(57)【要約】本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害の処置のための組成物および方法に関する。デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害の処置のための修飾アンチセンスオリゴマーが開示される。本開示は、少なくとも一部において、ミオスタチン治療剤と組み合わせたジストロフィン治療剤によるｍｄｘマウス（デュシェンヌ型筋ジストロフィーのマウスモデル）の全身処置により、とりわけ、マウスにおける握力（筋力）が増加したという驚くべき発見に基づく。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できるアンチセンスオリゴマーによって処置され得るジストロフィン遺伝子における変異を有する、デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害を有する被験体を処置する方法であって、
前記被験体に、１７〜４０サブユニットを含み、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソンを含む標的領域内の１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含む、有効量のアンチセンスオリゴマーを投与するステップを含み、前記アンチセンスオリゴマーが、前記エクソンのスキッピングを誘導し、
前記オリゴマーが、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットを含み、
前記被験体が、前記被験体におけるミオスタチン活性およびミオスタチン発現の一方または両方を阻害するミオスタチン治療剤を投与され、それによりデュシェンヌ型筋ジストロフィーまたは関連障害のうちの少なくとも１つを処置する、方法。
【請求項２】
前記エクソンが、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１９、エクソン２３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３またはエクソン５５から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記エクソンがエクソン２３を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記エクソンがエクソン４５を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記エクソンがエクソン５１を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記エクソンがエクソン５３を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記エクソンが、エクソン８、エクソン４４、エクソン５０、エクソン５２またはエクソン５５を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記アンチセンスオリゴマーが、２０〜３０サブユニットを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記アンチセンスオリゴマーが、配列番号７６〜配列番号３４８５から選択される配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記アンチセンスオリゴマーが、エテプリルセン（ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ターゲティング配列が、前記標的領域内の少なくとも１５の連続ヌクレオチドと相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ターゲティング配列が、前記標的領域内の少なくとも１７の連続ヌクレオチドと相補的である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ターゲティング配列が、前記標的領域と１００％相補的である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ミオスタチン治療剤が、タンパク質または核酸のうちの１つまたは複数から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質が、抗ミオスタチン抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質が、可溶性受容体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
可溶性受容体が、ＡＣＶＲ２である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸が、アンチセンスオリゴマーまたはｓｉＲＮＡのうちの少なくとも１つである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記アンチセンスオリゴマーが、１２〜４０サブユニットを含み、ミオスタチンプレｍＲＮＡの標的領域内の１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含み、
前記オリゴマーが、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記アンチセンスオリゴマーが、２０〜３０サブユニットを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ターゲティング配列が、前記標的領域内の少なくとも１５の連続ヌクレオチドと相補的である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ターゲティング配列が、前記標的領域内の少なくとも１７の連続ヌクレオチドと相補的である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記ターゲティング配列が、前記標的領域と１００％相補的である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記標的領域が、配列番号１を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記エクソンが、エクソン２を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的領域が、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドが、イントロン１／エクソン２およびエクソン２／イントロン２に伴うスプライス接合部にわたるヌクレオチド配列、または、（ｉｉ）ヌクレオチドが、イントロン１／エクソン２およびエクソン２／イントロン２に伴うスプライス接合部にわたらないヌクレオチド配列から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記スプライス接合部が、スプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位を含む配列から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記スプライスアクセプター部位が、配列番号２の内部に存在し、前記スプライスドナー部位が配列番号３の内部に存在する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記（ｉ）のヌクレオチドが、配列番号１６〜４３から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記（ｉｉ）のヌクレオチドが、配列番号４４〜７０から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記被験体が、７歳またはこれを超える、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害を処置する方法であって、
被験体に、１２〜４０サブユニットを含み、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソンを含む１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含む、有効量のアンチセンスオリゴマーを投与するステップを含み、
前記オリゴマーが、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットを含み、
前記被験体が、前記被験体の筋細胞内で機能的なジストロフィンタンパク質の発現を増加させるジストロフィン治療剤を投与され、それによりデュシェンヌ型筋ジストロフィーまたは関連障害のうちの少なくとも１つを処置する、方法。
【請求項３３】
前記被験体が、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できるアンチセンスオリゴマーによって処置され得るジストロフィン遺伝子における変異を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記アンチセンスオリゴマーが、２０〜３０サブユニットを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記ターゲティング配列が、標的領域内の少なくとも１５の連続ヌクレオチドと相補的である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記ターゲティング配列が、標的領域内の少なくとも１７の連続ヌクレオチドと相補的である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記アンチセンスオリゴマーが、標的領域と１００％相補的である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記標的領域が、配列番号１を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記エクソンが、エクソン２を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
前記標的領域が、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドがイントロン１／エクソン２およびエクソン２／イントロン２に伴うスプライス接合部にわたるヌクレオチド配列、または、（ｉｉ）ヌクレオチドがイントロン１／エクソン２およびエクソン２／イントロン２に伴うスプライス接合部にわたらないヌクレオチド配列から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
前記スプライス接合部が、スプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位を含む配列から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記スプライスアクセプター部位が、配列番号２の内部に存在し、前記スプライスドナー部位が、配列番号３の内部に存在する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記（ｉ）のヌクレオチドが、配列番号１６〜４３から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記（ｉｉ）のヌクレオチドが、配列番号４４〜７０から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記ジストロフィン治療剤が、タンパク質または核酸のうちの１つまたは複数から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項４６】
前記核酸が、アンチセンスオリゴマーである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記アンチセンスオリゴマーが、２０〜５０サブユニットを含み、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソンを含む標的領域内の１０またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含み、
前記オリゴマーが、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記エクソンが、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１９、エクソン２３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３またはエクソン５５から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記エクソンが、エクソン２３を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記エクソンが、エクソン４５を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記エクソンが、エクソン５１を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記エクソンが、エクソン５３を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記エクソンが、エクソン８、エクソン４４、エクソン５０、エクソン５２またはエクソン５５を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
前記アンチセンスオリゴマーが、２０〜３０サブユニットを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５５】
前記アンチセンスオリゴマーが、配列番号７６〜配列番号３４８５から選択される配列を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５６】
前記アンチセンスオリゴマーが、エテプリルセンである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ターゲティング配列が、標的領域内の少なくとも１５の連続ヌクレオチドと相補的である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ターゲティング配列が、標的領域内の少なくとも１７の連続ヌクレオチドと相補的である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５９】
前記ターゲティング配列が、標的領域と１００％相補的である、請求項４６に記載の方法。
【請求項６０】
ジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できるアンチセンスオリゴマーによって処置され得るジストロフィン遺伝子における変異を有する被験体においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害を処置する方法であって、
被験体に、式（Ｉ）：
【化１０３】
2018530560.tif 000195
を含む化合物または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含み、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり；
Ｚは、８から４８の整数であり；
各Ｙは、Ｏおよび−ＮＲ４から独立に選択され、式中、各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アラルキル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２およびＧから独立に選択され、式中、Ｒ５は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、ｎは、１から５の整数であり；
Ｔは、ＯＨおよび式：
【化１０４】
2018530560.tif 000196
の部分か選択され、式中、
Ａは、−ＯＨ、−Ｎ（Ｒ７）２Ｒ８から選択され、式中、
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ８は、電子対およびＨから選択され、そして
Ｒ６は、ＯＨ、−Ｎ（Ｒ９）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２および式：
【化１０５】
2018530560.tif 000197
の部分から選択され、式中、
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ１０は、Ｇ、Ｃ（Ｏ）−Ｒ１１ＯＨ、アシル、トリチル、４メトキシトリチル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２およびＣ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
ｍは、１から５の整数であり、
Ｒ１１は、式−（Ｏ−アルキル）ｙ−を有し、式中、ｙは、３から１０の整数であり、
ｙ個のアルキル基の各々は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｒ１２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ１の各例は、
−Ｎ（Ｒ１３）２Ｒ１４［式中、各Ｒ１３は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、そしてＲ１４は、電子対およびＨから選択される］；
式（ＩＩ）：
【化１０６】
2018530560.tif 000198
の部分［式中、
Ｒ１５は、Ｈ、Ｇ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＮＲ１８Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１８Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
Ｒ１８は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｑは、１から５の整数であり、
Ｒ１６は、電子対およびＨから選択され；
各Ｒ１７は、Ｈおよびメチルから独立に選択される］；および
式（ＩＩＩ）：
【化１０７】
2018530560.tif 000199
の部分［式中、
Ｒ１９は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｒＮＲ２２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ２２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）４ＮＨ２およびＧから選択され、式中、
Ｒ２２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｒは、１から５の整数であり、
Ｒ２０は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ２１は、電子対およびＨから選択される］
から独立に選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｇ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２３、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｓＮＲ２４Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ２４Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２および式：
【化１０８】
2018530560.tif 000200
の部分から選択され、式中、
Ｒ２３は、式−（Ｏ−アルキル）ｖ−ＯＨを有し、式中、ｖは、３から１０の整数であり、ｖ個のアルキル基の各々は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｒ２４は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｓは、１から５の整数であり；
Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−から選択され；
各Ｒ２５は、式−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２６）２を有し、式中、各Ｒ２６は、式−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２を有し；
Ｒ３は、電子対、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
ここで、Ｇは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰおよび−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択される細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）およびリンカー部分であるか、またはＧは、式：
【化１０９】
2018530560.tif 000201
を有し、式中、ＣＰＰは、Ｇの最大で１つの例が存在するという条件で、ＣＰＰのカルボキシ末端において、アミド結合により、リンカー部分に結合しており、
ここで、前記ターゲティング配列は、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソンを含む標的領域内の１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的であり、
ここで、前記被験体は、前記被験体におけるミオスタチン活性およびミオスタチン発現の一方または両方を阻害するミオスタチン治療剤を投与され、それによりデュシェンヌ型筋ジストロフィーまたは関連障害のうちの少なくとも１つを処置する、方法。
【請求項６１】
各Ｎｕが、独立に、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、シトシン、イノシン、ヒポキサンチン、２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、Ｃ５−プロピニル修飾ピリミジンまたは１０−（９−（アミノエトキシ）フェノキサジニル）である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記標的領域が、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドが前記エクソンに伴うスプライス接合部にわたるヌクレオチド配列；または（ｉｉ）ヌクレオチドが前記エクソン接合部に伴うスプライス接合部にわたらないヌクレオチド配列から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記ターゲティング配列が、配列番号７６〜３４８５から選択される配列を含むか、配列番号７６〜３４８５から選択されるターゲティング配列の少なくとも１０の連続ヌクレオチドの断片であるか、または配列番号７６〜３４８５から選択されるターゲティング配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
ｉ）Ｙが、Ｏであり、Ｒ２が、ＨもしくはＧから選択され、Ｒ３が、電子対もしくはＨから選択されるか；
ｉｉ）Ｒ２が、Ｇであり、式中、前記ＣＰＰが配列番号３４８６〜３５０１から選択される配列を有するか；
ｉｉｉ）各Ｒ１が、−Ｎ（ＣＨ３）２であるか；
ｉｖ）少なくとも１つのＲ１が、
【化１１０】
2018530560.tif 000202
から選択されるか；または
ｖ）Ｒ１基の５０〜９０％が、−Ｎ（ＣＨ３）２である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
Ｔが、式：
【化１１１】
2018530560.tif 000203
を有し、式中、Ａは、−Ｎ（ＣＨ３）２であり、Ｒ６は、式：
【化１１２】
2018530560.tif 000204
を有し、式中、Ｒ１０は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１１ＯＨである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
各Ｙが、Ｏであり、Ｔが、
【化１１３】
2018530560.tif 000205
から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６７】
Ｔが、式：
【化１１４】
2018530560.tif 000206
を有する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６８】
ジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できるアンチセンスオリゴマーによって処置され得るジストロフィン遺伝子における変異を有する被験体においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害を処置する方法であって、
被験体に、式（ＶＩ）：
【化１１５】
2018530560.tif 000207
を含む化合物または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含み、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり；
Ｚは、８から４８の整数であり；
各Ｙは、Ｏおよび−ＮＲ４から独立に選択され、式中、各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アラルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２およびＧから独立に選択され、式中、Ｒ５は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、ｎは、１から５の整数であり；
Ｔは、ＯＨおよび式：
【化１１６】
2018530560.tif 000208
の部分から選択され、式中、
Ａは、−ＯＨおよび−Ｎ（Ｒ７）２Ｒ８から選択され、式中
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ８は、電子対およびＨから選択され、
Ｒ６は、ＯＨ、−Ｎ（Ｒ９）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２および式：
【化１１７】
2018530560.tif 000209
の部分から選択され、式中、
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ１０は、Ｇ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１１ＯＨ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
ｍは、１から５の整数であり、
Ｒ１１は、式−（Ｏ−アルキル）ｙ−を有し、式中、ｙは、３から１０の整数であり、
ｙ個のアルキル基の各々は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｒ１２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｇ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２および−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２３から選択され；
Ｒ３は、電子対、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
ここで、前記ターゲティング配列は、配列番号７６〜３４８５から選択される配列を含むか、
配列番号７６〜３４８５から選択されるか、配列番号７６〜３４８５から選択される配列の少なくとも１０の連続ヌクレオチドの断片であるか、または配列番号７６〜３４８５から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体であり、
ここで、前記被験体は、前記被験体におけるミオスタチン活性およびミオスタチン発現の一方または両方を阻害するミオスタチン治療剤を投与され、それによりデュシェンヌ型筋ジストロフィーまたは関連障害のうちの少なくとも１つを処置する、方法。
【請求項６９】
ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できるアンチセンスオリゴマーによって処置され得るジストロフィン遺伝子における変異を有する被験体においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害を処置する方法であって、
被験体に、式（Ｉ）：
【化１１８】
2018530560.tif 000210
を含む化合物または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含み、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり；
Ｚは、８から４８の整数であり；
各Ｙは、Ｏおよび−ＮＲ４から独立に選択され、式中、各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アラルキル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２およびＧから独立に選択され、式中、Ｒ５は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、ｎは１から５の整数であり；
Ｔは、ＯＨおよび式：
【化１１９】
2018530560.tif 000211
の部分から選択され、式中、
Ａは、−ＯＨ、−Ｎ（Ｒ７）２Ｒ８から選択され、式中
Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ８は、電子対およびＨから選択され、
Ｒ６は、ＯＨ、−Ｎ（Ｒ９）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２および式：
【化１２０】
2018530560.tif 000212
の部分から選択され、式中、
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ１０は、Ｇ、Ｃ（Ｏ）−Ｒ１１ＯＨ、アシル、トリチル、４メトキシトリチル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２およびＣ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
ｍは、１から５の整数であり、
Ｒ１１は、式−（Ｏ−アルキル）ｙ−を有し、式中、ｙは、３から１０の整数であり、
ｙ個のアルキル基の各々は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｒ１２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ１の各例は、
−Ｎ（Ｒ１３）２Ｒ１４［式中、各Ｒ１３は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、Ｒ１４は、電子対およびＨから選択される］；
式（ＩＩ）：
【化１２１】
2018530560.tif 000213
の部分［式中、
Ｒ１５は、Ｈ、Ｇ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＮＲ１８Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１８Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
Ｒ１８は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｑは、１から５の整数であり、
Ｒ１６は、電子対およびＨから選択され；そして
各Ｒ１７は、Ｈおよびメチルから独立に選択される］；および
式（ＩＩＩ）：
【化１２２】
2018530560.tif 000214
の部分［式中、
Ｒ１９は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｒＮＲ２２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ２２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）４ＮＨ２およびＧから選択され、式中、
Ｒ２２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｒは、１から５の整数であり、
Ｒ２０は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ２１は、電子対およびＨから選択される］から独立に選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｇ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２３、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｓＮＲ２４Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ２４Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２および式：
【化１２３】
2018530560.tif 000215
の部分から選択され、式中、
Ｒ２３は、式−（Ｏ−アルキル）ｖ−ＯＨを有し、式中、ｖは、３から１０の整数であり、ｖ個のアルキル基の各々は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｒ２４は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｓは、１から５の整数であり；
Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−から選択され、
各Ｒ２５は、式−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２６）２を有し、式中、各Ｒ２６は、式−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２を有し；
Ｒ３は、電子対、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
ここで、Ｇは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰおよび−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択される、細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）およびリンカー部分であるか、またはＧは、式：
【化１２４】
2018530560.tif 000216
を有し、式中、ＣＰＰは、Ｇの最大で１つの例が存在するという条件で、ＣＰＰのカルボキシ末端において、アミド結合により、リンカー部分に結合しており、
ここで、前記ターゲティング配列は、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソンを含む標的領域内の１０またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的であり、
ここで、前記被験体は、前記被験体におけるミオスタチン活性およびミオスタチン発現の一方または両方を阻害するミオスタチン治療剤を投与され、それによりデュシェンヌ型筋ジストロフィーまたは関連障害のうちの少なくとも１つを処置する、方法。
【請求項７０】
各Ｎｕが、独立に、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、シトシン、イノシン、ヒポキサンチン、２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、Ｃ５−プロピニル修飾ピリミジンまたは１０−（９−（アミノエトキシ）フェノキサジニル）である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記ターゲティング配列が、配列番号１６〜７５から選択される配列を含むか、配列番号１６〜７５から選択されるターゲティング配列の少なくとも１０の連続ヌクレオチドの断片であるか、または配列番号１６〜７５から選択されるターゲティング配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
ｉ）Ｙが、Ｏであり、Ｒ２が、ＨもしくはＧから選択され、Ｒ３が、電子対もしくはＨから選択されるか；
ｉｉ）Ｒ２が、Ｇであり、前記ＣＰＰが、配列番号３４８６〜３５０１から選択される配列を有するか；
ｉｉｉ）各Ｒ１が、−Ｎ（ＣＨ３）２であるか；
ｉｖ）少なくとも１つのＲ１が、
【化１２５】
2018530560.tif 000217
から選択されるか、または
ｖ）Ｒ１基の５０〜９０％が、−Ｎ（ＣＨ３）２である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
Ｔが、式：
【化１２６】
2018530560.tif 000218
を有し、式中、Ａが、−Ｎ（ＣＨ３）２であり、Ｒ６が式：
【化１２７】
2018530560.tif 000219
を有し、式中、Ｒ１０が、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１１ＯＨである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
各Ｙが、Ｏであり、Ｔが、
【化１２８】
2018530560.tif 000220
から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
Ｔが、式：
【化１２９】
2018530560.tif 000221
を有する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７６】
被験体においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害を処置する方法であって、
被験体に、式（ＶＩ）：
【化１３０】
2018530560.tif 000222
を含む化合物または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含み、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり；
Ｚは、８から４８の整数であり；
各Ｙは、Ｏおよび−ＮＲ４から独立に選択され、式中、Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アラルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２およびＧから独立に選択され、式中、Ｒ５は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、ｎは、１から５の整数であり；
Ｔは、ＯＨおよび式：
【化１３１】
2018530560.tif 000223
の部分から選択され、式中、
Ａは、−ＯＨおよび−Ｎ（Ｒ７）２Ｒ８から選択され、式中、
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ８は、電子対およびＨから選択され、
Ｒ６は、ＯＨ、−Ｎ（Ｒ９）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２および式：
【化１３２】
2018530560.tif 000224
の部分から選択され、式中、
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ１０は、Ｇ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１１ＯＨ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
ｍは、１から５の整数であり、
Ｒ１１は、式−（Ｏ−アルキル）ｙ−を有し、式中、ｙは、３から１０の整数であり、
ｙ個のアルキル基の各々は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｒ１２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｇ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２および−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２３から選択され；
Ｒ３は、電子対、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
ここで、前記ターゲティング配列は、配列番号１６〜７５から選択される配列を含むか、配列番号１６〜７５から選択されるか、配列番号１６〜７５から選択される配列の少なくとも１０の連続ヌクレオチドの断片であるか、または配列番号１６〜７５から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体であり、
ここで、前記被験体は、前記被験体の筋細胞内で機能的なジストロフィンタンパク質の発現を増加させるジストロフィン治療剤を投与され、それによりデュシェンヌ型筋ジストロフィーまたは関連障害のうちの少なくとも１つを処置する、方法。
【請求項７７】
１２〜４０サブユニットのアンチセンスオリゴマー化合物と、薬学的に許容される担体とを含むミオスタチン関連医薬組成物であって、前記化合物が、
（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットと；
ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソンを含む標的領域内の１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列と
を含むミオスタチン関連組成物と組み合わせた、
１７〜４０サブユニットのアンチセンスオリゴマー化合物と、薬学的に許容される担体とを含むジストロフィン関連医薬組成物であって、前記化合物が、
（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または、（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットと；
ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソンを含む標的領域内の１０またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列と
を含むジストロフィン関連医薬組成物。
【請求項７８】
前記ジストロフィン関連組成物と前記ミオスタチン関連組成物とが、同じ医薬組成物として提供される、７７に記載の組成物。
【請求項７９】
ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できるアンチセンスオリゴマーによって処置され得る遺伝子変異を有する被験体においてミオスタチン発現をモジュレートするための方法であって、
前記被験体に、１２〜４０サブユニットを含み、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソンを含む１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含む、有効量のアンチセンスオリゴマーを投与するステップであって、
前記オリゴマーが、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットを含む、ステップと、
ミオスタチンプレｍＲＮＡ転写物内の標的領域に前記アンチセンスオリゴマーを結合させるステップと、
前記標的領域のヒトミオスタチンｍＲＮＡ転写物への転写を阻害するステップとを含み、
前記被験体が、前記被験体におけるジストロフィン発現を増加させるジストロフィン治療剤を投与されている、方法。
【請求項８０】
ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できるアンチセンスオリゴマーによって処置され得る遺伝子変異を有する被験体においてエクソン２の発現を減少させるための方法であって、
前記被験体に、１２〜４０サブユニットを含み、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソンを含む１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含む、有効量のアンチセンスオリゴマーを投与するステップと、ミオスタチンｍＲＮＡ転写物内のエクソン２の転写を阻害するステップとを含み、
前記被験体が、前記被験体におけるジストロフィン発現を増加させるジストロフィン治療剤を投与されている、方法。
【請求項８１】
ミオスタチンｍＲＮＡ転写物内のエクソン２の発現が、約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％減少する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できるアンチセンスオリゴマーによって処置され得るジストロフィン遺伝子における変異を有する被験体の筋細胞または組織における機能的なミオスタチンタンパク質の蓄積を減少させるための方法であって、
前記被験体に、１２〜４０サブユニットを含み、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソンを含む１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含む、有効量のアンチセンスオリゴマーを投与するステップと、
ミオスタチンｍＲＮＡ転写物内のエクソン２の転写を阻害するステップとを含み、
前記被験体が、前記被験体におけるジストロフィン発現を増加させるジストロフィン治療剤を投与されている、方法。
【請求項８３】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害を処置するための医薬であって、
（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットを含み；ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソンを含む１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含む、１２〜４０サブユニットを含むアンチセンスオリゴマー化合物と；
機能的なジストロフィンタンパク質の発現を増加させるジストロフィン治療剤とを含む医薬。
【請求項８４】
ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できるアンチセンスオリゴマーによって処置され得るジストロフィン遺伝子における変異を有する被験体においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害の進行を阻害するための方法であって、
前記被験体に、１２〜４０サブユニットを含み、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソンを含む１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含む、有効量のアンチセンスオリゴマーを投与するステップと、ミオスタチンｍＲＮＡ転写物内のエクソン２の転写を阻害するステップとを含み、
前記被験体が、前記被験体におけるジストロフィン発現を増加させるジストロフィン治療剤を投与され、それによりデュシェンヌ型筋ジストロフィーの進行を阻害する、方法。
【請求項８５】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害を有する被験体において機能的なミオスタチンタンパク質の蓄積を減少させる方法であって、
前記被験体に、１２〜４０サブユニットを含み、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソンを含む１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含む、有効量のアンチセンスオリゴマーを投与するステップと、
ミオスタチンｍＲＮＡ転写物内のエクソン２の転写を阻害するステップとを含み、
前記被験体における機能的なミオスタチンタンパク質の蓄積が減少し、
前記被験体が、前記被験体の筋細胞内で機能的なジストロフィンタンパク質の発現を増加させるジストロフィン治療剤を投与されている、方法。
【請求項８６】
そのような処置を必要とする被験体においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害を処置するための方法であって、
前記被験体において少なくとも約２００〜４００ｎＭのアンチセンスオリゴマーのピークの血中濃度を得るための有効量でアンチセンスオリゴマーを投与するステップを含む方法。
【請求項８７】
ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できるアンチセンスオリゴマーによって処置され得るジストロフィン遺伝子における変異を有する被験体において骨格筋量不足を処置する方法であって、
（ａ）前記被験体におけるミオスタチンタンパク質の血液中または組織中レベルを測定するステップと、
（ｂ）前記被験体に、１２〜４０サブユニットを含み、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソンを含む１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含む、有効量のアンチセンスオリゴマーを投与するステップと、
（ｃ）ミオスタチンｍＲＮＡ転写物内のエクソン２の転写を阻害するステップと、
（ｄ）選択した時間以後、前記被験体におけるミオスタチンタンパク質レベルを測定するステップと、
（ｅ）（ｄ）で測定された前記レベルを使用して前記の投与を反復するステップであって、投与されるアンチセンスオリゴマーの量の用量または投薬スケジュールを調整するステップとを含み、前記被験体におけるミオスタチンタンパク質の前記レベルが、前記アンチセンスオリゴマーの投与後に低下し、
前記被験体が、前記被験体の筋細胞において機能的なジストロフィン発現タンパク質の発現を増加させるジストロフィン治療剤を投与されている、方法。
【請求項８８】
ジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できるアンチセンスオリゴマーによって処置され得るジストロフィン遺伝子における変異を有する被験体においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害の進行を阻害する方法であって、
前記被験体に、１７〜４０サブユニットを含み、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソンを含む標的領域内の１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含む、有効量のアンチセンスオリゴマーを投与するステップを含み、前記アンチセンスオリゴマーが、前記エクソンのスキッピングを誘導し、
前記オリゴマーが、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットを含み、
前記被験体が、前記被験体におけるミオスタチンの活性および発現のうちの一方または両方を阻害するミオスタチン治療剤を投与され、それによりデュシェンヌ型筋ジストロフィーまたは関連障害のうちの少なくとも１つの進行を阻害する、方法。
【請求項８９】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーの進行を阻害する方法であって、
被験体に、１２〜４０サブユニットを含み、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソンを含む１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含む、有効量のアンチセンスオリゴマーを投与するステップを含み、
前記オリゴマーが、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットを含み、
前記被験体が、前記被験体の筋細胞において機能的なジストロフィンタンパク質の発現を増加させるジストロフィン治療剤を投与され、それによりデュシェンヌ型筋ジストロフィーの進行を阻害する、方法。
【請求項９０】
前記アンチセンスオリゴマーの３’末端または５’末端にコンジュゲートするアルギニンに富むペプチド配列をさらに含み、前記アルギニンに富むペプチド配列が、配列番号３４８６〜３５０１から選択される配列を含む、前出の請求項のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項９１】
Ｒ２が、Ｇであり、前記ＣＰＰが、配列番号３４８６〜３５０１から選択される配列を含む、請求項６０から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
アンチセンスオリゴマーの３’末端にコンジュゲートするアルギニンに富むペプチド配列をさらに含み、前記アルギニンに富むペプチド配列が、配列番号３４８６〜３５０１から選択される配列を含む、請求項８３に記載の医薬。
【請求項９３】
１７〜４０サブユニットを含み、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソンを含む標的領域内の１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含むアンチセンスオリゴマーであって、
（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットを含む、ジストロフィンを標的とする前記オリゴマーと；
１２〜４０サブユニットを含み、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソンを含む１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含むアンチセンスオリゴマーであって、
（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットを含む、ミオスタチンを標的とする前記オリゴマーとを含む組成物。
【請求項９４】
ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できるアンチセンスオリゴマーによって処置され得る遺伝子変異を有する被験体においてジストロフィン発現をモジュレートするための方法であって、
前記被験体に、１７〜４０サブユニットを含み、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソンを含む１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含む、有効量のアンチセンスオリゴマーを投与するステップを含み、
前記オリゴマーが、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットを含み、
前記被験体が、前記被験体におけるミオスタチン活性およびミオスタチン発現の一方または両方を阻害するミオスタチン治療剤を投与されている、方法。
【請求項９５】
ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できるアンチセンスオリゴマーによって処置され得る遺伝子変異を有する被験体においてミオスタチン発現をモジュレートするための方法であって、
前記被験体に、１２〜４０サブユニットを含み、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソンを含む１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含む、有効量のアンチセンスオリゴマーを投与するステップを含み、
前記オリゴマーが、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットを含み、
前記被験体が、前記被験体の筋細胞内で機能的なジストロフィンタンパク質の発現を増加させるジストロフィン治療剤を投与されている、方法。
【請求項９６】
前記アンチセンスオリゴマー、ジストロフィン治療剤またはミオスタチン治療剤の少なくとも１つが、前記被験体に全身投与される、請求項１から９５のいずれかに記載の方法。
【請求項９７】
前記被験体が、ヒトである、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記被験体が、７歳またはこれを超える、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
アンチセンスオリゴマーまたはジストロフィン治療剤が、配列番号９２７を含まない、請求項９８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
開示の分野
本発明は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害の処置のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の説明
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、タンパク質ジストロフィンの発現の欠陥に起因する。タンパク質をコードする遺伝子は、２００万を超えるＤＮＡのヌクレオチドにわたって広がる７９のエクソンを含む。エクソンのリーディングフレームを変えるか、または停止コドンを導入するか、あるいはフレームがあっていない１もしくは複数のエクソン全体の除去または１もしくは複数のエクソンの重複により特徴付けられるいかなるエクソンの変異も、機能的なジストロフィンの産生を途絶させ、それによりＤＭＤをもたらす可能性がある。
【０００３】
疾患の発症は、クレアチンキナーゼレベルの上昇により出生時に実証されることがあり、顕著な運動障害が生後１年で見られる場合がある。ＤＭＤを有する大部分の患者は７歳または８歳までに次第に足取りがぎこちなくなり、床から立ち上がり階段を登る能力を失い、１０〜１４歳までにほとんどが車椅子に依存する。ＤＭＤは一様に致命的であり、罹患個体は、典型的には、１０代後半または２０代前半には呼吸および／または心不全により死亡する。ＤＭＤの持続的な進行は、疾患の全ての段階で治療的介入が可能であるが、処置は現在のところ糖質コルチコイドに限られており、それは体重増加、行動変化、思春期変化、骨粗鬆症、クッシング様顔貌、発育阻止および白内障を含む多くの副作用を伴う。
【０００４】
典型的には１または複数のエクソンの欠失である変異により、ジストロフィン転写物全体にわたって正しいリーディングフレームとなり、その結果、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳が早まって終了しない場合には、本明細書で記載される関連障害である、低重症型の筋ジストロフィーであるベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）が発症することがわかっている。変異ジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセシングにおいて、上流および下流エクソンの接合により遺伝子の正しいリーディングフレームが維持される場合、若干の活性が保持された、短い内部欠失を有するタンパク質をコードするｍＲＮＡが生じ、その結果、ベッカー型の表現型となる。
【０００５】
長年、ジストロフィンタンパク質のリーディングフレームを変えない１または複数のエクソンの欠失が、ＢＭＤ表現型をもたらすが、フレームシフトが生じるエクソン欠失はＤＭＤをもたらすことが公知である（Monaco、Bertelsonら、１９８８年）。一般に、リーディングフレームを変更し、したがって適切なタンパク質翻訳を中断する、点変異およびエクソン欠失を含むジストロフィン変異は、ＤＭＤをもたらす。また、一部のＢＭＤおよびＤＭＤ患者は、複数のエクソンにまたがるエクソン欠失を有することに留意すべきである。
【０００６】
ＤＭＤの処置に対するスプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）の安全性および有効性を試験した最近の臨床試験は、スプライソソームの立体阻害によるプレｍＲＮＡの選択的スプライシングを誘導するＳＳＯ技術に基づく（Cirakら、２０１１年；Goemansら、２０１１年；Kinaliら、２００９年；van  Deutekomら、２００７年）。しかしながら、これらの成功にもかかわらず、ＤＭＤの処置に利用できる薬理学的オプションは限られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ゆえに、ＤＭＤの処置のための改善された治療的アプローチに対する強いニーズが依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
要旨
