(57)【要約】  本出願は、バイオマス、固体酸触媒およびセルロース系酵素またはバイオマスを有用な原料に転化するためのかかる酵素を発現する生物を含む反応混合物、および前記反応混合物を用いて発酵により産物を形成する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオマスから糖類を放出させる方法であって、
ａ）バイオマスを固体酸触媒で前処理する工程、
ｂ）前記前処理したバイオマス、工程ａ）の固体酸触媒、および１つ以上のセルラーゼ酵素および／またはヘミセルラーゼ酵素またはそれらの混合物、または１つ以上のセルラーゼ酵素および／またはヘミセルラーゼ酵素を発現可能な生物を含む、水性反応混合物を形成する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
産物を生合成的に製造する方法であって、
ａ）バイオマスを固体酸触媒で前処理する工程、
ｂ）前記前処理したバイオマス、固体酸触媒および１つ以上のセルラーゼ酵素および／またはヘミセルラーゼ酵素またはそれらの混合物、または１つ以上のセルラーゼ酵素および／またはヘミセルラーゼ酵素を発現可能な生物を含む、水性反応混合物を形成する工程；および
ｃ）工程ｂ）における前記反応混合物の存在下でまたは工程ｂ）における前記反応混合物の水性抽出物の存在下で原核生物または真核生物を培養して産物を形成する工程
を含む、前記方法。
【請求項３】
前記バイオマスが植物由来の有機物である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
工程ａ）を実質的に乾燥した条件下で行い、乾燥条件は約０．１〜約４０質量％、例えば、約０．２〜約２５質量％または約０．５〜約２０質量％の含水率の範囲であり、質量％はバイオマスおよび固体酸触媒の全質量を基準とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記植物由来の有機物が、トウモロコシ、紙、紙製品、紙屑、木材、パーティクルボード、鋸屑、農業廃棄物、下水、サイレージ、草、籾殻、バガス、綿、ジュート、麻、亜麻、竹、サイザル、アバカ、わら、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、スイッチグラス、アルファルファ、干し草、籾殻、椰子の毛、綿、合成セルロース、海藻、藻類およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
前記固体酸触媒が、表面酸性度を有する固体材料である、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記固体酸触媒が、粘土、アルミノケイ酸塩、水和アルミノケイ酸塩、またはブレンステッド酸もしくはルイス酸で処理した固体媒体である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記固体酸触媒が、カオリナイト、ハロイサイト、アタパルジャイト、モンモリロナイト、イライト、ナクライト、ディッカイト、アナウキサイト、カオリン、メタカオリン、ベントナイト、酸性ベントナイトゼオライト、硫酸もしくはメタンスルホン酸で処理された二酸化チタン、硫酸もしくはメタンスルホン酸で処理された酸化アルミニウム、アルミナ、硫酸もしくはメタンスルホン酸で処理されたアルミナ、バーミキュライト、白雲母およびタルクからなる群から選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記乾燥固体酸触媒と乾燥バイオマスとの質量比が約０．１対約１０〜約１０対約０．１、例えば、約０．２対約５〜約５対約０．２、例えば、約０．５対約２〜約２対約０．５の範囲である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前処理工程ａ）の間にバイオマスを用いて固体酸触媒に熱を適用する、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記適用される熱が、工程ａ）において約２０℃〜約１６０℃、例えば約４０℃〜約１２０℃の範囲である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前処理工程ａ）の後であるが工程ｂ）の酵素の添加前に水を加える、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記加えられる水が約