(57)【要約】  アミロイド形成ペプチド生体特異性薬剤は、近赤外（ＮＩＲ）下で、ならびに／または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）及び／もしくはコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）を用いて可視であるナノ粒子を含む。生体特異性薬剤は、トランスフェリン受容体及びアミロイド形成ペプチドに対して免疫特異的である少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントをさらに含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
近赤外（ＮＩＲ）下で、ならびに／または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）及び／もしくはコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）を用いて可視であるナノ粒子と、トランスフェリン受容体及びアミロイド形成ペプチドに対して免疫特異的である少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントと、を含む、アミロイド形成ペプチド生体特異性薬剤。
【請求項２】
前記少なくとも１つの抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ抗アミロイド形成ペプチド抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項１に記載の生体特異性薬剤。
【請求項３】
前記少なくとも１つの抗体または抗原結合フラグメントは、前記アミロイド形成ペプチドのオリゴマー及び原線維に特異的に結合するが、アミロイド形成ペプチドプラークまたはペプチドモノマーには特異的に結合しない、請求項１または２のいずれかに記載の生体特異性薬剤。
【請求項４】
前記アミロイド形成ペプチドに対する前記少なくとも１つの抗体または抗原結合フラグメントを作製するために使用される免疫原配列は、Ａβのアミノ酸配列、またはその変異体もしくはフラグメント、好ましくは部分的に凝集した配列番号１を含むか、またはそれからなる、請求項１〜３のいずれかに記載の生体特異性薬剤。
【請求項５】
前記アミロイド形成ペプチドに対する前記少なくとも１つの抗体または抗原結合フラグメントを作製するために使用される免疫原配列は、ハンチンチンのアミノ酸配列、またはその変異体もしくはフラグメント、好ましくは部分的に凝集した配列番号２を含むか、またはそれからなる、請求項１〜４のいずれかに記載の生体特異性薬剤。
【請求項６】
前記アミロイド形成ペプチドに対する前記少なくとも１つの抗体または抗原結合フラグメントを作製するために使用される免疫原配列は、α−シヌクレインのアミノ酸配列、またはその変異体もしくはフラグメント、好ましくは部分的に凝集した配列番号３を含むか、またはそれからなる、請求項１〜５のいずれかに記載の生体特異性薬剤。
【請求項７】
前記アミロイド形成ペプチドに対する前記少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントの解離定数値は、約１０−５〜１０−１３Ｍ、または１０−６〜１０−９Ｍ、または１０−１０〜１０−１２Ｍである、請求項１〜６のいずれかに記載の生体特異性薬剤。
【請求項８】
前記少なくとも１つの抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＭ抗トランスフェリン受容体抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の生体特異性薬剤。
【請求項９】
前記トランスフェリン受容体に対する前記少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントの解離定数値は、１×１０−４Ｍ以上または１×１０−３Ｍ以上である、請求項１〜８のいずれかに記載の生体特異性薬剤。
【請求項１０】
前記トランスフェリン受容体に対する少なくとも１つの抗体または抗原結合フラグメントを作製するために使用される免疫原配列は、配列番号４またはその変異体もしくはフラグメントを含むか、またはそれからなる、請求項１〜９のいずれかに記載の生体特異性薬剤。
【請求項１１】
前記生体特異性薬剤は、トランスフェリン受容体に対する免疫特異性を有する複数の抗体またはその抗原結合フラグメントと、アミロイド形成ペプチドに対する免疫特異性を有する複数の抗体またはその抗原結合フラグメントと、を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の生体特異性薬剤。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の生体特異性薬剤。
【請求項１３】
前記抗原結合フラグメントは、ＶＨ、ＶＬ、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｃフラグメントからなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれかに記載の生体特異性薬剤。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントは、トランスフェリン受容体に対して免疫特異的であるＦａｂ’フラグメントを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の生体特異性薬剤。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントは、アミロイド形成ペプチドに対して免疫特異的なＦａｂ’フラグメントを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載に記載の生体特異性薬剤。
【請求項１６】
前記Ｆａｂ’フラグメントは、アミロイド形成ペプチドのオリゴマー及び原繊維に特異的に結合するが、アミロイド形成ペプチドプラークまたはモノマーには特異的に結合しない、請求項１５に記載の生体特異性薬剤。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントは、アミロイド形成ペプチド及びトランスフェリン受容体に免疫特異的な二重特異性Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを含む、請求項１〜１６のいずれかに記載に記載の生体特異性薬剤。
【請求項１８】
前記二重特異性Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、アミロイド形成ペプチドに対して免疫特異性を示す第２のＦａｂ’フラグメントにコンジュゲートされるトランスフェリン受容体に対して免疫特異性を示す第１のＦａｂ’フラグメントを含む、請求項１７に記載の生体特異性薬剤。
【請求項１９】
前記ナノ粒子が、近赤外下で可視である内部コアを含み、前記コアがカドミウムまたは鉛を含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の生体特異性薬剤。
【請求項２０】
前記コアは、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＣｄＳ、ＰｂＳ、及びＰｂＳｅから選択される材料を含む、請求項１９に記載の生体特異性薬剤。
【請求項２１】
前記コアは、ＣｄＳｅを含む、請求項２０に記載の生体特異性薬剤。
【請求項２２】
前記ナノ粒子は、前記コアを取り囲むカドミウムまたは亜鉛シェルを含む、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の生体特異性薬剤。
【請求項２３】
前記シェルは、ＺｎＳまたはＣｄＳを含む、請求項２２に記載の生体特異性薬剤。
【請求項２４】
前記シェルは、ＺｎＳを含む、請求項２３に記載の生体特異性薬剤。
【請求項２５】
前記ナノ粒子は、ＭＲＩまたはＣＴを用いて可視である造影剤を含む、請求項１〜２４のいずれかに記載の生体特異性薬剤。
【請求項２６】
前記造影剤は、前記シェルをカプセル化する、請求項２５に記載の生体特異性薬剤。
【請求項２７】
前記造影剤は、ガドリニウム、金、ヨウ素、またはボロ硫酸（ｂｏｒｏ−ｓｕｌｐｈａｔｅ）を含む、請求項２５または請求項２６に記載の生体特異性薬剤。
【請求項２８】
前記造影剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（すなわち、ＤＯＴＡ）を含む、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の生体特異性薬剤。
【請求項２９】
前記造影剤は、カルボキシル官能化を可能にするように構成され、それによって前記少なくとも１つの抗体またはその抗原フラグメントがそれにコンジュゲートされ得る、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の生体特異性薬剤。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントは、カルボジイミド化学作用を用いて前記造影剤に共有結合している、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の生体特異性薬剤。
【請求項３１】
複数の抗体またはその抗原結合フラグメントが、造影剤層の外面を覆う相隔たるアレイに配置される、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の生体特異性薬剤。
【請求項３２】
診断に使用するための、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のアミロイド形成ペプチド生体特異性薬剤。
【請求項３３】
ＮＩＲ生体標識、ＭＲＩ生体標識、またはＣＴ生体標識としての、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のアミロイド形成ペプチド生体特異性薬剤の使用。
【請求項３４】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載のアミロイド形成ペプチド生体特異性薬剤を含む生体標識。
【請求項３５】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載のアミロイド形成ペプチド生体特異性薬剤の使用を含む、ＮＩＲ、ＭＲＩまたはＣＴ画像検査法。
【請求項３６】
アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動ニューロン疾患、脊髄小脳１型、２型及び３型、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び前頭側頭型認知症からなる群から選択される神経変性障害の診断に使用するための、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の薬剤、使用、生体標識または画像検査法。
【請求項３７】
神経変性障害に罹患しているもしくはその素因を有する対象を診断するための、または前記対象の状態の予後を提供するためのキットであって、前記キットが試験対象由来の生体試料中に存在するアミロイド形成ペプチドの濃度を検出するように構成された、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の生体特異性薬剤を含み、前記試料中のペプチドの存在が、前記対象が神経変性障害に罹患していることを提示する、キット。
【請求項３８】
神経変性障害に罹患しているもしくはその素因を有する対象を診断する、または前記対象の状態の予後を提供する方法であって、前記方法は、対象から得られた生体試料中に存在するアミロイド形成ペプチドの濃度を検出することを含み、前記検出は請求項１〜３１のいずれか１項に記載の生体特異性薬剤を用いて達成され、前記試料中の抗原の存在が、前記対象が神経変性障害に罹患していることを提示する、方法。
【請求項３９】
治療に使用するための、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のアミロイド形成ペプチド生体特異性薬剤。
【請求項４０】
神経変性障害を治療、改善または予防するのに使用するための、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のアミロイド形成ペプチド生体特異性薬剤。
【請求項４１】
神経変性障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病，運動ニューロン疾患、脊髄小脳１型、２型及び３型、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及び前頭側頭型認知症からなる群から選択され、好ましくはアルツハイマー病である、請求項４０に記載の使用のための薬剤。
【請求項４２】
前記神経変性障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病または運動ニューロン疾患からなる群から選択される、請求項４１に記載の使用のための薬剤。
【請求項４３】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の生体特異性薬剤と、場合により薬学的に許容されるビヒクルと、を含む、薬学的組成物。
【請求項４４】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の生体特異性薬剤の治療有効量を薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせることを含む、請求項４３に記載の薬学的組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性障害、特に、アルツハイマー病、パーキンソン病及びハンチントン病を含む、そのような状態を診断及び治療するための新規な組成物、治療法及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
「神経変性」という用語は、ニューロンの構造及び／または機能の進行性喪失に対して広く使用されている。アルツハイマー病、パーキンソン病及びハンチントン病を含む多くの神経変性疾患は、神経変性過程の結果として起こり、現在のところ不治であり、結果としてニューロンの進行性変性及び／または死をもたらす。多くの神経変性疾患に関連する共通の特徴は、それらがすべて、特定の構造的特徴を共有する繊維状タンパク質凝集体であるアミロイドの蓄積を伴うことである。アミロイドは不溶性であり、体内に天然に存在するタンパク質及びポリペプチドの少なくとも１８個の不適切にフォールドされたバージョンから生じる。これらのミスホールドされた構造は、互いに、または他の細胞成分と、誤って相互作用して不溶性原線維を形成するように、それらの適切な配置を変更する。これまで、器官におけるアミロイド原線維の異常な蓄積がアミロイドーシスを引き起こし得るという点で、アミロイドは２０を超える重篤なヒト疾患の病理に関連している。
【０００３】
