(57)【要約】本発明は、ウイルス感染を処置するための方法および組成物を提供する。ヌクレアーゼを使用して、感染細胞中のウイルス核酸を切断する。ヌクレアーゼは、配列特異的な様式でウイルス核酸を切断するため、感染宿主の遺伝子または感染宿主のゲノムに由来する他の重要なゲノム特徴を切断しない。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９等のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質であり、Ｃａｓ９と、ＨＳＶ核酸またはＣＭＶ核酸を標的とするように設計されたガイドＲＮＡとを含むリボ核タンパク質として感染細胞に送達される。それに加えてまたはその代わりに、ヌクレアーゼは、プラスミドにコードして送達してもよく、または標的細胞内で発現されるｍＲＮＡとして送達してもよい。方法および組成物は、患者を処置するために使用してもよく、または組織、細胞、もしくは臓器をｅｘ  ｖｉｖｏで処置するために使用してもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染の処置のための組成物であって、
ヌクレアーゼと、
ＨＳＶ核酸に相補的であり、前記ヌクレアーゼを前記ＨＳＶ核酸に向かわせることが可能な配列特異的標的指向性部分と
をコードするベクターを含む組成物。
【請求項２】
前記ＨＳＶ核酸が、複製開始点Ｓ（ｏｒｉＳ）領域である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＨＳＶ核酸が、ロングユニーク領域９（ＵＬ９）またはロングリピート領域２（ＲＬ２）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
経皮的に投与されるように構成されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
局所用溶液を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、およびメガヌクレアーゼからなる群から選択されるヌクレアーゼである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを含み、配列特異的結合モジュールが、ウイルスゲノムの部分を特異的に標的とするガイドＲＮＡを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
ヒト患者への送達用にさらにパッケージングされている、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
標的指向性の配列が、ガイドＲＮＡであり、ヒトゲノム内で６０％超の一致を有していない、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、プラスミド、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属ナノ粒子、ナノロッド、リポソーム、マイクロバブル、細胞透過性ペプチド、およびリポスフェアからなる群から選択されるベクターを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染を処置するための方法であって、
ヌクレアーゼとＨＳＶ核酸に相補的な配列特異的標的指向性部分とをコードするベクター、または前記ヌクレアーゼと前記配列特異的標的指向性部分とを含むリボ核タンパク質を宿主の細胞内に導入するステップ、
前記配列特異的標的指向性部分が、前記ヌクレアーゼを前記ＨＳＶ核酸に向かわせるようにさせるステップ、および
前記ヌクレアーゼに前記ＨＳＶ核酸を切断させるステップ
を含む方法。
【請求項１２】
前記ＨＳＶ核酸が、複製開始点Ｓ（ｏｒｉＳ）領域である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＨＳＶ核酸が、ロングユニーク領域９（ＵＬ９）またはロングリピート領域２（ＲＬ２）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ベクターを前記宿主に経皮的に投与するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
さらに、前記経皮的な投与が、前記ベクターを含む局所用溶液を塗布することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、およびメガヌクレアーゼからなる群から選択されるベクターである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを含み、配列特異的結合モジュールが、ウイルスゲノムの部分を特異的に標的とするガイドＲＮＡを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記宿主が、生体ヒト対象であり、前記ステップがｉｎ  ｖｉｖｏで実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
標的指向性の配列が、ガイドＲＮＡであり、ヒトゲノム内で６０％超の一致を有していない、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、プラスミド、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属ナノ粒子、ナノロッド、リポソーム、マイクロバブル、細胞透過性ペプチド、およびリポスフェアからなる群から選択されるベクターを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染の処置のための組成物であって、
ヌクレアーゼと、
ＨＳＶ核酸に相補的であり、前記ヌクレアーゼを前記ＨＳＶ核酸に向かわせることが可能な配列特異的標的指向性部分と
を含むリボ核タンパク質を含む組成物。
【請求項２２】
前記ＨＳＶ核酸が、複製開始点Ｓ（ｏｒｉＳ）領域である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ＨＳＶ核酸が、ロングユニーク領域９（ＵＬ９）またはロングリピート領域２（ＲＬ２）である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
経皮的に投与されるように構成されている、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
感染組織に局所塗布するための薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを含み、配列特異的結合モジュールが、ウイルスゲノムの部分を特異的に標的とするガイドＲＮＡを含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２９】
標的指向性の配列が、ガイドＲＮＡであり、ヒトゲノム内で６０％超の一致を有していない、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３０】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染の処置のための組成物であって、
ヌクレアーゼと、
ＣＭＶ核酸に相補的であり、前記ヌクレアーゼを前記ＣＭＶ核酸に向かわせることが可能な配列特異的標的指向性部分と
を含む組成物。
【請求項３１】
前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、およびメガヌクレアーゼからなる群から選択されるヌクレアーゼを含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ヌクレアーゼがＣａｓ９エンドヌクレアーゼである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ヌクレアーゼが、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを前記ＣＭＶ核酸の部分へと標的化するガイドＲＮＡをさらに含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ヌクレアーゼが、前記ＣＭＶ核酸中に少なくとも１つの二本鎖切断を引き起こす、請求項３０の組成物。
【請求項３５】
前記ヌクレアーゼが、前記ＣＭＶ核酸中に少なくとも１つの挿入を引き起こす、請求項３０の組成物。
【請求項３６】
臓器のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染を処置するための方法であって、
ヌクレアーゼと、ＣＭＶ核酸に相補的であり、前記ヌクレアーゼを前記ＣＭＶ核酸に向かわせることが可能な配列特異的標的指向性部分とを含む組成物を臓器内に導入するステップ、および
前記ヌクレアーゼに、ＣＭＶ核酸を標的とし、かつ切断させるステップ
を含む方法。
【請求項３７】
前記臓器が移植ドナーに由来する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記臓器が、心臓、肝臓、腎臓、目、肺、膵臓、腸、および胸腺からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、およびメガヌクレアーゼからなる群から選択されるヌクレアーゼを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記ヌクレアーゼがＣａｓ９エンドヌクレアーゼである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記ヌクレアーゼが、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを前記ＣＭＶ核酸の部分へと標的化するガイドＲＮＡをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記導入するステップが、送達用ウイルスベクターで前記ヌクレアーゼを送達することを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルスからなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記導入するステップが、プラスミド、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属ナノ粒子、ナノロッド、リポソーム、細胞透過性ペプチド、リポスフェア、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群から選択されるものを含むベクターで前記ヌクレアーゼを送達することを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
前記ヌクレアーゼが、前記ＣＭＶ核酸中に少なくとも１つの二本鎖切断を引き起こす、請求項３６に記載の方法。
【請求項４６】
前記ヌクレアーゼが、前記ＣＭＶ核酸中に少なくとも１つの挿入を引き起こす、請求項３６に記載の方法。
【請求項４７】
胎児のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染を処置するための方法であって、
ヌクレアーゼと、ＣＭＶ核酸に相補的であり、前記ヌクレアーゼを前記ＣＭＶ核酸に向かわせることが可能な配列特異的標的指向性部分とを含む組成物を妊婦に導入するステップ、および
前記ヌクレアーゼに、ＣＭＶ核酸を標的とし、かつ切断させるステップ
を含む方法。
【請求項４８】
前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、およびメガヌクレアーゼからなる群から選択されるヌクレアーゼを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ヌクレアーゼがＣａｓ９エンドヌクレアーゼである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記ヌクレアーゼが、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを前記ＣＭＶ核酸の部分へと標的化するガイドＲＮＡと会合している、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記導入するステップが、ウイルスベクター内の前記ヌクレアーゼを送達することを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルスからなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記導入するステップが、プラスミド、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属ナノ粒子、ナノロッド、リポソーム、細胞透過性ペプチド、リポスフェア、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群から選択されるものを含むベクターで前記ヌクレアーゼを送達することを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
前記ヌクレアーゼが、前記ＣＭＶ核酸中に少なくとも１つの二本鎖切断を引き起こす、請求項４７に記載の方法。
【請求項５５】
前記ヌクレアーゼが、前記ＣＭＶ核酸中に少なくとも１つの挿入を引き起こす、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１５年５月２９日に出願された米国仮出願番号第６２／１６８，２５９号、および２０１５年５月２９日に出願された米国仮出願番号第６２／１６８，２６２号の両方の利益および優先権を主張しており、これらの内容は参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、概して、ウイルス感染の処置および細胞中の外来核酸の切断に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
ウイルス感染は、重大な医学的問題である。例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、顔または口周辺の水疱という症状を示す口腔ヘルペス、または破裂して小さな潰瘍をもたらす場合がある水疱という症状を示す陰部ヘルペスを引き起こす場合がある。水疱が現われる前に、刺痛または電撃痛が生じる場合がある。加えて、ＨＳＶは、潜伏感染状態で細胞内に無期限に潜む能力、および処置した後でも完全には根絶されない能力を有する。潜伏感染は、免疫監視をすり抜けることができ、いつでも溶菌サイクルを再活性化することができるため、感染個体の発生ならびにそれに伴う疼痛および苦痛のリスクが持続する。
【０００４】
世界的には、人口の約９０％は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の一方または両方に感染しており、ＨＳＶ−１感染は、ＨＳＶ−２感染よりもはるかに多くまん延している。合衆国人口の約６５％は、ＨＳＶ−１に対する抗体を有しており、１４歳〜４９歳のアメリカ人の約１６％は、ＨＳＶ−２に感染している。
【０００５】
別の厄介なウイルスの例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）である。臓器移植を受ける際に、患者に感染することがある。ＣＭＶ感染は、肺、肝臓、膵臓、腎臓、胃、腸、脳、および副甲状腺に広がり、臓器不全を起こし、死亡に至ることさえある。このウイルスは、目に広がった場合、網膜剥離および失明を引き起こす場合がある。加えて、胎児は、子宮内でサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に感染し、最終的には、聴力損失、視覚障害、精神遅滞、協調運動障害、および死を引き起こす場合がある。ＣＭＶに感染した乳児は、生まれた時は健康でも、成長過程で何年にもわたって、聴力損失もしくは視力喪失または精神的欠陥の徴候をモニターしなければならない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（要旨）
本発明は、ウイルス感染を処置するための方法および組成物を提供する。ヌクレアーゼを使用して、感染細胞のウイルス核酸を切断する。ヌクレアーゼは、配列特異的な様式でウイルス核酸を切断するため、感染宿主の遺伝子または感染宿主のゲノムに由来する他の重要なゲノム特徴を切断しない。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９等のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質であり、Ｃａｓ９と、ＨＳＶ核酸またはＣＭＶ核酸を標的とするように設計されているガイドＲＮＡとを含むリボ核タンパク質として感染細胞に送達される。それに加えてまたはその代わりに、ヌクレアーゼは、プラスミドにコードして送達してもよく、または標的細胞内で発現されるｍＲＮＡとして送達してもよい。方法および組成物は、患者を処置するために使用してもよく、または組織、細胞、もしくは臓器をｅｘ  ｖｉｖｏで処置するために使用してもよい。
【０００７】
本発明の実施形態は、ＨＳＶに関する。
【０００８】
本発明は、ｏｒｉＳ、ＵＬ９、ＲＬ２、またはＬＡＴ等のＨＳＶゲノムの特定の領域を標的とするガイドされるヌクレアーゼ系を使用して、ＨＳＶ感染を選択的に処置するための組成物および方法を提供する。本発明の方法を使用して、宿主の遺伝物質の完全性を妨害せずに、潜伏性ＨＳＶ遺伝物質であっても宿主生物から除去することができる。ヌクレアーゼをＨＳＶ核酸へと標的にして核酸を損壊し、それによりウイルス複製または転写を妨害するか、または宿主ゲノムからウイルス遺伝物質を切除することさえ可能である。ＨＳＶに向けられている配列特異的標的指向性部分を使用することにより、ウイルス核酸が細胞内に粒子として存在するかまたは宿主ゲノムに組み込まれているかに関わらず、ヌクレアーゼが、宿主物質に作用せずにＨＳＶ核酸のみを除去することができるよう特異的に標的に向かい得る。配列特異的部分は、ヌクレアーゼで破壊しようとするウイルスゲノム物質を標的とするが、宿主細胞ゲノムを標的としないガイドＲＮＡを含んでいてもよい。一部の実施形態では、共にウイルスゲノム物質を標的とし、そしてそれを選択的に編集または破壊する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が使用される。ＣＲＩＳＰＲ（クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート）は、ファージ感染から細菌を保護する細菌免疫系の天然に存在するエレメントである。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を、ｏｒｉＳ、ＵＬ９、ＲＬ２、またはＬＡＴ等のＨＳＶ標的配列に局在化させる。複合体が結合することにより、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＨＳＶゲノム標的配列に局在化され、ウイルスゲノムの切断が引き起こされる。
【０００９】
ガイドされるヌクレアーゼ系は、例えば、局所用溶液を塗布することにより感染宿主内に経皮的に導入することができる。局所用溶液は、感染組織に直接塗布してもよい。
【００１０】
配列特異的部分は、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、または宿主の遺伝物質の正常機能を妨害することなくＨＳＶ核酸を分解または妨害するために使用することができる他の系を含む他のヌクレアーゼ系が、ＨＳＶ核酸を標的にすることを可能にする。
【００１１】
本発明の態様は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染を処置するための組成物を含む。組成物は、ヌクレアーゼと、ＨＳＶ核酸に相補的であり、かつヌクレアーゼをＨＳＶ核酸に向かわせることが可能な配列特異的標的指向性部分とをコードするベクターを含む。
【００１２】
