(57)【要約】遺伝子発現を調節する、すなわち、増加または減少のいずれかのために使用され得る、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍから単離されるポリヌクレオチドを含む天然プロモーター、及びそれに由来する変異プロモーターを提供する。また、徐々に増加するプロモーター活性を有する複数のプロモーターを含むプロモーターラダーを提供する。また、プロモーターを含む宿主細胞及び組換えベクター、及び対象遺伝子を発現し、宿主細胞を用いて生体分子を生成する方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１〜８からなる群から選択されるプロモーターポリヌクレオチド配列を含む、組換え核酸分子。
【請求項２】
前記プロモーターポリヌクレオチド配列が、配列番号１、５、及び７からなる群から選択される、請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項３】
リンカーオリゴヌクレオチドまたはリンカーポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１または２に記載の組換え核酸分子。
【請求項４】
前記少なくとも１つの異種標的遺伝子が、アミノ酸、有機酸、タンパク質、及びポリマーからなる群から選択される生体分子を生成する生合成経路の成分である遺伝子である、請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項５】
前記少なくとも１つの異種標的遺伝子が、
京都遺伝子ゲノム百科事典及びゲノム（ＫＥＧＧ）のエントリーＭ０００１６の遺伝子を含むリジン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００５２５の遺伝子を含むリジン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００５２６の遺伝子を含むリジン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００５２７の遺伝子を含むリジン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００３０の遺伝子を含むリジン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００４３３の遺伝子を含むリジン生合成経路；及び
ＫＥＧＧエントリーＭ００３１の遺伝子を含むリジン生合成経路
からなる群から選択される生合成経路のアミノ酸の成分である遺伝子である、請求項４に記載の組換え核酸分子。
【請求項６】
配列番号１〜８からなる群から選択される１つ以上の追加のプロモーターポリヌクレオチド配列をさらに含み、各プロモーターが、少なくとも１つの追加の異種遺伝子に機能的に連結している、請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項７】
前記組換え核酸分子が単離されている、請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項８】
少なくとも１つの異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１〜８からなる群から選択されるプロモーターポリヌクレオチド配列を含む、組換えベクター。
【請求項９】
前記プロモーターポリヌクレオチド配列が、配列番号１、５、及び７からなる群から選択される、請求項８に記載の組換えベクター。
【請求項１０】
前記標的遺伝子が、同じ代謝経路の一部である、請求項８または９に記載の組換えベクター。
【請求項１１】
前記標的遺伝子が、同じ代謝経路の一部ではない、請求項８または９に記載の組換えベクター。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換え核酸分子、または請求項８〜１１のいずれか１項に記載の組換えベクターで形質転換された組換え核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の１つ以上の追加の組換え核酸分子、または請求項８〜１１のいずれか１項に記載の１つ以上の追加の組換えベクターで形質転換された１つ以上の追加の組換え核酸分子をさらに含む、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の１つ以上の追加の組換え核酸分子、または請求項８〜１１のいずれか１項に記載の１つ以上の追加の組換えベクターが、異なる異種標的遺伝子に機能的に連結している、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
プロモーターポリヌクレオチド配列の組み合わせを含み、前記プロモーターポリヌクレオチド配列の各々が、異なる異種標的遺伝子に機能的に連結している、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記異なる異種標的遺伝子の各々が、同じ代謝経路の一部である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
前記異なる異種標的遺伝子の各々が、同じ代謝経路の一部ではない、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、請求項１８に記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１２月７日に出願された米国特許仮出願番号第６２／２６４，２３２号、及び２０１６年１２月７日に出願された米国特許仮出願番号第６２／４３１，４０９号の利益を主張し、それぞれの出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
テキストファイルとして提供された配列表の参照による組み込み
配列表は、２０１６年１１月３０日に作成され、４，５７５バイトのサイズを有する、テキストファイル「ＺＭＧ−００１−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔ」として本明細書に提供される。テキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍから単離されたポリヌクレオチドを含む天然プロモーター及びそれに由来する変異プロモーター、宿主細胞、及びプロモーターを含む組換えベクター、及び宿主細胞を培養することを含む、標的遺伝子の発現を改変し、生体分子を生成する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
コリネ型細菌、特に、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの株は、アミノ酸、有機酸、ビタミン、ヌクレオシド、及びヌクレオチドなどの生体分子の生成において重要な役割を果たし、生成処理を改善するために継続的な努力がなされている。前記処理は、例えば撹拌及び酸素供給などの発酵関連措置、または例えば発酵中の糖濃度などの栄養培地の組成、または例えばイオン交換クロマトグラフィーによって製品形態にワークアップ、または微生物自体の本来の性能特性に対して改良されてもよい。
【０００５】
性能特性には、例えば、収率、力価、生産性、副生成物の除去、処理逸脱への耐性、最適成長温度、及び成長速度を含み得る。微生物株の性能を改善する１つの方法は、代謝産物の生成を制御する遺伝子の発現を増加することである。遺伝子の発現を増加することは、その遺伝子によってコードされる酵素の活性を増加し得る。酵素活性を増加することは、酵素が属する経路によってなされる代謝産物の合成速度を増加し得る。場合によっては、代謝産物の生成速度を増加することは、他の細胞処理を不均衡にし、微生物培養の成長を阻害し得る。場合によっては、下方調節活性は、株の性能を改善するために重要である。例えば、副生成物から離れて流束を再指向することは、収率を改善し得る。従って、代謝経路内で種々の成分の発現レベルを同時に微調整することが、しばしば必要である。
【０００６】
プロモーターは、遺伝子が転写される速度を調節し、種々の方法で転写に影響を及ぼし得る。構成的プロモーターは、例えば、内部または外部の細胞条件に関わらず、それらの関連遺伝子の転写を一定速度で指向する一方で、調節可能なプロモーターは、内部及び／または外部細胞条件、例えば、成長速度、温度、特定の環境化学に対する応答などに応じて、遺伝子が転写される速度を増加または減少させる。プロモーターは、正常な細胞状況から単離され、事実上任意の遺伝子の発現を調節するように操作することができ、対象の細胞成長、生成物収率、及び／または他の表現型を効果的に改変することができる。
【０００７】
これまで説明してきたよりも十分に定められたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属プロモーターのより広範な仕分けを明確にする必要がある。そのようなプロモーターは、コリネフォルム細胞中の遺伝子の協調発現に有用であろう。例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍプロモーターの集合体は、所望の生体分子に対する生合成経路の成分をコードする遺伝子の発現を増強することによって、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞中の生体分子の工業規模生成を容易にする。本明細書に記載のプロモーターは、これら及び他の必要性を満たすのを助ける。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
簡単に言えば、本開示は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍから単離されたポリヌクレオチドを含む天然プロモーター及びそれに由来する変異プロモーターに関し、各々は、短いＤＮＡ配列、理想的には、１００未満の塩基対によってコードすることができ、徐々に増加する発現レベルを有する構成的プロモーターのラダー（はしご）を一緒になって表す。種々の遺伝子が前記プロモーターの制御下で有利に発現されることが可能である。
【０００９】
本発明の一実施形態は、配列番号１、配列番号５、または配列番号７から選択される配列を含む第１のプロモーターポリヌクレオチドに関する。いくつかの実施形態では、第１のプロモーターポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号５、または配列番号７から選択される配列からなる。本発明の一実施形態は、本明細書に記載の少なくとも２つの第１のプロモーターポリヌクレオチドを含むプロモーターポリヌクレオチドの組み合わせに関する。本発明の一実施形態は、本明細書に記載の少なくとも１つの第１のプロモーターポリヌクレオチド、及び配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、及び配列番号８からなる群から選択される配列を含む少なくとも１つの第２のプロモーターポリヌクレオチドを含むプロモーターポリヌクレオチドの組み合わせに関する。本発明の一実施形態は、本明細書に記載の少なくとも１つの第１のプロモーターポリヌクレオチド、及び配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、及び配列番号８からなる群から選択される配列からなる少なくとも１つの第２のプロモーターポリヌクレオチドを含むプロモーターポリヌクレオチドの組み合わせに関する。
【００１０】
本発明の一実施形態は、本明細書に記載の第１のプロモーターポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。本発明の一実施形態は、本明細書に記載の第１のプロモーターポリヌクレオチドを含む組換えベクターに関する。いくつかの実施形態では、第１のプロモーターポリヌクレオチドは、第１の標的遺伝子に機能的に連結している。本発明の一実施形態は、本明細書に記載のプロモーターポリヌクレオチドの組み合わせを含む宿主細胞に関する。本発明の一実施形態は、本明細書に記載のプロモーターポリヌクレオチドの組み合わせを含む組換えベクターに関する。いくつかの実施形態では、各プロモーターポリヌクレオチドは、異なる標的遺伝子に機能的に連結している。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、同じ代謝経路の一部である。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、同じ代謝経路の一部ではない。本発明の一実施形態は、本明細書に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
【００１１】
本発明の一実施形態は、標的遺伝子に機能的に連結した少なくとも１つのプロモーターポリヌクレオチドを含み；プロモーターポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８から選択される配列を含み；プロモーターポリヌクレオチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、または配列番号８から選択される配列を含む場合、標的遺伝子は、プロモーターポリヌクレオチドの内因性遺伝子以外である、宿主細胞に関する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、少なくとも２つのプロモーターポリヌクレオチドを含み、各プロモーターポリヌクレオチドは、異なる標的遺伝子に機能的に連結している。本発明の一実施形態は、標的遺伝子に機能的に連結した少なくとも１つのプロモーターポリヌクレオチドを含み；プロモーターポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８から選択される配列を含み；プロモーターポリヌクレオチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、または配列番号８から選択される配列を含む場合、標的遺伝子は、プロモーターポリヌクレオチドの内因性遺伝子以外である、組換えベクターに関する。いくつかの実施形態では、組換えベクターは、少なくとも２つのプロモーターポリヌクレオチドを含み、各プロモーターポリヌクレオチドは、異なる標的遺伝子に機能的に連結している。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、同じ代謝経路の一部である。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、同じ代謝経路の一部ではない。本発明の一実施形態は、本明細書に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
【００１２】
本発明の一実施形態は、本明細書に記載の宿主細胞を培養することを含み、各標的遺伝子の改変は、上方調節、及び下方調節から独立して選択される、１つ以上の標的遺伝子の発現を改変する方法に関する。標的遺伝子は、例えば、アミノ酸、有機酸、核酸、タンパク質、及びポリマーを含む、生体分子の生合成経路の１つ以上のポリペプチドまたはタンパク質をコ−ドするのが好ましい。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、生体分子を生成するのに適した条件下で、本明細書に記載の宿主細胞を培養することを含む、生体分子を生成する方法に関する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、アミノ酸、有機酸、香味料、及び香料、バイオ燃料、タンパク質、及び酵素、ポリマー／モノマー、及び他の生体材料、脂質、核酸、小分子治療薬、タンパク質またはペプチド治療薬、ファインケミカル、及び栄養補助食品から選択される生体分子を生成する生合成経路と関連する。好ましい実施形態では、生体分子は、Ｌ−アミノ酸である。具体的の実施形態では、Ｌ−アミノ酸は、リジンである。
【００１４】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２ゲノム中の遺伝子ごとの５’ＵＴＲ長（ｘ軸）対２つの成長条件（ｙ軸）にわたる発現比のグラフを示す。０．３３〜３の間の２つの成長条件にわたる発現比と、２６〜４０塩基対の間の５’ＵＴＲ長の両方を有する遺伝子は、黒丸によって表される。両方の基準に一致しなかった遺伝子は、灰色丸によって表される。
【図２】黄色の蛍光タンパク質ベースアッセイにおける８つの候補プロモーター（ｙ軸）の正規化活性（ｘ軸）のグラフを示す。各候補プロモーターの各生物学的複製は、黒丸によって表される。親プラスミドｐＫ１８ｒｅｐは、陰性対照として作用した。
【図３】アミノ酸Ｌ−リジンの生合成のための遺伝子及び生化学経路の図を提示する。生合成経路中で中間体を迂回する遺伝子（例えば、ｐｃｋ、ｏｄｘ、ｉｃｄ、及びｈｏｍ）は、下線で示す。
【図４】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍから、異種標的遺伝子ｆｂｐ、ｄａｐＢ、ｐｔｓＧ、ｌｙｓＡ、ｐｇｉ、及びｐｐｃに機能的に連結した配列番号１〜８からなる群から選択されるプロモーターポリヌクレオチド配列を有する組換え核酸分子で形質転換されたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの宿主細胞中のＬ−リジン生成の変化の本明細書による例示の実施形態の結果のグラフを提示する。
【図５】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍから、異種標的遺伝子ｄａｐＳ、ｃｇ０９３１、ＤａｐＢ、及びｌｙｓＡに機能的に連結した配列番号１〜８からなる群から選択されるプロモーターポリヌクレオチド配列を有する組換え核酸分子で形質転換されたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの宿主細胞中のＬ−リジン生成の変化の本明細書による例示の実施形態の結果のグラフを提示する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下の説明では、ある具体的な詳細が、本開示の種々の実施形態の完全な理解を提供するために記載される。しかしながら、当業者は、本開示が、これらの詳細によらずに実践されてもよいことを理解するであろう。
【００１７】
文脈によって別様に要求されない限り、以下の明細書及び請求項を通して、単語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」並びに「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその変形例は、「含むが、限定されない」という意味で、開かれた包括的な意味で解釈されるべきである。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「組換え核酸分子」という用語は、組換えＤＮＡ分子または組換えＲＮＡ分子を指す。組換え核酸分子は、異なる元の供給源から結合した核酸分子を含有し、天然には一緒に結合しない任意の核酸分子である。組換えＲＮＡ分子は、組換えＤＮＡ分子から転写されたＲＮＡ分子を含む。特に、組換え核酸分子は、異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１〜８のプロモーターを含む核酸分子を含む。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「異種標的遺伝子」という用語は、特定のゲノム中で作動的に連結するプロモーターによってその自然状態（例えば、遺伝子組換えではない細胞内）で制御されない任意の遺伝子またはコード配列を指す。本明細書中で提供される場合、自然には存在しないプロモーターに機能的に連結した全ての標的遺伝子は、「異種標的遺伝子」と考えられる。より詳細には、配列番号１、５、及び７のプロモーターポリヌクレオチド配列は自然には存在しないため、全ての機能的に連結した標的遺伝子配列は、「異種標的遺伝子」配列である。本明細書で使用される場合、異種標的遺伝子は、オペロンの一部である１つ以上の標的遺伝子を含み得る。すなわち、オペロンの内因性プロモーターは、配列番号１〜８の核酸配列を有するプロモーターポリヌクレオチド配列に置換される。本明細書で使用される場合、「プロモーターポリヌクレオチド配列」という用語は、関連配列番号に記載される配列を有する核酸を指す。
【００２０】
本明細書の全体を通して「一実施形態」または「ある実施形態」という言及は、実施形態に関連して記載された特定の特徴、構造、または特性は、本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。それゆえ、本明細書の全体を通した種々の場所における「一実施形態では」または「ある実施形態では」という用語の出現は、必ずしも同じ実施形態に言及するものではない。本発明のある特定の特徴は、明確にするため、別々の実施形態に関連して説明されているが、これを単一の実施態様に組み合わせても提供できることが理解される。逆に、本発明の種々の特徴は、簡潔にするために、単一の実施形態に関連して説明されているが、別々に提供されても、または任意の適切なサブコンビネーション中で提供されてもよい。
【００２１】
プロモーター活性を有するポリヌクレオチド
天然のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍプロモーターは、以下の基準：１）構成的プロモーターのラダー、すなわち、徐々に増加するレベルのプロモーター活性を有する複数のプロモーターを表すこと；及び２）短いＤＮＡ配列、理想的には、１００未満の塩基対によってコードされることの両方を満たすと同定された。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２においてグローバル遺伝子発現レベルを記述している公開されたデ−タセット（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ（２０１３）３５：７０９−７１７）は、異なる成長条件にわたって恒常的に発現される遺伝子を同定するために検査した。発現レベルが、２つの成長条件にわたって一定（０．３３〜３の間の発現比として定義される）のままであった、すなわち、過酸化水素の添加の有り無し両方の最少培地におけるケモスタット成長であった遺伝子は、第１の基準を満たした。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２トランスクリプトームを記述している公開されたデ−タセット（Ｐｆｅｉｆｅｒ−Ｓａｎｃａｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２０１３，１４：８８８）は、コンパクトプロモーターを有する遺伝子、すなわち、６０塩基対コアプロモーター領域と、２６〜４０の長さの塩基対の間の５’非翻訳領域とからなる遺伝子を見つけるために検査した。２つのデ−タセットを相互参照して、両方の基準を満たしたプロモーターを同定した。図１を参照されたい。以下の５つの野生型プロモーターが同定された（表１）。
【００２２】
【表１】
2018530991.tif 000003
【００２３】
野生型プロモーターｃｇ１８６０及びｃｇ３１２１は、文献には記載されていない。野生型プロモーターｃｇ０００７−ｇｙｒＢもまた、文献には記載されていない、しかしながら、Ｎｅｕｍａｎｎ及びＱｕｉｎｏｎｅｓ（Ｊ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９７；３７（１）：５３−６９）は、Ｅ．  ｃｏｌｉにおけるｇｙｒＢ遺伝子発現の調節について記載している。野生型プロモーターｃｇ０７５５は、メチオニン生合成経路の既知の一部である（Ｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００８）８１：５０５−５１３；及びＲｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０３（２００３）５１−６５）。野生型プロモーターｃｇ３３８１は、ｔａｔＡホモログである。ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍにおけるｔａｔＡ経路は、Ｋｉｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｖ．２００６，ｐ．７１８３−７１９２によって記載されている。強力な構成的プロモーターＰｃｇ０００７は、突然変異誘発のために選択された。予測されたＰｃｇ０００７の−１０要素（ＴＡＡＧＡＴ）における６つの位置のうちの４つを無作為化し、より強力なプロモーター変異体と、減衰したプロモーター変異体（配列番号１、５、及び７）の両方を生成した。
【００２４】
したがって、本発明の一実施形態は、徐々に増加するレベルのプロモーター活性を有する構成的プロモーターのラダーを一緒に表す、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍから単離されたポリヌクレオチドを含む天然プロモーター、及びそれに由来する変異プロモーターに関する。いくつかの実施形態では、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍプロモーターは、短いＤＮＡ配列によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍプロモーターは、１００未満の塩基対のＤＮＡ配列によってコードされ得る。
【００２５】