アルツハイマー病は、例えば、細胞外アミロイドプラークにおけるアミロイドベータ（Ａβ）の沈着ならびに脳内の神経原線維変化におけるタウの細胞内蓄積を特徴とする。Ａβ及びアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の突然変異は家族性アルツハイマー病に関連しており、したがってＡβは疾患過程において重要な役割を果たすと考えられている。Ａβファミリーの特定のメンバーは、有毒であり、最も顕著にＡβオリゴマーであり、膜欠陥、神経細胞死及び機能への影響を引き起こし、動物の行動及びニューロンネットワークの変化をもたらすことが示されている。Ａβペプチドは、アミロイド形成ペプチド及びタンパク質のより大きな群のメンバーであり、これらのアミロイド形成ペプチドの毒性作用は、自己集合してβシートリッチオリゴマー種及びクロスβ構造アミロイド原線維を形成する能力に関連すると考えられている。パーキンソン病及びハンチントン病に関与するアミロイドベースのペプチドは、それぞれα−シヌクレイン及びハンチンチンである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｃｏａｔｅｄ  ＣｄＳｅ／ＣｄＳ  Ｃｏｒｅ／Ｓｈｅｌｌ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓ，（Ｙａｎｇ  Ｘｕ，Ｄｒ．Ｋａｔｈｌｅｅｎ  Ｍｅｅｈａｎ，Ｄｒ．Ｌｏｕｉｓ  Ｊ．Ｇｕｉｄｏ，Ｄｒ．Ｇｕｏｑｕａｎ  Ｌｕ，Ｄｒ．Ｃｈｒｉｓ  Ｌ．Ｗｙａｔｔ，Ｄｒ．Ｎａｎｃｙ  Ｇ．Ｌｏｖｅ），Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００５，Ｂｌａｃｋｓｂｕｒｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在利用可能な診断ツールは、対応する疾患の後期に存在するＡβプラーク、シヌクレイン及びハンチンチンなどを含むこれらのアミロイドタンパク質を検出することができるが、状態の早期同定に焦点を当てることができない。したがって、アルツハイマー病、パーキンソン病及びハンチントン病のような神経変性疾患の早期診断及び／または治療のための新規な手段を提供する著しい必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、（ｉ）受容体介在性トランスサイトーシスを介して血液脳関門を通過して容易に輸送され得るような、トランスフェリン受容体、及び（ｉｉ）例えばＡβ、シヌクレイン及びハンチンチンのような異なるアミロイド形成ペプチド領域に対して高い特異性を示す新規な神経変性障害診断及び治療ツールを今回開発した。
【０００７】
したがって、本発明の第１の態様によれば、近赤外（ＮＩＲ）下で及び／または磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）及び／またはコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）を用いて可視であるナノ粒子と、トランスフェリン受容体及びアミロイド形成ペプチドに対して免疫特異的である少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントと、を含むアミロイド形成ペプチド生体特異性薬剤が提供される。
【０００８】
実施例に記載されているように、本発明の生体特異性薬剤は、細胞内アミロイド−ベータ（Ａβ）種を標的とする能力を示す一方、非常に低い細胞傷害性を示した。生体特異性薬剤は、アミロイド−βオリゴマー及び原繊維に高い親和性を示しながら、Ａβモノマー及びプラークとの低い交差反応性を示すので、現在利用可能な診断ツールを用いて可能であるよりも神経変性障害のより早期の診断を達成することができる。生体特異性薬剤はまた、受容体媒介性トランスサイトーシスを介して血液脳関門を効率的に横断するために必要とされる二重特異性抗体によって、一旦標的化されたトランスフェリン受容体に対して低い親和性を示した。本発明の生体特異性薬剤は、その化学組成のために、約８５０ｎｍで最大限近赤外（ＮＩＲ）にて光を放出し、したがって神経変性障害に罹患している、または罹患していると考えられる対象のインビボ診断に理想的な約２ｃｍの組織深さで視覚化することができる。さらに、実施例に記載されているように、薬剤の組成物は、薬剤の生体適合性を著しく改善し、その毒性を劇的に低下させ、ＭＲＩまたはＣＴによる検出を可能にする。驚くほど強力な診断能力に加えて、本発明者はまた、驚いたことに、免疫蛍光によって示されるように、それらが不溶性にされるためにニューロンに入ることが容易ではなかった、アミロイド形成ペプチドのオリゴマーに、薬剤が結合することができたので、薬剤が治療効果を示すことを観察した。
【０００９】
アミロイド形成ペプチドを標的とし、特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントの存在のために、本発明の生体特異性薬剤は、任意の神経変性疾患のバイオマーカーとして作用する任意のアミロイド形成ペプチドまたはタンパク質、例えばアルツハイマー病におけるＡβ、パーキンソン病におけるα−シヌクレインまたはハンチントン病におけるハンチンチン、を標的化するために使用することができる。該薬剤は、アミロイド形成ペプチドの高感度な及び非侵襲性の検出及び画像化、それゆえの神経変性疾患の早期診断に、非常に適している。このような疾患の早期検出は、現在利用可能な技術なしに可能であるよりはるかに早く、ならびに、そのいくつかは症状が蔓延する前１０年に起こりうる病態生理学的変化に焦点を当てて症状が現れ始める前に、治療計画を開始できることを意味する。この早期診断は、患者及びその家族が将来のために準備するのを助け、早期に救命可能性薬の臨床試験に入ることを選択することを可能にし、患者の予後が良好であるように、既存の薬剤をより効果的に使用するようにする。
【００１０】
本発明をよりよく理解し、その実施形態がどのように実施されるかを示すために、ここで例として添付図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明によるナノ粒子または「量子ドット」の一実施形態の概略図である。このナノ粒子は、セレン化カドミウムコアと、アミロイドベータ及びトランスフェリン受容体に対して免疫特異性を有する二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントがコンジュゲートした、Ｇｄ−ＤＯＴＡシリカ外殻によりカプセル化された硫化亜鉛シェルとを含む。
【図２】「診断用プローブ」として作用する二重特異性抗体にコンジュゲートしたＧｄ−ＤＯＴＡシリカでカプセル化されたＣｄＳｅ／ＺｎＳナノ粒子の吸収及び発光スペクトルを示す。
【図３】本発明のナノ粒子への暴露後の細胞生存率を示す棒グラフである。
【図４】ナノ粒子への暴露後のニューロンの生存率を示す棒グラフである。
【図５】トランスフェリン受容体に対するナノ粒子の親和性を決定するために用いた表面プラズモン共鳴の結果を示す。
【図６】図６は、ナノ粒子の蛍光データを示す。
【図７】図７は、ナノ粒子の蛍光データを示す。
【図８】図８は、ナノ粒子の蛍光データを示す。
【図９】図９は、ナノ粒子の蛍光データを示す。
【図１０】図１０は、ナノ粒子の蛍光データを示す。
【図１１】図１１は、ナノ粒子の蛍光データを示す。
【図１２】Ｃ５７Ｂｌ／Ｓｖ１２９の免疫蛍光染色を示す。ａ）ＤＡＰＩ核染色を示す。ｂ）インスリンの局在を示す。ｃ）アミロイド−ベータオリゴマー。
【図１３】異なる免疫蛍光アプローチが行われたことを示す。
【図１４】アミロイド−βオリゴマー及びナノ粒子を３０分間以上一緒にインキュベートした後の結果を示す。
【図１５】アミロイド−βオリゴマー及びナノ粒子を３０分間以上一緒にインキュベートした後の結果を示す。
【図１６】アミロイド−βオリゴマー及びナノ粒子を３０分間以上一緒にインキュベートした後の結果を示す。
【図１７】アミロイド−βオリゴマー及びナノ粒子を３０分間以上一緒にインキュベートした後の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
好ましくは、少なくとも１つの抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ抗アミロイド形成ペプチド抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。好ましくは、アミロイド形成ペプチドに対して免疫特異的である二重特異性薬剤の部分は、抗体フラグメント、より好ましくはＦａｂ’フラグメントを含む。
【００１３】
好ましくは、少なくとも１つの抗体または抗原結合フラグメントは、アミロイド形成ペプチドのオリゴマー及び原線維（前原線維を含む）に特異的に結合するが、アミロイド形成ペプチドプラーク及びペプチドモノマーには結合しない。都合の良いことには、アミロイド形成ペプチドオリゴマー及び原線維に対してはあるが、アミロイド形成ペプチドプラーク及びモノマーにはない、抗体の特異性は、早期段階の神経変性疾患を検出するために本発明の生体特異性薬剤を使用できることを意味する。
【００１４】
例えば、一実施形態では、本発明の生体特異性薬剤は、アルツハイマー病を検出し治療するために使用できる。したがって、好ましくは、アミロイド形成ペプチドに対する少なくとも１つの抗体または抗原結合フラグメントを作製するために使用される免疫原配列は、Ａβのアミノ酸配列、またはその変異体もしくはフラグメントを含むか、またはそれからなる。野生型Ａβ（１−４２）のアミノ酸配列は公知であり、本明細書において以下の配列番号１として表すことができる：
【表１】
2018526435.tif 000003
【００１５】
好ましくは、アミロイド形成ペプチドに対する少なくとも１つの抗体または抗原結合フラグメントを作製するために使用される免疫原配列は、配列番号１またはその変異体もしくはフラグメントを含むか、またはそれらからなる。本発明者は、Ａβオリゴマーがアルツハイマー患者の脳にはるかに高い濃度で存在することを認識しており、この増加は疾患の初期段階に現れ、ＡβオリゴマーはＡβプラークまたはＡβモノマーよりも魅力的なバイオマーカーとなる。したがって、好ましくは、アミロイド形成ペプチドに対する少なくとも１つの抗体または抗原結合フラグメントを作製するために使用される免疫原配列は、部分的に凝集した野生型Ａβ（１−４２）ペプチド、より好ましくは部分的に凝集した配列番号１を含むか、またはそれからなる。好ましくは、少なくとも１つの抗体または抗原結合フラグメントは、アミロイドβオリゴマー及び原線維（前原線維を含む）に特異的に結合するが、Ａβプラークまたはモノマーには結合しない。このように、Ａβオリゴマー及び原線維に対してはあるが、Ａβプラーク及びモノマーにはない抗体の特異性は、本発明の生体特異性薬剤が、早期段階のアルツハイマー病を検出するために使用できることを意味する。
【００１６】
別の実施形態において、本発明の生体特異性薬剤は、ハンチントン病を検出し治療するために使用できる。好ましくは、アミロイド形成ペプチドに対する少なくとも１つの抗体または抗原結合フラグメントを作製するために使用される免疫原配列は、ハンチンチンのアミノ酸配列、またはその変異体もしくはフラグメントを含むか、またはそれからなる。ヒトハンチンチンの一実施形態のアミノ酸配列は公知であり、本明細書において以下の配列番号２として表すことができる：
【表２−１】
2018526435.tif 000004
【表２−２】
2018526435.tif 000005
【００１７】
好ましくは、アミロイド形成ペプチドに対する少なくとも１つの抗体または抗原結合フラグメントを作製するために使用される免疫原配列は、配列番号２、またはその変異体もしくはフラグメントを含むか、またはそれらからなる。好ましくは、アミロイド形成ペプチドに対する少なくとも１つの抗体または抗原結合フラグメントを作製するために使用される免疫原配列は、部分的に凝集した配列番号２を含むか、またはそれからなる。最も好ましくは、少なくとも１つの抗体または抗原結合フラグメントは、ハンチンチンオリゴマー及び原繊維（前原繊維を含む）に特異的に結合するが、ハンチンチンプラーク及びモノマーには結合しない。有利には、ハンチンチンオリゴマー及び原繊維に対してはあるが、ハンチントンプラーク及びモノマーにはない抗体の特異性は、本発明の生体特異性薬剤が、早期段階のハンチントン病を検出するために使用できることを意味する。
【００１８】
さらに別の実施形態において、本発明の生体特異性薬剤は、パーキンソン病を検出及び処置するために使用できる。好ましくは、アミロイド形成ペプチドに対する少なくとも１つの抗体または抗原結合フラグメントを作製するために使用される免疫原配列は、α−シヌクレインのアミノ酸配列、またはその変異体もしくはフラグメントを含むか、またはそれからなる。ヒトα−シヌクレインの一実施形態のアミノ酸配列（例えばアイソフォームＮＡＣＰ１４０）は公知であり、本明細書において以下の配列番号３として表すことができる：
【表３】
2018526435.tif 000006
【００１９】
好ましくは、アミロイド形成ペプチドに対する少なくとも１つの抗体または抗原結合フラグメントを作製するために使用される免疫原配列は、配列番号３またはその変異体もしくはフラグメントを含むか、またはそれらからなる。好ましくは、アミロイド形成ペプチドに対する少なくとも１つの抗体または抗原結合フラグメントを作製するために使用される免疫原配列は、部分的に凝集した配列番号３を含むか、またはそれからなる。最も好ましくは、少なくとも１つの抗体または抗原結合フラグメントは、α−シヌクレインオリゴマー及び原繊維（前原繊維を含む）に特異的に結合するが、α−シヌクレインプラーク及びモノマーには結合しない。有利には、α−シヌクレインオリゴマー及び原線維に対してはあるが、α−シヌクレインプラーク及びモノマーにはない抗体の特異性は、本発明の生体特異性薬剤が早期段階のパーキンソン病を検出するために使用できることを意味する。
【００２０】
血液脳関門は、毛細血管内皮細胞によって形成される高度に選択的な透過性障壁であり、これは、ほとんどの物体は脳に到達しないことを保証し、侵入する病原体または毒素から脳を保護するのに有利であるが、ほとんどの治療剤が通過して脳に到達できないので問題である。トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対する低い親和性を有する抗体は、受容体媒介性トランスサイトーシスを介して血液脳関門を横断することができる。抗ＴｆＲ抗体またはそのフラグメントは、ナノ粒子を標的化してＴｆＲに結合させ、内皮細胞を横断して輸送されるが、受容体に対する抗体の低い親和性のために、内皮細胞の他の側に到達するとき、ＴｆＲから脳に放出される。
【００２１】
したがって、好ましくは、少なくとも１つの抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＭ抗トランスフェリン受容体抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。図４は、トランスフェリン受容体に対する本発明の生体特異性薬剤の親和性を決定するための表面プラズモン共鳴の結果を示す。これに見られるように、高いＫｄ値は、受容体介在性トランスサイトーシスが起こり得るために重要な、これらの受容体に対する低親和性の明確な実証である。好ましくは、トランスフェリン受容体との結合親和性は、マイクロモル範囲である。好ましくは、トランスフェリン受容体に対する少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントの解離定数値は、少なくとも１×１０−４Ｍ、より好ましくは少なくとも１×１０−３Ｍである。好ましくは、親和定数は、これより低い親和定数がトランスフェリン受容体に完全に関与しない可能性があるので、親和定数は１×１０−４Ｍ以上であるべきである。
