(57)【要約】本発明は、ファミリーＢポリメラーゼ酵素であって、以下の変異：２番目のアミノ酸がトレオニンであり、９°Ｎ内のアミノ酸４０８〜４１０と相同であるモチーフＡ領域における変異と、前記ファミリーＢポリメラーゼに存在する場合に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下または排除をもたらす変異とを含み、以下のモチーフＡ領域における変異：Ｌ４０８ＹもしくはＬ４０８Ｆおよび／またはＰ４１０ＳもしくはＰ４１０Ｇの一方または両方をさらに含む、ファミリーＢポリメラーゼ酵素に関する。ファミリーＢポリメラーゼ酵素は、ＤＮＡシークエンシングにおいて使用することができ、キット中に存在してもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファミリーＢポリメラーゼ酵素であって、以下の変異：２番目のアミノ酸がトレオニンであり、９°Ｎ内のアミノ酸４０８〜４１０と相同であるモチーフＡ領域における変異と、前記ファミリーＢポリメラーゼに存在する場合に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下または排除をもたらす変異とを含み、以下の前記モチーフＡ領域における変異：Ｌ４０８ＹもしくはＬ４０８Ｆおよび／またはＰ４１０ＳもしくはＰ４１０Ｇの一方または両方をさらに含む、ファミリーＢポリメラーゼ酵素。
【請求項２】
変異Ｙ４０９Ｔを有する９°Ｎポリメラーゼ、変異Ｙ４１２Ｔを有するＶｅｎｔポリメラーゼ、変異Ｙ４１０Ｔを有するＰｆｕポリメラーゼ、変異Ｙ４０９Ｔを有するＪＤＦ−３ポリメラーゼおよび変異Ｅ６１５Ｔを有するＴａｑポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１に記載のポリメラーゼ。
【請求項３】
以下の変異：Ｄ２１５Ａおよび／またはＤ３１５Ａのうちの１つまたは複数を含む、請求項１または２に記載のポリメラーゼ。
【請求項４】
変異Ａ４８５Ｌをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項５】
以下の変異のセット：（ｉ）Ｄ２１５Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ｌ４０８Ｙ、Ｙ４０９Ｔ、Ｐ４１０ＳおよびＡ４８５Ｌ、または（ｉｉ）Ｄ２１５Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ｌ４０８Ｆ、Ｙ４０９Ｔ、Ｐ４１０ＧおよびＡ４８５Ｌを有する、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項６】
対照ポリメラーゼと比較して、置換基が天然に存在する３’ヒドロキシル基よりも大きなサイズになるように、３’糖ヒドロキシルにおいて改変されたヌクレオチドの取り込み率の増大を示す、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載のポリメラーゼをコードする核酸分子。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項９】
置換基が天然に存在する３’ヒドロキシル基よりも大きなサイズになるように、３’糖ヒドロキシルにおいて改変されたヌクレオチドをＤＮＡに取り込むための方法であって、以下の物質：（ｉ）請求項１から６のいずれか一項に記載のポリメラーゼ、（ｉｉ）鋳型ＤＮＡ、（ｉｉｉ）置換基が前記天然に存在する３’ヒドロキシル基よりも大きなサイズになるように、前記３’糖ヒドロキシルにおいて改変された１つまたは複数のヌクレオチドを含む方法。
【請求項１０】
ＤＮＡシークエンシング、ＤＮＡ標識化、プライマー伸長、増幅などのための、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリメラーゼの使用。
【請求項１１】
請求項１から６のいずれか一項に記載のポリメラーゼを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学の分野、具体的には酵素の分野、より具体的にはポリメラーゼの分野に属する。本発明はまた、核酸シークエンシングの分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、ポリメラーゼ酵素、具体的には、対照ポリメラーゼと比較して改変ヌクレオチドの取り込みの改善を示す改変ＤＮＡポリメラーゼに関する。ＤＮＡシークエンシング、具体的には次世代シークエンシングのための、改変ポリメラーゼの使用方法も本発明に含まれる。
【０００３】
ＤＮＡポリメラーゼには、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩとのアミノ酸の類似性に基づいて、３つの主要なスーパーファミリーが存在する。これらは、それぞれファミリーＡポリメラーゼ、ファミリーＢポリメラーゼおよびファミリーＣポリメラーゼと称される。ファミリーＡポリメラーゼおよびファミリーＢポリメラーゼの結晶解析により、ヌクレオチド結合部位についての共通な構造コアが明らかになるが、ファミリー内でよく保存されている配列モチーフは、ファミリー間では弱くしか保存されておらず、これらのポリメラーゼのヌクレオチド類似体間の識別の仕方には有意差がある。ＤＮＡポリメラーゼを用いた初期の実験により、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）などの改変ヌクレオチドを取り込むことの難しさが明らかになった。したがって、ヌクレオチド類似体の取り込み率が上昇するようにＤＮＡポリメラーゼを改変したいくつかの例が存在する。これらの大多数は、ジデオキシヌクレオチド鎖ターミネーターの取り込みを増大させることを目的として、ファミリーＡポリメラーゼのバリアントに焦点を当てたものであった。例えば、TaborおよびRichardson（Proc.  Natl.  Acad.  Sci.（USA）１９９５年；９２巻：６３３９頁）には、Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓのＤＮＡポリメラーゼにおけるフェニルアラニン６６７のチロシンでの置換、およびＤＮＡポリメラーゼによるジデオキシヌクレオチドの識別に対するその効果が記載されている。
【０００４】
改変ヌクレオチドの取り込みの効率を増大させるために、ＤＮＡポリメラーゼが、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（ｅｘｏ−と称される）を欠くように利用または操作されてきた。９°Ｎポリメラーゼのｅｘｏ−バリアントは、Perlerら、１９９８年によるＵＳ５７５６３３４において、およびSouthworthら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.（USA）１９９６年；９３巻：５２８１頁において記載されている。
