(57)【要約】本出願の主題は、大豆茎疫病（Phytophthora root and stem rot）抵抗性が増強している大豆植物を特定するための方法及び組成物に関する。当該方法は、分子マーカーを使用して、大豆茎疫病（Phytophthora root and stem rot）抵抗性が増強した植物を特定及び選抜するものであり、又は大豆茎疫病（Phytophthora root and stem rot）抵抗性が低下した植物を特定及び除外するものである。本開示方法により生成された大豆植物もまた、本出願主題の特徴である。【選択図】図１
2018516088.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆茎疫病（Phytophthora root and stem rot）抵抗性（PRSR）の増強を示す大豆植物を特定する方法であって、前記方法は、前記大豆植物の遺伝資源において、マーカー座位の少なくとも１つのアレルを検出することを含み、この場合において：
a.  前記マーカー座位は、BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T及びBARC_1_01_Gm07_5629128_A_Cを含有し、ならびにこれらに隣接した染色体区間内に位置付けられており；及び
b.  前記少なくとも１つのアレルが、PRSR増強に関連付けられている、前記方法。
【請求項２】
前記マーカー座位が、BARCSOYSSR_07_0295及びInDel_1を含有し、ならびにこれらに隣接した染色体区間内に位置付けられている、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記マーカー座位は、BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T、BARCSOYSSR_07_0286、BARCSOYSSR_07_0289、BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C、BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T、Gm07_5480878_G_A、BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C、BARCSOYSSR_07_0295、BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G、BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T、BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A、BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G、BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T、BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A、InDel_2、InDel_1、BARCSOYSSR_07_0297、BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G、BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C、BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T、BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C、BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A、BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C、BARCSOYSSR_07_0300、及びBARC_1_01_Gm07_5629128_A_Cからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
請求項1に記載の方法により特定された大豆植物。
【請求項５】
前記マーカー座位は、Glyma.07G62500、Glyma.07G62600、Glyma.07G62700、Glyma.07G62800、及びGlyma.07G62900からなる群から選択される遺伝子を含有している、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子が、Glyma.07G62900である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
大豆茎疫病（Phytophthora root and stem rot）抵抗性（PRSR）の増強を示す大豆植物を特定する方法であって、前記方法は、大豆植物の遺伝資源において、1つ以上のマーカー座位のアレルを含有するハプロタイプを検出することを含み、この場合において：
a.  前記１つ以上のマーカー座位は、BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T及びBARC_1_01_Gm07_5629128_A_Cを含有し、ならびにこれらに隣接した染色体区間内に位置づけられており；及び 
b.  前記ハプロタイプは、PRSRの増強と関連づけられている、前記方法。
【請求項８】
前記１つ以上のマーカー座位が、BARCSOYSSR_07_0295及びInDel_1を含有し、ならびにこれらに隣接した染色体区間内に位置付けられている、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記マーカー座位は、BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T、BARCSOYSSR_07_0286、BARCSOYSSR_07_0289、BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C、BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T、Gm07_5480878_G_A、BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C、BARCSOYSSR_07_0295、BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G、BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T、BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A、BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G、BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T、BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A、InDel_2、InDel_1、BARCSOYSSR_07_0297、BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G、BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C、BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T、BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C、BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A、BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C、BARCSOYSSR_07_0300、及びBARC_1_01_Gm07_5629128_A_Cからなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
前記大豆植物が、その遺伝資源内で、PRSRの増強に関連したハプロタイプを含有しており、この場合において前記ハプロタイプは、BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T及びBARC_1_01_Gm07_5629128_A_Cを含有し、ならびにこれらに隣接した染色体区間内に位置づけられた１つ以上のマーカー座位でアレルを含有している、請求項7に記載の方法により特定された大豆植物。
【請求項１１】
前記マーカー座位は、Glyma.07G62500、Glyma.07G62600、Glyma.07G62700、Glyma.07G62800、及びGlyma.07G62900からなる群から選択される遺伝子を含有している、請求項7に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子が、Glyma.07G62900である、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
以下を含有するマーカー支援選抜の方法であって、
a.  マーカー座位の少なくとも１つのアレルを有する第一の大豆植物を取得することであって、前記マーカー座位は、BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T及びBARC_1_01_Gm07_5629128_A_Cを含有し、ならびにこれらに隣接した染色体区間内に位置付けられており、及びマーカー座位のアレルは、大豆茎疫病（Phytophthora root and stem rot）抵抗性（PRSR）の増強と関連していること；
b.  前記第一の大豆植物と第二の大豆植物を交配させること；
c.  前記少なくとも１つのアレルに関し、前記子孫物を評価すること；及び 
d.  前記少なくとも１つのアレルを保有する子孫植物を選抜すること、とを含む方法。
【請求項１４】
前記マーカー座位が、BARCSOYSSR_07_0295及びInDel_1を含有し、ならびにこれらに隣接した染色体区間内に位置づけられている、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記マーカー座位は、BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T、BARCSOYSSR_07_0286、BARCSOYSSR_07_0289、BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C、BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T、Gm07_5480878_G_A、BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C、BARCSOYSSR_07_0295、BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G、BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T、BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A、BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G、BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T、BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A、InDel_2、InDel_1、BARCSOYSSR_07_0297、BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G、BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C、BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T、BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C、BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A、BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C、BARCSOYSSR_07_0300、及びBARC_1_01_Gm07_5629128_A_Cからなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項１６】
前記植物が、マーカー座位の少なくとも１つのアレルを有しており、この場合において前記マーカー座位は、BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T及びBARC_1_01_Gm07_5629128_A_Cを含有し、ならびにこれらに隣接した染色体区間内に位置づけられている、請求項13に記載の方法により選抜された大豆子孫植物。
【請求項１７】
前記マーカー座位は、Glyma.07G62500、Glyma.07G62600、Glyma.07G62700、Glyma.07G62800、及びGlyma.07G62900からなる群から選択される遺伝子を含有している、請求項13に記載の方法。
【請求項１８】
前記遺伝子が、Glyma.07G62900である、請求項17に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体で本明細書に援用される2015年6月3日に出願された米国仮特許出願第62/170,441号明細書の優先権を主張するものである。
【０００２】
電子的に提出された配列表に対する参照
配列表の正式な複製が、ASCII形式の配列表としてEFS-WEBを介して電子的に提出されている。ファイル名は、“77970-WO-PCT_ST25_SEQUENCE_LISTING.txt”。作成日は2016年6月1日であり、サイズは15.7キロバイト。本明細書と同時に出願されている。このASCII形式の書面に含有されている配列表は、本明細書の一部であり、その全体で参照により本明細書に援用される。
【０００３】
本開示主題は、大豆植物における、大豆茎疫病（Phytophthora root and stem rot）に対する抵抗性の増強に有用な方法に関するものである。
【背景技術】
【０００４】