本開示は、少なくとも一部において、ミオスタチン治療剤と組み合わせたジストロフィン治療剤によるｍｄｘマウス（デュシェンヌ型筋ジストロフィーのマウスモデル）の全身処置により、とりわけ、マウスにおける握力（筋力）が増加したという驚くべき発見に基づく。握力（筋力）の増加に加えて、この複合治療的アプローチはまた、単独治療のみと比較して、エクソンスキッピング効率およびタンパク質発現、ならびに他のｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏエンドポイントを増加させた。これらには、とりわけ、体重、筋肉量、特定の筋線維の肥大および筋肉の再生の改善が含まれる。
【０００９】
さらに驚くべき発見は、とりわけ本明細書で記載される方法および組合せによる処置に受容的な集団の年齢に関する。若齢のｍｄｘマウスは、筋肉の成長および再生のより長い一定期間を経験し、ゆえにより穏やかな病変を示す傾向があることが一般的に公知である。例えば、McGreevyら、Disease  Models  &  Mechanisms、８巻：１９５〜２１３頁（２０１５年）を参照されたい。対照的に、老齢のｍｄｘマウスは、筋肉の完全性および機能のより一層一貫した低下を示し、処置が困難であるより重症の病変により特徴付けられる。しかしながら、驚くべきことに、上記のｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結果は、若齢のｍｄｘマウスのみならず老齢のマウスでも生じることを見出した。これは、本明細書で記載される組成物および方法が、より重症の病変および予後不良を有する高齢患者（例えば、７歳またはこれを超える小児患者）の処置に有用であることを示す。
【００１０】
さらに驚くべき発見は、試験した処置集団における長い寿命および／または高い生存率に関する。若齢のｍｄｘマウスは、ジストロフィン欠損であるにもかかわらず、臨床症状が最小であることが公知である（McGreevyら、２０１５年）。マウスが１５カ月齢またはこれを超えるまで、臨床表現型、例えば筋肉の消耗、脊柱側弯症および心不全をよく表す重症のジストロフィーの表現型が現れない。しかし、ｍｄｘマウスの寿命は野生型マウスと比較し約２５％短いため、早期死亡がこの時点でしばしば生じる。しかしながら、ここで本発明者らは驚くべきことに、本明細書の方法および組合せに従う処置が、このモデルにおける典型的な寿命／生存率をはるかに超える少なくとも約１８〜２４カ月に、ｍｄｘマウスの生存を延長したことを見出した。本明細書の多様な態様および実施形態に従い、老齢のｍｄｘマウスにおいて観察されたこれらの高い治療的利益および長い寿命は、驚くべきである。
【００１１】
したがって、本明細書に提示される多様な態様は、ジストロフィン治療剤とミオスタチン治療剤との組合せを投与することにより、被験体においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置する方法を含む。
【００１２】
多様な態様は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できるアンチセンスオリゴマーによって処置され得るジストロフィン遺伝子における変異を有する、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する被験体を処置する方法を含む。この方法は、前記被験体に、１７〜４０サブユニットを含み、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソンを含む標的領域内の１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含む、有効量のアンチセンスオリゴマーを投与するステップを含み、前記アンチセンスオリゴマーが、前記エクソンのスキッピングを誘導し、前記オリゴマーが、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットを含み、前記被験体が、前記被験体におけるミオスタチン活性およびミオスタチン発現の一方または両方を阻害するミオスタチン治療剤を投与され、それによりデュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置する。
【００１３】
多様な実施形態では、前記エクソンが、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１９、エクソン２３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３またはエクソン５５から選択される。一部の実施形態では、前記エクソンがエクソン２３を含む。一部の実施形態では、前記エクソンがエクソン４５を含む。一部の実施形態では、前記エクソンがエクソン５１を含む。一部の実施形態では、前記エクソンがエクソン５３を含む。一部の実施形態では、前記エクソンが、エクソン８、エクソン４４、エクソン５０、エクソン５２またはエクソン５５を含む。
【００１４】
多様な実施形態では、前記アンチセンスオリゴマーが、２０〜３０サブユニットを含む。一部の実施形態では、前記アンチセンスオリゴマーが、配列番号７６〜配列番号３４８５から選択される配列を含む。さらなる実施形態では、前記アンチセンスオリゴマーが、配列番号７６である。
【００１５】
多様な実施形態では、前記ターゲティング配列が、前記標的領域内の少なくとも１５の連続ヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、前記ターゲティング配列が、前記標的領域内の少なくとも１７の連続ヌクレオチドと相補的である。さらなる実施形態では、前記ターゲティング配列が、前記標的領域と１００％相補的である。
【００１６】
多様な実施形態では、前記ミオスタチン治療剤が、タンパク質または核酸である。一部の実施形態では、前記タンパク質が、抗ミオスタチン抗体である。一部の実施形態では、前記タンパク質が、可溶性受容体である。さらなる実施形態では、可溶性受容体が、ＡＣＶＲ２である。一部の実施形態では、前記核酸が、アンチセンスオリゴマーまたはｓｉＲＮＡのうちの少なくとも１つである。
【００１７】
多様な実施形態では、前記アンチセンスオリゴマーが、１２〜４０サブユニットを含み、ミオスタチンプレｍＲＮＡの標的領域内の１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含み、前記オリゴマーが、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットを含む。実施形態では、前記アンチセンスオリゴマーが、２０〜３０サブユニットを含む。一部の実施形態では、前記ターゲティング配列が、前記標的領域内の少なくとも１５の連続ヌクレオチドと相補的である。さらなる実施形態では、前記ターゲティング配列が、前記標的領域内の少なくとも１７の連続ヌクレオチドと相補的である。実施形態では、前記ターゲティング配列が、前記標的領域と１００％相補的である。実施形態では、前記標的領域が、配列番号１を含む。実施形態では、前記エクソンが、エクソン２を含む。
【００１８】
多様な実施形態では、前記標的領域が、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドが、イントロン１／エクソン２およびエクソン２／イントロン２に伴うスプライス接合部にわたるヌクレオチド配列、または、（ｉｉ）ヌクレオチドが、イントロン１／エクソン２およびエクソン２／イントロン２に伴うスプライス接合部にわたらないヌクレオチド配列から選択される。実施形態では、前記スプライス接合部が、スプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位を含む配列から選択される。実施形態では、前記スプライス接合部が、スプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位を含む配列から選択される。一部の実施形態では、前記スプライスアクセプター部位が、配列番号２の内部に存在し、前記スプライスドナー部位が配列番号３の内部に存在する。
【００１９】
多様な実施形態では、前記（ｉ）のヌクレオチドが、配列番号１６〜４３から選択される。実施形態では、前記（ｉｉ）のヌクレオチドが、配列番号４４〜７０から選択される。
【００２０】
多様な実施形態では、前記被験体が、７歳またはこれを超える小児患者である。
【００２１】
多様な態様は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置する方法であって、
被験体に、１２〜４０サブユニットを含み、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソンを含む１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含む、有効量のアンチセンスオリゴマーを投与するステップを含み、前記オリゴマーが、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットを含み、前記被験体が、前記被験体内でのジストロフィンの発現を増加させるジストロフィン治療剤を投与され、それによりデュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置する、方法を含む。
【００２２】
多様な実施形態では、前記被験体が、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できるアンチセンスオリゴマーによって処置され得るジストロフィン遺伝子における変異を有する。
【００２３】
多様な実施形態では、前記アンチセンスオリゴマーが、２０〜３０サブユニットを含む。実施形態では、前記ターゲティング配列が、標的領域内の少なくとも１５の連続ヌクレオチドと相補的である。実施形態では、前記ターゲティング配列が、標的領域内の少なくとも１７の連続ヌクレオチドと相補的である。実施形態では、前記アンチセンスオリゴマーが、標的領域と１００％相補的である。実施形態では、前記標的領域が、配列番号１を含む。実施形態では、前記エクソンが、エクソン２を含む。
【００２４】
多様な実施形態では、前記標的領域が、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドがイントロン１／エクソン２およびエクソン２／イントロン２に伴うスプライス接合部にわたるヌクレオチド配列、または、（ｉｉ）ヌクレオチドがイントロン１／エクソン２およびエクソン２／イントロン２に伴うスプライス接合部にわたらないヌクレオチド配列から選択される。実施形態では、前記スプライス接合部が、スプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位を含む配列から選択される。実施形態では、前記スプライスアクセプター部位が、配列番号２の内部に存在し、前記スプライスドナー部位が、配列番号３の内部に存在する。
【００２５】
多様な実施形態では、前記ジストロフィン治療剤が、タンパク質または核酸のうちの１つまたは複数から選択される。実施形態では、前記核酸が、アンチセンスオリゴマーである。一部の実施形態では、前記アンチセンスオリゴマーが、２０〜５０サブユニットを含み、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソンを含む標的領域内の１０またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含み、前記オリゴマーが、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットを含む。
【００２６】
様々な態様および実施形態は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できるアンチセンスオリゴマーによって処置され得るジストロフィン遺伝子における変異を有する被験体においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害を処置する方法を含む。様々な実施形態では、この方法は、被験体に、式（Ｉ）：
【化１】
2018530560.tif 000002
を含むターゲティング配列または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含み、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり；
Ｚは、８から４８の整数であり；
各Ｙは、Ｏおよび−ＮＲ４から独立に選択され、式中、各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アラルキル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２およびＧから独立に選択され、式中、Ｒ５は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、ｎは、１から５の整数であり；
Ｔは、ＯＨおよび式：
【化２】
2018530560.tif 000003
の部分か選択され、式中、
Ａは、−ＯＨ、−Ｎ（Ｒ７）２Ｒ８から選択され、式中、
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ８は、電子対およびＨから選択され、そして
Ｒ６は、ＯＨ、−Ｎ（Ｒ９）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２および式：
【化３】
2018530560.tif 000004
の部分から選択され、式中、
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ１０は、Ｇ、Ｃ（Ｏ）−Ｒ１１ＯＨ、アシル、トリチル、４メトキシトリチル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２およびＣ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
ｍは、１から５の整数であり、
Ｒ１１は、式−（Ｏ−アルキル）ｙ−を有し、式中、ｙは、３から１０の整数であり、
ｙ個のアルキル基の各々は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｒ１２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ１の各例は、
−Ｎ（Ｒ１３）２Ｒ１４［式中、各Ｒ１３は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、そしてＲ１４は、電子対およびＨから選択される］；
式（ＩＩ）：
【化４】
2018530560.tif 000005
の部分［式中、
Ｒ１５は、Ｈ、Ｇ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＮＲ１８Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１８Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
Ｒ１８は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｑは、１から５の整数であり、
Ｒ１６は、電子対およびＨから選択され；
各Ｒ１７は、Ｈおよびメチルから独立に選択される］；および
式（ＩＩＩ）：
【化５】
2018530560.tif 000006
の部分［式中、
Ｒ１９は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｒＮＲ２２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ２２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）４ＮＨ２およびＧから選択され、式中、
Ｒ２２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｒは、１から５の整数であり、
Ｒ２０は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ２１は、電子対およびＨから選択される］
から独立に選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｇ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２３、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｓＮＲ２４Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ２４Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２および式：
【化６】
2018530560.tif 000007
の部分から選択され、式中、
Ｒ２３は、式−（Ｏ−アルキル）ｖ−ＯＨを有し、式中、ｖは、３から１０の整数であり、ｖ個のアルキル基の各々は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｒ２４は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｓは、１から５の整数であり；
Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−から選択され；
各Ｒ２５は、式−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２６）２を有し、式中、各Ｒ２６は、式−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２を有し；
Ｒ３は、電子対、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
ここで、Ｇは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰおよび−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択される細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）およびリンカー部分であるか、またはＧは、式：
【化７】
2018530560.tif 000008
を有し、式中、ＣＰＰは、Ｇの最大で１つの例が存在するという条件で、ＣＰＰのカルボキシ末端において、アミド結合により、リンカー部分に結合しており、
ここで、前記ターゲティング配列は、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソンを含む標的領域内の１０またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的であり、
ここで、前記被験体は、ミオスタチン治療剤を投与されており、それにより、前記被験体におけるミオスタチン活性およびミオスタチン発現の一方または両方が抑制される。
【００２７】
多様な実施形態では、各Ｎｕが、独立に、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、シトシン、イノシン、ヒポキサンチン、２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、Ｃ５−プロピニル修飾ピリミジンまたは１０−（９−（アミノエトキシ）フェノキサジニル）である。
【００２８】
多様な実施形態では、前記標的領域が、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドが前記エクソンに伴うスプライス接合部にわたるヌクレオチド配列；または（ｉｉ）ヌクレオチドが前記エクソン接合部に伴うスプライス接合部にわたらないヌクレオチド配列から選択される。実施形態では、前記ターゲティング配列が、配列番号７６〜３４８５から選択される配列を含むか、配列番号７６〜３４８５から選択されるターゲティング配列の少なくとも１０の連続ヌクレオチドの断片であるか、または配列番号７６〜３４８５から選択されるターゲティング配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体である。
【００２９】
多様な実施形態では、
ｉ）Ｙが、Ｏであり、Ｒ２が、ＨもしくはＧから選択され、Ｒ３が、電子対もしくはＨから選択されるか；
ｉｉ）Ｒ２が、Ｇであり、式中、前記ＣＰＰが配列番号３４８６〜３５０１から選択される配列を有するか；
ｉｉｉ）各Ｒ１が、−Ｎ（ＣＨ３）２であるか；
ｉｖ）少なくとも１つのＲ１が、
【化８】
2018530560.tif 000009
から選択されるか；または
ｖ）Ｒ１基の５０〜９０％が、−Ｎ（ＣＨ３）２である。
【００３０】
多様な実施形態では、Ｔが、式：
【化９】
2018530560.tif 000010
を有し、式中、Ａは、−Ｎ（ＣＨ３）２であり、Ｒ６は、式：
【化１０】
2018530560.tif 000011
を有し、式中、Ｒ１０は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１１ＯＨである。
【００３１】
多様な実施形態では、各Ｙが、Ｏであり、Ｔが、
【化１１】
2018530560.tif 000012
から選択される。
【００３２】
多様な実施形態では、Ｔが、式：
【化１２】
2018530560.tif 000013
を有する。
【００３３】
多様な態様は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できるアンチセンスオリゴマーによって処置され得るジストロフィン遺伝子における変異を有する被験体においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害を処置する方法を含む。この方法は、被験体に、式（ＶＩ）：
【化１３】
2018530560.tif 000014
を含む化合物または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含み、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり；
Ｚは、８から４８の整数であり；
各Ｙは、Ｏおよび−ＮＲ４から独立に選択され、式中、各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アラルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２およびＧから独立に選択され、式中、Ｒ５は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、ｎは、１から５の整数であり；
Ｔは、ＯＨおよび式：
【化１４】
2018530560.tif 000015
の部分から選択され、式中、
Ａは、−ＯＨおよび−Ｎ（Ｒ７）２Ｒ８から選択され、式中
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ８は、電子対およびＨから選択され、
Ｒ６は、ＯＨ、−Ｎ（Ｒ９）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２および式：
【化１５】
2018530560.tif 000016
の部分から選択され、式中、
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ１０は、Ｇ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１１ＯＨ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
ｍは、１から５の整数であり、
Ｒ１１は、式−（Ｏ−アルキル）ｙ−を有し、式中、ｙは、３から１０の整数であり、
ｙ個のアルキル基の各々は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｒ１２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｇ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２および−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２３から選択され；
Ｒ３は、電子対、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
ここで、前記ターゲティング配列は、配列番号７６〜３４８５から選択される配列を含むか、
配列番号７６〜３４８５から選択されるか、配列番号７６〜３４８５から選択される配列の少なくとも１０の連続ヌクレオチドの断片であるか、または配列番号７６〜３４８５から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体である。
【００３４】
多様な態様は、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できるアンチセンスオリゴマーによって処置され得るジストロフィン遺伝子における変異を有する被験体においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害を処置する方法お含む。実施形態では、この方法は、
被験体に、式（Ｉ）：
【化１６】
2018530560.tif 000017
を含む化合物または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含み、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり；
Ｚは、８から４８の整数であり；
各Ｙは、Ｏおよび−ＮＲ４から独立に選択され、式中、各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アラルキル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２およびＧから独立に選択され、式中、Ｒ５は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、ｎは１から５の整数であり；
Ｔは、ＯＨおよび式：
【化１７】
2018530560.tif 000018
の部分から選択され、式中、
Ａは、−ＯＨ、−Ｎ（Ｒ７）２Ｒ８から選択され、式中
Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ８は、電子対およびＨから選択され、
Ｒ６は、ＯＨ、−Ｎ（Ｒ９）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２および式：
【化１８】
2018530560.tif 000019
の部分から選択され、式中、
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ１０は、Ｇ、Ｃ（Ｏ）−Ｒ１１ＯＨ、アシル、トリチル、４メトキシトリチル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２およびＣ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
ｍは、１から５の整数であり、
Ｒ１１は、式−（Ｏ−アルキル）ｙ−を有し、式中、ｙは、３から１０の整数であり、
ｙ個のアルキル基の各々は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｒ１２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ１の各例は、
−Ｎ（Ｒ１３）２Ｒ１４［式中、各Ｒ１３は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、Ｒ１４は、電子対およびＨから選択される］；
式（ＩＩ）：
【化１９】
2018530560.tif 000020
の部分［式中、
Ｒ１５は、Ｈ、Ｇ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＮＲ１８Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１８Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
Ｒ１８は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｑは、１から５の整数であり、
Ｒ１６は、電子対およびＨから選択され；そして
各Ｒ１７は、Ｈおよびメチルから独立に選択される］；および
式（ＩＩＩ）：
【化２０】
2018530560.tif 000021
の部分［式中、
Ｒ１９は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｒＮＲ２２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ２２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）４ＮＨ２およびＧから選択され、式中、
Ｒ２２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｒは、１から５の整数であり、
Ｒ２０は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ２１は、電子対およびＨから選択される］から独立に選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｇ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２３、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｓＮＲ２４Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ２４Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２および式：
【化２１】
2018530560.tif 000022
の部分から選択され、式中、
Ｒ２３は、式−（Ｏ−アルキル）ｖ−ＯＨを有し、式中、ｖは、３から１０の整数であり、ｖ個のアルキル基の各々は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｒ２４は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｓは、１から５の整数であり；
Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−から選択され、
各Ｒ２５は、式−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２６）２を有し、式中、各Ｒ２６は、式−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２を有し；
Ｒ３は、電子対、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
ここで、Ｇは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰおよび−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択される、細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）およびリンカー部分であるか、またはＧは、式：
【化２２】
2018530560.tif 000023
を有し、式中、ＣＰＰは、Ｇの最大で１つの例が存在するという条件で、ＣＰＰのカルボキシ末端において、アミド結合により、リンカー部分に結合しており、
ここで、前記ターゲティング配列は、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソンを含む標的領域内の１０またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的であり、
ここで、前記被験体は、ミオスタチン治療剤を投与されており、それにより、前記被験体におけるミオスタチン活性またはミオスタチン発現の一方または両方が抑制される。
【００３５】
多様な実施形態では、各Ｎｕが、独立に、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、シトシン、イノシン、ヒポキサンチン、２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、Ｃ５−プロピニル修飾ピリミジンまたは１０−（９−（アミノエトキシ）フェノキサジニル）である。
【００３６】
多様な実施形態では、前記ターゲティング配列が、配列番号１６〜７５から選択される配列を含むか、配列番号１６〜７５から選択されるターゲティング配列の少なくとも１０の連続ヌクレオチドの断片であるか、または配列番号１６〜７５から選択されるターゲティング配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体である。
【００３７】
多様な実施形態では、
ｉ）Ｙが、Ｏであり、Ｒ２が、ＨもしくはＧから選択され、Ｒ３が、電子対もしくはＨから選択されるか；
ｉｉ）Ｒ２が、Ｇであり、前記ＣＰＰが、配列番号３４８６〜３５０１から選択される配列を有するか；
ｉｉｉ）各Ｒ１が、−Ｎ（ＣＨ３）２であるか；
ｉｖ）少なくとも１つのＲ１が、
【化２３】
2018530560.tif 000024
から選択されるか、または
ｖ）Ｒ１基の５０〜９０％が、−Ｎ（ＣＨ３）２である。
【００３８】
多様な実施形態では、Ｔが、式：
【化２４】
2018530560.tif 000025
を有し、式中、Ａが、−Ｎ（ＣＨ３）２であり、Ｒ６が式：
【化２５】
2018530560.tif 000026
を有し、式中、Ｒ１０が、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１１ＯＨである。
【００３９】
多様な実施形態では、各Ｙが、Ｏであり、Ｔが、
【化２６】
2018530560.tif 000027
から選択される。
【００４０】
多様な実施形態では、Ｔが、式：
【化２７】
2018530560.tif 000028
のものである。
【００４１】
多様な態様は、ミオスタチンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できるアンチセンスオリゴマーによって処置され得るジストロフィン遺伝子における変異を有する被験体においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害を処置する方法を含む。多様な実施形態では、この方法は、被験体に、式（ＶＩ）：
【化２８】
2018530560.tif 000029
を含む化合物または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含み、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり；
Ｚは、８から４８の整数であり；
各Ｙは、Ｏおよび−ＮＲ４から独立に選択され、式中、Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アラルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２およびＧから独立に選択され、式中、Ｒ５は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、ｎは、１から５の整数であり；
Ｔは、ＯＨおよび式：
【化２９】
2018530560.tif 000030
の部分から選択され、式中、
Ａは、−ＯＨおよび−Ｎ（Ｒ７）２Ｒ８から選択され、式中、
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ８は、電子対およびＨから選択され、
Ｒ６は、ＯＨ、−Ｎ（Ｒ９）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２および式：
【化３０】
2018530560.tif 000031
の部分から選択され、式中、
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ１０は、Ｇ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１１ＯＨ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
ｍは、１から５の整数であり、
Ｒ１１は、式−（Ｏ−アルキル）ｙ−を有し、式中、ｙは、３から１０の整数であり、
ｙ個のアルキル基の各々は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｒ１２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｇ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２および−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２３から選択され；
Ｒ３は、電子対、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
ここで、前記ターゲティング配列は、配列番号１６〜７５から選択される配列を含むか、配列番号１６〜７５から選択されるか、配列番号１６〜７５から選択される配列の少なくとも１０の連続ヌクレオチドの断片であるか、または配列番号１６〜７５から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体である。
【００４２】
多様な態様は、１２〜４０サブユニットのアンチセンスオリゴマー化合物と、薬学的に許容される担体とを含むミオスタチン関連医薬組成物であって、前記化合物が、
（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットと；
ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソンを含む標的領域内の１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列と
を含むミオスタチン関連組成物と組み合わせた、
２０〜５０サブユニットのアンチセンスオリゴマー化合物と、薬学的に許容される担体とを含むジストロフィン関連医薬組成物であって、前記化合物が、
（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または、（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットと；
ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソンを含む標的領域内の１０またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列と
を含むジストロフィン関連医薬組成物を含む。多様な実施形態では、前記ジストロフィン関連組成物と前記ミオスタチン関連組成物とが、同じ医薬組成物として提供される。
【００４３】
多様な態様は、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できるアンチセンスオリゴマーによって処置され得る遺伝子変異を有する被験体においてミオスタチン発現をモジュレートするための方法であって、前記被験体に、１２〜４０サブユニットを含み、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソンを含む１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含む、有効量のアンチセンスオリゴマーを投与するステップであって、前記オリゴマーが、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットを含む、ステップと、ミオスタチンプレｍＲＮＡ転写物内の標的領域に前記アンチセンスオリゴマーを結合させるステップと、前記標的領域のヒトミオスタチンｍＲＮＡ転写物への転写を阻害するステップとを含み、前記被験体が、前記被験体におけるジストロフィン発現を増加させるジストロフィン治療剤を投与されている、方法を含む。
【００４４】
多様な態様は、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できるアンチセンスオリゴマーによって処置され得る遺伝子変異を有する被験体においてエクソン２の発現を減少させるための方法であって、前記被験体に、１２〜４０サブユニットを含み、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソンを含む１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含む、有効量のアンチセンスオリゴマーを投与するステップと、ミオスタチンｍＲＮＡ転写物内のエクソン２の転写を阻害するステップとを含み、前記被験体が、前記被験体におけるジストロフィン発現を増加させるジストロフィン治療剤を投与されている、方法を含む。多様な実施形態では、ミオスタチンｍＲＮＡ転写物内のエクソン２の発現が、約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％減少する。
【００４５】
多様な態様は、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できるアンチセンスオリゴマーによって処置され得るジストロフィン遺伝子における変異を有する被験体の筋細胞または組織における機能的なミオスタチンタンパク質の蓄積を減少させるための方法であって、前記被験体に、１２〜４０サブユニットを含み、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソンを含む１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含む、有効量のアンチセンスオリゴマーを投与するステップと、ミオスタチンｍＲＮＡ転写物内のエクソン２の転写を阻害するステップとを含み、前記被験体が、前記被験体におけるジストロフィン発現を増加させるジストロフィン治療剤を投与されている、方法を含む。
【００４６】
多様な態様は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害を処置するための医薬であって、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットを含み；ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソンを含む１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含む、１２〜４０サブユニットを含むアンチセンスオリゴマー化合物と；ジストロフィンの発現を増加させるジストロフィン治療剤とを含む医薬を含む。
【００４７】
多様な態様は、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できるアンチセンスオリゴマーによって処置され得るジストロフィン遺伝子における変異を有する被験体においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害の進行を阻害するための方法であって、前記被験体に、１２〜４０サブユニットを含み、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソンを含む１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含む、有効量のアンチセンスオリゴマーを投与するステップと、ミオスタチンｍＲＮＡ転写物内のエクソン２の転写を阻害するステップとを含み、前記被験体が、前記被験体におけるジストロフィン発現を増加させるジストロフィン治療剤を投与され、それによりデュシェンヌ型筋ジストロフィーの進行を阻害する、方法を含む。
【００４８】
多様な態様は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害を有する被験体において機能的なミオスタチンタンパク質の蓄積を減少させる方法であって、前記被験体に、１２〜４０サブユニットを含み、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソンを含む１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含む、有効量のアンチセンスオリゴマーを投与するステップと、ミオスタチンｍＲＮＡ転写物内のエクソン２の転写を阻害するステップとを含み、前記被験体における機能的なミオスタチンタンパク質の蓄積が減少し、前記被験体が、前記被験体内でジストロフィン発現を増加させるジストロフィン治療剤を投与されている、方法を含む。
【００４９】
多様な態様は、そのような処置を必要とする被験体においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害を処置するための方法であって、  前記被験体において少なくとも約２００〜４００ｎＭのアンチセンスオリゴマーのピークの血中濃度を得るための有効量でアンチセンスオリゴマーを投与するステップを含む方法を含む。
【００５０】
多様な態様は、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できるアンチセンスオリゴマーによって処置され得るジストロフィン遺伝子における変異を有する被験体において骨格筋量不足を処置する方法であって、（ａ）前記被験体におけるミオスタチンタンパク質の血液中または組織中レベルを測定するステップと、（ｂ）前記被験体に、１２〜４０サブユニットを含み、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソンを含む１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含む、有効量のアンチセンスオリゴマーを投与するステップと、（ｃ）ミオスタチンｍＲＮＡ転写物内のエクソン２の転写を阻害するステップと、（ｄ）選択した時間以後、前記被験体におけるミオスタチンタンパク質レベルを測定するステップと、（ｅ）（ｄ）で測定された前記レベルを使用して前記の投与を反復するステップであって、投与されるアンチセンスオリゴマーの量の用量または投薬スケジュールを調整するステップとを含み、前記被験体におけるミオスタチンタンパク質の前記レベルが、前記アンチセンスオリゴマーの投与後に低下し、前記被験体が、前記被験体においてジストロフィン発現を増加させるジストロフィン治療剤を投与されている、方法を含む。
【００５１】
多様な態様は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できるアンチセンスオリゴマーによって処置され得るジストロフィン遺伝子における変異を有する被験体においてデュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害の進行を阻害する方法であって、前記被験体に、１７〜４０サブユニットを含み、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソンを含む標的領域内の１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含む、有効量のアンチセンスオリゴマーを投与するステップを含み、前記アンチセンスオリゴマーが、前記エクソンのスキッピングを誘導し、前記オリゴマーが、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットを含み、前記被験体が、前記被験体におけるミオスタチンの活性および発現のうちの一方または両方を阻害するミオスタチン治療剤を投与され、それによりデュシェンヌ型筋ジストロフィーの進行を阻害する、方法を含む。
【００５２】
多様な態様は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの進行を阻害する方法であって、被験体に、１２〜４０サブユニットを含み、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソンを含む１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含む、有効量のアンチセンスオリゴマーを投与するステップを含み、前記オリゴマーが、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットを含み、前記被験体が、前記被験体においてジストロフィン発現を増加させるジストロフィン治療剤を投与され、それによりデュシェンヌ型筋ジストロフィーの進行を阻害する、方法を含む。
【００５３】
多様な態様および実施形態は、アンチセンスオリゴマーの３’末端または５’末端にコンジュゲートするアルギニンに富むペプチド配列をさらに含むアンチセンスオリゴマーを含み、前記アルギニンに富むペプチド配列が、配列番号３４８６〜３５０１から選択される配列を含む。
【００５４】
多様な態様は、１７〜４０サブユニットを含み、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソンを含む標的領域内の１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含むアンチセンスオリゴマーであって、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットを含む、ジストロフィンを標的とする前記オリゴマーと；１２〜４０サブユニットを含み、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソンを含む１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含むアンチセンスオリゴマーであって、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットを含む、ミオスタチンを標的とする前記オリゴマーとを含む組成物を含む。
【００５５】
多様な態様および実施形態は、ジストロフィン治療剤とミオスタチン治療剤を被験体に投与するステップを含み、前記被験体が、７歳またはこれを超える小児患者である。
【００５６】
多様な態様および実施形態は、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できるアンチセンスオリゴマーによって処置され得る遺伝子変異を有する被験体においてジストロフィン発現をモジュレートするための方法であって、
前記被験体に、１７〜４０サブユニットを含み、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソンを含む１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列をさらに含む、有効量のアンチセンスオリゴマーを投与するステップを含み、
前記オリゴマーが、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットを含み、
前記被験体が、前記被験体におけるミオスタチン活性およびミオスタチン発現の一方または両方を阻害するミオスタチン治療剤を投与されている、方法を含む。
【００５７】
ＤＭＤおよび関連障害を有する被験体において筋肉量をモジュレートする方法をさらに含む多様な態様および実施形態が提供される。
【００５８】
別の態様では、本開示は、ＤＭＤを有する患者を処置するための方法であって、被験体に、本明細書で記載されるいずれかのジストロフィン治療剤および本明細書で記載されるいずれかのミオスタチン治療剤の一方または両方を投与し、それによりＤＭＤを処置するステップを含む方法を提供する。患者は、例えばエクソンスキッピングを誘導できるオリゴヌクレオチドを使用してエクソンスキッピングされ得るＤＭＤ遺伝子における変異を有する患者であり得る。一部の実施形態では、患者はエクソン５１スキッピングされ得るＤＭＤ遺伝子における変異を有する。一部の実施形態では、患者はエクソン５３スキッピングされ得るＤＭＤ遺伝子における変異を有する。一部の実施形態では、患者はエクソン４５スキッピングされ得るＤＭＤ遺伝子における変異を有する。一部の実施形態では、患者はエクソン４４スキッピングされ得るＤＭＤ遺伝子における変異を有する。一部の実施形態では、患者はエクソン５２スキッピングされ得るＤＭＤ遺伝子における変異を有する。一部の実施形態では、患者はエクソン５０スキッピングされ得るＤＭＤ遺伝子における変異を有する。一部の実施形態では、患者はエクソン８スキッピングされ得るＤＭＤ遺伝子における変異を有する。一部の実施形態では、患者はエクソン５５スキッピングされ得るＤＭＤ遺伝子における変異を有する。
【００５９】
別の態様では、本開示は、本明細書で記載されるジストロフィン治療剤のいずれか１または複数と、本明細書で記載されるミオスタチン治療剤のいずれか１または複数とを含む組成物（例えば医薬組成物）を提供する。
【００６０】
本明細書で記載される方法または組成物の一部の実施形態では、ジストロフィン治療剤はエテプリルセンである。
【００６１】
本明細書で記載される方法または組成物の一部の実施形態では、ジストロフィン治療剤は、配列番号９２７に明示された配列を含まず、それからならない。
【００６２】
本明細書で記載される方法または組成物の一部の実施形態では、ジストロフィンはヒトジストロフィンである。本明細書で記載される方法または組成物の一部の実施形態では、ミオスタチンはヒトミオスタチンである。本明細書で記載される方法または組成物の一部の実施形態では、被験体はヒトである。
【００６３】
本明細書で記載される方法または組成物のいずれかの一部の実施形態では、被験体はヒト（例えばヒト患者）である。本明細書で記載される方法または組成物のいずれかの一部の実施形態では、被験体は男性被験体である。本明細書で記載される方法または組成物のいずれかの一部の実施形態では、被験体は小児患者である。本明細書で記載される方法または組成物のいずれかの一部の実施形態では、患者は７歳またはこれを超える。本明細書で記載される方法または組成物のいずれかの一部の実施形態では、患者は少なくとも７歳であるが、約２１歳未満である。
【００６４】
本明細書で記載される方法または組成物のいずれかの一部の実施形態では、ジストロフィン治療剤およびミオスタチン治療剤の一方または両方は、例えば静脈内投与により被験体に全身的に送達される。本明細書で記載される方法または組成物のいずれかの一部の実施形態では、ジストロフィン治療剤は、被験体に全身的に送達される。本明細書で記載される方法または組成物のいずれかの一部の実施形態では、ミオスタチン治療剤は、被験体に全身的に送達される。
【００６５】
本明細書で記載される方法または組成物のいずれかの一部の実施形態では、ジストロフィン治療剤およびミオスタチン治療剤の一方または両方は、被験体に慢性的に投与される。例えば、本明細書で記載される方法または組成物のいずれかの一部の実施形態では、治療剤の一方または両方は、各々独立に、毎日、毎週、毎月、２週に１回または２カ月に１回投与され得る。本明細書で記載される方法または組成物のいずれかの一部の実施形態では、治療剤の一方または両方の治療有効量は、各々独立に、単回用量（例えば週１回用量）として、または複数回用量（例えば２回またはこれを超える、例えば３、４、５、６または７回用量）として、処置期間内に、例えば週１回（毎週）または週２回被験体に送達することができる。
【００６６】
本明細書で記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、ジストロフィン治療剤は１回目に投与され、ミオスタチン治療剤は２回目に投与される。例えば、ジストロフィン治療剤（例えばエテプリルセン）は、ミオスタチン治療剤を被験体に投与する前に、１回目に、被験体の筋細胞内でジストロフィン産生を増加させるのに十分な量および期間投与され得る。したがって、一部の実施形態では、ジストロフィン治療剤（例えばエテプリルセン）は、ミオスタチン治療剤を投与する前に、週１回、ある期間（例えば６カ月、１年、１８カ月、２年またはこれを超える）、被験体の体重１ｋｇあたり約３０ｍｇで被験体に投与され、被験体の筋細胞内でジストロフィン発現が増加する。一部の実施形態では、ジストロフィン治療剤（例えばエテプリルセン）は、ミオスタチン治療剤を投与する前に、週１回、ある期間（例えば６カ月、１年、１８カ月、２年またはこれを超える）、被験体の体重１ｋｇあたり約３０〜約５０ｍｇで、被験体に投与され、被験体の筋細胞におけるジストロフィン発現が増加する。本明細書で記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、ミオスタチン治療剤は１回目に投与され、ジストロフィン治療剤は２回目に投与される。
【００６７】
一部の実施形態では、本明細書で記載される組成物および方法に使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は、細胞透過性ペプチドを含まない。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１Ａ】図１Ａは、リンカーを付加するための、５’末端における修飾オリゴマーを例示する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）にコンジュゲートしたアンチセンスオリゴヌクレオチドを例示する。
【図１Ｃ】図１Ｃは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）にコンジュゲートしたアンチセンスオリゴヌクレオチドを例示する。
【図１Ｄ−Ｇ】図１Ｄ、１Ｅ、１Ｆおよび１Ｇは、例示的なモルホリノオリゴヌクレオチドの反復サブユニットセグメントを例示する。
【００６９】
【図２Ａ】図２Ａは、トリチルピペラジンフェニルカルバメートの調製を例示する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、樹脂／試薬混合物の調製を例示する。
【００７０】
【図３Ａ】図３Ａは、ヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞における、ミオスタチンエクソン２のスキッピングのＲＴ−ＰＣＲ産物のゲル電気泳動を例示する。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＲＤ細胞における、ミオスタチンエクソン２のスキッピング効率（％）を例示する。
【００７１】
【図４Ａ】図４Ａは、ＲＤ細胞における、ミオスタチンエクソン２のスキッピングのＲＴ−ＰＣＲ産物のゲル電気泳動を例示する。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ミオスタチンエクソン２のスキッピングの相対的デンシトメトリー分析を例示する。
【００７２】
【図５Ａ】図５Ａは、Ｃ２Ｃ１２およびＨ２Ｋｂｍｄｘ細胞における、ミオスタチンエクソン２のスキッピングを例示する。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲ産物のデンシトメトリー分析、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるミオスタチンエクソン２のスキッピング効率（％）を例示する。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＲＴ−ＰＣＲ産物のデンシトメトリー分析、Ｈ２Ｋｂｍｄｘ細胞におけるミオスタチンエクソン２のスキッピング効率（％）を例示する。
【００７３】
【図６Ａ】図６Ａは、前脛骨（ＴＡ）筋におけるミオスタチンエクソン２のスキッピングのゲル電気泳動産物を例示する。
【図６Ｂ】図６Ｂは、体重に対して正規化した筋肉量を例示する。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ミオスタチンエクソン２のスキッピングのＲＴ−ＰＣＲ産物のデンシトメトリー分析を例示する。
【００７４】
【図７Ａ】図７Ａは、ｍｄｘマウス筋肉におけるミオスタチンエクソン２のスキッピングのゲル電気泳動を例示する。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ｍｄｘマウスにおけるミオスタチンエクソン２のスキッピングのＲＴ−ＰＣＲ産物のデンシトメトリー分析を例示する。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ｍｄｘマウスにおける、初期体重に対して正規化した筋肉重量を例示する。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ｍｄｘマウスにおける、最終体重に対して正規化した筋肉重量を例示する。
【００７５】
【図８Ａ】図８Ａは、１０ｍｇ／ｋｇのＢＰＭＯを投与されたｍｄｘマウスにおける体重の増加を例示する。
【図８Ｂ】図８Ｂは、１０ｍｇ／ｋｇのＢＰＭＯを投与されたｍｄｘマウスにおける筋肉量の増加を例示する。
【図８Ｃ】図８Ｃは、２０ｍｇ／ｋｇのＢＰＭＯを投与されたｍｄｘマウスにおける体重の増加を例示する。
【図８Ｄ】図８Ｄは、２０ｍｇ／ｋｇのＢＰＭＯを投与されたｍｄｘマウスにおける筋肉量の増加を例示する。
【００７６】
【図９Ａ】図９Ａは、１０ｍｇ／ｋｇのＢＰＭＯを投与されたｍｄｘマウスの握力試験を例示する。
【図９Ｂ】図９Ｂは、２０ｍｇ／ｋｇのＢＰＭＯを投与されたｍｄｘマウスの握力試験を例示する。
【図９Ｃ】図９Ｃは、１０ｍｇ／ｋｇのＢＰＭＯを投与されたｍｄｘマウスにおけるＴＡ筋の電気生理学的試験を例示する。
【００７７】
【図１０Ａ】図１０Ａは、横隔膜（ＤＩＡ）におけるミオスタチンエクソン２のスキッピングのＲＴ−ＰＣＲ産物のゲル電気泳動を例示する。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＤＩＡにおけるミオスタチンエクソン２のスキッピングのＲＴ−ＰＣＲ産物のデンシトメトリー分析を例示する。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ＴＡにおけるミオスタチンエクソン２のスキッピングのＲＴ−ＰＣＲ産物のゲル電気泳動を例示する。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、ＴＡにおけるミオスタチンエクソン２のスキッピングのＲＴ−ＰＣＲ産物のデンシトメトリー分析を例示する。
