(57)【要約】【課題】虚血性脳卒中を予防・治療するための薬物の調製におけるビフェノールの使用。【解決手段】本発明は、虚血性脳卒中を予防・治療するための薬物の調製におけるビフェノールの使用に関するものであり、前記使用は、虚血性脳卒中損傷を予防・治療するための薬物の調製における3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノール及びその薬学的に許容される塩、エステル化物又は溶媒和物の使用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血性脳卒中を治療及び/又は予防するための薬物の調製における、式（I）で示される3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノール及びその薬学的に許容される塩、エステル化物又は溶媒和物の使用。
【化１】
2018508479.tif 000018
【請求項２】
前記エステル化物は、3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールのモノエステル化物又はジエステル化物であり、好ましくは、前記エステル化物は式（II）で示されるモノエチルエステル化物又は式（III）で示されるジエチルエステル化物である、請求項1に記載の使用。
【化２】
2018508479.tif 000019
【請求項３】
前記薬学的に許容される塩は、3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールと有機酸、鉱酸又はアルカリ金属とから形成される塩であり、前記薬学的に許容される塩は、例えば、硫酸塩、リン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、グルコン酸塩、酒石酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩である、請求項1又は2に記載の使用。
【請求項４】
前記3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノール及びその薬学的に許容される塩、エステル化物又は溶媒和物は、薬物組成物に調製され、当該薬物組成物は3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノール或いはその薬学的に許容される塩、エステル化物又は溶媒和物、及び補助薬を含有する、請求項1又は2に記載の使用。
【請求項５】
前記3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノール及びその薬学的に許容される塩、エステル化物又は溶媒和物は、それを含む錠剤、カプセル剤、注射剤、乳剤、リポソーム、凍結乾燥粉末又はミクロスフェア剤に調製され、前記カプセル剤は、例えばソフトカプセルである、請求項1又は2に記載の使用。
【請求項６】
前記虚血性脳卒中を治療及び/又は予防することは、脳虚血及び/又は再灌流神経機能損傷行為を改善すること、脳虚血及び/又は再灌流脳梗塞体積を減少させること、脳組織内因性酸素遊離基スカベンジャーSODの消費を低減し、脂質過酸化損傷を軽減し、また血清MDA含有量を低減すること、脳組織細胞のFas発現を下げること、脳細胞のアポトーシスを抑制すること、及び/又は、脳組織細胞のIL-1βとTNF-α発現を下げることによって達成される、請求項1又は2に記載の使用。
【請求項７】
前記虚血性脳卒中は、脳血栓、一過性脳虚血発作、大脳基底核のラクナ梗塞、アテローム性血栓性脳梗塞、ラクナ梗塞、脳塞栓及び脳血管性痴呆のうち一種又は複数種の病症による損傷を含む、請求項1又は2に記載の使用。
【請求項８】
被験動物又は人に、有効量の3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノール及びその薬学的に許容される塩、エステル化物又は溶媒和物を投与することを含む方法であって、前記3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールの構造は式（I）で示される、動物又は人の虚血性脳卒中を治療及び/又は予防する方法。
【化３】
2018508479.tif 000020
【請求項９】
前記エステル化物は3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールのモノエステル化物又はジエステル化物であり、好ましくは、前記エステル化物は、式（II）で示されるモノエチルエステル化物又は式（III）で示されるジエチルエステル化物である、請求項8に記載の方法。
【化４】
2018508479.tif 000021
【請求項１０】
前記薬学的に許容される塩は、3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールと有機酸、鉱酸又はアルカリ金属とから形成される塩であり、例えば、前記薬学的に許容される塩は、硫酸塩、リン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、グルコン酸塩、酒石酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩である、請求項8又は9に記載の方法。
【請求項１１】
前記3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノール及びその薬学的に許容される塩、エステル化物又は溶媒和物は、薬物組成物に調製され、当該薬物組成物は3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノール或いはその薬学的に許容される塩、エステル化物又は溶媒和物、及び補助薬を含有する、請求項8又は9に記載の方法。
【請求項１２】
前記3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノール及びその薬学的に許容される塩、エステル化物又は溶媒和物は、それを含む錠剤、カプセル剤、注射剤、乳剤、リポソーム、凍結乾燥粉末又はミクロスフェア剤に調製され、前記カプセル剤は、例えばソフトカプセルである、請求項8又は9に記載の方法。
【請求項１３】
前記虚血性脳卒中を治療及び/又は予防することは、脳虚血及び/又は再灌流神経機能損傷行為を改善すること、脳虚血及び/又は再灌流脳梗塞体積を減少させること、脳組織内因性酸素遊離基スカベンジャーSODの消費を低減し、脂質過酸化損傷を軽減し、また血清MDA含有量を低減すること、脳組織細胞のFas発現を下げること、脳細胞のアポトーシスを抑制すること、及び/又は、脳組織細胞のIL-1βとTNF-α発現を下げることによって達成される、請求項8又は9に記載の方法。
【請求項１４】
前記虚血性脳卒中は、脳血栓、一過性脳虚血発作、大脳基底核のラクナ梗塞、アテローム性血栓性脳梗塞、ラクナ梗塞、脳塞栓及び脳血管性痴呆のうち一種又は複数種の病症による損傷を含む、請求項8又は9に記載の方法。
【請求項１５】
式（IV）で示される化合物から前記3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールを調製する工程を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の使用における前記3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールの調製方法又は請求項8〜14のいずれか1項に記載の方法における前記3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールの調製方法。
【化５】
2018508479.tif 000022
【請求項１６】
前記3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールは、式（IV）で示される化合物を有機溶媒に溶解するものであり、その後、亜ジチオン酸ナトリウムを含む水溶液と混合し反応することにより得られ、好ましくは、前記有機溶媒は、酢酸エチルであり、好ましくは、前記亜ジチオン酸ナトリウムを含む水溶液は、亜ジチオン酸ナトリウムと水酸化ナトリウムとから形成される水溶液である、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
式（IV）で示される化合物は、プロポフォールを有機溶媒に溶解するものであり、好ましくは、当該有機溶媒が酢酸エチルであり、その後、無機塩を加えて反応することにより得られ、好ましくは、前記無機塩は炭酸銀及び無水硫酸マグネシウムである、請求項15又は16に記載の方法。
【請求項１８】
