(57)【要約】  増殖性疾患、自己免疫疾患および同種免疫反応の治療を目的とした、キメラ融合タンパク質およびキメラ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。キメラ融合タンパク質は、ＣＤ２４細胞外ドメイン、ＥＢＶ−誘導性３（ＥＢＢ）ポリペプチドサブユニット、およびｐ２８  ＩＬ−２７ポリペプチドサブユニットを含み、ＥＢＢポリペプチドおよびｐ２８  ＩＬ−２７ポリペプチドはフレキシブルなペプチドリンカーによって共有結合的に連結される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ２４細胞外ドメイン、ＥＢＶ−誘導性３（ＥＢＩ３）ポリペプチドサブユニット、およびｐ２８  ＩＬ−２７ポリペプチドサブユニットを含むＩＬ−２７融合タンパク質であって、前記ＥＢＩ３ポリペプチドサブユニットおよび前記ｐ２８  ＩＬ−２７ポリペプチドサブユニットがペプチドリンカーによって共有結合的に連結される前記融合タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の前記融合タンパク質であって、前記タンパク質が、アミノ末端からカルボキシ末端の順に、前記ＣＤ２４細胞外ドメイン、前記ＥＢＩ３ポリペプチドサブユニット、前記ペプチドリンカー、および前記ｐ２８  ＩＬ−２７ポリペプチドサブユニットを含む前記融合タンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載の前記融合タンパク質であって、前記タンパク質が、アミノ末端からカルボキシ末端の順に、前記ＣＤ２４細胞外ドメイン、前記ｐ２８  ＩＬ−２７ポリペプチドサブユニット、前記ペプチドリンカーおよび前記ＥＢＩ３ポリペプチドサブユニットを含む前記融合タンパク質。
【請求項４】
請求項１に記載の前記融合タンパク質であって、２〜５個の間のタンデム配置されたＣＤ２４細胞外ドメインのコピーを含む前記融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１つに記載の前記融合タンパク質であって、免疫グロブリンＦｃドメインをさらに含む前記融合タンパク質。
【請求項６】
請求項５に記載の前記融合タンパク質であって、前記免疫グロブリンＦｃドメインがＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域を含む前記融合タンパク質。
【請求項７】
請求項６に記載の前記融合タンパク質であって、前記ＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域がＦｃγ受容体との結合を抑制または除去する突然変異を含む前記融合タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７のうちいずれか１つに記載の前記融合タンパク質であって、前記タンパク質がＰＤ−１細胞外ドメイン、ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインまたはＰＤ−Ｌ２細胞外ドメインをさらに含む前記融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１に記載の前記融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が配列番号７７〜８４および８８〜９５のいずれか１つに由来するアミノ酸配列を含む前記融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１つに記載の前記融合タンパク質を抗ＰＤ−１物質、抗ＰＤ−Ｌ１物質、抗ＰＤ−Ｌ２物質、またはその組み合わせからなる群から選択される１つまたはそれ以上の物質と併せて含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の前記医薬組成物であって、前記抗ＰＤ−１物質、抗ＰＤ−Ｌ１物質または抗ＰＤ−Ｌ２物質が抗体である前記医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１０に記載の前記医薬組成物であって、前記抗ＰＤ−１物質、抗ＰＤ−Ｌ１物質または抗ＰＤ−Ｌ２物質がｓｉＲＮＡである前記医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１０に記載の前記医薬組成物であって、前記抗ＰＤ−１物質、抗ＰＤ−Ｌ１物質または抗ＰＤ−Ｌ２物質がドミナントネガティブタンパク質である前記医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１から９のいずれか１つに記載の前記融合タンパク質をコードする融合タンパク質配列を含むポリヌクレオチドであって、前記融合タンパク質配列が前記ＩＬ−２７融合タンパク質を分泌するのに適したＮ−末端シグナルペプチド配列を含む前記ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載の前記ポリヌクレオチドであって、前記融合タンパク質配列のカルボキシ末端が前記ＩＬ−２７融合タンパク質を細胞膜に係留するのに適したＧＰＩアンカーシグナル配列を含む前記ポリヌクレオチド。  
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターであって、前記融合タンパク質配列が細胞内で前記融合タンパク質を発現するのに十分な１つまたはそれ以上の調節配列と機能的に連結される前記発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１８に記載の前記発現ベクターであって、抗ＰＤ−１物質、抗ＰＤ−Ｌ１物質、抗ＰＤ−Ｌ２物質、またはその組み合わせを発現するのに適した１つまたはそれ以上の配列をさらに含む前記発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の前記発現ベクターであって、前記発現ベクターがウイルスベクターである前記発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載の前記発現ベクターであって、前記ウイルスベクターが組換えアデノ随伴ウイルスである前記発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１４〜１９のいずれか１つに記載の前記ポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む細胞であって、前記細胞が前記融合タンパク質を発現する前記細胞。
【請求項２１】
請求項２０に記載の前記細胞であって、抗ＰＤ−１物質、抗ＰＤ−Ｌ１物質、抗ＰＤ−Ｌ２物質、またはその組み合わせをコードするポリヌクレオチドまたは発現ベクターをさらに含み、前記細胞が前記抗ＰＤ−１物質、抗ＰＤ−Ｌ１物質、抗ＰＤ−Ｌ２物質またはその組み合わせを発現する前記細胞。
【請求項２２】
請求項２１に記載の前記細胞であって、前記抗ＰＤ−１物質、抗ＰＤ−Ｌ１物質または抗ＰＤ−Ｌ２物質が抗体である前記細胞。
【請求項２３】
請求項２１に記載の前記細胞であって、前記抗ＰＤ−１物質、抗ＰＤ−Ｌ１物質または抗ＰＤ−Ｌ２物質がドミナントネガティブタンパク質である前記細胞。
【請求項２４】
請求項２１に記載の前記細胞であって、前記抗ＰＤ−１物質、抗ＰＤ−Ｌ１物質または抗ＰＤ−Ｌ２物質がｓｉＲＮＡである前記細胞。
【請求項２５】
請求項２３から２７のいずれか１つに記載の前記細胞であって、前記細胞が哺乳類細胞である前記細胞。
【請求項２６】
増殖性疾患を治療するための方法であって、前記増殖性疾患を治療するのに有効な量の請求項１から１２のいずれか１つに記載の前記融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む前記方法。
【請求項２７】
自己免疫疾患または同種免疫反応を治療するための方法であって、前記自己免疫疾患または前記同種免疫反応を治療するのに有効な量の請求項１から１２のいずれか１つに記載の前記融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む前記方法。
【請求項２８】
増殖性疾患を治療するための方法であって、前記増殖性疾患を治療するのに有効な量の請求項１６から１９のいずれか１つに記載の前記発現ベクターをそれを必要とする対象に投与することを含む前記方法。
【請求項２９】
自己免疫疾患または同種免疫反応を治療するための方法であって、前記自己免疫疾患または前記同種免疫反応を治療するのに有効な量の請求項１６から１９のいずれか１つに記載の前記発現ベクターをそれを必要とする対象に投与することを含む前記方法。
【請求項３０】
請求項２５から２８のいずれか１つに記載の前記方法であって：
抗ＰＤ−１  ｍＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ２  ｍＡｂまたはその組み合わせ；
抗ＰＤ−１  ｍＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ２  ｍＡｂを発現する発現ベクターまたはその組み合わせ；
ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２のドミナントネガティブタンパク質またはその組み合わせ；
ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２を発現する発現ベクターまたはその組み合わせ；
ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２に向けられたｓｉＲＮＡまたはその組み合わせ；または
ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２に向けられたｓｉＲＮＡまたはその組み合わせのうち１つまたはそれ以上を発現する発現ベクター；の投与をさらに含む前記方法。
【請求項３１】
増殖性疾患を治療するための方法であって、前記増殖性疾患を治療するのに有効な量の請求項２０から２５のいずれか１つに記載の前記細胞をそれを必要とする対象に投与することを含む前記方法。
【請求項３２】
自己免疫疾患または同種免疫反応を治療するための方法であって、前記自己免疫疾患または前記同種免疫反応を治療するのに有効な量の請求項２０から２５のいずれか１つに記載の前記細胞をそれを必要とする対象に投与することをさらに含む前記方法。
【請求項３３】
ペプチドリンカーによって共有結合的に連結されたＥＢＶ誘導性３（ＥＢＩ３）ポリペプチドサブユニットおよびｐ２８  ＩＬ−２７ポリペプチドサブユニットを含む融合タンパク質のコード配列を含むＡＡＶベクター。
【請求項３４】
請求項３３に記載の前記ＡＡＶベクターであって、前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ−ＩＬ−２７である前記ＡＡＶベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１４年１１月６日に出願された米国特許仮出願第６２／０７６，１８２号明細書に対する優先権を主張する。前述の明細書の全文は参照文献として本願に援用される。
【０００２】
本願は、全般的に、増殖性疾患、自己免疫疾患、および同種免疫反応の治療を目的としたキメラＩＬ−２７融合タンパク質を使用または発現する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
数十年の研究の後、我々の癌との戦いの主な武器として癌免疫療法が最終的に浮上している。現在の免疫療法の手法は、直接癌細胞を標的とする手法と、宿主免疫系を直接標的とする手法に分けられる。前者は、乳癌におけるＨＥＲ−２および白血病におけるＣＤ１９またはＣＤ２０などの、腫瘍細胞に大量に発現する分子に特異的な抗体を含む。後者は、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１などの、ネガティブチェックポイント調節因子と相互作用する抗体を含む。組み合わせの効力は、抗ＣＴＬＡ−４抗体と抗ＰＤ−１抗体を組み合わせることによる奏効率の著しい上昇により例示される。近年、ネガティブチェックポイント調節因子の数が拡大されて、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡおよびＶＩＳＴＡを含む新たな標的を提供する（Ｌｅ  Ｍｅｒｃｉｅｒ他、Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（６），Ａｒｔｉｃｌｅ  ４１８，２０１５年８月においてレビュー）。製薬会社によってさらなる組み合わせが熱心に探求されている。
【０００４】
ＩＬ−２７は、ＥＢＶ−誘導性遺伝子３（ＥＢＩ３）と呼ばれるＩＬ−１２  ｐ４０−関連タンパク質サブユニット、およびｐ３５−関連サブユニットｐ２８からなるＩＬ−１２サイトカインファミリーの一員である。ＩＬ−２７は、樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージなどの活性化抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって産生され、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞を含む多様な細胞において、ＷＳＸ−１およびｇｐ１３０サブユニットからなるヘテロ二量体受容体（ＩＬ−２７Ｒ）を経てシグナルを伝達する。ＩＬ−２７Ｒシグナリングにより、いくつかのＪａｋファミリーキナーゼの動員およびＳＴＡＴファミリー転写因子１および３の活性化が促進される。ＩＬ−２７はＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７およびＦｏｘＰ３＋  Ｔｒｅｇ（調節性Ｔ細胞）の調節において強力な活性を有することが示されている。ＩＬ−２７の特性の観点より、増殖性疾患、自己免疫疾患および同種免疫反応の治療を目的とした、ＩＬ−２７に基づく治療薬に対するニーズが存在する。
【０００５】
ＩＬ−２７は、ＥＢＶ−誘導性遺伝子３（ＥＢＩ３）と呼ばれるＩＬ−１２  ｐ４０−関連タンパク質サブユニット、およびｐ３５−関連サブユニットｐ２８からなるＩＬ−１２サイトカインファミリーの一員である。ＩＬ−２７は、樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージなどの活性化抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって産生され、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞を含む多様な細胞において、ＷＳＸ−１およびｇｐ１３０サブユニットからなるヘテロ二量体受容体（ＩＬ−２７Ｒ）を経てシグナルを伝達する。ＩＬ−２７Ｒシグナリングにより、いくつかのＪａｋファミリーキナーゼの動員およびＳＴＡＴファミリー転写因子１および３の活性化が促進される。ＩＬ−２７はＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７およびＦｏｘＰ３＋  Ｔｒｅｇ（調節性Ｔ細胞）の調節において強力な活性を有することが示されている。ＩＬ−２７の特性の観点より、増殖性疾患、自己免疫疾患および同種免疫反応の治療を目的とした、ＩＬ−２７に基づく治療薬に対するニーズが存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願の１つの態様は、ＣＤ２４細胞外ドメイン、ＥＢＶ−誘導性３（ＥＢＩ３）ポリペプチド、ｐ２８  ＩＬ−２７ポリペプチドサブユニットを含むＩＬ−２７融合タンパク質であって、ＥＢＩ３ポリペプチドおよびｐ２８  ＩＬ−２７ポリペプチドサブユニットがフレキシブルなペプチドリンカーによって共有結合的に連結されるＩＬ−２融合タンパク質に関する。
【０００７】
１つの実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端の順に、ＣＤ２４細胞外ドメイン、ＥＢＶ−誘導性３（ＥＢＩ３）ポリペプチドサブユニット、ペプチドリンカーおよびｐ２８  ＩＬ−２７ポリペプチドサブユニットを含む。
【０００８】
他の実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端の順に、ＣＤ２４細胞外ドメイン、ｐ２８  ＩＬ−２７ポリペプチドサブユニット、ペプチドリンカー、およびＥＢＶ−誘導性３（ＥＢＩ３）ポリペプチドを含む。
【０００９】
一定の実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質はタンデム配置されたＣＤ２４細胞外ドメインのコピーを２〜１０個または２〜５個含む。
【００１０】
他の実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質はタンデム配置された上記の細胞外ドメインのコピーを２〜５個含みうる。
【００１１】
他の実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質は免疫グロブリンＦｃドメインを含む。１つの実施形態においては、免疫グロブリンＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域を含む。他の実施形態においては、免疫グロブリンＦｃドメインは、Ｆｃγ受容体との結合を抑制または除去する突然変異を含む。一定の具体的な実施形態においては、融合タンパク質は配列番号７７〜８４または８８〜１０１のうちいずれか１つに準じたアミノ酸配列を含む。
【００１２】
本願の他の態様は、本開示に従ったＩＬ−２７融合タンパク質を、抗ＰＤ−１物質（剤）、抗ＰＤ−Ｌ１物質（剤）、抗ＰＤ−Ｌ２物質（剤）、またはその組み合わせからなる群から選択される１つまたはそれ以上の物質と併せて含む医薬組成物に関する。一定の実施形態においては、抗ＰＤ−１物質、抗ＰＤ−Ｌ１物質または抗ＰＤ−Ｌ１物質は抗体である。他の実施形態においては、抗ＰＤ−１物質、抗ＰＤ−Ｌ１物質または抗ＰＤ−Ｌ１物質はドミナントネガティブ変異タンパク質である。他の実施形態においては、抗ＰＤ−１物質、抗ＰＤ−Ｌ１物質または抗ＰＤ−Ｌ１物質はｓｉＲＮＡである。
【００１３】
本願の他の態様は、本願に記載のＩＬ−２７融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、さらには、細胞内で融合タンパク質を発現するのに適したヌクレオチド配列と機能的に連結した、ＩＬ−２７融合タンパク質コードポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。ポリヌクレオチドまたは発現ベクターは、それぞれＮ末端シグナルペプチド配列を追加的に含む。
【００１４】
一定の実施形態においては、ポリヌクレオチドまたは発現ベクターは、融合タンパク質を細胞膜に係留するために、融合タンパク質配列のカルボキシ末端にＧＰＩアンカーシグナル配列を追加的に含む。
【００１５】
他の実施形態においては、ポリヌクレオチドまたは発現ベクターは、融合タンパク質を細胞膜に係留するために、膜貫通ドメインを追加的に含む。
【００１６】
一定の実施形態においては、ポリヌクレオチドまたは発現ベクター、または追加的なポリヌクレオチドまたは発現ベクターは、抗ＰＤ−１物質、抗ＰＤ−Ｌ１物質、抗ＰＤ−Ｌ２物質、またはその組み合わせを発現するのに適した１つまたはそれ以上の配列をさらに含む。
【００１７】
一定の実施形態においては、抗ＰＤ−１／抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＰＤ−Ｌ１配列は抗体をコードする。
【００１８】
他の実施形態においては、抗ＰＤ−１／抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＰＤ−Ｌ１配列は、膜貫通ドメインおよび／または細胞質側末端を伴わない細胞外ドメインを含む、ドミナントネガティブ変異タンパク質または可溶性タンパク質をコードする。
【００１９】
抗体、ドミナントネガティブ変異タンパク質、または可溶性タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは発現ベクターは、抗ＰＤ−１／抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＰＤ−Ｌ２配列の分泌を目的として操作することもあれば（たとえば抗体またはＦｃ融合タンパク質として）、あるいはＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２変異体を細胞膜に係留するためのＣ末端ＧＰＩ連結アンカーシグナル配列または膜貫通ドメインで操作することもある。