【００７８】
【図１１Ａ】図１１Ａは、食塩水（陽性対照）を投与された若齢のジストロフィーマウスＣ５７ＢＬ１０、食塩水（陰性対照）を投与されたｍｄｘマウス、ＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄ（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与されたｍｄｘマウス、ＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄ（１０ｍｇ／ｋｇ）およびＢＰＭＯ−ＭＳＴＮ（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与されたｍｄｘマウス、または、ＢＰＭＯ−ＭＳＴＮ（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与されたｍｄｘマウスの初期重量に対して正規化した体重を例示する。統計解析は、毎週全ての群を比較する一方向分散分析およびボンフェローニ事後検定により行った。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、食塩水（陽性対照）を投与された若齢のジストロフィーマウスＣ５７ＢＬ１０、食塩水（陰性対照）を投与されたｍｄｘマウス、ＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄ（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与されたｍｄｘマウス、ＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄ（１０ｍｇ／ｋｇ）およびＢＰＭＯ−ＭＳＴＮ（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与されたｍｄｘマウス、または、ＢＰＭＯ−ＭＳＴＮ（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与されたｍｄｘマウスにおけるマウス前肢握力分析を例示する。
【００７９】
【図１２Ａ】図１２Ａは、エクソンスキッピングによるジストロフィンＲＮＡ再フレーミング（ｒｅｆｒａｍｉｎｇ）の定量を例示する。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、イムノブロット法によるジストロフィンタンパク質発現の定量を例示する。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ミオスタチンエクソン２のスキッピングの定量を例示する。
【００８０】
【図１３Ａ】図１３Ａは、若齢のジストロフィンマウスのＴＡにおける、最小フェレー径の変動係数を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、若齢のジストロフィンマウスのＴＡ筋における、中心核線維のパーセンテージを例示する。
【００８１】
【図１４Ａ】図１４Ａは、ｍｄｘマウスにおける体重の増加を例示する。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ＢＰＭＯ−Ｍ２３ＤまたはＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄ＋ＢＰＭＯ−ＭＳＴＮを投与されたｍｄｘマウスにおける筋肉量の増加を例示する。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、ＢＰＭＯ−Ｍ２３ＤまたはＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄ＋ＢＰＭＯ−ＭＳＴＮを投与されたｍｄｘマウスにおける前肢握力分析を例示する。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、ＢＰＭＯ−Ｍ２３ＤまたはＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄ＋ＢＰＭＯ−ＭＳＴＮを投与されたｍｄｘマウスにおけるｉｎ  ｓｉｔｕでの電気生理学的測定を例示する。
【００８２】
【図１５Ａ】図１５Ａは、ＢＰＭＯ−Ｍ２３ＤまたはＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄ＋ＢＰＭＯ−ＭＳＴＮを投与されたｍｄｘマウスの筋肉におけるエクソンスキッピングによる、ジストロフィンＲＮＡ再フレーミングを示すゲル電気泳動を例示する。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ＢＰＭＯ−Ｍ２３ＤまたはＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄ＋ＢＰＭＯ−ＭＳＴＮを投与されたｍｄｘマウスにおける、ＲＴ−ＰＣＲ産物の相対的デンシトメトリー分析を例示する。
【００８３】
【図１６Ａ】図１６Ａは、ＢＰＭＯ−Ｍ２３ＤまたはＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄ＋ＢＰＭＯ−ＭＳＴＮを投与されたｍｄｘマウスから回収した筋肉におけるジストロフィンタンパク質発現を例示する。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ＢＰＭＯ−Ｍ２３ＤまたはＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄ＋ＢＰＭＯ−ＭＳＴＮを投与されたｍｄｘマウスから回収した筋肉における、ジストロフィンタンパク質発現の相対的デンシトメトリー定量を例示する。
【００８４】
【図１７Ａ】図１７Ａは、ＢＰＭＯ−Ｍ２３ＤまたはＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄ＋ＢＰＭＯ−ＭＳＴＮを投与されたｍｄｘマウスの筋肉における、ミオスタチンのスキッピングの可変性を示すゲル電気泳動を例示する。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ＢＰＭＯ−Ｍ２３ＤまたはＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄ＋ＢＰＭＯ−ＭＳＴＮを投与されたｍｄｘマウスにおける、ミオスタチンのスキッピングのＲＴ−ＰＣＲ産物の相対的デンシトメトリー分析を例示する。
【００８５】
【図１８Ａ】図１８Ａは、マウスあたり１５回の読取値による、マウス握力試験を例示する。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、マウスあたり１５回の読取値から３つの平均値を採った、マウス握力試験を例示する。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、マウスあたりの３つの最高の読取値を採った、マウス握力試験を例示する。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
詳細な説明
以下の説明は、本質的に、単に例示的なものであり、本発明、その応用またはその使用を限定することを意図しない。図面全体を通じて、対応する参照番号は、類似または対応する部分および特徴を示すことを理解すべきである。本発明の多様な実施形態において示される具体例の記載は、説明のみを意図するものであり、本明細書で開示される発明の範囲を限定することを意図しない。さらに、述べられた特徴を有する複数の実施形態の説明は、さらなる特徴を有する他の実施形態、または述べられた特徴の異なる組合せが組み込まれた他の実施形態を除外することを意図しない。
【００８７】
さらに、本発明の多様な実施形態の詳細な説明は、例示として多様な実施形態を示す添付の図面を参照する。これらの実施形態は、当業者が本発明を実施することを可能にするのに十分詳細に記載されているが、他の実施形態が実現される可能性があり、本発明の思想および範囲から逸脱することなく、論理的および機構的変更をなし得ることを理解すべきである。このように、本明細書の詳細な説明は、限定を目的としてではなく、説明のみを目的として提示される。例えば、説明において挙げられるステップもしくは機能、いかなる方法、システムまたはプロセスも、いかなる順序で実施してもよく、提示される順序に限定されない。さらに、ステップまたはその機能のいずれかを、１または複数の第三者に外注または実行させてもよい。さらに、単数形へのいかなる言及も、複数の実施形態を含み、１つを超える構成要素に対するいかなる言及も、単数の実施形態を含み得る。
【００８８】
Ｉ．定義
【００８９】
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で記載される方法および材料と同様または同等な、任意の方法および材料を、本開示の主題の実施または試験において使用しうるが、好ましい方法および材料について記載する。本開示の目的で、下記では、以下の用語について規定する。
【００９０】
本明細書では、冠詞の「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」を、冠詞の文法的対象物の１つまたは１つを超える対象物（すなわち、少なくとも１つの対象物）を指すのに使用する。例を目的として述べると、「ある要素」とは、１つの要素または１つを超える要素を意味する。
【００９１】
用語「約」は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％ほど変動する、数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さを意味する。数値範囲に関して用語「約」を使用するとき、それは明示された数値の上下限値を拡張することによりその範囲を修正する。一般に、用語「約」は、述べられた値の上下≦１０％の変動により数値を修飾することを意図する。
【００９２】
本開示を通して、文脈によりそうでないことが要請されない限り、「〜を含む」、「〜を含む」、および「〜を含むこと」という語は、言明されるステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の包含を含意するが、他の任意のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の除外は含意しないことが理解されるであろう。
【００９３】
用語「〜からなること」は、「〜からなること」という語句に後続するあらゆる語句を含み、かつ、これに限定されることを意味する。したがって、「〜からなること」という語句は、列挙される要素が要請されるかまたは必須であり、他の要素は存在しえないことを指し示す。用語「〜から本質的になること」は、この語句の後に列挙される任意の要素を含み、かつ、列挙される要素について、本開示で指定される活性または作用に干渉または寄与しない、他の要素に限定されることを意味する。したがって、「〜から本質的になること」という語句は、列挙される要素が要請されるかまたは必須であるが、他の要素は任意選択であり、それらが列挙される要素の活性または作用に、実質的に影響を及ぼすのかどうかに応じて、存在してもよく、存在しなくてもよいことを示す。
【００９４】
「〜を投与すること」または「〜を投与する」という用語は、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーを含む治療剤の、被験体への、局所投与または全身投与による送達を含む。投与は、局所投与（眼投与、ならびに膣送達および直腸送達を含む、粘膜への投与を含む）、例えば、噴霧器による投与を含む、粉末またはエアゾールによる吸入または送気による、肺投与、気管内投与、鼻腔内投与、表皮投与および経皮投与、経口投与、または非経口投与でありうる。非経口投与は、静脈内注射もしくは静脈内注入、動脈内注射もしくは動脈内注入、皮下注射もしくは皮下注入、腹腔内注射もしくは腹腔内注入、または筋内注射もしくは筋内注入；あるいは頭蓋内投与、例えば、髄腔内投与または脳室内投与を含む。
【００９５】
本発明で使用される「共投与」または「共投与すること」または「併用療法」は、一般的には、本明細書で開示される１または複数のミオスタチン治療用化合物と組み合わせた、ＤＭＤエクソンスキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与を指す。言い換えると、用語「共投与すること」または「共投与」または「併用療法」は、薬学的に許容される下記の剤形で、本明細書で開示される１または複数のミオスタチン治療用化合物および任意選択で１または複数の糖質コルチコイドと同時にＤＭＤエクソンスキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばエテプリルセンを投与することを意味する：（ｉ）ＤＭＤエクソンスキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばエテプリルセンと、本明細書で開示される１または複数のミオスタチン治療用化合物と、任意選択で１または複数の糖質コルチコイドおよび薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を意味する、同じ剤形、例えば同じ錠剤または医薬組成物；（ｉｉ）投与方法が同じ別々の剤形、例えば、ＤＭＤエクソンスキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばエテプリルセンおよび薬学的に許容される担体を含む非経口投与に適する第１の医薬組成物と、本明細書で開示される１または複数のミオスタチン治療用化合物および薬学的に許容される担体を含む非経口投与に適する第２の医薬組成物と、任意選択で、本明細書で開示される１または複数の糖質コルチコイドおよび薬学的に許容される担体を含む非経口投与に適する第３の医薬組成物とを含むキット、ならびに（ｉｉｉ）投与方法が異なる別々の剤形、例えば、ＤＭＤエクソンスキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばエテプリルセンおよび薬学的に許容される担体を含む非経口投与に適する第１の医薬組成物と、本明細書で開示される１または複数のミオスタチン治療用化合物および薬学的に許容される担体を含む経口投与に適する第２の医薬組成物と、任意選択で、本明細書で開示される１または複数の糖質コルチコイドおよび薬学的に許容される担体を含む経口投与に適する第３の医薬組成物とを含むキット。
【００９６】
さらに、本開示の利益を受ける当業者は、本明細書で開示される１つを超えるミオスタチン治療用化合物が投与されるとき、当該薬剤は、同じ投与方法を共有する必要はなく、例えばＤＭＤエクソンスキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばエテプリルセンおよび薬学的に許容される担体を含む非経口投与に適する第１の医薬組成物と、本明細書で開示される第１のミオスタチン治療用化合物および薬学的に許容される担体を含む経口投与に適する第２の医薬組成物と、本明細書で開示される第２の非ステロイド性抗炎症性化合物および薬学的に許容される担体を含む非経口投与に適する第３の医薬組成物とを含むキットがあり得ると察知するであろう。当業者は、「共投与すること」または「共投与」に関して上で言及された同時投与が、ＤＭＤエクソンスキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物とミオスタチン治療用化合物を含む医薬組成物が、同じスケジュールに従い、すなわち同じ時間および日に、または異なるスケジュール、すなわち異なるが必ずしも明確に区別されないスケジュールに従い投与され得ることを意味すると察知するであろう。
【００９７】
そのことに関して、ＤＭＤエクソンスキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物と、ミオスタチン治療用化合物を含む医薬組成物とが、異なるスケジュールに従い投与されるとき、かかる異なるスケジュールは、本明細書では「バックグラウンド」または「バックグラウンド投与」と称する場合もある。例えば、ＤＭＤエクソンスキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物が１日２回、ある特定の剤形で投与され得、またミオスタチン治療用化合物を含む医薬組成物が１日１回投与され得、ゆえに、１日の投与のうちの１つの間に、ＤＭＤエクソンスキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物が、ミオスタチン治療用化合物を含む医薬組成物と、必ずではないが同時に投与され得る。もちろん、「共投与すること」、「共投与」または「併用療法」に対する他の適切な変形は、本開示の利益を受ける当業者に容易に明らかであり、またこの用語の意味の一部である。
【００９８】
本明細書で使用される「慢性投与」は、持続的、定期的、長期的な治療的投与、すなわち実質的な中断のない定期的投与を指す。例えば、患者において筋ジストロフィーを処置する目的で、少なくとも数週間または数カ月または数年間、毎日の投与である。例えば、患者において筋ジストロフィーを処置する目的で、少なくとも数カ月または数年間、毎週の投与である（例えば少なくとも６週間で毎週、少なくとも１２週間で毎週、少なくとも２４週間で毎週、少なくとも４８週間で毎週、少なくとも７２週間で毎週、少なくとも９６週間で毎週、少なくとも１２０週間で毎週、少なくとも１４４週間で毎週、少なくとも１６８週間で毎週、少なくとも１８０週間で毎週、少なくとも１９２週間で毎週、少なくとも２１６週間で毎週、または少なくとも２４０週間で毎週）。ある特定の実施形態では、ＤＭＤエクソンスキッピング化合物、例えばエテプリルセンは、本明細書で開示されるミオスタチン治療用化合物と組み合わせて、静脈内注入により毎週１回、３０ｍｇ／ｋｇで慢性投与される。
【００９９】
「細胞を接触させること」、「導入すること」、または「送達すること」という用語は、本開示の治療剤の、細胞への、当技術分野で慣例的な方法（例えば、トランスフェクション（例えば、リポソーム、リン酸カルシウム、ポリエチレンイミン）、電気穿孔（例えば、ヌクレオフェクション）、マイクロインジェクション）が挙げられる）による送達を含む。
【０１００】
「アルキル」という用語は、直鎖状（すなわち、非分枝状または非環式）、分枝状、環式、または多環式非芳香族の炭化水素基であって、任意選択で、１または複数の官能基により置換された炭化水素基を指す。そうでないことが指定されない限りにおいて、「アルキル」基は、１〜８個の炭素原子を含有し、好ましくは、１〜６個の炭素原子を含有する。Ｃ１〜Ｃ６アルキルとは、少なくともＣ１アルキル基、Ｃ２アルキル基、Ｃ３アルキル基、Ｃ４アルキル基、Ｃ５アルキル基、およびＣ６アルキル基を含むことを意図する。低級アルキルとは、１〜６個の炭素原子を含有するアルキル基を指す。アルキルの例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロブチル、ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシルなどを含むがこれらに限定されない。アルキルは、置換アルキルの場合もあり、非置換アルキルの場合もある。例示的な置換アルキル基は、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２−フルオロエチル、３−フルオロプロピル、ヒドロキシメチル、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、ベンジル、置換ベンジル、フェネチル、置換フェネチルなどを含むがこれらに限定されない。
【０１０１】
「アルコキシ」という用語は、アルキルのサブセットであって、上記で規定した、表示の数の炭素を伴うアルキル基が、酸素架橋を介して結合しているサブセットを指す。例えば、「アルコキシ」とは、直鎖状立体配置、分枝状立体配置、環式立体配置である、１〜８個の炭素原子を含有する−Ｏ−アルキル基を指す。「アルコキシ」の例は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−ブトキシ、ｓ−ペントキシなどを含むがこれらに限定されない。
【０１０２】
単独で、または「アラルキル」、「アラルコキシ」、または「アリールオキシアルキル」における通り、より大型の部分の一部として使用される「アリール」という用語は、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントラシル、および２−アントラシルなど、６〜１４個の環原子を有する芳香環基を指す。「アリール」環は、１または複数の置換基を含有しうる。「アリール」という用語は、「アリール環」という用語と互換的に使用することができる。「アリール」はまた、芳香環を１または複数の環へと縮合させた、縮合多環式芳香環系も含む。有用なアリール環基の非限定的な例は、フェニル、ヒドロキシフェニル、ハロフェニル、アルコキシフェニル、ジアルコキシフェニル、トリアルコキシフェニル、アルキレンジオキシフェニル、ナフチル、フェナントリル、アントリル、フェナントロなどのほか、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントラシル、および２−アントラシルを含む。本明細書で使用される「アリール」という用語の範囲内にはまた、芳香環を１または複数の非芳香環へと縮合させた基であって、ラジカルまたは結合点が芳香環上にある、インダニル、フェナントリジニル、またはテトラヒドロナフチルなどにおける基も含まれる。
【０１０３】
「アシル」という用語は、Ｃ（Ｏ）Ｒ基（式中、Ｒは、上記で規定したＨ、アルキル、またはアリールを意味する）を指す。アシル基の例は、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、フェニルアセチル、および類似の基を含む。
【０１０４】
「同族化合物」という用語は、同じ化学基の逐次的付加により規則的に異なる化合物を指す。例えば、化合物の同族化合物は、１または複数の−ＣＨ２−基、アミノ酸残基、ヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体の付加により異なりうる。
【０１０５】
「細胞透過性ペプチド」（ＣＰＰ）または「細胞取込みを増強するペプチド部分」という用語は、互換的に使用され、「輸送ペプチド」、「担体ペプチド」、または「ペプチド導入ドメイン」ともまた呼ばれる、カチオン性細胞透過性ペプチドを指す。例えば、ペプチドコンジュゲートホスホルアミデートまたはホスホロジアミデートモルホリノ（ＰＰＭＯ）は、本明細書で記載される、細胞取込みを増強する細胞透過性ペプチドまたは細胞透過性ペプチド部分を含みうる。多様な実施形態では、ペプチドは、修飾アンチセンスオリゴマーに共有結合させることができる。さらなる実施形態では、ペプチドは、修飾アンチセンスオリゴマーの３’末端または５’末端にコンジュゲートさせることができる。さらなる実施形態では、ペプチドは、３’末端のモルホリン環のピペラジニル部分または窒素原子へと連結することができる。一部の実施形態では、細胞取込みを増強する、細胞透過性ペプチドまたは細胞透過性ペプチド部分は、本明細書で記載される、アルギニンに富むペプチドを含みうる。非限定的な例において、本明細書で開示される通りの修飾アンチセンスオリゴマーは、（Ａｒｇ）６Ｇｌｙ（オリゴヌクレオチドに結合する６つのアルギニンおよび１つのグリシン）などのアルギニンに富むペプチドに結合することができる。
【０１０６】
本明細書で示されるペプチドは、全身投与されると、所与の細胞培養物集団の細胞のうちの約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％、または少なくともほぼこれらの比率の細胞内の細胞透過を誘導し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、複数の組織内の高分子のトランスロケーションを可能とする能力を有する。一部の実施形態では、ＣＰＰは、式−［（Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ’ＮＨ）ｍ］Ｒ’’［式中、Ｒ’は、天然に存在するアミノ酸、またはその１炭素同族化合物もしくは２炭素同族化合物の側鎖であり、Ｒ’’は、水素またはアシルから選択され、ｍは、最大で５０の整数である］を有する。当技術分野では、さらなるＣＰＰも周知であり、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国出願公開第２０１０００１６２１５号において開示されている。他の実施形態では、ｍは、１〜５０から選択される整数であり、ここで、ｍが１である場合、部分は、単一のアミノ酸またはその誘導体である。
【０１０７】
「アミノ酸」という用語は、一級アミノ基、カルボン酸基、側鎖、および水素原子が結合している炭素原子を含む化合物を指す。例えば、「アミノ酸」という用語は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アスパラギン酸、ヒスチジン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、システイン、グルタミン酸、セリン、チロシン、ピロリシン、セレノシステイン、およびアルギニンを含むがこれらに限定されない。加えて、本明細書で使用される「アミノ酸」はまた、エステル、およびアミド、および塩など、アミノ酸の誘導体のほか、活性形態へと代謝されると薬理学的特性を有する誘導体を含む、他の誘導体も含む。したがって、「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸を含むことが理解される。
【０１０８】
「電子対」という用語は、他の原子と結合しないかまたは共有されていない、電子の原子価対を指す。
【０１０９】
「相同性」という用語は、２つもしくはこれを超えるアミノ酸配列または２つもしくはこれを超えるヌクレオチド配列の類似性の量または程度を指す。いくつかの例において、配列相同性には、１または複数の保存的置換であって、対象タンパク質の基本的な構造または機能に影響を及ぼさない当該１または複数の置換が含まれ得る。保存的ヌクレオチド置換には、１つの核酸の別の核酸への置換であって、そのコドンによりコードされるアミノ酸を変化させない置換が含まれ得る。保存的アミノ酸置換には、１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換であって、置換されたアミノ酸が置換をするアミノ酸と同じまたは類似の分類に属する置換、例えばある脂肪族アミノ酸の別の脂肪族アミノ酸による置換が含まれ得る。相同性は、ＧＡＰなどの配列比較プログラムを使用して決定することができる（Ｄｅｖｅｒａｕｘら、１９８４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２巻、３８７〜３９５頁）。このようにして、本明細書で引例される配列と、類似の長さまたは実質的に異なる長さの配列を、アラインメントへのギャップの挿入により比較することができ、このようなギャップを、例えば、ＧＡＰにより使用される比較アルゴリズムにより決定する。
【０１１０】
「単離された」という用語は、その生来の状態では通常それに随伴する成分を、実質的または本質的に含まない材料を指す。例えば、本明細書で使用される「単離オリゴヌクレオチド」または「単離オリゴマー」とは、天然に存在する状態ではそれを挟む配列から精製されるかまたは取り出されたオリゴマー、例えば、ゲノム内の断片に隣接する配列から取り出されたＤＮＡ断片を指す場合がある。細胞に関する場合の、「〜を単離すること」という用語は、細胞（例えば、線維芽細胞、リンパ芽球）の、供給源となる被験体（例えば、オリゴヌクレオチドリピート病を伴う被験体）からの精製を指してもよい。ｍＲＮＡまたはタンパク質の文脈では、「〜を単離すること」とは、ｍＲＮＡまたはタンパク質の、供給源、例えば、細胞からの回収を指してもよい。
【０１１１】
「〜をモジュレートする」という用語は、１または複数の定量化可能なパラメータを、任意選択で、規定された量および／または統計学的に有意な量で「増加」または「減少」させることを含む。「〜を増加させる」もしくは「〜を増加させること」、「〜を増強する」もしくは「〜を増強すること」、または「〜を刺激する」もしくは「〜を刺激すること」とは、一般に、１もしくは複数の修飾アンチセンスオリゴマー化合物もしくは組成物、および／または、１もしくは複数の治療剤が、細胞または被験体において、アンチセンスオリゴマー化合物および／もしくは治療剤を伴わずに引き起こされる応答、または対照化合物により引き起こされる応答と比べて、より大きな生理学的応答（例えば下流における効果）をもたらすかまたは引き起こす能力を指す。関係のある生理学的応答または細胞応答（ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ）は、当業者には明らかであり、ミオスタチンｍＲＮＡにおけるエクソン２の包含の減少（もしくはエクソン２の除外の増加）、および／または、例えばそれを必要とする被験体の細胞もしくは組織における機能的なミオスタチンタンパク質の発現の減少を含み得る。他の関係のある生理学的応答または細胞応答（ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ）は、ジストロフィンｍＲＮＡにおける遺伝子変異を有する１または複数のエクソンの包含の減少（もしくは除外の増加）、および／または、細胞もしくは組織における、機能的もしくは半機能的なジストロフィンタンパク質の発現の増加を含み得る。「減少された」または「低減された」量とは、典型的には、「統計学的に有意な」量であり、修飾アンチセンスオリゴマー化合物および／もしくは治療剤の投与の非存在下で、それを必要とする被験体によりもたらされる量（例えば特定の被験体またはコホートの、「生来」または「自然」の発現率）または対照化合物によりもたらされる量と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０分の１またはこれ未満（例えば１００、５００、１０００分の１）であって、全ての整数およびそれらの間にあり１より大きい小数（ｄｅｃｉｍａｌ  ｐｏｉｎｔ）（例えば１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９を含む）分数の減少を含み得る。「〜を低減する」または「〜を阻害する」という用語は一般に、１もしくは複数のアンチセンスオリゴマー化合物もしくは組成物、および／または、１もしくは複数の治療剤が、本明細書に記載される疾患または状態の症状などの関係のある生理学的応答または細胞応答であって、診断技術分野で慣例的な技法に従い、測定される応答を「減少させる」能力に関する場合がある。「増加した」または「増強された」量とは、典型的には、「統計学的に有意な」量であり、修飾アンチセンスオリゴマー化合物および／もしくは治療剤の非存在下でそれを必要とする被験体によりもたらされる量（例えば特定の被験体またはコホートの「生来の」または「天然の」発現率）または対照化合物によりもたらされる量と比較して、全ての整数およびそれらの間にあって１より大きい小数（例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９）を含��て１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０倍またはこれを超える（例えば１００、５００、１０００倍）増加を含み得る。「〜を増強する」という用語は、一般に、１もしくは複数の修飾アンチセンスオリゴマー化合物もしくは組成物、および／または、１もしくは複数の治療剤が、本明細書に記載される疾患または状態の症状などの関係のある生理学的応答または細胞応答を、診断技術分野における慣例的な技法に従って測定したとき「増加させる」能力に関し得る。
【０１１２】
関係のある生理学的応答または細胞応答（ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ）は、当業者に明らかであり、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）および関連障害、例えばベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、肢帯筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー、筋緊張性筋ジストロフィー、眼球咽頭筋ジストロフィー、末梢型筋ジストロフィー、エメリー・ドライフス筋ジストロフィー、筋肉消耗状態または障害、例えばＡＩＤＳ、がんまたは化学療法関連の筋肉消耗、および線維症または線維症関連障害（例えば骨格筋線維症）などの症状または病変の減少を含み得る。他の実施形態では、例えば、症状または病変の軽減が、機能的なジストロフィンタンパク質の発現の増加および／または機能的なミオスタチンタンパク質の発現の減少に随伴するかまたはこれに関連し得る、デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害を処置する方法が提供される。応答の「増加」は、修飾アンチセンスオリゴマー化合物および／もしくは治療剤の投与の非存在下でそれを必要とする被験体によりもたらされる応答に比べて（例えば特定の被験体またはコホートの「生来の」または「天然の」発現率と比べて）または対照化合物と比べて「統計学的に有意」であり得、間にある全ての整数を含めて、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の増加を含み得る。
【０１１３】
本明細書で使用される用語「治療剤」（「ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ」または「ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ」）とは、治療効果を生じさせることができる薬剤を意味する。一部の実施形態では、治療剤は、ポリペプチド、ポリペプチド類似体、核酸、核酸類似体、アプタマーもしくは小分子であるか、またはそれらを含む。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、長さまたは翻訳後修飾に関係なく、交換可能に使用され、アミノ酸の任意のペプチド結合鎖を意味する。ポリペプチドは、野生型タンパク質、野生型タンパク質の機能的断片、または野生型タンパク質もしくは断片の変異体であってもよい。変異体は、１または複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入を含んでもよい。置換は保存的であっても、非保存的であってもよい。保存的置換には、典型的には、以下の群内の置換が含まれる：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシンおよびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリンおよびトレオニン；リシン、ヒスチジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。一部の実施形態では、タンパク質には抗体または可溶性受容体が含まれる。複数の実施形態では、可溶性受容体はＡＣＶＲ２（例えばＡＣＶＲ２Ｂ）である。一部の実施形態では、核酸はタンパク質、例えばジストロフィン、マイクロジストロフィンまたはミニジストロフィンをコードするものである。複数の実施形態では、核酸はアンチセンスオリゴマーまたはｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは本明細書で記載される通りの修飾アンチセンスオリゴマーである。
【０１１４】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、２つの軽鎖ポリペプチドと２つの重鎖ポリペプチドとを含む全抗体を指す。全抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体を含む異なる抗体アイソタイプを含む。「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ化されたもしくはキメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、脱免疫原性（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）抗体および完全ヒト抗体を含む。抗体は、例えば、哺乳動物、例えばヒト、非ヒト霊長類（例えばオランウータン、マントヒヒまたはチンパンジー）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、ラットおよびマウスなどの種々の種のいずれかで作製でき、またはそれらに由来し得る。抗体は、精製された抗体または組換え抗体であり得る。
【０１１５】
本明細書で使用するとき、用語「抗体断片」、「抗原結合断片」または類似の用語は、標的抗原と結合し、標的抗原の活性を阻害する能力を保持する抗体の断片を指す。かかる断片は、例えば単鎖抗体、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、Ｆｄ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片またはＦ（ａｂ’）２断片を含む。ｓｃＦｖ断片は、ｓｃＦｖが由来する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方を含む単一のポリペプチド鎖である。さらに、細胞内抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、低分子化抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）および二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）も抗体の定義に含まれ、本明細書で記載される方法での使用に適する。例えば、Todorovskaら、（２００１年）J  Immunol  Methods  ２４８巻（１号）：４７〜６６頁；HudsonおよびKortt（１９９９年）J  Immunol  Methods  ２３１巻（１号）：１７７〜１８９頁；Poljak（１９９４年）Structure  ２巻（１２号）：１１２１〜１１２３頁；RondonおよびMarasco（１９９７年）Annual  Review  of  Microbiology  ５１巻：２５７〜２８３頁を参照されたい。これらの各々は参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
本明細書で使用するとき、用語「抗体断片」はまた、例えばラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）された単一ドメイン抗体などの単一ドメイン抗体を含む。例えば、Muyldermansら（２００１年）Trends  Biochem  Sci  ２６巻：２３０〜２３５頁；Nuttallら（２０００年）Curr  Pharm  Biotech  １巻:２５３〜２６３頁；Reichmannら（１９９９年）J  Immunol  Meth  ２３１巻：２５〜３８頁；ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９４／０４６７８号および第ＷＯ９４／２５５９１号；ならびに米国特許第６，００５，０７９号を参照されたい。これらの各々は参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本開示は、単一ドメイン抗体が形成されるような修飾がなされた、２つのＶＨドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。
【０１１７】
一部の実施形態では、抗原結合断片は、重鎖ポリペプチドの可変領域と軽鎖ポリペプチドの可変領域とを含む。一部の実施形態では、本明細書で記載される抗原結合断片は、抗体の軽鎖および重鎖ポリペプチドのＣＤＲを含む。
【０１１８】
成長分化因子８（ＧＤＦ−８）とも称されるミオスタチンは、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）のスーパーファミリーに属する。ミオスタチンは、ＭＳＴＮ遺伝子によりコードされるタンパク質である。ミオスタチンのアミノ酸配列は、MQKLQLCVYIYLFMLIVAGPVDLNENSEQKENVEKEGLCNACTWRQNTKSSRIEAIKIQILSKLRLETAPNISKDVIRQLLPKAPPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHATTETIITMPTESDFLMQVDGKPKCCFFKFSSKIQYNKVVKAQLWIYLRPVETPTTVFVQILRLIKPMKDGTRYTGIRSLKLDMNPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGIEIKALDENGHDLAVTFPGPGEDGLNPFLEVKVTDTPKRSRRDFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWIIAPKRYKANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGKEQIIYGKIPAMVVDRCGCS（配列番号３５０２）である。ＭＳＴＮ遺伝子は主にヒト骨格筋で発現し、筋肉の成長の負の制御因子として作用する。例えば、ミオスタチン遺伝子を欠くように操作したマウスは、正常なマウスの２倍の筋肉量の発達を示す（McPherronら、（１９９７年）、Nature  ３８７巻：８３〜９０頁）。
【０１１９】
複数の実施形態では、ミオスタチン治療剤は、被験体におけるミオスタチン活性およびミオスタチン発現の一方または両方を抑制できる。ミオスタチン治療剤は、ミオスタチンプレｍＲＮＡを標的とし、ミオスタチンプレｍＲＮＡの成熟ｍＲＮＡへの転写に干渉する治療剤であってもよい。複数の実施形態では、ミオスタチン治療剤は、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できる。複数の実施形態では、ミオスタチン治療剤は、ミオスタチンプレｍＲＮＡにおけるエクソン２のスキッピングを誘導し、エクソン２を含むミオスタチンプレｍＲＮＡの発現を阻害する。ミオスタチン治療剤は、ミオスタチンタンパク質を標的とし、ミオスタチン受容体とのミオスタチンタンパク質の結合に干渉する治療剤であってもよい。ミオスタチン治療用タンパク質は、抗ミオスタチン抗体、例えば、抗ＧＤＦ８（Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、ＭＡ）、ドマグロズマブ（Ｄｏｍａｇｒｏｚｕｍａｂ）（ＰＦ−０６２５２６１６、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）；スタムルマブ（Ｓｔａｍｕｌｕｍａｂ）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；ＰＦ−３４４６８７９（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）；ランドグロズマブ（Ｌａｎｄｏｇｒｏｚｕｍａｂ）（ＬＹ−２４９５６５５；Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）；またはトレボグルマブ（Ｔｒｅｖｏｇｒｕｍａｂ）（ＲＥＧＮ−１０３；Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）であってもよい。複数の実施形態では、ミオスタチン治療剤は、可溶性受容体がＡＣＶＲ２である可溶性受容体であってもよい（例えばＡＣＶＲ２Ｂ；MTAPWVALALLWGSLCAGSGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTLLTVLAYSLLPIGGLSLIVLLAFWMYRHRKPPYGHVDIHEDPGPPPPSPLVGLKPLQLLEIKARGRFGCVWKAQLMNDFVAVKIFPLQDKQSWQSEREIFSTPGMKHENLLQFIAAEKRGSNLEVELWLITAFHDKGSLTDYLKGNIITWNELCHVAETMSRGLSYLHEDVPWCRGEGHKPSIAHRDFKSKNVLLKSDLTAVLADFGLAVRFEPGKPPGDTHGQVGTRRYMAPEVLEGAINFQRDAFLRIDMYAMGLVLWELVSRCKAADGPVDEYMLPFEEEIGQHPSLEELQEVVVHKKMRPTIKDHWLKHPGLAQLCVTIEECWDHDAEARLSAGCVEERVSLIRRSVNGTTSDCLVSLVTSVTNVDLPPKESSI；配列番号３５０３）。一部の実施形態では、可溶性受容体（例えばＡＣＶＲ２Ｂ）は、異種性部分、例えば被験体において治療剤の循環半減期を増加させる部分とコンジュゲートする。一部の実施形態では、部分はイムノグロブリンのＦｃ部分（例えばヒトＩｇＧ  Ｆｃ）である。一部の実施形態では、部分はポリエチレングリコール部分である。一部の実施形態では、部分はアルブミンポリペプチド（例えばヒトアルブミン）の全体または一部を含む。一部の実施形態では、ミオスタチン治療剤は、ヒトＡＣＶＲ２−Ｆｃ融合体、例えばラマテルセプト（ｒａｍａｔｅｒｃｅｐｔ）（Ａｃｃｅｌｅｒｏｎ）である。ミオスタチン治療剤は、核酸がアンチセンスオリゴマーおよびｓｉＲＮＡから選択される核酸を含む。アンチセンスオリゴマーは本明細書で記載される通りの修飾ミオスタチンアンチセンスオリゴマーであってもよい。一部の実施形態では、ミオスタチン治療剤は、小分子、例えばＯＳＸ−２００（Ｏｓｓｉａｎｉｘ  Ｉｎｃ）またはＳＲＫ−０１５（Ｓｃｈｏｌａｒ  Ｒｏｃｋ  Ｉｎｃ．）である。
【０１２０】
本明細書で記載される方法および組成物に有用なミオスタチンのアンタゴニストは、例えば、抗ミオスタチン抗体などのミオスタチンに直接結合する薬剤（ＧＤＦ−８）を含む。かかる抗体は当技術分野において公知であり、例えば国際特許出願公開第ＷＯ２００６１１６２６９号（Ｐｆｉｚｅｒ）、米国特許第８，０６６，９９６号（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、米国特許第７，８０７，１５９号（Ａｍｇｅｎ）、米国特許第６，０９６，５０６号および米国特許第６，４６８，５３５号に記載されており、これらの各々の開示は参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。ミオスタチンアンタゴニストは、可溶性アクチビン（Ａｃｔｉｖｉｎ）受容体タンパク質または、可溶性アクチビンタンパク質を含む融合タンパク質（例えばＡＣＶＲ２−Ｆｃ融合タンパク質）も含む。可溶性アクチビン受容体タンパク質は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１０１２９４０６号（ジョンズホプキンス大学）、米国特許出願公開第２００９０００５３０８号（Ａｃｃｅｌｅｒｏｎ）、国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０９７５４１号（Ａｃｃｅｌｅｒｏｎ）および国際特許出願公開第ＷＯ２０１００１９２６１号（Ａｃｃｅｌｅｒｏｎ）に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ミオスタチンアンタゴニストは、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびミオスタチンに対してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介できる短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子などの、ミオスタチンの発現を阻害する核酸である。かかる分子は、例えば米国特許出願公開第２００５０１２４５６６号および米国特許第７，８８７，７９３号に記載されており、これらの各々の開示は参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、例えばＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓへの米国特許第６，２８４，８８２号に記載されている通り、核酸はミオスタチンプロモーターを阻害し、それによりミオスタチン発現を阻害する。ミオスタチンの阻害剤は、その受容体を経るミオスタチンシグナリングを阻害する薬、例えば抗ＡＣＶＲ２Ｂ抗体を含む（例えば、米国特許出願公開第２０１００２７２７３４号（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）および国際特許出願公開第ＷＯ２０１４１７２４４８号（Ａｎａｐｔｙｓｂｉｏ）を参照されたい）。ミオスタチンのさらなる例示的な阻害剤は、国際特許出願公開第ＷＯ２００６／０８３１８３号に記載されている。
【０１２１】
一部の実施形態では、ジストロフィン治療剤は１回目に投与され、ミオスタチン治療剤は２回目に投与される。例えば、ジストロフィン治療剤は、治療剤が投与される被験体の筋肉において機能的なジストロフィンタンパク質の発現を促進し、回復させ、および／または増加させるのに十分な時間投与される。次に、ミオスタチン治療剤は、例えば被験体における筋肉量、筋力、および／または弾力性を強化するのに十分な時間で被験体に投与される。複数の実施形態では、ジストロフィン治療剤は、被験体におけるジストロフィンの発現を増加させることができる。ジストロフィン治療剤は、ジストロフィンまたは機能的もしくは半機能的な切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ジストロフィンの発現を増加させ得る。切断型ジストロフィンは、マイクロジストロフィンおよびミニジストロフィンを含むが、これらに限定されない（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる欧州特許第２１２５００６号で開示されている）。ジストロフィン治療剤は、ジストロフィンプレｍＲＮＡを標的とし、ジストロフィンプレｍＲＮＡの成熟ｍＲＮＡ、例えば本明細書で記載される修飾アンチセンスオリゴマーへの転写をモジュレートする治療剤であってもよい。複数の実施形態では、ジストロフィン治療剤は、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できる。複数の実施形態では、標的とされるジストロフィンプレｍＲＮＡは、１または複数の遺伝子変異を有してもよい。ジストロフィン治療剤が、エクソンスキッピングを誘導することにより、１または複数の遺伝子変異を含む１または複数のエクソンが、成熟ｍＲＮＡへのプロセシングの間、ジストロフィンプレｍＲＮＡから除去される。得られる切断型ｍＲＮＡは、機能的または半機能的なジストロフィンタンパク質に翻訳され得る。
【０１２２】
一部の実施形態では、ジストロフィン治療剤は、機能的なジストロフィンタンパク質、例えばマイクロジストロフィンまたはミニジストロフィンタンパク質をコードする核酸であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、核酸はウイルス送達により被験体の筋細胞に導入される。一部の実施形態では、核酸からの機能的なジストロフィンタンパク質の発現は、筋肉特異的プロモーター、例えば筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）のプロモーターにより駆動される。ＤＭＤの遺伝子治療のための、機能的なジストロフィンタンパク質を含むウイルスベクターの使用は、例えば、Shinら（２０１３年）Mol  Ther  ２１巻（４号）：７５０〜７５７頁；Rodino-Klapacら（２０１１年）Methods  Mol  Biol  ７０９巻：２８７〜２９８頁；Okadaら（２０１３年）Pharmaceuticals  ６巻（７号）：８１３〜８３６頁；Rodino-Klapacら（２０１０年）Mol  Ther  １８巻（１号）：１０９〜１１７頁；Vincentら（１９９３年）Nature  Genetics  ５巻：１３０〜１３４頁；Xuら（２００７年）Neuromusc  Disorders  １７巻：２０９〜２２０頁；Martinら（２００９年）Am  J  Physiol  Cell  Physiol  ２９６巻：４７６〜４８８頁；国際特許出願公開第ＷＯ２００９／０８８８９５号および米国特許出願公開第２０１０００３２１８号および同第２０１４０３２３９５６号に記載されており、これらの各々の開示は参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。当業者はまた、目的の細胞への導入遺伝子の送達に使用できる他のベクター系も熟知している（例えば米国特許第５，７０７，６１８号；Verhaartら（２０１２年）Curr  Opin  Neurol  ２５巻（５号）：５８８〜５９６頁；Odomら（２０１１年）Mol  Ther  １９巻（１号）：３６〜４５頁；およびKoppanatiら（２０１０年）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １７巻（１１号）：１３５５〜１３６２）。機能的なジストロフィンタンパク質のトランスジェニック送達を評価している進行中の臨床試験は、例えば米国ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別番号ＮＣＴ０２３７６８１６（Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）およびＮＣＴ００４２８９３５（Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）、ならびにBowlesら（２０１２年）Mol  Ther  ２０巻（２号）：４４３〜４５５頁により記載された治験を含む。
【０１２３】
当業者であれば、ジストロフィン遺伝子における多様な変異が治療的なエクソンスキッピングを受け得ることを熟知している。例えば、エクソン５１スキッピングされ得る以下のエクソン中の変異の非限定的な例は、例えば４５〜５０、４７〜５０、４８〜５０、４９〜５０、５０、５２、５２〜６３を含む（Leiden  Duchenne  muscular  dystrophy  mutation  database、Leiden  University  Medical  Center、オランダ）。患者がＤＭＤ遺伝子中に、エクソンスキッピングされ得る変異を有するか否かを判定することも、十分に当業者の技量の範囲内である（例えば、Aartsma-Rusら（２００９年）Hum  Mut  ３０巻：２９３〜２９９頁およびAbbsら（２０１０年）Neuromusc  Disorders  ２０巻：４２２〜４２７頁を参照されたい。これらの各々の開示は参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる）。
【０１２４】
エテプリルセン（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる米国特許第７，８０７，８１６号を参照されたい）は、その安全性および効能を試験するための臨床試験の対象であり、また臨床開発が進行中である。エテプリルセンは、ホスホロジアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）アンチセンスオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、ジストロフィン治療剤はエテプリルセンである。「ＡＶＮ−４６５８」としても公知である「エテプリルセン」は、塩基配列５’−ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ−３’（配列番号７６）を有するＰＭＯである。エテプリルセンは、ＣＡＳ登録番号１１７３７５５−５５−９として登録されている。化学名は、ＲＮＡ、［Ｐ−デオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）］（２’，３’−ジデオキシ−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコ）（２’ａ→５’）（Ｃ−ｍ５Ｕ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ａ−ｍ５Ｕ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−ｍ５Ｕ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−ｍ５Ｕ−ｍ５Ｕ−ｍ５Ｕ−Ｃ−ｍ５Ｕ−Ａ−Ｇ）（配列番号２６３）、５’−［Ｐ−［４−［［２−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］エトキシ］カルボニル］−１−ピペラジニル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルホスホンアミデート］およびＰ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−５’−Ｏ−｛Ｐ−［４−（１０−ヒドロキシ−２，５，８−トリオキサデカノイル）ピペラジン−１−イル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルホスホンアミドイル｝−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコシチジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，３’−ジデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコチミジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコシチジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコシチジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコアデニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコアデニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコシチジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコアデニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，３’−ジデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコチミジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコシチジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコアデニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコアデニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコグアニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコグアニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコアデニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコアデニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコグアニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコアデニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，３’−ジデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコチミジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコグアニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコグアニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコシチジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコアデニリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，３’−ジデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコチミジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，３’−ジデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコチミジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，３’−ジデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコチミジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコシチジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，３’−ジデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコチミジリル−（２’ａ→５’）−Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコアデニリル−（２’ａ→５’）−２’，３’−ジデオキシ−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコグアノシンを含む。
【０１２５】
エテプリルセンは、以下の構造を有する：
【化３１】
2018530560.tif 000032
【０１２６】
