(57)【要約】  本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに結合することができる新規抗体、具体的には、モノクローナル抗体、同様に当該抗体をコードするアミノ酸および核酸配列に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）配列番号１の配列のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２の配列のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号３の配列のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖、並びに
ｉｉ）配列番号４の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５の配列のＣＤＲ−Ｌ２および配列番号６の配列のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖
を含んでなる、ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
配列番号７の配列もしくは配列番号７の配列と少なくとも９０％の相同性を有する任意の配列の重鎖可変領域、および／または配列番号８の配列もしくは配列番号８の配列と少なくとも９０％の相同性を有する任意の配列の軽鎖可変領域を含んでなる、請求項１に記載のＩＧＦ−１Ｒ抗体。
【請求項３】
番号Ｉ−４８９３で、２０１４年９月１７日にＣＮＣＭ、パスツール研究所、パリに提出されたハイブリドーマによって分泌された、ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
ＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞の検出用またはＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞の発現レベルの判定用の薬剤として使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
ＩＧＦ−１Ｒの発現に関連した発癌性疾患のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ診断または予測に使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。  
【請求項６】
発癌性疾患を有する患者が、ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする阻害剤での治療から利益を受ける見込みがあるか否かの判定に使用するための、好ましくはＩＧＦ−１Ｒ抗体は単独、組み合わさったものであるかまたはコンジュゲートされたものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＩＧＦ−１Ｒ抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
被験体におけるＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞の存在および／または位置をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで検出する方法であって、
（ａ）該被験体からの生物学的試料を、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程、および
（ｂ）該ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントの、該生物学的試料への結合を検出する工程
を含んでなる方法。
【請求項８】
被験体においてＩＧＦ−１Ｒを発現している腫瘍細胞の割合をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで検出する方法であって、
（ａ）該被験体からの生物学的試料を、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程、および
（ｂ）該生物学的試料中のＩＧＦ−１Ｒを発現する細胞の割合を定量化する工程
を含んでなる方法。
【請求項９】
被験体中の腫瘍細胞におけるＩＧＦ−１Ｒの発現レベルをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで判定する方法であって、
（ａ）該被験体からの生物学的試料を、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程、および
（ｂ）該ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントの、該生物学的試料中のＩＧＦ−１Ｒへの結合レベルを定量化する工程
を含んでなる方法。
【請求項１０】
被験体中の腫瘍細胞または腫瘍のＩＧＦ−１Ｒスコア化をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで判定する方法であって、
（ａ）該被験体からの生物学的試料を、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程、
（ｂ）該生物学的試料中で、該ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントのＩＧＦ−１Ｒへの結合レベルを、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）によって定量化する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）で得た定量化されたレベルを、陽性細胞の染色の強度および割合の２つのパラメーターに基づく適切な基準と比較することにより腫瘍細胞または腫瘍をスコア化する工程
を含んでなる方法。
【請求項１１】
癌性疾患が、ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする抗体薬物での治療に感受性があるか否か判定する方法であって、
（ａ）請求項１０に記載の方法により、被験体中の腫瘍細胞または腫瘍のＩＧＦ−１Ｒ状態をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで判定する工程、および
（ｂ）腫瘍細胞または腫瘍のＩＧＦ−１Ｒ状態が、ＩＧＦ−１Ｒ（＋）である場合、発癌性疾患は、ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする抗体薬物での治療に感受性があると判定する工程
を含んでなる方法。
【請求項１２】
ＩＧＦ−１Ｒに関連した発癌性疾患を、該疾患に罹患している被験体において緩和するために設計された治療計画の有効性をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで判定する方法であって、
（ａ）第一生物学的試料において、請求項９の記載により第一ＩＧＦ−１Ｒ発現レベルを判定する工程であって、該第一生物学的試料が該治療の第一時点に対応するものである工程、
（ｂ）第二生物学的試料において、請求項９の記載により第二ＩＧＦ−１Ｒ発現レベルを判定する工程であって、該第二生物学的試料が該治療の第二の後の時点に対応するものである工程、
（ｃ）工程（ａ）で得られた該第一発現レベルの、工程（ｂ）で得られた該第二発現レベルに対する比を計算する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）の比が１を超える場合に、該治療計画の有効性が高いと判定する工程、または工程（ｃ）の比が１以下の場合に、該治療計画の有効性が低いと判定する工程
を含んでなる方法。
【請求項１３】
治療量のＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする抗体薬物の投与から利益があるか否かが予想される癌患者を選択する方法であって、
（ａ）請求項９に記載の方法により、ＩＧＦ−１Ｒ発現レベルを判定する工程、
（ｂ）前の工程（ａ）での発現レベルを、参照発現レベルと比較する工程、および
（ｃ）（ａ）で得られた発現レベルの参照発現レベルに対する比が１より大きい場合、ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする抗体薬物での治療から利益があると予測される患者を選択する工程、または
（ｄ）（ａ）で得られた発現レベルの参照発現レベルに対する比が１以下である場合、ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする抗体薬物での治療から利益があると予測されない患者を選択する工程
を含んでなる方法。
【請求項１４】
患者中のＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞を検出するためのキットであって、請求項１〜３のいずれか一項に記載の少なくともＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなる、キット。
【請求項１５】
発癌性疾患を有する患者が、ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする抗体薬剤での治療から利益を受ける見込みがあるか否か判定するためのキットであって、請求項１〜３のいずれか一項に記載の少なくともＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなる、キット。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに結合することができる新規抗体、具体的には、モノクローナル抗体、同様に当該抗体をコードするアミノ酸および核酸配列に関する。
【０００２】
ＩＧＦ−１Ｒ（または時にはＩＧＦ１Ｒ）と呼ばれるインスリン様成長因子Ｉ受容体は、チロシンキナーゼ活性を有し、インスリン受容体１Ｒと７０％の相同性を有する受容体である。ＩＧＦ−１Ｒは、分子量が約３５０，０００の糖タンパク質である。これは、ヘテロ四量体の受容体であり、その半分はそれぞれジスルフィド架橋によって連結しており、細胞外α−サブユニットおよび膜貫通β−サブユニットからなる。ＩＧＦ−１Ｒは、極めて高い親和性（Ｋｄ＃１ｎＭ）でＩＧＦ１およびＩＧＦ２と結合するが、同様にインスリンとも１００分の１〜１０００分の１の親和性で結合し得る。逆に、ＩＧＦは１００分の１の親和性でしかインスリン受容体と結合しないが、１Ｒは極めて高い親和性でインスリンと結合する。α−サブユニット上に存在するシステインに富む領域とβ−サブユニットのＣ末端部分にそれぞれ相同性の低い区域があるが、ＩＧＦ−１Ｒのチロシンキナーゼドメインと１Ｒのチロシンキナーゼドメインとは極めて高い配列相同性を有している。α−サブユニットに見られる配列の差異はリガンドの結合区域に存在するため、それはＩＧＦとインスリンのそれぞれに対するＩＧＦ−１Ｒと１Ｒの相対的親和性の基となっている。β−サブユニットのＣ末端部分における差異は、２つの受容体のシグナル伝達経路における相違をもたらし、ＩＧＦ−１Ｒは細胞分裂促進特性、分化作用および抗アポトーシス作用を媒介し、一方、１Ｒの活性化は主として代謝経路のレベルでの作用に関与する。
【０００３】
発癌におけるＩＧＦ系の役割は、ここ２０年で集中的な研究の対象となってきている。この関心は、ＩＧＦ−１Ｒが、その細胞分裂促進性および抗アポトーシス性に加えて、形質転換された発現型の確立と維持に必要であると思われるという事実の知見に従ったものである。実際に、ＩＧＦ−１Ｒの過剰発現または構成的活性化が、多様な細胞において、ウシ胎仔血清を含まない培地で補助に依存することなく細胞を成長させ、ヌードマウスにおいて腫瘍を形成さ細胞ということが十分に確認されている。成長因子の多数の受容体を含む、過剰発現した遺伝子の多様な産物が細胞を形質転換し得ることから、このこと自体は固有の特性ではない。しかしながら、ＩＧＦ−１Ｒが形質転換において果たす主要な役割を明らかに立証した重要な知見は、ＩＧＦ−１Ｒをコードする遺伝子が不活性化されたＩＧＲ−１Ｒ−細胞が、ウシパピローマウイルスのＥ５タンパク質などの、通常は細胞を形質転換することができる様々な物質、ＥＧＦＲまたはＰＤＧＦＲの過剰発現、ＳＶ４０のＴ抗原、活性化したＲａｓ、またはこれら最後の２つの因子の組合せなどによる形質転換に全く不応であるということを立証している。
【０００４】
このような文脈において、ＩＧＦ−１Ｒは、腫瘍学の興味深い対象と長い間考えられてきた。癌の治療用にＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストを開発するために、ＩＧＦ−１Ｒ（ヒト化された抗体もしくはヒト抗体、または小さな分子）を標的とする多くのプロジェクトが開始され、７０件を超える臨床試験が様々な適応で行なわれてきた。しかしながら、今日においても、これらのプロジェクトのどれも成功しておらず、市場に出ているＩＧＦ−１Ｒ抗体はない。
