(57)【要約】  本発明は、基板、好ましくは大理石表面などの石状基板からカビ菌類、藻類、細菌、地衣類、および類似の微生物などのバイオフィルムを除去するのに適した酵素バイオ洗浄キットに関する。さらに、本発明は、該酵素バイオ洗浄キットに基づいて、基板の完全性に影響を及ぼさずに表面から既存のバイオフィルムを除去し、表面保全のための期間またはコストを最適化する方法を開示する。該キットおよび方法は、多くの分野、特に美術品および文化遺産の分野において、モザイク、考古学的場所、古代タペストリ、またはその他の工芸品などの繊細かつ貴重な対象物を保全する際に、従来の殺傷物剤の代替として利用される。有益なことに、本発明によるキットは製造しやすく、各種実施形態、たとえば、酵素回収を可能にする実施形態などで使用しやすい。また、該キットは、ユーザ、基板、環境にとって安全である。
2018529012.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板（Ｌ）から既存の生物学的および化学的実体を除去するのに適したバイオ洗浄酵素キットであって、
１以上の粒子に安定的または一時的にリンクまたは結合された複数の固定化酵素を含む酵素システム（２０）と、
前記酵素システム（２０）のうちの１つ以上を含む配合物（１０）と、を備え、
前記キットが、前記配合物（１０）を塗布する媒体（３０）あるいは前記配合物（１０）を含浸させる媒体（３０）、または前記酵素システム（２０）が分散され、前記配合物（１０）に含まれる媒体（３０’）をさらに備え、
前記粒子が無機粒子であり、
前記配合物（１０）が前記基板（Ｌ）から容易に除去されて基板の完全性を保存することができる、バイオ洗浄酵素キット。
【請求項２】
前記生物学的および化学的実体が、バイオフィルム、カビ菌類、藻類、細菌、地衣類、ワックス、油、タンパク質配合物、脂質配合物、多糖類、ケラチン性配合物、またはそれらの組み合わせから成る群から選択され、
前記基板（Ｌ）が、石、木、紙、セラミック、金属、石造り、漆喰、セルロース基板、ポリマー、プラスチック、組織、ヒトの肌、動物の肌、またはそれらの組み合わせから成る群から選択される材料で作製されることを特徴とする、請求項１に記載のバイオ洗浄酵素キット。
【請求項３】
前記酵素が、トリプシン、ペプシン、リパーゼ、パパイン、アミラーゼ、キモトリプシン、エラスターゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、リグニナーゼ、フィシン、ブロメライン、またはそれらの組み合わせから成る群から選択され、
前記粒子が、シリカ粒子、シリカナノ粒子、ジルコニア粒子、ジルコニアナノ粒子、金属酸化物粒子、無機粒子、磁気粒子、メソ多孔質粒子、ナノ構造化材料、メソ多孔質材料、またはそれらの組み合わせから成る群から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載のバイオ洗浄酵素キット。
【請求項４】
前記媒体（３０、３０’）がゲル、水溶液、発泡体、親水性布、ポリマー、弾性支持体、剛直支持体、またはそれらの組み合わせから成る群から選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオ洗浄酵素キット。
【請求項５】
前記粒子が約１００〜約３００ｎｍの径を有する略球状で、約２．０〜約２．５ｎｍの孔径を有するメソ多孔質であり、
前記酵素システムが約２．５〜約２０ｍｇ／ｇの量のトリプシンを含有し、
前記媒体がメチルセルロースゲルまたは親水性布であり、
前記配合物（１０）が水または水溶液を用いて前記基板（Ｌ）から容易に除去することができ、
前記バイオ洗浄酵素キットが、リン酸塩緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、またはそれらの組み合わせから成る群から選択される緩衝液を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオ洗浄酵素キット。
【請求項６】
前記酵素システム（２０）が前記酵素の活性度を増幅させるのに有効なキレート剤を備え、前記キレート剤がＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＮＴＡ（ニトロトリアセタート）、ＭＧＤＡ（メチルグリシン二酢酸）、リン酸塩およびポリリン酸塩、ホスホン酸塩（ＤＴＰＭＰ、ＡＴＭＰ）、ＩＤＳ（イミノジコハク酸塩）、またはそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のバイオ洗浄酵素キット。
【請求項７】
２回以上再使用可能である、および／または乾燥形状で保管可能であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のバイオ洗浄酵素キット。
【請求項８】
前記キットの温度を所与の温度範囲内に維持するのに適した温度制御手段（５０）と、
前記キットの汚染を防止する、および／または前記配合物（１０）内の流体の損失を抑制するのに適した保護膜（４０）と、
前記キットと洗浄対象の基板（Ｌ）との接触を維持するのに適した固定手段（７０）と、
前記工程パラメータ、好ましくは、温度、ｐＨ、湿度の制御システム（９０）と、
適切な水和度を維持するように前記キットに流体を追加する、あるいは前記キットから流体を除去するのに適し、前記流体が好ましくはタンクに含まれる緩衝液である加湿器システム（８０）と、
から成る追加手段のうちの１つ以上をさらに備えることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載のバイオ洗浄酵素キット。
【請求項９】
前記温度制御手段（５０）が赤外灯、温風システム、加熱布または膜、ペルティエセルに基づく加熱または冷却システム、ヒートポンプに基づく加熱または冷却システム、気化冷却システム、相変化を有する冷却システム、またはそれらの組み合わせから成る群から選択される能動または受動素子であることを特徴とする、請求項８に記載のバイオ洗浄酵素キット。
【請求項１０】
前記追加手段のうちの１つ以上が前記媒体（３０）または前記保護膜（４０）に一体化されることを特徴とする、請求項８または９に記載のバイオ洗浄酵素キット。
【請求項１１】
前記キットの前記基板（Ｌ）への塗布のための塗布手段をさらに備え、前記塗布手段が好ましくはブラシ、スパチュラ、ローラ、またはその他の技術的に等価な解決策であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のバイオ洗浄酵素キット。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のバイオ洗浄酵素キットの作製方法であって、
粒子、好ましくはメソ多孔質シリカナノ粒子を取得するステップと、
機能化された粒子を取得するように、既知の技術により前記粒子を機能化するステップと、
前記酵素、好ましくはトリプシンを含有する溶液内に前記機能化粒子を分散させて、沈殿物を取得するように、取得された前記溶液を反応の最後まで攪拌するステップと、
粉末状の前記酵素システム（２０）を取得するように、前記沈殿物を濾過し乾燥させるステップと、
前記酵素に応じて選択される適切なｐＨ、トリプシンの場合、好ましくは約７．０〜約８のｐＨを有する緩衝液内で前記酵素システム（２０）を分散させて、前記緩衝液が好ましくはリン酸塩緩衝液またはクエン酸ナトリウム緩衝液、またはそれらの組み合わせであるステップと、
前記酵素システム（２０）を備える配合物（１０）、好ましくはゲル状の配合物を作製し、前記ゲルが前記溶液にゲル化剤、好ましくはメチルセルロースを追加することによって取得されるステップと、
前記媒体（３０）に前記配合物（１０）を塗布する、あるいは、前記媒体（３０）に前記配合物（１０）を含浸させる、好ましくは浸漬被覆によって親水性布から成る支持体に前記ゲル状の配合物（１０）を塗布するステップと、
前記酵素システム（２０）を分散させるために前記配合物（１０）に媒体（３０’）を含めるステップと、
保護膜（４０、４０’）を貼付して、前記膜の汚染を防止する、および／またはバイオ洗浄処理または前記キットの保管に適した化学的および物理的条件を維持するステップと、
のうちの１以上を備えることを特徴とする、バイオ洗浄酵素キットの作製方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のバイオ洗浄酵素キットによって基板（Ｌ）から生物学的および化学的実体を除去するのに適した酵素バイオ洗浄方法であって、
前記基板、前記化学的および生物学的実体、バイオ洗浄処理を実行する前記環境条件の特徴を分析する調査を実行するステップと、