「ジストロフィン」は、桿状の細胞質タンパク質であり、細胞膜を通じて筋線維の細胞骨格を周囲の細胞外マトリックスへ連結するタンパク質複合体の非常に重要な部分であり、ジストロフィン（すなわちＤＭＤ）遺伝子によりコードされる。ジストロフィンは、複数の機能的ドメインを含む。例えば、ジストロフィンは、アミノ酸１４〜２４０周辺にアクチン結合ドメインを、およびアミノ酸２５３〜３０４０周辺に中央桿状ドメインを含む。この大型の中央ドメインは、アルファ−アクチニンおよびスペクトリンとの相同性を有する、約１０９のアミノ酸からなる２４個のスペクトリン様の３重ヘリックスエレメントで形成される。その繰り返しは典型的には、４つのプロリンに富む非繰り返しセグメント（ヒンジ領域とも呼ばれる）により中断される。繰り返し１５および１６は、ジストロフィンのタンパク質分解切断のための主要部位を提供すると考えられる１８アミノ酸の伸長部により分離される。ほとんどの繰り返し同士の配列同一性は、１０〜２５％の範囲である。１つの繰り返しは３つのアルファ−ヘリックス：１、２および３を含む。アルファ−ヘリックス１および３は各々、７つのヘリックスターンにより形成され、おそらく疎水性インタフェースを介してコイルドコイルとして相互作用している。アルファ−ヘリックス２はより複雑な構造を有し、４つおよび３つのヘリックスターンのセグメントにより形成され、グリシンまたはプロリン残基により分離される。各繰り返しは２つのエクソンによりコードされ、典型的にはアルファ−ヘリックス２の第１の部分におけるアミノ酸４７と４８との間のイントロンにより中断される。他のイントロンは、繰り返し中の異なる位置に存在し、通常、ヘリックス−３上に点在する。ジストロフィンはまた、アミノ酸３０８０〜３３６０周辺に、粘菌（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）アルファ−アクチニンのＣ末端ドメインとの相同性を示す、システインに富むセグメント（すなわち２８０のアミノ酸のうち１５のシステイン）などのシステインに富むドメインを含む。カルボキシ末端ドメインは、アミノ酸３３６１〜３６８５周辺に存在する。
【０１２７】
ジストロフィンのアミノ末端はＦ−アクチンと結合し、カルボキシ末端は筋細胞膜においてジストロフィン関連タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）と結合する。ＤＡＰＣはジストログリカン、サルコグリカン、インテグリンおよびカベオリンを含み、これらの構成要素のいずれかにおける変異により、常染色体遺伝性の筋ジストロフィーが発症する。ジストロフィンが存在しない場合、ＤＡＰＣは不安定化し、それにより構成タンパク質のレベルが低下し、その結果、段階的な線維損傷および膜漏出に至る。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）およびベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）などの多様な型の筋ジストロフィーにおいて、主に誤ったスプライシングに至る遺伝子配列の変異に起因して、筋細胞は、変形され、機能的に不完全な形状のジストロフィンを産生するか、またはジストロフィンを全く産生しなくなる。不完全なジストロフィンタンパク質のプレドミナントな発現、またはジストロフィンもしくはジストロフィン様タンパク質の完全な欠乏は、上記のように筋変性の急速な進行につながる。この点に関して、「不完全な」ジストロフィンタンパク質は、当技術分野において公知のように、ＤＭＤまたはＢＭＤを有する特定の被験体において産生されるジストロフィンの形状により、または、検出可能なジストロフィンの欠如により特徴付けられ得る。
【０１２８】
ジストロフィンタンパク質に関する「機能的」という用語は、野生型タンパク質とも称される、ジストロフィン遺伝子のエクソン１〜７９の全てに対応する配列を含むｍＲＮＡ転写物に由来するタンパク質を含む。機能的なジストロフィンタンパク質とは、ＤＭＤまたは関連障害を有するある特定の被験体に存在する変形されたまたは「不完全な」形状のジストロフィンタンパク質と典型的に比較して、低減しなければデュシェンヌ型筋ジストロフィーに特徴的である筋組織の段階的分解を低減するのに十分な生物学的活性を有するジストロフィンタンパク質を一般に指す。機能的なジストロフィンタンパク質は、当技術分野で慣例的な技法により測定した場合に、野生型ジストロフィンのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ生物学的活性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％（それらの間の全ての整数を含む）を有し得る。１つの例として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの筋肉培養物におけるジストロフィン関連活性は、筋管サイズ、筋原線維の組織化（または分裂）、収縮活性およびアセチルコリン受容体の自発的なクラスタリングにより測定できる（例えば、Brownら、Journal  of  Cell  Science.１１２巻：２０９〜２１６頁、１９９９年を参照されたい）。動物モデルも疾患の病因を検討するための有用な資源であり、ジストロフィン関連活性を試験する手段を提供する。ＤＭＤ研究に最も広く使用されている動物モデルのうちの２つは、ｍｄｘマウスおよびゴールデンレトリバー筋ジストロフィー（ＧＲＭＤ）イヌであり、いずれもジストロフィンネガティブである（例えば、CollinsおよびMorgan、Int  J  Exp  Pathol  ８４巻：１６５〜１７２頁、２００３年を参照されたい）。これらおよび他の動物モデルは、多様なジストロフィンタンパク質の機能的活性を測定するために使用できる。本発明のアンチセンスオリゴマー化合物のいくつかにより産生される形状などの切断型ジストロフィンも含まれる。
【０１２９】
「機能的な」または「半機能的な」ジストロフィンタンパク質という用語は、切断型の転写物に対応する配列を含むｍＲＮＡ転写物、例えばジストロフィン遺伝子のエクソン１〜７９のうちの全てではないエクソンを有するジストロフィンｍＲＮＡ転写物に由来するタンパク質を含む。言い換えると、切断型のジストロフィンｍＲＮＡは、対応するジストロフィン遺伝子の１または複数のエクソンを除外し得る。切断型のジストロフィンｍＲＮＡは、マイクロジストロフィンタンパク質とも称される、切断または短縮型のジストロフィンタンパク質を発現し得る。
【０１３０】
ミオスタチンタンパク質に関する「機能的な」という用語は、野生型タンパク質とも称される、ミオスタチン遺伝子のエクソン１、エクソン２およびエクソン３に対応する全ての配列を含むｍＲＮＡ転写物に由来するタンパク質を含む。
【０１３１】
非機能的、機能不全、または不活性なミオスタチンタンパク質は、エクソン１、エクソン２およびエクソン３の配列に対応する全長遺伝子の全部もしくは任意の一部を欠失するミオスタチンｍＲＮＡ転写物に由来するタンパク質、または、イントロン１、イントロン２もしくは他のイントロン配列に対応する配列の全部もしくは一部を含むタンパク質、または、非機能的状態が、各エクソンに由来するような機能的な要素の欠失に関連する場合のタンパク質、または、さもなければ、その部分的または完全な配列を含む各イントロンを含むことに由来するタンパク質を含む。非機能的、機能不全、または不活性なミオスタチンタンパク質は、例えばエクソン２を除外するミオスタチンｍＲＮＡ転写物に由来するタンパク質、および／または、野生型ミオスタチンタンパク質と比較して機能性が低下したタンパク質を含む。
【０１３２】
このように、多様な実施形態では、機能的または半機能的なジストロフィンタンパク質の存在、発現または発現増加は、例えば修飾アンチセンスオリゴマーおよび／または本開示の治療剤により処置されたＤＭＤ患者由来の筋細胞の、例えばウェスタンブロット解析およびジストロフィン遺伝子の発現により決定できる。多様な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーおよび／または本開示の治療剤による、ＤＭＤの処置を必要とするＤＭＤ筋細胞または被験体の処置は、例えば正常な細胞または正常な被験体で発現されるジストロフィンタンパク質の正常な量の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の量の機能的なジストロフィンタンパク質の発現をもたらし得る。
【０１３３】
多様な実施形態では、ＤＭＤの処置を必要とする組織または被験体により発現されるジストロフィンまたは切断型ジストロフィンタンパク質の機能性は、例えば筋線維の数、筋肉量の増加、中心核を有する筋線維のパーセントおよび機能的なジストロフィンタンパク質の量の、未処置の同等物と比較した、免疫組織化学的分析によって決定し得る。ＤＭＤの処置を必要とする被験体のジストロフィンまたは切断型ジストロフィンタンパク質の機能性は、筋肉量および握力の測定を含む運動機能試験などの、物理的および生理学的試験によりさらに分析し得る。
【０１３４】
一部の実施形態では、ジストロフィン治療剤は、目的の細胞におけるジストロフィン発現を回復させる。ジストロフィン合成または産生の「回復」という用語は、一般には、本明細書に記載されるエテプリルセンによる処置後に筋ジストロフィーを有する患者における、切断型ジストロフィンを含めたジストロフィンタンパク質の産生を指す。一部の実施形態では、処置により、患者における新規ジストロフィン産生の、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％（これらの間の全ての整数を含む）の増加がもたらされる。一部の実施形態では、処置により、ジストロフィン陽性線維の数が、被験体において、正常値の少なくとも２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９５％〜１００％に増加する。他の実施形態では、処置により、ジストロフィン陽性線維の数が、被験体において、正常値の約２０％〜約６０％、または約３０％〜約５０％に増加する。処置後の患者におけるジストロフィン陽性線維のパーセントは、公知の技法を使用して筋生検により決定できる。例えば、筋生検は適切な筋肉、例えば患者における上腕二頭筋から採取し得る。
【０１３５】
陽性ジストロフィン線維のパーセンテージの分析は、処置前および／または処置後または一連の処置中の時点で行ってもよい。一部の実施形態では、処置後の生検は、処置前生検と対側の筋肉から採取される。処置前および処置後のジストロフィン発現の検討は、ジストロフィンに関するいかなる適切なアッセイを使用して行ってもよい。一実施形態では、筋生検から得た組織切片に対して、ジストロフィンのマーカーである抗体、例えばモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用して免疫組織化学的検出を実施する。例えば、ジストロフィンに対して非常に感受性の高いマーカーであるＭＡＮＤＹＳ１０６抗体が使用できる。いかなる適切な二次抗体も使用し得る。
【０１３６】
一部の実施形態では、ジストロフィン陽性線維のパーセントは、計数される全ての線維で陽性線維数を除算することにより算出される。正常な筋肉試料は、ジストロフィン陽性線維が１００％である。したがって、ジストロフィン陽性線維のパーセントは、正常値に対するパーセンテージとして表示できる。処置前筋肉ならびにリバータント（ｒｅｖｅｒｔａｎｔ）線維におけるジストロフィンの微量レベルの存在を補正（ｃｏｎｔｒｏｌ）するため、処置後筋肉におけるジストロフィン陽性線維を計数するときには、各患者から得た処置前筋肉の切片を使用してベースラインを設定できる。これは、その患者における処置後筋肉の切片におけるジストロフィン陽性線維を計数するための閾値として使用され得る。他の実施形態では、抗体染色した組織切片は、Ｂｉｏｑｕａｎｔ画像解析ソフトウェア（Ｂｉｏｑｕａｎｔ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ナッシュビル、ＴＮ）を使用するジストロフィンの定量のために使用することもできる。ジストロフィンの蛍光シグナル強度の合計を、正常値に対するパーセンテージとして報告することができる。さらに、モノクローナルまたはポリクローナル抗ジストロフィン抗体によるウェスタンブロット解析を使用して、ジストロフィン陽性線維のパーセンテージを決定することができる。例えば、Ｎｏｖａｃａｓｔｒａ製の抗ジストロフィン抗体ＮＣＬ−Ｄｙｓ１を使用してもよい。ジストロフィン産生はまた、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって測定することもできる。機能的なジストロフィンタンパク質を産生するジストロフィン遺伝子を測定するよう、プライマーを設計することができる。ジストロフィン陽性線維のパーセンテージはまた、サルコグリカン複合体（□□□）の構成要素および／またはニューロンのＮＯＳの発現を測定することにより分析できる。
【０１３７】
一部の実施形態では、処置により、処置を行わない場合に予想されるＤＭＤを有する患者における、進行性の呼吸筋機能不全および／または呼吸筋不全が遅延され、または減少する。一部の実施形態では、処置により、ＤＭＤを有する患者における呼吸筋機能が安定する。一実施形態では、エテプリルセンによる処置により、処置を行わない場合に予想される換気援助の必要性が減少するか、または除去され得る。一実施形態では、疾患の経過を追跡するための呼吸機能の測定、ならびに治療的介入の可能性の評価は、最大吸気圧（ＭＩＰ）、最大呼気圧（ＭＥＰ）および努力性肺活量（ＦＶＣ）を含む。ＭＩＰおよびＭＥＰは、それぞれ、個人の吸入および呼息の間に発生しうる圧力のレベルを測定し、呼吸筋力の精度の高い測定法である。ＭＩＰは、横隔膜筋肉の脆弱性の測定法である。
【０１３８】
一部の実施形態では、処置により、被験体の歩行能力が安定化し、維持され、改善され、または向上し得る（例えば歩行運動の安定化）。一部の実施形態では、処置により、例えば、McDonaldら（Muscle  Nerve、２０１０年；４２巻：９６６〜７４頁；Muscle  Nerve、２０１０年；４１巻：５００〜１０頁、その内容は参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）によって記載された６分間歩行試験（６ＭＷＴ）によって測定した場合に、患者の安定な歩行距離が維持され、増加され、またはその減少が低減される。６ＭＷＴは、疾患状態の変化の表れとして経時的な歩行機能の変化を特徴付ける歩行運動に着目した臨床的に有意義なエンドポイントである。
【０１３９】
６分間歩行距離（６ＭＷＤ）の変化は、絶対値、変化パーセンテージまたは予測値（％）の変化として表され得る。健常者の典型的な能力に対する、６ＭＷＴにおけるＤＭＤ患者の能力は、予測値（％）を算出することによって決定できる。例えば、予測６ＭＷＤ（％）は、男性の場合、以下の式を使用して算出され得る：１９６．７２＋（３９．８１×年齢）−（１．３６×年齢２）＋（１３２．２８×身長（メートル））。女性の場合、予測６ＭＷＤ（％）は、以下の式を使用して算出され得る：１８８．６１＋（５１．５０×年齢）−（１．８６×年齢２）＋（８６．１０×身長（メートル））（Henricsonら  PLoS  Curr.、２０１２年、２版、その内容は参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）。
【０１４０】
歩行運動は、ノーススター歩行能力評価（Ｎｏｒｔｈ  Ｓｔａｒ  Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）（ＮＳＡＡ）などの多様な方法により測定できる。ＮＳＡＡは、ＤＭＤを有する歩行可能な男児を評価するために、Ｎｏｒｔｈ  Ｓｔａｒｔ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＮｅｔｗｏｒｋのＰｈｙｓｉｏｔｈｅｒａｐｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐにより開発され、２〜０でスコア化される活動リストを提供する（正常：２および「独立して達成できない」：０）（２００６〜２０１１年  MDC/North  Star  Clinical  Network）。これらの活動は、最低３秒立っていられる〜箱を上り下りできる〜走れる、にわたる。ある特定の実施形態では、エテプリルセンによる処置により、例えばＮＳＡＡによって決定した場合に、歩行運動が維持、安定化、上昇または改善され得る。
【０１４１】
本発明では、修飾アンチセンスオリゴマーなどの治療剤を使用することで、エクソン２を含むミオスタチンｍＲＮＡの減少が誘導され、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの症状（例えば機能的なミオスタチンタンパク質の減少）が、未処置と比較して、約３０％〜約１００％の範囲、または機能性に関して上記で開示したパーセンテージで改善される。症状のかかる改善は、ミクロのレベル（例えば、免疫組織化学、免疫蛍光法、ウェスタンブロット解析などにより測定されるミオスタチンタンパク質発現の減少；筋肉の成長の増加；筋肉機能の回復）および生理学的なレベル（例えば、身体検査により評価される運動機能の改善）で観察され得る。
【０１４２】
修飾アンチセンスオリゴマーは、ジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセシングの間にエクソンスキッピングを誘導するために使用されるが、その際、ジストロフィンプレｍＲＮＡは、１もしくは複数の遺伝子変異を有するエクソンを含むか、またはジストロフィン遺伝子の１もしくは複数の領域が削除されており、それにより、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに関連する症状および関連障害が改善される（例えば機能的または半機能的なジストロフィンタンパク質の回復）。機能的または半機能的なジストロフィンタンパク質は、未処置と比較して、約３０％〜約１００％の範囲、または機能性に関して上記で開示したパーセンテージで増加し得る。症状のかかる改善は、ミクロのレベル（例えば、免疫組織化学、免疫蛍光法、ウェスタンブロット解析などにより測定されるジストロフィンタンパク質発現の増加；筋肉の成長の増加；筋肉機能の回復）および生理学的なレベル（例えば、身体検査により評価される運動機能の改善）で観察され得る。
【０１４３】
「ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオ塩基と、糖と、少なくとも１つのリン酸基（例えば、ホスホジエステル連結基）とを含む、天然に存在するヌクレオチドを指す。
【０１４４】
「ヌクレオチド類似体」という用語は、天然に存在するヌクレオチドの誘導体、または天然に存在するヌクレオチドに対する修飾、例えば、少なくとも１つの修飾を含むヌクレオチドを指す。このような修飾は、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せのうちの少なくとも１つを含みうる。当業者は、修飾を、ヌクレオチドサブユニットのうちの任意の１つの構成要素（例えば、修飾糖）に関して指定する場合、ヌクレオチドサブユニットのうちの、指定されていない部分は、依然として非修飾（例えば、非修飾ヌクレオシド間連結、非修飾ヌクレオ塩基）でありうることを察知すると予想される。
【０１４５】
「オリゴヌクレオチド」、「オリゴマー」、「オリゴ」、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「アンチセンスオリゴマー」、「修飾アンチセンスオリゴマー」および「アンチセンスオリゴ」という用語、ならびにこれらの他の適切な組合せおよび派生語は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の直鎖状配列であって、１または複数のヌクレオ塩基が、ワトソン−クリック塩基対合により、標的配列と称される、オリゴマーが指向される標的ＲＮＡの部分とハイブリダイズして、標的配列内で、オリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖を形成しうる直鎖状配列を指す。具体的に、「アンチセンス」、「オリゴヌクレオチド」、「オリゴマー」、「オリゴ」、および「化合物」という用語は、このようなオリゴマーを指すように、多様な組合せで、かつ、互換的に使用することができる。ヌクレオチドの部分を含む環式サブユニットは、リボースまたは別の五炭糖、糖類似体に基づく場合もあり、ある特定の実施形態では、修飾糖、例えば、モルホリノ基である場合もある（下記のモルホリノベースのオリゴマーについての記載を参照されたい）。
【０１４６】
オリゴマーに言及する場合の、「修飾された」、「天然に存在しない」、または「類似体」という用語、ならびにこれらの他の適切な組合せおよび派生形は、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、例えば、天然に存在するオリゴヌクレオチド内に見出される、標準的なホスホジエステル連結以外のヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、例えば、天然に存在するオリゴヌクレオチド内に見出される、リボース部分もしくはデオキシリボース部分以外の部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せから選択される、少なくとも１つの修飾を有する、１または複数のヌクレオチドサブユニットを有するオリゴマーを指す。多様な実施形態では、修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結およびホスホロトリアミデートヌクレオシド間連結から選択される。さらなる実施形態では、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結は、（１，４−ピペラジン）−１−イル部分、置換（１，４−ピペラジン）−１−イル部分、４−アミノピペリジン−１−イル部分、または置換４−アミノピペリジン−１−イル部分に共有結合したリン原子を含む。多様な実施形態では、修飾糖部分は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）サブユニット、ロックト核酸（ＬＮＡ）サブユニット、２’Ｏ，４’Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）サブユニット、トリシクロＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）サブユニット、２’Ｏ−メチルサブユニット、２’Ｏ−メトキシエチルサブユニット、２’−フルオロサブユニット、２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］サブユニット、およびモルホリノサブユニットから選択される。
【０１４７】
ヌクレオシド間連結への修飾は、オリゴマーの、少なくとも２つの糖部分および／または修飾糖部分の間の修飾でありうる。ヌクレオチド類似体は、ワトソン−クリック塩基対合により、天然に存在するオリゴヌクレオチド塩基への水素結合が可能な塩基を担い、ここで、類似体は、オリゴマー類似体分子と、天然に存在するオリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ）内の塩基との間で、配列特異的に、このような水素結合を可能とするように、塩基を提示する。例示的な類似体は、実質的に非荷電の、リンを含有するヌクレオシド間連結を有する類似体である。
【０１４８】
「ヌクレアーゼ耐性」オリゴマーとは、そのヌクレオシド間連結が、非ハイブリダイズ形態でも、ハイブリダイズ形態でも、ヌクレアーゼによる切断であって、体内の、一般的な、細胞外ヌクレアーゼおよび細胞内ヌクレアーゼによる（例えば、３’−エクソヌクレアーゼなどのエクソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮアーゼＨによる）切断に対して実質的に耐性であるオリゴマーを指す；すなわち、オリゴマーは、オリゴマーが曝露される、体内の正常なヌクレアーゼ条件下で、ヌクレアーゼによる切断を、ほとんどまたは全く示さない。「ヌクレアーゼ耐性ヘテロ二重鎖」とは、ヘテロ二重鎖が、細胞内ヌクレアーゼおよび細胞外ヌクレアーゼによる、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける分解であって、二本鎖ＲＮＡ／ＲＮＡ複合体または二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体を切断することが可能な分解に対して、実質的に耐性となるように、修飾アンチセンスオリゴマーの、その相補的な標的への結合により形成されるヘテロ二重鎖を指す。「ヘテロ二重鎖」とは、修飾アンチセンスオリゴマーと、標的ＲＮＡの相補的部分との二重鎖を指す。例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴマーは、本明細書で記載される修飾アンチセンスオリゴマーでありうる。
【０１４９】
「ヌクレオ塩基」（Ｎｕ）、「塩基対合部分」、または「塩基」という用語は、自然発生または「生来」のＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ウラシル、チミン、アデニン、シトシン、およびグアニン）のほか、天然に存在するプリンおよびピリミジンの類似体であって、結合アフィニティーなど、改善された特性を、オリゴマーへと付与する類似体において見出される、プリン塩基またはピリミジン塩基を指すように、互換的に使用される。例示的な類似体は、ヒポキサンチン（ヌクレオシドであるイノシンの塩基成分）；２，６−ジアミノプリン；５−メチルシトシン；Ｃ５−プロピニル修飾ピリミジン；１０−（９−（アミノエトキシ）フェノキサジニル（Ｇクランプ）などを含む。
【０１５０】
塩基対合部分のさらなる例は、それらのそれぞれのアミノ基を、アシル保護基で保護した、ウラシル、チミン、アデニン、シトシン、グアニン、およびヒポキサンチン（イノシン）、２−フルオロウラシル、２−フルオロシトシン、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、２，６−ジアミノプリン、アザシトシン、シュードイソシトシンおよびシュードウラシルなどのピリミジン類似体、ならびに８−置換プリン、８−置換キサンチン、または８−置換ヒポキサンチン（後者の２つは、天然の分解産物である）など、他の修飾ヌクレオ塩基を含むがこれらに限定されない。それらの内容が参照により本明細書に組み込まれる、ＣｈｉｕおよびＲａｎａ、ＲＮＡ、２００３年、９巻、１０３４〜１０４８頁、Ｌｉｍｂａｃｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４年、２２巻、２１８３〜２１９６頁；ならびにＲｅｖａｎｋａｒおよびＲａｏ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９９年、７巻、３１３頁において開示されている修飾ヌクレオ塩基もまた想定される。
【０１５１】
塩基対合部分のさらなる例は、１または複数のベンゼン環を付加したサイズ拡大型ヌクレオ塩基を含むがこれらに限定されない。核塩基置換（ｎｕｃｌｅｉｃ  ｂａｓｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）は、以下の例に記載されている：Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈのカタログ（ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）；Ｋｒｕｅｇｅｒ  ＡＴら、Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．、２００７年、４０巻、１４１〜１５０頁；Ｋｏｏｌ，  ＥＴ、Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．、２００２年、３５巻、９３６〜９４３頁；Ｂｅｎｎｅｒ  Ｓ．Ａ．ら、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．、２００５年、６巻、５５３〜５４３頁；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，  Ｆ．Ｅ．ら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．、２００３年、７巻、７２３〜７３３頁；Ｈｉｒａｏ，  Ｉ．、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．、２００６年、１０巻、６２２〜６２７頁（各例の内容は、本明細書において参考として援用される）。これらは、本明細書で記載される多様なオリゴマーの合成に有用であると想定される。サイズ拡大型ヌクレオ塩基の例を、下記：
【化３２】
2018530560.tif 000033
に示す。
【０１５２】
リボース、糖類似体、修飾糖、またはモルホリノに共有結合的に連結されたヌクレオ塩基は、ヌクレオシドを含む。「ヌクレオチド」は、少なくとも１つの連結リン酸基と併せたヌクレオシドを含む。リン酸基は、オリゴマーを形成するように、隣接するヌクレオチドへの共有結合的連結を含む。こうして、ヌクレオチドのリン酸基は一般に、「ヌクレオシド間連結」を形成すると称する。したがって、ヌクレオチドは、本明細書でさらに記載されるヌクレオシドと、ヌクレオシド間連結とを含む。一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、サブユニットを含み、ここで、「サブユニット」は、天然に存在するヌクレオチド、本明細書で記載されるヌクレオチド類似体、およびこれらの組合せを含む。ある特定の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、サブユニットを含み、ここで、少なくとも１つのサブユニットは、ヌクレオチド類似体である。
【０１５３】
「配列同一性」、「配列相同性」および「相補性」という用語（例えば「〜と５０％同一な配列」、「〜と５０％相同な配列」および「〜と５０％相補的な配列」）は、核酸に関しては、配列が、ヌクレオチド対ヌクレオチドベースで、比較ウィンドウにわたり同一である程度を指す。「同一性百分率」、「相同性百分率」および「〜と〜百分率相補的な」は、２つの最適にアラインメントされた配列を、比較ウィンドウにわたり比較し、両方の配列内で、同一な核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）が生じる位置の数を決定して、マッチさせた位置の数をもたらし、マッチさせた位置の数を、比較ウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で除し、結果に１００を乗じて、配列同一性の百分率をもたらすことにより計算することができる。比較ウィンドウをアラインメントするための、配列の最適のアラインメントは、コンピュータへのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）の実行により行うこともでき、精査と、選択される多様な方法のうちのいずれかにより生成される、最良のアラインメント（すなわち、比較ウィンドウにわたり最高の相同性百分率をもたらすアラインメント）とにより行うこともできる。また、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９頁、１９９７年により開示されている通り、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラムも参照することができる。多様な実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、表１（配列番号１〜３）および表２（配列番号４〜１５）におけるターゲティング配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる。
【０１５４】
本明細書で使用される通り、融点（Ｔｍ）が、４０℃、４５℃、５０℃を実質的に超え、多様な実施形態では、６０℃〜８０℃またはこれを超える生理学的条件下で、オリゴマーのターゲティング配列が、標的領域とハイブリダイズする場合に、オリゴマーは、オリゴヌクレオチドの標的領域と、「特異的にハイブリダイズする」。このようなハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に対応することが好ましい。所与のイオン強度およびｐＨにおいて、Ｔｍは、ターゲティング配列のうちの５０％が、標的領域における相補的な配列とハイブリダイズする温度である。このようなハイブリダイゼーションは、修飾アンチセンスオリゴマーの、標的領域への「ほぼ（ｎｅａｒ）」または「実質的な」相補性により生じうるほか、正確な相補性によっても生じうる。一部の実施形態では、オリゴマーは、標的領域と、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％でハイブリダイズしうる。
【０１５５】
本明細書で使用される、「サブユニット」という用語は、天然に存在するヌクレオチド、または少なくとも１つの修飾を含む、天然に存在するヌクレオチドを指す。修飾は、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せのうちの少なくとも１つを含みうる。さらなる実施形態では、修飾は、修飾ヌクレオ塩基を含みうる。
【０１５６】
本明細書で使用するとき、「十分な長さ」という用語は、プレｍＲＮＡ内の標的領域内の少なくとも２０〜５０の連続ヌクレオ塩基と相補的である修飾アンチセンスオリゴマーを指し、かかる相補性は、エクソン内の標的領域の完全に内部に存在してもよく、または、イントロン／エクソンもしくはエクソン／イントロン領域を横切るスプライス接合部にわたってもよい。複数の実施形態では、十分な長さは、プレｍＲＮＡ内の標的領域の少なくとも１２の連続ヌクレオ塩基と相補的である修飾アンチセンスオリゴマーを指す場合があり、かかる相補性は、エクソン内の標的領域の完全に内部に存在してもよく、または、イントロン／エクソンもしくはエクソン／イントロン領域を横切るスプライス接合部にわたってもよい。
【０１５７】
例えば、修飾ミオスタチンアンチセンスオリゴマーは、ミオスタチンプレｍＲＮＡのイントロン１／エクソン２、エクソン２、またはエクソン２／イントロン２と相補的であってもよい。多様な実施形態では、修飾ミオスタチンアンチセンスオリゴマーは、ミオスタチンプレｍＲＮＡ配列の標的領域と特異的にハイブリダイズすることが可能な少なくともいくつかのヌクレオチドを含む。好ましくは、十分な長さのオリゴマーは、これらの範囲の間の全ての整数を含めて、１２〜４０ヌクレオチド、１２〜３０ヌクレオチド、１２〜１５ヌクレオチド、１２〜２０ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、１５〜２２ヌクレオチド、１２〜２２ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、ミオスタチンアンチセンスオリゴマーは、約１２〜約４０または約１２〜約３０塩基の長さである。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、約１２〜約２５、約１５〜約２５または約１５〜約２０塩基の長さである。一部の実施形態では、ミオスタチンアンチセンスオリゴマー配列は、少なくとも約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０の連続塩基または非連続塩基であって、表１の標的配列（例えば、配列番号１、配列番号２または配列番号３、または配列番号Ｘ、配列番号Ｙまたは配列番号Ｚの少なくとも一部にわたる配列）と相補的な連続塩基または非連続塩基を含む。
【０１５８】
修飾ジストロフィンアンチセンスオリゴマーは、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１９、エクソン２３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３またはエクソン５５内に完全にある標的領域と相補的であってもよい。多様な実施形態では、修飾ジストロフィンアンチセンスオリゴマーは、ジストロフィンプレｍＲＮＡ配列の標的領域と特異的にハイブリダイズすることが可能な少なくともいくつかのヌクレオチドを含む。十分な長さのオリゴマーは、１７〜５０ヌクレオチド、１７〜４０ヌクレオチド、１４〜２５ヌクレオチド、１５〜３０ヌクレオチド、１７〜３０ヌクレオチド、１７〜２７ヌクレオチド、１０〜２７ヌクレオチド、１０〜２５ヌクレオチドまたは１０〜２０ヌクレオチドの長さであることが、これらの間の全ての整数を含めて、好ましい。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、約１７〜約４０または約１０〜約３０塩基の長さである。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、約１４〜約２５または約１７〜約２７塩基の長さである。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマー配列は、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０の連続塩基または非連続塩基であって、表２の標的配列（例えば配列番号４〜１５）と相補的な連続塩基または非連続塩基を含む。
【０１５９】
本明細書で使用するとき、「被験体」または「それを必要とする被験体」という用語は、ヒト被験体などの哺乳動物被験体を含む。例示的な哺乳動物被験体は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害を有するか、またはこれを有する危険性がある。本明細書で使用するとき、「筋ジストロフィー」、「デュシェンヌ型筋ジストロフィー」および「関連障害」という用語は、ミオスタチンタンパク質の過剰発現、または罹患個体におけるジストロフィン遺伝子の遺伝子変異を多くの場合特徴とするヒト常染色体劣性疾患を指す。一部の実施形態では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害は、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー、筋緊張性筋ジストロフィー、眼球咽頭筋ジストロフィー、末梢型筋ジストロフィー、エメリー・ドライフス筋ジストロフィー、筋肉消耗状態または障害、例えばＡＩＤＳ、がんまたは化学療法関連の筋肉消耗、および線維症または線維症関連障害（例えば骨格筋線維症）を含むが、これらに限定されない。
【０１６０】
本明細書で使用される「患者」は、本明細書で記載される通りに処置され得る症状を呈示するかまたは症状を呈示する危険性がある任意の個人、例えば、ＤＭＤもしくはＢＭＤ、またはこれらの状態に関連する症状のいずれか（例えば筋線維損失）を有するか、またはそれを有する危険性がある被験体などを含む。
【０１６１】
本明細書で使用される「小児患者」は、１〜２１歳（上下限値を含む）の患者である。一部の実施形態では、小児患者は７〜２１歳（例えば７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１歳）の患者である。一部の実施形態では、小児患者は７歳未満の患者である。一部の実施形態では、小児患者は７歳またはこれを超える患者である。
【０１６２】
本明細書で使用するとき、「標的」または「標的領域」という用語は、ミオスタチンまたはジストロフィンプレｍＲＮＡなどのプレｍＲＮＡ転写物内の領域を指す。多様な実施形態では、ミオスタチン標的領域は、ミオスタチンプレｍＲＮＡのイントロン１／エクソン２、エクソン２、またはエクソン２／イントロン２を含む領域である。多様な実施形態では、ジストロフィン標的領域は、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１９、エクソン２３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３またはエクソン５５のうちの１または複数を含む領域である。
【０１６３】
多様な実施形態では、「ターゲティング配列」という用語は、修飾アンチセンスオリゴマー内または修飾アンチセンスオリゴマー類似体内の配列であって、プレｍＲＮＡ転写物内の標的配列と相補的な配列を指す。修飾アンチセンスオリゴマーの全配列が、標的配列と相補的な場合もあり、修飾アンチセンスオリゴマーの一部分だけが、標的配列と相補的な場合もある。例えば、１２〜５０塩基を有するオリゴマー内の、約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個は、プレｍＲＮＡ転写物内の標的領域と相補的な配列（例えば、「ターゲティング配列」）を含有しうる。ターゲティング配列は、オリゴマー内の連続塩基から形成されることが典型的であるが、代替的に、例えば、オリゴマーの反対側の末端から一体とされると、標的配列にわたる配列を構成する非連続配列から形成される場合もある。
【０１６４】
「ターゲティング配列」は、標的配列に対して「ほぼ」または「実質的な」相補性を有し得、それでもなお、その意図した目的のため、例えば、遺伝子変異を有する１または複数のエクソンを排除したジストロフィンｍＲＮＡ発現のレベルを上昇させる、または機能的もしくは半機能的なジストロフィンタンパク質の発現を増加させるために機能し得る。ミオスタチンの場合、ターゲティング配列は、エクソン２を含むミオスタチンｍＲＮＡの発現レベルを低下させるか、または機能的なミオスタチンタンパク質の発現を減少させるように機能し得る。本開示における修飾アンチセンスオリゴマー化合物は、標的配列に対して、多くても１０ヌクレオチドに１つのミスマッチ、または２０ヌクレオチドに１つのミスマッチを有することが好ましい。あるいは、本明細書の修飾アンチセンスオリゴマーは、本明細書で示す例示的な標的配列に対する、少なくとも９０％の配列相同性、少なくとも９５％の配列相同性、少なくとも９９％の配列相同性または１００％の配列相同性を有する。
【０１６５】
ジストロフィンの場合、ターゲティング配列は、配列番号７６〜３４８５から選択される配列を含み得るか、配列番号７６〜３４８５から選択されるか、配列番号７６〜３４８５から選択される配列の少なくとも１０の連続ヌクレオチドの断片であるか、または配列番号７６〜３４８５から選択される配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体であり、各Ｘはウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号７６〜３４８５の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号７６〜３４８５の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。一部の実施形態では、ターゲティング配列は、配列番号７６を含み得る。
【０１６６】
ミオスタチンの場合、ターゲティング配列は、配列番号１６〜７５から選択される配列を含み得るか、配列番号１６〜７５から選択されるか、配列番号１６〜７５から選択される配列の少なくとも１０の連続ヌクレオチドの断片であるか、または配列番号１６〜７５から選択される配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体であり、各Ｘはウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号１６〜７５の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号１６〜７５の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。
【０１６７】
一部の実施形態では、ミオスタチンターゲティング配列は、
ａ）配列番号７１（ＹＹＡＧＹＹＹＡＸＹＸＸＹＸＹＹＸＧＧＸＹＹＸＧＧ）［Ｚは２５である］；
ｂ）配列番号７２（ＹＡＹＸＸＡＹＹＡＧＹＹＹＡＸＹＸＸＹＸＹＹＸＧＧ）［Ｚは２５である］；
ｃ）配列番号７３（ＹＹＡＹＸＸＧＹＡＸＸＡＧＡＡＡＡＸＹＡＧＹ）［Ｚは２２である］；
ｄ）配列番号７４（ＧＹＡＴＴＡＧＡＡＡＡＴＹＡＧＹＴＡＴＡＡＡＴＧ）［Ｚは２４である］；および
ｅ）配列番号７５（ＹＹＡＴＹＹＧＹＴＴＧＹＡＴＴＡＧＡＡＡＧＴＹＡＧＹ）［Ｚは２６である］
から選択され、各Ｘはウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号７１〜７５の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号７１〜７５の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。
【０１６８】
多様な実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＸはＴである。多様な実施形態では、ターゲティング配列の各ＸはＴである。
【０１６９】
多様な実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＸはＵである。多様な実施形態では、ターゲティング配列の各ＸはＵである。
【０１７０】
多様な実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＹは５ｍＣである。多様な実施形態では、ターゲティング配列の各Ｙは５ｍＣである。
【０１７１】
多様な実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＹはＣである。多様な実施形態では、ターゲティング配列の各ＹはＣである。
【０１７２】
多様な実施形態では、配列番号１６〜７５および配列番号７６〜３４８５の少なくとも１つのＸはＴである。多様な実施形態では、配列番号１６〜７５および配列番号７６〜３４８５の各ＸはＴである。
【０１７３】
多様な実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＸはＵである。多様な実施形態では、配列番号１６〜７５および配列番号７６〜３４８５の各ＸはＵである。
【０１７４】
多様な実施形態では、配列番号１６〜７５および配列番号７６〜３４８５の少なくとも１つのＹは５ｍＣである。多様な実施形態では、配列番号１６〜７５および配列番号７６〜３４８５の各Ｙは５ｍＣである。
【０１７５】
多様な実施形態では、配列番号１６〜７５および配列番号７６〜３４８５の少なくとも１つのＹはＣである。多様な実施形態では、配列番号１６〜７５および配列番号７６〜３４８５の各ＹはＣである。
【０１７６】
本明細書で使用される「ＴＥＧ」、「トリエチレングリコールテール」または「ＥＧ３」という用語は、例えば、その３’末端または５’末端でオリゴマーにコンジュゲートしたトリエチレングリコール部分を指す。例えば、一部の実施形態では、「ＴＥＧ」は、例えば、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）および（ＶＩＩＩ）の化合物のＴが、式：
【化３３】
2018530560.tif 000034
のものであるものを含む。
【０１７７】
本明細書で使用される、治療剤または組成物の「治療有効量」または「有効量」という用語は、組成物が有効な処置のために、障害の防止または処置において有効な量を指す。「障害」とは、ＢＭＤ、肢帯筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー、筋緊張性筋ジストロフィー、眼球咽頭筋ジストロフィー、末梢型筋ジストロフィー、エメリー・ドライフス筋ジストロフィー、筋肉消耗状態または障害、例えばＡＩＤＳ、がんまたは化学療法関連の筋肉消耗、および線維症または線維化関連障害（例えば骨格筋線維症）などのあらゆるデュシェンヌ型筋ジストロフィーまたは関連障害を指す。
【０１７８】
本明細書で使用される「〜を定量化すること」、「定量化」という用語、または他の類縁の語は、核酸、オリゴヌクレオチド、オリゴマー、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の、数量、質量、または単位容量中の濃度を決定することを指す。
【０１７９】
多様な実施形態では、本明細書で使用される「処置」という用語は、被験体（例えば、ヒトなどの哺乳動物）または細胞の処置（処理）であって、被験体または細胞の現在の経過を変更する処置を含む。処置は、医薬組成物の投与を含むがこれに限定されず、予防的に実施することもでき、病理学的事象の開始または病因作用物質との接触に後続して実施することもできる。また、処置される疾患もしくは状態の進行速度の低減、この疾患もしくは状態の発症の遅延、またはその発症の重症度の軽減を指向しうる「予防的」処置も含まれる。「処置」または「予防」とは、必ずしも、疾患もしくは状態、またはこれらの関連する症状の、完全な根絶、治癒、または防止を指し示すものではない。
【０１８０】
ＩＩ．プレｍＲＮＡ転写物のスプライシングのモジュレーション
例示を目的とし、理論に束縛されずに述べると、治療剤が修飾アンチセンスオリゴマーである場合、これらは、スプライソソームの作用および成熟ｍＲＮＡ転写物の産生を阻害するなどにより、プレｍＲＮＡのプロセシングの遮断、阻害、またはモジュレーションを促進すると考えられ、また、標的としたｍＲＮＡの分解も誘導しうる。一部の例では、スプライソソーム（spliceosome）がエクソン／イントロンスプライス接合部に結合するのを阻害して、エクソン／イントロンスプライス接合部がスキップされ、ｍＲＮＡ転写物から１つまたは複数のエクソンが除去されるようにすることができる。野生型ｍＲＮＡ転写物より１つまたは複数少ないエクソンを有する成熟ｍＲＮＡ転写物は、オープンリーディングフレームを保持するｍＲＮＡ転写物をもたらし得、それにより、ｍＲＮＡ転写物は、分解されるのでなく、機能的なタンパク質へと翻訳されうる。野生型ｍＲＮＡより少ないエクソンを有するｍＲＮＡ転写物から翻訳されたタンパク質は、結果として、野生型ｍＲＮＡ転写物から転写されたタンパク質より少ないアミノ酸残基を含む転写タンパク質となり得る。野生型タンパク質より少ないアミノ酸残基で構成された機能的なタンパク質は、野生型タンパク質と同じまたは同様の活性／機能性を有し得る。修飾アンチセンスオリゴマーは、それがハイブリダイズする標的配列または標的領域「を指向する」またはこれら「に対してターゲティングされた」ということができる。ある特定の実施形態では、標的配列はプレｍＲＮＡの３’スプライス接合部位もしくは５’スプライス接合部位を含む領域、分岐点、エクソンのスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）もしくはイントロンのスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）、またはスプライシングの調節に関与する他の配列を含む。イントロン内では、ドナー部位（イントロンの５’末端）およびアクセプター部位（イントロンの３’末端）が、スプライシングに必要である。スプライスドナー部位は、イントロンの５’末端にあるほとんど不変の配列ＧＵを、より大きい、それほど高度に保存されていない領域内に含む。イントロンの３’末端にあるスプライスアクセプター部位は、ほとんど不変のＡＧ配列によってイントロンを終結させる。標的配列は、エクソン内に完全にあり標的配列のいかなる部分もプライス接合部にわたらないか、エクソン／イントロンスプライス接合部内にあるか、またはエクソン／イントロンスプライス接合部にわたる、配列を含み得る。標的配列は、エクソン／イントロンドナースプライス部位を含み得る。
【０１８１】
標的プレｍＲＮＡ配列に対する配列相補性であって、標的ＲＮＡのスプライシングをモジュレートするのに十分な配列相補性を有する修飾アンチセンスオリゴマーは、スプライソソーム複合体に対する結合部位の遮蔽または妨害を誘発するのに十分な配列であって、他の点で、このようなスプライシングに影響を及ぼし、かつ／または、他の点で、ターゲティングされたプレｍＲＮＡの三次元構造の変更を含む配列を有する修飾アンチセンスオリゴマーを含む。
【０１８２】
Ａ．ミオスタチンプレｍＲＮＡのスプライシングのモジュレーション
多様な態様は、ミオスタチンプレｍＲＮＡのイントロンおよびエクソンのスプライシングをモジュレートするための方法に関する。さらなる態様は、ミオスタチンプレｍＲＮＡのイントロン１／エクソン２とエクソン２／イントロン２のスプライス接合部位でのスプライシングを阻害することに関する。さらなる態様では、所与の試料（例えば、血清試料、血漿試料、組織試料、細胞試料など）において、ミオスタチンエクソン２をコードするｍＲＮＡの発現は、例えばエクソン２野生型ｍＲＮＡと比較して、阻害される。多様な方法は、ミオスタチンプレｍＲＮＡ内の標的領域と相補的なターゲティング配列を含む本明細書で記載されるアンチセンスオリゴマーを投与するステップを含み、ミオスタチンエクソン２のｍＲＮＡの発現が、エクソン２野生型（すなわち対照）ｍＲＮＡの発現と比較して阻害される。
【０１８３】
多様な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーのターゲティング配列は、十分な長さおよびミオスタチンプレｍＲＮＡの標的領域内の配列に対して十分な相補性を有する。多様な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマー内のターゲティング配列は、エクソン２内に完全にありターゲティング配列のいかなる部分もスプライス接合部にわたらない標的配列の領域、あるいはミオスタチンプレｍＲＮＡのイントロン／エクソンまたはエクソン／イントロンスプライス接合部にわたる領域、例えばミオスタチンプレｍＲＮＡのイントロン２／エクソン２の＋２４／−０１もしくは＋１８／−０７領域、またはエクソン２／イントロン２の−０１／＋２１、−０１／＋２５もしくは−０９／＋１５の領域とハイブリダイズする。一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、約１２塩基〜約４０塩基の場合もあり、ターゲティング配列が、標的配列へのハイブリダイゼーション時に、スプライスモジュレーションを行うのに十分に相補的であり、任意選択で、プレｍＲＮＡと共に、Ｔｍが４５℃またはこれを超える、ヘテロ二重鎖を形成する限り、少数のミスマッチを含む。
【０１８４】
多様な実施形態では、アンチセンスターゲティング配列と標的配列との相補性の程度は、安定的な二重鎖を形成するのに十分である。修飾アンチセンスオリゴマーの、標的配列との相補性の領域は、１２〜１５塩基という短い領域であり得るが、１２〜２０塩基またはこれを超える領域であることが可能であり、例えば、これらの範囲の間の全ての整数を含む、１２〜４０塩基、１２〜３０塩基、１２〜２５塩基、１２〜２２塩基、１５〜２５塩基、１５〜２２塩基または１５〜２０塩基であり得る。ある特定の実施形態では、本明細書で論じられる、必須の結合Ｔｍを達成するのに、最小の長さの相補塩基が要請され得る。
【０１８５】
Ｂ．ジストロフィンプレｍＲＮＡのスプライシングのモジュレーション
多様な態様は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのイントロンおよびエクソンのスプライシングをモジュレートするための方法に関する。さらなる態様は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのイントロン／エクソンのスプライス接合部位およびエクソン／イントロンスプライス接合部におけるスプライシングを阻害することに関する。さらなる態様では、所与の試料（例えば血清試料、血漿試料、組織試料、細胞試料など）において切断型のジストロフィンコードｍＲＮＡの発現は、例えば、全長野生型ジストロフィンｍＲＮＡと比較して強化される。多様な方法は、ジストロフィンプレｍＲＮＡ内の標的領域と相補的なターゲティング配列を含む、本明細書で記載されるアンチセンスオリゴマーを投与するステップを含み、切断型ジストロフィンｍＲＮＡの発現が、全長野生型（すなわち対照）ｍＲＮＡの発現と比較して強化される。
【０１８６】
多様な実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン内部の標的領域と結合する。複数の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１９、エクソン２３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３またはエクソン５５から選択されるエクソンと結合する。複数の実施形態では、標的領域は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン内に完全にあり、ターゲティング配列のいかなる部分もスプライス接合部にわたらない、またはイントロン／エクソンもしくはエクソン／イントロンスプライス接合部にわたる領域である。複数の実施形態では、ジストロフィンプレｍＲＮＡの１または複数のエクソンは、１または複数の遺伝子変異を有する。複数の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、１または複数の遺伝子変異を有するエクソンを標的とし、それにより、エクソンが、プロセシングの間、プレｍＲＮＡ転写物から成熟ｍＲＮＡにスプライシングされ、短縮または切断型のジストロフィンｍＲＮＡとなる。
【０１８７】
多様な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーのターゲティング配列は、十分な長さおよびジストロフィンプレｍＲＮＡの標的領域内の配列への十分な相補性を有する。多様な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマー内のターゲティング配列は、１または複数のエクソン内に完全にありターゲティング配列のいかなる部分もスプライス接合部にわたらない標的配列の領域、または、ジストロフィンプレｍＲＮＡのイントロン／エクソンもしくはエクソン／イントロンのスプライス接合部にわたる領域とハイブリダイズする。一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、約８塩基〜約５０塩基の場合もあり、ターゲティング配列が、標的配列へのハイブリダイゼーション時にスプライスモジュレーションを行うのに十分に相補的であり、任意選択で、ＲＮＡと共に、Ｔｍが４５℃またはこれを超えるヘテロ二重鎖を形成する限り、少数のミスマッチを含む。
【０１８８】
多様な実施形態では、アンチセンスターゲティング配列と標的配列との相補性の程度は、安定的な二重鎖を形成するのに十分である。修飾アンチセンスオリゴマーの、標的配列との相補性の領域は、８〜１５塩基という短い領域であり得るが、８〜２０塩基またはこれを超える領域であることが可能であり、例えば、これらの範囲の間の全ての整数を含む、８〜４０塩基、８〜３０塩基、８〜２５塩基、８〜２２塩基、８〜２５塩基、８〜２２塩基、８〜２０塩基、１７〜２０塩基、１７〜２２塩基、１７塩基〜２５塩基、１７〜３０塩基、１７〜４０塩基または２０〜３０塩基であり得る。ある特定の実施形態では、本明細書で論じられる、必須の結合Ｔｍを達成するのに、最小の長さの相補塩基が要請され得る。
【０１８９】
多様な態様では、オリゴマーを、バイオアベイラビリティー、安定性、細胞更新（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｄａｔｅ）、およびヌクレアーゼ分解に対する耐性を含むがこれらに限定されない、さらなる機能性のために構成する。一般に、５０塩基を含むオリゴマーは、適切である可能性があり、ここで、少なくとも最小数の塩基、例えば、８または１２塩基は、標的配列と相補的である。多様な態様では、オリゴマーを、促進された細胞取込みまたは能動的な細胞取込みを増強するように構成する。多様な態様では、改変アンチセンスオリゴマーは、１または複数のホスホルアミデートモルホリノ単量体サブユニットまたはホスホロジアミデートモルホリノ単量体サブユニットを含む。多様な実施形態では、改変アンチセンスオリゴマーは、約８〜５０ホスホルアミデートモルホリノ単量体サブユニットまたはホスホロジアミデートモルホリノ単量体サブユニットを含む。多様な実施形態では、改変アンチセンスオリゴマーは、約８〜３０ホスホルアミデートモルホリノ単量体サブユニットまたはホスホロジアミデートモルホリノ単量体サブユニットを含む。多様な実施形態では、改変アンチセンスオリゴマーは、約１７〜４０ホスホルアミデートモルホリノ単量体サブユニットまたはホスホロジアミデートモルホリノ単量体サブユニットを含む。多様な実施形態では、改変アンチセンスオリゴマーは、約１２〜２５ホスホルアミデートモルホリノ単量体サブユニットまたはホスホロジアミデートモルホリノ単量体サブユニットを含む。多様な実施形態では、改変アンチセンスオリゴマーは、約１５〜２５ホスホルアミデートモルホリノ単量体サブユニットまたはホスホロジアミデートモルホリノ単量体サブユニットを含む。多様な実施形態では、改変アンチセンスオリゴマーは、約１５〜２２ホスホルアミデートモルホリノ単量体サブユニットまたはホスホロジアミデートモルホリノ単量体サブユニットを含む。
【０１９０】
多様な態様では、修飾アンチセンスオリゴマーは、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットと、プレｍＲＮＡ内の１０またはこれを超える連続ヌクレオチドの標的領域と相補的なターゲティング配列とを任意選択で含む、８〜５０サブユニットを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。多様な実施形態では、標的領域は、１または複数のエクソン内に完全にありターゲティング配列のいかなる部分もスプライス接合部にわたらないか、またはミオスタチンもしくはジストロフィン遺伝子のイントロン／エクソンもしくはエクソン／イントロンのスプライス接合部にわたる領域内の、１０、１２またはこれを超える連続ヌクレオチドを含む。
【０１９１】
多様な実施形態では、ミオスタチンプレｍＲＮＡの標的領域は、ミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソン２、イントロン１／エクソン２、または、エクソン２／イントロン２内の領域を含む。さらなる実施形態では、標的領域は、ミオスタチンプレｍＲＮＡのイントロン２／エクソン２の＋２４／−０１もしくは＋１８／−０７領域、または、エクソン２／イントロン２の−０１／＋２１、−０１／＋２５もしくは−０９／＋１５領域を含む。
【０１９２】
