(57)【要約】  本発明は、ヒアルロン酸又はその誘導体の分解を阻害する組成物に関し、より詳細には、２-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムを含有することでヒアルロニダーゼ活性に対する抵抗性が増加した、ヒアルロン酸又はその誘導体の分解抑制用組成物、及び前記分解抑制用組成物とヒアルロン酸又はその誘導体とを含有する生体投与又は美容整形用組成物、特に生体組織修復用組成物に関する。【選択図】図１
2018507213.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）を有効成分として含有する、ヒアルロン酸又はその誘導体の分解抑制剤。
【請求項２】
２-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）を有効成分として含有する、ヒアルロン酸又はその誘導体の分解抑制用組成物。
【請求項３】
前記２-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムは、組成物の総重量に対して０．０００１〜２０重量％の量で含有されることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の分解抑制剤又は請求項２に記載の分解抑制用組成物、及びヒアルロン酸又はその誘導体を含有する生体投与又は美容整形用組成物。
【請求項５】
前記組成物は、生体組織修復用であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、皮膚の保湿用であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物は、皮膚の弾力増進用であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は、皮膚のしわ改善用であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物は、皮膚のボリューム増加用であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、皮膚の老化防止用であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、皮膚の美白用であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物は、皮膚外用剤の形態で剤形化されることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の分解抑制剤又は請求項２に記載の分解抑制用組成物、及び生分解性高分子を有効成分として含有する生体組織修復用のプレフィルドシリンジ（ｐｒｅｆｉｌｌｅｄ  ｓｙｒｉｎｇｅ）。
【請求項１４】
前記生分解性高分子は、ヒアルロン酸又はその誘導体であることを特徴とする、請求項１３に記載のプレフィルドシリンジ。
【請求項１５】
請求項１に記載の分解抑制剤又は請求項２に記載の分解抑制用組成物、及び生分解性高分子を有効成分として含有する、生体組織修復用注射剤。
【請求項１６】
前記生分解性高分子は、ヒアルロン酸又はその誘導体であることを特徴とする、請求項１５に記載の注射剤。
【請求項１７】
前記注射剤は、バイアル（ｖｉａｌ）の形態で剤形化されることを特徴とする、請求項１６に記載の注射剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸又はその誘導体の分解を阻害する組成物に関し、より詳細には、２-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムを含有することによってヒアルロニダーゼ活性に対する抵抗性が増加したヒアルロン酸又はその誘導体の分解抑制剤、及び前記分解抑制剤とヒアルロン酸又はその誘導体とを含有する生体投与又は美容整形用組成物、特に、生体組織修復用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、アミノ酸とウロン酸からなる複雑な多糖類の一つで、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸が交互に鎖状に結合した分子量が２０万〜４０万からなる高分子化合物である。細胞外基質の主構成成分として水分保持、細胞間の間隔維持、細胞成長因子並びに栄養成分の貯蔵及び拡散に関与するだけでなく、細胞の分裂と分化、移動等に関与する。ヒアルロン酸は、動物のガラス体、関節液、軟骨、皮膚等に多く存在する成分で、多量の水と結合してゲル状態になって、関節の潤滑作用や皮膚の柔軟性等に関与し、粘性が大きいため細菌の侵入や毒物の皮膚への浸透を防ぐのにも重要な役割をする。