【００２２】
好ましくは、トランスフェリン受容体に対して免疫特異的である二重特異性薬剤の部分は、抗体フラグメント、より好ましくはＦａｂ’フラグメントを含む。
【００２３】
ヒトトランスフェリン受容体の一実施形態のアミノ酸配列は公知であり、本明細書において以下の配列番号４として表すことができる：
【表４】
2018526435.tif 000007
【００２４】
好ましくは、トランスフェリン受容体に対する少なくとも１つの抗体または抗原結合フラグメントを作製するために使用される免疫原配列は、配列番号４またはその変異体もしくはフラグメントを含むか、またはそれからなる。
【００２５】
一実施形態では、生体特異性薬剤は、トランスフェリン受容体に対する免疫特異性を有する少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメント、及びアミロイド形成ペプチドに対する免疫特異性を有する少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントを含み得る。好ましくは、生体特異性薬剤は、トランスフェリン受容体に対する免疫特異性を有する複数の抗体またはその抗原結合フラグメント、及びアミロイド形成ペプチドに対する免疫特異性を有する複数の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
【００２６】
少なくとも１つの抗体は、完全抗体（すなわち免疫グロブリン）であってもよく、または対応する全長抗体の抗原結合フラグメントまたは領域であってもよい。少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントは、１価、２価または多価であり得る。一価抗体は、軽鎖（Ｌ）を有するジスルフィド架橋によって会合した重（Ｈ）鎖を含む二量体（ＨＬ）である。二価抗体は、少なくとも１つのジスルフィド架橋によって会合された２つの二量体を含む四量体（Ｈ２Ｌ２）である。多価抗体はまた、例えば、複数の二量体を連結することによっても産生され得る。抗体分子の基本構造は、非共有結合的に会合し、ジスルフィド結合によって連結することができる２つの同一の軽鎖と、２つの同一の重鎖からなる。各重鎖及び軽鎖は、約１１０個のアミノ酸のアミノ末端可変領域及び鎖の残りの部分に定常配列を含む。可変領域は、抗体分子の抗原結合部位を形成し、抗原、トランスフェリン受容体またはアミロイド形成ペプチド、またはその変異体もしくはフラグメント（例えば、エピトープ）に対する特異性を決定する、いくつかの超可変領域または相補性決定領域を含む。重鎖及び軽鎖のＣＤＲのいずれかの側には、ＣＤＲを係留して配向するアミノ酸の比較的保存された配列であるフレームワーク領域がある。抗体フラグメントは、二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み得る。
【００２７】
定常領域は、５つの重鎖配列（μ、γ、ζ、α、またはε）のうちの１つ及び２つの軽鎖配列（κまたはλ）のうちの１つからなる。重鎖定常領域配列は、抗体のアイソタイプ及び分子のエフェクター機能を決定する。好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、単離または精製される。
【００２８】
一実施形態では、少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントは、ポリクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントは、ウサギ、マウスまたはラットにおいて生成され得る。
【００２９】
しかし、好ましい実施形態では、少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。好ましくは、本発明の抗体はヒト抗体である。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語「ヒト抗体」は、抗体、例えばモノクローナル抗体であって、トランスフェリン受容体（好ましくは、配列番号４）またはアミロイド形成ペプチド（好ましくは、配列番号１，２または３）に対する免疫特異性を示す特定のヒト抗体において見出されるものと実質的に同じ重鎖及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含むものを意味することができる。重鎖または軽鎖のＣＤＲと実質的に同一であるアミノ酸配列は、参照配列と比較したとき相当量の配列同一性を示す。そのような同一性は、特定のヒト抗体のアミノ酸配列を表すものとして決定的に知られているかまたは認識可能である。実質的に同じ重鎖及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列は、例えばアミノ酸のわずかな修飾または保存的置換を有することができる。このようなヒト抗体は、トランスフェリン受容体（好ましくは配列番号４）またはアミロイド形成ペプチド（好ましくは配列番号１、２または３）に選択的に結合するその機能を維持する。
【００３１】
用語「ヒトモノクローナル抗体」は、例えば、ファージライブラリーによる産生、リンパ球による産生またはハイブリドーマ細胞による産生などの組換え方法によって産生される、実質的にまたは完全なヒトＣＤＲアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体を含み得る。
【００３２】
用語「ヒト化抗体」は、ヒトにおいて天然に産生される抗体とのそれらの類似性を高めるためにそのタンパク質配列が修飾されている非ヒト種（例えば、マウスまたはウサギ）由来の抗体を意味し得る。
【００３３】
抗体は、組換え抗体であってもよい。用語「組換えヒト抗体」は、組換えＤＮＡ技術を用いて産生されたヒト抗体を含むことができる。
【００３４】
用語「抗原結合領域」は、その標的抗原、例えば、トランスフェリン受容体またはアミロイド形成ペプチドに対する特異的結合親和性を有する抗体の領域を意味し得る。結合領域は、超可変ＣＤＲまたはその機能的部分であり得る。ＣＤＲの「機能的部分」という用語は、標的抗原、すなわちトランスフェリン受容体またはアミロイド形成ペプチドに対する特異的親和性を示すＣＤＲ内の配列を意味することができる。ＣＤＲの機能的部分は、トランスフェリン受容体またはアミロイド形成ペプチドに特異的に結合するリガンドを含み得る。
【００３５】
用語「ＣＤＲ」は、重鎖及び軽鎖可変鎖中の超可変領域を意味し得る。抗体の重鎖及び軽鎖のそれぞれに１つ、２つ、３つまたはそれ以上のＣＤＲが存在し得る。通常、各鎖に少なくとも３つのＣＤＲがあり、それは、一緒に構成されると、抗原結合部位、すなわち抗原が結合するまたは特異的に反応する三次元結合部位を形成する。しかしながら、いくつかの抗体の重鎖には４つのＣＤＲが存在することが想定されている。
【００３６】
ＣＤＲの定義には、互いに比較した場合のアミノ酸残基の重複またはサブセットも含まれる。特定のＣＤＲまたはその機能的部分を包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及びサイズに依存して変化するであろう。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられている特定のＣＤＲを含む残基を日常的に決定することができる。
【００３７】
抗体の「機能的フラグメント」という用語は、機能的活性を保持する抗体の一部を意味することができる。機能的活性は、例えば抗原結合活性または特異性であり得る。機能的活性は、例えば、抗体定常領域によって提供されるエフェクター機能であってもよい。用語「機能的フラグメント」はまた、例えば、プロテアーゼ消化またはヒトモノクローナル抗体の還元によって、及び当業者に知られている組換えＤＮＡ法によって産生されたフラグメントを含むことが意図される。ヒトモノクローナル抗体機能性フラグメントには、例えば、ＶＬ、ＶＨ及びＦｄなどの個々の重鎖または軽鎖及びそのフラグメント、Ｆｖ、Ｆａｂ、及びＦａｂ’などの一価フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２のような二価フラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、及びＦｃフラグメントを含む。
【００３８】
用語「ＶＬフラグメント」は、ＣＤＲを含む軽鎖可変領域の全部または一部を含むヒトモノクローナル抗体の軽鎖のフラグメントを意味することができる。ＶＬフラグメントは、軽鎖定常領域配列をさらに含み得る。
【００３９】
用語「ＶＨフラグメント」は、ＣＤＲを含む重鎖可変領域の全部または一部を含むヒトモノクローナル抗体の重鎖のフラグメントを意味することができる。
【００４０】
用語「Ｆｄフラグメント」は、重鎖可変領域及び定常領域、すなわちＶＬ、ＣＬ及びＶＨ、ＣＨ−１に連結された軽鎖可変領域及び定常領域を意味し得る。
【００４１】
用語「Ｆｖフラグメント」は、重鎖及び軽鎖の可変領域の全部または一部を含み、重鎖及び軽鎖の定常領域が存在しないヒトモノクローナル抗体の一価抗原結合フラグメントを意味し得る。重鎖及び軽鎖の可変領域には、例えば、ＣＤＲが含まれる。例えば、Ｆｖフラグメントは、重鎖及び軽鎖の両方の約１１０個のアミノ酸のアミノ末端可変領域の全部または一部を含む。
【００４２】
用語「Ｆａｂフラグメント」は、Ｆｖフラグメントよりも大きいヒトモノクローナル抗体の一価抗原結合フラグメントを意味することができる。例えば、Ｆａｂフラグメントは、可変領域、ならびに重鎖及び軽鎖の第１定常部ドメインの全部または一部を含む。したがって、Ｆａｂフラグメントは、例えば、重鎖及び軽鎖の約１１０〜約２２０個のアミノ酸残基をさらに含む。
【００４３】
用語「Ｆａｂ’フラグメント」は、Ｆａｂフラグメントよりも大きいヒトモノクローナル抗体の一価抗原結合フラグメントを意味することができる。例えば、Ｆａｂ’フラグメントは、軽鎖のすべて、重鎖の可変領域のすべて、及び重鎖の第１及び第２定常部ドメインのすべてまたは一部を含む。例えば、Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖のアミノ酸残基２２０〜３３０個のいくつかまたはすべてをさらに含むことができる。したがって、１つの好ましい実施形態において、少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントは、トランスフェリン受容体に対して免疫特異的なＦａｂ’フラグメントを含む。別の好ましい実施形態では、少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントは、アミロイド形成ペプチドに免疫特異的なＦａｂ’フラグメントを含む。好ましくは、Ｆａｂ’フラグメントは、アミロイド形成ペプチドプラークまたはモノマーではなく、アミロイド形成ペプチドのオリゴマー及び原線維に特異的に結合する。
【００４４】
用語「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、ヒトモノクローナル抗体の二価抗原結合フラグメントを意味することができる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、例えば２つの重鎖及び２つの軽鎖の可変領域の全部または一部を含み、２つの重鎖及び２つの軽鎖の第１定常部ドメインの全部または一部をさらに含み得る。したがって、最も好ましい実施形態では、少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントは、アミロイド形成ペプチド及びトランスフェリン受容体に免疫特異的な二価または二重特異性Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを含む。二重特異性Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、好ましくは、アミロイド形成ペプチドに対する免疫特異性を示す第２のＦａｂ’フラグメントに（好ましくはその露出したスルフヒドリル基を介して）コンジュゲートしているトランスフェリン受容体に対する免疫特異性を示す第１のＦａｂ’フラグメントを含む。最も好ましくは、第２のＦａｂ’フラグメントは、アミロイド形成ペプチドプラークまたはモノマーではなく、アミロイド形成ペプチドのオリゴマー及び原線維に特異的に結合する。
【００４５】
用語「一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」は、短いリンカーペプチドと繋がった重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合を意味することができる。
【００４６】
用語「二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）」は、より短い連結ペプチドによって互いに連結された２つのｓｃＦｖを含む二重特異性抗体を意味することができる。
【００４７】
当業者は、抗体のフラグメントの正確な境界は、フラグメントが機能的活性を維持する限り、重要ではないことを熟知している。周知の組換え法を用いて、当業者は、特定の用途に望ましい任意のエンドポイントを有する機能性フラグメントを発現するポリヌクレオチド配列を操作することができる。抗体の機能的フラグメントは、ヒト抗体と実質的に同じ重鎖及び軽鎖可変領域を含むフラグメントを含むかまたはそれからなり得る。
【００４８】
好ましくは、本発明の第１の態様に関して、その抗原結合フラグメントは、トランスフェリン受容体またはアミロイド形成ペプチドである。その抗原結合フラグメントは、ＶＨ、ＶＬ、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｃフラグメントからなる群から選択されるフラグメントのいずれかを含むかまたはそれからなり得る。
【００４９】
その抗原結合フラグメントは、ヒト抗体のＶＬの、抗原結合領域配列のいずれか１つ、ＶＨの抗原結合領域配列のいずれか１つ、またはＶＬ及びＶＨ抗原結合領域の組み合わせを含み得るかまたはそれからなり得る。ＶＨ及びＶＬ抗原結合領域配列の適切な数及び組み合わせは、所望の親和性及び特異性及び抗原結合フラグメントの意図された用途に応じて、当業者によって決定され得る。抗体の機能的フラグメントまたは抗原結合フラグメントは、当業者に周知の方法を用いて容易に産生され、単離され得る。そのような方法には、例えば、タンパク質分解法、組換え法及び化学合成が含まれる。機能的フラグメントの単離のためのタンパク質分解的方法は、ヒト抗体を出発物質として使用することを含む。ヒト免疫グロブリンのタンパク質分解に適した酵素は、例えば、パパイン及びペプシンを含み得る。適切な酵素は、例えば、一価または二価のフラグメントが必要とされるかどうかに応じて、当業者によって容易に選択され得る。例えば、パパイン切断は、抗原とＦｃフラグメントに結合する２つの一価Ｆａｂ’フラグメントを生じる。例えば、ペプシン切断は、二価のＦ（ａｂ’）フラグメントを生じる。本発明のＦ（ａｂ’）２フラグメントは、例えば、ＤＴＴまたは２−メルカプトエタノールを用いてさらに還元されて、２つの一価Ｆａｂ’フラグメントを生成することができる。
【００５０】