前記調査から取得される結果に従って、少なくとも１つの酵素システム（２０）、好ましくはメソ多孔質シリカ粒子に固定化されるトリプシンを含む前記配合物（１０）を最適化するステップと、
前記調査から取得される結果に従って、
−前記配合物（１０）を塗布または含浸させる適切な媒体（３０）、または
−前記酵素システム（２０）を分散させ、前記配合物（１０）に含まれる適切な媒体（３０’）、
を選択するステップと、
前記配合物（１０）と前記媒体（３０、３０’）とを備える前記バイオ洗浄酵素キット（１）を作製するステップと、
好ましくは緩衝液、または基板の表面上への塩の形成を抑制するのに適した配合物を用いて、前記配合物（１０）の水和によって前記酵素システム（２０）を活性化するステップと、
バイオ洗浄処理の対象である前記基板（Ｌ）に前記バイオ洗浄酵素キット（１）を適用するステップと、
前記保護膜（４０、４０’）によって前記バイオ洗浄酵素キット（１）を保護するステップと、
制御システム（９０）によって、前記配合物（１０）の工程パラメータ、好ましくは、温度、ｐＨ、湿度を制御するステップと、
バイオ洗浄処理の条件に応じて前記工程パラメータを調節するステップと、
前記基板（Ｌ）から前記バイオ洗浄酵素キットを除去するステップと、
好ましくは脱イオン水で前記基板（Ｌ）を洗って前記基板から前記配合物（１０）の残留物を除去するステップと、
前記バイオ洗浄酵素キットの保管と将来の使用のために、乾燥によって前記酵素システム（２０）を非活性化するステップと、
乾燥後の将来の使用を可能にする適切な環境下で、前記バイオ洗浄酵素キットを再使用または保管するステップと、
のうちの１つ以上を備える方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、石、木、セラミック、またはその他の材料から作製された表面、好ましくは、繊細かつ独特な工芸品、たとえば、古代のモザイクまたは石造物の表面からバイオフィルムを除去する酵素バイオ洗浄キット、および該キットに基づく方法に関する。具体的には、本発明は、繊細かつ貴重な表面の完全性に影響を及ぼさずに、カビ菌、地衣類、藍色細菌、微小藻類などの微生物を備えるバイオフィルムを除去するという課題に対する新規の発明性を有する解決策を提供する。
【背景技術】
【０００２】
カビ菌、藍色細菌、微小藻類、地衣類などの微生物は、多くの場合、有機または無機物質と組み合わされて、特に大気中作用物質にさらされたとき、床、壁、または石造物に次第に付着する。技術的には「バイオフィルム」と定義されるこれらの有機付着物は、たいていの場合、修復不可能なほど、最初は表面の美観、次は基板の表面構造を変化させることによって、付着対象の基板を劣化させる。バイオフィルムによって誘発される表面劣化の反応速度は、基板の性質、ひいては基板の材料と有孔率に依存する。
【０００３】
バイオフィルムを除去するという課題は、増築によって覆うことができない場所（たとえば、考古学的エリア）であるために、大気中作用物質と表面に次第に定着する微生物との複合作用に常にさらされる場合、重大な憂慮すべき問題となる。
【０００４】
現在、表面からバイオフィルムを除去する専門家向けと家庭向けの両方の様々な市販品が提供されている。通常、これらの製品は、殺傷物剤、たとえば、次亜塩素酸ナトリウム、スズ配合物、または（ＣＴＳ、Ｂｒｅｓｃｉａｎｉ、またはＡｎｔａｒｅｓによって市販されている）ビオチン−Ｔやビオチン−Ｒなどのその他の化合物をベースとする。これらの既知の化合物は、化学的反応性が比較的高く、通常（大抵の場合、数回の塗布後、または大量の殺傷物剤を使って）バイオフィルムを有効に除去するが、表面の色を変化させ、表面構造にダメージを与える場合がある。たとえば、バイオフィルムは石造物の表面に付着しているため、石灰石基板（たとえば、大理石または石灰華）からバイオフィルムを除去するときに塩素系殺菌性製品を使用することは必ずしも推奨されない。
【０００５】
さらに、これらの既知の製品は、長期使用の結果、呼吸器または皮膚感作を引き起こす可能性があるため、ユーザにとって重大な化学的な危険を呈し、これはエアゾール配合物で多い。最後に、これらの製品は、バイオフィルムの構成要素に対して選択的な作用を発揮しない。こうした理由から、殺傷物剤に基づく従来の製品の使用は、表面、特に文化遺産に属する工芸品の繊細な、貴重な、または独特な表面の復元には推奨されない。
【０００６】
殺傷物剤に基づく洗浄製品の欠点を克服するため、近年、酵素を含有する配合物が市販されるようになっている。第１の利点として、酵素を含有する配合物は、選択的な洗浄作用を提供する。実際、表面からのバイオフィルムの除去は、酵素の化学構造によって認識される選択的結合に及ぼす酵素の侵食の結果として発生する。言い換えると、酵素はバイオフィルム除去の化学機構に作用する。
【０００７】
現状技術では、酵素、特定の表面活性剤、および酵素反応を担う微生物を使用するシステムから成るゲルが知られている（Ｒａｎａｌｌｉ、Ｇら。Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００５。９８、７３〜８３ページを参照）。具体的には、美術品と修復の分野では、酵素システムを使用して、フレスコ画、モザイク、絵画などの歴史的に重要な工芸品だけでなく、伝統的または現代の住宅の繊細な床や壁からバイオフィルムを除去することがよく知られている。酵素系洗浄配合物の一覧は、たとえば、Ｐ．Ｃｒｅｍｏｎｅｓｉ著の書籍「Ｌ’ｕｓｏ  ｄｅｇｌｉ  ｅｎｚｉｍｉ  ｎｅｌｌａ  ｐｕｌｉｔｕｒａ  ｄｉ  ｏｐｅｒｅ  ｐｏｌｉｃｒｏｍｅ」（Ｉｌ  Ｐｒａｔｏ編。２００２）、またはＭ．ＭａｔｔｅｉｎｉおよびＡ．Ｍｏｌｅｓ著の教科書「Ｌａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  ｎｅｌ  Ｒｅｓｔａｕｒｏ」（Ｎａｒｄｉｎｉ編。２００７）で見つけることができる。上記配合物の使用は特に適切であり、場合によっては、伝統的な洗浄システムの使用が修復対象の作品の損傷または破壊を引き起こすときは唯一の選択肢である。
【０００８】
こうした利点にかかわらず、酵素系コーティングは、具体的には、高コスト、組成安定化、急速な酵素不活性化、安全性の問題などのいくつかの欠点を備える。従来技術の酵素システム洗浄配合物の制約を克服する試みとして、近年、洗浄配合物および方法に関連する多数の特許出願が出されている。
【０００９】
たとえば、特許明細書ＵＳ２０１２２７６６１７Ａ１では、ＪＩＡらは有機汚染の安定的な自動洗浄のため、ポリマー改質酵素を含有する水安定化活性コーティングを提案している。具体的には、これらの組成は、基材、すなわち、ワックス系の表面薬剤、光沢剤、または防止剤と、該基材に関連するＰＥＧ改質（ポリエチレングリコール）酵素とを含む。上記特許が対処している主要な課題は、従来技術のコーティング材が水にさらされたときに急速に酵素が非活性化するという課題である。発明者らは、暴露による非活性化に対抗するコーティングの安定化を提供することによって、この問題を克服している。明らかに、発明者らは、基材への混入前に酵素に１つ以上のポリマー部分を追加することで、結果として生じるコーティング材の水安定性が向上することを発見した。
【００１０】
ＵＳ２０１２２７６６１７Ａ１に開示される活性一時コーティングの使用は、有機汚染または（たとえば、食品、虫、または環境からの）有機材料汚染の一時活性コーティング材への付着を確実に防止する。事実、ＰＥＧ改質酵素は、該活性コーティング材と接触する（基板とは接触しない）有機汚染の成分を分解することができる。よって、このようなコーティングは、既に存在する有機汚染またはバイオフィルムを基板、特に石造品から除去するのに有効ではない。ＪＩＡらによる教示は、上記の使用制限と、酵素に関連する有機基材を含むコーティング組成のせいで、歴史遺産の修復と保全の分野では古代の作品からバイオフィルムを除去することで元の基板を変質させたり、ワックスなどの残留物を残したりしてはならないために役に立たない。
【００１１】
もう１つの顕著な特許出願は、Ｘｅｒｏｓ  Ｌｔｄの名義で、好ましくは布の洗浄工程に特に適用される新規な洗浄材料を開示しているＷＯ２０１４００６４２４Ａ１である。この新規な洗浄材料は、小量の水の存在下で作用し、適切な洗浄成分と組み合わせて固体ポリマー洗浄粒子を含む洗浄配合物を使用する。特に、該システムは、固体ポリマー洗浄粒子に固定化される酵素である洗浄配合物を利用する。
【００１２】
酵素固定化は、洗浄性能だけでなく、複数回にわたって洗浄成分を再使用できる能力を高めることによって、環境上および経済上の恩恵を提供する。これらの顕著な利点にかかわらず、ＷＯ２０１４００６４２４Ａ１では、石状基板に対する新規な洗浄材の使用が提示されておらず、本特許の範囲からは明らかに外れていると思われる。また、石状基板の孔が固体ポリマー洗浄粒子を捕捉して、基板が劣化し、太陽放射の影響下で黄ばむ可能性がある。このため、修復によって元の基板を変質させたり、残留物を基板上に残したりしてはならない歴史遺産の分野では不適切である。