【００２０】
他の実施形態においては、抗ＰＤ−１／抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＰＤ−Ｌ２配列は、１つまたはそれ以上のｓｉＲＮＡを産生することを目的とした１つまたはそれ以上のｓｈＲＮＡを含む。
【００２１】
他の実施形態においては、ポリヌクレオチドまたは発現ベクター、または追加的なポリヌクレオチドまたは発現ベクターは、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡに向けられた抗体、またはＢ７−１、Ｂ７−２、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭＥ−３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡに由来する細胞外ドメインを含むタンパク質変異体、またはその組み合わせを発現するのに適した１つまたはそれ以上の配列をさらに含む。タンパク質変異体は分泌を目的として操作されることもあれば（たとえばＦｃ融合タンパク質として）、あるいはタンパク質変異体を細胞膜に係留するためのＧＰＩ連結アンカーシグナル配列または膜貫通ドメインで操作することもある。
【００２２】
発現ベクターはウイルスベクターであることも、あるいは非ウイルスベクターであることもある。
【００２３】
一定の好ましい実施形態においては、発現ベクターは組換えアデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
【００２４】
本願の他の態様は、ＩＬ−２７融合タンパク質コードポリヌクレオチドまたはＩＬ−２７融合タンパク質コード発現ベクターを含む細胞であって、細胞がＩＬ−２７融合タンパク質を発現する細胞に関する。一定の実施形態においては、細胞は、抗ＰＤ−１物質、抗ＰＤ−Ｌ１物質、抗ＰＤ−Ｌ２物質、またはその組み合わせを発現するポリヌクレオチドまたは発現ベクターであって、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２物質が抗体、ドミナントネガティブタンパク質、またはｓｉＲＮＡであるポリヌクレオチドまたは発現ベクターを追加的に含む。好ましい実施形態においては、細胞はヒトまたはマウス細胞などの哺乳類細胞である。
【００２５】
本願の他の態様は、増殖性疾患を治療するための方法に関する。方法は、本開示のＩＬ−２７融合タンパク質の有効量をそれを必要とする対象に投与するステップを含む。
【００２６】
本願の他の態様は、自己免疫疾患または同種免疫反応を治療するための方法に関する。方法は、本開示のＩＬ−２７融合タンパク質の有効量をそれを必要とする対象に投与するステップを含む。
【００２７】
本願の他の態様は、増殖性疾患を治療するための方法に関する。方法は、本開示のＩＬ−２７コード発現ベクターの有効量をそれを必要とする対象に投与するステップを含む。
【００２８】
本願の他の態様は、自己免疫疾患または同種免疫反応を治療するための方法に関する。方法は、本開示のＩＬ−２７コード発現ベクターの有効量をそれを必要とする対象に投与するステップを含む。
【００２９】
一定の実施形態においては、治療方法は：抗ＰＤ−１  ｍＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ２  ｍＡｂ、またはその組み合わせ；抗ＰＤ−１  ｍＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ２  ｍＡｂを発現する発現ベクターまたはその組み合わせ；ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２のドミナントネガティブタンパク質またはその組み合わせ；ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を発現する発現ベクターまたはその組み合わせ；ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２に向けられた１つまたはそれ以上のｓｉＲＮＡ；またはＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２に向けられた１つまたはそれ以上のｓｉＲＮＡを発現する発現ベクター；の有効量を対象に対して投与するステップをさらに含む。
【００３０】
他の実施形態においては、治療方法は：Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡに向けられたｍＡｂまたはその組み合わせ；Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡに向けられたｍＡｂを発現する発現ベクターまたはその組み合わせ；Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡのドミナントネガティブタンパク質またはこれらに由来する細胞外ドメインまたはその組み合わせ；Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡに由来するドミナントネガティブタンパク質またはこれらに由来する細胞外ドメインを発現する発現ベクターまたはその組み合わせ；Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡに向けられた１つまたはそれ以上のｓｉＲＮＡまたはその組み合わせ；またはＢ７−１、Ｂ７−２、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡに向けられた１つまたはそれ以上のｓｉＲＮＡを発現する発現ベクターまたはその組み合わせ；の有効量を対象に投与するステップをさらに含む。
【００３１】
本願の他の態様は、増殖性疾患を治療するための方法に関する。方法は、本開示のＩＬ−２７融合タンパク質を単独で、または１つまたはそれ以上の抗ＰＤ−１物質、抗ＰＤ−Ｌ１物質、抗ＰＤ−Ｌ２物質、抗Ｂ７−１物質、抗Ｂ７−２物質、抗ＣＴＬＡ−４物質、抗ＬＡＧ−３物質、抗ＴＩＭ−３物質、抗ＴＩＧＩＴ物質、抗ＢＴＬＡ物質、抗ＶＩＳＴＡ物質、またはその組み合わせと併せて、増殖性疾患を治療するのに有効な量で発現する細胞の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
【００３２】
本願の他の態様は、自己免疫疾患または同種免疫反応を治療するための方法に関する。方法は、本開示のＩＬ−２７融合タンパク質を単独で、または１つまたはそれ以上の抗ＰＤ−１物質、抗ＰＤ−Ｌ１物質、抗ＰＤ−Ｌ２物質、抗Ｂ７−１物質、抗Ｂ７−２物質、抗ＣＴＬＡ−４物質、抗ＬＡＧ−３物質、抗ＴＩＭ−３物質、抗ＴＩＧＩＴ物質、抗ＢＴＬＡ物質、抗ＶＩＳＴＡ物質、またはその組み合わせと併せて、自己免疫性疾患または同種免疫反応を治療するために有効な量で発現する細胞の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＡＡＶ−ＩＬ−２７投与によりＢ１６黒色腫の増殖および肺転移が阻害される。パネルＡ：Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＡＡＶ−ＩＬ−２７またはＡＡＶ−Ｃｔｒｌウイルスベクターを筋肉内注射した。マウスより経時的に採血し、血清中のＩＬ−２７濃度をＥＬＩＳＡで検出した。パネルＢ．２×１０５個のＢ１６．Ｆ１０細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。４日後、マウスにＡＡＶ−ＩＬ−２７またはＡＡＶ−Ｃｔｒｌウイルスベクターを投与した。腫瘍のサイズを経時的に測定した。棒は各群の５個の腫瘍の標準偏差を湿す。提示されたデータは、同様の結果となった３つの実験を示す。パネルＣ：２×１０５個のＢ１６．Ｆ１０細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに静脈注射した。４日後、マウスにＡＡＶ−ＩＬ−２７またはＡＡＶ−Ｃｔｒｌウイルスベクターを筋肉内投与した。腫瘍細胞の注射より２１日後にマウスを屠殺し、肺における腫瘍転移を示した。各マウス群の肺重量の平均を右のパネルに示す。棒は各群の４匹のマウスの肺重量の標準偏差を示す。提示されたデータは、同様の結果となった２つの実験を示す。
【図２】ＡＡＶ−ＩＬ−２７投与によりＴｒｅｇ細胞が枯渇し、ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞の腫瘍浸潤が促進される。２×１０５個のＢ１６．Ｆ１０細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。４日後、マウスにＡＡＶ−ＩＬ−２７またはＡＡＶ−Ｃｔｒｌウイルスベクターを投与した。１８日目にマウスを屠殺し、フローサイトメトリーを用いてＦｏｘＰ３＋  Ｔｒｅｇ細胞（パネルＡ）およびＩＮＦ−γ産生腫瘍浸潤Ｔ細胞（パネルＢ）を分析した。実験には各群５匹のマウスを用いた。提示されたデータは、同様の結果となった少なくとも３つの実験を示す。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定で＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３】ＡＡＶ−ＩＬ−２７投与によりＴ細胞上でＰＤ−Ｌ１発現が誘導される。パネルＡ：ＡＡＶ−ＩＬ−２７（赤）またはＡＡＶ−Ｃｔｒｌウイルス（青）ベクターを投与したマウスから採取した血液（ｎ＝３〜４／群）、脾臓（ｎ＝７〜８／群）、および腫瘍（ｎ＝７〜８／群）中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析。各マウス群から採取したＴ細胞上のＰＤ−ＬＩ発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を右のパネルに示す。棒は各群のＰＤ−ＬＩ  ＭＦＩの標準偏差を示す。提示されたデータは、同様の結果となった２つの実験を示す。パネルＢ：ＡＡＶ−ＩＬ−２７またはＡＡＶ−Ｃｔｒｌウイルスベクターを投与したマウスから採取した腫瘍中のＰＤ−１＋ＣＤ８  Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析。棒は各群５匹のマウスのＰＤ−１  ＭＦＩの標準偏差を示す。提示されたデータは、同様の結果となった２つの実験を示す。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定で＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図４】ＡＡＶ−ＩＬ−２７および抗ＰＤ１併用療法によりマウスの腫瘍が消失する。パネルＡ：２×１０５個のＢ１６．Ｆ１０細胞を各Ｃ５７ＢＬ６マウスに皮下注射した。４日後、マウスにＡＡＶ−ＩＬ−２７またはＡＡＶ−Ｃｔｒｌベクターを筋肉内投与した。また４日目より、抗ＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４）またはアイソタイプ適合対照抗体（２Ａ３）３００μｇ／マウス、４日間隔最大４回もマウスに投与した。各マウス群（ｎ＝５）の腫瘍のサイズを経時的に測定した。パネルＢ：２×１０５個のＢ１６．Ｆ１０細胞を各Ｃ５７ＢＬ６マウスに皮下注射した。４日後、マウスにＡＡＶ−ＩＬ−２７ベクターを筋肉内投与した。また４日目より、抗ＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４）または抗ＣＴＬＡ４（４Ｆ１０）または対照ＩｇＧ（２Ａ３）３００μｇ／マウスもマウスに投与した。各マウス群（ｎ＝５）の腫瘍のサイズを経時的に測定した。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定で＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。提示されたデータは、同様の結果となった３つの実験を示す。
【図５】ＡＡＶ−ＩＬ−２７および抗ＰＤ１併用療法により抗腫瘍Ｔｈ１／Ｔｃ１応答が促進される。２×１０５個のＢ１６．Ｆ１０細胞を各Ｃ５７ＢＬ６マウスに皮下注射した。４日後、マウスにＡＡＶ−ＩＬ−２７またはＡＡＶ−Ｃｔｒｌベクターを筋肉内投与した。また４日目より、抗ＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４）またはアイソタイプ適合対照抗体（２Ａ３）３００μｇ／マウス、４日間隔最大４回もマウスに投与した。腫瘍細胞注射より１８日後、マウスを屠殺し、その腫瘍を摘出し、ＣＤ４（パネルＡ）およびＣＤ８（パネルＢ）Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの産生について分析した。各マウス群（ｎ＝５）から採取したＩＦＮ−γ陽性Ｔ細胞の平均を右のパネルに示す。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定で＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。
【図６】ＡＡＶ−ＩＬ−２７投与によりＦｏｘＰ３＋  Ｔｒｅｇ細胞が消失する。マウスＢ１６黒色腫の確立および処理のプロトコルは、図３および４に記載したものと同じであった。腫瘍細胞注射より１８日後、マウスを屠殺し、その脾臓（パネルＡ）および腫瘍（パネルＢ）を摘出し、ＣＤ４  Ｔ細胞のＦｏｘｐ３およびＩＬ−１０の発現について分析した。各マウス群（ｎ＝５）から採取したＦｏｘＰ３陽性およびＩＬ−１０陽性Ｔ細胞の平均を右のパネルに示す。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定で＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。
【図７】ＡＡＶ−ＩＬ−２７および抗ＰＤ−１併用療法によりＴ細胞のＩＬ−１０産生が誘導される。マウスＢ１６黒色腫の確立および処理のプロトコルは、図３および図４に記載したものと同じであった。腫瘍細胞注射より１８日後、マウスを屠殺し、その脾臓（パネルＡ）および腫瘍（パネルＢ）を摘出し、ＣＤ８  Ｔ細胞におけるＩＬ−１０の発現について分析した。各マウス群（ｎ＝５）から採取したＩＬ−１０陽性Ｔ細胞の平均を右のパネルに示す。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定で＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。
【図８】ＡＡＶ−ＩＬ−２７により実験的自己免疫性脳脊髄炎が阻害される。Ｃ５７ＢＬ６／マウス（ｎ＝５／群）にＡＡＶ−ＩＬ−２７またはＡＡＶ−Ｃｔｒｌウイルスを投与した（２×１０１１ＤＶＰ／マウス、筋肉内注射）（パネルＡ）。２週間後、マウスをＭＯＧペプチドで免疫して実験的自己免疫疾患を誘導した。マウスは１日おきに観察し、０〜５まで０．５点刻みの中間スコアで採点した：０、臨床徴候なし；１、尾の緊張が消失；２、不安定な歩行；３、後肢の麻痺；４、前肢と後肢の麻痺；および５、死亡。パネルＢは、パネルＡのマウスのＡＡＶ感染４５日後の脾臓から採取したＣＤ４＋細胞サブセットのフローサイトメトリー分析を描出する。脾臓細胞は、ゴルジ遮断剤の存在下でＰＭＡにより４時間刺激し、サイトカインまたはＦｏｘｐ３の細胞内修飾によって評価した。Ｔｈ１、ＩＦＮγ−産生細胞；ＴＨ２、ＩＬ４＋細胞；Ｔｈ１７、ＩＬ−１７産生細胞；Ｔｒ１、ＩＬ−１０−産生細胞。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定で＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図９】ＡＡＶ−ＩＬ−２７により炎症性腸疾患（ＩＢＤ）が阻害される。０．３×１０６個の高ＣＤ４５ＲＢ  ＣＤ４＋Ｔ細胞の腹腔内注射により結腸炎を誘発した。細胞の注射より１週間後、マウスにウイルスベクター２×１０１１ＤＶＰ／マウスを筋肉内投与した。パネルＡはＴ細胞移入後の体重変化を描出する。開始時の体重を１００％と定義する。パネルＢはマウス腸の肉眼解剖所見の例を示す。パネルＣは３つのパラメーター：消耗症状の有無（０または１点）、大腸壁の肥厚度（正常、軽度肥厚、中等度肥厚、および重度肥厚に対して０〜３点）、および糞便（正常、軟便、下痢、および血便に対してそれぞれ０〜３点）に基づいて累計した臨床スコアを描出する。
【図１０】免疫療法のための融合タンパク質の産生。図１０はＩＬ２７ＦｃおよびＣＤ２４ＩＬ２７Ｆｃの作製を描出する。パネルＡのＩＬ２７Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の順に、シグナルペプチド、ＥＢＩ３、ＧＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶ（配列番号７）「ＰＶ」リンカーまたはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８）「ＧＳリンカー」、ｐ２４およびＦｃから構成される。パネルＡは、一方がＰＶリンカーを有し（左パネル）、もう一方がＧＳリンカー（右パネル）を有する２つの融合タンパク質の産生を示す。左側パネルは、配列番号７１のアミノ酸配列を有する融合タンパク質を示す一方、右側パネルは配列番号７３のアミノ酸配列を有する融合タンパク質を示す。タンパク質は、還元条件（左レーン）および非還元条件（右レーン）下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質収量をゲル写真の下に示す。パネルＢはＣＤ２４ＩＬ２４Ｆｃ融合タンパク質の作製を描出する。Ｎ末端からＣ末端の順に、シグナルペプチド、ヒトＣＤ２４、ＥＢＩ３、リンカー、ＰＶリンカーペプチド、ｐ２８およびＦｃから構成されるＣＤ２４ＩＬ２４Ｆｃ融合タンパク質。パネルＢは、配列番号７９のアミノ酸配列を有するＣＤ２４ＩＬ２４Ｆｃ融合タンパク質の産生を示す。タンパク質は、還元条件（右レーン）および非還元条件（左レーン）下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質収量をゲル写真の下に示す。
【図１１】図１０パネルＡのＩＬ２７Ｆｃ融合タンパク質のインビトロ活性。Ｂ６脾臓細胞（２×１０５／ウェル）を、所与の濃度のＩＬ−２７融合タンパク質の存在下で抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）により刺激した。３日目に上清を回収し、ＩＬ−１０レベル（パネルＡ）およびＩＮＦγレベル（パネルＢ）について分析した。２つの独立した実験より同様のデータが得られた。
【図１２】抗ＰＤ−１および配列番号７１（ＰＶ）のアミノ酸配列を有するＩＬ２７Ｆｃ融合タンパク質を用いた併用療法により腫瘍増殖速度およびＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇの個数が減少する。Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍細胞攻撃後、８日目に抗ＰＤ−１を注射する一方（１００μｇ／注射×５、１日おき）、１１日目にＰＶ注射を開始した（２．５μｇ／マウス×５連日注射）。パネルＡは腫瘍増殖速度の低下を描出する。キャリパーを用いて週に２回腫瘍を測定した。提示したデータは腫瘍の面積である。パネルＢはＴｒｅｇの減少を描出する。初回ＰＶ投与より７日目に末梢血を採取した。ＰＢＬをＣＤ４、ＣＤ１４、およびＦｏｘｐ３に特異的な抗体で染色した。提示するデータはＣＤ４コンパートメント中の％ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞である。対照群はｎ＝４、投与群はｎ＝５。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１．
【図１３】ＣＤ２４ＩＬ２７ｍＦｃＰＶ融合タンパク質（配列番号７９）単独、または抗ＰＤ１  ｍＡｂとの併用投与後の腫瘍増殖の阻害および生存期間の延長。パネルＡは腫瘍増殖の阻害を描出する。Ｂ１６黒色腫細胞２×１０５個／マウス）をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。マウスは、腫瘍細胞移植後８日目より、Ｆｃ（２００μｇ×３）、抗ＰＤ−１（２００μｇ×３）、ＣＤ２４ＩＬ２７ｍＦｃＰＶ（３０μｇ×３）、またはＰＤ−１＋ＣＤ２４ＩＬ２７ｍＦｃＰＶの３日間連日注射で処理した。腫瘍面積を週に２回測定した。Ｐ値は二元配置分散分析および事後検定としてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉにより判定した。パネルＢは、腫瘍担持マウスにおいて併用療法により生存期間が延長することを示す。データは、腫瘍径２ｃｍをエンドポイントとして用いるカプラン・マイヤー生存分析を使用した。Ｐ値はログランク検定により判定した。