本発明の一実施形態は、配列番号１（Ｐｃｇ０００７＿ｌｉｂ＿３９）、配列番号２（Ｐｃｇ１８６０）、配列番号３（Ｐｃｇ０００７）、配列番号４（Ｐｃｇ０７５５）、配列番号５（Ｐｃｇ０００７＿ｌｉｂ＿２６５）、配列番号６（Ｐｃｇ３３８１）、配列番号７（Ｐｃｇ０００７＿ｌｉｂ＿１１９）、または配列番号８（Ｐｃｇ３１２１）から選択される配列を含むプロモーターポリヌクレオチドに関する。別の実施形態では、本明細書は、少なくとも１つの異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１からなるプロモーターポリヌクレオチドを提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、少なくとも１つの異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号２のプロモーターポリヌクレオチドを提供し、それを含む。別の実施形態では、本明細書は、少なくとも１つの異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチドを提供し、それを含む。別の実施形態では、本明細書は、少なくとも１つの異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチドを提供し、それを含む。別の実施形態では、本明細書は、少なくとも１つの異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチドを提供し、それを含む。別の実施形態では、本明細書は、少なくとも１つの異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５からなるプロモーターポリヌクレオチドを提供し、それを含む。別の実施形態では、本明細書は、少なくとも１つの異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチドを提供し、それを含む。別の実施形態では、本明細書は、少なくとも１つの異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチドを提供し、それを含む。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「プロモーターカセット」は、少なくとも１つの異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列を指す。本開示のある特定の実施形態では、「プロモーターカセット」は、リンカーポリヌクレオチド、異種遺伝子に続く転写終結因子、異種遺伝子の開始コドンの上流のリボソーム結合部位、及び各々の組み合わせの１つ以上をさらに含み得る。本発明の一実施形態は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８からなる配列から選択されるプロモーターポリヌクレオチドに関する。ある実施形態では、本明細書は、配列番号１のプロモーターポリヌクレオチド配列を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を提供し、それを含む。本明細書で使用される場合、プロモーターカセットは、それに機能的に連結している異種標的遺伝子の名前に続く参照プロモーター名によって記載されてもよい。例えば、グルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ遺伝子をコードする遺伝子ｚｗｆに機能的に連結した、Ｐｃｇ１８６０と題された配列番号１のプロモーターは、Ｐｃｇ１８６０−ｚｗｆとして参照される。同様に、Ｐｃｇ０００７＿３９−ｌｙｓＡは、ポリペプチドジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする標的遺伝子ｌｙｓＡに機能的に連結した配列番号１の０００７＿３９プロモーターである。
【００２７】
本発明の一実施形態は、本明細書に記載のプロモーターポリヌクレオチドの組み合わせに関する。この文脈では、「プロモーターポリヌクレオチドの組み合わせ」という用語は、別々の単離配列として、別々のポリヌクレオチド分子の成分として、または同じポリヌクレオチド分子の成分として存在してもよい２つ以上のポリヌクレオチド、及びそれらの組み合わせを指す。ポリヌクレオチド分子の例としては、染色体、及びプラスミドが挙げられる。
【００２８】
本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドから本質的になる単離プロモーターポリヌクレオチドにも関する。ある実施形態では、本明細書は、配列番号１の単離プロモーターポリヌクレオチドを提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、配列番号５の単離プロモーターポリヌクレオチドを提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、配列番号７の単離プロモーターポリヌクレオチドを提供し、それを含む。
【００２９】
「本質的に」という用語は、この文脈において、１，０００未満、８００未満、７００未満、６００未満、５００未満または４００未満のヌクレオチド長のポリヌクレオチド；及び  １５，０００未満、１０，０００未満、７，５００未満、５，０００未満、２，５００未満、１，０００未満、８００未満、７００未満、６００未満、５００未満、または４００未満のヌクレオチド長のポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８のポリヌクレオチドの５’末端及び３’末端に添加されていることを意味する。
【００３０】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８のポリヌクレオチドのそれぞれの５’末端及び３’末端に添加されたポリヌクレオチドの前述の２つのリストからの特徴の任意の有用な組み合わせは、本発明に従う。「有用な組み合わせ」は、例えば、実施されている効率的な組換えをもたらす特徴の組み合わせを意味する。置換されるＤＮＡ領域に隣接する同じ長さの追加の使用は、実験手順における相同組換えによる領域の移動を容易にする。比較的長い隣接相同領域は、環状ＤＮＡ分子間の効率的な組換えに有利であるが、置換ベクターのクローニングは、フランクの長さが増すとより困難になる（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４３２：４３−５３（２００６））。本明細書は、標的遺伝子配列の相同組換え及び置換を指向するために、少なくとも１つの異種標的遺伝子（例えば、「プロモーターカセット」）に機能的に連結した配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列に隣接する相同領域を提供し、それを含む。ある実施形態では、相同領域は、直接繰り返し領域である。ある実施形態では、相同領域は、プロモーターカセットに隣接する標的遺伝子配列の各々の５００塩基対（ｂｐ）〜５０００ｂｐを含む。ある実施形態では、相同領域は、プロモーターカセットに隣接する標的遺伝子配列の各々の少なくとも５００ｂｐを含む。ある実施形態では、相同領域は、プロモーターカセットに隣接する標的遺伝子配列の各々の少なくとも１０００ｂｐ（１Ｋｂ）を含む。ある実施形態では、相同領域は、プロモーターカセットに隣接する標的遺伝子配列の各々の少なくとも２Ｋｂを含む。ある実施形態では、相同領域は、プロモーターカセットに隣接する標的遺伝子配列の各々の少なくとも５Ｋｂを含む。
【００３１】
さらに、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８に示すヌクレオチド配列からなる単離プロモーターポリヌクレオチドに関する。ある実施形態では、単離プロモーターポリヌクレオチドは、配列番号１のポリヌクレオチド配列からなる。ある実施形態では、単離プロモーターポリヌクレオチドは、配列番号５のポリヌクレオチド配列からなる。ある実施形態では、単離プロモーターポリヌクレオチドは、配列番号７のポリヌクレオチド配列からなる。
【００３２】
微生物などの生物中に存在するポリヌクレオチドの生化学及び化学構造に関する詳細は、例えば、Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．によるテキストブック“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ”［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ］に特に見つけることができる（Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２００３；ＩＳＢＮ  ３−８２７４−１３０３−６）。
【００３３】
核酸塩基または塩基アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、及びチミン（Ｔ）を含有するデオキシリボヌクレオチドモノマーからなるポリヌクレオチドは、デオキシリボ−ポリヌクレオチドまたはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）と呼ばれる。核酸塩基または塩基アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）を含有するリボヌクレオチドモノマーからなるポリヌクレオチドは、リボポリヌクレオチドまたはリボ核酸（ＲＮＡ）と呼ばれる。前記ポリヌクレオチド中のモノマーは、３’，５’−ホスホジエステル結合によって互いに共有結合している。
【００３４】
「プロモーターポリヌクレオチド」または「プロモーター」または「プロモーター活性を有するポリヌクレオチド」は、転写されるポリヌクレオチドに機能的に連結した場合、コードポリヌクレオチドの転写の開始点及び開始頻度を決定することで、制御されたポリヌクレオチドの発現の強度に影響を及ぼすことができるポリヌクレオチド、好ましくは、デオキシリボポリヌクレオチド、または核酸、好ましくは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を意味する。「プロモーターラダー」という用語は、本明細書で使用される場合、徐々に増加するレベルのプロモーター活性を有する複数のプロモーターを指す。「プロモーター活性」という用語は、本明細書で使用される場合、プロモーターが、ｍＲＮＡにポリヌクレオチド配列の転写を開始する能力を指す。プロモーター活性を評価する方法は、当該技術分野に周知であり、例えば、以下の実施例２に記載の方法が挙げられる。「構成的プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、内部または外部細胞条件に関わらず一定速度でｔｉｔｓ関連遺伝子の転写を指向するプロモーターを指す。
【００３５】
ＤＮＡの二本鎖構造のため、配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８中の鎖と相補的な鎖もまた同様に、本発明の主題である。
【００３６】
キット
本発明の一実施形態は、配列番号１、配列番号５、及び配列番号７から選択される配列を含む第１のプロモーターポリヌクレオチド、及びポリヌクレオチドの適当な保管手段を含むキットに関する。いくつかの実施形態では、第１のプロモーターポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号５、及び配列番号７から選択される配列からなる。いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも２つの本明細書に記載の第１のプロモーターポリヌクレオチドを含むプロモーターポリヌクレオチドの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の少なくとも１つの第１のプロモーターポリヌクレオチド、及び配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、及び配列番号８から選択される配列を含む少なくとも１つの第２のプロモーターポリヌクレオチドを含むプロモーターポリヌクレオチドの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の少なくとも１つの第１のプロモーターポリヌクレオチド、及び配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、及び配列番号８から選択される配列からなる少なくとも１つの第２のプロモーターポリヌクレオチドを含むプロモーターポリヌクレオチドの組み合わせを含む。
【００３７】
標的遺伝子
本発明の一実施形態は、本明細書に記載のプロモーターポリヌクレオチドを含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を培養することを含む、標的遺伝子を発現する方法に関する。標的遺伝子は、本明細書に記載のプロモーターによって発現が制御されるポリヌクレオチドである。標的遺伝子は、１つ以上のポリペプチド（複数可）をコードするコードポリヌクレオチド、または非コードＲＮＡなどの非コードポリヌクレオチドであり得る。タンパク質／ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＡＴＧ、ＧＴＧ、及びＴＴＧ、好ましくは、ＡＴＧまたはＧＴＧ、特に好ましくは、ＡＴＧからなる群から選択される開始コドン、タンパク質コ−ド配列、並びにＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡからなる群から選択される１つ以上の停止コドン（複数可）から本質的になる。
【００３８】
「転写」は、相補的ＲＮＡ分子が、ＤＮＡテンプレートから開始して生成される処理を意味する。この処理には、ＲＮＡポリメラーゼ、「シグマ因子」、及び転写調節タンパク質などのタンパク質を伴う。標的遺伝子がコードポリヌクレオチドである場合、合成ＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ、ｍＲＮＡ）は、ポリペプチドまたはタンパク質を続いて生じる翻訳の処理中にテンプレートとして機能する。
【００３９】
「機能的に連結した」は、この文脈において、センスＲＮＡ転写産物を生成するために前記さらなるポリヌクレオチドの転写をもたらす、さらなるオリゴ−またはポリヌクレオチドと共に本発明によるプロモーターポリヌクレオチドの連続的配置を意味する。
【００４０】
さらなるポリヌクレオチドが、ポリペプチド／タンパク質をコードし、開始コドンから開始され、停止コドン、必要に応じて、転写終結配列を含むポリペプチドのコード領域からなる標的遺伝子である場合、「機能的に連結した」は、前記標的遺伝子の転写、及び合成ＲＮＡの翻訳をもたらす、標的遺伝子と共に本発明によるプロモーターポリヌクレオチドの連続的配置を意味する。
【００４１】
標的遺伝子が複数のタンパク質／ポリペプチドをコードする場合、各遺伝子は、リボソーム結合部位によって先行されてもよい。必要に応じて、終結配列は、最後の遺伝子の下流に位置する。
【００４２】
標的遺伝子は、好ましくは、タンパク質を構成するアミノ酸、タンパク質を構成しないアミノ酸、ビタミン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、及び有機酸からなる群から選択される生体分子の生合成経路の１つ以上のポリペプチドまたはタンパク質をコ−ドするのが好ましい。標的遺伝子は、参照により本明細書に組み込まれるＥＰ１１０８７９０Ａ２の表１に記載される１つ以上のポリヌクレオチドからなるのが好ましい。
【００４３】
本明細書は、代謝及び生合成経路に関与する遺伝子として京都遺伝子ゲノム百科事典（ＫＥＧＧ）で同定可能な異種標的遺伝子のいずれか１つに機能的に連結した配列番号１〜８からなる群から選択されるプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を提供し、それを含む。ＫＥＧＧデータベースは、ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇにてインターネット上で入手可能である。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧマップ番号００３００に示されているように、リジン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、１つ以上の標的遺伝子は、リジンスクシニル−ＤＡＰ生合成経路、Ｍ０００１６から選択される。ある実施形態では、１つ以上の標的遺伝子は、リジンアセチル−ＤＡＰ生合成経路、Ｍ００５２５から選択される。ある実施形態では、１つ以上の標的遺伝子は、リジンＤＡＰデヒドロゲナーゼ生合成経路、Ｍ００５２６から選択される。ある実施形態では、１つ以上の標的遺伝子は、リジンＤＡＰアミノトランスフェラーゼ生合成経路、Ｍ００５２７から選択される。ある実施形態では、１つ以上の標的遺伝子は、ＡＡＡ経路生合成経路、Ｍ０００３０から選択される。ある実施形態では、１つ以上の標的遺伝子は、ＬｙｓＷ、Ｍ０００３１によって仲介される２−オキソグルタル酸、Ｍ００４３３、またはリジン生合成経路からのリジン生合成経路から選択される。
【００４４】
本開示は、エントリーＭ０００２０の遺伝子を含むセリン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列を提供し、それを含む。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００１８の遺伝子を含むスレオニン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２１の遺伝子を含むシステイン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ００３３８の遺伝子を含むシステイン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ００６０９の遺伝子を含むシステイン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００１７の遺伝子を含むメチオニン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００１９の遺伝子を含むバリン／イソロイシン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ００５３５の遺伝子を含むイソロイシン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ００５７０の遺伝子を含むイソロイシン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ００４３２の遺伝子を含むロイシン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００１５の遺伝子を含むプロリン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２８の遺伝子を含むオルニチン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ００７６３の遺伝子を含むオルニチン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２６の遺伝子を含むヒスチジン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２２の遺伝子を含むシキミ酸生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、エントリーＭ０００２３の遺伝子を含むトリプトファン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２４の遺伝子を含むフェニルアラニン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２５の遺伝子を含むチロシン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００４０の遺伝子を含むチロシン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。
【００４５】
本開示は、エントリーＭ０００２０の遺伝子を含むセリン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１、５または７のプロモーターポリヌクレオチド配列を提供し、それを含む。ある実施形態では、配列番号１、５または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００１８の遺伝子を含むスレオニン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２１の遺伝子を含むシステイン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ００３３８の遺伝子を含むシステイン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ００６０９の遺伝子を含むシステイン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００１７の遺伝子を含むメチオニン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００１９の遺伝子を含むバリン／イソロイシン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ００５３５の遺伝子を含むイソロイシン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ００５７０の遺伝子を含むイソロイシン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ００４３２の遺伝子を含むロイシン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００１５の遺伝子を含むプロリン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２８の遺伝子を含むオルニチン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ００７６３の遺伝子を含むオルニチン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２６の遺伝子を含むヒスチジン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２２の遺伝子を含むシキミ酸生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、エントリーＭ０００２３の遺伝子を含むトリプトファン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２４の遺伝子を含むフェニルアラニン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２５の遺伝子を含むチロシン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００４０の遺伝子を含むチロシン生合成経路の１つ以上の標的遺伝子に機能的に連結している。
【００４６】
本明細書は、表２に提供されるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２からの異種標的遺伝子のいずれか１つ、またはそれらの任意のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ等価物に機能的に連結した配列番号１〜８からなる群から選択されるプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を提供し、それを含む。配列開始及び末端位置は、ゲノムヌクレオチド受託ＮＣ＿００３４５０．３に相当する。当業者には、相当する遺伝子が、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの他の株に存在し、表２から容易に同定され得ることが理解されるであろう。実施形態では、本明細書は、表２に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号２のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号６のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を提供し、それを含む。
【００４７】
【表２−１】
2018530991.tif 000004
【表２−２】
2018530991.tif 000005
【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【００４８】
ある実施形態では、本明細書は、表２に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号２のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号６のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、それを含む。
【００４９】