【００１３】
タンパク質である遊離酵素は、特定条件下でヒトや動物のアレルギー反応などの免疫反応を刺激しやすい。したがって、アレルギー可能性と免疫原性のせいで、酵素の使用は、たとえば、Ｃ−Ｌｅｃｔａ  ＧｍｂＨの名義下の特許ＷＯ２０１４０６７９３３Ａ１で対処される安全上の問題を引き起こす。
【００１４】
この特許は、固体担体（好ましくは、熱分解法シリカ）上で固定化される酵素を含む不溶性酵素製剤に基づく使い捨て配合物を請求しており、不溶性酵素製剤が使い捨て配合物内に分散されている。遊離酵素配合物と比較して、本発明の不溶性酵素製剤では、上記酵素または配合物を含有する酵素の取扱、利用、または取込みを通じた酵素とヒトとの直接接触を含む特定用途において安全リスクが低減される。
【００１５】
ＷＯ２０１４０６７９３３Ａ１の使い捨て不溶性酵素製剤は、ケア製品や食品用途では特に有効であるが、水洗いまたは洗浄用途が当業者にとってほぼ無益な形でしか説明されていない。実際には有益な洗浄配合物が開示されていないにもかかわらず、発明者らは、この酵素製剤を使用して、使い捨ての硬表面（たとえば、食品業界で使用される機器の表面）に酵素製剤の作用を提供することができると断言している。さらに、バイオフィルムの除去は、レンズケースに形成されるバイオフィルムに関してしか言及しておらず、このバイオフィルムは石状基板に形成されるバイオフィルムとは全く異なる。この場合も、発明者らは何の有効な組成も開示していない。本発明の好適な実施形態では、コーティング、塗料、ワニスに酵素を埋め込むことによって、藻類やカビ菌類の定着を阻む保護が生じる。したがって、上記の配合物は、バイオフィルムの形成を防止するもので、既に基板に付着したバイオフィルムの除去には役立たない。
【００１６】
最後に、ＷＯ２０１４０６７９３３Ａ１の唯一の洗浄配合物は実施例４に提示されており、市販の家庭用クリーナにリパーゼの作用を提供する。まず指摘しておくべき点として、実施例４の第１の配合物はエアゾールであり（液体またはゲルではない）、リパーゼがＥｖｏｎｉｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  ＡＧ製の親水性熱分解法シリカであるＡｅｒｏｓｉｌ（登録商標）９０上に固定化され、非多孔質構造であることを特徴とする（たとえば、Ａｅｒｏｓｉｌ（登録商標）９０のデータシートを参照）。また、実施例４の性能検査の結果が不明瞭であるため、石状基板からバイオフィルムを除去するのに有益な液体またはゲル配合物を開発しようとする当業者にとっては無益である。
【００１７】
要約すると、ＷＯ２０１４０６７９３３Ａ１の範囲は、遊離酵素よりも安全性の懸念が少ない不溶性酵素製剤の使用に関する。明らかに、酵素活性の増強とコスト最適化は本発明の範囲外である。実際のところ、この製剤は、不溶性酵素「使い捨て配合物」、すなわち、最初の使用後に廃棄される、使い果たされる、あるいは今後の再使用に適さない形状となる配合物を指す。Ｃ−Ｌｅｃｔａ  ＧｍｂＨが国際出願ＷＯ２０１４０６７９３３Ａ１において提供する教示は、酵素が再使用可能である酵素配合物を用いて石状基板からバイオフィルムを除去することには役に立たない。よって、明らかに、開示される配合物は、文化遺産の修復および保持、または石状基板からのバイオフィルム除去に関する類似の課題を有する分野において現在使用されている既知の殺傷物剤または酵素配合物に対する実行可能な代替策にはならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
酵素が高コストであることは、既に市販されている酵素洗浄システムと従来技術のバイオフィルム除去方法の大きな欠点の１つである。実際に、酵素はそれ自体高額な製品であり、表面処理後に再使用するため再生することができない。また、酵素システムと酵素システムを組み込むキットを作製するには、酵素の保存が困難であり、洗浄動作を実行する直前に酵素システムを新たに作製しなければならないために長い時間がかかる。
【００１９】
酵素洗浄システムの高コスト、長い作製期間、および保存にはいくつかの実際的な欠点がある。第１に、既知の酵素システムの単位面積当たりの有効洗浄効果が低い。第２に、（たとえば、多くの考古学的な場所の）大規模な壁または床への適用が制限される。最後に、従来技術の酵素システムの使用は柔軟性に欠け、歴史遺産の維持と保全を担当する機関（イタリアでは、「文化財監督局」）が現在採択している最良の実施に準拠していない。
【００２０】
特にイタリアなどの常時の保全を必要とする文化遺産の豊かな国々において公的資金が制限されるとき、既知の酵素洗浄系のこれらの欠点が特に重大となることは、当業者にとって自明であろう。これらの欠点は、酵素システムの洗浄効果を高める、あるいは、スケールメリットからの恩恵を得てコストを節減することができる洗浄キットの製造方法を使用することによって軽減することができる。しかしながら、本発明者らの最良の知識によると、このような目的に有効な技術的教示は科学的および特許文献に見いだせない。
【００２１】
結論として、石状基板からバイオフィルムを除去するのに有効であり、従来技術の解決策と比較して合成と保存が簡易であり、歴史遺産または美術品などの要求が厳しい分野の要件を満たす安定的な酵素システムを含むバイオ洗浄配合物はまだ入手可能ではない。上記要件は、使用時の高洗浄効率および柔軟性、処理対象表面の単位当たりの低コスト、基板の完全性の保存（すなわち、処理後も基板の損傷や変質が生じず、基板に残留物が残らない）、最後にユーザと環境に対する些少なリスクなどである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本特許明細書によって、発明者らは、特に天然石、石状物質、セラミック、木の表面からバイオフィルムを除去するのに有効な酵素洗浄システムに関連する現状技術における既存の制約を克服することを目的とする。
【００２３】
したがって、本発明の第１の主要な目的は、添付の従属請求項に記載するような酵素システムを含むバイオ洗浄キットを提供することである。該バイオ洗浄キットは、既知の解決策よりも有効かつ安価に様々な種類の基板、好ましくは石状基板から既存のバイオフィルムを除去するのに役立つ。具体的には、本発明の重要なタスクは、高い酵素洗浄作用を有し、保管可能で数回際使用可能である安定的なバイオ洗浄キットを提供することである。本発明の別の重要なタスクは、様々な分野、特に文化遺産のニーズに応じてカスタマイズすることができるバイオ洗浄キットを提供することである。
【００２４】
本発明の第２の重要な目的は、添付の従属請求項に記載されるようなバイオ洗浄キットの製造方法、特に、既に市場にある酵素系の洗浄解決策と比べて競争力のあるコストで、既知の技術を用いて簡易に達成可能であるスケーラブルな製造方法を提供することである。
【００２５】
上記第１および第２の目的内で、本発明の第３の目的は、特に歴史遺産の分野での修復計画のコスト削減および簡略化を可能にする、基板、好ましくは石状基板からバイオフィルムを除去する方法を提供することである。
【００２６】
最後に、本発明の別の目的は、バイオ洗浄キットを提供することと、基板を損傷および変質させたり、ユーザと環境に対して化学的危険を呈したりすることなく、該キットを用いて基板からバイオフィルムを除去する方法を開発することである。
【００２７】
上述の従来技術の不利益や欠点に鑑み、本発明者らは無機粒子に固定化された酵素から成る酵素システムに関して多くの研究を重ねてきた。こうした研究は主に、酵素システムの最適化、酵素洗浄作用の増強、修復に関わる修復業者またはその他の専門家の作業条件に準拠する酵素システムを備える配合物の最適化に対処することに関する。
【００２８】
長期間の実践を通じて、発明者らは、基板、好ましくは石状基板からバイオフィルムを除去するのに適した、無機粒子、好ましくはシリカナノ粒子に固定化された酵素から成る酵素システムと、該酵素システムを含む配合物と、該配合物用の支持体と、を備える酵素バイオ洗浄キットを作製した。好ましくは、該酵素はトリプシンであるが、基板から除去されるべきバイオフィルムの特徴に応じて当業者が選択することもできる。
【００２９】
好適な形態では、該配合物は親水性布から成る支持体に含浸させるが、別の実施形態では、配合物はプラスチックフィルムなどの弾性または剛直な支持体に塗布されて、支持体と実質上異なる相を形成する。別の実施形態では、キットは支持体を有しておらず（すなわち、「無支持体」キット構造）、該配合物は配合物の一構成要素である媒体内に分散されている。該媒体は、酵素システムを搬送し、洗浄対象の基板と接触させるのに適した液体、ゲル、または固体媒体の形状である。
