(57)【要約】  本発明は、光合成細胞膜小胞とグルタチオン合成を触媒する酵素を組み合わせてグルタミン酸、システイン及びグリシンを反応基質としてグルタチオンを生産する方法に関する。グルタチオン合成を触媒する酵素を使用する方法には、ガンマグルタミルシステインとグルタチオン合成酵素を一緒に使用する方法、又は二機能性グルタチオン合成酵素を使用する方法がある。グルタチオンの合成には、高価のアデノシン三リン酸を持続的に供給しなければならない問題があるが、本発明は、アデノシン三リン酸の供給源として光合成細胞膜小胞を利用して追加的なアデノシン三リン酸の投入なしに持続的にグルタチオンを生産でき、これは、グルタチオン生産コストの節減に大きく寄与できる。
2018501811.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光合成細胞膜小胞（ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）とガンマグルタミルシステイン合成酵素（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧＳＨＩ）及びグルタチオン合成酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧＳＨＩＩ）を利用したグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）の生産方法において、前記方法は、光合成細胞膜小胞に光を照射し、アデノシン二リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＡＤＰ）と無機リン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）からアデノシン三リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＡＴＰ）を形成する段階を含むことを特徴とする生産方法。
【請求項２】
光合成細胞膜小胞（ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）と二機能性グルタチオン合成酵素（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ／ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧｓｈＦ）を利用したグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）の生産方法において、前記方法は、光合成細胞膜小胞に光を照射し、アデノシン二リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＡＤＰ）と無機リン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）からアデノシン三リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＡＴＰ）を形成する段階を含むことを特徴とする生産方法。
【請求項３】
次の段階を含むグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）の生産方法：
（ａ）光合成細胞膜小胞（ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）に光を照射し、アデノシン二リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＡＤＰ）及び無機リン酸（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）からアデノシン三リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＡＴＰ）を生成する段階と、
（ｂ）グルタチオンの合成を触媒する酵素が、前記段階（ａ）で生成されたアデノシン三リン酸を利用してグルタチオンを合成し、アデノシン二リン酸及び無機リン酸を形成する段階と、
（ｃ）前記段階（ｂ）で生成されたアデノシン二リン酸及び無機リン酸が、光合成細胞膜小胞のアデノシン三リン酸の生成に再使用される段階。
【請求項４】
前記光合成細胞膜小胞は、紫色非硫黄細菌（ｐｕｒｐｌｅ  ｎｏｎｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）から分離したクロマトホア細胞膜小胞（ｃｈｒｏｍａｔｏｐｈｏｒｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）及び藍色細菌（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）又は藻類（ａｌｇａｅ）から分離したチラコイド細胞膜小胞（ｔｈｙｌａｋｏｉｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）で構成された群から選択される小胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記グルタチオンの合成を触媒する酵素は、ガンマグルタミルシステイン合成酵素（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧＳＨＩ）、グルタチオン合成酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧＳＨＩＩ）及び二機能性グルタチオン合成酵素（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ／ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧｓｈＦ）で構成された群から選択される１以上の酵素であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記方法は、グルタチオン生産のための基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）としてグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）及びグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）を添加する段階を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記ガンマグルタミルシステイン合成酵素は、アデノシン三リン酸をアデノシン二リン酸と無機リン酸に転換しながら、グルタミン酸及びシステインをガンマグルタミルシステインに合成する過程を触媒し、前記グルタチオン合成酵素は、アデノシン三リン酸をアデノシン二リン酸と無機リン酸に転換しながら、ガンマグルタミルシステイン及びグリシンをグルタチオンに合成する過程を触媒する酵素であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記二機能性グルタチオン合成酵素は、請求項７に記載のガンマグルタミルシステイン合成酵素が触媒する反応及びグルタチオン合成酵素が触媒する反応を共に触媒し得る酵素であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記段階（ｂ）は、段階（ａ）で生成されたアデノシン三リン酸が、アデノシン二リン酸と無機リン酸に転換されながら、グルタミン酸とシステインがガンマグルタミルシステイン合成酵素によりガンマグルタミルシステインを形成する段階と、前記形成されたガンマグルタミルシステインとグリシンがグルタチオン合成酵素によりグルタチオンに合成されながら、段階（ａ）で生成されたアデノシン三リン酸がアデノシン二リン酸と無機リン酸に転換される段階と、を含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記段階（ｂ）は、グルタミン酸、システイン及びグリシンが二機能性グルタチオン合成酵素によりグルタチオンに合成されながら、段階（ａ）で生成されたアデノシン三リン酸がアデノシン二リン酸と無機リン酸に転換される段階を含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記ガンマグルタミルシステイン合成酵素：グルタチオン合成酵素の相対活性比（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒａｔｉｏ）は、４：１〜２０：１の間であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記光合成細胞膜小胞：ガンマグルタミルシステイン合成酵素：グルタチオン合成酵素の相対活性比（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒａｔｉｏ）は、１：１２：１〜５０：１２：１の間であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
光合成細胞膜小胞：二機能性グルタチオン合成酵素の相対活性比（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒａｔｉｏ）は、１０：１〜５００：１の間であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
（ｉ）光合成細胞膜小胞（ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）と；
