(57)【要約】本開示は、標的細胞の表面上にあるヒトＣＤ７０に結合する第一の結合ドメイン及びＴ細胞の表面上にあるヒトＣＤ３に結合する第二の結合ドメインを含む二重特異性抗体構築物に関する。さらには、本開示は、抗体構築物をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター及び前記ポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換されたまたはこれがトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。さらには、本開示は、本開示の抗体構築物を産生するための方法、前記抗体構築物の医学的使用、及び前記抗体構築物を含むキットを提供する。【選択図】図１
2018530996.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞の表面上にあるヒトＣＤ７０に結合する第一の結合ドメイン及びＴ細胞の表面上にあるヒトＣＤ３及び少なくともマカクＣＤ３に結合する第二の結合ドメインを含む、二重特異性抗体構築物。
【請求項２】
前記第一の結合ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含み、
・前記ＣＤＲ−Ｈ１が、アミノ酸配列Ｘ１ＹＸ２ＭＸ３（配列番号１８６９）を有し、Ｘ１が、Ｓ、ＴまたはＶであり、Ｘ２がＡまたはＳであり、Ｘ３がＳまたはＮである；
・前記ＣＤＲ−Ｈ２が、アミノ酸配列
2018530996.tif 000335
を有し、Ｘ１が、Ａ、Ｙ、Ｖ、Ｌ、またはＴであり、Ｘ２が、ＧまたはＳであり、Ｘ３が、Ｒ、Ｙ、Ｓ、ＧまたはＩであり、Ｘ４が、Ｔ、Ｉ、Ｐ、またはＡであり、Ｘ５が、Ｆ、Ｙ、Ｎ、ＱまたはＤであり、Ｘ６が、ＹまたはＦであり、Ｘ７がＥ、ＫまたはＱである；
・前記ＣＤＲ−Ｈ３が、アミノ酸配列
2018530996.tif 000336
を有し、Ｘ１が、Ｈ、ＧまたはＶであり、Ｘ２が、Ｐ、Ａ、ＬまたはＦであり、Ｘ３が、ＹまたはＦである；
・前記ＣＤＲ−Ｌ１が、アミノ酸配列
2018530996.tif 000337
を有し、Ｘ１が、ＳまたはＧであり、Ｘ２が、ＳまたはＧであり、Ｘ３が、ＩまたはＶであり、Ｘ４が、Ｒ、Ｓまたはアミノ酸無しであり、Ｘ５が、ＳまたはＧであり、Ｘ６が、Ｓ、Ｎ、ＴまたはＤであり、Ｘ７が、Ｙまたはアミノ酸無しであり、Ｘ８が、ＡまたはＧである；
・前記ＣＤＲ−Ｌ２が、アミノ酸配列
2018530996.tif 000338
を有し、Ｘ１が、ＧまたはＡであり、Ｘ２が、ＡまたはＳであり、Ｘ３が、Ｓ、Ｔ、ＮまたはＩであり、Ｘ４が、ＲまたはＬであり、Ｘ５が、ＡまたはＱであり、Ｘ６が、ＴまたはＳである；ならびに
・前記ＣＤＲ−Ｌ３が、アミノ酸配列
2018530996.tif 000339
を有し、Ｘ１が、Ｇ、ＹまたはＦであり、Ｘ２が、Ｄ、Ｓ、Ｙ、ＩまたはＡであり、Ｘ３が、Ｌ、Ｔ、ＳまたはＹであり、Ｘ４が、Ｆ、Ｌ、ＰまたはＩであり、Ｘ５が、ＴまたはＰである、請求項１に記載の抗体構築物。
【請求項３】
前記第一の結合ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含み、
・前記ＣＤＲ−Ｈ１が、アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号１４２２）またはＸ１ＹＡＭＳ（配列番号１８７５）を有し、Ｘ１が、Ｓ、ＴまたはＶである；
・前記ＣＤＲ−Ｈ２が、
2018530996.tif 000340
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、Ｘ１が、Ａ、Ｖ、ＬまたはＴであり、Ｘ２が、Ｒ、Ｓ、またはＧであり、Ｘ３が、Ｔ、ＰまたはＡであり、Ｘ４が、Ｆ、Ｎ、ＹまたはＱであり、Ｘ５が、Ｅ、Ｋ、またはＱである；
・前記ＣＤＲ−Ｈ３が、
2018530996.tif 000341
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、Ｘ１が、ＨまたはＶであり、Ｘ２が、Ｐ、ＬまたはＡであり、Ｘ３がＹまたはＦである；
・前記ＣＤＲ−Ｌ１が、アミノ酸配列
2018530996.tif 000342
を有し、Ｘ１が、ＳまたはＧであり、Ｘ２が、ＳまたはＧであり、Ｘ３が、ＩまたはＶであり、Ｘ４が、ＲまたはＳであり、Ｘ５が、ＳまたはＧであり、Ｘ６が、Ｓ、Ｔ、ＮまたはＤであり、Ｘ７がＡまたはＧである；
・前記ＣＤＲ−Ｌ２が、アミノ酸配列ＡＡＳＸＬＱＳ（配列番号１８７９）を有し、ＸがＴもしくはＩであるか、またはＧＸ１ＳＸ２ＲＡＴ（配列番号１８８０）を有し、Ｘ１が、ＡもしくはＳであり、Ｘ２が、ＳもしくはＮである；ならびに
・前記ＣＤＲ−Ｌ３が、
2018530996.tif 000343
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、Ｘ１が、Ｄ、Ｙ、ＳまたはＩであり、Ｘ２が、Ｌ、ＳまたはＴであり、Ｘ３が、ＦまたはＰであり、Ｘ４が、ＴまたはＰである、請求項１または２に記載の抗体構築物。
【請求項４】
前記第一の結合ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含み、
・前記ＣＤＲ−Ｈ１が、アミノ酸配列Ｘ１ＹＡＭＳ（配列番号１８７５）を有し、Ｘ１が、Ｓ、ＴまたはＶである；
・前記ＣＤＲ−Ｈ２が、アミノ酸配列
2018530996.tif 000344
を有し、Ｘ１が、Ａ、Ｖ、ＬまたはＴであり、Ｘ２が、Ｒ、Ｓ、またはＧであり、Ｘ３が、Ｔ、ＰまたはＡであり、Ｘ４が、Ｆ、Ｎ、ＹまたはＱであり、Ｘ５が、Ｅ、Ｋ、またはＱである；
・前記ＣＤＲ−Ｈ３が、アミノ酸配列
2018530996.tif 000345
を有し、Ｘ１が、ＨまたはＶであり、Ｘ２が、Ｐ、ＬまたはＡであり、Ｘ３が、ＹまたはＦである；
・前記ＣＤＲ−Ｌ１が、アミノ酸配列
2018530996.tif 000346
を有し、Ｘ１が、ＳまたはＧであり、Ｘ２が、ＳまたはＧであり、Ｘ３が、ＩまたはＶであり、Ｘ４が、ＲまたはＳであり、Ｘ５が、ＳまたはＧであり、Ｘ６が、Ｓ、Ｔ、ＮまたはＤであり、Ｘ７が、ＡまたはＧである；
・前記ＣＤＲ−Ｌ２が、アミノ酸配列
2018530996.tif 000347
を有し、Ｘ１が、ＡまたはＳであり、Ｘ２が、ＳまたはＮである；ならびに
・前記ＣＤＲ−Ｌ３が、アミノ酸配列
2018530996.tif 000348
を有し、Ｘ１が、Ｄ、Ｙ、ＳまたはＩであり、Ｘ２が、Ｌ、ＳまたはＴであり、Ｘ３が、ＦまたはＰであり、Ｘ４が、ＴまたはＰである、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体構築物。
【請求項５】
前記第一の結合ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を有し、
・前記ＣＤＲ−Ｈ１が、
2018530996.tif 000349
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し；
・前記ＣＤＲ−Ｈ２が、
2018530996.tif 000350
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し；
・前記ＣＤＲ−Ｈ３が、
2018530996.tif 000351
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し；
・前記ＣＤＲ−Ｌ１が、
2018530996.tif 000352
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し；
・前記ＣＤＲ−Ｌ２が、
2018530996.tif 000353
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し；
・前記ＣＤＲ−Ｌ３が、
2018530996.tif 000354
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体構築物。
【請求項６】
前記第一の結合ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を有し、前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３が、
１６）配列番号１０４４〜１０４９；
１７）配列番号１０８６〜１０９１；
１８）配列番号１１４２〜１１４７；
１９）配列番号１１７０〜１１７５；
２０）配列番号１１８４〜１１８９；
２１）配列番号１２１２〜１２１７；
２２）配列番号１２２６〜１２３１；
２３）配列番号１２４０〜１２４５；
２４）配列番号１２５４〜１２５９；
２５）配列番号１２６８〜１２７３；
２６）配列番号１３３８〜１３４３；
２７）配列番号１３５２〜１３５７；
２８）配列番号１３６６〜１３７１；
２９）配列番号１４２２〜１４２７；及び
３０）配列番号１４３６〜１４４１；
に記載のものからなる群より選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体構築物。
【請求項７】
前記第一の結合ドメインが、配列番号１０５０、配列番号１０９２、配列番号１１４８、配列番号１１７６、配列番号１１９０、配列番号１２１８、配列番号１２３２、配列番号１２４６、配列番号１２６０、配列番号１２７４、配列番号１３４４、配列番号１３５８、配列番号１３７２、配列番号１４２８、及び配列番号１４４２に記載のものからなる群より選択されるＶＨ領域を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体構築物。
【請求項８】
前記第一の結合ドメインが、配列番号１０５１、配列番号１０９３、配列番号１１４９、配列番号１１７７、配列番号１１９１、配列番号１２１９、配列番号１２３３、配列番号１２４７、配列番号１２６１、配列番号１２７５、配列番号１３４５、配列番号１３５９、配列番号１３７３、配列番号１４２９、及び配列番号１４４３に記載のものからなる群より選択されるＶＬ領域を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体構築物。
【請求項９】
前記第一の結合ドメインが、配列番号１０５０＋１０５１、配列番号１０９２＋１０９３、配列番号１１４８＋１１４９、配列番号１１７６＋１１７７、配列番号１１９０＋１１９１、配列番号１２１８＋１２１９、配列番号１２３２＋１２３３、配列番号１２４６＋１２４７、配列番号１２６０＋１２６１、配列番号１２７４＋１２７５、配列番号１３４４＋１３４５、配列番号１３５８＋１３５９、番号１３７２＋１３７３、配列番号１４２８＋１４２９、及び配列番号１４４２＋１４４３に記載のＶＨ領域及びＶＬ領域の対からなる群より選択されるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体構築物。
【請求項１０】
前記第一の結合ドメインが、配列番号１０５２、配列番号１０９４、配列番号１１５０、配列番号１１７８、配列番号１１９２、配列番号１２２０、配列番号１２３４、配列番号１２４８、配列番号１２６２、配列番号１２７６、配列番号１３４６、配列番号１３６０、配列番号１３７４、配列番号１４３０、及び配列番号１４４４に記載のものからなる群より選択されるポリペプチドを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体構築物。
【請求項１１】
配列番号１０５３、配列番号１０９５、配列番号１１５１、配列番号１１７９、配列番号１１９３、配列番号１２２１、配列番号１２３５、配列番号１２４９、配列番号１２６３、配列番号１２７７、配列番号１３４７、配列番号１３６１、配列番号１３７５、配列番号１４３１、及び配列番号１４４５に記載のものからなる群より選択されるポリペプチドを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体構築物
【請求項１２】
配列番号１６９６、配列番号１７０２、配列番号１７１０、配列番号１７１４、配列番号１７１６、配列番号１７２０、配列番号１７２２、配列番号１７２４、配列番号１７２６、配列番号１７２８、配列番号１７３８、配列番号１７４０、配列番号１７４２、配列番号１７５０、及び配列番号１７５２に記載のものからなる群より選択されるポリペプチドを含むまたはこれからなる、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体構築物。
【請求項１３】
前記第一の結合ドメインが、マカクＣＤ７０、好ましくは、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）  ＣＤ７０にさらに結合する、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体構築物。
【請求項１４】
前記第二の結合ドメインが、ヒトＣＤ３イプシロンに、及びマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ  Ｏｅｄｉｐｕｓ）またはリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ）  ＣＤ３イプシロンに結合する、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体構築物。
【請求項１５】
前記抗体構築物が、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ単一ドメインｍＡｂ、ダイアボディ及び前述の形式のオリゴマーからなる群より選択される形式である、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体構築物。
【請求項１６】
先行請求項のいずれか一項に定義する抗体構築物をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１６に定義するポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１８】
請求項１６に定義する前記ポリヌクレオチドまたは請求項１７に定義するベクターで形質転換されたまたはこれがトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体構築物を産生するための方法であって、請求項１８に定義する宿主細胞を前記抗体構築物の発現を可能にする条件下で培養する工程、及び前記産生された抗体構築物を前記培養物から回収する工程を含む、前記方法。
【請求項２０】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体構築物または請求項１９に記載の方法に従って産生される抗体構築物を含む、医薬組成物。
【請求項２１】
腫瘍もしくはがん疾患または転移性がん疾患の予防、処置または寛解において使用するための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の、または請求項１９に記載の方法に従って産生される、前記抗体構築物。
【請求項２２】
腫瘍もしくはがん疾患または転移性がん疾患の処置または寛解のための方法であって、それを必要とする対象に、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の、または請求項１９に記載の方法に従って産生される抗体構築物を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２３】
前記腫瘍またはがん疾患が、腎臓、肺、膵臓、卵巣、乳房、結腸、頭頸部、胃、直腸、胸腺、及び脳の腫瘍またはがん、白血病、リンパ腫、メラノーマ、カポジ肉腫、胚性がん腫、及び前述のいずれかに由来する転移性がん疾患からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法または請求項２１に記載の抗体構築物。
【請求項２４】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体構築物、請求項１９に記載の方法に従って産生される抗体構築物、請求項１６に定義するポリヌクレオチド、請求項１７に定義するベクター、及び／または請求項１８に定義する宿主細胞を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的細胞の表面上にあるヒトＣＤ７０に結合する第一の結合ドメイン及びＴ細胞の表面上にあるヒトＣＤ３に結合する第二の結合ドメインを含む二重特異性抗体構築物に関する。さらには、本発明は、抗体構築物をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター及び前記ポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換されたまたはこれがトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。さらには、本発明は、本発明の抗体構築物を産生するためのプロセス、前記抗体構築物の医学的使用、及び前記抗体構築物を含むキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ７０（ＣＤ２７Ｌ、ＴＮＦＳＦ７）は、その正常な発現が活性化Ｔ細胞及びＢ細胞、成熟樹状細胞及び胸腺髄質上皮細胞のサブセットに制限されるＩＩ型膜内在性タンパク質である。ＣＤ７０の生物学的機能は、リンパ球及びＮＫ細胞上に発現されるＣＤ２７受容体への結合を介して媒介される。ＣＤ７０相互作用は、Ｂ細胞成熟、Ｔ細胞同時刺激及びメモリーＴ細胞機能を制御する。マウスにおけるＣＤ２７の遺伝的除去は、ＣＤ７０シグナル伝達を抑止し、Ｂ及びＴ細胞の発生に影響しないが、ウイルスの再攻撃に対するメモリー反応に干渉する。
【０００３】
その高く制限された通常発現に加えて、異常なＣＤ７０発現は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の６０％、淡明細胞型腎細胞がん（ｃｃＲＣＣ）の７０％、乳頭状ＲＣＣの４０％、ならびに膵臓腺がんの２５％、喉頭／咽頭がん腫の２２％、卵巣がん腫の１５％、及び肺腺がん及び膠芽腫の１０％において記述されている。
【０００４】
米国では毎年、１４，０８０人が転移性ＲＣＣのために死亡している（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ：Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｆｉｇｕｒｅｓ．２０１５）。全ての患者が、血管新生阻害剤（ベバシズマブ、スニチニブ、ソラフェニブ、アキシチニブ）またはｍＴＯＲ阻害剤（テムシロリムス、エベロリムス）で処置されているが、転移性ＲＣＣを有する患者の５年生存率は、依然として２０％と著しく低いままである（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ：Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｆｉｇｕｒｅｓ  ２０１５）。重大な未解決の医療需要がこの疾患に対して残っており、米国においてＣＤ７０発現転移性ｃｃＲＣＣを患う年間最大で１０，０００人の患者がＣＤ７０標的療法の恩恵を受け得る。
【０００５】
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）は、米国において年間２８，７４０件の新規症例を有する最大のＮＨＬ亜型である（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ：Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｆｉｇｕｒｅｓ，２０１５）。ＤＬＢＣＬ腫瘍の７１％がＣＤ７０を発現し、大半の患者が最初は標準治療（リツキサン＋シクロホスファミド、アドリアマイシン、ビンクリスチン、プレドニゾン）に反応するものの、多くが再発するかまたは難治性であり、１９，７９０人の患者が毎年この疾患のために亡くなっている（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ：Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｆｉｇｕｒｅｓ  ２０１５）。それゆえ、明確な未解決の医療的需要がＤＬＣＢＬに対して残っており、米国において、ＣＤ７０発現ＤＬＢＣＬを患う年間最大で１４，０００人の患者がＣＤ７０標的療法の恩恵を受け得る。
【０００６】
米国において、毎年、膵臓（４０，５６０）、喉頭及び咽頭（６，３００）、卵巣（１４，１８０）、及び肺（１５８，０００）がん腫のために亡くなっている患者の数（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ：Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｆｉｇｕｒｅｓ，２０１５）に基づき、そしてこれらのがん型におけるＣＤ７０発現の発症率を考慮すると、米国においてＣＤ７０発現固形腫瘍を患う未解決の医療需要を有する年間最大で３０，０００人のさらなる患者がＣＤ７０標的療法の恩恵を受け得る。
【発明の概要】
【０００７】
上に論じるものなどの、ＣＤ７０の過剰発現に関連するがん疾患の処置のために利用可能なさらなる選択肢を有することに対する必要性が依然としてあるため、本明細書に、二重特異性ＣＤ７０×ＣＤ３抗体構築物の形態で、この問題の解決のための手段及び方法を提供する。
【０００８】
ゆえに、第一の態様では、本発明は、標的細胞の表面上にあるヒトＣＤ７０に結合する第一の結合ドメイン及びＴ細胞の表面上にあるヒトＣＤ３に結合する第二の結合ドメインを含む二重特異性抗体構築物を提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書で用いるとき、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の言及を含むことに留意されなければならない。ゆえに、例えば、「試薬」に対する言及は、１つまたは複数のそのような異なる試薬を含み、「方法」に対する言及は、本明細書に記載の方法に関して修正または置換することができる当業者に公知の同等の工程及び方法に対する言及を含む。
【００１０】
別段の指示がない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、この一連のあらゆる要素に言及すると理解されたい。当業者は、慣例の実験以上を使用せずに、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するまたは確認することができるだろう。そのような等価物は、本発明に包含されると意図される。
【００１１】
「及び（ならびに）／または（もしくは）」という用語は、本明細書のいずれの場所で使用される場合においても、「及び（ならびに）」、「または（もしくは）」及び「前記用語によって接続される要素の全てまたは任意の他の組み合わせ」の意味を含む。
【００１２】
本明細書で使用される「約」または「おおよそ」という用語は、所与の値または範囲の±２０％以内、好ましくは±１５％以内、より好ましくは±１０％以内、最も好ましくは±５％以内を意味する。
【００１３】
本明細書及び特許請求の範囲を通して、文脈がそうでないことを必要としない限り、「含む」という単語、及び「含む」「含んでいる」などの派生語は、言及されている整数値または工程または整数値もしくは工程のグループを含むが、任意のその他の整数値または工程または整数値もしくは工程のグループを排除しないことを暗に示すものと理解されるだろう。本明細書で用いるとき、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」もしくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」で、または本明細書で用いるとき、場合によっては「有する（ｈａｖｉｎｇ）」で置き換えることができる。
【００１４】
本明細書で用いるとき、「からなる」は、特許請求の範囲の要素において指定されていない任意の要素、工程、または成分を除外する。本明細書で用いるとき、「から本質的になる」は、特許請求の範囲の基本的及び新規の特性に物質的に影響しない物質または工程を除外しない。
【００１５】
本明細書の各例において、「含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という用語はいずれも、他の２つの用語のいずれかと置き換えられ得る。
【００１６】
「抗体構築物」という用語は、その構造及び／または機能が、例えば、完全長または全免疫グロブリン分子の、抗体の構造及び／または機能に基づく、分子を表す。従って、抗体構築物は、その特異的標的または抗原に結合することができる。さらには、本発明に従う抗体構築物は、標的結合を可能にする抗体の最小構造要件を含む。この最小要件は、例えば、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわちＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）及び／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわちＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）、好ましくは、全６つのＣＤＲの存在により定義され得る。本発明の構築物がベースとする抗体には、例えば、モノクローナル、組換え、キメラ、脱免疫化、ヒト化及びヒト抗体が含まれる。
【００１７】
本発明に従う「抗体構築物」の定義には、生物工学的またはタンパク質操作方法またはプロセスにより生成されるラクダ抗体及び他の免疫グロブリン抗体も含む完全長または全抗体が含まれる。これらの完全長抗体は、例えば、モノクローナル、組換え、キメラ、脱免疫化、ヒト化及びヒト抗体であり得る。「抗体構築物」の定義には、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ、（ｓ）ｄＡｂ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または「ｒ  ＩｇＧ」（「半抗体」）などの完全長抗体の断片も含まれる。本発明に従う抗体構築物は、抗体の修飾された断片でもあり得、変異体とも呼ばれ、例えば、ｓｃＦｖ、ｄｉ−ｓｃＦｖまたはｂｉ（ｓ）−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−ジッパー、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ’ｓ）、タンデムｄｉ−ｓｃＦｖ、タンデムｔｒｉ−ｓｃＦｖ、以下：（ＶＨ−ＶＬ−ＣＨ３）２、（ｓｃＦｖ−ＣＨ３）２、（（ｓｃＦｖ）２−ＣＨ３＋ＣＨ３）、（（ｓｃＦｖ）２−ＣＨ３）または（ｓｃＦｖ−ＣＨ３−ｓｃＦｖ）２のような構造に例示される「ミニボディ」、トリアボディまたはテトラボディなどのマルチボディ、及び他のＶ領域またはドメインから独立して抗原またはエピトープに特異的に結合するＶＨＨ、ＶＨまたはＶＬであり得る可変ドメインを１つのみ含むナノボディまたは単一可変ドメイン抗体などの単一ドメイン抗体が含まれる。本発明に従う抗体構築物のさらに好ましい形式は、クロスボディ、マキシボディ、ヘテロＦｃ構築物及びモノＦｃ構築物である。これらの形式の例は、本明細書下記に記載されるだろう。
【００１８】
結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を典型的に含み得る；しかし、両方ともを含む必要はない。Ｆｄ断片は、例えば、２つのＶＨ領域を有し、しばしばインタクトな抗原結合ドメインのいくつかの抗原結合機能を保持する。抗体断片、抗体変異体または結合ドメインの形式の追加の例としては、（１）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインを有する一価断片；（２）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を有する二価断片；（３）２つのＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片；（４）抗体のシングルアームのＶＬ及びＶＨドメインを有するＦｖ断片、（５）ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）、これは、ＶＨドメインを有する；（６）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び（７）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられ、後者が好ましい（例えば、ｓｃＦｖ−ライブラリーに由来する）。本発明に従う抗体構築物の実施形態の例は、例えば、ＷＯ００／００６６０５、ＷＯ２００５／０４０２２０、ＷＯ２００８／１１９５６７、ＷＯ２０１０／０３７８３８、ＷＯ２０１３／０２６８３７、ＷＯ２０１３／０２６８３３、ＵＳ２０１４／０３０８２８５、ＵＳ２０１４／０３０２０３７、ＷＯ２０１４／１４４７２２、ＷＯ２０１４／１５１９１０、及びＷＯ２０１５／０４８２７２に記載されている。
【００１９】
さらには、「抗体構築物」という用語の定義は、一価、二価及び多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ／ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）構築物及び、ゆえに、１つのみの抗原性構造に特異的に結合する単一特異的構築物、ならびに２つ以上、例えば、２つ、３つまたはそれ以上の抗原性構造に別個の結合ドメインを通して特異的に結合する二重特異性及び多重特異的（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ／ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）構築物を含む。さらには、「抗体構築物」という用語の定義は、１つのみのポリペプチド鎖からなる分子ならびに２つ以上のポリペプチド鎖からなる分子、これらの鎖は、同一（ホモ二量体、ホモ三量体またはホモオリゴマー）または異なる（ヘテロ二量体、ヘテロ三量体またはヘテロオリゴマー）ことができる、を含む。上記同定された抗体及びその変異体または誘導体の例は、特に、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）及びＵｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９），Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２ｎｄ  ｅｄ．２０１０及びＬｉｔｔｌｅ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００９に記載されている。
【００２０】
本発明の抗体構築物は、好ましくは、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成された抗体構築物」である。この用語は、上記定義に従う抗体構築物を表し、その可変領域（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ）の全てまたは一部は、非免疫細胞選択、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏファージディスプレイ、タンパク質チップまたは候補配列を抗原に結合するそれらの能力について検査することができる任意の他の方法において生成される。ゆえに、この用語は、好ましくは、動物の免疫細胞におけるゲノム再編成によってのみ生成される配列を除外する。「組換え抗体」は、組換えＤＮＡ技術または遺伝子工学の使用を通して作成される抗体である。
【００２１】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）またはモノクローナル抗体構築物という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を表す、すなわち、その集団を構成している個々の抗体は、微量で存在し得る潜在的な自然変異及び／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位または抗原の決定基に対して向けられており、それは、異なる決定基（またはエピトープ）に対して向けられた異なる抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的である。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらがハイブリドーマ培養によって合成され、ゆえに他の免疫グロブリンが混入していないという利点がある。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示しており、その抗体が任意の特定の方法によって製造されることを必要とするものとは解釈されない。
【００２２】
モノクローナル抗体の調製のために、連続的な細胞株培養により産生される抗体を提供する任意の技術を使用することができる。例えば、使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法により作成されてよく、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）によって作成されてよい。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのさらなる技術の例としては、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４（１９８３），７２）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５），７７−９６）が挙げられる。
【００２３】
次いで、ハイブリドーマを、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）及び表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））分析などの標準的な方法を使用してスクリーニングして、特定の抗原と特異的に結合する抗体を産生する１つまたは複数のハイブリドーマを同定することができる。任意の形態の関連する抗原を、免疫原として、例えば、組換え抗原、天然に存在する形態、その任意の変異体または断片、ならびにその抗原性ペプチドとして使用してよい。ＢＩＡｃｏｒｅシステムにおいて採用される表面プラズモン共鳴を使用して、ＣＤ７０またはＣＤ３イプシロンなどの標的抗原のエピトープに結合するファージ抗体の有効性を増大させることができる。（Ｓｃｈｉｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ７（１９９６），９７−１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３（１９９５），７−１３）。
【００２４】
モノクローナル抗体を作成する別の例示的な方法には、タンパク質発現ライブラリー、例えば、ファージディスプレイまたはリボソームディスプレイライブラリーをスクリーニングすることが含まれる。ファージディスプレイは、例えば、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，２２３，４０９号；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７，Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されている。
【００２５】
ディスプレイライブラリーの使用に加えて、関連する抗原を使用して、非ヒト動物、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ハムスター、ウサギまたはラット）に免疫付与することができる。一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、マウス抗体産生を欠くマウス系統をヒトＩｇ（免疫グロブリン）遺伝子座の大断片を用いて操作することは可能である。ハイブリドーマ技術を使用して、所望の特異性を有する遺伝子に由来する抗原特異的モノクローナル抗体を産生及び選択してよい。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１、ＵＳ２００３−００７０１８５、ＷＯ９６／３４０９６、及びＷＯ９６／３３７３５を参照されたい。
【００２６】
モノクローナル抗体は、非ヒト動物から得ることもでき、次いで、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技術を使用して、修飾する、例えば、ヒト化する、脱免疫化する、キメラにする等ができる。修飾された抗体構築物の例には、非ヒト抗体のヒト化変異体、「親和性成熟」抗体（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４，８８９−８９６（１９９２）及びＬｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０，１０８３２−  １０８３７（１９９１）を参照されたい）及びエフェクター機能（複数可）を改変した抗体突然変異体（例えば、米国特許第５，６４８，２６０号、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ（２０１０）、前掲書及びＬｉｔｔｌｅ（２００９）、前掲書を参照されたい）が含まれる。
【００２７】
免疫学では、親和性成熟は、Ｂ細胞が、免疫反応の過程で抗原に対する親和性が増加した抗体を産生するプロセスである。同じ抗原に反復曝露することで、宿主は、連続的により大きな親和性の抗体を産生するだろう。天然の原型のように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ親和性成熟は、突然変異及び選択の原理に基づく。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ親和性成熟は、抗体、抗体構築物、及び抗体断片を最適化するための使用に成功している。ＣＤＲ内のランダム突然変異は、放射線、化学的突然変異誘発物質またはエラープローンＰＣＲを使用して導入される。加えて、遺伝的多様性は、チェーンシャッフリングにより増大することができる。ファージディスプレイなどのディスプレイ法を使用する２または３ラウンドの突然変異及び選択は、通常、低ナノモル範囲の親和性を有する抗体断片をもたらす。
【００２８】
抗体構築物の好ましいタイプのアミノ酸置換変異体（ｖａｒｉａｎａｔｉｏｎ）は、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つまたは複数の超可変領域残基の置換を必然的に含む。通常、さらなる開発のために選択される結果得られる変異体（複数可）は、それらを生成した親抗体と比べて改善された生物学的特性を有するだろう。そのような置換変異体を生成する好都合な方法は、ファージディスプレイを用いる親和性成熟を必然的に含む。簡潔には、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）を、各部位で全ての可能性のあるアミノ酸置換を生成するように変異させる。そのようにして生成された抗体変異体は、繊維状ファージ粒子から一価の様式で、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合物として提示される。ファージディプレイされた変異体は次いで、本明細書に開示されるように、それらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための超可変領域部位候補を同定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発を行って、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定することができる。あるいは、または加えて、結合ドメインと例えば、ヒトＣＤ７０との間の接触点を同定するために、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することが有益であり得る。そのような接触残基及び隣接残基は、本明細書で詳述される技術にしたがう置換の候補である。一度そのような変異体が生成されたら、変異体のパネルは本明細書に記載されるスクリーニングに供され、そして１つまたは複数の関連するアッセイにおいて優れた特性を示す抗体が、さらなる開発のために選択され得る。
【００２９】
本発明のモノクローナル抗体及び抗体構築物は、具体的に、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、その鎖（複数可）の残りの部分が別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびに、所望の生物学的活性を示す限り、かかる抗体の断片を含む（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書における関心対象のキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿等）由来の可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む。キメラ抗体を作成するための様々な手法が記載されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１  ，１９８５；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２，１９８５，Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号；Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号；Ｔａｎａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＰ０１７１４９６；ＥＰ０１７３４９４；及びＧＢ２１７７０９６を参照されたい。
【００３０】
抗体、抗体構築物、抗体断片または抗体変異体は、例えば、ＷＯ９８／５２９７６またはＷＯ００／３４３１７に開示される方法によるヒトＴ細胞エピトープの特異的欠失（「脱免疫化」と呼ばれる方法）によっても修飾され得る。簡潔には、抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインを、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて分析することができる；これらのペプチドは、（ＷＯ９８／５２９７６及びＷＯ００／３４３１７で定義される）潜在的Ｔ細胞エピトープを表す。ＷＯ９８／５２９７６及びＷＯ００／３４３１７に記載されるように、潜在的Ｔ細胞エピトープの検出のために、「ペプチドスレッディング（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」と呼ばれるコンピューターモデリング手法を適用することができ、加えて、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースを、ＶＨ及びＶＬ配列に存在するモチーフについて検索することができる。これらのモチーフは、１８個の主要ＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲアロタイプのいずれかに結合し、ゆえに、潜在的Ｔ細胞エピトープを構成する。検出された潜在的Ｔ細胞エピトープは、可変ドメイン内の少数のアミノ酸残基を置換することによって、または好ましくは単一アミノ酸置換によって除去することができる。典型的には、保存的置換が行われる。全てではないが多くの場合、ヒト生殖細胞系列抗体配列内の位置で一般的なアミノ酸を使用してよい。ヒト生殖細胞系列配列は、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  Ｖｏｌ．１６（５）：２３７−２４２；及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：１４：４６２８−４６３８に開示されている。Ｖ  ＢＡＳＥディレクトリは、（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ＬＡ．ｅｔ  ａｌ．ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫによってコンパイルされた）ヒト免疫グロブリン可変領域配列の総合的なディレクトリを提供する。これらの配列は、例えば、フレームワーク領域及びＣＤＲのための、ヒト配列の供給源として使用することができる。例えば、米国特許第６，３００，０６４号に記載されるように、コンセンサスヒトフレームワーク領域も使用することができる。
【００３１】
「ヒト化」抗体、抗体構築物、変異体またはその断片（例えば、抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または他の抗原結合部分配列）は、大部分がヒト配列である抗体または免疫グロブリンであり、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列（複数可）を含有する。その大部分に関して、ヒト化抗体は、そのレシピエントの超可変領域（またはＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト（例えば、げっ歯類）種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、ハムスターまたはウサギの超可変領域からの残基により置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられる。さらには、本明細書で使用される「ヒト化抗体」は、レシピエント抗体またはドナー抗体のいずれにおいても見出されない残基も含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに洗練及び最適化するためになされる。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのもの、の少なくとも一部分も含み得る。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【００３２】
ヒト化抗体またはその断片は、抗原結合に直接関与しないＦｖ可変ドメインの配列を、ヒトＦｖ可変ドメインからの等価な配列で置き換えることによって生成することができる。ヒト化抗体またはその断片を生成するための例示的な方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７によって；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４によって；ならびにＵＳ５，５８５，０８９；ＵＳ５，６９３，７６１；ＵＳ５，６９３，７６２；ＵＳ５，８５９，２０５；及びＵＳ６，４０７，２１３によって提供される。これらの方法は、重鎖または軽鎖の少なくとも１つからの免疫グロブリンＦｖ可変ドメインの全てまたは一部をコードする核酸配列の単離、操作及び発現を含む。そのような核酸は、上記のような、所定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマから、ならびにその他の供給源から取得され得る。ヒト化抗体分子をコードする組換えＤＮＡは、次いで、適切な発現ベクターにクローニングすることができる。
【００３３】
ヒト化抗体はまた、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子を発現するが、内因性マウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子を発現することができないトランスジェニック動物、例えば、マウスを用いて産生され得る。Ｗｉｎｔｅｒは、本明細書に記載のヒト化抗体の調製に使用され得る例示的なＣＤＲ移植法を記載している（米国特許第５，２２５，５３９号）。特定のヒト抗体のＣＤＲの全てが非ヒトＣＤＲの少なくとも一部で置き換えられてよく、またはＣＤＲの一部のみが非ヒトＣＤＲで置き換えられてもよい。所定の抗原に対するヒト化抗体の結合に必要である数のＣＤＲを置き換えることのみが必要とされる。
【００３４】
ヒト化抗体は、保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖細胞系列置換及び／または復帰突然変異の導入によって最適化することができる。そのような改変された免疫グロブリン分子は、当技術分野で公知のいくつかの技術のいずれかによって作成することができる（例えば、Ｔｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：７３０８−７３１２，１９８３；Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２７９，１９８３；Ｏｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２：３−１６，１９８２、及びＥＰ  ２３９  ４００）。
【００３５】
「ヒト抗体」、「ヒト抗体構築物」及び「ヒト結合ドメイン」という用語は、例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）（前掲書）によって記載されたものを含む、当技術分野で公知のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に実質的に対応する抗体領域、例えば、可変及び定常領域またはドメインを有する、抗体、抗体構築物及び結合ドメインを含む。本発明のヒト抗体、抗体構築物または結合ドメインは、例えば、ＣＤＲにおいて、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によってまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）を含み得る。ヒト抗体、抗体構築物または結合ドメインは、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基で置き換えられた、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の位置を有し得る。本明細書で使用されるヒト抗体、抗体構築物及び結合ドメインの定義は、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅなどの技術またはシステムを使用することによって得ることができる、非人工的及び／または遺伝的に改変された抗体のヒト配列のみを含む、完全ヒト抗体も企図する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体構築物は、「単離された」または「実質的に純粋な」抗体構築物である。「単離された」または「実質的に純粋」は、本明細書に開示される抗体構築物を表現するために使用される場合、その産生環境の成分から同定、分離及び／または回収された抗体構築物を意味する。好ましくは、抗体構築物は、その産生環境由来の全ての他の成分を付随しないまたは実質的に付随しない。その産生環境の混入成分、例えば、組換えトランスフェクト細胞から発生する成分は、典型的にそのポリペプチドの診断または治療用途と干渉するだろう物質であり、酵素、ホルモン及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。抗体構築物は、例えば、所与の試料において総タンパク質の少なくとも約５重量％、または少なくとも約５０重量％を構成し得る。単離されたタンパク質は、その環境に応じて、総タンパク質含量の５重量％〜９９．９重量％を構成し得ることが理解される。ポリペプチドは、それが増加した濃度レベルで作成されるように、誘導性プロモーターまたは高発現プロモーターの使用を通して有意に高い濃度で生成され得る。この定義は、当技術分野で公知の幅広い生物及び／または宿主細胞における抗体構築物の産生を含む。好ましい実施形態では、抗体構築物は、（１）スピニングカップシークエネーターの使用によりＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（２）クマシーブルー、もしくは好ましくは銀染色を用いる非還元もしくは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質になるまで精製される。しかし、通常、単離された抗体構築物は、少なくとも１つの精製工程によって調製されるだろう。