ある実施形態では、本明細書は、表２に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号２のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号６のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。本明細書で使用される場合、宿主細胞は、１つ以上のプロモーターカセットで形質転換されている「発現」と題されたセクションで後述される有機体を指す。当業者には明らかとなるように、宿主細胞は、本明細書に記載の１つ以上のプロモーターカセットを含み得る。
【００５０】
ある実施形態では、本明細書は、表３に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号２のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号６のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。本明細書で使用される場合、宿主細胞は、１つ以上のプロモーターカセットで形質転換されている「発現」と題されたセクションで後述される有機体を指す。当業者には明らかとなるように、宿主細胞は、本明細書に記載の１つ以上のプロモーターカセットを含み得る。
【００５１】
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
2018530991.tif 000013
【００５２】
ある実施形態では、本明細書は、表３に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号２のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号６のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、それを含む。
【００５３】
ある実施形態では、本明細書は、表３に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号２のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号６のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。本明細書で使用される場合、宿主細胞は、１つ以上のプロモーターカセットで形質転換されている「発現」と題されたセクションで後述される有機体を指す。当業者には明らかとなるように、宿主細胞は、本明細書に記載の１つ以上のプロモーターカセットを含み得る。
【００５４】
本明細書は、表４に提供されるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２からの異種標的遺伝子のいずれか１つ、またはそれらの任意のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ等価物に機能的に連結した配列番号１〜８からなる群から選択されるプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。配列開始及び末端位置は、ゲノムヌクレオチド受託ＮＣ＿００３４５０．３に相当する。当業者には、相当する遺伝子が、Ｃ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍの他の株に存在し、表４から容易に同定され得ることが理解されるであろう。実施形態では、本明細書は、表４に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号２のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号６のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。本明細書で使用される場合、宿主細胞は、１つ以上のプロモーターカセットで形質転換されている「発現」と題されたセクションで後述される有機体を指す。当業者には明らかとなるように、宿主細胞は、本明細書に記載の１つ以上のプロモーターカセットを含み得る。
【００５５】
【表４】
2018530991.tif 000014
【００５６】
ある実施形態では、本明細書は、表４に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号６のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、それを含む。
【００５７】
ある実施形態では、本明細書は、表４に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号２のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号６のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に記載の異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。
【００５８】
いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、アミノ酸、有機酸、香味料、及び香料、バイオ燃料、タンパク質、及び酵素、ポリマー／モノマー、及び他の生体材料、脂質、核酸、小分子治療薬、タンパク質治療薬、ファインケミカル、及び栄養補助食品から選択される生体分子を生成する生合成経路と関連する。
【００５９】
いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、抗生物質、アルカロイド、テルペノイド、及びポリケチドから選択される二次代謝産物を生成する生合成経路と関連する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、アルコ−ル、アミノ酸、ヌクレオチド、抗酸化物質、有機酸、ポリオール、ビタミン、及び脂質／脂肪酸から選択される一次代謝産物を生成する代謝経路と関連する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、タンパク質、核酸、及びポリマーから選択されるマクロ分子を生成する生合成経路と関連する。
【００６０】
加えて、Ｌ−アミノ酸の生成は、それぞれの生合成経路、解糖、アナプレロシス、クエン酸回路、ペントースリン酸回路、アミノ酸輸送、及び必要に応じて調節タンパク質の１つ以上の酵素を増強、特に、過剰発現するのに有利であり得る。
【００６１】
それゆえ、例えば、Ｌ−アミノ酸の生成のために、以下の群から選択される１つ以上の遺伝子が増強、特に、過剰発現されるのが有利であり得る：ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子ｄａｐＡ（ＥＰ−Ｂ０１９７３３５）；エノラーゼをコードする遺伝子ｅｎｏ（ＤＥ：１９９４７７９１．４）；グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｇａｐ（Ｅｉｋｍａｎｎｓ（１９９２），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７４：６０７６−６０８６）；トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子ｔｐｉ（Ｅｉｋｍａｎｎｓ（１９９２），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７４：６０７６−６０８６）；３−ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子ｐｇｋ（Ｅｉｋｍａｎｎｓ（１９９２），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７４：６０７６−６０８６）；グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｚｗｆ（ＪＰ−Ａ−０９２２４６６１）；ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子ｐｙｃ（ＤＥ−Ａ−１９８３１６０９；Ｅｉｋｍａｎｎｓ（１９９２），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７４：６０７６−６０８６）；リンゴ塩−キノン−オキシドレダクターゼをコードする遺伝子ｍｑｏ（Ｍｏｌｅｎａａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５４，３９５−４０３（１９９８））；フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子ｌｙｓＣ（受託番号Ｐ２６５１２）；リジン輸送をコードする遺伝子ｌｙｓＥ（ＤＥ−Ａ−１９５４８２２２）；ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｈｏｍ（ＥＰ−Ａ  ０１３１１７１）；スレオニンデヒドラターゼをコードする遺伝子ｉｌｖＡ（Ｍｏｃｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９９２）８０６５−８０７２））またはフィードバック耐性スレオニンデヒドラターゼをコードする対立遺伝子ｉｌｖＡ（Ｆｂｒ）（Ｍｏｃｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １３：８３３−８４２）；アセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする遺伝子ｉｌｖＢＮ（ＥＰ−Ｂ  ０３５６７３９）；ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする遺伝子ｉｌｖＤ（Ｓａｈｍ  ａｎｄ  Ｅｇｇｅｌｉｎｇ（１９９９）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６５：１９７３−１９７９）；及びＺｗａ１タンパク質をコードする遺伝子ｚｗａ１（ＤＥ：１９９５９３２８．０，ＤＳＭ  １３１１５）。
【００６２】
さらに、Ｌ−アミノ酸の生成は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子ｐｃｋ（ＤＥ  １９９５０４０９．１；ＤＳＭ  １３０４７）；グルコース−６−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子ｐｇｉ（米国特許第６，５８６，２１４号；ＤＳＭ  １２９６９）；ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子ｐｏｘＢ（ＤＥ：１９９５１９７５．７；ＤＳＭ  １３１１４）；及びＺｗａ２タンパク質をコードする遺伝子ｚｗａ２（ＤＥ：１９９５９３２７．２、ＤＳＭ  １３１１３）からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現を減衰、特に、減少することも有利であり得る。
【００６３】
加えて、アミノ酸、特に、Ｌ−リジンの生成は、望ましくない副反応を排除することがさらに有利であり得る（Ｎａｋａｙａｍａ：“Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ”，ｉｎ：Ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｋｒｕｍｐｈａｎｚｌ，Ｓｉｋｙｔａ，Ｖａｎｅｋ（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，１９８２）。
【００６４】
したがって、本発明によるプロモーターは、Ｃ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ中で標的遺伝子を過剰発現または過小発現するいずれの場合において使用することができる。
【００６５】
リンカー
両方のポリヌクレオチドが、直接、またはリンカーオリゴヌクレオチドまたはリンカーポリヌクレオチドによってのいずれかで互いに機能的に連結されるように、標的遺伝子は、本発明によるプロモーターポリヌクレオチドの下流、すなわち、３’末端に位置する。リンカーオリゴヌクレオチドまたはリンカーポリヌクレオチドによって互いに機能的に連結したプロモーター及び標的遺伝子が好ましい。前記リンカーオリゴヌクレオチドまたはリンカーポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドからなる。
【００６６】
この文脈では、「直接互いに機能的に連結した」という表現は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８の３’末端でのヌクレオチドが、標的遺伝子の開始コドンの第１のヌクレオチドに直接連結していることを意味する。これは、５’−末端ＡＵＧ開始コドンで直ちに開始する「リーダーレス」ｍＲＮＡをもたらすため、任意の他の翻訳開始シグナルを有さない。
【００６７】
この文脈では、「リンカーオリゴヌクレオチドによって互いに機能的に連結した」」という表現は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８の３’末端でのヌクレオチドが、１、２、３、４または５のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドによって標的遺伝子の開始コドンの第１のヌクレオチドに連結されることを意味する。
【００６８】
この文脈では、「リンカーポリヌクレオチドによって互いに機能的に連結した」という表現は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８の３’末端でのヌクレオチドが、６〜６００未満のヌクレオチド長のポリヌクレオチドによって標的遺伝子の開始コドンの第１のヌクレオチドに連結されることを意味する。
【００６９】
この文脈では、「互いに機能的に連結した」という表現は、標的遺伝子は、標的遺伝子の転写、及び合成ＲＮＡの翻訳が保証されるように、本発明によるプロモーターポリヌクレオチドに結合することを意味する。
【００７０】
技術的な要件に応じて、リンカーポリヌクレオチドは、
６−６００、６−５００、６−４００、６−３００、６−２００、６−１８０、６−１６０、６−１４０、６−１２０、６−１００、６−８０、６−６０、６−５０、６−４０、６−３０、６−２８、６−２７、６−２６、６−２５；または
８−６００、８−５００、８−４００、８−３００、８−２００、８−１８０、８−１６０、８−１４０、８−１２０、８−１００、８−８０、８−６０、８−５０、８−４０、８−３０、８−２８、８−２７、８−２６、８−２５；または
１０−６００、１０−５００、１０−４００、１０−３００、１０−２００、１０−１８０、１０−１６０、１０−１４０、１０−１２０、１０−１００、１０−８０、１０−６０、１０−５０、１０−４０、１０−３０、１０−２８、１０−２７、１０−２６、１０−２５；または
１２−６００、１２−５００、１２−４００、１２−３００、１２−２００、１２−１８０、１２−１６０、１２−１４０、１２−１２０、１２−１００、１２−８０、１２−６０、１２−５０、１２−４０、１２−３０、１２−２８、１２−２７、１２−２６、１２−２５；または
１４−６００、１４−５００、１４−４００、１４−３００、１４−２００、１４−１８０、１４−１６０、１４−１４０、１４−１２０、１４−１００、１４−８０、１４−６０、１４−５０、１４−４０、１４−３０、１４−２８、１４−２７、１４−２６、１４−２０；または
１６−６００、１６−５００、１６−４００、１６−３００、１６−２００、１６−１８０、１６−１６０、１６−１４０、１６−１２０、１６−１００、１６−８０、１６−６０、１６−５０、１６−４０、１６−３０、１６−２８、１６−２７、１６−２６、１６−２５；または
１８−６００、１８−５００、１８−４００、１８−３００、１８−２００、１８−１８０、１８−１６０、１８−１４０、１８−１２０、１８−１００、１８−８０、１８−６０、１８−５０、１８−４０、１８−３０、１８−２８、１８−２７、１８−２６、１８−２５；または
２０−６００、２０−５００、２０−４００、２０−３００、２０−２００、２０−１８０、２０−１６０、２０−１４０、２０−１２０、２０−１００、２０−８０、２０−６０、２０−５０、２０−４０、２０−３０、２０−２８、２０−２７、２０−２６、２０−２５のヌクレオチド長である。
【００７１】
特に好ましい実施形態では、リンカーポリヌクレオチドは、これは、機能的構築物を生成するのが好ましいため、２０、２１、２２、２３、２４、または２５のヌクレオチド長である。
【００７２】
本発明はさらに、その３’末端でのヌクレオチドを介して、５’末端にＡＴＧまたはＧＴＧ開始コドンを含有し、１つ以上のポリペプチド（複数可）をコードする標的遺伝子に、直接、またはＲＮＡの翻訳を確実にするリンカーポリヌクレオチドによって機能的に連結する配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８のポリヌクレオチドから本質的になる単離プロモーターポリヌクレオチドに関する。リンカーポリヌクレオチドによって互いに機能的に連結したプロモーター及び標的遺伝子が好ましい。
【００７３】
本発明はさらに、その３’末端でのヌクレオチドを介して、リンカーオリゴヌクレオチドに機能的に連結している配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８のポリヌクレオチドから本質的になる単離ポリヌクレオチドに関する。
【００７４】
加えて、本発明はさらに、その３’末端でのヌクレオチドを介して、ＲＮＡの翻訳を確実にするリンカーポリヌクレオチドに機能的に連結している配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８のポリヌクレオチドから本質的になる単離ポリヌクレオチドに関する。
【００７５】
この文脈では、「本質的に」という用語は、１，０００未満、８００未満、７００未満、６００未満、５００未満、または４００未満のヌクレオチド長のポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８のポリヌクレオチドの５’末端に添加されている、１，０００未満、８００未満、７００未満、６００未満、５００未満、または４００未満のヌクレオチド長のポリヌクレオチドが、標的遺伝子の３’末端に添加されている、または１５，０００未満、１０，０００未満、７，５００未満、５，０００未満、２，５００未満、１，０００未満、８００未満、７００未満、６００未満、５００未満、または４００未満のヌクレオチド長のポリヌクレオチドが、リンカーオリゴ−またはポリヌクレオチドの３’末端に添加されていることを意味する。
【００７６】
ポリヌクレオチドの前述の３つのリストからの特徴の任意の有用な組み合わせは、本発明に従う。「有用な組み合わせ」は、例えば、実施されている効率的な組換えをもたらす特徴の組み合わせを意味する。置換されるＤＮＡ領域に隣接する同じ長さの追加の使用は、実験手順における相同組換えによる領域の移動を容易にする。比較的長い隣接相同領域は、環状ＤＮＡ分子間の効率的な組換えに有利であるが、置換ベクターのクローニングは、フランクの長さが増すとより困難になる（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４３２：４３−５３（２００６））。
【００７７】
加えて、３’末端が、その５’末端にＡＴＧまたはＧＴＧ開始コドンを含有し、１つ以上のポリペプチド（複数可）をコードする標的遺伝子に機能的に連結している場合、リンカーオリゴ−またはポリヌクレオチドの３’末端でのフランクは、１５，０００未満の長さのヌクレオチドに増加する。
【００７８】
これらの特に好ましい実施形態のリンカーポリヌクレオチドは、有利な方法でＲＮＡの翻訳を確実にする。
【００７９】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８のヌクレオチド配列を有する本発明によるポリヌクレオチド、ＲＮＡの翻訳を確実にするリンカーポリヌクレオチド、及びその５’末端にＡＴＧまたはＧＴＧ開始コドンを有する１つ以上のポリペプチド（複数可）をコードする標的遺伝子の間の化学結合を容易にするため、クローニングに必要な機能的ヌクレオチド配列は、それらの５’及び３’末端で前記ポリヌクレオチドに組み込まれてよく、前記クローニングの後でさえ少なくとも一部が保持される。
【００８０】
「クローニングに必要な機能的ヌクレオチド配列」という用語は、本明細書では、その配列は、通常、４〜８ヌクレオチドからなる、存在する任意のＲＥＩＩ（ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ）開裂部位を表す。
【００８１】
加えて、制限エンドヌクレアーゼの開裂部位を取り除くように突然変異誘発プライマーまたはヌクレオチド配列のデノボ遺伝子合成（例えば、ｂｙ  ＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ））による部位特異的な突然変異誘発は、その後のクローニング工程で前記開裂部位を有利に使用することができるために、サイレント突然変異を配列に導入してもよいことをここで言及すべきである。
【００８２】
ＲＮＡの翻訳を確実にするリンカーポリヌクレオチドに機能的に連結した本発明によるプロモーターから得られるポリヌクレオチドは、以下で発現単位とも呼ばれる。
【００８３】
発現
さらに、本発明は、微生物中で標的遺伝子またはポリヌクレオチドを発現するために、本発明によるプロモーターまたは本発明による発現単位を使用することに関する。本発明によるプロモーターまたは本発明による発現単位は、合成ＲＮＡ、好ましくは、ｍＲＮＡをポリペプチドに転写及び翻訳することを確実にする。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、微生物の形質転換細胞を指す。
【００８４】
本開示は、先に詳しく説明した組換え核酸及び組換えベクターを含む、形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。本開示はさらに、２つの組換え核酸で形質転換された宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、宿主細胞は、３つの組換え核酸で形質転換される。上で提供されるように、核酸は、所望の生成物の収率における全体的な効果に基づいた生合成経路から選択され得る。本明細書の宿主細胞に組み込まれてもよい組換え核酸の数に実質的な制限はない。発現は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の微生物中で実施されるのが好ましい。以下の種：沈着型株がＤＳＭ４４５４９であるＣ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ；沈着型株がＡＴＣＣ１３０３２であるＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ；及び沈着型株がＡＴＣＣ６８７１であるＣ．アンモニア遺伝子に基づいているＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属内の株が好ましい。種であるＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍが特に非常に好ましい。このように、相当する宿主中で存在しないかまたは検出可能ではない性質、好ましくは、酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することが可能である。それゆえ、例えば、Ｙｕｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．は、構成的Ｐｔｒｃプロモーターの制御下で、Ｃ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ  Ｒ中でＤ−キシロースを利用するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ遺伝子の発現を記載している（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８１，６９１−６９９（２００８））。
【００８５】
本明細書は、上述のプロモーターポリヌクレオチド配列の制御下で、２つ以上の遺伝子生合成経路を有するＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍを提供し、それを含む。種々の実施形態では、１つ以上の標的遺伝子は、上述のような配列番号１〜８の配列を有するプロモーターポリヌクレオチド配列の制御下に置かれる。他の実施形態では、１つ以上の標的遺伝子は、上述のような配列番号１、５、または７を有するプロモーターポリヌクレオチド配列の制御下に置かれる。
【００８６】
本明細書によるある特定の実施形態では、Ｃ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞は、配列番号１〜８の配列を有する２つの標的遺伝子の制御下でプロモーターを有する。本明細書によるある特定の他の実施形態では、Ｃ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞は、配列番号１、５、または７の配列を有する２つの標的遺伝子の制御下でプロモーターを有する。相同組換えを用いて、本開示のプロモーターは、内因性プロモーター及び内因性配列を置換して、異種遺伝子に機能的に連結したプロモーターを調製する。当業者には、組換えは内因性プロモーターの置換をもたらす一方で、その天然の遺伝子座で遺伝子を保持することが認識されるであろう。具体的な非限定例を以下の表８に示す。複数のプロモーター−異種標的対（例えば、プロモーターカセット）は、宿主細胞のゲノムに容易に組み込むことができる。ある実施形態では、プロモーターカセットは、宿主細胞に順次組み込むことができる。ある特定の実施形態では、本開示の組換えベクターは、単一構築物中に２つ以上の異なるプロモーターカセットを提供する。本明細書は、上述の方法を用いて開発することができるプロモーター置換の数に事実上の制限を設けない。
