(57)【要約】  年齢改変細胞と、細胞内のゲノム核酸メチル化のレベルを低減するかまたは増大させることにより、年齢改変細胞を作製するための方法とが提供される。細胞内のゲノム核酸メチル化のレベルを低減するかまたは増大させることにより、人工多能性幹細胞由来の細胞を含む、体細胞、幹細胞、幹細胞由来の体細胞などの、若齢、老化、成熟、および／または未成熟細胞について、老化および／または成熟過程を、加速または低減および制御することができる。本開示により記載される方法により、体細胞または幹細胞から、老齢細胞、若齢細胞、未成熟細胞、および／または成熟細胞など、年齢相応細胞を産生させることができる。このような年齢改変細胞は、遅発性疾患および／または障害について研究するためのモデル系を構成する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種または複数種の時系列マーカーを呈示する細胞を産生させるための方法であって、該１種または複数種の時系列マーカーの産生を誘導するのに十分な量かつ十分な期間、該１種または複数種の時系列マーカーが欠損した細胞内のゲノム核酸メチル化のレベルを低減するステップを含む方法。
【請求項２】
前記１種または複数種の時系列マーカーが欠損した前記細胞が、幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１種または複数種の時系列マーカーが欠損した前記細胞が、体細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記体細胞が、幹細胞を１種または複数種の分化因子と接触させるステップを含む方法により産生され、該分化因子が、該幹細胞の、該体細胞への分化を促進する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記体細胞が、線維芽細胞、肝細胞、心臓細胞、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞、末梢神経系（ＰＮＳ）細胞、腎細胞、肺細胞、造血細胞、膵臓ベータ細胞、骨髄細胞、骨芽細胞、破骨細胞、および内皮細胞からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＮＳ細胞が、神経前駆体、ニューロン、および神経膠細胞からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＮＳ細胞が、中脳ドーパミン（ｍＤＡ）ニューロン細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記接触させるステップが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ゲノム核酸メチル化を低減する前記方法が、前記細胞を、核酸メチル化を阻害する薬剤と接触させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記薬剤が、シチジンのヌクレオシド類似体；１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２（１Ｈ）−ピリミジノン；ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）阻害剤；ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）の阻害剤；メチル−ＣｐＧ−結合性タンパク質（ＭｅＣＰ２）の阻害剤；ＰＨＤおよびＲＩＮＧフィンガードメイン１タンパク質（ＵＨＲＦ１）の阻害剤；５−アザ−２−デオキシシチジン（５−アザ−ｄＣ）、ホモシステイン；Ｓ−アデノシル−ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）；４−クロロ−Ｎ−（４−ヒドロキシ−１−ナフタレニル）−３−ニトロ−ベンゼンスルホンアミド；（３Ｓ，３’Ｓ，５ａＲ，５ａＲ，１０ｂＲ，１０’ｂＲ，１１ａＳ，１１’ａＳ）−２，２’，３，３’，５ａ，５’ａ，６，６’−オクタヒドロ−３，３’−ビス（ヒドロキシメチル）−２，２’−ジメチル−［１０ｂ，１０’ｂ（１１Ｈ，１１’Ｈ）−ｂｉ３，１１ａ−エピジチオ−１１ａＨ−ピラジノ［１’，２’：１，５］ピロロ［２，３−ｂ］インドール］−１，１’，４，４’−テトロン；およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）の阻害剤、メチル−ＣｐＧ−結合性タンパク質（ＭｅＣＰ２）の阻害剤、および／またはＰＨＤおよびＲＩＮＧフィンガードメイン１タンパク質（ＵＨＲＦ１）の阻害剤が、アンチセンス分子；ｓｉＲＮＡ分子；ＤＮＭＴ、ＨＭＴ、ＭｅＣＰ２、および／またはＵＨＲＦ１に特異的に結合する抗体またはその断片；ならびにこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１種または複数種の時系列マーカーが、年齢関連マーカー、成熟関連マーカー、および疾患関連マーカーからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記１種または複数種の時系列マーカーが、表２または表３から選択される年齢関連マーカーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１種の時系列マーカーを誘導するのに十分な量かつ十分な期間、細胞内のゲノム核酸メチル化のレベルを低減することにより誘導される前記少なくとも１種の時系列マーカーを呈示する細胞。
【請求項１６】
ゲノム核酸メチル化を低減することが、前記細胞を、核酸メチル化を阻害する薬剤と接触させることを含む、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
ゲノム核酸メチル化のレベルを、表２または表３から選択される少なくとも１種の年齢関連時系列マーカーを発現させない細胞の１０〜３０％の間のレベルへと低減する、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１８】
ゲノム核酸メチル化のレベルを、表２または表３から選択される少なくとも１種の年齢関連時系列マーカーを発現させない細胞内のゲノム核酸メチル化のレベルから、１０〜３０％の間の量だけ低減する、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１９】
線維芽細胞、肝細胞、心臓細胞、ＣＮＳ細胞、ＰＮＳ細胞、腎細胞、肺細胞、造血細胞、膵臓ベータ細胞、骨髄細胞、骨芽細胞、破骨細胞、および内皮細胞からなる群から選択される体細胞である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項２０】
前記ＣＮＳ細胞が、神経前駆体、ニューロン、および神経膠細胞からなる群から選択される、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
前記ＣＮＳ細胞が、中脳ドーパミン（ｍＤＡ）ニューロン細胞である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２２】
前記少なくとも１種の時系列マーカーが、年齢関連マーカー、成熟関連マーカー、および疾患関連マーカーからなる群から選択される、請求項１５に記載の細胞。
【請求項２３】
前記少なくとも１種の時系列マーカーが、表２または表３から選択される年齢関連マーカーである、請求項１５に記載の細胞。
【請求項２４】
薬物スクリーニングのための方法であって、
年齢改変細胞を候補化合物と接触させるステップであって、該年齢改変細胞が、該細胞における少なくとも１種の時系列マーカーを誘導するのに十分な量かつ十分な期間、該細胞内のゲノム核酸メチル化のレベルを低減することにより誘導される該少なくとも１種の時系列マーカーを呈示する、ステップと、
該細胞の生存、生物学的活性、形態、または構造のうちの少なくとも１つの変化を検出するステップと、
該細胞の生存、生物学的活性、形態、または構造のうちの少なくとも１つを変化させる候補化合物を、薬物として選択するステップと
を含む方法。
【請求項２５】
細胞における少なくとも１種の時系列マーカーの発現レベルを低減するための方法であって、該少なくとも１種の時系列マーカーの発現レベルを低減するのに十分な量かつ十分な期間、１種または複数種の時系列マーカーを発現させる細胞内のゲノム核酸メチル化のレベルを増大させるステップを含む方法。
【請求項２６】
ゲノム核酸メチル化のレベルを増大させる前記方法が、前記細胞を、核酸メチル化を増大させる薬剤と接触させるステップを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記薬剤が、ＰＩＷＩタンパク質、ＰＩＷＩ相互作用性ＲＮＡ分子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）タンパク質、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）タンパク質、メチル−ＣｐＧ−結合性タンパク質（ＭｅＣＰ２）、ＰＨＤおよびＲＩＮＧフィンガードメイン１タンパク質（ＵＨＲＦ１）、レスベラトロール、ラパマイシン、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞内のゲノム核酸メチル化のレベルを増大させることにより調製される細胞であって、少なくとも１種の時系列マーカーの発現を低減するのに十分な量かつ十分な期間、メチル化のレベルが増大する細胞。
【請求項２９】
ゲノム核酸メチル化を増大させることが、前記細胞を、核酸メチル化を増大させる薬剤と接触させることを含む、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
前記薬剤が、ＰＩＷＩタンパク質、ＰＩＷＩ相互作用性ＲＮＡ分子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）タンパク質、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）タンパク質、メチル−ＣｐＧ−結合性タンパク質（ＭｅＣＰ２）、ＰＨＤおよびＲＩＮＧフィンガードメイン１タンパク質（ＵＨＲＦ１）、レスベラトロール、ラパマイシン、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２９に記載の細胞。
【請求項３１】
ゲノム核酸メチル化のレベルの低減が、ゲノム核酸反復エレメントの非コード領域におけるメチル化の低減を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記反復エレメントが、ＬＩＮＥ１（Ｌ１）エレメント、ＬＴＲエレメント、内因性レトロウイルス（ＥＲＶ）エレメント、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
１種または複数種の時系列マーカーを呈示する前記細胞における、前記反復エレメントの約２０〜８０％の間が、該１種または複数種の時系列マーカーが欠損した細胞と比較して低メチル化状態にある、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
細胞の分子年齢を決定するための方法であって、該細胞における、１または複数のＬｉｎｅ１（Ｌ１）、ＬＴＲ、および／またはＥＲＶ反復エレメントの発現レベルの、１または複数のＡＬＵ反復エレメントの発現レベルに対する比を決定するステップを含み、１を超える比が、該細胞が老化または老齢の分子状態を有することを示す方法。
【請求項３５】
１種または複数種の時系列マーカーを呈示する細胞を産生させるためのキットであって、細胞内のゲノム核酸メチル化を低減する薬剤を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１月１４日に提出された米国仮出願６２／１０３，４７１号、２０１５年１月２９日に提出された米国仮出願６２／１０９，４１２号および２０１５年１２月１日に提出された米国仮出願６２／２６１，８４９号に対する優先権を主張し、それらの各々は、本明細書にその全体が参照によって援用され、それらの各々に対する優先権を主張する。
【０００２】
１．技術分野
本開示は、細胞のゲノムメチル化のレベルを低減することにより、細胞の生物学的年齢または老化状態を加速させるための方法であって、前記細胞を、臨床ならびに基礎研究のどちらにおいても使用しうる、方法に関する。本開示はまた、１種または複数種の時系列マーカーを呈示する細胞ならびにこのようなマーカーを、体細胞、幹細胞、および／または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の体細胞を含む、幹細胞由来の体細胞などの細胞において誘導するための方法も対象とする。さらに、本開示はまた、ゲノム核酸メチル化または他のサイレンシングエピジェネティックマークを増大させることにより、細胞の老化を逆転する（すなわち、細胞の若返りの）方法も提示する。
【背景技術】
【０００３】
２．本開示の背景
老化という不可避の過程を理解し、逆転することは、人類の古来の夢を表す。とりわけ下等生物では、老化のペースが、様々な介入により操ることができることを、幸い多くの証拠が示している。しかし、老化状態を逆転して、より若い状態へと戻すことが可能なのは少数の過程に限られており、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の発生（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）は、これらのうちに含まれる。実際、細胞の、多能性への再プログラム化は、発生学的視点（developmental  perspective）から、生体時計を巻き戻すだけでなく、また、年齢のいくつかの特色も消去する。ｉＰＳＣの、多様な系統への再分化は、細胞の老化と関連するいくつかのマーカーを逆転することにより、細胞を、「若返った」ままにすることを示す証拠が、最近提示されている。
【０００４】
現在まで、ｉＰＳＣおよびそれらの分化させた後代における生物学的若返りの例について報告する研究は大半が、再プログラム化の前および後における表現型的形質を比較している。多能性は、エピジェネティック機構により、細胞の若さを回復させうることが提案されているが、この過程についての踏み込んだ解析は、いまだ実施されていない。若返りが、ゲノム内で、どのようにしてコードされているのかについて理解することにより、年齢の分子決定因子についての、極めて貴重な知見をもたらすことができ、細胞年齢を、細胞運命から独立して再プログラム化するための方法を考案する可能性を開き得る。
【０００５】
遅発性障害および／または疾患は、様々な生理学的系において生じうる。例えば、パーキンソン病（ＰＤ）またはアルツハイマー病（ＡＤ）などの神経変性障害は、社会にとってますます大きな負担となりつつある。平均余命の高齢化は、現在のところ治癒不可能であり、多くの場合に処置不可能な、これらの障害を伴うと診断された個体の数を爆発的に増大させている。６０歳を超える個体の罹患人口は、２０５０年までに世界の総人口の２１．８％を占め、２０億人に達することが推定されるので、この傾向は、強まることが予測されている（Ｌｕｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ、４５１巻：７１６〜７１９頁（２００８年））。
【０００６】
年齢はそれ自体、神経変性疾患の著明な危険因子であると考える研究者が多く、例えば、米国内のＡＤの症例は、２０１０年の４００万例から、２０５０年までにほぼ１４００万例へと、３倍を超えて増大することが推定されている（Ｈｅｂｅｒｔら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、８０巻（１９号）：１７７８〜８３頁（２０１３年））。ＰＤについても、今後３０年間にわたり、同様の発生率の増大が予測されている（Ｄｏｒｓｅｙら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、６８巻：３８４〜３８６頁（２００７年））。これと並行して、ＡＤおよびＰＤなどの年齢関連障害のための治療が開発されつつあるが、その速度は極めて緩慢である。入手可能なのは、症状の緩和だけであり、処置される症状およびその有効性の持続期間のいずれについても限定されており、新規の予防法および治療法に対する必要性が浮き彫りになっている。
【０００７】
平均余命の漸次の延長のために、パーキンソン病（ＰＤ）などの遅発性神経変性障害は、社会にとってますます大きな負担となりつつある。２０５０年までに、推定世界人口の２１．８％（約２０億人）が６０歳を超えることが推定されるので、ＰＤの発生率は、上昇し続ける可能性が高い（Ｌｕｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ、４５１巻：７１６〜７１９頁（２００８年））。
【０００８】
患者由来の皮膚細胞を、多能性状態へと再プログラム化して戻し、次いで、疾患関与性の細胞型へとさらに分化させうる、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）技術の使用は、現在のところ難治性であるヒト障害をモデル化し、処置する潜在的な可能性のための新たな機会を提示している（Ｂｅｌｌｉｎら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１３巻、７１３〜７２６頁（２０１２年））。しかし、ｉＰＳＣ由来細胞により、患者が晩年まで症状を発症せず、年齢を疾患の進行にとって必要な構成成分として含意する遅発性疾患が、どのくらい良好にモデル化されうるのかについての懸念がある。
【０００９】
複数のｉＰＳＣについての研究が、ｉＰＳＣの誘導中における、特定の年齢関連特徴の喪失を裏付けている（ＦｒｅｉｊｅおよびＬｏｐｅｚ−Ｏｔｉｎ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２４巻、７５７〜７６４頁（２０１２年）；ＭａｈｍｏｕｄｉおよびＢｒｕｎｅｔ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２４巻、７４４〜７５６頁（２０１２年）において総説されている）。例えば、老齢ドナーに由来するｉＰＳＣでは、テロメア長の延長（Ａｇａｒｗａｌら、Ｎａｔｕｒｅ、４６４巻：２９２〜２９６頁（２０１０年）；Ｍａｒｉｏｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、１４１〜１５４頁（２００９年））、ミトコンドリアの適合度（Ｐｒｉｇｉｏｎｅら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、７２１〜７３３頁（２０１０年）；Ｓｕｈｒら、ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ、ｅ１４０９５頁（２０１０年））、および老化マーカーの喪失（Ｌａｐａｓｓｅｔら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、２５巻：２２４８〜２２５３頁、２０１１年）など、年齢関連特徴の変化についての証拠があることから、老齢ドナー細胞の再プログラム化中に若返りが生じることが示唆される。ｉＰＳＣにおける、それらの初代体細胞供給源と比較した、年齢関連特徴の見かけの喪失に加えて、本開示のｉＰＳ由来細胞の老化においてｉＰＳ細胞を使用することの別の利点は、結果として得られる成熟表現型である。これに対し、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ：ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）の方向付けられた分化は、成熟マーカーおよび遅発性疾患の表現型を提示する能力を欠く、未成熟で胚様の細胞型をもたらすことが公知である。実際、誘導性老化を施さなければ、これらの未成熟なｉＰＳＣ由来細胞は、それらの特定の細胞型の頑健な機能特性を確立するのに、数カ月間にわたるｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける成熟を要求することが多い（Ｌｉｕら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２４巻：７６５〜７７４頁（２０１２年）；ＳａｈａおよびＪａｅｎｉｓｃｈ、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、５巻：５８４〜５９５頁（２００９年））。
【００１０】
長期にわたる分化は、ヒト発生の緩慢なタイミングを反映すると考えられている。例えば、ＰＤにおいて主に影響を受ける細胞型である、ヒト中脳ドーパミン（ｍＤＡ：ｍｉｄｂｒａｉｎ  ｄｏｐａｍｉｎｅ）ニューロンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて成熟した生理学的挙動を発生させるのに、数カ月間にわたる培養を要求し、ＰＤの動物モデルにおけるドーパミン欠損をレスキューするのに、数カ月間にわたるｉｎ  ｖｉｖｏ成熟を要求する（Ｉｓａｃｓｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０巻：４７７〜４８２頁（１９９７年）；Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４８０巻：５４７〜５５１頁（２０１１年））。さらに、発生しつつあるヒト脳についてのＢＲＡＩＮ−ｓｐａｎアトラス（ｂｒａｉｎｓｐａｎ．ｏｒｇ）に基づくと、ｈＰＳＣ由来の神経細胞による遺伝子発現データは、遅発性障害をモデル化するには早期に過ぎると考えられる段階である、妊娠初期胎児のトランスクリプトームにマッチする。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける分化データは、成熟または老化細胞の急速な発生を防止する、種特異的な内因性の「時計様」成熟過程により、ＰＤなどの遅発性神経変性障害のヒトｉＰＳＣベースのモデル化にとって大きな難題が提起されていることを指し示した。
【００１１】
細胞の再プログラム化中および分化中における老化および若返りの包括的な側面に取り組むときの問題は、体細胞ドナーの経時的年齢およびｉＰＳＣ派生物の対応する細胞年齢を信頼できる形で予測するマーカーの同定である。
【００１２】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、ヒト疾患のモデル化に有用であることが提起されている。例えば、ｉＰＳＣ技術は、家族性自律神経障害または単純ヘルペス脳炎などの早発性障害について研究するのに使用されている（Ｌｅｅら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、３０巻：１２４４〜１２４８頁（２０１２年）；Ｌｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ、４６１巻：４０２〜４０６頁（２００９年）；およびＬａｆａｉｌｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ、４９１巻：７６９〜７７３頁（２０１２年））。両方の障害についての疾患機構の発見およびハイスループットの薬物スクリーニングは、スクリーニングされた薬物候補をさらに調べうるヒトｉＰＳＣベースの疾患モデルを可能とした。
【００１３】
早発性遺伝性障害のモデル化における初期の進展にも拘らず、ｉＰＳＣ由来の中脳ドーパミン（ｍＤＡ）ニューロンの胚性の性格（ＬｅｅおよびＳｔｕｄｅｒ、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、７巻：２５〜２７頁（２０１０年）；ＳａｈａおよびＪａｅｎｉｓｃｈ、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、５巻：５８４〜５９５頁（２００９年）；ならびにＬｉｕら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２４巻：７６５〜７７４頁（２０１２年））を踏まえると、ｉＰＳＣベースの手法が、パーキンソン病（ＰＤ）などの遅発性障害を、どのくらい良好にモデル化しうるのかについての根本的疑問は残る。ＰＤなどの遅発性障害は、生涯の早期において、疾患のいかなる徴候も伴わずに、発症するのに数十年間を要する。実際、ｉＰＳＣ技術を使用してＰＤの遺伝性形態または散発性形態をモデル化する最新の研究は、疾患に特徴的な重度の変性病態を再現せずに、観察された表現型を示すことも、比較的微細な生化学的変化または形態変化を提示することもない（Ｓｏｌｄｎｅｒら、Ｃｅｌｌ、１４６巻：３１８〜３３１頁（２０１１年）；Ｓｏｌｄｎｅｒら、Ｃｅｌｌ、１３６巻：９６４〜９７７頁（２００９年）；Ｎｇｕｙｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、８巻：２６７〜２８０頁（２０１１年）；Ｓｅｉｂｌｅｒら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、３１巻：５９７０〜５９７６頁（２０１１年）；およびＣｏｏｐｅｒら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、４巻：１４１〜１９０頁（２０１２年））。
【００１４】
ｉＰＳＣから分化させた細胞における年齢を測定および操作する能力は、現在のところ解決されずに残る、多能性幹細胞研究における根本的課題を表す。細胞運命を、３つの胚葉全ての多様な派生物へと方向付けることにおいては、無視できない進展がなされているが、所与の細胞型の年齢を、要求に応じて、胚性状態から、新生児状態、成体状態、または老化状態へと切り替える技術はほとんど存在していない。これはｈＰＳＣ由来の成体様造血幹細胞、完全に機能的な心筋細胞、または成熟膵島を発生させることの変わらぬ不成功、ならびに遅発性疾患をモデル化するための、年齢相応および／または段階相応の老化細胞型を得ることの一般的な不可能性により例示される通り、依然として、当分野における大きな障害である。
【００１５】
ＰＤなどの遅発性障害のｉＰＳＣモデルは、疾患の重度の変性病態を十分に反映しない。したがって、遅発性神経変性障害をモデル化する新たな方法が必要とされている。具体的には、ｉＰＳＣ技術を使用して、患者の年齢により緊密に相似する老化細胞を発生させる新たな方法は、遅発性疾患、特に変性疾患、より具体的には神経変性疾患のための有効な処置を探索するのに極めて有用である。
加えて、細胞の成熟を加速する能力は、研究のためであれ、治療のためであれ、年齢相応細胞を迅速に供給するのに有用である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｌｕｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ、４５１巻：７１６〜７１９頁（２００８年）
【非特許文献２】Ｈｅｂｅｒｔら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、８０巻（１９号）：１７７８〜８３頁（２０１３年）
【非特許文献３】Ｄｏｒｓｅｙら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、６８巻：３８４〜３８６頁（２００７年）
【非特許文献４】Ｂｅｌｌｉｎら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１３巻、７１３〜７２６頁（２０１２年）
【非特許文献５】ＦｒｅｉｊｅおよびＬｏｐｅｚ−Ｏｔｉｎ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２４巻、７５７〜７６４頁（２０１２年）
【非特許文献６】ＭａｈｍｏｕｄｉおよびＢｒｕｎｅｔ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２４巻、７４４〜７５６頁（２０１２年）
【非特許文献７】Ａｇａｒｗａｌら、Ｎａｔｕｒｅ、４６４巻：２９２〜２９６頁（２０１０年）
【非特許文献８】Ｍａｒｉｏｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、１４１〜１５４頁（２００９年）
【非特許文献９】Ｐｒｉｇｉｏｎｅら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、７２１〜７３３頁（２０１０年）
【非特許文献１０】Ｓｕｈｒら、ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ、ｅ１４０９５頁（２０１０年）
【非特許文献１１】Ｌａｐａｓｓｅｔら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、２５巻：２２４８〜２２５３頁、２０１１年
【非特許文献１２】Ｌｉｕら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２４巻：７６５〜７７４頁（２０１２年）
【非特許文献１３】ＳａｈａおよびＪａｅｎｉｓｃｈ、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、５巻：５８４〜５９５頁（２００９年）
【非特許文献１４】Ｉｓａｃｓｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０巻：４７７〜４８２頁（１９９７年）
【非特許文献１５】Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４８０巻：５４７〜５５１頁（２０１１年）
【非特許文献１６】Ｌｅｅら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、３０巻：１２４４〜１２４８頁（２０１２年）
【非特許文献１７】Ｌｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ、４６１巻：４０２〜４０６頁（２００９年）
【非特許文献１８】Ｌａｆａｉｌｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ、４９１巻：７６９〜７７３頁（２０１２年）
【非特許文献１９】ＬｅｅおよびＳｔｕｄｅｒ、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、７巻：２５〜２７頁（２０１０年）
【非特許文献２０】Ｓｏｌｄｎｅｒら、Ｃｅｌｌ、１４６巻：３１８〜３３１頁（２０１１年）
【非特許文献２１】Ｓｏｌｄｎｅｒら、Ｃｅｌｌ、１３６巻：９６４〜９７７頁（２００９年）
【非特許文献２２】Ｎｇｕｙｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、８巻：２６７〜２８０頁（２０１１年）
【非特許文献２３】Ｓｅｉｂｌｅｒら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、３１巻：５９７０〜５９７６頁（２０１１年）
【非特許文献２４】Ｃｏｏｐｅｒら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、４巻：１４１〜１９０頁（２０１２年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
３．本開示の概要
少なくとも１種の時系列マーカーを呈示する細胞を産生させるための方法であって、細胞の核酸、例えば、ゲノムＤＮＡメチル化のレベルを低減するステップを含む方法が開示される。
【００１８】
このような時系列マーカーは、本明細書、および、参照により全ての目的のためにその全体において組み込まれる、２０１４年１０月２３日に公開された、国際公開第ＷＯ／２０１４／１７２５０７号において記載される、時系列マーカーを含む。
【００１９】
ある特定の実施形態では、メチル化のレベルを低減することは、細胞における遺伝子発現の、エピジェネティック抑制のレベルを低減する、例えば、転移性配列および反復配列の抑制解除をもたらす。
【００２０】
ある特定の実施形態では、本出願の方法は、細胞を、細胞内の核酸メチル化のレベルを低減または阻害するのに十分な量かつ十分な期間、核酸メチル化を阻害または低減する薬剤と接触させるステップを含む。細胞は、幹細胞の場合もあり、体細胞の場合もある。より特定された実施形態では、細胞は、ｉＰＳＣ由来細胞でありうる。さらにより特定された実施形態では、ｉＰＳＣ由来細胞は、ニューロンである。ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣ由来ニューロンは、中脳ドーパミンニューロン（ｍＤＡニューロン）である。ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンは、パーキンソン病を有する被験体に由来する。
【００２１】
ある特定の実施形態では、体細胞を、幹細胞を、１種または複数種の分化因子と接触させるステップを含む方法により産生させるが、この場合、前記分化因子は、前記幹細胞の、前記体細胞への分化を促進する。ある特定の実施形態では、接触させるステップは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて接触させるステップである。
【００２２】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化を阻害または低減する薬剤は、シチジンのヌクレオシド類似体、例えば、ゼブラリン（１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２（１Ｈ）−ピリミジノンまたはピリミジン−２−オンβ−Ｄ−リボフラノシドとしてもまた公知である）を含む。
【００２３】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化を阻害または低減する薬剤は、５−アザ−２−デオキシシチジン（５−アザ−ｄＣ；デシタビン）および／またはホモシステインおよび／またはホモシステインの代謝物である、Ｓ−アデノシル−ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）を含む。
【００２４】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化を阻害または低減する薬剤は、４−クロロ−Ｎ−（４−ヒドロキシ−１−ナフタレニル）−３−ニトロ−ベンゼンスルホンアミド（ＳＷ１５５２４６）を含む。
【００２５】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化を阻害または低減する薬剤は、（３Ｓ，３’Ｓ，５ａＲ，５ａＲ，１０ｂＲ，１０’ｂＲ，１１ａＳ，１１’ａＳ）−２，２’，３，３’，５ａ，５’ａ，６，６’−オクタヒドロ−３，３’−ビス（ヒドロキシメチル）−２，２’−ジメチル−［１０ｂ，１０’ｂ（１１Ｈ，１１’Ｈ）−ｂｉ３，１１ａ−エピジチオ−１１ａＨ−ピラジノ［１’，２’：１，５］ピロロ［２，３−ｂ］インドール］−１，１’，４，４’−テトロン、（ケトシン）を含む。
【００２６】
ある特定の実施形態では、薬剤は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）の阻害剤および／もしくはヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）の阻害剤、例えば、ＤＮＭＴおよび／もしくはＨＭＴに結合する抗体もしくはその断片、またはＤＮＭＴおよび／もしくはＨＭＴ酵素の発現を低減（reduced）もしくは阻害するアンチセンスもしくはｓｉＲＮＡ分子を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＭＴ酵素は、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、および／またはＤＮＭＴ３Ｌを含む。
【００２７】
ある特定の実施形態では、薬剤は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、例えば、ＳＵＶ３／９の阻害剤、例えば、ヒストンメチルトランスフェラーゼに結合する抗体もしくはその断片、またはヒストンメチルトランスフェラーゼの発現を低減もしくは阻害するアンチセンスもしくはｓｉＲＮＡ分子を含む。
【００２８】
