(57)【要約】  本発明は、組換え微生物、アラニンの製造方法、及びアラニンの発酵生産のための組換え微生物の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
gcvTHPオペロン又はその相同体若しくは機能的変異体の活性及び／若しくは発現の導入、増加又は増強を含む組換え微生物。
【請求項２】
alaD遺伝子の活性及び／若しくは発現の導入、増加又は増強をさらに含む、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
pflB遺伝子の活性及び／若しくは発現の低下、抑制又は欠失をさらに含む、請求項１又は２に記載の組換え微生物。
【請求項４】
adhE遺伝子の活性及び／若しくは発現の低下、抑制又は欠失をさらに含む、請求項１〜３のいずれか1項に記載の組換え微生物。
【請求項５】
ldhA遺伝子の活性及び／若しくは発現の低下、抑制又は欠失をさらに含む、請求項１〜４のいずれか1項に記載の組換え微生物。
【請求項６】
pta遺伝子の活性及び／若しくは発現の低下、抑制又は欠失をさらに含む、請求項１〜５のいずれか1項に記載の組換え微生物。
【請求項７】
frdAの活性及び／若しくは発現の低下、抑制又は欠失をさらに含む、請求項１〜６のいずれか1項に記載の組換え微生物。
【請求項８】
gcvTHPオペロンが、以下：
(i) 配列番号51の配列を含む核酸分子、又は
(ii) 配列番号51の核酸分子に対して少なくとも80％同一性を有する核酸分子、又は
(iii) ストリンジェントな条件下で、配列番号51を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(iv) 配列番号46、48及び50のポリペプチドのそれぞれをコードする核酸分子、又は
(v) 配列番号46のポリペプチドに対して少なくとも60％の相同性を有するポリペプチド、及び配列番号48のポリペプチドに対して少なくとも60％の相同性を有するポリペプチド、及び配列番号50のポリペプチドに対して少なくとも60％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか1項に記載の組換え微生物。
【請求項９】
alaD遺伝子が、以下：
(AA) 配列番号15の配列を含む核酸分子、又は
(BB) 配列番号15の核酸分子に対して少なくとも80％同一性を有する核酸分子、又は
(CC) ストリンジェントな条件下で配列番号15を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(DD) 配列番号16のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(EE) 配列番号16のポリペプチドに対して少なくとも60％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、請求項２〜８のいずれか1項に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
pflB遺伝子が、以下：
(A) 配列番号5の配列を含む核酸分子、又は
(B) 配列番号5の核酸分子に対して少なくとも80％同一性を有する核酸分子、又は
(C) ストリンジェントな条件下で配列番号5を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(D) 配列番号6のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(E) 配列番号6のポリペプチドに対して少なくとも60％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、請求項３〜９のいずれか1項に記載の組換え微生物。
【請求項１１】
adhE遺伝子が、以下：
(F) 配列番号7の配列を含む核酸分子、又は
(G) 配列番号7の核酸分子に対して少なくとも80％同一性を有する核酸分子、又は
(H) ストリンジェントな条件下で配列番号7を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(I) 配列番号8のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(J) 配列番号8のポリペプチドに対して少なくとも60％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、請求項４〜１０のいずれか1項に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
ldhA遺伝子が、以下：
(K) 配列番号9の配列を含む核酸分子、又は
(L) 配列番号9の核酸分子に対して少なくとも80％同一性を有する核酸分子、又は
(M) ストリンジェントな条件下で配列番号9を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(N) 配列番号10のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(O) 配列番号10のポリペプチドに対して少なくとも60％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、請求項５〜１１のいずれか1項に記載の組換え微生物。
【請求項１３】
pta遺伝子が、以下：
(P) 配列番号11の配列を含む核酸分子、又は
(Q) 配列番号11の核酸分子に対して少なくとも80％同一性を有する核酸分子、又は
(R) ストリンジェントな条件下で配列番号11を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(S) 配列番号12のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(T) 配列番号12のポリペプチドに対して少なくとも60％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、請求項６〜１２のいずれか1項に記載の組換え微生物。
【請求項１４】
frdA遺伝子が、以下：
(U) 配列番号13の配列を含む核酸分子、又は
(V) 配列番号13の核酸分子に対して少なくとも80％同一性を有する核酸分子、又は
(W) ストリンジェントな条件下で配列番号13を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(X) 配列番号14のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(Y) 配列番号14のポリペプチドに対して少なくとも60％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、請求項７〜１３のいずれか1項に記載の組換え微生物。
【請求項１５】
前記微生物が、コリネバクテリウム属、バチルス属、エルウィニア属、エシェリキア属、パントエア属、ストレプトマイセス属、ザイモモナス属及びロドコッカス属並びにサッカロマイセス属からなる群の属から選択される、請求項１〜１４のいずれか1項に記載の組換え微生物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか1項に記載の1以上の組換え微生物を含む組成物。
【請求項１７】
培地及び炭素源をさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
以下のステップ：
(I)微生物において請求項１又は８に定義される遺伝子の活性及び／若しくは発現を導入、増加又は増強するステップ；及び
(II) 請求項１又は８に定義される遺伝子の活性及び／若しくは発現が低下、抑制又は欠失されていない参照微生物と比較して、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン、ロイシン及び／若しくはアラニンの収率及び／又は生産性が増強された組換え微生物を生成するステップ
を含む、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン、ロイシン及び／若しくはアラニンの収率及び／又は生産性が増強された組換え微生物の作製方法。
【請求項１９】
前記方法で用いられる組換え微生物が、請求項２又は９に定義される遺伝子の活性及び／若しくは発現の増加又は増強、並びに／あるいは請求項３〜８又は１０〜１４のいずれか1項に定義される少なくとも1つの遺伝子の活性及び／若しくは発現の低下、抑制又は欠失をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記微生物が、コリネバクテリウム属、バチルス属、エルウィニア属、エシェリキア属、パントエア属、ストレプトマイセス属、ザイモモナス属及びロドコッカス属並びにサッカロマイセス属からなる群の属から選択される、請求項１８又は１９のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン、ロイシン及び／若しくはアラニンの製造を可能にする条件下で、請求項１〜１５のいずれか1項に記載の1以上の組換え微生物を培養するステップを含む、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン、ロイシン及び／若しくはアラニンの製造方法。
【請求項２２】
前記微生物が、0.5％〜30％(w/v)の糖を含む培地中で培養される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン、ロイシン及び／若しくはアラニンの収率が少なくとも80％である、請求項２１又２２に記載の方法。
【請求項２４】
L-アラニンのキラル純度が少なくとも95％である、請求項２１〜２３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
キラル純粋なL-アラニンが製造される、請求項２１〜２３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１〜１５のいずれか1項に記載の1以上の遺伝子改変微生物を培養培地に接種するステップ、及び前記遺伝子改変微生物を培地で培養又は増殖させるステップを含む、遺伝子改変微生物を培養する又は増殖させる方法。
【請求項２７】
ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン、ロイシン及び／若しくはアラニンの発酵生産のための、請求項１〜１５のいずれか1項に記載の組換え微生物あるいは請求項１６又は１７のいずれか1項に記載の組成物の使用。
【請求項２８】
以下のステップ：
(I) 発酵槽中で請求項１〜１５のいずれか1項に記載の微生物を増殖させるステップ、及び
(II) I)で得られた発酵ブロスから、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン、ロイシン及び／若しくはアラニンを回収するステップ
を含む、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン、ロイシン及び／若しくはアラニンの発酵生産のための方法。
【請求項２９】
請求項１又は８に定義される核酸に機能可能に連結された、微生物中で機能的なプロモーターを含む組換え発現構築物。
【請求項３０】
請求項１又は８に定義される核酸あるいは請求項２９に定義される組換え発現構築物を含む組換えベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え微生物、アラニンの製造方法、及びアラニンの発酵生産のための組換え微生物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸は、カルボキシ基及びアミノ基を有する有機化合物である。最も重要なアミノ酸は、アミノ基がカルボキシ基の隣に位置しているアルファ-アミノ酸である。タンパク質は、アルファ-アミノ酸に基づいている。
【０００３】
アラニンは、食料、飼料及び医薬品産業において添加剤として使用されているため、相当な関心を集めてきた。さらに、アラニンは、強力なキレート剤であるアラニン、N,N-ビス(カルボキシメチル)-、三ナトリウム塩(MGDA、商品名トリロンM(Trilon M))の工業的生産のための原料であり、これは有機及び無機スケールの溶解において優れた性能を示す(WO94/29421号、WO2012/150155号)。Trilon Mグレードは、標準的なOECD試験によれば、容易に生分解可能である。卓越した生態学的及び毒物学的プロファイルにより、Trilon Mグレードは最終消費者向け製品における使用に特に適しており、このような生分解性錯体ビルダーに対する需要は常に増大している。
【０００４】
アラニンは、コリネ型細菌(Hermann, 2003：Industrial production of amino acids by Coryneform bacteria, J. of Biotechnol, 104, 155-172)又は大腸菌(E.coli.)(WO2007/120198号、WO2008/119009号)による発酵によって生産することができる。
【０００５】
大腸菌におけるアラニン生産がより効率的であり、化学産業用原料としてのアラニンの工業的生産に広く使用されている。アラニンに対する化学産業の需要は増加しているため、アラニンの発酵生産の生産性の改善に対する需要が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第WO94/29421号
【特許文献２】国際公開第WO2012/150155号
【特許文献３】国際公開第WO2007/120198号
【特許文献４】国際公開第WO2008/119009号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Hermann, 2003：Industrial production of amino acids by Coryneform bacteria, J. of Biotechnol., 104, 155-172
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的の1つは、高収率及び高効率でのアラニンの発酵生産に使用し得る微生物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的の達成に対する寄与は、各参照微生物と比較して、gcvTHPオペロンの活性及び／若しくは発現の導入、増加又は増強を有するエシェリキア・コリ(Escherichia coli)(大腸菌)のファミリーの組換え微生物によって提供される。
【００１０】
例えば、酵素の発現及び／又は活性、あるいは収率又は生産性に関する用語「より高い」、「増加」又は「増強」は、有意に高い、増加又は増強された発現及び／又は活性、あるいは収率又は生産性を意味する。
【００１１】
「酵素の発現及び／若しくは活性の低下、抑制又は欠失」という用語は、発現及び／若しくは活性の有意な低下、抑制又は欠失を意味し、また各酵素の検出不能な発現及び／若しくは活性も包含する。
【００１２】
驚くべきことに、gcvTHPオペロンによりコードされるタンパク質の活性及び／若しくは発現の導入、増加又は増強を有する微生物は、各gcvTHPオペロンの活性及び／若しくは発現の導入、増加又は増強を含まない同じ微生物と比較した場合、発酵生産におけるアラニンのより高い収率及び／又は生産性を有することが発見された。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
したがって、本発明の目下の一実施形態は、各参照微生物と比較して、グリシン切断複合体のリポイルタンパク質をコードするgcvH遺伝子、ピリドキサールリン酸依存性グリシンデカルボキシラーゼをコードするgcvP遺伝子、及びテトラヒドロ葉酸依存性アミノメチルトランスフェラーゼをコードするgcvT遺伝子のそれぞれをコードするgcvTHPオペロンの活性及び／若しくは発現の導入、増加又は増強を含み、且つ各参照微生物と比較して、発酵生産におけるアラニンのより高い収率及び／又は生産性を有する、組換え微生物である。
【００１４】
本明細書において使用される「参照微生物」という用語は、組換え微生物が比較される対照微生物を意味する。この参照微生物は、分析される差異を除き、組換え微生物と実質的に同じ遺伝子型を有する。好ましくは、参照微生物は、組換え微生物が由来する菌株である。例えば、ある遺伝子が野生型微生物に導入され、組換え微生物が作出される場合、野生型がこの組換え微生物の好適な参照微生物となる。また、組換え微生物Aにさらなる変異を導入し、これにより組換え微生物Bを作出することも可能である。その結果、組換え微生物Aは組換え微生物Bの好適な参照微生物となり得る。結果的に、組換え微生物及び各参照微生物の性能は、実質的に同一条件下で増殖させた両微生物で比較しなければならない。
【００１５】
当業者には、アラニンの収率及び／又は生産性の増加を有する微生物はまた、アラニンと密接に関連している他の代謝産物、例えばアラニン経路における中間体である代謝産物、アラニン経路と共通の中間体を共有する代謝産物、又はそれらの経路における中間体としてアラニンを利用する代謝産物の生産にも使用し得ることが明らかである。本発明の微生物はまた、特定の酵素活性の増加又は導入により、あるいは特定の酵素活性のノックアウト又は低下により、このような関連代謝産物の収率及び／又は生産性の増加を有するように容易に適合させることができる。
【００１６】
このような代謝産物は、例えば、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン及びロイシンである。
【００１７】
例えば、本発明の組換え微生物を使用してスクシネートを生産するために、本発明の微生物のゲノムにおいて、遺伝子ldh、pfl、pta及びadhEをノックアウトして、PEPカルボキシラーゼ遺伝子及び／若しくはピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を導入する必要がある。各経路及び必要な変異は、例えば、Zhang et al. (2009), PNAS (106) pp.20180-20185に記載されている。
【００１８】
従って、本発明の目下の別の実施形態は、各参照微生物と比較して、gcvTHPオペロンの活性及び／若しくは発現の導入、増加又は増強を含み、且つ各参照微生物と比較して、発酵生産におけるピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン及び／又はロイシンのより高い収率及び／又は生産性を有する組換え微生物である。
【００１９】
一部の実施形態において、微生物は原核細胞である。好適な原核細胞としては、グラム陽性菌、グラム陰性菌及びグラム不定細菌細胞、好ましくはグラム陰性菌が挙げられる。
【００２０】
