(57)【要約】本発明は、着床前遺伝子スクリーニングの結果を検証するための方法を提供する。本発明の方法は、コピー数コールを確認するために、誤りを検出するために、サンプルを同定するために、およびコンタミネーション源を認識し、同定するために、上記アッセイから生成される一塩基多型（ＳＮＰ）を利用することによって、一般的ＰＧＳアッセイＦＡＳＴ−ＳｅｑＳの効力を増大させる。本発明の方法は、ＰＧＳ結果の信頼性を増大させ、それによって、胚選択をより正確にし、体外受精の結果を改善する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムサンプル中の推定染色体コピー数を検証するための方法であって、該方法は、
ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳによって増幅されたゲノムサンプルから配列決定リードを得る工程；
該配列決定リードからリードカウントを数える工程；
該リードカウントに基づいて該ゲノムサンプルの推定染色体コピー数を計算する工程；
該配列決定リードによって網羅される領域中のＳＮＰの対立遺伝子割合を得る工程；および
該対立遺伝子割合と該推定染色体コピー数とを比較して、該推定染色体コピー数を検証する工程
を包含する方法。
【請求項２】
前記ゲノムサンプルは、胚から生検される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ゲノムサンプルは、循環セルフリー胎児ＤＮＡ、羊水、絨毛膜絨毛、母体血液中の胎児細胞、栄養膜、臍帯血、腫瘍生検、または循環腫瘍ＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記推定染色体コピー数と一致しない対立遺伝子割合は、該推定染色体コピー数を無効にする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
推定染色体コピー数１は、モノソミーを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
推定染色体コピー数２は、ダイソミーを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
推定染色体コピー数３は、トリソミーを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
対立遺伝子割合は、ゲノム遺伝子座がホモ接合性であることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
対立遺伝子割合は、ゲノム遺伝子座がヘテロ接合性であることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
対立遺伝子割合または対立遺伝子割合セットが１００％であることは、モノソミーを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
対立遺伝子割合または対立遺伝子割合セットが５０％であることは、ダイソミーを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
対立遺伝子割合または対立遺伝子割合セットが１０％〜４０％の間または６０〜９０％の間にあることは、トリソミーまたはテトラソミーを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
二倍性と一致しない対立遺伝子割合と組み合わさった推定染色体コピー数２は、三倍性、半数性、またはイソダイソミー性片親性ダイソミーを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
予測対立遺伝子割合から閾値より大きな量外れる対立遺伝子割合を同定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記閾値は、１０％である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記閾値は、２０％である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
２１トリソミー、１８トリソミー、１３トリソミー、または別の異数性状態を診断する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ゲノムサンプル中の推定染色体コピー数を検証するための方法であって、該方法は、
ゲノムサンプルの推定染色体コピー数を得る工程であって、該コピー数は、ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳ増幅ＤＮＡの配列リードカウントから計算される工程；
該ゲノムサンプル中のＳＮＰの対立遺伝子割合を得る工程であって、該ＳＮＰは、ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳ増幅ＤＮＡから配列決定される工程；
該対立遺伝子割合と該推定染色体コピー数とを比較する工程；および
該推定染色体コピー数が該対立遺伝子割合と一致するか否かを決定する工程、
を包含する方法。
【請求項１９】
前記ゲノムサンプルは、胚から生検される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ゲノムサンプルは、循環セルフリー胎児ＤＮＡ、羊水、絨毛膜絨毛、母体血液中の胎児細胞、栄養膜、臍帯血、腫瘍生検、または循環腫瘍ＤＮＡを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記推定染色体コピー数と一致しない対立遺伝子割合または対立遺伝子割合セットは、該推定染色体コピー数を無効にする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
推定染色体コピー数１は、モノソミーを示す、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
推定染色体コピー数２は、ダイソミーを示す、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
推定染色体コピー数３は、トリソミーを示す、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
対立遺伝子割合は、ゲノム遺伝子座がホモ接合性であることを示す、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