ある特定の実施形態では、ＨＳＶ核酸は、以下の領域の１つまたは複数を含み得る：複製開始点Ｓ（ｏｒｉＳ）、ロングユニーク領域９（ＵＬ９、ｌｏｎｇ  ｕｎｉｑｕｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ９）、またはロングリピート領域２（ＲＬ２、ｌｏｎｇ  ｒｅｐｅａｔ  ｒｅｇｉｏｎ  ２）。組成物は、例えば、局所用溶液により経皮投与されるように構成されていてもよい。ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、およびメガヌクレアーゼであってもよい。
【００１３】
種々の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであってもよく、配列特異的結合モジュールは、ウイルスゲノムの部分を特異的に標的とするガイドＲＮＡを含んでいてもよい。本発明の組成物は、ヒト患者への送達用にパッケージされていてもよい。
【００１４】
ある特定の実施形態では、標的指向性配列は、ヒトゲノム内で６０％超の一致を有していないガイドＲＮＡであり得る。
【００１５】
ベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、プラスミド、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属ナノ粒子、ナノロッド、リポソーム、マイクロバブル、細胞透過性ペプチド、またはリポスフェアを含んでいてもよい。
【００１６】
ある特定の態様では、本発明は、ＨＳＶ感染を処置するための方法であって、ヌクレアーゼと、ＨＳＶ核酸に相補的な配列特異的標的指向性部分とをコードするベクターを宿主の細胞に導入するステップを含む方法を含む。さらなるステップとしては、配列特異的標的指向性部分が、ＨＳＶ核酸を切断するために、ヌクレアーゼがＨＳＶ核酸を標的にするようにするステップが挙げられる。
【００１７】
ＨＳＶ核酸は、複製開始点Ｓ（ｏｒｉＳ）、ロングユニーク領域９（ＵＬ９）、またはロングリピート領域２（ＲＬ２）を含む、１つまたは複数のゲノム領域の部分または全てを含み得る。本発明の方法は、ベクターを宿主に経皮投与することを含んでいてもよく、経皮投与は、ベクターを含む局所用溶液を塗布することを含んでいてもよい。
【００１８】
ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼであってもよい。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを含んでいてもよく、配列特異的結合モジュールは、ウイルスゲノムの部分を特異的に標的とするガイドＲＮＡを含んでいてもよい。
【００１９】
本発明の種々の方法では、宿主は、生体ヒト対象であってもよく、そのステップは、ｉｎ  ｖｉｖｏで実施してもよい。標的指向性配列は、ガイドＲＮＡであってもよく、ヒトゲノム内で６０％超の一致を有していない。
【００２０】
ある特定の方法では、ベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、プラスミド、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属ナノ粒子、ナノロッド、リポソーム、マイクロバブル、細胞透過性ペプチド、またはリポスフェアを含んでいてもよい。
【００２１】
本方法は、ＨＳＶゲノム編集または破壊を可能にし、それにより、宿主の未感染細胞に悪影響を及ぼさずにＨＳＶウイルス増殖の無能力化をもたらす。したがって、本発明の組成物および方法は、ＨＳＶゲノム機能を標的損壊するか、またはｏｒｉＳ、ＵＬ９、ＲＬ２、またはＬＡＴ等の、ＨＳＶゲノムにあるエンドヌクレアーゼ作用のための部位を標的とすることにより１つまたは複数の切断を引き起こして、ウイルス核酸を消化することにより、ＨＳＶ感染を処置するために使用することができる。
【００２２】
好ましい態様では、本発明は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染を処置するための組成物を提供する。組成物は、ヌクレアーゼと、ＨＳＶ核酸に相補的であり、かつヌクレアーゼをＨＳＶ核酸に向かわせることが可能な配列特異的標的指向性部分とを含むリボ核タンパク質を含む。ＨＳＶ核酸は、複製開始点Ｓ（ｏｒｉＳ）領域、ロングユニーク領域９（ＵＬ９）、ロングリピート領域２（ＲＬ２）、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。好ましくは、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを含み、配列特異的結合モジュールは、ウイルスゲノムの部分を特異的に標的とするガイドＲＮＡを含む。標的指向性配列は、ガイドＲＮＡであり、ヒトゲノム内で６０％超の一致を有していない。
【００２３】
組成物は、経皮投与用に構成されていてもよい。一部の実施形態では、組成物は、感染組織に局所塗布するための薬学的に許容される担体を含む。
【００２４】
本発明の実施形態はＣＭＶに関する。
【００２５】
本発明は、組織のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染を、感染個体が聴力喪失／視力喪失、精神的欠陥、多臓器不全、および死亡等のＣＭＶ感染の影響を被ることがないように処置するための方法を提供する。ＣＭＶ感染は、ＣＭＶ核酸を標的とするヌクレアーゼを使用することにより処置される。ヌクレアーゼは、ＣＭＶ核酸を切断し、したがってＣＭＶ核酸の機能を妨害し、それによりＣＭＶの組織または患者への感染が予防される。ヌクレアーゼは、ＣＭＶ感染している患者内に導入してもよく、または移植前の臓器内に導入してもよい。例えば、人命を救うための移植に必要な心臓を、ＣＭＶ標的化ヌクレアーゼに曝露して、移植前にＣＭＶゲノムを無力化してもよい。したがって、心臓移植レシピエントは、感染した心臓を受容するか、または次の心臓がＣＭＶ無感染であることを期待して見送って待機するかしかない選択する必要がなくなる。
【００２６】
ある特定の態様では、本発明は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染を処置するための組成物を提供する。組成物は、ヌクレアーゼと、ＣＭＶ核酸に相補的であり、かつヌクレアーゼをＣＭＶ核酸に向かわせることが可能な配列特異的標的指向性部分とを含む。
【００２７】
ある特定の態様では、本発明は、臓器のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染を処置するための方法を提供する。上記方法は、ＣＭＶ核酸を切断するヌクレアーゼを臓器内に導入し、その後ヌクレアーゼに、ＣＭＶ核酸を標的とし切断させることを含む。臓器は、移植ドナー由来であってもよく、または細胞から増殖または生成してもよい。一部の態様では、臓器は、心臓、肝臓、腎臓、目、肺、膵臓、腸、胸腺、または移植レシピエント内に移植される任意の他の生物学的組織である。送達用ヌクレアーゼの調製は、ヌクレアーゼをウイルスベクターまたは非ウイルスベクターと会合させることを含んでいてもよいことが理解されるべきである。例えば、ヌクレアーゼは、リポソーム内にヌクレアーゼを封入または結合させることにより臓器内に送達するように調製してもよい。
【００２８】
本発明の一部の実施形態では、組織（または臓器、これらは、本明細書では同義的に使用される）は、移植に使用される組織であり得る。例えば、組織は、レシピエントに移植するためにドナーが提供する臓器であってもよい。一部の実施形態では、臓器の組織をヌクレアーゼで処置して、ＣＭＶ核酸を切断および無力化する。
【００２９】
一部の実施形態では、移植ドナーをヌクレアーゼで処置するか、またはヌクレアーゼに曝露する。本発明の方法によると、ドナーはヌクレアーゼを治療剤として受け、患者内の組織からＣＭＶを除去する。任意の患者への送達用手段を使用することができることが理解されるべきである。例えば、ヌクレアーゼは、経口手段、非経口手段、吸入手段、局所手段、直腸手段、または膣手段により送達してもよい。
【００３０】
一部の実施形態では、移植レシピエントは、移植後にヌクレアーゼで処置するか、またはヌクレアーゼに曝露する。本発明の方法によると、移植レシピエントは、ＣＭＶが患者内および患者全体に広がることを予防するために、ヌクレアーゼで処置される。ヌクレアーゼは、当技術分野の任意の公知の手段により送達することができることが理解されるべきである。
【００３１】
一部の実施形態では、組織は患者内に位置する。本発明の方法によると、患者は、感染を予防するために、ＣＭＶを標的とするヌクレアーゼで処置されてもよい。例えば、患者は、妊婦であってもよい。ヌクレアーゼは、ＣＭＶゲノムを標的とし、ウイルスの機能を破壊または損壊させる。したがって、妊婦は、子宮内で胎児にウイルスを移さない。
【００３２】
一部の態様では、本発明は、胎児のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染を処置するための方法を提供する。上記方法は、ＣＭＶ核酸を切断するヌクレアーゼを提供すること、および妊婦内への送達用にヌクレアーゼを調製することを含む。ヌクレアーゼは、当技術分野で公知の技法により、妊婦内に、妊婦の子宮内に、または子宮の胎児内に送達してもよいことが理解されるべきである。
【００３３】
また、任意のタイプのヌクレアーゼを使用してＣＭＶ核酸を切断することができることが理解されるべきである。ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼであってもよい。ヌクレアーゼは、構造特異的ヌクレアーゼであってもよく、または配列特異的ヌクレアーゼであってもよい。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである。本発明の方法は、ヌクレアーゼを使用してＣＭＶ核酸を切断することをさらに含んでいてもよい。
【００３４】
一部の実施形態では、上記方法は、ＣＭＶ核酸の部分へとヌクレアーゼを向かわせるガイドＲＮＡを細胞または組織に送達することを含む。一部の実施形態では、例えば、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをＣＭＶ核酸の部分へと向かわせる。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ヒトゲノムに完全一致を有しないように設計される。ガイドＲＮＡは、ヌクレアーゼをＣＭＶゲノムの調節エレメントに向かわせてもよい。
【００３５】
ヌクレアーゼは、ウイルスベクターにより組織に送達してもよい。ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、またはアデノ随伴ウイルスであってもよい。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、プラスミド、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属ナノ粒子、ナノロッド、リポソーム、細胞透過性ペプチド、リポスフェア、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）により送達してもよい。
【００３６】
一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである。移植片の細胞内または組織内のＣＭＶゲノムの１つまたは複数の部分を特異的に標的とするガイドＲＮＡを使用してもよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体は、ＣＭＶゲノムに結合し、それを変更する。他の実施形態では、本発明は、共にＣＭＶゲノム物質を標的とし、ＣＭＶゲノム物質を選択的に編集または破壊する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ（クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート）は、ファージ感染から細菌を保護する細菌免疫系のエレメントである。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体をＣＭＶ標的配列に局在化させる。複合体が結合することにより、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＣＭＶゲノム標的配列に局在化され、ＣＭＶゲノムの破損を引き起こす。好ましい実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＣＭＶ核酸を損壊し、それが機能的に組み換わる機会を低減するために、ＣＭＶゲノムの複数の部位を標的とするように設計される。
【００３７】
本方法は、ＣＭＶゲノム破壊を可能にし、それにより、細胞に対する細胞毒性が観察されることなく、ウイルス増殖の無能力化がもたらされる。本発明の態様は、ＣＭＶゲノム物質（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を選択的に標的とするようにＣＲＩＳＰＲ／ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体を設計し、ＣＲＩＳＰＲ／ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体を、ＣＭＶゲノムを含む細胞または組織に送達し、ウイルスを無力化にするためにＣＭＶゲノムを切断することを提供する。本方法は、ＣＭＶゲノム機能が標的にされた損壊を可能にするか、または好ましい実施形態では、ＣＭＶゲノムにおけるヌクレアーゼ作用のための複数の部位を標的とすることにより引き起こされた複数の切断によってＣＭＶ核酸を消化することを可能にする。本発明の態様は、ＣＲＩＳＰＲ／ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体カクテルのトランスフェクションを提供することによって、ＣＭＶ増殖を完全に抑制する。本発明のさらなる態様および利点は、以下のその詳細な説明を考慮すると明白となる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、ＨＳＶ感染を標的とするための方法の概略を図示する。
【図２】図２は、ＨＳＶゲノムマップである。
【図３】図３は、ｃａｓ９による消化前および消化後のＨＳＶゲノム領域の増幅産物（アンプリコン）を示す。図３は、Ｃａｓ９を有するか、または有していない、ＲＬ２、ＬＡＴｉ、ＬＡＴｐ、ＵＬ９、ＯｒｉＳ、およびＵＳ１２ガイド配列で処置した細胞のゲノムＤＮＡサイズのバンド示すレーンのゲルである。
【図４】図４は、ＣＲＩＳＰＲ処置試料の様々なレベルのＨＳＶ  ＤＮＡ減少を示す定量ＰＣＲアッセイの結果を示す。
【図５】図５は、Ｃａｓ９陽性細胞の選択を可能にするＥＧＦＰマーカーがＣａｓ９タンパク質の後に融合されていることを示す。
【図６】図６は、プラスミドがｏｒｉ−Ｐを含むことにより、細胞内部の活性プラスミド複製が促進され、トランスフェクション効率が６０％超増加したことを示す。
【図７】図７は、候補となる構造関連標的、形質転換関連標的、および潜伏関連標的が示されているＥＢＶゲノムの概略図である。
【図８】図８は、ガイドＲＮＡ  ｓｇＥＢＶ２およびＰＣＲプライマー位置の周辺のゲノム構成を示す。
【図９】図９は、ｓｇＥＢＶ２により誘導された大きな欠失を示す（レーン１〜３は、それぞれ、ｓｇＥＢＶ２処置の前、５日後、および７日後である）。
【図１０】図１０は、ガイドＲＮＡ  ｓｇＥＢＶ３／４／５およびＰＣＲプライマー位置の周辺のゲノム構成を示す。
【図１１】図１１は、ｓｇＥＢＶ３／５およびｓｇＥＢＶ４／５により誘導された大きな欠失を示す。レーン１および２は、ｓｇＥＢＶ３／５処置の前および８日後の３Ｆ／５Ｒ  ＰＣＲ増幅産物である。レーン３および４は、ｓｇＥＢＶ４／５処置の前および８日後の４Ｆ／５Ｒ  ＰＣＲ増幅産物である。
【図１２】図１２は、サンガー配列決定法により、ｓｇＥＢＶ３／５の８日後にゲノム切断および修復ライゲーションが確認されたことを示す。
【図１３】図１３は、サンガー配列決定法により、ｓｇＥＢＶ４／５の８日後にゲノム切断および修復ライゲーションが確認されたことを示す。
【図１４】図１４は、ＥＢＶゲノム領域において種々の組合せのガイドＲＮＡで標的とした後の相対的細胞増殖を示す。
【図１５】図１５は、ｓｇＥＢＶ１〜７で処置する前のフローサイトメトリー散乱シグナルを示す。
【図１６】図１６は、ｓｇＥＢＶ１〜７で処置した５日後のフローサイトメトリー散乱シグナルを示す。
【図１７】図１７は、ｓｇＥＢＶ１〜７で処置した８日後のフローサイトメトリー散乱シグナルを示す。
【図１８】図１８は、ｓｇＥＢＶ１〜７で処置する前のアネキシンＶ  Ａｌｅｘａ６４７およびＤＡＰＩ染色結果を示す。
【図１９】図１９は、ｓｇＥＢＶ１〜７で処置した５日後のアネキシンＶ  Ａｌｅｘａ６４７およびＤＡＰＩ染色結果を示す。
【図２０】図２０は、ｓｇＥＢＶ１〜７で処置した８日後のアネキシンＶ  Ａｌｅｘａ６４７およびＤＡＰＩ染色結果を示す。
【図２１】図２１および図２２は、顕微鏡観察により、ｓｇＥＢＶ１〜７での処置後にアポトーシス細胞形態が明らかになったことを示す。
【図２２】図２１および図２２は、顕微鏡観察により、ｓｇＥＢＶ１〜７での処置後にアポトーシス細胞形態が明らかになったことを示す。
【図２３】図２３は、ｓｇＥＢＶ１〜７で処置する前の核形態を示す。
【図２４】図２４〜図２６は、ｓｇＥＢＶ１〜７で処置した後の核形態を示す。
【図２５】図２４〜図２６は、ｓｇＥＢＶ１〜７で処置した後の核形態を示す。
【図２６】図２４〜図２６は、ｓｇＥＢＶ１〜７で処置した後の核形態を示す。
【図２７】図２７は、デジタルＰＣＲによる様々なＣＲＩＳＰＲ処置後のＥＢＶ負荷を示す。Ｃａｓ９およびＣａｓ９−ｏｒｉＰは２つの複製物を有し、ｓｇＥＢＶ１〜７は５つの複製物を有していた。
【図２８】図２８は、マイクロ流体チップに捕捉されている単一のＲａｊｉ細胞を示す。
【図２９】図２９は、チップに捕捉されている単一のｓｇＥＢＶ１〜７処置細胞を示す。
【図３０】図３０は、処置前の単一細胞のＥＢＶ定量ＰＣＲ  Ｃｔ値のヒストグラムである。
【図３１】図３１は、ｓｇＥＢＶ１〜７で処置した７日後の単一生存細胞のＥＢＶ定量ＰＣＲ  Ｃｔ値のヒストグラムである。
【図３２】図３２は、ＥＢＶ  ＣＲＩＳＰＲのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを示す（レーンは左から右へと付番されている：レーン１：ＮＥＢ  １００ｂｐラダー；レーン２：ｓｇＥＢＶ１対照；レーン３：ｓｇＥＢＶ１；レーン４：ｓｇＥＢＶ５対照；レーン５：ｓｇＥＢＶ５；レーン６：ｓｇＥＢＶ７対照；レーン７：ｓｇＥＢＶ７；レーン８：ｓｇＥＢＶ４）。
【図３３】図３３は、ＣＲＩＳＰＲ処置が、ＥＢＶ陰性バーキットリンパ腫細胞株ＤＧ−７５に細胞毒性でなかったことを示す。
【図３４】図３４は、ＣＲＩＳＰＲ処置が、初代ヒト肺線維芽細胞ＩＭＲ９０に細胞毒性でなかったことを示す。
【図３５】図３５は、ウイルス核酸を切断するために使用されているＺＦＮを示す。
【図３６】図３６は、ウイルス感染を処置するための組成物（composition）を示す。
【図３７】図３７は、ＣＭＶを標的とするための本発明の実施形態のフローチャートを示す。
【図３８】図３８は、ＣＭＶゲノムのマップである。
【図３９】図３９は、ＣＭＶゲノムに由来するＰＣＲ増幅産物およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＲＩＳＰＲ消化に由来する対応する産物を示す（対で示されている）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼアッセイからの結果を示す。
【図４０】図４０は、ＣＭＶゲノムに由来するＰＣＲ増幅産物およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＲＩＳＰＲ消化に由来する対応する産物を示す（対で示されている）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼアッセイからの結果を示す。
【図４１】図４１は、ＣＭＶゲノムに由来するＰＣＲ増幅産物およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＲＩＳＰＲ消化に由来する対応する産物を示す（対で示されている）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼアッセイからの結果を示す。