ある特定の実施形態では、薬剤は、メチル−ＣｐＧ−結合性タンパク質（ＭｅＣＰ２）の阻害剤および／もしくはＰＨＤおよびＲＩＮＧフィンガードメイン１タンパク質（ＵＨＲＦ１）の阻害剤、例えば、ＭｅＣＰ２および／もしくはＵＨＲＦ１タンパク質に結合する抗体もしくはその断片、またはＭｅＣＰ２および／もしくはＵＨＲＦ１タンパク質の発現を低減もしくは阻害するアンチセンスもしくはｓｉＲＮＡ分子を含む。
【００２９】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化のレベルの低減は、ゲノム核酸反復エレメント（genomic  nucleic  acid  repetitive  element）、例えば、ＬＩＮＥ１（Ｌ１）エレメント、ＬＴＲ（長い末端反復（Ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ））エレメント、および／または内因性レトロウイルス（ＥＲＶ）エレメントの非コード領域におけるメチル化の低減を含む。
【００３０】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化のレベルの低減は、ゲノム核酸の非コード領域におけるメチル化の低減、および特異的なゲノム核酸プロモーターの、相伴う局所的高メチル化を含む。
【００３１】
ある特定の実施形態では、エピジェネティックサイレンシングの低減は、抑制性ヒストンマーク、例えば、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３および／またはＨ３Ｋ２７ｍｅ３のレベルの低減を含む。
【００３２】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化のレベルの低減は、ヒストンタンパク質Ｈ１のレベルの低減を含む。
【００３３】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化のレベルの低減は、ヘテロクロマチンマーカーＨＰ１αのレベルの低減を含む。
【００３４】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化のレベルの低減は、核形態マーカーラミンＢ１のレベルの低減を含む。
【００３５】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化のレベルの低減は、１種または複数種のＤＮＡ損傷のマーカー、例えば、ｙＨ２Ａｘのレベルの増大を含む。
【００３６】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化の低減は、１または複数のＣｐＧメチル化部位におけるメチル化のレベルおよび／またはメチル化率の低減を含む。
【００３７】
ある特定の実施形態では、本出願の方法は、細胞内の５−ヒドロキシ−メチル−シトシン（５ｈｍＣ）核酸修飾のレベルを増大させるステップを含む。
【００３８】
ある特定の実施形態では、本出願の方法は、細胞内の１０；１１転座（ｔｅｎ−ｅｌｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）（ＴＥＴ）タンパク質、例えば、これに限定されないがヒトｔｅｎ−ｅｌｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  １（ＴＥＴ１）のレベルまたは活性を増大させるステップを含む。
【００３９】
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される、核酸メチル化の低減は、ゲノムの不安定性を発生させ、転写から修復に至る範囲の、正常な核の機能に干渉し、最終的には、老化細胞状態を規定するホメオスタシスの喪失を結果としてもたらす。
【００４０】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化のレベルを、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）および／またはヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）および／またはメチル−ＣｐＧ−結合性タンパク質（ＭｅＣＰ２）および／またはＰＨＤおよびＲＩＮＧフィンガードメイン１タンパク質（ＵＨＲＦ１）内の変異、例えば、ＤＮＭＴ１内のハイポモルフ変異などのハイポモルフ変異により低減する。
【００４１】
一部の実施形態では、少なくとも１つの経時的マーカーは、年齢関連マーカー、成熟関連マーカー、および疾患関連マーカーからなる群から選択される。
【００４２】
また、少なくとも１種の時系列マーカーを誘導するのに十分な量かつ十分な期間、核酸メチル化のレベルを低減することにより誘導される、前記少なくとも１種の時系列マーカーを呈示する細胞も開示される。
【００４３】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化のレベルを、そのメチル化のレベルが、本明細書で記載される方法に従い低減されなかった細胞における、例えば、体細胞に由来するｉＰＳＣにおけるメチル化のレベルの約１０〜３０％の間のレベルへと低減する。
【００４４】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化のレベルを、そのメチル化のレベルが、本明細書で記載される方法に従い低減されなかった細胞における、例えば、体細胞に由来するｉＰＳＣにおけるメチル化のレベルから約１０〜３０％だけ低減する。
【００４５】
一部の実施形態では、細胞は、線維芽細胞、肝細胞、心臓細胞、ＣＮＳ細胞、ＰＮＳ細胞、腎細胞、肺細胞、造血細胞、膵臓ベータ細胞、骨髄細胞、骨芽細胞、破骨細胞、内皮細胞からなる群から選択される体細胞である。一部の実施形態では、細胞は、神経前駆体、ニューロン、およびグリア細胞からなる群から選択される。
【００４６】
ある特定の実施形態では、細胞は、中脳ドーパミン（ｍＤＡ）ニューロン細胞である。
【００４７】
ある特定の実施形態では、少なくとも１種の時系列マーカーは、本明細書で記載される、表２または表３から選択される年齢関連マーカーである。
【００４８】
また、薬物スクリーニングのための方法であって、年齢改変細胞（age-modified  cell）を候補薬物と接触させるステップと、細胞の生存、生物学的活性、形態、または構造のうちの少なくとも１つにおける変化を検出するステップとを含み、前記年齢改変細胞が、前記細胞において前記少なくとも１種の時系列マーカーを誘導するのに十分な量かつ十分な期間、ゲノム核酸メチル化のレベルを低減することにより誘導される少なくとも１種の時系列マーカーを呈示する、方法も開示される。一部の実施形態では、スクリーニング法は、年齢改変細胞を候補薬物と接触させるステップと、細胞の生存、生物学的活性、構造、または形態のうちの少なくとも１つにおける変化を検出するステップとを含む。
【００４９】
一部の実施形態では、ゲノム核酸メチル化のレベルを低減することにより、細胞の老化および／または成熟を加速させる。この過程を制御することにより、細胞の年齢を選択して、遅発性疾患、とりわけ、他の方法では十分に研究することができない疾患をモデル化することができる。こうして、産生させた細胞は、疾患のモデル化、薬物スクリーニング、および治療剤を含むがこれらに限定されない、様々な適用において使用することができる。
【００５０】
他の実施形態では、本開示は、年齢相応体細胞を産生させるための方法であって、培養物中の、細胞のゲノム核酸メチル化のレベルを低減するステップであって、前記細胞培養物が、少なくとも１つの第１の時系列マーカーシグネチャー（例えば、若いまたは未成熟細胞において見出されるシグネチャー）を有するステップと、これにより、少なくとも１つの第２の時系列マーカーシグネチャー（例えば、古いまたは成熟細胞において見出されるシグネチャー）を呈示する年齢相応体細胞を誘導するステップとを含む方法を提供する。さらなる実施形態では、初代体細胞培養物中の、ゲノム核酸メチル化のレベルを低減するステップを含み、初代体細胞培養物が、少なくとも１つの第１の疾患マーカーシグネチャーを有し、産生される年齢相応体細胞培養物が、少なくとも１つの第２の疾患マーカーシグネチャーを呈示する、本開示の方法を適用して、年齢相応体細胞を産生させることができる。時系列マーカーシグネチャーは、１種または複数種の時系列マーカーを含みうる。
【００５１】
一実施形態では、ニューロン細胞は、中脳ドーパミン細胞である。一実施形態では、ニューロン細胞培養物は、ＰＡＲＫＩＮニューロン細胞である。一実施形態では、ニューロン細胞培養物は、ＬＲＲＫ２ニューロン細胞である。
【００５２】
ある特定の実施形態では、本出願はまた、細胞の核酸、例えば、ゲノムＤＮＡメチル化のレベルを増大させる方法も提供する。ある特定の実施形態では、方法により、本明細書で記載される少なくとも１種の時系列マーカーの、老化細胞または核酸メチル化を増大させる方法に供していない細胞と比較して低発現レベルを呈示する細胞を産生させる。
【００５３】
ある特定の実施形態では、メチル化のレベルを増大させることにより、細胞内の遺伝子発現の、エピジェネティック抑制のレベルを増大させる。
【００５４】
ある特定の実施形態では、本出願の方法は、細胞を、細胞内の核酸メチル化のレベルを増大させるのに十分な量かつ十分な期間、核酸メチル化を増大させる薬剤と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、細胞は、幹細胞の場合もあり、体細胞の場合もある。より特定の実施形態では、細胞は、ｉＰＳＣ由来細胞でありうる。さらにより特定の実施形態では、ｉＰＳＣ由来細胞は、ニューロンである。ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣ由来ニューロンは、中脳ドーパミンニューロン（ｍＤＡニューロン）である。ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンは、パーキンソン病を有する被験体に由来する。
【００５５】
ある特定の実施形態では、細胞を、反復エレメント、例えば、ＬＩＮＥ１エレメントおよび／またはＭＩＲエレメントの発現を減少させるのに十分な量かつ十分な期間、核酸メチル化を増大させる薬剤と接触させる。
【００５６】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化を増大させる薬剤は、ＰＩＷＩタンパク質および／またはＰＩＷＩ相互作用性ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）および／または体細胞のトランスポゾン保護因子である、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂを含む。ある特定の実施形態では、薬剤は、ＤＮＡメチル化ヒストンマークまたは抑制性ヒストンマークを介する、遺伝子座特異的エピジェネティックサイレンシングをもたらす。
【００５７】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化を増大させる薬剤は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）および／またはヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）および／またはメチル−ＣｐＧ−結合性タンパク質（ＭｅＣＰ２）および／またはＰＨＤおよびＲＩＮＧフィンガードメイン１タンパク質（ＵＨＲＦ１）を含む。
【００５８】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化を増大させる薬剤は、レスベラトロール、ラパマイシン、またはこれらの組合せを含む。
【００５９】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化を増大させる薬剤は、目的の標的配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ））核酸（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、SanderおよびJoung、Nat  Biotechnol、２０１４年４月、３２巻（４号）：３４７〜５５頁により記載されている）を含む。ある特定の実施形態では、薬剤は、クロマチン修飾因子、例えば、ＤＮＭＴおよび／またはＨＭＴタンパク質へと融合させたＣＲＩＳＰＲを含む。ある特定の実施形態では、薬剤は、ＤＮＡメチル化ヒストンマークまたは抑制性ヒストンマークを介する、遺伝子座特異的エピジェネティックサイレンシングをもたらす。
【００６０】
ある特定の実施形態では、本開示は、細胞の分子年齢を決定するための方法であって、１または複数のＬｉｎｅ１（Ｌ１）、ＬＴＲ、および／またはＥＲＶ反復エレメントの発現レベルの、１または複数のＡＬＵ反復エレメントの発現レベルに対する比を決定するステップを含み、１を超える比が、細胞が老化または老齢の分子状態を有することを示す、方法を提供する。
【００６１】
本明細書で開示される対象物は、細胞における年齢を誘導する（inducing  age  in  a  cell）ためのキットであって、老化細胞が、１種または複数種の時系列マーカーを発現させる、キットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、（ａ）核酸メチル化の１種または複数種の阻害剤と、（ｂ）細胞が、老化細胞の１種または複数種の時系列マーカーを発現させるように、細胞における年齢を誘導するための指示であって、前記細胞を、核酸メチル化の前記１種または複数種の阻害剤と接触させることを含む指示とを含む。
【００６２】
さらに、本明細書で開示される対象物は、細胞における年齢を低減するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、（ａ）核酸メチル化を誘導するか、または増大させる、１種または複数種の薬剤と、（ｂ）細胞による、老化細胞の１種または複数種の時系列マーカーの発現が、低減されるように、細胞における年齢を低減するための指示であって、前記細胞を、核酸メチル化を誘導するか、または増大させる、前記１種または複数種の薬剤と接触させることを含む指示とを含む。
【００６３】
前出では、後続の詳細な記載をよりよく理解することができるように、本開示の特色および技術的利点を、広範に概括した。本明細書の以下では、本開示の特許請求の範囲の対象を形成する、本開示のさらなる特色および利点について記載する。当業者は、開示される概念および具体的な実施形態を、本開示の同じ目的を実現するために、他の構造を改変または設計するための基礎として、たやすく活用しうることを理解されたい。当業者はまた、このような均等な構成が、付属の特許請求の範囲で明示される、本出願の精神および範囲から逸脱しないことも認識されたい。本出願に特徴的であると考えられる新規の特色であって、その組織化および実施法の両方に関する新規の特色は、さらなる目的および利点と併せて、以下の記載からよりよく理解されよう。
４．図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１−１】図１Ａ〜Ｂは、年齢に伴う、ＤＮＡメチル化および抑制性ヒストンマークの減少を示す図である。Ａ）若齢線維芽細胞、老齢線維芽細胞、およびｉＰＳＣ由来の線維芽細胞によるＥＲＲＢＳの結果により、解析された全てのゲノム領域内の、ＤＮＡメチル化の、既に記載されている１レベルと同等なレベルへの低下を示す図である。ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞における比率は、再上昇している。若齢および老齢のバーは、４例のドナーの平均およびＳＥＭについて描示する。１例の若齢ドナーおよび１例の老齢ドナーに由来するｉＰＳＣ線維芽細胞における、予備的な比率が示される。Ｂ）若齢および老齢の初代線維芽細胞に由来する、総Ｈ３Ｋ９ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３についての、ウェスタンブロットによる定量を示す図である。バーは、４例のドナーの平均およびＳＴＤを示す（ｎ＝２）。
【図１−２】図１Ａ〜Ｂは、年齢に伴う、ＤＮＡメチル化および抑制性ヒストンマークの減少を示す図である。Ａ）若齢線維芽細胞、老齢線維芽細胞、およびｉＰＳＣ由来の線維芽細胞によるＥＲＲＢＳの結果により、解析された全てのゲノム領域内の、ＤＮＡメチル化の、既に記載されている１レベルと同等なレベルへの低下を示す図である。ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞における比率は、再上昇している。若齢および老齢のバーは、４例のドナーの平均およびＳＥＭについて描示する。１例の若齢ドナーおよび１例の老齢ドナーに由来するｉＰＳＣ線維芽細胞における、予備的な比率が示される。Ｂ）若齢および老齢の初代線維芽細胞に由来する、総Ｈ３Ｋ９ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３についての、ウェスタンブロットによる定量を示す図である。バーは、４例のドナーの平均およびＳＴＤを示す（ｎ＝２）。
【００６５】
【図２】図２Ａ〜Ｃは、ｉＰＳＣの発生および検証を示す図である。画像は、１例の若齢ドナーおよび１例の老齢ドナーに由来する代表的なクローンについて描示する。Ａ）多能性マーカーである、ＯＣＴ４（緑）およびＮａｎｏｇ（赤）についての免疫蛍光を示す図である。Ｂ）ｉＰＳＣクローンについての核型解析を示す図である。Ｃ）ＤＮＡフィンガープリンティングを介する細胞系認証（ＳＴＲプロファイリング）を示す図である。
【００６６】
【図３−１】図３Ａ〜Ｃは、健常老化および早期老化の基礎をなす、顕著に異なる転写プロファイルを示す図である。Ａ）若齢、老齢、およびＨＧＰＳドナーの初代線維芽細胞による、ＲＮＡ−Ｓｅｑデータの階層的クラスター化により、早老症試料の、若齢健常細胞および老齢健常細胞の両方からの分離を示す図である。Ｂ）健常老化（老齢と対比した若齢）および早期老化（ＨＧＰＳと対比した若齢）における差次的に発現した遺伝子についてのベン図により、正常老化と早老症との間の重複が限定的であることを示す図である。Ｃ）正常老化（老齢と対比した若齢）および早老症（ＨＧＰＳと対比した若齢）における、差次的に富化されたＧＯカテゴリーを示す図である。出典：DAVID  http://david.abcc.ncifcrf.gov/。
【図３−２】図３Ａ〜Ｃは、健常老化および早期老化の基礎をなす、顕著に異なる転写プロファイルを示す図である。Ａ）若齢、老齢、およびＨＧＰＳドナーの初代線維芽細胞による、ＲＮＡ−Ｓｅｑデータの階層的クラスター化により、早老症試料の、若齢健常細胞および老齢健常細胞の両方からの分離を示す図である。Ｂ）健常老化（老齢と対比した若齢）および早期老化（ＨＧＰＳと対比した若齢）における差次的に発現した遺伝子についてのベン図により、正常老化と早老症との間の重複が限定的であることを示す図である。Ｃ）正常老化（老齢と対比した若齢）および早老症（ＨＧＰＳと対比した若齢）における、差次的に富化されたＧＯカテゴリーを示す図である。出典：DAVID  http://david.abcc.ncifcrf.gov/。
【００６７】
【図４−１】図４Ａ〜Ｂは、Ａ）ＲＴ−ｑＰＣＲによりにより検出される、若齢および老齢ドナーの初代線維芽細胞における、ＬＩＮＥ１エレメントおよびＭＩＲエレメントの発現を示す図である。老齢試料中では、若齢試料中と対比して、解析される反復エレメントの発現の増大が検出された。Ｂ）ＲＮＡ−Ｓｅｑにより検出される、年齢の異なるドナー群に由来する初代線維芽細胞における、ＰＩＷＩＬ２およびＡＰＯＢＥＣ３Ｂの発現により、体細胞における、ＰＩＷＩタンパク質の最小限の発現が確認される。さらに、データは、体細胞のトランスポゾン保護因子である、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂのレベルの、年齢に伴う漸次低下（若齢＞中年齢＞老齢）を指し示す。
【図４−２】図４Ａ〜Ｂは、Ａ）ＲＴ−ｑＰＣＲによりにより検出される、若齢および老齢ドナーの初代線維芽細胞における、ＬＩＮＥ１エレメントおよびＭＩＲエレメントの発現を示す図である。老齢試料中では、若齢試料中と対比して、解析される反復エレメントの発現の増大が検出された。Ｂ）ＲＮＡ−Ｓｅｑにより検出される、年齢の異なるドナー群に由来する初代線維芽細胞における、ＰＩＷＩＬ２およびＡＰＯＢＥＣ３Ｂの発現により、体細胞における、ＰＩＷＩタンパク質の最小限の発現が確認される。さらに、データは、体細胞のトランスポゾン保護因子である、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂのレベルの、年齢に伴う漸次低下（若齢＞中年齢＞老齢）を指し示す。
【００６８】
【図５−１】図５Ａ〜Ｄは、ゲノムワイドのＤＮＡメチル化のレベルが、年齢と共に低下することを示す図である。Ａ〜Ｄ）１０〜９６歳の個体に由来する初代線維芽細胞について、強化型減少表示バイサルファイトシークエンシング（Enhanced  Reduced  Representation  Bisulphite  Sequencing）（ＥＲＲＢＳ）により測定される、包括的なＤＮＡｍレベルを示す図である。Ｅ）４例の若齢個体（１０〜１１歳）および４例の老齢個体（７１〜９６歳）に由来する初代線維芽細胞における、包括的なＤＮＡｍのレベルについての蛍光測定を示す図である。
【図５−２】図５Ａ〜Ｄは、ゲノムワイドのＤＮＡメチル化のレベルが、年齢と共に低下することを示す図である。Ａ〜Ｄ）１０〜９６歳の個体に由来する初代線維芽細胞について、強化型減少表示バイサルファイトシークエンシング（Enhanced  Reduced  Representation  Bisulphite  Sequencing）（ＥＲＲＢＳ）により測定される、包括的なＤＮＡｍレベルを示す図である。Ｅ）４例の若齢個体（１０〜１１歳）および４例の老齢個体（７１〜９６歳）に由来する初代線維芽細胞における、包括的なＤＮＡｍのレベルについての蛍光測定を示す図である。
【図５−３】図５Ａ〜Ｄは、ゲノムワイドのＤＮＡメチル化のレベルが、年齢と共に低下することを示す図である。Ａ〜Ｄ）１０〜９６歳の個体に由来する初代線維芽細胞について、強化型減少表示バイサルファイトシークエンシング（Enhanced  Reduced  Representation  Bisulphite  Sequencing）（ＥＲＲＢＳ）により測定される、包括的なＤＮＡｍレベルを示す図である。Ｅ）４例の若齢個体（１０〜１１歳）および４例の老齢個体（７１〜９６歳）に由来する初代線維芽細胞における、包括的なＤＮＡｍのレベルについての蛍光測定を示す図である。
【００６９】
【図６】図６Ａ〜Ｂは、エピジェネティックサイレンシングマーカーおよびコアヒストンの包括的なレベルが、年齢と共に低下することを示す図である。Ａ）若齢個体（１０〜１１歳）および老齢個体（７１〜９６歳）に由来する初代線維芽細胞における、主要なエピジェネティックサイレンシングマーカーである、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３のほか、総ヒストンＨ３の、包括的な発現レベルを示すウェスタンブロットである。Ｂ）（Ａ）からのウェスタンブロットバンドについての、光学密度計測による定量から、γ−チューブリンに対して正規化された、若齢細胞内と対比した老齢細胞内の、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３（＊＊ｐ＝０．００６７）およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３（＊＊ｐ＝０．００１５）の発現の有意な減少を示す図である。グラフは、３回の独立実験からの結果を表す。
【００７０】
【図７】図７は、ＤＮＡメチル化の年齢依存的喪失が、反復エレメントおよび転移ゲノムエレメントで顕著であることを示す図である。ゲノムＤＮＡメチル化の大部分は、転移エレメントなど、非コードの反復領域に集中している。したがって、ＤＮＡメチル化の年齢依存的減少は、反復エレメントに優先的に影響を及ぼす。若齢および老齢の線維芽細胞内のＤＮＡメチル化率についてのＥＲＲＢＳ測定は、若齢細胞と比較して、老齢細胞において、反復エレメントの７５％が、低メチル化状態にあることを示す。
【００７１】
【図８】図８は、反復エレメントの、年齢依存的な転写調節異常を示す図である。反復領域におけるＤＮＡメチル化の喪失は、これらの遺伝子座の転写抑制解除をもたらすことが予測される。したがって、若齢および老齢の線維芽細胞における総ＲＮＡ−Ｓｅｑ解析は、反復転写物の、年齢依存的な差次的発現を明らかにし、この場合、ＬＩＮＥ１エレメントは、優先的に上方調節され、ＡＬＵエレメントは、下方調節されると考えられる。
【００７２】
【図９−１】図９は、反復エレメントの、年齢に関連する転写変化は、リピートのクラスおよび転写物の存在度に依存することを示す図である。若齢細胞と老齢細胞との間の、反復転写物の差次的発現は、年齢依存的な転写の、下方調節と対比した上方調節の、ランダムでない分布を明らかにする。老齢個体に由来する細胞では、ＬＩＮＥ１（Ｌ１）、ＬＴＲエレメント、および内因性レトロウイルス（ＥＲＶ）に主に由来する低存在度エレメント（３０〜１０００ＦＰＫＭ）が優先的に上方調節されるのに対し、大半がＡＬＵエレメントに由来する高存在度転写物（１０，０００〜１００，０００ＦＰＫＭ）は、下方調節されると考えられる。
【図９−２】図９は、反復エレメントの、年齢に関連する転写変化は、リピートのクラスおよび転写物の存在度に依存することを示す図である。若齢細胞と老齢細胞との間の、反復転写物の差次的発現は、年齢依存的な転写の、下方調節と対比した上方調節の、ランダムでない分布を明らかにする。老齢個体に由来する細胞では、ＬＩＮＥ１（Ｌ１）、ＬＴＲエレメント、および内因性レトロウイルス（ＥＲＶ）に主に由来する低存在度エレメント（３０〜１０００ＦＰＫＭ）が優先的に上方調節されるのに対し、大半がＡＬＵエレメントに由来する高存在度転写物（１０，０００〜１００，０００ＦＰＫＭ）は、下方調節されると考えられる。
【図９−３】図９は、反復エレメントの、年齢に関連する転写変化は、リピートのクラスおよび転写物の存在度に依存することを示す図である。若齢細胞と老齢細胞との間の、反復転写物の差次的発現は、年齢依存的な転写の、下方調節と対比した上方調節の、ランダムでない分布を明らかにする。老齢個体に由来する細胞では、ＬＩＮＥ１（Ｌ１）、ＬＴＲエレメント、および内因性レトロウイルス（ＥＲＶ）に主に由来する低存在度エレメント（３０〜１０００ＦＰＫＭ）が優先的に上方調節されるのに対し、大半がＡＬＵエレメントに由来する高存在度転写物（１０，０００〜１００，０００ＦＰＫＭ）は、下方調節されると考えられる。
【００７３】
【図１０】図１０は、若齢および老齢の線維芽細胞を処理するのに使用される、６つの化合物全てについての毒性アッセイの結果であって、実施例１３により記載される結果を示す図である。青色／黒色の曲線は、３日目の試験を指し示し；赤色／グレーの曲線は、７日目の試験を指し示す。青色のボックスは、かつての実験で一般に使用された範囲を指し示し；赤色のボックスは、実施例１３で使用された範囲を指し示す。毒性試験により、７日目において、化合物が、３日目と同様な毒性レベルを有することが指し示されたことから、１０日目において見られる完全な毒性効果は、７〜１０日目の間に生じることが指し示される。
【００７４】
【図１１−１】図１１は、若齢（３４８）および老齢（２０４）線維芽細胞の、レスベラトロールおよびラパマイシンを伴う、３日間にわたる培養の、ヒストンタンパク質Ｈ１、ヘテロクロマチンマーカーＨＰ１α、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、核形態マーカーラミンＢ１（若い細胞年齢のマーカー）、およびｙＨ２Ａｘ（老いた細胞年齢のマーカー）の発現レベルに対する効果を示す図である。ＵＴとは、非処理を指し、Ｃ３、Ｃ２、およびＣ１とは、漸増濃度の薬物化合物（Ｃ３を最低とする）である。グラフは、２連のウェルからのデータであり、非処理強度に対して正規化されている。レスベラトロールは、全てのマーカーのレベルを増大させた。
【図１１−２】図１１は、若齢（３４８）および老齢（２０４）線維芽細胞の、レスベラトロールおよびラパマイシンを伴う、３日間にわたる培養の、ヒストンタンパク質Ｈ１、ヘテロクロマチンマーカーＨＰ１α、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、核形態マーカーラミンＢ１（若い細胞年齢のマーカー）、およびｙＨ２Ａｘ（老いた細胞年齢のマーカー）の発現レベルに対する効果を示す図である。ＵＴとは、非処理を指し、Ｃ３、Ｃ２、およびＣ１とは、漸増濃度の薬物化合物（Ｃ３を最低とする）である。グラフは、２連のウェルからのデータであり、非処理強度に対して正規化されている。レスベラトロールは、全てのマーカーのレベルを増大させた。
【図１１−３】図１１は、若齢（３４８）および老齢（２０４）線維芽細胞の、レスベラトロールおよびラパマイシンを伴う、３日間にわたる培養の、ヒストンタンパク質Ｈ１、ヘテロクロマチンマーカーＨＰ１α、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、核形態マーカーラミンＢ１（若い細胞年齢のマーカー）、およびｙＨ２Ａｘ（老いた細胞年齢のマーカー）の発現レベルに対する効果を示す図である。ＵＴとは、非処理を指し、Ｃ３、Ｃ２、およびＣ１とは、漸増濃度の薬物化合物（Ｃ３を最低とする）である。グラフは、２連のウェルからのデータであり、非処理強度に対して正規化されている。レスベラトロールは、全てのマーカーのレベルを増大させた。
【００７５】
【図１２】図１２Ａ〜Ｃは、若齢および老齢の個体に由来する初代線維芽細胞であって、実施例１３により記載される通り、非処理対照（Ｃｏｎ）であるか、または６．２５μＭ（低）、１２．５μＭ（中）、および２５μＭ（高）のレスベラトロール（ChenおよびGuarente、Trends  Mol  Med、２００７年）で、３日間にわたり処理された初代線維芽細胞を示す図である。ＳＷ１５５２４６による処理（図１４を参照されたい）とは対照的に、レスベラトロールによる処理は、（Ａ）ＨＰ１αおよび（Ｂ）Ｈ１のレベルを増大させ、（Ｃ）γＨ２ＡＸのレベルを低下させることにより、細胞年齢のマーカーを有意に逆転させる。
【００７６】
【図１３−１】図１３は、若齢（３４８）および老齢（２０４）線維芽細胞の、デシタビン、ゼブラリン、ＳＷ１５５２４６、およびケトシンを伴う、３日間にわたる培養の、ヒストンタンパク質Ｈ１、ヘテロクロマチンマーカーＨＰ１α、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、核形態マーカーラミンＢ１（若い細胞年齢のマーカー）、およびｙＨ２Ａｘ（老いた細胞年齢のマーカー）の発現レベルに対する効果を示す図である。ＵＴとは、非処理を指し、Ｃ３、Ｃ２、およびＣ１とは、漸増濃度の薬物化合物（Ｃ３を最低とする）である。高レベルのγＨ２Ａｘは、起こり得る毒性を指し示す。
【図１３−２】図１３は、若齢（３４８）および老齢（２０４）線維芽細胞の、デシタビン、ゼブラリン、ＳＷ１５５２４６、およびケトシンを伴う、３日間にわたる培養の、ヒストンタンパク質Ｈ１、ヘテロクロマチンマーカーＨＰ１α、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、核形態マーカーラミンＢ１（若い細胞年齢のマーカー）、およびｙＨ２Ａｘ（老いた細胞年齢のマーカー）の発現レベルに対する効果を示す図である。ＵＴとは、非処理を指し、Ｃ３、Ｃ２、およびＣ１とは、漸増濃度の薬物化合物（Ｃ３を最低とする）である。高レベルのγＨ２Ａｘは、起こり得る毒性を指し示す。
【図１３−３】図１３は、若齢（３４８）および老齢（２０４）線維芽細胞の、デシタビン、ゼブラリン、ＳＷ１５５２４６、およびケトシンを伴う、３日間にわたる培養の、ヒストンタンパク質Ｈ１、ヘテロクロマチンマーカーＨＰ１α、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、核形態マーカーラミンＢ１（若い細胞年齢のマーカー）、およびｙＨ２Ａｘ（老いた細胞年齢のマーカー）の発現レベルに対する効果を示す図である。ＵＴとは、非処理を指し、Ｃ３、Ｃ２、およびＣ１とは、漸増濃度の薬物化合物（Ｃ３を最低とする）である。高レベルのγＨ２Ａｘは、起こり得る毒性を指し示す。
【図１３−４】図１３は、若齢（３４８）および老齢（２０４）線維芽細胞の、デシタビン、ゼブラリン、ＳＷ１５５２４６、およびケトシンを伴う、３日間にわたる培養の、ヒストンタンパク質Ｈ１、ヘテロクロマチンマーカーＨＰ１α、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、核形態マーカーラミンＢ１（若い細胞年齢のマーカー）、およびｙＨ２Ａｘ（老いた細胞年齢のマーカー）の発現レベルに対する効果を示す図である。ＵＴとは、非処理を指し、Ｃ３、Ｃ２、およびＣ１とは、漸増濃度の薬物化合物（Ｃ３を最低とする）である。高レベルのγＨ２Ａｘは、起こり得る毒性を指し示す。
【図１３−５】図１３は、若齢（３４８）および老齢（２０４）線維芽細胞の、デシタビン、ゼブラリン、ＳＷ１５５２４６、およびケトシンを伴う、３日間にわたる培養の、ヒストンタンパク質Ｈ１、ヘテロクロマチンマーカーＨＰ１α、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、核形態マーカーラミンＢ１（若い細胞年齢のマーカー）、およびｙＨ２Ａｘ（老いた細胞年齢のマーカー）の発現レベルに対する効果を示す図である。ＵＴとは、非処理を指し、Ｃ３、Ｃ２、およびＣ１とは、漸増濃度の薬物化合物（Ｃ３を最低とする）である。高レベルのγＨ２Ａｘは、起こり得る毒性を指し示す。
【図１３−６】図１３は、若齢（３４８）および老齢（２０４）線維芽細胞の、デシタビン、ゼブラリン、ＳＷ１５５２４６、およびケトシンを伴う、３日間にわたる培養の、ヒストンタンパク質Ｈ１、ヘテロクロマチンマーカーＨＰ１α、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、核形態マーカーラミンＢ１（若い細胞年齢のマーカー）、およびｙＨ２Ａｘ（老いた細胞年齢のマーカー）の発現レベルに対する効果を示す図である。ＵＴとは、非処理を指し、Ｃ３、Ｃ２、およびＣ１とは、漸増濃度の薬物化合物（Ｃ３を最低とする）である。高レベルのγＨ２Ａｘは、起こり得る毒性を指し示す。
【００７７】
【図１４】図１４Ａ〜Ｄは、若齢および老齢の個体に由来する初代線維芽細胞であって、実施例１３により記載される通り、非処理対照（Ｃｏｎ）であるか、または０．８μＭ（低）、１．６μＭ（中）、および３．２μＭ（高）の、選択的ＤＮＭＴ１阻害剤であるＳＷ１５５２４６（Kilgoreら、JBC、２０１３年）で、３日間にわたり処理された初代線維芽細胞を示す図である。その後、ゲノムの老化マーカーである、ＨＰ１α、Ｈ１、およびγＨ２ＡＸを、免疫蛍光により定量した。高レベルのＨＰ１αおよびＨ１が、クロマチン凝縮の指標であり、したがって、より若い状態の指標であるのに対し、γＨ２ＡＸは、ＤＮＡ損傷部位をマークし、年齢と共に増大する。ＳＷ１５５２４６による処理は、（Ａ）ＨＰ１αおよび（Ｂ、Ｄ）Ｈ１のレベルを低下させ、（Ｃ）γＨ２ＡＸのレベルを増大させることにより、細胞年齢のマーカーを有意に誘導する。
【００７８】
【図１５−１】図１５は、若齢（３４８）および老齢（２０４）線維芽細胞の、デシタビン、ゼブラリン、ＳＷ１５５２４６、ケトシン、レスベラトロールまたはラパマイシンを伴う、１０日間にわたる培養の、細胞数カウントにより測定される、細胞の生存に対する効果を示す図である。細胞数は、８つのウェルの平均として計算する。
【図１５−２】図１５は、若齢（３４８）および老齢（２０４）線維芽細胞の、デシタビン、ゼブラリン、ＳＷ１５５２４６、ケトシン、レスベラトロールまたはラパマイシンを伴う、１０日間にわたる培養の、細胞数カウントにより測定される、細胞の生存に対する効果を示す図である。細胞数は、８つのウェルの平均として計算する。
【００７９】
【図１６】図１６Ａ〜Ｄは、若齢（３４８）および老齢（２０４）線維芽細胞の、デシタビン、ゼブラリン、ＳＷ１５５２４６、またはケトシンを伴う、３日間にわたる培養の、包括的なＤＮＡの５−ｍＣメチル化のレベルに対する効果を示す図である。（Ａ）選択的ＤＮＭＴ１阻害剤であるＳＷ１５５２４６で処理したところ、５−ｍＣのレベルは、処理により一貫して低下しなかった。（Ｂ）ＳＵＶ３／９阻害剤であるケトシンは、５−ｍＣのメチル化のレベルを増大させた。（Ｃ、Ｄ）いずれも、ＤＮＭＴ１／３ａおよびｂの阻害剤である、デシタビンおよびゼブラリンは、包括的な５−ｍＣのメチル化のレベルを低下させた。
【００８０】