【０００５】
本発明は、特にＩＧＦ−１Ｒの発現を特徴とするか、または異常なＩＧＦ−１Ｒ発現によって媒介される発癌性疾患を検出および／またはモニタリングするための診断的または予後的バイオマーカーに使用することができる少なくとも１つの試薬を提供することを目標とする。
【０００６】
適切な診断的または予後的ツールとして使用することができる価値のある抗体を開発する従前の試みの報告もあるが、これらのどれも満足のいくものではない。
【０００７】
以下の例から明白となるように、本発明者らは、驚くべきことにＩＧＦ−１Ｒを発現している腫瘍のスコア化のための、今日において一般的に使用されている市販の抗体が、偽陽性および／または偽陰性を示すので、関連していないようであることを実証した。この問題は、部分的にＩＧＦ−１Ｒ抗体での臨床試験の失敗につながり、その理由はＩＧＦ−１Ｒ抗体の実際の活性ではなく患者の選択による。
【０００８】
さらに、市販の抗体を使用して行なわれた最初の研究では、標的とされたＡＤＣ療法のＩＧＦ−１Ｒスコア化および抗腫瘍活性の間の不一致が示された。
【０００９】
本発明は、既存のものに反して染色できる、ＩＧＦ−１Ｒ標的療法の薬理学と相関関係を有する、新規抗体を提供することにより、この問題を改善することを意図する。
【００１０】
最初の側面では、本発明の主題は、高い親和性で、ＩＧＦ−１Ｒ、好ましくはヒトＩＧＦ−１Ｒに結合する単離した抗体またはその抗原結合フラグメントであって、従って、ＩＧＦ−１Ｒ発現によって媒介された病理学的過剰増殖性の発癌性疾患を診断する方法に有用となり得る。
【００１１】
本発明の実施態様は、配列番号１、２、３、４、５および６の配列の６つのＣＤＲを含んでなる抗体またはその抗原結合フラグメントに関係する。
【００１２】
特定の実施態様において、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、それは以下を含んでなることを特徴とする：
ｉ）配列番号１の配列のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２の配列のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号３の配列のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖；並びに
ｉｉ）配列番号４の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５の配列のＣＤＲ−Ｌ２および配列番号６の配列のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖。
【００１３】
用語「抗体」（antibody）、「抗体（複数）」（antibodies）、「ａｂ」または「免疫グロブリン」は、最も広い意味で互換的に使用され、モノクローナル抗体、単離された抗体、改変された抗体、化学的に合成された抗体、または組換え抗体（例えば、完全または無傷のモノクローナル抗体）、多クローン性抗体、多価抗体または多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、およびさらに抗体フラグメントを含むが、それらが所望の生物的活性を示すことが条件である。一つの実施態様において、本発明は組換え抗体に関する。
【００１４】
本明細書中で使用されるように、「ＩＧＦ−１Ｒ抗体」という表現は、「抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体」と同様と解釈するべきであり、ＩＧＦ−１Ｒに結合することができる抗体を意味する。
【００１５】
抗体の「ＩＧＦ−１Ｒ結合性フラグメント」または「抗原結合フラグメント」とは、抗体のＩＧＦ−１Ｒ標的物（一般に抗原とも言及される）へ結合する能力を保持する任意のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を示すことを意図している。一つの実施態様において、そのような「抗原結合フラグメント」は、Ｆｖ  ｓｃＦｖ（ｓｃとは単一鎖である）、Ｆａｂ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃのフラグメントまたはダイアボディーまたはポリ（エチレン）グリコール（「ペグ化」）（Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧまたはＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれるペグ化フラグメント）（「ＰＥＧ」とはポリ（エチレン）グリコール）等のポリ（アルキレン）グリコールの添加またはリポソーム内への組み入れ等の化学的改良によって増加するであろう半減期をもつ任意のフラグメントからなる群から選択され、当該フラグメントは、本発明による少なくとも１つの抗体の特徴的ＣＤＲを有する。好ましくは、当該「抗原結合フラグメント」は、それらの由来である可変性重鎖または可変性軽鎖の部分的配列からなるか、またはそれらを含んでなり得、当該部分的配列は、標的に対して、それらの由来である抗原と同一の結合特異性およびそれらの由来である抗原の親和性の、好ましくは少なくとも１／１００に等しく、より好ましい様式では少なくとも１／１０の十分な親和性を保持するのに十分である。
【００１６】
好ましくは、前記「ＩＧＦ−１Ｒ結合性フラグメント」または「抗原結合フラグメント」は、少なくとも以下を含んでなる：
ｉ）配列番号１の配列のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２の配列のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号３の配列のＣＤＲ−Ｈ３；および
ｉｉ）配列番号４の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５の配列のＣＤＲ−Ｌ２および配列番号６の配列のＣＤＲ−Ｌ３。
【００１７】
「結合する」（binding）、「結合する」（binds）などというのは、抗体またはその任意の抗原結合フラグメントが、生理的状態下で比較的安定している抗原と複合体を形成することを意図する。特異的結合は、少なくとも１ｘ１０−６Ｍ以下の平衡解離定数によって特徴づけることができる。２つの分子が結合するかどうか判定する方法は、当技術において公知であり、例えば、平衡透析法、表面プラズモン共鳴などが含まれる。疑義を生じさせないことを目的として、当該抗体は別の抗原に、低い水準で、結合または介入することができないという意味ではない。しかしながら、実施態様としては、当該抗体は、当該抗原にのみ結合するものとする。
【００１８】
ＣＤＲ領域またはＣＤＲ（複数）とは、ＩＭＧＴによって定義されるような免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を示すことを意図している。
【００１９】
ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、抗原受容体であれ、鎖型であれ、または種（species）であれ、可変ドメインを比較するために定義されている［Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)］。ＩＭＧＴ独自ナンバリングでは、保存されているアミノ酸は、常に同じ位置を持ち、例えば、システイン２３（１ｓｔ−ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ−ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ−ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）などである。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、フレームワーク領域の標準的な画定（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：１〜２６番、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５番、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４番およびＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８番）および相補性決定領域の標準的な画定：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８番、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５番およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７番を提供する。ギャップは占有されていない位置を表すので、ＣＤＲ−ＩＭＧＴ長（括弧内に示され、ドットで仕切られる、例えば［８．８．１３］）は重要な情報となる。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、IMGT Colliers de Perles［Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)］と呼ばれる２Ｄグラフ表示、およびIMGT/3Dstructure-DB［Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)］における３Ｄ構造において使用される。
【００２０】
本明細書に相反する記載がなければ、相補性決定領域またはＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って定義される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を意味すると理解しなければならない。
【００２１】
ＣＤＲもやはりＫａｂａｔナンバリングシステム（Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 第５版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991,および後続版）に従って定義することができる。３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲが存在する。本明細書では、用語「ＣＤＲ（単数）」または「ＣＤＲ（複数）」は、場合に応じて、抗体が認識する抗原またはエピトープに対するその抗体の親和性を担うアミノ酸残基の大多数を含むこれらの領域の１以上もしくはさらには全体を示すために使用される。本出願の通読を簡単にするために、ＫａｂａｔによるＣＤＲは定義しない。しかしながら、ＩＭＧＴによるＣＤＲの定義を用いてＫａｂａｔによるＣＤＲを定義することは当業者には自明であろう。
【００２２】
特定の実施態様において、本発明によるＩＧＦ−１Ｒ抗体は、配列番号７の配列の重鎖可変領域または配列番号７の配列と少なくとも９０％の相同性を有する任意の配列を含んでなることを特徴とする。
【００２３】
特定の実施態様において、本発明によるＩＧＦ−１Ｒ抗体は、配列番号８の配列または配列番号８の配列と少なくとも９０％の相同性を有する任意の配列の軽鎖可変領域を含んでなることを特徴とする。
【００２４】
さらに別の実施態様によると、８１０Ｄ１２と称する抗体は、アミノ酸配列、配列番号７または、配列番号７の配列と最適なアライメント後に、少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の相同性を有する配列を含んでなる重鎖可変領域配列を含んでなること；および／またはアミノ酸配列、配列番号８または、配列番号８の配列と最適なアライメント後に、少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の相同性を有する配列を含んでなる軽鎖可変領域配列を含んでなることを特徴とする。
【００２５】
