(57)【要約】  本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍を診断または処置するための手段および方法を提供する。悪性Ｂ細胞上のＢ細胞受容体のリバースターゲティングのための新規なコンジュゲートを提供する。コンジュゲートはＢＣＲ抗原および診断剤または治療剤を含む。本発明のＢＣＲ抗原コンジュゲートでの処置に好適に応答する素因がある患者を同定するための方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者におけるＢ細胞悪性腫瘍の診断法および／または処置法における使用のための診断剤および／または治療剤へとコンジュゲートさせたＢ細胞受容体（ＢＣＲ）抗原。
【請求項２】
Ｂ細胞悪性腫瘍が、ＢＣＲを発現するクローン性の悪性Ｂ細胞の存在を特徴とする、請求項１に記載の使用のためのコンジュゲートＢＣＲ抗原。
【請求項３】
前記クローン性の悪性Ｂ細胞が、細胞表面において、機能的なＢＣＲを発現する、請求項１から２のいずれかに記載の使用のためのコンジュゲートＢＣＲ抗原。
【請求項４】
Ｂ細胞悪性腫瘍が、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、脾辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、バーキットリンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫（ＰＣＮＳＬ）、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫（ＮＬＰＨＬ）、ヘアリーセル白血病、脾臓リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織の節外性辺縁帯リンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫）、節性辺縁帯リンパ腫、小児節性辺縁帯リンパ腫、原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、原発性縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、または原発性滲出性リンパ腫から選択される、請求項１から３のいずれかに記載の使用のためのコンジュゲートＢＣＲ抗原。
【請求項５】
ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、または多糖を含む、請求項１から４のいずれかに記載の使用のためのコンジュゲートＢＣＲ抗原。
【請求項６】
自己抗原、外因性抗原、同種抗原、または異種抗原から選択される、請求項１から５のいずれかに記載の使用のためのコンジュゲートＢＣＲ抗原。
【請求項７】
翻訳後修飾されているか、または修飾されていない、請求項６に記載の使用のためのコンジュゲートＢＣＲ抗原。
【請求項８】
クローン性の悪性Ｂ細胞のＢＣＲにより認識される、少なくとも１つのエピトープを含む、請求項１から７のいずれかに記載の使用のためのコンジュゲートＢＣＲ抗原。
【請求項９】
悪性Ｂ細胞のＢＣＲに結合することが可能である、請求項１から８のいずれかに記載の使用のためのコンジュゲートＢＣＲ抗原。
【請求項１０】
悪性Ｂ細胞のＢＣＲに、１０−７Ｍまたはこれ未満、好ましくは１０−８Ｍまたはこれ未満、より好ましくは１０−９Ｍまたはこれ未満の平衡解離定数により、特異的に結合する、請求項１から９のいずれかに記載の使用のためのコンジュゲートＢＣＲ抗原。
【請求項１１】
悪性Ｂ細胞上のＢＣＲに結合した後において、悪性Ｂ細胞により内部化される、請求項１から１０のいずれかに記載の使用のためのコンジュゲートＢＣＲ抗原。
【請求項１２】
患者における悪性Ｂ細胞の数を低減することが可能である、請求項１から１１のいずれかに記載の使用のためのコンジュゲートＢＣＲ抗原。
【請求項１３】
患者における悪性Ｂ細胞の活性化および／または増殖を阻害することが可能である、請求項１から１２のいずれかに記載の使用のためのコンジュゲートＢＣＲ抗原。
【請求項１４】
患者における悪性Ｂ細胞を殺滅することが可能である、請求項１から１３のいずれかに記載の使用のためのコンジュゲートＢＣＲ抗原。
【請求項１５】
前記治療剤が、放射性核種、結合剤、ＣＡＲ  Ｔ細胞、または毒素から選択される、請求項１から１４のいずれかに記載の使用のためのコンジュゲートＢＣＲ抗原。
【請求項１６】
前記結合剤が、免疫エフェクター細胞に結合することが可能である、請求項１５に記載の使用のためのコンジュゲートＢＣＲ抗原。
【請求項１７】
前記結合剤が、ＣＤ３結合剤、ＣＤ１６結合剤、またはＣＤ３８結合剤から選択される、請求項１５または１６に記載の使用のためのコンジュゲートＢＣＲ抗原。
【請求項１８】
前記結合剤が、モノクローナル抗体断片、ポリクローナル抗体断片、単鎖抗体断片、ＳｃＦｖ断片、ミニボディー断片、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ’）２断片から選択される、請求項１５、１６、または１７に記載の使用のためのコンジュゲートＢＣＲ抗原。
【請求項１９】
前記毒素が、エンジイン（enidyene）、デュオカルマイシン、メトトレキサート（methothrexate）、ドキソルビシン、メルファラン、クロランブシル、ＡＲＡ−Ｃ、ビンデシン、マイトマイシンＣ、シスプラチン、エトポシド、ブレオマイシン、ベドチン、エムタンシン、５−フルオロウラシル、またはチロシンキナーゼ阻害剤から選択される、請求項１５に記載の使用のためのコンジュゲートＢＣＲ抗原。
【請求項２０】
診断剤および／または治療剤へとコンジュゲートさせたＢＣＲ抗原の、請求項２から４のいずれかに記載のＢ細胞悪性腫瘍に対する診断法および／または処置法における使用。
【請求項２１】
請求項２から４のいずれかに記載の患者におけるＢ細胞悪性腫瘍を診断または処置するための方法であって、
ｉ．好ましくは請求項１５から１９のいずれかに記載の診断剤または治療剤へとコンジュゲートさせたＢＣＲ抗原を用意することと；
ｉｉ．前記コンジュゲートＢＣＲ抗原を、患者へと投与することと
を含む方法。
【請求項２２】
好ましくは請求項１５から１９のいずれかに記載の治療剤へとコンジュゲートさせたＢＣＲ抗原であって、
ｉ）請求項２から４のいずれかに記載のＢ細胞悪性腫瘍を患う患者における悪性Ｂ細胞のＢＣＲに結合すること
が可能なＢＣＲ抗原。
【請求項２３】
ｉ）ＢＣＲの、コンジュゲートＢＣＲ抗原への結合の後において、内部化されること
がさらに可能である、請求項２２に記載のコンジュゲートＢＣＲ抗原。
【請求項２４】
好ましくは請求項１５から１９のいずれかに記載の治療剤へとコンジュゲートさせたコンジュゲートＢＣＲ抗原と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項２５】
好ましくは請求項２から４のいずれかに記載のＢ細胞悪性腫瘍を患い、請求項２１または２２に記載のコンジュゲートＢＣＲ抗原に好適に応答する素因がある患者を同定するための非侵襲的方法であって、
ｉ）標識されたＢＣＲ抗原を用意することと；
ｉｉ）標識されたＢＣＲ抗原コンジュゲートを、悪性Ｂ細胞を含む各患者の試料へと添加することと；
ｉｉｉ）標識されたＢＣＲ抗原コンジュゲートの、前記悪性Ｂ細胞への結合および／または内部化について評価することと
を含み、
その悪性Ｂ細胞が、標識されたＢＣＲ抗原コンジュゲートに結合し、かつ／またはこれを内部化する患者は、コンジュゲートＢＣＲ抗原による処置に好適に応答する素因があるのに対し、その悪性Ｂ細胞が、標識されたＢＣＲ抗原コンジュゲートに結合せず、かつ／またはこれを内部化しない患者は、そのような素因がない、
非侵襲的方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
Ｂ細胞悪性腫瘍（リンパ節、血液、および／または骨髄における、Ｂ細胞およびそれらの前駆細胞の増殖および発生の異常を特色とする、造血器の悪性疾患）とは、広範に変動する特徴および臨床的挙動を伴う、不均一な障害群であって、米国において、毎年１５，０００人を超える死亡をもたらす障害群を表す。
【背景技術】
【０００２】
各々のＢ細胞悪性腫瘍は、Ｂ細胞性リンパ球産生の異なる段階において生じる、遺伝学的異常および後生遺伝学的異常の帰結である。Ｂリンパ球またはそれらの前駆細胞の悪性の形質転換を特徴とする、リンパ様組織（lymphiod tissue）の悪性新生物である、Ｂ細胞リンパ腫は、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の両方、Ｂ細胞白血病を含むが、造血組織の悪性新生物の群は、Ｂ細胞の増殖および発生の異常を特徴とし、血液および骨髄におけるそれらの前駆細胞は、最も一般的な小児がんに含まれる。Ｂ細胞の発生時における多様な表面マーカーの発現動態は、必要な増殖シグナル、分化シグナル、成熟シグナル、および生存シグナルをもたらす。所与の任意の段階にあるＢ細胞が悪性となると、その細胞表面分子および関連する細胞内シグナル伝達分子、ならびにこの発生段階と関連する過剰発現遺伝子産物の発現パターンは、そのクローン性の悪性派生細胞へと受け渡される。
【０００３】
臨床ケアの進歩にも拘らず、多くの成熟Ｂ細胞悪性腫瘍は、依然として治癒不能である。歴史的に、大半の罹患患者は、永続的な寛解と、場合によって、治癒とを達成することを意図して、放射線療法と組み合わせることが多い、細胞傷害剤の組合せを施された。しかし、多くの従来のレジメンはまた、顕著な急性の毒性および長期にわたる毒性を伴う。急性形態を患うか、または化学療法抵抗性を発症する患者のための最終的な代替法であることが多い幹細胞移植は、致死性の拒絶反応の顕著な危険性を随伴する。近年の治療法は、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）などのモノクローナル抗体、抗体コンジュゲート、およびＢ細胞表面抗原を認識するＣＡＲ  Ｔ細胞に焦点を当てている。多くの患者の生存の改善にも拘らず、長期にわたる寛解は、まれであり、疾患の再発は、依然として大きな問題である。加えて、従来の生物学的治療剤によりターゲティングされる大半の表面抗原は、疾患を表す悪性Ｂ細胞においてもっぱら発現するわけではなく、したがって、同じ表面分子を発現する他の（健常）細胞をターゲティングするので、大規模な（潜在的に致死性の）副作用の危険性を伴う。加えて、多くの標的表面マーカーは、悪性Ｂ細胞において、十分に大きな数で発現するわけではなく、したがって、それらの効果的な枯渇は可能でない。さらに、抗体など、大半の結合性分子は、比較的大型であり、生体内分布およびバイオアベイラビリティーに負の影響を及ぼし、それらの作製も比較的高価である。
【０００４】
したがって、まとめると、有効な処置は、利用可能な治療選択肢の特異性の欠如により損なわれており、しばしば、患者において、重度の副作用を結果としてもたらし、全ての悪性Ｂ細胞を有効に消失させることができない。
【０００５】
ＷＯ２０１０／０８５３４５Ａ１は、治療剤、細胞傷害剤、または診断剤へとカップリングさせた、ヒトリン酸化ｐａｒａｔａｒｇまたはそのエピトープについて、さらに包括的に開示している。ｐａｒａｔａｒｇ（ストマチン様タンパク質２）は、血液における、顕著に高レベルのパラプロテインの存在と関連する状態である、意義不明の単クローン性免疫グロブリン異常症（ＭＧＵＳ）を患う患者において分泌されるパラプロテイン（すなわち、最終的に分化した形質細胞の、異常なクローン性増殖により過剰に産生される、異常な免疫グロブリン断片）により認識される一般的な抗原性標的として同定されている。しかし、前記患者の血液において、非機能的なｐａｒａｔａｒｇ「スカベンジャー」として作用する、過剰なパラプロテインを考慮すると、この手法は、２つの理由で、患者において実施可能となる可能性が極めて低い：第１に、ＭＧＵＳにおける悪性細胞は、形質細胞であり、形質細胞は、それらの表面において、Ｂ細胞受容体を保有しない。したがって、この疾患においては、ＢＣＲは、悪性細胞をターゲティングすることができず、むしろ、分泌される「デコイ」のパラプロテインがこれらに結合し、パラプロテインを産生する悪性形質細胞に到達せずにパラプロテインに捕捉されるであろう。第２に、ＭＧＵＳおよびＭＭのいずれも、グロブリンの形態にある高量の可溶性ＢＣＲ、すなわち、パラプロテインが分泌され、それぞれの患者の血清に存在するという事実を特徴とする。組換えＢＣＲ抗原（すなわち、ｐａｒａｔａｒｇ）の全身への適用は、免疫複合体疾患の危険性が高い、免疫複合体の形成を結果としてもたらすであろう。毒素コンジュゲートＢＣＲ抗原の使用は、多様な器官の内皮細胞における、毒性免疫複合体の沈着を結果としてもたらすことから、これらの器官の顕著な損傷および推定される壊死、例えば、免疫複合体性腎炎、免疫複合体血管炎、および他の免疫複合体介在性炎症反応を引き起こすであろう。したがって、ＷＯ２０１０／０８５３４５Ａ１から、非機能的な分泌パラプロテインではなく、表面発現ＢＣＲをターゲティングする抗原コンジュゲートであれば、本明細書において記載されるＢ細胞悪性腫瘍、すなわち、機能的な表面ＢＣＲを発現し、好ましくは、免疫グロブリン異常症（血液における過剰量のパラプロテイン）と関連しない悪性Ｂ細胞を特徴とするＢ細胞悪性腫瘍を処置することために有用であることが明確に予見されうるであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の観点において、当技術分野においては、Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するための、新規の改善された治療剤であって、特異的であり、安全であり、かつ、有効な治療剤を提供することが火急に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、患者におけるＢ細胞悪性腫瘍の診断法および／または処置法における使用が意図される診断剤および／または治療剤へとコンジュゲートさせたＢ細胞受容体（ＢＣＲ）抗原に関する。Ｂ細胞悪性腫瘍は、悪性Ｂ細胞、特に、ＢＣＲを発現するクローン性の悪性Ｂ細胞、特に、細胞表面上で発現する機能的なＢＣＲの存在を特徴とすることが想定される。
【０００８】
コンジュゲートＢＣＲ抗原は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、脾辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、バーキットリンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫（ＰＣＮＳＬ）、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫（ＮＬＰＨＬ）、ヘアリーセル白血病、脾臓リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織の節外性辺縁帯リンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫）、節性辺縁帯リンパ腫、小児節性辺縁帯リンパ腫、原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、原発性縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、または原発性滲出性リンパ腫を含む様々なＢ細胞悪性腫瘍を処置するために使用することができる。