タンパク質分解によって産生された抗体の機能的または抗原結合フラグメントは、親和性及びカラムクロマトグラフィー手順によって精製することができる。例えば、消化されていない抗体及びＦｃフラグメントは、タンパク質Ａに結合することによって除去され得る。さらに、機能的フラグメントは、例えば、イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、その電荷及びサイズによって精製され得る。そのような方法は、当業者に周知である。
【００５１】
少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントは、組換え方法によって産生され得る。好ましくは、最初に抗体の重鎖及び軽鎖の所望の領域をコードするポリヌクレオチドを単離する。そのような領域は、例えば、重鎖及び軽鎖の可変領域の全部または一部を含み得る。好ましくは、このような領域は、特に、重鎖及び軽鎖の抗原結合領域、好ましくは抗原結合部位、最も好ましくはＣＤＲを含むことができる。
【００５２】
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、当業者に公知の方法を用いて産生され得る。抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、当該分野で公知のオリゴヌクレオチド合成の方法によって直接合成され得る。あるいは、より小さいフラグメントを合成して、当該分野で公知の組換え方法を用いてより大きな機能的フラグメントを形成することができる。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「免疫特異性」は、結合領域が、アミロイド形成ペプチドと特異的に結合することにより免疫反応できることを意味し得る。抗体またはその抗原結合フラグメントは、約１０−５〜１０−１３Ｍ、好ましくは１０−６〜１０−９Ｍ、さらにより好ましくは１０−１０〜１０−１２Ｍの親和定数で抗原（例えば、配列番号１、２または３、またはその変異体もしくはフラグメント）と選択的に相互作用することができる。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語「免疫特異性」は、結合領域が、トランスフェリン受容体と特異的に結合することにより免疫反応できることを意味し得る。好ましくは、トランスフェリン受容体との結合親和性は、マイクロモル範囲である。抗体またはその抗原結合フラグメントは、１×１０−４Ｍ以上、より好ましくは１×１０−３Ｍ以上の親和定数で抗原（例えば、配列番号４、またはその変異体もしくはフラグメント）と選択的に相互作用することができる。
【００５５】
用語「免疫反応」は、結合領域が配列番号１〜４のいずれか、またはそのエピトープとの結合の際に免疫応答を誘発することができることを意味し得る。
【００５６】
用語「エピトープ」は、抗体またはその抗原結合フラグメントの結合領域を誘発し、それと結合する能力を有する抗原の任意の領域を意味し得る。
【００５７】
好ましくは、本発明による抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１〜４のいずれかの１つ以上のアミノ酸に特異的に結合する。
【００５８】
本発明の生体特異性薬剤のナノ粒子成分は、赤外下で、ならびに／または（ＭＲＩ）及び／もしくはコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）を用いて可視にすることを可能にする材料からなることが理解されよう。このようなナノ粒子は、量子ドットとしても知られている。
【００５９】
好ましくは、ナノ粒子は、近赤外で可視である内部コアを含む。好ましくは、コアはカドミウムまたは鉛を含む。好ましくは、コアは、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＣｄＳ、ＰｂＳ及びＰｂＳｅから選択される材料を含む。最も好ましくは、コアはＣｄＳｅを含む。コアの平均直径は、５ｎｍ〜３０ｎｍ、または８ｎｍ〜２０ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ〜１５ｎｍ、最も好ましくは１２ｎｍ〜１４ｎｍであってよい。
【００６０】
好ましくは、ナノ粒子は、好ましくはコアを包囲し、かつ好ましくはコアの光学特性を改善し、量子収量（すなわち、吸収される光子の数／放出される光子の数）を増加させるカドミウムまたは亜鉛を含む、シェルを含む。シェルはＺｎＳまたはＣｄＳを含むことができる。好ましくは、シェルはＺｎＳを含む。図２に示すように、好都合なことに、シェルはまた、カドミウムベースまたは鉛ベースのコアの毒性を低下させる。シェルは、好ましくはコアの周りに成長して層を形成する。
【００６１】
ナノ粒子は、ＭＲＩまたはＣＴを用いて視認可能な造影剤を含むことが好ましい。好ましくは、造影剤は、コア、より好ましくはシェルをカプセル化するかまたは包囲する。
【００６２】
造影剤は、金属材料または非金属材料を含むことができる。造影剤は、磁性材料または非磁性材料を含むことができる。造影剤が磁性である実施形態では、造影剤はＭＲＩ造影剤を含むことができる。造影剤は、常磁性または超常磁性材料を含むことができる。例えば、造影剤コアは、鉄、ニッケル、コバルトまたはジスプロシウム、またはこれらの元素の１つ以上を含む酸化物または合金のような化合物を含むことができる。造影剤はマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）を含むことができる。
【００６３】
造影剤が非磁性である実施形態では、造影剤は、ＭＲＩ及びＣＴ造影剤の両方を含むことができる。例えば、造影剤は、ガドリニウム、金、ヨウ素またはボロ硫酸（ｂｏｒｏ−ｓｕｌｐｈａｔｅ）を含むことができる。これらの材料のそれぞれは、ＭＲＩまたはＣＴ造影剤のいずれかとして使用することができる。好ましくは、造影剤はガドリニウムを含む。
【００６４】
好ましくは、造影剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（即ち、ＤＯＴＡ）を含む。最も好ましくは、造影剤はキレート剤として有機酸「ＤＯＴＡ」からなる大環状構造のＧｄベースのＭＲＩ造影剤であるガドテル酸を含む。
【００６５】
造影剤は、シェルをカプセル化することが好ましい。Ｇｄ−ＤＯＴＡ／シリカカプセル化は、表面の塩類化によってシェルに付着させることができる。３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）は、Ｚｎ／チオール構造によって表面へのプライマーとして作用することができる。現在のメトキシシラン基（Ｓｉ−ＯＣＨＢ３Ｂ）は加水分解してシラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）になり、架橋し、シラン層をシェルの表面上に安定化させる。ケイ酸ナトリウム及び親水性トリメトキシシランの添加は、シロキサン結合の形成によるトリメトキシシラン基の架橋を可能にし、シリカ層がプライマー層及び最終的にシェルに接続されることを保証する。
【００６６】
少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントは、共有結合によって生体特異性薬剤の造影剤に結合され得る。好ましくは、造影剤は、カルボキシル官能化を可能にするように構成され、それによって少なくとも１つの抗体またはその抗原フラグメントがそれにコンジュゲートされ得る。一実施形態において、少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントは、本発明の生体特異性薬剤を作製するために、カルボジイミド化学作用を用いて造影剤に共有結合され得る。例えば、実施例に記載されているように、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミド塩酸塩）は、カルボキシル基を活性化して第一級アミンと自発的に反応し、抗体固定化及びハプテン−キャリヤータンパク質コンジュゲーションを可能にする水溶性カルボジイミド架橋剤である。したがって、コンジュゲーションは、造影剤の外層に存在するカルボキシル基に対する抗体のアミン基の共有結合を含む。
【００６７】
ナノ粒子に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントの量は、造影剤上の官能基（好ましくはカルボキシル基）の量、造影剤の種類及び結合の化学作用に依存する。好ましくは、複数の抗体またはその抗原結合フラグメントは、造影剤層の外面を覆う間隔を空けたアレイ内に配置される。
【００６８】
生体特異性薬剤は、実質的に球形であってもよい。生体特異性薬剤の平均直径は、サブミクロン、すなわち１０００ｎｍ未満、より好ましくは５００ｎｍ未満、またはさらにより好ましくは３００ｎｍ未満であってよい。生体特異性薬剤の平均直径は、１００〜４５０ｎｍであってよい。
【００６９】
したがって、１つの好ましい実施形態において、生体特異性薬剤は、
（ｉ）近赤外で可視である、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＣｄＳ、ＰｂＳまたはＰｂＳｅの内部コア（好ましくはＣｄＳｅ）と、
（ｉｉ）量子収量を増加させながらコアの光学特性を向上させかつ高めるコアを取り囲む亜鉛またはカドミウムシェル（好ましくはＺｎＳ）と、
（ｉｉｉ）磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）及び／またはコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）を用いて可視であるシェルをカプセル化する造影剤（好ましくはＧｄ−ＤＯＴＡ／シリカ）と
（ｉｖ）トランスフェリン受容体及びアミロイド形成性ペプチドに対して免疫特異性である少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントと、を含む。
【００７０】
好ましくは、少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントは、アミロイド形成ペプチド及びトランスフェリン受容体に対して免疫特異的な二重特異性Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを含む。二重特異性Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、好ましくは、トランスフェリン受容体に対して免疫特異性を示す第１のＦａｂ’フラグメント及びアミロイド形成ペプチドに対して免疫特異性を示す第２のＦａｂ’フラグメントを含む。最も好ましくは、第２のＦａｂ’フラグメントは、アミロイド形成ペプチドのオリゴマー及びに特異的に結合するが、アミロイド形成ペプチドプラークまたはモノマーには特異的に結合しない。
【００７１】
実施例に記載されるように、本発明者は、本発明の生体特異性薬剤が、神経変性障害の診断及び治療の両方において有用性を有することを実証した。
【００７２】
したがって、第２の態様において、診断に使用するための、第１の態様によるアミロイド形成ペプチド生体特異性薬剤を提供する。
【００７３】
生体特異性薬剤は、様々な生体画像化用途の範囲内でバイオセンサーとして使用され得ることが理解されるであろう。例えば、生体特異性薬剤は、好ましくは、ＭＲＩ、ＣＴまたはＩＲ画像処理技術において、生体標識として使用する。
【００７４】
したがって、第３の態様では、ＮＩＲ生体標識、ＭＲＩ生体標識またはＣＴ生体標識としての、第１の態様のアミロイド形成ペプチド生体特異性薬剤の使用を提供する。
【００７５】
第４の態様では、第１の態様によるアミロイド形成ペプチド生体特異性薬剤を含む生体標識を提供する。
【００７６】
この生体標識は、ＮＩＲ、ＭＲＩまたはＣＴ画像化に使用してもよい。
【００７７】
したがって、第５の態様では、第１の態様のアミロイド形成ペプチド生体特異性薬剤の使用を含むＮＩＲ、ＭＲＩまたはＣＴ画像化方法を提供する。
【００７８】
好ましくは、本発明の生体特異性薬剤は、近赤外領域で光を発する。赤外線は、波長７００ｎｍ〜１ｍｍの放射線として定義され、近赤外線は、約０．７５〜１．４μｍの波長を有する。最も好ましい近赤外Ｉは、約７０５ｎｍ〜９００ｎｍの波長を有する。好ましくは、本発明の生体特異性薬剤は、機能的ＮＩＲ  Ｉ分光法による非侵襲的検出能を有する光ルミネッセンスの増加に伴う減少した自己蛍光をもたらす。本発明の薬剤の最大発光波長は約８５０ｎｍであり、最大吸収波長は４９６ｎｍである。有利には、量子ドットの使用により、ＮＩＲにおける発光ピークは生体組織を２ｎｍ超まで透過することができ、これはアルツハイマー病などの脳疾患の診断に理想的である。
【００７９】
好ましくは、本発明の生体特異性薬剤は、Ｇｄ−ＤＯＴＡシリカに起因するＭＲＩ及び／またはＣＴ検出特性を有する。磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）及びコンピュータ断層撮影（ＣＴ）は、組織の画像化における選択方法である。ＭＲＩは、高度に水和した組織中のプロトンのアライメントを一時的に変化させる正味の磁気ベクトルを生成するための大きな磁場の能力に基づいている。ＭＲＩは、主に、靭帯、腱及び脊髄ならびに脳腫瘍における損傷の画像化に適している。しかしながら、この技術は、ＣＴによって得られると同様に詳細な脳障害の画像化を可能にしない。
【００８０】
ＣＴはＸ線減衰に基づいており、それは画素の値が計算され次いで画像に変換される検出器によって検出される。定量的コンピュータ断層撮影法（ＱＣＴ）は、脳密度の測定を提供することができ、脳密度の２次元領域ではなく、３次元における真の体積（ｍｇ／ｃｍ３）を測定する。
【００８１】
本発明者らは、本発明によるアミロイド形成ペプチド生体特異性薬剤が、アミロイド形成ペプチドの共通の存在による神経変性障害の症状の画像化に使用できることを実証した。
【００８２】
例えば、神経変性障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動ニューロン疾患、脊髄小脳１型、２型及び３型、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及び前頭側頭型認知症からなる群から選択されてよい。好ましくは、障害はアルツハイマー病である。
【００８３】
アルツハイマー病を診断するために、少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントは、好ましくは、アミロイドベータ（好ましくは部分的に凝集した配列番号１）オリゴマー及び原繊維に特異的に結合するが、アミロイドプラークには結合しないことが理解される。ハンチントン病を診断するために、少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントは、好ましくは、ハンチンチン（好ましくは部分的に凝集した配列番号２）オリゴマー及び原繊維に特異的に結合するが、ハンチンチンプラーク及びモノマーに特異的に結合しない。パーキンソン病を診断するために、少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントは、α−シヌクレイン（好ましくは部分的に凝集した配列番号３の）オリゴマー及び原繊維に特異的に結合するが、α−シヌクレインプラーク及びモノマーに特異的に結合しないことが好ましい。本明細書に記載の各実施形態において、生体特異性薬剤は、血液脳関門の通過を可能にするため、トランスフェリン受容体（好ましくは配列番号４）に対して免疫特異性のある少なくとも１つの抗体または抗原結合フラグメントを含む。