【図１７】図１７は、ｉＰＳＣを、中脳ドーパミンニューロン（ｍＤＡ）へと分化させるのに使用される細胞培養プロトコールについての記載を示す図である。ｉＰＳＣを、Kriksら、Nature、２０１１年１１月６日、４８０巻（７３７８号）：５４７〜５１頁；およびMillerら、Cell  Stem  Cell、２０１３年１２月５日、１３巻（６号）：６９１〜７０５頁に従い培養したが、ここでは、細胞を、ｍＤＡへと分化させる前に、ｉＰＳＣを、１２〜２４時間にわたり（培養−０〜−２日目）培養することによって、プロトコールを改変し、さらに、ｉＰＳＣをｍＤＡへと分化させる０〜２日目において、ｗｉｎｇｌｅｓｓ（Ｗｎｔ）シグナル伝達阻害剤であるＸＡＶ９３９を、細胞培養物へと添加した。ｍＤＡ細胞を、培養の１３および／または１５ならびに３０日目において、継代に供したが、この場合、３０日目の継代では、細胞を濾過し、低密度で播種した。１１日目から、ＤＡＰＴ（Ｎ−［（３，５−ジフルオロフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニル−２−フェニル］グリシン−１，１−ジメチルエチルエステル）を、培養物へと添加し、３２日目に、細胞を、マイトマイシンＣで、１時間にわたり処理した。
【００８１】
【図１８】図１８は、ミトコンドリアストレス因子（mitichondrial  stressor）であるロテノンおよびカルボニルシアニド（carbonilcyanide）ｐ−トリフルオロメトキシ（triflouromethoxy）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）の、６５および３０日間にわたる培養の後における、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡによる酸素消費に対する効果を示す図である。未分化ｉＰＳＣ（培養の０日目）を、対照として使用した。６５日間にわたり培養されたｍＤＡは、ストレス状態下で、３０日間にわたり培養されたｍＤＡおよび未分化ｉＰＳＣ対照と比較して、より大きな酸素消費を呈示した。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
５．詳細な記載
本開示は、細胞のゲノムメチル化のレベルを低減することにより、細胞の成熟を加速させるための方法、およびこのような方法により産生させる細胞、およびこのような細胞を含む組成物に関する。本明細書で記載される方法に従い産生させる細胞は、パーキンソン病などの疾患を処置するための細胞療法のために、ならびに障害および／または疾患、特に、遅発性障害および／または疾患をモデル化するための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞ベースの系に使用することができる。より具体的には、本明細書では、初代細胞（下記で定義される）の場合もあり、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞、またはヒト被験体もしくは動物被験体から回収された幹細胞など、未分化の（幹）細胞に由来する場合もある、体細胞およびこのような細胞を産生するための方法が提供される。体細胞は、細胞年齢、成熟、および／または疾患に特徴的な１つまたは複数のマーカーであって、１もしくは複数の細胞内マーカーもしくは形態マーカーを検出することにより確認することもでき、かつ／または細胞内の経時的マーカーシグネチャーを構成する１もしくは複数のマーカーを含む、１もしくは複数の細胞内マーカーの非存在を検出することにより確認することもできる、１つまたは複数のマーカーを呈示する。ある特定の実施形態では、細胞、例えば、ｉＰＳＣ内のゲノム核酸メチル化のレベルを低減する方法は、所望の細胞型への分化の前に実施することもでき、この後で実施することもできる。
開示の明確さを目的とするものであり、限定を目的とするものではないが、詳細な記載を、以下の小節：
５．１．定義；
５．２．老化を誘導するための方法；
５．３．パーキンソン病のモデル化；
５．４．処置法；
５．５  治療用化合物をスクリーニングする方法；
５．６．分子年齢を決定する方法；
５．７  老化を低減するための方法；および
５．８．キット
に分ける。
【００８３】
５．１  定義
本明細書で使用される用語は一般に、当技術分野で、本発明の文脈内で、かつ、各用語が使用される具体的な文脈でそれらの通常の意味を有する。ある特定の用語については、当業者にさらなる指針を与えるように、本発明の組成物および方法、ならびにそれらをどのようにして作製し、使用するのかについて記載しながら、下記で、または本明細書の別の個所で論じる。
【００８４】
「約」または「およそ」という用語は、当業者により決定される、特定の値についての、許容可能な誤差範囲内であって、部分的に、値が測定または決定される方法、すなわち、測定系の限界に依存する誤差範囲内を意味する。例えば、「約」は、当技術分野における慣行に従い、３標準偏差内または３標準偏差超を意味しうる。代替的に、「約」は、所与の値の、最大で２０％、例えば、最大で１０％、最大で５％、または最大で１％の範囲を意味しうる。代替的に、特に、生物学的系または生物学的過程に関して、その用語は、値の桁数内、例えば、５倍以内、または２倍以内を意味しうる。
【００８５】
本明細書で記載される「個体」または「被験体」または「患者」とは、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、哺乳動物などの脊椎動物である。哺乳動物は、ヒト、霊長動物、農場動物、競技動物、齧歯動物、および愛玩動物を含むがこれらに限定されない。非ヒト動物被験体の非限定的な例は、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットなどの齧歯動物；ウサギ；イヌ；ネコ；ヒツジ；ブタ；ヤギ；ウシ；ウマ；ならびに類人猿およびサルなどの非ヒト霊長動物を含む。
【００８６】
本明細書で使用される「疾患」という用語は、細胞、組織、または器官の正常な機能を損なうか、またはこれに干渉する、任意の状態または障害を指す。
【００８７】
本明細書で使用される「〜を処置すること」または「処置」という用語は、処置される個体または細胞の疾患経過を変更しようとする試みにおける臨床介入を指し、予防のために実施することもでき、臨床病態の経過中に実施することもできる。処置の治療効果は、限定せずに述べると、疾患の発病または再発の防止、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的帰結の縮減、転移の防止、疾患進行速度の低減、疾患状態の改善または軽減、および寛解または予後の改善を含む。疾患または障害の進行を防止することにより、処置は、罹患被験体もしくは診断を受けた被験体、または障害を有することが疑われる被験体における障害に起因する増悪を防止しうるが、処置はまた、障害に対する危険性があるか、または障害を有することが疑われる被験体における、障害または障害の症状の発症も防止しうる。
【００８８】
個体に言及して本明細書で使用される「若齢」という用語は、早期の時系列年齢を指し、これは、ヒトでは、数年間にわたる年齢を指す。細胞に言及する場合の「若齢」という用語は、若齢ドナーから単離された細胞のマーカーシグネチャー（例えば、表１により記載されたマーカーであるがこれらに限定されない）を提示する細胞、例えば、ｉＰＳＣ由来の若齢体細胞、すなわち、ｉＰＳＣをもたらした元の初代細胞のドナーの年齢に関わらず、若齢ドナーから単離された細胞のマーカーシグネチャーを提示する細胞など、未成熟細胞などの細胞状態を指す。これは、ｉＰＳＣ由来の「老齢」体細胞、または、実際のところ、老齢ドナーから単離された細胞のマーカーシグネチャーを提示する任意の体細胞と対照される。ｉＰＳＣ由来の老齢体細胞の例は、再プログラム化の後で、ｉＰＳＣ由来体細胞内のゲノム核酸メチル化のレベルを低減する場合に産生する体細胞である（ここでもまた、ｉＰＳＣをもたらした初代細胞のドナーの年齢に関わらない）。若齢細胞はまた、「初代若齢線維芽細胞」における通り、時系列年齢が若いドナーに由来する初代若齢細胞など、「若齢細胞」の集団も指す場合がある。
【００８９】
個体に言及して本明細書で使用される「老齢」という用語は、ヒトでは、数年間にわたる年齢を指す、時系列年齢を指す。細胞に言及する場合の「老齢」という用語は、老齢ドナーから単離された細胞のマーカーシグネチャー（例えば、表１〜３により記載されたマーカーであるがこれらに限定されない）を提示する細胞、例えば、細胞が、老化細胞と関連する１種もしくは複数種の時系列マーカーを発現する細胞状態、または老齢ドナーに由来する初代体細胞を指す。老齢細胞はまた、「初代老齢線維芽細胞」における通り、時系列年齢が老いたドナーに由来する初代老齢細胞など、「老齢細胞」の集団も指す場合がある。
【００９０】
幹細胞由来の体細胞に関して、ゲノム核酸メチル化のレベルを低減する効果は、限定せずに述べると（細胞の種類に応じて）、核形態および核組織化タンパク質の発現に影響を及ぼす、年齢関連の表現型のほか、ヘテロクロマチン、ＤＮＡ損傷、および反応性酸素分子種のマーカーの誘導、樹状突起の変性、年齢関連神経メラニンの形成、ＡＫＴの調節異常、ＴＨ陽性ニューロンの数の選択的低減、ならびにミトコンドリアの腫脹および封入体の超微細構造的証拠を含む。
【００９１】
本明細書で使用される「ドナー個体」または「ドナー」という用語は、初代細胞培養物をもたらすように細胞をそこから得た、任意の生物、ヒトまたは非ヒトを指す。ドナー個体は、任意の年齢であることが可能であり、罹患していない場合もあり、罹患している場合もある。ドナーは、生検、皮膚生検、血液細胞などを含む生物学的試料を提供することにより、本方法における使用のための細胞を提供しうる。
【００９２】
本明細書で使用される「疾患」という用語は、生存する動物体もしくは植物体またはその部分のうちの１つの正常状態に対する任意の機能障害であって、死活的機能の性能を中断または改変する機能障害を指す。徴候および症状を識別することにより顕在化することが典型的であるが、疾患は通例、ｉ）環境因子（栄養不良、工業災害、または気候など）；ｉｉ）特殊な感染性作用物質（蠕虫、細菌、またはウイルスなど）；ｉｉｉ）生物の遺伝性欠損または後天性欠損（遺伝的異常またはエピジェネティック異常など）；および／またはｉｖ）これらの因子の組合せに対する応答である。
【００９３】
本明細書で使用される「遅発性疾患」という用語は、中間齢患者および老齢患者における臨床的状態として顕在化する、患者の疾患または医学的状態を指す。したがって、遅発性疾患は、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、ハンチントン病など、神経変性疾患などの変性疾患、および心肥大、心臓線維症、ＩＩ型糖尿病、加齢黄斑変性を含む他の細胞系統の疾患、例えば、乳がん、結腸がん、および卵巣がん、家族性腺腫様ポリープ（ＦＡＰ）、心疾患などを含むがんを含みうるがこれらに限定されない。参照により組み込まれる、Ｗｒｉｇｈｔら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ、１９巻：９７〜１０６頁（２００３年）を参照されたい。
【００９４】
本明細書で使用される「細胞培養物」という用語は、研究または医療処置のための人工培地中の任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞の培養物を指す。この用語には、連続細胞系（例えば、不死表現型を伴う）、初代細胞培養物、有限細胞系（例えば、非形質転換細胞）、ならびに卵母細胞および胚を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持される他の任意の細胞集団が含まれる。
【００９５】
本明細書で使用される「培養培地」という用語は、ペトリプレート、マルチウェルプレートなど、培養器内の細胞を覆う液体を指し、細胞に栄養補給し、これを扶養する栄養物を含有する。培養培地はまた、細胞における所望の変化をもたらすように添加される増殖因子も含みうる。
【００９６】
本明細書で使用される「欠損」という用語は、遺伝子のｍＲＮＡ、遺伝子のタンパク質産物、またはこれらの両方を発現させない（すなわち、このような発現を欠く）細胞、またはそれらを低減されたレベルで発現させる細胞を指す。
【００９７】
本明細書で使用される「ニューロン成熟培地」または「ＢＡＧＣＴ培地」という用語は、Ｎ２培地を含み、中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋  ドーパミン（ＤＡ）ニューロンを分化させるための、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、アスコルビン酸（ＡＡ）、グリア細胞系由来神経栄養因子、ジブチリルｃＡＭＰ、およびβ３型形質転換増殖因子をさらに含む培養培地を指す。
【００９８】
本明細書で使用される、「精製された」、「精製する」、「精製」、「単離された」、「単離する」、「単離」という用語、および本明細書で使用されるこれらの文法的同等物は、試料に由来する少なくとも１つの夾雑物の量の低減を指す。例えば、細胞型は、望ましくない細胞型の量の、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、および最も好ましくは少なくとも９０％の低減により精製される。したがって、細胞型の精製は、「濃縮」、すなわち、細胞培養物中の細胞型の量の増大を結果としてもたらす。
【００９９】
本明細書で使用される「分化剤」または「分化誘導性化合物」という用語は、幹細胞を、体細胞をもたらす細胞経路にコミットさせる特性を有する、生体分子の場合もあり、低分子の場合もあり、物質の混合物の場合もある物質を指す。例えば、このような誘導性化合物は、Ｗｎｔ活性化剤またはＳＭＡＤ阻害剤を含みうるがこれらに限定されない。
【０１００】
本明細書で使用される「ソニックヘッジホッグタンパク質またはＳＨＨ」という用語は、ヘッジホッグと呼ばれる哺乳動物のシグナル伝達経路ファミリー内の３つのタンパク質のうちの１つを指す。ＳＨＨは、四肢の指の成長および脳の組織化など、脊椎動物の器官形成の調節において役割を果たすと考えられている。したがって、ソニックヘッジホッグタンパク質は、拡散して、濃度勾配を形成し、その濃度に応じて、発生しつつある胚細胞に異なる影響を及ぼすモルフォゲンである。ＳＨＨはまた、成体幹細胞の細胞分裂も制御する可能性があり、一部のがんの発生に関与している。
【０１０１】
本明細書で使用される「Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｔｈｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ」または「ＳＭＡＤ」という用語は、細胞外シグナルを、形質転換増殖因子ベータのリガンドから、核へと伝達し、そこで、下流における遺伝子転写を活性化させる細胞内タンパク質であり、幹細胞の方向付けられた分化をモジュレートすることが可能なシグナル伝達分子のクラスのメンバーである。
【０１０２】
本明細書で使用される「〜を接触させること」という用語は、、例えば、細胞に触れ合わせることによって、細胞を、化合物または物質がその活性を細胞へと及ぼすことを可能とする様式で、かつ／またはそのような位置において、化合物または物質へと曝露することを指す。接触は、任意の適する方法を使用して達成することができ、細胞外の場合もあり、細胞内の場合もある。例えば、一実施形態では、接触は、化合物／物質を、それ自体として細胞内に導入することを介するか、または化合物もしくは物質を発現させるように、細胞を遺伝子改変することを介する。接触は、細胞を、分子または分子を含有するビヒクルへと曝露する方法、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、トランスフェクションにより細胞へと送達する方法を含む、様々な方法で達することができる。接触はまた、接触が、細胞外膜上で生じるように、化合物または物質を細胞培養物へと添加することにより達成することもできる。接触はまた、細胞における組換えタンパク質の産生により（例えば、プロジェリンまたはプロジェリン様タンパク質をコードするｍＲＮＡの過剰発現により）、所与の細胞において達成することもできる。
【０１０３】
本明細書で使用される「再プログラム化すること」、「再プログラム化された」という用語は、「初代細胞」または「初代分化細胞」または「初代体細胞」の、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞など、未分化細胞（すなわち、いまだに特別な細胞型に発生していない細胞）への転換を指す。例えば、初代細胞の体細胞培養物（例えば、ある特定の年齢のドナーから単離された初代線維芽細胞またはパーキンソン病（ＰＤ）などの疾患を有する患者から単離された初代線維芽細胞、例えば、ＰＤ線維芽細胞など）であって、細胞系を含む初代細胞の体細胞培養物を、人工多能性幹細胞へと再プログラム化することができる。次いで、さらに、初代体細胞培養物中に出現する年齢関連マーカーシグネチャーを、再プログラム化された未分化細胞において変化させる。場合によって、分化させた体細胞培養物中に出現する疾患マーカーシグネチャー（すなわち、例えば、ＰＤマーカーシグネチャー）は、転換された未分化細胞内に存在しない可能性もあるが、正確なシグネチャーは、異なる初代体細胞ドナーから産生されたｉＰＳ細胞の間で異なりうる。初代細胞は、ドナー、すなわち、生検、皮膚生検、採血など、細胞系など、任意の供給源から得ることができる。
【０１０４】
本明細書で使用される「分化させた」という用語は、細胞、例えば、特化していない胚性細胞であって、細胞が、心臓細胞、肝臓細胞、または筋肉細胞など、特化した細胞の特色を獲得する作用を受けた細胞を指す。分化は、通例、細胞表面に埋め込まれたタンパク質が関与する、シグナル伝達経路を介する、細胞の遺伝子の、細胞の外部の物理的および化学的条件との相互作用により制御される。ある特定の実施形態では、「分化させた」体細胞とは、その種類に特徴的なマーカーシグネチャーなど、よりコミットした細胞型の特徴を有する細胞を指す。ある特定の実施形態では、「分化させた」ｉＰＳＣ由来体細胞とは、ｉＰＳＣにおいて提示されていない、少なくとも１つのマーカーシグネチャー、例えば、特化した細胞のマーカーシグネチャーを有する細胞を指す。
【０１０５】
細胞に言及して本明細書で使用される「分化を誘導すること」という用語は、デフォルトの細胞型（遺伝子型および／または表現型）を非デフォルトの細胞型（遺伝子型および／または表現型）へと変化させることを指す。したがって、「幹細胞において分化を誘導すること」とは、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）が分裂して、遺伝子型（例えば、マイクロアレイなどの遺伝子解析により決定される、遺伝子発現の変化）および／または表現型（例えば、タンパク質の発現の変化）など、幹細胞と異なる特徴を伴う後代細胞になるように誘導することを指す。ある特定の実施形態では、「分化を誘導すること」とは、Ｗｎｔ阻害剤および／もしくは活性化因子、ソニックヘッジホッグタンパク質および／もしくは活性化因子、ならびに／またはＳＭＡＤ阻害剤分子を含むがこれらに限定されない分化剤として作用する化合物により惹起されるプロセスを指す。このような薬剤は、大部分が遺伝子的に制御された分化過程であって、未分化細胞（胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、初代幹細胞など）を、さらなる分化を許容する場合であれ、許容しない場合であれ、より顕著に異なる形態および機能を有する特化細胞の表現型である、コミットした体細胞表現型へと転換する分化過程を誘発または促進する。例えば、人工多能性幹細胞は、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞、または限定なしに述べると、特異的な種類のジャンクション、特異的な範囲の送電速度、特異的な種類の神経化学的産生および／または神経化学的分泌などを伴うニューロンを含む、ｉＰＳＣ由来ニューロンへと転換することができる。
【０１０６】
細胞または細胞集団に言及して本明細書で使用される「老化」という用語は、若齢マーカーシグネチャーの発現から、老齢マーカーシグネチャーの発現への進行中の任意の段階を指す。老化の１つの例は、分子マーカーおよび形態マーカーを特徴とする、細胞における天然の老化過程であって、ゲノムの不安定性、テロメアの短縮、タンパク質恒常性の喪失、ヘテロクロマチンの喪失、および遺伝子転写の変化、ミトコンドリアの機能不全、細胞の老化、および幹細胞の消耗など、老化細胞と関連する老化過程である。本明細書では、誘導性老化の例は、培養物中の若齢細胞の、ゲノム核酸のメチル化レベルを低減した後で示される。老化はまた、成体細胞の、さらなる分子特性、物理特性、および機能特性（時系列マーカーシグネチャーを含む）を発現させる成熟も包摂しうる。
【０１０７】
本明細書で使用される「細胞老化の加速」という用語は、ｉＰＳＣ由来体細胞における年齢関連マーカーシグネチャーであって、ｉＰＳＣ由来の「老化した」体細胞を生み出すように、分化だけにより生み出されるシグネチャーと比べて、異なる年齢を特徴付けるシグネチャーの確立を指す。例えば、この過程は、ｉＰＳＣ由来体細胞内のゲノム核酸メチル化のレベルの低減により、例えば、メチル化の阻害剤、例えば、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子、またはＤＮＡメチルトランスフェラーゼに結合する抗体など、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性の阻害剤の、細胞への導入により媒介することができる。本明細書で記載される通り、この過程は、再プログラム化された／分化させたｉＰＳＣ由来体細胞を、老化したｉＰＳＣ由来体細胞へと誘導する。
【０１０８】
本明細書で使用される「指向的分化（directed  differentiation）」という用語は、幹細胞培養条件の操作であって、ニューロン前駆物質など、特定の（例えば、所望の）細胞型への分化を誘導する操作を指す。幹細胞に言及して本明細書で使用される「指向的分化」という用語は、低分子、増殖因子タンパク質、および他の成長条件の使用であって、幹細胞の、多能性状態から、より成熟または特化した細胞運命（例えば、ニューロン前駆物質、ニューロンなど）への移行を促進する使用を指す。
【０１０９】
本明細書で使用される「経時的マーカーシグネチャー」という用語は、ドナー個体または細胞の具体的な年齢に特徴的な任意の細胞内構造であって、その状態を決定するのに十分であるような細胞内構造を指す。単一のマーカーシグネチャーは、ドナーに由来する初代細胞の年齢または細胞（とりわけ、ドナー個体の年齢特徴を有さない幹細胞、または再プログラム化中およびその後の分化中などにおいて年齢特徴を失った幹細胞から分化した細胞）の年齢表現型であって、年齢関連表現型が誘導されている年齢表現型を特徴付けるのに十分な場合もあり、複数の異なるマーカーシグネチャーのプロファイルを評価して、ドナーの年齢、もしくは、実際のところ、他の任意の細胞の年齢を特徴付ける場合もある。
【０１１０】
本明細書で使用される「マーカー」という用語は、細胞の状態に特徴的であり、したがって、単独で、または他のマーカーと組み合わせて、その状態を指し示すのに有用な、分子形質または形態形質を指す。「マーカー」は、「年齢関連マーカー」および「成熟関連マーカー」を含む、「経時的マーカー」でありうる。「マーカー」はまた、「遅発性疾患マーカー」を含む「疾患関連マーカー」でもありうる。単一のマーカー（またはマーカーの組合せ）が、細胞の状態を指し示すのに十分であれば、それは、下記でさらに説明する通り、マーカーシグネチャーを構成する。ある特定の実施形態では、「マーカー」または「細胞マーカー」とは、特定の細胞または細胞型を同定する遺伝子またはタンパク質を指す。細胞についてのマーカーは、１つのマーカーに限定されない場合があり、マーカーとは、指定のマーカー群により、細胞または細胞型を、別の細胞または細胞型から識別しうる（may  identity）ように、マーカーの「パターン」を指す場合がある。
【０１１１】
本明細書で使用される「年齢関連マーカーシグネチャー」という用語は、天然の老化過程に特徴的な、任意の経時的マーカーシグネチャー（１つまたは複数のマーカーを含む）を指す。単一の年齢関連マーカーシグネチャーは、ドナーに由来する初代細胞の年齢または細胞の表現型段階であって、年齢表現型が誘導されている表現型段階を特徴付けるのに十分な場合もあり、複数の異なるマーカーシグネチャーのプロファイルを評価して、ドナーに由来する初代細胞の年齢、または細胞の表現型段階であって、年齢表現型が誘導されている表現型段階、または細胞の表現型年齢を特徴付ける場合もある。
【０１１２】
本明細書で使用される「成熟関連マーカーシグネチャー」という用語は、天然の成熟過程に特徴的な、任意の経時的マーカーシグネチャーを指す。単一の成熟関連マーカーシグネチャーは、初代細胞の成熟段階または細胞の表現型段階であって、年齢表現型が誘導されている表現型段階を特徴付けるのに十分な場合もあり、複数の異なるマーカーシグネチャーのプロファイルを評価して、初代細胞の成熟段階または細胞の表現型段階であって、年齢表現型が誘導されている表現型段階を特徴付ける場合もある。
【０１１３】
本明細書で使用される「疾患関連マーカーシグネチャー」という用語は、特異的な疾患に特徴的な、任意の細胞構造（分子的または形態的）を指す。単一のマーカーシグネチャーは、疾患を特徴付けるのに十分な場合もあり、複数の異なるマーカーシグネチャーのプロファイルを評価して、疾患状態を特徴付けることが必要な場合もある。
【０１１４】
本明細書で使用される「細胞」という用語は、単一の細胞のほか、細胞の集団（すなわち、複数の細胞）も指す。集団は、ニューロンの集団または未分化の胚性幹細胞の集団など、１つの細胞型を含む均一の集団でありうる。代替的に、集団は、複数の細胞型、例えば、ニューロンおよびグリア細胞を含む混合神経細胞集団も含みうる。集団内の細胞の数を限定することは意図せず、例えば、細胞の混合集団は、少なくとも１つの分化細胞を含みうる。一実施形態では、混合集団は、少なくとも１つの分化細胞および少なくとも１つの幹細胞を含みうる。本開示では、細胞集団が含みうる細胞型の数に対する限定はなされない。
【０１１５】
本明細書で使用される「初代細胞」または「初代体細胞」という用語は、配偶子（卵子または精子）以外の、身体の任意の細胞であって、本明細書で開示される方法に従い、かつ／または適切な条件下で、すなわち、適正な増殖因子、化合物、細胞外シグナル、細胞内シグナルと接触させ、再プログラム化遺伝子（因子）をトランスフェクトした場合などに、未分化のｉＰＳＣを発生させるために再プログラム化されうる「成体」細胞とも称する細胞を指す。例えば、初代細胞（培養物）は、線維芽細胞、分化初代体細胞、幹細胞系などを含む。一部の実施形態では、初代細胞は、患者から単離する。一部の実施形態では、初代細胞は、細胞系である。一部の実施形態では、初代細胞は、幹細胞系である。一部の実施形態では、初代細胞は、胚性幹細胞である。一部の実施形態では、初代細胞は、健常ボランティア、患者、臨床兆候に関わらず、特定の疾患または医学的状態を有する患者、すなわち、ある特定の遺伝子型または表現型を有する患者などに由来する供給源から単離する。一部の実施形態では、初代細胞は、哺乳動物から単離する。一部の実施形態では、初代細胞は、動物から単離する。
【０１１６】
本明細書で使用される「体細胞」という用語は、生物の任意の細胞であって、配偶子、生殖細胞、生殖母細胞、または未分化の幹細胞以外の、組織、皮膚、骨、血液、または器官の構成単位である細胞を指す。体細胞は、前駆細胞を含み、最終的には、分化細胞を含む。このような体細胞は、ニューロン、線維芽細胞、心筋細胞、上皮細胞、神経内分泌細胞、膵臓細胞、星状細胞、造血細胞、中脳ドーパミンニューロン、運動ニューロン、および／または大脳皮質ニューロンを含むがこれらに限定されない。本明細書で使用される「神経細胞培養物」という用語は、ニューロンおよび／またはグリア細胞の細胞培養物であって、細胞が、中枢神経系および／または末梢神経系の細胞の特徴を提示する細胞培養物を指す。
【０１１７】
体細胞（ｉＰＳＣ由来体細胞であれ、ｉＰＳＣ由来でない体細胞であれ）に言及して本明細書で使用される「許容状態」という用語は、ゲノム核酸メチル化のレベルが低減されており、結果として、細胞が老化可能であり、かつ／または存在する場合に疾患表現型を顕在化させることが可能な場合に成熟または老齢の「年齢」マーカーを発現させることが可能な細胞を指す。例えば、ゲノム核酸メチル化のレベルの低減は、ｉＰＳＣ由来体細胞を、許容状態に到達するように誘導して、遅発性疾患のモデル化を可能とする。
【０１１８】
本明細書で使用される「幹細胞」という用語は、全能性または多能性または複能性（multipotent）であり、胚性幹細胞、または器官から単離された幹細胞、例えば、間葉系幹細胞もしくは皮膚幹細胞もしくは人工多能性幹細胞など、１種または複数種の異なる細胞型へと分化することが可能な細胞を指す。
【０１１９】
本明細書で使用される「胚性幹細胞」という用語は、着床前期胚、胚、胎盤、または臍帯に由来する始原（未分化）細胞であって、培養物中で長期にわたり分化することなく分裂することが可能であり、３つの一次胚葉の細胞および組織へと発生することが知られている始原（未分化）細胞を指す。ヒト胚性幹細胞とは、ヒトに由来する胚性幹細胞を指す。本明細書で使用される「ヒト胚性幹細胞」または「ｈＥＳＣ」という用語は、早期のヒト胚であって、培養物中で長期にわたり分化することなく分裂することが可能であり、３つの一次胚葉の細胞および組織へと発生することが知られている胚盤胞段階まででありこれを含む早期のヒト胚に由来する、多能性幹細胞の種類を指す。
【０１２０】
本明細書で使用される「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」という用語は、胚性幹細胞と類似するが、体細胞（例えば、成体細胞）を、胚性幹細胞（ＥＳＣ）の「幹細胞性」、すなわち、異なる分化経路にコミットするように導かれるそれらの能力を維持するために重要な因子を発現させるように強いられることにより、胚性幹細胞様状態に入るように再プログラム化する場合に生み出される種類の多能性幹細胞を指す。このような因子は、体細胞へと導入される、ある特定の胚性遺伝子（ＯＣＴ４トランス遺伝子、ＳＯＸ２トランス遺伝子、およびＫＬＦ４トランス遺伝子など）（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、TakahashiおよびYamanaka、Cell、１２６巻：６６３〜６７６頁（２００６年）を参照されたい）を含みうる。
【０１２１】
細胞に言及して本明細書で使用される「前駆体」という用語は、前記細胞が、もはや多能性幹細胞でないが、また、いまだ完全にコミットした細胞でもない、中間の細胞段階を指す。本開示における前駆細胞は、体細胞内に含まれる。
【０１２２】
本開示による幹細胞は、「全能性」幹細胞の場合もあり、「多能性」幹細胞の場合もあり、かつ／または「複能性」幹細胞の場合もある。本明細書で使用される「全能性」という用語は、分化した生物内の任意の細胞型のほか、胎盤など、胚体外素材の細胞へも分化する細胞の能力を指す。本明細書で使用される「多能性」という用語は、任意の分化細胞型へと分化することが可能な細胞または細胞系、例えば、生物の３つの発生期胚葉であって、内胚葉、中胚葉、および外胚葉を含む胚葉へと発生する能力を指す。本明細書で使用される「複能性」という用語は、少なくとも２つの分化細胞型へと分化することが可能な細胞または細胞系を指す。
【０１２３】
マウスｉＰＳＣは、２００６年に報告され（ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ、Ｃｅｌｌ、１２６巻：６６３〜６７６頁（２００６年））、ヒトｉＰＳＣは、２００７年の後半に報告された（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ、２００７年１１月３０日、１３１巻（５号）：８６１〜７２頁）。マウスｉＰＳＣは、幹細胞マーカーの発現を含む、多能性幹細胞の重要な特徴を裏付ける。また、ヒトｉＰＳＣおよび動物ｉＰＳＣも、幹細胞マーカーを発現させ、３つの胚葉全てに特徴的な細胞を発生させることが可能である。胚性幹細胞とは異なり、ｉＰＳＣは、ある特定の胚性遺伝子（ＯＣＴ４トランス遺伝子、ＳＯＸ２トランス遺伝子、およびＫＬＦ４トランス遺伝子など）を、体細胞へと導入することにより人工的に形成される。例えば、ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ、Ｃｅｌｌ、１２６巻：６６３〜６７６頁（２００６年）ならびにＡｇａｒｗａｌら、Ｎａｔｕｒｅ、２９２〜２９６頁（２０１０年）を参照されたい。ｉＰＳＣは、例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、および／またはＫＬＦ４のうちの１つまたは複数など、１つまたは複数の遺伝子をトランスフェクトされた成体ヒト皮膚細胞または成体ヒト線維芽細胞から産生することができる。Ｙｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２４巻：７９７〜８０１頁（２００９年）を参照されたい。代替的に、それらは、血液または角化細胞など、他の種類の体細胞からも産生することができる。
【０１２４】
本明細書で開示される任意の細胞に言及する場合に、本明細書で使用される「〜から得られる、〜に由来する（derived  from）」または「〜から確立された」または「〜から分化させた」という用語は、限定せずに述べると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて培養された単一細胞の単離、例えば、タンパク質、化学物質、放射線、ウイルスの感染、例えばモルフォゲンなどによる、ＤＮＡ配列によるトランスフェクションを使用する、処理および／または変異誘発、培養された親細胞に含有される、任意の細胞の選択（連続培養などによる）など、任意の操作を使用して、細胞系内、組織（解離させた胚など）内、または体液中の親細胞から得られた（例えば、単離、精製されるなどした）細胞を指す。得られる細胞は、増殖因子、サイトカイン、サイトカイン処理の選択的進行過程（selected  progression）、接着性、接着性の欠如、分取手順などへの応答により、混合集団から選択することができる。
【０１２５】
本明細書で使用される「ｉＰＳＣ由来の年齢相応体細胞」という用語は、第１の幹細胞（これは、初代体細胞の再プログラム化に由来しうる）を分化させた後に、ゲノム核酸メチル化のレベルを低減させることにより得られる、任意の細胞を指す。ｉＰＳＣ由来の年齢相応体細胞は、それらが由来する第１の細胞の経時的マーカーシグネチャーを必ずしも特徴とせず、未成熟関連マーカーシグネチャーを提示する場合もあり、若齢関連マーカーシグネチャーを提示する場合もあり、成熟関連マーカーシグネチャーを提示する場合もあり、老齢関連マーカーシグネチャーを提示する場合もある。これらの細胞は、それらの意図される使用に適切な細胞年齢のマーカーを提示する点で「年齢相応」である。例えば、老齢細胞ではない成熟細胞は、老齢個体ではない成体個体の細胞モデルを確立するのに適切である。
【０１２６】
本明細書で使用される「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は、人工的な環境および人工的な環境内で生じる過程または反応を指す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境は、試験管および細胞培養物を含むがこれらに限定されない。
【０１２７】
本明細書で使用される「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、天然の環境（例えば、動物における環境）および胚性発生、細胞分化、神経管形成など、天然の環境内で生じる過程または反応を指す。
【０１２８】
本明細書で使用される「培養細胞」という用語は一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持された細胞を指す。培養細胞は、「細胞系」および「初代培養細胞」を含む。「細胞培養物」という用語は、任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞培養物を指す。この用語には、連続細胞系（例えば、不死表現型を伴う）、初代細胞培養物、有限細胞系（例えば、非形質転換細胞）、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持された他の任意の細胞集団であって、胚、多能性幹細胞を含む細胞集団（とりわけ、ニューロン）が含まれる。