【０００５】
GardnerおよびJack（Nucl.  Acis  Res.、１９９９年；２７巻：２５４５頁）には、リボヌクレオチド、２’デオキシリボヌクレオチドおよび３’デオキシリボヌクレオチドならびに２’３’−ジデオキシリボヌクレオチドの取り込みを増強するＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼの変異が記載されている。Ｖｅｎｔポリメラーゼの２つの個々の変異、Ｙ４１２ＶおよびＡ４８８Ｌにより、ヌクレオチドＡＴＰによる酵素の相対的な活性が増強された。さらに、Ｙ４１２およびＡ４８８における他の置換によっても、リボヌクレオチドの取り込みが、程度は劣るが増大する。残基４１２のアミノ酸の側鎖の大部分が、リボヌクレオチドの糖の２’−ヒドロキシルの結合部位への接近を遮断する「立体的ゲーティング」として作用することが結論づけられた。しかし、コルジセピン（３’−デオキシアデノシン三リン酸）についての率の増強はわずか２倍であり、これにより、Ｙ４１２Ｖポリメラーゼバリアントが３’糖ヒドロキシルの喪失に対しても感受性であることが示された。残基Ａ４８８については、活性の変化を合理的に説明するのはより難しい。Ａ４８８は、ヌクレオチド結合部位から離れて向いていることが予測され、本明細書では、活性の増強は、酵素反応に必要な活性化エネルギーに対する変化によって説明された。Ｖｅｎｔにおけるこれらの変異は９°ＮポリメラーゼにおけるＹ４０９およびＡ４８５に対応する。
【０００６】
Ａ４８８Ｌ変異の普遍性は、以下の超好熱性のポリメラーゼにおける相同変異によって確認されている。
【０００７】
Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのＡ４８６Ｙバリアント（Evansら、Nucl.  Acids  Res.、２０００年；２８巻：１０５９頁）。一連のランダムな変異をポリメラーゼ遺伝子に導入し、ｄｄＮＴＰの取り込みが改善されたバリアントを同定した。Ａ４８６Ｙ変異により、シークエンシングラダーにおけるｄｄＮＴＰ／ｄＮＴＰの比が野生型と比較して１５０倍改善された。しかし、Ｙ４１０のＡまたはＦへの変異では、野生型酵素と比較して劣ったシークエンシングラダーがもたらされるバリアントが生じた。さらなる情報に関しては、国際公開第ＷＯ０１／３８５４６号を参照されたい。
【０００８】
９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのＡ４８５Ｌバリアント（GardnerおよびJack、Nucl.  Acids  Res.、２００２年；３０巻：６０５頁）。この研究では、アミノ酸４８５におけるアラニンのロイシンへの変異により、３’糖ヒドロキシ部位を欠くヌクレオチド類似体（ａｃｙＮＴＰおよびジデオキシＮＴＰ）の取り込みが増強されることが実証された。
【０００９】
Ｔｓｐ  ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼのＡ４８５Ｔバリアント（Areziら、J.  Mol.  Biol.、２００２年；３２２巻：７１９頁）。この論文では、ｄｄＮＴＰの取り込みが増強されるバリアントが同定されたＪＤＦ−３ポリメラーゼに、ランダムな変異が導入された。個別に、２種の変異、Ａ４８５ＴおよびＰ４１０Ｌにより、ｄｄＮＴＰ取り込みが野生型酵素と比較して改善された。組み合わせると、これらの変異には相加効果があり、ｄｄＮＴＰ取り込みが２５０倍改善された。この論文では、ＤＮＡポリメラーゼの２つの領域の同時変異にはヌクレオチド類似体の取り込みに対する相加効果があり得ることが実証されている。さらに、この報告では、上記のＹ４０９に隣接するＰ４１０もまた、ヌクレオチド糖類似体の識別において役割を果たすことが実証されている。
【００１０】
ＷＯ０１／２３４１１には、ジデオキシヌクレオチドおよびアシクロヌクレオチド（ａｃｙｃｌｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）のＤＮＡへの取り込みにおけるＶｅｎｔのＡ４８８Ｌバリアントの使用が記載されている。当該出願は、これらのヌクレオチド類似体および残基４８５において変異させた９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのバリアントを用いるシークエンシングの方法も網羅する。
【００１１】
ＷＯ２００５／０２４０１０Ａ１は、モチーフＡ領域の改変、および９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼにも関する。しかし今のところ、改変によって改変ヌクレオチドの十分に高い取り込み率はまだ示されていない。したがって、そのような高い改変ヌクレオチドの取り込み率を有する酵素を有することが有益であると思われる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第５７５６３３４号明細書
【特許文献２】国際公開第２００１／０３８５４６号
【特許文献３】国際公開第２００１／０２３４１１号
【特許文献４】国際公開第２００５／０２４０１０号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】TaborおよびRichardson（Proc.  Natl.  Acad.  Sci.（USA）１９９５年；９２巻：６３３９頁）
【非特許文献２】Southworthら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.（USA）１９９６年；９３巻：５２８１頁
【非特許文献３】GardnerおよびJack（Nucl.  Acis  Res.、１９９９年；２７巻：２５４５頁）
【非特許文献４】Evansら、Nucl.  Acids  Res.、２０００年；２８巻：１０５９頁
【非特許文献５】GardnerおよびJack、Nucl.  Acids  Res.、２００２年；３０巻：６０５頁
【非特許文献６】Areziら、J.  Mol.  Biol.、２００２年；３２２巻：７１９頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
ある特定のＤＮＡシークエンシング方法の効率を改善するために、本発明者らは、ＤＮＡポリメラーゼを、そのような３’置換ヌクレオチド類似体の取り込み率が改善されるように改変することができるかどうかを分析した。
【００１５】