【０００９】
ＢＣＲ抗原は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、または多糖を含みうる。ＢＣＲ抗原は、自己抗原、外因性抗原、同種抗原、または異種抗原から選択することができる。ＢＣＲは、翻訳後修飾されている場合もあり、修飾されていない場合もある。
【００１０】
患者における悪性Ｂ細胞のＢＣＲは、コンジュゲートＢＣＲ抗原を認識し、かつ／またはコンジュゲートＢＣＲ抗原は、特に、それらのＢＣＲを介して、前記Ｂ細胞に結合することが可能であることが想定される。コンジュゲートＢＣＲ抗原はまた、それらのＢＣＲに結合した後で、悪性Ｂ細胞により内部化されることも可能である。さらに、本発明のコンジュゲートＢＣＲ抗原は、患者における、ＢＣＲを発現する悪性Ｂ細胞の数を低減することが可能であることも想定される。
【００１１】
コンジュゲートＢＣＲ抗原は、以下の有利な効果：悪性Ｂ細胞の数を低減し、悪性Ｂ細胞の活性化および／もしくは増殖を阻害し、かつ／または悪性Ｂ細胞を殺滅する効果のうちの１または複数を誘発することが可能であることが想定される。
【００１２】
ＢＣＲ抗原へとコンジュゲートさせた治療剤は、放射性核種、結合剤、ＣＡＲ  Ｔ細胞、または毒素から選択することができる。適切な毒素は、化学的毒素、化学療法剤、およびタンパク質毒素を含む。結合剤は特に、免疫エフェクター細胞、例えば、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、（細胞傷害性）Ｔ細胞、または好中球に結合することが可能でありうる。特に、本発明のＢＣＲコンジュゲートにおける使用に適する結合剤は、ＣＤ３結合剤、ＣＤ１６結合剤、またはＣＤ３８結合剤を含む。本明細書において記載される結合剤は、モノクローナル抗体断片、ポリクローナル抗体断片、単鎖抗体断片、ＳｃＦｖ断片、ミニボディー断片、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ’）２断片から選択することができる。
【００１３】
本発明のＢＣＲ抗原コンジュゲート中の治療剤として有用な化学療法剤は、エンジイン（enidyene）、デュオカルマイシン、メトトレキサート（methothrexate）、ドキソルビシン、メルファラン、クロランブシル、ＡＲＡ−Ｃ、ビンデシン、マイトマイシンＣ、シスプラチン、エトポシド、ブレオマイシン、ベドチン、エムタンシン、５−フルオロウラシル、またはチロシンキナーゼ阻害剤などの細胞増殖抑制剤を含む。
【００１４】
本明細書においてはまた、診断剤および／または治療剤へとコンジュゲートさせたＢＣＲ抗原の、本明細書において規定されるＢ細胞悪性腫瘍に対する診断法および／または処置法における使用も提供される。
【００１５】
さらに、本発明は、本明細書において規定される患者におけるＢ細胞悪性腫瘍を診断または処置するための方法であって、
（ｉ）好ましくは本明細書において規定される診断剤または治療剤へとコンジュゲートさせたＢＣＲ抗原を用意することと；
（ｉｉ）前記コンジュゲートＢＣＲ抗原を、患者へと投与することと
を含む方法に関する。
【００１６】
本発明はまた、好ましくは本明細書において規定される治療剤へとコンジュゲートさせたＢＣＲ抗原であって、本明細書において規定されるＢ細胞悪性腫瘍を患う患者における悪性Ｂ細胞のＢＣＲに結合することが可能であり、ＢＣＲの、コンジュゲートＢＣＲ抗原への結合の後において、内部化されることがさらに可能でありうるＢＣＲ抗原も提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、本明細書において規定されるコンジュゲートＢＣＲ抗原と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物も提供する。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、本明細書において規定されるＢ細胞悪性腫瘍を患い、本発明のコンジュゲートＢＣＲ抗原に好適に応答する素因がある患者を同定するための非侵襲的方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＡＲＳ２に対する特異性を伴うＢＣＲを保有するＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ細胞株であるＯＣＩ−Ｌｙ３によるＡＲＳ２への結合およびＡＲＳ２の内部化の裏付け。Ａ：細胞の調製；Ｂ〜Ｄ：ｔ＝０におけるフローサイトメトリー；Ｅ〜Ｇ：インキュベーションの１時間後（ｔ＝１）におけるフローサイトメトリー。
【図２】毒素コンジュゲートＢＡＲによる、ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬリンパ腫細胞の増殖の阻害。組換えＡＲＳ２／シュードモナス外毒素コンジュゲート（ＡＲＳ−ＥＴＡ）は、ＡＲＳ２に特異的なＢＣＲを伴うＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ細胞株に由来する細胞（Ｕ２９３２、ＯＣＩ−ＬＹ３）を特異的に殺滅するが、ＡＲＳ２以外に対するＢＣＲ特異性を伴うＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ細胞（ＨＢＬ−１、ＴＭＤ８）には影響を及ぼさない。対照の、ニューラビン１（原発性ＣＳＮリンパ腫３例中２例の抗原性標的）に対するＢＡＲ／毒素コンジュゲートである、ＮＲＢ１−ＥＴＡは、細胞株のうちのいずれに対しても毒性を及ぼさない。
【図３】インビトロ（in vitro）における、シュードモナス（Pseudomonas）属外毒素をコンジュゲートさせたＡＲＳ２による、ＯＣＹ−Ｌ３細胞の、ＢＣＲ特異的な殺滅。ＡＲＳ２毒素だけが、ＡＲＳ２に特異的なＢＣＲを有するＯＣＹ−Ｌ３を殺滅し；対照として、シュードモナス外毒素をコンジュゲートさせたニューラビン（ＣＳＮリンパ腫３例中２例に由来するＢＣＲに特異的な抗原）は、ＯＣＹ−Ｌ３細胞に影響を及ぼさずに放置する。
【図４】インビボ（in vivo）における、組換えシュードモナス外毒素コンジュゲートＡＲＳ２の、ＡＲＳ２に特異的なＢＣＲを伴うＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ細胞株（ＯＣＩ−Ｌｙ３）に対して特異的な細胞傷害作用。９日目に、５×１０６個のＯＣＩ−Ｌｙ３細胞を、ＳＣＩＤ  ｂｅｉｇｅマウスの脇腹へと注射した。６日目において、マウスに、１５μｇの毒素コンジュゲートＡＲＳ２または毒素コンジュゲートニューラビンの単回静脈内注射を施した。緑曲線は、ＡＲＳ２毒素を施される３匹のマウスの腫瘍容量（±ＳＥＭ）を表し、赤曲線は、対照毒素［シュードモナス外毒素をコンジュゲートさせたニューラビン（原発性ＣＳＮリンパ腫のうちの３分の２におけるＢＣＲ抗原）］を施される３匹のマウスの腫瘍容量（±ＳＥＭ）を表す。
【図５】二特異性ＣＤ３−ＡＲＳ２コンストラクトの、ＤＬＢＣＬ細胞株への結合。Ａ：Ｕ２９３２（ＡＲＳ２反応性）、Ｂ：ＨＢＬ−１（ＡＲＳ２反応性ではない）、Ｃ：ＯＣＩ−Ｌｙ３（ＡＲＳ２反応性）。色コード：赤＝リンパ腫細胞＋ＰＢＳ；黒＝リンパ腫細胞＋ＡＲＳ２；緑＝リンパ腫細胞＋ＡＲＳ２ＣＤ３。コンストラクトは特異的かつもっぱら、ＡＲＳ２に対する特異性を伴うＢＣＲを発現する細胞株に結合する。
【図６】ＣＤ３−ＡＲＳ２の、末梢血単球（ＰＢＭＣ）への結合。Ａ：健常対照のＰＢＭＣへの結合。結果は、ＣＤ３−ＡＲＳコンストラクトが、健常ドナーの末梢血中の、ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞に結合することを示す。Ｂ：ＣＤ４−ＦＩＴＣおよびＣＤ３−ＡＲＳによる二重染色（ＡＰＣ）。Ｃ：ＣＤ８−ＦＩＴＣおよびＣＤ３−ＡＲＳによる二重染色（ＡＰＣ）。
【図７】末梢血単球（Ｔ細胞）の、異なるびまん性大細胞型Ｂ細胞株に対する、ＣＤ３−ＡＲＳ−２を媒介する細胞傷害作用。ＡＲＳ−２に対する特異性を伴うＢＣＲを発現する細胞株（ＯＣＩＬｙ３、Ｕ２９３２）に対する細胞傷害性効果だけが観察される。Ａ〜Ｃ：異なるリンパ腫細胞株およびＰＢＭＣを、異なる濃度のＣＤ３−ＡＲＳ２と共にインキュベートした。製造元の指示書に従い、ＬＤＨ放出を決定することにより、細胞傷害作用を評価した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書において、本発明者らは、それらのＢ細胞受容体（ＢＣＲ）に対する毒性ベイトを使用して、Ｂ細胞悪性腫瘍内の新生物性Ｂ細胞をターゲティングする新規の手法を提供する。当然ながら、正常（および悪性）Ｂ細胞の表面上のＢＣＲの主要な機能は、その特異的抗原を認識し、これに結合することである。抗原の結合後、Ｂ細胞受容体／抗原複合体は、迅速に内部化される。抗原は、プロセシングされ、その断片は、抗原提示細胞としてのＢ細胞の表面上のＭＨＣ複合体の文脈で、Ｔ細胞へと提示される。
【００２１】
ＢＣＲへの結合の後、ＢＣＲ抗原は、Ｂ細胞を刺激し、増殖を誘導する。そのＢＣＲを介する、Ｂ細胞の慢性抗原性刺激は、Ｂ細胞リンパ腫の発生に関与する機構として提起されており、それらの発生の早期において、Ｂ細胞リンパ腫は、生存のために、抗原に依存する。本発明者らは、ＢＣＲ抗原の、ＢＣＲへの結合は、ＢＣＲ／抗原複合体の迅速な内部化（「摂食」）を結果としてもたらすので、ＢＣＲ抗原は、リンパ腫細胞を殺滅しうる薬剤へとカップリングさせると、致死性のベイトとして使用しうると想定した。実際、本発明者らは、毒素コンジュゲートＢＣＲ抗原は、インビトロにおいて、ターゲティングされたＢ細胞を阻害するかまたは殺滅することが可能であり、ＳＣＩＤマウスにおける、ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ細胞の腫瘍サイズの顕著な減少により裏付けられる通り、インビボにおいてもなおそうであることを見出した。当技術分野においては、Ｂ細胞の、その特異的抗原との遭遇が、Ｂ細胞の活性化および増殖を結果としてもたらすことが周知であるので、これらの知見は明らかに、驚くべきものであった。したがって、コンジュゲートＢＣＲ抗原が、実際に逆に作用し、悪性Ｂ細胞を阻害するか、なおまたはこれらを殺滅することが可能であると予見することはできなかった。この原理はまた、少数のＢＣＲ抗原しか、現在のところ、もっぱらＢ細胞リンパ腫の病因および発症機序への探求の結果として分子的に解明されていないために新規でもある。現在のところ、ＢＣＲ抗原を、Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するための治療剤として使用することは、示唆されていない。ＢＣＲ抗原を体系的に探索する中で、本発明者らは、様々なＢ細胞悪性腫瘍において優勢のＢＣＲ抗原を、先駆的に同定した。Ｂ細胞悪性腫瘍のこれらの種類の全てについて、ＢＣＲ抗原コンジュゲートは、新規の治療選択肢を表し、満たされていない医学的必要を満たす可能性がある。
【００２２】
ＢＣＲは、リンパ腫細胞の表面において夥多（全てのＢ細胞リンパ腫に対する、標準的な第一選択処置の一部である、モノクローナル抗体であるリツキシマブの標的であるＣＤ２０分子の、およそ１０倍の頻度）であるため、Ｂ細胞リンパ腫細胞は、特異的コンジュゲートさせたＢＣＲ抗原に対する感受性が高い。さらに、ＢＣＲ抗原は、個々のリンパ腫細胞に特異的であり、体内の他の任意のＢ細胞または他の任意の細胞においては見出されないため、このような処置は、高度で究極的な特異性を有する。したがって、本明細書において提供されるＢＣＲ抗原コンジュゲートは、悪性細胞だけをターゲティングし、体内の他の全ての細胞は放置するため、固有の特異性を有する。
【００２３】
これは、コンジュゲートＢＣＲ抗原を、ＣＡＲ−Ｔ細胞の部分または二特異性コンストラクトとして使用する場合に、特に重要となるはずである。ＣＡＲ  Ｔ細胞およびブリナツモマブなどの二特異性抗体は、強力な治療戦略であるが、おそらく、正常な交差反応性細胞による非特異的活性化のために、極めて毒性である。
【００２４】
別の利点として、ＢＣＲ結合性エピトープは、少数の分子、例えば、１０〜２０アミノ酸にわたるペプチドだけからなり、これにより、作製費用を低額に保つ。コンジュゲートの潜在的な小サイズのために、コンジュゲートは、薬理学的修飾（例えば、血液脳関門の透過のための）に関して、大きな柔軟性および様々な機会をもたらす。
【００２５】
本明細書において提示される手法は、広範に使用されている抗体戦略を逆向きにしたものであるため、「リバースターゲティングのためのＢ細胞受容体抗原」の頭字語である「ＢＡＲ」ともまた称し、抗体戦略では抗体が悪性細胞における抗原に結合するのに対し、ＢＡＲは、Ｂ細胞リンパ腫細胞の表面におけるＢＣＲに結合する抗原である。抗体のアフィニティーは、突然変異により増大しうるので、突然変異はまた、ＢＡＲの、それらのＢＣＲに対するアフィニティーも増大させうることが予測される。
【００２６】
ＢＣＲ抗原コンジュゲートに予測される低毒性および高有効性により、本明細書において提示される手法は最終的に、Ｂ細胞リンパ腫の大半のための、標準的な第一選択処置であって、Ｒ−ＣＨＯＰ（組合せ化学療法およびリツキシマブ）からなる第一選択処置の一部となることが仮定される。ＢＣＲ抗原コンジュゲートの、標準的なＲ−ＣＨＯＰへの付加は、実施可能なはずであるが、治癒率が１００％に近い患者（例えば、好都合なＤＬＢＣＬを伴う若齢患者）の亜集団であって、毒性が問題となる亜集団においてはまた、Ｒ−ＣＨＯＰの組合せの構成要素の代替（最も可能性が高い候補：ビンクリスチン）も想定することができる。
【００２７】
したがって、本発明は、患者におけるＢ細胞悪性腫瘍の診断法および／または処置法において使用される診断剤および／または治療剤へとコンジュゲートさせたＢ細胞受容体（ＢＣＲ）抗原を提供する。
【００２８】
ＢＣＲ抗原コンジュゲート