対立遺伝子割合は、ゲノム遺伝子座がヘテロ接合性であることを示す、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
対立遺伝子割合または対立遺伝子割合セットが１００％であることは、モノソミーを示す、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
対立遺伝子割合または対立遺伝子割合セットが５０％であることは、ダイソミーを示す、請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
対立遺伝子割合または対立遺伝子割合セットが１０％〜４０％の間または６０％〜９０％の間にあることは、トリソミーまたはテトラソミーを示す、請求項１８に記載の方法。
【請求項３０】
二倍性と一致しない１または複数の対立遺伝子割合と組み合わさった推定染色体コピー数２は、三倍性、半数性、またはイソダイソミー性片親性ダイソミーを示す、請求項１８に記載の方法。
【請求項３１】
予測対立遺伝子割合から閾値より大きな量外れる対立遺伝子割合を同定する工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項３２】
前記閾値は、１０％である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記閾値は、２０％である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
２１トリソミー、１８トリソミー、１３トリソミー、または別の異数性状態を診断する工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項３５】
２つのゲノムサンプル間の関連度を決定するための方法であって、該方法は、
ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳによって増幅された第１のゲノムサンプルおよび第２のゲノムサンプルから配列リードを得る工程；
該配列リードに基づいて、該サンプルに関する複数のＳＮＰ遺伝子座での遺伝子型コールを決定する工程；
該遺伝子型コールに基づいて、各サンプルに関してＤＮＡフィンガープリントを生成する工程；ならびに
該第１のゲノムサンプルのＤＮＡフィンガープリントと該第２のゲノムサンプルのＤＮＡフィンガープリントとを比較して、該２つのサンプル間の関連度を決定する工程、
を包含する方法。
【請求項３６】
前記第１のゲノムサンプルは、胚からの生検または循環セルフリー胎児ＤＮＡを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＤＮＡフィンガープリントを生成する工程は、
数値スコアを各ＳＮＰ遺伝子座に割り当てる工程；および
該数値スコアを鎖状に繋ぐ工程；
を包含し、
関連度を決定する工程は、
前記ＤＮＡフィンガープリント間の距離計量を計算する工程
を包含する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＤＮＡフィンガープリントする工程は、以下の状態：ヘテロ接合性基準、ヘテロ接合性代替、およびホモ接合性のうちの少なくとも２つを同定する数値スコアを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記計算された距離計量に基づいて系統発生を決定する工程をさらに包含する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
閾値より大きい関連度は、前記サンプルが同一であることを示す、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
閾値未満の関連度は、前記サンプルが異なる供給源に由来することを示す、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１のゲノムサンプルは、胚に由来するＤＮＡを含み、前記第２のゲノムサンプルは、該胚に由来すると推定される胎児から生検される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１のゲノムサンプルは、胚に由来するＤＮＡを含み、前記第２のゲノムサンプルは、きょうだい胚に由来するＤＮＡを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
サンプル中のコンタミネーションを決定するための方法であって、該方法は、
ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳによって増幅されたゲノムサンプルから配列リードを得る工程；
該配列リードに基づいて、該ゲノムサンプルに存在するＳＮＰの特徴を同定する工程；
該特徴と、該ゲノムサンプルに関して予測される特徴とを比較する工程；ならびに
該比較に基づいて、コンタミネーションが起こったか否かを決定する工程、
を包含する方法。
【請求項４５】
前記特徴は、遺伝子型コールを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記特徴は、対立遺伝子割合を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記特徴は、ある量の非ホモ接合性ＳＮＰを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記ゲノムサンプルは、胚からの生検または循環セルフリー胎児ＤＮＡを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記第２の決定する工程は、前記比較が、ＳＮＰの特徴が閾値を超えることを明らかにするか否かに基づく、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記比較に基づいて、コンタミネーション物質のＤＮＡフィンガープリントを決定する工程；および
該ＤＮＡフィンガープリントに基づいて、コンタミネーション源を同定する工程、
をさらに包含する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
前記予測される特徴は、既知の二倍体サンプルの特徴に基づく、請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
染色体コピー数を決定するための方法であって、該方法は、
ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳによって配列決定されたＳＮＰの対立遺伝子割合を得る工程；および
