(57)【要約】  本発明は、（ａ）ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤または薬学的に許容されるその塩と、（ｂ）Ｈｅｒ３アンタゴニストとを含む、乳がん脳転移を処置するために、同時に、別々に、または逐次的に投与するための医薬組合せ物；前記組合せ物を、それを必要としている対象に投与することを含む、乳がん脳転移を有する対象を処置する方法；乳がん脳転移を処置するためのそのような組合せ物の使用、およびそのような組合せ物を含む市販用パッケージに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2018506511.tif 000038
［式中、ＷはＣＲｗまたはＮであり、
Ｒｗは以下からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ハロゲン、
（４）メチル、
５）トリフルオロメチル、
（６）スルホンアミド、
Ｒ１は以下からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ニトロ、
（４）ハロゲン、
（５）置換および非置換のアルキル、
（６）置換および非置換のアルケニル、
（７）置換および非置換のアルキニル、
（８）置換および非置換のアリール、
（９）置換および非置換のヘテロアリール、
（１０）置換および非置換のヘテロシクリル、
（１１）置換および非置換のシクロアルキル、
（１２）−ＣＯＲ１ａ、
（１３）−ＣＯ２Ｒ１ａ、
（１４）−ＣＯＮＲ１ａＲ１ｂ、
（１５）−ＮＲ１ａＲ１ｂ、
（１６）−ＮＲ１ａＣＯＲ１ｂ、
（１７）−ＮＲ１ａＳＯ２Ｒ１ｂ、
（１８）−ＯＣＯＲ１ａ、
（１９）−ＯＲ１ａ、
（２０）−ＳＲ１ａ、
（２１）−ＳＯＲ１ａ、
（２３）−ＳＯ２ＮＲｌａＲ１ｂ
Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、独立して以下からなる群から選択され：
（ａ）水素、
（ｂ）置換または非置換のアルキル、
（ｃ）置換および非置換のアリール、
（ｄ）置換および非置換のヘテロアリール、
（ｅ）置換および非置換のヘテロシクリル、ならびに
（ｆ）置換および非置換のシクロアルキル、
Ｒ２は以下からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ニトロ、
（４）ハロゲン、
（５）ヒドロキシ、
（６）アミノ、
（７）置換および非置換のアルキル、
（８）−ＣＯＲ２ａ、ならびに
（９）−ＮＲ２ａＣＯＲ２ｂ
Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、独立して以下からなる群から選択され：
（ａ）水素、および
（ｂ）置換または非置換のアルキル；
Ｒ３は以下からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ニトロ、
（４）ハロゲン、
（５）置換および非置換のアルキル、
（６）置換および非置換のアルケニル、
（７）置換および非置換のアルキニル、
（８）置換および非置換のアリール、
（９）置換および非置換のヘテロアリール、
（１０）置換および非置換のヘテロシクリル、
（１１）置換および非置換のシクロアルキル、
（１２）−ＣＯＲ３ａ、
（１４）−ＮＲ３ａＲ３ｂ
（１３）−ＮＲ３ａＣＯＲ３ｂ、
（１５）−ＮＲ３ａＳＯ２Ｒ３ｂ、
（１６）−ＯＲ３ａ、
（１７）−ＳＲ３ａ、
（１８）−ＳＯＲ３ａ、
（１９）−ＳＯ２Ｒ３ａ
Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立して以下からなる群から選択され：
（ａ）水素、
（ｂ）置換または非置換のアルキル、
（ｃ）置換および非置換のアリール、
（ｄ）置換および非置換のヘテロアリール、
（ｅ）置換および非置換のヘテロシクリル、ならびに
（ｆ）置換および非置換のシクロアルキル、ならびに
Ｒ４は以下からなる群から選択される：
（１）水素、および
（２）ハロゲン］または薬学的に許容されるその塩と、（ｂ）配列番号１のＨＥＲ３受容体のドメイン２内のアミノ酸残基２６５〜２７７および３１５、ならびにドメイン４内のアミノ酸残基５７１、５８２〜５８４、５９６〜５９７、６００〜６０２、および６０９〜６１５を含むＨＥＲ３受容体のコンホメーションエピトープを認識するＨｅｒ３アンタゴニストとを含み、前記抗体またはその断片が、リガンド依存性およびリガンド非依存性のシグナル伝達をどちらも遮断する、乳がん脳転移の処置に使用するために、同時に、別々に、または逐次的に投与するための医薬組合せ物。
【請求項２】
前記式（Ｉ）の化合物が５−（２，６−ジ−モルホリン−４−イル−ピリミジン−４−イル）−４−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イルアミン、または薬学的に許容されるその塩である、請求項１に記載の医薬組合せ物。
【請求項３】
前記Ｈｅｒ３アンタゴニストが、配列番号１２８のＣＤＲ１、配列番号１２９のＣＤＲ２、および配列番号１３０のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１３１のＣＤＲ１、配列番号１３２のＣＤＲ２、および配列番号１３３のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の医薬組合せ物。
【請求項４】
乳がん脳転移を処置するための医薬を調製するための、請求項１に記載の組合せ物の使用。
【請求項５】
（ａ）式（Ｉ）の化合物：
【化２】
2018506511.tif 000039
［式中、ＷはＣＲｗまたはＮであり、
Ｒｗは以下からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ハロゲン、
（４）メチル、
５）トリフルオロメチル、
（６）スルホンアミド、
Ｒ１は以下からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ニトロ、
（４）ハロゲン、
（５）置換および非置換のアルキル、
（６）置換および非置換のアルケニル、
（７）置換および非置換のアルキニル、
（８）置換および非置換のアリール、
（９）置換および非置換のヘテロアリール、
（１０）置換および非置換のヘテロシクリル、
（１１）置換および非置換のシクロアルキル、
（１２）−ＣＯＲ１ａ、
（１３）−ＣＯ２Ｒ１ａ、
（１４）−ＣＯＮＲ１ａＲ１ｂ、
（１５）−ＮＲ１ａＲ１ｂ、
（１６）−ＮＲ１ａＣＯＲ１ｂ、
（１７）−ＮＲ１ａＳＯ２Ｒ１ｂ、
（１８）−ＯＣＯＲ１ａ、
（１９）−ＯＲ１ａ、
（２０）−ＳＲ１ａ、
（２１）−ＳＯＲ１ａ、
（２３）−ＳＯ２ＮＲｌａＲ１ｂ
Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、独立して以下からなる群から選択され：
（ａ）水素、
（ｂ）置換または非置換のアルキル、
（ｃ）置換および非置換のアリール、
（ｄ）置換および非置換のヘテロアリール、
（ｅ）置換および非置換のヘテロシクリル、ならびに
（ｆ）置換および非置換のシクロアルキル、
Ｒ２は以下からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ニトロ、
（４）ハロゲン、
（５）ヒドロキシ、
（６）アミノ、
（７）置換および非置換のアルキル、
（８）−ＣＯＲ２ａ、ならびに
（９）−ＮＲ２ａＣＯＲ２ｂ
Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、独立して以下からなる群から選択され：
（ａ）水素、および
（ｂ）置換または非置換のアルキル；
Ｒ３は以下からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ニトロ、
（４）ハロゲン、
（５）置換および非置換のアルキル、
（６）置換および非置換のアルケニル、
（７）置換および非置換のアルキニル、
（８）置換および非置換のアリール、
（９）置換および非置換のヘテロアリール、
（１０）置換および非置換のヘテロシクリル、
（１１）置換および非置換のシクロアルキル、
（１２）−ＣＯＲ３ａ、
（１４）−ＮＲ３ａＲ３ｂ
（１３）−ＮＲ３ａＣＯＲ３ｂ、
（１５）−ＮＲ３ａＳＯ２Ｒ３ｂ、
（１６）−ＯＲ３ａ、
（１７）−ＳＲ３ａ、
（１８）−ＳＯＲ３ａ、
（１９）−ＳＯ２Ｒ３ａ
Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立して以下からなる群から選択され：
（ａ）水素、
（ｂ）置換または非置換のアルキル、
（ｃ）置換および非置換のアリール、
（ｄ）置換および非置換のヘテロアリール、
（ｅ）置換および非置換のヘテロシクリル、ならびに
（ｆ）置換および非置換のシクロアルキル、ならびに
Ｒ４は以下からなる群から選択される：
（１）水素、および
（２）ハロゲン］または薬学的に許容されるその塩と、（ｂ）配列番号１のＨＥＲ３受容体のドメイン２内のアミノ酸残基２６５〜２７７および３１５、ならびにドメイン４内のアミノ酸残基５７１、５８２〜５８４、５９６〜５９７、６００〜６０２、および６０９〜６１５を含むＨＥＲ３受容体のコンホメーションエピトープを認識するＨｅｒ３アンタゴニストとを含む、併用で治療上有効な医薬組合せ物の量を、それを必要としている対象に投与することを含む、乳がん脳転移を処置する方法。
【請求項６】
前記Ｈｅｒ３アンタゴニストが、配列番号１２８のＣＤＲ１、配列番号１２９のＣＤＲ２、および配列番号１３０のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１３１のＣＤＲ１、配列番号１３２のＣＤＲ２、および配列番号１３３のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記式（Ｉ）の化合物が５−（２，６−ジ−モルホリン−４−イル−ピリミジン−４−イル）−４−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イルアミン、または薬学的に許容されるその塩である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｈｅｒ３アンタゴニストを、７〜２８日毎に２０ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌの用量で投与し、前記式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩を、毎日、約６０ｍｇ／日から約１２０ｍｇ／日までの範囲の用量で投与する、請求項５から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記医薬組合せ物を、同時に、別々に、または逐次的に投与する、請求項５から７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から３に記載の医薬組合せ物を、乳がん脳転移の前記処置における、その前記同時の、別々の、または逐次的な投与のための指示と共に含む市販用パッケージ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ａ）ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤または薬学的に許容されるその塩と、（ｂ）Ｈｅｒ３アンタゴニストとを含む、脳内の転移性乳がん（本明細書中で乳がん脳転移と呼ぶ）を処置するために、同時に、別々に、または逐次的に投与するための医薬組合せ物に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳がんのためのＨＥＲ２を標的とする療法の開発および最適化において、大きな進歩が達成されている。転移性疾患について有意な臨床的有効性を有する、ＦＤＡ認可された薬物の例には、抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ、二重ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２キナーゼ阻害剤ラパチニブ、抗ＨＥＲ２−ＨＥＲ３二量体化阻害剤ペルツズマブ、および抗体−薬物コンジュゲートＴ−ＤＭ１が含まれる（Krop, I.E., et al.Lancet Oncol (2014)、Slamon, D.J., et al.The New England journal of medicine 344, 783-792 (2001)）。臨床データは、アジュバントトラスツズマブ療法の後に脳転移（ＢＭ）の発生率の増加を明らかにしている（Olson, E.M., et al. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO 24, 1526-1533 (2013)）。この発生率は、進行疾患を有する患者においては５０％にもなる。確立されたＢＭは、しばしばトラスツズマブに対して耐性を示し、これは、主として、抗体が血液脳関門（ＢＢＢ）を通って貫通することが不十分なことに原因がある現象である（Lampson, L.A. mAbs 3, 153-160 (2011)）。しかし、十分な薬物送達にもかかわらず、ＢＭに対する小分子の有効性も非常に限定的であり、さらなる治療様式の付加によってわずかしか増加させることができない（Lin, N.U., et al. Journal of clinical oncology 26, 1993-1999 (2008)、Lin, N.U., et al. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 15, 1452-1459 (2009)、Bachelot, T., et al. The lancet oncology 14, 64-71 (2013)）。脳転移は乳がんの破壊的な進行である。処置の選択肢は限定的であり、全身的に成長を遅らせるものと同じ抗ＨＥＲ２療法は、典型的には脳転移を制御しない。したがって、乳がん脳転移を処置するために有用であり得る薬物を同定する必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
乳がん脳転移は脳内の転移性乳がんの結果である。本発明は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤とＨｅｒ３アンタゴニストの組合せ物を、乳がん脳転移を処置するために使用できるという驚くべき発見に基づいている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一態様では、本発明は、（ａ）式（Ｉ）の化合物からなる群から選択されるホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤：
【０００５】
【化１】
2018506511.tif 000002
［式中、ＷはＣＲｗまたはＮであり、
Ｒｗは以下からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ハロゲン、
（４）メチル、
５）トリフルオロメチル、
（６）スルホンアミド、
Ｒ１は以下からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ニトロ、
（４）ハロゲン、
（５）置換および非置換のアルキル、
（６）置換および非置換のアルケニル、
（７）置換および非置換のアルキニル、
（８）置換および非置換のアリール、
（９）置換および非置換のヘテロアリール、
（１０）置換および非置換のヘテロシクリル、
（１１）置換および非置換のシクロアルキル、
（１２）−ＣＯＲ１ａ、
（１３）−ＣＯ２Ｒ１ａ、
（１４）−ＣＯＮＲ１ａＲ１ｂ、
（１５）−ＮＲ１ａＲ１ｂ、
（１６）−ＮＲ１ａＣＯＲ１ｂ、
（１７）−ＮＲ１ａＳＯ２Ｒ１ｂ、
（１８）−ＯＣＯＲ１ａ、
（１９）−ＯＲ１ａ、
（２０）−ＳＲ１ａ、
（２１）−ＳＯＲ１ａ、
（２３）−ＳＯ２ＮＲｌａＲ１ｂ
Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、独立して以下からなる群から選択され：
（ａ）水素、
（ｂ）置換または非置換のアルキル、
（ｃ）置換および非置換のアリール、
（ｄ）置換および非置換のヘテロアリール、
（ｅ）置換および非置換のヘテロシクリル、ならびに
（ｆ）置換および非置換のシクロアルキル、
Ｒ２は以下からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ニトロ、
（４）ハロゲン、
（５）ヒドロキシ、
（６）アミノ、
（７）置換および非置換のアルキル、
（８）−ＣＯＲ２ａ、ならびに
（９）−ＮＲ２ａＣＯＲ２ｂ
Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、独立して以下からなる群から選択され：
（ａ）水素、および
（ｂ）置換または非置換のアルキル；
Ｒ３は以下からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ニトロ、
（４）ハロゲン、
（５）置換および非置換のアルキル、
（６）置換および非置換のアルケニル、
（７）置換および非置換のアルキニル、
（８）置換および非置換のアリール、
（９）置換および非置換のヘテロアリール、
（１０）置換および非置換のヘテロシクリル、
（１１）置換および非置換のシクロアルキル、
（１２）−ＣＯＲ３ａ、
（１４）−ＮＲ３ａＲ３ｂ
（１３）−ＮＲ３ａＣＯＲ３ｂ、
（１５）−ＮＲ３ａＳＯ２Ｒ３ｂ、
（１６）−ＯＲ３ａ、
（１７）−ＳＲ３ａ、
（１８）−ＳＯＲ３ａ、
（１９）−ＳＯ２Ｒ３ａ
Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立して以下からなる群から選択され：
（ａ）水素、
（ｂ）置換または非置換のアルキル、
（ｃ）置換および非置換のアリール、
（ｄ）置換および非置換のヘテロアリール、
（ｅ）置換および非置換のヘテロシクリル、ならびに
（ｆ）置換および非置換のシクロアルキル、ならびに
Ｒ４は以下からなる群から選択される：
（１）水素、および
（２）ハロゲン］または薬学的に許容されるその塩と、（ｂ）Ｈｅｒ３抗体またはその断片などのＨｅｒ３アンタゴニストとを含み、抗体または断片が、配列番号１のＨＥＲ３受容体のドメイン２内のアミノ酸残基２６５〜２７７および３１５ならびにドメイン４内のアミノ酸残基５７１、５８２〜５８４、５９６〜５９７、６００〜６０２、および６０９〜６１５を含むＨＥＲ３受容体のコンホメーションエピトープを認識し、抗体またはその断片が、リガンド依存性およびリガンド非依存性のシグナル伝達をどちらも遮断する、乳がん脳転移を処置するために、同時に、別々に、または逐次的に投与するための医薬組合せ物に関する。
【０００６】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、５−（２，６−ジ−モルホリン−４−イル−ピリミジン−４−イル）−４−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イルアミンまたはその塩酸塩である。
【０００７】
別の実施形態では、Ｈｅｒ３抗体または断片は、以下の表１に示す重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、Ｈｅｒ３抗体または断片は、配列番号１２８の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１２９のＣＤＲ２、配列番号１３０のＣＤＲ３、ならびに配列番号１３１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１３２のＣＤＲ２、および配列番号１３３のＣＤＲ３を含む。別の例では、ＨＥＲ３アンタゴニストはＭＯＲ１０７０３であってよく、その配列は以下の表１中に示されている。
【０００８】
別の実施形態では、本発明の医薬組合せ物には、５−（２，６−ジ−モルホリン−４−イル−ピリミジン−４−イル）−４−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イルアミンまたはその塩酸塩、ならびに、配列番号１のＨＥＲ３受容体のドメイン２内のアミノ酸残基２６５〜２７７および３１５ならびにドメイン４内のアミノ酸残基５７１、５８２〜５８４、５９６〜５９７、６００〜６０２、および６０９〜６１５を含むＨＥＲ３受容体のコンホメーションエピトープを認識し、リガンド依存性およびリガンド非依存性のシグナル伝達をどちらも遮断する抗体またはその断片が含まれる。
【０００９】
別の実施形態では、本発明の医薬組合せ物には、５−（２，６−ジ−モルホリン−４−イル−ピリミジン−４−イル）−４−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イルアミンまたはその塩酸塩、ならびに、配列番号１２８の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１２９のＣＤＲ２、配列番号１３０のＣＤＲ３、ならびに配列番号１３１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１３２のＣＤＲ２、および配列番号１３３のＣＤＲ３を含むＨｅｒ３抗体または断片が含まれる。
