(57)【要約】  本発明は、抗ＰＤ−１抗体、ならびにＰＤ−１活性に関連する疾患および状態、例えばがんを処置するためにそれらを使用する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖および軽鎖可変ドメインが、
ａ）それぞれ、配列番号２および３；
ｂ）それぞれ、配列番号４および５；
ｃ）それぞれ、配列番号４および６６；
ｄ）それぞれ、配列番号６および７；
ｅ）それぞれ、配列番号８および９；
ｆ）それぞれ、配列番号１０および１１；
ｇ）それぞれ、配列番号１２および１３；
ｈ）それぞれ、配列番号１４および１５；または
ｉ）それぞれ、配列番号１６および１７
のアミノ酸配列を含む抗体と、ヒトＰＤ−１に対する結合に関して競合するか、または該抗体と同じヒトＰＤ−１のエピトープに結合する、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号１８〜２０のアミノ酸配列を含む抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号２のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｃ）ＶＨが配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が配列番号２および６７のアミノ酸配列を含む抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号２１〜２３のアミノ酸配列を含む抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号３のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｇ）ＶＬが配列番号３のアミノ酸配列を含む抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が配列番号３および６８のアミノ酸配列を含む抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号１８〜２３のアミノ酸配列を含む抗体；
ｊ）ＶＨが配列番号２のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一であり、ＶＬが配列番号３のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｋ）ＶＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号３のアミノ酸配列を含む抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが配列番号２および６７のアミノ酸配列を含み、ＬＣが配列番号３および６８のアミノ酸配列を含む抗体
からなる群から選択される、請求項１に記載の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分。
【請求項３】
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号２４〜２６のアミノ酸配列を含む抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号４のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｃ）ＶＨが配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が配列番号４および６７のアミノ酸配列を含む抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号２７〜２９のアミノ酸配列を含む抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号５または６６のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｇ）ＶＬが配列番号５または６６のアミノ酸配列を含む抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が配列番号５または６６のアミノ酸配列および配列番号６８のアミノ酸配列を含む抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号２４〜２９のアミノ酸配列を含む抗体；
ｊ）ＶＨが配列番号４のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一であり、ＶＬが配列番号５または６６のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｋ）ＶＨが配列番号４のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号５または６６のアミノ酸配列を含む抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが配列番号４および６７のアミノ酸配列を含み、ＬＣが配列番号５または６６および配列番号６８のアミノ酸配列を含む抗体
からなる群から選択される、請求項１に記載の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分。
【請求項４】
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号３０〜３２のアミノ酸配列を含む抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号６のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｃ）ＶＨが配列番号６のアミノ酸配列を含む抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が配列番号６および６７のアミノ酸配列を含む抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号３３〜３５のアミノ酸配列を含む抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号７のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｇ）ＶＬが配列番号７のアミノ酸配列を含む抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が配列番号７および６８のアミノ酸配列を含む抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号３０〜３５のアミノ酸配列を含む抗体；
ｊ）ＶＨが配列番号６のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一であり、ＶＬが配列番号７のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｋ）ＶＨが配列番号６のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号７のアミノ酸配列を含む抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが配列番号６および６７のアミノ酸配列を含み、ＬＣが配列番号７および６８のアミノ酸配列を含む抗体
からなる群から選択される、請求項１に記載の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分。
【請求項５】
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号３６〜３８のアミノ酸配列を含む抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号８のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｃ）ＶＨが配列番号８のアミノ酸配列を含む抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が配列番号８および６７のアミノ酸配列を含む抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号３９〜４１のアミノ酸配列を含む抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号９のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｇ）ＶＬが配列番号９のアミノ酸配列を含む抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が配列番号９および６８のアミノ酸配列を含む抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号３６〜４１のアミノ酸配列を含む抗体；
ｊ）ＶＨが配列番号８のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一であり、ＶＬが配列番号９のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｋ）ＶＨが配列番号８のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号９のアミノ酸配列を含む抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが配列番号８および６７のアミノ酸配列を含み、ＬＣが配列番号９および６８のアミノ酸配列を含む抗体
からなる群から選択される、請求項１に記載の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分。
【請求項６】
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号４２〜４４のアミノ酸配列を含む抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号１０のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｃ）ＶＨが配列番号１０のアミノ酸配列を含む抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が配列番号１０および６７のアミノ酸配列を含む抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号４５〜４７のアミノ酸配列を含む抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号１１のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｇ）ＶＬが配列番号１１のアミノ酸配列を含む抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が配列番号１１および６８のアミノ酸配列を含む抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号４２〜４７のアミノ酸配列を含む抗体；
ｊ）ＶＨが配列番号１０のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一であり、ＶＬが配列番号１１のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｋ）ＶＨが配列番号１０のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号１１のアミノ酸配列を含む抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが配列番号１０および６７のアミノ酸配列を含み、ＬＣが配列番号１１および６８のアミノ酸配列を含む抗体
からなる群から選択される、請求項１に記載の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分。
【請求項７】
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号４８〜５０のアミノ酸配列を含む抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号１２のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｃ）ＶＨが配列番号１２のアミノ酸配列を含む抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が配列番号１２および６７のアミノ酸配列を含む抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号５１〜５３のアミノ酸配列を含む抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号１３のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｇ）ＶＬが配列番号１３のアミノ酸配列を含む抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が配列番号１３および６８のアミノ酸配列を含む抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号４８〜５３のアミノ酸配列を含む抗体；
ｊ）ＶＨが配列番号１２のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一であり、ＶＬが配列番号１３のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｋ）ＶＨが配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号１３のアミノ酸配列を含む抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが配列番号１２および６７のアミノ酸配列を含み、ＬＣが配列番号１３および６８のアミノ酸配列を含む抗体
からなる群から選択される、請求項１に記載の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分。
【請求項８】
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号５４〜５６のアミノ酸配列を含む抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号１４のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｃ）ＶＨが配列番号１４のアミノ酸配列を含む抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が配列番号１４および６７のアミノ酸配列を含む抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号５７〜５９のアミノ酸配列を含む抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号１５のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｇ）ＶＬが配列番号１５のアミノ酸配列を含む抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が配列番号１５および６８のアミノ酸配列を含む抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号５４〜５９のアミノ酸配列を含む抗体；
ｊ）ＶＨが配列番号１４のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一であり、ＶＬが配列番号１５のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｋ）ＶＨが配列番号１４のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号１５のアミノ酸配列を含む抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが配列番号１４および６７のアミノ酸配列を含み、ＬＣが配列番号１５および６８のアミノ酸配列を含む抗体
からなる群から選択される、請求項１に記載の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分。
【請求項９】
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号６０〜６２のアミノ酸配列を含む抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号１６のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｃ）ＶＨが配列番号１６のアミノ酸配列を含む抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が配列番号１６および６７のアミノ酸配列を含む抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号６３〜６５のアミノ酸配列を含む抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号１７のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｇ）ＶＬが配列番号１７のアミノ酸配列を含む抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が配列番号１７および６８のアミノ酸配列を含む抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号６０〜６５のアミノ酸配列を含む抗体；
ｊ）ＶＨが配列番号１６のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一であり、ＶＬが配列番号１７のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｋ）ＶＨが配列番号１６のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号１７のアミノ酸配列を含む抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが配列番号１６および６７のアミノ酸配列を含み、ＬＣが配列番号１７および６８のアミノ酸配列を含む抗体
からなる群から選択される、請求項１に記載の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分。
【請求項１０】
ａ）それぞれ、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、および２３；
ｂ）それぞれ、配列番号２４、２５、２６、２７、２８、および２９；
ｃ）それぞれ、配列番号３０、３１、３２、３３、３４、および３５；
ｄ）それぞれ、配列番号３６、３７、３８、３９、４０、および４１；
ｅ）それぞれ、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、および４７；
ｆ）それぞれ、配列番号４８、４９、５０、５１、５２、および５３；
ｇ）それぞれ、配列番号５４、５５、５６、５７、５８、および５９；または
ｈ）それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、および６５
のＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３アミノ酸配列を含む、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１１】
ａ）それぞれ、配列番号２および３；
ｂ）それぞれ、配列番号４および５；
ｃ）それぞれ、配列番号４および６６；
ｄ）それぞれ、配列番号６および７；
ｅ）それぞれ、配列番号８および９；
ｆ）それぞれ、配列番号１０および１１；
ｇ）それぞれ、配列番号１２および１３；
ｈ）それぞれ、配列番号１４および１５；または
ｉ）それぞれ、配列番号１６および１７
のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとを含む、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１２】
ａ）それぞれ、配列番号２および３；
ｂ）それぞれ、配列番号４および５；
ｃ）それぞれ、配列番号４および６６；
ｄ）それぞれ、配列番号６および７；
ｅ）それぞれ、配列番号８および９；
ｆ）それぞれ、配列番号１０および１１；
ｇ）それぞれ、配列番号１２および１３；
ｈ）それぞれ、配列番号１４および１５；または
ｉ）それぞれ、配列番号１６および１７
のアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとを含む、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３】
ａ）配列番号２および６７のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）、ならびに配列番号３および６８のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）；
ｂ）配列番号４および６７のアミノ酸配列を含むＨＣ、ならびに配列番号５および６８のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｃ）配列番号４および６７のアミノ酸配列を含むＨＣ、ならびに配列番号６６および６８のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｄ）配列番号６および６７のアミノ酸配列を含むＨＣ、ならびに配列番号７および６８のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｅ）配列番号８および６７のアミノ酸配列を含むＨＣ、ならびに配列番号９および６８のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｆ）配列番号１０および６７のアミノ酸配列を含むＨＣ、ならびに配列番号１１および６８のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｇ）配列番号１２および６７のアミノ酸配列を含むＨＣ、ならびに配列番号１３および６８のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｈ）配列番号１４および６７のアミノ酸配列を含むＨＣ、ならびに配列番号１５および６８のアミノ酸配列を含むＬＣ；または
ｉ）配列番号１６および６７のアミノ酸配列を含むＨＣ、ならびに配列番号１７および６８のアミノ酸配列を含むＬＣと
を含む、抗ＰＤ−１抗体。
【請求項１４】
それぞれ、配列番号１８〜２０および配列番号２１〜２３のアミノ酸配列を含む、Ｈ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３を含む、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１５】
配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１６】
配列番号２および６７のアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号３および６８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗ＰＤ−１抗体。
【請求項１７】
アミノ酸残基Ｋ１３１を含むＰＤ−１上のエピトープに結合する抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１８】
前記エピトープが、ＰＤ−１アミノ酸残基Ｐ１３０およびＡ１３２をさらに含む、請求項１７に記載の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分。
【請求項１９】
前記エピトープが、ＰＤ−１アミノ酸残基Ｖ６４およびＬ１２８をさらに含む、請求項１８に記載の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分。
【請求項２０】
前記エピトープが、ＰＤ−１アミノ酸残基Ｅ１３６をさらに含む、請求項１７に記載の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分。
【請求項２１】
アミノ酸残基Ｖ４４およびＴ１４５を含むＰＤ−１上のエピトープに結合する抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２２】
配列番号１のアミノ酸残基６９〜９０および１２２〜１４０を含むＰＤ−１上のエピトープに結合する、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２３】
前記エピトープが、配列番号１のアミノ酸残基５６〜６４をさらに含む、請求項２２に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項２４】
配列番号１の残基６９〜７５またはその断片を含むＰＤ−１上のエピトープに結合する、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２５】
配列番号１の残基１３６〜１４０またはその断片を含むＰＤ−１上のエピトープに結合する、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２６】
配列番号１の残基６９〜７５またはその断片、および残基１３６〜１４０またはその断片を含むＰＤ−１上のエピトープに結合する、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２７】
ＩｇＧである、請求項１〜１２、１４、１５、および１７〜２６のいずれか一項に記載の抗ＰＤ−１抗体。
【請求項２８】
ＩｇＧ１である、請求項２７に記載の抗ＰＤ−１抗体。
【請求項２９】
Ｆｃ領域に少なくとも１つの突然変異を含む、請求項２８に記載の抗ＰＤ−１抗体。
【請求項３０】
ＩＭＧＴナンバリングスキームに従って符番される、重鎖アミノ酸位置２２８、２３４、および２３５位の１つまたは複数において突然変異を含む、請求項２９に記載の抗ＰＤ−１抗体。
【請求項３１】
２３４および２３５位のアミノ酸残基の１つまたは両方が、Ａｌａに突然変異しており、および／または２２８位のアミノ酸残基がＰｒｏに突然変異している、請求項３０に記載の抗ＰＤ−１抗体。
【請求項３２】
以下の特性：
ａ）７５０ｐＭまたはそれ未満のＫＤでヒトＰＤ−１に結合すること；
ｂ）７ｎＭまたはそれ未満のＫＤでカニクイザルＰＤ−１に結合すること；
ｃ）１ｎＭまたはそれ未満のＫＤでマウスＰＤ−１に結合すること；
ｄ）ラットＰＤ−１に結合しないこと；
ｅ）ＳＥＢ全血アッセイにおいてＩＬ−２分泌を増加させること；
ｆ）一方向性混合リンパ球反応アッセイにおいてＩＦＮ−γ分泌を増加させること；
ｇ）フローサイトメトリー競合アッセイにおいて１０μｇ／ｍｌの濃度でＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を少なくとも６０％阻害すること；
ｈ）バイオレイヤー干渉法による分析によって決定した場合に１０μｇ／ｍｌの濃度でＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のＰＤ−１に対する結合を少なくとも９０％遮断すること；ならびに
ｉ）インビボで腫瘍増殖を阻害すること
のうちの少なくとも１つを有する、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項３４】
化学療法剤、抗新生物剤、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、またはＰＤ−１経路阻害剤をさらに含む、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
請求項１〜３２のいずれか一項の抗ＰＤ−１抗体の、重鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、または軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、またはその両方を含む単離核酸分子。
【請求項３６】
発現制御配列をさらに含む、請求項３５に記載の単離核酸分子を含むベクター。
【請求項３７】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の抗ＰＤ−１抗体の、重鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列と、軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列と、を含む宿主細胞。
【請求項３８】
請求項３７に記載の宿主細胞を提供すること、前記宿主細胞を、抗体または部分の発現にとって適した条件で培養すること、および得られた抗体または部分を単離することを含む、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分を産生する方法。
【請求項３９】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の抗ＰＤ−１抗体の結合特異性と、別の別個の抗体の結合特異性とを有する二特異性結合分子。
【請求項４０】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の抗ＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合部分、請求項３３もしくは３４に記載の医薬組成物、または請求項３９に記載の二特異性結合分子を患者に投与することを含む、それを必要とする前記患者における免疫を増強する方法。
【請求項４１】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の抗ＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合部分、請求項３３もしくは３４に記載の医薬組成物、または請求項３９に記載の二特異性結合分子を前記患者に投与することを含む、患者におけるがんを処置する方法。
【請求項４２】
がんが、皮膚、肺、腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟部組織、造血系、頭頚部、肝臓、膀胱、乳房、胃、子宮、および膵臓からなる群から選択される組織で発生するものである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