本発明における意味では、核酸またはアミノ酸の２配列間の「相同性パーセンテージ」とは、最適なアラインメント後に得られる、比較する２配列間の同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは、純粋に統計学的なものであり、２配列間の差異は、それらの長さに沿ってランダムに分配している。２つの核酸またはアミノ酸の配列間の比較は、それらを最適にアラインした後に配列を比較することにより慣例的に行われ、その比較は、セグメントまたは「アラインメント・ウィンドウ」の使用によって行なうことができる。比較のための配列の最適なアラインメントは、手による比較の他、Smith and Waterman (1981)［Ad. App. Math. 2:482］のローカルホモロジーアルゴリズムによるか、Neddleman and Wunsch (1970)[J. Mol. Biol. 48:443]のローカルホモロジーアルゴリズムによるか、Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]の類似性検索法によるか、またはこれらのアルゴリズムを用いるコンピューターソフトウエア（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、または比較ソフトウエアＢＬＡＳＴ  ＮＲもしくはＢＬＡＳＴ  Ｐによる）によって行うことができる。参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の相同性を示すアミノ酸配列に関して、好ましい例としては、参照配列、特定の改変、特に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加もしくは置換、末端切断または延長を含有するものが含まれる。１以上の連続または非連続アミノ酸の置換の場合、置換アミノ酸が「等価な」アミノ酸により置換される置換が好ましい。ここで、「等価なアミノ酸」という表現は、構造アミノ酸の１つに関しておそらく置換されるが、対応する抗体の、また、以下に定義される具体例の、生物活性を変更しない任意のアミノ酸も示すことを意味する。
【００２６】
等価なアミノ酸は、それらが置換されるアミノ酸との構造的相同性か、または生成される可能性のある種々の抗原結合性タンパク質間の生物活性の比較試験の結果のいずれかに基づいて決定し得る。
【００２７】
限定されない例として、下記表１は、対応する改変抗原結合性タンパク質の生物活性に有意な改変をもたらさずに行えると思われる潜在的置換をまとめたものであり、同じ条件下で逆の置換も当然可能である。
【００２８】
【表１】
2018516876.tif 000002
【００２９】
本発明の特定の側面は、抗体またはその任意の抗原結合フラグメントが、インスリン受容体（１Ｒ）に結合しないということである。
【００３０】
別の実施態様において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体からなる。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」または「Ｍａｂ」は、実質的に均質の抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、その集団の個々の抗体は、わずかな量で存在し得る潜在的な自然突然変異以外は同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一のエピトープに向けられている。このようなモノクローナル抗体は、Ｂ細胞の単一のクローンまたはハイブリドーマにより生産され得る。モノクローナル抗体はまた、組換え型であってもよく、すなわち、タンパク質工学よっても生産され得る。モノクローナル抗体はまた、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。加えて、一般に種々の決定基またはエピトープに対する種々の抗体を含むポリクローナル抗体の作製とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一のエピトープに対するものである。本発明は、天然資源から単離したかもしくは得られたか、または遺伝子組換えもしくは化学合成によって得られた抗体に関する。
【００３２】
別の実施態様において、本発明の抗体は組換え抗体からなる。用語「組換え抗体」とは、生細胞内の組換えＤＮＡの発現に起因する抗体を指す。本発明の組換え抗体は、生物学的有機体内で見つからないであろうＤＮＡ配列を作成する、当業者に周知の、遺伝子組換えの実験室手法を使用することにより得られる。
【００３３】
別の実施態様において、本発明の抗体は化学的に合成された抗体からなる。
【００３４】
「ＩＧＦ−１Ｒ抗体」には、（反対の記載が無い限り）マウス形態だけでなく、キメラ形態またはヒト化形態の前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体が含まれる。
【００３５】
より明確にするために、下記表２は、ＩＭＧＴに従い定義された抗体８１０Ｄ１２の配列を説明する。
【００３６】
【表２】
2018516876.tif 000003
【００３７】
一つの実施態様において、本明細書でのモノクローナル抗体には、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体が含まれる。抗体は、微生物培養物の仏国コレクション（ＣＮＣＭ、パスツール研究所、パリ、フランス）に提出されたマウス起源のハイブリドーマに由来し、当該ハイブリドーマは、Ｂａｌｂ／Ｃ免疫マウス脾細胞／リンパ球と骨髄腫Ｓｐ  ２／Ｏ−Ａｇ  １４細胞株の細胞の融合により得られたものである。
【００３８】
別の側面によれば、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体を分泌することができるマウスのハイブリドーマ、特に番号Ｉ−４８９３で、２０１４年９月１７日にＣＮＣＭ、パスツール研究所、パリ、フランスに寄託されたマウス起原のハイブリドーマに関する。
【００３９】
前記ハイブリドーマＩ−４８９３によって分泌された、本明細書では８１０Ｄ１２と称されるモノクローナル抗体またはその任意の抗原結合フラグメントが明らかに本発明の部分を形成する。
【００４０】
本発明は、番号Ｉ−４８９３で、２０１４年９月１７日にＣＮＣＭ、パスツール研究所、パリ、フランスに提出されたハイブリドーマによって分泌されたことを特徴とする、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００４１】
また、本発明は、番号Ｉ−４８９３で、２０１４年９月１７日にＣＮＣＭ、パスツール研究所、パリ、フランスに提出されたマウスのハイブリドーマを記載する。
【００４２】
本発明の新規の側面は、単離した核酸に関係し、それは次の核酸から選択されるという特徴をもつ：
ａ）本発明による抗体をコードする核酸；
ｂ）配列番号９または１０の配列から選択された配列、または配列番号９または１０の配列との最適なアラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の相同性を有する配列を含んでなる核酸；および
ｅ）ａ）またはｂ）に定義されたような核酸の相補的核酸。
【００４３】
下記表３は、本発明の抗体８１０Ｄ１２に関する種々のヌクレオチド配列をまとめたものである。
【００４４】
【表３】
2018516876.tif 000004
【００４５】
本明細書において互換的に使用される用語「核酸」、「核配列」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」は、非天然ヌクレオチドを含有するまたは含有しない核酸のフラグメントまたは領域を定義し、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたは当該ＤＮＡの転写産物のいずれかである、修飾されたまたは修飾されていないヌクレオチドの厳密な配列を意味する。
【００４６】
本明細書において、本発明が自然な染色体の環境（即ち、自然な状態）での核酸配列には関係しないことを含めるべきである。本発明の配列は単離および／または精製されており、すなわち、それらは例えば複製により直接的または間接的にサンプリングされたものであり、それらの環境は少なくとも部分的に改変されている。組換え遺伝学により、例えば宿主細胞の手段により得られた、または化学合成により得られた単離された核酸もまた本明細書において言及されるべきである。
【００４７】
また、本発明は、本発明に記載されているような核酸を含んでなるベクターに関する。
【００４８】
本発明は、そのようなヌクレオチド配列を含有しているクローンおよび／発現ベクターを特に標的とする。
【００４９】
本発明のベクターは好ましくは、所与の宿主細胞においてヌクレオチド配列の発現および／または分泌を可能とするエレメントを含有している。従って、ベクターは、プロモーター、翻訳開始および終結シグナル、同様に好適な転写調節領域を含有していなければならない。ベクターは、宿主細胞内で安定に維持可能でなければならず、場合により、翻訳されたタンパク質の分泌を指定する特異的シグナルを有してもよい。これらの種々のエレメントは、使用する宿主細胞に応じて当業者により選択および最適化される。この目的で、ヌクレオチド配列は、選択された宿主内でまたは自己複製するベクターに挿入できるか、または選択された宿主の組み込みベクターであり得る。
【００５０】
このようなベクターは当業者により一般に使用される方法によって作製され、得られたクローンは、リポフェクション、エレクトロポレーション、コンジュゲーション、熱ショックまたは化学法などの標準的方法により好適な宿主に導入することができる。
【００５１】
ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルス起源のベクターである。それらは本発明のヌクレオチド配列をクローニングまたは発現するように、宿主細胞を形質転換さ細胞ために使用される。  
【００５２】
また、本発明は、本発明に記載のベクターにより形質転換されたかそれを含んでなる宿主細胞を含んでなる。
【００５３】
宿主細胞は、例えば、細菌細胞などの原核生物系または真核生物系の中からだけでなく、酵母細胞または動物細胞、特に哺乳動物細胞の中から選択することができる。昆虫または植物細胞も使用可能である。
【００５４】
また、本発明は、本発明による形質転換した細胞を有する、ヒトを除く動物に関する。
【００５５】
本発明の別の側面は、本発明による抗体またはその機能性フラグメントの１つを製造するための方法に関し、当該方法は、以下の工程を含んでなることを特徴とする：
ａ）本発明による宿主細胞の培地中で、かつその本発明による宿主細胞に好適な培養条件での培養；および
ｂ）このようにして産生された前記抗体またはその機能性フラグメントの１つの、培養培地からまたは前記培養細胞からの回収。
【００５６】
本発明による形質転換細胞は、本発明による組換えポリペプチドの製造方法で使用される。組換え型の本発明によるポリペプチドの製造方法であって、本発明によるベクターおよび／またはベクターにより形質転換された細胞を用いることを特徴とする方法もまた、本明細書に含まれてなる。好ましくは、本発明によるベクターにより形質転換された細胞は、前記組換えポリペプチドの発現および当該組換えペプチドの回収を可能とする条件下で培養される。
【００５７】
既述のように、宿主細胞は、原核生物系または真核生物系の中から選択することができる。特に、このような原核生物系または真核生物系において分泌を促進する本発明のヌクレオチド配列を特定することができる。よって、このような配列を有する本発明によるベクターは、分泌される組換えタンパク質の製造に有利に使用できる。実際に、目的とするこれらの組換えタンパク質の精製は、それらが宿主細胞内部ではなく細胞培養の上清中に存在するという事実により容易となる。
【００５８】
バイオマーカーとしての本発明の抗体の使用も開示されている。方法は、ＩＧＦ−１Ｒの発現に関連した種々の過剰増殖性発癌性疾患、典型例として、制限することなく、前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、膠芽腫、結腸癌、胃癌、腎癌、膵癌、頭頚部癌またはＩＧＦ−１Ｒの発現に関連したその他の任意の癌を検出または診断するために使用してもよい。当業者であれば認識するように、特定の疾患に関連した抗体発現のレベルは、既に存在している病態の性質および／または重篤性によって変わるだろう。
【００５９】
本発明の抗体を、当業者において公知な任意の従来的方法（例えば、局所的、非経口、筋肉内等）で投与すると、試料中の異型細胞の検出する非常に有用な方法がもたらされ、同様に臨床医がＩＧＦ−１Ｒの発現に関連したかＩＧＦ−１Ｒの発現を媒介した過剰増殖性発癌性疾患の治療を受けている患者の治療計画（therapeutic regiment）をモニタリングすることが可能となる。
【００６０】
本発明による抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒの発現に関連した種々の病状の検出、診断、予後および病期診断を含む種々の医療用途または研究用途における使用が見出されるだろう。
【００６１】
本発明の一つの実施態様は、ＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞の検出用の薬剤として使用するための上記のようなＩＧＦ−１Ｒ抗体、またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００６２】
本発明の別の実施態様は、ＩＧＦ−１Ｒの発現に関連した発癌性疾患のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ診断または予測に使用するための上記のようなＩＧＦ−１Ｒ抗体、またはその抗原結合フラグメントである。
