(57)【要約】  本発明は、ワクチン接種に有用なT細胞エピトープを予測するための方法に関する。特に、本発明は、腫瘍関連ネオ抗原等、ペプチド若しくはポリペプチドにおける修飾が、免疫原性であり、特に、ワクチン接種に有用であるか予測するための方法、又は斯かる修飾のいずれが、最も免疫原性であり、特に、ワクチン接種に最も有用であるか予測するための方法に関する。本発明の方法は、特に、患者の腫瘍に特異的なワクチンの提供のために、よって、個人化癌ワクチンの文脈において使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原性アミノ酸修飾を予測するための方法であって、
a)1つ又は複数のMHCクラスII分子への、修飾されたタンパク質の断片である修飾されたペプチドの結合のスコアを確かめる工程と、
b)修飾されたタンパク質の発現又は存在量のスコアを確かめる工程と
を含む方法。
【請求項２】
1つ又は複数のMHCクラスII分子への結合を示す1つ又は複数のMHCクラスII分子への結合のスコアと、修飾されたタンパク質の発現、高レベルの発現又は存在量を示す修飾されたタンパク質の発現又は存在量のスコアが、修飾又は修飾されたペプチドが免疫原性であることを示す、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
免疫原性アミノ酸修飾を選択及び/又はランクづけするための方法であって、
a)1つ又は複数のMHCクラスII分子への、修飾されたタンパク質の断片である修飾されたペプチドの結合のスコアを確かめる工程と、
b)修飾されたタンパク質の発現又は存在量のスコアを確かめる工程と
を含み、2つ以上の異なる修飾について工程a)及びb)を行うことを含む方法。
【請求項４】
異なる修飾が、同じ及び/又は異なるタンパク質に存在する、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記2つ以上の異なる修飾のスコアを比較する工程を含む、請求項3又は4に記載の方法。
【請求項６】
前記2つ以上の異なる修飾のスコアが、異なる修飾をそれらのMHCクラスII結合スコアによってランクづけし、所定の閾値未満の発現又は存在量を有する修飾を除去することにより比較される、請求項3から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
1つ又は複数のMHCクラスII分子への結合のスコアが、1つ又は複数のMHCクラスII分子への結合の確率を反映する、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
2つ以上の異なる修飾されたペプチドについて工程a)を行う工程を含み、前記2つ以上の異なる修飾されたペプチドが同じ修飾を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
同じ修飾を含む2つ以上の異なる修飾されたペプチドが、修飾されたタンパク質の異なる断片を含み、前記異なる断片が、タンパク質に存在する同じ修飾を含む、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
同じ修飾を含む2つ以上の異なる修飾されたペプチドが、修飾されたタンパク質の異なる潜在的MHCクラスII結合断片を含み、前記断片が、タンパク質に存在する同じ修飾を含む、請求項8又は9に記載の方法。
【請求項１１】
1つ又は複数のMHCクラスII分子への結合の確率又は最高確率を有する、同じ修飾を含む2つ以上の異なる修飾されたペプチドから修飾されたペプチドを選択する工程を更に含む、請求項8から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
同じ修飾を含む2つ以上の異なる修飾されたペプチドが、修飾の長さ及び/又は位置が異なる、請求項8から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
同じ修飾を含む2つ以上の異なる修飾されたペプチドの1つ又は複数のMHCクラスII分子への結合の最良スコアが、修飾に割り当てられる、請求項8から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
修飾されたタンパク質の発現又は存在量のスコアを確かめる工程が、修飾が関連するタンパク質の発現のレベルを決定する工程と、修飾が関連するタンパク質の間での修飾されたタンパク質の頻度を決定する工程とを含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記修飾が関連するタンパク質の発現のレベルを決定する工程及び/又は修飾が関連するタンパク質の間での修飾されたタンパク質の頻度を決定する工程が、RNAレベルで行われる、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
修飾が関連するタンパク質の間での修飾されたタンパク質の頻度が、変異体対立遺伝子頻度を決定することにより決定される、請求項14又は15に記載の方法。
【請求項１７】
変異体対立遺伝子頻度が、突然変異部位をカバーする全ての検出された配列、特に、読み取りデータの合計で割った、突然変異部位をカバーし、突然変異を保有する検出された配列、特に、読み取りデータの合計である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
修飾されたタンパク質の発現又は存在量のスコアを確かめるために、修飾が関連するタンパク質の発現のレベルのスコアに、修飾が関連するタンパク質の間での修飾されたタンパク質の頻度のスコアを掛ける、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
修飾されたペプチドが、修飾されたタンパク質の断片を含み、前記断片が、タンパク質に存在する修飾を含む、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
1つ又は複数のタンパク質コード領域における非同義突然変異を同定する工程を更に含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
アミノ酸修飾が、1個又は複数の癌細胞及び任意選択で1個又は複数の非癌性細胞等、1個又は複数の細胞のゲノム又はトランスクリプトームを部分的に又は完全にシーケンシングし、1つ又は複数のタンパク質コード領域における突然変異を同定することによって同定される、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記突然変異が、体細胞突然変異である、請求項20又は21に記載の方法。
【請求項２３】
前記突然変異が、癌突然変異である、請求項20から22に記載の方法。
【請求項２４】
ワクチンの製造において使用される、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ワクチンが、前記方法によって免疫原性又はより免疫原性であると予測される修飾又は修飾されたペプチドに由来する、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
ワクチンを提供するための方法であって、
請求項1から25のいずれか一項に記載の方法によって免疫原性又はより免疫原性であると予測される修飾又は修飾されたペプチドを同定する工程
を含む方法。
【請求項２７】
免疫原性若しくはより免疫原性であると予測される修飾若しくは修飾されたペプチドを含むペプチド若しくはポリペプチド、又は前記ペプチド若しくはポリペプチドをコードする核酸を含むワクチンを提供する工程
を更に含む、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
請求項24から27のいずれか一項に記載の方法に従って産生されたワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン接種に有用なT細胞エピトープを予測するための方法に関する。特に、本発明は、腫瘍関連ネオ抗原等、ペプチド若しくはポリペプチドにおける修飾が、免疫原性であり、特に、ワクチン接種に有用であるか予測するための方法、又は斯かる修飾のいずれが、最も免疫原性であり、特に、ワクチン接種に最も有用であるか予測するための方法に関する。本発明の方法は、特に、患者の腫瘍に特異的なワクチンの提供のために、よって、個人化癌ワクチンの文脈において使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
突然変異は、癌免疫療法の理想的な標的であるとされている。いかなる健康な組織における発現も厳密に欠くネオエピトープとして、これは、安全であると期待され、中枢性寛容機構を迂回することができよう。しかし、ワクチンアプローチのための突然変異の体系的な使用は、患者毎の腫瘍における突然変異のレパートリー(「ミュータノーム(mutanome)」)の特有性によって妨害される(Alexandrov, L. B.ら、Nature 500、415 (2013))。本発明者らは近年、個々の突然変異の範囲を標的とする個人化免疫療法アプローチを提唱した(Castle, J. C.ら、Cancer Res 72、1081 (2012))。
【０００３】
しかし、エピトープ、特に、ネオエピトープが、効率的な免疫を誘導するか、よって、ワクチン接種において有用となるかを予測するためのモデルが必要とされている。
【０００４】
そこで、本発明者らは、3種の独立したマウス腫瘍モデルにおいて、相当な割合の非同義癌突然変異が、免疫原性であり、予想外なことに、免疫原性ミュータノームが、CD4+T細胞によって優勢に認識される(「CD4+イムノーム(immunome)」)ことを示す。斯かるCD4+免疫原性突然変異によるワクチン接種は、強い抗腫瘍活性を付与する。これらの知見によって後押しされ、本発明者らは、エクソームシーケンシングによる突然変異検出、豊富に発現され、優れたMHCクラスII結合剤であることが予測される突然変異したエピトープのもっぱらバイオインフォマティクスによる優先順位づけによるワクチン標的の選択、及びこのような突然変異したエピトープの複数をコードする合成mRNAワクチンの迅速な産生を含む方法を提供する。本発明者らは、斯かるポリネオエピトープmRNAワクチンによるワクチン接種が、マウスにおける強力な腫瘍制御及び確立された著しく成長する腫瘍の完全な拒絶を誘導することを示す。更に、本発明者らは、CD4+T細胞ネオエピトープワクチン接種が、腫瘍を有するマウスにおける独立した免疫優性抗原に対するCTL応答を誘導することを実証し、抗原拡散の編成を示す。最後に、本発明者らは、同じバイオインフォマティクス的アルゴリズムによる対応するヒトの癌型の分析により、同様にヒトの癌におけるMHCクラスIIに結合することが予測される突然変異の存在量を実証する。よって、ここに紹介する特化した免疫療法アプローチは、「ちょうど間に合って(just in time)」産生されるワクチンによる患者毎の腫瘍の標的化を可能にする、癌の莫大なネオエピトープ標的レパートリーの包括的な開拓のために普遍的に適用できる青写真として考慮することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO 97/24447号
【特許文献２】PCT/EP2006/009448号
【特許文献３】WO96/33739号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Alexandrov, L. B.ら、Nature 500、415 (2013)
【非特許文献２】Castle, J. C.ら、Cancer Res 72、1081 (2012)
【非特許文献３】「A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)」、H. G. W. Leuenberger、B. Nagel、及びH. Kolbl編、(1995) Helvetica Chimica Acta、CH-4010、スイス、Basel
【非特許文献４】Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、J. Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor 1989
【非特許文献５】Mahviら、Immunology and cell Biology 75:456〜460頁、1997
【非特許文献６】Maloyら(2001)、Proc Natl Acad Sci USA 98:3299〜303頁
【非特許文献７】Ng, PCら、PLoS Gen.、4(8):1〜15頁、2008
【非特許文献８】Zhangら、2011: The impact of next-generation sequencing on genomics. J. Genet Genomics 38(3)、95〜109頁
【非特許文献９】Voelkerdingら、2009: Next generation sequencing: From basic research to diagnostics. Clinical chemistry 55、641〜658頁
【非特許文献１０】Ronaghiら、1998: A sequencing method based on real-time pyrophosphate. Science 281(5375)、363〜365頁
【非特許文献１１】Teer及びMullikin 2010: Human Mol Genet 19(2)、R145〜51頁
【非特許文献１２】Hodgesら、2007: Nat. Genet. 39、1522〜1527頁
【非特許文献１３】Choiら、2009: Proc. Natl. Acad. Sci USA 106、19096〜19101頁
【非特許文献１４】Hoytら(EMBO J. 25(8)、1720〜9頁、2006)
【非特許文献１５】Zhangら(J. Biol. Chem.、279(10)、8635〜41頁、2004)
【非特許文献１６】Abastadoら、J. Immunol. 151(7)、3569〜75頁、1993
【非特許文献１７】Schlessingerら(Proteins、61(1)、115〜26頁、2005)
【非特許文献１８】Allardら(2004) Clinical Cancer Research 10:6897〜6904頁
【非特許文献１９】Nagrathら、2007: Nature 450、1235〜1239頁
【非特許文献２０】Soら、1997、Mol. Cells 7:178〜186頁
【非特許文献２１】Kriegら、1995、Nature 374:546〜549頁
【非特許文献２２】Science 268:1432〜1434頁、1995
【非特許文献２３】Castle, J. C.ら、BMC Genomics 15、190 (2014)
【非特許文献２４】Lower, M.ら、PLoS Comput Biol 8、e1002714(2012)
【非特許文献２５】Vita, R.ら、Nucleic Acids Res 38、D854-D862 (2010)
【非特許文献２６】Holtkamp, S.ら、Blood 108、4009 (2006)
【非特許文献２７】Kreiter, S.ら、Cancer Res 70、9031 (2010)
【非特許文献２８】PMID:2071934
【非特許文献２９】Griswold, D. P.及びCorbett, T. H.、Cancer 36、2441 (1975)
【非特許文献３０】Diken, M.ら、Gene Ther 18、702 (2011)
【非特許文献３１】Kreiter, S.ら、Curr Opin Immunol 23、399 (2011)
【非特許文献３２】Pascolo, S.、Handb Exp Pharmacol、221 (2008)
【非特許文献３３】Sahin, U.ら、Nat Rev Drug Discov 13、759 (2014)
【非特許文献３４】Van, L. S.ら、Hum Vaccin Immunother 9(2013)
【非特許文献３５】Kreiter, S.ら、J Immunol 180、309 (2008)
【非特許文献３６】Kuhn, A. N.ら、Gene Ther 17、961 (2010)
【非特許文献３７】Schumacher, T.ら、Nature 512、324 (2014)
【非特許文献３８】Tran, E.ら、Science 344、641 (2014)
【非特許文献３９】Britten, C. M.ら、Nat Biotechnol 31、880 (2013)
【非特許文献４０】Gerlinger, M.ら、N Engl J Med 366、883 (2012)
【非特許文献４１】Koebel, C. M.ら、Nature 450、903 (2007)
【非特許文献４２】Matsushita, H.ら、Nature 482、400 (2012)
【非特許文献４３】Robbins, P. F.ら、Nat Med 19、747 (2013)
【非特許文献４４】van, R. N.ら、J Clin Oncol 31、e439-e442 (2013))
【非特許文献４５】Duan, F.ら、J Exp Med 211、2231 (2014)
【非特許文献４６】Bennett, S. R.ら、Nature 393、478 (1998)
【非特許文献４７】Schoenberger, S. P.ら、Nature 393、480 (1998)
【非特許文献４８】Croxford, J. L.ら、Autoimmun Rev 1、251 (2002)
【非特許文献４９】Arnold, P. Y.ら、J Immunol 169、739 (2002))
【非特許文献５０】Dubey, P.ら、J Exp Med 185、695 (1997)
【非特許文献５１】Lennerz, V.ら、Proc Natl Acad Sci U S A 102、16013 (2005)
【非特許文献５２】Wolfel, T.ら、Science 269、1281 (1995)
【非特許文献５３】Lu, Y. C.ら、J Immunol 190、6034 (2013)
【非特許文献５４】Kroemer, G.及びZitvogel, L.、Oncoimmunology 1、579 (2012)
【非特許文献５５】Mittal, D.ら、Curr Opin Immunol 27、16 (2014))
【非特許文献５６】Castle, J. C.ら、Sci Rep 4、4743 (2014)
【非特許文献５７】Wang Pら、(2010) BMC Bioinformatics. 11:568. PMID: 21092157. http://tools.immuneepitope.org/mhcii/
【非特許文献５８】Ali Mortazaviら、(2008) Nature Methods 5、621〜628
【非特許文献５９】Fawcett T.、Pattern Recogn Lett. 2006;27:861〜874. doi: 10.1016/j.patrec.2005.10.010
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本発明は、免疫原性アミノ酸修飾を予測するための方法であって、
a)1つ又は複数のMHCクラスII分子への、修飾されたタンパク質の断片である修飾されたペプチドの結合のスコアを確かめる工程と、
b)修飾されたタンパク質の発現又は存在量のスコアを確かめる工程と
を含む方法に関する。
【０００８】
一実施形態では、1つ又は複数のMHCクラスII分子への結合を示す1つ又は複数のMHCクラスII分子への結合のスコアと、修飾されたタンパク質の発現、高レベルの発現又は存在量を示す修飾されたタンパク質の発現又は存在量のスコアは、修飾又は修飾されたペプチドが免疫原性であることを示す。
【０００９】
さらなる態様では、本発明は、免疫原性アミノ酸修飾を選択及び/又はランクづけするための方法であって、
a)1つ又は複数のMHCクラスII分子への、修飾されたタンパク質の断片である修飾されたペプチドの結合のスコアを確かめる工程と、
b)修飾されたタンパク質の発現又は存在量のスコアを確かめる工程と
を含み、2つ以上の異なる修飾について工程a)及びb)を行う工程を含む方法に関する。
【００１０】
一実施形態では、異なる修飾は、同じ及び/又は異なるタンパク質に存在する。
【００１１】
一実施形態では、本方法は、前記2つ以上の異なる修飾のスコアを比較する工程を含む。一実施形態では、前記2つ以上の異なる修飾のスコアは、異なる修飾をそれらのMHCクラスII結合スコアによってランクづけし、所定の閾値未満の発現又は存在量を有する修飾を除去することにより比較される。
【００１２】
本発明のあらゆる態様の一実施形態では、1つ又は複数のMHCクラスII分子への結合のスコアは、1つ又は複数のMHCクラスII分子への結合の確率を反映する。一実施形態では、1つ又は複数のMHCクラスII分子への結合のスコアは、MHCクラスII結合モチーフのデータベースとの配列比較を含む方法によって確かめられる。
【００１３】
本発明のあらゆる態様の一実施形態では、本方法は、2つ以上の異なる修飾されたペプチドについて工程a)を行う工程を含み、前記2つ以上の異なる修飾されたペプチドは同じ修飾を含む。一実施形態では、同じ修飾を含む2つ以上の異なる修飾されたペプチドは、修飾されたタンパク質の異なる断片を含み、前記異なる断片は、タンパク質に存在する同じ修飾を含む。一実施形態では、同じ修飾を含む2つ以上の異なる修飾されたペプチドは、修飾されたタンパク質の異なる潜在的MHCクラスII結合断片を含み、前記断片は、タンパク質に存在する同じ修飾を含む。一実施形態では、本方法は、1つ又は複数のMHCクラスII分子への結合の確率又は最高確率を有する、同じ修飾を含む2つ以上の異なる修飾されたペプチドから、修飾されたペプチドを選択する工程を更に含む。一実施形態では、同じ修飾を含む2つ以上の異なる修飾されたペプチドは、修飾の長さ及び/又は位置が異なる。一実施形態では、同じ修飾を含む2つ以上の異なる修飾されたペプチドの、1つ又は複数のMHCクラスII分子への結合の最良スコアが、修飾に割り当てられる。
【００１４】
本発明のあらゆる態様の一実施形態では、修飾されたタンパク質の発現又は存在量のスコアを確かめる工程は、修飾が関連するタンパク質の発現のレベルを決定する工程と、修飾が関連するタンパク質の間での修飾されたタンパク質の頻度を決定する工程とを含む。一実施形態では、前記修飾が関連するタンパク質の発現のレベルを決定する工程及び/又は修飾が関連するタンパク質の間での修飾されたタンパク質の頻度を決定する工程は、RNAレベルで行われる。一実施形態では、修飾が関連するタンパク質の間での修飾されたタンパク質の頻度は、変異体対立遺伝子頻度を決定することにより決定される。一実施形態では、変異体対立遺伝子頻度は、突然変異部位をカバーする全ての検出された配列、特に、読み取りデータの合計で割った、突然変異部位をカバーし、突然変異を保有する検出された配列、特に、読み取りデータの合計である。一実施形態では、変異体対立遺伝子頻度は、突然変異部位において決定された全ヌクレオチドの合計で割った、突然変異部位における突然変異したヌクレオチドの合計である。一実施形態では、修飾されたタンパク質の発現又は存在量のスコアを確かめるために、修飾が関連するタンパク質の発現のレベルのスコアに、修飾が関連するタンパク質の間での修飾されたタンパク質の頻度のスコアを掛ける。
【００１５】
本発明のあらゆる態様の一実施形態では、修飾されたペプチドは、修飾されたタンパク質の断片を含み、前記断片は、タンパク質に存在する修飾を含む。
【００１６】
本発明のあらゆる態様の一実施形態では、本方法は、1つ又は複数のタンパク質コード領域における非同義突然変異を同定する工程を更に含む。
【００１７】
本発明のあらゆる態様の一実施形態では、アミノ酸修飾は、1個又は複数の癌細胞及び任意選択で1個又は複数の非癌性細胞等、1個又は複数の細胞のゲノム又はトランスクリプトームを部分的に又は完全にシーケンシングし、1つ又は複数のタンパク質コード領域における突然変異を同定することにより同定される。一実施形態では、前記突然変異は、体細胞突然変異である。一実施形態では、前記突然変異は、癌突然変異である。
【００１８】
本発明のあらゆる態様の一実施形態では、本方法は、ワクチンの製造において使用される。一実施形態では、ワクチンは、前記方法によって免疫原性又はより免疫原性であると予測される修飾又は修飾されたペプチドに由来する。
【００１９】
