具体的な実施態様において、ルーチンの組換えDNA技法を用いて、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片のCDRのうちの1つ又は複数を既知のフレームワーク領域内に挿入することができる。フレームワーク領域は、天然のフレームワーク領域又はコンセンサスフレームワーク領域、好ましくは、ヒトフレームワーク領域であることができる(例えば、ヒトフレームワーク領域のリストについては、Chothiaらの文献、J. Mol. Biol. 278: 457-479(1998)を参照)。フレームワーク領域とCDRの組合せによって作製されるポリヌクレオチドは、MUC16に免疫特異的に結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードすることが好ましい。1以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で行うことができ、該アミノ酸置換は、該抗体のその抗原に対する結合を改善することが好ましい。さらに、そのような方法を用いて、鎖内ジスルフィド結合に関与する1以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換又は欠失を行い、1以上の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子を作製することができる。該ポリヌクレオチドに対する他の改変は本明細書に提供されており、かつ当業者の能力の範囲内である。
【０３９５】
ある実施態様において、単離又は精製された核酸分子又はその断片は、別の核酸分子との連結させたとき、融合タンパク質をコードすることができる。融合タンパク質の作製は、当業者の能力の範囲内であり、制限酵素又は組換えクローニング技法の使用を伴うことができる(例えば、Gateway(商標)(Invitrogen)を参照)。米国特許第5,314,995号も参照されたい。
【０３９６】
ある実施態様において、本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、第5.3.3節に記載されるベクター(例えば、発現ベクター)の形態である。
【０３９７】
ある態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16に免疫特異的に結合する本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片又はその抗原結合断片(例えば、可変軽鎖領域及び/もしくは可変重鎖領域)をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、並びにベクター、例えば、そのようなポリヌクレオチドを含む、宿主細胞(例えば、大腸菌及び哺乳動物細胞)におけるその効率的な発現のためのベクターである。いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチドは、単離又は精製されている。
【０３９８】
本明細書で使用される場合、「単離された」ポリヌクレオチド又は核酸分子とは、該核酸分子の天然源に(例えば、マウス又はヒトに)存在する他の核酸分子から分離されているものである。さらに、「単離された」核酸分子、例えば、cDNA分子は、組換え技法によって産生される場合は、他の細胞材料、もしくは培養培地を実質的に含まないものであることができ、又は化学合成される場合は、化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まないものであることができる。例えば、「実質的に含まない」という言葉は、約15％、10％、5％、2％、1％、0.5％、又は0.1％未満の他の材料、例えば、細胞材料、培養培地、他の核酸分子、化学的前駆物質、及び/又は他の化学物質を有するポリヌクレオチド又は核酸分子の調製物を含む。
【０３９９】
特定の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるアミノ酸配列を含む、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片、及びそのような抗体とMUC16に対する結合を(例えば、用量依存的な形で)競合するか、又はそのような抗体のエピトープと同じもしくは重複するエピトープに結合する抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。
【０４００】
ある態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の軽鎖又は重鎖をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドである。該ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるVH CDR(例えば、表1、表3、及び表5を参照)を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。該ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるVL CDR(例えば、表2、表4、及び表6を参照)を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。
【０４０１】
特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、例えば、表1、表3、又は表5に記載されているようなVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3を含有する、3つのVH CDRを含むMUC16グリコシル化抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、10C6、7B12、19C11、16C5、及び18C6コンセンサスVH CDRのVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3(すなわち、それぞれ、配列番号103、配列番号104、及び配列番号105、又はそれぞれ、配列番号109、配列番号110、及び配列番号111、又は配列番号115、配列番号116、及び配列番号117)をコードする。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、10C6のVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3(すなわち、それぞれ、配列番号3、配列番号4、及び配列番号5、又はそれぞれ、配列番号9、配列番号10、及び配列番号11、又はそれぞれ、配列番号15、配列番号16、及び配列番号17)をコードする。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、7B12のVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3(すなわち、それぞれ、配列番号23、配列番号24、及び配列番号25、又はそれぞれ、配列番号29、配列番号30、及び配列番号31、又はそれぞれ、配列番号35、配列番号36、及び配列番号37)をコードする。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、19C11のVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3(すなわち、それぞれ、配列番号43、配列番号44、及び配列番号45、又はそれぞれ、配列番号49、配列番号50、及び配列番号51、又はそれぞれ、配列番号55、配列番号56、及び配列番号57)をコードする。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、16C5のVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3(すなわち、それぞれ、配列番号63、配列番号64、及び配列番号65、又はそれぞれ、配列番号69、配列番号70、及び配列番号71、又はそれぞれ、配列番号75、配列番号76、及び配列番号77)をコードする。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、18C6のVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3(すなわち、それぞれ、配列番号83、配列番号84、及び配列番号85、又はそれぞれ、配列番号89、配列番号90、及び配列番号91、又はそれぞれ、配列番号95、配列番号96、及び配列番号97)をコードする。
【０４０２】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)例えば、表1、表3、又は表5に記載されているようなVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3を含有する、3つのVH CDR、並びに(b)例えば、表2、表4、又は表6に記載されているようなVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含有する3つのVL鎖CDRを含むMUC16グリコシル化抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、(a)10C6、7B12、19C11、16C5、及び18C6コンセンサスVH CDRのVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3(すなわち、それぞれ、配列番号103、配列番号104、及び配列番号105、又はそれぞれ、配列番号109、配列番号110、及び配列番号111、又は配列番号115、配列番号116、及び配列番号117)、並びに(b)10C6、7B12、19C11、16C5、及び18C6コンセンサスVL CDRのVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3(すなわち、それぞれ、配列番号106、配列番号107、及び配列番号108、又はそれぞれ、配列番号112、配列番号113、及び配列番号114、又は配列番号118、配列番号119、及び配列番号120)をコードする。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、(a)10C6のVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3(すなわち、それぞれ、配列番号3、配列番号4、及び配列番号5、又はそれぞれ、配列番号9、配列番号10、及び配列番号11、又はそれぞれ、配列番号15、配列番号16、及び配列番号17)、並びに(b)10C6のVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3(すなわち、それぞれ、配列番号6、配列番号7、及び配列番号8、又はそれぞれ、配列番号12、配列番号13、及び配列番号14、又はそれぞれ、配列番号18、配列番号19、及び配列番号20)をコードする。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、(a)7B12のVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3(すなわち、それぞれ、配列番号23、配列番号24、及び配列番号25、又はそれぞれ、配列番号29、配列番号30、及び配列番号31、又はそれぞれ、配列番号35、配列番号36、及び配列番号37)、並びに(b)7B12のVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3(すなわち、それぞれ、配列番号26、配列番号27、及び配列番号28、又はそれぞれ、配列番号32、配列番号33、及び配列番号34、又はそれぞれ、配列番号38、配列番号39、及び配列番号40)をコードする。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、(a)19C11のVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3(すなわち、それぞれ、配列番号43、配列番号44、及び配列番号45、又はそれぞれ、配列番号49、配列番号50、及び配列番号51、又はそれぞれ、配列番号55、配列番号56、及び配列番号57)、並びに(b)19C11のVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3(すなわち、それぞれ、配列番号46、配列番号47、及び配列番号48、又はそれぞれ、配列番号52、配列番号53、及び配列番号54、又はそれぞれ、配列番号58、配列番号59、及び配列番号60)をコードする。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、(a)16C5のVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3(すなわち、それぞれ、配列番号63、配列番号64、及び配列番号65、又はそれぞれ、配列番号69、配列番号70、及び配列番号71、又はそれぞれ、配列番号75、配列番号76、及び配列番号77)、並びに(b)16C5のVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3(すなわち、それぞれ、配列番号66、配列番号67、及び配列番号68、又はそれぞれ、配列番号72、配列番号73、及び配列番号74、又はそれぞれ、配列番号78、配列番号79、及び配列番号80)をコードする���具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、(a)18C6のVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3(すなわち、それぞれ、配列番号83、配列番号84、及び配列番号85、又はそれぞれ、配列番号89、配列番号90、及び配列番号91、又はそれぞれ、配列番号95、配列番号96、及び配列番号97)、並びに(b)18C6のVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3(すなわち、それぞれ、配列番号86、配列番号87、及び配列番号88、又はそれぞれ、配列番号92、配列番号93、及び配列番号94、又はそれぞれ、配列番号98、配列番号99、及び配列番号100)をコードする。
【０４０３】
ある実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるアミノ酸配列(例えば、配列番号1、配列番号21、配列番号41、配列番号61、配列番号81、又は配列番号101)を含む重鎖可変領域を含む本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該抗体は、MUC16に免疫特異的に結合する。
【０４０４】
ある実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるアミノ酸配列(例えば、配列番号2、配列番号22、配列番号42、配列番号62、配列番号82、又は配列番号102)を含む軽鎖可変領域を含む本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該抗体は、MUC16に免疫特異的に結合する。
【０４０５】
ある実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号102のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号2のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号42のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号2のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号21のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号41のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号42のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号61のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号62のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号81のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号82のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０４０６】
ある実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、又は配列番号148の核酸配列を含むVHをコードする。ある実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号141、配列番号143、配列番号145、配列番号147、又は配列番号149の核酸配列を含むVLをコードする。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号140の核酸配列を含むVH、及び配列番号141の核酸配列を含むVLをコードする(例えば、10C6)。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号142の核酸配列を含むVH、及び配列番号143の核酸配列を含むVLをコードする(例えば、7B12)。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号144の核酸配列を含むVH、及び配列番号145の核酸配列を含むVLをコードする(例えば、19C11)。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号146の核酸配列を含むVH、及び配列番号147の核酸配列を含むVLをコードする(例えば、16C5)。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列番号148の核酸配列を含むVH、及び配列番号149の核酸配列を含むVLをコードする(例えば、18C6)。
【０４０７】
具体的な態様において、本明細書に提供されるのは、軽鎖及び重鎖、例えば、個別の軽鎖及び重鎖を含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。重鎖に関して、具体的な実施態様において、本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、ガンマ(例えば、ガンマ1、ガンマ2、ガンマ3、又はガンマ4)重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施態様において、本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該抗体は重鎖を含み、かつ該重鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1、配列番号21、配列番号41、配列番号61、配列番号81、又は配列番号101の任意のアミノ酸配列を含むことができ、かつ該重鎖の定常領域は、ヒトガンマ重鎖定常領域である。
【０４０８】
軽鎖に関して、具体的な実施態様において、本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、カッパ軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、ラムダ軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。また別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、ヒトカッパ軽鎖又はヒトラムダ軽鎖を含む本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施態様において、本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該抗体は軽鎖を含み、かつ該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号2、配列番号22、配列番号42、配列番号62、配列番号82、又は配列番号102の任意のアミノ酸配列を含むことができ、かつ該軽鎖の定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域である。別の特定の実施態様において、本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、軽鎖を含む本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号2、配列番号22、配列番号42、配列番号62、配列番号82、又は配列番号102の任意のアミノ酸配列を含むことができ、かつ該軽鎖の定常領域は、ヒトラムダ軽鎖定常領域である。
【０４０９】
本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体の作製の詳細な例については、第6.2節及び第6.3節を参照されたい。
【０４１０】
(5.3.3  細胞及びベクター)
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、1以上のMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)を(例えば、組換え)発現する細胞(例えば、エクスビボ細胞)である。また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列(例えば、第5.3.2節を参照)を含む、宿主細胞における、好ましくは、哺乳動物細胞における組換え発現のためのベクター(例えば、発現ベクター)である。また本明細書に提供されるのは、そのようなベクター又はヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を組換え発現するための細胞(例えば、エクスビボ細胞)である。また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であって、そのようなMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を細胞(例えば、エクスビボ細胞)から発現させることを含む、方法である。好ましい実施態様において、該細胞は、エクスビボ細胞である。
【０４１１】
ベクター(例えば、発現ベクター)は、細胞(例えば、エクスビボ細胞)で発現される遺伝子を含むDNA分子である。通常、遺伝子発現は、構成的又は誘導性プロモーター、組織特異的調節エレメント、及びエンハンサーを含む、特定の調節エレメントの制御下に置かれる。そのような遺伝子は、調節エレメント、例えば、プロモーター「に動作可能に連結されている」と言われる。組換え宿主は、クローニングベクター又は発現ベクターのいずれかを含む任意の原核生物又は真核生物細胞であることができる。この用語には、宿主細胞の染色体もしくはゲノム又は宿主細胞の細胞(例えば、エクスビボ細胞)にクローン化された遺伝子を含むように遺伝子操作されている、原核生物又は真核生物細胞、及びトランスジェニック動物も含まれる。一実施態様において、プロモーターは、CMVプロモーターである。
【０４１２】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、第5.3.2節に記載される1以上のポリヌクレオチドを含むベクターである。ある実施態様において、第5.3.2節に記載されるポリヌクレオチドを好適なベクターにクローニングすることができ、任意の好適な宿主を形質転換又はトランスフェクトするために使用することができる。そのようなベクターを構築するためのベクター及び方法は当業者に公知であり、一般の技術的参考文献に記載されている(一般には、「組換えDNAパートD(Recombinant DNA Part D)」、Methods in Enzymology、第153号、Wu及びGrossman編、Academic Press(1987)を参照)。ある実施態様において、ベクターは、適切な場合、及び該ベクターがDNAであるか、それともRNAであるかということを考慮に入れて、該ベクターを導入することになる宿主のタイプ(例えば、細菌、真菌、植物、昆虫、又は哺乳動物)に特異的である調節配列、例えば、転写及び翻訳の開始及び終止コドンを含む。ある実施態様において、ベクターは、宿主の属に特異的である調節配列を含む。ある実施態様において、ベクターは、宿主の種に特異的である調節配列を含む。
【０４１３】
ある実施態様において、ベクターは、形質転換又はトランスフェクトされた宿主の選択を可能にする1以上のマーカー遺伝子を含む。マーカー遺伝子の非限定的な例としては、殺生物剤抵抗性、例えば、抗生物質、重金属などに対する抵抗性、原栄養性を提供するための栄養要求性宿主における相補性などが挙げられる。好ましい実施態様において、ベクターは、アンピシリン及びハイグロマイシン選択可能マーカーを含む。
【０４１４】
ある実施態様において、発現ベクターは、第5.3.2節に記載されるポリヌクレオチドに動作可能に連結された天然又は標準のプロモーターを含むことができる。例えば、強い、弱い、誘導性、組織特異的、及び発生特異的な、プロモーターの選択は、当業者の能力の範囲内である。同様に、上記の核酸分子又はその断片をプロモーターと組み合わせることも、当業者の能力の範囲内である。
【０４１５】
好適なベクターの非限定的な例としては、増殖及び拡大のために又は発現のために又はその両方のために設計されているものが挙げられる。例えば、クローニングベクターは、pUCシリーズ、pBluescriptシリーズ(Stratagene, LaJolla, Calif.)、pETシリーズ(Novagen, Madison, Wis.)、pGEXシリーズ(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)、及びpEXシリーズ(Clontech, Palo Alto, Calif.)からなる群から選択することができる。ラムダ-GT10、ラムダ-GT11、ラムダ-ZapII(Stratagene)、ラムダ-EMBL4、及びラムダ-NM1149などのバクテリオファージベクターを使用することもできる。植物発現ベクターの非限定的な例としては、pBI110、pBI101.2、pBI101.3、pBI121、及びpBIN19(Clontech)が挙げられる。動物発現ベクターの非限定的な例としては、pEUK-C1、pMAM、及びpMAMneo(Clontech)が挙げられる。TOPOクローニングシステム(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)を製造元の推奨に従って使用することもできる。
【０４１６】
ある実施態様において、ベクターは哺乳動物ベクターである。ある実施態様において、哺乳動物ベクターは、mRNAの転写の開始を媒介する少なくとも1つのプロモーターエレメント、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードする配列、並びに転写の終結及び転写物のポリアデニル化に必要とされるシグナルを含む。ある実施態様において、哺乳動物ベクターは、例えば、エンハンサー、Kozak配列、及びRNAスプライシングのためのドナー部位とアクセプター部位に隣接する介在配列などの、さらなるエレメントを含む。ある実施態様において、高効率の転写は、例えば、SV40由来の初期及び後期プロモーター、レトロウイルス、例えば、RSV、HTLVI、HIVI由来の長い末端リピート(LTRS)、並びにサイトメガロウイルス(CMV)の初期プロモーターを用いて達成することができる。しかしながら、細胞性エレメントを使用することもできる(例えば、ヒトアクチンプロモーター)。哺乳動物発現ベクターの非限定的な例としては、pIRESlneo、pRetro-Off、pRetro-On、PLXSN、又はpLNCX(Clonetech Labs, Palo Alto, Calif.)、pcDNA3.1(+/-)、pcDNA/Zeo(+/-)、又はpcDNA3.1/Hygro(+/-)(Invitrogen)、PSVL及びPMSG(Pharmacia, Uppsala, Sweden)、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC 37146)、並びにpBC12MI(ATCC 67109)などのベクターが挙げられる。そのような哺乳動物ベクターと組み合わせて使用することとができる哺乳動物宿主細胞の非限定的な例としては、ヒトHela 293、H9、及びJurkat細胞、マウスNIH3T3及びC127細胞、Cos 1、Cos 7、及びCV 1、ウズラQC1-3細胞、マウスL細胞、並びにチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が挙げられる。
【０４１７】
ある実施態様において、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、パルボウイルスに基づくベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス(AAV)に基づくベクター、AAV-アデノウイルスキメラベクター、及びアデノウイルスに基づくベクター、並びにレンチウイルスベクター、例えば、単純ヘルペス(HSV)に基づくベクターである。ある実施態様において、ウイルスベクターを操作して、ウイルスを複製欠損にする。ある実施態様において、ウイルスベクターを操作して、宿主に対する毒性を消失させる。これらのウイルスベクターは、例えば、Sambrookらの文献、分子クローニング、実験マニュアル(Molecular Cloning, a Laboratory Manual)、第2版、Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989);及びAusubelらの文献、分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y.(1994)に記載されている標準的な組換えDNA技法を用いて調製することができる。
【０４１８】
ある実施態様において、本明細書に記載されるベクター又はポリヌクレオチドを従来の技法によって細胞(例えば、エクスビボ細胞)に転移させることができ、得られた細胞を従来の技法によって培養して、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を産生することができる。したがって、本明細書に提供されるのは、宿主細胞におけるそのような配列の発現のためのプロモーターに動作可能に連結された、MUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片、その重鎖もしくは軽鎖、又はその軽鎖融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞である。ある実施態様において、プロモーターに動作可能に連結された重鎖をコードするベクター及びプロモーターに動作可能に連結された軽鎖をコードするベクターを、MUC16グリコシル化抗体全体の発現のために細胞で共発現させることができる。ある実施態様において、プロモーターに動作可能に連結された重鎖をコードするベクター及びプロモーターに動作可能に連結された軽鎖融合ポリペプチドをコードするベクターを、二重特異性結合分子全体の発現のために細胞で共発現させることができる。ある実施態様において、細胞は、プロモーターに動作可能に連結された本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体の重鎖と軽鎖ポリペプチドの両方をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。ある実施態様において、細胞は、プロモーターに動作可能に連結された本明細書に記載される二重特異性結合分子の重鎖と軽鎖融合ポリペプチドの両方をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。ある実施態様において、細胞は、プロモーターに動作可能に連結された重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第一のベクター及びプロモーターに動作可能に連結された軽鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第二のベクターという、2つの異なるベクターを含む。ある実施態様において、細胞は、プロモーターに動作可能に連結された重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第一のベクター及びプロモーターに動作可能に連結された軽鎖融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第二のベクターという、2つの異なるベクターを含む。ある実施態様において、第一の細胞は、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第一のベクターを含み、第二の細胞は、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体の軽鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第二のベクターを含む。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、そのような第一の細胞及びそのような第二の細胞を含む細胞の混合物である。ある実施態様において、第一の細胞は、本明細書に記載される二重特異性結合分子の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第一のベクターを含み、第二の細胞は、本明細書に記載される二重特異性結合分子の軽鎖融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第二のベクターを含む。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、そのような第一の細胞及びそのような第二の細胞を含む細胞の混合物である。好ましい実施態様において、該細胞は、該オリゴヌクレオチドが細胞によって効率的に転写されなおかつ効率的に翻訳される��うに、ベクター(単数)又はベクター(複数)を発現する。
【０４１９】
実施態様において、細胞は、オリゴヌクレオチド又はその断片が細胞によって効率的に転写されなおかつ効率的に翻訳されるように、ベクターを発現する。
【０４２０】
ある実施態様において、細胞は宿主内に存在し、該宿主は、動物、例えば、哺乳動物であることができる。細胞の例としては、ヒト細胞、ヒト細胞株、大腸菌(例えば、大腸菌TB-1、TG-2、DH5a、XL-Blue MRF'(Stratagene)、SA2821、及びY1090)、枯草菌(B. subtilis)、緑膿菌(P. aerugenosa)、出芽酵母(S. cerevisiae)、アカパンカビ(N. crassa)、昆虫細胞(例えば、Sf9、Ea4)、並びに本明細書で以下に示されるその他のものが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、細胞は、CHO細胞である。特に好ましい実施態様において、細胞は、CHO-S細胞である。
【０４２１】
ある実施態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドを細胞に導入することによって染色体に組み込まれた該ポリヌクレオチドを含む安定細胞株で発現させることができる。ある実施態様において、該ポリヌクレオチドは、例えば、エレクトロポレーションによって細胞に導入される。ある実施態様において、該ポリヌクレオチドは、例えば、該ポリヌクレオチドを含むベクターの細胞へのトランスフェクションによって細胞に導入される。ある実施態様において、該ベクターは、トランスフェクトされた細胞の同定及び単離を可能にするDHFR、GPT、ネオマイシン、又はハイグロマイシンなどの選択可能マーカーと共トランスフェクトされる。ある実施態様において、トランスフェクトされたポリヌクレオチドを増幅させて、大量のコードされたMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を発現させることもできる。例えば、DHFR(ジヒドロ葉酸レダクターゼ)マーカーを用いて、対象となるポリヌクレオチドの数百又は数千ものコピーを保有する細胞株を開発することができる。選択マーカーの別の例は、酵素グルタミンシンターゼ(GS)である(Murphyらの文献、Biochem. J. 227:277-279(1991); Bebbingtonらの文献、Bio/Technology 10:169-175(1992))。これらのマーカーを用いて、細胞を選択培地で成長させ、最も大きい耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は、染色体に組み込まれた増幅遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞及びNSO細胞は、抗体の産生に使用されることが多い。
【０４２２】
一実施態様において、ベクターは、(i)第一のプロモーターに動作可能に連結された、MUC16に結合する免疫グロブリン軽鎖をコードする第一のポリヌクレオチド配列、及び(ii)第二のプロモーターに動作可能に連結された、MUC16に結合する免疫グロブリン重鎖をコードする第二のポリヌクレオチドを含む。ある実施態様において、ベクターは、ウイルスベクターである。
【０４２３】
一実施態様において、ベクターは、(i)第一のプロモーターに動作可能に連結された、ペプチドリンカーを介してscFvに融合した免疫グロブリン軽鎖(ここで、該軽鎖はMUC16に結合し、該scFvはCD3に結合する)を含む軽鎖融合ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド配列及び(ii)第二のプロモーターに動作可能に連結された、MUC16に結合する免疫グロブリン重鎖をコードする第二のポリヌクレオチドを含む。ある実施態様において、ベクターは、ウイルスベクターである。
【０４２４】
(5.4  医薬組成物)
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、1以上のMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)の医薬有効量を含む組成物(例えば、医薬組成物)及びキットである。ある実施態様において、該医薬組成物は、本明細書に記載される抗体、その抗原結合断片、及び/又はCARを組換え発現する免疫細胞、例えば、T細胞を含む。組成物は、個々の単一単位剤形の調製において使用することができる。本明細書に提供される組成物は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、オンマヤ内、眼内、硝子体内、結腸内、子宮頸部内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、髄腔内、脳室内、脳実質内、又は経皮投与用に製剤化することができる。好ましい実施態様において、該組成物は、非経口投与用に製剤化される。特に好ましい実施態様において、該組成物は、静脈内投与用に製剤化される。好ましい実施態様において、該組成物は、腹腔内投与用に製剤化される。具体的な実施態様において、該組成物は、腹膜転移を治療するための腹腔内投与用に製剤化される。好ましい実施態様において、該組成物は、髄腔内投与用に製剤化される。具体的な実施態様において、該組成物は、脳転移を治療するための髄腔内投与用に製剤化される。例えば、Kramerらの文献、2010, 97: 409-418を参照されたい。好ましい実施態様において、該組成物は、脳における脳室内投与用に製剤化される。具体的な実施態様において、該組成物は、脳転移を治療するための脳室内投与用に製剤化される。例えば、Kramerらの文献、2010, 97: 409-418を参照されたい。好ましい実施態様において、該組成物は、脳における実質内投与用に製剤化される。具体的な実施態様において、該組成物は、脳腫瘍又は脳腫瘍転移を治療するための実質内投与用に製剤化される。例えば、Lutherらの文献、2014, Neuro Oncol, 16: 800-806、及びClinical Trial ID NO NCT01502917を参照されたい。