【００８７】
ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ０００７−ｌｙｓＡ、及びＰｃｇ３１２１−ｐｇｉを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ１８６０−ｐｙｃ、及びＰｃｇ０００７−ｚｗｆを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ０００７−ｌｙｓＡ、及びＰｃｇ０００７−ｚｗｆを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ３１２１−ｐｃｋ、及びＰｃｇ０００７−ｚｗｆを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ０００７＿３９−ｐｐｃ、及びＰｃｇ０００７−ｚｗｆを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ３１２１−ｐｃｋ、及びＰｃｇ３１２１−ｐｇｉを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ３３８１−ｄｄｈ、及びＰｃｇ０００７−ｚｗｆを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＢ、及びＰｃｇ０００７−ｚｗｆを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ０００７−ｚｗｆ、及びＰｃｇ３１２１−ｐｇｉを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ３３８１−ｄｄｈ、及びＰｃｇ３１２１−ｐｇｉを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ３１２１−ｐｇｉ、及びＰｃｇ１８６０−ｐｙｃを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ１８６０−ｐｙｃ、及びＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＢを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ１８６０−ｐｙｃ、及びＰｃｇ０００７−ｌｙｓＡを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ１８６０−ａｓｄ、及びＰｃｇ０００７−ｚｗｆを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＢ、及びＰｃｇ３１２１−ｐｇｉを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ１８６０−ｐｙｃ、及びＰｃｇ１８６０−ａｓｄを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主��胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ３３８１−ａｓｐＢ、及びＰｃｇ１８６０−ｐｙｃを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ３３８１−ｆｂｐ、及びＰｃｇ１８６０−ｐｙｃを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ３３８１−ｄｄｈ、及びＰｃｇ３３８１−ｆｂｐを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ０７５５−ｐｔｓＧ、及びＰｃｇ３１２１−ｐｇｉを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ１８６０−ｐｙｃ、及びＰｃｇ３１２１−ｐｃｋを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ１８６０−ａｓｄ、及びＰｃｇ３１２１−ｐｇｉを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ１８６０−ａｓｄ、及びＰｃｇ３３８１−ｆｂｐを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ０００７＿３９−ｌｙｓＥ、及びＰｃｇ３３８１−ｆｂｐを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ３３８１−ｆｂｐ、及びＰｃｇ０００７−ｌｙｓＡを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ０００７＿３９−ｌｙｓＥ、及びＰｃｇ１８６０−ｐｙｃを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ３１２１−ｐｇｉ、及びＰｃｇ３３８１−ｆｂｐを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ３１２１−ｐｃｋ、及びＰｃｇ０００７−ｌｙｓＡを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ０００７−ｌｙｓＡ、及びＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＢを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＢ、及びＰｃｇ１８６０−ａｓｄを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ３１２１−ｐｇｉ、及びＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＤを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ０００７−ｌｙｓＡ、及びＰｃｇ３３８１−ｄｄｈを含むトランスジェニック��．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ３１２１−ｐｃｋ、及びＰｃｇ１８６０−ａｓｄを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ０００７−ｌｙｓＡ、及びＰｃｇ１８６０−ａｓｄを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ３１２１−ｐｃｋ、及びＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＢを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ３３８１−ｄｄｈ、及びＰｃｇ１８６０−ａｓｄを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ０００７＿３９−ｐｐｃ、及びＰｃｇ１８６０−ａｓｄを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ０００７＿３９−ｐｐｃ、及びＰｃｇ０００７−ｌｙｓＡを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ３３８１−ｄｄｈ、及びＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＢを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＢ、及びＰｃｇ３３８１−ｆｂｐを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ０００７＿３９−ｐｐｃ、及びＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＢを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ３３８１−ａｓｐＢ、及びＰｃｇ３１２１−ｐｃｋを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＢ、及びＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＤを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ０００７＿３９−ｌｙｓＥ、及びＰｃｇ３３８１−ａｓｐＢを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ０００７＿３９−ｌｙｓＥ、及びＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＤを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ３３８１−ａｓｐＢ、及びＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＢを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ１８６０−ａｓｄ、及びＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＤを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は���プロモーターカセットであるＰｃｇ３３８１−ａｓｐＢ、及びＰｃｇ０００７−ｌｙｓＡを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ３３８１−ａｓｐＢ、及びＰｃｇ３３８１−ｄｄｈを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ０７５５−ｐｔｓＧ、及びＰｃｇ１８６０−ｐｙｃを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ０７５５−ｐｔｓＧ、及びＰｃｇ３３８１−ｆｂｐを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ０００７−ｚｗｆ、及びＰｃｇ３３８１−ｆｂｐを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットであるＰｃｇ０７５５−ｐｔｓＧ、及びＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＤを含むトランスジェニックＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。
【００８８】
本開示は、上述のような３つ以上のプロモーターカセットを有する宿主細胞を提供し、それを含む。ある実施形態では、宿主細胞は、Ｐｃｇ０００７＿３９−ｚｗｆ、Ｐｃｇ０００７＿３９−ｌｙｓＡ、及びＰｃｇ１８６０−ｐｙｃプロモーターカセットを含む。ある実施形態では、宿主細胞は、Ｃ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。
【００８９】
本発明によるプロモーターまたは本発明による発現単位はさらに、例えば、収率、力価、生産性、副産物除去、処理逸脱への耐性、最適成長温度、及び成長速度を含み得る、微生物の性能特性を改善するために使用される。いくつかの実施形態では、本発明によるプロモーターまたは本発明による発現単位は、微生物中の標的遺伝子を上方調節するために使用される（過剰発現）。過剰発現は、一般的に、後者が出発株である場合、出発株（親株）または野生型株と比較して、リボ核酸、タンパク質（ポリペプチド）、または酵素の細胞内濃度または活性の増加を意味する。いくつかの実施形態では、本発明によるプロモーターまたは本発明による発現単位は、微生物中の標的遺伝子を下方調節するために使用される（過少発現）。過少発現は、一般的に、後者が出発株である場合、出発株（親株）または野生型株と比較して、リボ核酸、タンパク質（ポリペプチド）、または酵素の細胞内濃度または活性の減少を意味する。いくつかの実施形態では、プロモーター及び／または本発明による発現単位の組み合わせを使用して、微生物中の２つ以上の標的遺伝子の発現を調節し、各標的遺伝子は、上方調節されるかまたは下方調節されるかのいずれかである。いくつかの実施形態では、プロモーター及び／または発現単位の組み合わせによって上方または下方調節された標的遺伝子は、同じ代謝経路の一部である。いくつかの実施形態では、プロモーター及び／または発現単位の組み合わせによって上方または下方調節された標的遺伝子は、同じ代謝経路の一部ではない。
【００９０】
本明細書に記載のプロモーターは、例えば、低活性を有する相当する酵素をコードし、または相当する遺伝子または酵素（タンパク質）を不活性化する弱いプロモーター、または遺伝子、または対立遺伝子を用いることで、必要に応じて、これらの対策を組み合わせて、相当するＤＮＡによってコードされる微生物中の１つ以上の酵素（タンパク質）の細胞内活性を減衰（減少または排除）するための当該技術分野で非常に周知の他の方法と組み合わせて使用することができる。
【００９１】
遺伝子発現の減少は、適当な培養によって、または遺伝子発現のシグナル構造の遺伝的改変（突然変異）によって実施することができる。遺伝子発現のシグナル構造は、例えば、リプレッサー遺伝子、活性化因子遺伝子、オペレーター、プロモーター、アテニュエーター、リボソーム結合部位、開始コドン、及び終結因子である。専門家は、例えば、特許出願国際公開第９６／１５２４６、Ｂｏｙｄ  ａｎｄ  Ｍｕｒｐｈｙ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７０：５９４９（１９８８））、Ｖｏｓｋｕｉｌ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｌｉｓｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６：３５４８（１９９８）、Ｊｅｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｈａｍｍｅｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ５８：１９１（１９９８））、Ｐａｔｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４２：１２９７（１９９６））、Ｖａｓｉｃｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８１：６１８８（１９９９））、及び遺伝学及び分子生物学の公知のテキストブック、例えば、Ｋｎｉｐｐｅｒｓ（“Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｋ［分子遺伝学］”，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９５）によるテキストブック、またはＷｉｎｎａｃｋｅｒ（“Ｇｅｎｅ  ｕｎｄ  Ｋｌｏｎｅ［遺伝子及びクローン］”，ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９０）によるテキストブックにおいて、この情報を見つけることができる。
【００９２】
酵素タンパク質の触媒特性において変化または減少をもたらす突然変異は、従来技術から公知であり、挙げることができる例は、Ｑｉｕ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄｍａｎ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７２：８６１１−８６１７（１９９７））、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６１：１７６０−１７６２（１９９７））、及びＭｏｃｋｅｌ（“Ｄｉｅ  Ｔｈｒｅｏｎｉｎｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ  ａｕｓ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ：Ａｕｆｈｅｂｕｎｇ  ｄｅｒ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｓｃｈｅｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｕｎｄ  Ｓｔｒｕｋｔｕｒ  ｄｅｓ  Ｅｎｚｙｍｓ［Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のスレオニンデヒドロゲナーゼ：アロステリック調節の取り消し、及び酵素の構造］”、Ｊｕｌｉｃｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅからの報告書，Ｊｕｌ−２９０６，ＩＳＳＮ０９４４２９５２，Ｊｕｌｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９４）による著作である。包括的な記述は、遺伝学及び分子生物学の公知のテキストブック、例えば、Ｈａｇｅｍａｎｎ（“Ａｌｌｇｅｍｅｉｎｅ  Ｇｅｎｅｔｉｋ［一般的な遺伝学］”，Ｇｕｓｔａｖ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，１９８６）によるものに記載されている。
【００９３】
可能な突然変異は、遷移、転換、挿入、及び欠失である。酵素活性におけるアミノ酸交換の効果に応じて、ミスセンス突然変異またはノンセンス突然変異と呼ばれる。遺伝子中の少なくとも１つの塩基対の挿入または欠失は、この不正確なアミノ酸が組み込まれるかまたは翻訳が途中で中断される結果として、フレームシフト突然変異をもたらす。いくつかのコドンの欠失は、典型的には、酵素活性の完全な喪失をもたらす。そのような突然変異の生成に関する指示は、先行技術であり、遺伝学及び分子生物学の公知のテキストブック、例えば、Ｋｎｉｐｐｅｒｓ（“Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｋ［分子遺伝学］”，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９５）によるテキストブック、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ（“Ｇｅｎｅ  ｕｎｄ  Ｋｌｏｎｅ［遺伝子及びクローン］”，ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９０）によるもの、またはＨａｇｅｍａｎｎ（“Ａｌｌｇｅｍｅｉｎｅ  Ｇｅｎｅｔｉｋ［一般的な遺伝学］”，Ｇｕｓｔａｖ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，１９８６）によるものに記載されている。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの遺伝子を突然変異する一般的な方法は、Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ  ａｎｄ  Ｐｕｈｌｅｒ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９，８４−８７（１９９１））によって記載されている遺伝子破壊及び遺伝子置換の方法である。
【００９４】
遺伝子破壊の方法では、対象遺伝子のコード領域の中央部は、宿主（典型的には、Ｅ．  ｃｏｌｉ）中で複製できるが、Ｃ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ中で複製できないプラスミドベクターでクローンされる。可能なベクターは、例えば、ｐＳＵＰ３０１（Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １，７８４−７９１（１９８３））、ｐＫ１８ｍｏｂまたはｐＫ１９ｍｏｂ（Ｓｃｈａｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １４５，６９−７３（１９９４））、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢまたはｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ（Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７４：５４６２−６５（１９９２））、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡ）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｓｈｕｍａｎ（１９９４）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６９：３２６７８−８４；米国特許第５，４８７，９９３号）、ｐＣＲ（登録商標）Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｈｏｌｌａｎｄ；Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２３４：５３４−５４１（１９９３））、またはｐＥＭ１（Ｓｃｈｒｕｍｐｆ  ｅｔ  ａｌ，１９９１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７３：４５１０−４５１６）である。その後、遺伝子のコード領域の中央部を含有するプラスミドベクターを、コンジュゲーションまたは形質転換によってＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍの所望の株に導入する。コンジュゲーションの方法は、例えば、Ｓｃｈａｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６０，７５６−７５９（１９９４））に記載されている。形質転換の方法は、例えば、Ｔｈｉｅｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９，３５６−３６２（１９８８））、Ｄｕｎｉｃａｎ  ａｎｄ  Ｓｈｉｖｎａｎ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７，１０６７−１０７０（１９８９））、及びＴａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２３，３４３−３４７（１９９４））に記載されている。「クロスオーバー」事象による相同組換え後、当該遺伝子のコード領域は、ベクター配列によって中断され、２つの不完全な対立遺伝子が得られ、１つは、３’末端が欠けており、１つは、５’末端が欠けている。この方法は、Ｃ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍのｒｅｃＡ遺伝子を排除するために、例えば、Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４２，５７５−５８０（１９９４））によって使用されている。
【００９５】
遺伝子置換の方法では、突然変異、例えば、欠失、挿入、または塩基交換は、対象遺伝子中で、インビトロで確立される。次いで、調製された対立遺伝子を、Ｃ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍに対して複製されないベクターでクローンされ、その後、形質転換またはコンジュゲーションによってＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍの所望の宿主に導入する。統合をもたらす第１の「クロスオーバー」事象、及び標的遺伝子または標的配列中で切除をもたらす適当な第２の「クロスオーバー」事象による相同組換え後、突然変異または対立遺gｌｕｔａｍｉｃｕｍ伝子の組み込みが達成される。この方法は、欠失によってＣ．のｐｙｃ遺伝子を排除するために、例えば、Ｐｅｔｅｒｓ−Ｗｅｎｄｉｓｃｈ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４４，９１５−９２７（１９９８））によって使用された。
【００９６】
本明細書に記載のプロモーターは、例えば、強いプロモーターを用いて、または、高活性を有する相当する酵素をコードする遺伝子を用いて、必要に応じて、これらの対策を組み合わせて、例えば、遺伝子のコピー数または遺伝子を増加することによって、相当するＤＮＡによってコードされる微生物中の１つ以上の酵素の細胞内活性を上昇（増強）するための当該技術分野で非常に周知の他の方法と組み合わせて使用することができる。
【００９７】
過剰発現を達成するために、相当する遺伝子のコピー数を増やすことができ、またはあるいは、プロモーター及び調節領域、または構造遺伝子の上流に位置するリボソーム結合部位を突然変異させることができる。構造遺伝子の上流に組み込まれる発現カセットは、同じように作用する。誘導性プロモーターによって、酵素アミノ酸生成の途中で発現を増加させることがさらに可能になる。発現は、ｍ−ＲＮＡの寿命を延ばすことを目的とした対策によって同様に改善される。さらに、酵素活性は、酵素タンパク質の劣化を防ぐことによって増強される。遺伝子または遺伝子構築物は、異なるコピー数を有するプラスミドに存在してもよく、または染色体中で統合、増幅されてもよい。あるいは、関連遺伝子の過剰発現はさらに、培地の組成物、及び培養条件を変えることによって達成されてもよい。
