(57)【要約】  本発明により、次世代シークエンシングアプローチによって希少および／または未知のＤＮＡ配列を同定する方法を提供する。単離された二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ、またはｄｓ／ｓｓＤＮＡは、断片化され、該断片は、必要に応じて、平滑化、リン酸化、およびテールを付加（tailed）される。断片化は、酵素的でも、または機械的でもよい。ユニバーサルアダプター配列を各フラグメントに連結させ、ここで、該アダプターは、５’リン酸を含まないトップ鎖、−ＯＨの代わりに−Ｈを有する３’、および／または平滑化断片に付加された塩基に相補的な３’の余分な塩基を有し得る。次いで、連結体（ligatamer）は、アダプター配列に相補的なフォワードプライマーおよび該フラグメント配列に標的化されたリバースプライマーを用いる増幅のための鋳型として用いられ得る。これらの方法によって製造された組成物およびこれらの方法を実施するために適合されたキットもまた、本明細書に記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然配列およびユニバーサルアダプター配列をそれぞれ含む複数のポリヌクレオチドを含む組成物であって、該天然配列が、目的の配列および天然配列プライミングドメインを含み、該ユニバーサルアダプター配列が、５’から３’の順に、アダプタープライミングドメイン、および所望により１〜２０個のヌクレオチドからなるバーコードドメインを含み、ここで、該ユニバーサルアダプター配列が、目的の配列の５’末端から一定距離離れた位置にある、組成物。
【請求項２】
該ユニバーサルアダプター配列と目的の配列との間のヌクレオチド配列が、識別配列を規定する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
バーコードドメインが存在するとき、該識別配列がバーコードドメインを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ヌクレオチド配列がアダプタープライミングドメインに相補的であるユニバーサルプライマーをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
ヌクレオチド配列が天然配列の領域に相補的であるプライマーをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
目的の配列が突然変異である、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
目的の配列が一塩基多型（ＳＮＰ）である、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
目的の配列が挿入または欠失（ＩＮＤＥＬ）である、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
アダプタープライミングドメインが、表４に列記されたものから選択され、所定の複数の配列の分子的にユニークである確率が、９５％より大きい、９９％より大きい、または９９．９％より大きい、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
目的の配列をコピーする方法であって、
それぞれが天然配列およびユニバーサルアダプター配列を少なくとも一方の末端に含む複数の鋳型ポリヌクレオチドを増幅し、
該天然配列が、目的の配列ならびに５’から３’の順に、アダプタープライミングドメイン、および所望により１〜２０個のヌクレオチドからなるバーコードドメインを含むユニバーサルアダプター配列を含み、
ここで、該ユニバーサルアダプター配列が、ユニバーサルアダプター配列と目的の配列との間のヌクレオチド配列が所定の鋳型およびその子孫アンプリコンに固有の識別配列を規定するように、目的の配列の５’末端から一定距離離れた位置にあり、該アンプリコンが、ユニバーサルアダプター配列のアダプタープライミングドメインの少なくとも１０ｂｐと同一であるユニバーサルプライマーと、目的の配列の下流の天然配列の領域に相補的な第１のリバースプライマーとを含む、プライマー対を用いて増幅される、方法。
【請求項１１】
目的の配列が、突然変異、ＳＮＰ、またはＩＮＤＥＬである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
複数のユニバーサルアダプター配列を複数の天然配列ポリヌクレオチドに連結させて、複数の鋳型ポリヌクレオチドを作製することをさらに含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
ライゲーション産物を増幅前に３’から５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼで処理する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ユニバーサルプライマーおよび第１のリバースプライマーに相補的な領域の上流の配列に相補的な第２のリバースプライマーを含むプライマー対を用いてアンプリコンを増幅する工程をさらに含む、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
第２のリバースプライマーが、５’配列決定タグを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
鋳型ポリヌクレオチドが断片化ゲノムＤＮＡを含む、請求項１０から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
鋳型ポリヌクレオチドがｃＤＮＡを含む、請求項１０から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
第１のリバースプライマーの融解温度が、ユニバーサルプライマーの融解温度よりも少なくとも約５℃高いか、または少なくとも約１０℃高い、請求項１０から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
アダプタープライミングドメインが、表４に列記されたものから選択され、各個々の鋳型ポリヌクレオチドが、最初の増幅工程の直前に、９５％より大きい、９９％より大きい、または９９．９％より大きい分子的にユニークである確率を有する、請求項１０から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、および複数のユニバーサルアダプターポリヌクレオチドを含むキットであって、各ユニバーサルアダプターポリヌクレオチドが、３’末端を伸長不能にするためにリバース鎖上に３’修飾を含み、そして各ユニバーサルアダプターポリヌクレオチドが、すべてのユニバーサルアダプターポリヌクレオチドに共通のプライミング配列、および所望により１〜２０個のヌクレオチドからなるバーコードドメインを含む、キット。
【請求項２１】
３’から５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ不含有ポリメラーゼ緩衝液、およびヌクレアーゼ不含有リガーゼ緩衝液をさらに含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
プライミング配列の少なくとも１０ｂｐに相補的なユニバーサルプライマーをさらに含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
３’修飾が、水素、リン酸、および酢酸からなる群から選択される、請求項２０から２２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２４】
プライミング配列が、表４に列記されたものから選択される、請求項２０から２３のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本発明は、核酸の配列決定のための方法およびキットを開示しており、より具体的には、次世代シークエンシングのための方法およびキットを開示している。本明細書に記載の方法によって作製された組成物もまた開示される。
【背景技術】
【０００２】
背景
このセクションは、必ずしも先行技術ではない本発明に関連する背景情報を提供する。
【０００３】
ゲノムウォーキングは、近くの配列の知識に基づいて、未知の特定のＤＮＡ配列を同定し、増幅する有用な方法である。例えば、Arnold ＆ Hodgson (1991) PCR Methods ＆ Apps. 1:39-42を参照のこと。
【０００４】
Xu et al. (2013) Sci. Reports 3:3465は、ゲノムウォーキングの基本的な技術は、ゲノム断片化、次いで断片の半ネスト化（semi-nested）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を可能にするために５’アダプターを用いてその断片をキャッピングすることを含むように、これらの技術を改変することにより、より特異的な、高効率の、再利用可能なものとされ得ることを記載している。