【０１２９】
本明細書で使用される「低分子」という用語は、医薬において一般に使用される有機分子とサイズが同等な、任意の有機分子を指す。用語は、生体高分子（例えば、ペプチド、タンパク質、核酸など）を除外する。好ましい低分子は、約１０Ｄａ〜約５０００Ｄａまで、より好ましくは２０００Ｄａまで、および最も好ましくは約１０００Ｄａまでのサイズの範囲にある。
【０１３０】
遺伝子またはタンパク質との関連において、本明細書で使用される「〜を発現させること」という用語は、ｍＲＮＡまたはタンパク質の産生を指し、これは、マイクロアレイアッセイ、抗体染色アッセイなどのようなアッセイを使用して観察することができる。
【０１３１】
５．２  老化を誘導するための方法
体細胞の、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）への、従来の再プログラム化では、それらの表現型が、胚年齢まで戻るようにリセットされ、したがって、遅発性障害をモデル化するのに、有意な障害を表している。加えて、ヒト被験体から回収された幹細胞およびこのような幹細胞に由来する体細胞はまた一般に、年齢も欠き、また、遅発性疾患の場合の疾患マーカーも欠くことが多い。本明細書で記載される通り、幹細胞由来の体細胞であって、限定なしに述べると、ヒトｉＰＳＣ由来細胞系統を含む体細胞において適切な時系列マーカーシグネチャーを誘導し、これにより、疾患モデルとして適する年齢相応細胞培養物を発生させるための方法が開示される。
【０１３２】
ある特定の実施形態では、このような疾患モデルは、「若齢」マーカーシグネチャーを発現させる体細胞において、老化時系列マーカーシグネチャー（必ずしも幹細胞の分化誘導により得られるわけではない）を誘導することにより開発することができる。この戦略を、アルツハイマー病（ＡＤ）もしくはパーキンソン病（ＰＤ）などの神経変性疾患、心筋細胞関連疾患、膵臓疾患、および／または造血器疾患を含むがこれらに限定されない、遅発性疾患および／または障害を有する患者に由来する細胞培養物へと適用して、患者年齢をより正確に表し、したがって、疾患状態をより正確に表す、年齢相応細胞培養物を得ることができる。
【０１３３】
本開示の方法はまた、本明細書で記載される老化細胞、例えば、老化ｉＰＳＣ由来細胞を使用する、遅発性疾患に関連する薬物スクリーニングまたは他の任意の実験に活用される細胞へも適用することができる。当技術分野で公知の、任意の薬物スクリーニング法を、本明細書で記載される細胞と共に使用することができる。例えば、ｉＰＳＣ由来細胞（老化させていない）を使用してＡＬＳを処置するための薬物についてスクリーニングする方法については、Yang  Y.M.ら、２０１３年、Cell  Stem  Cell、１２巻、７１３〜７２６頁（参照によりその全体において組み込まれる）により記載されている。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、本開示は、ゲノム核酸メチル化のレベルを低減することにより、培養物中の細胞の老化および／または成熟の加速を誘導する方法を提供する。ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣ由来細胞培養物（例えば、ｉＰＳ細胞由来の線維芽細胞内およびｉＰＳ細胞由来のニューロン）中の、ゲノム核酸メチル化のレベルを低減することにより、１種または複数種の時系列マーカーシグネチャー、ならびに成熟細胞および／または老齢細胞などの年齢相応細胞の他の特徴を構成する１種または複数種の時系列マーカーを誘導する。
【０１３５】
一部の実施形態では、本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける生存期間が長い細胞であって、ニューロンおよび心筋細胞など、万一損傷または罹患したらすぐには補充されないことが典型的な細胞、ならびに老化状態にあるこのような細胞を得る方法に関する。これらの細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する場合は通例、それらのｉｎ  ｖｉｖｏにおける対応物を表す老化および／または成熟マーカーを呈示するのに、長い培養時間を必要とする。このような手順は、利用可能であっても、時間がかかり、費用がかさむ。一部の実施形態では、本開示は、ゲノム核酸メチル化のレベルを低減して、それらの成熟もしくは老化またはこれらの両方を加速し、これにより、年齢相応細胞をもたらす方法に関する。一部の実施形態では、これらの細胞を使用して、神経変性疾患、アテローム性動脈硬化、および他の慢性代謝疾患など、遅発性疾患をモデル化することができる。
【０１３６】
一部の実施形態では、本開示は、ゲノム核酸メチル化のレベルを低減することによる、細胞培養物中の、哺乳動物細胞の制御された成熟および／または老化に関する。単独で使用されても、他の試薬（ｉＰＳＣ細胞のための細胞分化プロトコールなど）と組み合わせて使用されても、本開示による方法は、細胞の成熟および／または老化を、ゲノム核酸メチル化のレベルを調整することにより操作されうる制御された速度で加速する能力を付与する。例えば、本開示の方法による細胞の成熟および／または老化は、細胞へと曝露されるメチル化阻害剤の、用量、濃度、および／または曝露頻度を低減することにより緩徐化することもでき、阻害剤の曝露時間を縮減することにより緩徐化することもできる。代替的に、メチルトランスフェラーゼの酵素活性は、そのタンパク質の阻害性因子（例えば、ＲＮＡサイレンシング、ＲＮＡｉ、アンチセンス分子、抗体（例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ））、またはそのタンパク質に特異的なその断片など）を導入することにより低減または阻害することができる。成熟させた細胞は、本明細書で記載されるようにさらなる手順に供することもでき、実験、例えば、治療用化合物についてのスクリーニング法で使用することもでき、細胞療法で使用することもできる。
【０１３７】
ある特定の実施形態では、本開示は、ｉＰＳＣ由来体細胞など、ｉＰＳＣ由来細胞において老化の加速を誘導するための方法であって、ゲノム核酸メチル化のレベルを低減し、これにより、細胞において１種または複数種の時系列マーカーシグネチャーおよび／または他の年齢関連特徴を誘導するステップを含む方法を提供する。これらの実施形態の一部の態様では、マーカーシグネチャーおよび／または特徴は、老化および／または１種もしくは複数種の疾患表現型と関連する。
【０１３８】
例えば、細胞型特異的経時的マーカーシグネチャーは、表１および２で提示される疾患または経時的マーカーのうちの１つまたは複数の組合せ、ならびに／または表１および２で提示される疾患または経時的マーカーのうちの１つまたは複数の非存在を含みうるがこれらに限定されない。細胞型に特異的な特徴は、例えば、老化したｉＰＳＣ由来のドーパミンニューロン内の神経メラニンの蓄積など、１つまたは複数の表現型を含みうるがこれらに限定されない。ニューロン内の疾患表現型（パーキンソン病に関連する）は、樹状突起の顕著な変性、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）発現の進行性の喪失、および／またはミトコンドリアの肥大もしくはレビー小体前駆物質の封入を含むがこれらに限定されない。パーキンソン病（ＰＤ）ｉＰＳＣ由来のドーパミンニューロンの低メチル化誘導性老化は、遺伝的感受性に基づきうる、疾患表現型を誘導し得る。
【０１３９】
疾患表現型は、場合によって、老化感受性および／または遺伝的感受性に基づきうるしたがって、本開示は、１つまたは複数の経時的マーカーシグネチャーの誘導および提示を特徴とし、任意選択で、１つまたは複数の疾患シグネチャー（例えば、遺伝的素因を含む）の誘導および提示を特徴とする、ｉＰＳＣベースの年齢相応細胞培養物モデルにおいて、老化を誘導して、遅発性疾患および／または障害を検討するための方法を提供する。
【０１４０】
本発明の方法は、老化細胞または成熟細胞の、体細胞（ｉＰＳＣ由来であれ、初代細胞由来であれ）または幹細胞または完全分化細胞もしくは部分的分化細胞からの産生に適用することができる。
【０１４１】
本開示はまた、（１）「若齢」細胞または「未成熟」細胞のマーカーシグネチャーを提示する体細胞、幹細胞、ｉＰＳＣおよび／または幹細胞もしくはｉＰＳＣ由来体細胞を含む細胞において、成熟または老化を誘導するための方法；（２）細胞培養物（体細胞培養物であれ、幹細胞培養物であれ、ｉＰＳＣ由来細胞培養物であれ、初代細胞培養物であれ、分化途上の細胞であれ）中の誘導性老化を使用して、年齢相応細胞の培養物中の、パーキンソン病（ＰＤ）など、遅発性疾患および／または障害における時系列効果について研究するための方法；ならびに（３）１もしくは複数の経時的マーカーを産生するｉＰＳＣ由来年齢相応細胞、または１もしくは複数の経時的マーカーを産生しないｉＰＳＣ由来年齢相応細胞であって、これらの経時的マーカーの存在または非存在が、経時的マーカーシグネチャーおよび／または特定の細胞表現型に特徴的なｉＰＳＣ由来年齢相応細胞を含むｉＰＳＣ由来細胞（表１および２を参照されたい）も提示する。
【表１】
2018501809.tif 000003
【０１４２】
本開示の一部の実施形態は、ドナー線維芽細胞などのドナー細胞の経時的年齢と緊密に相関する細胞マーカーのセットであって、細胞マーカーが、核内組織化、ヘテロクロマチン、ＤＮＡ損傷、およびミトコンドリアにおけるストレスのマーカーを含むがこれらに限定されないセットを使用するための方法を提供する。理論に束縛されずに述べると、１つまたは複数の年齢関連マーカーは、元のドナーの細胞の年齢と関連し、再プログラム化すると、失われると考えられる。さらに、老化のある特定の特徴は、分化させると、ｉＰＳＣ由来の細胞系統により再獲得されない。したがって、見かけ上健常な細胞内で、ゲノム核酸メチル化のレベルを低減することにより、ｉＰＳＣの誘導の前に、ドナー細胞の年齢を規定する１種または複数種の年齢関連マーカーを誘導する。
【０１４３】
したがって、本開示は、細胞において老化を誘導するための方法であって、その老化が、ｉＰＳＣ由来の細胞系統内で、正常な老化の複数の側面を模倣するが、加速されている方法を提供する。ｉＰＳＣ由来細胞は、線維芽細胞を含むがこれに限定されない。加えて、本開示は、パーキンソン病などの遅発性障害をモデル化するための、開示される方法および細胞の１つの有用性も裏付け、他の疾患についての同様のモデルの確立についても教示する。低メチル化された細胞は、ｉＰＳＣの場合もあり、ｉＰＳＣに由来する場合もあり、胚性幹細胞、成体個体に由来する皮膚幹細胞、間葉幹細胞、造血幹細胞など、別の種類の幹細胞の場合もあり、別の種類の幹細胞に由来する場合もある。実際、低メチル化を使用して、由来に関わらず、ニューロンなどの任意の種類の体細胞において老化を誘導することができる。しかし、健常ドナーに由来するニューロンを得ることは困難であるので、幹細胞の分化と低メチル化への曝露との組合せが、「老齢」経時的マーカーシグネチャーを発現させるニューロンを得るのに好ましい方法である。
【０１４４】
表２は、老化ドナーに由来する初代線維芽細胞に見出される年齢関連マーカーのセットであって、線維芽細胞のｉＰＳＣへの再プログラム化中に失われ、このようなｉＰＳＣを、線維芽細胞様細胞またはｍＤＡニューロンなどの分化細胞へと分化させても産生されないマーカーのセットを提示する。すなわち、再プログラム化／分化は、体細胞ドナーの年齢に関わらず、「若齢」表現型（これは、遅発性疾患を研究するには年齢不相応である）を有する細胞を発生させる。しかし、年齢関連マーカーは、ゲノム核酸メチル化のレベルを低減すると、再確立することができ、これにより、年齢相応なｉＰＳＣ由来の「老齢」細胞または成熟ｉＰＳＣ由来細胞であって、成熟細胞もしくは遅発性疾患を研究するための、または成熟細胞の場合は、治療における使用のための、ｉＰＳＣ由来の「老齢」細胞または成熟ｉＰＳＣ由来細胞をもたらすことができる。
【０１４５】
例えば、パーキンソン病（ＰＤ）患者および見かけ上の健常ドナーに由来するｉＰＳＣは、それらの遺伝子型の差異にも拘らず、表現型では同一であると考えられる。ｍＤＡニューロンへと分化させたところ、ＰＤ細胞と対照細胞との間で観察されたのは、わずかな差異（疾患シグネチャーを伴わない／軽微な疾患シグネチャー）だけであった。ある特定の実施形態では、低メチル化は、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン細胞におけるｍＤＡの老化様シグネチャーを誘発し、また、ＰＤ  ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン内の、遺伝子型と表現型との間の相互作用を有する、複数の疾患関連（ＰＤ関連）表現型も顕在化させる（すなわち、疾患シグネチャーの増強）。
【表２−１】
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【表２−２】
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【０１４６】
体細胞ドナーの年齢を予測するマーカーであって、再プログラム化中、分化中、および誘導性老化中に細胞年齢をモニタリングするのに使用されうるマーカーは、細胞が老化するのに応じて短縮され、再プログラム化および結果として得られる機能的なテロメラーゼの産生により回復されるテロメア長を含む（Ａｇａｒｗａｌら、Ｎａｔｕｒｅ、４６４巻：２９２〜２９６頁（２０１０年）；およびＭａｒｉｏｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、１４１〜１５４頁（２００９年））。同様に、ｉＰＳＣの誘導は、老化細胞のミトコンドリアを若返らせる（Ｐｒｉｇｉｏｎｅら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、７２１〜７３３頁（２０１０年）およびＳｕｈｒら、ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ、５巻：ｅ１４０９５頁（２０１０年））。しかし、これらの研究は、高度に顕異する細胞型の間（線維芽細胞対ｉＰＳＣ）の個々の表現型の比較に限定されていた。これに対し、本開示は、ある範囲にわたる年齢関連マーカーであって、細胞年齢および対応する細胞運命と相関するマーカー（ドナーの線維芽細胞をｉＰＳＣ由来の線維芽細胞と対比させる）を提示する。
【０１４７】
さらなる適切なマーカーは、複数の組織にわたりドナー年齢を予測する、特定のＣｐＧ部位におけるメチル化のレベル（Ｈｏｒｖａｔｈ，  Ｓ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １４，  Ｒ１１５  （２０１３）；Ｈａｎｎｕｍら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．、４９巻：３５９〜３６７頁（２０１３年）；ならびにＫｏｃｈおよびＷａｇｎｅｒ、Ａｇｉｎｇ、３巻：１０１８〜１０２７頁（２０１１年））、およびｉＰＳＣ内の、ドナー細胞運命のエピジェネティック記憶を反映するメチル化パターン（Ｋｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ、４６７巻：２８５〜２９０頁（２０１０年）；およびＰｏｌｏら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２８巻：８４８〜８５５頁（２０１０年））を含むがこれらに限定されない。
【０１４８】
本開示は、細胞における低メチル化を誘導して、様々な細胞系統において細胞型特異的応答を誘導する方法について記載する（表２）。さらに、ある特定の実施形態では、本出願は、線維芽細胞内など、細胞における年齢を再確立し、移植されたｍＤＡニューロン内の神経メラニンの存在、ｍＤＡニューロンの包括的な転写の変化、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける樹状突起の変性表現型など、正常なニューロン老化のある特定の側面をフェノコピーするために、低メチル化を誘導する方法について記載する。ある特定の実施形態では、変性ニューロン応答は、線維ネットワークが確立された後で生じ、「神経変性」表現型もまた反映しうる、初代線維の伸長の低減（Sanchez-Danesら、EMBO  Molecular  Medicine、４巻：３８０〜３９５頁（２０１２年））とは顕著に異なる。
【０１４９】
本開示はまた、様々な細胞系統の老化を誘導するのにも適用することができる。これらの細胞は、脳、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、筋肉、皮膚、肺、血液、動脈、眼、骨髄、およびリンパ系を含むがこれらに限定されない、様々な組織内および器官内で見出される主要な細胞型を含む。例えば、表３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、低メチル化誘導性の老化または成熟から利益を得る可能性がある、さらなる細胞型およびそれらの老化マーカー（例えば、Ａ．  Ｓｈｅｙｄｉｎａら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１１年）、１２１巻、３１５〜３２９頁；Ｕ．  ＧｕｎａｓｅｋａｒａｎおよびＭ．  Ｇａｎｎｏｎ、２０１１年、Ａｇｉｎｇ、３巻（６号）：５６５〜５７５頁を参照されたい）を列挙する。加えて、ｉＰＳＣ由来細胞は、ＡＬＳ、パーキンソン病、およびアルツハイマー病を含む表４にまとめられる神経変性疾患について研究するのに使用されているが、これらのｉＰＳＣ由来ニューロンは、年齢改変されておらず、したがって、これらの遅発性疾患におけるニューロンを十分に表していない可能性がある。
【表３−１】
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【表３−２】
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【０１５０】
【表４】
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【０１５１】
本明細書で開示される通り、ゲノム核酸メチル化のレベルの低減は正常な老化を模倣することができ、これは、老化様状態を有する細胞であって、ＰＤなどの遅発性疾患をモデル化するのに適する細胞を産生させるための本方法のための基礎である。
【０１５２】
ある特定の実施形態では、本出願の方法は、細胞を、細胞内の核酸メチル化のレベルを低減または阻害するのに十分な量かつ十分な期間、核酸メチル化を阻害または低減する薬剤と接触させるステップを含む。
【０１５３】
本明細書で開示される通り、本出願は、細胞内の、核酸メチル化のレベルを、細胞の老化および／または成熟の加速を誘導するのに十分な量で低減する方法を提供する。ある特定の実施形態では、メチル化のレベルを、そのメチル化のレベルが、本明細書で記載される方法に従い低減されていない細胞、例えば、若齢細胞の、約０．１〜９５％の間、またはこの間の任意の値、例えば、約１〜９５％の間、または約５〜９５％の間、または約１０〜９５％の間、または約１５〜９５％の間、または約２０〜９５％の間、または約２５〜９５％の間、または約３０〜９５％の間、または約３５〜９５％の間、または約４０〜９５％の間、または約４５〜９５％の間、または約５０〜９５％の間、または約５５〜９５％の間、または約６０〜９５％の間、または約６５〜９５％の間、または約７０〜９５％の間、または約７５〜９５％の間、または約８０〜９５％の間、または約８５〜９５％の間、または約９０〜９５％の間、または約５〜９５％の間、または約５〜９０％の間、または約５〜８５％の間、または約５〜８０％の間、または約５〜７５％の間、または約５〜７０％の間、または約５〜６５％の間、または約５〜６０％の間、または約５〜５５％の間、または約５〜５０％の間、または約５〜４５％の間、または約５〜４０％の間、または約５〜３５％の間、または約５〜３０％の間、または約５〜２５％の間、または約５〜２０％の間、または約５〜１５％の間、または約５〜１０％の間のレベルへと低減する。
【０１５４】
ある特定の実施形態では、メチル化のレベルを、そのメチル化のレベルが、本明細書で記載される方法に従い低減されていない細胞、例えば、若齢細胞の、約１〜７０％の間、または約５〜６０％の間、または約１０〜５０％の間、または約１５〜４０％の間、または約２０〜３０％の間のレベルへと低減する。
【０１５５】
本明細書で開示される通り、本出願は、細胞内の、核酸メチル化のレベルを、細胞の老化および／または成熟の加速を誘導するのに十分な量で低減する方法を提供する。ある特定の実施形態では、メチル化のレベルを、そのメチル化のレベルが、本明細書で記載される方法に従い低減されていない細胞、例えば、若齢細胞内の、核酸メチル化のレベルから、約０．１〜９０％の間、または約１〜７０％の間、または約５〜６０％の間、または約１０〜５０％の間、または約１５〜４０％の間、または約２０〜３０％の間だけ低減する。
【０１５６】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化を阻害または低減する薬剤は、シチジンのヌクレオシド類似体、例えば、ゼブラリン（１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２（１Ｈ）−ピリミジノンまたはピリミジン−２−オンβ−Ｄ−リボフラノシドとしてもまた公知である）を含む。ある特定の実施形態では、ゼブラリンを、約５〜７０μＭの間、またはこの間の任意の値、例えば、約１０〜７０μＭの間、または約１５〜７０μＭの間、または約２０〜７０μＭの間、または約３０〜７０μＭの間、または約４０〜７０μＭの間、または約５０〜７０μＭの間、または約６０〜７０μＭの間、または約５〜６０μＭの間、または約５〜５０μＭの間、または約５〜４０μＭの間、または約５〜３０μＭの間、または約５〜２０μＭの間、または約５〜１５μＭの間、または約５〜１０μＭの間の濃度で投与する。
【０１５７】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化を阻害または低減する薬剤は、５−アザ−２−デオキシシチジン（５−アザ−ｄＣ；デシタビン）および／またはホモシステインおよび／またはホモシステインの代謝物である、Ｓ−アデノシル−ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）を含む。ある特定の実施形態では、デシタビンを、約０．０５〜５μＭの間、またはこの間の任意の値、例えば、約０．１〜５μＭの間、または約０．５〜５μＭの間、または約１〜５μＭの間、または０．０５〜１μＭの間、または約０．０５〜０．５μＭの間、または約０．０５〜０．１μＭの間の濃度で投与する。
【０１５８】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化を阻害または低減する薬剤は、４−クロロ−Ｎ−（４−ヒドロキシ−１−ナフタレニル）−３−ニトロ−ベンゼンスルホンアミド（ＳＷ１５５２４６）を含む。ある特定の実施形態では、ＳＷ１５５２４６を、約０．０５〜１０μＭの間、またはこの間の任意の値、例えば、約０．１〜１０μＭの間、または約１〜１０μＭの間、または約５〜１０μＭの間、または約０．０５〜５μＭの間、または約０．０５〜１μＭの間、または約０．０５〜０．１μＭの間の濃度で投与する。
【０１５９】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化を阻害または低減する薬剤は、（３Ｓ，３’Ｓ，５ａＲ，５ａＲ，１０ｂＲ，１０’ｂＲ，１１ａＳ，１１’ａＳ）−２，２’，３，３’，５ａ，５’ａ，６，６’−オクタヒドロ−３，３’−ビス（ヒドロキシメチル）−２，２’−ジメチル−［１０ｂ，１０’ｂ（１１Ｈ，１１’Ｈ）−ｂｉ３，１１ａ−エピジチオ−１１ａＨ−ピラジノ［１’，２’：１，５］ピロロ［２，３−ｂ］インドール］−１，１’，４，４’−テトロン、（ケトシン）を含む。ある特定の実施形態では、ケトシンを、約０．０００１〜１μＭの間、またはこの間の任意の値、例えば、約の間（between  about）  約０．００１〜１μＭの間、または約０．０１〜１μＭの間、または約０．１〜１μＭの間、または約０．０００１〜０．１μＭの間、または約０．０００１〜０．０１μＭの間、または約０．０００１〜０．００１μＭの間の濃度で投与する。
【０１６０】
ある特定の実施形態では、薬剤は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）の阻害剤および／もしくはヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）の阻害剤、例えば、ＤＮＭＴおよび／もしくはＨＭＴに結合する抗体もしくはその断片、またはＤＮＭＴおよび／もしくはＨＭＴ酵素の発現を低減もしくは阻害するアンチセンスもしくはｓｉＲＮＡ分子を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＭＴ酵素は、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、および／またはＤＮＭＴ３Ｌを含む。
【０１６１】
ある特定の実施形態では、薬剤は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、例えば、ＳＵＶ３／９の阻害剤、例えば、ヒストンメチルトランスフェラーゼに結合する抗体もしくはその断片、またはヒストンメチルトランスフェラーゼの発現を低減もしくは阻害するアンチセンスもしくはｓｉＲＮＡ分子を含む。
【０１６２】
ある特定の実施形態では、薬剤は、メチル−ＣｐＧ−結合性タンパク質（ＭｅＣＰ２）の阻害剤および／もしくはＰＨＤおよびＲＩＮＧフィンガードメイン１タンパク質（ＵＨＲＦ１）の阻害剤、例えば、ＭｅＣＰ２および／もしくはＵＨＲＦ１タンパク質に結合する抗体もしくはその断片、またはＭｅＣＰ２および／もしくはＵＨＲＦ１タンパク質の発現を低減もしくは阻害するアンチセンスもしくはｓｉＲＮＡ分子を含む。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化を低減する本明細書で記載される薬剤を、細胞と、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、または少なくとも約２０日間にわたり接触させる。ある特定の実施形態では、薬剤を、細胞と、最大で約１日間、最大で約（abut）２日間、最大で約３日間、最大で約４日間、最大で約５日間、最大で約６日間、最大で約７日間、最大で約８日間、最大で約９日間、最大で約１０日間、最大で約１１日間、最大で約１２日間、最大で約１３日間、最大で約１４日間、最大で約１５日間、最大で約１６日間、最大で約１７日間、最大で約１８日間、最大で約１９日間、または最大で約２０日間にわたり接触させる。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化のレベルを、変異、例えば、部位特異的変異誘発など、当技術分野で公知の任意の方法を介して、細胞の核酸へと導入される変異であって、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）および／またはヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）および／またはメチル−ＣｐＧ−結合性タンパク質（ＭｅＣＰ２）および／またはＰＨＤおよびＲＩＮＧフィンガードメイン１タンパク質（ＵＨＲＦ１）をコードする核酸における変異、例えば、ＤＮＭＴ１内のハイポモルフ変異などのハイポモルフ変異により低減する。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化の低減は、１または複数のＣｐＧメチル化部位におけるメチル化レベルおよび／またはメチル化率の低減を含む。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化のレベルの低減は、ゲノム核酸反復エレメント、例えば、ＬＩＮＥ１（Ｌ１）エレメント、ＬＴＲエレメント、および／または内因性レトロウイルス（ＥＲＶ）エレメントの非コード領域におけるメチル化の低減を含む。ある特定の実施形態では、若齢細胞と比較して低メチル化状態にある、老化細胞における反復エレメントの量は、細胞の反復エレメントの、約１０〜９０％の間、およびこの間の任意の値、例えば、約１５〜９０％の間、または約２０〜９０％の間、または約２５〜９０％の間、または約３０〜９０％の間、または約３５〜９０％の間、または約４０〜９０％の間、または約４５〜９０％の間、または約５０〜９０％の間、または約５５〜９０％の間、または約６０〜９０％の間、または約６５〜９０％の間、または約７０〜９０％の間、または約７５〜９０％の間、または約８０〜９０％の間、または約８５〜９０％の間、または約の間、約の間（or  between  about,  between  about）  または約１０〜８５％の間、または約１０〜８０％の間、または約１０〜７５％の間、または約１０〜７０％の間、または約１０〜６５％の間、または約１０〜６０％の間、または約１０〜５５％の間、または約１０〜５０％の間、または約１０〜４５％の間、または約１０〜４０％の間、または約１０〜３５％の間、または約１０〜３０％の間、または約１０〜２５％の間、または約１０〜２０％の間、または約１０〜１５％の間である。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、本出願の方法により達成される核酸メチル化の低減は、ＤＮＡ転写のエピジェネティックサイレンシングを低減し、この場合、このようなエピジェネティックサイレンシングの低減は、抑制性ヒストンマーク、例えば、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３および／またはＨ３Ｋ２７ｍｅ３のレベルの低減を含む。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化のレベルの低減は、ヒストンタンパク質Ｈ１のレベルの低減を含む。
【０１６９】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化のレベルの低減は、ヘテロクロマチンマーカーＨＰ１αのレベルの低減を含む。
【０１７０】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化のレベルの低減は、核形態マーカーラミンＢ１のレベルの低減を含む。
【０１７１】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化のレベルの低減は、ＤＮＡ損傷のマーカーである、ｙＨ２Ａｘのレベルの増大を含む。
【０１７２】
ある特定の実施形態では、本出願の方法により達成される核酸メチル化の低減は、若齢細胞と比較して、老化細胞において、反復エレメント、例えば、ＬＩＮＥ１（Ｌ１）エレメント、ＬＴＲエレメント、および／または内因性レトロウイルス（ＥＲＶ）エレメントの転写の発現を増大させる。ある特定の実施形態では、老化細胞において発現を上昇させる反復エレメントは、約１０〜１，０００の間、約２０〜５００の間、約３０〜約５０の間、約４０〜約２００の間、約５０〜約１５０の間の、マップされたリード１００万個あたり転写物の１キロベースあたりのフラグメント（Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  Ｐｅｒ  Ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｐｅｒ  Ｍｉｌｌｉｏｎ  ｍａｐｐｅｄ  ｒｅａｄｓ）（ＦＰＫＭ）、または約６０〜約１００の間のＦＰＫＭを有する低存在度エレメントであるエレメントを含む。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、細胞内の核酸メチル化を低減するための本出願の方法は、細胞内の５−ヒドロキシ−メチル−シトシン（５ｈｍＣ）核酸修飾のレベルを増大させるステップを含む。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、本出願の方法は、細胞内のｔｅｎ−ｅｌｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）タンパク質、例えば、これに限定されないがヒトｔｅｎ−ｅｌｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  １（ＴＥＴ１）のレベルまたは活性を増大させるステップを含む。
【０１７５】
５．２．１  ｉＰＳＣ由来体細胞の、低メチル化媒介年齢加速
ある特定の実施形態では、本開示は、ドナー年齢、例えば、線維芽細胞ドナーの年齢と相関する経時的マーカーシグネチャーであって、核形態および核組織化タンパク質発現についてのマーカーのほか、ヘテロクロマチン、ＤＮＡ損傷、および反応性酸素分子種についてのマーカーを含むがこれらに限定されないマーカーシグネチャーのセットを提示する。「老齢」線維芽細胞におけるこれらの年齢関連経時的マーカーシグネチャーは、再プログラム化中に失われ、その後の分化中に再獲得されないことから、ｉＰＳＣ由来細胞は、年齢記憶を維持しないという仮説が裏付けられる。組織特異的年齢関連マーカーシグネチャーは、短期間のゲノム核酸メチル化の減少への曝露後に、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞内およびｍＤＡニューロン内のいずれにおいても誘導することができる。本明細書で開示される方法では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるパーキンソン病をモデル化するために、かつ、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンの移植後に、細胞年齢と関連する経時的マーカーシグネチャーを迅速に誘導する能力を援用する。
【０１７６】
本明細書で開示される通り、最新のｉＰＳＣ技術を使用しても観察されない、複数の年齢関連表現型およびＰＤ関連表現型であって、本開示の細胞によりもたらされる年齢関連表現型および疾患関連表現型は、樹状突起の変性、年齢関連神経メラニンの形成、ＡＫＴの調節異常、ＴＨ＋ニューロンの数の選択的低減、ミトコンドリアの腫脹および封入体の超微細構造的証拠などを含むがこれらに限定されない。誘導性老化は、ｉＰＳＣ研究のためのモデル系であり、遅発性障害における遺伝的感受性および年齢関連感受性の寄与に取り組むための他の細胞型および疾患の病態へと適合させうるモデル系をもたらす。
【０１７７】
こうして、本開示は、初代体細胞、初代線維芽細胞、ｉＰＳＣ由来体細胞、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞および／またはｉＰＳＣ由来の中脳ドーパミンニューロンなど、ｉＰＳＣ由来ニューロンのためのモデルとしての、包括的な遺伝子シグネチャーおよびエピジェネティックシグネチャーを含むがこれらに限定されない、時系列マーカーシグネチャーを提示する。ある特定の態様では、経時的マーカーシグネチャーは、細胞年齢の正確なシグネチャーとしての、ゲノムワイドの遺伝的プロファイルおよびエピジェネティックプロファイルを同定することが可能な細胞挙動を反映する。細胞年齢は、例えば、遺伝的プロファイルを伴い、かつ／またはエピジェネティックプロファイルを介する、年齢関連マーカーの間の相互作用により決定することができる。
【０１７８】
線維芽細胞およびニューロンは、ドナー個体の特定の年齢に基づき、特異的なバイオマーカーを有することが公知である。本開示は、初代線維芽細胞（若齢または老齢の）内の年齢関連マーカーが、ｉＰＳＣの誘導中に、胚形成期のマーカーシグネチャーへと「リセット」されうることを裏付ける。その後、分化させると、胚形成期マーカーシグネチャーは、大部分が不変である。次いで、ゲノム核酸メチル化を低減させて、未成熟／胚性／若齢の年齢関連マーカーシグネチャーを、老齢の年齢関連マーカーシグネチャー（または成熟の年齢マーカーシグネチャー）へと転換することができる。このような年齢関連マーカーは、表２および表３に列挙される年齢関連マーカーを含むがこれらに限定されない。
【０１７９】
５．２．２  ｉＰＳＣ由来ニューロン細胞において老化を誘導するための方法