【００１０】
別の態様では、本発明は、（ａ）式（Ｉ）の化合物からなる群から選択されるホスファチジルイノシトール３−キナーゼまたは薬学的に許容されるその塩と、（ｂ）Ｈｅｒ３抗体またはその断片などのＨｅｒ３アンタゴニストとを含む、乳がん脳転移を処置するためおよび／または乳がん脳転移を処置するための医薬を調製するための医薬組合せ物の使用に関する。
【００１１】
一実施形態では、乳がん脳転移はＨＥＲ２陽性乳がん脳転移である。
【００１２】
別の態様では、本発明は、（ａ）式（Ｉ）の化合物からなる群から選択されるホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤：
【００１３】
【化２】
2018506511.tif 000003
［式中、ＷはＣＲｗまたはＮであり、
Ｒｗは以下からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ハロゲン、
（４）メチル、
５）トリフルオロメチル、
（６）スルホンアミド、
Ｒ１は以下からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ニトロ、
（４）ハロゲン、
（５）置換および非置換のアルキル、
（６）置換および非置換のアルケニル、
（７）置換および非置換のアルキニル、
（８）置換および非置換のアリール、
（９）置換および非置換のヘテロアリール、
（１０）置換および非置換のヘテロシクリル、
（１１）置換および非置換のシクロアルキル、
（１２）−ＣＯＲ１ａ、
（１３）−ＣＯ２Ｒ１ａ、
（１４）−ＣＯＮＲ１ａＲ１ｂ、
（１５）−ＮＲ１ａＲ１ｂ、
（１６）−ＮＲ１ａＣＯＲ１ｂ、
（１７）−ＮＲ１ａＳＯ２Ｒ１ｂ、
（１８）−ＯＣＯＲ１ａ、
（１９）−ＯＲ１ａ、
（２０）−ＳＲ１ａ、
（２１）−ＳＯＲ１ａ、
（２３）−ＳＯ２ＮＲｌａＲ１ｂ
Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、独立して以下からなる群から選択され：
（ａ）水素、
（ｂ）置換または非置換のアルキル、
（ｃ）置換および非置換のアリール、
（ｄ）置換および非置換のヘテロアリール、
（ｅ）置換および非置換のヘテロシクリル、ならびに
（ｆ）置換および非置換のシクロアルキル、
Ｒ２は以下からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ニトロ、
（４）ハロゲン、
（５）ヒドロキシ、
（６）アミノ、
（７）置換および非置換のアルキル、
（８）−ＣＯＲ２ａ、ならびに
（９）−ＮＲ２ａＣＯＲ２ｂ
Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、独立して以下からなる群から選択され：：
（ａ）水素、および
（ｂ）置換または非置換のアルキル；
Ｒ３は以下からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ニトロ、
（４）ハロゲン、
（５）置換および非置換のアルキル、
（６）置換および非置換のアルケニル、
（７）置換および非置換のアルキニル、
（８）置換および非置換のアリール、
（９）置換および非置換のヘテロアリール、
（１０）置換および非置換のヘテロシクリル、
（１１）置換および非置換のシクロアルキル、
（１２）−ＣＯＲ３ａ、
（１４）−ＮＲ３ａＲ３ｂ
（１３）−ＮＲ３ａＣＯＲ３ｂ、
（１５）−ＮＲ３ａＳＯ２Ｒ３ｂ、
（１６）−ＯＲ３ａ、
（１７）−ＳＲ３ａ、
（１８）−ＳＯＲ３ａ、
（１９）−ＳＯ２Ｒ３ａ
Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立して以下からなる群から選択され：
（ａ）水素、
（ｂ）置換または非置換のアルキル、
（ｃ）置換および非置換のアリール、
（ｄ）置換および非置換のヘテロアリール、
（ｅ）置換および非置換のヘテロシクリル、ならびに
（ｆ）置換および非置換のシクロアルキル、ならびに
Ｒ４は以下からなる群から選択される：
（１）水素、および
（２）ハロゲン］または薬学的に許容されるその塩と、（ｂ）配列番号１のＨＥＲ３受容体のドメイン２内のアミノ酸残基２６５〜２７７および３１５ならびにドメイン４内のアミノ酸残基５７１、５８２〜５８４、５９６〜５９７、６００〜６０２、および６０９〜６１５を含むＨＥＲ３受容体のコンホメーションエピトープを認識し、リガンド依存性およびリガンド非依存性のシグナル伝達をどちらも遮断するＨｅｒ３抗体またはその断片とを投与することを含む、乳がん脳転移を処置する方法に関する。一実施形態では、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤は、５−（２，６−ジ−モルホリン−４−イル−ピリミジン−４−イル）−４−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イルアミンまたはその塩酸塩であり、Ｈｅｒ３抗体または断片は、配列番号１２８の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１２９のＣＤＲ２、および配列番号１３０のＣＤＲ３、ならびに配列番号１３１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１３２のＣＤＲ２、および配列番号１３３のＣＤＲ３を含む。別の例では、ＨＥＲ３抗体は、ＭＯＲ１０７０３などの、表１中に示す任意の抗体であってよく、その配列は以下の表１中に示されている。組合せ物は、同時に、別々に、または逐次的に投与することができる。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は、（ａ）５−（２，６−ジ−モルホリン−４−イル−ピリミジン−４−イル）−４−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イルアミンまたは薬学的に許容されるその塩であるホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤と、（ｂ）配列番号１のＨＥＲ３受容体のドメイン２内のアミノ酸残基２６５〜２７７および３１５ならびにドメイン４内のアミノ酸残基５７１、５８２〜５８４、５９６〜５９７、６００〜６０２、および６０９〜６１５を含むＨＥＲ３受容体のコンホメーションエピトープを認識し、リガンド依存性およびリガンド非依存性のシグナル伝達をどちらも遮断するＨｅｒ３抗体またはその断片とを投与することを含む、乳がん脳転移を処置する方法に関する。一実施形態では、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤は、５−（２，６−ジ−モルホリン−４−イル−ピリミジン−４−イル）−４−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イルアミンまたはその塩酸塩であり、Ｈｅｒ３抗体または断片は、配列番号１２８の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１２９のＣＤＲ２、配列番号１３０のＣＤＲ３、ならびに配列番号１３１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１３２のＣＤＲ２、および配列番号１３３のＣＤＲ３を含む。別の例では、ＨＥＲ３抗体はＭＯＲ１０７０３であり、その配列は以下の表１中に示されている。
【００１５】
別の態様では、本発明は、治療剤としての、（ａ）式（Ｉ）の化合物からなる群から選択されるホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤または薬学的に許容されるその塩と、（ｂ）抗体またはその断片などのＨｅｒ３アンタゴニストとを、乳がん脳転移の処置において、それらを同時に、別々に、または逐次的に投与するための指示と共に含む市販用パッケージを提供する。本発明において有用なＨＥＲ３アンタゴニストは、配列番号１のＨＥＲ３受容体のドメイン２内のアミノ酸残基２６５〜２７７および３１５ならびにドメイン４内のアミノ酸残基５７１、５８２〜５８４、５９６〜５９７、６００〜６０２、および６０９〜６１５を含むＨＥＲ３受容体のコンホメーションエピトープを認識し、リガンド依存性およびリガンド非依存性のシグナル伝達をどちらも遮断する抗体またはその断片であってよい。一例では、ＨＥＲ３アンタゴニストは、配列番号１２８の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１２９のＣＤＲ２、配列番号１３０のＣＤＲ３、ならびに配列番号１３１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１３２のＣＤＲ２、および配列番号１３３のＣＤＲ３を含む。別の例では、ＨＥＲ３アンタゴニストはＭＯＲ１０７０３であってよく、その配列は以下の表１中に示されている。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】同様の標的阻害および薬物貫通にもかかわらず、ＭＦＰ内で成長中のＢＴ４７４−Ｇｌｕｃ腫瘍（図１Ａ）および脳内で成長中のＢＴ４７４−Ｇｌｕｃ腫瘍（図１Ｂ）の差次的応答を示す図である。
【図２】未処置、または化合物Ａ、ＭＯＲ１０７０３、もしくは化合物ＡとＭＯＲ１０７０３で処置したＢＴ４７４−Ｇｌｕｃ脳腫瘍の腫瘍成長曲線（２Ａ）および生存分析（２Ｂ）を示す図である。
【図３】未処置、または化合物Ａ、ＭＯＲ１０７０３、もしくは化合物ＡとＭＯＲ１０７０３で処置したＭＤＡ−ＭＢ−３６１−Ｇｌｕｃ脳腫瘍の腫瘍成長曲線（３Ａ）および生存分析（３Ｂ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
脳転移は乳がんの破壊的な進行である。現在、処置の選択肢は限定的である。本発明は、脳におけるＨＥＲ２経路の阻害に対する応答欠如は、薬物送達障害および曝露が原因なのではなく、ＨＥＲ３が脳微小環境によって活性化過剰となっており、また、この経路の治療的標的化がＨＥＲ２陽性乳がん脳転移のＰＩ３Ｋ阻害に対する耐性に打ち勝って生存を有意に改善するという発見に基づいている。
【００１８】
本発明は、（ａ）たとえば式（Ｉ）の化合物を含むホスファチジルイノシトール３−キナーゼ、または薬学的に許容されるその塩と、（ｂ）ＨＥＲ３アンタゴニストとを含む、乳がん脳転移の処置において使用するために、同時に、別々に、または逐次的に投与するための医薬組合せ物に関する。一実施形態では、乳がんからの脳転移はＨｅｒ２陽性乳がんからであってよい。別の実施形態では、乳がんからの脳転移はＨｅｒ２陽性乳がんからであってよく、これは、１つまたは複数のＰＩＫ３ＣＡ突然変異、たとえば、エクソン１、２、５、７、９、または２０中のもの（たとえば、エクソン９のＥ５４５Ｋ中またはエクソン２０のＨ１０４７Ｒ中）を有することも決定されている。ＨＥＲ３アンタゴニストは、配列番号１のＨＥＲ３受容体のドメイン２内のアミノ酸残基２６５〜２７７および３１５ならびにドメイン４内のアミノ酸残基５７１、５８２〜５８４、５９６〜５９７、６００〜６０２、および６０９〜６１５を含むＨＥＲ３受容体のコンホメーションエピトープを認識し、リガンド依存性およびリガンド非依存性のシグナル伝達をどちらも遮断する抗体またはその断片であってよい。具体的には、ＨＥＲ３アンタゴニストは、配列番号１２８の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１２９のＣＤＲ２、配列番号１３０のＣＤＲ３、ならびに配列番号１３１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１３２のＣＤＲ２、および配列番号１３３のＣＤＲ３を含む。一例では、ＨＥＲ３アンタゴニストはＭＯＲ１０７０３であってよく、その配列は以下の表１中に示されている。
【００１９】
本明細書中で使用する一般用語は、別段に明確に記述されていない限り、以下の意味で定義される。
【００２０】
用語「含む（comprising）」および「含む（including）」とは、別段に指摘しない限りは、本明細書中においてその開放的かつ非限定的な意味で使用されている。
【００２１】
本発明を記載する内容中（特に以下の特許請求の範囲の内容中）における、用語「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」ならびに同様のものへ言及は、本明細書中で別段に指定しない限り、または内容によって明白に矛盾しない限りは、単数形および複数形のどちらにも及ぶと解釈される。複数形を化合物、塩などについて使用する場合、これは単一の化合物、塩なども意味するとみなされる。
【００２２】
本明細書中で定義する用語「組合せ物」または「医薬組合せ物」とは、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤とＨｅｒ３アンタゴニストを同時に、または治療剤が協同的、たとえば相乗的な効果を示すことを可能にする時間間隔以内に別々に、独立して投与し得る組合せ投与のための、１つの単位剤形中の固定された組合せ物、固定されていない組合せ物、またはキットオブパーツ（kit of parts）のいずれかをいう。
【００２３】
用語「固定されていない組合せ物」とは、治療剤、たとえばホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤とＨｅｒ３アンタゴニストまたは薬学的に許容されるその塩をどちらも、別々の実体または剤形として、同時に、同時発生的に、または特定の時間制限なしに逐次的にのいずれかで、患者に投与することを意味し、そのような投与は、治療上有効なレベルの化合物を、それを必要としている対象、たとえば哺乳動物またはヒトの身体においてもたらす。たとえば、一実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤を毎日投与し、Ｈｅｒ３アンタゴニストを毎週投与する。
【００２４】
用語「キットオブパーツ」とは、区別された量の治療剤（ａ）および（ｂ）を用いて、独立して、または異なる固定された組合せ物を使用することによって、すなわち、同時にまたは異なる時点で投与する、上記定義した治療剤（ａ）および（ｂ）をいう。それにより、キットオブパーツのパーツは、同時にまたは時間的にずらして、すなわち、キットオブパーツの任意のパーツについて異なる時点および同等または異なる時間間隔で、投与することができる。組合せ調製物中の投与する治療剤（ａ）対治療剤（ｂ）の総量の比は、たとえば処置する患者部分集団の要求または単一の患者の要求に対処するために、変化させることができる。
【００２５】
本明細書中で定義する用語「ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤」または「ＰＩ３Ｋ阻害剤」とは、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ標的とする、減少させる、または阻害する化合物をいう。ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ活性は、インスリン、血小板由来成長因子、インスリン様成長因子、表皮成長因子、コロニー刺激因子、および肝細胞成長因子を含めた、いくつかのホルモンおよび成長因子の刺激に応答して増加することが示されており、細胞成長および形質転換に関連するプロセスに関連づけられている。
【００２６】
本明細書中で定義する用語「Ｈｅｒ３アンタゴニスト」とは、Ｈｅｒ３の活性を標的とする、減少させる、または阻害する阻害剤をいう。
【００２７】
本明細書中で使用する用語「ＨＥＲ３」または「ＨＥＲ３受容体」とは、「ＥｒｂＢ３」としても知られ、哺乳綱のＨＥＲ３タンパク質をいい、哺乳綱のＨＥＲ３遺伝子をいう。好ましいＨＥＲ３タンパク質は、細胞の細胞膜中に存在するヒトＨＥＲ３タンパク質である。ヒトＨＥＲ３遺伝子は、米国特許第５，４８０，９６８号明細書およびPlowman et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4905-4909に記載されている。ヒトＨＥＲ３は周知であり、受託番号ＮＰ＿００１９７３号（ヒト）に定義されており、以下に配列番号１として表す。
【００２８】
本明細書中で使用する用語「ＨＥＲ３リガンド」とは、ＨＥＲ３と結合してそれを活性化するポリペプチドをいう。ＨＥＲ３リガンドの例には、それだけには限定されないが、ニューレギュリン１（ＮＲＧ）およびニューレギュリン２、ベータセルリン、ヘパリン結合表皮成長因子、ならびにエピレギュリンが含まれる。この用語には、天然に存在するポリペプチドの生物活性がある断片および／または変異体が含まれる。
【００２９】
本明細書中で使用する語句「ＨＥＲ３活性」または「ＨＥＲ３活性化」とは、オリゴマー化の増加（たとえば複合体を含有するＨＥＲ３の増加）、ＨＥＲ３リン酸化、コンホメーションの再編成（たとえばリガンドによって誘導されるもの）、およびＨＥＲ３により媒介される下流シグナル伝達をいう。
【００３０】
本明細書中で使用する用語「リガンド依存性シグナル伝達」とは、リガンドによるＨＥＲ（たとえばＨＥＲ３）の活性化をいう。ＨＥＲ３活性化は、オリゴマー化（たとえばヘテロ二量体化）の増加および／または下流シグナル伝達経路（たとえばＰＩ３Ｋ）が活性化されるＨＥＲ３リン酸化によって証明される。抗体またはその断片は、抗原結合タンパク質（たとえば抗体）に曝露させた刺激した細胞内のリン酸化されたＨＥＲ３の量を、実施例中に記載したアッセイを使用して測定して、未処理の（対照）細胞と比較して統計的に有意に低減させることができる。ＨＥＲ３を発現する細胞は、天然に存在する細胞株（たとえばＭＣＦ７）であってよい、またはＨＥＲ３タンパク質をコードしている核酸を宿主細胞内に導入することによって、組換えによって生成することができる。細胞刺激は、活性化ＨＥＲ３リガンドの外因性添加によって、または活性化リガンドの内在性発現によってのどちらかで起こることができる。
【００３１】
本明細書中で使用する用語「リガンド非依存性シグナル伝達」とは、リガンド結合の必要性の非存在下における、細胞性ＨＥＲ３活性（たとえばリン酸化）をいう。たとえば、リガンド非依存性ＨＥＲ３活性化は、ＨＥＲ２過剰発現またはＥＧＦＲおよびＨＥＲ２などのＨＥＲ３ヘテロ二量体パートナー中の突然変異の活性化の結果であってよい。抗体またはその断片は、抗原結合タンパク質（たとえば抗体）に曝露させた細胞内のリン酸化されたＨＥＲ３の量を、未処理の（対照）細胞と比較して統計的に有意に低減させることができる。ＨＥＲ３を発現する細胞は、天然に存在する細胞株（たとえばＳＫ−Ｂｒ−３）であってよい、またはＨＥＲ３タンパク質をコードしている核酸を宿主細胞内に導入することによって、組換えによって生成することができる。
【００３２】
本明細書中で使用する用語「遮断する」とは、相互作用またはプロセスを止めるまたは防止すること、たとえば、リガンド依存性またはリガンド非依存性のシグナル伝達を止めることをいう。
【００３３】
本明細書中で使用する用語「抗体」とは、ＨＥＲ３エピトープと相互作用して（たとえば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布によって）シグナル伝達を阻害する全抗体をいう。天然に存在する「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続されている少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。それぞれの重鎖は重鎖可変領域（本明細書中でＶＨと略記）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインであるＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３から構成される。それぞれの軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書中でＶＬと略記）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存的な領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域へとさらに細分類することができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、免疫系の様々な細胞（たとえばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１補体（Ｃｌｑ）を含めた宿主組織または因子との結合を媒介し得る。用語「抗体」には、たとえば、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（たとえば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体が含まれる）、ならびに上記の任意のもののエピトープ結合断片が含まれる。抗体は、任意のアイソタイプ（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスのものであってよい。
【００３４】