【００６３】
本明細書で使用する、疾患を「診断する」とは、ＩＧＦ−１Ｒの発現に関連したかＩＧＦ−１Ｒの発現を媒介した病理学的過剰増殖性発癌性疾患を同定または検出する工程、この疾患の進行をモニタリングする工程、ＩＧＦ−１Ｒの発現に関連した疾患の指標となる細胞または試料を同定または検出する工程を指す。
【００６４】
本明細書で使用する「予後（prognosis）」とは、疾患からの回復の見込みあるいは疾患の可能性のある進展または転帰の予測を意味する。例えば、被験体からの試料がＩＧＦ−１Ｒ抗体での染色に対して陰性の場合、その被験体の「予後」は、試料がＩＧＦ−１Ｒ染色に対して陽性の場合より良好である。試料について、以降により詳細に説明されるように、適切な基準でのＩＧＦ−１Ｒ発現レベルをスコア化してもよい。
【００６５】
ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、免疫抱合体または検出可能／定量化可能なシグナルを得るための標識抗体の形で存在することができる。好適な標識または他の適切な検出可能な生体分子もしくは化学薬物と共に使用された場合、ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ診断および予測用途に特に有用である。
【００６６】
免疫アッセイで使用する標識は、当業者に一般に知られており、酵素、放射性同位体ならびに、例えばコロイド金またはラテックスビーズのような有色粒子を含む蛍光性、発光性および発色性の物質が含まれる。好適な免疫アッセイには、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。標識をＩＧＦ−１Ｒ抗体へコンジュゲートさ細胞種々の標識および方法は、例えば下記に示されたようなものなど、当業者において公知である。
【００６７】
本明細書で使用する、用語「ＩＧＦ−１Ｒの発現に関連した発癌性疾患」とは、疾患に罹患している被験体における高いレベルのＩＧＦ−１Ｒ（異常）の存在が、疾患の病態生理学または疾患の悪化を助長している要因のいずれかに関与していると示されたかまたは関与が疑われる疾患およびその他の疾患を含むことを意図している。あるいは、そのような疾患は、例えば、疾患に罹患している被験体の影響を受けた細胞または組織における細胞表面上のＩＧＦ−１Ｒレベルの増加によって証拠づけられてもよい。ＩＧＦ−１Ｒレベルの増加は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体を使用して検出されてもよい。
【００６８】
特定の実施態様において、ＩＧＦ−１Ｒに関係する「増加した発現」とは、対照に対して、発現（ＲＮＡ発現またはタンパク質発現によって測定される）に統計的に顕著な増加を示すタンパク質または遺伝子の発現レベルを指す。
【００６９】
一つの実施態様は、発癌性疾患を有する患者が、ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする阻害剤での治療から利益を受ける見込みがあるか否かの判定に使用するための、上記のＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントであり、好ましくはＩＧＦ−１Ｒ抗体は単独、組み合わさったものであるかまたはコンジュゲートされたものである。
【００７０】
本明細書で使用されるように、「ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする阻害剤」という表現は、ＩＧＦ−１Ｒのチロシンキナーゼ活性を、ＩＧＦ−１ＲのリガンドまたはＩＧＦＲ自体への結合のいずれかによって、減少または阻害さ細胞ことができる任意の化合物を意味する。そのような阻害剤の例は、タンパク質、ペプチド、抗体または抗体−薬物複合体、あるいはＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＩＧＦ−１Ｒ遺伝子もしくはＩＧＦＲリガンド（複数可）の１つをコードする遺伝子の発現を阻害するｓｉＲＮＡとしての機能を果たす任意の化学化合物、あるいは当業者に公知のその他の任意の薬物または化合物である。
【００７１】
より詳細には、本明細書における意味では、ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする阻害剤は、ＩＧＦ−１Ｒに結合することができ、かつそのリガンドの結合を阻害する任意の化合物または分子も包含することを意図している。
【００７２】
さらにより具体的には、本明細書における意味では、ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする阻害剤は、ＩＧＦ−１Ｒに結合する任意のモノクローナル抗体を包含することを意図している。
【００７３】
別の好ましい実施態様において、ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする阻害剤は、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）からなり、ここで抗体部分がＩＧＦ−１Ｒを標的とし、薬物部分が、細胞毒性薬、細胞増殖抑止剤、毒素等の任意の薬物から選択することができる。例証された一つの実施態様において、薬物部分は、オーリスタチン、アナログまたは誘導体からなることができる。
【００７４】
また、被験体におけるＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞の存在および／または位置をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで検出する方法であって、以下の工程を含んでなる方法を記載することも本発明の目的である：
（ａ）前記被験体からの生物学的試料を、上記の本発明による、ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程；および
（ｂ）前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントの、前記生物学的試料への結合を検出する工程。
【００７５】
また、本発明は、被験体における、好ましくはその細胞の表面での、ＩＧＦ−１Ｒの発現を検出および／または定量化および／またはそのレベルを決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ方法であって、以下の工程を含んでなる方法にも関する：
（ａ）前記被験体からの生物学的試料を、上記の本発明による、ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程；および
（ｂ）当該ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその原結合性フラグメントの、前記生物学的試料との結合を検出および／または定量化、またはそのレベルを判定する工程。
【００７６】
ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合は、当業者に利用可能な種々のアッセイによって検出および／または定量化および／または判定されてもよい。アッセイを実行するための任意の好適な手段は本発明に含まれているものの、特に、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットおよび免疫組織化学（ＩＨＣ）を言及することができる。好ましい方法にはＩＨＣとＦＡＣＳが含まれている。
【００７７】
また、本発明は、被験体においてＩＧＦ−１Ｒを発現している腫瘍細胞の割合をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで検出する方法であって、以下の工程を含んでなる方法を記載する：
（ａ）前記被験体からの生物学的試料を、上記のＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程；および
（ｂ）生物学的試料中のＩＧＦ−１Ｒを発現する細胞の割合を定量化する工程。
【００７８】
別の実施態様は、被験体中の腫瘍細胞または腫瘍におけるＩＧＦ−１Ｒの発現レベルをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで判定する方法であって、以下の工程を含んでなる方法である：
（ａ）前記被験体からの生物学的試料を、上記のＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程；および
（ｂ）前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントの、前記生物学的試料中のＩＧＦ−１Ｒへの結合レベルを定量化する工程。
【００７９】
当業者には明らかであるように、ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＩＧＦ−１Ｒへの結合レベルは、当業者に公知の任意の手段によって定量化してもよい。好ましい方法には、ＥＬＩＳＡアッセイ等の免疫酵素的方法、免疫蛍光法、ＩＨＣ、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）またはＦＡＣＳの使用が含まれている。
【００８０】
発明の方法によれば、前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントの、ＩＧＦ−１Ｒへの結合レベルは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）によって定量化される。
【００８１】
「生物学的試料」とは、被験体から取り出し得る任意の試料であってよい。そのような試料は、本発明のバイオマーカーの発現レベルの判定を可能にしなければならない。従って試料の性質は、腫瘍の性質に依存するだろう。
【００８２】
癌が液状腫瘍である場合、好ましい生物学的試料には、血液試料、血漿試料またはリンパ試料のような試料が含まれる。
【００８３】
癌が固形腫瘍である場合、好ましい生物学的試料には、生検試料または外科的切除療法から取り出された試料のような試料が含まれる。
【００８４】
好ましくは、生物学的試料は、血清などの体液、全血細胞、組織試料またはヒト由来の生検である。試料は、例えば、ＩＧＦ−１Ｒの発現に関連した病理学的発癌性疾患の存在のために簡単に分析することができる生検組織を含み得る。
【００８５】
一度、試験された生物学的試料中でＩＧＦ−１Ｒ発現レベルの判定がなされれば、結果を、ＩＧＦ−１Ｒの発現に関係した発癌性疾患を有していない個体からの、試験された生物学的試料と類似の方法で得られた対照試料のものと比較することができる。ＩＧＦ−１Ｒのレベルが、試験された生物学的試料中で著しく上昇した場合、それが導き出された被験体が、当該疾患を有しているか当該疾患を発症する見込みが増加していると結論付けられるかもしれない。
【００８６】
本発明は、ＩＧＦ−１Ｒを発現している腫瘍のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ診断または予測の方法であって、（ｉ）本発明による、そして上記に記載された、被験体中の腫瘍細胞または腫瘍におけるＩＧＦ−１Ｒの発現レベルをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで判定する方法によりＩＧＦ−１Ｒの発現レベルを判定する工程および（ｉｉ）工程（ｉ）の発現レベルを、正常組織またはＩＧＦ−１Ｒを発現していない組織からの参照発現レベルと比較する工程を含んでなる方法に関係する。
【００８７】
標的とされた抗腫瘍療法の開発に関して、免疫組織学的な技術での診断は、受容体発現レベルについてのｉｎ  ｓｉｔｕ情報をもたらし、従って、そのような治療に必要な受容体の発現レベルに従い治療に感受性である患者を選択することが可能となる。
【００８８】
病期判定は、潜在的な予後値を持ち、最適な療法を設計するための基準を提供する。Simpson et al., J. Clin. Oncology 18:2059 (2000)。例えば、固形腫瘍のための治療選択は、通常米国癌共同委員会（ＡＪＣＣ）からの腫瘍／結節／転移（ＴＮＭ）試験を使用して行なわれる腫瘍病期診断に基づく。この試験および病期システムが、被験体における固形癌が診断されたステージに関して価値のある情報を提供するものの、それが不正確で不十分であることは一般的に認識されている。特に、それは、腫瘍進行の最も初期のステージを同定しない。
【００８９】
別の実施態様は、被験体中の腫瘍細胞または腫瘍のＩＧＦ−１Ｒスコア化をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで判定する方法であって、以下の工程を含んでなる方法からなる：
（ａ）前記被験体からの生物学的試料を、上記のＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程；および