【００９８】
当業者は、特に、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５，１３７−１４６（１９８７））、Ｇｕｅｒｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ  １３８，３５−４１（１９９４））、Ｔｓｕｃｈｉｙａ  ａｎｄ  Ｍｏｒｉｎａｇａ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６，４２８−４３０（１９８８））、Ｅｉｋｍａｎｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ  １０２，９３−９８（１９９１））、欧州特許明細書０４７２８６９、米国特許第４，６０１，８９３号、Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ  ａｎｄ  Ｐｕｈｌｅｒ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９，８４−８７（１９９１）、Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６０，１２６−１３２（１９９４））、ＬａＢａｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７５，１００１−１００７（１９９３））、特許出願国際公開第９６／１５２４６、Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ  １３４，１５−２４（１９９３））、日本公開明細書ＪＰ−Ａ−１０−２２９８９１、Ｊｅｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｈａｍｍｅｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ５８，１９１−１９５（１９９８））、Ｍａｋｒｉｄｅｓ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６０：５１２−５３８（１９９６））、及び遺伝学並びに分子生物学の公知のテキストブックで上記の詳細を見つけることができる。
【００９９】
遺伝子は、例えば、エピソームプラスミドによって過剰発現されてもよい。適当なプラスミドは、コリネ型細菌中で複製されるものである。多くの公知のプラスミドベクター、例えば、ｐＺ１（Ｍｅｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９）６４：５４９−５５４）、ｐＥＫＥｘ１（Ｅｉｋｍａｎｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０２：９３−９８（１９９１））、またはｐＨＳ２−１（Ｓｏｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０７：６９−７４（１９９１））は、潜在プラスミドであるｐＨＭ１５１９、ｐＢＬ１、またはｐＧＡ１に基づいている。他のプラスミドベクター、例えば、ｐＣＧ４（米国特許第４，４８９，１６０号）、またはｐＮＧ２（Ｓｅｒｗｏｌｄ−Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ６６，１１９−１２４（１９９０））、またはｐＡＧ１（米国特許第５，１５８，８９１号）に基づくものを、同様の方法で使用してもよい。
【０１００】
さらに、染色体中の統合による遺伝子増幅の処理を利用可能な助けを借りたそれらのプラスミドベクター、例えば、ｈｏｍ−ｔｈｒＢオペロンを複製及び増幅するためのＲｅｉｎｓｃｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６０，１２６−１３２（１９９４））に記載されているものも適当である。この方法では、完全な遺伝子は、宿主（典型的には、Ｅ．  ｃｏｌｉ）中で複製できるが、Ｃ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ中で複製できないプラスミドベクターにクローンされる。適当なベクターは、例えば、ｐＳＵＰ３０１（Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １，７８４−７９１（１９８３））、ｐＫ１８ｍｏｂまたはｐＫ１９ｍｏｂ（Ｓｃｈａｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １４５，６９−７３（１９９４））、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡ）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｓｈｕｍａｎ（１９９４）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６９：３２６７８−８４；米国特許第５，４８７，９９３号）、ｐＣＲ（登録商標）Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２３４：５３４−５４１（１９９３））、ｐＥＭ１（Ｓｃｈｒｕｍｐｆ  ｅｔ  ａｌ，１９９１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７３：４５１０−４５１６）、またはｐＢＧＳ８（Ｓｐｒａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４１：３３７−３４２）である。次いで、増幅される遺伝子を含有するプラスミドベクターを、コンジュゲーションまたは形質転換によってＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍの所望の株に導入する。コンジュゲーションの方法は、例えば、Ｓｃｈａｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６０，７５６−７５９（１９９４））に記載されている。形質転換の方法は、例えば、Ｔｈｉｅｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９、３５６−３６２（１９８８））、Ｄｕｎｉｃａｎ  ａｎｄ  Ｓｈｉｖｎａｎ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７，１０６７−１０７０（１９８９））、及びＴａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２３，３４３−３４７（１９９４））に記載されている。クロスオーバー事象による相同組換え後、得られた株は、関連遺伝子の少なくとも２つのコピーを含有する。
【０１０１】
遺伝子発現を調節、すなわち、増加または減少する方法には、インビトロで提供されるＤＮＡ分子を用いて微生物が生成される組換え方法が含まれる。そのようなＤＮＡ分子は、例えば、プロモーター、発現カセット、遺伝子、対立遺伝子、コード領域などを含む。形質転換、コンジュゲーション、形質導入の方法、または同様の方法によって、それらを所望の微生物に導入する。
【０１０２】
本発明の場合には、プロモーターは、好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８のポリヌクレオチドであり、発現カセットは、好ましくは、その３’末端でのヌクレオチドを介して、ＲＮＡの翻訳を確実にするリンカーポリヌクレオチドに機能的に連結される配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８のポリヌクレオチドである。
【０１０３】
本発明によるプロモーターまたは本発明による発現単位を用いた過剰発現の対策は、過剰発現に対する対策の前の株中の前記ポリペプチドの活性または濃度に基づいて、相当するポリペプチドの活性または濃度を、通常は少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％または５００％、好ましくは、１，０００％、２，０００％、４，０００％、１０，０００％、または２０，０００％未満に増加させる。
【０１０４】
発現または過剰発現の程度は、遺伝子によって転写されたｍＲＮＡの量の測定、ポリペプチドの量の測定及び酵素活性の測定によって判断することができる。
【０１０５】
ｍＲＮＡの量は、特に、「ノーザンブロッティング」法、及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を使用することで決定してもよい。定量的ＲＴ−ＰＣＲでは、ポリメラーゼ連鎖反応の前に逆転写を行う。このため、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ，Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）システムを、例えば、Ｊｕｎｇｗｉｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２８１，１９０−１９７（２００８））に記載されているように使用してもよい。ゲル中のタンパク質の濃度は、適切な評価ソフトウェアを使用して、一次元及び二次元タンパク質ゲル分離、及びその後のタンパク質濃度の光学的同定を行うことによって測定することができる。コリネ型細菌に対するタンパク質ゲルを調製し、前記タンパク質を同定する一般的な方法は、Ｈｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２２：１７１２−２３（２００１））に記載されている手順である。同様に、タンパク質濃度は、検出対象のタンパク質に特異的な抗体を使用したウェスタンブロットハイブリダイゼーション（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ  Ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）、及びその後の適切な濃度測定ソフトウェアを使用した光学的評価（Ｌｏｈａｕｓ  ａｎｄ  Ｍｅｙｅｒ（１９９８）Ｂｉｏｓｐｅｋｔｒｕｍ  ５：３２−３９；Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  ３２１：２６３０−２６４７（１９９９））によって測定することができる。集めたデータの統計的有意性は、Ｔ検定によって決定する（Ｇｏｓｓｅｔ，Ｂｉｏｍｅｔｒｉｋａ  ６（１）：１−２５（１９０８））。
【０１０６】
本発明によるプロモーターを用いた標的遺伝子を過剰発現する対策は、さらなる過剰発現対策と適当な方法で組み合わせてもよい。過剰発現は、従来技術で利用可能な多数の方法によって達成される。これらには、遺伝子の発現を指向または制御するヌクレオチド配列を修正することに加えて、コピー数を増すことが含まれる。コピー数は、微生物の細胞質内で複製するプラスミドによって増加してもよい。この目的のために、豊富なプラスミドが、非常に異なる群の微生物に対する従来技術に記載されており、ここで、プラスミドは、遺伝子のコピー数の所望の増加を設定するために使用することができる。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に適当なプラスミドは、例えば、Ｔａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０４（１−３），２７−４０，（２００３））、及びＳｔａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７１，５９２０−５９２８（２００５））に記載されている。
【０１０７】
さらに、コピー数は、さらなるコピーを微生物の染色体に導入することによって、少なくとも１つ（１）のコピーだけ増加してもよい。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に適当な方法は、例えば、特許国際公開第０３／０１４３３０、国際公開第０３／０４０３７３、及び国際公開第０４／０６９９９６に記載されている。
【０１０８】
さらに、遺伝子発現は、標的遺伝子の上流の複数のプロモーターを位置決めすることで増加させてもよく、または発現される遺伝子にそれらを機能的に連結して、発現の増加をこのように達成してもよい。この例は、特許国際公開第２００６／０６９７１１に記載されている。
【０１０９】
遺伝子の転写は、必要に応じて、転写を抑制するタンパク質（リプレッサータンパク質）または促進するタンパク質（活性化因子タンパク質）によって制御される。従って、過剰発現は、活性化因子タンパク質の発現を増加させる、またはリプレッサータンパク質の発現を減少または発現のスイッチをオフにする、あるいはリプレッサータンパク質の結合部位を排除することによっても同様に達成することができる。伸長速度はコドンの使用によって影響を受ける。開始株で頻繁である転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）に対するコドンの使用により、翻訳を増加させることができる。さらに、多くの微生物（Ｅ．  ｃｏｌｉの７７％）において最も頻繁に生じるＡＴＧコドンによる開始コドンの交換は、大きく翻訳を改善させ得る。すなわち、ＲＮＡレべルでは、ＡＵＧコドンは、例えば、コドンＧＵＧ及びＵＵＧよりも２〜３倍効果的である（Ｋｈｕｄｙａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２３２（２）：３６９−７１  （１９８８）；Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ  ８２（１７）：５６５６−６０（１９８５））。また、開始コドンと隣接領域との間の相乗効果が記載されているため、開始コドンを取り囲む配列を最適化することができる（Ｓｔｅｎｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２７３（２）：２５９−６５（２００１）；Ｈｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３（３）：６２３−９（１９８４））。
【０１１０】
ＤＮＡの取り扱い、ＤＮＡの消化及び連結、形質転換体の形質転換及び選択に関する説明は、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ”（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）による公知のマニュアルに記載されている。
【０１１１】
本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを含むベクターにも関する。
【０１１２】
Ｋｉｒｃｈｎｅｒ  ａｎｄ  Ｔａｕｃｈ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０４：２８７−２９９（２００３））は、Ｃ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍに使用されるベクターの選択を記載している。本発明によるベクターを用いた相同組換えにより、染色体上のＤＮＡセグメントを、ベクターによって細胞に輸送される本発明によるポリヌクレオチドに置換することができる。ベクターの環状ＤＮＡ分子と染色体上の標的ＤＮＡの間の効率的な組換えでは、本発明によるポリヌクレオチドに置換されるＤＮＡ領域は、ベクターの統合部位とＤＮＡの置換部位を決定する標的部位に相同なヌクレオチド配列を有する末端で提供される。
【０１１３】
それゆえ本発明によるプロモーターポリヌクレオチドは、１）染色体中の標的遺伝子の天然遺伝子座で天然プロモーターに置換されてもよく；または２）後者の天然遺伝子座または別の遺伝子座で標的遺伝子と統合されてもよい。
【０１１４】
「標的遺伝子の天然遺伝子座での天然プロモーターの置換」は、そのヌクレオチド配列の形態で相当する野生型または相当する出発有機体中のその遺伝子座で単一コピーによって通常自然に存在する遺伝子の天然に存在するプロモーターが置換されていることを意味する。
【０１１５】
「別の遺伝子座」は、ヌクレオチド配列が標的遺伝子の配列と異なる遺伝子座を意味する。前記他の遺伝子座または前記他の遺伝子座でのヌクレオチド配列は、染色体内に位置するのが好ましく、通常、所望の化学化合物の成長及び生成に必須ではない。さらに、染色体内の遺伝子間領域、すなわち、コード機能がないヌクレオチド配列を使用することが可能である。
【０１１６】
発現または過剰発現は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の微生物中で実施されるのが好ましい。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属内で、以下の種：沈着型株がＤＳＭ４４５４９であるＣ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ；沈着型株がＡＴＣＣ１３０３２であるＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍ；及び沈着型株がＡＴＣＣ６８７１であるＣ．アンモニア遺伝子に基づいている株が好ましい。種であるＣ．gｌｕｔａｍｉｃｕｍが特に非常に好ましい。
【０１１７】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、特に、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ種の適当な株は、特に、公知の野生型株：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１５８０６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ    ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ  ＡＴＣＣ１７９６５、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、及びＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ  ＡＴＣＣ１４０２０；及びＬ−アミノ酸生成変異体、またはそれから調製された株、例えば、Ｌ−リジン生成株：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ１７０９、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ１７０８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ１７１２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ６４６３、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ６４６４、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＭ５８−１、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＧ５２−５、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＳＭ５７１４、及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＳＭ１２８６６である。
【０１１８】
「Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ」という用語は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに対しても使用されている。Ｃ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ種のいくつかの代表例は、従来技術におけるＣ．ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ、例えば、株ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９とも呼ばれている。
【０１１９】
本発明による発現または過剰発現対策に採用される微生物または株（出発株）は、所望のファインケミカルを周囲栄養培地で分泌し、そこに蓄積する能力をすでに持っていることが好ましい。「生成するために」という表現は、以下でこのようにも使用される。より詳細には、過剰発現対策に採用される株は、所望のファインケミカルを、細胞または栄養培地中で少なくとも０．１０ｇ／Ｌ、少なくとも０．２５ｇ／Ｌ、少なくとも０．５ｇ／Ｌ、少なくとも１．０ｇ／Ｌ、少なくとも１．５ｇ／Ｌ、少なくとも２．０ｇ／Ｌ、少なくとも４．０ｇ／Ｌ、または少なくとも１０．０ｇ／Ｌの濃度で、１２０時間未満、９６時間未満、４８時間未満、３６時間未満、２４時間未満、または１２時間未満蓄積する能力を持っている。出発株は、突然変異誘発及び選択、組換えＤＮＡ技術、または両方の方法の組み合わせによって調製される株が好ましい。
【０１２０】
当業者には、本発明の対策に適当な微生物が、野生株、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ型株ＡＴＣＣ１３０３２または株ＡＴＣＣ１４０６７における標的遺伝子の過剰発現のために、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８の本発明によるプロモーターをまず採用した後、従来技術に記載のさらなる遺伝的対策によって、微生物に所望のファインケミカル（複数可）を生成させることによって得ることもできることが理解される。
【０１２１】
「生体分子」という用語は、本発明の対策に関する、アミノ酸、有機酸、ビタミン、ヌクレオシド、及びヌクレオチドを意味する。タンパク質を構成するアミノ酸、タンパク質を構成しないアミノ酸、マクロ分子、及び有機酸が特に好ましい。
【０１２２】
「タンパク質を構成するアミノ酸」は、天然タンパク質、すなわち、微生物、植物、動物、及びヒトのタンパク質で発生するアミノ酸を意味する。それらは、ペプチド結合を介して互いに結合するタンパク質の構造単位として機能する。
【０１２３】
Ｌ−アミノ酸またはアミノ酸が以下で記載される場合、それらは、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−システイン、Ｌ−バリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リジン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−アルギニンからなる群から選択される、それらの塩を含む１つ以上のアミノ酸を意味するものとして理解されるべきである。Ｌ−リジンは特に好ましい。Ｌ−アミノ酸、特に、リジンは、ヒトの医学、製薬業界、食品業界、及び非常に特に動物栄養で使用される。したがって、アミノ酸、特に、Ｌ−リジンを調製するために新しい改善処理を提供することに一般的な関心がある。
【０１２４】
「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、交換可能である。
【０１２５】
本発明は、ファインケミカルを生成する微生物を提供し、前記微生物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８の本発明によるプロモーターを用いることで、特定の出発株と比較して１つ以上の遺伝子の発現が増加している。
【０１２６】
発酵調製物
本発明はさらに、
ａ）本発明による上述の微生物を適当な培地内において培養して発酵液を得る工程；及び
ｂ）工程ａ）で得られた発酵液または微生物の細胞内においてファインケミカルを濃縮する工程
を含む、ファインケミカルの発酵調製物のための処理を提供する。
【０１２７】
ファインケミカル含有発酵液、ファインケミカル、または液体または固体のファインケミカル含有生成物から得られることが好ましい。生成された微生物は、例えば、国際公開第０５／０２１７７２に開示されているように連続的に培養するか、または所望の有機化学化合物を生成する目的で、回分培養処理（回分培養）、流加培養処理、または繰り返し流加培養処理によって不連続的に培養してもよい。公知の培養方法についての一般的な性質の概要は、Ｃｈｍｉｅｌ（Ｂｉｏｐｒｏｚｅβｔｅｃｈｎｉｋ．１，Ｅｉｎｆｕｈｒｕｎｇ  ｉｎ  ｄｉｅ  Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ（Ｇｕｓｔａｖ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，１９９１））によるテキストブック、またはＳｔｏｒｈａｓ（Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ  Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ（Ｖｉｅｗｅｇ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，１９９４））によるテキストブックで入手可能である。
【０１２８】
使用される培養培地または発酵培地は、それぞれの株に関する要件を適切に満たしていなければならない。種々の微生物に対する培養培地の説明は、“Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”，ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）に存在している。「培養培地」及び「発酵培地」という用語は、互いに置き替え可能である。