【図１４】免疫機能不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖（ＩＰＥＸ）症候群のマウスモデルにおけるＩＬ−２７−ｒＡＶＶの治療効果。ＩＰＥＸ症候群は、男性のみに発現するＸ連鎖劣性遺伝疾患である。マウスおよびヒトにおいて、Ｆｏｘｐ３遺伝子の変異により致死的な自己免疫疾患が引き起こされる。罹患した小児の大半は生後２年以内に死亡する。Ｆｏｘｐ３遺伝子に変異を有するＳｃｕｒｆｙマウス（Ｆｏｘｐ３ｓｆ）はヒトＩＰＥＸと同様の病態形成を示すので、このモデルを用いてＩＬ−２７−ｒＡＡＶがＩＰＥＸを治療できるか判定した。パネルＡに示すように、ＩＬ−２７−ｒＡＡＶの単回注射は、周産期における体重増加として立証されるマウスの発育を大幅に改善した。さらに、治療によりＳｃｕｒｆｙマウスの生存期間がほぼ２倍になった（パネルＢ）。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
別段の定義がない限り、本願で用いる全ての技術および科学用語は、本開示の方法および組成物が属する技術に精通した当業者によって一般的に理解する意味と同じ意味を有する。本願および付属の請求項で用いる単数形「ある１つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈より別段の明確な指示がない限り複数の言及を含むことに留意しなければならない。したがって、たとえば、「１つのペプチド」への言及は複数のそのようなペプチドを含み、「そのペプチド」への言及は当業者に知られた１つまたはそれ以上のペプチドおよびその同等物への言及である、などである。
【００３５】
（ＩＬ−２７融合タンパク質組成物）
ＩＬ−２７は、ＥＢＶ−誘導性３（ＥＢＩ３）タンパク質サブユニットと呼ばれるＩＬ−１２  ｐ４０−関連タンパク質サブユニット、およびｐ３５−関連サブユニットｐ２８からなるＩＬ−１２サイトカインファミリーの一員である。１つの態様においては、増殖性疾患、自己免疫疾患および同種免疫反応を治療するためのＩＬ−２７融合タンパク質は、ＣＤ２４細胞外ドメイン（ＣＤ２４  ＥＣＤ）、ＥＢＩ３ポリペプチドサブユニットおよびｐ２８  ＩＬ−２７ポリペプチドサブユニットを含み、ＥＢＩ３ポリペプチドサブユニットおよびｐ２８  ＩＬ−２７ポリペプチドサブユニットはペプチドリンカー（ＰＬ）によって共有結合的に連結される。本願で用いる用語「ＩＬ−２７融合タンパク質」は、ＥＢＩ３、ｐ２８およびＣＤ２４細胞外ドメインを最小限含む、本願に記載する任意の融合タンパク質を広く意味する。一部の実施形態においては、融合タンパク質は修飾ヒトｐ２８ペプチド（配列番号１０）またはその機能的変異体を含む。他の実施形態においては、融合タンパク質は野性型ヒトｐ２８ペプチド（配列番号１４２、受託番号ＮＰ＿６６３６３４のアミノ酸残基２８〜２４３）またはその機能的変異体を含む。これ以降用いるペプチドの「機能的変異体」は、元のペプチドとアミノ酸配列が異なるが、元のペプチドの生物学的機能を維持しているペプチドである。一部の実施形態においては、機能的変異体は元のペプチドの生物活性または構造機能の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％を保持する。
【００３６】
具体的な実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端の順に、ＣＤ２４細胞外ドメイン、ＥＢＩ３ポリペプチドサブユニット、ペプチドリンカーおよびｐ２８  ＩＬ−２７ポリペプチドサブユニットを含む。
【００３７】
他の実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端の順に、ＣＤ２４細胞外ドメイン、ｐ２８  ＩＬ−２７ポリペプチドサブユニット、ペプチドリンカー、およびＥＢＩ３ポリペプチドサブユニットを含む。
【００３８】
一定の実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質はタンデム配置されたＣＤ２４細胞外ドメインのコピーを２〜１０個または２〜５個含みうる。
【００３９】
他の実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質は免疫グロブリンＦｃドメインをさらに含む。１つの実施形態においては、免疫グロブリンＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域を含む。他の実施形態においては、免疫グロブリンＦｃドメインはＦｃγ受容体との結合を抑制または除去する突然変異を含む。
【００４０】
他の実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質は、融合タンパク質を細胞膜に係留するためのＧＰＩ−連結グリカンまたは膜貫通ドメインを含む。
【００４１】
一定の実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質はアミノ末端にＣＤ２４細胞外ドメインおよび／またはカルボキシ末端にＢ７−１膜貫通ドメイン細胞質側末端を含む。
【００４２】
一部の実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質はＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡまたはその組み合わせに由来する細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をさらに含む。一定の実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質はこれらのＥＣＤのうち１つまたはそれ以上のタンデム配置されたコピーを２〜５個の間含みうる。
【００４３】
本開示のＩＬ−２７融合タンパク質は、異なる立体配置で互いに連結され、たとえば制限のない多様なソース（例：マウスおよびヒト）に由来する、多様な構造的および機能的ドメインを有するモジュラードメイン機構を有する。ＩＬ−２７融合タンパク質における代表的なドメインおよび組み入れのためのそのソースを表１に示す。表１の受託番号およびタンパク質配列名は、これらのアミノ酸配列に相当する核酸データベースにおいて、対応する核酸配列を確認するために用いることができる。配列番号７１、７５、７７および８０におけるアミノ酸配列をコードする代表的な核酸配列は、配列番号１３５、１３６、１３７および１３８にそれぞれ記載されている。これらの構築物におけるこれらの核酸配列は、本願に記載する構築物をコードする他のＩＬ−２７融合タンパク質の構築に用いうる。
【００４４】
表１に記載のドメインは、配列番号６７〜１０１のアミノ酸配列を含むがこれに限定されない、多様な構造的立体配置に配置することができる（表２参照）。本願に用いる、表１に列記するポリペプチドまたはポリペプチドドメインは対応する配列番号、さらにはその「機能的変異体」を含む。本願に用いる用語「機能的変異体」は、その機能的活性を維持し、且つ融合タンパク質に含まれる対応する野性型ポリペプチドまたはポリペプチドドメインと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するポリペプチドまたはポリペプチドドメインを指し、また列記した配列番号と比較して、アミノ末端および／またはカルボキシ末端側の領域で切断されたポリペプチドまたはポリペプチドドメインをさらに含み、そこにおいて、切断の合計が、表１に列記する配列番号のそれぞれにおける総アミノ酸の１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、または１０％未満を占める。
【００４５】
本開示の組成物および方法に、配列番号６７〜１０１に対応するアミノ酸配列を含む融合タンパク質を用いうる。さらに、これらのアミノ酸配列は、さらに再配置、機能的置換ドメインと置き換え、または配列番号１５〜６６に列記されるかまたは本願に別段記載される１つまたはそれ以上のポリペプチドドメインと組み合わせうる。記載されたドメインからの１つまたはそれ以上のアミノ酸の削除を含む追加的な修飾を用いて、融合タンパク質の生物活性および／または発現を高めることができる。全般的に、本願に記載の具体的な配列と比較して、各ドメインと少なくとも９０％の同一性、好ましくは９５％超の同一性が保持されることが好ましい。インビトロ分析においては、以下の実施例６にさらに記載されるように、臨床使用を目的とした融合タンパク質組成物を最適化するために使用可能である有用な機能分析を提供されたい。
【００４６】
【表１】
2018501302.tif 000003
2018501302.tif 000004
2018501302.tif 000005
【００４７】
【表２】
2018501302.tif 000006
2018501302.tif 000007
2018501302.tif 000008
【００４８】
ＣＤ２４はグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー分子として発現され、且つ相異なる系列において幅広い分布を有する。ＣＤ２４細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は強いグリコシル化を受け、またシアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（Ｓｉｇｌｅｃｓ）のファミリーのタンパク質と相互作用して、炎症反応、具体的には危険関連分子パターン（ＤＡＭＰＳ）に対する組織障害誘導性免疫応答を抑制することが知られている。たとえば、ＣＤ２４のＳｉｇｌｅｃ  １０との結合は、高移動度群タンパク質のＢボックス１（ＨＭＧＢ１）、熱ショックタンパク質７０、および熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）を含むＤＡＭＰＳとのＣＤ２４の関連を低下させる。これは、その刺激活性を負に調節しかつ核因子κＢ（ＮＦκＢ）活性化を阻害する役割を果たす。さらに、ＣＤ２４のＳｉｇｌｅｃ−Ｇとの結合は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を減弱させることが知られている。
【００４９】
ＣＤ２４の細胞外ドメイン（ＣＤ２４  ＥＣＤ）は、その抗炎症活性に加えて、本願に記載するＩＬ−２７融合タンパク質の発現促進をもたらす。
【００５０】
ヒトＣＤ２４およびマウスＣＤ２４はいずれもそれらのＤＡＭＰｓとの相互作用の点から機能的な同等物を構成するとみられるので、ＣＤ２４ＥＣＤはそれらからもたらされうる。ヒトＣＤ２４（受託番号ＮＰ＿０３７３６２）の細胞外ドメインは、アミノ酸配列
ＳＥＴＴＴＧＴＳＳＮＳＳＱＳＴＳＮＳＧＬＡＰＮＰＴＮＡＴＴＫＶ（配列番号１０２）、
ＳＥＴＴＴＧＴＳＳＮＳＳＱＳＴＳＮＳＧＬＡＰＮＰＴＮＡＴＴＫ（配列番号４）、
ＳＥＴＴＴＧＴＳＳＮＳＳＱＳＴＳＮＳＧＬＡＰＮＰＴＮＡＴＴ（配列番号１０３）、
ＳＥＴＴＴＧＴＳＳＮＳＳＱＳＴＳＮＳＧＬＡＰＮＰＴＮＡＴ（配列番号１０４）、またはその機能的変異体を含みうる。マウスＣＤ２４の細胞外ドメインは、アミノ酸配列
ＮＱＴＳＶＡＰＦＰＧＮＱＮＩＳＡＳＰＮＰＴＮＡＴＴＲＧ（配列番号１０５）、
ＮＱＴＳＶＡＰＦＰＧＮＱＮＩＳＡＳＰＮＰＴＮＡＴＴＲ（配列番号１０６）、
ＮＱＴＳＶＡＰＦＰＧＮＱＮＩＳＡＳＰＮＰＴＮＡＴＴ（配列番号１０７）、
ＮＱＴＳＶＡＰＦＰＧＮＱＮＩＳＡＳＰＮＰＴＮＡＴ（配列番号１０８）、またはその機能的変異体を含みうる。
【００５１】
一部の実施形態においては、用語「ＣＤ２４  ＥＣＤ」はヒトＣＤ２４（配列番号４）の全長細胞外ドメインまたはマウスＣＤ２４（配列番号３）の全長細胞外ドメイン、さらにはその機能的変異体などの、ＣＤ２４の全長細胞外ドメインを含む。ＣＤ２４  ＥＣＤの「機能的変異体」は、全長野性型ＣＤ２４  ＥＣＤの少なくとも１つまたは２つのＮ−結合グリコシル化部位候補、および少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１４個のＯ−結合グリコシル化部位候補を保持する１０〜６０アミノ酸のポリペプチドである。
【００５２】
ＣＤ２４  ＥＣＤは、ＥＢＩ−ＰＬ−ｐ２８（またはｐ２８−ＰＬ−ＥＢＩ）のＮ末端側またはＥＢＩ−ＰＬ−ｐ２８（またはｐ２８−ＰＬ−ＥＢＩ）のＣ末端側と融合されうる。一部の実施形態においては、Ｃ２４  ＥＣＤはＩＬ−２７融合タンパク質のＮ−末端およびＣ−末端の双方と融合されうる。他の実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９または１０コピーでタンデム配置されたＣＤ２４  ＥＣＤの複数のコピーを含みうる。
【００５３】
ＩＬ−２７融合タンパク質に含まれる任意の１つまたはそれ以上のポリペプチドドメインの間に、フレキシブルなペプチドリンカーを組み入れうる。フレキシブルなペプチドリンカーはグリシン、アラニン、プロリン、セリン、トレオニン、および／またはメチオニン残基などの小さなアミノ酸を含む。またその代わりに、ペプチドリンカーはＩｇＧヒンジ領域を含みうる。ペプチドリンカーは長さが３から４０アミノ酸、好ましくは６から１５アミノ酸でありうる。一般に、ペプチドリンカーはタンパク質の可動性を高め、伸長立体配置の採用を容易にし、且つ／または立体障害を解消することになる。リンカーの修飾、または他の既知のリンカーの使用により、ＩＬ−２７融合タンパク質に組み入れられたドメインの安定性および／または機能の向上が可能となりうる。
【００５４】
好ましいペプチドリンカーはアミノ酸プロリン、リジン、グリシン、アラニン、およびセリン、およびその組み合わせから構成される。一部の実施形態においては、ペプチドリンカーは複数のグリシン残基を含み、たとえばリンカー中のアミノ酸の４０％から７０％、または７０％から１００％がグリシン残基である。他の実施形態においては、ペプチドリンカーは複数のセリン残基を含み、たとえばリンカー中のアミノ酸の４０％から７０％、または７０％から１００％がセリン残基である（またはたとえばこれらの量のアラニンおよび／またはプロリン残基）。具体的な実施形態においては、式［（Ｇｌｙ）ｎ−Ｓｅｒ／Ａｌａ］ｍ、ただしｎが１から４（両端を含む）且つｍが１から４（両端を含む）を有するスペーサー。具体的なペプチドリンカーは、ＧＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶ（配列番号７）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８）；ＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０９）；ＧＳＧＲＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１０）；ＧＧＧＧＡＧＧＧ（配列番号１１１）；ＡＡＡＧＧＭＰＰＡＡＡＧＧＭ（配列番号１１２）；ＡＡＡＧＧＭ（配列番号１１３）；およびＰＰＡＡＡＧＧＭＭ（配列番号１１４）を含むが、これに限定されない。
【００５５】
他の実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質は免疫グロブリンＦｃポリペプチドドメインをさらに含む。Ｆｃ部分は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＡのヒンジ領域およびＣＨ２およびＣＨ３ドメイン；ＩｇＭのヒンジ領域およびＣＨ３およびＣＨ４領域；またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のキメラを含みうる。好ましくは、Ｆｃ受容体結合ドメインはヒト由来である。他の実施形態においては、Ｆｃドメインはマウス、ラット、ウサギ、サル、チンパンジー、ハムスターなどを含むがこれに限定されない、非ヒト哺乳類に由来する。具体的な実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質はＩｇＧ１  Ｈ鎖定常領域に由来する免疫グロブリンＦｃポリペプチドドメインを含む。
【００５６】
一部の実施形態においては、Ｆｃ領域は、Ｆｃ部分のエフェクター機能を変化させるために、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することにより修飾される。たとえば、１つまたはそれ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置換することにより、Ｆｃ部分のエフェクターリガンド（Ｆｃ受容体など）に対する親和性が変化し、且つ／またはＦｃ部分がＦｃγ受容体（例：ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎ）と結合不全となり、その結果抗体依存的細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介できなくなるか、またはその能力が著しく阻害されることがある。本開示のＩＬ−２７融合タンパク質のＦｃ領域に含めるための、代表的なＦｃγ受容体結合陰性ＩｇＧ１アイソタイプ変異は、配列番号１２に対する変異Ｌ１７Ａ、Ｌ１７Ｆ、Ｌ１８Ａ、Ｌ１８Ｅ、Ｄ４８Ａ、Ｎ８０Ａ、Ｎ８０Ｑ、またはＰ１１４Ｓのうちいずれか１つ、またはその組み合わせに対応する変異を含む。他の実施形態においては、１つまたはそれ以上のＦｃ領域アミノ酸が１つまたはそれ以上のアミノ酸残基で置換されることにより、生成するＦｃ部分のＣ１ｑ結合が変化し、且つ／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）が低下または消滅するか、またはＦｃ領域が補体を固定する能力が変化しうる。
【００５７】
一部の実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質またはＩＬ−２７融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、シグナルペプチド配列、ＧＰＩアンカーシグナル配列、膜貫通ドメイン、標的化ドメインまたはアフィニティタグの追加的なアミノ酸配列またはこれをコードするポリヌクレオチド配列を、それぞれさらに含みうる。
【００５８】
一定の実施形態においては、融合タンパク質はＧＰＩアンカーシグナル配列または膜貫通ドメイン配列を含みうる。ＧＰＩアンカーシグナルまたは膜貫通ドメイン配列を組み入れることによってＩＬ−２７融合タンパク質を細胞形質膜に係留することで、それらを固定してそのインビボ半減期を延長し、ＩＬ−２７融合タンパク質の局所的高濃度をもたらし、たとえばＩＬ−２７融合タンパク質を患者の腫瘍腫瘤に直接注射する時などに、高用量で投与することを可能とする。さらに、精製ＧＰＩアンカータンパク質は、ほぼあらゆる細胞の細胞膜と自然に一体化する能力を有する。
【００５９】
酵素、コートタンパク質、表面抗原、および接着分子を含む幅広い範囲の細胞表面タンパク質が、ＧＰＩアンカーを介して形質膜と結合する。本願で用いる用語「ＧＰＩ」は、グリコイノシトールリン脂質、具体的にはグリコシルホスファチジルイノシトールに関して用いられる。これらのリン脂質様アンカーは、タンパク質の機能と無関係な膜結合のための共通した構造を有する。ＧＰＩアンカーユニットは、ホスホエタノールアミン、３個のマンノース残基、およびイノシトールリン脂質と連結した非アセチル化グルコサミンを含む直鎖グリカンから構成される。ＧＰＩは翻訳後に付加される脂質アンカーであり；したがって、膜貫通ドメインが異なり且つ特定の細胞質側延長部と結合する一般的なポリペプチドアンカーと異なり、ＧＰＩアンカーは、その結合するタンパク質と無関係な、膜と結合するための共通した脂質構造を用いる。
【００６０】
ＧＰＩ結合部位の残基とその直後の残基は、典型的にはＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、ＣｙｓまたはＳｅｒなどの小さなアミノ酸である。結合残基の後には、結合点から７〜１０残基後より開始する約１０から２０残基の疎水性配列がある。ＧＰＩアンカーシグナル配列は、操作による他の非ＧＰＩアンカータンパク質のＣ末端上への結合に成功しており、またこれらのＧＰＩアンカータンパク質は細胞表面で被覆され且つ機能的である。
