(57)【要約】  本発明は、心的外傷後ストレス障害に関連した生理的反応を改善する方法であって、遊離アミノ酸β-アラニン又はその塩若しくはエステルを、心的外傷後ストレス障害に関連した生理的反応を改善するのに有効な量で長期間、ヒト用栄養補助食品として個人に投与する、該方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
心的外傷後ストレス障害に関連した生理的反応を改善する方法であって、
遊離アミノ酸β-アラニン又はその塩を含有するヒト用栄養補助食品（dietary supplement）を、心的外傷後ストレス障害に関連した1以上の生理的反応を改善するための有効量で長期間投与する
ことを含む、上記方法。
【請求項２】
生理的反応が、衝撃的な出来事の不快でつらい記憶、衝撃的な出来事が再び起こっているかのような追体験（フラッシュバック）、衝撃的な出来事についての心乱される夢、衝撃的な出来事を思い出させるものに対する大きな精神的苦痛若しくは身体的反応、衝撃的な出来事について考えたり話したりすることを避けようとすること、衝撃的な出来事を思い出させる場所、活動若しくは人を避けること、自己若しくは他者に対する否定的な感情、肯定的な感情を持てないこと、感情が麻痺した感覚、かつては楽しめた活動に対する興味の喪失、未来に対する絶望、記憶障害、親密な関係の維持が困難であること、神経過敏、怒りの爆発若しくは攻撃的な挙動、常に危険に警戒していること、極度の罪悪感若しくは恥辱感、自己破壊的な行動、集中困難、睡眠障害、容易に驚いたりおびえたりすること、及びこれらの組み合わせ、からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ヒト用栄養補助食品を1日1回以上で複数日間投与する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
有効量が少なくとも約3.0gの遊離アミノ酸β-アラニン又はその塩である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
複数日間が少なくとも14日間である、請求項3記載の方法。
【請求項６】
複数日間中に栄養補給をしない日を含み得る、請求項3記載の方法。
【請求項７】
栄養補給をしない日が、連続して1日以下であり、かつ7日間のうちに2日間以下である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
ヒト用栄養補助食品がクレアチンの形態と共に提供される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
ヒト用栄養補助食品がインスリン刺激物質と共に提供される、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
ヒト用栄養補助食品が炭水化物と共に提供される、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
ヒト用栄養補助食品が1種以上のビタミンと共に提供される、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
ヒト用栄養補助食品が1種以上の他のタンパク質及びアミノ酸と共に提供される、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
投与ステップが、使用者がPTSDに関連する症状を経験する前である、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
投与ステップが、使用者がPTSDに関連する症状を経験している時期である、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
投与ステップが、使用者がPTSDに関連する症状を経験した後である、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
投与ステップが、使用者が心的外傷後ストレス障害と診断される前である、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
投与ステップが、使用者が心的外傷後ストレス障害と診断されている時期である、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
投与ステップが、使用者が心的外傷後ストレス障害と診断された後である、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
心的外傷後ストレス障害に関連した生理的反応の改善が達成された場合に維持段階（maintenance phase）を可能とするように有効量を調整するステップを含む、請求項1記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は栄養補給及び生理に関し、より詳しくは、心的外傷後ストレス障害（PTSD）に関連した生理的反応を改善する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
β-アラニン (本明細書中でベータ-アラニン又はBAともいう)摂取を検討する研究は、一貫して、非常に激しい活動(例えば抵抗運動、反復的短距離走)の間の運動能力をプラセボよりも非常に大きく顕著に増大することを実証している (Hill et al., 2007; Hoffman et al., 2006; 2008a; 2008b; 2012; Kendrick et al., 2008; Stout et al., 2006; 2007)。β-アラニンの摂取の効果は、栄養補助食品（dietary supplement）として十分な期間、有効量で補給された場合に、骨格筋の疲労を遅らせることによってトレーニング及び運動の質を上げることができる効果に集中しているようである。単独で単回用量として摂取されたβ-アラニンの強壮作用は非常に限定されているようであるが、長期間に十分な量で消費されると、β-アラニンは骨格筋内でL-ヒスチジンと組み合わさってジペプチドのカルノシン(β-アラニルヒスチジン)を形成し、強壮効果を有するようである(Dunnett and Harris, 1999)。カルノシンの主要な役割は、筋肉内の水素イオン(H+)緩衝能の増大を介した酸-塩基の恒常性の維持にある (Harris et al., 2006)。β-アラニンの補給を介した筋肉内カルノシン濃度の上昇は、60秒 - 240秒間持続する最大運動のための強壮作用の可能性を実証した (Hobson et al., 2012)。カルノシンは骨格筋以外に他の組織、例えば脳及び心臓にも存在するため、更なる生理的な役割を有する可能性もある。
【０００３】
以前の研究から、β-アラニンがうつ病及び不安様行動と関連する脳機能に対して有益な効果を有することが示されている。
【０００４】
いくつかの研究から、カルノシンが神経保護剤（neuroprotector）として機能し得ることが示唆されている (Boldyrev et al., 2010; Stout et al., 2008)。カルノシンの抗酸化剤、抗糖化剤（antiglycating）及びイオンキレート剤としての生物学的な役割から、酸化的ストレスを受けている間の神経保護において潜在的な役割を有している可能性が示唆される。更に、近年の研究から、β-アラニンが脳内カルノシン濃度を上昇させ、それによりセロトニン濃度の低下をもたらし得ること、（新たなニューロン及びシナプスの成長及び分化に関与する）脳由来神経栄養因子を増加させ得ること、及びおそらくは抗不安様効果（antianxiety-like effects）をもたらし得ることが実証された(Murakami and Furuse, 2010)。従って、脳内カルノシン濃度の上昇も、非常に疲れる、非常に激しい活動の間及び活動後の集中力、注意力及び認知機能を維持するのに有益であり得る。
【０００５】
急激な外傷性の体験から生じたストレスは、繰り返される不快なその事象の記憶又は夢を含む様々な症状をもたらし、顕著な行動変化を引き起こし得る (American Psychiatric Association, 2013)。急性ストレスに対する応答には、その事象に対する感情又は事象を思い出させるものに対する回避、易刺激性（irritability）等の顕著な覚醒（arousal）、過覚醒（hypervigilance）、驚愕反応の増大、集中力の欠如（concentration deficit）又は感情の麻痺が挙げられる (American Psychiatric Association, 2013)。急性ストレスに対するこれらの応答はしばしば心的外傷後ストレス障害(PTSD)の診断のために使用されているが (American Psychiatric Association, 1994)、いくつかの研究から、一部の個人は外傷的体験後に短期間で適応することができ、PTSDを経験しないことが示されている (Bisson et al., 2004; Bryant et al., 2008)。外傷的体験後の最初の1カ月以内の急性ストレス障害の同定のPTSDの予測のための感受性は中程度のようである (3カ月及び12カ月内でそれぞれ51％及び45％) (Bryant et al.,  2014)。しかしながら、急性ストレス障害がないことは、その個人がPTSDを発症しないことを高い確率で予測するようである (3カ月及び12カ月内でそれぞれ95％及び94％) (Bryant et al., 2014)。