（ｉｉ）ガンマグルタミルシステイン合成酵素（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧＳＨＩ）、グルタチオン合成酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧＳＨＩＩ）及び二機能性グルタチオン合成酵素（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ／ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧｓｈＦ）で構成された群から選択されるグルタチオン合成触媒酵素と；
を含むグルタチオン生産用組成物。
【請求項１５】
（ｉ）アデノシン三リン酸の供給手段として光合成細胞膜小胞（ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）と；
（ｉｉ）グルタチオン合成反応触媒手段としてガンマグルタミルシステイン合成酵素（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧＳＨＩ）、グルタチオン合成酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧＳＨＩＩ）及び二機能性グルタチオン合成酵素（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ／ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧｓｈＦ）で構成された群から選択されるグルタチオン合成触媒酵素と；
を含むグルタチオン持続生産用システム。
【請求項１６】
請求項１５に記載のシステムにグルタチオン生産のための基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）としてグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）及びグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）を添加する段階を含むグルタチオンの持続生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光合成細胞膜小胞を利用してグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）を持続的に生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ、ＧＳＨ）は、Ｌ−グルタミン酸（Ｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、Ｌ−システイン（Ｌ−Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）が結合された物質であって、大部分の真核生物（ｅｕｋａｒｙｏｔｅ）及び一部の原核生物（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅ）で合成される。グルタチオンは、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−システイン、グリシンを開始物質として、ガンマグルタミルシステイン合成酵素（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧＳＨＩ、ＥＣ６．３．２．２）及びグルタチオン合成酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧＳＨＩＩ、ＥＣ６．３．２．３）が触媒する二つの段階の酵素反応により生合成される。最近、前記二つの酵素の反応が一つの酵素により行われる新しい生合成経路が明らかにされ、この役目をする酵素を二機能性グルタチオン合成酵素（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ／ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧｓｈＦ）と言う（Ｊａｎｏｗｉａｋ  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈ．２００５．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：１１８２９−１１８３９、Ｖｅｒｇａｕｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：４３８０−４３９４）。
【０００３】
グルタチオンは、還元力が強いチオール基（ｔｈｉｏｌ  ｇｒｏｕｐ）を保有していて、生体内でグルタチオン過酸化酵素（ＧＳＨ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、グルタチオン還元酵素（ＧＳＨ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、グルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＨ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）とともに作用して抗酸化剤（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ）の機能を行い、免疫促進及び生体異物（ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｓ）の無毒化（ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に関与することがある（Ｐａｓｔｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３３３：１９−３９）。通常、グルタチオン合成遺伝子は、生存に必須であり、これら遺伝子が欠損された生物体は、酸化ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ）及び各種有害物質に対する抵抗性が減少すると知られている。また、ヒトの様々な疾病が体内グルタチオンの濃度減少と関連しているという報告がある（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３４：４８９−４９２）。このために、グルタチオンは、抗酸化作用による老化防止及び健康増進を目的に食品、医薬品及び化粧品の添加物として広く使用されている。
【０００４】
現在まで知られたグルタチオンを生産する方法には、有機合成法、酵素を利用した（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ）方法、そして発酵を利用した（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ）方法がある。有機合成法は、化学的方法でグルタチオンを合成する方法であって、１９３５年に開発され、１９５０年に商業化された（Ｈａｒｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅａｄ．１９３５．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９：１６０２−１６１１、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２００４．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６６：２３３−２４２）。有機合成法で合成されたグルタチオンは、光学的に不活性状態（ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  ｉｎａｃｔｉｖｅ、ｒａｃｅｍｉｃ）で得られ、生物体は、Ｌ−グルタチオンのみを選択的に使用する。したがって、有機合成法で合成されたグルタチオンを食品や医薬品に利用するためには、Ｌ−グルタチオンを分離する過程が追加的に必要である。
【０００５】
１９５０年代にグルタチオンの生合成経路が発見され（Ｂｌｏｃｈ．１９４９．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７９：１２４５−１２５４）、生物学的にグルタチオンを生産しようとする試みが始まった。そのうち、発酵を利用してグルタチオンを生産する方法は、現在商業的に最も多く使用される方法であって、通常、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）又は酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．）を利用する。炭素源としては、ブドウ糖又は糖蜜（ｍｏｌａｓｓｅｓ）を利用し、通常、２０〜３０時間発酵条件で培養後、グルタチオンを抽出する。これに追加的に、グルタチオンの生産量を増進させるための多様な方法がある。一例として、Ｌ−システインを培地に添加し、グルタチオンの生産速度を増進させる方法がある（Ａｌｆａｆａｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ．３７：１４１−１４６）。また、グルタチオンを合成する二つの遺伝子（ＧＳＨＩ、ＧＳＨＩＩ）を発酵菌株内で過発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ）させて、グルタチオンの生産量を増進させようとする努力があったが、顕著な生産量の増加は現われないと知られている。