【０００５】
次世代シークエンシングは、より多くの配列プールから稀な変異を同定することができる。Schmitt et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109:14508-13。
【０００６】
次世代シークエンシングアプローチを用いるとき、出発鋳型(テンプレート)に存在していた変異と、複製プロセス中に不完全なコピーによって導入される突然変異とを識別することができるように、いくつかの種類のインデックススキームを用いる必要がある。Fu et al. (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:1891-96。例えば、出発鋳型材料をバーコード化することによって、どの低頻度変異が元のサンプルに存在し、どの変異が増幅プロセス中にコピーエラーとして導入されたかを決定することが可能である。
【発明の概要】
【０００７】
概要
このセクションは、本発明の概要を提供するが、その全範囲またはその特徴の全ての包括的な開示ではない。
【０００８】
一般的に言えば、本明細書に記載の方法およびキットは、所定の数のヌクレオチドを配列決定するのに必要なプライマーの総数を減らし、所定の反応においてより多数の配列を分析することを可能にし、そうしてより詳細な配列特異性の決定を可能にする。言い換えれば、本明細書に記載の方法およびキットは、従来技術の配列決定方法およびツールで可能であったよりも精密な解析度で、関連配列のより大きな集団における低頻度配列を検出するため用いることができる。これらの方法およびキットは、本明細書に記載の組成物を作製するために使用することができる。
【０００９】
一態様において、本発明は、天然配列およびユニバーサルアダプター配列をそれぞれ含む複数のポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。該天然配列は、目的の配列および天然配列プライミングドメインを含み、該ユニバーサルアダプター配列は、５’から３’の順に、アダプタープライミングドメイン、および所望により１〜２０個のヌクレオチドからなるバーコードドメインを含み、ここで、該ユニバーサルアダプター配列は、目的の配列の５’末端から一定距離離れた位置にある。
【００１０】
別の態様において、目的の配列をコピーする方法を提供する。該方法は、それぞれが天然配列およびユニバーサルアダプター配列を少なくとも一方の末端に含む複数の鋳型ポリヌクレオチドを増幅することを含み、ここで、該天然配列は、目的の配列ならびに５’から３’の順に、アダプタープライミングドメイン、および所望により１〜２０個のヌクレオチドからなるバーコードドメインを含むユニバーサルアダプター配列を含み、該ユニバーサルアダプター配列は、ユニバーサルアダプター配列と目的の配列との間のヌクレオチド配列が、所定の鋳型およびその子孫アンプリコンに固有の識別配列を規定するように、目的の配列の５’末端から一定距離離れた位置にあり、ここで増幅は、ユニバーサルアダプター配列のアダプタープライミングドメインの少なくとも１０ｂｐと同一であるユニバーサルプライマーと、目的の配列の下流の天然配列の領域に相補的な第１のリバースプライマーとを含む、プライマー対を用いて開始される。
【００１１】
さらに別の態様において、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、および複数のユニバーサルアダプターポリヌクレオチドを含むキットを提供し、ここで、各ユニバーサルアダプターポリヌクレオチドは、３’末端を伸長不能にするためにリバース鎖上に３’修飾を含み、および各ユニバーサルアダプターポリヌクレオチドは、すべてのユニバーサルアダプターポリヌクレオチドに共通のプライミング配列、および所望により１〜２０個のヌクレオチドからなるバーコードドメインを含む。
【００１２】
図面の簡単な説明
本明細書に添付の図面は、選択された態様の説明のみを目的とするものであり、すべての可能な実施形態ではなく、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本明細書に記載の方法における使用のための、ユニバーサルアダプター配列および２つのプライマーの構造を例示する。
【図２】図２は、３’から５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼでの消化による増幅に先立って、未結合の過剰なユニバーサルアダプター配列を系から除去することができる機構を示す。図中、“Ｔ”はチミジンを示す。このヌクレアーゼ処理工程は、過剰のユニバーサルアダプター分子を系外に除く必要性を除去する。
【図３】図３は、本明細書に記載の一方法例のワークフローを示す。
【図４】図４は、目的の配列と共にバーコードドメインが、固有の識別配列を規定する原理を図示する。
【図５】図５は、以下の表２に記載のユニバーサルアダプターとのライゲーション後のｄＣＴ値を示す。
【図６】図６は、固有のアンプリコン成分の一態様を示す。
【図７】図７は、連結されたアダプター配列（＋／−リガーゼ）を有するか、または有さない、示された遺伝子標的のＣｔ値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
定義
用語“バーコードドメイン”または“バーコード配列”は、天然配列または鋳型ポリヌクレオチドには存在せず、分子識別に使用される固有の配列を意味する。
【００１５】
本明細書で用いる用語“識別配列”は、ポリヌクレオチドの上流末端におけるユニバーサルアダプター配列と目的の配列との間の配列を意味する。ユニバーサルアダプター配列がバーコードドメインを含む態様では、識別配列もバーコードドメインを含み、従って、“バーコード識別配列”と称され得る。バーコードドメインを含み得る識別配列は、分子識別を提供する。
【００１６】
“プライミングドメイン”または“プライミング配列”は、遊離３’末端に相補的なヌクレオチドが付加され得るヌクレオチド配列を意味する。
【００１７】
本明細書で用いる用語“目的の配列”は、所定の配列決定法において分析および／または試験される配列を意味する。任意の配列は、目的の配列を定義する、または含むことができる。目的の配列の非限定的な例には、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入または欠失変異（ＩＮＤＥＬ）、多重タンデムリピート（ＭＴＲ）、多核多型、リボソームＲＮＡ配列、ホメオボックスドメイン配列、ｔＲＮＡ配列、または他のものが含まれる。目的の配列は、単一塩基または塩基配列であり得る。目的の配列が２以上の塩基を含むとき、バーコードドメインと目的の配列との間の距離は、全ての識別配列について同じ方法で測定される限り、目的の配列内の任意の塩基から測定され得る。
【００１８】
用語“上流”および“下流”は、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ分子のフォワード鎖に対する相対的な位置を意味する。“上流”配列は、フォワード鎖の３’末端に近い（従って、リバース鎖の５’末端にも近い）“下流”配列よりも、フォワード鎖の５’末端に近い位置（従って、リバース鎖の３’末端に近い位置）に見出される。
【００１９】
本明細書で用いる用語“ユニバーサルアダプター”は、プライミングドメインを含むポリヌクレオチドを意味し、ここで、該プライミングドメインは、所定の反応において多くのまたは全てのユニバーサルアダプター分子に共通である。特定の態様において、ユニバーサルアダプターはまた、異なるユニバーサルアダプター分子間で変化し得るバーコードドメインを含み得る。
【００２０】
本明細書で用いる用語“相補的”または“相補性”は、特異的な水素結合による塩基対形成による二本鎖核酸の形成を意味する。塩基対形成は、標準的なワトソン−クリック塩基対形成であり得る（例えば、ＴとＡが対形成し、ＧとＣが対形成する）。塩基対形成はまた、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合であり得る。２つの核酸間の相補性は部分的であってよく、一部の塩基対のみが完全に一致する相補性を有する場合には、パーセンテージで表される（例えば、約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％など）。相補性はまた、２つの核酸の全ての塩基対が完全に一致していれば（すなわち、％Ａ＝％Ｔ、％Ｇ＝％Ｃならば）、完全一致であり得る（すなわち、１００％）。
【００２１】
