(57)【要約】  本発明は、RELA遺伝子内に遺伝子移入された異種核酸配列を含む遺伝子編集イノシシ科動物に関する。特に、本発明は、家畜ブタのRALA遺伝子内に遺伝子移入されたイボイノシシアレルを含む遺伝子編集イノシシ科動物に関する。本発明は、そのようなイノシシ科動物を生成する方法、及びそのような遺伝子移入された配列を有するイノシシ科動物に由来する細胞にも関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
RELA遺伝子内に遺伝子移入された異種核酸配列を含む、遺伝子編集イノシシ科動物。
【請求項２】
イノシシ科動物が、家畜ブタである、請求項1に記載の遺伝子編集イノシシ科動物。
【請求項３】
遺伝子移入された異種核酸配列が、異種RELAアレルを含む、請求項1又は2に記載の遺伝子編集イノシシ科動物。
【請求項４】
遺伝子移入された異種配列が、種を超えた異種RELAアレルを含む、請求項3に記載の遺伝子編集イノシシ科動物。
【請求項５】
遺伝子移入された異種核酸配列が、野生型RELAアレルを、対応するイボイノシシRELAアレルに変換する、請求項1から4のいずれか一項に記載の遺伝子編集イノシシ科動物。
【請求項６】
2以上の塩基の変化により野生型RELAアレル配列とは異なる遺伝子移入されたRELAアレルを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の遺伝子編集イノシシ科動物。
【請求項７】
50以上の塩基長である遺伝子移入された異種核酸を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の遺伝子編集イノシシ科動物。
【請求項８】
遺伝子編集イノシシ科動物の全ての細胞が、遺伝子移入された異種核酸配列を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の遺伝子編集イノシシ科動物。
【請求項９】
遺伝子移入された異種核酸配列が、RELAタンパク質の配列を変える、請求項1から8のいずれか一項に記載の遺伝子編集イノシシ科動物。
【請求項１０】
遺伝子移入された異種核酸配列が、RELAのトランス活性化ドメインをコードするRELA遺伝子の領域の配列を変える、請求項1から9のいずれか一項に記載の遺伝子編集イノシシ科動物。
【請求項１１】
遺伝子移入された異種核酸配列が、RELAのアミノ酸448から531をコードするRELA遺伝子の領域を変える、請求項10に記載の遺伝子編集イノシシ科動物。
【請求項１２】
RELA遺伝子の遺伝子移入された種を超えたアレルを含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の遺伝子編集イノシシ科動物。
【請求項１３】
遺伝子移入されたイボイノシシRELA遺伝子を含む家畜ブタである、請求項1から12のいずれか一項に記載の遺伝子編集イノシシ科動物。
【請求項１４】
イノシシ科動物が、遺伝子移入されたRELAアレルについて両アレル性である、請求項1から13のいずれか一項に記載の遺伝子編集イノシシ科動物。
【請求項１５】
家畜ブタであり、遺伝子移入された異種核酸配列が、以下のRELAのアミノ酸:
-  T448、
-  S485及び
-  S531
のうち1つ又は複数の変化を引き起こす、請求項1から14のいずれか一項に記載の遺伝子編集イノシシ科動物。
【請求項１６】
3つ全てのアミノ酸が変化している、請求項15に記載の遺伝子編集イノシシ科動物。
【請求項１７】
RELAに対する以下のアミノ酸変化:T448A、S485P及びS531Pの少なくとも1つを含む、請求項15又は16に記載の遺伝子編集イノシシ科動物。
【請求項１８】
RELAに対する以下のアミノ酸変化:T448A、S485P及びS531Pをもたらす遺伝子移入された異種核酸配列を含む家畜ブタである、請求項1から17のいずれか一項に記載の遺伝子編集イノシシ科動物。
【請求項１９】
RELAのT448A、S485P及びS531P以外のアミノ酸変化が、遺伝子移入された異種核酸により引き起こされない、請求項18に記載の遺伝子編集イノシシ科動物。
【請求項２０】
以下に示す配列:
【化１】
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をコードするようにRELA遺伝子が編集された家畜ブタである、請求項1から19のいずれか一項に記載の遺伝子編集イノシシ科動物。
【請求項２１】
遺伝子移入された異種核酸に起因してASFV感染に対する耐性が改善された家畜ブタである、請求項1から20のいずれか一項に記載の遺伝子編集イノシシ科動物。
【請求項２２】
RELA遺伝子内に遺伝子移入された異種核酸配列を含むイノシシ科動物の細胞核、生殖細胞、幹細胞、配偶子、胚盤胞、胚、胎児及び/又はドナー細胞。
【請求項２３】
遺伝子移入されたイボイノシシRELAアレルを含む請求項11に記載のイノシシ科動物の細胞核、生殖細胞、幹細胞、配偶子、胚盤胞、胚、胎児及び/又はドナー細胞。
【請求項２４】
RELA遺伝子内に遺伝子移入された異種核酸配列を有する遺伝子編集イノシシ科動物を生成する方法であって、
-  イノシシ科動物接合体を準備する工程と、
-  前記接合体に、部位特異的ヌクレアーゼを導入する工程であって、前記ヌクレアーゼが、編集されるRELA遺伝子内の所望のゲノム配列を標的にし、二本鎖切断を導入するように適合されている、工程と、
-  RELA遺伝子に、遺伝子移入される異種核酸配列を含む鋳型核酸を導入する工程であって、異種配列の横にゲノムRELA配列と相同な配列が位置している、工程と、
-  部位特異的ヌクレアーゼによるゲノムの切断と、相同組換え修復によるRELA遺伝子への異種核酸配列の遺伝子移入とを可能にする適切な条件下で、前記接合体をインキュベートする工程と、
-  前記接合体から動物を産出する工程と
を含む方法。
【請求項２５】
イノシシ科動物が、家畜ブタである、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
部位特異的ヌクレアーゼが、RELAのトランス活性化ドメインをコードするRELA遺伝子の領域内を標的にして切断するように適合されている、請求項24又は25に記載の方法。
【請求項２７】
部位特異的ヌクレアーゼが、RELA遺伝子のエキソン9内を標的にして切断するように適合されている、請求項24から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
部位特異的ヌクレアーゼが、アミノ酸T448をコードするRELA遺伝子の領域の上流を標的にして切断するように適合されている、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
部位特異的ヌクレアーゼが、配列番号15を参照して塩基1200と1341の間にあるRELA遺伝子の配列を標的にして切断するように適合されている、請求項24から28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
部位特異的ヌクレアーゼが、協同的な部位特異的ヌクレアーゼの対を含み、対の一方の標的部位が、GATACTGATGAGGAC(配列番号18)であり、対の他方の標的部位が、CTCCGGGACGACGTC(配列番号19)である、請求項24から29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ヌクレアーゼをコードするmRNAが、接合体に導入される、請求項24から30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
異種核酸配列の遺伝子移入が、単細胞段階の接合体において完了する、請求項24から31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
鋳型核酸が、各側で相同配列が横に位置する異種核酸配列を含む領域を含む、請求項24から32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