【０００６】
生物学的にグルタチオンを生産するまた一つの方法は、酵素を利用するものである。大部分使用される方法は、大腸菌や酵母に界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）を処理し、物質透過性を高めた後、全体細胞を触媒として使用して、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−システイン、グリシン及びアデノシン三リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を添加し、Ｌ−グルタチオンを生産するものである。また、他の方法として、精製されたガンマグルタミルシステイン合成酵素及びグルタチオン合成酵素を利用して生産する方法があるが、多く使用される方法ではない。このような酵素を利用した方法の長所は、反応が選択的であり、発酵を利用した方法より収率が高いということである。しかし、反応に必要なアデノシン三リン酸のコストが高くて、商業化が難しいという短所がある。これを克服するために、アデノシン三リン酸を再生する酵素や細胞自体の解糖過程（ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）を利用してアデノシン三リン酸を供給することはできるが、費用問題を完全に解決しない状況である。したがって、低価で持続的にアデノシン三リン酸を供給できるシステムを具備する場合、酵素を利用したグルタチオンの生産が商業化される可能性が高い。
【０００７】
前述した背景技術として説明された事項は、本発明の背景に対する理解を増進させるためのものに過ぎず、この技術分野における通常の知識を有する者に既に知られた従来技術に該当することを認めるものと受け入れられるべきではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊａｎｏｗｉａｋ  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈ．２００５．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：１１８２９−１１８３９
【非特許文献２】Ｖｅｒｇａｕｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：４３８０−４３９４
【非特許文献３】Ｐａｓｔｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３３３：１９−３９
【非特許文献４】Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３４：４８９−４９２
【非特許文献５】Ｈａｒｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅａｄ．１９３５．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９：１６０２−１６１１
【非特許文献６】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２００４．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６６：２３３−２４２
【非特許文献７】Ｂｌｏｃｈ．１９４９．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７９：１２４５−１２５４
【非特許文献８】Ａｌｆａｆａｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ．３７：１４１−１４６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
グルタチオンは、食品、医薬品及び化粧品の添加物として非常に有用であり、酵素を利用したグルタチオンの合成は、反応が簡素化されるという長所があるが、酵素を利用する場合、助酵素の高いコストが現実的な問題になり得る。これにより、本発明者は、グルタチオンを比較的低価で生産できる方法を探そうと努力した。その結果、光合成細菌又は藻類の細胞膜に存在する小胞を分離し、光合成明反応実行機構を構成し、これにグルタチオンの合成を触媒する酵素を組み合わせて光を照射する場合、コストが非常に高いアデノシン三リン酸などの追加投入なしも、持続的にグルタチオンを合成できることを確認し、本発明を完成した。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、光合成細胞膜小胞とガンマグルタミルシステイン合成酵素及びグルタチオン合成酵素を利用したグルタチオンの生産方法を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、光合成細胞膜小胞と二機能性グルタチオン合成酵素を利用したグルタチオンの生産方法を提供することにある。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、光合成細胞膜小胞を含むグルタチオン生産用組成物を提供することにある。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、アデノシン三リン酸の供給手段として光合成細胞膜小胞を含むグルタチオン持続生産用システムを提供することにある。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、前記システムにグルタチオン生産のための基質を添加する段階を含むグルタチオンの持続生産方法を提供することにある。
【００１５】
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求範囲及び図面によって一層明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の一様態によれば、本発明は、光合成細胞膜小胞（ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）とガンマグルタミルシステイン合成酵素（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧＳＨＩ）及びグルタチオン合成酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧＳＨＩＩ）を利用したグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）の生産方法を提供する。
【００１７】
本発明の他の様態によれば、本発明は、光合成細胞膜小胞（ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）と二機能性グルタチオン合成酵素（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ／ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧｓｈＦ）を利用したグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）の生産方法を提供する。
【００１８】
本発明者は、食品、医薬品及び化粧品の添加物として有用なグルタチオンを持続的に生産できる方法を探そうと努力した。その結果、光合成細菌又は藻類の細胞膜に存在する小胞を分離し、光合成明反応実行機構を構成し、これにグルタチオンの合成を触媒する酵素を組み合わせて光を照射する場合、コストが非常に高いアデノシン三リン酸などの追加投入なしに、持続的にグルタチオンを合成できることを確認した。
【００１９】
本明細書で使用される用語「光合成細胞膜小胞（ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）」は、光エネルギーを利用して光合成を行うことができる光合成細菌（ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ）又は藻類（ａｌｇａｅ）から小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）形態で分離され得、適切な光が照射される条件で光合成の明反応を行うことができる細胞膜−タンパク質複合体を意味する。
【００２０】
前記光合成細胞膜小胞を形成する光合成細胞膜（ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）は、酸素非発生型の光合成細菌（ａｎｏｘｙｇｅｎｉｃ  ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ）に存在するクロマトホア細胞膜（ｃｈｒｏｍａｔｏｐｈｏｒｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ、或いはｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌｓｍｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＩＣＭ））と、酸素発生型の光合成細菌（ｏｘｙｇｅｎｉｃ  ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ）又は藻類（ａｌｇａｅ）に存在するチラコイド細胞膜（ｔｈｙｌａｋｏｉｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＴＭ）を含む。