【図４２】図４２は、細胞３２３７を処置して外来核酸を除去するための方法３２０１を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
（詳細な説明）
本発明の実施形態は、ＲＬ２、ＬＡＴ、ＵＬ９、またはＯｒｉＳ等のＨＳＶゲノムの特定の領域を標的とするガイドされるヌクレアーゼ系を使用して、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２感染を含むＨＳＶ感染を処置するための組成物および方法に関する。本発明の組成物は、宿主のゲノムに影響を及ぼさずに、宿主細胞のＨＳＶウイルス核酸をヌクレアーゼ活性により損壊する。本発明の方法および組成物は、感染宿主細胞のＨＳＶゲノムを損壊することにより、潜伏ＨＳＶ感染でさえ根絶することができる。
【００４０】
それに加えてまたはその代わりに、本発明の実施形態は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）を処置するための方法に関する。本発明の方法は、ＣＭＶゲノム中に大型または反復挿入または欠失を系統的に引き起こすことにより、細胞内、組織内、または患者内のＣＭＶを無力化するかまたは損壊し、完全ゲノムが再構築される可能性を低減するために使用される。ゲノムへの挿入または欠失は、ウイルスを無力化または破壊し、したがってＣＭＶが処置される。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体であってもよい。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡ等の配列により誘導される。一部の実施形態では、臓器等の組織が、移植前にヌクレアーゼで処置される。一部の実施形態では、移植ドナーまたは移植レシピエントが、移植手術の前および後で処置される。一部の実施形態では、ＣＭＶに感染した患者が、ヌクレアーゼで処置される。
【００４１】
図１には、ＨＳＶ感染を標的とするための方法を図示する。この方法は、標的することが可能なヌクレアーゼ（例えば、ヌクレアーゼのタンパク質または遺伝子として）を得ることを含む。ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、またはメガヌクレアーゼ等の、任意の好適なヌクレアーゼを使用することができる。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼはＣａｓ９である。ｏｒｉＳ、ＵＬ９、ＲＬ２、またはＬＡＴ等のＨＳＶゲノムの特定の標的へとヌクレアーゼを標的に向かわせる配列が提供される。ヌクレアーゼ遺伝子およびコードされたｇＲＮＡは、プラスミドまたはアデノウイルスに基づくベクター等のＤＮＡベクター中に提供されていてもよく、ベクターは、任意選択でプロモーターをさらに含んでいてもよい。その後、その組成物は、ＨＳＶ感染細胞に導入される。任意の好適なトランスフェクション法または送達法を使用することができる。細胞に導入されると、遺伝子が発現され、Ｃａｓ９酵素は、ｇＲＮＡを使用してＨＳＶゲノムを標的とし、それを切断する。ｇＲＮＡは、ＨＳＶゲノムに特異的であり、ヒトゲノムとの一致を有していないため、本明細書に記載の方法および基準によると、宿主ゲノムが無傷に保たれ、正常なヒト遺伝子機能が妨害されない。
【００４２】
ＨＳＶならびに標的とする領域に関する考察は、以下の文献に見出すことができる：Summersら、２００２年、Herpes  Simplex  Virus  Type  1  Origins  of  DNA  Replication  Play  No  Role  in  the  Regulation  of  Flanking  Promoters、J  Virol.、７６巻（１４号）；Eomら、２００３年、Replication-initiator  protein  (UL9)  of  the  herpes  simplex  virus  1  binds  NFB42  and  is  degraded  via  the  ubiquitin-proteasome  pathway、Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A、１００巻（１７号）：９８０３〜９８０７頁；McGeochら、１９９１年、Comparative  sequence  analysis  of  the  long  repeat  regions  and  adjoining  parts  of  the  long  unique  regions  in  the  genomes  of  herpes  simplex  viruses  types  1  and  2、J  Gen  Virol.、７２巻（Ｐｔ１２）：３０５７〜７５頁。これら文献の各々の内容は、それらの全体が参照によりあらゆる目的のために組み込まれる。
【００４３】
図２には、ＨＳＶゲノム、およびＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡにより標的とすることができるＨＳＶ  ｏｒｉＳパリンドローム二量体（ｏｒｉＳ）、ＲＬ２−ＩＣＰ０（ＲＬ２）、ＬＡＴイントロン（ＬＡＴｉ）、ＬＡＴプロモーター（ＬＡＴｐ）、ＵＬ９、およびＵＳ１２遺伝子が示されている。
【００４４】
図３には、ｃａｓ９および対応するガイドＲＮＡによる消化前および消化後のＨＳＶゲノム領域の増幅産物が示されている。Ｔ７  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を使用して、ＲＬ２、ＬＡＴｉ、ＬＡＴｐ、ＵＬ９、ｏｒｉＳ、およびＵＳ１２に対するスキャフォールドを有する完全ガイドＲＮＡを生成した。ゲノム標的の隣接領域は、ＨＳＶ２  Ｇ株のゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣから得た）からＰＣＲで増幅した。Ｃａｓ９タンパク質（ＰＮＡ  Ｂｉｏから得た）、ガイドＲＮＡ、および標的ＤＮＡを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏエンドヌクレアーゼアッセイのために混合およびインキュベートした。ｃａｓ９および各々の個々のゲノム領域を標的とするガイドＲＮＡによる消化前および消化後の、ＲＬ２、ＬＡＴｉ、ＬＡＴｐ、ＵＬ９、ｏｒｉＳ、およびＵＳ１２のＰＣＲ増幅産物が示されている図３に示されているように、消化されたＤＮＡのＤＮＡゲル電気泳動により、エンドヌクレアーゼ活性が高いことが明らかになった。
【００４５】
図３７には、ＣＭＶを標的とするための本発明の実施形態のフローチャートが示されている。概して、方法１００は、ＣＭＶゲノムを標的とするヌクレアーゼ１０５を導入することを含む。ヌクレアーゼは、臓器または妊婦に導入することができる。臓器または胎児は、ＣＭＶ感染を有することの疑いであり得る。この方法は、ヌクレアーゼに、ＣＭＶ核酸を標的とし、かつ切断させること１１０をさらに含む。ヌクレアーゼは、ＣＭＶゲノムに結合し、それを変更することができる。
【００４６】
（ｉ．感染細胞の処置）
細胞は、核酸中にコードされているヌクレアーゼで処置（例えば、ｍＲＮＡまたはプラスミドとして送達）してもよく、または活性形態で送達されてもよい。ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９等のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質である場合、活性リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を細胞に送達してもよい。
【００４７】
図４２には、細胞３２３７を処置して、単純ヘルペスウイルスに由来するウイルス核酸３２５１等の外来核酸を除去するための方法３２０１が示されている。方法３２０１は、感染を処置するために使用するために使用してもよく、または方法３２０１は、ヒトに由来の細胞等の対象細胞から外来核酸を除去するための研究開発にｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用してもよい。
【００４８】
方法３２０１は、ヌクレアーゼ３２０５およびＲＮＡ３２１３を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）３２３１を形成するステップ３２２５；細胞３２３７をドナーから得るステップ；ＲＮＰ３２３１を細胞３２３７に送達する（好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで）ステップ３２４５；および細胞３２３７内のウイルス核酸３２５１をＲＮＰ３２３１で切断するステップを含む。方法３２０１は、患者内に移植するための細胞３２３７を提供するステップを含んでいてもよい。
【００４９】
送達ステップ３２４５は、エレクトロポレーションを含んでいてもよく、またはＲＮＰは、送達ステップ３２４５用のリポソームにパッケージングされていてもよい。一部の実施形態では、ウイルス核酸３２５１は、エピゾームウイルスゲノムとして、つまりウイルスのエピソームまたはエピソームベクターとして存在し得る。ＲＮＡ３２１３は、ウイルス核酸３２５１内の標的に実質的に相補的であり、好ましくはヒトゲノムのいずれの位置に対しても実質的に相補的ではない部分を有する。好ましい実施形態では、ウイルスは、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタインバーウイルス、およびサイトメガロウイルスからなる群から選択されるもの等のヘルペスファミリーウイルスである。ウイルスは、細胞中で潜伏段階であってもよい。
【００５０】
好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ３２０５は、好ましくはＣａｓ９等のクリスパー関連タンパク質である。ＲＮＡ３２１３は、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの機能性を提供する）であってもよい。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ３２０５およびＲＮＡ３２１３は、ＲＮＰ３２３１として細胞に送達される。
【００５１】
好ましい実施形態では、細胞３２３７は、その内部にウイルス核酸３２５１を有し、上記方法は、ヌクレアーゼを使用してウイルス核酸を切断することをさらに含む。
【００５２】
一部の実施形態では、ＲＮＰは、臨床応用に、特に非経口送達用に好ましい（例えば、プラスミドＤＮＡと比べて）ことが判明する場合がある。ＲＮＰは、ＤＮＡ（ＡＡＶ）またはｍＲＮＡよりも利点をもたらす活性予形成薬物である。薬物成分は、細胞内で転写、翻訳、またはアセンブルされる必要がない。ＲＮＰ３２３１の送達は、薬物特性の向上、例えば、より早期の開始活性およびクリアランス（毒性）制御をもたらすことができる。
【００５３】
図３６には、ある特定の実施形態によるウイルス感染を処置するための組成物が示されている。組成物は、好ましくは、ヌクレアーゼと、ＨＳＶへとヌクレアーゼを標的に向かわせ、ＲＬ２、ＬＡＴ、ＵＬ９、またはＯｒｉＳ等のＨＳＶのゲノム領域に相補的であってもよい標的指向性部分（例えばｇＲＮＡ）とをコードするベクター（プラスミド、直鎖状ＤＮＡ、またはウイルスベクターであってもよい）を含む。組成物は、任意選択で、本明細書にさらに記載されているような、プロモーター、複製開始点、他のエレメント、またはそれらの組合せの１つまたは複数を含んでいてもよい。
【００５４】
（ｉｉ．ヌクレアーゼ）
本発明の方法は、プログラム可能であるか、または標的に向かわせることが可能なヌクレアーゼを使用して、ウイルス核酸を特異的に標的として破壊することを含む。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、他のエンドヌクレアーゼもしくはエキソヌクレアーゼ、またはそれらの組合せを含む、任意の好適な標的指向性ヌクレアーゼを使用することができる。Schiffer、２０１２年、Targeted  DNA  mutagenesis  for  the  cure  of  chronic  viral  infections、J  Virol、８８巻（１７号）：８９２０〜８９３６頁を参照されたい。この文献は、参照により組み込まれる。
【００５５】
ＣＲＩＳＰＲ方法論では、ガイドとしての小型ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体を形成して、任意のゲノム位置のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の上流にあるＤＮＡを配列特異的な様式で切断するＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）が使用される。ＣＲＩＳＰＲは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡとして公知の別々のガイドＲＮＡを使用することができる。このような２つの別々のＲＮＡを組み合わせて単一のＲＮＡにすることにより、短鎖ガイドＲＮＡ設計による部位特異的な哺乳類ゲノム切断が可能になる。Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、公知の方法により合成することができる。Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、非特異的ＤＮＡ切断タンパク質Ｃａｓ９、およびハイブリダイズしてＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を標的に向かわせ、そして動員するＲＮＡオリゴを使用する。Changら、２０１３年、Genome  editing  with  RNA-guided  Cas9  nuclease  in  zebrafish  embryos、Cell  Res、２３巻：４６５〜４７２頁；Hwangら、２０１３年、Efficient  genome  editing  in  zebrafish  using  a  CRISPR-Cas  system、Nat.  Biotechnol、３１巻：２２７〜２２９頁；Xiaoら、２０１３年、Chromosomal  deletions  and  inversions  mediated  by  TALENS  and  CRISPR/Cas  in  zebrafish、Nucl  Acids  Res、１〜１１頁を参照されたい。
【００５６】
ＣＲＩＳＰＲ（クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート）は、細菌に見出され、ファージ感染から細菌を保護すると考えられている。ＣＲＩＳＰＲは、近年では真核生物ＤＮＡの遺伝子発現を変更するための手段として使用されているが、抗ウイルス療法またはより幅広くゲノム物質を損壊する方法としては提案されていない。むしろ、ＣＲＩＳＰＲは、標的とした細胞または細胞集団のＤＮＡの転写を増加または減少させる手段としての挿入または欠失を導入するために使用されている。例えば、Horvathら、Science（２０１０年）３２７巻：１６７〜１７０頁；Ternsら、Current  Opinion  in  Microbiology（２０１１年）１４巻：３２１〜３２７頁；Bhayaら、Annu  Rev  Genet（２０１１年）４５巻：２７３〜２９７頁；Wiedenheftら、Nature（２０１２年）４８２巻：３３１〜３３８頁;Jinek  Mら、Science（２０１２年）３３７巻：８１６〜８２１頁；Cong  Lら、Science（２０１３年）３３９巻：８１９〜８２３頁；Jinek  Mら、（２０１３年）、eLife  2:ｅ００４７１；Mali  Pら、（２０１３年）Science、３３９巻：８２３〜８２６頁；Qi  LSら、（２０１３年）Cell、１５２巻：１１７３〜１１８３頁；Gilbert  LAら、（２０１３年）Cell、１５４巻：４４２〜４５１頁；Yang  Hら、（２０１３年）Cell、１５４巻：１３７０〜１３７９頁；およびWang  Hら、（２０１３年）Cell、１５３巻：９１０〜９１８頁）を参照されたい。これら文献の各々の内容は、それらの全体が参照によりあらゆる目的のために組み込まれる。
【００５７】
本発明の態様では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ゲノムの少なくとも２つの位置で二本鎖切断を引き起こす。こうした２つの二本鎖切断は、ゲノム断片の欠失を引き起こす。ウイルス修復経路により２つの末端がアニーリングされたとしても、ゲノムは依然として欠失したままであり得る。この機序を使用した１つまたは複数の欠失は、ウイルスゲノムを無力化することになる。その結果、宿主細胞からウイルス感染がなくなることになる。
【００５８】
本発明の実施形態では、ヌクレアーゼは、標的ウイルスのゲノムを切断する。ヌクレアーゼは、核酸のヌクレオチドサブユニット間のリン酸ジエステル結合を切断することが可能な酵素である。エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のリン酸ジエステル結合を切断する酵素である。デオキシリボヌクレアーゼＩ等、幾つかのものは、ＤＮＡを比較的非特異的に（配列に関わらず）切断するが、多くものは、典型的には制限エンドヌクレアーゼまたは制限酵素と呼ばれ、ヌクレオチド配列を非常に特異的にのみ切断する。本発明の好ましい実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、本発明の組成物および方法に組み込まれるが、任意のヌクレアーゼを使用することができることが理解されるべきである。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使用して、ゲノムを切断する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ゲノムに二本鎖切断を生成することが可能である。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、２つの機能性ドメインＲｕｖＣおよびＨＮＨを有しており、各々が異なる鎖を切断する。これらドメインが両方とも活性であると、Ｃａｓ９はゲノム中に二本鎖切断を引き起こす。
【００６０】
本発明の一部の実施形態では、ゲノムへの挿入は、無力化を引き起こすかまたはゲノム発現を変更するように設計することができる。加えて、挿入／欠失は、二本鎖切断に中途終止コードンを生成するか、またはリーディングフレームをシフトさせて二本鎖切断の下流に中途終止コードンを生成するかのいずれかにより、中途終止コードンを導入するためにも使用される。ＮＨＥＪ修復経路のこうした結果はいずれも、標的遺伝子を損壊するために活用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９系の使用により導入される変更は、ゲノムに恒久的に存続する。
【００６１】
本発明の一部の実施形態では、少なくとも１つの挿入は、ＣＲＩＳＰＲ／ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体により引き起こされる。好ましい実施形態では、ゲノム中に多数の挿入を引き起こすことにより、ウイルスが無力化される。本発明の態様では、挿入の数は、ゲノムが修復され得る確率を低下させる。
【００６２】
本発明の一部の実施形態では、少なくとも１つの欠失が、ＣＲＩＳＰＲ／ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体により引き起こされる。好ましい実施形態では、ゲノムに多数の欠失を引き起こすことにより、ウイルスが無力化される。本発明の態様では、欠失の数は、ゲノムが修復され得る確率を低下させる。非常に好ましい実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ系は、宿主ゲノムを無傷に保ったまま、著しいゲノム損壊を引き起こし、ウイルスゲノムの効果的な破壊をもたらす。