縮重配列は、少なくとも１つの縮重ヌクレオチドを含む。縮重ヌクレオチドは、構造的に異なるヌクレオチドと同じ機能を果たし得るか、または同じ作用（output）を生じ得るヌクレオチドである。縮重ヌクレオチドは、２重縮重（すなわち、２個のヌクレオチドの１つであってよい）、３重縮重（すなわち、３個のヌクレオチドの１つであってよい）、または４重縮重（４個のヌクレオチドの１つ、ＡまたはＣまたはＧまたはＴであってよい）を有し得る。３重縮重を有するヌクレオチドは、“Ｂ”（ＣまたはＧまたはＴであり得る）、“Ｄ”（ＡまたはＧまたはＴであり得る）、“Ｈ”（ＡまたはＣまたはＴであり得る）、および“Ｖ”（ＡまたはＣまたはＧであり得る）を含む。２重縮重を有するヌクレオチドは、“Ｋ”（ＧまたはＴであり得る）、“Ｍ”（ＡまたはＣであり得る）、“Ｒ”（ＡまたはＧであり得る）、“Ｙ”（ＣまたはＴであり得る）、“Ｓ”（ＣまたはＧであり得る）、および“Ｗ”（ＡまたはＴであり得る）を含む。
【００２２】
本明細書に記載の方法、キットおよび組成物は、全てのタイプおよび動物、植物、細菌、ウイルス、真菌などのあらゆる起源由来、または合成的に作製された核酸を分析するのに有用である。例えば、標的核酸は、天然のＤＮＡまたはＲＮＡ、組み換え分子、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）またはｃＤＮＡであり得る。さらに、標的核酸は、イントロン、調節領域、アレル、変異体、または突然変異などの、細胞のゲノムの特定の部分であり得る。本明細書に記載の方法で使用するための鋳型ヌクレオチドは、ゲノム全体またはゲノムの任意の部分から、ならびに複数のゲノムの混合物から組み立てることができる。ある態様において、鋳型ポリヌクレオチドは、環境分離株から組み立てることができる。環境サンプルの限定的でない例には、土壌サンプル、池または河口などの水域からのサンプル、下水サンプル、病院などからのスワブ棒表面などが含まれる。ある態様において、標的核酸は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡであり得る。鋳型ヌクレオチドは、少なくとも約２５、５０、１００、５００、１０００、２５００、５０００または１００００ｂｐなどの任意の長さ、または無傷の染色体であり得る。
【００２３】
本明細書に記載の方法、キットおよび組成物は、従来技術に比べて多くの利点を有する。例えば、本明細書に記載の方法は、Arnold ＆ Hodgson’s (1991)の“vectorette”型増幅法（特異的プライマー伸長後のユニバーサルプライマー鋳型合成）の利点を、次世代シークエンシングアダプター／ライゲーション法と組み合わせている。
【００２４】
さらに、本明細書に記載の方法は、干渉するアダプター配列を除去するのではなく消化することを可能にする。この利点は、それらが除去されなければ過剰なバーコード化アダプターが増幅の際にプライマーとして作用し、そうしてバーコードの使用から得られる顕著に有益な状況を破壊するため、分子バーコード化を含む適用で特に顕著である。このため、増幅前にバーコード化アダプターを取り除く必要がある。ビーズまたはカラムを用いた精製は当技術分野では一般的であるが、これらの方法は、サンプルから極まれな配列を失う危険性を伴う。加えて、そのような精製工程は、自動化されたワークフローの場合には困難または煩雑であり、一般的に、該工程へのヒトの介入を必要とし、ハイスループットのロボット作業スキームを複雑にする。本明細書に記載の方法、キットおよび組成物は、貴重な鋳型分子を失うことなく、ライゲーションされていないアダプターのみを標的とする酵素消化を可能にし、従って自動化を容易にする。
【００２５】
本明細書に記載の組成物は、要すれば、目的の配列からランドマーク配列相当の距離をおいて位置する任意のアダプターバーコード配列と、バーコードドメイン配列と目的配列との間の（ランドマーク）配列の組み合わせからなる識別配列を含み得る。ランドマーク距離は、１ヌクレオチド〜数百ヌクレオチド、例えば１〜５０ヌクレオチド、約５０〜１００ヌクレオチド、約１００〜２００ヌクレオチド、または約２００〜５００ヌクレオチドの範囲であり得る。バーコード配列とランドマーク配列とのこの組み合わせから形成された固有の分子識別配列は、同等の分子識別を有する一組の実質的により短いバーコードから所定の数のユニーク識別配列を達成することを可能にする。例えば、８縮重塩基アダプターを有する１００ｂｐのフラグメントは、ランドマーク距離を無視して１１または１２縮重塩基を必要とする。他の態様において、本明細書に記載の組成物は、ランドマーク配列から構成される識別配列を含む。ランドマーク配列を含むヌクレオチドの長さおよび配列は、独自の(unique)分子識別を提供する。
【００２６】
所定のチューブ内で指数関数的増幅を行い、次いで同じチューブ内で線形増幅を行って、一本鎖アンプリコンを作製することは当技術分野で常套手段であるが、本明細書に記載の方法はまた、ある態様において、線形増幅を１本のチューブで行い、次いで指数関数的な増幅を同じチューブで行うことも含む。このようにして、複数の直接的鋳型コピーを指数関数的増幅のコピーの前に作製して、同じ親分子から導かれた同一バーコード配列がより高い信頼性をもたらすようにすることができる。
【００２７】
ポリメラーゼ連鎖反応法
ＰＣＲにより目的の配列を増幅する方法は、本明細書に記載さており、ここで、複数の天然フラグメントポリヌクレオチドが複数のユニバーサルアダプターポリヌクレオチドに付加されている。各ユニバーサルアダプターは、すべてのユニバーサルアダプターポリヌクレオチドに共通のアダプタープライミングドメイン、ならびに要すれば、所定の配列および複数のヌクレオチド、例えば１〜２０個のヌクレオチドを含むバーコードドメインを含む。バーコードドメインは、一般に縮重している（すなわち、少なくとも１つの縮重ヌクレオチドを含む）。バーコードドメインは、一連のアンプリコンを所定の鋳型分子に由来するものとして同定するために使用できる情報を運搬する。ユニバーサルアダプターがその天然の断片分子に付加されると、存在する場合、バーコードドメインは、天然フラグメント内の目的の配列から一定の距離（すなわち、ランドマーク距離）に位置し得る。その距離は、１ヌクレオチドから数百ヌクレオチドの範囲であり得る。アダプター（またはアダプターのバーコード）から目的の配列までの距離にわたるヌクレオチド配列は、ランドマーク配列と称され得る。バーコードドメインの組み合わせ、ならびにランドマーク配列の長さおよび配列は、増幅反応内で、９０％を超える分子的にユニークである確率を有する、例えば９１％を超える、９２％を超える、９３％を超える、９４％を超える、９５％を超える、９６％を超える、９７％を超える、９８％を超える、９９％を超える、または９９．９％を超える分子的にユニークである確率を有する識別配列を規定する。従って、所定の識別配列を担持する反応における全てのアンプリコンは、アダプターまたは所定のバーコードドメインを天然フラグメント内の目的の配列から一定の距離離れた位置に配置した、元の付着事象に基づいて識別配列を獲得した共通の鋳型から誘導されたものであると確実に理解することができる。次いで、鋳型は、ユニバーサルアダプターのアダプタープライミング配列に相補的な少なくとも１つのプライマーを含むプライマー対を用いて増幅される。
【００２８】
例えば、図２および３は、本明細書に記載の方法のサンプル態様のワークフローを説明する。図２に示す通り、連結されていないユニバーサルアダプターの２つの鎖が、相補的な塩基対形成によって一体となって保持されるとき、該二本鎖構造は、そのヌクレアーゼ活性がｓｓＤＮＡに特異的であるＥｘｏＩによる消化に対して耐性がある。しかしながら、該アダプターの２つの鎖が、一旦、融解により剥がされると、トップ鎖は、その３’末端が接近可能となるため、ＥｘｏＩ消化の影響を受けやすくなる。融解後でさえ、図２のユニバーサルアダプターのボトム鎖は、その３’末端修飾のためにＥｘｏＩ消化されないままであり得る。一方、ユニバーサルアダプターの二本鎖ＤＮＡへの連結は結果として安定した二本鎖アダプター−鋳型連結体を生じるため、天然フラグメントに連結されたユニバーサルアダプター（連結体（ligatamer））はＥｘｏＩ消化を受けない。従って、融解温度がアダプターオリゴヌクレオチドの少なくとも一部を解離することができるアダプターを使用することにより、増幅前に鋳型プールから３’−５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼ（例えば、ＥｘｏＩ）を用いてアダプターを除去し、非連結ユニバーサルアダプター分子の非特異的増幅を減少させる便利な方法を提供する。
【００２９】
次に図３に示すように、天然の断片（１）をユニバーサルアダプター（２）に連結させて、３’末端ブロックを有する鋳型分子（３）を作製することができる。連結していないユニバーサルアダプター分子を除去するために３’から５’の一本鎖特異的エキソヌクレアーゼ（図示せず）で消化した後、天然フラグメント配列内の配列に特異的なプライマー（４）のプライマー伸長により、目的の配列を含む二本鎖鋳型を作製することができ、その後、これは配列決定およびさらなる分析のために増幅され得る（５）。特異的プライマー伸長の後に、ユニバーサルプライマーを用いるＰＣＲを行い、二本鎖鋳型を作製した。リン酸化された特異的プライマーは、ＮＧＳ逆アダプターの連結を促進することが可能であった。