【０１２９】
炭素源、糖、及び炭水化物として、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、砂糖大根またはサトウキビの処理によって得られるスクロース含有溶液、でんぷん、でんぷん加水分解物、及びセルロース；油、及び脂肪、例えば、大豆油、ひまわり油、落花生油、及びココナツ油；脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、及びリノール酸；アルコール、例えば、グリセロール、メタノール、及びエタノール；及び有機酸、例えば、酢酸及び乳酸を使用することができる。
【０１３０】
窒素源として、ペプトンなどの有機含窒素化合物、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、コーンスティープリカー、きなこ、及び尿素；または硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウムなどの無機化合物を使用することができる。窒素源は、単独または混合物として使用することができる。
【０１３１】
リン源として、リン酸、リン酸二水素カリウム、またはリン酸水素二カリウム、または相当するナトリウム含有塩を使用することができる。
【０１３２】
培養培地は、成長に必要な、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、及び鉄などの金属の塩化物または硫酸塩の形態の塩、例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄をさらに含んでもよい。最終的に、アミノ酸、例えば、ホモセリン及びビタミン、例えば、チアミン、ビオチン、またはパントテン酸などの必須発育因子は、上述した物質に加えて使用することができる。
【０１３３】
前記開始物質は、単一バッチの形態で培養物に添加してもよく、または培養時に適当な方法で供給してもよい。
【０１３４】
培養物のｐＨは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、またはアンモニア水などの塩基性化合物；またはリン酸または硫酸などの酸性化合物を適当な方法で使用して制御することができる。ｐＨは、一般的に、６．０〜８．５、好ましくは６．５〜８の値に調節される。泡を抑制するために、例えば、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を使用することができる。プラスミドの安定性を維持するために、例えば、抗生物質などの適当な選択的作用物質を培地に添加することができる。発酵は、好気性条件下で実施することが好ましい。これらの条件を維持するために、酸素または含酸素気体混合物（空気など）を培養物に導入する。同様に、過酸化水素を濃縮した液体を使用することもできる。必要に応じて、高圧下、例えば、０．０３〜０．２ＭＰａの高圧下で発酵を実施する。培養物の温度は、通常は２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃、特に好ましくは３０℃〜３７℃である。回分培養処理または流加培養処理では、所望の有機化学化合物が回収に十分な量となるまで培養を継続するのが好ましい。この目的は、通常、１０〜１６０時間以内に達成される。連続培養処理では、培養時間をさらに長くしてもよい。微生物の活性により、発酵培地及び／または前記微生物の細胞内で有機化学化合物の濃縮（蓄積）が生じる。
【０１３５】
適当な発酵培地の例としては、特に、米国特許第５，７７０，４０９号、米国特許第５，９９０，３５０号、米国特許第５，２７５，９４０号、国際公開第２００７／０１２０７８号、米国特許第５，８２７，６９８号、国際公開第２００９／０４３８０３号、米国特許第５，７５６，３４５号、及び米国特許第７，１３８，２６６号に記載されている。
【０１３６】
発酵中に一回以上（複数可）の濃度決定のためのＬ−アミノ酸の分析は、Ｓｐａｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌに記載されているように、イオン交換クロマトグラフィー、好ましくは、カチオン交換クロマトグラフィーと、ニンヒドリンを使用したポストカラム誘導体化によるＬ−アミノ酸の分離によって実施することができる（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１１９０−１２０６（１９５８））。ニンヒドリンの代わりに、オルトフタルジアルデヒドをポストカラム誘導体化に使用することもできる。イオン交換クロマトグラフィーの概要論文は、Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ（ＬＣ−ＧＣ（Ｍａｇａｚｉｎｅ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）７（６），４８４−４８７（１９８９））に記載されている。
【０１３７】
また、例えば、オルトフタルジアルデヒドまたはフェニルイソチオシアネートを使用したプレカラム誘導体化を実施し、逆相（ＲＰ）クロマトグラフィー、好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の形態によって得られたアミノ酸誘導体を分離することもできる。この種の方法は、例えば、Ｌｉｎｄｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５１：１１６７−１１７４（１９７９））に記載されている。
【０１３８】
検出は、光度測定（吸収率、蛍光）によって行う。
【０１３９】
アミノ酸分析に関するレビューは、特に、Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ  ａｎｄ  Ｚｏｒｂａｓからのテキストブック“Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ”に記載されている（Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ  １９９８）。
【０１４０】
発酵時における１つ以上の時点（複数可）でのα−ケト酸の濃度の決定は、Ｈ＋形態におけるスルホン化スチレン−ジビニルベンゼン重合体、例えば、０．０２５Ｍ硫酸によって、２１５ｎｍ（あるいは、２３０または２７５ｎｍ）でのＵＶ検出を使用したイオン交換クロマトグラフィー、好ましくは、カチオン交換クロマトグラフィーによるケト酸及びその他の分泌物の分離によって実施することができる。好ましくは、ＲＥＺＥＸ  ＲＦＱ−Ｆａｓｔ  Ｆｒｕｉｔ  Ｈ＋カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を使用することができるが、分離相の他の供給業者（例えば、ＢｉｏＲａｄ製のＡｍｉｎｅｘ）が実現可能である。同様な分離手法は、供給業者の応用例に記載されている。
【０１４１】
本発明によるプロモーター変異体を含有する処理または発酵処理の性能は、濃度（単位体積当たりに形成された化合物）、収率（消費された炭素源当たりに形成された化合物）、生成量（体積及び時間当たりに形成された化合物）、特定の生成量（細胞乾燥質量または生体乾燥質量、及び時間当たりに形成された化合物、または細胞タンパク質及び時間当たりに形成された化合物）、あるいはその他の処理パラメータ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上のパラメータにおいて、本発明によるプロモーター変異体を含有しない微生物を使用する処理または発酵処理に基づいて、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％増加される。これは、大規模な工業処理では非常に有益であると考えられる。
【０１４２】
発酵対策により、所望のファインケミカル、好ましくは、アミノ酸、有機酸、ビタミン、ヌクレオシド、またはヌクレオチドを含有する発酵液が得られる。
【０１４３】
次に、ファインケミカルを含有する生成物は、液体または固体形態で提供、または生成、または回収される。
【０１４４】
発酵液は、微生物を所定の時間にわたって所定の温度で培養した発酵培地または培養液を意味する。発酵中に使用する発酵培地または培地は、所望の化合物の生成並びに典型的には繁殖または生存を可能とする、全ての物質または成分を含む。
【０１４５】
発酵が完了すると、それによって得られた発酵液は、以下の成分を含む：
ａ）微生物の細胞の繁殖によって得られた微生物のバイオマス（細胞集団）；
ｂ）発酵中に形成された所望のファインケミカル；
ｃ）発酵中に任意に形成された有機副生成物；及び
ｄ）発酵で消費されない、例えば、ビオチンなどのビタミンまたは硫酸マグネシウムなどの塩の、使用された発酵培地または出発材料の成分。
【０１４６】
有機副生成物は、特に所望の化合物に加えて発酵に使用した微生物によって生成され、必要に応じて分泌される物質を含む。
【０１４７】
発酵液は、培養容器または発酵容器から取り出され、必要に応じて回収され、液体または固体形態のファインケミカルを含有する生成物を提供するために使用される。この場合にも、「ファインケミカル含有生成物を回収する」という表現を使用する。最も単純な場合には、発酵容器から取り出したファインケミカル含有発酵液自体は、回収された生成物を構成する。
【０１４８】
以下からなる群から選択される１つ以上の対策により、所望の有機化学化合物の濃縮または精製を達成する：
ａ）水の部分的（＞０％〜＜８０％）、完全（１００％）またはほぼ完全（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、または≧９９％）な除去；
ｂ）除去前に必要に応じて非活性化されているバイオマスの部分的（＞０％〜＜８０％）、完全（１００％）、またはほぼ完全（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、または≧９９％）な除去；
ｃ）発酵中に形成された有機副生成物の部分的（＞０％〜＜８０％）、完全（１００％）、またはほぼ完全（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、≧９９．３％、または≧９９．７％）な除去；及び
ｄ）発酵で消費されなかった、使用された発酵培地または出発材料の成分の、発酵液からの部分的（＞０％）、完全（１００％）、またはほぼ完全（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、≧９９．３％または≧９９．７％）な除去。これにより、所望の化合物含有量を有する生成物が単離される。
【０１４９】
水の部分的（＞０％〜＜８０％）、完全（１００％）、またはほぼ完全（≧８０％〜＜１００％）な除去（手段ａ））は、乾燥とも呼ばれる。
【０１５０】
処理の一変形例では、水、バイオマス、有機副生成物、及び使用した発酵培地の消費されなかった成分の完全またはほぼ完全な除去は、所望の有機化学化合物の純粋（≧８０重量％または≧９０重量％）、または非常に純粋（≧９５％重量、≧９７重量％、または≧９９重量％）な生成物形態をもたらす。対策ａ）、ｂ）、ｃ）、及びｄ）に対する多くの技術的説明は、従来技術で入手可能である。
【０１５１】
要件に応じて、バイオマスは、分離方法、例えば、遠心分離、濾過、デカンテーション、またはそれらの組み合わせによって発酵液から完全にまたは一部を除去することができ、または発酵液に完全に留置される。必要に応じて、バイオマスまたはバイオマス含有発酵液は、適当な処理工程中、例えば、熱処理（加熱）中、または酸を添加によって不活性化される。
【０１５２】
一手順では、バイオマスは、完全またはほぼ完全に除去されるため、全く（０％）、または多くても３０％、多くても２０％、多くても１０％、多くても５％、多くても１％または多くても０．１％のバイオマスが、調製された生成物中に残る。さらなる手順では、バイオマスは、除去されない、または小さな割合でしか除去されないため、全て（１００％）、または７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または９９．９％以上のバイオマスが、調製された生成物中に残る。本発明による一処理では、従って、バイオマスは、≧０％〜≦１００％の割合で除去される。
【０１５３】
最終的に、発酵後に得られた発酵液は、最終生成物の取扱適性を改善するように、バイオマスの完全または部分除去の前または後に、無機酸、例えば、塩酸、硫酸、またはリン酸；または有機酸、例えば、プロピオン酸で酸性ｐＨに調整することができる（ＧＢ１，４３９，７２８またはＥＰ１３３１２２０）。発酵液を完全な含有量のバイオマスで酸性化することも可能である。最終的に、発酵液は、亜硫酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３、ＧＢ１，４３９，７２８）または別の塩、例えば、亜硫酸のアンモニウム塩、アルカリ金属塩、またはアルカリ土類金属塩を添加することによっても安定化することができる。
【０１５４】
バイオマスの除去中、発酵液に存在する任意の有機または無機固体は、部分的または完全に除去される。発酵液に溶解した有機副生成物、及び発酵培地の溶解した消費されていない成分（出発材料）は、少なくとも部分的（＞０％）、好ましくは、少なくとも２５％の程度まで、特に好ましくは、少なくとも５０％の程度まで、及び非常に特に好ましくは、少なくとも７５％の程度まで生成物中に残る。必要に応じて、それらは、完全（１００％）またはほぼ完全（＞９５％または＞９８％または＞９９％を意味する）に生成物中に残る。この意味における生成物が、発酵液の成分の少なくとも一部を含む場合、これは、「発酵液に基づく生成物」という用語によっても記載される。
【０１５５】
その後、公知の方法、例えば、ロータリーエバポレーター、薄膜蒸発器、流下膜式蒸発器を用いて、逆浸透膜、またはナノ濾過によって、水を発酵液から除去し、または前記発酵液を濃くまたは濃縮する。次いで、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００６６５５に従って記載されているように、凍結乾燥、噴霧乾燥、噴霧造粒の方法によって、または循環流動層などの他の処理によって、この濃縮発酵液を、自由流動性の生成物、特に、微粉、または好ましくは、粗顆粒にワークアップすることができる。所望の生成物は、スクリーニングまたは除塵によって得られた顆粒から必要に応じて単離される。発酵液を、直接、すなわち、噴霧乾燥または噴霧造粒による予備濃縮せずに乾燥することも可能である。
【０１５６】
「自由流動性」は、異なるサイズのオリフィスを有する一連のガラスオリフィス容器から、５ｍｍオリフィスを有する容器の外に少なくとも妨げられずに流れる粉末を意味する（Ｋｌｅｉｎ：Ｓｅｉｆｅｎ，Ｏｌｅ，Ｆｅｔｔｅ，Ｗａｃｈｓｅ  ９４，１２（１９６８））。
【０１５７】
「微」は、２０〜２００μｍの直径の粒径を主に（＞５０％）有する粉末を意味する。
【０１５８】
「粗」は、２００〜２０００μｍの直径の粒径を主に（＞５０％）有する生成物を意味する。
【０１５９】
粒径判断は、レーザー回析分析法の方法によって実施することができる。対応する方法は、Ｒ．Ｈ．Ｍｕｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒ．Ｓｃｈｕｈｍａｎｎ，Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｌｉｃｈｅ  Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ（１９９６）によるテキストブック“Ｔｅｉｌｃｈｅｎｇｒｏβｅｎｍｅｓｓｕｎｇ  ｉｎ  ｄｅｒ  Ｌａｂｏｒｐｒａｘｉｓ”、またはＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９８）により公開されたＭ．Ｒｈｏｄｅｓによるテキストブック“Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”に記載されている。
【０１６０】
自由流動性の微粉は、次いで、適当な圧密または造粒処理によって、粗く、非常に自由流動性で、保存可能で、及び実質的に無塵の生成物に形質転換することができる。
【０１６１】
「無塵」という用語は、直径で１００μｍを下回る粒径を小さな割合（＜５％）でしか含まない生成物を意味する。
【０１６２】
本発明の意味における「保存可能」は、発生しているそれぞれの有機化学化合物の任意の実質的な損失をせずに乾燥し、涼しい環境で、少なくとも１年以上、好ましくは、少なくとも１．５年以上、特に好ましくは、２年以上保存することができる生成物を意味する。「実質的な損失」は、＞５％の損失を意味する。
【０１６３】
結合剤、ゲル化剤または増粘剤として食品または飼料、またはさらなる物質、例えば、シリカ、ケイ酸塩（ＥＰ０７４３０１６Ａ）、及びステアリン酸塩の処理に通常使用されるように、通常の有機または無機補助剤または担体、例えば、スターチ、ゼラチン、セルロース誘導体または同様の物質を造粒または圧密中に使用することが有利である。
【０１６４】
国際公開第０４／０５４３８１に記載されているように、得られた顆粒の表面を油または脂質で処理することがさらに有利である。使用され得る油は、鉱油、野菜油、または野菜油の混合物である。そのような油の例は、大豆油、オリーブ油、大豆油／レシチン混合物である。このように、シリコーン油、ポリエチレングリコール、またはヒドロキシエチルセルロースも適している。前記油による顆粒の表面の処理により、生成物の耐摩耗性の増加、及び含塵率の減少が達成される。生成物中の油含有量は、飼料添加物の総量に基づいて、０．０２〜２．０重量％、好ましくは、０．０２〜１．０重量％、及び非常に特に好ましくは、０．２〜１．０重量％である。
【０１６５】
好ましい生成物は、１００〜１８００μｍの粒径を持つ≧９７重量％の割合、または直径３００〜１８００μｍの粒径を持つ≧９５重量％割合を有する。塵、すなわち、＜１００ｐｍの粒径の粒子の割合は、好ましくは、＞０〜１重量％、特に好ましくは、０．５重量％を超えないものである。
【０１６６】
しかしながら、あるいは、生成物は、飼料、例えば、シリカ、ケイ酸塩、食事、ぬか類、小麦粉、スターチ、砂糖、または他のものの処理において、公知及び習慣的な有機または無機担体上に吸収されてもよく、及び／または一般的な増粘剤または結合剤と混合し、安定化してもよい。それの使用及び処理の例は、文献（Ｄｉｅ  Ｍｕｈｌｅ＋Ｍｉｓｃｈｆｕｔｔｅｒｔｅｃｈｎｉｋ  １３２（１９９５）４９，ｐａｇｅ  ８１７）に記載されている。
【０１６７】
実施形態：
１．少なくとも１つの異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１〜８からなる群から選択されるプロモーターポリヌクレオチド配列を含む、組換え核酸分子。
２．前記プロモーターポリヌクレオチド配列が、配列番号１、５、及び７からなる群から選択される、請求項１に記載の組換え核酸分子。
３．リンカーオリゴヌクレオチドまたはリンカーポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態１または２に記載の組換え核酸分子。
４．前記少なくとも１つの異種標的遺伝子が、アミノ酸、有機酸、タンパク質、及びポリマーからなる群から選択される生体分子を生成する生合成経路の成分である遺伝子である、実施形態１に記載の組換え核酸分子。
５．前記少なくとも１つの異種標的遺伝子が、
エントリーＭ０００２０の遺伝子を含むセリン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ０００１８の遺伝子を含むスレオニン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ０００２１の遺伝子を含むシステイン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００３３８の遺伝子を含むシステイン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００６０９の遺伝子を含むシステイン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ０００１７の遺伝子を含むメチオニン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ０００１９の遺伝子を含むバリン／イソロイシン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００５３５の遺伝子を含むイソロイシン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００５７０の遺伝子を含むイソロイシン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００４３２の遺伝子を含むロイシン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ０００１６の遺伝子を含むリジン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００５２５の遺伝子を含むリジン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００５２６の遺伝子を含むリジン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００５２７の遺伝子を含むリジン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００３０の遺伝子を含むリジン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００４３３の遺伝子を含むリジン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００３１の遺伝子を含むリジン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ０００１５の遺伝子を含むプロリン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ０００２８の遺伝子を含むオルニチン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００７６３の遺伝子を含むオルニチン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ０００２６の遺伝子を含むヒスチジン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ０００２２の遺伝子を含むシキミ酸生合成経路；
エントリーＭ０００２３の遺伝子を含むトリプトファン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ０００２４の遺伝子を含むフェニルアラニン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ０００２５の遺伝子を含むチロシン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ０００４０の遺伝子を含むチロシン生合成経路；及び
それらの生合成経路のいずれかの遺伝子の組み合わせ
からなる群から選択される生合成経路のアミノ酸の成分である遺伝子である、実施形態４に記載の組換え核酸分子。
６．配列番号１〜８からなる群から選択される１つ以上の追加のプロモーターポリヌクレオチド配列をさらに含み、各プロモーターが、少なくとも１つの追加の異種遺伝子に機能的に連結している、実施形態１に記載の組換え核酸分子。
７．前記組換え核酸分子が単離されている、実施形態１に記載の組換え核酸分子。
８．配列番号１〜８からなる群から選択されるプロモーターポリヌクレオチド配列、及びそれらの組み合わせを含む、各プロモーターが、少なくとも１つの異種標的遺伝子に機能的に連結している、組換えベクター。
９．前記プロモーターポリヌクレオチド配列が、配列番号１、５、及び７からなる群から選択される、実施形態８に記載の組換え核酸分子。
１０．配列番号１〜８からなる群から選択されるプロモーターポリヌクレオチド配列、及びそれらの組み合わせを含む２つ以上の組換え核酸分子の組み合わせを含み、各プロモーターが、少なくとも１つの異種標的遺伝子に機能的に連結している、実施形態８または９に記載の組換えベクター。
１１．前記プロモーターポリヌクレオチド配列の各々が、異なる異種標的遺伝子に機能的に連結している、実施形態１０に記載の組換えベクター。
１２．前記標的遺伝子が、同じ代謝経路の一部である、実施形態１１に記載の組換えベクター。
１３．前記標的遺伝子が、同じ代謝経路の一部ではない、実施形態１１に記載の組換えベクター。
１４．実施形態１〜６のいずれか１項に記載の組換え核酸分子、または実施形態１０に記載のそれらの組み合わせ、または実施形態８〜１３のいずれか１項に記載の組換えベクターを含む、宿主細胞。
１５．プロモーターポリヌクレオチド配列の組み合わせを含み、前記プロモーターポリヌクレオチド配列の各々が、異なる異種標的遺伝子に機能的に連結している、実施形態１４に記載の宿主細胞。
１６．前記異なる異種標的遺伝子の各々が、同じ代謝経路の一部である、実施形態１５に記載の宿主細胞。
１７．前記異なる異種標的遺伝子の各々が、同じ代謝経路の一部ではない、実施形態１５に記載の宿主細胞。
１８．Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、実施形態１４〜１７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