【００６３】
ＴＡＬＥＮは、本質的にあらゆる配列を標的とすることができるＤＮＡ結合ドメインに融合された非特異的ＤＮＡ切断ヌクレアーゼを使用する。ＴＡＬＥＮ技術の場合、標的部位を識別し、発現ベクターを製作する。線状にされた発現ベクター（例えば、Ｎｏｔ１により）を、ｍＲＮＡ合成の鋳型として使用することができる。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カールズバッド、米国カリフォルニア州）製のｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ  ＳＰ６転写キット等の市販のキットを使用してもよい。JoungおよびSander、２０１３年、TALENs:  a  widely  applicable  technology  for  targeted  genome  editing、Nat  Rev  Mol  Cell  Bio、１４巻：４９〜５５頁を参照されたい。
【００６４】
ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ法は、標的部位との１対１関係を提供する。つまり、ＴＡＬＥドメインの１単位のタンデムリピートが、標的部位の１つのヌクレオチドを認識し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡは、ＤＮＡ標的の相補配列にハイブリダイズする。これらの方法は、１対のＴＡＬＥＮまたは１つのｇＲＮＡを有するＣａｓ９タンパク質を使用して、標的に二本鎖切断を生成することを含み得る。その後、切断箇所は、非相同末端結合または相同組換え（ＨＲ）により修復される。
【００６５】
図３５は、ウイルス核酸を切断するために使用されているＺＦＮが示されている。手短に述べれば、ＺＦＮ法は、標的にされたＺＦＮ３０５および任意選択で少なくとも１つのアクセサリーポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのベクター（例えば、ＲＮＡ分子）を、感染宿主細胞に導入することを含む。例えば、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎの米国特許出願公開第２０１１／００２３１４４号を参照されたい。この文献は、参照により組み込まれる。細胞は、標的配列３１１を含む。細胞をインキュベートしてＺＦＮ３０５を発現させ、ＺＦＮ３０５により、標的とされた染色体配列３１１に二本鎖切断３１７を導入する。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドまたは交換ポリヌクレオチド３２１が導入される。ウイルス核酸の部分を無関連配列と交換することにより、ウイルス核酸の転写または複製を完全に妨害することができる。標的ＤＮＡ３１１は交換ポリヌクレオチド３２１と共に、誤りがちな非相同末端結合ＤＮＡ修復プロセスまたは相同性により導かれたＤＮＡ修復プロセスにより修復され得る。
【００６６】
典型的には、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメイン（つまり、ジンクフィンガー）および切断ドメイン（つまり、ヌクレアーゼ）を含み、この遺伝子は、ｍＲＮＡ（例えば、５’キャッピングされているか、ポリアデニル化されているか、またはその両方）として導入することができる。ジンクフィンガー結合ドメインは、選択した任意の核酸配列を認識および結合するように操作することができる。例えば、Quら、２０１３年、Zinc-finger-nucleases  mediate  specific  and  efficient  excision  of  HIV-1  proviral  DAN  from  infected  and  latently  infected  human  T  cells、Nucl  Ac  Res、４１巻（１６号）：７７７１〜７７８２頁を参照されたい。この文献は参照により組み込まれる。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規な結合特異性を有する場合がある。操作方法としては、これらに限定されないが、合理的設計および種々のタイプの選択が挙げられる。ジンクフィンガー結合ドメインは、ジンクフィンガー認識領域（つまり、ジンクフィンガー）を介して標的ＤＮＡ配列を認識するように設計することができる。例えば、米国特許第６，６０７，８８２号；第６，５３４，２６１号；および第６，４５３，２４２号を参照されたい。これら文献は、参照により組み込まれる。ジンクフィンガー認識領域を選択するための例示的な方法としては、ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を挙げることができ、米国特許第５，７８９，５３８号；米国特許第５，９２５，５２３号；米国特許第６，００７，９８８号；米国特許第６，０１３，４５３号；米国特許第６，４１０，２４８号；米国特許第６，１４０，４６６号；米国特許第６，２００，７５９号；および米国特許第６，２４２，５６８号に開示されている。これら文献の各々は、参照により組み込まれる。
【００６７】
また、ＺＦＮは切断ドメインを含む。ＺＦＮの切断ドメイン部分は、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼ等の任意の好適なエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。例えば、BelfortおよびRoberts、１９９７年、Homing  endonucleases:  keeping  the  house  in  order、Nucleic  Acids  Res、２５巻（１７号）：３３７９〜３３８８頁を参照されたい。切断ドメインは、切断活性に二量体化を必要とする酵素に由来していてもよい。各ヌクレアーゼが活性酵素二量体の単量体を含む場合、切断に２つのＺＦＮが必要とされる場合がある。あるいは、単一のＺＦＮが、活性酵素二量体を生成するための単量体を両方とも含んでいてもよい。存在する制限エンドヌクレアーゼは、配列特異的結合、および結合部位でのまたはその近傍でのＤＮＡ切断が可能であってもよい。ある特定の制限酵素（例えば、タイプＩＩＳ）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、タイプＩＩＳ酵素ＦｏｋＩは、二量体として活性であり、一方の鎖のその認識部位から９個のヌクレオチドで、および他方の鎖のその認識部位から１３個のヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。ＺＦＮに使用されるＦｏｋＩ酵素は、切断単量体とみなすことができる。したがって、ＦｏｋＩ切断ドメインを使用する標的とされる二本鎖切断の場合、各々がＦｏｋＩ切断単量体を含む２つのＺＦＮを使用して、活性酵素二量体を再構成することができる。Wahら、１９９８年、Structure  of  FokI  has  implications  for  DNA  cleavage、PNAS、９５巻：１０５６４〜１０５６９頁；米国特許第５，３５６，８０２号；米国特許第５，４３６，１５０号；米国特許第５，４８７，９９４号；米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号；米国特許出願公開第２００６／０１８８９８７号；米国特許出願公開第２００８／０１３１９６２号を参照されたい。これら文献の各々は、参照により組み込まれる。
【００６８】
ＺＦＮを使用したウイルス標的化は、ある配列を含む少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを細胞内に導入することを含んでいてもよい。ドナーポリヌクレオチドは、好ましくは、染色体への組込み部位のいずれかの側と配列類似性を共有する上流配列および下流配列に隣接されている導入されるべき配列を含む。ドナーポリヌクレオチドの上流配列および下流配列は、目的の染色体配列とドナーポリヌクレオチドとの組換えを促進するように選択される。典型的には、ドナーポリヌクレオチドはＤＮＡであり得る。ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡプラスミド、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスベクター、ＤＮＡの線状小片、ＰＣＲ断片、ネイキッド核酸であってもよく、リポソーム等の送達媒体を使用してもよい。ドナーポリヌクレオチドの配列は、エキソン、イントロン、調節配列、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。二本鎖切断は、ドナーポリヌクレオチドとの相同組換えにより修復され、所望の配列が染色体内に組み込まれる。ＺＦＮ媒介性プロセスの場合、ＺＦＮにより標的配列内に導入された二本鎖切断は、交換ポリヌクレオチドとの相同組換えにより修復され、交換ポリヌクレオチドの配列を標的配列の部分と交換することができる。二本鎖切断の存在は、切断の相同組換えおよび修復を促進する。交換ポリヌクレオチドは、物理的に組み込まれてもよく、あるいは切断を修復するための鋳型として交換ポリヌクレオチドを使用して、交換ポリヌクレオチドの配列情報が、標的配列のその部分の配列情報と交換されるという結果をもたらすことができる。したがって、ウイルス核酸の部分を、交換ポリヌクレオチドの配列に変換することができる。ＺＦＮ法は、ベクターを使用して、ＺＦＮおよび任意選択で少なくとも１つの交換ポリヌクレオチドまたは少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドをコードする核酸分子を感染細胞に送達することを含むことができる。
【００６９】
メガヌクレアーゼは、大型認識部位（１２〜４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）により特徴付けられるエンドデオキシリボヌクレアーゼであり、そのため、一般的にこの部位は任意の所与のゲノムに１つしか存在しない。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼにより認識される１８塩基対配列は、偶然に１つ見出すだけでも、平均でヒトゲノムの２０倍のサイズのゲノムを必要とするだろう（単一のミスマッチを有する配列は、ヒトサイズのゲノム１つ当たり約３倍見出されるが）。したがって、メガヌクレアーゼは、最も特異的な天然に存在する制限酵素であると考えられる。メガヌクレアーゼは、配列および構造モチーフに基づいて、５つのファミリーに分類することができる：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ−ＹＩＧ、ＨＮＨ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックス、およびＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ＸＫである。最もよく研究されているファミリーは、生命界の全てに見出されているＬＡＧＬＩＤＡＤＧタンパク質のファミリーであり、一般的にイントロンまたはインテイン内にコードされているが、独立したメンバーも存在する。配列モチーフＬＡＧＬＩＤＡＤＧは、酵素活性の必須エレメントである。幾つかのタンパク質は、そのようなモチーフを１つだけ含むが、他のタンパク質はそのようなモチーフを２つ含む。いずれの場合でも、このモチーフの後には、他のファミリーメンバーとの配列類似性がほとんどないかまたは全くない約７５〜２００個のアミノ酸残基が続いていた。結晶構造は、以下のＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーの配列特異性の様式および切断機序を示す：（ｉ）伸長β鎖がＤＮＡの主溝内に埋没することにより特異的接触が生じ、ＤＮＡ結合サドルが、ＤＮＡのヘリックスのねじれを模倣するピッチおよび輪郭を有する；（ｉｉ）タンパク質とＤＮＡとの間の完全な水素結合能力は、決して完全に実現されることはない；（ｉｉｉ）特徴的な４−ｎｔの３’−ＯＨ突出を生成する切断が副溝を横切って生じ、中央「４塩基」領域のＤＮＡの歪みにより、切断を受けるリン酸結合がタンパク質触媒コアにより接近する；（ｉｖ）固有の「金属共有」パラダイムが関与することがある、提唱されている２金属機序により切断が生じる；および（ｖ）最後に、コアα／βフォールディングの外側領域の「適応させられた（ａｄａｐｔｅｄ）」スキャフォールドから、さらなる親和性および／または特異的接触が生じ得る。Silvaら、２０１１年、Meganucleases  and  other  tools  for  targeted  genome  engineering、Curr  Gene  Ther、１１巻（１号）：１１〜２７頁を参照されたい。この文献は、参照により組み込まれる。
【００７０】
本発明の一部の実施形態では、鋳型配列がゲノム内に挿入される。ゲノムＤＮＡにヌクレオチド改変を導入するためには、相同性により導かれた修復（ＨＤＲ）の間に、所望の配列を含むＤＮＡ修複鋳型が存在しなければならない。ＤＮＡ鋳型は、通常、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９と共に細胞内にトランスフェクトされる。各相同性アームの長さおよび結合位置は、導入される変化のサイズに依存する。好適な鋳型が存在すると、ＨＤＲは、Ｃａｓ９誘導性二本鎖切断に著しい変化を導入することができる。
【００７１】
本発明の一部の実施形態では、修飾型のヌクレアーゼを使用してもよい。ＲｕｖＣ−またはＨＮＨ−のいずれかの単一不活性触媒ドメインを含む修飾型のＣａｓ９酵素は、「ニッカーゼ」と呼ばれる。活性ヌクレアーゼドメインが１つのみで、Ｃａｓ９ニッカーゼは、標的ＤＮＡの一方の鎖のみを切断し、一本鎖切断または「ニック」を生成する。不活性ｄＣａｓ９（ＲｕｖＣ−およびＨＮＨ−）と同様に、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ｇＲＮＡ特異性に基づいてＤＮＡに依然として結合することができるが、ニッカーゼは、ＤＮＡ鎖の一方のみを切断することになる。ＣＲＩＳＰＲプラスミドの大部分は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来し、ＲｕｖＣドメインは、Ｄ１０Ａ突然変異により不活化することができ、ＨＮＨドメインは、Ｈ８４０Ａ突然変異により不活化することができる。
【００７２】
一本鎖切断またはニックは、通常、インタクトな相補的ＤＮＡ鎖を鋳型として使用して、ＨＤＲ経路により迅速に修復される。しかしながら、Ｃａｓ９ニッカーゼにより導入された２つの近接した反対側の鎖のニックは、二本鎖切断として扱われ、この場合、「ダブルニック」または「二重ニッカーゼ」ＣＲＩＳＰＲ系と呼ばれることが多い。ダブルニック誘導性二本鎖切断は、遺伝子標的に対する所望の効果に応じて、ＮＨＥＪまたはＨＤＲのいずれかにより修復することができる。こうした二本鎖切断にて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体により挿入および欠失が引き起こされる。本発明の態様では、欠失は、２つの二本鎖切断を互いに近接して配置することにより引き起こされ、それによりゲノムの断片の欠失が引き起こされる。
【００７３】
（ｉｉｉ．標的指向性部分）
ヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の標的特異性を使用することができる。以下で考察されるように、ガイドＲＮＡまたは単一ガイドＲＮＡは、ウイルスゲノムを標的とするように特異的に設計される。
【００７４】
本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集複合体は、ウイルスゲノムを標的とするガイドＲＮＡと共に最適に作用する。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、任意の他の標的指向性オリゴ、またはそれらの任意の組合せを含む）は、ウイルスゲノムの損壊を引き起こすために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体をウイルスゲノムへと導く。本発明の態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、細胞内の特定のウイルスを標的とするように設計される。本発明の組成物を使用して任意のウイルスを標的とすることができることが理解されるべきである。ウイルスゲノムの特異的領域を識別することにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の開発および設計が支援される。
【００７５】
本発明の態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、細胞内の潜伏ウイルスを標的とするように設計される。細胞内にトランスフェクトされると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、反復挿入または欠失によりゲノムの無力化を引き起こすか、または挿入または欠失の数に起因して、修復の可能性を著しく低減させる。
【００７６】
一例として、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）は、ヒトヘルペスウイルス４（ＨＨＶ−４）とも呼ばれ、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体により細胞内で不活化される。ＥＢＶは、ヘルペスファミリーのウイルスであり、ヒトにおいて最も一般的なウイルスの１つである。ウイルスは、直径がおよそ１２２ｎｍ〜１８０ｎｍであり、タンパク質カプシドに包まれた二重らせんのＤＮＡで構成されている。この例では、適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとして役割を果たすのは、Ｒａｊｉ細胞株である。Ｒａｊｉ細胞株は、造血起源からの最初の連続継代性ヒト細胞株であり、細胞株は、非通常株のエプスタインバーウイルスを産生するが、最も広範に研究されているＥＢＶモデルの１つである。Ｒａｊｉ細胞内のＥＢＶゲノムを標的とするためには、ＥＢＶに対して特異性を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体が必要とされる。ＥＢＶを標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドの設計は、Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．から得たＵ６プロモーター駆動性キメラガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）およびユビキタスプロモーター駆動性Ｃａｓ９で構成される。本発明では、市販のガイドＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼを使用することができる。Ｃａｓ９タンパク質の後に融合されているＥＧＦＰマーカーにより、Ｃａｓ９陽性細胞の選択を可能にした。
【００７７】
本発明の態様では、ガイドＲＮＡは、商業的に購入したか否かに関わらず、特定のウイルスゲノムを標的とするように設計されている。ウイルスゲノムが識別され、ウイルスゲノムの選択部分を標的とするガイドＲＮＡが開発され、本発明の組成物に組み込まれる。本発明の態様では、ガイドＲＮＡ設計には、特定のウイルス株の基準ゲノムが選択される。
【００７８】
例えば、ＥＢＶゲノムを標的とするガイドＲＮＡは、本実施例における系の成分である。ＥＢＶに関しては、例えば、Ｂ９５−８株に由来する基準ゲノムを、設計指針として使用した。ＥＢＶ等の、目的のゲノム内の選択領域または遺伝子が標的とされる。例えば、６つの領域を、ゲノム編集の目的が異なる７つのガイドＲＮＡ設計で標的とすることができる。
【００７９】