本発明は、ファミリーＢポリメラーゼ酵素であって、以下の変異：２番目のアミノ酸がトレオニンであり、９°Ｎ内のアミノ酸４０８〜４１０と相同であるモチーフＡ領域における変異と、前記ファミリーＢポリメラーゼに存在する場合に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下または排除をもたらす変異とを含み、以下のモチーフＡ領域における変異：Ｌ４０８ＹもしくはＬ４０８Ｆおよび／またはＰ４１０ＳもしくはＰ４１０Ｇの一方または両方をさらに含む、ファミリーＢポリメラーゼ酵素に関する。
【００１６】
本発明は、改変ポリメラーゼのＤＮＡシークエンシングにおける使用およびそのような酵素を含むキットにも関する。
【００１７】
本明細書では、「取り込み」とは、改変ヌクレオチドを２番目のヌクレオチドの遊離の３’ヒドロキシル基に、改変ヌクレオチドの５’リン酸基とホスホジエステル結合を形成することによって接合することを意味する。改変ヌクレオチドを接合する２番目のヌクレオチドは、一般には、ポリヌクレオチド鎖の３’末端に存在する。
【００１８】
本明細書では、「改変ヌクレオチド」および「ヌクレオチド類似体」とは、本発明に関して使用される場合、置換基が天然に存在する３’ヒドロキシル基よりも大きなサイズになるように、３’糖ヒドロキシルにおいて改変されたヌクレオチドを指す。これらの用語は、互換的に使用することができる。
【００１９】
本明細書では、「大きな３’置換基」という用語は、天然に存在する３’ヒドロキシル基よりもサイズが大きな、３’糖ヒドロキシルにおける置換基を指す。
【００２０】
本明細書では、取り込みの「改善」とは、少なくとも１つの改変ヌクレオチドの取り込みの効率および／または観察される率が対照ポリメラーゼ酵素と比較して上昇することを含むものと定義される。しかし、本発明は、改変ヌクレオチドの取り込みの絶対的な率の改善だけに限定されない。以下に示される通り、ポリメラーゼは、他の改変およびいわゆるダークヌクレオチド（ｄａｒｋ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）も取り込み、したがって、「取り込みの改善」は、取り込み率の上昇を伴うまたは伴わない、これらの他の性質のいずれかの改善も包含するものと解釈されるべきである。「改善」は、全サイクルにわたって一定である必要はない。本明細書では、「改善」は、改変ヌクレオチドを対照酵素よりも低温でかつ／またはより広い温度範囲にわたって取り込むことができることであり得る。本明細書では、「改善」は、より低い濃度の改変ヌクレオチドを基質として使用して改変ヌクレオチドを取り込むことができることであり得る。好ましくは、変化したポリメラーゼは、ナノモル範囲の基質濃度で作用させた場合に検出可能な改変ヌクレオチドの取り込みを示すべきである。
【００２１】
本明細書では、「変化したポリメラーゼ酵素」とは、ポリメラーゼが対照ポリメラーゼ酵素と比較して少なくとも１つのアミノ酸の変化を有することを意味する。一般に、この変化は、少なくとも１つのアミノ酸での別のアミノ酸の置換を含む。特定の例では、これらの変化は、タンパク質の全体的な電荷分布を維持するための保存的変化である。しかし、本発明は、保存的置換だけに限定されない。本発明では非保存的置換も想定されている。さらに、置換基が天然に存在する３’ヒドロキシル基よりも大きなサイズになるように、３’糖ヒドロキシルにおいて改変されたヌクレオチドの取り込みに関してポリメラーゼの活性が対照ポリメラーゼ酵素と比較して改善されるのであれば、ポリメラーゼ配列の改変はタンパク質からの１つもしくは複数のアミノ酸の欠失またはタンパク質への１つもしくは複数のアミノ酸の付加であってよいことは本発明の意図の範囲内にある。
【００２２】
本明細書では、「ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドおよびヌクレオシドのどちらも含むものと定義される。ヌクレオシドは、ヌクレオチドと同様にリボースまたはデオキシリボースとグリコシドにより連結したプリンまたはピリミジン塩基を含むが、リン酸残基を欠き、リン酸残基によりヌクレオシドがヌクレオチドになる。この定義の範囲には、３’糖ヒドロキシルにおける改変前の合成ヌクレオチドおよび天然に存在するヌクレオチドが含まれる。
【００２３】
ここで、および本明細書全体を通して、ポリメラーゼのアミノ酸配列内の変異は、以下の形式で書かれている（ｉ）野生型ポリメラーゼにおいて見出される１文字アミノ酸、（ｉｉ）ポリメラーゼのアミノ酸配列における変化の位置および（ｉｉｉ）変化したポリメラーゼにおいて見出される１文字アミノ酸。したがって、アミノ酸配列の４０９位における、野生型ポリメラーゼのチロシン残基から変化したポリメラーゼのバリン残基への変異は、Ｙ４０９Ｖと書かれる。これは分子生物学における標準手順である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＰＬＡ１５９およびＰＬＡ１６３変異体の、ＰＬＡ９１、ＰＬＡ９７およびＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＩＩポリメラーゼと比較したＧｅｌ分析。ＰＬＡ１５９がレーン４に示されており、ＰＬＡ１６３がレーン８に示されている。
【図２】ＣＥ−活性データ（標識化ヌクレオチド）：  Ｔ３および改変ＮＥＢ  ９°Ｎポリメラーゼ（本明細書ではＴ９と称される）と比較した、ＣＥ−アッセイにおけるＰＬＡ１５９およびＰＬＡ１６３の性能。本実験では、１μｇ／ｍｌの酵素および１２５ｎＭのＲ６Ｇ−Ｎ３−ｄＵＴＰを使用した。ＰＬＡ１５９およびＰＬＡ１６３は、標識化ヌクレオチドＲ６Ｇ−Ｎ３−ｄＵＴＰについてＴ９およびＴ３よりも高い取り込み率を示した。
【図３】Ｔ３およびＴ９と比較した、ＣＥ−アッセイにおけるＰＬＡ１５９およびＰＬＡ１６３の性能。本実験では、１μｇ／ｍｌの酵素および１２５ｎＭのＡｌｅｘａ−Ｎ３−ｄＣＴＰを使用した。ＰＬＡ１５９は、標識化ヌクレオチドＡｌｅｘａ−Ｎ３−ｄＣＴＰについてＴ９およびＴ３よりも高い取り込み率を示した。ＰＬＡ１６３はＴ９よりも高い取り込み率を示し、Ｔ３とは同様の取り込み率を示した。
【図４】Ｔ３およびＴ９と比較した、ＣＥ−アッセイにおけるＰＬＡ１５９およびＰＬＡ１６３の性能。本実験では、１μｇ／ｍｌの酵素および１２５ｎＭのＲＯＸ−Ｎ３−ｄＡＴＰを使用した。ＰＬＡ１５９およびＰＬＡ１６３は、標識化ヌクレオチドＲｏｘ−Ｎ３−ｄＡＴＰについてＴ９およびＴ３よりも高い取り込み率を示した。
【図５】Ｔ３およびＴ９と比較した、ＣＥ−アッセイにおけるＰＬＡ１５９およびＰＬＡ１６３の性能。本実験では、１μｇ／ｍｌの酵素および１２５ｎＭのＣｙ５−Ｎ３−ｄＧＴＰを使用した。ＰＬＡ１５９およびＰＬＡ１６３は、標識化ヌクレオチドＣｙ５−Ｎ３−ｄＧＴＰについてＴ９およびＴ３よりも高い取り込み率を示した。
【図６】Ｔ３およびＴ９と比較した、ＣＥ−アッセイにおけるＰＬＡ１５９およびＰＬＡ１６３の性能。本実験では、１μｇ／ｍｌの酵素および１２５ｎＭのＮ３−ｄＴＴＰを使用した。ＰＬＡ１５９は、ダークヌクレオチドＮ３−ｄＴＴＰについてＴ３よりも高い取り込み率を示した。