鋳型構築物が、50以上の塩基長の異種核酸を含む、請求項24から33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
鋳型核酸が、SSNの標的部位にて、対応するゲノム核酸配列と比較して2以上の塩基の変化を含む、請求項24から34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
鋳型核酸が、各側で相同配列が横に位置するイボイノシシRELAハプロタイプを含む領域を含む、請求項26から35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
RELAに対する以下のアミノ酸変化:T448A、S485P及びS531Pをもたらす異種核酸配列を遺伝子移入する工程を含む、請求項26から36のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
鋳型核酸が、相同領域が横に位置する、タンパク質配列:
【化２】
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をコードする核酸配列を含む、251以上のヌクレオチド長のイボイノシシRELAを含む領域を含む、請求項26から37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
鋳型核酸が、二本鎖である、請求項26から38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
鋳型核酸が、プラスミドにおいて提供される、請求項26から39のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
鋳型が、626bp及び799bpの相同なアームが横に位置する、イボイノシシRELAハプロタイプを含む251bpの領域を含むプラスミドである、請求項26から40のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
-  家畜ブタ接合体を準備する工程と、
-  前記接合体に、協同的な部位特異的ヌクレアーゼの対を導入する工程であって、前記ヌクレアーゼが、T448Aをコードする配列の20bp以内の領域でRELA遺伝子を標的にし、二本鎖切断を導入するように適合されている、工程と、
-  ブタのゲノムRELA配列と相同な配列が横に位置する、対応するイボイノシシRELAハプロタイプをコードする配列を含む異種核酸を含む鋳型核酸を導入する工程と、
-  部位特異的ヌクレアーゼによるゲノムの切断と、相同組換え修復による異種核酸の遺伝子移入とを可能にする適切な条件下で、前記接合体をインキュベートする工程と、
-  前記接合体からブタを産出する工程
を含む、請求項24に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、RELA遺伝子内に遺伝子移入された異種核酸配列を含む遺伝子編集イノシシ科動物(swine)に関する。
【背景技術】
【０００２】
古典的な動物育種は、ゲノム全体にわたる配列変動を利用する。2匹の動物の交配の結果として得られた出生児は、両方の親の混合プラスde novo変異である遺伝子型を有する。農業では、有利な遺伝子型とそれによりコードされる形質とを獲得して、遺伝子改良をもたらす。このプロセスは、時間がかかり、複数回の交雑を必要とし、育種集団における所望の遺伝子変動の存在に依拠する。育種プロセスの間に消去される変動は、活用できない。
【０００３】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)アプローチ2が先駆けとなった標的ゲノム編集1の発展により、現在では、使用する所定の集団内に存在しない変動が可能になっている。このアプローチは、特定の標的配列に対する二本鎖切断(DSB)を指示する工学改変ヌクレアーゼに依拠する。研究者から提供されたDNA鋳型と組み合わせて用いる場合、DSBの修復の間に相同性に基づくプロセスにより染色体に特定の変化を導入できる。このようにして、元の標的配列を新しい配列に交換でき3、一世代で標的動物集団に単一アレル遺伝子移入を行うことができる4。
【０００４】
しかし、標的ゲノム編集の有望性にもかかわらず、標的動物にアレル遺伝子移入を行うためには著しい課題がまだ存在する。特に、家畜ブタ(イノシシ(Sus scrofa))へのアレル遺伝子移入は、いまだに成功していない。
【０００５】
野生種の家畜化の間に鍵となる表現型の違いを与える単一の点突然変異が見出されているが5、多くの場合、同じ遺伝子座における複数の点突然変異が原因であると考えられる。代表的で農業的に重要な例は、RELA内の変動である6。家畜ブタは、アフリカで見出される現在のブタ種とは対照的に、アフリカブタ熱ウイルスによる感染に対して感受性が高い。本発明者らは、イボイノシシ(Phacochoerus africanus)と家畜ブタのRELAの間に、3つのアミノ酸の違いを以前に同定した6。
【０００６】
WO2014/041327は、ZFN及びTALENによるDNA切断後にNHEJを介してインデルを創出することによるブタのゲノム編集について記載しているが、アレル遺伝子移入について記載していない。
【０００７】
本発明者らは、ブタのRELA遺伝子においてアレル遺伝子移入を行うことに成功した。本発明は、よって、この画期的な成功を完成するための著しい不確かさを克服する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO2014/041327
【特許文献２】US6,479,626
【特許文献３】US6,534,261
【特許文献４】US6,607,882
【特許文献５】US6,746,838
【特許文献６】US6,794,136
【特許文献７】US6,824,978
【特許文献８】US6,866,997
【特許文献９】US6,933,113
【特許文献１０】US6,979,539
【特許文献１１】US7,013,219
【特許文献１２】US7,030,215
【特許文献１３】US7,220,719
【特許文献１４】US7,241,573
【特許文献１５】US7,241,574
【特許文献１６】US7,585,849
【特許文献１７】US7,595,376
【特許文献１８】US6,903,185
【特許文献１９】US6,479,626
【特許文献２０】US8,106,255
【特許文献２１】US20030232410
【特許文献２２】US20090203140
【特許文献２３】US8420782
【特許文献２４】US8470973
【特許文献２５】US8440431
【特許文献２６】US8440432
【特許文献２７】US8450471
【特許文献２８】US8586363
【特許文献２９】US8697853
【特許文献３０】EP2510096
【特許文献３１】US8586526
【特許文献３２】US8623618
【特許文献３３】EP2464750
【特許文献３４】US2011041195
【特許文献３５】US2011247089
【特許文献３６】US2013198878
【特許文献３７】WO2012/116274
【特許文献３８】WO2014110552
【特許文献３９】WO2014070887
【特許文献４０】WO2014022120
【特許文献４１】WO2013192316
【特許文献４２】WO2010008562
【特許文献４３】US8,697,359
【特許文献４４】US2010076057
【特許文献４５】WO2013/176772
【特許文献４６】US8,771,945
【特許文献４７】US2010076057
【特許文献４８】US2014186843
【特許文献４９】US2014179770
【特許文献５０】US2014179006
【特許文献５１】WO2014093712
【特許文献５２】WO2014093701