一実施形態では、特に、癌患者等の患者に個人化ワクチンを提供するために、前記患者に修飾が存在する場合、前記1つ又は複数のMHCクラスII分子への結合のスコアを確かめる工程と、前記修飾されたタンパク質の発現又は存在量のスコアを確かめる工程が、前記患者に対して行われる。好ましくは、前記患者に前記1つ又は複数のMHCクラスII分子が存在する(本実施形態では、本発明は、患者の部分的又は完全なMHCクラスII発現パターンを決定する工程を含むことができる)。好ましくは、前記修飾されたタンパク質の発現又は存在量のスコアを確かめる工程は、腫瘍検体等、前記患者由来の試料において行われる。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、ワクチンを提供するための方法であって、
本発明の方法によって免疫原性又は(同様に分析された他の修飾又は修飾されたペプチドよりも)免疫原性であると予測される修飾又は修飾されたペプチドを同定する工程を含む方法に関する。一実施形態では、本方法は、
免疫原性若しくはより免疫原性であると予測される修飾若しくは修飾されたペプチドを含むペプチド若しくはポリペプチド、又はこのペプチド若しくはポリペプチドをコードする核酸を含むワクチンを提供する工程を更に含む。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、本発明による方法を使用して得ることができるワクチンを提供する。斯かるワクチンの好まれる実施形態は、本明細書に記載されている。
【００２２】
本発明に従って提供されるワクチンは薬学的に許容される担体を含んでいてよく、任意選択で1種又は複数のアジュバント、安定化剤等を含んでいてよい。ワクチンは治療ワクチン又は予防ワクチンの形態であり得る。
【００２３】
別の態様は、本発明に従って提供されるワクチンを患者に投与することを含む、患者において免疫応答を誘導する方法に関する。
【００２４】
別の態様は、癌患者を処置する方法であって、
(a)本発明による方法を使用してワクチンを提供する工程と、
(b)前記ワクチンを患者に投与する工程と
を含む方法に関する。
【００２５】
別の態様は、癌患者を処置する方法であって、本発明によるワクチンを患者に投与することを含む方法に関する。
【００２６】
さらなる態様では、本発明は、本明細書中に記載の処置方法で使用するため、特に癌の処置又は防止で使用するための、本明細書中に記載のワクチンを提供する。
【００２７】
本明細書中に記載の癌の処置は、外科的切除及び/又は放射線及び/又は伝統的な化学療法と組み合わせることができる。
【００２８】
本発明の他の特長及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明を以下に詳述するが、方法、プロトコル及び試薬は変動し得るため、本発明は本明細書中に記載の特定の方法、プロトコル及び試薬に限定されないことを理解されたい。また、本明細書中で使用する用語は特定の実施形態を説明する目的のみのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解されたい。別段に定義しない限りは、本明細書中で使用するすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００３０】
以下に本発明の要素を記載する。これらの要素は具体的な実施形態を用いて記載するが、これらを任意の様式及び任意の数で組み合わせて追加の実施形態を作製し得ることを理解されたい。様々に記載した実施例及び好ましい実施形態は、本発明を明白に記載した実施形態のみに限定すると解釈されるべきでない。この記載は、明白に記載した実施形態を任意の数の開示した及び/又は好ましい要素と組み合わせる実施形態を支援及び包含すると理解されたい。更に、内容により別段に示される場合以外は、本出願中のすべての記載した要素の任意の順列及び組合せが、本出願の説明によって開示されているとみなされるべきである。
【００３１】
好ましくは、本明細書中で使用する用語は、「A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)」、H. G. W. Leuenberger、B. Nagel、及びH. Kolbl編、(1995) Helvetica Chimica Acta、CH-4010、スイス、Baselに記載されている通りに定義する。
【００３２】
別段に指定しない限りは、本発明の実施には当分野の文献(たとえばMolecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、J. Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor 1989を参照)に記載されている生化学、細胞生物学、免疫学、及び組換えDNA技法の慣用方法を用いる。
【００３３】
内容により別段に要する場合以外は、本明細書全体及び続く特許請求の範囲全体にわたって、単語「含む(comprise)」、並びに「含む(comprises)」及び「含むこと(comprising)」等の変形は、記述したメンバー、整数若しくはステップ又はメンバー、整数若しくはステップの群の包含を暗示するが、任意の他のメンバー、整数若しくはステップ又はメンバー、整数若しくはステップの群を排除せず、ただし、一部の実施形態では、そのような他のメンバー、整数若しくはステップ又はメンバー、整数若しくはステップの群を排除し得る、すなわち、対象が記述したメンバー、整数若しくはステップ又はメンバー、整数若しくはステップの群の包含からなると理解されたい。用語「a」及び「an」及び「the」並びに本発明の記載との関連で(特に特許請求の範囲との関連で)で使用する同様の言及は、本明細書中に別段に指定しない又は内容により明らかに矛盾しない限りは、単数形及び複数形をどちらもカバーすると解釈されたい。本明細書中の値の範囲の列挙は、範囲内のそれぞれの別々の値を個々に言及する省略方法としての役割を果たすことのみを意図する。本明細書中で別段に指定しない限りは、それぞれの個々の値は、本明細書中で個々に列挙されているかのように、本明細書中に組み込まれている。
【００３４】
本明細書中に記載のすべての方法は、本明細書中で別段に指定しない又は内容により明らかに矛盾しない限りは、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書中で提供する任意かつすべての例、又は例示的な言葉(たとえば「等(such as)」)の使用は、本発明をより良好に例示することのみを意図し、他の箇所で特許請求の範囲に記載した本発明の範囲に対する限定を提示しない。本明細書中のいかなる言葉も、本発明の実施に必須である任意の非特許請求要素を示すと解釈されるべきでない。
【００３５】
いくつかの文書が本明細書の本文全体にわたって引用されている。本明細書中で引用した文書のそれぞれ(すべての特許、特許出願、科学的出版物、製造者の仕様書、指示書等が含まれる)は、上記であるか下記であるかにかかわらず、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている。本明細書中にいかなるものも、先行発明に基づいて本発明がそのような開示に先行する権利を有さないという承認として解釈されるべきでない。
【００３６】
本発明によれば、用語「ペプチド」とは、ペプチド結合によって共有結合した、2個以上、好ましくは3個以上、好ましくは4個以上、好ましくは6個以上、好ましくは8個以上、好ましくは10個以上、好ましくは13個以上、好ましくは16個以上、好ましくは21個以上、かつ好ましくは8、10、20、30、40又は50個まで、特に100個のアミノ酸を含む物質をいう。用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」とは、大きなペプチド、好ましくは100個を超えるアミノ酸残基を有するペプチドをいうが、一般に、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は同義語であり、本明細書中で互換性があるように使用される。
【００３７】
本発明によれば、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に関する用語「修飾」は、野生型ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の配列等、親配列と比較した、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質における配列変化に関する。この用語は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸付加変異体、アミノ酸欠失変異体及びアミノ酸置換変異体、好ましくはアミノ酸置換変異体を含む。本発明によるこれらの配列変化は全て、新たなエピトープを潜在的に生じ得る。
【００３８】
アミノ酸挿入変異体は、特定のアミノ酸配列中に1個若しくは2個又はそれより多くのアミノ酸の挿入を含む。
【００３９】
アミノ酸付加変異体は、1、2、3、4若しくは5個、又はそれより多くのアミノ酸等の1つ又は複数のアミノ酸のアミノ及び/又はカルボキシ末端融合を含む。
【００４０】
アミノ酸欠失変異体は、配列からの1個又は複数のアミノ酸の除去、たとえば、1、2、3、4若しくは5個又はそれ以上のアミノ酸の除去を特徴づけられる。
【００４１】
アミノ酸置換変異体は、配列中の少なくとも1つの残基が除去され、別の残基がその代わりに挿入されることによって特徴づけられる。
【００４２】
本発明によれば、本発明の方法における検査に使用される修飾又は修飾されたペプチドは、修飾を含むタンパク質に由来することができる。
【００４３】
本発明によれば、用語「由来する」とは、特定の実体、特に特定のペプチド配列が、それが由来する物体に存在することを意味する。アミノ酸配列、特に特定の配列領域の場合、「由来する」とは、特に、関連するアミノ酸配列が、それが存在するアミノ酸配列に由来することを意味する。
【００４４】
本発明の方法における検査に使用される修飾又は修飾されたペプチドが由来し得る修飾を含むタンパク質は、ネオ抗原となることができる。
【００４５】
本発明によれば、用語「ネオ抗原」は、親ペプチド又はタンパク質と比較して、1つ又は複数のアミノ酸修飾を含むペプチド又はタンパク質に関する。例えば、ネオ抗原は、腫瘍関連ネオ抗原となることができ、用語「腫瘍関連ネオ抗原」は、腫瘍特異的突然変異によるアミノ酸修飾を含むペプチド又はタンパク質を含む。
【００４６】
本発明によれば、用語「腫瘍特異的突然変異」又は「癌特異的突然変異」は、腫瘍又は癌細胞の核酸中に存在するが、対応する正常な、即ち、非腫瘍性又は非癌性細胞の核酸中には存在しない体細胞突然変異に関する。用語「腫瘍特異的突然変異」及び「腫瘍突然変異」並びに用語「癌特異的突然変異」及び「癌突然変異」は、本明細書において互換的に使用される。
【００４７】
用語「免疫応答」は、抗原等、標的に対する統合された身体的応答をいい、好ましくは、細胞性免疫応答又は細胞性及び液性免疫応答をいう。免疫応答は保護的防止的/予防的及び/又は治療的であり得る。
【００４８】
「免疫応答を誘導する」とは、誘導前には免疫応答が存在しなかったことを意味し得るが、誘導前に一定レベルの免疫応答が存在しており、誘導後に前記免疫応答が亢進されたことも意味し得る。したがって、「免疫応答を誘導する」には「免疫応答を亢進させる」ことも含まれる。好ましくは、対象において免疫応答を誘導した後、前記対象は癌疾患等の疾患を発症することから保護される、又は免疫応答を誘導することによって病状が寛解される。たとえば、腫瘍発現抗原に対する免疫応答を、癌疾患に罹患している患者又は癌疾患を発症する危険性にある対象において誘導し得る。この場合、免疫応答を誘導することは、対象の病状が寛解されている、対象が転移を発症しない、又は癌疾患を発症する危険性にある対象が癌疾患を発症しないことを意味し得る。
【００４９】
用語「細胞性免疫応答」及び「細胞性応答」又は同様の用語は、「ヘルパー」又は「キラー」のいずれかとして作用するT細胞又はTリンパ球に関与する、クラスI又はクラスII MHCによる抗原の提示によって特徴づけられた細胞に向けられる免疫応答をいう。ヘルパーT細胞(CD4+T細胞とも呼ばれる)は免疫応答を調節することによって中心的な役割を果たし、キラー細胞(細胞毒性T細胞、細胞溶解性T細胞、CD8+T細胞又はCTLとも呼ばれる)は癌細胞等の疾患細胞を死滅させ、さらなる疾患細胞の産生を防止する。好ましい実施形態では、本発明は、1つ又は複数の腫瘍発現抗原を発現する腫瘍細胞に対する抗腫瘍CTL応答の刺激、及び好ましくはクラスI MHCを用いてそのような腫瘍発現抗原を提示することを含む。
【００５０】
本発明による「抗原」は、抗体若しくはTリンパ球(T細胞)との特異的反応等、免疫応答の標的である、及び/又はこれを誘導するいずれかの物質、好ましくは、ペプチド又はタンパク質をカバーする。好ましくは、抗原は、T細胞エピトープ等、少なくとも1つのエピトープを含む。好ましくは、本抗原は、発明との関連において、任意選択でプロセッシング後に、好ましくは抗原(抗原を発現する細胞が含まれる)に特異的である免疫反応を誘導する分子である。抗原又はそのT細胞エピトープは、抗原(抗原を発現する細胞を含む)に対する免疫応答をもたらす、MHC分子の文脈において、疾患細胞、特に癌細胞を含む、好ましくは細胞、好ましくは抗原提示細胞によって提示される。
【００５１】
一実施形態では、抗原は、腫瘍抗原(本明細書中で、腫瘍発現抗原とも呼ばれる)、即ち、細胞質、細胞表面又は細胞核に由来し得る、特に、腫瘍細胞の細胞内で又は表面抗原として主に生じる、腫瘍細胞において発現されるタンパク質又はペプチド等、腫瘍細胞の一部である。例えば、腫瘍抗原は、癌胎児性抗原、α1-フェトプロテイン、イソフェリチン(isoferritin)及び胎児性スルホ糖タンパク質(sulphoglycoprotein)、α2-H-鉄タンパク質(ferroprotein)及びγ-フェトプロテインを含む。本発明によれば、腫瘍抗原は、好ましくは、腫瘍又は癌及び腫瘍又は癌細胞中で発現され、それについて種類及び/又は発現レベルに関して任意選択で特徴的な、任意の抗原、すなわち腫瘍関連抗原を含む。一実施形態では、用語「腫瘍関連抗原」とは、正常状態下では限定された数の組織及び/若しくは器官中又は特定の発生段階においてで特異的に発現されるタンパク質に関し、たとえば、腫瘍関連抗原は、正常状態下では胃組織中、好ましくは胃粘膜中、生殖器中、たとえば精巣中、栄養芽細胞組織中、たとえば胎盤中、又は生殖系列細胞中で特異的に発現される場合があり、1つ又は複数の腫瘍又は癌組織中で発現又は異常に発現される。この関連において、「限定された数」とは、好ましくは3つ以下、より好ましくは2つ以下を意味する。本発明との関連において、腫瘍抗原には、たとえば、分化抗原、好ましくは細胞種特異的分化抗原、すなわち正常状態下では特定の細胞種中で特定の分化段階において特異的に発現されるタンパク質、癌/精巣抗原、すなわち正常状態下では精巣中及び場合によっては胎盤中で特異的に発現されるタンパク質、並びに生殖系列特異的抗原が含まれる。好ましくは、腫瘍抗原又は腫瘍抗原の異常な発現が癌細胞を同定する。本発明との関連において、対象、たとえば癌疾患を患っている患者において癌細胞によって発現される腫瘍抗原は、好ましくは前記対象中の自己タンパク質である。好ましい実施形態では、腫瘍抗原は、本発明との関連において、正常状態下では、非必須である組織若しくは器官、すなわち免疫系によって損傷を受けた場合に対象の死をもたらさない組織若しくは器官中、又は免疫系によって接近可能でない若しくはわずかしか接近可能でない身体の器官若しくは構造体中で特異的に発現される
。
【００５２】
本発明によれば、用語「腫瘍抗原」、「腫瘍発現抗原」、「癌抗原」及び「癌で発現される抗原」は均等物であり、本明細書中で互換性があるように使用される。
【００５３】
用語「免疫原性」は、好ましくは、癌に対する処置等、治療的処置に関連する免疫応答を誘導するための相対的有効性に関する。本明細書中で使用する場合、用語「免疫原性(である)」は、免疫原性を有するという特性に関する。例えば、用語「免疫原性修飾」は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の文脈で使用する場合、前記修飾に起因する及び/又はこれに対して向ける免疫応答を誘導するための、前記ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の有効性に関する。好ましくは、修飾されていないペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、免疫応答を誘導しない、異なる免疫応答を誘導する、又は異なるレベル、好ましくはより低レベルの免疫応答を誘導する。
【００５４】
本発明によれば、用語「免疫原性」又は「免疫原性である」は、好ましくは、生物学的に関連性がある免疫応答、特に、ワクチン接種に有用な免疫応答を誘導するための相対的有効性に関する。よって、好まれる一実施形態では、アミノ酸修飾又は修飾されたペプチドは、対象における標的修飾に対する免疫応答を誘導する場合、免疫原性であり、この免疫応答は、治療又は予防目的に有益となることができる。
【００５５】
用語「主要組織適合複合体」及び略記「MHC」にはMHCクラスI及びMHCクラスII分子が含まれ、すべての脊椎動物中に存在する遺伝子の複合体に関する。MHCタンパク質又は分子は、免疫反応においてリンパ球と抗原提示細胞又は疾患細胞との間のシグナル伝達に重要であり、MHCタンパク質又は分子はペプチドと結合し、それらをT細胞受容体による認識のために提示する。MHCによってコードされているタンパク質は細胞の表面上に発現され、自己抗原(細胞自体からのペプチド断片)及び非自己抗原(たとえば侵入微生物の断片)をどちらもT細胞に表示する。
【００５６】
MHC領域はクラスI、クラスII、及びクラスIIIの3つの亜群に分けられる。MHCクラスIタンパク質はα-鎖及びβ2-ミクログロブリン(15番染色体によってコードされているMHCの一部ではない)を含有する。これらは抗原断片を細胞毒性T細胞に提示する。ほとんどの免疫系細胞、具体的には抗原提示細胞上で、MHCクラスIIタンパク質はα-及びβ-鎖を含有し、抗原断片をT-ヘルパー細胞に提示する。MHCクラスIII領域は、補体成分等の他の免疫構成要素及びサイトカインをコードしている一部のものをコードしている。
【００５７】
MHCは、多遺伝子性(数種類のMHCクラスI及びMHCクラスII遺伝子が存在する)且つ多型性(各遺伝子の複数の対立遺伝子が存在する)である。
【００５８】
本明細書中で使用する場合、用語「ハプロタイプ」は、一方の染色体上に存在するHLA対立遺伝子及びそれにコードされるタンパク質をいう。ハプロタイプは、MHC内のいずれか一方の座位に存在する対立遺伝子をいうこともできる。MHCの各クラスは、数種類の座位によって表される:例えば、クラスIに対しHLA-A(ヒト白血球抗原-A)、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、HLA-J、HLA-K、HLA-L、HLA-P及びHLA-V、並びにクラスIIに対しHLA-DRA、HLA-DRB1-9、HLA-、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DOA及びHLA-DOB。用語「HLA対立遺伝子」及び「MHC対立遺伝子」は、本明細書において互換的に使用される。
【００５９】
MHCは、極端な多型を示す:ヒト集団内で、各遺伝子座において、別個の対立遺伝子を含む非常に多数のハプロタイプが存在する。クラスI及びクラスIIの両方の異なる多型MHC対立遺伝子は、異なるペプチド特異性を有する:各対立遺伝子は、特定の配列パターンを示すペプチドに結合するタンパク質をコードする。
【００６０】
本発明のあらゆる態様の好まれる一実施形態では、MHC分子は、HLA分子である。
【００６１】
本発明によれば、MHCクラスIIは、HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA-DQ及びHLA-DRを含む。
【００６２】
本発明の文脈において、用語「MHC結合ペプチド」は、MHCクラスI及び/又はクラスII結合ペプチド、或いはプロセシングしてMHCクラスI及び/又はクラスII結合ペプチドを産生することができるペプチドを含む。クラスI MHC/ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には8〜12、好ましくは8〜10アミノ酸長であるが、より長い又はより短いペプチドも有効となり得る。クラスII MHC/ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には9〜30、好ましくは10〜25アミノ酸長であり、特に13〜18アミノ酸長である一方、より長い及びより短いペプチドも有効となり得る。
【００６３】
ペプチドは、直接的に、即ちプロセシングなしで、特に切断なしで提示される必要がある場合、MHC分子、特にクラスI MHC分子への結合に適した長さを有し、好ましくは、7〜20アミノ酸の長さ、より好ましくは7〜12アミノ酸の長さ、より好ましくは8〜11アミノ酸の長さ、特に9又は10アミノ酸の長さ等、7〜30アミノ酸の長さである。
【００６４】
ペプチドが、たとえばワクチン配列又はポリペプチドの付加配列を含むより大きな実体の一部であり、プロセッシング後、特に切断後に提示させる場合は、プロセッシングによって産生されたペプチドは、MHC分子、特にクラスI MHC分子との結合に適した長さを有し、好ましくは7〜20個のアミノ酸の長さ等、7〜30個のアミノ酸の長さ、より好ましくは7〜12個のアミノ酸の長さ、より好ましくは8〜11個のアミノ酸の長さ、特に9又は10個のアミノ酸の長さである。好ましくは、プロセシング後に提示される必要があるペプチドの配列は、ワクチン接種に使用される抗原又はポリペプチドのアミノ酸配列に由来する、即ち、その配列は、該抗原又はポリペプチドの断片に実質的に対応し、好ましくは  完全に同一である。
【００６５】
よって、MHC結合ペプチドは、一実施形態では、抗原の断片に実質的に対応し、好ましくは完全に同一な配列を含む。
【００６６】
用語「エピトープ」とは、抗原等の分子中の抗原決定基、すなわち、特にMHC分子との関連において提示された場合に、免疫系によって認識される、たとえばT細胞によって認識される分子中の一部又はその断片をいう。腫瘍抗原等のタンパク質のエピトープは、好ましくは前記タンパク質の連続的又は不連続的な一部分を含み、好ましくは5〜100、好ましくは5〜50、より好ましくは8〜30、最も好ましくは10〜25個のアミノ酸の長さである。たとえば、エピトープは、好ましくは9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25個のアミノ酸の長さであり得る。本発明との関連におけるエピトープはT細胞エピトープであることが特に好ましい。
【００６７】
本発明によれば、エピトープは細胞の表面上のMHC分子等のMHC分子と結合してよく、したがって「MHC結合ペプチド」であり得る。
【００６８】
本明細書中で使用する用語「ネオエピトープ」とは、正常な非癌細胞又は生殖系列細胞等の参照中には存在しないが、癌細胞中に見つかるエピトープをいう。これには、特に、正常な非癌細胞又は生殖系列細胞中に対応するエピトープが見つかるが、癌細胞中の1つ又は複数の突然変異が原因でエピトープの配列が変化することよってネオエピトープを生じるような状況が含まれる。
【００６９】
本明細書中で使用する場合、用語「T細胞エピトープ」は、T細胞受容体によって認識される立体配置におけるMHC分子に結合するペプチドをいう。典型的には、T細胞エピトープは、抗原提示細胞の表面に提示される。
【００７０】
本明細書中で使用する場合、用語「免疫原性アミノ酸修飾の予測」は、斯かるアミノ酸修飾を含むペプチドが、ワクチン接種において免疫原性となるか、従って、エピトープ、特にT細胞エピトープとして有用となるかに関する予測をいう。
【００７１】
本発明によれば、T細胞エピトープは、2つ以上のT細胞エピトープを含むワクチン配列及び/又はポリペプチド等、より大きな実体の一部としてワクチン中に存在することができる。提示されたペプチド又はT細胞エピトープは、適したプロセシング後に産生される。
【００７２】
T細胞エピトープは、TCR認識又はMHCへの結合に必須ではない1つ又は複数の残基において修飾することができる。斯かる修飾されたT細胞エピトープは、免疫学的に均等と考慮することができる。
【００７３】