【００２１】
クロマトホア細胞膜小胞（ｃｈｒｏｍａｔｏｐｈｏｒｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）は、クロマトホア細胞膜に由来し、光反応中心体（ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｃｅｎｔｅｒ）、光吸収体（ｌｉｇｈｔ−ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、アデノシン三リン酸合成酵素（ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）及び電子伝達系（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｃｈａｉｎ）タンパク質を含む細胞膜−タンパク質複合体を意味する。クロマトホア細胞膜は、循環的電子伝達（ｃｙｃｌｉｃ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｆｌｏｗ）を通じて形成された陽性子濃度勾配（ｐｒｏｔｏｎ  ｍｏｔｉｖｅ  ｆｏｒｃｅ）を利用してアデノシン二リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と無機リン酸（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）からアデノシン三リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を形成する。また、クロマトホア細胞膜に存在する複合体Ｉ（ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｉ）と複合体ＩＩ（ｃｏｍｐｌｅｘ  ＩＩ）を用いた逆電子伝達（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｆｌｏｗ）を通じて酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ｎｉｃｏｔｉａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ、ＮＡＤ＋）から還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ｎｉｃｏｔｉａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｅｄ、ＮＡＤＨ）を形成できる。かくして形成された還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）は、ピリジンヌクレオチド水素転移酵素（ｐｙｒｉｄｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を介して還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ｎｉｃｏｔｉａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｒｅｄｕｃｅｄ、ＮＡＤＰＨ）に転換され得る。
【００２２】
前記クロマトホア細胞膜小胞を分離できる酸素非発生型の光合成細菌は、制限がなく、好ましくは、紫色非硫黄細菌（ｐｕｒｐｌｅ  ｎｏｎ−ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）から分離でき、より好ましくは、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、ロドスピリルム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）、ロドシュードモナス属（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、ロゼオバクター属（Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）及びルブリヴィヴァックス属（Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｓｐ．）で構成される群から選択される紫色非硫黄細菌から分離できる。
【００２３】
チラコイド細胞膜小胞（ｔｈｙｌａｋｏｉｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）は、チラコイド細胞膜（ｔｈｙｌａｋｏｉｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）に由来し、二つの種類の光系（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍＩ／ＩＩ）とアデノシン三リン酸合成酵素及び電子伝達系タンパク質を含む細胞膜−タンパク質複合体を意味する。チラコイド細胞膜は、電子受容体として酸素を使用する電子伝達を通じて還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）と陽性子濃度勾配を形成する。かくして形成された陽性子濃度勾配は、アデノシン三リン酸合成酵素によりアデノシン二リン酸と無機リン酸をアデノシン三リン酸に合成するのに使用される。
【００２４】
前記チラコイド細胞膜小胞を分離できる酸素発生型の光合成細菌又は藻類は、制限がなく、好ましくは、藍色細菌（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）から分離でき、より好ましくは、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）、シネココックス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ノストック属（Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐ．）、グロイオバクター属（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）及びシアノバクテリア属（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）で構成される群から選択される藍色細菌から分離できる。
【００２５】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明は、前記光合成細胞膜小胞に光を照射し、アデノシン二リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＡＤＰ）と無機リン酸（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）からアデノシン三リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＡＴＰ）を形成する段階を含む。
【００２６】
本発明では、光合成細胞膜小胞をアデノシン三リン酸の供給源として利用し、グルタチオンの合成を触媒する酵素は、グルタチオンを形成する過程でアデノシン三リン酸を消耗しながらアデノシン二リン酸及び無機リン酸を形成する（図１ａ及び図１ｂ）。かくして形成されたアデノシン二リン酸及び無機リン酸は、光合成条件の下で光合成細胞膜小胞の明反応によりアデノシン三リン酸に再生され、グルタチオンの合成に関与する酵素の反応に再使用され得る。
【００２７】
本明細書で使用される用語「光合成条件」は、光合成細胞膜小胞の明反応を誘導するための条件を意味する。例えば、クロマトホア細胞膜小胞の場合、好ましくは、２０〜３７℃の温度、３〜３００Ｗａｔｔｓ／ｍ２の光度、３５０〜１０００ｎｍ波長帯の光が照射される条件の下で行われることができ、このような波長帯を満たすために、白熱灯を使用できる。また、チラコイド細胞膜小胞の場合、好ましくは、２０〜３７℃の温度と５〜５００μＥｉｎｓｔｅｉｎ／ｍ２・ｓ（μｍｏｌｅ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２・ｓ）の光度、４００〜７００ｎｍ波長帯の光で行われることができ、このような波長帯を満たすために、蛍光灯を使用できる。
【００２８】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、次の段階を含むグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）の生産方法を提供する：（ａ）光合成細胞膜小胞（ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）に光を照射し、アデノシン二リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＡＤＰ）及び無機リン酸（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）からアデノシン三リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＡＴＰ）を生成する段階と、（ｂ）グルタチオンの合成を触媒する酵素が前記段階（ａ）で生成されたアデノシン三リン酸を利用してグルタチオンを合成し、アデノシン二リン酸及び無機リン酸を形成する段階と、（ｃ）前記段階（ｂ）で生成されたアデノシン二リン酸及び無機リン酸が光合成細胞膜小胞のアデノシン三リン酸の生成に再使用される段階。
【００２９】