【００８４】
第１の態様による生体特異性薬剤は、インビボ、エクスビボまたはインビトロ診断において使用され得る。
【００８５】
本発明はまた、神経変性疾患に罹患している患者を診断するためのキットを提供する。
【００８６】
したがって、本発明の第６の態様によれば、神経変性障害に罹患しているもしくはその素因を有する対象を診断するため、または対象の状態の予後を提供するためのキットであって、該キットは対象由来の生体試料中に存在するアミロイド形成ペプチドの濃度を検出するように構成された第１の態様に関連する生体特異性薬剤を含み、試料中のペプチドの存在が、対象が神経変性障害に罹患していることを提示する。
【００８７】
第７の態様によれば、神経変性傷害に罹患しているもしくはその素因を有する対象を診断する方法、または対象の状態の予後を提供するための方法であって、該方法は、対象から得られた生体試料中に存在するアミロイド形成ペプチドの濃度を検出することを含み、検出は第１の態様による生体特異性薬剤を使用して達成され、試料中の抗原の存在が、対象が神経変性障害に罹患していることを提示する。
【００８８】
試料は、血液、尿、組織、脳生検などを含み得る。
【００８９】
好ましくは、オリゴマー及び原線維は早期段階の神経変性傷害を示すので、キットまたは方法は、試料中のアミロイド形成ペプチドオリゴマー及び原繊維（前原繊維を含む）の存在または非存在を同定するために使用され（しかし、アミロイド形成ペプチドプラーク及びモノマーは含まない）、または試料中のそれらの濃度を決定する。検出手段は、試料中のアミロイド形成ペプチドの存在及び／または非存在を検出するように適合されたアッセイを含み得る。キットまたは方法は、アッセイを比較することができる陽性対照及び／または陰性対照の使用を含み得る。例えば、キットは、神経変性傷害に罹患している（すなわち、陽性対照）か、またはそうでない（すなわち陰性対照）個体由来の試料中のアミロイド形成ペプチド濃度の基準を含むことができる。
【００９０】
キットは、検出され得る標識をさらに含み得る。用語「標識」は、生体特異性薬剤に結合することができる部分を意味することができる。部分は、例えば、治療または診断手順に使用することができる。治療用標識には、例えば、本発明の薬剤に結合することができ、薬剤のアミロイド形成ペプチドへの結合をモニターするために使用される部分が含まれる。診断標識は、例えば、分析方法によって検出され得る部分を含む。分析方法は、例えば、定性的及び定量的手順を含む。定性分析法には、例えば、免疫組織化学及び間接免疫蛍光抗体法が含まれる。定量分析法には、例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ分析などの免疫親和性手順が含まれる。分析方法はまた、インビトロ及びインビボ画像化手順の両方を含む。分析手段によって検出され得る診断用標識の特定の例には、酵素、放射性同位体、蛍光色素、化学発光マーカー、及びビオチンが含まれる。標識は、本発明の薬剤に直接結合させることができ、または本発明の薬剤に特異的に結合する二次結合剤に結合させることができる。そのような二次結合剤は、例えば、二次抗体であってよい。二次抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル、及びヒト、げっ歯類またはキメラ起源のいずれかであり得る。
【００９１】
生体特異性薬剤の強力なアミロイド形成標的特性を利用することができる様々な画像化及び診断技術に加えて、実施例及び図３、１４〜１７はまた、アミロイド形成性ペプチドを特異的に標的とするコンジュゲートした二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントが、神経毒性アミロイド−βオリゴマーをそれらが固定化されているように不溶性にする方法についても説明する。このように、これらの結合したオリゴマーは、ニューロン細胞に入ることが容易ではなく、それらの毒性は著しく低減される。このことは、生体特異性薬剤が、神経毒性アミロイド−βオリゴマーと結合し、それらが細胞に入るのを阻害することにより、著しい治療可能性を有することを示す。
【００９２】
したがって、第８の態様によれば、第１の態様によるアミロイド形成ペプチド生体特異性薬剤は、治療に使用するために提供される。
【００９３】
本発明の生体特異性薬剤は、神経変性障害を予防または治療するのに特に有用である。
【００９４】
したがって、第９の態様では、神経変性障害の治療、改善または予防に用いるための第１の態様によるアミロイド形成ペプチド生体特異性薬剤を提供する。
【００９５】
第１０の態様では、対象の神経変性障害を治療、改善または予防する方法が提供され、この方法は、そのような治療を必要とする対象に、治療的有効量の第１の態様によるアミロイド形成ペプチド生体特異性薬剤を投与することを含む。
【００９６】
好ましくは、神経変性障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動ニューロン疾患、脊髄小脳１型、２型及び３型、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及び前頭側頭型認知症であり、好ましくはアルツハイマー病である。
【００９７】
治療される神経変性障害は、好ましくは、「グローバル」ニューロンの損傷または死を特徴とする。例えば、神経変性障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動ニューロン疾患、脊髄小脳１型、２型及び３型、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及び前頭側頭型認知症からなる。
【００９８】
好ましくは、治療される神経変性障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病または運動ニューロン疾患である。最も好ましくは、治療される神経変性障害はアルツハイマー病である。
【００９９】
本発明による生体特異性薬剤は、単独療法（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント単独の使用、または抗体−薬物コンジュゲート単独の使用）で、神経変性障害を治療、改善または予防するために使用され得ることが理解されるであろう。あるいは、本発明による薬剤は、他のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤のような神経変性障害を治療、改善または予防するための既知の治療法の補助剤として、またはそれと組み合わせて使用することができる。
【０１００】
本発明による薬剤は、特に、組成物が使用される方法に応じて、多くの様々な形態を有する組成物中に組み合わせることができる。したがって、例えば、組成物は、粉末、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮パッチ、リポソーム懸濁液の形態でまたは治療を必要とするヒトまたは動物に投与される任意の他の形態であってよい。本発明による薬剤のビヒクルは、それが与えられる対象によって十分に耐容され、好ましくは血液脳関門を越えて薬剤の送達を可能にするものでなければならないことは理解されよう。
【０１０１】
本発明の薬剤を含む医薬は、多くの方法で使用することができる。例えば、経口投与が要求され得、その場合、薬剤は、例えば、錠剤、カプセルまたは液体の形態で経口的に摂取され得る組成物内に含まれ得る。本発明の薬剤及び薬物を含む組成物は、吸入（例えば、鼻腔内）によって投与することができる。組成物はまた、局所的使用のために処方され得る。例えば、クリームまたは軟膏は、例えば脳に隣接して、皮膚に適用することができる。
【０１０２】
本発明による薬剤及び薬物は、遅効性または遅延放出性のデバイス内に組み込むこともできる。そのようなデバイスは、例えば、皮膚の上または下に挿入することができ、薬物は、数週間または数ヶ月にわたって放出され得る。デバイスは、少なくとも処置部位、すなわち脳に隣接して配置され得る。このようなデバイスは、本発明に従って使用される薬剤による長期治療が必要であり、頻繁な投与（例えば、少なくとも毎日の注射）を通常必要とする場合に特に有利であり得る。
【０１０３】
好ましい実施形態では、本発明の薬剤及び薬物は、血流への注射によって、または治療を必要とする部位に直接的に、対象に投与され得る。例えば、薬物は、少なくとも脳に隣接して注射されてもよい。注射は、静脈内（ボーラスまたは注入液）または皮下（ボーラスまたは注入液）または皮内（ボーラスまたは注入液）であり得る。
【０１０４】
必要とされる生体特異性薬剤の量は、その生物学的活性及びバイオアベイラビリティによって決定され、これは同様に、投与様式、薬剤の物理化学的特性、及び単独療法として使用されるかまたは併用療法であるかどうかに依存して決定されることが理解されるであろう。投与頻度はまた、治療される対象内の薬剤の半減期によって影響される。投与される最適な投薬量は、当業者によって決定されてもよく、使用される特定の薬剤、医薬組成物の強度、投与様式、及び細菌感染の進展によって変化するであろう。治療される特定の対象に依存するさらなる因子は、対象の年齢、体重、性別、食事及び投与時間を含めて投与量を調整する必要が生じる。
【０１０５】
前記薬剤に依存して、一般に、本発明の薬剤の０．００１μｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の１日用量を、神経変性障害の治療、改善または予防に使用することができる。より好ましくは、薬剤の１日用量は、０．０１μｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重で、より好ましくは０．１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ体重で、最も好ましくは約０．１μｇ／ｋｇ〜１０μｇ／ｋｇ体重である。
【０１０６】
薬剤は、神経変性障害の発症前、発症中または発症後に投与することができる。毎日の用量は、単回投与（例えば、１日１回の注射）として与えられてもよい。あるいは、薬剤は１日に２回以上の投与を必要とできる。一例として、薬剤は、０．０７μｇ〜７００ｍｇ（すなわち、体重７０ｋｇを想定）の２回（または治療される神経変性障害の重症度に応じてより多く）の１日用量として投与され得る。治療を受けている患者は、起床時に第１回目の用量を、その後は夕方に（２回投与計画の場合）またはその後３または４時間間隔で第２回目の用量をとることができる。あるいは、徐放デバイスを使用して、反復投与を投与する必要なく、本発明による薬剤の最適用量を患者に提供することができる。製薬業界で常用されているような既知の手順（例えば、インビボ実験、臨床試験など）を用いて、本発明による薬剤の特定の製剤及び正確な治療レジメン（例えば、薬剤の１日用量及び投与の頻度）を形成することができる。
【０１０７】
本発明の第１１の態様では、第１の態様による生体特異性薬剤及び場合により薬学的に許容されるビヒクルを含む薬学的組成物を提供する。
【０１０８】
薬学的組成物は、好ましくは、抗神経変性疾患組成物、すなわち、対象における神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病、パーキンソン病またはハンチントン病などの、治療上の改善、予防または治療に使用される薬学的製剤である。
【０１０９】
本発明はまた、第１２の態様において、第９の態様による薬学的組成物の製造方法であって、第１の態様の生体特異性薬剤の治療有効量を薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせることを含む方法を提供する。
【０１１０】
少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントは、第１の態様に関して定義される通りであってよい。好ましくは、少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントは、アミロイド形成ペプチド及びトランスフェリン受容体に対して免疫特異性の二重特異性Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを含む。この二重特異性Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、好ましくは、アミロイド形成ペプチドに対して免疫特異性を示す第２のＦａｂ’フラグメントにコンジュゲートされたトランスフェリン受容体に対して免疫特異性を示す第１のＦａｂ’フラグメントを含む。最も好ましくは、第２のＦａｂ’フラグメントは、アミロイドベータタンパク質のオリゴマー及び原繊維に特異的に結合するが、アミロイド形成ペプチドプラーク及びペプチドモノマーには特異的に結合しない。
【０１１１】
「対象」は、脊椎動物、哺乳動物、または家畜であり得る。したがって、本発明による医薬は、任意の哺乳動物、例えば家畜（例えば、ウマ）、ペットを治療するために使用されてもよく、または他の獣医学の用途で使用されてもよい。最も好ましくは、対象はヒトである。
【０１１２】
生体特異性薬剤の「治療有効量」は、対象に投与されたときに、神経変性疾患を治療するために、または所望の効果を生じるのに必要な薬剤の量である任意の量である。
【０１１３】
例えば、使用される生体特異性薬剤の治療有効量は、約０．００１ｎｇ〜約１ｍｇ、好ましくは約０．０１ｎｇ〜約１００ｎｇであり得る。生体特異性薬剤の量は、約０．１ｎｇ〜約１０ｎｇが好ましく、そして最も好ましくは約０．５ｎｇ〜約５ｎｇの量である。
【０１１４】
本明細書で言及する「薬学的に許容されるビヒクル」は、薬学的組成物を製剤化するのに有用であることが当業者に知られている既知の化合物または既知の化合物の組み合わせを指す。
【０１１５】
一実施形態では、薬学的に許容されるビヒクルは固体であってもよく、組成物は粉末または錠剤の形態であってもよい。固体の薬学的に許容可能なビヒクルはまた、香味剤、潤滑剤、可溶化剤、懸濁化剤、染料、充填剤、流動促進剤、圧縮助剤、不活性結合剤、甘味料、防腐剤、染料、コーティング剤、または錠剤崩壊剤として作用し得る１つの以上の物質を含んでいてもよい。ビヒクルは、カプセル化材料であってもよい。散剤において、ビヒクルは、本発明による微細に分割された活性薬剤と混合された微細に分割された固体である。錠剤において、活性薬剤は、適切な割合で必要な圧縮特性を有するビヒクルと混合され、所望の形状及びサイズに圧縮されてもよい。散剤及び錠剤は、好ましくは９９％までの活性薬剤を含有する。好適な固体ビヒクルには、例えばリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、乳糖、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックス及びイオン交換樹脂が含まれる。別の実施形態では、薬学的ビヒクルはゲルであってもよく、組成物はクリームなどの形態であってもよい。
【０１１６】