大豆茎疫病（PRSR：Phytophthora root and stem rot）は、土壌病原体である大豆茎疫病菌（Phytophthora sojae）により発生し、大豆が栽培されている世界中のほとんどの地域において報告されている。最初は1948年にインドで確認され、そして1951年にオハイオ州で再び記録されている(Dorrance et al. 2007; Erwin and Ribeiro 1996; Kaufmann and Gerdemann 1958; Schmitthenner 1985)。PRSRは、ダイズシスト線虫(SCN：soybean cyst nematode）に次いで、２番目に壊滅的な打撃を大豆に与える疾患としてランク付けされており、これによって1996年から2009年にかけて米国で大豆の産生量が低下し、4470万ブッシェルの年間収量の損失が発生した(Koenning and Wrather 2010; Wrather and Koenning 2009)。
【０００５】
種特異的抵抗性の大豆栽培品種の開発が、PRSR管理の一番の戦略であり、大豆茎疫病（Phytophthora）による大豆生産量低下の抑制において、有効性が高く、経済的で、環境的に安全である(Dorrance et al. 2007; Dorrance and Schmitthenner 2000; Schmitthenner 1999)。これまでのところ、およそ25のRps遺伝子／アレルが特定されており、これらは8つの異なる染色体にわたり19個の座位に分布している。3番染色体（Chr.3)（MLG N）は、マッピングがなされているRps遺伝子／アレルのほとんどを有しており、Rps1a、Rps1b、Rps1c、Rps1d、Rps1k、Rps7、Rps9、RpsUN1、RpsYu25、RpsYD29、及び日本の栽培品種である「Waseshiroge」で報告されている、まだ名付けられていないRps遺伝子を含んでいる(Demirbas et al. 2001; Fan et al. 2009; Gao et al. 2005; Lin et al. 2013; Sugimoto et al. 2011; Sun et al. 2011; Weng et al. 2001; Wu et al. 2011a; Yao et al. 2010; Zhang et al. 2013)。2つのRps遺伝子、Rps2 及びRpsUN2は、有名な抵抗性遺伝子クラスター領域であるChr.16（MLG J）の末端でマッピングされている(Kanazin et al. 1996; Lin et al. 2013; Polzin et al. 1994)。興味深いことに、Rps3（3つのアレルの、3-a、3-b、3-cを含有する)、及びRps 8は、Chr.13(MLG F)上の別の抵抗性遺伝子リッチ領域でマッピングされている(Demirbas et al. 2001; Gordon et al. 2006)。RpsJSは、近年特定されたRps遺伝子であり、Rps4、Rps5、及びRps6と連鎖しており、それらはすべて、Chr.18(MLG G)の短腕上に位置している(Demirbas et al. 2001; Sandhu et al. 2004; Sun et al. 2014)。さらにRpsYB30、Rps ZS18、RpsSu、及びRps10が、それぞれ Chr.19 (MLG L)、 Chr. 2(MLG D1b)、 Chr. 10(MLG O)、及びChr. 17(MLG D2)にマッピングされている(Wu et al. 2011b; Yao et al. 2010; Zhang et al. 2013; Zhu et al. 2007)。
【０００６】
これらRps遺伝子のうちの多くがすでにPRSR制御のための大豆育種計画で成功裏に展開されている。それにもかかわらず、これら遺伝子はたった８〜１５年間しか効果が持続できない。その理由は、選択圧の下、急速で持続的な病原体の進化が発生するためである(Schmitthenner 1985)。さらに、公知のRps遺伝子を単一の栽培品種へとピラミッド化しても、効果的な長期的育種戦略とはならない可能性がある。その理由は、病原体群を組み替えることによって、育種家が抵抗性遺伝子を積み上げるのと同じくらい急速に、新たな病原性アレルの組み合わせが創出され得るからである(McDonald and Linde 2002)。従って、効果的な大豆茎疫病菌（Phytophthora）管理のための新規Rps遺伝子の特定がいまだに必要とされている。
【０００７】
新規の大豆茎疫病（Phytophthora）抵抗性座位が本開示において特定される。さらに、開示される新規大豆茎疫病（Phytophthora）抵抗性座位に連鎖しているマーカーも特定される。新規大豆茎疫病（Phytophthora）抵抗性座位に連鎖しているマーカーとしては、SSR、InDel、及びSNPマーカーが挙げられる。本開示において特定されるマーカーは、育種計画をサポートするための大豆茎疫病（Phytophthora）抵抗性遺伝子型決定に使用されることができる。本開示マーカーを使用して、育種計画のサポートにおいて大豆茎疫病（Phytophthora）抵抗性遺伝子型決定を行うことにより、特に以下の利益がもたらされる：コストと時間の節約；望ましい子孫物の早期選抜；及び大豆茎疫病（Phytophthora）抵抗性の大豆変種のより正確で急速な商業化。本明細書に開示される新規大豆茎疫病（Phytophthora）抵抗性座位に関し、表現型の根底となる候補遺伝子もまた記載される。
【発明の概要】
【０００８】
１つの実施形態において、PRSRに対する抵抗性の増強を示す大豆植物を特定する方法が提供され、当該方法は、大豆植物の遺伝資源において、マーカー座位の少なくとも１つのアレルを検出することを含む。マーカー座位は、７番染色体上にあって、及び染色体区間（chromosomal interval）内に位置しており、当該区間はBARC_1_01_Gm07_5383355_C_T及びBARC_1_01_Gm07_5629128_A_Cを含有し、ならびにこれらに隣接しており、少なくとも１つのアレルがPRSRに対する抵抗性の増強と関連している。一部の特定の実施形態において、マーカー座位は、以下のマーカー座位のうちのいずれかから選択され得る：BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T、BARCSOYSSR_07_0286、BARCSOYSSR_07_0289、BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C、BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T、Gm07_5480878_G_A、BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C、BARCSOYSSR_07_0295、BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G、BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T、BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A、BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G、BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T、BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A、InDel_2、InDel_1、BARCSOYSSR_07_0297、BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G、BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C、BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T、BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C、BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A、BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C、BARCSOYSSR_07_0300、及びBARC_1_01_Gm07_5629128_A_C、ならびにこれらマーカーに連鎖している任意の他のマーカー。一部の実施形態において、マーカー座位は７番染色体上にあり、及び区間内に位置しており、当該区間はBARCSOYSSR_07_0295及びInDel_1を含有し、ならびにこれらに隣接しており、マーカー座位はPRSRに対する抵抗性増強と関連しているアレルを少なくとも１つ含有している。一部の特定の実施形態において、マーカー座位は、以下のマーカー座位のうちのいずれかから選択され得る：BARCSOYSSR_07_0295、BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G、BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T、BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A、BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G、BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T、BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A、InDel2、及び InDel_1、ならびにこれらマーカーに連鎖している任意の他のマーカー。一部の実施形態において、マーカー座位は、Glyma.07G62500、Glyma.07G62600、Glyma.07G62700、Glyma.07G62800、及びGlyma.07G62900からなる群から選択される遺伝子を含有している。本方法により特定される大豆植物もまた対象である。
【０００９】
他の実施形態において、大豆植物の遺伝資源において、ハプロタイプを検出することによる、PRSRに対する抵抗性の増強を示す大豆植物を特定する方法が提供される。ハプロタイプは、１つ以上のマーカー座位でアレルを含有し、この場合において当該１つ以上のマーカー座位は、７番染色体染色体上で区間内に存在し、当該区間は、BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T及びBARC_1_01_Gm07_5629128_A_Cを含有し、ならびにこれらに隣接している。一部の特定の実施形態において、マーカー座位は、以下のマーカー座位のうちのいずれかから選択され得る：BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T、BARCSOYSSR_07_0286、BARCSOYSSR_07_0289、BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C、BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T、Gm07_5480878_G_A、BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C、BARCSOYSSR_07_0295、BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G、BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T、BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A、BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G、BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T、BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A、InDel_2、InDel_1、BARCSOYSSR_07_0297、BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G、BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C、BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T、BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C、BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A、BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C、BARCSOYSSR_07_0300、及びBARC_1_01_Gm07_5629128_A_C、ならびにこれらマーカーに連鎖している任意の他のマーカー。一部の実施形態において、ハプロタイプは、１つ以上のマーカー座位でアレルを含有し、この場合において当該１つ以上のマーカー座位は、７番染色体染色体上で区間内に存在し、当該区間は、BARCSOYSSR_07_0295及びInDel_1を含有し、ならびにこれらに隣接している。一部の特定の実施形態において、マーカー座位は、以下のマーカー座位のうちのいずれかから選択され得る：BARCSOYSSR_07_0295、BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G、BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T、BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A、BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G、BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T、BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A、InDel_1、及びInDel_1、ならびにこれらマーカーに連鎖している任意の他のマーカー。ハプロタイプは、PRSRに対する抵抗性の増強と関連づけられている。一部の実施形態において、マーカー座位は、Glyma.07G62500、Glyma.07G62600、Glyma.07G62700、Glyma.07G62800、及びGlyma.07G62900からなる群から選択される遺伝子を含有している。本方法により特定される大豆植物もまた対象である。
【００１０】