（ｂ）前記生物学的試料中で、前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントのＩＧＦ−１Ｒへの結合レベルを、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）によって定量化する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）で得た定量化されたレベルを、陽性細胞の染色の強度および割合である２つのパラメーターに基づく適切な基準と比較することにより腫瘍細胞または腫瘍をスコア化する工程。
【００９０】
一つの実施態様において、組織試料がホルマリン固定組織、ホルモル置換固定組織、Ｇｌｙｃｏ−ｆｉｘｘ固定組織、パラフィン包埋組織および／または冷凍組織の場合、ＩＧＦ−１Ｒ抗体はＩＧＦ−１Ｒを結合さ細胞ことができる。
【００９１】
ＩＧＦ−１Ｒの予後値を予測するために任意の従来の疾患分析方法を使用してもよい。代表的な分析方法には、打ち切り例の存在下で生存率または時間事象データ（time-to-event）をモデル化するための半パラメーター方法であるコックス回帰分析（Hosmer and Lemeshow, 1999; Cox, 1972）が含まれる。他の生存率分析（例えば、生命表、Kaplan-Meyer）とは対照的に、コックスは、モデルの中で予測因子（共変量）の介在を可能にする。従来的分析方法（例えば、コックス）を使用することで、原発腫瘍から再発疾患（疾患がない生存時間または転移性疾患までの時間）のいずれかの発症までの時間または疾患による死亡までの時間（全体の生存時間）におけるＩＧＦ−１Ｒ発現状態との関係性に関する仮説を検証することができるかもしれない。コックス回帰分析は、コックス比例疾患分析としても知られている。この方法は、患者の生存時間に対する腫瘍マーカーの予後値を試験するための標準方法である。多変数のモードで使用された場合、いくつかの共変量の影響は、独立した予後値を有する個々の共変量が同定され得るように並行して試験される、即ち最も有用なマーカーである。陰性または陽性の「ＩＧＦ−１Ｒ状態」という用語は、［ＩＧＦ−１Ｒ（−）］または［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］として言及することもできる。
【００９２】
癌の診断またはモニタリングの間に試料を「スコア化」してもよい。その最も単純な形態では、免疫組織化学による試料の目視点検での判断による分類的に陰性または陽性というものでもよい。より定量的なスコア化は、試料採取した染色（「陽性」）細胞の染色強度および割合である２つのパラメーターを判断することを含む。
【００９３】
発明の意味の範囲内で「ＩＧＦ−１Ｒ状態」とは、免疫組織化学（ＩＨＣ）、蛍光活性化細胞選別ＦＡＣＳまたは当業者に公知の他の方法等の任意の方法によって測定されたＩＧＦ−１Ｒの発現レベルの判定に基づいた、ＩＧＦ−１Ｒ陽性［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］またはＩＧＦ−１Ｒ陰性［ＩＧＦ−１Ｒ（−）］クラスへの腫瘍の分類に関係する。
【００９４】
標準化を確保するために、一つの実施態様において、試料は、異なるＩＧＦ−１Ｒ発現レベルに対して、異なる基準でスコア化してもよく、その大部分は、反応生成物の強度および陽性細胞の割合の評価に基づく（Payne et al., Predictive markers in breast cancer - the present, Histopathology 2008, 52, 82-90）。
【００９５】
別の実施態様において、特に本発明の方法の工程（ｃ）における前記スコア化には、陽性細胞の染色の強度および割合に基づく適切な基準を用いることが含まれてなる。
【００９６】
第一の例として、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体のＩＨＣ評価のためのQuick Allredスコア化から類推して、試料について、染色した細胞の反応性の強度および割合に対する０〜８個の組合わせスコアからの世界的基準でＩＧＦ−１Ｒ発現レベルをスコア化してもよい（Harvey JM, Clarck GM, Osborne CK, Allred DC; J. Clin. Oncol. 1999; 17; 1474-1481）。より詳細には、反応性の強度の第一基準は、０〜３の基準でスコア化され、０は「反応性なし」に対応し、３は「強い反応性」に対応する。反応性な割合の第二基準は、０〜５の基準でスコア化され、０はは「反応性なし」に対応し、５は「割合６７〜１００％反応性」に対応する。次いで、反応性スコアの強度および反応性スコアの割合を合計し、０〜８の合計スコアがもたらされる。合計スコア０〜２は陰性とみなされる一方、合計スコア３〜８は陽性とみなされる。
【００９７】
この基準によれば、本明細書において使用される、腫瘍または腫瘍細胞の陰性または陽性「ＩＧＦ−１Ｒ状態」という用語は、Ａｌｌｒｅｄ基準でそれぞれ０〜２または３〜８に対応するＩＧＦ−１Ｒの発現のレベルを指す。
【００９８】
以下の表４は、Ａｌｌｒｅｄ方法によるＩＨＣ結果を解釈するための指針を説明する。
【００９９】
【表４】
2018516876.tif 000005
【０１００】
発明によれば、方法は、前記適切な基準が、反応性なしを０とスコア化し、かつ反応性割合が６７〜１００％の割合での強い反応性を８とスコア化する、０〜８の基準であることを特徴とする。
【０１０１】
従って、好ましい実施態様において、本発明による被験体中の腫瘍細胞または腫瘍のＩＧＦ−１Ｒスコア化をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで判定する方法は、工程（ｃ）において、当該適切な基準が、反応性なしを０とスコア化し、かつ反応性割合が６７〜１００％の割合での強い反応性を８とスコア化する、０〜８の基準であることを特徴とする。
【０１０２】
換言すると、被験体からの腫瘍または腫瘍細胞の状態をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで判定する方法であって、以下の工程を含んでなる方法が記載されかつ請求されている：
（ａ）Ａｌｌｒｅｄ基準に従い、被験体からの腫瘍または腫瘍細胞をスコア化する工程；および
（ｂ）−ｉ）腫瘍または腫瘍細胞の状態が、Ａｌｌｒｅｄスコア３〜８で［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］であると判定する工程；または
−ｉｉ）腫瘍または腫瘍細胞の状態が、Ａｌｌｒｅｄスコア０〜２で［ＩＧＦ−１Ｒ（−）］であると判定する工程。
【０１０３】
本発明の特定の側面において、腫瘍または腫瘍細胞の状態が、Ａｌｌｒｅｄスコア３で［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。
【０１０４】
本発明の特定の側面において、腫瘍または腫瘍細胞の状態が、Ａｌｌｒｅｄスコア４で［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。
【０１０５】
本発明の特定の側面において、腫瘍または腫瘍細胞の状態が、Ａｌｌｒｅｄスコア５で［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。
【０１０６】
本発明の特定の側面において、腫瘍または腫瘍細胞の状態が、Ａｌｌｒｅｄスコア６で［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。
【０１０７】
本発明の特定の側面において、腫瘍または腫瘍細胞の状態が、Ａｌｌｒｅｄスコア７で［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。
【０１０８】
本発明の特定の側面において、腫瘍または腫瘍細胞の状態が、Ａｌｌｒｅｄスコア８で［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。
【０１０９】
本発明の別の特定の側面において、腫瘍または腫瘍細胞の状態が、Ａｌｌｒｅｄスコア３〜８で［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。
【０１１０】
被験体中の腫瘍または腫瘍細胞のＩＧＦ−１Ｒ状態をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで判定するための、本明細書に記載された別の特定の方法は、以下の工程を含んでなることを特徴とする：
（ａ）請求項１８の方法に従い、当該被験体からのＩＧＦ−１Ｒ腫瘍細胞または腫瘍をスコア化する工程；および
（ｂ）腫瘍細胞または腫瘍のＩＧＦ−１Ｒ状態が、スコア３〜８で［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］であると判定する工程；または
（ｃ）腫瘍細胞または腫瘍のＩＧＦ−１Ｒ状態が、スコア０〜２で［ＩＧＦ−１Ｒ（−）］であると判定する工程。
【０１１１】
第二の例として、ＨＥＲ−２受容体のＩＨＣ評価のための従来的スコア化から類推して、例えば、試料を、ＩＧＦ−１Ｒ発現レベルについて染色の強度（好ましくは、膜染色）およびに染色を示す細胞の割合を０〜３＋の組合わせ基準に統合している多少より単純化したスコア化方法でスコア化してもよい。
【０１１２】
単純化基準と称するこの基準において、０および１＋は陰性である一方、２＋および３＋は陽性染色を表す。しかしながら、スコア１＋〜３＋は、陽性として記録することができ、その理由としては、各陽性スコアは、スコア０（陰性）と比較した場合、再発性および致死性の疾患への危険性が顕著により高いことに関係しているかもしれないが、陽性スコアでの強度の増加はさらに危険性の低減をもたらすかもしれないためである。
【０１１３】
一般的に言えば、本明細書において使用されている、腫瘍または腫瘍細胞の陰性または陽性「ＩＧＦ−１Ｒ状態」という用語は、単純化基準のスコア０〜１＋または２＋〜３＋にそれぞれ対応するＩＧＦ−１Ｒの発現のレベルを指す。浸潤性腫瘍の完全な周辺膜質の反応性のみが考慮されるべきであり、しばしば「金網」の外観に似ていた。現在の指針下において、ＩＧＦ−１Ｒについて境界線（２＋または３＋のスコア）としてスコア化された試料は、さらなる評価をする必要がある。非制限的例として、対象が予想通りではない場合、試料がほぼ不自然な結果を含む場合、かつ過剰な抗原回復が示唆される正常乳管（内部制御）が強い膜質陽性をもつ場合、ＩＨＣ分析を拒絶し、かつＦＩＳＨまたは他の任意の方法によって、繰り返すか試験するかのいずれかを行うべきである。
【０１１４】
より明確にするために、下記表５はこれらパラメーターをまとめたものである。
【０１１５】
【表５】
2018516876.tif 000006
【０１１６】
本発明の方法は、前記の適切な基準が、０〜３＋の基準であって、腫瘍細胞の膜質反応性なしを０とスコア化し、かつ腫瘍細胞の１０％超での強い完全な反応性を３＋とスコア化する基準であることを特徴とする。
【０１１７】
より詳細には、上記のように、当該適切な基準は、０〜３の基準であって、腫瘍細胞の膜質反応性なしを０とスコア化し；腫瘍細胞の１０％超での弱い認知可能な膜質反応性を１＋とスコア化し；腫瘍細胞の１０％超での弱い〜中程度の完全な膜質反応性を２＋とスコア化し；かつ、腫瘍細胞の１０％超での強い完全な反応性を３＋とスコア化する基準である。
【０１１８】
換言すると、被験体からの腫瘍または腫瘍細胞の状態をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで判定するための方法であって、次の工程を含んでなる方法が記載され、かつ請求されている：（ａ）上記の単純化基準により被験体からの腫瘍または腫瘍細胞をスコア化する工程；および（ｂ）スコア２＋または３＋で、腫瘍または腫瘍細胞の状態を［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］と判定する工程；または（ｃ）スコア０または１＋で、腫瘍または腫瘍細胞の状態を［ＩＧＦ−１Ｒ（−）］と判定する工程。
【０１１９】
本発明の特定の側面において、腫瘍または腫瘍細胞はスコア２＋で［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。
【０１２０】
本発明の特定の側面において、腫瘍または腫瘍細胞はスコア３＋で［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。
【０１２１】
本発明の別の特定の側面において、腫瘍または腫瘍細胞はスコア２＋または３＋で［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。
【０１２２】
別の実施態様において、本発明は、被験体中の腫瘍細胞または腫瘍のＩＧＦ−１Ｒ状態をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで判定するための方法であって、次の工程を含んでなる方法に関する：
（ａ）前に記載された本発明の方法により被験体からの前記ＩＧＦ−１Ｒ腫瘍細胞または前記腫瘍をスコア化する工程；および