【０４２５】
具体的な実施態様において、該組成物は、腹膜転移のための腹腔内投与用に製剤化される。
【０４２６】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む1以上のポリヌクレオチドを含む組成物である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、細胞を含む組成物であり、ここで、該細胞は、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む1以上のポリヌクレオチドを含む。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、ベクターを含む組成物であり、ここで、該ベクターは、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む1以上のポリヌクレオチドを含む。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、細胞を含む組成物であり、ここで、該細胞はベクターを含み、ここで、該ベクターは、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む1以上のポリヌクレオチドを含む。
【０４２７】
ある実施態様において、本明細書に記載される組成物は、安定製剤又は保存製剤である。ある実施態様において、安定製剤は、塩分又は選択された塩を含むリン酸緩衝剤を含む。ある実施態様において、記載されている組成物は、薬学的又は獣医学的使用に好適な多目的の保存製剤である。ある実施態様において、本明細書に記載される組成物は防腐剤を含む。防腐剤は当業者に公知である。防腐剤の非限定的な例としては、フェノール、m-クレゾール、p-クレゾール、o-クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、亜硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム(例えば、六水和物)、アルキルパラベン(メチル、エチル、プロピル、ブチルなど)、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、及びデヒドロ酢酸ナトリウム、並びにチメロサール、又は水性希釈剤中のこれらの混合物が挙げられる。任意の好適な濃度又は混合物、例えば、0.001〜5％、又はその中の任意の範囲もしくは値、例えば、限定されないが、0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、又はその中の任意の範囲もしくは値を、当技術分野で公知の通りに使用することもできる。非限定的な例としては、防腐剤なし、0.1〜2％のm-クレゾール(例えば、0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0％)、0.1〜3％のベンジルアルコール(例えば、0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5％)、0.001〜0.5％のチメロサール(例えば、0.005、0.01)、0.001〜2.0％のフェノール(例えば、0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0％)、0.0005〜1.0％のアルキルパラベン(例えば、0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0％)などが挙げられる。
【０４２８】
本明細書に提供される組成物を、対象に、長時間にわたって、例えば、1週間〜1年間又はそれよりも長い間、単一の投与から送達することが望ましい場合もあり得る。様々な低速放出、デポ、又はインプラント剤形を利用することができる。例えば、剤形は、体液への溶解度が低い化合物の医薬として許容し得る無毒な塩、例えば、(a)多塩基酸、例えば、リン酸、硫酸、クエン酸、酒石酸、タンニン酸、パモン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンモノ-もしくはジ-スルホン酸、ポリガラクツロン酸などとの酸付加塩;(b)亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどの多価金属カチオンとの、もしくは例えば、N,N'-ジベンジル-エチレンジアミンもしくはエチレンジアミンから形成される有機カチオンとの塩;又は(c)(a)と(b)の組合せ、例えば、タンニン酸亜鉛塩を含むことができる。さらに、本明細書に提供される組成物、好ましくは、比較的不溶性の塩、例えば、今述べた塩は、例えば、注射に好適なゴマ油とともに、ゲル、例えば、モノステアリン酸アルミニウムゲルの中に製剤化することができる。特に好ましい塩は、亜鉛塩、タンニン酸亜鉛塩、パモ酸塩などである。注射用の低速放出デポ製剤の別のタイプは、例えば、米国特許第3,773,919号に記載されているような、ポリ乳酸/ポリグリコール酸ポリマーなどの、ゆっくりと分解する、無毒で、非抗原性のポリマーに分散又は封入された、化合物又は塩を含む。化合物又は好ましくは、比較的不溶性の塩、例えば、上記の塩は、特に動物で使用するための、コレステロールマトリックスシラスティックペレット中に製剤化することもできる。さらなる低速放出、デポ、又はインプラント組成物、例えば、気体又は液体リポソームは、文献で知られている(米国特許第5,770,222号及び「持続及び制御放出薬物送達系(Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems)」、J. R. Robinson編、Marcel Dekker社, N.Y., 1978)。
【０４２９】
本明細書に提供される少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片組成物(第5.1節及び第5.2節を参照)の範囲は、再構成時に、湿潤/乾燥系の場合、約1.0マイクログラム/ml〜約1000mg/mlの濃度をもたらす量を含むが、より低い濃度及びより高い濃度が操作可能であり、これらは、意図される送達ビヒクルに依存し、例えば、溶液製剤は、経皮パッチ、経肺的、経粘膜的方法、又は浸透圧もしくはマイクロポンプ法と異なる。
【０４３０】
ある実施態様において、本明細書に提供される組成物は、任意の好適な補助剤、例えば、限定されないが、希釈剤、結合剤、安定化剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、防腐剤、アジュバントなどのうちの少なくとも1つを含む。ある実施態様において、医薬として許容し得る補助剤が好ましい。そのような滅菌溶液及びそのような滅菌溶液を調製する方法の非限定的な例は当技術分野で周知であり、例えば、Gennaro編、レミントンの医薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)、第18版、Mack Publishing Co.(Easton, Pa.) 1990があるが、これに限定されない。本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の投与の様式、溶解性、及び/又は安定性に好適である医薬として許容し得る担体は、ルーチンで選択することができる。
【０４３１】
ある実施態様において、本明細書に提供される組成物は、1以上の医薬賦形剤及び/又は添加剤を含む。医薬賦形剤及び添加剤の非限定的な例は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、並びに炭水化物(例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、及びオリゴ糖を含む糖;誘導体化糖、例えば、アルジトール、アルドン酸、エステル化糖など;並びに多糖又は糖ポリマー)であり、これらは、単独又は組合せで存在し、単独又は組合せで1〜99.99重量又は体積％を含むことができる。タンパク質賦形剤の非限定的な例としては、血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)、組換えヒトアルブミン(rHA)、ゼラチン、カゼインなどが挙げられる。緩衝能力において機能することもできるアミノ酸/抗体成分の非限定的な例としては、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどが挙げられる。ある実施態様において、該アミノ酸はグリシンである。炭水化物賦形剤の非限定的な例としては、単糖、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、D-マンノース、ソルボースなど;二糖、例えば、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど;多糖、例えば、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなど;及びアルジトール、例えば、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール(グルシトール)、ミオイノシトールなどが挙げられる。ある実施態様において、炭水化物賦形剤は、マンニトール、トレハロース、又はラフィノースである。
【０４３２】
ある実施態様において、本明細書に提供される組成物は、1以上の緩衝剤又はpH調整剤を含み;通常、緩衝剤は、有機酸又は有機塩基から調製される塩である。緩衝剤の非限定的な例としては、有機酸塩、例えば、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、もしくはフタル酸の塩; Tris、トロメタミン塩酸塩、又はリン酸塩緩衝剤が挙げられる。ある実施態様において、緩衝剤は、有機酸塩、例えば、クエン酸塩である。他の賦形剤、例えば、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、防腐増強剤を任意にかつ好ましく希釈剤に添加することができる。等張剤、例えば、グリセリンは、一般に、既知の濃度で使用される。生理的に許容される緩衝剤を添加して、pH制御の改善をもたらすことが好ましい。該組成物は、約pH 4〜約pH 10などの広範囲のpH、及び約pH 5〜約pH 9の好ましい範囲、及び約6.0〜約8.0の最も好ましい範囲にわたることができる。本明細書に提供される組成物は、約6.8〜約7.8のpHを有することが好ましい。好ましい緩衝剤としては、リン酸塩緩衝剤、最も好ましくは、リン酸ナトリウム、特に、リン酸緩衝食塩水(PBS)が挙げられる。
【０４３３】
ある実施態様において、本明細書に提供される組成物は、例えば、ポリビニルピロリドン、フィコール(ポリマー糖)、デキストレート(例えば、シクロデキストリン、例えば、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン)、ポリエチレングリコール、香味剤、抗微生物剤、甘味料、抗酸化剤、帯電防止剤、界面活性剤(例えば、ポリソルベート、例えば、「TWEEN 20」及び「TWEEN 80」)、脂質(例えば、リン脂質、脂肪酸)、ステロイド(例えば、コレステロール)、並びに/又はキレート化剤(例えば、EDTA)などの、1以上のポリマー性賦形剤/添加剤を含む。
【０４３４】
他の添加剤、例えば、Tween 20(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート)、Tween 40(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノパルミテート)、Tween 80(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート)、Pluronic F68(ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー)、及びPEG(ポリエチレングリコール)又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート20もしくは80又はポロキサマー184もしくは188、Pluronic(登録商標) ポリル(polyls)、他のブロックコポリマーのような医薬として許容し得る可溶化剤、並びにキレート剤、例えば、EDTA及びEGTAを組成物に任意に添加して、凝集を低下させることができる。これらの添加剤は、ポンプ又はプラスチック容器を用いて組成物を投与する場合に、特に有用である。医薬として許容し得る界面活性剤の存在は、タンパク質が凝集する傾向を軽減する。
【０４３５】
本明細書に提供される組成物中で使用するのに好適なさらなる医薬賦形剤及び/又は添加剤は当業者に公知であり、例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、「レミントン:医薬の科学及び実践(Remington: The Science & Practice of Pharmacy)」、第19版、Williams & Williams,(1995)及び「医師の卓上参考書(Physician's Desk Reference)」、第52版、Medical Economics, Montvale, N.J.(1998)に言及されている。ある好ましい実施態様において、担体又は賦形剤の材料は、炭水化物(例えば、サッカリド及びアルジトール)並びに緩衝剤(例えば、クエン酸塩)又はポリマー剤である。
【０４３６】
水性希釈剤は、医薬として許容し得る防腐剤を任意にさらに含むことが好ましい。好ましい防腐剤としては、フェノール、m-クレゾール、p-クレゾール、o-クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン(メチル、エチル、プロピル、ブチルなど)、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、及びチメロサール、又はこれらの混合物からなる群から選択されるものが挙げられる。組成物中で使用される防腐剤の濃度は、抗微生物効果をもたらすのに十分な濃度である。そのような濃度は、選択される防腐剤に依存し、当業者によって容易に決定される。
【０４３７】
本明細書に提供される組成物は、本明細書に記載される少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)とフェノール、m-クレゾール、p-クレゾール、o-クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン(メチル、エチル、プロピル、ブチルなど)、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、及びチメロサール、又はこれらの混合物からなる群から選択される防腐剤とを水性希釈剤中で混合することを含むプロセスによって調製することができる。本明細書に記載される少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と防腐剤とを水性希釈剤中で混合することは、従来の溶解及び混合手順を用いて実施される。好適な組成物を調製するために、例えば、緩衝溶液中の一定量の本明細書に記載される少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を、所望の濃度の本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片及び防腐剤を提供するのに十分な分量の緩衝溶液中の所望の防腐剤と組み合わせる。本明細書に提供される組成物は、本明細書に記載される少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と選択された緩衝剤、好ましくは、塩分又は選択された塩を含むリン酸緩衝剤を混合することを含むプロセスによって調製することができる。本明細書に記載される少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と緩衝剤を水性希釈剤中で混合することは、従来の溶解及び混合手順を用いて実施される。好適な組成物を調製するために、例えば、水又は緩衝溶液中の一定量の本明細書に記載される少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を、所望の濃度のタンパク質及び緩衝剤を提供するのに十分な分量の水中の所望の緩衝剤と組み合わせる。これらのプロセスのバリエーションは、当業者によって認識されているであろう。例えば、成分を添加する順序、さらなる添加剤を使用するかどうかということ、組成物を調製する温度及びpHは全て、使用される濃度及び投与手段について最適化することができる因子である。
【０４３８】
(5.4.1  非経口製剤)
ある実施態様において、本明細書に提供される組成物は、非経口的な注射投与用に製剤化される。本明細書で使用される場合、「非経口」という用語は、静脈内、血管内、筋肉内、皮内、皮下、及び眼内を含む。非経口投与用に、該組成物は、医薬として許容し得る非経口ビヒクルと関連した、又はそれとは別々に提供される、溶液、懸濁液、エマルジョン、又は凍結乾燥粉末として製剤化することができる。そのようなビヒクルの非限定的な例は、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、グリセロール、エタノール、及び1〜10％ヒト血清アルブミンである。リポソーム及び非水性ビヒクル、例えば、固定油を使用することもできる。ビヒクル又は凍結乾燥粉末は、等張性を維持する添加剤(例えば、塩化ナトリウム、マンニトール)並びに化学的安定性を維持する添加剤(例えば、緩衝剤及び防腐剤)を含むことができる。製剤は、公知の又は好適な技法によって滅菌される。
【０４３９】
好適な医薬担体は、この分野の標準的な参考テキストである、レミントンの医薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)、A. Osolの最新版に記載されている。
【０４４０】
非経口投与用の製剤は、一般的な賦形剤として、滅菌水又は生理食塩水、ポリアルキレングリコール、例えば、ポリエチレングリコール、植物起源の油、水素化ナフタレンなどを含むことができる。注射用の水性又は油性懸濁液は、公知の方法に従って、適当な乳化剤又は湿度調整剤及び懸濁化剤を使用することにより調製することができる。注射用の薬剤は、無毒で、非経口投与可能な希釈剤、例えば、水溶液又は溶媒中の滅菌注射溶液もしくは懸濁液であることができる。使用可能なビヒクル又は溶媒として、水、リンガー溶液、等張生理食塩水などが許容され;通常の溶媒、又は懸濁溶媒として、滅菌不揮発性油を使用することができる。これらの目的のために、天然又は合成又は半合成の脂肪油又は脂肪酸;天然又は合成又は半合成のモノグリセリド又はジグリセリド又はトリグリセリドを含む、任意の種類の不揮発性油及び脂肪酸を使用することができる。非経口投与は当技術分野で公知であり、これには、従来の注射手段、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、米国特許第5,851,198号に記載されるガス加圧式無針注射装置及び米国特許第5,839,446号に記載されるレーザー穿孔装置が含まれるが、これらに限定されない。
【０４４１】
(5.4.2  肺製剤)
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)を含む組成物は、肺投与用に製剤化される。肺投与用に、該組成物は、肺の下気道又は鼻洞(sinuses)に達するのに有効な粒子サイズで送達される。肺投与用の組成物は、吸入による治療剤の投与のための当技術分野で公知の種々の吸入装置又は鼻腔用装置のいずれかによって送達することができる。エアロゾル化製剤を患者の鼻腔(sinus cavity)又は肺胞に堆積させることができるこれらの装置としては、定量吸入器、ネブライザー、乾燥粉末発生器、スプレーなどが挙げられる。本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の肺又は鼻腔投与を導くのに好適な他の装置も当技術分野で公知である。そのような装置は全て、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をエアロゾル中に分配するための投与に好適な製剤を使用する。そのようなエアロゾルは、溶液(水性と非水性の両方)又は固形粒子のいずれかから構成されることができる。Ventolin(登録商標)定量吸入器のような定量吸入器は、通常、噴射剤ガスを使用し、吸気中の作動を必要とする(例えば、WO 94/16970号、WO 98/35888号を参照)。いくつか例を挙げると、Turbuhaler(商標)(Astra)、Rotahaler(登録商標)(Glaxo)、Diskus(登録商標)(Glaxo)、Inhale Therapeuticsによって市販されている装置のような乾燥粉末吸入器は、混合粉末の呼吸作動を使用する(引用により完全に本明細書中に組み込まれる、米国特許第4,668,218号(Astra)、EP 237507号(Astra)、WO 97/25086号(Glaxo)、WO 94/08552号(Dura)、米国特許第5,458,135号(Inhale)、WO 94/06498号(Fisons))。Ultravent(登録商標)ネブライザー(Mallinckrodt)及びAcorn II(登録商標)ネブライザー(Marquest Medical Products)(米国特許第5,404,871号(Aradigm)、WO 97/22376号)のようなネブライザー(上記の参考文献は引用により完全に本明細書中に組み込まれる)は、溶液からエアロゾルを生じさせるが、定量吸入器、乾燥粉末吸入器などは、小粒子エアロゾルを発生させる。そのような市販の吸入装置の例は非限定的な例であり、範囲が限定されることを意図するものではない。
【０４４２】
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)を含むスプレーは、本明細書に記載される少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の懸濁液又は溶液を加圧下でノズルから押し出すことによって生成させることができる。ノズルのサイズ及び形状、加えられる圧力、並びに液体供給速度は、所望の産出量及び粒子サイズを達成するように選択することができる。エレクトロスプレーは、例えば、キャピラリー又はノズルフィードと接続した電場によって生成させることができる。好都合なことに、スプレーによって送達される本明細書に記載される少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を含む組成物の粒子は、約10um未満、好ましくは、約1um〜約5um、最も好ましくは、約2um〜約3umの範囲の粒子サイズを有する。
【０４４３】
スプレーとともに使用するのに好適な本明細書に記載される少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を含む組成物の製剤(第5.1節及び第5.2節を参照)は、通常、少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を、水溶液中に、約0.1mg〜約100mg/溶液のmlもしくはmg/gmの濃度、又はその中の任意の範囲もしくは値、例えば、限定されないが、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90、又は100mg/ml又はmg/gmで含む。該製剤は、賦形剤、緩衝剤、等張剤、防腐剤、界面活性剤、及び好ましくは、亜鉛などの薬剤を含むことができる。該製剤は、賦形剤又はMUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片組成物の安定化のための薬剤、例えば、緩衝剤、還元剤、バルクタンパク質、もしくは炭水化物を含むこともできる。そのような組成物を製剤化する際に有用なバルクタンパク質としては、アルブミン、プロタミンなどが挙げられる。抗体組成物タンパク質を製剤化する際に有用な典型的な炭水化物としては、スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、グルコースなどが挙げられる。該組成物は、エアロゾルを形成する際の溶液の噴霧化によって引き起こされる該組成物の表面誘導凝集を低下させるか又は防止することができる界面活性剤を含むこともできる。ポリオキシエチレン脂肪酸エステル及びアルコール、並びにポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルなどの、様々な従来の界面活性剤を利用することができる。量は、通常、製剤の0.001〜14重量％の範囲である。好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート80、ポリソルベート20などである。
【０４４４】
ある実施態様において、該組成物は、ネブライザー、例えば、ジェットネブライザー又は超音波ネブライザーを介して投与される。通常、ジェットネブライザーでは、圧搾空気源を用いて、開口部を通して高速空気噴射を生み出す。ガスがノズルの先に広がると、低圧力領域が生じ、これにより、抗体組成物タンパク質の溶液が、液体リザーバに接続されたキャピラリーチューブを通して引かれる。キャピラリーチューブからの液体流は、それが該チューブから出る時に剪断されて、不安定なフィラメント及び液滴になり、エアロゾルを生成する。様々な形状、流速、及びバッフルタイプを利用して、所与のジェットネブライザーから所望の性能特性を達成することができる。超音波ネブライザーでは、高周波数電気エネルギーを用いて、典型的には圧電変換器を利用して、力学的振動エネルギーを生み出す。このエネルギーは、直接的にか又はカップリング流体を通してかのいずれかで、抗体組成物タンパク質の製剤に伝達され、該抗体組成物タンパク質を含むエアロゾルを生成する。ネブライザーによって送達される抗体組成物タンパク質の粒子は、約10um未満、好ましくは、約1um〜約5um、及び最も好ましくは、約2um〜約3umの範囲の粒子サイズを有することが好都合である。
【０４４５】
ある実施態様において、該組成物は、噴射剤、本明細書に記載される少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)、並びに任意の賦形剤又は他の添加剤が液化高圧ガスを含む混合物としてキャニスターに含まれる、定量吸入器(MDI)を介して投与される。定量バルブの作動は、ダイ混合物(die mixture)を、好ましくは、約10um未満、好ましくは、約1um〜約5um、及び最も好ましくは、約2um〜約3umのサイズ範囲の粒子を含むエアロゾルとして放出させる。所望のエアロゾル粒子サイズは、ジェットミリング、スプレー乾燥、臨界点凝縮などを含む、当業者に公知の様々な方法によって産生される抗体組成物タンパク質の製剤を利用することによって得ることができる。好ましい定量吸入器としては、3M又はGlaxoによって製造され、かつハイドロフルオロカーボン噴射剤を利用しているものが挙げられる。
【０４４６】
定量吸入器装置とともに使用するための本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)の製剤は、通常、少なくとも1つの抗IL-6抗体を含む微細粉末を、例えば、界面活性剤の助けを借りて噴射剤に懸濁された非水性媒体中の懸濁液として含む。噴射剤は、この目的で利用される任意の従来の材料、例えば、クロロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン、又はトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、及び1,1,1,2-テトラフルオロエタンを含む炭化水素、HFA-134a(ハイドロフルオロアルカン-134a)、HFA-227(ハイドロフルオロアルカン-227)などであることができる。噴射剤はハイドロフルオロカーボンであることが好ましい。該界面活性剤は、活性剤を化学分解などに対して保護するために、本明細書に記載される少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を噴射剤中の懸濁液として安定化するように選択することができる。好適な界面活性剤としては、ソルビタントリオレエート、大豆レシチン、オレイン酸などが挙げられる。場合によっては、エタノールなどの溶媒を使用する溶液エアロゾルが好ましい。タンパク質の製剤のための当技術分野で公知のさらなる薬剤を製剤中に含めることもできる。
【０４４７】
(5.4.3  経口製剤)
ある実施態様において、本明細書に提供される組成物は、経口投与用に製剤化される。ある実施態様において、経口投与用に、組成物及び本明細書に記載される少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を投与する方法は、腸壁の透過性を人為的に増大させるための、例えば、レゾルシノール並びに非イオン性界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンオレイルエーテル及びn-ヘキサデシルポリエチレンエーテルなどのアジュバントの共投与、並びに酵素的分解を阻害するための、例えば、膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェート(DFF)、及びトラジロールなどの酵素阻害剤の共投与に頼っている。経口投与用の固体型剤形の活性成分化合物は、スクロース、ラクトース、セルロース、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、マルチトール、デキストラン、デンプン、寒天、アルギネート、キチン、キトサン、ペクチン、ガムトラガカント、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成又は半合成ポリマー、及びグリセリドを含む、少なくとも1つの添加剤と混合することができる。これらの剤形は、例えば、不活性希釈剤、滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、パラベン、防腐剤、例えば、ソルビン酸、アスコルビン酸、α-トコフェロール、酸化防止剤、例えば、システイン、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝剤、甘味剤、香味剤、芳香剤などのような、他のタイプの添加剤を含むこともできる。
【０４４８】
ある実施態様において、経口投与用の錠剤及び丸剤をさらに加工して、腸溶性コーティングされた調製物にすることができる。ある実施態様において、経口投与用の液体調製物としては、例えば、医学的使用に対して許容されるエマルジョン、シロップ、エリキシル、懸濁液、及び溶液調製物が挙げられる。これらの調製物は、該分野で通常使用される不活性希釈剤、例えば、水を含むことができる。リポソーム調製物は、例えば、インスリン及びヘパリンについて記載されている(米国特許第4,239,754号)ような、経口投与調製物に利用することができる。さらに、混合アミノ酸の人工ポリマーのマイクロスフェア(プロテノイド)は、例えば、米国特許第4,925,673号に記載されているような、医薬の経口投与において利用することができる。さらに、担体化合物、例えば、米国特許第5,879,681号及び米国特許第5,871,753号に記載されているものが、生物活性剤の経口投与において使用される。
【０４４９】
(5.4.4  粘膜製剤)
ある実施態様において、本明細書に提供される組成物は、粘膜表面からの吸収用に製剤化される。ある実施態様において、粘膜表面からの吸収用に、組成物及び本明細書に記載される少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)を投与する方法は、エマルジョン粒子の粘膜付着を達成することによって粘膜表面からの吸収を促進する、複数のサブミクロン粒子、粘膜付着性巨大分子、生体活性ペプチド、及び水性連続相を含むエマルジョンを含む(米国特許第5,514,670号)。本明細書に提供されるエマルジョンの適用に好適な粘膜表面としては、例えば、角膜、結膜、口腔内、舌下、鼻腔、膣内、肺、胃、腸、及び直腸への投与経路を挙げることができる。膣内又は直腸投与用の製剤、例えば、坐剤は、賦形剤として、例えば、ポリアルキレングリコール、ワセリン、ココアバターなどを含むことができる。鼻腔内投与用の製剤は固体であり、かつ賦形剤として、例えば、ラクトースを含むことができるか、又は点鼻剤の水性もしくは油性溶液であることができる。口腔内投与用に、賦形剤としては、例えば、糖、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、アルファ化デンプンなどが挙げられる(米国特許第5,849,695号)。
【０４５０】
(5.4.5  経皮製剤)
ある実施態様において、本明細書に提供される組成物は、経皮投与用に製剤化される。ある実施態様において、経皮投与用に、該組成物は、例えば、リポソーム又はポリマー性ナノ粒子、マイクロ粒子、マイクロカプセル、又はマイクロスフェア(別途明記されない限り、マイクロ粒子と総称される)などの送達装置に封入された、本明細書に記載される少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)を含む。いくつかの好適な装置が経皮投与用に知られており、これには、合成ポリマー、例えば、ポリヒドロキシ酸、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びこれらのコポリマー、ポリオルトエステル、ポリ無水物、並びにポリホスファゼン、並びに天然ポリマー、例えば、コラーゲン、ポリアミノ酸、アルブミン、及び他のタンパク質、アルギネート及び他の多糖、並びにこれらの組合せから作られたマイクロ粒子が含まれる(米国特許第5,814,599号)。
【０４５１】
(5.4.6  キット)
また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される1以上の抗体もしくはその抗原結合断片、又はそれらのコンジュゲートを含むキットである。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される医薬組成物の成分のうちの1つ又は複数、例えば、本明細書に記載される1以上の抗体又はその抗原結合断片が充填された1以上の容器を含む医薬パック又はキットである。いくつかの実施態様において、該キットは、本明細書に記載される医薬組成物及び予防剤又は治療剤を含む。
【０４５２】
そのような容器には、医薬品もしくは生物学的製品の製造、使用、又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の注意書き、剤形、及び/又はその使用説明書が任意に関連付けられることがある。ある実施態様において、該キットに含まれる説明書は、医薬組成物の投与についての投薬量及び/又は投与レジメンに関する指針を提供する。
【０４５３】
医薬包装材料の例としては、ブリスターパック、瓶、パケット、小袋、チューブ、吸入器、ポンプ、袋、バイアル、容器、シリンジ、並びに選択された医薬組成物並びに意図された投与及び治療の様式に好適な任意の包装材料が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５４】
本明細書に提供されるキットは、活性成分を投与するために使用される装置をさらに含むことができる。そのような装置の例としては、シリンジ、無針注射器、点滴袋、パッチ、及び吸入器が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５５】
本明細書に提供されるキットは、成分を投与するために使用することができる医薬として許容し得るビヒクルをさらに含むことができる。例えば、成分が、非経口投与用に再構成されなければならない固体形態で提供される場合、キットは、非経口投与に好適である微粒子非含有滅菌溶液を形成するように成分を溶解させることができるか、又は経口投与用の懸濁剤として再構成することができる好適なビヒクルの密閉容器を含むことができる。医薬として許容し得るビヒクルの例としては:注射用水USP;限定されないが、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、デキストロース注射液、デキストロース及び塩化ナトリウム注射液、並びに乳酸加リンガー注射液を含む、水性ビヒクル;限定されないが、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、及びポリプロピレングリコールを含む、水混和性ビヒクル;並びに限定されないが、トウモロコシ油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、及び安息香酸ベンジルを含む、非水性ビヒクルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５６】
(5.5  使用及び方法)
(5.5.1  治療的使用及び方法)
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象の癌、特に、対象のMUC16陽性癌を治療する方法であって、それを必要としている対象に、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)の治療有効量を投与することを含む、方法である。具体的な実施態様において、該対象は、第5.5.5節に記載されているような対象である。具体的な実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、第5.5.3節に記載されているような用量で投与される。具体的な実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、第5.5節に記載されているような方法に従って投与される。具体的な実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、第5.5.4節に記載されているような1以上の追加の医薬活性剤と組み合わせて投与される。
【０４５７】
特定の種の対象におけるMUC16グリコシル化抗体又はその断片の使用のために、その特定の種のMUC16に結合するMUC16グリコシル化抗体又はその断片が使用される。例えば、ヒトを治療するために、ヒトMUC16に結合するMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片が使用される。具体的な実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、免疫グロブリンである。
【０４５８】
さらに、特定の種の対象におけるMUC16グリコシル化抗体又はその断片の使用のために、MUC16グリコシル化抗体、好ましくは、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の定常領域は、その特定の種に由来する。例えば、ヒトを治療するために、MUC16グリコシル化抗体又はその断片は、免疫グロブリンであるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を含むことができ、ここで、該免疫グロブリンは、ヒト定常領域を含む。具体的な実施態様において、該対象は、ヒトである。
【０４５９】
具体的な実施態様において、MUC16陽性癌は、卵巣癌、肺癌、膵癌、乳癌、卵管癌、子宮(例えば、子宮内膜)癌、原発性腹膜癌、又はMUC16受容体を発現する任意の他の組織の癌である。
