(57)【要約】【課題】幅広いノロウイルス株をターゲットとする多価のノロウイルスワクチンを製造すること。【解決手段】  GI genotypeの第１のノロウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）抗原と、GII genotypeの第２のノロウイルスＶＬＰ抗原と、アニオン多糖類を含む多価ノロウイルス乾燥粉末ワクチン組成物、ノロウイルス感染に対する免疫を付与する方法および非経口経路による投与と粘膜経路による投与の両方に好適な多価乾燥粉末ノロウイルスワクチン組成物を製造する方法。【選択図】  図１４Ｄ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
GI genotypeの第１のノロウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）抗原と、
GII genotypeの第２のノロウイルスＶＬＰ抗原と、
アニオン多糖類と
を含む多価ノロウイルス乾燥粉末ワクチン組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、
前記多価ノロウイルス乾燥粉末ワクチン組成物は、非経口経路による投与と粘膜経路による投与の両方に好適である、組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物であって、
GI genotypeのノロウイルスＶＬＰの量は、乾燥粉末ワクチン組成物２０ｍｇ当たり、約１０μｇ〜５０μｇである、組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物であって、
GII genotypeのノロウイルスＶＬＰの量は、乾燥粉末ワクチン組成物２０ｍｇ当たり、約１０μｇ〜５０μｇである、組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物であって、
前記アニオン多糖類は、前記組成物の約０．２５％の量である、組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物であって、
前記乾燥粉末ワクチン組成物の平均微粒子直径は、２４μｍ〜３７μｍである、組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物であって、
前記アニオン多糖類は、ポリガラクツロン酸ナトリウムである、組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物であって、
前記GI genotypeのノロウイルスＶＬＰの量とGII genotypeのノロウイルスＶＬＰの量は、１：１〜３：１の割合である、組成物。
【請求項９】
GI genotypeのノロウイルスＶＬＰ、GII genotypeのノロウイルスＶＬＰ、およびイオン多糖類を含む多価ノロウイルス乾燥粉末ワクチン組成物により、哺乳類対象にノロウイルス感染に対する免疫を付与する方法であって、
前記対象に、少なくとも１用量の前記ワクチン組成物を投与することによって、前記対象のノロウイルス感染に対する能動免疫を与えるのに十分なノロウイルス抗原に対する免疫応答を開始する、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、
前記組成物は、粘膜経路および／または非経口経路により投与される、方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法であって、
水溶液中の前記組成物を再構築することをさらに含み、前記組成物は、非経口経路により投与される、方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の方法であって、
少なくとも２０ｍｇの組成物は、前記粘膜経路により投与される、方法。
【請求項１３】
請求項９に記載の方法であって、
少なくとも５μｇのGI genotypeのノロウイルスＶＬＰおよび５μｇのGII genotypeのノロウイルスＶＬＰは、各用量で投与される、方法。
【請求項１４】
請求項９に記載の方法であって、
粘膜経路および／または非経口経路により投与された対象当たりの総用量は、少なくとも５０μｇのGI genotypeのノロウイルスＶＬＰおよび５０μｇのGII genotypeのノロウイルスＶＬＰである、方法。
【請求項１５】
非経口経路による投与と粘膜経路による投与の両方に好適な多価乾燥粉末ノロウイルスワクチン組成物を製造する方法であって、
ａ．GI genotypeのノロウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）抗原を含む第１の溶液を得ることと、
ｂ．前記第１の溶液に、アニオン多糖類を導入することと、
ｃ．前記アニオン多糖類を含む前記第１の溶液を、実質的に非水状態まで乾燥して、第１の乾燥粉末組成物を生成することと、
ｄ．GII genotypeのノロウイルスＶＬＰ抗原を含む第２の溶液を得ることと、
ｅ．前記第２の溶液に、アニオン多糖類を導入することと、
ｆ．前記アニオン多糖類を含む前記第２の溶液を、実質的に非水状態まで乾燥して、第２の乾燥粉末組成物を生成することと、
ｇ．前記第１および第２の乾燥粉末組成物を組み合わせて、多価乾燥粉末ノロウイルスワクチン組成物を形成すること
を含む、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、
乾燥は、凍結乾燥による、方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法であって、
乾燥は、スプレー乾燥による、方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の方法であって、
前記GI genotypeのノロウイルスＶＬＰおよびGII genotypeのノロウイルスＶＬＰは、組換ウイルス様粒子を、原核細胞、真核細胞、E.coli細胞、出芽酵母（S.cerevisiae）細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、HEK 293細胞、CHO細胞、タバコモザイクウイルスおよびバキュロウイルスからなる群から選択される発現系において、発現することにより得られる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願を相互参照
本出願は、２０１５年８月２８日出願の米国仮出願第６２／２１１，２８９号の優先権を主張するものであり、内容を参照することにより組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、概して、感染症の予防のためのワクチン、特に、ノロウイルス感染およびノロウイルス関連疾病および症状の予防および／または緩和に関する。
【０００３】
カリシウイルス科の一本鎖ＲＮＡウイルスであるノロウイルスは、世界中の、非細菌性胃腸炎の主因であり、ウイルス胃腸炎全体の９６％を占めている[1]。ノロウイルスは、平均で、年間１９００万人から２１００万人に感染しており[2]、開発途上国において５歳未満の子供２０万人の死因[3、4]と推定されている。ノロウイルスは、主に糞口経路で伝染し[5]、学校、老人ホーム、クルーズ船や軍隊等の密集した公共の場の人々にとってノロウイルスは特に脅威となっている[6]。ノロウイルスはまた、ex vivoで安定しており、集団発生後の汚染除去が難しく時間がかかる。ノロウイルスの耐性は、低感染用量（一人＜１０個のビリオン）[7]であるが、ノロウイルスを、社会経済に著しい衝撃を与える高感染性ウイルスとさせている。この疾病負荷は、有効なワクチンの必要性を強く示しているが、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）認可のノロウイルスワクチンはないのが現状である。
【０００４】
ノロウイルスは、少なくとも５つの異なるGenogroup  GI、GII、GIN、GIVおよびGVに分類される。Genogroup  I、IIおよびIVのみがヒトに感染し、GIおよびGIIは、最も蔓延している[8、9]。最近は、Genogroup  IIが最も蔓延しており、世界的なノロウイルス大流行の８１．４％を占めている[10]。各Genogroupは、genoclusterにさらに分類される。様々なノロウイルス株の全長ゲノムシーケンシングによれば、ノロウイルスは、Genogroup内で３％〜３１％、Genogroup間で４９％〜５４％変動し得ることが示されている[11]。この大きな変動のために、広く有効なワクチンの開発がいまだ課題となっている。というのは、１つのGenogroupに対して免疫のあるヒトからの抗体は、他のGenogroupからのノロウイルスと交差反応しないからである[12]。