【００６１】
ＧＰＩアンカーシグナル配列は、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、５’−ヌクレオチダーゼ（ＣＯ７３）などの酵素；リンパ球機能関連抗原（ＬＦＡ−３；ＣＤ５８）および神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）などの接着分子；解離促進因子（ＤＡＦまたはＣＤ５５）などの補体調節タンパク質、またはＦｃγ受容体ＩＩＩＢ型（Ｆｃ−γ−ＲＩＩＩまたはＣＤ１６ｂ）、Ｔｈｙ−１（ＣＤ９０）、Ｑａ−２、Ｌｙ−６Ａおよび反応性細胞融解の膜阻害物質（ＭＩＲＬまたはＣＤ５９）などの他のものを含むがこれに限定されない、任意のＧＰＩ−アンカータンパク質から得ることができる。
【００６２】
ＧＰＩアンカーは、Ｃ末端ＧＰＩ結合シグナルがＧＰＩ部分の付加と同時に開裂する反応であるアミド基転移によって、小胞体内でタンパク質に結合する。したがって、ＧＰＩアンカー配列はＩＬ−２７融合タンパク質のＣ−末端に取り込まれうる。天然のＣＤ２４タンパク質はＧＰＩアンカータンパク質である。したがって、１つの実施形態においては、ＣＤ２４プロペプチド配列に由来するＣＤ２４  ＧＰＩアンカーシグナル配列は、ＩＬ−２７融合タンパク質の核酸コード領域にＣ末端で組み入れられる。具体的な実施形態においては、ＣＤ２４プロペプチドのシグナル配列を除いた全体は、ＩＬ−２７融合タンパク質（例：配列番号６０、６２）のＣ末端と融合される。
【００６３】
一部の実施形態においては、細胞への安定した結合を目的として、ＩＬ−２７融合タンパク質に膜貫通ドメインを組み入れうる。１つの実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質のＣ−末端に異種膜貫通ドメインを取り込みうる。膜貫通ドメインは、他の既知の膜貫通タンパク質を基にして設計することも、あるいは高度な脂溶性を有する人工的にデザインされたペプチドを含むこともある。
【００６４】
例示的な膜貫通ドメインは、マウス由来のドメインＢ７−１（ＰＰＤＳＫＮＴＬＶＬＦＧＡＧＦＧＡＶＩＴＶＶＶＩＶＶＩ、配列番号６３）、ヒトＢ７−１（ＬＬＰＳＷＡＩＴＬＩＳＶＮＧＩＦＶＩＣＣＬ、配列番号６４）、Ｐ−カドヘリン（ＦＩＬＰＩＬＧＡＶＬＡＬＬＬＬＬＴＬＬＡＬＬＬＬＶ、配列番号１１５）、ＣＤ２（ＩＹＬＩＩＧＩＣＧＧＧＳＬＬＭＶＥＦＶＡＬＬＶＦＹＩＴ、配列番号１１６）、ＣＤ４０（ＡＬＶＶＩＰＩＩＦＧＩＬＦＡＩＬＬＶＬＶＦＴ、配列番号１１７）、コントラクチン（ＩＳＧＡＴＡＧＶＰＴＬＬＬＧＬＶＬＰＡＰ）、配列番号１１８）、ＩＬ−４受容体（ＬＬＬＧＶＳＶＳＣＩＶＩＬＡＶＣＬＬＣＹＶＳＩＴ、配列番号１１９）、マンノース受容体（ＶＡＧＶＶＩＩＶＩＬＬＩＬＴＧＡＧＬＡＡＹＦＦＹ、配列番号１２０）、ＣＳＦ−１受容体（ＦＬＦＴＰＶＶＶＡＣＭＳＩＭＡＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬ、配列番号１２１）、ＰＤＧＦβ鎖受容体（ＶＶＶＩＳＡＩＬＡＬＶＶＬＴＩＩＳＬＩＩＬＩＭＬＷＱＫＫＰＲ、配列番号１２２）、ＰＤＧＦα鎖受容体（ＥＬＴＶＡＡＡＶＬＶＬＬＶＩＶＳＩＳＬＩＶＬＶＶＴＷ、配列番号１２３）、Ｐ−セレクチン（ＬＴＹＦＧＧＡＶＡＳＴＩＧＬＩＭＧＧＴＬＬＡＬＬ、配列番号１２４）、ＴＮＦＲ−１（ＴＶＬＬＰＬＶＩＦＦＧＬＣＬＬＳＬＬＦＩＧＬＭ、配列番号１２５）およびＶＣＡＭ−１（ＬＬＶＬＹＦＡＳＳＬＩＩＰＡＩＧＭＩＩＹＦＡＲ、配列番号１２６）を含むが、これに限定されない。
【００６５】
一定の実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質は、共刺激タンパク質Ｂ７−１に由来する膜貫通ドメインおよび細胞質側末端をＣ末端に含む（Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，ｖｏｌ．２０（５）：９２７−９３７，２０１２）。Ｂ７−１膜貫通ドメイン（ＴＭ）／細胞質側末端（ＣＴ）に対応する代表的なタンパク質配列は、配列番号６５（マウス）および配列番号６６（ヒト）に記載されている。
【００６６】
細胞標的化ドメインをＩＬ−２７融合タンパク質に組み入れて、細胞型特異的または細胞分化特異的標的化を付与することもできる。標的化ドメインは、抗体または抗体誘導体、ペプチドリガンド、受容体リガンド、受容体フラグメント、ホルモンなどを含みうる。一部の実施形態においては、標的化ドメインはファージディスプレイライブラリに由来する抗体由来またはペプチド由来標的化ドメインを含む。細胞表面分子または受容体と結合するために操作されたファージディスプレイライブラリは、当業者に周知である。
【００６７】
代表的な抗体または抗体由来標的化ドメインは：ＩｇＧ、抗体可変領域；分離ＣＤＲ領域；ペプチドリンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬドメインを含みその２つのドメインの関連が抗原結合部位を形成することを可能とする単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）；二重特異性ｓｃＦｖ二量体；ＣＨ３ドメインと連結したｓｃＦｖを含む低分子抗体、単鎖二重特異性抗体フラグメント、ＶＨまたはＶＬドメインからなるｄＡｂフラグメント；ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント；抗体ヒンジ領域に由来する１つまたはそれ以上のシステインを含めて、Ｈ鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に少数の残基が付加されたことによりＦａｂフラグメントと異なるＦａｂ’フラグメント；定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持するＦａｂ’フラグメントであるＦａｂ’−ＳＨフラグメント；連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；その誘導体、および抗原結合機能を保持した任意の他の抗体フラグメントからなる群の、任意の分子を含みうる。Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または二重特異性抗体分子は、ＶＨドメインとＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組み入れによって安定化しうる。抗体由来標的化剤を用いる場合、その中の標的化ドメインのいずれもまたは全ておよび／またはＦｃ領域を、当業者に周知である方法論を用いて「ヒト化」してもよい。
【００６８】
他の実施形態においては、アフィニティタグを組み入れて、アフィニティクロマトグラフィーによるＩＬ−２７融合タンパク質および／または目的のタンパク質の精製を促進することができる。アフィニティタグは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒスチジンタグ（例：６ｘＨｉｓ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、プロテインＡ、チオレドキシン、ユビキチン、ビオチン、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、ストレプトアビジンタグ、およびＦＬＡＧオクタペプチドタグ、ヘマグルチニンＡ（ＨＡ）タグ、ｍｙｃタグなどを含む多様な免疫原性ペプチドタグを含むがこれに限定されない、当業者に周知であるアフィニティタグを含む。
【００６９】
本開示において、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）遮断と併用したＩＬ−２７融合タンパク質は、抗腫瘍活性および抗自己免疫または抗同種免疫反応を相乗的に高めることができることが、予想外に確認されている。したがって、１つの態様においては、増殖性疾患、自己免疫疾患、および同種免疫反応の治療を目的とした医薬組成物は、本開示に従ったＩＬ−２７融合タンパク質を、抗ＰＤ−１物質、抗ＰＤ−Ｌ１物質、抗ＰＤ−Ｌ２物質、またはその組み合わせからなる群から選択される１つまたはそれ以上の物質と併せて含む。
【００７０】
ＰＤ−１およびそのリガンドは免疫応答の負の調節を行うことができる。ＰＤ−１は、Ｂ７ファミリーのタンパク質であるプログラム細胞死リガンド２（ＰＤ−Ｌ１）、およびプログラム細胞死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）の２つのリガンドを有する。ＰＤ−Ｌ１タンパク質は、ＬＰＳおよびＧＭ−ＣＳＦ投与に反応してマクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）上で、またＴＣＲおよびＢ細胞受容体シグナリング時にＴ細胞およびＢ細胞上でアップレギュレートされる一方、安静マウスにおいては、ＰＤ−Ｌ１  ｍＲＮＡは心臓、肺、胸腺、脾臓、および腎臓において検出可能である。ＰＤ−Ｌ１は、ＰＡ１骨髄腫、Ｐ８１５肥満細胞腫、およびＢ１６黒色腫を含むほぼ全てのマウス腫瘍細胞株においてＩＦＮ−γ処理直後に発現される。ＰＤ−Ｌ１は共刺激タンパク質Ｂ７−１と結合することも知られている。この結合相互作用はＴ細胞活性化および増殖、さらにはサイトカイン産生を阻害することができる。ＰＤ−Ｌ２発現はより制限され、且つ主としてＤＣおよび少数の腫瘍細胞株によって発現される。
【００７１】
ＰＤ−１活性は、ＰＤ−１と選択的に結合してその活性を阻害するか、またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２と選択的に結合してそれらとＰＤ−１との結合を阻害する抗体によって干渉されうる。したがって、一定の実施形態においては、抗ＰＤ−１物質、抗ＰＤ−Ｌ１物質または抗ＰＤ−Ｌ１物質は抗体である。代表的な抗ＰＤ−１抗体はＢＭＳ−９３６５５８（ブリストルマイヤーズスクイブにより開発中、別名ＭＤＸ−１１０６またはＯＮＯ−４５３８）、ＣＴ−０１１またはピディリズマブ（ＣｕｒｅＴｅｃｈにより開発中）、ＭＫ−３４７５（メルクにより開発中、別名ＳＣＨ９００４７５）を含むが、これに限定されない。代表的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＭＰＤＬ３２８０ＡまたはＲＧ７４４６（ジェネンテック／ロシュにより開発中）およびＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ−１１０５；ブリストルマイヤーズスクイブ）、ヒトＰＤ−Ｌ１と高い親和性で結合してＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１およびＢ７−１との双方との結合を遮断する完全ヒト免疫グロブリンＧ４（ＩｇＧ４）ｍＡｂを含むが、これに限定されない。
【００７２】
一部の実施形態においては、抗ＰＤ−１物質、抗ＰＤ−Ｌ１物質または抗ＰＤ−Ｌ２物質は、ＰＤ−１  ｍＲＮＡ、ＰＤ−Ｌ１  ｍＲＮＡ、またはＰＤ−Ｌ２  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを誘導するよう操作することのできる二重鎖ＲＮＡである。合成的に生成されたｓｉＲＮＡは、酵素ダイサーによって細胞内で正常にプロセシングされたｓｉＲＮＡの種類を構造的に模倣する。合成ｓｉＲＮＡは、周知のアルゴリズムを用いてデザインし、且つ従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて合成することができる。さらに、ｓｉＲＮＡは適切な発現ベクターから発現することができる。発現ベクターから発現する場合、発現ベクターを操作して、細胞内でプロセシングされて標的ｓｉＲＮＡとなる低分子二重鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を転写させる。合成ｓｈＲＮＡは、周知のアルゴリズムを用いてデザインし、且つ従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて合成しうる。
【００７３】
他の実施形態においては、抗ＰＤ−１物質、抗ＰＤ−Ｌ１物質または抗ＰＤ−Ｌ２物質は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２のドミナントネガティブ変異型である。本願で用いる用語「ドミナントネガティブ変異体」は、変異タンパク質とその正常タンパク質の結合対象の１つとの結合に干渉する変異非抗体タンパク質、またはその結合対象と結合するとその生物活性を欠損する複合体が生成する変異体を指す。たとえば、ドミナントネガティブＰＤ−１は、もはやＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２と結合することのできない変異を有する場合もある。またその代わりに、ドミナントネガティブタンパク質がその標的と結合するものの、シグナリングを欠損する複合体が生成することもある。代表的なドミナントネガティブ変異体はＡＭＰ−２２４である（グラクソスミスクラインとアンプリミューンによる共同開発）。ＡＭＰ−２２４は、ＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメインおよびヒトＩｇＧのＦｃ領域から構成される組換え融合タンパク質である。
【００７４】
一定の実施形態においては、本開示のＩＬ−２７融合タンパク質（または対応するポリヌクレオチド）は、対応する細胞質側末端を含まないＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメインを追加的に含むことも、あるいはコードすることもある。またその代わりに、別個のドミナントネガティブ抗ＰＤ−１タンパク質、抗ＰＤ−Ｌ１タンパク質または抗ＰＤ−Ｌ２タンパク質（またはその融合タンパク質）がＩＬ−２７融合タンパク質と併用投与されることも、あるいはそのようなドミナントネガティブタンパク質を発現する別個のポリヌクレオチドが、ＩＬ−２７発現ポリヌクレオチドと併用投与されることもある。
【００７５】
一部の実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質はＩＬ−２７と抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体またはそのフラグメントの間の融合を含む。他の実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質は抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体またはそのフラグメントと化学的に連結される。
【００７６】
一部の実施形態においては、抗ＰＤ−１物質、抗ＰＤ−Ｌ１物質または抗ＰＤ−Ｌ１物質は、ＰＤ−１と結合するがＰＤ−１を活性化しない、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を模倣する小分子またはペプチドである。
【００７７】
ＰＤ−１拮抗物質は、米国特許出願公開第２０１５／０２３２５５５号明細書、第２０１５／０２１６９７０号明細書、第２０１５／０２１０７７２号明細書、第２０１５／０２１０７６９号明細書、第２０１５／０２０３５７９号明細書、第２０１３／０２８０２６５号明細書、第２０１３／０２３７５８０号明細書、第２０１３／０２３０５１４号明細書、第２０１３／０１０９８４３号明細書、第２０１３／０１０８６５１号明細書、第２０１３／００１７１９９号明細書、第２０１２／０２５１５３７号明細書、第２０１２／００３９９０６号明細書、第２０１１／０２７１３５８号明細書、第２０１１／０１７１２１５号および欧州特許第２１７０９５９Ｂ１号明細書に記載のものを含む。
【００７８】
本開示のＩＬ−２７融合タンパク質中の上述の構造的および／または機能的ドメインのいずれも、本願に記載のフレキシブルなペプチドリンカーの１つまたはそれ以上によって互いに分離されて、各ペプチド部分の互いに対して独立した折りたたみを促進し、融合タンパク質中の個々のペプチド部分が互いに干渉しないようにしうる。
（ＩＬ−２７融合タンパク質コードポリヌクレオチド）
【００７９】
他の態様においては、本開示は本願に記載のＩＬ−２７融合タンパク質コードポリヌクレオチドを提供する。抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＰＤ−Ｌ２物質をコードする追加的ポリヌクレオチドを、ＩＬ−２７融合タンパク質コードポリヌクレオチドと併用投与してもよい。
【００８０】
１つの実施形態においては、発現ベクターが、細胞内でＩＬ−２７融合タンパク質（および／または抗ＰＤ−１／抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＰＤ−Ｌ２物質）を発現するのに適した１つまたはそれ以上の調節配列と機能的に連結された融合タンパク質（および／または抗ＰＤ−１／抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＰＤ−Ｌ２物質）をコードする。
【００８１】
一定の実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質を単独で、または本開示の抗ＰＤ−１／抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＰＤ−Ｌ２物質と併せてコードする発現する発現ベクターを患者に直接投与し、ＩＬ−２７融合タンパク質（さらにはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２物質）をインビボ発現させる。用語「インビボ発現ベクター」は、本開示のＩＬ−２７融合タンパク質またはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２物質を、宿主細胞におけるポリヌクレオチドからのインビボ発現に適した形態でコードするポリヌクレオチドを含む、ウイルスまたは非ウイルスベクターを指す。
【００８２】
他の実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質をコードする１つまたはそれ以上の発現ベクター単独で、または本開示の抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＰＤ−Ｌ２物質をコードする１つまたはそれ以上の発現ベクターと併せて細胞をトランスフェクトするかまたは感染させて、増殖性疾患、自己免疫疾患または望ましくない同種免疫反応を呈する対象にエクスビボ投与するための、安定したまたは一過性の細胞株を生成しうる。
【００８３】
ある核酸配列が他の核酸配列と機能的な関係に配置される場合、前者は後者と「機能的に連結」している。たとえば、あるプレ配列またはシグナルペプチドのＤＮＡが、あるポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、そのＤＮＡはそのポリペプチドのＤＮＡと機能的に連結し；あるプロモーターまたはエンハンサーがあるコード配列の転写に影響する場合、そのプロモーターまたはエンハンサーはその配列と機能的に連結し；あるいは、あるリボソーム結合部位が翻訳を促進する位置にある場合、そのリボソーム結合部位はコード配列と機能的に連結する。一般に、「機能的に連結」は、連結されているＤＮＡ配列が近接しており、且つシグナルペプチドの場合は、近接し且つリーディングフェーズ（reading phase）にあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも隣接しなくともよい。連結は、好都合な制限部位の結合によって完遂される。そのような部位が存在しない場合、従来の実践にしたがって合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを用いることもある。
【００８４】
ＩＬ−２７融合タンパク質を発現するための核酸配列は、アミノ末端シグナルペプチド配列（例：配列番号１および２）を含み、これは成熟タンパク質より除去される。シグナルペプチド配列は発現レベルに影響することがあるので、ポリヌクレオチドは、ＭＥＬＧＬＳＷＩＦＬＬＡＩＬＫＧＶＱＣ（配列番号１２７）；ＭＥＬＧＬＲＷＶＦＬＶＡＩＬＥＧＶＱＣ（配列番号１２８）；ＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳ（配列番号１２９）；ＭＤＷＴＷＲＩＬＦＬＶＡＡＡＴＧＡＨＳ（配列番号１３０）、ＭＤＷＴＷＲＦＬＦＶＶＡＡＡＴＧＶＱＳ（配列番号１３１）、ＭＥＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣ（配列番号１３２）およびＭＤＬＬＨＫＮＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳ（配列番号１３３）を含むがこれに限定されない、相異なる多様なＮ−末端シグナルペプチド配列をコードすることがある。