しかし、薬学的ビヒクルは液体であってもよく、薬学的組成物は溶液の形態である。液体ビヒクルは、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシル剤及び加圧組成物の調製に使用される。本発明による活性薬剤は、水、有機溶媒、両方の混合物、または薬学的に許容される油もしくは脂肪のような、薬学的に許容される液体ビヒクルに溶解または懸濁することができる。液体ビヒクルは、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、防腐剤、甘味剤、香味剤、懸濁化剤、増粘剤、着色剤、粘度調整剤、安定剤または浸透圧調節剤などの他の適切な薬学的添加物を含むことができる。経口及び非経口投与のための液体ビヒクルの適切な例には、水（部分的に上記の添加剤、例えばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を含む）、アルコール（一価アルコール及び多価アルコール、例えばグリコールを含む）及びそれらの誘導体、ならびに油（例えば、ヤシ油及び落花生油）が含まれる。非経口投与のために、ビヒクルは、オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルなどの油性エステルであってもよい。滅菌液体ビヒクルは、非経口投与のための滅菌液体形態組成物において有用である。加圧組成物用の液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される噴霧剤であってもよい。
【０１１７】
滅菌溶液または懸濁液である液体薬学的組成物は、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内及び特に皮下注射によって利用することができる。薬剤は、滅菌水、生理食塩水、または他の適切な滅菌注射用媒体を用いて投与時に溶解または懸濁され得る滅菌固体組成物として調製され得る。
【０１１８】
本発明の薬剤及び組成物は、他の溶質または懸濁剤（例えば、溶液を等張にするのに十分な生理食塩水またはグルコース）、胆汁酸塩、アカシア、ゼラチン、ソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０（ソルビトールのオレイン酸エステル及びエチレンオキシドと共重合されたその無水物）などを含有する滅菌溶液または懸濁液の形態で経口投与することができるなどが挙げられる。本発明に従って使用される薬剤は、液体または固体の組成物の形態で経口投与することもできる。経口投与に適した組成物には、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤及び散剤などの固体形態、及び液剤、シロップ剤、エリキシル剤及び懸濁剤などの液体形態が含まれる。非経口投与に有用な形態には、滅菌溶液、エマルジョン及び懸濁液が含まれる。
【０１１９】
本発明は、その変異体またはフラグメントを含めて、本明細書で言及される配列のいずれかのアミノ酸配列または核酸配列を含むかまたは実質的にそれらからなる、任意の核酸またはペプチドまたはそれらの変異体、誘導体もしくは類似体に及ぶことが理解される。用語「実質的にアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列」、「変異体」及び「フラグメント」は、本明細書で言及される配列のいずれか１つのアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列と少なくとも４０％の配列同一性を有する、例えば配列番号１−４として同定される配列と４０％の同一性などを有する配列であってよい。
【０１２０】
言及される配列のいずれかと同一性が５０％を超える配列同一性、より好ましくは６５％、７０％、７５％、さらにより好ましくは８０％を超える配列同一性を有するアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列もまた想定される。好ましくは、アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列は、本明細書で言及される配列のいずれかと少なくとも８５％の同一性、より好ましくは本明細書で言及される配列のいずれかと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。
【０１２１】
当業者は、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性の割合をどのように計算するかを理解するであろう。２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性のパーセンテージを計算するために、２つの配列のアラインメントを最初に調製し、次に配列同一性値を計算しなければならない。２つの配列の同一性のパーセンテージは、（ｉ）配列をアラインさせるために使用される方法、例えばＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（異なるプログラムで実施される）、または３Ｄ比較からの構造アラインメントなど、（ｉｉ）使用されるパラメータ、例えば、局所対グローバルアラインメント、使用されるペアスコアマトリックス（例えば、ｂｌｏｓｕｍ６２、ｐａｍ２５０、ｇｏｎｎｅｔなど）、及びギャップペナルティ、例えば、機能的な形態及び定数に依存して、様々な値をとることができる。
【０１２２】
アライメントを行った後、２つの配列間の同一性のパーセンテージを計算する多くの様々な方法がある。例えば、同一性の数を、（ｉ）最短配列の長さ、（ｉｉ）アラインメントの長さ、（ｉｉｉ）配列の平均長さ、（ｉｖ）ギャップのない位置の数または（ｉｖ）オーバーハングを除く等価位置の数で除する。さらに、同一性のパーセンテージもまた、かなり長さに依存することが理解されよう。したがって、配列の対が短いほど、偶然に起こることが予想される配列同一性が高くなる。
【０１２３】
したがって、タンパク質またはＤＮＡ配列の正確なアラインメントは複雑なプロセスであることが理解されるであろう。一般的なマルチプルアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，４６７３−４６８０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４，４８７６−４８８２）は、本発明に従ってタンパク質またはＤＮＡの複数のアライメントを生成するための好ましい方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷに適したパラメータは以下の通りである：ＤＮＡアライメントの場合：Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１５．０、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝６．６６、及びＭａｔｒｉｘ＝Ｉｄｅｎｔｉｔｙ。タンパク質アライメントの場合：Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１０．０、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．２、及びＭａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ。ＤＮＡ及びタンパク質アラインメントについては、ＥＮＤＧＡＰ＝−１及びＧＡＰＤＩＳＴ＝４である。当業者は、最適な配列アライメントのためにこれら及び他のパラメータを変更する必要があり得ることを認識するであろう。
【０１２４】
好ましくは、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性のパーセンテージ計算は、（Ｎ／Ｔ）×１００として計算される（ここで、Ｎは配列が同一残基を共有する位置の数であり、Ｔはギャップを含むがオーバーハングを除く位置の総数である）。したがって、２つの配列間の同一性のパーセンテージを計算するための最も好ましい方法は、（ｉ）例えば上記のような適切なパラメータのセットを用いてｃｌｕｓｔａｌｗプログラムを使用して配列アラインメントを調製することと、（ｉｉ）ｎ及びｔの値を以下の式：−配列同一性＝（Ｎ／Ｔ）×１００に挿入することと、を含む。
【０１２５】
類似の配列を同定するための別の方法は、当業者によく知られている。例えば、実質的に類似のヌクレオチド配列は、本明細書中に示される核酸配列のいずれかまたはその相補物にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列によってコードされる。ストリンジェントな条件では、ヌクレオチドは、約４５℃で３ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のフィルター結合ＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズした後、約２０〜６５℃で０．２ｘ  ｓｓｃ／０．１％ＳＤＳ中で少なくとも１回洗浄することを意味する。あるいは、実質的に類似のポリペプチドは、本明細書に示される配列と少なくとも１個、５、１０、２０、５０または１００個未満のアミノ酸が異なることがある。
【０１２６】
遺伝暗号の縮重のために、本明細書に記載される任意の核酸配列は、それによってコードされるタンパク質の配列に実質的に影響を及ぼすことなく、変化または変更され得、その機能的変異体を提供することは明らかである。適切なヌクレオチド変異体は、配列内の同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変化した配列を有するものであり、したがってサイレントな変化を生じる。他の適切な変異体は、相同なヌクレオチド配列を有するが、配列の全部または一部を含むものであり、これは、アミノ酸をコードする異なるコドンが、それが置換するアミノ酸と同様の生物物理学的特性の側鎖と置換することによって改変され、保存的変化を生じる。例えば、小さな非極性の疎水性アミノ酸には、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、及びメチオニンが含まれる。大きな非極性の疎水性アミノ酸には、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが含まれる。極性中性アミノ酸には、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン及びグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性の）アミノ酸には、リシン、アルギニン及びヒスチジンが含まれる。負に帯電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。したがって、どのアミノ酸が類似の生物物理学的特性を有するアミノ酸で置き換えられてもよく、当業者はこれらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を知っている。
【０１２７】
本明細書（添付の請求項、要約書及び図面を含む）に記載されたすべての特徴、及び／またはそのように開示された方法またはプロセスのすべてのステップは、そのような特徴及び／またはステップの少なくともいくつかが相互に排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで上記の態様のいずれかと組み合わせることができる。
【実施例】
【０１２８】
材料及び方法
１）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント
Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの市販のキットを用いてＦ（ａｂ’）２フラグメントを得た：
【０１２９】
モノクローナル抗体（ｍＡＢ）抗Ａβ（オリゴマー及び原繊維特異性）抗体（ＩｇＧ１）Ｆ（ａｂ’）２生成：
０．５ｍＬの抗体（８ｍｇ／ｍＬ）を予め平衡化された固定化フィシンカラムに加え、２５時間インキュベートした（３７℃）。生成したＦ（ａｂ’）２フラグメントをＮＡｂプロテインＡカラムで精製し、１０００ｘｇで１分間遠心分離した。２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより、フロースルー濃度を分光光度的に測定した。
【０１３０】
モノクローナル抗体（ｍＡＢ）抗ＴｆＲ（トランスフェリン受容体）抗体（ＩｇＭ）Ｆ（ａｂ’）２生成：
予め平衡化した固定化ペプシンカラムを８ｍＬのＩｇＭ  Ｆ（ａｂ’）２消化緩衝液（２００ｍｌ、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３、ｐＨ４．５）で洗浄した。カラムと１ｍＬの抗体（１ｍｇ／ｍＬ）を別々に３分間インキュベートした（３７℃）。抗体をカラムに加え、１．５時間インキュベートした（３７℃）。生成したＦ（ａｂ’）２フラグメントをＣ３０濃縮器で遠心分離し、濃度を５９５ｎｍで吸光度を測定することによって分光光度的に測定した。
【０１３１】
２）二重特異性抗体合成（Ｆａｂ’生成を含む）
抗体合成は、Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ＩＳＢＮ：９７８−０−１２−３７０５０１−３に記載されているように行った。
【０１３２】
Ｆａｂ’生成：
１ｍＬの抗Ａβオリゴマー特異的抗体Ｆ（ａｂ’）２（１０ｍｇ／ｍＬ）を２０ｍＭ緩衝液（リン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に溶解した。６ｍｇの２−ＭＥＡ・ＨＣｌを添加し、１．５時間インキュベートした（３７℃）。過剰の２−ＭＥＡ・ＨＣｌをゲル濾過により除去した。プロトコールを抗ＴｆＲ抗体Ｆａｂ’生成について繰り返した。
【０１３３】
抗Ａβオリゴマー特異的抗体Ｆａｂ’（Ｆａｂ’Ａ）をＤＴＮＢ（４０ｍｇＤＴＮＢ、１０ｍｌ１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）に添加し、室温でインキュベートした。等モル比のＦａｂ’Ａ−ＤＴＮＢ及び抗ＴｆＲ抗体（Ｆａｂ’Ｂ）を混合し、１．５時間インキュベートした（３７℃）。反応物を一晩（４℃）インキュベートした。二重特異性ＢｓＡｂ画分を、ＰＢＳ中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムで精製した。
【０１３４】
３）ＣｄＳｅ／ＺｎＳナノ粒子の合成
Ｙａｎｇ  Ｘｕら及びＢ．Ｏ．Ｄａｂｂｏｕｓｉらの刊行物に基づいてシリカカプセル化を用いてナノ粒子を合成した。しかしながら、本明細書に記載のプロトコールは、外殻にガドリニウムをさらに組み込み、カルボキシル官能化を可能にして抗体フラグメントコンジュゲーションを可能にする。
【０１３５】
ＣｄＳｅ／ＺｎＳ合成：
セレン化物有機金属前駆体（すなわち、トリオクチルホスフィンセレン化物）の製造は、１００ｍｌのトリオクチルホスフィン中に０．１ｍｏｌのセレン化物を溶解させることによって達成され、それによってトリオクチルホスフィンセレニドの１Ｍ溶液が得られた。他の有機金属前駆体としてジメチルカドミウムを用いた。配位トリオクチルホスフィンオキシド溶媒中のジメチルカドミウム及びトリオクチルホスフィンセレニドの熱分解を介してＣｄＳｅ前駆物質（量子ドットとしても知られている）を合成した。前駆体を３５００℃で注入し、粒子／ドットを２９００℃で成長させた。選択的なサイズの沈殿をメタノールで行い、粒子を粉末として回収した後、それらをヘキサンに再分散させた。５ｇのトリオクチルホスフィンオキシドを真空下で１９０℃に達するまで加熱し、次いで６００℃に冷却した。０．３ｕｍｏｌのＣｄＳｅをヘキサンに分散させ、溶媒を留去しながら反応容器に移した。