【図７】Ｔ３およびＴ９と比較した、ＣＥ−アッセイにおけるＰＬＡ１５９およびＰＬＡ１６３の性能。本実験では、１μｇ／ｍｌの酵素および１２５ｎＭのＮ３−ｄＡＴＰを使用した。ＰＬＡ１５９は、ダークヌクレオチドＮ３−ｄＡＴＰについてＴ９よりも高い取り込み率を示し、Ｔ３と比較して同様の取り込み率を示した。
【図８】Ｔ３およびＴ９と比較した、ＣＥ−アッセイにおけるＰＬＡ１５９およびＰＬＡ１６３の性能。本実験では、１μｇ／ｍｌの酵素および１２５ｎＭのＮ３−ｄＣＴＰを使用した。ＰＬＡ１５９は、ダークヌクレオチドＮ３−ｄＣＴＰについてＴ３よりも高い取り込み率を示した。ＰＬＡ１６３の取り込み率はＴ９よりも高く、Ｔ３とは同様であった。
【図９】Ｔ３およびＴ９と比較した、ＣＥ−アッセイにおけるＰＬＡ１５９およびＰＬＡ１６３の性能。本実験では、１μｇ／ｍｌの酵素および１２５ｎＭのＮ３−ｄＧＴＰを使用した。ＰＬＡ１５９は、ダークヌクレオチドＮ３−ｄＧＴＰについてＴ３よりも同様の取り込み率を示した。ＰＬＡ１６３の取り込み率はＴ９と同等であった。全てのポリメラーゼがＮ３−ｄＧＴＰについて高い取り込み率を示した。
【図１０Ａ】Ｔ３、Ｔ９、ＰＬＡ１５９およびＰＬＡ１６３のヌクレオチドの誤った取り込みの測定。各鋳型についてＣＥアッセイを用いて取り込みを決定した。
【図１０Ｂ】Ｔ３、Ｔ９、ＰＬＡ１５９およびＰＬＡ１６３のヌクレオチドの誤った取り込みの測定。各鋳型についてＣＥアッセイを用いて取り込みを決定した。
【図１０Ｃ】Ｔ３、Ｔ９、ＰＬＡ１５９およびＰＬＡ１６３のヌクレオチドの誤った取り込みの測定。各鋳型についてＣＥアッセイを用いて取り込みを決定した。
【図１０Ｄ】Ｔ３、Ｔ９、ＰＬＡ１５９およびＰＬＡ１６３のヌクレオチドの誤った取り込みの測定。各鋳型についてＣＥアッセイを用いて取り込みを決定した。
【図１１】種々のポリメラーゼおよび逆転写酵素と比較したＴ３活性。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明のポリメラーゼで実現された改変類似体の取り込み率の絶対的な上昇は予想外のものである。実施例から、既存の変異を有するポリメラーゼでもこれらの高い取り込み率は示されないことが示される。
【００２６】
本発明は、ファミリーＢポリメラーゼ酵素であって、以下の変異：ネイティブな形態では２番目のアミノ酸がチロシンであり、９°Ｎ内のアミノ酸４０８〜４１０と相同であるモチーフＡ領域における変異と、前記ファミリーＢポリメラーゼに存在する場合に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下または排除をもたらす変異とを含み、以下のモチーフＡ領域における変異：Ｌ４０８ＹもしくはＬ４０８Ｆおよび／またはＰ４１０ＳもしくはＰ４１０Ｇの一方または両方をさらに含む、ファミリーＢポリメラーゼ酵素に関する。これらの追加的な改変に関して、これらは交換することができ、したがって、酵素は、例えば、Ｌ４０８ＹおよびＰ４１０Ｓ、Ｌ４０８ＹおよびＰ４１０Ｇ、Ｌ４０８ＦおよびＰ４１０ＳまたはＬ４０８ＦおよびＰ４１０Ｇを有し得る。これらは、トレオニンがモチーフＡ領域の２番目のアミノ酸であり、モチーフＡ領域が９°Ｎ内のアミノ酸４０８〜４１０と相同である変異に加えたものであることが好ましい。
【００２７】
変化したポリメラーゼは、一般におよび好ましくは、「単離された」または「精製された」ポリペプチドである。「単離されたポリペプチド」とは、天然ではポリペプチドに付随し得る炭水化物、脂質、核酸または他のタンパク質性不純物などの混入細胞成分を実質的に含まないポリペプチドを意味する。本発明者らは精製のためにＨｉｓタグを使用したが、他の手段を使用することもできる。好ましくは、少なくとも変化したポリメラーゼは「組換え」ポリペプチドであり得る。
【００２８】
本発明による変化したポリメラーゼは、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ、またはその変異体もしくはバリアントであり得る。ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼとしては、多数の古細菌ＤＮＡポリメラーゼ、ヒトＤＮＡポリメラーゼαおよびＴ４、ＲＢ６９およびφ２９ファージＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ファミリーＡポリメラーゼとしては、ＴａｑおよびＴ７  ＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼが挙げられる。一実施形態では、ポリメラーゼは、任意のファミリーＢ古細菌ＤＮＡポリメラーゼ、ヒトＤＮＡポリメラーゼαまたはＴ４、ＲＢ６９およびφ２９ファージＤＮＡポリメラーゼから選択される。
【００２９】
好ましくは、ポリメラーゼは、変異Ｙ４０９Ｔを有する９°Ｎポリメラーゼ、変異Ｙ４１２Ｔを有するＶｅｎｔポリメラーゼ、変異Ｙ４１０Ｔを有するＰｆｕポリメラーゼ、変異Ｙ４０９Ｔを有するＪＤＦ−３ポリメラーゼおよび変異Ｅ６１５Ｔを有するＴａｑポリメラーゼからなる群から選択される。
【００３０】
理想的には、ポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼの以下の変異：Ｄ２１５Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ｄ１４１Ａおよび／またはＥ１４３Ａまたはこれらの組合せに対応する１つまたは複数の変異を含む。好ましい実施形態では、ポリメラーゼは、９°Ｎ  Ｄ１４１ＡおよびＥ１４３ＡまたはＤ２１５ＡおよびＤ３１５Ａに対応する変異を含む。
【００３１】
好ましくは、改変ポリメラーゼは、９°ＮポリメラーゼにおけるＡ４８５Ｌに対応する変異さらに含む。この変異は、ＶｅｎｔにおけるＡ４８８Ｌに対応する。
【００３２】
いくつかの他のグループがこの変異に関して発表している。
【００３３】
Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのＡ４８６Ｙバリアント（Evansら、Nucl.  Acids  Res.、２０００年；２８巻：１０５９頁）。一連のランダムな変異をポリメラーゼ遺伝子に導入し、ｄｄＮＴＰの取り込みが改善されたバリアントを同定した。Ａ４８６Ｙ変異により、シークエンシングラダーにおけるｄｄＮＴＰ／ｄＮＴＰの比が野生型と比較して１５０倍改善された。しかし、Ｙ４１０のＡまたはＦへの変異では、野生型酵素と比較して劣ったシークエンシングラダーがもたらされるバリアントが生じた；ＷＯ０１／３８５４６も参照されたい。
【００３４】