多様な実施形態では、ジストロフィンプレｍＲＮＡの標的領域は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１９、エクソン２３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３またはエクソン５５から選択されるエクソンのうちの１または複数内の領域を含む。
【０１９３】
多様な態様では、修飾アンチセンスオリゴマーは、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットと、配列番号１６〜７５および配列番号７６〜３４８５から選択される配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるターゲティング配列とを任意選択で含む、１０〜５０サブユニットを含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。一部の態様では、修飾アンチセンスオリゴマーは、配列番号７１〜７５および配列番号７６から選択される配列を含むことが好ましい。
【０１９４】
さらなる態様は、ミオスタチンまたはジストロフィンプレｍＲＮＡ内の標的領域と特異的にハイブリダイズする、８〜５０サブユニットの修飾アンチセンスオリゴマーを含む。
【０１９５】
多様な実施形態では、ミオスタチンプレｍＲＮＡ内の標的領域は、ミオスタチン遺伝子のエクソン２、イントロン１／エクソン２、または、エクソン２／イントロン２（またはスプライス接合部にわたる領域）内の領域を含む。多様な実施形態では、標的領域は、ミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソン２内に完全にある領域を含む。多様な実施形態では、標的領域は、イントロン１／エクソン２またはエクソン２／イントロン２内の領域を含む。多様な実施形態では、標的領域は、イントロン１／エクソン２またはエクソン２／イントロン２のスプライス接合部にわたる領域を含む。さらなる実施形態では、標的領域は、ミオスタチンプレｍＲＮＡのイントロン２／エクソン２の＋２４／−０１もしくは＋１８／−０７領域、または、エクソン２／イントロン２の−０１／＋２１、−０１／＋２５もしくは−０９／＋１５領域を含む。
【０１９６】
さらなる態様は、修飾糖部分を含む、ヌクレオチド類似体サブユニットを有する、修飾アンチセンスオリゴマーを含む。多様な実施形態では、修飾糖部分は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）サブユニット、ロックト核酸（ＬＮＡ）サブユニット、２’Ｏ，４’Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）サブユニット、トリシクロＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）サブユニット、２’Ｏ−メチルサブユニット、２’Ｏ−メトキシエチルサブユニット、２’−フルオロサブユニット、２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］サブユニット、およびモルホリノサブユニットから選択される。
【０１９７】
さらなる態様は、修飾ヌクレオシド間連結を含む、ヌクレオチド類似体サブユニットを有する、修飾アンチセンスオリゴマーを含む。多様な実施形態では、修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結およびホスホロトリアミデートヌクレオシド間連結から選択される。さらなる実施形態では、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結は、（１，４−ピペラジン）−１−イル部分、置換（１，４−ピペラジン）−１−イル部分、４−アミノピペリジン−１−イル部分、または置換４−アミノピペリジン−１−イル部分に共有結合したリン原子を含む。
【０１９８】
さらなる態様は、修飾糖部分と修飾ヌクレオシド間連結の少なくとも１つの組合せを含むヌクレオチド類似体サブユニットを有する修飾アンチセンスオリゴマーを含み、多様な実施形態では、１または複数のサブユニットは、
任意選択でホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロトリアミデートヌクレオシド間連結またはホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換されたモルホリノサブユニット、
任意選択でホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結またはホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換された２’Ｏ−メチルサブユニット、
任意選択でホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結またはホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換される２’Ｏ−メトキシエチルサブユニット、
任意選択でホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結またはホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換された２’−フルオロサブユニット、
任意選択でホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結またはホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換された２’Ｏ，４’Ｃ−エチレン架橋核酸サブユニット、
任意選択でホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結またはホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換された２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］サブユニット、
任意選択でホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結またはホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換されたトリシクロＤＮＡサブユニット、
任意選択でホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結またはホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換されたロックト核酸サブユニット、
ホスホロジアミデートのリン原子がモルホリノ環の窒素原子に共有結合し、（１，４−ピペラジン）−１−イル部分または置換（１，４−ピペラジン）−１−イル部分に共有結合する、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結をさらに含むモルホリノサブユニット、
ホスホロジアミデートのリン原子が４−アミノピペリジン−１−イル部分または置換４−アミノピペリジン−１−イル部分に共有結合する、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結をさらに含むモルホリノサブユニット、
ホスホロジアミデートのリン原子がモルホリノ環の窒素原子に共有結合し、ジメチルアミノ部分に共有結合する、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結をさらに含むモルホリノサブユニット、
ホスホロチオエートヌクレオシド間またはホスホルアミデートヌクレオシド間連結で置換されたリボース糖サブユニット、
ホスホロチオエートヌクレオシド間連結またはホスホルアミデートヌクレオシド間連結で置換されたデオキシリボース糖サブユニット、
任意選択で置換されたペプチド核酸サブユニット、
または前出の任意の組合せから選択される。
【０１９９】
多様な態様および実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、修飾アンチセンスオリゴマーに共有結合したペプチドをさらに含む。多様な実施形態では、アルギニンに富む細胞透過性ペプチドを、修飾アンチセンスオリゴマーの３’末端または５’末端にコンジュゲートさせる。
【０２００】
多様な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、これらの範囲の間の全ての整数を含む、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０塩基、または８〜５０、８〜４０、８〜３０、８〜２５、８〜２０、８〜１８、１２〜３０、１２〜２５、１０〜２０、１０〜１８、１５〜３０、１５〜２５、１５〜２０、１５〜１８、１７〜２０、１７〜３０、１７〜４０、１８〜３０、１８〜２５または１８〜２０の範囲の塩基からなる場合がある。一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、約８〜約５０、約８〜約４０または約８〜約３０塩基の長さである。一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、約１２〜約２５塩基の長さである。一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマー配列は、例えばミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソン２、イントロン１／エクソン２もしくはエクソン２／イントロン２、またはジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１９、エクソン２３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３もしくはエクソン５５のうちの１もしくは複数、またはミオスタチンもしくはジストロフィンプレｍＲＮＡの少なくとも一部にわたる配列などの、ミオスタチンまたはジストロフィンプレｍＲＮＡ内の標的配列と相補的である、少なくとも約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０の連続または非連続塩基を含む。
【０２０１】
修飾アンチセンスオリゴマーは、典型的には、ミオスタチンタンパク質のミオスタチンプレｍＲＮＡ配列のエクソン２、イントロン１／エクソン２、または、エクソン２／イントロン２内の配列または領域と十分に相補的である塩基配列を含み得る。下記の表１は、エクソン２、イントロン１／エクソン２およびエクソン２／イントロン２中の配列または領域を示す。
【０２０２】
【表１】
2018530560.tif 000035
【０２０３】
修飾アンチセンスオリゴマーは、典型的には、ジストロフィンタンパク質のジストロフィンプレｍＲＮＡ配列のエクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１９、エクソン２３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３またはエクソン５５のうちの１または複数のエクソン内の配列または領域と十分に相補的な塩基配列を含み得る。下記の表２は、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１９、エクソン２３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３およびエクソン５５のエクソン内の配列または領域を示す。
【０２０４】
【表２−１】
2018530560.tif 000036
【表２−２】
2018530560.tif 000037
【０２０５】
修飾アンチセンスオリゴマーは、エクソン、例えばエクソン２の発現を効果的に減少させ、それにより機能的なミオスタチンタンパク質の発現を減少させることが好ましい。修飾ジストロフィンアンチセンスオリゴマーは、ジストロフィンプレｍＲＮＡの異常なスプライシングを効果的にモジュレートし、それにより機能的または半機能的なジストロフィンタンパク質の発現を増加させることが好ましい。この要件は、任意選択で、オリゴマー化合物が、哺乳動物細胞により能動的に取り込まれ、取り込まれると、標的ｍＲＮＡと共に、任意選択で、Ｔｍが、約４０℃または４５℃を超える、安定的な二重鎖（またはヘテロ二重鎖）を形成する能力を有する場合に満たされる。
【０２０６】
本明細書で使用される「相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」または「相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」とは、標的配列と相補的なヌクレオチドターゲティング配列のうちの、約９０％〜約１００％を有する修飾アンチセンスオリゴマーのターゲティング配列を指す。複数の実施形態では、相補的なヌクレオチドターゲティング配列は、標的配列と特異的にハイブリダイズして、所望の効果、例えば、本明細書で記載される治療効果を誘導する。ある特定の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーのターゲティング配列は、オリゴマーターゲティング配列と標的配列との間に形成されるヘテロ二重鎖が、細胞ヌクレアーゼの作用、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生じうる、他の様態の分解に抗するのに十分に安定である限りにおいて、標的配列と１００％相補的な場合もあり、例えば、改変体を擁するように、ミスマッチを含む場合もある。よって、ある特定のオリゴマーターゲティング配列は、オリゴマーターゲティング配列と、標的配列との間の、約９０％または少なくとも約９０％の配列相補性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列相補性を意味する、実質的な相補性を有しうる。本明細書では、ヌクレアーゼによる切断を受けにくいオリゴマーのヌクレオシド間連結が提供される。ミスマッチは、存在する場合、ハイブリッド二重鎖の中央部より、末端領域に向かって、より不安定化しにくくなることが典型的である。許容されるミスマッチの数は、よく理解されている、二重鎖安定性の原理に従い、オリゴマーの長さ、二重鎖内のＧ：Ｃ塩基対の百分率、および二重鎖内のミスマッチの位置に依存すると予想される。このような改変アンチセンスオリゴマーは必ずしも、標的配列に対する、１００％の相補性を含むわけではないが、標的プレｍＲＮＡのスプライシングを十分にモジュレートする、例えば、本明細書で記載される治療効果を達成するように、標的配列に、有効に、安定的に、かつ特異的に結合するのに十分な相補性を有するべきである。
【０２０７】
理論に束縛されずに述べると、オリゴマーと、標的配列との間で形成される二重鎖の安定性は、結合Ｔｍと、二重鎖の、細胞酵素による切断の受けやすさとの関数であると考えられる。相補配列であるＲＮＡ二重鎖との関連における、オリゴマーのＴｍは、Ｈａｍｅｓら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８５年、１０７〜１０８頁により記載されている方法、またはＭｉｙａｄａ  Ｃ．  Ｇ．およびＷａｌｌａｃｅ  Ｒ．  Ｂ．、１９８７年、「Ｏｌｉｇｏｍｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５４巻、９４〜１０７頁（この内容は、本明細書中に参考として援用される）において記載されている方法など、従来の方法により測定することができる。多様な実施形態では、改変アンチセンスオリゴマーは、相補配列であるＲＮＡ二重鎖との関連における結合Ｔｍであって、例えば、約４５℃または５０℃を超えるなど、体温を超えるＴｍを有する。６０〜８０℃またはこれを超える範囲のＴｍもまた含まれる。周知の原理に従い、相補性ベースのＲＮＡハイブリッド二重鎖との関連における、オリゴマーのＴｍは、二重鎖内のＣ：Ｇ対合塩基の比を増加させ、かつ／またはヘテロ二重鎖の長さ（塩基対での）を増加させることにより、上昇させることができる。
【０２０８】
下記の表３は、ミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソン２、イントロン１／エクソン２、または、エクソン２／イントロン２内の標的領域と相補的な例示的なターゲティング配列（５’→３’方向）を示す。
【表３−１】
2018530560.tif 000038
【表３−２】
2018530560.tif 000039
【表３−３】
2018530560.tif 000040
【表３−４】
2018530560.tif 000041
【０２０９】
ある特定の修飾アンチセンスオリゴマーは、このように、表３の配列（例えば配列番号１６〜７５）を含むか、これからなるか、もしくはこれから本質的になるか、配列番号１６〜７５から選択されるか、配列番号１６〜７５から選択される配列の少なくとも１２の連続ヌクレオチドの断片であるか、または配列番号１６〜７５から選択される配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体であり、各Ｘはウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。例えば、ある特定の修飾アンチセンスオリゴマーは、配列番号１６〜７５のいずれかの、約または少なくとも約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０の連続または非連続ヌクレオチドを含む。非連続部分においては、介在するヌクレオチドを削除できるか、もしくは異なるヌクレオチドで置換でき、または介在ヌクレオチドを追加できる。変異体のさらなる例は、配列番号１６〜７５のいずれかの全長に対して、約または少なくとも約９０％の配列同一性または相同性、例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性または相同性を有するオリゴマーを含む。ある特定の実施形態では、ターゲティング配列は、配列番号１６〜７５から選択される。
【０２１０】
ジストロフィン遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドは、ＷＯ２００６／００００５７、ＷＯ２０１１／０５７３５０、ＷＯ２０１０／０４８５８６、ＷＯ２０１４／１００７１４、ＷＯ２０１４／１５３２２０、米国出願第ＵＳ２０１４０３１５８６２号、米国出願第ＵＳ２０１４０３２３５４４号、米国出願第ＵＳ２０１２０２０２７５２号、米国出願第ＵＳ２００３０２３５８４５号、米国出願第ＵＳ２０１１０３１２０８６号、米国出願第ＵＳ２００９０３１２５３２号、米国出願第ＵＳ２００９０２６９７５５号、米国出願第ＵＳ２０１３０２１１０６２号、米国出願第ＵＳ２０１４０３４３２６６号、米国出願第ＵＳ２０１２００５９０４２号、米国出願第ＵＳ２０１１０２９４７５３号、米国出願第ＵＳ２０１４０１１３９５５号、米国出願第ＵＳ２０１５０１６６９９６号、米国出願第ＵＳ２０１５０２０３８４９号、米国出願第ＵＳ２０１５００４５４１３号および米国出願第ＵＳ２０１４００５７９６４号に開示されており、これらは参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
【０２１１】
ある特定の修飾アンチセンスオリゴマーは、このように、表４の配列（例えば配列番号７６〜３４８５）を含むか、これからなるか、もしくはこれから本質的になるか、配列番号７６〜３４８５から選択されるか、配列番号７６〜３４８５から選択される配列の少なくとも１０の連続ヌクレオチドの断片であるか、または配列番号７６〜３４８５から選択される配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体であり、各Ｘはウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。例えば、ある特定の修飾アンチセンスオリゴマーは、配列番号７６〜３４８５のいずれかの、約または少なくとも約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０の連続または非連続ヌクレオチドを含む。非連続部分においては、介在するヌクレオチドを削除でき、もしくは異なるヌクレオチドで置換でき、または介在ヌクレオチドを追加できる。改変体のさらなる例は、約９０％または少なくとも約９０％の配列同一性または配列相同性、例えば、配列番号７６〜３４８５のいずれかの全長にわたる、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性または配列相同性を有するオリゴマーを含む。ある特定の実施形態では、ターゲティング配列は、配列番号７６〜３４８５から選択される。一部の実施形態では、ターゲティング配列は配列番号７６を含みうる。
【０２１２】
改変アンチセンスオリゴマーおよびその改変体の活性／機能性は、当技術分野における慣例的な技法に従いアッセイすることができる。例えば、サーベイされるＲＮＡのスプライス形態および発現レベルを、転写される核酸またはタンパク質のスプライス形態および／または発現を検出するための、多種多様な周知の方法のうちのいずれかにより評価することができる。このような方法の非限定的な例は、ＲＮＡのスプライシング形態についてのＲＴ−ＰＣＲに続く、ＰＣＲ産物のサイズによる分離、核酸ハイブリダイゼーション法、例えば、ノーザンブロット、ならびに／または核酸アレイ；核酸増幅法；タンパク質を検出するための免疫学的方法；タンパク質精製法；およびタンパク質機能アッセイまたはタンパク質活性アッセイの使用を含む。
【０２１３】
ＲＮＡ発現レベルは、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ（すなわち、転写されるオリゴヌクレオチド）を、細胞、組織、または生物体から調製し、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを、アッセイされる核酸またはその断片の相補体である基準オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることにより評価することができる。ｃＤＮＡは、任意選択で、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの前に、様々なポリメラーゼ連鎖反応またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける転写法のうちのいずれかを使用して増幅することもできるが；増幅しないことが好ましい。１または複数の転写物の発現はまた、転写物の発現レベルについて評価する、定量的ＰＣＲを使用して検出することもできる。
【０２１４】
ＩＩＩ．改変アンチセンスオリゴマー化学
Ａ．一般的特徴
多様な態様および実施形態では、改変アンチセンスオリゴマーは、ミオスタチンプレｍＲＮＡ内のターゲティング領域と特異的にハイブリダイズする。例示的な改変アンチセンスオリゴマーは、表３に明示されたターゲティング配列、表３のターゲティング配列のうちの、少なくとも１２連続ヌクレオチドの断片、または表３のターゲティング配列に対する、少なくとも９０％の配列同一性を有する改変体を含む。他の例示的な改変アンチセンスオリゴマーは、表３に明示されたターゲティング配列からなるか、またはこれらから本質的になる。
【０２１５】
多様な態様および実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、ジストロフィンプレｍＲＮＡ内の標的領域と特異的にハイブリダイズする。例示的な修飾アンチセンスオリゴマーは、表４に明示されたターゲティング配列、表４のターゲティング配列の少なくとも１０の連続ヌクレオチドの断片、または表４のターゲティング配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含む。他の例示的な修飾アンチセンスのオリゴマーは、表４に明示されたターゲティング配列からなるか、またはこれから本質的になる。
【０２１６】
さらなる態様では、ヌクレアーゼ耐性改変アンチセンスオリゴマーが提供される。多様な実施形態では、１または複数のヌクレオシド間連結の修飾を含む改変アンチセンスオリゴマーが提供される。他の実施形態では、１または複数の修飾糖部分を含む改変アンチセンスオリゴマーが提供される。他の実施形態では、１または複数の修飾ヌクレオシド間連結と、１または複数の修飾糖部分との組合せを含む、改変アンチセンスオリゴマーが提供される。他の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基単独、または修飾ヌクレオシド間連結もしくは修飾糖部分のうちのいずれかと組み合わせた修飾ヌクレオ塩基を含む、改変アンチセンスオリゴマーが提供される。
【０２１７】
多様な実施形態では、改変アンチセンスオリゴマーは、完全に修飾されたヌクレオシド間連結を有するオリゴマーを含むことが可能であり、例えば、ヌクレオシド間連結の１００％が修飾されている（例えば、２５ｍｅｒの改変アンチセンスオリゴマーは、本明細書で記載される修飾のうちの１つまたはこれらの任意の組合せで修飾された、２４のヌクレオシド間連結を含む）。多様な実施形態では、改変アンチセンスオリゴマーは、そのヌクレオシド間連結の約１００％〜２．５％が修飾されたものを含みうる。多様な実施形態では、改変アンチセンスオリゴマーは、そのヌクレオシド間連結のうちの約９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または２．５％、およびその間の整数（ｉｔｅｒａｔｉｏｎ）の％が修飾されたものを含みうる。他の実施形態では、改変アンチセンスオリゴマーは、本明細書で記載される修飾の任意の組合せを含みうる。
【０２１８】
修飾ヌクレオシド間連結のパーセントについての実施形態と組み合わせた実施形態を含む、多様な実施形態では、改変アンチセンスオリゴマーは、完全修飾糖部分を有するオリゴマーを含むことが可能であり、例えば、糖部分の１００％が修飾されている（例えば、２５ｍｅｒの改変アンチセンスオリゴマーは、本明細書で記載される修飾のうちの１つまたはこれらの任意の組合せで修飾された、２５の糖部分を含む）。多様な実施形態では、改変アンチセンスオリゴマーは、その糖部分の約１００％〜２．５％が修飾されたものを含みうる。多様な実施形態では、改変アンチセンスオリゴマーは、その糖部分のうちの約９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または２．５％、およびその間の整数の％が修飾されたものを含みうる。他の実施形態では、改変アンチセンスオリゴマーは、本明細書で記載される修飾の任意の組合せを含みうる。
【０２１９】
多様な実施形態では、改変アンチセンスオリゴマーは、実質的に非荷電であり、任意選択で、細胞膜を横切る、能動的な輸送または促進された輸送のための基質として適する。一部の実施形態では、全てのヌクレオシド間連結は、非荷電である。オリゴマーが、標的プレｍＲＮＡと共に、安定的な二重鎖を形成する能力はまた、標的との関連における、改変アンチセンスオリゴマーの相補性の長さおよび程度、Ｇ：Ｃ塩基マッチの、Ａ：Ｔ塩基マッチに対する比、ならびに任意のミスマッチ塩基の位置を含む、オリゴマーの他の特色にも関しうる。改変アンチセンスオリゴマーが、細胞ヌクレアーゼに抵抗する能力は、薬剤の存続および細胞質への最終的な送達を促進しうる。
【０２２０】
多様な実施形態では、改変アンチセンスオリゴマーは、生理学的ｐＨで正に荷電しているか、またはカチオン性である、少なくとも１つのヌクレオシド間連結を有する。さらなる実施形態では、改変アンチセンスオリゴマーは、約５．５〜約１２の間のｐＫａを呈示する、少なくとも１つのヌクレオシド間連結を有する。さらなる実施形態では、改変アンチセンスオリゴマーは、約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０のヌクレオシド間連結、少なくともほぼこれらの数のヌクレオシド間連結、またはほぼこれらの数を超えないヌクレオシド間連結であって、約４．５〜約１２の間のｐＫａを呈示するヌクレオシド間連結を含有する。一部の実施形態では、改変アンチセンスオリゴマーは、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％のヌクレオシド間連結、または少なくともほぼこれらの比率のヌクレオシド間連結であって、約４．５〜約１２の間のｐＫａを呈示するヌクレオシド間連結を含有する。任意選択で、改変アンチセンスオリゴマーは、塩基性の窒素と、アルキル基、アリール基、またはアラルキル基との両方を伴う、少なくとも１つのヌクレオシド間連結を有する。特定の実施形態では、１または複数のカチオン性ヌクレオシド間連結は、４−アミノピペリジン−１−イル（ＡＰＮ）基またはその誘導体を含む。一部の実施形態では、改変アンチセンスオリゴマーは、モルホリノ環を含む。理論に束縛されるわけではないが、オリゴマー内の、１または複数のカチオン性連結（例えば、ＡＰＮ基またはＡＰＮ誘導体）の存在は、標的ヌクレオチド内の、負に荷電したホスフェートへの結合を促進することが考えられる。こうして、変異体ＲＮＡと、カチオン性連結を含有するオリゴマーとの間のヘテロ二重鎖の形成は、イオン性引力およびワトソン−クリック塩基対合の両方により一体に保持されうる。
【０２２１】
多様な実施形態では、カチオン性連結の数は、少なくとも２つであり、全ヌクレオシド間連結の約半分を超えず、例えば、約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０のカチオン性連結、またはほぼこれらを超えないカチオン性連結である。一部の実施形態では、しかし、ヌクレオシド間連結のうちの、最大で全ては、カチオン性連結であり、例えば、全ヌクレオシド間連結のうちの約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０、または少なくともほぼこれらの数は、カチオン性連結である。さらなる実施形態では、約１９〜２０単量体サブユニットのオリゴマーは、２つ〜１０、例えば、４〜８つのカチオン性連結と、残りの非荷電連結とを有しうる。他の具体的な実施形態では、１４〜１５サブユニットのオリゴマーは、２〜７つ、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つのカチオン性連結と、残りの非荷電連結とを有しうる。こうして、オリゴマー内のカチオン性連結の総数は、約１〜１０〜１８〜２０〜３０またはこれを超えて（間の全ての整数を含む）変動することが可能であり、オリゴマー全体にわたり散在しうる。
【０２２２】
一部の実施形態では、改変アンチセンスオリゴマーは、１０の非荷電連結ごとに約４つ〜５つまたは４つもしくは５つなど、２つ〜５つまたは２つ、３つ、４つ、もしくは５つの非荷電連結ごとに約１つのカチオン性連結または最大で約１つのカチオン性連結を有しうる。
【０２２３】
ある特定の実施形態は、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のカチオン性連結を含有する改変アンチセンスオリゴマーを含む。ある特定の実施形態では、アンチセンス活性の最適な改善は、ヌクレオシド間連結のうちの約２５％がカチオン性である場合に見ることができる。ある特定の実施形態では、増強は、少数（例えば、１０〜２０％）のカチオン性連結に関して見ることもでき、カチオン性連結の数が、約６０％など、５０〜８０％の範囲内にある場合に見ることもできる。
【０２２４】
さらなる実施形態では、カチオン性連結を、ヌクレオシド間連結に沿って散在させる。このようなオリゴマーは任意選択で、少なくとも２つの連続非荷電連結を含有する；すなわち、オリゴマーは任意選択で、その全長に沿って、厳密に交互のパターンを有さない。具体的な場合では、各１つまたは２つのカチオン性連結は、ヌクレオシド間連結に沿って、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つの非荷電連結により隔てられる。
【０２２５】
また、カチオン性連結のブロックと、非荷電連結のブロックとを有するオリゴマーも含まれる。例えば、中央の非荷電連結のブロックが、カチオン性連結のブロックに挟まれる場合もあり、この逆の場合もある。一部の実施形態では、オリゴマーは、ほぼ等長の５’領域、３’領域、および中央領域を有し、中央領域内のカチオン性連結の百分率は、カチオン性連結の総数のうちの、約５０％、６０％、７０％、または８０％を超える。
【０２２６】
ある特定の改変アンチセンスオリゴマーでは、カチオン性連結のバルク（例えば、カチオン性連結のうちの７０、７５％、８０％、９０％）は、ヌクレオシド間連結の「中央領域」、例えば、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の真ん中の連結（ｃｅｎｔｅｒｍｏｓｔ  ｌｉｎｋａｇｅ）に近接して分布する。例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４ｍｅｒのオリゴマーは、全カチオン性連結のうちの、少なくとも５０％、６０％、７０％、または８０％を、８つ、９つ、１０、１１、または１２の真ん中の連結へと局在化させうる。
【０２２７】
Ｂ．化学の特色
改変アンチセンスオリゴマーは、様々なヌクレオチド類似体サブユニットを含有しうる。さ
らなる例は、
ホスホルアミデートを含有するオリゴマー、
ホスホロジアミデートを含有するオリゴマー、
ホスホロトリアミデートを含有するオリゴマー、
ホスホロチオエートを含有するオリゴマー、
モルホリノを含有するオリゴマーであって、任意選択で、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結またはホスホロジアミデートヌクレオシド間連結で置換されたオリゴマー、
２’Ｏ−メチルを含有するオリゴマーであって、任意選択で、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換されたオリゴマー、
ロックト核酸（ＬＮＡ）を含有するオリゴマーであって、任意選択で、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換されたオリゴマー、
２’Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）を含有するオリゴマーであって、任意選択で、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換されたオリゴマー、
２’−フルオロを含有するオリゴマーであって、任意選択で、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換されたオリゴマー、
２’Ｏ，４’Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）を含有するオリゴマーであって、任意選択で、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換されたオリゴマー、
トリシクロＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）を含有するオリゴマーであって、任意選択で、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換されたオリゴマー、
２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］を含有するオリゴマーであって、任意選択で、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換されたオリゴマー、
モルホリノを含有するオリゴマーであって、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結をさらに含み、ホスホロジアミデートのリン原子を、モルホリノ環の窒素原子に共有結合させ、かつ、（１，４−ピペラジン）−１−イル部分、または置換（１，４−ピペラジン）−１−イル（ＰＭＯプラス）部分に共有結合させたオリゴマー、
モルホリノを含有するオリゴマーであって、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結をさらに含み、ホスホロジアミデートのリン原子を、モルホリノ環の窒素原子に共有結合させ、かつ、４−アミノピペリジン−１−イル部分（すなわち、ＡＰＮ）または置換４−アミノピペリジン−１−イル（ＰＭＯ−Ｘ）部分に共有結合させたオリゴマー、
モルホリノサブユニットであって、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結をさらに含み、ホスホロジアミデートのリン原子を、モルホリノ環の窒素原子に共有結合させ、かつ、ジメチルアミノ部分に共有結合させたオリゴマー、
リボース糖を含有するオリゴマーであって、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結またはホスホルアミデートヌクレオシド間連結をさらに含むオリゴマー、
デオキシリボース糖を含有するオリゴマーであってホスホロチオエートヌクレオシド間連結オリゴマーまたはホスホルアミデートヌクレオシド間連結をさらに含むオリゴマー、
任意選択でさらに置換された、ペプチドコンジュゲートホスホロジアミデートモルホリノ含有オリゴマー（ＰＰＭＯ）、
さらなる置換を含む、任意選択でさらに置換された、ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマー、
および前出のうちのいずれかの組合せを含む。
【０２２８】
ある特定の実施形態では、ホスホロジアミデート連結のリン原子を、（１，４−ピペラジン）−１−イル部分、置換（１，４−ピペラジン）−１−イル部分、４−アミノピペリジン−１−イル部分、または置換４−アミノピペリジン−１−イル部分で、さらに置換する。
【０２２９】
一般に、ＰＮＡ化学およびＬＮＡ化学は、ＰＭＯおよび２’Ｏ−Ｍｅオリゴマーと比べた、それらの比較的高度な標的結合強度のために、より短いターゲティング配列を活用しうる。ホスホロチオエート化学と、２’Ｏ−Ｍｅ化学とを組み合わせて、２’Ｏ−Ｍｅ−ホスホロチオエート類似体を作出することができる。例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ／２０１３／１１２０５３号および同第ＷＯ／２００９／００８７２５号を参照されたい。
【０２３０】
場合によって、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）などの改変アンチセンスオリゴマーを、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）にコンジュゲートさせて、細胞内送達を促進することができる。ペプチドコンジュゲートＰＭＯは、ＰＰＭＯと呼ばれ、ある特定の実施形態は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ／２０１２／１５０９６０号において記載されているＰＰＭＯを含む。一部の実施形態では、例えば、本明細書で記載される改変アンチセンスオリゴマーの３’末端にコンジュゲートまたは連結させた、アルギニンに富むペプチド配列を使用することができる。
【０２３１】
１．ペプチド核酸（ＰＮＡ）
ペプチド核酸（ＰＮＡ）とは、骨格が、デオキシリボース骨格と構造的に同形である、ＤＮＡの類似体であって、ピリミジン塩基またはプリン塩基を結合させた、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位からなる類似体である。天然のピリミジン塩基およびプリン塩基を含有するＰＮＡは、ワトソン−クリック塩基対合則に従う相補的オリゴマーとハイブリダイズし、塩基対認識の点で、ＤＮＡを模倣する（Ｅｇｈｏｌｍ、Ｂｕｃｈａｒｄｔら、１９９３年）。ＰＮＡのヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル結合ではなく、ペプチド結合により形成されることから、アンチセンス適用（下記の構造を参照されたい）に良好に適する。骨格が非荷電である結果として、通常を超える熱安定性を呈示する、ＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖またはＰＮＡ／ＲＮＡ二重鎖がもたらされる。ＰＮＡは、ヌクレアーゼによっても、プロテアーゼによっても認識されない。ＰＮＡサブユニットを含むＰＮＡオリゴマーの非限定的な例を、下記：
【化３４】
2018530560.tif 000042
に描示する。
【０２３２】
天然構造に対する大幅な構造変化にもかかわらず、ＰＮＡは、ヘリックス形態による、ＤＮＡまたはＲＮＡへの配列特異的結合が可能である。ＰＮＡの特徴は、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡに対する高結合アフィニティー、単一塩基ミスマッチにより引き起こされる不安定化効果、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼに対する耐性、塩濃度に依存しない、ＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイゼーション、およびホモプリンＤＮＡとの三重鎖形成を含む。ＰＡＮＡＧＥＮＥ（Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ）は、Ｂｔｓ  ＰＮＡ単量体（Ｂｔｓ；ベンゾチアゾール−２−スルホニル基）と、オリゴマー化工程とを開発している。Ｂｔｓ  ＰＮＡ単量体を使用する、ＰＮＡのオリゴマー化は、脱保護、カップリング、およびキャッピングの反復的サイクルから構成される。ＰＮＡは、当技術分野で公知の任意の技法を使用して、合成により作製することができる。例えば、米国特許第６，９６９，７６６号、同第７，２１１，６６８号、同第７，０２２，８５１号、同第７，１２５，９９４号、同第７，１４５，００６号、および同第７，１７９，８９６号を参照されたい。ＰＮＡの調製についてはまた、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号も参照されたい。ＰＮＡ化合物についてのさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４巻：１４９７〜１５００頁、１９９１年においても見出すことができる。前出の各々は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。
【０２３３】
２．ロックト核酸（ＬＮＡ）
改変アンチセンスオリゴマー化合物はまた、「ロックト核酸」サブユニット（ＬＮＡ）も含有しうる。「ＬＮＡ」とは、架橋核酸（ＢＮＡ）と呼ばれる修飾のクラスのメンバーである。ＢＮＡは、リボース環のコンフォメーションを、Ｃ３０−エンド（ノーザン）糖パッカー（ｓｕｇａｒ  ｐｕｃｋｅｒ）にロックする共有結合的連結を特徴とする。ＬＮＡでは、架橋は、２’−Ｏ位と４’−Ｃ位との間のメチレンから構成される。ＬＮＡは、骨格の事前組織化（ｐｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）および塩基スタッキングを増強して、ハイブリダイゼーションおよび熱安定性を増加させる。
【０２３４】
ＬＮＡの構造は、例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Ｗｅｎｇｅｌら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９８年）、４５５巻；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９８年）、５４巻：３６０７頁、およびＡｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９９年）、３２巻：３０１頁）；Ｏｂｉｋａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９７年）、３８巻：８７３５頁；（１９９８年）、３９巻：５４０１頁、ならびにＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００８年）、１６巻：９２３０頁において見出すことができる。ＬＮＡサブユニットと、ホスホジエステルヌクレオシド間連結とを含む、ＬＮＡオリゴマーの非限定的な例を、下記：
【化３５】
2018530560.tif 000043
に描示する。
【０２３５】
本開示の化合物には、１または複数のＬＮＡを組み込むことができ、場合によって、化合物を、ＬＮＡから完全に構成することもできる。個別のＬＮＡヌクレオシドサブユニットの合成およびオリゴマーへのそれらの組込みのための方法については、例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５７２，５８２号、同第７，５６９，５７５号、同第７，０８４，１２５号、同第７，０６０，８０９号、同第７，０５３，２０７号、同第７，０３４，１３３号、同第６，７９４，４９９号、および同第６，６７０，４６１号において記載されている。典型的なヌクレオシド間リンカーは、ホスホジエステル部分およびホスホロチオエート部分を含み、代替的に、リン非含有リンカーを使用することもできる。さらなる実施形態は、ＬＮＡ含有化合物を含み、各ＬＮＡサブユニットは、ＤＮＡサブユニットで隔てられている。ある特定の化合物は、交互のＬＮＡサブユニットおよびＤＮＡサブユニットから構成され、ヌクレオシド間リンカーは、ホスホロチオエートである。
【０２３６】
２’Ｏ，４’Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）は、ＢＮＡのクラスの別のメンバーである。ＥＮＡサブユニットおよびホスホジエステルヌクレオシド間連結の非限定的な例を、下記：
【化３６】
2018530560.tif 000044
に描示する。
【０２３７】
ＥＮＡオリゴマーおよびそれらの調製については、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｏｂｉｋａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｔｔ、３８巻（５０号）：８７３５頁において記載されている。本開示の化合物には、１または複数のＥＮＡサブユニットを組み込むことができる。
【０２３８】
３．ホスホロチオエート
「ホスホロチオエート」（またはＳ−オリゴ）とは、生来ＤＮＡまたは生来ＲＮＡの改変体であって、ホスホジエステルヌクレオシド間連結の非架橋酸素のうちの１つを、硫黄で置きかえた改変体である。デオキシリボースサブユニットと、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結とを含む、ホスホロチオエートＤＮＡ（左）、および、リボースサブユニットと、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｏｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）ヌクレオシド間連結とを含む、ホスホロチオエートＲＮＡ（右）の非限定的な例を、下記：
【化３７】
2018530560.tif 000045
に描示する。
【０２３９】
ヌクレオシド間結合の硫黄化（ｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ）は、５’−３’および３’−５’ＤＮＡ  ＰＯＬ  １エクソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＳ１およびＰ１、ＲＮアーゼ、血清ヌクレアーゼ、ならびにヘビ毒ホスホジエステラーゼを含む、エンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼの作用を低減する。ホスホロチオエートは、２つの主要な経路：ホスホン酸水素上の炭素ジスルフィド内の硫黄元素の溶解作用、または亜リン酸トリエステルを、テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）もしくは３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド（3H-1,2-bensodithiol-3-one  1,1-dioxide；ＢＤＴＤ）で硫黄化する方法（例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Ｉｙｅｒら、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．５５巻、４６９３〜４６９９頁、１９９０年を参照されたい）により作製し得る。後者の方法は、大半の有機溶媒中の硫黄元素の不溶性および炭素ジスルフィドの毒性の問題を回避する。ＴＥＴＤ法およびＢＤＴＤ法はまた、高純度のホスホロチオエートももたらす。
【０２４０】
４．トリシクロＤＮＡおよびトリシクロホスホロチオエートヌクレオチド
トリシクロＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）とは、各ヌクレオチドを、シクロプロパン環の導入により修飾して、骨格のコンフォメーション可撓性を制約し、ねじれ角γの骨格形状を最適化した、拘束ＤＮＡ類似体のクラスである。ホモ塩基性のアデニン含有ｔｃ−ＤＮＡおよびチミン含有ｔｃ−ＤＮＡは、相補的なＲＮＡと共に、極めて安定的なＡ−Ｔ塩基対を形成する。トリシクロＤＮＡおよびそれらの合成については、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／１１５９９３号において記載されている。本開示の化合物には、１または複数のトリシクロＤＮＡサブユニットを組み込むことができ、場合によって、化合物は、トリシクロＤＮＡサブユニットから完全に構成されうる。
【０２４１】
トリシクロホスホロチオエートヌクレオチドとは、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を伴うトリシクロＤＮＡサブユニットである。トリシクロホスホロチオエートヌクレオチドおよびそれらの合成については、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０５３９２８号において記載されている。本開示の化合物には、１または複数のトリシクロＤＮＡサブユニットを組み込むことができ、場合によって、化合物は、トリシクロＤＮＡヌクレオチドから完全に構成されうる。トリシクロＤＮＡ／三環系（ｔｒｉｃｙｃｌｅ）サブユニットおよびホスホジエステルヌクレオシド間連結の非限定的な例を、下記：
【化３８】
2018530560.tif 000046
に描示する。
【０２４２】
５．  ２’Ｏ−メチルオリゴマー、２’Ｏ−ＭＯＥオリゴマー、および２’−Ｆオリゴマー
「２’Ｏ−Ｍｅオリゴマー」分子は、リボース分子の２’−ＯＨ残基において、メチル基を保有するサブユニットを含む。２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡは、ＤＮＡと同じ（または類似の）挙動を示すが、ヌクレアーゼによる分解に対して保護されている。２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡはまた、さらなる安定化のために、ホスホロチオエートオリゴマー（ＰＴＯ）と組み合わせることもできる。２’Ｏ−Ｍｅオリゴマー（２’−ＯＭｅサブユニットが、ホスホジエステルヌクレオシド間連結またはホスホロチオエートヌクレオシド間連結により接続されている）は、当技術分野における慣例的な技法（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｙｏｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３２巻：２００８〜１６頁、２００４年を参照されたい）に従い、合成することができる。２’−ＯＭｅサブユニットおよびホスホジエステルサブユニット間連結を含む２’Ｏ−Ｍｅオリゴマーの非限定的な例を、下記：
【化３９】
2018530560.tif 000047
に描示する。
【０２４３】
２’Ｏ−Ｍｅオリゴマーはまた、ホスホロチオエート連結（２’Ｏ−Ｍｅホスホロチオエートオリゴマー）も含みうる。２’Ｏ−Ｍｅオリゴマーなどの２’Ｏ−メトキシエチルオリゴマー（２’−Ｏ  ＭＯＥ）は、リボース分子の２’−ＯＨ残基において、メトキシエチル基を保有するサブユニットを含み、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ、７８巻、４８６〜５０４頁、１９９５年において論じられている。２’Ｏ−ＭＯＥサブユニットの非限定的な例を、下記：
【化４０】
2018530560.tif 000048
に描示する。
【０２４４】
前出のアルキル化２’ＯＨリボース誘導体と対照的に、２’−フルオロオリゴマーは、２’位において、２’ＯＨの代わりにフルオロラジカルを有するサブユニットを含む。２’−Ｆサブユニットおよびホスホジエステルヌクレオシド間連結を含む２’−Ｆオリゴマーの非限定的な例を、下記：
【化４１】
2018530560.tif 000049
に描示する。
【０２４５】
２’−フルオロオリゴマーについては、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００４／０４３９７７においてさらに記載されている。本開示の化合物には、１または複数の２’Ｏ−メチルサブユニット、２’Ｏ−ＭＯＥサブユニット、および２’−Ｆサブユニットを組み込むことができ、本明細書で記載されるヌクレオシド間連結のうちのいずれかを活用することができる。場合によって、本開示の化合物は、２’Ｏ−メチル、２’Ｏ−ＭＯＥ、または２’Ｆサブユニットから完全に構成しうると予想される。本開示の化合物についての一実施形態は、２’Ｏ−メチルサブユニットから完全に構成される。
【０２４６】
６．  ２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］オリゴマー（ＭＣＥ）
ＭＣＥは、本開示の化合物中で有用な、２’Ｏ修飾リボヌクレオチドの別の例である。この例では、２’ＯＨを、２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル部分へと誘導体化して、ヌクレアーゼ耐性を増加させる。ＭＣＥサブユニットおよびホスホジエステルヌクレオシド間連結を含むＭＣＥオリゴマーの非限定的な例を、下記：
【化４２】
2018530560.tif 000050
に描示する。
【０２４７】
ＭＣＥおよびそれらの合成については、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｙａｍａｄａら、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．、７６巻（９号）：３０４２〜５３頁において記載されている。本開示の化合物には、１または複数のＭＣＥサブユニットを組み込むことができる。
【０２４８】
７．モルホリノベースのオリゴマー
モルホリノベースのオリゴマーとは、ヌクレオ塩基を支持するモルホリノサブユニットを含むオリゴマーを指し、リボースの代わりに、モルホリニル環を含有する。例示的なヌクレオシド間連結は、例えば、１つのモルホリノサブユニットのモルホリニル環窒素を、隣接するモルホリノサブユニットの４’環外炭素に接合する、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結またはホスホロジアミデートヌクレオシド間連結を含む。各モルホリノサブユニットは、塩基特異的水素結合により、オリゴヌクレオチド内の塩基に結合するのに有効な、プリンまたはピリミジンのヌクレオ塩基を含む。
【０２４９】
モルホリノベースのオリゴマー（改変アンチセンスオリゴマーを含む）については、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６９８，６８５号；同第５，２１７，８６６号；同第５，１４２，０４７号；同第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，５２１，０６３号；同第５，５０６，３３７号；ならびに係属中の米国特許出願第１２／２７１，０３６号；同第１２／２７１，０４０号；およびＰＣＴ公開第ＷＯ／２００９／０６４４７１号および同第ＷＯ／２０１２／０４３７３０号；ならびにＳｕｍｍｅｒｔｏｎら、１９９７年、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、７巻、１８７〜１９５頁において詳述されている。「モルホリノサブユニット」という用語は、Summertonらに記載されている通りに使用される。
【０２５０】
オリゴマー構造内で、リン酸基は一般に、オリゴマーの「ヌクレオシド間連結」を形成する基として言及される。ＲＮＡおよびＤＮＡの天然に存在するヌクレオシド間連結は、３’−５’ホスホジエステル連結である。「ホスホルアミデート」基が、３つの結合酸素原子と、１つの結合窒素原子とを有するリンを含むのに対し、「ホスホロジアミデート」基は、２つの結合酸素原子と、２つの結合窒素原子とを有するリンを含む。「ホスホロトリアミデート」基（またはリン酸トリアミド基）は、１個の結合する酸素原子および３個の結合する窒素原子を有するリンを含む。本明細書で記載されるモルホリノベースのオリゴマーの非荷電ヌクレオシド間連結またはカチオン性ヌクレオシド間連結では、１つの窒素は常に、連結鎖に対してペンダントであるものである。ホスホロジアミデート連結における第２の窒素は、モルホリノ環構造内の環窒素であることが典型的である。
【０２５１】
「ＰＭＯ」とは、（ｉ）モルホリノ環の窒素原子への共有結合、および（ｉｉ）ジメチルアミノの窒素への第２の共有結合を伴うリン原子を有する、ホスホロジアミデートモルホリノベースのオリゴマーを指す。「ＰＭＯ−Ｘ」とは、（ｉ）モルホリノ環の窒素原子への共有結合、および（ｉｉ）例えば、４−アミノピペリジン−１−イル（すなわちＡＰＮ）または４−アミノピペリジン−１−イルの誘導体の環窒素への第２の共有結合を伴うリン原子を有するホスホロジアミデートモルホリノベースのオリゴマーを指す。例示的なＰＭＯ−Ｘオリゴマーについては、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／３８４５９号およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０７４８３４号において開示されている。ＰＭＯ−Ｘは、リン原子を、モルホリノ基、および４−アミノピペリジン−１−イル（すなわち、ＡＰＮ）の環窒素へと連結する、少なくとも１つのヌクレオシド間連結を含む、ＰＭＯ−Ｘオリゴマーを指す、「ＰＭＯ−ａｐｎ」、「ＰＭＯ−ＡＰＮ」または「ＡＰＮ」を含む。具体的な実施形態では、表３および表４に明示されたターゲティング配列を含む修飾アンチセンスオリゴマーは、少なくとも１つのＡＰＮを含有する連結またはＡＰＮ誘導体を含有する連結を含む。多様な実施形態は、モルホリノベースのオリゴマーであって、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の、ＡＰＮ／ＡＰＮ誘導体を含有する連結を有し、残りの連結（１００％未満である場合）が、非荷電連結であり、例えば、全ヌクレオシド間連結のうちの約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０、または少なくともほぼこれらの数が、ＡＰＮ／ＡＰＮ誘導体を含有する連結であるオリゴマーを含む。
【０２５２】
多様な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、式（Ｉ）：
【化４３】
2018530560.tif 000051
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり；
Ｚは、８から４８の整数であり；
各Ｙは、Ｏおよび−ＮＲ４から独立に選択され、式中、各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アラルキル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２およびＧから独立に選択され、式中、Ｒ５は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、ｎは、１から５の整数であり；
Ｔは、ＯＨおよび式：
【化４４】
2018530560.tif 000052
の部分か選択され、式中、
Ａは、−ＯＨ、−Ｎ（Ｒ７）２Ｒ８から選択され、式中、
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ８は、電子対およびＨから選択され、そして
Ｒ６は、ＯＨ、−Ｎ（Ｒ９）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２および式：
【化４５】
2018530560.tif 000053
の部分から選択され、式中、
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ１０は、Ｇ、Ｃ（Ｏ）−Ｒ１１ＯＨ、アシル、トリチル、４メトキシトリチル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２およびＣ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
ｍは、１から５の整数であり、
Ｒ１１は、式−（Ｏ−アルキル）ｙ−を有し、式中、ｙは、３から１０の整数であり、
ｙ個のアルキル基の各々は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｒ１２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ１の各例は、
−Ｎ（Ｒ１３）２Ｒ１４［式中、各Ｒ１３は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、そしてＲ１４は、電子対およびＨから選択される］；
式（ＩＩ）：
【化４６】
2018530560.tif 000054
の部分［式中、
Ｒ１５は、Ｈ、Ｇ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＮＲ１８Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１８Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
Ｒ１８は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｑは、１から５の整数であり、