【０００５】
ワクチン抗原としてのウイルス様粒子（ＶＬＰ）の成果は、肝炎ＢウイルスＶＬＰおよびヒトパピローマウイルスＶＬＰワクチンのライセンス取得者によって示されている。大規模調査は、非経口、経口または粘膜投与されるワクチン抗原としてのノロウイルスＶＬＰの開発に重点が置かれてきた[13、14]。臨床的証拠によれば、経口または鼻腔内投与されたノロウイルスＶＬＰは、十分な耐容性があり、多少の免疫原性があることが示されている[15、16]。さらなる研究では、バキュロウイルスおよびタバコモザイクウイルスを用いて、ノロウイルスＶＬＰを生成するために、組換発現技術を用いており、それによれば、従来のやり方で生成されるノロウイルスＶＬＰの構造と免疫原性に匹敵するものを商業規模で製造できることが実証された[18、19]。
【０００６】
以前の研究では、鼻腔からのノロウイルスＶＬＰ投与によって、全身性免疫と局所および遠位粘膜免疫を誘導できることが分かっている[20、21]。さらに、GelVac(tm)鼻乾燥粉末組成物にノロウイルスＶＬＰを組み込むと、抗原単体よりも免疫応答が大きくなる[20]。GelVac(tm)は、粘膜付着性のあるアロエベラＬ．由来多糖類ポリマーであるGelSite（登録商標）の乾燥粉末組成物である。二価のカチオンが存在していると、GelVac(tm)は、in-situでゲル化が可能となり、鼻腔内組成物に投与されたワクチンの粘膜滞留時間が改善される[22]。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以前の研究では、ノロウイルスＶＬＰの潜在的なワクチンとしての見込みは示されていないが、幅広いノロウイルス株をターゲットとする多価のノロウイルスワクチンを製造することが依然として必要とされている。さらに、ワクチンは、侵襲的な注射の数を最小にするために、多数の経路で投与されるのに好適なものでなければならない。また、ワクチンが乾燥粉末の形態だと、室温で長期保存ができるため、従来の液体形態より好ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、異なるGenogroupのノロウイルスからの１つ、２つまたはそれ以上の抗原を含む乾燥粉末ノロウイルスワクチンの組成物に関する。ある実施形態において、ノロウイルスワクチン組成物は、一価であり、Genogroup  GII  ＶＬＰ抗原を含む。ある実施形態において、ノロウイルスワクチン組成物は多価であり、複数のGenogroupのノロウイルスから誘導された複数のノロウイルスＶＬＰ抗原を含む。特定の実施形態において、ワクチン組成物は、それぞれ、GIとGIIのノロウイルスからの２つのノロウイルスＶＬＰ抗原を含む多価のノロウイルスワクチンである。特定の実施形態において、ワクチン組成物は、それぞれ、GI、GIIおよびGIVノロウイルスからの３つのノロウイルスＶＬＰ抗原を含む多価ノロウイルスワクチンである。ある実施形態において、ノロウイルスＶＬＰ抗原は、組換ＶＬＰである。組換ノロウイルスのウイスル様粒子は、ウイルス、バキュロウイルス発現系、タバコモザイクウイルスベクター系、原核細胞、E.coli系、出芽酵母（S.cerevisiae）、真核細胞発現系、Sf9昆虫細胞、哺乳類細胞、HEK 293およびCHO細胞からなる群から選択される発現系においてウイルス様粒子を発現させることにより得られる。
【０００９】
乾燥粉末ノロウイルスワクチンは、アニオン多糖類をさらに含んでいてもよい。ある実施形態において、アニオン多糖類は、ポリガラクツロン酸ナトリウムである。ポリガラクツロン酸ナトリウムは、粘膜付着性のあるアロエベラＬ．由来多糖類ポリマーである。二価のカチオンが存在していると、この化合物の乾燥粉末組成物は、鼻腔内組成物ワクチンの粘膜滞留時間を改善する。ある実施形態において、乾燥粉末ノロウイルスワクチンの組成物は、２つ以上のノロウイルスＶＬＰ抗原の混合物による１つの粉末組成物として生成される。他の実施形態において、ワクチンは、それぞれ１つのノロウイルスＶＬＰ抗原を含む２つ以上の一価のワクチン粉末の組み合わせとして配合される。
【００１０】
本発明は、さらに、多価の乾燥粉末ノロウイルスワクチンを製造する方法を提供する。本方法は、凍結乾燥ミリング方法を含む。他の実施形態において、本方法は、スプレー乾燥方法を含む。ある実施形態において、ポリガラクツロン酸ナトリウムは、少なくとも０．１％（ｗ／ｗ）含まれる。ある実施形態において、ノロウイルスのウイルス様粒子は、約１μｇ〜１００μｇのワクチン組成物を含む。
【００１１】
本発明はさらに、非経口および／または粘膜経路による少なくとも１つの免疫を含むノロウイルス感染に対する免疫付与方法を提供する。ある実施形態において、粘膜経路による１つ以上の免疫付与に続いて、非経口による１つ以上の免疫付与、またはこの反対を行って、粘膜および全身性免疫反応とノロウイルス感染に対する保護の両方を最大にする。ある実施形態において、乾燥粉末ワクチンを、非経口および粘膜による免疫付与の両方に用いる。すなわち、粘膜免疫付与は、鼻腔内投与により乾燥粉末ワクチンで直接行われ、非経口免疫付与は、筋肉内（ＩＭ）注射により再構成乾燥粉末ワクチンで行われる。対象追随免疫付与におけるノロウイルス特異性抗体およびノロウイルス中和抗体の増加は、対象におけるノロウイルスに対する能動免疫を示している。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ノロウイルスＶＬＰの透過型電子顕微鏡写真である。GI（Ａ）およびGII.4（Ｂ）ＶＬＰを水に溶解し、１５０，０００倍で撮像した（スケールバーは１００μｍ）。ＶＬＰ粒子の外観は球状で、予想サイズは２３ｎｍ〜３８ｎｍであった。
【図２】ＳＹＰＲＯオレンジを用いたノロウイルスＶＬＰの熱安定性評価。ＶＬＰを４倍のＳＹＰＲＯオレンジ溶液で希釈し、融解曲線を、蛍光サーマルサイクラーを用いて分析した。データを単位温度当たりの蛍光変化でプロットしてある。Ａは、ノロウイルスGI  ＶＬＰ融解曲線。Ｂは、ノロウイルスGII.4  ＶＬＰ融解曲線。
【図３】キャプチャーＥＬＩＳＡを用いたノロウイルスＶＬＰの熱安定性評価。ＶＬＰ試料（０．２μｇ／ｍＬ）を異なる温度で５分間処理した。各試料をキャプチャーＥＬＩＳＡにより分析した。
【図４】ＧｅｌＶａｃＴＭ  GI（Ａ）およびGII.4（Ｂ）ワクチン粉末のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析。ワクチン粉末を再構成し、ＶＬＰの存在を確認するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより分析した。左から右の順に、１００μｇ、５０μｇ、１５μｇ、５μｇ、１μｇ、０．１μｇ、０、参照基準である。GIとGIIの両方に〜５５ｋＤａの識別可能なバンドがあり、ＶＰ１のカプシドタンパク質のサイズと一致している。
【図５】ＧｅｌＶａｃＴＭワクチン粉末による鼻腔内免疫付与後の血清ノロウイルス特異性ＩｇＧ生成。メスのハートレー系モルモットに、様々な量のＶＬＰを含む２０ｍｇの粉末組成物により、０および２１日、鼻腔内免疫付与した。血清試料を、０、１４、２１、４２および５６日に集め、GI（Ａ）およびGII.4（Ｂ）ノロウイルス特異性ＩｇＧ抗体について分析した。＊プラセボ対照群に比べてＰ＜０．０５。
【図６】ＧｅｌＶａｃＴＭワクチン粉末による鼻腔内免疫付与後の血清ノロウイルス特異性ＩｇＧ１およびＩｇＧ２生成。メスのハートレー系モルモットに、様々な量のＶＬＰを含む２０ｍｇの粉末組成物により、０および２１日、鼻腔内免疫付与した。血清試料を、０、１４、２１、４２および５６日に集め、GI（Ａ）およびGII.4（Ｂ）ノロウイルス特異性ＩｇＧ１およびＩｇＧ２抗体について分析した。
【図７】ＧｅｌＶａｃＴＭワクチン粉末による鼻腔内免疫付与後の血清ノロウイルス特異性ＩｇＡ生成。メスのハートレー系モルモットに、様々な量のＶＬＰを含む２０ｍｇの粉末組成物により、０および２１日、鼻腔内免疫付与した。血清試料を、５６日に集め、GI（Ａ）およびGII.4（Ｂ）ノロウイルス特異性ＩｇＡ抗体について分析した。