該対立遺伝子割合に基づいて染色体コピー数を決定する工程、
を包含する方法。
【請求項５３】
前記ゲノムサンプルは、胚から生検される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ゲノムサンプルは、循環セルフリー胎児ＤＮＡ、羊水、絨毛膜絨毛、母体血液中の胎児細胞、栄養膜、臍帯血、腫瘍生検、または循環腫瘍ＤＮＡを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
対立遺伝子割合は、ゲノム遺伝子座がホモ接合性であることを示す、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
対立遺伝子割合は、ゲノム遺伝子座がヘテロ接合性であることを示す、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
対立遺伝子割合または対立遺伝子割合セットが１００％であることは、モノソミーを示す、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
対立遺伝子割合または対立遺伝子割合セットが５０％であることは、ダイソミーを示す、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
対立遺伝子割合または対立遺伝子割合セットが１０％〜４０％の間または６０％〜９０％の間にあることは、トリソミーまたはテトラソミーを示す、請求項５２に記載の方法。
【請求項６０】
予測対立遺伝子割合から閾値より大きな量外れる対立遺伝子割合を同定する工程をさらに包含する、請求項５２に記載の方法。
【請求項６１】
前記閾値は、１０％である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記閾値は、２０％である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
２１トリソミー、１８トリソミー、１３トリソミー、または別の異数性状態を診断する工程をさらに包含する、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、2015年1月15日に出願された米国仮特許出願第62/103,802号の利益および優先権を主張する。この出願の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、出生前遺伝子検査、および具体的には、ＳＮＰを使用して、コピー数を検証する、サンプル起源を同定する、またはサンプル中のコンタミネーションを検出することに関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
女性が妊娠しづらい場合、体外受精（ＩＶＦ）に考えが向く場合がある。ＩＶＦは、女性の卵巣から１個もしくはこれより多くの卵子を採り出し、それを受精させ、実験室でそれを成長させ、そして妊娠を望んでいる患者の子宮へとそれを移植することを要する。しかし、ＩＶＦには多くの困難が伴う。成功裡の妊娠は、サイクルのうちのおよそ２９％において達成されるに過ぎず、約２２％のみが、生児出産を生じる。
【０００４】
満期妊娠の見込みを増大させる１つの方法は、着床前遺伝子スクリーニング（ＰＧＳ）を行うことである。ＰＧＳは、胚の染色体コピー数を評価して、異性数の胚、従って、移植の良好な候補でないものを選別排除することを含む。異数性は、染色体の数が半数体数（ヒトでは２３）の正確な倍数ではない状態である。大部分の異数性（例えば、トリソミーおよびモノソミー）は、胎児にとって致死的である。そのほか（例えば、２１トリソミー（ダウン症候群）、１８トリソミー（エドワーズ症候群）、および１３トリソミー（パトウ症候群））は、小児に先天性の欠陥、発育不全、および知的障害を引き起こす。ＰＧＳは、移植から異数性の胚を選別排除することによってそれらの問題を回避することを目的とする。
【０００５】
ＰＧＳの既存の方法は、各染色体上のＤＮＡ配列のリードカウントを分析して、異数性を示すコピー数における差異を検出することを要する。しかし、分析誤りは、疑陽性の異数性コールをもたらし得る。さらに、リードカウントのみでは、ある種の変化したコピー数状態（三倍性、半数性、および片親性ダイソミーを含む）が区別できない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（要旨）
本発明は、着床前遺伝子スクリーニングの結果を検証する方法を提供する。本発明の方法は、コピー数コールを確認するために、誤りを検出するために、サンプルを同定するために、およびコンタミネーション源を認識し、同定するために、上記アッセイから生じる一塩基多型（single-nucleotide  polymorphism；ＳＮＰ）を利用することによってＰＧＳアッセイ、ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳの効力を増大させる。本発明の方法は、ＰＧＳ結果の信頼性を増大させ、それによって、胚選択をより正確にし、体外受精の結果を改善する。
【０００７】
ある実施形態において、本発明は、ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳ法によって捕捉されたＳＮＰを使用して、ゲノムサンプル中の推定染色体コピー数を検証するための方法を提供する。上記ＳＮＰは、種々の遺伝子座にわたる対立遺伝子割合（allele  fraction）を決定するために配列決定される。上記対立遺伝子割合は、ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳ法によって決定された染色体コピー数と比較されて、それらコピー数が妥当であるか否かを決定し得る。例えば、モノソミーを示すコピー数は、特定の染色体上に１または複数のヘテロ接合性ＳＮＰを検出することによって無効にされる。あるいは、ヘテロ接合性の喪失を示す対立遺伝子割合は、二倍性を示すコピー数が実際に半数体であることを証明し得る。種々の他の入れ替え（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）は、以下に記載される。
【０００８】