プロポフォールを有機溶媒に溶解し、さらに無機塩を加え、好ましくは、前記有機溶媒は酢酸エチルであり、好ましくは、前記無機塩は炭酸銀及び無水硫酸マグネシウムを含み、室温で撹拌する工程、
反応終了後、反応液に水を加え、固体を濾過し洗浄して、水相を除去し、酢酸エチル相を乾燥させ、濾過し、濾液を乾燥するまで蒸発させ、任意に洗浄し、ローズレッド色の結晶を得る工程、
上記のローズレッド色の固体を酢酸エチルに溶解し、亜ジチオン酸ナトリウム溶液と混合して、好ましくは、当該亜ジチオン酸ナトリウム溶液は亜ジチオン酸ナトリウムとNaOHとから形成される水溶液であり、必要に応じて攪拌した後、酢酸エチル相を分離し、水相を酢酸エチルで抽出し合併して、乾燥させ、濾過し、濾液を乾燥するまで蒸発させ、淡黄色の固体を得、洗浄して、白色固体である3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールを得る工程、
を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１９】
室温で、4’-ベンジルオキシ-3,3’,5,5’-テトライソプロピルビフェニル-4-アセテートを有機溶媒に溶解し、好ましくは、当該有機溶媒がメタノールであり、さらに触媒を加え、好ましくは、当該触媒はパラジウム炭素であり、真空にして、水素ガスを導入し、密封した後、室温で反応し、濾過し、濾液を乾燥するまで蒸発させ、白い固体である4’-ヒドロキシ-3,3’,5,5’-テトライソプロピルビフェニル-4-アセテートを得る工程を含む、
請求項2〜7のいずれか1項に記載の使用における式（II）で示されるモノエチルエステル化物の調製方法又は請求項9〜14のいずれか1項に記載の方法における式（II）で示されるモノエチルエステル化物の調製方法。
【請求項２０】
4,4’-ジヒドロキシ-3,3’,5,5’-テトライソプロピルビフェニルを無水酢酸に加え、窒素保護下で、還流反応し、反応液を室温まで冷却し、無水酢酸を除去し、残留物に水を加え、白色固体が現れ、洗浄し、乾燥させ、3,3’,5,5’-テトライソプロピルビフェニル-4’,4-ジアセテートを得る工程を含む、
請求項2〜7のいずれか1項に記載の使用における式（III）で示されるジエチルエステル化物の調製方法又は請求項9〜14のいずれか1項に記載の方法における式（III）で示されるジエチルエステル化物の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬技術分野に属し、薬物の新たな使用に関するものである。具体的に、虚血性脳卒中を治療及び/又は予防するための薬物の調製におけるビフェノールの新たな使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、脳卒中は人々、特に50歳以上の年配の人の健康を深刻に脅かす一般的な病気になってきた。脳卒中は、「高い発生率、高い身体障害率、高い死亡率、高い再発率、多い合併症」という「四高一多」の特徴を有し、脳卒中の患者では、様々な誘因によって脳動脈狭窄、閉塞又は破裂が起き、急性脳血液循環障害となり、臨床的に一過性又は永久性脳機能障害の症状及び兆候が見られる。
【０００３】
統計によると、世界中で脳卒中で死亡する人は、年間4000万人であり、中国だけでは、脳卒中にかかる人は、年間200万人である。現在、生き残った患者は700万人であり、そのうち450万人がある程度労働能力を失い、自分で身の回りのことができない。身体障害率は75％と高い。中国では、毎年120万人の脳卒中患者が死亡する。脳卒中にかかった患者は、また再発しやすく、再発するたびに悪化する。従って、さらに有効な措置をとって再発を予防する必要がある。
【０００４】
虚血性脳卒中は、全ての脳卒中の約80％を占め、局所の脳組織が血液循環障害、虚血、酸素欠乏によって軟化壊死することを意味する。主に、脳部へ血液を供給する動脈が、アテローム性動脈硬化症および血栓形成のため、管腔が狭くなり、ひいては閉塞することで、限局性急性脳不全となるので発病するものである。異常物体(固体、液体、気体)が血液循環とともに脳動脈や脳へ血液循環を供給する頚動脈に入ることにより、血液の流れが遮断され、又は血流量が急落するため、相応な支配領域の脳組織が軟化壊死することもある。
【０００５】
虚血性脳損傷は主に以下の2点によるものである。（1）虚血後のエネルギー生産が不十分であること。ATPに依存する酵素活性および生理的活動が抑制され、塩化物イオン、ナトリウムイオン及び水が内部へ流れるので、細胞が浮腫し、シナプス間隙興奮性アミノ酸（主にグルタミン酸）が集中し、グルタミン酸受容体を過剰的に作動させ、NMDAなどの受容体を介して、カルシウムイオンの内部への流れが増え、カリウムイオンが外部へ流れるようになり、細胞が脱分極する。電圧感受性カルシウムチャネルも開放するようになり、細胞内のカルシウムが過負荷し、ホスホリパーゼ、一酸化窒素シンターゼ（NOS）を含むいくつかの酵素が過剰に活性化され、一連の活性代謝物および遊離基が生じ、細胞が損傷されるようになる。（2）脳卒中患者は治療された後、虚血組織に血液灌流又は自発的再灌流がされ、再度養分が得られるにも関わらず、不可避的に虚血性脳再灌流損傷となってしまい、即ち、ある時間の脳虚血の後、血液供給を回復させても、その機能が回復できず、却ってより深刻な脳機能障害を引き起こす現象である。
【０００６】
虚血性脳損傷は、非常に複雑な病理生理過程にかかわり、その中の各部分、各要素の間の相互作用がまだ完全に解明されていない。しかしながら、現在、以下のようなメカニズムが重要な役割を果たすと考えられている。
【０００７】
（1）興奮性アミノ酸毒性と虚血性脳損傷
大量の研究により、虚血期間に高まる興奮性アミノ酸(excitatoryaminoacid,EAA)の興奮毒性は、虚血性神経細胞の損傷で重要な役割を果たすことが示された。興奮性アミノ酸は、主にグルタミン酸(glutamate,Glu)とアスパラギン酸(asparate,Asp)を指す。シナプス後ニューロンはEAAを過剰刺激することにより、細胞内シグナル伝達経路を活性化することができる。ある受容体が正常な生理的刺激によって生じるセカンドメッセンジャーの効果が拡大され、虚血後の炎症性遺伝子の発現を触発する。GluとAspなどの興奮性アミノ酸は虚血性神経細胞損傷において重要な役割を果たし、虚血時間が長いほど、脳間質GluとAspのピーク濃度が高くなり、神経病理学と神経学的損傷が厳しくなる。これは、EAA毒性作用が濃度依存性を有することと一致する。神経細胞に対する興奮性アミノ酸の毒性作用は、様々な面にある。過剰のEAAはその受容体を活性化させ、興奮性ニューロンの持続的な脱分極を引き起こし、細胞内Ca2+過負荷となり、結果として細胞壊死を引き起こす。遊離基（例えば、一酸化窒素）の生成が多くなり、遊離基によって細胞毒性作用が発生する。脳内の様々な代謝過程に関与し、クエン酸回路を阻害し、ATP生成が減少し、細胞に対するEAAの毒性作用が重くなる。
【０００８】
（2）遊離基及び脂質過酸化と虚血性脳損傷
虚血性脳損傷は、多くの要因が関与する複雑な病理生理的プロセスである。一般的に、酸素遊離基による組織脂質過酸化、及び細胞内カルシウム過負荷による不可逆的な損傷につながると考える。その有害な作用を以下のようにまとめる。多価不飽和脂肪酸に作用し、脂質過酸化が発生する。DNA、RNA、多糖類及びアミノ酸などの高分子物質の架橋を誘導し、架橋された高分子は本来の活性を失い、又は機能を低減させる。多糖類分子の重合および分解を促進し、遊離基は、不飽和脂肪酸を豊富に含む神経鞘と血管を広く攻撃でき、脂質過酸化のカスケード効果を引き起こし、タンパク質の変性、ポリヌクレオチド鎖の切断、ベースの新たな修飾が発生し、細胞構造の完全性を破壊し、膜透過性、イオン輸送、膜のバリア機能がいずれも深刻な影響を受けるので、細胞死をもたらす。遊離基は、EAA放出を増やし、脳虚血後再灌流損傷の発生を促すこともできる。
【０００９】
（3）Ca2+過負荷及び脳虚血性脳損傷
虚血性脳損傷では、Ca2+過負荷は、様々な要因による複合作用の結果であり、脳虚血損傷過程において各要因が作用する共通の経路にもなる。虚血性脳損傷におけるCa2+の役割は主に以下のとおりである。
【００１０】
〈1〉ミトコンドリア機能障害となり、細胞内外のカルシウム平衡が乱れ、細胞外のCa2+が細胞内へ流れ、主にミトコンドリア内に集まる。Ca2+はATP合成を阻害し、エネルギー生成の障害となる。Ca2+はミトコンドリアのホスホリパーゼを活性化させ、ミトコンドリア膜を損傷するようになる。ATP合成の他、ミトコンドリアは、細胞の酸化還元反応、浸透圧、pH値、細胞質内におけるシグナルの維持においても重要な役割を果たす。ミトコンドリアは、細胞損傷の重要な標的である。
【００１１】