【００３０】
さらに、他の実施形態では、酵素システムおよび外部気候条件の特徴に応じて酵素作用、ひいては基板洗浄を最適化するため、洗浄工程パラメータ（たとえば、温度、含水量およびｐＨ）を制御する手段追加の要素がバイオ洗浄キットに含まれる。追加要素は、基板、特に直立基板と保護膜への付着を促進し、外部作用物質による配合物の汚染を防ぐだけでなく、含浸支持体内の適切な含水量および温度を維持して有効な洗浄作用を可能にする媒体をさらに含む。
【００３１】
本発明は、特に工芸品の繊細かつ貴重な表面の完全性に影響を及ぼさずに、カビ菌類、藍色細菌、微小藻類、地衣類などの微生物を含むバイオフィルムを除去する方法も請求する。最良の形態では、該方法は、最初に基板と環境条件を分析して、適切な酵素システムおよびバイオ洗浄キット構造の選択を助ける。次に、該酵素配合物とバイオ洗浄キットが新しく作製される。次いで、該方法では、バイオフィルムに汚染された基板にキットを適用する。酵素クレンジング工程の終了後、キットが基板から取り外されて、今後の使用のために保管される。
【００３２】
もしくは、別の実施形態では、酵素配合物は新しく作製されず、予め保管された配合物またはキットが使用される。本実施形態では、該方法は、酵素システムの活性化を含む。１実施形態では、酵素配合物はゲル状であり、工芸品への適用前に活性化される（「湿潤形状」）。さらに別の実施形態では、工芸品への適用後に活性化が実行される（「乾燥形状」）。
【００３３】
有益なことに、本発明による酵素バイオ洗浄キットと、基板からバイオフィルムを除去する関連の方法は、酵素システムを備える配合物を、処理後に配合物の残留物を基板上に残さないように水洗洗浄によって基板から容易に除去できることを特徴とする。
【００３４】
用語及び定義
【００３５】
明細書と添付の請求項を理解するため、以下の説明では、化学元素は、一般的な元素周期表に記される個々の記号によって定義される。たとえば、水素は記号Ｈで表され、ヘリウムはＨｅで表される。また、特段指示されない限り、元素記号は、すべてのアイソトープとイオンを含むと理解すべきである。また、簡潔さのため、化学化合物は、本発明の関連技術分野で広く採用される頭字語で表すことができる。たとえば、頭字語のＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸を表す。
【００３６】
明瞭化のため、本発明の明細書と請求項で使用されるとき、「粒子」という文言は、原子、分子、またはその他の基本構成要素の集合を指し、その集合はマイクロメートル未満またはマイクロメートル超のサイズで、略球状だが非対称形状であるものとする。具体的には、単数または複数の「ナノ粒子」または「ナノ構造」という文言は、約１マイクロメートル未満のサイズの粒子を表すものとする。
【００３７】
「バイオフィルム」という文言は、有機および／または無機物質とカビ菌類、藻類、細菌類、地衣類などの微生物との単純または複雑な結合を意味し、該結合物が基板、たとえば岩状基板に付着する。また、本特許明細書では、「バイオ洗浄」という文言は、本発明によるバイオ洗浄システムの利点を活用して、基板から既存のバイオフィルム（すなわち、除去前に基板を覆うバイオフィルム）を除去することを指すものとする。
【００３８】
特に指示しない限り、「固定化」という文言は、酵素、またはより一般的にはポリペプチドを少なくとも１つの粒子またはナノ粒子に永久的または一時的に結合させる任意の化学的結合（共有結合、イオン結合、水素結合、またはファンデルワールス相互作用）、物理的結合（たとえば、静電引力）、または生理化学結合を意味する。明細書および図面において、同一の参照符号は、「支持体」（または、より一般的には「媒体」）、および「含浸支持体」（または、より一般的には「含浸媒体」）、すなわち、酵素システムを含有する配合物が塗布された支持体を指すために使用される。また、同一の参照符号は、対応する乾燥または脱水形状の「含浸支持体」を特定するのにも使用される。
【００３９】
また、明細書および請求項で使用されるとき、「基板の完全性の保存」という文言および類似の表現（たとえば、「基板の完全性を保存する」）は、工芸品修復の最善の実施により、基板の元の（すなわち、バイオフィルムの汚染前の）美観、色、表面構造に損傷も影響も及ぼさない基板洗浄処理を指す。
【００４０】
最後に、本明細書で使用するとき、「約」という文言は、具体的には、記載される値の±１０％内の値を含むことを意図する。「または」の使用は、特段指示されない限り「および／または」を意味する。詳細な説明は、限定を加えずに本発明の好適な実施形態を完全に開示することを目的とすると理解すべきである。
【発明の効果】
【００４１】
本発明による酵素バイオ洗浄キットおよび該キットに基づく関連方法は、従来技術の解決策を超える顕著な利点をいくつか備える。これらの恩恵と利点を以下に述べる。
【００４２】
粒子固定化のため、キットは安定し、より多くの酵素含有量を有する既知のゲル配合物よりも優れた酵素クレンジング能力を発揮する。発明者らが実験で実証したように、同じバイオフィルムを２０分の１の酵素で除去できるため、酵素コスト、アレルギー可能性、免疫原性を低下させることができる。
【００４３】
さらに、本発明によるバイオ洗浄キットは、保管可能であり、最大８回まで再使用可能であり（競争力のある価格で、使い捨ても可能である）、目覚ましい石状バイオフィルム洗浄効果を達成する。事実、保管可能な複数回使用のキットは、（製造時のスケールメリットにより）製造コストと洗浄対象表面の単位コストの両方を節減することができる。さらに、この特徴のおかげで、特に文化遺産の分野で、幅広い修復および保持プログラムの運営とスケジューリングの柔軟性を高めることができる。
【００４４】
本発明にかかるキットは、シリカナノ粒子がゲルまたは液体配合物内で結合され、遊離ナノ粒子および／または酵素を含有するエアゾールが形成されず、酵素がほとんど使用されないため、ユーザと環境にとって非毒性である。さらにユーザを増やし、環境上の安全性を高めるには、微小粒子をベースとする配合物も作製することができる。
【００４５】
より重要なことに、本発明によるバイオ洗浄キットおよび関連バイオ洗浄方法は、従来の殺傷物剤系の洗浄組成、またはポリマー粒子に結合する酵素をベースとする既知の組成のように、基板に損傷を及ぼさない（使用中、工芸品に影響を及ぼす場合がある表面上の塩の形成が最小化される）。実際に、処理後に基板に残る配合物残留物は、水洗洗浄を用いて基板から容易に除去することができる。にもかかわらず、基板の孔に捕捉される粒子は安定化し、多くの岩組成と化学的に共存する金属酸化物（たとえば、シリカ）であるため、表面の完全性に影響を及ぼさない。
【００４６】
最後に、本発明によるバイオ洗浄キットは、本明細書の実施例が例証するように、様々な構造で作製することができる。
【００４７】
本発明の他の目的および利点は以下の説明で部分的に説明し、該説明から部分的に自明となる、あるいは、本発明の実行を通じて習得することができる。
【００４８】
要約すると、本発明にかかるバイオ洗浄キットの利点は、既知の解決策よりも有効に、経済的に、および安全に様々な種類の基板、特に石状基板からバイオフィルムを除去できることである。当業者にとっては、本発明の利点が酵素システムをベースにする従来技術の洗浄システムでは達成できないことが自明であろう。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
本発明は、単に例示目的である以下の図面を参照することでより詳しく理解される。
【図１】図１は、本発明によるバイオ洗浄キットの一部を概略的に示す。（ａ）では、酵素システムを含有する配合物が支持体の表面に塗布され、（ｂ）では、この配合物が支持体自体に分散あるいは含浸させられ、（ｃ）では、キットが支持体を有しておらず、酵素システムが配合物自体に含まれる媒体内に分散される。
【図２】図２は、３つの異なる石状材料への本発明によるバイオ洗浄キットの適用を示す。
【図３】図３は、本発明の第３の実施形態によるバイオ洗浄キットの一部を概略的に示し、支持媒体がキットに一体化されることを特徴とする。
【図４】図４は、本発明によるバイオ洗浄キットの一部を概略的に示し、（ａ）では、温度制御装置と加湿器システムが含浸支持体の表面に適用されるが、（ｂ）では、温度制御装置が支持体自体に一体化される。
【図５】図５は、プーリア（イタリア）の史跡に位置する２つの石造物へのバイオ洗浄処理の結果を示す。地衣類およびその他の微生物の多様な結合物から成るバイオフィルムを除去するために、本発明の第２の実施形態にかかる無支持体バイオ洗浄キットが使用されている。
【００５０】