従って、本発明において使用することができる微生物としては、限定するものではないが、グルコノバクター・オキシダンス(Gluconobacter oxydans)、グルコノバクター・アサイイ(Gluconobacter asaii)、アクロモバクター・デルマルヴァエ(Achromobacter delmarvae)、アクロモバクター・ヴィスコサス(Achromobacter viscosus)、アクロモバクター・ラクチカム(Achromobacter lacticum)、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)、アグロバクテリウム・ラディオバクター(Agrobacterium radiobacter)、アルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)、アルスロバクター・シトレウス(Arthrobacter citreus)、アルスロバクター・ツメセンス(Arthrobacter tumescens)、アルスロバクター・パラフィネウス(Arthrobacter paraffineus)、アルスロバクター・ヒドロカルボグルタミカス(Arthrobacter hydrocarboglutamicus)、アルスロバクター・オキシダンス(Arthrobacter oxydans)、アウレオバクテリウム・サペルダエ(Aureobacterium saperdae)、アゾトバクター・インディカス(Azotobacter indicus)、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス(Brevibacterium ammoniagenes)、ブレビバクテリウム・ディバリカタム(Brevibacterium divaricatum)、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム(Brevibacterium lactofermentum)、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)、ブレビバクテリウム・グロボサム(Brevibacterium globosum)、ブレビバクテリウム・フスカム(Brevibacterium fuscum)、ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム(Brevibacterium ketoglutamicum)、ブレビバクテリウム・ヘルコラム(Brevibacterium helcolum)、ブレビバクテリウム・プシラム(Brevibacterium pusillum)、ブレビバクテリウム・テスタセウム(Brevibacterium testaceum)、ブレビバクテリウム・ロセウム(Brevibacterium roseum)、ブレビバクテリウム・イマリオフィラム(Brevibacterium immariophilium)、ブレビバクテリウム・リネンス(Brevibacterium linens)、ブレビバクテリウム・プロトファルミエ(Brevibacterium protopharmiae)、コリネバクテリウム・アセトフィラム(Corynebacterium acetophilum)、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum)、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム(Corynebacterium acetoglutamicum)、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エルウィニア・アミロボーラ(Erwinia amylovora)、エルウィニア・カロトボーラ(Erwinia carotovora)、エルウィニア・ヘルビコーラ(Erwinia herbicola)、エルウィニア・クリサンテミ(Erwinia chrysanthemi)、フラボバクテリウム・ペレグリナム(Flavobacterium peregrinum)、フラボバクテリウム・フカツム(Flavobacterium fucatum)、フラボバクテリウム・アウランティナム(Flavobacterium aurantinum)、フラボバクテリウム・レナナム(Flavobacterium rhenanum)、フラボバクテリウム・セワネンセ(Flavobacterium sewanense)、フラボバクテリウム・ブレーベ(Flavobacterium breve)、フラボバクテリウム・メニンゴセプティカム(Flavobacterium meningosepticum)、ミクロコッカス種CCM825(Micrococcus sp. CCM825)、モルガネラ・モルガニイ(Morganella morganii)、ノカルジア・オパカ(Nocardia opaca)、ノカルジア・ルゴサ(Nocardia rugosa)、プラノコッカス・ユーシナタス(Planococcus eucinatus)、プロテウス・レットゲリ(Proteus rettgeri)、プロピオニバクテリウム・シャーマニイ(Propionibacterium shermanii)、シュードモナス・シンキサンタ(Pseudomonas synxantha)、シュー���モナス・アゾトフォルマンス(Pseudomonas azotoformans)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、シュードモナス・オバリス(Pseudomonas ovalis)、シュードモナス・スタッツェリ(Pseudomonas stutzeri)、シュードモナス・アシドボランス(Pseudomonas acidovolans)、シュードモナス・ムシドレンス(Pseudomonas mucidolens)、シュードモナス・テストステロニ(Pseudomonas testosteroni)、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)、ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)、ロドコッカス・ロドクラウス(Rhodococcus rhodochrous)、ロドコッカス種ATCC 15592(Rhodococcus sp. ATCC 15592)、ロドコッカス種ATCC 19070(Rhodococcus sp. ATCC 19070)、スポロサルシナ・ウレアエ(Sporosarcina ureae)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、ビブリオ・メチニコフィイ(Vibrio metschnikovii)、ビブリオ・チロゲネス(Vibrio tyrogenes)、アクチノマデュラ・マデュレ(Actinomadura madurae)、アクチノマイセス・ビオラセオクロモゲネス(Actinomyces violaceochromogenes)、キタサトスポリア・パルロサ(Kitasatosporia parulosa)、ストレプトマイセス・アベルミティリス(Streptomyces avermitilis)、ストレプトマイセス・コエリコロル(Streptomyces coelicolor)、ストレプトマイセス・フラベラス(Streptomyces flavelus)、ストレプトマイセス・グリセオラス(Streptomyces griseolus)、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)、ストレプトマイセス・オリバセウス(Streptomyces olivaceus)、ストレプトマイセス・タナシエンシス(Streptomyces tanashiensis)、ストレプトマイセス・バージニエ(Streptomyces virginiae)、ストレプトマイセス・アンチバイオチクス(Streptomyces antibioticus)、ストレプトマイセス・カカオイ(Streptomyces cacaoi)、ストレプトマイセス・ラベンデュレ(Streptomyces lavendulae)、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス(Streptomyces viridochromogenes)、アエロモナス・サルモニシダ(Aeromonas salmonicida)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バチルス・チアミノリティカス(Bacillus thiaminolyticus)、エシェリキア・フロインディイ(Escherichia freundii)、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム(Microbacterium ammoniaphilum)、セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、サルモネラ・ショットムレリ(Salmonella schottmulleri)、ザントモナス・シトリ(Xanthomonas citri)が挙げられる。
【００２１】
一部の実施形態において、微生物は真核細胞である。好適な真核細胞としては、酵母細胞、例えば、例えば、サッカロマイセス種(Saccharomyces spec)、例えばサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ハンセヌラ種(Hansenula spec)、例えばハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、シゾサッカロマイセス種(Schizosaccharomyces spec)、例えばシゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロマイセス種(Kluyveromyces spec)、例えばクルイベロマイセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)及びクルイベロマイセス・マルキシアナス(Kluyveromyces marxianus)、ヤロウィア種(Yarrowia spec)、例えばヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、ピキア種(Pichia spec)、例えばピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピキア・スティピテス(Pichia stipites)及びピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ザイゴサッカロマイセス種(Zygosaccharomyces spec)、例えばザイゴサッカロマイセス・ルキシー(Zygosaccharomyces rouxii)及びザイゴサッカロマイセス・バイリイ(Zygosaccharomyces bailii)、カンジダ種(Candida spec)、例えばカンジダ・ボイジニイ(Candida boidinii)、カンジダ・ユティリス(Candida utilis)、カンジダ・フレイシュシイ(Candida freyschussii)、カンジダ・グラブラータ(Candida glabrata)及びカンジダ・ソノレンシス(Candida sonorensis)、シュワンニオマイセス種(Schwanniomyces spec)、例えばシュワンニオマイセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)、アルクスラ種(Arxula spec)、例えばアルクスラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)、オガタエア種(Ogataea spec)、例えばオガタエア・ミヌータ(Ogataea minuta)、クレブシエラ種(Klebsiella spec)、例えばクレブシエラ・ニューモニア(Klebsiella pneumonia)が挙げられる。
【００２２】
多数の工業用細菌株が、本明細書に開示される方法における使用に特に適している。一部の実施形態において、微生物は、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)の種、例えばC.アセトフィラム(C. acetophilum)、C.グルタミカム(C. glutamicum)、C.カルナエ(C. callunae)、C.アセトアシドフィラム(C. acetoacidophilum)、C.アセトグルタミカム(C. acetoglutamicum)である。一部の実施形態において、微生物は、バチルス属(Bacillus)の種、例えばB.チューリンゲンシス(B. thuringiensis)、B.アントラシス(B. anthracis)、B.メガテリウム(B. megaterium)、B.サブチリス(B. subtilis)、B.レンティルス(B. lentils)、B.サーキュランス(B. circulans)、B.プミルス(B. pumilus)、B.ラウタス(B. lautus)、B.コアギュランス(B.coagulans)、B.ブレビス(B. brevis)、B.フィルムス(B. firmus)、B.アルカオフィウス(B. alkaophius)、B.リケニフォルミス(B. licheniformis)、B.クラウシイ(B. clausii)、B.ステアロサーモフィルス(B. stearothermophilus)、B.ハロデュランス(B. halodurans)、B.サブチリス(B. subtilis)、B.プミルス(B. pumilus)、及びB.アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)である。一部の実施形態において、微生物は、エルウィニア属(Erwinia)の種、例えばE.ウレドボーラ(E. uredovora)、E.カロトボーラ(E. carotovora)、(E.アナナス(E. ananas)、E.ヘルビコーラ(E. herbicola)、E.プンクタータ(E. punctata)及びE.テレウス(E. terreus)である。一部の実施形態において、微生物は、エシェリキア属(Escherichia)の種、例えば大腸菌(E. coli)である。他の実施形態において、微生物は、パントエア属(Pantoea)の種、例えばP.シトレア(P. citrea)又はP.アグロメランス(P. agglomerans)である。なお他の実施形態において、微生物は、ストレプトマイセス属(Streptomyces)の種、例えばS.アムボファシエンス(S. ambofaciens)、S.アクロモゲネス(S. achromogenes)、S.アヴェルミティリス(S. avermitilis)、S.コエリコロル(S. coelicolor)、S.アウレオファシエンス(S. aureofaciens)、S.アウレウス(S. aureus)、S.フンギシディカス(S. fungicidicus)、S.グリセウス(S. griseus)又はS.リビダンス(S. lividans)である。さらなる実施形態において、微生物は、ザイモモナス属(Zymomonas)の種、例えばZ.モビリス(Z. mobilis)又はZ.リポリティカ(Z. lipolytica)である。さらなる実施形態において、微生物は、ロドコッカス属(Rhodococcus)の種、例えばR.オパカス(R opacus)である。
【００２３】
好ましくは、微生物は、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)から選択され、好ましくはエシェリキア属(Escherichia)、例えば大腸菌(E. coli)、好ましくはDSMZ 1116に相当する大腸菌W株(ATCC9637に相当)である。
【００２４】
gcvTHPオペロンの活性及び／若しくは発現の導入、増加又は増強に加えて、本発明の組換え微生物は、(a)ピルビン酸ギ酸リアーゼIをコードするpflB遺伝子の活性及び／若しくは発現の低下、抑制又は欠失(ここでpflB遺伝子の活性及び／若しくは発現の低下、抑制又は欠失は各参照微生物と比較して決定される)をさらに含み得る。
【００２５】
gcvTHPオペロンの活性及び／若しくは発現の導入、増加又は増強に加えて、本発明の組換え微生物は、(b)二機能性アセトアルデヒド-CoAデヒドロゲナーゼ／鉄依存性アルコールデヒドロゲナーゼ／ピルビン酸-ギ酸リアーゼデアクチバーゼをコードするadhE遺伝子の活性及び／若しくは発現の低下、抑制又は欠失(ここでadhE遺伝子の活性及び／若しくは発現の低下、抑制又は欠失は、各参照微生物と比較して決定される)をさらに含み得る。
【００２６】
gcvTHPオペロンの活性及び／若しくは発現の導入、増加又は増強に加えて、本発明の組換え微生物は、(c)NAD依存性発酵性D-乳酸デヒドロゲナーゼをコードするldhA遺伝子の活性及び／若しくは発現の低下、抑制又は欠失(ここでldhA遺伝子の活性及び／若しくは発現の低下、抑制又は欠失は、各参照微生物と比較して決定される)をさらに含み得る。
【００２７】
gcvTHPオペロンの活性及び／若しくは発現の導入、増加又は増強に加えて、本発明の組換え微生物は、(d)リン酸アセチルトランスフェラーゼをコードするpta遺伝子の活性及び／若しくは発現の低下、抑制又は欠失(ここでpta遺伝子の活性及び／若しくは発現の低下、抑制又は欠失は、各参照微生物と比較して決定される)をさらに含み得る。
【００２８】
gcvTHPオペロンの活性及び／若しくは発現の導入、増加又は増強に加えて、本発明の組換え微生物は、(e)フマル酸レダクターゼをコードするfrdA遺伝子の活性及び／若しくは発現の低下、抑制又は欠失(ここでfrdA遺伝子の活性及び／若しくは発現の低下、抑制又は欠失は、各参照微生物と比較して決定される)をさらに含み得る。
【００２９】
gcvTHPオペロンの活性及び／若しくは発現の導入、増加又は増強に加えて、本発明の組換え微生物は、(f)アラニンデヒドロゲナーゼをコードするalaD遺伝子の活性及び／若しくは発現の導入、増加又は増強(ここでalaD遺伝子の活性及び／若しくは発現の増加又は増強は、各参照微生物と比較して決定される)をさらに含み得る。
【００３０】
好ましくは、gcvTHPオペロンの活性及び／若しくは発現の導入、増加又は増強を含む本発明の組換え微生物は、以下：
(a) ピルビン酸ギ酸リアーゼIをコードするpflB遺伝子の活性及び／若しくは発現の低下、抑制又は欠失、並びに
(b) 二機能性アセトアルデヒド-CoAデヒドロゲナーゼ／鉄依存性アルコールデヒドロゲナーゼ／ピルビン酸-ギ酸リアーゼデアクチバーゼをコードするadhE遺伝子の活性及び／若しくは発現の低下、抑制又は欠失、並びに
(c) NAD依存性発酵性D-乳酸デヒドロゲナーゼをコードするldhA遺伝子の活性及び／若しくは発現の低下、抑制又は欠失、並びに
(d) リン酸アセチルトランスフェラーゼをコードするpta遺伝子の活性及び／若しくは発現の低下、抑制又は欠失、並びに
(e) フマル酸レダクターゼをコードするfrdA遺伝子の活性及び／若しくは発現の低下、抑制又は欠失、並びに
(f) アラニンデヒドロゲナーゼをコードするalaD遺伝子の活性及び／若しくは発現の導入、増加又は増強、
(ここで遺伝子の活性及び／若しくは発現の低下、抑制、欠失、増加又は増強は、各参照微生物と比較して決定される)
の群から選択される特徴の少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つ、さらにより好ましくは少なくとも4つ、さらにより好ましくは少なくとも5つ、最も好ましくは全てをさらに有する。
【００３１】
alaD遺伝子は、任意の生物に由来するものであってもよいし、又は人為的に設計された合成遺伝子、例えば本発明の組換え微生物における発現のために最適化されたコドン使用頻度を有する合成遺伝子、又は酵素活性が最適化された(例えばVmax若しくはKmが改善された)合成遺伝子であってもよい。好ましくは、alaD遺伝子は、バチルス属(Bacillus)、ゲオバチルス属(Geobacillus)、パエニバチルス属(Paenibacillus)、ハロバチルス属(Halobacillus)、ブレビバチルス属(Brevibacillus)の1つの微生物に由来する。より好ましい実施形態において、alaD遺伝子は、ゲオバチルス属の微生物に由来する。最も好ましい実施形態において、alaD遺伝子はゲオバチルス・ステアロサーモフィルス(Geobacillus stearothermophilus)に由来する。
【００３２】
好ましい実施形態において、alaD遺伝子は、本発明の組換え微生物における発現のためにコドン最適化されている。
【００３３】
本発明の微生物は、アラニン、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン及び／又はロイシン、好ましくはスクシネート又はアラニン、より好ましくはアラニンの収率及び／又は生産性をさらに改善する、さらなる遺伝子改変、例えば突然変異、ノックアウト又は酵素活性の増強若しくは導入を含み得る。例えば、本発明の微生物は、大腸菌由来のygaW遺伝子又はその相同体若しくは機能的等価物の発現及び／若しくは活性の増強又は増加をさらに含んでいてよく、これは、過剰発現されると微生物のアラニン生産性を改善することが最近報告された(WO2012/172822)。
【００３４】
別の例において、本発明の微生物は、さらに、リポアミドデヒドロゲナーゼタンパク質をコードするlpd遺伝子の活性及び／若しくは発現の導入、増加又は増強を含み得る。
【００３５】
さらなる例において、本発明の微生物は、さらに、PCT/IB2014/064426及びPCT/IB2014/066686の出願において特定され且つ詳細に記載されており、アラニン、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン及び／又はロイシン、好ましくはスクシネート又はアラニン、より好ましくはアラニンの生産に有利な遺伝子のいずれか1つ、任意の組み合わせ又は全てを含み得る。
【００３６】
さらなる実施形態において、本発明の組換え微生物において活性及び／若しくは発現が導入、増加又は増強される、グリシン切断複合体のリポイルタンパク質をコードするgcvH遺伝子、ピリドキサールリン酸依存性グリシンデカルボキシラーゼをコードするgcvP遺伝子、及びテトラヒドロ葉酸依存性アミノメチルトランスフェラーゼをコードするgcvT遺伝子のそれぞれをコードするgcvTHPオペロンは、以下：
(i) 配列番号51の配列を含む核酸分子、又は
(ii) 配列番号51の核酸分子に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも96％、さらにより好ましくは少なくとも97％、例えば少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％同一性を有する核酸分子、又は
(iii) 配列番号51を有する核酸分子に対して中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、又は