【０００６】
PTSDの病態生理は、ストレス及び記憶をコントロールする脳領域内のニューロンの構造の変化と関連していると考えられる(McEwen, 2007)。海馬は脳の最も敏感で順応性のある領域の1つであり、海馬での変化の多くは歯上回(DG)−CA3 領域で生じている (McEwen, 2007)。DG−CA3 領域は一連の事象の記憶において役割を果たしていると考えられ、ストレスの間にこの領域でいくつかの変化、例えばニューロン新生又は細胞生存の抑制、及び樹状突起及びシナプスの変性が生じることが示唆されている (McEwen, 1999; Sousa et al., 1998; Stewart et al., 2005)。しかしながら、脳機能に対するストレスの影響は海馬のみに限定されていない。海馬は皮質及びへんとう体と相乗的に機能して情動記憶の処理(Richardson et al., 2004)及び恐怖心の低減(Milad and Quirk, 2002)をコントロールしている。脳におけるニューロンの構造的リモデリングを刺激しているメカニズムは極めて複雑であるが、循環コルチコイド(McEwen, 2007; Myers et al., 2014) 及び脳由来神経栄養因子(BDNF)の発現 (Yao et al., 2011)の変化が脳機能の可塑性と密接に関連しているという証拠は説得力がある。
【０００７】
ストレスは神経内分泌系の変化に深刻な影響を有しており、グルココルチコイドの顕著な上昇をもたらす (Myers et al., 2014)。グルココルチコイドは副腎から放出され、血液脳関門を通過してニューロン又はグリア細胞の受容体に結合する。グルココルチコイド受容体は脳、特に海馬、へんとう体及び前頭皮質等のストレスに関連する部位内で高濃度で見出される (Fuxe et al., 1987; Myers et al., 2014)。齧歯類の背側海馬へのコルチコステロン注射により、海馬機能の損傷を伴うPTSD様の記憶障害が引き起こされることが実証されている (Kaouane et al., 2012)。グルココルチコイドの増加は、一般的に慢性ストレスの時期に見られるものと似通った樹状突起のリモデリング及び記憶と関連している (Miller and McEwen, 2006)。しかしながら、ストレスに対するグルココルチコイド応答は、逆転したUパターンに従うようである。ストレスを受けている間の循環グルココルチコイドの非常に低い濃度又は非常に高い濃度は、神経の可塑性をマイナスに変える可能性がより高い (Miller and McEwen, 2006)。
【０００８】
BDNFはニュートロフィンファミリーの一部であり、ニューロンのリモデリング、及びシナプスの可塑性及び神経伝達物質の放出の調節において重要な役割を有することが実証されている (Castren and Rantamaki, 2010)。PTSDと診断された個体におけるBDNF濃度が、外傷的事象にさらされたがPTSDと診断されていない個体と比較されている (Angelucci et al., 2014)。対照被験体と比較して、PTSD患者では血清BDNF濃度が有意に低かった。齧歯類モデルでは、ストレスへの暴露がBDNF mRNA発現をダウンレギュレートすることが示されている (Kozlovksy et al., 2007)。ストレスを経験している個体におけるBDNF発現の上昇、又はグルココルチコイドレベルの低下は、トラウマに暴露した後のPTSDに対する回復力の増大をもたらし得る。
【０００９】
PTSDの治療は非常に多様であり、一般的には診断後の心理療法及び薬理学的な選択肢の組み合わせを含む (Kirkpatrick and Heller, 2014)。しかしながら、PTSDを抑制するか、それに対する回復力を増大させるための可能な選択肢について、入手可能な情報は少ない。β-アラニンを補給したマウスの餌は大脳皮質及び視床下部における脳カルノシン濃度を上昇させることができ、海馬におけるBDNF濃度を上昇させることができた（Murakami and Furuse 2010）。これらの変化にはまた、高架式十字迷路試験のオープンアームでのマウスの有意により大きな活動性が伴っていた。β-アラニンは血液脳関門を通過できる抑制性神経伝達物質として作用すると考えられるが (Takeuchi et al., 2000)、大脳皮質及び視床下部におけるβ-アラニン濃度に有意な変化がないことは、観察される抗不安作用が脳内カルノシン（β-アラニル-L-ヒスチジン）濃度の上昇と関連している可能性を示唆している。
【００１０】
以下の文献は参照によりその全体を本明細書に組み入れるが、特に当業者が容易に理解するであろう、そのタイトルによって特徴付けられる情報を記載する。
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【００１１】
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【発明の概要】
【００２８】
本発明の実施形態は、心的外傷後ストレス障害（PTSD）に関連した生理的反応を改善する方法を提供する。
【００２９】
本発明の実施形態は、PTSDに関連した生理的反応を改善する方法を含み得る。一実施形態において、これは、有効量の遊離アミノ酸β-アラニン又はその塩若しくはエステルをヒトの食物に補給することによって達成され、この有効量は長期間にわたって提供される。当然のことながら、β-アラニンの塩若しくはエステルを摂取することができ、身体又は適切な送達媒体中で遊離アミノ酸に容易に変換されるであろう。本発明の一部の実施形態において、遊離アミノ酸β-アラニン又はその塩若しくはエステルは、使用者がPTSDに関連した症状を経験する前、間、又は後に投与され得る。本発明の別の実施形態において、遊離アミノ酸β-アラニン又はその塩若しくはエステルは、使用者がPTSDと診断される前、時期又は後に投与され得る。
【００３０】
本明細書に記載するβ-アラニンの有効量が提供される期間は、約7日間又はそれ以上であり得る。更に、β-アラニンは、この期間中毎日投与することができ、隔日に投与しても良く、又はこの期間中定期的に投与しても良い。
【００３１】
本発明の更なる特徴、利点、及び実施形態は、以下の詳細な説明、図面及び請求の範囲に記載され、又はこれらを考慮すれば明らかである。上記した本発明の概要及び以下の詳細な説明の双方が例示的なものであり、請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定することなく更なる説明を提供することを意図するものであることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
本発明の更なる理解をもたらすために含まれ、本願明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、本発明の好ましい実施形態を説明し、詳細な説明と共に本発明の原理を説明するために機能する。
【図１Ａ】図１Ａ−１Ｄは、高架式十字迷路における行動遂行のグラフである。図１Ａはオープンアーム内に滞在した時間についての群間の比較である。ａ＝UNEX＋PLと有意に異なる；ｂ＝UNEX＋BAと有意に異なる；ｄ＝PSS＋BAと有意に異なる；UNEX＋PL＝捕食者の匂いのストレスにさらされておらず、標準の食餌を与えられた動物；UNEX＋BA＝捕食者の匂いのストレスにさらされておらず、β-アラニンを補給された動物；PSS＋PL＝捕食者の匂いのストレスにさらされ、標準の食餌を与えられた動物；PSS＋BA＝捕食者の匂いのストレスにさらされ、β-アラニンを補給された動物。全てのデータは平均±SDとして報告されている。
【図１Ｂ】図１Ａ−１Ｄは、高架式十字迷路における行動遂行のグラフである。図１Ｂはオープンアームへの侵入回数における群間の比較である。ａ＝UNEX＋PLと有意に異なる；ｂ＝UNEX＋BAと有意に異なる；ｄ＝PSS＋BAと有意に異なる；UNEX＋PL＝捕食者の匂いのストレスにさらされておらず、標準の食餌を与えられた動物；UNEX＋BA＝捕食者の匂いのストレスにさらされておらず、β-アラニンを補給された動物；PSS＋PL＝捕食者の匂いのストレスにさらされ、標準の食餌を与えられた動物；PSS＋BA＝捕食者の匂いのストレスにさらされ、β-アラニンを補給された動物。全てのデータは平均±SDとして報告されている。
【図１Ｃ】図１Ａ−１Ｄは、高架式十字迷路における行動遂行のグラフである。図１Ｃは総活動性における群間の比較である。ａ＝UNEX＋PLと有意に異なる；ｂ＝UNEX＋BAと有意に異なる；ｄ＝PSS＋BAと有意に異なる；UNEX＋PL＝捕食者の匂いのストレスにさらされておらず、標準の食餌を与えられた動物；UNEX＋BA＝捕食者の匂いのストレスにさらされておらず、β-アラニンを補給された動物；PSS＋PL＝捕食者の匂いのストレスにさらされ、標準の食餌を与えられた動物；PSS＋BA＝捕食者の匂いのストレスにさらされ、β-アラニンを補給された動物。全てのデータは平均±SDとして報告されている。