【特許文献５３】WO2014093635
【特許文献５４】WO2014093694
【特許文献５５】WO2014093655
【特許文献５６】WO2014093709
【特許文献５７】WO2013/188638
【特許文献５８】WO2013/142578
【特許文献５９】WO2013/141680
【特許文献６０】WO2013/188522
【特許文献６１】US8546553
【特許文献６２】WO2014/089290
【特許文献６３】WO2014/093479
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Congら「Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems」、Science、2013年2月15日:339巻、6121号、819〜823頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、初めて、イノシシ科動物ゲノムへの異種核酸の遺伝子移入について記載する。特に、本発明者らは、家畜ブタRELA遺伝子に、イボイノシシRELAアレルの完全ハプロタイプを遺伝子移入した。ブタゲノムへのこのようなハプロタイプの遺伝子移入は、注目すべき成功であり、得られるブタは、著しい商業的重要性を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第一の態様によると、RELA遺伝子内に遺伝子移入された異種核酸配列を含む遺伝子編集イノシシ科動物が提供される。
【００１２】
イノシシ科動物は、ブタであることが特に好ましく、より好ましくは家畜ブタである。
【００１３】
RELAタンパク質、NFkappaBヘテロ二量体転写因子の主な構成要素である。よって、RELAのレベル又は活性を変更する遺伝子編集は、NFkappaB依存性細胞活動、特にNFkappaBにより誘導される遺伝子からの転写に直接影響する。NFkappaBは、感染を含む様々なストレスに対する動物の応答の鍵となるエフェクターである。RELA発現又は活性が変更された遺伝子編集動物は、よって、生物学的ストレス又は傷害、例えば感染、慢性及び/又は自己免疫疾患に対して、その編集されていない対応動物とは異なる反応をする。
【００１４】
遺伝子移入された異種核酸配列は、異種RELAアレルを含むことが特に好ましい。適切には、遺伝子移入された異種アレルは、種を超えた(trans-species)異種RELAアレルを含む。場合により、遺伝子移入された異種アレルは、属を超えた(trans-genus)異種RELAアレルを含む。
【００１５】
したがって、本発明の特に好ましい実施形態では、遺伝子移入された異種アレルは、野生型RELAアレルを、異種RELAアレル、より好ましくは種を超えた異種RELAアレル又は属を超えた異種RELAアレル、適切にはイボイノシシRELAアレルに変換する。
【００１６】
動物(例えば家畜ブタ)に存在するRELA遺伝子のアレル(これは、制御及び非コード配列を含み得る)が、異なるアレルが存在する(多くの場合、このことは、ほんの少数の塩基の変化を伴い得る)ように遺伝子移入により「書き換えられる」ことができることが、本発明の特に好ましい特徴である。このことは、完全に「クリーンな」様式で、すなわちフットプリントやその他の編集事象の痕跡が残らないように行うことができ、ゲノムに対する唯一の変化は、所望のアレル変換について必要なものである。このようにして、例えば、ある種において自然に見出されるRELAアレルを、そのアレルが存在しない集団(例えば種)に導入できる。このアプローチは、遺伝子(及びしばしば選択可能マーカー)が挿入、移動又は破壊されるが、ゲノム破壊の意味におけるある形態のフットプリントがもたらされる従来の遺伝子組換えとは大きく異なる。
【００１７】
本発明の異種アレルは、欠失、逆位又は非相同末端結合(NHEJ)の典型的な結果である、その他の無作為若しくは制御に乏しい編集により形成されない。遺伝子移入された異種アレルは、典型的に、部位特異的ヌクレアーゼ(SSN)誘発二本鎖切断(DSB)の相同組換え修復(HDR)によるアレル変換により、異種アレルの配列を含む鋳型核酸(典型的にDNA)配列に基づく前記アレルの遺伝子座又はその近くのゲノムDNAに遺伝子移入される。
【００１８】
好ましくは、遺伝子編集イノシシ科動物は、2以上の塩基の変化により野生型RELAアレル配列とは異なる遺伝子移入されたRELAアレルを含む。イノシシ科動物は、よって、好ましくは、遺伝子移入されたRELAハプロタイプを含む。ハプロタイプは、好ましくは、単一の編集事象により遺伝子移入される。ハプロタイプは、野生型RELA配列と比較して、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30以上の塩基の変化を含み得る。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態では、遺伝子編集イノシシ科動物は、50以上の塩基長、適切には100以上、150以上、200以上、250以上、500以上又は1000以上又は1500以上の塩基長であるRELA遺伝子内に遺伝子移入された核酸を含む。本発明が遺伝子移入されたハプロタイプに関する場合、変更される2以上の塩基にわたる距離は、50以上の塩基、場合によって100以上、150以上、200以上、250以上、500以上又は1000以上の塩基であり得る。
【００２０】
好ましくは、遺伝子編集イノシシ科動物の全ての細胞は、遺伝子移入された異種核酸配列を含む。このことは、例えば、単細胞接合体を改変し、接合体からイノシシ科動物を飼養することにより達成できる。
【００２１】
遺伝子移入されたRELAアレルは、好ましくは、RELA遺伝子がコードするRELAタンパク質の配列を変える。遺伝子移入されたRELAアレルが、RELA遺伝子のコード領域(エキソン)、すなわち配列番号15に示すcDNA配列に対応する領域の変更をもたらすことが遺伝子的に好ましい。遺伝子移入されたRELAアレルは、よって、好ましくは、配列番号16に示す野生型家畜ブタRELAアミノ酸配列に対して1又は複数のアミノ酸の変化をもたらす。
【００２２】
遺伝子移入されたRELAアレルが、RELAのトランス活性化ドメインをコードするRELA遺伝子の領域の配列を変えることが特に好ましい。ブタでは、このようなドメインは、野生型RELAタンパク質配列のアミノ酸431から553まで(別段の指定がない限り、核酸及びアミノ酸の番号付けは、野生型イノシシのRELA cDNA又はタンパク質配列を参照する)に広がる。トランス活性化ドメイン2は、アミノ酸431から521までに広がり、トランス活性化ドメイン1は、アミノ酸第522番からアミノ酸553のタンパク質のC末端までに広がる。より好ましくは、遺伝子移入されたRELAアレルは、RELAのアミノ酸448から531までをコードするRELA遺伝子の領域を変える。
【００２３】
適切には、遺伝子編集イノシシ科動物は、RELA遺伝子の遺伝子移入された種を超えたアレルを含むブタである。言い換えると、ブタは、家畜ブタRELA配列を、種を超えたアレルの配列に変換する、遺伝子移入された異種核酸配列を含む。より好ましくは、ブタは、サス(Sus)属以外のイノシシ科動物種からのRELA遺伝子の遺伝子移入された種を超えたアレルを含む。最も好ましくは、ブタは、イボイノシシRELA遺伝子の遺伝子移入された種を超えたアレル、特に、RELAのトランス活性化ドメインをコードする配列のアレルを含む。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態では、遺伝子移入された異種核酸配列は、遺伝子編集イノシシ科動物の品種、亜種そして好ましくは種内に存在しない配列である(例えば、これは、関連する種にとって自然でない)。例えば、遺伝子移入された異種核酸配列は、家畜ブタに存在しない異種RELAアレルを適切に含む。
【００２５】