（ｂ）−ｉ）スコア２＋または３＋で、腫瘍細胞または腫瘍のＩＧＦ−１Ｒ状態を［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］と判定する工程；または
−ｉｉ）スコア０または１＋で、腫瘍細胞のＩＧＦ−１Ｒ状態を［ＩＧＦ−１Ｒ（−）］と判定する工程。
【０１２３】
一般的に、試験またはアッセイの結果は、種々の形式の中からどれで示してもよい。結果は定性的に示すことができる。例えば、試験結果は、恐らく検出限度の指示と併せて、特定のポリペプチドが検出されたかどうかを単に示すかもしれない。結果は半定量的なものとして、表示されるかもしれない。例えば、様々な範囲が決定するかもしれず、その範囲には、一定の定量的情報を提供するスコア（例えば、使用した基準に依存して、０〜３＋または０〜８）が割り当てられるかもしれない。そのようなスコアは、種々の要因、例えば、ＩＧＦ−１Ｒが検出される細胞の数、信号（それは、ＩＧＦ−１ＲまたはＩＧＦ−１Ｒを有する細胞の発現レベルを示し得る）の強度等に反映されるかもしれない。結果は、タンパク質濃度等として、定量的方法で（例えば、ＩＧＦ−１Ｒが検出された細胞の割合として）表示されるかもしれない。
【０１２４】
当業者の通常技術により理解されるように、試験によって提供される出力の類型は、試験の技術的限界およびポリペプチドの検出に関連した生物学的意義に依存して変わるだろう。例えば、特定のポリペプチドの場合に、純粋に定性的な出力（例えば、ポリペプチドが一定の検出レベルで検出されたか否か）は、有意義な情報を提供する。他の場合では、より定量的な出力（例えば、試験された試料中のポリペプチドの発現レベル対標準レベルの比）が必要である。
【０１２５】
別の側面において、被験体中のＩＧＦ−１Ｒの発現に関連した病理学的過剰増殖性の発癌性疾患または病理学的状態への感受性を診断する方法であって、以下の工程を含んでなる方法が記載されている：
（ａ）本発明によるＩＧＦ−１Ｒを発現する細胞の検出のための方法および／またはＩＧＦ−１Ｒの発現レベルを判定するための方法によって、試料中のＩＧＦ−１Ｒを持つ細胞の存在または不存在を判定する工程、および
（ｂ）当該ＩＧＦ−１Ｒを持つ細胞の存在または不存在に基づき、病理学的状態または病理学的状態への感受性を診断する工程。
【０１２６】
本明細書に記述された方法において、ＩＧＦ−１Ｒを発現する細胞の検出またはＩＧＦ−１Ｒのレベルの増加は、一般に、ＩＧＦ−１Ｒを媒介した疾患を持つかまたはそれを示す疑いがある患者の指標となる。
【０１２７】
また、本発明は、個体の癌に罹患する危険性を予測する方法であって、本発明によるＩＧＦ−１Ｒを発現する細胞の検出のための方法および／またはＩＧＦ−１Ｒの発現レベルを判定するための方法によって、組織試料中のＩＧＦ−１Ｒ発現レベルを検出することを含んでなる方法を提供し、ここで高いＩＧＦ−１Ｒ発現のレベルが、癌にかかる高い危険性の指標となる。
【０１２８】
また、本発明は、腫瘍の攻撃性を評価する方法にも関する。
【０１２９】
本明細書中で使用されるような「腫瘍の攻撃性」とは、早く増殖しかつ急速に広がる傾向がある腫瘍を指す。
【０１３０】
一つの実施態様において、腫瘍の攻撃性を評価する前記方法は、以下：
（ａ）本発明によるＩＧＦ−１Ｒを発現する細胞の検出のための方法および／またはＩＧＦ−１Ｒの発現レベルを判定するための方法によって、腫瘍試料中の細胞によって発現されたＩＧＦ−１Ｒのレベルを判定する工程、
（ｂ）本発明によるＩＧＦ−１Ｒを発現する細胞の検出のための方法および／またはＩＧＦ−１Ｒの発現レベルを判定するための方法によって、同一の個体から後の時点で取り出された同等の組織試料中で発現されたＩＧＦ−１Ｒのレベルを判定する工程、および
（ｃ）工程（ａ）で得られた発現レベルと、工程（ｂ）で得られた比との間の比を判定する工程を含んでなり、
ここで、腫瘍試料中の時間をかけたＩＧＦ−１Ｒの発現の比は、癌進行の危険性についての情報を提供する。
【０１３１】
好ましい実施態様において、１を超える工程（ａ）で得られたレベルの工程（ｂ）で得られたレベルに対する比は、攻撃性を示す。別の実施態様において、１以下の比は、非攻撃性を示す。
【０１３２】
本発明の別の側面は、本発明による発現の検出および／またはＩＧＦ−１Ｒ発現の定量化および／または発現レベルの判定の方法によるＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする療法の投与に応じたＩＧＦ−１Ｒ発現をモニタリングすることである。このようなモニタリングは、前記療法が、ＩＧＦ−１Ｒの下方調節および／または分解を引き起こす場合、非常に有用になり得る。
【０１３３】
また、発癌性疾患が、ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする抗体薬物での治療に感受性か否か判定する方法であって、以下の工程を含んでなる方法について記載することも本発明の目的である：
（ａ）上記の本発明のスコア化方法により、被験体中の腫瘍の、腫瘍細胞の、ＩＧＦ−１Ｒ状態をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで判定する工程、および
（ｂ）腫瘍細胞または腫瘍のＩＧＦ−１Ｒ状態が、ＩＧＦ−１Ｒ（＋）である場合、発癌性疾患は、ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする抗体薬物での治療に感受性であると判定する工程。
【０１３４】
具体的には、細胞表面でＩＧＦ−１Ｒ発現をモニタリングすることは、臨床試験および「個別化された」療法の過程での治療の有効性を評価するための重大なツールとなり得る。
【０１３５】
従って、その用途は、被験体に適切な治療を判定する方法を提供する。
【０１３６】
本発明による発現の検出および／または発現レベルの判定の方法により判定できるＩＧＦ−１Ｒレベルの増加または減少は、ＩＧＦ−１Ｒに関連した癌の進化の指標となる。従って、ＩＧＦ−１Ｒを発現している細胞の数の増加あるいは様々な組織または細胞中にあるＩＧＦ−１Ｒ濃度の変化を測定することによって、ＩＧＦ−１Ｒに関連した悪性腫瘍を改善することを目的とした特定の治療形態が有効であるか否か判定することが可能である。
【０１３７】
また、本発明の別の目的は、ＩＧＦ−１Ｒに関連した発癌性疾患を、当該疾患に罹患している被験体において緩和するために設計された治療計画の有効性をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで判定する方法であって、以下の工程を含んでなる方法である：
（ａ）上記の本発明による発現の検出および／または発現レベルの判定の方法により、第一生物学的試料において第一ＩＧＦ−１Ｒ発現レベルを判定する工程であって、当該第一生物学的試料は当該治療の第一時点に対応する；
（ｂ）上記の本発明による発現の検出および／または発現レベルの判定の方法により、第二生物学的試料において第二ＩＧＦ−１Ｒ発現レベルを判定する工程であって、当該第二生物学的試料は当該治療の第二の後の時点に対応する；
（ｃ）工程（ａ）で得られた前記第一発現レベルの、工程（ｂ）で得られた前記第二発現レベルに対する比を計算する工程；および
（ｄ）工程（ｃ）の比が１を超える場合に、前記治療計画の有効性が高いと判定する工程；または工程（ｃ）の比が１以下の場合に、前記治療計画の有効性が低いと判定する工程。
【０１３８】
好ましい実施態様において、ＩＧＦ−１Ｒに関連した発癌性疾患を、当該疾患に罹患している被験体において緩和するために設計された治療計画には、当該被験体へのＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする療法の投与が含まれる。
【０１３９】
また、本発明による発現の検出および／または発現レベルの判定の方法を使用した、ＩＧＦ−１Ｒの発現に関連した発癌性疾患を造影するｉｎ  ｖｉｖｏでの方法を提供することも本発明の目的である。そのような方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞を見つけ出すこと、同様に、それらの浸潤性をモニタリングすることに有用である。同様に、方法は、ＩＧＦ−１Ｒに媒介された癌の診断を以前に受けた患者における進行および／または治療への応答性をモニタリングすることに有用である。
【０１４０】
一つの実施態様は、被験体中のＩＧＦ−１Ｒを発現している腫瘍細胞の位置を検出する方法であって、以下の工程を含んでなる方法である：
ａ）本発明によるＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントを被験体へ投与する工程；および
ｂ）当該ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合を検出する工程であって、この結合が、腫瘍細胞の存在を示す。
【０１４１】
発現している腫瘍の存在の検出に関しては、当業者に公知の多くの技術を使用することができる。しかしながら、好ましい手段はＩＨＣおよびＦＡＣＳである。
【０１４２】
別の側面において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏ造影試薬を提供し、当該試薬は本発明によるＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなり、当該ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、好ましくは標識され、より好ましくは放射性標識されたものである。
【０１４３】
また、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに媒介された癌にかかった患者の医用画像における当該試薬の使用を意図している。
【０１４４】
本発明の方法は、以下の工程を含んでなる：
（ａ）前記患者に、造影に有効な量の本発明の造影試薬を投与する工程および
（ｂ）当該試薬を検出する工程。
【０１４５】
好ましい実施態様において、造影剤は、本発明によるＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントおよび活性部分を含んでなる。
【０１４６】
本明細書に使用される「活性部分」とは、前記造影試薬のｉｎ  ｖｉｖｏ検出を可能にする薬剤である。本発明による活性部分には、テクネチウム−９９ｍ（９９ｍＴｃ）、銅−６７（Ｃｕ−６７）、スカンジウム−４７（Ｓｃ−４７）、ルテチウム−７７（Ｌｕ−１７７）銅６４（Ｃｕ−６４）、イットリウム−８６（Ｙ−８６）またはヨウ素−１２４（Ｉ−１２４）のような特定の放射性元素が含まれる。
【０１４７】
造影剤は、ヒト等の哺乳動物における診断的使用に有効な量で投与され、その後造影剤の局在性および蓄積が検出される。造影剤の局在性および蓄積は、放射性核種画像診断、放射性シンチグラフィー、核磁気共鳴像法、コンピューター断層撮影法、陽電子放出型断層撮影法、コンピューター軸断層撮影法、Ｘ線共鳴磁気画像診断方法または磁気共鳴画像診断方法、蛍光検出および化学発光検出によって検出されるかもしれない。
【０１４８】
標的抗腫瘍療法の開発に関して、免疫組織学的技術での診断により、受容体発現レベルｉｎ  ｓｉｔｕ情報（例えば、腫瘍のサイズおよび／または位置）がもたらされる。従って、診断により、そのような治療に必要とされる受容体の発現レベルに従い、治療に感受性な患者を選択することができる。
【０１４９】
本発明の特に関心のある側面は、治療量のＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする抗体薬物の投与から利益があるか否かが予想される癌患者を選択する方法であって、以下を含んでなる方法である：
（ａ）上記の本発明の方法によりＩＧＦ−１Ｒ発現レベルを判定する工程；
（ｂ）前の工程（ａ）での発現レベルを、参照発現レベルと比較する工程；および
（ｃ）（ａ）で得られた発現レベルの参照発現レベルに対する比が１より大きい場合、ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする抗体薬物での治療から利益があると予測される患者を選択する工程；または
（ｄ）（ａ）で得られた発現レベルの参照発現レベルに対する比が１以下である場合、ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする抗体薬物での治療から利益があると予測されない患者を選択する工程。
【０１５０】