(iv) 配列番号46、48及び50のポリペプチドのそれぞれをコードする核酸分子、又は
(v) 配列番号46のポリペプチドに対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、さらにより好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％の相同性を有するポリペプチドのそれぞれをコードする核酸分子、及び配列番号48のポリペプチドに対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、さらにより好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％の相同性を有するポリペプチド、及び配列番号50のポリペプチドに対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、さらにより好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％の相同性を有するポリペプチド
の群から選択され、
ここで(ii)、(iii)又は(v)によりコードされるポリペプチドは、配列番号46、48又は50のそれぞれを有するポリペプチドの少なくとも10％、20％、好ましくは少なくとも30％又は50％、より好ましくは少なくとも60％又は70％、さらにより好ましくは少なくとも75％、80％、85％又は90％、最も好ましくは少なくとも95％の活性を有する。
【００３７】
gcvTHPオペロンの発現及び／若しくは活性の導入、増加又は増強を含む本発明の組換え微生物は、例えば、配列番号1又は3の配列、配列番号1又は3の核酸分子に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも96％、さらにより好ましくは少なくとも97％、例えば少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％同一性を有する核酸分子、あるいは配列番号1又は3の核酸分子に対して中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子を有し得るlpd遺伝子をさらに含んでいてもよく、上記核酸のそれぞれは、配列番号2又は4のポリペプチドをコードしているか、あるいは配列番号2又は4のポリペプチドに対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、さらにより好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％の相同性を有するポリペプチドをコードしており、ここで上記ポリペプチドは、配列番号2又は4を有するポリペプチドの少なくとも10％、20％、好ましくは少なくとも30％又は50％、より好ましくは少なくとも60％又は70％、さらにより好ましくは少なくとも75％、80％、85％又は90％、最も好ましくは少なくとも95％の活性を有する。
【００３８】
gcvTHPオペロンの発現及び／若しくは活性の導入、増加又は増強をを含む本発明の組換え微生物は、上記の(a)〜(f)に定義される特徴の任意の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は全てをさらに含んでいてよく、
ここでpflB遺伝子は、以下：
(A) 配列番号5の配列を含む核酸分子、又は
(B) 配列番号5の核酸分子に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも96％、さらにより好ましくは少なくとも97％、例えば少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％同一性を有する核酸分子、又は
(C) 配列番号5を有する核酸分子に対して中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、又は
(D) 配列番号6のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(E) 配列番号6のポリペプチドに対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、さらにより好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、
(B)、(C)又は(E)によりコードされるポリペプチドは、配列番号6を有するポリペプチドの少なくとも10％、20％、好ましくは少なくとも30％又は50％、より好ましくは少なくとも60％又は70％、さらにより好ましくは少なくとも75％、80％、85％又は90％、最も好ましくは少なくとも95％の活性を有し、
adhE遺伝子は、以下：
(F) 配列番号7の配列を含む核酸分子、又は
(G) 配列番号7の核酸分子に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも96％、さらにより好ましくは少なくとも97％、例えば少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％同一性を有する核酸分子、又は
(H) 配列番号7を有する核酸分子に対して中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、又は
(I) 配列番号8のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(J) 配列番号8のポリペプチドに対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、さらにより好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、
(G)、(H)又は(J)によりコードされるポリペプチドは、配列番号8を有するポリペプチドの少なくとも10％、20％、好ましくは少なくとも30％又は50％、より好ましくは少なくとも60％又は70％、さらにより好ましくは少なくとも75％、80％、85％又は90％、最も好ましくは少なくとも95％の活性を有し、
ldhA遺伝子は、以下：
(K) 配列番号9の配列を含む核酸分子、又は
(L) 配列番号9の核酸分子に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも96％、さらにより好ましくは少なくとも97％、例えば少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％同一性を有する核酸分子、又は
(M) 配列番号9を有する核酸分子に対して中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、又は
(N) 配列番号10のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(O) 配列番号10のポリペプチドに対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、さらにより好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、
(L)、(M)又は(O)によりコードされるポリペプチドは、配列番号10を有するポリペプチドの少なくとも10％、20％、好ましくは少なくとも30％又は50％、より好ましくは少なくとも60％又は70％、さらにより好ましくは少なくとも75％、80％、85％又は90％、最も好ましくは少なくとも95％の活性を有し、
pta遺伝子は、以下：
(P) 配列番号11の配列を含む核酸分子、又は
(Q) 配列番号11の核酸分子に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも96％、さらにより好ましくは少なくとも97％、例えば少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％同一性を有する核酸分子、又は
(R) 配列番号11を有する核酸分子に対して中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、又は
(S) 配列番号12のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(T) 配列番号12のポリペプチドに対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、さらにより好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、
(Q)、(R)又は(T)によりコードされるポリペプチドは、配列番号12を有するポリペプチドの少なくとも10％、20％、好ましくは少なくとも30％又は50％、より好ましくは少なくとも60％又は70％、さらにより好ましくは少なくとも75％、80％、85％又は90％、最も好ましくは少なくとも95％の活性を有し、
frdA遺伝子は、以下：
(U) 配列番号13の配列を含む核酸分子、又は
(V) 配列番号13の核酸分子に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも96％、さらにより好ましくは少なくとも97％、例えば少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％同一性を有する核酸分子、又は
(W) 配列番号13を有する核酸分子に対して中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、又は
(X) 配列番号14のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(Y) 配列番号14のポリペプチドに対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、さらにより好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、
(V)、(W)又は(Y)によりコードされるポリペプチドは、配列番号14を有するポリペプチドの少なくとも10％、20％、好ましくは少なくとも30％又は50％、より好ましくは少なくとも60％又は70％、さらにより好ましくは少なくとも75％、80％、85％又は90％、最も好ましくは少なくとも95％の活性を有し、
alaD遺伝子は、以下：
(Z) 配列番号15の配列を含む核酸分子、又は
(AA) 配列番号15の核酸分子に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも96％、さらにより好ましくは少なくとも97％、例えば少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％同一性を有する核酸分子、又は
(BB) 配列番号15を有する核酸分子に対して中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、又は
(CC) 配列番号16のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(DD) 配列番号16のポリペプチドに対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、さらにより好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、
(AA)、(BB)又は(DD)によりコードされるポリペプチドは、配列番号16を有するポリペプチドの少なくとも10％、20％、好ましくは少なくとも30％又は50％、より好ましくは少なくとも60％又は70％、さらにより好ましくは少なくとも75％、80％、85％又は90％、最も好ましくは少なくとも95％の活性を有する。
【００３９】
本発明のさらなる実施形態は、上に定義される本発明の1以上の組換え微生物を含む組成物である。この組成物は、本発明の組換え微生物の増殖を可能にする培地をさらに含み得る。この培地は、炭素源、例えばヘキソース、ペントース又はポリオール(例えばスクロース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ラフィノース、キシロース、アラビノース、キシルロース(xylulose)、グリセロール、マンニトール、アラビトール、キシリトール、デンプン、セルロース、リグノセルロース)又はそれらの組み合わせを付加的に含み得る。好ましくは、炭素源はスクロースのグルコース(glucose of sucrose)であり、より好ましくは、炭素源はグルコースである。
【００４０】
好ましい実施形態において、本組成物は、本発明の微生物及びNBS培地、AM1培地又はPPM01培地を含む。より好ましくは、本組成物はさらに、炭素源、好ましくは糖を含む。これらの培地の成分は、当業者に公知である。
【００４１】
好ましくは、NBS培地は、1リットル当たり、
1〜5g、好ましくは3.5gのKH2PO4、及び
1〜10g、好ましくは5.0gのK2HPO4、及び
1〜5g、好ましくは3.5gの(NH4)2HPO4、及び
0.1〜1g、好ましくは0.25gのMgSO4-7H2O、及び
5〜25mg、好ましくは15mgのCaCL2-2H2O、及び
0.1〜1mg、好ましくは0.5mgのチアミン、及び
0.1〜5ml、好ましくは1mlの微量金属ストック
を含み、ここで微量金属ストックは、0.01〜1M、好ましくは0.1M HCLの1リットル当たり、0.5〜5g、好ましくは1.6gのFeCL3-6H2O；0.05〜0.5g、好ましくは0.2gのCoCl2-6H2O；0.01〜0.5g、好ましくは0.1gのCuCl2-2H2O；0.1〜0.5g、好ましくは0.2gのZnCl2；0.05〜0.5g、好ましくは0.2gのNaMoO4-2H2O；0.001〜0.1g、好ましくは0.05gのH3BO3を含む。
【００４２】
NBS培地中の好ましい炭素源はグルコース又はスクロース、好ましくは2％〜18％グルコース又は2％〜16％スクロースである。
【００４３】
好ましくは、AM 1培地は、0.1〜10mM、好ましくは1mMベタイン溶液1リットル当たり、
1〜10g、好ましくは2.6gの(NH4)2HPO4、及び
0.1〜5g、好ましくは0.87gのNH4H2PO4、及び
0.05〜2.5g、好ましくは0.15gのKCl、及び
0.05〜5g、好ましくは0.37gのMgSO4-7H2O、及び
0.1〜5ml、好ましくは1mlの微量金属ストック
を含み、ここで微量金属ストックは、0.01〜1M、好ましくは0.12M HCLの1リットル当たり、1〜5g、好ましくは2.4gのFeCL3-6H2O；0.1〜1g、好ましくは0.3gのCoCl2-6H2O；0.1〜1g、好ましくは0.21gのCuCl2-2H2O；0.1〜1g、好ましくは0.3gのZnCl2；0.1〜1g、好ましくは0.27gのNaMoO4-2H2O；0.01〜0.5g、好ましくは0.068gのH3BO3及び0.1〜1g、好ましくは0.5gのMnCl2-4H2Oを含み、場合により1〜30g、好ましくは15gの(NH4)2SO4を含む。
【００４４】
AM 1培地中の好ましい炭素源は、グルコース又はスクロース、好ましくは2％〜18％グルコース又は2％〜16％スクロースである。
【００４５】
好ましくは、PPM01培地は、1リットル当たり、
0.05〜5g、好ましくは0.37gのMgSO4-7H2O、及び
0.1〜10g、好ましくは1gの(NH4)2SO4、及び
0.05〜5g、好ましくは0.46gのベタイン、及び
0.001〜0.5g、好ましくは0.05gのシアノコバラミン(B12)、及び
1〜10g、好ましくは3.74gのKH2PO4、及び
0.1〜5ml、好ましくは1mlの微量金属ストック
を含み、ここで微量金属ストックは、10〜100mM、好ましくは60mM硫酸の1リットル当たり、1〜10g、好ましくは3.48gの(NH4)2Fe(II)(SO4)2-7H2O；0.1〜1g、好ましくは0.35gのCoSO4-7H2O；0.1〜1g、好ましくは0.31gのCuSO4-5H2O；0.1〜5g、好ましくは0.63gのZnSO4-7H2O；0.1〜1g、好ましくは0.27gのMnSO4-H2O；0.01〜1g、好ましくは0.07gのNaMoO4-2H2O及び0.1〜5g、好ましくは0.43gのH3BO3を含む。
【００４６】
PPM01培地中の好ましい炭素源は、グルコース一水和物、好ましくは培地1リットル当たり10〜500g、より好ましくは140gのグルコース一水和物である。
【００４７】
本発明のさらなる実施形態は、アラニン、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン及び／又はロイシン、好ましくはスクシネート又はアラニン、より好ましくはアラニンの収率又は生産性が増強された組換え微生物の作製方法であって、以下のステップ：
(I) 微生物において、gcvTHPオペロン又は上記の(i)〜(v)に定義されるようなものの1以上の活性及び／若しくは発現を導入、増加又は増強するステップ；及び
(II) gcvTHPオペロン又は上記の(i)〜(v)に定義されるようなものの活性及び／若しくは発現が導入、増加又は増強されていない対応する微生物と比較して、アラニン、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン及び／又はロイシン、好ましくはスクシネート又はアラニン、より好ましくはアラニンの収率又は生産性が増強された組換え微生物を作出、同定及び単離するステップ
を含む、上記方法である。
【００４８】
本発明の組換え微生物の作製方法の好ましい実施形態において、本方法は、例えば、上記の(A)〜(Y)に定義されるpflB遺伝子、adhE遺伝子、ldhA遺伝子、pta遺伝子又はfrdA遺伝子の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ又は全ての活性及び／若しくは発現を低下、抑制又は欠失するステップ、並びに／あるいは、例えば、上記の(Z)〜(DD)に定義されるalaD遺伝子の活性及び／若しくは発現を導入、増加又は増強するステップをさらに含む。
【００４９】
本発明の組換え微生物を作製するためのより好ましい方法は、pflB遺伝子、adhE遺伝子、ldhA遺伝子、pta遺伝子及びfrdA遺伝子の全ての活性及び／若しくは発現を低下、抑制又は欠失するステップ、及びalaD遺伝子及びgcvTHPオペロンの活性及び／若しくは発現を導入、増加又は増強するステップを含む。
【００５０】
本発明の組換え微生物の作製方法は、lpd遺伝子の活性及び／若しくは発現を導入、増加又は増強するステップをさらに含み得る。
【００５１】
さらに、本発明の組換え微生物の作製方法は、出願PCT/IB2014/064426及びPCT/IB2014/066686において特定され且つ詳細に記載されており、その低下、抑制又は欠失が、アラニン、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン及び／又はロイシン、好ましくはスクシネート又はアラニン、より好ましくはアラニン、最も好ましくは、L-アラニンの生産に有利なさらなる遺伝子を低下、抑制又は欠失するステップをさらに含み得る。
【００５２】
さらに、本発明の組換え微生物の作製方法は、出願PCT/IB2014/064426及びPCT/IB2014/066686において特定され且つ詳細に記載されており、その活性及び／若しくは発現の導入、増加又は増強が、アラニン、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン及び／又はロイシン、好ましくはスクシネート又はアラニン、より好ましくはアラニン、最も好ましくは、L-アラニンの生産に有利なさらなる遺伝子の活性及び／若しくは発現を導入、増加又は増強するステップをさらに含み得る。
【００５３】