【図１Ｄ】図１Ａ−１Ｄは、高架式十字迷路における行動遂行のグラフである。図１Ｄは不安指標における群間の比較である。ａ＝UNEX＋PLと有意に異なる；ｂ＝UNEX＋BAと有意に異なる；ｄ＝PSS＋BAと有意に異なる；UNEX＋PL＝捕食者の匂いのストレスにさらされておらず、標準の食餌を与えられた動物；UNEX＋BA＝捕食者の匂いのストレスにさらされておらず、β-アラニンを補給された動物；PSS＋PL＝捕食者の匂いのストレスにさらされ、標準の食餌を与えられた動物；PSS＋BA＝捕食者の匂いのストレスにさらされ、β-アラニンを補給された動物。全てのデータは平均±SDとして報告されている。
【図２Ａ】図２Ａ−２Ｂは聴覚性驚愕反応のグラフである。図２Ａは驚愕振幅（startle amplitude）における群間の比較である。ａ＝UNEX＋PLと有意に異なる；ｂ＝UNEX＋BAと有意に異なる；UNEX＋PL＝捕食者の匂いのストレスにさらされておらず、標準の食餌を与えられた動物；UNEX＋BA＝捕食者の匂いのストレスにさらされておらず、β-アラニンを補給された動物；PSS＋PL＝捕食者の匂いのストレスにさらされ、標準の食餌を与えられた動物；PSS＋BA＝捕食者の匂いのストレスにさらされ、β-アラニンを補給された動物。全てのデータは平均±SDとして報告されている。
【図２Ｂ】図２Ａ−２Ｂは聴覚性驚愕反応のグラフである。図２Ｂは驚愕馴化における群間の比較である。ａ＝UNEX＋PLと有意に異なる；ｂ＝UNEX＋BAと有意に異なる；UNEX＋PL＝捕食者の匂いのストレスにさらされておらず、標準の食餌を与えられた動物；UNEX＋BA＝捕食者の匂いのストレスにさらされておらず、β-アラニンを補給された動物；PSS＋PL＝捕食者の匂いのストレスにさらされ、標準の食餌を与えられた動物；PSS＋BA＝捕食者の匂いのストレスにさらされ、β-アラニンを補給された動物。全てのデータは平均±SDとして報告されている。
【図３】図３はキュー暴露による凍結行動のグラフである。ａ＝UNEX＋PLと有意に異なる；ｂ＝UNEX＋BAと有意に異なる；UNEX＋PL＝捕食者の匂いのストレスにさらされておらず、標準の食餌を与えられた動物；UNEX＋BA＝捕食者の匂いのストレスにさらされておらず、β-アラニンを補給された動物；PSS＋PL＝捕食者の匂いのストレスにさらされ、標準の食餌を与えられた動物；PSS＋BA＝捕食者の匂いのストレスにさらされ、β-アラニンを補給された動物。全てのデータは平均±SDとして報告されている。
【図４】図４はPSS暴露後8日目のコルチコステロン濃度のグラフである。ａ＝UNEX＋PLと有意に異なる；ｂ＝UNEX＋BAと有意に異なる；UNEX＋PL＝捕食者の匂いのストレスにさらされておらず、標準の食餌を与えられた動物；UNEX＋BA＝捕食者の匂いのストレスにさらされておらず、β-アラニンを補給された動物；PSS＋PL＝捕食者の匂いのストレスにさらされ、標準の食餌を与えられた動物；PSS＋BA＝捕食者の匂いのストレスにさらされ、β-アラニンを補給された動物。全てのデータは平均±SDとして報告されている。
【図５Ａ】図５Ａ−５ＣはPSS暴露後8日目のBDNF発現のグラフである。図５ＡはCA1小領域におけるBDNF発現を示す。ａ＝UNEX＋PLと有意に異なる；ｂ＝UNEX＋BAと有意に異なる；ｃ＝PSS＋PLと有意に異なる；ｄ＝PSS＋BAと有意に異なる；UNEX＋PL＝捕食者の匂いのストレスにさらされておらず、標準の食餌を与えられた動物；UNEX＋BA＝捕食者の匂いのストレスにさらされておらず、β-アラニンを補給された動物；PSS＋PL＝捕食者の匂いのストレスにさらされ、標準の食餌を与えられた動物；PSS＋BA＝捕食者の匂いのストレスにさらされ、β-アラニンを補給された動物。全てのデータは平均±SDとして報告されている。
【図５Ｂ】図５Ａ−５ＣはPSS暴露後8日目のBDNF発現のグラフである。図５ＢはCA3小領域におけるBDNF発現を示す。ａ＝UNEX＋PLと有意に異なる；ｂ＝UNEX＋BAと有意に異なる；ｃ＝PSS＋PLと有意に異なる；ｄ＝PSS＋BAと有意に異なる；UNEX＋PL＝捕食者の匂いのストレスにさらされておらず、標準の食餌を与えられた動物；UNEX＋BA＝捕食者の匂いのストレスにさらされておらず、β-アラニンを補給された動物；PSS＋PL＝捕食者の匂いのストレスにさらされ、標準の食餌を与えられた動物；PSS＋BA＝捕食者の匂いのストレスにさらされ、β-アラニンを補給された動物。全てのデータは平均±SDとして報告されている。
【図５Ｃ】図５Ａ−５ＣはPSS暴露後8日目のBDNF発現のグラフである。図５ＣはDG小領域におけるBDNF発現を示す。ａ＝UNEX＋PLと有意に異なる；ｂ＝UNEX＋BAと有意に異なる；ｃ＝PSS＋PLと有意に異なる；ｄ＝PSS＋BAと有意に異なる；UNEX＋PL＝捕食者の匂いのストレスにさらされておらず、標準の食餌を与えられた動物；UNEX＋BA＝捕食者の匂いのストレスにさらされておらず、β-アラニンを補給された動物；PSS＋PL＝捕食者の匂いのストレスにさらされ、標準の食餌を与えられた動物；PSS＋BA＝捕食者の匂いのストレスにさらされ、β-アラニンを補給された動物。全てのデータは平均±SDとして報告されている。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
遊離アミノ酸β-アラニン又はその塩若しくはエステルによる栄養補給を通して心的外傷後ストレス障害（PTSD）に関連した生理的反応を改善するための方法及び実施形態が記載され、これらは説明目的のためにのみ記載される。本明細書に記載される方法は、様々な多くの業界、例えば医療組織、軍、民兵組織、初期対応者（例えば消防士及び歩行者、救急隊員及び外科医）、スポーツチーム及び多くの他の業界で使用され得る。以下は本発明の特定の実施形態の更なる説明を提供する。本明細書中に記載し、特許請求するように、特定の用語が定義され、また互換可能に使用される。
【００３４】
本明細書中で使用する「β-アラニン」、「ベータ-アラニン」、及び「BA」は、遊離アミノ酸、又は遊離アミノ酸の塩若しくはエステルである、アミノ酸β-アラニンを表すことを意図する。理解されるように、これらの用語は、本明細書中で別の特定がされた場合を除き、互換可能に使用されるべきである。本明細書中で他に特定のない限り、これらの互換可能な用語の使用は、ジペプチド、オリゴペプチド、又はポリペプチドの成分としてのβ-アラニンを包含しない。従って、遊離アミノ酸β-アラニン又はそのエステル若しくは塩を含まず、ジペプチド、オリゴペプチド、又はポリペプチドを含むヒト用栄養補助食品は、本発明の範囲内のものではない。例えば、遊離アミノ酸β-アラニンを含まないカルノシン等の栄養補助食品は本発明の範囲内のものではない。しかしながら、ヒト用栄養補助食品が、遊離アミノ酸β-アラニン又はそのエステル若しくは塩と組み合わせてジペプチド、オリゴペプチド、又はポリペプチドを含有する場合には、そうしたヒト用栄養補助食品は、その遊離アミノ酸β-アラニン、又はそのエステル若しくは塩が本明細書で規定するような有効量で存在することを条件として、本発明の範囲内のものである。当然のことながら、遊離アミノ酸β-アラニンのエステル及びアミド形態、及びその塩は同様に使用することができるが、これらの形態は、その当初に提出された請求項には含まれていない。更に、本発明のヒト用栄養補助食品を記載する上でのこれらの互換可能な用語の使用は、他に具体的な記載や請求がされない限り、天然若しくは伝統的な食品又は食物製品由来のβ-アラニンを包含しない。天然若しくは伝統的な食物又は食品としては、限定するものではないが、牛肉、豚肉、鶏肉、肉抽出添加物（supplement）、及び予め消化された肉／タンパク質添加物、及び肉類の様々なエキスが挙げられる。これらの定義のもとで、用語「ヒト用栄養補助食品」は、鶏肉、肉エキス、チキンブロス又は肉フレーバー剤等の天然若しくは伝統的な食物又は食品を包含せず、また意味しない。
【００３５】
更に、本発明のヒト用栄養補助食品は医薬組成物を包含せず、本発明の方法は治療的処置を包含しない。本明細書に記載するヒト用栄養補助食品は非-医薬組成物であり、心的外傷後ストレス障害に関連した生理的反応を改善するための方法である。本明細書に記載する実施形態はヒトによる消費及び他の用途のための医薬品グレードの成分を利用し得るが、ヒト用栄養補助食品及び関連するアプローチは医薬ではない。本明細書に記載する実施形態は、栄養補助としての使用のみが意図される。
【００３６】
本明細書において使用する用語「ヒト用栄養補助食品」は、1994年の「ダイエタリーサプリメント健康教育法（the Dietary Supplement Health and Education Act）」（「DSHEA」）において定義されたようなダイエタリーサプリメントを意味することが意図される。本明細書において使用するヒト用栄養補助食品はまた、食事に補給して天然の若しくは伝統的な食事を通して自然に生じるよりも高いレベルで体内の補助食品の成分（例えばβ-アラニン）、又は補助食品の成分を含む物質（例えばカルノシン）を増加させる、及び／又は維持させる目的で、1回より多く個人に投与又は摂取させる栄養補助食品を意味する。更に、ヒト用栄養補助は更に、天然の又は伝統的な食物又は食品の一部ではなく、消費されて組織の機能を効果的に増大させる、丸剤、カプセル、錠剤、粉末、又は液体形態でヒトの食餌に添加することを意味する。