がんが、進行もしくは転移性黒色腫、非小細胞肺がん、頭頚部扁平上皮がん、腎細胞癌、またはホジキンリンパ腫からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
化学療法剤、抗新生物剤、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、またはＰＤ−１経路阻害剤を投与することをさらに含む、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
患者における免疫を増強する薬剤を調製するための、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の抗ＰＤ−１抗体もしくは抗原結合部分、請求項３３もしくは３４に記載の医薬組成物、または請求項３９に記載の二特異性結合分子の使用。
【請求項４６】
患者におけるがんを処置する薬剤を調製するための、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の抗ＰＤ−１抗体もしくは抗原結合部分、請求項３３もしくは３４に記載の医薬組成物、または請求項３９に記載の二特異性結合分子の使用。
【請求項４７】
がんが、皮膚、肺、腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟部組織、造血系、頭頚部、肝臓、膀胱、乳房、胃、子宮、および膵臓からなる群から選択される組織で発生するものである、請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
がんが、進行もしくは転移性黒色腫、非小細胞肺がん、頭頚部扁平上皮がん、腎細胞癌、またはホジキンリンパ腫からなる群から選択される、請求項４６に記載の使用。
【請求項４９】
前記薬剤が、化学療法剤、抗新生物剤、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、またはＰＤ−１経路阻害剤をさらに含む、請求項４５〜４８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５０】
それを必要とする患者における免疫の増強に使用するための、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の抗ＰＤ−１抗体もしくは抗原結合部分、請求項３３もしくは３４に記載の医薬組成物、または請求項３９に記載の二特異性結合分子。
【請求項５１】
患者におけるがんの処置に使用するための、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の抗ＰＤ−１抗体もしくは抗原結合部分、請求項３３もしくは３４に記載の医薬組成物、または請求項３９に記載の二特異性結合分子。
【請求項５２】
がんが、皮膚、肺、腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟部組織、造血系、頭頚部、肝臓、膀胱、乳房、胃、子宮、および膵臓からなる群から選択される組織で発生するものである、請求項５１に記載の使用のための、抗体もしくは抗原結合部分、医薬組成物、または二特異性結合分子。
【請求項５３】
がんが、進行もしくは転移性黒色腫、非小細胞肺がん、頭頚部扁平上皮がん、腎細胞癌、またはホジキンリンパ腫からなる群から選択される、請求項５１に記載の使用のための、抗体もしくは抗原結合部分、医薬組成物、または二特異性結合分子。
【請求項５４】
化学療法剤、抗新生物剤、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、またはＰＤ−１経路阻害剤と共に投与される、請求項５０〜５３のいずれか一項に記載の使用のための、抗体もしくは抗原結合部分、医薬組成物、または二特異性結合分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１５年１０月２日に提出された米国特許出願第６２／２３６，３４１号の優先権を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出されており、全体が参照により本明細書に組み込まれている配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩのコピーは、２０１６年９月２８日に作製され、名称は０２２６７５＿ＷＯ０５２＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは６５，０００バイトである。
【背景技術】
【０００３】
ＰＤ−１は、プログラム細胞死タンパク質１およびＣＤ２７９としても知られており、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するアミノ酸２６８個の細胞表面受容体である。ＰＤ−１は、ＣＤ２８Ｔ細胞調節因子ファミリーのメンバーであり、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージにおいて発現される。ＰＤ−１は、リガンドＰＤ−Ｌ１（Ｂ７ホモロクとしても知られる）およびＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣとしても知られる）に結合する。
【０００４】
ＰＤ−１は、その構造が、細胞外ＩｇＶドメイン、膜貫通領域、および２つのリン酸化部位を含む細胞内テールを含む、Ｉ型膜タンパク質である。免疫チェックポイントタンパク質として知られるＰＤ−１は、誘導型免疫調節性受容体として機能し、例えば抗原刺激に対するＴ細胞応答の負の調節において役割を有する。
【０００５】
ＰＤ−Ｌ１は、ＰＤ−１の主なリガンドである。ＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１に結合すると、Ｔ細胞活性を阻害し、サイトカイン産生を低減させ、およびＴ細胞増殖を抑制する。ＰＤ−Ｌ１を発現するがん細胞は、この機構を利用して、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１受容体に対する結合を介してＴ細胞の抗腫瘍活性を不活化することができる。
【０００６】
その免疫応答を調節する役割を考慮して、ＰＤ−１は、がんおよび自己免疫疾患の処置を含む免疫療法の潜在的標的として研究されている。２つの抗ＰＤ−１抗体、すなわちペンブロリズマブおよびニボルマブが、米国および欧州において特定のがんの処置に関して承認されている。
【０００７】
免疫調節剤としてのＰＤ−１の重要な役割を考慮すると、がんおよび免疫系の特定の障害を処置するためにＰＤ−１を標的とする新規の改善された免疫治療薬が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＰＤ−１を標的とする新規組換え抗体ならびにこれらの抗体の１つまたは複数を含む医薬組成物、ならびに患者において免疫を増強するための、および皮膚、肺、腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟部組織、造血系、頭頚部、肝臓、膀胱、乳房、胃、子宮、および膵臓などの組織で発生するがんを処置するための、抗体および医薬組成物の使用を対象とする。抗体処置を含むそのようながんの現在利用可能な処置と比較すると、本発明の抗体は、単独で、または別の免疫チェックポイントタンパク質を標的とする抗体などの別のがん治療薬と併用して、優れた臨床応答を提供しうると企図される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一実施形態において、本発明は、抗体１２８１９．１５３８４、１２７４８．１５３８１、１２７４８．１６１２４、１２８６５．１５３７７、１２８９２．１５３７８、１２７９６．１５３７６、１２７７７．１５３８２、１２７６０．１５３７５、および１３１１２．１５３８０のいずれか１つと、ヒトＰＤ−１に対する結合に関して競合するか、または該抗体と同じヒトＰＤ−１のエピトープに結合する、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００１０】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、抗体１２８１９．１５３８４、１２７４８．１５３８１、１２７４８．１６１２４、１２８６５．１５３７７、１２８９２．１５３７８、１２７９６．１５３７６、１２７７７．１５３８２、１２７６０．１５３７５、または１３１１２．１５３８０のＨ−ＣＤＲ１〜３配列をそれぞれ含む、Ｈ−ＣＤＲ１〜３を含む。
【００１１】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、抗体１２８１９．１５３８４、１２７４８．１５３８１、１２７４８．１６１２４、１２８６５．１５３７７、１２８９２．１５３７８、１２７９６．１５３７６、１２７７７．１５３８２、１２７６０．１５３７５、または１３１１２．１５３８０のＶＨドメインとアミノ酸配列が少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を有する。
【００１２】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、抗体１２８１９．１５３８４、１２７４８．１５３８１、１２７４８．１６１２４、１２８６５．１５３７７、１２８９２．１５３７８、１２７９６．１５３７６、１２７７７．１５３８２、１２７６０．１５３７５、または１３１１２．１５３８０のＶＨアミノ酸配列を含むＶＨを有する。
【００１３】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、抗体１２８１９．１５３８４、１２７４８．１５３８１、１２７４８．１６１２４、１２８６５．１５３７７、１２８９２．１５３７８、１２７９６．１５３７６、１２７７７．１５３８２、１２７６０．１５３７５、または１３１１２．１５３８０のＶＨアミノ酸配列、ならびに配列番号６７の重鎖定常領域アミノ酸配列を含む、重鎖（ＨＣ）を有する。
【００１４】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、抗体１２８１９．１５３８４、１２７４８．１５３８１、１２７４８．１６１２４、１２８６５．１５３７７、１２８９２．１５３７８、１２７９６．１５３７６、１２７７７．１５３８２、１２７６０．１５３７５、または１３１１２．１５３８０のＬ−ＣＤＲ１〜３配列をそれぞれ含むＬ−ＣＤＲ１〜３を含む。
【００１５】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、抗体１２８１９．１５３８４、１２７４８．１５３８１、１２７４８．１６１２４、１２８６５．１５３７７、１２８９２．１５３７８、１２７９６．１５３７６、１２７７７．１５３８２、１２７６０．１５３７５、または１３１１２．１５３８０のＶＬドメインとアミノ酸配列が少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を有する。
【００１６】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、抗体１２８１９．１５３８４、１２７４８．１５３８１、１２７４８．１６１２４、１２８６５．１５３７７、１２８９２．１５３７８、１２７９６．１５３７６、１２７７７．１５３８２、１２７６０．１５３７５、または１３１１２．１５３８０のＶＬアミノ酸配列を含むＶＬを有する。
【００１７】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、抗体１２８１９．１５３８４、１２７４８．１５３８１、１２７４８．１６１２４、１２８６５．１５３７７、１２８９２．１５３７８、１２７９６．１５３７６、１２７７７．１５３８２、１２７６０．１５３７５、または１３１１２．１５３８０のＶＬアミノ酸配列、ならびに配列番号６８の軽鎖定常領域アミノ酸配列を含む、軽鎖（ＬＣ）を有する。
【００１８】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、上記の重鎖配列のいずれかと、上記の軽鎖配列のいずれかとを含む。
【００１９】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、抗体１２８１９．１５３８４、１２７４８．１５３８１、１２７４８．１６１２４、１２８６５．１５３７７、１２８９２．１５３７８、１２７９６．１５３７６、１２７７７．１５３８２、１２７６０．１５３７５、または１３１１２．１５３８０のＨ−ＣＤＲ３およびＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【００２０】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、抗体１２８１９．１５３８４、１２７４８．１５３８１、１２７４８．１６１２４、１２８６５．１５３７７、１２８９２．１５３７８、１２７９６．１５３７６、１２７７７．１５３８２、１２７６０．１５３７５、または１３１１２．１５３８０のＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３アミノ酸配列を含む。
【００２１】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、抗体１２８１９．１５３８４、１２７４８．１５３８１、１２７４８．１６１２４、１２８６５．１５３７７、１２８９２．１５３７８、１２７９６．１５３７６、１２７７７．１５３８２、１２７６０．１５３７５、または１３１１２．１５３８０のＶＨおよびＶＬのそれぞれとアミノ酸配列が少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一であるＶＨおよびＶＬを有する。
【００２２】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、抗体１２８１９．１５３８４、１２７４８．１５３８１、１２７４８．１６１２４、１２８６５．１５３７７、１２８９２．１５３７８、１２７９６．１５３７６、１２７７７．１５３８２、１２７６０．１５３７５、または１３１１２．１５３８０のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列をそれぞれ含むかまたはからなるＶＨおよびＶＬを有する。
【００２３】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、抗体１２８１９．１５３８４、１２７４８．１５３８１、１２７４８．１６１２４、１２８６５．１５３７７、１２８９２．１５３７８、１２７９６．１５３７６、１２７７７．１５３８２、１２７６０．１５３７５、または１３１１２．１５３８０のＨＣおよびＬＣアミノ酸配列をそれぞれ含むかまたはからなるＨＣおよびＬＣを有する。
【００２４】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、（１）抗体１２８１９．１５３８４、１２７４８．１５３８１、１２７４８．１６１２４、１２８６５．１５３７７、１２８９２．１５３７８、１２７９６．１５３７６、１２７７７．１５３８２、１２７６０．１５３７５、および１３１１２．１５３８０からなる群から選択される抗体のＶＨアミノ酸配列、ならびに配列番号６７の重鎖定常領域アミノ酸配列を含むＨＣと、（２）その選択された抗体のＶＬアミノ酸配列、ならびに配列番号６８の軽鎖定常領域アミノ酸配列を含むＬＣと、を有する。
【００２５】
一部の実施形態において、本発明の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分は、
ａ）それぞれ、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、および２３；
ｂ）それぞれ、配列番号２４、２５、２６、２７、２８、および２９；
ｃ）それぞれ、配列番号３０、３１、３２、３３、３４、および３５；
ｄ）それぞれ、配列番号３６、３７、３８、３９、４０、および４１；
ｅ）それぞれ、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、および４７；
ｆ）それぞれ、配列番号４８、４９、５０、５１、５２、および５３；
ｇ）それぞれ、配列番号５４、５５、５６、５７、５８、および５９；または
ｈ）それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、および６５、
のＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３アミノ酸配列を含む。
【００２６】
一部の実施形態において、本発明の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分は、
ａ）それぞれ、配列番号２および３；
ｂ）それぞれ、配列番号４および５；
ｃ）それぞれ、配列番号４および６６；
ｄ）それぞれ、配列番号６および７；
ｅ）それぞれ、配列番号８および９；
ｆ）それぞれ、配列番号１０および１１；
ｇ）それぞれ、配列番号１２および１３；
ｈ）それぞれ、配列番号１４および１５；または
ｉ）それぞれ、配列番号１６および１７、
のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。
【００２７】
一部の実施形態において、本発明の抗ＰＤ−１抗体は、
ａ）配列番号２および６７のアミノ酸配列を含むＨＣ、ならびに配列番号３および６８のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｂ）配列番号４および６７のアミノ酸配列を含むＨＣ、ならびに配列番号５および６８のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｃ）配列番号４および６７のアミノ酸配列を含むＨＣ、ならびに配列番号６６および６８のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｄ）配列番号６および６７のアミノ酸配列を含むＨＣ、ならびに配列番号７および６８のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｅ）配列番号８および６７のアミノ酸配列を含むＨＣ、ならびに配列番号９および６８のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｆ）配列番号１０および６７のアミノ酸配列を含むＨＣ、ならびに配列番号１１および６８のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｇ）配列番号１２および６７のアミノ酸配列を含むＨＣ、ならびに配列番号１３および６８のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｈ）配列番号１４および６７のアミノ酸配列を含むＨＣ、ならびに配列番号１５および６８のアミノ酸配列を含むＬＣ；または
ｉ）配列番号１６および６７のアミノ酸配列を含むＨＣ、ならびに配列番号１７および６８のアミノ酸配列を含むＬＣ
を含む。
【００２８】
一部の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合部分は、それぞれ、配列番号１８〜２０および配列番号２１〜２３のアミノ酸配列を含む、Ｈ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３を含む。ある特定の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、配列番号２および６７のアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号３および６８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００２９】
本発明はまた、アミノ酸残基Ｋ１３１を含むＰＤ−１のエピトープに結合する抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分（例えば、表１、４〜９、および１１〜１４に記載の抗体などの１２８１９および１２８６５抗体）も提供する。一部の実施形態において、エピトープは、アミノ酸残基Ｐ１３０およびＡ１３２をさらに含み、アミノ酸残基Ｖ６４およびＬ１２８をさらに含んでもよい（例えば、１２８１９抗体）。一部の実施形態において、エピトープは、アミノ酸残基Ｅ１３６をさらに含む（例えば、１２８６５抗体）。
【００３０】
本発明はまた、配列番号１のアミノ酸残基Ｖ４４およびＴ１４５を含むＰＤ−１のエピトープに結合する抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分（例えば、表１、４〜７、９、および１１〜１４に記載の１３１１２抗体）も提供する。
【００３１】
特定の実施形態において、抗体または部分は、配列番号１のアミノ酸残基Ｖ６４、Ｌ１２８、Ｐ１３０、Ｋ１３１、およびＡ１３２（例えば、１２８１９抗体）、配列番号１のアミノ酸残基Ｋ１３１およびＥ１３６（例えば、１２８６５抗体）、または配列番号１のアミノ酸残基Ｖ４４およびＴ１４５（例えば、１３１１２抗体）を含むＰＤ−１のエピトープに結合する。
【００３２】
本発明はまた、配列番号１のアミノ酸残基６９〜９０、および１２２〜１４０を含むＰＤ−１のエピトープに結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分（例えば、１２８１９または１２８６５抗体）も提供する。ある特定の実施形態において、モノクローナル抗体または抗原結合部分は、配列番号１のアミノ酸残基５６〜６４、６９〜９０、および１２２〜１４０を含むＰＤ−１のエピトープに結合する（例えば、１２８１９抗体）。ある特定の実施形態において、抗体または部分は、配列番号１のアミノ酸残基６９〜７５（またはその断片）に結合する（例えば、１２８１９または１２８６５抗体）。ある特定の実施形態において、抗体または部分は、配列番号１のアミノ酸残基１３６〜１４０（またはその断片）に結合する（例えば、１２８１９または１２８６５抗体）。一部の実施形態において、抗体または部分は、配列番号１の残基６９〜７５（またはその断片）および残基１３６〜１４０（またはその断片）に結合する（例えば、１２８１９または１２８６５抗体）。
【００３３】
一部の実施形態において、本発明の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分は、以下の特性：
ａ）７５０ｐＭまたはそれ未満のＫＤでヒトＰＤ−１に結合すること；
ｂ）７ｎＭまたはそれ未満のＫＤでカニクイザルＰＤ−１に結合すること；
ｃ）１ｎＭまたはそれ未満のＫＤでマウスＰＤ−１に結合すること；
ｄ）ラットＰＤ−１に結合しないこと；
ｅ）ＳＥＢ全血アッセイにおいてＩＬ−２分泌を増加させること；
ｆ）一方向性混合リンパ球反応アッセイにおいてＩＦＮ−γ分泌を増加させること；
ｇ）フローサイトメトリー競合アッセイにおいて１０μｇ／ｍｌの濃度でＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を少なくとも６０％阻害すること；
ｈ）バイオレイヤー干渉法による分析によって決定した場合に１０μｇ／ｍｌの濃度でＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のＰＤ−１に対する結合を少なくとも９０％遮断すること；ならびに
ｉ）インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で腫瘍増殖を阻害すること、のうちの少なくとも１つを有する。
そのような抗体の例には、１２８１９抗体（特性ａ〜ｉを有する）；１２７４８、１２８９２、および１２７７７抗体（少なくとも特性ａ、ｂ、およびｅ〜ｈを有する）；１２８６５および１２７９６抗体（少なくとも特性ａ、ｂ、ｅ、ｆ、およびｈを有する）、ならびに１２７６０および１３１１２抗体（少なくとも特性ａ、ｂ、ｅ、およびｆを有する）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、本発明の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分は、前記特性の全てを有する。一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分は、少なくとも特性ａ、ｂ、およびｅ〜ｈを有する。一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分は、少なくとも特性、ａ、ｂ、ｅ、ｆおよびｈを有する。一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分は、少なくとも特性ａ、ｂ、ｅ、およびｆを有する。
【００３４】
特に明記しない限り、１２８１９、１２７４８、１２８６５、１２８９２、１２７９６、１２７７７、１２７６０、および１３１１２はそれぞれ、同じ６個のＣＤＲを有し、その１０桁の数値名称のうちの最初の５桁を共有する抗体の群を指す。例えば、１２７４８は、同じ６個のＣＤＲを有する（表２に示すように）抗体変異体１２７４８．１５３８１および１２７４８．１６１２４を含む。各群の抗体は、同じまたは実質的に同じ生物特性を共有すると予想される。
【００３５】
一部の実施形態において、本発明の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分は、ＰＤ−１に対する結合に関してペンブロリズマブまたはニボルマブと競合しない。一部の実施形態において、本発明の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分は、ペンブロリズマブまたはニボルマブと同じエピトープに結合せず、例えば本発明の抗体または部分は、ペンブロリズマブまたはニボルマブが結合しないＰＤ−１上の１つまたは複数の残基に結合する。
【００３６】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の少なくとも１つの抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００３７】
本発明はさらに、本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体の、重鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、またはその両方を含む、単離された核酸分子を提供する。
【００３８】
本発明はまた、発現制御配列をさらに含む、そのような単離核酸分子を含むベクターも提供する。
【００３９】
本発明はまた、本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体の、重鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、またはその両方を含む、宿主細胞も提供する。
【００４０】
本発明はまた、本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体の重鎖またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列と、本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体の軽鎖またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列とを含む宿主細胞を提供すること、前記宿主細胞を、抗体または部分の発現にとって適した条件で培養すること、および得られた抗体または部分を単離することを含む、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分を産生する方法も提供する。
【００４１】
本発明はまた、本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体の結合特異性と、別の抗ＰＤ−１抗体（例えば、本明細書に記載の別の抗ＰＤ−１抗体）または別の免疫チェックポイントタンパク質、がん抗原、もしくはその活性ががんなどの疾患状態を媒介する別の細胞表面分子などの異なるタンパク質を標的とする抗体の結合特異性とを有する、二特異性結合分子も提供する。
【００４２】
本発明はまた、本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合部分、医薬組成物、または二特異性結合分子を患者に投与することを含む、それを必要とする患者（例えば、ヒト患者）における免疫を増強する方法も提供する。
【００４３】
本発明はさらに、本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合部分、医薬組成物、または二特異性結合分子を患者に投与することを含む、患者（例えば、ヒト患者）におけるがんを処置する方法を提供する。一部の実施形態において、がんは、皮膚、肺、腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟部組織、造血系、頭頚部、肝臓、膀胱、乳房、胃、子宮、および膵臓からなる群から選択される組織で発生するものである。がんは、例えば進行もしくは転移性黒色腫、非小細胞肺がん、頭頚部扁平上皮がん、腎細胞癌、またはホジキンリンパ腫でありうる。一部の実施形態において、方法は、化学療法剤、抗新生物剤、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、またはＰＤ−１経路阻害剤を投与することをさらに含む。
【００４４】
本発明はさらに、上記の処置において使用するための本発明の抗体または抗原結合部分、ならびに上記の処置、すなわち自身の免疫系を増強するためにそれを必要とするヒトの処置、および上記のがんの１つなどのがんを有するヒトの処置、のための薬剤を製造するための本発明の抗体または抗原結合部分の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、対応するヒト重鎖ＩｇＧ１−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３およびヒト軽鎖ラムダ定常断片とそれぞれ、インフレームでクローニングされた抗ＰＤ−１抗体ＡＡＳ−１２８１９（黒色で示す）のＶＨおよびＶＬ領域を含むＰＣＲ産物を示す。このクローニングの制限部位はＡｐａｌおよびＡｖｒＩＩである。制限部位ＡｓｃＩおよびＮｈｅＩをＶＨとＶＬの５’末端の間に示す。プラスミドの複製開始点をｐＵＣ  ｏｒｉとして表し、アンピシリン耐性を付与する遺伝子をＡｍｐＲとして表す。
【図２】図２は、ＡｓｃＩおよびＮｈｅＩ制限部位を使用してＶＨおよびＶＬの５’末端の間に挿入したダブルＣＭＶプロモーターを有する発現コンストラクトを示す。ＶＨおよびＶＬ配列を黒色で表し、他の注釈付き遺伝子エレメントを白色で表す。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、（Ａ）ヒトＰＤ−１トランスフェクト細胞に特異的に結合する抗体クローン、（Ｂ）ＣＨＯ−Ｓ細胞に非特異的に結合するクローン、および（Ｃ）スクリーニングに使用する細胞集団のいずれにも結合しないクローン、に関する代表的なフローサイトメトリードットプロットを示す。