【０００３】
前記ヒアルロン酸は、全ての生きている有機体に自然の状態で存在する成分であり、哺乳類の体内に存在するヒアルロン酸の５０％以上が皮膚、特に、表皮の細胞間の間隔と真皮の結締組織に分布することが報告されており、このようなヒアルロン酸は、主に角質形成細胞と線維芽細胞によって合成されることが知られている。ヒアルロン酸は、皮膚に弾力を与え、皮膚の損傷時に皮膚の下層部の損傷を減らす役割をする。それに、重要なコラーゲンの細胞の間への動きを円滑にし、骨や関節の動きを円滑にする潤滑油のような役割をする。ヒアルロン酸はまた外部からのバクテリア等の物質の浸透を予防して皮膚感染等の疾病を予防する役割をする。
【０００４】
年をとるにつれて皮膚にあるヒアルロン酸の量が減少し、その生産能力も減ってくるが、通常１８歳の前後に最も高く、美しくボリュームのある姿になり、その後は減少すると知られている。このように、ヒアルロン酸の量は、老化と共に人間の皮膚から減少するが、これが老化に伴う皮膚弾力の低下及び水分含有量の減少の直接的な原因の一つである。
【０００５】
一方、２-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムは、シクロホスファミド及びイホスファミドを伴う抗がん療法でアジュバントとして使用される有機硫黄化合物であって、シクロホスファミド及びイホスファミドの使用による出血性膀胱炎及び血尿の発生率を低下させるための薬物として主に使用されてきた。また、米国特許公開第２０１４−１４２０６３号は、２-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムのようなチオール添加剤がヒドロゲルの形成過程を促進し、形成されたヒドロゲルの分解を促進することを記述しているが、２-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムが皮膚又は皮膚の組織内でどのように作用するかについては具体的に明らかになっていない。
【０００６】
既存においては、ヒアルロン酸の分解を防止するために、ヒアルロン酸フィラーを構成するゲルとゾルの比率を調整することでヒアルロン酸の分解を遅らせる方法があったが、このような方法では、ヒアルロン酸の分解を効果的に防ぐのには限界があった。
【０００７】
また、フランスのＶｉｖａｃｙ社が開発したスタイレージフィラー(Stylage filler)は、抗酸化剤であるマンニトールを添加して活性酸素を抑制することによってヒアルロン酸の分解を遅らせることができると言われているが、これに対する具体的な作用機序は解明されておらず、それに、マンニトールのような抗酸化剤を用いた活性酸素の抑制は、ヒアルロン酸の分解を直接的に抑制できる方法とは言えない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】韓国特許公開第１０−２０１１−００５７８９５号（２０１１年６月１日公開）
【特許文献２】米国特許公開第２０１４−１４２０６３号（２０１４年５月２２日公開）
【特許文献３】韓国特許公開第１０−２０１３−０１３２５０３号（２０１３年１２月４日公開）
【特許文献４】韓国特許公開第１０−２００４−００２０７８９号（２００４年３月９日公開）
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】キム・ミスク他、ヒアルロン酸誘導体の生体材料応用、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００８）１２（３）：８３−９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、ヒアルロン酸又はその誘導体の量（組成物中の残存量）及び／又は寿命を増加できるアプローチとして、ヒアルロニダーゼによるヒアルロン酸又はその誘導体の分解を防止できる物質を見つけようとし、驚くべきことには、２-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムが、ヒアルロニダーゼに対する抵抗性を付与することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
従って、本発明は、２-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムを使用することによってヒアルロニダーゼに対する抵抗性を有する組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記の目的を達成するために、本発明は、２-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）を有効成分として含有する、ヒアルロン酸又はその誘導体の分解抑制剤を提供する。