【００３７】
本明細書において使用する用語「期間（period of time）」、「時間をかけて（over time）」又は「持続時間（duration of time）」は、ヒト用栄養補助食品の単回より多い投与（dosing）、摂取（taking）又は投与（administration）を意味する。より具体的には、これらの用語は、ヒト用栄養補助食品が、7日間以上にわたって1日1回以上摂取されることを意味し、一般的には栄養補助食品の摂取なしで連続して2日間は経過せず、個人は任意の7日間のうちの少なくとも3日若しくは4日、より好ましくは任意の7日間のうちの4日以上、より好ましくは任意の7日間のうちの5日以上、より好ましくは任意の7日間のうちの6日以上、より好ましくは任意の7日間のうちの連続した7日間、食事に栄養補給をする。例えば、個人は、栄養補助食品を毎日摂取することができ、ここで栄養補助食品は1日間かけて提供され、または個人は栄養補助食品を毎日単回用量で摂取しても良い。個人はまた、補給しない日に関して上記の非補給日を有しても良い。本明細書に記載する期間は、少なくとも7日間〜約240日間、好ましくは約14日間〜約210日間、より好ましくは約21日間〜約180日間、より好ましくは約28日間〜約180日間、より好ましくは約28日間〜約60日間、更により好ましくは約30日間継続することができる。当業者であれば、期間は達成及び／又は維持すべき望ましいレベルに応じ、個人が調節できることを理解するであろう。
【００３８】
本明細書において使用する用語「有効量」又は「〜するために有効な量」とは、求められる増加又は改善を達成するために必要とされる補助食品の量をいい、平均的な食事に含まれるよりも多い量である。例えば、雑食動物は一日に約50〜300mgのカルノシンを消費し、用いられる調理法ではβ-アラニン量がこれよりも少なくなる。当業者であれば、β-アラニンの単回投与ではβ-アラニンを栄養補給する目的のための有効量を達成することができないことを理解するであろう。更に、当業者には、単回投与後に投与又は補給をしない日が連続して複数日続くと、本発明に記載するような有効量を達成しないことが理解されるであろう。
【００３９】
本明細書において使用する用語「心的外傷後ストレス障害」、「PTSD」等は、限定するものではないが、衝撃的な出来事によって引き起こされ得る精神衛生状態をいう。衝撃的な出来事は、体験するもの、及び／又は目撃するものであり得る。症状としては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：衝撃的な出来事の反復する不快でつらい記憶、衝撃的な出来事が再び起こっているかのような追体験（フラッシュバック）、衝撃的な出来事についての心乱される夢、衝撃的な出来事を思い出させるものに対する大きな精神的苦痛若しくは身体的反応、衝撃的な出来事について考えたり話したりすることを避けようとすること、衝撃的な出来事を思い出させる場所、活動若しくは人を避けること、自己若しくは他者に対する否定的な感情、肯定的な感情を持てないこと、感情が麻痺した感覚、かつては楽しめた活動に対する興味の喪失、未来に対する絶望、記憶障害、例えば衝撃的な出来事の重要な状況を覚えていないこと、親密な関係の維持が困難であること、神経過敏、怒りの爆発若しくは攻撃的な挙動、常に危険に警戒していること、極度の罪悪感若しくは恥辱感、自己破壊的な行動、例えば過度の飲酒若しくはスピードを出し過ぎての運転、集中困難、睡眠障害、容易に驚いたりおびえたりすること、及びこれらの組み合わせ。
【００４０】
本発明は、長期間にわたって提供される栄養素又は栄養補給がいかにして心的外傷後ストレス障害に関連した生理的反応を改善し得るかについての重要な理解を提供する。
【００４１】
形態及び製剤
β-アラニンの投与は遊離アミノ酸β-アラニンとしてであって良く、この遊離アミノ酸はジペプチド、オリゴペプチド又はポリペプチドの一部ではない。遊離アミノ酸はβ-アラニンのエステル又は塩であり得る。遊離アミノ酸は、丸剤、錠剤、カプセル、顆粒、又は粉末形態であり得る。遊離アミノ酸は固体、液体、又は半流動体（semi-liquid）の一部として投与され得る。遊離アミノ酸は、飲料（例えばスポーツドリンク）又は食品（例えばヘルスバー(health bar)）の一部として投与され得る。
【００４２】
β-アラニンは、徐放性製剤で投与することもでき、ここで遊離アミノ酸β-アラニンはジペプチド、オリゴペプチド、又はポリペプチドの一部ではない。徐放性製剤で投与されるβ-アラニンは、β-アラニンのエステル又は塩として存在していても良い。徐放性製剤は、錠剤、カプセル、顆粒又は粉末形態であり得る。徐放性製剤は固体、液体又は半流動体の一部として投与することができる。遊離アミノ酸β-アラニンの徐放性製剤は、飲料（例えばスポーツドリンク）又は食品若しくは食品マトリックス（例えばヘルス若しくはエナジー(energy)バー又はエナジーゲル）の一部として投与することができる。個体によっては、β-アラニンを遊離アミノ酸として摂取するとわずかな顔面紅潮／皮膚のチクチク感（tingling）を経験する場合があることが報告されている。この感覚は不快なものであるかも知れないが、典型的には持続時間は60分間未満である。β-アラニンの徐放性形態の使用によって、顔面紅潮／皮膚のチクチク感を抑制、低下及び／又は除去されることが示されている。
【００４３】
本発明の様々な実施形態において、ヒト用栄養補助食品は、他の成分と組み合わせて投与（例えば消費又は摂取）することができる。例えば、遊離アミノ酸β-アラニン、又はそのエステル若しくは塩は、クレアチンと組み合わせて投与しても良く、ここでクレアチンはクレアチン一水和物又はクレアチンの他の許容可能な形態である。クレアチンは本発明の製剤の強壮効果の増大のために望ましい。
【００４４】
別の実施形態において、遊離β-アラニンを含有する栄養補助食品は更に、例えば単炭水化物を含む1種以上の炭水化物を含有し得る。更に、炭水化物はデンプン及び／又は糖類、例えばグルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、及びマルトースを含み得る。糖類又は他の炭水化物は、ハチミツ、糖蜜（molasses）、シロップ（例えばコーンシロップ、グルコースシロップ）、糖蜜（treacle）又はゲルの様々な形態由来であり得る。本発明のヒト用栄養補助食品が、本明細書に開示された他の成分と組み合わせて、そして本発明によって規定される形態及び製剤の一部として1種以上の炭水化物を含有し得ることは理解されるであろう。
【００４５】
更に、本発明のヒト用栄養補助食品は、インスリン、インスリン模倣物、及び／又はインスリン作用調整剤を更に含有し得る。インスリン模倣物としては、限定するものではないが、D-ピニトール(3-O-メチル-カイロイノシトール(chiroinositol))、4-ヒドロキシイソロイシン、L783,281（デメチル-アステリキノンB-1化合物）、α-リポ酸、R-αリポ酸、グアニジノプロピオン酸（guanidiniopropionic acid）、硫酸バナジル等のバナジウム化合物又はペルオキソバナジウム等のバナジウム複合体、及び合成ホスホイノシトールグリカン（PIGペプチド）が挙げられる。体内でのインスリンの作用を増大又は阻害するインスリン作用調整剤としては、限定するものではないが、スルホニルウレア、チアゾリジンジオン、及びビグアニドが挙げられる。更に、ヒト用栄養補助食品は、インスリン刺激物質（例えばグルコース）を含有し得る。
【００４６】
別の実施形態において、遊離β-アラニンを含有する栄養補助食品は、1種以上の電解質及び／又はビタミン（例えばビタミンB6、B12、E、C、及びチアミン、リボフラビン、ナイアシン、葉酸、ビオチン及びパントテン酸）を更に含有し得る。別の実施形態において、ヒト用栄養補助食品は、脂質、他のアミノ酸、繊維、微量元素、着色剤、香料、天然及び／若しくは合成甘味料、天然の健康増強物質、抗酸化剤、安定化剤、保存剤、及び緩衝剤を含有し得る。
【００４７】
特定の他の実施形態において、本発明のヒト用栄養補助食品は、他の成分、例えば抗酸化剤、α-リポ酸、トコトリエノール、N-アセチルシステイン、コエンザイムQ-10、カルノソール等のローズマリー抽出物、緑茶ポリフェノール等の植物性抗酸化剤、ブドウ種子抽出物、レスベラトロール等のCOX-1型阻害剤、イチョウ、プテロスチルベン及びニンニク抽出物を含み得る。他のアミノ酸、例えばL-ヒスチジン、L-システイン及び／又はL-シトルリンを添加することができる。一部の実施形態において、本発明は、アセチルコリン前駆体との組み合わせを含んでいても良く、例えば血管拡張を促進するために、塩化コリン又はホスファチジルコリンが望ましい場合がある。本発明はまた、遊離アミノ酸β-アラニンを、ヒトでの消費のために好適な任意の型又は形態のミネラル及び微量元素としての他の成分と組み合わせて含有するヒト用栄養補助食品を提供する。カルシウム及びカリウムはそれらのグルコン酸塩、リン酸塩又はリン酸水素塩の形態で、マグネシウムは酸化物又は炭酸塩として、クロムはピコリン酸クロムとして、セレンは亜セレン酸ナトリウム又はセレン酸ナトリウムとして、亜鉛はグルコン酸亜鉛として提供することが好都合である。
【００４８】