【図４】図４は、ドナー６人（Ｄ１〜Ｄ６）におけるＳＥＢ（ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）エンテロトキシンＢ）による刺激の前後でのＰＤ−１を発現するリンパ球の頻度を示す。
【図５】図５Ａ〜Ｉは、ＳＥＢアッセイにおける候補抗ＰＤ−１抗体の滴定を示す。
【図６】図６Ａ〜Ｈは、一方向性ＭＬＲアッセイにおける候補抗ＰＤ−１抗体の滴定を示す。
【図７】図７Ａ〜Ｂは、抗ＰＤ−１抗体の存在下でのＰＤ−１発現細胞に対するＰＤ−Ｌ１の結合を示す。
【図８】試験した抗ＰＤ−１抗体１２８６６．１３１８８、１２８０７．１３１７７、１２８１９．１７１４９、１２８６５．１７１５０、１２８９２．１３１９５、１２７７７．１５３８２、１２７６０．１３１６９、１３１１２．１５３８０、ならびにニボルマブおよびペンブロリズマブアナログに関して同定されたエピトープ群（エピトープビン）の概要を示す。黒色の線でつないだ抗体は、交差ブロッキング活性を示す。他のＰＤ−１抗体との競合パターンに従って抗体を分類する。Ｎｉｖｏ：ニボルマブアナログ；Ｐｅｍｂｒｏ：ペンブロリズマブアナログ。
【図９】図９（パネルＡ〜Ｇ）は、ヒトＰＤ−１（ＰＤＢ  ４ＺＱＫおよび２Ｍ２Ｄ）の構造上の抗体エピトープの位置を示す。Ａ）ヒトＰＤ−１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（残基３３〜１５０）の図。ＧＦＣＣ’およびＡＢＥＤβシート、およびＣ’−Ｄループの位置を図示する。Ｂ）（Ａ）と同じ角度から見たヒトＰＤ−１：ヒトＰＤ−Ｌ１複合体の図である。Ｃ）密度マップとして示されるペンブロリズマブエピトープの分子モデルであり、より暗い領域はより強い結合を媒介する領域を表す。黒色の領域は、アラニンスキャニングによって見出された接触残基を表す。Ｄ）（Ｃ）で表したニボルマブエピトープの分子モデル。Ｅ）（Ｃ）で表した１２８１９抗体エピトープの分子モデル。Ｆ）（Ｃ）で表した１２８６５抗体エピトープの分子モデル。Ｇ）（Ｃ）で表した非リガンドブロッキング１３１１２抗体エピトープの分子モデル。
【図１０】図１０（パネルＡ〜Ｄ）は、４つの同系腫瘍モデルにおける腫瘍増殖に及ぼす抗ＰＤ−１抗体１２８１９．１７１４９、または媒体による処置の効果を示す。Ａ）ＣＴ２６（結腸がん）。Ｂ）Ｃ３８（結腸がん）。Ｃ）ＡＳＢ−ＸＩＶ（肺がん）。Ｄ）Ｓａ１Ｎ（線維肉腫）。灰色の領域は、処置期間を示す。データは平均値±ＳＥＭとして表す。＊Ｐ＜０．００１。
【図１１】ヒト黒色腫細胞株Ａ３７５を接種前に精製ヒトＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞と混合した半ヒト化異種移植片腫瘍モデルの腫瘍増殖に及ぼす、抗ＰＤ−１抗体１２８１９．１７１４９、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、または媒体による処置の効果を示す。灰色の領域は、処置期間を指す。データは、平均値±ＳＥＭとして表す。＊Ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明は、がん患者などのヒト患者における免疫系を増強するために使用することができる新規抗ヒトＰＤ−１抗体を提供する。特に明記しない限り、本明細書において使用される「ＰＤ−１」は、ヒトＰＤ−１を指す。ヒトＰＤ−１ポリペプチド配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ１５１１６（ＰＤＣＤ１＿ＨＵＭＡＮ）として入手可能で、本明細書において配列番号１として示される。
【００４７】
本明細書において使用される用語「抗体」（Ａｂ）または「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、ジスルフィド結合によって相互接続される２つの重（Ｈ）鎖（約５０〜７０ｋＤａ）および２つの軽（Ｌ）鎖（約２５ｋＤａ）を含む４量体を指す。それぞれの重鎖は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。ＶＨおよびＶＬドメインはさらに、より保存された「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる領域の間に存在する「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に細分することができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲ（本明細書においてＨ−ＣＤＲは重鎖からのＣＤＲを指し、Ｌ−ＣＤＲは軽鎖からのＣＤＲを指す）と、４つのＦＲとで構成され、これらはアミノ末端からカルボキシル末端に以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で整列する。重鎖または軽鎖におけるアミノ酸番号の割付は、ＩＭＧＴ（登録商標）の定義（Lefranc et al., Dev Comp Immunol 27(1):55-77 (2003)）；またはＫａｂａｔの定義、Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 and 1991); Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)；or Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989)に従って行われうる。
【００４８】
用語「組換え抗体」は、抗体をコードするヌクレオチド配列を含む細胞または細胞株から発現される抗体であって、前記ヌクレオチド配列が通常、天然では細胞に会合していない抗体である。
【００４９】
用語「単離タンパク質」、「単離ポリペプチド」、または「単離抗体」は、その起源または誘導源を理由に、（１）その天然の状態でそれが伴う天然で会合する成分に会合していない、（２）同じ種の他のタンパク質を含まない、（３）異なる種の細胞によって発現される、および／または（４）天然に存在しない、タンパク質、ポリペプチド、または抗体を指す。このため、化学合成されるか、またはそれが天然で起源とする細胞とは異なる細胞系で合成されるポリペプチドは、その天然で会合する成分から「単離」されている。タンパク質はまた、当技術分野で周知のタンパク質精製技術を使用して単離によって天然で会合する成分を実質的に含まないようにしてもよい。
【００５０】
本明細書において使用される用語「生殖系列」は、生殖細胞を通して親から子孫に伝達される抗体遺伝子および遺伝子セグメントのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を指す。生殖系列配列は、Ｂ細胞成熟の過程で組換えおよび超突然変異事象により変化している、成熟Ｂ細胞における抗体をコードするヌクレオチド配列とは区別される。特定の生殖系列配列を「利用する」抗体は、他の任意の生殖系列ヌクレオチドまたはアミノ酸配列より厳密に、その生殖系列ヌクレオチド配列と整列する、またはそれが指定するアミノ酸配列と整列するヌクレオチドまたはアミノ酸配列を有する。
【００５１】
用語「親和性」は、抗原と抗体の間の誘引力の尺度を指す。抗原に対する抗体の内因性の誘引力は、典型的に、特定の抗体−抗原相互作用の結合親和性平衡定数（ＫＤ）として表記される。抗体は、ＫＤが≦１ｍＭである場合、好ましくは≦１００ｎＭである場合、抗原に対して特異的に結合すると言われる。ＫＤ結合親和性定数は、例えば、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標））またはバイオレイヤー干渉法によって、例えば、Ｂｉｏ−ＲａｄのＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＸＰＲ３６  ＳＰＲシステムもしくはＯｃｔｅｔ（商標）システムを使用して測定することができる。
【００５２】
用語「ｋｏｆｆ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度定数を指す。ｋｏｆｆ解離速度定数は、バイオレイヤー干渉法によって、例えばＯｃｔｅｔ（商標）システムを使用して測定することができる。
【００５３】
本明細書において使用される用語「エピトープ」は、抗体または二特異性結合分子などの関連分子に特異的に結合する抗原の部分（決定基）を指す。エピトープ決定基は一般的に、アミノ酸、または炭水化物、または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、一般的に特異的三次元構造特徴、ならびに特異的電荷特徴を有する。エピトープは、「線状」または「コンフォメーション」でありうる。線状エピトープの場合、タンパク質（例えば、抗原）と相互作用分子（抗体など）の間の相互作用点の全てがタンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線上に存在する。コンフォメーションエピトープでは、相互作用点は、一次アミノ酸配列において互いに離れているタンパク質上のアミノ酸残基にわたって存在する。抗原上の所望のエピトープが決定されれば、当技術分野で周知の技術を使用してそのエピトープに対する抗体を生成することが可能である。例えば、線状エピトープに対する抗体は、例えば線状エピトープのアミノ酸残基を有するペプチドによって動物を免疫することによって、生成することができる。コンフォメーションエピトープに対する抗体は、例えば、コンフォメーションエピトープの関連するアミノ酸残基を含むミニドメインによって動物を免疫することによって生成することができる。特定のエピトープに対する抗体はまた、例えば目的の標的分子またはその関連部分（例えば、ＰＤ−１のＥＣＤ）によって動物を免疫すること、その後エピトープに対する結合に関してスクリーニングすることによって生成することもできる。
【００５４】
抗体が、本発明の抗ＰＤ−１抗体と同じエピトープに結合するか、または本発明の抗ＰＤ−１抗体と結合に関して競合するかは、競合アッセイ、エピトープビニング、およびアラニンスキャニングなどを含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の方法を使用することによって決定することができる。一部の実施形態において、本発明の試験抗体および抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１上の少なくとも１つの共通の残基（例えば、少なくとも２、３、４、または５個の共通の残基）に結合する。さらなる実施形態において、ＰＤ−１上の接触残基は、本発明の試験抗体と抗ＰＤ−１抗体の間で完全に同一である。一実施形態において、本発明の抗ＰＤ−１抗体を飽和条件でＰＤ−１に結合させることができ、次に試験抗体がＰＤ−１に結合する能力を測定する。試験抗体が、参照抗ＰＤ−１抗体と同時にＰＤ−１に結合することができる場合、試験抗体は、参照抗ＰＤ−１抗体とは異なるエピトープに結合する。しかし、試験抗体が、同時にＰＤ−１に結合することができない場合、試験抗体は、同じエピトープ、オーバーラップエピトープ、または本発明の抗ＰＤ−１抗体が結合するエピトープの近位に存在するエピトープに結合する。この実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）、バイオレイヤー干渉法、またはフローサイトメトリーを使用して実施することができる。抗ＰＤ−１抗体が別の抗ＰＤ−１抗体と交差競合するか否かを試験するために、上記の競合法を２つの方向で使用してもよく、すなわち公知の抗体が試験抗体を遮断するか否か、およびその逆を決定してもよい。そのような交差競合実験は、例えばＩＢＩＳ  ＭＸ９６  ＳＰＲ機器またはＯｃｔｅｔ（商標）システムを使用して実施することができる。
【００５５】
用語「キメラ抗体」は、その最も広い意味において、１つの抗体からの１つまたは複数の領域と、１つまたは複数の他の抗体からの１つまたは複数の領域とを含む抗体を指し、典型的に部分的にヒト起源であり、部分的に非ヒト起源である、すなわち部分的に非ヒト動物、例えばマウス、ラット、もしくは他の齧歯類、またはニワトリなどの鳥に由来する抗体を指す。キメラ抗体は、ヒトの抗抗体応答、例えばマウス抗体の場合のヒトの抗マウス抗体応答のリスクを低減させるために、非ヒト抗体より好ましい。典型的なキメラ抗体の例は、可変ドメイン配列がマウスであるが、定常領域配列はヒトである抗体である。キメラ抗体の場合、抗体をヒト化するために、非ヒト部分にさらなる変更を行ってもよい。本明細書に記載のキメラ抗体は、ニワトリの可変ドメイン配列とヒトの定常領域配列とを有する。
【００５６】
用語「ヒト化」は、抗体が、完全にまたは部分的に非ヒト起源（例えば、目的の抗原によるマウスもしくはニワトリの免疫からそれぞれ得たマウスもしくはニワトリ抗体、またはそのようなマウスもしくはニワトリ抗体に基づくキメラ抗体）である場合、ヒトにおける免疫応答を回避または最小限にするために、特に、重鎖および軽鎖のフレームワーク領域および定常領域における特定のアミノ酸を交換することが可能であるという事実を指す。免疫原性、およびそれによる特定の抗体に対するヒトの抗抗体応答を正確に予測することはできないが、非ヒト抗体は、ヒトにおいてヒト抗体より免疫原性である傾向がある。外来（例えば、齧歯類または鳥）の定常領域がヒト起源の配列と交換されているキメラ抗体は、一般的に、完全に外来起源の抗体より免疫原性が低いことが示されており、治療抗体における傾向は、ヒト化抗体または完全なヒト抗体の方向である。このため、キメラ抗体または他の非ヒト起源の抗体は、ヒトの抗抗体応答のリスクを低減させるためにヒト化することができる。
【００５７】
キメラ抗体に関して、ヒト化は典型的に、可変ドメイン配列のフレームワーク領域の改変を伴う。相補性決定領域（ＣＤＲ）の一部であるアミノ酸残基は、ヒト化に関連して変化しないことが最も多いが、ある特定の場合において、例えばグリコシル化部位、脱アミド部位、アスパラギン酸異性化部位、または望ましくないシステインもしくはメチオニン残基を除去するために、個々のＣＤＲアミノ酸残基を変化させることが望ましい場合がありうる。Ｎ−結合グリコシル化は、ＸがＰｒｏを除く任意のアミノ酸残基でありうるトリペプチド配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ中のアスパラギン残基にオリゴ糖鎖を結合させることによって起こる。Ｎ−グリコシル化部位の除去は、好ましくは保存的置換によってＡｓｎまたはＳｅｒ／Ｔｈｒ残基のいずれかを異なる残基に突然変異させることによって行われうる。アスパラギンおよびグルタミン残基の脱アミドは、ｐＨおよび表面露出などの要因に応じて起こりうる。アスパラギン残基は、主に配列Ａｓｎ−Ｇｌｙに存在する場合、および程度は低いもののＡｓｎ−Ａｌａなどの他のジペプチド配列に存在する場合、脱アミド化を特に受けやすい。したがって、そのような脱アミド部位、特にＡｓｎ−ＧｌｙがＣＤＲ配列に存在する場合、関与している残基の１つを除去するために、典型的に保存的置換によってその部位を除去することが望ましいであろう。
【００５８】
抗体配列のヒト化のための多数の方法が当技術分野で公知である；例えば、Almagro & Fransson, Front Biosci. 13:1619-1633 (2008)による論評を参照されたい。１つの一般的に使用される方法は、ＣＤＲグラフティングであり、これは、例えばマウス由来のキメラ抗体に関して、マウス可変ドメイン遺伝子に対するヒト生殖系列遺伝子相対物の同定、およびマウスＣＤＲ配列のこのフレームワークへのグラフティングを伴う。抗体の標的抗原との相互作用の特異性は、主に重鎖および軽鎖の６個のＣＤＲに位置するアミノ酸残基に存在する。したがって、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列より個々の抗体の間でかなり可変である。ＣＤＲ配列はほとんどの抗体−抗原相互作用の原因であることから、例えば異なる抗体からのフレームワーク配列に移植された特異的抗体からのＣＤＲ配列を発現する発現ベクターを構築することによって、特異的な天然起源の抗体、またはより一般的には所定のアミノ酸配列を有する任意の特異的抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である。結果として、非ヒト抗体を「ヒト化」することが可能であり、それでもなお当初の抗体の結合特異性および親和性を実質的に維持することができる。ＣＤＲグラフティングは、ＫａｂａｔのＣＤＲの定義に基づきうるが、より最近の刊行物（Magdelaine-Beuzelin et al., Crit Rev.Oncol Hematol. 64:210-225 (2007))）は、ＩＭＧＴ（登録商標）の定義（the international ImMunoGeneTics information system(R), www.imgt.org）が、ヒト化の結果を改善しうることを示唆している（Lefranc et al., Dev. Comp Immunol. 27:55-77 (2003)を参照されたい）。
【００５９】
場合によっては、ＣＤＲグラフティングは、そこからＣＤＲが得られる親抗体と比較してＣＤＲ移植非ヒト抗体の結合特異性および親和性を低減させ、このように生物活性を低減させうる。親抗体の結合特異性および親和性を再確立するために、復帰突然変異（時に「フレームワーク修復」と呼ばれる）を、典型的にフレームワーク領域におけるＣＤＲ移植抗体の選択された位置に導入してもよい。可能性がある復帰突然変異の位置の同定は、文献および抗体データベースにおいて利用可能な情報を使用して実施することができる。復帰突然変異の候補であるアミノ酸残基は典型的に、抗体分子の表面に位置する残基であり、埋もれているかまたは表面の露出の程度が低い残基は通常、変化しない。
【００６０】
ＣＤＲグラフティングおよび復帰突然変異の代替のヒト化技術は、非ヒト起源の非表面露出残基が保持されるが表面残基がヒト残基に変化する、リサーフェシングである。
【００６１】
ある特定の例において、標的エピトープに対する結合親和性を改善するために、１つまたは複数のＣＤＲアミノ酸残基を変化させることもまた望ましい場合がある。これは、「親和性成熟」として知られ、例えば抗体のヒト化によって、結合特異性または親和性の低減が起こり、復帰突然変異単独では結合特異性または親和性を十分に改善することが可能でない状況では、ヒト化に関連して行ってもよい。様々な親和性成熟方法、例えばBurks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997)によって記載されるインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）のスキャニング飽和突然変異誘発法、およびWu et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:6037-6042 (1998)の段階的インビトロ親和性成熟法が当技術分野で公知である。
【００６２】
本明細書において使用される抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えば、ヒトＰＤ−１またはその部分）に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つまたは複数の部分または断片を指す。完全長の抗体のある特定の断片が、抗体の抗原結合機能を実施することができることが示されている。用語「抗原結合部分」に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片：ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価の断片（例えば、以下に記載の１２８１９．１７１４９および１２８６５．１７１５０  Ｆａｂ断片）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片；ヒンジ領域でジスルフィド結合によって結合した２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体のシングルアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片；ならびに（ｖｉ）抗原に特異的に結合することができる単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、異なる遺伝子によってコードされるが、それらを単一のタンパク質鎖として作製することができる合成リンカーによって、組換え法を使用して結合させ、ＶＬおよびＶＨドメインが対を形成して一価の分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）を形成することができる。同様に、ＶＨおよび／またはＶＬを含む抗原結合分子も本発明に含まれる。ＶＨの場合、分子はまた、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、またはＣＨ３領域のうちの１つまたは複数を含みうる。そのような一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されると意図される。ダイアボディなどの一本鎖抗体の他の形態も同様に包含される。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間で対を形成するには短すぎるリンカーを使用することによって、別の鎖の相補性ドメインと強制的に対を形成させて、２つの抗原結合部位を作製する二価の二特異性抗体である。
【００６３】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片などの抗体部分は、抗体全体のパパインまたはペプシン消化などの通常の技術を使用して抗体全体から調製することができる。その上、抗体、抗体部分、およびイムノアドヘシンは、例えば本明細書に記載の標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して得ることができる。
【００６４】
抗ＰＤ−１抗体のクラス（アイソタイプ）およびサブクラスは、当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。一般的に、抗体のクラスおよびサブクラスは、抗体の特定のクラスおよびサブクラスに対して特異的である抗体を使用して決定することができる。そのような抗体は市販されている。クラスおよびサブクラスは、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットならびに他の技術によって決定することができる。あるいは、クラスおよびサブクラスは、抗体の重鎖および／または軽鎖の定常領域の全てまたは一部をシークエンシングすること、そのアミノ酸配列を免疫グロブリンの様々なクラスおよびサブクラスの公知のアミノ酸配列と比較すること、ならびに抗体のクラスおよびサブクラスを決定することによって決定することができる。
【００６５】
抗体配列の所定の位置での特定のアミノ酸残基に言及する場合、例えば「３５Ｓ」との表示は、その位置および残基を指し、すなわちこの場合、セリン残基（Ｓ）が配列の３５位に存在することを示す。同様に、例えば「１３Ｑ＋３５Ｓ」との表示は、それぞれの位置における２つの残基を指す。
【００６６】
特に明記しない限り、本開示において言及される全ての抗体アミノ酸残基の番号は、ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリングスキームに従う番号である。
【００６７】
抗ＰＤ−１抗体
本発明は、ＰＤ−１に対する抗体およびその抗原結合部分を提供する。抗体は、ニワトリに由来する可変ドメインとヒト定常領域とを有するキメラでありうるか、またはヒト化されうる。本明細書において開示される抗体は、特にヒト化抗体である。
【００６８】
本発明の８個の選択されたヒト化抗ＰＤ−１抗体のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列（配列番号２〜１７）を、以下の表４に詳しく示す（実施例４）。参照のために、配列番号を以下の表１に提供する。
【００６９】
本明細書において開示される抗ＰＤ−１抗体は、５桁の数字、例えば「１２８１９」または１０桁の数字、例えば「１２８１９．１５３８４」のいずれかによって言及されうる。本明細書において使用される５桁の数字は、表２にその数字に関して示される重鎖および軽鎖ＣＤＲ１〜３配列を有する全ての抗体を指すが、１０桁の数字の使用は、特定のヒト化変異体を指す。例えば、１２８１９．１５３８４は、表２に示される１２８１９抗体のＣＤＲ配列を有する特定のヒト化変異体である。５桁の数字は、例えば、ＦＲにおける一部の変化（例えば、成熟軽鎖のＮ末端で残基ＳＹを欠如する、またはＳＹの代わりに残基ＳＳを有する）を除き、以下の表１に示される１０桁の変異体と同一である抗体を包含する。これらの修飾は、抗体の機能的（例えば、抗原結合）特性を変化させない。
【００７０】
【表１】
2018529359.tif 000002
【００７１】
以下の表２は、抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の配列番号を提供する。
【００７２】
【表２】
2018529359.tif 000003
【００７３】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、以下：
ａ）そのＨ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号１８〜２０のアミノ酸配列を含む抗体；
ｂ）その重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号２のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｃ）そのＶＨが配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体；
ｄ）その重鎖（ＨＣ）が配列番号２および６７のアミノ酸配列を含む抗体；
ｅ）そのＬ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号２１〜２３のアミノ酸配列を含む抗体；
ｆ）その軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号３のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｇ）そのＶＬが配列番号３のアミノ酸配列を含む抗体；
ｈ）その軽鎖（ＬＣ）が配列番号３および６８のアミノ酸配列を含む抗体；
ｉ）そのＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号１８〜２３のアミノ酸配列を含む抗体；
ｊ）そのＶＨが配列番号２のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一であり、そのＶＬが配列番号３のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｋ）そのＶＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、そのＶＬが配列番号３のアミノ酸配列を含む抗体；ならびに
ｌ）そのＨＣが配列番号２および６７のアミノ酸配列を含み、そのＬＣが配列番号３および６８のアミノ酸配列を含む抗体
からなる群から選択される。
【００７４】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、以下：
ａ）そのＨ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号２４〜２６のアミノ酸配列を含む抗体；
ｂ）その重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号４のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｃ）そのＶＨが配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体；
ｄ）その重鎖（ＨＣ）が配列番号４および６７のアミノ酸配列を含む抗体；
ｅ）そのＬ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号２７〜２９のアミノ酸配列を含む抗体；
ｆ）その軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号５または６６のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｇ）そのＶＬが配列番号５または６６のアミノ酸配列を含む抗体；
ｈ）その軽鎖（ＬＣ）が配列番号５または６６のアミノ酸配列および配列番号６８のアミノ酸配列を含む抗体；
ｉ）そのＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号２４〜２９のアミノ酸配列を含む抗体；
ｊ）そのＶＨが配列番号４のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一であり、そのＶＬが配列番号５または６６のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｋ）そのＶＨが配列番号４のアミノ酸配列を含み、そのＶＬが配列番号５または６６のアミノ酸配列を含む抗体；ならびに
ｌ）そのＨＣが配列番号４および６７のアミノ酸配列を含み、そのＬＣが配列番号５または６６および配列番号６８のアミノ酸配列を含む抗体
からなる群から選択される。
【００７５】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、以下：
ａ）そのＨ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号３０〜３２のアミノ酸配列を含む抗体；
ｂ）その重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号６のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｃ）そのＶＨが配列番号６のアミノ酸配列を含む抗体；
ｄ）その重鎖（ＨＣ）が配列番号６および６７のアミノ酸配列を含む抗体；
ｅ）そのＬ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号３３〜３５のアミノ酸配列を含む抗体；
ｆ）その軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号７のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｇ）そのＶＬが配列番号７のアミノ酸配列を含む抗体；
ｈ）その軽鎖（ＬＣ）が配列番号７および６８のアミノ酸配列を含む抗体；
ｉ）そのＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号３０〜３５のアミノ酸配列を含む抗体；
