(57)【要約】  本発明は、牛樟芝から抽出された化合物及びその調製方法を提供する；また、本発明は、AC006、AC007、AC009、AC011、AC012、AC007-H1、AC009-H1及びAC012-H1からなるグループから選択された前記牛樟芝化合物を開示し、該化合物は肝癌、脳腫瘍、前立腺癌、乳癌、大腸癌と黒色腫を抑制する効果を有する。
2018507175.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物AC007-H1は下記のように：
【化１】
2018507175.tif 000022
【請求項２】
化合物AC009-H1は下記のように：
【化２】
2018507175.tif 000023
【請求項３】
化合物AC012-H1は下記のように：
【化３】
2018507175.tif 000024
そのうち該R1は水素基やアセチル基である。
【請求項４】
癌を治療する医薬組成物は、治療に有効な量の化合物、及び少なくとも一つの薬学的に許容されるキャリア、塩類やプロドラッグを含むことを特徴とする；該化合物はAC006、AC007、AC009、AC011、AC012、AC007-H1、AC009-H1、及びAC012-H1からなるグループから選択されるか、又は前記化合物のいずれかの少なくとも二つからなる組成物から選択される。
【請求項５】
該キャリアは賦形剤、希釈剤、増粘剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、油性や非油性の基剤、界面活性剤、懸濁化剤、ゲル化剤、補助剤、防腐剤、酸化防止剤、安定剤、色素や香料を含むことを特徴とする請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
該医薬組成物は癌細胞の増殖を抑制することで治療することを特徴とする請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
該医薬組成物は静脈注射、皮下注射、経口や塗抹の方法で患者に投与することを特徴とする請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項８】
該医薬組成物は溶液、乳剤、懸濁剤、粉末、錠剤、油剤、軟膏剤、経口剤、カプセルを含む剤形をすることを特徴とする請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項９】
癌を治療する方法は、有効な量の請求項４に記載の医薬組成物を投与することを特徴とする。
【請求項１０】
該癌は前立腺癌、肝癌、黒色腫、脳腫瘍、大腸癌からなるグループから選択されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該癌は大腸癌と肝癌であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
該医薬組成物は静脈注射、皮下注射、経口、や塗抹の方法で患者に投与することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
牛樟芝菌糸体で生物活性を有する化合物及びその誘導体を調製する方法は、以下のステップを含む：
牛樟芝菌糸体をｎ-ヘキサンで二回に還流抽出し、それぞれ一時間から三時間まで行った後、二回の抽出液を混合して濾過する；
７０−３２０ウェルのシリカゲル（silica gel）（７０−２３０ｍesh）を取り菌糸体と１：１（ｗ／ｗ）の重量比でカラムに充填し、ｎ-Hexane／酢酸エチル（Ethyl acetate）で勾配溶出し、溶出物はF1、F2とF3という割合に分けられ、それぞれの勾配は１７−２２％のEthyl acetate、２３−２７％のEthyl acetate及び２８−３３％のEthyl acetateであり、F3を保持時間（retention time）の順序に基づいて三つの段階F3-1~F3-3に分ける；
F3-1を取って移動相であるジクロロメタン／アセトン（CH2Cl2/Acetone）を用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（極性は50：1から20：1まで勾配溶出する）、40：1−15：1という段階を取り、更に順相MPLCでカラムを半分取しｎ-Hexane／Ethyl acetate（4：1）で分離純化してから化合物AC006を得る；
F3-2を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/Acetoneを用いてに勾配分離し（100％：0％  to 70%:30%）、95％:5％から85％:15％までの段階を取ってF3-2-1からF3-2-3まで三つの段階に分ける；
F3-2-3を更に分離純化し、移動相であるn-hexane/Acetoneを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（100%:0% to 0%:100%）、n-hexane/Acetone=90/10から70/30までの段階を取って移動相であるn-hexane/Acetoneを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し続けて（100%:0% to 0%:100%)、n-hexane/Ethyl acetate=60/40にAC007を得る；
F-3-3を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/Acetoneを用いて勾配溶出分離し（100％：0％  to 0%:100%）、90％:10％から70％:30％までの段階を取ってF3-3-1からF3-3-5まで五つの段階に分ける；F-3-3-5（CH2Cl2/Acetone=73/27の段階）を更に分離純化し、移動相であるn-hexane/Acetoneを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離して（95%:5% to 50%:50%）、85%:15% to 70%:30%段階を取ってF3-3-5-1からF3-3-5-5まで五つの段階に分ける；
F3-3-5-1（n-hexane/Acetone=90/10-80/20）を更に逆相MPLC  C-18カラムクロマトグラフィーで分離純化し、移動相である1％のメタノール／Methanol＝35％／65％から20％／80％まで勾配溶出し、28%/72%-22%/78%の段階を取って移動相であるn-hexane/Ethyl acetate=80%:20%から50%:50%までシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、n-hexane/Ethyl acetate=75%:25%-65%:35%にAC012を得る；
F3-3-5-3を更に逆相MPLC  C-18シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離純化し、移動相である1％のメタノール／Methanol＝25／75などの勾配で15ｍL／minの流速で溶出し、AC009が主とする段階（保持時間は130‐170min）を取って更に純化し、移動相であるCH2Cl2/Ethyl acetateを用いて（silica gel）シリカゲルカラムクロマトグラフィーで勾配溶出し（90%:0% to 0%:100%）、CH2Cl2/Ethyl acetate=80%/20%- 60%/40%にAC009を得る；
F3-3-5-4（n-hexane/Acetone=76/24)を取って逆相MPLC  C-18カラムクロマトグラフィーで分離純化し、移動相である1％のメタノール／Methanol＝25％:75％などまで勾配溶出し、純化産物はAC011である；
ここにおいて、該AC006、AC007、AC009、AC011、AC012はすなわち生物活性を有する化合物である。
【請求項１４】
該生物活性を有する化合物は更にC4が水酸基である誘導体の調製に適用でき、以下のステップを含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法：１モル当量のメタノールで該生物活性を有する化合物を加水分解させる；加水分解反応が終わった後アンバライト樹脂を加えて濾紙で濾過した後中間産物を得る；シリカゲルカラムクロマトグラフィーで該中間産物を分離し、n-ヘキサンと酢酸エチルを移動相とし、勾配比例をn-ヘキサンと酢酸エチル4:1から1:1までとして、勾配比例が1:1である時点に産物を収集する；該産物を逆相HPLC及びC18によりカラムを半取分し純化し、メタノール／FAバッファで75:25で勾配溶出し、C4がヒドロキシル基である誘導体を得ることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は牛樟芝から純化された化合物、その調製方法及び用途に関する；特には該化合物が癌細胞の増殖及び血管の新生を抑制し、それにより癌を治療する効果に達することができるものを示す。
【背景技術】
【０００２】
牛樟芝（Antrodia camphorata、以前はAntrodia cinnamomeaと命名された）は牛樟樹（Cinnamomum kanchirai Hayata、lauraceae）の空洞部に寄生するキノコで、台湾だけに生息するキノコである。昔から伝承医療に、樟芝は優れた解毒剤として、食物中毒や農薬中毒に適用でき、民間には肝炎や肝臓関連の病気の治療に用いる。樟芝は高度な薬用価値があり、栽培しにくくて成長は遅い原因で、今まで樟芝に対するゲノミクス及びメタボロミクスは研究され（Lu et al. 2014 PNAS、Lin et al. 2011 J Agr Food Chem）、それで牛樟芝の医薬用途及び栽培方法をもっと認識することを狙っている。
【０００３】
牛樟芝には高分子の多糖類と小分子のトリテルペン類化合物などの多種類の生物活性を有する物質が薬物として利用できる。そのうち多糖類は様々な単糖が結合したもので存在し、スペクトルで分析すると多糖類は1,3- β‐D‐グルカン（1,3-β-D-glucan）という成分を有することが分かる。報道された牛樟芝多糖にある多種類の医療用途は、血管新生を抑制すること（Yang et al. 2009 J Ethnopharmacol、Cheng et al. 2005 Life Sci）、免疫を抑制すること（Meng et al. 2012 Nutrition）、免疫反応を調節し且つ喘息を抑制すること（Liu et al. 2010 Immunology）、B型肝炎ウイルスを抑制すること（Lee et al. 2002 FEMS Microbiol Lett）、癌細胞の成長を抑制すること（Liu et al. 2004 Toxicol Appl Pharmacol、Lee et al. 2014 Food Funct）などを含む；更にアントロダン（antrodan）は、牛樟芝から抽出された糖タンパク質（glycoprotein、protein-bound polysaccharide）で、肝臓が受ける損傷を避ける機能を有する（Ker et al. 2014 PLoS ONE、TW500628、US 7763723）。
【０００４】
また、トリテルペン類化合物（Triterpenoids）は牛樟芝の主要な医薬用化合物であり、牛樟芝にある苦味の主な根源でもある。初期にはCherng et al.がエルゴスタン（ergostane）である三種類の新型なトリテルペン類化合物：antcins A-C(Ｃherng et al.1995 J Nat Prod)、及び四種類の新型なトリテルペン類化合物：antcins  E-F、methyl antcinate G、methyl antcinate H(Cherng et al. 1996 Phytochemistry)を開示した。その後何十種類のトリテルペン類化合物には、癌細胞の成長を抑制すること（Wu et al. 2010 J Nat Prod）、免疫反応を抑制すること（Liaw et al. 2013 J Nat Prod）、肝癌や肝炎を治療すること（Lien et al. 2014 Molecules）、疲労を抵抗すること（Huang et al. 2012 Evid Based Complement Altern Med）などを含む医療効果があると報道された。
【０００５】
米国特許申請US7109232には牛樟芝から純化された五種類の新型な化合物及びその用途が開示され、その用途は炎症及び腫瘍への抵抗を含む；US7732482には前記化合物が器官線維症を抑制する効果を有することが開示された。US7342137には、多種類の癌細胞の成長を抑制する効果を有する新型な牛樟芝化合物グループが開示された。US7745647には子実体から分離した新型なジテルペン類化合物が開示され、それは神経細胞を保護する効果を有する。US7994158には牛樟芝から純化されたデヒドロスルフレン酸（dehydrosulphurenic acid）が開示され、それは腫瘍細胞、特に白血病や膵癌を抑制する効果を有する。US7531627には分子量が29ｋDaである新型な牛樟芝タンパク質ACA1が開示され、それは免疫を促進する効果及び癌を治療する潜在力を有する。
【０００６】
牛樟芝の癌を抑制するメカニズムは化合物の化学構造によって異なっている。Yeh et al.はセスキテルペンラクトンアントロシン（sesquiterpene lactone antrocin）がJAK２／STAT３のメッセージ伝送経路を抑制でき、それによりアポトーシス（apoptosis）を誘発することを報道した（Yeh et al. 2013 Carcinogenesis）；Yang et al.は牛樟芝でHER-2／neuのメッセージ伝送を抑制するほか、卵巣癌を抑制できることを報道した（Yang et al. 2013 J Ethnopharmacol）；Wang et al.はアントロキノノールD（antroquinonol D）がDNAを脱メチル化にすることができ、且つ癌を抑制する潜在力を有することを報道した（Wang et al. 2014 J Agric Food Chem）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
要約すると、牛樟芝は抗癌の潜在力を有する物質を含み、多種類の癌に対して治療効果があることがすでに検証されたが、まだ新型な化合物が存在しているかどうか、及びどんな化合物が抗癌効果を有するかということについてはほとんど知られていない。もしも牛樟芝から新型な化合物を純化する上、その構造と効果を分析できれば、癌の治療に応用でき、新薬の開発にも役に立つ。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の目的は、AC007-H1化合物を提供することであり、該化合物は下記に示された：