イノシシ科動物は、遺伝子移入されたRELAアレルについてヘテロ接合性(単一アレル性)又はホモ接合性(両アレル性)であり得る。好ましくは、イノシシ科動物は、遺伝子移入されたRELAアレルについてホモ接合性(両アレル性)である。
【００２６】
好ましい実施形態では、改変は、以下のRELAのアミノ酸:
-  T448、
-  S485及び
-  S531
の1又は複数に位置するアミノ酸の変化を引き起こす。
【００２７】
適切には、これらの部位の2以上のアミノ酸が変更される。しかし、3つ全ての部位のアミノ酸が変更されることが特に好ましい。
【００２８】
改変は、RELAのアミノ酸内の以下の変化を適切にもたらすことができる:T448A、S485P及び/又はS531P。これらの変更は、家畜ブタとイボイノシシとの間で観察されている多型に相当する。これらの多型は、イボイノシシにおけるASFV感染に対する耐性と相関する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、改変は、RELAのアミノ酸内の以下の変化:T448A;S485P;S531P;T448A及びS485P;S485P及びS531P;T448A及びS531P;T448A、S485P及びS531Pのうちの1つを適切にもたらすことができる。
【００３０】
特に好ましい実施形態では、イノシシ科動物は、家畜ブタRELAタンパク質に対して以下のアミノ酸の変化:T448A、S485P及びS531Pをもたらす遺伝子移入された異種核酸配列を含むブタである。これらの3つの変化は、家畜ブタにおける野生型RELAタンパク質配列と、イボイノシシにおける野生型RELAタンパク質配列との間のアミノ酸の違いである。T448A、S485P及びS531P以外のアミノ酸変化が、遺伝子移入された異種核酸により引き起こされないことが好ましい。
【００３１】
遺伝子編集事象が、家畜ブタに対してこれらの3つのアミノ酸変化が作成される(更にそれ以外の変化がない)ことを意味する場合、完璧な属を超えたアレル変換が生じた、すなわち、意図されない変化をまったく起こさずに、家畜ブタRELAアレルが対応するイボイノシシアレルに完璧に変換したということができる。イボイノシシは、核酸レベルでいくつかの他の多型を含むが、これらは、発現されるアミノ酸配列に影響せず、よって、この場合では無視できる。
【００３２】
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、以下に示す配列(448位、485位及び531位のアミノ酸を太字で示す):
【化１】
2018529384.tif 000003
(すなわち、T449A、S485P及びS531Pの変化を含む-配列番号17)
を含むようにRELA遺伝子が編集された遺伝子編集ブタを提供する。
【００３３】
したがって、本発明は、S531、T449及びS485をコードする配列を含む自家RELA配列の少なくとも一部が、対応するイボイノシシ(Phacochoerus種)RELAタンパク質配列をコードする配列の遺伝子移入により(適切には、適切な標的SSNにより誘発されるDSBのHDRにより)置き換えられるように遺伝子編集された家畜ブタを提供する。遺伝子移入された核酸配列は、イボイノシシ配列と同一であり得るか、又は1若しくは複数の同義の塩基の変化を含む同等の人工配列であり得る。
【００３４】
本発明の特に好ましい実施形態では、遺伝子編集イノシシ科動物は、遺伝子移入された異種核酸に起因してASFV感染に対する耐性が改善されたブタ(好ましくは家畜ブタ)である。
【００３５】
死亡率、罹患率、著しい罹患を示す動物の割合(例えば体重減少又は成長率の低下)、罹患のレベル若しくは罹患の期間が低減する場合に、動物は、感染に対してより耐性であるということができる。家畜化されたブタにおけるASFVの場合、罹患率は、ナイーブ群において100%に近づく。死亡率は、単離株の病原性に依存し、0%から100%までの範囲であり得る。病原性が高い単離株は、全ての年齢のブタにおいてほぼ100%の死亡を引き起こすことができる。病原性がより低い単離株は、同時発生疾患を有するブタ、妊娠中の動物及び若年の動物においてより致命的である可能性が高い。亜急性疾患では、死亡率は、若年のブタにおいて70〜80%ほど高いことがあるが、より老齢の動物では20%未満である。同じ病原性レベルのASFV(理想的には同じ単離株)に曝露した場合の遺伝子編集ブタの集団と同等の非編集ブタの集団との間の死亡及び罹患におけるいずれの統計学的に有意な低減(例えば適当な検定を用いる95%の信頼又は99%の信頼)も、耐性の改善を示す。
【００３６】
本発明の第2の態様によると、RELA遺伝子内に遺伝子移入された異種核酸配列を含むイノシシ科動物の細胞核、生殖細胞、幹細胞、配偶子、胚盤胞、胚、胎児及び/又はドナー細胞が提供される。
【００３７】
本発明の第2の態様の好ましい特徴は、本発明の第1の態様のものに相当する。
【００３８】
好ましい実施形態では、細胞核、生殖細胞、幹細胞、配偶子、胚盤胞、胚、胎児及び/又はドナー細胞は、家畜ブタからであり、遺伝子移入された種を超えたRELAアレル、例えばイボイノシシRELAアレルを含む。
【００３９】
適切には、細胞核、生殖細胞、幹細胞、配偶子、胚盤胞、胚、胎児及び/又はドナー細胞は、上記のようなイノシシ科動物に由来する。或いは、本明細書に記載する方法を用いてde novoに創出できる。
【００４０】
第3の態様によると、本発明は、RELA遺伝子内に遺伝子移入された異種核酸配列を有する遺伝子編集イノシシ科動物を生成する方法であって、
-  イノシシ科動物接合体を準備する工程と、
-  前記接合体に、部位特異的ヌクレアーゼを導入する工程であって、ヌクレアーゼが、編集されるRELA遺伝子内の所望のゲノム配列を標的にし、二本鎖切断を導入するように適合されている、工程と、
-  RELA遺伝子に、異種核酸配列を遺伝子移入するように適合されている異種核酸を含む鋳型核酸を導入する工程であって、異種配列の横にゲノムRELA配列と相同な配列が位置している、工程と、
-  部位特異的ヌクレアーゼによるゲノムの切断と、相同組換え修復によるRELA遺伝子への異種核酸配列の遺伝子移入とを可能にする適切な条件下で、前記接合体をインキュベートする工程と、
-  前記接合体から動物を産出する工程と
を含む方法を提供する。
【００４１】
好ましくは、イノシシ科動物は、ブタであり、より好ましくは家畜ブタである。
【００４２】
好ましくは、部位特異的ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、RNA先導型CRISPR/Casヌクレアーゼ(CRISPR)又はメガヌクレアーゼを含む。より好ましくは、部位特異的ヌクレアーゼは、対の両方の要素が存在しており、DNA分子の両方の鎖を切断できるヘテロ二量体を形成する場合にのみDNA切断が生じるように適合されている、協同的なZFN、TALEN又はRNA先導型CRISPR「ニッカーゼ」(例えば一方のDNA鎖だけを切断できる改変Cas9ヌクレアーゼを有する)の対を含む。協同的なZFN、TALEN又はRNA先導型CRISPRの対の使用は、標的を外れた切断事象の可能性の低減をもたらす。いくつかの好ましい実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、ZFNの対を含む。
【００４３】
好ましくは、部位特異的ヌクレアーゼは、RELAのトランス活性化ドメインをコードするRELA遺伝子の領域内(すなわち、野生型RELAタンパク質配列のアミノ酸431から553)、又はそのわずかに上流若しくは下流、例えばその500、300、200、100、50若しくは20塩基上流若しくは下流内を標的にして切断するように適合されている。より好ましくは、部位特異的ヌクレアーゼは、RELAのアミノ酸448から531をコードするRELA遺伝子の領域内、又はそのわずかに上流、例えばその500、300、200、100、50、20若しくは10塩基上流内を標的にして切断するように適合されている。
【００４４】
好ましくは、部位特異的ヌクレアーゼは、RELA遺伝子のエキソン9内を標的にして切断するように適合されている。