ｊ）そのＶＨが配列番号６のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一であり、そのＶＬが配列番号７のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｋ）そのＶＨが配列番号６のアミノ酸配列を含み、そのＶＬが配列番号７のアミノ酸配列を含む抗体；ならびに
ｌ）そのＨＣが配列番号６および６７のアミノ酸配列を含み、そのＬＣが配列番号７および６８のアミノ酸配列を含む抗体
からなる群から選択される。
【００７６】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、以下：
ａ）そのＨ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号３６〜３８のアミノ酸配列を含む抗体；
ｂ）その重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号８のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｃ）そのＶＨが配列番号８のアミノ酸配列を含む抗体；
ｄ）その重鎖（ＨＣ）が配列番号８および６７のアミノ酸配列を含む抗体；
ｅ）そのＬ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号３９〜４１のアミノ酸配列を含む抗体；
ｆ）その軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号９のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｇ）そのＶＬが配列番号９のアミノ酸配列を含む抗体；
ｈ）その軽鎖（ＬＣ）が配列番号９および６８のアミノ酸配列を含む抗体；
ｉ）そのＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号３６〜４１のアミノ酸配列を含む抗体；
ｊ）そのＶＨが配列番号８のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一であり、そのＶＬが配列番号９のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｋ）そのＶＨが配列番号８のアミノ酸配列を含み、そのＶＬが配列番号９のアミノ酸配列を含む抗体；ならびに
ｌ）そのＨＣが配列番号８および６７のアミノ酸配列を含み、そのＬＣが配列番号９および６８のアミノ酸配列を含む抗体
からなる群から選択される。
【００７７】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、以下：
ａ）そのＨ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号４２〜４４のアミノ酸配列を含む抗体；
ｂ）その重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号１０のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｃ）そのＶＨが配列番号１０のアミノ酸配列を含む抗体；
ｄ）その重鎖（ＨＣ）が配列番号１０および６７のアミノ酸配列を含む抗体；
ｅ）そのＬ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号４５〜４７のアミノ酸配列を含む抗体；
ｆ）その軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号１１のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｇ）そのＶＬが配列番号１１のアミノ酸配列を含む抗体；
ｈ）その軽鎖（ＬＣ）が配列番号１１および６８のアミノ酸配列を含む抗体；
ｉ）そのＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号４２〜４７のアミノ酸配列を含む抗体；
ｊ）そのＶＨが配列番号１０のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一であり、そのＶＬが配列番号１１のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｋ）そのＶＨが配列番号１０のアミノ酸配列を含み、そのＶＬが配列番号１１のアミノ酸配列を含む抗体；ならびに
ｌ）そのＨＣが配列番号１０および６７のアミノ酸配列を含み、そのＬＣが配列番号１１および６８のアミノ酸配列を含む抗体
からなる群から選択される。
【００７８】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、以下：
ａ）そのＨ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号４８〜５０のアミノ酸配列を含む抗体；
ｂ）その重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号１２のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｃ）そのＶＨが配列番号１２のアミノ酸配列を含む抗体；
ｄ）その重鎖（ＨＣ）が配列番号１２および６７のアミノ酸配列を含む抗体；
ｅ）そのＬ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号５１〜５３のアミノ酸配列を含む抗体；
ｆ）その軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号１３のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｇ）そのＶＬが配列番号１３のアミノ酸配列を含む抗体；
ｈ）その軽鎖（ＬＣ）が配列番号１３および６８のアミノ酸配列を含む抗体；
ｉ）そのＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号４８〜５３のアミノ酸配列を含む抗体；
ｊ）そのＶＨが配列番号１２のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一であり、そのＶＬが配列番号１３のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｋ）そのＶＨが配列番号１２のアミノ酸配列を含み、そのＶＬが配列番号１３のアミノ酸配列を含む抗体；ならびに
ｌ）そのＨＣが配列番号１２および６７のアミノ酸配列を含み、そのＬＣが配列番号１３および６８のアミノ酸配列を含む抗体
からなる群から選択される。
【００７９】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、以下：
ａ）そのＨ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号５４〜５６のアミノ酸配列を含む抗体；
ｂ）その重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号１４のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｃ）そのＶＨが配列番号１４のアミノ酸配列を含む抗体；
ｄ）その重鎖（ＨＣ）が配列番号１４および６７のアミノ酸配列を含む抗体；
ｅ）そのＬ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号５７〜５９のアミノ酸配列を含む抗体；
ｆ）その軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号１５のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｇ）そのＶＬが配列番号１５のアミノ酸配列を含む抗体；
ｈ）その軽鎖（ＬＣ）が配列番号１５および６８のアミノ酸配列を含む抗体；
ｉ）そのＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号５４〜５９のアミノ酸配列を含む抗体；
ｊ）そのＶＨが配列番号１４のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一であり、そのＶＬが配列番号１５のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｋ）そのＶＨが配列番号１４のアミノ酸配列を含み、そのＶＬが配列番号１５のアミノ酸配列を含む抗体；ならびに
ｌ）そのＨＣが配列番号１４および６７のアミノ酸配列を含み、そのＬＣが配列番号１５および６８のアミノ酸配列を含む抗体
からなる群から選択される。
【００８０】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、以下：
ａ）そのＨ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号６０〜６２のアミノ酸配列を含む抗体；
ｂ）その重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号１６のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｃ）そのＶＨが配列番号１６のアミノ酸配列を含む抗体；
ｄ）その重鎖（ＨＣ）が配列番号１６および６７のアミノ酸配列を含む抗体；
ｅ）そのＬ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号６３〜６５のアミノ酸配列を含む抗体；
ｆ）その軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号１７のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｇ）そのＶＬが配列番号１７のアミノ酸配列を含む抗体；
ｈ）その軽鎖（ＬＣ）が配列番号１７および６８のアミノ酸配列を含む抗体；
ｉ）そのＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３がそれぞれ、配列番号６０〜６５のアミノ酸配列を含む抗体；
ｊ）そのＶＨが配列番号１６のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一であり、そのＶＬが配列番号１７のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である抗体；
ｋ）そのＶＨが配列番号１６のアミノ酸配列を含み、そのＶＬが配列番号１７のアミノ酸配列を含む抗体；ならびに
ｌ）そのＨＣが配列番号１６および６７のアミノ酸配列を含み、そのＬＣが配列番号１７および６８のアミノ酸配列を含む抗体
からなる群から選択される。
【００８１】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分は、１２８１９抗体（例えば、抗体１２８１９．１５３８４）のＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３アミノ酸配列を含む。
【００８２】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分は、１２７４８抗体（例えば、抗体１２７４８．１５３８１、または抗体１２７４８．１６１２４）のＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３アミノ酸配列を含む。
【００８３】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分は、１２８６５抗体（例えば、抗体１２８６５．１５３７７）のＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３アミノ酸配列を含む。
【００８４】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分は、１２８９２抗体（例えば、抗体１２８９２．１５３７８）のＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３アミノ酸配列を含む。
【００８５】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分は、１２７９６抗体（例えば、抗体１２７９６．１５３７６）のＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３アミノ酸配列を含む。
【００８６】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分は、１２７７７抗体（例えば、抗体１２７７７．１５３８２）のＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３アミノ酸配列を含む。
【００８７】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分は、１２７６０抗体（例えば、抗体１２７６０．１５３７５）のＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３アミノ酸配列を含む。
【００８８】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分は、１３１１２抗体（例えば、抗体１３１１２．１５３８０）のＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３アミノ酸配列を含む。
【００８９】
別の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分は、抗体１２８１９．１５３８４、１２７４８．１５３８１、１２７４８．１６１２４、１２８６５．１５３７７、１２８９２．１５３７８、１２７９６．１５３７６、１２７７７．１５３８２、１２７６０．１５３７５、および１３１１２．１５３８０のうちの任意の１つのＶＨおよびＶＬとそれぞれ、アミノ酸配列が少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一であるＶＨおよびＶＬを有する。
【００９０】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分は、抗体１２８１９．１５３８４、１２７４８．１５３８１、１２７４８．１６１２４、１２８６５．１５３７７、１２８９２．１５３７８、１２７９６．１５３７６、１２７７７．１５３８２、１２７６０．１５３７５、および１３１１２．１５３８０のうちの任意の１つのＶＨおよびＶＬアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨおよびＶＬを有する。
【００９１】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分は、
ａ）それぞれ、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、および２３；
ｂ）それぞれ、配列番号２４、２５、２６、２７、２８、および２９；
ｃ）それぞれ、配列番号３０、３１、３２、３３、３４、および３５；
ｄ）それぞれ、配列番号３６、３７、３８、３９、４０、および４１；
ｅ）それぞれ、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、および４７；
ｆ）それぞれ、配列番号４８、４９、５０、５１、５２、および５３；
ｇ）それぞれ、配列番号５４、５５、５６、５７、５８、および５９；または
ｈ）それぞれ、配列番号６０、６１、６２、６３、６４、および６５
のＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３アミノ酸配列を含む。
【００９２】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分は、
ａ）それぞれ、配列番号２および３；
ｂ）それぞれ、配列番号４および５；
ｃ）それぞれ、配列番号４および６６；
ｄ）それぞれ、配列番号６および７；
ｅ）それぞれ、配列番号８および９；
ｆ）それぞれ、配列番号１０および１１；
ｇ）それぞれ、配列番号１２および１３；
ｈ）それぞれ、配列番号１４および１５；または
ｉ）それぞれ、配列番号１６および１７
のアミノ酸配列と、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＶＨ、および８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＶＬを含む。
【００９３】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分は、
ａ）それぞれ、配列番号２および３；
ｂ）それぞれ、配列番号４および５；
ｃ）それぞれ、配列番号４および６６；
ｄ）それぞれ、配列番号６および７；
ｅ）それぞれ、配列番号８および９；
ｆ）それぞれ、配列番号１０および１１；
ｇ）それぞれ、配列番号１２および１３；
ｈ）それぞれ、配列番号１４および１５；または
ｉ）それぞれ、配列番号１６および１７
のアミノ酸配列であるＶＨおよびＶＬを含む。
【００９４】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、
ａ）配列番号２および６７のアミノ酸配列を含むＨＣ、ならびに配列番号３および６８のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｂ）配列番号４および６７のアミノ酸配列を含むＨＣ、ならびに配列番号５および６８のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｃ）配列番号４および６７のアミノ酸配列を含むＨＣ、ならびに配列番号６６および６８のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｄ）配列番号６および６７のアミノ酸配列を含むＨＣ、ならびに配列番号７および６８のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｅ）配列番号８および６７のアミノ酸配列を含むＨＣ、ならびに配列番号９および６８のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｆ）配列番号１０および６７のアミノ酸配列を含むＨＣ、ならびに配列番号１１および６８のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｇ）配列番号１２および６７のアミノ酸配列を含むＨＣ、ならびに配列番号１３および６８のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｈ）配列番号１４および６７のアミノ酸配列を含むＨＣ、ならびに配列番号１５および６８のアミノ酸配列を含むＬＣ；または
ｉ）配列番号１６および６７のアミノ酸配列を含むＨＣ、ならびに配列番号１７および６８のアミノ酸配列を含むＬＣ
を含む。
【００９５】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、
ａ）配列番号２および６７のアミノ酸配列からなるＨＣ、ならびに配列番号３および６８のアミノ酸配列からなるＬＣ；
ｂ）配列番号４および６７のアミノ酸配列からなるＨＣ、ならびに配列番号５および６８のアミノ酸配列からなるＬＣ；
ｃ）配列番号４および６７のアミノ酸配列からなるＨＣ、ならびに配列番号６６および６８のアミノ酸配列からなるＬＣ；
ｄ）配列番号６および６７のアミノ酸配列からなるＨＣ、ならびに配列番号７および６８のアミノ酸配列からなるＬＣ；
ｅ）配列番号８および６７のアミノ酸配列からなるＨＣ、ならびに配列番号９および６８のアミノ酸配列からなるＬＣ；
ｆ）配列番号１０および６７のアミノ酸配列からなるＨＣ、ならびに配列番号１１および６８のアミノ酸配列からなるＬＣ；
ｇ）配列番号１２および６７のアミノ酸配列からなるＨＣ、ならびに配列番号１３および６８のアミノ酸配列からなるＬＣ；
ｈ）配列番号１４および６７のアミノ酸配列からなるＨＣ、ならびに配列番号１５および６８のアミノ酸配列からなるＬＣ；または
ｉ）配列番号１６および６７のアミノ酸配列からなるＨＣ、ならびに配列番号１７および６８のアミノ酸配列からなるＬＣと
を含む。
【００９６】
一部の実施形態において、本明細書に記載の任意の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分は、以下の特性：
ａ）７５０ｐＭまたはそれ未満のＫＤでヒトＰＤ−１に結合すること；
ｂ）７ｎＭまたはそれ未満のＫＤでカニクイザルＰＤ−１に結合すること；
ｃ）１ｎＭまたはそれ未満のＫＤでマウスＰＤ−１に結合すること；
ｄ）ラットＰＤ−１に結合しないこと；
ｅ）ＳＥＢ全血アッセイにおいてＩＬ−２の分泌を増加させること；
ｆ）一方向性混合リンパ球反応アッセイにおいてＩＦＮ−γ分泌を増加させること；
ｇ）フローサイトメトリーアッセイにおいて１０μｇ／ｍｌの濃度でＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を少なくとも６０％阻害すること；
ｈ）バイオレイヤー干渉法による分析によって決定した場合に１０μｇ／ｍｌの濃度でＰＤ−１に対するＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の結合を少なくとも９０％阻害すること；ならびに
ｉ）インビボで腫瘍の増殖を阻害すること
のうちの少なくとも１つを有しうる。
【００９７】
一部の実施形態において、本明細書に記載の任意の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分は、少なくとも９００、少なくとも８５０、少なくとも８００、少なくとも７５０、少なくとも７００、少なくとも６５０、少なくとも６００、少なくとも５５０、少なくとも５００、少なくとも４５０、少なくとも４００、少なくとも３５０、少なくとも３００、少なくとも２５０、少なくとも２００、少なくとも１５０、少なくとも１００、少なくとも５０、少なくとも４０、少なくとも３０、または少なくとも２０ｐＭのＫＤでヒトＰＤ−１に結合しうる。ある特定の実施形態において、ＫＤは、表面プラズモン共鳴を使用して決定される。特定の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、またはその両方より高い親和性でヒトＰＤ−１に結合する。
【００９８】
一部の実施形態において、本明細書に記載の任意の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分は、少なくとも９０００、少なくとも８０００、少なくとも７０００、少なくとも６０００、少なくとも５０００、少なくとも４０００、少なくとも３０００、少なくとも２５００、少なくとも２０００、少なくとも１５００、少なくとも１０００、少なくとも９００、少なくとも８００、少なくとも７００、少なくとも６００、少なくとも５００、少なくとも４００、少なくとも３００、少なくとも２００、少なくとも１００、少なくとも７５、少なくとも５０、少なくとも２５、少なくとも２０、少なくとも１５、少なくとも１０、または少なくとも５ｐＭのＫＤでカニクイザルＰＤ−１（配列番号８９）に結合しうる。ある特定の実施形態において、ＫＤは、表面プラズモン共鳴を使用して決定される。
【００９９】
一部の実施形態において、本明細書に記載の任意の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分は、少なくとも１０００、少なくとも９５０、少なくとも９００、または少なくとも８５０ｐＭのＫＤでマウスＰＤ−１（配列番号９１）に結合しうる。ある特定の実施形態において、ＫＤは、表面プラズモン共鳴を使用して決定される。
【０１００】
一部の実施形態において、本明細書に記載の任意の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分は、フローサイトメトリー競合アッセイにおいて１０μｇ／ｍｌの濃度で、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％阻害しうる。ある特定の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を少なくとも８３％阻害しうる。
【０１０１】
一部の実施形態において、本明細書に記載の任意の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分は、バイオレイヤー干渉法による分析によって決定した場合に、１０μｇ／ｍｌの濃度でＰＤ−１に対するＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の結合を、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％遮断しうる。ある特定の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分は、ＰＤ−１に対するＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の結合を少なくとも９０％遮断する。
【０１０２】
一部の実施形態において、本明細書に記載の任意の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分は、ＰＤ−１に対する結合に関して１２８６５、１２８９２、および１２７７７抗体（例えば、抗体１２８６５．１５３７７、１２８９２．１５３７８、および１２７７７．１５３８２）と競合または交差競合しうる。一部の実施形態において、本明細書に記載の任意の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分は、ＰＤ−１に対する結合に関して１２８１９抗体（例えば、抗体１２８１９．１５３８４）と競合または交差競合しうる。一部の実施形態において、本明細書に記載の任意の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分は、ＰＤ−１に対する結合に関して１２７６０および１３１１２抗体（例えば、抗体１２７６０．１５３７５および１３１１２．１５３８０）と競合または交差競合しうる。
【０１０３】
一部の実施形態において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分は、配列番号１の以下の残基：Ｖ４４、Ｖ６４、Ｌ１２８、Ｐ１３０、Ｋ１３１、Ａ１３２、Ｅ１３６、およびＴ１４５のうちの少なくとも１つ（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つ）を含むＰＤ−１のエピトープに結合する。ある特定の実施形態において、抗体または抗原結合部分は、配列番号１の残基Ｖ６４、Ｌ１２８、Ｐ１３０、Ｋ１３１、およびＡ１３２を含むＰＤ−１のエピトープに結合する（１２８１９抗体、例えば抗体１２８１９．１５３８４など）。ある特定の実施形態において、抗体または抗原結合部分は、配列番号１の残基Ｋ１３１およびＥ１３６を含むＰＤ−１のエピトープに結合する（１２８６５抗体、例えば抗体１２８６５．１５３７７など）。ある特定の実施形態において、抗体または抗原結合部分は、配列番号１の残基Ｖ４４およびＴ１４５を含むＰＤ−１のエピトープに結合する（１３１１２抗体、例えば抗体１３１１２．１５３８０など）。
【０１０４】
一部の実施形態において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分は、配列番号１の残基５６〜６４、６９〜９０、および／または１２２〜１４０を含むＰＤ−１のエピトープに結合する。ある特定の実施形態において、抗体または抗原結合部分は、配列番号１の残基６９〜９０および１２２〜１４０を含むＰＤ−１のエピトープに結合する（１２８１９および１２８６５抗体、例えば、抗体１２８１９．１５３８４および１２８６５．１５３７７など）。ある特定の実施形態において、抗体または抗原結合部分は、配列番号１の残基５６〜６４、６９〜９０、および１２２〜１４０を含むＰＤ−１のエピトープに結合する（例えば、１２８１９抗体）。ある特定の実施形態において、抗体または抗原結合部分は、配列番号１の残基６９〜９０および１２２〜１４０を含むＰＤ−１のエピトープに結合する（例えば、１２８６５抗体）。一部の実施形態において、抗体または部分は、配列番号１の残基６９〜７５（またはその断片、例えば１、２、３、４、５、または６残基の断片など）に結合する（１２８１９および１２８６５抗体、例えば抗体１２８１９．１５３８４および１２８６５．１５３７７など）。一部の実施形態において、抗体または部分は、配列番号１の残基１３６〜１４０（またはその断片、例えば１、２、３、または４残基の断片）に結合する（１２８１９および１２８６５抗体、例えば抗体１２８１９．１５３８４および１２８６５．１５３７７など）。一部の実施形態において、抗体または部分は、配列番号１の残基６９〜７５（またはその断片）、および残基１３６〜１４０（またはその断片）に結合する（１２８１９および１２８６５抗体、例えば抗体１２８１９．１５３８４および１２８６５．１５３７７）。上記の残基の任意の組み合わせを有するエピトープも同様に企図される。
【０１０５】
一部の実施形態において、本明細書に記載のＰＤ−１エピトープを含むアミノ酸配列を免疫原として使用して（例えば、動物に投与するか、または抗体ライブラリをスクリーニングするための抗原として）、前記エピトープに結合する抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分を生成または同定することができる。
【０１０６】
本明細書に記載の方法によって得られた抗ＰＤ−１抗体のクラスを別のクラスまたはサブクラスに変更またはスイッチしてもよい。本発明の一態様において、ＶＬまたはＶＨをコードする核酸分子を、ＣＬまたはＣＨをコードする核酸配列を含まないように当技術分野で周知の方法を使用して単離する。次に、ＶＬまたはＶＨをコードする核酸分子を、免疫グロブリン分子の異なるクラスからのＣＬまたはＣＨをコードする核酸配列に作動可能に連結させる。これは、上記のようにＣＬまたはＣＨ鎖を含むベクターまたは核酸分子を使用して行うことができる。例えば、当初ＩｇＭであった抗ＰＤ−１抗体を、ＩｇＧにクラススイッチしてもよい。さらに、クラススイッチングを使用して、１つのＩｇＧサブクラスを別のサブクラスに、例えばＩｇＧ１からＩｇＧ２に変換してもよい。κ軽鎖定常領域をλ軽鎖定常領域に変化させることができる。所望のＩｇアイソタイプを有する本発明の抗体を産生する好ましい方法は、抗ＰＤ−１抗体の重鎖をコードする核酸分子および抗ＰＤ−１抗体の軽鎖をコードする核酸分子を単離する工程と、重鎖の可変ドメインを得る工程と、重鎖の可変ドメインを所望のアイソタイプの重鎖の定常領域にライゲートする工程と、軽鎖およびライゲートした重鎖を細胞において発現させる工程と、所望のアイソタイプを有する抗ＰＤ−１抗体を収集する工程とを含む。
【０１０７】
本発明の抗ＰＤ−１抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤ分子でありうるが、典型的にはＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、またはＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の分子である。一実施形態において、抗体はＩｇＧ１である。別の実施形態において、抗体はＩｇＧ４である。