〈2〉酵素の活性化Ca2+は、Ca2+依存性ホスホリパーゼ（主に、ホスホリパーゼCおよびホスホリパーゼA2である）を活性化し、膜リン脂質の分解を促進する。膜リン脂質の分解過程で生成された遊離脂肪酸、プロスタグランジン、ロイコトリエン、リゾリン脂質などは、いずれも細胞を毒害する。Ca2+はまたカルシウム依存性プロテアーゼを活性化させ、細胞内無害のキサンチンデヒドロゲナーゼをキサンチンオキシダーゼに変換し、酸素遊離基を大量に発生する。Ca2+はNOSを活性化することができる。
【００１２】
実験により、上記の病理生理的変化がある程度の薬物介入性を有することが確認された。信頼性の高い薬を服用して長期間、虚血性脳卒中を予防及び治療する場合、薬物服用を中止した患者と比べて、再発率が80％以上低減し、死亡率が90％以上低減する。三年以上長期投薬された患者のうち、80％以上は、再発のリスクがなく、ごく少ない患者は、軽く再発する。これは、薬物で虚血性脳損傷に抵抗することに理論的な基礎を築く。現在、脳血管疾患に使用される一般的な薬物は、主に以下のいくつかの種類を含む。
【００１３】
GABA受容体アゴニスト：GABAは興奮性アミノ酸の興奮毒性に抵抗することができ、代表的な薬物としてクロメチアジドがある。
【００１４】
NMDA受容体アンタゴニスト：NMDA受容体に拮抗することによって、NMDA受容体が介するカルシウムイオンの内部への流れを阻害し、代表的な薬物としてMK801がある。
【００１５】
カルシウムイオンアンタゴニスト：細胞内カルシウムの過負荷を阻止し、血管痙攣を防止し、血流量を増加させ、代表的な薬物としてニモジピンがある。
【００１６】
抗遊離基薬物：遊離基を捕捉し、脂質過酸化を阻害することにより、脳細胞、血管内皮細胞と神経細胞の酸化的損傷を抑制し、代表的な薬物としてエダラボンがある。
【００１７】
しかしながら、現在、虚血性脳卒中の具体的な損傷メカニズムは解明されておらず、多くの要因の相互作用による非常に複雑な病理生理的プロセスであると考えられる。一方、上記の薬物は、作用メカニズムが単一であり、臨床治療効果がまだ明確ではなく、あるいは重篤な副作用がある。そのため、虚血性脳卒中の治療におけるその使用が制限される。
【００１８】
近年、国内外のいくつかの研究により、麻酔薬であるプロポフォールは、虚血性脳卒中において非常に積極的な役割を果たす可能性があることが発見された。動物およびin vitro実験で、さらに一部の臨床研究では、プロポフォールは、神経損傷に対して明らかな保護および治療効果を有することが証明された。実験により証明されるように、プロポフォールは、ナトリウムイオンの流れを遮断し、又は、GABA受容体を活性化することによりカリウムイオン活性化されたGlu放出を減少させるのみでなく、酸化物処理後のGlu輸送に対する膠細胞の抑制を遮断することもでき、両者も最終的に細胞外のGlu濃度を低下させ、興奮性ニューロンの死亡を遅延や防止することができる。プロポフォールは、電圧依存性カルシウムチャネルを経由して流入した細胞外のカルシウムを抑制することができ、L-型電圧依存性カルシウムチャネルの電流不活性化率をある程度増加することができるので、カルシウムの内部への流れを減少させることができる。プロポフォールは、GABAa受容体の特定の部位に結合することができ、GABAによる塩化物イオンチャネルの開放頻度を増加させるのみでなく、正のアロステリック制御作用によって、低親和性GABA結合部位とGABAとの結合を強めることもできる。プロポフォールは、敗血症患者の血中の炎症性サイトカイン、例えばTNF、IL-1、IL-6などの発生を阻害することができ、そして、低濃度で比較的に強い阻害作用をもつ。プロポフォールは、脳組織のアポトーシス促進遺伝子caspase-3 mRNAの発現を阻害し、抗アポトーシス遺伝子BCl-2 mRNAの発現を向上させることができる。プロポフォールは、膜リン脂質に競争的に結合することができるし、過酸化物と安定したフェノキシ基を形成することができ、実際に活性の低い遊離基を生成し活性の高い遊離基を置換することで、後者による脂質過酸化カスケード反応を軽減するようになる。これらの結果は、本発明者らに、プロポフォールが虚血性脳卒中損傷に抵抗するメカニズムは、遊離基に抵抗し脂質過酸化を抑制すること、細胞内カルシウム過負荷を抑制すること、アポトーシスを抑制することなどの様々な種類を含むことを示唆している。しかしながら、プロポフォールは、そのものの全身麻酔作用により、虚血性脳卒中治療におけるその臨床応用が制限されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノール及びその薬学的に許容される塩、エステル化物又は溶媒和物の新たな使用を提供することを目的の1つとする。
【００２０】
このため、本発明は、虚血性脳卒中を治療及び/又は予防するための薬物の調製における、3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノール及びその薬学的に許容される塩、エステル化物又は溶媒和物の使用を提供する。前記3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールの構造は、式（I）で示される。
【００２１】
【化１】
2018508479.tif 000002
【００２２】
本発明における3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールは、さらに当該化合物の薬学的に許容される塩、エステル化物又は溶媒和物を含む。
【００２３】
発明者は検討したところ、以下の知見を得た。即ち、ビフェノールはGABA受容体に非常に強い親和性を持ち、またGABA作動性を持ち、さらにNMDA受容体に拮抗することができ、カルシウムイオンチャネルを調節し、細胞のカルシウムイオンの内部への流れを制限し、プロポフォールより強力な酸化防止性と遊離基捕捉作用をもつ。ビフェノールは、様々なメカニズムに基づき虚血性脳卒中損傷に抵抗する可能性がある。最も重要なことは、ビフェノールは、意識の喪失を生じることがないので、いくつかの虚血性脳卒中症状の治療において重要な臨床応用価値をもつ。
【００２４】
本発明におけるエステル化物は、3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールのモノエステル化物又はジエステル化物であり、好ましくは、前記エステル化物は式（II）で示されるモノエチルエステル化物又は式（III）で示されるジエチルエステル化物である。
【００２５】
【化２】
2018508479.tif 000003
【００２６】
本発明における「3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールのモノエステル化物又はジエステル化物」とは、前記3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールの4位及び/又は4’位のフェノール性水酸基に形成されたモノエステル化物又はジエステル化物を意味する。
【００２７】
本発明における「虚血性脳卒中を治療及び/又は予防する」ことは、通常、虚血性脳卒中による損傷を治療及び/又は予防することを意味する。本発明における「予防・治療」は、「治療及び/又は予防」を意味する。
【００２８】
本発明における薬学的に許容される塩は、3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールと有機酸、鉱酸又はアルカリ金属とから形成される塩である。前記薬学的に許容される塩は、例えば、硫酸塩、リン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、グルコン酸塩、酒石酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩である。
【００２９】
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明における使用において、前記3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノール及びその薬学的に許容される塩、エステル化物又は溶媒和物を薬物組成物に調製することができ、当該薬物組成物は3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノール或いはその薬学的に許容される塩、エステル化物又は溶媒和物、及び補助薬を含有する。
【００３０】
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明における使用において、前記3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノール及びその薬学的に許容される塩、エステル化物又は溶媒和物は、それを含む錠剤、カプセル剤、注射剤、乳剤、リポソーム、凍結乾燥粉末又はミクロスフェア剤に調製される。前記カプセル剤は、例えばソフトカプセルである。