【００４５】
好ましい実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、アミノ酸T448をコードするRELAの領域の上流、例えばその500、300、200、100、50又は20塩基上流内を標的にして切断するように適合されている。
【００４６】
特に好ましい実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、適切な配列を標的にして、塩基1200と1341の間(配列番号15を参照して)にある部位、より好ましくは塩基1250と1340の間にある部位、更により好ましくは塩基1300と1340の間にある部位、更により好ましくは塩基1320と1340の間にある部位を切断するように適合されている。一実施形態では、切断部位は、塩基1332と1333の間にある。
【００４７】
本発明の具体的な一実施形態では、協同的なSSNの対の一方の標的部位は、GATACTGATGAGGAC(配列番号18)であり、SSNの対の他方の標的部位は、CTCCGGGACGACGTC(配列番号19)である。他の標的配列を用いることができ、当業者は、異なるSSNについて最適化された適切な標的部位を容易に決定することができる。
【００４８】
部位特異的ヌクレアーゼは、任意の適切な形態の細胞に導入できることに注意すべきである。例えば、ヌクレアーゼは、機能性タンパク質として接合体に直接もたらすことができる。或いは、ヌクレアーゼは、接合体によりそこから活性ヌクレアーゼが生成される前駆体又は鋳型の形で接合体にもたらすことができる。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼをコードするmRNAを、例えば注入により接合体に導入する。mRNAは、次いで、細胞により翻訳され、機能性タンパク質を形成する。このようにしてmRNAを用いることにより、細胞内でのヌクレアーゼの迅速であるが一過性の発現が可能になり、このことは、遺伝子編集の目的から理想的である。
【００４９】
用語「接合体」は、配偶子の融合により形成される単細胞に言及する厳密な意味で用いることができる。しかし、この用語は、真の接合体の最初の数回の分裂により得られる細胞の束(これは、桑実胚としてより正確に知られている)に言及するようにより広く用いることもできる。
【００５０】
本方法は、好ましくは、単細胞段階の接合体において少なくとも開始され、好ましくは完了される。
【００５１】
遺伝子編集接合体は、成長して、胚、そして最終的には成体動物になることができる。編集事象が単細胞接合体で生じるならば、この動物の全ての細胞は、動物の全ての細胞は単一遺伝子編集細胞に由来するので、改変RELA遺伝子を含む。編集事象が1又は複数回の細胞分裂の後に生じるならば、得られる動物は、編集事象についてモザイクである可能性がある。なぜなら、動物は、編集細胞に由来するいくつかの細胞と、未編集の細胞に由来するいくつかの細胞を有するからである。
【００５２】
方法は、複数の接合体に対して行うことができ、方法は、所望の遺伝子改変が達成された接合体を選択する工程を含むことがある。
【００５３】
好ましくは、鋳型核酸は、各側で相同配列が横に位置する異種核酸配列を含む領域を含む。鋳型構築物は、例えば、50以上の塩基長、適切には100以上、150以上、200以上、250以上、500以上又は1000以上又は1500以上の塩基長である異種核酸配列を含み得る。フランキング相同配列は、例えば、50以上の塩基長、適切には100以上、150以上、200以上、250以上、500以上又は1000以上の塩基長であり得る。
【００５４】
好ましくは、鋳型核酸は、各側で相同領域が横に位置するイボイノシシRELAハプロタイプを含む領域を含む。イボイノシシRELAハプロタイプを含む領域は、典型的には、所望の編集を達成するために必要な塩基での変化を除いて、野生型標的配列と大部分相同であり得ることに注意することが重要である。相同領域は、例えば、200から1000の塩基長、適切には500から900の塩基長であり得る。
【００５５】
特定の一実施形態では、鋳型核酸は、相同領域が横に位置する、タンパク質配列
【化２】
2018529384.tif 000004
(配列番号23)(アミノ酸変化T448A、S485P及びS531Pを太字で示す)をコードする核酸配列を含む、251以上のヌクレオチド長のイボイノシシRELAを含む領域を含む。相同領域は、200以上の塩基長、適切には400以上の塩基長、より好ましくは600以上の塩基長であり得る。
【００５６】
好ましくは、鋳型核酸は、二本鎖である。
【００５７】
好ましくは、鋳型核酸は、プラスミドにおいて提供される。プラスミドの形態で鋳型を提供することにより、遺伝子移入の有効性及び/又は効率の改善がもたらされることが見出された。
【００５８】
特定の一実施形態では、鋳型は、626bp及び799bpの領域(相同なアーム)が横に位置する、イボイノシシRELAハプロタイプを含む251bpの領域(すなわち配列番号23をコードする)を含むプラスミドである。251bpの領域は、家畜ブタ配列をイボイノシシハプロタイプに変換するための5塩基の変化を含む。
【００５９】
鋳型核酸は、SSNの標的部位にて、対応するゲノム核酸配列と比較して1又は複数(好ましくは2以上、更により好ましくは3以上)の塩基の変化を含むことが特に好ましい。このような変化をもたらすことは、HDRの後にSSNの標的部位が破壊され(又は少なくとも最適以下にされ)、よって遺伝子移入が一旦成功したら、再切断を妨げるか又は低減することを意味する。
【００６０】
SSNの標的部位がGATACTGATGAGGAC(配列番号18)である本発明の好ましい実施形態では、鋳型核酸は、配列GATgCaGAcGAGGAC(配列番号20)を含んで、ゲノム配列を置き換え、SSNによる再切断を妨げる。明確性のために、遺伝子移入前後の対応する配列を以下に示す(SSN標的部位に下線を付し、切断部位は太字であり、変化は小文字で示す):
【化３】
2018529384.tif 000005
【００６１】
したがって、本発明の特に好ましい実施形態では、遺伝子移入されたイボイノシシRELAハプロタイプを有する遺伝子編集家畜ブタを生成する方法であって、
-  家畜ブタ接合体を準備する工程と、
-  前記接合体に、協同的な部位特異的ヌクレアーゼ(適切にはZFN)の対を導入する工程であって、前記ヌクレアーゼが、T448Aをコードする配列の領域(好ましくは上流、適切には20bp以内)でRELA遺伝子を標的にし、二本鎖切断を導入するように適合されている、工程と、
-  ブタのゲノムRELA配列と相同な配列が横に位置する、対応するイボイノシシRELAハプロタイプをコードする配列を含む異種核酸を含む鋳型核酸(好ましくは二本鎖DNA鋳型、例えばプラスミド)を導入する工程と、
-  部位特異的ヌクレアーゼによるゲノムの切断と、相同組換え修復による異種核酸の遺伝子移入とを可能にする適切な条件下で、前記接合体をインキュベートする工程と、
-  前記接合体からブタを産出する工程
を含む方法が提供される。
【００６２】
ここで本発明の実施形態を、添付の図面に言及しながら非限定的な実施例により以下で説明する。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１ａ】家畜ブタRELAのDSBの創出及び後続のHDRについての設計方策。(a)エキソンを実線とするRELA遺伝子の図。最後のエキソンの領域の拡大図は、家畜ブタ(赤)とイボイノシシ(緑)との間の3アミノ酸の違いを強調する。はさみは、意図するDSB部位を示す。
【図１ｂ】家畜ブタRELAのDSBの創出及び後続のHDRについての設計方策。(b)家畜ブタ配列上のZFN結合部位を表す実線バーを用いたDNA配列。下のパネルは、家畜ブタトレオニンをイボイノシシアラニンに同時に変えながら、同時にZFNによる再切断を妨げる配列変化を示す。