【００１３】
また、本発明は、２-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムを有効成分として含有する、ヒアルロン酸又はその誘導体の分解抑制用組成物を提供する。
【００１４】
また、本発明は、前記分解抑制剤とヒアルロン酸又はその誘導体とを含有する生体投与又は美容整形用組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のヒアルロン酸又はその誘導体の分解抑制剤は、２-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムを含有することによってヒアルロニダーゼによるヒアルロン酸の分解に対して増加した抵抗性を有することになり、従って、皮膚又は皮膚組織内のヒアルロン酸又はその誘導体の減少を防止し、また、老化に伴う皮膚弾力の低下及び水分含有量の減少を効果的に抑制することができる。また、本発明の組成物は、２-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムとヒアルロン酸とを含有することによって効果的に皮膚のボリュームを増加させて、これを長期間維持させることができる優れた生体組織の修復効果を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ヒアルロニダーゼによるヒアルロン酸の分解に対する抵抗性を測定した結果を示す。
【図２】図２は、ＭＥＳＮＡの濃度別の細胞毒性を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ヒアルロニダーゼによるヒアルロン酸の分解を抑制できる組成物に関し、具体的には、２-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムを有効成分として含有する、ヒアルロン酸又はその誘導体の分解抑制剤に関する。
【００１８】
また、本発明は、２-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムを有効成分として含有する、ヒアルロン酸又はその誘導体の分解抑制用組成物を提供する。
【００１９】
また、本発明は、前記分解抑制剤又は分解抑制用組成物と生分解性高分子、好ましくは、ヒアルロン酸又はその誘導体を含有する組成物、特に、生体投与又は美容整形用組成物、好ましくは、生体組織の修復用組成物に関する。
【００２０】
本明細書で用いられる「生分解性高分子」とは、生体に挿入時に、体内で分解が可能な物質を言い、その例としては、ヒアルロン酸、コラーゲン、アルブミン、キトサン等のような天然高分子、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリヒドロキシバレート等のようなポリエステル系列の合成高分子がある。
【００２１】
本明細書において、ヒアルロン酸の誘導体としては、その種類が特に限定されているものではないが、ヒアルロン酸−コラーゲン複合体、ヒアルロン酸−ポリカルボン酸含有の天然の高分子複合体、ヒアルロン酸−キトサン複合体、ヒアルロン酸系ブレンド（例えば、ポリビニルアルコール又はポリアクリル酸とヒアルロン酸とのブレンド）、グラフトヒアルロン酸の共重合体〔キム・ミスク他、ヒアルロン酸誘導体の生体材料の応用、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００８）１２（３）：８３−９５〕等を含む。
【００２２】
本発明の組成物には、２−メルカプトエタンスルホネート及びその塩が含まれ、好ましくは、２−メルカプトエタンスルホネートの金属塩が使用され得る。また、前記金属塩を形成する金属イオンとしては、その種類が特に限定されるものではないが、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム等を含み、特に好ましくはナトリウム陽イオンが使用される。
【００２３】
本発明で使用される２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムは、下記の化学式１で表される化合物であって、２−メルカプトエタンスルホネートＮａ（２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ  Ｎａ）又は簡略にＭＥＳＮＡと称する（以下、「ＭＥＳＮＡ」と称する）。