図７は、候補となる構造関連標的、形質転換関連標的、および潜伏関連標的が示されているＥＢＶゲノムの概略図である。さらに、図７には、ｓｇＥＢＶ１、ｓｇＥＢＶ２、ｓｇＥＢＶ３、ｓｇＥＢＶ４／５、ｓｇＥＢＶ６、およびｓｇＥＢＶ７が、ＥＢＶゲノムを標的とする箇所が示されている。
【００８０】
ＥＢＶに関して、感染の潜在モードおよび溶菌モードの両方で発現される唯一の核エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）タンパク質は、ＥＢＮＡ１である。ＥＢＮＡ１は、潜伏感染に幾つかの重要な役割を果たすことが公知であるが、ＥＢＮＡ１は、遺伝子調節および潜伏ゲノム複製を含む多数のＥＢＶ機能にとって重要である。したがって、ガイドＲＮＡ  ｓｇＥＢＶ４およびｓｇＥＢＶ５を選択して、ゲノムのこの全領域を切除するためにＥＢＮＡ１コード領域の両端を標的とした。こうした「構造」標的により、ＥＢＶゲノムを系統的により小さな小片に消化することが可能になる。ＥＢＮＡ３ＣおよびＬＭＰ１は、宿主細胞形質転換に不可欠であり、これら２つのタンパク質の５’エキソンをそれぞれ標的とするようにガイドＲＮＡ  ｓｇＥＢＶ３およびｓｇＥＢＶ７を設計した。
【００８１】
（ｉｖ．細胞への導入）
本発明の方法は、ヌクレアーゼおよび配列特異的標的指向性部分を細胞内に導入することを含む。ヌクレアーゼは、配列特異的標的指向性部分によりウイルス核酸を標的とし、その後、宿主ゲノムを妨害することなくウイルス核酸を切断する。任意の好適な方法を使用して、ヌクレアーゼを感染細胞または組織に送達することができる。例えば、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする遺伝子を、注射により、経口で、または流体力学的送達により送達することができる。ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする遺伝子は、全身循環に送達してもよく、または特定の組織タイプに送達してもよく、もしくはそうでなければ局在化させてもよい。ヌクレアーゼまたヌクレアーゼをコードする遺伝子を修飾またはプログラムして、コードされているヌクレアーゼが、ある特定の組織タイプで優先的にまたはある特定の組織タイプでのみ転写されるように組織特異的プロモーターを使用することによる等の、ある特定の条件下でのみ活性化させてもよい。
【００８２】
一部の実施形態では、特異的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が細胞内に導入される。ガイドＲＮＡは、ウイルスゲノムの少なくとも１つのカテゴリーの配列を標的とするように設計される。潜伏感染に加えて、本発明は、パッケージングにされる前に、または放出された後にウイルスゲノムを標的とすることにより、ウイルス複製を能動的に制御するために使用することもできる。
【００８３】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡのカクテルを細胞内に導入してもよい。ガイドＲＮＡは、ウイルスゲノムの多数のカテゴリーの配列を標的とするように設計される。ゲノムに沿って幾つかの領域を標的とすることにより、複数位置での二本鎖切断は、ゲノムを断片化し、修復の可能性を低下させる。修復機構が働いたとしても、こうした大きな欠失は、ウイルスを無力化する。
【００８４】
一部の実施形態では、幾つかのガイドＲＮＡを添加して、異なるカテゴリーの配列を標的とするカクテルが生成される。例えば、２、５、７、または１１個のガイドＲＮＡが、３つの異なるカテゴリーの配列を標的とするＣＲＩＳＰＲカクテル中に存在してもよい。しかしながら、任意の数のｇＲＮＡをカクテルに導入して、配列のカテゴリーを標的とすることができる。好ましい実施形態では、配列のカテゴリーは、それぞれ、ゲノム構造、宿主細胞形質転換、および潜伏感染性にとって重要である。
【００８５】
本発明の一部の態様では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験により、ウイルスゲノム内の最も必須な標的を決定することが可能である。例えば、ゲノムを効果的に無力化するために最も必須な標的を理解するために、ガイドＲＮＡのサブセットをモデル細胞内にトランスフェクトする。アッセイにより、どのガイドＲＮＡまたはどのカクテルが、必須なカテゴリーの配列を標的とするのに最も効果的であるかを決定することができる。
【００８６】
例えば、ＥＢＶゲノムを標的とする場合、ＣＲＩＳＰＲカクテル中の７個のガイドＲＮＡが、それぞれＥＢＶゲノム構造、宿主細胞形質転換、および潜伏感染性にとって重要であると識別されている３つの異なるカテゴリーの配列を標的とした。効果的なＥＢＶ処置に最も必須な標的を理解するために、ガイドＲＮＡのサブセットをＲａｊｉ細胞にトランスフェクトした。
【００８７】
図１４には、ＥＢＶゲノムの領域において種々の組合せのガイドＲＮＡで標的とした後の相対的細胞増殖が示されている。ｓｇＥＢＶ４／５は、ＥＢＶゲノムを８５％低減したが、完全カクテルほど効果的には細胞増殖を抑制することができなかった（図１４）。構造配列を標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＥＢＶ１／２／６）は、ＥＢＶ負荷を完全には除去しなかったが（２６％の減少）、細胞増殖を完全に中止させることができた。ゲノム編集の効率が高いことおよび増殖が停止したことを考慮すると、ｓｇＥＢＶ１／２／６の残留ＥＢＶゲノム痕跡は、インタクトなゲノムに起因するのではなく、ＥＢＶゲノムから消化された遊離の浮遊ＤＮＡ、つまり偽陽性であると疑われた。
【００８８】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を構築したら、複合体を細胞内に導入する。複合体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルまたはｉｎ  ｖｉｖｏモデルの細胞内に導入することができることが理解されるべきである。本発明の態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、トランスフェクション後にウイルスのインタクトなゲノムを残さないように設計され、複合体は、効率的なトランスフェクションのために設計される。
【００８９】
本発明の態様では、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを含む種々の方法によりＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡを細胞内にトランスフェクトすることが可能である。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスを挙げることができる。任意のウイルスベクターを本発明に組み込んで、細胞内へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の送達を達成することができることが理解されるべきである。消化または無力化のために設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体によっては、幾つかのウイルスベクターは、他のものよりも効果的であり得る。本発明の態様では、ベクターは、宿主細胞でベクターを複製および維持するのに必要な複製開始点等の必須成分を含む。
【００９０】
本発明の態様では、ウイルスベクターを送達ベクターとして使用して、複合体を細胞内に送達する。送達ベクターとしてのウイルスベクターの使用は、当技術分野で公知である。例えば、Wilkesらの米国特許出願公開第２００９／００１７５４３号を参照されたい。この文献の内容は、参照により組み込まれる。
【００９１】
レトロウイルスは、その核酸をｍＲＮＡゲノムの形態（５’キャップおよび３’ＰｏｌｙＡ尾部を含む）で格納し、偏性寄生体として宿主細胞を標的とする一本鎖ＲＮＡウイルスである。当技術分野の一部の方法では、核酸を細胞内に導入するためにレトロウイルスが使用されてきた。ウイルスは、宿主細胞の細胞質内部に入ると、それ自体の逆転写酵素を使用してそのＲＮＡゲノムからＤＮＡを産生する。これは、通常のパターンの逆であり、したがってレトロ（逆方向）である。その後、この新しいＤＮＡは、インテグラーゼ酵素により宿主細胞ゲノムに組み込まれ、その時点で、このレトロウイルスＤＮＡは、プロウイルスと呼ばれる。例えば、モロニーマウス白血病ウイルス等の組換えレトロウイルスは、安定的した様式の宿主ゲノム内への組込み能力を有する。それらは、宿主ゲノム内への組込みを可能にする逆転写酵素を含む。レトロウイルスベクターは、複製可能または複製欠損のいずれであってもよい。本発明の一部の実施形態では、細胞内へのトランスフェクションを達成にするためにレトロウイルスが組み込まれるが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、ウイルスゲノムを標的とするように設計される。
【００９２】
本発明の一部の実施形態では、レトロウイルスのサブクラスであるレンチウイルスが、ウイルスベクターとして使用される。レンチウイルスは、非分裂細胞のゲノム内への組込み能力を考慮すると、送達媒体（ベクター）として適合することができる。これは、他のレトロウイルスは分裂する細胞にしか感染することができないため、レンチウイルスに固有な特徴である。ＲＮＡの形態のウイルスゲノムは、ウイルスが細胞に進入してＤＮＡを産生する際に逆転写され、その後ウイルスのインテグラーゼ酵素により無作為位置でゲノム内に挿入される。この時点ではプロウイルスと呼ばれるベクターは、ゲノムに残留し、細胞が分裂するときに細胞の子孫に受け継がれる。
【００９３】
レンチウイルスとは対照的に、アデノウイルスＤＮＡは、ゲノムに組み込まれず、細胞分裂の間には複製されない。アデノウイルスおよび関連ＡＡＶは、宿主のゲノム内に組み込まれないため、送達ベクターとして有望な手法であろう。本発明の一部の態様では、標的とされるウイルスゲノムだけが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体により影響を受け、宿主の細胞は影響を受けない。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒトおよび幾つかの他の霊長類種に感染する小型ウイルスである。ＡＡＶは、分裂する細胞および分裂しない細胞の両方に感染することができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノム内に組み込むことができる。例えば、遺伝子治療ベクターとしての使用に有望であるため、自己相補性アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）と呼ばれる改変型ＡＡＶが研究者により生成されている。ＡＡＶは、ＤＮＡの一本鎖をパッケージングしており、第２鎖の合成プロセスを必要とするが、ｓｃＡＡＶは、両鎖をパッケージングしており、それらは共にアニーリングして二本鎖ＤＮＡを形成する。第２鎖の合成を省くことにより、ｓｃＡＡＶは、細胞内での迅速な発現が可能になる。それ以外については、ｓｃＡＡＶは、その対応するＡＡＶの多くの特徴を有している。本発明の方法は、送達ベクターの手段として、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、またはワクシニアウイルスを組み込むことができる。
【００９４】
本発明のある特定の実施形態では、非ウイルスベクターを使用して、トランスフェクションを達成することができる。核酸の非ウイルス送達法としては、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、または脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの作用剤増強性取り込みが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、第４，９４６，７８７号、および第４，８９７，３５５号に記載されており（これら文献の各々の内容は、それらの全体があらゆる目的にために参照により組み込まれる。）、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、ＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍおよびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性および中性脂質としては、Jesseeの米国特許第７，１６６，２９８号またはJesseの米国特許第６，８９０，５５４号に記載されているものが挙げられ、これら文献の各々の内容は、参照により組み込まれる。送達は、細胞に対してであってもよく（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ投与）、または標的組織に対してでもよい（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与）。
【００９５】
合成ベクターは、典型的には、負荷電の核酸と複合体を形成して１００ｎｍ程度の直径を有する粒子を形成することができるカチオン性脂質またはポリマーに基づく。複合体は、ヌクレアーゼによる分解から核酸を保護する。さらに、細胞および局所送達戦略は、内部移行、放出、および適切な細胞内コンパートメント中の分配の必要性に対処しなければならない。全身送達戦略は、さらなるハードル、例えば、カチオン性送達媒体と血液成分との強力な相互作用、細網内皮系による取り込み、腎臓ろ過、目的の細胞に対する担体の毒性および標的指向能力に遭遇する。カチオン性非ウイルスの表面を修飾することにより、血液成分とのそれらの相互作用を最小限に抑え、細網内皮系取り込みを低減し、それらの毒性を低減し、標的細胞とのそれらの結合親和性を増加させることができる。血漿タンパク質との結合（オプソニン化とも称される）は、ＲＥＳが循環ナノ粒子を認識する主要機序である。例えば、肝臓のクッパー細胞等のマクロファージは、スカベンジャー受容体を介してオプソニン化されたナノ粒子を認識する。
【００９６】
本発明の一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、標的送達およびトランスフェクションを達成するように修飾される。ペグ化（つまり、表面をポリエチレングリコールで修飾すること）は、非ウイルスベクターのオプソニン化および凝集を低減し、細網内皮系によるクリアランスを最小限に抑えて、静脈内（ｉ．ｖ．）投与後の循環寿命延長をもたらすために使用される主要な方法である。したがって、ペグ化ナノ粒子は、「ステルス」ナノ粒子と呼ばれることが多い。循環から迅速にクリアランスされないナノ粒子は、感染細胞に遭遇する機会を得ることになる。
【００９７】
しかしながら、表面のＰＥＧは、標的細胞による取り込みを減少させ、生物学的活動を低減させる場合がある。したがって、ペグ化成分の遠位端部に標的指向性リガンドを付加することが必要であり、標的細胞表面の受容体との結合が可能になるように、ＰＥＧ「シールド」を越えてリガンドを突出させる。カチオン性リポソームを遺伝子担体として使用する場合、核酸の放出には、六方相形成を促進してエンドソーム脱出を可能にすること以外に、中性ヘルパー脂質の応用が有用である。本発明の一部の実施形態では、核酸を全身送達するための、および実験動物モデルにおいて治療効果を得るための、中性またはアニオン性リポソームが開発される。また、新規のカチオン性脂質およびポリマー、およびペプチドと共有結合または非共有結合で結合する遺伝子、標的指向性リガンド、ポリマー、または環境感受性部分の設計および合成も、非ウイルスベクターが遭遇する問題の解決のために注目されている。無機ナノ粒子（例えば、金属ナノ粒子、酸化鉄、リン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、リン酸マンガン、複水酸化物、カーボンナノチューブ、および量子ドット）を送達ベクターに施したものを調製し、多くの異なる様式で表面官能化することができる。
【００９８】
本発明のガイドされるヌクレアーゼ系は、単独で投与してもよく、または活性成分として、薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバント、および媒体と組み合わせて投与してもよい。ベクターは、液体充填剤または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入物質を含んでいてもよい局所製剤または静脈内製剤に組み込んでもよく、ある臓器または身体の部分から別の臓器または身体の部分へと対象作用剤を運搬または搬送することに関与してもよい。各担体は、製剤の他の成分との適合性を有しているべきである。
【００９９】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、ヒドロゲルに封入されていてもよい。別の実施形態では、本明細書で開示されている組成物は、脂質に基づく製剤を含んでいてもよい。公知の脂質に基づく薬物送達系のいずれかを、本発明の実行に使用することができる。例えば、封入活性化合物の持続放出速度を確立することが可能である限り、多胞性リポソーム、多重層リポソーム、および単層リポソームを全て使用することができる。そのような製剤を使用して、ガイドされるヌクレアーゼ組成物の放出プロファイルを変更することができる。制御放出多胞性リポソーム薬物送達系を製作するための方法は、ＰＣＴ出願公開番号：ＷＯ９７０３６５２、ＷＯ９５１３７９６、およびＷＯ９４２３６９７に記載されている。これら文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１００】
合成膜小胞は、通常はステロイド、特にコレステロールと組み合わせたリン脂質の組合せを含んでいてもよい。他のリン脂質または他の脂質を使用することもできる。合成膜小胞の生産に有用な脂質の例としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシドが挙げられ、好ましい実施形態では、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン（distearoylphosphatidyleholine）、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、およびジオレオイルホスファチジルグリセロールが挙げられる。
【０１０１】
本発明の組成物を含有する脂質に基づく小胞を調製する場合、化合物封入の効率、化合物の不安定性（labiality）、得られる小胞集団の均一性およびサイズ、活性化合物対脂質の比率、透過性、調製物の不安定性、および製剤の薬学的許容性等の変数が考慮されるべきである。
【０１０２】
別の実施形態では、本発明のガイドされるヌクレアーゼシステムは、小胞、特にリポソームで送達することができる（Langer（１９９０年）Science、２４９巻：１５２７〜１５３３頁を参照されたい）。この文献の内容は、その全体が参照によりあらゆる目的のために組み込まれる。さらに別の実施形態では、ガイドされるヌクレアーゼシステムは、制御放出系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる（前出のLanger（１９９０年）を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる（Howardら、（１９８９年）、J.  Neurosurg.、７１巻：１０５頁を参照されたい。この文献の内容は、参照によりその全体があらゆる目的のために組み込まれる）。別の実施形態では、本発明のベクターは、例えば、レトロウイルスベクターを使用することにより（例えば、米国特許第４，９８０，２８６号を参照）、または直接注射により、または微粒子衝撃を使用することにより（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤でコーティングすることにより、または核に進入することが公知であるホメオボックス様ペプチドと連結させて投与することにより（Joliotら、１９９１年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８８巻：１８６４〜１８６８頁を参照）、細胞内に移行するように投与することができる。これら文献の内容は、それらの全体が参照によりあらゆる目的のために組み込まれる。あるいは、核酸を細胞内に導入し、相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に組み込んで発現させてもよい。