好ましくは、T細胞エピトープは、MHCによって提示され、T細胞受容体によって認識されると、適切な共刺激シグナルの存在下で、ペプチド/MHC複合体を特異的に認識するT細胞受容体を保有するT細胞のクローン増大を誘導することができる。
【００７４】
好ましくは、T細胞エピトープは、抗原の断片のアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含む。好ましくは、抗原の前記断片は、MHCクラスI及び/又はクラスII提示ペプチドである。
【００７５】
本発明によるT細胞エピトープは、好ましくは、抗原、又は疾患細胞、特に癌細胞等、抗原の発現によって、好ましくは抗原の提示によって特徴づけられる細胞に対する免疫応答、好ましくは細胞性応答を刺激することができる抗原の部分又は断片に関する。好ましくは、T細胞エピトープは、クラスI MHCを有する抗原の提示によって特徴づけられる細胞に対する細胞性応答を刺激することができ、好ましくは、抗原応答性細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を刺激することができる。
【００７６】
「抗原プロセッシング」又は「プロセッシング」とは、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の、前記ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の断片のプロセッシング産物への分解(たとえばポリペプチドのペプチドへの分解)、及び、細胞、好ましくは抗原提示細胞による、特異的T細胞に対する提示のための、これらの断片のうちの1つ又は複数とMHC分子との会合(たとえば結合による)をいう。
【００７７】
「抗原提示細胞」(APC)とは、その細胞表面上にMHC分子と会合したタンパク質抗原のペプチド断片を提示する細胞である。一部のAPCは抗原特異的T細胞を活性化し得る。
【００７８】
プロフェッショナル抗原提示細胞は、貪食又は受容体媒介エンドサイトーシスのどちらかによって抗原を内部移行し、その後、クラスII MHC分子と結合した抗原の断片をその膜上に表示することに、非常に効率的である。T細胞は抗原提示細胞の膜上の抗原-クラスII MHC分子複合体を認識してそれと相互作用する。その後、さらなる共刺激シグナルが抗原提示細胞によって生成され、T細胞の活性化をもたらす。共刺激分子の発現はプロフェッショナル抗原提示細胞の決定的な特長である。
【００７９】
プロフェッショナル抗原提示細胞の主な種類は、最も広範囲の抗原提示を有しており恐らく最も重要な抗原提示細胞である樹状細胞、マクロファージ、B-細胞、及び特定の活性上皮細胞。樹状細胞(DC)とは、末梢組織中で捕捉された抗原を、MHCクラスII及びIの抗原提示経路の両方によってT細胞に提示する白血球集団である。樹状細胞が免疫応答の強力な誘導因子であり、これらの細胞の活性化が抗腫瘍免疫の誘導の重要なステップであることは周知である。樹状細胞は「未成熟」及び「成熟」細胞へと都合よく分類され、これは2つの十分に特徴づけられる表現型間を区別するための簡単な方法として使用することができる。しかし、この命名法は分化のすべての可能な中間段階を排除すると解釈されるべきでない。未成熟樹状細胞は抗原の取り込み及びプロセッシングの高い能力を有する抗原提示細胞として特徴づけられ、これはFcγ受容体及びマンノース受容体の高い発現に相関している。成熟表現型は、典型的には、これらのマーカーの発現はより低いが、クラスI及びクラスII MHC、接着分子(たとえば、CD54及びCD11)並びに共刺激分子(たとえば、CD40、CD80、CD86及び4-1BB)等のT細胞活性化を司っている細胞表面分子の発現が高いことによって特徴づけられる。樹状細胞の成熟は、そのような抗原提示樹状細胞がT細胞の初回刺激をもたらす樹状細胞活性化の状態をいう一方で、未成熟樹状細胞による提示は寛容をもたらす。樹状細胞の成熟は、生得的受容体によって検出された微生物特長を有する生体分子(細菌DNA、ウイルスRNA、内毒素等)、炎症誘発性サイトカイン(TNF、IL-1、IFN)、CD40Lによる樹状細胞表面上のCD40のライゲーション、及びストレス性の細胞死を経験している細胞から放出された物質によって主に引き起こされる。樹状細胞は、骨髄細胞をインビトロで顆粒球-マクロファージコロニー-刺激因子(GM-CSF)及び腫瘍壊死因子アルファ等のサイトカインと共に培養することによって誘導することができる。
【００８０】
非プロフェッショナル抗原提示細胞は、ナイーブT細胞との相互作用に必要なMHCクラスIIタンパク質を構成的に発現しない。これらは、IFNγ等の特定のサイトカインによる非プロフェッショナル抗原提示細胞の刺激の際にのみ発現される。
【００８１】
抗原提示細胞は、提示しようとするペプチドを含むペプチド又はポリペプチドをコードする核酸、好ましくはRNA、例えば、ワクチン接種に使用される抗原又はポリペプチドをコードする核酸を細胞に形質導入することにより、MHCクラスI提示ペプチドを負荷することができる。
【００８２】
一部の実施形態では、樹状又は他の抗原提示細胞を標的とする核酸送達媒体を含む医薬組成物又はワクチンを患者に投与し、in vivoで起こるトランスフェクションをもたらすことができる。たとえば、樹状細胞のインビボ形質移入は、一般に、WO 97/24447号に記載のもの、又はMahviら、Immunology and cell Biology 75:456〜460頁、1997によって記載されている遺伝子銃手法等の、当技術分野で知られている任意の方法を使用して行い得る。
【００８３】
本発明によれば、用語「抗原提示細胞」には標的細胞も含まれる。
【００８４】
「標的細胞」とは、細胞性免疫応答等の免疫応答の標的である細胞を意味するものとする。標的細胞には、抗原、すなわち抗原に由来するペプチド断片を提示する細胞が含まれ、癌細胞等のすべての望ましくない細胞が含まれる。好ましい実施形態では、標的細胞とは、本明細書中に記載の抗原を発現しており、好ましくはクラスI MHCを用いて前記抗原を提示している細胞である。
【００８５】
用語「一部分」とは画分をいう。アミノ酸配列又はタンパク質等の特定の構造に関して、用語、その「一部分」は、前記構造の連続的又は不連続的な画分を指定し得る。好ましくは、アミノ酸配列の一部分は、前記アミノ酸配列のアミノ酸のうちの少なくとも1%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、更により好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%を含む。好ましくは、一部分が不連続的な画分である場合、前記不連続的な画分は構造の2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、又はそれより多くの部分から構成され、それぞれの部分は構造の連続的な要素である。たとえば、アミノ酸配列の不連続的な画分は、前記アミノ酸配列の2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、又はそれより多く、好ましくは4個以下の部分から構成されていてよく、それぞれの部分は、好ましくはアミノ酸配列の少なくとも5個の連続的なアミノ酸、少なくとも10個の連続的なアミノ酸、好ましくは少なくとも20個の連続的なアミノ酸、好ましくは少なくとも30個の連続的なアミノ酸を含む。
【００８６】
用語「部分」及び「断片」は本明細書中で互換性があるように使用され、連続的な要素をいう。たとえば、アミノ酸配列又はタンパク質等の構造の一部とは、前記構造の連続的な要素をいう。構造の一部分、一部又は断片は、好ましくは前記構造の1つ又は複数の機能的特性を含む。たとえば、エピトープ、ペプチド又はタンパク質の一部分、一部又は断片は、好ましくはそれが由来するエピトープ、ペプチド又はタンパク質に免疫学的に均等である。本発明との関連において、アミノ酸配列等の構造の「一部」は、構造又はアミノ酸配列全体の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%、少なくとも96%、少なくとも98%、少なくとも99%を好ましくは含み、好ましくはそれからなる。
【００８７】
本発明との関連における用語「免疫反応性細胞」とは、免疫反応中にエフェクター機能を発揮する細胞に関する。「免疫反応性細胞」は、好ましくは、抗原、又は抗原若しくはそのペプチド断片(例えば、T細胞エピトープ)の提示によって特徴づけられる細胞に結合し、免疫応答を媒介することができる。たとえば、そのような細胞は、サイトカイン及び/又はケモカインを分泌し、抗体を分泌し、癌細胞を認識し、任意選択でそのような細胞を排除する。たとえば、免疫反応性細胞は、T細胞(細胞毒性T細胞、ヘルパーT細胞、腫瘍浸潤性T細胞)、B細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージ、及び樹状細胞を含む。好ましくは、本発明のとの関連において、「免疫反応性細胞」はT細胞、好ましくはCD4+及び/又はCD8+T細胞である。
【００８８】
好ましくは、「免疫反応性細胞」は、特にMHC分子のコンテキストで抗原提示細胞又は癌細胞等の疾患細胞の表面上等に提示された場合に、抗原又はそのペプチド断片をある程度の特異性で認識する。好ましくは、前記認識は、抗原又はそのペプチド断片を認識する細胞が応答性又は反応性となることを可能にする。細胞が、MHCクラスII分子のコンテキストにおいて抗原又はそのペプチド断片を認識する受容体を保有するヘルパーT細胞(CD4+T細胞)である場合、そのような応答性又は反応性は、サイトカインの放出並びに/又はCD8+リンパ球(CTL)及び/若しくはB細胞の活性化を含み得る。細胞がCTLである場合、そのような応答性又は反応性は、たとえばアポトーシス又はパーフォリン媒介性細胞溶解による、MHCクラスI分子のコンテキストにおいて提示された細胞、すなわちクラスI MHCを用いた抗原の提示によって特徴づけられる細胞の排除を含み得る。本発明によれば、CTL応答性には、持続的なカルシウム流、細胞分裂、IFN-γ及びTNF-α等のサイトカインの産生、CD44及びCD69等の活性化マーカーの上方制御、並びに抗原発現標的細胞の特異的細胞溶解性死滅が含まれ得る。また、CTL応答性は、CTL応答性を正確に示す人工レポーターを使用しても決定し得る。抗原又は抗原断片を認識し、応答性又は反応性であるようなCTLは、本明細書中で「抗原応答性CTL」とも呼ばれる。細胞がB細胞である場合、そのような応答性は免疫グロブリンの放出を含み得る。
【００８９】
用語「T細胞」及び「Tリンパ球」は、本明細書中で互換性があるように使用され、Tヘルパー細胞(CD4+T細胞)及び細胞溶解性T細胞を含む細胞毒性T細胞(CTL、CD8+T細胞)が含まれる。
【００９０】
T細胞はリンパ球として知られる白血球の群に属しており、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たす。これらは、T細胞受容体(TCR)と呼ばれる特別な受容体がその細胞表面上に存在することによって、B細胞及びナチュラルキラー細胞等の他のリンパ球種から識別することができる。胸腺はT細胞の成熟を司っている主要な器官である。T細胞のいくつかの異なる部分組が発見されており、それぞれが明白に異なる機能を有する。
【００９１】
Tヘルパー細胞は、他の機能のなかでとりわけB細胞の形質細胞への成熟並びに細胞毒性T細胞及びマクロファージの活性化を含めた免疫プロセスにおいて、他の白血球を援助する。これらの細胞は、その表面上にCD4タンパク質を発現するため、CD4+T細胞としても知られる。ヘルパーT細胞は、抗原提示細胞(APC)の表面上に発現されるMHCクラスII分子によってペプチド抗原が提示された際に活性化される。活性化された後、これらは迅速に分裂し、活性免疫応答を調節又は援助するサイトカインと呼ばれる小タンパク質を分泌する。
【００９２】
細胞毒性T細胞はウイルス感染細胞及び腫瘍細胞を破壊し、また移植片拒絶にも関連づけられている。これらの細胞は、その表面上にCD8糖タンパク質を発現するため、CD8+T細胞としても知られる。これらの細胞は、身体のほぼすべての細胞の表面上に存在するMHCクラスIと会合した抗原と結合することによって、その標的を認識する。
【００９３】
大多数のT細胞では、T細胞受容体(TCR)がいくつかのタンパク質の複合体として存在する。実際のT細胞受容体は、独立したT細胞受容体アルファ及びベータ(TCRα及びTCRβ)遺伝子から産生される2つの別々のペプチド鎖から構成されており、α-及びβ-TCR鎖と呼ばれている。γδT細胞(ガンマデルタT細胞)は、その表面上に明白に異なるT細胞受容体(TCR)を保有するT細胞の小さな部分組を表す。しかし、γδT細胞中では、TCRは1本のγ-鎖及び1本のδ-鎖からなっている。このT細胞の群はαβT細胞よりもはるかに稀である(全T細胞の2%)。
【００９４】
T細胞の活性化における最初のシグナルは、T細胞受容体と別の細胞上のMHCによって提示された短いペプチドとの結合によって提供される。これは、そのペプチドに特異的なTCRを有するT細胞のみが活性化されることを確実にする。パートナー細胞は通常、プロフェッショナル抗原提示細胞等、抗原提示細胞であり、ナイーブ応答の場合、通常は樹状細胞であるが、B細胞及びマクロファージは、重要なAPCとなることができる。
【００９５】
本発明によれば、分子は、標準のアッセイにおいて標的に対して有意な親和性を有しており、前記事前に決定された標的と結合する場合に、前記事前に決定された標的と結合することができる。「親和性」又は「結合親和性」は多くの場合、平衡解離定数(KD)によって測定する。分子は、標準のアッセイにおいて標的に対して有意な親和性を有しておらず、前記標的と有意に結合しない場合に、前記標的と(実質的に)結合することができない。
【００９６】
細胞毒性Tリンパ球は、抗原又はそのペプチド断片を抗原提示細胞内にインビボで取り込ませることによって、インビボで産生し得る。抗原又はそのペプチド断片はタンパク質として、DNA(たとえばベクター内)として、又はRNAとして表し得る。抗原はプロセッシングされてMHC分子のペプチドパートナーを生じ得る一方で、その断片はさらなるプロセッシングを必要とせずに提示され得る。特にこれらがMHC分子と結合できる場合は後者の状況である。一般に、皮内注射による患者への投与が可能である。しかし、リンパ節内への結節内注射も実施し得る(Maloyら(2001)、Proc Natl Acad Sci USA 98:3299〜303頁)。生じる細胞は目的の複合体を提示し、自己細胞毒性Tリンパ球によって認識され、これはその後に増殖する。
【００９７】
CD4+又はCD8+T細胞の特異的活性化は様々な方法で検出し得る。特異的T細胞活性化を検出する方法には、T細胞の増殖、サイトカイン(たとえばリンホカイン)の産生、又は細胞溶解活性の発生を検出することが含まれる。CD4+T細胞では、特異的T細胞活性化を検出する好ましい方法はT細胞の増殖の検出である。CD8+T細胞では、特異的T細胞活性化を検出する好ましい方法は細胞溶解活性の発生の検出である。
【００９８】
「抗原の提示によって特徴づけられる細胞」若しくは「抗原を提示する細胞」又は同様の表現とは、MHC分子、特にMHCクラスI分子のコンテキストにおいて、それが発現する抗原又は前記抗原に由来する断片を、たとえば抗原のプロセッシングによって提示する疾患細胞、たとえば癌細胞、又は抗原提示細胞等の細胞を意味する。同様に、用語「抗原の提示によって特徴づけられる疾患」とは、特にクラスI MHCを用いた抗原の提示によって特徴づけられる細胞を含む疾患を示す。細胞による抗原の提示は、細胞に、抗原をコードしているRNA等の核酸を形質移入させることによって達成し得る。
【００９９】
「提示されている抗原の断片」又は同様の表現とは、たとえば抗原提示細胞に直接加えた場合に、MHCクラスI又はクラスII、好ましくはMHCクラスIによって提示され得る断片を意味する。一実施形態では、断片は、抗原を発現する細胞によって天然に提示される断片である。
【０１００】
用語「免疫学的に均等」とは、免疫学的に均等なアミノ酸配列等の免疫学的に均等な分子が、たとえば液性及び/若しくは細胞性免疫応答の誘導等の免疫学的効果の種類、誘導された免疫反応の強度及び/若しくは持続期間、又は誘導された免疫反応の特異性に関して、同じ若しくは本質的に同じ免疫学的特性を示す及び/又は同じ若しくは本質的に同じ免疫学的効果を発揮することを意味する。本発明のコンテキストにおいて、用語「免疫学的に均等」は、好ましくは、免疫化に使用するペプチドの免疫学的効果又は特性に関して使用する。たとえば、アミノ酸配列が対象の免疫系に曝された際に参照アミノ酸配列と反応する特異性を有する免疫反応を誘導する場合に、前記アミノ酸配列は参照アミノ酸配列に免疫学的に均等である。
【０１０１】
本発明のコンテキストにおける用語「免疫エフェクター機能」には、たとえば腫瘍細胞の死滅、又は腫瘍の内転移及び転移の阻害を含めた腫瘍成長の阻害及び/若しくは腫瘍発生の阻害をもたらす、免疫系の構成要素によって媒介される任意の機能が含まれる。好ましくは、本発明のコンテキストにおける免疫エフェクター機能はT細胞に媒介されるエフェクター機能である。そのような機能は、ヘルパーT細胞(CD4+T細胞)の場合は、MHCクラスII分子のコンテキストにおけるT細胞受容体による抗原又は抗原断片の認識、サイトカインの放出並びに/又はCD8+リンパ球(CTL)及び/若しくはB細胞の活性化、CTLの場合は、MHCクラスI分子のコンテキストにおけるT細胞受容体による抗原又は抗原断片の認識、たとえばアポトーシス又はパーフォリン媒介性細胞溶解による、MHCクラスI分子のコンテキストにおいて提示された細胞、すなわちクラスI MHCを用いた抗原の提示によって特徴づけられる細胞の排除、IFN-γ及びTNF-α等のサイトカインの産生、並びに抗原発現標的細胞の特異的細胞溶解性死滅を含む。
【０１０２】
本発明によれば、用語「スコア」は、検査又は試験の、通常は数値的に表現される結果に関する。「より良いスコア」又は「最良のスコア」等の用語は、検査又は試験のより良い結果又は最良の結果に関する。
【０１０３】
本発明によれば、修飾されたペプチドは、MHCクラスIIに結合するその予測される能力に従って、また、修飾されたペプチドが由来する修飾されたタンパク質の発現又は存在量に従ってスコア化される。一般に、MHCクラスIIに結合するより高い予測される能力を有するペプチドは、MHCクラスIIに結合するより低い予測される能力を有するペプチドよりも良くスコア化される。更に、対応する修飾されたタンパク質のより高い発現又は存在量を有するペプチドは、対応する修飾されたタンパク質のより低い発現又は存在量を有するペプチドよりも良くスコア化される。
【０１０４】
「予測する」、「予測している」又は「予測」等の用語は、見込みの決定に関する。
【０１０５】
本発明によれば、1つ又は複数のMHCクラスII分子へのペプチドの結合のスコアを確かめることは、1つ又は複数のMHCクラスII分子へのペプチドの結合の見込みの決定を含む。
【０１０６】
1つ又は複数のMHCクラスII分子へのペプチドの結合のスコアは、いずれかのペプチド:MHC結合予測ツールを使用することによって確かめることができる。例えば、免疫エピトープデータベース分析資源(IEDB-AR: http://tools.iedb.org)を使用することができる。
【０１０７】
予測は通常、あらゆる可能なMHCクラスII対立遺伝子又は患者に存在するMHCクラスII対立遺伝子のセット若しくはサブセット等、異なるMHCクラスII対立遺伝子のセット等、MHCクラスII分子のセットに対して為される。好ましくは、患者は、本発明に従ってその免疫原性が決定されるべき、又は本発明によるその予測される免疫原性に従って選択及び/又はランクづけされるべき修飾を有する。好ましくは、本明細書に記載されているワクチンは、最終的に前記患者に提供されるべきである。したがって、本発明は、患者のMHCクラスII発現パターンの決定を含むこともできる。
【０１０８】
本発明は、同じ修飾及び/又は異なる修飾を含む異なるペプチドにおいて本発明の方法を行うことを含むこともできる。
【０１０９】
用語「同じ修飾を含む異なるペプチド」は、一実施形態では、修飾されたタンパク質の異なる断片を含む又はからなるペプチドに関し、前記異なる断片は、タンパク質に存在する同じ修飾を含むが、修飾の長さ及び/又は位置が異なる。タンパク質が、位置xに修飾を有する場合、前記位置xをカバーする前記タンパク質の異なる配列ウィンドウをそれぞれ含む前記タンパク質の2つ以上の断片は、同じ修飾を含む異なるペプチドと考慮される。
【０１１０】
用語「異なる修飾を含む異なるペプチド」は、一実施形態では、同じ及び/又は異なるタンパク質のいずれかの異なる修飾を含む、同じ及び/又は異なる長さのいずれかのペプチドに関する。タンパク質が、位置x及びyに修飾を有する場合、位置x又は位置yのいずれかをカバーする前記タンパク質の配列ウィンドウをそれぞれ含む前記タンパク質の2つの断片は、異なる修飾を含む異なるペプチドと考慮される。
【０１１１】
本発明は、本発明に従ってその免疫原性が決定されるべき、又は本発明によるその予測される免疫原性に従って選択及び/又はランクづけされるべき修飾を有するタンパク質配列をMHC結合に適切なペプチドの長さに破損し、同じ及び/又は異なるタンパク質のいずれかの同じ及び/又は異なる修飾を含む異なる修飾されたペプチドの1つ又は複数のMHCクラスII分子への結合のスコアを確かめることを含むこともできる。出力は、ランクづけすることができ、ペプチド及びその結合の見込みを示すその予測されるスコアのリストからなることができる。
【０１１２】
修飾されたタンパク質の発現又は存在量のスコアを確かめる工程は、あらゆる異なる修飾、そのサブセット、例えば、1つ若しくは複数のMHCクラスII分子への結合に関して最良にスコア化する修飾により、又は1つ若しくは複数のMHCクラスII分子への結合に関して最良にスコア化する修飾のみにより行うことができる。
【０１１３】
前記更に別の工程後に、結果をランクづけすることができ、これは、ペプチド及びその免疫原性となる見込みを示すその予測されるスコアのリストからなることができる。
【０１１４】
本発明によれば、修飾されたタンパク質の発現又は存在量のスコアを確かめる工程は、例えば、癌患者等、患者の腫瘍検体において、癌患者等、患者に対して行うことができる。
【０１１５】
本発明によれば、修飾されたタンパク質の発現又は存在量のスコアを確かめる工程は、修飾が関連するタンパク質の発現のレベルを決定し、及び/又は修飾が関連するタンパク質をコードするRNAの発現のレベルを決定し(これは再度、修飾が関連するタンパク質の発現のレベルを示すことができる)、修飾が関連するタンパク質の間での修飾されたタンパク質の頻度を決定する工程、及び/又は修飾が関連するタンパク質をコードするRNAの間の修飾されたタンパク質をコードするRNAの頻度を決定する工程を含むことができる。
【０１１６】
修飾が関連するタンパク質の間での修飾されたタンパク質の頻度及び/又は修飾が関連するタンパク質をコードするRNAの間での修飾されたタンパク質をコードするRNAの頻度は、修飾が関連するタンパク質内の修飾されたタンパク質の比率、及び/又は修飾が関連するタンパク質をコードするRNA内の修飾されたタンパク質をコードするRNAの比率と考慮することができる。
【０１１７】
本発明によれば、用語「修飾が関連するタンパク質」は、修飾を含み得るタンパク質に関し、その非修飾及び修飾状態のタンパク質を含む。
【０１１８】
本発明によれば、用語「発現のレベル」は、絶対又は相対量をいうことができる。
【０１１９】
本発明に従ってその免疫原性が決定されるべき、又は本発明によるその予測される免疫原性に従って選択及び/又はランクづけされるべきアミノ酸修飾は、細胞の核酸における突然変異に起因することができる。斯かる突然変異は、公知のシーケンシング技法によって同定することができる。
【０１２０】
一実施形態では、突然変異は、腫瘍検体のゲノム、エクソーム及び/又はトランスクリプトームと、非腫瘍発生的(tumorigenous)検体のゲノム、エクソーム及び/又はトランスクリプトームとの間の配列差を同定することにより決定され得る、癌患者の腫瘍検体における癌特異的体細胞突然変異である。
【０１２１】
本発明によれば、腫瘍検体は、腫瘍又は癌細胞を含有する又は含有すると予想される患者に由来する身体試料等の任意の試料に関する。身体試料は、血液、原発性腫瘍若しくは腫瘍転移から得られた組織試料、又は腫瘍若しくは癌細胞を含有する任意の他の試料等の任意の組織試料であり得る。好ましくは、身体試料は血液であり、癌特異的体細胞突然変異又は配列相違は血液中に含有される1つ又は複数の循環腫瘍細胞(CTC)中で決定する。別の実施形態では、腫瘍検体は、循環腫瘍細胞(CTC)等の1つ若しくは複数の単離した腫瘍若しくは癌細胞又は循環腫瘍細胞(CTC)等の1つ若しくは複数の単離した腫瘍若しくは癌細胞を含有する試料に関する。