軽鎖および重鎖はどちらも、構造的および機能的相同性の領域へと分類される。用語「定常」および「可変」は、機能的に使用される。この点において、軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）部分のどちらの可変ドメインも、抗原認識および特異性を決定することを理解されたい。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を与える。慣例により、定常領域ドメインの付番は、抗原結合部位または抗体のアミノ末端から遠位になればなるほど増加する。Ｎ末端は可変領域であり、Ｃ末端は定常領域である。ＣＨ３およびＣＬドメインは、実際にはそれぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を構成する。
【００３５】
本明細書中で使用する語句「抗体断片」とは、ＨＥＲ３エピトープと特異的に相互作用して（たとえば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布によって）シグナル伝達を阻害する能力を保持している抗体の、１つまたは複数の部分をいう。結合断片の例には、それだけには限定されないが、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、ヒンジ領域でジスルフィド橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ）２断片、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、１つの抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、１つのＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）、ならびに単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、これらは、組換え方法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖としてこれらが作製されることを可能にする合成リンカーによって、結合することができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる。たとえば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426、およびHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883を参照）。そのような単鎖抗体も、用語「抗体断片」の範囲内に包含されることを意図する。これらの抗体断片は当業者に知られている慣用技術を使用して得られ、断片は、インタクトな抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングする。
【００３６】
語句、抗体（たとえばＨＥＲ３結合抗体）「特異的に（または選択的に）結合する」とは、タンパク質および他の生物製剤の異種集団中における同族抗原（たとえばヒトＨＥＲ３）の存在の決定因である結合反応をいう。上記の平衡定数（ＫＡ）に加えて、本発明のＨＥＲ３結合抗体は、典型的には５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満、もしくは１０−１５Ｍ未満、またはそれより低い解離速度定数（ＫＤ）（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）も有しており、非特異的な抗原（たとえばＨＳＡ）との結合におけるその親和性よりも少なくとも２倍超高い親和性でＨＥＲ３と結合する。一実施形態では、抗体またはその断片は、本明細書中に記載の方法または当業者に知られている方法（たとえば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＳＥＴ）（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ、スウェーデンＵｐｐｓａｌａ）を使用して評価して、３０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、２０００ｐＭ未満、１５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、７５０ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、２５０ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１５０ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、７５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、１ｐＭ未満の解離定数（Ｋｄ）を有する。本明細書中で使用する用語「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」とは、特定の抗体−抗原の相互作用の会合速度をいい、一方で、本明細書中で使用する用語「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」とは、特定の抗体−抗原の相互作用の解離速度をいう。本明細書中で使用する用語「ＫＤ」とは、Ｋｄ対Ｋａの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数をいう。抗体のＫＤ値は、当分野で十分に確立されている方法を使用して決定することができる。抗体のＫＤを決定する一方法は、表面プラズモン共鳴を使用すること、またはＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによるものである。
【００３７】
本明細書中で使用する語句「アンタゴニスト」とは、ＨＥＲ３と結合して、ＨＥＲ３シグナル伝達の生物活性を中和する、たとえば、たとえばホスホ−ＨＥＲ３またはホスホ−ＡｋｔアッセイにおいてＨＥＲ３誘導性のシグナル伝達活性を低減させる、減少させる、および／または阻害する抗体をいう。したがって、当分野で知られており、本明細書中に記載されている方法論に従って決定した、これらのＨＥＲ３機能的特性（たとえば、生化学的、免疫化学的、細胞的、生理的、または他の生物学的な活性など）のうちの１つまたは複数を「阻害する」抗体は、抗体が存在しない場合（またはたとえば関連しない特異性の対照抗体が存在する場合）においてみられるものと比較した、その特定の活性の統計的に有意な減少に関連していることを理解されよう。ＨＥＲ３活性を阻害する抗体は、そのような統計的に有意な減少を、測定したパラメータの少なくとも１０％、少なくとも５０％、８０％、または９０％もたらし、ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、細胞性ＨＥＲ３のリン酸化レベルの低減によって証明されるＨＥＲ３機能的活性を９５％、９８％、９９％より多く阻害し得る。ＨＥＲ３アンタゴニストの非限定的な例には、ＨＥＲ３のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含むＨＥＲ３受容体のコンホメーションエピトープと結合する抗体またはその断片が含まれる。この抗体またはその断片とドメイン２およびドメイン４との結合は、不活性または閉じたコンホメーションにおいてＨＥＲ３受容体を安定化し、それによりＨＥＲ３活性化が阻害される。そのような抗体は、リガンド依存性（たとえばニューレギュリン）およびリガンド非依存性のＨＥＲ３シグナル伝達経路をどちらも遮断する。
【００３８】
語句「単離した抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体をいう（たとえば、ＨＥＲ３と特異的に結合する単離した抗体は、ＨＥＲ３以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ＨＥＲ３と特異的に結合する単離した抗体は、他の抗原と交差反応性を有し得る。さらに、単離した抗体は、他の細胞物質および／または化学薬品を実質的に含まない場合がある。
【００３９】
本明細書中で定義する用語「医薬組成物」とは、その対象を侵している特定の疾患または状態を処置するために、対象、たとえば哺乳動物またはヒトに投与される少なくとも１つの治療剤を含有する混合物または溶液をいう。
【００４０】
本明細書中で定義する用語「薬学的に許容される」とは、健全な医学的判断の範囲内にあり、対象、たとえば哺乳動物またはヒトの組織と接触させるために適切な、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー応答、および他の問題合併症を起こさず、合理的な損益比で釣り合いのとれた、それらの化合物、材料、組成物、および／または剤形をいう。
【００４１】
本明細書中で使用する用語「処置すること」または「処置」とは、対象において少なくとも１つの症状を緩和、低減、もしくは軽減させる、または疾患の進行の遅延をもたらす処置を含む。たとえば、処置は、障害の１つもしくはいくつかの症状の減退、またはがんなどの障害の完全な根絶であってよい。また、本発明の意味の範囲内で、用語「処置する」は、発症を停止、遅延させること（すなわち、疾患の臨床徴候の前の期間）、および／または疾患が発生もしくは悪化する危険性を低減させることも意味する。
【００４２】
本明細書中で使用する用語「併用で（jointly）治療上活性がある」または「併用（joint）治療効果」とは、治療剤を、別々に（時間的にずらした様式で、特に順序特異的な（sequence-specific）様式で）、処置する温血動物、特にヒトにおいて依然として（好ましくは相乗的な）相互作用（併用治療効果）を示すような、好ましい時間間隔で与え得ることを意味する。事例が該当するかどうかは、とりわけ、少なくとも特定の期間の間、どちらの治療剤もが処置するヒトの血液中に存在することを示す、血液レベルを追跡することによって決定することができる。
【００４３】
用語、治療剤の医薬組合せ物の「薬学的有効量」または「臨床的有効量」とは、組合せ物で処置した乳がん脳転移の、ベースラインの臨床的に観察可能な徴候および症状を超える観察可能な改善をもたらすために十分な量である。
【００４４】
本明細書中で使用する用語「相乗効果」とは、それだけで投与したそれぞれの治療剤の効果の単純な加算よりも大きな効果、たとえば乳がん脳転移症候性進行またはその症状を遅らせることを生じる、たとえば（ａ）式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩とＨｅｒ３アンタゴニストなどの、２つの治療剤の作用をいう。相乗効果は、たとえば、シグモイド−Ｅマックス方程式（Holford, N. H. G. and Scheiner, L. B., Clin. Pharmacokinet. 6: 429-453 (1981)）、レーベ相加性の方程式（Loewe, S. and Muischnek, H., Arch. Exp. PatholPharmacol. 114: 313-326 (1926)）、およびメジアン効果方程式（Chou, T. C. and Talalay, P., Adv. Enzyme Regul. 22: 27-55 (1984)）などの適切な方法を使用して計算することができる。上述したそれぞれの方程式を実験データに適用し、対応するグラフを作成して、薬物の組合せの効果の評価を助けることができる。上述した方程式に関連する、対応するグラフは、それぞれ、濃度−効果曲線、アイソボログラム曲線、および組合せインデックス曲線である。
【００４５】
本明細書中で使用する用語「対象」または「患者」には、乳がん脳転移を患う可能性がある、またはそれを患っている動物が含まれる。対象の例には、哺乳動物、たとえば、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、およびトランスジェニック非ヒト動物が含まれる。好ましい実施形態では、対象は、ヒト、たとえば、乳がん脳転移を患っている、患う危険性にある、または患う可能性が潜在的にあるヒトである。
【００４６】
用語「約（about）または約（approximately）」は、所定の値または範囲の１０％以内、より好ましくは５％以内の意味を有する。
【００４７】
ＨＥＲ３アンタゴニスト
任意のＨＥＲ３アンタゴニストを使用することができる。一実施形態では、本発明には、参照によりその全体が本出願内に取り込まれた刊行物である国際公開第２０１２０２２８１４号パンフレットに記載の抗体またはその断片が含まれる。一例では、本明細書中に開示した方法における処置に有用なＨＥＲ３アンタゴニストには、ＨＥＲ３が補助受容体（それだけには限定されないが、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ４が含まれる）と相互作用することを抗体またはその断片が防止するように、ＨＥＲ３の特定のコンホメーション状態を認識する抗体またはその断片が含まれる。一部の実施形態では、抗体またはその断片は、ＨＥＲ３受容体を不活性または閉じた状態で安定化させることによって、ＨＥＲ３が補助受容体と相互作用することを防止する。一実施形態では、抗体またはその断片は、ＨＥＲ３のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基と結合することによって、ＨＥＲ３受容体を安定化させる。この不活性状態では、ドメイン２内に位置する二量体化ループは露出しておらず、したがって、他の補助受容体（それだけには限定されないが、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ４が含まれる）との二量体化に利用不可能である。一例では、抗体はＨＥＲ３受容体のコンホメーションエピトープを認識し、コンホメーションエピトープはＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含み、抗体またはその断片は、リガンド依存性およびリガンド非依存性のシグナル伝達をどちらも遮断する。コンホメーションエピトープは、アミノ酸残基２６５〜２７７、３１５（ドメイン２のもの）、５７１、５８２〜５８４、５９６〜５９７、６００〜６０２、６０９〜６１５（ドメイン４のもの）、またはそのサブセットを含む。一例では、抗体またはその断片のＶＨは、以下のＨＥＲ３残基のうちの少なくとも１つと結合する：Ａｓｎ２６６、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｎ２７１、Ｇｌｕ２７３、Ｐｒｏ２７４、Ａｓｎ２７５、Ｐｒｏ２７６、Ｈｉｓ２７７、Ａｓｎ３１５、Ａｓｐ５７１、Ｐｒｏ５８３、Ｈｉｓ５８４、Ａｌａ５９６、Ｌｙｓ５９７。別の例では、抗体またはその断片のＶＬは、以下のＨＥＲ３残基のうちの少なくとも１つと結合する：Ｔｙｒ２６５、Ｌｙｓ２６７、Ｌｅｕ２６８、Ｐｈｅ２７０、Ｇｌｙ５８２、Ｐｒｏ５８３、Ｌｙｓ５９７、Ｉｌｅ６００、Ｌｙｓ６０２、Ｇｌｕ６０９、Ａｒｇ６１１、Ｐｒｏ６１２、Ｃｙｓ６１３、Ｈｉｓ６１４、Ｇｌｕ６１５。単離した抗体またはその断片は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および合成抗体であってよい。
【００４８】
別の例では、単離した抗体またはその断片はＨＥＲ３受容体のコンホメーションエピトープを認識することができ、コンホメーションエピトープはＨＥＲ３受容体のドメイン２およびドメイン４内のアミノ酸残基を含み、抗体またはその断片は、ＨＥＲ３リガンド依存性リン酸化アッセイ（たとえば、アッセイは、ニューレギュリン（ＮＲＧ）の存在下において刺激したＭＣＦ７細胞を使用する）によって評価してＨＥＲ３のリン酸化を阻害する。この例では、ＨＥＲ３受容体に対する抗体またはその断片は、少なくとも１×１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、または１０１３Ｍ−１の解離（ＫＯ）を有することができる。
【００４９】
別の例では、単離した抗体またはその断片は、表１中に記載の抗体と同じコンホメーションエピトープと結合することができる。
【００５０】
一部の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１の（ｉ）ＨＥＲ３アミノ酸残基２６５〜２７７および３１５（ドメイン２のもの）および（ｉｉ）ＨＥＲ３アミノ酸残基５７１、５８２〜５８４、５９６〜５９７、６００〜６０２、６０９〜６１５（ドメイン４のもの）、またはそのサブセットを含むコンホメーションエピトープを有するヒトＨＥＲ３タンパク質と結合する。一部の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１のアミノ酸残基２６５〜２７７および３１５（ドメイン２のもの）および（ｉｉ）ＨＥＲ３アミノ酸残基５７１、５８２〜５８４、５９６〜５９７、６００〜６０２、６０９〜６１５（ドメイン４のもの）内またはそれと重複するアミノ酸と結合する。一部の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１のアミノ酸２６５〜２７７および３１５（ドメイン２のもの）ならびに（ｉｉ）ＨＥＲ３アミノ酸残基５７１、５８２〜５８４、５９６〜５９７、６００〜６０２、６０９〜６１５（ドメイン４のもの）、またはそのサブセット内のアミノ酸（および／またはそれからなるアミノ酸配列）と結合する。一部の実施形態では、抗体またはその断片は、ドメイン２およびドメイン４の移動性を制限して、それを不活性または閉じたコンホメーションに安定化するように、コンホメーションエピトープと結合する。活性コンホメーションの形成の失敗は、シグナル伝達の活性化の失敗をもたらす。一部の実施形態では、抗体またはその断片は、ドメイン２内の二量体化ループを閉鎖させることによって、それを受容体間相互作用に利用不可能にするように、コンホメーションエピトープと結合する。ホモまたはヘテロ二量体の形成の失敗は、シグナル伝達の活性化の失敗をもたらす。本発明は、リガンド依存性およびリガンド非依存性のＨＥＲ３シグナル伝達経路をどちらも遮断するように、ＨＥＲ３のコンホメーションエピトープを認識するＨＥＲ３抗体を利用することができる。そのような抗体クラスは、表１中に開示されている。
【００５１】
本発明は、配列番号１５、３３、５１、６９、８７、１０５、１２３、１４１、１５９、１７７、１９５、２１３、２３１、２４９、２６７、２８５、３０３、３２１、３３９、３５７、および３７５のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む、ＨＥＲ３タンパク質（たとえばヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３）と特異的に結合する抗体を提供する。本発明は、配列番号１４、３２、５０、６８、８６、１０４、１２２、１４０、１５８、１７６、１９４、２１２、２３０、２４８、２６６、２８４、３０２、３２０、３３８、３５６、および３７４のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む、ＨＥＲ３タンパク質（たとえばヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３）と特異的に結合する抗体を提供する。また、本発明は、下記の表１中に列挙したＶＨ  ＣＤＲのうちの任意の１つのアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲを含む、ＨＥＲ３タンパク質（たとえばヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３）と特異的に結合する抗体も提供する。特に、本発明は、下記の表１中に列挙したＶＨ  ＣＤＲのうちの任意のもののアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲを１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上含む（あるいはそれからなる）、ＨＥＲ３タンパク質（たとえばヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３）と特異的に結合する抗体を提供する。
【００５２】
本発明の他の抗体には、突然変異しているが、それでもＣＤＲ領域中に、表１中に記載した配列で示したＣＤＲ領域と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、または９８パーセントの同一性を有するアミノ酸が含まれる。一部の実施形態では、これには、表１に記載した配列で示したＣＤＲ領域と比較してＣＤＲ領域中の１、２、３、４、または５個以下のアミノ酸が突然変異している一方で、依然として元の抗体のエピトープに対するその特異性を維持している、突然変異アミノ酸配列が含まれる。
【００５３】