これらの図面は、本発明の各種特徴と実施形態、およびその製造方法を例示および例証しているが、本発明を限定すると解釈すべきではない。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
最良の形態
最良の形態におけるバイオ洗浄キットの説明
【００５２】
図１ｂを参照すると、符号（１）が付された本発明による酵素バイオ洗浄キットは、酵素システム（２０）を含有する配合物（１０）と、該配合物（１０）が塗布または分散される媒体（３０）と、保護膜（４０）と、温度制御手段（５０）と、を備える。
【００５３】
該酵素システム（２０）は、後述する工程によってメソ多孔質シリカナノ粒子に固定化されるトリプシンを含む。有益なことに、発明者らは、約１００〜約３００ｎｍの径と約２．１〜約２．３ｎｍの孔径を有するメソ多孔質シリカナノ粒子に約３〜約９ｍｇ／ｇの量のトリプシンを固定化することによって有効なバイオ洗浄作用が達成できることを発見した。ただし、ナノ粒子のモフォロジと化学組成、および酵素とバイオフィルムの配合に応じて、異なる値も可能である。
【００５４】
以下詳細に説明する方法によると、キット（１）を用いるバイオ洗浄処理は、支持体（３０）を基板（Ｌ）全体に配置することと、配合物（１０）をこの基板と有効に接触させることとを必要とする。
【００５５】
これらの目的を達成するため、本発明の最良の形態では、該配合物（１０）は、剛体または弾性支持体（３０）に塗布される酵素ゲル状であり、ゲルが支持体に有効に含浸される。具体的には、ビスコース／ポリエステル（６７％／３３％）布から成る親水性不織無菌ガーゼ（たとえば、Ｄｅｒｍａｔｅｓｓ  Ｍａｔｅｒ  Ａｉｄ製の布）が非常に有効であることが立証された。しかしながら、酵素システム（２０）を含有するゲル（１０）を基板に十分に含浸させるのに適した湿潤特性を有することを条件に、他の種類の布や親水性または高吸収性ポリマーも使用することができる。実際には、発明者らは、適切な含水量の含浸支持体（３０）を維持することが、有効なバイオ洗浄作用を確保するための基本要件であることを、実験を通じて発見した。
【００５６】
最良の形態では、該保護膜（４０）は、限定ではなく例示として図１に示すように、洗浄対象の基板（Ｌ）の反対側のバイオ洗浄キット（１）の表面（Ｓ）全体に配置されるＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）またはＤｏｍｏｐａｋ（登録商標）などの拡張可能膜とすることができる。保護膜（４０）は、バイオ洗浄処理中に基板（Ｌ）と直接接触して置かれるキットの活性表面（Ｓ’）も保護するように成形することができる。この構造は、バイオ洗浄キットがすぐに使用されず今後の使用のために保管しなければならないときに特に有効である。もしくは、キットの活性表面（Ｓ’）の保護は、単に追加の保護膜（４０’）を含めることによって達成することができる。
【００５７】
最後に、最良の形態では、バイオ洗浄（１）キットは、該キットと含浸支持体（３０）の外部に温度制御手段（５０）を備える。該温度制御手段（５０）は温度制御ヘアドライヤ、アクアリウムヒータ、またはその他の等価装置とすることができるが、バイオ洗浄処理中に所定範囲の温度を制御し維持するのに役立つその他の有益な解決策も特定されている。
【００５８】
最良の形態において記載されるバイオ洗浄キットは、本発明の全体範囲に属する様々な変形に適する。たとえば、酵素システムの配合物または製剤もしくは支持体に作用させることができる。さらに、バイオ洗浄キットは、直立壁、不均等または非均一な表面、または広い床からバイオフィルムを除去するように最適化することができる。温度制御手段などのキットのいくつかの要素を配合物の支持体に有益に一体化させて、本発明によるバイオ洗浄キットの適用の柔軟性をさらに高めることができる。このような代替の解決策を、その他の実施形態を参照して後述する。
【００５９】
最良の形態におけるキット構造は、ｐＨ値を変化させずに配合物の最適な水和作用を確保する。また、該構造は、酵素の洗浄作用を高めることによって、活性表面（Ｓ’）と基板との間の一定の接触を維持する。
【００６０】
最良の形態におけるキット作製方法の説明
【００６１】
本発明の好適な実施形態を参照すると、酵素システムおよびバイオ洗浄キットを作製する工程を、限定ではなく例示のために以下説明する。
【００６２】
ステップ１：粒子の作製および機能化
【００６３】
適切なメソ多孔質シリカナノ粒子は、既知の手順によって容易に合成することができる。もしくは、様々な種類の粒子が、たとえばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＳＢＡ−１５（７７７２４２）またはＭＣＭ−４１（６４３  ６４５）などから市販されている。シリカナノ粒子は様々な既知の技術を用いて機能化させることができる。たとえば第１の沈殿物を取得するため、約２時間室温で、シクロヘキサン溶液内で３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）およびｎ−プロピルアミン（両者とも約１．５〜約３．０％ｖ／ｖの割合）を反応させることができる。
【００６４】
当業者にとって十分既知な技術を用いることによって、第１の沈殿物が濾過され、シクロヘキサンで洗浄され、最終的に、機能化シリカ粒子を得るため残留溶媒を除去するのに十分な時間、約４０℃の炉内で乾燥させられる。
【００６５】
ステップ２：酵素固定化
【００６６】
その後、機能化シリカ粒子は、所定量のトリプシンを含有する緩衝液内で分散される。好ましくは、良好な酵素固定化は、ナノ粒子が約３〜約９ｍｇ／ｇのトリプシンと、ｐＨが約６で約１０〜約２０ミクロモルの濃度のリン酸塩緩衝液とを用いて達成される。
【００６７】
この分散液は、第２の沈殿物を取得するため、約２時間室温で継続的に攪拌される。たとえば保護環境内の空気中で第２の沈殿物を濾過および乾燥させた後、シリカナノ粒子から成る白色粉末状の酵素システムが得られ、そこにトリプシン分子が固定化される。
【００６８】
上述の手順に従うことで、当業者が酵素システムのＵＶ吸収スペクトルとＤＲＩＦＴ−ＩＲスペクトルの評価によって立証できるように、固定化された酵素と粒子との間に安定的な結合が形成される。このように合成される酵素システムは安定的であり、最小限しか自己分解の影響を受けない。事実、ナノ粒子上の固定化によって酵素分子がほとんど可動性を持たないため、水溶液または湿潤環境下でも相互作用が抑制または防止される。
【００６９】
合成工程は非限定例として本明細書に記載され、本発明の全体範囲に含まれる多数の変形を許容することができる。実際に、要件に応じて粒子と酵素を適切に選択することによって、特定の基板から特定のバイオフィルムを除去する配合物を作製することができる。具体的には、粒子の配合物、サイズ、または表面モフォロジ、酵素の種類または配合物内の量などのパラメータのうちの１つ以上に作用することによって、酵素システムをカスタマイズすることができる。たとえば、約１０００ｎｍ超の大きさのシリカ粒子だけでなく、ジルコニア（ＺｒＯ２）、チタニア（ＴｉＯ２）などの金属酸化物、またはジルコニア／チタニアなどの混合酸化物の粒子を利用することができる。さらに、固定化酵素を均一に分散させたことを特徴とする球状ナノ粒子が、マクロ孔質または非均質基板からバイオフィルムを除去するのに特に有効である。他の作業条件では、細長形状の粒子を使用して、固定化酵素システムの表面と基板上のバイオフィルムとの接触を向上させることが好ましい。
【００７０】
トリプシンに加えて、たとえば、ペプシン、リパーゼ、パパイン、アミラーゼ、キモトリプシン、エラスターゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、リグニナーゼ、フィシン、ブロメラインなどの他の加水分解または非加水分解酵素も使用することができる。また、固定化工程は、ナノ粒子の機能化も、酵素と基板間の非共有結合の形成も必要としない。また、工程パラメータ（たとえば、前駆体溶液のｐＨ、前駆体の温度、濃度、滴下速度）を変更して、粒子のモフォロジ、形状、または平均サイズを変化させることができる。
【００７１】
ステップ３：バイオ洗浄キットの作製と保存
【００７２】
工程は、本明細書に記載されるステップ１および２による酵素システムの合成後、または市販の適切な酵素システムの取得後、配合物（１０）の作製に続く。
【００７３】
最初に、酵素システム（２０）は、好ましくは約７．２〜約８．０のｐＨの緩衝液に分散される。この溶液はたとえば、リン酸塩緩衝液ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏとすることができるが、その他の等価溶液も使用することができる。次に、支持体（３０）に被覆させることができる適切な粘度の均質ゲル状配合物（１０）を得るために、ゲル化剤が追加される。好ましくは、該ゲル化剤は、約１：１０ｗ／ｗの割合で追加されるメチルセルロース（たとえば、Ｔｙｌｏｓｅ（登録商標）ＭＨ３００Ｐ）、または簡便に選択されるその他の等価化合物であり、有効なトリプシン（またはその他の酵素）作用にとって適切な粘度をもたらし、最も適切なｐＨ値を維持する。ゲル状配合物が好ましいが、酵素システムを含有するその他の配合物も可能である。