本明細書で使用される用語「グルタチオンの合成を触媒する酵素」は、アデノシン三リン酸を消耗しながらアデノシン二リン酸及び無機リン酸を形成し、これからグルタチオンを生成する反応を触媒する酵素を意味し、好ましくは、ガンマグルタミルシステイン合成酵素（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧＳＨＩ）、グルタチオン合成酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧＳＨＩＩ）及び二機能性グルタチオン合成酵素（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ／ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧｓｈＦ）で構成された群から選択される１以上の酵素を含む。
【００３０】
前記グルタチオンの合成を触媒する酵素は、グルタチオン生産のための基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を必要とし、好ましくは、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）及びグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）を基質として利用する。生物体は、Ｌ−グルタチオンのみを選択的に生産及び使用する点を考慮するとき、前記グルタミン酸及びシステインは、Ｌ−グルタミン酸（Ｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ）及びＬ−システイン（Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ）を利用することがより効率的である。
【００３１】
本発明の好ましい具現例によれば、前記グルタチオンの合成を触媒する酵素のうちガンマグルタミルシステイン合成酵素は、アデノシン三リン酸をアデノシン二リン酸と無機リン酸に転換しながらグルタミン酸及びシステインをガンマグルタミルシステインに合成する過程を触媒し、グルタチオン合成酵素は、アデノシン三リン酸をアデノシン二リン酸と無機リン酸に転換しながらガンマグルタミルシステイン及びグリシンをグルタチオンに合成する過程を触媒する酵素である。
【００３２】
すなわち、前記方法で、段階（ｂ）は、段階（ａ）で生成されたアデノシン三リン酸がアデノシン二リン酸と無機リン酸に転換されながら、グルタミン酸とシステインがガンマグルタミルシステイン合成酵素によりガンマグルタミルシステインを形成する段階と、前記形成されたガンマグルタミルシステインとグリシンがグルタチオン合成酵素によりグルタチオンに合成されながら、段階（ａ）で生成されたアデノシン三リン酸がアデノシン二リン酸と無機リン酸に転換される段階と、を含んで行われることができる（参照：図１ａ、以下、全体反応Ａという）。
【００３３】
本発明の好ましい具現例によれば、前記グルタチオンの合成を触媒する酵素のうち二機能性グルタチオン合成酵素は、ガンマグルタミルシステイン合成酵素が触媒する反応及びグルタチオン合成酵素が触媒する反応を共に触媒し得る酵素である。
【００３４】
すなわち、前記方法で、段階（ｂ）は、グルタミン酸、システイン及びグリシンが二機能性グルタチオン合成酵素によりグルタチオンに合成されながら、段階（ａ）で生成されたアデノシン三リン酸がアデノシン二リン酸と無機リン酸に転換される段階を含んで行われることができる（参照：図１ｂ、以下、全体反応Ｂという）。
【００３５】
本発明では、光合成細胞膜小胞及び各酵素間の相対量を表現するために、酵素活性（ｅｎｚｙｍｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を利用した。本明細書で用語「酵素活性」（以下、活性という）は、特定の量の酵素が単位時間当り生成できる産物の量を意味（μｍｏｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ／ｍｉｎ）し、実際活性がある酵素の量を反映する。「相対活性」は、クロマトホア細胞膜小胞及び酵素間の実際活性比（ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒａｔｉｏ）を簡単な整数比で示したとき、当該酵素又はクロマトホア細胞膜小胞の比率値を意味する。全体反応Ａにおいてガンマグルタミルシステイン合成酵素：グルタチオン合成酵素の相対活性比（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒａｔｉｏ）は、制限されないが、好ましくは、１：１〜１００：１、より好ましくは、４：１〜２０：１、最も好ましくは、８：１〜１６：１である。また、光合成細胞膜小胞：ガンマグルタミルシステイン合成酵素：グルタチオン合成酵素の相対活性比には、制限を設けないが、好ましくは、１：１２：１〜１００：１２：１、より好ましくは、１：１２：１〜５０：１２：１、最も好ましくは、１：１２：１〜２５：１２：１である。最後に、光合成細胞膜小胞：二機能性グルタチオン合成酵素の相対活性比も、制限がなく、好ましくは、１：１〜１０００：１、より好ましくは、１０：１〜５００：１、最も好ましくは、４０：１〜２００：１である。前記相対活性比を外れると言って、グルタチオンの生成が不可能なことではないが、全体的なグルタチオンの収率及び生産費用などを考慮すると、前記比率によることが一層効率的である。
【００３６】
本発明の好ましい具現例によれば、前記全体反応Ａ又は全体反応Ｂを無酸素条件（ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）で行う。これにより、光合成細胞膜小胞の活性を極大化し、生産物であるグルタチオンの酸化（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）を防止できる。
【００３７】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、（ｉ）光合成細胞膜小胞（ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）と；（ｉｉ）ガンマグルタミルシステイン合成酵素（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧＳＨＩ）、グルタチオン合成酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧＳＨＩＩ）及び二機能性グルタチオン合成酵素（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ／ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧｓｈＦ）で構成された群から選択されるグルタチオン合成触媒酵素と；を含むグルタチオン生産用組成物を提供する。
【００３８】
本発明は、組成物の形態に製品化され得、本発明の組成物は、適当な容器（ガラス瓶、プラスチック容器など）に収納されて流通され、グルタチオンの生産に活用され得る。グルタチオンを生産しようとする者は、前記光合成細胞膜小胞及びグルタチオンの合成を触媒する酵素が含まれた組成物に光源を照射し、グルタチオンを持続的に生産できる。
【００３９】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、（ｉ）アデノシン三リン酸の供給手段として光合成細胞膜小胞（ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）と；（ｉｉ）グルタチオン合成反応触媒手段としてガンマグルタミルシステイン合成酵素（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧＳＨＩ）、グルタチオン合成酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧＳＨＩＩ）及び二機能性グルタチオン合成酵素（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ／ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧｓｈＦ）で構成された群から選択されるグルタチオン合成触媒酵素と；を含むグルタチオン持続生産用システムを提供する。
【００４０】
本明細書で用語「グルタチオン持続生産用システム」は、アデノシン三リン酸の最初投入又はアデノシン二リン酸と無機リン酸の最初投入以外に追加的な投入を必ず必要とするものではないシステムであって、グルタミン酸、システイン及びグリシンのみを添加しても、グルタチオンを持続的に生産できるシステムを意味し、これは、反応器、キット、装置、設備などを含む。
【００４１】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、前記システムにグルタチオン生産のための基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）としてグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）及びグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）を添加する段階を含むグルタチオンの持続生産方法を提供する。
【発明の効果】
【００４２】
本発明の特徴及び利点を要約すると、次の通りである：