本発明の他の実施形態において、上記ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳ法において増幅および配列決定されたＳＮＰは、特有のＤＮＡフィンガープリントを生成するために利用され、これはサンプルの同定を助ける。ＤＮＡフィンガープリンティングは、２つの胚がきょうだいであるか否か、２つのサンプルが同じ胚に由来するか否か、および正しい胚が選択されかつ移植されたか否かを決定するために有用である。それはまた、検査の間のサンプルの適切な標識および同定を確認し、それによって、ＩＶＦの結果に影響を及ぼすヒューマンエラーの発生率を低減するために有用である。
【０００９】
別の実施形態において、ＳＮＰは、予測される分布に合わないＳＮＰの対立遺伝子割合または他の特徴をコールアウトすることによって、サンプル中のヒトによるコンタミネーション（ｈｕｍａｎ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）を検出するために使用され得る。サンプルコンタミネーションが起こってしまった場合、上記ＳＮＰの対立遺伝子パターンは、そのコンタミネーションしているサンプルのフィンガープリントを取り出し（ｂａｃｋ  ｏｕｔ）、コンタミネーション源を同定するために使用され得る。
【００１０】
ある実施形態において、染色体コピー数コーリング、ＤＮＡフィンガープリンティング、およびコンタミネーション検出することへの上記ＳＮＰベースのアプローチは、ＰＧＳを超えて他の適用のために使用され得る。本明細書で記載される方法は、がんのスクリーニング、法科学、父子鑑定、遺伝障害のスクリーニング、がん処置のモニタリング、および当該分野で公知であるとおりの多くの他の用途のために有用である。
【００１１】
ある種の局面において、本発明は、ゲノムサンプル中の推定染色体コピー数を検証するための方法を提供する。本方法は、ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳによって増幅されたゲノムサンプルから配列決定リードを得る工程；該配列決定リードからリードカウントを数える工程；該リードカウントに基づいて該ゲノムサンプルの推定染色体コピー数を計算する工程；該配列決定リードによって網羅される領域中のＳＮＰの対立遺伝子割合を得る工程；および該対立遺伝子割合と該推定染色体コピー数とを比較して、該推定染色体コピー数を検証する工程を含む。
【００１２】
本方法の一部の実施形態では、前記ゲノムサンプルは、胚から生検される。一部の実施形態では、前記ゲノムサンプルは、循環セルフリー胎児ＤＮＡ、羊水、絨毛膜絨毛、母体血液中の胎児細胞、栄養膜、臍帯血、腫瘍生検、または循環腫瘍ＤＮＡを含む。
【００１３】
ある実施形態では、前記推定染色体コピー数と一致しない対立遺伝子割合は、該推定染色体コピー数を無効にする。推定染色体コピー数１は、モノソミーを示し得る；推定染色体コピー数２は、ダイソミーを示し得る；および推定染色体コピー数３は、トリソミーを示し得る。一部の実施形態では、対立遺伝子割合は、ゲノム遺伝子座がホモ接合性であること、またはゲノム遺伝子座がヘテロ接合性であることを示し得る。対立遺伝子割合または対立遺伝子割合セットが１００％であることは、モノソミーを示し得、一方、対立遺伝子割合または対立遺伝子割合セットが５０％であることは、ダイソミーを示し得る。対立遺伝子割合または対立遺伝子割合セットが１０％〜４０％の間または６０〜９０％の間にあることは、トリソミーまたはテトラソミーを示し得る。二倍性と一致しない対立遺伝子割合と組み合わさった推定染色体コピー数２は、三倍性、半数性、またはイソダイソミー性片親性ダイソミーを示し得る。
【００１４】
一部の実施形態では、本方法は、予測対立遺伝子割合から閾値より大きな量外れる対立遺伝子割合を同定する工程をさらに含む。前記閾値は、例えば、１０％または２０％であり得る。ある実施形態では、本方法は、２１トリソミー、１８トリソミー、１３トリソミー、または別の異数性状態を診断する工程をさらに含み得る。
【００１５】
本発明の他の局面では、ゲノムサンプル中の推定染色体コピー数を検証するための方法が提供される。本方法は、ゲノムサンプルの推定染色体コピー数を得る工程であって、該コピー数は、ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳ増幅ＤＮＡの配列リードカウントから計算される工程；該ゲノムサンプル中のＳＮＰの対立遺伝子割合を得る工程であって、該ＳＮＰは、ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳ増幅ＤＮＡから配列決定される工程；該対立遺伝子割合と該推定染色体コピー数とを比較する工程；および該推定染色体コピー数が該対立遺伝子割合と一致するか否かを決定する工程、を含む。
【００１６】
特定の実施形態では、前記ゲノムサンプルは、胚から生検される。前記ゲノムサンプルは、循環セルフリー胎児ＤＮＡ、羊水、絨毛膜絨毛、母体血液中の胎児細胞、栄養膜、臍帯血、腫瘍生検、または循環腫瘍ＤＮＡを含み得る。
【００１７】
ある実施形態では、前記推定染色体コピー数と一致しない対立遺伝子割合は、該推定染色体コピー数を無効にする。推定染色体コピー数１は、モノソミーを示し得る；推定染色体コピー数２は、ダイソミーを示し得る；および推定染色体コピー数３は、トリソミーを示し得る。ある実施形態では、対立遺伝子割合は、ゲノム遺伝子座がホモ接合性であること、またはゲノム遺伝子座がヘテロ接合性であることを示し得る。対立遺伝子割合または対立遺伝子割合セットが１００％であることは、モノソミーを示し得、一方、対立遺伝子割合または対立遺伝子割合セットが５０％であることは、ダイソミーを示し得る。対立遺伝子割合または対立遺伝子割合セットが１０％〜４０％の間または６０％〜９０％の間にあることは、トリソミーまたはテトラソミーを示し得る。二倍性と一致しない対立遺伝子割合と組み合わさった推定染色体コピー数２は、三倍性、半数性、またはイソダイソミー性片親性ダイソミーを示し得る。
【００１８】
一部の実施形態では、本方法は、予測対立遺伝子割合から閾値より大きな量外れる対立遺伝子割合を同定する工程をさらに含む。前記閾値は、例えば、１０％または２０％であり得る。ある実施形態では、本方法は、２１トリソミー、１８トリソミー、１３トリソミー、または別の異数性状態を診断する工程を含み得る。
【００１９】
他の局面では、本発明は、２つのゲノムサンプル間の関連度を決定するための方法を提供する。本方法は、ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳによって増幅された第１のゲノムサンプルおよび第２のゲノムサンプルから配列リードを得る工程；該配列リードに基づいて、該サンプルに関する複数のＳＮＰ遺伝子座での遺伝子型コールを決定する工程；該遺伝子型コールに基づいて、各サンプルに関してＤＮＡフィンガープリントを生成する工程；ならびに該第１のゲノムサンプルのＤＮＡフィンガープリントと該第２のゲノムサンプルのＤＮＡフィンガープリントとを比較して、該２つのサンプル間の関連度を決定する工程、を含む。ある実施形態では、前記第１のゲノムサンプルは、胚からの生検または循環セルフリー胎児ＤＮＡを含む。