さらなる実施形態において、PRSRに対する抵抗性が増強した植物を選抜する方法が提供される。１つの態様において、マーカー座位のアレルを少なくとも１つ有する第一の大豆植物が取得され、この場合において当該アレルはPRSRに対する抵抗性の増強と関連づけられている。マーカー座位は７番染色体上で、区間内に存在していてもよく、当該区間は、BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T、及びBARC_1_01_Gm07_5629128_A_Cを含有し、ならびにこれらに隣接しており、一部の特定の実施形態においては、マーカー座位はBARCSOYSSR_07_0295及びInDel_1を含有し、ならびにこれらに隣接している区間内に存在していてもよい。第一の大豆植物を第二の大豆植物を交配させてもよく、及びその交配から生じた子孫物を、第一の大豆植物のアレルに関し評価してもよい。第一の大豆植物由来のアレルを保有している子孫植物を、PRSRに対する抵抗性増強を有するとして選抜してもよい。一部の実施形態において、マーカー座位は、Glyma.07G62500、Glyma.07G62600、Glyma.07G62700、Glyma.07G62800、及びGlyma.07G62900からなる群から選択される遺伝子を含有している。本方法により選抜される大豆植物もまた対象である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
本主題は、以下の詳細な記述、及び添付の図面、及び本出願の一部を成す配列表から、さらに完全に理解することができる。配列表は、Nucleic Acids Research 13:3021-3030 (1985)、及びthe Biochemical Journal 219 (No. 2):345-373 (1984)に記載されるIUPAC-IUBMB標準に準拠し規定される、ヌクレオチド配列の文字に対する１文字コード、アミノ酸に対する３文字コードを含有している。当該文献は、その全体で参照により本明細書に援用される。ヌクレオチド及びアミノ酸の配列に対し使用される記号及び形式は、37 C.F.R. §1.822に明記される規則に従っている。
【００１２】
【図１】図１は、抵抗性集団と感受性集団の間で異なっているSNPの分布に基づく、Rps11の位置を図解する。y軸は、７番染色体上の３つの異なるタイプのSNPを示す。T1は、SNPが、Williamsにおける感受性アレルとしてホモ接合性であることを示す。T3は、SNPが、PI 594527における抵抗性アレルとしてホモ接合性であることを示す。T2は、SNPが、両方の親由来のアレルを伴うヘテロ接合性であることを示す。x軸は、SNPの物理的な位置を示す。aとbの間の区間は、Rps11の可能性がある領域を示す。
【００１３】
【図２】図２は、７番染色体上のRps11の遺伝的地図及び物理的な地図を示す。図２(ａ)は、Rps11の遺伝子連鎖地図である。マーカーの名称は、左側に列記され、遺伝距離（cM）は右側にある。*「BARCSOYSSR_07_0241」に対する略語 図２（ｂ）は、SoyBaseウェブサイト上の大豆基準ゲノム（Glyma1.1）に対する、それらプライマー配列を探索するBLASTにより決定されたSSRマーカーの物理的位置を示す。カッコ内の数値は、塩基対（bp）中のマーカーの開始位置を表す。Rps11の区間は、黒色で強調されている。図２（ｃ）は、Williams 82基準ゲノム中のRps11区間の物理的位置を示す。バーは、０７番染色体の２つの腕を示し、マルは、セントロメア領域のおよその位置を示す。
【００１４】
【図３】図３は、Rps11座位、関連マーカー、及び当該領域中に予測されている５つの遺伝子モデルを含有する７番染色体上の61kb領域を図示する。10個のF3組み換え体の地図を示す。
【００１５】
配列番号 １〜３３及び５４は、SoySNP8K BeadChip上のアッセイを設計するために使用されたSNP、及び／又はKASP（商標）遺伝子型決定を設計するために使用されたSNPに隣接し、及びそれらを含む配列である。
【００１６】
配列番号 ３４〜５３及び５５〜６０は、７番染色体上にマッピングされたSSRマーカーに対するフォワードプライマーとリバースプライマーである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本主題は、PRSRに対する抵抗性が増強した大豆植物を特定及び選抜する方法を提供するものである。以下の定義は、本明細書に開示される主題を理解するための補助として提供される。
【００１８】
定義
「アレル」という用語は、特定の座位に存在する２つ以上の異なるヌクレオチド配列のうちの１つを指す。アレルは、当該アレルの存在が、当該アレルを含有する植物において所望される遺伝形質又は遺伝形質型が存在しているという指標であるとき、及び遺伝形質と連鎖しているとき、遺伝形質と「関連」している。
【００１９】
「戻し交配」とは、植物に核酸配列を導入するために使用されるプロセスを指す。戻し交配の技術は、植物に新たな遺伝形質を導入するために、ここ数十年間広く使用されている。Jensen, N., Ed. Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988. 典型的な戻し交配のプロトコールにおいて、対象の元々の変種（反復親）は、伝達される対象遺伝子を担持する第二の変種（非反復親）と交配される。次いで、この交配から得られた子孫物を再度反復親と交配させる。原則的に、非反復親由来の伝達遺伝子に加えて、反復親の望ましい形態学的特徴及び生理学的特徴のすべてが転換植物において回復されている状態である植物を得るまで、このプロセスを繰り返す。
【００２０】
センチモルガン（cM）は、組み換え頻度の測定単位である。1cMは、1つの遺伝子座位のマーカーが、一世代で交配を行うことによって第二の座位のマーカーから分離される１％の可能性と等しい。
【００２１】
「染色体区間」とは、植物体において、単一の染色体上に存在するゲノムDNAの連続的な直線距離を指定している。単一の染色体区間上に位置している遺伝的要素又は遺伝子は物理的に連鎖している。染色体区間のサイズは特に限定されない。一部の態様において、単一の染色体区間内に位置する遺伝的要素は、典型的には、例えば20cM以下、あるいは10cM以下の遺伝子組み換え距離で、遺伝的に連鎖している。すなわち、単一の染色体区間内にある２つの遺伝的要素は、20％又は10％以下の頻度で組み換えを受ける。
【００２２】
「染色体区間」という用語は、本開示主題中に明記されるマーカーのうちのいずれかにより規定されるありとあらゆる区間を指定している。PRSRに対する抵抗性の増強と相関している染色体区間が提供される。この区間は７番染色体上に位置しており、BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T及びBARC_1_01_Gm07_5629128_A_Cを含有し、ならびにこれらに隣接している。染色体区間のBARC_1_01_Gm07_5383355_C_T及びBARC_1_01_Gm07_5629128_A_Cの部分区間は、BARCSOYSSR_07_0295及びInDel_1である。
【００２３】
「相補配列」という用語は、所与のヌクレオチド配列に対し相補的なヌクレオチド配列を指す。すなわち、塩基対形成の規則により、当該配列は関連付けられている。
【００２４】
「連続的DNA」という用語は、重複する連続的な遺伝的断片を指す。
【００２５】
「交配した」又は「交配」という用語は、受粉を介した配偶子の融合を行い、子孫物（例えば、細胞、種子又は植物）を産生することを意味する。当該用語は、性的交配（その他の植物による、１つの植物の受粉）及び自殖（自家受粉。例えば、花粉と胚珠が同一植物に由来する場合）の両方を包含する。「交配する」という用語は、受粉を介して配偶子融合の行為を行い、子孫物を産生することを指す。
【００２６】
「好ましいアレル」は、望ましい表現型、例えばPRSRに対する抵抗性の増強などに貢献する、又はそれを与える特定の座位のアレルである。あるいは、育種計画又は栽培（対抗選抜）から取り除かれ得る、PRSRに対する抵抗性が低下した植物の特定を可能にするアレルである。マーカーの好ましいアレルは、好ましい表現型と共に分離するマーカーのアレルである。あるいは、好ましくない植物表現型と共に分離するマーカーのアレルであり、それによって、植物特定の利益がもたらされる。
【００２７】
「遺伝地図」は、所与の種の内の１つ以上の染色体上の座位（又は染色体）の間の遺伝的連鎖関連性に関する記載であり、一般的に、図表又は表の形式であらわされている。各遺伝地図に関して、座位間の距離は、それらの間の組み換え頻度により測定されており、座位間の組み換えは、様々な遺伝分子学的マーカー（または、「分子学的マーカー」、「遺伝学的マーカー」又はシンプルに「マーカー」とも呼ばれる）を使用して検出することができる。遺伝地図は、マッピング群及び使用されるマーカーのタイプと、異なる群間の各マーカーの多型の可能性の産物である。座位間の順序及び遺伝的距離は、遺伝地図ごとに異なり得る。しかしながら、例えばマーカーの位置及び順序などの情報は、SoyBaseウェブサイト上で公的に入手可能な例えばGlyma1.1などの大豆基準ゲノムを使用し、対象の染色体上のマーカーの物理的位置を決定することにより、地図間で相関させることができる。当業者であれば、公的に利用可能なゲノムブラウザを使用して、染色体上のマーカーの物理的位置を決定することができる。
【００２８】
「遺伝的マーカー」という用語は、任意のタイプの核酸塩基のマーカーを指すものとし、限定されないが、制限断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)）、単純反復配列（Simple Sequence Repeat (SSR)）、無作為増幅多型DNA（Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)）、開裂増幅多型配列（Cleaved Amplified Polymorphic Sequences (CAPS)）(Rafalski and Tingey, 1993, Trends in Genetics 9:275-280)、増幅断片長多型（Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)） (Vos et al, 1995, Nucleic Acids Res. 23:4407-4414)、一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism (SNP)）(Brookes, 1999, Gene 234:177-186)、配列特異的増幅領域（Sequence Characterized Amplified Region (SCAR)）(Pecan and Michelmore, 1993, Theor. Appl. Genet, 85:985-993)、配列タグ部位（Sequence Tagged Site (STS)）(Onozaki et al. 2004, Euphytica 138:255-262)、一本鎖高次構造多型（Single Stranded Conformation Polymorphism (SSCP)）(Orita et al., 1989, Proc Natl Aced Sci USA 86:2766-2770)があげられる。単純反復配列間領域（Inter-Simple Sequence Repeat (ISR)）(Blair et al. 1999, Theor. Appl. Genet. 98:780-792)、レトロトランスポゾン間増幅多型（Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism (IRAP)）、レトロトランスポゾン−マイクロサテライト増幅多型（Retrotransposon-Microsatellite Amplified Polymorphism (REMAP)）(Kalendar et al., 1999, Theor. Appl. Genet 98:704-711)、及びRNA開裂産物（例えばLynxタグ）など。
【００２９】
「遺伝子組み換え頻度」は、２つの遺伝子座位間の乗り換え事象（組み換え）の頻度である。組み換え頻度は、減数分裂後のマーカー及び／又は遺伝形質の分離を追跡することにより観察することができる。
【００３０】
「ゲノム」とは、染色体又は染色体のセットにより担持される総DNA、遺伝子の全体的なセットを指す。
【００３１】
「遺伝子型」という用語は、１つ以上の遺伝子座位での個々（又は個々のグループ）の遺伝的構成であり、観察可能な遺伝形質（表現型）と対比される。遺伝子型は、個体がその両親から遺伝を受け継いだ、１つ以上の公知の座位のアレル（複数含む）により規定される。遺伝子型という用語を使用して、複数のリード（led）での、単一の座位での、個体の遺伝的構成を指すことができ、又はより一般的には、遺伝子型という用語を使用して、そのゲノム中のすべての遺伝子に対する、個体の遺伝的構成を指すことができる。
【００３２】
「遺伝資源」とは、個体（例えば植物など）、個体群（例えば、植物の系統、変種、又は科）、又は系統、変種、種もしくは培養物に由来するクローンの遺伝物質、又はそれらからの遺伝物質を指す。遺伝資源は、生物体又は細胞の一部であってもよく、又は生物体もしくは細胞から分離されていてもよい。概して、遺伝資源は、生物体又は細胞培養物の遺伝的な質の一部又はすべてに対する物理的基礎をもたらす特定の分子学的構成を有する遺伝物質を提供する。本明細書において使用される場合、遺伝資源は、新たな植物が成長することができる細胞、種子、もしくは組織を含み、又は例えば全植物へと栽培され得る葉、幹、花粉、もしくは細胞などの植物部分を含む。
【００３３】
「ハプロタイプ」は、複数の遺伝子座位、すなわちアレルの組み合わせでの個体の遺伝子型である。典型的には、ハプロタイプにより記載される遺伝子座位は、物理的及び遺伝的に連鎖しており、すなわち、同じ染色体セグメント上にある。「ハプロタイプ」という用語は、特定の座位、例えば単一マーカー座位での配列多型を指すことができ、又は所与のゲノム中の染色体セグメントに沿った複数の座位での配列多型を指すこともできる。前者はまた、「マーカーハプロタイプ」又は「マーカーアレル」とも呼称され得る。一方で後者は、「長距離ハプロタイプ」（ロングレンジハプロタイプ）と呼称され得る。
【００３４】
「ヘテロ接合性」という用語は、異なるアレルが、相同染色体上の対応する座位に存在している遺伝的状態を意味する。
【００３５】
「ホモ接合性」という用語は、同一のアレルが、相同染色体上の対応する座位に存在している遺伝的状態を意味する。
【００３６】
「ハイブリダイゼーション」又は「核酸ハイブリダイゼーション」とは、相補的なRNA鎖及びDNA鎖の対形成を指し、ならびに相補的なDNA一本鎖の対形成も指す。
【００３７】
「ハイブリダイズ」という用語は、核酸鎖の相補的な領域の間の塩基対の形成を意味する。
【００３８】