【００２４】
【化１】
2018507213.tif 000003
【００２５】
本発明の組成物は、２−メルカプトエタンスルホネート及びその塩、好ましくは、ＭＥＳＮＡを組成物の総重量に対して０．０００１〜２０重量％、好ましくは０．０００５〜１５重量％、より好ましくは０．００１〜１０重量％、さらに好ましくは０．００５〜２重量％、さらにより好ましくは０．０１〜１．５重量％の量で含有する。０．０００１重量％未満の場合、所望の効果が得られず、皮膚に対する刺激及び他の成分との配合を考慮すると、２０重量％を超えることは適切ではない。
【００２６】
また、本発明の生体投与用組成物が、注射剤又はフィラー等のような液体形態の非経口投与剤に剤形化される場合には、最終生成物の浸透圧が生体投与に適した浸透圧の範囲、すなわち、人体内部の浸透圧と同様の２５０〜３５０ｍＯｓｍ、好ましくは３００〜３５０ｍＯｓｍの範囲になるように２−メルカプトエタンスルホネート及びその塩、好ましくはＭＥＳＮＡを含ませることがよい。このような浸透圧の範囲を考慮すると、液体形態の非経口投与剤において２−メルカプトエタンスルホネート及びその塩、好ましくはＭＥＳＮＡは、組成物の体積１ｍＬ当たり０．０００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１〜２０ｍｇ、より好ましくは組成物の体積１ｍＬ当たり０．００１〜１５ｍｇの量で含まれ得る。
【００２７】
本発明によると、２−メルカプトエタンスルホネート及びその塩、好ましくはＭＥＳＮＡは、酵素、特にヒアルロニダーゼの活性によるヒアルロン酸又はその誘導体の分解を抑制することで、皮膚の保湿力と皮膚の弾力及びボリュームとが低下することを効果的に防ぐことができ、さらに、皮膚の老化を防止する効果を示す。
【００２８】
また、本発明によって２−メルカプトエタンスルホネート及びその塩、好ましくはＭＥＳＮＡを有効成分として含む組成物は、前記効果と合わせて皮膚の美白効果も表し得る。
【００２９】
本発明の生体投与用組成物は、生分解性高分子、好ましくはヒアルロン酸又はその誘導体を組成物の総重量に対して０．００１〜９０重量％、好ましくは０．００５〜７０重量％、より好ましくは０．０１〜５０重量％の量で含有する。
【００３０】
このように、ヒアルロン酸とＭＥＳＮＡを一緒に使用すると、ヒアルロン酸の分解を抑制すると同時に、細胞内にヒアルロン酸を保持する時間を顕著に増加させることになり、皮膚の保湿力と弾力を増進させることはもちろん、皮膚のボリュームを増進させるのにも役立ち、さらに、皮膚老化の改善にも優れた効果が得られる。
【００３１】
また、本発明による組成物、特に好ましくはＭＥＳＮＡを含有する組成物、より好ましくはヒアルロン酸とＭＥＳＮＡを全て含有する組成物を、注射剤又はフィラー等のような液体形態の非経口投与剤として、目下、頬、額、鼻等のような皮膚組織のボリューム増加を希望する部位に適用すると、優れた皮膚の修復効果が得られるだけでなく、前記効果をより長期間維持させることができる。
【００３２】
また、本発明は、２−メルカプトエタンスルホネート及びその塩、好ましくはＭＥＳＮＡを用いることで、ヒアルロン酸の分解を抑制する方法を提供する。
【００３３】
本発明の組成物は、また、皮膚外用剤組成物、特に化粧料組成物として剤形化され得、化粧品学又は皮膚科学的に許容可能な媒質又は基材を含有して剤形化され得る。これは、局所適用に適した全ての剤形として、例えば、溶液、ゲル、固体、練りこねた無水生成物、水相に油相を分散させて得られたエマルジョン、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微細顆粒球又はイオン型（リポソーム）及び非イオン型の小嚢分散剤の形態で、又はクリーム、スキン、ローション、パウダー、軟膏、スプレー若しくはコンシーラースティックの形態で提供され得る。また、フォーム（Ｆｏａｍ）の形態で、又は圧縮された推進剤をさらに含有したエアロゾール組成物の形態としても使用され得る。
【００３４】
本発明の組成物は、顔、特に、目の周り、口の周り、頬、又は額部位、首、手、足等に使用され得るが、それらに限定されるものではなく、具体的に柔軟化粧水（スキンローション及びミルクローション）、栄養化粧水、エッセンス、栄養クリーム、マッサージクリーム、パック、ジェル、エッセンス、アイクリーム、アイエッセンス、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、パウダー、ボディーローション、ボディークリーム、ボディーオイル及びボディーエッセンスからなる群より選択された一つ以上の剤形に製造され得るが、それに限定されるものではない。これらの組成物は、当該分野の通常の方法によって製造され得る。