【化１】
2018507175.tif 000003
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、AC009-H1化合物を提供することであり、該化合物は下記に示された：
【化２】
2018507175.tif 000004
【００１０】
本発明のもう一つの目的は、AC012-H1化合物を提供することであり、該化合物は下記に示された：
【化３】
2018507175.tif 000005
【００１１】
本発明はまた癌を治療するための医薬組成物を提供し、それには治療に有効な量の化合物、及び少なくとも一種類の薬学的に許容されるキャリア、塩類、やプロドラッグが含まれ、該化合物はAC006、AC007、AC009、AC011、AC012、AC007-H1、AC009-H1及びAC012-H1からなるグループから選択されるか、又は前記化合物の少なくとも二つから任意に組み合わせ得る。
【００１２】
そのうち、該キャリアは賦形剤、希釈剤、増粘剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、油性や非油性の基剤、界面活性剤、懸濁化剤、ゲル化剤、補助剤、防腐剤、酸化防止剤、安定剤、色素や香料を含む。
【００１３】
そのうち、該医薬組成物は癌細胞の増殖を抑制することで治療する。
【００１４】
そのうち、該医薬組成物は静脈注射、皮下注射、経口、や塗抹の方法で患者に投与する。
【００１５】
そのうち、該医薬組成物は溶液、乳剤、懸濁剤、粉末、錠剤、油剤、軟膏剤、経口剤、カプセルを含む剤形をする。
【００１６】
本発明はまた癌を治療する方法を提供し、有効な量の医薬組成物を投与し、該医薬組成物は治療に有効な量の前記化合物を含む。
【００１７】
そのうち、該癌は前立腺癌、肝癌、黒色腫、脳腫瘍、大腸癌からなるグループから選択される。
【００１８】
そのうち、比較的に良い実施様態には、該がんが大腸癌と肝癌である。
【００１９】
そのうち、該医薬組成物は静脈注射、皮下注射、経口や塗抹の方法で患者に投与する。
【００２０】
本発明は更に牛樟芝菌糸体で生物活性を有する化合物及びその誘導体を調製する方法を提供し、それは以下のステップを含む：
牛樟芝菌糸体をｎ-ヘキサンで二回に還流抽出し、それぞれ一時間から三時間まで行った後、二回の抽出液を混合して濾過する；
７０−３２０ウェルのシリカゲル（silica gel）（７０−２３０ｍesh）を取り菌糸体と１：１（ｗ／ｗ）の重量比でカラムに充填し、ｎ-Hexane／酢酸エチル（Ethyl acetate）の勾配で溶出し、溶出物はF1、F2とF3という割合に分けられ、それぞれの勾配は１７−２２％のEthyl acetate、２３−２７％のEthyl acetate及び２８−３３％のEthyl acetateであり、F3を保持時間（retention time）の順序に基づいて三つの段階F3-1~F3-3に分ける；
F3-1を取って移動相であるジクロロメタン／アセトン（CH2Cl2/Acetone）を用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（極性は50：1から20：1まで勾配溶出する）、40：1−15：1という段階を取り、更に順相MPLCでカラムを半分取しｎ-Hexane／Ethyl acetate（4：1）で分離純化してから化合物AC006を得る；
F3-2を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/Acetoneを用いて勾配分離し（100％：0％  to 70%:30%）、95％:5％から85％:15％までの段階を取ってF3-2-1からF3-2-3まで三つの段階に分ける；
F3-2-3を更に分離純化し、移動相であるn-hexane/Acetoneを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（100%:0% to 0%:100%）、n-hexane/Acetone=90/10から70/30までの段階を取って移動相であるn-hexane/Acetoneを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し続けて（100%:0% to 0%:100%)、n-hexane/Ethyl acetate=60/40にAC007を得る；
F-3-3を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/Acetoneを用いて勾配溶出分離し（100％：0％  to 0%:100%）、90％:10％から70％:30％までの段階を取ってF3-3-1からF3-3-5まで五つの段階に分ける；F-3-3-5（CH2Cl2/Acetone=73/27の段階）を更に分離純化し、移動相であるn-hexane/Acetoneを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離して（95%:5% to 50%:50%）、85%:15% to 70%:30%段階を取ってF3-3-5-1からF3-3-5-5まで五つの段階に分ける；
F3-3-5-1（n-hexane/Acetone=90/10-80/20）を更に逆相MPLC  C-18カラムクロマトグラフィーで分離純化し、移動相である1％のメタノール／Methanol＝35％／65％から20％／80％まで勾配溶出し、28%/72%-22%/78%の段階を取って移動相であるn-hexane/Ethyl acetate=80%:20%から50%:50%までシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、n-hexane/Ethyl acetate=75%:25%-65%:35%にAC012を得る；
F3-3-5-3を更に逆相MPLC  C-18シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離純化し、移動相である1％のメタノール／Methanol＝25／75などの勾配で15ｍL／minの流速で溶出し、AC009が主とする段階（保持時間は130‐170min）を取って更に純化し、移動相であるCH2Cl2/Ethyl acetateを用いて（silica gel）シリカゲルカラムクロマトグラフィーで勾配溶出し（90%:0% to 0%:100%）、CH2Cl2/Ethyl acetate=80%/20%- 60%/40%にAC009を得る；
F3-3-5-4（n-hexane/Acetone=76/24)を取って逆相MPLC  C-18カラムクロマトグラフィーで分離純化し、移動相である1％のメタノール／Methanol＝25％:75％などまで勾配溶出し、純化産物はAC011である；
ここにおいて、該AC006、AC007、AC009、AC011、AC012はすなわち生物活性を有する化合物である。
【００２１】
ここにおいて、比較的良い実施様態には、該生物活性を有する化合物を更にC4がヒドロキシル基である誘導体の調製に用いられるが、下記ステップを含む：
１モル当量のメタノールで該生物活性を有する化合物を加水分解させる；
加水分解反応が終わった後アンバライト樹脂を加えて濾紙で濾過した後中間産物を得る；
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで該中間産物を分離し、n-ヘキサンと酢酸エチルを移動相とし、勾配比例をn-ヘキサンと酢酸エチル4:1から1:1までとして、勾配比例が1:1である時点に産物を収集する；
該産物を逆相HPLC及びC18によりカラムを半取分し純化し、メタノール／FAバッファで75:25で勾配溶出し、C4がヒドロキシル基である誘導体を得ることができる。
また、本発明は血管の新生と癌細胞の増殖を抑制する組成物を提供し、それは上記牛樟芝抗生物質、適当な希釈剤、賦形剤を含み、該組成物は高い増殖能力を持つ細胞の増殖を抑制できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は本発明の抽出物AC012が血管の新生を抑制する能力を示す；それぞれはEPC細胞の培養に（A）制御組、0.1μｇ／ｍｌの（B）AC012、0.3μｇ／ｍｌの（C）AC012、１μｇ／ｍｌの（D）AC012を加える。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書に使用するあらゆる技術性及び科学専門用語は、別に定義されたものを除いて、全部当業者が理解できる共通的意味を持つ。本発明は下記実施例で説明されるが、それらの例に限られない。別に説明されるものを除き、本発明が使用する材料は全部市販されて取得しやすく、下記はただ取得できるルートの例を示す。
【００２４】
専門用語「治療」、「治療に用いる」及びそれに類似する用語は患者が患っている診断可能な病気及び該病気による相関的な病症を遅延、改善、削減、や逆転する方法及び該病気やそれが属するいずれかの病症を予防する方法を指す。
【００２５】
専門用語「薬学的に許容される」とは物質や組成物がその薬学的な製剤にあるほかの成分と相容れるべきる上、患者の病症を悪化させない意味をする。
【００２６】
本発明が提供する化合物や組成物は当業者に知られている技術で、本発明が提供する化合物や組成物を、少なくとも一種類の薬学的に許容されるキャリア（vehicle）と結合し、本発明の組成物に適用する剤形を調製できるものを指す。ここにおいて該剤形は溶液、乳剤、懸濁液、粉末、錠剤、経口剤、タブレット、チューインガム、カプセル及びほかの類似物や本発明に適用する剤形を含むがそれらに限るわけではない。
【００２７】
専門用語「薬学的に許容されるキャリア」は下記から選択される一種類や多種類のタイプを含む：溶剤、乳化剤、懸濁剤、分解剤、結合剤、賦形剤、安定化剤、キレート剤、希釈剤、ゲル化剤、防腐剤、潤滑剤、界面活性剤及びほかの類似物や本発明に適用するキャリア。
【００２８】
前記組成物において、また需要によって一種類や多種類の上記製剤分野で通常に使用する溶解補助剤、緩衝剤、着色剤、調味剤などを適切に添加できる。
【００２９】
専門用語「薬学的に許容される賦形剤」はポリマー、樹脂、可塑剤、充填剤、潤滑剤、希釈剤、結合剤、崩壊剤、溶媒、共溶媒、界面活性剤、防腐剤、甘味剤、香味剤、医薬グレードの染料や顔料、及び増粘剤の少なくとも一つを含むがそれらに限られない。
【００３０】
専門用語「医薬組成物」は固体や液体組成物を指し、それは患者に投与しやすい適切な形式、濃度と純度をし、投与された後、ほしい生理的変化を誘発できる；医薬組成物は無菌及び／又は非発熱性のもの（non-pyrogenic）である。
【００３１】
専門用語「有効な量」は予期の生体反応を生成し、引き起こす必要な使用量を指すが、治癒する必要な定量ではない。当業者には理解でき、医薬組成物の有効な量が下記原因で変化する可能性はある：希望の生物終点、予定に提供する生物活性剤、カプセル化マトリックス（encapsulating matrix）の組成、目的組織など。
【００３２】
実施例1 牛樟芝化合物の調製
【００３３】
牛樟芝の液体発酵菌糸体をｎ−ヘキサン（n-hexane）で二回還流（reflux）させ、各回は１−３時間行う；排気し濾過した後、二回のn-hexane抽出液を合併する；７０−２３０ウェルのシリカゲル（silica gel）（７０‐２３０mesh）を取って菌糸体と１：１（ｗ／ｗ）の重量比でカラムに充填し、n-Hexane／酢酸エチル（Ethyl acetate）で勾配溶出し、溶出物はF1、F2とF3の三層に分けられ（fraction）、勾配はそれぞれ17-22%のEthyl acetate、23-27%のEthyl acetate及び28-33%のEthyl acetateで、F3を保持時間（retention time）の順序によって三つの段階F3-1~F3-3に分ける。
【００３４】
F3-1を取って移動相であるジクロロメタン／アセトン（CH2Cl2/Acetone）を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（極性が５０：１から２０：１まで勾配溶出する）、４０：１−１５：１の段階を取り、順相HPLC（Medium pressure liquid chromatography）でカラムを半取分し純化しn-Hexane / Ethyl acetate （４：１）で分離純化して化合物AC006を得る。
【００３５】
F3-2を順相MPLC（Medium pressure liquid chromatography）シリカゲルカラムクロマトグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/ Acetoneで勾配分離し（100%:0% to 70%: 30%）、95％：5％から85％：15％までの段階を取り三つの段階に分ける；F3-2-3を更に分離純化し、移動相であるn-hexane/Acetoneを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（100%:0% to 0%:100%）、n-hexane/Acetone=90/10から70/30までの段階を取って移動相であるn-hexane/Ethyl acetateを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（100%:0% to 0%:100%）n-hexane/Ethyl acetate=60/40にAC007を得る。
【００３６】
F-3-3を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて、移動相であるCH2Cl2/ Acetoneで勾配分離し（100%:0% to 0%: 100%）、90％：10％から70％：30％までの段階を取り五つの段階に分ける；F-3-3-5(CH2Cl2/Acetone=73/27の段階)を更に分離純化し、移動相であるn-hexane/Acetoneを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（95％：5％ to 50％：50％）、85%:15%から70%:30%までの段階を取って五つの段階に分ける；F3-3-5-1（n-hexane/Acetone=90/10-80/20）を取り逆相MPLC  C-18カラムクロマトグラフィーで更に分離純化し、移動相である１％のメタノール水溶液/ Methanol=35％/65％から20％/80％を勾配として、28％/72％−22％/78％の段階を取って更に移動相である n-hexane/Ethyl acetate=80%:20%から50％/50％までシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、n-hexane/Ethyl acetate=75%:25%-65%:35%にAC012を得る。