【図１ｃ】家畜ブタRELAのDSBの創出及び後続のHDRについての設計方策。(c)家畜ブタ配列をイボイノシシハプロタイプに変換するための5塩基の変化を含む、251bp領域を挟む626bp及び799bpの相同なアームを有するHDR鋳型の設計。
【図２】生存出生仔ブタの配列分析。3つの観察されるアミノ酸の違いをコードする家畜ブタとイボイノシシの両方の配列を上に示し、個別の動物からの配列トレースを下に示す。染色体の挿入図は、各動物(家畜ブタアレル-赤、イボイノシシアレル-緑)における各位置でのアレル構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。本明細書で定義する用語は、本発明に関する領域における当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「その(the)」のような用語は、単数の物質のみに言及することを意図しないが、全般的なクラスを含み、その具体例を説明のために用いることがある。本明細書における術語は、本発明の具体的な実施形態について記載するために用いるが、特許請求の範囲に概要を示す以外は、それらの使用は本発明の境界を定めない。
【００６５】
用語「イノシシ科動物」又はその変形は、本明細書で用いる場合、ペッカリー、バビルサ及びイボイノシシを含むイノシシ属(Sus)及びその他の関連する種の動物を含む、偶数の蹄を持つ有蹄動物のイノシシ科(Suidae)の任意の動物のことをいう。
【００６６】
用語「ブタ」又はその変形は、本明細書で用いる場合、イノシシ属の任意の動物のことをいう。この用語は、家畜ブタ(ブタ(Sus scrofa domesticus)又はブタ(Sus domesticus))及びその祖先である一般的なユーラシア系イノシシ(イノシシ(Sus scrofa))を含む。本発明の目的のために、家畜ブタは、イノシシ種の亜種とみなす。この用語は、ペッカリー、バビルサ及びイボイノシシを含まない。
【００６７】
用語「家畜ブタ」又はその変形は、本明細書で用いる場合、亜種であるブタ(Sus scrofa domesticus)に属する動物のことをいう。
【００６８】
用語「RELA遺伝子」又はその変形は、本明細書で用いる場合、RELA(V-Relトリ細網内皮症ウイルス癌遺伝子ホモログA遺伝子、p65遺伝子としても知られる、NCBI遺伝子ID:100135665)遺伝子のことをいい、コード領域及び非コード領域の両方を含み、関連する調節因子、プロモーター及びエンハンサー領域も含む。本発明の好ましい実施形態では、遺伝子移入は、RELA遺伝子ORF内、より好ましくは少なくとも1つのエキソン内の配列を改変する。
【００６９】
用語「部位特異的ヌクレアーゼ」又はその変形は、本明細書で用いる場合、所望の位置にてDNAを切断するように構成できる工学改変ヌクレアーゼのことをいう。このような部位特異的ヌクレアーゼは、工学改変ヌクレアーゼ、標的可能ヌクレアーゼ、ゲノム編集性ヌクレアーゼ、分子はさみ等としても知られる。部位特異的ヌクレアーゼの例は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、CRISPR/Cas系(CRISPR)及びメガヌクレアーゼ、例えばハイブリッドメガヌクレアーゼを含む。
【００７０】
用語「異種アレル」又はその変形は、本明細書で用いる場合、関連する動物の種に存在しないアレルのことをいう。異種アレルは、別の種若しくは属に自然に存在し得るか、又は任意の種において自然でないことがあり得る(すなわち、完全に人工的)。好ましくは、アレルは、別の種において自然に存在する。
【００７１】
用語「種を超えた異種アレル」又はその変形は、本明細書で用いる場合、関連する動物に自然に存在しないが、別の種において自然に存在するアレルのことをいう。異種アレルは、別の種において自然に存在でき、その種は、同じ又は異なる属からであり得る。よって、種を超えたアレルは、人工的でなく、自然に見出されるという意味においてまだ「自然なアレル」であるが、新しい種に遺伝子移入されて、所望の特性を有する新しい動物を形成する。
【００７２】
用語「属を超えた異種アレル」又はその変形は、本明細書で用いる場合、関連する動物の属に自然に存在しないが、別の属において自然に存在するアレルのことをいう。「属を超えた異種アレル」のセットは、よって、「種を超えた異種アレル」のサブセットであり、すなわち、属を超えた異種アレルは、関連する動物の属の外側に由来し、単に関連する動物の種の外側からでない。例えば、イボイノシシからのRELAアレルは、イノシシ属の動物、特に家畜ブタにとって属を超えた異種アレルである。
【００７３】
用語「ハプロタイプ」又はその変形は、本明細書で用いる場合、染色体対の単一の染色分体上の特定の遺伝子座でのDNA配列変動(典型的に一ヌクレオチド多型(SNP))の連結されたセットのことをいう。本発明では、ハプロタイプは、典型的に、ある種又は属と他のものとの間で異なる複数のSNPであり、これは、ある種又は属と他のものとの間の異種アレルに貢献するか又はそれを定義する。例えば、本実施例でのRELAアレルの場合、家畜ブタとイボイノシシとの間で3アミノ酸の変化がある。これらの変化は、家畜ブタとイボイノシシとの間の異種RELAアレルのハプロタイプを表す。
【００７４】
用語「遺伝子移入」又はその変形は、本明細書で用いる場合、典型的に、現存するゲノム配列の書き換え又は変換による、動物へのある供給源からの異種核酸配列、特に遺伝子又はアレルの導入のことをいう。本発明における書き換え又は変換は、HDRにより達成される。異種核酸配列の供給源は、別の種若しくは属からの動物であり得るか、又は人工配列であり得る。
【００７５】
用語「アレル遺伝子移入」又はその変形は、本明細書で用いる場合、動物のゲノムへアレルを導入する遺伝子編集のことをいう。アレル遺伝子移入は、「アレル変換」若しくは「アレル置き換え」であり得るか、又はアレル遺伝子移入は、例えば新しい遺伝子全体を導入できる。本発明の好ましい実施形態では、アレル遺伝子移入は、アレル変換又はアレル置き換えであり得る。
【００７６】
用語「アレル変換」若しくは「アレル置き換え」又はその変形は、本明細書で用いる場合、正常な、通常「野生型」のアレルを異種アレルで置き換える遺伝子移入のことをいう。ある場合において、野生型アレルの異種アレルへの変換又は置き換えは、野生型ゲノムDNA配列の、別の動物からの異種アレルのDNA配列と完全に一致する変更を含むことがある。しかし、他の場合において、変換又は置き換えは、コードされるタンパク質が、異種アレルによりコードされるタンパク質と一致するような野生型ゲノムDNA配列への改変のみを必要とすることがある(すなわち、同義の置換を野生型ゲノム配列に作成する必要はない)。必要とされる変更の種類は、例えば転写の制御に代わりコードされたタンパク質の活性によってアレルがその表現型を発揮する様式によって決まり、ここで上記のコードされたタンパク質の活性ではコードされるタンパク質配列が第一に重要であるが、上記の転写の制御ではDNA配列が第一に重要である。
【００７７】
本発明の様々な実施形態の作製及び使用を以下に詳細に論じるが、本発明は、広く多様な具体的な状況で実施できる多くの適用可能な発明の概念を提供することが認識されるべきである。本明細書で論じる具体的な実施形態は、発明を作製して使用する具体的な様式を単に説明するものであり、本発明の範囲の境界を定めるものではない。
【００７８】
Jasin実験室による先駆けとなる研究は、哺乳動物細胞における単一DSBが、中断されていない短い(<200bp)ハプロタイプを形成する一連の一ヌクレオチド多型(SNP)を、染色体外修復鋳型から染色体に移動させることができることを証明した7。
【００７９】