【図８】ＧｅｌＶａｃＴＭワクチン粉末による鼻腔内免疫付与後の中和抗体生成。メスのハートレー系モルモットに、様々な量のＶＬＰを含む２０ｍｇの粉末組成物により、０および２１日、鼻腔内免疫付与した。血清試料を、０、１４、２１、４２および５６日に集め、GI（Ａ）およびGII.4（Ｂ）中和抗体について分析した。＊プラセボ対照群に比べてＰ＜０．０５。
【図９】ＧｅｌＶａｃＴＭワクチン粉末による鼻腔内免疫付与後の膣ノロウイルス特異性ＩｇＧ生成。メスのハートレー系モルモットに、様々な量のＶＬＰを含む２０ｍｇの粉末組成物により、０および２１日、鼻腔内免疫付与した。膣洗浄試料を、０、１４、２１、４２および５６日に集め、GI（Ａ）およびGII.4（Ｂ）ノロウイルス特異性ＩｇＧ抗体について分析した。＊プラセボ対照群に比べてＰ＜０．０５。
【図１０】２回の鼻腔内免疫付与後、ＧｅｌＶａｃＴＭワクチン粉末の４２日の非経口免疫付与後の血清および膣ノロウイルス特異性ＩｇＧ生成。メスのハートレー系モルモットに、１００μｇのGIかGII.4  ＶＬＰを含む２０ｍｇの粉末組成物により、０および２１日、鼻腔内免疫付与した。４２日に、水による再構成後、１００μｇのGIかGII.4  ＶＬＰを含む２０ｍｇの筋肉内（ＩＭ）注射によりモルモットに免疫付与した。膣洗浄試料を、０、１４、２１、４２および５６日に集め、血清中ノロウイルスＶＬＰ特異性ＩｇＧ抗体（Ａ）および膣スワブ誘導によるノロウイルスＶＬＰ特異性ＩｇＧ抗体（Ｂ）について分析した。＊プラセボ対照群に比べてＰ＜０．０５。
【図１１Ａ】ＧｅｌＶａｃＴＭ一価および二価のワクチン粉末の鼻腔内免疫付与後の血清ノロウイルス特異性ＩｇＧおよびＩｇＡ生成。メスのハートレー系モルモットに、様々な量のGIおよびGII.4を含む２０ｍｇの二価のワクチン粉末組成物により、０および２１日、鼻腔内免疫付与した。血清試料を、０、１４、２１、４２および５６日に集め、GI（Ａ）に対する特異性ＩｇＧ抗体について分析した。エラーバーは、幾何標準エラーで与えてある。＊プラセボ対照群に比べてＰ＜０．０５。
【図１１Ｂ】ＧｅｌＶａｃＴＭ一価および二価のワクチン粉末の鼻腔内免疫付与後の血清ノロウイルス特異性ＩｇＧおよびＩｇＡ生成。メスのハートレー系モルモットに、様々な量のGIおよびGII.4を含む２０ｍｇの二価のワクチン粉末組成物により、０および２１日、鼻腔内免疫付与した。血清試料を、０、１４、２１、４２および５６日に集め、GII.4（Ｂ）に対する特異性ＩｇＧ抗体について分析した。エラーバーは、幾何標準エラーで与えてある。＊プラセボ対照群に比べてＰ＜０．０５。
【図１１Ｃ】ＧｅｌＶａｃＴＭ一価および二価のワクチン粉末の鼻腔内免疫付与後の血清ノロウイルス特異性ＩｇＧおよびＩｇＡ生成。メスのハートレー系モルモットに、様々な量のGIおよびGII.4を含む２０ｍｇの二価のワクチン粉末組成物により、０および２１日、鼻腔内免疫付与した。血清試料は、GI（Ｃ）に対する特異性ＩｇＡ抗体について分析した。エラーバーは、幾何標準エラーで与えてある。＊プラセボ対照群に比べてＰ＜０．０５。
【図１１Ｄ】ＧｅｌＶａｃＴＭ一価および二価のワクチン粉末の鼻腔内免疫付与後の血清ノロウイルス特異性ＩｇＧおよびＩｇＡ生成。メスのハートレー系モルモットに、様々な量のGIおよびGII.4を含む２０ｍｇの二価のワクチン粉末組成物により、０および２１日、鼻腔内免疫付与した。血清試料は、GII.4（Ｄ）に対する特異性ＩｇＡ抗体について分析した。エラーバーは、幾何標準エラーで与えてある。＊プラセボ対照群に比べてＰ＜０．０５。
【図１２Ａ】ＧｅｌＶａｃＴＭ乾燥一価および二価のワクチンの鼻腔内免疫付与後の血清ノロウイルス特異性ＩｇＧ１およびＩｇＧ２生成。血清試料の、GI（Ａ）に対するノロウイルス特異性ＩｇＧ１抗体について分析した。
【図１２Ｂ】ＧｅｌＶａｃＴＭ乾燥一価および二価のワクチンの鼻腔内免疫付与後の血清ノロウイルス特異性ＩｇＧ１およびＩｇＧ２生成。血清試料の、GII.4（Ｂ）に対するノロウイルス特異性ＩｇＧ１抗体について分析した。
【図１２Ｃ】ＧｅｌＶａｃＴＭ乾燥一価および二価のワクチンの鼻腔内免疫付与後の血清ノロウイルス特異性ＩｇＧ１およびＩｇＧ２生成。血清試料の、GI（Ｃ）に対するノロウイルス特異性ＩｇＧ２抗体について分析した。
【図１２Ｄ】ＧｅｌＶａｃＴＭ乾燥一価および二価のワクチンの鼻腔内免疫付与後の血清ノロウイルス特異性ＩｇＧ１およびＩｇＧ２生成。血清試料の、GII.4（Ｄ）に対するノロウイルス特異性ＩｇＧ２抗体について分析した。
【図１３】ＧｅｌＶａｃＴＭ乾燥一価および二価のワクチンの鼻腔内免疫付与後の中和抗体生成。メスのハートレー系モルモットに、様々な量のGIおよびGII.4  ＶＬＰを含む２０ｍｇの二価のワクチン粉末組成物により、０および２１日、鼻腔内免疫付与した。血清試料を、０、１４、２１、４２および５６日に集め、GI（Ａ）およびGII.4（Ｂ）中和抗体について分析した。エラーバーは、幾何標準エラーで与えてある。＊プラセボ対照群に比べてＰ＜０．０５。
【図１４Ａ】ＧｅｌＶａｃＴＭ乾燥一価および粉末二価ワクチンによる鼻腔内免疫付与後の粘膜ノロウイルス特異性抗体生成。メスのハートレー系モルモットに、様々な量のGIおよびGII.4  ＶＬＰを含む２０ｍｇの二価のワクチン粉末組成物により、０および２１日、鼻腔内免疫付与した。膣洗浄試料を、０、１４、２１、４２および５６日に集め、GI（Ａ）ノロウイルス特異性抗体について分析した。エラーバーは、幾何標準エラーで与えてある。＊プラセボ対照群に比べてＰ＜０．０５。
【図１４Ｂ】ＧｅｌＶａｃＴＭ乾燥一価および粉末二価ワクチンによる鼻腔内免疫付与後の粘膜ノロウイルス特異性抗体生成。メスのハートレー系モルモットに、様々な量のGIおよびGII.4  ＶＬＰを含む２０ｍｇの二価のワクチン粉末組成物により、０および２１日、鼻腔内免疫付与した。膣洗浄試料を、０、１４、２１、４２および５６日に集め、GII.4（Ｂ）ノロウイルス特異性抗体について分析した。エラーバーは、幾何標準エラーで与えてある。＊プラセボ対照群に比べてＰ＜０．０５。
【図１４Ｃ】ＧｅｌＶａｃＴＭ乾燥一価および粉末二価ワクチンによる鼻腔内免疫付与後の粘膜ノロウイルス特異性抗体生成。メスのハートレー系モルモットに、様々な量のGIおよびGII.4  ＶＬＰを含む２０ｍｇの二価のワクチン粉末組成物により、０および２１日、鼻腔内免疫付与した。５６日に、モルモットを安楽死させ、膣洗浄試料のGI（Ｃ）ノロウイルス特異性抗体について分析した。エラーバーは、幾何標準エラーで与えてある。＊プラセボ対照群に比べてＰ＜０．０５。
【図１４Ｄ】ＧｅｌＶａｃＴＭ乾燥一価および粉末二価ワクチンによる鼻腔内免疫付与後の粘膜ノロウイルス特異性抗体生成。メスのハートレー系モルモットに、様々な量のGIおよびGII.4  ＶＬＰを含む２０ｍｇの二価のワクチン粉末組成物により、０および２１日、鼻腔内免疫付与した。５６日に、モルモットを安楽死させ、膣洗浄試料のGII.4（Ｄ）ノロウイルス特異性抗体について分析した。エラーバーは、幾何標準エラーで与えてある。＊プラセボ対照群に比べてＰ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、乾燥粉末形態のノロウイルスワクチンの組成物、かかるワクチンの製造方法、およびかかるワクチンを投与することにより免疫付与する方法を含む。
【００１４】
開示内容をより容易に理解できるよう、特定の用語についてまず定義しておく。これらの定義は、以降の開示に適用され、当業者に理解されるものである。特に断りのない限り、本明細書で用いる全ての科学技術用語は、当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を持つ。さらなる定義については、詳細な説明にしてある。
【００１５】
本明細書で用いる「１つ」および「一つ」は、そうではないと明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味する。列挙した要素について用いる場合、「および／または」は、（１）単一の要素のみが存在する、または（２）２つ以上の要素が存在する、のいずれかを意味する。例えば、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおよびＢ、ＡおよびＣ、ＢおよびＣ、または、Ａ、ＢおよびＣを選択することを示す。「および／または」は、列挙した要素の「うち少なくとも１つ」または「１つ以上」と区別なく用いられる。
ノロウイルス
【００１６】