【００８５】
さらに、上述のように、ＧＰＩ連結ＩＬ−２７融合タンパク質を発現するための核酸配列はＣ末端ＧＰＩアンカーシグナル配列を含み、これは成熟タンパク質より除去される。代表的なＧＰＩアンカーシグナル配列は、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、５’−ヌクレオチダーゼ（ＣＯ７３）などの酵素；リンパ球機能関連抗原（ＬＦＡ−３；ＣＤ５８）および神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）などの接着分子；解離促進因子（ＤＡＦまたはＣＤ５５）などの補体調節タンパク質、またはＦｃγ受容体ＩＩＩＢ型（Ｆｃ−γ−ＲＩＩＩまたはＣＤ１６ｂ）、Ｔｈｙ−１（ＣＤ９０）、Ｑａ−２、Ｌｙ−６Ａおよび反応性細胞融解の膜阻害物質（ＭＩＲＬまたはＣＤ５９）などの他のものを含むがこれに限定されない、天然ＧＰＩ連結タンパク質に対応するタンパク質配列から得ることもある。
【００８６】
発現ベクターのデザインは形質転換しようとする宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存しうることが、当業者によって認識されることとなる。本開示の発現ベクターは、宿主細胞に導入することにより、本開示のＩＬ−２７融合タンパク質および抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＰＤ−Ｌ２物質などのタンパク質またはペプチドを産生することができる。
【００８７】
上記の「調節配列」は、１つまたはそれ以上の宿主生体における機能的に連結されたコード配列の発現にとって必要なＤＮＡ配列を指す。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節因子（例：ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図している。調節配列は、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を誘導する配列、または一定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を誘導する配列（例：組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターは、一般に転写終了のための配列を含み、かつｍＲＮＡの安定性に好ましく影響する１つまたはそれ以上の因子を追加的に含むこともある。
【００８８】
発現ベクターは、プロモーターおよび／またはエンハンサーを含む、ＩＬ−２７融合タンパク質の発現を誘導するための転写調節因子を１つまたはそれ以上含む。プロモーターは、転写開始部位に対して相対的に固定された位置から転写を開始するよう機能するＤＮＡ配列を含む。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子との塩基相互作用に必要とされる中核因子を含み、かつ他の上流因子および反応因子と組み合わせて機能することもある。
【００８９】
本願で用いる用語「プロモーター」はその最も広い文脈で解釈され、また、ＴＡＴＡボックスまたは正確転写開始のための開始因子を含めた、ゲノム遺伝子に由来する転写調節因子（ＴＲＥ）またはそれに由来するキメラＴＲＥを含み、追加的なＴＲＥ（すなわち上流活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー、およびサイレンサー）を伴うことも伴わないこともある。追加的なＴＲＥは、それと機能的に連結する遺伝子の活性化または抑制を、発達および／または外部刺激、およびトランス作動性調節タンパク質または核酸に対応して調節する。プロモーターはゲノムフラグメントを含むこともあれば、１つまたはそれ以上のＴＲＥと共に組み合わされたキメラを含むこともある。
【００９０】
好ましいプロモーターは、目的の標的細胞において発現を誘導することができるプロモーターである。プロモーターは、構成的プロモーター（例：ＨＣＭＶ、ＳＶ４０、延長因子１α（ＥＦ−１α））または目的とする特定の細胞型における優先的発現を示すプロモーターを含みうる。エンハンサーは、一般的に、転写開始部位から離れて機能し、且つ転写ユニットの５’または３’のいずれにも存在しうるＤＮＡ配列を指す。さらに、エンハンサーはイントロン内、さらにはコード配列内に存在することができる。長さは通常１０〜３００ｂｐであり、且つシスで機能する。エンハンサーは、近隣のプロモーターからの転写を増加および／または調節するよう機能する。好ましいエンハンサーは、エキソソーム発現細胞において高レベルの発現を誘導するエンハンサーである。
【００９１】
プロモーターおよび／またはエンハンサーは、光または特異的な化学誘導物質のいずれかによって特異的に活性化されうる。一部の実施形態においては、たとえばテトラサイクリンまたはデキサメタゾンなどの投与によって調節される誘導性発現系を用いることもある。他の実施形態においては、遺伝子発現は、ガンマ線照射および外部照射療法（ＥＢＲＴ）を含む放射線被曝、またはアルキル化化学療法剤によって促進しうる。
【００９２】
細胞または組織特異的転写調節因子（ＴＲＥ）を発現ベクターに組み入れ、所望の細胞型への発現を制限することができる。１つまたはそれ以上の細胞型においてＩＬ−２７融合タンパク質の発現を促進するよう、発現ベクターをデザインしうる。Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター（Ｈ１またはＵ６）は、ｓｈＲＮＡを発現するのに特に有用である。
【００９３】
さらに、発現ベクターはレポーター産物または選択マーカーをコードする核酸配列をさらに含みうる。レポーター産物は、遺伝子が細胞に送達されて発現しているか判定するために用いうる。代表的なマーカー遺伝子は、βガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコードするＥ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子を含む。
【００９４】
一定の実施形態においては、発現ベクターは、ＩＬ−２７融合タンパク質およびＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２を標的としたｓｉＲＮＡの双方を発現するよう操作されうる。ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを誘導するよう操作することのできる、二重鎖ＲＮＡである。合成的に生成されたｓｉＲＮＡは、酵素ダイサーによって細胞内で正常にプロセシングされたｓｉＲＮＡの種類を構造的に模倣する。発現ベクターから発現する場合、発現ベクターを操作して、細胞内でプロセシングされて標的ｓｉＲＮＡとなる低分子二重鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を転写させる。合成ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、周知のアルゴリズムを用いてデザインし、且つ従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて合成しうる。
【００９５】
ＩＬ−２７融合タンパク質およびＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２を標的とした適切なｓｈＲＮＡを共発現させるために、ＩＬ−２７融合タンパク質転写物（ＩＬ−２７融合タンパク質を産生する）およびｓｈＲＡＮ転写物の双方を発現するための、適切なスプライスドナー配列およびスプライスアクセプター配列を組み入れてもよく、これによりＩＬ−２７融合タンパク質コード配列はｓｈＲＮＡ配列の上流（５’−末端）に位置する。またその代わりに、ｓｈＲＮＡがＩＬ−２７コード配列の上流に組み入れられる場合、内部リボソーム結合配列（ＩＲＥＳ）または２Ａペプチド配列を、ｓｈＲＮＡ配列と下流のＩＬ−２７融合タンパク質のコード配列の間に挿入することもある。
【００９６】
ＩＲＥＳは、リボソームがそこに結合することが可能で、ｍＲＮＡの５’−末端にある必要がない構造を提供する。したがって、リボソームがｍＲＮＡ内の第２の開始コドンで翻訳を開始するよう誘導し、単一のｍＲＮＡから２つ以上のポリペプチドを産生することを可能とする。２Ａペプチドは、２Ａ部位より上流および下流のペプチドの共翻訳自己切断を媒介する短い配列を含み、単一の転写物から異なる２つのタンパク質を等モルで産生することを可能とする。ＣＨＹＳＥＬは２Ａペプチドの非制限的な例であり、翻訳中の真核生物リボソームに成長ポリペプチド鎖を放出させて、ｍＲＮＡから解離することなく合成させる。リボソームは、翻訳を続けることにより第２のポリペプチドを産生する。必要とされるのは、共発現を希望する２つの遺伝子間のフレーム内で、２Ａのコード配列、続いて次のＦＭＤＶタンパク質（例：２Ｂ）の第１のアミノ酸のコドンをクローニングすることのみである。２Ａの最終アミノ酸（Ｇｌｙ）および２Ｂの第１アミノ酸（Ｐｒｏ）の間のペプチド結合の合成が省かれ、１８ａａ（２Ａ）のＣ末端テールを有する上流タンパク質およびＮ末端にＰｒｏを有する下流タンパク質が産生される（ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、配列番号１３４）。
【００９７】
１つの実施形態においては、内部リボソーム結合配列（ＩＲＥＳ）または２Ａペプチド配列（ＣＹＳＥＬなど）をＩＬ−２７融合タンパク質コード配列とＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２についてのコード配列の間に挿入することにより、ＩＬ−２７融合タンパク質がＰＤ−１、ＰＬ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２に対する組換え抗体と共発現される。この実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質は組換え抗体配列の上流に組み入れられることもあれば、下流に組み入れられることもある。他の実施形態においては、発現ベクターは、それぞれがそれ自体の調節因子群によって調節される２つの別個の発現カセットを含む。またその代わりに、同時投与を目的とした異なる複数の発現ベクターが構築され、そこにおいて第１の発現ベクターがＩＬ−２７融合タンパク質をコードし、且つ１つまたはそれ以上の追加的な発現ベクターがＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２に対する組換え抗体（またはＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２に向けられたｓｈＲＮＡ）をコードする。
【００９８】
発現ベクターはウイルスベクターを含むことも、あるいは非ウイルスベクターを含むこともある。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２などのレンチウイルスを含む）、シンドビスおよび他のＲＮＡウイルス、アルファウイルス、アストロウイルス、コロナウイルス、オルソミクソウイルス、パポーバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルスなどに由来しうる。非ウイルスベクターは、ウイルス由来の成分（例：カプシドおよび／またはエンベロープ）によってパッケージングされていない単純に「裸の」発現ベクターである。
【００９９】
一定の例においては、これらのベクターは、ウイルスベクターに固有の標的化特性を用いることによって一定の疾患および細胞集団を標的とするよう操作されることも、あるいは操作されてウイルスベクターとなることもある。特定の細胞をポリヌクレオチドの送達、さらには発現を目的として「標的化」することもある。したがって、この場合の用語「標的化」は、カプシド、エンベロープタンパク質、特定の細胞への送達のための抗体の形態にある内因性または異種結合物質の使用、発現を特定の細胞サブセットに制限するための組織特異的調節因子の使用、またはその両者に基づくことがある。
【０１００】
一部の例においては、組換えウイルス粒子の産生には１つまたはそれ以上の「ヘルパー機能」を要する。「ヘルパー機能」は、ウイルスベクターの複製またはパッケージングに必要とされる機能をコードする核酸配列である。ヘルパー機能は天然発生核酸配列、さらにはそこから変異または変化した核酸配列を含みうる。典型的には、ヘルパー機能は、必要なヘルパー機能を提供するポリペプチドの発現を調節する発現制御配列と機能的に連結したヌクレオチド配列を含む。組換えウイルスに必要とされるヘルパー機能は、組換えウイルスの種類によって異なる。一般的に用いられる組換えウイルスに必要とされるヘルパー機能は、技術上既知である。
【０１０１】
一定の実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに由来する。ＡＡＶは、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの第２のウイルスの存在、または細胞内の複製に適したヘルパー機能に依存する、小型（２０〜２６ｎｍ）の複製不能、無エンベロープウイルスである。ＡＡＶは疾患を引き起こさないことが知られており、また非常に軽度の免疫応答を誘導する。ＡＡＶは分裂細胞にも非分裂細胞にも感染することが可能であり、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み入れることもある。３０種類以上の天然発生ＡＡＶ血清型がある。ＡＡＶカプシドには多くの天然変異体が存在し、送達目標の細胞に特に適した特性を有するＡＡＶベクターの特定と使用を可能とする。ＡＡＶベクターは比較的無毒性であり、効率の良い遺伝子移入をもたらし、且つ特定の目的に容易に最適化することができる。従来の分子生物学的技術を用いてＡＡＶウイルスを操作し、ＩＬ−２７融合タンパク質の細胞特異的送達、免疫原性の最小化、安定性の向上、核への送達などに対して、組換えＡＡＶ粒子の作製を最適化することができる。
【０１０２】
ＡＡＶベクターは、典型的には、哺乳類に対して病原性のない単鎖（ｓｓ）ＤＮＡパルボウイルスに由来する。ヒトまたは非ヒト霊長類から分離されたＡＡＶの血清型のうち、ヒト血清型２が最初に、且つ最も良く特性解析され、遺伝子移入ベクターとして開発されたＡＡＶである。その他の有用なＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびＡＡＶ１２を含む。一般的に、組換えＡＡＶによるベクターは、ｒｅｐおよびｃａｐ（カプシド）ウイルス遺伝子が除去され（ウイルスゲノムの９６％を占める）、隣接する２つの１４５塩基対（ｂｐ）の末端逆位配列（ＩＴＲ）が残り、これらはウイルスＤＮＡの複製、パッケージングおよび組込みの開始に用いられる。典型的には、ＡＡＶベクターには、１つまたはそれ以上の発現用調節因子と機能的に連結した導入遺伝子（すなわち本願に記載の融合タンパク質）を含む、長さ約４．５ｋｂの「ミニ遺伝子」を格納することができる。
【０１０３】
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２およびそのシュードタイプの組み合わせを含むが、これに限定されない組換えＡＡＶに対して、任意の適切なＡＡＶ血清型を利用しうる。シュードタイプ（またはキメラ）ＡＡＶベクターは２つ以上の血清型に由来する部分を含み、たとえば、１つのＡＡＶ血清型に由来するカプシドの一部分を異なるＡＡＶ血清型カプシドの第２の部分と融合し、シュードタイプＡＡＶ２／ＡＡＶ５カプシドをコードするベクターを生成することもできる。またその代わりに、シュードタイプＡＡＶベクターは、１つのＡＡＶ血清型に由来するカプシドを、もう１つのＡＡＶ血清型の背景構造内に含むこともある。たとえば、シュードタイプＡＡＶベクターは、１つのＡＡＶ血清型に由来するカプシドおよび他のＡＡＶ血清型に由来する末端逆位配列（ＩＴＲ）を含みうる。代表的なＡＡＶベクターは組換えシュードタイプＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８およびＡＡＶ２／９血清型ベクターを含む。別段明記されない限り、ＡＡＶ  ＩＴＲおよび本願に記載の選択された他のＡＡＶ構成成分は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２または他の既知の、または今のところ未知のＡＡＶ血清型を無制限に含む任意のＡＡＶ血清型の中から、容易に選択することができる。これらのＩＴＲまたは他のＡＡＶコンポーネントは、当業者が利用可能な技術を用いて１つのＡＡＶ血清型より容易に分離することができる。さらに、ＡＡＶ配列は学術的、商業的、または公的ソース（例：アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関、バージニア州マナッサス）から分離または入手することもできれば、あるいは文献またはＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄなどのデータベースなどから入手可能な配列などの公開配列を参照して、合成または他の適切な手段で入手することもできる。
【０１０４】
ＡＡＶベクターの相異なるサブタイプまたは相異なるＡＡＶシュードタイプを用いて、ＩＬ−２７融合タンパク質を細胞内にインビボまたはインビトロ発現することもできる。インビボ送達のためのベクターの種類は、好ましくは、選択したＡＡＶサブタイプに対する既存の免疫が宿主にないこと、および融合タンパク質の安定したインビボ発現に基づいて選択される
【０１０５】
構築してベクターおよび／またはヘルパー細胞とするための代表的なＡＡＶフラグメントは、カプシドサブユニットタンパク質、ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３、超可変領域、およびｒｅｐタンパク質、ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０を含む。ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ産物を提供する場合、ＡＡＶ  ｒｅｐおよびＡＡＶ  ｃａｐ配列の両者を１つの血清型由来、たとえば全てＡＡＶ８由来とすることもできれば、あるいは複数のＡＡＶ血清型由来とすることもできる。１つの実施形態においては、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は異なるソースから発現される（例：相異なる複数のベクター、または宿主細胞とベクター）。一部の実施形態においては、これらのｒｅｐ配列はフレーム内で異なるＡＡＶ血清型のｃａｐ配列と融合し、米国特許第７，２８２，１９９号明細書に記載のＡＡＶ２／８などのキメラＡＡＶベクターを形成することもある。
【０１０６】
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、本願に定義するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型カプシドタンパク質、またはそのフラグメントをコードする核酸配列；機能的ｒｅｐ遺伝子；最小限ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）および融合タンパク質コード核酸配列から構成されるベクター；およびミニ遺伝子をＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングすることを可能とするのに十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することによって作製しうる。ＡＡＶミニ遺伝子をＡＡＶカプシドにパッケージングするために、宿主細胞内で培養する必要がある構成成分は、途中で宿主細胞に提供しうる。またその代わりに、当業者に既知の方法を用いて、任意の１つまたはそれ以上の必要な構成成分（例：ミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、および／またはヘルパー機能）が、１つまたはそれ以上の必要な構成成分を含むよう操作された安定した宿主細胞によって、提供されることもある。たとえば、２９３細胞（構成的プロモーターの制御の元でＥ１ヘルパー機能を含む）に由来するが、構成的または誘導プロモーターの元でｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質を含む安定した宿主細胞を作製しうる。