【０１２２】
非腫瘍形成性検体は、患者又は好ましくは患者と同じ種の別の個体、好ましくは腫瘍又は癌細胞を含有しない又は含有しないと予想される健康な個体に由来する身体試料等の任意の試料に関する。身体試料は、血液又は非腫瘍形成性組織からの試料等の任意の組織試料であり得る。
【０１２３】
本発明は、患者の癌突然変異シグネチャの決定が関与することができる。用語「癌突然変異シグネチャ」とは、患者の1つ若しくは複数の癌細胞中に存在するすべての癌突然変異をいい得るか、又は患者の1つ若しくは複数の癌細胞中に存在する癌突然変異の一部分のみをいい得る。したがって、本発明は、患者の1つ若しくは複数の癌細胞中に存在するすべての癌特異的突然変異の同定を含み得るか、又は患者の1つ若しくは複数の癌細胞中に存在する癌特異的突然変異の一部分のみの同定を含み得る。一般に、本発明の方法は、本発明の方法に含まれるべき十分な数の修飾又は修飾されたペプチドを提供する、多数の突然変異の同定を提供する。
【０１２４】
好ましくは、本発明に従って同定される突然変異は、非同義突然変異、好ましくは腫瘍又は癌細胞中で発現されるタンパク質の非同義突然変異である。
【０１２５】
一実施形態では、癌特異的体細胞突然変異又は配列相違は、腫瘍検体のゲノム、好ましくはゲノム全体中で決定する。したがって、本発明は、1つ又は複数の癌細胞のゲノム、好ましくはゲノム全体の癌突然変異シグネチャを同定することを含み得る。一実施形態では、癌患者の腫瘍検体中の癌特異的体細胞突然変異を同定する工程は、全ゲノム癌突然変異プロフィールを同定することを含む。
【０１２６】
一実施形態では、癌特異的体細胞突然変異又は配列相違は、腫瘍検体のエクソーム、好ましくはエクソーム全体中で決定する。したがって、本発明は、1つ又は複数の癌細胞のエクソーム、好ましくはエクソーム全体の癌突然変異シグネチャを同定することを含み得る。一実施形態では、癌患者の腫瘍検体中の癌特異的体細胞突然変異を同定する工程は、全エクソーム癌突然変異プロフィールを同定することを含む。
【０１２７】
一実施形態では、癌特異的体細胞突然変異又は配列相違は、腫瘍検体のトランスクリプトーム、好ましくはトランスクリプトーム全体中で決定する。したがって、本発明は、1つ又は複数の癌細胞のトランスクリプトーム、好ましくはトランスクリプトーム全体の癌突然変異シグネチャを同定することを含み得る。一実施形態では、癌患者の腫瘍検体中の癌特異的体細胞突然変異を同定する工程は、全トランスクリプトーム癌突然変異プロフィールを同定することを含む。
【０１２８】
一実施形態では、癌特異的体細胞突然変異を同定する又は配列相違を同定する工程は、1個又は複数、好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個又は更にそれより多くの癌細胞の単一細胞シーケンシングを含む。したがって、本発明は、前記1つ又は複数の癌細胞の癌突然変異シグネチャを同定することを含み得る。一実施形態では、癌細胞は循環腫瘍細胞である。循環腫瘍細胞等の癌細胞は単一細胞シーケンシングの前に単離し得る。
【０１２９】
一実施形態では、癌特異的体細胞突然変異を同定する又は配列相違を同定する工程は、次世代シーケンシング(NGS)を使用することを含む。
【０１３０】
一実施形態では、癌特異的体細胞突然変異を同定する又は配列相違を同定する工程は、腫瘍検体のゲノムDNA及び/又はRNAのシーケンシングを行うことを含む。
【０１３１】
癌特異的体細胞突然変異又は配列相違を明らかにするために、腫瘍検体から得られた配列情報は、好ましくは、患者又は異なる個体のどちらかから入手し得る生殖系列細胞等の正常な非癌細胞のDNA又はRNA等の核酸のシーケンシングから得られた配列情報等の参照と比較する。一実施形態では、正常なゲノム生殖系列DNAは末梢血単核球(PBMC)から得られる。
【０１３２】
用語「ゲノム」とは、生物又は細胞の染色体中の遺伝情報の総量に関する。
【０１３３】
用語「エクソーム」は、発現される遺伝子のコード部分であるエクソンによって形成された、生物のゲノムの一部をいう。エクソームはタンパク質及び他の機能的遺伝子産物の合成において使用される遺伝的青写真を提供する。これはゲノムの最も機能的に関連性のある部分であり、したがって生物の表現型に寄与する可能性が最も高い。ヒトゲノムのエクソームは全ゲノムの1.5%を構成すると推定されている(Ng, PCら、PLoS Gen.、4(8):1〜15頁、2008)。
【０１３４】
用語「トランスクリプトーム」は、1個の細胞又は細胞の集団において産生されるmRNA、rRNA、tRNA及び他の非コードRNAを含むあらゆるRNA分子のセットに関する。本発明の文脈において、トランスクリプトームは、1個の細胞、細胞の集団、好ましくは、癌細胞の集団、又はある時点における所定の個体のあらゆる細胞において産生されるあらゆるRNA分子のセットを意味する。
【０１３５】
本発明によれば、「核酸」とは、好ましくはデオキシリボ核酸(DNA)又はリボ核酸(RNA)、より好ましくはRNA、最も好ましくはインビトロ転写RNA(IVT RNA)又は合成RNAである。本発明によれば、核酸にはゲノムDNA、cDNA、mRNA、組換え産生及び化学合成の分子が含まれる。本発明によれば、核酸は一本鎖又は二本鎖の直鎖状又は共有結合の環状閉鎖分子として存在し得る。本発明によれば、核酸は単離することができる。本発明によれば、用語「単離した核酸」とは、核酸が、(i)インビトロ、たとえばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅された、(ii)クローニングによって組換え産生された、(iii)たとえば切断及びゲル電気泳動による分離によって精製された、又は(iv)たとえば化学合成によって合成されたことを意味する。核酸(nucleic)は細胞内への導入、すなわち形質移入のために、特にDNA鋳型からのインビトロ転写によって調製することができるRNAの形態で用いることができる。RNAは、施用前に配列の安定化、キャッピング、及びポリアデニル化によって更に修飾することができる。
【０１３６】
用語「遺伝物質」とは、DNA若しくはRNAのどちらかの単離した核酸、二重らせんの一区間、染色体の一区間、又は生物若しくは細胞のゲノム全体、特にそのエクソーム若しくはトランスクリプトームをいう。
【０１３７】
用語「突然変異」とは、参照と比較した核酸配列の変化又は相違(ヌクレオチドの置換、付加又は欠失)をいう。「体細胞突然変異」は生殖細胞(精子及び卵子)以外の身体の細胞のうちの任意のもので起こる場合があり、したがって子供には伝わらない。これらの変更は(必ずしもではないが)癌又は他の疾患を引き起こす場合がある。好ましくは、突然変異は非同義突然変異である。用語「非同義突然変異」とは、翻訳産物中のアミノ酸置換等のアミノ酸変化をもたらす突然変異、好ましくはヌクレオチド置換をいう。
【０１３８】
本発明によれば、用語「突然変異」には点突然変異、インデル、融合、クロモスリプシス及びRNA編集が含まれる。
【０１３９】
本発明によれば、用語「インデル」とは、共存する挿入及び欠失並びにヌクレオチドの正味増加又は減少をもたらす突然変異として定義される、特別な突然変異クラスを説明する。ゲノムのコード領域では、インデルの長さが3の倍数でない限り、これらはフレームシフト突然変異を生じる。インデルは点突然変異と対照させることができる。インデルが配列からヌクレオチドを挿入及び欠失させる場合には、点突然変異はヌクレオチドのうちの1つを置き換える置換の一形態である。
【０１４０】
融合は、2つの以前は別々の遺伝子から形成されたハイブリッド遺伝子を生じることができる。これは転座、中間部欠失、又は染色体逆位の結果として生じることができる。多くの場合、融合遺伝子は癌遺伝子である。発癌性融合遺伝子は、新しい又は2つの融合パートナーからの異なる機能を有する遺伝子産物をもたらし得る。或いは、原癌遺伝子は強力なプロモーターと融合しており、したがって、発癌性機能は上流融合パートナーの強力なプロモーターによって引き起こされる上方制御によって機能し始める。また、発癌性融合転写物は、トランス-スプライシング又はリードスルー事象によっても引き起こされ得る。
【０１４１】
本発明によれば、用語「クロモスリプシス」とは、単一の破壊事象によってゲノムの特異的領域が砕かれ、その後に縫合される遺伝的現象をいう。
【０１４２】
本発明によれば、用語「RNA編集」又は「RNA編集する」とは、塩基構成中の化学的変化によってRNA分子中の情報内容が変更される分子プロセスをいう。RNA編集には、シチジン(C)からウリジン(U)及びアデノシン(A)からイノシン(I)等のヌクレオシド改変、脱アミノ化、並びに非鋳型のヌクレオチド付加及び挿入が含まれる。mRNAのRNA編集は、ゲノムDNA配列によって予測されているものと異なるように、コードされているタンパク質のアミノ酸配列を有効に変更する。
【０１４３】
用語「癌突然変異シグネチャ」とは、非癌性の参照細胞と比較した場合に癌細胞中に存在する一組の突然変異をいう。
【０１４４】
本発明によれば、「参照」は、腫瘍検体から本発明の方法で得られた結果を相関及び比較するために使用し得る。典型的には、「参照」は、患者又は1つ若しくは複数の異なる個体、好ましくは健康な個体、特に同じ種の個体のどちらかから得られた、1つ又は複数の正常検体、特に癌疾患によって影響を受けていない検体に基づいて入手し得る。「参照」は、十分に多数の正常検体を試験することによって経験的に決定することができる。
【０１４５】
突然変異を決定するために、いずれか適したシーケンシング方法を本発明に従って使用することができ、次世代シーケンシング(NGS)技術が好まれる。方法のシーケンシングステップの速度を上げるために、将来は第三世代シーケンシング方法がNGS技術を置き換える可能性がある。明確にする目的のために、本発明のコンテキストにおける用語「次世代シーケンシング」又は「NGS」とは、ゲノム全体を小片に切断することによって核酸鋳型をゲノム全体に沿ってランダムに並行して読み取る、サンガー化学として知られる「従来の」シーケンシング方法とは対照的に、すべての新規高スループットシーケンシング技術を意味する。そのようなNGS技術(超並列シーケンシング技術としても知られる)は、全ゲノム、エクソーム、トランスクリプトーム(ゲノムのすべての転写された配列)又はメチローム(ゲノムのすべてのメチル化された配列)の核酸配列情報を非常に短期間、たとえば、1〜2週間以内、好ましくは1〜7日間以内、又は最も好ましくは24時間未満以内に送達することができ、原理上は単一細胞シーケンシング手法を可能にする。市販されている又は文献中たとえば、Zhangら、2011: The impact of next-generation sequencing on genomics. J. Genet Genomics 38(3)、95〜109頁又はVoelkerdingら、2009: Next generation sequencing: From basic research to diagnostics. Clinical chemistry 55、641〜658頁に詳述されているものに言及されている複数のNGSプラットフォームを、本発明のコンテキストにおいて使用することができる。そのようなNGS技術/プラットフォームの非限定的な例は以下のとおりである。
1)たとえば、最初にRonaghiら、1998: A sequencing method based on real-time pyrophosphate. Science 281(5375)、363〜365頁に記載されている、Roche関連会社454 Life Sciences社(コネチカット州Branford)のGS-FLX 454 Genome Sequencer(商標)で実装されるパイロシーケンシングとして知られる合成技術によるシーケンシング。この技術は、エマルジョンPCR増幅のために油に取り囲まれたPCR反応物質を含有する水性ミセル中で激しく渦撹拌することによって一本鎖DNA結合ビーズがカプセル封入される、エマルジョンPCRを使用する。パイロシーケンシング工程中、ポリメラーゼがDNA鎖を合成する際にヌクレオチドの取り込み中にリン酸分子から放出される光が記録される。
2)可逆的色素-ターミネーターに基づいており、たとえばIllumina/Solexa Genome Analyzer(商標)及びIllumina HiSeq 2000 Genome Analyzer(商標)で実装されているSolexa社(現在はIllumina Inc.社の一部、カリフォルニア州San Diego)によって開発された、合成手法によるシーケンシング。この技術では、4つすべてのヌクレオチドを同時に、DNAポリメラーゼと共にフローセルチャネル中のオリゴ初回刺激したクラスター断片に加える。架橋増幅によりシーケンシングのために4つすべての蛍光標識ヌクレオチドを有するクラスター鎖を伸長させる。
3)たとえばApplied Biosystems社(現在はLife Technologies Corporation、カリフォルニア州Carlsbad)のSOLid(商標)プラットフォームで実装されている、ライゲーション手法によるシーケンシング。この技術では、固定長のすべての可能なオリゴヌクレオチドのプールを、シーケンシングした位置に従って標識する。オリゴヌクレオチドがアニーリング及びライゲーションされ、DNAリガーゼによる一致した配列の優先的なライゲーションは、その位置でのヌクレオチドの情報を与えるシグナルをもたらす。シーケンシングの前に、DNAをエマルジョンPCRによって増幅する。それぞれ同じDNA分子のコピーしか含有しない、生じるビーズをスライドガラス上に載せる。2つ目の例として、Dover Systems社(ニューハンプシャー州Salem)のPolonator(商標)G.007プラットフォームも、ランダムにアレイ配置したビーズに基づくエマルジョンPCRを使用して、並列シーケンシングのためにDNA断片を増幅することによって、ライゲーション手法によるシーケンシングを用いる。
4)たとえば、Pacific Biosciences社(カリフォルニア州Menlo Park)のPacBio RSシステム又はHelicos Biosciences社(マサチューセッツ州Cambridge)のHeliScope(商標)プラットフォームで実装されている単一分子シーケンシング技術。この技術の明確な特徴は、単一分子リアルタイム(SMRT)DNAシーケンシングと定義される、単一のDNA又はRNA分子を増幅なしにシーケンシングするその能力である。たとえば、HeliScopeは、それぞれのヌクレオチドが合成されていく最中にそれを直接検出するために、高感度の蛍光検出システムを使用する。蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)に基づく同様の手法がVisigen Biotechnology社(テキサス州Houston)から開発されている。他の蛍光に基づく単一分子技法は、U.S.Genomics(GeneEngine(商標))及びGenovoxx(AnyGene(商標))からのものである。
5)たとえば複製中に単一鎖上のポリメラーゼ分子の動きを監視するためにチップ上に配置されている様々なナノ構造を使用する、単一分子シーケンシングのためのナノ技術。ナノ技術に基づく手法の非限定的な例は、Oxford Nanopore Technologies社(英国Oxford)のGridON(商標)プラットフォーム、Nabsys社(ロードアイランド州Providence)によって開発されたハイブリダイゼーション支援のナノポアシーケンシング(HANS(商標))プラットフォーム、及びコンビナトリアルプローブアンカーライゲーション(cPAL(商標))と呼ばれるDNAナノボール(DNB)技術を用いた商標を有するリガーゼに基づくDNAシーケンシングプラットフォームである。
6)単一分子シーケンシングのための電子顕微鏡観察に基づく技術、たとえばLightSpeed Genomics社(カリフォルニア州Sunnyvale)及びHalcyon Molecular社(カリフォルニア州Redwood City)によって開発されたもの。
7)DNAの重合中に放出される水素イオンの検出に基づくイオン半導体シーケンシング。たとえば、Ion Torrent Systems社(カリフォルニア州San Francisco)は、この生化学的プロセスを超並列の様式で行うために微小測定ウェルの高密度アレイを使用する。それぞれのウェルは異なるDNA鋳型を有する。ウェルの下にイオン感受性層があり、その下に商標を有するイオンセンサーがある。
【０１４６】
好ましくは、DNA及びRNA調製物はNGSの出発物質として役割を果たす。そのような核酸は、生体物質等の試料から、たとえば、新鮮な、フラッシュ凍結した若しくはホルマリン固定したパラフィン包埋腫瘍組織(FFPE)から又は新たに単離した細胞から又は患者の末梢血中に存在するCTCから、容易に得ることができる。正常な突然変異していないゲノムDNA又はRNAは正常な体性組織から抽出することができるが、本発明のコンテキストにおいては生殖系列細胞が好ましい。生殖系列DNA又はRNAを、非血液学的悪性腫瘍に罹患している患者における末梢血単核細胞(PBMC)から抽出することができる。FFPE組織又は新鮮に単離した単一細胞から抽出した核酸は非常に断片化されているが、これらはNGSの応用には適している。
【０１４７】
エクソームシーケンシングのためのいくつかの標的NGS方法が文献(総説には、たとえばTeer及びMullikin 2010: Human Mol Genet 19(2)、R145〜51頁を参照)に記載されており、これらのすべてを本発明と併せて使用することができる。これらの方法の多く(たとえばゲノム捕捉、ゲノム分配、ゲノム濃縮等として記載)はハイブリダイゼーション技法を使用し、アレイに基づく(たとえばHodgesら、2007: Nat. Genet. 39、1522〜1527頁)及び液体に基づく(たとえばChoiら、2009: Proc. Natl. Acad. Sci USA 106、19096〜19101頁)ハイブリダイゼーション手法が含まれる。また、DNA試料の調製及び続くエクソームの捕捉のための市販のキットも入手可能であり、たとえば、Illumina Inc.社(カリフォルニア州San Diego)は、TruSeq(商標)DNA試料の調製キット(DNA Sample Preparation Kit)及びTruSeq(商標)エクソーム濃縮キット(Exome Enrichment Kit)を提供している。
【０１４８】
たとえば腫瘍試料の配列を生殖系列試料の配列等の参照試料の配列と比較する際に癌特異的体細胞突然変異又は配列相違の検出において偽陽性の発見数を減らすために、これらの試料種のうちの一方又は両方の複製中の配列を決定することが好ましい。したがって、生殖系列試料の配列等の参照試料の配列を2回、3回又はそれより多く決定することが好ましい。或いは又はそれに加えて、腫瘍試料の配列を2回、3回又はそれより多く決定する。また、生殖系列試料の配列等の参照試料の配列及び/又は腫瘍試料の配列はまた、ゲノムDNA中の配列を少なくとも1回決定し、前記参照試料及び/又は前記腫瘍試料のRNA中の配列を少なくとも1回決定することによって、複数回決定することも可能であり得る。たとえば、生殖系列試料等の参照試料の複製間の変異を決定することによって、予想される体細胞突然変異の偽陽性率(FDR)を統計的量として推定することができる。1つの試料の技術的反復は同一の結果を生じるはずであり、この「対同一物比較」中に検出されたすべての突然変異は偽陽性である。特に、参照試料に対する腫瘍試料における体細胞突然変異検出の偽発見率を決定するために、参照試料の技術的反復を、偽陽性の数を推定するための参照として使用することができる。更に、様々な品質関連の測定基準(たとえばカバレッジ又はSNP品質)を、機械学習手法を使用して単一の品質スコアへと合わせ得る。所定の体性変異について、上回る品質スコアを有するすべての他の変異を計数してよく、これによりデータセット中のすべての変異の順位づけが可能となる。
【０１４９】
本発明のコンテキストにおいて、用語「RNA」とは、少なくとも1つのリボヌクレオチド残基を含み、好ましくは完全に又は実質的にリボヌクレオチド残基から構成される分子に関する。「リボヌクレオチド」とは、β-D-リボフラノシル基の2'位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。用語「RNA」は、二本鎖RNA、一本鎖RNA、部分的又は完全に精製したRNA等の単離したRNA、本質的に純粋なRNA、合成RNA、並びに1つ又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び/又は変更によって天然に存在するRNAと異なる修飾RNA等の組換え産生したRNAを含む。そのような変更には、例えば、RNAの末端への又は内部での、たとえばRNAの1つ若しくは複数のヌクレオチドでの非ヌクレオチド物質の付加を含めることができる。また、RNA分子中のヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチド又は化学合成ヌクレオチド又はデオキシヌクレオチド等の非標準のヌクレオチドも含むことができる。これらの変更されたRNAは、類似体又は天然に存在するRNAの類似体と呼ぶことができる。
【０１５０】
本発明によれば、用語「RNA」には「mRNA」が含まれ、好ましくはそれに関する。用語「mRNA」とは「メッセンジャーRNA」を意味し、DNA鋳型を使用することによって作製され、ペプチド又はポリペプチドをコードしている「転写物」に関する。典型的には、mRNAは、5'-UTR、タンパク質コード領域、及び3'-UTRを含む。mRNAは細胞中及びインビトロにおいて限定された半減期しか持たない。本発明のコンテキストにおいて、mRNAはDNA鋳型からインビトロ転写によって作製し得る。インビトロ転写方法は当業者に知られている。たとえば、様々なインビトロ転写キットが市販されている。
【０１５１】
本発明によれば、RNAの安定性及び翻訳効率は必要に応じて改変し得る。たとえば、RNAの安定化効果を有する及び/又は翻訳効率を増加させる1つ又は複数の修飾によって、RNAを安定化させ、その翻訳を増加させ得る。そのような修飾は、たとえば、本明細書中に参考として組み込まれているPCT/EP2006/009448号に記載されている。本発明に従って使用するRNAの発現を増加させるために、コード領域、すなわち発現されるペプチド又はタンパク質をコードしている配列内で、好ましくは発現されるペプチド又はタンパク質の配列を変更させずに修飾することによって、GC含有率を増加させてmRNAの安定性を増加させ、コドン最適化を行い、したがって細胞内の翻訳を亢進させ得る。
【０１５２】
本発明で使用するRNAのコンテキストにおける用語「修飾」には、前記RNA中に天然で存在しない、RNAの任意の修飾が含まれる。
【０１５３】
本発明の一実施形態では、本発明に従って使用するRNAは非キャップ5'-三リン酸を有さない。そのような非キャップ5'-三リン酸の除去は、RNAをホスファターゼで処理することによって達成することができる。
【０１５４】
本発明によるRNAは、その安定性を増加する及び/又は細胞毒性を低下するために、修飾されたリボヌクレオチドを有し得る。たとえば、一実施形態では、本発明に従って使用するRNA中で、シチジンを5-メチルシチジンで部分的又は完全に、好ましくは完全に置換する。或いは又はそれに加えて、一実施形態では、本発明に従って使用するRNA中で、ウリジンをプソイドウリジンで部分的又は完全に、好ましくは完全に置換する。
【０１５５】
一実施形態では、用語「修飾」とは、RNAに5'-cap又は5'-cap類似体を提供することに関する。用語「5'-cap」とは、mRNA分子の5'末端上に見つかるcap構造をいい、一般に、普通ではない5'から5'の三リン酸結合を介してmRNAと連結したグアノシンヌクレオチドからなる。一実施形態では、このグアノシンは7位でメチル化されている。用語「従来の5'-cap」とは、天然に存在するRNA5'-cap、好ましくは7-メチルグアノシンキャップ(m7G)をいう。本発明のコンテキストにおいて、用語「5'-cap」には、RNAcap構造に似ており、好ましくはインビボ及び/又は細胞内でそれと付着している場合にRNAを安定化させる及び/又はRNAの翻訳を亢進させる能力を有するように修飾されている、5'-cap類似体が含まれる。