遊離アミノ酸β-アラニンを含有するヒト用栄養補助食品中に任意に含まれるものとして本明細書において開示する成分、化合物及び構成要素は、ヒト用栄養補助食品の一部として任意の組み合わせであって良い。このことは栄養補給及び運動生理学の分野の当業者には容易に理解されるであろう。
【００４９】
あるいは負荷段階として知られる、有効量のヒト用栄養補助食品の使用によってβ-アラニルヒスチジンのレベルが一旦上昇すると、本発明の目的のための心的外傷後ストレス障害に関連した生理的反応を改善するのに必要なβ-アラニルヒスチジンのレベルを維持するために、投与量を調節することができる。
【００５０】
本明細書に提供する形態及び製剤は、米国特許第5,965,596号、第6,426,361号、7,825,084号、8,067,381号、及び8,329,207号（これらのそれぞれを参照によりその全体を本明細書に組み入れる）に記載され、提供されたものであって良い。
【００５１】
一態様において、栄養補助食品は、本発明が必要とする有効量を達成するために、1日1回以上摂取することができる1回以上の服用のために製剤化される。従って、遊離β-アラニン又はそのエステル若しくは塩の有効量を満たすために必要とされる1日の合計摂取量は、栄養補助食品の合計1日摂取有効量とするために、一回分、又は合計で遊離β-アラニン又はそのエステル若しくは塩の必要量を満たす一日を通して摂取するより少量の複数回分によって、得ることができる。従って、栄養補助食品は、1日における複数回摂取の目的で、より少量の遊離β-アラニン又はそのエステル若しくは塩で製剤化することができ、この複数回摂取による合計量が、本発明によって規定される有効量となるような所望の合計1日摂取量を満たす。
【００５２】
β-アラニンは、組成物中約100g/kgの濃度で投与され得る。特定の実施形態において、濃度は、約70g/kg〜約130g/kg、約80g/kg〜約120g/kg、及び／又は約90g/kg〜約110g/kgであり得る。
【００５３】
β-アラニンは、遊離アミノ酸β-アラニン、又はそのエステル若しくは塩、及び1種以上の他の化合物の混合物（組成物）として提供し得る。1種以上の他の化合物は、限定するものではないが、グルコマンナンであり得る。特定の実施形態において、混合物は、約80％の遊離β-アラニン又はそのエステル若しくは塩、及び約20％のグルコマンナンであり得る。特定の実施形態において、遊離β-アラニン又はそのエステル若しくは塩のパーセンテージは、約50％〜約95％、約60％〜約90％、及び／又は約70％〜約85％であり得る。
【００５４】
混合物は溶液として提供され得る。溶液は、約100mlの水あたり約1.0〜1.2グラムの組成物を含み得る。
【００５５】
遊離アミノ酸β-アラニン又はそのエステル若しくは塩の合計一日摂取量は、約0.3グラム（g）〜約16.0g、好ましくは約1.0g〜約10.0g、より好ましくは約2.0g〜約8.0g、更により好ましくは約3.0g〜約7.0gの範囲である。本明細書に記載するように、これらの範囲内の合計一日摂取量は、所望の有効量の遊離β-アラニンを含有する1回分の製剤によって達成することができる。あるいはまた、これらの範囲内の合計一日摂取量は、一日で合計して本発明によって規定される有効量を送達する合計一日摂取量の所望の範囲内となるような量の遊離β-アラニンをそれぞれが含有する複数回分の製剤によって達成することができる。
【００５６】
栄養補助食品を本明細書に記載する範囲内の一日複数回分に製剤化する場合、製剤化される単位内の遊離β-アラニン又はそのエステル若しくは塩の量に依存して、2〜12回分又はそれ以上とし得ることが理解されるであろう。例えば、2.0gの遊離β-アラニンを含有する持続放出性錠剤は、6.0gの遊離β-アラニンの合計一日摂取量のために一日3回服用するようにすることができる。別の例として、0.5gの遊離β-アラニンを含有する製剤は、6.0gの合計一日摂取量のために一日を通して12回服用するようにすることができる。本発明のこの態様は、0.5gの遊離β-アラニンを含有する12個の錠剤を、一日を通して12回の異なる時間に服用するか、あるいは4個の錠剤を一日を通して3回の異なる時間に服用するように適用される。本発明において理解されるように、本発明に規定する有効量でなくてはならないのは遊離β-アラニンの合計一日摂取量である。更に、本明細書で提供される範囲内の有効量は、本発明で規定する補給しない日を考慮する（account for）。従って、本明細書に記載するように個人がそれぞれ自分の食事に補給する限り、栄養補助食品の合計一日摂取量は補給しない日を考慮し、長期的に必要とされる有効量を達成するものである。
【００５７】
遊離β-アラニンの合計一日摂取量についてのこれらの範囲はまた、様々な身体のサイズを考慮することができる。従って、より身体が小さい個人が、達成されるべき所望のパフォーマンスレベルに応じてより少ないか又はより多い量を摂取できることは理解されるであろう。同様に、合計一日摂取量の範囲は、所望のパフォーマンスレベルを達成するためにより多量の合計一日摂取量を必要とし得るより身体が大きい個人を考慮する。身体の大きさに関わらず、本発明の栄養補助食品における遊離β-アラニン又はそのエステル若しくは塩の有効量の合計一日摂取量は、個人の身体の型による必要性及び所望のパフォーマンスレベルに基づく量の調節を考慮し得る。
【００５８】
本明細書において規定されるように、遊離β-アラニン又はそのエステル若しくは塩の合計1日摂取量が本明細書に記載される範囲内に維持され、本発明の有効量の定義を満たす限り、消費される有効量が、上方に若しくは下方に調節できることも理解されるであろう。例えば、6.0g又は6.4gの合計1日摂取量を送達する処方で本発明の栄養補助食品を摂取する個人は、補給レベルを遊離アミノ酸β-アラニン又はそのエステル若しくは塩の1.6g、2.0g、3.0g又は3.2gの合計1日摂取量まで下げて調節することができる。これは維持段階と呼ばれる。当業者であれば、個人が本発明の栄養補助食品を通して所望のレベルに達することができ、その後、達成されたレベルを維持するために本発明のより少量の有効量まで有効量を下げることを選択できることを理解するであろう。逆の例として、有効量として3.0g又は3.2gの遊離β-アラニン又はそのエステル若しくは塩の合計1日摂取量を摂取する個人は、本明細書に記載する範囲内の任意の有効量まで遊離β-アラニンの合計1日摂取量を増加させることができる。例えば、個人は、更なるパフォーマンスの増大が望まれる場合、合計1日摂取量を、1.6g、2.0g、3.0g又は3.2gから6.0g又は6.4gまで増加させることができる。本明細書に記載される遊離β-アラニンの合計1日摂取量を調節するこれらの例は、個人がどのようにしてパフォーマンスレベルを上昇させる、又は達成されるパフォーマンスレベルを維持することができるかの例となることを意図するものであり、これらの例は本発明を限定することを意図するものではない。
【００５９】
本開示から、個人が、遊離β-アラニンの摂取をより多量又はより少量の合計1日摂取量のβ-アラニンの有効量の間で周期的に変更（cycle）することができることも理解されるであろう。例えば、個人は、非補給日を含めて28日間、有効量として遊離β-アラニン又はそのエステル若しくは塩の合計1日量6.4gを摂取し、続いて非補給日を含めて28日間、有効量として遊離β-アラニン又はそのエステル若しくは塩を1.6g摂取し、続いて非補給日を含めて28日間、有効量として遊離β-アラニン又はそのエステル若しくは塩を6.4g摂取することができる。この周期の例で記載した期間及び合計1日摂取量が、個人の体格による必要量及び所望のレベルに基づいて調節できることも理解されるであろう。
【００６０】
本発明の開示を通して当業者に理解されるように、他の成分、例えばクレアチン、他のアミノ酸、及び炭水化物が、遊離アミノ酸β-アラニン又はそのエステル若しくは塩について記載されたのと同様の量でヒト用栄養補助食品中に存在することができる。
【実施例】
【００６１】
一実施形態において、心的外傷後ストレス障害（PTSD）の動物モデルにおける行動反応及び神経内分泌反応に対して、30日間のβ-アラニン（BA）の摂取（100g・kg-1）を検討した。動物に、30日間のBA補給（100mg・kg-1）をして、又は補給をせずに（PL）通常の食餌を与えた。補給期間の後、動物は、PTSD様の行動を刺激する動物モデルにおける使用が実証されている捕食者の匂いストレス（predator-scent stress、PSS）又はシャム（UNEX）にさらされた。暴露7日後、高架式十字迷路法及び聴覚性驚愕反応により行動を評価した。コルチコステロン濃度（CS）、脳由来神経栄養因子（BDNF）の発現、及び脳カルノシン濃度を1日後に分析した。PSS＋PLの動物は、PSS＋BA、UNEX＋BA、又はUNEX＋PLよりもオープンアーム内の滞在時間及びEPM内の侵入回数が有意に少なかった。PSS＋BAの動物はUNEX＋BAと同等のスコアを有していた。不安指標は、PSS＋BA又は暴露されていない動物と比較してPSS＋PLでより高かった（p＜0.05）。ASR及び凍結行動は、暴露されていない動物と比較してPSSに暴露された動物でより大きかった（p＜0.05）。CS発現は、暴露されていない動物と比較してPSSに暴露された動物でより高かった（p＜0.05）。海馬及び他の脳切片における脳カルノシン濃度は、PLと比較してBAを補給した動物で有意に高かった。海馬のCA1及びDG小領域におけるBDNF発現は、暴露され、BAを補給された動物、又は暴露されていない動物と比較して、暴露され、標準の食餌を与えられた動物で低かった（p＜0.05）。このように、BA補給は、脳カルノシン濃度の上昇、PTSD様行動の減少をもたらすことができ、これは海馬におけるBDNF発現を維持することによって部分的に仲介され得る。