６０℃〜約２４０℃、例えば約８０℃〜約１６０℃の温度範囲である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記生物が原核生物でありかつ細菌である、請求項２から１３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記細菌がグラム陽性またはグラム陰性である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記細菌がコリネバクテリウム属、バチルス属、エルウィニア属、エシェリキア属、パントエア属、ストレプトマイセス属、ザイモモナス属およびロドコッカス属からなる群から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記生物が真核生物である、請求項２から１３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
前記真核生物が、サッカロマイセス属、ハンセヌラ属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロマイセス属、ヤロウィア属、ピキア属、ジゴサッカロマイセス属、カンジダ属、シュワニオミセス属、アークスラ属、オガタエア属およびクレブシエラ属から選択される酵母である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記産物が、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，４−ブタンジオール、グリセリン、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸またはコハク酸塩、ｎ−ブチルアクリレート、セバシン酸、グルタル酸、オレイン酸、リノール酸、グリコール酸、乳酸または乳酸塩、ガンマ−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシアルカン酸、アラニン、メタン、エタン、プロパン、ペンタン、ｎ−ヘキサン、ピルビン酸塩、アスパラギン酸塩、リンゴ酸塩、バリン、ロイシンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２から１８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
工程ｂ）において前記酵素による処理の前にまたはそれと一緒に、前記固体酸触媒とバイオマスを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのタンパク質およびまたはＴｗｅｅｎ８０およびＴｗｅｅｎ２０などの界面活性剤で処理する、請求項１から１９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
工程ｂ）に続いて、固体酸触媒を工程ｂ）の反応混合物から分離して水性抽出物を形成し、前記水性抽出物を原核生物または真核生物を用いて培養して産物を形成する、請求項２から２０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
前記固体酸触媒を、工程ｂ）の反応混合物から分離し、リサイクルする、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
原核生物または真核生物を培養して産物を形成することを、工程ｂ）の反応混合物のバイオマス、固体酸触媒および酵素の存在下で行う、請求項２から２０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
前記固体酸触媒がカオリンである、請求項１から２３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
前記カオリンを前記培養産物から単離してポゾラン材料を準備する、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記培養産物から単離したカオリンを燃焼してメタカオリンを形成する、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
生合成反応混合物であって、
ａ）固体酸触媒を用いて前処理されたバイオマスおよび
ｂ）１つ以上のセルロースもしくはヘミセルラーゼ酵素またはそれらの組み合わせ、または１つ以上のセルラーゼ酵素および／またはヘミセルラーゼ酵素を発現可能な生物