（ｉ）本発明は、光合成細胞膜小胞、ガンマグルタミルシステイン合成酵素及びグルタチオン合成酵素を利用したグルタチオンの生産方法を提供する。
（ｉｉ）また、本発明は、光合成細胞膜小胞、二機能性グルタチオン合成酵素を利用したグルタチオンの生産方法を提供する。
（ｉｉｉ）本発明は、ガンマグルタミルシステイン合成酵素、グルタチオン合成酵素、二機能性グルタチオン合成酵素がグルタチオンを合成するときに消耗されるアデノシン三リン酸を供給する手段として光合成細胞膜小胞を利用して、光が照射される条件でアデノシン三リン酸を持続的に供給することによって、アデノシン三リン酸の追加的な投入にかかる費用を節減できる長所を有する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１ａ】図１ａは、全体反応Ａであって、クロマトホア細胞膜小胞、ガンマグルタミルシステイン合成酵素及びグルタチオン合成酵素を利用してグルタチオンを合成する方法の反応模式図である。
【図１ｂ】図１ｂは、全体反応Ｂであって、クロマトホア細胞膜小胞及び二機能性グルタチオン合成酵素を利用してグルタチオンを合成する方法の反応模式図である。
【図２】図２は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）を行い、精製されたガンマグルタミルシステイン合成酵素、グルタチオン合成酵素及び二機能性グルタチオン合成酵素を確認した図である。
【図３】図３は、ガンマグルタミルシステイン合成酵素の活性を、アデノシン二リン酸の形成を検出する方法を利用して測定した例示である。
【図４】図４は、グルタチオン合成酵素の活性を、アデノシン二リン酸の形成を検出する方法を利用して測定した例示である。
【図５】図５は、グルタチオン合成酵素の相対活性（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を１に固定させ、ガンマグルタミルシステイン合成酵素の相対活性によるグルタチオンの生成量を確認した図である。
【図６】図６は、ガンマグルタミルシステイン合成酵素の相対活性：グルタチオン合成酵素の相対活性比を１２：１に固定させ、クロマトホア細胞膜小胞の相対活性によるグルタチオン生成量を確認した図である。
【図７】図７は、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−システイン、グリシン、アデノシン三リン酸が含まれた反応液において二機能性グルタチオン合成酵素のグルタチオン生成活性を測定した例示である。
【図８】図８は、二機能性グルタチオン合成酵素の相対活性を１に固定させ、クロマトホア細胞膜小胞の相対活性によるグルタチオン生成量を確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これらの実施例は、単に本発明を具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないことは、当業界において通常の知識を有する者に自明だろう。
【００４５】
実施例
実施例１：クロマトホア細胞膜小胞の分離
【００４６】
クロマトホア細胞膜小胞（ｃｈｒｏｍａｔｏｐｈｏｒｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）は、韓国特許出願第１０−２０１４−０１５１９０７号に開示された方法を利用して分離した。クロマトホア細胞膜小胞の分離のために使用された菌株は、紫色非硫黄細菌の一種であるロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈｅａｒｏｉｄｅｓ  ２．４．１、ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−８０８、Ｃｏｈｅｎ−Ｂａｚｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．１９５６．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４９：２５−６８）を利用した。前記菌株を培養するとき、シストロム最小培地（Ｓｉｓｔｒｏｍ．１９６２．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：６０７−６１６、表１）を使用した。培養方法は、まず、５ｍＬの培地が入っている試験管に菌株を接種した後、３０℃、２５０ｒｐｍで振とう培養した。６６０ｎｍにおいての吸光度が２．０程度になったとき、１８ｍＬ容量のスクリューキャップ（ｓｃｒｅｗ  ｃａｐ）試験管に初期吸光度が０．０５となるように継代培養した後、酸素の流入を遮断するために、スクリューキャップ試験管に培地を全部満たし、シールした。培養は、光合成の条件で行い、温度が３０℃に維持される培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）に白熱灯により１５Ｗａｔｔｓ／ｍ２の光度で光が照射される条件の下で１８時間嫌気培養した。２６０ｍＬの透明なガラス瓶を用意し、１８ｍＬのスクリューキャップ試験管で培養した菌株を８ｍＬ入れた後、残りの容量を培地で全部満たし、シールし、３０℃の温度、１５Ｗａｔｔｓ／ｍ２の光度の白熱灯の前で１８時間嫌気培養した。その後、クロマトホア細胞膜の分離過程は、すべて嫌気性チャンバー（ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｃｈａｍｂｅｒ、ｍｏｄｅｌ  １０、Ｃｏｙ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｏｄｕｃｔ）で行われた。嫌気性チャンバー内の気体組成は、窒素９０％、二酸化炭素５％、水素５％で構成される。２６０ｍＬで培養したロドバクター・スフェロイデス菌株を７０００ｇ、４℃に１０分間遠心分離した後、上澄み液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を捨てて、菌体（ｃｅｌｌ  ｐｅｌｌｅｔ）を得た。菌体は、リン酸バッファー（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．６）を４ｍＬ入れ、溶解（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）させた後、プロテアーゼ抑制剤混合液（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｒｏｃｈｅ）を製造社の指針によって添加した。以後の過程では、すべての試料を氷に載置し、温度を低く維持しながら進行された。次の過程は、細胞を破砕するために、超音波破砕機（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ、ｍｏｄｅｌ  ＶＣＸ１３０、Ｓｏｎｉｃｓ  ＆  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）を利用して、１００％増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）で２分間超音波を照射した後、２分間氷水で冷却させる過程を３回繰り返した。超音波を照射するときは、過熱を防止するために、菌体を氷水で冷却しつつ行われた。破砕した菌体は、６，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した後、その上澄み液のみを収得し、超高速遠心分離機（Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を利用して４℃、２００，０００ｇで１時間遠心分離した。上澄み液を除去した後、ショ糖密度勾配遠心分離（ｓｕｃｒｏｓｅ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）のために、クロマトホア細胞膜小胞を含む沈殿物（ｐｅｌｌｅｔ）を１ｍＬのリン酸バッファーで溶解させた。ショ糖密度勾配は、１３．５ｍＬ容量の超高速遠心分離用容器の最下層から、６０％（ｗ／ｖ、リン酸バッファーで溶解）ショ糖溶液８ｍＬ、４０％ショ糖溶液１ｍＬ、２０％ショ糖溶液１ｍＬよりなり、最上層に１ｍＬのクロマトホア細胞膜小胞沈殿物を上げた後、２００，０００ｇで４時間超高速遠心分離を行った。クロマトホア細胞膜小胞は、２０％ショ糖溶液階と４０％ショ糖溶液層との間に位置するようになり、赤褐色の層として現われる。クロマトホア細胞膜小胞を含む赤褐色の層を分離した後、同じ体積のリン酸バッファーを添加して希釈し、さらに、一般汚染菌の増殖を防止するために、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を１００μｇ／ｍＬの濃度で添加した後、プロテアーゼ抑制剤混合液を製造社の指針によって添加した後、無酸素（ａｎａｅｒｏｂｉｃ）の状態にシールし、４℃で保管した。
【００４７】
【表１】
2018501811.tif 000003
【００４８】
実施例２：グルタチオン合成に関与する酵素を暗号化する遺伝子確保
【００４９】