【０４６０】
具体的な実施態様において、治療は、限定されないが、検出可能であるか又は検出不可能であるかを問わず、症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の状態の安定化(すなわち、悪化させないこと)、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解(部分的又は完全を問わない)を含む、有益な又は所望の臨床的結果を達成するためのものであり得る。具体的な実施態様において、「治療」は、治療を受けない場合の予想される生存と比較して、生存を延長させるためのものでもあり得る。具体的な実施態様において、癌(例えば、卵巣癌、肺癌、膵癌、乳癌、卵管癌、子宮(例えば、子宮内膜)癌、原発性腹膜癌、又はMUC16受容体を発現する任意の他の組織の癌)を有する対象への本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片、又は本明細書に記載される医薬組成物の投与は、以下の効果:(i)癌の1以上の症状の重症度の低下もしくは改善;(ii)癌と関連する1以上の症状の持続期間の低下;(iii)癌と関連する症状の再発の予防;(iv)対象の入院の減少;(v)入院期間の短縮;(vi)対象の生存の増加;(vii)別の療法の治療効果の増強もしくは改善;(viii)癌と関連する1以上の症状の発生もしくは開始の阻害;(ix)癌と関連する症状の数の低下;(x)当技術分野で周知の方法によって評価される生活の質の改善;(x)腫瘍の再発の阻害;(xi)腫瘍及び/もしくはそれと関連する1以上の症状の退行;(xii)腫瘍及び/もしくはそれと関連する1以上の症状の進行の阻害;(xiii)腫瘍の成長の低下;(xiv)腫瘍サイズ(例えば、体積もしくは直径)の減少;(xv)新たに形成される腫瘍の形成の低下;(xvi)原発性、局所性、及び/もしくは転移性腫瘍の予防、根絶、除去、もしくは制御;(xvii)転移の数もしくはサイズの減少;(xviii)死亡率の低下;(xix)無再発生存の増加;(xx)当業者に利用可能な従来の方法、例えば、磁気共鳴イメージング(MRI)、ダイナミック造影MRI(DCE-MRI)、X線、及びコンピュータ断層撮影(CT)スキャンもしくは陽電子放出断層撮影(PET)スキャンによって測定したとき、腫瘍のサイズが維持されるか、増大しないか、もしくは標準療法の投与後の腫瘍の増加よりも少なく増加すること;並びに/又は(xxi)患者の寛解期間の増加のうちの少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、又はそれより多くを達成する。治療は、前述のうちの1つ又は複数を達成することであることができる。
【０４６１】
(5.5.2  診断的使用)
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)は、本明細書に記載される疾病(例えば、MUC16陽性癌細胞が関与する疾病)を検出、診断、又はモニタリングするために、診断目的で使用することができる。ある実施態様において、診断目的で使用するためのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、第5.2節に記載されている通りに標識される。
【０４６２】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される疾病の検出のための方法であって、(a)対象の細胞又は組織試料中のMUC16又はその断片の発現を、本明細書に記載される1以上のMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を用いてアッセイすること;及び(b)MUC16又はその断片の発現のレベルを、対照レベル、例えば、正常組織試料(例えば、本明細書に記載される疾病を有しない対象に由来するもの、又は該疾病の発症前の同じ患者に由来するもの)のレベルと比較することを含み、それにより、MUC16又はその断片の発現の対照レベルと比較したMUC16又はその断片の発現のアッセイレベルの増大又は減少が本明細書に記載される疾病を示すものとなる、方法である。
【０４６３】
本明細書に記載される抗体を用いて、本明細書に記載の又は当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を用いて、生体試料中のMUC16又はその断片のレベルをアッセイすることができる(例えば、Jalkanenらの文献、1985, J. Cell. Biol. 101:976-985;及びJalkanenらの文献、1987, J. Cell . Biol. 105:3087-3096を参照)。タンパク質遺伝子発現を検出するのに有用な他の抗体ベースの方法としては、免疫アッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)及び放射免疫アッセイ(RIA)が挙げられる。好適な抗体アッセイ標識は当技術分野で公知であり、これには、酵素標識、例えば、グルコースオキシダーゼ;放射性同位体、例えば、ヨウ素(125I、121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(121In)、及びテクネチウム(99Tc);発光標識、例えば、ルミノール;及び蛍光標識、例えば、フルオレセイン及びローダミン、並びにビオチンが含まれる。
【０４６４】
ある実施態様において、本明細書に記載される疾病(例えば、MUC16陽性癌)のモニタリングは、該診断方法を初回診断後のしばらくの間繰り返すことによって実施される。
【０４６５】
標識分子の存在は、インビボスキャニングのための当技術分野で公知の方法を用いて、対象で検出することができる。当業者は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定することができるであろう。本発明の診断方法において使用し得る方法及び装置としては、コンピュータ断層撮影法(CT)、全身スキャン、例えば、陽電子放出断層撮影法(PET)、磁気共鳴イメージング(MRI)、及び超音波検査法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４６６】
(5.5.3  用量及びレジメン)
本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)、又は組成物(第5.4節を参照)、又は該抗体もしくはその抗原結合断片を発現する細胞は、種々の経路によって対象に送達することができる。これらには、限定されないが、非経口、鼻腔内、気管内、経口、皮内、局所、筋肉内、腹腔内、経皮、静脈内、腫瘍内、結膜、及び皮下経路が含まれる。肺投与は、例えば、吸入器又はネブライザー、及びスプレー剤として使用されるエアロゾル化剤を含む製剤の使用によって利用されることもできる。一実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片又は組成物は、対象(例えば、第5.5.5節に記載されているような対象)に非経口投与される。具体的な実施態様において、該非経口投与は、静脈内、筋肉内、又は皮下である。
【０４６７】
疾病の治療及び/又は予防において有効であるMUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片又は組成物の量は、疾患の性質によって決まり、標準的な臨床的技法によって決定することができる。
【０４６８】
組成物中で利用されるべき正確な用量は、投与の経路、癌の種類によっても決まり、施術者の判断及び各々の対象の状況に従って決定されるべきである。例えば、有効用量は、投与の手段、標的部位、患者の生理的状態(年齢、体重、及び健康を含む)、患者がヒトであるか動物であるかということ、投与される他の薬物、又は治療が予防的か治療的かということによっても変わり得る。治療投薬量は、安全性及び有効性を最適化するために、任意に用量設定される。
【０４６９】
ある実施態様において、インビトロアッセイは、最適な投薬量範囲を特定するのを助けるために利用される。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られる用量応答曲線から外挿することができる。
【０４７０】
MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片について、投薬量は、患者の体重1kg当たり約0.0001〜100mg、より一般的には、0.01〜15mgの範囲であり得る。例えば、投薬量は、1mg/kg体重、10mg/kg体重、又は1〜10mg/kgの範囲内、すなわち、言い換えると、70kgの患者の場合、それぞれ、70mg又は700mg又は70〜700mgの範囲内であることができる。通常、ヒト抗体は、異種ポリペプチドに対する免疫応答のため、他の種由来の抗体よりも長いヒト体内での半減期を有する。したがって、ヒト抗体のより少ない投薬量及びより少ない投薬頻度が可能となることが多い。
【０４７１】
ある実施態様において、例えば、該抗体もしくはその抗原結合断片、又はCARを発現する改変細胞の投与において、対象物は、対象に、約100万〜約1000億細胞の範囲で、例えば、100万〜約500億細胞など(例えば、約500万細胞、約2500万細胞、約5億細胞、約10億細胞、約50億細胞、約200億細胞、約300億細胞、約400億細胞、又は前述の値のいずれか2つによって定義される範囲)、例えば、約1000万〜約1000億細胞(例えば、約2000万細胞、約3000万細胞、約4000万細胞、約6000万細胞、約7000万細胞、約8000万細胞、約9000万細胞、約100億細胞、約250億細胞、約500億細胞、約750億細胞、約900億細胞、又は前述の値のいずれか2つによって定義される範囲)、及び場合により、約1億細胞〜約500億細胞(例えば、約1億2000万細胞、約2億5000万細胞、約3億5000万細胞、約4億5000万細胞、約6億5000万細胞、約8億細胞、約9億細胞、約30億細胞、約300億細胞、約450億細胞)、又はこれらの範囲の間の任意の値で投与される。いくつかの実施態様において、全細胞の用量及び/又は細胞の個々の亜集団の用量は、104又は約104〜109又は約109細胞/キログラム(kg)体重の範囲、例えば、105〜106細胞/kg体重の範囲であり、例えば、1×105細胞/kgもしくは約1×105細胞/kg、1.5×105細胞/kgもしくは約1.5×105細胞/kg、2×105細胞/kgもしくは約2×105細胞/kg、又は1×106細胞/kgもしくは約1×106細胞/kg、2×106細胞/kgもしくは約2×106細胞/kg、5×106細胞/kgもしくは約5×106細胞/kg、又は10×106細胞/kgもしくは約10×106細胞/kg体重である。例えば、いくつかの実施態様において、該細胞は、104 T細胞/キログラム(kg)もしくは約104 T細胞/kg〜109 T細胞/kgもしくは約109 T細胞/kg体重、又はその一定の誤差範囲内、例えば、105〜107 T細胞/kg体重で投与される。
【０４７２】
MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は何度も投与することができる。1回の投薬間の間隔は、1週間、2週間、3週間、4週間、1カ月、2カ月、3カ月、6カ月、1年、又は2年であることができる。
【０４７３】
(5.5.4  組合せ療法)
具体的な実施態様において、対象の癌(例えば、卵巣癌、膵癌、肺癌、乳癌、卵管癌、子宮(例えば、子宮内膜)癌、又は原発性腹膜癌)を治療するための本明細書に提供される方法であって、それを必要としている対象に、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)を含む医薬組成物を投与することを含む方法は、該対象に、1以上の追加の治療剤を投与することをさらに含む。具体的な実施態様において、該追加の治療剤は、対象の癌(例えば、卵巣癌、膵癌、肺癌、乳癌、卵管癌、子宮(例えば、子宮内膜)癌、及び原発性腹膜癌)を治療するためのものである。具体的な実施態様において、該追加の治療剤は、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又は抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)による治療の任意の副作用を治療するためのものである。
【０４７４】
一実施態様において、N-グリコシル化Asn1806を含むが、N-グリコシル化Asn1800を含まないMUC16中のエピトープを認識する(すなわち、それは、MUC16に結合するのに、N-グリコシル化Asn1800ではなく、N-グリコシル化Asn1806を必要とする)第一のMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、N-グリコシル化Asn1806を含み、かつN-グリコシル化Asn1800も含むMUC16中のエピトープを認識する(すなわち、両方のN-グリコシル化部位が、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片によって認識されるエピトープの一部である)第二のMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と組み合わせて投与される。そのような第一のMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(このMUC16の第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;(ii)MUC16の第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如;及び(iii)MUC16の第四の形態(この第四の形態はグリコシル化されており、ここで、該第四の形態のアミノ酸配列は配列番号152である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力によって同定されることができ、ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞、MUC16の該第三の形態を組換え発現する細胞、及びMUC16の該第四の形態を組換え発現する細胞は、同じ細胞型のものである。そのような第二のMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;及び(ii)MUC16の第五の形態(この第五の形態はグリコシル化されており、ここで、該第五の形態のアミノ酸配列は配列番号172である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如によって同定されることができ、ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞は、MUC16の該第五の形態を組換え発現する細胞と同じ型の細胞である。配列番号172のアミノ酸配列によってコードされるタンパク質は、本明細書において、MUC16c114-N23とも呼ばれる。MUC16c114-N23は、アミノ酸位置24及び30のアスパラギン(配列番号150のアミノ酸位置Asn1800及びAsn1806に対応する)がアラニンに突然変異させられていることを除いて、成熟MUC16(配列番号150は成熟MUC16の配列である)のC末端の114アミノ酸残基からなる。したがって、MUC16c114-N23は、配列番号172のアミノ酸位置24及び30(配列番号150のアミノ酸位置Asn1800及びAsn1806に対応する)でN-グリコシル化されることができない。
【０４７５】
一実施態様において、N-グリコシル化Asn1806を含むが、N-グリコシル化Asn1800を含まないMUC16中のエピトープを認識する(すなわち、それは、MUC16に結合するのに、N-グリコシル化Asn1800ではなく、N-グリコシル化Asn1806を必要とする)第一のMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、N-グリコシル化Asn1800を含むが、N-グリコシル化Asn1806を含まないMUC16中のエピトープを認識する(すなわち、それは、MUC16に結合するのに、N-グリコシル化Asn1806ではなく、N-グリコシル化Asn1800を必要とする)第二のMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片と組み合わせて投与される。そのような第一のMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(このMUC16の第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;(ii)MUC16の第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如;及び(iii)MUC16の第四の形態(この第四の形態はグリコシル化されており、ここで、該第四の形態のアミノ酸配列は配列番号152である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力によって同定されることができ、ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞、MUC16の該第三の形態を組換え発現する細胞、及びMUC16の該第四の形態を組換え発現する細胞は、同じ細胞型のものである。そのような第二の抗体又はその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;(ii)MUC16の第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;及び(iii)MUC16の第四の形態(この第四の形態はグリコシル化されており、ここで、該第四の形態のアミノ酸配列は配列番号152である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如によって同定されることができ、ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞、MUC16の該第三の形態を組換え発現する細胞、及びMUC16の該第四の形態を組換え発現する細胞は、同じ細胞型のものである。
【０４７６】
具体的な実施態様において、該追加の薬剤は、卵巣癌を治療するために使用される薬剤である。具体的な実施態様において、該追加の薬剤は、膵癌を治療するために使用される薬剤である。具体的な実施態様において、該追加の薬剤は、肺癌を治療するために使用される薬剤である。具体的な実施態様において、該追加の薬剤は、乳癌を治療するために使用される薬剤である。具体的な実施態様において、該追加の薬剤は、卵管癌を治療するために使用される薬剤である。具体的な実施態様において、該追加の薬剤は、子宮(例えば、子宮内膜)癌を治療するために使用される薬剤である。具体的な実施態様において、該追加の薬剤は、原発性腹膜癌を治療するために使用される薬剤である。
【０４７７】
本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)は、追加の治療剤とともに、同時に又は連続的に(前及び/もしくは後に)投与することができる。該抗体又はその抗原結合断片及び該追加の治療剤は、同じ又は異なる組成物中で、及び同じ又は異なる投与経路によって投与することができる。第一の療法(これは、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)、又は追加の治療剤である)は、第二の療法(本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)、又は追加の治療剤)の投与の前に(例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、もしくは12週間前に)、それと同時に、又はその後に(例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、もしくは12週間後に)、癌(例えば、卵巣癌、膵癌、肺癌、乳癌、卵管癌、子宮(例えば、子宮内膜)癌、及び原発性腹膜癌)を有する対象に施すことができる。ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)と組み合わせて対象に投与される追加の治療剤は、同じ組成物(医薬組成物)中で投与される。他の実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)と組み合わせて投与される追加の治療剤は、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)と異なる組成物中で対象に投与される(例えば、2以上の医薬組成物が使用される)。
【０４７８】
(5.5.5  患者集団)
本明細書に提供される方法に従って治療される対象は、任意の哺乳動物、例えば、齧歯類、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、霊長類、又はヒトなどであることができる。好ましい実施態様において、該対象は、ヒトである。別の好ましい実施態様において、該対象は、イヌである。本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は、互換的に使用される。
【０４７９】
ある実施態様において、本明細書に提供される方法に従って治療される対象は、限定されないが、卵巣、肺、膵臓、乳房、子宮、卵管、もしくは原発性腹膜癌、又はMUC16を発現する任意の他の組織の癌を含む、MUC16陽性癌を有すると診断されている。
【０４８０】
以下の実施例は、限定としてではなく、実例として提供されている。
【実施例】
【０４８１】
(6.実施例)
(6.1  実施例1: MUC16/CA125のカルボキシ末端部分の発現は形質転換及び腫瘍浸潤を誘導する)
(6.1.1  序論)
MUC16の抗原性断片である血清CA125抗原は、1980年代初頭から卵巣癌の評価及び管理の中心であるが、その生物現象及び卵巣癌の発現への寄与はあまり理解されていない(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献1〜3を参照)。2001年に達成されたCA125のクローニングにより、小さい細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、推定切断部位の近位にあるエクトドメイン、及び各々156アミノ酸長の12〜20個のタンデムリピートの大きい重度グリコシル化領域を有する繋留型ムチンとしてのMUC16が初めて同定された(図1A)(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献4〜6を参照)。卵巣、卵管、及び子宮の漿液性癌は、多くの場合、大量のMUC16を発現し、異常なMUC16発現は、肺、膵臓、及び乳房の癌を含む、いくつかの他の悪性腫瘍に見出すことができる。他の繋留型ムチンの発現は上皮器官の共通の特徴であり、それらは、悪性腫瘍で過剰発現されることが多い。2つの著明な例は、多くの乳癌及び卵巣癌で過剰発現されるMUC1と膵癌及び消化器癌で特徴的に多く存在するMUC4である(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献7を参照)。これらのムチンはどちらも、形質転換特性を有することが確認されている(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献8及び9を参照)。これらの形質転換機構は異なっており、完全には理解されていない。MUC1は、核に移行して、転写因子として作用することが示されているβ-カテニン相同性領域を有する(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献10及び11を参照)。対照的に、MUC4は、その膜貫通領域内にHER結合ドメインを有し、少なくとも一部は、HERファミリーキナーゼを介して作用する(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献12及び13を参照)。MUC16は、これらのドメインの両方に対する相同領域を欠いており、独立に進化したと思われる(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献12を参照)。MUC1とMUC4の両方と比較して、MUC16の発現はより制限されており、通常、ほとんどミュラー管及び眼球上皮のみに発現される(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献14〜16を参照)。MUC16分子のタンデムリピート領域は、メソテリン及び他の間質タンパク質との重要な相互作用タンパク質として機能するように思われる(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献17を参照)。これらの相互作用は、おそらく、卵巣癌による古典的なパターンの漿膜拡散に関与している。臨床状況では、CA125抗原をコードするMUC16由来の高レベルの循環エレメントは、病期、悪性度、及び他の伝統的な臨床的因子とは独立に、有害な臨床転帰と関連している(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献18を参照)。MUC16のC末端を浸潤及び成長に重要なものと特定している者もいるが、形質転換に関与する近位MUC16配列の特定の領域は明らかにされていない(例えば、Therialtらの文献、Gynecol Oncol 2011, 121(3):434-443及びGiannakourosらの文献、Int. J. Oncol. 2015, 41(1):91-98を参照)。卵巣癌DNA中のMUC16をコードするゲノム領域の増幅及びMUC16 mRNAの過剰発現が癌ゲノムアトラス(The Cancer Genome Atlas)(TCGA)卵巣癌プロジェクトで認められており、より悪い転帰と関連している(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献19を参照)。マウスにおけるMUC16の喪失は明確な表現型と関連しているわけではなく、持続的な又は異常なMUC16発現の効果は不明である(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献20を参照)。本実��例におけるデータは、MUC16の114個のC末端アミノ酸残基(MUC16c114、配列番号133)の発現、特に、MUC16c114の残基Asn30(成熟MUC16(配列番号150)のAsn1806に対応する)のグリコシル化が、シグナル伝達、遺伝子発現、及び侵襲的な生物学的挙動の特定の変化と関連することを示している。
【０４８２】
(6.1.2  材料及び方法)
(6.1.2.1  MUC16カルボキシ末端(MUC16c114)及びMUC16-CA125ドメイン(MUC16c344) DNAコンストラクト並びにグリコシル化融合タンパク質の合成)
MUC16の切断形態(MUC16c344、MUC16c114、MUC16c80、及びMUC16c86と表記される;図1B及び図1C)をコードするDNAコンストラクトを作製した。phrGFP II-Cベクター(phrGFP)(Stratagene, LaJolla, CA)のEcoRV及びNotIマルチクローニングサイトを用いて、MUC16c114、MUC16c80、MUC16c86、及びMUC16c344 DNAを組み込み、GFPタンパク質が切断型MUC16融合タンパク質のカルボキシ末端に存在する状態で得られるGFP融合コンストラクトを作製した。鋳型としてのpBK-CMV-MUC16-B53 DNA(Yin BWTらの文献、International Journal of Cancer, 2002, 98(5):737-740)を用いて、MUC16断片(MUC16c344、MUC16c114、MUC16c80、及びMUC16c86)のPCR産物を作製し、PCR産物を1％アガロースゲル中で精製し、シークエンシングし、phrGFP II-Cベクター(phrGFP)のEcoRV及びNotIマルチクローニングサイトに挿入した。pFUSE-hIgG1-Fc2ベクターは、InvivoGen(San Diego, CA)から購入した。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマーをエクトドメインMUC16c57-114(配列番号150の位置1777〜1834)用に設計するか、又は制限酵素部位EcoRVをフォワードプライマーとして、及び制限酵素部位NcoIをリバースプライマーとして、117-244LGALS3の糖結合ドメインのDNA配列を合成した(Sigma-Genosys, The Woodlands, TX)。pBK-CMV-MUC16-B53 DNAを鋳型として用いて、MUC16c57-114断片のPCR産物を生成し、ATCC(Manassas, VA)から入手したLGALS3 cDNAクローン(MGC:2058 IMAGE:3050135 GenBank: AAH01120.1; DBSourceアクセッションBC001120.2)をDNA鋳型として用いて、LGALS3の糖結合ドメインのPCR産物を合成した。PCR産物を1％アガロースゲル中で精製し、シークエンシングし、pFUSE-hIgG1-Fc2ベクターに挿入した。
【０４８３】
(6.1.2.2  プライマー及びPCR)
MUC16-細胞質ドメイン(MUC16c114、カルボキシ末端114aa)のフォワード及びリバースプライマー
【化１６８】
2018509907.tif 000178
。フォワードプライマー中にEcoRV及びKOZAKがあり、リバースプライマー中にNotIがある、MUC16c344(システインループを1つだけ有する1つのタンデムリピート、344aa)
【化１６９】
2018509907.tif 000179
。MUC16c114-GFP DNAコンストラクトを用いて、クイックチェンジプライマーにより、MUC16c80及びMUC16c86コンストラクトを生成した。フォワードプライマー中にEcoRVがあり、リバースプライマー中にNcoIがある、MUC16c57-114 pFUSE-hIgG1-Fc2ベクター用のフォワード及びリバースプライマー
【化１７０】
2018509907.tif 000180
並びにpFUSE-hIgG1-Fc2ベクター用の117-244LGALS3の糖結合ドメインのフォワード及びリバースプライマー
【化１７１】
2018509907.tif 000181
。上記のプライマーは全て、Sigma Genosys, The Woodlands, TXにより合成された。
【０４８４】
PCR条件を以下のプロセスによって達成した:変性を達成するために、DNAを95℃で5分間融解させた。97℃で30秒間加熱し、60℃で1分間アニーリングさせ、72℃で1分間伸長させるという30回の反復サイクルを実施した。これに続いて、生成されたPCR産物鎖を72℃で5分間伸長させ、その後、4℃で一晩冷却した。
【０４８５】
phrGFP II-CベクターDNA、MUC16c114、MUC16c80、MUC16c86、MUC16c344、及びMUC16c678ゲル精製DNAを、EcoRV及びNotI(New England Biolabs, Beverly, MA)制限酵素を用いて、37℃の水浴で一晩、個別に消化した。pFUSE-hIgG1-Fc2ベクターDNA、MUC16c57-114、及び117-244LGALS3ゲル精製DNAを、EcoRV及びNcoI(New England Biolabs, Beverly, MA)制限酵素を用いて、37℃の水浴で一晩、個別に消化した。MUC16c114及びphrGFP; MUC16c344及びphrGFP;又はMUC16c678及びphrGFPの制限消化DNAをゲル精製し、T4リガーゼ(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)を用いて一晩ライゲーションした。同様に、MUC16c57-114及びpFUSE-hIgG1-Fc2; 117-244LGALS3及びpFUSE-hIgG1-Fc2の制限消化DNAをゲル精製し、T4リガーゼ(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)を用いて一晩ライゲーションした。ライゲーションされたDNAを、製造元のプロトコルに従って、XL-1 Blueスーパーコンピテント細胞(Stratagene, La Jolla, CA)に形質転換し、それらを、phrGFPベクター用のカナマイシン(50μg/mL、Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)を含むLB培地を含む寒天プレートに、又は25μg/mlのZeocin(Invitrogen, CA)を含むLB培地を含む寒天プレートにプレーティングした。クローンを翌日に選択し、ミニプレップDNAを、Wizard PlusミニプレップDNA精製システム(Promega Corporation, Madison, WI)を用いて抽出した。選択されたクローンのDNAを、MUC16及びphrGFPのフォワード及びリバースプライマーを用いて、MSKCC DNAシークエンシングコア施設でシークエンシングし、融合コンストラクト又はMUC16c57-114及びpFUSE-hIgG1-Fc2又は117-244LGALS3及びpFUSE-hIgG1-Fc2としての配列中のMUC16及びphrGFPの存在を確認した。そのようなクローン由来のメガプレップDNAを、Wizard PlusメガプレップDNA精製システム(Promega Corporation, Madison, WI)を使用することにより作製し、これにより、融合コンストラクトとしてのその配列中のMUC16及びphrGFP又はMUC16c57-114及びpFUSE-hIgG1-Fc2又は117-244LGALS3及びpFUSE-hIgG1-Fc2の存在も確認された。
【０４８６】
(6.1.2.3  蛍光活性化細胞選別(FACS))
トランスフェクトされた細胞をトリプシン処理し、洗浄し、血球計算盤によりカウントした。細胞を複数のエッペンドルフチューブに少なくとも0.5〜1×106個/チューブで分配した。細胞を、1％FCS及び0.025％アジ化ナトリウムを含むPBS(FACSバッファー)で洗浄した。表面FACS染色のために、細胞を、1μg/チューブのMUC16-カルボキシ末端モノクローナル体(4H11.2.5)の生体反応性上清、マウス抗ヒトOC125(M3519)(DakoCytomation, Dako North America社, Carpinteria, CA)なしで(二次抗体対照用に)、又はこれらとともに、氷上で30分間インキュベートした。エッペンドルフチューブ中の細胞を、1μg/チューブの非特異的アイソタイプマッチ対照マウス抗体(MSKCCモノクローナルコア施設から入手したIgG1モノクローナル体に対する13C4及びIgG2bモノクローナル体に対する4E11)でも表面染色し(データは示さない)、氷上で30分間インキュベートした。全ての細胞をFACSバッファーで3回洗浄した。細胞を1μg/チューブの二次抗体ヤギ抗マウスIgG1-PE又はIgG2b-PEとともに氷上で30分間インキュベートし、その後、FACSバッファーで3回洗浄した。細胞をFACS Caliburにより解析した。
【０４８７】
(6.1.2.4  細胞培養)
NIH/3T3(3T3)細胞(線維芽細胞)は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(ATCC, Manassas, VA)から入手した。A2780細胞は、ヒト卵巣癌細胞株である(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献28を参照)。両方の細胞株を公開されている条件に従って維持した。安定なMUC16陽性細胞株をMUC16発現ベクター(phrGFP-MUC16c344、phrGFP-MUC16c114、phrGFP-MUC16c80、及びphrGFP-MUC16c86)のトランスフェクションによって作出し、ジェネティシン(G418、Invitrogen, Grand Island, NY)を用いてそのそれぞれの培養培地中で選択し、緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現に基づいて単離した。MUC16c114トランスフェクタントは、推定切断部位からカルボキシ末端まで(配列番号150のアミノ酸1777〜1890)のMUC16タンパク質の細胞表面発現を有する(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献5を参照)。MUC16のカルボキシ末端(アミノ酸1547〜1890)にまで及ぶ344アミノ酸断片としてのMUC16タンパク質の細胞表面発現を有するMUC16c344-GFPベクターの発現を有する株を含む、より長いMUC16断片を有する細胞株を同様の方法で調製した(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献5を参照)。
【０４８８】
(6.1.2.5  トランスフェクション)
全てのコンストラクトを、製造元のプロトコルに従ってDOTAP(Roche Diagnostics, Indianapolis Corporation, IN)を用いて、NIH/3T3(3T3)及びA2780細胞に導入した。安定なトランスフェクタントを、400μg/mLのG418を用いて、3T3及びA2780細胞について、そのそれぞれの培養培地中で選択した。これらをMSKCCフローサイトメトリーコア施設(FCCF)でGFP発現について2回細胞選別し、選択された細胞を、最大15回の継代の間、株として成長させた。FACS解析によるルーチンのモニタリングを行って、これらの株のGFP陽性を確認した。これらの株のタンパク質抽出物を、抗hrGFP(Stratagene, La Jolla, CA)及び抗MUC16-カルボキシ末端モノクローナル抗体を用いるウェスタンブロットによって解析した(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献5及び14を参照)。
【０４８９】
(6.1.2.6  成長曲線)
1000個の安定なトランスフェクト細胞/ウェルをマルチプル96ウェル平底プレート中の200μLの培養培地/ウェルに播種し、37℃及び5％CO2で5日間インキュベートした。毎日、3つ組の培養プレートを25μL/ウェルのAlamar Blue(ABD Serotec Co. UK)で発色させ、37℃及び5％CO2で4時間インキュベートした。プレートを、530nMでの励起及び620nMでの放射を用いて、PerSeptive Biosystems CytoFluorマルチウェル蛍光プレートリーダーモデル# 4000で読み取った。4日間にわたる成長曲線を記録し、3つ組のプレートの平均値をそれに応じてプロットした。
【０４９０】
(6.1.2.7  軟寒天アッセイ)
安定なトランスフェクト細胞をアガロース懸濁液に入れ、薄いアガロース層の上にプレーティングし、足場非依存性コロニーを形成するその能力について解析した。ディッシュ当たり10mLの培地-アガロース懸濁液中の100〜500万個の細胞をプレーティングし、37℃及び5％CO2でインキュベートした。プレートをコロニー形成についてモニタリングした。追加の培養培地を4〜5日毎に重層した。11〜14日間培養した後、コロニーを数え、コロニーの写真を撮った。
【０４９１】
(6.1.2.8  真核生物発現ベクターへのトランスフェクション)