本発明の組換え微生物の作製方法の一実施形態において、微生物は、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)の種、例えばC.アセトフィラム(C. acetophilum)、C.グルタミカム(C. glutamicum)、C.カルナエ(C. callunae)、C.アセトアシドフィラム(C. acetoacidophilum)、C.アセトグルタミカム(C. acetoglutamicum)、バチルス属(Bacillus)の種、例えばB.チューリンゲンシス(B. thuringiensis)、B.アントラシス(B. anthracis)、B.メガテリウム(B. megaterium)、B.サブチリス(B. subtilis)、B.レンティルス(B. lentils)、B.サーキュランス(B. circulans)、B.プミルス(B. pumilus)、B.ラウタス(B. lautus)、B.コアギュランス(B.coagulans)、B.ブレビス(B. brevis)、B.フィルムス(B. firmus)、B.アルカオフィウス(B. alkaophius)、B.リケニフォルミス(B. licheniformis)、B.クラウシイ(B. clausii)、B.ステアロサーモフィルス(B. stearothermophilus)、B.ハロデュランス(B. halodurans)、B.サブチリス(B. subtilis)、B.プミルス(B. pumilus)、及びB.アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)、エルウィニア属(Erwinia)の種、例えばE.ウレドボーラ(E. uredovora)、E.カロトボーラ(E. carotovora)、E.アナナス(E. ananas)、E.ヘルビコーラ(E. herbicola)、E.プンクタータ(E. punctata)及びE.テレウス(E. terreus)、エシェリキア属(Escherichia)の種、例えば大腸菌(E. coli)、パントエア属(Pantoea)の種、例えばP.シトレア(P. citrea)、P.アグロメランス(P. agglomerans)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)の種、例えばS.アムボファシエンス(S. ambofaciens)、S.アクロモゲネス(S. achromogenes)、S.アヴェルミティリス(S. avermitilis)、S.コエリコロル(S. coelicolor)、S.アウレオファシエンス(S. aureofaciens)、S.アウレウス(S. aureus)、S.フンギシディカス(S. fungicidicus)、S.グリセウス(S. griseus)、S.リビダンス(S. lividans)、ザイモモナス属(Zymomonas)の種、例えばZ.モビリス(Z. mobilis)又はZ.リポリティカ(Z. lipolytica)、及びロドコッカス属(Rhodococcus)の種、例えばR.オパカス(R opacus)からなる群より選択される。
【００５４】
好ましくは、微生物は、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)から選択され、好ましくはエシェリキア(Escherichia)属、例えば大腸菌(E. coli)、好ましくはDSMZ 1116に相当する大腸菌W株(ATCC9637に相当)である。
【００５５】
本発明のさらなる実施形態は、アラニン、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン及び／又はロイシン、好ましくはスクシネート又はアラニン、より好ましくはアラニン、最も好ましくは、L-アラニンの生産方法であって、上に定義される1以上の組換え微生物を、アラニン、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン及び／又はロイシン、好ましくはスクシネート又はアラニン、より好ましくはアラニン、最も好ましくはL-アラニンの生産を可能とする条件下で培養するステップを含む、上記方法である。
【００５６】
一部の実施形態において、本発明に包含される組換え微生物は、バッチ発酵条件下又は連続発酵条件下で増殖させる。古典的なバッチ発酵は閉鎖系であり、培地の組成は発酵の開始時に設定され、発酵中は人為的変更が加えられない。バッチ系の変法がフェドバッチ発酵である。この変法では、発酵が進行するにつれて徐々に基質が添加される。フェドバッチ系は、異化抑制が細胞の代謝を阻害する可能性があり、培地中に限定量の基質を有することが望ましい場合に有用である。バッチ発酵及びフェドバッチ発酵は一般的であり、当技術分野において周知である。本発明において同様に有用な連続発酵は、規定の発酵培地をバイオリアクタに連続的に添加し、等量の馴化培地(例えば、所望の最終産物を含む)を処理のため同時に取り出す系である。連続発酵は、一般的に、培養物を一定の高密度に維持し、ここで細胞は、主として最終産物の生産が増強される増殖期にある。連続発酵系は、定常状態の増殖条件を維持することを目指す。連続発酵工程のための栄養素及び増殖因子を調節する方法、並びに産物形成速度を最大化する技術は、工業的微生物学の分野において周知である。
【００５７】
一部の実施形態において、発酵は、約10℃〜約60℃、約15℃〜約50℃、約20℃〜約45℃、約25℃〜約45℃、約30℃〜約45℃、及び約25℃〜約40℃の範囲内の温度で行われる。好ましい実施形態において、温度は約34℃、35℃又は36℃である。最も好ましい実施形態において、温度は約37℃又は38℃である。
【００５８】
他の一部の実施形態において、発酵は、約8時間〜240時間、約8時間〜約168時間、約10時間〜約144時間、約15時間〜約120時間、又は約20時間〜約72時間の範囲内の期間にわたって行われる。好ましくは、発酵は約20時間〜約40時間行われる。
【００５９】
一部の他の実施形態において、発酵は、pH約4〜約9の範囲内、約4.5〜約8.5の範囲内、約5〜約8の範囲内、又は約5.5〜約7.5の範囲内で行われる。好ましくは、発酵はpH7で行われる。
【００６０】
アラニン、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン及び／又はロイシン、好ましくはスクシネート又はアラニン、より好ましくはアラニンの生産方法の一実施形態において、微生物は、1％〜30％(w/v)の糖、5％〜25％(w/v)の糖、10％〜20％(w/v)の糖、12％〜18％(w/v)の糖を含む培地中で培養される。好ましくは、微生物は、12％〜16％(w/v)の糖を含む培地中で培養される。
【００６１】
アラニン、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン及び／又はロイシン、好ましくはスクシネート又はアラニン、より好ましくはアラニンの生産方法の別の実施形態において、アラニン、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン及び／又はロイシンの収率は、少なくとも80％、例えば少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％又は少なくとも85％である。好ましくは、収率は、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％又は少なくとも90％である。より好ましくは、収率は、少なくとも90.5％、少なくとも91％、少なくとも91.5％、少なくとも92％、少なくとも92.5％、少なくとも93％、少なくとも93.5％、少なくとも94％又は少なくとも94.5％である。さらにより好ましい実施形態において、収率は、少なくとも95％又は少なくとも95.5％である。最も好ましい実施形態において、収率は少なくとも96％である。収率％は、培地中1gのグルコースから生産される産物gとして計算される。従って、培地が100gのグルコースを含有し、発酵により98gのアラニンが生じた場合、収率は98％となる。
【００６２】
アラニンの生産方法の別の実施形態において、好ましくは、キラル純度が少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％又は少なくとも94％のL-アラニンが生産される。好ましい実施形態において、L-アラニンのキラル純度は、少なくとも95％又は少なくとも95.5％である。より好ましい実施形態において、L-アラニンのキラル純度は、少なくとも96％又は少なくとも96.5％又は少なくとも97％である。さらにより好ましい実施形態において、L-アラニンのキラル純度は、少なくとも97.5％、少なくとも98％又は少なくとも98.5％、例えば少なくとも99％である。さらにより好ましくは、L-アラニンのキラル純度は、少なくとも99.5％又は少なくとも99.6％、例えば少なくとも99.7％、少なくとも99.8％又は少なくとも99.9％である。最も好ましい実施形態において、キラル純粋なL-アラニンが生産される。
【００６３】
本発明の別の実施形態は、上に定義される遺伝子改変微生物のいずれかを培養する又は増殖させる方法であって、培養培地に1以上の遺伝子改変微生物を接種するステップ、及び上に定義される条件下で前記遺伝子改変微生物を培養培地中で培養する又は増殖させるステップを含む、上記方法である。
【００６４】
アラニン、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン及び／又はロイシン、好ましくはスクシネート又はアラニン、より好ましくはアラニン、最も好ましくはL-アラニンの発酵生産のための、上で定義した組換え微生物又は上で定義した組成物の使用は、本発明のさらなる実施形態である。
【００６５】
本発明による組換え微生物は、各参照微生物(例えば野生型)と比較して、gcvTHPオペロンによりコードされる酵素の発現及び／若しくは活性が増加していることを特徴とする。
【００６６】
一実施形態において、遺伝子の発現及び／若しくは活性の低下は、遺伝子の不活性化、変異又はノックアウトによって達成される。これは、遺伝子のコード領域及び／若しくはプロモーターの一部又は全部の欠失により、遺伝子のコード領域にフレームシフトをもたらす遺伝子の変異(例えば幾つかのヌクレオチド(例えば1個若しくは2個のヌクレオチド)の挿入又は欠失)により、コード領域における終止コドンの導入により、例えばプロモーターボックス(リボソーム侵入部位、TATAボックスなど)の欠失又は変異による遺伝子のプロモーターの不活性化によって、行うことが可能である。低下はまた、遺伝子の転写産物を分解することにより、例えばリボザイム、dsRNA、アンチセンスRNA又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入による分解によっても達成できる。遺伝子の活性の低下は、標的酵素に特異的に結合する抗体又はアプタマーを細胞中で発現させることによって達成することができる。遺伝子の発現及び／若しくは活性の低下のための他の方法は当業者に公知である。
【００６７】
本明細書に開示される酵素の発現及び／若しくは活性の低下、特に乳酸デヒドロゲナーゼ(ldhA)、ピルビン酸ギ酸リアーゼI(pflB)、二機能性アセトアルデヒド-CoAデヒドロゲナーゼ／鉄依存性アルコールデヒドロゲナーゼ／ピルビン酸-ギ酸リアーゼデアクチバーゼ(adhE)、リン酸アセチルトランスフェラーゼ(pta)及び／若しくはフマル酸レダクターゼ(frdA)によりコードされる酵素の発現の低下及び／若しくは活性の低下は、各参照微生物(例えば野生型の微生物)における前記酵素の発現及び／又は活性と比較して、少なくとも50％の発現及び／若しくは酵素活性の低下、又は少なくとも90％の発現及び／若しくは酵素活性の低下、又はより好ましくは、少なくとも95％の発現及び／若しくは酵素活性の低下、又はより好ましくは少なくとも98％の発現及び／若しくは酵素活性の低下、さらにより好ましくは少なくとも99％の発現及び／若しくは酵素活性の低下、又はさらにより好ましくは、少なくとも99.9％の発現及び／若しくは酵素活性の低下であり得る。最も好ましい実施形態において、酵素の発現及び／又は活性は、本発明の微生物において検出されない。
【００６８】
本明細書に開示される酵素の発現及び／若しくは活性の増強又は増加、特にgcvTHPオペロンによりコードされる酵素の発現及び／若しくは活性の増強又は増加は、各参照微生物(例えば野生型の微生物)における前記酵素の発現及び／又は活性と比較して、発現及び／若しくは酵素活性の少なくとも25％の増加、又は発現及び／若しくは酵素活性の少なくとも50％の増加、又はより好ましくは、発現及び／若しくは酵素活性の少なくとも100％の増加、又はより好ましくは、発現及び／若しくは酵素活性の少なくとも3倍、例えば少なくとも5倍の増加、又はさらにより好ましくは、発現及び／若しくは酵素活性の少なくとも10倍の増加、又はさらにより好ましくは、発現及び／若しくは酵素活性の少なくとも20倍の増加であり得る。
【００６９】
gcvTHPオペロンの発現及び／若しくは活性の増加は、各参照微生物と比較して、本発明の組換え微生物におけるアラニン、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン及び／又はロイシン、好ましくはスクシネート又はアラニン、より好ましくはアラニンの収率及び／又は生産性の改善をもたらす。従って、gcvTHPオペロンの発現及び／若しくは活性の増加は、本発明の組換え微生物のアラニン、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン及び／又はロイシン、好ましくはスクシネート又はアラニン、より好ましくはアラニンの収率又は生産性を、各参照微生物と比較して測定することにより決定することができる。代謝産物(例えばアラニン)の発酵生産方法は当業者に公知であり、本明細書にも記載されている。各参照微生物による発酵におけるアラニンの収率と比較した、本発明の微生物による発酵における、例えばアラニンの収率の改善は、gcvTHPオペロンの発現及び/又は活性の増加の尺度である。
【００７０】
乳酸デヒドロゲナーゼ(ldhA)の発現又は活性を測定する方法は、例えば、Bunch et al.「The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli」, Microbiology (1997), 第143巻, 187-155頁；又はBergmeyer, H.U., Bergmeyer J.及びGrassl, M. (1983-1986), 「Methods of Enzymatic Analysis」, 第3版, 第III巻, 126-133頁, Verlag Chemie, Weinheim；又は Enzymes in Industry：Production and Applications, 第2版 (2004), Wolfgang Aehle, 23頁により開示されている。好ましいのは最後の方法である。
【００７１】
ピルビン酸ギ酸リアーゼI(pflB)の発現又は活性を測定する方法は、例えば、Knappe J, Blaschkowski HP, Grobner P, Schmitt T (1974). 「Pyruvate formate-lyase of Escherichia coli: the acetyl-enzyme intermediate」 Eur J Biochem 1974;50(1);253-63. PMID: 4615902；KNAPPE, Joachim, et al.「Pyruvate Formate‐Lyase of Escherichia coli: the Acetyl‐Enzyme Intermediate」 European Journal of Biochemistry 50.1 (1974): 253-263；Wong, Kenny K., et al. 「Molecular properties of pyruvate formate-lyase activating enzyme」Biochemistry 32.51 (1993): 14102-14110；及びNnyepi, Mbako R., Yi Peng, and Joan B. Broderick. 「Inactivation of E. coli pyruvate formate-lyase: Role of AdhE and small molecules」 Archives of biochemistry and biophysics 459.1 (2007): 1-9に開示されている。
【００７２】
二機能性アセトアルデヒド-CoAデヒドロゲナーゼ／鉄依存性アルコールデヒドロゲナーゼ／ピルビン酸-ギ酸リアーゼデアクチバーゼ(adhE)の発現又は活性を測定する方法は、例えば、Membrillo-Hernandez, Jorge, et al. 「Evolution of the adhE Gene Product of Escherichia coli from a Functional Reductase to a Dehydrogenase GENETIC AND BIOCHEMICAL STUDIES OF THE MUTANT PROTEINS」 Journal of Biological Chemistry 275.43 (2000): 33869-33875；及びMbako R. Nnyepi, Yi Peng, Joan B. Broderick, Inactivation of E. coli pyruvate formate-lyase: Role of AdhE and small molecules, Archives of Biochemistry and Biophysics, 第459巻, 第1版, 2007年3月1日, 1-9頁に開示されている。
【００７３】
リン酸アセチルトランスフェラーゼ(pta)の発現又は活性を測定する方法は、例えば、Dittrich, Cheryl R., George N. Bennett, and Ka‐Yiu San. 「Characterization of the Acetate‐Producing Pathways in Escherichia coli」 Biotechnology progress 21.4 (2005): 1062-1067；及びBrown, T. D. K., M. C. Jones-Mortimer, and H. L. Kornberg. 「The enzymic interconversion of acetate and acetyl-coenzyme A in Escherichia coli」 Journal of general microbiology 102.2 (1977): 327-336に開示されている。
【００７４】
フマル酸レダクターゼ(frdA)の発現又は活性を測定する方法は、例えば、Dickie, Peter, and Joel H. Weiner.「Purification and characterization of membrane-bound fumarate reductase from anaerobically grown Escherichia coli」 Canadian journal of biochemistry 57.6 (1979): 813-821；Cecchini, Gary, et al. 「Reconstitution of quinone reduction and characterization of Escherichia coli fumarate reductase activity」 Journal of Biological Chemistry 261.4 (1986): 1808-1814；又はSchroder, I., et al. 「Identification of active site residues of Escherichia coli fumarate reductase by site-dfirected mutagenesis」 Journal of Biological Chemistry 266.21 (1991): 13572-13579に開示されている。
【００７５】
アラニンデヒドロゲナーゼ(alaD)の発現又は活性を測定する方法は、例えば、Sakamoto, Y., Nagata, S., Esaki, N., Tanaka, H., Soda, K. 「Gene cloning, purification and characterization of thermostable alanine dehydrogenase of Bacillus stearothermophilus」 J Fermen. Bioeng. 69 (1990):154-158に開示されている。
【００７６】
用語「酵素の発現の低下」は、例えば、前記遺伝子操作された(例えば、遺伝子組換えされた)微生物による、各参照微生物(例えば前記微生物の野生型)により発現される酵素より低いレベルでの酵素の発現を包含する。酵素の発現を低下させるための遺伝子操作としては、限定するものではないが、酵素をコードする遺伝子若しくはその一部を欠失させること、酵素をコードする遺伝子の発現に関連する調節配列若しくは部位を(例えば、強力なプロモーター若しくは抑制性プロモーターを除去することにより)変化させるか又は改変すること、酵素をコードする遺伝子の転写及び／若しくは遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質(例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写活性化因子など)を改変すること、あるいは当技術分野において慣例的な特定の遺伝子の発現を低下させる任意の他の慣用的手段(例えば、限定するものではないが、アンチセンス核酸分子の使用若しくは標的タンパク質の発現をノックアウト若しくはブロックする他の方法など)が挙げられる。さらに、mRNAに不安定化エレメントを導入してもよいし、RNAのリボソーム結合部位(RBS)の劣化をもたらす遺伝子改変を導入してもよい。翻訳効率及び速度を低下させるように遺伝子のコドン使用頻度を変化させることも可能である。