Ｒ１６は、電子対およびＨから選択され；
各Ｒ１７は、Ｈおよびメチルから独立に選択される］；および
式（ＩＩＩ）：
【化４７】
2018530560.tif 000055
の部分［式中、
Ｒ１９は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｒＮＲ２２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ２２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）４ＮＨ２およびＧから選択され、式中、
Ｒ２２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｒは、１から５の整数であり、
Ｒ２０は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ２１は、電子対およびＨから選択される］
から独立に選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｇ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２３、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｓＮＲ２４Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ２４Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２および式：
【化４８】
2018530560.tif 000056
の部分から選択され、式中、
Ｒ２３は、式−（Ｏ−アルキル）ｖ−ＯＨを有し、式中、ｖは、３から１０の整数であり、ｖ個のアルキル基の各々は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｒ２４は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｓは、１から５の整数であり；
Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−から選択され；
各Ｒ２５は、式−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２６）２を有し、式中、各Ｒ２６は、式−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２を有し；
Ｒ３は、電子対、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
ここで、Ｇは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰおよび−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択される細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）およびリンカー部分であるか、またはＧは、式：
【化４９】
2018530560.tif 000057
を有し、式中、ＣＰＰは、Ｇの最大で１つの例が存在するという条件で、ＣＰＰのカルボキシ末端において、アミド結合により、リンカー部分に結合している。
【０２５３】
多様な実施形態では、ターゲティング配列は、ミオスタチンプレｍＲＮＡ内の標的領域と相補的である。一部の実施形態では、ターゲティング配列は、エクソン２内に完全にありターゲティング配列のいかなる部分もスプライス接合部にわたらない標的領域内の、または、ミオスタチンプレｍＲＮＡのイントロン／エクソンもしくはエクソン／イントロンスプライス接合部にわたる領域（例えば配列番号２〜３）の、１２またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的である。
【０２５４】
多様な実施形態では、ターゲティング配列は、ジストロフィンプレｍＲＮＡ内の標的領域と相補的である。一部の実施形態では、ターゲティング配列は、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１９、エクソン２３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３またはエクソン５５から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン内の標的領域内の、１０またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的である。複数の実施形態では、標的領域は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン内に完全にありターゲティング配列のいかなる部分もスプライス接合部にわたらないか、または、ジストロフィンプレｍＲＮＡのイントロン／エクソンもしくはエクソン／イントロンスプライス接合部にわたる領域である。
【０２５５】
多様な実施形態では、ミオスタチンターゲティング配列は、配列番号１６〜７５のうちの１つを含むか、配列番号１６〜７５のうちの１つから選択されるか、配列番号１６〜７５のうちの少なくとも１つから選択される配列の少なくとも１２の連続ヌクレオチドの断片であるか、または、配列番号１６〜７５のうちの少なくとも１つから選択される配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体であり、各Ｘはウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号１６〜７５の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号１６〜７５の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。
【０２５６】
一部の実施形態では、式（Ｉ）のミオスタチンターゲティング配列は、
ａ）配列番号７１（ＹＹＡＧＹＹＹＡＸＹＸＸＹＸＹＹＸＧＧＸＹＹＸＧＧ）［Ｚは２５である］；
ｂ）配列番号７２（ＹＡＹＸＸＡＹＹＡＧＹＹＹＡＸＹＸＸＹＸＹＹＸＧＧ）［Ｚは２５である］；
ｃ）配列番号７３（ＹＹＡＹＸＸＧＹＡＸＸＡＧＡＡＡＡＸＹＡＧＹ）［Ｚは２２である］；
ｄ）配列番号７４（ＧＹＡＴＴＡＧＡＡＡＡＴＹＡＧＹＴＡＴＡＡＡＴＧ）［Ｚは２４である］；および
ｅ）配列番号７５（ＹＹＡＴＹＹＧＹＴＴＧＹＡＴＴＡＧＡＡＡＧＴＹＡＧＹ）［Ｚは２６である］
から選択され、各Ｘはウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号７１〜７５の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号７１〜７５の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。
【０２５７】
多様な実施形態では、ジストロフィンターゲティング配列は、配列番号７６〜３４８５のうちの１つを含むか、配列番号７６〜３４８５のうちの１つから選択されるか、配列番号７６〜３４８５のうちの少なくとも１つから選択される配列の少なくとも１０の連続ヌクレオチドの断片であるか、または、配列番号７６〜３４８５のうちの少なくとも１つから選択される配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体であり、各Ｘはウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号７６〜３４８５の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号７６〜３４８５の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。一部の実施形態では、ターゲティング配列は、配列番号７６を含み得る。
【０２５８】
多様な実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＸはＴである。多様な実施形態では、ターゲティング配列の各ＸはＴである。
【０２５９】
多様な実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＸはＵである。多様な実施形態では、ターゲティング配列の各ＸはＵである。
【０２６０】
多様な実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＹは５ｍＣである。多様な実施形態では、ターゲティング配列の各Ｙは５ｍＣである。
【０２６１】
多様な実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＹはＣである。多様な実施形態では、ターゲティング配列の各ＹはＣである。
【０２６２】
多様な実施形態では、配列番号１６〜７５および配列番号７６〜３４８５の少なくとも１つのＸはＴである。多様な実施形態では、配列番号１６〜７５および配列番号７６〜３４８５の各ＸはＴである。
【０２６３】
多様な実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＸはＵである。多様な実施形態では、配列番号１６〜７５および配列番号７６〜３４８５の各ＸはＵである。
【０２６４】
多様な実施形態では、配列番号１６〜７５および配列番号７６〜３４８５の少なくとも１つのＹは５ｍＣである。多様な実施形態では、配列番号１６〜７５および配列番号７６〜３４８５の各Ｙは５ｍＣである。
【０２６５】
多様な実施形態では、配列番号１６〜７５および配列番号７６〜３４８５の少なくとも１つのＹはＣである。多様な実施形態では、配列番号１６〜７５および配列番号７６〜３４８５の各ＹはＣである。
【０２６６】
一部の実施形態では、Ｒ３は式：
【化５０】
2018530560.tif 000058
の部分である［式中、Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−から選択され、
各Ｒ２５は、式−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２６）２を有し、各Ｒ２６は、式−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２を有する。かかる部分は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる米国特許第７，９３５，８１６号でさらに記載されている。
【０２６７】
ある特定の実施形態では、Ｒ３は下記に描示されるいずれの部分を含んでもよい：
【化５１】
2018530560.tif 000059
【０２６８】
多様な実施形態では、各ＹはＯであり、Ｒ２はＨまたはＧから選択され、Ｒ３は、電子対またはＨから選択される。一部の実施形態では、Ｒ２はＧであり、ＣＰＰは配列番号３４８６〜３５０１から選択される配列を有する。ある特定の実施形態では、Ｒ２はＨである。
【０２６９】
ある特定の実施形態では、各Ｒ１は−Ｎ（ＣＨ３）２である。一部の実施形態では、Ｒ１基の約５０〜９０％はジメチルアミノ（すなわち−Ｎ（ＣＨ３）２）である。ある特定の実施形態では、Ｒ１基の約７０％〜約８０％はジメチルアミノである。ある特定の実施形態では、Ｒ１基の約７５％はジメチルアミノである。ある特定の実施形態では、Ｒ１基の約６６％はジメチルアミノである。
【０２７０】
本開示の一部の実施形態では、Ｒ１は、
【化５２】
2018530560.tif 000060
から選択され得る。
【０２７１】
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は、
【化５３】
2018530560.tif 000061
である。
【０２７２】
ある特定の実施形態では、Ｔは式：
【化５４】
2018530560.tif 000062
を有し、式中、Ａは−Ｎ（ＣＨ３）２であり、Ｒ６は式：
【化５５】
2018530560.tif 000063
を有し、式中、Ｒ１０は−Ｃ（Ｏ）Ｒ１１ＯＨである。
【０２７３】
一部の実施形態では、各ＹはＯであり、Ｔは、
【化５６】
2018530560.tif 000064
から選択される。
【０２７４】
ある特定の実施形態では、Ｔは式：
【化５７】
2018530560.tif 000065
を有する。
【０２７５】
多様な実施形態では、各ＹはＯであり、Ｒ２はＨまたはＧから選択され、Ｒ３は電子対またはＨから選択される。一部の実施形態では、Ｒ２はＧであり、ＣＰＰは、後述する配列番号３４８６〜３５０１から選択される配列を有する。
【０２７６】
他の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、式（ＩＶ）：
【化５８】
2018530560.tif 000066
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり；
Ｚは、８から４８の整数であり；
各Ｙは、Ｏおよび−ＮＲ４から独立に選択され、式中、各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アラルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２およびＧから独立に選択され、式中、Ｒ５は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、ｎは、１から５の整数であり；
Ｔは、ＯＨおよび式：
【化５９】
2018530560.tif 000067
の部分から選択され、式中、
Ａは、−ＯＨおよび−Ｎ（Ｒ７）２Ｒ８から選択され、式中
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ８は、電子対およびＨから選択され、
Ｒ６は、ＯＨ、−Ｎ（Ｒ９）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２および式：
【化６０】
2018530560.tif 000068
の部分から選択され、式中、
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ１０は、Ｇ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１１ＯＨ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
ｍは、１から５の整数であり、
Ｒ１１は、式−（Ｏ−アルキル）ｙ−を有し、式中、ｙは、３から１０の整数であり、
ｙ個のアルキル基の各々は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｒ１２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｇ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２および−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２３から選択され；
Ｒ３は、電子対、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択される。
【０２７７】
多様な実施形態では、ターゲティング配列は、ミオスタチンプレｍＲＮＡ内の標的領域と相補的である。一部の実施形態では、ターゲティング配列は、エクソン２内に完全にありターゲティング配列のいかなる部分もスプライス接合部にわたらない標的領域内の１２またはこれを超える連続ヌクレオチド、または、ミオスタチンプレｍＲＮＡのイントロン／エクソンもしくはエクソン／イントロンのスプライス接合部（例えば配列番号１〜３）にわたる領域と相補的である。
【０２７８】
多様な実施形態では、ターゲティング配列は、ジストロフィンプレｍＲＮＡ内の標的領域と相補的である。一部の実施形態では、ターゲティング配列は、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１９、エクソン２３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３またはエクソン５５から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン内の標的領域内の１０またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的である。複数の実施形態では、標的領域は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン内に完全にありターゲティング配列のいかなる部分もスプライス接合部にわたらないか、または、ジストロフィンプレｍＲＮＡのイントロン／エクソンもしくはエクソン／イントロンのスプライス接合部にわたる領域（例えば配列番号７６〜３４８５）である。
【０２７９】
多様な実施形態では、ミオスタチンターゲティング配列は、配列番号４〜１５のうちの１つを含むか、配列番号４〜１５のうちの１つから選択されるか、配列番号４〜１５のうちの少なくとも１つから選択される配列の少なくとも１２の連続ヌクレオチドの断片であるか、または、配列番号４〜１５のうちの少なくとも１つから選択される配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体であり、各Ｘはウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号４〜１５の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号４〜１５の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。
【０２８０】
一部の実施形態では、式（ＩＶ）のミオスタチンターゲティング配列は、
ａ）配列番号７１（ＹＹＡＧＹＹＹＡＸＹＸＸＹＸＹＹＸＧＧＸＹＹＸＧＧ）［Ｚは２５である］；
ｂ）配列番号７２（ＹＡＹＸＸＡＹＹＡＧＹＹＹＡＸＹＸＸＹＸＹＹＸＧＧ）［Ｚは２５である］；
ｃ）配列番号７３（ＹＹＡＹＸＸＧＹＡＸＸＡＧＡＡＡＡＸＹＡＧＹ）［Ｚは２２である］；
ｄ）配列番号７４（ＧＹＡＴＴＡＧＡＡＡＡＴＹＡＧＹＴＡＴＡＡＡＴＧ）［Ｚは２４である］；および
ｅ）配列番号７５（ＹＹＡＴＹＹＧＹＴＴＧＹＡＴＴＡＧＡＡＡＧＴＹＡＧＹ）［Ｚは２６である］
から選択され、各Ｘはウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号７１〜７５の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号７１〜７５の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。
【０２８１】
多様な実施形態では、ジストロフィンターゲティング配列は、配列番号７６〜３４８５のうちの１つを含むか、配列番号７６〜３４８５のうちの１つから選択されるか、配列番号７６〜３４８５のうちの少なくとも１つから選択される配列の少なくとも１０の連続ヌクレオチドの断片であるか、または、配列番号７６〜３４８５のうちの少なくとも１つから選択される配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体であり、各Ｘはウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号７６〜３４８５の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号７６〜３４８５の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。一部の実施形態では、ターゲティング配列は、配列番号７６を含み得る。
【０２８２】
多様な実施形態では、ＹはＯであり、Ｒ２はＨまたはＧから選択され、Ｒ３は電子対またはＨから選択される。一部の実施形態では、Ｒ２はＧであり、ＣＰＰは配列番号９〜２４から選択される配列を有する。ある特定の実施形態では、Ｒ２はＨである。
【０２８３】
一部の実施形態では、ＹはＯであり、Ｔは、
【化６１】
2018530560.tif 000069
から選択される。
【０２８４】
一部の実施形態では、Ｔは式：
【化６２】
2018530560.tif 000070
を有し、Ｒ２は水素であり、Ｒ３は電子対である。
【０２８５】
他の実施形態では、改変アンチセンスオリゴマーは、式（Ｖ）：
【化６３】
2018530560.tif 000071
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり；
Ｚは、８から４８の整数であり；
各Ｙは、Ｏおよび−ＮＲ４から独立に選択され、式中、各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アラルキル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２およびＧから独立に選択され、式中、Ｒ５は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、ｎは１から５の整数であり；
Ｔは、ＯＨおよび式：
【化６４】
2018530560.tif 000072
の部分から選択され、式中、
Ａは、−ＯＨ、−Ｎ（Ｒ７）２Ｒ８から選択され、式中
Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ８は、電子対およびＨから選択され、
Ｒ６は、ＯＨ、−Ｎ（Ｒ９）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２および式：
【化６５】
2018530560.tif 000073
の部分から選択され、式中、
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ１０は、Ｇ、Ｃ（Ｏ）−Ｒ１１ＯＨ、アシル、トリチル、４メトキシトリチル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２およびＣ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
ｍは、１から５の整数であり、
Ｒ１１は、式−（Ｏ−アルキル）ｙ−を有し、式中、ｙは、３から１０の整数であり、
ｙ個のアルキル基の各々は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｒ１２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ここで、Ｇは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰおよび−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択される、細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）およびリンカー部分であるか、またはＧは、式：
【化６６】
2018530560.tif 000074
を有し、式中、ＣＰＰは、Ｇの最大で１つの例が存在するという条件で、ＣＰＰのカルボキシ末端において、アミド結合により、リンカー部分に結合している。
【０２８６】
多様な実施形態では、ターゲティング配列は、ミオスタチンプレｍＲＮＡ内の標的領域と相補的である。一部の実施形態では、ターゲティング配列は、エクソン２内に完全にありターゲティング配列のいかなる部分もスプライス接合部にわたらない標的領域内の１２もしくはこれを超える連続ヌクレオチド、または、ミオスタチンプレｍＲＮＡのイントロン／エクソンもしくはエクソン／イントロンのスプライス接合部（例えば配列番号１〜３）にわたる領域と相補的である。
【０２８７】
多様な実施形態では、ターゲティング配列は、ジストロフィンプレｍＲＮＡ内の標的領域と相補的である。一部の実施形態では、ターゲティング配列は、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１９、エクソン２３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３またはエクソン５５から選択される、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン内の標的領域内の１０またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的である。複数の実施形態では、標的領域は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン内に完全にありターゲティング配列のいかなる部分もスプライス接合部にわたらないか、またはジストロフィンプレｍＲＮＡのイントロン／エクソンもしくはエクソン／イントロンのスプライス接合部（例えば配列番号４〜１５）にわたる領域である。
【０２８８】
多様な実施形態では、ミオスタチンターゲティング配列は、配列番号１６〜７５のうちの１つを含むか、配列番号１６〜７５のうちの１つから選択されるか、配列番号１６〜７５のうちの少なくとも１つから選択される配列の少なくとも１２の連続ヌクレオチドの断片であるか、または、配列番号１６〜７５のうちの少なくとも１つから選択される配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体であり、各Ｘはウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号１６〜７５の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号１６〜７５の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。
【０２８９】
一部の実施形態では、式（Ｖ）のミオスタチンターゲティング配列は、
ａ）配列番号７１（ＹＹＡＧＹＹＹＡＸＹＸＸＹＸＹＹＸＧＧＸＹＹＸＧＧ）［Ｚは２５である］；
ｂ）配列番号７２（ＹＡＹＸＸＡＹＹＡＧＹＹＹＡＸＹＸＸＹＸＹＹＸＧＧ）［Ｚは２５である］；
ｃ）配列番号７３（ＹＹＡＹＸＸＧＹＡＸＸＡＧＡＡＡＡＸＹＡＧＹ）［Ｚは２２である］；
ｄ）配列番号７４（ＧＹＡＴＴＡＧＡＡＡＡＴＹＡＧＹＴＡＴＡＡＡＴＧ）［Ｚは２４である］；および
ｅ）配列番号７５（ＹＹＡＴＹＹＧＹＴＴＧＹＡＴＴＡＧＡＡＡＧＴＹＡＧＹ）［Ｚは２６である］
から選択され、各Ｘはウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号７１〜７５の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号７１〜７５の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。
【０２９０】
多様な実施形態では、ジストロフィンターゲティング配列は、配列番号７６〜３４８５のうちの１つを含むか、配列番号７６〜３４８５のうちの１つから選択されるか、配列番号７６〜３４８５のうちの少なくとも１つから選択される配列の少なくとも１０の連続ヌクレオチドの断片であるか、または、配列番号７６〜３４８５のうちの少なくとも１つから選択される配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体であり、各Ｘはウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号７６〜３４８５の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号７６〜３４８５の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。一部の実施形態では、ターゲティング配列は、配列番号７６を含み得る。
【０２９１】
多様な実施形態では、各ＹはＯであり、Ｔは、
【化６７】
2018530560.tif 000075
から選択される。
一部の実施形態では、Ｔは式：
【化６８】
2018530560.tif 000076
を有する。
【０２９２】
ある特定の実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーは、式（ＶＩ）：
【化６９】
2018530560.tif 000077
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり、
Ｚは、１５〜２５の整数であり、
各Ｙは、Ｏであり、
各Ｒ１は、
【化７０】
2018530560.tif 000078
から独立に選択される。
【０２９３】
多様な実施形態では、少なくとも１つのＲ１は−Ｎ（ＣＨ３）２である。一部の実施形態では、各Ｒ１は−Ｎ（ＣＨ３）２である。
【０２９４】
多様な実施形態では、ターゲティング配列は、ミオスタチンプレｍＲＮＡ内の標的領域と相補的である。一部の実施形態では、ターゲティング配列は、エクソン２内に完全にありターゲティング配列のいかなる部分もスプライス接合部にわたらない標的領域内の１２またはこれを超える連続ヌクレオチド、または、ミオスタチンプレｍＲＮＡのイントロン／エクソンもしくはエクソン／イントロンのスプライス接合部（例えば配列番号１〜３）にわたる領域と相補的である。
【０２９５】
多様な実施形態では、ターゲティング配列は、ジストロフィンプレｍＲＮＡ内の標的領域と相補的である。一部の実施形態では、ターゲティング配列は、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１９、エクソン２３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３またはエクソン５５から選択される、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン内の標的領域内の１０またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、標的領域は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン内に完全にありターゲティング配列のいかなる部分もスプライス接合部にわたらないか、またはジストロフィンプレｍＲＮＡのイントロン／エクソンもしくはエクソン／イントロンのスプライス接合部（例えば配列番号４〜１５）にわたる領域である。
【０２９６】
多様な実施形態では、ミオスタチンターゲティング配列は、配列番号１６〜７５のうちの１つを含むか、配列番号１６〜７５のうちの１つから選択されるか、配列番号１６〜７５のうちの少なくとも１つから選択される配列の少なくとも１２の連続ヌクレオチドの断片であるか、または、配列番号１６〜７５のうちの少なくとも１つから選択される配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体であり、各Ｘはウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号１６〜７５の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号１６〜７５の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。
【０２９７】
一部の実施形態では、式（ＶＩ）のミオスタチンターゲティング配列は、
ａ）配列番号７１（ＹＹＡＧＹＹＹＡＸＹＸＸＹＸＹＹＸＧＧＸＹＹＸＧＧ）［Ｚは２５である］；
ｂ）配列番号７２（ＹＡＹＸＸＡＹＹＡＧＹＹＹＡＸＹＸＸＹＸＹＹＸＧＧ）［Ｚは２５である］；
ｃ）配列番号７３（ＹＹＡＹＸＸＧＹＡＸＸＡＧＡＡＡＡＸＹＡＧＹ）［Ｚは２２である］；
ｄ）配列番号７４（ＧＹＡＴＴＡＧＡＡＡＡＴＹＡＧＹＴＡＴＡＡＡＴＧ）［Ｚは２４である］；および
ｅ）配列番号７５（ＹＹＡＴＹＹＧＹＴＴＧＹＡＴＴＡＧＡＡＡＧＴＹＡＧＹ）［Ｚは２６である］
から選択され、各Ｘはウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号７１〜７５の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号７１〜７５の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。
【０２９８】
多様な実施形態では、ジストロフィンターゲティング配列は、配列番号７６〜３４８５のうちの１つを含むか、配列番号７６〜３４８５のうちの１つから選択されるか、配列番号７６〜３４８５のうちの少なくとも１つから選択される配列の少なくとも１０の連続ヌクレオチドの断片であるか、または、配列番号７６〜３４８５のうちの少なくとも１つから選択される配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体であり、各Ｘはウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号７６〜３４８５の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号７６〜３４８５の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。一部の実施形態では、ターゲティング配列は、配列番号７６を含み得る。
【０２９９】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは式（ＶＩＩ）：
【化７１】
2018530560.tif 000079
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり、
Ｚは、８〜４８の整数であり、
各Ｙは、Ｏであり、
各Ｒ１は、
【化７２】
2018530560.tif 000080
から選択され、
Ｒ２は、Ｈ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２および−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２３から選択され；
Ｒ３は電子対、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択される。
【０３００】
多様な実施形態では、ターゲティング配列は、ミオスタチンプレｍＲＮＡ内の標的領域と相補的である。一部の実施形態では、ターゲティング配列は、ミオスタチンプレｍＲＮＡのエクソン内に完全にある標的領域内の１２もしくはこれを超える連続ヌクレオチド、または、ミオスタチンプレｍＲＮＡのイントロン／エクソンもしくはエクソン／イントロンのスプライス接合部（例えば配列番号１〜３）にわたる領域と相補的である。
【０３０１】
多様な実施形態では、ターゲティング配列は、ジストロフィンプレｍＲＮＡ内の標的領域と相補的である。一部の実施形態では、ターゲティング配列は、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１９、エクソン２３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３またはエクソン５５から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン内の標的領域内の１０またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的である。複数の実施形態では、標的領域は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン内に完全にありターゲティング配列のいかなる部分もスプライス接合部にわたらないか、またはジストロフィンプレｍＲＮＡのイントロン／エクソンもしくはエクソン／イントロンのスプライス接合部（例えば配列番号４〜１５）にわたる領域である。
【０３０２】
多様な実施形態では、ミオスタチンターゲティング配列は、配列番号１６〜７５のうちの１つを含むか、配列番号１６〜７５のうちの１つから選択されるか、配列番号１６〜７５のうちの少なくとも１つから選択される配列の少なくとも１２の連続ヌクレオチドの断片であるか、または、配列番号１６〜７５のうちの少なくとも１つから選択される配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体であり、各Ｘはウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号１６〜７５の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号１６〜７５の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。
【０３０３】
一部の実施形態では、式（ＶＩＩ）のミオスタチンターゲティング配列は、
ａ）配列番号７１（ＹＹＡＧＹＹＹＡＸＹＸＸＹＸＹＹＸＧＧＸＹＹＸＧＧ）［Ｚは２５である］；
ｂ）配列番号７２（ＹＡＹＸＸＡＹＹＡＧＹＹＹＡＸＹＸＸＹＸＹＹＸＧＧ）［Ｚは２５である］；
ｃ）配列番号７３（ＹＹＡＹＸＸＧＹＡＸＸＡＧＡＡＡＡＸＹＡＧＹ）［Ｚは２２である］；
ｄ）配列番号７４（ＧＹＡＴＴＡＧＡＡＡＡＴＹＡＧＹＴＡＴＡＡＡＴＧ）［Ｚは２４である］；および
ｅ）配列番号７５（ＹＹＡＴＹＹＧＹＴＴＧＹＡＴＴＡＧＡＡＡＧＴＹＡＧＹ）［Ｚは２６である］
から選択され、各Ｘはウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号７１〜７５の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号７１〜７５の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。
【０３０４】
多様な実施形態では、ジストロフィンターゲティング配列は、配列番号７６〜３４８５のうちの１つを含むか、配列番号７６〜３４８５のうちの１つから選択されるか、配列番号７６〜３４８５のうちの少なくとも１つから選択される配列の少なくとも１０の連続ヌクレオチドの断片であるか、または、配列番号７６〜３４８５のうちの少なくとも１つから選択される配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体であり、各Ｘはウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号７６〜３４８５の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号７６〜３４８５の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。一部の実施形態では、ターゲティング配列は、配列番号７６を含み得る。
【０３０５】
多様な実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＸはＴである。多様な実施形態では、ターゲティング配列の各ＸはＴである。
【０３０６】
多様な実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＸはＵである。多様な実施形態では、ターゲティング配列の各ＸはＵである。
【０３０７】
多様な実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＹは５ｍＣである。多様な実施形態では、ターゲティング配列の各Ｙは、５ｍＣである。
【０３０８】
多様な実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＹはＣである。多様な実施形態では、ターゲティング配列の各ＹはＣである。
【０３０９】
多様な実施形態では、配列番号１６〜７５および配列番号７６〜３４８５の少なくとも１つのＸはＴである。多様な実施形態では、配列番号１６〜７５および配列番号７６〜３４８５の各ＸはＴである。
【０３１０】
多様な実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＸはＵである。多様な実施形態では、配列番号１６〜７５および配列番号７６〜３４８５の各ＸはＵである。
【０３１１】
多様な実施形態では、配列番号１６〜７５および配列番号７６〜３４８５の少なくとも１つのＹは５ｍＣである。多様な実施形態では、配列番号１６〜７５および配列番号７６〜３４８５の各Ｙは５ｍＣである。
【０３１２】
多様な実施形態では、配列番号１６〜７５および配列番号７６〜３４８５の少なくとも１つのＹはＣである。多様な実施形態では、配列番号１６〜７５および配列番号７６〜３４８５の各ＹはＣである。
【０３１３】
ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、式（ＶＩＩＩ）：
【化７３】
2018530560.tif 000081
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり、
Ｚは、８〜４８の整数である。
【０３１４】
多様な実施形態では、ターゲティング配列は、ミオスタチンプレｍＲＮＡ内の標的領域と相補的である。一部の実施形態では、ターゲティング配列は、エクソン／イントロンスプライス接合部位内の標的領域内の１２もしくはこれを超える連続ヌクレオチド、または、ミオスタチンプレｍＲＮＡのイントロン／エクソンもしくはエクソン／イントロンのスプライス接合部（例えば配列番号１〜３）にわたる領域と相補的である。
【０３１５】
多様な実施形態では、ターゲティング配列は、ジストロフィンプレｍＲＮＡ内の標的領域と相補的である。一部の実施形態では、ターゲティング配列は、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１９、エクソン２３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３またはエクソン５５から選択される、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン内の標的領域内の１０またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的である。複数の実施形態では、標的領域は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン内に完全にありターゲティング配列のいかなる部分もスプライシング接合部にわたらないか、またはジストロフィンプレｍＲＮＡのイントロン／エクソンもしくはエクソン／イントロンのスプライス接合部（例えば配列番号４〜１５）にわたる領域である。
【０３１６】
多様な実施形態では、ミオスタチンターゲティング配列は、配列番号１６〜７５のうちの１つを含むか、配列番号１６〜７５のうちの１つから選択されるか、配列番号１６〜７５のうちの少なくとも１つから選択される配列の少なくとも１２の連続ヌクレオチドの断片であるか、または、配列番号１６〜７５のうちの少なくとも１つから選択される配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体であり、各Ｘはウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号１６〜７５の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号１６〜７５の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。
【０３１７】
一部の実施形態では、ミオスタチンターゲティング配列は、
ａ）配列番号７１（ＹＹＡＧＹＹＹＡＸＹＸＸＹＸＹＹＸＧＧＸＹＹＸＧＧ）［Ｚは２５である］；
ｂ）配列番号７２（ＹＡＹＸＸＡＹＹＡＧＹＹＹＡＸＹＸＸＹＸＹＹＸＧＧ）［Ｚは２５である］；
ｃ）配列番号７３（ＹＹＡＹＸＸＧＹＡＸＸＡＧＡＡＡＡＸＹＡＧＹ）［Ｚは２２である］；
ｄ）配列番号７４（ＧＹＡＴＴＡＧＡＡＡＡＴＹＡＧＹＴＡＴＡＡＡＴＧ）［Ｚは２４である］；および
ｅ）配列番号７５（ＹＹＡＴＹＹＧＹＴＴＧＹＡＴＴＡＧＡＡＡＧＴＹＡＧＹ）［Ｚは２６である］
から選択され、各Ｘはウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号７１〜７５の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号７１〜７５の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。
【０３１８】
多様な実施形態では、ジストロフィンターゲティング配列は、配列番号７６〜３４８５のうちの１つを含むか、配列番号７６〜３４８５のうちの１つから選択されるか、配列番号７６〜３４８５のうちの少なくとも１つから選択される配列の少なくとも１０の連続ヌクレオチドの断片であるか、または、配列番号７６〜３４８５のうちの少なくとも１つから選択される配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体であり、各Ｘはウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号７６〜３４８５の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号７６〜３４８５の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。一部の実施形態では、ターゲティング配列は、配列番号７６を含み得る。
【０３１９】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、および（ＶＩＩＩ）の化合物を含む本開示のアンチセンスオリゴマーの各Ｎｕは、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、シトシン、ヒポキサンチン（イノシン）、２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、Ｃ５−プロピニル修飾ピリミジン、および１０−（９−（アミノエトキシ）フェノキサジニル）から独立に選択される。一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、および（ＶＩＩＩ）の化合物を含む本開示のアンチセンスオリゴマーのターゲティング配列は、配列番号２、３、４もしくは６から選択される配列を含むか、配列番号２、３、４もしくは６から選択されるか、配列番号２、３、４もしくは６から選択される配列のうちの、少なくとも１２連続ヌクレオチドの断片であるか、または、配列番号２、３、４もしくは６から選択される配列に対する、少なくとも９０％の配列同一性を有する改変体であり、ここで、Ｘは、ウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から選択され、Ｉは、イノシンである。
【０３２０】
本開示に従い使用されうる、さらなる改変アンチセンスオリゴマー／化学は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、以下の特許および特許公報：ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／００２３９０号；同第ＷＯ２０１０／１２０８２０号；および同第ＷＯ２０１０／１４８２４９号；米国特許第７，８３８，６５７号；ならびに米国特許出願第２０１１／０２６９８２０号において記載されているアンチセンスオリゴマー／化学を含む。
【０３２１】
Ｃ．モルホリノサブユニットおよびホスホルアミデートヌクレオシド間リンカーの調製
モルホリノ単量体サブユニット、修飾ヌクレオシド間連結、およびこれらを含むオリゴマーは、例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１８５，４４４号および同第７，９４３，７６２号において記載されている通りに調製することができる。モルホリノサブユニットは、以下の一般的な反応スキームＩに従い調製することができる。
【化７４】
2018530560.tif 000082
【０３２２】
反応スキーム１［式中、Ｂは、塩基対合部分を表し、ＰＧは、保護基を表す］を参照すると、モルホリノサブユニットは、示される通り、対応するリボヌクレオシド（１）から調製することができる。モルホリノサブユニット（２）は、任意選択で、適切な保護基前駆体、例えば、トリチルクロリドを伴う反応により保護することができる。下記でより詳細に記載される通り、３’保護基は一般に、固体オリゴマー合成時に除去する。塩基対合部分は、固相オリゴマー合成に適するように保護することができる。適切な保護基は、アデニンおよびシトシンのためのベンゾイル、グアニンのためのフェニルアセチル、およびヒポキサンチン（Ｉ）のためのピバロイルオキシメチルを含む。ピバロイルオキシメチル基は、ヒポキサンチン複素環塩基のＮ１位へと導入することができる。非保護のヒポキサンチンサブユニットも使用しうるが、塩基を保護する場合の活性化反応の収率は、はるかに優れている。他の適切な保護基は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第８，０７６，４７６号において開示されている保護基を含む。
【０３２３】
活性化リン化合物４を伴う化合物３の反応は、所望の連結部分である化合物５を有するモルホリノサブユニットをもたらす。構造４の化合物は、任意の数の、当業者に公知の方法を使用して調製することができる。例えば、このような化合物は、対応するアミンと、オキシ塩化リン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ  ｏｘｙｃｈｌｏｒｉｄｅ）との反応により調製することができる。この点で、アミン出発材料は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、実施例、ならびに参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１８５，４４４号、同第７，９４３，７６２号、および同第８，７７９，１２８号において記載されている方法を使用して調製することができる。
【０３２４】
構造５の化合物は、ヌクレオシド間連結を含むオリゴマーを調製するための固相自動式オリゴマー合成において使用することができる。このような方法は、当技術分野で周知である。略述すると、構造５の化合物は、固体支持体へのリンカーを含有するように、５’末端において修飾することができる。例えば、化合物５は、Ｌ１１およびＬ１５を含むリンカーにより、固体支持体へと連結することができる。支持がなされたら、保護基（例えば、トリチル）を除去し、遊離アミンを、第２の構造５の化合物の活性化リン部分と反応させる。このシークエンスを、所望の長さのオリゴが得られるまで繰り返す。５’末端における保護基は、除去することもでき、５’修飾が望ましい場合は、残すこともできる。オリゴは、任意の数の方法、例えば、ＤＴＴによる処理に続く、水酸化アンモニウムによる処理を使用して、固体支持体から除去することができる。
【０３２５】
修飾モルホリノサブユニットおよびモルホリノベースのオリゴマーの調製については、実施例においてより詳細に記載する。本明細書で記載される方法、当技術分野で公知であり、かつ／または参照により本明細書で記載される方法を使用して、任意の数の修飾連結を含有するモルホリノベースのオリゴマーを調製することができる。実施例ではまた、既に記載されている（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／０３６１２７号を参照されたい）通りに調製された、モルホリノベースのオリゴマーの全般的な修飾についても記載する。
【０３２６】
「保護基」という用語は、化合物の一部または全部の反応性部分をブロックし、保護基を除去するまで、このような部分が、化学反応に参与することを防止する化学的部分、例えば、Ｔ．Ｗ．  Ｇｒｅｅｎｅ、Ｐ．Ｇ．Ｍ．  Ｗｕｔｓ、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９９年）（その全体が本明細書において参考として援用される）において列挙および記載されている部分を指す。異なる保護基を使用する場合、各（異なる）保護基が、異なる手段により除去可能であることは、有利でありうる。完全に非対応の反応条件下で切断される保護基は、このような保護基の示差的な除去を可能とする。例えば、保護基は、酸、塩基、および加水分解により除去することができる。トリチル、ジメトキシトリチル、アセタール、およびｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルなどの基は、酸不安定性であり、加水分解により除去可能なＣｂｚ基、および塩基不安定性のＦｍｏｃ基で保護されるアミノ基の存在下で、カルボキシ反応性部分およびヒドロキシ反応性部分を保護するのに使用することができる。カルボン酸部分は、限定なしに述べると、メチルまたはエチルなどの塩基不安定性基でブロックすることができ、ヒドロキシ反応性部分は、ｔｅｒｔ−ブチルカルバメートなどの酸不安定性基、または酸安定性であり、かつ、塩基安定性であるが、加水分解により除去可能なカルバメートでブロックされるアミンの存在下では、アセチルなどの塩基不安定性基でブロックすることができる。
【０３２７】
カルボン酸反応性部分およびヒドロキシル反応性部分はまた、ベンジル基など、加水分解により除去可能な保護基でブロックしうるのに対し、アミン基は、Ｆｍｏｃなどの塩基不安定性基でブロックすることができる。式（Ｉ）の化合物を合成するのに、特に有用なアミン保護基は、トリフルオロアセトアミドである。カルボン酸反応性部分が、２，４−ジメトキシベンジルなど、酸化により除去可能な保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｇｒｏｕｐ）でブロックしうるのに対し、共存するアミノ基は、フルオリド不安定性シリルカルバメートでブロックすることができる。
【０３２８】
アリルブロッキング基は、酸保護基および塩基保護基の存在下において、前者が、安定であり、その後、金属またはパイ−酸触媒により除去されうるので、有用である。例えば、アリルでブロックされたカルボン酸は、酸不安定性ｔ−ブチルカルバメートまたは塩基不安定性アセテートアミン保護基の存在下で、パラジウム（０）触媒反応により脱保護することができる。保護基のさらに別の形態は、化合物または中間体が結合しうる樹脂である。残基が樹脂に結合する限りにおいて、その官能基は、ブロックされており、反応することができない。樹脂から放出されると、官能基は、反応に利用可能である。
【０３２９】
典型的なブロッキング／保護基は、当技術分野で公知であり、以下：
【化７５】
2018530560.tif 000083
の部分を含むがこれらに限定されない。
【０３３０】
そうでないことが注記されない限りにおいて、全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｆｌｕｋａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得た。ベンゾイルアデノシン、ベンゾイルシチジン、およびフェニルアセチルグアノシンは、Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ、ＵＫ）から得た。
【０３３１】
本明細書で記載される、さらなる連結修飾を含有する、ＰＭＯ、ＰＭＯプラス、ＰＰＭＯ、およびＰＭＯ−Ｘの合成は、当技術分野で公知であり、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１２／２７１，０３６号および同第１２／２７１，０４０号ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２００９／０６４４７１号において記載されている方法を使用して行った。
【０３３２】
３’トリチル修飾を伴うＰＭＯは、脱トリチル化（ｄｅｔｒｉｔｙｌａｔｉｏｎ）ステップを省くことを除き、本質的に、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００９／０６４４７１号において記載されている通りに合成する。
【０３３３】
Ｄ．細胞透過性ペプチド
本開示の改変アンチセンスオリゴマー化合物は、本明細書ではまた、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）とも称するペプチドにコンジュゲートしていてもよい。ある特定の好ましい実施形態では、ペプチドは、化合物の、細胞への輸送を増強するのに有効な、アルギニンに富むペプチド輸送部分である。輸送部分は、オリゴマーの末端に、結合させることが好ましい。ペプチドは、全身投与されると、所与の細胞培養物集団の細胞のうちの３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％であって、間の全ての整数を含む％の細胞内の細胞透過を誘導し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、複数の組織内の高分子のトランスロケーションを可能とする能力を有する。一実施形態では、細胞透過性ペプチドは、アルギニンに富むペプチド輸送体でありうる。別の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ペネトラチンまたはＴａｔペプチドでありうる。当技術分野では、これらのペプチドが周知であり、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１０−００１６２１５Ａ１号において開示されている。ペプチドの、本開示の改変アンチセンスオリゴマーへのコンジュゲーションのための１つの手法は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１２／１５０９６０号において見出すことができる。本開示のペプチドコンジュゲートオリゴマーについての一部の実施形態は、ＣＰＰと、改変アンチセンスオリゴマーとの間のリンカーとして、グリシンを活用する。例えば、本開示のペプチドコンジュゲートＰＭＯは、Ｒ６−Ｇ−ＰＭＯからなる。
【０３３４】
上記で記載した輸送部分は、結合オリゴマーの細胞移入を、結合輸送部分の非存在下におけるオリゴマーの取込みと比べて大幅に増強することが示されている。取込みは、非コンジュゲート化合物と比べて、少なくとも１０倍増強することが好ましく、２０倍増強することがより好ましい。
【０３３５】
アルギニンに富むペプチド輸送体（すなわち、細胞透過性ペプチド）の使用は、本開示を実施するのに特に有用である。ある特定のペプチド輸送体は、アンチセンス化合物の、筋細胞を含む初代細胞への送達において、高度に有効であることが示されている（参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Ｍａｒｓｈａｌｌ，  Ｏｄａら、２００７年；Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，  Ｍｏｕｌｔｏｎら、２００８年；Ｗｕ，  Ｍｏｕｌｔｏｎら、２００８年）。さらに、ペネトラチンおよびＴａｔペプチドなど、他の公知のペプチド輸送体と比較して、本明細書で記載されるペプチド輸送体は、アンチセンスＰＭＯにコンジュゲートさせると、複数の遺伝子転写物のスプライシングを変更する能力の増強を裏付ける（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｍａｒｓｈａｌｌ，  Ｏｄａら、２００７年）。
【０３３６】
リンカーを除く、例示的なペプチド輸送体を、下記の表５に示す。
【表５】
2018530560.tif 000084
【０３３７】
多様な実施形態では、Ｇ（式Ｉ、ＩＶ、およびＶで列挙された）は、以下：
−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択される細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）およびリンカー部分であるか、またはＧは、式：
【化７６】
2018530560.tif 000085
のものであり、式中、ＣＰＰは、ＣＰＰのカルボキシ末端において、アミド結合により、リンカー部分に結合している。一部の実施形態では、ＣＰＰは、配列番号３４８６〜３５０１から選択される。
【０３３８】
一部の実施形態では、Ｇ（式Ｉ、ＩＶ、およびＶにおいて列挙する通り）は、式：
【化７７】
2018530560.tif 000086
であり、Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択され、Ｊは、４〜９の整数である。ある特定の実施形態では、Ｊは、６である。
【０３３９】
一部の実施形態では、ＣＰＰ（式Ｉ、ＩＶ、およびＶにおいて列挙する通り）は、式：
【化７８】
2018530560.tif 000087
であり、Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択され、Ｊは、４〜９の整数である。ある特定の実施形態では、ＣＰＰは、配列番号１５である。多様な実施形態では、Ｊは、６である。一部の実施形態では、Ｒａは、Ｈおよびアセチルから選択される。例えば、一部の実施形態では、Ｒａは、Ｈである。ある特定の実施形態では、Ｒａは、アセチルである。
【０３４０】
ＩＶ．製剤
本開示の化合物はまた、取込み、分布、および／または吸収を支援するために、例えば、リポソーム、受容体にターゲティングされた分子、経口製剤、直腸製剤、局所製剤、または他の製剤として、他の分子、分子構造、または化合物の混合物と混合するか、これらと共に封入するか、これらにコンジュゲートさせるか、またはこれらと他の形で会合させることもできる。このような取込み支援製剤、分布支援製剤、および／または吸収支援製剤の調製について教示する、代表的な米国特許は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１０８，９２１号；同第５，３５４，８４４号；同第５，４１６，０１６号；同第５，４５９，１２７号；同第５，５２１，２９１号；同第５，５４３，１５８号；同第５，５４７，９３２号；同第５，５８３，０２０号；同第５，５９１，７２１号；同第４，４２６，３３０号；同第４，５３４，８９９号；同第５，０１３，５５６号；同第５，１０８，９２１号；同第５，２１３，８０４号；同第５，２２７，１７０号；同第５，２６４，２２１号；同第５，３５６，６３３号；同第５，３９５，６１９号；同第５，４１６，０１６号；同第５，４１７，９７８号；同第５，４６２，８５４号；同第５，４６９，８５４号；同第５，５１２，２９５号；同第５，５２７，５２８号；同第５，５３４，２５９号；同第５，５４３，１５２号；同第５，５５６，９４８号；同第５，５８０，５７５号および同第５，５９５，７５６号を含むがこれらに限定されない。