【００２０】
本方法の一部の実施形態では、ＤＮＡフィンガープリントを生成する工程は、数値スコアを各ＳＮＰ遺伝子座に割り当てる工程；および該数値スコアを鎖状に繋ぐ工程；を含み、関連度を決定する工程は、前記ＤＮＡフィンガープリント間の距離計量を計算する工程を含む。ＤＮＡフィンガープリントする工程は、以下の状態：ヘテロ接合性基準、ヘテロ接合性代替、およびホモ接合性のうちの少なくとも２つを同定する数値スコアを含む。本方法は、前記計算された距離計量に基づいて系統発生を決定する工程をさらに含み得る。閾値より大きい関連度は、前記サンプルが同一であることを示し得、一方、閾値未満の関連度は、前記サンプルが異なる供給源に由来することを示し得る。ある実施形態では、前記第１のゲノムサンプルは、胚に由来するＤＮＡを含み、前記第２のゲノムサンプルは、該胚に由来すると推定される胎児から生検される。他の実施形態では、前記第１のゲノムサンプルは、胚に由来するＤＮＡを含み、前記第２のゲノムサンプルは、きょうだい胚に由来するＤＮＡを含む。
【００２１】
本発明の別の局面は、サンプル中のコンタミネーションを決定するための方法を提供する。本方法は、ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳによって増幅されたゲノムサンプルから配列リードを得る工程；該配列リードに基づいて、該ゲノムサンプルに存在するＳＮＰの特徴を同定する工程；該特徴と、該ゲノムサンプルに関して予測される特徴とを比較する工程；ならびに該比較に基づいて、コンタミネーションが起こったか否かを決定する工程、を含む。
【００２２】
ある実施形態では、前記特徴は、遺伝子型コール、対立遺伝子割合またはある量の非ホモ接合性ＳＮＰを含む。前記ゲノムサンプルは、胚からの生検または循環セルフリー胎児ＤＮＡを含み得る。本方法の特定の実施形態では、前記第２の決定する工程は、前記比較が、ＳＮＰの特徴が閾値を超えることを明らかにするか否かに基づく。前記予測される特徴は、既知の二倍体サンプルの特徴に基づき得る。
【００２３】
本方法は、前記比較に基づいて、コンタミネーション物質のＤＮＡフィンガープリントを決定する工程；および該ＤＮＡフィンガープリントに基づいて、コンタミネーション源を同定する工程、をさらに含み得る。
【００２４】
他の局面では、本発明は、染色体コピー数を決定するための方法を提供する。本方法は、ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳによって配列決定されたＳＮＰの対立遺伝子割合を得る工程；および該対立遺伝子割合に基づいて染色体コピー数を決定する工程、を含む。
【００２５】
本方法の一部の実施形態では、前記ゲノムサンプルは、胚から生検される。一部の実施形態では、前記ゲノムサンプルは、循環セルフリー胎児ＤＮＡ、羊水、絨毛膜絨毛、母体血液中の胎児細胞、栄養膜、臍帯血、腫瘍生検、または循環腫瘍ＤＮＡを含む。
【００２６】
ある実施形態では、対立遺伝子割合は、ゲノム遺伝子座がホモ接合性であること、またはゲノム遺伝子座がヘテロ接合性であることを示し得る。対立遺伝子割合または対立遺伝子割合セットが１００％であることは、モノソミーを示し得、一方、対立遺伝子割合または対立遺伝子割合セットが５０％であることは、ダイソミーを示し得る。対立遺伝子割合または対立遺伝子割合セットが１０％〜４０％の間または６０％〜９０％の間にあることは、トリソミーまたはテトラソミーを示し得る。
【００２７】
一部の実施形態では、本方法は、予測対立遺伝子割合から閾値より大きな量外れる対立遺伝子割合を同定する工程をさらに含む。前記閾値は、例えば、１０％または２０％であり得る。ある実施形態では、本方法は、２１トリソミー、１８トリソミー、１３トリソミー、または別の異数性状態を診断する工程をさらに含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、コピー数コールを作製し、誤りを検出するための方法のフローチャートを示す。
【００２９】
【図２】図２は、ＤＮＡフィンガープリンティングのための方法のフローチャートを示す。
【００３０】
【図３】図３は、コンタミネーションを検出するための方法のフローチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（詳細な説明）
本開示は、一般に、着床前遺伝子スクリーニング（ＰＧＳ）の結果を検証することに関する。ＰＧＳおよび複数の他の遺伝子検査（例えば、がん腫瘍配列決定および出生前スクリーニング）に共通する１つの鍵となる目的は、各染色体のコピー数を正確に決定することである。染色体コピー数のこのような正確なコーリングは、異数性の同定、および半数体染色体カウントの予測外の整数倍数の存在の両方を可能にするはずである。異数性のタイプとしては、モノソミー（染色体１コピー）、トリソミー（染色体３コピー）、およびテトラソミー（染色体４コピー）が挙げられ、半数体染色体カウントの予測外の整数倍数の一般例としては、三倍性（染色体完全３セット）、テトラソミー（染色体完全４セット）、半数性（染色体１セット）、およびイソダイソミー性片親性ダイソミー（両方が片親に由来する染色体２セット）が挙げられる。
【００３２】
当該分野で公知のＰＧＳの方法（例えば、ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳ）は、染色体異数性および他の染色体カウント異常性を検出するために有用である。しかし、それらの方法はなお、誤り（偽陽性および偽陰性）、ならびにサンプルのコンタミネーションを受けやすい。
【００３３】
インビトロで成長させた胚から、または妊婦から得られた循環セルフリー胎児ＤＮＡ（ｃｃｆｆＤＮＡ）から配列決定される一塩基多型（ＳＮＰ）は、例えば、異数性、他の染色体カウント異常、およびコンタミネーションについての洞察を提供するために使用され得る。本発明とともに使用するＳＮＰは、大規模並行配列決定技術（例えば、ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳ）によって捕捉されたにＤＮＡに由来し得る。
【００３４】