【０１０８】
一実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、Ｆｃ領域に少なくとも１つの突然変異を含みうる。変化したエフェクター機能を提供する多数の異なるＦｃ突然変異が公知である。例えば、多くの場合において、例えばリガンド／受容体相互作用が望ましくない場合、または抗体−薬物コンジュゲートの場合、エフェクター機能を低減または除去することが望ましい。
【０１０９】
一実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、エフェクター機能を低減させる少なくとも１つの突然変異をＦｃ領域に含む。エフェクター機能を低減させるために突然変異させることが有利であるＦｃ領域のアミノ酸位置は、アミノ酸位置がＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリングスキームに従って符番される、２２８、２３３、２３４、および２３５位の１つまたは複数を含む。
【０１１０】
一実施形態において、２３４位および２３５位でのアミノ酸残基の１つまたは両方を、例えばＬｅｕからＡｌａ（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）に突然変異させてもよい。これらの突然変異は、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のエフェクター機能を低減させる。さらにまたはあるいは、２２８位のアミノ酸残基を、例えばＰｒｏに突然変異させてもよい。別の実施形態において、２３３位のアミノ酸残基を、例えばＰｒｏに突然変異させてもよく、２３４位のアミノ酸残基を例えばＶａｌに変異させてもよく、および／または２３５位のアミノ酸残基を例えばＡｌａに突然変異させてもよい。アミノ酸の位置は、ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリングスキームに従って符番される。
【０１１１】
別の実施形態において、抗体がＩｇＧ４サブクラスの抗体である場合、抗体は、アミノ酸の位置がＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリングスキームに従って符番される、突然変異Ｓ２２８Ｐを含むことができ、すなわち２２８位にプロリンを有することができる。この突然変異は、望ましくないＦａｂアーム交換を低減させることが知られている。
【０１１２】
ある特定の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合部分は、抗体または抗体部分と１つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合または非共有結合によって形成されたより大きいイムノアドヘシンの一部でありうる。そのようなイムノアドヘシンの例には、４量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Kipriyanov et al., Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101 (1995))、ならびに二価のビオチン化ｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチド、およびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Kipriyanov et al., Mol. Immunol. 31:1047-1058 (1994)）が挙げられる。他の例には、目的の抗原に特異的に結合するイムノアドヘシンにするために共有結合または非共有結合によって抗体からの１つまたは複数のＣＤＲを分子に組み込むことが挙げられる。そのような実施形態において、ＣＤＲを、より大きいポリペプチド鎖の一部として組み込んでもよく、別のポリペプチド鎖に共有結合させてもよく、または非共有結合によって組み込んでもよい。
【０１１３】
別の実施形態において、別のポリペプチドに連結された本発明の抗ＰＤ−１抗体の全てまたは一部を含む融合抗体またはイムノアドヘシンを作製してもよい。ある特定の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体の可変ドメインのみがポリペプチドに連結される。ある特定の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体のＶＨドメインが第一のポリペプチドに連結され、抗ＰＤ−１抗体のＶＬドメインが、ＶＨおよびＶＬドメインが互いに相互作用して抗原結合部位を形成することができるように、第一のポリペプチドに会合する第二のポリペプチドに連結される。別の好ましい実施形態において、ＶＨドメインは、ＶＨおよびＶＬドメインが互いに相互作用することができるようにリンカーによってＶＬドメインから分離されている（例えば、一本鎖抗体）。次に、ＶＨ−リンカー−ＶＬ抗体を目的のポリペプチドに連結する。さらに、２つ（またはそれより多く）の一本鎖抗体が互いに連結している融合抗体を作製することができる。これは、単一のポリペプチド鎖上で二価もしくは多価抗体を作製したい場合、または二特異性抗体を作製したい場合に有用である。
【０１１４】
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を作製するために、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片を、フレキシブルリンカーをコードする、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別の断片に作動可能に連結し、ＶＨおよびＶＬ配列を、ＶＨおよびＶＬドメインがフレキシブルリンカーによって結合されている連続する一本鎖タンパク質として発現させることができる。例えば、Bird et al., Science 242:423 426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879 5883 (1988); and McCafferty et al., Nature 348:552 554 (1990)を参照されたい。一本鎖抗体は、１つのみのＶＨおよびＶＬを使用する場合には一価でありうる；２つのＶＨおよびＶＬを使用する場合には二価でありうる；または２つより多くのＶＨおよびＶＬを使用する場合には、多価でありうる。ヒトＰＤ−１と、例として別の分子とに特異的に結合する二特異性または多価抗体を作製してもよい。
【０１１５】
他の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体コード核酸分子を使用して他の修飾抗体を調製してもよい。例として、本明細書の教示に従って標準的な分子生物学技術を使用して、「カッパボディ」（Ill et al., Protein Eng. 10:949-57 (1997)）、「ミニボディ」（Martin et al., EMBO J. 13:5303-9 (1994)）、「ダイアボディ」（Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)）、または「ヤヌシン（ｊａｎｕｓｉｎ）」（Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991) and Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992)）を調製してもよい。
【０１１６】
本発明の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分を、誘導体化するか、または別の分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）に連結することができる。一般的に、抗体またはその部分は、ＰＤ−１結合が誘導体化または標識によって有害に影響を受けないように誘導体化される。したがって、本発明の抗体および抗体部分は、本明細書に記載のヒト抗ＰＤ−１抗体のインタクト型と修飾型の両方を含むと意図される。例えば、本発明の抗体または抗体部分を、別の抗体（例えば、二特異性抗体またはダイアボディ）、検出剤、薬剤、および／または抗体もしくは抗体部分と別の分子（ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグ）との会合を媒介することができるタンパク質もしくはペプチドなどの１つもしくは複数の他の分子に機能的に連結させることができる（例えば、化学カップリング、遺伝子融合、非共有結合、またはその他）。
【０１１７】
誘導体化抗体の１つのタイプは、２つ以上の抗体（同じタイプまたは異なるタイプの抗体、例えば二特異性抗体を作製するために）を架橋することによって産生される。適した架橋剤には、適切なスペーサーで隔てられた２つの別個の反応基を有するヘテロ二官能性（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）またはホモ二官能性（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）である架橋剤が挙げられる。そのようなリンカーは、例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌから得ることができる。
【０１１８】
抗ＰＤ−１抗体はまた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチルもしくはエチル基、または炭水化物基などの化学基によって誘導体化することもできる。これらの基は、抗体の生物特徴を改善するために、例えば血清中半減期を増加させるために有用でありうる。
【０１１９】
本発明に従う抗体はまた、標識してもよい。本明細書において使用される用語「標識」または「標識された」は、抗体に別の分子を取り込むことを指す。一実施形態において、標識は検出可能マーカー、例えば放射標識アミノ酸の取り込み、または標識したアビジン（例えば、光学法または比色測定法によって検出することができる蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出することができるビオチン化部分のポリペプチドへの結合である。別の実施形態において、標識またはマーカーは、治療的、例えば薬物コンジュゲートまたは毒素でありうる。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野で公知であり、使用することができる。ポリペプチドの標識の例には、放射性同位元素または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド燐光体）、酵素標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される既定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、ガドリニウムキレートなどの磁性剤、百日咳毒素などの毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそれらのアナログまたはホモログが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、標識は、起こりうる立体妨害を低減するために、様々な長さのスペーサーアームによって結合される。
【０１２０】
ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、中性型（両性イオン型を含む）または陽性荷電もしくは陰性荷電種として存在しうる。一部の実施形態において、抗体を、対イオンと複合体を形成させて、薬学的に許容される塩を形成してもよい。
【０１２１】
用語「薬学的に許容される塩」は、１つまたは複数の抗体と、薬学的に許容される無機および有機の酸および塩基から誘導される１つまたは複数の対イオンとを含む複合体を指す。
【０１２２】
二特異性結合分子
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体の結合特異性と、別の抗ＰＤ−１抗体（例えば、本明細書に記載の別の抗ＰＤ−１抗体）、または異なるタンパク質、例えば別の免疫チェックポイントタンパク質、がん抗原、もしくはその活性ががんなどの疾患状態を媒介する別の細胞表面分子を標的とする抗体の結合特異性とを有する二特異性結合分子を提供する。そのような二特異性結合分子は当技術分野で公知であり、二特異性結合分子の異なるタイプの例を本明細書において他所で示す。
【０１２３】
核酸分子およびベクター
本発明はまた、本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子および配列も提供する。一部の実施形態において、異なる核酸分子が、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖アミノ酸配列をコードする。他の実施形態において、同じ核酸分子が、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖アミノ酸配列をコードする。
【０１２４】
ヌクレオチド配列に対する言及は、特に明記しない限り、その相補体を包含する。このため、特定の配列を有する核酸に対する言及は、その相補的配列を有するその相補鎖を包含すると理解すべきである。本明細書において言及される用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれか、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾型である、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドのポリマー型を意味する。この用語は、一本鎖および二本鎖型を含む。
【０１２５】
本発明はまた、本明細書において列挙した１つまたは複数のヌクレオチド配列、例えば配列番号６９〜８８からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列も提供する。核酸配列の文脈における用語「パーセント配列同一性」は、最大に一致するように整列させた場合に２つの配列において同じである残基を指す。配列同一性比較の長さは、一続きの少なくとも約９ヌクレオチド、通常少なくとも約１８ヌクレオチド、より通常少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、および好ましくは少なくとも約３６、４８、またはそれ超のヌクレオチドでありうる。ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる、当技術分野で公知の多数の異なるアルゴリズムが存在する。例として、ポリヌクレオチド配列を、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅバージョン１０．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎにおけるプログラムである、ＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ、またはＢｅｓｔｆｉｔを使用して比較することができる。例えば、プログラムＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３を含むＦＡＳＴＡは、クエリ配列と検索配列との間の最善のオーバーラップ領域のアライメントおよびパーセント配列同一性を提供する（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258 (1996); and Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998)を参照されたい）。特に明記しない限り、特定のプログラムまたはアルゴリズムのデフォルトパラメータを使用する。例として、核酸配列間のパーセント配列同一性は、ＦＡＳＴＡをそのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６およびスコア行列に関してＮＯＰＡＭファクター）で使用するか、またはＧａｐを、全体が参照により本明細書に組み込まれているＧＣＧバージョン６．１で提供されるそのデフォルトパラメータで使用して決定することができる。
【０１２６】
一態様において、本発明は、配列番号６９〜８８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
【０１２７】
上記の実施形態のいずれにおいても、核酸分子は単離されうる。
【０１２８】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分の鎖の１つを発現するために適したベクターを提供する。本明細書において使用される用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。一部の実施形態において、ベクターは、プラスミド、すなわちその中に追加のＤＮＡセグメントがライゲートされうるＤＮＡの環状二本鎖小片である。一部の実施形態において、ベクターは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムの中にライゲートされうるウイルスベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、それが導入されている宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他の実施形態において、ベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。その上、特定のベクターは、それが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単純に「発現ベクター」）と呼ばれる。
【０１２９】
本発明は、本発明の抗ＰＤ−１抗体の重鎖もしくはその抗原結合部分、本発明の抗ＰＤ−１抗体の軽鎖もしくはその抗原結合部分、または本発明の抗ＰＤ−１抗体の重鎖および軽鎖もしくはその抗原結合部分の両方をコードする核酸分子を含むベクターを提供する。本発明はさらに、融合タンパク質、修飾抗体、抗体断片、およびそのプローブをコードする核酸分子を含むベクターを提供する。
【０１３０】
本発明の抗ＰＤ−１抗体の重鎖および／または軽鎖またはその抗原結合部分をコードする核酸分子は、そのような抗体または部分を産生する任意の起源から単離することができる。様々な実施形態において、核酸分子は、ヒトＰＤ−１抗原によって免疫した動物から単離された、抗ＰＤ−１抗体を発現するＢ細胞から、またはそのようなＢ細胞から産生された不死化細胞から単離される。抗体をコードする核酸を単離する方法は当技術分野で周知である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または抗体遺伝子のｃＤＮＡクローニングに使用するためのｃＤＮＡを産生するために、ｍＲＮＡを単離および使用してもよい。ある特定の実施形態において、本発明の核酸分子は単離されるよりむしろ合成することができる。
【０１３１】
一部の実施形態において、本発明の核酸分子は、任意の起源からの重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列にインフレームで結合した、本発明の抗ＰＤ−１抗体からのＶＨドメインまたは抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含みうる。同様に、本発明の核酸分子は、任意の起源からの軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列にインフレームで結合した、本発明の抗ＰＤ−１抗体からのＶＬドメインまたは抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含みうる。
【０１３２】
本発明のさらなる態様において、重（ＶＨ）および／または軽（ＶＬ）鎖の可変ドメインをコードする核酸分子を、完全長の抗体遺伝子に「変換」してもよい。一実施形態において、ＶＨまたはＶＬドメインをコードする核酸分子を、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに作動可能に連結され、および／またはＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結されるように、重鎖定常（ＣＨ）または軽鎖定常（ＣＬ）ドメインを既にコードする発現ベクターにそれぞれ挿入することによって、完全長の抗体遺伝子に変換する。別の実施形態において、ＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードする核酸分子を、標準的な分子生物学技術を使用してＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードする核酸分子を、ＣＨおよび／またはＣＬドメインをコードする核酸分子に連結する、例えばライゲートすることによって、完全長の抗体遺伝子に変換する。次に、完全長の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子を、それが導入されている細胞から発現させて、抗ＰＤ−１抗体を単離してもよい。
【０１３３】
核酸分子を使用して、大量の抗ＰＤ−１抗体を組換え発現させてもよい。核酸分子はまた、本明細書に記載のキメラ抗体、二特異性抗体、一本鎖抗体、イムノアドヘシン、ダイアボディ、突然変異抗体および抗体誘導体を産生するために使用してもよい。
【０１３４】
別の実施形態において、本発明の核酸分子は、特異的抗体配列に関するプローブまたはＰＣＲプライマーとして使用される。例として、核酸は、診断方法におけるプローブとして、または中でも抗ＰＤ−１抗体の可変ドメインをコードするさらなる核酸分子を単離するために使用することができるＤＮＡの領域を増幅するためにＰＣＲプライマーとして使用することができる。一部の実施形態において、核酸分子はオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、目的の抗体の重鎖および軽鎖の超可変ドメインに由来する。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の本発明の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分のＣＤＲの１つまたは複数の全てまたは一部をコードする。
【０１３５】
別の実施形態において、核酸分子およびベクターは、突然変異した抗ＰＤ−１抗体を作製するために使用してもよい。抗体は、例えば抗体の結合特性を変更するために重鎖および／または軽鎖の可変ドメインにおいて突然変異させてもよい。例えば、抗ＰＤ−１抗体のＫＤを増加もしくは減少するために、ｋｏｆｆを増加もしくは減少させるために、または抗体の結合特異性を変更するために、ＣＤＲの１つまたは複数において突然変異を導入してもよい。別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体における、生殖系列と比較して変化することが知られているアミノ酸残基で、１つまたは複数の突然変異を作製する。突然変異は、可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域において、または定常領域において作製してもよい。好ましい実施形態において、可変ドメインにおいて突然変異を作製する。一部の実施形態において、本発明の抗体の可変ドメインまたはその抗原結合部分のＣＤＲまたはフレームワーク領域における、生殖系列と比較して変化することが知られているアミノ酸残基で、１つまたは複数の突然変異を作製する。
【０１３６】
別の実施形態において、フレームワーク領域を、得られたフレームワーク領域が、対応する生殖系列遺伝子のアミノ酸配列を有するように突然変異させる。抗ＰＤ−１抗体の半減期を増加させるために、突然変異をフレームワーク領域または定常領域において作製してもよい。例えば、ＰＣＴ公報国際公開第００／０９５６０号を参照されたい。フレームワーク領域または定常領域における突然変異もまた、抗体の免疫原性を変化させるために、および／または別の分子に対する共有結合もしくは非共有結合のための部位を提供するために作製することができる。本発明に従って、単一の抗体が、可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域の任意の１つもしくは複数において、または定常領域において突然変異を有してもよい。
【０１３７】
一部の実施形態において、本発明の抗ＰＤ−１抗体または抗原結合部分は、遺伝子が転写および翻訳制御配列などの必要な発現制御配列に作動可能に連結されるように、上記で得られた部分的または完全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入することによって発現させる。発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソーム等が挙げられる。抗体コード配列を、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体コード配列の転写および翻訳を調節する、その意図される機能を発揮するように、ベクターにライゲートしてもよい。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合性であるように選択されうる。抗体軽鎖コード配列および抗体重鎖コード配列を個別のベクターに挿入して、同じまたは異なる発現制御配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結してもよい。一実施形態において、両方のコード配列を同じ発現ベクターに挿入し、同一の発現制御配列（例えば、プロモーター）を分離するために同じ発現制御配列（例えば、共通のプロモーター）に、または異なる発現制御配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結してもよい。抗体コード配列を、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限部位のライゲーションまたは制限部位が存在しない場合には平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入してもよい。
【０１３８】
簡便なベクターは、任意のＶＨまたはＶＬ配列を上記のように容易に挿入して発現させることができるように工学操作されている適切な制限部位を有する、機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬ免疫グロブリン配列をコードするベクターである。そのようなベクターにおけるＨＣおよびＬＣコード遺伝子は、関連するｍＲＮＡを安定化することによって全体的な抗体タンパク質の収率を増加させる、イントロン配列を含み得る。イントロン配列は、ＲＮＡスプライシングが起こる場所を決定するスプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位に隣接する。イントロン配列の位置は、抗体鎖の可変もしくは定常領域のいずれかでありうるか、または多数のイントロンを使用する場合には可変および定常領域の両方でありうる。ポリアデニル化および転写終止は、コード領域の下流のネイティブ染色体部位で起こりうる。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードしうる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが免疫グロブリン鎖のアミノ末端にインフレームで連結されるようにベクターにおいてクローニングされうる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）でありうる。
【０１３９】
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有しうる。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等などの要因に依存しうることは当業者に認識されるであろう。哺乳動物宿主細胞発現にとって好ましい調節配列は、哺乳動物細胞において高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメント、例えばレトロウイルスＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマ、ならびにネイティブ免疫グロブリンおよびアクチンプロモーターなどの強い哺乳動物プロモーターに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。ウイルス調節エレメントおよびその配列に関する詳しい記述に関しては、例えば、米国特許第５，１６８，０６２号、第４，５１０，２４５号、および第４，９６８，６１５号を参照されたい。プロモーターおよびベクターの記述、ならびに植物の形質転換を含む、植物において抗体を発現させる方法は、当技術分野で公知である。例えば米国特許第６，５１７，５２９号を参照されたい。細菌細胞または真菌細胞、例えば酵母細胞においてポリペプチドを発現させる方法もまた、当技術分野で周知である。
【０１４０】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列（例えば、複製開始点）および選択可能マーカー遺伝子などの追加の配列を有しうる。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号、および第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例えば、典型的に選択可能マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ヒグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を、ベクターが導入されている宿主細胞に付与する。例えば、選択可能マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ−宿主細胞においてメトトレキサート選択／増幅に使用するため）、ｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）、およびグルタミン酸シンテターゼ遺伝子が挙げられる。
【０１４１】