【００７４】
次に、良好な含浸を確保するのに十分な時間（たとえば、５分間以上）、配合物（１０）を含有する容器内に予め切断された布を浸漬被覆させることによって、均一層のゲル配合物（１０）が支持体（３０）上に形成される。浸漬被覆に加えて、支持体（剛直または弾性）と酵素システムを含有する配合物（ゲル、液体、エアゾール）との性質に応じて、その他の既知の塗布技術（たとえば、ロール塗布または噴霧）を使用することができる。さらに、具体的な用途のニーズを満たすため、これらの既知の技術を用いて、所定パターンに従い支持体（３０）の特定領域に配合物（１０）を付着させることができる。
【００７５】
保護膜（４０）、好ましくは伸長可能膜（たとえば、Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）、Ｄｏｍｏｐａｋ（登録商標）またはその他の拡張可能膜）の表面（Ｓ）に含浸布（３０）を貼付することによって、最終的に本発明の最良の形態によるバイオ洗浄キットが作製される。キットがすぐに使用されず、外部作用物質からの配合物の保護が必要とされるとき、保護膜（４０）は活性表面（Ｓ’）も覆うように成形することができる。同様に、第２の保護膜（４０’）は、バイオフィルム汚染基板（Ｌ）に直接接触する活性表面（Ｓ’）に貼付することができる。実質上、（たとえば、包装業界における）周知の技術を用いて、キット自体の使用および保存の各種条件に応じてキットの表面Ｓおよび／またはＳ’を保護するように、１つ以上の保護膜を成形および貼付することができる。このように作製されたバイオ洗浄キットは、後述の手順に従って基板（Ｌ）に適用する準備ができている。
【００７６】
有益なことに、バイオ洗浄キットは、作成後に数日または数ヶ月、保管および使用することができる。この場合、含浸支持体（３０）の乾燥をキット作製手順に含めなければならない。この追加ステップは、排気型サーモスタットドライヤなどの保護環境にキットを配置することによって実行することができる。事実、発明者らは、驚くべきことに、ゲル配合物（１０）を含浸させた支持体（３０）の乾燥後、バイオ洗浄作用の特性を失わずに数ヶ月間も保管することができることを発見した。
【００７７】
好ましくは、含浸支持体（３０）はプラスチック容器に保持されて、あるいは保護膜（４０、４０’）に覆われて、約４℃の温度で標準的冷蔵庫に保管される。このように、酵素システム（２０）は乾燥支持体に捕捉されて、分散されない。さらに、適切な含水量が存在しない場合、酵素の自己分解が防止または最小化される。使用前に洗浄特性を回復させるには、キットを室温に戻し、支持体に数滴の緩衝液を滴下して、配合物を再活性化させる必要がある。発明者らは、ゲル状の配合物（１０）は、洗浄特性を失わずに十分長期間乾燥および保存させるべきではないことを発見した。
【００７８】
酵素バイオ洗浄キットの構造に応じて、本明細書で開示されるキット製造工程の様々な変形が可能である。本発明の範囲に属する上記の変形を、バイオ洗浄キットの他の実施形態を参照して以下説明する。
【００７９】
当業者にとっては、本明細書に記載される工程により、酵素システム（２０）の洗浄特性を長期間維持するという優れた特徴のおかげで、バイオ洗浄キットの作製と使用とを有益に分割できることが自明であろう。この特徴は、重要な実質的な意味合いを含むことで、現状技術で既知な解決策の制約を克服できる非常に重要な改良、特にコスト削減と広範な修復作業のスケジューリングの柔軟性向上を実現する。他の利点も当業者に自明となるであろう。
【００８０】
バイオフィルム除去方法の説明
【００８１】
このように作製されるバイオ洗浄キット（１）は、以下のステップを備える方法によって基板、好ましくは石状基板から既存のバイオフィルムを除去するのに役立つ。該方法を本発明の最良の形態を参照して以下説明する。
【００８２】
ステップ１：基板の分析と環境条件
【００８３】
バイオフィルム除去方法はまず、バイオ洗浄処理に影響を及ぼす場合がある処理対象表面の特徴（材料、基板有孔率、バイオフィルムの種類、侵食の重篤度など）だけでなく現場の環境条件（温度、湿度、風や汚染物質の存在など）の分析を含む予備ステップから始まる。基板が古代モザイクなどの貴重な工芸品などの貴重な工芸品である場合には注意を払わなければならない。この予備ステップでは、作業条件とその他の要件に応じて最も適切なバイオ洗浄キット（特に酵素システム）を選択することができる。
【００８４】
ステップ２：バイオ洗浄キット適用前の準備
【００８５】
いったん最も適切な酵素システムがステップ１で選択されると、バイオフィルムの除去方法はバイオ洗浄キットの作製に続く。最良の形態において親水性布（たとえば、Ｄｅｒｍａｔｅｓｓ  Ｍａｔｅｒ  Ａｉｄ）である支持体（３０）は、まず、バイオフィルムで汚染された石造物の形状と表面拡張部に応じたサイズに切断される。
【００８６】
配合物が新たに作製された場合、酵素システムは既に活性化されており、バイオ洗浄キットは洗浄対象の石造物の表面（Ｌ）への適用準備ができている。バイオ洗浄キットが予め作製および保管されている場合（上述の最良の形態におけるキット製造方法を参照）、バイオ洗浄方法は、酵素システム（２０）の活性化、すなわち、適切な配合物の含水量、温度、ｐＨの復活を必要とする。本発明によると、酵素配合物（１０）の活性化は、石造物の表面（Ｌ）へのバイオ洗浄キットの適用前後の両方で行うことができる。
【００８７】
第１のケースでは、緩衝液（好ましくは、リン酸塩緩衝液）が噴霧されて、含浸親水性布支持体（３０）を適切に湿らせる。よって、バイオ洗浄キットは次の適用ステップの準備ができている。さもなければ、酵素配合物（１０）は、処理対象の表面（Ｌ）にバイオ洗浄キットを適用した後に活性化される。この第２のケースでは、緩衝液が含浸支持体（３０）に直接噴霧される。どちらのケースでも、先のステップ１の分析に従って基板有孔率を考慮に入れて、含浸支持体（３０）を適切に湿らせることが重要である。事実、孔上の塩の形成は防止または最小限まで抑制するべきである。
【００８８】
ステップ３：表面へのバイオ洗浄キットの適用
【００８９】
修復業者またはその他の専門家は、平坦または湾曲表面（Ｌ）が最良の形態ではゲル状である酵素システム（２０）を含有する配合物（１０）と接触するように注意して、基板（Ｌ）にバイオ洗浄キットを適用する。
【００９０】
上述したように、酵素システムの活性化は、本ステップ３でも実行することができる。限定ではなく例示のために本明細書に記載される本発明の最良の形態を参照すると、発明者らは、驚くべきことに、最適なバイオ洗浄キットの活性化は、まずゲル状の（液体状ではない）リン酸塩緩衝液を基板（Ｌ）に塗布し、次に、リン酸塩緩衝液層全体に酵素ゲル（１０）を含む含浸布（３０）を直接塗布することによって実行できることを発見した。有益なことに、この構成は、石表面を劣化させる場合があり、（特に歴史的工芸品の処理時に）回避しなければならない塩の形成を制限する。さらに、この構成は、粒子に固定化された酵素が支持体から移動するのを防止し、最終的には、キットを加湿する緩衝液の使用を制限することによって、バイオ洗浄工程をさらに簡易化しコストを節減する。
【００９１】
適切な湿度を維持し、配合物の汚染を防止するため、Ｄｏｍｏｐａｋ（登録商標）などの保護膜（またはＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）などのその他の拡張可能膜）を貼付することが、この構成要素がバイオ洗浄キットの一部となっていない場合には有益である。
【００９２】
この段階で、本発明による方法は、キットに含まれる酵素によって基板の選択的で満足のいく洗浄が行われるために必要な時間を待つ必要がある。基板の種類とモフォロジとバイオフィルム配合物に応じて、適切な温度、ｐＨ、含水量が維持されるという条件下で、石造物の有効なバイオ洗浄にとっては約３０分〜約６時間の洗浄時間で十分である。処理中の最適な工程条件を維持するため、外部環境条件に従って温度制御手段（５０）を調節することができる。さらに、基板の処理中、適切な量の緩衝液を噴霧または供給することによって、含水量またはｐＨ配合物を回復させる必要がある場合がある。
【００９３】
本発明の最良の形態では、上述したように、温度制御部（５０）は、支持体（２０）の外部の構成要素であるアクアリウムヒータである。しかしながら、発明者らは、その他の実施形態を参照して後述するその他の有益な解決策を発見した。