ある特定の実施形態では、本開示は、ゲノム核酸メチル化を低減させることによってｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるニューロンの老化を方向付けて、遅発性神経変性障害の疾患モデルを確立するための方法を提供する。理論に束縛されることを意図せずに述べると、ドナーの年齢および／または疾患と関連するマーカーは、ｉＰＳＣベースの再プログラム化中にリセットされ、その後のｉＰＳＣ由来の細胞系統への分化後には再確立されないことが考えられる。したがって、本開示は、ｉＰＳＣ由来の細胞系統を分化させ、１つまたは複数の年齢関連マーカーおよび／または疾患関連マーカーであって、それらのマーカーの存在または非存在が、１つまたは複数の年齢関連マーカーシグネチャーおよび／または疾患関連マーカーシグネチャーおよび／または細胞挙動を含みうるマーカーを再確立するための方法を提供する。これらの実施形態のある特定の態様では、ｉＰＳＣの分化を、Ｗｎｔ阻害剤および／または１種もしくは複数種のＳＭＡＤ阻害剤を含むがこれらに限定されない、１種または複数種の化合物により惹起する。ｉＰＳＣを分化させる方法は、各々が参照によりその全体において組み込まれる、２０１０年２月１７日に出願された、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／０２４４８７号；２０１１年５月１９日に出願された、同第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０３７１７９号；２０１２年１１月２日に出願された、同第ＰＣＴ／ＵＳ１２／０６３３３９号；２０１４年４月２８日に出願された、同第ＰＣＴ／ＵＳ１４／０３５７６０号；２０１４年１１月２１日に出願された、同第ＰＣＴ／ＵＳ１４／０６６９５２号；２０１４年４月１６日に出願された、同第ＰＣＴ／ＵＳ１４／０３４４３５号；ならびに２０１５年６月１日に出願された、米国仮出願第６２／１６９４４４号；および２０１５年６月１日に出願された、同第６２／１６９３７９号により記載されている。
【０１８０】
ｉＰＳＣ技術の到来は、広範にわたる遺伝性障害のための治療の開発を加速する潜在的可能性を有し、疾患過程についての日常的な研究を繰り返しうる細胞培養プラットフォームを提示する。ｉＰＳＣ法はまた、疾患過程への機構的洞察をもたらす可能性もあり、したがって、将来の薬物開発のための標的部位を同定することもできる。
【０１８１】
年齢という構成成分を、遅発性障害のｉＰＳＣベースのモデルへと導入するための方法が開示される。本明細書で記載される通り、確立された体細胞培養物の再プログラム化は、人工多能性幹細胞由来の未成熟細胞型であって、罹患した老化個体において発生する、遅発性障害および／または疾患の表現型を呈示しない細胞型をもたらす。したがって、一実施形態では、本開示は、ゲノム核酸メチル化のレベルを低減させることにより、「年齢」および／または「成熟」を、ｉＰＳＣ由来の細胞型へと導入するための方法を提供する。多様な細胞型および老化についてのマーカーの例は、表２および表３に列挙されるものを含むがこれらに限定されない。
【０１８２】
これらの方法についての一態様では、ｉＰＳＣ由来体細胞は、遅発性疾患および／または障害の表現型の１つまたは複数のマーカーを呈示する。これらの方法についての関連態様では、許容度の大きい状態は、ｉｎ  ｖｉｖｏの老化ＰＤ脳内で観察される細胞応答と緊密に符合する、１つまたは複数の細胞応答を含む。本明細書で開示される通り、１つまたは複数の経時的マーカーシグネチャーを含む、１つまたは複数の経時的マーカーを、ｉＰＳＣ細胞培養物内でモニタリングすることもでき、再プログラム化することもでき、かつ／または誘導することもできる。ｉＰＳＣ由来の細胞培養物モデルにおいて、経時的マーカーシグネチャーを誘導することにより、遅発性ヒト疾患のモデル化および治療標的の発見を改善し、より一般に、ヒト疾患および年齢に関連する根本的疑問に取り組む。
【０１８３】
本明細書で開示される方法は、ｉＰＳＣ技術を援用して、年齢関連マーカーをリセットし、神経疾患についての細胞培養物モデルにおいて、これを再確立する。ドナー細胞型のＤＮＡメチル化の残留など、ある特定のエピジェネティック特徴は、ｉＰＳＣを得た後に、少なくとも一過性に保持することができる（Ｋｉｍら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２９巻：１１１７〜１１１９頁（２０１１年）；Ｋｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ、４６７巻：２８５〜２９０頁（２０１０年）；およびＰｏｌｏら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２８巻：８４８〜８５５頁（２０１０年））。本開示は、例えば、線維芽細胞など、初代老化細胞における経時的マーカーは、ｉＰＳＣへと変換し、再プログラム化されたｉＰＳＣを、その後、線維芽細胞および／またはニューロン細胞などの体細胞へと分化させても再獲得されないことを裏付けるデータを提示する。  
【０１８４】
したがって、本開示は、異なる細胞型内の経時的マーカーシグネチャーおよび／または機能特徴を比較するための方法を提供する。例えば、中枢神経系内の増殖細胞（例えば、星状細胞）および有糸分裂後細胞（例えば、ニューロン）のいずれも、本明細書で開示される方法により産生し、老化させ、細胞の増殖および成熟と細胞型特異的な老化シグネチャーとの関係について研究するためのモデル系として使用することができる。多様な細胞型および老化についてのマーカーの例は、表２および表３に列挙されるものを含むがこれらに限定されない。
【０１８５】
ある特定の実施形態では、細胞を、メチル化の阻害剤、例えば、シチジンのヌクレオシド類似体、例えば、ゼブラリン（１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２（１Ｈ）−ピリミジノンまたはピリミジン−２−オンβ−Ｄ−リボフラノシドとしてもまた公知である）と接触させることにより、細胞内のゲノム核酸メチル化のレベルを低減する。
【０１８６】
ある特定の実施形態では、薬剤は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）の阻害剤、例えば、ＤＮＭＴに結合する抗体もしくはその断片、またはＤＮＭＴ酵素の発現を低減もしくは阻害するアンチセンスもしくはｓｉＲＮＡ分子を含む。
【０１８７】
５．２．３  包括的トランスクリプトームおよびメチル化
本開示は、例えば、ＲＮＡ−Ｓｅｑによる、ｍＲＮＡのシークエンシングにより、包括的トランスクリプトームを評価するための方法を提供する。本開示はまた、例えば、ＥＲＲＢＳ（強化型減少表示バイサルファイトシークエンシング）を使用して、５−メチルシトシン（５−ｍＣ）および／またはＤＮＡメチル化シグネチャーを測定することにより、包括的なＤＮＡメチル化を測定する方法も提供する。例えば、細胞の発生および再プログラム化の一構成成分は、ＤＮＡメチル化およびヒストンマーカーのエピジェネティック改変を含む。５−メチルシトシン（５−ｍＣ）および５−ヒドロキシメチルシトシン（５−ｈｍＣ）のいずれも、ニューロンの分化中および神経変性条件下（それぞれ、Ｓｚｕｌｗａｃｈら、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１４巻：１６０７〜１６１６頁（２０１１年）；ならびにＩｒｉｅｒおよびＪｉｎ、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、３１巻（増刊１号）：Ｓ４２〜４８頁（２０１２年））で、根本的に改変される。しかし、これらのエピジェネティックマーカーの機能的な役割は、分化させたｉＰＳＣおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける年齢モデル化の文脈で完全に探索されているわけではない。したがって、本明細書で開示される、神経変性疾患の遅発性をモデル化するための再プログラム化／分化／老化パラダイムは、これらのエピジェネティック変化およびこれらの遺伝子発現に対する影響を探索するためのプラットフォームを提示する。
【０１８８】
本明細書で記載される方法は、年齢関連初代線維芽細胞内およびそれらのｉＰＳＣにおけるゲノムワイドの５−ｍＣプロファイルおよび５−ｈｍＣプロファイルの決定を提供する。例えば、ｉＰＳＣは、５−ｍＣマーカーにおいて、それらの初代線維芽細胞より有意により多くメチル化されている（WuおよびZhang、Cell  Cycle、１０巻：２４２８〜２４３６頁（２０１１年））。
【０１８９】
一実施形態では、本開示は、ＤＮＡメチル化データおよびトランスクリプトミクスデータを、年齢関連表現型マーカーシグネチャーデータと統合して、細胞の年齢についてのより正確な記載をもたらすための方法を提供する。一実施形態では、年齢のより精密な特徴付け（例えば、複数の老化マーカー、例えば、表２および表３に列挙されるマーカーの発現を測定することによる）により、ｉＰＳＣ由来の細胞培養物など、体細胞培養物を使用して、遅発性疾患のモデル化を改善する。
【０１９０】
いくつかのコンピュータ解析により、データの統合を実施して、遺伝的（エピジェネティック）変化の、老化に対する機能的な影響を同定することができる。例えば、ＤＮＡメチル化と遺伝子発現との統合解析を実施して、「老齢」線維芽細胞を識別する、調節異常経路および「駆動」イベントを同定することができる。これらの解析は、老化線維芽細胞内および低メチル化誘導性ｉＰＳＣ線維芽細胞内に存在するエピジェネティック変化と転写変化との機能的関係の同定を伴う。
【０１９１】
１つの手法は、メチル化状態による遺伝子発現の直接的な調節を同定することである。５−ｍＣプロファイリングまたは５−ｈｍＣプロファイリングによる差次的なメチル化領域は、ＤＮＡメチル化により調節される可能性が最も高い、近位遺伝子と関連しうる。次に、これらのメチル化の変化と最も相関する遺伝子発現の変化を同定することができる。
【０１９２】
別の手法は、エピジェネティック変化および転写変化の両方により相互に調節される共通の経路の同定に焦点を当てることである。メチル化状態の異常により同定される遺伝子および／または差次的に発現する遺伝子に対して、機能的な強化解析を実施することができる（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、１０２巻：１５５４５〜１５５５０頁（２００５年））。
【０１９３】
それらの全てが、遺伝子間の相互作用を考慮に入れて、機能的「モジュール」（特異的な細胞機能または細胞経路に関与し、共調節される相互接続遺伝子の群（Ｍｅｒｉｃｏら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、５巻：ｅ１３９８４頁（２０１０年）））を同定する、ＳＰＩＡ４３、ＮｅｔＢｏｘ４４、およびＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｍａｐを含むがこれらに限定されないツールを使用して、これらの遺伝子セットのネットワーク的接続性を探索することができる。よって、メチル化データセットおよび遺伝子発現データセットのいずれにおいても高い度数で表される経路は、老化過程について機能的に関与性である可能性が高い。
【０１９４】
遺伝子発現シグネチャーおよび機能的経路の摂動の、年齢関連マーカーシグネチャーとの相関は、細胞の老化を駆動する遺伝過程を決定しうる。例は、差次的発現および／または差次的メチル化などの遺伝性変化の関数としての、年齢関連バイオマーカーシグネチャー（例えば、ヘテロクロマチン状態、ＤＮＡ損傷、および核形態）に由来する定量的リードアウトのモデル化を伴う。回帰モデル（リッジ回帰、レッソ回帰、部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰、またはサポートベクトル回帰など）は、差次的なメチル化領域を、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３マーカーにより定量的に測定されるヘテロクロマチンの変化と相関させうる。同様に、差次的なメチル化および発現遺伝子は、損傷したミトコンドリア機能からＤＮＡ損傷応答を識別するように、単純ベイズ分類器、ロジスティック回帰、およびサポートベクトルマシンなどのアルゴリズムを使用する、教師ありの分類スキームにおいても使用することができる。
【０１９５】
これらの想定されるコンピュータモデルはまた、老化表現型を最もよく予測するゲノム特徴の最小のセットももたらしうる。回帰スキームおよび分類スキームの両方における多様な特徴選択法を使用して、年齢バイオマーカーアッセイを最もよく予測する、遺伝子およびエピジェネティック改変を同定することができる。例えば、ｑＰＣＲを使用して、検証を目的として使用されるサブセットを同定することができる。代替的に、ＲＮＡｉ実験を使用して、機能的関係について調べることができる（Ｌｉｐｃｈｉｎａら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、２５巻：２１７３〜２１８６頁（２０１１年））。
【０１９６】
５．２．４細胞老化の機能的特徴
一部の実施形態では、本開示は、誘導性老化と経時的老化との関係を調べるための方法を提供する。これらの実施形態のある特定の態様では、誘導性老化過程は、可逆性である。他の態様では、誘導性老化モデルおよび経時的老化モデルは、ヒト脳における年齢を研究するのに関与性の新規のマーカーセットを含む。
【０１９７】
５．２．５  年齢関連マーカーの感度
時系列および低メチル化誘導性細胞老化を使用して、年齢関連マーカーの感度を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて調べることができる。例えば、年齢関連マーカーの変化は、ドナーがある特定の年齢（例えば、＞７０歳）に到達すると、突然生じる場合もあり、老齢が進むにつれ、年齢関連マーカーの発現が漸次増大する場合もある。
【０１９８】
健常ドナー個体から、３つの異なる年齢群：（ｉ）０〜１５歳、（ｉｉ）３０〜５０歳、（ｉｉｉ）７０〜９０歳の体細胞、例えば、初代線維芽細胞を得ることができる。確立された年齢関連マーカーシグネチャー（例えば、核ラミナ構造、ヘテロクロマチン、ＤＮＡ損傷、およびミトコンドリアの損傷）のほか、新たに発見された年齢関連マーカーシグネチャーおよび／または遺伝性マーカーを決定することにより、マーカーの発現と線維芽細胞ドナーの個体年齢との関係を決定しうる。例えば、年齢関連マーカーシグネチャーの発現は、同一の継代数で維持された各線維芽細胞系について、かつ、各年齢群につき少なくとも３つずつの線維芽細胞系について、独立の３連で決定することができる。これらの時間経過データを、ゲノム核酸メチル化のレベルが低減している、８２歳のドナー個体に由来するｉＰＳＣ由来の線維芽細胞系および１１歳のドナー個体に由来するｉＰＳＣ由来の線維芽細胞系と比較する。
【０１９９】
これらのデータの解析により、年齢関連アッセイの感度、および多様な年齢マーカー間の関係を決定することができる。これらのデータは、年齢関連表現型内および年齢関連表現型間に現存する階層性についての情報をもたらしうる。第２に、これらのデータを使用して、低メチル化で処理されたｉＰＳＣ由来の線維芽細胞における所与の表現型についての「年齢同等物」を、多様なドナー年齢の初代線維芽細胞と対比して正確に示し、低メチル化への曝露後における一時的変化が、高齢化させる場合のドナー個体に由来する初代線維芽細胞において観察される経時的変化にマッチするのかどうかを評価することができる。  
【０２００】
５．２．６  線維芽細胞の可逆性
一部の実施形態では、本開示は、線維芽細胞内のゲノム核酸メチル化のレベルを低減するか、または増大させるための方法を提供する。関連する態様では、方法は、線維芽細胞を、年齢関連マーカーシグネチャーの表現型の変化の順序についてモニタリングするステップをさらに含む。
【０２０１】
５．２．７  ニューロンの可逆性
ある特定の実施形態では、本開示は、中脳ドーパミンニューロンの培養物における、ゲノム核酸メチル化のレベルを低減するか、または増大させるための方法を提供する。他の態様では、方法は、ニューロンを、年齢関連マーカーシグネチャーの表現型の変化の順序についてモニタリングするステップをさらに含む。
【０２０２】
５．３  パーキンソン病のモデル化
パーキンソン病は、米国内で罹患した患者約０．５〜１．０×１０６例の有病率を有する。症状は、硬直、振戦、動作緩慢（運動の緩慢さ）、および／または平衡感覚／歩行の不良を含むがこれらに限定されない。臨床病理学では、ＰＤを、主に、中脳ドーパミンニューロンの喪失により診断する。ＰＤの病因は、大部分が未知であり、散発性であるが、複数の遺伝子が、ＰＤの家族性形態に関与している。
【０２０３】
一実施形態では、本開示は、細胞の老化を誘導して、例えば、ＰＤモデル系として援用されうる、遅発性神経変性疾患細胞を生み出すステップを含む方法を提供する。ある特定の態様では、細胞は、人工多能性幹細胞である。
【０２０４】
誘導性の細胞老化は、遅発性神経変性疾患の年齢関連態様をモデル化する系を提示する。このような系を使用して、疾患表現型における遺伝的感受性と年齢関連脆弱性との相互作用について直接調べることができる。
【０２０５】
本開示はまた、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンにおいて細胞年齢を誘導するための方法も提示する。ある特定の態様では、これらの方法は、パーキンソン病（ＰＤ）における年齢依存性作用をモデル化するために援用することができる。本明細書で提示されるデータは、以下の問題：例えば、（ｉ）真正のｍＤＡニューロンを発生させるように方向付けられた分化技法を使用すること；（ｉｉ）広範囲にわたる遺伝性ＰＤ−ｉＰＳＣ細胞系を確立すること；（ｉｉｉ）年齢関連マーカーシグネチャーの表現型をｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロン内で検証すること；（ｉｖ）年齢表現型と疾患表現型との相互作用について裏付けること；および（ｖ）遺伝子編集ＰＤ−ｉＰＳＣ細胞系を確立することについて取り組む。これらの遺伝子編集細胞系は、年齢誘導脆弱性と対比した遺伝的感受性の理解に寄与しうる。
【０２０６】
本開示はまた、少なくとも１つのＰＤ−ｉＰＳ細胞を含む細胞も提示する。一態様では、ＰＤ−ｉＰＳ細胞は、ＰＤ患者の皮膚線維芽細胞に由来する。他の態様では、ＰＤ−ｉＰＳ細胞をもたらす線維芽細胞は、Ｐａｒｋｉｎ、ＰＩＮＫ１、ＬＲＲＫ２、α−シヌクレイン、およびグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）（Ｋｉｔａｄａら、Ｎａｔｕｒｅ、３９２巻：６０５〜６０８頁（１９９８年）；Ｖａｌｅｎｔｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０４巻：１１５８〜１１６０頁（２００４年）；Ｚｉｍｐｒｉｃｈら、Ｎｅｕｒｏｎ、４４巻、６０１〜６０７頁（２００４年）；Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７６巻：２０４５〜２０４７頁（１９９７年）；Ｔｏｆｔら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、６６巻：４１５〜４１７頁（２００６年））を含む群から選択される少なくとも１つの変異を含む。したがって、ＰＤ−ｉＰＳ細胞をもたらす線維芽細胞は、疾患表現型を発現させる。
【０２０７】
ある特定の実施形態では、本出願は、低メチル化を誘導して、ＰＩＮＫ１変異体またはＰａｒｋｉｎ変異体のパーキンソン病個体のいずれかに由来するｉＰＳＣ由来の中脳ドーパミン細胞培養物に由来するｍＤＡニューロンにおいて、加速された樹状突起変性表現型および／または樹状突起短縮表現型をもたらす方法を提供する。
【０２０８】
５．４  処置法
細胞は、本明細書で提示される方法に従う、未分化のｉＰＳ細胞の発生における使用のために健常被験体、危険性がある被験体および罹患した被験体から単離することもでき、当技術分野で利用可能な他の方法で単離することもできる。再プログラム化するために使用される初代体細胞は、細胞の「年齢」またはドナーの「年齢」に関わらず、線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、白血球、循環白血球、粘膜細胞、および角化細胞を含むがこれらに限定されない、循環細胞および／または患者／被験体の組織内の細胞など、様々な体内の位置から単離することができる。一部の態様では、初代体細胞は、若齢ドナーから単離された、「若齢」細胞マーカーシグネチャーを発現させる若齢細胞であって、疾患シグネチャーを発現させる場合もあり、発現させない場合もある細胞でありうる。他の態様では、初代体細胞は、「老齢」マーカーシグネチャーを発現させる老齢細胞でありうる。さらなる態様では、初代体細胞は、ドナーの経時的年齢に関わらず、疾患マーカーシグネチャーを発現させる細胞でありうる。ｉＰＳＣを体細胞から発生させるための任意の方法を使用して、これらの初代細胞を、培養物中で再プログラム化して、ｉＰＳＣをもたらすことができる。当技術分野では、本明細書で記載または言及される方法以外のこのような方法が公知である。
【０２０９】
発生させた任意の由来のｉＰＳ細胞であって、本明細書で記載される方法により発生させた細胞を含むｉＰＳ細胞を、分化するｉＰＳＣ由来細胞および分化させたｉＰＳＣ由来細胞を産生するための分化プロトコールであって、低メチル化による老化組成物および本開示の方法において使用されうる分化プロトコールにおいて使用することができる。分化するｉＰＳＣ由来細胞および分化させたｉＰＳＣ由来細胞は、それらが、それらの特定の細胞型、すなわち、許容細胞の遺伝子マーカーシグネチャーおよび細胞マーカーシグネチャーを発現させることが可能である限りにおいて、部分的に分化させた（すなわち、分化する）細胞を含む、デフォルトおよび非デフォルトの分化細胞系統を含むがこれらに限定されない。本開示の低メチル化方法を使用する老化の誘導において使用されうる細胞型の例は、ニューロン（運動ニューロン、大脳皮質ニューロン、末梢感覚ニューロン、中脳ドーパミンニューロンなど、任意の亜型）、心筋細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、膵臓ベータ細胞、星状細胞などを含むがこれらに限定されない、ｉＰＳＣ由来細胞である。
【０２１０】
したがって、本開示による低メチル化処理では、ある特定の段階にあるｉＰＳ由来細胞であって、分化を経始めつつあるｉＰＳ由来細胞、コミットした細胞型へと進行しつつあるｉＰＳ由来細胞、成熟細胞型へと進行しつつあるｉＰＳ由来細胞などを含むがこれらに限定されないｉＰＳ由来細胞が使用される。例えば、ｉＰＳＣ由来の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆物質（例えば、健常被験体に由来する）を、本開示に従い老化させることができ、ＰＤ患者へと導入するために、細胞ベースの治療において使用することができる。したがって、本開示は、本明細書で記載される老化細胞を含む医薬組成物を提供する。
【０２１１】
本明細書に記載の老化を誘導する方法と共に使用されうる、特異的なｉＰＳＣ由来の細胞型および関連疾患の非限定的な例は、神経変性疾患のためのｉＰＳＣ由来ニューロン、心臓変性疾患のためのｉＰＳＣ由来の心筋細胞、白血病ならびに他の白血球疾患および白血球障害、ならびに、より一般に、造血器疾患／障害のためのｉＰＳＣ由来の造血幹細胞、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、およびＩＩ型糖尿病など、ある特定の他の種類のインスリン調節障害のためのｉＰＳＣ由来の膵臓ベータ細胞、ＡＬＳのためのｉＰＳＣ由来の運動ニューロン、アルツハイマー病のためのｉＰＳＣ由来の大脳皮質ニューロン、大脳皮質基底核変性症のためのｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンおよびｉＰＳＣ由来の大脳皮質ニューロン、神経変性障害のためのｉＰＳＣ由来の星状細胞、心肥大および心臓線維症のためのｉＰＳＣ由来の心筋細胞などを含む。
【０２１２】
一部の実施形態では、本開示のｉＰＳＣを、未成熟であるか、または成熟するのに長時間を要する体細胞型（例えば、細胞におけるタンパク質発現、遺伝子発現プロファイル、機能試験などにより評価される）へと分化させる。このような未成熟細胞内のゲノム核酸メチル化レベルを低減して、細胞集団内で成熟を誘導することができるので、これらの細胞は、細胞療法において使用することができる。このような未成熟のｉＰＳＣ分化細胞の例は、ペースメーカー活性、ドーパミントランスポーターであるＤＡＴの発現、および神経メラニンを欠き、パーキンソン病マウスをレスキューするのに、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてさらに５カ月間にわたる成熟を要求する、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンである（Isacsonら、Trends  Neurosci、２０巻：４７７〜４８２頁（１９９７年）；Kriksら、Nature、４８０巻：５４７〜５５１頁（２０１１年））。さらに、ＢｒａｉｎＳｐａｎ：Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ（http://www.  brainspan.org）に基づくと、多能性幹細胞由来の神経細胞からの遺伝子発現データは、妊娠初期の胎児のトランスクリプトームにマッチする。細胞療法および／または薬物開発における使用のために想定される所望の成熟ニューロンの亜型に特徴的であると上記で列挙されたマーカーについて評価される、未成熟ニューロンの成熟を加速する目的で該未成熟ニューロン内のゲノム核酸メチル化レベルを低減することができる。特に、本開示の方法によりもたらされる細胞は、薬物のスクリーニング、すなわち、老化制御剤のための化合物候補、本明細書で記載される疾患または障害など、特異的な疾患または障害を処置するための薬剤などの評価において用途を見出すことができる。
【０２１３】
ｉＰＳＣ由来細胞を使用する他の例は、ｉＰＳＣに由来する造血幹細胞（ＨＳＣ）であって、成体ＨＳＣのシグネチャーマーカーを発現させず、成体マーカーシグネチャー（限定なしに述べると、ＨｏｘＢ４、Ｔｅｋ（Ｔｉｅ２としてもまた公知の）、およびＨｏｘＡ９を含む）の発現を誘導する、低メチル化処理から利益を得る可能性があるＨＳＣである。他のマーカーの例については、マウスから精製された、発生しつつあるＨＳＣのトランスクリプトームについて示す、ＭｃＫｉｎｎｅｙ−Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、１１巻：７０１〜７１４頁（２０１２年）を参照されたい。
【０２１４】
別の例として、ｉＰＳＣに由来する心筋細胞は、未成熟であり、本開示のナトリウム電流の増大、リドカインに対する感受性の低減、拍動頻度、テトロドトキシン（ＴＴＸ）に対する感受性、およびアクチニンなどのサルコメアタンパク質の組織化パターンなどの電気生理学的特性を含むがこれらに限定されない、成熟マーカーの誘導を同定するための方法において使用される。
【０２１５】
ｉＰＳＣに由来するベータ細胞は、本開示の方法において用途が見出され、細胞療法および／または薬物開発における使用が想定される。特に、ｉＰＳ由来のベータ細胞内のゲノム核酸メチル化のレベルの低減は、未成熟細胞において見出されない、グルコースに応答する、インスリンの発現およびインスリンの放出を誘導する能力と共に、成熟マーカーであるＵｃｎ３の発現を誘導するために使用することができる。例えば、Blum-Meltonら、Nat  Biotechnol、３０巻：２６１〜２６４頁（２０１２年）は、ベータ細胞の成熟が、ＧＳＩＳの、低グルコースレベルに対する感受性の低下、およびＵｃｎ３の発現の増大であって、インスリンおよびＵｃｎ３についての細胞内ＦＡＣＳ解析により示される低下および増大により規定されるのはどこであるのかを示す。
【０２１６】
本明細書で開示される老化（または若返り）細胞は、障害、例えば、パーキンソン病（ＰＤ）またはアルツハイマー病（ＡＤ）を処置または防止するために、被験体へと全身投与するかまたは全身に施すこともでき、直接投与するかまたは直接施すこともできる。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される細胞を、目的の器官（例えば、神経障害の影響を受ける器官、例えば、中枢神経系（ＣＮＳ））へと、直接注射する。本明細書で開示される細胞は、被験体のＣＮＳへと、直接投与（注射）することができる。
【０２１７】
本明細書で開示される細胞は、任意の生理学的に許容されるビヒクル中で投与することができる。本明細書で開示される細胞と、薬学的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物もまた提供される。本明細書で開示される細胞およびこれを含む医薬組成物は、局所注射、同所（ＯＴ）注射、全身注射、静脈内注射、または非経口投与を介して投与することができる。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される細胞は、神経障害（例えば、ＰＤまたはＡＤ）を患う被験体へと、同所（ＯＴ）注射を介して投与する。
【０２１８】
本明細書で開示される細胞およびこれを含む医薬組成物は、選択されたｐＨへと緩衝されうる、滅菌液体調製物、例えば、等張水溶液、懸濁液、エマルジョン、分散液、または粘性組成物として提供されると好都合でありうる。液体調製物は通常、ゲル、他の粘性組成物、および固体組成物より、調製が容易である。加えて、液体組成物は、とりわけ注射により投与するのに、多少、より好都合である。他方、粘性組成物は、特異的な組織との接触時間を、より長くするのに、適切な粘性範囲内で製剤化することができる。液体組成物または粘性組成物は、例えば、水、食塩液、リン酸緩衝食塩液、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒でありうるキャリアを含みうる。滅菌注射用溶液は、本明細書で開示される対象物の組成物、例えば、本明細書で開示される細胞を含む組成物を、要求量の適切な溶媒中に、所望に応じて、多様な量の他の成分と共に組み込むことにより調製することができる。このような組成物は、適切なキャリア、希釈剤、または賦形剤、例えば、滅菌水、生理食塩液、グルコース、デキストロースなどとの混合物であり得る。組成物はまた、凍結乾燥させることもできる。組成物は、所望の投与経路および調製物に応じて、湿潤剤、分散剤、または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化または粘性増強添加剤、保存剤、芳香剤、着色剤などのような補助物質を含有しうる。参照により本明細書に組み込まれる、「REMINGTON'S  PHARMACEUTICAL  SCIENCE」、１７版、１９８５年などの標準的な教科書を照会して、不要な実験を伴わずに、適切な調製物を調製することができる。
【０２１９】
組成物の安定性および無菌性を増強する、多様な添加剤であって、抗微生物保存剤、抗酸化剤、キレート化剤、および緩衝剤を含む添加剤を、添加することができる。微生物作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸など、多様な抗菌剤および抗真菌剤により確保することができる。注射用医薬形態の持続吸収は、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム（alum  inurn  monostearate）およびゼラチンの使用によりもたらすことができる。しかし、本明細書で開示される対象物に従い、使用される任意のビヒクル、希釈剤、または添加剤は、本細胞に適合性でなければならない。
【０２２０】
組成物の粘性は、所望の場合、薬学的に許容される増粘剤（ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を使用して、選択されるレベルで維持することができる。メチルセルロースは、たやすく、かつ、廉価に入手可能であり、取り扱いが容易であるため、使用することができる。他の適切な増粘剤は、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カーボマーなどを含む。増粘剤（ｔｈｉｃｋｅｎｅｒ）の濃度は、選択される剤に依存しうる。重要な点は、選択された粘性を達成する量を使用することである。明らかに、適切なキャリアおよび他の添加剤の選び出しは、正確な投与経路および特定の剤形、例えば、液体剤形の性質（例えば、組成物を、液剤へと製剤化するのか、懸濁剤へと製剤化するのか、ゲル剤へと製剤化するのか、徐放形態または液体充填形態など、別の液体形態へと製剤化するのか）に依存する。
【０２２１】
当業者は、組成物の構成成分は、化学的に不活性となるように選択すべきであり、本明細書で開示される細胞の生存または有効性には影響を及ぼさないことを認識されたい。これは、化学および薬学分野の当業者には問題とならないか、または問題は、標準的な教科書を参照することにより、もしくは本開示および本明細書で引用される文献からの簡素な実験（過度の実験を必要としない）によりたやすく回避することができる。
【０２２２】
本明細書で開示される細胞の治療的使用に関する、１つの検討事項は、最適な効果を達成するのに必要な細胞の量である。最適な効果は、神経障害（例えば、ＰＤまたはＡＤ）を患う被験体のＣＮＳの再増殖、および／または被験体のＣＮＳの機能の改善を含むがこれらに限定されない。
【０２２３】
「有効量」（または「治療有効量」）とは、処置に対して有益または所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回または複数回の用量で被験体へと投与することができる。処置との関係で、有効量とは、神経障害（例えば、ＰＤまたはＡＤ）の進行を軽減するか、改善するか、安定化させるか、逆転させるか、もしくは緩徐化するか、または神経障害（例えば、ＰＤまたはＡＤ）の病理学的帰結を、他の方法で低減するのに十分な量である。有効量は一般に、医師が症例ごとに決定するものであり、当業者の技術の範囲内にある。有効量を達成するのに適切な投与量を決定する場合、いくつかの因子について考慮することが典型的である。これらの因子は、被験体の年齢、性別、および体重、処置される状態、状態の重症度、ならびに投与される細胞の形態および有効濃度を含む。
【０２２４】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される細胞の有効量とは、神経障害（例えば、ＰＤまたはＡＤ）を患う被験体のＣＮＳを再増殖させるのに十分な量である。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される細胞の有効量とは、神経障害（例えば、ＰＤまたはＡＤ）を患う被験体のＣＮＳの機能を改善するのに十分な量であり、例えば、改善された機能は、正常者のＣＮＳの機能の、約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、または約１００％でありうる。
【０２２５】
投与される細胞の量は、処置される被験体に応じて変動する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される細胞の約１×１０４〜約１×１０１０、約１×１０４〜約１×１０５、約１×１０５〜約１×１０９、約１×１０５〜約１×１０６、約１×１０５〜約１×１０７、約１×１０６〜約１×１０７、約１×１０６〜約１×１０８、約１×１０７〜約１×１０８、約１×１０８〜約１×１０９、約１×１０８〜約１×１０１０、または約１×１０９〜約１×１０１０個を、被験体へと投与する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される細胞の約１×１０５〜約１×１０７個を、神経障害（例えば、ＰＤまたはＡＤ）を患う被験体へと投与する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される細胞の約２×１０５個を、神経障害（例えば、ＰＤまたはＡＤ）を患う被験体へと投与する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される細胞約１×１０６〜約１×１０７個を、神経障害（例えば、ＰＤまたはＡＤ）を患う被験体へと投与する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される細胞約２×１０６〜約４×１０６個を、神経障害（例えば、ＰＤまたはＡＤ）を患う被験体へと投与する。有効用量と考えられるものの正確な決定は、各被験体に個別の因子であって、特定の被験体のサイズ、年齢、性別、体重、および状態を含む因子に基づきうる。当業者は、本開示および当技術分野における知見により、投与量をたやすく確認することができる。