【０３４１】
本開示のアンチセンス化合物は、任意の薬学的に許容される塩、エステル、もしくはこのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物へと投与されると、生物学的に活性の代謝物もしくはその残余物をもたらす（直接的または間接的に）ことが可能な、他の任意の化合物を包含する。したがって、例えば、本開示はまた、本開示の化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容される塩、このようなプロドラッグの薬学的に許容される塩、および他の生物学的同等物へも導かれる。
【０３４２】
「プロドラッグ」という用語は、内因性酵素または他の化学物質および／もしくは条件の作用により、体内またはその細胞内で活性形態（すなわち、薬物）へと転換される、不活性形態で調製された治療剤を指し示す。特に、本開示のオリゴマーのプロドラッグバージョンは、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、１９９３年１２月９日に公開された、ＧｏｓｓｅｌｉｎらによるＰＣＴ公開第ＷＯ１９９３／２４５１０号またはＩｍｂａｃｈらによる、ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９４／２６７６４号および米国特許第５，７７０，７１３号において開示されている方法に従い、ＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェート］誘導体として調製される。
【０３４３】
「薬学的に許容される塩」という用語は、本開示の化合物の、生理学的かつ薬学的に許容される塩：すなわち、親化合物の望ましい生物学的活性を保持し、望ましくない毒性効果をこれに付与しない塩を指す。オリゴマーについては、薬学的に許容される塩およびそれらの使用の例については、その全体において本明細書に参考として援用される、米国特許第６，２８７，８６０号においてさらに記載されている。
【０３４４】
本開示はまた、本開示のアンチセンス化合物を含む医薬組成物および製剤も含む。本開示の医薬組成物は、局所処置が望ましいのか、全身処置が望ましいのか、および処置される領域に応じて、多数の方式で投与することができる。投与は、局所投与（眼投与および膣送達および直腸送達を含む粘膜への投与を含む）、肺投与、例えば、噴霧器による投与を含む、散剤またはエアゾールによる吸入または送気による投与；気管内投与、鼻腔内投与、表皮投与および経皮投与、経口投与、または非経口投与でありうる。非経口投与は、静脈内注射もしくは静脈内注入、動脈内注射もしくは動脈内注入、皮下注射もしくは皮下注入、腹腔内注射もしくは腹腔内注入、または筋内注射もしくは筋内注入；あるいは頭蓋内投与、例えば、髄腔内投与または脳室内投与を含む。少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を伴うオリゴマーは、経口投与に特に有用であると考えられる。局所投与のための医薬組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液剤（ｌｉｑｕｉｄ）、および散剤を含みうる。従来の医薬担体、水性、粉末、または油性の基剤、増粘剤などが、必要であるかまたは望ましい場合がある。コーティングされたコンドーム、手袋などもまた、有用でありうる。
【０３４５】
単位剤形で提示されると好都合でありうる本開示の医薬製剤は、製薬業界で周知の従来の技法に従い調製することができる。このような技法は、有効成分を、医薬担体または賦形剤と会合させるステップを含む。一般に、製剤は、有効成分を、液体担体もしくは微細に分割された固体担体、またはこれらの両方と、均一かつ十分に会合させ、次いで、必要な場合、生成物を成形することにより調製する。
【０３４６】
本開示の組成物は、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟質ゲル、坐剤、および浣腸剤（ｅｎｅｍａ）などであるがこれらに限定されない、多くの可能な剤形のうちのいずれかへと製剤化することができる。本開示の組成物はまた、水性媒体中、非水性媒体中、または混合媒体中の懸濁物としても製剤化することができる。水性懸濁物は、懸濁物の粘性を増加させる物質であって、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む物質をさらに含有しうる。懸濁物はまた、安定化剤も含有しうる。
【０３４７】
本開示の医薬組成物は、溶液、エマルジョン、泡沫、およびリポソームを含有する製剤を含むがこれらに限定されない。本開示の医薬組成物および製剤は、１または複数の浸透増強剤、担体、賦形剤、または他の活性成分もしくは不活性成分を含みうる。
【０３４８】
エマルジョンは、通常０．１μｍの直径を超える液滴の形態で、別の液体中に分散させた１つの液体による不均質系であることが典型的である。エマルジョンは、分散相に加えたさらなる成分と、水相中、油相中の溶液、または分離相としてのそれ自体として存在しうる活性薬物とを含有しうる。マイクロエマルジョンは、本開示の実施形態として含まれる。当技術分野では、エマルジョンおよびそれらの使用が周知であり、その全体において本明細書に参考として援用される、米国特許第６，２８７，８６０号においてさらに記載されている。
【０３４９】
本開示の製剤は、リポソーム製剤を含む。本開示で使用される「リポソーム」という用語は、１または複数の球状の二重層内に配置された、両親媒性脂質から構成される小胞を意味する。リポソームとは、親油性材料から形成された膜と、送達される組成物を含有する水性の内部とを有する、単層または多重層の小胞である。カチオン性リポソームは、正に荷電したリポソームであり、負に荷電したＤＮＡ分子と相互作用して、安定的な複合体を形成すると考えられる。ｐＨ感受性であるか、または負に荷電したリポソームは、ＤＮＡと複合体化するのではなく、ＤＮＡを捕獲すると考えられる。カチオン性リポソームおよび非カチオン性リポソームのいずれも、ＤＮＡを、細胞へと送達するのに使用されている。
【０３５０】
リポソームはまた、本明細書で使用される用語であって、１または複数の特殊化された脂質を含むリポソームを指す、「立体安定化」リポソームも含み、この脂質は、リポソームへと組み込まれると、このような特殊化された脂質を欠くリポソームと比べて、循環寿命の増強を結果としてもたらす。立体安定化リポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が、１もしくは複数の糖脂質を含むか、またはリポソームの小胞形成脂質部分の一部を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分など、１もしくは複数の親水性ポリマーで誘導体化した立体安定化リポソームである。リポソームおよびそれらの使用については、その全体において本明細書に参考として援用される、米国特許第６，２８７，８６０号においてさらに記載されている。
【０３５１】
本開示の医薬製剤および医薬組成物はまた、界面活性剤も含みうる。当技術分野では、薬物製品中、製剤中、およびエマルジョン中の界面活性剤の使用が周知である。界面活性剤およびそれらの使用については、その全体において本明細書に参考として援用される、米国特許第６，２８７，８６０号においてさらに記載されている。
【０３５２】
一部の実施形態では、本開示は、多様な浸透増強剤を使用して、核酸、特に、オリゴマーの効率的な送達を行う。細胞膜を横切る非親油性薬物の拡散の支援に加えて、浸透増強剤はまた、親油性薬物の透過性も増強する。浸透増強剤は、５つの大きな類別、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤のうちの１つに属するものとして分類することができる。浸透増強剤およびそれらの使用については、その全体において本明細書に参考として援用される、米国特許第６，２８７，８６０号においてさらに記載されている。
【０３５３】
当業者は、製剤が、それらの意図される使用、すなわち、投与経路に従い、慣例的にデザインされることを認識するであろう。
【０３５４】
局所投与のための製剤は、本開示のオリゴマーを、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤、および界面活性剤など、局所送達剤と混合した製剤を含む。脂質およびリポソームは、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＰＥ、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）、およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）を含む。
【０３５５】
局所投与または他の投与のために、本開示のオリゴマーを含む治療剤を、リポソーム内に封入することもでき、リポソーム、特に、カチオン性リポソームとの複合体を形成することもできる。代替的に、治療剤は、脂質、特に、カチオン性脂質と複合体化させることもできる。脂肪酸およびエステル、薬学的に許容されるそれらの塩、ならびにそれらの使用については、その全体において本明細書に参考として援用される、米国特許第６，２８７，８６０号においてさらに記載されている。局所製剤については、それらの全体において本明細書に参考として援用される、１９９９年５月２０日に出願された、米国特許出願第０９／３１５，２９８号およびＭｏｕｒｉｃｈら，２００９，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  １２９（８）：１９４５−５３において詳細に記載されている。
【０３５６】
経口投与のための組成物および製剤は、粉末または顆粒、マイクロ粒子、ナノ粒子、水中または非水性媒体中の懸濁物または溶液、カプセル、ゲルカプセル、小袋（ｓａｃｈｅｔ）、錠剤またはミニ錠剤（ｍｉｎｉｔａｂｌｅｔ）を含む。増粘剤、矯味矯臭剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましい場合がある。経口製剤は、本開示のオリゴマーを、１または複数の浸透増強剤、界面活性剤、およびキレート剤と共に投与する経口製剤である。界面活性剤は、脂肪酸および／またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸および／またはその塩を含む。胆汁酸／塩および脂肪酸ならびにそれらの使用については、その全体において本明細書に参考として援用される、米国特許第６，２８７，８６０号においてさらに記載されている。一部の実施形態では、本開示は、浸透増強剤の組合せ、例えば、胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩を提示する。例示的な組合せは、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透増強剤は、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルを含む。本開示のオリゴマーは、経口送達することもでき、噴霧乾燥粒子を含む顆粒形態で送達することもでき、マイクロ粒子またはナノ粒子を形成するように複合体化させることもできる。オリゴマー複合体化剤およびそれらの使用については、その全体において本明細書に参考として援用される、米国特許第６，２８７，８６０号においてさらに記載されている。オリゴマーのための経口製剤およびそれらの調製については、それらの全体において本明細書に参考として援用される、米国出願第０９／１０８，６７３号（１９９８年７月１日に出願された）、同第０９／３１５，２９８号（１９９９年５月２０日に出願された）、および同第１０／０７１，８２２号（２００２年２月８日に出願された）において詳細に記載されている。
【０３５７】
非経口投与、髄腔内投与、または脳室内投与のための組成物および製剤は、浸透増強剤、担体化合物、および他の薬学的に許容される担体または賦形剤などであるがこれらに限定されない、緩衝液、希釈剤および他の適切な添加剤もまた含有しうる、滅菌水溶液を含みうる。
【０３５８】
別の関連する実施形態では、本開示の組成物は、第１の核酸へとターゲティングされた、１または複数のアンチセンス化合物、特にオリゴマーと、第２の核酸標的へとターゲティングされた、１または複数のさらなるアンチセンス化合物とを含有しうる。代替的に、本開示の組成物は、同じ核酸標的の異なる領域へとターゲティングされた、２つまたはこれを超えるアンチセンス化合物を含有しうる。当技術分野では、アンチセンス化合物の多数の例が公知である。２つまたはこれを超える組合せ化合物を、併せて使用することもでき、逐次的に使用することもできる。
【０３５９】
Ｖ．使用方法
ある特定の態様は、ミオスタチン治療剤を受けている被験体に、ジストロフィン治療剤も投与するステップを含む、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたは関連障害を有する被験体を処置する方法に関する。
【０３６０】
複数の態様では、治療剤は、ＤＭＤまたは関連障害を有する被験体に投与される。複数の実施形態では、１または複数の治療剤は、本明細書で記載される通りの修飾アンチセンスオリゴマーによる処置の前に被験体に投与され得る。複数の実施形態では、１または複数の治療剤は、修飾アンチセンスオリゴマーの投与前、それと同時、または投与後に被験体に投与され得る。複数の実施形態では、治療剤はタンパク質または核酸である。一部の実施形態では、タンパク質は抗体または可溶性受容体である。複数の実施形態では、可溶性受容体はＡＣＶＲ２である。複数の実施形態では、核酸はアンチセンスオリゴマーまたはｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、本明細書で記載される通りの修飾アンチセンスオリゴマーである。
【０３６１】
複数の実施形態では、治療剤は、被験体におけるミオスタチン活性またはミオスタチン発現のうちの一方または両方を抑制できるミオスタチン治療剤である。ミオスタチン治療剤は、ミオスタチンプレｍＲＮＡを標的とし、ミオスタチンプレｍＲＮＡの成熟ｍＲＮＡへの転写に干渉する治療剤であり得る。複数の実施形態では、ミオスタチン治療剤は、ヒトミオスタチンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できる。複数の実施形態では、ミオスタチン治療剤は、ミオスタチンプレｍＲＮＡにおけるエクソン２のスキッピングを誘導し、エクソン２を含むミオスタチンプレｍＲＮＡの発現を阻害する。ミオスタチン治療剤は、ミオスタチンタンパク質を標的とし、ミオスタチン受容体とのミオスタチンタンパク質の結合に干渉する治療剤であり得る。
【０３６２】
ミオスタチン治療剤は、タンパク質および核酸から選択される。タンパク質は、抗ミオスタチン抗体、例えば、抗ＧＤＦ８（Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ  ＭＡ）、または可溶性受容体であり得る。複数の実施形態では、可溶性受容体はＡＣＶＲ２である。核酸は、アンチセンスオリゴマーおよびｓｉＲＮＡから選択される。アンチセンスオリゴマーは、本明細書で記載される通りの修飾ミオスタチンアンチセンスオリゴマーであり得る。
【０３６３】
複数の実施形態では、治療剤は、被験体においてジストロフィンを増加させることができるジストロフィン治療剤である。ジストロフィン治療剤は、機能的または半機能的なジストロフィンまたは切断型ジストロフィンの発現を増加させ得る。切断型ジストロフィンは、マイクロジストロフィンおよびミニジストロフィン（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる欧州特許第２１２５００６号に開示）を含むが、これらに限定されない。ジストロフィン治療剤は、ジストロフィンプレｍＲＮＡを標的とし、ジストロフィンプレｍＲＮＡの成熟ｍＲＮＡへの転写をモジュレートする治療剤であり得る。複数の実施形態では、ジストロフィン治療剤は、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングを誘導できる。複数の実施形態では、標的とされるジストロフィンプレｍＲＮＡは、１または複数の遺伝子変異を有する。ジストロフィン治療剤は、エクソンスキッピングを誘導し、それにより、１または複数の遺伝子変異を含む１または複数のエクソンは、成熟ｍＲＮＡへのプロセシングの間、ジストロフィンプレｍＲＮＡから除去される。得られる切断型ｍＲＮＡは、機能的または半機能的なジストロフィンタンパク質への翻訳が可能である。
【０３６４】
一部の態様では、修飾ジストロフィンアンチセンスオリゴマーは、ジストロフィン遺伝子のプレｍＲＮＡ内で領域と特異的にハイブリダイズするのに十分な長さおよび相補性のヌクレオチド配列を含み、修飾アンチセンスオリゴマーが当該領域に結合することにより、ジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングが誘導される。複数の実施形態では、ジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセシングの間のエクソンスキッピングにより、遺伝子変異を有する１または複数のエクソンがプレｍＲＮＡから除去される。複数の実施形態では、遺伝子変異を有する１または複数のエクソンのジストロフィンプレｍＲＮＡからの除去により、細胞および／または被験体の組織における非変異ジストロフィンプレｍＲＮＡのレベルが上昇する。被験体における非変異ジストロフィンプレｍＲＮＡのレベルの上昇は、機能的または半機能的なジストロフィンタンパク質の発現の増加にさらにつながり得る。このように、本開示は、本明細書で記載される通りの修飾ジストロフィンアンチセンスオリゴマーを使用して、非変異ジストロフィンｍＲＮＡのレベルを上昇させることにより、機能的または半機能的なジストロフィンタンパク質を増加させる方法に関する。
【０３６５】
一部の態様では、修飾ミオスタチンアンチセンスオリゴマーは、ミオスタチン遺伝子のプレｍＲＮＡ内の領域と特異的にハイブリダイズするのに十分な長さおよび相補性のヌクレオチド配列を含み、修飾アンチセンスオリゴマーが当該領域に結合することにより、ミオスタチンプレｍＲＮＡのプロセシングの間、エクソンスキッピングが誘導される。複数の実施形態では、修飾ミオスタチンオリゴマーが当該領域に結合することにより、細胞および／または被験体の組織におけるエクソン２含有ミオスタチンｍＲＮＡのレベルが低下する。被験体におけるエクソン２含有ミオスタチンｍＲＮＡのレベルの低下は、機能的なミオスタチンタンパク質の発現の減少にさらにつながり得る。
【０３６６】
方法は、治療剤と組み合わせて、有効量の本開示の修飾アンチセンスオリゴマーを被験体に投与することを含む、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）もしくは関連障害に罹患している、またはそれを発症する危険性がある個体を処置するステップを含む。修飾アンチセンスオリゴマーは、同じ組成物中にあってもなくてもよく、また、被験体に共投与されてもされなくてもよい。多様な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、治療剤と同時に、またはほぼ同時に投与される。さらなる実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、治療剤とは実質的に異なる時間に投与される。本明細書で記載される通りの修飾アンチセンスオリゴマーにより標的とされる例示的な配列を、表１および２に示す。
【０３６７】
また、ＤＭＤもしくは関連障害を処置するための、または、ＤＭＤもしくは関連障害の処置のための医薬の調製に使用するための、治療剤および修飾アンチセンスオリゴマーが含まれ、処置または医薬には治療剤が含まれる。複数の実施形態では、医薬は、本明細書で記載される通りの修飾アンチセンスオリゴマーを含み、例えば、修飾アンチセンスオリゴマーは、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットと、ジストロフィンまたはミオスタチンプレｍＲＮＡ内の標的領域内の１０またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列とを任意選択で有する１０〜５０サブユニットを含む。
【０３６８】
多様な実施形態では、ターゲティング配列は、ミオスタチンプレｍＲＮＡ内の標的領域と相補的である。一部の実施形態では、ターゲティング配列は、エクソン２内に完全にありターゲティング配列のいかなる部分もスプライス接合部にわたらない標的領域内の１２もしくはこれを超える連続ヌクレオチド、または、ミオスタチンプレｍＲＮＡのイントロン／エクソンもしくはエクソン／イントロンのスプライス接合部（例えば配列番号１〜３）にわたる領域と相補的である。一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーのターゲティング配列は、（ａ）配列番号１６〜７５から選択される配列を含むか、（ｂ）配列番号１６〜７５から選択されるか、
（ｃ）配列番号１６〜７５から選択される配列の少なくとも１２の連続ヌクレオチドの断片であるか、または、（ｄ）配列番号１６〜７５から選択される配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体であり、Ｘはウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から選択され、Ｃはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から選択される。
【０３６９】
多様な実施形態では、ターゲティング配列は、ジストロフィンプレｍＲＮＡ内の標的領域と相補的である。一部の実施形態では、ターゲティング配列は、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１９、エクソン２３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３またはエクソン５５から選択される、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン内で、標的領域内の１０またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的である。複数の実施形態では、標的領域は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン内に完全にありターゲティング配列のいかなる部分もスプライス接合部にわたらないか、またはジストロフィンプレｍＲＮＡのイントロン／エクソンもしくはエクソン／イントロンのスプライス接合部（例えば配列番号４〜１５）にわたる領域である。一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーのターゲティング配列は、（ａ）配列番号７６〜３４８５から選択される配列を含むか、（ｂ）配列番号７６〜３４８５から選択されるか、（ｃ）配列番号７６〜３４８５から選択される配列の少なくとも１０の連続ヌクレオチドの断片であるか、または、（ｄ）配列番号７６〜３４８５から選択される配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体であり、Ｘはウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から選択され、Ｃはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から選択される。
【０３７０】
一部の実施形態では、ＤＭＤもしくは関連障害を処置する方法、またはＤＭＤもしくは関連障害を処置するための医薬は、修飾糖部分を含むヌクレオチド類似体サブユニットを有する修飾アンチセンスオリゴマーを含む。修飾糖部分は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）サブユニット、ロックト核酸（ＬＮＡ）サブユニット、２’Ｏ，４’Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）サブユニット、トリシクロＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）サブユニット、２’Ｏ−メチルサブユニット、２’Ｏ−メトキシエチルサブユニット、２’−フルオロサブユニット、２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］サブユニット、およびモルホリノサブユニットから選択されうる。
【０３７１】
これらのさらなる態様および実施形態は、修飾ヌクレオシド間連結を含む、ヌクレオチド類似体サブユニットを有する、修飾アンチセンスオリゴマーを含む。多様な実施形態では、修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結から選択される。さらなる実施形態では、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結は、（１，４−ピペラジン）−１−イル部分、置換（１，４−ピペラジン）−１−イル部分、４−アミノピペリジン−１−イル部分、または置換４−アミノピペリジン−１−イル部分に共有結合したリン原子を含む。
【０３７２】
これらのさらなる態様および実施形態は、修飾糖部分と修飾ヌクレオシド間連結との少なくとも１つの組合せを含む、ヌクレオチド類似体サブユニットを有する、修飾アンチセンスオリゴマーを含む。
【０３７３】
一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、哺乳動物細胞により能動的に取り込まれる。さらなる実施形態では、かかる取り込みを促進するために、本明細書で記載される通り修飾アンチセンスオリゴマーを輸送部分（例えば輸送ペプチドまたはＣＰＰ）とコンジュゲートさせてもよい。多様な態様は、本明細書で記載される通りの修飾アンチセンスオリゴマーを使用して、細胞、組織および／または被験体における、エクソン２含有ミオスタチンｍＲＮＡ転写物および／または機能的なミオスタチンタンパク質の発現を減少させる方法に関する。一部の場合では、エクソン２含有ミオスタチンｍＲＮＡ転写物および／または機能的なミオスタチンタンパク質は、対照、例えば対照細胞／被験体（例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィーまたは関連障害を有さない被験体）、修飾アンチセンスオリゴマーを含まない対照組成物、処置の欠如および／または当初の時点と比較して、約または少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％減少するか、または低下する。また、健常対照、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたは関連障害を有さない被験体のレベルと比較して、エクソン２含有ｍＲＮＡ転写物または機能的なミオスタチンタンパク質の発現を減少させる方法が含まれる。本明細書で使用するとき、「有効量」または「治療的な量」とは、被験体に投与されたとき、ミオスタチンプレｍＲＮＡ転写物の標的領域と結合し、対照細胞／被験体と比較して、増加に関して開示したパーセンテージの範囲で、エクソン２含有ミオスタチンｍＲＮＡ転写物および機能的なミオスタチンタンパク質の発現を減少させることができる、修飾アンチセンスオリゴマーの用量を指す。
【０３７４】
多様な態様は、本明細書で記載される通りの修飾アンチセンスオリゴマーを使用して、ジストロフィンプレｍＲＮＡのイントロンおよびエクソンのスプライシングをモジュレートし、細胞、組織および／または被験体におけるジストロフィンまたは切断型ジストロフィンプレｍＲＮＡの発現を増加させる方法に関する。さらなる態様では、例えば全長野生型ジストロフィンプレｍＲＮＡと比較して、切断型ジストロフィンプレｍＲＮＡの発現が強化される。一部の場合において、ジストロフィンｍＲＮＡ転写物および／または機能的もしくは半機能的なジストロフィンタンパク質は、対照、例えば、対照細胞／被験体（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたは関連障害を有さない被験体）、修飾アンチセンスオリゴマーを含まない対照組成物、処置の欠如および／または当初の時点と比較して、約または少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％増加するか、または強化される。方法はまた、健常対照、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィーまたは関連障害を有さない被験体のレベルと比較して、ジストロフィンｍＲＮＡ転写物または機能的もしくは半機能的なジストロフィンタンパク質の発現を増加させるステップを含む。本明細書で使用するとき、「有効量」または「治療的な量」は、被験体に投与されたとき、ジストロフィンプレｍＲＮＡ転写物の標的領域と結合し、対照細胞／被験体と比較て、増加に関して開示したパーセンテージの範囲で、ジストロフィンまたは切断型ジストロフィンｍＲＮＡ転写物、および機能的なジストロフィンタンパク質の発現を増加させることができる、修飾アンチセンスオリゴマーの用量を指す。
【０３７５】
方法はまた、本明細書で記載される通り、細胞、組織および／または被験体における機能的／活性型ミオスタチンタンパク質の発現を減少させるステップを含む。ある特定の場合において、機能的／活性型ミオスタチンタンパク質のレベルは、対照、例えば、対照細胞／被験体（例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィーまたは関連障害を有する被験体）、治療剤を含まない対照組成物、処置の欠如および／または当初の時点と比較して、約または少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％減少する。方法はまた、影響を受けた対照、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィーまたは関連障害を有する被験体のレベルと比較して、機能的／活性型ミオスタチンタンパク質の発現を減少させるステップを含む。
【０３７６】
方法はまた、本明細書で記載される通り、細胞、組織および／または被験体における機能的または半機能的／活性型ジストロフィンタンパク質の発現を増加させるステップを含む。ある特定の場合において、機能的または半機能的／活性型ジストロフィンタンパク質のレベルは、対照、例えば、対照細胞／被験体（例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィーまたは関連障害を有さない被験体）、治療剤を含まない対照組成物、処置の欠如および／または当初の時点と比較して、約または少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％増加する。方法はまた、影響を受けた対照、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたは関連障害を有する被験体のレベルと比較して、機能的または半機能的／活性型ジストロフィンタンパク質の発現を増加させるステップを含む。
【０３７７】
方法はまた、本明細書で記載される通りのアンチセンスオリゴマーと組み合わせて治療剤を使用して、被験体におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害の進行を阻害するステップを含む。
【０３７８】
一部の実施形態では、治療剤および修飾アンチセンスオリゴマーを、１または複数の適切な医薬担体中で、ＤＭＤまたは関連障害の１または複数の症状を呈示する被験体に投与する。本明細書で使用するとき、「処置」という用語は、ＤＭＤもしくは関連障害、またはＤＭＤもしくは関連障害に関連する少なくとも１つの識別可能な症状の改善を指す。一部の実施形態では、「処置」は、被験体によって必ずしも識別可能ではない少なくとも１つの測定可能な物理的および／または生物学的パラメータの改善を指す。被験体は、例えば筋力および協調の物理的な改善を経験する場合がある。それらのパラメータは、例えば自己評価試験、医師の検査、物理的および生理学的測定のための実験室検査、ならびに被験体からの試料の生物学的試験により評価され得る。別の実施形態では、「処置」とは、ＤＭＤまたは関連障害の進行を遅延させるか、または進行を逆転させることを指す。本明細書で使用するとき、「予防する」または「阻害する」は、ＤＭＤまたは関連障害の発症を遅延させるか、またはそれが発症する危険性を低下させることを指す。
【０３７９】
方法は、それを必要とする被験体において、ＤＭＤおよび関連障害の１または複数の症状を適宜、軽減または改善するステップを含む。具体的な例は、頻繁な転倒、臥位または座位からの立ち上がりの困難さ、走行および跳躍の困難さ、アヒル歩行、つま先歩行、ヒラメ筋肉肥大、筋肉の痛みおよび凝りおよび学習障害などの、段階的筋衰弱の症状を含む。
【０３８０】
方法はまた、被験体における骨格筋量を増加させるステップを含む。方法はまた、健常な被験体または疾患、障害もしくは症状に罹患する被験体において、被験体の筋肉量の減少を処置または予防するステップを含む。方法はまた、疾患、障害または状態に罹患する被験体の骨格筋量不足を処置するステップを含む。多様な実施形態では、ミオスタチンおよびジストロフィンタンパク質の一方または両方の血液中または組織レベルは、治療剤および本明細書で記載されるアンチセンスオリゴマーの一方または両方の投与前に患者において測定する。有効量の、治療剤および本明細書のアンチセンスオリゴマーの一方または両方が被験体に投与される。ミオスタチンおよびジストロフィンタンパク質の一方または両方の血液中または組織中レベルは、選択した時間およびアンチセンスオリゴマーの投与の後、被験体において測定する。任意選択で、治療剤およびアンチセンスオリゴマーの一方または両方の投与量および／または投薬スケジュールは、測定により調整し、例えば、一方または両方の治療的な量が被験体において存在することを確実にするために投与量を増加させる。選択した時間は、本明細書で記載される治療剤およびアンチセンスオリゴマーのうちの一方または両方の投与後の、血流中への吸収ならびに／または肝臓および他の代謝プロセスによる代謝に要する時間を見越した時間の量を含み得る。一部の実施形態では、選択した時間は、投与後約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１８、２０、２２または２４時間であり得る。一部の実施形態では、選択した時間は、投与後約１２、１８または２４時間であり得る。他の実施形態では、選択した時間は、投与後約１、２、３、４、５、６または７日であり得る。
【０３８１】
このような処置と共に、ゲノム薬理学（すなわち、個体の遺伝子型と、外来化合物または薬物へのその個体の応答との関係についての研究）について考慮することもできる。治療剤の代謝の差違は、薬理学的な活性薬物の用量と血中濃度との関係を変更することにより、重度の毒性または治療の失敗をもたらしうる。こうして、医師または臨床医は、治療剤を投与すべきなのかどうかの決定においてのほか、治療剤による処置の投与量および／または治療レジメンの調整においても関与性のゲノム薬理学研究において得られる知見の適用について考慮することができる。
【０３８２】
修飾アンチセンスオリゴマーを含む治療剤の、標的核酸への有効な投与および送達は、さらなる側面である。治療剤の送達経路は、経口経路および非経口経路を含む、多様な全身経路、例えば、静脈内送達、皮下送達、腹腔内送達、および筋内送達のほか、吸入送達、経皮送達、および局所送達を含むがこれらに限定されない。適切な経路は、当業者が、処置下にある被験体の状態に適切な経路として決定することができる。血管循環または血管外循環の、血液またはリンパ系、および脳脊髄液は、ＲＮＡを導入しうる、一部の非限定的な部位である。
【０３８３】
特定の実施形態では、治療剤を、被験体に、静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）投与する、すなわち、アンチセンスオリゴマーを、静脈へと静脈内投与もしくは静脈内送達するか、または皮膚と筋肉との間の脂肪層へと皮下投与もしくは皮下送達する。静脈内注射部位の非限定的な例は、腕、手、脚、または足の静脈を含む。皮下注射部位の非限定的な例は、腹部、大腿部、下方背部（ｌｏｗｅｒ  ｂａｃｋ）、または上腕部を含む。例示的な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーのＰＭＯ形態、ＰＭＯ−Ｘ形態、またはＰＰＭＯ形態を、ＩＶ投与またはＳＣ投与する。他の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーを、被験体に、筋内内（ＩＭ）投与する、例えば、アンチセンスオリゴマーを、腕部の三角筋、脚部の外側広筋、腰部の腹側臀筋（ｖｅｎｔｒｏｇｌｕｔｅａｌ  ｍｕｓｃｌｅ）、臀部の背側臀筋（ｄｏｒｓｏｇｌｕｔｅａｌ  ｍｕｓｃｌｅ）、胸郭の横隔膜筋および内肋間筋へと投与または送達する。
【０３８４】
ある特定の実施形態では、本開示の治療剤は、経皮的な方法により（例えば、このような修飾アンチセンスオリゴマーを、任意選択で、リポソームへとパッケージングする、修飾アンチセンスオリゴマーの、例えば、エマルジョンへの組込みを介して）送達することができる。送達のこのような経皮的な方法およびエマルジョン／リポソーム媒介型の方法は、修飾アンチセンスオリゴマーの送達について、当技術分野、例えば、それらの全体において本明細書に参考として援用される、米国特許第６，９６５，０２５号において記載されている。
【０３８５】
本明細書で記載される治療剤はまた、植込み可能なデバイスを介して送達することもできる。このようなデバイスのデザインは、当技術分野で認知された工程であって、例えば、それらの全体において本明細書に参考として援用される、米国特許第６，９６９，４００号において記載されている、例えば、合成インプラントデザインを伴う工程である。
【０３８６】
当技術分野で認知された技法（例えば、トランスフェクション、電気穿孔、融合、リポソーム、コロイド状ポリマー性粒子、およびウイルスベクターおよび非ウイルスベクターのほか、当技術分野で公知の他の手段）を使用して、治療剤を、細胞へと導入することができる。選択される送達法は、例えば、オリゴマー化学、処置（処理）される細胞、および細胞の場所に依存し、そして当業者には明らかであろう。例えば、局在化は、表面上にリポソームを方向づける特異的なマーカーを伴うリポソーム、標的細胞を含有する組織への直接的な注射、特異的な受容体媒介型の取込みなどにより達成することができる。
【０３８７】
当技術分野で公知の通り、治療剤は、例えば、リポソーム媒介型の取込み、脂質コンジュゲート、ポリリシン媒介型の取込み、ナノ粒子媒介型の取込み、および受容体媒介型のエンドサイトーシスのほか、マイクロインジェクション、透過化（例えば、ストレプトリジンＯによる透過化、アニオン性ペプチドによる透過化）、電気穿孔、およびエンドサイトーシス以外の多様な非侵襲性送達法であって、当技術分野で公知の送達法など、エンドサイトーシス以外のさらなる送達方式（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＤｏｋｋａおよびＲｏｊａｎａｓａｋｕｌ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、４４巻、３５〜４９頁（２０００）を参照されたい）を伴う方法を使用して送達することができる。
【０３８８】
治療剤は、生理学的および／または薬学的に許容される、任意の好都合なビヒクルまたは担体により投与することができる。このような組成物は、薬学的に許容される、様々な標準的担体であって、当業者により使用される担体のうちのいずれかを含みうる。例は、食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、水、水性エタノール、油／水エマルジョンまたはトリグリセリドエマルジョンなどのエマルジョン、錠剤、およびカプセルを含むがこれらに限定されない。生理学的に許容される適切な担体の選出は、選び出される投与方式に応じて変動するであろう。「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与に適合性の担体など、任意で全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤を含むことを意図する。当技術分野では、薬学的に活性な物質のための、このような媒体および薬剤の使用が周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性化合物に不適合性である場合を除き、組成物中のその使用が想定される。補充の活性化合物もまた、組成物へと組み込むことができる。
【０３８９】
本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは一般に、遊離酸または遊離塩基として活用することができる。代替的に、本開示の化合物は、酸付加塩または塩基付加塩の形態で使用することもできる。本開示の遊離アミノ化合物の酸付加塩は、当技術分野で周知の方法により調製することができ、有機酸および無機酸から形成することができる。適切な有機酸は、マレイン酸、フマル酸、安息香酸、アスコルビン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、プロピオン酸、酒石酸、サリチル酸、クエン酸、グルコン酸、乳酸、マンデル酸、ケイ皮酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、グリコール酸、グルタミン酸、およびベンゼンスルホン酸を含む。
【０３９０】
適切な無機酸は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、および硝酸を含む。塩基付加塩は、カルボン酸アニオンと共に形成される塩を含み、さらに、アルカリ金属およびアルカリ土類金属（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、バリウム、およびカルシウム）から選択されるもののほか、アンモニウムイオンおよびその置換誘導体（例えば、ジベンジルアンモニウム、ベンジルアンモニウム、２−ヒドロキシエチルアンモニウムなど）などの、有機カチオンおよび無機カチオンと共に形成される塩を含む。こうして、「薬学的に許容される塩」という用語は、任意で全ての許容される塩形態を包含することを意図する。
【０３９１】
加えて、本開示の文脈にはまた、プロドラッグも含まれる。プロドラッグとは、このようなプロドラッグを、患者へと投与すると、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、化合物を放出する、共有結合した任意の担体である。プロドラッグは一般に、慣例的な操作により、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、修飾が切断されて、親化合物をもたらすように、官能基を修飾することにより調製する。プロドラッグは、例えば、本開示の化合物であって、ヒドロキシ基、アミン基、またはスルフヒドリル基を、患者へと投与されると、切断されて、ヒドロキシ基、アミン基、またはスルフヒドリル基を形成する任意の基に結合させた化合物を含む。こうして、プロドラッグの代表例は、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーのアルコール官能基およびアミン官能基の、酢酸誘導体、ギ酸誘導体、および安息香酸誘導体を含む（がこれらに限定されない）。さらに、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）の場合は、メチルエステル、エチルエステルなどのエステルも使用することができる。
【０３９２】
場合によって、リポソームを使用して、修飾アンチセンスオリゴマーの、細胞への取込みを促進することもできる（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｓ．Ａ．、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１０巻（１２号）：１９８０〜１９８９頁、１９９６年；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．、２３巻：１１９頁、１９９４年；Ｕｈｌｍａｎｎら、「ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ：  ａ  ｎｅｗ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ」、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、９０巻、４号、２５  ５４４〜５８４頁、１９９０年；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，  Ｇ．、１４章、「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、２８７〜３４１頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９７９年を参照されたい）。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１９９３／０１２８６において記載されている通り、ヒドロゲルもまた、修飾アンチセンスオリゴマーを投与するためのビヒクルとして使用することができる。代替的に、オリゴマーは、マイクロスフェアまたはマイクロ粒子により投与することもできる（例えば、Ｗｕ，  Ｇ．Ｙ．およびＷｕ，  Ｃ．Ｈ．、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６２巻：４４２９〜４４３２頁、３０  １９８７年を参照されたい）。代替的に、米国特許第６，２４５，７４７号において記載されている通り、修飾アンチセンスオリゴマーと複合体化させたガス充填マイクロバブルの使用によっても、標的組織への送達を増強することができる。持続放出組成物もまた、使用することができる。これらは、フィルムまたはマイクロカプセルなどの成形品の形態にある半透性ポリマーマトリクスを含みうる。かかる文献の各々は、その全体が本明細書において参考として援用される。
【０３９３】
一部の実施形態では、治療剤を、少なくとも２００〜４００ｎＭの治療剤のピーク血中濃度を結果としてもたらすのに有効な量および様式で投与する。一般に、約１〜２週間にわたり、定期的な間隔で、１または複数の用量の治療剤が投与されることが典型的である。経口投与に好ましい用量は、７０ｋｇ当たりのオリゴマー約１〜１０００ｍｇである。場合によって、患者１人当たりのオリゴマー１０００ｍｇを超える用量が必要でありうる。ｉ．ｖ．投与では、好ましい用量は、７０ｋｇ当たりのオリゴマー約０．５ｍｇ〜１０００ｍｇである。治療剤は、短期間にわたり、定期的な間隔で、例えば、２週間またはこれ未満にわたり、毎日投与することができる。しかし、場合によって、治療剤を、より長期間にわたり、間欠的に投与する。投与は、抗生剤または他の治療的処置の投与が後続する場合もあり、これらと共時的な場合もある。処置レジメンは、処置下の被験体についての、イムノアッセイ、他の生化学的検査および生理学的精査の結果に基づき指し示される通りに、調整することができる（用量、頻度、経路など）。
【０３９４】
本開示の治療剤を使用する、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効な処置レジメンは、持続期間、用量、頻度、および投与経路のほか、処置下の被験体の状態（すなわち、限局感染または全身感染に応答した投与と対比した予防的投与）に従い変化させることができる。したがって、このようなｉｎ  ｖｉｖｏにおける治療は、最適な治療転帰を達成するために、処置下にある特定の種類の障害に適切な検査によるモニタリング、および用量または処置レジメンにおける対応する調整を要請することが多いであろう。
【０３９５】
処置は、例えば当技術分野において公知の疾患の一般的な指標によりモニターされ得る。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与された治療剤の効能は、治療剤の投与前、その間、およびその後に被験体から採取した生体試料（組織、血液、尿など）から決定され得る。治療剤が修飾アンチセンスオリゴマーである、かかる試料のアッセイは、（１）当業者に公知の手順、例えば、電気泳動ゲル移動度アッセイを使用して、標的配列および非標的配列によるヘテロ二重鎖の形成の有無をモニターすること；（２）参照エクソン２含有ミオスタチンｍＲＮＡに関する、ミオスタチンエクソン２を含まないｍＲＮＡの量をモニターすること；または（３）ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロッティング、ＥＬＩＳＡもしくはウェスタンブロット法などの標準的な技法により決定される、１または複数の遺伝子変異を含む参照ジストロフィンｍＲＮＡに関する、１または複数の遺伝子変異を有する１または複数のエクソンを含むジストロフィンｍＲＮＡを含まないｍＲＮＡの量をモニターすることを含む。一部の実施形態では、処置は症状評価によりモニターされる。それらの評価は、自己評価、医師の検査、筋肉のサイズ、筋肉量、筋力、反射、無意識筋運動の測定を含む運動機能テスト（例えば握力試験）、電気生理学的試験、筋線維および中心核を有する線維の数、ならびに心電図（ＥＫＧまたはＥＧＧ）などの心血管機能試験を含む。
【０３９６】
一部の実施形態では、本明細書で記載される方法はまた、別の治療剤と組み合わせた投与を含む。このさらなる治療剤は、本発明の治療剤（単数または複数）の投与の前に、それと並行して、または並行せずに、例えば、その後投与され得る。例えば、治療剤はステロイドおよび／または抗生物質と組み合わせて投与され得る。別の例では、患者は、エテプリルセンの投与の前に、コルチコステロイドを用いて処置（例えば４〜６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４週もしくはこれを超える週、一定用量のコルチコステロイド）されている。ステロイドは、糖質コルチコイドまたはプレドニゾンであってもよい。コルチゾールなどの糖質コルチコイドは、炭水化物、脂肪およびタンパク質代謝を制御し、リン脂質の放出を防止することにより抗炎症性であり、それにより好酸球作用およびいくつかの他の作用機序を減少させる。アルドステロンなどの鉱質コルチコイドは、主に腎臓におけるナトリウム貯留を促進することにより、電解質および水分のレベルを制御する。コルチコステロイドは、脊椎動物の副腎皮質で天然に産生されるステロイドホルモン、および実験室で合成されるこれらのホルモンの類似体を含む、化学物質の種類である。コルチコステロイドは、ストレス応答、免疫応答、ならびに炎症、糖質代謝、タンパク質異化、血中電解質レベルおよび挙動の調節など、広範囲にわたる生理学的プロセスに関与する。コルチコステロイドは、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロンおよびプレドニゾンを含むが、これらに限定されない。本発明の組成物の投与の前に、それと並行して、またはその後に投与され得る、目的の、１つの特定のステロイドは、デフラザコルト（ｄｅｆｌａｚａｃｏｒｔ）およびその製剤である（例えばＭＰ−１０４、Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ＬＬＣ）。
【０３９７】
一部の実施形態では、治療剤（例えばエテプリルセンなどの治療用オリゴヌクレオチド）の投与量は、ＤＭＤを処置するのに十分な期間中、約３０ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、治療剤は、患者に、例えば週１回、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ｍｇ／ｋｇ）の用量で投与される。一部の実施形態では、治療剤は、患者に、例えば週１回、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２８ｍｇ／ｋｇ〜約３２ｍｇ／ｋｇまたは約３０ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ）の用量で投与される。
【０３９８】
一部の実施形態では、治療剤は週１回静脈内投与される。ある特定の実施形態では、注入時間は約１５分から約４時間までである。一部の実施形態では、注入時間は約３０分から約３時間までである。一部の実施形態では、注入時間は約３０分から約２時間までである。一部の実施形態では、注入時間は約１時間から約２時間までである。一部の実施形態では、注入時間は約３０分から約１時間までである。一部の実施形態では、注入時間は約６０分である。一部の実施形態では、注入時間は３５〜６０分である。
【０３９９】
ＶＩ．投薬
治療用組成物の製剤化およびそれらのその後における投与（投薬）は、当業者の技術の範囲内にあると考えられる。投薬は、処置される疾患状態の重症度および応答性に依存し、処置の過程は、数日間から数カ月間にわたり持続するか、または治癒がなされるか、もしくは疾患状態の減殺が達成されるまで持続する。最適の投薬スケジュールは、患者の体内の薬物蓄積の測定値から計算することができる。当業者は、最適の投与量、投薬法、および反復速度を容易に決定することができる。最適の投与量は、個々のオリゴマーの相対的効力に応じて変動させることができ、一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの動物モデルにおいて有効であることが見出されているＥＣ５０に基づき推定することができる。一般に、投与量は、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｇであり、毎日、毎週、毎月、もしくは毎年１回もしくは複数回にわたり、なおまたは２〜２０年間ごとに１回施すことができる。当業者は、体液中または組織内の、薬物の測定された滞留時間および濃度に基づき、投薬の反復速度を、容易に推定することができる。処置が成功した後、患者に、疾患状態の再発を防止する維持療法であって、オリゴマーを、経口投与のためには、体重７０ｋｇ当たり１〜１０００ｍｇのオリゴマー、またはｉ．ｖ．投与のためには、体重７０ｋｇ当たり０．５ｍｇ〜１０００ｍｇのオリゴマーの範囲の維持用量で、毎日１回または複数回〜２０年ごとに１回投与する維持療法を受けさせることが望ましい場合がある。
【０４００】
その実施形態のうちのいくつかに従い、本開示について具体的に記載してきたが、以下の実施例は、本開示を例示することだけに資するものであり、これを限定することを意図するものではない。本出願で列挙される、参考文献、特許、特許出願、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号などの各々は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０４０１】
ＶＩ．実施例
以下の実施例は、例示を目的として使用することができ、本発明の範囲を狭めるものと考えるべきではない。
【０４０２】
本開示の修飾アンチセンスオリゴマー（図１Ａ〜１Ｇに図示）を、ジストロフィンまたはミオスタチンプレｍＲＮＡ転写物内の標的領域と結合するようデザインし、以下のプロトコールを使用して調製した。
【０４０３】
活性サブユニットの調製手順Ａ：
【化７９】
2018530560.tif 000088
【０４０４】
ジクロロメタン中の撹拌溶液６（１当量）に、ＰＯＣｌ３（１．１当量）を添加し、続いて０℃でジイソプロピルエチルアミン（３当量）を添加し、氷浴で冷却した。１５分後、氷浴を除去し、溶液を１時間室温へと温めた。反応が完了したら、反応溶液をジクロロメタンで希釈し、１０％のクエン酸水溶液で３回洗浄した。ＭｇＳＯ４で乾燥させた後、有機層をシリカゲルプラグに通し、減圧中で濃縮した。得られるホスホロアミドジクロリド（４）をさらに精製せずに次のステップで直接使用した。
【０４０５】
ホスホロアミドジクロリド（４）（１当量）の溶液に、ジクロロメタン中の２，６−ルチジン（１当量）、Ｍｏ（Ｔｒ）Ｔ（７）（０．５当量）／ジクロロメタン溶液を添加し、続いてＮ−メチルイミダゾール（０．２当量）を添加した。反応液を室温で終夜撹拌した。反応が完了したら、反応溶液をジクロロメタンで希釈し、１０％のクエン酸水溶液で３回洗浄した。ＭｇＳＯ４で乾燥させた後、有機層を濾過し、次いで濃縮した。生成物（８）をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサンの勾配で溶出）により精製し、次いで−２０℃で保存した。ＬＣＭＳ分析により構造を確認した。
【０４０６】
活性化サブユニットの調製手順Ｂ：
【化８０】
2018530560.tif 000089
【０４０７】
ジクロロメタン中のＰＯＣｌ３（１．１当量）溶液に、２，６−ルチジン（２当量）を添加し、続いて０℃でＭｏ（Ｔｒ）Ｔ（７）（１当量）／ジクロロメタン溶液を滴下添加した。１時間後、反応溶液をジクロロメタンで希釈し、１０％のクエン酸水溶液で３回、手早く洗浄した。ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を蒸発させた後、所望のホスホジクロリデート（９）を得た。
【０４０８】
ジクロロメタン中のホスホジクロリデート（１当量）溶液に、０℃でアミン（１当量）／ジクロロメタンを溶液への滴下により添加した。１５分後、反応混合物を約１時間、室温へと温めた。反応が完了したら、ヘキサンを添加して沈殿させ、続いて濾過することによって、白色固体としての生成物（８）を回収した。生成物を減圧下で乾燥させた後、−２０℃で保存した。ＬＣＭＳ分析により構造を確認した。
（実施例１）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチルホスホロジクロリデート
【化８１】
2018530560.tif 000090
【０４０９】
オキシ塩化リン（２．１２ｍＬ、２２．７ｍｍｏｌ）の冷却（氷／水浴）ＤＣＭ溶液（２０ｍＬ）に、２，６−ルチジン（４．８２ｍＬ、４１．４ｍｍｏｌ）を滴下添加し、次いで、Ｍｏ（Ｔｒ）Ｔ（２）（１０．０ｇ、２０．７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（２０ｍＬ）を１５分にわたり滴下添加し（内部温度：０〜１０℃）、次いで浴槽を除去し、２０分間周囲温度で撹拌を継続させた。反応物をクエン酸溶液（４０ｍＬ×３、１０％ｗ／ｖ水溶液）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、白色泡状物（９．７９ｇ）となるまで濃縮し、次いで以下の手順に直接使用した。
（実施例２）
（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（ジメチルアミノ）ピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化８２】
2018530560.tif 000091
【０４１０】
実施例１で得たジクロロホスフェート（５．００ｇ、５．００ｍｍｏｌ）の冷却（氷／水浴）ＤＣＭ溶液（５ｍＬ）に、ピペリジン（０．６１ｇ、４．７６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（５ｍＬ）を滴下添加し、次いで浴槽を除去し、周囲温度で３０分間撹拌を継続させた。反応物をカラム上に直接ロードした。［ＳｉＯ２カラム（４０ｇ）、ＤＣＭ／ＥｔＯＨ溶出液（勾配１：０〜１：１）］でのクロマトグラフィーにより、白色泡状物として表題化合物（２．５ｇ）を得た。１（４ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４６Ｈ５５Ｎ８Ｏ７ＰのＥＳＩ／ＭＳ：計算値８６２．４、実測値ｍ／ｚ＝８６３．６（Ｍ＋１）。
（実施例３）
１−（１−（クロロ（（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メトキシ）ホスホリル）ピペリジン−４−イル）−１−メチルピロリジン−１−イウムクロリド
【化８３】
2018530560.tif 000092
【０４１１】
実施例２に記載の方法と類似の方法で表題化合物を合成し、白色固体として表題化合物（０．６ｇ）を得た。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４９Ｈ６０Ｎ８Ｏ７ＰのＥＳＩ／ＭＳ：計算値９０３．４、実測値ｍ／ｚ＝９０３．７（Ｍ＋）。
（実施例４）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−メチルピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化８４】
2018530560.tif 000093
【０４１２】
オキシ塩化リン（１．０２ｍＬ、１１．０ｍｍｏｌ）の冷却（氷／水浴）ＤＣＭ溶液（１０ｍＬ）に、２，６−ルチジン（３．４９ｍＬ、２９．９ｍｍｏｌ）を滴下添加し、次いでメチルピペラジン（１．００ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１０ｍＬ）を滴下添加し、１時間撹拌を継続させた。Ｍｏ（Ｔｒ）Ｔ（２）（４．８２、１０．０ｍｍｏｌ）およびＮＭＩ（７９μＬ、１．０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１０ｍＬ）を添加し、４時間撹拌し、次いでカラム上に直接ロードした。
【０４１３】
（ＳｉＯ２カラム（８０ｇ）、ＤＣＭ／アセトン（勾配１：０〜０：１）、２％のＴＥＡ溶出液）でのクロマトグラフィーにより、白色泡状物として表題化合物（０．８ｇ）を得た。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４３Ｈ４８Ｎ７Ｏ８ＰのＥＳＩ／ＭＳ：計算値８３４．４、実測値ｍ／ｚ＝８３５．５（Ｍ＋１）。
（実施例５）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−エチルピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化８５】
2018530560.tif 000094
【０４１４】
実施例４に記載の方法と類似の方法で表題化合物を合成し、白色泡状物として表題化合物（１１．５ｇ）を得た。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４５Ｈ５３Ｎ８Ｏ７ＰのＥＳＩ／ＭＳ：計算値８４８．４、実測値ｍ／ｚ＝８４９．７（Ｍ＋１）。