を含む、前記生合成反応混合物。
【請求項２８】
前記混合物が、原核生物または真核生物を有する発酵ブロスをさらに含有する、請求項２７記載の生合成反応混合物。
【請求項２９】
ポゾラン材料であって、
ａ）バイオマスをカオリン固体酸触媒で前処理する工程
を含む方法から製造された前記ポゾラン材料。
【請求項３０】
前記ポゾラン材料の製造方法が、
ｂ）前記前処理したバイオマス、工程ａ）のカオリン固体酸触媒、および１つ以上のセルラーゼ酵素および／またはヘミセルラーゼ酵素またはそれらの混合物、または１つ以上のセルラーゼ酵素および／またはヘミセルラーゼ酵素を発現可能な生物を含む水性反応混合物を形成する工程、および
ｃ）カオリン固体酸触媒を単離してポゾラン材料を準備する工程
をさらに含む、請求項２９記載のポゾラン材料。
【請求項３１】
前記ポゾラン材料の製造方法が、前記カオリンを加熱してメタカオリンを形成することをさらに含む、請求項２９または３０記載のポゾラン材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／１４６，５７１号明細書（U. S. Provisional Application No. 62/146,571）の利益を主張するものであり、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。
【０００２】
開示の分野
本出願は、バイオマスを有用な原料に変換するための、バイオマス、固体酸触媒およびセルロース分解性の酵素を含む反応混合物ならびに前記反応混合物を使用して発酵を介して産物を形成する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
開示の背景
「バイオマス」という用語は、化石化されていないもの、すなわち、再生可能な有機物を指す。様々な種類のバイオマスとしては、植物バイオマス（以下に定義）、動物バイオマス（動物副産物、動物廃棄物など）および都市ごみバイオマス（除去された金属やガラスなどのリサイクル可能な住宅や軽商業用ごみ）が挙げられる。
【０００４】
これらの安価なバイオマス材料の変換は、発酵産物の原料としての用途について幅広く研究されている。微生物がこれらのバイオマス原料を使用するためには、この原料を、微生物によって容易に使用され得る糖に分解する必要がある。
【０００５】
セルロース系バイオマスの前処理は、硬質細胞壁構造内の基質、セルロースおよびヘミセルロースにセルロース分解酵素を接触させるために必要な工程と考えられている。セルロース系材料バイオマス構造の扱いにくさを低減するために、何年にもわたって多くの前処理技術が開発されており、そのほとんどが高温高圧条件下で液相での何らかの形の化学処理を伴う。硫酸は、塩基または溶媒などの他の化学物質と比較して安価で、かつヘミセルロースの有効な可溶化をもたらし得るため、最も一般的に添加される化学物質の１つである。
【０００６】
濃硫酸は、セルロースおよびヘミセルロースの両方をモノマー糖に可溶化するために利用することができるが、この方法は、通常、これらの分解産物のほとんどが発酵生物に対して非常に阻害的であるため、大量の分解産物の形成による低い加水分解収率およびそれに続く非常に低い発酵収率が問題となる。したがって、ほとんどの酸の前処理は低濃度の硫酸で行われる。しかしながら、重大な欠点がある。第一に、ヘミセルロース画分は、希酸により容易に単糖に加水分解することができる。しかしながら、セルロース画分とリグニン画分はほとんど変化せず、不溶性セルロース画分をさらなる酵素加水分解工程で分解するためには通常かなりの量の酵素が必要とされる。第二に、希酸の前処理は、通常、高温高圧条件下にて液相反応器内で行われる。酸性触媒とバイオマスとを確実に最良に混合するためには、十分な量の水が必要であるか、または予備浸漬工程が必要である。これらの条件では希酸の腐食作用が強いため、通常は反応器のために非常に高価な建材が必要である。最後に、酵素加水分解工程または発酵工程を行う前に酸を中和しなければならない。安価な水酸化カルシウムで中和すると、多量の石膏の形成が下流プロセスにとって問題となり得る。したがって、様々な発酵産物の生合成的な製造のための発酵性糖の製造に適した、より効率的で安価なリグノセルロース系材料の製造方法が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
開示の概要