全体反応Ａ（図１ａ）のガンマグルタミルシステイン合成酵素とグルタチオン合成酵素を暗号化（ｃｏｄｉｎｇ）する遺伝子、及び全体反応Ｂ（図１ｂ）の二機能性グルタチオン合成酵素をクローニング（ｃｌｏｎｉｎｇ）するために、重合酵素連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った。ガンマグルタミルシステイン合成酵素の場合、前方プライマー（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）として配列番号１を使用し、後方プライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）として配列番号２を使用し、グルタチオン合成酵素の場合、前方プライマーとして配列番号３を使用し、後方プライマーとして配列番号４を使用し、それぞれ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒ．Ｋ−１２  ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５）の染色体ＤＮＡ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ）を鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として重合酵素連鎖反応を行った。二機能性グルタチオン合成酵素は、前方プライマーとして配列番号５を使用し、後方プライマーとして配列番号６を使用し、ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ａｇａｌａｃｔｉａｅ  ｓｔｒ．２６０３Ｖ／Ｒ、ＡＴＣＣＢＡＡ−６１１）の染色体ＤＮＡ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ）を鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として重合酵素連鎖反応を行った。かくして重合酵素連鎖反応で確保した遺伝子切片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）の両末端には、制限酵素ＢｓａＩの認識配列及びＩＢＡ社で勧奨する追加配列を挿入し、これをＩＢＡ社で提供する発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）であるｐＡＳＫ−ＩＢＡ７ｐｌｕｓ（ガンマグルタミルシステイン合成酵素、二機能性グルタチオン合成酵素）及びｐＡＳＫ−ＩＢＡ３ｐｌｕｓ（グルタチオン合成酵素）に接合した。結果的に、Ｎ−末端にストレプタグ（ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ）が接合されたガンマグルタミルシステイン合成酵素及び二機能性グルタチオン合成酵素と、Ｃ−末端にストレプタグ（ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ）が接合されたグルタチオン合成酵素を発現させる構造物を完成した。
【００５０】
【表２】
2018501811.tif 000004
【００５１】
【表３】
2018501811.tif 000005
【００５２】
【表４】
2018501811.tif 000006
【００５３】
実施例３：グルタチオン合成反応を触媒する酵素の精製
【００５４】
本実施例では、実施例２で製作した発現ベクター構造物で大腸菌菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）し、ガンマグルタミルシステイン合成酵素とグルタチオン合成酵素及び二機能性グルタチオン合成酵素をそれぞれ過発現する形質転換菌株を獲得した。前記三つの酵素の精製時に、同一の方法を使用する。まず、試験管に５０μｇ／ｍＬのアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）を含むＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地５ｍＬを入れ、形質転換菌株を接種し、２５０ｒｐｍ、３７℃で１２時間振とう培養する。試験管で振とう培養した菌株を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンが含まれた５００ｍＬのＬＢ培地が収納された１Ｌのフラスコ（ｆｌａｓｋ）に接種した。接種時、６００ｎｍの最初吸光度が０．０５となるようにした後、２５０ｒｐｍ、３７℃で振とう培養しつつ、吸光度が０．４に到逹すると、無水テトラサイクリン（ａｎｈｙｄｒｏｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）を０．２μｇ／ｍＬの濃度で添加した。２５０ｒｐｍ、３０℃で約１２時間振とう培養した後、４，０００ｇで１０分間遠心分離し、上澄み液を除去し、菌体（ｐｅｌｌｅｔ）を獲得した。菌体を１０ｍＬのバッファーＷ（１００ｍＭ  のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）に溶解した後、プロテアーゼ抑制剤混合液（Ｒｏｃｈｅ）を製造社の勧奨量で添加し、菌体を破砕するために超音波破砕機（Ｂｒａｎｓｏｎ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０）を利用した。超音波破砕は、アウトプット（ｏｕｔｐｕｔ）３の強度で５分間破砕した後、５分間氷水で冷却する過程を３回繰り返した。破砕後、６，０００ｇで１０分間遠心分離し、水溶性酵素が含まれた上澄み液を分離し、ストレプタグを利用した親和性クロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で酵素を精製した。ストレプタグ親和性クロマトグラフィーは、製造社（ＩＢＡ）で勧奨する方法を使用した。最終的に、精製した酵素は、１０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）で確認した（図２）。予想分子量は、ガンマグルタミルシステイン合成酵素が約５８ｋＤａ（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．１９８６．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：４３９３）、グルタチオン合成酵素が約３５ｋＤａ（Ｇｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．１９８４．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：９２９９）、二機能性グルタチオン合成酵素が約８５ｋＤａ（Ｊａｎｏｗｉａｋ  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈ．２００５．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：１１８２９−１１８３９）であった。
【００５５】
実施例４：光の照射によるクロマトホア細胞膜小胞のアデノシン三リン酸生成活性測定
【００５６】
クロマトホア細胞膜小胞の定量及び活性測定は、韓国特許出願第１０−２０１４−０１５１９０７号に開示された方法を利用した。クロマトホア細胞膜小胞は、バクテリオクロロフィルエイ（ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  ａ、ｂｃｈ  ａ）濃度を利用して定量し、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の生成活性の測定時、０．２５〜０．５μｇ  ｂｃｈ  ａ／ｍＬの濃度でクロマトホア細胞膜小胞を使用した。反応は、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、２ｍＭのリン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、１０ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、０．４ｍＭのアデノシン二リン酸で構成されたバッファーにクロマトホア細胞膜小胞を適量投入した後、３０℃、１５Ｗａｔｔｓ／ｍ２の白熱灯が照射される無酸素（ａｎａｅｒｏｂｉｃ）の条件で時間別に生成されるアデノシン三リン酸の量をアデノシン三リン酸検出キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を利用して測定した。クロマトホア細胞膜小胞の活性は、単位時間当たり生成されたアデノシン三リン酸の量（ｎｍｏｌｅ  ＡＴＰ／ｍｉｎ）で表現した。
【００５７】
実施例５：ガンマグルタミルシステイン合成酵素とグルタチオン合成酵素の酵素活性測定
【００５８】