【００３１】
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明における使用において、前記虚血性脳卒中を治療及び/又は予防することは、脳虚血及び/又は再灌流神経機能損傷行為を改善すること、脳虚血及び/又は再灌流脳梗塞体積を減少させること、脳組織内因性酸素遊離基スカベンジャーSODの消費を低減し、脂質過酸化損傷を軽減し、また血清MDA含有量を低減すること、脳組織細胞のFas発現を下げること、脳細胞のアポトーシスを抑制すること、及び/又は、脳組織細胞のIL-1βとTNF-α発現を下げることによって達成される。
【００３２】
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明における使用において、前記虚血性脳卒中は、脳血栓、一過性脳虚血発作、大脳基底核のラクナ梗塞、アテローム性血栓性脳梗塞、ラクナ梗塞、脳塞栓及び脳血管性痴呆のうち一種又は複数種の病症による損傷を含む。
【００３３】
本発明は、動物又は人の虚血性脳卒中を治療及び/又は予防する方法を提供する。前記方法は、被験動物又は人に、有効量の3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノール及びその薬学的に許容される塩、エステル化物又は溶媒和物を投与することを含み、前記3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールの構造は式（I）で示される。
【００３４】
【化３】
2018508479.tif 000004
【００３５】
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明における動物又は人の虚血性脳卒中を治療及び/又は予防する方法において、前記エステル化物は3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールのモノエステル化物又はジエステル化物であり、好ましくは、前記エステル化物は、式（II）で示されるモノエチルエステル化物又は式（III）で示されるジエチルエステル化物である。
【００３６】
【化４】
2018508479.tif 000005
【００３７】
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明における動物又は人の虚血性脳卒中を治療及び/又は予防する方法において、前記薬学的に許容される塩は、3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールと有機酸、鉱酸又はアルカリ金属とから形成される塩であり、例えば、前記薬学的に許容される塩は、硫酸塩、リン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、グルコン酸塩、酒石酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩である。
【００３８】
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明における動物又は人の虚血性脳卒中を治療及び/又は予防する方法において、前記3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノール及びその薬学的に許容される塩、エステル化物又は溶媒和物は、薬物組成物に調製され、当該薬物組成物は3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノール或いはその薬学的に許容される塩、エステル化物又は溶媒和物、及び補助薬を含有する。
【００３９】
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明における動物又は人の虚血性脳卒中を治療及び/又は予防する方法において、前記3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノール及びその薬学的に許容される塩、エステル化物又は溶媒和物は、それを含む錠剤、カプセル剤、注射剤、乳剤、リポソーム、凍結乾燥粉末又はミクロスフェア剤に調製され、前記カプセル剤は、例えばソフトカプセルである。
【００４０】
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明における動物又は人の虚血性脳卒中を治療及び/又は予防する方法において、前記虚血性脳卒中を治療及び/又は予防することは、脳虚血及び/又は再灌流神経機能損傷行為を改善すること、脳虚血及び/又は再灌流脳梗塞体積を減少させること、脳組織内因性酸素遊離基スカベンジャーSODの消費を低減し、脂質過酸化損傷を軽減し、また血清MDA含有量を低減すること、脳組織細胞のFas発現を下げること、脳細胞のアポトーシスを抑制すること、及び/又は、脳組織細胞のIL-1βとTNF-α発現を下げることによって達成される。
【００４１】
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明における動物又は人の虚血性脳卒中を治療及び/又は予防する方法において、前記虚血性脳卒中は、脳血栓、一過性脳虚血発作、大脳基底核のラクナ梗塞、アテローム性血栓性脳梗塞、ラクナ梗塞、脳塞栓及び脳血管性痴呆のうち一種又は複数種の病症による損傷を含む。
【００４２】
本発明における3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールは、市場で購入することもできるし、本発明により提供される方法で調製することもできる。
【００４３】
本発明は、3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールの調製方法を提供することをもう1つの目的とする。
【００４４】
このため、本発明は、式（IV）で示される化合物から前記3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールを調製する工程を含む前記3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールの調製方法を提供する。
【００４５】
【化５】
2018508479.tif 000006
【００４６】
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明における調製方法において、前記3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールは、式（IV）で示される化合物を有機溶媒に溶解するものであり、その後、亜ジチオン酸ナトリウムを含む水溶液と混合し反応することにより得られる。好ましくは、前記有機溶媒は、酢酸エチルであり、好ましくは、前記亜ジチオン酸ナトリウムを含む水溶液は、亜ジチオン酸ナトリウムと水酸化ナトリウムとから形成される水溶液である。
【００４７】
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明における調製方法において、式（IV）で示される化合物は、プロポフォールを有機溶媒に溶解するものであり、その後、無機塩を加えて反応することにより得られる。好ましくは、前記無機塩は炭酸銀及び無水硫酸マグネシウムである。好ましくは、当該有機溶媒は、酢酸エチルである。
【００４８】
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明における調製方法において、前記3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールの調製方法は以下の工程を含む。
【００４９】
プロポフォールを有機溶媒に溶解する。好ましくは、前記有機溶媒は酢酸エチルであり、さらに好ましくは、前記プロポフォールと前記酢酸エチルとの質量体積比が1 g:4〜6 mLである。さらに無機塩を加え、室温で撹拌する。好ましくは、前記無機塩は炭酸銀及び無水硫酸マグネシウムを含む。さらに好ましくは、前記プロポフォールと前記炭酸銀とのモル比は1.1〜1.4:1であり、前記プロポフォールと前記無水硫酸マグネシウムとのモル比は1.2〜1.4:1である。
【００５０】
反応終了後、反応液に水を加え、固体を濾過し、洗浄する（好ましくは、酢酸エチルで洗浄する）。水相を除去し、酢酸エチル相を乾燥させ（好ましくは、無水硫酸ナトリウムで乾燥する）、濾過し、濾液を乾燥するまで蒸発させ（好ましくは、減圧下で乾燥するまで蒸発させる）、任意に洗浄し（好ましくは、無水メタノールで洗浄する）、ローズレッド色の結晶を得る。
【００５１】