本発明者らは、固体酸触媒が、バイオマスのセルロース画分とヘミセルロース画分の両方を固相反応においてオリゴマー糖に加水分解し得ることを発見した。さらに重要なことに、本発明者らは、セルロース分解酵素を用いてオリゴマー糖を分解し、残留不溶性バイオマス物質および／または発酵生物を適用して糖を種々の発酵産物に変換する際に、固体酸触媒の存在によって酵素および／または生物が不活性化しないことも発見した。したがって、酵素加水分解および／または発酵中の固体酸触媒の除去が回避され、このことはバイオマス変換プロセスのための設備投資と処理コストの大幅な節約となる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明者らは、バイオマス材料の効果的な加水分解に有用な反応混合物と、バイオマスを分解して使用可能な糖に転化し、かつ産物の発酵に使用するための原料を生合成的に製造する方法との両方を開示する。このように、この出願はいくつかの方法に関するものである。
【０００９】
バイオマスから糖類を放出させる方法であって、ａ）バイオマスを固体酸触媒で前処理する工程、ｂ）前処理したバイオマス、固体酸触媒、および１つ以上のセルラーゼ酵素および／またはヘミセルラーゼ酵素またはそれらの混合物；または１つ以上のセルラーゼ酵素および／またはヘミセルラーゼ酵素を発現可能な生物を含む、水性反応混合物を形成する工程を含む、前記方法。
【００１０】
産物を生合成的に製造する方法であって、ａ）バイオマスを固体酸触媒で前処理する工程、ｂ）前処理したバイオマス、固体酸触媒および１つ以上のセルラーゼ酵素および／またはヘミセルラーゼ酵素またはそれらの混合物、または１つ以上のセルロース酵素および／またはヘミセルラーゼ酵素を発現可能な生物を含む、水性反応混合物を形成する工程、およびｃ）工程ｂ）における前記反応混合物の存在下でまたは工程ｂ）における前記反応混合物の水性抽出物の存在下で原核生物または真核生物を培養して産物を形成する工程を含む、前記方法。
【００１１】
生合成反応混合物であって、ａ）固体酸触媒で前処理したバイオマスおよびｂ）１つ以上のセルラーゼ酵素および／またはヘミセルラーゼ酵素またはそれらの組み合わせ、または１つ以上のセルロース酵素および／またはヘミセルラーゼ酵素を発現可能な生物を含む、前記生合成反応混合物。
【００１２】
また、ａ）バイオマスをカオリン固体酸触媒で前処理する工程を含む方法から製造されるポゾラン材料も開示されている。前記ポゾラン材料の製造方法は、さらにｂ）前処理したバイオマス、工程ａ）のカオリン固体酸触媒、および１つ以上のセルラーゼ酵素および／またはヘミセルラーゼ酵素またはそれらの混合物、または１つ以上のセルラーゼ酵素および／またはヘミセルラーゼ酵素を発現可能な生物を含む、水性反応混合物を形成する工程；およびｃ）前記カオリン固体酸触媒を単離してポゾラン材料を準備する工程を含み得る。前記方法はカオリンを加熱してメタカオリンを形成することも含み得る。
【００１３】
図面の簡単な説明
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、本開示のいくつかの実施形態を示し、説明と共に、本開示の原理を説明する役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、実施例１における粉砕した乾燥バイオマスおよびカオリン粘土混合物を用いた同時糖化発酵プロセスを示すグラフである。
【図２】図２は、実施例２におけるカオリン処理したトウモロコシ繊維の酵素加水分解を示す棒グラフである。
【図３】図３は、実施例３における同等のバイオマス固形分負荷での乾燥した磨砕鋸屑試料および液体抽出試料による同時糖化発酵（ＳＳＦ：simultaneous saccharification and fermentation）の比較を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本明細書で使用される用語「含む（comprising）」およびその変形は、用語「含む（including）」およびその変形と同義で使用され、オープンな非限定的な用語である。用語「含む（comprising）」および「含む（including）」という用語は、本明細書では様々な実施形態を説明するために使用されているが、用語「〜から実質的になる（consisting essentially of）」および「〜からなる（consisting of）」は、より具体的な実施形態を提供するために「含む（comprising）」および「含む（including）」の代わりに使用することができ、また開示されている。本開示および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそれ以外を指示しない限り、複数の指示対象を含む。本明細書におけるパーセンテージ範囲やその他の範囲の開示には、範囲の終点とその範囲内で提供される任意の整数の開示が含まれる。