【００３０】
本明細書に記載の方法は、プライマー対の種々の構造を用いて行うことができる。ある態様では、プライマー対は、目的の配列の下流の配列に相補的なリバースプライマーを含む。他の態様では、増幅は、フォワードプライマーがユニバーサルアダプターのプライミング配列に相補的である複数のプライマー対を伴い、複数のリバースプライマーは、１以上の天然フラグメント内の１以上の目的の位置の下流の配列にそれぞれ相補的である。
【００３１】
本発明はまた、２セット以上の増幅工程を含む方法を提供し、ここで、工程の第一のセットが１つのプライマーセットを含み、その後、工程の１または複数のセットが、追加のリバースプライマーを含むとき、それぞれが、初期の増幅からのリバースプライマーの上流であるが、依然として目的の配列の下流である領域に相補的である。ある態様において、後続の増幅工程の１つにおけるリバースプライマー（または、複数のリバースプライマー）は、５’配列決定タグを担持する（またはそれぞれ担持する）。ある態様において、初期の増幅工程で用いるリバースプライマーの融解温度は、フォワードプライマーの融解温度よりも高く、例えば、少なくとも約２℃、少なくとも約５℃、少なくとも約７℃、少なくとも約１０℃、少なくとも約１２℃、または少なくとも約１５℃である。
【００３２】
ユニバーサルアダプター配列は、当技術分野においてよく知られている方法のいずれかによって天然フラグメントに結合させることができる。例えば、特定の態様において、ユニバーサルアダプターは、リガーゼを用いてライゲーションすることによって天然フラグメントに結合される。他の態様において、ユニバーサルアダプターは、プライマー伸長によって天然フラグメントに付加される。
【００３３】
本明細書に記載の方法で使用されるユニバーサルアダプターは、種々の方法で設計され得る。特定の態様において、ユニバーサルアダプターは、５’フォワード鎖オーバーハングを含み、所望により、リバース鎖の３’末端が、非伸長性であるように、例えばヒドロキシルの代わりに水素で、アセテートまたはホスフェート基で、あるいは対形成していないヌクレオチドで修飾されていてよい。ある態様において、ユニバーサルアダプターは、平滑末端、例えば、フォワード鎖の３’末端である。他の態様において、ユニバーサルアダプターは、フォワード鎖の３’末端またはリバース鎖の５’末端に少なくとも１つの不対塩基を有する。ある態様において、フォワード鎖の５’末端は、例えば、ホスフェートの代わりにヒドロキシルで、連結不可能な（unligatable）ように修飾される。
【００３４】
目的の配列は、天然のフラグメントポリヌクレオチドの１つのヌクレオチドまたはヌクレオチド鎖であり得る。特定の態様において、目的の配列は、突然変異内に位置するか、または突然変異である。特定の態様において、目的の配列は、一塩基多型（ＳＮＰ）内に存在するか、またはＳＮＰである。特定の態様において、目的の配列は、挿入または欠失（ＩＮＤＥＬ）内に存在するか、またはＩＮＤＥＬである。
【００３５】
上記の方法は、例えばＥｘｏＩなどの３’から５’の一本鎖特異的エキソヌクレアーゼで消化することにより、増幅前の系から連結していないユニバーサルアダプターポリヌクレオチドを除去することをさらに含み得る。ある態様において、増幅は、Arnold ＆ Hodgson (1991)に記載の方法と同様に、“vectorette”様式のゲノムウォーキング法を用いる。
【００３６】
この方法で使用することができる天然フラグメントは、特定の供給源または特定の調製物に限定されない。ある態様において、天然フラグメントは、断片化されたゲノムＤＮＡ、例えば酵素消化によって、または超音波処理およびキャビテーションなどの物理的剪断法によって断片化されたＤＮＡから得られる。他の態様において、天然フラグメントは、生物のトランスクリプトーム（複数可）の全部または一部から生成されたｃＤＮＡである。
【００３７】
同様に、アダプタープライミング配列は、当技術分野で公知の種々の配列から選択され得る。ある態様において、アダプタープライミング配列は、表４に含まれる群から選択される。
【００３８】
限定されない例として、本明細書に記載のＰＣＲ法は、複数のユニバーサルアダプター配列を複数の天然配列ポリヌクレオチドに連結することを含み得る。加えて、またはこれらに代えて、この方法は、第一のリバースプライマーを伸長させ、アダプター配列を含むプライマー伸長産物に相補的なフォワード鎖を形成することを含み得る。加えて、またはこれらに代えて、この方法は、増幅前に３’から５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼでライゲーション産物を処理することを含み得る。特定の態様において、エキソヌクレアーゼ処理は、プライマー伸長の前に行うことができ、他の態様では、エキソヌクレアーゼ処理の前にプライマー伸長を行う。加えて、またはこれらに代えて、この方法は、ユニバーサルプライマーおよび第一のリバースプライマーに相補的な領域の上流の配列に相補的な第二のリバースプライマーを含む、１対のプライマーでアンプリコンを増幅することを含み得る。
【００３９】
特定の態様では、本明細書に記載の方法で使用するための少なくとも１つのアダプターポリヌクレオチドは、５’末端でヒドロキシル化され、および／または３’末端で、水素、リン酸、酢酸、または１以上の不対ヌクレオチドからなる群より選択される修飾により修飾される。
【００４０】
ある態様において、第２のリバースプライマーは、５’配列決定タグを含む。
【００４１】
ある態様において、鋳型ポリヌクレオチドは、断片化されたゲノムＤＮＡを含む。他の態様において、鋳型ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡを含む。
【００４２】
ある態様において、第１のリバースプライマーの融解温度は、ユニバーサルプライマーの融解温度よりも高く、例えば少なくとも約２℃、少なくとも約５℃、少なくとも約７℃、少なくとも約１０℃、少なくとも約１２℃、または少なくとも約１５℃である。
【００４３】
特定の態様において、以下のように目的の配列を増幅するための方法が提供される：血液サンプルを患者から抽出し、全てのｇＤＮＡをサンプルから単離および精製する。単離および精製されたｇＤＮＡを、選択したエンドヌクレアーゼで消化し、フラグメントを平滑末端化し、次いでフラグメントの３’末端のそれぞれに単一のアデノシンオーバーハングを付加することにより、フラグメントを平滑末端化する。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼおよびＡＴＰと共に、複数のユニバーサルアダプター分子をフラグメント混合物に添加する。適切な間隔後に、ライゲーション産物をＥｘｏＩエキソヌクレアーゼで消化した。次いで、エキソヌクレアーゼを熱不活性化する（例えば、８０℃で２０分間、９５℃で２分間）。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび複数のプライマーを該混合物に添加する。これらのプライマーの１つは、ユニバーサルアダプター分子上のプライミング配列に相補的であり、他のプライマーは、それぞれ目的の配列の下流の既知の配列に相補的である。既知の下流の配列に相補的なプライマーはすべて、約６５℃の融解温度を有するが、アダプター配列に相補的なプライマーは、６０℃の融解温度を有する。６５℃でのアニーリングおよび７２℃での伸長を１０回行った後、６０℃でアニーリングしてさらに１０回の増幅を行う。次いで、リバースプライマーの第１のセットに対して、“ネステッド(nested)”プライマーとして作用するリバースプライマーの別のセットが加えられる。これらのネステッドプライマーは、６０℃〜６５℃の間の融解温度を有し得る。次のプライマーは、５’末端に配列決定タグを含む。さらに１０〜２０回の増幅を６０℃でアニーリングして行い、次いで増幅産物を配列決定する。最初の（増幅前の）鋳型プールにおける異なる分子種の相対的出現率は、各目的の配列の変異体に関連する固有の識別配列の数に基づいて推定することができる。
【００４４】
ヌクレオチド組成物
本発明はまた、本明細書に記載の方法で製造された組成物を提供する。これらの組成物は、それぞれが天然配列およびユニバーサルアダプター配列を含む複数のアンプリコンポリヌクレオチドを含み、ここで、該天然配列は、目的の配列および天然配列プライミングドメインを含み、該ユニバーサルアダプター配列は、アダプタープライミングドメインを含み、および要すれば、１〜２０個のヌクレオチドからなるバーコードドメインを含む。ユニバーサルアダプター配列は、ユニバーサルアダプター配列と目的の配列との間のヌクレオチド配列が一体となって識別配列を規定するように、目的の配列の５’末端から一定距離離れて位置する。ユニバーサルアダプター配列がバーコードドメインを含む態様では、識別配列はバーコードドメインも含む（図６参照のこと）。