【００３７】
F3-3-5-3を取って逆相（reverse phase）MPLC  C-18カラムクロマトグラフィーで分離純化し、移動相である１％のメタノール水溶液/ Methanol=25/75を用いて１５ml/minの流速で勾配（isocratic）溶出し、AC009を主とする段階（保持時間は１３０−１７０min）を取って更に純化し、移動相であるCH2Cl2/Ethyl acetate以（silica gel）シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離して勾配溶出し（90%:0% to 0%:100%）、CH2Cl2/Ethyl acetate=80%/20%- 60%/40%にAC009を得る。
【００３８】
F3-1を取り逆相MPLC  C-18シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離純化し、移動相である１％のメタノール水溶液/ Methanol=25%/75%を用いて１５ml/minの流速で勾配溶出し、純化産物はAC-05-01である。
【００３９】
F3-3-5-4（n-hexane/Acetone=76/24）を取り逆相MPLC  C-18シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離純化し、移動相である１％のメタノール水溶液/ Methanol=25%/75%を用いて１５ml/minの流速で勾配溶出し、純化産物はAC011。
【００４０】
ここにおいて該抽出物はAC006、AC007、AC009、AC011、AC012すなわち牛樟芝にある抗がん活性を有する化合物。
【００４１】
実施例２  牛樟芝化合物の化学構造に対する分析
【００４２】
前記抽出された化合物は、スペクトル分析でその化学構造を識別し、１D/２D  NMR及び質量分析計の使用が含まれる。該化合物の構造分析結果は下記のとおりである：
【００４３】
実施例２．１
【化４】
2018507175.tif 000006
【００４４】
EIMS, m/z 471.2701 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.77 (1H, d, J = 3.2 Hz, H-4), 5.18 (1H, t, J = 5.6 Hz, H-12), 5.16 (1H, t, J = 6.4 Hz, H-8), 5.11 (1H, dt, J = 1.6, 8.8 Hz, H-16), 4.43 (1H, q, J=6.8, H-15), 4.00 (3H, s, H-24), 3.62 (3H, s, H-23), 2.53 (1H, m, H-6), 2.29 (1H, m, H-7a), 2.24 (2H, m, H-14), 2.11 (2H, m, H-11), 2.10 (3H, s, -OAc), 2.08 (1H, m, H-10a), 2.02 (1H, m, H-7b), 1.94 (1H, m, H-10b), 1.92 (1H, m, H-5), 1.71 (3H, d, J = 1.2 Hz, H-18), 1.66 (3H, d, J = 1.2 Hz, H-19), 1.64 (3H, s, H-20), 1.58 (3H, s, H-21), 1.18 (3H, d, J = 6.8 Hz, H-22); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 199.2 (s, C-1), 171.6 (s, - COCH3), 160.7 (s, C-3), 138.9 (s, C-2), 138.8 (s, C-9), 134.9 (s, C-17), 132.9 (s, C-13), 129.6 (d, C-16), 128.4 (d, C-12), 122.2 (d, C-8), 70.4 (d, C-4), 68.1 (d, C-15), 61.2 (q, C-23), 60.4 (q, C-24), 49.2 (t, C-14), 44.4 (d, C-5), 42.6 (d, C-6), 40.9 (t, C-10), 28.1 (t, C-7), 27.6 (t, C-11), 26.1 (q, C-18), 21.0 (q, - COCH3), 18.5 (q, C-19), 16.8 (q, C-20), 16.5 (q, C-21), 13.3 (q, C-22).
【００４５】
実施例２．２
【化５】
2018507175.tif 000007
【００４６】
EIMS, m/z 471.2690 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.76 (1H, d, J = 3.1 Hz, H-4), 5.57 (1H, m, H-16), 5.55 (1H, m, H-15), 5.16 (1H, t, J = 7.3 Hz, H-12), 5.15 (1H, t, J = 7.1 Hz, H-8), 3.99 (3H, s, H-24), 3.61 (3H, s, H-23), 2.52 (1H, m, H-6), 2.27 (1H, m, H-7a), 2.11 (2H, m, H-11), 2.10 (3H, s, -OAc), 2.02 (1H, m, H-7b), 2.00 (2H, m, H-10), 1.93 (1H, m, H-5), 1.59 (3H, s, H-20), 1.58 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-14), 1.57 (3H, s, H-21), 1.25 (3H, s, H-19), 1.25 (3H, s, H-18), 1.17 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-22); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 199.1 (s, C-1), 171.4 (s, - COCH3), 160.6 (s, C-3), 140.5 (d, C-16), 138.9 (s, C-2), 138.7 (s, C-9), 135.1 (s, C-13), 126.2 (d, C-15), 126.1 (d, C-12), 122.1 (d, C-8), 71.1 (s, C-17), 70.3 (d, C-4), 61.1 (q, C-23), 60.2 (q, C-24), 44.2 (d, C-5), 43.5 (t, C-14), 42.5 (d, C-6), 40.8 (t, C-10), 30.0 (q, C-18), 30.0 (q, C-19), 28.0 (t, C-7), 27.5 (t, C-11), 20.8 (q, - COCH3), 16.3 (q, C-21), 16.1 (q, C-20), 13.1 (q, C-22).
【００４７】
実施例２．３
【化６】
2018507175.tif 000008
【００４８】
EIMS, m/z 471.26498 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.77 (1H, d, J = 3.2 Hz, H-4), 5.39 (1H, td, J = 7.2, 1.2 Hz, H-16), 5.16 (1H, td, J = 7.2, 0.8 Hz, H-12), 5.16 (1H, td, J = 7.2, 0.8 Hz, H-8), 4.00 (3H, s, H-23), 3.91 (2H, s, H-18), 3.62 (3H, s, H-24), 2.53 (1H, m, H-6), 2.28 (1H, m, H-7a), 2.14 (2H, m, H-11), 2.14 (2H, m, H-15), 2.10 (3H, s, -OAc), 2.04 (1H, m, H-7b), 2.03 (2H, m, H-10), 2.03 (2H, m, H-14), 1.92 (1H, m, H-5), 1.64 (3H, s, H-19), 1.62 (3H, s, H-20), 1.58 (3H, s, H-21), 1.18 (3H, d, J = 7.2 Hz, H-22); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 199.2 (s, C-1), 171.6 (s, - COCH3), 160.8 (s, C-3), 138.9 (s, C-2), 138.8 (s, C-9), 136.0 (s, C-13), 136.0 (s, C-17), 126.7 (d, C-16), 125.7 (d, C-12), 122.2 (d, C-8), 70.5 (d, C-4), 69.1 (t, C-18), 61.3 (q, C-24), 60.4 (q, C-23), 44.4 (d, C-5), 42.6 (d, C-6), 41.0 (t, C-10), 40.7 (t, C-14), 28.1 (t, C-7), 27.6 (t, C-16), 27.5 (t, C-11), 21.0 (q, - COCH3), 16.5 (q, C-21), 16.3 (q, C-20), 13.9 (q, C-19), 13.1 (q, C-22).
【００４９】
実施例２．４
【化７】
2018507175.tif 000009
【００５０】
EIMS, m/z 473.2846 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.77 (1H, d, J = 3.2 Hz, H-4), 5.16 (1H, t, J = 7.6 Hz, H-8), 5.13 (1H, t, J = 7.2 Hz, H-12), 4.00 (3H, s, H-24), 3.62 (3H, s, H-23), 3.38 (1H, d, J = 10.2 Hz, H-18a), 3.31 (1H, d, J = 5.6 Hz, H-18b), 2.53 (1H, m, H-6), 2.26 (1H, m, H-7a), 2.13 (2H, m, H-11), 2.10 (3H, s, -OAc), 2.04 (1H, m, H-7b), 2.00 (2H, m, H-10), 1.96 (2H, m, H-14), 1.93 (1H, m, H-5), 1.60 (3H, s, H-20), 1.58 (3H, s, H-21), 1.56 (1H, m, H-17), 1.36 (2H, m, H-15), 1.06 (2H, m, H-16), 1.06 (3H, d, J = 4.8 Hz, H-22), 0.90 (3H, d, J = 6.8 Hz, H-19); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 198.9 (s, C-1), 171.3 (s, - COCH3), 160.5 (s, C-3), 138.7 (s, C-9), 138.6 (s, C-2), 136.2 (s, C-13),  125.3 (d, C-12), 122.0 (d, C-8), 70.3 (d, C-4), 68.4 (t, C-18), 61.1 (q, C-23), 60.2 (q, C-24), 44.2 (d, C-5), 42.5 (d, C-6), 41.0 (t, C-14), 40.9 (t, C-10), 36.8 (d, C-17), 34.0 (t, C-16), 28.0 (t, C-7), 27.4 (t, C-11), 26.5 (t, C-15), 20.9 (q, - COCH3), 17.2 (q, C-19), 16.4 (q, C-21), 16.0 (q, C-20), 13.2 (q, C-22).
【００５１】
実施例２．５
【化８】
2018507175.tif 000010
【００５２】
EIMS, m/z 475.2553 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.81 (1H, d, J = 3.2 Hz, H-4), 5.57 (1H, m, H-16), 5.55 (1H, m, H-15), 5.15 (1H, t, J = 6.8 Hz, H-12), 5.12 (1H, t, J = 7.2 Hz, H-8), 3.99 (3H, s, H-23), 3.62 (3H, s, H-22), 2.66 (1H, d, J = 5.2 Hz, H-14),  2.38 (2H, m, H-6), 2.09 (3H, s, -OAc), 2.05 (2H, m, H-11), 2.03 (1H, m, H-7a), 2.01 (2H, m, H-10), 1.99 (1H, m, H-7b), 1.92 (1H, m, H-5), 1.58 (3H, s, H-20), 1.58 (3H, s, H-21), 1.25 (3H, s, H-19), 1.25 (3H, s, H-18); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 197.1 (s, C-1), 171.6 (s, - COCH3), 161.8 (s, C-3), 140.5 (d, C-15), 139.5 (s, C-2), 135.2 (s, C-13), 126.2 (d, C-16), 126.0 (d, C-12), 122.2 (d, C-8), 121.9 (s, C-9), 71.1 (s, C-17), 71.1 (d, C-4), 61.1 (q, C-22), 60.0 (q, C-23), 43.5 (t, C-14), 40.8 (t, C-10), 39.2 (t, C-6), 38.3(d, C-5), 30.1 (t, C-7), 30.0 (q, C-18), 30.0 (q, C-19), 27.5 (t, C-11), 20.7 (q, - COCH3), 16.3 (q, C-21), 16.2 (q, C-20).