【００１６】
バイオマス
バイオマスとは、持続可能な基準に基づいてエネルギーを利用できる、実質的にいかなる植物由来の有機物（木質系または非木質系）をも意味する。植物バイオマスとしては、トウモロコシ、農作物廃棄物、および残渣、例えばトウモロコシ茎葉、小麦わら、稲わら、サトウキビバガス等を挙げることができるが、これらに限定されない。植物バイオマスとしては、さらに樹木、木質エネルギー作物、木材廃棄物および残留物、例えば軟木森林伐採材、バキー廃棄物（粗い樹皮のような廃棄物）、鋸屑、紙およびパルプ産業廃棄物流、木質繊維などが挙げられるが、これらに限定されない。また、スイッチグラスなどの草作物は、別の植物バイオマス源として大規模に生産される可能性がある。都市部では、最も有力な植物バイオマス原料としては庭廃棄物（例えば、草刈り、葉、木切り、および枝）と野菜処理廃棄物が挙げられる。「リグノセルロース系原料」とは、任意の種類の植物バイオマス、例えば、これに限定されないが、非木質植物バイオマス、牧草、例えば、これに限定されないが、イネ科植物、例えば、これに限定されないが、Ｃ４植物、例えば、スイッチグラス、イネ科スパルティナ属の多年草、ライグラス、ススキ、クサヨシ、またはそれらの組み合わせ、または糖処理残渣、例えば、バガス、またはビートパルプ、農産物残留物、例えば、大豆茎葉、トウモロコシ茎葉、稲わら、籾殻、大麦わら、トウモロコシ穂軸、小麦わら、カノーラわら、稲わら、オート麦わら、オート麦の殻、トウモロコシ繊維、リサイクル木材パルプ繊維、鋸屑、硬材、例えばアスペン材および鋸屑、軟材、またはそれらの組み合わせである。また、セルロース原料としては、セルロース廃棄物（cellulosic waste material）、例えば、新聞用紙、厚紙、鋸屑などが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００１７】
バイオマス材料がリグノセルロース系材料である場合、これはセルロース、ヘミセルロース、およびリグニンの含有物を有するであろう。通常、このようなリグノセルロース系材料では、セルロース、ヘミセルロース、およびリグニンが、少量の抽出物、ペクチン、タンパク質、および灰とともに複合ゲル構造で結合される。一般的に、リグノセルロース系材料は、セルロースを加水分解するために使用される微生物、酵素などにあまりよく接触させることができない。
【００１８】
固体酸触媒
固体酸材料は、表面酸度を有する固体材料であり得る。「固体」とは、約１５質量パーセント、２０質量パーセント、２５質量パーセント、３０質量パーセントまたは４０質量パーセント未満の含水率を有する固体材料、半固体材料、または他の材料を意味する。表面酸度とは、材料の固体表面の酸度を指す。表面酸度の決定方法は、塩基の溶液からの塩基の吸着に基づく。固体酸材料の固体表面を単層で覆うであろう塩基の量は、表面酸度と定義され、かつ使用される塩基のｐＫａに対応する。使用される塩基は、ｎ−ブチルアミン、シクロヘキサミン、または他の適切な塩基であってもよい。表面の酸度は、通常、ＨａｍｍｅｔとＤｅｙｒｕｐの酸度関数Ｈ０：
Ｈ０＝ｐＫＢＨ＋−ｌｏｇ（ＣＢＨ＋／ＣＢ）  （Ｉ）
によって表される。このように、この式では、指示薬Ｂが材料の固体表面の酸性部位に吸着すると、指示薬の一部が酸性部位でプロトン化される。酸性部位の強度は、ＢＨ＋のｐＫＢＨ＋の値によって式（Ｉ）で表され得る。ＢＨ＋は、ＢＨ＋の濃度（ＣＢＨ＋）がＢの濃度（ＣＢ）と等しい場合、指示薬Ｂの共役酸である。したがって、Ｈ０で示される酸強度は、塩基指示薬Ｂの半分をプロトン化する酸性部位によって共役酸に変化する共役能力を示す。ルイスの定義では、Ｈ０値は、吸収された塩基指示薬Ｂの半分から電子対を受け取る能力を示す。Masudaらの“Powder Technology Handbook”、第３版、（２００６年）を参照されたい。−８．２のＨ０は９０パーセントの硫酸の酸度に相当し、−３．０のＨ０は約４８パーセントの硫酸の酸度に相当する。
【００１９】