【００３７】
「結合ドメイン」という用語は、本発明との関係で、所与の標的エピトープまたは標的分子上の所与の標的部位（抗原）、ここではそれぞれ、ＣＤ７０及びＣＤ３に（特異的に）結合する／それらと相互作用する／それらを認識するドメインを特徴決定する。（ＣＤ７０を認識する）第一の結合ドメインの構造及び機能、ならびに好ましくは（ＣＤ３を認識する）第二の結合ドメインの構造及び／または機能もまた、抗体の、例えば、完全長または全免疫グロブリン分子の構造及び／または機能に基づく。本発明に従い、第一の結合ドメインは、３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）及び／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）の存在を特徴とする。第二の結合ドメインは、好ましくは、標的結合を可能にする抗体の最小構造要件も含む。より好ましくは、第二の結合ドメインは、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）及び／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。第一及び／または第二の結合ドメインは、既存の（モノクローナル）抗体からのＣＤＲ配列をスキャフォールドに移植するよりむしろファージディスプレイまたはライブラリスクリーニング法によって産生されるまたは入手可能であることが想定される。
【００３８】
本発明に従って、結合ドメインは、１つまたは複数のポリペプチドの形態である。このようなポリペプチドは、タンパク質性の部分及び非タンパク質性の部分（例えば、化学リンカーまたは化学的架橋剤、例えば、グルタルアルデヒド）を含んでよい。タンパク質（その断片、好ましくは、生物学的に活性な断片、及びペプチド、通常は、３０個未満のアミノ酸を有する、を含む）は、（アミノ酸の鎖をもたらす）共有ペプチド結合を介して互いに連結した２つ以上のアミノ酸を含む。本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、通常３０個を超えるアミノ酸からなる分子の群を表す。ポリペプチドは、多量体、例えば、二量体、三量体及びより高次のオリゴマーを形成し得る、すなわち、２つ以上のポリペプチド分子からなり得る。そのような二量体、三量体等を形成するポリペプチド分子は、同一または非同一であり得る。その結果、そのような多量体の対応する高次構造は、ホモまたはヘテロ二量体、ホモまたはヘテロ三量体等と称される。ヘテロ多量体の例は、その天然形態において、２つの同一の軽ポリペプチド鎖及び２つの同一の重ポリペプチド鎖からなる抗体分子である。「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語はまた、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等のような翻訳後修飾による修飾がなされた天然修飾ペプチド／ポリペプチド／タンパク質を表す。本明細書における「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」はまた、化学修飾、例えば、ペグ化されたものであり得る。そのような修飾は、当技術分野で周知であり、本明細書下記に記載される。
【００３９】
好ましくは、ＣＤ７０に結合する結合ドメイン及び／またはＣＤ３に結合する結合ドメインは、ヒト結合ドメインである。少なくとも１つのヒト結合ドメインを含む抗体及び抗体構築物は、非ヒト、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスターまたはウサギ）可変及び／または定常領域を有する抗体または抗体構築物に関連する問題のいくつかを回避する。このようなげっ歯類由来のタンパク質の存在は、抗体または抗体構築物の迅速なクリアランスをもたらし得るかまたは患者による抗体または抗体構築物に対する免疫反応の生成をもたらし得る。げっ歯類由来の抗体または抗体構築物の使用を回避するために、ヒトまたは完全ヒト抗体／抗体構築物を、げっ歯類が完全ヒト抗体を産生するように、ヒト抗体機能のげっ歯類への導入を通して生成することができる。
【００４０】
メガベースサイズのヒト遺伝子座をＹＡＣ中にクローニング及び再構築するならびにそれらをマウス生殖細胞系列に導入する能力は、非常に大きいまたは大まかにマッピングされた遺伝子座の機能的要素の解明ならびにヒト疾患の有用なモデルの作製に対する強力な手法を提供する。さらには、マウス遺伝子座をそれらのヒト等価物で置換するためのこのような技術の利用は、発生過程におけるヒト遺伝子産物の発現及び制御、それらの他の系との連絡、ならびに疾患の誘導及び進行におけるそれらの関与に関して独自の洞察を提供することができる。
【００４１】
そのような戦略の重要な応用は、マウス液性免疫系の「ヒト化」である。内因性Ｉｇ遺伝子が不活性化されているマウスへのヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の導入は、抗体のプログラムされた発現及び構築ならびにＢ細胞の発生におけるそれらの役割の根底にあるメカニズムを研究する機会を提供する。さらには、そのような戦略は、ヒト疾患における抗体療法の可能性を実現する上で重要なマイルストーンである完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の産生のための理想的な供給源を提供し得る。完全ヒト抗体または抗体構築物は、マウスまたはマウス由来ｍＡｂに固有の免疫原性及びアレルギー反応を最小化すること、ゆえに、投与される抗体／抗体構築物の有効性及び安全性を向上させることが期待される。完全ヒト抗体または抗体構築物の使用は、反復的な化合物投与を必要とする慢性及び再発性のヒト疾患、例えば、炎症、自己免疫及びがんの処置において実質的な利益を提供することが期待され得る。
【００４２】
この目的を目指す１つの手法は、マウスがマウス抗体の非存在下でヒト抗体の大レパートリーを産生することを期待して、マウス抗体産生性を欠くマウス系統をヒトＩｇ遺伝子座の大断片を用いて操作することであった。大きなヒトＩｇ断片は、大きな可変遺伝子多様性ならびに抗体産生及び発現の適切な調節を保存するであろう。抗体の多様化及び選択ならびにヒトタンパク質に対する免疫寛容の欠如のためにマウス機構を利用することによって、これらのマウス系統において再現されたヒト抗体レパートリーは、ヒト抗原を含む関心対象の任意の抗原に対する高親和性抗体を生ずるはずである。ハイブリドーマ技術を使用することで、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトｍＡｂを容易に産生及び選択することができる。この一般的な戦略は、最初のＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウス系統の生成と関連して実証された（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１（１９９４）を参照されたい）。このＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統は、それぞれコア可変及び定常領域配列を含むヒト重鎖遺伝子座及びカッパ軽鎖遺伝子座の２４５ｋｂ及び１９０ｋｂサイズの生殖細胞系列構成断片を含有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）を用いて操作された。このヒトＩｇ含有ＹＡＣは、抗体の再編成及び発現の両方に関してマウス系と適合することが証明され、不活性化されたマウスＩｇ遺伝子と置き換えることができた。これは、Ｂ細胞の発生を誘導して、完全ヒト抗体の成体様ヒトレパートリーを産生し、そして抗原特異的ヒトｍＡｂを生成するそれらの能力によって実証された。これらの結果はまた、多数のＶ遺伝子、追加の調節エレメント、及びヒトＩｇ定常領域を含有するヒトＩｇ遺伝子座の大部分の導入が、感染及び免疫付与に対するヒト液性反応に特徴的である実質的に完全なレパートリーを再現し得ることを示唆した。Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．の成果は、近年、それぞれヒト重鎖遺伝子座及びカッパ軽鎖遺伝子座のメガベースサイズの生殖系構成ＹＡＣ断片の導入を通したヒト抗体レパートリーのおおよそ８０％超の導入に拡張された。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）及び米国特許出願番号第０８／７５９，６２０号を参照されたい。
【００４３】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウスの産生は、米国特許出願番号第０７／４６６，００８号、同第０７／６１０，５１５号、同第０７／９１９，２９７号、同第０７／９２２，６４９号、同第０８／０３１，８０１号、同第０８／１１２，８４８号、同第０８／２３４，１４５号、同第０８／３７６，２７９号、同第０８／４３０，９３８号、同第０８／４６４，５８４号、同第０８／４６４，５８２号、同第０８／４６３，１９１号、同第０８／４６２，８３７号、同第０８／４８６，８５３号、同第０８／４８６，８５７号、同第０８／４８６，８５９号、同第０８／４６２，５１３号、同第０８／７２４，７５２号、及び同第０８／７５９，６２０号；ならびに米国特許第６，１６２，９６３号；同第６，１５０，５８４号；同第６，１１４，５９８号；同第６，０７５，１８１号、及び同第５，９３９，５９８号ならびに日本特許第３  ０６８  １８０号Ｂ２、同第３  ０６８  ５０６号Ｂ２、及び同第３  ０６８  ５０７号Ｂ２にさらに記載及び描写されている。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）及びＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５（１９９８）、ＥＰ  ０  ４６３  １５１  Ｂ１、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ００／７６３１０、及びＷＯ０３／４７３３６も参照されたい。
【００４４】
代替の手法では、ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，を含むその他は、「ミニ遺伝子座」手法を活用している。ミニ遺伝子座手法では、外因性Ｉｇ遺伝子座は、Ｉｇ遺伝子座からの小片（個々の遺伝子）を含むことを通して模倣される。ゆえに、１つまたは複数のＶＨ遺伝子、１つまたは複数のＤＨ遺伝子、１つまたは複数のＪＨ遺伝子、ミュー定常領域、及び第二の定常領域（好ましくは、ガンマ定常領域）が、動物への挿入のための構築物に形成される。この手法は、米国特許第５，５４５，８０７号（Ｓｕｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）ならびに米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，６２５，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，７７０，４２９号；同第５，７８９，６５０号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８７７，３９７号；同第５，８７４，２９９号；同第６，２５５，４５８（それぞれＬｏｎｂｅｒｇ及びＫａｙ）、米国特許第５，５９１，６６９及び同第６，０２３．０１０号（Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ及びＢｅｒｎｓ）、米国特許第５，６１２，２０５号；同第５，７２１，３６７号；及び同第５，７８９，２１５号（Ｂｅｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．）、ならびに米国特許第５，６４３，７６３（Ｃｈｏｉ及びＤｕｎｎ）、ならびにＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ米国特許出願番号第０７／５７４，７４８号、同第０７／５７５，９６２号、同第０７／８１０，２７９号、同第０７／８５３，４０８号、同第０７／９０４，０６８号、同第０７／９９０，８６０号、同第０８／０５３，１３１号、同第０８／０９６，７６２号、同第０８／１５５，３０１号、同第０８／１６１，７３９号、同第０８／１６５，６９９号、同第０８／２０９，７４１に記載されている。ＥＰ  ０  ５４６  ０７３  Ｂ１、ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９２／２２６４５、ＷＯ９２／２２６４７、ＷＯ９２／２２６７０、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／００５６９、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９６／１４４３６、ＷＯ９７／１３８５２、及びＷＯ９８／２４８８４ならびに米国特許第５，９８１，１７５号も参照されたい。さらにＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）、Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、及びＴｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）をさらに参照されたい。
【００４５】
Ｋｉｒｉｎも、微細胞融合を通して、染色体の大きな欠片、または染色体全体が導入されているマウスからのヒト抗体の生成を実証している。欧州特許出願第７７３  ２８８号及び同第８４３  ９６１号を参照されたい。Ｘｅｎｅｒｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓは、ヒト抗体の可能性のある生成のための技術を開発している。この技術では、ＳＣＩＤマウスは、ヒトリンパの細胞、例えば、Ｂ及び／またはＴ細胞で再構築される。次いで、マウスは、抗原で免疫付与され、抗原に対する免疫反応を生成することができる。米国特許第５，４７６，９９６号；同第５，６９８，７６７号；及び同第５，９５８，７６５号を参照されたい。
【００４６】
ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応は、産業界がキメラまたはそれ以外のヒト化抗体を調製する要因となった。しかしながら、ある特定のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）反応が、特にこの抗体の慢性的なまたは多用量の利用において観察されるであろうと予想される。ゆえに、ＨＡＭＡまたはＨＡＣＡ反応の懸念及び／または影響を取り除くために、ＣＤ７０に対するヒト結合ドメイン及び／またはＣＤ３に対するヒト結合ドメインを含む抗体構築物を提供することが望ましいだろう。
【００４７】
本発明の文脈において生成された二重特異性抗体構築物のＣＤ７０結合ドメインは、実施例２に記載のように、それらのエピトープ特異性について特徴決定された。結合因子は、フローサイトメトリー読み出しにおいて結合の喪失が観察されたキメラＣＤ７０分子に応じて、異なる群（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＩＩｖ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩ−表４を参照されたい）へと分類された。従って、好ましい実施形態に従い、本発明の抗体構築物の第一の結合ドメインは、領域名Ｅ３（配列番号７４５に記載の領域）内に含まれるＣＤ７０のエピトープに結合する。以下に記載するように、領域Ｅ３を認識する結合ドメインは、追加のＣＤ７０領域を認識し得る。
【００４８】
本発明の抗体構築物の第一の結合ドメインが、
ａ）領域Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４及びＥ６、
ｂ）領域Ｅ２、Ｅ３及びＥ４、
ｃ）領域Ｅ２、Ｅ３及びＥ６、
ｄ）領域Ｅ２及びＥ３、
ｅ）領域Ｅ３、Ｅ４及びＥ６、
ｆ）領域Ｅ３及びＥ４、及び
ｇ）領域Ｅ３及びＥ６
からなる群より選択されるＣＤ７０領域の組み合わせ内に含まれるＣＤ７０のエピトープに結合することがさらに想定される。
【００４９】
抗ＣＤ７０結合ドメインにより認識されるエピトープは、直鎖または立体構造的であってよい。ヒトＣＤ７０タンパク質内での上記の領域Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４及びＥ６の位置ならびにそれらの配列識別子（ｉｄｅｎｔｉｆｙｅｒ）を、実施例１に記載する。
【００５０】
さらに好ましい実施形態では、本発明の抗体構築物の第一の結合ドメインは、領域名Ｅ１内に含まれるエピトープに結合しない。本発明の抗体構築物の第一の結合ドメインが、領域名Ｅ７内に含まれるエピトープに結合しないことが、加えてまたは代替として、想定される。
【００５１】
「に（特異的に）結合する」、「（特異的に）認識する」、「に（特異的に）指向される」、及び「と（特異的に）反応する」という用語は、本発明に従って、結合ドメインが、所与のエピトープまたは標的分子（抗原）上の所与の標的部位、ここでは：それぞれ、ＣＤ７０及びＣＤ３と相互作用するまたは特異的に相互作用することを意味する。
【００５２】
「エピトープ」という用語は、結合ドメイン、抗体もしくは免疫グロブリン、または抗体もしくは免疫グロブリンの誘導体、断片もしくは変異体が特異的に結合する抗原上の部位を表す。「エピトープ」は抗原性であり、ゆえに、エピトープという用語は本明細書において「抗原性構造」または「抗原性決定基」も表す場合がある。ゆえに、結合ドメインは、「抗原相互作用部位」である。前記結合／相互作用はまた、「特異的認識」を定義することが理解されている。
【００５３】
「エピトープ」は、連続アミノ酸またはタンパク質の三次元折り畳みによって並置される非連続アミノ酸の両方によって形成することができる。「直線状エピトープ」は、アミノ酸一次配列が認識されるエピトープを含むエピトープである。直線状エピトープは、典型的に、固有の配列内に、少なくとも３つまたは少なくとも４つ、及びより一般には少なくとも５つまたは少なくとも６つまたは少なくとも７つ、例えば、約８〜約１０のアミノ酸を含む。
【００５４】
「立体構造エピトープ」は、直線状エピトープと対照的に、エピトープを含むアミノ酸の一次配列が、認識されるエピトープの唯一の定義要素ではないエピトープ（例えば、アミノ酸の一次配列が必ずしも結合ドメインによって認識されないエピトープ）である。典型的に、立体構造エピトープは、直線状エピトープよりも含むアミノ酸の数が多い。立体構造エピトープの認識に関して、結合ドメインは、抗原、好ましくはペプチドもしくはタンパク質またはそれらの断片の三次元構造を認識する（本発明に関しては、第一の結合ドメインに対する抗原性構造は、ＣＤ７０タンパク質内に含まれる）。例えば、タンパク質分子が折り畳まれて三次元構造が形成される場合、立体構造エピトープを形成するある特定のアミノ酸及び／またはポリペプチド骨格は並置した状態になり、それによって抗体はそのエピトープを認識できるようになる。エピトープの立体構造を決定する方法は、ｘ線結晶解析、二次元核磁気共鳴（２Ｄ−ＮＭＲ）分光分析及び部位特異的スピンラベル及び電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光分析を含むがこれらに限定されない。
【００５５】
エピトープマッピングするための方法を以下に記載する：ヒトＣＤ７０タンパク質中の領域（連続アミノ酸ストレッチ）が、非ヒト及び非霊長類ＣＤ７０抗原（例えば、マウスＣＤ７０、しかし他の例えば、ニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギ等も考えられ得る）のその対応する領域と交換／置き換えられるとき、結合ドメインが使用される非ヒト、非霊長類ＣＤ７０に対して交差反応しない限り、結合ドメインの結合において低減が生じると予想される。前記低減は、ヒトＣＤ７０タンパク質におけるそれぞれの領域に対する結合を１００％として、ヒトＣＤ７０結合タンパク質におけるそれぞれの領域への結合と比較して、好ましくは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％；より好ましくは、少なくとも６０％、７０％、または８０％、及び最も好ましくは、９０％、９５％またさらには１００％である。前述のヒトＣＤ７０／非ヒトＣＤ７０キメラがＣＨＯ細胞において発現されることが想定される。キメラ分子のＣ末端で、ｖ５タグが、例えば、ＧＧＧＧＳリンカーを介して融合することが想定される。その方法は、実施例１及び２においてより詳細に記載される。
【００５６】
エピトープマッピングのための代替または追加の方法では、ヒトＣＤ７０細胞外ドメインのいくつかの短縮切断されたものを、結合ドメインにより認識される特定の領域を決定するために、生成することができる。これらの短縮切断されたものでは、異なる細胞外ＣＤ７０ドメイン／部分ドメインまたは領域は、Ｃ末端から開始して、段階的に除去される。短縮切断されたＣＤ７０バージョンがＣＨＯ細胞において発現されることが想定される。短縮切断された分子のＣ末端でｖ５タグが、例えば、ＧＧＧＧＳリンカーを介して融合されるとも想定される。これは、細胞表面上でのそれらの正しい発現の検証を可能にする。結合の低減または喪失は、結合ドメインにより認識されるＣＤ７０領域以外を何も包含しない短縮切断されたＣＤ７０バージョンで生じると想定される。ヒトＣＤ７０タンパク質（またはその細胞外領域またはドメイン）全体に対する結合を１００％として、結合の低減は、好ましくは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％；より好ましくは、少なくとも６０％、７０％、８０％、及び最も好ましくは、９０％、９５％またさらには１００％である。
【００５７】
抗体構築物または結合ドメインによる認識に対する標的抗原の特定の残基の寄与を決定するさらなる方法は、アラニンスキャニングであり（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＫＬ  ＆  Ｗｅｉｓｓ  ＧＡ．Ｃｕｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２００１  Ｊｕｎ；５（３）：３０２−７を参照されたい。）、この場合、分析される各残は、例えば、部位特異的突然変異誘発を介して、アラニンにより置き換えられる。アラニンは、その大きくない、化学的に不活性な、メチル官能基のために使用され、これは、前記にもかかわらず、他のアミノ酸の多くが有する二次構造基準を模倣する。時には、バリンまたはロイシンなどの大きいアミノ酸を、突然変異した残基のサイズの保存が望ましい場合に使用することができる。アラニンスキャニングは、長期にわたって使用されている成熟した技術である。
【００５８】
結合ドメインとエピトープまたはエピトープを含む領域の間の相互作用は、結合ドメインが、特定のタンパク質または抗原上のエピトープ／エピトープを含む領域（ここでは：それぞれＣＤ７０及びＣＤ３）に対して認識可能な親和性を呈すること、及び、概して、ＣＤ７０またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原と有意な反応性を呈さないことを暗示する。「認識可能な親和性」は、約１０−６Ｍ（ＫＤ）またはより強い親和性での結合を含む。好ましくは、結合は、結合親和性が、約１０−１２〜１０−８Ｍ、１０−１２〜１０−９Ｍ、１０−１２〜１０−１０Ｍ、１０−１１〜１０−８Ｍ、好ましくは、約１０−１１〜１０−９Ｍであるときに、特異的であると考えられる。結合ドメインが、特異的に標的と反応するまたは標的に結合するかどうかは、容易に検査することができ、なかでも、前記結合ドメインの標的タンパク質または抗原との反応を、前記結合ドメインとＣＤ７０またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原との反応と比較することにより検査することができる。好ましくは、本発明の結合ドメインは、ＣＤ７０またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原と本質的にまたは実質的に結合しない（すなわち、第一の結合ドメインは、ＣＤ７０以外のタンパク質と結合することができず、第二の結合ドメインは、ＣＤ３以外のタンパク質と結合することができない）。
【００５９】
「本質的／実質的に結合しない」または「結合できない」という用語は、本発明の結合ドメインが、ＣＤ７０またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原に結合しない、すなわち、ＣＤ７０またはＣＤ３のそれぞれに対する結合を１００％として、ＣＤ７０またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原と、３０％超を超えて反応を示さない、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、特に好ましくは９％、８％、７％、６％または５％以下であることを意味する。
【００６０】
特異的な結合は、結合ドメイン及び抗原のアミノ酸配列内の特定のモチーフにより影響されると考えられる。ゆえに、結合は、それらの一次、二次及び／または三次構造の結果としてならびに前記構造の二次的修飾の結果として達成される。その特異的抗原との抗原相互作用部位の特異的相互作用は、抗原に対する前記部位の単純な結合をもたらし得る。さらには、その特異的抗原との抗原相互作用部位の特異的相互作用は、あるいはまたは加えて、例えば、抗原の立体構造の変化の誘導、抗原のオリゴマー形成等に起因して、シグナルの開始をもたらし得る。
【００６１】
好ましくは、本発明の二重特異性抗体構築物の第一の結合ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含み、前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３は、
１）配列番号１〜６；
２）配列番号１１〜１６；
３）配列番号２１〜２６；
４）配列番号３１〜３６；
５）配列番号４１〜４６；
６）配列番号５１〜５６；
７）配列番号６１〜６６；
８）配列番号７１〜７６；
９）配列番号８１〜８６；
１０）配列番号９１〜９６；
１１）配列番号１０１〜１０６；
１２）配列番号１１１〜１１６；
１３）配列番号１２１〜１２６；
１４）配列番号１３１〜１３６；
１５）配列番号１４１〜１４６；
１６）配列番号１５１〜１５６；
１７）配列番号１６１〜１６６；
１８）配列番号１７１〜１７６；
１９）配列番号１８１〜１８６；
２０）配列番号１９１〜１９６；
２１）配列番号２０１〜２０６；
２２）配列番号２１１〜２１６；
２３）配列番号２２１〜２２６；
２４）配列番号２３１〜２３６；
２５）配列番号２４１〜２４６；
２６）配列番号２５１〜２５６；
２７）配列番号２６１〜２６６；
２８）配列番号２７１〜２７６；
２９）配列番号２８１〜２８６；
３０）配列番号２９１〜２９６；
３１）配列番号３０１〜３０６；
３２）配列番号３１１〜３１６；
３３）配列番号３２１〜３２６；
３４）配列番号３３１〜３３６；
３５）配列番号３４１〜３４６；
３６）配列番号３５１〜３５６；
３７）配列番号３６１〜３６６；
３８）配列番号３７１〜３７６；
３９）配列番号３８１〜３８６；
４０）配列番号３９１〜３９６；
４１）配列番号４０１〜４０６；
４２）配列番号４１１〜４１６；
４３）配列番号４２１〜４２６；
４４）配列番号４３１〜４３６；
４５）配列番号４４１〜４４６；
４６）配列番号４５１〜４５６；
４７）配列番号４６１〜４６６；
４８）配列番号４７１〜４７６；
４９）配列番号４８１〜４８６；
５０）配列番号４９１〜４９６；
５１）配列番号５０１〜５０６；
５２）配列番号５１１〜５１６；
５３）配列番号５２１〜５２６；
５４）配列番号５３１〜５３６；
５５）配列番号５４１〜５４６；
５６）配列番号５５１〜５５６；
５７）配列番号５６１〜５６６；
５８）配列番号５７１〜５７６；
５９）配列番号５８１〜５８６；
６０）配列番号５９１〜５９６；
６１）配列番号６０１〜６０６；
６２）配列番号６１１〜６１６；
６３）配列番号６２１〜６２６；
６４）配列番号６３１〜６３６；
６５）配列番号６４１〜６４６；
６６）配列番号６５１〜６５６；
６７）配列番号６６１〜６６６；
６８）配列番号６７１〜６７６；
６９）配列番号６８１〜６８６；
７０）配列番号６９１〜６９６；
７１）配列番号７０１〜７０６；
７２）配列番号７１１〜７１６；
７３）配列番号７２１〜７２６；
７４）配列番号７３１〜７３６；
７５）配列番号１０４４〜１０４９；
７６）配列番号１０５８〜１０６３；
７７）配列番号１０７２〜１０７７；
７８）配列番号１０８６〜１０９１；
７９）配列番号１１００〜１００５；
８０）配列番号１１１４〜１１１９；
８１）配列番号１１２８〜１１３３；
８２）配列番号１１４２〜１１４７；
８３）配列番号１１５６〜１１６１；
８４）配列番号１１７０〜１１７５；
８５）配列番号１１８４〜１１８９；
８６）配列番号１１９８〜１２０３；
８７）配列番号１２１２〜１２１７；
８８）配列番号１２２６〜１２３１；
８９）配列番号１２４０〜１２４５；
９０）配列番号１２５４〜１２５９；
９１）配列番号１２６８〜１２７３；
９２）配列番号１２８２〜１２８７；
９３）配列番号１２９６〜１３０１；
９４）配列番号１３１０〜１３１５；
９５）配列番号１３２４〜１３２９；
９６）配列番号１３３８〜１３４３；
９７）配列番号１３５２〜１３５７；
９８）配列番号１３６６〜１３７１；
９９）配列番号１３８０〜１３８５；
１００）配列番号１３９４〜１３９９；
１０１）配列番号１４０８〜１４１３；
１０２）配列番号１４２２〜１４２７；
１０３）配列番号１４３６〜１４４１；
１０４）配列番号１４５０〜１４５５；
１０５）配列番号１４６４〜１４６９；
１０６）配列番号１４７８〜１４８３；
１０７）配列番号１４９２〜１４９７；
１０８）配列番号１５０６〜１５１１；
１０９）配列番号１５２０〜１５２５；
１１０）配列番号１５３４〜１５３９；
１１１）配列番号１５４８〜１５５３；及び
１１２）配列番号１５６２〜１５６７
に記載のものからなる群より選択される。
【００６２】
上に定義する抗体構築物の中で、以下のものは、実施例３−１６にて決定するように、特定の有益な特徴を有すると見いだされた：標的細胞の表面上にあるヒトＣＤ７０に結合する第一の結合ドメイン及びＴ細胞の表面上にあるヒトＣＤ３に結合する第二の結合ドメインを含む二重特異性抗体構築物であって、第一の結合ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含み、前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３が、
１）配列番号１０４４〜１０４９；
２）配列番号１０８６〜１０９１；
３）配列番号１１４２〜１１４７；
４）配列番号１１７０〜１１７５；
５）配列番号１１８４〜１１８９；
６）配列番号１２１２〜１２１７；
７）配列番号１２２６〜１２３１；
８）配列番号１２４０〜１２４５；
９）配列番号１２５４〜１２５９；
１０）配列番号１２６８〜１２７３；
１１）配列番号１３３８〜１３４３；
１２）配列番号１３５２〜１３５７；
１３）配列番号１３６６〜１３７１；
１４）配列番号１４２２〜１４２７；及び
１５）配列番号１４３６〜１４４１に記載のものからなる群より選択される、前記二重特異性抗体構築物。
【００６３】
これらの構築物は、特に高い親和性、高い細胞傷害活性（低いＥＣ５０値）、及び有益な種間親和性ギャップ、ならびにヒト生殖細胞系列に対するＶＨ及びＶＬ配列の高い配列同一性、低い単量体から二量体への転換率、高い熱安定性、高い血漿安定性、低い濁度、高いタンパク質均質性、及び有益な単量体／二量体効力ギャップを特徴とする。この文脈では、これらのＣＤＲアミノ酸配列がかなり高い配列類似性を有することに留意されるべきであり、これは、以下の表１及び２において概説される。
【００６４】
（表１）ＣＤ７０結合因子の選択一覧のＶＨ−ＣＤＲ配列
2018530996.tif 000003
【００６５】
（表２）ＣＤ７０結合因子の選択因子のＶＬ−ＣＤＲ配列
2018530996.tif 000004
【００６６】
抗体構築物の共通の生物学的／生化学的特徴に関するこの顕著な配列類似性は、６つのＶＨ及びＶＬ  ＣＤＲに関するコンセンサス配列の草案を可能にする。これらのコンセンサス配列は、以下において同定される。それゆえ、本発明の目的は、標的細胞の表面上にあるヒトＣＤ７０に結合する第一の結合ドメイン及びＴ細胞の表面上にあるヒトＣＤ３に（及び一実施形態では少なくともマカクＣＤ３に）結合する第二の結合ドメインを含む二重特異性抗体構築物であって、第一の結合ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含み、
・前記ＣＤＲ−Ｈ１が、アミノ酸配列Ｘ１ＹＸ２ＭＸ３（配列番号１８６９）を有し、Ｘ１がＳ、ＴまたはＶであり、Ｘ２がＡまたはＳであり、Ｘ３がＳまたはＮである；
・前記ＣＤＲ−Ｈ２が、アミノ酸配列
2018530996.tif 000005
を有し、Ｘ１が、Ａ、Ｙ、Ｖ、Ｌ、またはＴであり、Ｘ２が、ＧまたはＳであり、Ｘ３が、Ｒ、Ｙ、Ｓ、ＧまたはＩであり、Ｘ４が、Ｔ、Ｉ、Ｐ、またはＡであり、Ｘ５が、Ｆ、Ｙ、Ｎ、ＱまたはＤであり、Ｘ６が、ＹまたはＦ、Ｘ７がＥ、ＫまたはＱである；
・前記ＣＤＲ−Ｈ３が、アミノ酸配列
2018530996.tif 000006
を有し、Ｘ１が、Ｈ、ＧまたはＶであり、Ｘ２が、Ｐ、Ａ、ＬまたはＦであり、Ｘ３が、ＹまたはＦである；
・前記ＣＤＲ−Ｌ１が、アミノ酸配列
2018530996.tif 000007
を有し、Ｘ１が、ＳまたはＧであり、Ｘ２が、ＳまたはＧであり、Ｘ３が、ＩまたはＶであり、Ｘ４が、Ｒ、Ｓまたはアミノ酸無しであり、Ｘ５が、ＳまたはＧであり、Ｘ６が、Ｓ、Ｎ、ＴまたはＤであり、Ｘ７が、Ｙまたはアミノ酸無しであり、Ｘ８が、ＡまたはＧである；
・前記ＣＤＲ−Ｌ２が、アミノ酸配列
2018530996.tif 000008
を有し、Ｘ１が、ＧまたはＡであり、Ｘ２が、ＡまたはＳであり、Ｘ３が、Ｓ、Ｔ、ＮまたはＩであり、Ｘ４が、ＲまたはＬであり、Ｘ５が、ＡまたはＱであり、Ｘ６が、ＴまたはＳである；ならびに
・前記ＣＤＲ−Ｌ３が、アミノ酸配列
2018530996.tif 000009
を有し、Ｘ１が、Ｇ、ＹまたはＦであり、Ｘ２が、Ｄ、Ｓ、Ｙ、ＩまたはＡであり、Ｘ３が、Ｌ、Ｔ、ＳまたはＹであり、Ｘ４が、Ｆ、Ｌ、ＰまたはＩであり、Ｘ５が、ＴまたはＰである、前記二重特異性抗体構築物を提供することである。
【００６７】
さらに、
・前記ＣＤＲ−Ｈ１が、アミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号１４２２）またはＸ１ＹＡＭＳ（配列番号１８７５）を有し、Ｘ１が、Ｓ、ＴまたはＶである；
・前記ＣＤＲ−Ｈ２が、
2018530996.tif 000010
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、Ｘ１が、Ａ、Ｖ、ＬまたはＴであり、Ｘ２が、Ｒ、Ｓ、またはＧであり、Ｘ３が、Ｔ、ＰまたはＡであり、Ｘ４が、Ｆ、Ｎ、ＹまたはＱであり、Ｘ５が、Ｅ、Ｋ、またはＱである；
・前記ＣＤＲ−Ｈ３が、
2018530996.tif 000011
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、Ｘ１が、ＨまたはＶであり、Ｘ２が、Ｐ、ＬまたはＡであり、Ｘ３がＹまたはＦである；
・前記ＣＤＲ−Ｌ１が、アミノ酸配列
2018530996.tif 000012
を有し、Ｘ１が、ＳまたはＧであり、Ｘ２が、ＳまたはＧであり、Ｘ３が、ＩまたはＶであり、Ｘ４が、ＲまたはＳであり、Ｘ５が、ＳまたはＧであり、Ｘ６が、Ｓ、Ｔ、ＮまたはＤであり、Ｘ７がＡまたはＧである；
・前記ＣＤＲ−Ｌ２が、アミノ酸配列ＡＡＳＸＬＱＳ（配列番号１８７９）を有し、ＸがＴもしくはＩであるか、またはＧＸ１ＳＸ２ＲＡＴ（配列番号１８８０）を有し、Ｘ１が、ＡもしくはＳであり、Ｘ２が、ＳもしくはＮである；ならびに
・前記ＣＤＲ−Ｌ３が
2018530996.tif 000013
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、Ｘ１が、Ｄ、Ｙ、ＳまたはＩであり、Ｘ２が、Ｌ、ＳまたはＴであり、Ｘ３が、ＦまたはＰであり、Ｘ４が、ＴまたはＰである
ことが想定される。
【００６８】
さらに、
・前記ＣＤＲ−Ｈ１が、アミノ酸配列Ｘ１ＹＡＭＳ（配列番号１８７５）を有し、Ｘ１が、Ｓ、ＴまたはＶである；
・前記ＣＤＲ−Ｈ２が、アミノ酸配列
2018530996.tif 000014
を有し、Ｘ１が、Ａ、Ｖ、ＬまたはＴであり、Ｘ２が、Ｒ、Ｓ、またはＧであり、Ｘ３が、Ｔ、ＰまたはＡであり、Ｘ４が、Ｆ、Ｎ、ＹまたはＱであり、Ｘ５が、Ｅ、Ｋ、またはＱである；
・前記ＣＤＲ−Ｈ３が、アミノ酸配列
2018530996.tif 000015
を有し、Ｘ１が、ＨまたはＶであり、Ｘ２が、Ｐ、ＬまたはＡであり、Ｘ３が、ＹまたはＦである；
・前記ＣＤＲ−Ｌ１が、アミノ酸配列
2018530996.tif 000016
を有し、Ｘ１が、ＳまたはＧであり、Ｘ２が、ＳまたはＧであり、Ｘ３が、ＩまたはＶであり、Ｘ４が、ＲまたはＳであり、Ｘ５が、ＳまたはＧであり、Ｘ６が、Ｓ、Ｔ、ＮまたはＤであり、Ｘ７が、ＡまたはＧである；
・前記ＣＤＲ−Ｌ２が、アミノ酸配列
2018530996.tif 000017
を有し、Ｘ１が、ＡまたはＳであり、Ｘ２が、ＳまたはＮである；ならびに
・前記ＣＤＲ−Ｌ３が、アミノ酸配列
2018530996.tif 000018
を有し、Ｘ１が、Ｄ、Ｙ、ＳまたはＩであり、Ｘ２が、Ｌ、ＳまたはＴであり、Ｘ３が、ＦまたはＰであり、Ｘ４が、ＴまたはＰである
ことが想定される。
【００６９】
さらに、
・前記ＣＤＲ−Ｈ１が、
2018530996.tif 000019
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し；
・前記ＣＤＲ−Ｈ２が、
2018530996.tif 000020
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し；
・前記ＣＤＲ−Ｈ３が、
2018530996.tif 000021
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し；
・前記ＣＤＲ−Ｌ１が、
2018530996.tif 000022
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し；
・前記ＣＤＲ−Ｌ２が、
2018530996.tif 000023
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し；
・前記ＣＤＲ−Ｌ３が、
2018530996.tif 000024
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する
と想定される。
【００７０】
「可変」という用語は、それらの配列において可変性を呈し、特定の抗体の特異性及び結合親和性の決定に関与する、抗体または免疫グロブリンドメインの一部分（すなわち、「可変ドメイン（複数可）」）を表す。可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）の対合は、一つになって単一の抗原結合部位を形成する。
【００７１】
可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているのではなく；それは重鎖及び軽鎖可変領域のそれぞれの部分ドメインに集中している。これらの部分ドメインは、「超可変領域」または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変ドメインのより保存された（すなわち、非超可変）部分は、「フレームワーク」領域（ＦＲＭまたはＦＲ）と呼ばれ、抗原結合表面を形成するための三次元空間における６つのＣＤＲのためのスキャフォールドを提供する。天然に存在する重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、４つのＦＲＭ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）を含み、大部分がβシート配置をとり、３つの超可変領域によって接続され、これは、ループ接続を形成し、いくつかの例ではβシート構造の一部を形成する。各鎖の超可変領域は、ＦＲＭによって他の鎖からの超可変領域と近接してまとめて保持されており、抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，前掲書を参照されたい）。
【００７２】
「ＣＤＲ」という用語及びその複数形は、相補性決定領域（ＣＤＲ）を表し、そのうちの３つが軽鎖可変領域の結合特性を構成し（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）、３つが重鎖可変領域の結合特性を構成する（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）。ＣＤＲは、抗体と抗原の特異的相互作用を担う残基の大部分を含有し、従って、抗体分子の機能的活性に寄与する：それらは、抗原特異性の主要決定基である。
【００７３】
厳密なＣＤＲの境界及び長さは、異なる分類及びナンバリング方式に従う。従ってＣＤＲは、本明細書に記載されるナンバリング方式を含む、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、接点または任意のその他の境界の定義によって表され得る。境界が異なるとしても、これらの方式の各々は、可変配列内のいわゆる「超可変領域」を構成するものに関してある程度重複している。従って、これらの方式に従うＣＤＲの定義は、長さ及び隣接するフレームワーク領域との境界領域において異なり得る。例えば、Ｋａｂａｔ（種間配列可変性に基づく手法）、Ｃｈｏｔｈｉａ（抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づく手法）、及び／またはＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，前掲書；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９８７，１９６：９０１−９１７；及びＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６２：７３２）を参照されたい。抗原結合部位を特徴決定するためのさらに別の標準は、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されるＡｂＭ定義である。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．ａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓを参照されたい。２つの残基同定技術が同一領域ではない重複する領域を定義する程度まで、それらを組み合わせて、ハイブリッドＣＤＲを定義することができる。しかし、いわゆるＫａｂａｔ方式に従ったナンバリングが好ましい。
【００７４】
典型的に、ＣＤＲは、カノニカル構造に分類され得るループ構造を形成する。「カノニカル構造」という用語は、抗原結合（ＣＤＲ）ループによって取り入れられる主鎖の立体構造を表す。比較構造研究から、６つの抗原結合ループのうちの５つは、利用可能な立体構造の限られたレパートリーしか有さないことが見出された。各カノニカル構造は、ポリペプチド骨格のねじれ角によって特徴づけることができる。従って、抗体間で対応するループは、そのループの大部分において高度のアミノ酸配列可変性にもかかわらず、非常によく似た三次元構造を有し得る（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８７，１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４２：８７７；Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６３：８００）。さらには、採用されるループ構造とその周囲のアミノ酸配列の間には関連性がある。特定のカノニカルクラスの立体構造は、ループの長さ及びそのループ内ならびに保存されたフレームワーク内（すなわち、ループ外）の重要な位置に存在するアミノ酸残基によって決定される。従って、特定のカノニカルクラスへの割り当ては、これらの重要なアミノ酸残基の存在に基づいて行うことができる。
【００７５】
「カノニカル構造」という用語は、例えば、Ｋａｂａｔによって（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，前掲書）分類されるように、抗体の直鎖状配列に対する考慮も含み得る。Ｋａｂａｔのナンバリングスキーム（方式）は、抗体可変ドメインのアミノ酸残基のナンバリングを一貫した様式で行うために広く採用されている標準であり、本明細書の他所でも述べられているように本発明に適用される好ましいスキームである。さらなる構造の考慮も、抗体のカノニカル構造を決定するために使用され得る。例えば、Ｋａｂａｔのナンバリングによっては十分に反映されない差異は、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．のナンバリング方式によって説明され得る、及び／またはその他の技術、例えば、結晶学及び二次元もしくは三次元コンピューターモデリングによって明らかにされ得る。従って、所与の抗体配列は、（例えば、様々なカノニカル構造をライブラリーに含めたいという要望に基づき）とりわけ、適切なシャーシ（ｃｈａｓｓｉｓ）配列を同定することができるカノニカルクラスに分類され得る。抗体アミノ酸配列のＫａｂａｔナンバリング及びＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，前掲書により記載される構造の考慮ならびに抗体構造のカノニカルの側面を解釈するためのそれらの含意は、文献に記載されている。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元構造は、当技術分野で周知である。抗体構造の概説については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８を参照されたい。
【００７６】
軽鎖のＣＤＲ３及び、特に、重鎖のＣＤＲ３は、軽鎖及び重鎖可変領域内での抗原結合において最も重要な決定基を構成し得る。いくつかの抗体構築物では、重鎖ＣＤＲ３は、抗原と抗体の間の主要接触領域を構成するとみられる。抗体の結合特性を変化させるためまたはどの残基が抗原の結合に寄与するかを決定するために、ＣＤＲ３のみを変異させるｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択スキームを使用することができる。従って、ＣＤＲ３は、典型的に、抗体結合部位内の分子多様性の最大の源である。例えば、Ｈ３は、２つのアミノ酸残基という短いものまたは２６アミノ酸より大きなものであることができる。
【００７７】
古典的な完全長抗体または免疫グロブリンでは、各軽（Ｌ）鎖は、１つの共有ジスルフィド結合により重（Ｈ）鎖に連結しており、一方で、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて１つまたは複数のジスルフィド結合により互いに連結している。ＶＨに最も近位であるＣＨドメインは、通常ＣＨ１と呼ばれる。定常（「Ｃ」）ドメインは、抗原結合に直接関与しないが、様々エフェクター機能、例えば、抗体依存性、細胞媒介性細胞傷害性及び補体活性化を呈する。抗体のＦｃ領域は、重鎖定常ドメイン内に含まれ、例えば、細胞表面に位置するＦｃ受容体と相互作用することができる。
【００７８】
アセンブリ及び体細胞突然変異後の抗体遺伝子の配列は高度に変動しており、これらの変動した遺伝子は１０１０個の異なる抗体分子をコードすると推定される（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｊｏｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９５）。従って、免疫系は免疫グロブリンのレパートリーを提供する。「レパートリー」という用語は、少なくとも１つの免疫グロブリンをコードする少なくとも１つの配列から全体がまたは一部が派生した少なくとも１つのヌクレオチド配列を表す。この配列（複数可）は、重鎖のＶ、Ｄ及びＪセグメントならびに軽鎖のＶ及びＪセグメントのｉｎ  ｖｉｖｏでの再編成によって生成され得る。あるいは、この配列（複数可）は、再編成を起こさせるもの、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激、に応じて細胞から生成することができる。あるいは、この配列（複数可）の一部または全てが、ＤＮＡスプライシング、ヌクレオチド合成、突然変異誘発、及びその他の方法によって取得され得る、例えば、米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい。レパートリーは、１つのみの配列を含み得るか、または、遺伝的に多様なコレクションにおける配列を含む複数の配列を含み得る。
【００７９】
本発明に従う好ましい抗体構築物は、標的細胞の表面上にあるヒトＣＤ７０に結合する第一の（好ましくはヒト）結合ドメイン及びＴ細胞の表面上にあるヒトＣＤ３に結合する第二の結合ドメインを含み、第一の結合ドメインが、抗体ＣＤ７０−１からＣＤ７０−７４ならびに以下の項目７５〜１１２に示されるものからなる群より選択される抗体、すなわち、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含む抗体と同じ、ヒトＣＤ７０上のエピトープに結合し、前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３が、