本明細書においては、「診断剤および／または治療剤へとコンジュゲートさせたＢ細胞受容体抗原」はまた、「コンジュゲートＢＣＲ抗原」、「ＢＣＲ抗原コンジュゲート」、「ＢＡＲ」、または「コンジュゲート」とも略記され、治療剤および／または診断剤へとコンジュゲートさせた抗原、すなわち、治療剤および／または診断剤へと連結された抗原について示し、好ましくは、患者において存在する、悪性Ｂ細胞のＢＣＲにより認識される抗原について示す。本発明のコンジュゲートはまた、「抗原性部分」または「抗原性標的」、すなわち、ＢＣＲ抗原と、「治療／診断部分」、すなわち、治療剤または診断剤とを含むともいう。「抗原」という用語は、ＢＣＲなど、選択的結合剤が結合することが可能な分子、または分子の部分を指す。抗原は、１または複数のエピトープを有しうる。その全ての文法的形態における、「コンジュゲートさせた」という用語は、抗原と、薬剤とが、以下：１または複数の共有結合、１または複数のイオン性結合、１または複数の恒久性双極子結合、１または複数の一過性双極子結合［誘導性双極子結合（ファンデルワールス結合）］のうちの１または複数により、互いと連結されているか、または結合していることを意味する。本明細書においては、「〜へとカップリングさせた」、「〜へと連結された」、「〜へとコンジュゲートさせた」という用語を、互換的に使用する。特に、ＢＣＲ抗原コンジュゲートは、Ｂ細胞悪性腫瘍を患う患者において存在する悪性Ｂ細胞のＢＣＲに結合することが可能であると想定されている。意図される作用方式に依存して、例えば、毒素へとカップリングさせる場合、ＢＣＲ抗原コンジュゲートは、悪性Ｂ細胞に内部化され、好ましくは、悪性Ｂ細胞を殺滅するために、毒素を放出する。しかし、例えば、結合剤である、ＣＡＲ  Ｔ細胞または診断剤へとカップリングさせる場合、ＢＣＲ抗原コンジュゲートが、悪性Ｂ細胞のＢＣＲに結合し、これにより、悪性細胞の検出（例えば、診断剤を、ＢＣＲ抗原へとコンジュゲートさせる場合）、または悪性細胞の殺滅（例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、または好中球を含むがこれらに限定されない細胞傷害性エフェクター細胞に結合し、これらを活性化させることが可能なＣＡＲ  Ｔ細胞または抗体を、ＢＣＲ抗原へとコンジュゲートさせる場合）が可能となるように、悪性細胞と、治療剤または診断剤とを近接させれば十分な場合もある。
【００２９】
Ｂ細胞およびＢＣＲ
その最も広義における「Ｂ細胞」または「Ｂリンパ球」という用語は、前駆Ｂ細胞、未成熟Ｂ細胞、成熟ナイーブＢ細胞、成熟活性化Ｂ細胞、メモリーＢ細胞、Ｂ系統リンパ球、または他の任意のＢ系統細胞を含む。当業者は、［「毒性ベイト」（すなわち、ＢＣＲ抗原コンジュゲート）を、患者において存在する悪性Ｂ細胞のＢＣＲへとターゲティングすることが、本発明の根底をなす原理であるので］悪性Ｂ細胞が、好ましくは、本発明のＢＣＲ抗原コンジュゲートを認識すること、すなわち、これに結合することが可能なＢＣＲ、好ましくは、細胞表面の機能的なＢＣＲを、好ましくは発現することをたやすく理解するであろう。すなわち、本発明の文脈において、「Ｂ細胞」という用語は、形質細胞、すなわち、Ｂ細胞系統の最終分化細胞であって、抗体を高率で分泌し、それらの表面における、（機能的な）Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の発現を欠くことが公知である形質細胞を好ましくは除外することが想定される。Ｂ細胞はさらに、フローサイトメトリーにより識別可能な、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ７９、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、またはＩｇＡを含む特異的細胞表面マーカーの発現も特徴としうる。
【００３０】
「Ｂ細胞受容体」または「ＢＣＲ」とは、Ｂ細胞がもっぱら発現する膜貫通受容体タンパク質複合体であり、クローン的に可変性の抗原結合性部分（免疫グロブリンの重鎖および軽鎖）であって、ジスルフィド架橋により一体に結合した、Ｉｇ−α／Ｉｇ−β（ＣＤ７９）と呼ばれるヘテロ二量体と関連する抗原結合性部分を含む。二量体の各メンバーは、細胞膜にわたり、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を保有する細胞質テールを有する。Ｂ細胞受容体複合体の抗原結合性部分は、Ｂ細胞が最終的に産生する分泌抗体抗原特異性と同じ抗原特異性を有する、細胞表面の免疫グロブリンである。したがって、完全Ｂ細胞受容体は、６本鎖の複合体（２本の同一な軽鎖、２本の同一な重鎖、１本のＩｇα、１本のＩｇβ）であると考えられる。理論に束縛されることを望まずに述べると、ＢＣＲは、好ましくは、未成熟Ｂ細胞、ナイーブＢ細胞、および成熟Ｂ細胞が発現するのに対し、形質細胞においては、細胞表面におけるＢ細胞受容体の発現が失われうると考えられる。
【００３１】
Ｂ細胞悪性腫瘍
その最も広義における「Ｂ細胞悪性腫瘍」または「Ｂ細胞新生物」という用語は、Ｂ細胞の悪性腫瘍または新生物、すなわち、任意の段階のＢ細胞に由来する悪性腫瘍または新生物を指す。用語は、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、および骨髄腫を包含する。本発明に従うＢ細胞悪性腫瘍は、悪性Ｂ細胞、好ましくはＢＣＲを発現するクローン性の悪性Ｂ細胞の存在を特徴とする。「悪性」細胞とは一般に、それらの増殖に自己限定されず、隣接組織への浸潤が可能であり、遠隔の組織へと拡散すること（転移すること）が可能でありうる。本明細書において使用される場合の「悪性」とは、「がん性」と同義である。本明細書において使用される場合、「悪性Ｂ細胞」という用語は、当技術分野において公知の規定の方法を使用して確認される通り、アポトーシスを回避し、増殖シグナル自己充足性を提示し、かつ／または抗増殖シグナルに対する非感受性を呈することが可能なＢ細胞を指すことが特に想定される。例えば、アポトーシスの回避は、Elmore S Toxicol Pathol. 2007; 35(4): 495-516において総説されている通り、例えば、カスパーゼ活性を査定することにより決定することができる。本明細書の別の箇所において記載される通り、本発明のＢＣＲ抗原コンジュゲートによる処置が想定されるＢ細胞悪性腫瘍は特に、クローン性の悪性形質細胞、および／または免疫グロブリン異常症と関連しないＢ細胞悪性腫瘍を含む。
【００３２】
「クローン性」Ｂ細胞という用語は、好ましくは単独の前駆細胞後代であり、一般に、これと遺伝子的に同一なＢ細胞の群を指す。「一般に遺伝子的に同一な」とは、クローン性のＢ細胞が、それらを互いから分化させる自発的な突然変異を含みうることを意味する。しかし、クローン性の悪性Ｂ細胞は、同じ抗原特異性を有するＢＣＲ、すなわち、同じ抗原を認識し、したがって、同じＢＣＲ抗原コンジュゲートによりターゲティングされうるＢＣＲを発現することが想定される。
【００３３】
クローン性の悪性Ｂ細胞の存在は、当技術分野において公知の規定の方法を使用して査定することができる。クローン性の悪性Ｂ細胞の存在は通例、リンパ節肥大の外見、または全血算（ＣＢＣ）検査における、ある種類の白血球の増大である、リンパ球増加症の存在によりまず疑われる。さらに、顕微鏡検査および／またはフローサイトメトリーを使用して、患者、通例、Ｂ細胞悪性腫瘍の種類に応じて、血液、骨髄、リンパ節またはリンパ節外組織などから得られた試料中におけるＢリンパ球の異常（すなわち、クローン性の悪性）集団を裏付けることができる。悪性Ｂ細胞は、細胞表面における、非定型的であるが、特徴的な分子パターンであって、蛍光標識を伴う特異的抗体であって、前記マーカー分子を認識する特異的抗体を使用して、フローサイトメトリーにより確認される分子パターンを発現することが多い。クローン性は通例、異常Ｂ細胞の全集団における、相互に排他的な免疫グロブリン（immunglobulin）軽鎖であるカッパ鎖またはラムダ鎖のうちの１つだけの検出により推定することができる。正常Ｂリンパ球は、異なる免疫グロブリン産生細胞の混合せであって、カッパ鎖発現細胞およびラムダ鎖発現細胞の両方の混合物を結果としてもたらす混合せからなる。カッパ鎖を産生するＢ細胞およびラムダ鎖を産生するＢ細胞の正常分布の欠如は、クローン性を裏付ける１つの基盤である。
【００３４】
本発明のコンジュゲートＢＣＲ抗原は、本明細書の別の箇所で説明される通り、それらの表面上で機能的なＢＣＲを発現するクローン性の悪性Ｂ細胞の存在により引き起こされ、これと関連する、様々なＢ細胞悪性腫瘍、好ましくは、Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するために有用であることが想定される。このような悪性腫瘍は、限定なしに述べると、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、脾辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、バーキットリンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫（ＰＣＮＳＬ）、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫（ＮＬＰＨＬ）、ヘアリーセル白血病、脾臓リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織の節外性辺縁帯リンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫）、節性辺縁帯リンパ腫、小児節性辺縁帯リンパ腫、原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、原発性縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、または原発性滲出性リンパ腫を含む。
【００３５】
本発明のコンジュゲートＢＣＲ抗原は、患者において存在する悪性Ｂ細胞のＢＣＲをターゲティングすることが意図されるので、前記コンジュゲートによる処置は、好ましくは、悪性Ｂ細胞、特に、ＢＣＲ、好ましくは、細胞表面の機能的なＢＣＲを発現するクローン性の悪性Ｂ細胞の阻害または殺滅を結果としてもたらすことが理解されるであろう。Ｂ細胞悪性腫瘍病因が複合的であることが典型的であり、一部のＢ細胞悪性腫瘍（例えば、ＭＧＵＳ）は、ＢＣＲを発現する悪性Ｂ細胞（すなわち、抗体産生形質細胞の前駆細胞）の存在を特徴とするだけでなく、また、ＢＣＲを発現しない悪性Ｂ細胞（例えば、抗体産生形質細胞）の存在も特徴とする。理論に束縛されることを望まずに述べると、このような症例においては、ＢＣＲ、特に、細胞表面の機能的なＢＣＲを発現する悪性Ｂ細胞は、本発明のＢＣＲ抗原コンジュゲートによりターゲティングできるが、ＢＣＲ、特に、細胞表面の機能的なＢＣＲを発現しない悪性Ｂ細胞は、ターゲティングできないことが想定される。したがって、本発明のＢＣＲ抗原コンジュゲートによる処置は、患者におけるＢＣＲ、特に、細胞表面の機能的なＢＣＲを発現するＢ細胞の数を低減すると考えられるが、このようなＢＣＲを発現しないＢ細胞を消失させるには、さらなる処置も要求されうる。処置されるＢ細胞悪性腫瘍が、例えば、（機能的な表面）ＢＣＲを発現しない悪性Ｂ細胞の前駆細胞である、（機能的な表面）ＢＣＲを発現する悪性Ｂ細胞の存在を特徴とする場合、本発明のＢＣＲ抗原コンジュゲートによる処置は、前駆細胞を阻害するかまたは殺滅し、これにより、好ましくは、悪性の娘Ｂ細胞の産生源を消失させ、かつ／または患者の再発を防止するために、特に有用でありうることが想定される。したがって、本発明のコンジュゲートはまた、原理的に、寛解時：すなわち、パラプロテインを産生する形質細胞の数が著明に低減され、本発明のコンジュゲートが、分泌される「デコイ」のパラプロテインが結合し、パラプロテインを産生する悪性形質細胞に到達せずにこれらに捕捉される可能性が低い場合のＭＧＵＳ／ＭＭを安定化させるためにも使用しうるであろう。
【００３６】
しかし、本明細書においては特に、それらの表面において機能的なＢＣＲを保有する、クローン性の悪性Ｂ細胞の拡大により引き起こされ、これと関連するが、抗体または抗体断片を分泌する形質Ｂ細胞の拡大により引き起こされ、これと関連する（ＭＭ／ＭＧＵＳの場合のように）のではないＢ細胞悪性腫瘍を処置することが想定されている。これは、コンジュゲートＢＣＲ抗原が、好ましくは、分泌される抗体またはその断片（パラプロテインなど）への結合により「拉致され」、枯渇するのではなく、クローン性の悪性Ｂ細胞における表面発現ＢＣＲが結合することが想定されているためにそうである。処置が特に想定されるＢ細胞悪性腫瘍は、疾患が、クローン性の悪性形質細胞またはそれらの抗体産生前駆体により引き起こされ、これと関連するのではない限りにおいて、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＴＬ）、原発性中枢神経系リンパ腫（ＰＣＮＳＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、濾胞性リンパ腫を含む。すなわち、ＢＣＲ抗原コンジュゲートによる処置が想定される前述の疾患は、免疫グロブリン異常症／（非機能的）グロブリンの過剰産生と関連しないことが好ましい。
【００３７】
本明細書において明示される通り、本発明のコンジュゲートＢＣＲ抗原により処置されるＢ細胞悪性腫瘍は、ＢＣＲ、特に、細胞表面の機能的なＢＣＲを発現するクローン性の悪性Ｂ細胞の存在を特徴とすることが好ましい。ＢＣＲの細胞表面発現は、当技術分野において規定の方法を使用して、例えば、表面グロブリンの定常領域に特異的な標識抗体によるフローサイトメトリーを使用して容易に決定することができる。本明細書において、ＢＣＲは、以下の特性：ｉ）抗原の特異的認識；および、抗原を認識するかまたはこれに結合した後における、ｉｉ）ＢＣＲ−ＢＣＲ抗原コンジュゲート複合体の内部化のうちの１または複数を有する場合に、「機能的」と称する。機能的ＢＣＲは、その特異的抗原性標的への結合の後において、以下の能力：ｉｉｉ）Ｉｇα／βにおける、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化；ｉｖ）下流におけるシグナル伝達構成要素である、Ｓｙｋ、ブルトン型チロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）、および／またはホスホリパーゼＣγ２（ＰＬＣγ２）のリン酸化；ｖ）第２のメッセンジャーである、ＤＡＧおよび／またはＩＰ３の産生；ｖｉ）細胞内貯蔵庫からのＣａ２＋の放出のうちの１または複数をさらに呈しうる。
【００３８】
ＢＣＲ−ＢＣＲ抗原コンジュゲート複合体の内部化は、本明細書の別の箇所において記載されている通り、蛍光顕微鏡法および標識コンジュゲートを使用して視覚化することができる。Ｉｇα／β  ＩＴＡＭ、Ｓｙｋ、Ｂｒｋ、またはＰＬＣγ２のリン酸化は、市販の抗体を使用する免疫沈降および免疫ブロット法など、規定の技法を使用して、たやすく確認される。また、細胞内のＣａ２＋またはＤＡＧの放出を検出するためのキットも市販されている。
【００３９】
したがって、コンジュゲートＢＣＲ抗原は、悪性Ｂ細胞のＢＣＲに結合した後において、悪性Ｂ細胞により内部化されうることが想定される。ＢＣＲ−ＢＣＲ抗原コンジュゲート複合体の内部化（またはエンドサイトーシス）は、当技術分野において公知であり、付属の実施例において明示される規定の方法を使用して評価することができる。内部化は、ＢＣＲ抗原コンジュゲートが、内部化され、好ましくは、細胞内において、ＢＣＲ抗原コンジュゲートから放出されると、その機能（すなわち、悪性Ｂ細胞の阻害または殺滅）を果たしうる毒素を含む場合に、特に重要であると考えられる。
【００４０】
ＢＣＲ抗原