上記ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳ法は、サンプル中の全染色体に由来するフラグメントを１つのプライマー対で捕捉することを要する。１つのプライマー対を使用することは、ＰＧＳプロセスを合理化する。以前の技術は、全ゲノムライブラリーの調製を要し、これには、多くの複雑かつ技術的に困難な工程を要した（全ゲノム増幅、ＤＮＡフラグメント化、末端修復、５’−リン酸化、３’末端への末端ｄＡヌクレオチドの付加、アダプターへのライゲーション、ＰＣＲ増幅、いくつかの精製工程、配列決定、および染色体コピー数コーリングが挙げられる）。ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳは、１つのプライマー対、および全ゲノムではなく、少ないとはいえ有効な数の評価されるべきＤＮＡフラグメントを使用することによって、それらの工程のうちの多くを回避する。国際特許出願公開番号ＷＯ  ２０１３１４８４９６；およびＫｉｎｄｅら，  ２０１２，  “ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳ：  Ａ  Ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ  ｂｙ  Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，”  ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ７（７）：ｅ４１１６２（その全体は、本明細書に参考として援用される）を参照のこと。
【００３５】
ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳ法によって捕捉され、配列決定された一塩基多型（ＳＮＰ）は、ＰＧＳの多くの適用のために使用され得る。本開示は、コピー数コーリングおよび誤りの検出、ＤＮＡフィンガープリンティング、ならびにヒトによるコンタミネーションの検出を含む、配列決定されたＳＮＰの用途を提供する。当業者によって理解されるように、本明細書で記載されるＳＮＰベースのアプローチは、ＰＧＳを超えて多くの他の遺伝子スクリーニング適用のために使用され得る。本明細書で記載される方法は、がんスクリーニング、法科学、父子鑑定、遺伝障害のスクリーニング、がん処置のモニタリングなどのために有用である。
【００３６】
ａ．コピー数コーリングおよび誤りの検出
ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳは、目的の染色体にわたる配列リードから得られる染色体コピー数を使用して、異数性を検出する。しかし、配列リードのみを使用しても、偽陽性の異数性コールを（特に、モノソミー、トリソミー、およびテトラソミーについて）生じる分析の誤り、および他の染色体カウント異常（例えば、三倍性、半数性、および片親性ダイソミー）に関するあいまいな結果をもたらし得る。
【００３７】
例えば、変数配列リード深度または他の分析不規則性は、特定の染色体が、サンプル中の他の染色体の配列リードと比較されるときに１コピーのみを有するということをリードカウントデータが示す場合に、モノソミーの誤ったコールに寄与し得る。リードカウントのみを使用すると、不正確になりやすい。しかし、本開示によれば、モノソミーの結果は、問題の染色体のＳＮＰをアッセイすることによって確認され得る。
【００３８】
図１は、推定染色体コピー数コールを検証するための方法１００を示す。この方法１００は、ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳによって増幅されたゲノムサンプルから配列リードを得る第１の工程１０５を含む。そのサンプルは、胚性の組織、ｃｃｆｆＤＮＡ、絨毛膜絨毛組織、羊水、母体血液中の胎児細胞、栄養膜、臍帯血、または出生前診断での使用に関して当該分野で公知の任意の他のサンプルタイプを含み得る。このサンプルはまた、腫瘍ＤＮＡまたは循環腫瘍ＤＮＡを含み得る。第２の工程１０９は、上記配列リードからリードカウントを数える（enumerate）工程を含む。次いで、工程１１３では、推定染色体コピー数が、上記リードカウントに基づいて計算される。必要に応じて、本発明の方法を実施する当業者は、ゲノムサンプルに関する推定染色体コピー数を得ることによって開始し得る。ここで上記コピー数は、別の当業者によって行われたＦＡＳＴ−ＳｅｑＳ増幅ＤＮＡの配列リードカウントから計算されている。推定染色体コピー数が一旦得られれば、上記方法は、ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳ配列リードによって捕捉されたＳＮＰに関する対立遺伝子割合を得て、工程１１７において継続する。
【００３９】
対立遺伝子割合（allele  fraction）は、目的の遺伝子座における特定の対立遺伝子の比率である。それは、パーセンテージとして表され得る。例えば、ホモ接合性遺伝子座は、対立遺伝子割合１００％を有するといわれ得るのに対して、ヘテロ接合性である二倍体遺伝子座は、対立遺伝子割合５０％を有するといわれ得る。対立遺伝子割合を測定する場合、いくらかの誤差範囲が予測され得るので、例えば、測定された対立遺伝子割合４７％は、ヘテロ接合性二倍体遺伝子座となおいわれ得る。しかし、以下でさらに詳細に考察されるように、１００％または５０％から有意に外れる対立遺伝子割合は、異数性を示し得る。
【００４０】
上記対立遺伝子割合および上記推定染色体コピー数は、工程１２１において、推定染色体コピー数を検証するために比較される。どんなタイプの異数性（または正倍数性）が推定染色体コピー数データによって示されるかに依存して、上記検証工程は、この２セットのデータ間で異なる比較計量を調べる工程を含み得る。一般に、観察された対立遺伝子割合が上記推定染色体コピー数と一致しない場合、その結果は、上記推定染色体コピー数を無効にする。
【００４１】
一実施形態において、調査者は、推定染色体コピー数によって示されるモノソミーコール（すなわち、コピー数１）を検証することを望み得る。実際は二倍体である染色体に関して、サンプル中の誤ったモノソミーコールを検出するために、調査者は、上記染色体に沿って非ホモ接合性遺伝子型コールの存在を捜し得る。対立遺伝子割合１００％は、モノソミーと一致するが、任意のゲノム遺伝子座におけるヘテロ接合性ＳＮＰの存在（２つの対立遺伝子の存在）は、少なくとも２というコピー数を明らかにする。コピー数２は、少なくともダイソミーを示す。このような場合に、リードカウントに基づくモノソミーコールは、間違った結果であると判明する。他方で、目的の染色体に沿ったＳＮＰがヘテロ接合性の明らかな喪失を明らかにした場合、上記モノソミーコールは、確認される。
【００４２】