９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのＡ４８５Ｌバリアント（GardnerおよびJack、Nucl.  Acids  Res.、２００２年；３０巻：６０５頁）。この研究では、アミノ酸４８５におけるアラニンのロイシンへの変異により、３’糖ヒドロキシ部位を欠くヌクレオチド類似体（ａｃｙＮＴＰおよびジデオキシＮＴＰ）の取り込みが増強されることが実証された。
【００３５】
Ｔｓｐ  ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼのＡ４８５Ｔバリアント（Areziら、J.  Mol.  Biol.、２００２年；３２２巻：７１９頁）。この論文では、ＪＤＦ−３ポリメラーゼにランダムな変異を導入し、これにより、ｄｄＮＴＰの取り込みが増強されるバリアントが同定された。
【００３６】
ＷＯ０１／２３４１１には、ジデオキシヌクレオチドおよびアシクロヌクレオチドのＤＮＡへの取り込みにおけるＶｅｎｔのＡ４８８Ｌバリアントの使用が記載されている。この出願は、これらのヌクレオチド類似体および残基４８５において変異させた９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのバリアントを用いるシークエンシングの方法も網羅する。
【００３７】
理想的かつ好ましくは、酵素は、以下の変異のセット、（ｉ）Ｄ２１５Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ｌ４０８Ｙ、Ｙ４０９Ｔ、Ｐ４１０ＳおよびＡ４８５Ｌ、または（ｉｉ）Ｄ２１５Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ｌ４０８Ｆ、Ｙ４０９Ｔ、Ｐ４１０ＧおよびＡ４８５Ｌを有する。
【００３８】
好ましくは、ポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼマイナスであり、以下の変異：Ｌ４０８Ｙ、Ｙ４０９Ｔ、Ｐ４１０ＳおよびＡ４８５Ｌ、またはＬ４０８Ｆ、Ｙ４０９Ｔ、Ｐ４１０ＧおよびＡ４８５Ｌを有する。
【００３９】
本発明は、対照ポリメラーゼと比較して、置換基が天然に存在する３’ヒドロキシル基よりも大きなサイズになるように、３’糖ヒドロキシルにおいて改変されたヌクレオチドの取り込み率の増大を示す、本明細書に示されている変異を有するポリメラーゼに関する。
【００４０】
そのようなヌクレオチドは、ＷＯ２００４０１８４９７Ａ２に開示されている。ここでは、プリンまたはピリミジン塩基、および除去可能な３’−ＯＨブロッキング基が共有結合により付着し、したがって、３’炭素原子に構造：−Ｏ−Ｚ（式中、Ｚは−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’’）２’Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｈ）Ｒ’’および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ３のいずれかであり、各Ｒ’’は、除去可能な保護基またはその一部であり、各Ｒ’は、独立に、水素原子、アルキル、置換アルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環式、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシもしくはアミド基、もしくは連結基を通じて付着した検出可能な標識である、または（Ｒ’）２は式＝Ｃ（Ｒ’’’）２のアルキリデン基であり、各Ｒ’’’は同じであっても異なってもよく、水素原子およびハロゲン原子ならびにアルキル基を含む群から選択され、前記分子は、各Ｒ’’がＨに交換された中間体が生じるように反応し得、その中間体が水性条件下で解離して、遊離の３’−ＯＨを有する分子がもたらされる）の基が付着したリボースまたはデオキシリボース糖部分を含む改変ヌクレオチド分子が開示されている。
【００４１】
本発明は、本発明によるポリメラーゼをコードする核酸分子、および前記核酸分子を含む発現ベクターにも関する。
【００４２】
本発明は、置換基が天然に存在する３’ヒドロキシル基よりも大きなサイズになるように、３’糖ヒドロキシルにおいて改変されたヌクレオチドをＤＮＡに取り込むための方法であって、以下の物質（ｉ）請求項１から７のいずれか一項に記載のポリメラーゼ、（ｉｉ）鋳型ＤＮＡ、（ｉｉｉ）置換基が天然に存在する３’ヒドロキシル基よりも大きなサイズになるように、３’糖ヒドロキシルにおいて改変された１つまたは複数のヌクレオチドを含む方法にも関する。
【００４３】
本発明は、核酸標識化またはシークエンシングなどの方法における本発明によるポリメラーゼの使用にも関する。本発明のポリメラーゼは、シークエンシング反応、ポリヌクレオチド合成、核酸増幅、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、一塩基多型研究、および他のそのような技法を含めた、ヌクレオチドのポリヌクレオチドへの取り込みが必要とされる様々な技法において有用である。本発明の改変ポリメラーゼを利用するすべてのそのような使用および方法は本発明の範囲内に含まれる。
【００４４】
シークエンシングでは、３’ブロックを有するヌクレオチドの使用により、連続的なヌクレオチドをポリヌクレオチド鎖に制御された様式で取り込むことが可能になる。各ヌクレオチド付加後、３’ブロックが存在することにより、さらなるヌクレオチドの鎖への取り込みが妨げられる。取り込まれたヌクレオチドの性質が決定されたら、保護を除去し、次のヌクレオチドの付加のために遊離の３’ヒドロキシル基を残すことができる。ＤＮＡの合成によるシークエンシングには、理想的には、シークエンシングされるオリゴヌクレオチドに対して正しい相補的ヌクレオチドの制御された（すなわち１回に１つの）取り込みが必要である。これにより、各ヌクレオチド残基が１回に１つずつシークエンシングされ、したがって、制御されていない一連の取り込みが起こるのが妨げられるので、ヌクレオチドを多数のサイクルで付加することによる正確なシークエンシングが可能になる。取り込まれたヌクレオチドを、標識部分の除去およびその後のシークエンシングの次のラウンドの前に、それに付着させた適切な標識を使用して読み取る。単一の取り込みのみが起こるのを確実にするために、一塩基取り込みを確実にするためにシークエンシングヌクレオチドの構造的修飾（「ブロッキング基」）が必要であるが、それによりその後あらゆるさらなるヌクレオチドのポリヌクレオチド鎖への取り込みが妨げられる。ブロッキング基はその後に、シークエンシングされるＤＮＡの完全性に干渉しない反応条件下で除去可能でなければならない。その後、次の保護された標識化ヌクレオチドの取り込みでシークエンシングサイクルを継続することができる。実用的使用のためには、多数のシークエンシングのサイクルを容易にするためにプロセス全体が高収率の高度に特異的な化学的および酵素的ステップからなるべきである。