本明細書において詳細に記載される通り、本発明は、「毒性ベイト」、すなわち、前記悪性Ｂ細胞により特異的に認識され、最終的に、前記細胞の阻害または死滅を結果としてもたらすＢＣＲ抗原コンジュゲートを使用して、患者における悪性Ｂ細胞をターゲティングしようとする考えに基づく。一般に、任意の抗原を、それが、悪性Ｂ細胞のＢＣＲに結合すること（すなわち、これにより認識されること）が可能である限りにおいて、本発明のＢＣＲ抗原コンジュゲートの一部として使用することができる。ＢＣＲ抗原の有利な能力（すなわち、悪性Ｂ細胞を阻害するかまたは殺滅する能力）を及ぼすのに、本発明のＢＣＲ抗原コンジュゲートの内部化が要求される場合、抗原は、好ましくは、前記コンジュゲートの内部化を可能とするものとする。患者における悪性Ｂ細胞のＢＣＲにより認識される抗原性標的は、タンパク質アレイを使用して見出すことができる。例えば、Ｂ細胞は、標準的なプロトコールを使用して、試料（例えば、患者の血液、骨髄、リンパ節、またはリンパ節外組織）から得、ＢＣＲのＦａｂ断片をもたらすパパイン消化にかけることができる。その後、（市販の）タンパク質アレイ、例えば、Ｕｎｉｐｅｘ  １およびＵｎｉｐｅｘ  ２（Ｓｏｕｒｃｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、Ｆａｂ断片を、抗原への結合についてスクリーニングすることができる。抗原性標的が見出されるまで、異なるタンパク質アレイにより、Ｆａｂ断片のスクリーニングを繰り返すことができる。Ｂ細胞新生物を患う患者においては、悪性Ｂ細胞が夥多に存在することが典型的であるために、悪性Ｂ細胞の抗原性標的は、結合したＦａｂ断片を、（蛍光）標識二次（抗Ｆａｂ）抗体により検出することを介して、容易に同定することができる。興味深いことに、悪性腫瘍において見出される悪性Ｂ細胞のＢＣＲにより認識されうる抗原Ｂ細胞の数は、理論的には、膨大な数に上るにも拘らず、本発明者らは、様々なＢ細胞新生物について、優勢の抗原、すなわち、同じＢ細胞悪性腫瘍を患う多数の患者において共有される抗原性標的が存在することを見出した。
【００４１】
本発明者らが見出した、例示的な優勢の抗原を、表１に明示する。
【００４２】
【表１−１】
2018516996.tif 000002
【表１−２】
2018516996.tif 000003
(＊)サブセットは、ほぼ同様なBCRまたは同一なBCRを伴うCLL患者(「BCR常同性患者」)を指す。
【００４３】
とりわけ、当業者により察知される通り、ＢＣＲ抗原コンジュゲートは、抗原性標的として同定される完全分子（例えば、タンパク質）を必ずしも含まなくてもよく、前記断片が、悪性Ｂ細胞のＢＣＲに結合することが可能である、すなわち、好ましくは、前記ＢＣＲにより認識される１または複数のエピトープを含む限りにおいて、同定される抗原性標的の断片（例えば、ペプチド）だけを含む場合もある。
【００４４】
ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、および多糖を、特に、抗原性標的として、すなわち、本発明のコンジュゲートの抗原性部分として想定する。「ペプチド」という用語が、それらのそれぞれのカルボキシル基と、アミノ基との間の化学結合（すなわち、ペプチド結合）により連結された、２〜１０アミノ酸からなる化合物を指すのに対し、「ポリペプチド」は、１０を超えるアミノ酸からなり、「タンパク質」は、１００を超えるアミノ酸からなる。「ペプチド」という用語は、天然ペプチド（例えば、分解産物または組換えペプチド）ならびにペプトイドおよびセミペプトイドを含むペプチド模倣体（合成により作製されたペプチド）を包含する。同様に、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、それぞれ、天然ポリペプチドまたは天然タンパク質、合成により作製されたポリペプチドまたはタンパク質、および組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質も包含する。
【００４５】
また、例えば、改善された機能性またはさらなる機能性、例えば、免疫原性の低減、流体力学サイズ（溶液中のサイズ）の増大または減少、可溶性および／または安定性および／または血清半減期の延長を含むように変更された、修飾ＢＣＲ抗原を使用することも考えうる。本発明に従う使用のための、例示的な機能的部分は、人体内の他のタンパク質（血清アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域または新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）など）に結合するペプチドドメインまたはタンパク質ドメイン、多様な長さのポリペプチド鎖［例えば、ＸＴＥＮ技術またはＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）］、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、もしくはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーなどの多様なポリオールを含むがこれらに限定されない非タンパク質性ポリマー、またはヒドロキシエチルデンプン［例えば、ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）］もしくはポリシアル酸［例えば、ＰｏｌｙＸｅｎ（登録商標）技術］などの炭水化物のコポリマーを含む。
【００４６】
「脂質」という用語は、トリグリセリド、脂肪酸、中性脂肪、リン脂質、糖脂質、蝋、およびステロイドを含む、脂肪および脂肪様物質を包含する。「多糖」という用語は、３つまたはこれを超える単糖分子から形成された炭水化物ポリマーを指す。反復型の炭水化物エピトープを含む多糖が、多糖抗原性標的として特に適切であることが想定される。
【００４７】
抗原は、内因性抗原、特に、自己抗原の場合もあり、外因性抗原の場合もある。「内因性抗原」は、正常な細胞代謝の一部として、宿主細胞内から産生されるか、または、細胞が、（細胞内の）細菌またはウイルスに感染した場合に、宿主細胞内から産生される。「自己抗原」（自己抗原）は、宿主による免疫応答を惹起することが可能な、宿主の内因性構成要素である。特に、それが、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である場合、前記自己抗原は、翻訳後修飾されている場合もあり、修飾されていない場合もあることが想定される。「翻訳後修飾」とは、リボソームによるその翻訳が完了した後のタンパク質において生じる修飾である。「翻訳後修飾」は、官能基の、タンパク質への（共有結合的）付加を含むが、また、タンパク質が機能的に成熟するのに必要な、タンパク質分解性のプロセシング過程およびフォールディング過程も指す。本発明の文脈において考えうる翻訳後修飾は、限定なしに述べると、リン酸化、パルミトイル化、グリコシル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、メチル化、アセチル化、および脱カルボキシル化またはそれぞれの逆向きの過程［脱リン酸化、脱アセチル化、脱メチル化（de-mythlation）など］を含む。
【００４８】
抗原はまた、外因性抗原、すなわち、例えば、吸入、摂取、または注射を介して、外部から宿主の体内に侵入する抗原でもありうる。外因性抗原は、宿主内において外来であると考えられる粒子を含む。用語はまた、「異種抗原（heterologousantigen）」または「異種抗原（heteroantigen）」、すなわち、宿主に対して外来である種に由来する抗原も含む。例示的な外因性抗原は、アレルゲン（花粉など）または微生物の部分（細菌、ウイルスなどの外被、莢膜、細胞壁、鞭毛、線毛、または毒素など）を含む。
【００４９】
さらに、抗原は、同種抗原、すなわち、同じ種（例えば、ヒト）のメンバーに由来する外来抗原でありうることも想定される。
【００５０】
さらに、本発明のＢＣＲ抗原コンジュゲートの抗原は、クローン性の悪性Ｂ細胞のＢＣＲにより認識される、少なくとも１つのエピトープを含むことも想定される。「エピトープ」という用語は、任意の決定基、特に、ＢＣＲなど、免疫グロブリンへの特異的結合が可能な抗原の領域を含む。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの分子の、化学的に活性の表面基を含み、特異的な三次元構造特徴および／または特異的な電荷特徴を有しうる。とりわけ、ＢＣＲ抗原コンジュゲートは、抗原の断片（すなわち、抗原性断片）であって、好ましくは、悪性Ｂ細胞のＢＣＲにより認識される、１つまたは複数のエピトープを含む断片だけを含みうることが想定される。
【００５１】
免疫学的結合は一般に、例えば、例示を目的とし、限定を目的とせずに述べると、静電相互作用、イオン性相互作用、親水性引力もしくは親水性斥力および／または疎水性引力もしくは疎水性斥力、立体構造力、水素結合、ファンデルワールス力、および他の相互作用の結果として、免疫グロブリン分子（ＢＣＲ内の免疫グロブリン分子）と、免疫グロブリンが特異的である抗原と間において生じる種類の、非共有結合的相互作用を指す。一般に、免疫グロブリン分子などの分子は、それが、代替的な物質より、特定の物質と、より高頻度に、より迅速に、より長い持続時間にわたり、かつ／またはより大きなアフィニティーにより反応または会合する場合、「特異的結合」を呈するという。したがって、本明細書において、ＢＣＲは、それが、分子の複合混合物中の、その標的抗原を優先的に認識する、すなわち、他の物質より、その抗原と、より大きなアフィニティー、アビディティーにより、よりたやすく、かつ／またはより長い持続時間にわたり反応する場合、ＢＣＲ抗原コンジュゲート（または、より具体的には、コンジュゲートの抗原部分）に「特異的に」結合するという。当技術分野においてはまた、このような特異的結合を決定する方法も周知である。
【００５２】
免疫学的結合相互作用の強度またはアフィニティーは、相互作用の解離定数（Ｋｄ）との関係で表すことができ、この場合、小さなＫｄほど、大きなアフィニティーを表す。選択したポリペプチドの免疫学的結合特性は、当技術分野において周知の方法を使用して定量化することができる。１つのこのような方法は、抗原結合性部位／抗原複合体の形成および解離の速度を測定することを伴い、この場合、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用のアフィニティー、いずれの方向においても、速度に同等に影響を及ぼす形状パラメータに依存する。したがって、「結合速度（on rate）定数」（Ｋｏｎ）および「解離速度（off rate）定数」（Ｋｏｆｆ）のいずれも、濃度ならびに実際の会合速度および解離速度を計算することにより決定することができる。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、アフィニティーと関連しない全てのパラメータの相殺を可能とし、したがって、解離定数Ｋｄと等しい。ＢＣＲは特に、平衡解離定数が、１０−７Ｍもしくはこれ未満、好ましくは１０−８Ｍもしくはこれ未満、またはより好ましくは１０−９Ｍもしくはこれ未満である場合に、ＢＣＲ抗原コンジュゲート（または、より具体的には、コンジュゲートの抗原性部分）に特異的に結合しうる。
【００５３】
本発明のコンジュゲートＢＣＲ抗原は、多様な有利な能力を有することが想定される。本発明のコンジュゲートＢＣＲ抗原は、患者における悪性Ｂ細胞の活性化および／または増殖を阻害する（本明細書においてはまた、「阻害」または「〜を阻害すること」とも略称する）ことが想定される。これは、例えば、細胞増殖抑制剤と近接させることにより達することもでき、活性化および／または増殖を阻害する他の細胞を動員することにより達することもできる。加えてまたは代替的に、本発明のコンジュゲート患者における悪性Ｂ細胞の殺滅も想定される。殺滅は、アポトーシスの誘導、毒素を近接させること、または標的Ｂ細胞を殺滅しうる細胞傷害性Ｔリンパ球またはマクロファージなど、他の細胞を誘引することなど、いくつかの機構のうちの１つにより達することができる。悪性Ｂ細胞の殺滅は、当技術分野において公知の規定の方法、例えば、付属の実施例において明示される規定の方法を使用して確認される。
【００５４】
好ましくは、悪性Ｂ細胞を阻害し、かつ／または殺滅することにより、本発明のコンジュゲートＢＣＲ抗原はまた、患者における悪性Ｂ細胞の数を最終的に低減することも想定される。
【００５５】
コンジュゲート剤
本明細書において明示される通り、本発明は、治療剤または診断剤へとコンジュゲートさせたＢＣＲ抗原を想定する。本発明に従い、Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するために特に有用な、例示的治療剤は、放射性核種、結合剤、ＣＡＲ  Ｔ細胞、および毒素を含む。
【００５６】
放射性核種
放射性核種とは、放射性の核種であり、また、放射性同位元素（ａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅ）または放射性同位元素（ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｉｓｏｔｏｐｅ）とも称する。適切な放射性核種は、例えば、２２５Ａｃ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２４Ｒａ、または２２３Ｒａなどのアルファ線放出同位元素から選択することができる。代替的に、細胞傷害性放射性核種は、１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、１３１Ｉ、６７Ｃｕ、６４Ｃｕ、１５３Ｓｍ、または１６６Ｈｏなどのベータ線放出同位元素でもありうる。毒素としての使用を考えうる、他の細胞傷害性放射性核種は、オージェ電子および低エネルギー電子を放出し、１２５Ｉ、１２３Ｉ、または７７Ｂｒから選択することができる。
【００５７】
本発明における使用のための放射性核種は、２２５Ａｃ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２４Ｒａ、または２２３Ｒａなどのアルファ線放出同位元素であることが好ましい。代替的に、放射性核種は、１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、１３１Ｉ、６７Ｃｕ、６４Ｃｕ、１５３Ｓｍ、または１６６Ｈｏなどのベータ線放出同位元素でもありうる。さらに、放射性核種は、オージェ電子および低エネルギー電子を放出することが可能であり、同位元素である１２５Ｉ、１２３Ｉ、または７７Ｂｒのうちの１つでもありうる。
【００５８】
結合剤
また、「結合剤」を、本発明のＢＣＲ抗原へとカップリングさせることも想定される。結合剤は、例えば、免疫エフェクター細胞を、悪性Ｂ細胞へと動員するのに使用することができる。免疫エフェクター細胞は、好ましくは、非Ｂ細胞、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好中球、または（細胞傷害性）Ｔ細胞である。例えば、ＢＣＲ抗原コンジュゲートの抗原性部分が、悪性Ｂ細胞をターゲティングする一方で、コンジュゲートさせたＣＤ１６結合剤は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を、悪性Ｂ細胞へと動員することが可能であると考えられ、これにより、Ｂ細胞を最終的に殺滅する。本明細書においてはまた、ＮＫ細胞または悪性Ｂ細胞を殺滅するかもしくは阻害することが可能な他の免疫エフェクター細胞を動員することが可能な他の結合剤、例えば、ＣＤ３結合剤およびＣＤ３８結合剤も想定される。好ましい結合剤は、単離ポリペプチド、特に、単離抗体またはその抗原結合性断片である。当業者は、本発明のＢＣＲ抗原コンジュゲートの一部として選び出される結合剤が、悪性細胞と、動員される免疫エフェクター細胞との間の「アダプター」として機能し、これにより、本明細書において記載される特性と同じ有利な特性（すなわち、悪性Ｂ細胞のＢＣＲに結合し、前記細胞を殺滅するかまたは阻害すること）を有することが好ましいＢＣＲ抗原コンジュゲートをもたらすＢＣＲ抗原コンジュゲートの能力を保持するように、悪性Ｂ細胞のＢＣＲの、コンジュゲートの抗原性部分への結合に、（例えば、立体的に）干渉しないことが好ましいことをたやすく理解するであろう。