【０１０７】
本開示の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を産生するのに必要とされるミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、およびヘルパー機能は、パッケージング宿主細胞またはヘルパー細胞で送達することもあれば、これらに収容することもある。選択された遺伝因子は、本願に記載の方法および技術上利用可能な他の任意の方法を含む任意の適切な方法を用いて送達しうる。ｒＡＡＡビリオンを作製する非制限的な方法は、技術上周知である。
【０１０８】
一部の実施形態においては、融合タンパク質導入遺伝子は、組織特異的プロモーターまたはユビキタスプロモーターなどの調節因子の制御下にある。一部の実施形態においては、融合タンパク質導入遺伝子の発現を制御する、ＣＭＶプロモーターまたはＣＭＶニワトリβアクチンハイブリッド（ＣＡＧ）などのユビキタスプロモーター。他の実施形態においては、筋肉などの組織特異的プロモーター（例：肝臓特異的プロモーター）を用いて、導入遺伝子の発現を制御する。筋特異的プロモーターの代表的な非制限的例は、ヒト筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーターであり；適切な肝特異的プロモーターはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーターである。
【０１０９】
ｒＡＡＶは、たとえば髄腔内および／または脳内注射などによる脳脊髄液（ＣＳＦ）内への直接投与後、ＣＮＳ組織全体に拡散することができる。一部の実施形態においては、ｒＡＡＶ（ＡＡＶ−９およびＡＡＶ−１０など）は、静脈内投与後に血液脳関門を通過して対象のＣＮＳ組織全体への広汎な分布を達成する。一部の例においては、血管内（例；静脈内）投与により、他の投与形態（例：髄腔内、脳内）よりも大きな体積の使用が容易になる。したがって、血管内（例：静脈内）投与により、高用量ｒＡＡＶ（例：最大１０１５ｒＡＡＶゲノムコピー（ＧＣ）／対象）を一度に送達することができる。血管内投与のための方法は技術上周知であり、たとえば皮下針、末梢カニューレ、中心静脈ラインなどの使用を含む。
【０１１０】
一定の実施形態においては、第１のｒＡＡＶがＩＬ−２７融合タンパク質をコードし、且つ第２のｒＡＡＶがＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２を標的とした組換え抗体をコードする併用投与を目的として、複数の相異なるｒＡＡＶを構築することもある。
【０１１１】
裸のＤＮＡの直接注射によって、あるいはＩＬ−２７融合タンパク質コードポリヌクレオチドおよび／またはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２標的化ポリヌクレオチドをリポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセル、ウイルス様粒子、または赤血球ゴーストに封入することによって、非ウイルス発現ベクターを非ウイルス遺伝子移入に利用することができる。そのような組成物は、化学的コンジュゲーションによって、たとえば微生物転座ドメインおよび／または標的化ドメインとさらに連結し、標的化送達および／または所望の細胞の核への核酸の移行を促進し、遺伝子の発現を促進することができる。さらに、重合ＤＮＡ結合陽イオン様ポリリジン、プロタミン、およびアルブミンなどの合成遺伝子移入分子と共にプラスミドベクターをインキュベートし、さらにアシアロオロソムコイド、インスリン、ガラクトース、ラクトース、またはトランスフェリンなどの細胞標的化リガンドと連結してもよい。
【０１１２】
またその代わりに裸のＤＮＡを用いてもよい。裸のＤＮＡの取り込み効率は、コンパクションによって、または生分解性ラテックスビーズを用いることによって改善しうる。そのような送達は、疎水性を高めることでエンドソームの崩壊と細胞質内へのＤＮＡの放出を促進するようビーズを処理することによって、さらに改善しうる。
（治療の方法）
【０１１３】
１つの態様においては、細胞増殖性疾患を治療するための方法は、本願に記載のＩＬ−２７融合タンパク質またはＩＬ−２７融合タンパク質を発現する発現ベクターを、増殖性疾患を治療するのに有効な量で、それを必要とする対象に投与することを含む。
【０１１４】
他の態様においては、自己免疫疾患または同種免疫反応を治療するための方法は、本願に記載のＩＬ−２７融合タンパク質またはＩＬ−２７融合タンパク質を発現する発現ベクターを、自己免疫疾患または同種免疫反応を治療するのに有効な量で、それを必要とする対象に投与することを含む。
【０１１５】
本願で用いる用語「治療する」および「治療」は、細胞増殖性疾患、自己免疫疾患、または同種免疫反応に随伴する１つまたはそれ以上の症状の寛解；細胞増殖性疾患、自己免疫疾患、または同種免疫反応の１つまたはそれ以上の症状の発現の予防または遅延；および／または細胞増殖性疾患、自己免疫疾患、または同種免疫反応の１つまたはそれ以上の症状の重症度または頻度の減少を指す。
【０１１６】
本文脈で用いる用語「改善」、「上昇」または「減少」は、本願に記載の治療を開始する前の同じ個体における測定値、または本願に記載の治療の不在下での対照個体（または複数の対照個体）における測定値などのベースライン測定値と比較した、数値またはパラメーターを指す。
【０１１７】
「対照個体」は、治療を受けている個体と同じ癌に罹患した個体であり、治療を受けている個体とほぼ同じ年齢である（治療される個体と対照個体の病期が比較可能であることを担保するため）。治療される個体（「患者」または「対象」とも呼ばれる）は、癌を有するヒト胎児、乳児、小児、青少年、または成人でありうる。
【０１１８】
用語「細胞増殖性疾患」は、細胞の異常な増殖によって特徴付けられる障害を指す。増殖性疾患は、細胞の成長速度に関するいかなる制限も意味せず、単に成長および細胞分裂に影響する正常な制御の喪失を示す。したがって、一部の実施形態においては、増殖性疾患の細胞は正常細胞と同じ細胞分裂速度を有することがあるが、そのような成長を制限するシグナルに反応しない。「細胞増殖性疾患」の範囲内に、組織の異常な増殖である新生物または腫瘍が存在する。「癌」は、周辺の組織に浸潤および／または新たな定着部位に転移する能力を有する細胞の増殖によって特徴付けられる、多様な悪性新生物のうち任意の１つを指し、白血病、リンパ腫、癌腫、黒色腫、肉腫、胚細胞性腫瘍、および芽細胞腫を含む。本開示の方法による治療の対象となる代表的な癌は、脳、膀胱、乳房、子宮頸部、結腸、頭頸部、腎臓、肺、非小細胞肺、中皮腫、卵巣、前立腺、胃、および子宮の癌、白血病、および髄芽腫を含む。
【０１１９】
用語「白血病」は、血液形成器官の進行性悪性疾患を指し、一般的には血液および骨髄における白血球およびその前駆体の歪な増殖および発生によって特徴付けられる。代表的な白血病は、たとえば急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞性白血病、非白血性白血病、白血球症性白血病、好塩基球性白血病、芽細胞性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、ヘアリー細胞白血病、血芽球性白血病、血球始原細胞性白血病、組織球性白血病、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞性白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄性顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、形質細胞白血病、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病、幹細胞性白血病、亜白血病性白血病、および未分化細胞性白血病などを含む。
【０１２０】
用語「癌腫」は、周辺組織に浸潤し、且つ転移を引き起こす傾向のある、上皮細胞の悪性増殖を指す。代表的な癌腫は、たとえば腺房癌、小葉癌、腺嚢癌腫、腺様嚢胞癌、腺癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｓｕｍ）、副腎皮質癌、肺胞癌、肺胞上皮癌、基底細胞癌（ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、基底細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｂａｓｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、類基底細胞癌、基底扁平細胞癌、細気管支肺胞上皮癌、細気管支癌、気管支原性癌、大脳様癌、胆管細胞癌、絨毛膜癌（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膠様癌（ｃｏｌｌｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、面皰癌、子宮体癌、篩状癌、鎧状癌、皮膚癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｕｔａｎｅｕｍ）、円柱癌、円柱細胞癌、管癌、硬癌、胎児性癌、脳様癌（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、類表皮癌（エピエノイド癌腫：ｅｐｉｅｎｎｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺様上皮癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｅ  ａｄｅｎｏｉｄｅｓ）、外方発育癌、潰瘍癌、線維性癌、膠様癌（ｇｅｌａｔｉｎｉｆｏｒｍ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膠様癌（ｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌（ｇｉａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｇｉｇａｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、腺癌（ｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、顆粒細胞癌、毛母組織癌、血様癌、肝細胞癌、ヒュルトレ細胞癌、硝子状癌、副腎様癌（ハイペメフロイド癌腫：ｈｙｐｅｍｅｐｈｒｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、幼児型胎児性癌、上皮内癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）、表皮内癌、上皮内癌（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クロムペッヘル癌、クルチツキー細胞癌、大細胞癌、レンズ状癌（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、レンズ状癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪腫様癌、リンパ上皮癌、髄様癌、（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、髄様癌（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色癌、軟性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｏｌｌｅ）、粘液癌（ｍｕｃｉｎｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液分泌性癌、粘液細胞性癌、粘表皮癌、粘液癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｃｏｓｕｍ）、粘液性癌、粘液腫様癌、鼻咽頭癌、燕麦細胞癌、骨化性癌、類骨癌、乳頭状癌、門脈周囲癌、前浸潤癌、有棘細胞癌、軟性癌（ｐｕｌｔａｃｅｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ），腎細胞癌、予備細胞癌、肉腫癌、総排泄腔癌、硬性癌、陰嚢癌、印環細胞癌、単純癌、小細胞癌、バレイショ状癌、回転楕円面細胞癌腫、紡錘細胞癌、海綿様癌、扁平上皮細胞癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ストリング癌腫、血管拡張性癌腫、毛細血管拡張性癌腫、移行上皮癌、結節癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、結節癌（ｔｕｂｅｒｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、疣状癌、および絨毛癌などを含む。
【０１２１】
用語「肉腫」は、胚性結合組織様の物質から形成される腫瘍を指し、一般的に筋原線維物質または均一な物質に包埋され密接に圧縮された細胞から構成される。代表的な肉腫は、たとえば軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アバーネーシ肉腫（アベメシー：Ａｂｅｍｅｔｈｙ’ｓ）肉腫、脂肪肉腫（ａｄｉｐｏｓｅ  ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ）、胞巣状軟部肉腫、エナメル上皮歯牙肉腫、ブドウ状肉腫、緑色腫肉腫、絨毛膜癌（ｃｈｏｒｉｏ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胎児性肉腫、ウィルムス肉腫（ウィルンス：Ｗｉｌｎｓ’）、腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質性肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞性肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、Ｂ細胞性免疫芽球性肉腫、リンパ腫（例：非ホジキンリンパ腫）、Ｔ細胞免疫芽球性肉腫、イエンセン肉腫、カポジ肉腫、クッパー星細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉腫肉腫、傍骨肉腫、細網肉腫、ラウス肉腫、漿液嚢胞性肉腫、滑膜肉腫、および毛細血管拡張性肉腫などを含む。
【０１２２】
用語「黒色腫」は、皮膚および他の器官のメラニン細胞系から発生する腫瘍を指す。黒色腫は、たとえば末端黒子型黒色腫、無色素性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、Ｓ９１黒色腫、ハーディング−パッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、結節型黒色腫舌下黒色腫、および表在性拡大型黒色腫などを含む。
【０１２３】
追加的な癌は、たとえばホジキン病、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃癌、結腸癌、悪性膵インシュリノーマ（インスラノーマ：ｉｎｓｕｌａｎｏｍａ）、悪性カルチノイド、前癌性皮膚病変、精巣癌、甲状腺癌、神経芽細胞腫、食道癌、尿生殖路癌、悪性高カルシウム血症、子宮頸癌、子宮内膜癌、および副腎皮質癌などを含む。
【０１２４】
本願で用いる用語「自己免疫疾患」は、個体の免疫系（例：活性化Ｔ細胞）がその個体自身の組織および細胞を攻撃する状態を指す。本願で用いる用語「同種免疫反応」は、個体の免疫系が移植された組織または細胞（移植片として）を攻撃する状態を指す。
【０１２５】
本開示の方法による治療の対象となる代表的な自己免疫性疾患は、関節炎、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、クローン病、皮膚筋炎、糖尿病（１型）、糸球体腎炎、グレーヴス病、ギラン−バレー症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、ループス腎炎、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋炎、天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、甲状腺炎（橋本甲状腺炎およびオード甲状腺炎など）、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、白斑、ヴェグナー肉芽腫症を含む。本開示の方法による治療の対象となる代表的な同種免疫反応は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）および移植片拒絶を含む。
【０１２６】
１つの実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質またはＩＬ−２７コード発現ベクターは単独で投与される。
【０１２７】
他の実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質またはＩＬ−２７コード発現ベクターは、１つまたはそれ以上の抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、および／または抗ＰＤ−Ｌ２物質と併せて、増殖性疾患、自己免疫性疾患または同種免疫反応を治療するのに有効な量で、投与される。抗ＰＤ−１物質、抗ＰＤ−Ｌ１物質または抗ＰＤ−Ｌ２物質は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を標的とする抗体、ドミナントネガティブタンパク質またはｓｉＲＮＡの形態をとりうる。
【０１２８】
一定の実施形態においては、抗ＰＤ−１物質、抗ＰＤ−Ｌ１物質または抗ＰＤ−Ｌ１物質は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメインを含む可溶性Ｆｃ融合タンパク質を含む。またその代わりに、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２に由来する１つまたはそれ以上の細胞外ドメインを、本開示のＩＬ−２７融合タンパク質のいずれかに組み入れることもある。
【０１２９】
他の実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質または発現ベクターは、１つまたはそれ以上の抗Ｂ７−１物質、抗Ｂ７−２物質、抗ＣＴＬＡ−４物質、抗ＬＡＧ−３物質、抗ＴＩＭ−３物質、抗−ＴＩＧＩＴ物質、抗−ＢＴＬＡ物質、抗−ＶＩＳＴＡ物質と併せて、増殖性疾患、自己免疫疾患または同種免疫反応を治療するのに有効な量で投与される。抗Ｂ７−１物質、抗Ｂ７−２物質、抗ＣＴＬＡ−４物質、抗ＬＡＧ−３物質、抗ＴＩＭ−３物質、抗ＴＩＧＩＴ物質、抗ＢＴＬＡ物質、または抗ＶＩＳＴＡ物質は、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡおよび／またはＶＩＳＴＡを標的とした抗体、ドミナントネガティブタンパク質またはｓｉＲＮＡの形態を取りうる。
【０１３０】
一定の実施形態においては、抗Ｂ７−１物質、抗Ｂ７−２物質、抗ＣＴＬＡ−４物質、抗ＬＡＧ−３物質、抗ＴＩＭ−３物質、抗ＴＩＧＩＴ物質、抗ＢＴＬＡ物質、または抗ＶＩＳＴＡ物質は、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡおよび／またはＶＩＳＴＡの細胞外ドメインを含む可溶性Ｆｃ融合タンパク質を含む。またその代わりに、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、および／またはＶＩＳＴＡに由来する１つまたはそれ以上の細胞外ドメインを、本開示のＩＬ−２７融合タンパク質のいずれかに組み入れうる。
【０１３１】