【００７７】
酵素の活性の低下は、酵素の活性の低下をもたらす1つ以上の有害な遺伝子変異を導入することによって得ることもできる。さらに、酵素の活性の低下として、活性を低下させるべき酵素を活性化するために必要な活性化酵素の不活性化(又は発現の低下)も挙げることができる。後者の手法により、活性を低下させるべき酵素は、好ましくは、不活性化状態で維持される。
【００７８】
本出願による有害変異は、遺伝子のコード領域によりコードされるタンパク質のタンパク質活性の低下又は除去をもたらす、プロモーター及びコード領域を含む遺伝子内の任意の変異である。このような有害変異は、例えば、フレームシフト、コード領域への終止コドンの導入、転写を妨げるプロモーターエレメント(例えばTATAボックス)の変異などを含む。
【００７９】
gcvTHPオペロンによりコードされる酵素の発現及び／又は活性が増加又は増強した微生物は、天然に(すなわち自然突然変異により)生じ得る。微生物は、様々な技術(例えば化学的処理又は放射線照射)によって、前記遺伝子の1つ以上によりコードされる酵素の活性が有意に増加するように改変することができる。この目的のため、微生物は、例えば、変異誘発性化学薬剤、X線、又はUV光によって処理される。次のステップにおいて、前記遺伝子の1つ以上によりコードされる酵素の発現及び／又は活性が増加した微生物が選択される。組換え微生物は、前記遺伝子の1つ以上を、野生型遺伝子によりコードされる酵素と比較して発現及び／若しくは活性が増加した酵素をコードする対応する遺伝子で置換することを目的とする相同組換え技術によっても得ることができる。
【００８０】
本発明による組換え微生物の一実施形態によれば、gcvTHPオペロンによりコードされる酵素の発現及び／若しくは活性の増加は、gcvTHPオペロンの改変によって達成することが可能であり、この/これらの遺伝子改変(1つ又は複数)は、好ましくは、微生物のゲノム中のgcvTHPオペロンのコピー数の増加により、自己複製発現ベクター上の遺伝子を微生物に導入することにより、gcvTHPオペロンのプロモーターをより強力なプロモーターと交換することにより、あるいは遺伝子の内因性プロモーターをより強力なプロモーターに変換することによって(例えばプロモーター配列に点突然変異を導入することにより)実現される。
【００８１】
さらに、gcvTHPオペロンの活性は、遺伝子の活性を高めるタンパク質におけるアミノ酸交換を達成するために遺伝子を変異させることによって増強することができる。このような方法は、当業者に公知である。
【００８２】
本発明の目下の別の実施形態は、各参照微生物と比較して、テトラヒドロ葉酸依存性アミノメチルトランスフェラーゼをコードするgcvT遺伝子の活性及び／若しくは発現の導入、増加又は増強を含み、且つ各参照微生物と比較して、発酵生産におけるアラニンのより高い収率及び／又は生産性を有する組換え微生物である。
【００８３】
本発明の目下の別の実施形態は、各参照微生物と比較して、グリシン切断複合体のリポイルタンパク質をコードするgcvH遺伝子の活性及び／若しくは発現の導入、増加又は増強を含み、且つ各参照微生物と比較して、発酵生産におけるアラニンのより高い収率及び／又は生産性を有する組換え微生物である。
【００８４】
本発明の目下の別の実施形態は、各参照微生物と比較して、ピリドキサールリン酸依存性グリシンデカルボキシラーゼをコードするgcvP遺伝子の活性及び／若しくは発現の導入、増加又は増強を含み、且つ各参照微生物と比較して、発酵生産におけるアラニンのより高い収率及び／又は生産性を有する組換え微生物である。
【００８５】
さらに、本発明の目下の別の実施形態は、各参照微生物と比較して、gcvT遺伝子とgcvH遺伝子、又はgcvT遺伝子とgcvP遺伝子、又はgcvH遺伝子とgcvP遺伝子の活性及び／若しくは発現の導入、増加又は増強を含み、且つ各参照微生物と比較して、発酵生産におけるアラニンのより高い収率及び／又は生産性を有する組換え微生物である。
【００８６】
さらに、本発明の目下の別の実施形態は、各参照微生物と比較して、オープンリーディングフレームgcvT(配列番号45)、gcvH(配列番号47)、gcvP(配列番号49)の順序を変更したgcvTHPオペロン(gcvPHT、又はgcvHPT、又はgcvTPH、又はgcvPTH、又はgcvHTPオペロンを生じる)の活性及び／若しくは発現の導入、増加又は増強を含み、且つ各参照微生物と比較して、発酵生産におけるアラニンのより高い収率及び／又は生産性を有する組換え微生物である。
【００８７】
上記遺伝子(1つ又は複数)への変異は、例えば、部位特異的変異誘発又はランダム変異誘発、その後の組換えによる微生物のゲノムへの改変遺伝子の導入によって導入することができる。遺伝子の変異体は、PCRにより遺伝子配列を変異させることにより作成することができる。「Quickchange Site-directed Mutagenesis Kit」（Stratagene）を使用して、部位特異的変異誘発を行うことができる。コード配列全体、さもなければその一部のみにわたるランダム変異誘発は、「GeneMorph II Random Mutagenesis Kit」（Stratagene）を用いて実施することができる。変異誘発率は、使用される鋳型DNAの量を介して所望の変異量に設定される。多重変異は、標的とされる個々の変異の組み合わせ又はいくつかの変異誘発サイクルの連続実施によって作製される。
【００８８】
以下では、組換え、特に変異導入又は配列欠失のための好適な技術が記載される。
【００８９】
この技術はまた、本明細書中で「キャンベル組換え（Campbell recombination）」と呼ばれる場合もある（Leenhouts et al., Appl Env Microbiol. (1989), Vol. 第55巻, p.394-400）。本明細書で用いられる「キャンベルイン（Campbell in）」とは、環状二本鎖DNA分子(例えばプラスミド)の全体が、単一相同組換え事象(クロスイン事象)によって染色体に組み込まれ、それにより、前記環状DNA分子の線状型が、前記環状DNA分子の第一DNA配列に相同な染色体の第一DNA配列に効率的に挿入される、元の宿主細胞の形質転換体を指す。「キャンベルドイン(Campbelled in)」とは、「キャンベルイン」形質転換体の染色体に組み込まれている線状DNA配列を指す。「キャンベルイン」は、第一相同DNA配列の重複を含有し、その各コピーは、相同組換え交差点のコピーを含み、それを取り囲んでいる。
【００９０】
本明細書で用いられる「キャンベルアウト(Campbell out)」は、第二相同組換え事象(クロスアウト事象)が、「キャンベルドイン」DNAの線状化挿入DNA上に含まれる第二DNA配列と、前記線状化挿入体の第二DNA配列に相同な染色体由来の第二DNA配列との間で生じた「キャンベルイン」形質転換体の子孫である細胞を指し、上記の第二組換え事象は、組み込まれたDNA配列の一部の欠失(放出)を生じるが、重要なことに、組み込まれた「キャンベルドイン」DNAの一部(これは最小で単一塩基であり得る)の染色体中への残存をも生じ、元の宿主細胞と比較して「キャンベルアウト」細胞は、染色体における1つ以上の意図的な変化(例えば、一塩基置換、複数塩基置換、異種遺伝子若しくはDNA配列の挿入、相同遺伝子若しくは改変相同遺伝子のさらなる1つ又は複数コピーの挿入、あるいはこれらの上に挙げた例の2つ以上を含むDNA配列の挿入)を含む。「キャンベルアウト」細胞は、好ましくは、「キャンベルドイン」DNA配列の一部(放出されることが望ましい部分)に含まれる遺伝子(例えば、約5％〜10％スクロースの存在下で増殖する細胞中で発現されると致死である、枯草菌(バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)sacB遺伝子)に対するカウンターセレクションによって得られる。カウンターセレクションを行っても、又は行わなくても、所望の「キャンベルアウト」細胞は、任意のスクリーニング可能な表現型を用いて、所望の細胞をスクリーニングすることによって（例えば以下に限定されるものではないが、コロニーの形態、コロニーの色、抗生物質耐性の存在又は不在、ポリメラーゼ連鎖反応による所与のDNA配列の存在又は不在、栄養要求性の存在又は不在、酵素の存在又は不在、コロニー核酸ハイブリダイゼーション、抗体スクリーニングなど）、得る又は同定することができる。「キャンベルイン」及び「キャンベルアウト」という用語はまた、上記の方法又は工程を指す様々な時制の動詞として使用することもできる。
【００９１】
「キャンベルイン」又は「キャンベルアウト」をもたらす相同組換え事象は、相同DNA配列内のDNA塩基の範囲にわたって生じ得ることが理解されており、相同配列はこの範囲の少なくとも一部については互いに同一であるため、交差事象が生じた場所を正確に特定することは通常は可能ではない。言い換えれば、どの配列が挿入DNAに由来し、どの配列が染色体DNAに由来するかを正確に特定することはできない。さらに、第一相同DNA配列及び第二相同DNA配列は、通常、部分的に非相同な領域によって分離され、「キャンベルアウト」細胞の染色体に残ったままであるのはこの非相同領域である。
【００９２】
好ましくは、第一及び第二相同DNA配列は、少なくとも約200塩基対長であり、最大数千塩基対長であり得る。しかし、本手法は、より短い配列又はより長い配列で機能するようにすることができる。例えば、第一相同配列及び第二相同配列の長さは約500〜2000塩基であってよく、「キャンベルイン」から「キャンベルアウト」を得ることは、第一相同配列と第二相同配列とをほぼ同じ長さに配置することによって（好ましくは200塩基対未満の差となるように、最も好ましくは2つのうち塩基対が短い方を長い方の少なくとも70％の長さであるようにすることにより）容易になる。
【００９３】
一実施形態において、gcvTHPオペロンによりコードされる酵素の発現及び／若しくは活性の誘導は、gcvTHPオペロンの活性化により達成される。
【００９４】
本発明の文脈において使用される用語「アラニン、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン及び／又はロイシン」は、それらの最も広い意味で理解されるべきであり、その塩、例えば、Na+塩及びK+塩などのアルカリ金属塩、又はMg2+塩及びCa2+塩などの土類アルカリ塩、あるいはアラニン、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン及び／又はロイシンのアンモニウム塩若しくは無水物も包含する。
【００９５】
好ましくは、アラニン、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン及び／又はロイシン、好ましくはスクシネート又はアラニン、より好ましくはアラニンは、微好気的条件下で生産される。好気的条件又は嫌気的条件も使用し得る。
【００９６】
微好気的とは、酸素濃度が空気中の濃度未満であることを意味する。一実施形態によれば、微好気的とは、酸素圧5〜27mmHg、好ましくは10〜20Hgを意味する（Megan Falsetta et al. (2011), The composition and metabolic phenotype of Neisseria gonorrhoeae biofilms, Frontiers in Microbiology, 第2巻, p.1-11）。好ましくは、微好気的条件は、0.1〜1vvmの気流を用いて確立される。
【００９７】
嫌気的条件は、慣用技術により、例えば、反応媒体の成分を脱気し、二酸化炭素若しくは窒素又はそれらの混合物、及び場合により水素を、例えば流速0.1〜1又は0.2〜0.5vvmで導入することにより嫌気的条件を維持することによって確立することができる。好気的条件は、慣用技術により、例えば、流速0.1〜1又は0.2〜0.5vvmで空気又は酸素を導入することによって確立することができる。適切であれば、工程中に0.1〜1.5バールのわずかな過圧を印加してもよい。
【００９８】
本発明による方法の一実施形態によれば、同化可能な炭素源は、グルコース、グリセリン、グルコース、マルトース、マルトデキストリン、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キシロース、スクロース、アラビノース、ラクトース、ラフィノース、及びそれらの組み合わせであり得る。
【００９９】
好ましい実施形態において、同化可能な炭素源は、グルコース、スクロース、キシロース、アラビノース、グリセロール又はそれらの組み合わせである。好ましい炭素源は、グルコース、スクロース、グルコース及びスクロース、グルコース及びキシロース、並びに／又はグルコース、アラビノース及びキシロースである。本発明による方法の一実施形態によれば、同化可能な炭素源は、スクロース、グリセリン及び／若しくはグルコースであり得る。
【０１００】
同化可能な炭素源の初期濃度、好ましくは初期濃度は、好ましくは、5〜250g/l、好ましくは50〜200g/l、より好ましくは125〜150g/l、最も好ましくは約140g/lの範囲内の値に調整され、培養中に前記範囲内に維持することができる。反応培地のpHは、例えば、気体アンモニア、NH4OH、NH4HCO3、(NH4)2CO3、NaOH、Na2CO3、NaHCO3、KOH、K2CO3、KHCO3、Mg(OH)2、MgCO3、Mg(HCO3)2、Ca(OH)2、CaCO3、Ca(HCO3)2、CaO、CH6N2O2、C2H7N及び／若しくはそれらの混合物などの好適な塩基の添加によって制御することができる。
【０１０１】
本発明の別の実施形態は、アラニン、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン及び／又はロイシン、好ましくはスクシネート又はアラニン、より好ましくはアラニン、最も好ましくは、L-アラニンの発酵生産方法であって、以下のステップ：
I)   発酵槽中で、上に定義される本発明による微生物を増殖させるステップ、及び
(II) (I)で得られた発酵ブロスから、アラニン、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン及び／又はロイシン、好ましくはスクシネート又はアラニン、より好ましくはアラニン、最も好ましくは、L-アラニンを回収するステップ
を含む、上記方法である。
【０１０２】
本発明による発酵ステップI)は、例えば、撹拌発酵槽、気泡塔及びループ反応器中で行うことができる。撹拌型及び幾何学的設計を含む可能な方法型の包括的概説は、Chmiel：「Bioprozesstechnik：Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik」第1巻に見出すことができる。本発明による方法において、利用し得る典型的な変形は、当業者に公知であるか、又は例えばChmiel, Hammes and Bailey:「Biochemical Engineering」中に説明されている以下の変形、例えば、バイオマスの再循環を伴う又は伴わない、バッチ発酵、フェドバッチ発酵、反復フェドバッチ発酵、さもなければ他の連続発酵である。優れた収率(YP/S)を達成するために、生産株に応じて、空気、酸素、二酸化炭素、水素、窒素又は適切な気体混合物の注入(スパージ)を行い得る。
【０１０３】
方法ステップ(I)において、アラニン、ピルベート、スクシネート、アスパルテート、マレート、ラクテート、バリン及び／又はロイシン、好ましくはスクシネート又はアラニン、より好ましくはアラニン、最も好ましくはL-アラニンを生産するための特に好ましい条件は：
同化可能な炭素源：グルコース
温度：30〜45℃
pH：6.0〜7.0
微好気的条件
である。
【０１０４】
方法ステップ(II)において、方法ステップ(I)において得られた発酵ブロスから生産物が回収される。
【０１０５】
通常、回収方法は、いわゆる「バイオマス」としての発酵ブロスから組換え微生物を分離するステップを含む。バイオマスを除去する方法は当業者に公知であり、ろ過、沈降、浮揚又はそれらの組み合わせを含む。その結果、バイオマスは、例えば、遠心機、分離機、デキャンター、フィルターを用いて、又は浮揚装置中で除去することができる。価値ある生産物を最大限回収するため、例えば透析ろ過形式でバイオマスを洗浄することが多くの場合望ましい。方法の選択は、発酵ブロス中のバイオマス含量及びバイオマスの特性に応じて決定され、またさらに、バイオマスと有機化合物(例えば価値ある生産物)との相互作用によっても決まる。一実施形態において、発酵ブロスは滅菌又は殺菌することができる。さらなる実施形態において、発酵ブロスは濃縮される。必要に応じて、この濃縮はバッチ様式で又は連続的に行うことができる。圧力及び温度範囲は、第一に産物の損傷が生じないように、第二に必要とされる装置及びエネルギーの使用が最小限になるように選択されなければならない。多段蒸発法についての圧力及び温度レベルを上手に選択すると、特に、エネルギーの節約が可能となる。
【０１０６】
回収方法は、発酵産物がさらに精製される付加的な精製ステップをさらに含み得る。しかし、発酵産物が以下に記載するように化学反応により二次有機産物に変換される場合には、発酵産物のさらなる精製は、反応の種類及び反応条件によっては、必ずしも必要とされるわけではない。方法ステップ(II)において得られる発酵産物の精製のため、当業者に公知の方法、例えば結晶化、ろ過、電気透析、及びクロマトグラフィーを用いることができる。望ましくない残留イオンを除去するために、得られた溶液を、イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製してもよい。
【０１０７】
本発明のさらなる実施形態は、上記の(i)〜(v)に定義される核酸に機能可能に連結された、微生物中で機能的なプロモーターを含む組換え発現構築物である。好ましくは、プロモーターは、上記の(i)〜(v)に定義される核酸に対して異種である。
【０１０８】
本発明のさらなる実施形態は、上記の(i)〜(v)に定義される核酸分子を含む組換えベクター、又は上記に定義される組換え発現構築物である。
【０１０９】
定義
本発明は、特定の方法論又はプロトコルに限定されるものでないことを理解されたい。また、本明細書中で使用される用語法は特定の実施形態を説明することだけを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は、添付した特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されたい。本明細書及び添付した特許請求の範囲において使用される単数形の「a」「an」及び「the」は、文脈が明らかに別段に指示しない限り複数参照を含むものであることに留意しなければならない。従って、例えば、「ベクター(a vector)」との言及は１つ以上のベクターを指し、当業者に公知のその等価物などを包含する。本明細書中で使用される用語「約」は、ほぼ、大まかに、およそ、又はその領域内を意味する。用語「約」が数値範囲と共に用いられる場合、「約」は、示される数値の上限及び下限の境界を拡げることによって、その範囲を変更する。一般的に、用語「約」は、本明細書において、記載される値の上限及び下限の数値を20％、好ましくは10％上方若しくは下方(高い若しくは低い)の変動により変更するために使用される。本明細書中で使用される用語「又は(若しくは、あるいは)」は、特定のリストの任意の1つのメンバーを意味し、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも包含する。用語「含む(「comprise」、「comprising」、「include」、「including」、及び「includes」)」との語は、本明細書及び以下の特許請求の範囲において使用される場合、1つ以上の記載される特徴、整数、成分、又はステップの存在を特定することを意図するが、これらの用語は1つ以上の他の特徴、整数、成分、ステップ、又はそれらの群の存在若しくは付加を排除するものではない。明確性のため、本明細書において使用される特定の用語は以下の通りに定義及び使用される。
【０１１０】
コード領域：本明細書中で使用される用語「コード領域」は、構造遺伝子に関連して用いられる場合、mRNA分子の翻訳の結果として新生ポリペプチド中に見られるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を指す。コード領域は、真核生物においては、5'側では開始メチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ATG」によって結合し、原核生物は、開始コドンとしてトリプレット「GTG」及び「TTG」も利用する。3'側では、コード領域は、終止コドンを特定する3つのトリプレット(すなわち、TAA、TAG、TGA)のうちの1つにより結合されている。さらに、遺伝子は、RNA転写産物上に存在する配列の5'と3'末端の両方に位置する配列も含み得る。これらの配列は、「隣接(flanking)」配列又は領域と呼ばれる(これらの隣接配列は、mRNA転写産物上に存在する非翻訳配列に対して5'若しくは3'に位置する)。5'隣接領域は、調節配列、例えば、遺伝子の転写を制御するか又は遺伝子の転写に影響を与えるプロモーター及びエンハンサーを含み得る。3'隣接領域は、転写の終結、転写後の切断及びポリアデニル化を指示する配列を含み得る。