本発明者らは、ゲノム編集を用いて、イボイノシシRELAハプロタイプ全体(これは、251塩基対にわたり、5つのSNPを有し、3アミノ酸変化をもたらす)を単一ヌクレアーゼ誘発DSBにより導入しようとした。本発明者らの知る限り、このような編集により駆動されるハプロタイプ遺伝子移入は、いずれの哺乳動物種の生存出生動物でも以前に報告されていない。本発明者らは、今回、このことを、接合体細胞質への直接注入により家畜ブタにおいて効率的に達成できることを証明する。注目すべきことには、本発明者らは、仔ブタの遺伝子型決定による1ステップ両アレル性ハプロタイプ移動を観察する。詳細な材料及び方法は、以下の別の項に示し、おおよその方法論、結果及び結論をここで論じる。
【００８０】
ZFNは、任意のゲノム位置にてDSBを誘発するように工学改変できる。この具体的な場合では、ヌクレアーゼ設計の検討は、複数のSNPを有する全体で251bpのハプロタイプを移動する必要があることを考慮に入れた。本発明者らは、ある方策(図1a)を考え付いたが、この方策では、上流の染色体のアームが修復鋳型の片側に侵入することにより、内因性遺伝子座に下流のハプロタイプ全体を合成依存性鎖アニーリングベースで移動させることができるのではないかと考えて、ZFNを、ハプロタイプでマーキングしたひと続きのすぐ上流の領域に工学改変するものである。
【００８１】
ブタRELA cDNA配列(NM_001114281)における翻訳開始部位に対して1330から1338bpに接する領域と結合するZFNヘテロ二量体(詳細について表1を参照されたい)を作製した。本発明者らは、ZFNについての発現構築物の2つのフォーマット、すなわちそれぞれ単一ZFN単量体をコードする2つのプラスミドと、リボソームスタッタリングシグナル(ribosome stuttering signal)又は2Aペプチド8、9により繋がれた両方のZFN単量体をコードする1つのプラスミドを比較した。本発明者らは、これらのプラスミドを家畜ブタから樹立された形質転換済み細胞株(PK15)にトランスフェクトし、Surveyor/Cel-1エンドヌクレアーゼアッセイ10によりゲノム編集効率を比較した。本発明者らは、両方の発現構築物の構成により駆動される同等の狙い通りの編集を観察した。RELAの指示によるZFNによって駆動される編集効率は、GGTA遺伝子の破壊を有する生存ブタを得るのにうまく使用されたZFNで観察されたもの11の2倍近くあり、このことは、これらのヌクレアーゼが、胚内編集のために適しているであろうことを示唆した。
【００８２】
本発明者らは、ZFNを用いてゲノムにDSBを創出したが、このような切断は、現在当業者に周知の様々なその他の部位特異的ヌクレアーゼを用いて達成できる。例えば、適切なTALEN対を容易に設計して同じ遺伝子座を標的にし、野生型又は対形成した「ニッカーゼ」Casヌクレアーゼのいずれかを先導する適切な先導RNA配列をもたらすことによりCRISPR/Cas系も用いることができる。したがって、ZFNを本実施例において開示し、ZFNは、非常に望ましい特性を示したが、本発明は、ZFNの使用に限定されない。
【００８３】
ZFN技術は、文献、なかでも全て参照により組み込まれる以下の特許文献US6,479,626、6,534,261、6,607,882、6,746,838、6,794,136、6,824,978、6,866,997、6,933,113、6,979,539、7,013,219、7,030,215、7,220,719、7,241,573、7,241,574、7,585,849、7,595,376、6,903,185、6,479,626、8,106,255、20030232410及び20090203140に広範に記載されている。ZFNは、CompoZr(登録商標)ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術ブランド製品及びサービスの下で、Sigma-Aldrich社(St.Louis、MO、US)から商業的に入手できる。
【００８４】
TALEN技術は、文献、なかでも全て参照により組み込まれる以下の特許文献:US8420782、US8470973、US8440431、US8440432、US8450471、US8586363、US8697853、EP2510096、US8586526、US8623618、EP2464750、US2011041195、US2011247089、US2013198878、WO2012/116274、WO2014110552、WO2014070887、WO2014022120、WO2013192316及びWO2010008562に広範に記載されている。TALENは、GeneArt(登録商標)TALブランド製品及びサービス(以前はLife Technologies社ブランドの下で販売されていた)の下で、Thermo Fisher Scientific,Inc.社(Waltham、MA、US)から商業的に入手できる。
【００８５】
CRISPR/Cas技術は、文献(例えばCongら「Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems」、Science、2013年2月15日:339巻、6121号、819〜823頁)、なかでも全て参照により組み込まれている以下の特許文献:US8,697,359、US2010076057、WO2013/176772、US8,771,945、US2010076057、US2014186843、US2014179770、US2014179006、WO2014093712、WO2014093701、WO2014093635、WO2014093694、WO2014093655、WO2014093709、WO2013/188638、WO2013/142578、WO2013/141680、WO2013/188522、US8546553、WO2014/089290及びWO2014/093479に広範に記載されている。CRISPR/Cas系は、CRISPR/CasヌクレアーゼRNA先導型ゲノム編集シリーズの製品及びサービスの下でSigma-Aldrich社(St.Louis、MO、US)から、又はGeneArt(登録商標)CRISPRブランドの製品及びサービスの下でThermo Fisher Scientific,Inc.社(Waltham、MA、US)から商業的に入手できる。
【００８６】
効率的な狙い通りのマーキング及び初期胚発生に対する最小限の毒性の頑強な組み合わせは、ヌクレアーゼをコードするmRNAを胚に送達することにより達成できる12。本発明者らは、RELA ZFNをコードするORFを、in vitro mRNA生成のための2つの別々のベクター(in vitroポリアデニル化を必要とするpVAX、及びある特定の長さのポリAトラックを含むpGEM)に移した。両方のベクターについて、本発明者らは、単一ZFNを有する構築物と、自己切断性の2Aシグナルにより分けられた両方のZFNを同じORF上に有する構築物とを作製した。キャッピング及びポリアデニル化されたmRNAを、次いで、全ての構築物からin vitro転写し、ブタPK15細胞への一過性トランスフェクションにより、狙い通りの編集効率を評価した。
【００８７】
この後に、Surveyor/Cel-1及びディープシーケンシングベースのアッセイを行って、編集された染色分体のパーセンテージを測定した。全ての場合で陽性対照ZFNにより駆動されるものを超える頑強な編集効率が、全ての4つのベクター/ORF構成を用いて得られた。本発明者らは、家畜接合体の細胞質への工学改変ヌクレアーゼの送達が、標的部位での非相同末端結合により駆動される(NHEJ)切断修復により、小さい挿入又は欠失(インデル)の生成をもたらし得ることを以前に示した13〜15。この送達方法が、DNA鋳型と組み合わせた場合にもHDRをもたらし得るのかどうか明確でなかった。本発明者らは、ブタ接合体に、ZFNの対をコードするmRNAと、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(ssODN16)又はイボイノシシSNPを有するプラスミドDNAのいずれかを同時注入した。注入された接合体を、レシピエント若雌ブタに移した14。
【００８８】