【００４５】
図６に示すように、これらの組成物は複数のアンプリコンポリヌクレオチドを含み、その各々は、ユニバーサルアダプターポリヌクレオチドが目的の配列を含む天然フラグメントに付加されたときに作製された元の鋳型分子に由来する。組成物内の種々のアンプリコンセットが配列決定されると、各アンプリコンセットの識別配列は、使用者（ユーザー）によって決定され、次いで、使用者は、それぞれの目的の配列に関連する別個の識別配列の数に基づいて、所定のゲノムおよび／またはトランスクリプトーム内の様々な目的の位置のそれぞれにおける異なる配列配置の相対的な出現率を計算することができる。
【００４６】
ある態様において、個々のアンプリコンは、それぞれが互いに異なる２つの末端を有する。例えば、特定の態様において、各アンプリコンのフォワード鎖の５’末端の１０個のヌクレオチドおよびフォワード鎖の３’末端の１０個のヌクレオチドは、最大９０％の同一性、例えば最大８５％の同一性、最大８０％の同一性、最大７５％の同一性、最大７０％の同一性、最大６５％の同一性、最大６０％の同一性、または最大５０％の同一性を有する。ある態様において、全てが同一の元の鋳型分子に由来する識別配列を共有する所定のアンプリコンのセットの確率は、９０％より大きい、例えば９１％より大きい、９２％より大きい、９３％より大きい、９４％より大きい、９５％より大きい、９６％より大きい、９７％より大きい、９８％より大きい、９９％より大きい、または９９．９％より大きい。
【００４７】
本明細書に記載の組成物は、１以上の非伸長プライマーを含み得る。特定の態様では、これらのプライマーは、ユニバーサルアダプターのプライミング配列に相補的なプライマーおよび目的の配列の下流に位置する天然フラグメントの領域に相補的なプライマーの１つまたは複数を含む。
【００４８】
ある態様において、組成物は、天然フラグメント分子に付加されていない多量のユニバーサルアダプター配列を含まない。ある態様において、組成物は、天然のフラグメント分子に付加されていないユニバーサルアダプター配列を含まない。
【００４９】
ある態様において、組成物は、同じ天然フラグメント配列の異なる部分に相補的である少なくとも２つのリバースプライマー配列を含み、要すれば、これらの２つのリバースプライマーの少なくとも１つは、フォワードプライマーの融解温度よりも、少なくとも約２℃、少なくとも約５℃、少なくとも約７℃、少なくとも約１０℃、少なくとも約１２℃、または少なくとも約１５℃高い融解温度を有する。
【００５０】
限定しない例として、本明細書に記載の組成物は、そのヌクレオチド配列が、アダプタープライミングドメインに相補的であるユニバーサルプライマー、および／またはそのヌクレオチド配列が、天然配列の領域に相補的であるプライマーを含み得る。プライミングドメインとは、プライマーがハイブリダイズするヌクレオチド配列または供給されたプライマーと同一のヌクレオチド配列を意味する。
【００５１】
組成物中の少なくとも１つのポリヌクレオチドは、５’末端でヒドロキシル化されていてもよく、および／または３’末端がＨ、リン酸、酢酸および不対ヌクレオチドからなる群から選択される修飾で修飾されていてもよい。
【００５２】
増幅産物は、ユニバーサル配列と天然配列との間の増幅の結果であり得る。他の態様において、増幅産物は、５’ユニバーサルアダプター配列と３’ユニバーサルアダプター配列との間の増幅の結果であり得る。
【００５３】
ある態様において、縮重分子の可能性および目的の配列の可能性のある距離の産物は、ライゲーション事象の数を超える。
【００５４】
天然フラグメントがユニバーサルアダプターに結合されると、所定の鋳型分子が単に偶然に別の鋳型と同一である確率は、ｌ÷［Ｆ／（Ｘｎ×Ｌ）］で与えられ、式中、Ｆは、出発天然配列フラグメントの数であり、Ｘは、バーコードドメインの各位置における縮重ヌクレオチドの数であり、ｎは、バーコードドメインの縮重ヌクレオチド位置の数であり、Ｌは、出発天然配列断片の長さである。従って、言い換えれば、組成物中の２つの分子が識別配列を共有するとき、それらが異なる鋳型分子由来である可能性は非常に低い。
【００５５】
ある態様において、開始天然配列フラグメントの長さは高度に均一である。他の態様において、開始天然配列フラグメントの長さは多様である。長さが多岐にわたる場合、多様性は、ＤＮＡ単離後の断片化、例えば酵素的断片化または機械的断片化の結果として生じ得る。ある態様において、組成物内の鋳型分子は、ユニバーサルアダプター配列のランダムに断片化されたＤＮＡへのライゲーションの結果得られ得る。
【００５６】
キット
上記の方法を実施するためのキットも本明細書に記載される。本明細書に記載のキットは、上記の方法を実施するために必要な成分のいくつかまたは全てを含み得る。例えば、本明細書に記載のキットは、以下：プライマー；ユニバーサルアダプター分子；リガーゼ；３’から５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼ、例えばＥｘｏＩ；ＤＮＡポリメラーゼ；逆転写酵素；リガーゼ緩衝液；ＰＣＲ緩衝液；ｄＮＴＰ；ＭｇＣｌ２；ヌクレアーゼ不含有チューブおよびピペットチップ；ならびに、対応する反応緩衝液と共に制限エンドヌクレアーゼ、の１以上を含み得る。
【００５７】
限定しない例として、本明細書に記載のキットは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、および複数のユニバーサルアダプターポリヌクレオチドを含み得て、ここで、各ユニバーサルアダプターポリヌクレオチドは、３’末端を伸長不能にするためにリバース鎖上に３’修飾を含み、および各ユニバーサルアダプターポリヌクレオチドは、全てのユニバーサルアダプターポリヌクレオチドに共通のプライミング配列、および所望により１〜２０個のヌクレオチドからなるバーコードドメインを含む。バーコードドメインは縮重可能である。
【００５８】
キットはさらに、本明細書に記載の方法を実施するために必要に応じて種々の任意の成分を含んでいてよく、当業者は、そのような必要な成分を決定することができる。かかる成分の限定されない例には、３’から５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ不含有ポリメラーゼ緩衝液、ヌクレアーゼ不含有リガーゼ緩衝液、少なくとも１０ｂｐのプライミング配列に相補的なユニバーサルプライマーおよびそれらの組み合わせが含まれる。
【００５９】
３’修飾は、ポリメラーゼ伸長を妨げることができる公知の修飾であり得る。ある態様において、３’修飾は、Ｈ、リン酸、酢酸、および不対ヌクレオチドからなる群より選択される。加えて、またはこれらの代わりに、各ユニバーサルアダプターは、少なくとも一方の末端が平滑であり得る。加えて、またはこれらの代わりに、アダプターポリヌクレオチドは、部分的に二本鎖であり、部分的に一本鎖であってよく、ここで該フォワード鎖は、５’末端に不対のオーバーハングを含む。加えて、またはこれらの代わりに、アダプターポリヌクレオチドのフォワード鎖は、調製された天然配列へのライゲーションに適した３’末端を含み得る。加えて、またはこれらの代わりに、ユニバーサルアダプターポリヌクレオチドのフォワード鎖は、天然配列の３’末端に相補的な３’末端を含み得る。加えて、またはこれらの代わりに、ユニバーサルアダプターポリヌクレオチドのフォワード鎖は、天然配列の５’末端に相補的な５’末端を含み得る。加えて、またはこれらの代わりに、アダプターポリヌクレオチドのフォワード鎖およびリバース鎖は、少なくとも１つの平滑末端を含み得る。例えば、ユニバーサルアダプターポリヌクレオチドのリバース鎖は、５’リン酸を含む。
【００６０】
ある態様において、キットは、全てのアダプターポリヌクレオチドに共通のアダプターポリヌクレオチドの少なくとも一部と配列が同一であるユニバーサルプライマーを含む。
【００６１】
ある態様において、キットは、全てのアダプターポリヌクレオチドに共通のアダプターポリヌクレオチドの部分の全長と配列が同一であるユニバーサルプライマーを含む。
【００６２】
特定の態様において、キットは、表４に含まれる多様なユニバーサルアダプターおよびプライマー分子を含むチューブ；アダプター分子に相補的なプライマーオリゴのチューブ；Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ；ＡＴＰを含むリガーゼ緩衝液；ＥｘｏＩエキソヌクレアーゼ；熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ；Klenow ポリメラーゼ；ｄＡＴＰ；ｄＮＴＰ；および、ＭｇＣｌ２を含む。
【００６３】
プライマー