【００３５】
また、本発明による組成物は、脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤、ゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤（ｆｏａｍｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型若しくは非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、キレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、親水性若しくは親油性活性剤、脂質小嚢又は化粧品に通常使用される任意の他の成分のような化粧品学又は皮膚科学分野において通常的に使用される補助剤を含有することができる。前記補助剤は、化粧品学又は皮膚科学の分野で一般的に使用される量で導入される。
【００３６】
また、本発明の化粧料組成物は、効果を増加させるために皮膚への吸収促進物質を含有することができる。
【００３７】
また、本発明の組成物は、薬学組成物として剤形化され得る。本発明による組成物を医薬品に適用する場合には、本発明で使用される有効成分に常用される無機又は有機の担体を加えて半固体又は液状の形態で非経口投与剤に剤形化することができ、本発明による前記薬学組成物は、非経口、直腸、局所、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下等に投与され得る。
【００３８】
前記非経口投与のための剤形としては、注射剤、フィラー、点滴剤、軟膏、ローション、スプレー、懸濁剤、油剤、坐剤等が挙げられる。本発明による組成物は、当業界に広く知られている通常の方法によって実施することによって、有効成分を容易に剤形化することができ、この際、界面活性剤、賦形剤、着色料、香辛料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、その他常用する補助剤を適宜使用することができる。
【００３９】
特に、本発明の組成物が、注射剤、フィラー等の形態で剤形化される場合、プレフィルドシリンジ（ｐｒｅｆｉｌｌｅｄ  ｓｙｒｉｎｇｅ）、バイアル（ｖｉａｌ）等に剤形化され得る。
【００４０】
本発明の薬学組成物の有効成分の投与容量は、投与される対象の年齢、性別、体重、病履状態及びその重症度、投与経路又は処方者の判断によって異なる。このような因子に基づいて適当な容量の決定は、当業者の水準内にあり、その１日の投与容量は、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、より具体的には５ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日になり得るが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００４１】
以下、試験例及び剤形例を挙げ、本発明の構成及び効果をより具体的に説明する。しかし、これら試験例及び剤形例は、本発明に対する理解を助けるけるための例示の目的にのみ提供されるだけで、本発明の範疇及び範囲が下記例によって限定されるものではない。
【００４２】
[試験例１]ヒアルロン酸の分解に対する抵抗性の評価
１．試料
酵素の分解抵抗性の試験のために実施例１及び比較例１〜２の試験試料を準備した。この際、実施例１、比較例１及び比較例２は、ヒアルロニダーゼの分解抵抗物質の候補群としてそれぞれＭＥＳＮＡ、ＮａＣｌ及びマンニトール中の１種を試験物質として使用し、試験物質を含むゾル（ｓｏｌ）状態の液体とヒアルロン酸（ＨＡ）を含むゲル（ｇｅｌ）状態の液体とから構成され、ゾルとゲルを６：４の体積比率で混合したものを試料として使用した。具体的な組成は、下記の表１のとおりであり、ゲルとして使用したヒアルロン酸物質に対しては、下記に具体的に記載した。
【００４３】
【表１】
2018507213.tif 000004
１）リン酸塩バッファー１０ｍＭ
＝リン酸水素ナトリウム脱水物（Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｍｏｎｏｂａｓｉｃ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）０．４９ｇ
＋リン酸水素二ナトリウム脱水物（Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｂａｓｉｃ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）２．４５ｇ