【００５９】
「抗体」という用語は、抗原性標的に結合するモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、または前記抗体の誘導体であって、その結合特異性を保持するかもしくは本質的に保持する誘導体を指す。このような抗体の例示的誘導体は、例えば、マウス可変領域またはラット可変領域と、ヒト定常領域とを含むキメラ抗体、およびヒト化抗体、すなわち、非ヒト由来の抗体であって、可変領域における少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）であり、ＣＤＲ３などのＣＤＲ、および、好ましくは、６つのＣＤＲ全てが、所望の特異性を有するヒト由来の抗体のＣＤＲにより置きかえられ、適宜、抗体の非ヒト定常領域が、ヒト抗体の定常領域により置きかえられた抗体である。
【００６０】
「抗体」という用語はまた、機能的な抗体断片、すなわち、抗体の断片であって、分離された軽鎖および重鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ／ｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２など、抗体の結合特異性を保持するかまたは本質的に保持する断片も包含する。「抗体」という用語はまた、二官能性（二特異性）抗体および単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、タンデムｓｃＦｖ、ビスｓｃＦｖなどの抗体コンストラクト、または抗体融合タンパク質、重鎖抗体およびその可変性ドメイン、従来の４鎖抗体分子の重鎖可変性ドメイン（ＶＨ）もしくは軽鎖可変性ドメイン（ＶＬ）に基づくかもしくは由来するドメイン抗体（「ｄＡｂ」）、ダイアボディー、単鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成された多特異性抗体も含む。
【００６１】
本明細書においては、抗原および結合剤を含む二特異性Ｂ細胞抗原コンジュゲートはまた、「Ｂｉ−ＢＡＲ」とも称する。
【００６２】
毒素
本発明のコンジュゲート中の抗原へとカップリングさせた治療剤は、毒素でありうる。本明細書において使用される「毒素」という用語は、限定なしに述べると、化学毒素、化学療法剤、およびタンパク質毒素を包含する。それを、本明細書において記載されるＢＣＲ抗原へとコンジュゲートさせることができ、好ましくは、本明細書において記載される能力と同じ有利な能力（すなわち、悪性Ｂ細胞のＢＣＲに結合し、前記細胞を殺滅するかまたは阻害すること）を有するＢＣＲコンジュゲートをもたらす限りにおいて、他の任意の化合物もまた考えうる。
【００６３】
本発明による使用のために考えうる「化学療法剤」は、Ｂ細胞悪性腫瘍の処置において有用な、任意の抗新生物剤および／または細胞増殖抑制剤であって、有機低分子、ペプチド、オリゴヌクレオチドなどを含む抗新生物剤および／または細胞増殖抑制剤を含む。化学療法剤の定義に含まれる薬剤は、限定なしに述べると、アルキル化剤、例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロランブシル、イホスファミド、ブスルファン、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレア（ＭＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（ＭｅＣＣＮＵ）、ホテムスチン、ストレプトゾトシン、ダカルバジン、ミトゾロミド、テモゾロミド、チオテパ、マイトマイシン、ジアジクオン（ＡＺＱ）、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、プロカルバジン、およびヘキサメチルメラミン；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサート、ペメトレキセド、フルオロウラシル、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、デシタビン、ビダーザ、フルダラビン、ネララビン、クラドリビン、クロファラビン、ペントスタチン、チオグアニン、メルカプトプリン；抗微小菅薬剤、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ビンフルニン、パクリタキセル、ドセタキセル、ポドフィロトキシン；トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、テニポシド、ノボビオシン、メルバロン、アクラルビシン；細胞傷害性抗生剤、例えば、アクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、アクラルビシン、ミトキサントロン；有毒レクチン；植物毒素、例えば、リシン、アブリン（ａｂｒｉｎ）、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）；ボツリヌス毒素、ジフテリア毒素；エンジイン、デュオカルマイシン、カリケアミシン、エスペラミシン、ドキソルビシン、ＡＲＡ−Ｃ、シス白金、５−フルオロウラシル、ドラスタチン、アウリスタチン、ベドチン、エムタンシン；チロシンキナーゼ阻害剤、または本明細書において規定されるＢ細胞悪性腫瘍の処置について、当技術分野において公知である、他の任意の低分子薬である。誘導体およびこれらの組合せもまた、本発明のＢＣＲコンジュゲートにおける使用のために想定される。特に、本発明に従う好ましい毒素は、限定なしに述べると、エンジイン、デュオカルマイシン、メトトレキサート、ドキソルビシン、メルファラン、クロランブシル、ＡＲＡ−Ｃ、ビンデシン、マイトマイシンＣ、シスプラチン、エトポシド、ブレオマイシン、ベドチン、エムタンシン、５−フルオロウラシル、およびチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブ）を含む。
【００６４】
ＣＡＲ  Ｔ細胞
ＣＡＲ  Ｔ細胞とは、人工のキメラＴ細胞受容体［またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）］を保有するＴ細胞である。これらの受容体は、モノクローナル抗体の特異性を、Ｔ細胞へとグラフトするのに使用されることが典型的である。これらの分子の最も一般的形態は、ＣＤ３−ξの膜貫通ドメインおよびエンドドメインへと融合させたモノクローナル抗体に由来する、単鎖可変性断片（ｓｃＦｖ）の融合体である。その抗原性標的のｓｃＦｖを認識すると、このようなＣＡＲは、サイトカインの活性化、増殖、作製、および／またはＣＡＲ−Ｔ細胞のエフェクター機能を誘導するシグナルの伝達を結果としてもたらす。
【００６５】
本発明のＢＣＲコンジュゲートにおいて治療剤として利用されるＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＢＣＲに結合するコンジュゲートの抗原性部分により、悪性Ｂ細胞へとターゲティングされることが想定されており、この場合、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、最終的に活性化し、悪性Ｂ細胞を阻害するかまたは殺滅する。
【００６６】
本明細書においてはまた、ＣＡＲ−Ｔ細胞を治療剤として含むＢＣＲ抗原コンジュゲートを、「ＢＡＲ−ＣＡＲ」とも称する。
【００６７】
化学修飾
コンジュゲートＢＣＲ抗原は、化学修飾することができる。一般に、それらが、本発明のコンジュゲートＢＣＲ抗原の有利な特性を失効化させない限りにおいて、全ての種類の修飾を考えうる、すなわち、化学修飾されたＢＣＲ抗原コンジュゲートは、付属の実施例において査定した化合物の能力と同等な能力を有することが好ましいものとする。特に、修飾ＢＣＲ抗原コンジュゲートは、悪性Ｂ細胞のＢＣＲに結合し、前記Ｂ細胞を阻害するかまたは殺滅するそれらの能力を保持することが好ましいものとする。内部化能力も、さらに所望されうる。
【００６８】
診断剤
診断目的で、（検出用）標識を、ＢＣＲ抗原へと接合させることができる。本発明に従う使用を考えうるこのような標識は、限定なしに述べると、蛍光分子、または磁性粒子などの磁性実体を含む。こうして、検出用標識によりもたらされるシグナルを検出することにより、試料における標的の存在および／または濃度を検出することができる。
【００６９】
検出用標識は、直接的に検出することもでき、間接的に検出することもでき、１または複数の標的を検出するのに、異なる特異的抗体へとコンジュゲートさせたいくつかの異なる検出用標識を組み合わせて使用することができる。
【００７０】
直接的に検出されうる検出用標識の例は、蛍光標識、酵素標識、放射性同位元素、化学発光標識、電気化学発光標識、生物発光標識、ポリマー、ポリマー粒子、金属粒子、ハプテン、および色素を含む。蛍光標識の例は、５−（および６）−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセインまたは６−カルボキシフルオレセイン、６−（フルオレセイン）−５−（および６）−カルボキサミドヘキサン酸、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、ならびにＣｙ２、Ｃｙ３、およびＣｙ５などの色素、ＡＭＣＡ、ＰｅｒＣＰを含む、適宜置換されたクマリン、Ｒ−フィコエリトリン（ＲＰＥ）およびアロフィコエリトリン（ＡＰＣ）を含むフィコビリタンパク質、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｒｅｄ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびその類似体、ならびにＲ−フィコエリトリンまたはアロフィコエリトリンのコンジュゲート、コーティングＣｄＳｅナノ晶子など、半導体材料に基づく粒子などの無機蛍光標識を含む。ポリマー粒子標識の例は、蛍光色素を埋め込まれうる、ポリスチレン、ＰＭＭＡ、もしくはシリカのマイクロ粒子もしくはラテックス粒子、または色素、酵素、もしくは基質を含有するポリマーミセルもしくはカプセルを含む。金属粒子標識の例は、銀染色により転換されうる、金粒子およびコーティング金粒子を含む。ハプテンの例は、ＤＮＰ、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ビオチン、およびジゴキシゲニンを含む。酵素標識の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰまたはＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（β−Ｎ−acetylglucosamimidase）、β−グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ、およびグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）を含む。一般に使用される西洋ワサビペルオキシダーゼの基質の例は、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ニッケルによる増強を伴うジアミノベンジジン、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、ベンジジンジヒドロクロリド（ＢＤＨＣ）、ハンカー−イェーツ試薬（ＨＹＲ）、インドファンブルー（ＩＢ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、４−クロロ−１−ナフトール（ＣＮ）、α−ナフトールピロニン（α−ＮＰ）、ｏ−ジアシジン（ＯＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（5-bromo-4-chloro-3-indolylphosp- hate）（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、２−（ｐ−ヨードフェニル）−３−ｐ−ニトロフェニル−５−フェニルテトラゾリウムクロリド（2-(p-iodophenyl)-3-p-nitropheny- l-5-phenyl tetrazolium chloride）（ＩＮＴ）、テトラニトロブルーテトラゾリウム（ＴＮＢＴ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ベータ−Ｄ−ガラクトシド／フェロ−フェリシアニド（ＢＣＩＧ／ＦＦ）を含む。一般に使用されるアルカリホスファターゼの基質の例は、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−リン酸／ファーストレッドＴＲ（ＮＡＢＰ／ＦＲ）、ナフトール−ＡＳ−ＭＸ−リン酸／ファーストレッドＴＲ（ＮＡＭＰ／ＦＲ）、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−リン酸／ファーストレッドＴＲ（Naphthol-AS-B1-phosphate/- fast red TR）（ＮＡＢＰ／ＦＲ）、ナフトール−ＡＳ−ＭＸ−リン酸／ファーストレッドＴＲ（ＮＡＭＰ／ＦＲ）、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−リン酸／ニューフクシン（ＮＡＢＰ／ＮＦ）、ブロモクロロインドリルリン酸／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−ｄ−ガラクトピラノシド（ＢＣＩＧ）を含む。発光標識の例は、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、１，２−ジオキセタン、およびピリドピリダジンを含む。電気化学発光標識の例は、ルテニウム誘導体を含む。放射性標識の例は、ヨウ素（iodide）、コバルト、セレニウム、トリチウム、炭素、硫黄、およびリンの放射性同位元素を含む。
【００７１】
本明細書においてはまた、治療剤および診断剤の両方へとコンジュゲートさせたＢＣＲ抗原も想定され、例えば、同時に悪性Ｂ細胞をターゲティングしながら、患者におけるコンジュゲートの分布および内部化についてモニタリングするために使用しうるであろう。
【００７２】
リンカー