【０１０３】
本発明の一部の実施形態では、組織の固有環境および外部刺激に応答する標的指向性制御放出系が使用される。金ナノロッドは、近赤外領域に強い吸収帯を有し、したがって、吸収された光エネルギーは、金ナノロッドにより熱に変換される。これは、いわゆる「光熱効果」である。近赤外光は組織の深部まで透通することができるため、金ナノロッドの表面を核酸で修飾して、制御放出することができる。修飾した金ナノロッドを近赤外光で照射すると、光熱効果に起因して誘導される熱変性により核酸が放出される。放出される核酸の量は、光放射の出力および露光時間に依存する。
【０１０４】
本発明の一部の実施形態では、リポソームを使用して、細胞内または組織内へのトランスフェクションを達成することができる。核酸のリポソーム製剤の薬理学の大部分は、核酸がリポソーム二重層内部に封入される程度により決定される。封入された核酸は、ヌクレアーゼ分解から保護されるが、リポソーム表面に単に会合しているものは保護されない。封入された核酸は、インタクトなリポソームと長期循環寿命および体内分散を共有するが、表面に会合しているものは、リポソームから乖離すると裸の核酸の薬理学に従う。
【０１０５】
一部の実施形態では、本発明の複合体は、リポソームに封入される。低分子薬物とは異なり、核酸は、主にサイズが大きく親水性の性質であるため、インタクトな脂質二分子膜を通り抜けることができない。したがって、核酸は、エタノール液滴法（ＳＡＬＰのような）、逆相蒸発法、およびエタノール希釈法（ＳＮＡＬＰのような）等の従来の受動担持技術を用いてリポソーム内に捕捉することができる。
【０１０６】
一部の実施形態では、汎用性があり、トランスフェクション効率が比較的高いため、直鎖ポリエチレンイミン（Ｌ−ＰＥＩ）が、非ウイルスベクターとして使用される。Ｌ−ＰＥＩは、肺、脳、膵臓、網膜、膀胱等の広範な臓器内に、ならびに腫瘍内に遺伝子をｉｎ  ｖｉｖｏで効率的に送達するために使用されている。Ｌ−ＰＥＩは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで、核酸を効率的に濃縮し、安定化させ、送達することができる。
【０１０７】
マイクロバブルと組み合わせた低強度超音波は、安全な遺伝子送達法として最近注目されている。超音波は、組織透過効果を示す。マイクロバブルと組み合わせた低強度超音波は、非侵襲性であり、部位特異的であり、非標的臓器に影響を及ぼさずに、全身送達後に腫瘍細胞を破壊することを可能にすることができる。超音波媒介性マイクロバブル破壊は、薬物および核酸を様々な組織に非侵襲的に送達するための革新的な方法として提案されている。マイクロバブルを使用して、目的の特定領域に到達するまで薬物または遺伝子を担持させ、その後、超音波を使用してマイクロバブルを破裂させることにより、生物活性物質の部位特異的な送達がもたらされる。さらに、アルブミンをコーティングしたマイクロバブルがグリコカリックス（glycocalix）損傷または内皮機能障害を有する管脈領域に付着する能力は、超音波が存在しない場合でも薬物を送達することが可能な別の機序である。Tsutsuiら、２００４年、The  use  of  microbubbles  to  target  drug  delivery、Cardiovasc  Ultrasound、２巻：２３頁を参照されたい。この文献の内容は、参照により組み込まれる。超音波誘発薬物送達では、組織透過効果は、超音波造影剤、ガス充填マイクロバブルを使用して強化することができる。核酸を送達するためのマイクロバブルの使用は、マイクロバブルが標的領域を通ってそれらが微小血管で移動している間に超音波ビームの焦点を合わせることによりＤＮＡ担持マイクロバブルを破壊すると、マイクロバブルシェルの損壊に際し局所的な形質導入が引き起こされるが、非標的領域で形質導入が引き起こされることはないという仮説に基づく。
【０１０８】
超音波媒介性送達の他に、磁気標的指向性送達を送達に使用することができる。磁性ナノ粒子は、通常、核酸送達を画像化するために遺伝子ベクターに捕捉される。核酸担体は、超音波および磁場の両方に応答することができ、つまり磁気および音響活性リポスフェア（ＭＡＡＬ）であってもよい。基本的な前提は、治療剤が、磁気マイクロまたはナノ粒子に付加されているか、または磁気マイクロまたはナノ粒子内に封入されているということである。こうした粒子は、官能化することができるポリマーまたは金属コーティングを有する磁気コアを有していてもよく、または細孔内に沈殿している磁性ナノ粒子を含む多孔性ポリマーで構成されていてもよい。ポリマーまたは金属コーティングを官能化することにより、例えば、標的化学療法のための細胞毒性薬物または遺伝子欠損を修正するための治療用ＤＮＡを付加することが可能である。結合させたら、粒子／治療剤複合体を、多くの場合ではカテーテルを使用して標的近傍の注射部位に位置決めして、血流に注入する。一般的には強磁場で高勾配の希土類磁石からの磁場を、標的部位に集中させ、粒子が磁場に進入する際に粒子にかかる力により、粒子を標的にて捕捉および溢出させることが可能になる。
【０１０９】
従来のリポソームと比較して細胞毒性が低減されていることと組み合わせてトランスフェクション効率が強化されている合成カチオン性ポリマーに基づくナノ粒子（直径約１００ｎｍ）が開発されている。様々な物理的および化学的特徴を有する脂質分子で構成されている別個の層をポリマーナノ粒子製剤に組み込むことにより、細胞膜との融合および細胞内への進入がより良好になり、細胞内部での分子放出が強化され、ナノ粒子複合体の細胞内分解が低減されるため、効率の向上がもたらされる。
【０１１０】
一部の実施形態では、複合体は、中でもリポソーム、アルブミンに基づく粒子、ペグ化タンパク質、生分解性ポリマー薬物複合材料、ポリマーミセル、デンドリマー等の全身療法用のナノ系にコンジュゲートされる。Davisら、２００８年、Nanotherapeutic  particles:  an  emerging  treatment  modality  for  cancer、Nat  Rev  Drug  Discov.、７巻（９号）：７７１〜７８２頁を参照されたい。この文献は、参照により組み込まれる。リポソーム等の長期循環巨大分子担体では、増強された透過性、および腫瘍血管からの優先的血管外漏出に対する保持効果を活用することができる。ある特定の実施形態では、本発明の複合体は、細胞への送達用のリポソームまたはポリマーソーム（polymerosome）にコンジュゲートされているか、または封入されている。例えば、リポソームアントラサイクリンは、非常に効率的な封入化を達成しており、リポソームダウノルビシンおよびペグ化リポソームドキソルビシン等の超長期循環性を有する型が挙げられる。Krishnaら、Carboxymethylcellulose-sodium  based  transdermal  drug  delivery  system  for  propranolol、J  Pharm  Pharmacol.、１９９６年４月；４８巻（４号）：３６７〜７０頁を参照されたい。
【０１１１】
リポソーム送達系は、安定製剤を提供し、薬物動態の向上、および組織に対するある程度の「受動的」または「生理学的」標的指向性を提供する。有望な化学治療剤等の親水性および疎水性物質の封入化は公知である。例えば、以下の文献を参照されたい：Schneiderの米国特許第５，４６６，４６８号、合成脂質を含む非経口投与可能なリポソーム製剤が開示されている；Hostetlerらの米国特許第５，５８０，５７１号、リン脂質にコンジュゲートされているヌクレオシド類似体が開示されている；Nyqvistの米国特許第５，６２６，８６９号、薬学的活性化合物が、少なくとも１つの両親媒性成分および極性脂質成分および少なくとも１つの無極性脂質成分を含む限定脂質系に含まれているヘパリンまたはその断片である医薬組成物が開示されている。
【０１１２】
リポソームおよびポリマーソームは、複数の溶液および化合物を含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、本発明の複合体は、ポリマーソームとカップリングされているか、またはポリマーソームに封入されている。人工小胞の一種としてのポリマーソームは、溶液を取り囲む極小中空球体であり、両親媒性合成ブロックコポリマーを使用して小胞膜を形成することにより製作される。一般的なポリマーソームは、それらのコアに水溶液を含有し、薬物、酵素、他のタンパク質およびペプチド、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡ断片等の感受性分子を封入し、保護するのに有用である。ポリマーソーム膜は、生物学的系に見出されるもの等の、外部物質から封入した物質を隔離する物理的障壁を提供する。ポリマーソームは、公知の技法により複乳剤から生成することができる。Lorenceauら、２００５年、Generation  of  Polymerosomes  from  Double-Emulsions、Langmuir、２１巻（２０号）：９１８３〜６頁を参照されたい。この文献は、参照により組み込まれる。
【０１１３】
本発明の一部の実施形態は、遺伝子銃またはバイオリスティック銃粒子送達系を提供する。遺伝子銃は、遺伝子情報を細胞に注入するためのデバイスであり、ペイロードは、プラスミドＤＮＡでコーティングされている重金属の元素粒子であってもよい。この技法は、バイオバリスティックまたはバイオリスティックと呼ばれる場合もある。また、ＤＮＡワクチンを送達するためにも遺伝子銃が使用されている。遺伝子銃は、ＤＮＡプラスミド、蛍光タンパク質、色素等の、幅広く様々な有機および非有機種を細胞にトランスフェクトすることができる。
【０１１４】
本発明の態様は、送達ベクターの使用を数多く提供する。送達ベクターの選択は、標的とされている細胞または組織、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡの特定の組成に基づく。例えば、上記で考察されているＥＢＶの例では、リンパ球は、リポフェクションに抵抗性であることが公知であるため、Ｒａｊｉ細胞内へのＤＮＡ送達には、ヌクレオフェクション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒと呼ばれるデバイスにより生成される電気的パラメータと、細胞核内および細胞質内に基質を直接移行させる細胞タイプ特異的試薬との組合せ）が必要であった。Ｌｏｎｚａ  ｐｍａｘプロモーターは、Ｃａｓ９発現を駆動する。それは、このプロモーターがＲａｊｉ細胞内での強力な発現をもたらしていたためである。ヌクレオフェクションの２４時間後、蛍光顕微鏡で、少数の細胞から明白なＥＧＦＰシグナルが観察された。
【０１１５】
図６には、プラスミドがｏｒｉ−Ｐを含む場合、細胞内部の活性プラスミド複製が促進され、トランスフェクション効率が６０％超増加したことが示されている。左側のパネルは、非処置細胞およびＣａｓ９で処置した細胞は、蛍光マーカーを有する細胞の数が同様に少なかったことを示している。右パネルは、ｏｒｉＰがより高いトランスフェクションを促進したことを示している。
【０１１６】
しかしながら、ＥＧＦＰ陽性細胞集団は劇的に減少し、ヌクレオフェクションの４８時間後に１０％未満のトランスフェクション効率が測定された（図６）。ＥＢＶ複製開始点配列ｏｒｉＰを含んでいたＣＲＩＳＰＲプラスミドは、６０％超のトランスフェクション効率をもたらした（図６）。
【０１１７】
本発明の態様は、標的指向性送達のためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を使用する。一般的で公知の経路としては、経皮経路、経粘膜（transmucal）経路、経鼻経路、経眼経路、経肺経路が挙げられる。薬物送達系はとしては、リポソーム、プロリポソーム、ミクロスフェア、ゲル、プロドラッグ、シクロデキストリン等を挙げることができる。本発明の態様では、肺の特定部位または細胞集団を標的とするためのエアロゾルに移行されることになる、生分解性ポリマーで構成されているナノ粒子が使用され、所定の様式での薬物放出および許容される期間内での分解が提供される。経皮的および径粘膜的制御放出送達系、鼻およびバッカルエアゾルスプレー、薬物含浸ロゼンジ、封入細胞、経口柔質ゲル、皮膚を介して薬物を投与するイオントフォレーシスデバイス、ならびに様々なプログラム可能な移植薬物送達デバイス等の制御放出技術（ＣＲＴ）を、本発明の複合体と共に使用して、標的指向性制御送達が達成される。
【０１１８】
ＣＭＶ標的指向性ヌクレアーゼは、本明細書に記載の技法により、および当技術分野で公知の技法により、細胞、臓器、患者、または胎児内へと送達することができることが理解されるべきである。本発明のＣＭＶ標的指向性ヌクレアーゼは、ベクターおよび／またはガイドＲＮＡと会合させること（結合、封入など）により送達用に調製することができる。
【０１１９】
本発明の態様は、胎盤を越える、即ち経胎盤的なＣＭＶ標的指向性ヌクレアーゼの送達を提供する。胎児への導管としての胎盤は、薬物標的でもあり、薬物障壁でもある。あるいは、ヌクレアーゼは、羊膜嚢内または胎児内に導入することができる。例えば、ヌクレアーゼは、注射により羊膜嚢内または胎児内に導入することができる。あるいは、胎児は、幼児に治療剤を送達するための当技術分野で公知の任意の技法を使用し、出産後に本発明の方法を使用して、ＣＭＶ感染を処置することができる。
【０１２０】
（ｖ．ウイルス核酸切断）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、細胞内部に入ると、ウイルスゲノムを標的とする。本発明の態様では、複合体は、ウイルスゲノムへと標的化されている。潜伏感染に加えて、本発明を使用して、パッケージングにされる前にまたは放出された後にウイルスゲノムを標的とすることにより、ウイルス複製を能動的に制御することもできる。一部の実施形態では、本発明の方法および組成物は、Ｃａｓ９等のヌクレアーゼを使用して潜伏ウイルスゲノムを標的とし、それにより増殖の機会を低減させる。ヌクレアーゼは、ｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）と複合体を形成し得る。複合体は、ウイルス核酸を標的化様式で切断して、ウイルスゲノムを無力化する。上記で考察されているように、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ウイルスゲノムの二本鎖切断を引き起こす。ウイルスゲノムに沿った幾つかの位置を標的とし、一本鎖切断ではなく二本鎖切断を引き起こすことにより、ゲノムに沿った幾つかの位置でゲノムが効果的に切断される。好ましい実施形態では、二本鎖切断は、天然の修復機構がゲノムを共に接合した場合であってもゲノムが無力化されるように、小型の欠失が引き起こされるか、または小さな断片がゲノムから除去されるように設計されている。
【０１２１】
細胞内への導入後、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、ウイルスゲノム、遺伝子、転写物、または他のウイルス核酸に作用する。ＣＲＩＳＰＲにより生成された二本鎖ＤＮＡ切断は、修復されて小型の欠失がもたらされる。こうした欠失は、タンパク質コードを中断し、したがってノックアウト効果を発揮することになる。
【０１２２】
ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする遺伝子は、トランスフェクションにより感染細胞内に送達することができる。例えば、感染細胞に、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡをコードするＤＮＡをトランスフェクトすることができる（単一の小片または別々の小片で）。ｇＲＮＡは、ウイルスゲノムに沿って１つまたは幾つかの位置にＣａｓ９エンドヌクレアーゼを局在化させるように設計される。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ゲノム中に二本鎖切断を引き起こし、ウイルスゲノムから小断片を欠失させる。欠失は、修復機構が働いたとしても、ウイルスゲノムを無力化する。
【０１２３】
その後、本発明の方法によるヌクレアーゼで処置した細胞および組織は、移植用に提供される。一部の実施形態では、臓器は、組織を無ＣＭＶ化するヌクレアーゼで移植前に処置される。
【０１２４】
本発明の一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、移植臓器で使用するために調製される。臓器移植は、臓器をある身体から別の身体へと移動させるか、またはドナー部位からその個体自身の身体の別の位置へと移動させて、レシピエントの損傷したまたは欠けている臓器を置換することである。また、臓器は、その個体自身の細胞（幹細胞、または不全臓器から抽出された細胞）、または別の個体の細胞から生成または再増殖することができる。臓器は、生体供給源または死体供給源のいずれかからであってもよい。移植することができる臓器は、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、腸、および胸腺である。組織としては、骨、腱（両方とも筋骨格移植片と呼ばれる）、角膜、皮膚、心臓弁、神経、および静脈が挙げられる。角膜移植片および筋骨格移植片は、一般的に移植される組織または臓器である。
【０１２５】
（ｖｉ．宿主ゲノム）
本発明の方法および組成物は、宿主遺伝物質を妨害せずにウイルス核酸を標的とするために使用することができることが理解される。本発明の方法および組成物は、ウイルス配列内の標的にハイブリダイズする配列を有するガイドＲＮＡ等の標的指向性部分を使用する。本発明の方法および組成物は、ｇＲＮＡを使用して、排他的にウイルスゲノムと結合し、二本鎖を切断することによりウイルス配列を宿主から除去するｃａｓ９酵素等の標的に向かうヌクレアーゼまたはそのようなヌクレアーゼをコードするベクターをさらに使用してもよい。
【０１２６】
標的指向性部分がガイドＲＮＡを含む場合、ｇＲＮＡの配列またはガイド配列は、ウイルス配列を調査して、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接し、しかもプロトスペーサーモチーフに隣接する宿主ゲノムには出現しない約２０個のヌクレオチドの領域を見出すことにより決定することができる。
【０１２７】
好ましくは、ガイド配列は、ガイド配列に従って製作されるｇＲＮＡ／ｃａｓ９複合体が、宿主ゲノムを妨害することなく、ウイルス配列の指定の特徴または標的と結合しそれらを消化することになるように、ある特定の類似性基準（例えば、ＰＡＭにより近い領域に向かってバイアスのかかった同一性と少なくとも６０％同一であること）を満たす。好ましくは、ガイドＲＮＡは、ウイルス配列中のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（例えば、ＮＧＧ、この場合Ｎは任意のヌクレオチドである）の次のヌクレオチド文字列に対応する。好ましくは、宿主ゲノムは、（１）所定の類似性基準によるヌクレオチド文字列が一致し、（２）またＰＡＭに隣接するあらゆる領域を欠如する。所定の類似性基準は、例えば、ＰＡＭの５’側にある２０個ヌクレオチド内に少なくとも１２個の一致ヌクレオチドがあるという要件を含んでいてもよく、また、ＰＡＭの５’側にある１０個ヌクレオチド内に少なくとも７個の一致ヌクレオチドがあるという要件を含んでいてもよい。注釈付きウイルスゲノム（例えば、ＧｅｎＢａｎｋからの）を使用して、ウイルス配列の特徴を識別し、ウイルス配列の選択特徴（例えば、ウイルス複製開始点、末端反復、複製因子結合部位、プロモーター、コード配列、または反復領域）内のウイルス配列のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の次のヌクレオチド文字を見出してもよい。ウイルス配列および注釈は、ゲノムデータベースから得ることができる。
【０１２８】