上記のローズレッド色の固体を酢酸エチルに溶解し、亜ジチオン酸ナトリウム溶液と混合する。好ましくは、当該亜ジチオン酸ナトリウム溶液は、亜ジチオン酸ナトリウムとNaOHとから形成される水溶液である。必要に応じて攪拌した後、酢酸エチル相を分離する。水相を複数回抽出し（好ましくは、当該水相を酢酸エチルで2回抽出する）、乾燥させる（好ましくは、無水硫酸ナトリウムで乾燥する）。濾過し、濾液を乾燥するまで蒸発させ（好ましくは、減圧下で乾燥するまで蒸発させる）、淡黄色の固体を得る。洗浄して、白色固体の3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールを得る（好ましくは、石油エーテルで洗浄する）。
【００５２】
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明における調製方法において、前記3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールの調製方法は以下の工程を含む。
【００５３】
プロポフォールを有機溶媒（酢酸エチルが好ましい）に溶解し、さらに無機塩（炭酸銀及び無水硫酸マグネシウムが好ましい）を加え、室温で撹拌する。
【００５４】
反応終了後、反応液に水を加え、固体を濾過し、洗浄する（好ましくは、酢酸エチルで洗浄する）。水相を除去し、酢酸エチル相を乾燥させ（好ましくは、無水硫酸ナトリウムで乾燥する）、濾過し、濾液を乾燥するまで蒸発させ（減圧が好ましい）、任意に洗浄し（好ましくは、無水メタノールを加える）、ローズレッド色の結晶を得る。
【００５５】
上記のローズレッド色の固体を酢酸エチルに溶解し、亜ジチオン酸ナトリウム溶液（亜ジチオン酸ナトリウムとNaOHとから形成される水溶液が好ましい）と混合する。必要に応じて攪拌した後、酢酸エチル相を分離する。水相を複数回、好ましくは二回抽出し（好ましくは、酢酸エチルを使用する）、乾燥させる（無水硫酸ナトリウムが好ましい）。濾過し、濾液を乾燥するまで蒸発させ（減圧が好ましい）、淡黄色の固体を得る。洗浄して（好ましくは、石油エーテルを使用する）、白色固体を得る。
【００５６】
本発明は、3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノールエステル化物の調製方法を提供することをもう1つの目的とする。
【００５７】
このため、本発明は、以下の工程を含む式（II）で示されるモノエチルエステルの調製方法を提供する。
【００５８】
室温で、4’-ベンジルオキシ-3,3’,5,5’-テトライソプロピルビフェニル-4-アセテートを有機溶媒に溶解する。好ましくは、当該有機溶媒は、メタノールである。その後、さらに触媒を加える。好ましくは、当該触媒はパラジウム炭素である。真空にして、水素ガスを導入する。密封した後、室温で反応し濾過する。濾液を蒸発除去する。好ましくは、濾液を減圧下で蒸発除去し、白い固体である4’-ヒドロキシ-3,3’,5,5’-テトライソプロピルビフェニル-4-アセテートを得る。
【００５９】
本発明は、以下の工程を含む式（III）で示されるジエチルエステルの調製方法を提供する。
【００６０】
4,4’-ジヒドロキシ-3,3’,5,5’-テトライソプロピルビフェニルを無水酢酸に加え、窒素保護下で、還流反応し、反応液を室温まで冷却する。無水酢酸を除去し、好ましくは減圧下で無水酢酸を除去する。残留物に水を加え、白色固体が現れる。洗浄し（好ましくはエタノールと水で洗浄する）、乾燥させ、3,3’,5,5’-テトライソプロピルビフェニル-4’,4-ジアセテートを得る。
【００６１】
本発明は、また、前記3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノール及びその薬学的に許容される塩、エステル化物又は溶媒和物を含有する薬物組成物も提供し、当該薬物組成物は、少なくとも1種の3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノール又はその薬学的に許容される塩、エステル化物又は溶媒和物を含有する。
【００６２】
必要に応じて、本発明の薬物組成物に、1種又は複数種の薬学的に許容される担体又は賦形剤が添加されても良い。
【００６３】
本発明の薬物組成物では、3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノール又はその薬学的に許容される塩、エステル化物又は溶媒和物は、重量百分率で0.1〜99.9％を占めてもよく、残部は薬学的に許容される担体である。
【００６４】
本発明の薬物組成物は、薬学的に許容されるいかなる剤形に調製されてもよく、これらの剤形は、錠剤、糖衣錠剤、薄膜コーティング錠剤、腸溶コーティング錠剤、カプセル剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、経口液、口腔剤、顆粒剤、舐剤、丸剤、散剤、膏剤、丹剤、懸濁剤、粉剤、溶液剤、注射剤、坐剤、軟膏剤、硬膏剤、クリーム剤、スプレー剤、ドロップ剤、パッチ剤を含む。本発明の製剤は、好ましくは、錠剤、カプセル剤、注射剤、乳剤、リポソーム、凍結乾燥粉末又はミクロスフェア剤であり、前記カプセル剤は、例えば軟カプセルである。
【００６５】
本発明の薬物組成物は、その経口投与の製剤が通常の賦形剤、例えば結合剤、充填剤、希釈剤、タブレットエイド剤、潤滑剤、崩壊剤、着色剤、調味剤および湿潤剤を含有してもよく、必要に応じて錠剤をコーティングしてもよい。
【００６６】
好適な充填剤は、セルロース、マンニトール、ラクトースおよび他の類似する充填剤を含む。好適な崩壊剤は、デンプン、ポリビニルピロリドンおよびデンプン誘導体、例えばデンプングリコール酸ナトリウムを含む。好適な潤滑剤は、例えば、ステアリン酸マグネシウムを含む。適切な薬学的に許容される湿潤剤は、ラウリル硫酸ナトリウムを含む。
【００６７】
固体経口組成物は、混合、充填、打錠などの通常の方法により調製することができる。混合を繰り返すことにより、大量の充填剤を使用した組成物全体にわたって活性物質を分散させることができる。
【００６８】
経口液体製剤は、例えば、水性又は油性懸濁液、溶液、乳剤、シロップ剤又はエリキシル剤の形であってもよく、或いは、使用する前に水又は他の適切な担体で再度配合することができる乾燥製品でもよい。このような液体製剤は、例えば懸濁剤、乳化剤、非水性担体、防腐剤などの通常の添加剤を含有してもよく、必要に応じて、通常の香味剤又は着色剤を含有してもよい。前記懸濁剤は、例えば、ソルビトール、シロップ、メチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル及び/又は水素化食用脂肪である。前記乳化剤は、例えば、レシチン、モノオレイン酸ソルビタン及び/又はアラビアガムである。前記非水性担体（これらが食用油を含んでも良い）は、例えば、アーモンド油、分留ヤシ油、グリセリンのエステルのような油性エステル、プロピレングリコール及び/又はエタノールである。前記防腐剤は、例えば、パラベン又はプロピルパラベン、及び/又はソルビン酸である。
【００６９】
注射剤について、調製された液体単位剤型は、本発明の活性物質（即ち、本発明における3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノール及びその薬学的に許容される塩、エステル化物又は溶媒和物）及び無菌担体を含有する。担体および濃度に応じて、この化合物を懸濁又は溶解することができる。溶液の調製について、通常、活性物質を担体に溶解し、それを適切なバイアル又はアンプルに入れる前に濾過滅菌し、その後密封する。補助薬、例えば局所麻酔剤、防腐剤及び緩衝剤もこのような担体に溶解することができる。その安定性を高めるために、バイアルに入れた後にこのような組成物を冷凍し、真空で水を除去することができる。
【００７０】
本発明の薬物組成物は、薬剤に調製される時、薬学的に許容される適切な担体を選択的に加えることができ、前記薬学的に許容される担体は、マンニトール、ソルビトール、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、塩酸システイン、チオグリコール酸、メチオニン、ビタミンC、EDTA二ナトリウム、EDTAカルシウムナトリウム、一価アルカリ金属の炭酸塩、酢酸塩、リン酸塩又はその水溶液、塩酸、酢酸、硫酸、リン酸、アミノ酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、乳酸ナトリウム、キシリトール、マルトース、グルコース、フルクトース、デキストラン、グリシン、デンプン、スクロース、ラクトース、マンニトール、シリコン誘導体、セルロースおよびその誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、グリセリン、ツイーン80、寒天、炭酸カルシウム、重炭酸カルシウム、界面活性剤、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン、β-シクロデキストリン、リン脂質材料、カオリン、タルク粉、ステアリン酸カルシウム及び/又はステアリン酸マグネシウムなどから選択される。