ＤＮＡシークエンシングにおいて有用であるためには、ヌクレオチド、より通常には、ヌクレオチド三リン酸は、一般に、ポリヌクレオチド鎖への取り込みのために使用されるポリメラーゼがヌクレオチド上の塩基が付加されたら複製し続けることを妨げるために、３’−ＯＨブロッキング基を必要とする。シークエンシング反応のためのＤＮＡ鋳型は、一般には、シークエンシング反応においてさらなるヌクレオチドを付加するためのプライマーまたは開始点としての機能を果たす遊離の３’ヒドロキシル基を有する二本鎖領域を含む。シークエンシングされるＤＮＡ鋳型の領域は、相補鎖のこの遊離の３’ヒドロキシル基にオーバーハングする。シークエンシングされる鋳型の領域とハイブリダイズする遊離の３’ヒドロキシル基を有するプライマーを別の成分（例えば、短いオリゴヌクレオチド）として付加することができる。あるいは、シークエンシングされるプライマーおよび鋳型鎖は、それぞれ、例えばヘアピンループ構造などの分子内二重鎖を形成することができる部分的に自己相補的な核酸鎖の部分に由来するものであってよい。ヌクレオチドが連続的に遊離の３’ヒドロキシル基に付加され、その結果、ポリヌクレオチド鎖が５’から３’の方向に合成される。各ヌクレオチド付加後、付加された塩基の性質を決定し、したがって、ＤＮＡ鋳型に関する配列情報をもたらす。
【００４５】
そのようなＤＮＡシークエンシングは、改変ヌクレオチドが鎖ターミネーターとしての機能を果たし得る場合に可能であり得る。改変ヌクレオチドが、シークエンシングされる鋳型の領域と相補的な、伸長中のポリヌクレオチド鎖（growing  polynucleotide  chain）に取り込まれたら、さらなる配列伸長を導くために遊離の３’−ＯＨ基を利用することはできなくなり、したがって、ポリメラーゼはさらなるヌクレオチドを付加することができない。伸長中の鎖に取り込まれた塩基の性質が決定されたら、３’ブロックを除去して次の連続的なヌクレオチドの付加を可能にすることができる。これらの改変ヌクレオチドを使用して導出された産物を順序付けることにより、ＤＮＡ鋳型のＤＮＡ配列を推定することが可能である。そのような反応は、改変ヌクレオチドのそれぞれに、各取り込みステップで付加される塩基間の識別を容易にするために、特定の塩基に対応することが公知の異なる標識を付着させれば、単一の実験において行うことができる。あるいは、改変ヌクレオチドのそれぞれを別々に含有する別々の反応を行うことができる。
【００４６】
好ましい実施形態では、改変ヌクレオチドは、それらの検出を容易にするための標識を有する。好ましくは、これは蛍光標識である。各ヌクレオチド型は、異なる蛍光標識を有してよい。しかし、検出可能な標識は蛍光標識である必要はない。ヌクレオチドのＤＮＡ配列への取り込みの検出を可能にする任意の標識を使用することができる。
【００４７】
本発明の第２の態様および第３の態様における使用に適した、蛍光標識されたヌクレオチドを検出するための１つの方法は、標識化ヌクレオチドに特異的な波長のレーザー光の使用または他の適切な照明の供給源の使用を含む。
【００４８】
一実施形態では、ヌクレオチド上の標識からの蛍光は、ＣＣＤカメラによって検出することができる。
【００４９】
好ましくは、ＤＮＡ鋳型を表面上に固定化する場合、高密度アレイが形成されるように表面上に固定化する。最も好ましくは、本発明の出願人らによって開発された技術によると、高密度アレイは、アレイ上の検出可能な別個の部位のそれぞれに単一のＤＮＡ分子が存在する単一分子アレイを含む。光学的手段によって個別に分解可能な核酸分子で構成される単一分子アレイ、およびシークエンシングにおけるそのようなアレイの使用は、例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ００／０６７７０に記載されている。ヘアピンループ構造を含めた個別に分解可能な核酸分子で構成される単一分子アレイは、同じくその内容が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０１／５７２４８に記載されている。本発明のポリメラーゼは、ＷＯ００／０６７７０またはＷＯ０１／５７２４８の開示に従って調製された単一分子アレイと併せて使用するのに適している。しかし、本発明の範囲は、ポリメラーゼと単一分子アレイを併せて使用することに限定されるものではないことが理解されるべきである。単一分子アレイに基づくシークエンシング方法は、蛍光標識された改変ヌクレオチドおよび変化したポリメラーゼを単一分子アレイに付加することによって機能させることができる。相補的ヌクレオチドは、各ヌクレオチド断片の第１の塩基と対合する塩基であり、改善されたポリメラーゼ酵素によって触媒される反応においてプライマーに付加される。残った遊離のヌクレオチドを除去する。次いで、各改変ヌクレオチドに対して特異的な波長のレーザー光により、取り込まれた改変ヌクレオチド上の適切な標識を励起させ、それにより標識の蛍光を導く。この蛍光を、アレイ全体をスキャンすることが可能な適切なＣＣＤカメラによって検出して、各断片に取り込まれた改変ヌクレオチドを同定することができる。したがって、数百万の部位を並行して潜在的に検出することができる。次いで、蛍光を除去することができる。取り込まれた改変ヌクレオチドの同一性により、対合する試料配列内の塩基の同一性が明らかになる。次いで、取り込み、検出および同定のサイクルをおよそ２５回繰り返して、検出可能である、アレイに付着した各オリゴヌクレオチド断片の最初の２５塩基を決定する。したがって、検出可能であるアレイ上の全ての分子を同時にシークエンシングすることにより、アレイに単一コピーで付着した数億のオリゴヌクレオチド断片について最初の２５塩基を決定することができる。明らかに、本発明は、２５塩基のシークエンシングに限定されない。必要な配列情報の詳細さのレベルおよびアレイの複雑さに応じて、さらに多くのまたは少ない塩基をシークエンシングすることができる。適切なバイオインフォマティクスプログラムを使用して、生成した配列をアラインメントし、特定の参照配列と比較することができる。これにより、例えば一塩基多型（ＳＮＰ）などの、任意の数の公知のおよび未知の遺伝的変異の決定が可能になる。本発明の変化したポリメラーゼの有用性は、単一分子アレイを使用したシークエンシング適用に限定されない。ポリメラーゼは、ヌクレオチドをポリヌクレオチド鎖に取り込むためにポリメラーゼの使用を必要とする任意の型のアレイに基づく（特に、任意の高密度アレイに基づく）シークエンシング技術、特に、３’ブロッキング基などの大きな３’置換基（天然のヒドロキシル基よりも大きい）を有する改変ヌクレオチドの取り込みに依拠する任意のアレイに基づくシークエンシング技術と併せて使用することができる。本発明のポリメラーゼは、固体支持体上への核酸分子の固定化によって形成される実質的に任意の型のアレイでの核酸シークエンシングのために使用することができる。