１）配列番号１〜６；
２）配列番号１１〜１６；
３）配列番号２１〜２６；
４）配列番号３１〜３６；
５）配列番号４１〜４６；
６）配列番号５１〜５６；
７）配列番号６１〜６６；
８）配列番号７１〜７６；
９）配列番号８１〜８６；
１０）配列番号９１〜９６；
１１）配列番号１０１〜１０６；
１２）配列番号１１１〜１１６；
１３）配列番号１２１〜１２６；
１４）配列番号１３１〜１３６；
１５）配列番号１４１〜１４６；
１６）配列番号１５１〜１５６；
１７）配列番号１６１〜１６６；
１８）配列番号１７１〜１７６；
１９）配列番号１８１〜１８６；
２０）配列番号１９１〜１９６；
２１）配列番号２０１〜２０６；
２２）配列番号２１１〜２１６；
２３）配列番号２２１〜２２６；
２４）配列番号２３１〜２３６；
２５）配列番号２４１〜２４６；
２６）配列番号２５１〜２５６；
２７）配列番号２６１〜２６６；
２８）配列番号２７１〜２７６；
２９）配列番号２８１〜２８６；
３０）配列番号２９１〜２９６；
３１）配列番号３０１〜３０６；
３２）配列番号３１１〜３１６；
３３）配列番号３２１〜３２６；
３４）配列番号３３１〜３３６；
３５）配列番号３４１〜３４６；
３６）配列番号３５１〜３５６；
３７）配列番号３６１〜３６６；
３８）配列番号３７１〜３７６；
３９）配列番号３８１〜３８６；
４０）配列番号３９１〜３９６；
４１）配列番号４０１〜４０６；
４２）配列番号４１１〜４１６；
４３）配列番号４２１〜４２６；
４４）配列番号４３１〜４３６；
４５）配列番号４４１〜４４６；
４６）配列番号４５１〜４５６；
４７）配列番号４６１〜４６６；
４８）配列番号４７１〜４７６；
４９）配列番号４８１〜４８６；
５０）配列番号４９１〜４９６；
５１）配列番号５０１〜５０６；
５２）配列番号５１１〜５１６；
５３）配列番号５２１〜５２６；
５４）配列番号５３１〜５３６；
５５）配列番号５４１〜５４６；
５６）配列番号５５１〜５５６；
５７）配列番号５６１〜５６６；
５８）配列番号５７１〜５７６；
５９）配列番号５８１〜５８６；
６０）配列番号５９１〜５９６；
６１）配列番号６０１〜６０６；
６２）配列番号６１１〜６１６；
６３）配列番号６２１〜６２６；
６４）配列番号６３１〜６３６；
６５）配列番号６４１〜６４６；
６６）配列番号６５１〜６５６；
６７）配列番号６６１〜６６６；
６８）配列番号６７１〜６７６；
６９）配列番号６８１〜６８６；
７０）配列番号６９１〜６９６；
７１）配列番号７０１〜７０６；
７２）配列番号７１１〜７１６；
７３）配列番号７２１〜７２６；
７４）配列番号７３１〜７３６；
７５）配列番号１０４４〜１０４９；
７６）配列番号１０５８〜１０６３；
７７）配列番号１０７２〜１０７７；
７８）配列番号１０８６〜１０９１；
７９）配列番号１１００〜１００５；
８０）配列番号１１１４〜１１１９；
８１）配列番号１１２８〜１１３３；
８２）配列番号１１４２〜１１４７；
８３）配列番号１１５６〜１１６１；
８４）配列番号１１７０〜１１７５；
８５）配列番号１１８４〜１１８９；
８６）配列番号１１９８〜１２０３；
８７）配列番号１２１２〜１２１７；
８８）配列番号１２２６〜１２３１；
８９）配列番号１２４０〜１２４５；
９０）配列番号１２５４〜１２５９；
９１）配列番号１２６８〜１２７３；
９２）配列番号１２８２〜１２８７；
９３）配列番号１２９６〜１３０１；
９４）配列番号１３１０〜１３１５；
９５）配列番号１３２４〜１３２９；
９６）配列番号１３３８〜１３４３；
９７）配列番号１３５２〜１３５７；
９８）配列番号１３６６〜１３７１；
９９）配列番号１３８０〜１３８５；
１００）配列番号１３９４〜１３９９；
１０１）配列番号１４０８〜１４１３；
１０２）配列番号１４２２〜１４２７；
１０３）配列番号１４３６〜１４４１；
１０４）配列番号１４５０〜１４５５；
１０５）配列番号１４６４〜１４６９；
１０６）配列番号１４７８〜１４８３；
１０７）配列番号１４９２〜１４９７；
１０８）配列番号１５０６〜１５１１；
１０９）配列番号１５２０〜１５２５；
１１０）配列番号１５３４〜１５３９；
１１１）配列番号１５４８〜１５５３；及び
１１２）配列番号１５６２〜１５６７に記載のものからなる群より選択される、二重特異性抗体構築物であると定義することもできる。
【００８０】
抗体構築物が、別の所与の抗体構築物と同じ、ＣＤ７０のエピトープに結合するかどうかは、例えば、本明細書に上記した及び実施例２に記載のように、キメラまたは短縮切断した標的分子を用いたエピトープマッピングにより測定することができる。
【００８１】
本発明に従う好ましい抗体構築物は、標的細胞の表面上にあるヒトＣＤ７０に結合する第一の（好ましくはヒト）結合ドメイン及びＴ細胞の表面上にあるヒトＣＤ３に結合する第二の結合ドメインを含み、第一の結合ドメインが、ＣＤ７０−１からＣＤ７０−７４ならびに上記の項目７５〜１１２に記載のものからなる群より選択される抗体、すなわち、上の項目１）〜１１２）に記載のものからなる群より選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含む抗体との結合に競合する、二重特異性抗体構築物として定義することもできる。
【００８２】
抗体構築物が、別の所与の抗体構築物との結合に関して競合するかどうかは、競合ＥＬＩＳＡまたは細胞ベースの競合アッセイなどの競合アッセイにおいて測定することができる。アビジン結合微粒子（ビーズ）も使用することができる。アビジン被覆ＥＬＩＳＡプレートと同様に、ビオチン化タンパク質と反応するとき、これらのビーズの各々を、その上でアッセイを行うことができる基材として使用することができる。抗原は、ビーズの上にコーティングされ、次いで、一次抗体でプレコーティングされる。二次抗体を加え、任意の追加の結合が決定される。読み出しは、フローサイトメトリーを介して生じる。図２を参照されたい。
【００８３】
一実施形態では、本発明の抗体構築物の第一の結合ドメインは、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、配列番号７７、配列番号８７、配列番号９７、配列番号１０７、配列番号１１７、配列番号１２７、配列番号１３７、配列番号１４７、配列番号１５７、配列番号１６７、配列番号１７７、配列番号１８７、配列番号１９７、配列番号２０７、配列番号２１７、配列番号２２７、配列番号２３７、配列番号２４７、配列番号２５７、配列番号２６７、配列番号２７７、配列番号２８７、配列番号２９７、配列番号３０７、配列番号３１７、配列番号３２７、配列番号３３７、配列番号３４７、配列番号３５７、配列番号３６７、配列番号３７７、配列番号３８７、配列番号３９７、配列番号４０７、配列番号４１７、配列番号４２７、配列番号４３７、配列番号４４７、配列番号４５７、配列番号４６７、配列番号４７７、配列番号４８７、配列番号４９７、配列番号５０７、配列番号５１７、配列番号５２７、配列番号５３７、配列番号５４７、配列番号５５７、配列番号５６７、配列番号５７７、配列番号５８７、配列番号５９７、配列番号６０７、配列番号６１７、配列番号６２７、配列番号６３７、配列番号６４７、配列番号６５７、配列番号６６７、配列番号６７７、配列番号６８７、配列番号６９７、配列番号７０７、配列番号７１７、配列番号７２７、配列番号７３７、配列番号９２０、配列番号９２４、配列番号９２８、配列番号９３２、配列番号９３６、配列番号９４０、配列番号９４４、配列番号９４８、配列番号９５２、配列番号９５６、配列番号９６０、配列番号９６４、配列番号９６８、配列番号９７２、配列番号９７６、配列番号９８０、配列番号９８４、配列番号９８８、配列番号９９２、配列番号９９６、配列番号１０００、配列番号１００４、配列番号１００８、配列番号１０１２、配列番号１０１６、配列番号１０２０、配列番号１０２４、配列番号１０２８、配列番号１０３２、配列番号１０３６、配列番号１０４０、配列番号１０５０、配列番号１０５４、配列番号１０６４、配列番号１０６８、配列番号１０７８、配列番号１０８２、配列番号１０９２、配列番号１０９６、配列番号１１０６、配列番号１１１０、配列番号１１２０、配列番号１１２４、配列番号１１３４、配列番号１１３８、配列番号１１４８、配列番号１１５２、配列番号１１６２、配列番号１１６６、配列番号１１７６、配列番号１１８０、配列番号１１９０、配列番号１１９４、配列番号１２０４、配列番号１２０８、配列番号１２１８、配列番号１２２２、配列番号１２３２、配列番号１２３６、配列番号１２４６、配列番号１２５０、配列番号１２６０、配列番号１２６４、配列番号１２７４、配列番号１２７８、配列番号１２８８、配列番号１２９２、配列番号１３０２、配列番号１３０６、配列番号１３１６、配列番号１３２０、配列番号１３３０、配列番号１３３４、配列番号１３４４、配列番号１３４８、配列番号１３５８、配列番号１３６２、配列番号１３７２、配列番号１３７６、配列番号１３８６、配列番号１３９０、配列番号１４００、配列番号１４０４、配列番号１４１４、配列番号１４１８、配列番号１４２８、配列番号１４３２、配列番号１４４２、配列番号１４４６、配列番号１４５６、配列番号１４６０、配列番号１４７０、配列番号１４７４、配列番号１４８４、配列番号１４８８、配列番号１４９８、配列番号１５０２、配列番号１５１２、配列番号１５１６、配列番号１５２６、配列番号１５３０、配列番号１５４０、配列番号１５４４、配列番号１５５４、配列番号１５５８、配列番号１５６８、及び配列番号１５７２に記載のものからなる群より選択されるＶＨ領域を含む。
【００８４】
本発明の抗体構築物の第一の結合ドメインが、配列番号１０５０、配列番号１０９２、配列番号１１４８、配列番号１１７６、配列番号１１９０、配列番号１２１８、配列番号１２３２、配列番号１２４６、配列番号１２６０、配列番号１２７４、配列番号１３４４、配列番号１３５８、配列番号１３７２、配列番号１４２８、及び配列番号１４４２に記載のものからなる群より選択されるＶＨ領域を含むときが好ましい。
【００８５】
さらなる実施形態では、本発明の抗体構築物の第一の結合ドメインは、配列番号８、配列番号１８、配列番号２８、配列番号３８、配列番号４８、配列番号５８、配列番号６８、配列番号７８、配列番号８８、配列番号９８、配列番号１０８、配列番号１１８、配列番号１２８、配列番号１３８、配列番号１４８、配列番号１５８、配列番号１６８、配列番号１７８、配列番号１８８、配列番号１９８、配列番号２０８、配列番号２１８、配列番号２２８、配列番号２３８、配列番号２４８、配列番号２５８、配列番号２６８、配列番号２７８、配列番号２８８、配列番号２９８、配列番号３０８、配列番号３１８、配列番号３２８、配列番号３３８、配列番号３４８、配列番号３５８、配列番号３６８、配列番号３７８、配列番号３８８、配列番号３９８、配列番号４０８、配列番号４１８、配列番号４２８、配列番号４３８、配列番号４４８、配列番号４５８、配列番号４６８、配列番号４７８、配列番号４８８、配列番号４９８、配列番号５０８、配列番号５１８、配列番号５２８、配列番号５３８、配列番号５４８、配列番号５５８、配列番号５６８、配列番号５７８、配列番号５８８、配列番号５９８、配列番号６０８、配列番号６１８、配列番号６２８、配列番号６３８、配列番号６４８、配列番号６５８、配列番号６６８、配列番号６７８、配列番号６８８、配列番号６９８、配列番号７０８、配列番号７１８、配列番号７２８、配列番号７３８、配列番号９２１、配列番号９２５、配列番号９２９、配列番号９３３、配列番号９３７、配列番号９４１、配列番号９４５、配列番号９４９、配列番号９５３、配列番号９５７、配列番号９６１、配列番号９６５、配列番号９６９、配列番号９７３、配列番号９７７、配列番号９８１、配列番号９８５、配列番号９８９、配列番号９９３、配列番号９９７、配列番号１００１、配列番号１００５、配列番号１００９、配列番号１０１３、配列番号１０１７、配列番号１０２１、配列番号１０２５、配列番号１０２９、配列番号１０３３、配列番号１０３７、配列番号１０４１、配列番号１０５１、配列番号１０５５、配列番号１０６５、配列番号１０６９、配列番号１０７９、配列番号１０８３、配列番号１０９３、配列番号１０９７、配列番号１１０７、配列番号１１１１、配列番号１１２１、配列番号１１２５、配列番号１１３５、配列番号１１３９、配列番号１１４９、配列番号１１５３、配列番号１１６３、配列番号１１６７、配列番号１１７７、配列番号１１８１、配列番号１１９１、配列番号１１９５、配列番号１２０５、配列番号１２０９、配列番号１２１９、配列番号１２２３、配列番号１２３３、配列番号１２３７、配列番号１２４７、配列番号１２５１、配列番号１２６１、配列番号１２６５、配列番号１２７５、配列番号１２７９、配列番号１２８９、配列番号１２９３、配列番号１３０３、配列番号１３０７、配列番号１３１７、配列番号１３２１、配列番号１３３１、配列番号１３３５、配列番号１３４５、配列番号１３４９、配列番号１３５９、配列番号１３６３、配列番号１３７３、配列番号１３７７、配列番号１３８７、配列番号１３９１、配列番号１４０１、配列番号１４０５、配列番号１４１５、配列番号１４１９、配列番号１４２９、配列番号１４３３、配列番号１４４３、配列番号１４４７、配列番号１４５７、配列番号１４６１、配列番号１４７１、配列番号１４７５、配列番号１４８５、配列番号１４８９、配列番号１４９９、配列番号１５０３、配列番号１５１３、配列番号１５１７、配列番号１５２７、配列番号１５３１、配列番号１５４１、配列番号１５４５、配列番号１５５５、配列番号１５５９、配列番号１５６９、及び配列番号１５７３に記載のものからなる群より選択されるＶＬ領域を含む。
【００８６】
本発明の抗体構築物の第一の結合ドメインが、配列番号１０５１、配列番号１０９３、配列番号１１４９、配列番号１１７７、配列番号１１９１、配列番号１２１９、配列番号１２３３、配列番号１２４７、配列番号１２６１、配列番号１２７５、配列番号１３４５、配列番号１３５９、配列番号１３７３、配列番号１４２９、及び配列番号１４４３に記載のものからなる群より選択されるＶＬ領域を含むときが好ましい。
【００８７】
別の実施形態では、本発明の抗体構築物の第一の結合ドメインは、配列番号７＋８、配列番号１７＋１８、配列番号２７＋２８、配列番号３７＋３８、配列番号４７＋４８、配列番号５７＋５８、配列番号６７＋６８、配列番号７７＋７８、配列番号８７＋８８、配列番号９７＋９８、配列番号１０７＋１０８、配列番号１１７＋１１８、配列番号１２７＋１２８、配列番号１３７＋１３８、配列番号１４７＋１４８、配列番号１５７＋１５８、配列番号１６７＋１６８、配列番号１７７＋１７８、配列番号１８７＋１８８、配列番号１９７＋１９８、配列番号２０７＋２０８、配列番号２１７＋２１８、配列番号２２７＋２２８、配列番号２３７＋２３８、配列番号２４７＋２４８、配列番号２５７＋２５８、配列番号２６７＋２６８、配列番号２７７＋２７８、配列番号２８７＋２８８、配列番号２９７＋２９８、配列番号３０７＋３０８、配列番号３１７＋３１８、配列番号３２７＋３２８、配列番号３３７＋３３８、配列番号３４７＋３４８、配列番号３５７＋３５８、配列番号３６７＋３６８、配列番号３７７＋３７８、配列番号３８７＋３８８、配列番号３９７＋３９８、配列番号４０７＋４０８、配列番号４１７＋４１８、配列番号４２７＋４２８、配列番号４３７＋４３８、配列番号４４７＋４４８、配列番号４５７＋４５８、配列番号４６７＋４６８、配列番号４７７＋４７８、配列番号４８７＋４８８、配列番号４９７＋４９８、配列番号５０７＋５０８、配列番号５１７＋５１８、配列番号５２７＋５２８、配列番号５３７＋５３８、配列番号５４７＋５４８、配列番号５５７＋５５８、配列番号５６７＋５６８、配列番号５７７＋５７８、配列番号５８７＋５８８、配列番号５９７＋５９８、配列番号６０７＋６０８、配列番号６１７＋６１８、配列番号６２７＋６２８、配列番号６３７＋６３８、配列番号６４７＋６４８、配列番号６５７＋６５８、配列番号６６７＋６６８、配列番号６７７＋６７８、配列番号６８７＋６８８、配列番号６９７＋６９８、配列番号７０７＋７０８、配列番号７１７＋７１８、配列番号７２７＋７２８、配列番号７３７＋７３８、配列番号９２０＋９２１、配列番号９２４＋９２５、配列番号９２８＋９２９、配列番号９３２＋９３３、配列番号９３６＋９３７、配列番号９４０＋９４１、配列番号９４４＋９４５、配列番号９４８＋９４９、配列番号９５２＋９５３、配列番号９５６＋９５７、配列番号９６０＋９６１、配列番号９６４＋９６５、配列番号９６８＋９６９、配列番号９７２＋９７３、配列番号９７６＋９７７、配列番号９８０＋９８１、配列番号９８４＋９８５、配列番号９８８＋９８９、配列番号９９２＋９９３、配列番号９９６＋９９７、配列番号１０００＋１００１、配列番号１００４＋１００５、配列番号１００８＋１００９、配列番号１０１２＋１０１３、配列番号１０１６＋１０１７、配列番号１０２０＋１０２１、配列番号１０２４＋１０２５、配列番号１０２８＋１０２９、配列番号１０３２＋１０３３、配列番号１０３６＋１０３７、配列番号１０４０＋１０４１、配列番号１０５０＋１０５１、配列番号１０５４＋１０５５、配列番号１０６４＋１０６５、配列番号１０６８＋１０６９、配列番号１０７８＋１０７９、配列番号１０８２＋１０８３、配列番号１０９２＋１０９３、配列番号１０９６＋１０９７、配列番号１１０６＋１１０７、配列番号１１１０＋１１１１、配列番号１１２０＋１１２１、配列番号１１２４＋１１２５、配列番号１１３４＋１１３５、配列番号１１３８＋１１３９、配列番号１１４８＋１１４９、配列番号１１５２＋１１５３、配列番号１１６２＋１１６３、配列番号１１６６＋１１６７、配列番号１１７６＋１１７７、配列番号１１８０＋１１８１、配列番号１１９０＋１１９１、配列番号１１９４＋１１９５、配列番号１２０４＋１２０５、配列番号１２０８＋１２０９、配列番号１２１８＋１２１９、配列番号１２２２＋１２２３、配列番号１２３２＋１２３３、配列番号１２３６＋１２３７、配列番号１２４６＋１２４７、配列番号１２５０＋１２５１、配列番号１２６０＋１２６１、配列番号１２６４＋１２６５、配列番号１２７４＋１２７５、配列番号１２７８＋１２７９、配列番号１２８８＋１２８９、配列番号１２９２＋１２９３、配列番号１３０２＋１３０３、配列番号１３０６＋１３０７、配列番号１３１６＋１３１７、配列番号１３２０＋１３２１、配列番号１３３０＋１３３１、配列番号１３３４＋１３３５、配列番号１３４４＋１３４５、配列番号１３４８＋１３４９、配列番号１３５８＋１３５９、配列番号１３６２＋１３６３、配列番号１３７２＋１３７３、配列番号１３７６＋１３７７、配列番号１３８６＋１３８７、配列番号１３９０＋１３９１、配列番号１４００＋１４０１、配列番号１４０４＋１４０５、配列番号１４１４＋１４１５、配列番号１４１８＋１４１９、配列番号１４２８＋１４２９、配列番号１４３２＋１４３３、配列番号１４４２＋１４４３、配列番号１４４６＋１４４７、配列番号１４５６＋１４５７、配列番号１４６０＋１４６１、配列番号１４７０＋１４７１、配列番号１４７４＋１４７５、配列番号１４８４＋１４８５、配列番号１４８８＋１４８９、配列番号１４９８＋１４９９、配列番号１５０２＋１５０３、配列番号１５１２＋１５１３、配列番号１５１６＋１５１７、配列番号１５２６＋１５２７、配列番号１５３０＋１５３１、配列番号１５４０＋１５４１、配列番号１５４４＋１５４５、配列番号１５５４＋１５５５、配列番号１５５８＋１５５９、配列番号１５６８＋１５６９、及び配列番号１５７２＋１５７３に記載のＶＨ領域及びＶＬ領域の対からなる群より選択されるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。
【００８８】
本発明の抗体構築物の第一の結合ドメインが、配列番号１０５０＋１０５１、配列番号１０９２＋１０９３、配列番号１１４８＋１１４９、配列番号１１７６＋１１７７、配列番号１１９０＋１１９１、配列番号１２１８＋１２１９、配列番号１２３２＋１２３３、配列番号１２４６＋１２４７、配列番号１２６０＋１２６１、配列番号１２７４＋１２７５、配列番号１３４４＋１３４５、配列番号１３５８＋１３５９、番号１３７２＋１３７３、配列番号１４２８＋１４２９、及び配列番号１４４２＋１４４３に記載のＶＨ領域及びＶＬ領域の対からなる群より選択されるＶＨ領域及びＶＬ領域を含むときが好ましい。
【００８９】
なおもさらなる実施形態では、本発明の抗体構築物の第一の結合ドメインは、配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１９、配列番号１２９、配列番号１３９、配列番号１４９、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６７９、配列番号６８９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号９２２、配列番号９２６、配列番号９３０、配列番号９３４、配列番号９３８、配列番号９４２、配列番号９４６、配列番号９５０、配列番号９５４、配列番号９５８、配列番号９６２、配列番号９６６、配列番号９７０、配列番号９７４、配列番号９７８、配列番号９８２、配列番号９８６、配列番号９９０、配列番号９９４、配列番号９９８、配列番号１００２、配列番号１００６、配列番号１０１０、配列番号１０１４、配列番号１０１８、配列番号１０２２、配列番号１０２６、配列番号１０３０、配列番号１０３４、配列番号１０３８、配列番号１０４２、配列番号１０５２、配列番号１０５６、配列番号１０６６、配列番号１０７０、配列番号１０８０、配列番号１０８４、配列番号１０９４、配列番号１０９８、配列番号１１０８、配列番号１１１２、配列番号１１２２、配列番号１１２６、配列番号１１３６、配列番号１１４０、配列番号１１５０、配列番号１１５４、配列番号１１６４、配列番号１１６８、配列番号１１７８、配列番号１１８２、配列番号１１９２、配列番号１１９６、配列番号１２０６、配列番号１２１０、配列番号１２２０、配列番号１２２４、配列番号１２３４、配列番号１２３８、配列番号１２４８、配列番号１２５２、配列番号１２６２、配列番号１２６６、配列番号１２７６、配列番号１２８０、配列番号１２９０、配列番号１２９４、配列番号１３０４、配列番号１３０８、配列番号１３１８、配列番号１３２２、配列番号１３３２、配列番号１３３６、配列番号１３４６、配列番号１３５０、配列番号１３６０、配列番号１３６４、配列番号１３７４、配列番号１３７８、配列番号１３８８、配列番号１３９２、配列番号１４０２、配列番号１４０６、配列番号１４１６、配列番号１４２０、配列番号１４３０、配列番号１４３４、配列番号１４４４、配列番号１４４８、配列番号１４５８、配列番号１４６２、配列番号１４７２、配列番号１４７６、配列番号１４８６、配列番号１４９０、配列番号１５００、配列番号１５０４、配列番号１５１４、配列番号１５１８、配列番号１５２８、配列番号１５３２、配列番号１５４２、配列番号１５４６、配列番号１５５６、配列番号１５６０、配列番号１５７０、及び配列番号１５７４に記載のものからなる群より選択されるポリペプチドを含む。
【００９０】
本発明の抗体構築物の第一の結合ドメインが、配列番号１０５２、配列番号１０９４、配列番号１１５０、配列番号１１７８、配列番号１１９２、配列番号１２２０、配列番号１２３４、配列番号１２４８、配列番号１２６２、配列番号１２７６、配列番号１３４６、配列番号１３６０、配列番号１３７４、配列番号１４３０、及び配列番号１４４４に記載のものからなる群より選択されるポリペプチドを含むときが好ましい。
【００９１】
本明細書で使用される「二重特異性」という用語は、「少なくとも二重特異性」である抗体構築物を表す、すなわち、該抗体構築物は、少なくとも第一の結合ドメイン及び第二の結合ドメインを含み、第一の結合ドメインが１つの抗原または標的（ここでは：ＣＤ７０）に結合し、第二の結合ドメインが別の抗原または標的（ここでは：ＣＤ３）に結合する。従って、本発明に従う抗体構築物は、少なくとも２つの異なる抗原または標的に対する特異性を含む。本発明の「二重特異性抗体構築物」という用語は、多重特異性抗体構築物、例えば、三重特異性抗体構築物、これは３つの結合ドメインを含む、または３つより多い（例えば、４、５．．．）特異性を有する構築物も包含する。
【００９２】
本発明に従う抗体構築物が（少なくとも）二重特異性であることを考慮すると、それらは、天然には生じず、天然に存在する産物からは明らかに異なる。「二重特異性」抗体構築物または免疫グロブリンは、従って、異なる特異性を有する少なくとも２つの別個の結合部位を有する人工ハイブリッド抗体または免疫グロブリンである。二重特異性抗体構築物は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の結合を含む様々な方法により産生することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ＆  Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）を参照されたい。
【００９３】
本発明の抗体構築物の少なくとも２つの結合ドメイン及び可変ドメインは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含んでも含まなくてもよい。「ペプチドリンカー」という用語は、本発明に従って、それにより本発明の抗体構築物の１つ（可変及び／または結合）ドメイン及び別の（可変及び／または結合）ドメインのアミノ酸配列が互いに連結する、アミノ酸配列を含む。このようなペプチドリンカーの本質的な技術的特徴は、それが、いずれの重合活性も含まないことである。とりわけ好適なペプチドリンカーは、米国特許第４，７５１，１８０号及び同第４，９３５，２３３号またはＷＯ８８／０９３４４に記載のものである。ペプチドリンカーを使用して、他のドメインまたはモジュールまたは領域（例えば、半減期延長ドメイン）を本発明の抗体構築物に付着させることもできる。
【００９４】
リンカーが使用される事象においては、このリンカーは、好ましくは、第一及び第二のドメインの各々が互いから独立してそれらの異なる結合特異性を保持することができることを確実にするのに十分な長さ及び配列のリンカーである。本発明の抗体構築物において少なくとも２つの結合ドメイン（または２つの可変ドメイン）を連結するペプチドリンカーの場合、数個のアミノ酸残基、例えば、１２個のアミノ酸残基またはそれ未満のみを含むペプチドリンカーが好ましい。ゆえに、１２、１１、１０、９、８、７、６または５個のアミノ酸残基のペプチドリンカーが好ましい。５個のアミノ酸未満を有する想定されるペプチドリンカーは、４、３、２または１個のアミノ酸を含み、Ｇｌｙリッチリンカーが好ましい。前記「ペプチドリンカー」の文脈で特に好ましい「単一」アミノ酸は、Ｇｌｙである。従って、前記ペプチドリンカーは、単一アミノ酸Ｇｌｙからなり得る。ペプチドリンカーの別の好ましい態様は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、すなわちＧｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号７７１）、またはその多量体、すなわち（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘを特徴とし、ここでｘは１またはそれより大きい整数である（例えば、２または３）。好ましいリンカーは、配列番号７７０〜７７８に示す。二次構造の促進が存在しない前記ペプチドリンカーの特徴は当技術分野で公知であり、例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）３７，９２６６−９２７３）、Ｃｈｅａｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）２９，２１−３０）及びＲａａｇ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｌｏｗ（ＦＡＳＥＢ（１９９５）９（１）、７３−８０）に記載されている。さらにいかなる二次構造も促進しないペプチドリンカーが好ましい。前記ドメインの相互に対する連結は、例えば、実施例に記載されるような遺伝子工学によって提供することができる。融合された及び作動可能に連結した二重特異性単鎖構築物を調製し、それらを哺乳動物細胞または細菌において発現させる方法は、当技術分野で周知である（例えば、ＷＯ９９／５４４４０またはＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）。
【００９５】
本明細書に上述するように、本発明は、抗体構築物が、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−単一ドメインｍＡｂ、ダイアボディ及び前述の形式のいずれかのオリゴマーからなる群より選択される形式である、好ましい実施形態を提供する。「の形式である」という用語は、本明細書に記載のような、他の基への付加または融合によりさらに修飾することができる構築物を除外しない。
【００９６】
特定の好ましい実施形態に従い、そして添付の実施例において記載されているように、本発明の抗体構築物は、「二重特異性単鎖抗体構築物」、より好ましくは二重特異性「単鎖Ｆｖ」（ｓｖＦｖ）である。Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、ＶＬ及びＶＨ領域が対になり１価分子を形成する単一のタンパク質鎖としてそれらを形成することを可能にする（本明細書に前述するように）合成リンカーによる組換え法を用いて接合することができる；例えば、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照されたい）。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を用いて取得され、その断片は、全または完全長抗体と同じ様式で機能について評価される。単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、従って、通常約１０〜約２５アミノ酸、好ましくは約１５〜２０アミノ酸の短いリンカーペプチドを用いて接続される、免疫グロブリンの重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質である。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシン、ならびに溶解性のためにセリンまたはトレオニンを豊富に含み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端にまたはその逆のいずれかで接続することができる。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、当初の免疫グロブリンの特異性を保持する。
【００９７】
二重特異性単鎖分子は当技術分野で公知であり、ＷＯ９９／５４４４０、Ｍａｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７），１５８，３９６５−３９７０、Ｍａｃｋ，ＰＮＡＳ，（１９９５），９２，７０２１−７０２５、Ｋｕｆｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，（１９９７），４５，１９３−１９７、Ｌｏｆｆｌｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，（２０００）、９５，６，２０９８−２１０３、Ｂｒｕｈｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００１）、１６６，２４２０−２４２６、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９９），２９３，４１−５６に記載されている。単鎖抗体の産生に関して記載された技術（特に、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ（２０１０）、前掲書及びＬｉｔｔｌｅ（２００９）、前掲書を参照されたい）を適応して、選出された標的（複数可）を特異的に認識する単鎖抗体構築物を産生することができる。
【００９８】
二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）（二価（ｄｉｖａｌｅｎｔ）とも呼ばれる）または二重特異性単鎖可変断片（形式（ｓｃＦｖ）２を有するｂｉ−ｓｃＦｖまたはｄｉ−ｓｃＦｖは、２つのｓｃＦｖ分子を（例えば、本明細書に前述するリンカーを用いて）連結することによって操作することができる。これらの２つのｓｃＦｖ分子が同じ結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）２分子は好ましくは二価と呼ばれるであろう（すなわち、それは同じ標的エピトープに対して２の価数を有する）。２つのｓｃＦｖ分子が異なる結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）２分子は好ましくは、二重特異性と呼ばれるだろう。連結は、タンデムｓｃＦｖを生成する、２つのＶＨ領域及び２つのＶＬ領域を有する単一のペプチド鎖を産生することによって行うことができる（例えば、Ｋｕｆｅｒ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２（５）：２３８−２４４を参照されたい）。別の可能性は、２つの可変領域を一緒に折り畳み、ｓｃＦｖを二量体化させるには短すぎるリンカーペプチド（例えば、約５個のアミノ酸）を用いるｓｃＦｖ分子の作製である。このタイプは、ダイアボディとして公知である（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｐｈｉｌｉｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊｕｌｙ  １９９３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９０（１４）：６４４４−８を参照されたい）。
【００９９】
本発明の抗体構築物のさらに好ましい実施形態に従い、（標的抗原ＣＤ７０またはＣＤ３のいずれかに結合する）結合ドメインの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）は、上記のペプチドリンカーを介して直接連結しないが、結合ドメインは、ダイアボディについて記載されるように形成される。ゆえに、ＣＤ３結合ドメインのＶＨは、ＣＤ７０結合ドメインのＶＬに、ペプチドリンカーを介して融合し、ＣＤ７０結合ドメインのＶＨは、ＣＤ３結合ドメインのＶＬに、かかるペプチドリンカーを介して融合する。
【０１００】
単一ドメイン抗体は、他のＶ領域またはドメインに非依存的に、特定の抗原に選択的に結合することができる１つのみの（単量体）抗体可変ドメインを含む。最初の単一ドメイン抗体は、ラクダにおいて見出される重鎖抗体から操作され、これらはＶＨＨ断片と呼ばれる。軟骨魚もまた、重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ）を有し、そこからＶＮＡＲ断片と呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることができる。代替手法は、例えば、ヒトまたはげっ歯類由来の一般的な免疫グロブリン由来の二量体可変ドメインを単量体に分割し、それによって単一ドメインＡｂとしてＶＨまたはＶＬを得ることである。単一ドメイン抗体に関する研究の大半は現時点で重鎖可変ドメインに基づいているが、軽鎖由来のナノボディもまた、標的エピトープに特異的に結合することが示されている。単一ドメイン抗体の例は、ｓｄＡｂ、ナノボディまたは単一可変ドメイン抗体と呼ばれる。
【０１０１】
従って、（単一ドメインｍＡｂ）２は、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ及びＶＮＡＲを含む群から個々に選択される（少なくとも）２つの単一ドメインモノクローナル抗体で構成されるモノクローナル抗体構築物である。リンカーは、好ましくは、ペプチドリンカーの形態をとる。同様に、「ｓｃＦｖ−単一ドメインｍＡｂ」は、上記の少なくとも１つの単一ドメイン抗体及び上記の１つのｓｃＦｖ分子で構成されるモノクローナル抗体構築物である。この場合も、リンカーは、好ましくは、ペプチドリンカーの形態をとる。
【０１０２】
本発明の抗体構築物は、標的分子であるＣＤ７０及びＣＤ３に結合するその機能に加えて、さらなる機能を有することも想定されている。この形式で、抗体構築物は、ＣＤ７０への結合を通して標的細胞を標的化し、ＣＤ３結合を通して細胞傷害性Ｔ細胞の活性を媒介し、そしてさらなる機能、例えば、ＮＫ細胞等のエフェクター細胞の動員を通して抗体依存的細胞傷害性を媒介する完全機能性Ｆｃ定常ドメイン、標識（蛍光等）、治療剤、例えば、毒素もしくは放射性核種等、及び／または血清半減期を強化する手段等を提供することにより、三機能性または多機能性抗体構築物となる。
【０１０３】
本発明の抗体構築物の血清半減期を延長する手段の例としては、抗体構築物に融合されたまたはそれ以外で付着されたペプチド、タンパク質またはタンパク質のドメインが挙げられる。このペプチド、タンパク質またはタンパク質ドメイン群は、血清アルブミンなどのヒト体内において好ましい薬物動態プロフィールを伴って他のタンパク質に結合するペプチドを含む（ＷＯ２００９／１２７６９１を参照されたい）。そのような半減期延長ペプチドの代替的なコンセプトは、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ、ＷＯ２００７／０９８４２０を参照されたい）に結合するペプチドを含み、これも本発明の構築物において使用することができる。タンパク質のより大きなドメインまたは完全なタンパク質を付着させるコンセプトは、例えば、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンの変異体または突然変異体（ＷＯ２０１１／０５１４８９、ＷＯ２０１２／０５９４８６、ＷＯ２０１２／１５０３１９、ＷＯ２０１３／１３５８９６、ＷＯ２０１４／０７２４８１、ＷＯ２０１３／０７５０６６を参照されたい）またはそのドメインの融合ならびに免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃドメイン）及びその変異体の融合を含む。Ｆｃドメインのそのような変異体は、Ｆｃ受容体結合性（例えば、Ｆｃγ受容体）を除去するためまたはその他の理由で、二量体または多量体の所望の対合を可能にするために最適化／修飾され得る。ヒト体内で小タンパク質化合物の半減期を延長するための当技術分野で公知のさらなるコンセプトは、本発明の抗体構築物などの化合物のペグ化である。
【０１０４】
好ましい実施形態では、本発明に従う二重特異性抗体構築物は、例えば、構築物の血清半減期を延長する目的のために、融合パートナー（例えば、タンパク質またはポリペプチドまたはペプチド）と（例えば、ペプチド結合を介して）連結し得る。これらの融合パートナーは、ヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」または「ＨＡＬＢ」）ならびにその配列変異体、ＨＡＳに結合するペプチド、ＦｃＲｎに結合するペプチド（「ＦｃＲｎ  ＢＰ」）、または（抗体由来の）Ｆｃ領域を含む構築物から選択することができる。これらの融合パートナーの例示的な配列を、配列番号７８０〜８２６に示す。一般に、融合パートナーは、直接（例えば、ペプチド結合を介して）または（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ここで、「ｎ」は、２またはそれより多い整数である、例えば、２または３または４）などのペプチドリンカーを通してのいずれかで本発明に従う二重特異性抗体構築物のＮ末端またはＣ末端に連結し得る。好適なペプチドリンカーを、配列番号７７０〜７７８に示す。
【０１０５】
従って、本発明に従う好ましい抗体構築物は、以下を含む：
（ａ）Ｎ末端から開始して以下の順番で：
・配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１９、配列番号１２９、配列番号１３９、配列番号１４９、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６７９、配列番号６８９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号９２２、配列番号９２６、配列番号９３０、配列番号９３４、配列番号９３８、配列番号９４２、配列番号９４６、配列番号９５０、配列番号９５４、配列番号９５８、配列番号９６２、配列番号９６６、配列番号９７０、配列番号９７４、配列番号９７８、配列番号９８２、配列番号９８６、配列番号９９０、配列番号９９４、配列番号９９８、配列番号１００２、配列番号１００６、配列番号１０１０、配列番号１０１４、配列番号１０１８、配列番号１０２２、配列番号１０２６、配列番号１０３０、配列番号１０３４、配列番号１０３８、配列番号１０４２、配列番号１０５２、配列番号１０５６、配列番号１０６６、配列番号１０７０、配列番号１０８０、配列番号１０８４、配列番号１０９４、配列番号１０９８、配列番号１１０８、配列番号１１１２、配列番号１１２２、配列番号１１２６、配列番号１１３６、配列番号１１４０、配列番号１１５０、配列番号１１５４、配列番号１１６４、配列番号１１６８、配列番号１１７８、配列番号１１８２、配列番号１１９２、配列番号１１９６、配列番号１２０６、配列番号１２１０、配列番号１２２０、配列番号１２２４、配列番号１２３４、配列番号１２３８、配列番号１２４８、配列番号１２５２、配列番号１２６２、配列番号１２６６、配列番号１２７６、配列番号１２８０、配列番号１２９０、配列番号１２９４、配列番号１３０４、配列番号１３０８、配列番号１３１８、配列番号１３２２、配列番号１３３２、配列番号１３３６、配列番号１３４６、配列番号１３５０、配列番号１３６０、配列番号１３６４、配列番号１３７４、配列番号１３７８、配列番号１３８８、配列番号１３９２、配列番号１４０２、配列番号１４０６、配列番号１４１６、配列番号１４２０、配列番号１４３０、配列番号１４３４、配列番号１４４４、配列番号１４４８、配列番号１４５８、配列番号１４６２、配列番号１４７２、配列番号１４７６、配列番号１４８６、配列番号１４９０、配列番号１５００、配列番号１５０４、配列番号１５１４、配列番号１５１８、配列番号１５２８、配列番号１５３２、配列番号１５４２、配列番号１５４６、配列番号１５５６、配列番号１５６０、配列番号１５７０、及び配列番号１５７４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号７７０〜７７８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；ならびに
・配列番号８３５、配列番号８４４、配列番号８５３、配列番号８６２、配列番号８７１、配列番号８８０、配列番号８８９、配列番号８９８、配列番号９０７、配列番号９１６、及び配列番号９１９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
・任意選択でＨｉｓ−タグ、例えば、配列番号７７９に記載のもの
を含むポリペプチド；
（ｂ）Ｎ末端から開始して以下の順番で：
・配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１９、配列番号１２９、配列番号１３９、配列番号１４９、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６７９、配列番号６８９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号９２２、配列番号９２６、配列番号９３０、配列番号９３４、配列番号９３８、配列番号９４２、配列番号９４６、配列番号９５０、配列番号９５４、配列番号９５８、配列番号９６２、配列番号９６６、配列番号９７０、配列番号９７４、配列番号９７８、配列番号９８２、配列番号９８６、配列番号９９０、配列番号９９４、配列番号９９８、配列番号１００２、配列番号１００６、配列番号１０１０、配列番号１０１４、配列番号１０１８、配列番号１０２２、配列番号１０２６、配列番号１０３０、配列番号１０３４、配列番号１０３８、配列番号１０４２、配列番号１０５２、配列番号１０５６、配列番号１０６６、配列番号１０７０、配列番号１０８０、配列番号１０８４、配列番号１０９４、配列番号１０９８、配列番号１１０８、配列番号１１１２、配列番号１１２２、配列番号１１２６、配列番号１１３６、配列番号１１４０、配列番号１１５０、配列番号１１５４、配列番号１１６４、配列番号１１６８、配列番号１１７８、配列番号１１８２、配列番号１１９２、配列番号１１９６、配列番号１２０６、配列番号１２１０、配列番号１２２０、配列番号１２２４、配列番号１２３４、配列番号１２３８、配列番号１２４８、配列番号１２５２、配列番号１２６２、配列番号１２６６、配列番号１２７６、配列番号１２８０、配列番号１２９０、配列番号１２９４、配列番号１３０４、配列番号１３０８、配列番号１３１８、配列番号１３２２、配列番号１３３２、配列番号１３３６、配列番号１３４６、配列番号１３５０、配列番号１３６０、配列番号１３６４、配列番号１３７４、配列番号１３７８、配列番号１３８８、配列番号１３９２、配列番号１４０２、配列番号１４０６、配列番号１４１６、配列番号１４２０、配列番号１４３０、配列番号１４３４、配列番号１４４４、配列番号１４４８、配列番号１４５８、配列番号１４６２、配列番号１４７２、配列番号１４７６、配列番号１４８６、配列番号１４９０、配列番号１５００、配列番号１５０４、配列番号１５１４、配列番号１５１８、配列番号１５２８、配列番号１５３２、配列番号１５４２、配列番号１５４６、配列番号１５５６、配列番号１５６０、配列番号１５７０、及び配列番号１５７４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号７７０〜７７８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号８３５、配列番号８４４、配列番号８５３、配列番号８６２、配列番号８７１、配列番号８８０、配列番号８８９、配列番号８９８、配列番号９０７、配列番号９１６、及び配列番号９１９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・任意選択で配列番号７７０〜７７８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号７８０及び７８６〜８１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
・任意選択でＨｉｓ−タグ、例えば、配列番号７７９に記載のもの
を含むポリペプチド；
（ｃ）Ｎ末端から開始して以下の順番で：
・アミノ酸配列
2018530996.tif 000025
を有し、Ｘ１が、ＹまたはＨである、ポリペプチド；ならびに
・配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１９、配列番号１２９、配列番号１３９、配列番号１４９、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６７９、配列番号６８９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号９２２、配列番号９２６、配列番号９３０、配列番号９３４、配列番号９３８、配列番号９４２、配列番号９４６、配列番号９５０、配列番号９５４、配列番号９５８、配列番号９６２、配列番号９６６、配列番号９７０、配列番号９７４、配列番号９７８、配列番号９８２、配列番号９８６、配列番号９９０、配列番号９９４、配列番号９９８、配列番号１００２、配列番号１００６、配列番号１０１０、配列番号１０１４、配列番号１０１８、配列番号１０２２、配列番号１０２６、配列番号１０３０、配列番号１０３４、配列番号１０３８、配列番号１０４２、配列番号１０５２、配列番号１０５６、配列番号１０６６、配列番号１０７０、配列番号１０８０、配列番号１０８４、配列番号１０９４、配列番号１０９８、配列番号１１０８、配列番号１１１２、配列番号１１２２、配列番号１１２６、配列番号１１３６、配列番号１１４０、配列番号１１５０、配列番号１１５４、配列番号１１６４、配列番号１１６８、配列番号１１７８、配列番号１１８２、配列番号１１９２、配列番号１１９６、配列番号１２０６、配列番号１２１０、配列番号１２２０、配列番号１２２４、配列番号１２３４、配列番号１２３８、配列番号１２４８、配列番号１２５２、配列番号１２６２、配列番号１２６６、配列番号１２７６、配列番号１２８０、配列番号１２９０、配列番号１２９４、配列番号１３０４、配列番号１３０８、配列番号１３１８、配列番号１３２２、配列番号１３３２、配列番号１３３６、配列番号１３４６、配列番号１３５０、配列番号１３６０、配列番号１３６４、配列番号１３７４、配列番号１３７８、配列番号１３８８、配列番号１３９２、配列番号１４０２、配列番号１４０６、配列番号１４１６、配列番号１４２０、配列番号１４３０、配列番号１４３４、配列番号１４４４、配列番号１４４８、配列番号１４５８、配列番号１４６２、配列番号１４７２、配列番号１４７６、配列番号１４８６、配列番号１４９０、配列番号１５００、配列番号１５０４、配列番号１５１４、配列番号１５１８、配列番号１５２８、配列番号１５３２、配列番号１５４２、配列番号１５４６、配列番号１５５６、配列番号１５６０、配列番号１５７０、及び配列番号１５７４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号７７０〜７７８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号８３５、配列番号８４４、配列番号８５３、配列番号８６２、配列番号８７１、配列番号８８０、配列番号８８９、配列番号８９８、配列番号９０７、配列番号９１６、及び配列番号９１９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・アミノ酸配列
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を有するポリペプチド；ならびに
・任意選択でＨｉｓ−タグ、例えば、配列番号７７９に記載のもの
を含むポリペプチド；
（ｄ）Ｎ末端から開始して以下の順番で：