【００５３】
実施例２．６
【化９】
2018507175.tif 000011
【００５４】
EIMS, m/z 385.2379 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.25 (1H, t, J = 4.3 Hz, H-12), 5.20 (1H, t, J = 4.8 Hz, H-8), 4.69 (1H, m, H-15), 4.16 (1H, q, J = 4.1 Hz, H-4), 2.73 (1H, m, H-17), 2.36 (1H, m , H-14a), 2.31 (1H, m, H-6), 2.29 (1H, m, H-7a), 2.27 (2H, m, H-3), 2.23 (1H, m, H-14b), 2.19 (1H, m, H-16a), 2.16 (2H, m, H-11), 2.08 (2H, m, H-10), 2.02 (1H, m, H-7b), 1.98 (1H, m, H-16b), 1.88 (2H, m, H-2), 1.67 (3H, s, H-20), 1.65 (3H, s, H-21), 1.41 (1H, m, H-5), 1.23 (3H, d, J = 4.9 Hz, H-19), 1.06 (3H, d, J = 4.3 Hz, H-22); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 213.8 (s, C-1), 182.7 (s, H-18), 137.9 (s, C-9), 131.8 (s, C-13), 129.3 (d, C-12), 122.7 (d, C-8), 78.8 (d, C-15), 76.2 (d, C-4), 48.6 (d, C-6), 48.2 (d, C-5), 46.0 (t, C-14), 40.6 (t, C-10), 36.6 (t, C-3), 35.7 (t, C-16), 35.1 (d, C-17), 32.9 (t, C-7), 29.6 (t, C-2), 27.5 (t, C-11), 16.5 (q, C-20), 16.3 (q, C-21), 16.0 (q, C-19), 11.8 (q, C-22).
【００５５】
実施例３  牛樟芝化合物の置換基修飾
【００５６】
前記牛樟芝化合物の化学構造を分析した後、そのC3とC4置換基を修飾する；その置換基で改造された産物がC4に水酸基（−OH）で置換されたものは、H1で標識される；その置換基で改造された産物がC4に水酸基で置換され且つC4にジメトキシ（dimethoxy）で置換されたものは、H2で標識される。
【００５７】
１モル当量のNaOMe （Sodium methoxide)及び無水エタノールを溶剤としてAC012を加水分解反応させる。加水分解プロセスをTLC(thin layer chromatography)で監視測定し、完全に反応した後アンバーライト樹脂（amberlite）を加えて中和反応させ、またamberliteを濾紙で濾過した後中間産物を得る。
【００５８】
該中間産物を順相システムを利用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分析し、シリカゲルで樹脂を分離し、hexane/ethyl acetateを流動相とし、溶出比例はhexane:ethyl acetate=4:1から1:1まで、溶出プロセスをTLCで監視測定し、AC012-H1とAC012-H2の混合物はhexane:ethyl acetate=1:1である時点に溶出され、それを収集して濃縮し、濃縮された産物を得る。
【００５９】
濃縮された該産物を逆相HPLCで最後に純化し、C18でステンレス製カラムを半分取し、移動相であるエタノール：0.1％のリン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline）＝75：25を用いて単一比例で溶出する。
AC012-1の保持時間（retention time）は約31minから25minまで；AC012-H2は39minから43minまで。
【００６０】
AC012-H1及びAC012-H2の化学構造は下記に示すように：
AC012-H1
【化１０】
2018507175.tif 000012
【化１１】
2018507175.tif 000013
同じ置換基の加水分解方法は本発明が提供する他の牛樟芝化合物にも適用できる。
【００６１】
初期半応物がAC007であれば、AC007-H1の保持時間は36‐43min；AC007-H2の保持時間は47‐53min。
【００６２】
初期反応物がAC009であれば、AC009-H1の保持時間は27‐32min；AC009-H2の保持時間は35‐40min。
【００６３】
実施例４  牛樟芝化合物が血管新生を抑制する効果
【００６４】
本発明はSR8試験及び血管形成試験（matrigel capillary tube formation assay）を使用し、牛樟芝から純化される化合物が血管新生を抑制する効果を分析する。
【００６５】
SRB試験はヒト内皮前駆細胞（EPC、endothelial progenitor cells）を5*103の細胞/培養皿ウェル（cell/well）の数量比例で96ウェルの培養皿に置き、且つそれを無血清（serum free）の培地に置かせて48時間飢餓状態にさせた後、10％のFBS培地及び異なる濃度のAC012に入れて48時間培養し、AC012の濃度はそれぞれ0.1、0.3、1、3、10と30マイクログラム/ミリリットル（μg/ml）。処理薬物で培養した後の培地を取り出して、培養皿のウェルに100マイクロリットル（μl）10％のトリクロロ酢酸（trichloroacetic acid）（ｗ/ｖ）を加え、4℃で1時間放置することで細胞を固定する。培養皿を脱イオン水で洗浄して乾燥する。それぞれのウェルに50マイクロリットル0.4％のSulforhodamine B (SRB) (w/v)（また1％の酢酸を含む）を加えて室温で5min放置し、次に1％の酢酸で細胞と結合しないSRBを洗浄してから乾燥する。細胞と結合したSRBを100マイクロリットル10ｍMのTrisバッファ（ｐHは10.5）で溶解し、且つ光度計で495ｎｍに定量する。
【００６６】
Matrigel capillary tube formation試験は下記ステップを含む：Matrigelを10μl/wellで15ウェルの培養皿に加え、37℃で30min放置してゲル層（gel layer）を形成する。その後、5*103のEPC細胞、VEGF(vascular endothelia growth factor)、及び濃度が異なっているAC012（0、0.1、0.3、1μg/ml）を培養皿のウェルに入れ、37℃、5％の二酸化炭素という条件で16時間放置する。その後、位相差顕微鏡（inverted contrast phase microscope (Nikon, Japan)）で細胞の生成を観察する。
【００６７】
AC012が血管新生を抑制する効果：IC50は29μg/ml；1μg/mlのAC012は31.89％の血管新生を抑制できる。
【００６８】
実施例５  牛樟芝化合物が癌細胞の増殖を抑制する効果
【００６９】
SRB試験で牛樟芝から純化される化合物及びその誘導体が癌細胞の増殖を抑制する効果を分析する；この実施例はすなわちAC006、AC007、AC009、AC011とAC012、及びその加水分解で置換基を改造した産物が、多種類の癌細胞株の増殖を抑制する効果を分析するわけである。
【００７０】
それぞれの細胞株を5*103cell/wellsの数量比例で96ウェルの培養皿に置き、且つそれを無血清（serum free）の培地で48時間飢餓状態にさせた後、10％のFBS培地及び0.1、0.3、1、3、10と30μg/mlなどという濃度のAC006、AC007、AC009、AC011、AC012に入れて48時間培養する。処理薬物で培養した後の培地を取り出して培養皿のウェルに100マイクロリットル（μl）10％のトリクロロ酢酸（trichloroacetic acid）（ｗ/ｖ）を加え、4℃で1時間放置することで細胞を固定する。培養皿を脱イオン水で洗浄して乾燥する。それぞれのウェルに50マイクロリットル0.4％のSulforhodamine B (SRB) (w/v)（また1％の酢酸を含む）を加えて室温で5min放置し、次に1％の酢酸で細胞と結合しないSRBを洗浄してから乾燥する。細胞と結合したSRBを100マイクロリットル10ｍMのTris緩衝液（ｐHは10.5）で溶解し、且つ光度計で495ｎｍに定量する。
【００７１】
実施例5.1  AC006の抑制効果
【００７２】
AC006で4種類の異なる癌をテストし、7種類の異なる癌細胞株は含まれ、それは半数の癌細胞の増殖を抑制できる有効な濃度、すなわちIC50効果、その結果はフラフ１に掲示される：
【表１】
2018507175.tif 000014
【００７３】
実施例5.2  AC007及びその誘導体の抑制効果
【００７４】
AC007で5種類の異なる癌をテストし、7種類の異なる癌細胞株は含まれ、そのIC50効果の結果はフラフ2、グラフ3に掲示される：
【表２】
2018507175.tif 000015
【表３】
2018507175.tif 000016
【００７５】
実施例5.3  AC009及びその誘導体の抑制効果
【００７６】
AC009及びその誘導体で4種類の異なる癌をテストし、10種類の異なる癌細胞株は含まれ、そのIC50効果の結果がフラフ4、グラフ5に掲示される：
【表４】
2018507175.tif 000017
【表５】
2018507175.tif 000018
【００７７】
実施例5.4  AC011の抑制効果
【００７８】
AC011で4種類の異なる癌細胞株をテストするIC50効果は、その結果がフラフ6に掲示される：
【表６】
2018507175.tif 000019
【００７９】
実施例5.4  AC012及びその誘導体の抑制効果
【００８０】
AC012及びその誘導体で5種類の異なる癌をテストし、8種類の異なる癌細胞株は含まれ、そのIC50効果の結果がフラフ7、グラフ8に掲示される：
【表７】
2018507175.tif 000020
【表８】
2018507175.tif 000021
【００８１】
実施例に開示されたものをまとめると、本発明は牛樟芝化合物及びその抽出方法を提供し、且つその化学構造を分析し、それが低濃度で血管新生を抑制する効果を開示する；該牛樟芝化合物に基づき、本発明も化学的に新規な化合物を合成する方法を提供する。本発明に開示された新規な抽出方法は該化合物を大量に純化でき、牛樟芝子実体を培養するコストを軽減する。
【００８２】
本発明も該化合物が癌細胞の増殖を抑制できる効果を有することを開示し、癌治療用薬物の調製に適用できる。その他、牛樟芝化合物の加水分解により、その置換基を改造して得る新規な化合物H１は、化合物が癌細胞、特に大腸癌細胞株の増殖を抑制する効果を効果的に向上させることができる；ここでHCT116は低い表現量を特徴とするBax（Wang et al. 2012)、及びgrowth factor(TGFα and EGFR)-independent (Howell et al. 1998)である。更に、本発明で提供される化合物は肝癌細胞にとってもその増殖を抑制する高度な効果を有し、特にアジア人からの上皮様肝癌細胞株（epithelial-like tumorigenic cells）であるHuh-7に対してHFE突然変異を特徴とする（Vecchi et al. 2009）。
【００８３】
要約すると、本発明は牛樟芝化合物を純化する方法を提供し、その化学構造、及びそれが血管新生及び癌細胞の増殖を抑制する効果に関する。
【図１】
2018507175.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成29年11月30日(2017.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）で表される化合物。
【化１】
2018507175.tif 000026
R1は水素又はアセチル基である。
【請求項２】
式（ＩＩ）で表される化合物。
【化２】
2018507175.tif 000027
R1は水素又はアセチル基である。
【請求項３】
式（ＩＩＩ）で表される化合物。
【化３】
2018507175.tif 000028
R1は水素又はアセチル基である。
【請求項４】
癌の治療用の医薬組成物であって、該組成物は、治療に有効な量の化合物、塩類又はプ
ロドラッグと、少なくとも一つの薬学的に許容されるキャリアとを含み、
前記化合物は、AC006、AC007、AC009、AC011、AC012、AC007-H1、AC009-H1及びAC012-H
1からなる群から選択される少なくとも１種である癌の治療用の医薬組成物。
【請求項５】
前記キャリアは、賦形剤、希釈剤、増粘剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、油性及
び非油性の基剤、界面活性剤、懸濁化剤、ゲル化剤、補助剤、防腐剤、酸化防止剤、安定