【００６２】
結論として、本研究の結果から、30日間のβ-アラニン摂取が心的外傷後ストレス障害に関連した生理的反応を改善できることが示される。
【００６３】
方法
動物：
体重200-250gmの成体オスSprague-Dawleyラット（n＝122）を、少なくとも7日間、飼育条件に慣れさせた。全ての動物を、安定した温度、逆転した12時間の明／暗サイクルを有し、餌及び水を無制限に摂取できる生態動物園（vivarium）のケージあたり4匹ずつ飼育した。β-アラニンはグルコマンナンと共に80：20の配合比の粉末形態で与えた。体重1kgあたり100mgの粉末をラットに与えた（合計30mgの粉末を25mlの水に溶解した）。PL処理されたラットに、同じ相対用量のベヒクル（グルコマンナン）を与えた。動物は1日1回扱った。全ての試験を暗赤色灯条件で暗期に実施した。本研究は、「アメリカ国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針（the National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）」の原則及びガイドラインに従って行った。全ての処置及び試験の手法はイスラエルのネゲヴ・ベン＝グリオン大学（Ben-Gurion University of the Negev）の動物実験委員会（Animal Care Committee）によって承認された。
【００６４】
実験設計：
ラットを4つの処置群（群あたりn＝30又は31）の1つにランダムに割り当てた：
１）非暴露及びベヒクル処置群（UNEXP+PL）：ラットに標準の食餌及び水を30日間与え、新しく未使用のトイレ砂（litter）に15分間暴露した。
２）非暴露及びβ-アラニン処置群（UNEXP+BA）：ラットにβ-アラニンを含む水を与え、新しく未使用のトイレ砂に15分間暴露した。
３）暴露及びベヒクル処置群（EXP+PL）：ラットに標準の食餌及び水を30日間与え、PSSに15分間暴露した。
４）暴露及びβ-アラニン処置群（EXP+BA）：ラットにβ-アラニンを含む水を与え、PSSに暴露した。
【００６５】
全てのラットに標準の粉末型の食餌を与える7日間の馴化期間の後、ラットを4つの群にランダム化した。標準の食餌、又はβ-アラニンを補給した食餌を30日間与えた後、ラットをPSS又はシャムプロトコルに暴露させた。全ての行動試験をPSS又はシャムプロトコルの7日後に実施し、24時間後にラットを犠牲にして脳を摘出した。食餌は試験終了時まで維持した。このモデルの有効性はいくつかの研究で実証されている（Cohen et al., 2004; 2012b; Kozlovsky et al., 2007）。
【００６６】
捕食者の匂いストレス（PSS）
30日間の補給レジメンの後、動物をPSSプロトコルに暴露した。PSSプロトコルは、閉鎖環境中で、十分に汚れたネコ用トイレ砂（well-soiled cat litter）(ネコが2日間使用し、糞便を除いたもの)の上に実験動物を10分間置くこととした。対照動物は新しい未使用のトイレ砂に同じ時間だけ暴露させた。状況を思い出させるものは、新しい未使用のネコ用トイレ砂の上に15分間動物を置くこととした。
【００６７】
評価スケジュール
高架式十字迷路、聴覚性驚愕反応及び状況的凍結行動（contextual freezing）で行動反応を評価した。EthoVision自動追跡システム（Noldus Information Technology, The Netherlands）を使用して全ての結果を記録し、分析した。高架式十字迷路内での行動及び聴覚性驚愕反応はPSSへの最初の暴露の7日後に実施した。状況的凍結行動の測定は、最初の暴露後の8日目に実施した。これらの測定の実施のPSSからの遅れは、極端な行動変化が暴露の7日後に安定し、長期間持続する（Cohen and Zohar, 2004; Cohen et al., 2004）「慢性症状」（Cohen et al., 2004）を示すという知見に基づく。行動評価の後、全ての動物を犠牲にし、分析のために脳を摘出した。
【００６８】
行動測定
高架式十字迷路（EPM）
EPM内で行われる行動評価は、以前に記載されている（Cohen H et al., 2003; 2012）。EPMは、2つの反対方向のオープンアーム及び２つの反対方向のクローズドアーム（中央のプラットフォームに向けてのみ開いており、三方は高さ14cmの不透明の壁で囲まれている）を有する十字型のプラットフォームである。ラットをオープンアームに向けて中央のプラットフォーム上に置き、迷路を5分間探索させた。各セッションをビデオに録画し、続いて独立した観察者によってスコア付けした。アームへの侵入は4本の肢の全てがアームに侵入するものとして定義した。評価した行動は以下のものであった：オープンアーム及びクローズドアーム内、及び中央のプラットフォーム上に滞在した時間（持続時間）；オープンアーム及びクローズドアームへの侵入回数；及び探索合計（全てのアームへの侵入）。探索合計は、探索行動障害、クローズドアームに限られた探索（回避）及び自由探索を識別するために、迷路の任意のアームへの侵入回数として算出した。EPM行動測定値を統合する指標である「不安指標」は以下のようにして算出した：
2018507870.tif 000002
不安指標の数値は0-1の範囲であり、指標の増加は不安様行動の増大を表す。
【００６９】
聴覚性驚愕反応
驚愕反応は、2つの換気された驚愕チャンバー（SR-LAB system, San Diego Instruments, San Diego, CA）を使用して測定した。SR-LAB目盛り単位を常に使用して、試験チャンバー間、及び経時的な一貫性のある重心計（stabilimeter）感度を確実なものとした。各プレキシガラス（Plexiglas）シリンダーを、防音の換気したチャンバー内のプラットフォーム上に置く。チューブ内部の動きをフレーム下部の圧電型加速度計で検出する。各試験チャンバー内の騒音レベルを騒音レベルメーターを使用して常に測定して一貫性のある提示を確実にする。各試験セッションは、68dBのバックグラウンドホワイトノイズに対する5分間の馴化時間で開始し、続いて6つのブロックで30回の聴覚性驚愕試験刺激を与えた（30秒間又は45秒間の試験間インターバルをおいて40msの110dBのホワイトノイズ）。行動評価は、平均驚愕振幅（全30回の試験の平均）及び聴覚的パルスの反復的提示に対する驚愕馴化パーセントから構成された。馴化パーセント−最初のブロックの音刺激に対する反応と最後のものに対する反応との変化パーセント−は、以下のようにして算出した：
2018507870.tif 000003
【００７０】
状況的凍結行動測定
凍結行動は、状況を思い出させるもの／キューへの暴露時にスコア付けされ、全ての動き（呼吸を除く）がなくなるものと定義された（Kim et al., 1992）。合計累積凍結時間（各評価期間で凍結していた秒数の合計）を測定し、全時間のパーセンテージとして計算した。凍結行動をオーバーヘッドビデオカメラを用いて記録し、記録された画像を用いて不動性についてスコア付けした。ビデオテープ及び記録した画像の双方を、処理条件を知らない熟練の観察者がスコア付けした。
【００７１】
血液採取
各群20匹のラットの頭部をギロチンで切り落とした。状況によるストレスを最小限にするために注意した：それぞれの犠牲の間で場所を十分に洗浄し、死体は取り除いた。胴体からの血液を採取し、室温で2時間置き、次いでHermle遠心分離機で遠心分離した（1000g、4℃で10分）。血清（各ラットからおよそ1ml）を回収し、分析を行うまで-80℃で保存した。
【００７２】
血清コルチコステロンの測定
血清コルチコステロンは、ELISA Test Kit（Endocrine Technologies Inc. Newark, CA）を用い、製造業者の説明書に従って測定した。プレートを450nmで読取った。反応は全て二重に測定した。アッセイ間の変動は6.1％であり、アッセイ内の変動は5.9％であった。全てのサンプルを二重に測定した。このアッセイで検出可能な最低レベルは0.1ng/mL血清である。
【００７３】
脳内BDNFレベル
組織調製
行動試験の24時間後、各群10匹の動物を深麻酔し（ケタミン及びキシラジンの混合物）、冷した0.9％生理食塩水、次いで0.1M リン酸緩衝液（pH7.4）中の4％パラホルムアルデヒド（Sigma-Aldrich）を経心腔的にかん流した。脳を速やかに取り除き、同じ固定液中に12時間4℃で後置（postfixed）し、4℃の0.1M リン酸緩衝液中30％スクロースで一晩凍結防止処置を行った。脳をドライアイス上で凍結し、-80℃で保存した。各動物について、クライオスタット（Leica CM1850）を使用して背側海馬のレベルの連続的冠状切片（serial coronal sections、10μm）を回収し、被覆したスライド上に載せた。
【００７４】
免疫蛍光