【０１５６】
RNAに5'-cap又は5'-cap類似体を提供することは、前記5'-cap又は5'cap類似体の存在下におけるDNA鋳型のインビトロ転写によって達成してよく、前記5'-capが作製されたRNA鎖内に同時転写的に取り込まれるか、又は、RNAは、たとえばインビトロ転写によって作製されてよく、5'-capは、キャッピング酵素、たとえばワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用して転写後にRNAに付着させてよい。
【０１５７】
RNAはさらなる修飾を含み得る。たとえば、本発明で使用するRNAのさらなる修飾は、天然に存在するポリ(A)テイルの伸長若しくは切断、又は、前記RNAのコード領域に関連していないUTRの導入、たとえば、グロビン遺伝子、たとえばアルファ2-グロビン、アルファ1-グロビン、ベータ-グロビン、好ましくはベータ-グロビン、より好ましくはヒトベータ-グロビンに由来する1つ若しくは複数、好ましくは2コピーの3'-UTRによる既存の3'-UTRの交換若しくはその挿入等の、5'-若しくは3'-非翻訳領域(UTR)の変更であり得る。
【０１５８】
マスキングされていないポリ-A配列を有するRNAは、マスキングされたポリ-A配列を有するRNAよりも効率的に翻訳される。用語「ポリ(A)テイル」又は「ポリ-A配列」とは、典型的にはRNA分子の3'末端上に位置するアデニル(A)残基の配列に関し、「マスキングされていないポリ-A配列」とは、RNA分子の3'末端のポリ-A配列がポリ-A配列のAで終了し、ポリ-A配列の3'末端、すなわち下流に位置するA以外のヌクレオチドが続かないことを意味する。更に、約120塩基対の長いポリ-A配列は、RNAの最適な転写安定性及び翻訳効率をもたらす。
【０１５９】
したがって、本発明に従って使用するRNAの安定性及び/又は発現を増加させるために、好ましくは10〜500、より好ましくは30〜300、更により好ましくは65〜200、特に100〜150個のアデノシン残基の長さを有するポリ-A配列と共に存在するようにこれを修飾し得る。特に好ましい実施形態では、ポリ-A配列は約120個のアデノシン残基の長さを有する。本発明に従って使用するRNAの安定性及び/又は発現を更に増加させるために、ポリ-A配列をマスキングしないことができる。
【０１６０】
更に、RNA分子の3'-非翻訳領域内への3'-非翻訳領域(UTR)の取り込みは、翻訳効率の亢進をもたらすことができる。2個以上のそのような3'-非翻訳領域を取り込ませることによって、相乗効果を達成し得る。3'-非翻訳領域は、それらが導入されるRNAに対して自己又は異種であり得る。特定の一実施形態では、3'-非翻訳領域はヒトβ-グロビン遺伝子に由来する。
【０１６１】
上述の修飾の組合せ、すなわちポリ-A配列の取り込み、ポリ-A配列の脱マスキング及び1つ又は複数の3'-非翻訳領域の取り込みは、RNAの安定性及び翻訳効率の増加に対して相乗的な影響を有する。
【０１６２】
用語、RNAの「安定性」とは、RNAの「半減期」に関連する。「半減期」とは、分子の活性、量、又は数の半分を排除するために必要な期間に関する。本発明のコンテキストにおいて、RNAの半減期は前記RNAの安定性の指標である。RNAの半減期は、RNAの「発現の持続期間」に影響を与え得る。長い半減期を有するRNAは長期間の間発現されることを予測することができる。
【０１６３】
もちろん、本発明に従ってRNAの安定性及び/又は翻訳効率を減少させることが望ましい場合は、RNAの安定性及び/又は翻訳効率を増加させる上述の要素の機能を妨害するようにRNAを修飾することが可能である。
【０１６４】
用語「発現」とは、本発明に従って最も一般的な意味で使用され、たとえば転写及び/又は翻訳による、RNA及び/又はペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質の産生を含む。RNAに関して、用語「発現」又は「翻訳」とは、特にペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の産生に関する。また、これは核酸の部分的発現も含む。更に、発現は一過性又は安定であることができる。
【０１６５】
本発明によれば、用語発現には、「異常な発現」又は「異常発現」も含まれる。本発明によれば、「異常な発現」又は「異常発現」とは、参照、たとえば、特定のタンパク質、たとえば腫瘍抗原の異常な発現又は異常発現に関連している疾患に罹患していない対象の状態と比較して、発現が変更されている、好ましくは増加していることを意味する。発現の増加とは、少なくとも10%、特に少なくとも20%、少なくとも50%若しくは少なくとも100%、又はそれより多くの増加をいう。一実施形態では、発現は患部組織中でのみ見つかり、健康な組織中の発現は抑制されている。
【０１６６】
用語「特異的に発現される」とは、タンパク質が本質的に特異的組織又は器官中でのみ発現されることを意味する。たとえば、胃粘膜中で特異的に発現される腫瘍抗原とは、前記タンパク質が主に胃粘膜中で発現され、他の組織中では発現されない又は他の組織若しくは器官種中では有意な程度には発現されないことを意味する。したがって、胃粘膜の細胞中で排他的に発現され、精巣等の任意の他の組織中では有意により少ない程度に発現されるタンパク質は、胃粘膜の細胞中で特異的に発現される。一部の実施形態では、腫瘍抗原はまた、正常状態下では、複数の組織型又は器官、たとえば2つ又は3つの組織型又は器官であるが、好ましくは3つ以下の異なる組織又は器官種中で特異的に発現され得る。この場合、腫瘍抗原はこれらの器官中で特異的に発現される。たとえば、腫瘍抗原が正常状態下で肺及び胃中で好ましくはほぼ同程度に発現される場合、前記腫瘍抗原は肺及び胃中で特異的に発現される。
【０１６７】
本発明のコンテキストにおいて、用語「転写」とは、DNA配列の遺伝暗号がRNAへと転写されるプロセスに関する。続いて、RNAはタンパク質へと翻訳され得る。本発明によれば、用語「転写」は「インビトロ転写」を含み、用語「インビトロ転写」とは、RNA、特にmRNAが、無細胞系中で、好ましくは適切な細胞抽出物を使用してインビトロ合成されるプロセスに関する。好ましくは、クローニングベクターを転写物の作製に応用する。これらのクローニングベクターは一般に転写ベクターと命名され、本発明によれば用語「ベクター」によって包含される。本発明によれば、本発明で使用するRNAは好ましくはインビトロ転写RNA(IVT-RNA)であり、適切なDNA鋳型のインビトロ転写によって得られ得る。転写を制御するためのプロモーターは、任意のRNAポリメラーゼの任意のプロモーターであることができる。RNAポリメラーゼの具体的な例は、T7、T3、及びSP6 RNAポリメラーゼである。好ましくは、インビトロ転写は、本発明によればT7又はSP6プロモーターによって制御される。インビトロ転写のためのDNA鋳型は、核酸、特にcDNAをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクター内に導入することによって得られ得る。cDNAはRNAの逆転写によって得られ得る。
【０１６８】
本発明による用語「翻訳」とは、メッセンジャーRNAの鎖がアミノ酸の配列のアセンブリを指示してペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を作製する、細胞のリボソーム中のプロセスに関する。
【０１６９】
本発明によれば核酸と機能的に連結していてもよい、発現制御配列又は調節配列は、核酸に関して相同的又は異種であることができる。コード配列及び調節配列は、コード配列の転写又は翻訳が調節配列の制御下又は影響下となるように一緒に共有結合されている場合に、「機能的に」一緒に連結されている。調節配列とコード配列との機能的連結を用いてコード配列を機能的タンパク質へと翻訳させる場合は、調節配列の誘導は、コード配列の読み枠のシフト又はコード配列が所望のタンパク質若しくはペプチドへと翻訳されないことを引き起こさずに、コード配列の転写をもたらす。
【０１７０】
本発明によれば、用語「発現制御配列」又は「調節配列」とは、核酸の転写又は誘導されたRNAの翻訳を制御する、プロモーター、リボソーム結合配列及び他の制御要素を含む。本発明の特定の実施形態では、調節配列を制御することができる。調節配列の正確な構造は種又は細胞種応じて変動する可能性があるが、一般に、TATAボックス、キャッピング配列、CAAT配列等の転写又は翻訳の開始に関与している5'-非転写並びに5'-及び3'-非翻訳配列を含む。特に、5'-非転写調節配列は、機能的に結合した遺伝子の転写制御のプロモーター配列が含まれるプロモーター領域を含む。また、調節配列は、エンハンサー配列又は上流の活性化配列も含むことができる。
【０１７１】
好ましくは、本発明によれば、細胞中で発現させるRNAを前記細胞内に導入する。本発明による方法の一実施形態では、細胞内に導入するRNAは適切なDNA鋳型のインビトロ転写によって得られる。
【０１７２】
本発明によれば、「発現することができるRNA」及び「コードしているRNA」等の用語は本明細書中で互換性があるように使用され、特定のペプチド又はポリペプチドに関しては、RNAは、適切な環境中で、好ましくは細胞内に存在する場合、発現させて前記ペプチド又はポリペプチドを産生することができることを意味する。好ましくは、本発明によるRNAは、細胞の翻訳機構と相互作用して、それが発現することができるペプチド又はポリペプチドを提供することができる。
【０１７３】
「移す」、「導入する」又は「形質移入する」等の用語は本明細書中で互換性があるように使用され、核酸、特に外因性又は異種の核酸、特にRNAを細胞内に導入することに関する。本発明によれば、細胞は、器官、組織及び/又は生物の一部を形成することができる。本発明によれば、核酸の投与は、裸の核酸として達成する、又は投与試薬と組み合わせて達成するのいずれかである。ある。好ましくは、核酸の投与は裸核酸の形態である。好ましくは、RNAはRNase阻害剤等の安定化物質と組み合わせて投与する。また、本発明は、長期間の持続的発現を可能にするために核酸を細胞内に繰返し導入することも想定している。
【０１７４】
細胞は、たとえばRNAと複合体を形成すること又はRNAを封入若しくはカプセル封入する小胞を形成することによってRNAと会合させ、裸RNAと比較して増加したRNAの安定性をもたらすことができる、任意の担体を用いて形質移入することができる。本発明に従って有用な担体には、たとえば、カチオン性脂質、リポソーム、特に陽イオン性リポソーム、及びミセル等の脂質含有担体、並びにナノ粒子が含まれる。カチオン性脂質は負荷電の核酸と複合体を形成し得る。任意のカチオン性脂質を本発明に従って使用し得る。
【０１７５】
好ましくは、細胞、特にインビボで存在する細胞内へのペプチド又はポリペプチドをコードしているRNAの導入は、細胞中での前記ペプチド又はポリペプチドの発現をもたらす。特定の実施形態では、核酸を特定の細胞に標的化することが好ましい。そのような実施形態では、核酸を細胞に投与するために適用する担体(たとえばレトロウイルス又はリポソーム)は、標的化分子を示す。たとえば、標的細胞上の表面膜タンパク質又は標的細胞上の受容体のリガンドに特異的な抗体等の分子を、核酸担体内に取り込ませ得る、又はそれと結合させ得る。核酸をリポソームによって投与する場合、標的化及び/又は取り込みを可能にするために、エンドサイトーシスに関連している表面膜タンパク質と結合するタンパク質をリポソーム配合物内に取り込ませ得る。そのようなタンパク質は、特定の細胞種、内部移行されるタンパク質に対する抗体、細胞内の位置を標的とするタンパク質等に特異的なカプシドタンパク質又はその断片を包含する。
【０１７６】
用語「細胞」又は「宿主細胞」は、好ましくは、無処置の細胞、すなわち、酵素、オルガネラ、又は遺伝物質等のその正常な細胞内成分を放出していない無処置の膜を有する細胞である。無処置の細胞は、好ましくは、生細胞、すなわちどの正常な代謝機能を実施することができる生細胞である。好ましくは、本発明によれば、前記用語は、外因性の核酸を用いて形質転換又は形質移入することができる任意の細胞に関する。本発明によれば、用語「細胞」には、原核細胞(たとえば大腸菌(E.coli))又は真核細胞(たとえば、樹状細胞、B細胞、CHO細胞、COS細胞、K562細胞、HEK293細胞、HELA細胞、酵母細胞、及び昆虫細胞)が含まれる。外因性の核酸は、細胞内に(i)それ自体で自由に分散して、(ii)組換えベクター内に組み込まれて、又は(iii)宿主細胞ゲノム若しくはミトコンドリアDNA内に組み込まれて見つかり得る。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、及び霊長類からの細胞等の哺乳動物細胞が特に好ましい。細胞は多数の組織型に由来していてよく、初代細胞及び細胞系が含まれる。具体的な例には、ケラチノサイト、末梢血白血球、骨髄幹細胞、及び胚性幹細胞が含まれる。さらなる実施形態では、細胞は抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球、又はマクロファージである。
【０１７７】
核酸分子を含む細胞は、好ましくは核酸によってコードされているペプチド又はポリペプチドを発現する。
【０１７８】
用語「クローン増殖」とは、特定の実体が増えるプロセスをいう。本発明のコンテキストにおいて、この用語は、好ましくは、リンパ球が抗原によって刺激され、増殖し、前記抗原を認識する特異的リンパ球が増幅される免疫学的応答との関連で使用される。好ましくは、クローン増殖はリンパ球の分化をもたらす。
【０１７９】
「低下させる」又は「阻害する」等の用語は、好ましくは5%以上、10%以上、20%以上、より好ましくは50%以上、最も好ましくは75%以上の全体的なレベルの減少を引き起こす能力に関する。用語「阻害する」又は同様の語句には、完全な又は本質的に完全な阻害、すなわちゼロ又は本質的にゼロまでの低下が含まれる。
【０１８０】
「増加させる」、「亢進させる」、「促進する」又は「延長する」等の用語は、好ましくは、少なくとも約10%、好ましくは少なくとも20%、好ましくは少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも100%、好ましくは少なくとも200%、特に少なくとも300%の増加、亢進、促進又は延長に関する。また、これらの用語は、ゼロ又は測定不可能又は検出不可能なレベルからゼロより高いレベル又は測定可能若しくは検出可能なレベルへの増加、亢進、促進又は延長にも関し得る。
【０１８１】
本発明は、本発明の方法によって免疫原性であると予測されるアミノ酸修飾又は修飾されたペプチドに基づいて設計された、癌ワクチン等のワクチンを提供する。
【０１８２】
本発明によれば、用語「ワクチン」とは、投与の際に、病原体又は癌細胞等の疾患細胞を認識して攻撃する免疫応答、特に細胞性免疫応答を誘導する、医薬調製物(医薬組成物)又は生成物に関する。ワクチンは、疾患の防止又は処置に使用し得る。用語「個人化癌ワクチン」又は「個別化癌ワクチン」は、特定の癌患者に関わり、癌ワクチンが、個々の癌患者の必要又は特殊な状況に適応されることを意味する。
【０１８３】
一実施形態では、本発明に従って提供されるワクチンは、本発明の方法によって免疫原性であると予測される1つ若しくは複数のアミノ酸修飾又は1つ若しくは複数の修飾されたペプチドを含むペプチド又はポリペプチド、或いは前記ペプチド又はポリペプチドをコードする核酸、好ましくはRNAを含むことができる。
【０１８４】
本発明に従って提供される癌ワクチンは、患者(patent)に投与した場合に、患者の腫瘍に特異的なT細胞の刺激、プライミング及び/又は増大に適した1つ又は複数のT細胞エピトープを提供する。T細胞は、好ましくは、T細胞エピトープが由来する抗原を発現している細胞に対して方向づけられる。よって、本明細書中に記載されているワクチンは、好ましくは、クラスI MHCによる1つ又は複数の腫瘍関連ネオ抗原の提示によって特徴づけられる癌疾患に対する細胞性応答、好ましくは、細胞傷害性T細胞活性を誘導又は促進することができる。本発明に従って提供されたワクチンは癌特異的突然変異を標的とするため、これは患者の腫瘍に特異的となる。
【０１８５】
本発明に従って提供されるワクチンは、患者(patent)に投与した場合に、本発明の方法によって免疫原性であると予測されるアミノ酸修飾又は修飾されたペプチドを取り込む、好ましくは、2個以上、5個以上、10個以上、15個以上、20個以上、25個以上、30個以上、好ましくは60個まで、55個まで、50個まで、45個まで、40個まで、35個まで又は30個までのT細胞エピトープ等、1つ又は複数のT細胞エピトープを提供するワクチンに関する。斯かるT細胞エピトープは、本明細書中で「ネオエピトープ」とも呼ばれる。患者の細胞、特に抗原提示細胞によるこれらのエピトープの提示は、好ましくは、MHCに結合した際にT細胞がエピトープを標的化すること、したがって、患者の腫瘍、好ましくは原発性腫瘍及び腫瘍転移が、MHCに提示されたT細胞エピトープが由来する抗原を発現し、腫瘍細胞の表面上に同じエピトープを提示することをもたらす。
【０１８６】
本発明の方法は、癌ワクチン接種に対する同定されたアミノ酸修飾又は修飾されたペプチドの有用性を決定する更に別の工程を含むことができる。したがって、さらなる工程は以下のうちの1つ又は複数を含むことができる:(i) 修飾が既知の又は予測されたMHCに提示されたエピトープ中に位置するかどうかの評価、(ii)修飾がMHCに提示されたエピトープ中に位置するかどうかのインビトロ及び/又はin silico試験、たとえば、修飾が、MHCに提示されたエピトープへとプロセッシングされる及び/又はそれとして提示されるペプチド配列の一部であるかどうかの試験、並びに(iii)想定された修飾されたエピトープが、特にその天然の配列構成で存在する場合、たとえば天然に存在するタンパク質中で前記エピトープにも隣接するアミノ酸配列に隣接している場合、及び抗原提示細胞中で発現された場合に、所望の特異性を有する患者のT細胞等、T細胞を刺激することができるかどうかのインビトロ試験。そのような隣接配列は、それぞれ3個以上、5個以上、10個以上、15個以上、20個以上、好ましくは50個まで、45個まで、40個まで、35個まで又は30個までのアミノ酸を含んでいてよく、N末端及び/又はC末端でエピトープ配列に隣接していてよい。
【０１８７】
本発明に従って決定される修飾されたペプチドは、癌ワクチン接種用のエピトープとしてその有用性について順位づけし得る。したがって、一態様では、本発明の方法は、同定された修飾されたペプチドが、提供するそれぞれのワクチンにおけるその有用性について分析及び選択される、手動又はコンピュータベースの分析処理を含む。好ましい実施形態では、前記分析処理はコンピュータアルゴリズムベースの処理である。好ましくは、前記分析処理は、以下の工程のうちの1つ又は複数、好ましくは、前記分析方法は、免疫原性となるその能力の予測に従ってエピトープを決定及び/又はランクづけする工程を含む。
【０１８８】
本発明に従って同定され、本発明のワクチンによって提供される、ネオエピトープは、好ましくは、ポリエピトープポリペプチド等、前記ネオエピトープを含むポリペプチド、又は前記ポリペプチドをコードしている核酸、特にRNAの形態で存在する。更に、ネオエピトープは、たとえば天然に存在するタンパク質中で前記エピトープにも隣接するアミノ酸配列に隣接して、ポリペプチド中にワクチン配列の形態で存在し得る、すなわちその天然の配列構成で存在し得る。そのような隣接配列は、それぞれ5個以上、10個以上、15個以上、20個以上、好ましくは50個まで、45個まで、40個まで、35個まで又は30個までのアミノ酸を含んでいてよく、N末端及び/又はC末端でエピトープ配列に隣接していてよい。したがって、ワクチン配列は、20個以上、25個以上、30個以上、35個以上、40個以上、好ましくは50個まで、45個まで、40個まで、35個まで又は30個までのアミノ酸を含み得る。一実施形態では、ネオエピトープ及び/又はワクチン配列はポリペプチド中で頭-尾で並んでいる。
【０１８９】
一実施形態では、ネオエピトープ及び/又はワクチン配列はリンカー、特に中性リンカーによって離間されている。本発明による用語「リンカー」とは、エピトープ又はワクチン配列等の2つのペプチドドメインの間に付加して前記ペプチドドメインを接続するペプチドに関する。リンカー配列に関して特に制限はない。しかし、リンカー配列は2つのペプチドドメイン間の立体障害を減らし、良好に翻訳され、エピトープのプロセッシングを支援又は許可することが好ましい。更に、リンカーは免疫原性の配列要素を有さない、又は僅かしか有さないべきである。リンカーは、好ましくは、所望しない免疫反応を生じ得る、近接ネオエピトープ間の接合部縫合から生じたもの等の非内在性ネオエピトープを作成するべきではない。したがって、ポリエピトープワクチンは、好ましくは、所望しないMHC結合性接合部エピトープの数を減らすことができるリンカー配列を含有するべきである。Hoytら(EMBO J. 25(8)、1720〜9頁、2006)及びZhangら(J. Biol. Chem.、279(10)、8635〜41頁、2004)は、グリシンに富んだ配列はプロテアソームプロセッシングを損なわせ、したがって、グリシンに富んだリンカー配列の使用は、プロテアソームによるプロセッシングが可能なリンカーに含有されるペプチドの数を最小限にする働きを持つことを示している。更に、グリシンは、MHC結合溝位置で強力な結合を阻害することが観察された(Abastadoら、J. Immunol. 151(7)、3569〜75頁、1993)。Schlessingerら(Proteins、61(1)、115〜26頁、2005)は、アミノ酸配列中に含められたアミノ酸グリシン及びセリンは、プロテアソームによってより効率的に翻訳及びプロセッシングされ、コードされているネオエピトープへのより良好な接近を可能にする、より柔軟なタンパク質をもたらすことを発見した。リンカーは、それぞれ3個以上、6個以上、9個以上、10個以上、15個以上、20個以上、好ましくは50個まで、45個まで、40個まで、35個まで又は30個までのアミノ酸を含み得る。好ましくは、リンカーはグリシン及び/又はセリンアミノ酸に富んでいる。好ましくは、リンカーのアミノ酸の少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、又は少なくとも95%はグリシン及び/又はセリンである。好ましい一実施形態では、リンカーはアミノ酸グリシン及びセリンから実質的に構成される。一実施形態では、リンカーはアミノ酸配列(GGS)a(GSS)b(GGG)c(SSG)d(GSG)eを含み、式中、a、b、c、d及びeは独立して、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20から選択される数字であり、a+b+c+d+eは0とは異なり、好ましくは2以上、3以上、4以上又は5以上である。一実施形態では、リンカーは、配列GGSGGGGSG等の、実施例中に記載のリンカー配列を含めた本明細書中に記載の配列を含む。
【０１９０】
特に好まれる一実施形態では、本発明によるポリエピトープポリペプチド等、1つ又は複数のネオエピトープを取り込むポリペプチドは、抗原提示細胞等、患者の細胞中で発現されてポリペプチドを産生し得る核酸、好ましくはin vitro転写された又は合成RNA等のRNAの形態で患者に投与される。また、本発明は、本発明の目的のために用語「ポリエピトープポリペプチド」によって含まれる1つ又は複数のマルチエピトープポリペプチドを、好ましくは、抗原提示細胞等の患者の細胞中で発現させて1つ又は複数のポリペプチドを産生させ得る核酸、好ましくはインビトロで転写された又は合成RNA等のRNAの形態で投与することも想定する。複数のマルチエピトープポリペプチドを投与する場合、異なるマルチエピトープポリペプチドによって提供されるネオエピトープは異なる又は部分的に重複していてよい。ひとたび抗原提示細胞等の患者の細胞中に存在すると、本発明によるポリペプチドはプロセッシングされ、本発明に従って同定されたネオエピトープを産生する。本発明に従って提供されるワクチンの投与は、MHCに提示されたエピトープが由来する抗原を発現する細胞に対するCD4+ヘルパーT細胞応答を誘発することができる、MHCクラスIIに提示されたエピトープを好ましくは提供する。本発明に従って提供されるワクチンの投与は、MHCに提示されたエピトープが由来する抗原を発現する細胞に対するCD8+T細胞応答を誘発することができる、MHCクラスIに提示されたエピトープも提供し得る。更に、本発明に従って提供されるワクチンの投与は、1つ又は複数のネオエピトープ(既知のネオエピトープ及び本発明に従って同定されたネオエピトープが含まれる)、並びに癌特異的体細胞突然変異を含有しないが、癌細胞によって発現され、好ましくは癌細胞に対する免疫応答、好ましくは癌特異的免疫応答を誘導する1つ又は複数のエピトープを提供し得る。一実施形態では、本発明に従って提供されるワクチンの投与は、MHCクラスIIに提示されたエピトープである及び/又はMHCに提示されたエピトープが由来する抗原を発現する細胞に対するCD4+ヘルパーT細胞応答を誘発することができるネオエピトープ、並びに癌特異的体細胞突然変異を含有せず、MHCクラスIに提示されたエピトープである及び/又はMHCに提示されたエピト