【００９４】
ステップ４：基板からのキット取り外し
【００９５】
満足のいくバイオ洗浄が達成されると、キットが基板から取り外される。過剰な配合物（１０）は、洗浄された表面を脱イオン水ですすぐ、あるいは脱イオン水を染みこませたスポンジまたはティッシュで表面を軽く叩くことによって除去される。明らかに、本発明によるバイオフィルム除去方法は、以下の実施例で後述するように、石造物の元の色も基板も変化させない。
【００９６】
ステップ５：キットの保存と保管
【００９７】
酵素システムは有益なことに数回際使用可能であるため、本発明によるバイオ洗浄方法では最終的に、バイオ洗浄キットが約４℃の温度で家庭用または研究所用冷蔵庫に保管される。このステップは、（上述したように）酵素システムを非活性化する含浸支持体（３０）の脱水と、最終的な保護膜（４０）またはその他の技術上等価の手段によるキット（１）の保護を含む。
【００９８】
本明細書に開示するバイオフィルム除去工程に対する多くの変形が可能であり、それらはすべて本発明の全体範囲に含まれる。このような変形は、特定のバイオ洗浄キット構造、固有の特徴、基板外部の環境状況に左右される。他の要因も、提供される特許開示または発明の実施を通じて自明となる。たとえば、上述のステップは全部または一部のみを実行することができる。ニーズに応じて、個々のステップは変更および簡略化することができ、ステップの順序も変更することができる。
【００９９】
当業者にとっては、本発明のキットに基づくバイオ洗浄手順は、特にバイオ洗浄キットの再生利用に関して、現状技術で既知な解決策に対して目覚ましい成果を上げることが自明であろう。
【０１００】
実施例１：石状基板のバイオ洗浄処理
【０１０１】
提示する図２は、本明細書に開示されるバイオ洗浄キットとバイオフィルム除去工程のテストに使用される石基板とを示す。具体的には、発明者らは、ローマのカラカラ浴場の２つの工芸品、すなわち大理石の柱頭と黒白モザイク床タイルとを対象にしたキットの効果および洗浄工程を、実験を通じて立証した。図２（ｂ）を参照すると、どちらの工芸品も、特に、無脊椎動物（Ｍａｃｒｏｂｉｏｔｕｓ  Ｔａｒｄｉｇｒａｄｏ）、原生動物（Ａｓｐｉｄｉｓｉａ）微小藻類、真菌類（接合菌類および子嚢菌類）、様々な細菌を含む不均質な微生物／真菌共同体から成るバイオフィルムで汚染されている。
【０１０２】
該キットは、本発明の最良の形態の教示に従って作製した。（Ｄｅｒｍａｔｅｓｓ製の）５×５ｃｍ２のサイズの親水性ガーゼから作製した支持体を、（標準的技術を用いて発明者らによって合成された）メソ多孔質シリカナノ粒子に固定化されたトリプシンを約５〜約１０％の割合で含むメチルセルロース（Ｔｙｌｏｓｅ  ＭＨ３００Ｐ）のゲル配合物に浸漬被覆した。
【０１０３】
２つの石片の処理中、温度制御手段としてアクアリウムヒータを用いて、約３０℃〜約４０℃の範囲に温度を維持した。配合物の適切な含水量と約７．２〜約８．０のｐＨは、緩衝液で親水性布を優しく湿らせることによって維持した。安定した工程条件を維持し、配合物の汚染を回避するため、キットをＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）膜で保護した。
【０１０４】
これらの工程条件下で、約３０〜９０分の単独のバイオ洗浄処理では、酵素ゲル配合物を含浸させた布を貼付することで、石造物の領域のバイオフィルム（図２では緑で示す）を完全に除去することができた。具体的には、アルギニンおよびリシン（バイオフィルムを構成する同じ種によって生成されるアミノ酸）に対するバイオ洗浄キットの有効かつ選択的な作用が証明された。さらに、本発明によるキットおよび方法の適用後も工芸品は損傷されなかった。含浸布の取り外し後に基板上に残ったゲル配合物の残留物は、脱イオン水の使用によって簡易に完全に除去された。
【０１０５】
空気乾燥後、バイオ洗浄脱水化したゲルを含む含浸布を、家庭用冷蔵庫で５ヶ月間保管した。いったんリン酸塩緩衝液で再活性化されると、同じキットを最大８回再利用して、本発明の教示により長期間バイオ洗浄効果が維持されることを実証することができる。
【０１０６】
驚くべきことに、発明者らは、トリプシンとシリカメソ多孔質ナノ粒子の組み合わせは、（同量の酵素含有量を有する）従来技術のクレンジング配合物、特に、熱分解法シリカに固定化される酵素をベースとする配合物または遊離酵素をベースとする配合物よりもバイオフィルムの除去能力と再利用能力が高いことを発見した。本発明者らの最良の知識では、これを達成するのは自明ではなく、この現象をより深く理解するには更なる研究と実験が必要であるが、メソ多孔質構造によって生じる特定の酵素分散またはナノ粒子周囲の電荷分布に左右される場合がある。
【０１０７】
実施例２：他の基板のバイオ洗浄処理
【０１０８】
実施例１のキットと略同様のバイオ洗浄キットを、様々な基板：石（玄武岩、大理石、着色大理石）、テラコッタ、漆喰壁、（テンペラ塗料または可洗塗料）を塗った壁に適用した。サンプル表面は、主にカビ菌から成るバイオフィルムに侵されていた。
【０１０９】
上述の手順に従い、湿潤形状（すなわち、適用前にゲル酵素を活性化させる）と乾燥形状（すなわち、適用後にゲル酵素を活性化させる）の両方で基板にキットを適用した。親水性布支持体とゲル配合物の組み合わせは、様々なサンプル材料の不均等な表面プロファイルに最適に適合した。約９０分間のバイオ洗浄処理が有効であり、実行も簡易であった。同じ結果が、カビ菌に侵された木表面（天然の艶出しオーク材）とプラスチック表面（透明メタクリル酸塩）の両方で達成された。
【０１１０】
このように、本明細書に開示されるバイオ洗浄キットは、石状材料と異なる基板、または非均質表面モフォロジを特徴とする基板から有効にバイオフィルムを除去することによって、本発明の別の目的を達成できることが立証された。
【０１１１】
実施例３：複雑な形状の基板の処理
【０１１２】
バイオ洗浄キットのいくつかの構造により、複雑な形状の石造物の表面からのバイオフィルムの除去が簡易化される。たとえば、適切な弾性の予め成形された親水性布（３０）に酵素配合物（１０）を含浸させることによって、柱や彫像の頭などの湾曲したまたは複雑な表面からバイオフィルムを有益に除去することができる。この目的で、発明者らは、標準的な親水性の予成形弾性ガーゼや（たとえば、３Ｍ（登録商標）製の）外傷治療で使用される管状ネットの有効な含浸を発見した。
【０１１３】
また、既知のダイス切断技術は、布またはその他の支持体（３０）の特定領域にのみバイオ洗浄処理を実行する必要があるときに有効である。もしくは、配合物（１０）を支持体の特定領域に付着させることができ、この場合、配合物の粘度に応じてインクジェットまたはスクリーン印刷フレームなどの標準的な印刷技術を利用する。
発明の形態
【０１１４】
限定ではなく例示のために本発明による他の実施形態を以下提示する。最良の形態によるキット製造方法への変更も、このような変更が自明とは思われない場合に提示する。
【０１１５】
限定ではなく例示のために本明細書に記載される本発明の第２の実施形態では、バイオ洗浄キットは「無支持体」である。すなわち、支持体（３０）を含まない構造である。最良の形態と異なり、この場合、配合物（１０）はバイオフィルム汚染基板（Ｌ）に直接塗布され、配合物（１０）自体の一部である酵素システム（２０）が適切な媒体（３０’）内に分散される。該媒体（３０’）はゲル（たとえば、適切なゲル緩衝液）とすることができる。この場合、配合物の塗布は スパチュラ、ブラシ、または直立基板への塗布に適した技術を用いて実行される。配合物と脱離させたバイオフィルムは、バイオ洗浄処理の最後に基板（Ｌ）を単に水洗いすることによって除去できる。
【０１１６】
実施例４：無支持体バイオ洗浄キットによる石基板の処理
【０１１７】
図５は、レッチェ県アルネザーノのＰａｌａｚｚｏ  Ｍａｒｃｈｅｓａｌｅ（イタリア）に位置する２つの石造物に行ったバイオ洗浄処理の結果を示す。この史跡は、本発明の第２の実施形態にかかる「無支持体」構造のバイオ洗浄キットをテストするために選択された。事実、石造物は、他のクレンジング技術では除去できなかった地衣類およびその他の微生物の多様な結合物によってひどく汚染されていた。実施例１と同じ配合物を新たに作製し、基板に塗布し、約３０〜４０分間基板と接触させた。基板上のゲル配合物の残留物は、脱イオン水を用いて簡易かつ完全に除去した。図５が明確に示すように、バイオ洗浄キットとその関連方法は地衣類を完全に除去することによって、元の基板の完全性に影響を及ぼさず、処理後に配合物の残留物を残さずに、元の基板を露わにした。
【０１１８】
限定ではなく例示のために本明細書に記載される第３の実施形態では、本発明の最良の形態による酵素バイオ洗浄キットは、特に壁などの直立表面からバイオフィルムを除去するときに、基板とキットの活性表面（Ｓ’）との接着、ひいては酵素作用を促進する固定手段（７０）を含む。この目的で、発明者らはいくつかの有益な解決策を特定した。