スライスした切片を風乾し、凍結メタノール中（2分間）及び4％パラホルムアルデヒド中（4分間）でインキュベートした。Tween20を含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（PBS/T, Sigma-Aldrich）で3回洗浄した後、切片を（PBS中の正常ヤギ又はウマ血清）中のブロッキング溶液中で60分間、次いでBDNFに対する一次抗体（それぞれ1:250；Abcam）と共に4℃で一晩インキュベートした。PBS/Tで3回洗浄した後、2％正常血清を含有するPBS中のDyLight-488中で切片を2時間インキュベートした。切片を洗浄し、封入剤（mounting medium、Vectrastain Vector laboratories, USA）と共に封入した。対照の染色は、一次抗体なしで実施した。更に、二次蛍光標識を用いて交差反応性をチェックし、切片を一次抗体なしでインキュベートして二次抗体の非特異的結合をチェックした。
【００７５】
定量
コンピューターを使った画像解析システム（Leica Application Suite V3.6, Leica, Germany）を免疫染色の定量分析のために使用し、50倍の対物レンズを用いて海馬内のBDNF-IR陽性細胞の数を、3つの（別個に計数する）領域：CA1部分領域（subfield）、CA3部分領域、及び歯状回（DG）に分けて評価した。目的の領域の輪郭を描き、コンピューターを使った評価により、CA1及びCA3の錐体層、及びDGの顆粒層内のBDNF-IR細胞の数を計算した。各群の各動物から海馬の7つの代表的な区域（ブレグマ-2.30〜ブレグマ-3.60の間）を選択した。選択した区域を、処理プロトコルを知らない2名の観察者が分析した。標準的な技術を使用して、それぞれの調べた海馬構造について単位領域当たりのBDNF細胞プロファイルの数を評価した。
【００７６】
脳カルノシン濃度の測定
脳ホモジェネートにおけるカルノシン濃度をLC-MS-MS分析によって測定した。
脳を氷上で部分的に融解し、6つの脳領域をサンプルとした：大脳皮質、視床下部、海馬、へんとう体、嗅球、及び視床。各サンプルを秤量し、更なるホモジナイゼーションのために個々のバイアルに移した。
【００７７】
脳サンプルを、Polytron Homogenizerを使用して、1mM EDTAを添加した生理食塩水（0.9％ NaCl；100 mg/1 ml）中でホモジナイズした。LC/MS/MS分析前にホモジェネートを-20℃±5℃で保存した。Sigmaから購入したL-カルノシンを用いて較正曲線のための標準品を調製した（ppbで）。サンプルを分析前に5倍に希釈した。標準曲線から読み取った濃度に希釈率をかけ、ppm単位に変換した。
【００７８】
統計解析
統計解析は一元配置分散分析（ANOVA）を使用して行った。F値（F ratio）が有意である場合、LSD事後解析を用いてペアワイズ比較を行った。全てのデータを平均±SDとして報告する。ピアソンの積率相関を使用して、選択された二変量相関を決定した。p＜0.05のαレベルを用いて統計的有意性を決定した。データはSPSS v22ソフトウェア（SPSS Inc., Chicago, IL）を使用して解析した。
【００７９】
結果：
高架式十字迷路：
オープンアーム内に滞在した時間についての群間の比較から、有意な効果が示された（F (3, 118) = 7.06, p＜0.001）。事後解析から、標準の食餌を与えられ、PSSに暴露された動物は、他の全ての処理群よりも、オープンアーム内に有意に短い時間滞在した（p値の範囲は＜0.001〜0.012）ことが示された。他の群間では、オープンアーム内に滞在した時間の差は認められなかった（図１Ａを参照されたい）。オープンアームへの侵入の比較（図１Ｂを参照されたい）でも、群間の有意な相互作用が示された（F (3, 118) = 9.55, p＜0.001）。標準の食餌を与えられ、PSSに暴露された動物は、全ての他の処理群よりも有意に少ない（p＜0.001）回数の侵入を示した（p＜0.001）。オープンアームへの侵入において他の群間での差異は認められなかった。
【００８０】
全ての群のEPM上での全活動性の分析（図１Ｃを参照されたい）から、群間での有意差はなかった（F (3, 118) = 0.925, p = 0.431）。統合された行動測定値に基づいて、不安指標における有意差が群間で認められた（図１Ｄを参照されたい）（F (3, 118) = 8.05, p＜0.001）。標準の食餌を与えられ、PSSに暴露された動物は、他の処理群よりも有意に大きな不安を示した（p値の範囲は＜0.001〜0.002）（図１Ｄを参照されたい）。他の群間での影響は認められなかった。
【００８１】
急性驚愕反応及び驚愕馴化：
聴覚驚愕振幅（amplitude）における群間比較から、群間の有意差が明らかになった（F (3, 118) = 14.02, p＜0.001）（図２Ａを参照されたい）。驚愕振幅は、食餌によらず、暴露されていない動物と比較して（p＜0.001）、PSSに暴露され、標準の食餌を与えられた動物において、また、標準の食餌を与えられた（p＜0.001）又はBAを補給された（p = 0.0001）未暴露の動物と比較して、PSSに暴露され、BAを補給された動物において、有意に大きかった。更に、PSSに暴露され、食餌にBAを補給された動物は、BAを補給されずに暴露された動物よりも驚愕振幅が低い傾向を有していた（p = 0.085）。驚愕馴化においても有意な差が認められた（F (3, 118) = 9.11, p＜0.001）（図２Ｂを参照されたい）。食餌にかかわらず、PSSに暴露された動物は、全ての他の群よりも有意に低い馴化スコアを有していた（p＜0.001）。群間で他の有意な差は認められなかった。
【００８２】
8日目における凍結行動に対するキュー暴露の影響
図３は、キュー暴露後の凍結行動を示す。凍結行動において群間で有意な差が見られた（F (3,118) = 9.342, p＜0.001）。PSSに暴露され、標準の食餌を与えられた動物は、暴露されず、標準の食餌を与えられた（p＜0.001）又はBAを補給した食餌を与えられた（p＜0.001）動物よりも、キューによる有意に大きな不動性を有していた。PSSに暴露され、BAを補給された動物も、暴露されず、標準の食餌を与えられた（p = 0.01）又はBAを補給した食餌を与えられた（p = 0.003）動物よりも、キューによる有意に大きな不動性を有していることが観察された。PSSに暴露され、BAを補給された動物は、PSSに暴露され、標準の食餌を与えられた動物よりも凍結が約6％短かかった（40.9％に対して34.8％）。しかしながら、この差異は統計的に有意ではなかった（p = 0.148）。
【００８３】
PSS暴露8日後のコルチコステロン濃度
コルチコステロン濃度において、群間での有意な差異が観察された（F(3,76)=13.883, p＜0.001、図４）。PSSに暴露し、標準の食餌を与えられた動物におけるコルチコステロン濃度は、暴露せず、同様の食餌を与えられた（p＜0.001）又はBAを補給された（p＜0.001）動物よりも有意に高かった。更に、PSSに暴露し、BAを補給された動物も、暴露せず、標準の食餌を与えられた（p＜0.001）又は暴露せず、BAを補給された（p＜0.001）動物よりも有意に高いコルチコステロン濃度を有していることが観察された。暴露し、BAを補給されたラットと比較して、暴露し、標準の食餌を与えられたラットでは有意差は認められなかった（p=0.837）。
【００８４】
PSS暴露8日後のBDNF発現
CA1、CA3及びDG小領域におけるBDNF発現の群間比較をそれぞれ図５Ａ−５Ｃに観察することができる。CA1（F (3, 36) = 23.2, p＜0.001）及びDG（F (1, 36) = 4.126, p = 0.013）小領域では有意差が認められた。CA3小領域（F (1, 36) = 0.918, p = 0.442）では群間で有意差が観察されなかった。PSSに暴露され、標準の食餌を与えられた動物のCA1及びDG小領域のBDNF発現は、他の全ての群よりも有意に低かった（p値範囲＜0.001〜0.011）。更に、PSSに暴露し、BAを補給された動物におけるBDNF発現は、暴露されなかった動物よりも有意に低かった（r値範囲0.009〜0.024）が、CA1のみで、暴露され、標準の食餌を与えられたラットよりも有意に高かった（p＜0.001）。DG小領域では、PSSに暴露され、しかしBAを補給された動物におけるBDNF発現は、暴露されず、標準の食餌を与えられた（p=0.765）又はBAを補給された（p=0.818）動物と統計的な差異はなかったが、暴露され、BAを与えられた動物におけるBDNFの発現は、暴露され、標準の食餌を与えられた動物よりも高かった（p=0.011）。他の差異は認められなかった。
【００８５】
PSS暴露8日後の脳カルノシン濃度