【０１１１】
相補性：「相補的」又は「相補性」は、逆平行ヌクレオチド配列中の相補的塩基残基間で水素結合を形成すると(塩基対合規則により)相互に対合することが可能な逆平行ヌクレオチド配列を含む、2つのヌクレオチド配列を指す。例えば、配列5'-AGT-3'は配列5'-ACT-3'と相補的である。相補性は「部分的」であっても「全体」であってもよい。「部分的」相補性は、１つ以上の核酸塩基が塩基対合規則によってマッチしない場合である。核酸分子間の「全体」又は「完全」相補性は、それぞれ及び全ての核酸塩基がもう1つの塩基と、塩基対合規則の下でマッチする場合である。核酸分子鎖間の相補度は、核酸分子鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に有意な影響を与える。本明細書で使用される核酸配列の「相補体」は、その核酸分子が核酸配列の核酸分子に対して全体相補性を示すヌクレオチド配列を指す。
【０１１２】
内因性：「内因性」ヌクレオチド配列は、野生型微生物のゲノム中に存在するヌクレオチド配列を指す。
【０１１３】
発現の増強：微生物における核酸分子の発現の「増強」又は「増加」は、本明細書中で等価に使用され、微生物における核酸分子の発現のレベルが、参照微生物(例えば野生型)より高いことを意味する。本明細書中で使用される用語「増強」又は「増加」は、ここでは発現させるべき核酸分子のより高い、好ましくは有意に高い発現を意味する。本明細書中で使用される、作用物質(例えばタンパク質、mRNA又はRNA)のレベルの「増強」又は「増加」は、実質的に同一の条件下で増殖させた実質的に同一の微生物と比較して、そのレベルが増加したことを意味する。本明細書中で使用される、標的遺伝子により発現された作用物質(例えばpreRNA、mRNA、rRNA、tRNA等)のレベル、及び／若しくはそれによりコードされるタンパク質産物のレベルの「増強」又は「増加」は、そのレベルが、好適な参照微生物と比較して、50％以上、例えば100％以上、好ましくは200％以上、より好ましくは5倍以上、さらにより好ましくは10倍以上、最も好ましくは20倍以上、例えば50倍増加することを意味する。その増強又は増加は、当業者が熟知している方法によって測定することができる。従って、核酸又はタンパク質の量の増強又は増加は、例えば、タンパク質の免疫学的検出によって測定することができる。さらに、タンパク質アッセイ、蛍光、ノーザンハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護アッセイ、逆転写(定量RT−PCR)、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ(RIA)又は他のイムノアッセイ及び蛍光活性化細胞分析(FACS)などの技術を用いて、微生物中の特定のタンパク質又はRNAを測定することができる。誘導されるタンパク質産物の種類に応じて、微生物の表現型に与えるその活性又は効果を測定することもできる。タンパク質の量を測定する方法は当業者に公知である。言及し得る例は、以下のものである：マイクロ-ビウレット法（Goa J (1953) Scand J Clin Lab Invest 5：218-222）、フォーリン-チオカルト法（Lowry OH ら (1951) J Biol Chem 193：265-275）又はCBB G-250の吸収を測定する方法（Bradford MM (1976) Analyt Biochem 72：248-254）。
【０１１４】
発現：「発現」は、細胞における、遺伝子産物の生合成、好ましくは、ヌクレオチド配列、例えば、内因性遺伝子又は異種遺伝子の転写及び／若しくは翻訳を指す。例えば、構造遺伝子の場合、「発現」は、構造遺伝子のmRNAへの転写及び、場合により、それに続く１つ以上のポリペプチドへのmRNAの翻訳を包含する。他の場合、発現はRNA分子を保有するDNAの転写のみを指し得る。
【０１１５】
外来：用語「外来」は、実験的操作により細胞に導入された任意の核酸分子(例えば、遺伝子配列)を指し、導入された配列が幾つかの改変(例えば、点突然変異、選択マーカー遺伝子の存在等)を含み、これにより天然の配列と比較して異なる限り、その細胞中に見られる配列を包含し得る。
【０１１６】
機能的連結：用語「機能的連結（functional linkage）」又は「機能的に連結された（functionally linked）」は、用語「機能可能な連結（operable linkage）」又は「operably linked）」と等価であり、例えば、調節エレメント(例えばプロモーター)と発現対象の核酸配列との、さらに適切な場合にはさらなる調節エレメント(例えばターミネーター)との連鎖配列（sequential arrangement）であって、調節エレメントのそれぞれがその意図される機能を実行して前記核酸配列の発現を可能にし、改変し、促進し又はさもなくば影響を与えることができるような前記連鎖配列を意味すると理解される。同義語として、表現「機能可能な連結」又は「機能可能に連結された」を使用してもよい。発現は、センス又はアンチセンスRNAに対する核酸配列の配置に応じて生じ得る。この目的のためには、化学的な意味での直接連結は必ずしも必要ではない。遺伝子制御配列(例えばエンハンサー配列など)は、さらに離れた位置から、又は他のDNA分子からでさえも、標的配列に対するそれらの機能を果たし得る。好ましい配置は、組換え発現される核酸配列がプロモーターとして作用する配列の後方に位置し、その結果、2つの配列が相互に共有的に連結される配置である。好ましい実施形態において、転写開始点が本発明のキメラRNAの所望の起点と同一であるように、転写対象の核酸配列はプロモーターの後方に位置している。機能的連結、及び発現構築物は、以下に記載される慣用の組換え技術及びクローニング技術を用いて作製することができる（例えば、Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY)；Silhavy et al. (1984) Expeiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY)；Ausubel et al., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience；Gelvin et al., (編) (1990) Plant Molecular Biology Manual; Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, The Netherlands）。しかし、例えば、制限酵素の特異的切断部位を有するリンカーとして作用する、又はシグナルペプチドとして作用するさらなる配列が2つの配列間に配置されていてもよい。配列の挿入はまた、融合タンパク質の発現をももたらし得る。好ましくは、調節領域(例えばプロモーター)と発現対象の核酸配列との連結からなる発現構築物は、ベクター組込み形態で存在していてもよいし、又は、例えば形質転換によってゲノム中に挿入されていてもよい。
【０１１７】
遺伝子：用語「遺伝子」は、遺伝子産物(例えば、ポリペプチド又は機能性RNA)の発現をいくつかの様式で調節することができる適切な調節配列に機能可能に連結された領域を指す。遺伝子は、コード領域(オープンリーディングフレーム、ORF)に先行する(上流の)、及び後続する(下流の)、DNAの非翻訳調節領域(例えば、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー等)を包含する。本明細書中で使用される用語「構造遺伝子」は、mRNAに転写され、その後特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸の配列に翻訳されるDNA配列を意味することを意図している。
【０１１８】
ゲノム及びゲノムDNA：用語「ゲノム」又は「ゲノムDNA」は、宿主生物の遺伝性の遺伝情報を指す。前記ゲノムDNAは核様体のDNAを含むが、自己複製プラスミドのDNAも含む。
【０１１９】
異種：核酸分子又はDNAに関する用語「異種」は、天然では機能可能に連結されてないか、又は天然では異なる位置で機能可能に連結されている第2の核酸分子に、機能可能に連結された、又は機能可能に連結されるように遺伝子操作された核酸分子を指す。核酸分子及びそれに連結された1以上の調節核酸分子(例えばプロモーター又は転写終結シグナル)を含む異種発現構築物は、例えば、実験的操作に由来する構築物であって、(a)前記核酸分子、又は(b)前記調節核酸分子、あるいは(c)両方(すなわち(a)及び(b))のいずれかが、その天然の(生来の)遺伝子的環境に位置していないか、又は、実験的操作により改変されている(改変の例は１つ以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、逆位又は挿入である)、上記構築物である。天然の遺伝子的環境は、由来生物における天然のゲノム遺伝子座、又はゲノムライブラリーにおける存在を指す。ゲノムライブラリーの場合、核酸分子の配列の天然の遺伝子的環境は、好ましくは少なくとも部分的に保持される。前記環境は、少なくとも一側が核酸配列に隣接し、少なくとも50bp、好ましくは少なくとも500bp、とりわけ好ましくは少なくとも1,000bp、非常にとりわけ好ましくは少なくとも5,000bpの長さの配列を有する。天然の発現構築物(例えば、プロモーターと対応する遺伝子との天然の組み合わせ)は、非天然の、合成的な「人為的」方法、例えば突然変異誘発により改変されると、トランスジェニック発現構築物になる。このような方法は報告されている(米国特許第5,565,350号；WO 00/15815号)。例えば、この分子の天然のプロモーターでないプロモーターに機能可能に連結された、タンパク質をコードする核酸分子は、プロモーターに対して異種であるとみなされる。好ましくは、異種DNAは、それが導入される細胞に対して内因性ではないか又は天然には随伴しないが、別の細胞から得られたか又は合成されたDNAである。異種DNAはまた、幾つかの改変を含む内因性DNA配列、非天然の、複数コピーの内因性DNA配列、又は、それに物理的に連結されている別のDNA配列を天然には随伴しないDNA配列も包含する。一般的に、必ずではないが、異種DNAは、それが発現される細胞によっては通常産生されないRNA又はタンパク質をコードする。
【０１２０】
ハイブリダイゼーション：本明細書中で使用される用語「ハイブリダイゼーション」は「核酸分子の鎖が塩基対合を介して相補鎖と一緒になる任意のプロセス」を包含する（J. Coombs (1994） Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York）。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度(すなわち、核酸分子間の会合の強度)は、核酸分子間の相補度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのTm、及び核酸分子内のG：C比などの因子の影響を受ける。本明細書中で使用される用語「Tm」は「融点」に関連して使用される。融点は二本鎖核酸分子の集団が半分解離して一本鎖になる温度である。核酸分子のTmを計算する式は当技術分野において周知である。標準的な参考文献によって示されるように、核酸分子が1M NaClの水溶液中にある場合、Tm値の簡単な推定値は、式：Tm=81.5+0.41(％、G+C)によって計算することができる［例えば、Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985）を参照］。他の参考文献は、Tmの計算に、構造的特性並びに配列特性を考慮に入れたより複雑な計算を含む。ストリンジェントな条件は当業者に公知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6中に見出し得る。
【０１２１】
好適なハイブリダイゼーション条件は、例えば、配列の相補体の少なくとも50、好ましくは少なくとも100、より好ましくは少なくとも150、さらにより好ましくは少なくとも200、最も好ましくは少なくとも250個の連続ヌクレオチドを含む核酸分子に対する、50℃における7％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M Na3PO4、1mM EDTA中でのハイブリダイゼーションと50℃における2X SSC、0.1％SDS中での洗浄(低ストリンジェンシー)、と同等の条件下でハイブリダイズする条件である。他の好適なハイブリダイゼーション条件は、配列の相補体の少なくとも50、好ましくは少なくとも100、より好ましくは少なくとも150、さらにより好ましくは少なくとも200、最も好ましくは少なくとも250個の連続ヌクレオチドを含む核酸分子に対する、50℃における7％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M Na3PO4、1mM EDTA中でのハイブリダイゼーションと50℃(中程度ストリンジェンシー)又は65℃(高ストリンジェンシー)における1X SSC、0.1％SDS中での洗浄である。他の好適なハイブリダイゼーション条件は、配列の相補体の少なくとも50、好ましくは少なくとも100、より好ましくは少なくとも150、さらにより好ましくは少なくとも200、最も好ましくは少なくとも250個の連続ヌクレオチドを含む核酸分子に対する、50℃における7％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M Na3PO4、1mM EDTA中でのハイブリダイゼーションと65℃における0.1X SSC、0.1％SDS中での洗浄である(非常に高ストリンジェンシー)。
【０１２２】
「同一性」：「同一性」は、2以上の核酸又はアミノ酸分子の比較に関して用いられる場合、前記分子の配列がある程度の配列類似性を有し、配列が部分的に同一であることを意味する。
【０１２３】
2つのアミノ酸配列又は2つの核酸分子のパーセント同一性(本明細書中、「相同性」は、核酸配列を指す場合には互換的に使用される)を決定するために、配列の1つを他方の配列の下に書いて最適な比較を行う(例えば、他のタンパク質又は他の核酸と最適なアラインメントを作成するために、一方のタンパク質又は核酸の配列中にギャップを挿入することができる)。
【０１２４】
次いで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又は核酸分子を比較する。1つの配列中のある位置が、他方の配列中の対応する位置のアミノ酸残基又は核酸分子と同じアミノ酸残基又は同じ核酸分子によって占められている場合、その分子はこの位置において同一である。2つの配列間のパーセント同一性は、配列が共有する同一の位置の数の関数(すなわち、％同一性＝同一の位置の数／位置の総数×100)である。従って、用語「相同性」及び「同一性」は、核酸配列を参す場合には同義語とみなされる。アミノ酸配列を指す場合、用語「同一性」は、配列中の特定の位置における同一のアミノ酸を指し、用語「相同性」は、配列中の特定の位置における相同アミノ酸を指す。相同アミノ酸は、類似の側鎖を有するアミノ酸である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で規定されている。
【０１２５】
本発明のタンパク質に相同なタンパク質をコードする核酸分子は、1以上のアミノ酸置換、付加又は欠失がコードされるタンパク質に導入されるように、1以上のヌクレオチド置換、付加又は欠失をヌクレオチド配列に導入することにより創出することができる。突然変異は、標準的な技術、例えば部位特異的変異誘発及びPCR介在変異誘発により、本発明の配列の1つに導入することができる。好ましくは、1以上の予測非必須アミノ酸残基において保存的アミノ酸置換を行う。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているるアミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えばアスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分岐側鎖を有するアミノ酸(例えばスレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を包含する。従って、本発明のタンパク質中の予測非必須アミノ酸残基は、好ましくは同じ側鎖ファミリーに属する別のアミノ酸残基で置換される。
【０１２６】
あるいは、別の実施形態において、変異は、例えば飽和変異誘発によりコード配列の全体又は一部に沿ってランダムに導入することが可能であり、得られた変異体を本明細書に記載される各活性についてスクリーニングして、それらの活性を保持する変異体を同定することができる。本発明の配列の1つの変異誘発後、コードされるタンパク質を組換え的に発現させることが可能であり、タンパク質の活性は、例えば本明細書に記載のアッセイを用いて決定することができる。
【０１２７】
2以上のアミノ酸又は2以上のヌクレオチド配列のパーセント同一性を決定するために、幾つかのコンピューターソフトウエアプログラムが開発されている。2以上の配列の同一性は、例えば、ソフトウエアfastaを用いて計算することが可能であり、現在はバージョンfasta 3が使用されている（W. R. Pearson and D. J. Lipman, PNAS 85, 2444(1988)；W. R. Pearson, Methods in Enzymology 183, 63 (1990)；W. R. Pearson and D. J. Lipman, PNAS 85, 2444 (1988)；W. R. Pearson, Enzymology 183, 63 (1990））。異なる配列の同一性の計算のための別の有用なプログラムは標準blastプログラムであって、これはBiomax pedantソフトウエアに含まれている（Biomax、Munich、Federal Republic of Germany）。このソフトウエアは残念ながら、blastが主題及びクエリの完全な配列を常に含むとは限らないため、最適性の劣る結果をもたらす場合がある。それにも関わらず、このプログラムは極めて効率的であるため、膨大な数の配列を比較するために用いることができる。以下の設定は、典型的には、このような配列の比較のために使用される：