単一分子アレイに加えて、適切なアレイとして、例えば、アレイ上の別個の領域が１つの個別のポリヌクレオチド分子の多数のコピー、またはさらには少数の異なるポリヌクレオチド分子の多数のコピー（例えば、２つの相補的な核酸鎖の多数のコピー）を含む、複数のポリヌクレオチドアレイまたはクラスター化アレイを挙げることができる。具体的には、その内容が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ９８／４４１５２に記載されている核酸シークエンシング方法において、本発明のポリメラーゼを利用することができる。この国際出願には、固体支持体上の別個の位置にある多数の鋳型の並行シークエンシングの方法が記載されている。この方法は、標識化ヌクレオチドのポリヌクレオチド鎖への取り込みに依拠する。その内容が参照により本明細書に組み込まれる国際出願ＷＯ００／１８９５７に記載されている方法において、本発明のポリメラーゼを使用することができる。この出願には、核酸コロニーの形成によって多数の別個の核酸分子を同時に高密度でアレイおよび増幅し、その後、核酸コロニーをシークエンシングする、固相核酸増幅およびシークエンシングの方法が記載されている。この方法のシークエンシングステップにおいて、本発明の変化したポリメラーゼを利用することができる。核酸分子の複数のポリヌクレオチドアレイまたはクラスター化アレイは、当技術分野で公知の技法を使用して生成することができる。例として、ＷＯ９８／４４１５１およびＷＯ００／１８９５７のどちらにも、固定化された核酸分子のクラスターまたは「コロニー」で構成されるアレイを形成するために増幅産物を固体支持体上に固定化することが可能になる核酸増幅の方法が記載されている。クラスター化アレイの調製、およびそのようなアレイの核酸シークエンシング用の鋳型としての使用に関するＷＯ９８／４４１５１およびＷＯ００／１８９５７の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。これらの方法に従って調製したクラスター化アレイ上に存在する核酸分子は、本発明のポリメラーゼを使用してシークエンシングするための適切な鋳型である。しかし、本発明は、これらの特定の方法に従って調製したクラスター化アレイ上で行われるシークエンシング反応におけるポリメラーゼの使用を意図するものではない。本発明のポリメラーゼは、さらに、Mitraら（Analytical  Biochemistry、２００３年；３２０巻：５５頁）に記載されているものなどの蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕシークエンシングの方法においても使用することができる。
【００５０】
さらに、別の態様では、本発明は、（ａ）本発明によるポリメラーゼ、ならびに任意選択で、本発明の複数の異なる個々のヌクレオチドおよび／またはその包装材料を含むキットを提供する。
【実施例】
【００５１】
種々の９°Ｎ変異体を生成した。驚くべきことに、この手法では、改変ヌクレオチドについて例外的に良好な取り込み率を示す２種の変異体が見出された。ポリメラーゼのアミノ酸配列は、以下の置換変異を含む：
ＰＬＡ１５９［配列番号２］：
Ｄ２１５Ａ／Ｄ３１５Ａ／Ｌ４０８Ｙ／Ｙ４０９Ｔ／Ｐ４１０Ｓ／Ａ４８５Ｌ／Ｃ末端Ｈｉｓタグ
ＰＬＡ１６３［配列番号４］：
Ｄ２１５Ａ／Ｄ３１５Ａ／Ｌ４０８Ｆ／Ｙ４０９Ｔ／Ｐ４１０Ｇ／Ａ４８５Ｌ／Ｃ末端Ｈｉｓタグ
【００５２】
以下の表１は、本研究において開発された合成ポリメラーゼによる新しいシークエンシングを示す。２列目〜５列目には、以前から市販されている９°ＮポリメラーゼバリアントＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＩＩポリメラーゼ（本明細書ではＴ３とも称される）と比較したそれらのアミノ酸配列内の変化が記載されている：
【表Ａ】
2018530320.tif 000002
【００５３】
変異体の精製
Ｈｉｓタグを付けた変異体ポリメラーゼをＮｉ−ＮＴＡ−スーパーフローカラムによって分取スケールで精製した。変異体は、ＳＤＳ−Ｇｅｌ分析によると、９９％純粋であった（図１）。
【００５４】
一塩基取り込みアッセイ（ＣＥ−アッセイ）
異なるポリメラーゼ変異体の、標識化ヌクレオチド（＝ヌクレオチド＋ブロッキング基＋リンカー−フルオロフォア基）を取り込む能力を測定するために、一塩基取り込みアッセイを実施した。
【００５５】
標識化ユニバーサルプライマーおよび４種の標識されていない鋳型（それぞれが４種の標識化ヌクレオチドのうちの１つまたは４種のダークヌクレオチド（＝ヌクレオチド＋ブロッキング基）のうちの１つを試験するためのものである）を伸長反応に使用した。それぞれ２４塩基対および１８塩基対のハイブリダイズした鋳型プライマー対を２：１の比で使用した。酵素またはヌクレオチドのいずれかを反応に添加することによって反応を開始した。標識化プライマーの３’末端における一塩基伸長を１２０秒の時間枠にわたって既定の間隔で測定し、キャピラリー電気泳動アナライザーを用いて分析した。伸長したプライマーおよび伸長しなかったプライマーの量を電気泳動図の蛍光ピーク面積によって算出し、比を時間に対してプロットした。
【００５６】
Ｔ３およびＴ９と比較した、ＰＬＡ１５９およびＰＬＡ１６３の標識化ヌクレオチドおよびダークヌクレオチドの取り込みに関する詳細なデータが図２〜９に示されている。
【００５７】
全てのポリメラーゼが、標識化ヌクレオチドで良好な取り込み性能を示した。全てのヌクレオチドでＰＬＡ１５９の取り込み率が最も高かった。Ｔ３参照よりもはるかに高かった。概して、ＣＥ−アッセイにおける新しいポリメラーゼ変異体の性能ははるかに良好であった。
【００５８】
マッチするヌクレオチドの添加を伴わないエキソヌクレアーゼ活性
エキソヌクレアーゼ活性を測定するために、１２．５ｎＭのＦＡＭ標識化プライマーを２５ｎＭの鋳型ＤＮＡとアニーリングさせた。アニーリングステップ後にポリメラーゼを鋳型／プライマー混合物に添加した。反応混合物を、ヌクレオチドの添加を伴わずに６５℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション期間後、反応産物をキャピラリー電気泳動によって分析した。分解されたオリゴヌクレオチドと分解されなかったオリゴヌクレオチドはサイズが異なる（分解されなかったオリゴヌクレオチドのピークサイズ：７〜７．２；分解されたオリゴヌクレオチドのピークサイズ：＜７）。サイズの異なるピークの蛍光ピーク面積を利用して、分解されたプライマーの量を算出した。
【００５９】
Ｔ３およびＴ９と同様に、変異体ポリメラーゼであるＰＬＡ１５９およびＰＬＡ１６３はどちらも、ＦＡＭプライマーピークよりも小さなピークを検出することができなかった通り、検出可能なエキソヌクレアーゼ活性を示さなかった。
【表１】