複数の候補ｇＲＮＡ標的がウイルスゲノムに見出される場合、ガイドＲＮＡの鋳型である配列の選択は、ガイド配列としての標的特徴に最も近いかまたは最も５’端にある候補標的を優先してもよい。選択は、好ましくは、中間的な（例えば、４０％〜６０％の）ＧＣ含量を有する配列を優先的に選んでもよい。エンドヌクレアーゼによるＲＮＡ指向性標的化に関するさらなる背景は、以下の文献で考察されている：米国特許出願公開第２０１５／００５０６９９号；米国特許出願公開第２０１４０３５６９５８号；米国特許出願公開第２０１４／０３４９４００号；米国特許出願公開第２０１４／０３４２４５７号；米国特許出願公開第２０１４／０２９５５５６号；および米国特許出願公開第２０１４／０２７３０３７号。これら文献の各々の内容は、参照によりあらゆる目的のために組み込まれる。感染細胞にヒトゲノムのバックグラウンドが存在するため、ウイルスゲノムに対する効率が高く、ヒトゲノムに対するオフターゲット効果が低いことを保証するための１組のステップが提供される。こうしたステップは、（１）ウイルスゲノム内の標的を選択すること、（２）宿主ゲノムのＰＡＭ＋標的配列を回避すること、（３）株間で保存されているウイルス標的を方法論的に選択すること、（４）適切なＧＣ含量を有する標的を選択すること、（５）細胞でのヌクレアーゼ発現を制御すること、（６）ベクターを設計すること、（７）アッセイで検証すること等、およびそれらの種々の組合せを含んでいてもよい。標的指向性部分（ガイドＲＮＡ等）は、好ましくは、（ｉ）潜伏関連標的、（ｉｉ）感染および症状関連標的、および（ｉｉｉ）構造関連標的等の、ある特定のカテゴリー内の標的と結合する。
【０１２９】
ｇＲＮＡの第１のカテゴリーの標的は、潜伏関連標的を含む。ウイルスゲノムは、潜伏を維持するためにある特定の特徴を必要とする。こうした特徴としては、これらに限定されないが、マスター転写制御因子、潜伏特異的プロモーター、宿主細胞と情報交換するシグナル伝達タンパク質等が挙げられる。宿主細胞が潜伏中に分裂している場合、ウイルスゲノムは、複製系がゲノムのコピーレベルを維持することが必要である。ウイルス複製開始点、末端反復、および複製開始点に結合する複製因子は、良好な標的である。こうした特徴の機能が妨害されると、ウイルスが再活性化し、それは、従来の抗ウイルス療法で処置することができる。
【０１３０】
ｇＲＮＡの第２のカテゴリーの標的は、感染関連および症状関連の標的を含む。ウイルスは、感染を促進するための種々の分子を産生する。ウイルスは、宿主細胞に進入すると、溶菌サイクルを開始し、それにより細胞死および組織損傷（ＨＢＶ）を引き起こし得る。ＨＰＶ１６等のある特定の場合では、細胞産物（Ｅ６およびＥ７タンパク質）は、宿主細胞を形質転換し、がんを引き起こし得る。こうした分子を産生する重要なゲノム配列（プロモーター、コード配列等）を妨害すると、さらなる感染を予防することができ、および／またはその疾患の症状を治癒しないとしても、緩和することができる。
【０１３１】
ｇＲＮＡの第３のカテゴリーの標的は、構造関連標的を含む。ウイルスゲノムは、ゲノム統合、複製、または他の機能を支援する反復領域を含む場合がある。反復領域を標的とすると、ウイルスゲノムを切断して複数の小片にすることができ、それによりゲノムは物理的に破壊される。
【０１３２】
ヌクレアーゼがｃａｓタンパク質である場合、標的指向性部分は、ガイドＲＮＡである。各ｃａｓタンパク質は、標的とされた配列の次の特定のＰＡＭ（ガイドＲＮＡのではない）を必要とする。これは、ヒトゲノム編集の場合と同じある。現在の理解では、ガイドＲＮＡ／ヌクレアーゼ複合体は、まずＰＡＭに結合し、その後ガイドＲＮＡと標的ゲノムとの間の相同性を探索する。Sternbergら、２０１４年、DNA  interrogation  by  the  CRISPR  RNA-guided  endonuclease  Cas9、Nature、５０７巻（７４９０号）：６２〜６７頁。ＤＮＡは、認識されると、ＰＡＭの３−ｎｔ上流で消化される。こうした結果は、オフターゲット消化が起こるためには、宿主ＤＮＡにＰＡＭが存在し、かつガイドＲＮＡとＰＡＭ直前の宿主ゲノムとの間の親和性が高いことが必要であることを示唆している。
【０１３３】
高度に保存されているウイルスゲノムの部分を標的とする標的指向性部分を使用することが好ましい場合がある。ウイルスゲノムは、ヒトゲノムよりもはるかに変異性が高い。異なる株を標的とするために、ガイドＲＮＡは、好ましくは、保存された領域を標的とすることになる。ＰＡＭは、最初の配列認識にとって重要であるため、保存された領域にＰＡＭを有することも不可欠である。
【０１３４】
好ましい実施形態では、本発明の方法を使用して、核酸を細胞に送達する。細胞に送達される核酸は、決定されたガイド配列を有するｇＲＮＡを含んでいてもよく、または核酸は、標的遺伝物質に対して作用することになる酵素をコードするプラスミド等のベクターを含んでいてもよい。その酵素が発現されることにより、標的遺伝物質の分解またはそうでなければ妨害が可能になる。酵素は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ等のヌクレアーゼであってもよく、また、核酸は、決定されたガイド配列を有する１つまたは複数のｇＲＮＡをコードしていてもよい。
【０１３５】
ｇＲＮＡにより、ヌクレアーゼは、標的遺伝物質を標的とする。標的遺伝物質がウイルスゲノムを含む場合、そのゲノムの一部分に相補的なｇＲＮＡは、ヌクレアーゼによるそのゲノムの分解（degredation）を誘導することができ、それにより、インタクトなウイルスゲノムのさらなる複製が一切防止されるか、またはさらに細胞から完全に除去される。こうした手段により、潜伏ウイルス感染を標的として根絶することができる。
【０１３６】
宿主細胞は、特定の細胞タイプによっては、異なる速度で増殖する場合がある。迅速な細胞複製にはヌクレアーゼの発現が高いことが必要であるが、未感染細胞のオフターゲット切断を回避するには、発現は低い方が役に立つ。ヌクレアーゼ発現の制御は、幾つかの態様により達成することができる。ヌクレアーゼがベクターから発現される場合、ベクターがウイルス複製開始点を有することにより、ベクターのコピー数を感染細胞でのみ劇的に増加させることができる。各プロモーターは、異なる組織では異なる活性を有する。遺伝子転写は、異なるプロモーターを選択することにより調整することができる。また、転写物およびタンパク質安定性は、安定化または不安定化モチーフ（ユビキチン標的指向性配列等）を配列に組み込むことにより調整することができる。
【０１３７】
ｇＲＮＡ配列、ヌクレアーゼ（例えば、ｃａｓ９）、他のエレメント、またはそれらの組合せに対する特異的プロモーターを使用してもよい。例えば、一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｕ６プロモーターにより駆動される。タンパク質発現用のプロモーターを含むベクターを設計してもよい（例えば、Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ（バーゼル、スイス）によりＰＭＡＸＣＬＯＮＩＮＧという商標名で販売されているベクターに記載されているプロモーターを使用して）。ベクターは、プラスミドであってもよい（例えば、合成機器２５５および組換えＤＮＡ実験装置で生成される）。ある特定の実施形態では、プラスミドは、Ｕ６プロモーター駆動性ｇＲＮＡまたはキメラガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）およびユビキタスプロモーター駆動性ｃａｓ９を含む。任意選択で、ベクターは、後にｃａｓ９＋細胞を選択することを可能にするために、ｃａｓ９タンパク質の後に融合されているＥＧＦＰ等のマーカーを含んでいてもよい。ｃａｓ９は、ｇＲＮＡ（元の細菌系のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と類似している）を、相補的なｔｒａｎｓ活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と共に使用して、ｇＲＮＡに相補的なウイルス配列を標的とすることができることが理解される。ｃａｓ９は、単一のＲＮＡ分子、ｇＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのキメラでプログラムすることができることも示されている。単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、プラスミドにコードすることができ、ｓｇＲＮＡの転写は、ｃａｓ９のプログラミングおよびｔｒａｃｒＲＮＡの機能を提供することができる。背景については、Jinek、２０１２年、A  programmable  dual-RNA-guided  DNA  endonuclease  in  adaptive  bacterial  immunity、Science、３３７巻：８１６〜８２１頁、および特にこの文献の図５Ａを参照されたい。
【０１３８】
上記の原理を使用すると、本発明の方法および組成物を使用して、宿主ゲノムに悪影響を及ぼさずに、感染宿主のウイルス核酸を標的とすることができる。
【０１３９】
さらなる背景は、Hsu、２０１３年、DNA  targeting  specificity  of  RNA-guided  Cas9  nucleases、Nature  Biotechnology、３１巻（９号）：８２７〜８３２頁；およびJinek、２０１２年、A  programmable  dual-RNA-guided  DNA  endonuclease  in  adaptive  bacterial  immunity、Science、３３７巻：８１６〜８２１頁を参照されたい。これら文献の各々の内容は、参照により組み込まれる。標的位置は、（ｉ）潜伏関連標的（ｉｉ）感染および症状関連標的、または、（ｉｉｉ）構造関連標的等の、ある特定のカテゴリー内にあるものが選択されるため、これら配列を切断することにより、ウイルスが不活化され、宿主からウイルスが除去される。標的指向性ＲＮＡ（ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）は、ウイルス遺伝子配列の標的と一致するが、宿主ゲノムと一致する一切のオフターゲットを起こさないという類似性基準を満たすように設計されているため、潜伏ウイルス遺伝物質は、宿主ゲノムを一切妨害せずに宿主から除去される。
【０１４０】
（ｉｉ．アポトーシス経路）
少数の細胞しか感染しておらず、その全体細胞（ならびにＣＭＶゲノム）を取り除くだけで十分である場合、本発明の態様では、潜伏ウイルス状態で活性であり、殺細胞遺伝子を駆動するプロモーターを含むベクターの投与が企図される。この手法の場合、特に興味深い標的はＨＳＶである。それは、数千〜数万個のニューロンにしか潜伏感染していないと推定されるためである。Hoshinoら、２００８年、The  number  of  herpes  simplex  virus  -infected  neurons  and  the  number  of  viral  genome  copies  per  neuron  correlate  with  latent  viral  load  in  ganglia、Virology、３７２巻（１号）：５６〜６３頁を参照されたい。この文献は、参照により組み込まれる。殺細胞遺伝子の例としては、（１）細胞ゲノムを標的とする標的化可能なヌクレアーゼ；ならびに（２）ＢＡＸおよびＢＡＫ等のアポトーシスエフェクターおよびアルファ溶血素等の細胞膜またはミトコンドリア膜の完全性を破壊するタンパク質の両方が挙げられる（Bayles、「Bacterial  programmed  cell  death:  making  sense  of  a  paradox」、  Nature  Reviews  Microbiology、１２巻、６３〜６９頁（２０１４年））。潜伏感染細胞でのみ活性であるプロモーターは、この状況で使用することができるだけでなく、活性を感染細胞特異的にすることによりヌクレアーゼ療法の選択性を増加させるためにも使用することができる。そのようなプロモーターの一例は、潜伏関連プロモーター１または「ＬＡＰ１」である（PrestonおよびEfstathiou、「Molecular  Basis  of  HSV  Latency  and  Reactivation」、Human  Herpesviruses:  Biology,  Therapy  and  Immunoprophylaxis、２００７年）。一部の実施形態では、本発明は、宿主細胞であるが、感染している細胞のみの死滅を引き起こすために使用することができる方法および治療薬を提供する。例えば、処置は、細胞死を引き起こすタンパク質の遺伝子を送達することを含んでいてもよく、上記遺伝子は、感染ウイルスのゲノムに由来するプロモーター等のウイルス調節エレメントの制御下にあるか、または上記遺伝子は、ウイルス複製開始点を含むベクターにコードされている。ウイルスが存在する場合、遺伝子が発現され、遺伝子産物は、その細胞の死滅を引き起こすことになる。遺伝子は、アポトーシスに重要なタンパク質をコードし得るか、または遺伝子は、宿主ゲノムを消化するヌクレアーゼをコードし得る。
【０１４１】
アポトーシス実施形態を使用すると、感染細胞および未感染細胞の混合物を含む試料内からの感染細胞を除去することができる。標的化可能なヌクレアーゼを使用して、ウイルス駆動性プロモーター、標的化可能なヌクレアーゼ、および細胞（例えばヒト）ゲノムを標的とするガイドＲＮＡを含む組成物を提供することができる。ウイルスが存在すると、ヌクレアーゼは、細胞を死滅させることになる。試料には未感染細胞のみが残されることになる。
【０１４２】
アポトーシスタンパク質は、治療薬として使用することができる。ベクター内にコードされている治療薬が提供されてもよく、ベクターには、ウイルスに感染した細胞内に治療薬を発現させる配列もコードされている。配列は、ウイルスのゲノムに由来する調節エレメント（例えば、プロモーターおよび複製開始点）であってもよい。治療薬は、ウイルス感染細胞の死滅を選択的に引き起こす機構を提供することができる。例えば、細胞のアポトーシス経路欠損を回復させるタンパク質を使用してもよい。遺伝子は、例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＣＬ−２、またはアルファ溶血素であってもよい。好ましくは、治療薬は、ウイルスに感染した細胞にアポトーシスを誘導し、未感染細胞ではアポトーシスを誘導しない。
【０１４３】
一部の実施形態では、本発明は、ウイルスベクター、プラスミド、またはアポトーシスを促進する少なくとも１つの遺伝子をコードする他のコード核酸、およびウイルスゲノムに関連する少なくとも１つのプロモーターを含む組成物を提供する。アポトーシス制御因子Ｂｃｌ−２は、ミトコンドリア外膜透過性（ＭＯＭＰ）を支配し、Ｂａｘ、ＢＡＤ、Ｂａｋ、Ｂｏｋ、Ｂｃｌ−ｒａｍｂｏ、Ｂｃｌ−ｘｓ、およびＢＯＫ／Ｍｔｄ等のアポトーシス促進性タンパク質を含むタンパク質のファミリーである。
【０１４４】
アポトーシス制御因子ＢＡＸは、ｂｃｌ−２様タンパク質４としても公知であり、ヒトではＢＡＸ遺伝子によりコードされるタンパク質である。ＢＡＸは、Ｂｃｌ−２遺伝子ファミリーのメンバーである。このタンパク質は、ＢＣＬ２とヘテロ二量体を形成し、アポトーシス活性化因子として機能する。このタンパク質は、ミトコンドリア膜電位依存アニオンチャンネル（ＶＤＡＣ）と相互作用し、その開口を増加させ、膜電位の喪失およびシトクロムｃの放出に至ることが報告されている。
【０１４５】
Ｂｃｌ−２相同性アンタゴニスト／キラーは、ヒトでは第６染色体上のＢＡＫ１遺伝子によりコードされているタンパク質である。このタンパク質は、ミトコンドリアに局在化されており、アポトーシスを誘導するように機能する。それは、ミトコンドリア膜電位依存アニオンチャンネルと相互作用し、その開口を加速させ、膜電位の喪失およびシトクロムｃの放出に至る。
【０１４６】
このファミリーに属するタンパク質をコードするヒト遺伝子としては、以下のものが挙げられる：ＢＡＫ１、ＢＡＸ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ａ１、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＢＣＬ２Ｌ１０、ＢＣＬ２Ｌ１３、ＢＣＬ２Ｌ１４、ＢＯＫ、およびＭＣＬ１。
【０１４７】
（参照による組込み）
本開示の全体にわたって、特許、特許出願、特許公報、ジャーナル、本、論文、ウェブコンテンツ等の他の文献が参照および引用されている。そのような文献は全て、それらの全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４８】
（均等物）
本明細書に図示および記載されているものに加えて、本発明およびその多数のさらなる実施形態に対する種々の改変は、当業者であれば、本明細書に引用されている科学文献および特許文献への参照を含む本書類の完全な内容から明白になる。本明細書の主題は、種々の実施形態およびその均等物にて本発明を実施するために応用することができる重要な情報、例示、および指針を含む。
【実施例】
【０１４９】
（実施例１）
標的ＨＳＶ
Ｔ７  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により、スキャフォールドを有する完全なガイドＲＮＡを産生した。ゲノム標的の隣接領域を、ＨＳＶ２  Ｇ株ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣから得た）からＰＣＲで増幅した。Ｃａｓ９タンパク質（ＰＮＡ  Ｂｉｏから得た）、ガイドＲＮＡ、および標的ＤＮＡを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏエンドヌクレアーゼアッセイのために混合およびインキュベートした。
【０１５０】
細胞内でのＨＳＶに対する効率をさらに試験するため、本発明者らは、上述の各ＨＳＶ２増幅産物を発現ベクターにサブクローニングした。また、同じガイドＲＮＡ配列（ＲＬ２、ＬＡＴｉ、ＬＡＴｐ、ＵＬ９、ＯｒｉＳ、およびＵＳ１２）を、ＣＭＶプロモーター駆動性ｃａｓ９およびＵ６プロモーター駆動性ｓｇＲＮＡスキャフォールドを含むＣＲＩＳＰＲプラスミドにクローニングした。本発明者らは、リポフェクタミン２０００を用いて、ＨＳＶ２増幅産物クローンおよび抗ＨＳＶ  ＣＲＩＳＰＲプラスミドを両方とも、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、細胞を回収してゲノムＤＮＡを単離した。
【０１５１】
図３は、Ｃａｓ９を用いてまたは用いずに、ＲＬ２、ＬＡＴｉ、ＬＡＴｐ、ＵＬ９、ＯｒｉＳ、およびＵＳ１２ガイド配列で処置した細胞のゲノムＤＮＡサイズのバンド示すレーンのゲルである。
【０１５２】
図４には、ＣＲＩＳＰＲ処置試料における様々なレベルのＨＳＶ  ＤＮＡ減少を示す定量ＰＣＲアッセイの結果が示されている。一過性の細胞モデルを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ抗ＨＳＶ処置では、本発明者らは、スクランブルｓｇＲＮＡ配列を有するＣＲＩＳＰＲプラスミドを対照として使用した。ＤＮＡ試料インプットは、各対照試料で正規化した。ＯｒｉＳは、最も高いウイルスＤＮＡ除去活性を示し、次にＲＬ２、ＵＬ９、およびＬＡＴｉが続いた。
【０１５３】
（実施例２）
標的ＥＢＶ
バーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ、Ｎａｍａｌｗａ、およびＤＧ−７５を、ＡＴＣＣから取得し、ＡＴＣＣの推奨に従って１０％ＦＢＳおよびＰＳＡで補完されたＲＰＭＩ１６４０で培養した。ヒト原発性肺線維芽細胞ＩＭＲ−９０を、Ｃｏｒｉｅｌｌから取得し、１０％ＦＢＳおよびＰＳＡで補完されたアドバンストＤＭＥＭ／Ｆ−１２で培養した。
【０１５４】