【００７１】
好ましくは、本発明における補助薬は、ポリエチレングリコール、リン脂質、植物油、ビタミンE及び/又はグリセリンを含んでもよい。
【００７２】
前記リン脂質は、大豆リン脂質、卵黄レシチン及び水素添加リン脂質から選択される1種又は複数種でもよい。
【００７３】
前記植物油は、大豆油、オリーブ油及びサフラワー油から選択される1種又は複数種でもよい。
【００７４】
本発明における虚血性脳卒中損傷は、脳血栓、一過性脳虚血発作、大脳基底核のラクナ梗塞、アテローム性血栓性脳梗塞、ラクナ梗塞、脳塞栓及び脳血管性痴呆の病症に関わる。上記病症は、通常、頭痛、めまい、耳鳴、半身不随、嚥下困難、悪い歯切れ、吐き気、嘔吐、昏迷などの様々な状況を引き起こす。
【００７５】
本発明における使用は、虚血再灌流神経機能損傷行為を改善することにより達成される。
【００７６】
本発明における使用は、虚血再灌流脳梗塞体積を減少させることにより達成される。
【００７７】
本発明における使用は、内因性酸素遊離基スカベンジャーSODの消費を低減し、脂質過酸化損傷を軽減し、また血清MDA含有量を低減することにより達成される。
【００７８】
本発明における使用は、脳組織細胞のFas発現を有効に下げることにより達成される。
【００７９】
本発明における使用は、脳細胞のアポトーシスを有効に抑制することにより達成される。
【００８０】
本発明における使用は、脳組織細胞のIL-1βとTNF-α発現を有効に下げることにより達成される。
【００８１】
本発明の実施例において、発明者が縫合閉塞法（Suture-occluded method）で構築した中大脳動脈閉塞動物モデル（MCAO）を採用した。該モデルは、開頭せず、傷が小さく、虚血と再灌流時間を精確に制御できるというメリットを有し、現在最も権威ある限局性脳虚血再灌流モデルであり、国内外での脳虚血実験と脳虚血再灌流損傷治療薬物の評価に広く使用されている。
【００８２】
脳虚血再灌流の時、細胞内の酸素遊離基は、大いに増加し、不飽和二重結合を含むバイオフィルム構造を極めて攻撃しやすい。脂質過酸化が起こり、膜構造を破壊し、膜の透過性に影響を与える。イオン輸送、バイオエネルギーの生成及びオルガネラの機能に一連の病理生理的変化をもたらし、神経細胞、膠細胞及び血管内皮細胞を損傷させる。SODは、細胞内で酸素遊離基に抵抗する主な酵素防御システムであり、不均化方法によってスーパーオキシドアニオン遊離基を捕捉する。酸素遊離基としてのMDAとバイオフィルム不飽和脂肪酸とが脂質過酸化反応して得られた代謝物の含有量変化は、間接的に組織における酸素遊離基含有量と細胞損傷の度合いを反映する。そのため、虚血再灌流においてSODの活性及びMDAの含有量を測定することは、生命体における遊離基による脂質過酸化反応の度合いを反映することができる。
【００８３】
脳虚血再灌流損傷は、主に、酸化ストレス反応、炎症反応、カルシウム過負荷、脳浮腫及びアポトーシスなどに関連する。脳虚血再灌流の時、エネルギー代謝及び各種の内因性活性物質の作用により、貯蔵プールのCa2+の放出が刺激され、細胞内のCa2+濃度が上昇する。一方、脳虚血は、ニューロン又は膠細胞神経伝達物質プール又は代謝プールからのEAAの過剰放出を引き起こす可能性がある。EAAは、細胞内のCa2+過負荷を誘導することができ、遊離基の生成を増やす。そして、遊離基、EAAの増加は、いずれも脳虚血再灌流時のアポトーシス因子、例えばFasの発現を誘導し、アポトーシスの発生を促進することができる。従って、アポトーシスの状況も脳細胞の損傷程度を反映することができる。IL-1βおよびTNF-αは、脳損傷後の主な炎症性因子であり、虚血領域と再灌流領域の炎症反応に関与する。脳虚血-再灌流の後、損傷領域の内皮細胞、ニューロン、アストロサイト及び血管周囲の炎症細胞が活性化され、IL-1βとTNF-αを放出することにより炎症反応に触発し、ニューロンを損傷する。炎症反応の開始因子としてのIL-1β、TNF-αの含有量を測定することは、虚血-再灌流後の脳損傷の評価にとって重要である。
【００８４】
また、脳卒中患者にとって、再灌流の発生はよく遅れるので、脳組織虚血性「飢餓」傷も無視されることができない。このため、本発明では、同様に、縫合閉塞法で構築した中大脳動脈閉塞動物モデル（MCAO）を使用して、永久性虚血損傷におけるビフェノールの保護作用を評価した。
【００８５】
本発明では、実験により証明されたように、3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノール及びその薬学的に許容される塩、エステル化物又は溶媒和物は、脳虚血再灌流損傷による内因性酸素遊離基スカベンジャーSOD活力の消費を有効に低減し、脂質過酸化損傷を軽減し、血清MDA含有量を低減し、Fasの発現を有効に下げ、アポトーシス細胞を減少させることができるとともに、炎症性因子IL-1βとTNF-αの発現を低減することができるので、脳虚血再灌流ラットのニューロンに対して保護作用を有し、また、永久性脳虚血損傷に対しても比較的に良い保護作用を有する。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
以下、実施例を挙げて、本発明をさらに説明する。なお、これらの実施例は本発明を説明するためのもののみであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００８７】
実施例1  化合物1：3,3’,5,5’-テトライソプロピル-4,4’-ビフェノール
【００８８】
【化６】
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【００８９】
プロポフォール20gを秤量し、酢酸エチル100mLに溶解させ、さらに炭酸銀24.75gと無水硫酸マグネシウム10gを加え、室温で2時間撹拌し、反応終了を検出した。気泡が発生しないまで、反応液に水を加えた。固体を濾過し、酢酸エチルで洗浄し、水相を除去した。酢酸エチル相を無水硫酸ナトリウムで1h乾燥し、濾過して、濾液を減圧下で乾燥するまで蒸発させた。適切な量の無水メタノールで洗浄し、ローズレッド色の結晶12.30gを得た。上記ローズレッド色の固体7gを秤量し、酢酸エチル100mLで溶解させる。さらに、亜ジチオン酸ナトリウム27.66gを1mol/L NaOHに溶解させた後、上述したように得られたローズレッド色の固体の酢酸エチル溶液に添加し、室温で1.5時間撹拌し、反応終了を検出した。酢酸エチル相を分離し、水相を酢酸エチルで2回抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させる。濾過し、濾液を減圧下で乾燥するまで蒸発させ、淡黄色固体5gを得、石油エーテルで洗浄することで、白い固体4.5gを得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.22 (s, 4H), 4.81 (s, 2H), 3.27-3.20 (m, 4H), 1.37-1.35(d, 24H)。
【００９０】
実施例2  化合物2：4’-ヒドロキシ-3,3’,5,5’-テトライソプロピルビフェニル-4-アセテート
【００９１】
【化７】
2018508479.tif 000008
【００９２】
室温で、4’-ベンジルオキシ-3,3’,5,5’-テトライソプロピルビフェニル-4-アセテート（5 g，10.27 mmol）をメタノール200mLに溶解させ、さらに10％パラジウム炭素（570 mg）を加え、真空にして水素ガスを導入することを3回繰り返した。密封した後、室温で10 h反応させ、反応液中のパラジウム炭素を濾過し、濾液を減圧下で蒸発除去させ、白い固体である4’-ヒドロキシ-3,3’,5,5’-テトライソプロピルビフェニル-4-アセテート（3.9 g，95.73％）を得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.19 (s, 4H), 4.86 (s, 1H), 3.37-3.32 (m, 4H), 3.16 (s, 3H), 1.20 (d, 24H)。
【００９３】
実施例3  化合物3：3,3’,5,5’-テトライソプロピルビフェニル-4’,4-ジアセテート
【００９４】
【化８】
2018508479.tif 000009
【００９５】