治療剤または診断剤は、リンカーを介して、ＢＣＲ抗原へと接合させることが典型的である。考えうるリンカーは、例えば、可撓性リンカー、切断可能リンカー、および非可撓性リンカーを含み、コンジュゲートの種類および意図される使用／適用に応じて選択されるであろう。例えば、治療適用のためには、有害な免疫原性反応の危険性を低減しながら、ある程度の柔軟性またはドメイン間の相互作用を確保するために、非免疫原性の可撓性リンカーが好ましいことが多い。このようなリンカーは一般に、小型の非極性（例えば、Ｇｌｙ）アミノ酸または極性（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）アミノ酸から構成され、Ｇｌｙ残基およびＳｅｒ残基の連なりからなる「ＧＳ」リンカーを含む。最も広範に使用される可撓性リンカーであって、本発明のコンジュゲートにもまた想定される可撓性リンカーの例は、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎの配列を有する。
【００７３】
処置
その全ての文法的形態における「処置」という用語は、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療的処置または予防的処置を含む。「治療的処置または予防的処置」とは、臨床症状および／または病理学的症状の完全な防止を眼目とする予防的処置、または臨床症状および／または病理学的症状の改善もしくは寛解を眼目とする治療的処置を含む。したがって、「処置」という用語はまた、Ｂ細胞悪性腫瘍の改善または予防も含む。
【００７４】
処置は、治療有効量のＢＣＲ抗原コンジュゲートの投与を伴うことが好ましい。「治療有効量」とは、本明細書において記載される治療効果を誘発するＢＣＲ抗原コンジュゲートの量を意味する。ＢＣＲ抗原コンジュゲートの正確な用量は、処置の目的（例えば、疾患の急性炎症状態または転移性拡散と対比した寛解維持）に依存し、公知の技法を使用する当業者により確認されるであろう。投与経路、年齢、体重、全般的健康状態、性別、食餌、投与回数、薬物相互作用、および状態の重症度についての調整が必要な場合があるが、当業者の手になる規定の実験により確認されるであろう。
【００７５】
本発明に関する文脈において、「治療効果」という用語は一般に、処置の所望の影響または有益な影響、例えば、疾患症状の改善または寛解を指す。本明細書において、疾患の「症状」という用語は、その感知可能な発現について記載するのに使用され、本明細書の以下においては、身体検査時に検出される可能性があり、かつ／または患者が感知可能な疾患の徴候（すなわち、症候）として規定される臨床症状、ならびに細胞レベルおよび分子レベルにおける疾患の発現を意味する病理学的症状の両方を含む。例えば、それぞれの患者の一般的な外見（例えば、体調、身体健康）について査定することができるが、これはまた、当業者が、治療効果が誘発されているのかどうかについて査定する一助ともなるであろう。当業者は、本発明のＢＣＲ抗原コンジュゲートの治療効果を観察するのに適する、他の多数の方途についても熟知している。
【００７６】
本明細書においてはまた、「対象」とも称する「患者」という用語は、ヒト疾患（すなわち、Ｂ細胞悪性腫瘍）のモデル系として使用されうる、任意の哺乳動物または任意の脊椎動物を含むことを意図する。対象の例は、ヒト、サル、類人猿、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、ハムスター、およびこれらのトランスジェニック種を含む。本発明の文脈においては、ヒト患者が好ましい。
【００７７】
本発明のコンジュゲートの投与には、経口経路、局所経路、経皮経路、皮下経路、静脈内経路、腹腔内経路、筋内経路、または眼内経路を含むがこれらに限定されない、様々な経路が適用可能である。しかし、所望の場合、当業者は、他の任意の経路もたやすく選び出すことができる。
【００７８】
組合せ療法
本発明のＢＣＲ抗原コンジュゲートはまた、Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するために使用される一般的な治療法と併せた、組合せ療法にも想定される。組合せ療法に考えうる治療法は、例えば、リツキシマブ（Ｒ−ＣＨＯＰ）、ＢＲ（ベンダムスチンおよびリツキシマブ）、Ｒ−ＣＶＰ（リツキシマブ、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン）、およびフルダラビンベースの組合せにより適宜補完したＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）を含む。放射線療法（外部照射による放射線療法が典型的である）もまた、リツキシマブ、オファツムマブ、オビノツズマブなどのモノクローナル抗体、または抗体−薬物コンジュゲートであるブレツキシマブベドチンを伴う処置として想定される。幹細胞移植もまた、要求されうる。Ｂ細胞悪性腫瘍またはその処置により引き起こされる、疼痛、悪心、息切れ、不眠、および他の身体症状を含む、Ｂ細胞悪性腫瘍処置の副作用および症状を軽減またはコントロールするために、緩和剤のさらなる投与もまた想定される。
【００７９】
当業者は、処置される具体的なＢ細胞悪性腫瘍に応じて、処置選択肢が変動することに同意するであろう。一般に、本発明のＢＣＲ抗原コンジュゲートによる処置は、一般的治療法に先行および／または後続させることもでき、同時に行うこともできる。本明細書においては、本発明のコンジュゲートを、一般的な治療選択肢と組み合わせることが想定されるが、また、Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するのに一般に使用される化学療法レジメンの構成要素を置きかえるのに使用することもできる。例えば、その優れた特異性のために、よって、副作用の低減が予測されることのために、リツキシマブ処置またはビンクリスチン処置（例えば、Ｒ−ＣＨＯＰにおける）を置きかえるのに、本発明のコンジュゲートを使用しうることもまた想定される。
【００８０】
診断法
ＢＣＲ抗原コンジュゲートの、診断法における使用もまた想定される。前記診断法は、対象におけるＢＣＲ抗原コンジュゲートを認識する、ＢＣＲを発現する悪性Ｂ細胞の同定および特徴づけに基づき、インビボにおいて行うこともでき、エクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）において行うこともでき、インビトロにおいて行うこともできる。インビボ法は、対象へと、標識されたＢＣＲ抗原コンジュゲートを投与することを含みうる。エクスビボ法またはインビトロ法のためには、本発明のコンジュゲートＢＣＲ抗原に結合する悪性Ｂ細胞を含有することが疑われる、体液試料、組織試料、または細胞試料、特に、血液試料を、前記細胞のＢＣＲに結合することが可能な、標識されたＢＣＲ抗原コンジュゲートと接触させることができる。標識コンジュゲートの結合は、試料における、コンジュゲートの抗原性部分を特異的に認識するＢＣＲを有するＢＣＲ発現細胞の存在を指し示し、当業者に周知の方法により検出することができる。本発明の一部の態様は、コンジュゲートＢＣＲ抗原を認識する悪性Ｂ細胞の存在または量またはレベルを決定することにより、対象におけるＢ細胞悪性腫瘍を診断またはモニタリングすることに関する。このようなＢ細胞の存在またはレベルは、当業者に公知の規定の方法を使用して決定することができる。特に、（標識された）ＢＣＲ抗原コンジュゲートは、従来の診断法に基づき既に診断されたある特定のＢ細胞悪性腫瘍についての疑念を裏打ちする一助となりうる。
【００８１】
層別化
本明細書においてはまた、本明細書において記載されるＢ細胞悪性腫瘍を患う患者であって、本発明のコンジュゲートＢＣＲ抗原に好適に応答する素因がある患者を同定するための非侵襲的方法も想定される。前記方法は、（ｉ）標識されたＢＣＲ抗原コンジュゲートを用意することと；（ｉｉ）標識されたＢＣＲ抗原を、悪性Ｂ細胞を含む各患者の試料へと添加することと；（ｉｉｉ）標識されたＢＣＲ抗原コンジュゲートの、本明細書において記載される前記悪性Ｂ細胞への結合および／または内部化について評価することとを含む。
【００８２】
本発明のコンジュゲートＢＣＲ抗原に好適に応答する素因がある患者「を同定すること」という用語は、患者を層別化することを含む。「〜を層別化すること」という用語は、患者を、前記コンジュゲートによる治療から利益を得ることができる患者、または利益を得ることのできない患者へと分けることを指す。特に、患者を層別化することは、本発明のコンジュゲートに結合し、かつ／またはこれを内部化する、患者の悪性Ｂ細胞の能力を決定することを伴う。本明細書においては、その悪性Ｂ細胞が、標識されたＢＣＲ抗原コンジュゲートに結合し、かつ／またはこれを内部化する患者は、コンジュゲートＢＣＲ抗原による処置に好適に応答する素因があるのに対し、その悪性Ｂ細胞が、標識されたＢＣＲ抗原コンジュゲートに結合せず、かつ／またはこれを内部化しない患者は、そのような素因がないと規定する。
【００８３】
「好適に応答する素因がある」とは、患者が、本発明のコンジュゲートＢＣＲ抗原により処置された場合、有益な効果を享受する可能性が高いことを意味する。有益な効果は、悪性Ｂ細胞の阻害および／もしくは殺滅、悪性Ｂ細胞数の低減、ならびに／または当技術分野において公知の規定の方法を使用して確認される治療効果を含む。前記患者は、Ｂ細胞悪性腫瘍を伴うと既に診断されていることが好ましい。
【００８４】
組成物
ＢＣＲ抗原コンジュゲートを、医薬組成物の形態で投与することが想定される。前記ＢＣＲ抗原コンジュゲートは、医薬組成物において、治療有効量により存在することが好ましい。「医薬組成物」という用語は特に、ヒトへの投与に適する組成物、すなわち、好ましくは、薬学的に許容される成分を含有する滅菌組成物を指す。医薬組成物は、ＢＣＲ抗原コンジュゲートを、１または複数の医薬賦形剤と共に含むことが好ましい。「賦形剤」という用語は、充填剤、結合剤、崩壊剤、コーティング、吸着剤、粘着防止剤、流動促進剤、保存剤、抗酸化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、溶媒、共溶媒、緩衝剤、キレート剤、粘性付与剤、界面活性剤、希釈剤、保湿剤、担体、希釈剤、保存剤、乳化剤、安定化剤、または等張性修飾剤を含む。本発明の医薬組成物は、治療有効量のＢＣＲ抗原コンジュゲートを含むことが好ましく、多様な形態、例えば、固体形態、液体形態、気体形態、または乾燥凍結形態において製剤化することができ、とりわけ、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ゲル、粉剤、錠剤、溶液、エアゾール、顆粒、丸剤、懸濁液、エマルジョン、カプセル、シロップ、液体、エリキシル、抽出物、点滴剤、または流体抽出物の形態とすることもでき、特に、所望の投与法に適する、他の任意の形態とすることもできる。
【００８５】
本発明の医薬組成物はさらに、１または複数のさらなる薬剤も含みうる。前記薬剤は、Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するために、治療的に有効であることが好ましい。本発明の医薬組成物において使用されうる、特定のさらなる薬剤は、限定なしに述べると、本明細書の別の箇所において記載される毒素であって、化学療法剤または緩和剤を含む毒素を含む。
【００８６】
ＢＣＲ抗原コンジュゲートまたはＢＣＲ抗原コンジュゲートを含むキット、および処置法の文脈において記載される全ての態様はまた、変更すべき点は変更して、本発明の医薬組成物にも適用可能であることに注目されたい。
【００８７】
前出の観点において、本発明はまた、本明細書において規定されるＢＣＲ抗原コンジュゲートの、Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するための医薬組成物の製造のための使用も提供する。
【００８８】
キット
ＢＣＲ抗原コンジュゲートは、キットの一部として使用しうることもまた想定される。したがって、さらなる態様において、本発明はまた、ＢＣＲ抗原コンジュゲートを含むキットであって、特に、本明細書の別の箇所において規定される、Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するための方法における使用が意図されるキットにも関する。
【００８９】
キットは、２つまたはこれを超える部分によるキットであり得、ＢＣＲ抗原コンジュゲート、または前記ＢＣＲ抗原コンジュゲートと、医薬組成物の文脈において規定される１もしくは複数のさらなる薬剤とを含む医薬組成物を含む。キットの構成要素は、容器またはバイアルに含有されうる。ＢＣＲ抗原コンジュゲートまたはＢＣＲ抗原コンジュゲートを含む医薬組成物、および処置法の文脈において記載される全ての態様はまた、変更すべき点は変更して、本発明のキットにも適用可能であることに注目されたい。
【００９０】
キットに含まれるさらなる薬剤は、ＢＣＲ抗原コンジュゲートの投与との関係で、同時に適用することもでき、逐次的に適用することもでき、別個に適用することもできることが想定される。本発明はさらに、異なる投与経路を介する薬剤の投与も包含する。
【００９１】
本発明の別の態様は、それを必要とする対象における、Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するための方法であって、治療有効量の本明細書において規定されるＢＣＲ抗原コンジュゲートを、前記対象へと投与することを含む方法である。当業者は、ＢＣＲ抗原コンジュゲートまたはＢＣＲ抗原コンジュゲートを含む医薬組成物およびキットの文脈において記載される全ての態様は、変更すべき点は変更して、処置法に適用可能であることに同意するであろう。
【００９２】
そうでないことが文脈により明確に指し示されない限りにおいて、本明細書において使用される単数形の「ある（a）」、「ある（an）」、および「その」は、複数の指示対象を含むことに注意されたい。したがって、例えば、「ある試薬」に対する言及は、このような異なる試薬のうちの１または複数を含み、「その方法」に対する言及は、当業者に公知の、同等な工程および方法であって、改変される場合もあり、本明細書において記載される方法を代替する場合もある工程および方法に対する言及を含む。
【００９３】
そうでないことが指し示されない限りにおいて、要素の系列に先行する「少なくとも」という用語は、その系列野中のあらゆるエレメントを指すと理解されたい。当業者は、規定の実験だけを使用して、本明細書において記載される、本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認することが可能であろう。本発明は、このような均等物を包含することを意図する。
【００９４】
本明細書のどの箇所で使用される場合であれ、「および／または」という用語は、「および」、「または」、および「前記用語と関連する要素の全ての組合せまたは他の任意の組合せ」の意味を含む。
【００９５】
本明細書において使用される「約」または「およそ」という用語は、所与の値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内を意味し、より好ましくは５％以内を意味する。しかし、「約」または「およそ」という用語はまた名数も含み、例えば、約２０は２０を含む。
【００９６】
「〜未満」または「〜を超える」という用語は、名数を含む。例えば、２０未満とは、２０未満またはこれと等しいことを意味する。同様に、「〜より大きい」または「〜を超える」とは、それぞれ、「〜より大きいかもしくはこれと等しい」、または「〜を超えるかもしくはこれと等しい」を意味する。