本発明は、少なくとも２つのノロウイルスのウイルス様粒子抗原を含む組成物を提供する。本明細書において「ノロウイルス」とは、カリシウイルス科のノロウイルス属に属するものを指す。ある実施形態において、ノロウイルスは、ヒトに急性胃腸炎を起こし、ヒトに限られるものではないが、ヒトを含む哺乳類に感染し得る一群のウイルスである。ノロウイルスには、業界で公知の核酸およびアミノ酸配列により定義される少なくとも５つのGenogroup（GI-GV）が含まれる[40]。ある実施形態において、ノロウイルスは、Genogroupの部分集合を指す。特定の実施形態において、ノロウイルスは、GIおよびGII  Genogroupを指す。特定の実施形態において、ノロウイルスは、GI、GIIおよびGIV  Genogroupを指す。
【００１７】
業界に公知のノロウイルスは多数ある。例えば、これらに限らえるものではないが、ノーウォークウイルス、サザンプトンウイルス、デザートシールドウイルスおよびハワイウイルスが挙げられる。ノロウイルスの新株は定期的に発見されている[41]。GIおよびGII等のノロウイルスGenogroupと組み合わせまたは一部を表す合成構造体の組み合わせを用いることも、ある実施形態では考えられる。
【００１８】
ノロウイルスは、組換ノロウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）を指す。ノロウイルスＶＬＰは、天然ノロウイルスと構造的に同様かつ免疫原性を有するが、感染に必要なノロウイルスのウイルスＲＮＡゲノムがない。本明細書において、「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」は、業界に公知の方法を用いて生成されるウイルス様粒子またはその断片を指す[18、19]。ある実施形態において、ＶＬＰは、バキュロウイルスまたはタバコモザイクウイルスを用いて生成される[18、19、23]。
【００１９】
本明細書において、「ノロウイルス抗原」または「抗原」は、in vivoで免疫反応を引き出すノロウイルスＶＬＰのタンパク質またはペプチドの形態またはその断片を指す。ノロウイルスＶＬＰは、これらに限られるものではないが、ＶＰ１およびＶＰ２等のノロウイルスカプシドタンパク質またはその断片を含んでいてもよい。ある実施形態において、ノロウイルス抗原は、ノロウイルスＶＬＰを含む。ある実施形態において、ノロウイルスＶＬＰは、一価または多価であってよい。本明細書において用いる「一価」は、ノロウイルスの単一Genogroupから誘導された抗原を指す。「多価」は、ノロウイルスの２つ以上のGenogroupから誘導された抗原を指す。例えば、本明細書で用いる組成物が多価と呼ばれる場合、組成物は、ノロウイルスの異なるGenogroupから誘導された抗原を含む。ノロウイルスＶＬＰが多価のときは、ノロウイルスＶＬＰは、ノロウイルスの異なるGenogroupからのＶＰ１およびＶＰ２等のカプシドタンパク質または誘導体を有する。一価または多価のノロウイルスＶＬＰの組み合わせをノロウイルスワクチンの組成物に用いてもよい。これらの実施形態において、得られるワクチンは、ノロウイルスの異なるGenogroupから誘導されたノロウイルスＶＬＰを含む多価のものとされる。多価ワクチンは、２つの異なるGenogroupからの２つのノロウイルスＶＬＰを含むときは、二価であり、３つの異なるGenogroupからの３つのノロウイルスＶＬＰを含むときは、三価である。
抗原作製
【００２０】
本明細書で用いる抗原は、天然由来の微生物から単離精製される。抗原は、組換技術により生成してよい。例えば、ノロウイルスＶＬＰは、原核生物や真核生物等の細胞から生成することができる。これらの細胞としては、これらに限られるものではないが、E.coli、出芽酵母（S.cerevisiae）、Sf9等の昆虫細胞、HEK 293およびCHO細胞等の哺乳類細胞が挙げられる。ある実施形態において、抗原は、GIおよび／またはGII  Genogroupから誘導された組換ノロウイルスＶＬＰである。組換ノロウイルスＶＬＰは、バキュロウイルスまたはタバコモザイクウイルスを用いて発現される[18、19]。ある実施形態において、組換ノロウイルスＶＬＰは、前述した通り、ベンサミアナタバコ等の植物から発現および生成される[23]。簡単に述べると、ノロウイルスＶＬＰを含む清澄葉抽出物をろ過および濃縮する。さらに、抽出物を、セファロースカラムに通して、ＶＬＰを回収する。エンドトキシンおよびその他不純物を分留によりさらに除去してもよい。ある実施形態において、ノロウイルスＶＬＰの純度は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％または１００％である。本明細書で用いるノロウイルスＶＬＰは、組み合わせて用いるときin vivoで免疫原性を引き出せるよう、各ＶＬＰの効果を阻害しないのが好ましい。
ワクチン組成物
【００２１】
本明細書で用いる「ワクチン」または「ワクチン組成物」は、ヒトを含む哺乳類に投与可能で、in vivoで免疫応答を引き出せる、ノロウイルス抗原を含む組成物を指す。本発明のワクチン組成物は、ノロウイルスの感染を防ぎ、かつ／または改善する。ワクチン組成物は、ノロウイルス感染に関連する少なくとも１つの症状を緩和する。ワクチン組成物は、別投与のノロウイルス抗原の効果をさらに高める。本明細書で用いる「免疫原性」、「免疫原性応答」または「免疫応答」は、体液性および／または細胞媒介性の免疫応答を指す。体液性応答は、Ｂリンパ球からの抗原の生成につながる。細胞媒介性免疫応答は、Ｔリンパ球またはマクロファージ等のその他細胞により媒介される応答を指す。
【００２２】
ある実施形態において、ノロウイルスワクチンは、粘膜経路により組成可能な乾燥粉末の形態として投与される。ある実施形態において、乾燥粉末ワクチンは、鼻腔内送達デバイスを用いて鼻腔内に送達される。乾燥粉末ワクチン組成物は、乾燥粉末形態として投与されてもよいし、任意で、哺乳類様組成物の前に水溶液中で再構成してもよい。このように、ワクチン組成物は、水溶液に溶ける。水溶液としては、これらに限られるものではないが、水と塩水緩衝剤が挙げられる。ある実施形態において、ワクチン組成物を投与する他の経路が考えられ、これらに限られるものではないが、皮膚および非経口法が挙げられる。ある実施形態において、ワクチンは、筋肉内注射により送達される。本発明の組成物を投与する詳細な経路および選択肢については、免疫付与方法の段落で説明する。
【００２３】
本発明は、一価または多価のノロウイルスワクチンの組成物を含む。多価ノロウイルスワクチンは、１つの多価ノロウイルスＶＬＰ抗原または少なくとも２つの一価または多価ノロウイルスＶＬＰ抗原を含む１つの粉末組成物として組成される。あるいは、多価ワクチンは、それぞれ１つの一価または多価ノロウイルスＶＬＰ抗原を含む少なくとも２つの乾燥粉末組成物の混合物として組成されてもよい。このように、本明細書で用いるノロウイルスワクチンは、ノロウイルスの異なるGenogroupから誘導された１つ以上のノロウイルスＶＬＰ抗原を含む。特定の実施形態において、ノロウイルスワクチンは、ノロウイルスの異なるGenogroupから誘導された２つのノロウイルスＶＬＰ抗原を含む。これらの実施形態において、ノロウイルスＶＬＰは、GIおよびGIIから誘導されてもよい。ノロウイルスＶＬＰは所望の用量に応じて、乾燥粉末ワクチン組成物２０ｍｇ当たり、０．０１μｇ〜１，０００μｇ存在する。ある実施形態において、ノロウイルスＶＬＰは、乾燥粉末ワクチン組成物２０ｍｇ当たり、１０μｇ〜５０μｇである。
【００２４】
本明細書で用いるノロウイルスワクチンの組成物は、少なくとも１つ以上の賦形剤をさらに含んでいてもよい。組成物に用いる賦形剤は、ノロウイルスＶＬＰを阻害しないのが好ましい。ある実施形態において、賦形剤は、投与されたワクチン組成物の粘膜滞留時間を増大することにより、ワクチン組成物の治療効果をさらに高める。本発明の組成物は、これらに限られるものではないが、防腐剤、粘度調節剤、等張化剤および緩衝剤をはじめとする種類に分類される少なくとも１つ以上の賦形剤を含んでいてよい。
【００２５】