・配列番号８３３、配列番号８４２、配列番号８５１、配列番号８６０、配列番号８６９、配列番号８７８、配列番号８８７、配列番号８９６、配列番号９０５、配列番号９１４、及び配列番号９１７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号７７７に記載のアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号８、配列番号１８、配列番号２８、配列番号３８、配列番号４８、配列番号５８、配列番号６８、配列番号７８、配列番号８８、配列番号９８、配列番号１０８、配列番号１１８、配列番号１２８、配列番号１３８、配列番号１４８、配列番号１５８、配列番号１６８、配列番号１７８、配列番号１８８、配列番号１９８、配列番号２０８、配列番号２１８、配列番号２２８、配列番号２３８、配列番号２４８、配列番号２５８、配列番号２６８、配列番号２７８、配列番号２８８、配列番号２９８、配列番号３０８、配列番号３１８、配列番号３２８、配列番号３３８、配列番号３４８、配列番号３５８、配列番号３６８、配列番号３７８、配列番号３８８、配列番号３９８、配列番号４０８、配列番号４１８、配列番号４２８、配列番号４３８、配列番号４４８、配列番号４５８、配列番号４６８、配列番号４７８、配列番号４８８、配列番号４９８、配列番号５０８、配列番号５１８、配列番号５２８、配列番号５３８、配列番号５４８、配列番号５５８、配列番号５６８、配列番号５７８、配列番号５８８、配列番号５９８、配列番号６０８、配列番号６１８、配列番号６２８、配列番号６３８、配列番号６４８、配列番号６５８、配列番号６６８、配列番号６７８、配列番号６８８、配列番号６９８、配列番号７０８、配列番号７１８、配列番号７２８、配列番号７３８、配列番号９２１、配列番号９２５、配列番号９２９、配列番号９３３、配列番号９３７、配列番号９４１、配列番号９４５、配列番号９４９、配列番号９５３、配列番号９５７、配列番号９６１、配列番号９６５、配列番号９６９、配列番号９７３、配列番号９７７、配列番号９８１、配列番号９８５、配列番号９８９、配列番号９９３、配列番号９９７、配列番号１００１、配列番号１００５、配列番号１００９、配列番号１０１３、配列番号１０１７、配列番号１０２１、配列番号１０２５、配列番号１０２９、配列番号１０３３、配列番号１０３７、配列番号１０４１、配列番号１０５１、配列番号１０５５、配列番号１０６５、配列番号１０６９、配列番号１０７９、配列番号１０８３、配列番号１０９３、配列番号１０９７、配列番号１１０７、配列番号１１１１、配列番号１１２１、配列番号１１２５、配列番号１１３５、配列番号１１３９、配列番号１１４９、配列番号１１５３、配列番号１１６３、配列番号１１６７、配列番号１１７７、配列番号１１８１、配列番号１１９１、配列番号１１９５、配列番号１２０５、配列番号１２０９、配列番号１２１９、配列番号１２２３、配列番号１２３３、配列番号１２３７、配列番号１２４７、配列番号１２５１、配列番号１２６１、配列番号１２６５、配列番号１２７５、配列番号１２７９、配列番号１２８９、配列番号１２９３、配列番号１３０３、配列番号１３０７、配列番号１３１７、配列番号１３２１、配列番号１３３１、配列番号１３３５、配列番号１３４５、配列番号１３４９、配列番号１３５９、配列番号１３６３、配列番号１３７３、配列番号１３７７、配列番号１３８７、配列番号１３９１、配列番号１４０１、配列番号１４０５、配列番号１４１５、配列番号１４１９、配列番号１４２９、配列番号１４３３、配列番号１４４３、配列番号１４４７、配列番号１４５７、配列番号１４６１、配列番号１４７１、配列番号１４７５、配列番号１４８５、配列番号１４８９、配列番号１４９９、配列番号１５０３、配列番号１５１３、配列番号１５１７、配列番号１５２７、配列番号１５３１、配列番号１５４１、配列番号１５４５、配列番号１５５５、配列番号１５５９、配列番号１５６９、及び配列番号１５７３からなる群より選択されるアミノ酸配列、その後、Ｃ末端にセリン残基を有するポリペプチド；
・配列番号８１６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；ならびに
Ｎ末端から開始して以下の順番で：
・配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、配列番号７７、配列番号８７、配列番号９７、配列番号１０７、配列番号１１７、配列番号１２７、配列番号１３７、配列番号１４７、配列番号１５７、配列番号１６７、配列番号１７７、配列番号１８７、配列番号１９７、配列番号２０７、配列番号２１７、配列番号２２７、配列番号２３７、配列番号２４７、配列番号２５７、配列番号２６７、配列番号２７７、配列番号２８７、配列番号２９７、配列番号３０７、配列番号３１７、配列番号３２７、配列番号３３７、配列番号３４７、配列番号３５７、配列番号３６７、配列番号３７７、配列番号３８７、配列番号３９７、配列番号４０７、配列番号４１７、配列番号４２７、配列番号４３７、配列番号４４７、配列番号４５７、配列番号４６７、配列番号４７７、配列番号４８７、配列番号４９７、配列番号５０７、配列番号５１７、配列番号５２７、配列番号５３７、配列番号５４７、配列番号５５７、配列番号５６７、配列番号５７７、配列番号５８７、配列番号５９７、配列番号６０７、配列番号６１７、配列番号６２７、配列番号６３７、配列番号６４７、配列番号６５７、配列番号６６７、配列番号６７７、配列番号６８７、配列番号６９７、配列番号７０７、配列番号７１７、配列番号７２７、配列番号７３７；配列番号９２０、配列番号９２４、配列番号９２８、配列番号９３２、配列番号９３６、配列番号９４０、配列番号９４４、配列番号９４８、配列番号９５２、配列番号９５６、配列番号９６０、配列番号９６４、配列番号９６８、配列番号９７２、配列番号９７６、配列番号９８０、配列番号９８４、配列番号９８８、配列番号９９２、配列番号９９６、配列番号１０００、配列番号１００４、配列番号１００８、配列番号１０１２、配列番号１０１６、配列番号１０２０、配列番号１０２４、配列番号１０２８、配列番号１０３２、配列番号１０３６、配列番号１０４０、配列番号１０５０、配列番号１０５４、配列番号１０６４、配列番号１０６８、配列番号１０７８、配列番号１０８２、配列番号１０９２、配列番号１０９６、配列番号１１０６、配列番号１１１０、配列番号１１２０、配列番号１１２４、配列番号１１３４、配列番号１１３８、配列番号１１４８、配列番号１１５２、配列番号１１６２、配列番号１１６６、配列番号１１７６、配列番号１１８０、配列番号１１９０、配列番号１１９４、配列番号１２０４、配列番号１２０８、配列番号１２１８、配列番号１２２２、配列番号１２３２、配列番号１２３６、配列番号１２４６、配列番号１２５０、配列番号１２６０、配列番号１２６４、配列番号１２７４、配列番号１２７８、配列番号１２８８、配列番号１２９２、配列番号１３０２、配列番号１３０６、配列番号１３１６、配列番号１３２０、配列番号１３３０、配列番号１３３４、配列番号１３４４、配列番号１３４８、配列番号１３５８、配列番号１３６２、配列番号１３７２、配列番号１３７６、配列番号１３８６、配列番号１３９０、配列番号１４００、配列番号１４０４、配列番号１４１４、配列番号１４１８、配列番号１４２８、配列番号１４３２、配列番号１４４２、配列番号１４４６、配列番号１４５６、配列番号１４６０、配列番号１４７０、配列番号１４７４、配列番号１４８４、配列番号１４８８、配列番号１４９８、配列番号１５０２、配列番号１５１２、配列番号１５１６、配列番号１５２６、配列番号１５３０、配列番号１５４０、配列番号１５４４、配列番号１５５４、配列番号１５５８、配列番号１５６８、及び配列番号１５７２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号７７７に記載のアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号８３４、配列番号８４３、配列番号８５２、配列番号８６１、配列番号８７０、配列番号８７９、配列番号８８８、配列番号８９７、配列番号９０６、配列番号９１５、及び配列番号９１８からなる群より選択されるアミノ酸配列、その後、Ｃ末端にセリン残基を有するポリペプチド；ならびに
・配列番号８１７に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；
（ｅ）Ｎ末端から開始して以下の順番で：
・配列番号８３３、配列番号８４２、配列番号８５１、配列番号８６０、配列番号８６９、配列番号８７８、配列番号８８７、配列番号８９６、配列番号９０５、配列番号９１４、及び配列番号９１７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号７７７に記載のアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号８、配列番号１８、配列番号２８、配列番号３８、配列番号４８、配列番号５８、配列番号６８、配列番号７８、配列番号８８、配列番号９８、配列番号１０８、配列番号１１８、配列番号１２８、配列番号１３８、配列番号１４８、配列番号１５８、配列番号１６８、配列番号１７８、配列番号１８８、配列番号１９８、配列番号２０８、配列番号２１８、配列番号２２８、配列番号２３８、配列番号２４８、配列番号２５８、配列番号２６８、配列番号２７８、配列番号２８８、配列番号２９８、配列番号３０８、配列番号３１８、配列番号３２８、配列番号３３８、配列番号３４８、配列番号３５８、配列番号３６８、配列番号３７８、配列番号３８８、配列番号３９８、配列番号４０８、配列番号４１８、配列番号４２８、配列番号４３８、配列番号４４８、配列番号４５８、配列番号４６８、配列番号４７８、配列番号４８８、配列番号４９８、配列番号５０８、配列番号５１８、配列番号５２８、配列番号５３８、配列番号５４８、配列番号５５８、配列番号５６８、配列番号５７８、配列番号５８８、配列番号５９８、配列番号６０８、配列番号６１８、配列番号６２８、配列番号６３８、配列番号６４８、配列番号６５８、配列番号６６８、配列番号６７８、配列番号６８８、配列番号６９８、配列番号７０８、配列番号７１８、配列番号７２８、配列番号７３８、配列番号９２１、配列番号９２５、配列番号９２９、配列番号９３３、配列番号９３７、配列番号９４１、配列番号９４５、配列番号９４９、配列番号９５３、配列番号９５７、配列番号９６１、配列番号９６５、配列番号９６９、配列番号９７３、配列番号９７７、配列番号９８１、配列番号９８５、配列番号９８９、配列番号９９３、配列番号９９７、配列番号１００１、配列番号１００５、配列番号１００９、配列番号１０１３、配列番号１０１７、配列番号１０２１、配列番号１０２５、配列番号１０２９、配列番号１０３３、配列番号１０３７、配列番号１０４１、配列番号１０５１、配列番号１０５５、配列番号１０６５、配列番号１０６９、配列番号１０７９、配列番号１０８３、配列番号１０９３、配列番号１０９７、配列番号１１０７、配列番号１１１１、配列番号１１２１、配列番号１１２５、配列番号１１３５、配列番号１１３９、配列番号１１４９、配列番号１１５３、配列番号１１６３、配列番号１１６７、配列番号１１７７、配列番号１１８１、配列番号１１９１、配列番号１１９５、配列番号１２０５、配列番号１２０９、配列番号１２１９、配列番号１２２３、配列番号１２３３、配列番号１２３７、配列番号１２４７、配列番号１２５１、配列番号１２６１、配列番号１２６５、配列番号１２７５、配列番号１２７９、配列番号１２８９、配列番号１２９３、配列番号１３０３、配列番号１３０７、配列番号１３１７、配列番号１３２１、配列番号１３３１、配列番号１３３５、配列番号１３４５、配列番号１３４９、配列番号１３５９、配列番号１３６３、配列番号１３７３、配列番号１３７７、配列番号１３８７、配列番号１３９１、配列番号１４０１、配列番号１４０５、配列番号１４１５、配列番号１４１９、配列番号１４２９、配列番号１４３３、配列番号１４４３、配列番号１４４７、配列番号１４５７、配列番号１４６１、配列番号１４７１、配列番号１４７５、配列番号１４８５、配列番号１４８９、配列番号１４９９、配列番号１５０３、配列番号１５１３、配列番号１５１７、配列番号１５２７、配列番号１５３１、配列番号１５４１、配列番号１５４５、配列番号１５５５、配列番号１５５９、配列番号１５６９、及び配列番号１５７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
・配列番号８１８に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；ならびに
Ｎ末端から開始して以下の順番で：
・配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、配列番号７７、配列番号８７、配列番号９７、配列番号１０７、配列番号１１７、配列番号１２７、配列番号１３７、配列番号１４７、配列番号１５７、配列番号１６７、配列番号１７７、配列番号１８７、配列番号１９７、配列番号２０７、配列番号２１７、配列番号２２７、配列番号２３７、配列番号２４７、配列番号２５７、配列番号２６７、配列番号２７７、配列番号２８７、配列番号２９７、配列番号３０７、配列番号３１７、配列番号３２７、配列番号３３７、配列番号３４７、配列番号３５７、配列番号３６７、配列番号３７７、配列番号３８７、配列番号３９７、配列番号４０７、配列番号４１７、配列番号４２７、配列番号４３７、配列番号４４７、配列番号４５７、配列番号４６７、配列番号４７７、配列番号４８７、配列番号４９７、配列番号５０７、配列番号５１７、配列番号５２７、配列番号５３７、配列番号５４７、配列番号５５７、配列番号５６７、配列番号５７７、配列番号５８７、配列番号５９７、配列番号６０７、配列番号６１７、配列番号６２７、配列番号６３７、配列番号６４７、配列番号６５７、配列番号６６７、配列番号６７７、配列番号６８７、配列番号６９７、配列番号７０７、配列番号７１７、配列番号７２７、配列番号７３７；配列番号９２０、配列番号９２４、配列番号９２８、配列番号９３２、配列番号９３６、配列番号９４０、配列番号９４４、配列番号９４８、配列番号９５２、配列番号９５６、配列番号９６０、配列番号９６４、配列番号９６８、配列番号９７２、配列番号９７６、配列番号９８０、配列番号９８４、配列番号９８８、配列番号９９２、配列番号９９６、配列番号１０００、配列番号１００４、配列番号１００８、配列番号１０１２、配列番号１０１６、配列番号１０２０、配列番号１０２４、配列番号１０２８、配列番号１０３２、配列番号１０３６、配列番号１０４０、配列番号１０５０、配列番号１０５４、配列番号１０６４、配列番号１０６８、配列番号１０７８、配列番号１０８２、配列番号１０９２、配列番号１０９６、配列番号１１０６、配列番号１１１０、配列番号１１２０、配列番号１１２４、配列番号１１３４、配列番号１１３８、配列番号１１４８、配列番号１１５２、配列番号１１６２、配列番号１１６６、配列番号１１７６、配列番号１１８０、配列番号１１９０、配列番号１１９４、配列番号１２０４、配列番号１２０８、配列番号１２１８、配列番号１２２２、配列番号１２３２、配列番号１２３６、配列番号１２４６、配列番号１２５０、配列番号１２６０、配列番号１２６４、配列番号１２７４、配列番号１２７８、配列番号１２８８、配列番号１２９２、配列番号１３０２、配列番号１３０６、配列番号１３１６、配列番号１３２０、配列番号１３３０、配列番号１３３４、配列番号１３４４、配列番号１３４８、配列番号１３５８、配列番号１３６２、配列番号１３７２、配列番号１３７６、配列番号１３８６、配列番号１３９０、配列番号１４００、配列番号１４０４、配列番号１４１４、配列番号１４１８、配列番号１４２８、配列番号１４３２、配列番号１４４２、配列番号１４４６、配列番号１４５６、配列番号１４６０、配列番号１４７０、配列番号１４７４、配列番号１４８４、配列番号１４８８、配列番号１４９８、配列番号１５０２、配列番号１５１２、配列番号１５１６、配列番号１５２６、配列番号１５３０、配列番号１５４０、配列番号１５４４、配列番号１５５４、配列番号１５５８、配列番号１５６８、及び配列番号１５７２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号７７７に記載のアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号８３４、配列番号８４３、配列番号８５２、配列番号８６１、配列番号８７０、配列番号８７９、配列番号８８８、配列番号８９７、配列番号９０６、配列番号９１５、及び配列番号９１８からなる群より選択されるアミノ酸配列、その後、Ｃ末端でセリン残基を有するポリペプチド；ならびに
・配列番号８１９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；
（ｆ）Ｎ末端から開始して以下の順番で：
・配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１９、配列番号１２９、配列番号１３９、配列番号１４９、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６７９、配列番号６８９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号９２２、配列番号９２６、配列番号９３０、配列番号９３４、配列番号９３８、配列番号９４２、配列番号９４６、配列番号９５０、配列番号９５４、配列番号９５８、配列番号９６２、配列番号９６６、配列番号９７０、配列番号９７４、配列番号９７８、配列番号９８２、配列番号９８６、配列番号９９０、配列番号９９４、配列番号９９８、配列番号１００２、配列番号１００６、配列番号１０１０、配列番号１０１４、配列番号１０１８、配列番号１０２２、配列番号１０２６、配列番号１０３０、配列番号１０３４、配列番号１０３８、配列番号１０４２、配列番号１０５２、配列番号１０５６、配列番号１０６６、配列番号１０７０、配列番号１０８０、配列番号１０８４、配列番号１０９４、配列番号１０９８、配列番号１１０８、配列番号１１１２、配列番号１１２２、配列番号１１２６、配列番号１１３６、配列番号１１４０、配列番号１１５０、配列番号１１５４、配列番号１１６４、配列番号１１６８、配列番号１１７８、配列番号１１８２、配列番号１１９２、配列番号１１９６、配列番号１２０６、配列番号１２１０、配列番号１２２０、配列番号１２２４、配列番号１２３４、配列番号１２３８、配列番号１２４８、配列番号１２５２、配列番号１２６２、配列番号１２６６、配列番号１２７６、配列番号１２８０、配列番号１２９０、配列番号１２９４、配列番号１３０４、配列番号１３０８、配列番号１３１８、配列番号１３２２、配列番号１３３２、配列番号１３３６、配列番号１３４６、配列番号１３５０、配列番号１３６０、配列番号１３６４、配列番号１３７４、配列番号１３７８、配列番号１３８８、配列番号１３９２、配列番号１４０２、配列番号１４０６、配列番号１４１６、配列番号１４２０、配列番号１４３０、配列番号１４３４、配列番号１４４４、配列番号１４４８、配列番号１４５８、配列番号１４６２、配列番号１４７２、配列番号１４７６、配列番号１４８６、配列番号１４９０、配列番号１５００、配列番号１５０４、配列番号１５１４、配列番号１５１８、配列番号１５２８、配列番号１５３２、配列番号１５４２、配列番号１５４６、配列番号１５５６、配列番号１５６０、配列番号１５７０、及び配列番号１５７４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号７７０〜７７８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号８３５、配列番号８４４、配列番号８５３、配列番号８６２、配列番号８７１、配列番号８８０、配列番号８８９、配列番号８９８、配列番号９０７、配列番号９１６、及び配列番号９１９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号８２０に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；及び
配列番号８２１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；
（ｇ）Ｎ末端から開始して以下の順番で：
・配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１９、配列番号１２９、配列番号１３９、配列番号１４９、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６７９、配列番号６８９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号９２２、配列番号９２６、配列番号９３０、配列番号９３４、配列番号９３８、配列番号９４２、配列番号９４６、配列番号９５０、配列番号９５４、配列番号９５８、配列番号９６２、配列番号９６６、配列番号９７０、配列番号９７４、配列番号９７８、配列番号９８２、配列番号９８６、配列番号９９０、配列番号９９４、配列番号９９８、配列番号１００２、配列番号１００６、配列番号１０１０、配列番号１０１４、配列番号１０１８、配列番号１０２２、配列番号１０２６、配列番号１０３０、配列番号１０３４、配列番号１０３８、配列番号１０４２、配列番号１０５２、配列番号１０５６、配列番号１０６６、配列番号１０７０、配列番号１０８０、配列番号１０８４、配列番号１０９４、配列番号１０９８、配列番号１１０８、配列番号１１１２、配列番号１１２２、配列番号１１２６、配列番号１１３６、配列番号１１４０、配列番号１１５０、配列番号１１５４、配列番号１１６４、配列番号１１６８、配列番号１１７８、配列番号１１８２、配列番号１１９２、配列番号１１９６、配列番号１２０６、配列番号１２１０、配列番号１２２０、配列番号１２２４、配列番号１２３４、配列番号１２３８、配列番号１２４８、配列番号１２５２、配列番号１２６２、配列番号１２６６、配列番号１２７６、配列番号１２８０、配列番号１２９０、配列番号１２９４、配列番号１３０４、配列番号１３０８、配列番号１３１８、配列番号１３２２、配列番号１３３２、配列番号１３３６、配列番号１３４６、配列番号１３５０、配列番号１３６０、配列番号１３６４、配列番号１３７４、配列番号１３７８、配列番号１３８８、配列番号１３９２、配列番号１４０２、配列番号１４０６、配列番号１４１６、配列番号１４２０、配列番号１４３０、配列番号１４３４、配列番号１４４４、配列番号１４４８、配列番号１４５８、配列番号１４６２、配列番号１４７２、配列番号１４７６、配列番号１４８６、配列番号１４９０、配列番号１５００、配列番号１５０４、配列番号１５１４、配列番号１５１８、配列番号１５２８、配列番号１５３２、配列番号１５４２、配列番号１５４６、配列番号１５５６、配列番号１５６０、配列番号１５７０、及び配列番号１５７４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
・配列番号８２２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；ならびに
Ｎ末端から開始して以下の順番で：
・ポリペプチド配列番号８３５、配列番号８４４、配列番号８５３、配列番号８６２、配列番号８７１、配列番号８８０、配列番号８８９、配列番号８９８、配列番号９０７、配列番号９１６、及び配列番号９１９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する；ならびに
・配列番号８２３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；
（ｈ）Ｎ末端から開始して以下の順番で：
・配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１９、配列番号１２９、配列番号１３９、配列番号１４９、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６７９、配列番号６８９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号９２２、配列番号９２６、配列番号９３０、配列番号９３４、配列番号９３８、配列番号９４２、配列番号９４６、配列番号９５０、配列番号９５４、配列番号９５８、配列番号９６２、配列番号９６６、配列番号９７０、配列番号９７４、配列番号９７８、配列番号９８２、配列番号９８６、配列番号９９０、配列番号９９４、配列番号９９８、配列番号１００２、配列番号１００６、配列番号１０１０、配列番号１０１４、配列番号１０１８、配列番号１０２２、配列番号１０２６、配列番号１０３０、配列番号１０３４、配列番号１０３８、配列番号１０４２、配列番号１０５２、配列番号１０５６、配列番号１０６６、配列番号１０７０、配列番号１０８０、配列番号１０８４、配列番号１０９４、配列番号１０９８、配列番号１１０８、配列番号１１１２、配列番号１１２２、配列番号１１２６、配列番号１１３６、配列番号１１４０、配列番号１１５０、配列番号１１５４、配列番号１１６４、配列番号１１６８、配列番号１１７８、配列番号１１８２、配列番号１１９２、配列番号１１９６、配列番号１２０６、配列番号１２１０、配列番号１２２０、配列番号１２２４、配列番号１２３４、配列番号１２３８、配列番号１２４８、配列番号１２５２、配列番号１２６２、配列番号１２６６、配列番号１２７６、配列番号１２８０、配列番号１２９０、配列番号１２９４、配列番号１３０４、配列番号１３０８、配列番号１３１８、配列番号１３２２、配列番号１３３２、配列番号１３３６、配列番号１３４６、配列番号１３５０、配列番号１３６０、配列番号１３６４、配列番号１３７４、配列番号１３７８、配列番号１３８８、配列番号１３９２、配列番号１４０２、配列番号１４０６、配列番号１４１６、配列番号１４２０、配列番号１４３０、配列番号１４３４、配列番号１４４４、配列番号１４４８、配列番号１４５８、配列番号１４６２、配列番号１４７２、配列番号１４７６、配列番号１４８６、配列番号１４９０、配列番号１５００、配列番号１５０４、配列番号１５１４、配列番号１５１８、配列番号１５２８、配列番号１５３２、配列番号１５４２、配列番号１５４６、配列番号１５５６、配列番号１５６０、配列番号１５７０、及び配列番号１５７４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
・配列番号８２４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；ならびに
Ｎ末端から開始して以下の順番で：
・配列番号８３５、配列番号８４４、配列番号８５３、配列番号８６２、配列番号８７１、配列番号８８０、配列番号８８９、配列番号８９８、配列番号９０７、配列番号９１６、及び配列番号９１９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
・配列番号８２５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；または
（ｉ）Ｎ末端から開始して以下の順番で：
・配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１９、配列番号１２９、配列番号１３９、配列番号１４９、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６７９、配列番号６８９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号９２２、配列番号９２６、配列番号９３０、配列番号９３４、配列番号９３８、配列番号９４２、配列番号９４６、配列番号９５０、配列番号９５４、配列番号９５８、配列番号９６２、配列番号９６６、配列番号９７０、配列番号９７４、配列番号９７８、配列番号９８２、配列番号９８６、配列番号９９０、配列番号９９４、配列番号９９８、配列番号１００２、配列番号１００６、配列番号１０１０、配列番号１０１４、配列番号１０１８、配列番号１０２２、配列番号１０２６、配列番号１０３０、配列番号１０３４、配列番号１０３８、配列番号１０４２、配列番号１０５２、配列番号１０５６、配列番号１０６６、配列番号１０７０、配列番号１０８０、配列番号１０８４、配列番号１０９４、配列番号１０９８、配列番号１１０８、配列番号１１１２、配列番号１１２２、配列番号１１２６、配列番号１１３６、配列番号１１４０、配列番号１１５０、配列番号１１５４、配列番号１１６４、配列番号１１６８、配列番号１１７８、配列番号１１８２、配列番号１１９２、配列番号１１９６、配列番号１２０６、配列番号１２１０、配列番号１２２０、配列番号１２２４、配列番号１２３４、配列番号１２３８、配列番号１２４８、配列番号１２５２、配列番号１２６２、配列番号１２６６、配列番号１２７６、配列番号１２８０、配列番号１２９０、配列番号１２９４、配列番号１３０４、配列番号１３０８、配列番号１３１８、配列番号１３２２、配列番号１３３２、配列番号１３３６、配列番号１３４６、配列番号１３５０、配列番号１３６０、配列番号１３６４、配列番号１３７４、配列番号１３７８、配列番号１３８８、配列番号１３９２、配列番号１４０２、配列番号１４０６、配列番号１４１６、配列番号１４２０、配列番号１４３０、配列番号１４３４、配列番号１４４４、配列番号１４４８、配列番号１４５８、配列番号１４６２、配列番号１４７２、配列番号１４７６、配列番号１４８６、配列番号１４９０、配列番号１５００、配列番号１５０４、配列番号１５１４、配列番号１５１８、配列番号１５２８、配列番号１５３２、配列番号１５４２、配列番号１５４６、配列番号１５５６、配列番号１５６０、配列番号１５７０、及び配列番号１５７４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号７７０〜７７８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号８３５、配列番号８４４、配列番号８５３、配列番号８６２、配列番号８７１、配列番号８８０、配列番号８８９、配列番号８９８、配列番号９０７、配列番号９１６、及び配列番号９１９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
・配列番号８２６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド。
【０１０６】
上記のように、いくつかの好ましい本発明の抗体構築物は、アルブミンまたはアルブミン変異体などの別の部分との融合により修飾される。これらの融合構築物が、特定のそれらの標的親和性または細胞傷害活性においてなど、それらの特性について特徴決定される場合、当業者は、同様の融合構築物または未修飾二重特異性抗体構築物が、同様の（または可能には、より良好である）特性を有すると予測することができることに気づくだろう。例えば、アルブミンと融合した二重特異性抗体構築物が、認識できるまたは所望の細胞傷害活性または標的親和性を有する場合、同じ／同様のまたはさらにはより高い細胞傷害活性／標的親和性がアルブミンを伴わない同じ構築物について観察されるだろうと予測することができる。
【０１０７】
別の好ましい実施形態に従って、本発明の二重特異性抗体構築物は、（２つの結合ドメインに加えて）、それぞれがヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド単量体を含む第三のドメインを含み、前記２つのポリペプチド（またはポリペプチド単量体）は、ペプチドリンカーを介して互いに融合する。好ましくは、前記第三のドメインは、ＮからＣ末端の順で：ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。前記第三のドメインに好ましいアミノ酸配列を、配列番号１８５６〜１８６３に示す。前記ポリペプチド単量体はそれぞれ好ましくは、配列番号１８４８〜１８５５からなる群より選択される、またはこれらの配列に少なくとも９０％同一である、アミノ酸配列を有する。別の好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体構築物の第一及び第二の結合ドメインは、例えば、配列番号７７０、７７１、７７３、７７４、７７５、７７７及び７７８からなる群より選択されるペプチドリンカーを介して第三のドメインに融合する。
【０１０８】
本発明に即して、「ヒンジ」は、ＩｇＧヒンジ領域である。この領域は、Ｋａｂａｔナンバリングを使用する類似性により同定することができ、Ｋａｂａｔ位置２２３〜２４３を参照されたい。上記に即して、「ヒンジ」に対する最小要件は、Ｋａｂａｔナンバリングに従うＤ２３１からＰ２４３のＩｇＧ１配列ストレッチに対応するアミノ酸残基である。ＣＨ２及びＣＨ３という用語は、免疫グロブリン重鎖定常領域２及び３を表す。これらの領域も、Ｋａｂａｔナンバリングを使用する類似性により同定することができ、ＣＨ２についてはＫａｂａｔ位置２４４〜３６０を、ＣＨ３についてはＫａｂａｔ位置３６１〜４７８を参照されたい。免疫グロブリン間でそれらのＩｇＧ１Ｆｃ領域、ＩｇＧ２  Ｆｃ領域、ＩｇＧ３  Ｆｃ領域、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域、ＩｇＭ  Ｆｃ領域、ＩｇＡ  Ｆｃ領域、ＩｇＤ  Ｆｃ領域及びＩｇＥ  Ｆｃ領域に関していくらかの変動があることが理解されたい（Ｉｓ  ｉｓ）（例えば、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３１（３），１６９−２１７（１９９３）を参照されたい。）Ｆｃ単量体という用語は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの重鎖定常領域、及びＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの重鎖定常領域を指す。Ｆｃ単量体は、これらのドメインに可動性ヒンジＮ末端も含むことができる。ＩｇＡ及びＩｇＭについては、Ｆｃ単量体は、Ｊ鎖を含み得る。ＩｇＧについては、Ｆｃ部分は、免疫グロブリンドメインＣＨ２及びＣＨ３ならびに最初の２つのドメイン間のヒンジ及びＣＨ２を含む。免疫グロブリンのＦｃ部分の境界は変動し得るが、機能的なヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ部分の例は、例えば、ナンバリングはＫａｂａｔに従って、（ヒンジドメインの）残基Ｄ２３１から（ＣＨ３ドメインのＣ末端の）Ｐ４７６、またはＤ２３１からＬ４７６を、それぞれ、ＩｇＧ４について含むと定義することができる。
【０１０９】
本発明の抗体構築物は、従って、Ｎ〜Ｃ末端の順番で：
（ａ）第一の結合ドメイン；
（ｂ）配列番号７７１、７７７、及び７７８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
（ｃ）第二の結合ドメイン；
（ｄ）配列番号７７０、７７１、７７３、７７４、７７５、７７７及び７７８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
（ｅ）（ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む）第三のドメインの第一のポリペプチド単量体；
（ｆ）配列番号１８６５、１８６６、１８６７、及び１８６８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；ならびに
（ｇ）（ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む）第三のドメインの第二のポリペプチド単量体
を含み得る。
【０１１０】
本発明の抗体構築物が、Ｎ〜Ｃ末端の順番で：
・配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１９、配列番号１２９、配列番号１３９、配列番号１４９、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６７９、配列番号６８９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号９２２、配列番号９２６、配列番号９３０、配列番号９３４、配列番号９３８、配列番号９４２、配列番号９４６、配列番号９５０、配列番号９５４、配列番号９５８、配列番号９６２、配列番号９６６、配列番号９７０、配列番号９７４、配列番号９７８、配列番号９８２、配列番号９８６、配列番号９９０、配列番号９９４、配列番号９９８、配列番号１００２、配列番号１００６、配列番号１０１０、配列番号１０１４、配列番号１０１８、配列番号１０２２、配列番号１０２６、配列番号１０３０、配列番号１０３４、配列番号１０３８、配列番号１０４２、配列番号１０５２、配列番号１０５６、配列番号１０６６、配列番号１０７０、配列番号１０８０、配列番号１０８４、配列番号１０９４、配列番号１０９８、配列番号１１０８、配列番号１１１２、配列番号１１２２、配列番号１１２６、配列番号１１３６、配列番号１１４０、配列番号１１５０、配列番号１１５４、配列番号１１６４、配列番号１１６８、配列番号１１７８、配列番号１１８２、配列番号１１９２、配列番号１１９６、配列番号１２０６、配列番号１２１０、配列番号１２２０、配列番号１２２４、配列番号１２３４、配列番号１２３８、配列番号１２４８、配列番号１２５２、配列番号１２６２、配列番号１２６６、配列番号１２７６、配列番号１２８０、配列番号１２９０、配列番号１２９４、配列番号１３０４、配列番号１３０８、配列番号１３１８、配列番号１３２２、配列番号１３３２、配列番号１３３６、配列番号１３４６、配列番号１３５０、配列番号１３６０、配列番号１３６４、配列番号１３７４、配列番号１３７８、配列番号１３８８、配列番号１３９２、配列番号１４０２、配列番号１４０６、配列番号１４１６、配列番号１４２０、配列番号１４３０、配列番号１４３４、配列番号１４４４、配列番号１４４８、配列番号１４５８、配列番号１４６２、配列番号１４７２、配列番号１４７６、配列番号１４８６、配列番号１４９０、配列番号１５００、配列番号１５０４、配列番号１５１４、配列番号１５１８、配列番号１５２８、配列番号１５３２、配列番号１５４２、配列番号１５４６、配列番号１５５６、配列番号１５６０、配列番号１５７０、及び配列番号１５７４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第一の結合ドメイン；
・配列番号７７１、７７７、及び７７８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号８３５、配列番号８４４、配列番号８５３、配列番号８６２、配列番号８７１、配列番号８８０、配列番号８８９、配列番号８９８、配列番号９０７、配列番号９１６、及び配列番号９１９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第二の結合ドメイン
・配列番号７７０、７７１、７７３、７７４、７７５、７７７及び７７８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；ならびに
・配列番号１８５６〜１８６３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第三のドメイン
を含むことも好ましい。
【０１１１】
従って、好ましい実施形態では、本発明の抗体構築物は、配列番号１５７６〜１８４７に記載のものからなる群より選択されるポリペプチドを含むまたはこれからなる。配列番号１６９６、配列番号１７０２、配列番号１７１０、配列番号１７１４、配列番号１７１６、配列番号１７２０、配列番号１７２２、配列番号１７２４、配列番号１７２６、配列番号１７２８、配列番号１７３８、配列番号１７４０、配列番号１７４２、配列番号１７５０、及び配列番号１７５２に記載のものからなる群より選択されるポリペプチドが好ましい。
【０１１２】
抗体構築物の共有結合修飾もまた、本発明の範囲に含まれ、そしてそれは、常にではないが通常、翻訳後に行われる。例えば、抗体構築物のいくつかのタイプの共有結合修飾は、抗体構築物の特定のアミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって、分子内に導入される。
【０１１３】
システイニル残基は、最も一般的には、α−ハロアセテート（及び対応するアミン）、例えば、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応して、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀安息香酸、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
【０１１４】
ヒスチジル残基は、ジエチルピロカーボネートとのｐＨ５．５〜７．０での反応によって誘導体化されるが、それはこの作用物質がヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるためである。パラ−ブロモフェナシルブロミドもまた有用であり；この反応は、好ましくは、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中ｐＨ６．０で行われる。リシニル及びアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応する。これらの作用物質を用いる誘導体化は、リシニル残基の電荷を反転させる効果を有する。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬は、イミドエステル、例えば、ピコリンイミド酸メチル；ピリドキサールリン酸；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソウレア；２，４−ペンタンジオン；及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。
【０１１５】
アルギニル残基は、１つまたは複数の従来の試薬、中でもフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンとの反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａのためにこの反応がアルカリ条件下で行われることを必要とする。さらには、これらの試薬は、リジンの基及びアルギニンのイプシロン−アミノ基と反応し得る。
【０１１６】
チロシル残基の特定の修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基へのスペクトル標識の導入を特に目的として、行われ得る。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）及びテトラニトロメタンが、それぞれ、Ｏ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を形成するために使用される。チロシル残基は、ラジオイムノアッセイにおいて使用するための標識化タンパク質を調製するために、１２５Ｉまたは１３１Ｉを用いてヨウ素添加され、上記のクロラミンＴ法が適している。
【０１１７】
カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に修飾され、ここで、Ｒ及びＲ’は任意選択で異なるアルキル基、例えば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドである。さらには、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換される
【０１１８】
二官能性の作用物質を用いる誘導体化は、本発明の抗体構築物を、様々な方法において使用するために、水不溶性の支持マトリクスまたは表面に架橋するのに有用である。広く使用されている架橋剤は、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、ジスクシンイミジルエステル、例えば、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）を含むホモ二官能性イミドエステル、及び二官能性マレイミド、例えば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンを含む。誘導体化剤、例えば、メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートは、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化可能な中間体を生成する。あるいは、反応性水不溶性マトリクス、例えば、臭化シアン活性化炭水化物ならびに米国特許第３，９６９，２８７号；同第３，６９１，０１６号；同第４，１９５，１２８号；同第４，２４７，６４２号；同第４，２２９，５３７号；及び同第４，３３０，４４０号に記載される反応性基質が、タンパク質の固定化のために使用される。
【０１１９】
グルタミニル及びアスパラギニル残基は、それぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基へとしばしば脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も、本発明の範囲に含まれる。
【０１２０】
他の修飾は、プロリン及びリジンの水酸化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８３，ｐｐ．７９−８６）、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０１２１】
本発明の範囲に含まれる抗体構築物の別のタイプの共有結合修飾は、タンパク質のグリコシル化パターンの変更を含む。当技術分野で公知のように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、以下で考察される特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在または非存在）、またはそのタンパク質を産生する宿主細胞もしくは生物の両方に依存し得る。特定の発現系を、下記で考察する。
【０１２２】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的に、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着を表す。Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸である、三ペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素付着のための認識配列である。ゆえに、ポリペプチド中のこれらの三ペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を形成する。Ｏ結合型グリコシル化は、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの付着を表すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用してよい。
【０１２３】
抗体構築物へのグリコシル化部位の付加は、（Ｎ結合型グリコシル化部位のための）上記の三ペプチド配列のうちの１つまたは複数を含有するようにアミノ酸配列を変更することによって、好都合に達成される。変更は、（Ｏ結合型グリコシル化部位のための）出発配列への１つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基の付加またはこれによる置換によっても行われ得る。簡潔には、抗体構築物のアミノ酸配列は、好ましくは、ＤＮＡレベルでの変化を通して、特に所望のアミノ酸に翻訳するだろうコドンが生じるようポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基で突然変異させることによって、変更される。
【０１２４】
抗体構築物上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、そのタンパク質へのグリコシドの化学的または酵素的カップリングによる。これらの手順は、Ｎ及びＯ結合型グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞においてタンパク質の産生を必要としない点で有利である。使用されるカップリングの様式に依存して、糖（複数可）は、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えば、システインのそれら、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えば、セリン、トレオニンもしくはヒドロキシプロリンのそれら、（ｅ）芳香族残基、例えば、フェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンのそれら、または（ｆ）グルタミンのアミド基に付着され得る。これらの方法は、ＷＯ８７／０５３３０、及びＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，１９８１，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６に記載されている。
【０１２５】
出発抗体構築物上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成し得る。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価化合物へのタンパク質の暴露を必要とする。この処理は、ポリペプチドをインタクトな状態で維持しつつ、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたは全ての糖を切断する。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２によって及びＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１によって記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０に記載されるような様々なエンド及びエキソグリコシダーゼの使用によって達成することができる。潜在的なグリコシル化部位でのグリコシル化は、Ｄｕｓｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５によって記載されるような化合物ツニカマイシンの使用によって防止され得る。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド連結の形成を阻止する。
【０１２６】
抗体構築物の他の修飾も本明細書に企図される。例えば、抗体構築物の別のタイプの共有結合修飾は、抗体構築物を、様々なポリオール、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールのコポリマーを含むがこれらに限定されない様々な非タンパク質性ポリマーへの、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に明記する様式での連結を含む。加えて、当技術分野で公知のように、アミノ酸置換は、例えば、ＰＥＧなどのポリマーの付加を促進するために、抗体構築物内の様々な位置でなされてよい。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体構築物の共有結合修飾は、１つまたは複数の標識の付加を含む。標識基は、潜在的な立体障害を減らすために、様々な長さのスペーサーアームを介して抗体構築物にカップリングされ得る。タンパク質を標識するための様々な方法が当技術分野で公知であり、本発明を実施する際で使用することができる。「標識」または「標識基」という用語は、任意の検出可能な標識を表す。一般に、標識は、それらを検出するアッセイに依存して様々なクラスに分類され、以下の例は：
ａ）同位体標識、これは放射活性または重同位元素であり得、例えば、放射性同位元素または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）
ｂ）磁気標識（例えば、磁気粒子）
ｃ）酸化還元活性部分
ｄ）光学色素（発色体、リン光体及び蛍光体を含むがこれらに限定されない）、例えば、蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、化学発光基、及び「低分子」蛍光体またはタンパク質性蛍光体のいずれかであり得る蛍光体
ｅ）酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）