Cong  Lら、（２０１３年）、Multiplex  Genome  Engineering  Using  CRISPR/Cas  Systems.、Science、３３９巻：８１９〜８２３頁に記載されているような、Ｕ６プロモーター駆動性キメラガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）およびユビキタスプロモーター駆動性Ｃａｓ９からなるプラスミドは、ａｄｄｇｅｎｅから得た。Ｃａｓ９タンパク質の後に融合されているＥＧＦＰマーカーで、Ｃａｓ９陽性細胞の選択を可能にした（図６）。本発明者らは、より効率的なＰｏｌ−ＩＩＩ転写およびより安定的なステム−ループ構造のために修飾型キメラガイドＲＮＡ設計を採用した（Chen  Bら、（２０１３年）、Dynamic  Imaging  of  Genomic  Loci  in  Living  Human  Cells  by  an  Optimized  CRISPR/Cas  System.、Cell、１５５巻：１４７９〜１４９１頁）。
【０１５５】
本発明者らは、ｐＸ４５８をＡｄｄｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．から得た。合成イントロン（ｐｍａｘ）を有する修飾ＣＭＶプロモーターを、Ｌｏｎｚａ対照プラスミドｐｍａｘ−ＧＦＰからＰＣＲで増幅した。修飾ガイドＲＮＡ  ｓｇＲＮＡ（Ｆ＋Ｅ）をＩＤＴに注文した。ＥＢＶ複製開始点ｏｒｉＰを、Ｂ９５−８形質転換リンパ芽球様細胞株ＧＭ１２８９１からＰＣＲで増幅した。本発明者らは、標準的なクローニングプロトコールを使用して、ｐｍａｘ、ｓｇＲＮＡ（Ｆ＋Ｅ）、およびｏｒｉＰをｐＸ４５８にクローニングし、元のＣＡＧプロモーター、ｓｇＲＮＡ、およびｆ１開始点を置換した。本発明者らは、Ｂ９５−８基準に基づいてＥＢＶ  ｓｇＲＮＡを設計し、ＩＤＴにＤＮＡオリゴを注文した。ｐＸ４５８の元々のｓｇＲＮＡプレースホールダーは、陰性対照として役目を果たす。
【０１５６】
リンパ球は、リポフェクションに抵抗性であることが公知であり、したがって、本発明者らは、Ｒａｊｉ細胞内へのＤＮＡ送達にヌクレオフェクションを使用した。本発明者らは、Ｌｏｎｚａ  ｐｍａｘプロモーターを選択して、Ｃａｓ９発現を駆動する。それは、このプロモーターがＲａｊｉ細胞内での強力な発現をもたらしていたためである。本発明者らは、ＤＮＡ送達にＬｏｎｚａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩを使用した。５００万個のＲａｊｉ細胞またはＤＧ−７５細胞に、各々１００ｕｌ反応で５ｕｇプラスミドをトランスフェクトした。細胞株キットＶおよびプログラムＭ−０１３を、Ｌｏｎｚａの推奨に従って使用した。ＩＭＲ−９０の場合、１００ｕｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｖ中で５ｕｇプラスミドを用いて、１００万個の細胞にプログラムＴ−０３０またはＸ−００５をトランスフェクトした。本発明者らは、ヌクレオフェクションの２４時間後に、蛍光顕微鏡で少数の細胞からの明白なＥＧＦＰシグナルを観察した。しかしながら、その後ＥＧＦＰ陽性細胞集団は劇的に減少し、本発明者らは、ヌクレオフェクションの４８時間後には１０％未満のトランスフェクション効率を測定した（図６）。本発明者らは、このトランスフェクション効率の減少は、細胞分裂によるプラスミド希釈に起因すると考えた。宿主細胞内のプラスミドレベルを活性に維持するために、本発明者らは、ＥＢＶ複製開始点配列、ｏｒｉＰを含むようにＣＲＩＳＰＲプラスミドの再設計した。細胞内部での活性プラスミド複製により、トランスフェクション効率は、６０％超に上昇した（図６）。
【０１５７】
ＥＢＶゲノムを標的とするガイドＲＮＡを設計するために、本発明者らは、Ｂ９５−８株に由来するＥＢＶ基準ゲノムに依存した。本発明者らは、ゲノム編集の目的が異なる７つのガイドＲＮＡ設計で６つの領域を標的とした。
【０１５８】
プライマー設計等のさらなる情報は、WangおよびQuake、２０１４年、RNA-guided  endonuclease  provides  a  therapeutic  strategy  to  cure  latent  herpesviridae  infection、PNAS、１１１巻（３６号）：１３１５７〜１３１６２頁、およびＰＮＡＳのウェブサイトにオンラインで公開されているこの論文の補足情報に示されている。これら文書の内容は両方とも、参照によりあらゆる目的のために組み込まれる。
【０１５９】
ＥＢＮＡ１は、遺伝子調節および潜伏ゲノム複製を含む、多くのＥＢＶ機能にとって重要である。ゲノムのこの領域全体を切除するために、ＥＢＮＡ１コード領域の両端に対するガイドＲＮＡ  ｓｇＥＢＶ４およびｓｇＥＢＶ５を用いた。ガイドＲＮＡ  ｓｇＥＢＶ１、２、および６は、反復領域内にあるため、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ切断の成功率が倍増する。こうした「構造」標的により、ＥＢＶゲノムを系統的により小さな小片に消化することが可能になる。ＥＢＮＡ３ＣおよびＬＭＰ１は、宿主細胞形質転換に不可欠であり、本発明者らは、これら２つのタンパク質の５’エキソンを標的とするように、それぞれガイドＲＮＡ  ｓｇＥＢＶ３を設計し、そしてｓｇＥＢＶ７は設計された。
【０１６０】
ＥＢＶゲノム編集。ＣＲＩＳＰＲにより生成される二本鎖ＤＮＡ切断は、修復されて小型の欠失がもたらされる。図８〜１３は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が大きな欠失を誘導したことを示す。
【０１６１】
図８には、ガイドＲＮＡ  ｓｇＥＢＶ２およびＰＣＲプライマー位置の周辺のゲノム構成が示されている。
【０１６２】
図９には、ｓｇＥＢＶ２により誘導された大きな欠失が示されている。レーン１〜３は、それぞれ、ｓｇＥＢＶ２処置の前、５日後、および７日後である。
【０１６３】
図１０には、ガイドＲＮＡ  ｓｇＥＢＶ３／４／５およびＰＣＲプライマー位置の周辺のゲノム構成が示されている。
【０１６４】
図１１には、ｓｇＥＢＶ３／５およびｓｇＥＢＶ４／５により誘導された大きな欠失が示されている。レーン１および２は、ｓｇＥＢＶ３／５処置の前および８日後の３Ｆ／５Ｒ  ＰＣＲ増幅産物である。レーン３および４は、ｓｇＥＢＶ４／５処置の前および８日後の４Ｆ／５Ｒ  ＰＣＲ増幅産物である。
【０１６５】
図１２および図１３には、サンガー配列決定法により、ｓｇＥＢＶ３／５処置（図１２）およびｓｇＥＢＶ４／５処置（図１３）の８日後にゲノム切断および修復ライゲーションが確認されたことが示されている。領域６９０および７００（図１２）、ならびに領域６９０および７００（図１３）は、修復ライゲーション前の２つの末端を示す。
【０１６６】
こうした欠失は、タンパク質コードを中断し、したがってノックアウト効果を発揮することになる。ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイにより、個々の部位の効率的な編集を確認した。
【０１６７】
図３２には、ＥＢＶ  ＣＲＩＳＰＲのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイが示されている（レーンは左から右へと付番されている：レーン１：ＮＥＢ  １００ｂｐラダー；レーン２：ｓｇＥＢＶ１対照；レーン３：ｓｇＥＢＶ１；レーン４：ｓｇＥＢＶ５対照；レーン５：ｓｇＥＢＶ５；レーン６：ｓｇＥＢＶ７対照；レーン７：ｓｇＥＢＶ７；レーン８：ｓｇＥＢＶ４）。
【０１６８】
各ガイドＲＮＡにより誘導された独立した小型欠失を越えた標的部位間の大きな欠失は、ＥＢＶゲノムを系統的に破壊することができる。ガイドＲＮＡ  ｓｇＥＢＶ２は、１２個の１２５ｂｐ反復単位を有する領域を標的とする（図８）。反復領域全体のＰＣＲ増幅産物は、約１．８ｋｂのバンドを示した（図９）。ｓｇＥＢＶ２トランスフェクションの５日後または７日後、本発明者らは、同じＰＣＲ増幅に由来する約０．４ｋｂのバンドを得た（図９）。約１．４ｋｂ欠失は、最初の反復単位の切断と最後の反復単位の切断との間の修復ライゲーションの予想産物である（図８）。
【０１６９】
ｓｇＲＮＡ標的に隣接するＤＮＡ配列を、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅した。ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを、製造業者の説明書に従って実施した。大きな欠失を有するＤＮＡ増幅産物を、ＴＯＰＯクローニングし、単一のコロニーを使用してサンガー配列決定を行った。ＥＢＶ負荷を、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ＢｉｏＭａｒｋでのＴａｑｍａｎデジタルＰＣＲで測定した。保存されているヒト遺伝子座を標的とするＴａｑｍａｎアッセイを、ヒトＤＮＡ正規化に使用した。Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃ１に由来する単一細胞全ゲノム増幅産物の１ｎｇを、ＥＢＶ定量ＰＣＲに使用した。
【０１７０】
固有標的間の領域を欠失させることが可能である（図１０）。ｓｇＥＢＶ４〜５トランスフェクションの６日後、隣接領域全体をＰＣＲ増幅したところ（プライマーＥＢＶ４Ｆおよび５Ｒを用いて）、より短い増幅産物が得られ、同時に、予想される２ｋｂのバンドは非常によりかすかであった（図１１）。増幅産物クローンをサンガー配列決定したところ、２つの予期される切断部位が直接接続されていることが確認された（図１３）。ｓｇＥＢＶ３〜５を用いた同様の実験でも、ＥＢＮＡ３ＣからＥＢＮＡ１までのさらに大きな欠失が判明した（図１１）。
【０１７１】
プライマー設計等のさらなる情報は、WangおよびQuake、２０１４年、RNA-guided  endonuclease  provides  a  therapeutic  strategy  to  cure  latent  herpesviridae  infection、PNAS、１１１巻（３６号）：１３１５７〜１３１６２頁、およびＰＮＡＳのウェブサイトにオンラインで公開されているこの論文の補足情報に示されている。これら書類の内容は両方とも、参照によりあらゆる目的のために組み込まれる。
【０１７２】
ＥＢＶゲノム破壊による細胞増殖停止。ＣＲＩＳＰＲトランスフェクションの２日後、ＥＧＦＰ陽性細胞を、さらなる培養のためにフロー選別し、生存細胞を毎日計数した。図１４〜図２６には、ＥＢＶゲノム破壊による細胞増殖停止が示されている。図１４には、異なるＣＲＩＳＰＲ処置後の細胞増殖曲線が示されている。ここでは、５つの独立したｓｇＥＢＶ１〜７処置が示されている。図１５〜図２０には、ｓｇＥＢＶ１〜７処置の前（図１５）、５日後（図１６）および８日後（図１４）のフローサイトメトリー散乱シグナルが示されている。図１８〜図２０には、ｓｇＥＢＶ１〜７処置の前（図１８）、５日後（図１９）、および８日後（図２０）のアネキシンＶ  Ａｌｅｘａ６４７およびＤＡＰＩ染色結果が示されている。領域３００および２００は、（図１５〜図１７）の部分集団Ｐ３およびＰ４に対応する。
【０１７３】
図２１および図２２には、顕微鏡観察により、ｓｇＥＢＶ１〜７処置後にアポトーシス細胞形態が明らかなったことが示されている。
【０１７４】
図２３には、ｓｇＥＢＶ１〜７で処置する前の核形態が示されている。
【０１７５】
図２４〜図２６には、ｓｇＥＢＶ１〜７で処置した後の核形態が示されている。
【０１７６】
予想通り、ｏｒｉＰまたはｓｇＥＢＶを欠如したＣａｓ９プラスミドで処置した細胞は、数日内にＥＧＦＰ発現を喪失し、非処置対照群と同様の速度で増殖した（図１４）。Ｃａｓ９−ｏｒｉＰおよびスクランブルガイドＲＮＡを有するプラスミドは、８日後にＥＧＦＰ発現を維持したが、細胞増殖速度が低減されなかった。混合カクテルｓｇＥＢＶ１〜７による処置は、測定可能な細胞増殖をもたらさず、全細胞数は一定のままであったか減少したかのいずれかであった（図１４）。
【０１７７】
図１５には、フローサイトメトリー散乱シグナルが、ｓｇＥＢＶ１〜７処置後に細胞形態が変化したことを明白に明らかにし、大多数の細胞が、サイズが収縮し、粒状化が増加した（Ｐ４からＰ３へのシフト）ことが示されている。
【０１７８】
図１９には、集団Ｐ３の細胞が膜透過性障害も示したことを示すＤＡＰＩ染色結果が示されている。特に複数のガイドＲＮＡによるＣＲＩＳＰＲ細胞毒性の可能性を排除するために、２つの他の試料：ＥＢＶ陰性バーキットリンパ腫細胞株ＤＧ−７５および初代ヒト肺線維芽細胞ＩＭＲ９０に対して同じ処置を実施した。
【０１７９】
図３３には、ＣＲＩＳＰＲ処置が、ＥＢＶ陰性バーキットリンパ腫細胞株ＤＧ−７５に細胞毒性でなかったことが示されている。
【０１８０】
図３４には、ＣＲＩＳＰＲ処置が、初代ヒト肺線維芽細胞ＩＭＲ９０に細胞毒性でなかったことが示されている。
【０１８１】
トランスフェクションの８日後および９日後では、細胞増殖速度は、非処置対照群と変わらず、細胞毒性が無視できる程度であったことを示唆している。
【０１８２】
以前の研究によると、ＥＢＶ腫瘍形成能力は、宿主細胞アポトーシスを妨害するためであると考えられている（Ruf  IKら、（１９９９年）、Epstein-Barr  Virus  Regulates  c-MYC,  Apoptosis,  and  Tumorigenicity  in  Burkitt  Lymphoma.、Molecular  and  Cellular  Biology、１９巻：１６５１〜１６６０頁）。したがって、ＥＢＶ活性の抑制は、アポトーシスプロセスを回復させることができる。そう考えれば、本発明者らの実験で細胞死が観察されたことを説明することができる。アネキシンＶ染色は、インタクトな細胞膜を有するが、ホスファチジルセリンが露出している細胞の特徴的な部分集団を明らかにした。これは、アポトーシスによる細胞死を示唆している（図１８）。明視野顕微鏡では、明白なアポトーシス細胞形態が示され（図２１）、蛍光染色は、劇的なＤＮＡ断片化を示した（図２３）。まとめると、こうした証拠は、ＥＢＶゲノム破壊後に正常な宿主細胞アポトーシス経路が回復したことを示唆している。
【０１８３】
図２７〜図３１には、ＣＲＩＳＰＲ処置後のＥＢＶ負荷量が示されている。
【０１８４】
図２７には、デジタルＰＣＲによる、様々なＣＲＩＳＰＲ処置後のＥＢＶ負荷が示されている。Ｃａｓ９およびＣａｓ９−ｏｒｉＰは、２つの複製物を有し、ｓｇＥＢＶ１〜７は５つの複製物を有していた。
【０１８５】
（部分集団中のＥＢＶの完全クリアランス）
細胞増殖停止とＥＢＶゲノム編集との間の関連の可能性を研究するために、ＥＢＮＡ１を標的としたデジタルＰＣＲを用いて、ＥＢＶ負荷を異なる試料で定量した。保存されているヒト体細胞遺伝子座を標的とする別のＴａｑｍａｎアッセイは、ヒトＤＮＡ正規化の内部対照としての役目を果たした。各非処置Ｒａｊｉ細胞は、平均で、４２コピーのＥＢＶゲノムを有する（図２７）。ｏｒｉＰまたはｓｇＥＢＶを欠如したＣａｓ９プラスミドで処置した細胞は、非処置対照と明白に異なるＥＢＶ負荷差を示さなかった。ｏｒｉＰを有するがｓｇＥＢＶを有していないＣａｓ９プラスミドで処置した細胞は、約５０％低減されたＥＢＶ負荷を示した。この実験の細胞では増殖速度差が一切示されなかったという上記の観察と合わせて考えると、本発明者らは、これは、プラスミド複製中のＥＢＮＡ１結合の競合によるものである可能性が高いと解釈する。ガイドＲＮＡカクテルｓｇＥＢＶ１〜７をトランスフェクションに付加することにより、ＥＢＶ負荷が劇的に低減された。生存細胞および死細胞は両方とも、非処置対照と比較して６０％超のＥＢＶ減少を示している。
【０１８６】
７つのガイドＲＮＡは同じモル比で提供したが、プラスミドトランスフェクションおよび複製プロセスは、非常に確率論的である可能性が高い。幾つかの細胞は、必然的にガイドＲＮＡカクテルの異なるサブセットまたは混合物を受け取ることになり、これは処置効率に影響及ぼす場合がある。そのような効果を制御するため、ＥＢＶ負荷を、自動マイクロ流体システムによる単一細胞全ゲノム増幅を使用することにより単一細胞レベルで測定した。
【０１８７】
新たに培養したＲａｊｉ細胞を、マイクロ流体チップに搭載し、８１個の単一細胞を捕捉した。
【０１８８】
ｓｇＥＢＶ１〜７処置細胞の場合、トランスフェクションの８日後に生存細胞をフロー選別して、９１個の単一細胞を捕捉した。
【０１８９】
図２８には、マイクロ流体チップに捕捉されている単一のＲａｊｉ細胞が示されている。
【０１９０】
図２９には、チップに捕捉されている単一のｓｇＥＢＶ１〜７処置細胞が示されている。
【０１９１】
製造業者の説明書に従って、約１５０ｎｇの増幅ＤＮＡを、各単一細胞反応チャンバから得た。品質管理目的のため、本発明者らは、各単一細胞増幅産物に対して４遺伝子座のヒト体細胞ＤＮＡ定量ＰＣＲを実施し（Wang  J,  Fan  HC,  Behr  B,  Quake  SR、（２０１２年）Genome-wide  single-cell  analysis  of  recombination  activity  and  de  novo  mutation  rates  in  human  sperm.、Cell、１５０巻：４０２〜４１２頁）、少なくとも１つの遺伝子座から陽性増幅産物を得ることを条件とした。
【０１９２】
図３０は、処置前の単一細胞のＥＢＶ定量ＰＣＲ  Ｃｔ値のヒストグラムである。点線は、細胞当たり１つのＥＢＶゲノムのＣｔ値を表す。ＥＢＶ負荷の対数正規分布は、品質管理に合格した６９個の非処置単一細胞産物により示されており、ほとんど全ての細胞が著しい量のＥＢＶゲノムＤＮＡを示した。
【０１９３】
本発明者らは、単一の統合ＥＢＶゲノムを含むＮａｍａｌｗａバーキットリンパ腫細胞のサブクローンを用いて、定量ＰＣＲアッセイを較正した。単一コピーＥＢＶ測定によると、Ｃｔは２９．８であった。これにより、本発明者らは、６９個のＲａｊｉ単一細胞試料の平均Ｃｔが、バルクデジタルＰＣＲ測定による細胞当たり４２コピーのＥＢＶに対応していたと決定することが可能になった。ｓｇＥＢＶ１〜７処置試料の場合、７１個の単一細胞産物が品質管理に合格し、ＥＢＶ負荷分布は劇的により広範であった。
【０１９４】
図３１は、ｓｇＥＢＶ１〜７で処置した７日後の単一生存細胞のＥＢＶ定量ＰＣＲ  Ｃｔ値のヒストグラムである。点線は、細胞当たり１つのＥＢＶゲノムのＣｔ値を表す。
【０１９５】
２２個の細胞は、非処置細胞と同じＥＢＶ負荷を有していたが、１９個の細胞は、検出可能なＥＢＶを有しておらず、残りの３０個の細胞は、非処置試料と比べて劇的なＥＢＶ負荷減少を示した。
【０１９６】
図３２には、ＥＢＶ  ＣＲＩＳＰＲのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイが示されている。レーン１（レーンは左から右へと付番されている）：ＮＥＢ  １００ｂｐラダー；レーン２：ｓｇＥＢＶ１対照；レーン３：ｓｇＥＢＶ１；レーン４：ｓｇＥＢＶ５対照；レーン５：ｓｇＥＢＶ５；レーン６：ｓｇＥＢＶ７対照；レーン７：ｓｇＥＢＶ７；レーン８：ｓｇＥＢＶ４。図３３には、ＥＢＶ陰性バーキットリンパ腫ＤＧ−７５を用いたＣＲＩＳＰＲ細胞毒性試験が示されている。図３４には、初代ヒト肺線維芽細胞ＩＭＲ−９０を用いたＣＲＩＳＰＲ細胞毒性試験が示されている。
【０１９７】
ＥＢＶ処置に必須の標的。本発明者らのＣＲＩＳＰＲカクテルの７つのガイドＲＮＡは、それぞれＥＢＶゲノム構造、宿主細胞形質転換、および潜伏感染性にとって重要な３つの異なるカテゴリーの配列を標的とする。効果的なＥＢＶ処置に最も必須な標的を理解するために、本発明者らは、ガイドＲＮＡのサブセットをＲａｊｉ細胞にトランスフェクトした。ｓｇＥＢＶ４／５は、ＥＢＶゲノムを８５％低減したが、完全カクテルほど効果的には細胞増殖を抑制することができなかった（図１４）。構造配列を標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＥＢＶ１／２／６）は、ＥＢＶ負荷を完全には除去しなかったが（２６％の減少）、細胞増殖を完全に停止させることができた。本発明者らは、ゲノム編集の効率が高いことおよび増殖が停止したことを考慮して（図２）、ｓｇＥＢＶ１／２／６の残存ＥＢＶゲノム痕跡は、インタクトなゲノムによるものではなく、ＥＢＶゲノムから消化された遊離浮遊ＤＮＡ、つまり偽陽性であると推測する。本発明者らは、ＥＢＶ処置には、特定の重要なタンパク質を標的とするよりも、ＥＢＶゲノム構造を系統的に破壊する方がより効果的であると結論付ける。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【国際調査報告】
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