MUC16c57-114-pFUSE-hIgG1-Fc2及び117-244LGALS3-pFUSE-hIgG1-Fc2コンストラクトを、融合タンパク質を無血清培地中に発現及び分泌するヒト胚性腎臓(HEK) FreeStyle 293F細胞(Invitrogen, CA)に別々にトランスフェクトした。3枚の10％SDS-PAGEゲルに、pFUSE-hIgG1-Fc2対照空ベクター、MUC16c57-114-pFUSE-hIgG1-Fc2ベクター、及びLGALS3-pFUSE-hIgG1-Fc2ベクターで一過性トランスフェクトされたHEK 293F細胞由来の5μg/レーンの融合タンパク質上清を泳動させた。1枚のゲルを、製造元のプロトコルに従って、Gelcode試薬で直接染色した。2枚のゲル由来のタンパク質を、5％無脂肪乳-0.1％Tween-20を含むリン酸緩衝食塩水(PBST)で、シェーカー上で、室温で1時間ブロッキングした2枚のニトロセルロース膜に転写した。これらの膜を、5％無脂肪乳PBST中1:5,000希釈の抗ヒトIgG1-Fc-HRP(γ1鎖特異的)(Southern Biotech社、CA); 5％無脂肪乳PBST中1:2000希釈の4H11-HRP mAb(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献14を参照)、及び5％無脂肪乳PBST中1:200希釈の抗ヒトGAL3 mAb(Santa Cruz Biotechnology, CA)で、シェーカー上で、4℃で一晩プロービングした。GAL3膜をPBSTで3回洗浄し、5％無脂肪乳PBST中1:3,000希釈の抗マウスIgG-HRP二次抗体で、シェーカー上で、室温で1時間標識した。膜をPBSTで3回洗浄し、その後、これらをECL試薬(Perkin Elmer, NY)化学発光基質で5分間処理し、発光したシグナルをX線フィルム上に捕捉した。
【０４９２】
(6.1.2.9  浸潤)
基底膜浸潤をマトリゲル浸潤チャンバー(BD Biosciences, Bedford, MA)で決定した。マトリゲル遊走を48時間で3つ組のウェル中で測定し、phrGFPベクター対照と比較し、％phrGFP対照マトリゲル浸潤として表した。0.1μg/mLのツニカマイシン(Sigma-Aldrich, St. Louis MO cat # T7765)又は5μg/mLのMUC16c57-c114-pFUSE-hIgG1-Fc2又は5μg/mLの117-244LGALS3 pFUSE-hIgG1-Fc2融合タンパク質で処理された安定細胞株の48時間後のマトリゲル遊走を測定し、％phrGFP対照マトリゲル浸潤として表した。
【０４９３】
BD BioCoat(商標) Matrigel(商標)浸潤インサート又はチャンバー(カタログ# 354480、24ウェルプレート中)及び対照インサート(カタログ# 354578、24ウェルプレート中)は、BD Biosciences, MAから購入した。マトリゲル浸潤アッセイは、製造元のプロトコルに従って実施した。簡潔に述べると、24ウェルプレート中のマトリゲルチャンバー(-20℃で保存されたもの)及び対照インサート(4℃で保存されたもの)を室温に至らせておいた。両方のインサートを、インサート中で、及び24ウェルプレートの外側のウェル中で、37℃の5％CO2加湿インキュベーターにて2時間、0.5mLの無血清培地で再水和させた。培養した3T3又はA2780細胞をトリプシン処理し、培養培地で洗浄した。100万個の細胞を別の遠心分離チューブに分け、無血清培地で3回洗浄した。後に、これらの細胞を調整して、0.5mLの無血清培地中、10,000細胞にした。再水和させたインサート中の培地を除去し、このインサートを、化学誘引物質としての役割を果たすウェル中の0.75mLの10％胎仔ウシ血清(FBS)含有培養培地を含む新しい24ウェルプレートに移した。すぐに、無血清培地中の0.5mLの該細胞(10,000細胞)をインサートに添加した。適切な注意を払って、インサート及び外側のウェルに気泡が閉じ込められないように配慮した。24ウェルプレートを37℃の5％CO2加湿インキュベーターで48時間インキュベートした。インキュベーション後、綿棒をマトリゲル又は対照インサートに挿入して「擦る」ことにより、非浸潤細胞を膜の上表面から除去し、綿棒の先端を膜表面にわたって移動させながら、穏やかに圧力をかけた。培地に浸した第二の綿棒で擦ることを繰り返した。その後、蒸留水中の0.5mLの0.5％クリスタルバイオレット染料を含む新しい24ウェルプレート中で30分間、インサートを染色した。染色後、インサートを蒸留水の3つのビーカー中ですすいで、余分な染料を除去した。インサートを新しい24ウェルプレート中で風乾させた。浸潤した細胞を、200倍の倍率の倒立顕微鏡下で、手でカウントした。3つ組の膜のいくつかの視野をカウントし、図に記録した。
【０４９４】
(6.1.2.10  リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応)
RNA単離物をRiboPureキット(Ambion, Austin, TX)プロトコルに従って調製した。転移及び細胞外マトリックスタンパク質遺伝子のパネルのRT PCRを、以前に記載されている通りに、RT2 Profiler PCRアレイシステム(Super Array, Frederick, MD)を用いて実施した(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献29を参照)。
【０４９５】
(6.1.2.11  無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍成長)
トランスフェクトされた細胞株及び適当な対照細胞株を無胸腺ヌードマウスの側腹又は腹腔に導入し、日常的な動物の世話は、MSKCC抗癌評価コア施設(MSKCC Antitumor Assessment Core Facility)によって提供された。腫瘍成長評価実験のために、各々の腫瘍株由来の200万個の細胞を5〜15匹の無胸腺ヌードマウスの各々に移植した。腫瘍測定を週2回行い、腫瘍成長を、MSKCC RARCガイドラインに従って、1500mm3の最大サイズまで記録した。
【０４９６】
(6.1.2.12  ウェスタンブロット解析)
安定細胞株を、10cmディッシュで、そのそれぞれの培養培地中で培養し、37℃及び5％CO2で3日間インキュベートした。その後、これらを氷冷PBSで2回洗浄し、1〜2mLの氷冷PBSで擦り落とし、遠心分離した。ペレット化した細胞を、0.2mLの改変Ripa溶解バッファー(20mM Tris-HCL、pH 7.4; 150mM NaCl; 1％NP-40; 1mM Na3VO4; 1mM PMSF; 1mM DTT;プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル(cat # 11836170001、Roche Diagnostics, IN製)を含む)で、氷上で30分間溶解させ、4℃で10分間遠心分離した。上清のタンパク質濃度をBio-Radタンパク質アッセイ(BioRaD Laboratories, Hercules, CA)を用いて測定した。等量のタンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で分離し、BioRad転写装置を用いて4℃でPVDF膜に転写した。膜を、0.1％Tween-20を含むPBS(PBST)中の3％ウシ血清アルブミン(BSA)又は5％無脂肪乳で、4℃で一晩ブロッキングした。膜を種々の一次抗体(Cell Signaling, MA: Akt cat #9272;ホスホ-Akt(Ser473)(193H12) cat # 4058; p44/43 MAPK(Erk1/2) cat # 9102;ホスホ-p44/43 MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204) cat #9101);(Sigma-Aldrich社, St. Louis, MO:β-アクチン cat # A5441);(Southern BioTech, Birmingham, AL:抗ヒト-Fc-IgG1-HRP cat # 9054-05、及びAbgent, San Diego, CA:ポリクローナルLGALS3 抗体 cat # AP11938b)で4℃で一晩発色させた。膜をPBSTで3回洗浄し、HRPコンジュゲート抗マウス又は抗ウサギ抗体(GE Healthcare, UK)(1:5000希釈)で室温で1時間で発色させた。その後、膜をPBS-Tで3回洗浄し、Western Lightning化学発光試薬(ECL, Perkin Elmer)で室温で1〜5分間発色させ、シグナルをHyBlot CLフィルム(Denville Scientific社. Metuchen, NJ)上で現像した。
【０４９７】
(6.1.2.13  MUC16のTCGA発現解析)
包括的なゲノムデータは、316個の漿液性卵巣癌試料について、TCGAプロジェクト(tcga.cancer.gov)の一部として入手可能であった。遺伝子レベルのDNAコピー数のコールを、GISTICを用いてCBSセグメント化Agilent 1Mマイクロアレイデータから得た。MUC16 mRNA発現を3つの異なるプラットフォーム(Agilent 244K全ゲノム発現アレイ、Affymetrix HT-HG-U133A、及びAffymetrix Exon 1.0アレイ)を用いて測定し、遺伝子発現値を以前に記載されている通りに導出した(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献30を参照)。MUC16中の体細胞突然変異を、全エクソーム捕捉と、それに続く、次世代シークエンシング(SOLiD又はIllumina)により同定した。全てのTCGAデータをcBio Cancer Genomics Portal(www.cbioportal.org)からダウンロードした。その後、mRNA発現値を対応するDNAコピー数のカテゴリー(ホモ接合性欠失、半接合性欠失、二倍体、増加、高レベルの増幅)と関連付け、体細胞突然変異を全試料にわたって重ね合わせ、以前に記載されている通りに、統計的フレームワークR(www.R-project.org)を用いて、ボックスプロットとしてプロットした(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献31を参照)。臨床データは、TCGAデータポータル(tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)から入手した。
【０４９８】
(6.1.2.14  MUC16c354トランスジェニックマウス)
コンディショナルなカルボキシ末端354アミノ酸(MUC16c354)トランスジェニックコンストラクトを、ベクターphrGFP II-C(Stratagene, La Jolla, CA)を用いて作製し、CMVプロモーターをベクターpCAG-CreERT2(Addgene, Cambridge, MA)由来のCAGプロモーターと交換した。MUC16c354断片を、Yin BWらによって作製されたコンストラクトB53から、PCRによって増幅させた(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献5及び6を参照)。MUC16c354コンディショナルコンストラクトは、以下のユニット: pCAG、5'loxP、hrGFP、BGHpA、3'loxP、MUC16c354、HA、及びSV40pAを含有する。
【０４９９】
上記のMUC16c354コンディショナルトランスジェニックコンストラクトを用いて、MSKCCマウス遺伝学コア施設(Mouse Genetics Core Facility)でB6CBAF1/Jマウスに対する顕微注入処置を行った。12匹のMUC16c354コンディショナルトランスジェニックマウスを99匹のマウスからサザンブロットにより同定した。全12匹のプロファウンダーをB6.FVB-Tg(EIIa-cre)C5379Lmgd/Jマウス(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, MI)と交配させて、2つのloxPの間に位置するhrGFPを除去した。各々のプロファウンダーのMUC16c354 PCR陽性雌マウスを解剖した。これらの解剖されたマウス由来の器官(脳、結腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、卵巣、及び脾臓)を細かく切り、ホモジナイズした。タンパク質試料をウェスタンブロットにより解析して、MUC16c354を高発現するファウンダーを特定した。得られたトランスジェニックマウスを混合バックグラウンドで維持した。
【０５００】
トランスジェニックMUC16c354マウスの2匹のファウンダーをp53ヘテロ接合性マウス(B6.129S2-Trp53tm1Tyj/J)(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, MI)と掛け合わせて、二重トランスジェニックMUC16c354:p53+/-を作出した。得られたトランスジェニックマウスを混合バックグラウンドで維持した。全てのマウスを抽出された足指又は尻尾のDNAを用いるPCRによりジェノタイピングした。全ての実験動物をMSKCC施設内動物管理使用委員会及び研究動物資源センターにより承認されたガイドライン並びに実験動物の管理使用に関するNIH指針に準拠して維持した。
【０５０１】
(6.1.2.15  組織学的解析)
12カ月齢のマウスを屠殺し、剖検した。肉眼検査の後、解剖された組織試料を10％中性緩衝ホルマリンで24時間固定し、その後、アルコール及びキシレン中で処理し、パラフィンに包埋し、5μmの厚さで切削し、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)で染色した。組織は、獣医病理学者(SM)によって調べられ、腫瘍性病変と非腫瘍性病変が、齧歯類病理命名法に関する公表されたガイドラインに従って診断された。
【０５０２】
(6.1.2.16  統計解析)
インビトロ成長、浸潤、及び軟寒天成長潜在能力の検討のために、スチューデントの対応のある両側t検定を用いて、群を比較した。χ二乗検定を用いて、提供されているソフトウェア(SuperArray)に従って、RT-PCRデータを有意性について解析した。各々の動物における全腫瘍体積の経時的な曲線下面積評価を用いて、腫瘍体積の比較を行った。全ての動物が両方の群で生きていた最後の日を基にして、腫瘍体積の評価を行った。ノンパラメトリック順位検定(ウィルコクソン二標本検定)を用いて、群間分布差について検定した。動物生存研究で、事象を腫瘍体積が1,500mm3を超えるまでの時間又は潰瘍形成までの時間と定義して、時間事象解析を行った。1,500mm3未満の腫瘍体積を有する動物を最大60日間追跡調査し、その後、打ち切った。カプラン-マイヤー法を用いて、生存分布を推定した(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献32を参照)。
【０５０３】
(6.1.3  結果)
MUC16タンパク質のタンデムリピート領域の明かな切断及び放出の後、このタンパク質のカルボキシ末端の約114アミノ酸(c114)は細胞表面に残ると考えられており、この分子のこの部分の潜在的な機能は不明である。3T3線維芽細胞及び卵巣癌細胞株の悪性形質転換及び挙動におけるMUC16タンパク質のこの最近位部分の役割を解析した。切断部位の近位にある残りのc114アミノ酸エレメントの効果を検討するために、2つのベクター:(1)MUC16c114-GFPベクター及び(2)切断型MUC16c344-GFPベクター(図1)を設計し、これらのベクター及びphrGFP対照ベクターを3T3線維芽細胞に独立にトランスフェクトした。MUC16c114発現細胞株及びMUC16c344発現細胞株をG418を用いて選択し、維持し、MUC16c114及びMUC16c344の安定発現を、MUC16カルボキシ末端のユニークなアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体を用いるFACS解析により確認した(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献14を参照)。MUC16タンパク質由来の344アミノ酸(配列番号132)を発現する細胞株(MUC16c344-GFP株)は、FACS解析により細胞表面でOC125抗体によって認識される古典的なCA125エピトープを担持しており、CA125は細胞培養上清中に放出される。OC125は、MUC16c114-GFP細胞を認識しない。しかしながら、トランスフェクトされた株は全て、推定切断部位の近位にあり、かつMUC16エクトドメイン特異的4H11抗体によって認識されるMUC16c114細胞外配列(配列番号133)について細胞表面陽性であった(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献14を参照;図1)。
【０５０４】
(6.1.3.1  3T3細胞)
MUC16の切断後の残存エレメントによって付与される形質転換特性を調べるために、3T3 MUC16c114-GFP及び3T3 MUC16c344-GFP細胞株の特徴を解析し、これら2つの最小MUC16エレメントの効果をベクター対照と比較した。MUC16配列の最近位の114アミノ酸(MUC16c114)又は近位の344アミノ酸(MUC16c344)のいずれかの発現は、親株のインビトロ成長速度と比較したとき、トランスフェクトされた細胞株のどのインビトロ成長速度にも有意な効果を有しなかった(図2A)。しかしながら、MUC16タンパク質の同じエレメントの発現は、軟寒天クローニングにおいて3T3足場依存性成長を実質的に変化させた。最小c114断片とc344断片はどちらも、ベクターのみの対照と比較して軟寒天コロニーの数を有意に増加させた(図3A)。MUC16タンパク質の近位部分の発現は、phrGFPベクター対照でトランスフェクトされた3T3細胞と比較して、古典的マトリゲル浸潤アッセイでMUC16+3T3細胞の遊走も増強した(p＜0.0001)(図3B)。様々なMUC16タンパク質断片を発現する3T3細胞を選択された転移及び浸潤遺伝子転写物の発現について調べたとき、ケモカインリガンド12(CXCL12)、カドヘリン11(CDH11)、並びにマトリックスメタロプロテイナーゼMMP2及びMMP9を含む、多数の浸潤遺伝子が上方調節されていた(図3C)。フィブロネクチン(FN1)及びニューロフィブロミン(NF2)を含む他の転写物は一貫して減少している。MUC16はインビボ腫瘍成長を変化させ、かつMUC16タンパク質を担持する細胞の浸潤特性を増大させるので、MUC16は、MUC1及びMUC4の効果と同様の方法で、標準的なシグナル伝達経路を介して作用し得る。相互作用するERK及びAKT経路は、卵巣癌における重要なシグナル伝達機構及び腫瘍細胞浸潤の調節因子として以前に同定されている(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献21及び22を参照)。図3Dに示されているように、pAKT(S473)及びpERK(T202/Y204)の増大から明らかな両方の経路の活性化が見られた。
【０５０５】
発癌性形質転換の最も明白な特徴は、免疫不全マウスで成長を促進する能力である。腫瘍成長速度に対するMUC16の効果を測定するために、側腹腫瘍モデルを用いて、定期的な腫瘍測定を容易にした。図3Eに示されているように、MUC16を発現する3T3細胞株(ベクターphrGFP、MUC16c114-GFP、及びMUC16c344-GFP)を無胸腺ヌードマウスの側腹に移植したとき、MUC16c114-GFPとMUC16c344-GFPはどちらも、4週でベクターのみの対照と比較してより大きい腫瘍を形成した。MUC16c114-GFPタンパク質を発現する細胞株とMUC16c344-GFPタンパク質を発現する細胞株の間に統計的な差はなく(図3E)、MUC16発現の発癌効果がこの分子の最近位部分と関連していることを示唆した。この腫瘍成長速度の増加は、腫瘍成長の期間の全体を通して見られ、(血清CA125としての)高レベルのMUC16発現と不良な生存との臨床的関連と一致している(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献18を参照)。
【０５０６】
(6.1.3.2  A2780ヒト卵巣癌細胞)
3T3細胞におけるMUC16タンパク質の発現は形質転換の特徴と明確に関連していたが、完全に形質転換した卵巣癌細胞株の中には、培養したとき、MUC16発現を欠くものもある。ヒト卵巣癌細胞の挙動に対するMUC16の寄与を調べるために、A2780細胞(MUC16を発現しないヒト卵巣癌細胞株)をMUC16c114-GFP又はMUC16c344-GFPでトランスフェクトした。MUC16発現細胞をG418により選択し、MUC16及びGFP発現についてのFACSに供した。これらの細胞は、MUC16発現がなくても軟寒天中でよく成長するので、マトリゲル浸潤に対するMUC16c344及びMUC16c114の効果を解析した。図4Aに示されているように、MUC16c114及びMUC16c344発現は、A2780細胞におけるマトリゲル浸潤を明らかに促進した。同様に、ERK及びAKT経路の活性化に対するMUC16c114及びMUC16c344の効果は、3T3細胞で見られるものと類似しており、pAKT(S473)とpERK(T202/Y204)の両方の基礎レベルを増大させた(図4B)。したがって、悪性卵巣細胞株でも、MUC16カルボキシ末端エレメントの発現の増大は、浸潤の増大及び癌遺伝子活性化と関連している。さらに、MUC16c114及びMUC16c344トランスフェクトA2780株のインビボ腫瘍成長を解析した(図4C)。両方の状況において、MUC16c114細胞株及びMUC16c344細胞株は、ベクターのみの対照よりも急速に成長した。このヒト癌モデルにおいて、ベクター対照は、実際、十分な速度で成長し、最後には動物を死滅させた。
【０５０７】
(6.1.3.3  グリコシル化研究)
形質転換に関与するMUC16c114の特定の部分を決定するために、2つのさらなるMUC16断片:(1)MUC16c114のエクトドメイン由来の34アミノ酸配列(原著公開文献で付番されている、位置1798〜1831)が欠失しているMUC16c80(図1D;配列番号135)(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献5を参照);並びに(2)MUC16c114コンストラクトがMUC16のエクトドメイン全体を保持しているが、細胞質ドメインの推定Ezrinドメイン、潜在的なチロシンリン酸化部位、及びSH2ドメイン由来の28アミノ酸配列(位置1857〜1884)を除去しているMUC16c86(図1D;配列番号134)を構築した。これらのコンストラクトを3T3細胞に導入し、残りのMUC16c80及びMUCc86配列の細胞表面発現についてFACSにより選択した。その後、これら2つのさらなる細胞集団をMUC16c80及びMUCc86依存的変化について調べた。MUC16c86コンストラクト(インタクトなエクトドメインを有するコンストラクト)は、MUC16c80コンストラクト(インタクトな細胞質ドメインを有するコンストラクト)よりもはるかに大きい軟寒天コロニー形成能力を保持していた(図5A)。これは、マトリゲル浸潤能力についても当てはまった(図5B)。MUC16c80発現3T3細胞は、phrGFPベクター対照の浸潤速度と統計的に異ならない浸潤速度を有していた。対照的に、MUC16c86発現3T3細胞は、インタクトなMUC16c114及びMUC16c344細胞と同様の、より浸潤性の高い表現型を保持していた。AKT及びERK経路の活性化を調べたとき、結果は、軟寒天コロニー及びマトリゲル浸潤研究と一致した(図5C)。(完全にインタクトなエクトドメインを有しない)MUC16c80断片の発現は、ERK及びAKTを活性化せず、phrGFPベクター対照と類似していたが、対照的に、(インタクトなエクトドメインを有する)MUC16c86を発現する3T3細胞は、ERK及びAKTの活性化に関して完全なMUC16c114を発現する3T3細胞と類似していた。最後に、インタクトなエクトドメインの重要性を異種移植腫瘍モデルで確認した。
【０５０８】
インタクトなMUC16エクトドメインの喪失(3T3 MUC16c80)は、MUC16c114対照と比較して、MUC16c114依存的3T3成長増強の喪失をもたらし、一方、MUC16c86発現3T3細胞は、わずかに成長が遅延していたが、MUC16c114発現3T3細胞と類似した全体的効果を有していた(図5D)。したがって、MUC16c114断片の細胞外部分は、3T3細胞におけるMUC16の形質転換効果に関与していた。MUC16c114の細胞外断片の役割をさらに調べるために、MUC16c114発現3T3細胞に関して、MUC16を標的とする抗体のパネルを用いて、共沈研究を実施した(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献14を参照)。共沈する単一バンドは銀染色によって同定されず、EGFR、インテグリン、及びHER3の特異的ウェスタンブロットは陰性であった。しかしながら、MUC16c114配列の解析により、エクトドメインの3つの潜在的N-グリコシル化部位(Asn1777、Asn1800、及びAsn1806(図6、配列番号132及び配列番号133))が役割を果たし得ることが示唆された。これらのN-グリコシル化部位の役割を解析した。部位特異的点突然変異を用いて、3つ全てのアスパラギンをアラニンに変化させた。MUC16c114-N123と表記される、この修飾MUC16c114コンストラクトを3T3細胞に導入し、MUC16c114-N123発現細胞をFACS及び4H11エクトドメイン抗体により単離した。図7Aに示されているように、これらのアスパラギンからアラニンへの突然変異は、もとのMUC16c114発現ベクターで見られるMUC16c114誘導性のマトリゲル浸潤の増強を3T3細胞で完全に無効化した。N-グリコシル化の役割を確認するために、3T3細胞をグリコシル化阻害剤のツニカマイシン(0.1μg/mL)で処理し、マトリゲル浸潤の顕著な減少が認められた。MUC16c114細胞外配列の役割をさらに調べるために、2つの合成タンパク質阻害剤も試験した。MUC16外部配列(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献5で付番されている位置1777〜1834)をヒトFc骨格pFUSEに接続して(MUC16c57-c114 pFUSE)、「ダミー」受容体を提供した。このコンストラクトをMUC16c114浸潤対照とpFUSEベクター対照の両方と比較した。図7Bに示されているように、「ダミー」受容体コンストラクトは、マトリゲル浸潤に対するMUC16c114発現ベクターの全体的効果を減少させた(図7)。レクチンがグリコシル化MUC16c114タンパク質の効果に関連があると仮定して、第二の阻害剤を、LGALS3の糖結合ドメイン(アミノ酸117〜244;図7及び図8)(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献23を参照)が同じpFUSE骨格に接続されたもの(117-244LGALS3pFUSE)から構築した。ツニカマイシンと同様、これらのタンパク質阻害剤はどちらも、MUC16c114と他の細胞表面タンパク質との相互作用を妨害したが、pFUSEベクターのみでは効果がなかった(図7B)。他の妨害と同様に、pAKT発現及びpERKに対する効果は、図7Cに示されているように、N-グリコシル化部位を除去したとき、マトリゲル浸潤の喪失と同時に減少した。しかしながら、MUC16c114-N123コンストラクトは、4H11(MUC16エクトドメイン特異的)結合によって示されるように、高レベルのMUC16c114-N123タンパク質の発現を有していた。N-グリコシル化の喪失の影響は、図7Dに示されているような、nu/nuマウスにおけるトランスフェクト3T3細胞の成長の低下においても同様に確認された。
【０５０９】
(6.1.3.4  トランスジェニックマウス)
トランスジェニックマウスにおけるカルボキシ末端MUC16エレメントの発現の効果及び自然発生的な腫瘍形成の割合を調べた。MUC16c354(完全なc114配列及び最近位のCA125担持タンデムリピート)を発現するコンディショナルトランスジェニックマウスを作製した。CMV初期エンハンサー＋ニワトリβアクチンプロモーター(CAG)を用いて、全てのマウス組織における実質的なMUC16c354発現を強制した。ヒト卵巣の生理機能がマウス生殖器系と非常に異なり、組織特異的卵巣プロモーターが弱く、かつトランスジェニックシステムで使用するのが比較的難しいので、この戦略を選んだ。これらのマウスについての戦略を図9Aに示す。
【０５１０】
コンディショナルトランスジェニック動物を、図9Bに示されているように、サザンブロットによって選択し、EIIa-Creマウスと掛け合わせて、MUC16c354トランスジェニックファウンダーを生じさせた。図9Cに示されているように、2匹のファウンダーを選び、MUC16c354トランスジェニックマウスのコロニーを作り出した。この2匹のファウンダーは、多くの器官、例えば、脳、結腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、卵巣、及び脾臓でMUC16c354を高発現する。これらのマウスは、MUC16c354の広範な異所性発現から影響を受けず、正常な雄:雌子孫比、正常な受精能、及び2年を超える明らかに正常な生存期間を有する。3カ月間隔で最大1年の対照集団及びMUC16c354トランスジェニックマウス由来の2匹の外見上健康な動物(雄1匹及び雌1匹)の剖検では、高齢の雌マウスにおける軽度/中程度の子宮内膜過形成が目立つだけであったが、発生率及び重症度は、野生型対照と顕著には異ならなかった。選択された組織を図10に示す。1つの自然発生的軟部組織腫瘍(肉腫)しか、2年以上観察した100匹を超える動物のコロニーで認められなかった。
【０５１１】
この結果に基づいて、「セカンドヒット」が必要となる可能性があるという仮説を立てた。BRCA1突然変異のマウスモデルもセカンドヒットを必要とし、p53の喪失が腫瘍の頻度を顕著に増加させたことは注目に値する。MUC16c354マウスをJackson Laboratoryからのp53+/-マウスと掛け合わせた。初期影響は限られていた。しかしながら、約6カ月後、p53+/-を有するMUC16c354マウスは、正常な対照動物の速度よりも高い速度で軟部組織の自然発生的肉腫性腫瘍及びリンパ腫を発症し始めた。選択された腫瘍を図9Dのパネル挿入図に示す。これらのマウスのカプラン-マイヤー生存を図9Eに示す。MUC16c354:p53+/-マウスは、自然発生的腫瘍発生のために、有意により悪い全生存を示した(p＜0.014)。各々の群で見られた腫瘍の総数は: p53+/-マウス、20/107匹のマウス; MUC16c354及びp53+/-マウス、34/91匹のマウス; MUC16c354マウス、1/72匹のマウス;野生型マウス、0/91匹のマウスであった。8つの選択された腫瘍をp53ゲノムシークエンシングについて調べたとき、自然発生的腫瘍は全て、正常なp53アレルを喪失しており、MUC16依存的腫瘍発生が正常なp53機能の喪失も必要とすることを示した。
【０５１２】
(6.1.3.5  卵巣TCGA)
実験モデルにおける形質転換及び腫瘍侵襲性に対するMUC16断片に基づいて、MUC16の遺伝子変化と卵巣癌の転帰の関連を調べた。TCGA卵巣癌プロジェクトは、臨床転帰データを含む完全なデータを備えた316種の漿液性卵巣癌を含むよく研究されたコレクションである。MUC16タンパク質の発現は癌挙動の重要な原動力であるので、MUC16 mRNA発現に対するMUC16コピー数の影響を解析した。MUC16転写物発現は、MUC16遺伝子コピー数に概ね関連していたが、調べた群の全て(当然ながら、MUC16の稀なホモ接合性欠失を除く)においてMUC16転写物発現に広範な変動があった。ほとんどの場合、MUC16 mRNA発現は、対照として含まれる正常な卵管試料よりも大きい転写物数でクラスター化した。遺伝子コピー数は、MUC16タンパク質の発現を変化させる可能性があるいくつかの変数の1つであるが、MUC16 mRNA発現(及び当然、MUC16タンパク質)が漿液性卵巣癌で増大していることが多いことは明白である。TCGAデータセットにおける臨床転帰に対するMUC16過剰発現又は突然変異の複合的影響も調べた。TCGAデータセットをMUC16発現五分位数に分けたとき、最大のMUC16発現を有する20％の患者は、より低いMUC16発現を有する患者よりも有意に悪い生存率を有していた(p＝0.02969)。図11Aに示されているように、この関係は、MUC16突然変異を有する18人の患者を高MUC16発現群に含めるとさらに強くなった(p＝0.02117)。まとめると、この解析から、MUC16発現が卵巣癌を有する患者の生存に対する悪影響を有することが示され、本発明者らの前臨床モデルで同定されたMUC16発現の負の生物学的効果が確認される。
【０５１３】
卵巣癌は、多くの場合、PI3K経路の活性化を示す。卵巣癌は、通常、コピー数の変化によって特徴付けられるので、これらの活性化は、主に、点突然変異事象ではなく、増幅及び過剰発現を通じて生じる。本発明者らの細胞株モデルにおけるPI3K/AKT経路の活性化に基づいて、PI3K経路におけるMUC16と他の活性化遺伝子変化の関係を調べた。図11Bに示されているように、MUC16と関連する過剰発現及び突然変異事象は、通常、PTEN喪失、AKT1、AKT2、又はPI3KCAの増幅のような他の経路事象を補完する。このMUC16駆動性AKT活性化の機構は依然として不明である。さらに、ERK活性化の役割を調べたが、MUC16発現とERK経路突然変異の関連は確認されなかった。
【０５１４】
(6.1.4  考察)
CA125抗原をコードするMUC16は、卵巣癌を有する多くの患者の血漿中に循環する(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献1を参照)。MUC16は、その発現がミュラー組織の外側に限定されている点で、繋留型ムチンの中で独特である(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献2及び14を参照)。腫瘍の大きさと独立した有害な予後因子と見なされることが増えているが、その負の影響の生物学的機構は、十分には理解されていない(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献18を参照)。この分子のNH2-部分は、CA125抗原をコードし、かつメソテリン及びいくつかのガレクチンの重要な接着パートナーとしての機能を果たすと思われる多数のタンデムリピートを含む(図1A)(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献5、17、及び24〜26を参照)。これらの接着機能はMUC16関連の有害転帰に極めて重要であることが示唆されているが、これらの研究が、観察された卵巣癌細胞挙動の変化の全てを説明しているわけではない。MUC16糖タンパク質のクローニングにより、MUC16遺伝子産物に関する基本的な構造情報が提供された(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献4及び5を参照)。本実施例に提示されたデータは、MUC16が環境から癌細胞へのシグナル伝達を媒介し得ることを示す最初のデータであり、特に、本実施例に提示されたデータから、グリコシル化MUC16エクトドメインがMUC16による癌細胞挙動の変化にとって極めて重要なものとして特定される。
【０５１５】
本実施例は、MUC16のカルボキシ末端由来の114アミノ酸がNIH/3T3(3T3)細胞を形質転換し、軟寒天成長の増大とマトリゲル浸潤の増大の両方を支持するのに十分であることを示している。MUC16の最も膜に近いC末端部分をMUC16誘導性挙動における極めて重要なエレメントと特定している者もいるが、本発明者らは、これらの挙動を保持されたMUC16エクトドメイン中のN-グリコシル化部位と関連付けている。これらの変化は、遺伝子発現プロファイルの変化、並びにMMP2、MMP9、CXCL12、及びCDH11などの極めて重要な浸潤遺伝子の発現の増大と関連している。より長いエレメントはより悪性の強い挙動を誘導することができるが、推定切断部位の近位の残りの114アミノ酸でさえも、3T3細胞で浸潤遺伝子発現の同じ変化を誘導するのに十分である。さらに、MUC16c114のAsn30(成熟MUC16(配列番号150)のAsn1806に対応する)のグリコシル化は、MUC16c114発癌特性に不可欠であった。任意の特定の理論に束縛されるものではないが、これらの研究結果は、残りの細胞外ドメインと膜貫通ドメイン及び細胞質テールを合わせたもの含む、このタンパク質の最近位部分による「外から内への」シグナル伝達とほとんど一致する。Theriault(Therialtらの文献、Gynecol Oncol 2011, 121(3):434-443)及びGiannakouros(Giannakourosらの文献、Int. J. Oncol. 2015, 41(1):91-98)の結果とは対照的に、細胞内の細胞質ドメインの喪失は、グリコシル化エクトドメインの喪失よりも影響が小さかった。これらの違いは、選ばれた特定の突然変異及び発現を低下させる方法を反映している可能性がある。「内から外への」シグナルは、軟寒天及びヌードマウスにおけるMUC16発現細胞の着床及び成長を促進する遺伝子プログラムの転写を活性化するように思われる。トランスフェクトされた細胞を一般的な発癌経路の活性化について調べると、AKT経路とERK経路の両方がMUC16の構成的発現によって活性化されるように思われる。MUC16がAKT/ERKリン酸化を増大させる機構は不明確であり、さらなる研究を必要とする。共沈する受容体が存在しないことから、他の機構も関与し得ることが示唆される。MUC16配列は非常に異なっているが、MUC1とMUC4の両方を含む他の繋留型ムチンは、3T3細胞及びラット線維芽細胞でシグナル発生癌遺伝子として作用することが示されている(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献8及び9を参照)。癌細胞表面のムチンの役割は、未だ規定されていない機構を介して重要な役割を果たしている可能性がある。
【０５１６】
3T3細胞での研究結果に基づくと、MUC16トランスジェニックマウス実験の結果は非常に支持的である。単独で、同じMUC16近位354配列を、トランスジェニックマウスに有害効果を及ぼすことなく、ほとんど全てのマウス組織で容易に発現させることができた。自然発生的な腫瘍形成の割合はこれらのマウスで非常に低く、生殖機能は影響を受けていないように思われた。しかしながら、他のマウス卵巣癌モデルと同様、p53機能の喪失は、MUC16依存的腫瘍形成において強い許容的役割を果たしているように思われる(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献27を参照)。これらの結果は、TCGAデータセットにおいて卵巣癌を特徴付ける、均一なp53不活化と確かに一致している。
【０５１７】
これらの研究結果は、MUC16と関連した細胞挙動及び遺伝子転写の変化を説明するものである。このインビトロ及びインビボモデルは、漿液性卵巣癌におけるMUC16発現レベルの有害作用と一致しており、卵巣癌の挙動の発症誘因としてのMUC16の理解を促進する。増大するCA125発現の悪い影響は、MUC16(+) 3T3トランスフェクタントのインビボ腫瘍成長及び致死率の増大と一致している(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献18を参照)。
(6.1.5  実施例1で引用された参考文献)
【０５１８】
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【０５１９】
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【０５２０】
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【０５２１】
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【０５２２】
5.   Yin BW, Lloyd KO (2001) Molecular cloning of the CA125 ovarian cancer antigen: identification as a new mucin, MUC16. J Biol Chem 276: 27371-27375.