ｆ）ビオチニル化基
ｇ）２次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ、等）
を含むがこれらに限定されない。
【０１２８】
「蛍光標識」は、その固有の蛍光特性を介して検出され得る任意の分子を意味する。好適な蛍光標識は、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルーＪ、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＬＣレッド６４０、Ｃｙ  ５、Ｃｙ  ５．５、ＬＣレッド７０５、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０）、カスケードブルー、カスケードイエロー及びＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ＦＩＴＣ、ローダミン及びテキサスレッド（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を含むがこれらに限定されない。蛍光体を含む好適な光学色素は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｂｙ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄに記載されている。
【０１２９】
好適なタンパク質性蛍光標識はまた、Ｒｅｎｉｌｌａ、ＰｔｉｌｏｓａｒｃｕｓまたはＡｅｑｕｏｒｅａ種のＧＦＰ（Ｃｈａｌｆｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：８０２−８０５）、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ５５７６２）を含む緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．１８０１  ｄｅ  Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ  Ｂｌｖｄ．Ｗｅｓｔ，８ｔｈ  Ｆｌｏｏｒ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ  Ｈ３Ｈ  １Ｊ９；Ｓｔａｕｂｅｒ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４：４６２−４７１；Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８−１８２）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５４０８−５４１７）、βガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２６０３−２６０７）及びＲｅｎｉｌｌａ（ＷＯ９２／１５６７３、ＷＯ９５／０７４６３、ＷＯ９８／１４６０５、ＷＯ９８／２６２７７、ＷＯ９９／４９０１９、米国特許第５，２９２，６５８号；同第５，４１８，１５５号；同第５，６８３，８８８号；同第５，７４１，６６８号；同第５，７７７，０７９号；同第５，８０４，３８７号；同第５，８７４，３０４号；同第５，８７６，９９５号；同第５，９２５，５５８号）を含むがこれらに限定されない。
【０１３０】
ロイシンジッパードメインは、それらが見い出されるタンパク質のオリゴマー形成を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、当初、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質において同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９）、そしてそれ以降、様々な異なるタンパク質において見出されている。とりわけ知られているロイシンジッパーは、二量体化または三量体化する天然に存在するペプチド及びその誘導体である。可溶性オリゴマータンパク質を産生するのに好適なロイシンジッパードメインの例は、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１０３０８に記載されており、肺サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパーはＨｏｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４４：１９１に記載されている。それに融合された異種タンパク質の安定的な三量体化を可能にする修飾されたロイシンジッパーの使用は、Ｆａｎｓｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７−７８に記載されている。１つの手法において、ロイシンジッパーペプチドに融合されたＣＤ７０抗体断片または誘導体を含む組換え融合タンパク質が、好適な宿主細胞において発現され、そして形成する可溶性オリゴマーＣＤ７０抗体断片または誘導体が培養上清から回収される。
【０１３１】
本発明の抗体構築物は、例えば、その分子の単離において有用なまたはその分子の採用された薬物動態プロフィールに関連する追加のドメインも含んでよい。抗体構築物の単離において有用なドメインは、ペプチドモチーフまたは二次的に導入される部分から選択され得、これらは単離方法、例えば、単離用カラムにおいて捕捉することができる。そのような追加のドメインの非限定的な実施形態は、Ｍｙｃタグ、ＨＡＴタグ、ＨＡタグ、ＴＡＰタグ、ＧＳＴタグ、キチン結合ドメイン（ＣＢＤタグ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰタグ）、Ｆｌａｇタグ、Ｓｔｒｅｐタグ及びそれらの変異体（例えば、ＳｔｒｅｐＩＩタグ）ならびにＨｉｓタグとして公知のペプチドモチーフを含む。同定されたＣＤＲによって特徴づけられる本明細書に開示される抗体構築物は全て、好ましくは５つの、及びより好ましくは６つのＨｉｓ残基（ヘキサ−ヒスチジン）の分子のアミノ酸配列における連続Ｈｉｓ残基の反復として通常公知である、Ｈｉｓタグドメインを含むことが好ましい。Ｈｉｓタグは、例えば、抗体構築物のＮまたはＣ末端に位置し得、好ましくは、Ｃ末端に位置する。最も好ましくは、ヘキサ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ、配列番号７７９を参照されたい）は、本発明に従う抗体構築物のＣ末端に結合したペプチドを介して連結する。
【０１３２】
本発明の抗体構築物の第一の結合ドメインは、標的細胞の表面上にあるヒトＣＤ７０に結合する。ヒトＣＤ７０の好ましいアミノ酸配列は、配列番号７４１により表される。「表面上」という用語は、本発明の文脈において、結合ドメインが、ＣＤ７０細胞外ドメイン（ＣＤ７０  ＥＣＤ）内に含まれるエピトープに特異的に結合することを意味する。本発明に従う第一の結合ドメインは、従って、好ましくは、天然発現細胞もしくは細胞株によって、及び／またはＣＤ７０で形質転換されたもしくは（安定的に／一過的に）これがトランスフェクトされた細胞もしくは細胞株によって発現されるときに、ＣＤ７０に結合する。好ましい実施形態では、第一の結合ドメインは、ＣＤ７０がｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイ、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅまたはスキャッチャードにおいて「標的」または「リガンド」分子として使用されるときにも、ＣＤ７０に結合する。「標的細胞」は、その表面上でＣＤ７０を発現する任意の原核生物または真核生物細胞であることができ；好ましくは、標的細胞は、ヒトまたは動物の身体の一部である細胞、例えば、腎臓、肺、膵臓、卵巣、乳房、結腸、または頭頚部がん、メラノーマ、カポジ肉腫、胚性がん腫、脳腫瘍、白血病またはリンパ腫からなる群より選択される特定のがん細胞である。
【０１３３】
「ＣＤ７０  ＥＣＤ」という用語は、ＣＤ７０の膜貫通及び細胞質ドメインを本質的に含まないＣＤ７０の一形態を表す。本発明のＣＤ７０ポリペプチドに関して同定される膜貫通ドメインは、そのタイプの疎水性ドメインの同定に関して当技術分野で慣用的に用いられている定法を用いて同定されることが、当業者によって理解されるだろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は、変動し得るが、本明細書で具体的に言及されているドメインのいずれかの末端の約５アミノ酸以下である可能性が高い。好ましいヒトＣＤ７０  ＥＣＤは、配列番号７４２に示されている。
【０１３４】
ヒトＣＤ７０に対する第一の結合ドメインの親和性は、好ましくは≦２０ｎＭまたは≦１５ｎＭ、より好ましくは≦１０ｎＭ、さらにより好ましくは≦５ｎＭ、さらにより好ましくは≦２ｎＭ、さらにより好ましくは≦１ｎＭ、さらにより好ましくは≦０．６ｎＭ、さらにより好ましくは≦０．５ｎＭ、及び最も好ましくは≦０．４ｎＭである。親和性は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイまたはスキャッチャードアッセイにおいて、例えば、実施例に記載のように測定することができる。親和性を決定する他の方法も当業者に周知である。
【０１３５】
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球（それ自体、白血球の１種である）の１種である。Ｔ細胞には、各々別個の機能を有するいくつかのサブセットが存在する。Ｔ細胞は、その細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により他のリンパ球、例えば、Ｂ細胞及びＮＫ細胞と区別することができる。ＴＣＲは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識を担い、２つの異なるタンパク質鎖から構成される。Ｔ細胞の９５％において、ＴＣＲは、アルファ（α）及びベータ（β）鎖からなる。ＴＣＲが抗原ペプチド及びＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ複合体）と係合すると、Ｔリンパ球は、関連酵素、コレセプター、専用アダプター分子、及び活性化もしくは放出された転写因子によって媒介される一連の生化学的イベントを通して活性化される。
【０１３６】
ＣＤ３受容体複合体は、タンパク質複合体であり、４つの鎖から構成される。哺乳動物では、この複合体は、ＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、及び２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含む。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びいわゆるζ（ゼータ）鎖と会合してＴ細胞受容体ＣＤ３複合体を形成し、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。ＣＤ３γ（ガンマ）、ＣＤ３δ（デルタ）及びＣＤ３ε（イプシロン）鎖は、単一の細胞外免疫グロブリンドメインを含有する免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連する細胞表面タンパク質である。ＣＤ３分子の細胞内尾部は、ＴＣＲのシグナル伝達能に必須である免疫受容体チロシンベース活性化モチーフまたは略してＩＴＡＭとして公知の単一の保存されたモチーフを含有する。ＣＤ３イプシロン分子は、ヒトでは第１１染色体に存在するＣＤ３Ｅ遺伝子によってコードされるポリペプチドである。ＣＤ３イプシロンの最も好ましいエピトープは、ヒトＣＤ３イプシロン細胞外ドメインのアミノ酸残基１〜２７内に含まれる。
【０１３７】
多特異的、少なくとも二重特異性抗体構築物によるＴ細胞の動員を介した標的細胞の再指向溶解（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｌｙｓｉｓ）は、細胞溶解シナプス形成ならびにパーフォリン及びグランザイムの送達に関与する。係合するＴ細胞は、連続的な標的細胞溶解を行うことができ、ペプチド抗原プロセシング及び提示、またはクローン性Ｔ細胞の分化に干渉する免疫回避機構に影響されない；例えば、ＷＯ２００７／０４２２６１を参照されたい。
【０１３８】
ＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物によって媒介される細胞傷害性は、様々な方法で測定することができる。実施例８．１〜８．７を参照されたい。エフェクター細胞は、例えば、刺激された富化（ヒト）ＣＤ８陽性Ｔ細胞または未刺激の（ヒト）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であることができる。標的細胞がマカク起源であるまたはマカクＣＤ７０を発現するもしくはマカクＣＤ７０がトランスフェクトされている場合、エフェクター細胞もまた、マカク起源、例えば、マカクＴ細胞株、例えば、４１１９ＬｎＰｘであるべきである。標的細胞は、ＣＤ７０、例えば、ヒトまたはマカクＣＤ７０（の少なくとも細胞外ドメイン）を発現するべきである。標的細胞は、ＣＤ７０、例えば、ヒトまたはマカクＣＤ７０が安定的または一過的にトランスフェクトされた細胞株（例えば、ＣＨＯ）であることができる。あるいは、標的細胞は、ＣＤ７０陽性天然発現体細胞株、例えば、ヒト卵巣がん腫細胞株ＯＶＣＡＲ８であることができる。通常、ＥＣ５０値は、その細胞表面上により高いレベルのＣＤ７０を発現する標的細胞株でより低くなると予測される。エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比は、通常、約１０：１であるが、これは変動することもできる。ＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性は、５１クロム放出アッセイ（インキュベート時間約１８時間）においてまたはＦＡＣＳベースの細胞傷害性アッセイ（インキュベート時間約４８時間）において（ｉｎ  ａ  ｉｎ  ａ）測定することができる。アッセイのインキュベート時間（細胞傷害性反応）の変更も可能である。細胞傷害性を測定する他の方法は、当業者に周知であり、ＭＴＴまたはＭＴＳアッセイ、ＡＴＰベースのアッセイを含み、それには生物発光アッセイ、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイ、ＷＳＴアッセイ、クローン形成アッセイ及びＥＣＩＳ技術が含まれる。
【０１３９】
本発明のＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物によって媒介される細胞傷害活性は、好ましくは、細胞ベースの細胞傷害性アッセイにおいて測定される。それは、５１クロム放出アッセイにおいて測定してもよい。それは、最大半量効果濃度（ベースラインと最大の間の中間の細胞傷害性反応を誘導する抗体構築物の濃度）に対応するＥＣ５０値によって表される。好ましくは、ＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値は、≦１０．０００ｐＭもしくは≦５０００ｐＭ、より好ましくは≦４０００ｐＭもしくは≦３０００ｐＭ、さらにより好ましくは≦２０００ｐＭもしくは≦１０００ｐＭ、さらにより好ましくは≦５００ｐＭもしくは≦４００ｐＭ、さらにより好ましくは≦３００ｐＭもしくは≦２００ｐＭ、さらにより好ましくは≦１００ｐＭもしくは≦５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦２０ｐＭもしくは≦１０ｐＭ、及び最も好ましくは≦５ｐＭもしくは≦２ｐＭもしくは≦１ｐＭ、またさらには≦０．５ｐＭもしくは≦０．２ｐＭもしくは≦０．１ｐＭである。
【０１４０】
上記所与のＥＣ５０値は、異なるアッセイにおいて測定することができる。当業者は、ＥＣ５０値が、未刺激のＰＢＭＣと比較して、刺激された／富化されたＣＤ８＋Ｔ細胞がエフェクター細胞として使用されるときに、低くなると予測することができると知っている。ＥＣ５０値は、標的細胞が低標的発現ラットと比較して、多い数の標的抗原を発現するとき、低くなるとさらに予測することができる。例えば、刺激された／富化されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用する（及びＣＨＯ細胞などのＣＤ７０トランスフェクト細胞またはＣＤ７０陽性細胞株のいずれかを標的細胞として使用する）とき、ＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値は、好ましくは≦１０００ｐＭ、より好ましくは≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは≦２５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦１００ｐＭ、さらにより好ましくは≦５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦１０ｐＭ、及び最も好ましくは≦５ｐＭまたは≦２ｐＭまたは≦１ｐＭである。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用するとき、ＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値は、好ましくは≦１０．０００ｐＭまたは≦５０００ｐＭまたは≦４０００ｐＭ（特に、標的細胞が、ＣＤ７０陽性細胞株であるとき）、より好ましくは≦２０００ｐＭ（特に、標的細胞が、ＣＨＯ細胞などのＣＤ７０トランスフェクト細胞であるとき）、より好ましくは≦１０００ｐＭまたは≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは≦２００ｐＭ、さらにより好ましくは≦１５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦１００ｐＭ、及び最も好ましくは≦５０ｐＭまたは≦２０ｐＭであるか、それより低い。ＬｎＰｘ４１１９などのマカクＴ細胞株をエフェクター細胞として使用するとき、及びＣＨＯ細胞などのマカクＣＤ７０トランスフェクト細胞株を標的細胞株として使用するとき、ＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値は、好ましくは≦２０００ｐＭまたは≦１５００ｐＭ、より好ましくは≦１０００ｐＭまたは≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは≦３００ｐＭまたは≦２５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦１００ｐＭ、及び最も好ましくは≦５０ｐＭまたは≦２０ｐＭであるか、それより低い、例えば、≦１０ｐＭ、≦５ｐＭ、≦１ｐＭ、または≦０．５ｐＭである。
【０１４１】
好ましくは、本発明のＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物は、ＣＨＯ細胞などのＣＤ７０陰性細胞の溶解を誘導／媒介しないまたは本質的に溶解を誘導／媒介しない。「溶解を誘導しない」、「本質的に溶解を誘導しない」、「溶解を媒介しない」または「本質的に溶解を媒介しない」という用語は、本発明の抗体構築物が、ＣＤ７０陽性細胞株の溶解（上を参照されたい）を１００％として、ＣＤ７０陰性細胞の３０％を超えて溶解を誘導または媒介せず、それは好ましくは２０％を超えず、より好ましくは１０％を超えず、特に好ましくは９％、８％、７％、６％または５％を超えないことを意味する。これは通常、５００ｎＭまでの抗体構築物の濃度に適用される。当業者は、さらなる労力なしに細胞溶解を測定する方法に精通している。さらに、本明細書は、細胞溶解を測定する方法の具体的な手引きを教示する。
【０１４２】
個々のＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の単量体アイソフォームと二量体アイソフォームの間の細胞傷害活性の差は、「効力ギャップ」と称される。この効力ギャップは、例えば、その分子の単量体形態のＥＣ５０値と二量体形態のＥＣ５０値の間の比として算出することができ、実施例１５を参照されたい。本発明のＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の効力ギャップは、好ましくは≦５、より好ましくは≦４、さらにより好ましくは≦３、さらにより好ましくは≦２または≦１．５、及び最も好ましくは≦１である。
【０１４３】
本発明の抗体構築物の第一の及び／または第二の（または任意のさらなる）結合ドメイン（複数可）は、好ましくは、霊長類の哺乳類目のメンバーについて種間特異的である。種間特異的ＣＤ３結合ドメインは、例えば、ＷＯ２００８／１１９５６７に記載されている。一実施形態に従い、第一及び／または第二の結合ドメインは、それぞれ、ヒトＣＤ７０及びヒトＣＤ３への結合に加えて、新世界霊長類（例えば、マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ  Ｏｅｄｉｐｕｓ）またはリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ））、旧世界霊長類（例えば、ヒヒ及びマカク）、テナガザル、オランウータン、及び非ヒトのヒト亜科動物を含む（がこれらに限定されない）霊長類のＣＤ７０／ＣＤ３にも結合するだろう。標的細胞の表面上にあるヒトＣＤ７０に結合する本発明の抗体構築物の第一の結合ドメインが、少なくともマカクＣＤ７０にも結合し、及び／またはＴ細胞の表面上にあるヒトＣＤ３に結合する第二の結合ドメインが、少なくともマカクＣＤ３にも結合することが想定される。好ましいマカクは、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）  である。アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）も想定される。
【０１４４】
好ましい本発明の二重特異性抗体構築物は、標的細胞の表面上にあるヒトＣＤ７０に結合する第一の結合ドメイン及びＴ細胞の表面上にあるヒトＣＤ３及び少なくともマカクＣＤ３に結合する第二の結合ドメインを含む。
【０１４５】
本発明の一態様では、第一の結合ドメインは、ヒトＣＤ７０に結合し、マカクＣＤ７０に、例えば、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のＣＤ７０、及びより好ましくは、マカクＣＤ７０  ＥＣＤにさらに結合する。好ましいカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）  ＣＤ７０を、配列番号７５５に示す。好ましいマカクＣＤ７０  ＥＣＤを、配列番号７５６に示す。マカクＣＤ７０に対する第一の結合ドメインの親和性は、好ましくは≦５０または≦４０ｎＭ、より好ましくは≦３０ｎＭまたは≦２０ｎＭまたは≦１５ｎＭ、より好ましくは≦１０ｎＭまたは≦５ｎＭ、さらにより好ましくは≦２ｎＭまたは≦１ｎＭ、さらにより好ましくは≦０．５ｎＭまたは≦０．２ｎＭ、及び最も好ましくは≦０．１ｎＭである。
【０１４６】
好ましくは、マカクＣＤ７０対ヒトＣＤ７０［ｍａ  ＣＤ７０：ｈｕ  ＣＤ７０］への結合に関する本発明に従う抗体構築物の親和性ギャップは（例えば、ＢｉａＣｏｒｅによりまたはスキャッチャード分析により決定して）、０．１〜１０の間、より好ましくは、０．２〜５の間または０．２〜２の間、さらにより好ましくは、０．３〜４の間、さらにより好ましくは、０．５〜３の間または０．５〜２．５の間、最も好ましくは、０．５〜２の間または０．６〜２の間である。実施例３及び４を参照されたい。
【０１４７】
本発明の抗体構築物の一実施形態では、第二の結合ドメインは、ヒトＣＤ３イプシロン及びマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ  Ｏｅｄｉｐｕｓ）またはリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ）  ＣＤ３イプシロンに結合する。好ましくは、第二の結合ドメインは、これらのＣＤ３イプシロン鎖の細胞外エピトープに結合する。第二の結合ドメインが、ヒト及びマカク  ＣＤ３イプシロン鎖の細胞外エピトープに結合することも想定される。ＣＤ３イプシロンの最も好ましいエピトープは、ヒトＣＤ３イプシロン細胞外ドメインのアミノ酸残基１〜２７内に含まれる。さらにより具体的には、エピトープは、少なくともアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕを含む。マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）及びワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ  ｏｅｄｉｐｕｓ）は両方とも、マーモセット科（Ｃａｌｌｉｔｒｉｃｈｉｄａｅ科）に属する新世界霊長類であり、一方でリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ）は、オマキザル科（Ｃｅｂｉｄａｅ科）に属する新世界霊長類である。
【０１４８】
本発明の抗体構築物にとって、
Ｔ細胞の表面上にあるヒトＣＤ３に結合する第二の結合ドメインが、
（ａ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号２７に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号２８に示すＣＤＲ−Ｌ２及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号２９に示すＣＤＲ−Ｌ３；
（ｂ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１１７に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１１８に示すＣＤＲ−Ｌ２及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１１９に示すＣＤＲ−Ｌ３；及び
（ｃ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５３に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５４に示すＣＤＲ−Ｌ２及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５５に示すＣＤＲ−Ｌ３
より選択されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含むことが、特に好ましい。
【０１４９】
本発明の抗体構築物の代替の好ましい実施形態では、Ｔ細胞の表面上にあるヒトＣＤ３に結合する第二の結合ドメインは：
（ａ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１３に示すＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１４に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｂ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３０に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３１に示すＣＤＲ−Ｈ２及びのＷＯ２００８／１１９５６７配列番号３２に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｃ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号４８に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号４９に示すＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号５０に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｄ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号６６に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号６７に示すＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号６８に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｅ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号８４に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号８５に示すＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号８６に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｆ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１０２に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１０３に示すＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１０４に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｇ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２０に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２１に示すＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２２に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｈ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１３８に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１３９に示すＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１４０に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｉ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５６に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５７に示すＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５８に示すＣＤＲ−Ｈ３；及び
（ｊ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７４に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７５に示すＣＤＲ−Ｈ２及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７６に示すＣＤＲ−Ｈ３
より選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域を含む。
【０１５０】
本発明の抗体構築物にとって、Ｔ細胞の表面上にあるヒトＣＤ３に結合する第二の結合ドメインが、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３５、３９、１２５、１２９、１６１または１６５に示すＶＬ領域からなる群より選択されるＶＬ領域を含むことがさらに好ましい。
【０１５１】
あるいは、Ｔ細胞の表面上にあるヒトＣＤ３に結合する第二の結合ドメインが、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５、１９、３３、３７、５１、５５、６９、７３、８７、９１、１０５、１０９、１２３、１２７、１４１、１４５、１５９、１６３、１７７または１８１に示すＶＨ領域からなる群より選択されるＶＨ領域を含むことが好ましい。
【０１５２】
より好ましくは、本発明の抗体構築物は、
（ａ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７または２１に示すＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５または１９に示すＶＨ領域；
（ｂ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３５または３９に示すＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３３または３７に示すＶＨ領域；
（ｃ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号５３または５７に示すＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号５１または５５に示すＶＨ領域；
（ｄ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号７１または７５に示すＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号６９または７３に示すＶＨ領域；
（ｅ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号８９または９３に示すＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号８７または９１に示すＶＨ領域；
（ｆ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１０７または１１１に示すＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１０５または１０９に示すＶＨ領域；
（ｇ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２５または１２９に示すＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２３または１２７に示すＶＨ領域；
（ｈ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１４３または１４７に示すＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１４１または１４５に示すＶＨ領域；
（ｉ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１６１または１６５に示すＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５９または１６３に示すＶＨ領域；及び
（ｊ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７９または１８３に示すＶＬ領域及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７７または１８１に示すＶＨ領域
からなる群より選択されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含むＴ細胞の表面上にあるヒトＣＤ３に結合する第二の結合ドメインを特徴とする。
【０１５３】
本発明の抗体構築物の好ましい実施形態に従って、結合ドメイン及び具体的には、第二の結合ドメイン（Ｔ細胞の表面上にあるヒトＣＤ３に結合する）は、以下の形式を有する：ＶＨ領域及びＶＬ領域の対は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）の形式である。ＶＨ及びＶＬ領域は、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨの順番に配列される。ＶＨ−領域がリンカー配列のＮ末端に位置し、ＶＬ−領域がリンカー配列のＣ末端に位置することが好ましい。
【０１５４】
本発明の上記抗体構築物の好ましい実施形態は、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号２３、２５、４１、４３、５９、６１、７７、７９、９５、９７、１１３、１１５、１３１、１３３、１４９、１５１、１６７、１６９、１８５または１８７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＴ細胞の表面上にあるヒトＣＤ３に結合する第二の結合ドメインを特徴とする。
【０１５５】
従って、一実施形態では、本発明の抗体構築物は、配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０、配列番号５０、配列番号６０、配列番号７０、配列番号８０、配列番号９０、配列番号１００、配列番号１１０、配列番号１２０、配列番号１３０、配列番号１４０、配列番号１５０、配列番号１６０、配列番号１７０、配列番号１８０、配列番号１９０、配列番号２００、配列番号２１０、配列番号２２０、配列番号２３０、配列番号２４０、配列番号２５０、配列番号２６０、配列番号２７０、配列番号２８０、配列番号２９０、配列番号３００、配列番号３１０、配列番号３２０、配列番号３３０、配列番号３４０、配列番号３５０、配列番号３６０、配列番号３７０、配列番号３８０、配列番号３９０、配列番号４００、配列番号４１０、配列番号４２０、配列番号４３０、配列番号４４０、配列番号４５０、配列番号４６０、配列番号４７０、配列番号４８０、配列番号４９０、配列番号５００、配列番号５１０、配列番号５２０、配列番号５３０、配列番号５４０、配列番号５５０、配列番号５６０、配列番号５７０、配列番号５８０、配列番号５９０、配列番号６００、配列番号６１０、配列番号６２０、配列番号６３０、配列番号６４０、配列番号６５０、配列番号６６０、配列番号６７０、配列番号６８０、配列番号６９０、配列番号７００、配列番号７１０、配列番号７２０、配列番号７３０、配列番号７４０、配列番号９２３、配列番号９２７、配列番号９３１、配列番号９３５、配列番号９３９、配列番号９４３、配列番号９４７、配列番号９５１、配列番号９５５、配列番号９５９、配列番号９６３、配列番号９６７、配列番号９７１、配列番号９７５、配列番号９７９、配列番号９８３、配列番号９８７、配列番号９９１、配列番号９９５、配列番号９９９、配列番号１００３、配列番号１００７、配列番号１０１１、配列番号１０１５、配列番号１０１９、配列番号１０２３、配列番号１０２７、配列番号１０３１、配列番号１０３５、配列番号１０３９、配列番号１０４３、配列番号１０５３、配列番号１０５７、配列番号１０６７、配列番号１０７１、配列番号１０８１、配列番号１０８５、配列番号１０９５、配列番号１０９９、配列番号１１０９、配列番号１１１３、配列番号１１２３、配列番号１１２７、配列番号１１３７、配列番号１１４１、配列番号１１５１、配列番号１１５５、配列番号１１６５、配列番号１１６９、配列番号１１７９、配列番号１１８３、配列番号１１９３、配列番号１１９７、配列番号１２０７、配列番号１２１１、配列番号１２２１、配列番号１２２５、配列番号１２３５、配列番号１２３９、配列番号１２４９、配列番号１２５３、配列番号１２６３、配列番号１２６７、配列番号１２７７、配列番号１２８１、配列番号１２９１、配列番号１２９５、配列番号１３０５、配列番号１３０９、配列番号１３１９、配列番号１３２３、配列番号１３３３、配列番号１３３７、配列番号１３４７、配列番号１３５１、配列番号１３６１、配列番号１３６５、配列番号１３７５、配列番号１３７９、配列番号１３８９、配列番号１３９３、配列番号１４０３、配列番号１４０７、配列番号１４１７、配列番号１４２１、配列番号１４３１、配列番号１４３５、配列番号１４４５、配列番号１４４９、配列番号１４５９、配列番号１４６３、配列番号１４７３、配列番号１４７７、配列番号１４８７、配列番号１４９１、配列番号１５０１、配列番号１５０５、配列番号１５１５、配列番号１５１９、配列番号１５２９、配列番号１５３３、配列番号１５４３、配列番号１５４７、配列番号１５５７、配列番号１５６１、配列番号１５７１、及び配列番号１５７５に記載のものからなる群より選択されるポリペプチドを含む。
【０１５６】
本発明の抗体構築物が、配列番号１０５３、配列番号１０９５、配列番号１１５１、配列番号１１７９、配列番号１１９３、配列番号１２２１、配列番号１２３５、配列番号１２４９、配列番号１２６３、配列番号１２７７、配列番号１３４７、配列番号１３６１、配列番号１３７５、配列番号１４３１、及び配列番号１４４５に記載のものからなる群より選択されるポリペプチドを含むときが好ましい。
【０１５７】
本明細書に記載の抗体構築物のアミノ酸配列修飾も企図される。例えば、抗体構築物の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望まれる場合がある。抗体構築物のアミノ酸配列変異体は、抗体構築物の核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することによってまたはペプチド合成によって調製される。以下に記載されるアミノ酸（ａｃｄ）配列修飾の全てが、未修飾の親分子の所望の生物学的活性（ＣＤ７０及びＣＤ３に結合する）を依然として保持している抗体構築物を生成するはずである。
【０１５８】
「アミノ酸」または「アミノ酸残基」という用語は、典型的に、その当技術分野で認められている定義を有するアミノ酸、例えば、アラニン（ＡｌａまたはＡ）；アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）；アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）；アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）；システイン（ＣｙｓまたはＣ）；グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）；グルタミン酸（ＧＩｕまたはＥ）；グリシン（ＧｌｙまたはＧ）；ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；イソロイシン（ＨｅまたはＩ）：ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）；リジン（ＬｙｓまたはＫ）；メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）；フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）；ｐｒｏｌｉｎｅ（ＰｒｏまたはＰ）；セリン（ＳｅｒまたはＳ）；トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）；トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）；チロシン（ＴｙｒまたはＹ）；及びバリン（ＶａｌまたはＶ）からなる群より選択されるアミノ酸を表すが、所望に応じて、修飾、合成または希少アミノ酸も使用されてよい。一般に、アミノ酸は、非極性側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）；負荷電側鎖（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）；正荷電側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）；または非荷電極性側鎖（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ及びＴｙｒ）を有するとしてグループ分けすることができる。
【０１５９】
アミノ酸修飾は、例えば、抗体構築物のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／またはそれへの挿入、及び／またはそれの置換を含む。任意の組み合わせの欠失、挿入及び置換が、最終構築物が所望の特徴を保持している限り、最終構築物に達するために行われる。アミノ酸変化は、例えば、グリコシル化部位の数または位置の変化はまた、抗体構築物の翻訳後プロセスを変更し得る。
【０１６０】
例えば、１、２、３、４、５または６個のアミノ酸がＣＤＲのそれぞれにて（当然、それらの長さに依存して）挿入または欠失され得る一方で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２５個のアミノ酸がＦＲのそれぞれにて挿入または欠失され得る。好ましくは、アミノ酸配列の挿入は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の残基から百またはそれ以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ及び／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。本発明の抗体構築物の挿入変異体は、酵素の抗体構築物のＮ末端もしくはＣ末端への融合または抗体構築物の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
【０１６１】
置換突然変異誘発に関する最大の関心対象の部位は、重鎖及び／または軽鎖のＣＤＲ、特に超可変領域を含むが、重鎖及び／または軽鎖におけるＦＲの変更もまた企図される。置換は好ましくは、本明細書に記載される保存的置換である。好ましくは、ＣＤＲまたはＦＲの長さに依存して、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸がＣＤＲにおいて置換され得、一方で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２５個のアミノ酸がフレームワーク領域（ＦＲ）において置換され得る。例えば、ＣＤＲ配列が６個のアミノ酸を包含する場合、これらのアミノ酸のうちの１、２または３個が置換されることが想定される。同様に、ＣＤＲ配列が１５個のアミノ酸を包含する場合、これらのアミノ酸のうちの１、２、３、４、５または６個が置換されることが想定される。
【０１６２】
突然変異誘発に好ましい位置である抗体構築物のある特定の残基または領域の同定に有用な方法は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）においてＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓによって記載された「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれるものである。この方法では、抗体構築物内の残基または標的残基群が同定され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）、中性または負荷電アミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）で置き換えられて、エピトープを有するアミノ酸の相互作用に影響を与える。
【０１６３】
置換に対して機能的感受性を実証するこれらのアミノ酸位置は、次いで、その置換部位でまたは置換部位に関して、さらなるまたは他の変異を導入することによって最適化される。ゆえに、アミノ酸配列変異体を導入する部位または領域は予め決定されるが、突然変異の性質自体は予め決定される必要はない。例えば、所与の部位での突然変異の働きを分析または最適化するため、アラニンスキャニングまたはランダム突然変異誘発が標的のコドンまたは領域で行われ、発現される抗体構築物変異体が所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングされ得る。既知の配列を有するＤＮＡ内の所定の部位で置換突然変異を行うための技術は周知であり、例えば、Ｍ１３プライマー突然変異誘発及びＰＣＲ突然変異誘発がある。突然変異体のスクリーニングは、ＣＤ７０またはＣＤ３結合などの抗原結合活性のアッセイを用いて行われる。
【０１６４】
一般に、重鎖及び／または軽鎖のＣＤＲの１つまたは複数または全てにおいてアミノ酸が置換される場合、それによって得られる「置換された」配列が、「当初の」ＣＤＲ配列に対して少なくとも６０％または６５％、より好ましくは７０％または７５％、さらにより好ましくは８０％または８５％、及び特に好ましくは９０％または９５％同一であることが好ましい。これは、それがどの程度「置換された」配列と同一であるのかがＣＤＲの長さに依存することを意味する。例えば、５個のアミノ酸を有するＣＤＲは、少なくとも１つのアミノ酸置換を有するために、その置換されたアミノ酸配列と好ましくは８０％同一である。従って、抗体構築物のＣＤＲは、それらの置換配列に対して異なる程度の同一性を有し得る、例えば、ＣＤＲＬ１は８０％を有し得、ＣＤＲＬ３は９０％を有し得る。
【０１６５】
好ましい置換（または置き換え）は、保存的置換である。しかし、抗体構築物が第１の結合ドメインを介してＣＤ７０に結合し、第２の結合ドメインを介してＣＤ３またはＣＤ３イプシロンに結合する能力を保持している限り、及び／またはそのＣＤＲがそのように置換される配列に対して同一性を有している（「当初」のＣＤＲ配列に対して少なくとも６０％または６５％、より好ましくは７０％または７５％、さらにより好ましくは８０％または８５％、及び特に好ましくは９０％または９５％同一である）限り、任意の置換（非保存的置換または以下の表３に列挙される「例示的な置換」の１つもしくは複数を含む）が想定されている。
【０１６６】
保存的置換は、表３に「好ましい置換」という見出しの下で示されている。このような置換が生物学的活性を変化させる場合、表３に「例示的な置換」として挙げられた、またはアミノ酸クラスに関連して以下にさらに記載されるようなより実質的な変更が導入され得、その産物は所望の特性についてスクリーニングされ得る。
【０１６７】
（表３）アミノ酸置換
2018530996.tif 000027
【０１６８】
本発明の抗体構築物の生物学的特性における実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えば、シートもしくはらせん立体構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の大きさ、の維持に対するそれらの効果が有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づくグループ：（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性親水性；ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｉｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖の配向性に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ、に分類される。