乾燥粉末形態の組成物はまた、１つ以上の賦形剤も含んでいてよい。ある実施形態において、ワクチン組成物は、粘膜付着性を備えたポリマーを含む。特定の実施形態において、ワクチン組成物は、アニオン多糖類を含む。アニオン多糖類としては、これらに限られるものではないが、デキストラン、グアーガム、ビンガム、メチルセルロースおよびポリガラクツロン酸ナトリウムが挙げられる。ある実施形態において、ワクチン組成物は、ポリガラクツロン酸ナトリウムおよび／またはGelSite（登録商標）を含む。GelSite（登録商標）は、アロエベラＬ．から抽出された化学的および機能的に特異な高分子量アニオン多糖類（ガラクツロン酸ナトリウム）である。本明細書で用いるアロエベラＬ．からポリマーを抽出する例示の方法は、参考文献として組み込まれる（米国特許第７，７０５，１３５号）。ガラクツロン酸ナトリウムとGelSite（登録商標）は、本明細書においては区別なく用いられる。乾燥粉末ワクチン組成物は、少なくとも０．０１％、０．１％、０．２５％、０．５％または１％（ｗ／ｗ）の量でGelSite（登録商標）を含んでいてよい。特定の実施形態において、乾燥粉末ワクチン組成物は、０．２５％（ｗ／ｗ）のGelSite（登録商標）を含む。「GelVac(tm)ノロウイルスワクチン」は、GelSite（登録商標）と少なくとも１つのノロウイルスＶＬＰ抗原を含む乾燥粉末ワクチン組成物を指す。
【００２６】
本発明の組成物は、粘膜付着性のある１種類以上の賦形剤を含んでいてよいため、組成物は、ミョウバン助剤等の免疫助剤は必要としない。ある実施形態において、ワクチン組成物はさらに、これらに限られるものではないが、ポビドンとラクトース等の賦形剤を含んでいてもよい。ポビドン（ポリビニルピロリドン）は、薬剤を分散および懸濁するための合成ポリマービヒクルとして製薬業界において通常使用されているものである。ラクトースもまた、製薬業界において一般的に用いられている賦形剤である。
製造方法
【００２７】
本発明のノロウイルスワクチン組成物は、乾燥粉末の形態として製造され、使用するまで無水で保管される。組成物を乾燥させる様々な方法が業界で知られている[42]。方法としては、これらに限られるものではないが、沈殿、結晶化、ジェットミリング、スプレー乾燥および凍結乾燥（フリーズドライ）が挙げられる。乾燥、ミリング、ふるい分けといった下流操作がさらに必要な場合もある。ある実施形態において、組成物をフリーズドライして、所望の特性を備えた粉末を製造する。均一な混合物とするために、凍結粉砕がさらに必要な場合もある。凍結粉砕方法については、米国特許第８，０７４，９０６号が参考文献として組み込まれる。あるいは、組成物は、スプレー乾燥方法により、粉末として製造される。乾燥粉末の形態になると、ノロウイルスワクチンは、１μｍ〜１００μｍの平均直径の粒子サイズとなる。
【００２８】
ある実施形態において、異なるGenogroupのノロウイルスから誘導された少なくとも２つのノロウイルスＶＬＰ抗原を、組成物に添加して、多価乾燥粉末ノロウイルスワクチンを製造する。ある実施形態において、多価乾燥粉末ワクチンを製造するために、異なるノロウイルスGenogroupからの少なくとも３つのノロウイルスＶＬＰ抗原を組成物に添加する。他の実施形態において、多価乾燥粉末ノロウイルスワクチンは、それぞれ１つのノロウイルスＶＬＰ抗原を含む少なくとも２つの乾燥粉末を混合することにより生成される。乾燥は、組成物のデシケート、脱水、実質的な脱水から構成され、乾燥粉末組成物が生成される。ある実施形態において、乾燥組成物は、制御された低湿（＜１０％ＲＨ）環境下で乳棒と乳鉢を用いてミリングし、任意で、７０μｍのフィルタに通して、殺菌してもよい。
免疫付与方法
【００２９】
各抗原またはワクチン組成物用量における抗原体の量を、多大な副作用なく、強固な免疫応答を引き起こす量として選択する。概して、本発明において、対象に投与される用量は、経時で、対象にとって有益な治療応答を生じさせる、または抗原特異性抗体を生成させるのに十分なものでなければならない。このように、ワクチン組成物は、特定の抗原に対する免疫応答を引き出し、かつ／または疾病または感染による症状および／または合併症を緩和、削減または治療するのに十分な量で患者に投与される。これを行うのに適した量は、「治療有効用量」と定義される。
【００３０】
本発明のワクチン組成物は、これらに限られるものではないが、粘膜、皮膚および非経口経路等により投与される。詳細な経路としては、これらに限られるものではないが、経口、局所、皮下、鼻腔、静脈、筋肉内、舌下、経皮、真皮下および座薬経路が例示される。ワクチン組成物は、乾燥粉末の形態として投与または投与の前に水溶液中で再構築される。ある実施形態において、一度に、または数時間、数日、数か月または数年に分けて少なくとも２回の免疫付与が対象に行われる。ある実施形態において、１回以上の免疫が粘膜経路または非経口経路により投与される。ある実施形態において、粘膜経路による１回以上の免疫付与に続いて、非経口経路による１回以上の免疫付与またはこの逆を行うと、粘膜および全身性免疫応答と、ノロウイルス感染に対する保護の両方が最大になる。ある実施形態において、乾燥粉末ワクチンを非経口と粘膜免疫付与の両方に用いる。すなわち、粘膜免疫付与は、鼻腔内投与により乾燥粉末ワクチンで直接行われ、非経口免疫付与は、筋肉内注射により再構築乾燥粉末ワクチンでなされる。
【００３１】
上述した通り、本発明のワクチン組成物は、ノロウイルスへの露出前のノロウイルス感染リスクを減じ、ノロウイルス感染の症状を改善、かつ／または治療するために対象に投与される。ノロウイルス感染の症状は業界で周知されており、これらに限られるものではないが、吐き気、嘔吐、下痢、胃痙攣、微熱、頭痛、悪寒、筋肉痛および疲労感が挙げられる。本発明は、本発明のワクチン組成物の組成時に、ノロウイルスに露出されていない対象における免疫応答を引き起こす方法を含む。あるいは、組成物は、ノロウイルスに現在感染している対象に投与して、投与後に、ノロウイルス感染に関連する少なくとも１つの症状を緩和および／または減少させるものであってもよい。ワクチンによる免疫付与が上手くいくと、免疫付与された対象に、ノロウイルスに対する能動免疫が与えられる。対象にワクチンによる免疫を付与するための治療有効用量は、ワクチン抗原に対する特定の抗体が生成されるようなものである。さらに、対象にワクチンによる免疫を付与するための治療有効用量は、対象におけるノロウイルス中和抗体の増大となるようなものである。対象の血清および粘膜におけるノロウイルス抗原に対する特定の抗体の増大が、能動活性を与える。同様に、対象におけるノロウイルス中和抗体の生成が、ノロウイルス感染に対する能動活性を与える。特定の抗体の力価の増加は、通常、ワクチンにより与えられる保護免疫の程度に比例する。症状の減少は、対象による自己評価により、臨床医の評価により、または、これらに限られるものではないが、体温、ノロウイルス感染のレベル、抗体力価およびＴ細胞の数をはじめとする適切な分析または測定を行うことにより、主観的もしくは客観的に判断される。
【実施例】
【００３２】
以下の実施例は、本開示の例示の実施形態である。当業者であれば、本開示の思想または範囲を変えることなく数多くの修正および変更を行える。かかる修正および変更は、本開示の範囲に含まれる。実施例は本開示を限定するものではない。
実施例１
GIおよびGIIワクチン組成物
【００３３】
ベンサミアナタバコ中で発現した組換ノロウイルスGIおよびGII  ＶＬＰを、前述した通り、ケンタッキーバイオプロセッシング（ケンタッキー州、オーウェンズボロ）[23]より入手し、粉末組成物で用いた。一方、バキュロウイルス発現系を用いて、Sf9昆虫細胞から発現および精製した組換ノロウイルスGIおよびGII  ＶＬＰもまた用いた[18、19]。
【００３４】
GelVac(tm)ワクチン粉末を、凍結乾燥ミリング法により作製した。GelSite（登録商標）ポリマー、ポビドンおよびラクトースを入れた溶液中組換ＶＬＰを含む組成物を用いて、まず、液体組成物を調製した。それらを凍結乾燥した。凍結乾燥後、乾燥組成物は、所望の用量に応じて、０．２５％（ｗ／ｗ）GelSite（登録商標）、９９％ラクトース、０．０５％ポビドン、組成物２０ｍｇ当たり０μｇ〜１００μｇ（ＥＬＩＳＡデータ基準で）含んでいる。GIおよびGII  ＶＬＰを併せて組成物に添加して多価の粉末を、または個別に一価の粉末を製造した。多価粉末はまた、２種類以上の一価の粉末を併せて混合することによっても製造することができる。各乾燥組成物は、制御された低湿（＜１０％ＲＨ）環境下で乳棒と乳鉢を用いてミリングし、７０μｍのフィルタに通してもよい。粉末組成物は、同じく、スプレー乾燥装置を用いて作製することができる。粉末は、室温で乾燥下、密閉容器で使用するまで保管した。
実施例２
ワクチン組成物の特性評価
ＶＬＰ特性評価
【００３５】
GIおよびGII  ＶＬＰストックについて、粉末製造の前に透過型電子顕微鏡により無傷のＶＬＰの存在について分析した。結果によれば、GlおよびGII  ＶＬＰストックの両方について、予測したサイズ（３８ｎｍ）の無傷のＶＬＰの存在が確認された。
【００３６】