剤、色素及び香料の少なくとも１種を含む請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記医薬組成物は、癌細胞の増殖を抑制することにより治療効果を有する請求項４に記
載の医薬組成物。
【請求項７】
前記医薬組成物は、静脈注射、皮下注射、経口又は塗布の剤形を有する請求項４に記載
の医薬組成物。
【請求項８】
前記医薬組成物は、溶液、乳剤、懸濁剤、粉末、錠剤、油剤、軟膏剤、経口剤、カプセ
ルを含む剤形を有する請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項９】
有効量の請求項４に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む癌の治療法。
【請求項１０】
前記癌は、前立腺癌、肝癌、黒色腫、脳腫瘍、大腸癌からなる群から選択される少なく
とも１種である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌は大腸癌又は肝癌である請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記医薬組成物を、静脈注射、皮下注射、経口又は塗布の剤形で患者に投与する請求項
９に記載の方法。
【請求項１３】
牛樟芝菌糸体で生物活性を有する化合物及びその誘導体の製造方法であって、
該方法は、
牛樟芝菌糸体をｎ-ヘキサンで二回に還流抽出し、それぞれ一時間から三時間まで行っ
た後、二回の抽出液を混合して濾過し、
７０−３２０ウェルのシリカゲル（silica gel）（７０−２３０ｍesh）を取り菌糸体
と１：１（ｗ／ｗ）の重量比でカラムに充填し、ｎ-Hexane／酢酸エチル（Ethyl acetate
）で勾配溶出し、溶出物はF1、F2とF3という割合に分けられ、それぞれの勾配は１７−２
２％のEthyl acetate、２３−２７％のEthyl acetate及び２８−３３％のEthyl acetate
であり、F3を保持時間（retention time）の順序に基づいて三つの段階F3-1〜F3-3に分け
、
F3-1を取って移動相であるジクロロメタン／アセトン（CH2Cl2/Acetone）を用いて、シ
リカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（極性は50：1から20：1まで勾配溶出する）
、40：1−15：1という段階を取り、更に順相MPLCでカラムを半分取しｎ-Hexane／Ethyl a
cetate（4：1）で分離、精製して化合物AC006を得、
F3-2を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/Acetone
を用いてに勾配分離し（100％：0％  to 70%:30%）、95％:5％から85％:15％までの段階
を取ってF3-2-1からF3-2-3まで三つの段階に分離し、
F3-2-3を更に分離、精製し、移動相であるn-hexane/Acetoneを用いてシリカゲルカラム
クロマトグラフィーで分離し（100%:0% to 0%:100%）、n-hexane/Acetone=90/10から70/3
0までの段階を取って移動相であるn-hexane/Acetoneを用いてシリカゲルカラムクロマト
グラフィーで分離し続けて（100%:0% to 0%:100%)、n-hexane/Ethyl acetate=60/40にAC0
07を得、
F-3-3を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/Aceton
eを用いて勾配溶出分離し（100％：0％  to 0%:100%）、90％:10％から70％:30％までの
段階を取ってF3-3-1からF3-3-5まで五つの段階に分離し、
F-3-3-5（CH2Cl2/Acetone=73/27の段階）を更に分離、精製し、移動相であるn-hexane/
Acetoneを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離して（95%:5% to 50%:50%）
、85%:15% to 70%:30%段階を取ってF3-3-5-1からF3-3-5-5まで五つの段階に分離し、
F3-3-5-1（n-hexane/Acetone=90/10-80/20）を更に逆相MPLC  C-18カラムクロマトグラ
フィーで分離、精製し、移動相である1％のメタノール／Methanol＝35％／65％から20％
／80％まで勾配溶出し、28%/72%-22%/78%の段階を取って移動相であるn-hexane/Ethyl ac
etate=80%:20%から50%:50%までシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、n-hexane
/Ethyl acetate=75%:25%-65%:35%にAC012を得、
F3-3-5-3を更に逆相MPLC  C-18シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離、精製し、
移動相である1％のメタノール／Methanol＝25／75などの勾配で15ｍL／minの流速で溶出
し、AC009が主とする段階（保持時間は130‐170min）を取って更に精製し、移動相である
CH2Cl2/Ethyl acetateを用いて（silica gel）シリカゲルカラムクロマトグラフィーで勾
配溶出し（90%:0% to 0%:100%）、CH2Cl2/Ethyl acetate=80%/20%- 60%/40%にAC009を得
、
F3-3-5-4（n-hexane/Acetone=76/24)を取って逆相MPLC  C-18カラムクロマトグラフィ
ーで分離、精製し、移動相である1％のメタノール／Methanol＝25％:75％などまで勾配溶
出し、生成化はAC011であり、
前記AC006、AC007、AC009、AC011、AC012は、生物活性を有する化合物である製造方法
。
【請求項１４】
１モル当量のメタノールで前記生物活性を有する化合物を加水分解し、
加水分解反応が終わった後、アンバライト樹脂を加えて濾紙で濾過し、中間産物を得、
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで該中間産物を分離し、n-ヘキサンと酢酸エチル
を移動相とし、勾配比例をn-ヘキサンと酢酸エチル4:1から1:1までとして、勾配比例が1:
1である時点に産物を収集し、
該産物を逆相HPLC及びC18によりカラムを取分して精製し、メタノール／FAバッファに
て75:25で勾配溶出して、前記生物活性を有する化合物のC4が水酸基である誘導体を製造
する請求項１３に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は牛樟芝から純化された化合物、その製造方法及び用途に関する。特に、該化合
物が癌細胞の増殖及び血管の新生を抑制し、それにより癌を治療することができる。
【背景技術】
【０００２】
牛樟芝（Antrodia camphorata、以前はAntrodia cinnamomeaと命名された）は牛樟樹（
Cinnamomum kanchirai Hayata、lauraceae）の空洞部に寄生するキノコで、台湾だけに生
息するキノコである。昔から伝承医療に、樟芝は優れた解毒剤として、食物中毒や農薬中
毒に適用でき、民間には肝炎や肝臓関連の病気の治療に用いる。樟芝は高度な薬用価値が
あり、栽培しにくくて成長は遅いため、今まで樟芝に対するゲノミクス及びメタボロミク
スは研究され（Lu et al. 2014 PNAS、Lin et al. 2011 J Agr Food Chem）、それによっ
て、牛樟芝の医薬用途及び栽培方法をより理解することを意図している。
【０００３】
牛樟芝には高分子の多糖類と小分子のトリテルペン類化合物などの多種類の生物活性を
有する物質がが含有され、それが薬物として利用できる。そのうち多糖類は様々な単糖が
結合したもので存在し、スペクトルで分析すると多糖類は1,3- β‐D‐グルカン（1,3-β
-D-glucan）という成分を有している。公表された牛樟芝多糖にある多種類の医療用途は
、血管新生を抑制すること（Yang et al. 2009 J Ethnopharmacol、Cheng et al. 2005 L
ife Sci）、免疫を抑制すること（Meng et al. 2012 Nutrition）、免疫反応を調節し且
つ喘息を抑制すること（Liu et al. 2010 Immunology）、Ｂ型肝炎ウイルスを抑制するこ
と（Lee et al. 2002 FEMS Microbiol Lett）、癌細胞の成長を抑制すること（Liu et al
. 2004 Toxicol Appl Pharmacol、Lee et al. 2014 Food Funct）などを含む。更にアン
トロダン（antrodan）は、牛樟芝から抽出された糖タンパク質（glycoprotein、protein-
bound polysaccharide）で、肝臓が受ける損傷を避ける機能を有する（Ker et al. 2014 
PLoS ONE、TW500628、US 7763723）。
【０００４】
また、トリテルペン類化合物（Triterpenoids）は牛樟芝の主要な医薬用化合物であり
、牛樟芝にある苦味の主な根源でもある。初期にはCherng et al.がエルゴスタン（ergos
tane）である三種類の新型なトリテルペン類化合物、antcins A-C(Ｃherng et al.1995 J
Nat Prod)及び四種類の新型なトリテルペン類化合物、antcins E-F、methyl antcinate 
G、methyl antcinate H(Cherng et al. 1996 Phytochemistry)を開示した。その後、何十
種類ものトリテルペン類化合物には、癌細胞の成長を抑制すること（Wu et al. 2010 J N
at Prod）、免疫反応を抑制すること（Liaw et al. 2013 J Nat Prod）、肝癌及び肝炎を
治療すること（Lien et al. 2014 Molecules）、疲労を低減すること（Huang et al. 201
2 Evid Based Complement Altern Med）などを含む医療効果があると発表された。
【０００５】
米国特許US7109232には牛樟芝から精製された五種類の新型な化合物及びその用途が開
示され、その用途は炎症及び腫瘍への抵抗を含む。US7732482には前記化合物が器官線維
症を抑制する効果を有することが開示された。US7342137には、多種類の癌細胞の成長を
抑制する効果を有する新規な牛樟芝化合物群が開示された。US7745647には子実体から分
離した新型なジテルペン類化合物が開示され、それは神経細胞を保護する効果を有する。
US7994158には牛樟芝から純化されたデヒドロスルフレン酸（dehydrosulphurenic acid）
が開示され、それは腫瘍細胞、特に白血病や膵癌を抑制する効果を有する。US7531627に
は分子量が29ｋDaである新型な牛樟芝タンパク質ACA1が開示され、それは免疫を促進する
効果及び癌を治療する潜在力を有する。
【０００６】
牛樟芝の癌を抑制するメカニズムは化合物の化学構造によって異なっている。Yeh et a
l.はセスキテルペンラクトンアントロシン（sesquiterpene lactone antrocin）がJAK２
／STAT３のメッセージ伝送経路を抑制し、それによりアポトーシス（apoptosis）を誘発
することを発表した（Yeh et al. 2013 Carcinogenesis）。Yang et al.は牛樟芝でHER-2
／neuのメッセージ伝送を抑制するほか、卵巣癌を抑制できることを発表した（Yang et a
l. 2013 J Ethnopharmacol）。Wang et al.はアントロキノノールD（antroquinonol D）
がDNAを脱メチル化し、且つ癌を抑制する潜在力を有することを発表した（Wang et al. 2
014 J Agric Food Chem）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
要約すると、牛樟芝は抗癌の可能性を有する物質を含み、多種類の癌に対して治療効果
があることがすでに検証されたが、まだ新型な化合物が存在しているかどうか及びどんな
化合物が抗癌効果を有するかということについてはほとんど知られていない。牛樟芝から
新型な化合物を精製する上で、その構造と効果を分析できれば、癌の治療に応用でき、新
薬の開発に有効である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の目的は、式（Ｉ）に示した化合物を提供することである。
【化１】
2018507175.tif 000029
R1は水素又はアセチル基である。
【０００９】
そのうち、この化合物はAC007及びAC007-H1であり、下記に示される。
【化２】
2018507175.tif 000030