【０２２６】
ある特定の実施形態では、神経障害を処置するために、神経障害（例えば、ＰＤまたはＡＤ）を患う被験体へと投与される細胞は、本明細書で記載される方法に従い分化および老化させた、中脳ドーパミンニューロンの集団である。ある特定の実施形態では、神経障害を処置するために、神経障害（例えば、ＰＤまたはＡＤ）を患う被験体へと投与される細胞は、本明細書で記載される方法に従い分化および老化させた、中脳ドーパミンニューロンの前駆物質の集団である。
【０２２７】
５．５  治療用化合物をスクリーニングする方法
一部の実施形態では、本明細書で記載される通りに得られる、老化したｉＰＳＣ由来の細胞型は、疾患のモデル化における、ならびに、治療剤としての使用のための新たな薬物化合物の試験における使用のためのおよび患者の処置における実際の使用のための低メチル化により老化させた細胞段階を同定するためなどの、治療上関係する発生中の細胞段階を同定するための用途を見出すことができる。したがって、一部の実施形態では、ｉＰＳＣ由来の細胞型のための初代体細胞ドナーは、ｉＰＳＣ由来の細胞／組織培養物において誘導される疾患または疾患表現型であって、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、タウオパチー、すなわち、ヒト脳内のタウタンパク質の病理学的凝集と関連する神経変性疾患のクラスなど、実際のまたはモデルの神経変性疾患、心筋細胞関連疾患（心肥大、心臓線維症、チャネル病、例えば、ナトリウムチャネルの病態、不整脈など）、膵臓疾患、造血器疾患、代謝疾患、がんなどを含むがこれらに限定されない、疾患または疾患表現型を有する。
【０２２８】
本明細書で開示される老化細胞は、障害、例えば、パーキンソン病（ＰＤ）およびアルツハイマー病（ＡＤ）などの神経障害をモデル化するのに使用することができ、疾患に関連する欠損を克服しうる候補化合物についてスクリーンするのに、プラットフォームとして働くことができる。候補化合物が、障害（例えば、ＰＤまたはＡＤ）を緩和する能力は、罹患細胞、例えば、ｉＰＳＣをＰＤ患者から得られた体細胞から調製する、そのｉＰＳＣ由来の中脳ドーパミンニューロン（ｍＤＡ）、またはその前駆物質おいて、生理学的欠損または細胞欠損をレスキューする、候補化合物の能力をアッセイすることにより決定することができる。
【０２２９】
本明細書で開示される対象物は、障害（例えば、ＰＤまたはＡＤ）を処置するのに適する化合物を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングする方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、例えば、表２または４により記載されている少なくとも１つの細胞疾患表現型をレスキューすることが可能な化合物を同定するステップを含む。
【０２３０】
ある特定の実施形態では、方法は、（ａ）（ｉ）本明細書で開示される老化細胞（例えば、ｉＰＳＣ由来のＰＤニューロンまたはその前駆体）の集団、および（ｉｉ）被験化合物を用意するステップと；（ｂ）細胞を被験化合物と接触させるステップと；（ｃ）例えば、表２または４により記載されている、１種または複数種の疾患表現型のレベルまたは存在（level  or  presence）を測定するステップであって、１種または複数種の疾患表現型の存在のレベルを低減する被験化合物を、候補治療用化合物として選択するステップとを含む。
【０２３１】
５．６  分子年齢を決定する方法
本開示は、細胞、例えば、ｉＰＳＣ由来体細胞（例えば、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞およびｉＰＳＣ由来ニューロン）などのｉＰＳＣ由来細胞の分子年齢を決定するための方法であって、第１の細胞のＤＮＡメチル化のレベルを決定するステップ、および、レベルを、若齢細胞のＤＮＡメチル化レベルと比較するステップを含み、第１の細胞のＤＮＡメチル化のレベルが、若齢細胞のＤＮＡメチル化未満である場合に、第１の細胞を、老化または老齢の分子状態を有すると同定する、方法を提供する。
【０２３２】
ある特定の実施形態では、第１の細胞のＤＮＡメチル化レベルを、ＤＮＡメチル化参照標準と比較するが、この場合、参照標準は、若齢細胞のＤＮＡメチル化レベルに対応する。
【０２３３】
ある特定の実施形態では、細胞の分子年齢を決定するための方法は、１または複数のＬｉｎｅ１（Ｌ１）、ＬＴＲ、および／またはＥＲＶ反復エレメントの発現レベルの、１または複数のＡＬＵ反復エレメントの発現レベルに対する比を決定するステップを含み、この場合、１を超える比は、細胞が老化または老齢の分子状態を有することを示す。
【０２３４】
５．７  老化を低減するための方法
ある特定の実施形態では、本開示は、細胞、例えば、ｉＰＳＣ由来体細胞（例えば、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞およびｉＰＳ細胞由来のニューロン）など、ｉＰＳＣ由来細胞の老化および／または成熟を低減するための方法であって、ゲノム核酸メチル化または他の抑制性マークのレベルを増大させ、これにより、本明細書で記載される成熟細胞および／または老齢細胞など、年齢相応細胞の、１種または複数種の時系列マーカーシグネチャーおよび／または他の年齢関連特徴の、細胞における発現レベルまたは存在を低減するステップを含む方法を提供する。これらの実施形態の一部の態様では、マーカーシグネチャーおよび／または特徴は、老化および／または１種もしくは複数種の疾患表現型と関連する。ある特定の実施形態では、方法は、遺伝子発現に対する、ゲノムワイドのエピジェネティックサイレンシング、およびより若々しい細胞状態を再確立するか、または増大させる。
【０２３５】
例えば、細胞型特異的時系列マーカーシグネチャーは、表１および２で提示される１種もしくは複数種の疾患表現型または時系列マーカーの組合せ、ならびに／または表１および２で提示される時系列マーカーのうちの１種もしくは複数種の非存在を含みうるがこれらに限定されない。細胞型に特異的な特徴は、例えば、老化したｉＰＳＣ由来のドーパミンニューロン内の神経メラニンの蓄積など、１種または複数種の表現型を含みうるがこれらに限定されない。ニューロンにおける疾患表現型（パーキンソン病に関連する）は、樹状突起の顕著な変性、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）発現の進行性の喪失、および／またはミトコンドリアの肥大もしくはレビー小体前駆物質の封入を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、本出願は、パーキンソン病（ＰＤ）−ｉＰＳＣ由来のドーパミンニューロンの低メチル化誘導性老化であって、遺伝的感受性に基づきうる疾患表現型をもたらす老化を提供する。
【０２３６】
本発明の方法は、若齢（young）細胞または若々しい（youthful）細胞の、体細胞（ｉＰＳＣ由来細胞であれ、初代細胞であれ）または幹細胞または完全分化細胞もしくは部分的分化細胞からの産生に適用することができる。
【０２３７】
本開示はまた、（１）細胞における成熟または老化を低減し、「老化」細胞または「成熟」細胞のマーカーシグネチャーを提示する体細胞、幹細胞、および／または幹細胞誘導性体細胞を含む細胞において、若々しさを促進するための方法；（２）例えば、パーキンソン病（ＰＤ）など、遅発性疾患および／または障害を有する被験体を処置するための、本明細書で記載される方法；ならびに細胞培養物（体細胞培養物であれ、幹細胞培養物であれ、ｉＰＳＣ由来細胞培養物であれ、初代細胞培養物であれ、分化途上の細胞であれ）における老化の低減を使用して、年齢相応細胞の培養物中の、パーキンソン病（ＰＤ）など、遅発性疾患および／または障害における時系列効果について研究するための方法に従い調製された、年齢を低減した細胞の治療的使用法；ならびに（３）１種もしくは複数種の時系列マーカーを産生するｉＰＳＣ由来年齢相応細胞、または１種もしくは複数種の時系列マーカーを産生しないｉＰＳＣ由来年齢相応細胞であって、これらの時系列マーカーの存在または非存在が、時系列マーカーシグネチャーおよび／または特定の細胞表現型に特徴的である、ｉＰＳＣ由来年齢相応細胞を含むｉＰＳＣ由来細胞（表１〜３を参照されたい）も提供する。
【０２３８】
ある特定の実施形態では、本出願の方法は、細胞を、細胞内の核酸メチル化のレベルを増大させるのに十分な量かつ十分な期間、核酸メチル化を増大させる薬剤と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、細胞は、幹細胞の場合もあり、体細胞の場合もある。より特定の実施形態では、細胞は、ｉＰＳＣ由来細胞でありうる。さらにより特定の実施形態では、ｉＰＳＣ由来細胞は、ニューロンである。ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣ由来ニューロンは、中脳ドーパミンニューロン（ｍＤＡニューロン）である。ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンは、パーキンソン病を有する被験体に由来する。
【０２３９】
ある特定の実施形態では、細胞を、反復エレメント、例えば、ＬＩＮＥ１エレメントおよび／またはＭＩＲエレメントの発現を減少させるのに十分な量かつ十分な期間、核酸メチル化を増大させる薬剤と接触させる。
【０２４０】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化を増大させる薬剤は、ＰＩＷＩタンパク質および／またはＰＩＷＩ相互作用性ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）および／または体細胞のトランスポゾン保護因子である、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂおよび／またはＣＲＩＳＰＲ核酸を含む。
【０２４１】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化を増大させる薬剤は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）および／またはヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）および／またはメチル−ＣｐＧ−結合性タンパク質（ＭｅＣＰ２）および／またはＰＨＤおよびＲＩＮＧフィンガードメイン１タンパク質（ＵＨＲＦ１）を含む。
【０２４２】
ある特定の実施形態では、本出願の方法により達成される核酸メチル化の増大は、ＤＮＡ転写のエピジェネティックサイレンシングを増大させ、この場合、このようなエピジェネティックサイレンシングの増大は、抑制性ヒストンマーク、例えば、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３および／またはＨ３Ｋ２７ｍｅ３のレベルの増大を含む。
【０２４３】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化のレベルの増大は、ヒストンタンパク質Ｈ１のレベルの増大を含む。
【０２４４】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化のレベルの増大は、ヘテロクロマチンマーカーＨＰ１αのレベルの増大を含む。
【０２４５】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化のレベルの増大は、核形態マーカーラミンＢ１のレベルの増大を含む。
【０２４６】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化のレベルの増大は、ＤＮＡ損傷のマーカー、例えば、ｙＨ２Ａｘのレベルの低下を含む。
【０２４７】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化を増大させる薬剤は、サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）活性化因子、例えば、レスベラトロールを含む。ある特定の実施形態では、薬剤を、約１〜５０μＭの間、またはこの間の任意の値、例えば、約５〜５０μＭの間、または約１０〜５０μＭの間、または約２０〜５０μＭの間、または約３０〜５０μＭの間、または約４０〜５０μＭの間、または約１〜４０μＭの間、または約１〜３０μＭの間、または約１〜２０μＭの間、または約１〜１０μＭの間、または約１〜５μＭの間の濃度で投与する。
【０２４８】
ある特定の実施形態では、核酸メチル化を増大させる薬剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンを含む。ある特定の実施形態では、薬剤を、約０．５〜２０μＭの間、またはこの間の任意の値、例えば、約１〜２０μＭの間、または約５〜２０μＭの間、または約１０〜２０μＭの間、または約１５〜２０μＭの間、または約０．５〜１５μＭの間、または約０．５〜１０μＭの間、または約０．５〜５μＭの間、または約０．５〜１μＭの間の濃度で投与する。
【０２４９】
５．７．１  年齢誘導性多能性幹細胞由来の中脳ドーパミンニューロンにおける年齢の逆転または遺伝子損傷
本開示は、老化が誘導された多能性幹細胞由来の中脳ドーパミンニューロン細胞を提供する。変異体系と対照系（control  line）との、マッチさせたアイソジェニック対における疾患表現型を利用して、遺伝的感受性を細胞から除去することの効果を評価することができる。
【０２５０】
年齢表現型の逆転は、（ｉ）ｐ−ＡＫＴ活性の低下、（ｉｉ）樹状突起の変性の、対照と比較した非存在もしくは低減、または（ｉｉｉ）アポトーシス率の、低メチル化状態にあるＰＤ−ｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンと比較した低減によりモニタリングすることができる。変異させた遺伝子の遺伝子編集により、年齢関連挙動がリセットされる。
【０２５１】
５．８  キット
本明細書で開示される対象物は、細胞、例えば、ｉＰＳＣ由来体細胞（例えば、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞およびｉＰＳＣ由来ニューロン）など、ｉＰＳＣ由来細胞の老化および／または成熟を誘導するためのキットであって、老化細胞が、老化細胞の１種または複数種の時系列マーカーを発現させる、キットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、核酸メチル化の１種または複数種の阻害剤と、細胞が、老化細胞の１種または複数種の時系列マーカーを発現させるように、細胞における年齢を誘導するための指示とを含む。
【０２５２】
ある特定の実施形態では、指示は、細胞を、細胞内のＤＮＡメチル化のレベルを低下させるのに有効な量の阻害剤（複数可）と接触させることを含む。
【０２５３】
本明細書で開示される対象物は、細胞、例えば、ｉＰＳＣ由来体細胞（例えば、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞およびｉＰＳＣ由来ニューロン）など、ｉＰＳＣ由来細胞の老化および／または成熟を低減するためのキットであって、細胞の年齢を低減した後で、細胞における年齢の１種または複数種の時系列マーカーの発現を減少させる、キットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、核酸メチル化を誘導するか、または増大させる、１種または複数種の薬剤と、指示に従う細胞の処理の後で、細胞における、老化細胞の１種または複数種の時系列マーカーの発現を減少させるように、細胞における年齢を低減するための指示とを含む。
【０２５４】
ある特定の実施形態では、指示は、細胞を、細胞内のＤＮＡメチル化のレベルを増大させるのに有効な量の薬剤（複数可）と接触させることを含む。
【０２５５】
ある特定の実施形態では、キットは、本明細書で開示される細胞、例えば、中脳ドーパミンニューロン、もしくはその前駆物質など、幹細胞由来のニューロンの集団、または前記細胞を含む組成物を、神経障害、例えば、パーキンソン病またはアルツハイマー病などの障害を患う被験体へと投与するための指示を含む。指示は、障害を処置または防止するための、細胞または組成物の使用についての情報を含みうる。ある特定の実施形態では、指示は、以下：治療剤についての記載；障害またはその症状を処置または防止するための投薬スケジュールおよび投与；基本的注意（precaution）；警告；適応症；禁忌；過剰投与量についての情報；有害反応；動物薬理学；臨床研究；および／または参考文献のうちの少なくとも１つを含む。指示は、細胞を含む容器（存在する場合）上に直接印字することもでき、容器へと貼付されるラベルとして印字することもでき、容器内に、または容器と共に供給される、別個のシート、冊子、カード、またはフォルダーとして印字することもできる。
【実施例】
【０２５６】
６．実施例
本明細書で開示される対象物は、本明細書で開示される対象物を例示するものとして提示されるものであり、限定を目的として提示するものではない、以下の実施例を参照することにより、よりよく理解されよう。
【０２５７】
（実施例１）
ニューロン細胞型の指向的分化
本実施例は、方向付けられた分化技法のうちの１つの方法であって、特異的な神経細胞型を発生させる方法について記載する。中脳ドーパミン（ｍＤＡ）ニューロンなど、ＣＮＳ細胞系統のほぼ純粋な集団を、本明細書で記載される方法において使用する。Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１１年、下掲のプロトコールを使用することができる（他の方法のうちで）。
【０２５８】
略述すると、既に記載されている（Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４８０巻：５４７〜５５１頁（２０１１年））通りに、二重ＳＭＡＤ阻害プロトコールの改変形を使用して、細胞を、フロアプレートベースのｍＤＡニューロンへと方向付け得る。ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンを、分化の３０日目において、１０μＭのＹ−２７６３２（３２日目まで）、ならびにＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子、２０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）、アスコルビン酸（ＡＡ；０．２ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＧＤＮＦ（グリア細胞系由来神経栄養因子、２０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）、ＴＧＦβ３（形質転換増殖因子β３型、１ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）、ジブチリルｃＡＭＰ（０．５ｍＭ；Ｓｉｇｍａ）、およびＤＡＰＴ（１０ｎＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）を補充されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７／Ｌ−グルタミン含有培地（ＮＢ／Ｂ２７；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、ポリオルニチン（ＰＯ：ｐｏｌｙｏｒｎｉｔｈｉｎｅ；１５μｇ／ｍｌ）／ラミニン（１μｇ／ｍｌ）／フィブロネクチン（２μｇ／ｍｌ）であらかじめコーティングされたディッシュ上に、１ｃｍ２当たりの細胞２６０，０００個で再播種することができる。播種の１〜２日後、細胞を、１μｇ／ｍｌマイトマイシンＣ（Ｔｏｃｒｉｓ）で、１時間にわたり処理して、任意の残りの増殖夾雑物を死滅させることができる。ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンを、２〜３日ごとにフィードし、所与の実験のための所望の時点まで、継代せずに維持することができる。ＰＯ、ラミニン、およびフィブロネクチンを、７〜１０日ごとに培地へと添加して、ニューロンの離昇を防止することができる。
【０２５９】
（実施例２）
ｍＲＮＡ、５ｈＭＣ、およびＤＮＡメチル化についてのプロファイリング
本実施例は、本明細書で記載される年齢パラダイムにおける、ｍＲＮＡ、５ｈＭＣ、およびＤＮＡメチル化についてプロファイリングする１つの技術について記載する。これらの方法は、年齢関連因子に対する分子制御に関するデータをもたらす。
【０２６０】
５−ｍＣの検出
強化型減少表示バイサルファイトシークエンシング（ＥＲＲＢＳ）法を使用することができる。このプロトコールでは、ゲノムＤＮＡを、ＭｓｐＩ制限酵素により消化し、断片をサイズで選択して、ＣｐＧ部位について濃縮された断片を得る。これらの断片に、亜硫酸水素塩転換を施し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００３５上でシークエンシングし、シークエンシングデータを、亜硫酸水素塩処理シークエンシングのリードおよび出力を、同定されたＣｐＧ部位のメチル化状態へとマップする、特注のソフトウェアにより解析する。
【０２６１】
５−ｈｍＣの検出
Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ製のＨｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ（商標）キットを使用することができる。このプロトコールは、ビオチン部分の、５−ｈｍＣ位置への選択的付加に続く免疫沈降（ＩＰ）ステップに基づく。ＣｈＩＰ−ｓｅｑ実験と同様に、細胞の総入力およびＩＰ断片の両方をシークエンシングする。５−ｈｍＣ修飾を、バックグラウンドレベルを凌駕する高カバレッジ領域として同定する。
【０２６２】
遺伝子発現の検出
ＲＮＡ−ｓｅｑプロトコールを使用することができる。このプロトコールは、当技術分野で周知であり、ＷＣＭＣエピゲノミクスコアにおいて日常的に実施されている。シークエンシング実験は、シークエンシングの費用を軽減し、バッチエフェクトを防止する、マルチプレックス実験となる。
【０２６３】
（実施例３）
遺伝子補正ＰＤ−ｉＰＳＣ細胞系
本実施例は、遺伝子補正ＰＤ−ｉＰＳＣ細胞系（例えば、ＴＡＬＥＮベースの遺伝子ターゲティング）の使用について記載する。開示の機構を理解することは必要でないが、これらの細胞系は、ＰＤ−ｉＰＳＣと対照ｉＰＳＣとのアイソジェニック対へのアクセスであって、年齢に関連する疾患因子と、ＰＤに対する遺伝的感受性に関連する因子とをより正確に識別するアクセスをもたらすと考えられる。
（実施例４）
人工多能性幹細胞の、中脳ドーパミン細胞への代替的な分化
【０２６４】
代替的に、二重ＳＭＡＤ阻害の改変形（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２７巻：２７５〜２８０頁（２００９年））を使用して、ｉＰＳＣの神経分化を誘発することもできる。ＬＤＮ−１９３１８９（１００ｎＭ（０．５〜５０μＭの濃度の範囲にわたる）；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ（０．５〜５０μＭの濃度の範囲にわたる）；Ｔｏｃｒｉｓ、Ｅｌｌｉｓｖｉｌｌｅ、ＭＩ）、ＳＨＨ  Ｃ２５ＩＩ（１００ｎｇ／ｍｌ（１０〜２０００ｎｇ／ｍｌの濃度の範囲にわたる）；Ｒ＆Ｄ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、パルモルファミン（２μＭ（１０〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度の範囲にわたる）；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＦＧＦ８（１００ｎｇ／ｍｌ（１０〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度の範囲にわたる）；Ｒ＆Ｄ）、およびＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ；３μＭ（０．１〜１０μＭの濃度の範囲にわたる）；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）への時限式の曝露に基づく、フロアプレート誘導（参照により本明細書に組み込まれる、Ｆａｓａｎｏら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、６巻：３３６〜３４７頁（２０１０年））プロトコールを使用することができる。「ＳＨＨ」処理とは、細胞の、１００ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ  Ｃ２５ＩＩ＋パルモルファミン（２μＭ）の組合せへの曝露、すなわち接触を指す。
【０２６５】
細胞を播種し（１ｃｍ２当たりの細胞３５〜４０×１０３個）、ＤＭＥＭ、１５％のノックアウト血清代替、２ｍＭのＬ−グルタミン、および１０μＭの（１〜２５μＭの濃度の範囲にわたる）β−メルカプトエタノールを含有するノックアウト血清代替（ＫＳＲ）培地中のマトリゲルまたはゲルトレックス上（購入時の通りに使用する）（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）で培養することができる。ＫＳＲ培地は、分化の５日目から始めて、既に記載されている（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２７巻：２７５〜２８０頁（２００９年））通りに、５〜６日目において７５％（ＫＳＲ）：２５％（Ｎ２）、７〜８日目において５０％（ＫＳＲ）：５０％（Ｎ２）、および９〜１０日目において２５％（ＫＳＲ）：７５％（Ｎ２）の比で混合することにより、Ｎ２培地へと漸進的にシフトさせた。
【０２６６】
分化の１１日目において、培地を、ＣＨＩＲ（１３日目まで）、ならびにＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子、５〜１００の範囲にわたる２０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）、アスコルビン酸（ＡＡ；０．２ｍＭ（０．０１〜１ｍＭの濃度の範囲にわたる）、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ＧＤＮＦ（グリア細胞系由来神経栄養因子、２０ｎｇ／ｍｌ（１〜２００ｎｇ／ｍｌの濃度の範囲にわたる）；Ｒ＆Ｄ）、ＴＧＦβ３（形質転換増殖因子β３型、１ｎｇ／ｍｌ（０．１〜２５ｎｇ／ｍｌの濃度の範囲にわたる）；Ｒ＆Ｄ）、ジブチリルｃＡＭＰ（０．５ｍＭ（０．０５〜２ｍＭの濃度の範囲にわたる）；Ｓｉｇｍａ）、およびＤＡＰＴ（１０ｎＭ（０．５〜５０ｎＭの濃度の範囲にわたる）；Ｔｏｃｒｉｓ）を補充されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地／Ｂ２７培地（１：５０の希釈率）／Ｌ−グルタミン（有効範囲：０．２〜２ｍＭ））含有培地（ＮＢ／Ｂ２７；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へと、９日間にわたり交換することができる。
【０２６７】
２０日目において、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、細胞を解離し、高細胞密度条件（例えば、１ｃｍ２当たりの細胞３００〜４００×１０３個）下で、ポリオルニチン（ＰＯ）；１５μｇ／ｍｌ（１〜５０μｇ／ｍｌの濃度の範囲にわたる）／ラミニン（１μｇ／ｍｌ）（０．１〜１０μｇ／ｍｌの濃度の範囲にわたる）／フィブロネクチン（２μｇ／ｍｌ（０．１〜２０μｇ／ｍｌの濃度の範囲にわたる）分化培地中で（ＮＢ／Ｂ２７＋ＢＤＮＦ、ＡＡ、ＧＤＮＦ、ｄｂｃＡＭＰ（本明細書で記載される濃度の範囲にわたる）、ＴＧＦβ３およびＤＡＰＴ（本明細書で記載される濃度の範囲にわたる）であらかじめコーティングされたディッシュ上に、所与の実験のための所望の成熟段階まで再播種することができる。
【０２６８】
（実施例５）
免疫組織化学的解析
抗体のリストおよび濃度を、時系列マーカーを検出するために使用されうる、下記の表５に提供する。これらの抗体は、とりわけ、電子顕微鏡法（ＥＭ）；フローサイトメトリー（ＦＣ）；免疫細胞化学（ＩＣＣ）；免疫組織化学（ＩＨＣ）；ウェスタンブロット（ＷＢ）を含む技法により経時的マーカーを検出するために使用することができる。
【表５−１】
2018501809.tif 000009
【表５−２】
2018501809.tif 000010
【０２６９】
（実施例６）
線維芽細胞の分化
ｉＰＳＣの、線維芽細胞様細胞への分化は、Ｐａｒｋら、Ｎａｔｕｒｅ、１４１〜１４６頁（２００８年）によるプロトコールに基づくことができる。略述すると、ｉＰＳＣクローンを、Ｄｉｓｐａｓｅを使用して、酵素的に継代培養し、多細胞塊として、ＭＥＦ上で２４時間にわたり馴化され、次いで、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２および１０μＭのＹ−２７６３２を補充されたｉＰＳＣ維持培地中のゼラチンへと播種することができる。翌日、培地を、１５％のウシ胎仔血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＭｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ａｌｐｈａ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で置きかえ、その後、隔日で持続的に交換した。分化細胞は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、最初の２週間にわたり、５〜６日ごとに注意深く継代培養し、次いで、その後、トリプシン処理することができる。継代日に、Ｙ−２７６３２を、培地へと添加して、接着を支援する一助とすることができる。４週間後、線維芽細胞様細胞を、表現型評価および過剰発現研究の前に、ＣＤ−１３およびＨＬＡ−ＡＢＣの高発現レベルに基づき分取することができる。その後、分取された細胞を、１５％のウシ胎仔血清を伴うＭｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ａｌｐｈａ（Ｙ−２７６３２を伴わない）中で増殖させることができる。
【０２７０】
（実施例７）
ｍＤＡニューロンの分化
本実施例は、実施例１のプロトコールのロングバージョンを含有する。既に記載されている（Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４８０巻：５４７〜５５１頁（２０１１年））通りに、二重ＳＭＡＤ阻害プロトコールの改変形を使用して、細胞を、フロアプレートベースのｍＤＡニューロンへと方向付けることができる。
【０２７１】
ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンを、分化の３０日目において、１０μＭのＹ−２７６３２（３２日目まで）、ならびにＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子、２０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）、アスコルビン酸（ＡＡ；０．２ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＧＤＮＦ（グリア細胞系由来神経栄養因子、２０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）、ＴＧＦβ３（形質転換増殖因子β３型、１ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）、ジブチリルｃＡＭＰ（０．５ｍＭ；Ｓｉｇｍａ）、およびＤＡＰＴ（１０ｎＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）を補充されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７／Ｌ−グルタミン含有培地（ＮＢ／Ｂ２７；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、ポリオルニチン（ＰＯ；１５μｇ／ｍｌ）／ラミニン（１μｇ／ｍｌ）／フィブロネクチン（２μｇ／ｍｌ）であらかじめコーティングされたディッシュ上に、１ｃｍ２当たりの細胞２６０，０００個で再播種することができる。  
【０２７２】
播種の１〜２日後、細胞を、１μｇ／ｍｌマイトマイシンＣ（Ｔｏｃｒｉｓ）で、１時間にわたり処理して、任意の残りの増殖夾雑物を死滅させることができる。ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンを、２〜３日ごとにフィードし、所与の実験のための所望の時点まで、継代せずに維持することができる。ＰＯ、ラミニン、およびフィブロネクチンを、７〜１０日ごとに培地へと添加して、ニューロンの離昇を防止することができる。
【０２７３】
（実施例８）
老化の評価
製造元の指示に従い、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ製の染色キットを使用して、老化活性化ベータ−ガラクトシダーゼを評価することができる。陽性細胞染色は、手作業で評価した（各々細胞５０個ずつの２連）。
【０２７４】
ＨＴ−ＱＦＩＳＨによるテロメア長の測定
細胞を、底部が透明で壁面が黒色の９６ウェルプレートであって、試料１例当たりのウェル４連を含む９６ウェルプレート上に播種し、既に記載されている（Ｃａｎｅｌａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、１０４巻：５３００〜５３０５頁（２００７年））通りに、ハイスループット定量的蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＨＴ−ＱＦＩＳＨ）を実施した。画像は、２０倍の対物レンズを使用するＯｐｅｒｅｔｔａで捕捉した。Ｈａｒｍｏｎｙ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して、画像の加工を実施した。テロメア長の値は、四連試料中のＣｙ３標識テロメアプローブ（試料１例当たり＞６００個のスポット）の特異的結合に対応する個々のテロメアスポットを使用して測定し、既に記載されている（Ｃａｎｅｌａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、１０４巻：５３００〜５３０５頁（２００７年）；およびＭｃＩｌｒａｔｈら、Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、６１巻：９１２〜９１５頁（２００１年））通りに、テロメア長が既知である対照細胞系を使用して、蛍光強度をキロベースへと転換した。
【０２７５】
（実施例９）
年齢改変細胞を使用して、薬物をスクリーニングするための方法
ｉＰＳＣは、例えば、本明細書で開示される方法、およびそうでなければ当技術分野で公知の方法により、ヒト線維芽細胞から得ることができる。年齢改変体細胞は、分化およびゲノム核酸メチル化の低減により、ｉＰＳＣから得ることができる。したがって、特化した年齢改変体細胞であって、脳、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、筋肉、皮膚、肺、血液、動脈、眼、骨髄、およびリンパ系から単離された体細胞の特徴を有する細胞を得ることができる。心筋細胞（例えば、Ｖａｎ  Ｏｏｒｓｃｈｏｔ  ＡＡら、Ｐａｎｍｉｎｅｒｖａ  Ｍｅｄ．、２０１０年６月、５２巻（２号）：９７〜１１０頁を参照されたい）、肝細胞（例えば、Ａｌａｉｍｏ  Ｇ．ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２０１３年６月、２２８巻（６号）：１２４９〜５４頁を参照されたい）、腎細胞（例えば、Ｄｅ  Ｃｈｉａｒａ  Ｌ．ら、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．、２０１４年２月、２５巻（２号）：３１６〜２８頁を参照されたい）、膵臓ベータ細胞（例えば、Ｒｏｃｈｅ  Ｅ．ら、Ｊ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２０１２年、７巻（４号）：２１１〜２８頁を参照されたい）、白血球（例えば、ｄｅ  Ｐｏｏｔｅｒ  ＲＦら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、２００７年、３８０巻：７３〜８１頁を参照されたい）を含むこのような体細胞をもたらす分化プロトコールは公知である。  