ノロウイルスＶＬＰの融点を、ＳＹＰＲＯオレンジにより求めることにより、ＶＬＰ安定性を確認した。簡潔に述べると、ＳＹＰＲＯオレンジ（ミズーリ州、セントルイス、シグマ−アルドリッチ）を、ＰＢＳで希釈して、最終の４倍濃度のＳＹＰＲＯオレンジを作製した。各ＶＬＰを４倍ＳＹＰＲＯオレンジで１ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで希釈した。各試料を蛍光サーマルサイクラーに入れ、蛍光信号を読みながら、２５℃〜９５℃の勾配で実施した。蛍光信号の連続点間の差により信号の関数を求めた。ノイズは、４点移動平均フィルターを用いて減じた。GI（図２Ａ）およびGII（図２Ｂ）について融解曲線プロットを示す。GI  ＶＬＰは、２つの融解ピークを有しており、１つの小ピークは４３℃、大ピークは６５℃であった。GII  ＶＬＰは、６５℃の大ピークを示した。GII  ＶＬＰ融解曲線で観察された大ピークは、GI  ＶＬＰの大ピークと一致している。これらの結果によれば、ＶＬＰ抗原は、６５℃までの温度で安定であったことが示された。
【００３７】
ＶＬＰ安定性はまた、抗原性に基づいて評価された。ノロウイルスＶＬＰを、様々な温度でインキュベートし、キャプチャーＥＬＩＳＡで試験した。ＰＢＳで１：２０００に希釈したマウスモノクローナルｌｇＧ２抗ノロウイルス抗体（マリーンバイオテック、MAB228（GI）、MAB227（GII））を、Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６−ウェルプレート（ペンシルバニア州、ピッツバーグ、フィッシャーサインティフィック）に４℃で一晩コートした。ウェルを洗浄緩衝剤で５回洗って、ブロッキング緩衝剤で室温で１時間ブロックした。ノロウイルスＶＬＰをブロッキング緩衝剤で希釈して、室温で１時間プレート上でインキュベートさせた。ウェルを洗浄緩衝剤で３回洗った後、ブロッキング緩衝剤で１：２０００に希釈した対応のマウスモノクローナルＩｇＧ１抗ノロウイルス抗体（ミリポア、MAB80143（GI）、マリーンバイオテックMAB226（GII））で１時間室温でインキュベーションした。ウェルを洗浄緩衝剤で３回洗った後、ブロッキング緩衝剤で１：２０００に希釈したモノクローナル抗マウスＩｇＧ１：ＨＲＰ（マサチューセッツ州、ケンブリッジ、アブカム）で１時間室温でインキュベーションした。最後に、ウェルを洗浄緩衝剤で３回洗い、メーカーのプロトコル（マサチューセッツ州、ウォルサム、サーモサイテンティフィック）に従って、１ステップでＵｌｔｒａ  ＴＭＢを用いて発現させた。４５０ｎｍでのＯＤを測定し、公知のＶＬＰ濃度に対してプロットした。
【００３８】
各ＶＬＰについて、６５℃でＯＤは大幅に減少した。これは、ＳＹＰＲＯオレンジ（図３）により観察された大きな融解ピークと一致している。このように、高温でのＶＬＰ抗原の変性は、抗原性の喪失と相関していた。これらの結果によってまた、キャプチャＥＬＩＳＡの無傷ＶＬＰに対する特異性も確認され、動物研究に用いる各GelVac(tm)ワクチン粉末抗原用量を求めるのに用いた。
GelVac(tm)ワクチン粉末特性評価
【００３９】
GelVac(tm)ワクチン粉末を、窒素ガス下、手動のミリングプロセスにより作製した。レーザー回折粒子サイズ分布によれば、全ての粉末について、体積平均粒子サイズが、２４μｍ〜３７μｍであることが確認された。これは、液体モジュールによるレーザー回折粒子サイズ分析装置を用いて求められた（カリフォルニア州、パサディナ、ベックマンコールターＬＳ１３  ３２０）。さらに、粉末のｄ１０は、全ての粉末について約５μｍであり、肺深く届く粉末（＜５μｍ）の量が最小になった。各抗原についての代表的な粒子分布結果を表１に示す。GI  ＶＬＰ組成物の平均粒径は、２９．７３μｍであり、GII  ＶＬＰ組成物については２５．２μｍであった。
【００４０】
【表１】
2018526437.tif 000003
【００４１】
ワクチン粉末中の各GIおよびGIIについてのノロウイルスＶＰ１の存在を求めるために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングを行った（図４）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングの両方共、全ての粉末において〜５５ｋＤａに大きなバンドの存在を示している。これらの結果は、ＶＰ１の予想サイズと一致している。感度がないために、ＶＬＰは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティングのいずれにおいても＜１５μｇの用量では目視されなかった。多数のバンドの存在が以前は観察され、それは、ＶＰ１タンパク質の切断の可能によるものと確認された[26、27]。これらの結果はまた、ＶＰ１の相対量が、ＶＬＰの総濃度と一致していたことも示すものである。
【００４２】
キャプチャＥＬＩＳＡを用いて、各ワクチン粉末のＶＬＰ用量を定量した。GIおよびGIIキャプチャＥＬＩＳＡを、１５μｇ用量の組成物ワクチンで行った。各１５μｇＶＬＰ用量粉末の１０ｍｇを１ｍＬの水に溶解した。各粉末をキャプチャＥＬＩＳＡで試験し、ＶＬＰ参照基準と比較した。４−ＰＬ（パラメータロジスティックス）フィットを用いて、各粉末の抗原濃度を、ワクチン粉末の重量を基準として定量した（表２）。キャプチャＥＬＩＳＡを、GI-およびGII-特異性モノクローナル抗体を用いて確かめた。２つのGenogroup間で交差性は観察されなかった。さらに、粉末組成物賦形剤による支障は観察されなかった。
【００４３】
【表２】
2018526437.tif 000004
実施例３
ワクチン組成物の免疫原性
GelVac(tm) GIおよびGII粉末の免疫原性
【００４４】
GI  ＶＬＰを配合したGelVac(tm)ワクチン粉末の免疫原性については前述した[20]。これをさらに調べるために、抗原の用量依存免疫応答を、雌（２５０ｇ）のハートレー系モルモットで、GIまたはGII  ＶＬＰを入れたGelVac(tm)ワクチン粉末により調べた。モルモットには、異なる量のノロウイルスGIまたはGII  ＶＬＰ（表３）または多価GI/GII  ＶＬＰワクチン（GIおよびGII  ＶＬＰをそれぞれ５０μｇ、０および２１日で日に２回）を投与した。
【００４５】
【表３】
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【００４６】
ワクチン粉末は、Ａｐｔａｒ  Ｕｎｉｔ  Ｄｏｓｅ  Ｓｐｒａｙ（ＵＤＳ）デバイス（ニューヨーク州、コンガーズ、アプターファーマー）を用いて、一方の鼻腔に抗原合計用量の半分（鼻腔毎に合計で１０ｍｇの粉末）で、鼻腔内投与した。対照群は、同量のプラセボ粉末組成物を投与した。血清および膣洗浄試料を、０日（予備免疫付与）、２１日、４２日および５６日でモルモットから集めた。
臨床所見
【００４７】
予防接種後、モルモットに異常な臨床所見はなかった。対照と試験ワクチン群間の体重の統計的な差異もなかった（データは示していない）。免疫原性調査の５６日間、ワクチンは全て、被験動物による耐容性について良好であった。GI抗原の１００μｇ用量群のうち１匹のモルモットは、２１日目の第２の免疫付与後に死んだ。解剖したところ、死因は、麻酔および／または血液採取手順によるものだった。
血清抗体応答
【００４８】
血清試料を、ＥＬＩＳＡによりノロウイルスＶＬＰ特異性ＩｇＧについて分析した。ＰＢＳ中ノロウイルスGIまたはGII  ＶＬＰ（２μｇ／ｍＬ）を、Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６−ウェルプレート（フィッシャーサインティフィック）で、室温で４時間インキュベートした。プレートは、ブロッキング緩衝剤で４℃で一晩ブロックした。試料は全て、ブロッキング緩衝剤中で希釈し、プレートにて連続して２倍まで希釈した。試料を、室温で１時間インキュベートさせた。ウェルを洗浄緩衝剤で５回洗った後、抗モルモットＩｇＧ−ＨＲＰ二次抗体（アラバマ州、バーミンガム、サザンバイオテック）により、１：１０００で、室温で１時間インキュベートした。ウェルを洗浄緩衝剤で５回洗った。ウェルをメーカーのプロトコルに従って、１ステップでＵｌｔｒａ  ＴＭＢを用いて発現させた。終点力価を、バックグラウンドより０．１上のＯＤとなり最高希釈度の逆数として記録した。再現性を確認するためのGIまたはGII  ＶＬＰに対してモルモットで生成された正の制御血清が、各試験実行で含まれていた。
【００４９】