2018530320.tif 000003
【００６０】
マッチするヌクレオチドを用いた誤った取り込み
実験的セットアップにおいて、酵素を鋳型−プライマー混合物および４種のヌクレオチド（マッチしないヌクレオチド３種およびマッチするヌクレオチド１種）と一緒にインキュベートした。ＧｅｎｅＲｅａｄｅｒ実行の伸長期の間のヌクレオチドの取り込みのために与えられた時間枠である２分後、および３０分後に取り込みを測定した（図１０）。ＰＬＡ１５９およびＰＬＡ１６３をＴ３およびＴ９と比較した。ミスマッチ取り込みにより、シークエンシング性能が妨害される可能性があるので、ミスマッチ取り込みがほとんどないか全くないポリメラーゼをシークエンシングのために選択するべきである。
【００６１】
ＰＬＡ１５９およびＰＬＡ１６３では、３０分後にミスマッチ取り込みが示されるのみであり、誤った取り込み率は、Ｔ３およびＴ９参照とほぼ同等であった。
【００６２】
ＰＬＡ１５９では、３０分後に鋳型Ａおよび鋳型Ｃに関して些細なミスマッチ取り込みが示された（それぞれ０，０２７および０，０１３）。ＰＬＡ１６３についてのミスマッチ取り込みは鋳型Ｔに関してのみ測定された（０，０４３）。
【００６３】
陽性対照Ｔ３およびＴ９でも低レベルのミスマッチ取り込みが示された。Ｔ３については、２分のインキュベーション後にすでにミスマッチ取り込みが鋳型Ｔおよび鋳型Ｃについて検出された（０，００７および０，００９）。率は３０分後にわずかに上昇した（０，０１２および０，０２３）。Ｔ９についてのミスマッチ取り込みは３０分のインキュベーション後にのみ鋳型Ｃについて検出された（０，０３４）。どちらのポリメラーゼもシークエンシングポリメラーゼとして使用されるので、これらの低レベルの誤った取り込みは、シークエンシング反応には影響を及ぼさないと思われる。したがって、ＰＬＡ１５９およびＰＬＡ１６３に関して測定された低レベルの誤った取り込みは、いかなるシークエンシング反応も妨害するではないことが想定される。ＰＬＡ１５９およびＰＬＡ１６３の潜在的なミスマッチ取り込みは些細なものであり、シークエンシング反応に対して負の影響を及ぼす可能性は低い。
【００６４】
どちらの変異体も、標識化ヌクレオチドおよびダークヌクレオチドについて優れた取り込み率を示し、次世代シークエンシングのような、改変ヌクレオチドが使用される適用に使用することができる。エキソヌクレアーゼ活性ならびにミスマッチ取り込みはどちらもシークエンシング反応についての酵素の適用性に影響を及ぼす可能性があるので、どちらもＴ３およびＴ９と比較して評価した。本発明者らのデータから、ＰＬＡ１５９およびＰＬＡ１６３はミスマッチ取り込みの増大もエキソヌクレアーゼ活性の増大も示さないことが示される。
【００６５】
合成ポリメラーゼによる新しいシークエンシングについて、性能データを鑑み、全ての要求を考慮して（活性、ミスマッチ取り込み、エキソヌクレアーゼ活性）、ポリメラーゼ、ＰＬＡ１５９およびＰＬＡ１６３はどちらも、当技術分野で公知のポリメラーゼよりも優れている。
【００６６】
いくつかの野生型ポリメラーゼおよび逆転写酵素とＴ３の比較
標識化ヌクレオチドについてのＴ３の取り込み活性を異なるポリメラーゼおよび逆転写酵素と比較した。Ｔ３（９°Ｎ  ｅｘｏ−／Ｌ４０８Ｓ／Ｙ４０９Ａ／Ｐ４１０Ｖ）と９°Ｎ野生型ポリメラーゼＲｏｘ−Ｎ３−ｄＡＴＰのｅｘｏ−バリアントの比較を使用した（図１１、黒棒）。Ｔ３ポリメラーゼを、他の、単一の変異を有する９°Ｎ  ｅｘｏ−変異体（Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒポリメラーゼ；変異Ａ４８５Ｌ）または２つの変異を有する９°Ｎ  ｅｘｏ−変異体（ＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒポリメラーゼＬ４０８Ｑ）、ならびに単一の変異を有するＫＯＤ  ｅｘｏ−変異体（Ｌ４０８Ｑ）、野生型Ｔａｑ−ポリメラーゼ、ＱｉａｇｅｎからのＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ、およびＥｎｚｙｍａｔｉｃｓにより販売されているｅｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼとも比較した。これらの酵素とＴ３ポリメラーゼの比較のために、Ｒ６Ｇ−Ｎ３−ｄＵＴＰを使用した（黒色／白棒）。さらに、種々の市販のＲＴ酵素を、Ｃｙ５−Ｎ３−ｄＧＴＰを使用してＴ３と比較した（白棒）。
【００６７】
試験した酵素の全てが、それぞれの実験において使用した改変ヌクレオチドで取り込み活性を示さなかった。したがって、これらの変異単独では試験した改変ヌクレオチドの取り込みはブーストされない。
【００６８】
結論：Ｔａｑ−ポリメラーゼのような野生型酵素、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ、他の逆転写酵素、単一の変異Ｌ４０８Ｑを有する９°ＮまたはＫＯＤポリメラーゼのｅｘｏ−バリアントは、試験した標識化ヌクレオチドに対して検出可能な取り込み活性を示さない。
【００６９】
アッセイ条件：
ポリメラーゼ：１μｇ／ｍｌ
ヌクレオチド濃度：１２５ｎＭ
鋳型：２５ｎＭ
プライマー：１２，５ｎＭ
インキュベート時間：２分
温度：６５℃
【００７０】
分析したポリメラーゼ：
【表２】
2018530320.tif 000004
【００７１】
酵素配列
【表３−１】
2018530320.tif 000005
【表３−２】
2018530320.tif 000006
【表３−３】
2018530320.tif 000007
【図１】
2018530320.tif 000008
【図２】
2018530320.tif 000009
【図３】
2018530320.tif 000010
【図４】
2018530320.tif 000011
【図５】
2018530320.tif 000012
【図６】
2018530320.tif 000013
【図７】
2018530320.tif 000014
【図８】
2018530320.tif 000015
【図９】
2018530320.tif 000016
【図１０Ａ】
2018530320.tif 000017
【図１０Ｂ】
2018530320.tif 000018
【図１０Ｃ】
2018530320.tif 000019
【図１０Ｄ】
2018530320.tif 000020
【図１１】
2018530320.tif 000021
【配列表】
2018530320000001.app
【国際調査報告】
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2018530320.tif 000023
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