【０５２３】
6.   Yin BW, Dnistrian A, Lloyd KO (2002) Ovarian cancer antigen CA125 is encoded by the MUC16 mucin gene. Int J Cancer 98: 737-740.
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【０５５０】
(6.2  実施例2: MUC16グリコシル化抗体)
(6.2.1  序論)
OC125抗体によって認識されるCA125抗原(下記の第6.2.5節に列挙されている参考文献1を参照)は、MUC16糖タンパク質の細胞外部分由来のタンデムリピートドメイン中で発現される重度グリコシル化抗原である(下記の第6.2.5節に列挙されている参考文献2及び3を参照)。この循環抗原は、主に、良性又は悪性のミュラー組織に由来し、ヒト卵巣癌の腫瘍マーカーとしてFDAに認可されているが、発癌におけるその機能及び役割は不明である(下記の第6.2.5節に列挙されている参考文献4〜6を参照)。MUC16は、複合繋留型ムチンのファミリーに属し、それは、大きい重度グリコシル化細胞外ドメイン、膜と推定切断部位の間にある小さいエクトドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、及び短い細胞質テールからなる(図1)(下記の第6.2.5節に列挙されている参考文献7及び8を参照)。ほとんどのMUC16タンパク質は、切断後、周囲の空間に放出され、エクトドメインは細胞表面に残る。OC125及び他のMUC16反応性モノクローナル抗体(mAb)の大半は、この分子の切断部分にのみ存在するタンデムリピート領域中の抗原と反応する。これらのエピトープは循環中に見られる可能性が高いので、既存のmAbを用いて、残りのMUC16タンパク質断片の結末を追跡することはできず、MUC16発現の真の分布を正確には反映しない可能性がある(下記の第6.2.5節に列挙されている参考文献9を参照)。グリコシル化された表面タンパク質が、EGFR、PDGFR、及びその他のようなチロシンキナーゼ受容体のN-グリコシル化部位とのガレクチン3に基づく相互作用を通じて細胞増殖及び分化を調節することができることを示している者もいる(KS Lau Cell 129:123, 2007)。実施例1(第6.1節を参照)に示されているように、MUC16の近位部分(わずか114アミノ酸程度のもの)は、不死化3T3細胞を形質転換することができ、この効果は、ツニカマイシンによって無効化されるように思われる。
【０５５１】
本実施例は、これらの効果を媒介する正確なグリコシル化部位及びMUC16依存的形質転換におけるガレクチン3の必須の役割を示している。したがって、接着及び浸潤などの重要なMUC16媒介性癌機能を阻害するために、グリコシル化特異的な形で近位ペプチド配列(例えば、MUC16c114)に結合することができる抗体を開発した。規定の合成N-糖ペプチド抗原を重要なエピトープ模倣体として使用することにより、MUC16エクトドメイン内の重要なN-グリコシル化部位に対するモノクローナル抗体を作製した。効果のない他の非グリコシル化タンパク質に対するmAbとは対照的に、これらの抗体は、MUC16駆動性のマトリゲル浸潤、癌遺伝子活性化、及び腫瘍成長を減少させることにより、MUC16の発癌性生物現象を阻害した。これらの抗体はムチン形質転換の機構を示し、これにより、MUC16陽性腫瘍における診断的及び治療的使用のための有用なツールが提供される。
【０５５２】
(6.2.2  材料及び方法)
(6.2.2.1  糖ペプチドの合成)
合成糖ペプチドを、MUC16c55(配列番号129、図13)のAsn30に明確に定義されたキトビオース(GlcNAc2)を取り込んだ重要なエピトープ模倣体として用いて、MUC16の55-アミノ酸配列
【化１７２】
2018509907.tif 000182
の3番目のグリコシル化部位(MUC16のAsn1806と類似している、Asn30)に特異的な抗体を作製した。均一なN-糖ペプチドの合成は高度に収束的であり、ランズベリーアスパラギン酸化条件下での部分的に保護された全長ペプチド(MUC16c55;配列番号129)とキトビオースアミンとのカップリングを伴った(下記の第6.2.5節に列挙されている参考文献11を参照)。MUC16c55(配列番号129)は、マイクロ波支援Fmoc固相ペプチド合成(SPPS)と、それに続く、樹脂上でのN-アセチル化(Ac2O、DIEA)、Asp30の脱アリル化(Pd(PPh3)4、PhSiH3)、及びその後の樹脂の切り離し(1〜2％TFA/CH2Cl2)によって得られた。1フラスコアスパラギン酸化/脱保護手順(下記の第6.2.5節に列挙されている参考文献12に記載されているもの)を用いて、位置Asn30の遊離カルボン酸側鎖をキトビオースアミンとカップリングさせ(下記の第6.2.5節に列挙されている参考文献13を参照)、その後、TFA処理して(カクテルR: 90％TFA、5％チオアニソール、3％エタンジチオール、2％アニソール)、糖ペプチドGlcNAc2-55-merを生じさせた。シュードプロリンモチーフの存在は、アスパラギン酸化時の望ましくないアスパルチミド形成を軽減する役割を果たした。
【０５５３】
さらに、Man3GlcNAc2含有ペプチドを同様の1フラスコシーケンスで調製した。
【０５５４】
MUC16c55(配列番号129)のAsn30及びAsn24(それぞれ、MUC16のAsn1800及びAsn1806に類似している)を包含するより短い糖ペプチドである、
【化１７３】
2018509907.tif 000183
を調製した。18-mer及び15-merの糖ペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)にコンジュゲートした。15-mer(配列番号131)は、Asn7(MUC16のAsn1806に類似している)にキトビオースを取り込んだ。15-merの糖ペプチドは、55merの糖ペプチドの合成と類似の方法で合成した。
【０５５５】
18-mer(配列番号130)は、Asn4及びAsn10(それぞれ、MUC16のAsn1800及びAsn1806に類似している)にキトビオースを取り込んだ。18-merのAsn4及びAsn10(それぞれ、MUC16のAsn1800及びAsn1806に類似している)のアリル保護は、顕著なアスパルチミド形成をもたらした。したがって、より束縛の大きいO-2-フェニルイソプロピルエステル(O-2-PhiPr、OPp)をSPPSで用いて、N-アセチル化及び同時的な樹脂切断/OPp除去(1〜2％TFA/CH2Cl2)の後に、遊離のAsn4及びAsn10側鎖(それぞれ、MUC16のAsn1800及びAsn1806に類似している)を有する18-merの部分的に保護されたペプチドを提供した。二重ランズベリーアスパラギン酸化と、それに続く、全体的な酸脱保護による2つのキトビオース単位の高度に収束的な導入を実施して、ビス-グリコシル化された18-merペプチドを生成させた(HPLC精製後、27％)。
【０５５６】
18-mer及び15-merの糖ペプチドのN末端システイン残基とマレイミド誘導体化キャリアタンパク質との最後のカップリングにより、マウスワクチン接種用のKLHコンジュゲートコンストラクトが提供された。
【０５５７】
(6.2.2.2  マウス免疫付与プロトコル)
5匹のBALB/c及び5匹のSwiss Websterマウスを、25μLのTitermaxアジュバントの存在下、55-merの糖ペプチド(第6.2.2.1節を参照)で3週間毎に3回免疫して、マウスを免疫した。3週間後、マウスを、モノ-グリコシル化された15-mer(配列番号131)のKLHコンジュゲートコンストラクトとビス-グリコシル化された18-mer(配列番号130)のKLHコンジュゲートコンストラクトの混合物で免疫した。血清を、KLHにコンジュゲートされていない55-merのGlcNAc2-グリコシル化糖ペプチド及びより短い糖ペプチドに対する反応性について解析した。グリコシル化されていない55-mer、15-mer、及び18-merペプチドを、2つのMUC16非関連キトビオース含有ペプチドとともに、スクリーニングの陰性対照として使用した。マウスを15-mer及び18-merのKLH-コンジュゲートで3週間毎にさらにもう2回免疫し、各々の免疫付与後に、応答をELISAによって解析した。
【０５５８】
(6.2.2.3  浸潤)
第6.1.2.9節を参照されたい。shRNA実験のために、BD BioCoat(商標) Matrigel(商標)浸潤インサート又はチャンバー(カタログ# 354480、24ウェルプレート中)及び対照インサート(カタログ# 354578、24ウェルプレート中)は、BD Biosciences, MAから購入した。マトリゲル浸潤アッセイは、製造元のプロトコルに従って実施した。簡潔に述べると、24ウェルプレート中のマトリゲルチャンバー(-20℃で保存されたもの)及び対照インサート(4℃で保存されたもの)を室温に至らせておいた。両方のインサートを、インサート中で、及び24ウェルプレートの外側のウェル中で、37℃の5％CO2加湿インキュベーターにて2時間、0.5mLの無血清培地で再水和させた。培養したSKOV3細胞をトリプシン処理し、培養培地で洗浄した。100万個の細胞を別の遠心分離チューブに分け、無血清培地で3回洗浄した。後に、これらの細胞を調整して、0.5mLの無血清培地中、5,000細胞にした。再水和させたインサート中の培地を除去し、このインサートを、化学誘引物質としての役割を果たすウェル中の0.75mLの10％胎仔ウシ血清(FBS)含有培養培地を含む新しい24ウェルプレートに移した。すぐに、無血清培地中の0.5mLの該細胞(5,000細胞)をインサートに添加した。適切な注意を払って、インサート及び外側のウェルに気泡が閉じ込められないように配慮した。24ウェルプレートを37℃の5％CO2加湿インキュベーターで48時間インキュベートした。インキュベーション後、綿棒をマトリゲル又は対照インサートに挿入して「擦る」ことにより、非浸潤細胞を膜の上表面から除去し、綿棒の先端を膜表面にわたって移動させながら、穏やかに圧力をかける。培地に浸した第二の綿棒で擦ることを繰り返した。その後、蒸留水中の0.5mLの0.5％クリスタルバイオレット染料を含む新しい24ウェルプレート中で30分間、インサートを染色した。染色後、インサートを蒸留水の3つのビーカー中ですすいで、余分な染料を除去した。インサートを新しい24ウェルプレート中で風乾させた。浸潤した細胞を、200倍の倍率の倒立顕微鏡下で、手でカウントした。3つ組の膜のいくつかの視野をカウントし、図に記録した。
【０５５９】
(6.2.2.4  無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍成長)
第6.1.2.11節を参照されたい。
【０５６０】
(6.2.2.5  ビオチン化糖ペプチドの結合アッセイ)
ForeBio Octet QKを用いて、結合親和性を決定した。ビオチン化され、キトビオースがコンジュゲートされた5μg/mLの18-merの糖ペプチドをストレプトアビジンバイオセンサー上にローディングした。余分な抗原を洗い流した後、マウス抗体を、それぞれ、会合及び解離工程について、10μg/mLで試験した。1:1結合部位モデル、部分フィットを用いて、結合パラメータを計算した。
【０５６１】
(6.2.2.6  組織マイクロアレイの免疫組織化学検査)
既存のパラフィン包埋組織のコア針生検を、いわゆる、ドナーブロックから入手し、その後、Kononenらによる技法(Kononen Jらの文献、 Nat Med 1998;4(7):8447を参照)、その後、Hedvatら(Hedvat CVらの文献、Hum Pathol 2002;33(10):968-74を参照)によって改変された技法を用いて、レシピエントパラフィンアレイ「マスター」ブロックに再配置した。Beecher Instruments社(Sun Prairie, WI)製の手動で操作されるTissue Arrayer MTA-1を用いて、直径が0.6〜1.0mmの大きさの試料円形スポット(コア)を作製した。コアを、互いに0.3〜0.4mm離してアレイ化した。エッジング効果を避けるために、対照組織の層を実際の組織マイクロアレイの周囲に戦略的に置いた。各々の組織マイクロアレイの具体的な組成は、以下で詳述されている。卵巣癌又は対照組織についての組織マイクロアレイのスライドを、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から4um切片を切ることにより調製した。
【０５６２】
標準的なOC125(Ventana, Tuscon, AZ)、4H11(Raoらの文献、Appl. Immunohistochem Mol Morphol, 2010, 18(5):462-72を参照)、及び19C11モノクローナル抗体による組織マイクロアレイで免疫組織化学検査を実施した。組織マイクロアレイの切片を4ミクロンで切削し、Superfrost/Plus顕微鏡スライド(Fisher銘柄)上に置き、60°のオーブンで少なくとも60分間焼いた。その後、スライドを脱パラフィン処理し、蒸留水に対して水和させ、pH 6.00のクエン酸塩バッファーに97℃で30分間浸漬させ、流水で2〜5分間洗浄し、蒸留水に希釈した3％過酸化水素中で5分間インキュベートした。スライドを蒸留水中で1分間洗浄し、リン酸緩衝食塩水(PBS)、pH 7.2の浴槽に移して、各々5分間で2回交換し、PBSに希釈した0.05％BSA中に最低1分間入れた。組織切片の周囲を乾燥させた後、正常血清を2％BSA/PBS中1:20希釈で適用し、湿度チャンバーにて室温で最低10分間インキュベートした。その後、切片を乾燥させないように、血清を最後まで吸引し、1:1000の希釈の約150ラムダの新しい抗体を組織の上に載せた。スライドを湿度チャンバーにて4℃で一晩(約15〜18時間)インキュベートした。各々10分間の3回のPBS交換を用いて、一次抗体を洗い流した。二次抗体であるVector laboratories(Burlingame、Ca)製のビオチン化α-マウスを1％BSA/PBS中1:500希釈で適用し、湿度チャンバーにて室温で45〜60分間インキュベートした。上記のように、3回のPBS交換を用いて、抗体を再び洗い流した。その後、スライドを、PBSに希釈したジアミノベンジジン(DAB)の浴槽に5〜15分間移した。その後、スライドを水道水中で1分間洗浄し、Harris改変ヘマトキシリン(Fisher)を用いて対比染色し、1％酸アルコールで脱色し、アンモニア水中で青色にし、各々2分間の95％エタノール、100％エタノール、及びキシレンの各々3回の交換で脱水し、永久封入媒体を用いてカバーグラスで覆った。
【０５６３】
(6.2.2.7  内在化アッセイ)
89Zr-19C11の内在化を、MUC16c114を発現するSKOV3細胞で調べた。約1×105個の細胞を12ウェルプレートに播種し、37℃の5％CO2インキュベーターで一晩インキュベートした。ある容量の放射性標識タンパク質を各々のウェルに添加し、プレートを37℃及び4℃で1、5、12、及び24時間インキュベートした。各々のインキュベーション期間の後、培地を回収し、細胞を1mLのリン酸緩衝食塩水(PBS)ですすいだ。細胞を、100mMグリシンを含む1mLの100mM酢酸(1:1、pH 3.5)中、4℃で洗浄することにより、表面結合活性を回収した。その後、接着細胞を1mLの1M NaOHで溶解させた。各々の洗浄液を回収し、活性についてカウントした。最終洗浄液の活性と全ての洗浄液の全活性との比を用いて、内在化された％を決定した。
【０５６４】
(6.2.3  結果)
(6.2.3.1  MUC16病理生物現象はC末端のMUC16エクトドメインのN-グリコシル化に依存的である)
実施例1(第6.1節を参照)は、MUC16c114の発現が3T3マウス線維芽細胞のより侵襲的なインビトロ/インビボ挙動をもたらし、MUC16c114駆動性マトリゲル浸潤の顕著な増大及びインビボでのより急速な腫瘍成長をもたらすことを示した。したがって、SKOV-3細胞株(MUC16の発現を欠くヒト卵巣細胞株)をMUC16c114依存的特性の効果について調べた。MUC16c114発現は、細胞表面発現とマトリゲル浸潤のほぼ3倍の増大とを引き起こした(図12Aのレーン1と2を比較されたい)。Asn30のアラニンへの突然変異(MUC16c114-N3、図12A、レーン3)、Asn1及びAsn24のアラニンへの突然変異(MUC16c114-N12、図12A、レーン4)、並びにAsn1、Asn24、及びAsn30のアラニンへの突然変異(MUC16c114-N123、図12A、レーン4)がマトリゲル浸潤を無効化したので、この浸潤の増大は、MUC16c114のアミノ酸位置1(Asn1)、24(Asn24)、及び30(Asn 30)のアスパラギン(それぞれ、成熟MUC16(配列番号150)のAsn1777、Asn1800、及びAsn1806に対応する; MUC16c114-N123)のN-グリコシル化に依存的であった。図12Bも参照されたい。さらに、MGAT5又はLGALS3発現を低下させるノックダウンshRNA実験がN-グリコシル化部位におけるMUC16c114突然変異と類似した効果を有し、かつ浸潤を基礎レベル近くにまで低下させたので、MUC16c114によって誘導されるマトリゲル浸潤の増大は、MGAT5(N-グリコシル化反応に関与する最初の酵素)及び/又はLGALS3(多くの悪性度の高い漿液性癌で増幅される酵素)に依存的であった(図12A、レーン6〜10)。
【０５６５】
発癌性形質転換の最も明白な特徴は、免疫不全マウスで成長を促進する能力である。腫瘍成長速度に対するMUC16のN-グリコシル化、MGAT5、及びLGALS2の効果を測定するために、側腹腫瘍モデルを用いて、定期的な腫瘍測定を容易にした。図12Cに示されているように、ベクター(phrGFP)、MUC16c114、MUC16c114-N123、MUC16c114と抗MGAT5 shRNA(MUC16c114-shMGAT5)、又はMUC16c114と抗LGALS3 shRNA(MUC16c114-shLGALS3)を発現する3T3細胞株を無胸腺ヌードマウスの側腹に移植したとき、MUC16c114 3T3細胞のみが24日でベクターのみの対照と比較してより大きい腫瘍を形成した。これらのデータは、MUC16のN-グリコシル化、MGAT5、及びLGALS3が腫瘍成長に必要であることを示すインビトロ解析を裏付けるものである
【０５６６】
(6.2.3.2  mAb開発のための重要なエピトープ模倣体としての均一なN-糖ペプチドの合成)
MUC16c114のAsn30部位(成熟MUC16(配列番号150)のAsn 1806に対応する; MUC16c114-N3)におけるN-グリコシル化はMUC16発癌作用の主要な要件であることが明らかになったので、MUC16c114-N12がAsn30(成熟MUC16(配列番号150)のAsn1806に対応する)でN-グリコシル化される能力を保持するため、SKOV3細胞で発現されるMUC16c114-N12のグリカンプロファイリングを実施した。グライコーム解析により、様々なマンノース部分が結合する最小反復単位としての極めて重要なキトビオース(GlcNAc2)ステムを有する、このC末端MUC16断片の極めて多様なN-グリコシル化パターンが示された(図13A)。
【０５６７】
したがって、転移及び浸潤に対するMUC16のグリコシル化依存的効果を阻害するために、グリコシル化に対するmAbを作製した。これらの抗体は、MUC16エクトドメイン内のより短い55-アミノ酸配列(MUC16C55;配列番号129)上の重要な3番目のグリコシル化部位(MUC16c114のAsn30)を含むN-糖ペプチドエピトープを標的とするように設計された。免疫原として利用される糖ペプチドの合成の説明については、第6.2.2.1節、並びに図13B、図13C、及び図13Dを参照されたい。免疫付与プロセスの説明については、第6.2.2.2節を参照されたい。
【０５６８】
MUC16c114のAsn24及び/又はAsn30に対応する(それぞれ、成熟MUC16(配列番号150)のAsn1800及びAsn1806に対応する)アミノ酸残基にキトビオースを含む短い(55-mer、18-mer、及び15-merの)MUC16糖ペプチドで免疫することにより、抗体を作製した。より大きいNグリカンに共通する最も小さいモチーフであることに加えて、キトビオースは、グリカンに対する依存性だけでなく、ペプチド特異性も示す抗体を誘導するための基礎にあるMUC16由来ペプチドのより良好な曝露も可能にするであろう。この低グリコシル化は、正常細胞と比較した腫瘍細胞の表面のムチン糖タンパク質のよくある際立った特徴である。
【０５６９】
(6.2.3.3  合成糖ペプチド/糖コンジュゲートによるマウスワクチン接種及び血清学的アッセイ)
マウスワクチン接種及び血清回収を第6.2.2.2節に記載されているプロトコルに従って実施した。GlcNAc2-55-mer(図13B)による3回の免疫付与の後、マウスをKLHコンジュゲートコンストラクトの混合物(モノ-グリコシル化15-mer(配列番号131;図13C)及びビス-グリコシル化18-mer(配列番号130;図13D))でさらに免疫し、10匹のマウスのうち2匹が、両方の55-mers(GlcNAc2ありとGlcNAc2なし)について陽性のELISAシグナルを示したが、応答は概して弱く、マウスが55-merの免疫付与で完全には感作されなかったことを示唆している。KLHコンジュゲート(GlcNAc2-15-mer(図13C)及び(GlcNAc2)2-18-mer(図13D))によるさらに2回の免疫付与は、特に、2匹のマウス(マウス7及びマウス8)において、より短い15-mer及び18-merの糖ペプチドに対するIgG免疫応答の増強をもたらした。しかしながら、これらの抗体は、55-mer-糖ペプチドとのELISAによる検出可能な反応性を示さず、これにより、この特定のアッセイでは、この大きい断片中のエピトープが接近不可能であるか又は立体構造的に異なるかのどちらかであることが示唆される。両方の55-mer(キトビオース含有ペプチド及び/又は非グリコシル化ペプチド)に応答したマウス5は、Man3GlcNAc2誘導体化55-merに対して陰性であった。非グリコシル化ペプチド骨格に対する4H11 mAb(Raoらの文献、Appl. Immunohistochem Mol Morphol, 2010, 18(5):462-72)が、コンジュゲートされていない15/18-merの糖ペプチドに対する結合を示さなかったことは驚くべきことではなく、利用可能なエピトープにある程度の違いがあり得ることを示した。図14を参照されたい。
【０５７０】
(6.2.3.4  グリコシル化依存的モノクローナル抗体の開発及びインビトロでの生物学的アッセイ−MUC16駆動性マトリゲル浸潤)
その血清が非グリコシル化ペプチドと比較して短い糖ペプチドに対する最大の反応性比を示し、したがって、糖の存在に対してある程度の選好を示す、10匹のマウスのうちの1匹(マウス7)を選択した。マウス7の脾臓を摘出し、標準的なハイブリドーマ培養技術により、IgG産生ハイブリドーマ細胞株を提供した。脾細胞をハイブリドーマ融合パートナーと融合させ、並外れて高い融合効率を得た(平均して＞5.5コロニー/ウェル、＞30,000個のハイブリドーマ)。上清を、個々の糖ペプチドに対するELISAによる反応性について選択し、スクリーニングした。(同じウェル中で組み合わせた)15mer-キトビオースペプチド及び18mer-キトビオースペプチドに対する融合試験プレートの予備的なELISA解析は、抗ペプチド抗体の存在を示すいくつかの陽性シグナルを示したが、そのグリコシル化依存性をこの時点で完全には評価することができなかった。図14を参照されたい。それにもかかわらず、キトビオース-グリコシル化抗原に対する、好ましい陽性度を有し、したがって、より特異的な抗体の割合が、非グリコシル化抗原と比較してより高いことが観察された。培養物の希釈により、各々のウェルで成長している単一のクローン(上記の1:1の比)が得られ、一次スクリーニングにより、これらのハイブリドーマによって産生された抗体がグリコシル化されていない15-/18-merの近くにある4H11エピトープを認識しないことが明らかになった。図14を参照されたい。より大きい希釈でモノクローナル抗体スクリーニングを遂行した後に、糖ペプチドエピトープに対する選好を示す抗体が得られた。このように、このプロセスによって、36個のキトビオース依存性一次mAbが得られ、これをMUC16に対する反応性について試験した。これらのうち、15個のmAbを(4H11と並行して)、浸潤に対するその効果について、SKOV3-MUC16c114トランスフェクタントを用いるマトリゲルアッセイにより評価した(図15A)。MUC16グリコシル化抗体1B5、10C6、13A7、18C6、19C11、16C5、6H10、21F8、7B12は、マトリゲル浸潤の阻害を示したが、4H11は、この特性に対して効果がなく、MUC16c114のAsn30(成熟MUC16(配列番号150)のAsn1806に対応する)に対する抗体がMUC16の生物現象を阻害することを示した。後に、MUC16グリコシル化抗体をサブクローニングし、精製した。特定のMUC16グリコシル化抗体の結合パラメータを決定した(表9を参照)。
【０５７１】
表9. MUC16グリコシル化抗体の結合パラメータ
【表９】
2018509907.tif 000184
*＝計算の信頼性が低い;解離速度にフィットするものがない
**＝kaが低すぎて、会合速度を決定することができない
【０５７２】
最後に、MUC16グリコシル化抗体10C6を用いて実施されたヒト卵巣組織試料の免疫組織化学検査は、4H11又はOC125を用いて実施された免疫組織化学検査と比較して、MUC16の検出の向上を示した(図16E)。
【０５７３】
(6.2.3.5  MUC16グリコシル化抗体はMUC16グリコシル化に特異的である)
MUC16グリコシル化抗体の特異性を調べるために、(i)ネイティブの(成熟)MUC16を発現する細胞(OVCA-433細胞)、(ii)対照ベクターを発現し、MUC16発現を欠く、SKOV3細胞(SKOV3 phrGFP細胞)、(iii)MUC16c114を発現するSKOV3細胞(SKOV3 MUC16c114)、(iv)MUC16c114-N1を発現するSKOV3細胞(SKOV3 MUC16c114-N1)、(v)MUC16c114-N3を発現するSKOV3細胞(SKOV3 MUC16c114-N3)、又は(vi)SKOV3 MUC16c114-N123を発現するSKOV3細胞(SKOV3 MUC16c114-N123)に対して、MUC16グリコシル化抗体(18C6、19C11、10C6、1B5、もしくは13A7)又はモノクローナル抗MUC16抗体4H11の存在下又は非存在下で、FACs解析を実施した。(表10)抗体4H11、18C6、19C11、10C6、1B5、及び13A7は、OVCA-433細胞に対する結合を示した(表10; ID番号3〜8を陰性対照のID番号1及び2と比較されたい)。対照的に、抗体の研究及び作製の設計に基づいて予想されたように、抗体4H11、18C6、19C11、10C6、1B5、及び13A7はいずれも、SKOV3 phrGFP細胞に結合しなかった(表10、陰性対照のID番号9及び10と比較した、ID番号11〜16)。抗体4H11、18C6、19C11、10C6、1B5、及び13A7は、SKOV3 MUC16c114に結合した(表10、陰性対照のID番号17及び18と比較した、ID番号19〜24)。MUC16c114のAsn1(成熟MUC16(配列番号150)のAsn1777に対応する)の突然変異は、SKOV3 MUC16c114-N1細胞に対する抗体結合を阻害しなかった(表10、陰性対照のID番号25及び26と比較した、ID番号27〜32)。しかしながら、MUC16c114のAsn30(成熟MUC16(配列番号150)のAsn1806に対応する)の突然変異は、MUC16グリコシル化抗体18C6、19C11、10C6、1B5、及び13A7の結合を無効化した(表10、陰性対照のID番号33及び34と比較した、ID番号36〜40)。さらに、MUC16c114のAsn30(成熟MUC16(配列番号150)のAsn1806に対応する)の突然変異は、MUC16グリコシル化抗体ではない抗体4H11の結合を無効化しなかった(表10、陰性対照のID番号33及び34と比較した、ID番号35)。さらに、Asn1、Asn24、及びAsn30(それぞれ、成熟MUC16(配列番号150)のAsn1777、Asn1800、及びAsn1806に対応する)におけるアスパラギンからアラニンへの突然変異は、MUC16グリコシル化抗体18C6、19C11、10C6、及び1B5の結合を無効化したが(表10、陰性対照のID番号41及び42と比較した、ID番号44〜47)、4H11の結合は無効化されなかった。13A7がSKOV3 MUC16c114-N123細胞に対する結合を維持したことが留意される。これらのデータは、MUC16グリコシル化抗体がグリコシル化依存的な様式でMUC16c114に結合することを示している。
【０５７４】
表10. OVCA-433又はSKOV3トランスフェクタント細胞を用いたMUC16グリコシル化抗体のFACs解析
【表１０】
2018509907.tif 000185
2018509907.tif 000186