材料のＨ０を決定する任意の適切な方法、例えば、Investigation of the Surface Acidity of a Bentonite modified by Acid Activation and Thermal Treatment, Turk. J. Chem., 2003; 27:675-681（その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているシクロヘキサン中のｎ−ブチルアミンの溶液からｎ−ブチルアミンを吸収することを用いる方法が使用され得る。あるいは、一般的にハメット指示薬と呼ばれる指示薬を使用して、材料のＨ０を決定してもよい。ハメット指示薬は、対象材料の特定の表面酸度を表す色の変化に依存する。
【００２０】
本発明では、多くの固体酸材料が使用され得る。一般に、本発明における固体酸材料は、表面酸度を有する固体材料であり得る。好ましくは、固体酸材料は、約−３．０未満、好ましくは約−５．６未満のＨ０を有する。
【００２１】
一実施形態では、固体酸材料は粘土材料である。本明細書で使用する「粘土材料」とは、微細粒の鉱物で主に構成された材料と定義されており、一般的には、適切な含水率の塑性体であり、乾燥または焼成すると硬化するであろう。本発明に用いられる粘土材料の大部分を占める例示的な鉱物としては、カオリナイトまたはカオリン、ハロイサイト、アタパルジャイト、モンモリロナイト、イライト、ナクライト、ディッカイト、およびアナウキサイト（annauxite）が挙げられる。本発明に用いられる粘土の非限定な例としては、フラー土、カオリン、およびベントナイトが挙げられる。カオリンは、主に鉱物カオリナイトからなる粘土材料である。ベントナイトは、かなりの量のモンモリロナイトを含有し、かつ典型的にはいくらかのマグネシウムおよびそれに関連するものを有する粘土である。任意に、粘土材料を酸処理して、その粘土材料に表面酸度をさらに与えてもよい。
【００２２】
別の実施形態では、固体酸材料は、アルミノケイ酸塩（粘土のサブセット）または水和アルミノケイ酸塩の鉱物である。例えば、固体酸は、バーミキュライト、白雲母、カオリナイト、メタカオリン、ハロイサイト、アタパルジャイト、モンモリロナイト、イライト、ナクライト、ディッカイト、およびアナウキサイト、またはゼオライト、例えば、方沸石、チャバザイト、ヘウランダイト、ナトロライト、フィリップサイト、およびスティルバイト、または一般式Ａｌ２Ｏ３．ｘＳｉＯ２．ｎＨ２Ｏを有する鉱物であってよい。
【００２３】
別の実施形態では、固体酸材料は超酸材料である。超酸材料は、超酸材料の表面上の酸性部位の数が多いので、本発明において有用である。ブレンステッド超酸は、１００パーセントの硫酸よりも強い酸として記載され得る。ルイス超酸は、無水三塩化アルミニウムよりも強い酸として記載され得る。固体超酸は、固体媒体、すなわち、ブレンステッド酸またはルイス酸のいずれかで処理されたアルミナで構成されている。使用される固体としては、天然粘土および鉱物、金属酸化物および硫化物、金属塩、および混合金属酸化物が挙げられ得る。例示的なブレンステッド超酸としては、二酸化チタン：硫酸（ＴｉＯ２：Ｈ２ＳＯ４）および二酸化ジルコニウム：硫酸（ＺｒＯ２：Ｈ２ＳＯ４）の混合物が挙げられる。例示的なルイス超酸は、二酸化ケイ素（ＳｂＦ５：ＳｉＯ２）、酸化アルミニウム（ＳｂＦ５：Ａｌ２Ｏ３）、または二酸化チタン（ＳｂＦ５：ＴｉＯ２）などの、金属酸化物に五フッ化アンチモンを配合したものを含む。一実施形態では、超酸は、ブレンステッド酸またはルイス酸で処理された金属酸化物である。特定の実施形態では、超酸は、以下に示すように、硫酸またはメタンスルホン酸で処理されたアルミナである。
【００２４】
あるいは、固体酸材料は、タルクなどのケイ酸塩材料、またはアルミナなどの表面酸度を有する他の適切な固体材料、および本明細書に記載される材料のいずれかの組み合わせであってもよい。
【００２５】
一実施形態では、固体酸材料はカオリンである。カオリンは主に鉱物カオリナイトで構成される。カオリナイト（Ａｌ２Ｓｉ２Ｏ５（ＯＨ）４）は、水酸基によって結合された八面体配位アルミニウムと四面体配位ケイ素の交互シートで作られた層状のケイ酸塩である。あるいは、固体酸は無水カオリンの形でもよく、これは通常、５００℃を上回るカオリンを加熱することによって製造され得る。別の実施形態では、カオリンは、表面の酸度を高めるために熱処理または蒸気処理され得る。例えば、カオリンはメタカオリンに変換され、固体酸触媒として使用され得る。
【００２６】
あるいは、固体酸触媒、例えばカオリンまたはメタカオリンは、粉砕されてより小さな粒子を形成して表面積を増やし、したがってその酸度を上昇させ得る。
【００２７】