【０１３６】
ヘキサメチルジシラザン及びジエチル亜鉛を亜鉛及び硫化物の前駆体として使用した。ＣｄＳｅコア前駆体の平均半径をＴＥＭから決定し、次に適切なＣｄＳｅ対ＺｎＳ比を計算した。これは、コアのシェル体積に対するシェル体積の比を考慮し、球状コア及びシェルを想定し、バルク格子パラメータを考慮に入れて行った。前駆体を不活性大気グローブボックス内のトリオクチルホスフィン３ｍＬに溶解した。前駆体を、トリオクチルホスフィンオキシド中に分散させたＣｄＳｅコアを有する反応フラスコに取り付けた添加ロートに移した。トリオクチルホスフィンを窒素雰囲気下で加熱し、次いで前駆体を１８００℃の温度で１０分間反応混合物に滴下した。次いで、混合物を３時間撹拌しながら９００℃に冷却し、５ｍＬのブタノールを添加して冷却時間中にトリオクチルホスフィンオキシドの固化を抑制した。ナノ粒子は溶液中に保存され、その表面はトリオクチルホスフィンオキシドで不動態化されたままであった。回収すると、粉末形成粒子をメタノールで沈殿させ、次いで溶媒（例えば、ヘキサン、ＴＨＦなど）中に再分散させた。
【０１３７】
キレート化ガドリニウム（Ｇｄ−ＤＯＴＡ）シリカカプセル化：
珪酸ナトリウム及びメルカプトプロピルトリメトキシシランを脱イオン水で０．１５％及び０．７％の最終パーセンテージに希釈した。０．１ｍＬの希釈メルカプトプロピルトリメトキシシランをＣｄＳｅ／ＺｎＳナノ粒子の１０ｍＬ溶液に添加し、次いで２０分間振とうした。これは、Ｚｎ／チオール結合を介して硫化亜鉛シェルとメルカプトプロピルトリメトキシシランとの結合を可能にし、シリカコーティングの堆積を可能にする。先に希釈したケイ酸ナトリウム溶液（ｐＨ１０）０．２ｍＬを加え、溶液をよく混合し、室温の暗室に保持してシリカの重合を可能にした。４時間後、溶液を８ｍＬのエタノール（１００％）を含有する別のバイアルに移して、過剰のケイ酸塩の沈殿のためにより厚いシリカコーティングの成長を可能にした。次いで、シリカカプセル化ナノ粒子を沈殿させた。得られたシリカカプセル化ナノ粒子を１０ｕｍｏｌの１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）モノ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに室温で２４時間添加した。ＤＯＴＡへのガドリニウムキレート化は、２モル当量のガドリニウム前駆体（Ｇｄ３＋、ＧｄＣｌ３）を室温で２４時間添加することによって達成した。Ｇｄ−ＤＯＴＡでドープされたシリカカプセル化ナノ粒子を、遠心分離及び洗浄によって集めた。
【０１３８】
Ｇｄ−ＤＯＴＡシリカカプセル化ナノ粒子のカルボキシル官能化：
４０ｇのＧｄ−ＤＯＴＡシリカカプセル化ナノ粒子を、室温で２４時間、１：２の脱イオン水−エタノール混合物（１２ｍＬ、４ｍＬ：１２ｍＬ）中の０．０５ｍｍｏｌのＡＰＴＥＳと反応させた。アミノ末端化した後、末端アミン基をカルボキシル基に変換するために、Ｇｄ−ＤＯＴＡシリカカプセル化ナノ粒子をエタノール中で２回洗浄し、次いで無水コハク酸（０．０６ｍｍｏｌ）の添加と共に無水ジメチルホルムアミド２０ｍＬ中に、室温で一晩再分散させた後、エタノールで２回洗浄する。
【０１３９】
ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミド塩酸塩）は、ペプチド固定化及びハプテン−キャリヤータンパク質コンジュゲーションを可能にする、第一級アミンとの自発的反応のためにカルボキシル基を活性化する水溶性カルボジイミド架橋剤である。コンジュゲーションは、二重特異性抗体のアミン基のカルボキシル基への共有結合を含む（Ｗｅｎ−Ｙｅｎ  Ｈｕａｎｇらに記載される）。
【０１４０】
カルボキシル官能化Ｇｄ−ＤＯＴＡシリカカプセル化ナノ粒子への二重特異性抗体コンジュゲーション：
２５ｍＭカルボキシル官能化Ｇｄ−ＤＯＴＡシリカカプセル化ナノ粒子を二重特異性抗体（１ｍｇ／ｍＬ）とカップリングさせた。使用直前にＥＤＣ（２０ｍＭ）／スルホ−ＮＨＳ（５０Ｍｍ）を調製した。２５０μＬのＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳを、カルボキシル官能化Ｇｄ−ＤＯＴＡシリカカプセル化ナノ粒子の溶液に添加した。反応物を室温で１０分間インキュベートし、７μＬの２−ＭＥＡを添加して過剰のＥＤＣをクエンチした。２５μＬの二重特異性抗体溶液を、活性化されたカルボキシル官能化Ｇｄ−ＤＯＴＡシリカカプセル化ナノ粒子に添加した。反応物を室温で６０分間インキュベートした。過剰の反応物及びスルホ−ＮＨＳを、Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４、５０ｍＭ）に対する透析によって除去した。
【０１４１】
５）凝集
アミロイド−ベータ１−４２の凝集プロトコールは、製造業者（ａｂｃａｍ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ−ｐｅｐｔｉｄｅ−１−４２−ｈｕｍａｎ−ａｂ１２０３０１．ｈｔｍｌ）によって提唱されている内容に従った。
【０１４２】
使用前、バイアルを開ける前に、製品が少なくとも１時間室温に平衡することが推奨される。アミロイドβ（１−４２）ヒトペプチドは、１００％ＨＦＩＰ（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール）中に１ｍｇ／ｍｌの濃度で最初に溶解する必要がある。この溶液は中程度の速度で時々ボルテックスして室温で１時間インキュベートする必要がある。次に、この溶液を水浴超音波処理機で１０分間超音波処理する必要がある。次いで、ＨＦＩＰ／ペプチド溶液を、穏やかな窒素ガス流下で乾燥する必要がある。１００％ＤＭＳＯを使用してペプチドを再懸濁する必要がある。この溶液は、時々ボルテックスしながら室温で１２分間インキュベートする必要がある。次いで、最終溶液をより少量に等分し、−８０℃で保存する必要がある。実際の溶液では、（使用する最終濃度に応じて）５００−１０００μｌのＤ−ＰＢＳをペプチド原液に添加し、室温で２時間インキュベートしてペプチド凝集させる。ゲル電気泳動により、アミロイド−ベータ種の分子量を決定した。
【０１４３】
６）表面プラズモン共鳴
表面プラズモン共鳴は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）を使用して実施し、実験設定は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ及びＢｉａｃｏｒｅ（商標）Ｓｅｎｓｏｒ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋに従った。
【０１４４】
ナノ粒子−プローブ親和性：
表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて、種々の標的に対する二重特異性抗体の親和性を決定した。デキストランマトリックスに０．４Ｍ  ＥＤＣ／１Ｍ  ＮＨＳ溶液を流速１０μｌ／分で７分間加えて表面を活性化させた。ＴｆＲ溶液（リガンド、５０μｇ／ｍＬ、ＰＢＳ希釈液）を流速１０μｌ／分で７分間添加した。１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を流速１０μｌ／分で７分間添加して、過剰の反応性基を失活させた。２倍濃度を含む様々な濃度のナノ粒子−プローブ溶液（検体、ＰＢＳ希釈剤）を使用した。参照分析のために未修飾の表面を使用した。リガンドとして様々なサイズのＡβオリゴマーを用いてプロトコールを繰り返した。
【０１４５】
７）直接的蛍光アッセイ
Ａβモノマー、オリゴマー、原繊維及びプラーク（１００ｐｇ／ｍｌ〜８００ｐｇ／ｍｌ）を、３８４ウェルプレート中のＰＢＳ（ｗ／５％ＢＳＡ）中でブロックした。プローブを添加し、室温で１時間インキュベートし、次いでＰＢＳ−Ｔで洗浄した。プレートリーダーを用いて８００ｎｍ（４８８ｎｍ励起）で蛍光を読み取った。
【０１４６】
８）アッセイキット
標準ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイキット（ＭＴＴ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＡＴＣＣ（登録商標）３０−１０１０Ｋ（商標））を使用して、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞に対するドットプローブの細胞傷害性を決定した。
【０１４７】
９）免疫蛍光法
ａｂｃａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／ｐｓ／ｐｄｆ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｄｏｕｂｌｅ％２０ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ％２０−ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ％２０ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｐｄｆ）に記載されているように、二重免疫蛍光法を実施した。
【０１４８】
免疫蛍光プロトコール：
カバースリップを室温で１時間、ポリエチレンイミンで被覆した。カバースリップを滅菌水で３回、それぞれ５分間すすいだ。カバースリップを完全に乾燥させ、次いでＵＶ光下で６時間完全に滅菌した。Ｃ５７Ｂｌ／Ｓｖ１２９細胞をガラスカバースリップ上で増殖させ、次いでリン酸緩衝生理食塩水で短時間すすいだ。細胞をＰＢＳＴ（ｗ／１％ＢＳＡ）中で３０分間インキュベートして、非特異的結合を減少させた。光退色を避けるために暗所に保存したコンジュゲート一次抗体（アミロイドβ１−４２（オリゴマー及び原繊維）及びビメンチン）をＰＢＳＴと共に４℃で一晩インキュベートした。溶液をデカントし、ＰＢＳ中でそれぞれ５分間３回洗浄した。細胞をまた、０．５μｇ／ｍｌのＤＡＰＩと共に１分間インキュベートし、次いでＰＢＳですすいだ。マウンティング剤をカバースリップ上に滴下し、乾燥を避けるためにネイルポリッシュを塗布することによってカバースリップを密封した。試料を−２００℃で暗所に保管した。共焦点顕微鏡法を用いて、免疫蛍光の結果を特徴づけた。
【０１４９】
実施例１−ナノ粒子
図１を参照すると、本発明によるナノ粒子２の一実施形態が示されている。ナノ粒子２は、アルツハイマー病またはハンチントン病のような神経変性障害を、各疾患において一般的なバイオマーカーを特異的に標的化することによって検出するために使用される。さらに、ナノ粒子２は、後述するように、疾患発症を阻止し予防することによって各疾患を治療するために使用することができる。
【０１５０】
ナノ粒子２（本明細書では「量子ドット」とも呼ぶ）は、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）でできた内部コア４からなり、それは硫化亜鉛（ＺｎＳ）シェル６でコーティングされ、それ自体がガドリニウム（Ｇｄ）−ＤＯＴＡシリカでカプセル化されて外側シェル８を形成する。他の実施形態では、コアは（ＣｄＳｅの代わりに）ＣｄＴｅ、ＣｄＳ、ＰｂＳまたはＰｂＳｅなどで構成され、シェルは（ＺｎＳの代わりに）ＣｄＳから構成され、Ｇｄの代わりに金ナノ粒子を用いることができる。一連の二重特異性抗体１０またはその抗原結合フラグメントがＧｄ−ＤＯＴＡシリカ殻８にコンジュゲートされる。各二重特異性抗体１０は、トランスフェリン受容体に対して免疫特異的である、すなわちＩｇＭ抗トランスフェリン受容体抗体のＦａｂ’フラグメントである第１のＦａｂ’フラグメント１２からなる。
【０１５１】
一実施形態では、第１のＦａｂ’フラグメント１２は、その露出したスルフヒドリル基を介して、アミロイドベータタンパク質のオリゴマー及び原繊維に免疫特異的である第２のＦａｂ’フラグメント１４にコンジュゲートされ、すなわち、それはＩｇＧ１抗アミロイドベータ（オリゴマー及び原繊維特異性）抗体のＦａｂ’フラグメントであり、アミロイドプラークに対して免疫特異的ではない。この第１の実施形態において、二重特異性抗体１０は、アルツハイマー病の診断／治療に使用することができる。しかし、第２の実施形態では、二重特異性抗体１０中の抗アミロイドβ（オリゴマー及び原繊維特異性）Ｆａｂ’フラグメント１４を標的に切り替えて、それにより他のバイオマーカー、例えばパーキンソン病のα−シヌクレインオリゴマー及び原繊維またはハンチントン病のハンチンチンを同定することによって、二重特異性抗体１０を他の神経変性疾患（パーキンソン病、ハンチントン病など）の診断／治療に用いるために改変できる。
【０１５２】
ＩｇＧ１抗アミロイドベータ（オリゴマー及び原繊維特異性）抗体フラグメント１４を作製するために使用した免疫原は、アミノ酸配列：ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡ−ＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号１）を有するヒトアミロイド−ベータ（１−４２）に対応する部分的に凝集した組換えペプチドであった。二重特異性抗体２は、ＩｇＭ抗トランスフェリン受容体抗体のＦａｂ’フラグメントに起因してトランスフェリン受容体に対して低い親和性を有し、受容体媒介トランスサイトーシスを介して血液脳関門を通過することができる。二重特異性抗体１０は、アミロイド−βオリゴマー及び原線維に特異的であり、アルツハイマーに至るその活性は、最初の症状が見られる１０年前に検出することができるが、一方アミロイド−βモノマー及びプラークとの低い交差反応性を示す。原繊維はオリゴマーよりも著しく大きく、アルツハイマー病の初期段階にも存在する。したがって、原繊維のみに対して原繊維及びオリゴマーを検出することが有益である。
【０１５３】
ナノ粒子２は、最初に、硫化亜鉛シェル６で囲まれた内側のカドミウムセレン化物コア４を形成することによって生成される。次に、シェル６は、ガドリニウムを混入したカルボキシル官能化シリカシェル８でカプセル化される。ナノ粒子２はカルボキシル官能化され、共有結合を用いてそれらのアミン基と反応することによりＦａｂ’フラグメント１２、１４とのタンパク質コンジュゲーションを可能にする。ナノ粒子２は、近赤外（ＮＩＲ  ＩＩ）領域で光を放出することができ、機能的ＮＩＲ  Ｉ分光法による非侵襲的検出能を有するフォトルミネッセンスの増加よる自己蛍光の減少を生じる。量子ドットの最大発光波長は８４５ｎｍであり、最大吸収波長は４９６ｎｍである。さらに、ナノ粒子２は、Ｇｄ−ＤＯＴＡシリカシェル８によるＭＲＩ検出特性を有する。
【０１５４】
そのコンジュゲートした二重特異性抗体１０を有するナノ粒子２は、神経毒性アミロイド−βオリゴマーを不溶性（固定化）にし、したがって、結合したオリゴマーは細胞への進入が容易でなく、その毒性が有意に低減される。
【０１５５】
実施例２−吸収及び発光スペクトルの評価
図２を参照すると、二重特異性抗体１０にコンジュゲートされたＧｄ−ＤＯＴＡシリカでカプセル化されたＣｄＳｅ／ＺｎＳナノ粒子２の吸収スペクトル及び発光スペクトルが示されている。ナノ粒子２は広い吸収スペクトルを示すが、量子ドットの特徴である識別可能なピークを有する比較的狭い発光スペクトルを示す。やはり量子ドットの特徴である、蛍光消光を最終的に減少させ、シグナルを増加させる大きな「ストークスシフト」もあった。発光ピークは８５０ｎｍであり、吸収ピークは４９６ｎｍであった。発光ピークは近赤外（ＮＩＲ）にあり、生体組織を浸透することができる。さらに、量子ドットの使用は、Ｈｏｎｇらによって記載されているように、＞２ｎｍまでの浸透深さを増加させる。