【０１６９】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーから別のクラスのメンバーへの交換を伴うものだろう。抗体構築物の適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基は、その分子の酸化安定性を改善し異常な架橋を防ぐために、通常セリンで置換されてよい。逆に、システイン結合（複数可）は、その安定性を（特にその抗体が抗体断片、例えば、Ｆｖ断片である場合に）改善するために抗体に加えてよい。
【０１７０】
アミノ酸配列に関して、配列同一性及び／または類似性は、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５により記載された、好ましくはデフォルト設定を使用するＢｅｓｔ  Ｆｉｔ配列プログラムを含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の標準的技術を使用することによってまたは目視によって決定される。好ましくは、パーセント同一性は、以下のパラメータに基づきＦａｓｔＤＢによって算出される：ミスマッチペナルティー１；ギャップペナルティー１；ギャップサイズペナルティー０．３３；及び接合ペナルティー（ｊｏｉｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ）３０、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，“Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ１２７−１４９（１９８８），Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ。
【０１７１】
有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ、ペアワイズなアラインメントを使用して関連配列の群から複数の配列アラインメントを生成する。それはまた、アラインメントを生成するために使用されたクラスター化関係を示すツリーをプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０のプログレッシブアラインメント法の簡易版を使用する；この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３により記載されたものに類似する。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは、デフォルトギャップウェイト３．００、デフォルトギャップ長ウェイト０．１０及びウェイテッドエンドキャップ（ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｅｎｄ  ｇａｐ）を含む。
【０１７２】
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；及びＫａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３−５７８７に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６６：４６０−４８０から得られたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメータを使用し、その大部分はデフォルト値に設定される。調節可能なパラメータは、以下の値に設定される：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワードしきい値（Ｔ）＝ＩＩ。ＨＳＰ  Ｓ及びＨＳＰ  Ｓ２パラメータは動的な値であり、特定の配列の組成及び検索される関心対象の配列に対する特定のデータベースの組成に依存してプログラム自体によって決定される；しかし、この値は感度を高めるために調節され得る。
【０１７３】
追加の有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２によって報告されたギャップドＢＬＡＳＴである。ギャップドＢＬＡＳＴは、ＢＬＯＳＵＭ−６２置換スコアを使用し；しきい値Ｔパラメータは９に設定され；ギャップなし伸長をもたらすツーヒット法は、ギャップ長ｋに１０＋ｋのコストをかけ；Ｘｕは１６に設定され、そしてＸｇはデータベース検索段階では４０に、アルゴリズムの出力段階では６７に設定される。ギャップドアラインメントは、約２２ビットに相当するスコアによってもたらされる。
【０１７４】
一般に、個々の変異体ＣＤＲ間のアミノ酸相同性、類似性または同一性は、本明細書に示される配列に対して少なくとも６０％であり、より典型的には相同性または同一性が好ましくは少なくとも６５％または７０％に、より好ましくは少なくとも７５％または８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、及びほぼ１００％に増加することが好ましい。同様の様式で、本明細書で同定される結合タンパク質の核酸配列に関する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、抗体構築物のコード配列内のヌクレオチド残基と同一である候補配列内のヌクレオチド残基の割合（％）と定義される。特定の方法は、デフォルトパラメータに設定され、オーバーラップスパン及びオーバーラップフラクションがそれぞれ１及び０．１２５に設定された、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用する。
【０１７５】
一般に、個々の変異体ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列と本明細書に示されるヌクレオチド配列の間の核酸配列相同性、類似性または同一性は、少なくとも６０％であり、より典型的には相同性または同一性は少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、及びほぼ１００％に増加することが好ましい。従って、「変異体ＣＤＲ」は、本発明の親ＣＤＲに対して指定された相同性、類似性または同一性を有するものであり、親ＣＤＲの特異性及び／または活性の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含むがこれらに限定されない生物学的機能を共有している。
【０１７６】
一実施形態では、本発明に従う抗体構築物のヒト生殖細胞系列に対する同一性の割合（％）は、≧７０％または≧７５％、より好ましくは≧８０％または≧８５％、さらにより好ましくは≧９０％、最も好ましくは≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％またさらには≧９６％、≧９７％または≧９８％である。実施例７を参照されたい。ヒト抗体生殖細胞系列遺伝子産物に対する同一性は、治療タンパク質が処置中に患者内でその薬物に対する免疫反応を誘発する危険を減らすために重要な特徴であると考えられる。Ｈｗａｎｇ  ＆  Ｆｏｏｔｅ（「Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６（２００５）３−１０）は、薬物抗体構築物の非ヒト部分の減少が処置中に患者内で抗薬物抗体を誘導する危険を減らすことを実証している。膨大な数の臨床的に評価された抗体薬及び各々の免疫原性データを比較することによって、抗体のＶ領域のヒト化が、改変されていない非ヒトＶ領域を有する抗体（平均で患者の２３．５９％）よりもそのタンパク質を低免疫原性にする（平均で患者の５．１％）傾向が示される。従って、抗体構築物の形態のＶ領域に基づくタンパク質治療にとって、ヒト配列に対するより高い同一性が望ましい。生殖細胞系列同一性を決定するこの目的のために、ＶＬのＶ領域を、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウェアを使用して、ヒト生殖細胞系列Ｖセグメント及びＪセグメントのアミノ酸配列（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）とアラインメントすることができ、アミノ酸配列を、同一アミノ酸残基をＶＬの総アミノ酸残基数で割ることによって百分率で算出する。ＶＨセグメント（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）について、ＶＨ  ＣＤＲ３がその高い多様性及び既存のヒト生殖細胞系列ＶＨ  ＣＤＲ３アラインメントパートナーの欠如に起因して除外され得ることを除いて同じことを行うことができる。次いで、ヒト抗体生殖細胞系列遺伝子に対する配列同一性を増加させるために組換え技術を使用することができる。
【０１７７】
さらなる実施形態では、本発明の二重特異性抗体構築物は、標準的な研究スケールの条件下で、例えば、標準的な二段階精製プロセスにおいて、高い単量体収量を呈する。好ましくは、本発明に従う抗体構築物の単量体収量は、≧０．２５ｍｇ／Ｌ上清、より好ましくは≧０．５ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは≧１ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは≧２．５ｍｇ／Ｌ上清である。
【０１７８】
同様に、抗体構築物の二量体抗体構築物アイソフォームの収量及び、従って、単量体率（すなわち、単量体：（単量体＋二量体））を決定することができる。単量体及び二量体抗体構築物の生産性及び算出される単量体率は、例えば、ローラーボトル中での標準化された研究スケールでの産生からの培養物上清のＳＥＣ精製工程において取得することができる。一実施形態では、抗体構築物の単量体率は、≧８０％、より好ましくは≧８５％、さらにより好ましくは≧９０％、最も好ましくは≧９５％である。
【０１７９】
一実施形態では、≦８または≦７または≦６、より好ましくは≦５または≦４、より好ましくは≦３．５または≦３、さらにより好ましくは≦２．５または≦２、及び最も好ましくは≦１．５または≦１の好ましい血漿安定性（血漿非存在下でのＥＣ５０に対する血漿存在下でのＥＣ５０の比）を有する。抗体構築物の血漿安定性は、構築物をヒト血漿中、３７℃で２４時間インキュベートし、その後に５１クロム放出細胞傷害性アッセイにおいてＥＣ５０を決定することによって検査することができる。細胞傷害性アッセイにおいてエフェクター細胞は、刺激された富化ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞であることができる。標的細胞は、例えば、ヒトＣＤ７０がトランスフェクトされたＣＨＯ細胞であることができる。エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比は、１０：１として選択することができる。この目的のために使用されるヒト血漿プールは、ＥＤＴＡコーティングされたシリンジによって回収された健常ドナーの血液から得られる。細胞成分を遠心分離によって除去し、上部血漿相を回収し、その後にプールする。対照として、抗体構築物を、細胞傷害性アッセイの直前にＲＰＭＩ−１６４０培地にて希釈する。血漿安定性は、ＥＣ５０（対照）に対するＥＣ５０（血漿インキュベーション後）の比率として計算される。実施例１１を参照されたい。
【０１８０】
本発明の抗体構築物の単量体から二量体への変換率は低くあることがさらに好ましい。変換率は、異なる条件下で測定することができ、高性能サイズ排除クロマトグラフィーによって分析することができる。実施例９を参照されたい。例えば、抗体構築物の単量体アイソフォームのインキュベーションは、インキュベーター内、３７℃で７日間、例えば、１００μｇ／ｍｌまたは２５０μｇ／ｍｌの濃度で行うことができる。これらの条件下で、本発明の抗体構築物は、≦５％、より好ましくは≦４％、さらにより好ましくは≦３％、さらにより好ましくは≦２．５％、さらにより好ましくは≦２％、さらにより好ましくは≦１．５％、及び最も好ましくは≦１％、≦０．６％、または≦０．５％、≦０．３％またさらには０％の二量体率を示すことが好ましい。
【０１８１】
本発明の二重特異性抗体構築物が数回の凍結／解凍サイクル後に非常に低い二量体変換率で存在することも好ましい。例えば、抗体構築物の単量体は、例えば、ジェネリック製剤緩衝液中、２５０μｇ／ｍｌの濃度に調節され、３回の凍結／解凍サイクル（−８０℃で３０分間凍結、その後に室温で３０分間解凍）に供され、その後に高性能ＳＥＣに供されて、二量体抗体構築物に変換された初期単量体抗体構築物の割合（％）が決定される。好ましくは、二重特異性抗体構築物の二量体率は、例えば、３回の凍結／解凍サイクル後に、≦５％、より好ましくは≦４％、さらにより好ましくは≦３％、さらにより好ましくは≦２．５％、さらにより好ましくは≦２％、さらにより好ましくは≦１．５％、及び最も好ましくは≦１％またさらには≦０．５％または０％である。
【０１８２】
本発明の二重特異性抗体構築物は好ましくは、凝集温度≧４５℃または≧５０℃、より好ましくは≧５２℃または≧５４℃、さらにより好ましくは≧５６℃または≧５７℃、及び最も好ましくは≧５８℃または≧５９℃または≧６０℃を有する好都合な熱安定性を示す。熱安定性パラメータは、抗体凝集温度に関して以下のように決定することができる：２５０μｇ／ｍｌの濃度の抗体溶液を、単回使用キュベットへと移し、動的光散乱（ＤＬＳ）装置に入れる。試料を、測定された半径を常に取得しながら０．５℃／分の加熱速度で４０℃から７０℃へと加熱する。タンパク質の融解及び凝集を示す半径の増加を使用して、抗体の凝集温度を算出する。実施例１０を参照されたい。
【０１８３】
あるいは、抗体構築物の固有の生物物理学的タンパク質安定性を決定するため、融解温度曲線を示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により決定することができる。これらの実験は、ＭｉｃｒｏＣａｌ  ＬＬＣ（Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ）ＶＰ−ＤＳＣデバイスを用いて行う。抗体構築物を含む試料のエネルギー取り込みを、製剤緩衝液のみを含有する試料との比較で、２０℃から９０℃まで記録する。抗体構築物を、例えば、ＳＥＣ泳動緩衝液中、２５０μｇ／ｍｌの最終濃度に調節する。それぞれの融解曲線の記録のために、試料全体の温度を段階的に上昇させる。各温度Ｔで、試料及び製剤緩衝液基準物のエネルギー取り込みを記録する。試料から基準物を差し引いたエネルギー取り込みＣｐ（ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ／℃）の差を、それぞれの温度に対してプロットする。融解温度は、エネルギー取り込みが最初に最大となる温度と定義される。
【０１８４】
本発明のＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物がヒトＣＤ７０パラログＣＤ４０Ｌと交差反応しない（すなわち、これに本質的に結合しない）とさらに想定される。さらには、本発明のＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物が、マカク／ｃｙｎｏ  ＣＤ７０パラログＣＤ４０Ｌと交差反応しない（すなわち、これに本質的に結合しない）ことが想定される。実施例６を参照されたい。
【０１８５】
本発明の抗体構築物の第一の結合ドメインのヒトＣＤ７０への結合が、可溶性ＣＤ２７の存在により、≦２５％、好ましくは≦２０％、より好ましくは≦１５％、より好ましくは≦１０％、さらにより好ましくは≦５％、及び最も好ましくは≦２％減少することがさらに想定される。この文脈におけるＣＤ２７の濃度は、生物学的である、例えば、約１００及び約５００ｐｇ／ｍｌの間、またさらにはより高い、例えば、最大で１μｇ／ｍｌまでであると想定される。アッセイの詳細については、実施例１６を参照されたい。
【０１８６】
本発明のＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物はまた、≦０．２、好ましくは≦０．１５、より好ましくは≦０．１２、さらにより好ましくは≦０．１、及び最も好ましくは≦０．０８または≦０．０５の濁度（精製された単量体抗体構築物を２．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、一晩インキュベーションした後のＯＤ３４０により測定される）を有すると想定される。実施例１２を参照されたい。
【０１８７】
本発明のＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物は、内部移行しないまたは標的細胞により有意な内部移行を受けないとも想定される。Ｔ細胞の不在下での標的細胞上での該構築物のプレインキュベーションの関数としてのＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の効力の変化を測定することができる。抗体構築物が内部移行する場合、それは、リソソーム分解を受けているはずである。有効濃度は、経時的に低減するはずで、ゆえに、見かけの効力も同様に低減するはずである。該効果は、他の標的で観察され、これは既知の現象である。
【０１８８】
内部移行の比率は、例えば、以下のようにアッセイすることができる：Ｔ細胞を計数し、アッセイ培地中１×１０５／ｍｌの濃度に希釈する。ＣＤ７０陽性（例えば、天然発現体）細胞を計数し、ウェルあたり２５００細胞（ｃｐｗ）でプレーティングする。抗体構築物を段階的に１：２に希釈し、出発濃度は１００ｎＭとする。抗体構築物を、培養物アッセイプレートに添加して、０時間、１時間または２時間のインキュベーションを行ってからＴ細胞を添加する。次いで、Ｔ細胞を２５０００ｃｐｗでプレーティングし、アッセイ物を４８時間にわたって３７℃でインキュベートする。標的細胞生存を、例えば、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）システム（２５μｌ／ウェル）を用いて分析する。好ましくは、内部移行率は、標的細胞と抗体構築物の２時間（プレ）インキュベーション後に≦２０％、より好ましくは≦１５％、さらにより好ましくは≦１０％、及び最も好ましくは≦５％である。
【０１８９】
さらなる実施形態では、本発明に従う抗体構築物は、酸性ｐＨ下で安定である。非生理学的ｐＨ、例えば、ｐＨ５．５（例えば、カチオン交換クロマトグラフィーを実行するのに必要とされるｐＨ）で抗体構築物がより大きな耐性を示すほど、充填されたタンパク質の総量に対するイオン交換カラムから溶出する抗体構築物の回収率が高くなる。ｐＨ５．５でのイオン（例えば、カチオン）交換カラムからの抗体構築物の回収率は、好ましくは≧５０％、より好ましくは≧６０％または≧６５％、さらにより好ましくは≧７０％または≧７２％または≧７４％または≧７６％または≧７８％、さらにより好ましくは≧８０％、さらにより好ましくは≧９０％、さらにより好ましくは≧９５％、及び最も好ましくは、≧９９％である。実施例１３を参照されたい。
【０１９０】
本発明の二重特異性抗体構築物が治療効果または抗腫瘍活性を呈することがさらに想定される。これは、例えば、進行段階のヒト腫瘍異種移植モデルの以下の例に開示される研究において評価することができる。
【０１９１】
研究第１日目に、５×１０６個の細胞のヒトＣＤ７０陽性がん細胞株を、雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右背側面に皮下注射する。平均腫瘍体積が約１００ｍｍ３に達したときに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させたヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞を、この動物の腹腔へ約２×１０７個の細胞を注射することによりマウスに移植する。ビヒクル対照群１のマウスにはエフェクター細胞を与えず、ビヒクル対照群２（エフェクター細胞を与える）との比較のための未移植対照として使用して、腫瘍成長に与えるＴ細胞単独の影響をモニターする。抗体処置は、平均腫瘍体積が約２００ｍｍ３に達したときに開始する。処置開始日における各処置群の平均腫瘍サイズは、任意の他の群と統計的に相違しないべきである（分散分析）。マウスを、０．５ｍｇ／ｋｇ／日のＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物を用いて、約１５〜２０日間の静脈内ボーラス注射により処置する。研究中、腫瘍はキャリパーによって測定し、進行は腫瘍体積（ＴＶ）の群間比較によって評価する。腫瘍成長阻害Ｔ／Ｃ［％］は、ＴＶを、Ｔ／Ｃ％＝１００×（分析群のＴＶ中央値）／（対照群２のＴＶ中央値）として算出することによって決定する。
【０１９２】
当業者は、この研究のある特定のパラメータ、例えば、注射する腫瘍細胞の数、注射部位、移植するヒトＴ細胞の数、投与する二重特異性抗体構築物の量及びタイムラインを変更または適合させつつ、なおも有意義かつ再現性のある結果に到達する方法に精通している。好ましくは、腫瘍成長阻害Ｔ／Ｃ［％］は≦７０もしくは≦６０であり、より好ましくは≦５０もしくは≦４０であり、さらにより好ましくは≦３０もしくは≦２０であり、最も好ましくは≦１０もしくは≦５またさらには≦２．５である。
【０１９３】
本発明は、本発明の抗体構築物をコードするポリヌクレオチド／核酸分子をさらに提供する。
【０１９４】
ポリヌクレオチドは、鎖内で共有結合的に結合された１３個またはそれ以上のヌクレオチド単量体から構成されるバイオポリマーである。ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）及びＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、異なる生物学的機能を有するポリヌクレオチドの例である。ヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡの様な核酸分子の単量体またはサブユニットとして機能する有機分子である。核酸分子またはポリヌクレオチドは、二本鎖及び一本鎖、直線状及び環状であることができる。それは、好ましくは宿主細胞内に含まれるベクター内に好ましくは含まれる。前記宿主細胞は、例えば、本発明のベクターまたはポリヌクレオチドを用いた形質転換またはトランスフェクション後に、抗体構築物を発現することができる。その目的のために、ポリヌクレオチドまたは核酸分子は、制御配列に作動可能に連結される。
【０１９５】
遺伝子コードは、遺伝物質（核酸）内で暗号化されている情報をタンパク質に翻訳するルール集である。生物細胞における生物学的解読は、リボソームによって達成され、それは、アミノ酸を運搬し、ｍＲＮＡに一度に３つのヌクレオチドを読み取らせるｔＲＮＡ分子を用いて、ｍＲＮＡによって指定される順にアミノ酸を連結する。このコードは、コドンと呼ばれるこれらのヌクレオチドトリプレットの配列がどのようにして、どのアミノ酸がタンパク質合成の間に次に付加されるかを指定するかを定義する。いくつかの例外があるが、核酸配列内の３ヌクレオチドコドンは、単一のアミノ酸を指定する。大部分の遺伝子が正確に同一のコードによってコードされるため、この特定のコードはしばしば、カノニカルまたは標準的な遺伝子コードと称される。遺伝子コードが所与のコード領域に関するタンパク質配列を決定し、他のゲノム領域はいつどこでこれらのタンパク質が産生されるかに影響することができる。
【０１９６】
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチド／核酸分子を含むベクターを提供する。
【０１９７】
ベクターは、（外来）遺伝物質を細胞内に運搬するためのビヒクルとして使用される核酸分子である。「ベクター」という用語は、プラスミド、ウイルス、コスミド及び人工染色体を含むがこれらに制限されない。一般に、工学ベクターは、複製起点、マルチクローニング部位及び選択可能マーカーを含む。ベクター自体は、一般に、インサート（導入遺伝子）及びベクターの「骨格」の役割を担う、より大きな配列を含むヌクレオチド配列、通常ＤＮＡ配列である。最近のベクターは、導入遺伝子インサート及び骨格に加えて追加の特徴：プロモーター、遺伝子マーカー、抗生物質耐性、レポーター遺伝子、標的化配列、タンパク質精製タグを包含し得る。発現ベクター（発現構築物）と呼ばれるベクターは特に、標的細胞において導入遺伝子を発現させるためのものであり、一般に、制御配列を有する。
【０１９８】
「制御配列」という用語は、作動可能に連結されたコード配列を特定の宿主生物において発現させるために必要なＤＮＡ配列を表す。原核生物に好適な制御配列は、例えば、プロモーター、場合によりオペレーター配列及びリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが公知である。
【０１９９】
核酸は、それが別の核酸配列との機能的関係の下に置かれているとき、「作動可能に連結」する。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのためのＤＮＡがポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結されるのは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合であり；プロモーターもしくはエンハンサーがコード配列に作動可能に連結されるのは、それがその配列の転写に影響する場合であり；または、リボソーム結合部位がコード配列に作動可能に連結されるのは、それが翻訳を促進するよう配置される場合である。一般に、「作動可能に連結」は、連結されるＤＮＡ配列が連続していること、及び、分泌リーダーの場合は、連続しかつリーディングフェーズ内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続している必要はない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合、従来の実践に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。
【０２００】
「トランスフェクション」は、核酸分子またはポリヌクレオチド（ベクターを含む）を標的細胞に意図的に導入するプロセスである。この用語は、ほとんどの場合、真核生物細胞における非ウイルス的方法のために使用される。形質導入は、しばしば、核酸分子またはポリヌクレオチドのウイルスを介した移入を表すために使用される。動物細胞のトランスフェクションは、典型的に、物質の取り込みを可能にする、細胞膜における一過的な孔または「穴」の開口に関与する。トランスフェクションは、リン酸カルシウムを用いて、エレクトロポレーションによって、細胞スクイージング（ｃｅｌｌ  ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ）によって、またはカチオン性脂質とリポソームを産生するために物質を混合することによって行うことができ、これは細胞膜と融合しそれら積荷を中に沈着させる。
【０２０１】
「形質転換」という用語は、細菌への、また、植物細胞を含む非動物真核生物細胞への核酸分子またはポリヌクレオチド（ベクターを含む）の非ウイルス的移入を記載するために使用される。形質転換は、従って、細胞膜（複数可）を通じたその周囲からの直接的取り込み及びその後の外因性遺伝子物質（核酸分子）の組み込みから生じる細菌または非動物真核生物細胞の遺伝的変更である。形質転換は、人為的手段によって影響を与えることができる。形質転換を生じさせるために、細胞または細菌は、飢餓及び細胞密度などの環境条件に対する時限的反応として起こり得る受容能の状態でなければならない。
【０２０２】
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチド／核酸分子またはベクターで形質転換されたまたはこれがトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【０２０３】
本明細書で用いるとき、「宿主細胞」または「レシピエント細胞」という用語は、本発明の抗体構築物をコードするベクター、外因性核酸分子、及びポリヌクレオチドのレシピエントとなり得るまたはレシピエントである任意の個々の細胞または細胞培養物；及び／または抗体構築物そのもののレシピエントを含むと意図される。細胞へのそれぞれの物質の導入は、形質転換、トランスフェクション等の方法によって実行される。「宿主細胞」という用語はまた、単一細胞の子孫または潜在的子孫を含むことも意図する。後続世代では、自然発生的、偶発的もしくは意図的な突然変異のいずれかに起因してまたは環境的影響に起因して、ある特定の修飾が生じ得るため、そのような子孫は、実際には、その親細胞と（形態学的にまたはゲノムもしくは総ＤＮＡ相補体に関して）完全に同一ではないかもしれないが、依然としてそれは本明細書で使用されるこの用語の範囲に含まれる。好適な宿主細胞は、原核生物または真核生物細胞を含み、細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞及び動物細胞、例えば、昆虫細胞及び哺乳動物細胞、例えば、マウス、ラット、マカクまたはヒトも含むがこれらに限定されない。
【０２０４】
本発明の抗体構築物は、細菌内で産生することができる。発現後、本発明の抗体構築物は、可溶性画分において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞ペーストから単離され、例えば、親和性クロマトグラフィー及び／またはサイズ排除を通して精製することができる。最終精製は、例えば、ＣＨＯ細胞において発現させた抗体を精製するための方法と同様に実行することができる。
【０２０５】
原核生物に加えて、真核微生物、例えば、糸状菌または酵母が、本発明の抗体構築物に好適なクローニングまたは発現宿主である。サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または一般パン酵母は、下等真核宿主微生物の中で最も一般的に使用されている。しかし、多くの他の属、種及び株が一般に利用可能であり、本発明において有用でありそれは例えば、シゾサッカロミセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属宿主、例えば、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １２４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ  １６０４５）、Ｋ．ウィッカーラミ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ  ２４１７８）、Ｋ．ウォルティ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ  ５６５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ  ３６９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、及びＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウイア（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ  ４０２  ２２６）；ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ  １８３  ０７０）；カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマリージア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ  ２４４  ２３４）；ニューロスポラ  クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）；シュワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、シュワニオミセス  オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；及び糸状菌、例えば、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、及びアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属宿主、例えば、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）である。
【０２０６】
本発明のグリコシル化抗体構築物の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物から得られる。無脊椎動物細胞の例は、植物及び昆虫細胞を含む。多くのバキュロウイルス株及び変異体ならびにヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（毛虫）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）などの宿主由来の対応する許容される昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えば、キンウワバの一種（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異体及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）ＮＰＶのＢｍ−５株、が公的に入手可能であり、そのようなウイルスが、本発明に従って本明細書においてウイルスとして、特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために、使用され得る。
【０２０７】
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、シロイヌナズナ及びタバコの植物細胞培養物もまた、宿主として使用することができる。植物細胞培養物におけるタンパク質の産生に有用なクローニング及び発現ベクターは当業者に公知である。例えば、Ｈｉａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４２：７６−７８、Ｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７９０−７９４、Ａｒｔｓａｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ８：７４５−７５０及びＦｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３２：９７９−９８６を参照されたい。
【０２０８】
しかし、脊椎動物細胞に対する関心が最も高く、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の繁殖は慣用手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胎児腎臓株（懸濁培養において成長のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶＩ  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８７）；ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓由来細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、１４１３  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５  １）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８２）３８３：４４−６８）；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒトヘパトーマ株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０２０９】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明の抗体構築物の産生のためのプロセスであって、本発明の宿主細胞を、本発明の抗体構築物の発現を可能にする条件下で培養する工程、及び産生された抗体構築物を培養物から回収する工程を含む、前記プロセスを提供する。
【０２１０】
本明細書で用いるとき、「培養」という用語は、培地中における好適な条件下での細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの維持、分化、成長、増殖及び／または繁殖を表す。「発現」という用語は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾及び分泌を含むがこれらに限定されない、本発明の抗体構築物の産生に関与する任意の工程を含む。
【０２１１】
組換え技術を用いるとき、抗体構築物は、ペリプラズム間隙で細胞内産生する、または培地に直接分泌することができる。抗体構築物が細胞内産生される場合、最初の工程として、宿主細胞または溶解した断片のいずれかの粒状のデブリが、例えば、遠心分離または限外ろ過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）は、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム間隙に分泌される抗体を単離する手順を記載している。簡潔には、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間かけて解凍する。細胞のデブリは、遠心分離によって除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合、そのような発現系からの上清は、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットを用いて通常最初に濃縮される。プロテアーゼ阻害剤、例えば、ＰＭＳＦは、タンパク質分解を阻害するために、上記の工程のいずれかに含まれ得、抗生物質は、外来混入物の増殖を防ぐために、含まれ得る。
【０２１２】
宿主細胞から調製された本発明の抗体構築物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及び親和性クロマトグラフィーを用いて回収または精製することができる。タンパク質精製のための他の技術、例えば、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈降、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈降もまた、回収される抗体に応じて利用可能である。本発明の抗体構築物がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が精製に有用である。
【０２１３】
親和性クロマトグラフィーは、好ましい精製技術である。親和性リガンドを付加するマトリクスは、アガロースであることが最も多いが、他のマトリクスも利用可能である。機械的に安定なマトリクス、例えば、コントロールドポアガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースを用いて達成することができるよりも速い流速及び短い処理時間を可能にする。
【０２１４】
さらに、本発明は、本発明の抗体構築物または本発明のプロセスに従って産生される抗体構築物を含む、医薬組成物を提供する。
【０２１５】
本明細書で用いるとき、「医薬組成物」という用語は、患者、好ましくはヒト患者への投与に好適な組成物に関連する。本発明の特に好ましい医薬組成物は、１つまたは複数の本発明の抗体構築物を、好ましくは治療有効量で含む。好ましくは、医薬組成物は、１つまたは複数の（薬学的に有効な）担体、安定剤、賦形剤、希釈剤、可溶化剤、界面活性剤、乳化剤、保存剤及び／またはアジュバントの好適な製剤をさらに含む。組成物の許容される構成成分は、好ましくは、採用される投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性である。本発明の医薬組成物は、液体、凍結及び凍結乾燥組成物を含むがこれらに限定されない。
【０２１６】
本発明の組成物は、薬学的に許容され得る担体を含み得る。一般に、本明細書で用いるとき、「薬学的に許容され得る担体」は、薬学的投与、特に非経口投与に適合する、任意かつ全ての水性及び非水性溶液、滅菌溶液、溶媒、緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液、水、懸濁液、エマルジョン、例えば、油／水エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、リポソーム、分散媒及びコーティングを意味する。医薬組成物におけるそのような媒体及び薬剤の使用は当技術分野で周知であり、そのような担体を含む組成物は周知の従来法によって配合することができる。
【０２１７】
ある特定の実施形態は、本発明の抗体構築物及びさらなる１つまたは複数の賦形剤、例えば、この節及び本明細書の他箇所に例示されているものを含む医薬組成物を提供する。賦形剤は、この点で本発明において幅広い様々な目的のため、例えば、製剤の物理的、化学的もしくは生物学的特性を調節するため、例えば、粘度の調節のため、ならびにまたは有効性を改善するため及びもしくはそのような製剤及びプロセスを、例えば、製造、輸送、保管、使用前準備、投与時及びそれ以降に発生するストレスに起因する分解及び損傷に対して安定化させるための本発明のプロセスのために使用することができる。
【０２１８】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、オスモル濃度、粘性、清澄性、色、等張性、臭気、滅菌性、安定性、溶解もしくは放出速度、吸収性または浸透性を改変、維持または保存する目的のための配合材料を含有し得る（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ  １８’’  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．）、１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい）。そのような実施形態では、適当な配合材料は、
・アミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、トレオニン、プロリン、２−フェニルアラニン、これには、荷電アミノ酸、好ましくはリジン、酢酸リジン、アルギニン、グルタミン酸塩及び／またはヒスチジンが含まれる
・抗菌剤、例えば、抗細菌剤及び抗真菌剤；
・抗酸化物質、例えば、アスコルビン酸、メチオニン、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム；
・緩衝液、緩衝系及び緩衝化剤、これは組成物を生理学的ｐＨでまたは若干低いｐＨで、典型的には約５〜約８または９のｐＨ範囲内で維持するために使用される；緩衝液の例は、ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩またはその他の有機酸、コハク酸塩、リン酸塩、ヒスチジン及び酢酸塩；例えば、約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝液または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液；
・非水性溶媒、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステル；
・生理食塩水及び緩衝化媒体を含む水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液を含む水性担体；
・生分解性ポリマー、例えば、ポリエステル；
・増量剤、例えば、マンニトールまたはグリシン；
・キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；
・等張剤及び吸収遅延剤；
・錯化剤、例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン；
・充填剤；
・単糖類；二糖類；及び他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）；炭水化物は非還元糖、好ましくはトレハロース、スクロース、オクタスルファート、ソルビトールまたはキシリトールであり得る；
・（低分子量）タンパク質、ポリペプチドまたはタンパク質性担体、例えば、ヒトまたはウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン、好ましくはヒト起源のもの；
・着色及び香味剤；
・硫黄含有還元剤、例えば、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、［アルファ］−モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム
・希釈剤；
・乳化剤；
・親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；
・塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；
・保存剤、例えば、抗菌剤、抗酸化物質、キレート化剤、不活性ガス等；例としては、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素である）；
・金属錯体、例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体；
・溶媒及び共溶媒、（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）；
・糖及び糖アルコール、例えば、トレハロース、スクロース、オクタスルファート、マンニトール、ソルビトールまたはキシリトールスタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、ミオイニシトース（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｓｅ）、ガラクトース、ラクトース、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール；及び多価糖アルコール；
・懸濁剤；
・界面活性剤または湿潤剤、例えば、プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）；界面活性剤は、好ましくは＞１．２ＫＤの分子量を有する洗浄剤及び／または好ましくは＞３ＫＤの分子量を有するポリエーテルであり得る；好ましい洗浄剤の非限定的な例は、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ４０、Ｔｗｅｅｎ  ６０、Ｔｗｅｅｎ  ８０及びＴｗｅｅｎ  ８５である；好ましいポリエーテルの非限定的な例は、ＰＥＧ  ３０００、ＰＥＧ  ３３５０、ＰＥＧ  ４０００及びＰＥＧ  ５０００である；
・安定性向上剤、例えば、スクロースまたはソルビトール；
・等張性向上剤、例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール；
・非経口送達ビヒクル、これは、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液または固定油を含む；
・静脈内送達ビヒクル、これは、体液及び栄養補給液、電解質補給液（例えば、リンガーデキストロースをベースとするもの）を含む、
を含み得るがこれらに限定されない。
【０２１９】
医薬組成物の異なる構成成分（例えば、上記のもの）は異なる効果を有することができることが当業者に明らかであり、例えば、アミノ酸は、緩衝液、安定剤及び／または抗酸化物質として機能することができ；マンニトールは、増量剤及び／または等張性向上剤として機能することができ；塩化ナトリウムは、送達ビヒクル及び／または等張性向上剤として機能することができる、等である
【０２２０】
本発明の組成物は、その組成物の意図されている用途に応じて、本明細書で定義される本発明のポリペプチドに加えてさらなる生物学的に活性な薬剤を含み得ることが想定される。そのような薬剤は、胃腸系に対して作用する薬物、細胞増殖抑制剤として作用する薬物、高尿酸血症（ｈｙｐｅｒｕｒｉｋｅｍｉａ）を防ぐ薬物、免疫反応を阻害する薬物（例えば、コルチコステロイド）、炎症反応を調節する薬物、循環系に対して作用する薬物及び／または当技術分野で公知の薬剤、例えば、サイトカインであり得る。本発明の抗体構築物が連携治療において、すなわち別の抗がん薬と併用して適用されることも想定される。
【０２２１】
最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式及び所望の用量に基づいて、当業者によって決定されるだろう。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、上記を参照されたい。ある特定の実施形態では、そのような組成物は、本発明の抗体構築物の物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出速度及びｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス速度に影響し得る。ある特定の実施形態では、医薬組成物中の主たるビヒクルまたは担体は、本来的に水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、好適なビヒクルまたは担体は、非経口投与用組成物において一般的な他の物質を補充され得る、注射用水、生理食塩水溶液または人工脳脊髄液であり得る。中性緩衝化生理食塩水または血清アルブミンを混合された生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。ある特定の実施形態では、本発明の組成物の抗体構築物は、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形態で望ましい純度を有する選択された組成物を任意の配合剤（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、上記）と混合することによって保存用に調製され得る。さらに、ある特定の実施形態では、本発明の抗体構築物は、適当な賦形剤、例えば、スクロースを用いて凍結乾燥物として配合され得る。
【０２２２】