【００１０】
本発明は、また式（ＩＩ）に示した化合物を提供する。
【化３】
2018507175.tif 000031
R1は水素又はアセチル基である。
【００１１】
この化合物は、AC009及びAC009-H1であり、下記に示される。
【化４】
2018507175.tif 000032
【００１２】
本発明は、更に式（ＩＩＩ）に示した化合物を提供する。
【化５】
2018507175.tif 000033
R1は水素又はアセチル基である。
【００１３】
この化合物はAC012及びAC012-H1であり、下記に示される。
【化６】
2018507175.tif 000034
【００１４】
本発明は、また癌を治療するための医薬組成物を提供する。それには治療に有効な量の
化合物及び少なくとも一種類の薬学的に許容されるキャリア、塩類又はプロドラッグが含
まれる。この化合物はAC006、AC007、AC009、AC011、AC012、AC007-H1、AC009-H1及びAC0
12-H1からなるグループから選択されるか又は前記化合物の少なくとも二つから任意に組
み合わることができる。
【００１５】
キャリアは賦形剤、希釈剤、増粘剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、油性又は非油
性の基剤、界面活性剤、懸濁化剤、ゲル化剤、補助剤、防腐剤、酸化防止剤、安定剤、色
素、香料を含む。
【００１６】
医薬組成物は癌細胞の増殖を抑制することにより、治療に用いられる。
医薬組成物は静脈注射、皮下注射、経口又は塗布の方法で患者に投与される。
医薬組成物は溶液、乳剤、懸濁剤、粉末、錠剤、油剤、軟膏剤、経口剤、カプセルを含
む剤形を有する。
本発明はまた癌を治療する方法を提供し、有効な量の医薬組成物を投与し、該医薬組成
物は治療に有効な量の前記化合物を含む。
癌は前立腺癌、肝癌、黒色腫、脳腫瘍、大腸癌からなるグループから選択される。なか
でも、大腸癌及び肝癌に対して有効である。
医薬組成物は静脈注射、皮下注射、経口又は塗布の方法で患者に投与される。
【００１７】
本発明は更に牛樟芝菌糸体で生物活性を有する化合物及びその誘導体を製造する方法を
提供し、それは以下のステップを含む。
牛樟芝菌糸体をｎ-ヘキサンで二回還流抽出する。それぞれ一時間から三時間まで行っ
た後、二回の抽出液を混合して濾過する。
７０−３２０ウェルのシリカゲル（silica gel）（７０−２３０ｍesh）を取り、菌糸
体と１：１（ｗ／ｗ）の重量比でカラムに充填し、ｎ-ヘキサン／酢酸エチルの勾配で溶
出する。溶出物はF1、F2とF3に分画され、それぞれの勾配は１７−２２％の酢酸エチル、
２３−２７％の酢酸エチル及び２８−３３％の酢酸エチルである。F3を保持時間（retent
ion time）の順序に基づいて三つの段階F3-1〜F3-3に分ける。
F3-1を取って移動相であるジクロロメタン／アセトン（CH2Cl2/Acetone）を用いて、シ
リカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（極性は50：1から20：1まで勾配溶出する）
、40：1−15：1という段階を取り、更に順相MPLCでカラムを分取しｎ-ヘキサン／酢酸エ
チル（4：1）で分離、精製してから化合物AC006を得る。
F3-2を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/Acetone
を用いて勾配分離し（100％：0％  to 70%:30%）、95％:5％から85％:15％までの段階を
取ってF3-2-1からF3-2-3まで三つの段階に分ける。
F3-2-3を更に分離、精製し、移動相であるｎ−ヘキサン／アセトンを用いてシリカゲル
カラムクロマトグラフィーで分離し（100%:0% to 0%:100%）、ｎ−ヘキサン／アセトン=9
0/10から70/30までの段階を取って、移動相であるｎ−ヘキサン／アセトンを用いてシリ
カゲルカラムクロマトグラフィーで分離し続け（100%:0% to 0%:100%)、ｎ−ヘキサン／
酢酸エチル=60/40にAC007を得る。
F-3-3を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/Aceton
eを用いて勾配溶出分離し（100％：0％から 0%:100%）、90％:10％から70％:30％までの
段階を取ってF3-3-1からF3-3-5まで五つの段階に分ける。
F-3-3-5（CH2Cl2/Acetone=73/27の段階）を更に分離、精製し、移動相であるn-hexane/
Acetoneを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離して（95%:5%から 50%:50%
）、85%:15%から70%:30%段階を取ってF3-3-5-1からF3-3-5-5まで五つの段階に分ける。
【００１８】
F3-3-5-1（n-hexane/Acetone=90/10-80/20）を更に逆相MPLC  C-18カラムクロマトグラ
フィーで分離、精製し、移動相である1％のメタノール／Methanol＝35％／65％から20％
／80％まで勾配溶出し、28%/72%-22%/78%の段階を取って移動相であるn-hexane/Ethyl ac
etate=80%:20%から50%:50%までシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、n-hexane
/Ethyl acetate=75%:25%-65%:35%にAC012を得る。
F3-3-5-3を更に逆相MPLC  C-18シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離、精製し、
移動相である1％のメタノール／Methanol＝25／75などの勾配で15ｍL／minの流速で溶出
し、AC009が主とする段階（保持時間は130‐170min）を取って更に精製し、移動相である
CH2Cl2/Ethyl acetateを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで勾配溶出し（90%:
0% から0%:100%）、CH2Cl2/Ethyl acetate=80%/20%- 60%/40%にAC009を得る。
F3-3-5-4（n-hexane/Acetone=76/24)を取って逆相MPLC  C-18カラムクロマトグラフィ
ーで分離、精製し、移動相である1％のメタノール／Methanol＝25％:75％などまで勾配溶
出し、精製物はAC011である。
これらAC006、AC007、AC009、AC011、AC012はすなわち生物活性を有する化合物である
。
【００１９】
好ましい実施様態では、該生物活性を有する化合物を更にC4がヒドロキシル基である誘
導体の製造に用いられ、下記ステップを含む。
１モル当量のメタノールで該生物活性を有する化合物を加水分解させる。
加水分解反応が終わった後アンバライト樹脂を加えて濾紙で濾過した後、中間産物を得
る。
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで該中間産物を分離し、n-ヘキサンと酢酸エチル
を移動相とし、勾配比例をn-ヘキサンと酢酸エチル4:1から1:1までとして、勾配比例が1:
1である時点に生成物を収集する。
この生成物を逆相HPLC及びC18によりカラムを取分して精製し、メタノール／FAバッフ
ァにて75:25で勾配溶出し、C4がヒドロキシル基である誘導体を得る。
また、本発明は血管の新生と癌細胞の増殖を抑制する組成物を提供する。それは上記牛
樟芝抗生物質、適当な希釈剤、賦形剤を含む。この組成物は高い増殖能力を持つ細胞の増
殖を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の抽出物AC012のインビトロでの血管新生を抑制する能力を示す。それぞれはEPC細胞の培養に別々に、（A）対照群、(B)0.1μｇ／ｍｌのAC012、（C）0.3μｇ／ｍｌのAC012、（D）１μｇ／ｍｌのAC012を加えた。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書に使用するあらゆる技術性及び科学専門用語は、別に定義されたものを除いて
、全部当業者が理解できる共通的意味を持つ。本発明は下記実施例で説明されるが、それ
らの例に限られない。別に説明されるものを除き、本発明が使用する材料は全部市販され
て取得しやすく、下記はただ取得できるルートの例を示す。
【００２２】
用語「治療」、「治療に用いる」及びそれに類似する用語は患者が患っている診断可能
な病気及び該病気による相関的な病症を遅延、改善、緩和又は逆転する方法及び該病気や
それが属するいずれかの病症を予防する方法を指す。
用語「薬学的に許容される」とは、物質及び組成物が、その薬学的な製剤にあるほかの
成分を含むことができ、患者の病症を悪化させないことを意味する。
本発明が提供する化合物及び組成物は当業者に知られている技術で、本発明が提供する
化合物及び組成物を、少なくとも一種類の薬学的に許容されるキャリア（vehicle）と組
み合わせ、本発明の組成物に適用する剤形を製造できるものを指す。剤形は溶液、乳剤、
懸濁液、粉末、錠剤、経口剤、タブレット、チューインガム、カプセル及びほかの類似物
、本発明に適用する剤形を含むがそれらに限定されない。
用語「薬学的に許容されるキャリア」は下記から選択される一種類又は多種類のタイプ
を含む。溶剤、乳化剤、懸濁剤、分解剤、結合剤、賦形剤、安定化剤、キレート剤、希釈
剤、ゲル化剤、防腐剤、潤滑剤、界面活性剤及びほかの類似物、本発明に適用するキャリ
ア等である。
【００２３】
前記組成物において、また必要により、一種類又は多種類の上記製剤分野で通常に使用
する溶解補助剤、緩衝剤、着色剤、調味剤などを適切に添加できる。
用語「薬学的に許容される賦形剤」はポリマー、樹脂、可塑剤、充填剤、潤滑剤、希釈
剤、結合剤、崩壊剤、溶媒、共溶媒、界面活性剤、防腐剤、甘味剤、香味剤、医薬グレー
ドの染料及び顔料ならびに増粘剤の少なくとも一つを含むが、それらに限定されない。
用語「医薬組成物」は固体又は液体組成物を指し、それは患者に投与しやすい適切な製
剤、濃度、純度を有し、投与された後、意図する生理的変化を誘発することができる。医
薬組成物は無菌及び／又は非発熱性のもの（non-pyrogenic）である。
用語「有効な量」は意図する生体反応を生じさせ、引き起こす必要な使用量を指すが、
治癒する必要な定量ではない。当業者には理解でき、医薬組成物の有効な量が下記原因で
変化する可能性はある。希望の生物終点、予定に提供する生物活性剤、カプセル化マトリ
ックス（encapsulating matrix）の組成、目的組織などである。
【００２４】
実施例１：牛樟芝化合物の製造
牛樟芝の液体発酵菌糸体をｎ−ヘキサン（n-hexane）で二回還流（reflux）させ、各回
は１−３時間行う。排気し濾過した後、二回のn-hexane抽出液を合わせる。７０−２３０
ウェルのシリカゲル（７０‐２３０mesh）を取って菌糸体と１：１（ｗ／ｗ）の重量比で
カラムに充填し、n-Hexane／酢酸エチル（Ethyl acetate）で勾配溶出する。溶出物を、F
1、F2及びF3の三層に分ける（fraction）。勾配はそれぞれ17-22%のEthyl acetate、23-2
7%のEthyl acetate及び28-33%のEthyl acetateで、F3を保持時間（retention time）の順
序によって三つの段階F3-1〜F3-3に分ける。
【００２５】
F3-1を取って移動相であるジクロロメタン／アセトン（CH2Cl2/Acetone）を用いてシリ
カゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（極性が５０：１から２０：１まで勾配溶出す
る）、４０：１−１５：１の段階を取り、順相HPLC（Medium pressure liquid chromatog
raphy）でカラムを取分し、精製、n-Hexane / Ethyl acetate （４：１）で分離、精製し
て化合物AC006を得る。
【００２６】
F3-2を順相MPLC（Medium pressure liquid chromatography）シリカゲルカラムクロマ
トグラフィーで、移動相であるCH2Cl2/ Acetoneで勾配分離し（100%:0% to 70%: 30%）、
95％：5％から85％：15％までの段階を取り三つの段階に分ける。
F3-2-3を更に分離純化し、移動相であるn-hexane/Acetoneを用いてシリカゲルカラムク
ロマトグラフィーで分離し（100%:0% to 0%:100%）、n-hexane/Acetone=90/10から70/30
までの段階を取って移動相であるn-hexane/Ethyl acetateを用いてシリカゲルカラムクロ
マトグラフィーで分離し（100%:0% to 0%:100%）n-hexane/Ethyl acetate=60/40にAC007
を得る。
【００２７】