本発明の他の抗体には、突然変異しているが、それでもフレームワーク領域中に、表１中に記載した配列で示したフレームワーク領域と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、または９８パーセントの同一性を有するアミノ酸が含まれる。一部の実施形態では、これには、表１に記載した配列で示したフレームワーク領域と比較してフレームワーク領域中の１、２、３、４、５、６、または７個以下のアミノ酸が突然変異している一方で、依然として元の抗体のエピトープに対するその特異性を維持している、突然変異アミノ酸配列が含まれる。また、本発明は、ＨＥＲ３タンパク質（たとえばヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３）と特異的に結合する抗体のＶＨ、ＶＬ、完全長重鎖、および完全長軽鎖をコードしている核酸配列も提供する。
【００５４】
本発明の方法において有用な本発明のＨＥＲ３抗体は、ＨＥＲ３のドメイン２およびドメイン４からのアミノ酸残基を含むＨＥＲ３のコンホメーションエピトープと結合することができる。
【００５５】
【表１−１】
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【００５６】
【表１−２】
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【００５７】
【表１−３】
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【００５８】
【表１−４】
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【００５９】
【表１−５】
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【００６０】
【表１−６】
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【００６１】
【表１−７】
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【００６２】
【表１−８】
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【００６３】
【表１−９】
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【００６４】
【表１−１０】
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【００６５】
【表１−１１】
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【００６６】
【表１−１２】
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【００６７】
【表１−１３】
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【００６８】
【表１−１４】
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【００６９】
【表１−１５】
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【００７０】
【表１−１６】
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【００７１】
【表１−１７】
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【００７２】
【表１−１８】
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【００７３】
【表１−１９】
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【００７４】
【表１−２０】
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【００７５】
【表１−２１】
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【００７６】
【表１−２２】
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【００７７】
【表１−２３】
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【００７８】
【表１−２４】
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【００７９】
【表１−２５】
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【００８０】
【表１−２６】
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【００８１】
【表１−２７】
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【００８２】
【表１−２８】
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【００８３】
【表１−２９】
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【００８４】
【表１−３０】
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【００８５】
【表１−３１】
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【００８６】
【表１−３２】
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【００８７】
【表１−３３】
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【００８８】
本発明の他の抗体には、アミノ酸またはアミノ酸をコードしている核酸が、突然変異しているが、それでも表１中に記載した配列に対して少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、および９９パーセントの同一性を有するものが含まれる。一部の実施形態では、これには、表１中に記載した配列で示した可変領域と比較して可変領域中の１、２、３、４、または５個以下のアミノ酸が突然変異している一方で、実質的に同じ治療活性を保持している、突然変異アミノ酸配列が含まれる。
【００８９】
これらの抗体またはその断片のそれぞれがＨＥＲ３と結合できるため、ＶＨ、ＶＬ、完全長軽鎖、および完全長重鎖の配列（アミノ酸配列およびアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列）を「ミックスアンドマッチ」して本発明の他のＨＥＲ３結合抗体を作製することができる。そのような「ミックスアンドマッチ」ＨＥＲ３結合抗体は、当分野で知られている結合アッセイ（たとえば、ＥＬＩＳＡ、および参照によりその全体が本明細書中に組み込まれている国際公開第２０１２０２２８１４号パンフレットに記載されている他のアッセイ）を使用して試験することができる。これらの鎖をミックスアンドマッチした場合、特定のＶＨ／ＶＬの対合からのＶＨ配列を、構造的に類似のＶＨ配列で置き換えるべきである。同様に、特定の完全長重鎖／完全長軽鎖の対合からの完全長重鎖配列を、構造的に類似の完全長重鎖配列で置き換えるべきである。同様に、特定のＶＨ／ＶＬの対合からのＶＬ配列を、構造的に類似のＶＬ配列で置き換えるべきである。同様に、特定の完全長重鎖／完全長軽鎖の対合からの完全長軽鎖配列を、構造的に類似の完全長軽鎖配列で置き換えるべきである。したがって、一態様では、本発明は、配列番号１５、３３、５１、６９、８７、１０５、１２３、１４１、１５９、１７７、１９５、２１３、２３１、２４９、２６７、２８５、３０３、３２１、３３９、３５７、および３７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１４、３２、５０、６８、８６、１０４、１２２、１４０、１５８、１７６、１９４、２１２、２３０、２４８、２６６、２８４、３０２、３２０、３３８、３５６、および３７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを有しており、抗体がＨＥＲ３（たとえばヒトおよび／またはカニクイザル）と特異的に結合する、単離したモノクローナル抗体またはその断片を提供する。
【００９０】
別の態様では、本発明は、表１中に記載の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、またはそれらの組合せを含むＨＥＲ３結合抗体を提供する。抗体のＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号２、８、２０、２６、３８、４４、５６、６２、７４、８０、９２、９８、１１０、１１６、１２８、１３４、１４６、１５２、１６４、１７０、１８２、１８８、２００、２０６、２１８、２２４、２３６、２４２、２５４、２６０、２７２、２７８、２９０、２９６、３０８、３１４、３２６、３３２、３４４、３５０、３６２、および３６８に示されている。抗体のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号３、９、２１、２７、３９、４５、５７、６３、７５、８１、９３、９９、１１１、１１７、１２９、１３５、１４７、１５３、１６５、１７１、１８３、１８９、２０１、２０７、２１９、２２５、２３７、２４３、２５５、２６１、２７３、２７９、２９１、２９７、３０９、３１５、３２７、３３３、３４５、３５１、３６３、および３６９に示されている。抗体のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号４、１０、２２、２８、４０、４６、５８、６４、７６、８２、９４、１００、１１２、１１８、１３０、１３６、１４８、１５４、１６６、１７２、１８４、１９０、２０２、２０８、２２０、２２６、２３８、２４４、２５６、２６２、２７４、２８０、２９２、２９８、３１０、３１６、３２８、３３４、３４６、３５２、３６４、および３７０に示されている。抗体のＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号５、１１、２３、２９、４１、４７、５９、６５、７７、８３、９５、１０１、１１３、１１９、１３１、１３７、１４９、１５５、１６７、１７３、１８５、１９１、２０３、２０９、２２１、２２７、２３９、２４５、２５７、２６３、２７５、２８１、２９３、２９９、３１１、３１７、３２９、３３５、３４７、３５３、３６５、および３７１に示されている。抗体のＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号６、１２、２４、３０、４２、４８、６０、６６、７８、８４、９６、１０２、１１４、１２０、１３２、１３８、１５０、１５６、１６８、１７４、１８６、１９２、２０４、２１０、２２２、２２８、２４０、２４６、２５８、２６４、２７６、２８２、２９４、３００、３１２、３１８、３３０、３３６、３４８、３５４、３６６、および３７２に示されている。抗体のＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号７、１３、２５、３１、４３、４９、６１、６７、７９、８５、９７、１０３、１１５、１２１、１３３、１３９、１５１、１５７、１６９、１７５、１８７、１９３、２０５、２１１、２２３、２２９、２４１、２４７、２５９、２６５、２７７、２８３、２９５、３０１、３１３、３１９、３３１、３３７、３４９、３５５、３６７、および３７３に示されている。ＣＤＲ領域は、カバットシステムを使用して描写されている（Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242、Chothiaet al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342: 877-883、およびAl-Lazikani et al., (1997) J. Mol. Biol. 273, 927-948）。
【００９１】
具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３のＣＤＲ２、配列番号４のＣＤＲ３、配列番号５の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号６のＣＤＲ２、および配列番号７のＣＤＲ３を含む。
【００９２】
具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号２０の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２１のＣＤＲ２、配列番号２２のＣＤＲ３、配列番号２３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２４のＣＤＲ２、および配列番号２５のＣＤＲ３を含む。
【００９３】
具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号３８の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３９のＣＤＲ２、配列番号４０のＣＤＲ３、配列番号４１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４２のＣＤＲ２、および配列番号４３のＣＤＲ３を含む。
【００９４】
具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号５６の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５７のＣＤＲ２、配列番号５８のＣＤＲ３、配列番号５９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号６０のＣＤＲ２、および配列番号６１のＣＤＲ３を含む。
【００９５】
具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号７４の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号７５のＣＤＲ２、配列番号７６のＣＤＲ３、配列番号７７の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号７８のＣＤＲ２、および配列番号７９のＣＤＲ３を含む。
【００９６】
具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号９２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号９３のＣＤＲ２、配列番号９４のＣＤＲ３、配列番号９５の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号９６のＣＤＲ２、および配列番号９７のＣＤＲ３を含む。
【００９７】
具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号１１０の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１１１のＣＤＲ２、配列番号１１２のＣＤＲ３、配列番号１１３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１１４のＣＤＲ２、および配列番号１１５のＣＤＲ３を含む。
【００９８】
具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号１２８の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１２９のＣＤＲ２、配列番号１３０のＣＤＲ３、配列番号１３１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１３２のＣＤＲ２、および配列番号１３３のＣＤＲ３を含む。
【００９９】
具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号１４６の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１４７のＣＤＲ２、配列番号１４８のＣＤＲ３、配列番号１４９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１５０のＣＤＲ２、および配列番号１５１のＣＤＲ３を含む。
【０１００】
具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号１６４の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１６５のＣＤＲ２、配列番号１６６のＣＤＲ３、配列番号１６７の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１６８のＣＤＲ２、および配列番号１６９のＣＤＲ３を含む。
【０１０１】
具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号１８２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１８３のＣＤＲ２、配列番号１８４のＣＤＲ３、配列番号１８５の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１８６のＣＤＲ２、および配列番号１８７のＣＤＲ３を含む。
【０１０２】
具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号２００の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２０１のＣＤＲ２、配列番号２０２のＣＤＲ３、配列番号２０３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２０４のＣＤＲ２、および配列番号２０５のＣＤＲ３を含む。
【０１０３】
具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号２１８の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２１９のＣＤＲ２、配列番号２２０のＣＤＲ３、配列番号２２１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２２２のＣＤＲ２、および配列番号２２３のＣＤＲ３を含む。
【０１０４】
具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号２３６の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２３７のＣＤＲ２、配列番号２３８のＣＤＲ３、配列番号２３９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２４０のＣＤＲ２、および配列番号２４１のＣＤＲ３を含む。
【０１０５】
具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号２５４の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２５５のＣＤＲ２、配列番号２５６のＣＤＲ３、配列番号２５７の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２５８のＣＤＲ２、および配列番号２５９のＣＤＲ３を含む。
【０１０６】
具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号２７２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２７３のＣＤＲ２、配列番号２７４のＣＤＲ３、配列番号２７５の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２７６のＣＤＲ２、および配列番号２７７のＣＤＲ３を含む。
【０１０７】
具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号２９０の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２９１のＣＤＲ２、配列番号２９２のＣＤＲ３、配列番号２９３の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２９４のＣＤＲ２、および配列番号２９５のＣＤＲ３を含む。
【０１０８】
具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号３０８の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３０９のＣＤＲ２、配列番号３１０のＣＤＲ３、配列番号３１１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３１２のＣＤＲ２、および配列番号３１３のＣＤＲ３を含む。