【０１１９】
第１の解決策では、添付の図３に概略的に示すように、該固定手段（７０）は、バイオ洗浄キットに一体化される構成要素であり、好ましくは可逆接着システムが支持体（３０）の周縁に沿って適用される。処理対象の壁の特徴に応じて、いくつかの既知の接着システムが有益に使用することができる。繊細な湿潤表面用の両面接着テープ（たとえば、３Ｍ（商標）Ａｃｔｉｖｅ（商標）Ｓｔｒｉｐまたはその他の医療用テープ）、マジックテープ（登録商標）式の締結製品、微小吸引システムだけでなく、水糊あるいはその他の物理的または化学的接着剤が使用可能である。もしくは、該固定手段（７０）は、土台または仮プラットフォームに固定されるフレームなどの洗浄対象の壁または床をバイオ洗浄キットに接触させておくことができるバイオ洗浄キットの外部非一体化要素、またはその他の技術的に等価な既知の解決策である。
【０１２０】
第３の実施形態によるバイオ洗浄キットは、有益なことに、直立壁（Ｌ）からバイオフィルムを除去して、本発明の別の目的を達成することができる。この場合、発明者らは、最良の形態と同じゲル配合物（１０）を親水性布（３０）に有効に含浸させることを発見した。事実、ゲルは、重力による落下を抑制するのに適した粘着性を有し、緩衝液の重力による滴下が同緩衝液の毛細管上昇と有効にバランスがとれるため、布構造が十分な湿潤性を保つことが立証された。しかしながら、必要に応じて、含浸布（３０）の上部の正確な含浸は、緩衝液の追加によって調節することができる。
【０１２１】
温度制御部（５０）はアクアリウムヒータまたは標準的な赤外灯などの外部構成要素とすることができる、あるいは、第２の実施形態のようにバイオ洗浄キットに一体化させることができる。
【０１２２】
限定ではなく例示のために図４に概略的に示す第４の実施形態では、バイオ洗浄キットは、酵素バイオ洗浄キットに一体化される温度制御手段（５０）（最良の形態では外部構成要素ではない）と、加湿器（８０）の２つの追加要素を含む。本実施形態によると、別の２つの構造も可能である。第１の構造では、温度制御部（たとえば、ＧＳＩ製のプリント抵抗加熱要素）は配合物を含浸させた支持体（３０）の（外部／内部）の表面に直接配置されるが、第２の構造では、温度制御部（たとえば、Ｇｅｒｂｉｎｇ  ＭＩＣＲＯＷＩＲＥ（登録商標）  Ｈｅａｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙなどの加熱微細ワイヤ）が含浸支持体（３０）に挿入される。家庭用の加湿器または研究所用の精密加湿器はいずれも適切である。工程条件は制御システム（９０）によって管理される。配合物と支持体は好適な実施形態と同じにすることができる。
【０１２３】
限定ではなく例示のために本明細書に記載される本発明による第５の実施形態では、酵素システム（２０）を含有する配合物は、トリプシンの酵素作用を阻害する基板（またはバイオフィルム）の物質との錯体を形成することができる錯化剤を含む。このため、発明者らは、二価イオンの作用を阻害するキレート剤である有効なＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を発見した。ただし、他の既知のキレート剤も有益に使用することができる。
【０１２４】
結論として、専門家であれば、上述の他の実施形態がどのようにして現状技術で既知な解決策を大幅に改良するかを理解するであろう。
【０１２５】
実施例５：直立表面のバイオ洗浄
【０１２６】
（水拭き可能な塗料を塗った）標準的な住居の壁を覆う藍色細菌およびカビ菌から成るバイオフィルムを除去するため、発明者らは、ゲル化リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２〜８）を壁に直接塗布し、最良の形態と同じ組成の配合物（１０）を含浸させた親水性布をそれに被せた。
【０１２７】
親水性布は、スコッチペーパーで縁を固定することによって壁の所定位置に保持した。処理中、壁の温度を（標準的な赤外灯を使用して）約３７℃に維持する一方、適切な水和と約７．２〜約８のｐＨ値を維持するために緩衝液を定期的に布に噴霧した。ゲル化リン酸塩緩衝液の粘度と噴霧する緩衝液の量とを調整することで、緩衝液と配合物は壁に沿ってほとんど滴下しなかった。
【０１２８】
本実施例が実証するように、本発明によるバイオ洗浄キットは直立表面に適用可能であり、本発明の別の重要な目的を達成する。
【０１２９】
結論として、当業者にとっては、本明細書に開示される新規な酵素バイオ洗浄キットと、基板から既存のバイオフィルムを除去する関連の方法とによって、本発明が意図する目的を十分に果たすことは自明であろう。よって、このように構想された本発明は、本明細書に開示される基本的概念から逸脱せずに、様々な変更や変形を受け入れることができる。さらに、細部はすべて、他の技術上等価な要素と置き換えることができる。さらに、上述の工程ステップの順序は単に例であって限定ではなく、便宜的に変更することができる。
【０１３０】
上記の説明および図面は、本発明の目的、特徴、利点を実現する好適な実施形態を単に例示しており、本発明がその実施形態に限定されることを目的としていない。当業者にとって既知である、上記の好適な実施形態の要素に対するすべての構造的、化学的、機能的等価物は引用により本明細書に明確に組み込まれ、請求項に包含されることを目的とする。本発明の範囲は、当業者にとって自明となるであろうその他の実施形態を完全に包含すると理解される。
【０１３１】
上述の説明と実施例は多くの細部を含むが、これらは発明の範囲を限定すると解釈すべきではなく、本発明の好適な実施形態の一部を単に例示していると解釈すべきである。したがって、以下の請求項の精神と範囲に属する本発明の変更は、発明の一部とみなされる。
【０１３２】
添付の請求項では、単数で構成要素を言及することは、特段明示されない限り、「唯一」ではなく「１以上」を意味する。請求項に記載される特徴と技術に参照符号が付されている場合、参照符号は請求項の理解しやすさを高める目的のみで付されており、該参照符号によって限定ではなく例示的に特定される各要素の解釈を限定するものではない。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本発明による酵素バイオ洗浄用キットと関連洗浄方法は、基板からのバイオフィルムの除去が美観、構造、衛生、または保存のために必要とされる、あるいは望まれる多くの専門的および消費者分野に応用されている。
【０１３４】
具体的には、本発明で発揮される利点により、文化遺産の分野、特に、考古学的な場所、モザイク、陶磁器、古代フレスコなどの繊細で貴重な工芸品の修復においては、従来の殺傷物剤の代替として酵素ゲル配合物が最適である。実際に、バイオ洗浄キットは、既知の解決策には見られない、基板の色を変化させたり基板に損傷を及ぼしたりせずに石状表面からバイオフィルムを除去する優れた機能を備える。
【０１３５】
ただし、本発明は、実証されるように、家庭の壁や床からカビ菌類を除去するのにも有益かつ有効である。最後に、たとえば、食品業界での工場の清掃などの他の分野への応用も可能である。
【図１（ａ）】
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【図１（ｂ）】
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【図１（ｃ）】
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【図２（ａ）】
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【図２（ｂ）】
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【図２（ｃ）】
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【図３】
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【図４】
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【図５（ａ）】
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【図５（ｂ）】
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【国際調査報告】
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