−p プログラム名 [文字列]；−d データベース [文字列]；デフォルト = nr；−i クエリーファイル[File In]；デフォルト = stdin；−e 期待値 (E) [実数]；デフォルト = 10.0；−m アラインメントビューオプション：0 = ペアワイズ；1 = 同一性を示すクエリー−アンカー；2 = 同一性を示さないクエリー−アンカー；3 = フラットクエリー−アンカー、同一性を示す；4 = フラットクエリー−アンカー、同一性を示さない；5 = フラットクエリー−アンカー、同一性なし、且つ平滑末端；6 = フラットクエリー−アンカー、同一性なし、且つ平滑末端；7 = XML Blast出力；8 = 表形式；9 コメントラインを含む表形式[整数]；デフォルト = 0；−o BLASTリポート出力ファイル[File Out] オプション；デフォルト = stdout；−F フィルタークエリー配列(blastnではDUST、他ではSEG) [文字列]；デフォルト = T；−G ギャップを開くためのコスト(0はデフォルト動作を引き起こす) [整数]；デフォルト = 0；−E ギャップを拡張するためのコスト(0はデフォルト動作を引き起こす) [整数]；デフォルト = 0；−X ギャップ付加されたアラインメントに関するX下落値(ビット)(0はデフォルト動作を引き起こす)；blastn 30、megablast 20、tblastx 0、他の全て15 [整数]；デフォルト = 0；−I デフラインにGIを示す[T/F]；デフォルト = F；-q ヌクレオチド不一致に関するペナルティ(blastnのみ) [整数]；デフォルト = -3；-r ヌクレオチド一致に関する報酬(blastnのみ) [整数]；デフォルト = 1；-v (V)に関する1行記述を示すデータベース配列の数 [整数]；デフォルト = 500；-b (B)に関するアラインメントを示すデータベース配列の数 [整数]；デフォルト = 250；-f 拡張ヒットに関する閾値、デフォルト 0の場合；blastp 11、blastn 0、blastx 12、tblastn 13；tblastx 13、megablast 0 [整数]；デフォルト = 0；-g ギャップ付加アラインメントを実行(tblastxでは利用不可) [T/F]；デフォルト = T；-Q 使用するクエリー遺伝子コード[整数]；デフォルト = 1；-D DB遺伝子コード(tblast[nx]についてのみ) [整数]；デフォルト = 1；-a 使用するプロセッサーの数[整数]；デフォルト = 1；-O SeqAlignファイル[File Out] オプション；-J クエリーデフラインを信じる[T/F]；デフォルト = F；-M マトリックス[文字列]；デフォルト = BLOSUM62；-W ワードサイズ、デフォルト 0の場合 (blastn 11、megablast 28、その他全て 3) [整数]；デフォルト = 0；-z データベースの有効長さ(実際のサイズについては0を使用する) [実数]；デフォルト = 0；-K 保持する領域から得られる最良のヒットの数(デフォルトによりオフ、使用する場合、100の値が推奨される) [整数]；デフォルト = 0；-P 複数ヒットについては0、単一ヒットについては1[整数]；デフォルト = 0；−Y 検索スペースの有効長さ(実際のサイズについては0を使用する) [実数]；デフォルト = 0；-S データベースに対して検索するためのクエリー・ストランド(blast[nx]、及びtblastxについて)；3は両方、1は最高値、2は最低値である[整数]；デフォルト = 3；-T HTML出力を作成[T/F]；デフォルト = F；-l GIの一覧に対するデータベースの限定的検索 [文字列] オプション；-U FASTA配列のフィルタリングには小文字を使用する [T/F] オプション；デフォルト = F；-y ビットで示される非ギャップ付加拡張に関するX下落値(0.0はデフォルト動作を引き起こす)；blastn 20、megablast 10、その他全て 7 [実数]；デフォルト = 0.0；-Z ビットで示される最終的なギャップ付加アライン���ントに関するX下落値(0.0はデフォルト動作を引き起こす)；blastn/megablast 50、tblastx 0、その他全て 25 [整数]；デフォルト = 0；-R PSI-TBLASTN チェックポイントファイル[File In] オプション；-n MegaBlast検索 [T/F]；デフォルト = F；-L クエリー配列上の位置[文字列] オプション；-A 複数ヒットウィンドウサイズ、デフォルト 0の場合(blastn/megablast 0、その他全て 40 [整数]；デフォルト = 0；-w フレームシフトペナルティ(blastxに関するOOFアルゴリズム) [整数]；デフォルト = 0；-t HSPsを連結するためにtblastnにおいて許容される最大のイントロンの長さ (0は連結不可) [整数]；デフォルト = 0。
【０１２８】
Needleman及びWunsch、又はSmith及びWatermanのアルゴリズムを用いることにより、高品質の結果が達成される。従って、前記アルゴリズムに基づくプログラムが好ましい。有利には、配列の比較は、プログラムPileUp（J. Mol. Evolution., 25, 351 (1987）、Higgins et al., CABIOS 5, 151 (1989））又は、好ましくは、プログラム「Gap」及び「Needle」(両方とも、Needleman及びWunsch（J. Mol. Biol. 48; 443 (1970)のアルゴリズムに基づく）並びに「BestFit」（Smith及びWaterman（Adv. Appl. Math. 2; 482 (1981)）のアルゴリズムに基づく）を用いて行うことができる。「Gap」及び「BestFit」はGCGソフトウェアパッケージ（Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991); Altschul ら（Nucleic Acids Res. 25:3389 (1997））の一部であり、「Needle」はThe European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS）(Trends in Genetics 16 (6）, 276 (2000））の一部である。従って、好ましくは、配列同一性のパーセントを決定する計算を、配列の全範囲にわたりプログラム「Gap」又は「Needle」を用いて行う。核酸配列の比較のための以下の標準的な調整を「Needle」について用いた：マトリックス： EDNAFULL, ギャップ_ペナルティ：10.0、 拡張_ペナルティ： 0.5。核酸配列の比較のための以下の標準的な調整を「Gap」について用いた：ギャップウエイト：50、長さウエイト：3、平均マッチ：10.000、平均ミスマッチ：0.000。
【０１２９】
例えば、核酸レベルで配列番号1の配列と80％同一性を有するといわれる配列は、配列番号1により表される配列と上記プログラム「Needle」により上記パラメーターセットを用いて比較すると80％同一性を有する配列を意味すると理解される。好ましくは、同一性はクエリー配列、例えば配列番号1の全長に基づいて計算される。
【０１３０】
単離された：本明細書中で使用される用語「単離された」は、材料が人手により取り出されて、その元の、天然の環境から離れて存在しているため、天然の産物でないことを意味する。単離された材料又は分子(例えばDNA分子又は酵素)は精製形態で存在していてもよく、又は例えば、トランスジェニック宿主細胞などの非天然環境中に存在していてもよい。例えば、生細胞中に存在する天然の核酸分子又はポリペプチドは単離されてないが、天然の系において共存する材料の一部又は全てから分離された同じ核酸分子又はポリペプチドは単離されている。このような核酸分子はベクターの一部である可能性があり、且つ／又はこのような核酸分子若しくはポリペプチドは組成物の一部であり得るため、このようなベクター若しくは組成物が元の環境の一部ではないという点において、単離されている。好ましくは、核酸分子に関して、「単離された核酸配列」のように使用される場合、用語「単離された」は、その天然源においては通常随伴している少なくとも１つの夾雑核酸分子から同定及び分離された核酸配列を指す。単離された核酸分子は、天然に見出される形態又は設定とは異なる形態又は設定で存在する核酸分子である。対照的に、非単離核酸分子は、それらが天然に存在する状態で見出されるDNA及びRNAなどの核酸分子である。例えば、所与のDNA配列(例えば、遺伝子)は、宿主細胞染色体上で、隣接する遺伝子に近接して見出され；RNA配列(例えば、特定のタンパク質をコードする特定のmRNA配列)は、細胞中で、多数のタンパク質をコードする数多くの他のmRNAとの混合物として見出される。しかし、例えば配列番号1を含む単離された核酸配列としては、例として、細胞中の通常は配列番号1を含む核酸配列であって、その核酸配列が天然の細胞のゲノム位置若しくはプラスミド位置とは異なるゲノム位置若しくはプラスミド位置にあるか、又は、さもなくば、天然に見出されるのとは異なる核酸配列に隣接される、前記核酸配列が挙げられる。単離された核酸配列は、一本鎖又は二本鎖の形態で存在し得る。単離された核酸配列がタンパク質を発現させるために利用される場合、その核酸配列は、センス鎖又はコード鎖の少なくとも一部を最小限に含む(すなわち、核酸配列は一本鎖であり得る)。あるいは、センス鎖とアンチセンス鎖の両方を含み得る(すなわち、核酸配列は二本鎖であり得る)。
【０１３１】
非コード：用語「非コード」は、発現されるタンパク質の一部若しくは全てをコードしない核酸分子の配列を指す。非コード配列としては、限定するものでないが、エンハンサー、プロモーター領域、3'非翻訳領域、及び5'非翻訳領域が挙げられる。
【０１３２】
核酸及びヌクレオチド：用語「核酸」及び「ヌクレオチド」は、天然又は合成若しくは人工の核酸又はヌクレオチドを指す。用語「核酸」及び「ヌクレオチド」はデオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド又は任意のヌクレオチド類似体及びポリマーあるいはそれらのハイブリッドを、一本鎖若しくは二本鎖のセンス形態又はアンチセンス形態で含む。別段に示されない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に改変されたそれらの変異体(例えば、縮重コドン置換)及び相補配列、並びに明確に示される配列も暗に包含する。用語「核酸」は、本明細書中で「遺伝子」、「cDNA」、「mRNA」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸分子」と互換的に使用される。ヌクレオチド類似体は、塩基、糖及び／若しくはリン酸の化学構造に改変を保有するヌクレオチドを包含し、例えば、限定するものでないが、5位ピリミジン改変、8位プリン改変、シトシン環外アミンの改変、5-ブロモ-ウラシルの置換などが挙げられ；2'位糖改変としては、例えば、限定するものではないが、2'-OHが、H、OR、R、ハロ、SH、SR、NH2、NHR、NR2、又はCNから選択される基で置換されている糖改変リボヌクレオチドが挙げられる。ショートヘアピンRNA(shRNA)はまた、非天然エレメント、例えば、非天然塩基（例えばイオノシン及びキサンチン）、非天然糖（例えば2'-メトキシリボース）、又は非天然リン酸ジエステル結合（例えばメチルホスホネート、ホスホロチオエート及びペプチド）も含み得る。
【０１３３】
核酸配列：表現「核酸配列」は、5'から3'末端へ読まれたデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖のポリマーを指す。核酸配列は、染色体DNA、自己複製プラスミド、DNA又はRNAの感染性ポリマー及び主に構造的役割を果たすDNA又はRNAを包含する。「核酸配列」はまた、ヌクレオチドを表す略語、文字、記号又は単語の連続的リストも指す。一実施形態において、核酸は、通常は、長さ100ヌクレオチド未満の比較的短い核酸である「プローブ」であり得る。多くの場合、核酸プローブは、長さ約50ヌクレオチド〜長さ約10ヌクレオチドである。核酸の「標的領域」は、目的のものであると同定された核酸部分である。核酸の「コード領域」は、適切な調節配列の制御下に配置されると配列特異的な様式で転写及び翻訳されて特定のポリペプチド又はタンパク質を産生する核酸の部分である。コード領域は、このようなポリペプチド又はタンパク質をコードすると言われる。
【０１３４】
オリゴヌクレオチド：用語「オリゴヌクレオチド」はリボ核酸(RNA)又はデオキシリボ核酸(DNA)あるいはそれらの模倣物のオリゴマー又はポリマー、並びに同様に機能する非天然部分を有するオリゴヌクレオチドを指す。このような改変された又は置換されたオリゴヌクレオチドは、望ましい特性、例えば、細胞取込みの増強、核酸標的に対する親和性の増強及びヌクレアーゼの存在下における安定性の増加などにより、多くの場合は天然型よりも好ましい。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、結合(例えば、リン酸ジエステル)又は代替的結合により互いに共役結合された2以上のヌクレオモノマーを包含する。
【０１３５】
オーバーハング：「オーバーハング」は、二本鎖オリゴヌクレオチド分子の5'-又は3'-ヒドロキシル末端の比較的短い一本鎖ヌクレオチド配列である(「伸長」「突出末端」又は「粘着性末端」とも呼ばれる)。
【０１３６】
ポリペプチド：用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」、「遺伝子産物」、「発現産物」及び「タンパク質」は、本明細書中で互換的に使用され、連続アミノ酸残基のポリマー又はオリゴマーを指す。
【０１３７】
プロモーター：用語「プロモーター」又は「プロモーター配列」は等価であり、本明細書中で使用される場合、目的のヌクレオチド配列に機能可能に連結されると、目的のヌクレオチド配列のRNAへの転写を制御することができるDNA配列を指す。プロモーターは、それがmRNAへの転写を制御する目的のヌクレオチド配列の転写開始部位の近位の5'(すなわち、上流)に位置し、転写開始のためのRNAポリメラーゼ及び他の転写因子による特異的結合のための部位を提供する。プロモーターはコード領域又は5'非翻訳領域を含まない。プロモーターは、例えば、それぞれの細胞に対して異種であってもよいし、同種であってもよい。核酸分子配列は、外来種に由来する場合、又は同じ種由来であってその元の形態から改変されている場合、生物又は第2の核酸分子配列に対して「異種」である。例えば、「異種コード配列に機能可能に連結されたプロモーター」は、そのコード配列が、そのプロモーターが由来する種とは異なる種由来のコード配列、又は、同じ種由来である場合、そのプロモーターに天然には随伴しないコード配列(例えば、遺伝子操作されたコード配列又は異なる生態型又は品種に由来する対立遺伝子)を指す。好適なプロモーターは、発現を起こさせるべき宿主細胞の遺伝子に由来するものであってもよく、又はこの宿主に対する病原体に由来するものであってもよい。
【０１３８】
精製された：本明細書中で使用される用語「精製された」は、それらの天然の環境から取り出され、単離又は分離された分子(核酸配列又はアミノ酸配列)を指す。「実質的に精製された」分子は、それが天然に随伴する他の成分の少なくとも60％、好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％を含まない。精製された核酸配列は単離された核酸配列であってもよい。
【０１３９】
組換え体：核酸分子に関する用語「組換え体」は、組換えDNA技術によって産生された核酸分子を指す。この用語はまた、それ自体は天然には存在しないが、人為的に改変、変化、変異又はさもなければ操作された核酸分子も含む。好ましくは、「組換え核酸分子」は、配列において天然の核酸分子とは少なくとも1つの核酸が異なる非天然の核酸分子である。「組換え核酸分子」はまた、好ましくは機能可能に連結された、天然にはその順序で存在しない核酸分子の配列を含む「組換え構築物」も含み得る。前記組換え核酸分子を作製するための好ましい方法は、クローニング技術、部位特異的又は非部位特異的（non-directed）突然変異誘発、合成又は組換え技術を含み得る。
【０１４０】
有意な増加：例えば、酵素活性、遺伝子発現、特定の産物の生産性又は収率における、測定技術に固有の誤差より大きな増加、好ましくは、対照酵素の活性、発現、生産性又は収率、あるいは対照細胞における発現、対照細胞の生産性又は収率の約10％又は25％、好ましくは50％又は75％、より好ましくは2倍若しくは5倍又はそれ以上の増加、さらにより好ましくは、約10倍又はそれ以上の増加。
【０１４１】
有意な低下：例えば、酵素活性、遺伝子発現、特定の産物の生産性又は収率における、測定技術に固有の誤差より大きな低下、好ましくは、少なくとも約5％又は10％、好ましくは少なくとも約20％又は25％、より好ましくは少なくとも約50％又は75％、さらにより好ましくは少なくとも約80％又は85％、最も好ましくは少なくとも約90％、95％、97％、98％又は99％の低下。
【０１４２】
実質的に相補的な：その最も広い意味で、用語「実質的に相補的な」は、本明細書中で参照又は標的ヌクレオチド配列に関連してヌクレオチド配列について使用される場合、前記参照又は標的ヌクレオチド配列の実質的に相補的なヌクレオチド配列と正確に相補的な配列との間に、少なくとも60％、より望ましくは少なくとも70％、より望ましくは少なくとも80％又は85％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも93％、なおより好ましくは少なくとも95％又は96％、さらになおより好ましくは少なくとも97％又は98％、さらになおより好ましくは少なくとも99％、又は最も好ましくは100％(後者は、この文脈において用語「同一」と等価である)の同一性パーセントを有するヌクレオチド配列を意味する。好ましくは、同一性は(以下に別段に特定されない場合)、前記参照配列に対して核酸配列の少なくとも19ヌクレオチド、好ましくは少なくとも50ヌクレオチドの長さ、より好ましくは全長にわたって評価される。配列比較は、Needleman及びWunschのアルゴリズム(Needleman and WunscH(1970) J Mol. Biol. 48：443−453；上記に定義した通り)に基づく、ウィスコンシン大学GCG、GAPのSEQWEBアプリケーションによるデフォルトGAP分析を用いて行われる。参照ヌクレオチド配列に対して「実質的に相補的な」ヌクレオチド配列は、低ストリンジェンシー条件、好ましくは中ストリンジェンシー条件、最も好ましくは高ストリンジェンシー条件(上記に定義される)下で、参照ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。
【０１４３】
トランスジーン：本明細書中で使用される用語「トランスジーン」は、実験的操作により細胞のゲノム中に導入される任意の核酸配列を指す。トランスジーンは「内因性DNA配列」又は「異種DNA配列」(すなわち「外来DNA」)であり得る。用語「内因性DNA配列」は、天然の配列と比較して幾つかの改変(例えば点突然変異、選択マーカー遺伝子の存在等)を含まない限り、その配列が導入される細胞中に天然に見られるヌクレオチド配列を指す。
【０１４４】
トランスジェニック：生物を指す場合、用語「トランスジェニック」は、好ましくは目的のDNA配列に機能可能に連結された好適なプロモーターを含む組換えDNA分子によって、形質転換された、好ましくは安定的に形質転換されたことを意味する。
【０１４５】
ベクター：本明細書中で使用される用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸分子を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの1つのタイプはゲノムに組み込まれるベクター、すなわち、宿主細胞のゲノムDNAに組み込まれ得る「組み込みベクター」である。別のタイプのベクターは、エピソームベクター、すなわち、染色体外で複製することができるプラスミド又は核酸分子である。それらが機能可能に連結されている遺伝子の発現を指示し得るベクターは、本明細書中で「発現ベクター」と呼ばれる。本明細書においては、文脈からそうでないことが明らかでない限り、「プラスミド」と「ベクター」は、互換的に用いられる。
【０１４６】
野生型：用語「野生型」、「天然の」又は「天然起源の」は、生物に関しては、前記生物が人為的に変化、変異されていないか、又はそうでなければ操作されていないことを意味する。ポリペプチド又は核酸配列に関しては、そのポリペプチド又は核酸配列が天然に生じたものであるか、又は人為的に変化、変異されていないか、又はそうでなければ操作されていない少なくとも1つの天然の生物において入手可能であることを意味する。
【０１４７】
野生型の微生物とは、そのゲノムが、ある遺伝子の遺伝子改変の導入前と同様の状態で存在する微生物を指す。遺伝子改変は、例えば、遺伝子若しくはその一部の欠失、又は遺伝子の点突然変異若しくは導入であり得る。
【０１４８】
用語「生産」又は「生産性」は当技術分野において認識されており、所与の時間内に所与の発酵体積で形成される発酵産物(例えばアラニン)の濃度(例えばkg産物/時間/リットル)を包含する。用語「生産効率」は、特定のレベルの生産が達成されるのに必要とされる時間(例えば、細胞がファインケミカルの出力の特定の速度を達成するために必要とされる時間)を包含する。
【０１４９】
用語「収率」又は「産物／炭素収率」は当技術分野において認識されており、産物(すなわちファインケミカル)への炭素源の変換の効率を包含する。これは、一般的には、炭素源1kg当たりのkg産物として記載される。化合物の収率又は生産を増加させることにより、所与量の時間にわたる所与量の培養物における前記化合物の回収分子の量又は有用な回収分子の量が増加する。
【０１５０】
「組換え微生物」という用語は、それが由来する野生型微生物と比較して、改変された又は異なる遺伝子型及び／若しくは表現型を示すように遺伝子改変された微生物(例えば、遺伝子改変が微生物のコード核酸配列に影響を及ぼす場合)を包含する。組換え微生物は、少なくとも1つの組換えDNA分子を含む。
【０１５１】
DNAに関する用語「組換え体」は、組換えDNA技術を使用して人為的に作製されたDNA分子を指す。この用語は、それ自体は天然には存在しないか、又は当前記DNAが由来する生物中には存在しないが、人為的に改変、変化、変異又はさもなければ操作されたDNA分子を含む。好ましくは、「組換えDNA分子」は、配列において天然の核酸分子とは少なくとも1つの核酸が異なる非天然の核酸分子である。「組換えDNA分子」は、好ましくは機能可能に連結された、天然にはその順序で存在しない核酸分子の配列を含む「組換え構築物」も含み得る。前記組換えDNA分子を作製するための好ましい方法は、クローニング技術、部位特異的又は非部位特異的突然変異誘発、遺伝子合成又は組換え技術を含み得る。
【０１５２】
このような組換えDNAの例は、異種DNA配列が挿入されているプラスミド、あるいはその組換えDNAが由来する遺伝子又はプロモーターと比較して変異している遺伝子又はプロモーターである。変異は、当技術分野で公知の部位特異的突然変異誘発技術を用いて、又はランダム変異誘発技術(例えば、化学剤、UV光若しくはx線変異誘発)、あるいは適応進化技術によって導入することができる。