「遺伝子移入」又は「遺伝子移入する」という用語は、１つの遺伝的背景から他の遺伝的背景への、遺伝子座位の所望されるアレルの伝達を指す。例えば、特定の座位の所望されるアレルの遺伝子移入は、同種の２つの親の間の性的交配を介して、少なくとも１つの子孫物に伝達されることができ、ここで当該親の内の少なくとも１つは、そのゲノム中に当該所望されるアレルを有している。あるいは、例えばアレルの伝達は、例えば融合プロトプラストなどの２つのドナーゲノム間の組み換えにより発生させることができる。ここで、当該ドナープロトプラストの内の少なくとも１つが、そのゲノム中に当該所望されるアレルを有している。所望されるアレルは、例えば、マーカーの選択アレル、量的形質座位（QTL）、導入遺伝子などであってもよい。いずれの場合でも、所望されるアレルを含有する子供は、所望される遺伝的背景を有し、及び所望されるアレルに関して選抜された系統に反復して戻し交配させ、その結果、当該アレルを選抜された遺伝的背景に固定させることができる。例えば、本明細書に記載される７番染色体の座位は、PRSRに対し感受性の反復親に遺伝子移入されてもよい。その後、遺伝子移入された遺伝子又は座位を有する反復親系統は、PRSRに対する抵抗性を増強させる。
【００３９】
本明細書において使用される場合、「連鎖」又は「連鎖された」という用語を使用し、１つのマーカー座位が、他のマーカー座位又はいくつかの他の座位（例えばPRSR座位）と関連している程度が記載される。分子マーカーと表現型の間の連鎖の関係性は、「確率」又は「調整された確率」として与えられる。連鎖は、望ましい限界又は範囲として表されることができる。例えば一部の実施形態において、マーカーが50、40、30、25、20、又は15cMのマップ単位未満で離れているときに、任意のマーカーは、任意の他のマーカーに（遺伝的及び物理的に）連鎖している。一部の態様において、例えば10〜20cM、10〜30cM、又は10〜40cMなどの連鎖の階層範囲を規定することが有益である。第二の座位により近くマーカーが連鎖するほど、そのマーカーは、当該第二の座位に対するより良い指標となる。従って、例えばマーカー座位などの「近くに連鎖した座位」と第二の座位は、10％以下、好ましくは約9％以下、さらにより好ましくは約8％以下、よりさらに好ましくは約7％以下、さらにより好ましくは約6％以下、よりさらに好ましくは約5％以下、さらにより好ましくは約4％以下、さらにより好ましくは約3％以下、及びさらにより好ましくは約2％以下の座位間の組み換え頻度を示す。非常に好ましい実施形態において、関連座位は、約1％以下、例えば約0.75％以下、より好ましくは約0.5％以下、又はさらにより好ましくは約0.25％以下の組み換え頻度を示す。同じ染色体に位置付けられ、及び10未満（例えば、約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.75%、0.5%、0.25%以下）の頻度で２つの座位間の組み換えが発生するような距離にある２つの座位は、互いに「近位にある」とも言われる。1cMは、1％の組み換え頻度を示す2つのマーカー間の距離であるため、例えば10cM以下の距離にあるなど、ごく近接している任意の他のマーカーに対し、任意のマーカーは（遺伝的に及び物理的に）近く連鎖している。同じ染色体上にある２つの近くに連鎖したマーカーは、互いから、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.75、0.5又は0.25cM以下に位置していてもよい。
【００４０】
「連鎖不均衡」という用語は、両方に対する遺伝子座位又は遺伝形質の非無作為な分離を指す。いずれにしても、連鎖不均衡は、染色体の丈に沿って関連座位が十分な物理的近接の内にあり、それによって、無作為的よりも高い（すなわち非無作為の）頻度で、一緒に分離することを示唆している（共分離遺伝形質の場合において、当該遺伝形質の基礎となる座位は、互いに十分に近接している）。連鎖不均衡を示す複数のマーカーは、連鎖しているとみなされる。50％超の割合、例えば約51％〜約100％の割合で、連鎖座位は共分離する。言い換えると、共分離する２つのマーカーは、50％未満の組み換え頻度を有している（及び当然ながら、同一染色体上で50cM未満で分離される）。本明細書において使用される場合、連鎖は、２つのマーカーの間であってもよく、あるいは、マーカーと表現型の間であてもよい。マーカー座位は、例えばPRSRに対する抵抗性の増強などの遺伝形質「と関連していてもよい」（連鎖していてもよい）。表現型の遺伝形質に対する分子マーカーの連鎖の程度は、例えば当該マーカーと当該表現型の共分離の統計的確率として測定される。
【００４１】
連鎖不均衡は、Hill, W. G. and Robertson, A, Theor Appl. Genet 38:226-231 (1988)により記載される式を使用して算出される、r2という評価基準を使用して最も普遍的に評価されている。 r2=1である場合、完全なLDが、２つのマーカー座位の間に存在しており、これは、当該マーカーが組み換えにより分離されないこと、及び同じアレル頻度を有していることを意味する。r2が1/3を超える値の場合、マッピングに有用な、十分な強さのLDを示唆している（Ardlie at al., Nature Reviews Genetics 3:299-309 (2002)）。ゆえに、一対のマーカー座位間のr2値が、0.33、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、又は1.0以上である場合、アレルは連鎖不均衡の状態にある。
【００４２】
本明細書において使用される場合、「連鎖平衡」とは、２つのマーカーが独立して分離する、すなわち、子孫物の中で無作為にソートしている状況を記載する。連鎖平衡を示すマーカーは、（それらが同一の染色体上にあろうとなかろうと）連鎖していないとみなされる。
【００４３】
「ロッド値（logarithm of odds (LOD) value）」又は「ロッドスコア（Lod score）」(Risch, Science 255:803-804 (1992))は、２つのマーカー座位間の連鎖の程度を記載するための区間マッピングに使用される。２つのマーカーの間のロッドスコアが3では、連鎖が無い可能性よりも、連鎖がある可能性のほうが1000倍高いことを示唆している一方で、ロッドスコアが2では、連鎖が無い可能性よりも、連鎖がある可能性のほうが100倍高いことを示唆している。2以上のロッドスコアを使用して、連鎖を検出してもよい。
【００４４】
「座位」及び「マーカー座位」は本明細書において相互交換可能に使用され、遺伝子及び／又はマーカーが位置している染色体上の位置を意味している。
【００４５】
本明細書において使用される場合、「マッピング群」という用語は、遺伝子マッピングに使用される植物群を指す場合がある。マッピング群は、典型的には、親遺伝子型の制御された交配から取得される。親の選抜、及びマッピング群の開発のための交配設計、及び使用されるマーカーのタイプに関する決定は、マッピングされる遺伝子、マーカーの可用性、及び分子地図に依存している。マッピング群内の親植物は、核酸配列及び表現型のレベルの両方で、対象の遺伝形質（複数含む）に関し十分な多様性を有していなければならない。親の核酸配列の多様性を使用して、マッピング群の植物における組み換え事象を追跡する。有益な多型マーカーの可用性は、核酸配列の多様性の程度に依存している。
【００４６】
「マーカー」は、基準点として使用されるヌクレオチド配列、又はそれらのコード産物（例えばタンパク質）である。組み換えの検出に有用なマーカーについては、モニターされる群内の差異又は多型を検出することが必要である。分子マーカーに関しては、ポリヌクレオチド配列の差異に起因する、DNAレベルでの差異を意味する（例えば、SSR、RFLP、FLP、SNP）。ゲノムの変動性は、任意の起源による変動性であってもよく、例えば挿入、欠失、重複、反復因子、点変異、組み換え事象、又は転移因子の存在と配列などによる変動性であってもよい。分子マーカーは、ゲノム核酸又は発現核酸（例えばEST）に由来していてもよく、またプローブ、又はPCRをベースとした方法を使用することにより配列断片を増幅することができるプライマー対として使用される核酸を指すこともある。多くの大豆分子マーカーが当分野において公知であり、例えばSoyBaseインターネットリソースなどの様々なソースから公開され、又は利用可能である。
【００４７】
群のメンバー間の遺伝子多型に対応するマーカーを、当分野で確立された方法により検出してもよい。それら方法としては、例えば、DNA配列解析法、PCRをベースとした配列特異的増幅法、制限断片長多型（RFLP）の検出法、アイソザイムマーカーの検出法、アレル特異的ハイブリダイゼーション（ASH）によるポリヌクレオチド多型の検出法、植物ゲノムの増幅可変配列の検出法、自家持続配列複製の検出法、単純反復配列（SSR）の検出法、一塩基多型（SNP）の検出法、又は増幅断片長多型（AFLP）の検出法があげられる。発現配列タグ（EST）、及びEST配列から誘導されたSSRマーカー、及び無作為増幅多型DNA（RAPD）を検出するための方法も良く確立されており、公知である。
【００４８】
「マーカーアレル」、あるいは「マーカー座位のアレル」は、当該マーカー座位に関し多型である群において、マーカー座位に存在する複数の多型ヌクレオチド配列のうちの１つを指すことがある。
【００４９】
「マーカー支援選抜」（Marker assisted selection）（又はMAS）は、マーカーの遺伝子型に基づき表現型が選抜される方法である。
【００５０】
「マーカー支援対抗選抜」（Marker assisted counter-selection）は、マーカーの遺伝子型を使用して、選抜されない植物を特定し、それによって育種計画又は栽培からそれら植物を外すことが可能となる方法である。
【００５１】
「マーカー座位」は、特定のマーカーが見出され得る場合の、ある種のゲノム中の特定の染色体の位置である。マーカー座位を使用して、例えば表現型形質をコードする、又は表現型形質の発現に寄与する連鎖座位などの、第二の連鎖座位の存在を追跡することができる。例えば、マーカー座位を使用して、当該マーカー座位に遺伝的又は物理的に連鎖している、例えば、QTL又は単一遺伝子などの、座位のアレルの分離を監視することができる。
【００５２】
「マーカープローブ」は、マーカー座位の存在を特定するために使用することができる核酸配列又は核酸分子であり、例えば、核酸ハイブリダイゼーションを介するなど、マーカー座位配列に相補的な核酸プローブである。マーカー座位の30個以上の連続したヌクレオチド（マーカー座位配列の「全部または一部」）を含有するマーカープローブを、核酸ハイブリダイゼーションに使用してもよい。あるいは、一部の態様において、マーカープローブとは、マーカー座位に存在する特定のアレル（すなわち遺伝子型）を識別することができる任意のタイプのプローブを指す。
【００５３】
「分子マーカー」という用語を使用して、上記に規定されるように、遺伝子マーカー、又は連鎖座位を特定する場合の基準点として使用されるそのコード産物（例えば、タンパク質）を指す場合もある。マーカーは、ゲノムヌクレオチド配列から誘導されてもよく、又は発現ヌクレオチド配列（例えば、スプライシングされたRNA、cDNAなど）から誘導されてもよく、又はコードポリぺプチドから誘導されてもよい。当該用語はまた、プローブとして使用される核酸、又はマーカー配列を増幅することができるプライマー対として使用される核酸などの、マーカー配列に対し相補的な核酸配列、又はマーカー配列に隣接する核酸配列を指す。「分子マーカープローブ」は、例えばマーカー座位配列に対し相補的な核酸プローブなどの、マーカー座位の存在を特定するために使用することができる核酸配列又は核酸分子である。あるいは、一部の態様において、マーカープローブとは、マーカー座位に存在する特定のアレル（すなわち遺伝子型）を識別することができる任意のタイプのプローブを指す。例えばワトソン−クリック塩基対形成規則に従い溶液中で特異的にハイブリダイズする場合、核酸は「相補的」である。また本明細書に記載されるマーカーの一部は、例えば本明細書に記載される同一線上にない領域などのindel領域上に位置する場合、ハイブリダイゼーションマーカーとも呼称される。これは、定義によると、挿入領域は、挿入が無い植物に対して多型であるからである。ゆえに、マーカーは、indel領域が存在しているか、存在していないかを示しさえすれば十分である。任意の適切なマーカー検出技術を使用し、かかるハイブリダイゼーションマーカーを特定してもよい。例えばSNP技術が本明細書に提示される実施例に使用される。
【００５４】
「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、及び「核酸断片」は相互交換可能に使用され、及び一本鎖もしくは二本鎖のRNA又はDNAのポリマーを指し、任意で合成ヌクレオチド塩基、非天然ヌクレオチド塩基、又は改変ヌクレオチド塩基を含有する。「ヌクレオチド」は、DNA又はRNAのポリマーが構築される単量体単位であり、プリン塩基又はピリミジン塩基、ペントース、及びリン酸基からなる。ヌクレオチド（通常、その５’−一リン酸型で存在する）は、以下の一文字記号により言及される：「A」はアデニル酸塩又はデオキシアデニル酸塩（それぞれRNA又はDNAに関する）。「C」はシチジル酸塩又はデオキシシチジル酸塩。「G」はグアニル酸塩又はデオキシグアニル酸塩。「U」はウリジル酸塩。「T」はデオキシチミジル酸塩。「R」はプリン類（A又はG)。「Y」はピリミジン類（C又はT）。「K」はG又はT。「H」はA又はC又はT。「I」はイノシン。及び「N」は任意のヌクレオチドである。
【００５５】
「表現型」又は「表現型形質」又は「遺伝形質」という用語は、生物体の１つ以上の遺伝形質を指す。表現型は、裸眼で、又は当分野に公知の任意の他の評価手段、例えば顕微鏡、生化学解析、又は電気機械的アッセイなどにより観察可能である。一部の例において、表現型は、単一の遺伝子又は遺伝子座位、すなわち「単一の遺伝子の遺伝形質」によって直接制御される。他の場合においては、表現型はいくつかの遺伝子の結果である。
【００５６】
ゲノムの「物理的地図」は、染色体DNA上の識別可能なランドマーク（遺伝子、マーカーなどを含む）の直線的な順序を示す地図である。しかしながら、遺伝地図とは対照的に、ランドマーク間の距離は絶対的であり（例えば、塩基対で測定される、又は単離され及び重複する連続遺伝子断片で測定される）、遺伝子組み換えに基づいてはいない。
【００５７】
「植物」は、全植物、その任意の部分、又は植物から誘導された細胞もしくは組織培養物であってもよい。従って、「植物」という用語は、全植物、植物の構成要素もしくは器官（例えば、葉、幹、根など）、植物の組織、種子、植物細胞、及び／又はそれらの子孫物のいずれかを指し得る。植物細胞は、植物の細胞、植物から採取された細胞、又は植物から採取された細胞からの培養物を介して誘導された細胞である。
【００５８】
「多型」は、新たな変異に過ぎないとするには普遍的すぎるDNA中の多様性である。多型は、群中、少なくとも1％の頻度を有していなければならない。多型は、一塩基多型、又はSNP、又は本明細書において「indel」とも呼称される挿入／欠失多型であってもよい。
【００５９】
「確率値」又は「p-値」は、表現型と、特定のマーカーアレルの存在又は非存在の特定の組み合わせが無作為である、統計学的な可能性である。従って、確率のスコアが低くなると、表現型と特定のマーカーが共分離している可能性が高くなる。一部の態様において、確率スコアは、「有意」又は「有意ではない」とみなされる。一部の実施形態において、無作為の組み合わせの0.05の確率スコア（p=0.05、又は5％の確率）は、有意な共分離の指標とみなされる。しかしながら、受容可能な確率は、50％未満のいずれかの確率であってもよい（p=0.5)。例えば、有意な確率は、0.25未満、0.20未満、0.15未満、0.1未満、0.05未満、0.01未満、又は0.001未満であってもよい。