F-3-3を順相MPLCシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて、移動相であるCH2Cl2/
Acetoneで勾配分離し（100%:0% to 0%: 100%）、90％：10％から70％：30％までの段階
を取り五つの段階に分ける。
F-3-3-5(CH2Cl2/Acetone=73/27の段階)を更に分離、精製し、移動相であるn-hexane/Ac
etoneを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し（95％：5％から50％：50％
）、85%:15%から70%:30%までの段階を取って五つの段階に分ける。
F3-3-5-1（n-hexane/Acetone=90/10-80/20）を取り逆相MPLC  C-18カラムクロマトグラ
フィーで更に分離、精製し、移動相である１％のメタノール水溶液/ Methanol=35％/65％
から20％/80％を勾配として、28％/72％−22％/78％の段階を取って更に移動相である n-
hexane/Ethyl acetate=80%:20%から50％/50％までシリカゲルカラムクロマトグラフィー
で分離し、n-hexane/Ethyl acetate=75%:25%-65%:35%にAC012を得る。
【００２８】
F3-3-5-3を取って逆相（reverse phase）MPLC  C-18カラムクロマトグラフィーで分離
純化し、移動相である１％のメタノール水溶液/ Methanol=25/75を用いて１５ml/minの流
速で勾配（isocratic）溶出し、AC009を主とする段階（保持時間は１３０−１７０min）
を取って更に精製し、移動相であるCH2Cl2/Ethyl acetate以（silica gel）シリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーで分離して勾配溶出し（90%:0% to 0%:100%）、CH2Cl2/Ethyl ac
etate=80%/20%- 60%/40%にAC009を得る。
【００２９】
F3-1を取り逆相MPLC  C-18シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離純化し、移動相
である１％のメタノール水溶液/ Methanol=25%/75%を用いて１５ml/minの流速で勾配溶出
し、精製物はAC-05-01である。
【００３０】
F3-3-5-4（n-hexane/Acetone=76/24）を取り逆相MPLC  C-18シリカゲルカラムクロマト
グラフィーで分離、精製し、移動相である１％のメタノール水溶液/ Methanol=25%/75%を
用いて１５ml/minの流速で勾配溶出し、精製物はAC011である。
抽出物はAC006、AC007、AC009、AC011、AC012すなわち牛樟芝にある抗がん活性を有す
る化合物である。
【００３１】
実施例２：牛樟芝化合物の化学構造に対する分析
前記抽出された化合物は、スペクトル分析でその化学構造を識別し、１D/２D  NMR及び
質量分析計の使用が含まれる。この化合物の構造分析結果は下記のとおりである。
【００３２】
実施例２．１：AC006
【化７】
2018507175.tif 000035
【００３３】
EIMS, m/z 471.2701 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.77 (1H, d, J = 3.2 Hz
, H-4), 5.18 (1H, t, J = 5.6 Hz, H-12), 5.16 (1H, t, J = 6.4 Hz, H-8), 5.11 (1H,
dt, J = 1.6, 8.8 Hz, H-16), 4.43 (1H, q, J=6.8, H-15), 4.00 (3H, s, H-24), 3.62
(3H, s, H-23), 2.53 (1H, m, H-6), 2.29 (1H, m, H-7a), 2.24 (2H, m, H-14), 2.11 
(2H, m, H-11), 2.10 (3H, s, -OAc), 2.08 (1H, m, H-10a), 2.02 (1H, m, H-7b), 1.94
(1H, m, H-10b), 1.92 (1H, m, H-5), 1.71 (3H, d, J = 1.2 Hz, H-18), 1.66 (3H, d,
J = 1.2 Hz, H-19), 1.64 (3H, s, H-20), 1.58 (3H, s, H-21), 1.18 (3H, d, J = 6.8
Hz, H-22); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 199.2 (s, C-1), 171.6 (s, - COCH3), 160.
7 (s, C-3), 138.9 (s, C-2), 138.8 (s, C-9), 134.9 (s, C-17), 132.9 (s, C-13), 12
9.6 (d, C-16), 128.4 (d, C-12), 122.2 (d, C-8), 70.4 (d, C-4), 68.1 (d, C-15), 6
1.2 (q, C-23), 60.4 (q, C-24), 49.2 (t, C-14), 44.4 (d, C-5), 42.6 (d, C-6), 40.
9 (t, C-10), 28.1 (t, C-7), 27.6 (t, C-11), 26.1 (q, C-18), 21.0 (q, - COCH3), 1
8.5 (q, C-19), 16.8 (q, C-20), 16.5 (q, C-21), 13.3 (q, C-22).
【００３４】
実施例２．２：AC007
【化８】
2018507175.tif 000036
【００３５】
EIMS, m/z 471.2690 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.76 (1H, d, J = 3.1 Hz
, H-4), 5.57 (1H, m, H-16), 5.55 (1H, m, H-15), 5.16 (1H, t, J = 7.3 Hz, H-12), 
5.15 (1H, t, J = 7.1 Hz, H-8), 3.99 (3H, s, H-24), 3.61 (3H, s, H-23), 2.52 (1H,
m, H-6), 2.27 (1H, m, H-7a), 2.11 (2H, m, H-11), 2.10 (3H, s, -OAc), 2.02 (1H, 
m, H-7b), 2.00 (2H, m, H-10), 1.93 (1H, m, H-5), 1.59 (3H, s, H-20), 1.58 (2H, d
, J = 8.0 Hz, H-14), 1.57 (3H, s, H-21), 1.25 (3H, s, H-19), 1.25 (3H, s, H-18),
1.17 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-22); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 199.1 (s, C-1), 171
.4 (s, - COCH3), 160.6 (s, C-3), 140.5 (d, C-16), 138.9 (s, C-2), 138.7 (s, C-9)
, 135.1 (s, C-13), 126.2 (d, C-15), 126.1 (d, C-12), 122.1 (d, C-8), 71.1 (s, C-
17), 70.3 (d, C-4), 61.1 (q, C-23), 60.2 (q, C-24), 44.2 (d, C-5), 43.5 (t, C-14
), 42.5 (d, C-6), 40.8 (t, C-10), 30.0 (q, C-18), 30.0 (q, C-19), 28.0 (t, C-7),
27.5 (t, C-11), 20.8 (q, - COCH3), 16.3 (q, C-21), 16.1 (q, C-20), 13.1 (q, C-2
2).
【００３６】
実施例２．３：AC009
【化９】
2018507175.tif 000037
【００３７】
EIMS, m/z 471.26498 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.77 (1H, d, J = 3.2 H
z, H-4), 5.39 (1H, td, J = 7.2, 1.2 Hz, H-16), 5.16 (1H, td, J = 7.2, 0.8 Hz, H-
12), 5.16 (1H, td, J = 7.2, 0.8 Hz, H-8), 4.00 (3H, s, H-23), 3.91 (2H, s, H-18)
, 3.62 (3H, s, H-24), 2.53 (1H, m, H-6), 2.28 (1H, m, H-7a), 2.14 (2H, m, H-11),
2.14 (2H, m, H-15), 2.10 (3H, s, -OAc), 2.04 (1H, m, H-7b), 2.03 (2H, m, H-10),
2.03 (2H, m, H-14), 1.92 (1H, m, H-5), 1.64 (3H, s, H-19), 1.62 (3H, s, H-20), 
1.58 (3H, s, H-21), 1.18 (3H, d, J = 7.2 Hz, H-22); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 
199.2 (s, C-1), 171.6 (s, - COCH3), 160.8 (s, C-3), 138.9 (s, C-2), 138.8 (s, C-
9), 136.0 (s, C-13), 136.0 (s, C-17), 126.7 (d, C-16), 125.7 (d, C-12), 122.2 (d
, C-8), 70.5 (d, C-4), 69.1 (t, C-18), 61.3 (q, C-24), 60.4 (q, C-23), 44.4 (d, 
C-5), 42.6 (d, C-6), 41.0 (t, C-10), 40.7 (t, C-14), 28.1 (t, C-7), 27.6 (t, C-1
6), 27.5 (t, C-11), 21.0 (q, - COCH3), 16.5 (q, C-21), 16.3 (q, C-20), 13.9 (q, 
C-19), 13.1 (q, C-22).
【００３８】
実施例２．４：AC012
【化１０】
2018507175.tif 000038
【００３９】
EIMS, m/z 473.2846 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.77 (1H, d, J = 3.2 Hz
, H-4), 5.16 (1H, t, J = 7.6 Hz, H-8), 5.13 (1H, t, J = 7.2 Hz, H-12), 4.00 (3H,
s, H-24), 3.62 (3H, s, H-23), 3.38 (1H, d, J = 10.2 Hz, H-18a), 3.31 (1H, d, J 
= 5.6 Hz, H-18b), 2.53 (1H, m, H-6), 2.26 (1H, m, H-7a), 2.13 (2H, m, H-11), 2.1
0 (3H, s, -OAc), 2.04 (1H, m, H-7b), 2.00 (2H, m, H-10), 1.96 (2H, m, H-14), 1.9
3 (1H, m, H-5), 1.60 (3H, s, H-20), 1.58 (3H, s, H-21), 1.56 (1H, m, H-17), 1.36
(2H, m, H-15), 1.06 (2H, m, H-16), 1.06 (3H, d, J = 4.8 Hz, H-22), 0.90 (3H, d,
J = 6.8 Hz, H-19); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 198.9 (s, C-1), 171.3 (s, - COCH
3), 160.5 (s, C-3), 138.7 (s, C-9), 138.6 (s, C-2), 136.2 (s, C-13),  125.3 (d, 
C-12), 122.0 (d, C-8), 70.3 (d, C-4), 68.4 (t, C-18), 61.1 (q, C-23), 60.2 (q, C
-24), 44.2 (d, C-5), 42.5 (d, C-6), 41.0 (t, C-14), 40.9 (t, C-10), 36.8 (d, C-1
7), 34.0 (t, C-16), 28.0 (t, C-7), 27.4 (t, C-11), 26.5 (t, C-15), 20.9 (q, - CO
CH3), 17.2 (q, C-19), 16.4 (q, C-21), 16.0 (q, C-20), 13.2 (q, C-22).