*は、結合が認められないと考えられることを示している。
【０５７５】
(6.2.3.6  MUC16グリコシル化抗体はマトリゲル浸潤を阻害する)
MUC16グリコシル化抗体のグリコシル化特異性(表9)を考慮して、MUC16グリコシル化抗体の生体反応性上清がグリコシル化特異的な形でマトリゲル浸潤を阻害する能力を評価した。したがって、マトリゲル浸潤アッセイを、phrGFPを発現するSKOV3卵巣癌安定細胞株(図15A、レーン1)又はphr-GFP-MUC16c114を発現するSKOV3卵巣癌安定細胞株(MUC16c114;図15A、レーン2〜18)を用いて、MUC16グリコシル化抗体の生体反応性上清の存在下(図15A、レーン3〜18)又は非存在下(図15A、レーン1及び2)で実施した。MUC16モノクローナル抗体4H11(図15A、レーン3)をMUC16グリコシル化抗体の生体反応性上清(図15A、レーン4〜18)の対照として用いて、マトリゲル浸潤のグリコシル化依存性を評価した。単独又は4H11の存在下(図15A、それぞれ、レーン2及び3)のいずれかのMUC16c114の発現は、マトリゲル浸潤活性の増大をもたらした。対照的に、MUC16グリコシル化抗体とのインキュベーション(図15A、レーン4〜18)は、MUC16c114発現卵巣癌細胞のマトリゲル浸潤を減少させた。
【０５７６】
次に、精製MUC16グリコシル化抗体がマトリゲル浸潤を阻害する能力を評価した。この目的のために、MUC16c114を発現するSKOV3細胞をMUC16抗体4H11又は精製MUC16グリコシル化抗体の存在下及び非存在下でインキュベートした(図15B)。MUC16グリコシル化抗体7B12、19C11、18C6、及び10C6は、MUC16c114誘導性マトリゲル浸潤を阻害した(図15B、レーン3〜6を陰性対照のレーン2と比較されたい)。対照的に、モノクローナル抗MUC16抗体4H11は、MUC16c114誘導性マトリゲル浸潤を阻害しなかった(図15B、レーン2を陰性対照のレーン1と比較されたい)。これらのデータは、モノクローナル抗体4H11と対照的に、MUC16グリコシル化抗体(例えば、7B12、19C11、18C6、及び10C6)がマトリゲル浸潤を阻止することを示している。
【０５７７】
MUC16グリコシル化抗体がマトリゲル浸潤を阻害する能力をMUC16c114 N-グリコシル化突然変異体との関連でアッセイした(図16A)。この目的のために、マトリゲル浸潤アッセイを、SKOV3 phrGFP細胞、SKOV3 MUC16c114細胞、SKOV3 MUC16c114-N1細胞、SKOV3 MUC16c114-N2細胞、又はSKOV3 MUC16c114-N3細胞に対して、(i)対照抗体;(ii)4H11抗体;又は(iii)MUC16グリコシル化抗体10C6の存在下で実施した(図16A、それぞれ、レーン1〜5)。MUC16c114のAsn30がMUC16c114マトリゲル浸潤に必要であるため、MUC16c114誘導性マトリゲル浸潤は、SKOV3 MUC16c114-N3細胞で阻害された。さらに、マトリゲル浸潤は、MUC16モノクローナル抗体4H11の存在下及び非存在下、SKOV3 MUC16c114細胞、SKOV3 MUC16c114-N1細胞、及びSKOV3 MUC16c114-N2細胞で誘導された。対照的に、これらの細胞のMUC16グリコシル化抗体10C6とのインキュベーションは、マトリゲル浸潤を無効化した(図16A)。これらのデータは、図16B及びMUC16c344突然変異体を発現する3T3細胞でも裏付けられた(図16C)。
【０５７８】
まとめると、これらのデータは、MUC16グリコシル化抗体が、モノクローナル抗MUC16抗体4H11とは対照的に、マトリゲル浸潤をグリコシル化依存的な形でを阻害することができることを示している。
【０５７９】
(6.2.3.7  MUC16グリコシル化抗体19C11は内在化される)
最後に、MUC16c114のAsn30を標的とするMUC16グリコシル化抗体が内在化される能力を評価した。MUC16c114を発現するSKOV3細胞を89Zr-DFO標識19C11抗体とともにインキュベートし、内在化をRadiotracerにより決定した(図17)。これらのデータは、37℃でインキュベートされたMUC16c114発現SKOV3細胞とともにインキュベートしたとき、抗体で処理してから早くも1時間後に標識19C11抗体が内在化されたことを示している。標識抗体の細胞取込みは4℃で減少した。
【０５８０】
(6.2.4  考察)
MUC1との相当な相同性を有するムチンファミリーのメンバーであるMUC16/CA125抗原は、長い間、婦人科悪性腫瘍と関連付けられてきた(下記の第6.2.5節に列挙されている参考文献4を参照)。一般的なスクリーニングツールとして十分に感度が高いわけでも、特異的であるわけでもないが、CA125測定は、通常、抗体ベースの検出方法によって、卵巣癌を有する患者をモニタリングするために使用される。OC125などの、圧倒的多数のMUC16反応性抗体は、この分子の切断画分に見られるグリコシル化依存性エピトープに対するものであり、切断後のMUC16の近位部分を検出するスクリーニングツールとしては有用でない。結果として、残りのMUC16タンパク質断片に関する生物学的研究が不足している。実施例1(第6.1節)のデータは、近位MUC16領域(MUC16C114)の114アミノ酸配列がいくつかの卵巣癌細胞株で浸潤及び腫瘍成長を増大させるのに十分であることを示した。このC末端エクトドメインの、特に、3番目のAsn部位(成熟MUC16(配列番号150)のAsn1806に対応する、Asn30)におけるN-グリコシル化が、MUC16の発癌効果にとって重要であるという本明細書における特筆すべき発見は、MUC16の新しい役割を示唆しており、その結果、疾患の消極的マーカーと考えることができるだけでなく、病原性分子と考えることもできる。この前提に基づいて、MUC16のこれらの保持される部分に対するモノクローナル抗体の開発は、このムチンの病理生物現象を探索し、かつMUC16を標的とする治療薬を作出するための強力なツールのように思われる。
【０５８１】
先の研究により、MUC16の非切断C末端領域に対するmAbが同定されたが、過去の抗体とは対照的に、これらは、複雑な糖タンパク質エピトープに対してではなく、非グリコシル化ペプチド骨格に対するものであった。特に、4H11は、MUC16エクトドメインに対する高親和性結合を示し、エピトープの位置が近接しているために、OC125よりも効率的に卵巣癌細胞によって内在化された。この研究結果から、糖タンパク質の近位領域が推定切断部位の遠位にあるMUC16の放出部分と無関係な生物現象を有することが示唆された。しかしながら、4H11は、MUC16の病原性作用に必要とされるエクトドメイン内の重要なグリコシル化部位を認識しないので、標的療法におけるその将来の研究の可能性は限られる。
【０５８２】
ハイブリドーマ技術と組み合わせてKLHコンジュゲート合成糖ペプチド模倣体を使用することにより、MUC16エクトドメイン中の重要な糖ペプチドエピトープに対するグリコシル化依存的モノクローナル抗体のパネルを開発した。この方法は、ポリクローナル抗体作製よりも好ましいが、それは、ポリクローナル段階では、糖ペプチド特異性が完全ではなく、一部には、非グリコシル化MUC16ペプチド断片に対する結合も、検出されたからである。MUC16グリコシル化抗体を得るために、モノクローナル抗体作製の一次選択は、糖の存在に対するある程度の選好に対して関連付けられた多クローン培養物におけるより高い割合のグリコシル化依存性を基にした。新しいモノクローナル抗体の能力及び糖ペプチドエピトープに対するそのより高い特異性は、MUC16駆動性マトリゲル浸潤に対するその効果を検討することにより示された。これらのMUC16グリコシル化抗体がマトリゲルアッセイで浸潤を阻害することができたのに対し、非グリコシル化に対する4H11は浸潤を阻害することができなかった。Asn30におけるN-グリコシル化がMUC16作用に不可欠であるという研究結果に基づいて、これらの結果により、新たに作製された抗体が、MUC16エクトドメインの重要な糖ペプチドエピトープを特異的に標的とし、それにより、MUC16病理生物現象の阻害をもたらすことが確認される。重要なことに、MUC16グリコシル化抗体10C6は、MUC16c114発現卵巣癌細胞が移植された無胸腺ヌードマウスモデルでMUC16陽性腫瘍成長を顕著に遅延させ、これらのモノクローナル抗体が最適化された臨床用途でのその治療的使用のための有望なツールとして浮上する可能性を示した。
(6.2.5  引用された参考文献)
【０５８３】
1. Bast, R. C. Jr. et al. Reactivity of a monoclonal antibody with human ovarian carcinoma. J. Clin. Invest. 68, 1331-1337 (1981).  
【０５８４】
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【０５８５】
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【０５８６】
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【０５９２】
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【０５９９】
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【０６００】
18. Moore, R.G., Maclaughlan, S. & Bast, R.C. Jr. Current state of biomarker development for clinical application in epithelial ovarian cancer. Gynecol Oncol. 116, 240-245 (2010).
【０６０１】
(6.3  実施例3: MUC16の腫瘍促進効果はガレクチン-3及び細胞表面受容体との相互作用を必要とする)
本実施例は、(a)実施例2(第6.2節)に記載されている実験のうちのいくつかのより詳細な説明;並びに(b)実施例2(第6.2節)と比較した追加実験を提供するものである。
【０６０２】
(6.3.1  序論)
MUC16/CA125の過剰発現は、漿液性卵巣癌で一般的であり、血清CA125レベルの上昇は、生存の減少と関連している。OC125抗体によって認識されるCA125抗原は、MUC16糖タンパク質の細胞外部分由来のタンデムリピートドメイン内に発現される重度グリコシル化抗原である(下記の第6.3.13節の参考文献3及び22を参照)。この抗原は、良性又は悪性のミュラー組織によって主に発現されるが、発癌におけるその機能及び役割は、現在、完全には理解されていない(下記の第6.3.13節の参考文献4を参照)。MUC16は、不均一にグリコシル化された大きい細胞外ドメイン、細胞膜と推定切断部位の間にある58アミノ酸のエクトドメイン、疎水性膜貫通領域、及び短い細胞質テールからなる非常に複雑な繋留型ムチンである(下記の第6.3.13節の参考文献21を参照)。OC125及びほとんどの他のMUC16反応性モノクローナル抗体(mAb)は、この分子の切断部分に存在する免疫原性のある156アミノ酸のタンデムリピート領域を認識する。より新しいエクトドメイン特異的抗体(例えば、4H11及び4A5)は、切断後に保持されるMUC16の部分中のペプチドエピトープを認識する(下記の第6.3.13節の参考文献6を参照)。MUC16のC末端部分(MUC16c114)は、足場非依存的成長の増大、AKT及びERK経路の活性化、マトリゲル浸潤の増大、並びにヌードマウス異種移植片における成長の増強によって測定したとき、不死化3T3細胞を形質転換することが示されている(第6.1節及び下記の第6.3.13節の参考文献19を参照)。これらの効果はMUC16のエクトドメインに依存的であったが、31アミノ酸の細胞質テールの喪失は、これらの特性にほとんど効果がなかった。エクトドメインが発癌性挙動を促進する機構は完全には理解されていない(下記の第6.3.13節の参考文献19を参照)。コンセンサスタンパク質結合ドメインは存在しないが、MUC16エクトドメインの58アミノ酸配列は、MUC16の他の細胞表面分子との潜在的な相互作用/調節部位を表す3つのN-グリコシル化部位を含む。
【０６０３】
チロシンキナーゼ受容体、例えば、上皮成長因子受容体(EGFR)、血小板由来成長因子受容体(PDGFR)、及びその他のN-グリコシル化部位は、ガレクチン-3などの細胞性レクチンと相互作用して、表面滞留、シグナル伝達の強度、及び細胞挙動を調節するように思われる(下記の第6.3.13節の参考文献12を参照)。N-グリコシル化の効果は、成長増強受容体上のN-グリコシル化部位の数及び複雑なN-グリコシル化種に対するガレクチン-3の親和性に依存する。N-グリコシル化部位は、形質転換成長因子-ベータ(TGF-β)受容体などの細胞表面分子からの拮抗阻害シグナル上にほとんど存在しない。これらの受容体は、成長因子関連の高栄養フラックスに感受性であり、通常の状況において減衰機能をもたらす。しかしながら、癌関連糖タンパク質の古典的な受容体チロシンキナーゼとの相互作用の機構は不明である。MUC1、MUC4、及びMUC16は全て、膜貫通ドメインの存在を特徴とする重度にグリコシル化された繋留型糖タンパク質であり、上皮癌で過剰発現される(下記の第6.3.13節の参考文献10を参照)。
【０６０４】
本実施例(第6.3節)は、MUC16のグリコシル化が、複雑な細胞表面相互作用を媒介することにより、ムチン関連の形質転換において重要な役割を果たすことを示している。
【０６０５】
MUC16のC末端部分は、癌遺伝子活性化、マトリゲル浸潤、及び腫瘍成長を促進した。これらの効果は、58アミノ酸の保持されるMUC16エクトドメイン中の2つの近位Nグリコシル化部位のMGAT5依存的グリコシル化に依存的であった。より遠位のMUC16タンデムリピート領域におけるN-グリコシル化部位も、O-グリコシル化部位も、これら2つの部位を機能的に代替することができなかった。MUC16グリコシル化のパターンは多様であったが、キトビオースステムが全てのN-グリコシル化種の基部を特徴付けた。近位のキトビオース含有MUC16糖ペプチドに対する抗体は、ガレクチン3媒介性の細胞表面シグナル伝達受容体に対する結合を遮断し、MUC16の腫瘍促進効果を阻害した。
【０６０６】
MUC16糖ペプチドの系統的改変を用いて、グリカン構造とMUC16発現によってもたらされる腫瘍促進効果との関係を直接調べた。これらの効果は、共局在、癌遺伝子活性化、マトリゲル浸潤、及び腫瘍異種移植片成長を含め、MUC16の保持される非循環部分上のN-グリコシル化配列と上皮成長因子受容体(EGFR)及びインテグリンβ1などの細胞表面分子とのガレクチン-3媒介性結合によってもたらされた。細胞外ムチン駆動性腫瘍促進は、N-グリコシル化部位に対する抗体によってうまく標的化することができる、本明細書に提示された研究結果及びデータによって裏付けられた機構である。
【０６０７】
本実施例に示されているように:(1)MUC16の細胞外グリコシル化状態は、卵巣漿液性癌挙動を駆動し;(2)浸潤及びMUC16+異種移植片成長は、特定のMUC16 N-グリコシル化部位に依存し;(3)MUC16は、ガレクチン-3及びEGFR又はインテグリンβ1のいずれかとのヘテロ三量体複合体を形成し;かつ(4)抗グリコシル化部位抗体は、細胞外MUC16腫瘍促進を阻止した。
【０６０８】
(6.3.2  材料及び方法)
(6.3.2.1  MUC16カルボキシ末端(MUC16c114)、MUC16-CA125ドメイン(MUC16c344)、及びグリコシル化融合タンパク質DNAコンストラクトの合成)
MUC16 C末端コンストラクトの説明については、第6.1.2節及び第6.2.2節、並びに下記の第6.3.13節の参考文献19を参照されたい。pFUSE-ヒトIgG1-Fc2ベクター(pFUSE)は、InvivoGen(San Diego, CA)から購入した。キメラタンパク質MUC16c57-114-pFUSE及び117-244LGALS3-pFUSEの構築も、第6.1.2節及び第6.2.2節、並びに下記の第6.3.13節の参考文献19に記載されている。
【０６０９】
(6.3.2.2  細胞培養、トランスフェクション、及び細胞株の特徴解析)
SKOV3、CAOV3、及びOVCAR3細胞株を入手し、第6.1.2節及び第6.2.2節、並びに下記の第6.3.13節の参考文献19に記載されている通りに維持した。詳細については、第6.3.6節を参照されたい。
【０６１０】
(6.3.2.3  糖ペプチドの合成)
MUC16糖ペプチドの詳細な合成の説明については、第6.4節を参照されたい。
【０６１１】
(6.3.2.4  マトリゲル浸潤)
基底膜浸潤をマトリゲル浸潤チャンバー(BD Biosciences, Bedford, MA)で決定した。安定細胞株を、5μg/mLのツニカマイシン(Sigma-Aldrich, St. Louis MO cat # T7765)、又は5μg/mLのMUC16c57-c114-pFUSE、又は5μg/mLの117-244LGALS3-pFUSE融合タンパク質で処理し;次に、マトリゲル遊走を48時間後に3つ組のウェルで測定し、phrGFPベクター対照及びMUC16c114トランスフェクタントと比較した。第6.1.2節及び第6.2.2節、並びに下記の第6.3.13節の参考文献19も参照されたい。
【０６１２】
(6.3.2.5  無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍成長)
トランスフェクトされた細胞株及び適当な対照細胞株を無胸腺雌ヌードマウスの側腹に導入し、日常的な動物の世話は、メモリアル・スローン・ケタリング癌センター抗腫瘍評価コア施設(Memorial Sloan Kettering Cancer Center Antitumor Assessment Core Facility)によって提供された。腫瘍測定を週2回行い、腫瘍成長を、メモリアル・スローン・ケタリング癌センター研究動物資源センター(Memorial Sloan Kettering Cancer Center Research Animal Resource Center)のガイドラインに従って、1,500mm3の最大サイズまで記録した。第6.1.2節及び第6.2.2節、並びに下記の第6.3.13節の参考文献19も参照されたい。
【０６１３】
(6.3.2.6  モノクローナル抗体の調製;マウス免疫付与プロトコル)
免疫付与プロトコルは、5匹のBALB/cマウス及び5匹のSwiss Websterマウスにアジュバントの存在下で3週間毎に3回投与される、キトビオースを含有する55-merのMUC16糖ペプチド(GlcNAc2-55-mer;配列番号129)から開始された。4回目の免疫付与は、KLHコンジュゲートされ、モノ-グリコシル化された15-merのMUC16コンストラクト(GlcNAc2-15-mer-KLH;配列番号131)とKLHコンジュゲートされ、ビス-グリコシル化された18-merのMUC16コンストラクト([GlcNAc2]2-18-mer-KLH;配列番号130)の混合物を用いて実施した。血清を、GlcNAc2-55-mer(配列番号129)並びにコンジュゲートされていない、キトビオースを担持する15/18-merの糖ペプチド(それぞれ、配列番号131及び配列番号130)に対する反応性について解析した。さらに、グリコシル化されていない55-merペプチド(配列番号129)、15-merペプチド(配列番号131)、及び18-merペプチド(配列番号130)を、2つのMUC16非関連キトビオース含有ペプチドとともに、スクリーニングの陰性対照として使用した(配列番号168及び169)。マウスを、より短いKLH-コンジュゲート(配列番号130及び配列番号131)で3週間毎にさらにもう2回免疫し、各々の免疫付与の後、応答をELISAにより解析した。第6.2.2節も参照されたい。
【０６１４】
(6.3.2.7  ELISA)
サンドイッチELISAを実施し、ELISAアッセイのルーチンのコア施設プロトコルに従って、個々の(グリコール)ペプチドに対する抗体の陽性度を評価した。第6.2.2節も参照されたい。
【０６１５】
(6.3.2.8  ウェスタンブロット解析)
等量のタンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により分離し、BioRad転写装置を用いて4℃で二フッ化ポリビニリデン(PVDF)又はニトロセルロース膜に転写した。膜を0.1％Tween-20を含むPBS(PBST)中の3％ウシ血清アルブミン(BSA)又は5％無脂肪乳で室温で1時間ブロッキングした。膜を種々の一次抗体[Cell Signaling, MA: Akt cat #9272;ホスホ-Akt(Ser473)(193H12) cat # 4058; p44/43 MAPK(Erk1/2) cat # 9102;ホスホ-p44/43 MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204) cat #9101; Src cat # 2109S;ホスホ-Src cat # 2101L; EGFR cat # 2237L;ホスホ-EGFR(Y1068)(D7A5) XP(R) cat #3777S];(Sigma-Aldrich社, St. Louis, MO:β-アクチンcat # A5441);(Southern BioTech, Birmingham, AL:抗ヒト-Fc-IgG1-HRP cat # 9054-05);(Abgent, San Diego, CA:ポリクローナルLGALS3抗体 cat # AP11938b);及び(Origene, Rockville, MD:マウスモノクローナル抗EGFR v3クローンOTI3H2 cat # TA506224;マウスモノクローナル抗DDKクローン4C5 cat # TA50011-100)で4℃で一晩発色させた。膜をPBS-Tで3回洗浄し、HRPコンジュゲート抗マウス又は抗ウサギ抗体(GE Healthcare, UK)(1:5000希釈)で室温で1時間で発色させた。その後、膜をPBS-Tで3回洗浄し、Western Lightning化学発光試薬(ECL, Perkin Elmer)で室温で1〜5分間発色させ、シグナルをHyBlot CLフィルム(Denville Scientific社. Metuchen, NJ)上で現像した。
【０６１６】
ウェスタンブロット解析プロトコルの説明については、第6.1.2節及び第6.2.2節、並びに下記の第6.3.13節の参考文献6も参照されたい。
【０６１７】
(6.3.3  組織マイクロアレイ(TMA)の免疫組織化学検査)
ヒトTMAスクリーニングの免疫組織化学検査を以前に記載されている通りに実施した(下記の第6.3.13節の参考文献6を参照)。
【０６１８】
(6.3.4  OVCAR3、SKOV3-MUC16c344、及びSKOV3-MUC16c114の免疫蛍光染色)
50,000個の細胞をDelta TPG 0.17mmディッシュに個別に播種し、そのそれぞれの培地中、37℃、5％CO2で一晩培養した。接着細胞を、1％胎仔ウシ血清(FCS)及び0.025％アジ化ナトリウムを含むPBS(FACSバッファー)で2回洗浄した。細胞を、1:50希釈で、EGFR(R-1)-Alexa Fluor 647nm(Santa Cruz Biotechnology, CA, cat # sc-101 AF647)と4H11又はインテグリンβ1(4B7R)-Alexa Fluor 647nm(Santa Cruz Biotechnology, CA, cat # sc-9970 AF647)と4H11のいずれかで、4℃で30分間染色した。細胞をFACSバッファーで3回洗浄し、その後、ヤギ抗マウスIgG2b-PE(Santa Cruz Biotechnology, CA, cat # sc-3766-PE)で、4℃で30分間標識した。細胞をFACSバッファーで3回洗浄し、20x/0.8NAエア対物レンズ及び63x/1.4NAオイル対物レンズを備えたZeiss Axio Observer Z1で、ZEN2取得ソフトウェアを用いて、画像を撮影した
【０６１９】
(6.3.5  統計解析)
成長及び浸潤のインビトロ及びインビボ研究で評価した群を比較するために、両側スチューデントt-検定をGraphPad Prismソフトウェア(San Diego, CA)とともに用いて、データを統計的有意性について解析した。
【０６２０】
(6.3.6  細胞培養、トランスフェクション、及び細胞株の特徴解析)
OVCA-433細胞株に関しては、第6.3.13節の参考文献3を参照されたい。pLentiテトラサイクリン誘導性システムをInvitrogen, CA(cat # K4925-00)から購入し、pLenti-SKOV3c114を生成するために使用した。EGFR発現ウイルスプラスミドのshRNAヘアピンノックアウトは、メモリアル・スローン・ケタリング癌センターハイスループットスクリーニング(HTS)コア施設(Memorial Sloan Kettering Cancer Center High Throughput Screening(HTS) Core Facility)によって得られた;トランスフェクトされたHEK293細胞及びウイルス上清をHEK293細胞から回収して、pLenti-SKOV3c114-shEGFR細胞株に感染させた。MUC16c114トランスフェクタントは、推定切断部位からカルボキシ末端まで(配列番号150のアミノ酸1777〜1890)のMUC16タンパク質の細胞表面発現を有していた(下記の第6.3.13節の参考文献21を参照)。MUC16のカルボキシ末端にまで及ぶ344アミノ酸断片(配列番号150のアミノ酸1547〜1890)としてのMUC16タンパク質の細胞表面発現を有するMUC16c344-GFPベクターの発現を有する株を含む、より長いMUC16断片を有する細胞株を同様の方法で調製した(下記の第6.3.13節の参考文献19及び22を参照)。
【０６２１】
(6.3.7  トランスフェクション)
製造元のプロトコルに従ってDOTAP(Roche Diagnostics, Indianapolis Corporation, IN)を用いて、DNAコンストラクトをSKOV3細胞に導入した。安定なトランスフェクタントを、その培養培地中のSKOV3細胞について、800μg/mLのG418で選択した。該細胞をGFP発現について2回細胞選別し、選択した細胞を最大15回の継代の株として成長させた。FACS解析のルーチンのモニタリングを行って、これらの株のGFP陽性を確認した。これらの株のタンパク質抽出物を、抗hrGFP(Stratagene, La Jolla, CA)及び抗MUC16-カルボキシ末端モノクローナル抗体を用いるウェスタンブロットにより解析した(下記の第6.3.13節の参考文献19を参照)。第6.1節に記載されているように、MUC16c57-114-pFUSE-hIgG1-Fc2及び117-244LGALS3-pFUSE-hIgG1-Fc2コンストラクトを、製造元のプロトコルに従って、融合タンパク質を無血清培地中に発現及び分泌するヒト胚性腎臓(HEK) FreeStyle 293F細胞(Invitrogen, CA)に別々にトランスフェクトした(第6.1節及び下記の第6.3.13節の参考文献19を参照)。分泌された融合タンパク質を精製し、抗ヒトIgG1-Fc-HRP(γ1鎖特異的)(Southern Biotech社, Birmingham, AL)又は4H11-HRP又はポリクローナル抗ヒトLGALS3抗体(Abgent, San Diego, CA)を用いるウェスタンブロット解析により特徴付けた。HEK293細胞で発現されるEGFRDDK-HIS(cat # TP700043)、LGALS3Myc-DDK(cat # TP308785)、及びインテグリン-β1Myc-DDK(cat # TP303818)精製タンパク質は、Origene, Rockville, MDから購入した。
【０６２２】
(6.3.8  FACS解析による免疫蛍光染色)
MUC16発現のFACS解析は、第6.1節及び下記の第6.3.13節の参考文献6に記載されている通りに実施した。
【０６２３】
(6.3.9  成長曲線)
成長曲線は、第6.1節及び第6.2節並びに下記の第6.3.13節の参考文献18及び19に記載されている通りに実施した。
【０６２４】
(6.3.10  命名法)
実施例3(第6.3節)で使用されているように、「N1」は、「Asn1777」とも呼ばれる、配列番号150の位置1777のアスパラギンを指す。実施例3(第6.3節)で使用されているように、「N24」は、「Asn1800」とも呼ばれる、配列番号150の位置1800のアスパラギンを指す。実施例3(第6.3節)で使用されているように、「N30」は、「Asn1806」とも呼ばれる、配列番号150の位置1806のアスパラギンを指す。
【０６２５】
(6.3.11  結果)
(6.3.11.1   MUC16の病理生物現象はC末端MUC16エクトドメインのN-グリコシル化に依存的である)