【０１０９】
具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号３２６の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３２７のＣＤＲ２、配列番号３２８のＣＤＲ３、配列番号３２９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３３０のＣＤＲ２、および配列番号３３１のＣＤＲ３を含む。
【０１１０】
具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号３４４の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３４５のＣＤＲ２、配列番号３４６のＣＤＲ３、配列番号３４７の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３４８のＣＤＲ２、および配列番号３４９のＣＤＲ３を含む。
【０１１１】
具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号３６２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３６３のＣＤＲ２、配列番号３６４のＣＤＲ３、配列番号３６５の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３６６のＣＤＲ２、および配列番号３６７のＣＤＲ３を含む。
【０１１２】
具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号１５のＶＨおよび配列番号１４のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号３３のＶＨおよび配列番号３２のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号５１のＶＨおよび配列番号５０のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号６９および配列番号６８のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号８７のＶＨおよび配列番号８６のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号１０５のＶＨおよび配列番号１０４のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号１２３のＶＨおよび配列番号１２２のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号１４１のＶＨおよび配列番号１４０のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号１５９のＶＨおよび配列番号１５８のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号１７７のＶＨおよび配列番号１７６のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号１９５のＶＨおよび配列番号１９４のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号２１３のＶＨおよび配列番号２１２のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号２３１のＶＨおよび配列番号２３０のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号２４９のＶＨおよび配列番号２４８のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号２６７のＶＨおよび配列番号２６６のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号２８５のＶＨおよび配列番号２８４のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号３０３のＶＨおよび配列番号３０２のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号３２１のＶＨおよび配列番号３２０のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号３３９のＶＨおよび配列番号３３８のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号３５７のＶＨおよび配列番号３５６のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ３と結合する抗体は、配列番号３７５のＶＨおよび配列番号３７４のＶＬを含む。
【０１１３】
本明細書中で使用するヒト抗体は、抗体の可変領域または完全長鎖がヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合、特定の生殖系列配列「の産物である」または「それに由来する」重鎖もしくは軽鎖の可変領域または完全長の重鎖もしくは軽鎖を含む。そのような系には、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを目的の抗原で免疫化すること、またはファージ上にディスプレイされるヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリを目的の抗原でスクリーニングすることが含まれる。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物である」または「それに由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、配列がヒト抗体配列と最も近い（すなわち最大の％同一性の）ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することによって、そうであると同定することができる。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物である」または「それに由来する」ヒト抗体は、たとえば、天然に存在する体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的導入が原因で、生殖系列配列と比較してアミノ酸の相違を含有し得る。しかし、ＶＨまたはＶＬのフレームワーク領域中で、選択されたヒト抗体は、典型的には、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされているアミノ酸配列とアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であり、ヒト抗体を、他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列（たとえばネズミ生殖系列配列）と比較した場合にヒトであると同定するアミノ酸残基を含有する。ある特定の事例では、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされているアミノ酸配列と、アミノ酸配列が少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは少なくとも９５％、またはさらには少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であり得る。典型的には、組換えヒト抗体は、ＶＨまたはＶＬのフレームワーク領域中のヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされているアミノ酸配列と、１０個以下のアミノ酸の相違を示す。ある特定の事例では、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされているアミノ酸配列と、５個以下、またはさらには４、３、２、もしくは１個以下のみのアミノ酸の相違を示し得る。代表的ないくつかのＨＥＲ３抗体についてのＶＨおよびＶＬの生殖系列配列を使用した様々な生殖系列のバージョンは、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれている国際公開第２０１２０２２８１４号パンフレットに示されている。
【０１１４】
本明細書中に開示する抗体は、単鎖抗体、ジアボディ、ドメイン抗体、ナノボディ、およびユニボディの誘導体であってよい。さらに別の実施形態では、本発明は、表１中に記載した配列と相同的であるアミノ酸配列を含む抗体またはその断片を提供し、前記抗体は、ＨＥＲ３タンパク質（たとえばヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３）と結合し、表１中に記載のこれらの抗体の所望の機能的特性を保持している。
【０１１５】
たとえば、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離したモノクローナル抗体（またはその機能的断片）を提供し、重鎖可変領域は、配列番号１５、３３、５１、６９、８７、１０５、１２３、１４１、１５９、１７７、１９５、２１３、２３１、２４９、２６７、２８５、３０３、３２１、３３９、３５７、および３７５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１４、３２、５０、６８、８６、１０４、１２２、１４０、１５８、１７６、１９４、２１２、２３０、２４８、２６６、２８４、３０２、３２０、３３８、３５６、および３７４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、抗体は、ＨＥＲ３（たとえばヒトおよび／またはカニクイザルＨＥＲ３）と結合し、ＨＥＲ３のシグナル伝達活性を中和し、これは、リン酸化アッセイまたはＨＥＲシグナル伝達の他の測度で測定することができる（たとえば、国際公開第２０１２０２２８１４号パンフレットに記載のホスホ−ＨＥＲ３アッセイ、ホスホ−Ａｋｔアッセイ、細胞増殖、およびリガンド遮断アッセイ）。また、本発明の範囲内には、可変の重鎖および軽鎖の親ヌクレオチド配列、ならびに哺乳動物細胞中での発現に最適化された完全長重鎖および軽鎖の配列も含まれる。本発明の他の抗体には、突然変異しているが、それでも上述の配列に対して少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、または９８％パーセントの同一性を有するアミノ酸または核酸が含まれる。一部の実施形態では、これには、上述の配列で示した可変領域と比較して、可変領域中の１、２、３、４、または５個以下のアミノ酸がアミノ酸の欠失、挿入、または置換によって突然変異している突然変異アミノ酸配列が含まれる。
【０１１６】
他の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬのアミノ酸配列は、表１中に記載の配列と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり得る。他の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬのアミノ酸配列は、１、２、３、４、または５個以下のアミノ酸位置でのアミノ酸置換以外は同一であり得る。表１中に記載した抗体のＶＨおよびＶＬの領域と高い（すなわち８０％以上）の同一性を有するＶＨおよびＶＬの領域を有する抗体は、突然変異誘発（たとえば部位特異的またはＰＣＲ媒介性の突然変異誘発）、次いで、本明細書中に記載の機能的アッセイを使用した、保持されている機能についての、コードされている変更された抗体の試験によって得ることができる。
【０１１７】
他の実施形態では、重鎖および／または軽鎖のヌクレオチド配列の可変領域は、上述の配列と６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり得る。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変領域とを有しており、これらのＣＤＲ配列のうちの１つまたは複数は、本明細書中に記載の抗体に基づく指定のアミノ酸配列またはその保存的修飾を有しており、抗体は、本発明のＨＥＲ３結合抗体の所望の機能的特性を保持している。
【０１１９】
したがって、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変領域とからなる単離したＨＥＲ３モノクローナル抗体またはその断片を提供し、重鎖可変領域ＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号２、８、２０、２６、３８、４４、５６、６２、７４、８０、９２、９８、１１０、１１６、１２８、１３４、１４６、１５２、１６４、１７０、１８２、１８８、２００、２０６、２１８、２２４、２３６、２４２、２５４、２６０、２７２、２７８、２９０、２９６、３０８、３１４、３２６、３３２、３４４、３５０、３６２、および３６８、ならびにその保存的修飾からなる群から選択され、重鎖可変領域ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号３、９、２１、２７、３９、４５、５７、６３、７５、８１、９３、９９、１１１、１１７、１２９、１３５、１４７、１５３、１６５、１７１、１８３、１８９、２０１、２０７、２１９、２２５、２３７、２４３、２５５、２６１、２７３、２７９、２９１、２９７、３０９、３１５、３２７、３３３、３４５、３５１、３６３、および３６９、ならびにその保存的修飾からなる群から選択され、重鎖可変領域ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号４、１０、２２、２８、４０、４６、５８、６４、７６、８２、９４、１００、１１２、１１８、１３０、１３６、１４８、１５４、１６６、１７２、１８４、１９０、２０２、２０８、２２０、２２６、２３８、２４４、２５６、２６２、２７４、２８０、２９２、２９８、３１０、３１６、３２８、３３４、３４６、３５２、３６４、および３７０、ならびにその保存的修飾からなる群から選択され、軽鎖可変領域ＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号５、１１、２３、２９、４１、４７、５９、６５、７７、８３、９５、１０１、１１３、１１９、１３１、１３７、１４９、１５５、１６７、１７３、１８５、１９１、２０３、２０９、２２１、２２７、２３９、２４５、２５７、２６３、２７５、２８１、２９３、２９９、３１１、３１７、３２９、３３５、３４７、３５３、３６５、および３７１、ならびにその保存的修飾からなる群から選択され、軽鎖可変領域ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号６、１２、２４、３０、４２、４８、６０、６６、７８、８４、９６、１０２、１１４、１２０、１３２、１３８、１５０、１５６、１６８、１７４、１８６、１９２、２０４、２１０、２２２、２２８、２４０、２４６、２５８、２６４、２７６、２８２、２９４、３００、３１２、３１８、３３０、３３６、３４８、３５４、３６６、および３７２、ならびにその保存的修飾からなる群から選択され、ＣＤＲ３の軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号７、１３、２５、３１、４３、４９、６１、６７、７９、８５、９７、１０３、１１５、１２１、１３３、１３９、１５１、１５７、１６９、１７５、１８７、１９３、２０５、２１１、２２３、２２９、２４１、２４７、２５９、２６５、２７７、２８３、２９５、３０１、３１３、３１９、３３１、３３７、３４９、３５５、３６７、および３７３、ならびにその保存的修飾からなる群から選択され、抗体またはその断片は、ＨＥＲ３と特異的に結合し、ＨＥＲシグナル伝達経路を阻害することによってＨＥＲ３活性を中和し、これは、リン酸化アッセイまたはＨＥＲシグナル伝達の他の測度で測定することができる（たとえば、国際公開第２０１２０２２８１４号パンフレットに記載のホスホ−ＨＥＲ３アッセイ、ホスホ−Ａｋｔアッセイ、細胞増殖、およびリガンド遮断アッセイ）。
【０１２０】
別の例では、単離した抗体またはその断片は、表１中に記載の抗体と交叉競合する。抗体は、配列番号１５、配列番号３３、配列番号５１、配列番号６９、配列番号８７、配列番号１０５、配列番号１２３、配列番号１４１、配列番号１５９、配列番号１７７、配列番号１９５、配列番号２１３、配列番号２３１、配列番号２４９、配列番号２６７、配列番号２８５、配列番号３０３、配列番号３２１、配列番号３３９、配列番号３５７、および配列番号３７５からなる群から選択されるＶＨ、ならびに配列番号１４、配列番号３２、配列番号５０、配列番号６８、配列番号８６、配列番号１０４、配列番号１２２、配列番号１４０、配列番号１５８、配列番号１７６、配列番号１９４、配列番号２１２、配列番号２３０、配列番号２４８、配列番号２６６、配列番号２８４、配列番号３０２、配列番号３２０、配列番号３３８、配列番号３５６、および配列番号３７４からなる群から選択されるＶＬ、またはそれらの９７〜９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【０１２１】
別の例では、単離した抗体またはその断片は、配列番号２、２０、３８、５６、７４、９２、１１０、１２８、１４６、１６４、１８２、２００、２１８、２３６、２５４、２７２、２９０、３０８、３２６、３４４、および３６２からなる群から選択される重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３、２１、３９、５７、７５、９３、１１１、１２９、１４７、１６５、１８３、２０１、２１９、２３７、２５５、２７３、２９１、３０９、３２７、３４５、および３６３からなる群から選択されるＣＤＲ２、配列番号４、２２、４０、５８、７６、９４、１１２、１３０、１４８、１６６、１８４、２０２、２２０、２３８、２５６、２７４、２９２、３１０、３２８、３４６、および３６４からなる群から選択されるＣＤＲ３、配列番号５、２３、４１、５９、７７、９５、１１３、１３１、１４９、１６７、１８５、２０３、２２１、２３９、２５７、２７５、２９３、３１１、３２９、３４７、および３６５からなる群から選択される軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号６、２４、４２、６０、７８、９６、１１４、１３２、１５０、１６６、１８６、２０４、２２２、２４０、２５８、２７６、２９４、３１２、３３０、３４８、および３６６からなる群から選択されるＣＤＲ２、ならびに配列番号７、２５、４３、６１、７９、９７、１１５、１３３、１５１、１６９、１８７、２０５、２２３、２４１、２５９、２７７、２９５、３１３、３３１、３４９、および３６７からなる群から選択されるＣＤＲ３を含む。
【０１２２】
具体例では、単離した抗体またはその断片は、配列番号１２８の重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１２９のＣＤＲ２、配列番号１３０のＣＤＲ３、配列番号１３１の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１３２のＣＤＲ２、および配列番号１３３のＣＤＲ３を含む。
【０１２３】
本発明において使用する抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ２）’、Ｆ（ａｂ）２’、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、ＶＨ、ＶＬ、ｄＡｂからなる群から選択される、ＨＥＲ３と結合する抗体の断片であってよい。
【０１２４】
また、本発明には、表１中に記載のＨＥＲ３結合抗体と同じエピトープと相互作用する（たとえば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布によって）抗体も含まれる。
【０１２５】
本発明は、ＨＥＲ３タンパク質（たとえばヒトおよび／またはカニクイザル／マウス／ラットＨＥＲ３）と特異的に結合する、完全にヒトである抗体を提供する。キメラまたはヒト化抗体と比較して、本発明のヒトＨＥＲ３結合抗体は、ヒト対象に投与した場合にさらに低減した抗原性を有する。
【０１２６】
ヒトＨＥＲ３結合抗体は、当分野で知られている方法を使用して作製することができる。たとえば、ヒューマニアリング技術は、非ヒト抗体を、操作したヒト抗体にするために使用されている。米国特許出願公開第２００５０００８６２５号明細書は、非ヒト抗体のものと比較して同じ結合特徴を維持するまたはより良好な結合特徴を提供しつつ、抗体において非ヒト抗体の可変領域をヒト可変領域で置き換えるためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を記載している。
【０１２７】