血清中に存在する合計抗原特異性ＩｇＧ抗体は、両GIおよびGIIワクチン粉末で、用量依存性の増大を示した（図５）。対照群に比べて、血清ＩｇＧ力価は、１μｇを超える全ての用量で、２１日目に増大し、４２日目でピークとなった。４２日で、GIＩｇＧ力価は、≧１５μｇの全ての用量群について＞６００倍増大し、GIIＩｇＧ力価は、≧５μｇの全ての用量群について＞３００倍増大した。対象における抗原特異性ＩｇＧ力価の＞１００倍の増大に対応するワクチンの用量は、ノロウイルス感染に対する、能動活性を与える。１０〜１０００倍の抗原特異性抗体力価の増大は、ウイルスに対する能動活性の指標である。GIについては１５μｇ〜１００μｇの用量、GIIについては５μｇ〜１００μｇの用量については大きな差はなかった。抗原特異性ＩｇＧ応答を示す最低用量は、GIとGIIの両方について１μｇであり、これは、それぞれ、５６日目の４９５および３２０の力価に対応していた。予想通り、０．１μｇを超える用量は全て、GIとGII粉末の両方の２１日目の２回目の投与後、ブースター効果を示した。これらの結果によれば、GelVac(tm)鼻腔粉末によるＶＬＰ組成物は、高い免疫原性であり、GI  ＶＬＰが１５μｇ、GII  ＶＬＰが５μｇのGelVac(tm)鼻腔粉末で有意の抗体産生がなされるということが示された。
【００５０】
全体として、GIおよびGIIワクチン粉末は両方共、用量依存抗体応答を引き起こした。血清抗原特異性ＩｇＧ抗体生成は、粉末に存在する両GIおよびGII  ＶＬＰ抗原の量と相関しており、ＶＬＰ抗原１５μｇ〜５０μｇの最大レベルに達した。高用量のＶＬＰを投与しても、非常に高レベルの抗原特異性ＩｇＧｓとはならなかった。全身性および粘膜ＩｇＧｓへのブースター効果は、２１日目の２回目の後に、各ＶＬＰ抗原で観察されたことに留意することが大切である。
【００５１】
両方のＩｇＧ１およびｌｇＧ２サブクラスもまた、各群からの血清試料を用いて分析した（図６）。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２は両方とも、上述の合計ＩｇＧと同様の応答プロフィールを示した。GIおよびGII  ＶＬＰ粉末の両方について、ＩｇＧ２力価は、特に、１００倍までの差で、低用量レベル（１および５μｇ）で、ＩｇＧ１力価より明らかに高かった（図６）。
【００５２】
抗原特異性ＩｇＡ血清レベルもまた調べた。５６日目、anti-GIおよびanti-GII  ＶＬＰ  ＩｇＡ抗体を、投与した全ての用量で、１．０μｇの用量群以外の偽用量対照と比べて、観察した（図７）。これもまた、抗原用量が多いと、高いレベルという全体的な傾向を示した。これらの結果によれば、GelVac(tm)鼻腔粉末によるＶＬＰ組成物は、高い免疫原性であり、GI  ＶＬＰが１５μｇ、GII  ＶＬＰが５μｇのGelVac(tm)鼻腔粉末で有意の抗原特異性抗体が得られるということが示された。
血清中和抗体応答
【００５３】
以前の研究によれば、ノロウイルスＶＬＰ特異性抗体は、株特異的に、ノロウイルスＶＬＰをＡＢＨ血液型抗原（ＨＢＧＡ）への結合をブロックすることができることが示された[28]。ＨＡＧＡは、ノロウイルス結合および進入の天然受容体と目されてきた粘膜組織および赤血球で普遍的に発現する炭水化物であり、ＶＬＰとのＨＢＧＡ相互作用のブロックによりノロウイルス感染を防ぐものとされている[29]。これを達成するために、抗原特異性抗体が、ノロウイルスＶＬＰのモルモットの胃ムチンへの結合を阻害する能力について調べられた。血清に存在する中和抗体は、抗体特異性ＩｇＧ抗体力価で観察されたものと同様の用量依存応答を示した（図８）。対照と比べて、ＧＩ中和抗体力価は、２１日の１５μｇ用量群、４２日の１５μｇ、５０μｇおよび１００μｇの用量群、および５６日の１μｇを超える全ての用量群で上昇した。GII中和抗体力価は、２１日の１００μｇ用量群で上昇し、４２日の５μｇ、５０μｇおよび１００μｇの用量群で上昇し、５６日の１μｇを超える全ての用量群で上昇した。４２日で、GI中和抗原力価は、＞５μｇの全ての用量群について５倍増大し、GII中和抗原力価は、＞１μｇの全ての用量群について１０倍増大した。このことは、血清ＩｇＧ力価での所見と一致している。５６日のGIおよびGII両方について、５μｇ〜１００μｇの用量で大きな差はなかった。５６日の検出可能な中和力価となった最低用量は、GIおよびGIIの両方について５μｇであった。５６日の最も高い中和抗体力価は、GIについては１５μｇの用量群、GIIについては１００μｇの用量群であった。予想通り、GIおよびGIIの両方について５μｇを超える全ての群が、２１日の２回目後、ブースター効果を示した。これらの結果によれば、中和抗体力価は、合計血清ＩｇＧ力価について観察されたのと同様の用量依存応答に従ったことが示された。
【００５４】
抗原特異性血清抗体の生成は必要であるが、ノロウイルス感染に対する保護には十分ではない。しかしながら、ＨＢＧＡ結合部位を中和する血清抗体の生成は、効率のための、代用マーカーとして広く受け入れられてきており、ヒトおよびチンパンジーにおける保護と良く相関している[17、37、38]。本開示は、鼻腔内投与されたGIかGII  ＶＬＰのいずれかを含むGelVac(tm)ワクチン粉末が、ＶＬＰのモルモットの胃ムチンへの結合を阻害するモルモットにおいて抗体を生成可能であったことを示すものである。これらの中和抗体の血清レベルは、モルモットに投与されたGIまたはGII  ＶＬＰの量と相関していた。血清ＩｇＧ抗体について観察されたのと同様のやり方で、２回目組成物後の中和抗体力価におけるブースター効果についても観察した。しかしながら、特異性ＩｇＧ抗体全体の誘導に比べて、中和抗体の生成には大量のＶＬＰ抗原が必要であった。GIおよびGII  ＶＬＰ抗原の両方について、中和抗体の生成を最大にするためには、１５μｇの用量が必要であった。これらの結果は、血清ＩｇＧ力価と良く相関しており、各Genogroupについての最大有効用量１５μｇをさらにサポートするものである。抗原特異性ＩｇＧ力価における少なくとも＞１００倍の増大および中和抗体力価における＞５倍の増大に対応するワクチンの用量だと、ノロウイルス感染に対する能動活性を与えるのに有効と考えられる。
粘膜抗体応答
【００５５】
様々な抗原用量での粘膜免疫応答を調べるために、粘膜抗体力価を、膣洗浄により、生殖器で評価した（図９）。GI膣抗体力価を、２１日の５０μｇ用量群および５６日の１μｇより多い量の群全てで増大した。GII膣抗体力価を、４２日の５μｇ、５０μｇおよび１００μｇ用量群で増大した。粘膜ＩｇＧ応答を示す最低用量は、GIおよびGIIの両方について５μｇであった。最大の膣抗体力価は、GIについては１５μｇ、GIIについては１００μｇで生じた。これらの結果によれば、GIおよびGIIのそれぞれについて１５μｇおよび５０μｇという非常に高いレベルに達した用量依存応答を示したことがわかった。
【００５６】
膣における抗原特異性ＩｇＧ抗体生成は、血清中で検出された抗原特異性ＩｇＧ抗体と中和抗体の両方について観察されたものと同様の傾向を示した。粘膜ＩｇＧ抗体の存在は、血清ＩｇＧ抗体の浸出によるものが最もあり得る[39]。これらの結果は、GelVac(tm)ワクチン粉末が、中和抗体応答と共に、粘膜応答を引き起こすことができることを示している。
実施例４
粘膜および非経口経路の両方による免疫付与
【００５７】
モルモットは、GIまたはGIIを含むGelVac(tm)ノロウイルスＶＬＰ粉末の２つの用量をまず受けた。４ＶＬＰを、上述した通り、０および２１日で鼻腔内投与した。３番目の用量については、同量のワクチン粉末を、水で再構築し、４２日に筋肉内（ＩＭ）注射により投与した。血清および膣抗体を、上述した通りに測定した。図１０に示す通り、血清および膣に存在する合計抗原特異性ＩｇＧ抗体は、一価のGIおよびGIIワクチン粉末により増大した。本実験で用いた一価の粉末ワクチンは、GIかGIIノロウイルスＶＬＰのいずれかにより製造したものであった。対照群に比べて、血清ＩｇＧ力価は、２１日で増大し、４２日でもっと高くなった。４２日で、血清ＩｇＧ力価は、GIおよびGII抗原の両方について、＞２００倍増大した。
【００５８】