代表的な抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ（ブリストルマイヤーズスクイブ）、ペンブロリズマブ（メルク）、ＭＫ−３４７５、ＢＭＳ−９３６５５８（ブリストルマイヤーズスクイブ）、およびピディリズマブ／ＣＴ−０１１（ＣｕｒｅＴｅｃｈ）、ＭＤＸ−１１０６（Ｍｅｄａｒｅｘ）を含む。
【０１３２】
代表的な抗−ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＢＭＳ−９３６５５９（ブリストルマイヤーズスクイブ）、ＭＥＤＩ４７３６（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／アストラゼネカ）、ＭＰＤＬ３３２８０Ａ（ジェネンテック／ロシュ）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ）を含む。
【０１３３】
代表的な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブおよびトレメリムマブを含む。代表的な抗ＣＴＬＡ−４ドミナントネガティブタンパク質は、ＣＴＬＡ−４  ＥＣＤと融合したＩｇＧ１のＦｃ領域を含むヒト化融合タンパク質アバタセプト（オレンシア）、およびアバタセプトと比較してＣＴＬＡ−４  ＥＣＤに２つのアミノ酸置換基を有する第２世代高親和性ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ変異体ベラタセプト（ヌロジクス（登録商標））を含む。
【０１３４】
融合タンパク質または発現ベクターの治療上または予防上有効な用量を患者に提供するために、任意の適切な投与経路または様式を用いることができる。代表的な投与経路または様式は非経口（例：静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内）、経口、局所（例：鼻腔、経皮、皮内または眼内）、粘膜（例：鼻腔、舌下、バッカル、直腸、膣）、吸入、リンパ内、脊髄内、頭蓋内、腹腔内、気管内、膀胱内、髄腔内、腸内、肺内、リンパ内、体腔内、眼窩内、嚢内および経尿道、さらにはカテーテルまたはステントによる局所送達を含む。
【０１３５】
本開示に従った融合タンパク質または発現ベクターを含む医薬組成物を、医薬上許容できる任意の担体または添加剤で製剤化しうる。本願で用いる用語「医薬上許容できる担体」は、生理学的に適合する任意且つ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などを含む。医薬組成物は適切な固形またはゲル相単体または添加剤を含みうる。代表的担体または添加剤は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、多様な糖類、デンプン類、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどのポリマーを含むが、これに限定されない。代表的な医薬上許容できる担体は、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのうち１つまたはそれ以上、さらにはその組み合わせを含む。多くの場合、たとえば糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール類、または塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含むことが好ましい。医薬上許容できる担体は、治療薬の有効期限を延長するか、または有効性を高める湿潤剤または乳化剤、保存料または緩衝剤などの少量の補助物質をさらに含みうる。
【０１３６】
融合タンパク質または組換え発現ベクターは、非経口投与に適した医薬組成物に組み入れることができる。適切な緩衝剤はコハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムを含むが、これに限定されない。０〜３００ｍＭの濃度（液状剤型には１５０ｍＭが至適）にある塩化ナトリウムを、溶液の毒性を変更するために用いることができる。凍結防止剤は凍結乾燥剤型に含めることができ、主として０〜１０％ショ糖である（０．５〜１．０％が至適）。他の適切な凍結防止剤はトレハロースおよびラクトースを含む。充填剤は凍結乾燥剤型に含めることができ、主として１〜１０％マンニトールである（２〜４％が至適）。安定化剤は液状剤型および凍結乾燥剤型の双方に用いることが可能であり、主として１〜５０ｍＭのＬ−メチオニンである（５〜１０ｍＭが至適）。他の適切な充填剤はグリシン、アルギニンを含み、０〜０．０５％ポリソルベート８０として含めることができる（０．００５〜０．０１％が最適）。追加的な界面活性剤はポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性剤を含むが、これに限定されない。
【０１３７】
治療融合タンパク質製剤は、好ましくは真空下で凍結乾燥し、無菌粉末として保存した後、注射の前に静菌水（たとえばベンジルアルコール保存料を含有）または滅菌水に再溶解することができる。たとえばボーラス注射または持続点滴などの注射による非経口投与を目的として、医薬組成物を製剤化することもある。
【０１３８】
医薬組成物中の治療薬は、「治療上有効な量」または「予防上有効な量」で製剤化しうる。「治療上有効な量」は、所望の治療結果を達成するために、投与時および必要な期間中に有効である量を指す。組換えベクターの治療上有効な量は、治療しようとする状態、状態の重症度および経過、投与様式、抗体または薬剤が予防目的で投与されるのか治療目的で投与されるのか、個別の薬剤のバイオアベイラビリティ、融合タンパク質またはベクターが個体において所望の反応を誘発する能力、前治療、患者の年齢、体重および性別、患者の臨床履歴および抗体への応答、使用する融合タンパク質または発現ベクターの種類、主治医の裁量に応じて変動しうる。治療上有効な量は、治療的に好ましい効果が組換えベクターの毒性または有害作用を上回る量でもある。「予防上有効な量」は、所望の予防結果を達成するために、投与時および必要な期間中に有効である量を指す。
【０１３９】
投与する治療薬剤に対する炎症反応を低下させるために、好ましくは、融合タンパク質のポリペプチドドメインまたはポリヌクレオチドは、投与しようとする宿主と同じ宿主に由来とする。
【０１４０】
融合タンパク質または発現ベクターは、一度に、または一連の治療にわたって患者に適切に投与され、且つ診断以降の任意の時点で患者に投与しうる。融合タンパク質または発現ベクターは、単独の治療として投与することも、あるいは対象とする状態を治療する上で有用な他の薬剤または治療薬と併せて投与することもある。
【０１４１】
一般的な提案として、融合タンパク質の治療上有効な量または予防上有効な量は、１回の投与であれ、それ以上の回数の投与であれ、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲内で投与される。具体的な実施形態においては、各融合タンパク質または発現ベクターは約１ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１μｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１μｇ／ｋｇ体重／日、１０ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１μｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日から約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日から約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日から約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日から約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日から約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日から約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日から約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１００μｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００μｇ／ｋｇ体重／日から約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００μｇ／ｋｇ体重／日から約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１ｍｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１ｍｇ／ｋｇ体重／日から約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲で投与される。
【０１４２】
他の実施形態においては、融合タンパク質は５００μｇから２０ｇ３日毎、または２５ｍｇ／ｋｇ体重３日毎の用量で投与される。
【０１４３】
他の実施形態においては、各融合タンパク質は約１０ｎｇから約１００ｎｇ／回、約１０ｎｇから約１μｇ／回、約１０ｎｇから約１０μｇ／回、約１０ｎｇから約１００μｇ／回、約１０ｎｇから約１ｍｇ／回、約１０ｎｇから約１０ｍｇ／回、約１０ｎｇから約１００ｍｇ／回、約１０ｎｇから約１０００ｍｇ／注射、約１０ｎｇから約１０，０００ｍｇ／回、約１００ｎｇから約１μｇ／回、約１００ｎｇから約１０μｇ／回、約１００ｎｇから約１００μｇ／回、約１００ｎｇから約１ｍｇ／回、約１００ｎｇから約１０ｍｇ／回、約１００ｎｇから約１００ｍｇ／回、約１００ｎｇから約１０００ｍｇ／注射、約１００ｎｇから約１０，０００ｍｇ／回、約１μｇから約１０μｇ／回、約１μｇから約１００μｇ／回、約１μｇから約１ｍｇ／回、約１μｇから約１０ｍｇ／回、約１μｇから約１００ｍｇ／回、約１μｇから約１０００ｍｇ／注射、約１μｇから約１０，０００ｍｇ／回、約１０μｇから約１００μｇ／回、約１０μｇから約１ｍｇ／回、約１０μｇから約１０ｍｇ／回、約１０μｇから約１００ｍｇ／回、約１０μｇから約１０００ｍｇ／注射、約１０μｇから約１０，０００  ｍｇ／回、約１００μｇから約１ｍｇ／回、約１００μｇから約１０ｍｇ／回、約１００μｇから約１００ｍｇ／回、約１００μｇから約１０００ｍｇ／注射、約１００μｇから約１０，０００ｍｇ／回、約１ｍｇから約１０ｍｇ／回、約１ｍｇから約１００ｍｇ／回、約１ｍｇから約１０００ｍｇ／注射、約１ｍｇから約１０，０００ｍｇ／回、約１０ｍｇから約１００ｍｇ／回、約１０ｍｇから約１０００ｍｇ／注射、約１０ｍｇから約１０，０００ｍｇ／回、約１００ｍｇから約１０００ｍｇ／注射、約１００ｍｇから約１０，０００ｍｇ／回および約１０００ｍｇから約１０，０００ｍｇ／回の範囲で投与される。融合タンパク質または発現ベクターは、連日、２、３、４、５、６または７日毎、または１、２、３、または４週間毎に投与しうる。
【０１４４】
他の具体的な実施形態においては、融合タンパク質の量は約０．０００６ｍｇ／日、０．００１ｍｇ／日、０．００３ｍｇ／日、０．００６ｍｇ／日、０．０１ｍｇ／日、０．０３ｍｇ／日、０．０６ｍｇ／日、０．１ｍｇ／日、０．３ｍｇ／日、０．６ｍｇ／日、１ｍｇ／日、３ｍｇ／日、６ｍｇ／日、１０ｍｇ／日、３０ｍｇ／日、６０ｍｇ／日、１００ｍｇ／日、３００ｍｇ／日、６００ｍｇ／日、１０００ｍｇ／日、２０００ｍｇ／日、５０００ｍｇ／日または１０，０００ｍｇ／日の用量で投与しうる。予想されるように、用量は病状、患者のサイズ、年齢、および状態に依存することになる。
【０１４５】
一定の実施形態においては、医薬組成物は、少なくとも１０１０、少なくとも１０１１、少なくとも１０１２、少なくとも１０１３、または少なくとも１０１４個ゲノムコピー（ＧＣ）または組換えウイルス粒子／ｋｇ含む量またはその任意の範囲で、ｒＡＡＶなどの組換えウイルスの有効量を含む。一定の実施形態においては、医薬組成物は、少なくとも１０１０、少なくとも１０１１、少なくとも１０１２、少なくとも１０１３、少なくとも１０１４、少なくとも１０１５個のゲノムコピーまたは組換えウイルス粒子／対象を含む量またはその任意の範囲で、ｒＡＡＶなどの組換えウイルスの有効量を含む。
【０１４６】
用量は、個別の癌、自己免疫疾患または同種免疫反応に適した、いくつかの技術上許容される動物モデルで試験することができる。
【０１４７】
送達の方法論は、死菌ウイルスと連結または非連結のポリカチオン縮合ＤＮＡ、リガンド連結ＤＮＡ、リポソーム、真核細胞送達担体細胞、光重合ハイドロゲル材料の沈着、手持ち式遺伝子移入粒子銃の使用、電離放射線、核電荷中和また細胞膜との融合、粒子媒介遺伝子移入などの使用も含みうる。
【０１４８】
さらなる態様においては、増殖性疾患、自己免疫疾患、および同種免疫反応を治療するための方法は、本開示のＩＬ−２７融合タンパク質を単独で、または抗ＰＤ−１物質、抗ＰＤ−Ｌ１物質、抗ＰＤ−Ｌ２物質、またはその組み合わせと併せて発現する細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【０１４９】
一定の実施形態においては、Ｔ細胞の刺激および結果的治療の有効性を高めるために、融合タンパク質、発現ベクターおよび／または細胞は、腫瘍抗原またはキメラ抗原受容体形質導入Ｔ細胞と併用して投与することもある。
【０１５０】
（ＩＬ−２７融合タンパク質を産生するための方法）
本願の他の態様は、ＩＬ−２７融合タンパク質構築物を一時的にまたは安定的に発現する細胞を培養すること；および培養細胞からＩＬ−２７融合タンパク質を精製することを含む、ＩＬ−２７融合タンパク質を産生する方法に関する。機能的ＩＬ−２７融合タンパク質を産生する能力のある任意の細胞を用いることができる。好ましい実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質発現細胞は真核生物または哺乳類に由来する。一定の実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質産生細胞はヒト細胞である。多様な組織細胞型に由来する細胞を用いて、ＩＬ−２７融合タンパク質を単独で、または抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＰＤ−Ｌ２物質のうち１つまたはそれ以上と併せて発現させうる。他の実施形態においては、細胞は酵母細胞、昆虫細胞または細菌細胞である。
【０１５１】
一部の実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質産生細胞は、ＩＬ−２７融合タンパク質を発現するベクターで安定的に形質転換される。他の実施形態においては、エキソソーム産生細胞が融合タンパク質を発現するベクターで一時的に形質転換される。
【０１５２】
発現ベクターは、裸のＤＮＡの技術、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、ポリマー媒介トランスフェクション、ペプチド媒介トランスフェクション、ウイルス媒介トランスフェクション、物理的または化学的物質または処理、エレクトロポレーションなどの任意の従来の方法で、細胞に導入することができる。１つの実施形態においては、ベクターでトランスフェクトされた細胞を、エキソソーム源として直接使用してもよい（一時的トランスフェクション）。またその代わりに、融合タンパク質および／またはを発現する安定的に形質転換されたクローンの選択を容易にする選択マーカーと共に、ＩＬ−２７融合タンパク質を発現するベクターで細胞をトランスフェクトすることもある。引用された参照文献および本願の実施例にさらに記載されるように、そのような細胞によって産生されるエキソソームは、遠心分離、クロマトグラフィなどの技術上既知の技術にしたがって回収および／または精製される。
【０１５３】
哺乳類細胞に適した選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログＧ４１８、ハイドロマイシンおよびピューロマイシンを含む。そのような選択的マーカーの哺乳類宿主細胞への導入が成功するとき、形質転換された哺乳類宿主細胞は選択圧下におかれた場合に生存することができる。選択方式には２つの広く用いられる特徴的カテゴリーが存在する。第１のカテゴリーは、細胞の代謝と、補充培地に依存せずに発育する能力を欠く変異細胞株の使用に基づいている。２つの例はＣＨＯ  ＤＨＦＲ−細胞およびマウスＬＴＫ−細胞である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンなどの栄養素の添加なしで発育する能力を欠く。これらの細胞は、ヌクレオチド合成経路を完成させるために必要な一定の遺伝子を欠いているので、失われたヌクレオチドが補充培地に提供されない限り生存できない。培地への補充の代替法は、未変化のＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子をそれぞれの遺伝子を欠く細胞に導入し、これによりその発育要求を変化させることである。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子で形質転換されていない個々の細胞は、非補充培地内での生存が不可能となる。
【０１５４】
第２のカテゴリーは、任意の細胞型に使用され、変異細胞株の使用を必要としない選択スキームを指す優性選択である。これらのスキームは、典型的には宿主細胞の発育を停止させる薬剤を用いる。新規遺伝子を有する細胞は薬剤耐性をもたらすタンパク質を発現し、選択を生き延びるであろう。そのような優性選択の例は薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸、およびヒグロマイシンを用いる。３つの例では、細菌遺伝子を真核制御の元で用いて、適切な薬剤Ｇ４１８またはネオマイシン（ジェネテシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはヒグロマイシンに対する耐性をそれぞれもたらす。その他は、ネオマイシンアナログＧ４１８およびピューロマイシンを含む。
【０１５５】
代表的なＩＬ−２７融合タンパク質発現細胞は、ヒトジャーカット細胞、ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ）２９３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスＷＥＨＩ線維肉腫細胞、さらにはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔａｒｅｎｔｏｌａｅなどの単細胞原生生物種を含む。さらに、ｃ−ｍｙｃまたは不死化剤を用いて不死化した一次細胞を用いて、安定的に形質転換された融合タンパク質産生細胞株を生成することができる。
【０１５６】
１つの実施形態においては、細胞株はＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔａｒｅｎｔｏｌａｅなどの安定的に形質転換されたＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞株を含む。Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａは、哺乳類型グリコシル化パターンを示す真核生物タンパク質の高レベル発現を目的とした、堅牢で発育の早い単細胞宿主を提供することが知られている。市販のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ真核発現キットが入手可能である（Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ、イエナ、ドイツ）。
【０１５７】
一部の実施形態においては、細胞株は少なくとも１ｍｇ、少なくとも２ｍｇ、少なくとも５ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも２０ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、または少なくとも１００ｍｇ／培養ＬのＩＬ−２７融合タンパク質を発現する。
【０１５８】