別の態様では、本発明は、本発明のＨＥＲ３結合抗体またはその断片を含む二重パラトープ性、二重特異性、または多特異性の分子を特長とする。本発明の抗体またはその断片を、別の機能的分子、たとえば別のペプチドまたはタンパク質（たとえば受容体に対する別の抗体またはリガンド）で誘導体化する、またはそれと連結させて、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子と結合する二重特異性分子を作製することができる。実際、本発明の抗体を、１つより多くの他の機能的分子で誘導体化する、またはそれと連結させて、２つ以上の結合部位および／または標的分子と結合する二重パラトープ性または多重特異性の分子を作製し得る；そのような二重パラトープ性または多重特異性の分子。本発明の二重特異性分子を作製するために、二重特異性分子がもたらされるように、本発明の抗体を、別の抗体、抗体断片、ペプチド、または結合模倣体などの１つまたは複数の他の結合分子と機能的に連結させる（たとえば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有会合、または他の方法による）ことができる。
【０１２８】
ＰＩ３Ｋ阻害剤
ＰＩ３キナーゼ阻害剤には、それだけには限定されないが、４−［２−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−６−［［４−（メチルスルホニル）ピペラジン−１−イル］メチル］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−イル］モルホリン（ＧＤＣ０９４１としても知られ、ＰＣＴ国際公開第０９／０３６０８２号パンフレットおよび同第０９／０５５７３０号パンフレットに記載されている）、２−メチル−２−［４−［３−メチル−２−オキソ−８−（キノリン−３−イル）−２，３−ジヒドロイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］フェニル］プロピオニトリル（ＢＥＺ２３５またはＮＶＰ−ＢＥＺ２３５として知られ、ＰＣＴ国際公開第０６／１２２８０６号パンフレットに記載されている）、ＢＫＭ１２０、ならびに（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（ＢＹＬ７１９として知られる）を含めることができる。
【０１２９】
一例では、本発明の組合せ物には、式（Ｉ）の化合物からなる群から選択されるＰＩ３Ｋ阻害剤：
【０１３０】
【化３】
2018506511.tif 000037
［式中、ＷはＣＲｗまたはＮであり、
Ｒｗは以下からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ハロゲン、
（４）メチル、
５）トリフルオロメチル、
（６）スルホンアミド、
Ｒ１は以下からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ニトロ、
（４）ハロゲン、
（５）置換および非置換のアルキル、
（６）置換および非置換のアルケニル、
（７）置換および非置換のアルキニル、
（８）置換および非置換のアリール、
（９）置換および非置換のヘテロアリール、
（１０）置換および非置換のヘテロシクリル、
（１１）置換および非置換のシクロアルキル、
（１２）−ＣＯＲ１ａ、
（１３）−ＣＯ２Ｒ１ａ、
（１４）−ＣＯＮＲ１ａＲ１ｂ、
（１５）−ＮＲ１ａＲ１ｂ、
（１６）−ＮＲ１ａＣＯＲ１ｂ、
（１７）−ＮＲ１ａＳＯ２Ｒ１ｂ、
（１８）−ＯＣＯＲ１ａ、
（１９）−ＯＲ１ａ、
（２０）−ＳＲ１ａ、
（２１）−ＳＯＲ１ａ、
（２３）−ＳＯ２ＮＲｌａＲ１ｂ
Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、独立して以下からなる群から選択され：
（ａ）水素、
（ｂ）置換または非置換のアルキル、
（ｃ）置換および非置換のアリール、
（ｄ）置換および非置換のヘテロアリール、
（ｅ）置換および非置換のヘテロシクリル、ならびに
（ｆ）置換および非置換のシクロアルキル、
Ｒ２は以下からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ニトロ、
（４）ハロゲン、
（５）ヒドロキシ、
（６）アミノ、
（７）置換および非置換のアルキル、
（８）−ＣＯＲ２ａ、ならびに
（９）−ＮＲ２ａＣＯＲ２ｂ
Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、独立して以下からなる群から選択され：
（ａ）水素、および
（ｂ）置換または非置換のアルキル；
Ｒ３は以下からなる群から選択され：
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ニトロ、
（４）ハロゲン、
（５）置換および非置換のアルキル、
（６）置換および非置換のアルケニル、
（７）置換および非置換のアルキニル、
（８）置換および非置換のアリール、
（９）置換および非置換のヘテロアリール、
（１０）置換および非置換のヘテロシクリル、
（１１）置換および非置換のシクロアルキル、
（１２）−ＣＯＲ３ａ、
（１４）−ＮＲ３ａＲ３ｂ
（１３）−ＮＲ３ａＣＯＲ３ｂ、
（１５）−ＮＲ３ａＳＯ２Ｒ３ｂ、
（１６）−ＯＲ３ａ、
（１７）−ＳＲ３ａ、
（１８）−ＳＯＲ３ａ、
（１９）−ＳＯ２Ｒ３ａ
Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立して以下からなる群から選択され：
（ａ）水素、
（ｂ）置換または非置換のアルキル、
（ｃ）置換および非置換のアリール、
（ｄ）置換および非置換のヘテロアリール、
（ｅ）置換および非置換のヘテロシクリル、ならびに
（ｆ）置換および非置換のシクロアルキル、ならびに
Ｒ４は以下からなる群から選択される：
（１）水素、および
（２）ハロゲン］または薬学的に許容されるその塩が含まれる。
【０１３１】
式（Ｉ）の化合物の定義において使用されている基および記号は、参照によりその全体が本出願内に取り込まれた刊行物である国際特許第０７／０８４７８６号パンフレット中に開示されている意味を有する。
【０１３２】
式（Ｉ）のＰＩ３Ｋ阻害化合物は、遊離塩基または薬学的に許容されるその塩の形態で組合せて存在し得る。式（Ｉ）の化合物の適切な塩には、以下に限定されないが、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、ジグルコン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、グルコ酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３フェニルプピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐトルエンスルホン酸塩、およびウンデカン酸塩が含まれる。また、基本の窒素含有基は、メチル、エチル、プロピル、およびブチルの塩化物、臭化物、およびヨウ化物などのハロゲン化アルキル、ジメチル、ジエチル、ジブチル、およびジアミルの硫酸塩などの硫酸ジアルキル、デシル、ラウリル、ミリスチル、およびステアリルの塩化物、臭化物、およびヨウ化物などの長鎖ハロゲン化物、ベンジルおよびフェネチルの臭化物などのハロゲン化アラルキル等の薬剤を用いて四級化することができる。
【０１３３】
式（Ｉ）の化合物の適切な塩には、それだけには限定されないが、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム塩などの、アルカリおよびアルカリ土類金属に基づく陽イオン、ならびに、それだけには限定されないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含めた、無毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミン陽イオンがさらに含まれる。塩基付加塩の形成に有用な他の代表的な有機アミンには、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ピリジン、ピコリン、トリエタノールアミンなど、ならびにアルギニン、リシン、およびオルニチンなどの塩基性アミノ酸が含まれる。
【０１３４】
本発明の組合せ物における使用に式（Ｉ）の好ましい化合物は、ＰＩ３Ｋ阻害剤５−（２，６−ジ−モルホリン−４−イル−ピリミジン−４−イル）−４−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イルアミン（ＢＫＭ１２０としても知られる）またはその塩酸塩である。この化合物の合成は、その内容が本明細書中に参照により組み込まれている国際公開第２００７／０８４７８６号パンフレット中、実施例１０として記載されている。
【０１３５】
組合せ物および投与の使用
本発明に従って、ＨＥＲ３アンタゴニストとＰＩ３Ｋ阻害剤の組合せ物は、乳がん脳転移の処置において、それを必要としている対象において、対象に、（ａ）有効量のホスファチジルイノシトール３−キナーゼ、たとえば式（Ｉ）の化合物からなる群から選択されるものと、（ｂ）有効量のＨｅｒ３アンタゴニストとを含む医薬組合せ物を投与することによって使用し得る。好ましくは、これらの治療剤は、組み合わせた場合に、どちらの単独療法と比較しても、たとえば乳がん脳転移の進行の遅延に関してまたは腫瘍体積の変化に関して、併用で有益な効果、たとえば相乗的または改善された抗増殖効果をもたらす、治療上有効な用量で投与する。投与は別々、同時、または逐次的であり得る。一実施形態では、乳がんはＨｅｒ２陽性であり、エクソン１、２、５、７、９、または２０中（たとえば、エクソン９のＥ５４５Ｋ中またはエクソン２０のＨ１０４７Ｒ中）に１つまたは複数のＰＩＫ３ＣＡ突然変異を有することが決定されている。
【０１３６】
一態様では、本発明は、上述の（ａ）式（Ｉ）の化合物からなる群から選択されるホスファチジルイノシトール３−キナーゼまたは薬学的に許容されるその塩と、（ｂ）Ｈｅｒ３抗体またはその断片との組合せ物を、乳がん脳転移に対して治療上有効な量で、それを必要としている対象に投与することを含む、乳がん脳転移を処置する方法に関する。一実施形態では、乳がんはＨｅｒ２陽性である。別の実施形態では、乳がんはＨｅｒ２陽性であり、１つまたは複数のＰＩＫ３ＣＡ突然変異、たとえば、エクソン１、２、５、７、９、または２０中のもの（たとえば、エクソン９のＥ５４５Ｋ中またはエクソン２０のＨ１０４７Ｒ中）を有することが決定されている。
【０１３７】
一態様では、本発明は、乳がん脳転移を処置するための医薬を調製するための、上述の（ａ）式（Ｉ）の化合物からなる群から選択されるホスファチジルイノシトール３−キナーゼまたは薬学的に許容されるその塩と、（ｂ）Ｈｅｒ３抗体またはその断片との組合せ物の使用に関する。一実施形態では、乳がんはＨｅｒ２陽性である。別の実施形態では、乳がんはＨｅｒ２陽性であり、１つまたは複数のＰＩＫ３ＣＡ突然変異、たとえば、エクソン１、２、５、７、９、または２０中のもの（たとえば、エクソン９のＥ５４５Ｋ中またはエクソン２０のＨ１０４７Ｒ中）を有することが決定されている。
【０１３８】
乳がん脳転移を有する患者には、本発明に従った前記乳がん脳転移の処置のために、本明細書中に記載の（ａ）式（Ｉ）の化合物からなる群から選択されるホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤または薬学的に許容されるその塩と、（ｂ）Ｈｅｒ３アンタゴニストとを含む組合せ物を、別々に、同時に、または逐次的に投与し得る。
【０１３９】
ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤とＨｅｒ３アンタゴニストの投与は、たとえば症状の軽減、進行の遅延、または阻害に関して、有益な効果、たとえば、組合せ物の個々の治療剤の単独療法と比較した治療効果、たとえば相乗的な治療効果だけでなく、本発明の組合せ物において使用する薬学的治療剤のうちの一方のみを施用する単独療法と比較して、さらなる驚くべき有益な効果、たとえばより少ない副作用、生活の質の改善、または罹患率の減少ももたらし得る。一実施形態では、脳転移の進行が低減する。
【０１４０】
さらなる利点は、より低い用量のホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤とＨｅｒ３アンタゴニストの治療剤を、たとえば、多くの場合は用量が必ずしも少ないだけでなく、より少ない頻度で施用されるように使用できること、または、治療剤のうちの一方単独で観察される副作用の発生率を減退させるために使用できることである。処置する患者の要望および要件に従うものである。
【０１４１】
確立された試験モデルによって、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤とＨｅｒ３アンタゴニストが、本明細書中に上述した有益な効果をもたらすことを示すことができる。当業者は、そのような有益な効果を証明するために、関連する試験モデルを選択する能力を十分に有する。ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤とＨｅｒ３アンタゴニストの薬理活性は、本明細書中で以下に本質的に記載のように、たとえば、臨床研究またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験手順において実証し得る。
【０１４２】
乳がん脳転移を処置するためのそれぞれの治療剤の最適な用量は、公知の方法を使用してそれぞれの個体について経験的に決定することができ、それだけには限定されないが、疾患の進行の度合、個体の年齢、体重、全体的な健康、性別、および食習慣、投与の時間および経路、ならびに個体が摂取している他の医薬品を含めた様々な要因に依存するであろう。最適な用量は、当分野で周知のルーチン的な試験および手順を使用して確立し得る。
【０１４３】
単一の剤形を生成するために担体材料と合わせ得るそれぞれの治療剤の量は、処置する個体および特定の投与様式に応じて変動する。一部の実施形態では、本明細書中に記載した薬剤の組合せを含有する単位剤形は、組合せのそれぞれの薬剤を、薬剤を単独で投与する場合に典型的に投与する量で含有する。
【０１４４】
用量の頻度は、使用する化合物および処置する特定の状態に応じて変動し得る。一般に、有効な治療を提供するために十分である、最小用量の使用が好ましい。患者は、一般に、当業者に慣用の、処置する状態に適したアッセイを使用して、治療的有効性についてモニタリングし得る。
【０１４５】
毒性なしに有効性をもたらす薬物化合物の最適な比、個々および組合せの用量、ならびに濃度は、標的部位への治療剤の利用可能度の動力学に基づいており、当業者に知られている方法を使用して決定する。
【０１４６】
治療剤および診断剤の配合物は、たとえば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、ローション、または懸濁液の形態の、生理的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤と混合することによって調製することができる（たとえば、Hardman et al., (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.、Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y.、Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY、Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY、Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY、Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.を参照）。
【０１４７】
治療剤の投与レジメンの選択は、実体の血清または組織代謝回転速度、症状のレベル、実体の免疫原性、および生物学的マトリックス中における標的細胞の到達性を含めたいくつかの要因に依存する。ある特定の実施形態では、投与レジメンは、患者に送達される治療剤の量を最大限にし、これは許容される副作用のレベルと調和している。したがって、送達する生物剤の量は、特定の実体および処置する状態の重篤度に部分的に依存する。抗体、サイトカイン、および小分子の適切な用量を選択するための指針が利用可能である（たとえば、Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK、Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y.、Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N.Y.、Baertet al., (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608、Milgrom et al., (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973、Slamon et al., (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792、Beniaminovitz et al., (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619、Ghosh et al., (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32、Lipskyet et al., (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602を参照）。
【０１４８】
本発明のＨｅｒ３抗体またはその断片を含む組合せ物は、ＰＩ３Ｋ阻害剤と別々にまたは同時に提供することができ、抗体を含む組成物は、持続注入によって、または、たとえば、１日、１週間の間隔、もしくは１週間に１〜７回の用量によって提供することができる。用量は、静脈内、皮下、局所、経口、経鼻、直腸、筋肉内、脳内、または吸入によって提供し得る。具体的な用量プロトコールは、顕著な望ましくない副作用を回避する、最大の用量または用量頻度を含むものである。合計週間用量は、少なくとも０．０５μｇ／体重１ｋｇ、少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、少なくとも０．５μｇ／ｋｇ、少なくとも１μｇ／ｋｇ、少なくとも１０μｇ／ｋｇ、少なくとも１００μｇ／ｋｇ、少なくとも０．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも５０ｍｇ／ｋｇであり得る（たとえば、Yang et al., (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434、Herold et al., (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698、Liu et al., (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456、Portielji et al., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144を参照）。抗体またはその断片の所望の用量は抗体またはポリペプチドとほぼ同じであり、モル／体重１ｋｇ基準である。抗体またはその断片の所望の血漿濃度は、概ねのモル／体重１ｋｇ基準である。用量は、少なくとも１５μｇ、少なくとも２０μｇ、少なくとも２５μｇ、少なくとも３０μｇ、少なくとも３５μｇ、少なくとも４０μｇ、少なくとも４５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも５５μｇ、少なくとも６０μｇ、少なくとも６５μｇ、少なくとも７０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも８０μｇ、少なくとも８５μｇ、少なくとも９０μｇ、少なくとも９５μｇ、または少なくとも１００μｇであり得る。対象に投与する用量の回数は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回以上であり得る。
【０１４９】