【０１５６】
実施例３細胞生存率試験
図３を参照すると、本発明のナノ粒子２への暴露後の細胞生存率を示す棒グラフが示されている。ナノ粒子２は、ニューロン細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３）に対して細胞毒性をほとんど示さず、シリカカプセル８及びカドミウムベースのコア４の周りのＺｎＳシェル６に、対照試料と比較して＞９０％である４８時間のインキュベーション期間後の細胞生存率が認められた。
【０１５７】
実施例４−ニューロン生存率試験
図４を参照すると、ナノ粒子２への曝露後のニューロン生存率を示す棒グラフが示されている。オリゴマー及び原繊維は、ニューロン細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３）に対して有意な細胞傷害性を示し、対照試料と比較して細胞生存率はそれぞれ２５％及び４２％である。しかし、結合したオリゴマー及び原繊維は、低下した細胞傷害性を示し、結合したオリゴマーが７１％であり、結合した原繊維が８３％である細胞生存率を示した。このように、ナノ粒子２は、アミロイドβの最も神経毒性の形態であるアミロイドβ原線維及びオリゴマーの細胞傷害性を減少させることによって、有意な治療可能性を示す。
【０１５８】
実施例５−トランスフェリン受容体へのナノ粒子の親和性
図５は、トランスフェリン受容体に対するナノ粒子２の親和性を決定するために使用される表面プラズモン共鳴の結果を示す。ナノ粒子２は１．３６×１０−４のマイクロモルＫｄ（解離定数）値を有していた。この高いＫｄ値は、トランスフェリン受容体に対する低い親和性の実証である。トランスフェリン受容体に対する低い親和性のために、ナノ粒子２は、受容体媒介トランスサイトーシスを介して血液脳関門を通過することができる。二重特異性抗体１０中の抗トランスフェリン受容体Ｆａｂ’１２はＩｇＭであり、ＩｇＭは天然に低い親和性を有する傾向がある。
【０１５９】
実施例６−蛍光実験
図６〜１１は、ナノ粒子２の蛍光データを示す。示されているように、顕著な蛍光が結合した原繊維及びオリゴマーから放出された。原繊維から放出された蛍光は一定のままであった。しかしながら、図１１に見られるように、結合したオリゴマー種から放出された蛍光は、オリゴマーの「サイズ」（分子量）に依存していた。図９は、５７ｋＤａ以上の結合したオリゴマーがモノマー及び原線維からほとんど蛍光を発しない結果をもたらすことを示し、したがって、ナノ粒子２が他のアミロイド−β種との交差反応性がほとんどなく、誤診の機会を減らすことが示された。
【０１６０】
実施例７−アミロイド−βオリゴマーの検出
図１２を参照すると、Ｃ５７Ｂｌ／Ｓｖ１２９の免疫蛍光染色が示されている。図１２（ａ）はＤＡＰＩ核染色を示し、図１２（ｂ）はインスリンの局在を示し、図１２（ｃ）はアミロイド−βオリゴマーを示す。免疫蛍光の成功は、ナノ粒子２が細胞内アミロイド−βオリゴマーをうまく標的化できることを実証する。
【０１６１】
図１３は、異なる免疫蛍光アプローチが行われたことを示す。ナノ粒子をアミロイド−βオリゴマーを含む培地に加え、予め１５分間インキュベートした。図１２と比較して、より少ないオリゴマーが培地から細胞に入ることができるので、アミロイド−ベータオリゴマーの細胞内レベルの有意な減少がある。これは、ナノ粒子が細胞内への神経毒性タンパク質の侵入を妨げる可能性があることを実証する。
【０１６２】
実施例８−ナノ粒子の治療可能性
図１４〜１７は、アミロイド−ベータオリゴマーとナノ粒子２を３０分間以上一緒にインキュベートした後の結果を示す。次に、結合したオリゴマーを含む培地を神経外胚葉細胞に導入した。共焦点像で見られるように、細胞内アミロイドベータはごくわずかであった。図１３に示すように、インキュベーション時間が１５分の場合、一部のアミロイド−βオリゴマーは依然として培地から細胞に侵入することができたが、３０分間以上のインキュベーション時間後に、細胞内に非常に少ないオリゴマーが存在した。これは、ナノ粒子２が、神経毒性アミロイド−βオリゴマーに結合し、それらが細胞に入るのを阻害することにより、治療可能性を有することを示す。
【０１６３】
討論
このデータは、Ｇｄ−ＤＯＴＡシリカ外殻８にコンジュゲートされた二重特異性抗体１０からなる本発明のナノ粒子２が、細胞内アミロイド−β種を標的とする能力を示す一方、低い細胞傷害性を示したことを示す。ナノ粒子２は、アミロイドベータモノマー及びプラークとの低い交差反応性を示したが、アミロイドベータオリゴマー及び原繊維に対する高い親和性を示した。ナノ粒子２はまた、受容体媒介トランスサイトーシスを介して血液脳関門を通過するのに必要な特性であるトランスフェリン受容体に対して低い親和性を示した。外側シェル８はカルボキシル官能化されて、抗体Ｆａｂ’フラグメントの直接的なタンパク質コンジュゲーションを可能した。ナノ粒子はまた、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ組成物のために、ＮＩＲにおいて最大８５０ｎｍで光を放出することが実証された。Ｇｄ−ＤＯＴＡシリカカプセル化（すなわち外殻８）は、ナノ粒子２の生体適合性を有意に改善し、その毒性を劇的に低下させ、Ｇｄは潜在的なＭＲＩ検出を可能にする。
【０１６４】
本発明者は、ナノ粒子２はまた、免疫蛍光によって示されるように、不溶性にされたために細胞に入ることが容易ではないオリゴマーに結合することにより、治療効果を示すことを観察して驚いた。
【０１６５】
ナノ粒子２の重要な特徴は、ナノ粒子２が血液脳関門を通過することを可能にするので、ＩｇＭ抗トランスフェリン受容体抗体Ｆａｂ’フラグメント１２である。しかし、二重特異性抗体の合成に使用されるＩｇＧ１抗アミロイドβ（オリゴマー及び原線維特異性）抗体Ｆａｂ’フラグメント１４は、他の神経変性疾患を診断する他のタンパク質オリゴマー及び原線維を検出する抗体で置き換えることができる。例えば、パーキンソン病では、抗アルファシヌクレイン（オリゴマー及び原繊維特異性）抗体などの抗体を使用して、パーキンソン病の特徴的なバイオマーカーを同定することができる。
【０１６６】
参考文献
１．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｃｏａｔｅｄ  ＣｄＳｅ／ＣｄＳ  Ｃｏｒｅ／Ｓｈｅｌｌ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓ，（Ｙａｎｇ  Ｘｕ，Ｄｒ．Ｋａｔｈｌｅｅｎ  Ｍｅｅｈａｎ，Ｄｒ．Ｌｏｕｉｓ  Ｊ．Ｇｕｉｄｏ，Ｄｒ．Ｇｕｏｑｕａｎ  Ｌｕ，Ｄｒ．Ｃｈｒｉｓ  Ｌ．Ｗｙａｔｔ，Ｄｒ．Ｎａｎｃｙ  Ｇ．Ｌｏｖｅ），Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００５，Ｂｌａｃｋｓｂｕｒｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ
２．（ＣｄＳｅ）ＺｎＳ  Ｃｏｒｅ−Ｓｈｅｌｌ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓｉｚｅ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｔｅｓ  Ｂ．Ｏ．Ｄａｂｂｏｕｓｉ，Ｊ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｖｉｅｊｏ，Ｆ．Ｖ．Ｍｉｋｕｌｅｃ，Ｊ．Ｒ．Ｈｅｉｎｅ，Ｈ．Ｍａｔｔｏｕｓｓｉ，Ｒ．Ｏｂｅｒ，Ｋ．Ｆ．Ｊｅｎｓｅｎ，ａｎｄ  Ｍ．Ｇ．Ｂａｗｅｎｄｉ
３．Ｇａｄｏｌｉｎｉｕｍ−ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｌａｑｕｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．Ｐｅｔｉｅｔ  Ａ，Ｓａｎｔｉｎ  Ｍ，Ｂｅｒｔｒａｎｄ  Ａ，Ｗｉｇｇｉｎｓ  ＣＪ，Ｐｅｔｉｔ  Ｆ，Ｈｏｕｉｔｔｅ  Ｄ，Ｈａｎｔｒａｙｅ  Ｐ，Ｂｅｎａｖｉｄｅｓ  Ｊ，Ｄｅｂｅｉｒ  Ｔ，Ｒｏｏｎｅｙ  Ｔ，Ｄｈｅｎａｉｎ  Ｍ．
４．Ｂｏｏｓｔｉｎｇ  ｂｒａｉｎ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｉｔｓ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ａ  ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ  ｔａｒｇｅｔ．Ｙｕ  ＹＪ，Ｚｈａｎｇ  Ｙ，Ｋｅｎｒｉｃｋ  Ｍ，Ｈｏｙｔｅ  Ｋ，Ｌｕｋ  Ｗ，Ｌｕ  Ｙ，Ａｔｗａｌ  Ｊ，Ｅｌｌｉｏｔｔ  ＪＭ，Ｐｒａｂｈｕ  Ｓ，Ｗａｔｔｓ  ＲＪ，Ｄｅｎｎｉｓ  ＭＳ．（２０１１  Ｍａｙ  ２５）
５．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ  Ｍ  Ｎｅｍｅｙｅｒ  ２００４
６．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｇｒｅｇ  Ｔ  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ２００８
７．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：β−ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  
Ｓｅｅｍａｎ  Ｐ，Ｓｅｅｍａｎ  Ｎ
８．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｕｇｇｅｓｔｓ  ａｎ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ａβ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  Ｒａｌｆ，Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈａ，Ｋａｔｈａｒｉｎａ  Ｔｅｐｐｅｒ，Ｒａｉｋ  Ｒｏｎｉｃｋｅｃ，Ｍａｌｌｅ  Ｓｏｏｍａ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｗｅｓｔｅｒｍａｎｎｄ，Ｋｌａｕｓ  Ｒｅｙｍａｎｎｃ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ  Ｋａｅｔｈｅｒａ，ａｎｄ  Ｍａｒｃｕｓ  Ｆａｎｄｒｉｃｈａ
９．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ＡＰＰ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ  ｏｒ  Ｃｙ３：ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ．Ｆｅｎｇ  Ｌ，Ｌｉ  Ｓ，Ｘｉａｏ  Ｂ，Ｃｈｅｎ  Ｓ，Ｌｉｕ  Ｒ，Ｚｈａｎｇ  Ｙ．
（２０１０  ２５ｔｈ  Ｍａｒｃｈ）
１０．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃ  ａｍｙｌｏｉｄ−β１−４２  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｔｏ  ｆｉｂｒｉｌｓ
Ｍａｈｉｕｄｄｉｎ  Ａｈｍｅｄ，Ｊｕｄｉａｎｎｅ  Ｄａｖｉｓ，Ｄａｒｒｙｌ  Ａｕｃｏｉｎ，Ｔａｋｅｓｈｉ  Ｓａｔｏ，Ｓｈｉｖａｎｉ  Ａｈｕｊａ，Ｓａｂｕｒｏ  Ａｉｍｏｔｏ，Ｊａｍｅｓ  Ｉ  Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ  Ｖａｎ  Ｎｏｓｔｒａｎｄ  ＆  Ｓｔｅｖｅｎ  Ｏ  Ｓｍｉｔｈ（２０１０  Ｍａｒｃｈ  ５ｔｈ）
１１．Ａｍｙｌｏｉｄ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ：ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ａｂ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  Ｍａｓａｆｕｍｉ  Ｓａｋｏｎｏ  ａｎｄ  Ｔａｍｏｔｓｕ  Ｚａｋｏ１（６ｔｈ  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１０）
１２．Ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｖｅｒｓｕｓ  ｈｉｇｈ−ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  Ｔｈｏｍａｓ  Ｊ．Ｅｓｐａｒｚａ  ＢＳ１，Ｈａｎｚｈｉ  Ｚｈａｏ  ＢＳ１，Ｊｏｈｎ  Ｒ．Ｃｉｒｒｉｔｏ  ＰｈＤ１，２，３，Ｎｉｇｅｌ  Ｊ．Ｃａｉｒｎｓ  ＰｈＤ１，３，４，Ｒａｎｄａｌｌ  Ｊ．Ｂａｔｅｍａｎ  ＭＤ１，２，３，Ｄａｖｉｄ  Ｍ．Ｈｏｌｔｚｍａｎ  ＭＤ１，２，３，５  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌ．Ｂｒｏｄｙ  ＭＤ，ＰｈＤ１，２，＊（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ７ｔｈ  ２０１２）
１３．Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｂｉｏｍｏｌ
１４．Ｃｙｓ  ｄｉａｂｏｄｙ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（ＩｍｍｕｎｏＱｄｏｔｓ）  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｂｈａｓｗａｔｉ  Ｂａｒａｔ，†  Ｓｈａｎｎｏｎ  Ｓｉｒｋ，†  Ｋａｔｅｌｙｎ  ＭｃＣａｂｅ，†  Ｊｉａｎｑｉｎｇ  Ｌｉ，‡  Ｅｒｉｃ  Ｊ  Ｌｅｐｉｎ，†  Ｒｏｌａｎｄ  Ｒｅｍｅｎｙｉ，Ａｉ  Ｌｅｅｎ  Ｋｏｈ，¶  Ｔｏｖｅ  Ｏｌａｆｓｅｎ，†  Ｓａｎｊｉｖ  Ｓ．Ｇａｍｂｈｉｒ，§  Ｓｈｉｍｏｎ  Ｗｅｉｓｓ，‡  ａｎｄ  Ａｎｎａ  Ｍ．Ｗｕ†＊
１５．Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｍａｕｒｅｅｎ  Ａ．Ｗａｌｌｉｎｇ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ａ．Ｎｏｖａｋ  ａｎｄ  Ｊａｓｏｎ  Ｒ．Ｅ．Ｓｈｅｐａｒｄ  ＊（２００９）
１６．Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｍａｕｒｅｅｎ  Ａ．Ｗａｌｌｉｎｇ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ａ．Ｎｏｖａｋ  ａｎｄ  Ｊａｓｏｎ  Ｒ．Ｅ．Ｓｈｅｐａｒｄ  ＊（２００９）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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