ＩＧＦ−１Ｒの発現レベルは、「参照レベル」または「参照発現レベル」とも称される対照細胞または試料におけるレベルに関して優位に比較または測定される。本明細書において、「参照レベル」、「参照発現レベル」、「対照レベル」および「対照」は、互換的に使用される。「対照レベル」とは、一般に疾患または癌のない匹敵する対照細胞において測定された個別の基線レベルを意味する。当該対照細胞は、同一の個体からのものであってもよく、その理由としては、癌患者においてさえも、腫瘍の部位である組織には依然として非腫瘍正常細胞が含まれてなるからである。またそれは、正常の個体または病気感染した試料か試験試料が得られた疾患と同一の疾患を示さない個体に由来してもよい。本発明の文脈の範囲において、「参照レベル」という用語は、患者の試料に含有している癌細胞中のＩＧＦ−１Ｒ発現の試験レベルを評価するために使用される、ＩＧＦ−１Ｒの発現の「対照レベル」を指す。例えば、患者の生物学的試料中のＩＧＦ−１Ｒのレベルが、ＩＧＦ−１Ｒの参照レベルより高い場合、細胞は、ＩＧＦ−１Ｒの高いレベルの発現、即ち過剰発現をしていると考えられる。参照レベルは、複数の方法によって決定することができる。従って、発現レベルはＩＧＦ−１Ｒを持つ細胞または代替的にＩＧＦ−１Ｒを発現する細胞の数と無関係のＩＧＦ−１Ｒの発現レベルを定義するかもしれない。従って、各患者の参照レベルは、ＩＧＦ−１Ｒの参照比によって規定することができ、この参照比は、本明細書に記載された参照レベルを決定する方法のいずれかによって決定することができる。
【０１５１】
例えば、対照は種々の形態を取り得る所定値でもよい。それはメジアンまたは平均のように、単一カットオフ値であってよい。「参照レベル」は、すべての患者に個々に等しい単一の数であってもよいし、または、参照レベルは、患者の特定の部分母集団により変化してもよい。従って、例えば、同一癌についてより年齢が高い男性はより年齢が低い男性とは異なる参照レベルを有しているかもしれず、かつ同一癌について女性は男性とは異なる参照レベルを有しているかもしれない。あるいは、「参照レベル」は、試験する新生細胞の組織と同一の組織からの非発癌性癌細胞中でのＩＧＦ−１Ｒの発現レベルを測定することにより決定することができる。同様に、「参照レベル」は、患者の非腫瘍細胞のＩＧＦ−１Ｒレベルに対する同一患者の新生細胞のＩＧＦ−１Ｒの一定の比かもしれない。また、「参照レベル」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞のＩＧＦ−１Ｒレベルであり得、それは腫瘍細胞をシミュレーションするために操作することができ、または参照レベルを正確に決定する発現レベルを産出する他の任意の方法で操作することができる。他方では、「参照レベル」は、上昇したＩＧＦ−１Ｒレベルがないグループおよび上昇したＩＧＦ−１Ｒレベルがあるグループにおいてなど、比較グループに基づいて設定することができる。比較グループの別の例は、特定の疾患、病態または症状を有するグループ、およびその疾患のないグループとなるだろう。例えば、試験された母集団が等しく（または不平等に）危険性の低いグループ、危険性の中程度のグループおよび危険性の高いグループ等のグループに分割される場合、所定値を取り決めることができる。
【０１５２】
また、参照レベルも、同一癌に罹患している患者の母集団中のＩＧＦ−１Ｒレベルを比較することによって決定することができる。これは、例えば、ヒストグラム分析によって達成することができ、ここで患者の全コホートはグラフ式に示され、ここで、第一軸は、ＩＧＦ−１Ｒレベルに対応し、第二軸は、その癌細胞が所定値でＩＧＦ−１Ｒを発現するコホート内の患者の数を表わす。患者の別個の２つ以上のグループは、同一か類似のＩＧＦ−１Ｒレベルを有するコホートの部分的母集団の同定によって決定することができる。その後、参照レベルの決定は、これらの個別グループを最良に区別するレベルに基づき行うことができる。また、参照レベルは、２つ以上のマーカーのレベルを表すことができ、そのうちの１つはＩＧＦ−１Ｒである。２つ以上のマーカーは、例えば、各マーカーのレベルの値の比によって表わすことができる。
【０１５３】
同様に、明らかに健康な母集団は、ＩＧＦ−１Ｒの発現に関係した病態を有すると知られている母集団が有するものとは異なる「正常な」範囲を持つだろう。このため、選択された所定値では、個体が該当する区分を考慮してもよい。適正な範囲および区分は、当業者の通常のルーチン的実験の域を出ずに選択され得る。「上昇した」「増加した」というと、選択された対照への関係性が高いことを意味する。典型的に、その対照は、適切な年齢層における明らかに健康で正常な個体に基づくだろう。
【０１５４】
また、本発明による対照は、所定値に加えて、実験材料と並行に試験された材料の試料であってもよいことが理解されよう。例には、同一の被験体から同時に得られた組織または細胞、例えば、被験体からの１つの生検の部位または１つの細胞試料の部位が含まれる。
【０１５５】
別の実施態様において、本発明は、上記の本発明によるＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントまたは標識されたその抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容可能な担体を含んでなる、ＩＧＦ−１Ｒの発現に関連した発癌性疾患のｉｎ  ｖｉｖｏ造影のための医薬組成物に関する。
【０１５６】
別の側面において、患者中のＩＧＦ−１Ｒを発現している腫瘍細胞を検出するためのキットであって、少なくとも上記のＩＧＦ−１Ｒ抗体または抗原結合フラグメントおよび好ましくは抗体８１０Ｄ１２を含んでなることを特徴とするキットが記載されている。
【０１５７】
診断アッセイ（例えば、キット）を行なうための指示書付きで所定量の試薬の組合わせを含んでなるパッケージ化された材料も本発明の範囲内である。キットには、ＩＧＦ−１Ｒのｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出および定量化用のＩＧＦ−１Ｒ抗体が含まれる（例えば、ＥＬＩＳＡにて）。ＩＧＦ−１Ｒ抗体が酵素で標識付けされた場合、キットは基質および酵素によって要求される補助因子（例えば、検出可能な発色団か発蛍光団を提供する基質前駆体）を含む。加えて、他の添加剤、例えば、安定化装置、緩衝剤（例えば、ブロッキングバッファーまたは細胞溶解バッファー）が含まれていてもよい。そのようなキットは、バイアル、チューブ等の１つ以上の容器を受けるために仕切られた入れ物を備えてなっていてもよく、そのような容器は、本発明の個々の要素を保持している。例えば、１つの容器には、不溶性または部分的に可溶性の担体へ結合した第一抗体が含まれていてもよい。第二容器には、凍結乾燥された形態であるかまたは溶液に入った、可溶性の、検出可能に標識された第二抗体が含まれていてもよい。また入れ物には、凍結乾燥された形態であるかまたは溶液に入った、検出可能に標識された第三抗体を保持する第三容器が含まれていてもよい。この性質のキットは、本発明のサンドイッチ分析で使用することができる。ラベルまたは添付文書の表示には、組成物の説明と同様に意図するｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは診断的使用のための指示が提供されていてもよい。
【０１５８】
種々の試薬の相対量は、試薬の溶液中でアッセイの感度を本質的に最適化する濃度を提供するために幅広く変化し得る。特に、試薬は、通常凍結乾燥された乾燥粉末として提供されてもよく、溶解することで適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤が含まれる。
【０１５９】
より一層の側面において、本発明による本明細書に詳述されているＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントは、それらが、前述の抗原を有する細胞を診断または同定するために、例えば、キットとしてパッケージ化されて使用できるように検出可能な部分で標識されて提供される。そのような標識の非制限的な例として、フルオレセインイソチオシアネート等の発蛍光団；発色団、放射性核種、ビオチンまたは酵素が挙げられる。そのような標識されたＩＧＦ−１Ｒ抗体は、抗原の組織学的局在化、ＥＬＩＳＡ、細胞選別、同様にＩＧＦ−１Ｒを検出するかまたは定量化するための他の免疫学的手法に使用することができる。
【０１６０】
また本発明は、本発明によるＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなることを特徴とするキットに関する。
【０１６１】
また本発明は、本発明によるＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントの配列番号１〜６の配列を有する６つのＣＤＲから得ることができる、キメラまたはヒト化のＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなることを特徴とするキットに関する。
【０１６２】
細胞からのＩＧＦ−１Ｒの精製または免疫沈降のための陽性対照として有用なキットも提供される。ＩＧＦ−１Ｒの単離および精製のために、キットは、ビーズ（例えば、セファロースビーズ）に結合した、本発明による本明細書に詳説されたＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントを含有し得る。ＩＧＦ−１Ｒのｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出および定量化（例えば、ＥＬＩＳＡにて）のための抗体を含有しているキットを提供することができる。キットは容器および容器の上または容器に付いたラベルまたは添付文書を備えてなる。例えば、希釈剤および緩衝剤、対照抗体を含有する追加の容器が含まれていてもよい。ラベルまたは添付文書には、組成物の説明と同様に意図するｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは診断的使用のための指示が提供されていてもよい。
【０１６３】
より詳しくは、本発明は、本明細書に記載された方法によって被験体中の腫瘍の腫瘍細胞のＩＧＦ−１Ｒ状態をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｔｒｏで判定するためのキットに関係する。好ましい実施態様において、実施例に記載されるように、本発明は、ＩＨＣおよび／またはＦＡＣＳ方法によって腫瘍、または腫瘍細胞のＩＧＦ−１Ｒ状態を判定するためのキットに関する。
【０１６４】
特別の実施態様において、本発明は、少なくとも上記の本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなるキットにあり、当該抗体は標識されている。
【０１６５】
好ましい実施態様において、本発明によるキットは、さらに前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体とＩＧＦ−１Ｒとの間の結合度合いを検出するために有用な試薬を含んでなる。
【０１６６】
別の好ましい実施態様において、ＩＧＦ−１Ｒを発現している腫瘍中のＩＧＦ−１Ｒ発現レベルをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｔｒｏで判定するために有用な本発明のキットは、前記標識されたＩＧＦ−１Ｒ抗体とＩＧＦ−１Ｒとの間の結合レベルを定量化するために有用な試薬をさらに含んでなる。
【０１６７】
一層別の実施態様において、本発明によるキットは、さらに次のものを含んでなる：ｉ）前記標識されたＩＧＦ−１Ｒ抗体とＩＧＦ−１Ｒとの間の結合度合いを検出するために有用な試薬；およびｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒ発現レベルのスコア化に有用な陽性および陰性の対照試料。
【０１６８】
前記キットは、マウス抗体、またはヒト／ヒト化抗体に特異的な多クローン性抗体を含んでなり、好ましくは、当該マウス、ヒト化またはヒト抗体に特異的な多クローン性抗体は標識されている。
【０１６９】
本発明の特定の実施態様によれば、ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする阻害剤の療法的投与から利益を受けるか利益を受けないと予想される癌患者をｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択するためのキットは、次のものを含んでなり得る：ｉ）前記標ＩＧＦ−１Ｒ抗体とＩＧＦ−１Ｒとの間の結合度合いを検出するために有用な試薬；ｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒ阻害剤への感受性に相互に関連付けられた対照レベルおよび／またはｉｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒ阻害剤への耐性に相互に関連付けられた対照レベル。
【０１７０】
また、本発明は、発癌性疾患を有する患者が、ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする抗体薬物での治療から利益を受ける可能性があるか否か判定するためのキットであって、少なくとも上記の本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなることを特徴とするキットに関する。
【０１７１】
別の実施態様において、このようなキットは、さらに以下を含んでなることを特徴とする。