【００４０】
実施例２．５：AC011
【化１１】
2018507175.tif 000039
【００４１】
EIMS, m/z 475.2553 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.81 (1H, d, J = 3.2 Hz
, H-4), 5.57 (1H, m, H-16), 5.55 (1H, m, H-15), 5.15 (1H, t, J = 6.8 Hz, H-12), 
5.12 (1H, t, J = 7.2 Hz, H-8), 3.99 (3H, s, H-23), 3.62 (3H, s, H-22), 2.66 (1H,
d, J = 5.2 Hz, H-14),  2.38 (2H, m, H-6), 2.09 (3H, s, -OAc), 2.05 (2H, m, H-11
), 2.03 (1H, m, H-7a), 2.01 (2H, m, H-10), 1.99 (1H, m, H-7b), 1.92 (1H, m, H-5)
, 1.58 (3H, s, H-20), 1.58 (3H, s, H-21), 1.25 (3H, s, H-19), 1.25 (3H, s, H-18)
; 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 197.1 (s, C-1), 171.6 (s, - COCH3), 161.8 (s, C-3)
, 140.5 (d, C-15), 139.5 (s, C-2), 135.2 (s, C-13), 126.2 (d, C-16), 126.0 (d, C
-12), 122.2 (d, C-8), 121.9 (s, C-9), 71.1 (s, C-17), 71.1 (d, C-4), 61.1 (q, C-
22), 60.0 (q, C-23), 43.5 (t, C-14), 40.8 (t, C-10), 39.2 (t, C-6), 38.3(d, C-5)
, 30.1 (t, C-7), 30.0 (q, C-18), 30.0 (q, C-19), 27.5 (t, C-11), 20.7 (q, - COCH
3), 16.3 (q, C-21), 16.2 (q, C-20).
【００４２】
実施例２．６：AC-05-01
【化１２】
2018507175.tif 000040
【００４３】
EIMS, m/z 385.2379 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.25 (1H, t, J = 4.3 Hz
, H-12), 5.20 (1H, t, J = 4.8 Hz, H-8), 4.69 (1H, m, H-15), 4.16 (1H, q, J = 4.1
Hz, H-4), 2.73 (1H, m, H-17), 2.36 (1H, m , H-14a), 2.31 (1H, m, H-6), 2.29 (1H
, m, H-7a), 2.27 (2H, m, H-3), 2.23 (1H, m, H-14b), 2.19 (1H, m, H-16a), 2.16 (2
H, m, H-11), 2.08 (2H, m, H-10), 2.02 (1H, m, H-7b), 1.98 (1H, m, H-16b), 1.88 (
2H, m, H-2), 1.67 (3H, s, H-20), 1.65 (3H, s, H-21), 1.41 (1H, m, H-5), 1.23 (3H
, d, J = 4.9 Hz, H-19), 1.06 (3H, d, J = 4.3 Hz, H-22); 13C NMR (100 MHz, CD3OD)
δ 213.8 (s, C-1), 182.7 (s, H-18), 137.9 (s, C-9), 131.8 (s, C-13), 129.3 (d, 
C-12), 122.7 (d, C-8), 78.8 (d, C-15), 76.2 (d, C-4), 48.6 (d, C-6), 48.2 (d, C-
5), 46.0 (t, C-14), 40.6 (t, C-10), 36.6 (t, C-3), 35.7 (t, C-16), 35.1 (d, C-17
), 32.9 (t, C-7), 29.6 (t, C-2), 27.5 (t, C-11), 16.5 (q, C-20), 16.3 (q, C-21),
16.0 (q, C-19), 11.8 (q, C-22).
【００４４】
実施例３：牛樟芝化合物の置換基修飾
前記牛樟芝化合物の化学構造を分析した後、そのC3とC4置換基を修飾する。その置換基
で改造された産物がC4に水酸基（−OH）で置換されたものは、H1で標識される。その置換
基で改造された産物がC4に水酸基で置換され且つC4にジメトキシ（dimethoxy）で置換さ
れたものは、H2で標識される。
【００４５】
１モル当量のNaOMe （Sodium methoxide)及び無水エタノールを溶剤としてAC012を加水
分解反応させる。加水分解プロセスをTLC(thin layer chromatography)で監視測定し、完
全に反応した後、アンバーライト樹脂（amberlite）を加えて中和反応させ、またamberli
teを濾紙で濾過した後、中間産物を得る。
【００４６】
該中間産物を、順相システムを利用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分析し
、シリカゲルで樹脂を分離し、hexane/ethyl acetateを流動相とする。溶出比例はhexane
:ethyl acetate=4:1から1:1まで、溶出プロセスをTLCで監視測定し、AC012-H1とAC012-H2
の混合物はhexane:ethyl acetate=1:1である時点に溶出され、それを収集して濃縮し、濃
縮された産物を得る。
【００４７】
濃縮された該産物を逆相HPLCで最後に純化し、C18でステンレス製カラムを分取し、移
動相であるエタノール：0.1％のリン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline）＝
75：25を用いて単一比例で溶出する。
AC012-1の保持時間（retention time）は約31minから25minまでである。AC012-H2は39m
inから43minまでである。
【００４８】
AC012-H1及びAC012-H2の化学構造は下記に示すとおりである。
【化１３】
2018507175.tif 000041
【００４９】
同じ置換基の加水分解方法は本発明が提供する他の牛樟芝化合物にも適用できる。
初期半応物がAC007であれば、AC007-H1の保持時間は36‐43分であり、AC007-H2の保持
時間は47‐53分である。
初期反応物がAC009であれば、AC009-H1の保持時間は27‐32分であり、AC009-H2の保持
時間は35‐40分である。
【００５０】
実施例４：牛樟芝化合物が血管新生を抑制する効果
本発明はSR8試験及び血管形成試験（matrigel capillary tube formation assay）を使
用し、牛樟芝から精製された化合物が血管新生を抑制することを確認する。
SRB試験はヒト内皮前駆細胞（EPC、endothelial progenitor cells）を5*103の細胞/培
養皿ウェル（cell/well）の数量比例で96ウェルの培養皿に置き、且つそれを無血清（ser
um free）の培地に置いて48時間飢餓状態にさせた後、10％のFBS培地及び異なる濃度のAC
012に入れて48時間培養する。AC012の濃度はそれぞれ0.1、0.3、1、3、10と30マイクログ
ラム/ミリリットル（μg/ml）である。処理薬物で培養した後の培地を取り出して、培養
皿のウェルに100マイクロリットル（μl）10％のトリクロロ酢酸（trichloroacetic acid
）（ｗ/ｖ）を加え、4℃で1時間放置することで細胞を固定する。培養皿を脱イオン水で
洗浄して乾燥する。それぞれのウェルに50マイクロリットル0.4％のSulforhodamine B (S
RB) (w/v)（また1％の酢酸を含む）を加えて室温で5分放置する。次に1％の酢酸で細胞と
結合しないSRBを洗浄してから乾燥する。細胞と結合したSRBを100マイクロリットル10ｍM
のTrisバッファ（ｐHは10.5）で溶解し、且つ光度計で495ｎｍに定量する。
【００５１】
Matrigel capillary tube formation試験は下記ステップを含む。Matrigelを10μl/wel
lで15ウェルの培養皿に加え、37℃で30min放置してゲル層を形成する。その後、5*103のE
PC細胞、VEGF(vascular endothelia growth factor)及び濃度が異なっているAC012（0、0
.1、0.3、1μg/ml）を培養皿のウェルに入れ、37℃、5％の二酸化炭素という条件で16時
間放置する。その後、位相差顕微鏡（inverted contrast phase microscope (Nikon, Jap
an)）で細胞の生成を観察する。
【００５２】
AC012が血管新生を抑制する効果
IC50は29μg/ml；1μg/mlのAC012は31.89％の血管新生を抑制できる。
【００５３】
実施例５  牛樟芝化合物が癌細胞の増殖を抑制する効果
SRB試験で牛樟芝から精製された化合物及びその誘導体が癌細胞の増殖を抑制する効果
を確認する。
この実施例はすなわちAC006、AC007、AC009、AC011とAC012及びその加水分解で置換基
を改造した生成物が、多種類の癌細胞株の増殖を抑制するかどうかを確認する。
【００５４】
それぞれの細胞株を5*103cell/wellsの数量比例で96ウェルの培養皿に置き、且つそれ
を無血清（serum free）の培地で48時間飢餓状態にさせた後、10％のFBS培地及び0.1、0.
3、1、3、10及び30μg/mlなどの濃度のAC006、AC007、AC009、AC011、AC012に入れて48時
間培養する。処理薬物で培養した後の培地を取り出して培養皿のウェルに100マイクロリ
ットル（μl）10％のトリクロロ酢酸（trichloroacetic acid）（ｗ/ｖ）を加え、4℃で1
時間放置することで細胞を固定する。培養皿を脱イオン水で洗浄して乾燥する。それぞれ
のウェルに50マイクロリットル0.4％のSulforhodamine B (SRB) (w/v)（また1％の酢酸を
含む）を加えて室温で5min放置し、次に1％の酢酸で細胞と結合しないSRBを洗浄してから
乾燥する。細胞と結合したSRBを100マイクロリットル10ｍMのTris緩衝液（ｐHは10.5）で
溶解し、且つ光度計で495ｎｍに定量する。
【００５５】
実施例5.1：AC006の抑制効果
AC006で4種類の異なる癌をテストする。7種類の異なる癌細胞株が含まれ、それは半数
の癌細胞の増殖を抑制できる有効な濃度、すなわちIC50効果である。
その結果をは表１に示す。
【表１】
2018507175.tif 000042
【００５６】
実施例5.2：AC007及びその誘導体の抑制効果
AC007で5種類の異なる癌をテストする。7種類の異なる癌細胞株が含まれている。
そのIC50効果を表２及び３に示す。
【表２】
2018507175.tif 000043
【表３】
2018507175.tif 000044
【００５７】
実施例5.3：AC009及びその誘導体の抑制効果
AC009及びその誘導体で4種類の異なる癌をテストしり。10種類の異なる癌細胞株が含ま
れている。そのIC50効果を表４及び５に示す。
【表４】
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【表５】
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【００５８】
実施例5.4：AC011の抑制効果
AC011で4種類の異なる癌細胞株をテストする。IC50の結果を表６に示す。
【表６】
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【００５９】
実施例5.4：AC012及びその誘導体の抑制効果
AC012及びその誘導体で5種類の異なる癌をテストする。8種類の異なる癌細胞株が含ま
れる。そのIC50効果を表７及び８に示す。
【表７】
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【表８】
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【００６０】
実施例から、本発明は牛樟芝化合物及びその抽出方法を提供し、且つその化学構造を分
析し、それが低濃度で血管新生を抑制する効果を開示する。該牛樟芝化合物に基づき、本
発明も化学的に新規な化合物を合成する方法を提供する。本発明に開示された新規な抽出
方法は該化合物を大量に精製することができ、牛樟芝子実体を培養するコストを軽減する
。
本発明は、また、該化合物が癌細胞の増殖を抑制できる効果を有することを開示し、癌
治療用薬物の製造に適用できる。その他、牛樟芝化合物の加水分解により、その置換基を
改造して得る新規な化合物H１は、化合物が癌細胞、特に大腸癌細胞株の増殖を抑制する
効果を効果的に向上させることができる。ここでHCT116は低い表現量を特徴とするBax（W
ang et al. 2012)、及びgrowth factor(TGFα and EGFR)-independent (Howell et al. 1
998)である。更に、本発明で提供される化合物は肝癌細胞にとってもその増殖を抑制する
高度な効果を有し、特にアジア人からの上皮様肝癌細胞株（epithelial-like tumorigeni
c cells）であるHuh-7に対してHFE突然変異を特徴とする（Vecchi et al. 2009）。
本発明は牛樟芝化合物を精製する方法を提供し、その化学構造及びそれが血管新生及び
癌細胞の増殖を抑制する効果に関する。
【国際調査報告】
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