【００９７】
本明細書および後続の特許請求の範囲を通して、文脈によりそうでないことが要求されない限りにおいて、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、ならびに「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「〜を含むこと」などの変化形は、言明された整数または工程または整数もしくは工程の群の包含を含意し、他の任意の整数もしくは工程または整数もしくは工程の群の除外は含意しないように理解される。本明細書において使用される場合、「〜を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「〜を含有すること」もしくは「〜を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、または、本明細書において使用される一部の場合には、「〜を有すること」という用語により代用することができる。
【００９８】
本明細書において使用される場合、「〜からなること」は特許請求の範囲の要素において指定されていない、任意の要素、工程、または成分を除外する。本明細書において使用される場合、「〜から本質的になること」は、特許請求の範囲の基本的特徴および新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料または工程を除外しない。
【００９９】
本発明は、本明細書において記載される、特定の方法、プロトコール、材料、試薬、および物質などに限定されず、それ自体変動しうることを理解されたい。本明細書において使用される用語法は、特定の実施形態について記載することだけを目的とするものであり、特許請求の範囲だけにより規定される、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１００】
本明細書の本文を通して引用される全ての刊行物および特許（全ての特許、特許出願、学術刊行物、製造元の仕様、指示書などを含む）は、上記の引用であれ、下記の引用であれ、参照によりそれらの全体において組み込まれる。本明細書におけるいかなる事柄も、本発明が、先行発明により、このような開示に先行する権利が与えられていないことの容認としてみなされないものとする。参照により組み込まれた材料が、本明細書に反するか、またはこれと齟齬を来す程度において、明細書は、任意のこのような材料に対して優先される。
【０１０１】
例示だけを目的として与えられる以下の実施例から、本発明およびその利点についてのよりよい理解が得られるであろう。実施例は、本発明の範囲を、いかなる形であれ、限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【０１０２】
本発明者らは、以下において明示される、様々なＢ細胞悪性腫瘍のためのＢＡＲを、臨床において使用するための手法を開発した。
【０１０３】
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）：
ＣＬＬの発生数は、毎年１０，００００人当たりの新たな症例４例であると推定されている。米国では、毎年約１４，６２０例の新たなＣＬＬ症例が発生し、４，６５０人がＣＬＬで死亡しており（American Cancer Society 2014: Cancer Facts and Figures 2014; retrieved from http://www.cancer.org/acs/groups/content/@research/documents/webcontent/ acspc-042151.pdf）、欧州全体では、毎年１０，０００人が死亡している７。
【０１０４】
ＢＡＲの臨床適応：ＣＬＬは、症候が生じてから処置される、進行の遅い疾患である。最新の第一選択処置によれば、応答が得られる頻度が高く、大半の患者に無処置期間の延長がもたらされている。再処置を要求する患者には、多くの異なるレジメンが選択肢とされ、多くの患者は、疾患に斃れるまでに、多岐にわたる処置を受ける。しかし、多発性骨髄腫と同様に、ＣＬＬは、この、大半が高齢の集団ではまれにしか可能とならない同種移植を伴わずには治癒不能であると考えられる。異なる利用可能なレジメンの配列の選出しは、有効性および忍容性に基づき、ＢＡＲについて仮定されうる特色である高有効性および低毒性を伴う新たな薬物の余地が依然として存在する。現在のところ、ＢＡＲが利用可能なのは、全てのＣＬＬ症例のうちの約３０％であるが、ＣＬＬのためのＢＡＲに関する問題は、抗原性ＢＣＲ標的が極めて多様であり、それらの大半が、公知のＢＡＲを伴う症例において、所与のＢＡＲ内に、異なるエピトープを有することである。ＢＡＲを作製するための費用が廉価であると予測されるにも拘らず、利用可能なＣＬＬ  ＢＡＲのいずれにも、個々の認可手順が必要であるならば、ＢＡＲの臨床における広範な適用は疑問視される。ＣＬＬ−ＢＡＲについては、群全体にわたる認可を追求すべきである。
【０１０５】
候補患者の同定：
公知の抗原を、コーティングとして使用する、十分に確立された全血液溶解物ＥＬＩＳＡにより、末梢血（ＣＬＬ細胞）を、ＢＣＲ特異性について調べる。
【０１０６】
実施戦略：
（複数回）再発したＣＬＬ患者におけるＣＬＬ−ＢＡＲの単剤薬物活性を裏付ける（理論的には、欧米において、毎年１５，０００人のＣＬＬによる死亡者のうち、３０％が、このようなフェーズＩ／ＩＩ研究の潜在的な候補者となるであろう）。
【０１０７】
活性の場合、次のステップにおいて、第一選択（first-fine）処置に応答するＣＬＬ患者を、維持ＢＡＲまたは観察へと無作為化する。
【０１０８】
第３のステップとして（代替的に、ステップ１の後で）：患者を、ＢＡＲ（誘導に維持を追加した）を伴う第一選択処置およびこれを伴わない第一選択処置について無作為化する。
【０１０９】
マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）
ＭＣＬは、非ホジキンリンパ腫の全症例のうちの約３％を含む。米国における全発生数は、毎年１００，０００人当たり０．５５人であり、年齢と共に増大する：５０歳未満の患者においては、０．０７人であり、７０〜７９歳の患者においては、２．９７人であり、８０歳以上の患者においては２．７８人である。ＭＣＬの発生数は、男性（１００，０００人のうちの０．８４人）において、女性（１００，０００人のうちの０．３４人；Ｐ＜０．０５）におけるより大きく、白色人種（１００，０００人のうちの０．６１人）において、アフリカ系アメリカ人（１００，０００人のうちの０．３２人）におけるより大きい。後期（ＩＩＩ〜ＩＶ期）ＭＣＬは、患者のうちの７４．６％において診断されている８。米国については、毎年約４，２００例の新たなＭＣＬ症例が推定されており、欧州においては、６，０００例が推定されている。現在、ＭＣＬは、組合せ化学療法または免疫療法を追加した化学療法に続く、幹細胞移植を使用して処置されている。しかし、ボルテゾミブ、イブルチニブ、およびレナリドミドなどの薬剤が、Ｂ細胞受容体によるシグナル伝達をターゲティングすることにより、無進行生存（ＰＦＳ）および全生存（ＯＳ）を改善する能力を近年裏付けており、かつての３年生存率から、７年間の中央値への著明な改善が示唆されている。初期の組合せ化学療法レジメンに対する応答率は、ＭＣＬを伴う患者において極めて良好であることが多いが、再発は、極めて一般的であり、おそらく、これらの、大半が高齢の患者であり、診断年齢中央値を７０歳とする患者のうちの少数者だけにおいて実施可能な同種移植を例外として、利用可能な処置選択肢により、患者が治癒しうるのかどうかは、いまだ不明である９。したがって、新たな手法が必要とされている。
【０１１０】
ＢＡＲの臨床適応：近年において、新たな薬物により達成された、処置結果の大幅な改善にも拘らず、ＭＣＬの治癒率は、依然として低く、第一選択処置で治癒する患者は少数である。したがって、ＭＣＬには依然として、満たされていない医学的必要が存在する。ＢＡＲ（ＬＲＰＡＰ１）は、ＭＣＬを伴う症例９例中４例（４４％）において同定されている。ＢＡＲ処置の潜在的な候補者である、ＭＣＬを伴う患者のうちの高百分率は、ＭＣＬ−ＢＡＲの臨床的発症を加速化させるはずである。
【０１１１】
候補患者の同定：
ＭＣＬ−ＢＣＲを、ＬＲＰＡＰ−１への結合について点検する。発症下にある末梢血を使用して調べる。
【０１１２】
実施戦略：
フェーズＩ／ＩＩ試験の再発ＭＣＬ患者において、ＭＣＬ−ＢＡＲの単剤薬物活性を裏付ける。ＭＣＬ−ＢＡＲについて予測される高活性および低毒性のために、これは第１に、高齢ＭＣＬ患者の再発において行うことができ、第２に、若齢ＭＣＬ患者の再発において行うことができるであろう。欧米において毎年推定１０，０００例の新たなＭＣＬ症例のうち、４，４００例が、ＬＲＰＡＰ１に特異的なＢＣＲを有することが予測される。これらのうち、４分の１は、毎年再発することが予測されうる。したがって、推定１，０００例の患者が毎年、このようなフェーズＩ／ＩＩ試験の潜在的な候補者となるであろう。
【０１１３】
活性の場合、次のステップにおいて、第一選択処置に応答するＭＬＬ患者を、維持ＢＡＲまたは観察へと無作為化する。
【０１１４】
第３のステップとして（代替的に、ステップ１の後で）：患者を、ＢＡＲ（誘導に維持を追加した）を伴う第一選択処置およびこれを伴わない第一選択処置について無作為化する。
【０１１５】
原発性中枢神経系リンパ腫（ＰＣＮＳＬ）
ＰＣＮＳＬは、全ての原発性脳腫瘍のうちの３．１％を表し、ＮＨＬのうちの２〜３％を表す。２０年前に観察された３倍の上昇の後、ＰＣＮＳＬの発生数は、過去１０年間、６０歳を上回る個体において、わずかに増大したに過ぎず、現在のところ、患者１００，０００例歳当たり０．４６である。米国については、毎年１，０００例の新たな患者が推定されている。診断時における年齢中央値は、６０〜６５歳であり、生存中央値は、１０〜２０カ月間であり、５年間生存は、２０％未満〜３０％である１０。６０歳より年長の患者の数字は実質的に悪く、５年生存率は、若齢の患者についての７５％と比較した１９％である。自家幹細胞移植を伴う、高用量の化学療法は、結果を改善しうるが、全ての患者において実施可能ではない１１、１２。再発時における予後は思わしくなく、特に、リンパ腫が高用量の化学療法に対して抵抗性である場合は思わしくない。
【０１１６】
ＢＡＲの臨床適応：全てのＰＣＮＳＬ症例のうちの３分の２は、ＣＮＳにおいて優先的に発現するタンパク質であるニューラビン１のＳＡＭＤ１４ドメインに対する特異性を伴うＢＣＲを有する。興味深いことに、これらの患者においては、ニューラビン１／ＳＡＭＤ１４は、健常対照と比較して、グリコシル化が高度である。この高グリコシル化の理由は未知であるが、この修飾タンパク質が、ニューラビン１に対する特異性を伴うＢ細胞の慢性抗原性応答を誘導し、悪性クローンのクローン性進化を最終的に結果としてもたらすという仮説を裏打ちする。ＰＣＮＳＬ、特に、再発性ＰＣＮＳＬの予後不良のために、より有効な処置に対する必要が満たされていない。したがって、ＰＣＮＳＬの希少性にも拘らず、ＰＣＮＳＬを伴う全ての患者のうちの３分の２はまた、ＰＣＮＳＬ−ＢＡＲによる処置の潜在的な候補者でもあるため、ＰＣＮＳＬ−ＢＡＲの臨床開発を急速に進めるべきである。欧米において毎年推定２，０００例の新たなＰＣＮＳＬ症例のうち、少なくとも４分の１は毎年、フェーズＩ／ＩＩ研究に参加可能である。ＰＣＮＳＬ−ＢＡＲの必要条件は、それらが血液脳関門を透過することである。ＢＡＲなどの低分子（s small molecule）は、ＢＣＲ結合性エピトープのみに相当するので、血液脳関門を透過すると予測することができ、ＢＣＲ結合性エピトープのサイズが小さいため、血液脳関門突破を目的とする、いくつかの薬理学的修飾の余地が残る。
【０１１７】
候補患者の同定：
確立されたＥＬＩＳＡにより、末梢血を、高グリコシル化ニューラビンについて調べる。
【０１１８】
実施戦略：
フェーズＩ／ＩＩ試験の再発ＰＣＮＳＬ患者において、ＰＣＮＳＬ−ＢＡＲの単剤薬物活性を裏付ける。再発患者の思わしくない予後のために、５０例の患者を伴うフェーズＩ／ＩＩ研究であれば、どの患者が、１年以内に登録可能となるのかについての強い警告を示すのに十分なはずである。
【０１１９】
活性の場合、次のステップにおいて、ＰＣＮＳＬ−ＢＡＲを、無作為化フェーズＩＩ研究における、標準的なサルベージ療法レジメンと組み合わせるものとする。
【０１２０】
第３のステップとして（またはステップ２と並行して）、ＰＣＮＳＬ−ＢＡＲを伴う標準的な処置およびこれを伴わない標準的な処置についての無作為化フェーズＩＩＩ研究を実施するものとする。目的は、無進行生存の、６カ月間の改善であるものとする。
【０１２１】
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）
びまん性大細胞型Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＤＬＢＣＬ）は、最も高頻度な非ホジキンリンパ腫であり、非ホジキンリンパ腫系列のうちの３０％〜５８％を構成する（地理的領域に応じて）。欧州連合における粗発生数は、１年当たり１００，０００人当たり３〜４人である。発生数は、１年当たり１００，０００人当たり０．３人（３５〜３９歳）から、１年当たり１００，０００人当たり２６．６人（８０〜８４歳）へと、年齢と共に増大する。ＮＨＬの発生数は、１９７０年代から、１９９０年代半ばまで、劇的に増大し、２０１０年の米国においては、推定６５，５４０例の新たな症例が予測され、このため、ＮＨＬは、７番目に一般的ながんとなっている（基底細胞皮膚がんおよび扁平上皮皮膚がんを除く）１３。時にこの期間、ごく若齢者を除き、人種類別にわたり、全ての年齢群にわたり、両性において、リンパ腫およびＤＬＢＣＬの発生例の、毎年３％〜４％の安定的な増大が生じた。１９９０年代後半において、発生数は、プラトーに達し、１９９２年から、２００６年へと、ＤＬＢＣＬの年齢で調整した発生率は、１００，０００人の集団１つ当たり、８．０７から、８．９８例へと、１年当たり約１％増大した。１９７０年代からのＤＬＢＣＬ発生率の増大は、匹敵するのが皮膚がんの上昇だけである、いまだかつてない上昇を表す。
【０１２２】
モノクローナル抗体であるリツキシマブの導入以来、ＤＬＢＣＬ患者の予後は、大幅に改善されており、患者のうちの７５％は、リツキシマブと、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）とからなる組合せ免疫化学療法により治癒することが予測されうる。治癒率は、国際予後指標（ＩＰＩ）に従う危険性因子：年齢＞６０歳、処置前血清ＬＤＨレベルの上昇、病期の進行（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ病期分類システムに従い、ＩＩＩ／ＩＶ）、および１つ超のリンパ節外の病変部位の数に依存する。ＩＰＩのほか、他の独立の危険性因子も同定されており、最も広範に許容されている危険性因子は、ＣＯＯ（ｃｅｌｌ  ｏｆ  ｏｒｉｇｉｎ）である。ＣＯＯに従い、胚中心（ＧＣ型）に由来するＤＬＢＣＬを、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ型）に由来するＤＬＢＣＬから識別し、ＣＯＯを割り当てることができない、副次的な症例群を残す。ＡＢＣ型は、全てのＤＬＢＣＬのうちの約４０％を表すと推定されており、その頻度は、年齢と共に増大し、６０歳超の患者について検討する大半のシリーズでは、ＧＣ−ＤＬＢＣＬと少なくとも同数のＡＢＣ−ＤＬＢＣＬが観察される。遺伝子発現プロファイリングにより決定されるＧＣ−ＤＬＢＣＬの治癒または５年生存率は、７５％であると報告されたが、ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬについては、４０％に過ぎなかった１４。転帰不良が報告されている他の亜型は、ＭＹＣの切断を伴うＤＬＢＣＬ、ＢＣＬ２の切断を伴うＤＬＢＣＬ、二重ヒットのＤＬＢＣＬ、ならびにＭＹＣタンパク質およびＢＣＬ２タンパク質の両方を発現するＤＬＢＣＬである。