ープが由来する抗原を発現する細胞に対するCD8+T細胞応答を誘発することができるエピトープを提供する。一実施形態では、癌特異的体細胞突然変異を含有しないエピトープは腫瘍抗原に由来する。一実施形態では、癌特異的体細胞突然変異を含有しないネオエピトープ及びエピトープは癌の処置において相乗効果を有する。好ましくは、本発明に従って提供されるワクチンは細胞毒性及び/又はヘルパーT細胞応答のポリエピトープ刺激に有用である。
【０１９１】
本発明に従って提供されるワクチンは組換えワクチンであり得る。
【０１９２】
用語「組換え」とは、本発明との関連において、「遺伝子操作によって作製された」ことを意味する。好ましくは、本発明との関連での組換えポリペプチド等の「組換え実体」は天然に存在せず、好ましくは、天然では組み合わされないアミノ酸又は核酸配列等の実体の組合せの結果である。たとえば、組換えポリペプチドは、本発明との関連において、ネオエピトープ、又は異なるタンパク質若しくは同じタンパク質の異なる部分がたとえばペプチド結合若しくは適切なリンカーによって一緒に融合されたものに由来するワクチン配列等の、いくつかのアミノ酸配列を含有し得る。
【０１９３】
本明細書中で使用する用語「天然に存在する」とは、物体を自然で見つけることができることをいう。たとえば、生物(ウイルスを含めて)中に存在し、天然源から単離することができ、人によって実験室内で意図的に改変されていないペプチド又は核酸は、天然に存在する。
【０１９４】
本明細書中に記載の薬剤、組成物及び方法を使用して、疾患、たとえば、抗原を発現し、その断片を提示する疾患細胞の存在によって特徴づけられた疾患に罹患している対象を処置することができる。特に好ましい疾患は癌疾患である。また、本明細書中に記載の薬剤、組成物及び方法を使用して、本明細書中に記載の疾患を防止するために免疫化又はワクチン接種を行い得る。
【０１９５】
本発明によれば、用語「疾患」とは、癌疾患、特に本明細書中に記載の癌疾患の形態を含めた任意の病理状態をいう。
【０１９６】
用語「正常な」とは、健康な状態又は健康な対象若しくは組織、すなわち非病的状態における状態をいい、「健康な」とは、好ましくは非癌性であることを意味する。
【０１９７】
本発明によれば、「抗原を発現する細胞を含む疾患」とは、患部組織又は器官の細胞において抗原の発現が検出されることを意味する。患部組織又は器官の細胞中の発現は、健康な組織又は器官の状態と比較して増加していてよい。増加とは、少なくとも10%、特に少なくとも20%。少なくとも50%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも500%、少なくとも1000%、少なくとも10000%又は更にそれより多くの増加をいう。一実施形態では、発現は患部組織中でのみ見つかり、健康な組織中の発現は抑制される。本発明によれば、抗原を発現する細胞を含む又はそれに関連する疾患には癌疾患が含まれる。
【０１９８】
本発明によれば、用語「腫瘍」又は「腫瘍疾患」とは、好ましくは腫脹又は病変を形成する、細胞の異常成長(新生細胞、腫瘍形成性細胞又は腫瘍細胞と呼ばれる)をいう。「腫瘍細胞」とは、迅速な非制御の細胞増殖によって成長し、新しい成長を開始した刺激が終わった後に成長し続ける異常細胞を意味する。腫瘍は構造的組織化及び正常組織との機能的協調の部分的又は完全な欠如を示し、通常は、良性、前悪性又は悪性のいずれかであり得る明確な組織塊を形成する。
【０１９９】
癌(医学用語は悪性新生物)とは、細胞の群が非制御の成長(正常な限界を超えた分裂)、侵襲(近接組織の侵入及び破壊)、並びに場合によっては転移(リンパ又は血液を介した身体内の他の位置への拡散)を示す疾患のクラスである。これら3つの癌の悪性特性により、これらが自己限定的であり浸潤又は転移しない良性腫瘍から区別される。ほとんどの癌は腫瘍を形成するが、白血病等の一部のものは形成しない。悪性疾患、悪性新生物、及び悪性腫瘍は癌と本質的に同義である。
【０２００】
新生物とは、新形成の結果としての異常な組織塊である。新形成(ギリシャ語で新しい成長)とは、細胞の異常増殖である。細胞の成長は、その周りの正常組織の成長を上回り、協調的でない。成長は刺激が終わった後さえも同じ過剰な様式で持続する。これは通常は塊又は腫瘍を引き起こす。新生物は良性、前悪性又は悪性であり得る。
【０２０１】
本発明による「腫瘍の成長」又は「腫瘍成長」とは、腫瘍の大きさが大きくなる傾向及び/又は腫瘍細胞が増殖する傾向に関する。
【０２０２】
本発明の目的のために、用語「癌」及び「癌疾患」は、用語「腫瘍」及び「腫瘍疾患」と互換性があるように使用される。
【０２０３】
癌は腫瘍に似ている細胞の種類、したがって腫瘍の起源であると推定される組織の種類によって分類される。これらはそれぞれ組織学及び位置である。
【０２０４】
本発明による用語「癌」は、癌腫、腺癌腫、芽腫、白血病、精上皮腫、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、副腎癌、甲状腺癌、血液癌、皮膚癌、脳癌、子宮頸癌、腸癌、肝臓癌、結腸癌、胃癌、腸管癌、頭頸部癌、胃腸癌、リンパ節癌、食道癌、結腸直腸癌、膵臓癌、耳、鼻及び咽頭(ENT)癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌及び肺癌並びにその転移を含む。その例は、肺癌腫、乳房癌腫、前立腺癌腫、結腸癌腫、腎細胞癌腫、子宮頸癌腫、又は上述の癌種若しくは腫瘍の転移である。また、本発明によれば、用語癌は癌の転移及び癌の再発(relapse)も含む。
【０２０５】
「転移」とは、その元の部位から身体の別の部分への癌細胞の拡散を意味する。転移の形成は非常に複雑なプロセスであり、原発性腫瘍からの悪性細胞の脱離、細胞外基質の侵襲、体腔及び血管に入るための内皮基底膜の貫通、その後、血液によって輸送された後に、標的器官の浸潤に依存する。最後に、標的部位での新しい腫瘍、すなわち二次腫瘍又は転移性腫瘍の成長は血管形成に依存する。腫瘍転移は、多くの場合、原発性腫瘍の除去後にも起こり、これは腫瘍細胞又は構成要素が残って転移能を発生し得るためである。一実施形態では、本発明による用語「転移」とは、原発性腫瘍及び所属リンパ節系から離れた転移に関する「遠隔転移」に関する。
【０２０６】
二次又は転移性腫瘍の細胞は元の腫瘍のものに似ている。これは、たとえば卵巣癌が肝臓に転移する場合、二次腫瘍は異常肝細胞ではなく異常卵巣細胞から構成されていることを意味する。この場合、肝臓中の腫瘍は肝臓癌ではなく転移性卵巣癌と呼ばれる。
【０２０７】
用語「循環腫瘍細胞」又は「CTC」とは、原発性腫瘍又は腫瘍転移から脱離して血流中に循環する細胞に関する。CTCは、続く様々な組織中のさらなる腫瘍(転移)の成長の種子を構成し得る。循環腫瘍細胞は、転移性疾患に罹患している患者の全血1mLあたり約1〜10個のCTCの頻度で見つかる。CTCを単離するための研究方法が開発されている。当技術分野においてCTCを単離するためのいくつかの研究方法、たとえば、上皮細胞が正常な血液細胞中では存在しない細胞接着タンパク質EpCAMを一般的に発現することを使用する技法が記載されている。免疫磁気ビーズに基づく捕捉は、血液検体を、磁気粒子とコンジュゲートさせたEpCAMに対する抗体で処理し、続いて、タグづけされた細胞を磁場中で分離することを含む。その後、単離した細胞を別の上皮マーカー、サイトケラチン、及び一般的な白血球マーカーCD45に対する抗体で染色することによって、稀なCTCを汚染白血球から識別する。この頑強かつ半自動的な手法は、CTCを約1個のCTC/mLの平均収率及び0.1%の純度で同定する(Allardら、2004: Clin Cancer Res 10、6897〜6904頁)。CTCを単離するための第2の方法は、EpCAMに対する抗体でコーティングすることによって機能的にした80,000個のマイクロポストを包埋したチャンバに全血を流すことを含む、マイクロ流体に基づくCTC捕捉装置を使用する。その後、CTCをサイトケラチン又は前立腺癌におけるPSA若しくは乳癌におけるHER2等の組織特異的マーカーのいずれかに対する二次抗体で染色し、マイクロポストを複数の平面で三次元座標に沿って自動走査することによって可視化する。CTC-チップは、患者中のサイトケラチン(cytokerating)陽性循環腫瘍細胞を、収率の中央値が50個の細胞/ml、純度の範囲が1〜80%で同定することができる(Nagrathら、2007: Nature 450、1235〜1239頁)。CTCを単離するための別の可能性は、血液の管中のCTCを捕捉、同定、及び計数するVeridex,LLC社(ニュージャージー州Raritan)のCellSearch(商標)循環腫瘍細胞(CTC)試験を使用することである。CellSearch(商標)システムは、全血中のCTCを数え上げるための米国食品医薬品局(FDA)に認可された方法であり、免疫磁気標識及び自動デジタル顕微鏡観察の組合せに基づく。CTCを単離するための他の方法が文献中に記載されており、そのすべてを本発明と併せて使用することができる。
【０２０８】
再発(relapse又はrecurrence)は、人が、過去に影響を受けていた状態によって再度影響を受ける場合に起こる。たとえば、患者が腫瘍疾患を患い、前記疾患の処置を受けて成功し、前記疾患を再度発症する場合、前記新しく発症した疾患は再発(relapse又はrecurrence)としてみなされ得る。しかし、本発明によれば、腫瘍疾患の再発(relapse又はrecurrence)は、元の腫瘍の部位疾患で起こってもよいが、必ずしもそうである必要はない。したがって、たとえば、患者が卵巣腫瘍を患っており、受けた処置が成功した場合、再発(relapse又はrecurrence)は、卵巣腫瘍の発生又は卵巣とは異なる部位での腫瘍の発生であり得る。また、腫瘍の再発(relapse又はrecurrence)には、腫瘍が元の腫瘍の部位とは異なる部位で発生する状況及び元の腫瘍の部位で発生する状況も含まれる。好ましくは、患者が処置を受けた元の腫瘍は原発性腫瘍であり、元の腫瘍の部位とは異なる部位での腫瘍は二次又は転移性腫瘍である。
【０２０９】
「処置する」とは、対象中の腫瘍の大きさ若しくは腫瘍の数を低下させること、対象において疾患を停止若しくは遅延させること、対象において新しい疾患の発症を阻害若しくは遅延させること、疾患に現在罹患している若しくは以前に罹患していた対象において症状及び/若しくは再発(recurrence)の頻度若しくは重篤度を減少させること、並びに/又は対象の寿命を延長、すなわち増加させることを含めて、疾患を防止又は排除するために、本明細書中に記載の化合物又は組成物を対象に投与することを意味する。特に、用語「疾患の処置」には、疾患の発症又はその症状を治癒すること、持続期間を短縮すること、進行若しくは悪化を寛解、防止、遅延若しくは阻害すること、又は防止若しくは遅延させることが含まれる。
【０２１０】
「危険性がある」とは、一般集団と比較して疾患、特に癌を発症する可能性が正常よりも高いと同定された対象、すなわち患者を意味する。更に、疾患、特に癌を患っていた、又は現在患っている対象とは、そのような対象は疾患を発症し続け得るため、疾患を発症する危険性が増加した対象である。また、癌を現在患っている、又は患っていた対象も癌の転移の危険性が増加している。
【０２１１】
用語「免疫療法」とは、特異的免疫反応の活性化を含む処置に関する。本発明のコンテキストにおいて、「保護する」、「防止する」、「予防(的)」、「防止的」、又は「保護的」等の用語は、対象における疾患の発生及び/又は増殖の防止若しくは処置又は両方に関し、特に、対象が疾患を発症する可能性を最小限にすること又は疾患の発症を遅延させることに関する。たとえば、上述の腫瘍の危険性にある人は、腫瘍を防止する治療法の候補となる。
【０２１２】
免疫療法の予防的投与、たとえば本発明のワクチンの予防的投与は、好ましくはレシピエントを疾患の発症から保護する。免疫療法の治療的投与、たとえば本発明のワクチンの治療的投与は、疾患の進行/成長の阻害をもたらし得る。これは、好ましくは疾患の排除をもたらす疾患の進行/成長の減速、特に疾患の進行の破壊を含む。
【０２１３】
免疫療法は、本明細書中に提供する薬物が疾患細胞を患者から除去するように機能する、様々な技法のうちの任意のものを使用して行い得る。そのような除去は、患者において抗原又は抗原を発現する細胞に特異的な免疫応答を亢進又は誘導することの結果として起こり得る。
【０２１４】
特定の実施形態では、免疫療法は活性免疫療法であってよく、処置は、疾患細胞に反応するように免疫応答改変剤(本明細書中に提供するポリペプチド及び核酸等)の投与を用いて宿主の内在免疫系をインビボ刺激することに依存する。
【０２１５】
本明細書中に提供する薬物及び組成物は、単独で、又は手術、照射法、化学療法及び/若しくは骨髄移植(自己、同系の、アロジェネイック又は非関連)等の従来の治療レジメンと組み合わせて使用し得る。
【０２１６】
用語「免疫化」又は「ワクチン接種」とは、治療的又は予防的理由のために免疫応答を誘導する目的で対象を処置するプロセスを記載する。
【０２１７】
用語「インビボ」とは、対象内の状況に関する。
【０２１８】
用語「対象」、「個体」、「生物」又は「患者」とは互換性があるように使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物に関する。たとえば、本発明のコンテキストにおける哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、家畜、たとえばイヌ、ネコ、ヒツジ、畜牛、ヤギ、ブタ、ウマ等、実験動物、たとえばマウス、ラット、ウサギ、モルモット等、並びに捕獲動物、たとえば動物園の動物である。また、本明細書中で使用する用語「動物」にはヒトも含まれる。また、用語「対象」には、疾患、好ましくは本明細書中に記載の疾患に罹患している患者、すなわち動物、好ましくはヒトも含まれ得る。
【０２１９】
用語「自己」とは、同じ対象に由来するすべてのものを記載するために使用する。たとえば、「自己移植」とは、同じ対象に由来する組織又は器官の移植をいう。そのような手順は、そうでなければ拒絶をもたらす免疫学的障壁を克服するため有利である。
【０２２０】
用語「異種」とは、複数の異なる要素からなるものを記載するために使用する。一例として、1つの個体の骨髄を別の個体内に移入することは異種移植を構成する。異種遺伝子とは、対象以外の供給源に由来する遺伝子である。
【０２２１】
免疫化又はワクチン接種のための組成物の一部として、好ましくは本明細書中に記載の1種又は複数の薬剤を、免疫応答を誘導する又は免疫応答を増加させるための1種又は複数のアジュバントと一緒に投与する。用語「アジュバント」とは、免疫応答を延長又は亢進又は加速する化合物に関する。本発明の組成物は、好ましくはアジュバントを加えずにその効果を発揮する。それでも、本出願の組成物は任意の既知のアジュバントを含有し得る。アジュバントは油乳濁液(たとえばフロイントアジュバント)、無機化合物(ミョウバン等)、細菌産物(百日咳菌(Bordetella pertussis)毒素等)、リポソーム、及び免疫刺激複合体等の化合物の異種群を含む。アジュバントの例は、モノホスホリル-脂質-A(MPL SmithKline Beecham)、QS21(SmithKline Beecham)、DQS21(SmithKline Beecham、WO96/33739号)、QS7、QS17、QS18、及びQS-L1等のサポニン(Soら、1997、Mol. Cells 7:178〜186頁)、不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント、ビタミンE、モンタナイド(montanid)、ミョウバン、CpGオリゴヌクレオチド(Kriegら、1995、Nature 374:546〜549頁)、並びにスクワレン及び/又はトコフェロール等の生分解性の油から調製される様々な油中水乳濁液である。
【０２２２】
また、患者の免疫応答を刺激する他の物質も投与し得る。たとえば、リンパ球に対するその調節特性のおかげで、ワクチン接種中でサイトカインを使用することが可能である。そのようなサイトカインは、たとえば、ワクチンの保護作用を増加させることが示されたインターロイキン-12(IL-12)(Science 268:1432〜1434頁、1995を参照)、GM-CSF及びIL-18を含む。
【０２２３】
免疫応答を亢進し、したがってワクチン接種において使用し得るいくつかの化合物が存在する。前記化合物は、B7-1及びB7-2(それぞれCD80及びCD86)等のタンパク質又は核酸の形態で提供される同時刺激分子を含む。
【０２２４】
本発明によれば、身体試料は、体液及び/又は細胞試料を含む組織試料となることができる。そのような身体試料は、パンチ生検を含めた組織生検によって、及び血液、気管支吸引液、痰、尿、糞便又は他の体液を採取することによって等の従来の様式で得られ得る。本発明によれば、用語「試料」には、生体試料の画分又は単離物、たとえば核酸若しくは細胞の単離物等の加工試料も含まれる。
【０２２５】
本明細書中に記載のワクチン及び組成物等、薬剤は、注射又は輸液によるものを含めた、任意の従来の経路を介して投与し得る。投与は、たとえば、経口的に、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、皮下に又は経皮に実施し得る。一実施形態では、投与はリンパ節内への注射によって等の結節内で実施する。他の投与形態は、本明細書中に記載の核酸を用いた樹状細胞等の抗原提示細胞のインビトロ形質移入、次いで抗原提示細胞の投与を想定している。
【０２２６】
本明細書中に記載の薬剤は有効量で投与する。「有効量」とは、単独で、又はさらなる用量と一緒に、所望の反応又は所望の効果を達成する量をいう。特定の疾患又は特定の状態の処置の場合、所望の反応は、好ましくは疾患の経過の阻害に関する。これは、疾患の進行の遅延、特に疾患の進行の中断又は逆行を含む。また、疾患又は状態の処置における所望の反応は、前記疾患又は前記状態の発症の遅延又は発症の防止であってもよい。
【０２２７】
有効量の本明細書中に記載の薬剤は、処置する状態、疾患の重篤度、年齢、生理的状態、大きさ及び重量を含めた患者の個々のパラメータ、処置の持続期間、付随する治療の種類(存在する場合)、特定の投与経路及び同様の要因に依存する。したがって、本明細書中に記載の薬剤の投与用量は、様々なそのようなパラメータに依存し得る。患者における反応が初期用量では不十分な場合、より高い用量(又は、異なるより局所的な投与経路によって達成される有効により高い用量)を使用し得る。
【０２２８】
本明細書中に記載の医薬組成物は好ましくは無菌的であり、所望の反応又は所望の効果を生じるために有効量の治療活性を有する物質を含有する。
【０２２９】
本明細書中に記載の医薬組成物は、一般に、薬学的に適合性のある量で、薬学的に適合性のある調製物で投与する。用語「薬学的に適合性のある」とは、医薬組成物の活性構成要素の作用と相互作用しない、無毒性の物質をいう。この種の調製物は、通常は、塩、緩衝物質、保存料、担体、アジュバント、たとえばCpGオリゴヌクレオチド、サイトカイン、ケモカイン、サポニン、GM-CSF及び/又はRNA等の補助免疫亢進物質、並びに適切な場合は他の治療活性を有する化合物を含有し得る。医薬中で使用する場合は、塩は薬学的に適合性があるべきである。しかし、薬学的に適合性のない塩を薬学的に適合性のある塩の調製に使用してもよく、本発明に含まれる。この種の薬理学的及び薬学的に適合性のある塩は、非限定的な様式で、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸等の酸から調製されたものを含む。また、薬学的に適合性のある塩は、ナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩等のアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩としても調製し得る。
【０２３０】
本明細書中に記載の医薬組成物は薬学的に適合性のある担体を含み得る。用語「担体」とは、適用を容易にするために活性構成要素を組み合わせる、天然又は合成の性質の有機又は無機の構成要素をいう。本発明によれば、用語「薬学的に適合性のある担体」には、患者への投与に適した1種又は複数の適合性のある固体又は液体の充填剤、希釈剤又はカプセル封入物質が含まれる。本発明の医薬組成物の構成要素は、通常、所望の薬学的有効性を実質的に損なわせる相互作用が起こらないようなものである。
【０２３１】
本明細書中に記載の医薬組成物は、塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸及び塩中のリン酸等の適切な緩衝物質を含有し得る。
【０２３２】
また、医薬組成物は、適切な場合は、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン及びチメロサール等の適切な保存料も含有し得る。
【０２３３】
医薬組成物は通常は均一剤形で提供され、それ自体で知られている様式で調製し得る。本発明の医薬組成物は、たとえば、カプセル剤、錠剤、ロゼンジ、液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤の形態で、又は乳剤の形態であり得る。
【０２３４】
非経口投与に適した組成物は、通常、好ましくはレシピエントの血液に等張である、活性化合物の無菌的な水性又は非水性調製物を含む。適合性のある担体及び溶媒の例はリンゲル液及び等張塩化ナトリウム溶液である。更に、通常は無菌的な不揮発性の油が溶液又は懸濁液の媒体として使用される。
【０２３５】
本発明を、以下の図及び実施例によって詳述し、これらは例示目的でのみ使用し、限定することを意図しない。説明及び実施例のおかげで、同様に本発明に含まれるさらなる実施形態が当業者によって利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０２３６】
【図１ａ】非同義癌関連突然変異は、高頻度で免疫原性であり、CD4+T細胞によって優勢に認識される。a、免疫原性検査のため、マウス(b及びcはn=5、dはn=3)に、合成ペプチド及びアジュバントとしてのポリ(I:C)(b)又は突然変異したエピトープ(マウス当たり2種の突然変異)を表す抗原コードRNA(c、d)のいずれかをワクチン接種した。突然変異したペプチド又は無関係な対照ペプチドによりex vivoで脾細胞を再刺激し、IFNγ  Elispot(例として図2aを参照)並びに細胞内サイトカイン及びCD4/CD8表面染色によって検査して、誘発された免疫応答のサブタイプを評価した。
【図１ｂ】非同義癌関連突然変異は、高頻度で免疫原性であり、CD4+T細胞によって優勢に認識される。b〜c、B16F10腫瘍モデルにおける突然変異したエピトープによるC57BL/6マウスのワクチン接種によって得られたT細胞応答。左、非免疫原性、MHCクラスI又はクラスII限定の突然変異したエピトープの普及。右、突然変異特異的T細胞の検出及びタイプ分類の例(個々のエピトープに関するデータについてはTable 1(表1)を参照)。
【図１ｃ】非同義癌関連突然変異は、高頻度で免疫原性であり、CD4+T細胞によって優勢に認識される。b〜c、B16F10腫瘍モデルにおける突然変異したエピトープによるC57BL/6マウスのワクチン接種によって得られたT細胞応答。左、非免疫原性、MHCクラスI又はクラスII限定の突然変異したエピトープの普及。右、突然変異特異的T細胞の検出及びタイプ分類の例(個々のエピトープに関するデータについてはTable 1(表1)を参照)。
【図１ｄ】非同義癌関連突然変異は、高頻度で免疫原性であり、CD4+T細胞によって優勢に認識される。d、左、CT26モデルにおいて発見された非免疫原性、MHCクラスI又はクラスII限定の突然変異したエピトープの普及。