任意のオリゴヌクレオチド配列を、本明細書に記載の方法、キットおよび組成物においてプライマーとして用いることができる。本明細書に記載の方法、キットおよび組成物における使用のためのプライマーは、少なくとも約１０ｂｐ、例えば、少なくとも１５ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも２５ｂｐ、または少なくとも３０〜約５０ｂｐを含み得る。そのようなプライマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組合せであり得る。さらに、プライマーは、修飾されたリン酸−糖主鎖を含み得る。プライマーは、どのような鋳型配列が増幅されようとも、付着部位に相補的な配列を含む。例えば、アダプター分子に相補的なプライマーは、表４に含まれるものを含み得る。プライマーは、従来の核酸合成技術を用いて合成的に作製することができる。例えば、プライマーは、核酸合成装置を利用する標準的なホスホラミダイト技術により合成することができる。そのような合成装置は、例えばApplied Biosystems, Inc.（Foster City, California）から入手可能である。
【００６４】
ユーザが、本明細書に記載の組成物内の特定のアンプリコンを単離し、分析することを望むとき、その後の捕捉または精製を容易にするために、プライマーを、例えばビオチンまたはハプテンまたはフルオロフォアで標識することができる。プライマーは、Ｈ３またはＰ３２などの放射性同位体で標識することもできる。さらに、プライマーは、その後の増幅またはハイブリダイゼーション工程で使用するために、いわゆるシークエンシングタグのような非アニーリング配列を５’末端に有し得る。
【００６５】
ユニバーサルアダプターポリヌクレオチド
本明細書に記載の方法、キット、および組成物における使用のためのユニバーサルアダプター配列は、所定の反応において多くのまたは全てのユニバーサルアダプター分子に共通のプライミングドメイン配列を少なくとも含まなければならない。ある態様において、ユニバーサルアダプターはまた、異なるユニバーサルアダプター分子間で変化し得るバーコードドメインを含み得る。ユニバーサルアダプター配列は、５’から３’の順で、ユニバーサルプライミングドメイン、および場合によりバーコードドメインを含み得る。バーコードドメイン配列は一般に縮重している。ある態様において、縮重バーコードドメインは、１〜２０個の縮重ヌクレオチドを含む。他の態様では、バーコードドメインは縮重していない。ある態様では、ユニバーサルアダプターは、固体支持体係留プライマーおよび／またはプローブへのハイブリダイゼーションに適している。ある態様では、固定ユニバーサル配列は、捕捉構造とのハイブリダイゼーションに適していてもよい。
【００６６】
ユニバーサルアダプターにおけるプライミングドメインは、単一の配列であっても複数の配列であってもよく、任意の長さであり得る。限定されない例として、プライミング配列は、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも１５ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも２５ｂｐ、少なくとも３０ｂｐ、少なくとも３５ｂｐ、少なくとも４０ｂｐ、または少なくとも４５ｂｐの長さであり得る。限定されない例として、プライミング配列は、最大１００ｂｐ、最大９０ｂｐ、最大８０ｂｐ、最大７０ｂｐ、最大６０ｂｐ、最大５０ｂｐ、最大４５ｂｐ、最大４０ｂｐ、最大３５ｂｐ、最大３０ｂｐ、最大２５ｂｐ、最大２０ｂｐ、または最大１５ｂｐの長さであり得る。例えば、本明細書に記載の方法、キット、および組成物において使用するためのプライミング配列は、１５〜２５ｂｐの長さであり得る。プライミングドメイン配列の非限定的な例には、表４に示すものが含まれる。
【００６７】
バーコードドメインは、任意の数のヌクレオチド長であってよく、任意のヌクレオチド順であり得る。例えば、バーコードは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチド長であり得る。バーコード配列は、所定のアンプリコンの先行する系譜に関する情報を伝える。本明細書に記載の組成物および方法における分子祖先の同一性は、固有の識別配列によって決定され、バーコードは該識別配列の一部のみであるため、所定の反応における各ユニバーサルアダプター配列がそれぞれ、固有のバーコードを有する必要はない。バーコード配列が固有の分子識別配列を生じる原理は、図４に示されている。
【００６８】
図４において、“ｎ”は、０より大きい整数を意味する。例えば、ｎは、１〜２０の整数であり得る。“Ｎ”は、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、チミジン（Ｔ）、およびシトシン（Ｃ）から選択されるヌクレオチド塩基である。“Ｌ”は、所望の配列で、ＳＮＰなどのランドマークを意味する。Ｌは、ｎＮから任意の距離離れて位置し得る。その結果、ｎＮと、ｎＮとＬの間に介在する配列との組み合わせは、独立して構築された別の識別配列と区別されない４ｎ×Ｄ分の１の確率のみを有する識別配列を規定し、ここで、Ｄは、ｎＮとＬとの間のヌクレオチド塩基の数である。例えば、Ｄが１００である場合、１〜１２の範囲のｎについて分子独自性（uniqueness）を、以下の表に示す。
【００６９】
【表１】
2018516569.tif 000002
【００７０】
所定の反応における異なるユニバーサルアダプター分子は、共通のプライミング配列を共有することができるが、異なる長さのバーコードドメインを有する。バーコードドメインは一般にプライミング配列の下流に位置する。いくつかの態様では、プライミング配列およびバーコードドメインは一体となってユニバーサルアダプター分子の全長を占めるが、他の態様では、ユニバーサルアダプターはプライミング配列およびバーコードドメインを超えたさらなる配列を含み得る。
【００７１】
天然断片ポリヌクレオチド
本明細書に記載の方法および組成物において使用するための鋳型分子は、所望によりさらなる配列と組み合わせて、少なくともユニバーサルアダプター配列および天然フラグメント配列の組み合わせからなる。本明細書に記載の方法および組成物において使用するための天然フラグメントポリヌクレオチドは、任意の供給源または複数の供給源から得ることができる。限定されない例として、天然フラグメントは、ヒト個体、環境分離株または作物に由来し得る。特定の態様では、天然フラグメントには断片化されたゲノムＤＮＡが含まれる。他の態様では、天然フラグメントにはｃＤＮＡが含まれる。１つまたは複数のエンドヌクレアーゼおよび機械的手段による消化を含む、ＤＮＡを断片化する技術は、当技術分野でよく知られている。天然フラグメントは任意の長さであってよい。例えば、天然フラグメントは、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも５０００ｂｐ、または少なくとも１００００ｂｐの長さであり得る。限定されない例として、天然フラグメントは、最大１００ｋｂｐ、最大９０ｋｂｐ、最大８０ｋｂｐ、最大７０ｋｂｐ、最大６０ｋｂｐ、最大５０ｋｂｐ、最大４０ｋｂｐ、最大３０ｋｂｐ、最大２０ｋｂｐ、または最大１０ｋｂｐの長さであり得る。
【００７２】
天然フラグメントは、当業者に知られている多くの方法のいずれか１つによってユニバーサルアダプターに結合させ得る。例えば、いくつかの態様では、天然フラグメントは、適切なリガーゼとのライゲーションによってユニバーサルアダプターに付着される。このような用途で使用するためのリガーゼは、当業者によく知られている。ライゲーションが意図されている場合、断片化された鋳型のいわゆる“端部平滑化（end polishing）”工程をそれをユニバーサルアダプターに付着する前に行うことが有利であり得ることは当業者には理解される。そのような末端平滑化は、平滑末端化および／またはリン酸化および／または一方もしくは他方の末端への不対ヌクレオチドの付加などにより、ユニバーサルアダプターの反対側の末端に相補的ないわゆる“粘着末端”を作成する工程を含んでいてよい。いくつかの態様において、ユニバーサルアダプター配列は、プライマー伸長によって天然フラグメントに付加され得る。
【００７３】
一本鎖ポリメラーゼ連鎖反応
上記の鋳型およびプライマーに加えて、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅は、熱安定性ポリメラーゼを必要とする。かかるポリメラーゼは当業者によく知られており、例えば、Ｗａｒｄらの米国特許第７，９７２，８２８号（その内容全体を引用により本明細書中に包含させる）に記載の熱安定性ポリメラーゼが挙げられる。
【００７４】
本明細書に記載の方法の個々の別個の工程は、ポリプロピレンＰＣＲチューブのような、それぞれ独立した別個の容器で行われ得る。他の態様において、所定のチューブで２以上の工程を実行することができる。ある態様において、本明細書に記載の方法の全ての工程は、単一のチューブ内で行うことができる。