ｉ）腫瘍細胞の表面で前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体とＩＧＦ−１Ｒとの間の結合度合いを検出するための試薬；および／または
ｉｉ）腫瘍細胞の表面で前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体とＩＧＦ−１Ｒとの間の結合レベルを定量化するための試薬。
【０１７２】
本発明の他の特性および利点は、説明の続きとともにその説明が下記に表わされている実施例および図において示されている。
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１】図１は、ｒｈＩＧＦ１Ｒ  ＥＬＩＳＡでの８１０Ｄ１２抗体で得たＯＤ値の図式的表示である。データフィッティングおよびＥＣ５０測定はＰｒｉｓｍ適用を使用して決定される。
【図２】図２Ａ〜２Ｃ：８１０Ｄ１２（図２Ａ）と、Ｇ１１抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（Roche Ventana）（図２Ｂ）とまたはＡＦ−３０５（R&D system）抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（図２Ｃ）との、パラフィン包埋腫瘍ＭＣＦ−７の認識免疫組織化学（ＩＨＣ）パターンを示す図である。
【図３】図３：ＭＣＦ−７異種移植モデルにおける抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＤＣのｉｎｖｉｖｏ活性を示す図である。
【図４】図４Ａ〜４Ｃ：８１０Ｄ１２と、Ｇ１１抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（Roche Ventana）（図４Ｂ）とまたはＡＦ−３０５（R&D system）抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（図４Ｃ）との、パラフィン包埋腫瘍ＳＢＣ−５の認識免疫組織化学（ＩＨＣ）パターンを示す図である。
【図５】図５：ＳＢＣ−５異種移植モデルにおける抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を示す図である。
【実施例】
【０１７４】
実施例１：８１０Ｄ１２の生成および選択
下記のように、ｒｈＩＧＦ−１Ｒに対して生成されたＭａｂを生産し選択した。
【０１７５】
雌のＢａｌｂ／Ｃマウスを、Ｆｒｅｕｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔでの組換え型ヒトＩＧＦ−１Ｒタンパク質（R and D Systems、391-GR）１０μｇの皮下注射によって免疫付与した。免疫付与は、２週間の間隔で３回繰り返した。４回目の射出をアジュバントの存在下で腹腔内注射によって行った。
【０１７６】
３日後に脾臓細胞を、ＰＥＧ５０％を有するＳＰ２ＯＡｇ１４骨髄腫細胞と融合した。１４日間のＨＡＴ代謝選択後、ヒトＭＣＦ７乳癌細胞を使用して、ＦＡＣＳによってハイブリドーマ上澄みを試験した。ＭＣＦ７結合抗体のみが保持された。
【０１７７】
その後、目的の抗体を限界希釈によってクローニングした。クローニングから８日後に、ＭＣＦ７細胞を使用して、ＦＡＣＳによって上澄みを再度選択した。各ハイブリドーマに対して、３つの陽性クローンが保持された。分泌された抗体のアイソタイプ化は、Southern Biotechnologies（Cat: 5300-05）からのSBA clonotypingシステムＨＲＰキットを使用して判定した。最後に、１つのクローンを拡張し凍結させた。
【０１７８】
その後、ｒｈＩＧＦ−１ＲまたはｒｍＩＧＦ−１Ｒまたはｒｈ１Ｒ  ＥＬＩＳＡ等のハイブリドーマ上澄みを使用して８１０Ｄ１２抗体のさらなる特徴化を行なった。すべての直接ＥＬＩＳＡにおいて、各々のウェルの底で目的のタンパク質（１μｇ／ｍｌ）を不動にした。飽和させた後、ハイブリドーマ上澄みをウェルに添加した。１時間のインキュベーション期間および洗浄工程後に、ＴＭＢ基質を添加する前に、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ標識多クローン性抗体を検出に用いた。波長４５０ｎｍでの分光光度計でＯＤを読み取る前に、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４溶液で反応を停止させた。データは下記表６に示されている。
【０１７９】
【表６】
2018516876.tif 000007
【０１８０】
ｒｈＩＧＦ−１Ｒコーティングでの８１０Ｄ１２抗体に対する用量応答曲線は、図１に示されている。ＥＣ５０の値は、Ｐｒｉｓｍ適用を使用して決定される。
【０１８１】
データから、８１０Ｄ１２抗体が、０．５１ｎＭのＥＣ５０でｒｈ  ＩＧＦ−１Ｒのみを認識することが示された。それは、ＩＧＦ−１Ｒのマウス形態にもヒトＩＲにも結合しない。
【０１８２】
実施例２：本発明の抗体との病期診断の相関関係およびＭＣＦ−７異種移植モデル中のＩＧＦ−１Ｒを標的とするＡＤＣの活性の評価
腫瘍の悪性度を薬理学と相関づけるために、腫瘍を類別し（２．１項）、その後、吸収されることが知られているＩＧＦ−１Ｒを標的とする抗体部分およびオーリスタチン（２．２項）からなる薬物部分を含んでなるＡＤＣで  ＭＣＦ−７異種移植モデルにｉｎ  ｖｉｖｏ実験を行った。
【０１８３】
２．１：ＭＣＦ−７異種移植片モデルに対するＩＧＦ−１Ｒ発現の免疫組織化学検出
ＭＣＦ−７異種移植片からの組織切片を脱パラフィン化し、再水和し、４０分間の９８℃での熱によるエピトープ回復のために９８℃に事前加熱した沸騰浴中のTarget Retrieval Buffer 1X (Dako S1699)内に置き、次いでさらに２０分Target Retrieval Bufferに置いた。Tris Buffer Saline -0.05%  tween 20（ＴＢＳ−Ｔ）（Ｄａｋｏ  Ｓ３００６）中で３回洗浄した後、内因性ペルオキシダーゼ活性を、Peroxidase Blocking Reagent（Dako K4007）を使用して５分間遮断した。切片をＴＢＳ−Ｔで洗浄し、遮断薬(UltraV block-TA-125UB- LabVision)を５分間インキュベートし、その後、室温で１時間、陰性対照として８１０Ｄ１２モノクローナル抗体（５μｇ／ｍｌで）またはマウスＩｇＧ１／カッパ（5μg/ml、X0931、Dako)とインキュベートした。切片をＴＢＳ−Ｔで洗浄し、３０分間Envision (Dako)でインキュベートした。ジアミノベンジジンを使用して褐色反応生成物(Dako K3468)を作成した。スライドを２分間ヘマトキシリン中に浸し、逆染色 (Dako S3309)させた。
【０１８４】
本発明の抗ＩＧＦ−１Ｒモノクローナル抗体８１０Ｄ１２は、ＭＣＦ−７の細胞膜の異なった染色を行った。このＩＨＣ手順では、褐色反応生成物は細胞膜の陽性染色に相互に関連し、褐色反応生成物の不足は陰性染色および細胞膜の非可視化に相互に関連する。膜質アルゴリズムを使用すると、ＭＣＦ−７腫瘍細胞の染色に関するスコアは３＋（図２Ａ）であった。Ｇ１１抗体（Roche Ventana）またはＡＦ−３０５（R&D system）抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を使用すると、同一腫瘍の切片は２＋（それぞれ図２Ｂおよび２Ｃ）とスコア化された。
【０１８５】
２．２：ＭＣＦ−７異種移植片モデル中の抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ活性
抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＤＣを、ＭＣＦ−７異種移植片モデル中で、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価した。
【０１８６】
全ての動物手続きは、科学的目的のために使用される動物の保護に関する指令２０１０／６３／ＵＥの指針に従い行った。試験計画書は、Pierre Fabre Instituteの動物倫理委員会（Animal Ethical Committee）によって承認された。ＭＣＦ−７細胞５百万個を、７週令スイス／ヌードマウスへ皮下注射した。細胞注射前に、ＭＣＦ−７腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に必要なエストロゲンを放出するために、エストロゲンペレット剤（Innovative Research of America）をマウスの左脇腹に注入した。
【０１８７】
ＭＣＦ−７細胞注入から２０日後、腫瘍が平均サイズ１２０〜１５０ｍｍ３に達した際に、動物を腫瘍サイズおよび様相によりマウス６個体ずつのグループに分割した。抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＤＣを、４日ごとの（Ｑ４ｄ４）６回の注射サイクルで腹腔内注射によって接種した。動物の健康状態を毎日モニタリングした。腫瘍容積を研究終了まで週に二度電子カリパスで測定した。腫瘍容積は次の計算式で計算した：π／６×長さ×幅×高さ。動物の体重に従い、１週間当たり３回毒性を評価した。統計分析をマン＝ホイットニー（Mann-Whitney）試験を使用して、測定ごとに行った。
【０１８８】
抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＤＣの注射により、著しい阻害および完全な腫瘍増殖退行（図３）さえも引き起こされたことは、３＋に等級分けされた腫瘍では予想通りであったが、２＋に等級分けされた腫瘍では予想通りではなかった。
【０１８９】
実施例３：本発明の抗体との病期診断の相関関係およびＳＢＣ−５異種移植片モデル中のＩＧＦ−１Ｒを標的とするＡＤＣの活性の評価
腫瘍の悪性度を薬理学と相互に関連付けるために、腫瘍を類別し(3.1項)、その後、ＩＧＦ−１Ｒを標的とする抗体部分およびオーリスタチン（３．２項）からなる薬物部分を含んでなるＡＤＣでＳＢＣ−５異種移植モデルにｉｎ  ｖｉｖｏ実験を行った。
【０１９０】
３．１  ＳＢＣ−５異種移植片モデルに対するＩＧＦ−１Ｒ発現の免疫組織化学検出 
ＩＧＦ−１Ｒのレベルは、前の実施例２の２．１項に記載された同一の試験計画書を使用して分析した。
【０１９１】
ＩＧＦ−１Ｒを８１０Ｄ１２で検出した際、低レベルが検出された（１＋）（図４Ａ）。ＩＧＦ−１ＲをＧ１１抗体（Roche Ventana）またはＡＦ−３０５（R&Dsystem）抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体で検出した際、同一腫瘍からの切片は３＋（それぞれ図４Ｂおよび４Ｃ）とスコア化された。
【０１９２】
３．２：ＳＢＣ−５異種移植片モデル中の抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＤＣのｉｎｖｉｖｏ活性
抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＤＣを、ＳＢＣ−５異種移植片モデル中で、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価した。
【０１９３】
全ての動物手続きは、科学的目的のために使用される動物の保護に関する指令２０１０／６３／ＵＥの指針に従い行った。試験計画書は、Pierre Fabre Instituteの動物倫理委員会（Animal Ethical Committee）によって承認された。ＳＢＣ−５細胞５百万個を、７週令胸腺欠損マウスへ皮下注射した。細胞注入から１２日後、腫瘍が平均サイズ１５０ｍｍ３に達した際に、動物を腫瘍サイズおよび様相によりマウス６個体ずつのグループに分割した。抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＤＣを、４日ごとの（Ｑ４ｄ４）６回の注射サイクルで腹腔内注射によって接種した。動物の健康状態を毎日モニタリングした。腫瘍容積を研究終了まで週に二度電子カリパスで測定した。腫瘍容積は次の計算式で計算した：π／６×長さ×幅×高さ。動物の体重に従い、１週間当たり３回毒性を評価した。統計分析をマン＝ホイットニー試験を使用して、測定ごとに行った。
【０１９４】
ＳＢＣ−５腫瘍細胞の腫瘍進行が抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＤＣの注射による影響を受けなかった（図５）ことは１＋に等級分けされた腫瘍では予想通りであったが、３＋に等級分けされた腫瘍では予想通りではなかった。
【図１】
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【図２Ａ−２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ−４Ｃ】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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