【０１５３】
用語「適応進化」は、本明細書中で用語「代謝的進化」と同義に用いられ、目的の形質を有する変異体の増殖を選択する選択圧をかけることを含む。選択圧は、種々の培養条件、ATPと増殖の組み合わせ選択、及び酸化還元関連選択に基づき得る。選択圧は、連続移動接種を行うバッチ発酵又は同じ圧による連続培養を用いて実施することができる(Dragosits, M. & Mattanovich, D. Adaptive laboratory evolution -- principles and applications for biotechnology. Microbial cell factories 12, 64, doi:10.1186/1475-2859-12-64 (2013)；Zhang, X. et al. Metabolic evolution of energy-conserving pathways for succinate production in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences 106, 20180-20185, doi:10.1073/pnas.0905396106 (2009))。
【０１５４】
用語「発現」又は「遺伝子発現」は、特定の遺伝子(1つ若しくは複数)又は特定の遺伝子ベクター構築物の転写を意味する。用語「発現」又は「遺伝子発現」は、特に、遺伝子(1つ若しくは複数)又は遺伝子ベクター構築物のmRNAへの転写を意味する。このプロセスは、DNAの転写を包含し、得られたRNA産物のプロセシングを包含し得る。用語「発現」又は「遺伝子発現」はまた、mRNAの翻訳及び、それとともに、コードされるタンパク質の合成(すなわちタンパク質発現)も包含し得る。
【実施例】
【０１５５】
化学物質及び一般的方法
別段に示されない限り、本発明の目的のために行なわれるクローニング手順、例えば制限消化、アガロースゲル電気泳動、核酸の精製、核酸のライゲーション、形質転換、細菌細胞の選択及び培養は、記載される通りに行なわれる(Sambrook et al., 1989)。組換えDNAの配列分析は、レーザー蛍光DNAシーケンサー(Applied Biosystems, Foster City、CA, USA)により、Sangerの技術(Sanger et al., 1977)を用いて行なわれる。別段に記載されない限り、化学物質及び試薬は、Sigma Aldrich社（Sigma Aldrich, St. Louis, USA）、Promega社(Madison, WI, USA)、Duchefa社（Haarlem, The Netherlands）又はInvitrogen社(Carlsbad、CA, USA)から入手される。制限エンドヌクレアーゼは、New England Biolabs社（Ipswich, MA, USA）又はRoche Diagnostics GmbH社（Penzberg、ドイツ）から入手される。オリゴヌクレオチドは、Eurofins MWG Operon社（Ebersberg、ドイツ）により合成される。
【０１５６】
実施例1：
ackA-pta、adhE、frdABCD及びpflB ORFの不活性化並びにalaD遺伝子のコドン最適化変異体(alaD-gstear)によるldhA ORFの置換により、L-アラニン産生について大腸菌W株(LU17032)を遺伝子操作した。
【０１５７】
ackA-pta、adhE、frdABCD及びpflB ORFは、FRT隣接カナマイシン耐性カセットの挿入と、それに続くFLP組換えによる抗生物質耐性カセットの除去により不活性化された。
【０１５８】
ldhA遺伝子は、alaD-gstear及び下流FRT隣接ゼオシン耐性カセット(最終的にはFLP組換えにより除去される)により置換された。
【０１５９】
材料及び方法
細菌培養
大腸菌W株(LU17032)を、Luria-Bertani(LB)液体培地中又はLuria-Bertani固体培地上で培養した。W株の同一性を確認するために、時々、10mMスクロースを含有するM9最小寒天上にクローンを継代した。抗生物質を、15μg/mL(カナマイシン、クロラムフェニコール)、25μg/mL(ゼオシン)又は3μg/mL(テトラサイクリン)の最終濃度まで、適宜、液体培地及び固体培地に添加した。
【０１６０】
Red/ET組換え
Gene Bridges GmbH(www.genebridges.com)の標準プロトコルを用いて、Red/ET組換えを行った。手短に言えば、Red/ET能を有する大腸菌W株を、OD600nmが0.3になるまで30℃で好気的に増殖させた。red遺伝子の発現を、50μlの10％(w/v) L-アラビノースの添加及びそれに続く37℃までの温度上昇によって誘導した。アラビノースは、非誘導対照培養物には添加しなかった。37℃での35分間のインキュベーション後、細胞を、氷冷10％(v/v)グリセロールで2回洗浄し、1.35kV、10μF、600Ωで500ngのPCR産物を用いてエレクトロポレーションした。次に、細胞を1mL氷冷LB培地中で再懸濁し、37℃で約1.5時間好気的に増殖させた。次に、培養物を、15μg/mLカナマイシン(ノックアウト)又は25μg/mLゼオシン(ノックイン)を含有するLB寒天上にプレーティングした。
【０１６１】
FLP組換え
隣接するFRT部位は、大腸菌染色体の改変後、FLP組換えによる抗生物質耐性マーカーの除去を可能にした。FLP組換えは、単一のFRT部位(34bp)並びに短い隣接配列(それぞれ約20bp)を残し、これは、カセットの増幅においてプライマー結合部位として用いられる。
【０１６２】
FLP組換えを行うために、エレクトロポレーションによりFLPリコンビナーゼをコードするプラスミド708-FLPe(表1)をRed/ET組換え体に導入した。KanR CmR又はZeoR CmR形質転換体を用いて、0.2mL LB培養液に接種し、これを30℃で3時間インキュベートした。次に、37℃への温度シフト及びそれに続く37℃で3時間のインキュベーションにより、FLP活性を誘導した。その後、これらの培養物から得られた単一コロニーを、CmS及びKanS又はZeoS表現型についてスクリーニングした。
【０１６３】
DNA調製及び分析
Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit B（Qiagen, Hilden、ドイツ）を用いて、大腸菌ゲノムDNA(gDNA)を一晩培養物から単離した。ノックアウトカセット又はノックインカセットを有するPCR産物を、PRECISOR高忠実度DNAポリメラーゼ（BioCat, Heidelberg）を用いて鋳型プラスミドから増幅し、PCR Extender System（5PRIME GmbH, Hamburg、ドイツ）を用いて、製造業者の推奨に従い分析PCR反応を行った。PCR増幅産物は、GeneJET PCR Purification Kit又はGeneJET Gel Extraction Kit（Fermentas, St. Leon-Rot、ドイツ）を用いて精製し、配列決定はGATC BioTech社（Konstanz、ドイツ）又はBioSpring社(Frankfurt am Main, ドイツ)により行なった。
【０１６４】
【表１】
2018508226.tif 000002
【０１６５】
1.1. ackA-pta遺伝子座 - ackA-ptaの標的化
約500ngのΔackA-pta PCR構築物(1737bp)を、Red/ET能を有する大腸菌W株細胞にエレクトロポレーションした。8種類のKanR形質転換体を、ゲノム特異的プライマーを用いるPCRにより、耐性マーカーカセットの正しい組み込みに関して分析した。3種類のクローンがFLP組換えに供され、FLP組換えは材料及び方法に記載される通りに行われた(データ示さず)。
【０１６６】
クローン確認。ackA-pta遺伝子座の不活性化及びカナマイシン耐性カセットの除去は、FRT残痕にわたるPCRにより確認した。正しいPCRシグナルを生じた1種類のクローンは、配列決定によっても確認した。
【０１６７】
1.2 adhE遺伝子座 - adhEの標的化
約500ngのΔadhE PCR構築物(1093bp)を、ΔackA-pta::FRT改変を保有するRed/ET能を有する大腸菌W株細胞にエレクトロポレーションした。8種類のKanR形質転換体を、ゲノム特異的プライマーを用いるPCRにより、耐性マーカーカセットの正しい組み込みに関して分析した。2種類のクローンがFLP組換えに供され、FLP組換えは材料及び方法に記載される通りに行われた(データ示さず)。
【０１６８】
クローン確認。adhE遺伝子座の不活性化及びカナマイシン耐性カセットの除去は、FRT残痕にわたるPCRによって確認した。正しいPCRシグナルを生じた1種類のクローンは、配列決定によっても確認した。
【０１６９】
1.3 frd遺伝子座 - frdABCDの標的化
約500ngのΔfrdABCD PCR構築物(1093bp)を、ΔackA-pta::FRT及びΔadhE::FRT改変を保有するRed/ET能を有する大腸菌W株細胞にエレクトロポレーションした。8種類のKanR形質転換体を、ゲノム特異的プライマーを用いるPCRにより、耐性マーカーカセットの正しい組み込みに関して分析した。1種類のクローンがFLP組換えに供され、FLP組換えは材料及び方法に記載される通りに行われた(データ示さず)。
【０１７０】
クローン確認。frd遺伝子座の不活性化及びカナマイシン耐性カセットの除去は、FRT残痕にわたるPCRにより確認した。正しいPCRシグナルを生じた1種類のクローンは、配列決定によっても確認した。
【０１７１】
1.4 pflB遺伝子座 - pflBの標的化
約500ngのΔpflB PCR構築物(1093bp)を、ΔackA-pta::FRT、ΔadhE::FRT及びΔfrdABCD::FRT改変を保有するRed/ET能を有する大腸菌W株細胞にエレクトロポレーションした。8種類のKanR形質転換体を、ゲノム特異的プライマーを用いるPCRにより、耐性マーカーカセットの正しい組み込みに関して分析した。4種類のクローンがFLP組換えに供され、FLP組換えは材料及び方法に記載される通りに行われた(データ示さず)。
【０１７２】
クローン確認。pflB遺伝子座の不活性化及びカナマイシン耐性カセットの除去は、FRT残痕にわたるPCRにより確認した。正しいPCRシグナルを生じた1種類のクローンは、配列決定によっても確認した。
【０１７３】
1.5 ldhA遺伝子座 - alaD-gstearのノックイン
約500ngのΔldhA::alaD-gstear PCR構築物(1783bp)を、ΔackA-pta::FRT、ΔadhE::FRT、ΔfrdABCD::FRT及びΔpflB::FRT改変を保有するRed/ET能を有する大腸菌W株細胞にエレクトロポレーションした。4種類のZeoR形質転換体を、ゲノム特異的プライマーを用いるPCRにより、耐性マーカーカセットの正しい組み込みに関して分析した。1種類のクローンがFLP組換えに供され、FLP組換えは材料及び方法に記載される通りに行われた(データ示さず)。
【０１７４】
クローン確認。alaD-gstearの組み込み及びゼオシン耐性カセットの除去は、FRT残痕にわたるPCRにより確認した。正しいPCRシグナルを生じた1種類のクローンは、配列決定によっても確認した。
【０１７５】
実施例2：アラニンのHPLC検出及び定量化
細胞培養培地におけるアラニン検出のため、以下のHPLC法を用いた：
カラム：Aminex HPX−87Cカラム(Bio−Rad社)、300×7.8mm (内径)、粒径9μm
移動相：0.1mol/LのCa(NO3)2 90％、アセトニトリル10％
流速：0.6mL/分
カラム温度：60℃
検出：屈折率検出器
【０１７６】
上記の方法の下では、細胞培養サンプルマトリックス中の主要な推定成分を、アラニンの定量化を妨げることなく、アラニンからうまく分離させることができる。
【０１７７】
サンプル中のアラニンの量は、外部標準較正法により決定した。0.5〜10.0g/Lのアラニンを含有する標準サンプルを注入し、ピーク面積を較正に用いた。較正曲線の線形回帰係数は、0.9995であった。
【０１７８】
サンプルは20μLで、1回で注入される。ピーク面積を用いて、Waters LC Milleniumソフトウェアにより、サンプル中に存在する量を算出する。
【０１７９】
実施例3：グルコース、スクシネート、ラクテート、ホルメート、アセテート及びエタノールのHPLC検出及び定量化
使用したHPLC法：
カラム：Aminex HPX-87Hカラム(Bio-Rad社)、300×7.8mm (内径) 粒径 9μm
移動相：H2SO4 4mM
流速：0.4mL/分
カラム温度：45℃
検出：屈折率検出器
【０１８０】
分析物の量は、外部標準較正法により決定した。0.1〜38.0g/Lのグルコース、0.05〜10.0g/Lのスクシネート、ラクテート、ホルメート、アセテート及びエタノールを含有する標準サンプルを注入し、ピーク面積を較正に用いた。全6種類の較正曲線の線形回帰係数は、0.999よりも良好であった。
【０１８１】
サンプルは20μLで、1回で注入される。ピーク面積を用いて、Waters LC Milleniumソフトウェアにより、サンプル中に存在する量を算出する。
【０１８２】
実施例4：アラニン収率の改善のための、実施例1に由来する大腸菌Wステム株の代謝的進化
【０１８３】
大腸菌Ex1株と命名された、実施例1に記載される全ての突然変異を含む大腸菌ステム株を、大腸菌Ex1ステム株のアラニン収率を改善するための代謝的進化手順に用いた。
【０１８４】
代謝的進化は、以下の通りに実施した：第1進化ラウンド及び第2進化ラウンドにおいては、5％グルコースを含むNBS培地中で、それぞれ500時間及び750時間にわたって連続的進化を実施した。
【０１８５】
NBS培地：
3.5g KH2PO4
5.0g K2HPO4
3.5g (NH4)2HPO4
0.25g MgSO4-7H2O
15mg CaCL2-2H2O
0.5mg チアミン
1ml 微量金属ストック
【０１８６】
微量金属ストックは、0.1M HCL、1.6gのFeCL3-6H2O；0.2gのCoCl2-6H2O；0.1gのCuCl2-2H2O；0.2gのZnCl2；0.2gのNaMoO4-2H2O；0.05gのH3BO3で調製した。
【０１８７】
細胞を、LBプレート上で画線培養し、アラニン収率について試験した。開始ステム株である大腸菌Ex1株が80％〜83％のアラニン収率を生じたのと比較して、最良の大腸菌ステム株(大腸菌Ev1株)は、5％グルコースを含むNBS培地を用いた37℃で24時間及び48時間の発酵において、84％〜86％のアラニン収率を生じた。
【０１８８】
大腸菌Ev1株を、20日間のバッチ進化として実施したさらなる適応進化ステップに使用した。5％の細胞を、37℃にて、14％グルコースを含むAM1培地に、24時間、48時間、72時間等毎に新鮮な培地に再接種した。
【０１８９】
AM1培地：
19.92mM (NH4)2HPO4 = 2.6g /L  MW：132.07
7.56 mM NH4H2PO4 = 0.87g/L    MW：115
2.0mM KCl = 0.15g/L            MW：74.55
1.5 mM MgSO4-7H2O = 0.37g/L  MW：246.5
15g/L 硫酸アンモニウムは最終ステップで添加した
1mM ベタイン
1ml 微量金属ストック
【０１９０】
1Lの微量金属ストックを作成するため：
微量金属ストックは、0.12M HCL、2.4gのFeCL3-6H2O；0.3gのCoCl2-6H2O；0.21gのCuCl2-2H2O；0.3gのZnCl2；0.27gのNaMoO4-2H2O；0.068gのH3BO3；0.5gのMnCl2-4H2Oで調製した。
【０１９１】
この適応進化から、ステム大腸菌Ev2株が単離された。このステム株を、14％グルコースを含むAM1培地を含む発酵槽中で行った発酵において試験した。同条件下での大腸菌Ev1株の91％〜92％のアラニン収率と比較して、ステム大腸菌Ev2株は、92％〜94％のアラニン収率を有していた。
【０１９２】
12％グルコースを含むAM1培地中での300時間のさらなるバッチ適応進化ステップ、及びそれに続く12％グルコースを含むAM1中での10回のバッチ適応進化ステップの後に、ステム大腸菌Ev3株が単離された。
【０１９３】
アラニン収率に関する試験は、同条件下での大腸菌Ev2株の92％〜93％のアラニン収率と比較して、ステム大腸菌Ev3株が、12％グルコースを含むAM1培地中で94％〜96％のアラニン収率を有していたことを明らかにした。
【０１９４】
実施例5：gcvTHPオペロンの発現の増加が、L-アラニン生産性に与える影響
【０１９５】
gcvT(配列番号45)、gcvH(配列番号47)及びgcvP(配列番号49)のORFからなるgcvTHPオペロン(配列番号51)のさらなるコピーを、pACYC184プラスミドのIPTG誘導性Ptrcプロモーターの制御下に導入した。pACYC-gcvTHPと命名されるベクター(配列番号52)を、市販のInFusionクローニング技術(Clontech, Mountain View、CA, USA)により構築した。pACYC184ベクター(NEB)を、HindIII及びSalI制限エンドヌクレアーゼ(NEB)で線状化した。生成したベクター骨格を、アガロースゲル抽出により精製した。gcvTHPオペロンを、野生型大腸菌W株ゲノムDNAから、プライマーgcvTHP-pACYC_F(配列番号53)及びプライマーgcvTHP-pACYC_R(配列番号54)を用いてPCR増幅した。これらのプライマーは、ベクター骨格に対する付加的な15bp相同オーバーハングと、IDT(Integrated DNA Technologies, Inc.)により合成されたPtrcプロモーター(配列番号55)を有する二本鎖DNA断片とを含んでいた。増幅されたgcvTHPオペロン、上流Ptrcプロモーター及び線状化pACYC184ベクター骨格を、InFusionクローニングマニュアルに従って一緒にクローン化した。得られたpACYC-gcvTHPプラスミドを、PCT/IB2014/064426及びPCT/IB2014/066686に記載されるとおり、エレクトロポレーション及びLBクロラムフェニコールプレート上の選抜により、大腸菌株Ev3に形質転換した。DNA配列決定により、陽性構築物を確認した。
【０１９６】
gcvTHP過剰発現がL-アラニン生産性に与える影響を、空の対照プラスミド(配列番号56)を保有する大腸菌株Ev3とgcvTHP過剰発現プラスミドpACYC-gcvTHP(配列番号52)を保有する大腸菌株Ev3との比較培養により試験した。前培養物を、プラスミド維持のために25μg/mLのクロラムフェニコールを添加したLB培地(20％充填容量)を含む振盪フラスコ中で、37℃、200rpmにて一晩増殖させた。発酵は、DASGIP 1.5L並行バイオリアクターシステム(Eppendorf社)において、500mLのAM 1培地(2.6g/L (NH4)2HPO4、0.87g/L NH4H2PO4、0.15g/L KCl、0.37g/L MgSO4・7H2O、15g/L (NH4)2SO4、1mMベタイン、1ml/L微量金属ストック溶液)中で行なった。微量金属ストックは、1.6g/LのFeCL3・6H2O；0.2g/LのCoCl2・6H2O；0.1g/LのCuCl2・2H2O；0.2g/LのZnCl2；0.2g/LのNaMoO4・2H2O；0.05g/LのH3BO3、0.1M HCLを含んでいた。140g/Lのグルコースを炭素源として使用し、25μg/mLのクロラムフェニコールを発酵培地に添加してプラスミドを安定的に維持した。細胞の指数増殖中に、PtrcプロモーターからのgcvTHPオペロンの発現を、200μMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)により誘導した。各菌株を、37℃及び400rpm撹拌速度にて2回反復で実験した。発酵全体を通して、5N NH4OHを使用してpHを6.8に制御し、培養液にアラニン前駆体としてのアンモニウムを提供した。細胞による培地中の溶存酸素の初期消費後に発酵が微好気的条件下で行われるように、発酵の間は通気せず、容器に加圧しなかった。発酵全体を通してサンプルを採取し、L-アラニン及びグルコースの濃度についてHPLCにより分析した。
【０１９７】
60時間の発酵時間後、gcvTHPオペロン(配列番号51)がpACYC-gcvTHPプラスミド(配列番号52)から過剰発現された大腸菌株Ev3は、空の対照プラスミドを保有する菌株のL-アラニン力価(37.23±0.01g/L)と比較して、有意に高いL-アラニン力価(53.37±1.45g/L)に達した。
【配列表】
2018508226000001.app
【国際調査報告】
2018508226.tif 000003
2018508226.tif 000004
2018508226.tif 000005
2018508226.tif 000006