非経口投与が企図されるとき、本発明において使用される治療組成物は、薬学的に許容され得るビヒクル中に所望の本発明の抗体構築物を含む、発熱物質非含有の、非経口的に許容可能な水溶液の形態で提供され得る。非経口注射に特に好適なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、その中に本発明の抗体構築物が滅菌性、等張性の溶液として配合され、適切に保存される。ある特定の実施形態では、調製物は、所望の分子と、注射可能なマイクロスフィア、生体内分解性粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸もしくはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームなどの、蓄積注射を介して送達することができる製品の制御または持続放出を提供し得る薬剤との配合を必然的に含むことができる。ある特定の実施形態では、循環における持続時間を向上させる効果を有するヒアルロン酸も使用され得る。ある特定の実施形態では、移植可能な薬物送達デバイスが、所望の抗体構築物を導入するために使用され得る。
【０２２３】
持続または制御送達／放出製剤中に本発明の抗体構築物を必然的に含む製剤を含む、さらなる医薬組成物が、当業者に明らかだろう。様々な他の持続または制御送達手段、例えばリポソーム担体、生体内分解性マイクロスフィアまたは多孔性ビーズ及び蓄積注射を配合する技術もまた当業者に公知である。例えば、医薬組成物の送達のための多孔性ポリマーマイクロ粒子の制御放出について記載する、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９を参照されたい。持続放出調製物は、成形物、例えばフィルム、またはマイクロカプセルの形態の半透過性ポリマーマトリックスを含み得る。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号及び欧州特許出願公開ＥＰ０５８４８１に記載される）、Ｌ−グルタミン酸及びガンマエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７及びＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニル酢酸（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１、上記）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開ＥＰ１３３，９８８）を含み得る。持続放出組成物は、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製することができるリポソームも含み得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８−３６９２；欧州特許出願公開ＥＰ０３６，６７６；同ＥＰ０８８，０４６及び同ＥＰ１４３，９４９を参照されたい。
【０２２４】
抗体構築物はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）に、またはマクロエマルジョンに捕捉され得る。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．，Ｅｄ．，（１９８０）に開示されている。
【０２２５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために使用される医薬組成物は、典型的に、滅菌調製物として提供される。滅菌は、滅菌ろ過膜を通す、ろ過によって達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を用いた滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前後のいずれかに実施され得る。非経口投与用組成物は、凍結乾燥形態または溶液として保存することができる。非経口組成物は、通常、滅菌されたアクセスポートを有するコンテナ、例えば皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液用バッグまたはバイアル中に入れられる。
【０２２６】
本発明の別の態様は、国際特許出願ＷＯ０６１３８１８１Ａ２（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２５９９）に記載されるように、医薬組成物として使用することができる、本発明の自己緩衝性抗体構築物製剤を含む。様々な解説が、タンパク質の安定化ならびにこれに関して有用な製剤質及び方法に対して利用可能である、例えば、Ａｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｏｌｖｅｎｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，”Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．８（３）：２８５−９１（１９９１）；Ｋｅｎｄｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ”：ＲＡＴＩＯＮＡＬ  ＤＥＳＩＧＮ  ＯＦ  ＳＴＡＢＬＥ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ：ＴＨＥＯＲＹ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ内、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｎｎｉｎｇ，ｅｄｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１３：６１−８４（２００２）、及びＲａｎｄｏｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”，Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１５９−７５（２００２）、特に獣医学的及び／またはヒト医学的使用のためのタンパク質医薬品及びプロセスに関連する、本発明に従う自己緩衝性タンパク質製剤と同じ賦形剤及びプロセスに関する部分を特に参照されたい。
【０２２７】
塩は、本発明のある特定の実施形態にしたがい、例えば、製剤のイオン強度及び／もしくは等張性を調節するため、ならびに／または本発明に従う組成物のタンパク質もしくは他の成分の溶解度及び／もしくは物理的安定性を改善するために使用され得る。周知のように、イオンは、未変性状態のタンパク質を、タンパク質の表面上の荷電残基に結合することによって、ならびにタンパク質中の荷電及び極性基を遮蔽しそれらの静電気相互作用、誘引及び反発相互作用の強度を減少させることによって安定化させ得る。イオンは、特にタンパク質の変性したペプチド結合（−−ＣＯＮＨ）に結合することによって変性状態のタンパク質を安定化させることができる。さらには、タンパク質中の荷電及び極性基とのイオン相互作用は、分子間静電気相互作用も減少させ、それによってタンパク質の凝集及び不溶化を防止または減少させることができる。
【０２２８】
イオン種は、タンパク質に対するそれらの効果において大きく異なる。イオンとタンパク質に対するそれらの効果のカテゴリー別順位づけが多数開発され、これらは本発明に従う医薬組成物の製剤化に使用され得る。一例は、イオン性及び極性非イオン性溶質を、溶液中のタンパク質の立体構造安定性に対するそれらの効果によって順位づけするホフマイスターシリーズである。安定化させる溶質は、「コスモトロピック」と称される。不安定化させる溶質は、「カオトロピック」と称される。コスモトロープは通常、溶液からタンパク質を沈殿（「塩析」）させるために高濃度（例えば、＞１モル硫酸アンモニウム）で使用される。カオトロープは通常、タンパク質を変性及び／または可溶化（「塩溶」）させるために使用される。「塩溶」及び「塩析」に対するイオンの相対的な有効性が、ホフマイスターシリーズにおけるそれらの位置を定義する。
【０２２９】
遊離アミノ酸は、本発明の様々な実施形態に従う本発明の抗体構築物製剤において、増量剤、安定剤及び抗酸化剤として、ならびにその他の標準的用途で使用され得る。リジン、プロリン、セリン及びアラニンは、製剤中のタンパク質を安定化させるために使用することができる。グリシンは、正確なケークの構造及び特性を確保するために凍結乾燥時に有用である。アルギニンは、液体及び凍結乾燥の両製剤においてタンパク質の凝集を防ぐために有用であり得る。メチオニンは、抗酸化剤として有用である。
【０２３０】
ポリオールは、糖、例えば、マンニトール、スクロース及びソルビトールならびに多価アルコール、例えば、グリセロール及びプロピレングリコール、ならびに、本明細書の考察の目的のために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び関連物質を含む。ポリオールはコスモトロピックである。これらは、タンパク質を物理的及び化学的分解プロセスから保護するための液体及び凍結乾燥の両製剤における有用な安定剤である。ポリオールは、製剤の等張性を調節するためにも有用である。本発明の選択された実施形態において特に有用なポリオールはマンニトールであり、凍結乾燥製剤においてケークの構造安定性を確保するために広く使用される。それは、ケークに対して構造安定性を確保する。それは一般に、凍結乾燥保護物質、例えばスクロースと共に使用される。ソルビトール及びスクロースは、等張性を調節するために及び輸送中または製造プロセス中のバルク調製中の凍結・解凍ストレスから保護するための安定剤として特に好ましい薬剤である。（遊離アルデヒドまたはケトン基を含む）還元糖、例えばグルコース及びラクトースは、表面リジン及びアルギニン残基を糖化し得る。従って、それらは概して、本発明に従う使用に関して特に好ましいポリオールではない。加えて、そのような反応性種を形成する糖、例えば酸性条件下でフルクトース及びグルコースに加水分解され、その結果糖化をもたらすスクロースもまたこの点で本発明の特に好ましいポリオールではない。ＰＥＧは、タンパク質を安定化させるために及び凍結保護物質として有用であり、この点で本発明において使用することができる。
【０２３１】
本発明の抗体構築物製剤の実施形態は、界面活性剤をさらに含む。タンパク質分子は、表面上の吸着ならびに空気−液体、固体−液体、及び液体−液体界面での変性及びその結果としての凝集を引き起こしやすいものであり得る。これらの効果は通常、タンパク質濃度に反比例する。これらの有害な相互作用は通常、タンパク質濃度と反比例し、典型的には、例えば製品の輸送及び取り扱い時に生じる物理的撹拌によって悪化する。界面活性剤は、慣用的に、表面吸着を防止する、最小化するまたは減少させるために使用される。この点で本発明において有用な界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタンポリエトキシレートのその他の脂肪酸エステル及びポロキサマー１８８を含む。界面活性剤はまた、タンパク質の立体構造安定性を制御するために広く使用されている。任意の所与の界面活性剤は典型的に一部のタンパク質を安定化させ他を不安定化させるので、この点で界面活性剤の使用はタンパク質特異的である。
【０２３２】
ポリソルベートは、酸化的分解を起こしやすく、しばしば、供給されるときに、タンパク質残基の側鎖、特にメチオニンの酸化を引き起こすのに十分な量のペルオキシドを含有する。結果として、ポリソルベートは、注意して使用するべきであり、使用する際は、それらの最低有効濃度で用いるべきである。この点で、ポリソルベートは、賦形剤がそれらの最低有効濃度で使用されるべきとする一般的なルールの一例である。
【０２３３】
本発明の抗体構築物製剤の実施形態は、１つまたは複数の抗酸化剤をさらに含む。適当なレベルの周囲酸素及び温度を維持することによって、ならびに光への暴露を回避することによって、医薬製剤中でのタンパク質の有害な酸化をある程度まで防ぐことができる。タンパク質の酸化分解を防ぐために、抗酸化性賦形剤も使用することができる。この点で特に有用な抗酸化剤は、還元剤、酸素／フリーラジカル消去剤及びキレート剤である。本発明に従う治療用タンパク質製剤において使用される抗酸化剤は、好ましくは水溶性であり、製品の保存可能期間を通してそれらの活性を維持するものである。ＥＤＴＡは、この点で本発明に従う好ましい抗酸化剤である。抗酸化剤は、タンパク質を損傷し得る。例えば、グルタチオンなどの還元剤は特に、分子内ジスルフィド連結を破壊し得る。従って、本発明において使用するための抗酸化剤は、中でもそれ自体が製剤中のタンパク質に損傷を与える可能性を排除するまたは十分に減少させるように選択される。
【０２３４】
本発明に従う製剤は、タンパク質の補因子でありタンパク質配位錯体を形成するのに必要とされる金属イオン、例えば、ある特定のインスリン懸濁液を形成するのに必要とされる亜鉛を含み得る。金属イオンはまた、タンパク質を分解するいくつかのプロセスを阻害し得る。しかし、金属イオンは、タンパク質を分解する物理的及び化学的プロセスも触媒する。マグネシウムイオン（１０〜１２０ｍＭ）は、アスパラギン酸からイソアスパラギン酸への異性化を阻害するために使用され得る。Ｃａ＋２イオン（最大１００ｍＭ）は、ヒトデオキシリボヌクレアーゼの安定性を向上させ得る。Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２及びＺｎ＋２は、しかし、ｒｈＤＮａｓｅを不安定化させ得る。同様にＣａ＋２及びＳｒ＋２は、第ＶＩＩＩ因子を安定化させ得、それはＭｇ＋２、Ｍｎ＋２及びＺｎ＋２、Ｃｕ＋２及びＦｅ＋２によって不安定化され得、そしてその凝集はＡｌ＋３イオンによって増大し得る。
【０２３５】
本発明の抗体構築物の製剤の実施形態は、１つまたは複数の保存剤をさらに含む。保存剤は、同じコンテナからの複数回の抽出を必然的に含む多用量非経口製剤を開発する際に必要となる。それらの主な機能は、その医薬品の保存可能期間または有効使用期間を通して、微生物の成長を阻害し、製品の滅菌性を確保することである。広く使用されている保存剤には、ベンジルアルコール、フェノール及びｍ−クレゾールが含まれる。保存剤は、低分子量非経口薬と共に使用される長い歴史を有しているが、保存剤を含むタンパク質製剤の開発は、困難であり得る。保存剤は、ほぼ常に、タンパク質に対して不安定化効果（凝集）を有し、これが多用量タンパク質製剤におけるそれらの使用を制限する大きな要因となっている。今日まで、ほとんどのタンパク質薬は、単回使用のみのために配合されている。しかし、多用量製剤が可能であれば、それらは患者の利便性及び高い市場性を実現するという追加の利点を有する。良い例は、保存処理された製剤の開発がより利便性の高い複数回使用の注射ペンの提案の商業化を実現しているヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のそれである。ｈＧＨの保存処理された製剤を含む少なくとも４つそのようなペンデバイスが、現在市場で入手可能である。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（液体、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ  ＡＱ（液体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及びＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（凍結乾燥−デュアルチャンバーカートリッジ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ）はフェノールを含み、Ｓｏｍａｔｒｏｐｅ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）にはｍ−クレゾールが配合されている。いくつかの態様は、保存処理された剤形の製剤及び開発中に考慮される必要がある。医薬品における有効な保存剤濃度は、最適化されなければならない。これは、タンパク質の安定性を損なわずに抗微生物効果を付与する濃度範囲で剤形中の所与の保存剤を試験することを必要とする。
【０２３６】
予想され得るように、保存剤を含有する液体製剤の開発は、凍結乾燥製剤よりも困難である。凍結乾燥製品は、保存剤なしで凍結乾燥され、使用時に保存剤を含む希釈剤で再構成され得る。これにより保存剤がタンパク質と接触する時間が短縮され、付随する安定性リスクを著しく低くする。液体製剤では、保存剤の有効性及び安定性は、製品保存可能期間全体（約１８〜２４ヶ月）にわたって維持されるべきである。注意すべき重要な点は、保存剤の有効性は、活性な薬物及び全ての賦形剤成分を含有する最終製剤において実証されるべきであることである。
【０２３７】
本明細書に開示される抗体構築物はまた、免疫リポソームとしても製剤化され得る。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物送達に有用な様々なタイプの脂質、リン脂質、及び／または界面活性剤から構成される小さな小胞である。リポソームの成分は通常、生体膜の脂質の配置と同様の二層形式で配置される。抗体構築物を含有するリポソームは、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号；ならびにＷ０９７／３８７３１に記載されるような当技術分野で公知の方法によって調製される。循環時間が向上したリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームは、所望の直径のリポソームを得るために、所定の孔サイズのフィルターを通して押出される。本発明の抗体構築物のＦａｂ’断片は、ジスルフィド相互交換反応を介して、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されるようなリポソームにコンジュゲートすることができる。化学療法剤は、リポソーム内に任意選択で含有される。Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１（１９）１４８４（１９８９）を参照されたい。
【０２３８】
医薬組成物が製剤化されたら、それは溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、結晶として、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアル中で保管され得る。そのような製剤は、即時使用可能な形態であるかまたは投与前に再構成される（例えば、凍結乾燥された）形態のいずれかで保管され得る。
【０２３９】
本明細書で定義される医薬組成物の生物学的活性は、例えば、以下の実施例に、ＷＯ９９／５４４４０にまたはＳｃｈｌｅｒｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０（２００５），１−１２）によって記載されるような、細胞傷害性アッセイによって決定することができる。本明細書で使用される「有効性」または「ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性」は、例えば標準化ＮＣＩ応答基準を使用する、本発明の医薬組成物による治療に対する応答を表す。本発明の医薬組成物を使用する治療の成功またはｉｎ  ｖｉｖｏ有効性は、その意図する目的に対する組成物の有効性、すなわち、組成物がその所望の効果、すなわち病理学的細胞、例えば腫瘍細胞の枯渇をもたらす能力を表す。ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性は、白血球数、鑑別、蛍光活性化セルソーティング、骨髄吸引を含むがこれらに限定されない、各々の病態に対して確立されている標準的な方法によってモニタリングされ得る。加えて、様々な疾患に特異的な臨床化学パラメータ及びその他の確立された標準的な方法が使用され得る。さらには、コンピューター支援断層撮影、Ｘ線、核磁気共鳴断層撮影（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ基準に基づく反応評価のため［Ｃｈｅｓｏｎ  ＢＤ，Ｈｏｒｎｉｎｇ  ＳＪ，Ｃｏｉｆｆｉｅｒ  Ｂ，Ｓｈｉｐｐ  ＭＡ，Ｆｉｓｈｅｒ  ＲＩ，Ｃｏｎｎｏｒｓ  ＪＭ，Ｌｉｓｔｅｒ  ＴＡ，Ｖｏｓｅ  Ｊ，Ｇｒｉｌｌｏ−Ｌｏｐｅｚ  Ａ，Ｈａｇｅｎｂｅｅｋ  Ａ，Ｃａｂａｎｉｌｌａｓ  Ｆ，Ｋｌｉｐｐｅｎｓｔｅｎ  Ｄ，Ｈｉｄｄｅｍａｎｎ  Ｗ，Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ  Ｒ，Ｈａｒｒｉｓ  ＮＬ，Ａｒｍｉｔａｇｅ  ＪＯ，Ｃａｒｔｅｒ  Ｗ，Ｈｏｐｐｅ  Ｒ，Ｃａｎｅｌｌｏｓ  ＧＰ．Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｔｏ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．ＮＣＩ  Ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１９９９  Ａｐｒ；１７（４）：１２４４］）、陽電子放射断層撮影スキャンニング、白血球数、鑑別、蛍光活性化セルソーティング、骨髄吸引、リンパ節生検／組織検査、及び様々なリンパ腫に特異的な臨床化学パラメータ（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ）、ならびにその他の確立されている標準的な方法が使用され得る。
【０２４０】
本発明の医薬組成物などの薬物の開発における別の大きな課題は、薬物動態特性の予測可能な調整である。この目的のために、所与の状態を処置する特定の薬物の能力に影響する候補薬物の薬物動態プロフィール、すなわち、薬物動態パラメータのプロフィールを確立することができる。ある特定の病態を処置するための薬物の能力に影響する薬物の薬物動態パラメータは、半減期、分布体積、肝初回通過代謝及び血清結合度を含むがこれらに限定されない。所与の薬物の有効性は、上記のパラメータの各々によって影響される可能性がある。
【０２４１】
「半減期」は、投与された薬物の５０％が生物学的プロセス、例えば代謝、排泄等を通して排除される時間を意味する。「肝初回通過代謝」は、薬物が肝臓と最初に接触したときに、すなわちそれが最初に肝臓を通過する間に代謝される性向を意味する。「分布体積」は、身体の種々の区画、たとえば細胞内空間及び細胞外空間、組織ならびに臓器などの全体に薬物が保持される程度、ならびにこれらの区画内における薬物分布を意味する。「血清結合度」は、薬物が血清タンパク質、たとえばアルブミンと相互作用及び結合して、その薬物の生物活性を低下または喪失させる性向を意味する。
【０２４２】
薬物動態パラメータには、所与の薬物投与量に対するバイオアベイラビリティ、遅延時間（Ｔｌａｇ）、Ｔｍａｘ、吸収速度、即効性（ｍｏｒｅ  ｏｎｓｅｔ）及び／またはＣｍａｘも含まれる。「バイオアベイラビリティ」は、血液区画中の薬物量を意味する。「遅延時間」は、薬物投与とそれが血液または血漿中に検出及び測定可能になるまでの間の時間の遅れを意味する。「Ｔｍａｘ」は、薬物の最大血中濃度に達した時間であり、「Ｃｍａｘ」は所与の薬物について得られた最大血中濃度である。薬物がそれの生物学的効果のために要求される血中濃度または組織濃度に達するまでの時間は、あらゆるパラメータにより影響される。前記に概説したようにチンパンジー以外の霊長類における前臨床動物試験で決定できる、種間特異性を呈する二重特異性抗体構築物の薬物動態パラメータは、例えばＳｃｈｌｅｒｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０（２００５）、１−１２）による刊行物にも示されている。
【０２４３】
一実施形態は、腫瘍もしくはがん疾患のまたは転移性がん疾患の予防、処置または寛解において使用するための本発明の抗体構築物または本発明のプロセスに従って産生される抗体構築物を提供する。この腫瘍またはがんまたは転移性がんは、ＣＤ７０発現性であると想定される。
【０２４４】
本明細書に記載される製剤は、それを必要とする患者において本明細書に記載される病理学的医学的状態の処置、寛解及び／または予防において医薬組成物として有用である。「処置」という用語は、治療的処置及び予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃまたはｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方を表す。処置は、疾患／障害、疾患／障害の症状、または疾患／障害の素因を有する患者の身体、単離された組織または細胞に対する、疾患、疾患の症状または疾患の素因を治す、治癒する、軽減する、緩和する、変化させる、治療する、寛解する、改善するまたはそれに影響を与える目的での、製剤の適用または投与を含む。
【０２４５】
本明細書で使用される「寛解」という用語は、それを必要とする対象への本発明に従う抗体構築物の投与による、本明細書に下で指定される腫瘍またはがんまたは転移性がんを有する患者の疾患状態の任意の改善を表す。そのような改善はまた、患者の腫瘍またはがんまたは転移性がんの進行の鈍化または停止として見られることもある。本明細書で使用される「予防」という用語は、それを必要とする対象への本発明に従う抗体構築物の投与による、本明細書に下で指定される記載される腫瘍またはがんまたは転移性がんを有する患者の発症または再発の回避を意味する。
【０２４６】
「疾患」という用語は、本明細書に記載される抗体構築物または医薬組成物を用いた処置の恩恵を受けるだろう任意の状態を表す。これは、哺乳動物を問題の疾患にかかりやすくさせる病態を含む、慢性及び急性の障害または疾患を含む。
【０２４７】
「新生物」は、組織の異常成長であり、必ずではないが通常、腫瘤を形成する。腫瘤も形成するとき、それは、「腫瘍」と一般的に称される。新生物または腫瘍または、良性、潜在的に悪性（前がん性）、または悪性であることができる。悪性新生物は、一般的にがんと呼ばれる。これらは、通常、周辺組織に侵入して破壊し、転移を形成する、すなわち、これらは、身体の他の部分、組織または臓器へと拡散する可能性がある。従って、「転移性がん」という用語は、当初の腫瘍のうちの１つ以外の他の組織臓器への転移を包含する。リンパ腫及び白血病は、リンパ性新生物である。本発明の目的のために、これらのも、「腫瘍」または「がん」という用語に包含する。
【０２４８】
本発明の好ましい実施形態では、腫瘍またはがん疾患は、腎臓、肺、膵臓、卵巣、乳房、結腸、頭頸部、胃、直腸、胸腺、及び脳の腫瘍またはがん、白血病、リンパ腫、メラノーマ、カポジ肉腫、胚性がん腫、ならびに前述のいずれかに由来する転移性がん疾患からなる群より選択される。
【０２４９】
より具体的には、腫瘍またはがん疾患は、腎細胞がん（ＲＣＣ）、腎明細胞がん（ｃｃＲＣＣ）、乳頭状腎細胞がん、嫌色素性腎細胞がん、肉腫様腎細胞がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺扁平がん、膵臓腺がん、例えば、膵管腺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺扁平がん、喉頭がん腫、咽頭がん腫、鼻咽頭がん腫、鼻咽腔未分化がん腫、リンパ上皮腫、膠芽腫、神経膠腫、髄膜腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｔ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病、Ｂ細胞株がん、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、バーキットリンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、多発性骨髄腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性小型異型細胞リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、中心芽細胞性（ｅｎｔｒｏｂｌａｓｔｉｃ）／中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫、ＨＩＶ関連体腔液性リンパ腫、キャッスルマン病、またはワルデンシュトレームマクログロブリン血症からなる群より選択することができる。転移性がん疾患は、前述のいずれかに由来し得る。
【０２５０】
本発明は、腫瘍またはがん疾患または転移性がん疾患を処置または寛解するための方法であって、それを必要とする対象に本発明の抗体構築物または本発明のプロセスに従って産生される抗体構築物を投与する工程を含む、前記方法も提供する。この腫瘍またはがんまたは転移性がんは、ＣＤ７０発現性であると想定される。
【０２５１】
「必要とする対象」または「処置を必要とする」対象という用語は、すでにその障害を有する対象、ならびにその障害が予防されるべきである対象を含む。必要とする対象または「患者」は、予防的または治療的いずれかの処置を受けるヒト及び他の哺乳動物対象を含む。
【０２５２】
本発明の抗体構築物は、通常、とりわけ、変動するバイオアベイラビリティ及び持続性を伴って、特定の投与経路及び投与方法のために、特定の投与量及び投与頻度のために、特定の疾患の特定の処置のために設計されるだろう。組成物の材料は、好ましくは、その投与部位にとって許容可能な濃度で配合される。
【０２５３】
従って、製剤及び組成物は、本発明に従い、任意の好適な投与経路による送達のために設計され得る。本発明の文脈において、投与経路は、
・局所経路（例えば、皮膚、吸入、鼻、眼、耳（ａｕｒｉｃｕｌａｒ／ａｕｒａｌ）、膣、粘膜）
・腸経路（例えば、経口、胃腸、舌下、唇下、口腔、直腸）及び
・非経口経路（例えば、静脈内、動脈内、骨内、筋内、脳内、脳室内、硬膜外、くも膜下、皮下、腹腔内、羊膜外、関節内、心臓内、皮内、病巣内、子宮内、膀胱内、硝子体内、経皮、鼻内、経粘膜、滑液嚢内、管腔内）
を含むがこれらに限定されない。
【０２５４】
本発明の医薬組成物及び抗体構築物は、例えば、ボーラス注射などの注射による、または連続注入などの注入による、非経口投与、例えば、皮下または静脈内送達に特に有用である。医薬組成物は、医療デバイスを用いて投与され得る。医薬組成物を投与するための医療デバイスの例は、米国特許第４，４７５，１９６号；同第４，４３９，１９６号；同第４，４４７，２２４号；同第４，４４７，２３３号；同第４，４８６，１９４号；同第４，４８７，６０３号；同第４，５９６，５５６号；同第４，７９０，８２４号；同第４，９４１，８８０号；同第５，０６４，４１３号；同第５，３１２，３３５号；同第５，３１２，３３５号；同第５，３８３，８５１号；及び同第５，３９９，１６３号に記載されている。
【０２５５】
具体的には、本発明は、好適な組成物の連続的な投与を提供する。非限定的な例として、連続的なまたは実質的に連続的な、すなわち持続投与は、患者が着用した患者体内への療法薬の流入を計量するための小型ポンプシステムにより実現され得る。本発明の抗体構築物を含む医薬組成物は、前記ポンプシステムを用いることによって投与することができる。そのようなポンプシステムは、概して当技術分野で公知であり、一般には注入すべき治療剤を収容するカートリッジの定期的交換を必要とする。そのようなポンプシステムにではカートリッジを交換する際、それ以外では中断されない患者体内への治療剤の流入の一時的中断が生じる可能性がある。そのような場合、カートリッジ交換前の投与期とカートリッジ交換後の投与期は、本発明の薬学的手段及び方法の意味の範囲内で、そのような治療剤の１回の「連続的な投与」を合わせて構成すると依然としてみなされるであろう。
【０２５６】
本発明の抗体構築物の持続的または連続的な投与は、流体送達デバイスまたは小型ポンプシステムにより静脈内または皮下に行なうことができ、これには流体をレザバーから駆出するための流体駆動機構及びこの駆動機構を作動させるための作動機構が含まれる。皮下投与用のポンプシステムは、患者の皮膚を穿通して好適な組成物を患者体内に送達するための針またはカニューレを含み得る。前記ポンプシステムは、静脈、動脈または血管とは関係なく、患者の皮膚に直接固定または設置されてよく、それによりポンプシステムと患者の皮膚を直接接触させることができる。ポンプシステムは、患者の皮膚に２４時間〜数日間にわたって設置させることができる。ポンプシステムは、少容量用のリザーバを備える小型のものであってよい。非限定的な例として、投与すべき好適な医薬組成物用のリザーバの容量は、０．１〜５０ｍｌの間であることができる。
【０２５７】
持続投与は、皮膚に貼付して一定間隔で交換するパッチによる経皮投与であってもよい。この目的に適した薬物送達用パッチシステムは当業者に既知である。有利には、使用済み第一パッチを取り除く直前に、たとえば使用済み第一パッチのすぐ隣の皮膚の表面に新たな第二パッチを配置すると同時に使用済み第一パッチの交換を達成できるので、経皮投与は連続投与特に好適であることに注目されたい。流れの中断または電池不良の問題は生じない。
【０２５８】
医薬組成物が凍結乾燥される場合、凍結乾燥された物質はまず、投与の前に適切な液体において再構成される。凍結乾燥された物質は、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、生理学的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または凍結乾燥の前にタンパク質が入っていたものと同じ製剤で再構成され得る。
【０２５９】
本発明の組成物は、例えば、本明細書に記載される種間特異性を呈する漸増用量の本発明の抗体構築物をチンパンジー以外の霊長類、例えばマカク、に投与する用量漸増研究によって決定することができる好適な用量で対象に投与することができる。上記のように、本明細書に記載される種間特異性を呈する本発明の抗体構築物は、チンパンジー以外の霊長類における前臨床試験において及びヒトにおける薬物として同一の形態で、好都合に使用できる。投薬レジメンは、担当医及び臨床的要因によって決定されるだろう。医学分野で周知のように、ある１人の患者に対する投与量は、その患者のサイズ、体の表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間及び経路、全身健康状態ならびに同時に投与される他の薬物を含む、多くの要因に依存する。
【０２６０】
「有効用量」または「有効投与量」という用語は、所望の効果を達成するまたは少なくとも部分的に達成するのに十分な量と定義される。「治療有効用量」という用語は、疾患にすでに罹患している患者において疾患及びその合併症を治癒するまたは少なくとも部分的に抑止するのに十分な量と定義される。この用途で有効な量または用量は、処置される状態（適応症）、送達される抗体構築物、治療の内容及び目的、疾患の重篤度、治療歴、患者の病歴及び治療剤に対する反応、投与経路、サイズ（体重、体表面積もしくは臓器サイズ）ならびに／または患者の状態（年齢及び全身健康状態）、ならびに患者自身の免疫系の全般的状態に依存するだろう。適当な用量は、それが一度にまたは一連の投与として患者に投与され得るよう、及び最適な治療効果を得るために、担当医の判断に従い調節することができる。
【０２６１】
典型的な投与量は、上述の要因に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜最大約３０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であり得る。特定の実施形態では、投与量は、１．０μｇ／ｋｇ〜最大約２０ｍｇ／ｋｇ、任意選択で１０μｇ／ｋｇ〜最大約１０ｍｇ／ｋｇまたは１００μｇ／ｋｇ〜最大約５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
【０２６２】
治療有効量の本発明の抗体構築物は、好ましくは、疾患症状の重篤度の低下、無疾患症状期の頻度もしくは期間の増加、または疾患の苦痛に起因する機能障害もしくは能力障害の防止をもたらす。ＣＤ７０発現腫瘍の処置のために、治療有効量の本発明の抗体構築物、例えば、抗ＣＤ７０／抗ＣＤ３抗体構築物は、好ましくは、細胞成長または腫瘍成長を未処置患者と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％阻害する。腫瘍成長を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における作用を予測する動物モデルにおいて評価され得る。
【０２６３】
医薬組成物は、単回治療としてまたは必要に応じて抗がん治療などの追加の治療、例えば他のタンパク質性及び非タンパク質性薬物と組み合わせて投与することができる。これらの薬物は、本明細書で定義される本発明の抗体構築物を含む組成物と共に同時に投与されてよい、または前記抗体構築物の投与前後に時間的に定義された間隔及び用量で別々に投与されてよい。
【０２６４】
本明細書で使用される「有効及び非毒性用量」という用語は、大きな毒性作用を伴わずにまたは本質的に伴わずに、病理学的細胞の枯渇、腫瘍除去、腫瘍縮退または疾患の安定化をもたらすのに十分高い、本発明の抗体構築物の許容可能な用量を表す。そのような有効及び非毒性用量は、例えば、当技術分野で記載されている用量漸増研究によって決定されてよく、重篤な有害副事象を誘導する用量未満であるべきである（用量制限毒性、ＤＬＴ）。
【０２６５】
本明細書で使用される「毒性」という用語は、有害事象または重篤な有害事象において現れる薬物の毒性作用を表す。これらの副事象は、投与後の全身における薬物の耐容性の欠如及び／または局所的な耐容性の欠如を表し得る。毒性はまた、その薬物によって引き起こされる催奇形効果または発がん効果を含み得る。
【０２６６】
本明細書で使用される「安全性」、「ｉｎ  ｖｉｖｏ安全性」または「耐容性」という用語は、投与直後に（局所的耐性）及びより長期の薬物適用期間中に重篤な有害事象を誘導しない薬物の投与を定義する。「安全性」、「ｉｎ  ｖｉｖｏ安全性」または「耐容性」は、例えば、処置中及び経過観察期間中に一定間隔で評価することができる。測定は、臨床評価、例えば臓器の兆候、及び検査異常のスクリーニングを含む。臨床評価が実施され、ＮＣＩ−ＣＴＣ及び／またはＭｅｄＤＲＡ標準にしたがう正常所見からの逸脱が記録／コード化され得る。臓器の兆候は、例えば、Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｖｅｎｔｓ  ｖ３．０（ＣＴＣＡＥ）に示されるように、アレルギー／免疫学、血液／骨髄、心不整脈、凝固等の基準を含み得る。検査され得る検査パラメータは、例えば、血液学、臨床化学、凝固プロフィール及び尿検査ならびにその他の体液、例えば血清、血漿、リンパまたは脊髄液、リカー等の試験を含む。従って安全性は、例えば身体試験、画像化技術（すなわち、超音波、ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、専門的デバイスを用いるその他の測定（すなわち、心電図）、バイタルサインによって、検査パラメータを測定し有害事象を記録することによって、評価することができる。例えば、本発明に従う使用及び方法において、チンパンジー以外の霊長類における有害事象が、組織病理学及び／または組織化学法により試験され得る。
【０２６７】
上記の用語はまた、例えば、Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓａｆｅｔｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｓ６；ＩＣＨ  Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ  Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ；ＩＣＨ  Ｓｔｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  Ｊｕｌｙ  １６，１９９７においても言及されている。
【０２６８】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明の抗体構築物、本発明のプロセスに従って産生される抗体構築物、本発明のポリヌクレオチド／核酸分子、本発明のベクター、及び／または本発明の宿主細胞を含む、キットを提供する。
【０２６９】
本発明の文脈において、「キット」という用語は、２つ以上の構成要素を意味し、そのうちの１つは、コンテナ、容器またはその他にまとめて梱包された本発明の抗体構築物、医薬組成物、ベクターまたは宿主細胞に対応する。キットは、従って、単品として販売することができる、ある特定の目的を達成するために十分な製品及び／または用品の一式として表すことができる。
【０２７０】
キットは、投与に適した用量（上記参照）の本発明の抗体構築物または医薬組成物を含有する任意の適切な形状、サイズ及び材質（好ましくは、防水性、例えば、プラスチックまたはガラス）の１つまたは複数の容器（例えば、バイアル、アンプル、コンテナ、シリンジ、ボトル、バッグ）を含み得る。キットは、（例えば、リーフレットまたは指示マニュアルの形態の）使用説明書、本発明の抗体構築物を投与するための手段、例えば、シリンジ、ポンプ、インフューザー等、本発明の抗体構築物を再構成するための手段及び／また本発明の抗体構築物を希釈するための手段をさらに含有し得る。
【０２７１】
本発明は、単回用量投与単位のためのキットも提供する。本発明のキットは、乾燥／凍結乾燥された抗体構築物を含む第１の容器及び水性製剤を含む第２の容器も含み得る。本発明のある特定の実施形態では、単一チャンバー及びマルチチャンバー式充填済みシリンジ（例えば、液体シリンジ及びリオシリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含有するキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０２７２】
【図１】抗Ｖ５抗体を使用して、ＣＨＯ細胞上でのエピトープマッピングに使用される構築物の発現制御。実施例１を参照されたい。
【図２】多重エピトープ・ビニングまたは競合アッセイ及びＦＡＣＳ読み出しの概略図。１４個のビーズをそれぞれ異なる抗体で予めコーティングする。二次抗体「Ｘ」を加え、追加の結合を決定する。追加の結合を決定することができない場合、抗体は、互いに結合に競合している。
【図３】エピトープマッピング分析の実験のセットアップ、実施例２を参照されたい。Ｖ５タグを、示すように、グリシン／セリンリンカーを介して、キメラ分子のＣ末端に融合した。
【図４Ａ−１】実施例２に記載の通りに実行したｓｃＦｃ形式のいくつかの例示的なＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性結合因子のエピトープマッピング結果。図４Ａにおいて特に示していないが、全ての構築物は、ＣＤ７０×ＣＤ３（Ｉ２Ｃ）二重特異性であり、ｓｃＦｃ形式であった。ｘ軸は、複合体ＰＥ−Ａ（ＰＥ＝フィコエリトリン；Ａ＝シグナル面積）を示し、ｙ軸は、モードに正規化した（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｔｏ  ｍｏｄｅ）計数（事象）を示す。
【図４Ａ−２】実施例２に記載の通りに実行したｓｃＦｃ形式のいくつかの例示的なＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性結合因子のエピトープマッピング結果。図４Ａにおいて特に示していないが、全ての構築物は、ＣＤ７０×ＣＤ３（Ｉ２Ｃ）二重特異性であり、ｓｃＦｃ形式であった。ｘ軸は、複合体ＰＥ−Ａ（ＰＥ＝フィコエリトリン；Ａ＝シグナル面積）を示し、ｙ軸は、モードに正規化した（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｔｏ  ｍｏｄｅ）計数（事象）を示す。
【図４Ｂ−１】実施例２に記載の通りに実行したｓｃＦｃ形式のいくつかの例示的なＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性結合因子のエピトープマッピング結果。図４Ｂにおいて特に示していないが、全ての構築物は、ＣＤ７０×ＣＤ３（Ｉ２Ｃ）二重特異性であり、ｓｃＦｃ形式であった。ｘ軸は、複合体ＰＥ−Ａ（ＰＥ＝フィコエリトリン；Ａ＝シグナル面積）を示し、ｙ軸は、モードに正規化した（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｔｏ  ｍｏｄｅ）計数（事象）を示す。
【図４Ｂ−２】実施例２に記載の通りに実行したｓｃＦｃ形式のいくつかの例示的なＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性結合因子のエピトープマッピング結果。図４Ｂにおいて特に示していないが、全ての構築物は、ＣＤ７０×ＣＤ３（Ｉ２Ｃ）二重特異性であり、ｓｃＦｃ形式であった。ｘ軸は、複合体ＰＥ−Ａ（ＰＥ＝フィコエリトリン；Ａ＝シグナル面積）を示し、ｙ軸は、モードに正規化した（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｔｏ  ｍｏｄｅ）計数（事象）を示す。
【図５Ａ】実施例５及び６において解析する、ｓｃＦｃ形式の代表的な数の抗体構築物に関して示される、二重特異性結合、種間交差反応性及びヒトＣＤ７０パラログＣＤ４０Ｌへの結合の不存在。ｘ軸は、複合体ＰＥ−Ａ（ＰＥ＝フィコエリトリン；Ａ＝シグナル面積）を示し、ｙ軸は、計数（事象）を示す。
【図５Ｂ】実施例５及び６において解析する、ｓｃＦｃ形式の代表的な数の抗体構築物に関して示される、二重特異性結合、種間交差反応性及びヒトＣＤ７０パラログＣＤ４０Ｌへの結合の不存在。ｘ軸は、複合体ＰＥ−Ａ（ＰＥ＝フィコエリトリン；Ａ＝シグナル面積）を示し、ｙ軸は、計数（事象）を示す。
【図５Ｃ】実施例５及び６において解析する、ｓｃＦｃ形式の代表的な数の抗体構築物に関して示される、二重特異性結合、種間交差反応性及びヒトＣＤ７０パラログＣＤ４０Ｌへの結合の不存在。ｘ軸は、複合体ＰＥ−Ａ（ＰＥ＝フィコエリトリン；Ａ＝シグナル面積）を示し、ｙ軸は、計数（事象）を示す。
【図６】：ヒトＣＤ７０がトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞として、未刺激ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用するＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイにおいて分析した、ＣＤ７０−２１Ｄ＿ＣＣｘＩ２Ｃ−ｓｃＦｃの細胞傷害活性。アッセイは、実施例８．５に記載の通りに実行した。並行して、可溶性ＣＤ２７を１ｎｇ／ｍｌの濃度にて加えた。可溶性形態のＣＤ２７の存在は、検査される抗体構築物の細胞傷害活性を損なわなかった。
【実施例】
【０２７３】
以下の実施例は、本明細書を示す。これらの実施例は、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみ制限される。
【０２７４】
実施例１
野生型及び短縮切断されたＣＤ７０を発現するＣＨＯ細胞の生成
ＣＤ７０抗原の細胞外ドメインを、異なる部分ドメインまたは領域Ｅ１〜Ｅ７へと細分することができ、これらは、実施例１及び２の目的のために、以下のアミノ酸位置：
Ｅ１
ａａ４３〜６２
配列番号７４３
Ｅ２
ａａ６３〜８４
配列番号７４４
Ｅ３
ａａ８５〜１０９
配列番号７４５
Ｅ４
ａａ１１０〜１３４
配列番号７４６
Ｅ５
ａａ１３５〜１５１
配列番号７４７
Ｅ６
ａａ１５２〜１７５
配列番号７４８
Ｅ７
ａａ１７６〜１９３
配列番号７４９
Ｅ１＋２
ａａ４３〜８４
配列番号７５０
Ｅ３＋４
ａａ８５〜１３４
配列番号７５１
Ｅ４＋５
ａａ１１０〜１５１
配列番号７５２
Ｅ５＋６
ａａ１３５〜１７５
配列番号７５３
Ｅ６＋７
ａａ１５２〜１９３
配列番号７５４
によって定義される。
【０２７５】
エピトープマッピング（実施例２）のために使用されるヒト／マウスキメラＣＤ７０分子の構築については、それぞれの７つのヒト領域ならびに２つの隣接するヒト領域の５つの組み合わせの配列（上を参照されたい）を、マウスＣＤ７０からの対応する領域と置き換えた。さらには、Ｖ５タグ
2018530996.tif 000028
を「ＧＧＧＧＳ」リンカーを介して、キメラ分子のＣ末端に融合した。最終キメラ分子配列を、配列番号７５９〜７６８に示す。加えて、完全長ヒトＣＤ７０（配列番号７４１）及び完全長マウスＣＤ７０（配列番号７５７）を構築し、両方とも「ＧＧＧＧＳ」リンカーを介してそれらのＣ末端に融合されたＶ５タグ
2018530996.tif 000029
を有した。
【０２７６】
上記構築物を発現するＣＨＯ  ｄｈｆｒ−細胞の生成のために、それぞれのコード配列をｐＥＦ−ＤＨＦＲと呼ばれるプラスミドへとクローニングした（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１）１４１−１５０に記載されている）。ヒトＣＤ７０がトランスフェクトされているがＶ５タグを伴わないＣＨＯ細胞も生成した。全てのクローン作成手順は、標準的なプロトコルに従って実行された（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１））。各構築物については、Ｋａｕｆｍａｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５，５３７−５６６に記載のように、対応するプラスミドを、真核生物の発現のためにＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞へとトランスフェクトした。
【０２７７】
ＣＨＯ細胞上での構築物の発現を、モノクローナルマウスＩｇＧ２ａ抗ｖ５タグ抗体（１μｇ／ｍｌ；ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ，＃ＭＣＡ  １３６０）を使用して検証した。結合したモノクローナル抗体を、抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ−ガンマ−ＰＥで検出した。陰性対照として、細胞を、一次抗体の代わりにアイソタイプ対照抗体とインキュベートした。試料は、フローサイトメトリーにより測定した。ＣＨＯトランスフェクタントは、Ｅ５単独またはＥ５＋６を発現しなかった。図１を参照されたい。
【０２７８】
実施例２
抗ＣＤ７０抗体構築物のエピトープマッピング
実施例１に記載の通りに生成されたＣＨＯ細胞を、個々の抗ＣＤ７０  ｓｃＦｖ分子を含有する粗製の未希釈ペリプラズム抽出物で染色した。結合したｓｃＦｖは、マウスモノクローナル抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（１μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ  Ｆ１８０４）で、その後、抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ−ガンマ−ＰＥ（１：１００；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃１１５−１１６−０７１）で検出した。全ての抗体を、ＰＢＳ／１．５％ＦＣＳに希釈した。陰性対照として、細胞を、ペリプラズム抽出物の代わりにＰＢＳ／２％ＦＣＳとインキュベートした。試料は、フローサイトメトリーにより測定した。全ての検査された抗ＣＤ７０  ｓｃＦｖ分子がＶ５タグを伴わないヒトＣＤ７０に結合することができた（強力なＦＡＣＳシグナル）一方で、それらはマウスＣＤ７０に結合することができなかった（ＦＡＣＳシグナル無し）。
【０２７９】