本明細書において使用される用語「発現制御配列」は、それがライゲートされるコード配列の発現およびプロセシングを行うために必要であるポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列には、適切な転写開始、終止、プロモーター、およびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増加させる配列；および望ましければタンパク質分泌を増加させる配列が挙げられる。そのような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なり、原核生物では、そのような制御配列は一般的にプロモーター、リボソーム結合部位、および転写終止配列を含み、真核生物では一般的に、そのような制御配列はプロモーターおよび転写終止配列を含む。用語「制御配列」は、その存在が発現およびプロセシングにとって必須である少なくとも全ての成分を含むと意図され、同様にその存在が有利である追加の成分、例えばリーダー配列および融合パートナー配列も含みうる。
【０１４２】
抗体および抗体組成物産生のための宿主細胞および方法
本発明のさらなる態様は、本発明の抗体組成物ならびに抗体および抗原結合部分を産生する方法に関する。本発明のこの態様の一実施形態は、抗体を発現することができる組換え宿主細胞を提供すること、前記宿主細胞を抗体の発現にとって適した条件で培養すること、および得られた抗体を単離することを含む、本明細書において定義される抗体を産生する方法に関する。そのような組換え宿主細胞におけるそのような発現によって産生された抗体を、本明細書において「組換え抗体」と呼ぶ。本発明はまた、そのような宿主細胞の子孫細胞、そのような子孫細胞によって産生された抗体も提供する。
【０１４３】
本明細書において使用される用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入されている細胞を意味する。本発明は、例えば上記の本発明に従うベクターを含みうる宿主細胞を提供する。本発明はまた、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分の、重鎖またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、軽鎖またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、またはその両方を含む宿主細胞も提供する。「組換え宿主細胞」および「宿主細胞」は、特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の子孫も意味すると理解すべきである。その後の世代では、突然変異または環境の影響のいずれかにより特定の修飾が起こりうることから、そのような子孫は、実際には親細胞と同一ではないが、それでもなお本明細書において使用される用語「宿主細胞」の範囲に含まれる。
【０１４４】
抗ＰＤ−１抗体をコードする核酸分子およびこれらの核酸分子を含むベクターは、適した哺乳動物、植物、細菌、または酵母宿主細胞のトランスフェクションのために使用することができる。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の公知の方法によって行うことができる。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入する方法は当技術分野で周知であり、これには、デキストラン法によるトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン法によるトランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、ポリヌクレオチドのリポソームへの封入、およびＤＮＡの核への直接マイクロインジェクションが挙げられる。さらに、核酸分子をウイルスベクターによって哺乳動物細胞に導入してもよい。細胞を形質転換する方法は当技術分野で周知である。例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，９１２，０４０号、第４，７４０，４６１号、および第４，９５９，４５５号を参照されたい。例えばアグロバクテリウム法による形質転換、バイオリスティック形質転換、直接注入、電気穿孔、およびウイルス形質転換を含む、植物細胞を形質転換する方法は、当技術分野で周知である。細菌および酵母細胞を形質転換する方法も同様に当技術分野で周知である。
【０１４５】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当技術分野で周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が挙げられる。これらには、中でもチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞、および他の多くの細胞株が挙げられる。特に好ましい細胞株は、どの細胞株が高い発現レベルを有するかを決定することによって選択される。使用することができる他の細胞株は、昆虫細胞株、例えばＳｆ９またはＳｆ２１細胞である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを、哺乳動物宿主細胞に導入する場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現を可能にするために、またはより好ましくは宿主細胞が増殖する培養培地への抗体の分泌を可能にするために十分な期間、宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を使用して、培養培地から回収することができる。植物細胞には、例えば、ニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ウキクサ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ等が挙げられる。細菌宿主細胞には、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種が挙げられる。酵母宿主細胞には、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられる。
【０１４６】
さらに、産生細胞株からの本発明の抗体またはその抗原結合部分の発現は、多数の公知の技術を使用して増強することができる。例えばグルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）は、ある特定の条件下での発現を増強するための一般的なアプローチである。ＧＳ系は、全てまたは一部が、欧州特許第０２１６８４６号、第０２５６０５５号、第０３２３９９７号、および第０３３８８４１号に関連して考察されている。
【０１４７】
異なる細胞株によってまたはトランスジェニック動物において発現された抗体は、互いに異なるグリコシル化パターンを有する可能性がある。しかし、本明細書において提供される核酸分子によってコードされる、または本明細書において提供されるアミノ酸配列を含む抗体は全て、抗体のグリコシル化状態によらず、より一般的には、翻訳後修飾の有無によらず、本発明の抗体の一部である。
【０１４８】
医薬組成物
本発明の別の態様は、本発明の抗ＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合部分、または抗ＰＤ−１抗体組成物を活性成分として（または唯一の活性成分として）含む医薬組成物である。医薬組成物は、本明細書に記載の任意の抗ＰＤ−１抗体組成物または抗体もしくはその抗原結合部分を含みうる。一部の実施形態において、組成物は、ＰＤ−１関連障害（例えば、ＰＤ−１の過剰発現または過剰活性によって特徴付けられる障害）および／またはがんの改善、予防、および／または処置のために意図される。一部の実施形態において、組成物は、免疫系の活性化のために意図される。ある特定の実施形態において、組成物は、皮膚、肺、腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟部組織、造血系、頭頚部、肝臓、膀胱、乳房、胃、子宮、および膵臓などの組織で発生するがんの改善、予防、および／または処置のために意図される。
【０１４９】
一般的に、本発明の抗体またはその抗原結合部分は、例えば以下に記述されるような１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と会合した製剤として投与するために適している。
【０１５０】
本発明の医薬組成物は、本発明の１つまたは複数の抗ＰＤ−１抗体または結合部分、例えば１つまたは２つの抗ＰＤ−１抗体または結合部分を含む。一実施形態において、組成物は、本発明の単一の抗ＰＤ−１抗体またはその結合部分を含む。
【０１５１】
別の実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１つの抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分、例えば１つの抗ＰＤ−１抗体または部分と、１つまたは複数の関連する細胞表面受容体、例えば１つまたは複数のがん関連受容体を標的とする１つまたは複数の追加の抗体とを含みうる。
【０１５２】
用語「賦形剤」は、本明細書において本発明の化合物以外の任意の成分を記述するために使用される。賦形剤の選択は、特定の投与様式、溶解度および安定性に及ぼす賦形剤の効果、および投与剤形の性質などの要因に大きい程度に依存する。本明細書において使用される「薬学的に許容される賦形剤」は、生理学的に適合性であるありとあらゆる溶媒、分散培地、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等を含む。薬学的に許容される賦形剤のいくつかの例は、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、ならびにその組み合わせである。多くの場合、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。薬学的に許容される物質のさらなる例は、湿潤剤または微量の補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、抗体の貯蔵寿命または有効性を増強する保存剤または緩衝剤である。
【０１５３】
本発明の医薬組成物およびその調製方法は、当業者に容易に明らかであろう。そのような組成物およびその調製方法は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995)において見出されうる。医薬組成物は好ましくは、ＧＭＰ（医薬品等の製造管理品質管理基準）に従って製造される。
【０１５４】
本発明の医薬組成物は、バルク、単一単位用量、または複数の単一単位用量として調製、梱包、または販売することができる。本明細書において使用される「単位用量」は、活性成分の既定量を含む医薬組成物の別個の量である。活性成分の量は、一般的に対象に投与される活性成分の用量に等しいか、または例えばそのような用量の２分の１または３分の１などのそのような用量の簡便な分画に等しい。
【０１５５】
当技術分野において容認されている、ペプチド、タンパク質、または抗体を投与する任意の方法を、本発明の抗体および抗原結合部分のために適切に使用することができる。
【０１５６】
本発明の医薬組成物は典型的には、非経口投与にとって適している。本明細書において使用されるように、医薬組成物の「非経口投与」は、対象の組織の物理的侵害によって特徴づけられる任意の投与経路、およびそれによって一般的に血流、筋肉、または内部臓器への直接投与がもたらされる、組織の侵害を通しての医薬組成物の投与を含む。このため、非経口投与は、組成物の注射による医薬組成物の投与、外科的切開を通しての組成物の適用、組織を貫通する非外科的創傷を通しての組成物の適用等を含むが、これらに限定されない。特に、非経口投与は、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内、静脈内、動脈内、髄腔内、脳室内、尿道内、頭蓋内、および滑膜内の注射または注入、ならびに腎透析注入技術を含むがこれらに限定されないと企図される。局所灌流もまた企図される。好ましい実施形態は、静脈内および皮下経路を含む。
【０１５７】
非経口投与にとって適した医薬組成物の製剤は典型的に、薬学的に許容される担体、例えば滅菌水または滅菌等張食塩水と組み合わせた活性成分を含む。そのような製剤は、ボーラス投与または持続的投与にとって適した剤形で調製、梱包、または販売されうる。注射可能製剤は、保存剤を含むアンプルまたは多用量容器などの単位投与剤形で調製、梱包、または販売することができる。非経口投与のための製剤には、懸濁剤、液剤、油性または水性媒体中の乳剤、パスタ剤等が挙げられるがこれらに限定されない。そのような製剤は、懸濁剤、安定化剤、または分散剤を含むがこれらに限定されない１つまたは複数の追加の成分をさらに含みうる。非経口投与のための製剤の一実施形態において、活性成分は、適した媒体（例えば、滅菌発熱物質フリー水）によって再構成した後、再構成された組成物を非経口投与するための乾燥（すなわち、粉末または顆粒）剤形で提供される。非経口投与製剤はまた、塩、炭水化物、および緩衝剤（好ましくはｐＨ３〜９）などの賦形剤を含みうる水溶液を含むが、一部の応用に関しては、それらはより適切には、滅菌の非水溶液として製剤化されうるか、または滅菌の発熱物質フリー水などの適した媒体と共に使用される乾燥剤形として製剤化されうる。例示的な非経口投与剤形には、滅菌水溶液、例えばプロピレングリコールまたはデキストロース水溶液中の溶液または懸濁液が挙げられる。そのような投与剤形は、必要に応じて適切に緩衝させることができる。有用である他の非経口投与可能な製剤は、微結晶型のまたはリポソーム調製物中の活性成分を含む製剤を含む。非経口投与のための製剤は、即時および／または調節された放出となるように製剤化することができる。放出調節製剤には、遅延、持続的、パルス、制御、標的化、およびプログラム放出が挙げられる。
【０１５８】
例えば、一態様において、滅菌注射可能溶液は、抗ＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合部分または抗ＰＤ−１抗体組成物の必要量を、上記で列挙した成分の１つまたは組み合わせと共に適切な溶媒に組み入れた後、必要に応じてろ過滅菌することによって調製することができる。一般的に、分散剤は、活性化合物を、基本分散培地および上記で列挙した成分からの必要な他の成分を含む滅菌媒体に組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予めろ過滅菌されたその溶液から、活性成分に加えて任意の追加の所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングを使用することによって、分散剤の場合には必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。注射可能組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含めることによって、および／または放出調節コーティング（例えば、徐放性コーティング）を使用することによってもたらすことができる。
【０１５９】
本発明の抗体は、鼻腔内または吸入によって、典型的に乾燥粉末インヘラーからの乾燥粉末剤形（単独で、混合物として、または例えば適した薬学的に許容される賦形剤と混合した混合成分粒子として）で、適したプロペラントの存在下または非存在下で、加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー（好ましくは、微細なミストを産生するために電気流体力学を使用するアトマイザー）、もしくはネブライザーからのエアロゾルスプレーとして、または点鼻液として投与することができる。
【０１６０】
加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー、またはネブライザーは、一般的に例えば適した分散剤、溶解剤、または活性物質の放出を持続させる薬剤、溶媒としてのプロペラントを含む、本発明の抗体の溶液または懸濁液を含む。
【０１６１】
乾燥粉末または懸濁液製剤での使用前に、薬物産物は一般的に、吸入によるデリバリーにとって適した大きさ（典型的に５マイクロメートル未満）となるように微粉化される。これは、スパイラルジェットミル、流動床ジェットミル、ナノ粒子を形成するための超臨界流体プロセシング、高圧ホモジナイゼーション、または噴霧乾燥などの任意の適切な粉砕方法によって達成することができる。
【０１６２】
インヘラーまたは吸入器において使用するためのカプセル剤、ブリスタパック、およびカートリッジは、本発明の化合物、適した粉末基剤、および性能修飾剤の粉末混合物を含むように製剤化することができる。
【０１６３】
微細なミストを産生するために電気流体力学を使用するアトマイザーにおいて使用するための適した液剤は、１回作動あたり本発明の抗体の適した用量を含むことができ、作動容積は、例えば１μＬ〜１００μＬまで変化しうる。
【０１６４】
適した香料、例えばメントールおよびレボメントール、または甘味料、例えばサッカリンまたはサッカリンナトリウムを、吸入／鼻腔内投与のために意図される本発明のそれらの製剤に添加してもよい。
【０１６５】
吸入／鼻腔内投与のための製剤は、即時および／または修飾放出となるように製剤化することができる。放出調節製剤は、遅延、持続、パルス、制御、標的化、およびプログラム放出を含む。
【０１６６】
乾燥粉末インヘラーおよびエアロゾルの場合、用量単位は、一定量を送達するバルブによって決定される。本発明に従う単位は、典型的には本発明の抗体の一定量または「一吹き」を送達するように配置される。総一日量は、典型的には、１回用量で投与されるか、またはより通常、１日を通して分割用量で投与される。
【０１６７】
本発明の抗体および抗体部分はまた、経口経路投与のために製剤化されうる。経口投与は、化合物が消化管に入るように飲み込むこと、および／またはそれによって化合物が口から直接血流に入る口腔内、舌、または舌下投与を伴いうる。
【０１６８】
経口投与にとって適した製剤は、錠剤；多数のまたはナノ粒子、液体、または粉末を含む軟カプセルまたは硬カプセル；トローチ剤（液体充填型を含む）；咀嚼剤、ゲル；速崩性投与剤形；フィルム；オビュール（ｏｖｕｌｅ）；スプレー；および口腔内／粘膜接着パッチなどの、液体、または粉末固体、半固体、および液体系を含む。
【０１６９】
液体製剤は、懸濁剤、液剤、シロップ剤、およびエリキシル剤を含む。そのような製剤は、軟または硬カプセル（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースから作製される）内の充填剤として使用してもよく、典型的には、担体、例えば水、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、または適した油、ならびに１つまたは複数の乳化剤および／または懸濁剤を含む。液体製剤はまた、例えば分包剤からの固体の再構成によって調製することができる。
【０１７０】
本発明の抗体および組成物の治療的使用
一態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体およびその抗原結合部分、抗ＰＤ−１組成物、および二特異性結合分子は、それを必要とするヒトにおいて免疫系を増強または活性化するために使用される。一部の実施形態において、患者は、ＰＤ−１の過剰発現または過剰活性によって特徴付けられる状態を有する。一部の実施形態において、患者は免疫抑制されている。ある特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合部分、組成物、または二特異性結合分子医薬組成物は、がん、例えば皮膚、肺、腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟部組織、造血系、頭頚部、肝臓、膀胱、乳房、胃、子宮、および膵臓などの組織で発生するがん、ならびにＰＤ−１活性に依存する、または患者がＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、もしくはその両方を発現もしくは過剰発現する、任意のがんまたは他の状態の処置において使用するためである。本発明の抗ＰＤ−１抗体、その抗原結合部分、抗ＰＤ−１組成物、および／または二特異性結合分子によって処置されるがんは、例えば、黒色腫（例えば進行黒色腫、または切除不能もしくは転移性黒色腫）、非小細胞肺がん、膀胱がん、頭頚部扁平上皮癌、卵巣がん、結腸直腸がん、ホジキンリンパ腫、および腎細胞癌（ＲＣＣ）が挙げられうる。
【０１７１】
一部の実施形態において、本発明の抗ＰＤ−１抗体、抗原結合部分、抗ＰＤ−１組成物、および／または二特異性結合分子によって処置されるがんには、例えば、黒色腫（例えば進行黒色腫、または転移性黒色腫）、非小細胞肺がん、頭頚部扁平上皮がん、腎細胞癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、神経膠芽腫、神経膠腫、肺扁平上皮がん、小細胞肺がん、肝細胞癌、膀胱がん、上部尿路上皮がん、食道がん、胃食道接合部がん、胃がん、肝臓がん、結腸がん、結腸直腸癌、多発性骨髄腫、肉腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、鼻咽頭がん、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、小リンパ性リンパ腫、卵巣がん、胃腸癌、原発性腹腔がん、ファロピウス管がん、尿路上皮がん、ＨＴＬＶ関連Ｔ細胞白血病／リンパ腫、前立腺がん、尿生殖器がん、髄膜腫、副腎皮質がん、神経膠肉腫、線維肉腫、腎臓がん、乳がん、膵臓がん、子宮内膜がん、皮膚基底細胞がん、虫垂がん、胆管がん、唾液腺がん、進行メルケル細胞がん、びまん性大細胞Ｂリンパ腫、濾胞性リンパ腫、中皮腫、および固形腫瘍が挙げられうる。
【０１７２】
「処置する」、「処置している」、および「処置」は、生物学的障害および／またはその付随する症状の少なくとも１つを軽減または除去する方法を指す。本明細書において使用される、疾患、障害、または状態を「軽減する」ことは、疾患、障害、または状態の症状の重症度および／または発生頻度を低減させることを意味する。さらに、本明細書における「処置」という言及は、治癒、緩和、および予防的処置に対する言及を含む。
【０１７３】
「治療有効量」は、処置される障害の症状の１つまたは複数をある程度軽減する、投与される治療剤の量を指す。抗がん治療薬の治療有効量は、腫瘍の縮小、生存の増加、がん細胞の消失、疾患進行の減少、転移の逆転、または医療の専門家にとって望ましい他の臨床エンドポイントをもたらしうる。
【０１７４】
本発明の抗体組成物または抗体もしくはその抗原結合部分は、単独で、または１つもしくは複数の他の薬物もしくは抗体と共に（またはその任意の組み合わせとして）投与することができる。本発明の医薬組成物、方法、および使用は、以下に詳述するように他の活性剤と併用（同時投与）する実施形態も包含する。
【０１７５】
本明細書において、本発明の抗体組成物ならびに抗体およびその抗原結合部分を参照して使用される、１つまたは複数の他の治療剤と「同時投与」、「同時投与される」、および「併用される」という用語は、以下：
−  そのような成分が前記患者に前記成分を実質的に同時に放出する単一の投与剤形に共に製剤化されている場合、処置を必要とする患者への、本発明の抗体組成物／抗体／抗原結合部分と、治療剤とのそのような組み合わせの同時投与、
−  そのような成分が、前記患者によって実質的に同時に服用される個別の投与剤形に別々に製剤化される場合、それによって前記成分が前記患者に実質的に同時に放出される、処置を必要とする患者への本発明の抗体組成物／抗体／抗原結合部分と、治療剤とのそのような組み合わせの実質的に同時投与、
−  そのような成分が、それぞれの投与の間に有意な時間間隔で前記患者によって連続する時間で服用される個別の投与剤形に別々に製剤化される場合、それによって前記成分が前記患者に実質的に異なる時間に放出される、処置を必要とする患者への本発明の抗体組成物／抗体／抗原結合部分と、治療剤とのそのような組み合わせの連続的投与
−  そのような成分が、前記成分を制御された方法で放出する単一の投与剤形に共に製剤化される場合、それによってそれらが前記患者に同時におよび／または異なる時間に同時、連続的、および／またはオーバーラップするように放出される、処置を必要とする患者への本発明の抗体組成物／抗体／抗原結合部分と、治療剤とのそのような組み合わせの連続的投与であって、
それぞれの部分が同じ経路または異なる経路のいずれかで投与されうる、投与
を意味すると意図される、指す、および含む。
【０１７６】
本発明の抗体組成物ならびに抗体およびその抗原結合部分は、追加の治療的処置を行わずに、すなわち単独の治療として投与されうる。あるいは、本発明の抗体組成物ならびに抗体およびその抗原結合部分による処置は、少なくとも１つの追加の治療的処置（併用治療）を含みうる。一部の実施形態において、抗体組成物または抗体もしくはその抗原結合部分は、がんの処置のために別の薬剤／薬物と同時投与されるまたは共に製剤化されうる。追加の治療的処置は、例えば化学療法剤、抗新生物剤、抗血管新生剤、異なる抗がん抗体、および／または放射線治療を含みうる。
【０１７７】
本発明の抗体組成物、抗体、または抗原結合部分を、癌細胞の最終分化を誘導することが知られている薬剤と併用することによって、効果をさらに改善することができる。そのような化合物は、例えば、レチノイン酸、トランスレチノイン酸、シスレチノイン酸、フェニル酪酸塩、神経生長因子、ジメチルスルホキシド、活性型ビタミンＤ３、ペルオキシソーム増殖因子−活性化受容体ガンマ、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボル１３−アセテート、ヘキサメチレン−ビス−アセトアミド、トランスフォーミング増殖因子−ベータ、酪酸、環状ＡＭＰ、およびベスナリノンからなる群から選択されうる。一部の実施形態において、化合物は、レチノイン酸、フェニル酪酸塩、オールトランスレチノイン酸、および活性型ビタミンＤからなる群から選択される。
【０１７８】
本発明の抗ＰＤ−１抗体組成物または抗ＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合部分と、少なくとも１つの他の薬剤（例えば、化学療法剤、抗新生物剤、または抗血管新生剤）は、がん治療において同時、個別、または連続的投与のための併用処置として使用することができる。他の薬剤は、問題の特定のがんの処置にとって適した任意の薬剤、例えばアルキル化剤、例えばシスプラチン、カルボプラチン、および／またはオキサリプラチンなどの白金誘導体；植物アルカロイド、例えばパクリタキセル、ドセタキセル、および／またはイリノテカン：抗腫瘍抗生物質、例えばドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、アクチノマイシン、ルテオマイシン、および／またはマイトマイシン；トポテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤；ならびに／または抗代謝剤、例えばフルオロウラシルおよび／または他のフルオロピリミジンからなる群から選択される薬剤でありうる。
【０１７９】
本発明の抗ＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合部分または抗ＰＤ−１抗体組成物はまた、ワクチン、サイトカイン、酵素阻害剤、およびＴ細胞治療などの他の抗がん治療と併用して使用することができる。ワクチンの場合、これは例えば、処置されるがんに関連する１つまたは複数の抗原を含むタンパク質、ペプチド、もしくはＤＮＡワクチン、または抗原と共に樹状細胞を含むワクチンでありうる。適したサイトカインには、例えばＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、およびＧＭ−ＣＳＦが挙げられる。抗がん活性を有するタイプの酵素阻害剤の例は、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、例えば１−メチル−Ｄ−トリプトファン（１−Ｄ−ＭＴ）である。養子Ｔ細胞治療は、自身の腫瘍を認識して攻撃する患者自身のＴ細胞を増加させるまたは操作することを伴う様々な免疫治療技術を指す。
【０１８０】
同様に、本発明の抗ＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合部分または抗ＰＤ−１抗体組成物は、チロシンキナーゼ阻害剤と共に補助治療において使用されうると企図される。これらは、受容体の細胞内チロシンキナーゼドメインと相互作用し、細胞内Ｍｇ−ＡＴＰ結合部位に関して競合することによってリガンド誘発受容体リン酸化を阻害する、合成の、主にキナゾロン由来の低分子量分子である。
【０１８１】
一部の実施形態において、抗体組成物または抗体もしくはその抗原結合部分は、Ａ２ＡＲ、ＢＬＴＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ５５、ＣＤ７３、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＣＴＬＡ−３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＧＡＬ９、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＩＲ１、ＬＡＧ−３、ＯＸ４０、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３、ＴＧＦＲ−ベータ、ＶＩＳＴＡおよび／または２Ｂ４の発現または活性を媒介する薬剤を含むがこれらに限定されない、免疫系の活性化を媒介する別の薬剤／薬物と併用して使用することができる。ある特定の実施形態において、薬剤は、上記の分子の１つに結合する抗体またはその抗原結合断片である。ある特定の実施形態において、本発明の抗体組成物または抗体もしくはその抗原結合部分は、ＣＴＬＡ−４阻害剤（例えば、トレメリムマブまたはイピリムマブなどの抗ＣＴＬＡ−４抗体）と併用して投与することができる、一実施形態において、本発明の抗体組成物または抗体もしくはその抗原結合部分は、イピリムマブと併用して投与されうる。
【０１８２】
ある特定の態様において、本発明の抗体および抗原結合部分は、ＰＤ−１または１つもしくは複数のそのリガンドを標的としうるＰＤ−１経路の別の阻害剤と併用して投与することができる。そのような阻害剤の例には、他の抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および抗ＰＤ−Ｌ２抗体が挙げられる。一部の実施形態において、本発明の抗体組成物、抗体、および／または抗原結合部分は、ペンブロリズマブおよび／またはニボルマブと併用して投与されうる。
【０１８３】
本発明の抗体組成物ならびに抗体およびその抗原結合部分は、本明細書に記載の処置方法において使用されうる、本明細書に記載の処置において使用するためでありうる、および／または本明細書に記載の処置のための薬剤の製造に使用するためでありうると理解される。
【０１８４】
用量および投与経路
本発明の抗体組成物は、問題の状態の処置のために有効量で、すなわち所望の結果を達成するために必要な用量および期間で投与される。治療有効量は、処置される特定の状態、患者の年齢、性別、および体重、ならびに抗体が単独処置として投与されるか、または１つもしくは複数の追加の抗がん処置と併用して投与されるかなどの要因に従って変化しうる。
【０１８５】