類似の方法を使用して、誤ったトリソミーまたはテトラソミーコールは、同様に検出され得る。リードカウントが２より多くのコピーの染色体（すなわち、トリソミーまたはテトラソミー）を示すサンプルでは、調査者は、その染色体に沿ってヘテロ接合性ＳＮＰコールの対立遺伝子割合を調べ得る。誤ったコールの場合には、ヘテロ接合性コール対立遺伝子割合は、二倍体サンプルに関する予測、すなわち、各対立遺伝子に関しておよそ５０％とは統計的に異ならない。各ヘテロ接合性対立遺伝子がおよそ５０％存在することは、上記染色体が事実２コピー存在することを示す。許容閾値が使用され得、ここで対立遺伝子頻度が例えば、４５％〜５５％の間である場合、それが２コピー存在すると考えられる。あるいは、上記許容閾値は、４０％〜６０％であり得る。
【００４３】
しかし、ヘテロ接合性コールの対立遺伝子割合が、二倍体の場合に関して予測されるものから有意にシフトしていた場合に、そのことは、リードカウントに基づいて上昇したコピー数の測定値の存在下で観察されるのであれば、真のトリソミーまたはテトラソミーを示す。上記対立遺伝子頻度が許容閾値の外に入るのであれば（例えば、一方の対立遺伝子が２５％で存在し、他方が７５％で存在するのであれば）、上記調査者は、異数性が存在すると結論づけ得る。
【００４４】
三倍性、半数性、およびイソダイソミー性片親性ダイソミーは、上記調査者に対して異なる分析問題を示す。リードカウントのみに基づけば、それらの異常性は、二倍体であるようである。その理由は、リードカウントが、アウトライアーを同定するために染色体間のリードの相対数に依拠するからである。しかし、ＳＮＰを使用すると、上記サンプルの正しい倍数性レベルが明らかになり得る。例えば、リードカウントが全ての常染色体に関して推定コピー数２を生じるサンプル中で、三倍性（すなわち、染色体の半数体数の３倍、すなわち３ｎを有する）を検出するためには、上記サンプルは、ヘテロ接合性ＳＮＰコールの数、および別個に、サンプル中の上記ヘテロ接合性ＳＮＰコールの対立遺伝子割合についてアッセイされ得る。ヘテロ接合性ＳＮＰの数が二倍体サンプルに関する予測とは異なるか、またはヘテロ接合性ＳＮＰコールの対立遺伝子割合分布が予測対立遺伝子割合分布とは異なる（すなわち、５０％とは有意に異なる）かのいずれかの場合、上記リードベースのコピー数測定値がたとえ二倍性を示すとしても、上記サンプルが三倍体であると推論され得る。
【００４５】
同様に、リードカウント単独では二倍体であると決定されたサンプル中で、半数性またはイソダイソミー性片親性ダイソミー（isodisomic  uniparental  disomy；ｉＵＰＤ）を検出し得る。コール可能な既知のＳＮＰ遺伝子座のうちの複数の（または好ましくは全ての）遺伝子型が評価され得る。上記複数のＳＮＰ部位の遺伝子型がヘテロ接合性の喪失を示す場合、上記リードベースのコピー数測定値がたとえ二倍性を示すとしても、サンプル中の半数性またはｉＵＰＤの存在を推論し得る。
【００４６】
上記の方法を使用すると、ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳ単独で決定されたコピー数を確認できるかまたは誤りを証明することができる。上記方法は、染色体異常（例えば、２１トリソミー、１８トリソミー、および１３トリソミー）のより有効な同定を可能にする。
【００４７】
ｂ．ＤＮＡフィンガープリンティング
ＤＮＡフィンガープリンティング（ＤＮＡプロファイリングまたはＤＮＡタイピングとしても公知）は、当該分野で周知の技術であり、これは、個体のＤＮＡを使用して個体を同定するために使用され得る。ＤＮＡフィンガープリンティングは、個々人によって異なる非常に変わりやすい配列に依拠する。
【００４８】
本開示は、ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳ増幅ＤＮＡからのＳＮＰの遺伝子型コールを使用して、ＤＮＡフィンガープリントを生成して、サンプルを同定する方法を提供する。上記方法は、上記サンプルに対してＦＡＳＴ−ＳｅｑＳを行う工程および複数の遺伝子座にわたって遺伝子型コールを生成する工程を要する。図２に示されるように、ＤＮＡフィンガープリンティングを使用して関連度を決定するための方法２００は、ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳによって増幅された２つのゲノムサンプルから配列リードを得る第１の工程２０５を含み得る。サンプルは、胚生検、ｃｃｆｆＤＮＡ、羊水などを含み得る。あるいは、サンプルは、行われる特定の比較に依存して、当業者によって理解されるとおり、唾液、血液、口腔粘膜（buccal）スワブ、または任意の他の体の細胞サンプルを含み得る。次に、工程２０９では、遺伝子型コールが、配列リードに基づいて、サンプルに関する複数のＳＮＰ遺伝子座において決定される。ＤＮＡフィンガープリントは、工程２１３において、上記遺伝子型コールに基づいて各サンプルに関して生成される。上記遺伝子型コールは、デジタル識別子または数値スコアに割り当てられ得、記号列へと鎖状に繋がれ得る。例えば、上記デジタル識別子は、ホモ接合性基準（homozygous  reference）、ホモ接合性代替（homozygous  alternate）、およびヘテロ接合性遺伝子型に相当する、それぞれ、０、１、および２であり得る。あるいは、上記デジタル識別子は、０は、基準対立遺伝子のみの存在を示し、１は、非基準対立遺伝子（ホモ接合性非基準またはヘテロ接合性）の存在を示すような様式で要約され得る。
【００４９】
遺伝子型コールまたはデジタル識別子の鎖状に繋がれた記号列（concatenated  string）は、ＤＮＡフィンガープリントを構成し、工程２１７において示されるように、別のサンプルのＤＮＡフィンガープリントと比較されて、関連度または同一性を決定し得る。サンプルは、それらがある閾値の関連度を満たす場合に同一であると決定され得る。関連度を決定するための方法は、当該分野で公知であり、関連度を推論するために、距離計量（distance  metric）に基づいてクラスター化（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）を行うことを含み得る。
【００５０】
サンプルに割り当てられたフィンガープリントは、他のサンプルに由来するフィンガープリントとの比較の基礎として働いて、それらの間の関連度を決定し得る。このフィンガープリントは、２つのサンプルが関連しないか、関連性があるか、または同一であるかを決定し得る。ＰＧＳの状況では、それらフィンガープリントは、サンプル取り違えが起こったことを決定するかまたは除外するために使用され得る。サンプル取り違えは、ＩＶＦを行うクリニック、または生検した組織を分析する研究所のいずれかによって、ヒューマンエラーに起因して起こり得る。