血清ＶＬＰ特異性力価は、GIおよびGIIの両方について、ＩＭ免疫付与後、さらに１０倍増大した（図１０）。ＶＬＰ特異性ＩｇＧ力価もまた、膣洗浄試料でさらに増大した。２回のＩＭ免疫付与後４２日で、抗原特異性ＩｇＧ力価における２〜４倍の増大が、GIおよびGII  ＶＬＰの両方において膣洗浄で観察された。ＩＭ免疫付与後、膣洗浄のＶＬＰ特異性力価は、GIおよびGII  ＶＬＰの両方において１０倍増大した。このように、粘膜抗体における比較的大きな増大が、ＩＭ免疫付与後得られた。これらの結果によれば、GelVac(tm)鼻腔粉末によるノロウイルスＶＬＰ組成物は、非常に免疫原性で、有意の全身性および粘膜抗体生成の後、粘膜または鼻腔内免疫付与を引き起こすことができ、そして、重要なのは、全身性および粘膜抗体応答の両方が、さらなる非経口またはＩＭ免疫付与によってさらに増大し得るということが示された。
【００５９】
本開示は、さらに、ノロウイルスワクチンにより引き起こされた免疫応答が、非経口と粘膜経路の両方による免疫付与によってさらに高められることを示す。本明細書で示した通り、モルモットにまず、ノロウイルスＶＬＰ粉末ワクチンにより鼻腔内で二回、免疫付与した後、再構成粉末ワクチンによりＩＭ注射でさらに免疫付与すると、全身性および粘膜免疫応答の両方が、ＩＭ注射によるさらなる免疫付与後、有意の増大を示した。このように、免疫応答をさらに高めるために、ノロウイルスワクチンは、粘膜経路による１回以上の用量に続いて、非経口経路による１回以上の用量またはこの逆で投与される。２つの経路の免疫付与の間には２〜４週間の間隔である。第１の用量は、粘膜経路で投与され、第２の用量は、非経口経路で投与されるのが好ましい。乾燥粉末ワクチンは、組み合わせ経路による免疫付与にとって特に有利である。すなわち、粘膜免疫付与は、鼻腔内送達による乾燥粉末ワクチンで直接行われ、ＩＭ注入による非経口免疫付与は、再構成後、同じ乾燥粉末ワクチンで行われる。単に、滅菌水で行ってよい。
実施例５
二価のワクチンによる免疫付与
GelVac GIおよびGII粉末の免疫原性
【００６０】
GIおよびGII  ＶＬＰをそれぞれ投与したGelVac(tm)ワクチン粉末の免疫原性については、報告がなされている[14、16]。さらなる研究によれば、用量依存免疫応答について、GIおよびGIIノロウイルスＶＬＰを含む二価のGelVac(tm)ワクチン組成物で調べられた。モルモットに、異なる量の二価のノロウイルスGIおよびGII  ＶＬＰ（表４）を０および２１日投与した。血清および膣洗浄試料を０日（予備免疫付与）、２１日、４２日および５６日でモルモットから集めた。膣洗浄液は、研究終了後集めた（５６日）。
【００６１】
【表４】
2018526437.tif 000006
血清抗体応答
【００６２】
血清試料のノロウイルスＶＬＰ特異性ＩｇＧについて、ＥＬＩＳＡにより分析した。血清中に存在する合計の抗原特異性ＩｇＧ抗体は、GIおよびGIIワクチン粉末の両方で、用量依存性の増大を示した（図１１）。対照群に比べて、血清ＩｇＧ力価は、１４日に増大し、さらなる増大は、＞５μｇの全ての用量で２１日および４２日に観察された。１４日までに、GIＩｇＧ力価は、対照に比べて＞４倍増大した。GIＩｇＧ力価におけるさらなる増大は、１４日に比べると、２１日に観察された。GIIＩｇＧ力価についても１４日と２１日で同じ結果が観察された。４２日のGIＩｇＧ力価は、≧５μｇの全ての用量群について２１日に比べて＞６００倍増大し、GIIＩｇＧ力価は、≧５μｇの全ての用量群について２１日に比べて＞３００倍増大した。GIについて１５μｇ〜１００μｇ、GIIについて５μｇ〜１００μｇに大きな違いはなかった。抗原特異性ＩｇＧ応答を引き出す最低用量は、GIおよびGIIの両方について５μｇであり、それぞれ、５６日の３０８００および２４５８４０の力価に対応していた。抗原特異性ＩｇＡ血清レベルもまた調べた。５６日に、抗GIおよび抗GII  ＶＬＰ  ＩｇＡ抗体を、疑似用量対照に比べて、投与された全ての用量で観察した（図１１）。これも、抗原用量が多いと、レベルがより高くなるという全体の傾向を示した。
【００６３】
ＩｇＧ１およびＩｇＧ２サブクラスも、各群からのプール血清試料を用いて分析した（図１２）。図示する通り、GIおよびGIIＩｇＧ２特異性抗体力価もまた１４日で観察したが、ＩｇＧＩ特異性力価についてはしなかった。GIおよびGIIｌｇＧ２特異性力価はまた、２１日で、GIまたはGIIＩｇＧＩ特異性力価より高くなった。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ブースター効果もまた、４２日に、GIおよびGIIの両方について観察された。全体として、ＩｇＧ２力価は、GIおよびGII  ＶＬＰの両方について、ＩｇＧＩ力価より高かった（図１２）。これらの結果によれば、二価のGI/GII  ＶＬＰワクチン組成物は、高い免疫原性があり、広範囲の抗体応答を生成することが可能であった。
血清中和抗体応答
【００６４】
ノロウイルスＶＬＰが豚の胃ムチンへの結合するのを阻害する抗原特異性抗体の能力について調べた。血清中に存在する中和抗体は、抗原特異性ＩｇＧ抗体力価について観察されたのと同様の用量依存応答を示した（図１３）。対照に比べて、GI中和抗体力価は、５６日に観察された同様の力価で、４２日の１５μｇ、５０μｇおよび１００μｇ用量群で上昇した。GII中和抗体力価を、５６日に観察された同様の力価で、４２日に全ての群について上昇した。４２日に、GI中和抗体力価は、≧１５μｇの全ての用量群について＞５０倍増大し、GII中和抗体力価は、≧５μｇの全ての用量について＞１９０倍増大し、血清ＩｇＧ力価での知見と一致している。５６日でのGIおよびGIIの両方について、５μｇ〜１００μｇ用量で大きな差はなかった。５６日に、検出可能な中和力価となった最低用量は、GIについては１５μｇ、GIIについては５μｇであった。これらの結果によれば、中和抗体力価は、合計血清ＩｇＧ力価で観察されたものに対するのと同様の用量依存応答に従っていることが示された。
粘膜抗体応答
【００６５】
様々な抗原用量での粘膜抗体応答を調べるために、粘膜抗体力価を、生殖器および腸で評価した（図１４）。GI膣抗体力価は、２１日に、５０μｇと１００μｇ用量群および５６日に、５μｇを超える全ての用量群で上昇した。GII膣抗体力価は、４２日に、５μｇ、１５μｇ、５０μｇおよび１００μｇ用量群で上昇した。粘膜ＩｇＧ応答を示した最低用量は、GIおよびGIIの両方について５μｇであった。最も高い膣抗体力価は、GIおよびGIIの両方について、５０μｇで生じた。これらの結果によれば、膣ＩｇＧ抗体力価は、用量依存性応答を示すことが示された。GIおよびGII特異性ＩｇＧ力価もまた、５６日に、腸で観察した（図１４ＣおよびＤ）。図示する通り、抗体力価は、GIおよびGII特異性抗体の両方について、全ての治療群で観察した。
引用文献
【００６６】
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均等物
【００６７】
当業者であれば、日常の実験だけで、本明細書に記載した発明の具体的な実施形態の多くの等価物を認識または確認できるであろう。かかる等価物は、請求項に包含されるものとする。
【図１】
2018526437.tif 000007
【図２】
2018526437.tif 000008
【図３】
2018526437.tif 000009
【図４】
2018526437.tif 000010
【図５】
2018526437.tif 000011
【図６】
2018526437.tif 000012
【図７】
2018526437.tif 000013
【図８】
2018526437.tif 000014
【図９】
2018526437.tif 000015
【図１０】
2018526437.tif 000016
【図１１Ａ】
2018526437.tif 000017
【図１１Ｂ】
2018526437.tif 000018
【図１１Ｃ】
2018526437.tif 000019
【図１１Ｄ】
2018526437.tif 000020
【図１２Ａ】
2018526437.tif 000021
【図１２Ｂ】
2018526437.tif 000022
【図１２Ｃ】
2018526437.tif 000023
【図１２Ｄ】
2018526437.tif 000024
【図１３】
2018526437.tif 000025
【図１４Ａ】
2018526437.tif 000026
【図１４Ｂ】
2018526437.tif 000027
【図１４Ｃ】
2018526437.tif 000028
【図１４Ｄ】
2018526437.tif 000029
【国際調査報告】
2018526437.tif 000030
2018526437.tif 000031
2018526437.tif 000032
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