【０２７６】
細胞をスクリーニングのために準備できたら、それらを播種して、多様な播種密度および細胞培養容器について調べることができる。例えば、これらの細胞は、６ウェルプレート上、２４ウェルプレート上、９６ウェルプレート上、３８４ウェルプレート上、または薬物スクリーニングを容易とする他の任意のプラットフォーム上に播種することができる。適切なＨＴＳフォーマットを選択したら、栄養素の施与中止の開始時および持続期間も最適化することになる。
【０２７７】
幹細胞由来の体細胞に基づく薬物スクリーニングについては記載されている。例えば、Ｙａｎｇら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、１２巻：７１３〜７２６頁（２０１３年）を参照されたい。略述すると、低分子による生存スクリーニングは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）におけるＭＮの死滅に対抗する薬物について探索するように、野生型のＳＯＤ１マウス胚性幹細胞および変異体のＳＯＤ１マウス胚性幹細胞の両方に由来するｉＰＳＣ由来の運動ニューロン（ＭＮ）を使用して実行した。マウスＥＳＣを、ＭＮへと分化させ、９６ウェルプレート内または３８４ウェルプレート内に播種した。加えてまた、分化の３０日後における、ヒトＥＳＣに由来するヒトＭＮおよびヒトｉＰＳＣに由来するヒトＭＮも使用した。低分子スクリーニングのために、解離されたばかりの細胞を、ウェル１つ当たりのＧＦＰ＋細胞８，０００個（３８４ウェルプレート）またはＧＦＰ＋細胞３０，０００個（９６ウェルプレート）の密度で播種した。４日後、栄養素を除去し、個々の化合物をウェルへと添加した。一次スクリーニングのため、各化合物を、３つの濃度（０．１ｍＭ、１ｍＭ、および１０ｍＭ）の２連で調べた。さらに７２時間後（７日目）、細胞を固定および染色し、全ウェル内の残りのＧＦＰ＋細胞をカウントすることにより、生存するＭＮの数を解析した。生存は、栄養素を伴わずに維持された培養物と比較した倍数の増大として測定する。この方法を使用して、Ｙａｎｇおよび同僚は、ケンパウロンという化合物が、ＭＮの健常な生存を延長する目覚ましい能力を有することを発見した。
【０２７８】
本開示で記載されている年齢改変法と、ＨＴＳプラットフォームとを組み合わせることにより、薬物スクリーニングを、遅発性ヒト疾患を表す細胞に対して実施することができる。本開示の方法によれば、適切な年齢マーカーおよび／または成熟マーカーを伴う年齢改変細胞は、体細胞から発生させることもでき、幹細胞から発生させることもできる。例えば、年齢相応のｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンは、ｉＰＳＣ由来ニューロンにおいてゲノム核酸メチル化を低減させることができる。薬物スクリーニングにおける被験細胞を播種して、多様な播種密度および細胞培養容器について調べることができる。例えば、細胞は、６ウェルプレート上、２４ウェルプレート上、９６ウェルプレート上、３８４ウェルプレート上、または薬物スクリーニングを容易とする他の任意のプラットフォーム上に播種することができる。適切なＨＴＳフォーマットを選択したら、栄養素の施与中止の開始時および持続期間も最適化することになる。
【０２７９】
薬物スクリーニングにおける使用のための分子は、自家製でデザインすることもでき、商業的に入手することもできる、低分子化合物ライブラリーを含む様々な供給源に由来しうる。年齢相応のｉＰＳＣ由来ｍＤＡニューロンの場合、パーキンソン病などの神経変性疾患のための公知の薬物分子であって、生体分子および低分子を含む薬物分子について調べることができる。このような分子を、薬物スクリーニング有効性を最適化するように、異なる細胞密度と組み合わせた、異なる濃度でスクリーニングすることができる。例えば、Ｙａｎｇらは、約５０００の低分子のコレクションについてスクリーニングして、ＡＬＳ薬について探索した。一次スクリーニングのため、各化合物を、３つの濃度（０．１ｍＭ、１ｍＭ、および１０ｍＭ）の２連で調べた。さらに７２時間後（７日目）、ＭＮ細胞を固定し、染色し、生存について評価した（Ｙａｎｇら、同上）。
【０２８０】
処置を意図する疾患のほか、これらの化合物／分子の、これらの細胞に対する意図される効果に応じて、候補化合物（低分子であれ、生物学的薬剤であれ）への曝露後における年齢改変細胞の表現型変化を選択することができる。これらの表現型の変化は、とりわけ、細胞の生存、細胞の形態変化、細胞によるある特定の因子の分泌、ある特定の細胞表面分子の発現、細胞の、他の細胞および／または固体支持体との相互作用、細胞の光学的特性、電気的特性、および化学的特性の変化、細胞の蛍光シグナル（例えば、細胞に蛍光タンパク質をトランスフェクトする場合など）、ならびに疾患マーカーの減衰または消失を含むがこれらに限定されない。本開示で記載される方法の１つの適用は、パーキンソン病およびアルツハイマー病などの神経変性疾患にとって鍵となるニューロン細胞の健常な生存を延長しうる薬物についてスクリーニングすることである。したがって、薬物スクリーニングは、ニューロンの生存を促進する化合物を選択するようにデザインすることができる。ＰＤの場合、ｉＰＳＣに由来する年齢改変ｍＤＡニューロンを培養し、播種し、化合物へと曝露し、それらの生存率を評価することができる。さらに、さらなるマーカーを、細胞の生存に加えて、薬物スクリーニングのベースとして活用することもできる。例えば、表２または表３に列挙されたマーカーなどの老化／成熟関連マーカーを、薬物スクリーニングのための基準として使用することができる。１つまたは複数の老化マーカーまたは疾患マーカーの発現を緩徐化しうるか、停止させうるか、または逆転しうる化合物であれば、これらの神経変性疾患を処置する一助となりうる薬物のための候補となりうる。
【０２８１】
ヒットとは、上記で記載した１つまたは複数の年齢関連マーカーシグネチャーまたは疾患関連マーカーシグネチャーを効果的に逆転する化合物／分子として規定することができる。例えば、細胞の生存を評価項目として使用する場合、細胞に適切な形態特徴を保存しながら、生存細胞（例えば、年齢相応のｉＰＳＣ由来ｍＤＡニューロン）の数を実質的に増大させる分子を選択することができる。
【０２８２】
一次スクリーニングから選択された候補化合物は、任意選択で、再度調べることができ、用量反応アッセイおよび毒性アッセイを含むがこれらに限定されない、さらなる試験下に置くことができる。リード化合物を選択することができ、所望の特徴を改善し、かつ／または副作用を低減するように、構造的に改変することができる。リード化合物に対する他の改善は、吸収の増大、半減期の延長、細胞に対するアフィニティーの増大、ならびに局所送達および／または全身送達の増強を含みうる。リード化合物およびその改変された変異体について、適切な細胞培養物による研究および動物モデル系による研究を含む前臨床研究でさらに研究することができ、好適な治療的プロファイルおよび毒性プロファイルを呈示する化合物は、ヒト臨床試験において、さらなるｉｎ  ｖｉｖｏ試験下に置くことができる。
参考文献
【化１】
2018501809.tif 000011
【化２】
2018501809.tif 000012
【０２８３】
（実施例１０）
低メチル化による、細胞における年齢の誘導
序説
不治の状態のための新たな治療の開発への基礎的ステップは、罹患組織の研究である。最近まで、これは、特に、パーキンソン病（ＰＤ）またはアルツハイマー病（ＡＤ）などの脳障害についての生検の入手可能性が希少であることにより妨げられていた。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）という革新的技術の恩恵により、検査室において疾患について研究するのに、無尽蔵の細胞供給源として、身体の任意の細胞型を産生させることが今や可能である。「疾患のモデル化」と称するこの技法を、ディッシュ内で疾患機構を解析するため、および患者の「ｉｎ  ｖｉｔｒｏバージョン」において、新たな薬物をスクリーニングするために使用し、有効性または副作用を予測する一助とする。
【０２８４】
多数の研究が、ｉＰＳＣは、この目的で、強力なツールであることを示しているが、今のところ、小児期早期についての状態だけが信頼できる形で再現（recreated）可能であるのに対し、老齢の障害のモデル化は、患者において生じる、極めて重大な症状を再現していない。この問題の源泉は、成体細胞を再プログラム化して、胚性状態へと戻すことからなるｉＰＳＣ法に内在する。ｉＰＳＣ法により、細胞は、身体の任意の組織を産生することが可能となるが、同時に、それらの生体時計が、新生児と同等な、極めて若齢の段階へと逆転される。最近、ｉＰＳＣ由来の細胞は、老齢ドナーに由来する元の細胞と比較して、若返ることが示されている。この現象により、老齢細胞において細胞の若さを回復するという、揺るぎない可能性が開かれる一方で、ｉＰＳＣから生み出された細胞は、若過ぎて、年齢徴候を顕示しないために、年齢依存的疾患に対するｉＰＳＣ技術の使用は排除される。
【０２８５】
これらの事実に照らして、本明細書では、再プログラム化に続く若返りが、ＤＮＡ内で、どのようにしてコードされるのかについて、初めて解明すること、および、これと並行して、ｉＰＳＣ由来の細胞における、年齢の徴候および疾患の症状を増進させるための、ディッシュ内での、自然の老化の加速についての方法を開発することが提示される。
【０２８６】
最近では、早期老化（早老症）の一因をなす疾患因子を介して、細胞年齢を急速に前進させることに成功している。これにより、ＰＤ患者の脳内で見られる細胞の異常を、ディッシュ内で再現することが初めて可能となった。しかし、新たなデータにより、早期老化と、実際の老化との間には、分子的乖離が存在しうることが示唆されることから、疾患因子の使用は、実験結果の解釈を損ないうることが指し示される。
【０２８７】
本明細書では、大半の組織の正常細胞において観察される自然の老化過程を模倣することによる、方法の改善が記載される。この機構は、核機構および従って全ての細胞過程の適正な機能を担う因子である、ＤＮＡメチル化の喪失である。異なる器官における、年齢についてのこの側面の、実証された関連性により、この技法は、様々な細胞型および疾患へと適用可能となるはずである。
【０２８８】
概要
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の出現は、疾患についての研究を革新し、疾患機構について研究するための患者特異的細胞、および薬物スクリーニングのための患者特異的細胞の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける発生を可能としている。同時に、ｉＰＳＣは、細胞の同一性の定義および順応性について調査するための、強力な生物学的パラダイムも提供している。ｉＰＳＣの、多様な系統への分化は、若々しい状態を再獲得した、胚様の性質の細胞を生み出す。この過程について理解することは、細胞年齢を制御し、おそらく逆転する分子機構を明らかにしうる。逆に、この現象は、ｉＰＳＣ由来細胞における老齢の側面を模倣し、これにより、遅発性疾患をモデル化することに対する障害となる。
【０２８９】
本実施例の一実施形態は、ドナー年齢の異なる初代細胞、およびそれらの運命をマッチさせたｉＰＳＣ由来の後代のトランスクリプトームおよびエピジェネティックプロファイリングにより、再プログラム化を介して細胞の若返りを規定する（dictate）ゲノム過程を解明することである。これにより、生物学的老化を測定するための、新たな分子マーカーの包括的セットがもたらされるほか、どの因子を操作して、細胞年齢を逆転しうるのかも、潜在的に指し示されるはずである。
【０２９０】
第２に、ｉＰＳＣ技術による年齢依存的障害のモデル化を容易とすることを目的として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて年齢を加速させる、新規の戦略を提起する。プロジェリンの発現により、ｉＰＳＣ由来のドーパミンニューロンから、年齢関連の表現型を誘導することが可能であったことは既に裏付けられている（参照により全ての目的のためにその全体において組み込まれる、２０１４年１０月２３日に公開された、国際公開第ＷＯ／２０１４／１７２５０７号を参照されたい）。本実施例により記載される手法は、プロジェリンの発現によりもたらされる疾患関連の構成成分を、老化構成成分から切り離すことを目的とする。細胞を老化させるための方法を改善するために、本実施例は、ＤＮＡメチル化の漸次の喪失である、自然発生の年齢依存的イベントを再現する（recapitulate）。異なる組織および細胞型における老化に対する、ＤＮＡ低メチル化の保存された役割を踏まえれば、このような取組みにより、複数の系統において生物学的老化を迅速に進める、簡素なツールをもたらすことができる。
【０２９１】
細胞の再プログラム化に随伴する若返り効果は、幹細胞生物学のうちの、魅力的であるが、ほんの僅かばかり探索された領域を代表する。同時に、この現象は、遅発性疾患の研究のためのｉＰＳＣの使用に対する障害も生み出す。いくつかのグループが、病理学的細胞挙動を誘発するために、細胞に、損傷剤または環境ストレス因子を負荷することにより、この限界を迂回しようと試みている２１、２２。多くの疾患、例えば、ＰＤについて、環境毒素への曝露は、主要な危険因子であるが、細胞の急性処理は、実際の疾患個体発生を再現せず、したがって、真に有意な結果をもたらさない可能性がある。
【０２９２】
細胞年齢の加速は、プロジェリンの発現を介して実施可能であり、ｉＰＳＣベースのＰＤモデルで、いまだ同定されたことがない変性表現型を誘発しうることが示されていることから、ｉＰＳＣ由来細胞において、年齢依存的表現型を促進するには、年齢の誘導が必要であるという概念が立証されている。しかし、予備的データは、早老症は、正常年齢の転写特色およびエピジェネティック特色を共有しないことを明らかにし、そのことは、プロジェリンの発現が、生理学的老化を、信頼できる形で反映しない可能性のあることを示している。このような技術的バイアスは潜在的に、アーチファクトの結果および誤解をもたらしうる。
【０２９３】
本実施例は、最新技術と、異なるドナー年齢に由来する、初代細胞系およびｉＰＳＣ由来のアイソジェニック細胞系の固有のセットとを使用して、老化および細胞の若返りの分子動態を、詳細に特徴付ける。これは、生理学的老化についての新規の分子マーカーを同定し、幹細胞分野において答えられていない、根本的な疑問である、幹細胞の若返り状態を統御する分子シグネチャーを解明する潜在的可能性を有する。実験は、包括的な低メチル化と、老化との因果関係であって、老化分野に対して深甚な影響を及ぼし、老化過程におけるＤＮＡメチル化の能動的な関与を裏付ける因果関係を求める。したがって、本明細書で記載される方法は、ｉＰＳＣ技術を介して、より正確な、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ年齢依存的疾患モデルを可能とするように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞年齢の操作のための簡素なツールを提供しうる。
【０２９４】
１．再プログラム化を介する細胞の若返りについてのゲノムプロファイリング
老化という不可避の過程を理解し、逆転することは、人類の古来の夢である。証拠は、老化のペースが、様々な介入により操ることができることを示す２、３。しかし、老化状態を逆転して、より若々しい状態へと戻すことが可能なのはほんの僅かの過程に限られており、細胞の、多能性への再プログラム化は、これらのうちに含まれる３。実際、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の発生（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）は、発生的（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ）視点から、生体時計を巻き戻すだけでなく、また、細胞年齢の特色も消去する３〜６。ｉＰＳＣの、多様な系統への再分化は、生物学的老化の多数の特質をリセットすることにより、細胞を、「若返った」ままにすることを示す揺るぎない証拠が、最近提示されている７。いくつかの研究が、この現象の異なる側面について記載しているが、これらは大半が、再プログラム化の前および後における、細胞特色の表現型の比較に焦点を当てている７〜９。多能性は、エピジェネティック機構を介して、細胞の若さを回復させうることが示唆されている４、１０が、この過程についての、踏み込んだゲノム解析は、報告されていない。若返りが、ゲノム内で、どのようにしてコードされているのかについて理解することにより、年齢の分子決定因子についての、極めて貴重な知見をもたらすことができ、細胞年齢を、細胞運命から独立して再プログラム化するための方法を考案する可能性を開き得る。
【０２９５】
この点で、本実施例は、細胞年齢を規定する転写的特色およびエピジェネティック特色が、再プログラム化および同じ細胞型への再分化の後で、どのようにしてリモデリングされて、若々しい実体（youthful  identity）を回復させるのかについて包括的に表す。これは、年齢の異なるドナーに由来する初代線維芽細胞、およびそれらのｉＰＳＣ由来線維芽細胞後代についてのゲノムプロファイリングにより達成する。この手法の強みは、細胞年齢を逆転する一方で、細胞運命を回復し、これにより、再プログラム化の前および後におけるアイソジェニック細胞を比較し、遺伝子変動性の影響を消失させるｉＰＳＣ技術の固有の利点に存在する。
【０２９６】
初代線維芽細胞系のコホートを、３つの年齢群：若齢、中年齢、および老齢から得た。３つの若齢細胞系、２つの中年齢細胞系、４つの老齢細胞系について、ｉＰＳＣを発生させ、検証し（図２）、さらなるｉＰＳＣの誘導も進行中である。ｉＰＳＣを線維芽細胞へと戻す分化は、確立されたプロトコールに従い、真正な（bone  fide）線維芽細胞の獲得は、細胞表面マーカーの発現により検証した７。トランスクリプトームプロファイルおよびＤＮＡメチル化プロファイルを、全ての初代線維芽細胞について作成した（それぞれ、ＲＮＡ−ＳｅｑおよびＥＲＲＢＳ）。老化における役割が報告されている、主要なヒストン修飾（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３）１１についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑは、最適化されている。老齢初代細胞および若齢初代細胞についての、初期トランスクリプトームデータは、若齢細胞と老齢細胞との間の、特異的な経路の差次的調節を指し示す、年齢に関連する明確な分離を示す（図３ａ）。老化は、エピジェネティックランドスケープの規定された変化、特に、ＤＮＡの低メチル化および抑制性ヒストン修飾の喪失と関連している１１、１２。本データにより、ゲノムワイドな老化細胞内のＤＮＡメチル化のレベル、ならびに抑制性マークであるＨ３Ｋ９ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３のレベルの低下が確認されることは、これと符合する（図１）。予備的な結果により、若齢および老齢ドナーのいずれによるｉＰＳＣ由来の線維芽細胞においても、メチル化のレベルが回復することが裏付けられることは興味深い（図１Ａ）。この興味深い観察は、再プログラム化されると、細胞年齢は、どのようにして逆転されうるのかについての最初の分子的暗示をもたらし、ｉＰＳＣ由来細胞内の高レベルのメチル化は、それらの胚的性質を示唆しうる。ＤＮＡメチル化の老化関連変化の頑健さを踏まえ、独立のグループが、特異的なＣｐＧ部位の、「エピジェネティック年齢予測因子」としての使用について提起している１３〜１６。特に、最近の研究は、それらのメチル化状態が、全ての被験ヒト組織および細胞型にわたり、時系列年齢と厳密に相関する、３５３のＣｐＧ部位の存在を明らかにしている１４。この「分子年齢マーカー」を、本実施例へと組み込むために、カスタマイズされたメチル化プラットフォームを開発し、現在調べている。
【０２９７】
５−ヒドロキシ−メチル−シトシン（５ｈｍＣ）は最近発見されたＤＮＡ修飾であり、多能性および脳での老化における役割が報告されている１６。初代若齢細胞および初代老齢細胞に由来する５ｈｍＣプロファイルは、現在作成されつつあり、これにより、ニューロン以外の体細胞型における、この新規のエピジェネティックマークの、可能な年齢依存的役割に対する洞察がもたらされ得る。
【０２９８】
本実施例の知見により、初代細胞における老化状態を規定する、包括的な分子特色を同定することができ、再プログラム化され、同じ細胞型へと再分化したときに、このシグネチャーが、どのようにして、完全に、または部分的に失われるのかを解明することができる。このパラダイムは、遺伝的多様性の影響を除外しながら、再プログラム化の前および後において、同じ実体（same  identity）のアイソジェニック細胞系を直接比較することの、前例のない利益を有する。このような方法により、細胞年齢の逆転を、細胞運命から切り離す試みへと適用しうる、若返りの機構を明らかにすることができる。最後に、本明細書で記載される方法により同定される分子年齢マーカーのセットは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて老化を誘導する取組みの文脈で、生物学的年齢を測定するツールとして用いられうる。
【０２９９】
加えて、本実施例では、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞のトランスクリプトームと、初代胚線維芽細胞のトランスクリプトームとを比較する。このような比較は、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞における、線維芽細胞同一性の、任意の不完全な回復であって、年齢を表すゲノム変化を同定することを目的とする比較解析に干渉しうる、不完全な回復を補完しうる。
【０３００】
２．ｉＰＳＣ由来系統内で生理学的年齢を誘導する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける老化戦略の改善
ここ数年で、ｉＰＳＣ技術は、ヒト疾患についての研究および新規の治療標的の発見のための革新的ツールであることが立証されている。実際、一連の研究の成功は、様々な障害のための、ｉＰＳＣベースの疾患のモデル化の潜在的可能性を裏付けている。しかし、最近まで、患者特異的ｉＰＳＣを使用して、発生または若年における病理だけが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて信頼できる形で再現可能であった１７〜２０。実際、いくつかの報告では、早期の分子的および生化学的疾患指標の存在が示唆されている２１〜２３が、神経変性障害など、年齢依存的状態のモデル化では、特徴的な変性表現型が再現されていない。変性の特色の欠如は、ｉＰＳＣ由来細胞の、未成熟であるまたは若々しいという性質に起因する可能性があり、よって、遅発性疾患についてのこのモデル化は、真に関与性の結果を導くのに、「年齢」を組み入れることを要求しうる。これは、プロジェリンの発現を介して、細胞年齢を加速させることにより、パーキンソン病（ＰＤ）患者からの、ｉＰＳＣ由来中脳ドーパミンニューロン（ｍＤＡ）において、変性の特色を誘発することに初めて成功した最近の研究７により裏付けられる。プロジェリンとは、ハッチンソン−ギルフォード早老症候群（ＨＧＰＳ）として公知の、早期老化の重度形態の一因をなす変異体タンパク質であり２４、ＨＧＰＳ患者に由来する細胞は、老齢ドナーに由来する細胞において見られる、多くの表現型年齢マーカーを提示する。しかし、ＨＧＰＳ小児の、老齢個体との驚くべき相似にも拘らず、分子的視点からみて、早老症が、「真の」老化と同等であるのかどうかは、依然として不確定なままである２５。ｉＰＳＣによる疾患モデルにおいて、プロジェリンを利用することの危険性は、疾患因子の使用に由来する潜在的バイアスである。共有された分子特色が、早老症細胞と、老齢細胞との間の表現型的類似性を決定するのかどうかについて調査するため、初代若齢線維芽細胞、初代老齢線維芽細胞、および早老症線維芽細胞の、遺伝子発現プロファイルおよびＤＮＡメチル化プロファイルを比較した。老化細胞と早老症細胞との間で広く共有されている、多数の表現型マーク７とは対照的に、早老症細胞のトランスクリプトームプロファイル（図３）およびエピジェネティックプロファイル（データは示さない）は、若齢健常細胞および老齢健常細胞のいずれとも、有意に異なった。この新たなデータは、包括的なゲノムレベルでは、早老症細胞が、老齢細胞と緊密に符号しないことの論拠となる。この乖離は、若齢細胞と対比した早老症細胞と比較して、若齢細胞と対比した老齢細胞において差次的に調節された遺伝子の重複が限定的であることに、さらに反映されている（図３Ｂ）。最後に、このデータについての遺伝子オントロジー解析は、若齢試料と比較して、健常老齢細胞または早老症細胞において、明らかに顕著に異なるシグナル伝達経路の富化を示す（図３Ｃ）。まとめると、これらのデータは、別個の経路が、早期老化および実際の老化の共通の表現型の基礎をなす可能性があることを指し示し、自然の老化過程に対するより高度な忠実度で、年齢を誘導する、代替的な戦略を見出す必要性を強調する。
【０３０１】
２ａ．適度のゲノムＤＮＡ低メチル化を介して誘導される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける老化のための新規の戦略
上記の２節で記載した最近の結果に照らして、自然の老化過程をよりよく反映するように改善された、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける老化のパラダイムについて記載する。本実施例では、種および組織にわたり進化的に保存された生理学的老化機構を再現するように、適度なゲノムワイドのＤＮＡ低メチル化の誘導に基づく戦略を提起する。
【０３０２】
年齢に伴う、ゲノムワイドのＤＮＡメチル化の漸次の喪失は、脊椎動物から、ヒトを含む哺乳動物まで、老化についての最も頑健な分子シグネチャーである。包括的な低メチル化は、老化細胞およびがん性細胞の両方についての分子特質である１、２、１１、１２。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるメチル化の喪失は、がんに加えた、いくつかの年齢関連疾患、特に神経変性障害と相関する１２、２６。ゲノムの低メチル化は、腫瘍形成を引き起こしうることが示されている２７、２８が、老化との機構的関連は探索されていない。ＤＮＡの低メチル化の下流のイベントは、ゲノムの不安定性をもたらすことから、変異原性イベント２２、２３、２９、または細胞の老化３０、３１をもたらすことが裏付けられている。がんの発生率は、年齢と共に大幅に増大し、年齢は、大部分のがんの主要な危険因子であり、老化細胞と腫瘍細胞とは同様なゲノムの特色を共有する３２。
【０３０３】
いかなる理論にも束縛されずに述べると、本実施例は、ある特定の閾値を下回る、変異原性イベントの非存在下では、年齢に関連するＤＮＡ低メチル化は、ゲノムの安定性を損ない、転写から修復に至る範囲の、正常な核の機能に干渉し、最終的には、老化細胞状態を規定するホメオスタシスの喪失を結果としてもたらすことを仮定する。
【０３０４】
ゲノムＤＮＡの低メチル化の効果については研究されているが、主に胚発生およびがんとの関連においてである。さらに、これらの研究は大半が、例えばノックアウトマウス３３、３４、強いハイポモルフ２７、２８、３５、または強力なＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）阻害剤による急性処理３１を介するメチル化レベルの重度の低減を伴った。ＤＮＭＴ活性の欠失または大幅な低減は、マウスにおける胚発生、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞増殖と適合性ではない２７、２８、３１、３３〜３６。細胞増殖に対して許容的なレベルまでの、慢性の、わずかなＤＮＡの低メチル化の効果については調査されていない。
【０３０５】
本実施例では、老化組織内で生じるものなど、包括的なＤＮＡメチル化の、持続的で適度の低下（−１０〜３０％）を誘導することにより、細胞における年齢の特質を再現することが可能であるのかどうかについて探索する。これはまず、弱いＤＮＭＴ阻害剤（ゼブラリン３７）を介する薬理学的手段により試み、細胞周期全体を通して、安定的な低メチル化のレベルを維持することを目的とする、「パルスおよびチェイス」処理を伴う。体細胞における主要なＤＮＭＴ活性は、ＤＮＭＴ１により媒介され、ＤＮＭＴ１は、メチル化のレベルを維持することができるが、ｄｅ  ｎｏｖｏのメチル化能は無視できる程度である３８、３９ので、阻害剤の中止により、ＤＮＭＴの機能性を復元して、元のメチル化を回復させることは期待されない。並行して、ｓｉＲＮＡを介する適度のＤＮＭＴ１ノックダウンによる、または弱いＤＮＭＴハイポモルフ変異を有する細胞系を発生させることによる４０、遺伝子法も活用する。この新たな戦略により細胞年齢を促進する能力についてはまず、最近の報告７で記載され、本実施例のために活用される細胞系において検証されたマーカーを利用して、表現型的レベルで評価する。第２に、「分子年齢」を、ゲノムスクリーンで規定される新たに同定された老化シグネチャーに基づき測定する。この新規の年齢誘導戦略の有効性についてはまず、初代線維芽細胞およびｉＰＳＣ由来の線維芽細胞において調べる。その後、このパラダイムを、ＰＤ患者に由来するｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロンなど、疾患関与性の細胞型へと適応させる。
【０３０６】
本実施例により記載される初代細胞のコホート内の、包括的なメチル化の低下のほか、それらのそれぞれのｉＰＳＣ由来の線維芽細胞におけるレベルの再増大（図１Ａ）も確認された。これらの予備的なデータにより、頑健な老化マーカーとしてのＤＮＡメチル化がさらに確認され、再獲得されたメチル化のレベルが、再プログラム化の若返り効果において役割を果たしうることを指し示す。
【０３０７】
本発明の手法は、ＤＮＡメチル化が、細胞の老化に対して、ならびに増殖を通じて下流の欠損の蓄積を可能にする低度な慢性レベルの脱メチル化を誘導するいまだ探索されていない試みにおいて、因果効果を有することを提起する。本発明の手法は、ＤＮＡメチル化と老化との間の、第１の機構的つながりを確立するだけでなく、また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて年齢を加速させる簡素なツールも提供する。
【０３０８】
本実施例では、低メチル化の影響を軽減しうる、可能な二次機構を防止するために、Ｇ９ＡまたはＳＵＶｈ１／２による、Ｈ９Ｋ９ｍｅ３など、抑制性ヒストンマークの代償的沈着を防止するように、エピジェネティック抑制解除を、検証された市販のヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤で補助することができる。本実施例はまた、特異的な処理条件のほか、メチル化のわずかな（−１０〜３０％）低下を検出するのに適する、十分に高感度のアッセイも同定しようと試みる。
【０３０９】
２ｂ．遅発性疾患のモデル化のための、ｉＰＳＣ由来系統における、低メチル化による老化の誘導
本実施例の一実施形態は、ｉＰＳＣ技術の、遅発性疾患のモデル化への、エントリーポイントを提示することである。最近、プロジェリンの異所性発現が、ＰＤの年齢依存的表現型であって、かつてのＰＤ  ｉＰＳＣモデルでは見られなかった表現型の出現を誘発することが示されている７、４１。本実施例は、技法を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて年齢を加速させる、より生理学的で、非病理学的な方法へと洗練させることを目的とする。
【０３１０】
本実施例では、本明細書で記載される、年齢を誘導するパラダイムが、ＰＤ患者からの、ｉＰＳＣ由来ｍＤＡニューロンにおける、ＰＤの年齢依存的影響についてのモデル化の改善を可能とするのかどうかについて調べる。上記で最適化された方法を、プロトコールへの細胞型特異的な適応を要求しうる、ｉＰＳＣ−ｍＤＡへと移行させる。まず、本明細書で記載される新規のプロトコールにより、または、これとの比較で、確立されたプロジェリン法により老化させた、ＰＤ−ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンについて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける、詳細な表現型的比較を、ＰＤ由来のｍＤＡニューロンについて既に記載されている公知の特色のセット７に焦点を当てて実施する。最後に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて老化させた、ｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロンの遺伝子発現プロファイルを、老齢ドナーおよび若齢ドナーの中脳黒質に由来する初代ヒト脳組織へと調整すること（aligning）により、「真の生物学的年齢」を促進するための新たな手法の、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける有意性について評価する。初代組織は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ）から入手可能であり、ＮＤＲＩを介して、年齢の異なる試料のセットであって、遺伝子発現プロファイリングおよびＤＮＡメチル化プロファイリングのためのパイプラインに速やかに登録される試料のセットを収集した。
【０３１１】
本実施例は、ｉＰＳＣベースのＰＤモデルに焦点を合わせているが、年齢に関連するＤＮＡ低メチル化が、大半の組織について報告されたことを踏まえると、本明細書で記載される方法は、中枢神経系の内部および外部の、他の細胞型へ適用しうる。この文脈では、本明細書で記載される手法はまた、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）についてのｉＰＳＣモデルへも適用することができる。
【０３１２】
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される戦略は、成体体細胞組織内のＤＮＭＴの活性が主に、複製依存的なメチル化パターンの維持に存する、そのＤＮＭＴの阻害に基づく。ニューロンは、複製依存的なＤＮＭＴ活性を呈示しない。したがって、ある特定の実施形態では、低メチル化を、神経誘導プロトコールの、パターン化段階において誘導する４２。この段階は、一過性であり、神経幹細胞（ＮＳＣ）集団と同等である。一過性ＮＳＣ集団に加えて、神経原性が高度な長期神経幹細胞系（ＬＴＮＳＣ）であって、ｍＤＡを含む多様なニューロンへと分化するようにパターン化することができ、細胞運命を変化させずに、最も強い脱メチル化をもたらす、多様な脱メチル化戦略について調べうる、ＬＴＮＳＣが入手可能である。
【０３１３】
方法
１．健常ドナーおよびＨＧＰＳドナーに由来する初代線維芽細胞は、Ｃｏｒｉｅｌｌから得たが、これらは、ドナー群（若齢：１０〜１１歳、中年齢：３１〜５１歳、老齢：７１〜９６歳、およびＨＧＰＳ：３〜１４歳）１つ当たり４例ずつの細胞系を含む。シークエンシングは、Ｗｅｉｌｌ  Ｃｏｒｎｅｌｌ（ＷＣＭＣ）Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅで実行する。ＲＮＡ−Ｓｅｑは、ＰｏｌｙＡ±（図１）および総ＲＮＡ−Ｓｅｑ（進行中）の両方に基づく。ＤＮＡメチル化は、強化型減少表示バイサルファイトシークエンシング（ＥＲＲＢＳ）によりプロファイリングした。カスタマイズされたメチル化解析のためのプラットフォーム（「クロックＣｐＧ」１４、Ａｉｍ１）は、Ｓｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して開発した。５ｈｍＣ解析は、参考文献（４３）に従い実施する。ヒストン修飾についてのＣｈＩＰ−Ｓｅｑは、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、Ｈ４Ｋ４ｍｅ３、およびＨ３Ｋ３６ｍｅ３を含む。クロマチン調製条件は、Ｃｏｖａｒｉｓ  ｔｒｕＣｈＩＰプロトコールに基づき最適化した。ｉＰＳＣの発生は、ＳｅＶ再プログラム化により行った。ｉＰＳＣの検証は、多能性マーカー、核型解析、ＳＴＲのプロファイリング（図２）、およびＥＢの形成に基づく。ｉＰＳＣ−線維芽細胞は、参考文献（７）に従い誘導する。ｉＰＳＣの、皮膚線維芽細胞をもたらす特異的系統である、近軸皮節運命への指向的分化のためには、異なるプロトコールを使用することができる。