4,4’-ジヒドロキシ-3,3’,5,5’-テトライソプロピルビフェニル（5 g，14.10 mmol）を無水酢酸30 mLに加え、窒素ガス保護下で3 h還流した後、反応液を室温まで冷却した。無水酢酸を減圧下で除去し、残留物に水（200 mL）を加え、白い固体が現れ、10％冷たいエタノール（100mL）および水（200mL）で洗浄し乾燥することにより、白い固体である3,3’,5,5’-テトライソプロピルビフェニル-4’ 4-ジアセテート（6 g，95.06％）を得た。
【００９６】
白い固体，1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.19 (s, 4H), 2.91-2.89 (m, 4H), 2.32 (s, 6H), 1.19 (d, 24H)。
【００９７】
実施例4  脳虚血再灌流損傷ラット神経機能損傷評価、脳梗塞体積、脳組織Fas、IL-1β、TNF-α及びアポトーシスへの化合物1〜3の影響
【００９８】
（1）材料：
濃度10mg/mLの化合物1〜3のPEG400水溶液であった。当該PEG400水溶液におけるPEG400の濃度は400 mg/mlであった。GL-22M低温遠心分離機（湖北賽特湘儀）。BI2000画像解析装置（成都泰盟社）。SOD、MDAキット（南京建成生物工程研究所）。Fas、TUNELキット（武漢博士徳生物工程有限公司）。IL-1β及びTNF-αキット（上海恒遠生物科技有限公司）。他の試薬は全て中国産分析グレードであった。
【００９９】
（2）方法：
1. 実験動物及び群分け
第四軍医大学実験動物センターから、体重250〜300gの健康な雄性SDラット120匹が提供された。無作為に5つの群に平均で分けた。即ち、偽手術群、虚血再灌流群、実施例1群（化合物1を試験サンプルとして用いる）、実施例2群（化合物2を試験サンプルとして用いる）及び実施例3群（化合物3を試験サンプルとして用いる）であった。
【０１００】
2. 動物モデルの調製及び処理
ラットの腹腔に10％抱水クロラールを350mg/kg注射し、麻酔させた後、Zea Longa改良法に準じて、首の真ん中から切開し、右総頸動脈を分離し、右側外頸動脈の各ブランチを結紮し、外頸動脈の遠位端から小さな口をカットして、事前に用意した縫線を入れた。総頸動脈と外頸動脈を経て分枝し、中大脳動脈前端まで、内頸動脈に浸入した。縫線浸入深さを18〜19mmとした。適切に縫線を固定し、層ごとに傷口を縫合した。手術後、クリーンインキュベーターに置き、目覚めさせた。ラットが意識を取り戻した後、右側にHorner症候群が現れ、また、左側が半身不随になることを脳虚血モデルの調製成功の基準とした。偽手術群、虚血再灌流群、実施例群では、厳格に要求に従い、脳虚血再灌流モデルを構築し、偽手術群では、縫線を外頸動脈のみに入れた。動物を目覚めさせた後、自由に飲食させた。2h後縫線を引き出し、再灌流を達成させる。偽手術群、虚血再灌流群、実施例群では、再灌流する30min前及び12h再灌流した後、それぞれ、化合物1〜3のPEG400水溶液40mg/kgを静脈投与した（当該40 mg/kgは、ラットの体重1kgあたり試験化合物40mgを投与することを表す）。偽手術群、虚血再灌流群では、同じ時点で等量のPEG400ブランク水溶液を注射した。
【０１０１】
3. ラット神経機能損傷程度の評価
24h再灌流した後、各群のラットについて、神経機能損傷程度を評価した。Longaの5級評価法に基づく。0級：神経損傷症状なし。1級：対側前肢を伸ばすことができない。2級：対側へ回る。3級：対側へ傾き倒れる。4級：独立した活動をすることができず、意識喪失を伴う。
【０１０２】
4. サンプル及び調製
24h再灌流した後、各群ごとに8匹のラットを殺し、首を切って脳を取った。PBS（pH7.4）で洗浄した後、-20℃で20min静置した。均一にスライスして（厚さ2mm）、2％TTC溶液を用いて37℃で30min遮光染色した。10％ホルマリンで24h固定し、撮影した後梗塞体積を分析した。別途に、各群ごとに8匹のラットについて、麻酔状態で大腿動脈と静脈の混合血を取った。4℃の遠心分離機に置いて、3500r/minで20min遠心分離した。上澄液を取り、SOD、MDAを検出するまで-20℃の冷蔵庫で保存した。採血後、心尖を経て上行大動脈まで灌流針を挿入した。排出液が清澄になるまで、4℃生理食塩水で速く灌流し、次に、4％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液で灌流固定した。開頭し、脳を取った。視神経交叉前後2mmの脳組織を取り、固定した。脱水し、透明させ、ワックスをディッピングし、包埋した。脳部の連続コロナ組織の病理切片を連続的に切り取った。各群ごとに残った8匹のラットを殺し、脳を取った。アイストレーの上で、迅速に虚血側の大脳半球を取り、IL-1β及びTNF-αを検出するために、10％脳組織ホモジネートを調製した。
【０１０３】
5. 相対梗塞体積の検出
imageJ画像ソフトで、各脳スライスの梗塞面積を分析、定量化し、最後に脳梗塞体積が脳体積全体で占める割合を計算した。
【０１０４】
6. SOD、MDA検出
厳格にキット明細書の要求に従い、SODとMDAを検出した。
【０１０５】
7. Fas検出
免疫組織化学的方法で検出した。脳組織のパラフィン切片を脱ロウして、3％H2O2で内因性ペルオキシダーゼの活性を除き、蒸留水で3回濯いだ。クエン酸ナトリウム緩衝液で抗原を熱回復した。15分間、室温で仔ウシ血清を密閉静置した。ウサギ抗マウスFas抗体を滴下し、4℃で一晩した。ビオチン化ヤギ抗ウサギIgGを滴下し、37℃の水浴で20分置いた。PBSで5min 4回濯ぎ続いた。DAB発色し、十分に濯ぎ、再度染色しなかった。勾配のあるエタノールで脱水し、キシレンで透明化させ、密封固定した。高倍率光学顕微鏡を利用し、カメラで採集して画像解析システムに導入し、画像解析を行った。各切片ごとに、ランダムに5つの重畳しない視野を選択し、各視野ごとに、5つの領域を選択しグレー値を測定した。平均グレー値を計算した。その平均グレー値は、発現の陽性率と反比例する。
【０１０６】
8.アポトーシス検出
TUNEL法で検出した。脳組織のパラフィン切片を脱ロウして、3％H2O2で内因性ペルオキシダーゼの活性を除き、蒸留水で2min洗浄し、3回濯ぎ続いた。標識液を加え、37℃で2h標識し、ブロッキング液を加え、室温で30minブロッキングした。ビオチン化抗ジゴキシン抗体をを加え、37℃で30min反応させ、SABCを加え、37℃で30min反応させた。TBSで5min 4回濯ぎ続いた。DAB発色し、十分に濯ぎ、ヘマトキシリンで軽く再度染色し、勾配のあるエタノールで脱水し、キシレンで透明化させ、密封固定した。各切片ごとに、ランダムに半影帯の5つの重畳しない視野を選択し、画像解析システムに導入し、アポトーシス細胞の数をそれぞれ数えた。平均値をアポトーシス細胞数とした。
【０１０７】
9.IL-1β及びTNF-αの検出
脳組織のホモジネート液を3000rpmで15min低温遠心分離した後、上澄みを取り、厳格にキット明細書の要求に従い、IL-1β及びTNF-αの検出を行った。
【０１０８】
（3）結果：
化合物1〜3は、虚血再灌流ラットの神経機能損傷行為を顕著に改善することができ、虚血再灌流ラットの脳梗塞体積を顕著に減少させることができ、ラット内因性酸素遊離基スカベンジャーSODの消費を顕著に低減し、脂質過酸化損傷を軽減し、また血清MDA含有量を低減することができ、脳組織細胞のFas発現を有効に下げることができ、脳細胞アポトーシスを有効に抑制することができ、ラット脳組織細胞のIL-1β及びTNF-α発現を有効に下げることができた。結果を以下の表1に示す。
【０１０９】
【表１】
2018508479.tif 000010
【０１１０】
実施例5  永久性脳虚血ラット神経機能損傷評価、脳梗塞体積、脳組織Fas、IL-1β、TNF-α及びアポトーシスに対する化合物1〜3の影響
【０１１１】
（1）材料：
濃度10mg/mLの化合物1〜3のPEG400水溶液であった。当該PEG400水溶液におけるPEG400の濃度は400 mg/mlであった。GL-22M低温遠心分離機（湖北賽特湘儀）。BI2000画像解析装置（成都泰盟社）。SOD、MDAキット（南京建成生物工程研究所）。Fas、TUNELキット（武漢博士徳生物工程有限公司）。IL-1β及びTNF-αキット（上海恒遠生物科技有限公司）。他の試薬は全て中国産分析グレードであった。
【０１１２】
（2）方法：
1. 実験動物及び群分け
第四軍医大学実験動物センターから、体重250〜300gの健康な雄性SDラット120匹が提供された。無作為に5つの群に平均で分けた。即ち、永久性脳虚血モデル群、実施例1群（化合物1を試験サンプルとして用いた）、実施例2群（化合物2を試験サンプルとして用いた）及び実施例3群（化合物3を試験サンプルとして用いた）であった。
【０１１３】