【００６０】
「子孫物」という用語は、交配から生じた子供を指す。
【００６１】
「子孫植物」は、２つの植物の間の交配から生じる。
【００６２】
「基準配列」は、配列比較の基として使用される既定の配列である。基準配列は、多くの系統を座位で遺伝子型決定し、配列アライメントプログラム（例えば、Sequencher）でヌクレオチド配列を整列させ、その後、当該アライメントのコンセンサス配列を取得することにより、取得される。
【００６３】
「一塩基多型（SNP）」は、ゲノム（又は他の共有配列）中の１つのヌクレオチド−A、T、C又はG−が、生物学的な種のメンバー間で異なっている場合、又は個体の対形成した染色体の間で異なっている場合に発生するDNA配列の多様性である。例えば、別の個体に由来する２つの配列解析されたDNA断片で、AAGCCTAとAAGCTTAは、１つのヌクレオチドに違いを有している。
【００６４】
「大豆植物」という用語は、全大豆（Glycine max)植物、大豆植物細胞、大豆植物プロトプラスト、大豆植物が再生され得る大豆植物細胞又は大豆組織の培養物、大豆植物のカルス、及び大豆植物又は大豆植物の一部、例えば大豆種子、大豆の外皮、大豆の花、大豆の子葉、大豆の葉、大豆の茎、大豆の芽、大豆の根、大豆の根端などにおける損なわれていない大豆植物細胞を含む。
【００６５】
「ストリンジェントな条件下」という文言は、プローブ又はポリヌクレオチドが、典型的には核酸の複合混合物中で、特定の核酸配列にハイブリダイズするが、他の配列には原則としてハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる環境中では異なってくる。
【００６６】
配列が長くなれば、高い温度でも特異的にハイブリダイズする。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度pHでの特定の配列に対する熱融点（Tm）よりも約5〜10℃低くなるよう選択される。Tmは、標的に対し相補的なプローブの50％が、平衡状態で当該標的配列に（既定のイオン強度、pH、及び核酸濃度下で）ハイブリダイズする温度である（標的配列は余剰に存在しているため、Tmで、プローブの50は平衡状態で占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、pH 7.0〜8.3で、約1.0M ナトリウムイオン未満、典型的には濃度で約0.01〜1.0Mナトリウム（またな他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば、10〜50ヌクレオチド）に対しては少なくとも約30℃、長いプローブ（例えば、50ヌクレオチドよりも長い）に対しては少なくとも約60℃である。ストリンジェントな条件はまた、例えばホルムアミドなどの脱安定化剤の添加で達成され得る。選択的ハイブリダイゼーション又は特異的ハイブリダイゼーションに関しては、陽性シグナルは少なくともバックグラウンドの2倍であり、好ましくはバックグラウンドのハイブリダイゼーションの10倍である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は多くの場合、以下である：50%ホルムアミド、5xSSC、及び1% SDS、42℃でインキュベーション。又は5xSSC、1% SOS、65℃でインキュベーション。0.2xSSC、及び0.1% SDS、65℃で洗浄。PCRに関しては、約36℃の温度が、低ストリンジェンシー増幅に対する典型であるが、アニーリング温度は、プライマーの長さに応じて約32℃〜約48℃の間で変化し得る。ハイブリダイゼーションのパラメーター決定に関するさらなるガイドラインは、多くの参照文献に提示されている。
【００６７】
配列アライメント、及び同一性割合の算出は、相同配列を検出するよう設計された様々な比較方法を使用して決定することができ、限定されないが、LASERGENE（登録商標）バイオインフォマティクスコンピュータースイートのMEGALIGN（登録商標）プログラム(DNASTAR（登録商標） Inc., Madison, Wis.)があげられる。別段の定めがない限り、本明細書に提供される配列の多重アライメントは、デフォルトのパラメーター（GAP PENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY=10）を用いたClustal V法のアライメント(Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989))を使用して行われた。ペアワイズアライメント、及びClustal V法を使用したタンパク質配列の同一性割合の算出のデフォルトのパラメーターは、KTUPLE=1、GAP PENALTY=3、WINDOW=5、及びDIAGONALS SAVED=5である。核酸に関しては、これらのパラメーターは、KTUPLE=2、GAP PENALTY=5、WINDOW=4、及びDIAGONALS SAVED=4である。Clustal Vプログラムを使用した配列のアライメントを行った後、同プログラム上の「配列距離」表を評価することにより、「同一性割合」及び「発散（divergence）」値を取得することができる。別段の規定がない限り、本明細書に提示され、請求される同一性割合及び発散は、この方法で算出された。
【００６８】
本主題を詳細に記述する前に、本発明は特定の実施形態に限定されないことを理解されたい。また、本明細書に使用される専門用語は、特定の実施形態を記述する目的のためであり、限定を意図していないことを理解されたい。本明細書、及び添付の請求項において使用される場合、単数での用語、及び単数形の「a」、「an」、及び「the」は例えば、内容に別段の明白な指示がない限り、複数の指示対象を含む。従って例えば、「植物」、「その植物」、又は「ある植物」という言及もまた、複数の植物を含む。その内容に応じて、「植物」という用語の使用は、その植物の遺伝的に類似した又は同一の子孫物も含み得る。「核酸」という用語の使用は任意でその核酸分子の多量の複製を含む。
【００６９】
遺伝子マッピング
長い間、例えばPRSRに対する抵抗性の増強などの、特定の表現型と相関する特定の遺伝子座位は、生物体ゲノム中にマッピングされ得るものと認識されている。植物育種家は有益に分子マーカーを使用して、連鎖不均衡として現れる、所望される表現型との共分離に関し、統計学的に有意な確率を示すマーカーアレルを検出することにより、所望される個体の特定を行うことができる。対象の遺伝形質と共分離する分子マーカー、又は分子マーカーのクラスターを特定することにより、育種家は、適切な分子マーカーアレルを選択することにより所望される表現型を素早く選択することができる（マーカー支援選抜、又は「MAS」と呼称される方法）。
【００７０】
当分野に公知の様々な方法を、例えばPRSRに対する抵抗性の増強などの対象の遺伝形質と共分離する分子マーカー、又は分子マーカーのクラスターの検出に利用することができる。これらの方法の根底にある基礎的なアイディアは、マーカーの検出であり、そのマーカーに対し、別の遺伝子型（又はアレル）は有意に異なる平均表現型を有している。従って、別の遺伝子型（又はアレル）の間の差異の程度のマーカー座位間の比較、又はその差異の有意レベルのマーカー座位間の比較を行う。遺伝形質は、最も大きな関連遺伝子型の差異を有しているマーカー（複数含む）の最も近くに位置していると推測される。
【００７１】
対象の遺伝形質の座位を検出するために使用される、２つのかかる方法は、以下である：１）群をベースとした関連性解析、及び２）従来からの連鎖解析。群をベースとした関連性解析において、系統は、複数の創始系統、例えば選良育種系統などを有する、従前から在る群から取得される。群をベースとした関連性解析は、連鎖不均衡（LD）の低下と、体系化されていない群においては対象の遺伝形質を制御する遺伝子とそれら遺伝子近くに連鎖しているマーカーの間の相関のみが、数世代の無作為交配の後でも保持されるというアイディアに依っている。実際には、従前から存在している群のほとんどが、群の副次的構造を有している。従って、体系化された関連性アプローチの使用は、ゲノム中に無作為に散らばったマーカーから得られるデータを使用して群に対する個体の位置決定することにより、群構造の制御に役立ち、それによって、個体群内の群構造（下位群とも呼ばれる）による不均衡が最小化される。表現型の値は、下位群の各系統に対するマーカー座位の各々で、遺伝子型（アレル）と比較される。マーカー−遺伝形質の有意な関連性は、マーカー座位と、当該遺伝形質の発現に関与する遺伝子座位の１つ以上の間の用量近接を示している。
【００７２】
同じ原理が、従来的な連鎖解析の根底にある。しかしながら、少数の創始系統から群を作ることによって、LDが生じてしまう。創始系統を選択し、構成された群内の多型のレベルを最大化させ、そして多型部位を、所与の表現型との共分離のレベルに関して評価する。多くの統計的手法を使用し、マーカー−遺伝形質の有意な関連性を特定する。そのような方法の１つは、区間マッピング法である(Lander and Botstein, Genetics 121:185-199 (1989)。当該方法は、遺伝地図に沿った、多数の位置の各々（約1cMの区間）が、対象の遺伝形質を制御する遺伝子がその位置にある可能性を検証される。遺伝子型／表現型のデータを使用して、各検証位置に対するLODスコア（可能性比の対数）を算出する。LODスコアが閾値を超える場合、遺伝地図のその位置（２つの特定のマーカー座位の中間に位置）に、対象の遺伝形質を制御する遺伝子の位置があるという有意な証拠となる。
【００７３】
PRSR抵抗性に関連したマーカー
PRSR抵抗性に関連したマーカーが、本明細書において特定される。当該方法は、大豆植物の遺伝資源において、抵抗性増強と関連した少なくとも１つのマーカーアレルの存在を検出することを含む。マーカー座位は、BARCSOYSSR_07_0295、BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G、BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T、BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A、BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G、BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T、BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A、及びInDel_1、ならびにこれらマーカーに連鎖している任意の他のマーカー（連鎖マーカーは、公的に利用可能なSoyBaseリソースから決定することができる）を含む、表６に提示されるマーカー座位のうちのいずれかから選択することができる。マーカー座位は、BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T、BARCSOYSSR_07_0286、BARCSOYSSR_07_0289、BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C、BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T、Gm07_5480878_G_A、BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C、BARCSOYSSR_07_0295、BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G、BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T、BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A、BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G、BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T、BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A、InDel_2、InDel_1、BARCSOYSSR_07_0297、BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G、BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C、BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T、BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C、BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A、BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C、BARCSOYSSR_07_0300、及びBARC_1_01_Gm07_5629128_A_C、ならびにこれらマーカーに連鎖している任意の他のマーカー（連鎖マーカーはSoyBaseリソースから決定することができる）を含む、表６に提示されるマーカー座位のいずれかから選択することができる。
【００７４】
単一の染色体上のゲノムDNAの連続した直線距離上に位置している遺伝要素又は遺伝子は、物理的に連鎖している。BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T及びBARC_1_01_Gm07_5629128_A_Cは両方ともPRSR抵抗性に強く関連しており、PRSR抵抗性座位を定めている。配列番号６（BARC_1_01_Gm07_5383355_C_Tに対するSNP源配列）及び配列番号２４（BARC_1_01_Gm07_5629128_A_Cに対するSNP源配列）の間にあり、それらを含む連続的DNAにアセンブリする任意のポリヌクレオチドが、PRSR抵抗性に関連するマーカー座位を保有していてもよい。
【００７５】
単一の染色体上のゲノムDNAの連続した直線距離上に位置している遺伝要素又は遺伝子はBARCSOYSSR_07_0295とInDel_1の部分区間に物理的に連鎖している。BARCSOYSSR_07_0295及びInDel_1は両方ともPRSR抵抗性に強く関連しており、PRSR抵抗性座位を定めている。配列番号４３（BARCSOYSSR_07_0295に対するフォワードプライマー配列）及び配列番号５８（InDel_1に対するリバースプライマー配列）の間にあり、それらを含む連続的DNAにアセンブリする任意のポリヌクレオチドが、PRSR抵抗性に関連するマーカー座位を保有していてもよい。
【００７６】