＋蒸留水  １Ｌ
２）リドカイン：０．３％の濃度になるように添加する。
３）人体内部の浸透圧が、２５０〜３５０ｍＯｓｍであるので、ＭＥＳＮＡ、ＮａＣｌ及びマンニトールを最終浸透圧が３００ｍＯｓｍになるように使用する。
−ＭＥＳＮＡ：Ｊｉａｎｇｓｕ  Ｈｅｎｇｒｕｉ  Ｍｅｄｉｃｉｎ．Ｃｏ.、バッチ番号６４２１３０９０４
−ＮａＣｌ：Ｓａｍｃｈｕｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ、ロット０８０２０７
−マンニトール：Ｓｉｇｍａ、ロット３１Ｋ０００３
【００４４】
４）ヒアルロン酸：
ナトリウムヒアルロネート繊維（ＮａＨＡ、Ｍｗ＝０．５〜３ＭＤａ）１ｇを１０ｇの１％水酸化ナトリウム溶液と混合し、混合物を５時間水和するように置いた。ここで、１５０ｍｇの１,４−ブタンジオールジグリシジルエーテルをＮａＨＡゲルに添加して混合物を均一に混合し、生成された架橋結合されたヒドロゲルを同モル量の塩酸（ＨＣｌ）で中和し、これをＰＢＳ（ｐＨ約７）中で膨張させた。このようにして得られたヒドロゲルを機械的に均質化し、これを実施例及び比較例の製造に使用した。
【００４５】
２．試験プロトコール
１）前処理
実施例１、比較例１〜２の試料を１５ｍＬチューブにそれぞれ０．１ｍＬずつ精密に定量して入れた。リン酸塩バッファー（ｐＨ７．０、１０ｍＭのＰＢＳ、ＮａＣｌ  ０．８％、以下「ＰＢＳ」と言う。）にヒアルロニダーゼを溶かして１００ＩＵ／ｍＬになるように作り（１５００ＩＵ／１５ｍＬ）、前記１００ＩＵ／ｍＬのヒアルロニダーゼ溶液を各試料別に下記の表２のように投与し、ＰＢＳを加えて総１ｍＬになるようにした。
【００４６】
【表２】
2018507213.tif 000005
【００４７】
２）処理
実施例１、比較例１〜２それぞれの試料に酵素溶液を投与した後、３７℃、８０ｒｐｍで３０分間反応させた。各試料に０．１ＮのＨＣｌ溶液１ｍＬずつを投入し、１０秒間強力に攪拌を行った後、反応を停止させた。攪拌完了後、０．１ＮのＮａＯＨ１ｍＬとＰＢＳを全ての試料にそれぞれ加えて合計４ｍＬになるように中和した。４ｍＬになった溶液は、孔直径が０．２μｍの膜で濾した後、冷蔵保管した。
【００４８】
３．定量−カルバゾール分析
カルバゾールと反応させてグルクロン酸の含量を測定した。具体的には、実施例１、比較例１又は比較例２を０．１７０ｇずつ精密に測定して、これをそれぞれ水に溶解し、１００ｇの水溶液を作り、前記水溶液１０ｇを精密に測定し、そこに水を入れて正確に２００ｇにした後、これを検液とし、実施例１、比較例１〜２をそれぞれ含む３種の検液を製造した。減圧にて恒量に乾燥したＤ−グルクロン酸約０．１ｇを精密に測定し、そこに水を入れて正確に１００ｇの水溶液を作り、前記水溶液の一定量に水を入れて水溶液１ｇ中のグルクロン酸をそれぞれ６．５μｇ、１６．３μｇ、３２．５μｇ、４８．８μｇ及び６５μｇを含有する溶液５種を作り、標準液とした。試験管２５本を用意し、１〜２５に表示して氷水に入れた。前記５種の標準液１．０ｍＬずつを各濃度について３回取って試験管に入れて標準液試験管（１〜１５）にした後、３種の検液を各１．０ｍＬずつ３回取って９本の試験管に入れて検液試験管（１６〜２４）にした。最後の試験管には、水のみを入れて空試験液試験管（２５）にした。各試験管に、新たに作った０．９５ｗ／ｖ％硼砂の硫酸溶液を５ｍＬずつ入れてプラスチックの蓋で気密にして塞ぎ、振って混ぜた後、水浴で１５分間放置し、その後、氷水で冷ました。各試験管に０．１２５ｗ／ｖ％カルバゾールのエタノール溶液を０．２ｍＬずつ入れて蓋で気密にして閉め、振って混ぜた後、水浴で１５分間放置し、室温で冷ました。これらの液を持って紫外可視部吸光度測定法によって空試験液を対照として波長５３０ｎｍで吸光度を測定した。標準液の平均吸光度から作成した検量線（下記数学式１がそれに該当する）を使い、検液中のＤ−グルクロン酸の平均濃度を求めた。数学式１は、グルクロン酸がヒアルロン酸ナトリウム内に含まれた構造であるため、グルクロン酸をコントロール標準液としてヒアルロン酸ナトリウムの総量を計算する式であり、乾燥された減量を通じて分解されたヒアルロン酸の百分率を算定することができる。
【００４９】
【数１】
2018507213.tif 000006
【００５０】
Ｃｇ：検液中のＤ−グルクロン酸の平均濃度（ｍｇ／ｇ）
Ｃｓ：検液中の実施例１、比較例１又は比較例２の平均濃度（ｍｇ／ｇ）
Ｚ：Ｄ−グルクロン酸の含量（％）
ｈ：乾燥減量（％）
４０１．３：二糖類（ヒアルロン酸）の相対分子量
１９４．１：グルクロン酸の相対分子量
【００５１】
前記数学式１によって求めた残存ヒアルロン酸ナトリウムの量を基にして、分解されたヒアルロン酸の百分率を算定し、それに対する結果を図１に示した。