本発明の抗体またはその断片では、患者に投与する用量は、患者の体重の０．０００１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇであり得る。用量は、患者の体重の０．０００１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１から２ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１から１ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇから０．７５ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇから０．５ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇから０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１から０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１から０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１から０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１から０．２５ｍｇ／ｋｇ、または０．０１から０．１０ｍｇ／ｋｇであり得る。一例では、用量は、重量に基づいて、たとえば、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、または固定量として、たとえば、７５ｍｇ、１５０ｍｇ、３００ｍｇ、５００ｍｇ、７００ｍｇ、１０００ｍｇで送達し得る。
【０１５０】
本発明の抗体またはその断片の単位用量は、０．１ｍｇから２０ｍｇ、０．１ｍｇから１５ｍｇ、０．１ｍｇから１２ｍｇ、０．１ｍｇから１０ｍｇ、０．１ｍｇから８ｍｇ、０．１ｍｇから７ｍｇ、０．１ｍｇから５ｍｇ、０．１から２．５ｍｇ、０．２５ｍｇから２０ｍｇ、０．２５から１５ｍｇ、０．２５から１２ｍｇ、０．２５から１０ｍｇ、０．２５から８ｍｇ、０．２５ｍｇから７ｍｇ、０．２５ｍｇから５ｍｇ、０．５ｍｇから２．５ｍｇ、１ｍｇから２０ｍｇ、１ｍｇから１５ｍｇ、１ｍｇから１２ｍｇ、１ｍｇから１０ｍｇ、１ｍｇから８ｍｇ、１ｍｇから７ｍｇ、１ｍｇから５ｍｇ、または１ｍｇから２．５ｍｇであり得る。
【０１５１】
本発明の抗体またはその断片の用量は、対象において少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、少なくとも０．５μｇ／ｍｌ、少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくとも２μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも６μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも１５μｇ／ｍｌ、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、少なくとも２５μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、少なくとも１２５μｇ／ｍｌ、少なくとも１５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１７５μｇ／ｍｌ、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、少なくとも２２５μｇ／ｍｌ、少なくとも２５０μｇ／ｍｌ、少なくとも２７５μｇ／ｍｌ、少なくとも３００μｇ／ｍｌ、少なくとも３２５μｇ／ｍｌ、少なくとも３５０μｇ／ｍｌ、少なくとも３７５μｇ／ｍｌ、または少なくとも４００μｇ／ｍｌの血清力価を達成し得る。あるいは、本発明の抗体またはその断片の用量は、対象において少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、少なくとも０．５μｇ／ｍｌ、少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくとも、２μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも６μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも１５μｇ／ｍｌ、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、少なくとも２５μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、少なくとも１２５μｇ／ｍｌ、少なくとも１５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１７５μｇ／ｍｌ、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、少なくとも２２５μｇ／ｍｌ、少なくとも２５０μｇ／ｍｌ、少なくとも２７５μｇ／ｍｌ、少なくとも３００μｇ／ｍｌ、少なくとも３２５μｇ／ｍｌ、少なくとも３５０μｇ／ｍｌ、少なくとも３７５μｇ／ｍｌ、または少なくとも４００μｇ／ｍｌの血清力価を達成し得る
【０１５２】
本発明の抗体またはその断片の用量は繰り返してもよく、投与は少なくとも１日、２日、３日、５日、７日、１０日、１５日、２１日、３０日、４５日、２カ月、７５日、３カ月、または少なくとも６カ月隔てられていてもよい。
【０１５３】
一実施形態では、組合せ物のＨｅｒ３アンタゴニストを、５〜１４日毎に、２０ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌの用量で投与する。一実施形態では、組合せ物のＨｅｒ３アンタゴニストＭＯＲ１０７０３を、７日毎に、２０ｍｇ／ｍｌの用量で投与する。一実施形態では、組合せ物のＨｅｒ３アンタゴニストＭＯＲ１０７０３を、７日毎に、２０ｍｇ／ｍｌ＋／−１０ｍｇ／ｍｌの用量で投与する。一実施形態では、組合せ物のＨｅｒ３アンタゴニストＭＯＲ１０７０３を、１４日毎に、２０ｍｇ／ｍｌ＋／−１０ｍｇ／ｍｌの用量で投与する。一実施形態では、組合せ物のＨｅｒ３アンタゴニストＭＯＲ１０７０３を、２１日毎に、２０ｍｇ／ｍｌ＋／−１０ｍｇ／ｍｌの用量で投与する。
【０１５４】
組合せ物のＰＩ３Ｋ阻害剤は、好ましくは、１日１回、約０．００１から１０００ｍｇ／体重１ｋｇ／日までの範囲の用量、より好ましくは１．０から３０ｍｇ／体重１ｋｇまでで投与する。一実施形態では、式Ｉの化合物の用量は、約１０ｍｇから約２０００ｍｇの範囲／人／日である。一例では、１．０から３０ｍｇ／体重１ｋｇである。好ましい一実施形態では、式（Ｉ）の化合物の用量は、特に温血動物がヒトの成人である場合に、約６０ｍｇ／日から約１２０ｍｇ／日の範囲である。好ましくは、式（Ｉ）の化合物の用量は、ヒトの成人において約６０ｍｇ／日から約１００ｍｇ／日の範囲である。式（Ｉ）の化合物は、ヒトの成人に、１日１回、連続的に（各日）または断続的に（たとえば７日間のうちの５日間）、適切な用量で経口投与し得る。たとえば、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤５−（２，６−ジ−モルホリン−４−イル−ピリミジン−４−イル）−４−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イルアミンまたはその塩酸塩は、６０ｍｇ／日から約１２０ｍｇ／日まで、たとえば１００ｍｇ．ｍｌで投与し、ＭＯＲ１０７０３の用量は、５〜１４日毎に、２０ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌの間の用量で投与する。別の例では、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤の５−（２，６−ジ−モルホリン−４−イル−ピリミジン−４−イル）−４−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イルアミンまたはその塩酸塩は、６０ｍｇ／日から約１２０ｍｇ／日の間で、たとえば１００ｍｇ．ｍｌで投与し、ＭＯＲ１０７０３の用量は、１４〜３０日毎、たとえば２１〜２８日毎に、２０ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌの間の用量で投与する。別の例では、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤の５−（２，６−ジ−モルホリン−４−イル−ピリミジン−４−イル）−４−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イルアミンまたはその塩酸塩は、６０ｍｇ／日から約１２０ｍｇ／日の間で、たとえば、１００ｍｇ．ｍｌで投与し、ＭＯＲ１０７０３の用量は、７〜２８日毎、たとえば２１日毎に、２０ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌの間の用量で投与する。
【０１５５】
特定の患者の有効量は、処置する状態、患者の全体的な健康、投与の方法、経路、および用量、ならびに副作用の重篤度などの要因に応じて変動し得る（たとえば、Maynard et al., (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, Fla.、Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UKを参照）。
【０１５６】
組合せ物のＰＩ３Ｋおよび／またはＨｅｒ３アンタゴニストの投与経路は、たとえば、局所もしくは皮膚への施用、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、脳脊髄内、病巣内による注射もしくは輸液、または持続放出系もしくは移植片によるものであり得る（たとえば、Sidman et al., (1983) Biopolymers 22:547-556、Langer et al., (1981) J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277、Langer (1982) Chem. Tech. 12:98-105、Epstein et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692、Hwang et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034、米国特許第６，３５０，４６６号明細書および第６，３１６，０２４号明細書を参照）。必要な場合は、注入部位での疼痛を和らげるために、組成物にリドカインなどの可溶化剤および局所麻酔剤を含めてもよい。さらに、たとえば吸入器または噴霧器を使用し、エアロゾル化剤と配合することによって、肺内投与も用いることができる。たとえば、そのそれぞれその全体が参照により本明細書中に組み込まれている、米国特許第６，０１９，９６８号明細書、第５，９８５，３２０号明細書、第５，９８５，３０９号明細書、第５，９３４，２７２号明細書、第５，８７４，０６４号明細書、第５，８５５，９１３号明細書、第５，２９０，５４０号明細書、および第４，８８０，０７８号明細書、ならびにＰＣＴ国際公開第９２／１９２４４号パンフレット、同第９７／３２５７２号パンフレット、同第９７／４４０１３号パンフレット、同第９８／３１３４６号パンフレット、および同第９９／６６９０３号パンフレットを参照されたい。
【０１５７】
また、本発明の組成物は、１つまたは複数の投与経路を介して、当分野で知られている様々な方法のうちの１つまたは複数を使用して投与し得る。たとえば注射または輸液による非経口投与経路を使用し得る。非経口投与とは、経腸および局所投与以外の、通常は注射による投与様式を表す場合があり、それだけには限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および輸液が含まれる。あるいは、本発明の組成物は、局所、表皮、または粘膜の投与経路、たとえば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下、または局所などの、非経口でない経路を介して投与することができる。
【０１５８】
式（Ｉ）の化合物などのＰＩ３キナーゼ阻害剤を用いた同時投与または処置の方法は当分野で知られている（たとえば、Hardman et al., (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10.sup.th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.、Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.、Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.を参照）。
【０１５９】
ＰＩ３Ｋ阻害剤は、本明細書中に記載の抗体またはその断片と組み合わせて投与することができ、本発明の抗体またはその断片から、５分未満空けて、３０分未満空けて、１時間空けて、約１時間空けて、約１から約２時間空けて、約２時間から約３時間空けて、約３時間から約４時間空けて、約４時間から約５時間空けて、約５時間から約６時間空けて、約６時間から約７時間空けて、約７時間から約８時間空けて、約８時間から約９時間空けて、約９時間から約１０時間空けて、約１０時間から約１１時間空けて、約１１時間から約１２時間空けて、約１２時間から１８時間空けて、１８時間から２４時間空けて、２４時間から３６時間空けて、３６時間から４８時間空けて、４８時間から５２時間空けて、５２時間から６０時間空けて、６０時間から７２時間空けて、７２時間から８４時間空けて、８４時間から９６時間空けて、または９６時間から１２０時間空けて投与し得る。２つ以上の治療は、１回の同じ患者の訪問内に投与し得る。
【０１６０】
ＨＥＲ３アンタゴニストおよびＰＩ３Ｋ阻害剤は周期的に投与し得る。サイクリング療法は、定期間の１回目の治療（たとえば１回目の予防剤または治療剤）の投与、次いで一定期間の２回目の治療（たとえば２回目の予防剤または治療剤）の投与、任意選択で、次いで一定期間の３回目の治療（たとえば予防剤または治療剤）の投与などを行い、治療のうちの１つに対する耐性の発生を低減させるため、治療のうちの１つの副作用を回避もしくは低減させるため、および／または治療の有効性を改善するために、この逐次投与、すなわちサイクルを繰り返すことを含む。
【０１６１】
ある特定の実施形態では、本発明の抗体またはその断片は、適切なｉｎ  ｖｉｖｏ分布が確実となるように配合することができる。たとえば、血液脳関門（ＢＢＢ）は多くの高親水性化合物を排除する。本発明の治療化合物がＢＢＢを横切ることを確実にするために（所望する場合）、これらをたとえばリポソームとして配合することができる。リポソーム作製方法には、たとえば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書、第５，３７４，５４８号明細書、および第５，３９９，３３１号明細書を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または臓器内に選択的に輸送される１つまたは複数の部分を含み、したがって標的化薬物送達を増強させ得る（たとえばRanade, (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照）。例示的な標的化部分には、葉酸塩またはビオチン（たとえばＬｏｗらの米国特許第５，４１６，０１６号明細書を参照）、マンノシド（Umezawa et al., (1988) Biochem.Biophys. Res. Commun. 153:1038）、抗体（Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140、Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）、界面活性剤タンパク質Ａ受容体（Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134）、ｐ１２０（Schreier et al, (1994) J. Biol. Chem. 269:9090）が含まれる。K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123、J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照されたい。
【０１６２】
本発明は、ＰＩ３Ｋ阻害剤と組み合わせたＨＥＲ３アンタゴニストの投与を提供する。本発明の組合せ療法の治療は、同時にまたは逐次的に対象に投与することができる。また、本発明の組合せ療法の治療は、周期的に投与することもできる。サイクリング療法は、一定期間の１回目の治療（たとえば１回目の予防剤または治療剤）の投与、次いで一定期間の２回目の治療（たとえば２回目の予防剤または治療剤）の投与を行い、治療（たとえば薬剤）のうちの１つに対する耐性の発生を低減させるため、治療（たとえば薬剤）のうちの１つに対する副作用を回避もしくは低減させるため、および／または治療の有効性を改善するために、この逐次投与、すなわちサイクルを繰り返すことを含む。
【０１６３】
ＨＥＲ３アンタゴニストおよびＰＩ３Ｋ阻害剤の組合せ療法は、同時発生的に対象に投与することができる。用語「同時発生的に」とは、正確に同時に治療（たとえば予防剤または治療剤）を投与することに限定されず、本発明の抗体またはその断片を含む医薬組成物を、対象に、本発明の抗体がＰＩ３Ｋ阻害剤と一緒に作用して、それらを別の方法で投与した場合よりも増加した利点をもたらすような順序および時間間隔以内に投与することを意味する。たとえば、それぞれの治療は、対象に、同時に、または任意の順序の異なる時点に逐次的に投与し得る。しかし、同時に投与しない場合は、これらは、所望の治療的または予防的効果をもたらすために十分に近い時間間隔で投与するべきである。それぞれの治療は、対象に、別々に、任意の適切な形態および任意の適切な経路で投与することができる。様々な実施形態では、治療（たとえば予防剤または治療剤）は、対象に、１５分間未満、３０分未満、１時間未満空けて、約１時間空けて、約１時間から約２時間空けて、約２時間から約３時間空けて、約３時間から約４時間空けて、約４時間から約５時間空けて、約５時間から約６時間空けて、約６時間から約７時間空けて、約７時間から約８時間空けて、約８時間から約９時間空けて、約９時間から約１０時間空けて、約１０時間から約１１時間空けて、約１１時間から約１２時間空けて、２４時間空けて、４８時間空けて、７２時間空けて、または１週間空けて投与する。他の実施形態では、２つ以上の治療（たとえば予防剤または治療剤）は、同じ患者の訪問内に投与する。
【０１６４】
組合せ療法は、同じ医薬組成物中で対象に投与することができる。あるいは、組合せ療法は、別々の医薬組成物中で同時発生的に対象に投与することができる。治療剤は、同じまたは異なる投与経路によって対象に投与し得る。
【０１６５】
本発明を完全に記載したが、例示的でありさらに限定することを意図しない以下の実施例および特許請求の範囲によってさらに例示する。
【実施例】
【０１６６】
〔実施例１〕
ＭＦＰまたは脳内で成長中の場合の、ＰＩ３Ｋ阻害に対するＨＥＲ２陽性乳がんの差次的応答
５−（２，６−ジ−モルホリン−４−イル−ピリミジン−４−イル）−４−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イルアミン（本明細書中で「化合物Ａ」と呼ぶ）は、ＨＥＲ２増幅および発がん性ＰＩ３Ｋ触媒性サブユニットアルファ（ＰＩＫ３ＣＡ）突然変異を保有する乳がん細胞に対する活性を有する、強力かつ特異的なパンクラスＩ  ＰＩ３Ｋ阻害剤である。本発明者らは、ヌードマウスのＭＦＰまたは脳実質内で成長中の同一のヒトＨＥＲ２陽性乳がん細胞に対する、化合物Ａの有効性を比較した。検査した３つの乳がん細胞株には、ＨＥＲ２増幅したＢＴ４７４、ＨＥＲ２増幅したＰＩＫ３ＣＡ突然変異体（Ｅ５４５Ｋ）ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、およびＰＩＫ３ＣＡ突然変異体（Ｈ１０４７Ｒ）Ｔ−４７Ｄ細胞株が含まれていた。化合物Ａは、ＭＦＰ内で成長中のＨＥＲ２またはＰＩ３Ｋに駆動される乳房腫瘍の退行をもたらしたが、確立された脳転移性病変は処置に耐性であった（図１Ａおよび１Ｂ）。化合物Ａの最終用量の２時間後の採取した腫瘍組織は、ＭＦＰ腫瘍と比較してＢＭ内で匹敵するレベルのｐ−ＡＫＴ阻害を示した。阻害レベルに加えて、ＢＭまたはＭＦＰ腫瘍内で短期の化合物Ａ処置の後にｐ−ＡＫＴ阻害の同様の時間経過が本発明者らにより観察された。さらに、両部位で成長中の乳房腫瘍内の化合物Ａの濃度、およびこれらのマウスの血漿中の濃度も同一であった。総合すると、これらのデータは、ＰＩ３Ｋ阻害に対する成長感度の劇的な相違は、単純に、脳腫瘍において化合物Ａの薬物動態学／薬力学的なプロファイルが損なわれるせいではないことを示している。
【０１６７】
〔実施例２〕
ＨＥＲ２陽性乳がん細胞は耐性のために脳微小環境からの持続的な影響を必要とする。
本発明者らは、乳がん細胞が脳微小環境からの持続的な影響を必要とするかどうかを問うことによって、ＰＩ３Ｋ阻害に対する乳がんＢＭの耐性の調査を始めた。脳転移性腫瘍の解離後の乳がん細胞を単離した（ＢＴ４７４−Ｇｌｕｃ−ＢＲと呼ぶ）。１週間ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した後、ＧＦＰによって同定して、生細胞の大多数はがん細胞であった。これらの「脳微小環境に曝露された」乳がん細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで化合物Ａに対して親細胞と同様に感受性であった。このデータは、脳微小環境は乳がん細胞に永続的な変化を誘導せず、また、脳内における化合物Ａ耐性クローンの優先的な成長も存在しないことを示唆している。そうではなく、乳がん細胞は、耐性を維持するためには、脳微小環境によって連続的に支えられなければならない。