【０３１４】
本実施例は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて観察される脱メチル化よりわずかに高度な、適度の脱メチル化（若齢レベルに対して、−１０％〜−３０％である）を誘発して、加速した老化の効果を達成することを目的とする。細胞は、「パルス−チェイス」処理および／または低濃度の、弱いＤＮＭＴ阻害剤（ゼブラリン３７）および／または滴定可能なｓｉＲＮＡ投薬を可能とする、ドキシサイクリン誘導性（Dox-inducible）ｓｉＲＮＡを介する、中程度のＤＮＭＴ１ノックダウンへと曝露することができる。オフターゲット効果を消失させるために、弱いＤＮＭＴ１ハイポモルフ変異を有する誘導性細胞系を発生させることができる（例えば、参考文献４０により記載されている通り）。予備的実験を使用して、所望のメチル化のレベルを達成し、老化表現型を誘発するのに適切な、化学的処理またはｓｉＲＮＡ処理の条件（濃度および持続期間）を決定することができる。スクリーンは、マルチウェルフォーマットによる、自動式の画像収集および解析を可能とする、高解像度のイメージングシステム（Ｏｐｅｒｅｔｔａ）を使用して実行することができる。実験はまず、初代老齢線維芽細胞およびプロジェリンで老化させたｉＰＳＣ−線維芽細胞と比較して、初代若齢線維芽細胞およびｉＰＳＣ由来の線維芽細胞において実行することができる。このパラダイムはその後、ＰＤ患者に由来するｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロンなど、ｉＰＳＣ由来の、疾患関与性の細胞型へと移行させることができる。
【０３１５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ誘導老化のための、中脳ドーパミンニューロン（ｍＤＡ）は、開発されたプロトコールにより、ＰＤ−ｉＰＳＣから発生させることができる４２。広範にわたる遺伝性ＰＤ−ｉＰＳＣ細胞系は、ＰＤ−ｉＰＳＣコンソーシアム（http://pdips.org）への参加を介して入手可能である。誘導される老化の、ｉＰＳＣ−ｍＤＡによる、ＰＤのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル化に対する影響について評価するため、３つの主要な表現型：神経突起変性、アポトーシス、およびα−シヌクレイン凝集に焦点を絞ることができる。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける解析は、６−ＯＨ−ＤＡにより病変を来した、ＮＯＤＳＣＩＤマウスへの移植研究を伴う。
【０３１６】
考察
ｉＰＳＣを介する、有効な疾患のモデル化は、関与性の細胞表現型の発生に依存する。ｉＰＳＣ系の限界は、年齢依存的疾患に典型的な変性の側面を再現できないことである。この障害を、若過ぎて、年齢依存的表現型を提示しない細胞を発生させる、再プログラム化過程の若返り効果へと帰する証拠が、最近提示されている。したがって、ｉＰＳＣの、多様な系統への分化は、胚様細胞をもたらすことが広く受容されている。これらの知見は、細胞レベルにおける老化の性質およびそのプログラム化についての精査（interrogation）のための、新たな道筋を開く。しかし、これらの知見はまた、ｉＰＳＣ技術により、年齢依存的状態を、どのくらい良好にモデル化しうるのかについての疑問も起こる。１つの論拠は、現在までになされている大半のｉＰＳＣ研究が、遅発性疾患の変性表現型を呈示するのに十分老化していない細胞を活用しているということである。この障害を迂回するために、本発明の手法は、毒性化合物により、病理学的細胞応答を誘発することを求める。環境因子は、疾患の主要な危険因子であるが、急性曝露は、疾患の自然の進行を再現せず、よって、これらの手段により得られる結果は、関与性が疑わしい。本実施例は、ｉＰＳＣによる、遅発性状態の信頼できるモデル化は、生物学的年齢の組込みを要求することを提起する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて年齢を加速させるのに、プロジェリンを活用する最近の研究は、年齢についての、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、関与性の疾患モデルを獲得するのに、ｉＰＳＣ由来系統の老化の誘導が、必要であり、かつ、実施可能であるという原理証明を提供する。しかし、早老症と、実際の年齢との間の乖離を指し示す最近のデータに照らすと、生理学的老化過程により近い類似性がある代替的な戦略を考案することが必要とされている。
【０３１７】
本明細書で記載される方法は、多能性を介して、若返りを指定する分子機構を明らかにし、同時に、自然発生の過程、すなわち、年齢に伴う、ゲノムＤＮＡメチル化の漸次の喪失を模倣することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて年齢を誘導する新規の手法を提示する、二重の目的を有する。
【０３１８】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、ヒト疾患について研究するための強力な技術である。しかし、ｉＰＳＣを介する、発生障害および若年性障害についての研究は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける病理学的機構を再現する、一貫した結果をもたらしているが、パーキンソン病（ＰＤ）またはアルツハイマー病（ＡＤ）など、遅発性状態のモデル化は、特徴的な変性表現型を再び生み出すことにおける困難により、依然として限定されている。ｉＰＳＣ由来細胞における、年齢依存的表現型の欠如は、それらの未成熟で若々しいという性質に起因する可能性があり、このため、神経変性および他の年齢依存的障害の有効なモデル化は、細胞「年齢」の実行（implementation）を要求する。これは、再プログラム化されると、どのようにして表現型年齢マークが消去され、分化の後でも再獲得されないのかについて記載する、最近の研究により支持される。さらに、早期老化の一因をなす変異体タンパク質であるプロジェリンを使用する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞年齢の加速は、ＰＤ患者に由来する、ｉＰＳＣ由来ドーパミンニューロンにおいて、いまだ見られたことがない変性の特色を誘発するのに十分であった。
【０３１９】
この手法は、老化の誘導を、ｉＰＳＣによる疾患モデルへと適用するための概念の証明をもたらしたが、本実施例からのデータは、早老性（progeroid）老化と、正常老化とは、転写レベルおよびエピジェネティックレベルにおいて、かなり顕著に異なることを示す。したがって、プロジェリンの発現は、実際の老化を完全には再現せず、潜在的には実験の結果を損なう可能性がある。
【０３２０】
本実施例の包括的目的は、ＰＤおよびＡＤなど、神経変性病理の基礎的構成成分である生理学的年齢を誘導する、改善された戦略を開発することにより、本ｉＰＳＣベースの疾患モデルを増強することである。
【０３２１】
第１に、本実施例は、再プログラム化の前および後における、転写の変化およびエピジェネティック変化についての包括的な解析を介して、再プログラム化されると、細胞年齢は、どのようにしてリセットされるのかについて、ゲノムレベルで解明することを目的とする。
【０３２２】
参考文献
【化３】
2018501809.tif 000013
【化４】
2018501809.tif 000014
【化５】
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【化６】
2018501809.tif 000016
【化７】
2018501809.tif 000017
【０３２３】
（実施例１１）
メチル化の増大による、細胞における年齢の低減
序説
ＰＩＷＩタンパク質は、ＲＮＡｉエフェクタータンパク質の、Ａｒｇｏｎａｕｔｅスーパーファミリーの生殖細胞系列特異的クレードとして公知である。ＰＩＷＩは、これまでに解析された、全ての後生動物において発現し、それらのＲＮＡパートナーである、ｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ相互作用性ＲＮＡ）との相互作用を介して、生殖細胞系列の発生および生殖能力に不可欠の機能である、生殖細胞における転移エレメントの活性を抑制する（Aravinら、２００７年、Julianoら、２０１１年）。ＰＩＷＩ−ｐｉＲＮＡ系による、トランスポゾンおよび他の反復配列（セントロメア領域およびテロメア領域など）のサイレンシングでは、複数の経路が利用される。最もよく特徴付けられている機構は、ＰＩＷＩタンパク質のエンドヌクレアーゼ性分解活性を介する、リピート転写物の直接的な切断である。加えて、転写の抑制は、エピジェネティック手段、すなわち、ヒストン修飾因子およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）を含む、ヘテロクロマチン形成因子の動員を介して生じうる（PengおよびLin、２０１３年）。ＰＩＷＩタンパク質は、哺乳動物の生殖細胞系列内の、転移エレメントに対する、ｄｅ  ｎｏｖｏのＤＮＡメチル化を媒介することが示された（Kuramochi-Miyagawaら、２００８年）。ＰＩＷＩ媒介性サイレンシングの遺伝子座特異性は、標的配列との相補的な塩基対合を介して、ＰＩＷＩを、特異的なゲノムの領域へと方向付ける、ｐｉＲＮＡガイドとの相互作用により付与される。ここで、ＰＩＷＩ−ｐｉＲＮＡ複合体は、標的遺伝子座の転写の抑制およびヘテロクロマチン化を誘発する、多数のエピジェネティック修飾因子を動員する（Rossら、２０１４年）。
【０３２４】
後生動物の生殖細胞系列発生および生殖能力への関与に加えて、ＰＩＷＩタンパク質は最近、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおける生物寿命に関与していた（Simonら、２０１３年）。ＰＩＷＩタンパク質はまた、ヒトにおける進化を含む進化を通して、成体幹細胞ニッチにおいても発現し、この場合は、例えば、造血幹細胞および前駆体内で見出される。生殖細胞系列の不死性は、例えば、寄生性エレメントを抑制することにより、世代にわたり、ゲノムの完全性を守る能力に依存すると考えられるが、ＰＩＷＩを介するゲノムの保護により、生物の生存期間を通した、成体幹細胞の複能性および自己再生を保存する、基礎的機構をもたらすことができる（Julianoら、２０１１年、Rossら、２０１４年において総説されている）。
【０３２５】
方法
包括的なＤＮＡメチル化および抑制性ヒストンマークの喪失により媒介される、年齢関連の核欠損の大部分は、転移エレメントおよび他の反復配列の過剰活性化に帰することができる。老化組織内のゲノムリピートの発現の増大については、既に記載されている（Heynら、２０１２年）。
【０３２６】
本実施例は、ＰＩＷＩ−ｐｉＲＮＡ系を利用して、ＤＮＡの低メチル化および抑制性ヒストンマークの喪失の帰結として、老化組織における発現が異常な遺伝子座において、エピジェネティックサイレンシングを回復させる技法について記載する。ＰＩＷＩタンパク質は、生殖細胞系列コンパートメントおよび成体幹細胞コンパートメントでは富化されており、大半の体細胞組織では非存在である。ターゲティングされた、遺伝子座特異的ｐｉＲＮＡ発現と連携させた、ＰＩＷＩタンパク質の、体細胞おける制御された再導入は、時系列年齢の関数として、エピジェネティック抑制が異常に失われた、反復性および寄生性のゲノム遺伝子座の再サイレンシングを方向付ける戦略を表しうる。
【０３２７】
結果
若齢および老齢ドナーの初代線維芽細胞における、ＬＩＮＥ１エレメントおよびＭＩＲエレメントの存在は、ＲＴ−ｑＰＣＲを使用して決定した。老齢試料中では、若齢試料と比較して、解析される反復エレメントの発現の増大が検出された（図４Ａ）。
【０３２８】
年齢の異なるドナー群に由来する初代線維芽細胞における、ＰＩＷＩＬ２およびＡＰＯＢＥＣ３Ｂの発現は、ＲＮＡ−Ｓｅｑ解析を使用して決定した。体細胞において、ＰＩＷＩタンパク質の最小限の発現が検出された。加えて、試料年齢が増大するにつれて、体細胞のトランスポゾン保護因子である、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ（トランスポゾンクリアランスの一因をなす体細胞因子）のレベルの漸次低下（若齢＞中年齢＞老齢）が検出された。
（実施例１２）
老齢被験体に由来する線維芽細胞は、ＤＮＡメチル化のレベルを低下させている
【０３２９】
方法
初代線維芽細胞を、若齢（１０〜１１歳）および老齢（７１〜９６歳）の被験体から回収した。線維芽細胞における、ゲノムワイドのＤＮＡメチル化のレベルのほか、特異的な反復エレメントのメチル化レベルは、包括的なＤＮＡｍレベルについての、減少表示バイサルファイトシークエンシング（ＥＲＲＢＳ）のほか、蛍光測定により決定した。反復エレメントの転写発現は、全ＲＮＡ−Ｓｅｑ解析により決定した。また、転写抑制の２つのマークである、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３の発現レベルも、ウェスタンブロット解析を使用して決定した。
【０３３０】
結果
若齢被験体に由来する初代線維芽細胞は、老齢被験体に由来する線維芽細胞と比較して、高レベルの、包括的なＤＮＡｍを呈示した（図５Ａ〜Ｅ）。若齢線維芽細胞は、多数のメチル化ＣｐＧ（図５ＡおよびＣ）のほか、より高率のＣｐＧメチル化（図５ＢおよびＤ）も呈示した。同様に、転写抑制に特異的なエピジェネティックマークである、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３に関して、若齢線維芽細胞は、これらの２つのマークの、老齢線維芽細胞と比較して高度な発現を呈示した（図６Ａ〜Ｂ）。
【０３３１】
メチル化および転写抑制の年齢依存的喪失は、転移エレメントなどの非コード反復エレメントにおいて顕著であり（図７および８）、この場合、老齢線維芽細胞では、反復エレメントの７５％が、若齢線維芽細胞と比較して低メチル化状態にあった（図７）。加えて、老齢線維芽細胞において、反復的転写物の、若齢線維芽細胞内と対比して、年齢依存的な差次的発現が検出されたが、この場合、老齢線維芽細胞では、ＬＩＮＥ１エレメントは、優先的に上方調節され、ＡＬＵエレメントは、下方調節された（図８）。さらに、老齢線維芽細胞において上方調節される反復エレメントが主に、ＬＩＮＥ１（Ｌ１）、ＬＴＲエレメント、および内因性レトロウイルス（ＥＲＶ）に主に由来する、低存在度エレメント（３０〜１０００ＦＰＫＭ）であったのに対し、大半がＡＬＵエレメントに由来する、高存在度転写物（１０，０００〜１００，０００ＦＰＫＭ）、は、老齢線維芽細胞において下方調節され、若齢線維芽細胞において上方調節されるようである（図９）。
（実施例１３）
ＤＮＡメチル化の増大による、細胞における老化表現型の誘導
【０３３２】
概要
ヒトにおける老化は、とりわけ遅発性疾患の領域では、よくは理解されていない過程である。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、遅発性疾患について研究する有望なモデルを提供するが、最近、多能性の誘導は、細胞の年齢シグネチャーを逆転させることが明確となったことから、老化とは、「プログラムされた」状態であることが指し示されている。ＤＮＡメチル化およびヒストン修飾は、エピジェネティクスにおいて、重要な過程である。ＤＮＡメチル化は、メチル基の、シトシンの５−炭素への付加を介して生じ、５−メチルシトシン（５−ｍＣ）が生み出される。５−ｍＣパターンは、発生中に、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）、ＤＮＭＴ３ａ、およびＤＮＭＴ３ｂにより確立され、複製中に、ＤＮＭＴ１により維持される。これらの５−ｍＣ領域は、転写因子の動員を遮断し、どの遺伝子を発現させ、どの遺伝子を発現させないのかを調節することにより、転写の阻害因子として作用する。エピジェネティック修飾により、「老化」状態を誘導しうるのか、「若返った」状態を誘導しうるのかについて調べるため、若齢および老齢の線維芽細胞を、ＤＮＡメチル化およびヒストン修飾の調節をモジュレートする薬物化合物で処理した。化合物のうちの２つである、デシタビンおよびゼブラリンは、ＤＮＭＴ１ならびにＤＮＭＴ３ａおよびｂの阻害剤として作用する。別の化合物である、ＳＷ１５５２４６は、選択的なＤＮＭＴ１阻害剤として作用する。第４の阻害剤化合物は、ＳＵＶ３／９阻害剤として作用する、ケトシンであった。ＳＵＶ３／９は、ヘテロクロマチンの組織化および細胞複製中のヒストンメチル化の維持において重要な役割を果たす。化合物が、細胞レベルで、「老化」効果を呈示するのか、「若返り」効果を呈示するのかを決定するため、年齢と共に増大する、ＤＮＡ損傷のレベル（ｙＨ２Ａｘレベル）について試験した。また、ヒストンタンパク質Ｈ１、ヘテロクロマチンマーカーＨＰ１α、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、核形態マーカーラミンＢ１の発現レベル、および若々しい細胞年齢のマーカーである、包括的なＤＮＡメチル化も試験した。被験化合物は、多様な被験マーカーの発現レベルをモジュレートすることが可能であった。
【０３３３】
また、赤ワイン中の化合物であって、サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）活性化因子である、レスベラトロール、およびｍＴＯＲ阻害剤であるラパマイシンの、細胞のエピジェネティック状態に対する効果も決定した。サーチュインとは、その機能がよく理解されていないタンパク質のファミリーであるが、研究は、ＳＩＲＴ１が、ＤＮＡ損傷応答および代謝において役割を果たすことを示している。ｍＴＯＲとは、細胞増殖、細胞成長、タンパク質の合成、転写、および、オートファジーの活性化であって、不必要であるかまたは機能不全である細胞構成成分を分解し、細胞のエネルギーレベルを維持することにより、細胞が生存するのを助ける過程である、オートファジーの活性化、の調節において役割を果たす、タンパク質キナーゼである。レスベラトロールおよびラパマイシンは、老齢細胞と比較して、若齢細胞においてより多い、若々しい年齢マーカーのレベルを増大させた。
【０３３４】
方法
細胞試料
細胞試料は全て、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓにより供給された。若齢個体（＜２０歳）に由来する細胞系は、ＧＭ０３３４８（「３４８」）であった。老齢個体（＞６５歳）に由来する細胞系は、ＧＭ０４２０４（「２０４」）であった。
【０３３５】
細胞培養物
細胞を、９５％のＧｉｂｃｏ製Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、４．５％のウシ胎仔血清、および０．５％のペニシリン／ストレプトマイシンから作製された、ヒト線維芽細胞培地中で培養した。細胞を、１５ｃｍのプレート上に播種し、必要に応じて、２〜３日間ごとに継代し、隔日でフィードした。実験のために、細胞を、９６ウェルプレート内または６ウェルプレート内に播種した。固定の前に、細胞を、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．９、０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭのＮａＣｌ、および３００ｍＭのスクロースを含有する前抽出緩衝液（preextraction  buffer）により、４℃で、７分間にわたり処理して、初期染色で見られた高レベルのバックグラウンドを低減した。次いで、細胞を、４％のパラホルムアルデヒドにより、室温で１５分間にわたり固定した。
【０３３６】
毒性試験
細胞を、異なる濃度の６つの化合物で、４日間にわたり処理し、次いで、Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｓａｌｔ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で、全細胞生存率について調べた。生細胞は、レサズリンを、高度に蛍光発光性であるレソフリン（resofurin）へと還元することが可能である。細胞を、１０ｕｇ／ｍｌのレサズリンを含む培地中に、９０分間にわたり入れ、次いで、培地を、細胞から除去し、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＥＮＳＰＩＲＥプレートリーダーで読み取った。プレートリーダーにより、蛍光を測定し、これを、生存率を１００％とする陽性対照、および非生存率を１００％とする陰性対照に基づき解析する。６日後の、第２の毒性試験時点のために、同じ手順を再度繰り返した。
【０３３７】
免疫蛍光による、マーカー発現の検出
固定の後、細胞を、ＰＢＳ中に、０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１％のＢＳＡを含有する透過化緩衝液中、室温で、３５分間にわたりインキュベートした。次いで、細胞を、マーカーに対する一次抗体（ＰＢＳ中に１：１０００）と共に、４℃で一晩にわたりインキュベートした。インキュベーション後、細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、二次抗体（ＰＢＳ中に１：５００）と共に、遮光下、室温で３０分間にわたりインキュベートした。このインキュベーション後、細胞を、ＰＢＳで１回洗浄し、次いで、ＰＢＳ中に１：１０００のＤＡＰＩと共に、遮光下、室温で７分間にわたりインキュベートし、次いで、ＰＢＳで２回洗浄した。染色は、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１顕微鏡またはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｏｐｅｒｅｔｔａ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを使用してイメージングした。各マーカーの発現レベルは、同じ処理プレート上の非処理対照（図１１、１３、１５、および１６）、または同じマーカーについて、全ての処理プレートにわたる非処理対照の平均（図１２および１４）と比べて決定した。
【０３３８】
イメージングおよび定量
免疫蛍光のイメージングは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｏｐｅｒｅｔｔａ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して行った。各ウェルでは、各プレート内のいくつかの（＞１５）ランダムスポットをイメージングし、染色強度の定量は、Ｏｐｅｒｅｔｔａ  Ｈａｒｍｏｎｙソフトウェアを使用して行った。解析は、他のウェル内の平均強度レベルと比較した、単一のウェル内の各染色の平均強度レベルに基づく。
【０３３９】
ＤＮＡメチル化の定量および解析
ゲノムＤＮＡは、Ｑｕｉｃｋ−ｇＤＮＡ  ＭｉｃｒｏＰｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ）を使用して、処理された細胞試料から抽出した。ＤＮＡメチル化の包括的レベルは、製造元の指示に従い、比色法によるＭｅｔｈｙｌｆｌａｓｈ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＤＮＡ定量キット（Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ）を使用して測定し、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＥＮＳＰＩＲＥプレートリーダーを使用して読み取った。ｇＤＮＡの試料サイズは、５０ｎｇであった。解析は、製造元の指示に従い実施した。
【０３４０】
化合物
化合物の各々の原液は、製造元により提示されている最大溶解度に従い、ＤＭＳＯ中に各々を再懸濁させることにより作製した。原液は、デシタビン（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ：型番２２９３）、５０ｍＭ；ゼブラリン（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ：型番２６２４）、１００ｍＭ；ＳＷ１５５２４６（Ｓｉｇｍａ：型番ＳＭＬ１１３６）、１０ｍＭ；ケトシン（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ：型番４５０４）、１０ｍＭ；レスベラトロール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ：型番５５４３２５）、１００ｍＭであった。ラパマイシン（Ｓｉｇｍａ：型番Ｒ８７８１）は、ＤＭＳＯ中に２．７４ｍＭの原液として入手した。
【０３４１】
結果
処理に適正な密度の決定
実験は、１つは、若齢ドナー（＜１８歳）に由来し（「若齢細胞」）、１つは、老齢ドナー（＞６５歳）に由来する（「老齢細胞」）、ヒト皮膚線維芽細胞の２つの細胞系により実施した。細胞を、化合物で処理する前に、毒性試験を行って、どれほどの濃度の各化合物で、細胞を処理すべきなのかを決定した。この試験に適正な細胞密度を決定するために、本発明者らは、ウェル１つ当たり細胞１０００個〜ウェル１つ当たり細胞１０，０００個とし、各密度を６連とする、１０の異なる初期細胞密度を有する９６ウェルプレートを使用する、実験をデザインした。３日後、細胞を固定し、ビメンチン（中間径フィラメント）およびＤＡＰＩ（核マーカー）に対する抗体で染色して、理想的な細胞密度を決定した。３日後のマークにおける、各初期密度の集密度について評価することにより、ウェル１つ当たり細胞２，５００個の初期密度が、本発明者らが行う毒性アッセイの期間（７日間）に理想的であると決定した。
【０３４２】
各薬物および細胞の処理による毒性についての評価
実際の細胞処理を開始する前に、各化合物の毒性について調べて、生存能および増殖する能力を失わずに、細胞を曝露しうる最大濃度を決定した。使用される各薬物の初期濃度は、化合物の各々を使用したかつての実験について調査することにより決定した。細胞を、９６ウェルプレート内で、第１列を陰性対照（細胞死を確実にするために、０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００で処理した細胞）とし、最終列を陽性対照（薬物を溶解させるのに使用される化合物であるＤＭＳＯで処理された細胞、１：１０００）として処理した。各中間濃度の３連を使用し、各濃度を、先行濃度のモル濃度の２分の１とした。レスベラトロールおよびゼブラリンの濃度は、４００μＭ〜０．０００３８μＭの範囲であった（１３、１４）。ラパマイシンの濃度は、１００μＭ〜０．００００９５μＭの範囲であった（１５）。ケトシンの濃度は、３０μＭ〜０．００００２８μＭの範囲であった（１６）。デシタビンの濃度は、２００μＭ〜０．０００１９μＭの範囲であった（１７）。ＳＷ１５５２４６の濃度は、５０μＭ〜０．０００４７μＭの範囲であった（１８）。
【０３４３】
細胞を、これらの濃度の各化合物で処理し、４日目に、Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｓａｌｔを使用して、毒性について調べた（「方法」を参照されたい）。レサズリンアッセイを実行した後で、細胞を、１日目に該細胞を処理したのと同じ濃度の化合物と共に新鮮培地中でインキュベートし、７日目に、再度レサズリンアッセイを使用して調べた。４日目および７日目の両方からのデータを使用して、本発明者らは、処理のための各化合物の濃度を決定した（図１０）。これらの濃度を、Ｃ１、Ｃ２、およびＣ３と称し、Ｃ１を最高濃度とする。使用した濃度は、レスベラトロール：２５μＭ、１２．５μＭ、および６．２５μＭ；ラパマイシン：６．２５μＭ、３．１２５μＭ、１．５６２５μＭ；デシタビン：０．８μＭ、０．４μＭ、０．２μＭ；ゼブラリン：５０μＭ、２５μＭ、１２．５μＭ；ケトシン：０．００７３２μＭ、０．００３６６μＭ、０．００１８３μＭ；ならびにＳＷ１５５２４６：３．２μＭ、１．６μＭ、０．８μＭであった。
【０３４４】
次いで、細胞を、６つの化合物の各々で、３日間にわたり処理した。各化合物は、若齢および老齢の非処理対照の両方を有するほか、若齢および老齢細胞の両方について、３つの所定の濃度を有した。加えて、デシタビン、ゼブラリン、ケトシン、およびＳＷ１５５２４６のために、６ウェルプレートを用意し、包括的なＤＮＡメチル化のレベルを定量するための、非処理対照としての使用のために、さらなる３ｃｍのプレートも用意した。処理の後で、細胞を、ＨＰ１α、Ｈ１、γＨ２Ａｘ、ラミンＢ１、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、およびＨ２Ｋ２７ｍｅ３について免疫蛍光染色した。
【０３４５】
レスベラトロールおよびラパマイシンの、老化マーカーに対する効果
レスベラトロールまたはラパマイシンへの曝露を伴う３日間にわたる培養後、細胞は、若い細胞「年齢」を示すマーカーである、高レベルの「若い状態（younger  state）についての５つのマーカー」を示し始めた。評価されるマーカーは、ヒストンリンカータンパク質である、ヒストンタンパク質Ｈ１；ヘテロクロマチンマーカーＨＰ１α；それらのいずれもが、転写抑制と相関するメチル化部位である、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３；ならびに核形態マーカーラミンＢ１を含んだ。したがって、老化は、これらのマーカーの減少と関連する。また、ＤＮＡ損傷マーカーγＨ２Ａｘについても試験したが、この場合、γＨ２Ａｘのレベルは、年齢と共に増大する傾向がある。
【０３４６】
レスベラトロールによる処理の後、図１１および図１２において示される通り、若い状態についての５つのマーカーは全て増大した。これらのマーカーの増大は、抗老化効果と符合する。しかし、γＨ２Ａｘレベルもまた、増大した。レスベラトロールは、若齢細胞に及ぼす効果が、老齢細胞に及ぼす効果より大きかった。ラパマイシンで処理された細胞はまた、若い状態についての５つのマーカーの増大も示した（図１１）。ここでもまた、若齢細胞に対する効果は、老齢細胞に対する効果より大きかったが、２つの年齢の間の差異は、レスベラトロールについて見られた差異より小さかった。ラパマイシンと同様に、レスベラトロールもまた、γＨ２Ａｘを増大させた。γＨ２Ａｘレベルの増大ほか、他のマーカーの発現の増大も、化合物が細胞に対して毒性となる濃度（concentratin）で生じうる。
【０３４７】
阻害剤化合物の、老化マーカーに対する効果
デシタビン、ゼブラリン、ＳＷ１５５２４６、およびケトシンによる処理に関して述べると、これらの４つの化合物は、６つの被験マーカーの発現をモジュレートした（図１３および図１４）。デシタビン、ゼブラリン、およびＳＷ１５５２４６で処理された細胞では、場合によって、これらの化合物による処理と関連して、若々しいマーカーの発現について、逆Ｕ字型の曲線が見られた。これらの場合、最高用量の薬物は、５つのマーカーの一部の、低レベルの発現を結果としてもたらし、中または低用量は、高レベルの発現を結果としてもたらした（図１３）。上記で言及した通り、マーカーの発現の増大は、化合物が細胞に対して毒性となる濃度で生じうる。
【０３４８】
長期の処理は、細胞の枯渇を結果としてもたらす
化合物を伴う長期にわたる培養が、毒性効果を結果としてもたらすのかどうかを決定するために、細胞を、化合物と共に、１０日間にわたり培養した。老齢細胞の対照培養物は、大部分が、その時点で死滅し、薬物は、それらをレスキューしなかった（図１５）。若齢細胞の対照培養物は、１０日後に、依然として健常であり、化合物はいずれも、生存能に対して影響を及ぼした（図１５）。最高毒性は、ケトシンについて見られた。毒性はまた、ラパマイシンおよびレスベラトロールについても見られた。はるかに小さい毒性が、デシタビン、ゼブラリン、およびＳＷ１５５２４６について見られた。
【０３４９】
ＤＮＭＴ阻害剤による処理は、包括的なＤＮＡメチル化レベルをモジュレートする
化合物の、包括的な５−ｍＣ  ＤＮＡメチル化レベルに対する効果について、デシタビン、ゼブラリン、ケトシン、およびＳＷ１５５２４６による３日間にわたる処理後に評価した。選択的ＤＮＭＴ１阻害剤である、ＳＷ１５５２４６で処理した細胞では、ＤＮＡメチル化のレベルは、最高および最低濃度のいずれでも増大したが、中濃度でわずかに低下した（図１６ａ）。ＳＵＶ３／９阻害剤であるケトシンで処理した細胞では、ＤＮＡメチル化のレベルは、濃度に基づき、着実に増大した（図１６ｂ）。ＤＮＭ１およびＤＮＭＴ３ａ／ｂの両方の阻害剤である、ゼブラリンおよびデシタビンのいずれについても、処理により、包括的なＤＮＡメチル化のレベルは低下した（図１６ｃ、ｄ）。
【０３５０】
（実施例１４）
ｉＰＳＣ由来の中脳ドーパミンニューロンは、成熟するにつれて、ミトコンドリアに依拠する度合いが大きくなる
ｉＰＳＣを、Kriksら、Nature、２０１１年１１月６日、４８０巻（７３７８号）：５４７〜５１頁；およびMillerら、Cell  Stem  Cell、２０１３年１２月５日、１３巻（６号）：６９１〜７０５頁により記載されている通りに、中脳ドーパミンニューロン（ｍＤＡ）へと分化させたが、ここでは、方法を、図１７において示される通りに改変した。具体的には、ｉＰＳＣを、ｍＤＡへと分化させる前に、該ｉＰＳＣを、１２〜２４時間にわたり（培養−０〜−２日目）培養し、ｉＰＳＣをｍＤＡへと分化させる０〜２日目において、ｗｉｎｇｌｅｓｓ（Ｗｎｔ）シグナル伝達阻害剤であるＸＡＶ９３９を、細胞培養物へと添加した。ｍＤＡ細胞を、培養の１３および／または１５ならびに３０日目において、継代に供したが、この場合、３０日目の継代では、細胞を濾過し、低密度で播種した。１１日目から、ＤＡＰＴ（Ｎ−［（３，５−ジフルオロフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニル−２−フェニル］グリシン−１，１−ジメチルエチルエステル）を、培養物へと添加し、３２日目に、細胞を、マイトマイシンＣで、１時間にわたり処理した。次いで、細胞を、ミトコンドリアストレス因子であるロテノンまたはカルボニルシアニド（carbonilcyanide）ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）の存在下で、酸素消費について、６５および３０日目にアッセイした。未分化ｉＰＳＣ（培養の０日目）を、対照として使用した。図１８に示される通り、６５日間にわたり培養されたｍＤＡは、ストレス状態下で、３０日間にわたり培養されたｍＤＡおよび未分化ｉＰＳＣ対照と比較して、より大きな酸素消費を呈示した。
【０３５１】
参考文献
【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化２４】
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【化２５】
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【０３５２】
本発明の範囲は、本明細書で記載される具体的な実施形態により限定されない。実際、前出の記載から、当業者には、本明細書で記載される改変に加えて、本発明の多様な改変が明らかとなろう。このような改変は、付属の特許請求の範囲内に収まることを意図する。
【０３５３】
本出願を通して、特許、特許出願、刊行物、製品についての記載、およびプロトコールが引用されるが、これらの開示は、全ての目的のためにそれらの全体において、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１−１】
2018501809.tif 000036
【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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