図１を見ると、３０分間酵素処理した結果、試験物質、すなわち、ＭＥＳＮＡ、ＮａＣｌ又はマンニトールを含む実施例１、比較例１及び２の試料の場合、いずれもある程度ヒアルロニダーゼによるヒアルロン酸の分解に対する抵抗性を示すものの、ヒアルロン酸の分解率が比較例１の場合には８８％であり、比較例２の場合には、９２％であることが示され、ヒアルロニダーゼによるヒアルロン酸の分解に対する抵抗性の程度が微弱なレベルである反面、実施例１の場合は、ヒアルロン酸の分解率が７９％程度で、ヒアルロン酸の分解がかなり阻害されたことを確認することができる。
【００５２】
これは、ＭＥＳＮＡがヒアルロニダーゼの分解活性に対して高い抵抗性を示し、ＭＥＳＮＡを混合した場合には、ヒアルロン酸がヒアルロニダーゼによって分解されることを効果的に抑制できることを示唆する。
【００５３】
[試験例２]ＭＥＳＮＡに対する安定性評価−Ｍｅｌａｎ ａ細胞での細胞毒性評価
ＭＥＳＮＡの安定性を検証するために、Ｍｅｌａｎ ａ細胞で試験物質の投与量による細胞毒性を評価した。
【００５４】
下記の表３に示すように、ＭＥＳＮＡを濃度別に細胞培養培地〔ＲＰＭＩ  ｍｅｄｉａ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ；Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含む〕に希釈して細胞毒性テストを行った。細胞毒性テストは、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＣＣＫ８  ｋｉｔ；Ｄｏｊｉｎｄｏ）を使用して行われた。具体的な評価方法は次のようである。
【００５５】
ＣＣＫ８試薬と細胞培養培地とを１：１０の体積比率で混ぜ、細胞が生育する４８ウェルに５００μＬずつ入れて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで細胞を１時間半培養した。培養後、培地だけを集めてＯ．Ｄ値（ｓｙｎｅｒｇｙ２、Ｂｉｏｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．）を４５０ｎｍで測定した。
【００５６】
何も処理していないグループ１のＯ．Ｄ値を１００％とし、これに対比した残りグループのＯ．Ｄ値を変換計算した。対比値が８０％以上の場合、毒性がないと判断した。結果は、表４及び図２に示した。
【００５７】
【表３】
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【００５８】
【表４】
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【００５９】
前記表４及び図２に示すように、評価した全てのグループで細胞毒性は示さなかった。従って、これよりＭＥＳＮＡは、副作用のない安定な物質であることを確認することができた。
【００６０】
[参考例１]剤形例１及び比較剤形例１〜２の製造
下記の表５の組成によって剤形例１及び比較剤形例１〜２を製造した（単位：重量％）。
【００６１】
【表５】
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【００６２】
〈製造方法〉
（１）水相成分（１〜８）を室温で均一に混合する。
（２）エタノール相成分（９〜１２）を５０〜５５℃で加熱して均一に溶解及び混合する。
（３）攪拌下で前記（２）に前記（１）を投入して均一に可溶化する。
【００６３】
[試験例３]皮膚弾力の改善効果の評価
本発明による組成物の皮膚弾力の改善効果を確認するために、前記剤形例１及び比較剤形例１〜２を用いて次のように試験した。
【００６４】
３０〜４０代女性３５名をそれぞれ５名ずつ７組に分け、各組に対してそれぞれ前記剤形例１、比較剤形例１又は比較剤形例２を毎日２回（朝、夜）ずつ４週間顔面に塗布した。塗布開始前と、塗布後の４週間が経過した時点とで皮膚弾力の測定器（Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ  ＳＥＭ５７５、Ｃ＋Ｋ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｃｏ．、ドイツ）を用いて皮膚の弾力程度を測定し、皮膚弾力の改善効果を算定した。その結果を示した表６の結果値は、皮膚の粘弾性（ｖｉｓｃｏｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ）性質の改善程度を意味する。
【００６５】
【表６】
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【００６６】