2. 動物モデルの調製及び処理
ラットの腹腔に10％抱水クロラールを350mg/kg注射し、麻酔させた後、Zea Longa改良法に準じて、首の真ん中から切開し、右総頸動脈を分離し、右側外頸動脈の各ブランチを結紮し、外頸動脈の遠位端から小さな口をカットして、事前に用意した縫線を入れた。総頸動脈と外頸動脈を経て分枝し、中大脳動脈前端まで、内頸動脈に浸入した。縫線浸入深さを18〜19mmとした。適切に縫線を固定し、層ごとに傷口を縫合した。手術後、クリーンインキュベーターに置き、目覚めさせた。ラットが意識を取り戻した後、右側にHorner症候群が現れ、また、左側が半身不随になることを脳虚血モデルの調製成功の基準とした。偽手術群、永久性脳虚血モデル群、実施例群では、厳格に要求に従い調製し、偽手術群では、縫線を外頸動脈のみに入れた。動物を目覚めさせた後、自由に飲食させた。偽手術群、永久性脳虚血モデル群、実施例群では、縫線挿入の30min前及び栓塞後12hに、それぞれ、化合物1〜3のPEG400水溶液40mg/kgを静脈投与した（当該40 mg/kgは、ラットの体重1kgあたり試験化合物40mgを投与することを表す）。偽手術群、永久性脳虚血モデル群では、同じ時点で等量のPEG400ブランク水溶液を注射した。
【０１１４】
3. ラット神経機能損傷程度の評価
24h栓塞した後、各群のラットについて、神経機能損傷程度を評価した。Longaの5級評価法に基づく。0級：神経損傷症状なし。1級：対側前肢を伸ばすことができない。2級：対側へ回る。3級：対側へ傾き倒れる。4級：独立した活動をすることができず、意識喪失を伴う。
【０１１５】
4. サンプル及び調製
24h栓塞した後、各群ごとに8匹のラットを殺し、首を切って脳を取った。PBS（pH7.4）で洗浄した後、-20℃で20min静置した。均一にスライスして（厚さ2mm）、2％TTC溶液を用いて37℃で30min遮光染色した。10％ホルマリンで24h固定し、撮影した後梗塞体積を分析した。別途に、各群ごとに8匹のラットについて、麻酔状態で大腿動脈と静脈の混合血を取った。4℃の遠心分離機に置いて、3500r/minで20min遠心分離した。上澄液を取り、SOD、MDAを検出するまで-20℃の冷蔵庫で保存した。採血後、心尖を経て上行大動脈まで灌流針を挿入した。排出液が清澄になるまで、4℃生理食塩水で速く灌流し、次に、4％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液で灌流固定した。開頭し、脳を取った。視神経交叉前後2mmの脳組織を取り、固定した。脱水し、透明させ、ワックスをディッピングし、包埋した。脳部の連続コロナ組織の病理切片を連続的に切り取った。各群ごとに残った8匹のラットを殺し、脳を取った。アイストレーの上で、迅速に虚血側の大脳半球を取り、IL-1β及びTNF-αを検出するために、10％脳組織ホモジネートを調製した。
【０１１６】
5. 相対梗塞体積の検出
imageJ画像ソフトで、各脳スライスの梗塞面積を分析、定量化し、最後に脳梗塞体積が脳体積全体で占める割合を計算した。
【０１１７】
6. SOD、MDA検出
厳格にキット明細書の要求に従い、SODとMDAを検出した。
【０１１８】
7. Fas検出
免疫組織化学的方法で検出した。脳組織のパラフィン切片を脱ロウして、3％H2O2で内因性ペルオキシダーゼの活性を除き、蒸留水で3回濯いだ。クエン酸ナトリウム緩衝液で抗原を熱回復した。15分間、室温で仔ウシ血清を密閉静置した。ウサギ抗マウスFas抗体を滴下し、4℃で一晩した。ビオチン化ヤギ抗ウサギIgGを滴下し、37℃の水浴で20分置いた。PBSで5min 4回濯ぎ続いた。DAB発色し、十分に濯ぎ、再度染色しなかった。勾配のあるエタノールで脱水し、キシレンで透明化させ、密封固定した。高倍率光学顕微鏡を利用し、カメラで採集して画像解析システムに導入し、画像解析を行った。各切片ごとに、ランダムに5つの重畳しない視野を選択し、各視野ごとに、5つの領域を選択しグレー値を測定した。平均グレー値を計算した。その平均グレー値は、発現の陽性率と反比例する。
【０１１９】
8.アポトーシス検出
TUNEL法で検出した。脳組織のパラフィン切片を脱ロウして、3％H2O2で内因性ペルオキシダーゼの活性を除き、蒸留水で2min洗浄し、3回濯ぎ続いた。標識液を加え、37℃で2h標識し、ブロッキング液を加え、室温で30minブロッキングした。ビオチン化抗ジゴキシン抗体をを加え、37℃で30min反応させ、SABCを加え、37℃で30min反応させた。TBSで5min 4回濯ぎ続いた。DAB発色し、十分に濯ぎ、ヘマトキシリンで軽く再度染色し、勾配のあるエタノールで脱水し、キシレンで透明化させ、密封固定した。各切片ごとに、ランダムに半影帯の5つの重畳しない視野を選択し、画像解析システムに導入し、アポトーシス細胞の数をそれぞれ数えた。平均値をアポトーシス細胞数とした。
【０１２０】
9.IL-1β及びTNF-αの検出
脳組織のホモジネート液を3000rpmで15min低温遠心分離した後、上澄みを取り、厳格にキット明細書の要求に従い、IL-1β及びTNF-αの検出を行った。
【０１２１】
（3）結果：
化合物1〜3は、永久性脳虚血モデルラットの神経機能損傷行為を顕著に改善することができ、永久性虚血モデルラットの脳梗塞体積を顕著に減少させることができ、永久性脳虚血モデルラットの内因性酸素遊離基スカベンジャーSODの消費を顕著に低減し、脂質過酸化損傷を軽減し、また血清MDA含有量を低減することができ、永久性脳虚血モデルラットの脳組織細胞のFas発現を有効に下げることができ、脳細胞アポトーシスを有効に抑制することができ、永久性脳虚血モデルラットの脳組織細胞のIL-1β及びTNF-α発現を有効に下げることができた。結果を以下の表2に示す。
【０１２２】
【表２】
2018508479.tif 000011
【０１２３】
実施例6  本発明と従来の陽性薬品薬効との比較
【０１２４】
上述した実施例4、5に記載された方法により、ラット虚血再灌流モデル及び永久脳虚血モデルに対するプロポフォールとエダラボンの治療効果を評価した（プロポフォール15mg/kg。エダラボン3mg/kg。ここで、15 mg/kgは、ラットの体重1kgあたりプロポフォール15mgを投与することを表す。ここで、3mg/kgは、ラットの体重1kgあたりエダラボン3 mgを投与することを表す。）。また、投与後のラットの行動変化を観察した。実験結果をそれぞれ以下の表3、表4に示す。
【０１２５】
【表３】
2018508479.tif 000012
【０１２６】
表3の結果から分かるように、ビフェニル誘導体は、陽性対照薬であるプロポフォール及びエダラボンに比べて、モデル群に対する治療効果がより良かった。また、ほとんどの実施例は、薬効が陽性薬に比べて明らかに優れた（p<0.05）。表3に、参照として、実施例1群の薬効実験データと陽性薬との比較のみを示す。また、プロポフォールを投与した後、ラットの正向反射が消失し、麻酔状態となるが、他の投与群では、ラットに有意な行動変化がないことが発見された。
【０１２７】
【表４】
2018508479.tif 000013
【０１２８】
表4の結果から分かるように、ビフェニル誘導体は、陽性対照薬であるプロポフォール及びエダラボンに比べて、モデル群に対するの治療効果がより良かった。また、ほとんどの実施例は、薬効が陽性薬に比べてに明らかに優れた（p<0.05）。表4に、参照として、実施例1群の薬効実験データと陽性薬との比較のみを示す。また、プロポフォールを投与した後、ラットの正向反射が消失し、麻酔状態となるが、他の投与群では、ラットに有意な行動変化がないことが発見された。
【０１２９】
実施例7  油性製剤
【０１３０】
本発明のビフェニル誘導体の油性製剤の配合を表5に示す。
【０１３１】
【表５】
2018508479.tif 000014
【０１３２】
実施例8  錠剤
【０１３３】
本発明のビフェニル誘導体の錠剤の配合を表6に示す。
【０１３４】
【表６】
2018508479.tif 000015
【０１３５】
実施例9  カプセル
【０１３６】
本発明のビフェニル誘導体のカプセルの配合を表7に示す。
【０１３７】
【表７】
2018508479.tif 000016
【０１３８】
実施例10  乳剤
【０１３９】
本発明のビフェニル誘導体の乳剤の配方を表8に示す。
【０１４０】
【表８】
2018508479.tif 000017
【国際調査報告】
2018508479.tif 000023
2018508479.tif 000024
2018508479.tif 000025
2018508479.tif 000026
2018508479.tif 000027
2018508479.tif 000028
2018508479.tif 000029
2018508479.tif 000030