１９．Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、実施形態１８に記載の宿主細胞。
２０．実施形態１２〜１９のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養することを含み、前記１つ以上の標的遺伝子の各々が、配列番号１〜８からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に機能的に連結した異なる異種標的遺伝子であり、各異種標的遺伝子の発現の改変が、上方調節または下方調節から独立して選択される、１つ以上の標的遺伝子の発現を改変する方法。
２１．実施形態１２〜１９のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養することを含み、前記１つ以上の標的遺伝子の各々が、配列番号１〜８からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に機能的に連結した異なる異種標的遺伝子であり、各異種標的遺伝子の発現の改変が、上方調節または下方調節から独立して選択される、１つ以上の標的遺伝子の発現を改変する方法。
２２．生体分子を生成するのに適した条件下で、実施形態１２〜１９のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養することを含む、生体分子を生成する方法。
２３．前記生体分子が、Ｌ−アミノ酸である、実施形態２０に記載の方法。
２４．前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジンである、実施形態２２に記載の方法。
２５．前記少なくとも１つの異種標的遺伝子が、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．２．１．１１）；４−ヒドロキシ−テトラヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＥＣ：４．３．３．７）；ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．１７．１．８）；２，３，４，５−テトラヒドロピリジン−２−カルボン酸Ｎ−スクシニルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．１．１１７）；２，３，４，５−テトラヒドロピリジン−２−カルボン酸Ｎ−スクシニルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．１．１１７）；Ｎ−スクシニルジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．６．１．１７）；スクシニル−ジアミノピメリン酸デサクシニラーゼ（ＥＣ：３．５．１．１８）；ジアミノピメリン酸エピメラーゼ（ＥＣ：５．１．１．７）；ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．２０）；ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．４．１．１６）；アスパルトキナーゼＬｙｓｃアルファ及びベ−タサブユニット（ＥＣ：２．７．２．４）；アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．６．１．１）；ホスホトランスフェラーゼシステム（ＰＴＳ）；ＰＴＳのグルコース−特異的酵素ＩＩ  ＢＣ成分（ＥＣ：２．７．１．６９）；グルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．１．１．４９  １．１．１．３６３）；グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（ＥＣ：５．３．１．９）；トランスケトラーゼ（ＥＣ：２．２．１．１）；６−ホスホフルクトキナーゼ１（ＥＣ：２．７．１．１１）；ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．３１）；ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＥＣ：６．４．１．１）；イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．１．１．４２）；ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＧＴＰ）（ＥＣ：４．１．１．３２）；オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．３）；ホモセリンキナーゼ（ＥＣ：２．７．１．３９）；ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．１．１．３）；スレオニンシンターゼ（ＥＣ：４．２．３．１）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコ−ドする遺伝子である、実施形態２０に記載の方法。
２６．異種標的遺伝子に機能的に連結した少なくとも１つのプロモーターポリヌクレオチドを含み、プロモーターポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８からなる群から選択される配列を含む、宿主細胞。
２７．異種標的遺伝子に機能的に連結した２つ以上のプロモーターポリヌクレオチド配列の組み合わせを含み、各プロモーターポリヌクレオチドが、異なる異種標的遺伝子に機能的に連結している、実施形態２５に記載の宿主細胞。
２８．前記組み合わせが、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．２．１．１１）；４−ヒドロキシ−テトラヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＥＣ：４．３．３．７）；ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．１７．１．８）；２，３，４，５−テトラヒドロピリジン−２−カルボン酸Ｎ−スクシニルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．１．１１７）；２，３，４，５−テトラヒドロピリジン−２−カルボン酸Ｎ−スクシニルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．１．１１７）；Ｎ−スクシニルジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．６．１．１７）；スクシニル−ジアミノピメリン酸デサクシニラーゼ（ＥＣ：３．５．１．１８）；ジアミノピメリン酸エピメラーゼ（ＥＣ：５．１．１．７）；ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．２０）；ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．４．１．１６）；アスパルトキナーゼＬｙｓｃアルファ及びベ−タサブユニット（ＥＣ：２．７．２．４）；アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．６．１．１）；ホスホトランスフェラーゼシステム（ＰＴＳ）；ＰＴＳのグルコース−特異的酵素ＩＩ  ＢＣ成分（ＥＣ：２．７．１．６９）；グルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．１．１．４９  １．１．１．３６３）；グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（ＥＣ：５．３．１．９）；トランスケトラーゼ（ＥＣ：２．２．１．１）；６−ホスホフルクトキナーゼ１（ＥＣ：２．７．１．１１）；ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．３１）；ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＥＣ：６．４．１．１）；イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．１．１．４２）；ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＧＴＰ）（ＥＣ：４．１．１．３２）；オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．３）；ホモセリンキナーゼ（ＥＣ：２．７．１．３９）；ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．１．１．３）；及びスレオニンシンターゼ（ＥＣ：４．２．３．１）からなる群から選択された２つの異種標的遺伝子を含み、各々が、配列番号１〜８からなる群から選択されるプロモーターに機能的に連結している、実施形態２６に記載の宿主細胞。
２９．前記組み合わせが、前記異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１、５、及び７からなる群から選択されるプロモーターを含む、実施形態２７に記載の宿主細胞。
３０．前記組み合わせが、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．２．１．１１）；４−ヒドロキシ−テトラヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＥＣ：４．３．３．７）；ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．１７．１．８）；２，３，４，５−テトラヒドロピリジン−２−カルボン酸Ｎ−スクシニルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．１．１１７）；２，３，４，５−テトラヒドロピリジン−２−カルボン酸Ｎ−スクシニルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．１．１１７）；Ｎ−スクシニルジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．６．１．１７）；スクシニル−ジアミノピメリン酸デサクシニラーゼ（ＥＣ：３．５．１．１８）；ジアミノピメリン酸エピメラーゼ（ＥＣ：５．１．１．７）；ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．２０）；ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．４．１．１６）；アスパルトキナーゼＬｙｓｃアルファ及びベ−タサブユニット（ＥＣ：２．７．２．４）；アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．６．１．１）；ホスホトランスフェラーゼシステム（ＰＴＳ）；ＰＴＳのグルコース−特異的酵素ＩＩ  ＢＣ成分（ＥＣ：２．７．１．６９）；グルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．１．１．４９  １．１．１．３６３）；グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（ＥＣ：５．３．１．９）；トランスケトラーゼ（ＥＣ：２．２．１．１）；６−ホスホフルクトキナーゼ１（ＥＣ：２．７．１．１１）；ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．３１）；ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＥＣ：６．４．１．１）；イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．１．１．４２）；ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＧＴＰ）（ＥＣ：４．１．１．３２）；オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．３）；ホモセリンキナーゼ（ＥＣ：２．７．１．３９）；ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．１．１．３）；及びスレオニンシンターゼ（ＥＣ：４．２．３．１）からなる群から選択される３つの異種標的遺伝子を含み、各々が、配列番号１〜８からなる群から選択されるプロモーターに機能的に連結している、実施形態２６に記載の宿主細胞。
３１．前記組み合わせが、前記異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１、５、及び７からなる群から選択されるプロモーターを含む、実施形態２９に記載の宿主細胞。
３２．前記異種標的遺伝子が、同じ代謝経路の一部である、実施形態２６に記載の宿主細胞。
３３．前記異種標的遺伝子が、同じ代謝経路の一部ではない、実施形態２６に記載の宿主細胞。
３４．Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、実施形態２５〜３２のいずれか１項に記載の宿主細胞。
３５．Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、実施形態２５〜３３のいずれか１項に記載の宿主細胞。
３６．実施形態２５〜３４のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養することを含み、各異種標的遺伝子の改変が、上方調節または下方調節から独立して選択され、前記上方調節または下方調節が、内因性プロモーターの制御下で前記標的遺伝子の発現のレベルに相対的である、１つ以上の標的遺伝子の発現を改変する方法。
３７．生体分子を生成するのに適した条件下で、実施形態２５〜３５のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養することを含む、生体分子を生成する方法。
３８．前記生体分子が、Ｌ−アミノ酸である、実施形態３６に記載の方法。
３９．前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジンである、実施形態３７に記載の方法。
４０．前記少なくとも１つの異種標的遺伝子が、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．２．１．１１）；４−ヒドロキシ−テトラヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＥＣ：４．３．３．７）；ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．１７．１．８）；２，３，４，５−テトラヒドロピリジン−２−カルボン酸Ｎ−スクシニルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．１．１１７）；２，３，４，５−テトラヒドロピリジン−２−カルボン酸Ｎ−スクシニルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．１．１１７）；Ｎ−スクシニルジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．６．１．１７）；スクシニル−ジアミノピメリン酸デサクシニラーゼ（ＥＣ：３．５．１．１８）；ジアミノピメリン酸エピメラーゼ（ＥＣ：５．１．１．７）；ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．２０）；ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．４．１．１６）；アスパルトキナーゼＬｙｓｃアルファ及びベ−タサブユニット（ＥＣ：２．７．２．４）；アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．６．１．１）；ホスホトランスフェラーゼシステム（ＰＴＳ）；ＰＴＳのグルコース−特異的酵素ＩＩ  ＢＣ成分（ＥＣ：２．７．１．６９）；グルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．１．１．４９  １．１．１．３６３）；グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（ＥＣ：５．３．１．９）；トランスケトラーゼ（ＥＣ：２．２．１．１）；６−ホスホフルクトキナーゼ１（ＥＣ：２．７．１．１１）；ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．３１）；ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＥＣ：６．４．１．１）；イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．１．１．４２）；ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＧＴＰ）（ＥＣ：４．１．１．３２）；オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．３）；ホモセリンキナーゼ（ＥＣ：２．７．１．３９）；ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．１．１．３）；スレオニンシンターゼ（ＥＣ：４．２．３．１）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態３８に記載の方法。
４１．異種標的遺伝子に機能的に連結した少なくとも１つのプロモーターポリヌクレオチドを含み；プロモーターポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８から選択される配列を含み；プロモーターポリヌクレオチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、または配列番号８から選択される配列を含み、標的遺伝子が、プロモーターポリヌクレオチドの内因性遺伝子以外である、組換えベクター。
４２．少なくとも２つのプロモーターポリヌクレオチドを含み、各プロモーターポリヌクレオチドが、異なる標的遺伝子に機能的に連結している、実施形態４０に記載の組換えベクター。
４３．標的遺伝子が、同じ代謝経路の一部である、実施形態４１に記載の組換えベクター。
４４．標的遺伝子が、同じ代謝経路の一部ではない、実施形態４２に記載の組換えベクター。
４５．実施形態４０〜４３のいずれか１項に記載の組換えベクターで形質転換された、宿主細胞。
４６．Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、実施形態４４に記載の宿主細胞。
４７．Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、実施形態４６に記載の宿主細胞。
４８．実施形態４４〜４６のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養することを含み、各標的遺伝子の改変が、上方調節、及び下方調節から独立して選択される、１つ以上の標的遺伝子の発現を改変する方法。
４９．生体分子を生成するのに適した条件下で、実施形態４４〜４７のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養することを含む、生体分子を生成する方法。
５０．前記生体分子が、Ｌ−アミノ酸である、実施形態４８に記載の方法。
【０１６８】
以下の実施例は、例示の目的で限定せずに提供される。
【実施例】
【０１６９】
実施例１：候補プロモーターの同定
以下の手順を使用して、天然のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍプロモーターは、以下の基準：１）構成的プロモーターのラダーを表すこと；及び２）短いＤＮＡ配列、理想的には、１００未満の塩基対によってコードされ得ることの両方を満たした天然のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍプロモーターを同定した。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２においてグローバル遺伝子発現レベルを記述している公開されたデ−タセット（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１３）を検査して、異なる成長条件にわたって恒常的に発現された遺伝子を同定した。発現レベルが、２つの成長条件にわたって一定（０．３３〜３の間の発現比として定義される）のままであった、すなわち、過酸化水素の添加の有り無し両方の最少培地におけるケモスタット成長であった遺伝子は、第１の基準を満たした。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２トランスクリプトームを記述している公開されたデ−タセット（Ｐｆｅｉｆｅｒ−Ｓａｎｃａｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２０１３，１４：８８８）は、コンパクトプロモーターを有する遺伝子、すなわち、６０塩基対コアプロモーター領域と、２６〜４０の長さの塩基対の間の５プライム非翻訳領域とからなる遺伝子を見つけるために検査した。２つのデ−タセットを相互参照して、両方の基準を満たしたプロモーターを同定した。図１を参照されたい。５つ候補プロモーター（配列番号２、３、４、６、及び８）を選択して、さらに評価した。
【０１７０】
実施例２：候補プロモーター活性の評価
候補プロモーター活性を評価するため、蛍光レポーター構築物に基づく一連のプラスミドを設計した。簡単に言えば、各プロモーターを、ｅｙｆｐ、シャトルベクターｐＫ１８ｒｅｐ中の黄色の蛍光タンパク質をコードする遺伝子の前にクローニングした。これらのプラスミドを、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４に形質転換し、分光分析法によるＹＦＰタンパク質の蓄積を測定することによって、プロモーター活性を評価した。
【０１７１】
シャトルベクターｐＫ１８ｒｅｐは、ｐＫ１８ｍｏｂＳａｃＢ（ＡＴＣＣ８７０８７）中のｓａｃＢ遺伝子をｐＢＬ１複製起点（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ０９２０３７．１）と置き換えることによって構築し、Ｅ．  ｃｏｌｉ及びＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの両方で繁殖可能なベクターが得られた。簡単に言えば、プライマーｐＫ１８Ｆ（ＴＣＡＴＧＡＣＣＡＡＡＡＴＣＣＣＴＴＡＡＣＧＴＧ（配列番号９））及びｐＫ１８Ｒ（ＧＣＧＴＡＣＴＣＴＴＣＧＡＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＴＣＴＣ（配列番号１０））を用いて、Ｅ．  ｃｏｌｉ複製起点及びカナマイシン耐性遺伝子ｎｐｔＩＩを含有するｐＫ１８ｍｏｂＳａｃＢの一部をＰＣＲ増幅し、ｐＢＬ１複製起点をコードする合成ＤＮＡをプライマーｐＢＬ１Ｆ（ＧＡＣＣＴＡＡＡＡＴＧＴＧＴＡＡＡＧＧＧＣＡＡＡＧＴＧＴＡＴＡＣａａｃａａｃａａｇａｃｃｃａｔｃａｔａｇｔｔｔｇｃ（配列番号１１））、及びｐＢＬ１Ｒ（ＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡｃａｃａｔｇｃａｇｔｃａｔｇｔｃｇｔｇｃ（配列番号１２））でＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ生成物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で必要に応じて処理し、ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ−５（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で精製し、製造者の指示書に従って、ギブソンアセンブリマスターミックス（ＮＥＢ）によるギブソンアセンブリ方法を用いて組み立てた。製造者の指示書に従って、ギブソンアセンブリ反応をＮＥＢターボコンピテント細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天＋２５μｇ／ｍＬカナマイシン上で選択し、サンガーシークエンシングによって確認した。
【０１７２】
リポーター構築物ｐＫ１８ｒｅｐ−Ｐｓｏｄ−ｅｙｆｐは、ｐＫ１８ｒｅｐの制限消化及びライゲーション、及びｅｙｆｐ遺伝子の上流のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２からスーパーオキシドジスムターゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡ００００３６．３）プロモーターをコ−ドする１９１塩基対のＤＮＡ配列、続いて、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ制限部位が隣接したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２からｓｏｄ終結因子をコードする７７塩基対のＤＮＡ配列からなる合成ＤＮＡ構築物によって構築された。親ベクター及び合成ＤＮＡ挿入をＥｃｏＲＩ−ＨＦ、及びＳａｌＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、得られた生成物をアガロースゲル上で実行した。製造者の指示書に従って、ＤＮＡをゲルから抽出し、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ  Ｇｅｌ  ＤＮＡ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて精製し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）でライゲーションした。製造者の指示書に従って、ライゲーション反応をＮＥＢターボコンピテント細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天＋２５μｇ／ｍＬカナマイシン上で選択し、サンガーシークエンシングによって確認した。