【００７５】
本明細書に記載の方法の所謂“単一のチューブ”の態様において、天然フラグメントＤＮＡを、リガーゼ、ポリメラーゼ、３’から５’の一本鎖特異的エキソヌクレアーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ、およびポリメラーゼ連鎖反応に必要な全ての他の成分と共に、チューブに加える。このような態様において、成分は、所望により、ｄｓＤＮＡアンプリコンの形成の進行を追跡するために、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ’−［４−［（Ｅ）−（３−メチル−１，３−ベンゾチアゾール−２−イリデン）メチル］−１−フェニルキノリン−１−イウム−２−イル］−Ｎ’−プロピル−プロパン−１，３−ジアミン（ＳＹＢＲ(登録商標)Ｇｒｅｅｎ）などの蛍光色素を含んでもよい。本明細書に記載の方法、キットおよび組成物と共に使用する増幅方法は、所定の用途に必要であれば、非定量的、半定量的または定量的であり得る。当業者は、所望されるように定量的または非定量的結果を達成するために増幅戦略を最適化する方法を容易に理解し得る。
【００７６】
増幅は、ネステッドプライマーを用いて一連のプログレッシブ工程で進行し得る。単一チューブの態様において、フォワードプライマーよりも高い融点を有するように、最も下流のリバースプライマーを設計することが有利であり得る。このようにして、プライマー伸長の第１ラウンドまたは複数ラウンドは、より高い温度で、かつより厳密な特異的アニーリング温度で行われ得る。リバースプライマーのこの高温伸長は、線形的または指数関数的に起こり得る。このようにして、精製工程を必要とせず、過剰なユニバーサルアダプターを、指数関数的増幅の前に系から除去することができる。次いで、その後の増幅ラウンドは、より低いアニーリング温度で、かつ指数関数的に進行し得る。ある態様において、上流および下流リバースプライマーの融解温度は、少なくとも約２℃、少なくとも約５℃、少なくとも約７℃、少なくとも約１０℃、少なくとも約１２℃、または少なくとも約１５℃違っていてよい。
【００７７】
診断方法
本明細書に記載の方法、キットおよび組成物は、疾患の診断のための突然変異（複数可）の検出に使用することができる。ある態様において、疾患は、作物または動物、例えば家畜、ペット、またはヒトにおいて生じる。特定の態様では、本明細書に記載の方法、キットおよび組成物は、ヒトの腫瘍を検出するために使用することができる。検出されるべき腫瘍は、良性腫瘍、前悪性腫瘍または悪性（すなわち、癌性）腫瘍のような任意のタイプであり得る。特に、はるかに一般的な遺伝子パターンを背景とした低頻度の遺伝子パターンを検出するための本明細書に記載の方法、キットおよび組成物の能力向上のために、そのような発癌性の特徴的パターンを有する細胞が血液サンプルのような所定の患者サンプルにおいて全ての細胞の極僅かな部分を構成するに過ぎないとき、非常に早い段階で腫瘍形成を示す遺伝子パターンシグナチャーを検出することが可能である。例えば、発癌性シグネチャーパターンは、１０４個のうち１個、１０６個のうち１個、１０９個のうち１個、１０１２個のうち１個または１０１５個のうち１個の細胞のみで見出すことができる。同様に、発癌性パターンは、循環細胞を含まないＤＮＡから測定することができた。
【００７８】
農業利用
本明細書に記載の方法、キットおよび組成物はまた、農業育種プログラムにも使用することができる。例えば、本明細書に記載の方法、キット、および組成物は、交雑育種後の所定の形質の導入を決定するために使用することができる。
【００７９】
環境モニタリング
本明細書に記載の方法、キットおよび組成物はまた、所定の環境のバイオームをモニターするために使用することができる。例えば、本明細書に記載の方法、キット、および組成物は、池、河川、下水管、または貯水池における種々の微生物の相対的汚染率を決定するために使用することができる。加えて、本明細書に記載の方法、キット、および組成物は、発酵槽または醸造容器のような工業環境における異なる微生物の相対的汚染率をモニターするために使用することができる。
【実施例】
【００８０】
実施例
さらなる説明がない限り、当業者は、上記の説明および以下の実施例を用いて、本明細書に記載の組成物を作製および利用し、特許請求の範囲に記載の方法を実施することができると考えられる。従って、以下の実施例は、本発明の代表的な態様を具体的に説明するものであり、いかなる場合にも本明細書の残りの部分を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００８１】
実施例１
本明細書に記載の方法、キットまたは組成物に用いるための例示的ユニバーサルアダプターを図１に示す。本実施例では、“Ｎ”は、天然フラグメントに連結するための突出塩基（cohesive base）または複数の突出塩基を意味する。対形成していないＮを用いて、ユニバーサルアダプター配列を天然フラグメント分子に結合させるのを助けることができる。“Ｐ”は５’リン酸を意味する。“Ｘ”は、例えば、ミスマッチ塩基、３’リン酸、３’酢酸、３’−ＯＨの代わりの−Ｈなどを含む、３’末端に対する非伸長性の修飾であり得る。“Ｙ”は、例えば、リン酸の代わりの−ＯＨのような、５’末端に対する非連結性の修飾であり得る。“Ｚ”は、５’末端に対する任意の非連結可能修飾であり得る。Ｚは、Ｙと同じであっても異なっていてもよい。
【００８２】
実施例２
サンプルからの全ｇＤＮＡをＨｐｙＣＨ４Ｖ（NEB, Ipswitch, Massachusetts）で消化した。これらの断片を、ＫＡＰＡ(登録商標)Ｈｙｐｅｒキット（Wilmington, Massachusetts）を用いて末端修復した。その結果、複数のｄＡテイルｇＤＮＡ Ｈｐｙ断片が得られた。次いで、これらのｇＤＮＡ断片を、ＤＮＡリガーゼの存在下または不存在下で、ユニバーサルアダプターポリヌクレオチドと共にインキュベートし、その後ユニバーサルアダプター配列に相補的なフォワードプライマーおよびｇＤＮＡ内の多様な配列に相補的な複数の２１個の異なるリバースプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅させた。
【００８３】
２１個のプライマーセットのうち１９個で、ライゲーションされた鋳型から予想される産物サイズを有するアンプリコンが得られた。これらの１９個のうち１６個が、単一産物アンプリコンであった。２１個のプライマーセットのうち３個のみが、非連結鋳型を有するアンプリコン産物を生じた。
【００８４】
実施例３
サンプルからの全ｇＤＮＡは、約１５０ｂｐに断片化されたCovarisであった。これらの断片を、ＫＡＰＡ(登録商標)Ｈｙｐｅｒキット（Wilmington, Massachusetts）を用いて末端修復した。その結果、複数のｄＡテイルｇＤＮＡ断片が得られた。次いで、これらのｇＤＮＡ断片を、ＤＮＡリガーゼの存在下で、ユニバーサルアダプターポリヌクレオチドと共にインキュベートし、その後ユニバーサルアダプター配列に相補的なフォワードプライマーおよびｇＤＮＡ内の多様な配列に相補的な複数の２２個の異なるリバースプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅させた。
【００８５】
全ての２２個のプライマーセットは、連結された鋳型から予想される複数の産物サイズを有するアンプリコンを生じた。
【００８６】
実施例４
一連のユニバーサルアダプター分子を、表１に示す配列から、等モル量のトップ鎖配列を各ボトム鎖配列と組み合わせ、変性させ、そしてゆっくりと冷却することによって調製した。以下の二本鎖アダプターを、ＥｘｏＩエキソヌクレアーゼの存在下または不存在下で、ＰＣＲ緩衝液中３７℃にてインキュベートした。インキュベートしたサンプルを、Bioanalyzer（Agilent Tech., Santa Clara, California）で分析した。ボトム鎖の“ｐ”はリン酸を示す。ＥｘｏＩを含む全てのサンプルにおいて、トップ鎖は成功裏に消化された。
【００８７】
【表２】
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【００８８】
次いで、表１のユニバーサルアダプターを鋳型試験配列に連結させた。再度、各連結体(ligatamer)のサンプルをＥｘｏＩを含むまたは含まないＰＣＲ緩衝液中で、３７℃にてインキュベートし、その後定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）増幅を行った。ユニバーサルアダプター配列に特異的なフォワードプライマーまたは試験配列に特異的なフォワードプライマーのいずれかを用いてＰＣＲを行った。リバースプライマーは、すべての増幅反応において試験配列に特異的であった。ユニバーサルフォワードプライマーで得られたＣｔ値と試験配列特異的フォワードプライマーで得られたＣｔ値との差は、各ユニバーサルアダプター構造についてのライゲーション効率を示す。図５は、これらの反応の各々から得られたｄＣｔ値（ｕ／ｆ，ｒ−ｆ／ｒ）を示す。理解されるように、ライゲーション効率は、アダプター＃３−７について実質的に等しかった。ｄＣｔ値は、ＥｘｏＩ処理された連結体と、ＥｘｏＩ処理されなかった連結体との間で同一であった。