【図１ｅ】非同義癌関連突然変異は、高頻度で免疫原性であり、CD4+T細胞によって優勢に認識される。e、免疫原性の突然変異したエピトープのMHC限定を、予測されるMHCクラスI結合に基づき優先順位づけし、優れた(0.1〜2.1)又は不十分な(>3.9)結合スコアのいずれかに基づき選択した。個々のエピトープに関するデータについてはTable 2(表2)を参照されたい。
【図２ａ】単一突然変異のCD4+T細胞エピトープをコードするRNAワクチンによる免疫化による、B16F10メラノーマにおける効率的腫瘍制御及び延命効果。a、B16-M30  RNAをワクチン接種したマウス(n=5)の脾細胞を、合成ペプチドの認識に関してELISpotによって検査した。左、突然変異型(B16-M30)対、対応する野生型(B16-WT30)配列。右、B16-M30のトランケートされた変異体の認識の検査による最小エピトープの定義(平均+SEM)。
【図２ｂ】単一突然変異のCD4+T細胞エピトープをコードするRNAワクチンによる免疫化による、B16F10メラノーマにおける効率的腫瘍制御及び延命効果。b、B16F10腫瘍細胞を皮下接種し、無処置のまま置いた(対照)、又はCD4若しくはCD8枯渇抗体の投与あり若しくはなしでB16-M30コードRNA(B16-M30)によりIVで免疫化したC57BL/6マウス(n=10)の平均+SEM腫瘍成長(左)及び生存(右)。
【図２ｃ】単一突然変異のCD4+T細胞エピトープをコードするRNAワクチンによる免疫化による、B16F10メラノーマにおける効率的腫瘍制御及び延命効果。c、ルシフェラーゼトランスジェニックB16F10腫瘍細胞(B16F10-Luc)のIV注射後に肺転移を発症しているB6アルビノマウス(n=10)を、B16-M30コードRNA(B16-M30)又は無関係な対照RNAで処置した。BLIにより中位腫瘍成長を決定した。
【図２ｄ】単一突然変異のCD4+T細胞エピトープをコードするRNAワクチンによる免疫化による、B16F10メラノーマにおける効率的腫瘍制御及び延命効果。d、無処置(対照、n=x)又はB16-M30  RNA免疫化マウス(n=4)のB16F10腫瘍の単一細胞懸濁液を、B16-M30ペプチド、培地又は無関係なペプチド(VSV-NP52-59)で再刺激し、IFNγ  ELISpotアッセイにおいて検査した(平均+SEM)。
【図２ｅ】単一突然変異のCD4+T細胞エピトープをコードするRNAワクチンによる免疫化による、B16F10メラノーマにおける効率的腫瘍制御及び延命効果。e、B16-M30  RNAワクチン接種したマウスにおける腫瘍浸潤白血球のフローサイトメトリーによる特徴づけ。B16F10腫瘍細胞を皮下接種した、無処置(対照)又はMut30  RNAワクチン接種したC57BL/6マウス(n=3)のCD45+細胞及びGr-1+/CD11b+細胞(MDSC)の間のCD4+、CD8+又はFoxP3+/CD4+T細胞の頻度が描写されている。
【図３ａ】RNAペンタトープ(pentatope)による免疫化は、個々の突然変異したエピトープに対するT細胞応答を誘導し、マウス腫瘍モデルにおける疾患制御及び有意な延命効果を付与する。a、ポリネオエピトープRNAワクチンの遺伝子操作。RNAペンタトープは、pST1-Sp-MITD-2hBgUTR-A120骨格(UTR、非翻訳領域;sp、シグナルペプチド;MITD、MHCクラスI輸送ドメイン)に挿入されたgly/serリンカーによって接続された5個の27mer配列を含有する。
【図３ｂ】RNAペンタトープ(pentatope)による免疫化は、個々の突然変異したエピトープに対するT細胞応答を誘導し、マウス腫瘍モデルにおける疾患制御及び有意な延命効果を付与する。b、BALB/cマウス(n=5)に、ペンタトープRNA(35μg)又は5種のRNAモノトープ(monotope)(各7μg)の対応する混合物のいずれかをワクチン接種した。マウスのペプチド刺激された脾細胞におけるT細胞応答を、IFNγ  ELISpotアッセイにおいて19日目にex vivoで測定した(培地対照を差し引いた平均+SEM)。
【図３ｃ】RNAペンタトープ(pentatope)による免疫化は、個々の突然変異したエピトープに対するT細胞応答を誘導し、マウス腫瘍モデルにおける疾患制御及び有意な延命効果を付与する。c、CT26-Luc細胞のIV注射後に肺転移を発症しているBALB/cマウス(n=10)を、2種のRNAペンタトープの混合物で同時に処置した、又は無処置のまま置いた(対照)。BLIによる中位腫瘍成長(左)、生存データ(中央)及び処置した動物の肺(右)を示す。
【図３ｄ】RNAペンタトープ(pentatope)による免疫化は、個々の突然変異したエピトープに対するT細胞応答を誘導し、マウス腫瘍モデルにおける疾患制御及び有意な延命効果を付与する。d、ペンタトープ1+2処置動物の肺のCD3染色した組織切片(上部パネル)。各パネルの左側は分析された切片を示し、右側は拡大図を示す(スケールバー:スキャン:1000μm、上部写真:100μm、下部写真:50μm)。対照(n=6)又はRNAペンタトープ(CD3:n=14;CD4、CD8、FoxP3:n=12)処置動物の連続した免疫組織化学的肺組織切片におけるCD3+、CD4+、FoxP3+及びCD8+(CD3+面積-CD4+面積により計算)面積を定量化し、腫瘍の比率を計算した。右図は、対照(n=18)及びペンタトープ1+2(n=39)処置動物(ペンタトープ1+2処置群の腫瘍がない動物は除外した)の切片における腫瘍面積の比較を描写する。平均±SEMが描写されている。
【図４ａ】in silicoで予測される都合よいMHCクラスII結合特性及び豊富な発現のために選択された突然変異を有するRNAペンタトープワクチンは、強力な抗腫瘍制御を付与する。a、免疫原性及び非免疫原性突然変異のMHC II結合スコアの比較(中位数を示す)。
【図４ｂ】in silicoで予測される都合よいMHCクラスII結合特性及び豊富な発現のために選択された突然変異を有するRNAペンタトープワクチンは、強力な抗腫瘍制御を付与する。b、MHCクラスII結合スコアを考慮して(「ME」突然変異)又は考慮せずに(「E」突然変異)、高い発現レベルを有する突然変異を選択した。Table 4(表4)も参照されたい。それぞれ2種のペンタトープによって表される各カテゴリーの中から10種の突然変異を、CT26-Luc肺腫瘍を有するマウスのワクチン接種に使用した。腫瘍成長曲線(左)、曲線下面積(中央)及びインク処置した肺(右)を示す。
【図４ｃ】in silicoで予測される都合よいMHCクラスII結合特性及び豊富な発現のために選択された突然変異を有するRNAペンタトープワクチンは、強力な抗腫瘍制御を付与する。c、マウス(群当たり5匹)を、IFNγ  ELISpotアッセイにおけるRNA電気穿孔した同一遺伝子BMDCによる再刺激により、ワクチン接種したペンタトープに対するT細胞応答に関して分析した。各ドットは、無関係なRNA対照を差し引いた、ある1匹のマウスの平均スポット計数を表す(平均±SEM)。
【図４ｄ】in silicoで予測される都合よいMHCクラスII結合特性及び豊富な発現のために選択された突然変異を有するRNAペンタトープワクチンは、強力な抗腫瘍制御を付与する。d、CT26腫瘍細胞をIV接種し、無処置のまま置いた、又は無関係なRNA、ペンタトープ1、ペンタトープ2若しくはCT26-M19  RNAを注射したBALB/cマウス(n=10)の肺当たりの腫瘍小結節。
【図４ｅ】in silicoで予測される都合よいMHCクラスII結合特性及び豊富な発現のために選択された突然変異を有するRNAペンタトープワクチンは、強力な抗腫瘍制御を付与する。e、gp70423-431(gp70-AH1)に対するT細胞応答を、血液(5匹のマウスからプール、腫瘍接種後20日目)及び脾臓(n=5)においてIFNγ  ELISpotアッセイにより決定した(バックグラウンド(ペプチドなし対照)を差し引いた平均±SEMを描写)。
【図４ｆ】in silicoで予測される都合よいMHCクラスII結合特性及び豊富な発現のために選択された突然変異を有するRNAペンタトープワクチンは、強力な抗腫瘍制御を付与する。f、The Cancer Genome Atlas(TCGA)由来の個々のヒト癌試料(黒色ドット)の体細胞突然変異及びRNA-Seqデータを用いて、ゲノムの(上部パネル)及び発現した(中央パネル)非同義一塩基多様性(nsSNV)を同定した。(下部パネル)  患者のHLA-DRB1対立遺伝子に結合することが予測されるネオエピトープ(パーセンタイルランク<10%)を示す(SKCM、皮膚(skin cutaneous)メラノーマ;COAD、結腸腺癌腫;BRCA、浸潤性乳癌腫)。
【図５】変異体対立遺伝子頻度(VAF)の計算。本図は、ゲノムDNAの一部分におけるエクソンの組合せとしての理想化された遺伝子(上部分)及びこの座位に整列された例としての読み取りデータ配列(下部分、よりズームしたレベルで示す)を示す。突然変異事象の部位(「突然変異部位」)を破線(上部分)又はボックス(下部分)で示す。突然変異体ヌクレオチドを赤色に着色し、野生型ヌクレオチドを緑色に着色する。また、VAF配合物におけるこれらのヌクレオチドの合計をこれに従って着色する。
【図６】MHC II-スコアの予測性能における突然変異した対立遺伝子の発現の影響。マウス腫瘍モデル4T1、CT26及びB16F10由来の185種の選択された突然変異を、その抗原性に関して検査した。計算されたMHC II-スコアの予測性能を、受信者動作特性曲線下面積(AUC、白丸)から推定した。総mRNA発現(左パネル)及び突然変異した対立遺伝子の発現(右パネル、mRNA発現*突然変異した対立遺伝子頻度、黒丸)の異なる閾値を適用した後に、この値をその後に再計算した。最大AUC値を示す。突然変異した対立遺伝子の発現は、予測性能の改善に更に寄与する。
【図７】発現における閾値あり及びなしの受信者動作特性(ROC)曲線の比較。ROC曲線は、マウス腫瘍モデル4T1、CT26及びB16F10由来の全185種の選択された突然変異の抗原性予測の性能(ドットの曲線)、並びにmRNA発現が≧6RPKMであった(左パネル、実線の曲線)又は突然変異した対立遺伝子の発現が≧4RPKMであった(右パネル、実線の曲線)突然変異の性能を示す。選択された閾値は、最大AUC値を達成した(図6を参照)。
【実施例】
【０２３７】
本明細書中で使用する技法及び方法は、本明細書中に記載されているか、又はそれ自体で知られている様式で、及びたとえばSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州Cold Spring Harborに記載されているように実施する。キット及び試薬の使用を含めたすべての方法は、別段に具体的に示さない限りは製造者の情報に従って実施する。
【０２３８】
(実施例1)
材料と方法
試料。雌8〜12週齢C57BL/6、BALB/cマウス(Janvier Labs社)及びC57BL/6BrdCrHsd-Tyrcマウス(B6アルビノ、Harlan社)を、マインツ大学(University of Mainz)における動物研究に関する連邦政府政策に従って維持した。B16F10メラノーマ細胞株、CT26結腸癌腫細胞株及び4T1-luc2-tdtomato(4T1-Luc)細胞は、それぞれ2010、2011及び2011年に購入し(ATCC CRL-6475ロット#58078645、ATCC CRL-2638ロット#58494154、Caliper 125669ロット#101648)、サプライヤーによって示唆される通りに維持した。ホタルルシフェラーゼ発現CT26-Luc及びB16F10-Luc細胞は、レンチウイルスにより形質導入した。マスター及び作業用細胞バンクを作製し、その3回目及び4回目の継代を腫瘍実験に使用した。
【０２３９】
次世代シーケンシング及びデータ処理については以前に記載した(Castle, J. C.ら、Cancer Res 72、1081 (2012);Castle, J. C.ら、BMC Genomics 15、190 (2014))。手短に説明すると、BALB/c又はC57BL/6マウスのマウス腫瘍細胞及び尾の組織試料から捕捉したエクソームを3回複製して配列決定した(4T1-Lucは2回複製して)。遺伝子発現プロファイリングのためのオリゴ(dT)に基づくRNAシーケンシングライブラリーを3回複製して調製した。Illumina HiSeq2000においてライブラリーを配列決定して、それぞれ50種のヌクレオチドシングルエンド(B16F10)又は100種のヌクレオチドペアードエンド(CT26、4T1-Luc)読み取りデータを作製した。転写物エクソン及び接合部に重複する読み取りデータを計数し、RPKM発現単位(百万個のマッピングされた読み取りデータ当たりの転写物長1キロベース当たりでマッピングする読み取りデータ(Reads which map per kilobase of transcript length per million mapped reads))に対して正規化することにより、遺伝子発現値を決定した。1億を掛けた、マッピングされた読み取りデータの総計数に対する突然変異したRNA読み取りデータの正規化により、突然変異発現を決定した(正規化された変異体読み取りデータ計数;NVRC)。
【０２４０】
突然変異選択、検証及び優先順位づけについては、以前に記載した(Castle, J. C.ら、Cancer Res 72、1081(2012);Castle, J. C.ら、BMC Genomics 15、190(2014);Lower, M.ら、PLoS Comput Biol 8、e1002714(2012))。探究するべき突然変異は、次の判断基準に基づいて選択した:(i)3回複製してシーケンシングしたそれぞれの腫瘍細胞株に存在するが、3回複製した対応する健康な組織試料には存在しないこと、(ii)RefSeq転写物中に生じること、及び(iii)非同義変化を引き起こすこと。更に別の判断基準は、腫瘍細胞株の発現された遺伝子における発生であった(複製にわたる中位RPKM)。検証のため、B16F10、CT26又は4T1-Luc細胞及びC57BL/6又はBALB/c尾の組織のDNAから突然変異を増幅し、サンガーシーケンシングに付した。サンガーシーケンシング又はRNASeq読み取りデータのいずれかによって確認される場合、検証される通りにDNA由来の突然変異を分類した。図4に示す実験に関して、サンガーシーケンシング及び免疫原性検査による確認を行わなかった。図1に示す実験のため、免疫エピトープデータベース(Vita, R.ら、Nucleic Acids Res 38、D854-D862 (2010))のコンセンサス方法(バージョン2.5)に基づき、その予測されるMHCクラスI結合に従って、突然変異したエピトープを優先順位づけした。その発現(NVRC)単独で、又はその予測されるMHCクラスIIペプチド結合能力と共にのいずれかに基づいて、図4b〜図4eに示す実験において標的とされる突然変異を選択した(IEDBコンセンサス方法バージョン2.5)。IEDBコンセンサス方法バージョン2.12により、図4aに示すMHC II結合予測のレトロスペクティブ分析を決定した。ヒト腫瘍における突然変異の分析のため、The Cancer Genome Atlas(TCGA)(2014年8月)から検索した皮膚メラノーマ(SKCM、n=308)、結腸腺癌腫(COAD、n=192)又は浸潤性乳癌腫(BRCA、n=872)のDNAシーケンシングデータにフィルターをかけて、ゲノム非同義点突然変異(nsSNV)を得た。同定されたゲノム突然変異を有する腫瘍試料のRNA-Seqデータ(TCGA)を使用して、発現されたnsSNVを定義した。MHC II結合を予測するために、発現されたネオエピトープseq2HLAを用いて、患者の4桁のHLAクラスII(HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRB1)型を同定した。IEDBコンセンサス結合予測(バージョン2.12)を使用して、27merペプチド及び患者HLA-DRB1対立遺伝子からMHCクラスII結合を予測した。IEDBから推奨される通り、10%を下回るパーセンタイルランクを有するネオエピトープ(neo-eptiope)を結合剤として考慮した。
【０２４１】
合成RNA及び合成ペプチド。中央(位置14)に突然変異したアミノ酸を有するそれぞれの27merアミノ酸エピトープの文脈において、同定された非同義突然変異を研究した。これらの突然変異したペプチドのいずれも、JPT Peptide Technologies GmbH社によって、対照ペプチド(水疱性口内炎(vesiculo-stomatitis)ウイルス核タンパク質(VSV-NP52-59)、gp70-AH1(gp70423-431)及びチロシナーゼ関連タンパク質2(Trp2180-188))と共に合成した。或いは、突然変異した27merペプチドをコードする配列を、翻訳効率と、モノトープとしての又はその間の10アミノ酸長グリシン-セリンリンカーをコードする配列によって互いに融合されたペンタトープとしてのエピトープのMHCクラスI/IIプロセシングの観点から薬理学的に最適化された合成RNAのための配列エレメントを特長とする、pST1-Sp-MITD-2hBgUTR-A120骨格(Holtkamp, S.ら、Blood 108、4009 (2006))にクローニングした。このようなプラスミドコンストラクトの直鎖化、このような鋳型のin vitro翻訳(IVT)及び精製については、他の文献に詳細に記載されている(Holtkamp, S.ら、Blood 108、4009 (2006))。
【０２４２】
マウスモデル
突然変異したエピトープの免疫原性を調べる実験のため、0、3、7及び14日目に(RNAによる免疫化)又は0及び7日目に(ペプチドによる免疫化)、同齢雌C57BL/6又はBALB/cマウスにワクチン接種し、最後の免疫化から5〜6日後に読み取りを行った。カチオン性脂質と複合体形成した200μl(B16F10は突然変異当たり20μg、CT26は突然変異当たり40μg)RNAの後眼窩注射(投稿準備中)又はPBS中に製剤化された100μg合成ペプチド及び50μgポリ(I:C)の外側の側腹部への皮下注射(200μL総容量)のいずれかによりワクチン接種を行った。マウス当たり2種の突然変異を検査した(B16F10はn=5、CT26はn=3)。免疫原性突然変異及びサブタイプ分類の確認のため、単一突然変異に対してマウスにワクチン接種した(n=5)。
【０２４３】
治療的腫瘍実験のため、C57BL/6マウスの右側腹部に、1×105個のB16F10メラノーマ細胞を皮下接種し、処置群にランダムに分布させた。腫瘍体積をノギスにより非盲検で測定し、式(A×B2)/2(Aは腫瘍の最大直径、Bは最小直径)を使用して計算した。肺転移実験において、5×105個のCT26-Luc又は2×105個のCT26細胞をBALB/cマウスの尾静脈に、又は1.5×105個のB16F10-Luc腫瘍細胞をB6アルビノマウスに注射して、肺腫瘍を得た。ルシフェラーゼトランスジェニック細胞の腫瘍成長を、IVIS Lumina(Caliper Life Sciences社)においてD-ルシフェリンの水性溶液(250μl、1.6mg、BD Bioscience社)のi.p.注射後に生物発光イメージングにより非盲検で追跡した。注射5分後に、放射された光子を定量化した。IVIS Living Image 4.0ソフトウェアを使用して、目的の領域(ROI)におけるin vivo生物発光を全光束(光子/秒)として定量化した。その全光束値(ANOVA-P方法、DanielのXL Toolbox V6.53)に基づきマウスをランダム化した。気管インク(PBSに1:10希釈)注射及びFeketeの溶液(5mL 70%EtOH、0.5mLホルマリン及び0.25mL氷酢酸)による固定後に、CT26肺腫瘍負荷を非盲検で定量化した。治療実験において、モノトープ(40μg)、ペンタトープRNA(合計で40μg)又は等モル量の無関係なRNAのいずれかの反復用量をマウスに投与した。
機構的研究のため、CD8枯渇(クローンYTS191、BioXcell社)、CD4枯渇(クローンYTS169.1、BioXcell社)又はCD40L遮断(クローンMR1、Stephen Schoenberger教授のご厚意により分与)抗体の反復用量を、図に示す通りに腹腔内投与した(200μL PBS中に200μg/マウス)。
【０２４４】
酵素免疫スポット(ELISpot)については以前に記載された(Kreiter, S.ら、Cancer Res 70、9031 (2010))。手短に説明すると、抗INF-γ(10μg/mL、クローンAN18、Mabtech社)コーティングされたMultiscreen 96ウェルプレート(Millipore社)において、5×105個の脾細胞を一晩37℃で培養し、抗IFN-γ抗体(1μg/mL、クローンR4-6A2、Mabtech社)によりサイトカイン分泌を検出した。刺激のため、2μg/mLペプチドを添加した、又はRNAをトランスフェクトした5×104個の同一遺伝子骨髄由来樹状細胞(BMDC)と共に脾臓細胞をコインキュベートした。腫瘍浸潤リンパ球の分析のため、肺転移の単一細胞懸濁液を一晩休ませて、プラスチック接着により生きている腫瘍細胞を取り除いた。密度勾配遠心分離により生細胞を分離した。回収された細胞を全てELISpotプレートに添加した。末梢血におけるT細胞応答の分析のため、PBMCを密度勾配遠心分離により単離し、計数し、ペプチド及び同一遺伝子BMDCの添加によって再刺激した。MHCクラスII遮断抗体(20μg/ml、クローンM5/114、BioXcell社)の添加により、T細胞応答のサブタイプ分類を行った。全試料を2回複製又は3回複製して検査した。
【０２４５】
フローサイトメトリー分析を使用して、突然変異反応性T細胞のサブタイプを決定した。ブレフェルジンA(Sigma-Aldrich社)の存在下、2×106個の脾細胞を2×105個のRNAトランスフェクトしたBMDC又は2μg/mLペプチドで刺激した。陽性対照として、ホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA、0.5μg/ml、Sigma-Aldrich社)及びイオノマイシン(1μg/ml、Sigma-Aldrich社)で脾細胞を処置した。細胞を5時間37℃でインキュベートし、その後、CD4+及びCD8+細胞表面マーカーを染色した。BD Cytofix/Cytopermをメーカーのプロトコールに従って使用して、細胞を透過処理及び固定し、その後、INF-γ、TNF-α及びIL-2サイトカイン(BD Biosciences社)を染色した。応答しているT細胞サブタイプを決定するために、刺激された試料におけるCD4+又はCD8+T細胞の間のサイトカイン分泌を対照試料(培地、無関係なRNA又は無関係なペプチド)と比較した(n=5)。以前に記載された通りに(PMID:2071934)、皮下B16F10腫瘍から腫瘍浸潤白血球を調製した。その結果得られる細胞懸濁液を、CD4、CD8、Gr-1及びCD11b表面マーカーに関して染色した。メーカーのプロトコール(マウスFoxp3バッファーセット、BD社)に従って細胞内FoxP3染色を行った。BD FACSCanto IIにおいて試料を取得した。
【０２４６】
免疫組織化学。CT26腫瘍を有するマウスの肺を4%リン酸緩衝ホルムアルデヒド溶液(Carl Roth社)において一晩固定し、パラフィンに包埋した。HRPコンジュゲート抗体(ポリHRP-抗ウサギIgG、ImmunoLogic社)及び対応するペルオキシダーゼ基質(Vector Nova Red、Vector Laboratories社)による検出に従って、50μm連続切片(マウス当たり3枚)をCD3(クローンSP7、Abcam社)、CD4(クローン1、cat#50134-M08H、Sino Biologinal社)及びFoxP3(ポリクローナル、cat#NB100-39002、Novus Biologicals社)に関して染色し、ヘマトキシリンで対比染色した。CD3+、CD4+、FoxP3+及び腫瘍面積をAxio Scan.Z1(Zeiss社)において捕捉し、手作業で予め定義された腫瘍及び肺領域をコンピュータ処理画像分析ソフトウェア(Tissue Studio 3.6.1、Definiens社)により定量化した。
【０２４７】