投与レジメンは、最適な所望の応答を提供するために調節することができる。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、または治療状況の緊急性に応じて用量をそれに比例して低減もしくは増加させてもよい。投与の容易さおよび用量の均一性のために非経口組成物を単位投与剤形に製剤化することは特に有利である。本明細書において使用される単位投与剤形は、それぞれの単位が、必要な薬学的担体に会合して所望の治療効果を生じるように計算された活性化合物の既定量を含む、処置される患者／対象にとって単位用量として適した物理的に個別の単位を指す。本発明の単位投与剤形の仕様は、（ａ）化学療法剤の独自の特徴、および達成される特定の治療効果または予防効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の処置のためにそのような活性化合物を合成する当技術分野における固有の限界によって一般的に左右され、直接依存する。
【０１８６】
このため、当業者は、本明細書に提供される開示に基づいて、用量および投与レジメンが、治療の技術分野において周知の方法に従って調節されることを認識するであろう。すなわち、最大忍容量を容易に確立することができ、患者に検出可能な治療恩典を提供する有効量を、患者に検出可能な治療的恩典を提供するためにそれぞれの薬剤を投与するための時間的必要条件と同様に決定することができる。したがって、ある特定の用量および投与レジメンを本明細書において例示するが、これらの例は、本発明を実践するために患者に提供されうる用量および投与レジメンを決して制限しない。
【０１８７】
用量の値は、軽減される状態のタイプおよび重症度によって変化しうること、および単回用量または複数回用量を含みうることに注意すべきである。さらに、任意の特定の対象に関して、特定の用量レジメンを、個々の要求および組成物を投与するまたは投与を管理する人の専門的判断に応じて経時的に調節すべきであること、ならびに本明細書に記載の用量範囲は単なる例に過ぎず、具体化された組成物の範囲または実践を制限する意図はないと理解すべきである。さらに、本発明の組成物による投与レジメンは、疾患のタイプ、患者の年齢、体重、性別、医学的状態、状態の重症度、投与経路、および使用される特定の抗体を含む多様な要因に基づきうる。このため、投与レジメンは広く異なりうるが、標準的な方法を使用して日常的に決定することができる。例えば、毒性作用、および／または臨床検査値などの臨床効果を含みうる薬物動態または薬力学的パラメータに基づいて用量を調節してもよい。このため、本発明は、当業者によって決定される患者内の用量増加を包含する。適切な用量およびレジメンの決定は関連技術分野において周知であり、本明細書において開示される教示が提供されれば、当業者によって包含されると理解されるであろう。
【０１８８】
本発明の抗体組成物の適した用量は、約０．５〜５０ｍｇ／ｋｇなどの０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲、例えば、約１〜２０ｍｇ／ｋｇであると企図される。抗体組成物は、少なくとも０．２５ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも１ｍｇ／ｋｇなどの少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも２ｍｇ／ｋｇなどの少なくとも１．５ｍｇ／ｋｇ、例えば、少なくとも４ｍｇ／ｋｇなどの少なくとも３ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも５ｍｇ／ｋｇ；および例えば多くても３０ｍｇ／ｋｇなどの多くても５０ｍｇ／ｋｇ、例えば多くても１５ｍｇ／ｋｇなどの多くても２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されうる。投与は通常、適した間隔で、例えば１週間に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、または４週間毎に１回、および必要に応じて用量を適宜増加または減少させることができる責任のある医師が適切であると考える期間、繰り返される。
【０１８９】
腫瘍治療の有効量は、患者における、疾患の進行を安定化させるその能力および／または症状を軽減する能力によって、ならびに好ましくは例えば腫瘍サイズを低減させることによる疾患の進行を逆転させる能力によって測定することができる。本発明の抗体または組成物ががんを阻害する能力は、例えば実施例に記載のインビトロアッセイによって、ならびにヒト腫瘍における効能を予測する、適した動物モデルにおいて評価することができる。それぞれの特定の状況、例えば単回ボーラスとしてまたは連続注入として投与される状況において最適な治療応答を提供するために、適した投与レジメンを選択し、それぞれの場合の緊急性に応じて用量の調節が可能である。
【０１９０】
診断的使用および組成物
本発明の抗体はまた、診断プロセス（例えば、インビトロ、エクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ））においても有用である。例えば、抗体は、患者からの試料（例えば、組織試料、または炎症滲出物、血液、血清、腸液、唾液、もしくは尿などの体液試料）中のＰＤ−１のレベルを検出および／または測定するために使用することができる。適した検出および測定方法には、フローサイトメトリー、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、および免疫組織学などの免疫学的方法が挙げられる。本発明はさらに、本明細書に記載の抗体を含むキット（例えば、診断キット）を包含する。
【０１９１】
本明細書において特に定義していない限り、本発明に関連して使用される科学技術用語は、当業者に一般的に理解される意味を有する。例示的な方法および材料を以下に記述するが、本明細書に記載の方法および材料と類似または同等の方法および材料も同様に、本発明の実践または試験において使用することができる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先する。
【０１９２】
一般的に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、合成有機化学、医化学および薬化学、ならびにタンパク質および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法およびそれらの技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。酵素反応および精製技術は、当技術分野において一般的に行われるように、または本明細書に記載されるように製造元の仕様書に従って実施される。
【０１９３】
さらに、本文がそれ以外であることを明記している場合を除き、単数形は複数形を含み、複数形は単数形を含む。本明細書および実施形態を通して、用語「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその変化形は、記載された整数または整数の群を含むが、他の任意の整数または整数の群を除外しないことを暗示すると理解される。
【０１９４】
本明細書において言及した刊行物および他の参考文献は全て、全体が参照により本明細書に組み込まれている。多数の文書が本明細書において引用されているが、この引用が、これらの文書のいかなるものも当技術分野における一般的知識の一部を形成すると認めたわけではない。
【０１９５】
本発明がよりよく理解されうるように、以下の実施例を説明する。これらの実施例は、単に説明目的であり、本発明の範囲をいかなるようにも制限しないと解釈すべきである。
実施例
【実施例１】
【０１９６】
ニワトリＢ細胞からの抗ＰＤ−１抗体のクローニング
抗体分泌Ｂ細胞（ＡＳＣ）からのニワトリ由来抗体遺伝子のクローニングは、Ｓｙｍｐｌｅｘ（商標）抗体発見技術によって実施した。簡単に説明すると、ＡＳＣを、ＰＤ−１抗原によって免疫されているニワトリのリンパ系臓器から、可溶性タンパク質抗原および／または真核細胞上で提示されるそのネイティブの細胞膜結合型として単離した。ＡＳＣを蛍光標識抗体によって染色すると、ＰＣＲ容器での選別の前に、ＡＳＣを他の細胞（例えば、Ｔ細胞、ナイーブＢ細胞、単球等）と識別することができた。単細胞ＡＳＣソーティングは、フローサイトメトリーによって実施した。次に、Ｓｙｍｐｌｅｘ（商標）技法を実施して、本明細書において以降記述されるように、それぞれの選別されたＢ細胞に関して同源のＶＨおよびＶＬ対を含むＰＣＲ産物を生成した。
【０１９７】
選別したＡＳＣについて、ＶＨおよびＶＬコード配列の連結を実施して配列の同源の対形成を促進した。プロセスは、１ステップマルチプレックスオーバーラップ伸長ＲＴ−ＰＣＲの後にネステッドＰＣＲに基づく２ステップＰＣＲ技法を利用した。Ｓｙｍｐｌｅｘ（商標）技術を使用して同源のＶＨおよびＶＬ配列を連結させる原理は、国際公開第２００５／０４２７７４号；国際公開第２００８／１０４１８４号；国際公開第２０１０／０２２７３８号、およびMeijer et al., J Mol Biol 358(3):764-72 (2006)に詳細に記述されている。簡単に説明すると、同源のＶＨおよびＶＬ増幅断片を、いわゆるネステッドＰＣＲ工程においてオーバーラップ伸長ＰＣＲによって結合させる。その後のプロセスにおいて、ＰＣＲ産物をプールした後、プラスミドベクターにおいてクローニングする。これは、ニワトリ抗体の可変ドメインをコードするクローニングされたＤＮＡ断片を、トランスフェクト哺乳動物細胞において単一のプラスミド発現コンストラクトから完全なキメラ抗体として発現させることができるように行われる。その結果、ＰＤ−１抗原に対して特異的結合を示すキメラ抗体に関して細胞上清をスクリーニングすることが可能である。
【０１９８】
材料および方法
上記の刊行物に記載のＳｙｍｐｌｅｘ（商標）技術を改変して、選別したニワトリＢ細胞からＶＬおよびＶＨを増幅した。機能的発現コンストラクトのクローニングを以下に記述されるように２工程で実施した。
【０１９９】
工程１．対にしたＶＨおよびＶＬ断片を含む増幅されたＰＣＲ産物を、ネステッドＰＣＲ反応において増幅した。これによって、それぞれの末端でＡｐａＩおよびＡｖｒＩＩのための隣接する制限酵素認識部位を付加することができた。同源のＶＨおよびＶＬ配列は、それぞれの選別したＡＳＣからのシングルＰＣＲ産物において対を形成したことから、ＰＣＲ断片の全てをプールした後、ＰＣＲ産物のクローニングを実施した。プラスミドｐＭＬ３９２は、対応する制限部位ＡｐａＩおよびＡｖｒＩＩの消化によってＳｙｍｐｌｅｘ（商標）ＰＣＲ産物を受け入れるように構築した。得られたプールしたＰＣＲ産物とｐＭＬ３９２とのライゲーションを、図１に示す。本明細書において、ＰＣＲ産物の挿入により、ＶＨおよびＶＬ配列がヒトＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３およびラムダ定常ｃＤＮＡ領域の前にそれぞれ配置され、それによって完全長の重鎖および軽鎖読み取り枠を得た。
【０２００】
工程２．初回のコンストラクトにおいて、重鎖および軽鎖配列をコードする２つの読み取り枠を頭−頭結合で配置して、ＡｓｃＩおよびＮｈｅＩの制限酵素認識部位を含むＤＮＡ配列によって隔てた。重鎖および軽鎖遺伝子の２つの５’末端の間に、５’−ＵＴＲとシグナルペプチドとを含む対応するＡｓｃＩ／ＮｈｅＩ消化ダブルＣＭＶプロモーターＤＮＡ断片を挿入することにより、図２に描写される完全な発現コンストラクトを得た。
【実施例２】
【０２０１】
抗ＰＤ−１参照抗体アナログのクローニング
本実施例は、抗ＰＤ−１抗体ニボルマブおよびペンブロリズマブの参照アナログを作製する方法を簡単に示す。
【０２０２】
ニボルマブおよびペンブロリズマブの抗体アナログの可変重鎖および軽鎖ドメインをコードするアミノ酸配列を、ＩＭＧＴ（登録商標）ウェブサイトｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ｍＡｂ−ＤＢ／；から得た。以下の表３を参照されたい。タンパク質配列を、ヒトコドン使用を有するＤＮＡ配列に逆翻訳した。次に、対応するＤＮＡ配列を遺伝子合成して、定常ヒトＩｇＧ４重鎖またはカッパ軽鎖ドメインを含む発現ベクターにクローニングし、完全長の抗体の発現を得た。Ｆａｂアームの交換を防止するために、２２８位のセリン残基をプロリンに置換した（Angal et al., Mol. Immunol. 30:105-108 (1993)）。標準的なタンパク質発現系を使用して、ＣＨＯ細胞に、対応する発現プラスミドをトランスフェクトした。対応する抗体上清を、標準的なプロテインＡ精製カラムクロマトグラフィーを使用して精製した。
【０２０３】
【表３】
2018529359.tif 000004
【実施例３】
【０２０４】
細胞表面発現ＰＤ−１に対する結合に関する抗体レパートリーのスクリーニング
抗ＰＤ−１レパートリーのクローン化抗体を、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２３４７−０１９）を使用して３８４ウェルフォーマットでＨＥＫ２９３細胞において個々にトランスフェクトして発現させ、抗体含有上清をトランスフェクションの６日後に収集した。
【０２０５】
細胞に基づく抗体スクリーニングに関して、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１６４４７−１００）を使用して、３８４ウェルフォーマットで、ＣＨＯ−Ｓ細胞に完全長のヒトＰＤ−１をトランスフェクトして、発現させ、非トランスフェクト細胞を陰性対照として使用した。マルチプレックススクリーニング設定を可能にするために、ＣＦＳＥを使用して非トランスフェクト細胞を標識し、１：１の比率で、それぞれ、１Ｅ６細胞／ｍｌの密度で非標識ＰＤ−１トランスフェクト細胞と混合した。３８４ウェルプレートにおいて、この細胞混合物４０μｌを抗体含有上清１０μｌと混合し、洗浄しない設定で、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＡＦ６４７二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ａ２１４４５）を添加することによって細胞結合抗体を顕色した。試料を、ハイスループットフローサイトメトリー（ｉＱｕｅ（登録商標）Ｓｃｒｅｅｎｅｒ、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）を使用して獲得し、ＣＦＳＥとヒトＩｇＧの結合（ＡＦ６４７）とを比較してプロットすることによって、データを、ＦｏｒｅＣｙｔ（登録商標）ソフトウェアを使用して分析した。ＰＤ−１特異的な一次ヒットは、ヒトＰＤ−１トランスフェクト細胞（ＣＳＦＥ陰性）のみに結合するが、対照細胞（ＣＳＦＥ陽性）には結合しない抗体クローンとして同定され、ヒットを採取するためおよびその後の配列分析のためにプレート番号およびプレート座標を収集した。
【０２０６】
図３Ａ〜３Ｃは、（Ａ）ヒトＰＤ−１トランスフェクト細胞に特異的に結合する抗体クローン、（Ｂ）ＣＨＯ−Ｓ細胞に非特異的に結合するクローン、および（Ｃ）スクリーニングに使用した細胞集団のいずれにも結合しないクローン、に関する代表的なフローサイトメトリードットプロットを示す。
【実施例４】
【０２０７】
抗ＰＤ−１抗体のヒト化
ヒトに投与した場合に最少の免疫原性を有するが、親のニワトリ抗体の特異性および親和性を実質的に保持している抗体分子を産生するために、ニワトリ抗ＰＤ−１抗体のフレームワーク領域のヒト化を実施した。
【０２０８】
材料および方法
ニワトリ由来抗体のヒト化は、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)によって最初に記述された方法である「ＣＤＲグラフティング」アプローチを使用して実施した。最初に、近縁のヒト生殖系列遺伝子を発見するために、抗体の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ドメインをヒトＩｇＧデータベースに対してｂｌａｓｔ検索を行った。これによって、ニワトリＶＨおよびＶＬ遺伝子に対して近縁であるとしてそれぞれ、ヒトＩＧＨＶ３−２３＊０１（Ｍ９９６６０）およびＩＧＬＶ３−１９＊０１（Ｘ５６１７８）遺伝子が同定された。同様に、Ｊ遺伝子領域ヒト化のために選択されたヒトアミノ酸配列を、ＶＨおよびＶＬに関してそれぞれ、ＩＧＨＪ１＊０１（Ｊ００２５６）およびＩＧＬＪ６＊０１（Ｍ１８３３８）から誘導した。さらに、抗体ＶＨおよびＶＬ遺伝子を、ニワトリ免疫グロブリン生殖系列遺伝子に対して整列させて、抗体の機能および／または構造において役割を果たしうる体細胞変異をフレームワーク領域において同定した。そのような残基は、いわゆる「復帰突然変異」残基として最終ヒト化抗体遺伝子に含まれてもよい。最後に、抗体の構造、安定性、および機能において重要な役割を果たすことが知られている一部のアミノ酸位置、いわゆる「ベニヤ残基」（Foote and Winter, J Mol Biol. 224(2):487-99 (1992)）を考慮して、対応する生殖系列からのヒトまたはニワトリ残基のいずれかを含む代替のヒト化抗体変異体を生成した。
【０２０９】
本明細書におけるＣＤＲ配列は、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２に関してＩＭＧＴ（登録商標）定義に従って決定した。重鎖および軽鎖ＣＤＲ３に関して、本明細書における定義は、ＩＭＧＴ−ＣＤＲ３の上流の１つの余分のアミノ酸残基（Ｃｙｓ）と、下流の１つの余分のアミノ酸残基（ＶＨ  ＣＤＲ３に関してＴｒｐ、ＶＬ  ＣＤＲ３に関してＰｈｅ）を含む。
【０２１０】
ニワトリＣＤＲおよびヒトフレームワーク領域のアセンブリは、オーバーラップ伸長ＰＣＲによって実施した。得られたヒト化ＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲ産物を、ヒト重鎖および軽鎖定常領域を有する発現ベクター（プラスミド）においてクローニングした。ラムダ鎖の上流のシグナルペプチドの正確な切断を増加させるために、ラムダ遺伝子ＩＧＬＶ３．１９の２位のアミノ酸（Ｓｅｒ）を、他のヒト生殖系列、例えばＩＧＬＶ３．２５に存在する別のアミノ酸（Ｔｙｒ）に交換した。重鎖配列は、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のエフェクター機能を低減させることが知られている２つの「ＬＡＬＡ」突然変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａを含む（Armour et al., Eur J Immunol. 29(8):2613-24 (1999)；およびArmour et al., Mol Immunol. 40(9):585-93 (2003)）。発現ベクターはまた、必要な調節配列を含み、軽鎖と重鎖の同時発現を可能にし、これらは哺乳動物細胞へのトランスフェクション後に完全長の抗体へとアセンブルされる。
【０２１１】
結果
最終のヒト化抗体配列を以下の表４に示し、ＣＤＲ配列を個別に表５に示す。ＣＤＲ配列は、表においてＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリングスキームに従って定義される。
【０２１２】
【表４】
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【０２１３】
【表５】
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【０２１４】
ヒト化抗体は全て、以下に示すＩｇＧ１「ＬＡＬＡ」変異体重鎖定常領域および軽鎖定常領域アミノ酸配列を含む。
重鎖定常領域（配列番号６７）
【化１】
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軽鎖定常領域（配列番号６８）
GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
【実施例５】
【０２１５】
抗ＰＤ−１抗体候補体のスクリーニング
ＰＤ−１は、主に活性化Ｔリンパ球の表面上に発現され、Ｔ細胞活性を負に調節する。最も機能的な抗ＰＤ−１抗体候補体を選択するために、２つの異なるインビトロスクリーニング系、すなわちブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）全血アッセイおよび一方向性混合リンパ球反応アッセイを確立した。
【０２１６】
材料および方法
ＩｇＧ１−ＬＡＬＡスキャホールドフォーマット、すなわち実施例４に記載の「ＬＡＬＡ」変異を有し、上記のようにクローニングしてヒト化した６９個の独自のヒト化ｍＡｂのレパートリーを、最初にＳＥＢ全血アッセイにおいて機能的活性に関してスクリーニングした。ＳＥＢは、ＭＨＣクラスＩＩ分子、およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の特異的Ｖβ領域に結合する超抗原であり、Ｔ細胞の非特異的刺激を誘導する。これによってポリクローナルＴ細胞活性化／増殖が起こり、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γを含むサイトカインの放出が起こる。
【０２１７】
抗ＰＤ−１活性のスクリーニングに関するＳＥＢアッセイの適切性を調べるために、異なるドナーのＰＤ−１の発現レベルを、ＳＥＢ刺激の前後で調べた。異なる６人のドナーからのＰＢＭＣをＳＥＢ刺激の０日目および３日目にフローサイトメトリーによってＰＤ−１発現に関して試験した。さらなる分析のために適切なリンパ球ゲートを設定した。
【０２１８】
少なくとも３人の異なるドナーからの血液を使用するＳＥＢ全血アッセイにおけるスクリーニングに基づいて、上位１０個の抗ＰＤ−１抗体リード候補体を同定した。次に、抗ＰＤ−１抗体リード候補体をさらに滴定して、陽性対照、抗ＰＤ−１抗体ペンブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ）およびニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）の参照アナログと比較してそれぞれの個々の抗体に関して用量反応曲線を得た。実施例２を参照されたい
【０２１９】
上位１０個の選択された抗ＰＤ−１抗体の機能性を、代替のインビトロアッセイである一方向性混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて確認した。このアッセイにおいて、１人のドナーからの樹状細胞（ＤＣ）を、別のドナーからのＣＤ４＋Ｔ細胞と同時培養し、全てのＴ細胞の１０〜１５％に誘導される同種異系抗原特異的刺激を得て、Ｔ細胞活性化／増殖およびサイトカイン分泌を得た。
【０２２０】
候補体の１つ（１２７４８．１５３８１）のタンパク質安定性の問題のために、この特異的抗体に関して代替の生殖系列配列を使用した。得られた抗体の１つ、１２７４８．１６１２４を以下に参照する。この変異体は、異なるＶＬ配列を有するが、１２７４８．１５３８１と同じＶＨ配列を有する（表１、上記）。
【０２２１】
結果
図４のデータは、ＰＤ−１を発現するリンパ球の頻度が、ＳＥＢ刺激後に、試験した全てのドナーにおいて増加することを明らかに示している。これらの知見は、抗ＰＤ−１抗体スクリーニングに関するこのアッセイの適切性を確認する。
【０２２２】
図５Ａ〜Ｉに示されるように、ＳＥＢアッセイにおける最も機能的な抗ＰＤ−１抗体の滴定により、陽性対照抗体アナログであるペンブロリズマブおよびニボルマブと類似であるかまたは優れた機能性を有する抗ＰＤ−１リード候補体を同定した。このアッセイにおいて、全血を表記の抗体の存在下でＳＥＢによって４８時間刺激し、４８時間後のＩＬ−２分泌をＥＬＩＳＡによって測定した。それぞれのデータポイントは、６回の反復実験の平均値を表し、バーはＳＥＭを示す。
【０２２３】
図５Ａ〜Ｈは、ヒト化抗ＰＤ−１抗体について得られた結果を示す。抗体の１つ［１２７４８．１５３８１］では５％を超える凝集により、この抗体の代替のフレームワークを試験した。図５Ｉのデータは、当初のヒト化抗体［１２７４８．１５３８１］とその生殖系列（フレームワーク）変異体［１２７４８．１６１２４］の機能性が類似であることを示す。
【０２２４】
抗ＰＤ−１抗体の機能性を一方向性ＭＬＲアッセイにおいて確認した。このアッセイにおいて、２人の異なるドナーからの樹状細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞（比率１：１０）とを同時培養して、ＩＦＮ−γ分泌を５日後にＭｅｓｏＳｃａｌｅによって測定した。それぞれのデータポイントは、６回の反復実験の平均値を表し、バーはＳＥＭを示す。図６Ａ〜Ｈに示す一方向ＭＬＲアッセイから得たデータは、ＳＥＢアッセイから得たデータと同じ機能性およびランキングを示す。異なるアッセイ間でのデータがこのように一貫することは、選択された抗体が機能的であることのさらなる確認を提供する。
【０２２５】
選択された抗体は、２つの異なる主要なエピトープビンを起源とし、このことは、それらが２つの異なる非オーバーラップエピトープに結合することを示している。示された抗ＰＤ−１抗体は全てビン１に属するが、例外として１２７６０および１３１１２抗体はビン２に属する。ビン１の抗ＰＤ−１抗体は、これらのインビトロアッセイにおいて最高の機能性を示すことが見出された。
【実施例６】
【０２２６】
ＰＤ−Ｌ１リガンド遮断活性に関する抗ＰＤ−１抗体のフローサイトメトリー分析
本実施例は、抗ＰＤ−１抗体のパネルを、細胞表面発現ＰＤ−１および蛍光色素標識可溶性ＰＤ−Ｌ１を使用するフローサイトメトリー競合アッセイを実施することによってＰＤ−Ｌ１リガンド遮断活性に関してどのように試験したかを例証する。
【０２２７】
材料および方法
ＰＤ−Ｌ１リガンド遮断活性を、マルチプレックス細胞アッセイにおいて試験し、ヒトおよびカニクイザルＰＤ−１をＣＨＯ−Ｓ細胞上で組換え発現させ、Ｒ−ＰＥ（Ｒ−フィコエリスリン）標識ヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃキメラタンパク質の結合をフローサイトメトリーによって分析した。市販の組換えＰＤ−Ｌ１−Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）をＬｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｒ−フィコエリスリンコンジュゲーションキット（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＫ）を使用してＲ−ＰＥにコンジュゲートした。ヒトＰＤ−１を発現するように一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｓ細胞を、カニクイザルＰＤ−１を一過性に発現するＣＦＳＥ染色ＣＨＯ−Ｓ細胞と混合した。次に、この細胞混合物を、氷中で２０μｇ／ｍｌの抗ＰＤ−１抗体５０μｌと共にインキュベートした後、およそ３．４μｇ／ｍｌのＲ−ＰＥ標識ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ  ５０μｌ（最終濃度１６．４ｎＭ）を添加し、さらに２０分間さらにインキュベートした（抗ＰＤ−１抗体の最終濃度：１０μｇ／ｍｌ）。結合した抗体をＡＰＣ（アロフィコシアニン）コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ軽鎖抗体を使用して検出した。ＰＤ−Ｌ１と抗ＰＤ−１抗体の結合を、Ｒ−ＰＥおよびＡＰＣ蛍光を検出するフローサイトメトリーによってそれぞれ、定量した。
【０２２８】
結果
競合実験の結果を図７Ａ〜Ｂに表し、以下の表６に要約する。全ての抗ＰＤ−１抗体を最終抗体濃度１０μｇ／ｍｌ（上記を参照されたい）で試験した。試験した抗体のうち３つは、ＰＤ−Ｌ１結合を８３％またはそれ超阻害することができ、これは抗ＰＤ−１参照抗体であるランブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ）と類似であり、ランブロリズマブは、ペンブロリズマブと同じであり、陽性対照として含めた。１つの抗体（１２７７７．１３３６２）が、ごく部分的に結合を６９％阻害した。１つの抗体（１３１１２．１３２０８）は、ＰＤ−１結合を遮断しなかった。陰性対照抗ＶＥＧＦＲ２抗体ラムシルマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）の存在下でのＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１発現細胞への結合を、０％に設定した。
【０２２９】
【表６】
2018529359.tif 000008
【０２３０】
表６に示したヒト化変異体は、表１の変異体が軽鎖のＮ末端でアミノ酸残基「ＳＹ」を有することを除き、その名称の最初の５桁を共有する表１のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、ＳＹジペプチドは、抗体軽鎖の発現の際のシグナルペプチドプロセシングを改善する。表１および６の変異体は、同一の機能的特性を有すると予想される。
【実施例７】
【０２３１】
ヒトおよびカニクイザルＰＤ−１  ＥＣＤ抗原に対するＰＤ−１抗体親和性の測定
本実施例は、多数の抗ＰＤ−１抗体が、ヒトおよびカニクイザルＰＤ−１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の両方に対して、高いピコモル濃度（ｐＭ）の親和性を示し、良好な交差反応性を示すことを証明する。
【０２３２】
材料および方法
精製抗ＰＤ−１抗体レパートリーの動態結合分析を、ＸＰＲ−３６表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＵＳＡ）において実施した。ＨｉｓタグヒトまたはカニクイザルＰＤ−１  ＥＣＤ抗原を、Ａｃｒｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫから購入した。既に記述されているように（Canziani et al., Anal Biochem 325(2):301-307 (2004)）、抗ＰＤ−１抗体を固定し、一価のＰＤ−１抗原を溶液中で維持することによって、一価の抗原条件下で結合速度論を測定した。非特異的結合および物質移動限界を防止するために、可能な最低の抗ＰＤ−１抗体密度を適用した。抗体速度論を測定するために、抗ＰＤ−１抗体を１．０μｇ／ｍｌの濃度に調節し、モノクローナル抗ヒトＦｃ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）のおよそ１０００ＲＵを固定することによって生成された抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ表面上で捕捉した。抗ＰＤ−１抗体をヒトまたはカニクイザルＰＤ−１  ＥＣＤに対する結合に関して、２５ｎＭから０．３１ｎＭまでの３倍濃度範囲で試験した後、３Ｍ  ＭｇＣｌ２再生緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）によって表面を再生した。２０μｌ／分の高い流速、３．３３分の結合時間、および１．５時間〜２．７５時間の解離時間を使用した。記録された結合応答を単純ラングミュア１：１結合モデルにフィットさせて、二重参照を使用して、結合速度（ｏｎ  ｒａｔｅ）（ｋｏｎまたはｋａ）、解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）（ｋｏｆｆ、またはｋｄ）、および親和性（ＫＤ）定数を計算した。