C末端MUC16エクトドメインの最近位の114アミノ酸(MUC16c114)の発現は、MUC16駆動性マトリゲル浸潤の顕著な増大及びインビボでのより急速な腫瘍成長を含む、3T3マウス線維芽細胞のより侵襲的なインビトロ/インビボ挙動を引き起こした(第6.1節及び下記の第6.3.13節の参考文献19を参照)。ヒト卵巣細胞におけるMUC16の役割及びそのグリコシル化効果を調べるために、MUC16陰性SKOV3ヒト卵巣細胞株をMUC16発現の影響について調べた(図18A〜18C)。図19Aに示されているように、MUC16c114安定発現ベクターによるSKOV3細胞のトランスフェクションは、高レベルの細胞表面MUC16発現及び2倍を超えるマトリゲル浸潤の増大をもたらした。該細胞をN-グリコシル化阻害剤のツニカマイシンに24時間曝露させると、SKOV3-MUC16c114細胞の浸潤特性が大きく減少したが、SKOV3-phrGFPベクターのみでトランスフェクトされた細胞のマトリゲル浸潤に対してはほとんど効果がなかった(図19A)。
【０６２６】
レクチンは、これまで、グリコシル化効果の媒介に関係があるとされており(下記の第6.3.13節の参考文献17を参照)、ガレクチン-3は、ヒト卵巣癌で過剰発現されていることが多いので、ガレクチン-3の糖結合ドメイン(117-244LGALS3)と可変結合ドメインを欠く切断型pFUSE-ヒトIgG1-Fc2配列(pFUSE)とを組み合わせることにより、レクチン遮断コンストラクトを生成した(「117-244LGALS3-pFUSE」)(下記の第6.3.13節の参考文献1を参照)。このキメラ分子は、ガレクチン-3リガンドに結合するが、ガレクチン-3五量体を形成する能力を欠く。図19Aに示されているように、このガレクチン遮断コンストラクトを細胞に導入したとき、それは、対照SKOV3-phrGFP細胞によるマトリゲル浸潤に対してほとんど効果がなかったが、SKOV3-MUC16c114浸潤を顕著に低下させた。ガレクチン-3糖結合ドメインを欠く対照pFUSEベクターは効果がなかった。同じpFUSEベクターをMUC16エクトドメイン由来の58アミノ酸に連結することにより構築された可溶性MUC16エクトドメインも作製した(「MUC16c57-114-pFUSE」)。ガレクチン-3-pFUSE(117-244LGALS3-pFUSE)遮断コンストラクトの場合と同様、MUC16c57-114-pFUSEコンストラクトもまた、SKOV3-MUC16c114細胞の浸潤を顕著に減少させたが、SKOV3-phrGFP細胞の浸潤は減少させなかった。MGAT5は、ガレクチン-3結合に対する最も高い親和性を有する四本鎖N-グリカンの形成を触媒するグリコシル化酵素である(下記の第6.3.13節の参考文献9を参照)。MGAT5ノックアウトマウスは、腫瘍成長に抵抗性である(下記の第6.3.13節の参考文献8を参照)。任意の特定の理論に束縛されるものではないが、MUC16効果はガレクチン-3とMGAT5発現の両方に依存的であるという仮説を立てた。図19Bに示されているように、MGAT5又はガレクチン-3(LGALS3)のいずれかを低下させるshRNAは、SKOV3-MUC16c114浸潤を著しく減少させたが、Lamelliをノックダウンする陰性対照shRNAは効果がなかった。
【０６２７】
MUC16エクトドメインN-グリコシル化部位(MUC16c114エクトドメインの位置N1、N24、及びN30のアスパラギン残基)への突然変異の導入は、観察されるMUC16-グリコシル化依存的変化を低下させた。図19Cに示されているように、切断部位に隣接する、最遠位のアスパラギン(N1)のアスパラギンからアラニンへの突然変異は、浸潤に対する負の効果を有しなかった。対照的に、より近位のアスパラギン(N24又はN30)のどちらかのアスパラギンからアラニンへの突然変異は、浸潤に負の影響を及ぼした。特に、膜表面に最も近いアスパラギン(N30)の保存は、浸潤の増強に最も重要であり、その効果は、他のアスパラギン残基のアスパラギンからアラニンへのさらなる突然変異によって大きくは増大しなかった。MUC16 C末端由来の344アミノ酸を有するより大きいMUC16コンストラクト(MUC16c344)も調べた。MUC16c344のN30又はMUC16c344のN24及びN30にMUC16突然変異を担持する発現ベクターをSKOV3細胞株にトランスフェクトすると、マトリゲル浸潤が顕著に低下した(図19D)。このより大きいコンストラクトは、切断部位の遠位にある7つのさらなるN-グリコシル化部位を有するが、図19Dに示されているように、重要な近位のN24及びN30部位を突然変異させてもなお、これらの突然変異がSKOV3-MUC16c114で浸潤を変化させたのと全く同じように、マトリゲル浸潤を減少させた。
【０６２８】
3T3細胞のMUC16c114形質転換におけるERK経路とPI3K/AKT経路の両方の下流活性化が示されている(第6.1節及び下記の第6.3.13節の参考文献19を参照)。図19Eにおいて、MUC16c114によるSKOV3細胞のトランスフェクションが、pERK1/2、pSRC、及びEGFRのリン酸化を含む、種々の癌遺伝子を活性化させたことが分かる。図19Eは、以下の条件の各々が、MUC16c114誘導性の癌遺伝子活性化: MGAT5のノックダウン(shMGAT5)、ガレクチン-3のノックダウン(shLGALS3)、及びN30のアスパラギンからアラニンへの突然変異を障害することを示している。これらのデータは、MUC16c114発現に関連するマトリゲル浸潤で観察される減少と一致している。
【０６２９】
MGAT5もしくはLGALS3のノックダウン又はMUC16c114エクトドメインN-グリコシル化部位の突然変異の効果をヌードマウスにおける異種移植腫瘍成長で調べた。図19Fに示されているように、これらのN-グリコシル化に対する介入のいずれかによって、MUC16c114誘導性腫瘍成長の完全な無効化が見られた。受容体安定性に対するMUC16c114の効果も調べた。N-グリコシル化とガレクチン格子への結合の両方の存在が細胞表面でのEGFRの安定化と関連付けられている(下記の第6.3.13節の参考文献11を参照)。任意の特定の理論に束縛されるものではないが、MUC16の存在の増大が細胞表面ガレクチン格子を安定化し、それにより、細胞表面のEGFRを安定化すると推論された。図20Aに示されているように、SKOV3細胞の細胞表面のEGFRの存在は、FACS解析を用いて安定なSKOV3-MUC16c114トランスフェクタントをベクターのみの対照と比較したとき増大していた。さらに、MUC16c114発現は、新しいEGFR合成を阻害するためのシクロヘキシミド(CHX)処理の後、phrGFPベクター対照と比較して、細胞表面のEGFRのほぼ2倍であった。MUC16c114エクトドメイン(4H11陽性)の安定性はCHXによって変化しなかった。経時的な全EGFRを、ウェスタンブロッティングにより、CHXで24時間処理した安定なSKOV3-MUC16c114及びSKOV3-phrGFP細胞で比較し、EGFRをβ-アクチンと比較した。デンシトメトリー曲線(図20B)は、細胞表面のMUC16c114の存在がphrGFP-ベクター対照と比較してEGFRを安定化することを示した。この効果がSKOV3安定MUC16c114クローンの選択と関連する可能性を排除するために、テトラサイクリン誘導性MUC16c114系を利用した。図20Cに示されているように、24時間のテトラサイクリン曝露は、空のphrGFPベクターでトランスフェクトされた対照SKOV3細胞でも、安定なCMV駆動性MUC16c114発現ベクターでトランスフェクトされた対照SKOV3細胞でも、マトリゲル浸潤に効果がなかった。MUC16c114テトラサイクリン誘導系では、テトラサイクリン曝露によって、対照とMUC16c114の両方の安定トランスフェクタントと同様のMUC16c114依存的マトリゲル浸潤が誘導された。EGFRの必要性を、SKOV3細胞に導入される、EGFR発現を低下させるshRNAコンストラクト(shEGFR)の安定発現によって調べた。shEGFRトランスフェクト細胞の単一細胞クローンはどちらも、マトリゲル浸潤の著しい減少を示した。これら2つのshEGFR細胞株におけるMUC16c114のテトラサイクリン誘導性発現は、SKOV3-MUC16c114細胞株と比較して、マトリゲル浸潤に対する最小限の効果しか有せず、SKOV3-MUC16c114誘導性マトリゲル浸潤がEGFRの発現に共依存的であることが確認された。CHXで処理されたテトラサイクリン誘導性SKOV3-MUC16c114におけるEGFRの安定性をウェスタンブロッティングによって調べ、β-アクチンと比較した。図20Dに示されているように、24時間のCHX曝露は、未誘導のMUC16(-)SKOV3細胞における全EGFRタンパク質の着実な低下をもたらした。同じ実験をSKOV3-MUC16c114(tet)細胞のテトラサイクリン誘導後に実施した場合、CHX誘導性のEGFR喪失率は低下した。MUC16が該細胞のEGFR含有量を安定化しただけでなく、それは、未誘導のSKOV3-MUC16c114(tet)細胞と比較して、テトラサイクリン誘導性SKOV3-MUC16c114(tet)細胞におけるpEGFR発現レベルも安定化した(図21)。
【０６３０】
(6.3.11.2  モノクローナル抗体(mAb)開発のためのエピトープ模倣体としての均一なN-糖ペプチドの合成)
MUC16c114のN24及びN30部位におけるN-グリコシル化がMUC16作用にとって重要な必要条件であることを確認したので、SKOV3-MUC16c114細胞株から精製された、N1及びN24にアラニンからアスパラギンへの突然変異を含むMUC16c114突然変異型糖ペプチドのグリカンプロファイルを解析した(図22)。この精製糖ペプチドは、したがって、N-グリコシル化のための単一のアスパラギン残基(N30)を含有していた。この精製糖ペプチドのグライコーム解析を図22Aに示す。これは、大部分は、フコース及び様々なマンノース残基が結合する最小反復単位としての共通の近位キトビオース(GlcNAc2)二糖を共有する切断されたグリコシル化種からなる多様なN-グリコシル化パターンを特徴とした(図22A)。
【０６３１】
重要なN30グリコシル化部位を包含するMUC-16-エクトドメインエピトープを標的とする抗体が、MUC16とガレクチン格子との相互作用を阻害し、腫瘍成長及び浸潤を含む、MUC16発現の有害作用を減少させ得るという仮説を立てた。したがって、このN30部位においてキトビオースでグリコシル化された、MUC16エクトドメイン内の様々な長さの合成ペプチド抗原(すなわち、55、18、及び15アミノ酸の長さ;それぞれ、配列番号129、131、及び130)を設計した。より大きく、より複雑なN-グリカンに共通する最小モチーフであることに加え、キトビオース二糖は、基礎にあるペプチドのより良好な露出がペプチド特異性を保持するグリカンに対する抗体の誘発を可能にするはずでもあった。
【０６３２】
55-merのMUC16-エクトドメインN-糖ペプチド(GlcNAc2-55-mer;配列番号129)の合成は、高度に収束的であり、好都合に保護された全長ペプチド(55-mer)とキトビオースアミンとのカップリングと、それに続く、本発明者らの1フラスコアスパラギン酸化/脱保護手順を用いる酸による全体的な脱保護を伴った(第6.2節及び第6.4節並びに下記の第6.3.13節の参考文献7及び20を参照)。同様のアプローチの後、末端トリマンノースグリカンを担持するより複雑なMan3GlcNAc2-55-mer糖ペプチドも収束的アスパラギン酸化によって調製した。
【０６３３】
関連するグリコシル化部位の周囲のよりサイズの小さいエピトープに対する免疫応答に焦点を当てるために、それぞれ、1つのキトビオースグリカン(N30)及び2つのキトビオースグリカン(N24及びN30)を担持する、より短い15-mer及び18-merの糖ペプチドも合成した(図22C;それぞれ、配列番号131及び130)。後者は、いくつかのmAbに対する結合に必要であることが示されている、Tn抗原(GalNAc-α-O-Ser/Thr)のクラスター提示との類似によるものである(第6.2節及び第6.4節並びに下記の第6.3.13節の参考文献14〜16を参照)。その後、これらの糖ペプチドを、N末端システインを介してKLHキャリアタンパク質にコンジュゲートして、マウスワクチン接種のための対応する免疫原を作製した。
【０６３４】
(6.3.11.3  合成糖ペプチド/糖コンジュゲートによるマウスワクチン接種及び血清学的アッセイ)
マウスワクチン接種及び血清回収は、第6.2節及び第6.4節に記載されているプロトコルに従って実施した。GlcNAc2-55-mer糖ペプチド(配列番号129、図22B)による3回の免疫付与と、それに続く、キトビオース担持KLHコンジュゲートコンストラクト(モノ-グリコシル化された15-mer(配列番号131)とビス-グリコシル化された18-mer(配列番号130))の等量の混合物による免疫付与の後、10匹のマウスのうちの2匹しか、両方の55-mer(GlcNAc2ありとGlcNAc2なし(配列番号129))について弱陽性のELISAシグナルを示さず、これらのマウスが、55-merの免疫付与に対する限られた免疫応答しか有しないことが示唆された。両方のKLHコンジュゲート(GlcNAc2-15-mer(配列番号131)及び(GlcNAc2)2-18-mer(配列番号130))によるさらに2回の追加免疫付与は、特に2匹のマウス(マウス7及びマウス8)において、より短い糖ペプチドに対する免疫応答(IgGタイプ)の増強をもたらした。MUC16ペプチド骨格の異なる非グリコシル化部分に対する4H11 mAbは、15-mer/18-merの糖ペプチドに対する結合を示さず、マウス血清陽性とは別の異なる認識エピトープを示した。
【０６３５】
マウス7由来のポリクローナル血清をELISAによってさらに特徴付け、MUC16c114発現あり及びMUC16c114発現なしのいくつかの細胞株に対するFACSによってスクリーニングした。これらの細胞選別研究により、抗MUC16 4H11抗体対照と同様の、SKOV3-MUC16c114細胞とOVCAR3細胞の両方に対する陽性シグナルが確認された(下記の第6.3.13節の参考文献6を参照)。MUC16を欠くSKOV3-phrGFP対照細胞は、マウス7血清での結合について陰性であった。
【０６３６】
(6.3.11.4  グリコシル化に対するmAbの選択)
マウス7の脾臓を摘出し、脾細胞を高い融合効率でハイブリドーマ融合パートナーと融合させた。上清を選択し、個々の糖ペプチドに対するELISAによる反応性についてスクリーニングした(図22C)。複数の上清がGlcNAc2-15-mer及び(GlcNAc2)2-18-mer糖ペプチドと反応したが、スクリーニングされたハイブリドーマ上清の中に、ELISAスクリーニングで、非グリコシル化ペプチドよりもグリコシル化に対して高度の選択性を示すものはなかった。MUC16特異性は維持され、陽性の上清の中に、キトビオースでグリコシル化された無関係なペプチドと反応するものはなかった。4H11 mAbによって認識されるペプチド配列との重複は見られなかった。
【０６３７】
連続サブクローニングの後、このプロセスにより、MUC16-グリコシル化エピトープ及び相同な非グリコシル化配列と反応するが、陰性対照としての役割を果たす、キトビオースを担持する無関係なペプチドとは反応しないキトビオースに対する複数の一次mAbが得られた。このプールのうち、4つの高親和性抗体を選択し、特徴解析のためにさらに精製した。
【０６３８】
(6.3.11.5  抗MUC16 N30グリコシル化標的化/指向性mAbの特徴解析)
4つの代表的な抗体についての確証的特徴解析研究の結果は、図23AのELISAにより示されている。様々な合成ペプチドに対する候補抗体の結合を評価し、MUC16-エクトドメインペプチド骨格を認識する4H11抗体の結合と比較した。関連のないキトビオース結合ペプチドは、選択されたどの抗グリカン-MUC16抗体による顕著な結合も示さなかった。候補抗体は全て、両方のMUC16由来の15-mer(すなわち、非グリコシル化ペプチド及び対応するキトビオース糖ペプチド)に対する同様の結合親和性を示した。単一のGlcNAc、末端トリマンノース-キトビオース(Man3GlcNAc2)、及びフコシル化キトビオース(GlcNAc2Fuc)を含む、別の糖部分を担持するさらなる合成糖ペプチドは、免疫付与に使用されたキトビオース結合MUC16ペプチドに対する抗体反応性を大きくは変化させなかった。
【０６３９】
各々の抗体を、示差的にグリコシル化されたMUC16ペプチドを発現する細胞株の広範なパネルで、グリカン-MUC16c114及びグリカン-MUC16c344特異性についても試験した(表11)。これらの研究では、SKOV3-phrGFPトランスフェクタントを、SKOV3-MUC16c114(完全N-グリコシル化)、SKOV3-MUC16N24c114突然変異体(N24グリコシル化部位がないもの)、SKOV3-MUC16N30c114(N30グリコシル化部位がないもの)、及びSKOV3-MUC16N1-N24-N30c114(N1グリコシル化部位も、N24グリコシル化部位も、N30グリコシル化部位もないもの)と比較した。SKOV3-MUC16c114は、N1、N24、及びN30でN-グリコシル化されることができるMUC16の切断形態を発現するSKOV3細胞を指す。SKOV3-MUC16N24c114は、配列番号150のAsn1800に対応するアミノ酸位置がアスパラギンからアラニンへの突然変異を含み、したがって、この位置でN-グリコシル化されることができない、MUC16の切断された突然変異体形態を発現するSKOV3細胞を指す。SKOV3-MUC16N30c114は、配列番号150のAsn1806に対応するアミノ酸位置がアスパラギンからアラニンへの突然変異を含み、したがって、この位置でN-グリコシル化されることができない、MUC16の切断された突然変異体形態を発現するSKOV3細胞を指す。SKOV3-MUC16N1-N24-N30c114は、配列番号150のAsn1777、Asn1800、及びAsn1806に対応するアミノ酸位置がアスパラギンからアラニンへの突然変異を含み、したがって、これらの位置でN-グリコシル化されることができない、MUC16の切断された突然変異体形態を発現するSKOV3細胞を指す。ELISAデータと同様に、これらの結果は、MUC16特異的標的化が存在することを示した。
【０６４０】
しかしながら、ELISAデータと対照的に、MUC16エクトドメインのN24グリコシル化部位とN30グリコシル化部位の両方の喪失は、グリコシル化を標的とする抗体の反応性を低下させるのに対し、4H11抗体に対する反応性は保持され、それにより、細胞表面SKOV3-MUC16c114の存在が確認された。344アミノ酸にまで延長されたMUC16 C末端鎖を担持する細胞(例えば、SKOV3-MUC16c344)も、N24又はN30グリコシル化を同様に必要とした(表11)。さらに、グリカン-MUC16エクトドメインに対する抗体との反応性は、MGAT5の下方調節によって低減せず(表11)、N24/N30部位のキトビオースが、より複雑な分岐にもかかわらず、全細胞との抗体結合に寄与することが確認された。
【０６４１】
表11。表11は、N-グリコシル化部位修飾を伴うSKOV3-MUC16トランスフェクション時の4H11及び4つのGlcNAc2-MUC16エクトドメインモノクローナル抗体の幾何平均フィコエリスリン(PE)蛍光を提供している。4H11は、グリコシル化修飾の有無を問わず、全ての細胞株(MUC16を発現しないSKOV3-phrGFP株を除く)に対する結合を保持し、したがって、細胞表面のMUC16タンパク質が確認された。グリコシル化のN24部位とN30部位の両方が失われたとき、MUC16c114トランスフェクタントとMUC16c344トランスフェクタントの両方についてグリカン-MUC16抗体結合の低下が見られた。MGAT5ノックダウン細胞株に対する反応性の限られた喪失により、キトビオースが各々のGlcNAc2-MUC16エクトドメイン抗体に不可欠である一方で、より規模の大きい分岐が限られた効果しか有しないことが確認された。
【表１１】
2018509907.tif 000187
「G抗M」は、ヤギ抗マウスを指す。「PE」は、フィコエリスリンを指す。
【０６４２】
特徴付けられた4つの代表的なMUC16グリコシル化抗体(18C6、10C6、19C11、7B12)を、結合親和性(表12)及びSKOV3-MUC16c114トランスフェクタントを用いるマトリゲルアッセイによる浸潤に対するその効果について、4H11とともに評価した。図23B〜23Dに示されているように、新しく開発された抗体がマトリゲル浸潤の広範な阻害を示したのに対し、4H11は、そのSKOV3-MUC16c114媒介性浸潤を阻止する能力の欠如によって区別され、MUC16エクトドメイン中のグリコシル化ペプチドエピトープを標的とするこれらの抗体が、密に隣接するエピトープを標的とする抗体よりも良好にMUC16の重要な生物学的特性のいくつかを阻害することを示した。MUC16グリコシル化抗体は全て、CAOV3及びOVCA-433細胞などの、ネイティブの全長MUC16を発現する卵巣癌細胞で阻害性であった。これにより、N24/N30グリコシル化部位がMUC16の浸潤特性の増強に極めて重要である一方で、他のMUC16 N-及びO-グリコシル化部位の存在は、MUC16グリコシル化抗体によるこの極めて重要なエピトープの遮断を克服するのに不十分であることが示唆される。任意の特定の理論に束縛されるものではないが、MUC16に対するガレクチン-3のN24/30結合の抗体阻害も同様に、EGFR細胞表面安定化を障害すると予想される。図23B〜23Dは、これらの抗体のうちの1つ(10C6)を細胞培養物に導入したとき、テトラサイクリン誘導性SKOV3-MUC16c114(tet)のEGFR安定化効果が克服され、CHXに曝露された細胞におけるEGFR喪失の割合がMUC16c114発現のない未誘導のSKOV3-MUC16c114(tet)細胞株のEGFR喪失の割合と同様であったことを示している。抗体による免疫組織化学染色も卵巣癌組織マイクロアレイで調べた。図23Eに示されているように、グリカンに対するMUC16エクトドメイン抗体の各々は、4H11挙動と同様に、パラフィン固定組織中の漿液性卵巣癌細胞に結合し、他の間質組織との相互作用は限られていた。最後に、免疫不全マウスにおけるSKOV3-MUC16344の成長に対する10C6抗体の効果を試験した。複数のN-及びO-グリコシル化部位を有するMUC16陽性腫瘍細胞における抗体効果のよりストリンジェントな試験として、SKOV3-MUC16c114細胞の代わりに、SKOV3-MUC16c344細胞を利用した。10C6抗体は、MUC16c344細胞によるマトリゲル浸潤を減少させ(図23F)、腫瘍担持マウスに週2回投与したとき、マウス側腹におけるSKOV3-MUC16c344腫瘍細胞の成長を顕著に低下させた(図23G)。
【０６４３】
【表１２】
2018509907.tif 000188
*計算の信頼性が低く、解離速度にフィットするものがない
**kaが低すぎて、会合速度を決定することができない
【０６４４】
(6.3.11.6  MUC16と他の細胞表面タンパク質のガレクチン依存的共局在)
MUC16安定化EGFRは、卵巣癌細胞浸潤の重要な原動力であるように思われ、この相互作用は、EGFRと、適切にN-グリコシル化されたMUC16タンパク質エクトドメインと、ガレクチン-3の存在とに依存する。これら3つのタンパク質間の必要/十分な3者相互作用を立証するために、この相互作用を、精製タンパク質を用いて評価した。この目的のために、精製MUC16c57-114-pFUSEタンパク質(ヒト胚性腎臓[HEK] FreeStyle 293F細胞で産生される)(相互作用のMUC16部分としてのもの)、精製EGFRタンパク質(HEK293細胞によって産生される)、及び精製ガレクチン-3タンパク質(LGALS3; HEK293細胞によって産生される)を利用した。これらのタンパク質はヒト細胞で産生されるので、それらは、典型的なネイティブのグリコシル化種を担持すると予想された。任意の特定の理論に束縛されるものではないが、この3つのタンパク質は、免疫共沈降法によって同定することができるヘテロマーを形成するという仮説を立てた。図24Aは、この免疫共沈降の結果を示しており、ここでは、検出された3つのタンパク質の各々が左の3つのレーンの直接的な免疫ブロットに示されている。アガロースプロテインA/G PLUSビーズを用いると、MUC16c57-114-pFUSEタンパク質がプロテインA/G PLUSコンジュゲートビーズに結合し、SDS-PAGEゲルで分離したとき、溶出液中に存在したことが分かる。EGFRは、ガレクチン-3(LGALS3)も存在したときにのみ、組み合わせた溶出液中でMUC16c57-114-pFUSEとともに存在した。抗体18C6は、ガレクチン-3のN-グリコシル化結合部位を遮断することにより、EGFR-MUC16相互作用を消失させた(図24Aを参照)。また、直接的な分子二重免疫蛍光イメージングを用いて、生きた細胞におけるEGFRとMUC16の共局在を確認した。図24B及び図25Aに示されているように、EGFRとMUC16は、OVCAR3、SKOV3-MUC16c344、及びSKOV3-MUC16c114細胞において密に共局在した(図24B及び25Aの矢印を参照)。これらの研究により、MUC16がガレクチン-3と組み合わさって、MUC16陽性卵巣癌細胞の表面のEGFRと関連することが強く確認された。任意の特定の理論に束縛されるものではないが、多くの成長増強受容体はグリコシル化されているので、レクチン依存的なMUC16細胞表面効果は他のN-グリコシル化タンパク質を含み、EGFRに限定されない可能性があると推論された。インテグリンタンパク質は癌で変化し、SRCリン酸化及び他の下流の効果を誘発する間質-上皮相互作用によって開始される「外から内への」シグナル伝達に関与することが多い。図24Cは、MUC16と、癌の発生及び進行と関連する頻度が高いインテグリン成分であるインテグリンβ1との相互作用を示している。EGFRの場合と同様に、精製MUC16c57-114-pFUSEは、ガレクチン-3依存的な形でインテグリンβ1に結合し、このヘテロ三量体相互作用は、3つ全てのタンパク質を必要とした。EGFRと同様に、この相互作用は、抗MUC16c114グリコシル化部位ブロッキング抗体の18C6によって完全に遮断された。MUC16とインテグリンβ1の共局在もいくつかの卵巣癌細胞株における二重免疫蛍光により確認された(図24D及び図25B)。したがって、MUC16-エクトドメインペプチドエピトープ上の重要な部位におけるN-グリコシル化は、細胞表面タンパク質受容体との相互作用をレクチン特異的な形で媒介して、マトリゲル浸潤、PI3K/ERK及びSRC経路の活性化、及び免疫不全マウスにおけるMUC16陽性腫瘍成長の増強を含む、悪性挙動の��徴を生じさせた。
【０６４５】
任意の特定の機構に束縛されるものではないが、癌関連ムチンMUC16、及び卵巣癌細胞挙動に対するその効果の機械的モデルが図26に示されている。図26Aにおいて、MUC16は、ガレクチン-3を介してEGFR及びインテグリンβ1に結合して、安定性並びに成長及び浸潤を促進する「内から外への」シグナルを増強する。MUC16エクトドメインN-グリコシル化部位を突然変異させるか又はMGAT5活性を抑制すると(図26B)、その結合は妨げられ、EGFR/インテグリンシグナルは低下する。同様に、ガレクチン-3タンパク質発現が抑制された場合(図26C)、分子会合は失われ、シグナル及び浸潤は低下する。最後に、MUC16-エクトドメインキメラ抗体又はキメラ「TRAP」LGALS3分子は分子相互作用を妨げ、癌細胞は、観察されるMUC16腫瘍促進特性の全てを欠く(図26D)。
【０６４６】
(6.3.12  考察)
MUC16並びにMUC1及びMUC4などの他の繋留型ムチンは、3T3細胞を形質転換することができ、かつ有害転帰と関連している。癌における異常発現ムチンの機構は複雑かつ多様である。N-グリコシル化パターンが局所環境に応答した細胞成長において重要な役割を果たすということが十分に記載されている。糖タンパク質パターンの多様性は、ゴルジ体ベースのグリコシル化による環境依存的なヘキソサミンフラックスによって影響を受ける。EGFR、インスリン様成長因子受容体(IGF1R)、及びPDGFRなどの一般的な成長因子受容体は、栄養依存的な形で最初に優先的にグリコシル化され、これらの重度にグリコシル化された受容体は、細胞表面に優先的に送達される。対照的に、TGF-βなどの抑制性受容体はN-グリコシル化部位が少なく、後になって細胞表面に提示され、結果として成長プログラムの阻害が生じる(下記の第6.3.13節の参考文献12を参照)。卵巣癌において、EGFR発現は、侵襲的挙動と関連付けられており、EGFRシグナル伝達は、受容体のグリコシル化状態及びレクチンに対するN-グリコシル化種の親和性に依存的である(下記の第6.3.13節の参考文献2を参照)。酵素MGAT5は、癌細胞で過剰発現される重要なレクチンである、ガレクチン-3に対する最も大きい親和性を有する四本鎖の分岐N-グリカンの合成に重要であると思われる(下記の第6.3.13節の参考文献17を参照)。
【０６４７】