本実施例では、実施例３で精製したガンマグルタミルシステイン合成酵素及びグルタチオン合成酵素の酵素活性（ｅｎｚｙｍｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を測定するために、アデノシン二リン酸の形成を測定する方法（Ｓｅｅｌｉｇ  ａｎｄ  Ｍｅｉｓｔｅｒ．１９８５．Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１３：３７９−３９０）を使用した。活性測定時に使用した反応バッファーは、０．１ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．６）、１０ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、０．８ｍＭのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２ｍＭのホスホエノールピルビン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ）、０．２ｍＭのニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、１４．３Ｕｎｉｔ／ｍＬのピルビン酸キナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ）、１４．３Ｕｎｉｔ／ｍｌの乳酸脱水素酵素（ｌａｃｔｉｃ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）で構成される。ガンマグルタミルシステイン合成酵素の活性を測定する場合、前記反応バッファーに１０ｍＭのＬ−グルタミン酸（Ｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ）と１０ｍＭのＬ−システイン（Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ）を添加し、グルタチオン合成酵素の活性を測定する場合、前記反応バッファーに１０ｍＭのグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）、１ｍＭのガンマグルタミルシステイン（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）を添加した。反応温度は、３０℃にした。ガンマグルタミルシステイン合成酵素とグルタチオン合成酵素の酵素反応が起こる場合、アデノシン二リン酸が生成され、これと同時に、アデノシン二リン酸と同じ当量の還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）が酸化された形態（ＮＡＤ＋）に転換される。還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは、３４０ｎｍで吸光性を示す一方で、酸化された形態は、吸光性がないので、時間による３４０ｎｍにおいての吸光度の減少を測定することによって、二つの酵素の活性を把握できる。図３は、ガンマグルタミル合成酵素の活性を測定した例示であり、図４は、グルタチオン合成酵素の活性を測定した例示である。酵素活性の計算時、３４０ｎｍでモル吸光係数（６２２０Ｍ−１ｃｍ−１）を利用してニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の濃度変化量を求め、１当量のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドが消耗されるとき、各酵素の産物が１当量生成されると仮定した。かくして計算された単位時間当り生成された産物の数（ｎｍｏｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ／ｍｉｎ）を酵素活性で表現した。
【００５９】
実施例６：ガンマグルタミルシステイン合成酵素とグルタチオン合成酵素によるグルタチオン生成確認
【００６０】
本実施例では、ガンマグルタミルシステイン合成酵素とグルタチオン合成酵素によりＬ−グルタミン酸、Ｌ−システイン、グリシン及びアデノシン三リン酸からグルタチオンが形成されることを確認した。使用した反応バッファーは、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、２ｍＭのリン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、１０ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、０．８ｍＭのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、１０ｍＭのＬ−グルタミン酸、１０ｍＭのＬ−システイン、１０ｍＭのグリシンで構成し、生成されたグルタチオンの酸化を防止するために、３０℃、無酸素の条件（ａｎａｅｒｏｂｉｃ）で反応を進行した。グルタチオンの検出は、グルタチオン検出キット（ＧＳＨ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用した。各酵素は、実施例５の方法で活性を測定した後、活性を基盤として定量した。図５は、グルタチオン合成酵素の相対活性を固定させ、それによるガンマグルタミルシステイン合成酵素の相対活性を変化させながら、グルタチオンが生成される量を測定したものである。結果的に、二つの酵素によりグルタチオンが形成されることを確認し、グルタチオン生産量が最大になる二つの酵素間の最小活性比（ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒａｔｉｏ、図５のＧＳＨＩ：ＧＳＨＩＩ）は、約１２：１であった。したがって、下記の実施例では、ガンマグルタミルシステイン合成酵素とグルタチオン合成酵素の比を１２：１で使用した。
【００６１】
実施例７：光が照射される条件でクロマトホア細胞膜小胞、ガンマグルタミルシステイン合成酵素及びグルタチオン合成酵素によるグルタチオン生成確認
【００６２】
本実施例では、クロマトホア細胞膜小胞、ガンマグルタミルシステイン合成酵素、グルタチオン合成酵素によりアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）がなく、光が照射される条件でグルタチオンの生成を確認した。使用した反応バッファーは、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、２ｍＭのリン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、１０ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、０．４ｍＭのアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、１０ｍＭのＬグルタミン酸、１０ｍＭのＬシステイン、１０ｍＭのグリシンを含み、３０℃、無酸素の条件で反応を進行した。光源（ｌｉｇｈｔ  ｓｏｕｒｃｅ）としては、１５Ｗａｔｔｓ／ｍ２の光度の白熱灯を使用した。図６は、ガンマグルタミルシステイン合成酵素：グルタチオン合成酵素の相対活性を１２：１に固定させ、クロマトホア細胞膜小胞の相対活性を変化させながら、グルタチオンの生成量を確認したものである。クロマトホア細胞膜小胞の量が増加するほど、グルタチオンの生成量（又は生成速度）が増加することを確認し、クロマトホア細胞膜小胞の相対活性が２５以上であるとき、グルタチオンの生成量が最大に近接した。
【００６３】
実施例８：二機能性グルタチオン合成酵素のグルタチオン生成活性測定
【００６４】
本実施例では、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−システイン、グリシン及びアデノシン三リン酸が含まれた反応液において二機能性グルタチオン合成酵素がグルタチオンを生成することを確認した。反応液の組成は、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、２ｍＭのリン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、１０ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、１００ｍＭのＬグルタミン酸、１０ｍＭのＬシステイン、２５ｍＭのグリシン、０．８ｍＭのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）で構成し、３０℃で反応を行った。図７は、それぞれ異なる量の二機能性グルタチオン合成酵素を含む反応液において時間によるグルタチオン生成量を測定し、二機能性グルタチオン合成酵素の活性（ｎｍｏｌｅ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ／ｍｉｎ）を決定したものである。二機能性グルタチオン合成酵素の反応は、初期に誘導期（ｌａｇ  ｐｈａｓｅ）が存在するため、活性を計算するときには、線形（ｌｉｎｅａｒ）区間の反応速度で計算する。
【００６５】
実施例９：光が照射される条件でクロマトホア細胞膜小胞と二機能性グルタチオン合成酵素によるグルタチオン生成確認
【００６６】
本実施例では、アデノシン三リン酸の代わりに、アデノシン二リン酸を添加した後、光が照射される条件でクロマトホア細胞膜小胞と二機能性グルタチオン合成酵素を一緒に使用してＬ−グルタミン酸、Ｌ−システイン、グリシンからグルタチオンが生成されることを確認した。反応液は、前記実施例８の反応液において０．８ｍＭのアデノシン三リン酸の代わりに０．４ｍＭのアデノシン二リン酸を添加したものを使用した。反応は、１５Ｗａｔｔｓ／ｍ２の光度の白熱灯が照射される３０℃の無酸素の条件で行われた。図８は、二機能性グルタチオン合成酵素の相対活性を１に固定させ、クロマトホア細胞膜小胞の活性によるグルタチオンの生成量を測定したものであり、クロマトホア細胞膜小胞の量が増加するほど、グルタチオンの生成量が増加することを確認した。
【００６７】
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したところ、当業界において通常の知識を有する者にとってこのような具体的な技術は、単に好ましい具現例に過ぎず、これに本発明の範囲が制限されるものではない点は、明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物によって定義されると言える。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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