脳の様々な領域におけるカルノシン濃度を表１に見ることができる。有意差は、海馬（F (3, 36) = 5.818, p = 0.002）、大脳皮質（F (1, 36) = 6.659, p = 0.001）、視床下部（F (3, 36) = 5.348, p = 0.004）、へんとう体（F (3, 36) = 3.825, p = 0.018）、及び視床（F (3, 36) = 5.162, p = 0.005）で認められた。嗅球では有意差は認められなかった（F (3, 36) = 2.051, p = 0.124）。海馬、大脳皮質、視床下部、へんとう体、及び視床では、BAを摂取し、PSSに暴露された動物は、暴露によらず、標準の食餌を与えられた動物よりも有意に高いカルノシン濃度を有していた（p値の範囲は＜0.001〜0.011）。PSSに暴露されず、BAを補給された動物は、暴露されず標準の食餌を与えられた動物と比較して、海馬（p = 0.030）及び視床（p = 0.042）において有意に高いカルノシン濃度を有していた。PSSに暴露されず、BAを補給された動物間の更なる比較から、大脳皮質、視床下部及びへんとう体において、暴露にかかわらず、標準の食餌を与えられた動物と比較して、強い傾向が生じているようであった（p値の範囲は 0.051〜0.089）。暴露され、標準の食餌を与えられた動物と比較して、暴露されず、BAを補給された動物間の比較では、差異が認められないのは視床下部（p = 0.113）及びへんとう体（p = 0.115）のみであった。
【００８６】
【表１】
2018507870.tif 000004
ａ＝UNEX＋PLと有意に異なる；
ｃ＝PSS＋PLと有意に異なる；
UNEX＋PL＝捕食者の匂いストレスに暴露されず、標準の食餌を与えられた動物；
UNEX＋BA＝捕食者の匂いストレスに暴露されず、β-アラニンを補給された動物；
PSS＋PL＝捕食者の匂いストレスに暴露され、標準の食餌を与えられた動物；
PSS＋BA＝捕食者の匂いストレスに暴露され、β-アラニンを補給された動物。
全てのデータを平均±SDとして報告する。
【００８７】
考察
本研究の結果から、ラットにおけるβ-アラニンの30日間の摂取が、試験されたPSS暴露と関連する行動の一部を弱くする上で有効であることが示された。標準の食餌を与えられ、PSSに暴露されたラットは、高架式迷路内に置かれた時に活動性が有意に少ないことが観察され、暴露されていない動物、又は暴露され、BAを補給された動物と比較して、より大きな不安レベルを有していた。暴露されたがβ-アラニンを補給された動物では、暴露され、補給を受けていない動物よりも19％低い驚愕反応（p = 0.085）及び15％低い凍結反応（（p = 0.148）を示した。
【００８８】
本研究で使用したPTSDの動物モデルは、特定のストレス反応パターンの生体分子及び生理的パラメーターを検討する正当かつ有効な方法として以前に確立されている。このモデルはまた、ストレスに対する行動反応に対する様々な介入の効果を測定するための有効なアプローチとしても確立されている。UNEX＋PL又はUNEX＋BAに対するPSS＋PLの驚愕振幅応答のそれぞれの差（2.5〜2.2倍高い）は、以前の報告での2.5倍の増大と一致していた。本研究でのPSSへの暴露はまた、暴露されていない動物と比較して、不安指標の30％の上昇、及び凍結反応のほぼ2倍の増大をもたらした。
【００８９】
PSSへの暴露はまた、ストレス7日後の血漿コルチコステロン濃度の有意な上昇を伴っていた。これは、同じストレスモデルを使用した他の研究と一致していた。グルココルチコイドの上昇は、ストレスへの暴露と関連しているが、近年の証拠から、グルココルチコイドの上昇が、回復の促進／障害において役割を果たしている可能性が示唆されている。以前の研究から、急性ストレスに対する視床下部・下垂体・副腎系応答の鈍化がPTSD様の症状の感受性を高める可能性があり、これが高用量のコルチゾン投与治療によって回復できることが示されている。しかしながら、グルココルチコイド濃度は、逆U字効果を実証しているようである。低濃度はPTSDの予測因子であり得るが、高濃度が、ストレス時に見られるマイナスの行動応答にも寄与するニューロンの形態学的変化と関連していることも示唆された。海馬は急性ストレス及び慢性ストレスの双方に対して感受性を有する。慢性ストレス反応は海馬内、特にDG-CA3領域におけるニューロンに可逆性のリモデリングを生じさせる脳内グルココルチコイド発現を上昇させ得る。これらの変化はしばしば、海馬依存性の記憶機能を低下させ得る樹状突起の萎縮と関連している。対照的に、BDNFは、神経発生及び樹状突起のリモデリングを促進することで神経可塑性に対して逆の効果を有していることが報告されている。本研究でPSSに暴露されたラットの双方の群で観察されたコルチコステロン濃度の上昇は、これらの動物が経験したストレスを示しているようであった。しかしながら、BAを補給された動物は、その不安レベル及びEPM内での挙動に関して、ストレスから回復しているようであり、ストレスに対するより大きな抵抗性を実証した。これは、脳カルノシンレベルの上昇及びBDNFの発現上昇の双方と関連している可能性がある。このことは、本研究で観察されたCA1及びDG部分領域におけるBDNF発現の上昇で見られた、試験した動物の驚愕反応（それぞれ r = -0.341, p = 0.031 及び r = -0.523. p = 0.001）及び凍結反応（それぞれ r = -0.572, p < 0.001 及び r = -0.335. p = 0.035）の低下との関連性により裏付けられる。
【００９０】
本研究でβ-アラニンを補給されたラットは、脳のほぼ全てのセグメントにおいて、カルノシン濃度の有意な上昇を経験した。β-アラニンの補給は嗅球におけるカルノシン濃度に影響を有していないようであった。このことは、おそらくほとんどの哺乳動物種の嗅球で一般的に見られる高濃度のカルノシンと関連している。しかしながら、他の脳領域内のカルノシン濃度の差から、β-アラニンを補給した食餌がマウス及びニワトリの脳カルノシン濃度を上昇させることができることを示した以前の研究が支持される。脳内カルノシンは、ノルエピネフリンの脳内代謝産物の低減によって、又はその構成成分の1種であるヒスチジンを介したヒスタミン感作性ニューロンの刺激を通して、うつ様の行動を弱めることができる。他の研究者から、カルノシンが脳の抗酸化活性に影響し得ることが示唆されており、一方で、視床下部及び大脳皮質内の脳カルノシン濃度の上昇がマウス海馬のBDNF濃度の上昇と関連することが報告されている。本研究では、PSS＋BA群における脳カルノシン濃度の上昇が、PSS＋PLラットと比較して、海馬のCA1及びDG部分領域におけるBDNF発現の維持と関連していた。海馬、大脳皮質、視床下部、へんとう体及び視床におけるカルノシン濃度の上昇は、不安指標と逆に相関し（rの範囲は -0.471〜-0.550、p＜0.002）、オープンアーム内の滞在時間の改善と正に相関していた（rの範囲は 0.453〜0.521、p＜0.003）。
【００９１】
PSSに暴露され、標準の食餌を与えられた齧歯類で観察されたBDNF発現の有意な低下は、BDNF発現の減弱及びPTSD様の行動ストレス応答を報告した以前の研究と一致している。β-アラニンの摂取及びその後の脳でのカルノシン合成は暴露されていないラットにおけるBDNF発現を上昇させないようであったが、PSSに暴露されたラットにおけるBDNF発現を維持するようであった。UNEX＋BA及びUNEX＋PLの双方における類似のBDNF発現から、脳カルノシンレベルの上昇が、BDNF発現の変化に直接関連していないことが示唆された。これらの表面上の結果は、β-アラニン摂取後の海馬ホモジネートにおけるBDNF濃度の有意な上昇を示した研究と対照的であるようである。しかしながら、先の研究者等は対照として非ストレス群を用いていなかった。脳カルノシンの上昇及び海馬におけるBDNF発現の維持のメカニズムは十分に理解されていないが、抗酸化剤としてのその作用を介した神経保護剤としての作用と関連し得る。脳における酸化ストレス及び炎症は、PTSDの進行及び更なる増悪を引き起こすことが実証されている。従って、抗酸化剤としてのカルノシンの役割は、グルココルチコイドの上昇と関連する神経変性を防止し、BDNF発現を間接的に維持し得る。
【００９２】
まとめると、本研究の結果から、30日間のβ-アラニン補給はPSSからの回復力（resiliency）及び／又は回復（recovery）を促進するらしいということが示される。脳内カルノシンの上昇と関連する保護効果は、海馬内のBDNF発現の保護と関連し得る。β-アラニンはPTSDの治療又は予防のための栄養補給として使用することができる。
【００９３】
上記の記載は本発明の特定の実施形態に関連するものであるが、他の変更及び改変が当業者には明らかであり、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく実施できることが理解される。更に、本発明の一実施形態と関連付けて記載された特徴は、明確に記載されていなくても、他の実施形態との関連で使用し得る。
【図１Ａ】
2018507870.tif 000005
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2018507870.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2018507870.tif 000014
【図５Ｃ】
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【国際調査報告】
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