免疫蛍光染色。凍結保存した臓器を8μm切片に切り、Superfrostスライドに付着させた。切片を一晩室温(RT)で乾燥させ、4%パラホルムアルデヒド(PFA)において10分間RTで暗所にて固定した。切片をPBSで3回洗浄し、1%BSA、5%マウス血清、5%ラット血清及び0.02%Nonidentを補充したPBSを使用して1時間RTで暗所にてブロッキングした。蛍光標識した抗体(FoxP3、クローンFJK-16s、eBioscience社;CD8、クローン53-6.7、BD社;CD4、クローンRM4-5、BD社)を染色バッファー(1%BSA、5%マウス血清及び0.02%Nonidentを補充したPBS)に希釈し、切片を一晩4℃で染色した。洗浄バッファー(1%BSA及び0.02%Nonidentを補充したPBS)で2回、PBSで1回洗浄した後に、スライドをヘキスト(Sigma社)で3分間染色し、PBSで3回、蒸留水で1回洗浄し、Mounting Medium Flouromount G(eBioscience社)を使用してマウントした。落射蛍光顕微鏡(ApoTome、Zeiss社)を使用して免疫蛍光画像を取得した。コンピュータ処理画像分析ソフトウェア(Tissue Studio 3.6.1.、Definiens社)により、手作業で予め定義された腫瘍領域内の腫瘍、CD4、CD8及びFoxP3染色面積を定量化した。
【０２４８】
統計学。2群に対しスチューデントt検定を使用することにより、平均を比較した。3群以上における平均の比較のため、チューキー検定による一元配置ANOVAを適用した。1群当たり単一のマウスに対し、腫瘍成長動力学の比較のために曲線下面積(AUC)を決定し、中位数として表示した。2群間の中位数における統計学的な差をノンパラメトリックなマン・ホイットニーのU検定により計算した。ログ・ランク検定により延命効果を決定した。全分析は両側であり、GraphPad Prism 5.03を使用して行った。ns:P>0.05、*:P≦0.05、**:P≦0.01、***:P≦0.001。外れ値の同定のためにグラブス検定を使用した(アルファ=0.05)。
【０２４９】
(実施例2)
ネオエピトープワクチンにおけるMHCクラスII限定T細胞エピトープ
A.突然変異したエピトープに対し反応性のT細胞サブタイプの特徴づけ
近年、本発明者らは、NGSによるB16F10腫瘍の非同義突然変異の包括的マッピングのためのワークフローについて記載した(図1a)(Castle, J. C.ら、Cancer Res 72、1081 (2012))。腫瘍を有するC57BL/6マウスを、突然変異したエピトープ(位置14に突然変異)をコードする合成27merペプチドで免疫化し、in vivo腫瘍制御を付与するT細胞応答をもたらした。この研究の継続において、本発明者らは次に、MHC I結合の高い見込みを有するものから始めて、突然変異したエピトープに対するT細胞応答を特徴づけた。マウスに合成27merの突然変異したエピトープペプチドをワクチン接種した(図1b右上)。IFN-γ  ELISpotにおいてマウスの脾細胞を検査して、サブタイプ及びサイトカイン発現のさらなる分析のための免疫原性突然変異を同定した(図1a)。突然変異したエピトープの約30%は、マウスにおいて突然変異反応性サイトカイン分泌T細胞を誘導することが判明した(図1b)。驚いたことに、殆ど全ての突然変異したエピトープ(16/17、95%)に対する応答は、CD4+T細胞型のものであった(図1b、Table 1(表1))。
【０２５０】
【表１】
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【０２５１】
ペプチドに基づくワクチンフォーマットに関連するいかなる偏りも除外するために、突然変異したエピトープをコードするin vitro転写された(IVT)mRNAを使用して本実験を反復した(図1c上部グラフ右側)。このようなRNAモノトープにより決定されたT細胞反応性は、合成ペプチドにより得られるデータに大部分は匹敵した(図1c、Table 1(表1))が、幾分より少ない数の免疫原性エピトープ(約25%)であった。重要なことに、この設定において同様に、突然変異特異的免疫応答の大部分(10/12、ほぼ80%)は、CD4+T細胞によって付与された。
【０２５２】
本発明者らは、BALB/cマウスにおける化学的に誘導された結腸癌腫モデルCT26(Griswold, D. P.及びCorbett, T. H.、Cancer 36、2441 (1975))にまで自身の研究を拡張し、これによると、本発明者らは近年、1680種を超える非同義突然変異を同定した(Castle, J. C.ら、BMC Genomics 15、190 (2014))。本発明者らは、その予測されるMHCクラスI結合特性に基づき96種の突然変異を選択した。B16F10研究に類似して、候補の半分は、優れた結合剤(「低スコア」0.1〜2.1)であった。もう半分は、不十分なMHC I結合(「高スコア」>3.9)のため慎重に選択した。合計して、突然変異したエピトープの約20%は、それぞれのRNAモノトープで免疫化したマウスにおいて免疫原性であった(図1d円グラフ、Table 2(表2))。「低」MHC Iスコアサブグループにおいて、2種のCD8+T細胞を誘導するエピトープが同定され、これは、「高」スコアサブグループには当てはまらなかったことに注目すべきである(図1d右)。これは明らかに、MHCクラスII限定エピトープに対して偏らなかったが、このことは、これらが、CT26免疫原性突然変異の大部分(16/21、80%)を構成する両方のサブグループにおいて同様の頻度で表されたことから分かる。
【０２５３】
【表２】
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【０２５４】
同様の話の流れで、全38種の突然変異を表すRNAモノトープに対する全ての免疫応答を分析する際に、本発明者らは、4T1乳腺癌腫モデルにおいて、認識されるエピトープの殆ど70%が、CD4+T細胞によって認識されたことを同定した(データ図示せず; Table 3(表3))。
【０２５５】
【表３】
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【０２５６】
よって、本発明者らは、異なるMHCバックグラウンドの3種の独立したマウス腫瘍モデルにおいて、相当な割合の非同義癌突然変異が、免疫原性であり、極めて予想外なことに、免疫原性ミュータノームが、CD4+T細胞によって優勢に認識されることを見出した。
【０２５７】
B.ワクチン標的としてのMHCクラスII限定癌突然変異
MHCクラスII限定癌突然変異が、in vivoにおける優れたワクチン標的であるか調べるために、本発明者らは、ワクチンフォーマットとしての合成RNAの使用へと進んだ。抗原コード合成RNAは、2つ以上のエピトープを送達するその能力、抗原提示細胞(APC)によるその選択的な取込み、及びその固有のアジュバント活性を含むその利点により、有望なワクチン技術として現れつつある(Diken, M.ら、Gene Ther 18、702 (2011);Kreiter, S.ら、Curr Opin Immunol 23、399 (2011);Pascolo, S.、Handb Exp Pharmacol、221 (2008);Sahin, U.ら、Nat Rev Drug Discov 13、759 (2014);Van, L. S.ら、Hum Vaccin Immunother 9(2013))。本発明者らのグループは、薬理学的に最適化されたRNA(RNA配列及びリポソーム製剤における安定化エレメント)を開発し、これはその一方で、臨床検査(NCT01684241)の段階に達した(Holtkamp, S.ら、Blood 108、4009 (2006);Kreiter, S.ら、J Immunol 180、309 (2008);Kuhn, A. N.ら、Gene Ther 17、961 (2010))。本発明者らは、B16F10腫瘍モデルにおいて同定されたエピトープの1つであるB16-M30をコードするRNAを遺伝子操作した。B16-M30は、野生型ペプチドを認識しない強いCD4+T細胞応答を誘発した(図2a左)が、このことは、突然変異したアミノ酸が、T細胞認識に必須であると示されたことから分かる(図2a右)。B16F10腫瘍を有するC57BL/6マウスに、B16-Mt30  RNAモノトープを反復的にワクチン接種した場合、腫瘍成長は大いに遅延された(図2b)。B16-M30  RNA処置マウスの半分が、腫瘍ワクチン接種の120日後に未だ生きていたが、対照RNA処置マウスは全て、65日以内に死んだ。
【０２５８】
同様に、ルシフェラーゼ形質導入B16F10細胞を有する肺転移モデルにおける反復的ワクチン接種は、生物発光イメージング(BLI)によって示される、マウスの圧倒的多数における対照合成RNAではなくB16-M30  RNAによる効率的な転移根絶を明らかにした(図2c)。一貫して、B16-M30  RNA免疫化マウスのB16F10腫瘍から精製された腫瘍浸潤白血球は、B16-M30に対する強い反応性を示した(図2d)。
【０２５９】
総合すると、これらのデータは、B16F10腫瘍における新規の主要拒絶抗原としてB16-M30を確立する。これらのデータは、単一の免疫原性の突然変異したエピトープをコードするRNAによる免疫化が、機能的なT細胞を生じ得ることも例証する。このような細胞は、癌病変を標的化し、マウス腫瘍モデルにおける制御及び更には治癒の引き金を引くことができると思われる。本発明者らの知見は、近年の報告と合致して、癌の制御におけるCD4+T細胞免疫の極めて重要な役割を支持している(Schumacher, T.ら、Nature 512、324 (2014);Tran, E.ら、Science 344、641 (2014))。
【０２６０】
突然変異の圧倒的多数は、個々の患者に特有であるため、ワクチン抗原の供給源としてのミュータノームの開拓は、活発に個別化されたアプローチを要求する(Britten, C. M.ら、Nat Biotechnol 31、880 (2013))。この点について、主要な課題の1つは、特化したオンデマンドワクチンの即時製造である。これは、RNAワクチン技術によって実行可能に取り組むことができる。in vitro転写に基づくRNA製造は通常、数日間を要する(図3a)。現在のところ、GMPグレードの材料は、3週間以内に発売準備を整えることができ、この方法は継続的に、この期間を低減するように最適化されている。話は変わるが、本発明者らは、単一突然変異を有するマウスモデルにおける腫瘍根絶を示してきたが、理想的には、ポリネオエピトープワクチンにおいていくつかの突然変異を組み合わせることが好まれるであろう。このことから、本発明者らは、腫瘍多様性及び免疫編集等、ヒトにおけるワクチンの臨床成功を相殺するいくつかの要因に取り組む(Gerlinger, M.ら、N Engl J Med 366、883 (2012);Koebel, C. M.ら、Nature 450、903 (2007))。
【０２６１】
これらの考慮を踏まえて、本発明者らは、免疫原性エピトープに関する自身の洞察を使用して、「ミュータノーム遺伝子操作RNA免疫療法(mutanome engineered RNA immunotherapy)」(MERIT)と呼ばれる癌ワクチン概念を開発する仕方を探索した(図3a)。この概念を検査するために、本発明者らは、CT26モデル(Table 2(表2)を参照)に由来する4種のMHCクラスII(CT26-M03、CT26-M20、CT26-M27、CT26-M68)及び1種のMHCクラスI(CT26-M19)限定突然変異並びにこれらのそれぞれをコードする遺伝子操作されたRNAモノトープを選択した。加えて、接合部エピトープの作製を回避するために10mer非免疫原性グリシン/セリンリンカーによって接続された、全5種の突然変異したエピトープをコードする合成RNAペンタトープを遺伝子操作した(図3a)。ナイーブBALB/cマウスを免疫化することにより、本発明者らは、ペンタトープによって誘発されるIFN産生T細胞の含量が、これらの突然変異の3種に関して、それぞれのモノトープによって惹起されるものに匹敵することを見出した(図3b)。しかし、これらの突然変異のうち2種に関して、ペンタトープRNAは、突然変異特異的T細胞の強い増大化において有意に優れていた。
【０２６２】
本発明者らは、CT26ルシフェラーゼトランスフェクタント(CT26-Luc)腫瘍の肺転移モデルにおけるRNAペンタトープワクチンによって誘発される免疫応答の抗腫瘍有効性を評価した。腫瘍を有するBALB/cマウスに、以前の実験において検査された突然変異を含む2種のRNAペンタトープの混合物(3種のMHCクラスI及び7種のクラスII限定エピトープ)を反復的にワクチン接種した。ワクチン接種したマウスにおける腫瘍成長は、肺のBLIによって測定される通り、有意に阻害された(図3c左)。32日目に、RNAペンタトープ群における全マウスは生きていたが、一方で、対照マウスの80%は既に死んでいた(図3c中央)。組織切片の死後の巨視的(図3c右)、組織学的(図3d右)及びコンピュータ処理画像分析(データ図示せず)は、無処置対照と比較して、ワクチン接種したマウスにおける有意により低い腫瘍負荷を明らかにした。ペンタトープRNAワクチン接種したマウスの腫瘍病変は、CD3+T細胞により活発に浸潤された一方、CD3+T細胞の数は、その周囲の肺組織において有意により低かった。無処置対照の腫瘍は、含量の観点から、また、腫瘍内ではなく主に腫瘍辺縁における周囲の肺組織と大差ないCD3+細胞染色を表示した(図3d)。
【０２６３】
まとめると、これらの知見は、各単一エピトープに対するT細胞が、ポリネオエピトープコードRNAワクチンを用いたMERITアプローチにより誘発されることを示す。このようなT細胞は、腫瘍病変を標的とし、その突然変異した標的を認識し、in vivoにおける効率的な腫瘍制御をもたらす。
【０２６４】
C.抗腫瘍免疫を有する突然変異の選択
重大な問題の1つは、効率的抗腫瘍免疫の誘導の最高確率を有する突然変異をどのように選択するかである。本発明者ら(図1d右)及び他の研究者ら(Matsushita, H.ら、Nature 482、400 (2012);Robbins, P. F.ら、Nat Med 19、747 (2013);van, R. N.ら、J Clin Oncol 31、e439-e442 (2013))は、MHCクラスI結合スコアが、CD8+応答及び腫瘍拒絶を誘発する突然変異したエピトープ候補の濃縮を可能にすることを示した(Duan, F.ら、J Exp Med 211、2231 (2014))。上述の本発明者らの知見は、MHCクラスII提示の突然変異したエピトープが、MERITアプローチの更に高い関心の的になることも可能であることを示す。実際、相関分析は、免疫原性突然変異が、非免疫原性のものと比較して有意により良いMHCクラスII結合スコアを有することを明らかにした(図4a)。大部分の癌は、MHCクラスII発現を欠く。MHCクラスII陰性腫瘍におけるCD4+T細胞によるネオエピトープの有効な認識は、抗原提示細胞(APC)によって取り入れられて提示されることになる腫瘍抗原の放出に依存する筈である。これは、高度に豊富な発現を有する抗原に最も効率的となる筈である。この仮説を検査するために、本発明者らは、優れたMHCクラスII結合を、突然変異したエピトープをコードするmRNAの豊富な発現と組み合わせたアルゴリズムを実行した。後者のため、本発明者らは、全体的な読み取りデータ計数に対して正規化された、確認された突然変異したRNAシーケンシング読み取りデータを使用した(NVRC:正規化された変異体読み取りデータ計数)。本発明者らは、このアルゴリズムによりCT26ミュータノームデータをランクづけし、最も豊富な候補エピトープ(NVRC≧60)の間から、優れたMHCクラスII結合剤であると予測される上位10種の突然変異を選択した(Table 4(表4)における「ME」突然変異)。対照として、本発明者らは、豊富な発現のみに基づき10種の突然変異を選択する(Table 4(表4)における「E」突然変異)。最も重要なことに、これらのエピトープを、さらなる予備検証又は免疫原性検査を全く行わずに使用して、群毎に2種のRNAペンタトープを遺伝子操作した(PME及びPEペンタトープ)。確立されたCT26-Luc肺腫瘍を有するマウスにこれらのエピトープをワクチン接種した場合、PMEは、PEペンタトープと比較して、はるかにより強いT細胞応答を誘導した(図4c)。確立された肺転移は、ほぼ全てのマウスにおいて完全に拒絶された一方、PEペンタトープは、腫瘍成長制御を付与することができなかった(図4b)。
【０２６５】
【表４】
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【０２６６】
抗原特異的TH細胞は、樹状細胞のCD40リガンド媒介性ライセンス化による腫瘍特異的CTL応答の交差プライミングを促進する。TH細胞が、無関係CTLエピトープを交差提示する同じAPC上のその抗原を認識する場合、これは、抗原拡散をもたらすことができる(Bennett, S. R.ら、Nature 393、478 (1998);Schoenberger, S. P.ら、Nature 393、480 (1998))。一致して、PEではなくPMEペンタトープで免疫化されたマウスの血液及び脾臓において、本発明者らは、内在性マウス白血病ウイルス関連の細胞表面抗原に由来する十分に特徴づけされた免疫優性CTLエピトープである、gp70-AH1に対する強いCD8+T細胞応答を検出した(図4d)。これは、癌ネオエピトープ特異的TH細胞が、ウイルスネオ抗原特異的T細胞に類似して(Croxford, J. L.ら、Autoimmun Rev 1、251 (2002))、抗原拡散及びCTL応答の増強によってその抗腫瘍機能を発揮することができることを示す。
【０２６７】
D.要約
要約すると、本発明者らのデータは、MHCクラスII限定T細胞エピトープが、癌ミュータノームにおいて豊富であり、マウス腫瘍モデルにおいて実質的な治療効果を有するRNAに基づくポリネオエピトープワクチンのカスタマイズに使用することができることを示す。
【０２６８】
突然変異の高い率のCD4+T細胞認識の原因となる機構は、未だに不明である。単純な説明としては、それぞれのペプチドによって突然変異がカバーされる見込みを増加させる、MHCクラスIエピトープと比較して、MHCクラスII分子において提示されるペプチドのより長く可変的なサイズが挙げられよう。MHCクラスI分子によって提示されるT細胞エピトープは、典型的には、十分に定義されたN及びC末端を有する、8〜11アミノ酸の間の長さのペプチドである。MHCクラスII分子は、両者共にCD4+T細胞による認識に寄与する、9アミノ酸MHCIIコア結合領域及び可変数の追加的なフランキングアミノ酸を有する、13〜17アミノ酸の長さのより長いペプチドを提示する(Arnold, P. Y.ら、J Immunol 169、739 (2002))。
【０２６９】
癌患者における突然変異した遺伝子産物に向けられた自発的CD8+及びCD4+T細胞応答の最初の証拠は、1990年代に得られたが(Dubey, P.ら、J Exp Med 185、695 (1997);Lennerz, V.ら、Proc Natl Acad Sci U S A 102、16013 (2005);Wolfel, T.ら、Science 269、1281 (1995))、近年のハイレベルな刊行物のみが、癌患者において抗腫瘍活性を付与する突然変異特異的T細胞の莫大な潜在力の幅広い承認を得た(Lu, Y. C.ら、J Immunol 190、6034 (2013);Schumacher, T.ら、Nature 512、324 (2014);Tran, E.ら、Science 344、641 (2014))。メラノーマ、結腸及び乳癌のマウスモデルにおいて本発明者らが解明した原理が、ヒト設定に当てはまるか評価するために、本発明者らは、The Cancer Genome Atlas(TCGA)によって提供される同じ3種のヒト癌型における突然変異及びRNA-Seqデータを分析した。全3種のヒト癌型について、本発明者らは、マウスモデルにおいて本発明者らが明らかにした、MHCクラスIIに結合することが予測される突然変異の存在量を確認した(図4e)。
【０２７０】
本明細書において本発明者らが発表したMERITアプローチは、次世代シーケンシング、計算免疫学及び合成ゲノミクスの分野における進歩を統合し、これにより、ネオエピトープ標的レパートリーの包括的開拓のための統合された技術を提供する。一度に複数の突然変異を標的とすることは、少なくとも理論上は、クローン多様性及び抗原エスケープ等、現在の癌薬物開発において重大な意味を持つ問題の解決への道を開くことができる(Kroemer, G.及びZitvogel, L.、Oncoimmunology 1、579 (2012);Mittal, D.ら、Curr Opin Immunol 27、16 (2014))。
【０２７１】
一方、本研究及び本発明者らの以前の仕事に基づき、臨床解釈が開始され、メラノーマ患者におけるファースト・イン・コンセプト(first-in-concept)治験(Castle, J. C.ら、Cancer Res 72、1081 (2012);Castle, J. C.ら、Sci Rep 4、4743 (2014);Lower, M.ら、PLoS Comput Biol 8、e1002714 (2012))が活発にリクルートを行っており(NCT02035956)、ポリネオエピトープmRNA癌ワクチンの「ちょうど間に合う」産生が実際に実行可能であるかを確認する。
【０２７２】
(実施例3)
抗腫瘍免疫を有する突然変異の選択
アミノ酸配列修飾の選択/ランクづけのため、次の通りに進むことができる:
1.非同義点突然変異の所定のリスト内で、中央に突然変異したアミノ酸を有し、それぞれN及びC末端において最大13アミノ酸に両側を挟まれたペプチド配列を算出する;この配列は、以下の文では27merと呼ばれる(突然変異が、タンパク質全体のN又はC末端に近い場合、各両側フランキング配列の長さは、13アミノ酸より小さくてもよい)
2.各27merの重複する15nt長の部分列毎に、MHCクラスII結合予測コンセンサススコアを算出する(例えば、IEDB T細胞予測ツール[Wang Pら、(2010) BMC Bioinformatics. 11:568. PMID: 21092157. http://tools.immuneepitope.org/mhcii/]を使用して);最良(=最低)スコアが27mer全体に割り当てられる
3.27merが関連する遺伝子の発現(好ましくは、RPKM単位で[Ali Mortazaviら、(2008) Nature Methods 5、621〜628])を算出する
4.RNAにおける各突然変異の変異体対立遺伝子頻度(VAF)を算出する:
-  入力は、突然変異検出に使用されたものと同じ腫瘍試料により為されたRNA-Seq実験の短い読み取りデータ整列である
-  突然変異部位に重複する整列及び読み取りデータを探索する
-  先の工程で集計された読み取りデータを使用して、突然変異部位にマッピングされるヌクレオチドを符合させる
-  突然変異のゲノム部位にマッピングされる全ヌクレオチドの合計で割った突然変異体対立遺伝子ヌクレオチドの合計を算出する(図5)
5.それぞれの遺伝子発現にVAFを掛けて、突然変異発現を得る(好ましくは、RPKM単位で)
6.MHC結合スコア(工程2において算出され、最低スコアが最良である)によって全27merをランクづけし、所定の閾値未満の関連する突然変異発現を有する27merを除去する
【０２７３】
マウスデータセットへの適用:
アルゴリズムを検査するため、マウス腫瘍モデル4T1、CT26及びB16F10から185種の突然変異を選択し、その抗原性について検査した。次に、本発明者らは先ず、アルゴリズムの予測性能における遺伝子及び突然変異発現のレベルの影響の検査を試みた(図6)。そこで、本発明者らは、遺伝子発現の代わりに突然変異発現にフィルターをかけた場合、受信者動作特性の最大曲線下面積(ROC AUC [Fawcett T.、Pattern Recogn Lett. 2006;27:861〜874. doi: 10.1016/j.patrec.2005.10.010])が、より高いことを観察することができる(図6左(遺伝子発現)vs.右(突然変異発現)プロット)。
図7は、ごく並の相対的結合親和性を有する結合剤の突然変異発現の顕著な影響を示す、最適閾値のROC曲線を示す(図7、右パネル、偽陽性率約0.3〜0.6の間の値)。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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