本実施例は、MUC16発現と関連する挙動が、細胞表面に対してMUC16の最近位のエクトドメイン領域上の特定のN-グリコシル化部位に対するこれらのプロセスを介して媒介されるという証拠を提供した。MGAT5依存的なN-グリコシル化パターンは、浸潤、癌遺伝子活性化、及び免疫不全マウスにおける腫瘍成長の増大を促進するためのガレクチン-3及び細胞表面タンパク質との高親和性相互作用に必要とされた。特に、切断後に保持されるMUC16のエクトドメイン上の最近位部位におけるN-グリコシル化は、この相互作用に極めて重要であった。これらのN-グリコシル化部位を除去するか、該部位をダミー受容体で遮断するか、又はその完全N-グリコシル化を妨害する介入は全て、MUC16の形質転換効果を障害した。これらの形質転換効果は、MUC16のみにではなく、近位N-グリコシル化部位におけるN-グリコシル化MUC16とガレクチン-3及び他の細胞表面タンパク質との相互作用にも依存すると思われた。MUC16エクトドメイン発現は、成長及び浸潤のメディエーターであるEGFRを安定化することが示され、もとのSKOV3phrGFP細胞と比較して、SKOV3-MUC16c114細胞表面におけるその滞留を引き延ばした。1つのN-グリコシル化部位しか保持しない単純化されたMUC16糖ペプチドモデルでさえも、グリコシル化の確率的性質のために、全て共通のキトビオースステムを介してMUC16タンパク質骨格に結合している種々のN-グリカンの存在をもたらした。したがって、MUC16エクトドメインの(N24/N30部位で)キトビオースに結合したMUC16c114グリカン-ペプチドエピトープに対する抗体を調製した。これらの新しい抗体(MUC16グリコシル化抗体)は、MUC16増強性の浸潤、癌遺伝子活性化、及びインビボ腫瘍成長を阻止した。重要なことに、これらのMUC16グリコシル化抗体は、全長MUC16発現を伴う細胞だけでなく、より短いMUC16 C末端発現を伴う切断型試験コンストラクトでもMUC16関連特性を阻害した。MUC16グリコシル化抗体は、CHXの存在下で卵巣癌細胞表面のEGFR安定化を妨害し、かつヌードマウスにおける移植された成長物を障害した。さらに、MUC16グリコシル化抗体の効果は、組換えガレクチン-3の存在下で、精製MUC16と精製EGFR又はインテグリンβ1のいずれかとの相互作用も妨げた。
【０６４８】
本実施例は、癌におけるムチン過剰発現の役割に関する洞察を明らかにしている。レクチン媒介性の低親和性多分子複合体の形成を通じて、MUC16は、グリコシル化依存的な形で「外から内への」シグナル伝達を増強することができた。最大限の効果の原因となる特定のN-グリコシル化部位は独特で、かつ細胞表面の近くにあり、一方、他のより遠位のN-グリコシル化部位は、あまり重要ではない可能性がある。臨床開発中のガレクチン-3阻害剤が存在するが、ダミー受容体「ガレクチン-3-TRAP」コンストラクト又は切断型「MUC16-TRAP」分子は、本実施例のインビトロモデルで同様の効果を有した。本実施例で同定されたMUC16グリコシル化抗体は、MUC16の形質転換効果を阻害した。
(6.3.13  参考文献)
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【０６７１】
(6.4  実施例4:補足的な化学情報)
本実施例は、(a)実施例2及び3(第6.2節及び第6.3節)で使用された方法及び記載された実験のいくつかのより詳細な説明;並びに(b)実施例2及び3(第6.2節及び第6.3節)と比較した追加の情報を提供する。
【０６７２】
(6.4.1  一般的な材料及び方法)
市販の材料(Aldrich、Fluka、Novabiochem)は全て、それ以上精製することなく使用した。N-α-Fmoc保護アミノ酸、シュードプロリンジペプチド、Oxyma Pure、及びNovaSyn TG Sieber樹脂は、Novabiochemから購入した。1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム 3-オキシドヘキサフルオロホスフェート(HATU)は、Genscriptから購入した。(7-アザベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyAOP)は、Oakwood Products社から購入した。キトビオースオクタアセテートは、Carbosynth Limitedから購入した。TCEP溶液(0.5M、中性pH)及びヘテロ二官能性リンカーのスルホ-GMBSは、Pierce, ThermoScientificから購入した。他の全ての試薬は、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)を含め、Aldrichから購入した。溶媒は全て、試薬等級又はHPLC等級(Fisher Scientific)であった。無水テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、トルエン、及びベンゼンは、無水溶媒系(アルゴン雰囲気下で中性アルミナのカラムに通したもの)から取得し、それ以上乾燥させることなく使用した。
【０６７３】
反応を予め精製した無水アルゴンの雰囲気下で実施した。大気及び水分感受性の液体及び溶液をシリンジで移した。適当な炭水化物試薬をトルエンによる水の共沸除去により乾燥させた。分子篩を350℃で活性化し、使用直前に粉砕し、その後、真空下で火炎乾燥させた。有機溶液を、減圧下、回転蒸発により、30℃未満で濃縮した。NMRスペクトル(1H及び13C)をBruker Advance DRX-600 MHz分光計で記録し、TMS又は残留溶媒を基準とした。低分解能質量スペクトル分析をJOEL JMS-DX-303-HF質量分析計又はWaters Micromass ZQ質量分析計を用いて実施した。分析的TLCをE. Merckシリカゲル60 F254プレートで実施し、UV光(254nm)下で、又はモリブデン酸セリウムアンモニウム(CAM)もしくはメタノール中5％硫酸で染色することにより可視化した。シリカフラッシュカラムクロマトグラフィーをE. Merck 230-400メッシュシリカゲル60で実施した。
【０６７４】
(6.4.1.1  UPLC/LC-MS分析及びRP-HPLC精製)
逆相クロマトグラフィー分離は全て、水中の0.05％トリフルオロ酢酸(TFA)(v/v)及びアセトニトリル中の0.04％TFAからなる移動相を伴った。反応進行は、光ダイオード検出器及び単一の四重極質量検出器を有し、Acquity UPLC BEH C18/C8/C4カラム(1.7μm、2.1×100mm)を備えた、Waters AcquityTM超高速液体クロマトグラフィーシステムでのUPLC-MS分析により、0.3mL/分の流速でモニタリングした。分析的LC-MS分析は、Varian Microsorb C18カラム(150×2.0mm)、Varian Microsorb C8/C4カラム(250×2.0mm)、又はWaters X-Bridge C18カラム(150×2.1mm)を用いて、Waters 2996光ダイオードアレイ検出器を備えたWaters 2695分離モジュールで、0.2mL/分の流速で実施した。分取スケールのHPLC精製は、Agilent Dynamax逆相HPLC Microsorb C18/C8/C4カラム(250×21.4mm)又はWaters X-Bridge C18カラム(150×19.0mm)を用いて、Rainin UV-1検出器を備えたRanin HPLC溶媒送達系で、16.0mL/分の流速で実施した。
【０６７５】
(6.4.2  実験手順)
(6.4.2.1  Fmocベースの固相ペプチド合成(SPPS))
自動ペプチド合成をCEM Libertyマイクロ波ペプチド合成装置で行った。ペプチドを、標準的なFmocプロトコルの下、NovaSyn TG Sieber樹脂上で合成した。デブロック混合物は、Oxyma Pure(0.1M)の20％ピペリジン/DMF溶液からなっていた。Novabiochem製の以下のFmocアミノ酸: Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Dmcp)-OH、Fmoc-Asp(OMpe)-OH、Fmoc-Asp(OPp)-OH、Fmoc-Asp(OAllyl)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Dmcp)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OHを使用した。以下のDmb(2,4-ジメトキシベンジル)及びシュードプロリンジペプチド(Novabiochem): Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH、Fmoc-Gly-Thr(ψMe,MePro)-OH、Fmoc-Phe-Thr(ψMe,MePro)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(ψMe,MePro)-OHを使用した。
【０６７６】
(6.4.2.2  ペプチド-樹脂のN末端アセチル化)
0.1mmolスケールでの自動合成の終了後、ペプチド-樹脂をDMF(2mL)で洗浄して、ペプチド合成容器に入れ、DMF(2mL)中の無水酢酸(188μL、2mmol)及びDIEA(384μL、2.2mmol)で処理した。混合物を穏やかな窒素バブリングによって1時間振盪させ、その後、DMF及びCH2Cl2で洗浄した後、脱アリル化に供した。
【０６７７】
(6.4.2.3  アスパラギン酸側鎖Asp(Oアリル)の樹脂上での脱アリル化)
N-アセチル化樹脂結合ペプチド(0.1mol)をDMF/CH2Cl2中のPd(PPh3)4(7.5mg、6.5μmol)及びフェニルシラン(75μL、0.6mmol)(4mL、1:1)で処理した。20分間の穏やかな窒素バブリングの後、Pd(PPh3)4/フェニルシラン処理を2回繰り返した。その後、ペプチド-樹脂を、DMF、CH2Cl2、及びメタノールで洗浄し、真空下で乾燥させた。
【０６７８】
(6.4.2.4  樹脂からの切断[及び該当する場合、同時的なAsp(O-2-PhiPr)側鎖脱保護])
乾燥後、ペプチド-樹脂を切断カクテル(1％TFA/CH2Cl2、4mL)に5サイクル×5分で供し、このプロセスを4回繰り返した。さらなる切断シーケンスには、1.5％TFA/CH2Cl2(4mL、5サイクル×5分)及び2％TFA/CH2Cl2(4mL、5サイクル×5分)による処理が含まれた。切断溶液のそれぞれの部分を氷冷Et2Oに個別にプールし、濃縮した。対応する油性残渣を最小量のトリフルオロエタノールに再懸濁させ、水で沈殿させた。得られた混合物をすぐに凍結乾燥させると、C末端アミドを担持する粗保護ペプチドが得られた。
【０６７９】
(6.4.2.5  ランズベリーアスパラギン酸化による部分的に保護された全長ペプチド(55-mer)とグリカンアミンとのカップリングと、その後のカクテルRによる酸に不安定な保護基の除去)
部分的に保護された全長ペプチド(1.0当量)及びグリカンアミン(キトビオース: 4.0当量; Man3GlcNAc2 1.6当量)を合わせ、無水DMSOに溶解させた。この混合物に、新たに調製されたPyAOP(4.0当量)のDMSO溶液、その後、DIEA(6.0当量)を添加した。反応混合物を3時間撹拌し、1mLの氷冷水(0.05％TFA)の添加によりクエンチした。形成された沈殿を遠心分離により単離し、水/CH3CN(1:1、0.05％TFA)に再懸濁させ、すぐに凍結乾燥させた。
【０６８０】
その後、保護された糖ペプチドを、カクテルR(90％TFA、5％チオアニソール、3％エタンジチオール、2％アニソール)(1mL)での2時間の処理による全体的な酸脱保護に供した。残渣を氷冷Et2O(12mL)で沈殿させ、得られた懸濁液を遠心分離すると、白色のペレットが得られた。上清をデカントで捨て、ペレットを氷冷ジエチルエーテル(12mL)で粉砕した。このプロセスを合計3回繰り返し、得られた沈殿を水/CH3CN(1:1、0.05％TFA)に可溶化させ、凍結乾燥させた。対応する粗糖ペプチドをRP-HPLCにより精製した。
【０６８１】
(6.4.2.6  ランズベリー/二重ランズベリーアスパラギン酸化による部分的に保護されたサイズの小さいペプチド(15-及び18-mer)とキトビオースアミンとのカップリングと、その後の酸に不安定な保護基の除去)
部分的に保護されたペプチド(1.0当量)及びキトビオースアミン(3.0当量/二重ランズベリーアスパラギン酸化については、7.0当量)を合わせ、無水DMSOに溶解させた。この混合物に、新たに調製されたPyAOP(4当量/後者の場合、6当量)のDMSO溶液、その後、DIEA(それぞれ、6当量/8当量)を添加した。反応混合物を2.5時間撹拌し、1mLの氷冷水(0.05％TFA)の添加によりクエンチした。形成された沈殿を遠心分離により単離し、水/CH3CN(1:1、0.05％TFA)に再懸濁させ、すぐに凍結乾燥させた。
【０６８２】
その後、保護された糖ペプチドを、TFAカクテル(94％TFA、2.5％H2O、2.5％EDT、1％TIPSH)(1mL)での2時間の処理による全体的な酸脱保護に供した。残渣を氷冷Et2O(12mL)で沈殿させ、懸濁液を遠心分離すると、白色のペレットが得られた。上清をデカントで捨て、ペレットを氷冷ジエチルエーテル(12mL)で粉砕した。このプロセスを合計3回繰り返し、得られた沈殿を水/CH3CN(1:1、0.05％TFA)に溶解させ、凍結乾燥させた。対応する粗糖ペプチドをRP-HPLCにより精製した。
【０６８３】
(6.4.2.7  15/18-merの糖ペプチドのKLHコンジュゲーション)
KLHを、まず、ヘテロ二官能性架橋剤のスルホ-GMBS)とともに、pH 7のリン酸緩衝食塩水(PBS)中で2時間インキュベートした。コンジュゲートされなかった架橋剤をサイズ排除クロマトグラフィー(それぞれ、Bio-Gel P-10微細カラムに通す)より除去し、その後、マレイミド活性化KLHを得た。末端チオール官能基を担持する新たに脱保護された(糖)ペプチドをマレイミド含有KLHとpH 7のPBS中で混合し、室温で6時間インキュベートした。この後、Amicon Ultra-4遠心分離フィルター(分子量カットオフは50000)を用いて、未反応の(糖)ペプチドを除去した。最終的に、対応するKLHコンジュゲートがPBS溶液として得られた。
【０６８４】
(6.4.3  全長MUC16糖ペプチド(55-mer)の合成)
(6.4.3.1  キトビオース担持全長糖ペプチドの合成)
第6.4.2.1節の方法による自動合成の終了後、ペプチド-樹脂をN-アセチル化及び脱アリル化(それぞれ、第6.4.2.2節及び第6.4.2.3節を参照)に供すると、樹脂からの切断(第6.4.2.4節を参照)の後に、Asp30側鎖に遊離カルボン酸を担持する部分的に保護されたペプチドp55-mer[N1-S55]が得られた。この粗ペプチドの画分を5→12％MeOH/CH2Cl2で溶出させるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製すると、凍結乾燥後に、ペプチドp55-mer[N1-S55](70mg)が白色の固体として得られた。図27Aは、側鎖が保護されたN-アセチル化55-merペプチドアミドを示している。図27Bは、糖ペプチドp55-mer[N1-S55]についてのESI-MSとUPLC分析からのUVトレースとを示している。
【０６８５】
第6.4.2.6節に従って、ペプチドp55-mer[N1-S55](20mg、2.0μmol)及びキトビオース(GlcNAc2)アノマーアミン(3.5mg、8.1μmol)を合わせ、無水DMSO(100μL)に溶解させた。PyAOP(4.3mg、8.1μmol)のDMSO(30μL)溶液、その後、DIEA(2.0μL、12.2μmol)を添加した。金色〜黄色の混合物を3時間撹拌し、1mLの氷冷水(0.05％TFA)の添加によりクエンチし、凍結させ、凍結乾燥させた。
【０６８６】
その後、保護された糖ペプチドを、第6.4.2.6節に記載されている通りに、カクテルR(1.0mL)に2時間供し、氷冷Et2Oで沈殿させ、遠心分離し、再懸濁させ、凍結乾燥させた。粗ペプチドを25％アセトニトリル/水(0.05％TFA)(2mL)に溶解させ、30分かけての水中25〜35％アセトニトリル(0.05％TFA)の線形勾配を用いて、X-Bridge C18カラムでのHPLCにより精製した。20分で溶出する所望の生成物を含む画分を回収し、凍結乾燥させると、糖ペプチド「55-mer(キトビオース)[N1-S55]」(GlcNAc2-55-mer)(3.0mg、22％収率)が白色の固体として得られた(図28A)。図28Bは、糖ペプチド「55mer(キトビオース)[N1-S55]」(GlcNAc2-55-mer)についてのESI-MSとUPLC分析からのUVトレースとを提供している。
【０６８７】
(6.4.3.2  五糖担持全長糖ペプチドの合成)
第6.4.2.6節に従って、ペプチドp55-mer[N1-S55](10mg、1.0μmol)及び五糖Man3GlcNAc2アノマーアミン(1.5mg、1.6μmol)を合わせ、無水DMSO(30μL)に溶解させた。その後、PyAOP(2.1mg、4.1μmol)のDMSO(5μL)溶液、その後、DIEA(1.0μL、6.1μmol)を添加した。金色〜黄色の混合物を3時間撹拌し、1mLの氷冷水(0.05％TFA)の添加によりクエンチし、凍結させ、凍結乾燥させた。
【０６８８】
その後、保護された糖ペプチドを、第6.4.2.6節に記載されている通りに、カクテルR(1.0mL)に2時間供し、氷冷Et2Oで沈殿させ、遠心分離し、再懸濁させ、凍結乾燥させた。粗ペプチドを25％アセトニトリル/水(0.05％TFA)(2mL)に溶解させ、30分かけての水中25〜35％アセトニトリル(0.05％TFA)の線形勾配を用いて、X-Bridge C18カラムでのHPLCにより精製した。18分で溶出する所望の生成物を含む画分を回収し、凍結乾燥させると、糖ペプチド「55-mer(Man3GlcNAc2)[N1-S55]」(Man3GlcNAc2-55-mer)(1.5mg、20％収率)が白色の固体として得られた。図29Aは、Man3GlcNAc2を担持する55-merの糖ペプチド:「55-mer(Man3GlcNAc2)[N1-S55]」(Man3GlcNAc2-55-mer)を示している。図29Bは、糖ペプチド「55mer(Man3GlcNAc2)[N1-S55]」(Man3GlcNAc2-55-mer)についてのESI-MSと分析的HPLC分析からのUVトレースとを示している。
【０６８９】
(6.4.4  よりサイズの小さい糖ペプチド(15-mer及び18-mer)の合成)
(6.4.4.1  キトビオース-モノグリコシル化15-merの合成)
第6.4.2.1節による自動合成の終了後、ペプチド-樹脂をN-アセチル化及び脱アリル化(それぞれ、第6.4.2.2節及び第6.4.2.3節を参照)に供すると、樹脂からの切断(第6.4.2.4節を参照)の後に、Asp30(配列番号150のAsn1806に対応する)側鎖に遊離カルボン酸を担持する部分的に保護されたペプチドp15-mer[C-G25-V38]が得られた。図30A。このペプチドを、それ以上精製することなく、次の工程で使用した。
【０６９０】
ペプチドp15-mer[C-G25-V38](10mg、3.8μmol)及びキトビオース(GlcNAc2)アノマーアミン(4.8mg、11.3μmol)を合わせ、無水DMSO(80μL)に溶解させた。PyAOP(5.9mg、11.3μmol)のDMSO(20μL)溶液、その後、DIEA(2.6μL、15μmol)を添加し、金色〜黄色の混合物を2.5時間撹拌し、凍結させ、凍結乾燥させた。その後、保護された糖ペプチドを、第6.4.2.6節に従って、TFAカクテル(1mL)に2時間供し、氷冷ジエチルエーテルで沈殿させ、遠心分離し、再懸濁させ、凍結乾燥させた。粗ペプチドを15％アセトニトリル/水(0.05％TFA)(2mL)に溶解させ、30分かけての水中15〜35％アセトニトリル(0.05％TFA)の線形勾配を用いて、C18カラムでのHPLCにより精製した。17分で溶出する所望の生成物を含む画分を回収し、凍結乾燥させると、糖ペプチド「15-mer(キトビオース)[C-G25-V38]」(GlcNAc2-15-mer)(2.0mg、25％収率)が白色の固体として得られた。キトビオース-モノグリコシル化15-mer糖ペプチド: 15-mer(キトビオース)[C-G25-V38](GlcNAc2-15-mer)については、図30Bを参照されたい。図30Cは、糖ペプチド「15mer(キトビオース)[C-G25-V38]」(GlcNAc2-15-mer)についてのESI-MSと分析的HPLC分析からのUVトレースとを示している。
【０６９１】
(6.4.4.2  キトビオース-ビスグリコシル化18-merの合成)
第6.4.2.1節による自動合成の終了後、ペプチド-樹脂をN-アセチル化に供した(第6.4.2.2節を参照)。その後、樹脂からの切断及びそれと同時のOPp保護基の除去を、第6.4.2.4節に示される方法に従って達成すると、Asp24側鎖とAsp30側鎖の両方(それぞれ、配列番号150のAsn1800及びAsn1806に対応する)に遊離カルボン酸を担持する部分的に保護されたペプチドp18-mer[C-T22-V38]が得られた。このペプチドを、それ以上精製することなく、次の工程で使用した。図32Aを参照されたい。
【０６９２】
ペプチドp18-mer[C-T22-V38](30mg、9.1μmol)及びキトビオース(GlcNAc2)アノマーアミン(27mg、63.4μmol)を合わせ、無水DMSO(150μL)に溶解させた。その後、PyAOP(28.5mg、54.6μmol)をDMSO(50μL)中に添加し、その後、DIEA(2.6μL、15μmol)を添加し、金色〜黄色の混合物を2.5時間撹拌し、凍結させ、凍結乾燥させた。その後、保護された糖ペプチドを、第6.4.2.6節に従って、TFAカクテル(1mL)に2時間供し、氷冷ジエチルエーテルで沈殿させ、遠心分離し、再懸濁させ、凍結乾燥させた。粗ペプチドを15％アセトニトリル/水(0.05％TFA)(6mL)に溶解させ、30分かけての水中15〜27％アセトニトリル(0.05％TFA)の線形勾配を用いて、C8カラムでのHPLCにより精製した。15分で溶出する所望の生成物を含む画分を回収し、凍結乾燥させると、糖ペプチド「18-mer(キトビオース)2[C-T22-V38]」[(GlcNAc2)2-18-mer](6.5mg、25％収率)が白色の固体として得られた。図32Bを参照されたい。図32Cは、糖ペプチド「18mer(キトビオース)2[C-T22-V38]」[(GlcNAc2)2-18-mer]についてのESI-MSと分析的HPLC分析からのUVトレースとを示している。
【０６９３】
(6.5  15-mer及び18-merのMUC16糖ペプチドのKLHコンジュゲーション)
糖ペプチド「15-mer(キトビオース)[C-G25-V38]」及び「18-mer(キトビオース)2[C-T22-V38]」を、第6.4.2.7節に示された手順に従って、KLHにコンジュゲートすると、それぞれ、対応するKLHコンジュゲートのGlcNAc2-15-mer-KLH及び(GlcNAc2)2-18-mer-KLHが得られた。図33A及び図33Bを参照されたい。
【０６９４】
(7.配列の表)
表13.配列の表
【表１３】
2018509907.tif 000189
2018509907.tif 000190
2018509907.tif 000191
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2018509907.tif 000238
【０６９５】
(8.等価物)
本明細書に引用されている全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも各々の個々の刊行物又は特許出願が、引用により組み込まれることが具体的かつ個別的に示されているかのように引用により本明細書中に組み込まれる。上の発明は、理解の明快さのために図及び実施例としていくらか詳細に記載されているが、本発明の教示に照らし、添付の特許請求の範囲の精神又は範囲を逸脱することなく、一定の変更及び修正をそれに加えることができることが当業者には容易に明らかになるであろう。
【図１Ａ−Ｂ】
2018509907.tif 000313
【図１Ｃ−Ｄ】
2018509907.tif 000314
【図１Ｅ−Ｆ】
2018509907.tif 000315
【図１Ｇ−Ｉ】
2018509907.tif 000316
【図２】
2018509907.tif 000317
【図３Ａ−Ｃ】
2018509907.tif 000318
【図３Ｄ−Ｅ】
2018509907.tif 000319
【図４】
2018509907.tif 000320
【図５Ａ−Ｂ】
2018509907.tif 000321
【図５Ｃ−Ｄ】
2018509907.tif 000322
【図６】
2018509907.tif 000323
【図７Ａ−Ｂ】
2018509907.tif 000324
【図７Ｃ−Ｄ】
2018509907.tif 000325
【図７Ｅ−Ｆ】
2018509907.tif 000326
【図７Ｇ−Ｈ】
2018509907.tif 000327
【図８】
2018509907.tif 000328
【図９Ａ】
2018509907.tif 000329
【図９Ｂ−Ｃ】
2018509907.tif 000330
【図９Ｄ−Ｅ】
2018509907.tif 000331
【図１０】
2018509907.tif 000332
【図１１Ａ】
2018509907.tif 000333
【図１１Ｂ−Ｃ】
2018509907.tif 000334
【図１２Ａ】
2018509907.tif 000335
【図１２Ｂ】
2018509907.tif 000336
【図１２Ｃ】
2018509907.tif 000337
【図１３Ａ】
2018509907.tif 000338
【図１３Ｂ−Ｃ】
2018509907.tif 000339
【図１４】
2018509907.tif 000340
【図１５Ａ】
2018509907.tif 000341
【図１５Ｂ】
2018509907.tif 000342
【図１６Ａ】
2018509907.tif 000343
【図１６Ｂ】
2018509907.tif 000344
【図１６Ｃ】
2018509907.tif 000345
【図１６Ｄ】
2018509907.tif 000346
【図１６Ｅ】
2018509907.tif 000347
【図１７】
2018509907.tif 000348
【図１８】
2018509907.tif 000349
【図１９Ａ】
2018509907.tif 000350
【図１９Ｂ−Ｄ】
2018509907.tif 000351
【図１９Ｅ−Ｆ】
2018509907.tif 000352
【図２０Ａ−Ｂ】
2018509907.tif 000353
【図２０Ｃ】
2018509907.tif 000354
【図２０Ｄ】
2018509907.tif 000355
【図２１】
2018509907.tif 000356
【図２２Ａ】
2018509907.tif 000357
【図２２Ｂ−Ｃ】
2018509907.tif 000358
【図２３Ａ】
2018509907.tif 000359
【図２３Ｂ−Ｄ】
2018509907.tif 000360
【図２３Ｅ−Ｆ】
2018509907.tif 000361
【図２３Ｇ−Ｈ】
2018509907.tif 000362
【図２４Ａ−Ｂ】
2018509907.tif 000363
【図２４Ｃ−Ｄ】
2018509907.tif 000364
【図２５Ａ】
2018509907.tif 000365
【図２５Ｂ】
2018509907.tif 000366
【図２６】
2018509907.tif 000367
【図２７Ａ】
2018509907.tif 000368
【図２７Ｂ】
2018509907.tif 000369
【図２８Ａ】
2018509907.tif 000370
【図２８Ｂ】
2018509907.tif 000371
【図２９Ａ】
2018509907.tif 000372
【図２９Ｂ】
2018509907.tif 000373
【図３０Ａ】
2018509907.tif 000374
【図３０Ｂ】
2018509907.tif 000375
【図３０Ｃ】
2018509907.tif 000376
【図３１Ａ】
2018509907.tif 000377
【図３１Ｂ】
2018509907.tif 000378
【図３１Ｃ】
2018509907.tif 000379
【図３２Ａ】
2018509907.tif 000380
【図３２Ｂ】
2018509907.tif 000381
【配列表】
2018509907000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年12月14日(2017.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018509907000001.app
【国際調査報告】
2018509907.tif 000382
2018509907.tif 000383
2018509907.tif 000384
2018509907.tif 000385
2018509907.tif 000386
2018509907.tif 000387
2018509907.tif 000388