【００８９】
これらのデータは、アダプター二重鎖の長さが７ｂｐ程度の短さであっても、切断されたボトム鎖を有するユニバーサルアダプターが、２０℃で高効率のライゲーションを可能にすることを示している。すべての二本鎖アダプターは、ＥｘｏＩを用いて３７℃にて消化可能であったが、３’リン酸で保護された連結体は、ＥｘｏＩ消化に対して完全に耐性であった。
【００９０】
実施例５
試験配列鋳型を、以下の表２に示す循環温度下でｑＰＣＲにより増幅させた。ユニバーサルアダプター配列に特異的な種々のフォワードプライマーを、各反応に１つずつ用いた。これらのフォワードプライマーは、それぞれ異なる長さを有し、対応する異なる融解温度（５４．９℃から６８．５℃の範囲）を有していた。対照反応は、試験配列鋳型に特異的なフォワードプライマーを含み、融解温度は７０℃であった。全ての反応は、試験配列鋳型内の配列に特異的であり、７０℃の融解温度を有する、同じリバースプライマーを用いた。これらの反応からのＣｔ値を表２に示す。
【００９１】
【表３】
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【００９２】
表２のデータから分かるように、リバースプライマーがフォワードプライマーの融解温度よりも十分に高い融解温度を有するように、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを対にすることにより、プライマー対を最適化して、直鎖伸長反応を初めに高温で行い、続いてより低い温度で指数関数的増幅を行う二段階法が可能であることが明らかである。換言すれば、天然フラグメントから連結されたユニバーサルアダプターへの線形的増幅、続いて両方のプライマーを含む反応におけるユニバーサルプライマーと天然配列プライマーとの間の指数関数的増幅を行うことが可能である。
【００９３】
この単一チューブ法をさらに試験するために、別のセットのｑＰＣＲ反応を、表２の手順で用いたのと同じプライマーセットで行った。この操作には、９４℃／７２℃で２０サイクル、続いて９４℃／６０℃／７２℃で２０サイクルが含まれた。このｑＰＣＲ操作は、以下の表３に示す“第１のＣｔ”データを生じた。同一セットの反応混合物を、９４℃／６０℃／７２℃で２×２０サイクルで並行して行った。この操作は、以下の表３に示す“第２のＣｔ”データを生じた。表３の“ｄＣｔ”カラムは、各プライマー対についての第１および第２のＣｔデータ間の差異を示す。第１のＣｔセットの反応では線形的な第１のステップ、その後の指数関数的な第２のステップについて約３−４のｄＣｔが予想される。このようなｄＣｔ値は、“第１Ｃｔ”ｑＰＣＲの最初の２０サイクルが線形的増幅のみを含み、大きい（＞７）ｄＣｔ値は“第１Ｃｔ”ｑＰＣＲが線形的増幅または指数関数的増幅を含むことを示す。理解されるように、線形的増幅は、“第１Ｃｔ”反復の最初の２０サイクルの間に６０℃未満の融解温度を有するプライマーで生じた。タッチダウンＰＣＲは、２つのプライマーの間の融解温度の最小限の最適化を伴う単一チューブ適用を可能にし得る。
【００９４】
【表４】
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【００９５】
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【００９６】
実施例６
血液サンプルは、まだ検出されていない腫瘍を有する患者から採取される。患者の血液中の腫瘍ＤＮＡの頻度は、正常ＤＮＡの頻度よりも顕著に少なく、１０４個の正常ゲノムごとに１個の癌ゲノム程度である。無細胞ＤＮＡは血液サンプルから単離される。単離されたＤＮＡ、末端平滑化、およびユニバーサルアダプター配列は、平滑化されたフラグメントに連結される。該フラグメントは、ユニバーサルアダプター配列に特異的なフォワードプライマーおよび種々の既知の癌変異の下流の配列に特異的なリバースプライマーの混合物を用いて、ＰＣＲによって増幅される。これらの試験された配列の１以上における癌シグネチャー変異の特異的かつ正確な検出に基づいて、悪性腫瘍の存在が非常に早い段階で検出される。
【００９７】
実施例７
新たに導入されたトランスジェニック形質を有する植物は、商業的種子生産者の市販の生殖細胞と交配される。倍数体の子孫がこの交配から産生され、子葉クリッピング（clipping）が苗から集められる。ｇＤＮＡを各クリッピングから単離し、断片化する。断片は平滑末端化される。ユニバーサルアダプター配列を平滑化した断片に連結させ、ユニバーサルアダプター配列に特異的なフォワードプライマーおよび形質（trait）配列に特異的なリバースプライマーを用いてＰＣＲを行う。形質の有無にかかわらず各苗からの断片の相対的な有病率は、各苗木における形質対立遺伝子のコピー数を示し、それに応じて将来の交雑を最適化することができる。
【００９８】
実施例８
水サンプルを、レクリエーションビーチ（recreational beach）から１週間にわたって毎日収集する。微生物をサンプルからろ過し、各ろ液から全ＤＮＡを単離する。ＤＮＡを断片化し、断片を平滑末端化する。ユニバーサルアダプター配列を、平滑化されたフラグメントに連結させる。該フラグメントを、ユニバーサルアダプターに特異的なフォワードプライマーおよび種々の病原体に特異的なリバースプライマーを用いてＰＣＲによって分析する。各サンプルにおける各病原体の相対的汚染率は、各プライマー対からのアンプリコンプール中のユニークな識別配列の数に基づいて決定される。このようにして、異なる病原体種の頻度の漸増および漸減が、このビーチで経時的に追跡される。
【００９９】
実施例９
循環細胞を含まないＤＮＡを、循環核酸単離キット（例えば、Qiagen）を用いて、１０ｍｌのヒト血漿から５０μｌの溶出緩衝液中に単離した。単離されたＤＮＡ５μｌを、商業的な次世代シークエンシングライブラリー調製キット（KAPA Hyper Prep Kit、Kapabiosystems）からの反応材を用いて製造業者の方法に従って、末端修復し、Ａテール化した。Kapaキットのライゲーション成分を用いて、推奨されるＹアダプターについて、ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT（配列番号１）＋[リン酸]GAUCGGAAG[リン酸]で構成されたアダプターに置き換えて、末端修復されたＤＮＡへのアダプターライゲーション（＋／−リガーゼ）を行った。タッチダウンｑＰＣＲを、ユニバーサルプライマーACACTCTTTCCCTACACGACGCTC（配列番号１１４）と、以下の表５に列記した特異的プライマー（０．２μＭユニバーサル、０．２μＭ特異的、IX SYBR Green Jumpstart Taq Readimix）との間で行った。サイクルパラメータは、９４℃／１５秒、７２℃／１５秒（サイクル当たり０．３℃の低下）で２０サイクル、次いで、９４℃／１５秒、６５℃／１５秒、７２℃／１５秒で３９サイクルであった。結果を下記の表５および図７に示す。＋と−のリガーゼ反応間のΔＣｔは、ユニバーサルプライマーと特異的プライマーとの間の増幅を示す。
【０１００】
【表１７】
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【０１０１】
本出願で引用される全ての文献、特許および特許出願は、引用によりその全体を本明細書中に包含させる。本明細書および特許請求の範囲で用いるように、単数形“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数形を含む。本明細書中、“Ａおよび／またはＢ”などの語句に用いる用語“および／または”は、“ＡおよびＢ”、“ＡまたはＢ”、“Ａ”ならびに“Ｂ”を含むことが意図される。特許請求の範囲に記載の方法、キットおよび組成物は、種々の特定の材料、手順および実施例を参照することによって本明細書に開示および説明されているが、本発明はその目的のために選択される材料および手順の特定の組み合わせに限定されないことが理解される。当業者には理解されるように、そのような詳細の数多くの変形が包含され得る。本明細書および実施例は単なる例示としてみなされることが意図される。本発明の真の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲によって示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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