連鎖に関する普遍的な評価基準は、遺伝形質が共分離する頻度である。これは、共分離の割合（組み換え頻度）、又はセンチモルガン（cM）で表されることができる。cMは、遺伝子組み換え頻度の測定単位である。1cMは、1つの遺伝子座位の遺伝形質が、一世代で交配を行うことによって他の座位の遺伝形質から分離される１％の可能性と等しい（99％の確率で、遺伝形質は一緒に分離することを意味する）。染色体の距離は遺伝形質間の組み換え事象の頻度におよそ比例しているため、組み換え頻度と相関する、およその物理的距離となる。
【００７７】
マーカー座位は、自身が遺伝形質であり、分離時のマーカー座位を追跡することによる、標準的な連鎖解析法に従って評価することができる。従って、1cMは、マーカー座位が、一世代で交配を行うことによって、別の座位から分離される１％の可能性と等しい。
【００７８】
表４に列挙されるマーカーに連鎖する他のマーカーを使用して、大豆植物におけるPRSR抵抗性を予測してもよい。これには、PRSR抵抗性に関連するマーカーである、BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T、BARCSOYSSR_07_0286、BARCSOYSSR_07_0289、BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C、BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T、Gm07_5480878_G_A、BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C、BARCSOYSSR_07_0295、BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G、BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T、BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A、BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G、BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T、BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A、InDel_2、InDel_1、BARCSOYSSR_07_0297、BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G、BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C、BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T、BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C、BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A、BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C、BARCSOYSSR_07_0300、及びBARC_1_01_Gm07_5629128_A_Cの50cM未満（例えば、約10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.75cM、0.5cM、又は0.25cM以下）の内にある任意のマーカーが挙げられる。対象の遺伝形質を制御する遺伝子にマーカーが近づけば近づくほど、所望の遺伝形質に対する指標として、当該マーカーはより効果的で有益なものとなる。より近くに連鎖した座位は、約10％以下、好ましくは約9％以下、さらにより好ましくは約8％以下、よりさらに好ましくは約7％以下、さらにより好ましくは約6％以下、よりさらに好ましくは約5％以下、さらにより好ましくは約4％以下、さらにより好ましくは約3％以下、及びさらにより好ましくは約2％以下の座位間の組み換え頻度を示す。非常に好ましい実施形態において、関連座位（例えば、マーカー座位及び標的座位）は、約1％以下、例えば約0.75％以下、より好ましくは約0.5％以下、又はさらにより好ましくは約0.25％以下の組み換え頻度を示す。従って、座位は、約10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.75cM、0.5cM、又は0.25cM以下、離れている。言い換えれば、同じ染色体に位置付けられ、及び10%未満（例えば、約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.75%、0.5%、0.25%以下）の頻度で２つの座位間の組み換えが発生するような距離にある２つの座位は、互いに「近位にある」とも言われる。
【００７９】
特定のマーカーアレルが、PRSRに対する抵抗性増強との共分離を示す場合もあるが、必ずしもマーカー座位がPRSR抵抗性の表現型の発現の原因ではないことに留意することが重要である。例えば、マーカーポリペプチド配列が、PRSRに対する抵抗性増強を与える遺伝子の一部である（例えば、遺伝子のオープンリーディングフレームの一部である）ことは、必須条件ではない。特定のマーカーアレルと、PRSR抵抗性増強の表現型の間の関連性は、当該マーカーアレルと、そのアレルの起源となった祖先大豆系統のアレルの間の、最初の「カップリング」連鎖段階によるものである。最終的には、組み換えを繰り返すことで、マーカーと遺伝子座位の間の乗り換え事象は、この方向性を変化させ得る。この理由によって、分離群を創成するために使用された抵抗性の親の内に存在する好ましいマーカーアレルは、連鎖段階に応じて変化する場合がある。しかしこのことは、マーカーを使用して、表現型の分離をモニターすることができるという事実は変えるものではない。所与の分離群中で、どのマーカーアレルが好ましいとみなされるかが変化するのみである。
【００８０】
「染色体区間」という用語は、本開示中に明記されるマーカーのうちのいずれかにより規定されるありとあらゆる区間を指定している。PRSR抵抗性と相関している染色体区間が提供される。この区間は７番染色体上に位置しており、BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T及びBARC_1_01_Gm07_5629128_A_Cを含有し、ならびにこれらに隣接している。染色体区間のBARC_1_01_Gm07_5383355_C_T及びBARC_1_01_Gm07_5629128_A_Cの部分区間は、BARCSOYSSR_07_0295及びInDel_1である。
【００８１】
当分野において、染色体区間を特定するための様々な方法が公知であり、利用可能である。かかる染色体区間の境界は、対象の遺伝形質を制御する遺伝子に連鎖するマーカーを包含するように引かれる。言い換えると、染色体区間は、当該区間内にある任意のマーカー（区間の境界を規定する末端マーカーを含む）が、PRSR抵抗性のマーカーとして使用することができるように、引かれる。上述の区間は、PRSR抵抗性と共分離するマーカーのクラスターを包含する。マーカーのクラスター化は、染色体上の比較的小さいドメインで起こっており、このことから、それら染色体領域中に、対象の遺伝形質を制御する遺伝子が存在することが示唆される。当該区間は、PRSR抵抗性と共分離するマーカーを包含するよう引かれる。当該区間は、末端を規定するマーカーならびに区間内をマッピングするマーカーを包含する。例えば、BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T、及びBARC_1_01_Gm07_5629128_A_Cの区間は、Glyma2.0基準ゲノムに基づくと、368,797bp離れており、PRSR抵抗性と共分離するマーカークラスターを包含する染色体区間を規定している。第二の例は、BARCSOYSSR_07_0295、及びInDel_1の部分区間を含み、Glyma2.0基準ゲノムに基づくと、61,874bp離れており、PRSR抵抗性と共分離するマーカークラスターを包含する染色体区間を規定する。区間のエンドポイントを規定する末端マーカーにより記述される区間は、末端マーカー、及び当該染色体ドメイン内に局在する任意のマーカーを、それらが現時点で公知、又は非公知であろうと含有する。
【００８２】
染色体区間は、対象のマーカーに連鎖し（対象のマーカーとの連鎖不均衡を示す）、及び関連実験環境中で連鎖不均衡（LD）の普遍的な評価基準であるマーカーにより規定されることもできる。もしBARC_1_01_Gm07_5383355_C_T及びBARC_1_01_Gm07_5629128_A_Cの区間内、BARCSOYSSR_07_0295及び InDel_1の部分区間内、ならびにBARC_1_01_Gm07_5383355_C_T及びBARC_1_01_Gm07_5629128_A_Cの任意の他の部分区間内にある７番染色体マーカー座位のいずれかと、PRSR抵抗性増強と関連するアレルを有する当該区間内の特定マーカーの間のLDのr2値が、１／３よりも大きかった場合(Ardlie et al. Nature Reviews Genetics 3:299-309 (2002))、当該座位は連鎖している。
【００８３】
本明細書に開示される主題マーカーはまた、他でハプロタイプとして公知の、マーカー座位のアレルの組み合わせであってもよい。当業者であれば、本明細書に特定される７番染色体マーカーの中、及び周囲のマーカー座位に、さらなる多型部位が存在し得、１つ以上の多型部位が、PRSR抵抗性増強と関連したアレルと連鎖不均衡（LD）状態にあることを予測するであろう。別の多型部位の２つの特定のアレルは、もしその部位のうちの１つのアレルの存在が、同一染色体上の他方の部位のアレルの存在を予測する傾向がある場合に、LDの状態にあると言われる(Stevens, Mol. Diag. 4:309-17 (1999))。
【００８４】
マーカー支援選抜 
分子マーカーを、様々な植物育種アプリケーションに使用することができる（例えば、Staub et al. (1996) Hortscience 729-741; Tanksley (1983) Plant Molecular Biology Reporter 1: 3-8を参照のこと）。対象の主要領域のうちの１つは、マーカー支援選抜（MAS)を使用した、戻し交配及び遺伝子移入の効率の上昇である。所望される表現形質に影響を与える座位との連鎖を示す分子マーカーは、植物群中の遺伝形質の選抜に有用なツールを提供する。これは特に、例えば多くの疾患抵抗性遺伝形質など、表現型を分析するのが困難である場合、又は例えば種子特性など植物発達の後期に発生する場合に当てはまる。DNAマーカーの分析は、野外の表現型解析よりも労力が少なく、物理的スペースも少なくて済むことから、より大きな群を分析することができ、ドナー系統からレシピエント系統へと移動した標的セグメントを有する組み換え体を発見するチャンスも増加する。連鎖が近くなればなるほど、遺伝形質に寄与する遺伝子とマーカーの間に組み換えが発生して偽陽性が生じ得る可能性が低くなることから、マーカーの有用性は高くなる。二重の組み換え事象が必要となることから、隣接するマーカーであれば、偽陽性選抜が発生する可能性が低下する。理想的な状況は、遺伝子それ自身の中にマーカーを有していることであり、それによってマーカーと遺伝子の間に組み換えは発生できなくなる。そのようなマーカーは、「パーフェクトマーカー」と呼ばれる。
【００８５】
遺伝子がMASにより移入される場合、当該遺伝子だけではなく、隣接する領域も導入される（Gepts. (2002). Crop Sci; 42: 1780-1790）。これは、「連鎖ドラッグ」（linkage drag）と呼ばれる。ドナー植物が、レシピエント植物に対して高度に非関連性である場合、これら隣接する領域は、農学的に望ましくない遺伝形質をコードし得る追加の遺伝子を担持する。この「連鎖ドラッグ」は、選良大豆系統への戻し交配を複数サイクル行った後でさえも、収率の低下、又は他のネガティブな農学的特性を生じさせる可能性がある。これは時々、「収率ドラッグ」（yield drag）とも呼称される。隣接領域の大きさは、さらなる戻し交配を行うことで低下する場合もあるが、育種家は、当該領域のサイズ、又は組み換えのブレイクポイントを超えて制御は行わないため、これが常に成功するわけではない(Young et al, (1998) Genetics 120:579-585)。伝統的な育種において、通常、ドナーセグメントのサイズ低下に寄与する組み換えが選択されることはまったくの偶然である (Tanksley et al. (1989). Biotechnology 7: 257-264)。このタイプの戻し交配で、20回の戻し交配を行った後でも、ドナー染色体の相当な部分はいまだに選抜される遺伝子に連鎖していることが予測され得る。しかしながらマーカーを用いれば、対象の遺伝子の近くで組み換えが発生した稀な個体を選択することが可能となる。150の戻し交配植物において、単回減数分裂の地図距離に基づけば、少なくとも１つの植物で、当該遺伝子の1cM 以内で組み換えが発生している確率は、95％である。マーカーは、それら個体を明白に特定する。１回の追加的な戻し交配を300の植物で行えば、当該遺伝子の別側の単回減数分裂の地図距離1cM以内の戻し交配が行われ、単回減数分裂の地図距離に基づいた2cM未満の標的遺伝子周囲のセグメントが生成される確率は95％である。これは、マーカーを用いると2世代で達成することができる一方で、マーカーを用いなければ平均で100世代が必要とされる（上記のTanksley et al.を参照のこと）。遺伝子の正確な位置が判明している場合、当該遺伝子周囲の隣接マーカーを利用して、異なる群サイズにおいて、組み換えに関し、選抜することができる。例えば、小さなサイズの群では、組み換えは当該遺伝子からさらに離れていることが予測され、より遠くに隣接するマーカーが、組み換えの検出に必要とされる。
【００８６】
周知の大豆マーカーの密度が高い、大豆基準ゲノムの可用性、及び大豆ゲノムのコンセンサス連鎖マップの可用性は、大豆遺伝子マッピング及びMASにより促進される。例えば、SoyBaseウェブサイトでオンライン利用可能である、アセンブリGlyma1.1及びGlyma2.0、ならびに比較Glycine maxコンセンサス4.0を参照のこと。
【００８７】
MASの実施に重要な構成要素は、以下である：（i）群、又は無作為もしくは系統化された群を分離させることができる、マーカー−遺伝形質相関が決定される群の定義；（ii）遺伝形質と比較し、多型マーカーの分離又は相関をモニターし、統計的手法を使用して連鎖又は相関を決定すること；（iii）統計解析の結果に基づき、所望されるマーカーのセットを定義すること、及び；（iv）この情報を、現在の育種遺伝子源設定に使用し、及び／又は外挿し、マーカーを基にした、選抜決定の実行を可能とすること。本開示に記載されるマーカー、ならびに例えばFLPなどの他のマーカー型を、マーカー支援選抜プロトコールに使用することができる。
【００８８】