【００５１】
ＤＮＡフィンガープリンティングはまた、父系を確認することを含め、サンプル間の系統関係を決定するために使用され得る。これらのサンプルは、ＰＧＳのための胚生検であり得るか、または他のサンプルタイプ（例えば、母体血液中のｃｃｆｆＤＮＡ、同種異系レシピエントにおけるドナーＤＮＡ、先祖もしくは血縁について知ることを要求している個体に由来する血液もしくは唾液サンプル、および法医学適用のための生物学的サンプル）であり得る。
【００５２】
サンプル取り違えがＰＧＳの間に起こったか否かを決定する場合、所定の患者に由来する全ての胚は、きょうだい間での関連度に等しい関連度を示すはずである。類似の関連度のレベルを示さないこのような患者に由来する任意の胚は、従って、取り違えとして同定され得る。同様に、生物学的液体または組織のサンプルが、母親から得られる場合、ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳは、その母親のフィンガープリントを決定するためにそのサンプルに対して行われ得る。この情報を使用して、彼女のサンプルに由来するフィンガープリントに対するそれらの関連度を決定することによって、所定のＩＶＦ手順から全ての胚の全体として誤った表示（gross  mislabeling）を同定することが可能である。
【００５３】
さらに、移植前に検査した胚のＦＡＳＴ−ＳｅｑＳフィンガープリントと、胎児、小児、または胚におそらく由来する妊娠による生成物のフィンガープリントとを比較することは、可能である。そのようにして、選択された胚が実際に移植された胚であるかを担保するためにチェックし得る。この手順は、２つの胚サンプルのＤＮＡフィンガープリントを互いに比較するのではなく、胚のフィンガープリントを、代替のサンプルタイプのフィンガープリントと比較することを除いて、そのフィンガープリントは、正しい胚が実際に利用された場合に同一であるという見込みをもって上記と同じ様式で行われる。
【００５４】
ｃ．ヒトによるコンタミネーションの検出
ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳ法によって分析されるサンプルのヒトによるコンタミネーションはまた、ＳＮＰを使用して同定され得る。当業者によって認識されるように、ホモ接合性およびヘテロ接合性のコールの対立遺伝子割合は、特定の予測された分布に一致するはずである。任意の所定のサンプルに関する対立遺伝子割合の分布がその予測から外れる場合、サンプルコンタミネーションが起こったと推論され得る。各遺伝子座に関する特定のシフトに基づいて、そのコンタミネーションしているサンプルの実際のフィンガープリントを取り消すことが可能ですらあり得る。よって、そのコンタミネーション源を同定し得る。
【００５５】
さらに、ヘテロ接合性ＳＮＰの数は、コンタミネーションが存在するか否かを評価するために使用され得る。ヘテロ接合性遺伝子座の数が、サンプルの割に特に大きい場合、複数のサンプルが、同時に増幅されている可能性もある。ヘテロ接合性遺伝子座の数は、コンタミネーションがないと知られているサンプルに対して経験的に観察される数と比較した場合、大きいと見做される。
【００５６】
図３は、本開示に従って、サンプル中のコンタミネーションを検出するための方法３００を示す。上記方法３００は、ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳ技術によって増幅されるゲノムサンプルから配列リードを得る第１の工程３０５を含む。上記サンプルは、胚性の組織、ｃｃｆｆＤＮＡ、絨毛膜絨毛組織、羊水、母体血液中の胎児細胞、栄養膜、臍帯血、または出生前診断での使用に関して当該分野で公知の任意の他のサンプルタイプを含み得る。上記サンプルはまた、腫瘍ＤＮＡまたは循環腫瘍ＤＮＡを含み得る。次に、工程３０９において、ゲノムサンプル中のＳＮＰの特徴は、配列リードから同定される。その特徴は、複数のＳＮＰ遺伝子座にわたる遺伝子型コールであり得る。その特徴はまた、１もしくはこれより多くのＳＮＰ遺伝子座における対立遺伝子割合であり得る。あるいは、その特徴は、上記サンプル中の非ホモ接合性ＳＮＰの量であり得る。いくつかの実施形態において、それら特徴のうちの１つのみが使用される。他の実施形態において、複数が使用される。複数の特徴を使用すると、結果の信頼性が増大し得る。当該分野で公知の他の類似の特徴がまた、使用され得る。
【００５７】
方法３００は、工程３０９において同定された特徴と、コンタミネーションされていないゲノムサンプルに関して予測される特徴とを比較する工程３１３を含む。例えば、方法３００の実施者は、既知の二倍体サンプルまたは二倍体サンプルのセットに関して予測される遺伝子型コールとの比較を行い得る。その予測される特徴は、工程３０９において同定された上記の特徴のうちのいずれかであり得る。その比較は、工程３１３において、上記サンプルがアウトライアーであり、従って、コンタミネーションが起こったか否かを決定する一助となる。その決定は、ＳＮＰにおいて測定された特徴がある閾値を超えることを上記比較が示すか否かに基づき得る。
【００５８】
必要に応じて、サンプルがアウトライアーであると決定される場合、上記方法３００は、各ＳＮＰまたは他の多型遺伝子座に関する予測から離れるシフトの方向に基づいてその遺伝子型を「取り出す」ことによって、コンタミネーション部分のフィンガープリントを導き出す工程を含み得る。
【００５９】
（援用の表示）
他の文書（例えば、特許、特許出願、特許公報、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツ）への参照および引用は、本開示全体を通じて行われてきた。全てのこのような文書は、それらの全体において全ての目的のために本明細書に参考として援用される。
【００６０】
（均等物）
本発明の種々の改変およびその多くのさらなる実施形態は、本明細書で示され、記載されるものに加えて、本明細書で引用される科学文献および特許文献への参照を含め、この文書の全内容から当業者に明らかになる。本明細書中の主題は、その種々の実施形態およびその均等物において本発明の実施に適合され得る重要な情報、例示およびガイダンスを含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2018501808.tif 000006
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