ヌクレアーゼがブタRELAの標的編集を駆動したかを決定するために、分娩後2日目の仔ブタから耳切りを行い、ゲノムDNAを調製した。標的遺伝子座にわたりこれらの生成物を配列決定するPCRを用いて、小さいインデル(NHEJの結果)又は特定の点突然変異(HDR事象の結果)のいずれかを有するアレルを同定した。非常に驚くべきことに、遺伝子型決定した動物のいずれにおいても、ZFN標的部位にてインデルは観察されなかった。このことは、NHEJにより作製されたアレルを有する編集動物を得る本発明者らの能力、及びブタにおけるインデルによるゲノム編集での本発明者らの以前の経験13、14の両方とは対照的である。
【００８９】
ヌクレアーゼ標的部位でのインデルの欠如は、ゲノム編集プロセス自体の失敗によったのではない。なぜなら、4匹の生存仔ブタは、RELAのHDRにより作製されたアレルを有したからである(以下の表2を参照されたい)。4匹全ては、ZFNをコードするmRNAとプラスミド修復鋳型とを注入された46匹の動物のコホートにおいて生じた。対照的に、ssODNをHDR鋳型として用いた39匹の生存出生ブタではHDR事象は観察されなかった。HDR陽性ブタの標的遺伝子座にわたるPCR生成物のサンガー配列決定は、仔ブタ354及び364がプラスミド鋳型によりコードされる5塩基の変化のそれぞれにてヘテロ接合性であったことを示し、よって、完全ハプロタイプ遺伝子移入を示した(図2)。仔ブタ367は、ZFN標的部位に最も近い4塩基の変化についてホモ接合性であり、最も離れた改変についてヘテロ接合性であった。この知見は、遺伝子変換の継続が哺乳動物細胞におけるDSB-Rから追跡されることを証明し、2つのホモログが、初期胚で切断され、それに続き別個のHDRベースの切断の変換がなされたことを示す。注目すべきことに、仔ブタ563は、5つ全ての塩基の変化についてホモ接合性であった。
【００９０】
家畜育種により、動物家畜化以来、動物生産性は継続的な増加を可能にしてきた。今後の課題は、人口増加とともに、気候変化、資源及び土地利用可能性により農業に課される要求に見合うようにこの改良プロセスを加速させていくことである。ゲノム編集技術は、家畜育種に革命を起こす可能性があり4、いくつかの家畜種での標的遺伝子ノックアウトが、ZFN、TALエフェクターヌクレアーゼ及びCRISPR/Cas9を含む複数の別個の設計されたヌクレアーゼプラットフォームを用いて達成されている11、13、15、17〜19。
【００９１】
本発明者らは、ハプロタイプ全体の標的化された移動を含むように、ゲノム編集者の道具箱を著しく広げた。特に、プラスミド修復鋳型を用いるZFN誘発切断の相同性に依存する修復により、本発明者らは、RELA遺伝子のアレルをイノシシ科動物種間で遺伝子移入して、所望のハプロタイプについてヘテロ接合性及びホモ接合性の両方の生存仔ブタを生成した。
【００９２】
材料及び方法
ZFN設計及び確認。ブタRELA遺伝子の示した位置に対するZFNを設計し、記載されるようにして[2]、予め確認された2フィンガーモジュールのアーカイブを用いて組み立てた。ORFを、DNA形態での送達及びin vitro転写mRNAの生成のために最適化されたFokIの増強された絶対ヘテロ二量体の形を保有する発現ベクターにクローニングした[20](Vierstraら、印刷中)。ZFN標的配列及びDNA認識ヘリックスは、表1に記載する。ブタPK15細胞を、記載されるようにしてZFNをコードするDNA又はmRNAを用いてエレクトロポレーションし、エレクトロポレーションの48時間後にゲノムDNAを採集し、インデルを有する染色分体のパーセンテージを、記載されるようにして[10]Surveyor/Cel1を用いて、又はIlluminaプラットフォームでのディープシーケンシングを用いて測定した。
【表１ａ】
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【表１ｂ】
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【００９３】
HDR鋳型の設計及び構築。96マーのssODNを、ZFNの標的部位にわたり、所望のT448A変換(図1)をコードする2塩基の変化と第3(サイレント)の塩基の変化とを含むように設計して、いずれの遺伝子移入されたアレルでのZFN再切断を妨げることを支援した。プラスミドDNA鋳型は、ZFN標的部位にてssODNと同じ3塩基の変化と、S485P及びS531Pをコードする更なる単一塩基の変化とを有するように設計した(図1)。5つ全ての塩基の変化を含むこの251bpの中央ドメインの横に、626bpの相同なアーム(最初の塩基の変化の5'側に)及び799bpの相同なアーム(最後の塩基の変化の3'側に)を配置した。
【００９４】
接合体注入及び移動。およそ9カ月齢で、使用時に少なくとも120kgの体重の大ヨークシャー(Large-White)若雌ブタから胚を生成した。発情期が観察された後11日と15日の間に、20mgアルトレノゲスト(Regumate、Hoechst Roussel Vet Ltd社)を1日1回4日間と、5日目に20mgアルトレノゲストを2回与えることにより、過剰排卵を達成した。6日目に、1500IUのeCG(PMSG、Intervet UK Ltd社)を20:00時に注射した。83時間後に、750IU hCG(Chorulon、Intervet UK Ltd社)を注射した。過剰排卵の後に発生する熱を示した後、6時間間隔で2回、ドナー若雌ブタを授精させた。交配させたドナーから、全身麻酔の下、正中線開腹術により、発情期後第1日に、手術により胚をNCSU-23 HEPESベース培地に回収した。胚を、それぞれssODN又はプラスミド鋳型とともに、2ng/μL又は4ng/μLのpVAX単一mRNAの単回の2〜5plの細胞質注入に供した。レシピエントの雌を、ドナー若雌ブタと、未交配のままにする以外は同様に処理した。ZFN注入の後、受精胚を、全身麻酔下の正中線開腹術の後に、レシピエント若雌ブタに移した。手術中、生殖器系を露出させ、3.5フレンチサイズトムキャットカテーテルを用いて、レシピエントの輸卵管に胚を移した。同腹仔は、1〜13匹の範囲の仔ブタであった。
【００９５】
【表２】
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【００９６】
遺伝子型決定。ゲノムDNAを、分娩後2日目の仔ブタから採取した耳生検から調製した。AccuPrime HiFiを用いるPCR増幅を、プラスミドがコードする5'の相同なアームの外側と結合するプライマーoSL1(gggtacaaagaggggtgagg-配列番号13)及びプラスミドの3'の相同なアームの内側で結合するoSL2(ctagctctgccctttccaga-配列番号14)とを用いて行った。サイクルは、95℃120秒、次いで94℃30秒、59℃30秒及び68℃90秒を40サイクル、その後68℃5分間のプライマー伸長であった。精製PCR生成物を、直接配列決定した。
【００９７】
参照配列
イノシシv-relトリ細網内皮症ウイルス癌遺伝子ホモログA(RELA)、mRNA/cDNA配列(NCBI受託NM_001114281、バージョンNM_001114281.1)、ZFN結合部位に下線を付し、切断部位は、太字で示す2つの塩基の間にある。
【化４】
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【００９８】
イノシシRELA、タンパク質配列(NCBI参照配列:NP_001107753.1):
【化５】
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【００９９】
(参考文献)
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2018529384.tif 000012
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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