【０１７３】
さらなるプロモーターリポーター構築物は、ｐＫ１８ｒｅｐ−Ｐｓｏｄ−ｅｙｆｐ中のｓｏｄプロモーターを置き換えることによって構築された。ｓｏｄプロモーターを除外するｐＫ１８ｒｅｐ−Ｐｓｏｄ−ｅｙｆｐをプライマーｐＫ１８ｒｅｐＲ（ｇｃｔｔｇｃａｔｇｃｃｔｇｃａｇｇｔｃｇａ（配列番号１３））、及びｙｆｐＦ（ＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣ（配列番号１４））でＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ生成物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理し、ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ−５（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で精製し、製造者の指示書に従って、ギブソンアセンブリマスターミックス（ＮＥＢ）によるギブソンアセンブリ方法を用いて、対象プロモーター＋目的ベクターに対する２５塩基対の相同配列をコードする合成ＤＮＡ構築物と組み立てた。製造者の指示書に従って、ギブソンアセンブリ反応をＮＥＢターボコンピテント細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天＋２５μｇ／ｍＬカナマイシン上で選択し、サンガーシークエンシングによって確認した。
【０１７４】
さらに、強力な構成的プロモーターＰｃｇ０００７（配列番号２）を突然変異誘発のために選択した。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍでは、−１０要素は、プロモーター活性を決定するのに重要な役割を果たすと考えられる（Ｐｆｅｉｆｅｒ−Ｓａｎｃａｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２０１３，１４：８８８）ため、予測されたＰｃ０００７の−１０要素（ＴＡＡＧＡＴ）における６つの位置のうちの４つを無作為化し、予測されたＰｃｇ０００７の−１０要素（ＴＡＡＧＡＴ）における６つの位置のうちの４つを無作為化し、より強力なプロモーター変異体と、減衰したプロモーター変異体（配列番号１、５、及び７）の両方を生成した。このライブラリーは、ｐＫ１８ｒｅｐ−Ｐｃ０００７−ｅｙｆｐをＰｃｇ０００７Ｆｗｄ（ＧＧＡＡＡＣＧＴＣＴＧＴＡＴＣＧＧＡＴＡＡＧＴＡＧ（配列番号１５））及びＰｃ０００７Ｒｅｖ（ＣＴＡＣＴＴＡＴＣＣＧＡＴＡＣＡＧＡＣＧＴＴＴＣＣＡＮＮＮＮＡＣＡＣＧＣＴＴＡＧＧＴＣＣＣＣＡＣＧＴＡＧＴＡＣＣＡ（配列番号１６））でＰＣＲ増幅し、ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理し、製造者の指示書に従って、ギブソンアセンブリマスターミックス（ＮＥＢ）によるギブソンアセンブリ方法を用いて組み立てることによって生成された。製造者の指示書に従って、ギブソンアセンブリ反応をＮＥＢターボコンピテント細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天＋２５μｇ／ｍＬカナマイシン上で選択し、個々のコロニーをサンガーシークエンシングによって特徴付けた。寒天を削り取ることによってコロニーをプールし、精製されたプラスミドＤＮＡをＺｙｐｐｙミニプレップキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて単離した。
【０１７５】
精製されたリポーター構築物プラスミドを、エレクトロポレーションによってＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４に形質転換した（Ｈａｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９０）。形質転換体をＢＨＩ寒天＋２５μｇ／ｍＬカナマイシン上で選択した。形質転換ごとに、複数の単一コロニーを選び、３００μＬのＢＨＩ培地＋２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する９６ミッドウェルブロックの個々のウェルに接種した。１，０００ｒｐｍで撹拌しながら３０℃にて４８時間インキュベーションによって、細胞を飽和に成長させた。インキュベーション後、培養物を３，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、吸引によって培地を除去した。３００μＬのＰＢＳ中の再懸濁によって細胞を１回洗浄し、３，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を吸引し、３００μＬのＰＢＳ中で最終の再懸濁をした。この混合物の２０μＬのアリコートを、１８０μＬのＰＢＳを含有する９６ウェルの全領域が黒の透明底のアッセイプレートに移した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５マイクロプレートリーダーで６００ｎｍでの細胞の光学密度を測定し、５１４ｎｍで励起し、５２７ｎｍでの放射を測定することによって、ＴＥＣＡＮ  Ｍ１０００マイクロプレートリーダーで蛍光を測定した。ウェルごとに、蛍光を光学密度で割ることによって、正規化された蛍光活性を算出した。親プラスミドｐＫ１８ｒｅｐは、陰性対照として作用した。正規化された蛍光活性をリポーター構築物間、及び生物学的複製物間で比較した（図２）。プロモーター活性の数値的な概要を以下の表５に提示する。
【０１７６】
【表５】
2018530991.tif 000015
【０１７７】
実施例３：Ｌ−リジン生合成経路への候補プロモーターの適用
本開示のプロモーターは、宿主細胞中の生体分子の生成のための処理を改善するのに有用である。本開示のプロモーターの適用及び使用の例は、アミノ酸Ｌ−リジンの生成に関する。図３は、Ｌ−リジンの生成のための生合成経路を提示し、中間体を経路から分岐させて、全体のＬ−リジン収率を減少させる遺伝子ｐｃｋ、ｏｄｘ、ｉｃｄ、及びｈｏｍ（例えば、ホモセリン／スレオニンシンターゼ経路）を含む。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＡＴＣＣ１３０３２の記号、遺伝子名、酵素委員会番号（ＥＣ番号）、及びマップ位置を以下の表３に提供する。
【０１７８】
表３に提供される標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１〜８のプロモーターを含む組換えベクターを、酵母菌相同組換えクローニング技術を用いて、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍクローニングベクターにクローニングし、直接繰り返し領域に各プロモーターが隣接しているベクターを組み立て、標的遺伝子座でのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃａｎの相同組換えを提供した。組換え時には、内因性プロモーターは、内因性Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃａｎ遺伝子座におけるそれぞれの標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１〜８のプロモーターによって置き換えられる。プロモーター及び機能的に連結した標的遺伝子を含む種々の標的ベクターは、０．５Ｋｂ、１Ｋｂ、２Ｋｂ、及び５Ｋｂの範囲の相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ）繰り返しアーム長さ範囲を含んだ。各ＤＮＡ挿入は、テンプレートとして、市販供給されるオリゴ、及び上述の宿主株ゲノムＤＮＡを用いて相同領域のＰＣＲ増幅によって生成された。ゲノムに導入されるプロモーターは、オリゴ尾においてコードされる。酵母菌中の相同組換えを用いて、ＰＣＲ断片をベクターバックボーンに組み立てた。
【０１７９】
標準的なヒートショック形質転換技術を用いて、ベクターをまずＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、正しく組み立てられたクローンを同定し、検証する。形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細菌は、組み立てが成功したか試験する。各Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換プレートから４つのコロニーを培養し、ＰＣＲを介して組み立てが正しいか試験する。Ｅ．ｃｏｌｉ宿主中でベクターを増幅し、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換のためのベクターＤＮＡを提供する。
【０１８０】
検証されたクローンは、エレクトロポレーションを介してＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞に形質転換される。形質転換ごとに、ＤＮＡ１μｇ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を、挿入サイズの関数として決定する。コリネゲノム統合は、相同アーム長さの関数として分析される。より短いアームは、効率がより低かった。
【０１８１】
挿入カセットの統合が成功したものとして同定されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの培養を、５％スクロースを含有する培地上で培養し、ｓａｃｂ選択遺伝子のループアウトについてカウンターセレクトした。種々の相同組換え繰り返しアームのスクロース耐性頻度は、アーム長さで著しく変動しない。これらの結果は、ループアウト効率が、０．５ｋｂ〜５ｋｂの相同アーム長さにわたって一定に保たれることを示唆している。
【０１８２】
ループアウト事象をさらに検証するために、スクロース耐性を示すコロニーを培養し、シークエンシングを介して分析した。挿入ゲノム領域のシークエンシングの結果を以下の表６にまとめる。
【０１８３】
【表６】
2018530991.tif 000016
【０１８４】
シークエンシング結果は、ループアウトにおいて１０〜２０％の効率を示す。任意の特定の理論に限定されないが、ループアウトは、挿入配列に依存してもよい。正しい場合であっても、１０〜２０スクロース耐性コロニーのピッキングは、高い成功率につながる。
【０１８５】
統合の際に、組換えベクターは、内因性プロモーター配列を、Ｐｃｇ１８６０（配列番号２）、Ｐｃｇ０００７（配列番号３）、Ｐｃｇ０７５５（配列番号４）、Ｐｃｇ０００７＿ｌｉｂ＿２６５（配列番号５）、Ｐｃｇ３３８１（配列番号６）、Ｐｃｇ００７＿ｌｉｂ＿１１９（配列番号７）、及びＰｃｇ３１２１（配列番号８）からなる群から選択されるプロモーターと置き換える。得られた組換え株のリストを以下の表７に提供する。
【０１８６】
複数の単一コロニー（表７ではＮ）を選択し、接種し、小規模培養として成長させる。試験プロモーターを含む新しく作成された各株を、生成物力価性能を評価するように設計された小規模培養におけるリジン収率について試験する。工業規模培養からの培地を用いて、小規模培養を実施する。生成物力価は、標準比色アッセイによる炭素消耗（すなわち、単一バッチ収率の代表例）で光学的に測定される。簡単に言えば、濃縮アッセイ混合物を調製し、試薬の最終濃度が、１６０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、０．２ｍＭのＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ、０．２Ｕ／ｍＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ、及び０．００５Ｕ／ｍＬのリジンオキシダーゼであるように発酵試料を添加する。反応を完了まで進行し、Ｔｅｃａｎ  Ｍ１０００プレート分光光度計を用いて、５６０ｎｍ波長での光学密度を測定する。
【０１８７】
表７に示すように、Ｌ−リジンの収率は、操作されていない株よりも２４％以上に増加する（例えば、組換え株７０００００７８４０）。他の実施形態では、Ｌ−リジンの収率は、ほぼ９０％減少する（例えば、組換え株７０００００７７３）。表７に提供されるように、ｐｇｉ及びｚｗｆのプロモーターの置換は、Ｌ−リジン生成に対して１０％を超える改善をもたらす。
【０１８８】
とりわけ、Ｌ−リジンの生成は、最も活性なプロモーターの組み込みに単に依存していることはない。図４に示すように、リジン収率は、比較的弱いプロモーター（例えば、１、７×、または４８×の相対プロモーター発現を有するｐｇｉ、または７×の相対プロモーター強度でのｄａｐＢ）によって最大になり、または中間発現（例えば、４５４×の相対プロモーター発現を有するｌｙｓＡ）によって最大になる。場合によっては、相対プロモーター強度が最大になる場合に（例えば、ｐｐｃ）、発現は最大になる。図５で例示されるように、遺伝的経路（図３）における遺伝子の位置は、Ｌ−リジン収率または最適プロモーター強度の相対増加または相対減少を確実に予測しない。例えば、高レベルのｃｇ０９３１の発現は、収率の改善をもたらす一方、より高レベルのｄａｐＤは、収率を全く改善しないかまたは収率の減少をもたらす。
【０１８９】
【表７−１】
2018530991.tif 000017
【表７−２】
2018530991.tif 000018
【表７−３】
2018530991.tif 000019
【表７−４】
2018530991.tif 000020
【０１９０】
実施例４：Ｌ−リジン生合成経路の操作
Ｌ−リジンの収率は、表８に提供されるように、標的遺伝子に対するプロモーターの対をスワッピングすることで修正される。実施例３の構築物を使用して、表８に提供されるように、組換え有機体を調製する。示すように、Ｐｃｇ０００７−ｌｙｓＡとＰｃｇ３１２１−ｐｇｉの組み合わせは、最も高い収率のＬ−リジンをもたらす。
【０１９１】
【表８−１】
2018530991.tif 000021
【表８−２】
2018530991.tif 000022
【０１９２】
本明細書において参照される全ての米国特許、米国特許出願公開広報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、及び非特許刊行物は、本記述と矛盾しない範囲でその全体を参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９３】
上記のことから、本明細書に記載の特定の実施形態は例示の目的のために本明細書に記載されているが、本明細書に記載の精神及び範囲から逸脱することなく種々の修正がなされ得ることが理解されるであろう。したがって、本開示は、添付される特許請求の範囲による場合を除いて限定されない。
【図１】
2018530991.tif 000023
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月23日(2018.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１〜８からなる群から選択されるプロモーターポリヌクレオチド配列を含む、組換え核酸分子。
【請求項２】
前記プロモーターポリヌクレオチド配列が、配列番号１、５、及び７からなる群から選択される、請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項３】
前記プロモーターポリヌクレオチド配列が、配列番号１〜２からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列との強力なプロモーターをコードする、請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項４】
前記プロモーターポリヌクレオチド配列が、配列番号３、４、及び５からなる群から選択される中間プロモーターをコードする、請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項５】
前記プロモーターポリヌクレオチド配列が、配列番号６〜８からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列との弱いプロモーターをコードする、請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項６】
リンカーオリゴヌクレオチドまたはリンカーポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項７】
前記少なくとも１つの異種標的遺伝子が、アミノ酸、有機酸、タンパク質、及びポリマーからなる群から選択される生体分子を生成する生合成経路の成分である遺伝子である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項８】
前記少なくとも１つの異種標的遺伝子が、
京都遺伝子ゲノム百科事典及びゲノム（ＫＥＧＧ）のエントリーＭ０００１６の遺伝子を含むリジン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００５２５の遺伝子を含むリジン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００５２６の遺伝子を含むリジン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００５２７の遺伝子を含むリジン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００３０の遺伝子を含むリジン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００４３３の遺伝子を含むリジン生合成経路；及び
ＫＥＧＧエントリーＭ００３１の遺伝子を含むリジン生合成経路
からなる群から選択される生合成経路のアミノ酸の成分である遺伝子である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換え核酸分子を含む、組換えベクター。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換え核酸分子、または請求項９に記載の組換えベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１１】
コリネバクテリウム属に属する、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
少なくとも１つの異種標的遺伝子に機能的に連結したプロモーターポリヌクレオチドの組み合わせを含む、形質転換された宿主細胞であって、
前記プロモーターポリヌクレオチドの組み合わせが、徐々に増加するレベルのプロモーター活性を有する複数のプロモーターを含む、前記形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】
前記標的遺伝子が、アミノ酸、有機酸、香味料、及び香料、バイオ燃料、タンパク質、及び酵素、ポリマー／モノマー、及び他の生体材料、脂質、核酸、小分子治療薬、タンパク質治療薬、ファインケミカル、及び栄養補助食品から選択される生体分子を生成する生合成経路と関連する、請求項１２に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１４】
前記標的遺伝子が、抗生物質、アルカロイド、テルペノイド、及びポリケチドから選択される二次代謝産物を生成する生合成経路と関連する、請求項１２に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１５】
各プロモーターポリヌクレオチドが、異なる異種標的遺伝子に機能的に連結している、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
少なくとも１つの異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１〜８からなる群から選択されるプロモーターポリヌクレオチド配列を含む、組換え核酸分子。
（項目２）
前記プロモーターポリヌクレオチド配列が、配列番号１、５、及び７からなる群から選択される、項目１に記載の組換え核酸分子。
（項目３）
リンカーオリゴヌクレオチドまたはリンカーポリヌクレオチドをさらに含む、項目１または２に記載の組換え核酸分子。
（項目４）
前記少なくとも１つの異種標的遺伝子が、アミノ酸、有機酸、タンパク質、及びポリマーからなる群から選択される生体分子を生成する生合成経路の成分である遺伝子である、項目１に記載の組換え核酸分子。
（項目５）
前記少なくとも１つの異種標的遺伝子が、
京都遺伝子ゲノム百科事典及びゲノム（ＫＥＧＧ）のエントリーＭ０００１６の遺伝子を含むリジン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００５２５の遺伝子を含むリジン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００５２６の遺伝子を含むリジン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００５２７の遺伝子を含むリジン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００３０の遺伝子を含むリジン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００４３３の遺伝子を含むリジン生合成経路；及び
ＫＥＧＧエントリーＭ００３１の遺伝子を含むリジン生合成経路
からなる群から選択される生合成経路のアミノ酸の成分である遺伝子である、項目４に記載の組換え核酸分子。
（項目６）
配列番号１〜８からなる群から選択される１つ以上の追加のプロモーターポリヌクレオチド配列をさらに含み、各プロモーターが、少なくとも１つの追加の異種遺伝子に機能的に連結している、項目１に記載の組換え核酸分子。
（項目７）
前記組換え核酸分子が単離されている、項目１に記載の組換え核酸分子。
（項目８）
少なくとも１つの異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１〜８からなる群から選択されるプロモーターポリヌクレオチド配列を含む、組換えベクター。
（項目９）
前記プロモーターポリヌクレオチド配列が、配列番号１、５、及び７からなる群から選択される、項目８に記載の組換えベクター。
（項目１０）
前記標的遺伝子が、同じ代謝経路の一部である、項目８または９に記載の組換えベクター。
（項目１１）
前記標的遺伝子が、同じ代謝経路の一部ではない、項目８または９に記載の組換えベクター。
（項目１２）
項目１〜７のいずれか１項に記載の組換え核酸分子、または項目８〜１１のいずれか１項に記載の組換えベクターで形質転換された組換え核酸分子を含む、宿主細胞。
（項目１３）
項目１〜７のいずれか１項に記載の１つ以上の追加の組換え核酸分子、または項目８〜１１のいずれか１項に記載の１つ以上の追加の組換えベクターで形質転換された１つ以上の追加の組換え核酸分子をさらに含む、項目１２に記載の宿主細胞。
（項目１４）
項目１〜７のいずれか１項に記載の１つ以上の追加の組換え核酸分子、または項目８〜１１のいずれか１項に記載の１つ以上の追加の組換えベクターが、異なる異種標的遺伝子に機能的に連結している、項目１３に記載の宿主細胞。
（項目１５）
プロモーターポリヌクレオチド配列の組み合わせを含み、前記プロモーターポリヌクレオチド配列の各々が、異なる異種標的遺伝子に機能的に連結している、項目１２に記載の宿主細胞。
（項目１６）
前記異なる異種標的遺伝子の各々が、同じ代謝経路の一部である、項目１５に記載の宿主細胞。
（項目１７）
前記異なる異種標的遺伝子の各々が、同じ代謝経路の一部ではない、項目１５に記載の宿主細胞。
（項目１８）
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、項目１２〜１７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
（項目１９）
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、項目１８に記載の宿主細胞。
【手続補正書】
【提出日】平成30年4月26日(2018.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018530991000001.app
【国際調査報告】
2018530991.tif 000028
2018530991.tif 000029
2018530991.tif 000030
2018530991.tif 000031
2018530991.tif 000032
2018530991.tif 000033