（実施例６）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（６−ベンズアミド−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−エチルピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化８６】
2018530560.tif 000095
【０４１５】
実施例４に記載の方法と類似の方法で表題化合物を合成し、白色泡状物として表題化合物（４．５ｇ）を得た。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ５２Ｈ５６Ｎ１１Ｏ６ＰのＥＳＩ／ＭＳ：計算値９６１．４、実測値ｍ／ｚ＝９６２．８（Ｍ＋１）。
（実施例７）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−イソプロピルピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化８７】
2018530560.tif 000096
【０４１６】
実施例４に記載の方法と類似の方法で表題化合物を合成し、白色泡状物として表題化合物（３．５ｇ）を得た。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４６Ｈ５５Ｎ８Ｏ７ＰのＥＳＩ／ＭＳ：計算値８６２．４、実測値ｍ／ｚ＝８６３．７（Ｍ＋１）。
（実施例８）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチルメチル（２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチル）ホスホルアミドクロリデート
【化８８】
2018530560.tif 000097
【０４１７】
実施例４に記載の方法と類似の方法により表題化合物を合成し、白色泡状物として表題化合物（１．０ｇ）を得た。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４４Ｈ４８Ｆ３Ｎ８Ｏ８ＰのＥＳＩ／ＭＳ：計算値９０４．３、実測値ｍ／ｚ＝９０３．７（Ｍ−１）。
（実施例９）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチルメチル（２−（２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−メチルアセトアミド）エチル）ホスホルアミドクロリデート
【化８９】
2018530560.tif 000098
【０４１８】
実施例４に記載の方法と類似の方法で表題化合物を合成し、白色泡状物として表題化合物（１．８ｇ）を得た。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４５Ｈ５０Ｆ３Ｎ８Ｏ８ＰのＥＳＩ／ＭＳ：計算値９１８．３、実測値ｍ／ｚ＝１８３６．６（２Ｍ＋）。
（実施例１０）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）ピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化９０】
2018530560.tif 000099
【０４１９】
ＤＣＭ（１９０ｍＬ）中のオキシ塩化リン（１７．７ｍＬ、１９０ｍｍｏｌ）冷却溶液（氷／水浴）に、２，６−ルチジン（１０１ｍＬ、８６４ｍｍｏｌ）を滴下添加し、次いでＭｏ（Ｔｒ）Ｔ（２）（８３．５ｇ、１７３ｍｍｏｌ）を１５分にわたり一部ずつ添加し（内部温度０〜１０℃）、撹拌した。３０分後、４−アミノピペリジンモノトリフルオロアセトアミド（４８．９ｇ、約１９０ｍｍｏｌ）を１５分にわたり滴下添加し（内部温度０〜８℃）、撹拌した。１時間後、ＤＩＰＥＡ（５０ｍＬ）を滴下添加し（内部温度０〜１０℃）、１時間撹拌した。反応物をクエン酸溶液（５００ｍＬ×３、１０％ｗ／ｖ水溶液）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮して粘稠な油状物を得、それをカラムに直接ロードした。［ＳｉＯ２カラム（３３０ｇ）、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ溶出液（勾配１：０〜０：１）］でのクロマトグラフィーにより、白色泡状物として表題化合物（９１．３ｇ、７０％の収率）を得た。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４３Ｈ４８Ｎ７Ｏ８ＰのＥＳＩ／ＭＳ：計算値９３０．９、実測値ｍ／ｚ＝９５４．４（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４２０】
実施例１１〜１４は、上記手順Ａにより調製した。
（実施例１１）
（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（１−（２，２，２−トリフルオロアセチル）ピペリジン−４−イル）ピペラジン−ｌ−イル）ホスホノクロリデート
【化９１】
2018530560.tif 000100
（実施例１２）
（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−モルホリノピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化９２】
2018530560.tif 000101
（実施例１３）
（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチルビス（３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）プロピル）ホスホルアミドクロリデート
【化９３】
2018530560.tif 000102
（実施例１４）
（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル［１，４’−ビピペリジン］−１’−イルホスホノクロリデート
【化９４】
2018530560.tif 000103
以下の実施例１５から２０は、上記の手順Ｂにより調製した。
（実施例１５）
（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（ピリミジン−２−イル）ピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化９５】
2018530560.tif 000104
（実施例１６）
（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（２−（ジメチルアミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化９６】
2018530560.tif 000105
（実施例１７）
（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−フェニルピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化９７】
2018530560.tif 000106
（実施例１８）
（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−メチルアセトアミド）ピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化９８】
2018530560.tif 000107
（実施例１９）
（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチルメチル（３−（２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−メチルアセトアミド）プロピル）ホスホルアミドクロリデート
【化９９】
2018530560.tif 000108
（実施例２０）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（６−ベンズアミド−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）ピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化１００】
2018530560.tif 000109
（実施例２１）
（４−（ピロリジン−１−イル）ピペリジン−１−イル）ホスホニックジクロリド塩酸塩
【０４２１】
ＤＣＭ（３０ｍＬ）中のオキシ塩化リン（５．７０ｍＬ、５５．６ｍｍｏｌ）冷却（氷／水浴）溶液に、２，６−ルチジン（１９．４ｍＬ、１６７ｍｍｏｌ）および４−（１−ピロリジニル）−ピペリジン（８．５８ｇ、５５．６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（３０ｍＬ）を添加し、１時間撹拌した。懸濁液を濾過し、固体を過剰量のジエチルエーテルで洗浄し、白色固体として表題のピロリジン（１７．７ｇ、９１％の収率）を得た。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ１９Ｈ３０Ｎ５Ｏ４ＰのＥＳＩ／ＭＳ：計算値４２３．２、実測値ｍ／ｚ＝４２２．２（Ｍ−１）。
【化１０１】
2018530560.tif 000110
（実施例２２）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（ピロリジン−１−イル）ピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデート塩酸塩
【化１０２】
2018530560.tif 000111
【０４２２】
ＤＣＭ（１００ｍＬ）中の実施例２１で得たジクロロホスホルアミデート（１７．７ｇ、５０．６ｍｍｏｌ）撹拌冷却（氷／水浴）溶液に、Ｍｏ（Ｔｒ）Ｔ（２）（２４．５ｇ、５０．６ｍｍｏｌ）、２，６−ルチジン（１７．７ｍＬ、１５２ｍｍｏｌ）および１−メチルイミダゾール（０．４０１ｍＬ、５．０６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１００ｍＬ）を１０分にわたり滴下添加した。懸濁液を撹拌しながら、浴槽を周囲温度へと温めた。６時間後、懸濁液をジエチルエーテル（１Ｌ）上に注ぎ、１５分間撹拌し、濾過し、固体をさらなるエーテルで洗浄し、白色固体（４５．４ｇ）を得た。粗生成物をクロマトグラフィー［ＳｉＯ２カラム（１２０グラム）、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ溶出液（勾配１：０〜６：４）］により精製し、合わせた画分をジエチルエーテル（２．５Ｌ）上に注ぎ、１５分間撹拌し、濾過し、得られた固体を、さらなるエーテルで洗浄し、白色固体として表題化合物（２３．１ｇ、６０％の収率）を得た。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４８Ｈ５７Ｎ８Ｏ７ＰのＥＳＩ／ＭＳ：計算値８８８．４、実測値ｍ／ｚ＝８８７．６（Ｍ−１）。
【０４２３】
（実施例２３）
修飾アンチセンスオリゴマーおよび例示的な修飾アンチセンスオリゴマーのデザインおよび製造
トリチルピペラジンフェニルカルバメート３５の調製（図２Ａ）：ジクロロメタン中の化合物１１の冷却懸濁物（６ｍＬ／ｇの１１）に、水中の炭酸カリウム（３．２当量）溶液（４ｍＬ／ｇの炭酸カリウム）を添加した。この２相混合物に、ジクロロメタン中のクロロギ酸フェニル（１．０３当量）溶液（２ｇ／ｇのクロロギ酸フェニル）を、ゆっくりと添加した。反応混合物を、２０℃へと温めた。反応が完了したら（１〜２時間）、層を分離した。有機層を、水で洗浄し、無水炭酸カリウムで乾燥させた。生成物３５を、アセトニトリルからの結晶化により単離した。
【０４２４】
カルバメートアルコール３６の調製：水素化ナトリウム（１．２当量）を、１−メチル−２−ピロリジノン（３２ｍＬ／ｇの水素化ナトリウム）中に懸濁させた。この懸濁物に、トリエチレングリコール（１０．０当量）および化合物３５（１．０当量）を添加した。結果として得られるスラリーを、９５℃へと加熱した。反応が完了したら（１〜２時間）、混合物を、２０℃へと冷却した。この混合物に、３０％のジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ｖ：ｖ）および水を添加した。生成物を含有する有機層を、水性ＮａＯＨ、水性コハク酸、および飽和水性塩化ナトリウムで、逐次洗浄した。生成物３６を、ジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／ヘプタンからの結晶化により単離した。
【０４２５】
テール型酸（Ｔａｉｌ  ａｃｉｄ）３７の調製：テトラヒドロフラン中の化合物３６の溶液（７ｍＬ／ｇの３６）に、無水コハク酸（２．０当量）およびＤＭＡＰ（０．５当量）を添加した。混合物を、５０℃へと加熱した。反応が完了したら（５時間）、混合物を、２０℃へと冷却し、水性ＮａＨＣＯ３により、ｐＨ８．５へと調整した。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを添加し、生成物を、水性層へと抽出した。ジクロロメタンを添加し、混合物を、水性クエン酸により、ｐＨ３へと調整した。生成物を含有する有機層を、クエン酸緩衝液と、飽和水性塩化ナトリウムとの、ｐＨ＝３の混合物で洗浄した。この３７のジクロロメタン溶液を、単離せずに、化合物３８の調製において使用した。
【０４２６】
３８の調製：化合物３７の溶液に、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）（１．０２当量）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．３４当量）を添加し、次いで、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）（１．１当量）を添加した。混合物を、５５℃へと加熱した。反応が完了したら（４〜５時間）、混合物を、２０℃へと冷却し、１：１の０．２Ｍクエン酸／ブラインおよびブラインで、逐次洗浄した。ジクロロメタン溶液に、アセトンへの溶媒交換、次いで、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドへの溶媒交換を施し、生成物を、アセトン／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドからの、飽和水性塩化ナトリウムへの沈殿により単離した。粗生成物を、水中で、複数回にわたり、再スラリー化させて、残留するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよび塩を除去した。
【０４２７】
活性化「テール」の、アンカーロード樹脂への導入は、固相合成におけるサブユニットの組込みのために使用される手順により、ジメチルイミダゾリジノン（ＤＭＩ）中で実施した。
【０４２８】
モルホリノベースのオリゴマーの合成のための固体支持体の調製：この手順は、粗い多孔性（４０〜６０μｍ）のガラスフリット、オーバーヘッド撹拌機、および、フリットを介してＮ２を沸騰させるかまたは真空抽出を可能とする、Ｔｅｆｌｏｎ製の三方止め栓を伴う、シラン化、ジャケット付きのペプチド容器（ＣｈｅｍＧｌａｓｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）内で実施した。
【０４２９】
以下の手順における樹脂処理／洗浄ステップは、２つの基本的な操作からなる：樹脂流動化または撹拌床樹脂反応器および溶媒／溶液抽出。樹脂の流動化のために、フリットを通ってＮ２の逆流（ｆｌｏｗ  ｕｐ）を可能とするように、止め栓を位置付け、指定の樹脂処理／洗浄液を、反応器へと添加し、樹脂を透過化させ、完全に湿潤させた。次いで、混合を開始し、指定の回数にわたり、樹脂スラリーを混合した。溶媒／溶液抽出のために、混合およびＮ２の流れを停止させ、真空ポンプを始動させ、次いで、樹脂処理／洗浄液を排出して廃棄することを可能とするように、止め栓を位置付けた。そうでないことが注記されない限りにおいて、樹脂処理／洗浄液の全容量は、樹脂１ｇ当たり１５ｍＬであった。
【０４３０】
シラン化、ジャケット付きのペプチド容器内のアミノメチルポリスチレン樹脂（１００〜２００メッシュ；窒素置換に基づき、１ｇ当たり約１．０ｍｍｏｌのロード；７５ｇ、１当量、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｓ、ＵＫ、型番：１４６４−Ｘ７９９）に、１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ；樹脂１ｇ当たり２０ｍｌ）を添加し、樹脂を、混合しながら、１〜２時間にわたり膨潤させた。膨潤溶媒（ｓｗｅｌｌ  ｓｏｌｖｅｎｔ）の排出後、樹脂を、ジクロロメタン（２×１〜２分間）、２５％のイソプロパノール／ジクロロメタン中に５％のジイソプロピルエチルアミン（２×３〜４分間）、およびジクロロメタン（２×１〜２分間）で洗浄した。最終洗浄液を排出した後、樹脂を、１−メチル−２−ピロリジノン中の、ジスルフィドアンカー３４溶液（０．１７Ｍ；樹脂１ｇ当たり１５ｍＬ、約２．５当量）で処理し、樹脂／試薬混合物を、４５℃で６０時間にわたり加熱した。反応が完了したら、加熱を中断し、アンカー溶液を排出し、樹脂を、１−メチル−２−ピロリジノン（４×３〜４分間）およびジクロロメタン（６×１〜２分間）で洗浄した。樹脂を、ジクロロメタン中に１０％（ｖ／ｖ）のジエチルジカーボネート溶液（１６ｍＬ／ｇ；２×５〜６分間）で処理し、次いで、ジクロロメタン（６×１〜２分間）で洗浄した。樹脂３９（図２Ｂ）を、Ｎ２流下で、１〜３時間にわたり、次いで、真空下で、一定の重量（±２％）まで乾燥させた。収率：元の樹脂重量の１１０〜１５０％。
【０４３１】
アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂のローディングの決定：樹脂のローディング（潜在的に利用可能な反応性部位の数）は、分光アッセイにより、樹脂１グラム当たりのトリフェニルメチル（トリチル）基の数について決定する。
【０４３２】
公知の重量（２５±３ｍｇ）の乾燥樹脂を、２５ｍｌのシラン化メスフラスコへと移し、ジクロロメタン中に２％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸約５ｍＬを添加する。内容物を、静かな回旋により混合し、次いで、３０分間にわたり静置する。容量を、ジクロロメタン中に２％（ｖ／ｖ）の、さらなるトリフルオロ酢酸により、２５ｍＬへと増量し、内容物を、完全に混合した。容積型ピペット（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｐｉｐｅｔｔｅ）を使用して、トリチル含有溶液（５００μＬ）のアリコートを、１０ｍＬのメスフラスコへと移し、容量を、メタンスルホン酸により、１０ｍＬへと増量する。
【０４３３】
最終溶液中のトリチルカチオン含量は、４３１．７ｎｍにおけるＵＶ吸光度により測定し、樹脂のローディングは、適切な容量、希釈率、消衰係数（ε：４１μｍｏｌ−１ｃｍ−１）、および樹脂重量を使用して、樹脂１グラム当たりのトリチル基（μｍｏｌ／ｇ）により計算する。アッセイは、三連で実施し、平均ローディングを計算する。
【０４３４】
本実施例における樹脂のローディング手順により、約５００μｍｏｌ／ｇのローディングを有する樹脂を提供する。ジスルフィドアンカーの組込みステップを、室温で２４時間にわたり実施する場合、μｍｏｌ／ｇ単位で３００〜４００のローディングが得られた。
【０４３５】
テールローディング：アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂を調製するための設定および容量と同じ設定および容量を使用して、テールを、固体支持体へと導入することができる。アンカーロード樹脂をまず、酸性条件下で脱保護し、結果として得られる材料を中性化させてから、カップリングした。カップリングステップのために、ジスルフィドアンカー溶液の代わりに、４−エチルモルホリン（ＮＥＭ、０．４Ｍ）を含有するＤＭＩ中の、３８の溶液（０．２Ｍ）を使用した。４５℃で２時間後、樹脂３９を、２５％のイソプロパノール／ジクロロメタン中に５％のジイソプロピルエチルアミンで２回にわたり洗浄し、ＤＣＭで１回洗浄した。樹脂に、安息香酸無水物（０．４Ｍ）およびＮＥＭ（０．４Ｍ）の溶液を添加した。２５分後、反応器ジャケットを、室温へと冷却し、樹脂を、２５％のイソプロパノール／ジクロロメタン中に５％のジイソプロピルエチルアミンで、２回にわたり洗浄し、ＤＣＭで、８回にわたり洗浄した。樹脂４０を濾過し、高真空下で乾燥させた。樹脂４０に対するローディングは、テールローディングにおいて使用した、元のアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂３９のローディングであると規定する。
【０４３６】
固相合成：モルホリノベースのオリゴマーは、Ｇｉｌｓｏｎ  ＡＭＳ−４２２  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ上、２ｍＬのＧｉｌｓｏｎポリプロピレン反応カラム（型番：３９８０２７０）内で調製した。カラムを合成器に静置するときに、カラムの周囲に、水流のためのチャネルを伴うアルミニウム製のブロックを入れた。ＡＭＳ−４２２は、代替的に、試薬／洗浄液を添加し、指定された時間にわたり保持し、真空を使用して、カラムを排気する。
【０４３７】
最大で約２５サブユニットの長さの範囲のオリゴマーでは、ローディングを、樹脂１ｇ当たり約５００μｍｏｌとする、アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂が好ましい。より大型のオリゴマーでは、ローディングを、樹脂１ｇ当たり３００〜４００μｍｏｌとする、アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂が好ましい。５’テールを伴う分子が所望される場合も、同じローディング指針により、テールでローディングした樹脂を選択する。
【０４３８】
以下の試薬溶液を調製した。
【０４３９】
脱トリチル化溶液：４：１ジクロロメタン／アセトニトリル中に、１０％のシアノ酢酸（ｗ／ｖ）；中性化溶液：３：１のジクロロメタン／イソプロパノール中に、５％のジイソプロピルエチルアミン；カップリング溶液：所望の塩基型および連結型を有する、０．１８Ｍ（または２０サブユニットより長くなったオリゴマーには、０．２４Ｍ）の活性化モルホリノサブユニット、ならびに１，３−ジメチルイミダゾリジノン中に、０．４ＭのＮエチルモルホリン。ジクロロメタン（ＤＣＭ）を、異なる試薬溶液の洗浄を隔てる、一過性洗浄液として使用した。
【０４４０】
ブロックを４２℃に設定した合成器上で、３０ｍｇのアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂（またはテール樹脂）を含有する各カラムに、２ｍＬの１−メチル−２−ピロリジノンを添加し、室温で、３０分間にわたり静置した。２ｍＬのジクロロメタンで、２回にわたる洗浄の後、以下の合成サイクルを使用した。
【０４４１】
【表６】
2018530560.tif 000112
【０４４２】
各カラムが、適正な配列の、適正なカップリング溶液（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｉ）を受容するように、個々のオリゴマーの配列を、合成器へとプログラムした。カラム内のオリゴマーが、その最終的なサブユニットの組込みを完了したら、カラムを、ブロックから取り出し、０．８９Ｍの４−エチルモルホリンを含有する、４−メトキシトリフェニルメチルクロリド（ＤＭＩ中に０．３２Ｍ）を含むカップリング溶液により、最終サイクルを、手動で実施した。
【０４４３】
樹脂からの切断ならびに塩基および保護基の除去：メトキシトリチル化の後、樹脂を、２ｍＬの１−メチル−２−ピロリジノンで、８回にわたり洗浄した。１−メチル−２−ピロリジノン中に、０．１Ｍの１，４−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）および０．７３Ｍのトリエチルアミンを含む、１ｍＬの切断溶液を添加し、カラムに蓋をし、室温で、３０分間にわたり静置した。この時間の後、溶液を、１２ｍＬのＷｈｅａｔｏｎバイアルへと排出した。大幅に縮んだ樹脂を、３００μＬの切断溶液で、２回にわたり洗浄した。溶液に、４．０ｍＬの濃縮アンモニア水（−２０℃で保存された）を添加し、バイアルにきつく蓋をし（テフロン（登録商標）加工のねじ蓋により）、混合物を回旋にかけて、溶液をミックスした。バイアルを、４５℃のオーブンに、１６〜２４時間にわたり入れて、塩基および保護基の切断を行った。
【０４４４】
粗生成物の精製：バイアルに入れた（ｖｉａｌｅｄ）アンモノリシス溶液を、オーブンから取り出して、室温へと冷却した。溶液を、２０ｍＬの０．２８％の水性アンモニアで希釈し、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ＨＱ樹脂（ＢｉｏＲａｄ）を含有する、２．５×１０ｃｍのカラムに通した。塩勾配（Ａ：０．２８％のアンモニアに、Ｂ：０．２８％のアンモニア中に１Ｍの塩化ナトリウムを伴う；６０分間でＢを０〜１００％とする）を使用して、メトキシトリチルを含有するピークを溶出させた。合わせた画分をプールし、所望される生成物に応じて、さらに加工した。
【０４４５】
モルホリノベースのオリゴマーの脱メトキシトリチル化：Ｍａｃｒｏｐｒｅｐによる精製からプールされた画分を、１ＭのＨ３ＰＯ４で処理して、ｐＨを２．５へと低下させた。初期の混合の後、試料を、室温で４分間にわたり静置し、この時間に、それらを、２．８％のアンモニア／水で、ｐＨ１０〜１１へと中性化させる。生成物は、固相抽出（ＳＰＥ）により精製した。
【０４４６】
ＳＰＥカラムのパッキングおよびコンディショニング：Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ  ＣＧ−３００Ｍ（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）（３ｍＬ）を、２０ｍＬのフリットカラム（ＢｉｏＲａｄ  Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（７３２〜１０１１））へとパッキングし、樹脂を、３ｍＬの以下のもの：０．２８％のＮＨ４ＯＨ／８０％のアセトニトリル；０．５ＭのＮａＯＨ／２０％のエタノール；水；５０ｍＭのＨ３ＰＯ４／８０％のアセトニトリル；水；０．５のＮａＯＨ／２０％のエタノール；水；０．２８％のＮＨ４ＯＨですすいだ。
【０４４７】
ＳＰＥの精製：脱メトキシトリチル化からの溶液を、カラムへとロードし、樹脂を、０．２８％の水性アンモニア３〜６ｍＬで、３回にわたりすすいだ。Ｗｈｅａｔｏｎバイアル（１２ｍＬ）を、カラムの下に置き、生成物を、０．２８％の水性アンモニア中に、４５％のアセトニトリル２ｍＬで２回にわたる洗浄により溶出させた。
【０４４８】
生成物の単離：溶液を、ドライアイス内で凍結させ、バイアルを凍結乾燥機に入れて、綿毛状の白色粉末をもたらした。試料を、水中に溶解させ、シリンジを使用して、０．２２ミクロンのフィルター（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｃｒｏｄｉｓｃ  ２５ｍｍシリンジフィルターに、０．２ミクロンのＨＴ  Ｔｕｆｆｒｙｎ膜を伴う）を通して濾過し、ＵＶ分光光度計上で、光学濃度（ＯＤ）を測定して、存在するオリゴマーのＯＤ単位を決定したほか、試料を解析のために分注した。次いで、凍結乾燥させるために、溶液を、Ｗｈｅａｔｏｎバイアルに戻した。
【０４４９】
ＭＡＬＤＩによる、モルホリノベースのオリゴマーについての解析：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を、使用して、精製物中の画分の組成を決定したほか、オリゴマーの正体の証拠（分子量）ももたらした。マトリックスとしての、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸（シナピン酸）、３，４，５−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）、またはアルファ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＨＣＣＡ）の溶液による希釈後に、試料を試行にかけた。
【０４５０】
（実施例２４）
ＰＭＯミオスタチン配列のｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニング
ミオスタチンエクソン２をスキップするようにデザインされたＰＭＯ配列をスクリーニングした。ヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）およびマウス筋芽細胞（正常：Ｃ２Ｃ１２、およびジストロフィー：Ｈ２Ｋｂｍｄｘ）細胞の両方において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＭＯ配列の有効性を試験した。次に、ＲＤ細胞において、ミオスタチンエクソン２の５’末端を標的とする４つのヒト特異的なＰＭＯをスクリーニングした。
【０４５１】
Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールズバッド、ＣＡ）によって、製造業者の標準的なプロトコールに従い、ＰＭＯをトランスフェクトした。ＲＴ−ＰＣＲ産物のゲル電気泳動結果のデンシトメトリー分析に従い、スキップされた産物およびスキップされなかった産物の総密度に対するスキップされた産物の密度のパーセンテージとして、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、ＰＭＯのスキッピング効率を評価した。配列を表７に列挙する。
【０４５２】
配列ＰＭＯ３９（配列番号４８）、ＰＭＯ４２（配列番号１６）、ＰＭＯ４３（配列番号４９）、ＰＭＯ４４（配列番号１７）、ＰＭＯ４５（配列番号１８）およびＰＭＯ１２４を、マウスおよびヒトミオスタチンエクソン２の両方と結合するようにデザインした。ＰＭＯは、４つの用量（０．２５、０．５、１および２μＭ）で３回ずつ試験した。上記のようにＲＴ−ＰＣＲ（図３Ａ）およびＲＴ−ＰＣＲ産物のデンシトメトリー分析により、スキップされた産物およびスキップされなかった産物の総強度に対するスキップされた産物の強度のパーセンテージとして、ミオスタチンエクソン２のスキッピング効率を評価した。統計解析は、ＰＭＯの効率を、個々の用量において、ミオスタチンエクソン２をスキップする有効なＰＭＯとして示されたＰＭＯ２８（ＧｅｎｅＴｏｏｌｓにより合成）のそれと比較する一方向分散分析により実施した（図３Ｂ）。
【０４５３】
ヒトミオスタチンエクソン２の５’末端と結合するように全てデザインされた４つのヒト特異的ＰＭＯ（ＰＭＯ４０、ＰＭＯ４６（配列番号２１）、ＰＭＯ４７（配列番号２０）、ＰＭＯ４８（配列番号１９））を分析した。ＰＭＯは、１μＭの用量で３回試験し、３’末端を標的とするＰＭＯと同じ濃度で比較した。これらのＰＭＯがエクソン２スキッピングを誘導すると予想されたので、それらの有効性を、確立したＲＴ−ＰＣＲプロトコールにより、上記のようなデンシトメトリー分析に従い評価した。ＲＴ−ＰＣＴ産物の結果を図４Ａに示し、デンシトメトリー分析を図４Ｂに示す。
【０４５４】
ミオスタチンエクソン２の３’末端を標的とするＰＭＯのうち、ＰＭＯ４４（配列番号１７）およびＰＭＯ４５（配列番号１８）（ならびにより高い濃度でＰＭＯ３９（配列番号４８））は、特に低い濃度で、他よりも一貫したスキッピングを誘導した（図４Ｂ）。ミオスタチンエクソン２の５’末端を標的とするＰＭＯを使用したとき、スキッピング有効性はさらに高く、ＰＭＯ４６（配列番号２１）はほぼ１００％のスキッピングを誘導し、ＰＭＯ４０および４８（配列番号１９）は約８０％のスキッピングを誘導した（図４Ｂ）。
マウスミオスタチンのエクソン２のスキッピング用のＰＭＯのスクリーニング：Ｃ２Ｃ１２およびＨ２Ｋｂｍｄｘ細胞におけるＰＭＯ３９、４２、４３、４４、４５、１２４の用量反応試験
【０４５５】
ｍｄｘマウスモデルにおける特異的および再現可能なエクソンスキッピングの最初の例が、Wiltonら（Wilton、Lloydら１９９９年、その内容は参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）により報告された。アンチセンス分子をドナースプライス部位に指向させることにより、培養細胞の６時間以内の処理で、一貫したおよび効果的なエクソン２３のスキッピングがジストロフィンｍＲＮＡにおいて誘導された。Wiltonらはまた、より長いアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた、マウスジストロフィンプレｍＲＮＡのアクセプター領域のターゲッティングについて記載している。イントロン２３のドナースプライス部位を指向する第１のアンチセンスオリゴヌクレオチドが初代培養筋芽細胞において一貫したエクソンスキッピングを誘導した一方で、この化合物が、より高いレベルのジストロフィンを発現する不死化細胞培養ではそれ程効率的でないことがわかった。しかしながら、ターゲッティングおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドのデザインを改良することにより、特異的なエクソン除去の効率がほぼ１桁増加した（Mann、Honeymanら、２００２年、その内容は参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）。
【０４５６】
最初に、マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞において、０．２５、０．５、１、２および５μＭの用量で各４回、ＰＭＯを試験した（図５Ａおよび図５Ｃ）。ＰＭＯ配列ならびに０．５および２μＭの用量を用いて、スキッピングの変動が反復的に観察された。代わりに筋芽細胞ジストロフィー細胞モデルであるＨ２Ｋｂｍｄｘ細胞においてスクリーニングを行った結果、より一貫した、信頼性が高い結果が示された（図５Ａおよび図５Ｂ）。
【０４５７】
試験したＨ２Ｋｂｍｄｘ細胞培養において、ＰＭＯ２８は、高濃度で最高のＰＭＯであり、低濃度で最も効率的なＰＭＯの１つであった（ＰＭＯ４５（配列番号１８）およびＰＭＯ３９（配列番号４８）と同程度）（図５Ｂ）。
ｍｄｘマウスにおける、非コンジュゲートＰＭＯ−ＭＳＴＮ配列の予備的ｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニング
【０４５８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの結果に基づき、ＰＭＯ３９（配列番号４８）、４４（配列番号１７）および４５（配列番号１８）を本試験用に選択した。ＰＭＯ１２４を対照として使用した。ＰＭＯ１２４の最適用量である３ｎｍｏｌ（１８×１０１４分子に相当）を、８週齢のｍｄｘマウスの各前脛骨（ＴＡ）筋に注射した。他のＰＭＯの量は、注射したＰＭＯ１２４の同じ分子数に対して正規化した。２匹のマウスの両方のＴＡ筋に、２５μｌの最終量（食塩水で希釈）で、各ＰＭＯ（群あたりｎ＝４）を注射した。注射の２週後に筋肉を採取した。結果を図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃに図示する。
ＰＭＯ用量の算出：
ａ）ＰＭＯ３９（配列番号４８（１８ｍｅｒ））＝１８．５μｇ（２匹のマウス、４つのＴＡ）
ｂ）ＰＭＯ４４（配列番号１７（２５ｍｅｒ））＝２５．４μｇ（２匹のマウス、４つのＴＡ）
ｃ）ＰＭＯ４５（配列番号１８（２５ｍｅｒ））＝２５．５μｇ（２匹のマウス、４つのＴＡ）
ｄ）ＰＭＯ１２４（２８ｍｅｒ）＝２８．８μｇ（２匹のマウス、４つのＴＡ）
これらのμｇ量は、各ＰＭＯにつき１８×１０１４個の分子に対応する。
【０４５９】
試験した全てのＰＭＯは、ｉｎ  ｖｉｖｏで生物学的に活性であった。スキッピング効率は、ＰＭＯ１２４で処理した筋肉において最も高く、ＰＭＯ４５（配列番号１８）で処理した筋肉において最も低かった（図６Ｃ）。しかしながら、かかる効率は筋肉重量の増加と相関していなかった。ＰＭＯ４５（配列番号１８）で処理した筋肉は、未処理の、またはＰＭＯ１２４もしくは４４（配列番号１７）で処理された筋肉より重かったが、差が有意でなかった（図６Ｂ）。
ｍｄｘマウスにおけるＰＭＯの全身注射
【０４６０】
また、ＰＭＯ３９（配列番号４８）、４４（配列番号１７）、４５（配列番号１８）および１２４を、全身的なスキッピング有効性について試験した。８週齢のｍｄｘマウスにおいて尾静脈内注射を通じてスクリーニングを実施した。ＰＭＯ１２４を対照として、２００μｌの食塩水で希釈した２００ｍｇ／ｋｇの用量（１２．５３×１０１８の分子または２０．８μｍｏｌに相当）で使用した。他のＰＭＯの量は、注射したＰＭＯ１２４の分子数に対して正規化した。群あたり３匹のマウスを使用した。注射の２週後、横隔膜−ＤＩＡ、長指伸筋−ＥＤＬ、腓腹筋−ＧＡＳ、ヒラメ筋−ＳＯＬおよび前脛骨−ＴＡを含む筋肉を回収した。結果を図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃおよび図７Ｄに図示する。
ＰＭＯ用量の算出：
ａ）ＰＭＯ１２４（２８ｍｅｒ）＝２００ｍｇ／ｋｇ（３匹のマウス）
ｂ）ＰＭＯ４５（配列番号１８（２５ｍｅｒ））＝１７６．２μｇ（３匹のマウス）
ｃ）ＰＭＯ４４（配列番号１７（２５ｍｅｒ））＝１７６．８μｇ（３匹のマウス）
ｄ）ＰＭＯ３９（配列番号４８（２８ｍｅｒ））＝１２８．６μｇ（３匹のマウス）
これらのμｇ量は、各ＰＭＯにつき１２．５３×１０１８個の分子（２０．８μｍｏｌ）に対応する。
【０４６１】
スキッピング結果は、１匹のマウスから採取した筋肉間、および異なるマウスからの同じタイプの筋肉間で変動していた（図７Ａおよび図７Ｂ）。しかしながら、全てのＰＭＯは、１回のＩＶ注射後、ジストロフィーの筋肉において生物学的に活性であった。ＧＡＳおよびＴＡは、ＰＭＯ４５（配列番号１８）または１２４の注射後、食塩水を注射されたマウスの、同じタイプの筋肉と比較して、重量が増加する傾向を示した（最終体重に対して正規化、図７Ｄ）。
Ｃ５７マウスにおける、ＢペプチドコンジュゲートＰＭＯのｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニング
【０４６２】
前のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングから選抜されたＰＭＯ  Ｄ３０（配列番号１６）、ＰＭＯ３９（配列番号４８）およびＰＭＯ４５（配列番号１８）を、ＰＭＯの３’末端でＢペプチド（ＲＡｈｘＲＲＢＲＲＡｈｘＲＲＢＲＡｈｘＢ：配列番号３４９９およびペプチドのカルボキシ末端におけるＡｈｘＢリンカー部分）とコンジュゲートさせ、全身尾静脈注射で毎週、１４週間にわたり送達した。ＢペプチドコンジュゲートＰＭＯ（以下「ＢＰＭＯ」とも称する）を、１２週齢のＣ５７マウス（群あたり１０匹のマウス）において実施した。１０または２０ｍｇ／ｋｇの２つの用量で試験した。最終の注射後、握力試験により前肢の筋力を測定した（図９Ａおよび図９Ｂ）。１０ｍｇ／ｋｇのＢＰＭＯで処理したマウスのＴＡ筋の最大筋力を、ｉｎ  ｓｉｔｕで電気生理学的に測定した（図９Ｃ）。筋肉量およびミオスタチンエクソンスキッピングの評価のため、心臓、ＤＩＡおよび４つの骨格筋（ＥＤＬ、ＧＡＳ、ＳＯＬ、ＴＡ）を回収した。
【０４６３】
２０ｍｇ／ｋｇのＢＰＭＯ−３９およびＢＰＭＯ−Ｄ３０処理群のマウスの何匹かは、尾静脈がほとんど見えなかったため、最後の４〜６週の間、ＩＶ注射を受けなかった。その代わりに、これらのマウスにはＩＰ注射を行った。ＢＰＭＯ−３９、２０ｍｇ／ｋｇの処理群において、２匹のマウスは、本試験の間に死亡した。
結果：
【０４６４】
１）体重および筋肉量の増加：ＢＰＭＯ−３９処理群（１０または２０ｍｇ／ｋｇ）におけるマウスの体重は、食塩水およびスクランブルＢＰＭＯを注射した動物のいずれの体重と比較しても、有意に増加した（図８Ａおよび図８Ｃ）。ＢＰＭＯ−Ｄ３０は、２０ｍｇ／ｋｇで使用したとき、非常に効果的な体重増加を誘導した（図８Ｃ）。投与される投与量および検討した筋肉に依存して、筋肉量の変動（初期体重に対して正規化）が観察された（図８Ｂおよび図８Ｄ）。ＢＰＭＯ−３９は、ＴＡ（１０または２０ｍｇ／ｋｇの処理、図８Ｂおよび図８Ｄ）およびＧＡＳ（１０ｍｇ／ｋｇの処理、図８Ｂ）において最も一貫した筋肉増加を示し、一方、ＢＰＭＯ−Ｄ３０または−４５は、ＴＡ（１０ｍｇ／ｋｇの処理、図８Ｂ）またはＧＡＳ（２０ｍｇ／ｋｇの処理、図８Ｄ）において質量増加を誘導した。２０ｍｇ／ｋｇの処理を受けたマウスのＤＩＡでは、試験したＢＰＭＯの全てが有意な筋肉重量増加を誘導した（図８Ｄ）。最後の数回の注射の際に使用したＩＰ送達経路は、この結果に対する影響を有した可能性がある。
【０４６５】
２）握力の分析：前肢力の測定は、両方のＢＰＭＯ用量で処理したマウスで実施した（図９Ａおよび図９Ｂ）。ＢＰＭＯ−３９は、食塩水群と比較して、また１０ｍｇ／ｋｇの処理でのみ、筋力強化を示す唯一の候補であった（図９Ａ）。スクランブルＢＰＭＯは、予想外にも、また説明不能であるが、１０および２０ｍｇ／ｋｇの用量の両方で、食塩水処理マウスと比較して有意に異なって、その処理マウスの前肢の筋力を増加させた（図９Ａおよび図９Ｂ）。
【０４６６】
３）ｉｎ  ｓｉｔｕにおける筋肉の生理学的試験：１０ｍｇ／ｋｇのＢＰＭＯで処理したマウスのＴＡを、電気生理学的評価を使用して分析した。ＢＰＭＯ−Ｄ３０は、スクランブルＰＭＯおよび他の試験したＢＰＭＯと比較して、発生する最大かつ比筋力を有意に増加させた（図９Ｃ）。
【０４６７】
４）エクソンスキッピングの定量：ＤＩＡ（図１０Ａおよび図１０Ｂ）ならびにＴＡ（図１０Ｃおよび図１０Ｄ）の筋肉のミオスタチンスキッピング効率を分析した。２０ｍｇ／ｋｇの処理を受けた筋肉のスキッピングレベルは、１０ｍｇ／ｋｇで処理した筋肉でのレベルより３〜４倍高かった（図１０Ｂおよび図１０Ｄ）。ＢＰＭＯ−Ｄ３０および−４５は、使用した２０ｍｇ／ｋｇの用量（ＤＩＡ、図１０ＢとＴＡ、図１０Ｄ）または１０ｍｇ／ｋｇの用量（ＴＡ、図１０Ｄ）では、ＢＰＭＯ−３９よりも有意に効率が高かった。
【０４６８】
ｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングの暫定的結果：ＢＰＭＯ−Ｄ３０およびＢＰＭＯ−４５は、筋肉重量、筋力およびエクソンスキッピング効率に対する全体的な効果を考慮して、最も有効な分子であった。（筋線維の断面分析に関する有力なデータとして）組織学的分析を行う。
（実施例２５）
ＢＰＭＯの誘導による二重エクソンスキッピング：ミオスタチンおよびジストロフィンによる組合せ処理
若齢のジストロフィーマウスにおけるジストロフィンリーディングフレームのレスキュー＋ミオスタチンのノックダウン。
【０４６９】
ＰＭＯ  Ｍ２３Ｄ（配列番号９３７）を、ＰＭＯの３’末端においてＢペプチド（ＲＡｈｘＲＲＢＲＲＡｈｘＲＲＢＲＡｈｘＢ：配列番号３４９９およびペプチドのカルボキシ末端のＡｈｘＢリンカー部分）とコンジュゲートさせ、ＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄと命名した。ＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄ（１０ｍｇ／ｋｇ）および／またはＢＰＭＯ−ＭＳＴＮ（Ｄ３０、１０ｍｇ／ｋｇ）を２００μｌの食塩水で希釈し、６週齢のｍｄｘマウスまたはＣ５７ＢＬ１０マウスの尾静脈を通して注射した。１０週間にわたり、注射を毎週繰り返した。１０匹のマウスを各処理に使用した。５つのマウスの群の詳細は以下の通りである：
ａ）Ｃ５７ＢＬ１０マウス＋食塩水（陽性対照）
ｂ）Ｍｄｘマウス＋食塩水（陰性対照）
ｃ）Ｍｄｘマウス＋ＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄ（配列番号９３７）（１０ｍｇ／ｋｇ）
ｄ）Ｍｄｘマウス＋ＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄ（配列番号９３７）（１０ｍｇ／ｋｇ）およびＢＰＭＯ−ＭＳＴＮ（配列番号１６）（１０ｍｇ／ｋｇ）
ｅ）Ｍｄｘマウス＋ＢＰＭＯ−ＭＳＴＮ（配列番号１６）（１０ｍｇ／ｋｇ）
結果：
【０４７０】
１２週間の処理の後、処理を受けたｍｄｘマウスにおいて、食塩水を注射された動物と比較した体重の有意な増加が観察されなかった（図１１Ａ）。前肢の筋力を測定する握力分析は、ＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄの注射が、ｍｄｘマウスと比較して、筋力の有意な増加を誘導する一方、ＢＰＭＯ−Ｍ２３ＤおよびＢＰＭＯ−ＭＳＴＮの共注射は、筋力をＣ５７マウスの筋力に対して正常化したことを明らかにした（図１１Ｂ）。ＢＰＭＯ−ＭＳＴＮ処理単独では、食塩水を注射されたｍｄｘマウスと比較して、処理を受けたマウスの筋力を変化させなかった（図１１Ｂ）。上で報告された握力試験を、以下の通りにさらに実施した。３日連続で（アクティビティケージ評価に従い）試験を実施した。各試験では、５回の読取値／マウスの値を記録した。各値は、２回の読取値間のインターバルを３０秒間とし、３０秒以内に測定される前肢の筋力の最も高い値とした。合計１５回の読取値／マウス（図１８Ａ）として、または、３×５回の読取値の平均／マウス／試験（図１８Ｂ）として、または、３×５回の読取値の最高値／マウス／試験（図１８Ｃ）としてデータを示す。統計解析は、一方向分散分析およびボンフェローニ事後検定（群あたりｎ＝１０）により行った。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【０４７１】
ＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄ処理は、単独で、またはＢＰＭＯ−ＭＳＴＮとの組合せで、心臓における約２５％のスキッピングを除き、分析した全ての筋肉において、７０〜８０％のジストロフィン再フレーミングとなる非常に効率的なジストロフィンエクソンスキッピングを誘導した（図１２Ａ）。ＢＰＭＯ−ＭＳＴＮとＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄとの組合せによる処理は、ＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄ単独による処理よりも、高いＤＭＤエクソンスキッピング効率をもたらした。次にジストロフィンタンパク質の回復をウェスタンブロット解析により確認し、骨格筋での発現はＣ５７マウスのレベルの３０〜１００％の間の範囲のであった（図１２Ｂ）。免疫組織化学によりジストロフィン発現を再確認した。ミオスタチンエクソン２のスキッピングは、二重処理を受けたマウスにおいても効率的であり、試験した全ての筋肉において、平均スキッピングが約５５％であった（図１２Ｃ）。
【０４７２】
筋線維肥大および再生に対する処理の効果を試験するため、採取した筋肉においてさらなる組織学的分析を実施した。中心核線維の頻度に加え、筋線維の数および直径を調査した。ＥＤＬ、ＧＡＳ、ＳＯＬおよびＴＡ筋における治療的利益を評価した。ＴＡ線維分析の結果を代表として報告する（図１３Ａおよび図１３Ｂ）。ＢＰＭＯ−ＭＳＴＮ単独による処理は、ジストロフィーの表現型を変化させなかったが、ＢＰＭＯ−Ｍ２３ＤおよびＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄ＋ＢＰＭＯ−Ｄ３０処理は、未処理のｍｄｘの筋肉と比較して、筋線維の断面領域の変動（図１３Ａ）および中心核線維の存在（図１３Ｂ）の減少により病変を部分的に改善した。この効果は、基本的に、ｍｄｘの筋肉の偽性肥大および筋肉の変性プロセスの両方を低下させるジストロフィンの回復に起因するものであった。
老齢のｍｄｘマウスにおけるミオスタチンのジストロフィンリーディングフレームのレスキュー＋ノックダウン
【０４７３】
ＢＰＭＯ−ＭＳＴＮおよびＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄを、上で報告したように、同一の用量レジメンおよび投与経路を使用して、ヒトで観察されるジストロフィー疾患を（若齢のｍｄｘマウスと比較して）より正確に再現する老齢（＞１８カ月齢）のｍｄｘマウスに注射した。１０ｍｇ／ｋｇのＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄ（ｎ＝５）またはＢＰＭＯＭ２３Ｄ（１０ｍｇ／ｋｇ）とＢＰＭＯ−ＭＳＴＮ（１０ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝５）または、２０ｍｇ／ｋｇのスクランブルＢＰＭＯ（ｎ＝４）により、週１回で１０週間、マウスに注射した。最終の注射の１週後、前肢の筋力を調査するため、マウスの握力分析を行った。筋肉を採取する前に、処理を受けたマウスのＴＡ筋を、次の週に電気生理学的に分析した。
結果：
【０４７４】
処理を受けたマウスの体重の（スクランブル群と比較した）有意な変化が、７週目以降に観察された（図１４Ａ）。スクランブル、ＢＰＭＯ−Ｍ２３ＤおよびＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄ＋ＢＰＭＯ−ＭＳＴＮで処理したマウスの、ＤＩＡ、ＥＤＬ、ＧＡＳ、ＳＯＬ、ＴＡおよび心筋の筋肉量を試験した（図１４Ｂ）。しかしながら、スクランブルを注射したマウスが徐々に死亡し、本試験終了時には１匹のマウスしか生存しなかったため、体重または筋肉重量に関する統計解析は行わなかった。ＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄで、またはＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄ＋ＢＰＭＯ−ＭＳＴＮで処理したマウスは全て、試験期間中生存した。握力分析は、ＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄで、またはＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄ＋ＢＰＭＯ−ＭＳＴＮで処理されたマウスが、スクランブルＢＰＭＯで処理されたマウスよりも強いことを示した（図１４Ｃ）。単一処理と二重処理との間の、ＴＡ筋の最大および比筋力をさらに比較した結果、組合せ処理群において良好な効果が見られ、筋肉損傷性の延長収縮（伸張性収縮）に対する抵抗力の有意な改善が示された（図１４Ｄ）。
【０４７５】
次に、全ての筋肉においてジストロフィン再フレーミングの顕著なレベルを示したジストロフィンのエクソン２３のスキッピング効率を評価するため、ＲＴ−ＰＣＲを実施した（図１５Ａ）。若齢のｍｄｘマウスで観察されるように、ＢＰＭＯ−ＭＳＴＮの追加により一貫してＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄのスキッピング効率が上昇した（図１５Ｂ）。ジストロフィンエクソンスキッピングの結果は、分析した全ての筋肉におけるタンパク質発現の有意な増加と相関していた（図１６Ａ）。さらに、ＢＰＭＯ−ＭＳＴＮとＢＰＭＯ−Ｍ２３Ｄとの組合せによる処理が、Ｍ２３Ｄ単独による処理よりもジストロフィンレベルを上昇させることが示された（図１６Ｂ）。
【０４７６】
採取した全ての筋肉におけるミオスタチンエクソン２のスキッピングを、ＲＴ−ＰＣＲにより評価した（図１７Ａ）。スキッピングのレベルは、分析した筋肉のタイプに応じて５％〜４０％の間で変動した。全ての筋肉の結果を総合して得られる平均値は約２０％であった（図１７Ｂ）。
【０４７７】
上に明示した開示は、独立した有用性を伴う少なくとも１つの別個の発明を含むと考えられる。本発明は、例示的な形態で開示されているが、多くの変形が可能であるため、本明細書に開示および例示される通りのその特定の実施形態は、限定的な意味で考慮されるべきでない。多様な実施形態、材料、組成物および方法の均等な変更、修飾およびバリエーションが、本発明の範囲内で実質的に類似の結果をもたらす態様で実施され得る。本発明の主題は、本明細書で開示される様々な要素、特徴、機能および／または特性の全ての新規かつ非自明な組合せおよびサブコンビネーションを包含する。
【０４７８】
本明細書では、特定の実施形態に関する利益、他の利点および課題解決手段を記載した。しかしながら、利益、利点、課題解決手段、および任意の利益、利点、または解決手段をもたらすまたはより明らかにし得る任意の要素または要素の組合せは、本発明のいずれかまたは全ての請求項の決定的な、必要な、または不可欠な特徴または要素として解釈されるべきでない。本発明の範囲内における多くの変更および修飾は、全てのそのような修飾を包含する。下記の特許請求の範囲における、全ての要素の対応する構造、材料、操作および均等物は、具体的に特許請求された通りの他の請求項の要素と組み合わせて機能を発揮するあらゆる構造、材料または操作を包含することを意図するものである。本発明の範囲は、上記で示される実施例よりはむしろ、添付の特許請求の範囲およびそれらの法的均等物により決定されるべきである。
【表７−１】
2018530560.tif 000113
【表７−２】
2018530560.tif 000114
【表７−３】
2018530560.tif 000115
【表７−４】
2018530560.tif 000116
【表７−５】
2018530560.tif 000117
【表７−６】
2018530560.tif 000118
【表７−７】
2018530560.tif 000119
【表７−８】
2018530560.tif 000120
【表７−９】
2018530560.tif 000121
【表７−１０】
2018530560.tif 000122
【表７−１１】
2018530560.tif 000123
【表７−１２】
2018530560.tif 000124
【表７−１３】
2018530560.tif 000125
【表７−１４】
2018530560.tif 000126
【表７−１５】
2018530560.tif 000127
【表７−１６】
2018530560.tif 000128
【表７−１７】
2018530560.tif 000129
【表７−１８】
2018530560.tif 000130
【表７−１９】
2018530560.tif 000131
【表７−２０】
2018530560.tif 000132
【表７−２１】
2018530560.tif 000133
【表７−２２】
2018530560.tif 000134
【表７−２３】
2018530560.tif 000135
【表７−２４】
2018530560.tif 000136
【表７−２５】
2018530560.tif 000137
【表７−２６】
2018530560.tif 000138
【表７−２７】
2018530560.tif 000139
【表７−２８】
2018530560.tif 000140
【表７−２９】
2018530560.tif 000141
【表７−３０】
2018530560.tif 000142
【表７−３１】
2018530560.tif 000143
【表７−３２】
2018530560.tif 000144
【表７−３３】
2018530560.tif 000145
【表７−３４】
2018530560.tif 000146
【表７−３５】
2018530560.tif 000147
【表７−３６】
2018530560.tif 000148
【表７−３７】
2018530560.tif 000149
【表７−３８】
2018530560.tif 000150
【表７−３９】
2018530560.tif 000151
【表７−４０】
2018530560.tif 000152
【表７−４１】
2018530560.tif 000153
【表７−４２】
2018530560.tif 000154
【表７−４３】
2018530560.tif 000155
【表７−４４】
2018530560.tif 000156
【表７−４５】
2018530560.tif 000157
【表７−４６】
2018530560.tif 000158
【表７−４７】
2018530560.tif 000159
【表７−４８】
2018530560.tif 000160
【表７−４９】
2018530560.tif 000161
【表７−５０】
2018530560.tif 000162
【表７−５１】
2018530560.tif 000163
【表７−５２】
2018530560.tif 000164
【表７−５３】
2018530560.tif 000165
【表７−５４】
2018530560.tif 000166
【表７−５５】
2018530560.tif 000167
【表７−５６】
2018530560.tif 000168
【表７−５７】
2018530560.tif 000169
【表７−５８】
2018530560.tif 000170
【表７−５９】
2018530560.tif 000171
【表７−６０】
2018530560.tif 000172
【表７−６１】
2018530560.tif 000173
【表７−６２】
2018530560.tif 000174
【表７−６３】
2018530560.tif 000175
【表７−６４】
2018530560.tif 000176
【表７−６５】
2018530560.tif 000177
【表７−６６】
2018530560.tif 000178
【表７−６７】
2018530560.tif 000179
【表７−６８】
2018530560.tif 000180
【表７−６９】
2018530560.tif 000181
【表７−７０】
2018530560.tif 000182
【表７−７１】
2018530560.tif 000183
【表７−７２】
2018530560.tif 000184
【表７−７３】
2018530560.tif 000185
【表７−７４】
2018530560.tif 000186
【表７−７５】
2018530560.tif 000187
【表７−７６】
2018530560.tif 000188
【表７−７７】
2018530560.tif 000189
【表７−７８】
2018530560.tif 000190
【表７−７９】
2018530560.tif 000191
【表７−８０】
2018530560.tif 000192
【表７−８１】
2018530560.tif 000193
【表７−８２】
2018530560.tif 000194
【０４７９】
実施形態では、本明細書で記載される通りの修飾アンチセンスオリゴマーのいずれかにおけるいかなるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）ヌクレオチドも、Ｘまたはｎで置換され得る。実施形態では、各Ｘまたはｎは、ウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択される。
【図１Ａ】
2018530560.tif 000225
【図１Ｂ】
2018530560.tif 000226
【図１Ｃ】
2018530560.tif 000227
【図１Ｄ】
2018530560.tif 000228
【図１Ｅ】
2018530560.tif 000229
【図１Ｆ】
2018530560.tif 000230
【図１Ｇ】
2018530560.tif 000231
【図２Ａ】
2018530560.tif 000232
【図２Ｂ】
2018530560.tif 000233
【図３Ａ】
2018530560.tif 000234
【図３Ｂ】
2018530560.tif 000235
【図４Ａ】
2018530560.tif 000236
【図４Ｂ】
2018530560.tif 000237
【図５Ａ】
2018530560.tif 000238
【図５Ｂ】
2018530560.tif 000239
【図５Ｃ】
2018530560.tif 000240
【図６Ａ】
2018530560.tif 000241
【図６Ｂ】
2018530560.tif 000242
【図６Ｃ】
2018530560.tif 000243
【図７Ａ】
2018530560.tif 000244
【図７Ｂ】
2018530560.tif 000245
【図７Ｃ】
2018530560.tif 000246
【図７Ｄ】
2018530560.tif 000247
【図８Ａ】
2018530560.tif 000248
【図８Ｂ】
2018530560.tif 000249
【図８Ｃ】
2018530560.tif 000250
【図８Ｄ】
2018530560.tif 000251
【図９Ａ】
2018530560.tif 000252
【図９Ｂ】
2018530560.tif 000253
【図９Ｃ】
2018530560.tif 000254
【図１０Ａ】
2018530560.tif 000255
【図１０Ｂ】
2018530560.tif 000256
【図１０Ｃ】
2018530560.tif 000257
【図１０Ｄ】
2018530560.tif 000258
【図１１Ａ】
2018530560.tif 000259
【図１１Ｂ】
2018530560.tif 000260
【図１２Ａ】
2018530560.tif 000261
【図１２Ｂ】
2018530560.tif 000262
【図１２Ｃ】
2018530560.tif 000263
【図１３Ａ】
2018530560.tif 000264
【図１３Ｂ】
2018530560.tif 000265
【図１４Ａ】
2018530560.tif 000266
【図１４Ｂ】
2018530560.tif 000267
【図１４Ｃ】
2018530560.tif 000268
【図１４Ｄ】
2018530560.tif 000269
【図１５Ａ】
2018530560.tif 000270
【図１５Ｂ】
2018530560.tif 000271
【図１６Ａ】
2018530560.tif 000272
【図１６Ｂ】
2018530560.tif 000273
【図１７Ａ】
2018530560.tif 000274
【図１７Ｂ】
2018530560.tif 000275
【図１８Ａ】
2018530560.tif 000276
【図１８Ｂ】
2018530560.tif 000277
【図１８Ｃ】
2018530560.tif 000278
【配列表】
2018530560000001.app
【国際調査報告】
2018530560.tif 000279
2018530560.tif 000280
2018530560.tif 000281
2018530560.tif 000282