前記表６に示した結果から、ＭＥＳＮＡを含む剤形例１の場合、ＭＥＳＮＡを含有しない比較剤形例１及び２に比べ１５２％〜１６８％程度に顕著に優れた皮膚弾力の増進効果を示すことを確認することができた。
【００６７】
[試験例４]リフティング効果の官能評価
本発明による組成物のリフティング効果を確認するために、前記剤形例１及び比較剤形例１〜２を用いて次のように試験した。
【００６８】
皮膚のたるみで悩む２５〜３５歳の女性３５名をそれぞれ５名ずつ７組に分けて、各組に対してそれぞれ前記剤形例１、比較剤形例１又は比較剤形例２を毎日２回（朝、夜）ずつ４週間、一般的な化粧水のような方法で使用するようにした後、使用開始後、１週間隔で使用者の皮膚リフティング効能感の程度を下記の評価基準に従ってアンケートによる評価を行った。その結果は、下記表７に示した。
【００６９】
〈評価基準〉
＋＋＋：非常に良好な改善効果がある
＋＋：かなりの改善効果がある
＋：少しの改善効果がある
±：改善効果はないが、悪化してもいない
−：改善効果がなく、むしろ悪化する
【００７０】
【表７】
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【００７１】
前記表７に示した結果から、ＭＥＳＮＡを含む剤形例１の場合、ＭＥＳＮＡを含有しない比較剤形例１及び２に比べ迅速でより優れたリフティング効能を示すことを確認することができた。
【００７２】
[試験例５]皮膚の障壁機能回復効果の測定
本発明による組成物が皮膚損傷によって損傷された皮膚障壁機能の回復に及ぼす効果を確認するために、前記剤形例１及び比較剤形例１〜２を用いて次のような試験を行った。
【００７３】
成人男女１０人の上膊をテープストリッピング（Ｔａｐｅ  Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ）方法を用いて皮膚障壁に損傷を与え、前記剤形例１、比較剤形例１又は比較剤形例２の３つの組成物をそれぞれ毎日塗布しながら７日間、１日に１回経皮の水分損失量（ＴＷＥＬ）の回復程度をＶａｐｏｍｅｔｅｒ（Ｄｅｌｆｉｎ、フィンランド ）で測定比較した。実験結果は、下記の表８に示した。結果は、障壁損傷前と障壁損傷後の処理前の差を１００％基準にして比較したものである。
【００７４】
【表８】
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【００７５】
前記表８に示した結果から、ＭＥＳＮＡを含む剤形例１の場合、ＭＥＳＮＡを含有しない比較剤形例１及び２に比べて、早い速度で経皮の水分損失量が正常に戻り、障壁損傷が回復することを確認することができた。
【００７６】
[試験例６]皮膚保湿力の増加効果の測定
本発明による組成物の皮膚保湿改善効果を確認するために、前記剤形例１及び比較剤形例１〜２を用いて次のように試験を行った。
【００７７】
乾燥肌に分類された４０〜５０代の成人男女６０名をそれぞれ２０名ずつ３組に分け、各組に対してそれぞれ前記剤形例1、比較剤形例１又は比較剤形例２を毎日２回（朝、夜）ずつ、４週間顔面に塗布した。塗布開始前と、塗布後の１週間、２週間、４週間が経過した時点、そして塗布を中止した２週間経過（総６週間）後に、恒温、恒湿条件（２４℃、相対湿度４０％）で、皮膚の水分量測定器（Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ  ＣＭ８２５、Ｃ＋Ｋ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｃｏ.、ドイツ）で皮膚の水分量を測定した。その結果は下記の表９に示した。表９の結果は、試験開始直前に測定した皮膚の水分量測定器の値を基準として一定期間処置した後の測定値の増加分を百分率で表したものである。
【００７８】
【表９】
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【００７９】
前記表９の結果を見ると、比較剤形例１及び２を塗布した場合には、塗布が行われた４週間までは、約３０％程度の水分増加率を示したが、塗布を中止した後には、皮膚の水分量が減少する一方で、ＭＥＳＮＡを含有した剤形例１を塗布した場合には、塗布を中止した後にも３０％以上の皮膚の水分増加率を示したことを確認することができた。このことから、ＭＥＳＮＡを含有した組成物は、皮膚の保湿力改善効果に優れていることが分かる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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