【０１２３】
ＢＡＲの臨床適応：ＡＢＣ型のＤＬＢＣＬ細胞株５例中３例は、ＡＲＳ２タンパク質に対する特異性を伴うＢＣＲ受容体を発現したが、ＧＣ型のＤＬＢＣＬ細胞株４例のうちのいずれも、これらを発現しなかった。興味深いことに、これらの患者においては、ＡＲＳ２は（ＤＬＢＣＬ細胞株におけるＡＲＳ２と同様に）、リン酸化が低度であった。この低リン酸化の理由は未知であるが、この修飾タンパク質が、ＡＲＳ２に対する特異性を伴うＢ細胞の慢性（自己）抗原性応答を誘導し、悪性クローンのクローン性進化を最終的に結果としてもたらすという仮説を裏打ちする。ＤＬＢＣＬに由来するエクスビボデータまたは生検データは、なおも限定されているが、ＡＢＣ亜型のＤＬＢＣＬは、それぞれの細胞株ほど高頻度には、ＡＲＳ２に対する特異性を伴うＢＣＲを発現しないと考えられる。しかし、米国および欧州において、毎年１００，０００例を超える新たなＤＬＢＣＬ症例のほぼ全てが処置されているが、それらのうちの３分の１は、応答を達成しないか、または応答を達成した後で再発するので、それらのうちの約３３，０００例は、サルベージ処置を必要とすると計算することができる。第一選択処置の結果と好対照に、再発ＤＬＢＣＬの処置結果は、リツキシマブの導入以来、大幅に悪化している。高用量の化学療法および自家幹細胞移植を含むサルベージ処置にも拘らず、永続的な第２の寛解を達成するのは、若齢患者のうちの２０％に過ぎず、高用量の化学療法に十分に適合しない再発性患者（高齢患者）においては、永続的寛解率はさらに低い。ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬから採取したての生検についての近年の研究は、３１例中８例が、低リン酸化ＡＲＳ２を発現することを示した。再発ＤＬＢＣＬは、ＤＬＢＣＬのＡＢＣ亜型について濃縮されているので、全ての再発ＤＬＢＣＬのうちの１０％〜２０％にわたる患者が、低リン酸化ＡＲＳ２を発現する（expresse）と仮定することができ、よって、ＤＬＢＣＬ−ＢＡＲが選択肢となる患者は毎年、３，０００人超であると予測することができる。
【０１２４】
候補患者の同定：
確立されたＥＬＩＳＡにより、末梢血を、低リン酸化ＡＲＳ２について調べる。
【０１２５】
実施戦略：
フェーズＩ／ＩＩ試験の再発ＤＬＢＣＬにおいて、ＤＬＢＣＬ−ＢＡＲの単剤薬物活性を裏付ける。これらの患者の高有病率のために、５０例の患者の、フェーズＩ／ＩＩへの登録は、１年以内に実施可能であるものとする。
【０１２６】
活性の場合、次のステップにおいて、ＤＬＢＣＬ−ＢＡＲを、無作為化フェーズＩＩ研究における、標準的なサルベージ療法レジメンと組み合わせるものとする。目標は、ＰＦＳの、６カ月間の延長であるものとする。
【０１２７】
第３のステップとして（またはステップ２と並行して）、ＤＬＢＣＬ−ＢＡＲを伴う標準的な処置およびこれを伴わない標準的な処置についての無作為化フェーズＩＩＩ研究を実施するものとする。目的は、無進行生存の、７．５〜１０％の改善であるものとする。
【０１２８】
濾胞性リンパ腫（ＦＬ）
濾胞性リンパ腫（ＦＬ）は、米国において、２番目に一般的なリンパ腫であり、毎年診断される患者ほぼ１４，０００例を表し１３、毎年の発生数は、１００，０００人当たりの症例３例である。米国および欧州において、同様な数の新たな症例を予測しうるように、欧州における推定発生数は、毎年１００，０００人当たりの症例２．１８例である１５。発生数は、時間経過にわたり安定的であるが、民族ごとに変動し、白人における発生数は、黒人集団およびアジア人集団の２倍を超えている１６〜１８。
【０１２９】
進行期にも拘らず、生存中央値は、８〜１５年間の範囲であり、無痛性の呼称をもたらしている。注意深い待機、すなわち、患者が症候性となるまで、処置を延期することは、進行期濾胞性リンパ腫を伴う患者のための選択肢である。進行期濾胞性リンパ腫を伴う患者は、現行の治療選択肢によっては治癒しない。患者のうちの＞９０％が、第一選択レジメン（ＣＨＯＰ、ベンダムスチン）に応答するが、処置に対する完全応答を達成した患者においてもなお、再発率は、時間経過にわたり不変であり１９、５年無進行生存は、約５０％である２０。
【０１３０】
ＢＡＲの臨床適応：体系的ではなく、派生的な探索であるが、現在同定されている唯一のＢＡＲは、濾胞性リンパ腫を伴う患者４０例中４例のＢＣＲの標的であることが見出されたオプチニューリンである。患者のうちの５０％は、５年間が経過すると、再処置を必要とするが、多くの処置選択肢が存在し、患者は通例、複数のサルベージ処置に応答する。ＦＬ−ＢＡＲによる処置の潜在的な候補者であるＦＬ患者は１０％に過ぎず、このリンパ腫型においてＢＡＲの適応を見出すことは困難でありうるであろう。
【０１３１】
候補患者の同定：
試験は確立されていない。
【０１３２】
実施戦略：
フェーズＩ／ＩＩ試験の再発ＦＬにおいて、ＦＬ−ＢＡＲの単剤薬物活性を裏付ける。現在のところ、利用可能なＦＬ−ＢＡＲ（FL-Bars）の割合が小さいため、フェーズＩ／ＩＩへと、５０例の患者を登録するには、数年間を要しうるであろう。３０％の応答率が、臨床的に意味がある目標となるであろう。
【０１３３】
活性の場合、再発性患者における無作為化フェーズＩＩＩ研究であって、ＦＬ−ＢＡＲを、規定のサルベージ処置と組み合わせる無作為化フェーズＩＩＩ研究が選択肢となるであろう。
【０１３４】
別の選択肢は、全ての応答患者、または検出およびモニタリングされうる残存疾患が最小限である応答患者だけである患者のいずれかの、第一選択処置に応答する患者における、安定化／維持のためのＦＬ−ＢＡＲについての無作為化研究となるであろう。
【実施例２】
【０１３５】
Ｕ２９３２細胞内の、ＡＲＳ２の内部化
ＦＬＡＧでタグ付けされたＡＲＳ２（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９ＢＸＰ５；２０１６年４月１３日現在の最新改定バージョン１２７）タンパク質を伴うインキュベーション（１０μｇ／ｍｌ、３０分間、４℃）の後、細胞の量を、２つのプールへと分け、これらのうち、第１のプールは、４℃で保ち、即座に染色する一方、他のプールは、染色を行う前に、３７℃で１時間にわたりインキュベートした。いずれのプールも、以下の手順により、４℃で染色した：各プールを、２つの部分へと細分し、これらのうちの１つの部分を、未処理のまま保つ一方で、他の部分は、２％のＰＦＡ／０．２％のサポニンにより処理した。次いで、マウス抗ＦＬＡＧ  ｍＡｂを添加する（３０分間）のに続き、集中的な洗浄（ＰＢＳ）および抗マウスＦＩＴＣ  ｍＡｂによるインキュベーション（３０分間）を行った。その後、細胞を再度洗浄し（ＰＢＳ；４℃）、ＦＡＣＳにより解析した。
【０１３６】
ＦＡＣＳ解析により、４℃においては、ＡＲＳ２は、細胞の表面だけにおいて検出されたが、３７℃で１時間後の内部化の後においては、ＡＲＳ２は、細胞質中に濃縮されたことが明確に示される［Ｘ軸：ＦＳＣ；Ｙ軸：ＦＩＴＣシグナル（図１）］。
【実施例３】
【０１３７】
抗毒素で処理されたＡＢＣ型ＤＬＢＣＬ細胞の増殖の阻害
抗毒素で処理されたＡＢＣ型ＤＬＢＣＬ細胞の増殖の阻害：ＡＲＳ２へとカップリングさせたシュードモナス外毒素（ＡＲＳ２−ＥＴＡ）または対照としてのニューラビンへとカップリングさせたシュードモナス外毒素（ＮＲＢ１−ＥＴＡ）の存在下において、ＡＲＳ２陽性細胞株（Ｕ２９３、ＯＣＩ−Ｌｙ３）およびＡＲＳ２陰性細胞株（ＨＢＬ−１、ＴＭＤ８）を培養した（３７℃、２４時間）。細胞増殖は、製造元の指示書に従い、ＥＺ４Ｕキット（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して測定した（図２）。
【実施例４】
【０１３８】
ＡＲＳ２−抗毒素コンストラクトによるＯＣＩ−Ｌｙ３細胞の殺滅
ＯＣＩ−Ｌｙ３細胞は、ＡＲＳ２−ＥＴＡまたはＮＲＢ１−ＥＴＡの存在下で培養した（ウェル１つ当たりの毒素１ｕｇ当たりの細胞２．５×１０４個）。培養物を、トリパンブルーにより染色し、カウントすることにより、生細胞について解析した（図３）。
【実施例５】
【０１３９】
ＳＣＩＤマウスにおいて異種移植されたＡＢＣ型のＡＲＳ２陽性ヒトＤＢＬＣ細胞の増殖の、毒素コンジュゲートＡＲＳ２による特異的阻害
５〜７週齢の雌ＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｋｏｌｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。マトリゲル１つ当たり１００μｌのＰＢＳ中のＡＲＳ２陽性ＯＣＩ−ＬＹ３細胞５×１０６個ずつを、０日目に、５〜７週齢の雌ＳＣＩＤ  ｂｅｉｇｅマウスの脇腹へと、皮下注射した。２００μｌのＡＲＳ２−ＥＴＡまたは対照としてのＮＲＢ１−ＥＴＡを、それぞれ、ＰＢＳ中、１ｍｌ当たりの毒素７５μｇの用量（dosis）で、腫瘍接種後６日目に、尾静脈へと、１回注射した。腫瘍直径は、スライド式キャリパーを使用して、２つの直交方向において、毎日測定した。腫瘍容量は、Ｖ＝（π／６）×最小直径×最大直径に従い計算した。ＡＲＳ２−ＥＴＡ（緑線）およびＡＲＢ１−ＥＴＡにより処置された３匹ずつのマウスによる結果を、図４に示す。
【実施例６】
【０１４０】
ＣＤ３−ＡＲＳ２の、ＤＬＢＣＬ細胞株への結合
背景
自己抗原は、異なる型のＢ細胞新生物の発生において重要な役割を果たすことが疑われている。ＣＬＬ、ＭＣＬにおける、定型的なＩｇＨｖレパートリーの制限的使用であり、ごく近年、ＤＬＢＣＬにおいても発見された制限的使用は、この仮説を示唆する。ＡＲＳ２は、本明細書においてＡＲＳ２反応性リンパ腫と称する、ＤＬＢＣＬのうちの約５％に対する増殖刺激性自己抗原であって、ＤＬＢＣＬのうちの著明な部分のＢ細胞受容体（ＢＣＲ）に、高アフィニティーにより結合する自己抗原として近年同定された。本発明者らは、ＣＤ３に対する組換え単鎖断片（ｓｃＦｖ）へと連結された、ＡＲＳ２に対するｓｃＦｖを含有する二特異性生成物（ＣＤ３−ＡＲＳ２）をデザインした。Ｔ細胞を、リンパ腫細胞へと再指向化するために、一方の部位は、ヒトＴ細胞のＴ細胞共受容体であるＣＤ３に係合し、他の部位は、ＡＲＳ２反応性リンパ腫のＢ細胞受容体を、高特異性により認識する。本発明者らは、この二特異性コンストラクトを、ＡＲＳ２反応性リンパ腫細胞株に対する選択的細胞傷害作用について調べた。
【０１４１】
材料および方法
ＯＫＴ  ３ハイブリドーマのＶＬ遺伝子およびＶＨ遺伝子と、ＡＲＳ２のエピトープを含有する３３アミノ酸のＤＮＡ配列とを、標準的なクローニング法により、ｐｃＤＮＡ  ３．１ベクターへとクローニングした。ＶＬを、ＡＲＳ２エピトープへと連結するのと同様に、ＶＨとＶＬとを、グリシン−セリンリンカーにより連結する結果として、ＶＨ−ＧｌｙＳｅｒ−ＶＬ−ＧｌｙＳｅｒ−ＡＲＳ２ペプチド鎖をもたらした。その後の検出および精製のために、ヒスチジンテールを組み入れた。
【０１４２】
二特異性コンストラクトを作製するために、最終的なクローニング産物を、ＨＥＫ細胞にトランスフェクトした。リンパ腫細胞株（ＯＣＩ−Ｌｙ  ３、Ｕ２９３２、ＨＢＬ−１）およびＰＢＭＣへの結合能は、フローサイトメトリーにより評価した。モノクローナル抗Ｈｉｓタグ抗体を伴うインキュベーションの後において、ＣＤ３−ＡＲＳ２を検出するために、ウェスタンブロット解析を使用した。細胞傷害作用は、ＬＤＨ放出アッセイにより査定した。
【０１４３】
ＨＥＫ  ２９３細胞内のトランスフェクションは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製のＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ（商標）ＨＰ  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用して行った。リンパ腫細胞株（ＯＣＩ−Ｌｙ  ３、Ｕ２９３２、ＨＢＬ−１）およびＰＢＭＣへの結合能は、フローサイトメトリーにより評価した。モノクローナル抗Ｈｉｓタグ抗体を伴うインキュベーションの後において、ＣＤ３−ＡＲＳ２を検出するために、ウェスタンブロット解析を使用した。タンパク質の精製は、コバルトベースの「固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）」を使用して達した。この技法は、ヒスチジンでタグ付けされたタンパク質、例えば、ＣＤ３−ＡＲＳ２に結合する磁気ビーズを使用する。細胞傷害作用は、ＬＤＨ放出アッセイ（Ｒｏｃｈｅ製の「細胞傷害作用検出キット」）により査定した。
【０１４４】
使用したプライマーは、以下：
CD3-VH-HindIII (5'-3'):
AAGCTTGCCACCATGCAGGTCCAGCTGCAGCAG
CD3-VH-BamHI (5'-3'):
GGATCCACCACCACCGGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCTGTTGTTTTGGCTGAGGA
CD3-VK-BamHI (5'-3'):
GGATCCCAAATTGTTCTCACCCAGTC
CD3-VK-EcoRI (5'-3'):
GAATTCGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCAGTTGGTGCAGTATCAGCC
ARS2 AA342-EcoRV (5'-3'):
GATATCATGAAGGAAGCCAAAAAGAGTAGC
ARS2 AA375-His-SmaI (5'-3'):
CCCGGGTTAATGGTGGTGGTGATGATGAGCGCTCTCTGACTCCGACTCAGAC
の通りであった。
【０１４５】
結果
本発明者らによるＣＤ３−ＡＲＳ２二特異性コンストラクトは、Ｔ細胞上のＣＤ３と、それらのＢ細胞受容体を介して、ＡＲＳ２反応性リンパ腫細胞株とに同時に結合する。本発明者らによるＣＤ３−ＡＲＳ２二特異性コンストラクトは、２５０ｎｇ／ｍｌという低濃度下、エフェクター−標的比を１０：１として、もっぱらＡＲＳ２反応性リンパ腫細胞株において、迅速な細胞傷害作用を誘導する（図５、６）。特異的な細胞介在性細胞傷害作用は、４時間後に４０％に達した。異なる特異性のＢＣＲを伴うリンパ腫細胞株は、影響を受けていない（図７）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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