結合因子は、それに対して結合の喪失が観察されたキメラＣＤ７０分子に依存して、異なる群（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＩＩｖ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩ）へと分類された。結合の喪失は、大半の場合は完全であるが、部分的である場合もある。部分的にのみ喪失される結合は、領域名Ｅ６（群ＩＩ、ＩＩＩｖ、ＶＩ及びＶＩＩＩを参照されたい）において特に観察されたが、いくつかの場合では他の領域でも観察された。検査されたいくつかの結合因子については、２つの隣接する領域の組み合わせ（Ｅ１＋２、Ｅ３＋４、Ｅ４＋５、Ｅ６＋７）で得られた結果は、必ずしも明確ではなかった。それゆえ、異なる群への分類は、マウス対応領域で置き換えられた領域を１つのみ有するキメラ分子で得られた結果により主に推進された。結果は、表４に示す。
【０２８０】
（表４）細胞外ＣＤ７０ドメインのいくつかの領域（Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ６及びそれらの組み合わせ）は、ＦＡＣＳシグナルの完全なまたは部分的な喪失により検出されて、それぞれの抗ＣＤ７０結合分子により認識されるエピトープを含むと同定された。＊群及び結合因子の名称は、配列表においても使用される。
2018530996.tif 000030
【０２８１】
「Ｅ１」または「Ｅ７」キメラ分子に対して結合の喪失を示した抗ＣＤ７０  ｓｃＦｖ分子はなかった。従って、本発明の抗体構築物の第一の結合ドメインは、領域名Ｅ１内に含まれるエピトープに結合しないと思われ、かつ領域名Ｅ７内に含まれるエピトープに結合しないと思われる。群ＶＩＩでは、キメラ分子中のＶ５タグの存在が、抗ＣＤ７０  ｓｃＦｖ分子の結合に干渉するとみられる。それゆえ、エピトープを決定できなかった。この群の抗ＣＤ７０  ｓｃＦｖ分子は、領域名Ｅ７内に含まれるエピトープに結合すると推測でき、それは、この領域がＶ５タグに隣接するためである。
【０２８２】
図３は、実験のセットアップを示し、図４Ａ及びＢは、ｓｃＦｃ形式のいくつかの例示的な二重特異性結合因子のエピトープマッピング結果を示す。
【０２８３】
実施例３
ヒト及びカニクイザルＣＤ７０及びＣＤ３に対する抗体親和性のＢｉａｃｏｒｅ及びＯｃｔｅｔに基づく決定
Ｂｉａｃｏｒｅ分析実験を、アルブミンを伴う組換えヒト／ｃｙｎｏ  ＣＤ７０−ＥＣＤ融合タンパク質を使用して行って、本発明の抗体構築物の標的結合を決定した。
【０２８４】
詳細には、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、製造業者のマニュアルに従って酢酸塩緩衝液ｐＨ４．５を使用しておおよそ６００〜８００ＲＵのそれぞれの組換え抗原で固定化した。ＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物試料を、以下の濃度の希釈系列：ＨＢＳ−ＥＰランニングバッファー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中に希釈された５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ及び３．１３ｎＭにロードした。流速は３０μｌ／分で３分間とし、次いで、ＨＢＳ−ＥＰランニングバッファーを８分から２０分間、再度流速３０μｌ／ｍｌで適用した。１０ｍＭグリシン１０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ１．５溶液を使用してチップの再生を行った。データセットは、ＢｉａＥｖａｌソフトウェアを使用して分析した。概して、２つの独立した実験を行った。
【０２８５】
さらには、Ｏｃｔｅｔ分析実験を、組換えヒト／ｃｙｎｏ  ＣＤ７０−ＮＨＳ−ＰＥＧビオチンを使用して行って、本発明の抗体構築物の標的結合を決定した。詳細には、ストレプトアビジン−チップを、製造業者のマニュアルに従っておおよそ０．１〜０．２ｎｍのそれぞれの組換え抗原で固定化した。ＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物試料を、以下の濃度の希釈系列：ＨＢＳ−ＥＰランニングバッファー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中に希釈した３００ｎＭ、１５０ｎｍ、７５ｎＭ、３７．５ｎＭ、１８．８ｎＭ、９．４ｎＭにおいて調製した。全ての希釈に関して、１つのストレプトアビジン−チップを、抗原で固定化した。会合は、ブラック９６ウェルＭＴＰにおいて測定し、８分間の会合にわたって流速は１０００ｒｐｍとした。解離については、チップを、ＨＢＳ−ＥＰランニングバッファー中で１５分から３０分間、再度１０００ｒｐｍの流速でインキュベートした。データセットは、ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ分析ソフトウェアを使用して分析した。概して、２つの独立した実験を行った。
【０２８６】
分析したｓｃＦｃ形式のＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物は、１桁ナノモル範囲でヒトＣＤ７０に対し非常に高い親和性を示し（非常に低い２桁ナノモル範囲の１つの構築物を除く）、これは、Ｏｃｔｅｔ分析により決定した。マカクＣＤ７０への結合はバランスを保っており、これも１桁ナノモル範囲の親和性を示した。親和性値ならびに算出された親和性ギャップを表５に示す。
【０２８７】
（表５）Ｏｃｔｅｔ分析により決定した、ＣＤ７０×ＣＤ３（Ｉ２Ｃ）二重特異性抗体構築物のヒト及びマカクＣＤ７０に対する親和性、ならびに算出された種間親和性ギャップ。全ての構築物は、２つの独立した実験において測定され、そのそれぞれが希釈系列を使用したが、例外として（＊）のマークが付いているものは１つのみの実験で測定した。
2018530996.tif 000031
【０２８８】
さらには、二重特異性抗体構築物のヒトＣＤ３及びマカクＣＤ３に対する、ならびにヒト及びｃｙｎｏ  ＦｃＲｎに対する結合は、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにおいて確認され、強力でバランスがよくとれていることが示された。分析されたｓｃＦｃ形式のＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物は、非常に低い２桁または１桁ナノモル範囲にてヒトＣＤ３への高い親和性を示した。マカクＣＤ３への結合は、バランスがとれており、これも同様の範囲で親和性を示した。親和性値ならびに算出された親和性ギャップを表６に示す。
【０２８９】
（表６）Ｂｉａｃｏｒｅ分析により決定したＣＤ７０×ＣＤ３（Ｉ２Ｃ）二重特異性抗体構築物のヒト及びマカクＣＤ３に対する親和性、ならびに算出された種間親和性ギャップ
2018530996.tif 000032
【０２９０】
実施例４
標的抗原陽性細胞上のヒト及びマカクＣＤ７０に対するＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物親和性のスキャッチャードに基づく分析ならびに種間親和性ギャップの決定
ＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のヒトまたはマカクＣＤ７０がトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に対する親和性は、ヒト及びマカクＣＤ７０間の潜在的な親和性ギャップを測定するための最も信頼できる方法として、スキャッチャード分析によっても決定された。スキャッチャード分析については、飽和結合実験を、それぞれの細胞株へのＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の一価結合を正確に決定するために、一価検出システムを使用して行った。
【０２９１】
２×１０４個の細胞のそれぞれの細胞株（組換えヒトＣＤ７０発現ＣＨＯ細胞株、組換えマカクＣＤ７０発現ＣＨＯ細胞株）を、各々、５０μｌのトリプレット希釈系列（１：２での１２希釈）のそれぞれのＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物と、１０〜２０ｎＭから出発して（飽和に達するまで）インキュベートし、その後、撹拌しながら４℃で１６時間のインキュベーション、及び１回の残渣洗浄工程を行った。次いで、細胞を、さらに一時間、３０μｌのＣＤ３×ＡＬＥＸＡ４８８コンジュゲート溶液とインキュベートした。１回の洗浄工程の後、細胞を、３．５％ホルムアルデヒドを含有する１５０μｌ  ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、さらに１５分間インキュベートし、遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ機器及びＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを使用して分析した。データは、２つの独立したセットの実験から生成し、それぞれ３重測定を使用した。それぞれのスキャッチャード分析を計算して、最大結合（Ｂｍａｘ）を推定した。ＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の半最大結合での濃度は、それぞれのＫＤを反映させて決定した。三重測定の値を、双曲線及びＳ字曲線としてプロットして、最小から最適な結合までの適切な濃度範囲を実証した。
【０２９２】
結果を、ｓｃＦｃ形式の代表的な数の抗体構築物に関して表７に示す。細胞ベースのスキャッチャード分析により、本発明のＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物が、ヒトＣＤ７０及びｍａｃ  ＣＤ７０に対する親和性において低ナノモル範囲にあり、約１の小さくて非常に好ましいｃｙｎｏ／ヒト種間親和性ギャップを提示することが確認された。
【０２９３】
（表７）細胞ベースのスキャッチャード分析において決定されたＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の親和性（ＫＤ）と、算出された親和性ギャップＫＤマカクＣＤ７０／ＫＤヒトＣＤ７０。抗体構築物は、２つの独立した実験において測定され、それぞれ三重測定を使用した。
2018530996.tif 000033
【０２９４】
実施例５
二重特異性結合及び種間交差反応性
ヒトＣＤ７０及びＣＤ３ならびにｃｙｎｏ  ＣＤ７０及びＣＤ３への結合の確認のために、本発明の二重特異性抗体構築物を、
・それぞれ、ヒトＣＤ７０及びマカクＣＤ７０がトランスフェクトされたＣＨＯ細胞
・ＣＤ７０陽性ヒト卵巣がん腫細胞株ＯＶＣＡＲ８（しかし、他のＣＤ７０陽性ヒト細胞株、例えば、腎明細胞腺がん細胞株Ｏ−７８６も考えられ得る）
・ＣＤ３発現ヒトＴ細胞白血病細胞株ＨＰＢ−ａｌｌ（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ＡＣＣ４８３）、及び
・カニクイザルＣＤ３発現Ｔ細胞株ＬｎＰｘ  ４１１９
を使用するフローサイトメトリーにより検査した。
【０２９５】
フローサイトメトリーについては、２００，０００個の細胞のそれぞれの細胞株を、６０分間４℃で、５μｇ／ｍｌの濃度にて５０μｌの精製された二重特異性抗体構築物とインキュベートした。細胞を、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中で２回洗浄し、次いで、二重特異性抗体構築物のＣＤ３結合部分に特異的なインハウスマウス抗体（２μｇ／ｍｌ）と、３０分間４℃でインキュベートした。洗浄後、結合したマウス抗体を、３０分間４℃でヤギ抗マウスＦｃγ−ＰＥ（１：１００）を用いて検出した。試料は、フローサイトメトリーにより測定した。トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞を、陰性対照として使用した。
【０２９６】
結果を、ｓｃＦｃ形式の代表的な数の抗体構築物に関して図５Ａ〜５Ｃに示す。全ての検査されたＣＤ７０×ＣＤ３構築物は、ヒトＣＤ７０及びｃｙｎｏ  ＣＤ７０がトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を染色し、これらは、ＣＤ７０陽性腎明細胞腺がん細胞株Ｏ−７８６（天然の発現体）も染色した。ＣＤ３を発現するヒト及びｃｙｎｏ  Ｔ細胞株も、二重特異性抗体構築物により認識された。さらには、陰性対照細胞（ヒトＣＤ４０ＬがトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞）の染色はなかった。
【０２９７】
実施例６
ヒトパラログに対する結合の欠如の確認
ヒトＣＤ７０パラログＣＤ４０Ｌは、ＣＨＯ細胞に安定的にトランスフェクトされた。本実施例において使用されるパラログの配列は、配列表中に同定されている（配列番号７６９）。タンパク質発現は、特異的抗体を用いたＦＡＣＳ分析において確認された。フローサイトメトリーアッセイは、実施例５に記載の通りに実行した。結果を図５Ａ〜Ｃに示し、実施例５においても言及する。分析により、本発明のＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物が、ヒトＣＤ７０パラログＣＤ４０Ｌと交差反応しないことが確認された。
【０２９８】
実施例７：
ヒト生殖細胞系列に対する同一性
抗体構築物の配列の、ヒト抗体生殖細胞系列遺伝子に対する同一性／類似性を分析するために、本発明のＣＤ７０結合ドメインを以下のように整列させた：全てのＣＤＲを含む完全ＶＬを整列させた；ＣＤＲ１及び２を含むがＣＤＲ３を含まない完全ＶＨを、ヒト抗体生殖細胞系列遺伝子に対して整列させた（Ｖｂａｓｅ）。詳細は、本出願の明細書において見出すことができる。結果を以下の表８に示す。全ての変異体は、高い生殖細胞系列類似性を示す。
【０２９９】
（表８）ヒト生殖細胞系列に対するＶＨ及びＶＬの同一性の割合（％）
2018530996.tif 000034
【０３００】
実施例８
細胞傷害活性
ＣＤ７０発現標的細胞に対するエフェクターＴ細胞の再指向における本発明のＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の効力を、５つのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイにおいて分析した：
・ヒトＣＤ７０トランスフェクトＣＨＯ細胞に対する刺激されたヒトＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の再指向におけるＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の効力を、１８時間の５１クロム放出アッセイにおいて測定した。
・ＣＤ７０陽性ヒト卵巣がん腫細胞株ＯＶＣＡＲ８（しかし、他のＣＤ７０陽性ヒト細胞株も考えられ得る）に対する刺激されたヒトＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の再指向におけるＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の効力を、１８時間の５１クロム放出アッセイにおいて測定した。
・ヒトＣＤ７０トランスフェクトＣＨＯ細胞に対する未刺激ヒトＰＢＭＣのＴ細胞の再指向におけるＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の効力を、４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイにおいて測定した。
・ＣＤ７０陽性ヒト卵巣がん腫細胞株ＯＶＣＡＲ８（しかし他のＣＤ７０陽性ヒト細胞株も考えられ得る）に対する未刺激ヒトＰＢＭＣのＴ細胞の再指向におけるＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の効力を、４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイにおいて測定した。
・交差反応性ＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物が、マカクＴ細胞を、マカクＣＤ７０トランスフェクトＣＨＯ細胞に対して再指向することができることを確認するために、４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイを、マカクＴ細胞株をエフェクターＴ細胞として用いて行った。
【０３０１】
実施例８．１
刺激されたヒトＴ細胞を用いるクロム放出アッセイ
ＣＤ８＋Ｔ細胞が富化された刺激されたＴ細胞を、以下の通りに得た。ペトリ皿（１４５ｍｍ直径、Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ  ＧｍｂＨ、Ｋｒｅｍｓｍｕｎｓｔｅｒ）を、市販の抗ＣＤ３特異性抗体（ＯＫＴ３、Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ）を１μｇ／ｍｌの最終濃度で用いて３７℃で１時間コーティングした。結合していないタンパク質をＰＢＳで１回洗浄することにより除去した。３〜５×１０７個のヒトＰＢＭＣを、安定化グルタミン／１０％ＦＣＳ／ＩＬ−２  ２０Ｕ／ｍｌ（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）、Ｃｈｉｒｏｎ）を含む１２０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０中のプレコートしたペトリ皿に加え、２日間刺激した。３日目に、細胞を回収し、ＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。ＩＬ−２を２０Ｕ／ｍｌの最終濃度に加え、細胞を上記と同じ細胞培養培地中で再び１日間培養した。ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を、製造業者のプロトコルに従ってＤｙｎａｌ−Ｂｅａｄｓを使用してＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞の欠失により富化させた。
【０３０２】
Ｃｙｎｏ  ＣＤ７０またはヒトＣＤ７０トランスフェクトＣＨＯ標的細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、１１．１ＭＢｑ５１Ｃｒを用いて５０％ＦＣＳを有する１００μｌ  ＲＰＭＩの最終容量において、６０分間３７℃で標識した。続いて、標識した標的細胞を５ｍｌ  ＲＰＭＩで３回洗浄し、次いで、細胞傷害性アッセイに使用した。アッセイは、１０：１のＥ：Ｔ比率を有する２００μｌ補充ＲＰＭＩの総容量の９６ウェルプレート中で行った。０．０１〜１μｇ／ｍｌの出発濃度の精製された二重特異性抗体構築物及びその３倍希釈物を使用した。アッセイのためのインキュベーション時間は、１８時間とした。細胞傷害性は、最大溶解（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘの添加）と自発的溶解（エフェクター細胞無し）の差異に対する上清中に放出されたクロムの相対値として決定した。全ての測定は、４回測定で実行した。上清中のクロム活性の測定を、Ｗｉｚａｒｄ３’’ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧｍｂＨ，Ｋｏｌｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にて行った。結果の分析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ対応Ｐｒｉｓｍ５（バージョン５．０、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて実行した。シグモイド用量反応曲線から解析プログラムにより算出されたＥＣ５０値を、細胞傷害活性の比較に使用した。
【０３０３】
実施例８．２
刺激されたヒトエフェクターＴ細胞をヒトＣＤ７０トランスフェクトＣＨＯ細胞に対して再指向する効力
本発明に従うＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性を、５１クロム（５１Ｃｒ）放出細胞傷害性アッセイにおいて、ヒトＣＤ７０がトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞として、刺激されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用して、分析した。実験は、実施例８．１に記載の通りに実行した。
【０３０４】
結果を、ｓｃＦｃ形式の代表的な数の抗体構築物に関して表９に示す。ＣＤ７０×ＣＤ３（Ｉ２Ｃ）二重特異性抗体構築物は、サブピコモル範囲で、非常に強力な細胞傷害活性をヒトＣＤ７０トランスフェクトＣＨＯ細胞に対して示した。
【０３０５】
（表９）５１クロム（５１Ｃｒ）放出細胞傷害性アッセイにおいて、ヒトＣＤ７０がトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞として、刺激されたヒトＣＤ８  Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用して分析されたＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値［ｐＭ］。
2018530996.tif 000035
【０３０６】
実施例８．３
刺激されたヒトエフェクターＴ細胞をＣＤ７０陽性ヒト細胞株に対して再指向する効力
ＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性を、５１クロム（５１Ｃｒ）放出細胞傷害性アッセイにおいて、ＣＤ７０陽性ヒト卵巣がん腫細胞株ＯＶＣＡＲ８を標的細胞源として、刺激されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用して、分析した。アッセイは、実施例８．１に記載の通りに実行した。
【０３０７】
結果を、ｓｃＦｃ形式の代表的な数の抗体構築物に関して表１０に示す。刺激された富化ヒトＣＤ８＋Ｔリンパ球をエフェクター細胞として、ヒトＣＤ７０トランスフェクトＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる５１クロム放出アッセイの結果に従って、本発明のＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物はまた、サブピコモル範囲で天然発現体細胞に対する細胞傷害活性を有する天然発現体標的細胞に対する細胞傷害活性において非常に強力である。
【０３０８】
（表１０）１８時間の５１クロム（５１Ｃｒ）放出細胞傷害性アッセイにおいて、ＣＤ７０陽性ヒト卵巣がん腫細胞株ＯＶＣＡＲ８を標的細胞源として、刺激された富化ヒトＣＤ８Ｔ細胞とエフェクター細胞として用いて分析されたＣＤ７０×ＣＤ３（Ｉ２Ｃ）二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値［ｐＭ］。
2018530996.tif 000036
【０３０９】
実施例８．４
未刺激ヒトＰＢＭＣを用いたＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイ
エフェクター細胞の単離
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、輸血のための血液を収集する血液バンクの副産物である富化リンパ球調製物（バフィーコート）からＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離により調製した。バフィーコートは、地元の血液バンクから供給され、ＰＢＭＣは、血液採取の同日に調製した。Ｆｉｃｏｌｌ密度遠心分離及びダルベッコのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を用いた広範な洗浄の後、残存する赤血球を、ＰＢＭＣから、赤血球溶解緩衝液（１５５ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、１００μＭ  ＥＤＴＡ）とのインキュベーションを介して除去した。血小板は、上清を介して、１００ｘｇでのＰＢＭＣの遠心分離の際に除去した。残存するリンパ球は、主にＢ及びＴリンパ球、ＮＫ細胞及び単球を包含する。ＰＢＭＣは、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を有するＲＰＭＩ培地中（Ｇｉｂｃｏ）中３７℃／５％ＣＯ２で培養し続けた。
【０３１０】
ＣＤ１４＋及びＣＤ５６＋細胞の枯渇
ＣＤ１４＋細胞の枯渇のために、ヒトＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃ，ＭＡＣＳ，＃１３０−０５０−２０１）を使用し、ＮＫ細胞の枯渇のために、ヒトＣＤ５６マイクロビーズ（ＭＡＣＳ，＃１３０−０５０−４０１）を使用した。ＰＢＭＣを計数し、１０分間室温にて３００ｘｇで遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットをＭＡＣＳ単離緩衝液［８０μＬ／１０７細胞；ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃２００１２−０４３）、０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，＃１０２７０−１０６）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，＃Ｅ−６５１１）］に再懸濁した。ＣＤ１４マイクロビーズ及びＣＤ５６マイクロビーズ（２０μＬ／１０７細胞）を加え、１５分間４〜８℃でインキュベートした。細胞を、ＭＡＣＳ単離緩衝液（１〜２ｍＬ／１０７細胞）で洗浄した。遠心分離（上記参照）の後、上清を廃棄し、細胞をＭＡＣＳ単離緩衝液（５００μＬ／１０８細胞）に再懸濁した。次いで、ＣＤ１４／ＣＤ５６陰性細胞を、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，＃１３０−０４２−４０１）を使用して単離した。ＣＤ１４＋／ＣＤ５６＋細胞を伴わないＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ完全培地、すなわち１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，＃Ｓ０１１５）、１×必須でないアミノ酸（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，＃Ｋ０２９３）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，＃Ｌ１６１３）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，＃Ｌ０４７３）及び１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，＃Ａ２２１３）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，＃ＦＧ１２１５）中、３７℃でインキュベーター中にて必要となるまで培養した。
【０３１１】
標的細胞標識
フローサイトメトリーアッセイにおける細胞溶解の分析のために、蛍光性膜色素ＤｉＯＣ１８（ＤｉＯ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、＃Ｖ２２８８６）を使用して、ヒトＣＤ７０またはマカクＣＤ７０トランスフェクトＣＨＯ細胞を標的細胞として標識し、それらをエフェクター細胞から区別した。簡潔には、細胞を回収し、ＰＢＳで一回洗浄し、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び膜色素ＤｉＯ（５μＬ／１０６細胞）を含有するＰＢＳ中１０６細胞／ｍＬに調節した。３分間３７℃でインキュベーションした後、細胞を、完全ＲＰＭＩ培地中で２回洗浄し、細胞数を１．２５×１０５細胞／ｍＬに調節した。０．５％（ｖ／ｖ）等張性エオシンＧ溶液（Ｒｏｔｈ，＃４５３８０）を用いて細胞の活力を決定した。
【０３１２】
フローサイトメトリーに基づく分析
このアッセイは、ＣＤ７０二重特異性抗体構築物の連続希釈の存在下でのｃｙｎｏまたはヒトＣＤ７０トランスフェクトＣＨＯ細胞の溶解を定量するように設計された。等量のＤｉＯ標識標的細胞及びエフェクター細胞（すなわち、ＣＤ１４＋細胞を伴わないＰＢＭＣ）を混合し、１０：１のＥ：Ｔ細胞比率をもたらした。１６０μｌのこの懸濁液を、９６ウェルプレートの各ウェルに移した。４０μＬの連続希釈したＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物及び陰性対照二重特異性（無関係の標的抗原を認識するＣＤ３ベースの二重特異性抗体構築物）またはＲＰＭＩ完全培地を追加の陰性対照として、加えた。二重特異性抗体が媒介する細胞傷害性反応は、４８時間、７％ＣＯ２加湿インキュベーター内で進行させた。次いで、細胞を、新しい９６ウェルプレートに移し、標的細胞膜完全性の喪失を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を１μｇ／ｍＬの最終濃度で加えることによりモニターした。ＰＩは、通常、生存細胞から排除される膜不浸透性色素であるが、死んだ細胞はそれを取り込み、蛍光発光によって同定可能となる。
【０３１３】
試料を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ装置上でフローサイトメトリーにより測定し、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（両方ともＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）により分析した。標的細胞を、ＤｉＯ陽性細胞として同定した。ＰＩ陰性標的細胞を生存標的細胞として分類した。細胞傷害性の割合（％）は、以下の式：
2018530996.tif 000037
に従って計算した。
【０３１４】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェア（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を使用して、細胞傷害性の割合（％）を、対応する二重特異性抗体構築物濃度に対してプロットした。用量反応曲線を、固定されたヒルスロープを有するシグモイド用量反応曲線の評価のために４つのパラメトリックなロジスティック回帰分析モデルで分析し、ＥＣ５０値を算出した。
【０３１５】
実施例８．５
未刺激ヒトＰＢＭＣをヒトＣＤ７０トランスフェクトＣＨＯ細胞に再指向する効力
ＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性を、ＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイにおいて、ヒトＣＤ７０でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞として、未刺激ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用して、分析した。アッセイは、上の実施例８．４に記載の通りに実行した。さらなる手法では、可溶性ＣＤ２７を、可溶性形態のＣＤ２７の存在が、検査される抗体構築物の細胞傷害活性を損ない得るかどうかを確認するために、１ｎｇ／ｍｌの濃度にて加えた。
【０３１６】
ＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイの結果を、ｓｃＦｃ形式の代表的な数の抗体構築物に関して表１１に示し、未刺激ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞とし、ヒトＣＤ７０トランスフェクトＣＨＯ細胞を標的とする。ＥＣ５０値は、ＣＤ２７の存在により有意には影響されなかった。構築物ＣＤ７０−２１Ｄ＿ＣＣｘＩ２Ｃ−ｓｃＦｃに関する結果を示す図６も参照されたい。
【０３１７】
（表１１）４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイにおいて、未刺激ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、ヒトＣＤ７０がトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いて測定されたＣＤ７０×ＣＤ３（Ｉ２Ｃ）二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値［ｐＭ］。
2018530996.tif 000038
【０３１８】
予想したように、ＥＣ５０値は、刺激されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を使用する細胞傷害性アッセイと比較して、未刺激ＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いた細胞傷害性アッセイにおいて、全体的に高かった（実施例８．２を参照されたい）。
【０３１９】
実施例８．６
未刺激ヒトＰＢＭＣをＣＤ７０陽性ヒト卵巣がん腫細胞株に対して再指向する効力
ＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性を、ＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイにおいて、ＣＤ７０陽性ヒト卵巣がん腫細胞株ＯＶＣＡＲ８を標的細胞源として、未刺激ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用して、さらに分析した。アッセイは、上の実施例８．４に記載の通りに実行した。結果を、ｓｃＦｃ形式の代表的な数の抗体構築物に関して表１２に示す。
【０３２０】
（表１２）４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイにおいて、未刺激ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、ヒト細胞株ＳＨＰ−７７を標的細胞源として用いて測定されたＣＤ７０×ＣＤ３（Ｉ２Ｃ）二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値［ｐＭ］。
2018530996.tif 000039
【０３２１】
実施例８．７
マカクＴ細胞をマカクＣＤ７０発現ＣＨＯ細胞に対して再指向する効力
最後に、ＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性を、ＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイにおいて、マカク（ｃｙｎｏ）ＣＤ７０がトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞として、マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘ（Ｋｎａｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ９５：３２５６−６１（２０００））をエフェクター細胞源として使用して、分析した。マカクＣＤ７０トランスフェクトＣＨＯ細胞の標的細胞標識及び細胞傷害活性のフローサイトメトリーに基づく分析を、上記のように行った。
【０３２２】
結果を、ｓｃＦｃ形式の代表的な数の抗体構築物に関して表１３に示す。細胞株４１１９ＬｎＰｘ由来のマカクＴ細胞を誘導して、マカクＣＤ７０トランスフェクトＣＨＯ細胞を本発明に従うＣＤ７０×ＣＤ３（Ｉ２Ｃ）二重特異性抗体構築物により効果的に殺傷した。抗体構築物は、このアッセイにおいてサブピコモルのＥＣ５０値を強力に提示し、これらがマカク系において非常に活性であることを確認した。
【０３２３】
（表１３）４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイにおいて、マカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘをエフェクター細胞として、マカクＣＤ７０がトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いて測定されたＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値［ｐＭ］。
2018530996.tif 000040
【０３２４】
実施例９
（ｉ）３回の凍結／解凍サイクル及び（ｉｉ）２５０μｇ／ｍｌでの７日間のインキュベーション後の単量体から二量体への変換率
二重特異性ＣＤ７０×ＣＤ３抗体単量体構築物を、異なるストレス条件に供し、その後、高性能ＳＥＣを行って、二量体抗体構築物へと変換されている初期単量体抗体構築物の割合（％）を決定した。
【０３２５】
（ｉ）２５μｇの単量体抗体構築物を、ジェネリック製剤緩衝液で２５０μｇ／ｍｌの濃度へと調節し、次いで、−８０℃で３０分間凍結し、その後３０分間室温で解凍した。３回の凍結／解凍サイクルの後、二量体含有率を、ＨＰ−ＳＥＣにより決定した。
【０３２６】
（ｉｉ）２５μｇの単量体抗体構築物を、ジェネリック製剤緩衝液で２５０μｇ／ｍｌの濃度へと調節し、その後、３７℃で７日間インキュベーションした。二量体含有率は、ＨＰ−ＳＥＣにより決定した。
【０３２７】
高分解能ＳＥＣカラムＴＳＫ  Ｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷＸＬ（東ソー、東京−日本）を、Ａ９０５オートサンプラーを備えたＡｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ  １０  ＦＰＬＣ（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）に接続した。カラムを平衡化し、１００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４−２００ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４からなるランニングバッファーをｐＨ６．６に調節した。抗体溶液（２５μｇタンパク質）を、平衡化したカラムに適用し、溶出を、０．７５ｍｌ／分の流速で７ＭＰａの最大圧力にて実行した。全実行は、２８０、２５４及び２１０ｎｍ吸光度でモニターされた。分析は、Ａｋｔａ  Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェア実行評価シートにおいて記録された２１０ｎｍシグナルのピーク積分によりなされた。二量体含有率は、二量体ピークの面積を単量体と二量体ピークの総面積で割ることにより算出した。
【０３２８】
結果を、ｓｃＦｃ形式の代表的な数の抗体構築物に関して表１４に示す。本発明のＣＤ７０×ＣＤ３（Ｉ２Ｃ）二重特異性抗体構築物は、３回の凍結／解凍サイクル後に、≦１．５％の二量体割合（％）を提示し（大半の構築物は、≦１．０％の二量体割合（％）を提示する）、３７℃での７日間のインキュベーション後には、≦０．６％の二量体割合（％）を提示した（大半の構築物は、０％の二量体割合（％）を提示する）。
【０３２９】
（表１４）高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）により決定した単量体ＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物対二量体ＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の割合（％）。
2018530996.tif 000041
【０３３０】
実施例１０
熱安定性
抗体凝集温度は、以下のように決定した：２５０μｇ／ｍｌの４０μｌの抗体構築物溶液を、単回使用キュベットへと移し、Ｗｙａｔｔ動的光散乱デバイスＤｙｎａＰｒｏ  Ｎａｎｏｓｔａｒ（Ｗｙａｔｔ）に入れた。試料を、測定された半径を常に取得しながら０．５℃／分の加熱速度で４０℃から７０℃へと加熱した。タンパク質の融解及び凝集を示す半径の増加をＤＬＳデバイスと一緒に送られたソフトウェアパッケージにより使用して、抗体の凝集温度を算出した。
【０３３１】
全ての検査された本発明のＣＤ７０×ＣＤ３（Ｉ２Ｃ）二重特異性抗体構築物は、≧５２．０℃の凝集温度で熱安定性を示した。これは、ｓｃＦｃ形式の代表的な数の抗体構築物に関して以下の表１５に示す。
【０３３２】
（表１５）ＤＬＳ（動的光散乱）により決定したＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の熱安定性
2018530996.tif 000042
【０３３３】
実施例１１
ヒト血漿における２４時間のインキュベーション後の安定性
精製した二重特異性抗体構築物を、１：５の比率でヒト血漿プールにて３７℃で９６時間、２〜２０μｇ／ｍｌの最終濃度でインキュベートした。血漿インキュベーション後、抗体構築物を、５１クロム放出アッセイにおいて、刺激した富化ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞及びヒトＣＤ７０トランスフェクトＣＨＯ細胞と、０．０１〜０．１μｇ／ｍｌの出発濃度で、１０：１のエフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比率を用いて、比較した（実施例８．１に記載の通りのアッセイ）。インキュベートしていない、新鮮に解凍された二重特異性抗体構築物を対照として含んだ。
【０３３４】
結果を、ｓｃＦｃ形式の代表的な数の抗体構築物に関して表１６に示す。大半の検査された抗体構築物は、≦３．０または≦２．５の非常に好ましい血漿安定性（ＥＣ５０血漿／ＥＣ５０対照）を有した。
【０３３５】
（表１６）血漿インキュベーションを伴うまたは伴わないＣＤ７０×ＣＤ３（Ｉ２Ｃ）抗体構築物のＥＣ５０値及び算出した血漿／対照値
2018530996.tif 000043
【０３３６】
実施例１２
２５００μｇ／ｍｌ抗体濃度での濁度
２５０μｇ／ｍｌの濃度の１ｍｌの精製された抗体構築物溶液を、スピン濃縮装置により２５００μｇ／ｍｌまで濃縮した。１６時間５℃で貯蔵した後、抗体溶液の濁度を、ジェネリック製剤緩衝液に対するＯＤ３４０ｎｍ光吸収測定によって決定した。
【０３３７】
結果を、ｓｃＦｃ形式の代表的な数のＣＤ７０×ＣＤ３（Ｉ２Ｃ）抗体構築物に関して表１７に示す。全ての検査された抗体構築物は、≦０．０５の非常に好ましい濁度を有する。
【０３３８】
（表１７）２．５ｍｇ／ｍｌに一晩濃縮した後の抗体構築物の濁度
2018530996.tif 000044
【０３３９】
実施例１３
高分解能カチオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質均質性
本発明の抗体構築物のタンパク質均質性を、高分解能カチオン交換クロマトグラフィーＣＩＥＸにより分析した。
【０３４０】
５０μｇの抗体構築物単量体を、５０ｍｌ結合緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％オクタン酸ナトリウム、ｐＨ５．５）で希釈し、４０ｍｌのこの溶液を、Ａｋｔａ  Ｍｉｃｒｏ  ＦＰＬＣデバイス（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続した１ｍｌ  ＢｉｏＰｒｏ  ＳＰ−Ｆカラム（ＹＭＣ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に適用した。試料結合の後、さらなる結合緩衝液を用いた洗浄工程を実行した。タンパク質溶出については、最大５０％パーセント緩衝液Ｂまでの緩衝液Ｂ（２０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、１０００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％オクタン酸ナトリウム、ｐＨ５．５）を使用した直線的に増加する塩勾配を、１０カラム容量にわたって適用した。全実行は、２８０、２５４及び２１０ｎｍ吸光度でモニターされた。分析は、Ａｋｔａ  Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェア実行評価シートにおいて記録された２８０ｎｍシグナルのピーク積分によりなされた。
【０３４１】
結果を、ｓｃＦｃ形式の代表的な数のＣＤ７０×ＣＤ３（Ｉ２Ｃ）抗体構築物に関して表１８に示す。全ての検査された抗体構築物は、≧６０％の好都合な均質性を有し（主ピークの曲線下面積（＝ＡＵＣ））、１５のうち９の構築物が≧７０％の均質性を有する。
【０３４２】
（表１８）抗体構築物のタンパク質均質性（主ピークのＡＵＣの割合（％））
2018530996.tif 000045
【０３４３】
実施例１４
ＨＩＣブチルにより測定された表面疎水性
本発明の二重特異性抗体構築物の表面疎水性を、フロースルーモードにおいて疎水性相互作用クロマトグラフィーＨＩＣにて検査した。
【０３４４】
５０μｇの抗体構築物単量体を、ジェネリック製剤緩衝液で希釈して、５００μｌの最終容量（１０ｍＭクエン酸、７５ｍＭリジンＨＣｌ、４％トレハロース、ｐＨ７．０）とし、Ａｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ  ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続した１ｍｌブチルセファロースＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に適用した。全実行は、２８０、２５４及び２１０ｎｍ吸光度でモニターされた。分析は、Ａｋｔａ  Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェア実行評価シートにおいて記録された２８０ｎｍシグナルのピーク積分によりなされた。溶出挙動は、タンパク質シグナルの上昇及び低下の面積及び速度を比較することによって評価し、それによって、ＢｉＴＥアルブミン融合体とマトリックスとの相互作用の強さを示した。
【０３４５】
ｓｃＦｃ形式の代表的な数のＣＤ７０×ＣＤ３（Ｉ２Ｃ）抗体構築物を分析し、良好な溶出挙動を有することが示され、これはほとんど迅速及び完全であった。
【０３４６】
実施例１５
二重特異性抗体構築物の単量体アイソフォーム及び二量体アイソフォーム間の効力ギャップ
個々のＣＤ７０×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の単量体アイソフォーム及び二量体アイソフォーム間の細胞傷害活性における差異（効力ギャップと称する）を決定するために、１８時間の５１クロム放出細胞傷害性アッセイを、精製された二重特異性抗体構築物単量体及び二量体を用いて本明細書上記（実施例８．１）のように実行した。エフェクター細胞は、刺激された富化ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞とした。標的細胞は、ｈｕ  ＣＤ７０トランスフェクトＣＨＯ細胞とした。エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比率は、１０：１とした。効力ギャップは、ＥＣ５０値間の比率として算出した。
【０３４７】
結果を、ｓｃＦｃ形式の代表的な数の抗体構築物に関して表１９に示す。検査されたＣＤ７０×ＣＤ３（Ｉ２Ｃ）二重特異性抗体構築物の効力ギャップは、０．０から１．５の間であった。従って、そのそれぞれの単量体と比較して実質的により活性な二量体はない。
【０３４８】
（表１９）単量体アイソフォーム及び二量体アイソフォーム間の効力ギャップ
2018530996.tif 000046
【０３４９】
実施例１６
ＣＤ２７は、抗ＣＤ７０  ｓｃＦｖ分子の結合を阻害しない
このアッセイは、可溶性形態のＣＤ２７（ヒト血清中の１３６〜４５８ｐｇ／ｍｌ可溶性ＣＤ２７；Ｈｕａｎｇ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９０：１−９）が、本発明に従う抗ＣＤ７０結合ドメインのＣＤ７０への結合を損ない得るかどうかを検査するために実行した。
【０３５０】
ヒトＣＤ７０がトランスフェクトされたＣＨＯ細胞へのヒトＣＤ２７の結合を検証するために、細胞を、ヒトＣＤ２７と３０分間にわたって４℃でインキュベートした（１μｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  ＃３８２−ＣＤ−１００）。結合したＣＤ２７は、抗ＨＩＳ抗体（５μｇ／ｍｌ；ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）、その後、抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ−ガンマ−ＰＥ（１：１００；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃１１５−１１６−０７１）で検出した。陰性対照として、細胞を、ＣＤ２７の代わりにＰＢＳ／２％ＦＣＳでインキュベートした。
【０３５１】
ＣＤ２７による抗ＣＤ７０  ｓｃＦｖの置き換えを検査するために、ヒトＣＤ７０がトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、ＣＤ２７とまたはＣＤ２７無しで３０分間にわたって４℃でインキュベートした（１μｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  ＃３８２−ＣＤ−１００）。その後、細胞を２回洗浄し、次いで、ＣＤ７０に結合するｓｃＦｖを含有する粗製の、未希釈ペリプラズム抽出物で染色した。結合したｓｃＦｖは、マウスモノクローナル抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（１μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ  Ｆ１８０４）、その後抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ−ガンマ−ＰＥ（１：１００；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃１１５−１１６−０７１）で検出した。陰性対照として、細胞を、抗ＣＤ７０  ｓｃＦｖの代わりに非特異的ｓｃＦｖとインキュベートした。ＣＤ２７及び全ての抗体は、２％ＦＣＳを有するＰＢＳに希釈した。
【０３５２】
分析された本発明のＣＤ７０結合因子のいずれについても可溶性ＣＤ２７及び抗ＣＤ７０  ｓｃＦｖ間での競合は、観察されなかった。
【０３５３】
（表２０）配列表
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ｂ−１】
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【図４Ｂ−２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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