【０２３３】
結果
結合速度論を以下の表７に作表し、これは抗ＰＤ−１抗体が、ｐＭ範囲の非常に高い親和性でＰＤ−１に結合することを例証している。抗体は全て、ニボルマブおよびペンブロリズマブアナログより高い親和性でヒトＰＤ−１を認識した。最高親和性の抗体［１２８１９．１５３８４］は、ヒトＰＤ−１に２０ｐＭのＫＤで結合する。
【０２３４】
【表７】
2018529359.tif 000009
【実施例８】
【０２３５】
抗ＰＤ−１抗体のエピトープビニング
本実施例は、ペアにした競合パターンに基づいて抗ＰＤ−１抗体をエピトープビンに分類する方法を例証する。異なるエピトープビンに属する抗体は、ＰＤ−１  ＥＣＤ上の異なるエピトープを認識する。
【０２３６】
方法
ペアにした抗体競合試験は、ＩＢＩＳ  ＭＸ９６  ＳＰＲ機器（ＩＢＩＳ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）と組み合わせて連続流マイクロスポッター（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｆｌｏｗ  Ｍｉｃｒｏｓｐｏｔｔｅｒ）（ＣＦＭ）（Ｗａｓａｔｃｈ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，ＵＳ）を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によって実施した。表面プラズモン共鳴イメージング分析は、Ｅ２Ｓ  ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）ＳＰＲセンサー（Ｓｓｅｎｓ  ＢＶ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）上で実施した。全体で１０個の抗ＰＤ−１抗体（ヒト、ＩｇＧ１）を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５中で１０μｇ／ｍｌに希釈した。抗体を、連続流マイクロスポッターを使用してＥ２Ｓ  ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）上にスポットし、１５分間コンジュゲートさせた。スポッティング後、ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）をＩＢＩＳ  ＭＸ９６バイオセンサーに配置して、１Ｍエタノールアミン、ｐＨ８．５によって１０分間不活化した。センサーの調製後、古典的なサンドイッチアッセイを使用して抗体競合分析を実施した。一価ＰＤ−１  ＥＣＤ抗原（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｃｈｉｎａ）をＨＢＳ−ＥＰランニング緩衝液中で希釈して、抗ＰＤ−１抗体のコンジュゲートアレイによって捕捉した。次に、ＨＢＳ−ＥＰランニング緩衝液中で１００ｎＭに希釈した１０個のＰＤ−１抗体のそれぞれの個々の注入を実施して、抗体競合パターンを確立した。それぞれの競合サイクル後、１０ｍＭグリシン塩酸緩衝液、ｐＨ２．０によってセンサー表面を再生した。
【０２３７】
結果
１０個の抗ＰＤ−１抗体の競合パターンを図８に示す。１２８６６および１２８０７は、細胞に基づくアッセイにおいて機能的活性を有することが見出されなかったが、個別のエピトープを認識することからそれらを含めた。試験した機能的な抗ＰＤ−１抗体は、２つの非オーバーラップエピトープビンに結合することが見出された。エピトープビン１に属する機能的抗体は全て、互いに交差遮断し、これには、ニボルマブアナログ（「Ｎｉｖｏ」）、ペンブロリズマブアナログ（「Ｐｅｍｂｒｏ」）、１２８１９、１２８９２、１２８６５、および１２７７７が挙げられる。これらの抗体は、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２結合を有意に遮断することが見出された。１２７６０および１３１１２は、互いに交差遮断したが、エピトープビン１からの抗体のいずれの結合も遮断しなかったことから個別のエピトープビン２に結合することが見出された。その結果、１２７６０および１３１１２は、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２リガンド結合部位とオーバーラップしないＰＤ−１上の異なる部位に結合する可能性がある。
【０２３８】
エピトープビン１に属する交差遮断性の機能的抗体１２８１９、１２８６５、１２８９２、１２７７７、ニボルマブ、およびペンブロリズマブは、１２８６６および１２８０７との競合に基づいて４つのサブビンにさらに細分することができる。１２８１９（ビン１Ｃ）は、１２８６６および１２８０７の両方の結合を遮断する唯一の抗体であったが、ニボルマブ（ビン１Ｄ）は１２８６６のみを遮断し、ペンブロリズマブ（ビン１Ｆ）は１２８０７のみを遮断した。ビン１Ｅに属する抗体の群（１２８６５、１２８９２、および１２７７７）は、それらが１２８６６または１２８０７のいずれの結合も遮断しないという点において独自であった。
【０２３９】
最後に、１２８６６（ビン１Ａ）および１２８０７（ビン１Ｂ）は、独自のエピトープビンに結合した。１２８６６は、１２８１９、およびニボルマブによって遮断されたが、他のＰＤ−１抗体によって遮断されず、１２８０７は１２８１９およびペンブロリズマブによって遮断されたが、他の抗ＰＤ−１抗体によって遮断されなかった。
【実施例９】
【０２４０】
マウスおよびラットＰＤ−１  ＥＣＤ抗原に対するＰＤ−１抗体の交差反応性の測定
本実施例は、抗ＰＤ−１抗体１２８１９．１５３８４がマウスＰＤ−１抗体と強く交差反応するが、ラットＰＤ−１には結合しないことを証明している。
【０２４１】
材料および方法
ＨｉｓタグマウスおよびラットＰＤ−１  ＥＣＤをＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから購入した。結合速度論分析を実施例７に記載のように実施した。
【０２４２】
結果
結合速度論を以下の表８に作表する。抗ＰＤ−１抗体１２８１９．１５３８４は、マウスＰＤ−１にＫＤ  ８０９ｐＭで結合するが、ラットＰＤ−１を認識しない。ヒトＰＤ−１  ＥＣＤに対する親和性は、実施例７において測定した親和性と類似であった。抗体１２８６５．１７１５０は、マウスまたはラットＰＤ−１に結合しなかった。ニボルマブおよびペンブロリズマブの参照アナログはいずれも、マウスまたはラットＰＤ−１と交差反応しなかった（データは示していない）。
【０２４３】
【表８】
2018529359.tif 000010
【実施例１０】
【０２４４】
ＰＤ−１  ｍＡｂのＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２リガンド遮断活性の分析
本実施例は、バイオレイヤー干渉法による分析を使用して競合アッセイを実施することによって、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２リガンド遮断活性に関して抗ＰＤ−１抗体のパネルを分析する方法を例証する。
【０２４５】
材料および方法
ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２リガンド遮断活性の試験を、Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ３８４機器（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ，ＵＳＡ）を使用するバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）による分析によって実施した。市販のヒトＰＤ−１  Ｆｃ融合タンパク質（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）の５μｇ／ｍｌ濃度を抗ヒトＦｃセンサーチップ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ，ＵＳＡ）上で捕捉し、残りの抗Ｆｃ部位をＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）陰性対照抗体によって遮断した。次に、抗原コーティング表面を、１０μｇ／ｍｌ濃度の抗ＰＤ−１抗体で飽和した。抗ＰＤ−１抗体による抗ＰＤ−１の飽和後、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２のリガンド遮断活性を、５μｇ／ｍｌで試験するヒトＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２  Ｆｃ融合タンパク質（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）と共にインキュベートすることによって評価した。
【０２４６】
結果
競合分析の結果を以下の表９に表す。全ての抗体がＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２リガンド結合を完全に遮断したが、例外として抗体１２７６０．１３１６９は、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２（それぞれ、２６％および３６％）の有意な遮断を示さず、１３１１２．１３２０８は、ＰＤ−Ｌ１の遮断を示さなかったが、ＰＤ−Ｌ２の弱い遮断（それぞれ、２７％および５３％）を示した。結果は、エピトープビニング分析（実施例８）およびエピトープマッピング分析（実施例１１）と良好に一致し、１２７６０および１３１１２を除く全ての抗体がＰＤ−１上のＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２結合部位にマップされるオーバーラップエピトープに結合するが、１２７６０および１３１１２抗体は、異なるＰＤ−１部位に結合し、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２と有意に交差競合しないことを示した。
【０２４７】
【表９】
2018529359.tif 000011
【実施例１１】
【０２４８】
ＰＤ−１突然変異誘発による抗ＰＤ−１抗体のエピトープマッピング
抗体エピトープは一般的に、線状エピトープ（同様に連続的エピトープとも呼ばれる）またはコンフォメーションエピトープ（不連続エピトープとも呼ばれる）として特徴付けすることができる。線状エピトープは、単一の連続するアミノ酸配列に基づいて定義されるが、コンフォメーションエピトープは、多くのより小さい不連続な線状配列または単一の接触残基からなりうる。抗体と抗原の間の分子間タンパク質界面でクラスタを形成する接触残基の集合体はまた、ホットスポットまたはコアエピトープとも呼ばれる（Moreira et al., Proteins 68(4):803-12 (2007))）。ほとんどのＢ細胞エピトープは、天然では不連続であり（Sivalingam and Shepherd, Mol Immunol. 51(3-4):304-92012 (2012), Kringelum et al., Mol Immunol. 53(1-2):24-34 (2013)）、平均的なエピトープは１５〜２２アミノ酸残基に及び、そのうち２〜５アミノ酸が結合エネルギーのほとんどに寄与する（Sivalingam and Shepherd、上記）ことは現在では広く認識されている。
【０２４９】
１１１個の異なるＰＤ−１突然変異体に対する結合親和性をランク付けすることによって、本実施例は、１２８１９および１２８６５抗体の結合エピトープを、ニボルマブおよびペンブロリズマブによって認識されるエピトープとは異なる線状エピトープおよびホットスポットに分割することができる方法を例証する。
【０２５０】
方法
ヒトＰＤ−１受容体は、２６８アミノ酸（残基２１〜２８８位）の細胞外ドメインからなる。細胞外ドメインは、アミノ酸２１〜１７０位に及び、その後膜貫通ドメイン（残基１７１〜１９１位）および細胞質ドメイン（残基１９２〜２８８位）が続く。ＰＤ−１は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、ＧＦＣＣ’β鎖が一方の側に存在し、ＡＢＥＤβ鎖がもう一方の側に存在する、２つのβシートに整列した８個の逆平行β鎖の相互作用によって作製される２層のβサンドイッチで構成される。２つのβシートは、残基Ｃ５４〜Ｃ１２３の間のジスルフィド結合によって安定化される。結晶構造は、ヒトＰＤ−１：ヒトＰＤ−Ｌ１複合体（ＰＤＢ  ４ＺＱＫ）に関して利用可能であるが、Ｃ’とＤ  β鎖の間のＣ’Ｄループは、構造化されておらず、残基１４６の後のＣ末端配列の一部と同様に欠失している（ＰＤＢ  ４ＺＱＫ、Zak et al., Structure 23(12):2341-2348 (2015)）。最近、ヒトＰＤ−１：ペンブロリズマブ複合体の結晶構造が公表された（ＰＤＢ  ５ＪＸＥ、Na et al., Cell Res. 2016 [Epub ahead of print], PMID: 27325296）。この構造において、Ｃ’Ｄループは、非常に規則正しく、ペンブロリズマブ結合にとって重要な接触残基は、このループ上のコアエピトープにクラスタを形成することが示された。ヒトＰＤ−１：ヒトＰＤ−Ｌ２複合体の結晶構造は利用できない。溶液中のヒトＰＤ−１のＮＭＲ構造は、ＰＤＢ  ４ＺＱＫ（ＰＤＢ  ２Ｍ２Ｄ、Cheng et al., J Biol Chem 288(17):11771-85 (2013))の結晶構造と高い構造類似性を示す。ヒトＰＤ−１は、ヒトＰＤ−Ｌ１またはヒトＰＤ−Ｌ２リガンドに１：１の化学量論で結合し、結合は主に、ＧＦＣＣ’βシートによって媒介されるオーバーラップ結合部位で起こる（Cheng et al., J Biol Chem 288(17):11771-11785 (2013)）（図９、パネルＡおよびＢ）。ヒトＰＤ−Ｌ１は、Ｃβ鎖に存在する接触残基Ｖ６４、Ｎ６６、Ｙ６８、ならびにＦおよびＧβ鎖に存在するＧ１２４、Ｉ１２６、Ｌ１２８、Ａ１３２、Ｉ１３４、およびＥ１３６を通してヒトＰＤ−１に結合する（Zak et. al., Structure 23(12):2341-8 (2015)）。ヒトＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２はそれぞれ、８μＭおよび２μＭのＫＤでヒトＰＤ−１に結合する（Cheng et. al.、上記）。
【０２５１】
ヒトＰＤ−１のタンパク質配列はＵｎｉｐｒｏｔ（受託番号Ｑ１５１１６、アミノ酸配列を配列番号１に表す）からダウンロードした。完全長のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）タンパク質配列をＵｎｉｐｒｏｔ（受託番号Ｂ０ＬＡＪ３＿ＭＡＣＦＡ（配列番号８９））からダウンロードした。セキショクヤケイ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｕｓ）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、およびクマネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ＰＤ−１の完全長タンパク質配列をそれぞれ、ＮＣＢＩ（ＸＰ＿４２２７２３．（配列番号９０）、ＮＰ＿０３２８２４．１（配列番号９１）およびＸＰ＿００６２４５６３３．１（配列番号９２）からダウンロードした。ヒトＰＤ−１と比較した異なるＰＤ−１細胞外アミノ酸配列の配列同一性を以下の表１０に示す。
【０２５２】
【表１０】
2018529359.tif 000012
【０２５３】
解像度２．４５Åで決定したヒトＰＤ−１：ヒトＰＤ−Ｌ１複合体の結晶構造（ＰＤＢ  ４ＺＱＫ）とＡＰＯヒトＰＤ−１のＮＭＲ構造（ＰＤＢ  ２Ｍ２Ｄ）からの構造情報を組み合わせることによってヒトＰＤ−１の分子モデルを構築した。ＰＤＢ  ４ＺＱＫの構造を、ＮＭＲ構造から提供されたＰＤ−１の欠失Ｃ’ＤループおよびＣ末端部分と共にモデルの基礎として使用した。次に、表面露出アミノ酸残基を目立たせて、８３個の個々のアラニン置換をヒトＰＤ−１  ＥＣＤ上の表面露出残基（アラニンスキャン）において設計し、ヒト、マウス、およびラットＰＤ−１の間で異なる５個の露出残基位置をラットＰＤ−１残基に復帰突然変異させた。
【０２５４】
ネイティブヒトＰＤ−１構造の状況において線状抗体エピトープをマップするために、ヒトＰＤ−１  ＥＣＤ配列における１０個のアミノ酸が、アミノ酸５個がオーバーラップするセグメントにおいてニワトリ配列に連続的に交換されている２３個のキメラタンパク質を作製した。このセグメント外のセキショクヤケイタンパク質配列は、ヒトＰＤ−１と良好に整列せず、除外したことから、配列交換を、アミノ酸３１〜１４６位に及ぶヒトＰＤ−１の細胞外ドメインにおいて実施した。
【０２５５】
ヒトＰＤ−１の細胞外ドメインをコードするＰＤ−１  ｃＤＮＡを合成して、ＣＭＶプロモーターおよびヒトＩｇＧ１  Ｆｃ配列（残基Ｐ１０１−Ｋ３３０）を含むベクターにおいてクローニングし、クローニングされたＰＤ−１  ＥＣＤに対してＣ末端でＩｇＧ１  Ｆｃの融合体を得た。標準的なＰＣＲおよび工学技術によって、変異したヒトＰＤ−１  Ｆｃ融合コンストラクトを作製し、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系を使用してタンパク質を２ｍｌ培養物において一過性に発現させた。ヒトＰＤ−１  Ｆｃ融合コンストラクトを９日後に回収して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、上清を抗ＰＤ−１  Ｆａｂに対する結合親和性に関して試験した。ＰＤ−１融合タンパク質を含む培養上清を、連続流マイクロスポッター（ＣＦＭ，Ｗａｓａｔｃｈ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，ＵＳ）を使用して、Ｇ−ａ−ｈｕ−ＩｇＧ  Ｆｃ  ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）（Ｓｓｅｎｓ  ＢＶ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）上に１５分間固定した。スポッティング後、ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）を、ＩＢＩＳ  ＭＸ９６バイオセンサーに配置して、ＦｉｘＩＴキット（Ｓｓｅｎｓ  ＢＶ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、捕捉されたタンパク質を表面に固定した。いわゆる動的滴定（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）シリーズ（Karlsson R. 2006）を適用することによって速度論分析を実施し、本発明の抗体の単量体Ｆａｂ断片を、それぞれの抗体注入後表面再生工程を適用せずに、１ｎＭ〜５０ｎＭの漸増濃度で注入した。Ｆａｂ会合を１５分間実施して、抗原解離を３０分間実施した。記録された結合応答を、結合速度（ｏｎ  ｒａｔｅ）（ｋｏｎまたはｋａ）、解離速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）（ｋｏｆｆまたはｋｄ）、または親和性（ＫＤ）定数を計算するために、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ  ２ソフトウェアによって、単純ラングミュア１：１結合モデルにフィットさせた。
【０２５６】
結果
抗ＰＤ−１  Ｆａｂ  １２８１９．１７１４９および１２８６５．１７１５０ならびに参照アナログニボルマブおよびペンブロリズマブの結合親和性を評価した。１２８１９．１７１４９および１２８６５．１７１５０はそれぞれ、ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列が１２８１９．１５３８４および１２８６５．１５３７７と同一であるが、前者のそれぞれの２つの変異体の重鎖および軽鎖配列が、宿主細胞において異なるプラスミドではなくて同じプラスミド上で同時発現されることから、異なる１０桁の数字によって同定される。非ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２リガンド遮断Ｆａｂ  １３１１２．１５３８０ならびにＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を対照として含めた。
【０２５７】
試験した１１１個のＰＤ−１突然変異体は全て良好に発現した。３つのキメラコンストラクトのみが試験した抗体のいずれにも結合せず、これら３つのコンストラクトに導入された突然変異によっておそらく、試験したＰＤ−１抗体の全ての結合に影響を及ぼす主要なコンフォメーションの乱れを生じたことを示唆した。変異したＰＤ−１コンストラクトに結合するＦａｂ抗体の結合親和性の変化を、野生型と比較して、ＫＤ突然変異体／ＫＤ野生型（標準化結合親和性）の比率として表記する。１０アミノ酸のセキショクヤケイ配列をヒトＰＤ−１  ＥＣＤに挿入することによって実施した線状エピトープスキャンの概要を以下の表１１に示す。突然変異したＰＤ−１コンストラクトに対する結合親和性の低減を検出するためのカットオフ基準として、親和性の少なくとも５倍の低減を使用した。一部の例において、特異的抗体に対する結合は検出できなかった。これらのコンストラクトをＮ．Ｂ．（結合しない）として記載した。
【０２５８】
単一接触残基もまた、８３個のアラニン置換または５個のラット復帰突然変異を実施することによってマップした（以下の表１２）。
【０２５９】
試験した抗体に関して同定された線状エピトープまたは接触残基の概要を表１３に示す。ヒトＰＤ−１  ＥＣＤの構造に関する密度プロットとして示されるマップされた結合エピトープの図を図９に示す。
【０２６０】
分析から、１２８１９および１２８６５抗ＰＤ−１抗体の結合エピトープが、参照抗体ニボルマブおよびペンブロリズマブと比較して明確に異なることが示された（表１１〜１３、図９）。ペンブロリズマブのコアエピトープ（図９、パネルＣ）は、Ｃ’β鎖およびＣ’−Ｄループに位置した。接触残基／線状エピトープはまた、ＰＤ−Ｌ１の接触残基が同様に存在するＣおよびＦβ鎖においても見出された。ニボルマブのコアエピトープ（図９、パネルＤ）は、ヒトＰＤ−Ｌ１が利用する報告されたＰＤ−１接触残基の一部を覆うＦβ鎖の末端および全Ｇβ鎖に存在した。１２８１９および１２８６５のコアエピトープ（図９、パネルＥおよびＦ）は、ニボルマブより大きい領域を覆いなおかつこの領域におけるヒトＰＤ−Ｌ１の報告された全ての接触残基とオーバーラップする、ＦおよびＧβ鎖に存在する。１２８６５はまた、残基６９〜７５での突然変異に対して非常に感受性であった。１２８１９はまた、ヒトＰＤ−Ｌ１の接触残基であると報告されているＣβ鎖上の１つの接触残基をペンブロリズマブ（Ｖ６４）と共有した。１２８１９および１２８６５はいずれも、ＣおよびＣ’β鎖ならびにＣ’Ｄループの一部にマップされる線状エピトープを共有した。残基Ｖ６４を別として、試験抗体の間で他の接触残基は共有されなかった。非リガンド遮断抗体１３１１２は、アラニンスキャンによって、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２リガンド遮断部位から離れた領域にマップされることが示された（図９、パネルＧ）。
【０２６１】
要約すると、本実施例は、１２８１９、１２８６５、ニボルマブおよびペンブロリズマブが、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２リガンドの結合を遮断することができるヒトＰＤ−１上のオーバーラップエピトープに結合するが、それぞれの抗体は、競合結合分析（エピトープビニング、実施例８）から証明されるように、および表１３に要約される１１１個のＰＤ−１突然変異体のパネルによって個々の線状エピトープおよび接触残基をマップすることによって分子レベルで示されるように、異なる結合エピトープを有することを例証する。１２８１９はまた、試験した抗ＰＤ−１パネルにおいて、マウスＰＤ−１  ＥＣＤと交差反応する唯一の抗体であり（ＫＤ  ８０９ｐＭ、実施例９）、この抗体の結合エピトープが、試験した他のＰＤ−１抗体と比較して独自であることを強調する。
【０２６２】
【表１１−１】
2018529359.tif 000013
【表１１−２】
2018529359.tif 000014
【０２６３】
【表１２−１】
2018529359.tif 000015
【表１２−２】
2018529359.tif 000016
【表１２−３】
2018529359.tif 000017
【０２６４】
【表１３】
2018529359.tif 000018
【実施例１２】
【０２６５】
４つの同系マウス腫瘍モデルにおける１２８１９抗体のインビボ効能
本実施例は、４つの同系マウス腫瘍モデルにおける１２８１９抗体のインビボ効能を証明する。
【０２６６】
方法
２ｘ１０５個のＳａ１Ｎ（繊維肉腫）、１ｘ１０６個のＣＴ２６（結腸癌）、５ｘ１０６個のＡＳＢ−ＸＩＶ（肺癌）、または８ｘ１０６個のＭＣ３８（結腸癌）細胞を６〜８週齢の雌性Ａ／Ｊ（Ｓａ１Ｎ）、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＲｊ（ＣＴ２６およびＡＳＢ−ＸＩＶ）、またはＣ５７ＢＬ／６（ＭＣ３８）マウスの脇腹皮下に接種した。腫瘍を、キャリパーで２つの寸法を週に３回測定し、ｍｍ３での腫瘍体積を、式：（幅）２×長さ×０．５に従って計算した。平均腫瘍サイズが３０〜５０ｍｍ３で、マウスを１群１０匹の２群に無作為化して、処置を開始した。マウスを媒体緩衝液またはモノクローナル抗体１２８１９．１７１４９の腹腔内注射によって週に３回、全体で６回処置し、その後観察期間を設けた。抗体処置は１０ｍｇ／ｋｇで投与した。ボンフェローニの多重比較検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを適用して、処置群の間の各時点での腫瘍体積を比較した。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して実施した。
【０２６７】
結果
結果は、試験した全ての同系腫瘍モデルにおける抗体１２８１９．１７１４９の強い腫瘍阻害効果を示す（媒体に対してＰ＜０．００１）（図１０）。抗体１２８１９．１７１４９は、Ｓａ１Ｎ腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖の抑制を誘導し、ＣＴ２６、ＭＣ３８、およびＡＳＢ−ＸＩＶ腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖の遅れをもたらした。
【実施例１３】
【０２６８】
ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞とＡ３７５黒色腫細胞の混合物による半ヒト化異種移植片腫瘍モデルにおける１２８１９抗体のインビボ効能
本実施例は、ヒト黒色腫細胞株Ａ３７５を精製ヒトＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞と混合した、半ヒト化異種移植片腫瘍モデルにおける１２８１９抗体のインビボ効能を証明する。
【０２６９】
方法
４．５×１０５個のＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞をヒトＰＢＭＣドナーから単離して、２．０５×１０６個のＡ３７５（ヒト黒色腫）癌細胞と混合した後、６〜８週齢の雌性ＮＯＤｓｃｉｄマウスの脇腹に皮下接種した。腫瘍接種日に処置を開始して、マウスを、媒体緩衝液、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）（ペンブロリズマブ）（１０ｍｇ／ｋｇ）、またはモノクローナル抗体１２８１９．１７１４９（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって週に３回、全体で６回処置した後、観察期間を設けた。腫瘍を、キャリパーで２つの寸法を週に３回測定し、ｍｍ３での腫瘍体積を、式：（幅）２×長さ×０．５に従って計算した。ボンフェローニの多重比較検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを適用して、処置群の間の各時点での腫瘍体積を比較した。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して実施した。
【０２７０】
結果
半ヒト化腫瘍モデルにおいて、抗体１２８１９．１７１４９による処置によって、腫瘍増殖の有意な遅れがもたらされたが（媒体に対してＰ＜０．００１）、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）は、媒体処置群と比較して腫瘍増殖に対して限定的な効果を示した（図１１）。
【０２７１】
【表１４】
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【０２７２】
【表１５−１】
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【表１５−２】
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【表１５−３】
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【表１５−４】
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【表１５−５】
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【表１５−６】
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【表１５−７】
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【表１５−８】
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【表１５−９】
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【表１５−１０】
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【表１５−１１】
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【表１５−１２】
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【表１５−１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図５−９】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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