ＩＬ−２７融合タンパク質は、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、およびＡＩＭ  Ｖ（登録商標）などの任意の適切な培地中での培養および維持後、ＩＬ−２７融合タンパク質発現細胞から分離することができる。ＩＬ−２７融合タンパク質は、当業者に既知の従来のタンパク質精製方法論（例：アフィニティ精製、クロマトグラフィなど）を用いて精製することができる。一部の実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質を培養上清に分泌させ、そこから分離するよう操作することができる。ＩＬ−２７融合タンパク質は、Ｆｃ結合領域を含むＩＬ−２７融合タンパク質のプロテインＡまたはプロテインＧイムノアフィニティ精製の使用を含む、従来のタンパク質精製方法論を用いて分離することができる。
【０１５９】
上記の方法は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に向けられた抗体およびドミナントネガティブタンパク質を含むタンパク質を発現するために、同様に用いることができる。
【０１６０】
本発明は、制限的であると解釈すべきでない以下の実施例によってさらに例示される。本願を全文で引用された全ての引用文献、特許明細書および公開特許明細書の内容、さらに図面と表は、参照文献として本願に援用される。
【実施例１】
【０１６１】
（組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによるＩＬ−２７融合タンパク質の発現）
ＥＢＩ３、ｐ２８、およびその間のリンカーを含むｃＤＮＡを、プライマーｍＩＬ−２７（Ｘｈｏ１）：５’−ＡＡＴ  ＣＴＡ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＡＣＣ  ＧＧＴ  ＡＧＧ  ＡＧＧ  ＧＣＣ  ＡＡ−３’（配列番号１３９）およびｍＩＬ−２７（ＥｃｏＲＶ）：５’−ＡＴＧ  ＴＡＴ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＡＴＧ  ＴＣＧ  ＡＧＣ  ＴＡＧ  ＣＴＴ  ＡＧＧ  ＡＡ−３’（配列番号１４０）を用いて、ｐＵＮＯ１−ｍＩＬ２７（ｅｂｉ３ｐ２８）（インビボジェン）からＰＣＲ増幅した。１つの実施形態においては、ＣＭＶ−ニワトリβアクチンハイブリッド（ＣＡＧ）プロモーターの制御下で、ＰＣＲ増幅産物をＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＶで切断し、ＡＡＶ−８発現ベクター（ｐＡＭ／ＣＢＡ−ｐｌ−ＷＰＲＥ−ｂＧＨ、配列番号１４１）に接続してＩＬ−２７発現ベクターを形成した。ＩＬ−２７発現ベクターは、報告（Ｗａｎｇ  Ｚ他、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５；２３（３）：３２１−８；およびＱｉａｏ  Ｃ他、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００８；１９（３）：２４１−５４）に従って、２９３Ｋ細胞内でｐＡＡＶ−ＲＣベクター（ＡＡＶ血清型８、ＡＡＶ８）およびアデノウイルスヘルパーベクターを用いてパッケージングし、ｐＵＮＯ１−ｍＩＬ２７（ｅｂｉ３ｐ２８）ベクターでコードされるＩＬ−２７融合タンパク質を発現する、ＡＡＶ８に基づく組換えＡＡＶベクターであるＡＡＶ−ＩＬ−２７を生成した。
【実施例２】
【０１６２】
（癌免疫療法の治療薬としてのＡＡＶ−ＩＬ−２７の使用）
ＩＬ−２７を癌治療薬候補として使用できるか判定するために、ＩＬ−２７を発現する組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ−ＩＬ−２７）の筋肉内注射を実施し、実施例１において結果を対象ＡＡＶベクター（ＡＡＶ−Ｃｔｒｌ）と比較した。ＡＡＶ−ＩＬ−２７の不全ウイルス粒子（ＤＶＰ）２×１０１１個／マウスの筋肉内投与により、マウス末梢血において高く且つ安定したＩＬ−２７産生を達成した（図１Ａ）。
【０１６３】
ＡＡＶ−ＩＬ−２７を用いてＢ１６黒色腫を有するマウスを治療できるか試験するため、Ｂ１６．Ｆ１０黒色腫細胞（２×１０５個／マウス）をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。腫瘍細胞注射より４日後、マウスにＡＡＶ−ＩＬ−２７またはＡＡＶ−ＣｔｒｌウイルスをＤＶＰ２×１０１１個／マウスの用量で筋肉内注射した。図１Ｂに示すように、ＡＡＶ−Ｃｔｒｌウイルス投与マウスでは腫瘍が徐々に成長した一方、ＡＡＶ−ＩＬ−２７投与マウスではＢ１６腫瘍の成長が有意に阻害された。さらに、Ｂ１６．Ｆ１０細胞をＢ６マウスに静脈内投与し、４日後にＡＡＶ−ＩＬ−２７またはＡＡＶ−ＣＴｒｌ対照ウイルスの１回用量（ＤＶＰ２×１０１１個／マウス）を筋肉内注射により投与した。図１Ｃに示すように、ＡＡＶ−ＩＬ−２７投与を受けたマウスは、ＡＡＶ−Ｃｔｒｌウイルスを投与されたマウスと比較して、肺の腫瘍病巣が有意に減少した。その結果、２つのマウス群の肺重量には有意差があった。したがって、ＡＡＶ−ＩＬ−２７投与によりＢ１６黒色腫腫瘍の増殖および肺転移が有意に阻害される。
【０１６４】
ＩＬ−２７はＴｈ１／Ｔｃ１応答を促進することが知られているので、ＡＡＶ−ＩＬ−２７投与マウスとＡＡＶ−Ｃｔｒｌウイルス投与マウス間でＴ細胞応答が異なるか検討することに関心が持たれた。フローサイトメトリーを用いて、ＡＡＶ−ＩＬ−２７投与マウスおよび対照から採取した脾臓および腫瘍内のＴ細胞応答を分析した。印象深いこととして、ＡＡＶ−ＩＬ−２７投与マウス由来の脾臓内でＦｏｘＰ３＋  Ｔｒｅｇ細胞が枯渇しているのが確認され、且つ腫瘍内で減少していた（図２Ａ）。さらに、ＡＡＶ−ＩＬ−２７の投与は、腫瘍内でＩＦＮ−γ産生ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の割合を有意に高めたことが確認された（図２Ｂ）。これらの結果より、ＡＡＶ−ＩＬ−２７投与が末梢リンパ器官からＴｒｅｇ細胞を枯渇させ、且つ腫瘍におけるＴｈ１／Ｔｈ２応答を促進することが示される。
【実施例３】
【０１６５】
（ＡＡＶ−ＩＬ−２７を包含する併用療法および他の免疫療法）
ＡＡＶ−ＩＬ−２７投与によりＴｒｅｇ細胞が減少し、腫瘍特異的Ｔｈ１／Ｔｃｌ細胞が促進されるものの、全てのＡＡＶ−ＩＬ−２７投与マウスにおいて最終的に腫瘍が成長したため、ＡＡＶ−ＩＬ−２７の抗腫瘍有効性は不完全であった。したがって、ＡＡＶ−ＩＬ−２７療法の有効性を制限する因子を検討することに興味が持たれた。
【０１６６】
最近、ＩＬ−２７が、Ｔ細胞上のＰＤ１との相互作用を介して、Ｔ細胞の耐性を誘導するＰＤ−Ｌ１のＴ細胞における発現を誘導することが示された。この所見は、ＡＡＶ−ＩＬ−２７投与を受けた血液、脾臓、および腫瘍に由来するＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞において確認された（図３Ａ）。さらに、ＰＤ１を発現することが確認された腫瘍浸潤ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の割合は著しく高く、またＡＡＶ−ＩＬ−２７投与はＴ細胞におけるＰＤ１発現をアップレギュレートすることが確認された（図３Ｂ）。
【０１６７】
Ｔ細胞におけるＩＬ−２７誘導ＰＤ−Ｌ１発現によってＩＬ−２７療法の有効性が低下するか判定するために、４群のＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５マウス／群）にＢ１６．Ｆ１０細胞２×１０５個を皮下注射し、その後以下の４つの相異なる治療のうちいずれか１つを実施した：（１）ＡＡＶ−Ｃｔｒｌウイルス＋対照ｍＡｂ；（２）ＡＡＶ−Ｃｔｒｌウイルス＋抗ＰＤ１；（３）ＡＡＶ−ＩＬ−２７ウイルス＋対照ｍＡｂ；および（４）ＡＡＶ−ＩＬ−２７ウイルス＋抗−ＰＤ１。腫瘍細胞注射の４日後、ＡＡＶウイルスをＤＶＰ２×１０１１個の用量で各マウスに筋肉内注射した。４日目より用量３００μｇ／マウス３日間隔の抗体を、マウスに腹腔内注射した。図４Ａに示すように、ＡＡＶ−ＩＬ−２７＋対照ｍＡｂを投与されたマウスは、ＡＡＶ−Ｃｔｒｌウイルス＋対照ｍＡＢまたはＡＡＶ  Ｃｔｒｌウイルス＋抗ＰＤ１を投与されたマウスと比較して、腫瘍の成長の有意な減少を示した。最も著明な腫瘍成長阻害は、ＡＡＶ−ＩＬ−２７＋抗ＰＤ−１を投与されたマウスに認められた（図４Ａ）。ＡＡＶ−ＩＬ−２７＋抗ＰＤ−１を投与されたマウスの有効性を、ＡＡＶ−ＩＬ−２７＋抗ＣＴＬＡ−４投与を受けたマウスと比較した。この分析より、ＰＤ１遮断と組み合わせたＩＬ−２７発現が、Ｂ１６黒色腫腫瘍成長の阻害において有意な相乗効果をもたらしたことが示された（図４Ｂ）。対照的に、ＡＡＶ−ＩＬ投与は、Ｂ１６黒色腫腫瘍成長の阻害においてＣＴＬＡ４遮断との相乗効果を全くもたらさなかった（図４Ｂ）。
【０１６８】
ＡＡＶを介したＩＬ−２７発現およびＰＤ１遮断併用治療が腫瘍阻害を誘導したメカニズムを検討するために、ＡＡＶ−ＩＬ−２７＋抗ＰＤ１投与マウス由来の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）および他の対照群由来のＴＩＬを分析した。ＡＡＶ−ＩＬ−２７または抗ＰＤ１投与は、単独でＩＦＮ−γ産生ＣＤ４＋（図５Ａ）およびＣＤ８＋（図５Ｂ）Ｔ細胞の割合を高めることが確認された。しかし、ＡＡＶ−ＩＬ−２７＋抗ＰＤ−１併用療法は、単独でＩＦＮ−γ産生ＣＤ４＋（図５Ａ）およびＣＤ８＋（図５Ｂ）Ｔ細胞の割合を大幅に高めた。しかし、抗ＰＤ−１投与と無関係に、ＡＡＶ−ＩＬ−２７は脾臓（図６Ａ）および腫瘍微小環境（図６Ｂ）のいずれにおいてもＦＯＸＰ３＋  Ｔｒｅｇを抑制した。
【０１６９】
Ｂ１６腫瘍の腫瘍微小環境においては、Ｔｒｅｇは主要なＩＬ−１０源とみられた（図６）。しかし、ＡＡＶ−ＩＬ−２７投与マウスおよびＡＡＶ−ＩＬ−２７＋抗ＰＤ−１投与マウスにおいては、脾臓において通常のＣＤ４＋  Ｔ細胞ではなく通常のＴＩＬ  ＣＤ４＋  Ｔ細胞が誘導されてＩＬ−１０を産生し、且つＡＡＶ−ＩＬ−２７と抗ＰＤ１の投与によりＣＤ４＋Ｔ細胞においてＩＬ−１０分泌が相乗的に誘導されるとみられた（図６Ｂ）。ＩＬ−２７は脾臓ＣＤ８＋  Ｔ細胞においてＩＬ−１０を誘導できなかったが（図７Ａ）、腫瘍のＣＤ８＋  Ｔ細胞においてＩＬ−１０の堅牢な誘導が認められ、ＡＡＶ−ＩＬ−２７と抗ＰＤ１の併用療法が、ＴＩＬ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＩＬ−１０誘導において相乗効果をもたらした。
【実施例４】
【０１７０】
（自己免疫疾患を治療するためのＡＡＶ−ＩＬ２７の使用）
ＡＡＶ−ＩＬ２７が自己免疫疾患を悪化させるのか減弱させるのか検討するため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘導した後、従来の手順に従いＭＯＧペプチドを用いて対照ＡＡＶまたはＡＡＶ−ＩＬ−２７を投与した。図８Ａに示すように、対照ＡＡＶを投与したＥＡＥマウスは堅牢な自己免疫疾患を呈した。対照的に、ＡＡＶ−ＩＬ−２７を投与したＥＡＥマウスは、Ｔｈ１の産生が亢進し、Ｔｒｅｇの産生が減少したものの、臨床徴候を全く示さなかった（図８Ｂ）。ＡＡＶ−ＩＬ−２７投与マウスにおけるＥＡＥの低下は、Ｔｈ１７＋細胞の割合の低下およびＴｒ１＋細胞の割合の上昇と相関していた（図８Ｂ）。
【０１７１】
自己免疫疾患の治療におけるＡＡＶ−ＩＬ−２７の全般的な有用性を検討するため、免疫不全Ｒａｇ１−欠損マウスへのＣＤ４５ＲＢｈｉ  ＣＤ４  Ｔ細胞の養子移入によって、マウスに炎症性腸疾患を誘発した。図９に示すように、ＡＡＶ−ＩＬ−２７投与は体重減少を予防し（図９Ａ）、結腸の腫脹を低減し（図９Ｂ）、且つ炎症性腸疾患の全ての臨床徴候を消散させた（図９Ｃ）。対照的に、ＩＬ−２７のｐ２８サブユニットと同一であるＡＡＶ−ＩＬ３０はほとんど効果を示さなかった。
【０１７２】
図８および図９の結果よりＩＬ−２７、および本願に開示のＩＬ−２７から構成される多様な形態の融合タンパク質を、自己免疫疾患を治療するために使用しうることが示される。ＩＬ−２７投与は、活動性疾患エピソードを示す患者または自己免疫疾患の寛解期にある患者に用いうる。
【実施例５】
【０１７３】
（ＩＬ−２７融合タンパク質の組成と産生：ＧＳ−ＩＬ２７Ｆｃ、ＰＶ−ＩＬ２７Ｆｃ、ＧＳ−ＩＬ２７ｍＦｃおよびＰＶ−ＩＬ２７ｍＦｃ）
ウイルスベクターと比較して、組換えタンパク質は臨床的使用についての標準化が容易であり、且つ規制当局から承認されやすい作用経路を有する。しかし、複合タンパク質の作製には困難な点がいくつかある。第１に、ＩＬ−２７は２本鎖からなり、またこれにより別個に発現された場合共に正確に折りたたまれるのが難しいこともある。将来的な大スケール製造および精製を確実にし、かつインビボでの安定性の上昇に備えるため、ＩＬ−２７融合構築物を免疫グロブリンＦｃフラグメントに融合した。一定の実施形態においては、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を含めた、Ｆｃ結合に付随する望ましくない生体作用を予防するために、変異を導入した。したがって、２つのＩＬ−２７融合タンパク質が生成された（配列番号７１および７３）。
【０１７４】
図の上段に示すように、図１０ＡのＩＬ２７Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の順に、シグナルペプチド、ＥＢＩ３、ＰＶ（配列番号７）またはＧＳリンカー（配列番号８）、ｐ２４およびＦｃから構成される。図１０Ａは、一方がＰＶリンカーを有し（左パネル）、もう一方がＧＳリンカー（右パネル）を有する２つの融合タンパク質の産生を示す。左側パネルは、配列番号７１のアミノ酸配列を有する融合タンパク質を示す一方、右側パネルは配列番号７３のアミノ酸配列を有する融合タンパク質を示す。タンパク質は、還元条件（左レーン）および非還元条件（右レーン）下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。この分析により、融合タンパク質は２量体を形成することが確認された。タンパク質収量をゲル写真の下に示す。
【０１７５】
これら２つの融合タンパク質の精製の成功はアフィニティ精製によって達成され；２つの融合タンパク質（配列番号７１、７３）が同様の収率で発現され且つ精製された（図１０Ａ）。これらのデータより、変異型Ｆｃは精製に有意に有害な影響を与えることなく生成できることが示される。
【０１７６】
表１および表２を含めて上にさらに記載されるように、いくつかの追加的な構造的立体配置が意図される。実施例５におけるＩｇＧ１の使用は、ＩｇＧ  Ｆｃ（すなわち、ＩｇＧ  Ｈ鎖定常領域）のための単なる代表的ＩｇＧアイソタイプソースであり；図１０に図示するのと同じデザインに基づいて他のＦｃサブクラスを用いることもある。
【実施例６】
【０１７７】
（ＩＬ−２７融合タンパク質活性の機能分析）
ＩＬ−２７融合タンパク質の生物活性はＩＬ−２７誘導Ｔ細胞の生存および腫瘍拒絶にとって不可欠であるため、この活性を検討するためにインビトロスクリーニングにＩＬ１０産生の誘導を使用した。図１１Ａに示すように、実施例５に記載のＩＬ−２７融合タンパク質のいずれも、抗ＣＤ−３刺激脾臓細胞におけるＩＬ−１０の強力な誘導物質であることが確認されている。さらに、低用量ＩＬ−２７融合タンパク質はＩＦＮγ産生を中程度に促進する一方で、高用量ではＩＦＮγ産生を抑制し、融合タンパク質は高用量で自己免疫疾患の抑制に用いうることを示唆した（図１１Ｂ）。
【０１７８】
これらの機能分析を用いて、ＩＬ−２７融合タンパク質の生物活性をモニタリングすることもあれば、あるいはこれらを用いてアミノ酸組成を最適化し高収量且つ有効な生物活性を確保することもある。
【実施例７】
【０１７９】
（ＩＬ−２７融合タンパク質のインビボ直接注射）
ＩＬ２７ｍＦｃが腫瘍拒絶を促進できるか検討するため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＢ１７Ｆ１０腫瘍細胞株で攻撃した。ＩＬ−２７は抗ＰＤ−１抗体と相乗的に作用し、且つ抗ＰＤ−１単独ではマウスの腫瘍増殖に影響しないため（図４）、抗ＰＤ１  ｍＡｂと併せたＩＬ２７ｍＦｃ融合タンパク質の直接注射を用いた併用療法を試験した。図１２Ａに示すように、抗ＰＤ１抗体と併せたＩＬ−２７ｍＦｃ融合タンパク質の直接注射は、腫瘍の増殖を有意に遅延させた。これらのデータより、ＩＬ−２７Ｆｃは、抗ＰＤ１と併せた使用するとき強力な腫瘍成長阻害物質であることが示された。好ましくは、ヒト成分と最も相同な融合タンパク質組成物が癌治療に用いられることになる。
【実施例８】
【０１８０】
（ＣＤ２７−ＩＬ−２７−Ｆｃ融合タンパク質の産生）
抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂなどの多くの癌免疫療法剤は、好ましくない自己免疫作用を引き起こす。したがって、癌治療効果を低減することなく、自己免疫性疾患に対する治療効果をさらに高めることが好ましい。したがって、１つの実施形態においては、ＩＬ−２７融合タンパク質はＣＤ２４の細胞外ドメインがＩＬ２７Ｆｃに挿入されるよう構築された（図１０Ｂ）。図１０Ｂ（上段パネル）に図示するように、ＣＤ２４ＩＬ２７Ｆｃプロタンパク質はシグナルペプチド、ＣＤ２４細胞外ドメイン（ＣＤ２４  ＥＣＤ）、リンカーで接続されたＥＢＩ３とｐ２８サブユニット、およびＩｇＧ  Ｆｃを含む。配列番号７９中のアミノ酸配列を含むこれらのタンパク質の１つは、ＣＨＯ細胞へのトランスフェクションによって発現に成功した。図１０Ｂ（下段パネル）に示すように、この融合タンパク質は、ＩＬ２７Ｆｃ（配列番号７１、７３）と比較するときほぼ６倍のレベルで発現することが確認された。これらのデータより、ＣＤ２７  ＥＣＤの組み入れは、おそらく安定性および／または溶解度の向上によって、発現および収率を向上させることができることが立証された。
【実施例９】
【０１８１】
（癌に対する治療薬としてのＣＤ２７ＩＬ２７Ｆｃ）
ＣＤ２４ＩＬ２７ｍＦｃ（配列番号７９）の癌治療用治療薬としての可能性を検討するため、Ｂ１０Ｆ１０腫瘍細胞を同系Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに皮下移植した。８日目に腫瘍が明確に触知されるようになったとき、マウスにＦｃ対照、ＣＤ２４ＩＬ２７ｍＦｃ融合タンパク質（配列番号７９）、抗ＰＤ１またはＣＤ２７ＩＬ−２７ｍＦｃと組み合わせた抗ＰＤ１を投与した。３日間の連日投与後、マウスを４週間超観察した。図１３Ａに示すように、抗ＰＤ−１は腫瘍成長を低減しない一方で、ＣＤ２４ＩＬ２７ｍＦｃは、単独あるいは抗ＰＤ１との組み合わせのいずれかで腫瘍成長を有意に低減した（図１３Ａ）。抗ＰＤ−１およびＣＤ２４ＩＬ２７ｍＦｃの双方を用いたとき、統計的に有意な生存の延長が認められた（図１３Ｂ）。これらのデータをまとめると、単独療法または抗ＰＤ−１などの他の免疫療法剤との併用療法のいずれかで、ＣＤ２４ＩＬ２４Ｆｃを用いることができるという概念を実践することに帰着する。
【実施例１０】
【０１８２】
（ＩＰＥＸ症候群の治療についてのモデル系）
マウスおよびヒトにおいて、Ｆｏｘｐ３遺伝子の変異により致死的な自己免疫疾患が引き起こされる。症状は、免疫機能不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖（ＩＰＥＸ）よりＩＰＥＸ症候群と呼ばれる。治癒は不可能であるが、治療の選択肢として骨髄移植が浮上している。罹患した小児の大半は生後２年以内に死亡する。ＩＰＥＸ症候群は、男性のみに発現するＸ連鎖劣性遺伝疾患である。Ｆｏｘｐ３遺伝子に変異を有するＳｃｕｒｆｙマウス（Ｆｏｘｐ３ｓｆ）はヒトＩＰＥＸと同様の病態形成を示すので、このモデルを用いてＩＬ−２７−ｒＡＡＶがＩＰＥＸを治療できるか判定した。図１４に示すように、ＩＬ−２７−ｒＡＡＶの単回注射は、周産期における体重増加として立証されるマウスの発育を大幅に改善した（図１４Ａ）。さらに、治療によりＳｃｕｒｆｙマウスの生存期間がほぼ２倍になった（図１４Ｂ）。
【０１８３】
上記は、当業者に本発明を実践する方法を教示することを目的としており、本記載を読むとき当業者に明らかとなるその明白な変更および変法の全てを詳述することを意図していない。しかし、そのような明白な変更および変法の全ては、以下の請求項に定義される本発明の範囲内に含まれることが意図されている。請求項は、文脈が反対のことを示されない限り、請求された構成要素およびステップを、そこで意図された目的を満たすのに有効な任意の順で包含することを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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