SSRは、6bp以下の長さの、比較的短い距離のタンデムリピートDNAとして定義され得る(Tautz (1989) Nucleic Acid Research 17: 6463-6471; Wang et al. (1994) Theoretical and Applied Genetics, 88:1-6)。多型は、おそらくはDNA複製の間のずれが原因の、反復単位数における多様性によって生じる(Levinson and Gutman (1987) Mol Biol Evol 4: 203-221)。反復長の多様性は、PCRプライマーを、保存的非反復隣接領域に対して設計することにより検出することができる(Weber and May (1989) Am J Hum Genet. 44:388-396)。SSRは、多重アレル性、共優性、複製可能、及びハイスループット自動化に受容性であるため、マッピング及びMASに非常に適合している (Rafalski et al. (1996) Generating and using DNA markers in plants. In Non-mammalian genomic analysis: a practical guide. Academic Press, pp 75-135)。
【００８９】
様々なタイプのSSRマーカーを作成することができ、抵抗性系統のSSRプロファイルは、増幅産物のゲル電気泳動により取得することができる。マーカー遺伝子型のスコアリングは、増幅断片のサイズに基づいている。大豆のSSR事業は、Saint-Jean-sur-Richelieu, Quebec, CanadaのDNA Landmarksにより、契約に基づき公的に利用可能である。
【００９０】
様々なタイプのFLPマーカーを作成することもできる。最も普遍的なのは、増幅プライマーを使用して、断片長多型を作成することである。そのようなFLPマーカーは、当該プライマーにより増幅される領域が多くの場合、高度反復領域ではない点を除き、色々な意味でSSRマーカーに類似している。さらに、増幅領域又はアンプリコンは、遺伝資源の中で充分な変動性を有している。変動性はしばしば挿入又は欠失に起因しており、そのために増幅プライマーにより生成された断片を、多型個体間で識別することができ、そしてそのようなindelが大豆で頻繁に発生することが知られている（Bhattramakki et al. (2002). Plant Mol Biol 48, 539-547; Rafalski (2002b)、上記）。
【００９１】
SNPマーカーは、一塩基対ヌクレオチド置換を検出する。すべての分子マーカー型のうち、SNPが最も豊富であり、それゆえに、遺伝地図解明の最も高い可能性を有している（Bhattramakki et al. 2002 Plant Molecular Biology 48:539-547）。SNPは、SSRよりもさらに高いレベルのスループット、いわゆる「ウルトラ−ハイスループット」の様式でも分析することができる。その理由は、多量のDNAを必要とせず、アッセイの自動化をすぐに進ませることができるためである。またSNPは、比較的低コストのシステムとなる見込みがある。これら３つの要素が一緒になって、SNPは、MASでの使用において非常に魅力的なものとなっている。SNPの遺伝子型決定のためのいくつかの方法が利用可能であり、限定されないが、ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、オリゴヌクレオチドのライゲーション、ヌクレアーゼ開裂、ミニシークエンス、及びコード化スフィア（coded spheres)が挙げられる。かかる方法は、以下に概要がまとめられている：Gut (2001) Hum Mutat 17 pp, 475-492: Shi (2001) Clin Chem 47, pp. 164-172; Kwok (2000) Pharmacogenomics 1, pp. 95-100: Bhattramakki and Rafalski (2001) Discovery and application of single nucleotide polymorphism markers in plants. In: R, J Henry, Ed, Plant Genotyping: The DNA Fingerprinting of Plants, CABI Publishing, VVallingford. 様々な市販の技法が、これら方法や他の方法を利用してSNPを調べており、市販されている技法としては、Masscode（商標）. (Qiagen社)、Invader（登録商標）(Third Wave Technologies社)、SnapShot（登録商標）(Applied Biosystems社)、Taqman（登録商標）(Applied Biosystems社)及びBeadarrays（商標）(Illumina社)などが挙げられる。
【００９２】
配列内、又は連鎖配列にまでわたる多くのSNPを共に使用して、任意の特定の遺伝子型に対するハプロタイプを記載することができる（Ching et al. (2002), BMC Genet. 3:19 pp Gupta et al. 2001, Rafalski (2002b), Plant Science 162:329-333）。ハプロタイプは、１つのSNPよりも情報量が多く、任意の特定の遺伝子型に関し、より記述的となることができる。例えば、PRSR抵抗性が増強した特定の系統又は変種に関し、１つのSNPは、アレル「T」であり得るが、アレル「T」は、反復親に利用されている大豆育種群中にも存在する可能性がある。この場合では、例えば連鎖SNPマーカーでのアレルの組み合わせなどのハプロタイプは、より情報量が多くなることができる。固有ハプロタイプがドナー染色体領域に割り当てられたら、当該ハプロタイプを当該群又はその任意の下位群で使用して、個体が特定の遺伝子を有しているかどうかを決定することができる。例えば、WO2003054229を参照のこと。当分野の当業者に公知の自動化ハイスループットマーカー検出プラットフォームを使用して、このプロセスの効率を上げ、効果的なものとする。
【００９３】
表６に列記されるマーカーの配列を使用して、本開示に記述される染色体区間内の追加の多型SNP（及び他のマーカー）を容易に取得することができる。記載される地図領域内のマーカーを、人工細菌染色体（BAC）又は他のゲノムライブラリーにハイブリダイズさせて、又はゲノム配列と電子的にアライメントさせて、記述されるマーカーとおよそ同じ位置にある新たな配列を発見することができる。
【００９４】
上述のSSR、FLP、及びSNPに加えて、他のタイプの分子マーカーも広く使用されており、例えば限定されないが、発現配列タグ（EST）、EST配列から誘導されたSSRマーカー、無作為増幅多型DNA（RAPD）、及び多の核酸ベースのマーカーが挙げられる。
【００９５】
アイソザイムのプロファイル及び連鎖多型特性も、一部の例においてはマーカーとして間接的に使用することができる。それらは直接的にDNAの差異を検出することはないが、特定の遺伝的差異により影響を受けることが多い。しかしながら、DNAの多様性を検出するマーカーは、アイソザイムマーカーや形態学的マーカーよりも非常に多く、多様である（Tanksley (1983) Plant Molecular Biology Reporter 1:3-8）。
【００９６】
配列アライメント又はコンティグを使用して、本明細書に列記される特定のマーカーの上流又は下流の配列を発見することもできる。本明細書に記載されるマーカーに近接する、これらの新たな配列を使用して、機能的に均等なマーカーを見出し、開発する。例えば、異なる物理的地図及び／又は遺伝地図をアライメントさせ、本開示に記述されていないが、類似した領域内にある均等マーカーを位置づける。これら地図は大豆種の内にあってもよく、又は大豆と遺伝的又は物理的にアライメントされる、例えば緑豆、ササゲ又はインゲンマメなどの他の種からであってもよい。
【００９７】
概して、MASは、PRSR抵抗性と共分離する可能性が有意であると特定されている多型マーカーを使用する。かかるマーカーは、植物にPRSR抵抗性の表現型を与える遺伝子（複数含む）の近くに位置すると推測されており、所望される遺伝形質又はマーカーに対する指標とみなされている。マーカー中の所望されるアレルの存在に関して植物を検証し、そして所望される遺伝子型を１つ以上の座位で含有する植物は、所望される遺伝子型を、所望される表現型とともにそれらの子孫物へと伝達することが期待される。BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T、BARCSOYSSR_07_0286、BARCSOYSSR_07_0289、BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C、BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T、Gm07_5480878_G_A、BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C、BARCSOYSSR_07_0295、BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G、BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T、BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A、BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G、BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T、BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A、InDel_2、InDel_1、BARCSOYSSR_07_0297、BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G、BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C、BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T、BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C、BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A、BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C、BARCSOYSSR_07_0300、及びBARC_1_01_Gm07_5629128_A_Cを含む、本明細書に記載されるマーカー座位のうちのいずれか１つで、特定のアレルを有する植物を特定することによる、PRSR抵抗性が増強している大豆植物を特定する手段。
【００９８】
本明細書に提示される区間には、PRSR抵抗性の増強を示す植物を選抜するためのMASにおける用途が見出される。BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T及びBARC_1_01_Gm07_5629128_A_Cにより規定され、及びそれらを含む７番染色体区間内に位置する任意のマーカーを、本目的に使用することができる。さらに、BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T及びBARC_1_01_Gm07_5629128_A_Cに規定され、及びそれらを含む７番染色体区間内の１つ以上のマーカー座位でアレルを含有するハプロタイプを使用して、大豆の系統又は変種にPRSR抵抗性の増強を導入することができる。PRSR抵抗性の増強と関連するアレルと、連鎖不均衡の状態にある任意のアレル又はハプロタイプをMASに使用して、PRSR抵抗性が増強した植物を選抜することができる。
【００９９】
Rps11の根底にある候補遺伝子
育種計画のサポートにおいて大豆茎疫病（Phytophthora）抵抗性遺伝子型決定を行うための分子マーカーの開発を行うことにより、特に以下の利益がもたらされる：コストと時間の節約；望ましい子孫物の早期選抜；及び大豆茎疫病（Phytophthora）抵抗性の大豆変種のより正確で急速な商業化。商業用植物の育種家にとって、様々な群でスクリーニングすることができる高品質の遺伝子マーカーが利用できることでも十分である。しかしながら、大豆茎疫病（Phytophthora）抵抗性の表現型形質の根底にある重要な遺伝子（複数含む）、及びそのアレル多様性、及び作用機序を特定することによって、さらなる利益がもたらされる。表現型形質の根底にある、又はそれと関連する重要な遺伝子（複数含む）の特定を行うことにより、主要遺伝子又はQTLと関連した分子マーカーを使用したマーカー支援育種の限界を超えることができる。例えば、１つの群で特定されたQTL又は対象遺伝子に連鎖する分子マーカーは多型ではない可能性があり、又は異なる遺伝子起源からの育種素材では厳密には連鎖されていない可能性がある。本明細書において、記載される新規Rps11抵抗性表現型の根底となる可能性がある候補遺伝子が提示される。
【実施例】
【０１００】
以下の実施例は、解説のために提示されるものであり、限定されないが、添付の請求項に対して提示されている。本明細書に記載される実施例及び実施形態は、解説目的のためであり、当分野の当業者であれば、本発明の主旨から逸脱することなく、又は添付の請求項の範囲から逸脱することなく、様々な試薬又はパラメーターが改変され得ることを認識することを理解されたい。
【０１０１】
実施例1：植物素材、及び大豆茎疫病菌（Phytophthora sojae）の単離株
PRSRに寄与するとされている、総数で204の大豆系統を、USDA-ARS Soybean Collectionから選択し、最初の評価を行った。初回のスクリーニングを行った後、総数で72の系統を、株17及び株25の両方に対し抵抗性を有すると特定した。今まで報告されている単一Rps遺伝子の中では株17及び株25の両方に対する抵抗性は稀であり、そのため、これらの系統は、複数株抵抗性の見込みがあるとして選択された。追加の大豆茎疫病菌（P. sojae）単離株の植菌後、72の系統をさらに、広域スペクトラムPRSRを示す23の系統へと選抜した。さらなる解析を行った後、植物導入（PI：Plant Introduction）594527を、大豆茎疫病菌（P. sojae）に対するその強力で広域スペクトラムな抵抗性を理由として、抵抗性系統の見込みがあるとして特定した。
【０１０２】
マッピング群は、感受性品種の「Williams」と、本発明者らによって特定された抵抗性系統のPI 594527を交配させることにより誘導された、58のF2個体、及び209のF2:3ファミリーからなった。PI 594527は、Fujian, Chinaから寄贈され、USDA Soybean Germplasm Collectionにより維持されている大豆系統である。PI 594527は、USDAにより、株1、株3、株7、及び株25を含む多くの大豆茎疫病菌（P. sojae）単離株に対する強力な抵抗性に寄与しているとして報告されているが、その抵抗性の遺伝子源はまだ判明していなかった。F1植物を温室内で自家授粉させてF2群を生成した。少数のF2種子を、初回解析のために維持し、残りは野外で自家授粉させ、表現型と遺伝子型の両方の評価のためのF2:3マッピングファミリーを成長させた。