【０１６８】
〔実施例３〕
ＭＦＰおよび脳腫瘍は等しい成長速度を有する。
本発明者らはまず、脳微小環境が、乳がん細胞がより増殖性となることを誘導し、したがって、標的化剤を用いてその成長を遅らせる能力が低減させると仮定した。腫瘍を形成するために必要な乳がん細胞はＭＦＰと比較して脳実質内の方が少ないが、腫瘍が確立された後は、２つの微小環境内でのがん細胞の成長速度は同一である。
【０１６９】
〔実施例４〕
ＭＦＰと比較して脳実質内で成長中、およびヒト脳転移中の乳房腫瘍において、ＥｒｂＢファミリーメンバーは高リン酸化されており、過剰発現されている。
本発明者らは、宿主の脳実質からの分泌因子が、がん細胞の表面上の受容体を活性化して、ＰＩ３Ｋ阻害に対する耐性を媒介できると仮定した。したがって、ＭＦＰと脳腫瘍との間でいくつかの成長因子受容体のリン酸化状態の相違を調査するために、ホスホ受容体タンパク質アレイを行った。アレイは、ＢＴ４７４−Ｇｌｕｃ脳腫瘍においてＥｒｂＢファミリーメンバーであるＥＧＦＲおよびＨＥＲ３の明白な活性化過剰を示した。ウエスタンブロッティングにより、ＢＴ４７４−ＧｌｕｃおよびＴ−４７Ｄ−Ｇｌｕｃ脳腫瘍のどちらにもおいて、そのＭＦＰ対応物と比較して、増加したリン酸化ＨＥＲ３および全ＨＥＲ３が確認された。ＢＴ４７４−Ｇｌｕｃ脳腫瘍は増加したリン酸化ＥＧＦＲおよび全ＥＧＦＲを示すが、Ｔ−４７Ｄ−Ｇｌｕｃ脳腫瘍はＭＦＰ腫瘍と比較してはるかに少ない。ＭＤＡ−ＭＢ−３６１−Ｇｌｕｃ脳腫瘍は、全ＥＧＦＲは増加するがリン酸化されたタンパク質は検出可能なレベルではなく、全ＨＥＲ３はわずかに増加するがリン酸化ＨＥＲ３は増加しないことが認められた。この発見により、本発明者らの乳がんＢＭモデルにおける耐性の制御因子としてＨＥＲ３を注目することとなった。ＨＥＲ３タンパク質の増加と整合することには、ヒトＨＥＲ３のｍＲＮＡ発現は、脳内で成長中のＢＴ４７４−Ｇｌｕｃ腫瘍がより高い。最後に、対応するヒト原発性乳がんおよびＢＭの免疫組織化学的分析により、原発がんの１３％（８件中１件）と比較して、脳転移性病変６３％（８件中５件）で増加したＨＥＲ３タンパク質が示された。
【０１７０】
〔実施例５〕
ニューレギュリンはＰＩ３Ｋ阻害に対する乳がん細胞の耐性を誘導し、ＭＦＰと比較してネズミ脳内でより発現される。
２２０個成長因子の不偏分析において、ＮＲＧ−１および−２が、試験した３つのＨＥＲ２陽性乳がん細胞株において化合物Ａに対する耐性の最も強力な誘導因子であった。
【０１７１】
ＨＥＲ３はＮＲＧの主要な受容体であるため、本発明者らは、ＮＲＧはＨＥＲ３を通してシグナル伝達されて耐性を誘導すると仮定した。したがって、ＮＲＧ誘導性のＰＩ３ＫまたはＨＥＲ２阻害をｉｎ  ｖｉｔｒｏで克服する、ＨＥＲ３阻害の能力を試験した。ＨＥＲ３を標的とするために、本発明者らはコンホメーション変化を誘導し、ＨＥＲ３を不活性状態に固定する抗体であるＭＯＲ１０３７５を用いた。ＮＲＧ１誘導性の乳がんＰＩ３Ｋ阻害剤耐性は、ＭＯＲ１０７０３の添加によって克服された。これらのデータは、化合物Ａ耐性の乳がんＢＭにおいて活性化過剰となるＮＲＧ−ＨＥＲ３軸が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＩ３Ｋ阻害に対する乳がん細胞の耐性を駆動することを示している。総合すると、これらの発見は、脳微小環境によって構成的に生成されるＮＲＧは、ＨＥＲ３活性化によってＰＩ３Ｋ阻害に対するＨＥＲ２陽性乳がん脳転移性耐性を誘導することを示唆している。
【０１７２】
〔実施例６〕
ＨＥＲ３阻害は、ＰＩ３ＫまたはＨＥＲ２阻害に対する乳房腫瘍の脳微小環境媒介性の耐性を克服する。
本発明者らは、ＨＥＲ３阻害剤ＭＯＲ１０７０３が単独でまたは化合物Ａと組み合わせて、ＢＴ４７４−Ｇｌｕｃ脳腫瘍ＢＭの成長を遅らせる能力を試験した（図２Ａ〜Ｂ）。ＭＯＲ１０７０３の単独療法は、脳実質内における乳がんの成長を有意に遅らせなかった。しかし、ＨＥＲ３阻害と化合物Ａとの組合せは乳がんＢＭの成長を有意に遅らせた。組合せ療法を用いた腫瘍成長の遅延は、ＢＴ４７４−ＧｌｕｃまたはＭＤＡ−ＭＢ−３６１−Ｇｌｕｃ脳腫瘍において、化合物Ａの単独療法群と比較して生存のそれぞれ２．５または２倍の増加をもたらした（３Ａ〜Ｂ）。
【０１７３】
結論：本発明者らの発見は、頭蓋外のＨＥＲ２陽性疾患の耐性を媒介することが知られている経路が、脳微小環境において先験的に活性化過剰となっており、新規の耐性をもたらすことを示している。この報告の前は、現在までに、乳がん脳転移におけるＮＲＧ−１の潜在的な役割に関する公開されたデータは存在しない。ＮＲＧ−１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長中の乳がん細胞におけるＰＩ３Ｋ阻害剤耐性の媒介因子として記載されているが、本発明者らは、発現レベルが天然に存在するｉｎ  ｖｉｖｏの臓器内におけるその役割を記載する。本発明者らは、乳がんＢＭの治療耐性の促進におけるＮＲＧ−１のトランスレーショナルな証拠を明らかにし、さらに、本明細書中に記載のものなどのＨｅｒ３アンタゴニストを使用することによって、ＮＲＧ−１活性を克服し、脳微小環境における治療上の有効性を改善するための処置の選択肢を提案する。本発明の処置は、今や、脳内の転移性乳がんを使用するために使用することができる。
【０１７４】
〔実施例７〕
方法の要約
細胞株、感染、および培養。ＢＴ４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、およびＴ−４７Ｄ細胞を、内部リボソーム進入部位によって隔てられたＧｌｕｃおよびＧＦＰをコードしている発現カセットを用いて、レンチウイルスベクターを使用して形質導入した。ＧＦＰ陽性細胞をＦＡＣＳＡｒｉａ細胞選別機（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で選別した。ＢＴ４７４−ＧｌｕｃおよびＴ−４７Ｄ−Ｇｌｕｃ細胞を１０％（体積／体積）のＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を補充したＲＰＭＩ１６４０中で維持した。ＭＤＡ−ＭＢ−３６１−Ｇｌｕｃは、１０％（体積／体積）のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２中で維持した。
【０１７５】
乳腺脂肪パッドおよび脳転移性異種移植片。雌のヌードマウス（８〜９週齢）を卵巣摘出し、腫瘍細胞を移植する前日に、０．３６ｍｇまたは０．７２ｍｇの１７β−エストラジオールペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を移植した。ペレットは６０または９０日間のどちらかの有効期限日に交換した。乳腺脂肪パッドモデルでは、５×１０６個のＢＴ４７４−Ｇｌｕｃ細胞を、５０μＬのＰＢＳとＭａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘ高濃度（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の１：１比の混合物中に注射前に懸濁させた。脳内への注射では、マウスの頭部を定位固定装置で固定し、脳の左半球を覆う頭蓋骨を皮膚切開によって露出させた。バーチップサイズが直径０．５ｍｍの高速エアタービンドリル（ＣＨ４２０１Ｓ、Ｃｈａｍｐｉｏｎ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を使用して、正方形の３辺（約２．５ｍｍの長さ、各辺）を、骨フラップが緩むまで頭蓋骨にドリルで穴を空けた。尖っていないピンセットを使用して骨フラップを引き返して脳実質を露出させた。１μＬのＰＢＳで希釈した１００，０００個のがん細胞をマウスの左前頭葉内に定位的に注射した。その後骨フラップを頭蓋骨中の位置に戻し、組織適合性のシアノアクリレート糊を使用して密閉し、頭蓋骨の上の皮膚を縫合して閉じた。すべての動物手順は、公衆衛生局の実験動物の人道的管理に関する規範の指針に従って、かつマサチューセッツ総合病院の施設動物実験委員会によって認可されたプロトコールに従って行った。
【０１７６】
頭蓋窓、超音波イメージング、および腫瘍体積の計算。頭蓋窓をヌードマウス内に移植した。腫瘍体積を評価するために、小動物超音波検査装置（Ｖｅｖｏ  ２１００、ＦｕｊｉＦＩｌｍ  ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．）を使用して、頭蓋窓を通してｉｎ  ｖｉｖｏイメージングを行った。
【０１７７】
腫瘍サイズのモニタリングおよび生存分析。血液中の分泌Ｇｌｕｃの活性を測定することによって、腫瘍サイズを週に２回測定した。血中Ｇｌｕｃの測定は以前に記載のように行った５３。手短に述べると、マウスの尾静脈の小さな切れ目から採血した。１３μＬの血液を採取し、３μＬの５０ｍＭ  ＥＤＴＡと混合し、その後、−８０℃で保管した。血液を不透明な９６ウェルプレートに移し、基質としてセレンテラジン（ＣＴＺ、Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ）を使用し、プレートルミノメーター（Ｃｅｎｔｒｏ  ＸＳ  ＬＢ９６０、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、Ｇｌｕｃ活性を測定した。ルミノメーターは、１００μＬのＰＢＳ中に５０μｇ／ｍＬ  ＣＴＺを自動的に注入するように設定し、光子計数を１秒間獲得した。生存分析には、２０％より多くの体重が減少した場合、または持続的な苦痛もしくは神経機能障害の徴候を示した場合に、マウスを安楽死させた。
【０１７８】
試薬および処置。化合物Ａは、３０または５０ｍｇ／ｋｇのどちらかで、１日１回、経口胃管栄養法（ｐ．ｏ．）によって投与した。ＭＯＲ１０７０３は、２５ｍｇ／ｋｇで、２日毎に、腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によって投与した。化合物ＡおよびＭＯＲ１０７０３はどちらもＮｏｖａｒｔｉｓから入手した。トラスツズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）およびペルツズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、１５ｍｇ／ｋｇで、週に１回、ｉ．ｐ．によって投与した。トラスツズマブおよびペルツズマブはどちらもマサチューセッツ総合病院の薬局から入手した。ネラチニブは、２０ｍｇ／ｋｇで、１日１回、ｐ．ｏ．によって投与し、ＬＣ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。組換えＮＲＧ１βはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。
【０１７９】
化合物Ａの濃度測定。腫瘍試料を採取し、秤量し、Ｌｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｄチューブ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）内、ＲＩＰＡ緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＣＳＴ））中で、固定重量／体積比で溶解した。試料を、１３，０００ｒｐｍおよび４℃、マイクロ遠心分離機内で、１０分間遠心分離した。上清を溶解物から採取し、−８０℃で保管した。腫瘍溶解物中の化合物Ａの濃度はＩｎｖｅｎｔｉｖ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂ，Ｉｎｃ．のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。その後、これを腫瘍重量−溶解緩衝液の比によって正規化して、腫瘍組織中の化合物Ａの曝露（ｎｇ／ｍＬ）を得た。
【０１８０】
脳転移性腫瘍組織からのがん細胞の単離。腫瘍組織をＲＰＭＩ培地中でハサミおよびメスで刻み、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）および１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ／ｄｉｓｐａｓｅ酵素ミックス（Ｒｏｃｈｅ）中、３７℃で、振盪しながら１時間インキュベートした。その後、組織を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した。組織をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓ中に再懸濁させ、十分にピペッティングして塊を解離させた。さらに、プレーティングの前に混合物を７０ｍフィルターに通してピペッティングした。培地を翌日に新鮮なものにした。
【０１８１】
定量的リアルタイム−ポリメラーゼ連鎖反応。ＲＮＡを、ＲＮＥａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造者のプロトコールを使用して、任意選択のオンカラムＤＮＡ消化を用いて抽出した。ｉＳｃｒｉｐｔ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ＲＴシステム（ＢｉｏＲａｄ）を用いることによってｃＤＮＡを合成した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は以下のプライマーを用いて行った：ＨＥＲ３、順方向ＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＡＴＣＴＡＣＡＡ（配列番号３８０）および逆方向ＴＧＴＣＡＧＡＴＧＧＧＴＴＴＴＧＣＣＧＡ（配列番号３８１）、ＨＥＲ２順方向ＡＧＣＣＧＣＧＡＧＣＡＣＣＣＡＡＧＴ（配列番号３８２）および逆方向ＴＴＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＴＡＧＧＴＧＡＧＴＴ（配列番号３８３）、ＧＦＡＰ順方向ＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧＴＴＧＡＡＴＣＧＣＴＧＧＡ（配列番号３８４）および逆方向ＣＧＧＧＡＣＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＴＧ（配列番号３８５）、Ｉｂａ１順方向ＧＴＣＣＴＴＧＡＡＧＣＧＡＡＴＧＣＴＧＧ（配列番号３８６）および逆方向ＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＡＴＧＧＣＡＧＡＴＣ（配列番号３８７）、アクチン順方向ＡＧＡＡＡＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣＡＣＡＣＣ（配列番号３８８）および逆方向ＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧ（配列番号３８９）、ＮＲＧ−１順方向ＧＧＴＧＡＴＣＧＣＴＧＣＣＡＡＡＡＣＴＡ（配列番号３９０）および逆方向ＧＡＧＴＧＡＴＧＧＧＣＴＧＴＧＧＡＡＧＴ（配列番号３９１）、ＮＲＧ−２順方向ＧＧＴＡＡＴＣＣＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＡ（配列番号３９２）および逆方向ＧＧＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＣＧＡＴＧＴＡＧ（配列番号３９３）。
【０１８２】
分泌された成長因子の耐性分析。分泌された１回膜貫通タンパク質を表すｃＤＮＡ構築物のコレクションを同定し（以前に記載５６）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ＯＲＦコレクションから購入した。（ライブラリはＤＭＰ  ＢｉｏＡｒｃｈｉｖｅによって維持されている。）ｐＣＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）がすべてのクローンのプラスミドベクターであり、すべてのクローン挿入物は完全シーケンシングによって確認された。この研究には、２２０個のユニークな分泌タンパク質および１回膜貫通タンパク質を表す３３８個のｃＤＮＡ構築物のコレクションを使用して、それぞれの化合物処置の存在下においてレスキューされたリガンドを同定した。それぞれのｃＤＮＡ構築物は、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７を使用してリバーストランスフェクションした。３日間のインキュベーションの後、分泌タンパク質を研究した細胞株に移し、次いで、化合物を加えて９６時間インキュベーションした。その後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイを使用してエンドポイントの読取りを実施した。３つ組の生のＣＴＧ読取値のプレート間正規化の後、それぞれの分泌タンパク質のレスキュー％値を、以下の式を使用して計算した：レスキュー％＝［中央値（薬物＋上清）−中央値（薬物）］／［中央値（ＤＭＳＯ）−中央値（薬物）］。また、レスキュー％値の統計的確率スコアも計算した：ｐ値＝カイ分布［Ｚ（薬物＋上清）２、１］。式中、Ｚ（薬物＋上清）＝［中央値（薬物＋上清）−中央値（薬物）］／標準（薬物＋上清）であり、薬物＋上清は、１つのユニークな分泌タンパク質を含有すると予想される個々の上清で処置した個々の試料を表す。その後、ＳｐｏｔＦｉｒｅソフトウェアを使用してデータ点をプロットした。２０％以上のレスキュー、Ｐ値≦０．０５を有していた分泌タンパク質を、それぞれの散布図中で標識した。
【０１８３】
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ細胞成長アッセイ。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステム（Ａｃｅａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用して、Ｔ−４７Ｄ、ＢＴ４７４、およびＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞の細胞インデックスを評価した。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅは、組織培養Ｅ−プレートの底部に組み込まれた微小電極間の電気インピーダンスを測定して、細胞の数、形態学、および生存度を含めた細胞の生物学的状態に関する定量的情報を提供する。薬物を添加する１日前、細胞を９６ウェルのＥ−プレートに、６０００〜１００００個の細胞／ウェルの密度で、９０μｌの増殖培地中で播種した。Ｅ−プレート９６の組み込まれたセンサ電極アレイによって細胞を２４時間までの期間の間、１５分毎にモニタリングした。２４時間のインキュベーションの後、Ｅ−プレートを除去し、ＭＯＲ１０７０３（１００ｎＭ）を最初に加え、１時間インキュベートし、次いでＮＲＧ１（１０ｎｇ）および／または化合物Ａ（１μＭ）を加えた。それぞれの処置を３つ組で試験した。電気インピーダンスは、薬物を加えた後、実験の終わりまで１時間間隔で測定した。付着した細胞の数を表すために測定した電気インピーダンスの相対的変化として誘導される無次元のパラメータである細胞インデックス値を電気インピーダンスから計算し、販売者から提供されるＲＴＣＡソフトウェアを使用してプロットした。実験の終わりに、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏルミネセント細胞生存度アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を使用して、製造者のプロトコールに従って細胞性ＡＴＰ含有量を測定することによって、細胞成長および／または生存度を決定した。
【０１８４】
統計分析。データは、別段に指摘しない限りは平均±ＳＥＭとして表す。主な統計的検定は一方向ＡＮＯＶＡであり、チューキーの事後検定を使用してすべてのカラムの対を比較した。ｔ検定（両側、不等分散）は、２つの変数が分析中に存在する場合に使用した。腫瘍成長の有意差は、特定の血液Ｇｌｕｃ活性に達するまでにかかった時間（日数）を決定することによって達成した。生存曲線はカプラン−マイヤー方法を使用して推定し、統計的相違を決定する場合は中央生存日を使用した。統計的有意性は本文全体および図の凡例中に定義されている。すべての統計分析にＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
2018506511000001.app
【国際調査報告】
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2018506511.tif 000044
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