【０１０３】
大豆判別セットを、すべての植菌実験において標準対照として使用して、適切に感染した単離株を確保した(Lin et al. 2013)。これらの判別基準は、Union (Rps1-a)、Harosoy 13xx (Rps1-b)、Williams79 (Rps1-c)、PI 103091 (Rps1-d)、Williams82 (Rps1-k)、L76-1988 (Rps2)、L83-570 (Rps3-a)、PRx146-36 (Rps3-b)、PRx145-48 (Rps3-c)、L85-2352 (Rps4)、L85-3059 (Rps5)、Harosoy 62xx (Rps6)、Harosoy (Rps7)、PI 399073 (Rps8)、及び感受性品種のWilliams (rps)であった。
【０１０４】
異なる病原性を有する総数で8の大豆茎疫病菌（P. sojae）単離株を最初に使用して、大豆系統PI 594527の抵抗性を評価した。これらの単離株は、ISA19A-1、ISA71D-1、ISA33O-8、124C-1 (株1)、pmg(10)-1 (株10)、pmg (13)-1 (株13)、pmg (17)-1 (株17)、pmg (25)-1 (株25)、及び96-13S-106A (株28)であった。集団の分離解析及び遺伝子マッピングのために、大豆茎疫病菌（P. sojae）の単離株124C-1(株1)を使用して、F2個体とF2:3ファミリーの表現型データを取得した。単離株は、リママメアガー（LBA：lima bean agar）培地（150g/L リママメ、2%アガー）上で維持された。
【０１０５】
PI 594527は、株1、株10、株13、株17、株25、株28、及びその表現型が任意の公知の株指定に合致していない他の3つの単離株を含む、大豆茎疫病菌（P. sojae）に対する、強力で広範なスペクトラムの抵抗性を有していたため、抵抗性の見込みがあると特定された（表１）。
【０１０６】
【表１】
2018516088.tif 000003
【０１０７】
実施例2：疾患の植菌及び評価
すべての実験の疾患植菌に対し、改変胚軸植菌法を行った(Dorrance et al. 2008)。簡潔に述べると、種子を植えて、平均気温25℃の温室内で成長させた。種の植え付けから7日目、1/2LBA上で増殖させた14日齢の培養物から菌糸形成スラリーを得て、それを実生の胚軸に注入した（子葉の約1cm下）。植菌後、実生をプラスチックの蓋で12時間超覆い、感染の間、高い相対湿度を確保した（直射日光外）。蓋を外し、5〜7日間、疾患を発病させ（最大で10日）、その後に評価を行った。
【０１０８】
実生が病変部位を拡大させることなく生存している場合には抵抗性、又は実生の胚軸が茶色くなり枯れたら感受性として、反応を記録した。各F2:3ファミリーに対しては、12〜36個の子孫物をスコアリングした。実生が12個よりも少ないファミリーはすべて、データ解析から外した。ファミリーを、80％超の子孫物が生存していた場合にはホモ接合性抵抗体（R）、実生の20％未満が生存していた場合にはホモ接合性感受性体（S)、又は21〜79％が枯れた場合は分離体（Rs）として分類した (Gordon et al. 2006; Zhang et al. 2013)。
【０１０９】
個々のF2子孫物を、PI 594527と感受性品種の「Williams」の交配から生成し、それを、大部分のRps遺伝子に対し無発病性の単離株1を使用して検証した。58個のF2子孫物の中で、45個が抵抗性で、13個が感受性であった。分離比は45:13であり、メンデル比の3:1によく適合していた（χ2=0.21、p=0.65）（表2）。より正確な表現型の結果と、F2子孫物のヘテロ接合性抵抗体の情報を得るために、次に、F2群の残りをF2:3世代へと進め、その後に各F2植物から得た約12〜36個のF3実生をスコアリングした。F2:3マッピング群において分離比をさらに調査した。R（ホモ接合性抵抗体）の観察比：Rs (分離体)：S（ホモ接合性感受性体）は、59：102：48であり、これも予想比の1：2：1によく適合していた (χ2=1.28、p=0.53)。これらすべての結果から、PI 594527における、株1への抵抗性は、本発明者らがRps11と指定した単一の新規抵抗性優性遺伝子により制御されていることが示唆された。
【０１１０】
実施例3：サンプル収集及びDNAの単離
若い葉の組織を温室内で集め、氷上に置き、その後使用するまで液体窒素中に保持、又は−80℃の冷凍庫のいずれかで保存した。F2：3ファミリーに関しては、同量の葉組織の混合物を、およそ12〜20個のF3実生から採取した。それら混合物はある程度、各F2の先祖植物を現わしていた。ゲノムDNAは、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）法を、若干の改変を加えて使用して抽出した（Allen et al. 2006）。DNAの濃度は、NanoDrop ND-1000分光光度計(Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, DE)を使用して決定された。最終DNA濃度は、50ng/ulに調整された。
【０１１１】
実施例4：SNP遺伝子型決定と組み合わされた集団分離解析
Rps表現型と関連する座位の位置を素早く特定するために、集団分離解析（BSA）をF2分離群に適用した（Michelmore et al. 1991）。抵抗性及び感受性の集団は、植菌結果に基づき、10個の抵抗性F2個体、又は10個の感受性F2個体のいずれかのDNAサンプルを等量プールすることにより形成させた。抵抗性親系統及び感受性親系統も、SNP遺伝子型決定に含めた。SNP遺伝子型決定は、Michigan State Universityで、Illumina iScanプラットフォームを介したSoySNP8K BeadChip (Illumina, Inc. San Diego, CA)を使用して行われた。詳細なInfiniumIIアッセイのプロトコールは、Song (Song et al. 2013)により記載されている。SNPアレルは、GenomeStudio Genotyping Module v1.8.4 (Illumina, Inc. San Diego, CA)を使用して判定された。
【０１１２】
実施例5：SSPマーカー及びPCR解析
SSRのプライマーは、Song (Song et al. 2010)から取得され、その後、Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA)により合成された。２つの親系統の間の多型SSRマーカーを実験に使用した。PCR増幅は、Ping et al. 2014に従い、若干の改変を加えて行った。簡潔に述べると、各PCR反応物は、鋳型DNAを100ng、10xPCR緩衝液(2.5mM Mg2+)、0.2mM dNTP、0.2μMのフォワードプライマーとリバースプライマー、ならびに1.0UのTaqDNAポリメラーゼを、総量20μlで含有した。反応は、MyCyclerサーモサイクラー(Bio-Rad Lab, Hercules, CA)上で行われ、最初の変性を95℃で3分、その後、95℃で30秒、55〜60℃で30秒、及び72℃で30秒を35サイクル行い、最終伸長を72℃で10分間行った。PCR産物を6xローディング緩衝液と混合し、4％アガロースゲル(DOT Scientific Inc., Burton, MI)で分離させ、エチジウムブロマイドで染色し、その後、Molecular Imager Gel Doc XRシステム(Bio-Rad Lab, Hercules, CA)で可視化した。次いでSSRのバンドを、ゲル画像から手動でスコアリングした。
【０１１３】
実施例6：データ解析及び連鎖地図の構築
カイ二乗（χ2）解析を行い、有意閾値をP=0.05とし、SPSS 22.0ソフトウェア(SPSS, Chicago, USA)を使用して、予想メンデル比への適合度に対し、表現型データと遺伝子型データを検証した。予想メンデル比からの有意な分離ひずみを示したマーカーは、地図構築から除外した。遺伝的連鎖地図は、Joinmap 4.1ソフトウェア(Van Ooijen 2011)を使用して構築された。連鎖群は、3.0のロッド（LOD）閾値を使用して決定された。
【０１１４】
20個の染色体中に無作為に分布したSNPが、総数で2588個、2つの親系統間で特定された。単一遺伝子遺伝仮説に基づき、感受性F2集団で検出された遺伝子及びその隣接領域のSNPは、感受性の「Williams」から遺伝した感受性アレルに対しホモ接合性であると予想される。一方で、両アレルは親から受け継いでいるため、他の領域はヘテロ接合性のはずである。しかしながら、ホモ接合性抵抗性体と、ヘテロ接合性抵抗性体のF2子孫が両方ともDNAプールに存在しているため、抵抗性F2集団のSNPは常にヘテロ接合性であるものとする。従って、この２つの集団は、他のすべての領域ではヘテロ接合性であるが、標的領域においては遺伝的に非類似であった。この方法を使用して、7番染色体（MLG M）上の3Mbから始まり8Mbまでの約5Mbの総ゲノム領域を、原因座位の位置である可能性があると特定した（図1）。この領域で特定されたSNPを表2に示す。
【０１１５】
新規Rps11座位をさらにマッピングするために、連鎖解析と遺伝子マッピングを、交配から得られた209個のF2：3ファミリーを用いて行った。BSAの結果に基づき、14個の無作為に分布したSSRプライマーを、暫定マッピング領域から選択した（Song et al. 2010）。4つの多型SSRマーカーのBARCSOYSSR_07_0223、BARCSOYSSR_07_0266、BARCSOYSSR_07_0278、及びBARCSOYSSR_07_0459が、マッピング群の2つの親の間で特定された。次いで、これら4つのマーカーを使用して、F2：3ファミリーのうちの50個の遺伝子型決定を行った。それぞれ、9個、2個、0個、及び14個の組み換え体が特定されたことから、Rps11座位は、BARCSOYSSR_07_0223とBARCSOYSSR_07_0459の間であり、BARCSOYSSR_07_0266とBARCSOYSSR_07_0278により連鎖していたことが示唆された。予備解析も、SNP-Chip解析からのマッピング結果をさらに確認した。
【０１１６】
次いで、SSR_07_0223とSSR_07_0459の間に位置する9個の多型SSRマーカーが、全群の遺伝子型決定に選択された。209個のF2：3ファミリーからの遺伝子型データのカイ二乗解析から、9個すべての多型マーカーが、予想1：2：1の分離比に適合したことが明らかとなった（表3）。そして、9個のSSRマーカーとRps11からなる遺伝地図が、Joinmap 4.1ソフトウェア(Van Ooijen 2011)を使用して作製された。この方法で、Rpsの座位は、SSRマーカーのBARCSOYSSR_07_0286とBARCSOYSSR_07_0300に隣接し、Glyma1.1基準ゲノムによると、0.5cMの領域で226kbの範囲にマッピングされた（図2）。SSRマーカーのBARCSOYSSR_07_0295は、この座位と共分離することが判明した。
【０１１７】
【表２】
2018516088.tif 000004
2018516088.tif 000005
【０１１８】
【表３】
2018516088.tif 000006
【０１１９】
実施例7：Rps11 QTL領域の良好なマッピング、及び候補遺伝子予測
良好なマッピング群は、WilliamsとPI594527の間の最初の交配から誘導された2640個のF3個体からなる。葉のサンプルは、標準的なセチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）法を使用したDNA単離を目的として、野外で各個体から採取された。P. sojae株1を、組み換え体の抵抗性評価に使用した。すべての植菌作業は、Lin et al. (2013)に記載されるような標準的な胚軸植菌法を使用して行われた。F3：4ファミリーは、子孫物の80％超が生存した場合にはホモ接合性抵抗性とみなされ、21％〜79％が生存した場合にはヘテロ接合性抵抗性とみなされ、20％未満が生存した場合には感受性とみなされた。
【０１２０】
SSRマーカーのBARCSOYSSR_07_0286及びBARCSOYSSR_07_0300は、7番染色体上のRps11 QTLに隣接しており、Glyma1.1基準ゲノムに基づくと225kbの物理的距離で離れている（Ping et al., 2015）。これら隣接するマーカーを使用して、F3全群を精査して、組み換え体を特定した。その結果、10個の新たな組み換え体が特定された。SSRマーカーに加えて、KASP（商標）マーカー及び挿入／欠失（InDel）マーカーも開発し、組み換え体の遺伝子決定を行った。Rps11 はSSRマーカーのBARCSOYSSR_07_0295、及びInDelマーカーのInDel_1により規定される61kb領域にマッピングされた（図３；表４）。この61kb領域の中には、Glyma2.0基準ゲノムによると5個の新たな遺伝子モデルが予測された（表５）。遺伝子アノテーションに基づくと、Glyma.07G062900が、NB-ARCドメイン含有疾患抵抗性タンパク質をコードし得る唯一の遺伝子であった。
【０１２１】
【表４】
2018516088.tif 000007
2018516088.tif 000008
【０１２２】
【表５】
2018516088.tif 000009
【０１２３】
マーカーのフレームワーク、及びマーカー支援選抜への使用
普遍的なマーカーのセットを使用して、染色体区間中のマーカーを特定するためのフレームワークを確立することができる。表４は、作成された7番染色体の遺伝子連鎖地図上で互い一致した位置関係にあるマーカーを示す。SSRマーカーの物理的位置は、SoyBaseウェブサイト上で公的に利用可能な大豆基準ゲノムのGlyma1.1又はGlyma2.0に対する、それらプライマー配列を探索するBLASTにより決定される。
【０１２４】
その座位の好ましいアレルと連鎖不均衡にあるアレルを有する、対象の座位に隣接する、近接に連鎖したマーカーを効果的に使用して、PRSR抵抗性が増強した子孫植物を選択してもよい。従って、例えば表6に列記されるものなどの本明細書に記載されるマーカー、ならびに同じ染色体セグメントに遺伝的又は物理的にマッピングされている他のマーカーを使用して、PRSR抵抗性が増強した大豆植物を選択してもよい。典型的には、これらマーカーセットは、対象座位に隣接する領域において使用される（例えば、2以上、3以上、4以上、5以上）。任意で、実在の遺伝子及び／又は座位の内にあるマーカーを使用してもよい。
【０１２５】
【表６】
2018516088.tif 000010
【０１２６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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