別の実施形態では、固体酸はベントナイト、例えば、酸性ベントナイトである。ベントナイトは吸湿性アルミニウムフィロケイ酸塩であり、一般的に大部分がモンモリロナイト、（Ｎａ，Ｃａ）０．３３（Ａｌ，Ｍｇ）２Ｓｉ４Ｏ１０（ＯＨ）２（Ｈ２Ｏ）ｎからなる不純物を含む粘土である。ナトリウムベントナイトとも呼ばれる膨潤型ベントナイトと、カルシウムベントナイトとしての非膨潤型ベントナイトの２種類がある。
【００２８】
酸性ベントナイトは、ベントナイトを１Ｍ塩酸溶液で処理するなどして、ベントナイトを１種以上の酸で処理することによって製造され得る。
【００２９】
さらに別の特定の実施形態では、固体酸は、２Ｍ硫酸で処理したアルミナを含む固体超酸であり、ろ過され、約８００℃で約５時間焼成される。
【００３０】
カオリンおよび酸性ベントナイトは、本発明で使用するのに望ましい材料である。なぜなら、これらの材料は固有の水分量と共に高い表面酸度をもたらし、このことは構造的な表面のヒドロキシ基の存在と自由水含有量の両方に起因しており、これらは両方ともセルロース材料のグリコシド結合を加水分解するのに有用である。したがって、酸性ベントナイト、ベントナイト、メタカオリンおよびカオリンを固体酸材料として使用することは、これらの材料の使用が可溶化プロセスに水を追加する必要性を排除し、それによってセルロースの溶解における時間と費用を大幅に削減し得るので相当の利益をもたらし得る。
【００３１】
別の実施形態では、固体酸材料は、酸処理された材料、例えば、硫酸処理されたアルミナであり、超酸を生成する。この超酸を製造するために、アルミナは２Ｍの硫酸中で撹拌され、ろ過され、かつ約８００℃で約５時間焼成される。アルミナを硫酸で処理することで固体のアルミナ表面に硫酸イオンが加えられ、それによって固体酸材料は電子をさらに受け入れるようになる。結果として、これらの超酸は非常に高い表面酸度を有する。しかしながら、超酸はベントナイトまたはカオリナイトよりも高い表面酸度を有し得るが、超酸の含水率はあまり多くないこともある。理論に縛られることを望むわけではないが、結果として、カオリンとベントナイトで見られる追加の含水率は、酸処理されたアルミナよりもベントナイトまたはカオリナイトで見られるセルロースの可溶化効率により大きく寄与すると考えられる。このことは、より高い含水率を有するカオリンに比較して、無水カオリナイトがより低い可溶化効率を示すことによってさらにサポートされる。
【００３２】
このように、本明細書に開示された方法は、ａ）バイオマスを固体酸触媒で前処理することを必要とし、その際、固体酸触媒は表面酸度を有する固体材料である。一実施形態では、固体酸触媒は、粘土、アルミノケイ酸塩、水和アルミノケイ酸塩またはブレンステッド酸またはルイス酸で処理した固体培地である。別の実施形態では、固体酸触媒は、カオリナイト、ハロイサイト、アタパルジャイト、モンモリロナイト、イライト、ナクライト、ディッカイト、アナウキサイト、カオリン、メタカオリン、ベントナイト、酸性ベントナイトゼオライト、硫酸処理された二酸化チタンまたはメタンスルホン酸、硫酸またはメタンスルホン酸で処理した酸化アルミニウム、アルミナ、硫酸またはメタンスルホン酸で処理したアルミナ、バーミキュライト、白雲母およびタルクからなる群から選択される。
【００３３】
上記で説明したように、バイオマスは固体酸触媒と一緒に前処理される。この前処理は、しばしば、固体酸触媒と一緒になったバイオマスの磨砕、粉砕またはせん断を含み、比較的乾燥した条件下で行われることが多い。
【００３４】
工程ａ）
セルロースまたはヘミセルロースを加水分解するために、前処理工程ではいくらかの水が必要であるが、最小限の含水率で前処理工程ａ）を行わなければならない。
【００３５】
「最小限の水（含水率）」または「実質的に乾燥」とは、前処理段階（工程ａ）中のバイオマスおよび固体酸触媒からの全含水率が、約０．１質量％〜約４０質量％、例えば約０．２質量％〜約２５質量％または約０．５質量％〜約２０質量％の含水率の範囲であり、質量％はバイオマスおよび固体酸触媒の全質量に基づく。
【００３６】
別の実施形態では、固体酸材料の自由水含有量は、工程ａ）において固体酸材料の約４質量パーセント〜約１０質量パーセントの範囲にある。この固体酸材料の自由含水量は、固体酸材料の全質量と含水率に基づく。例えば、水分を含有する固体酸材料が１００ｇであり、かつ１０％の水分を含有する場合、１００ｇの自由水含有量は１０ｇである。
【００３７】
例えば、硫酸を上回る、固体酸材料を使用する利点の１つは、バイオマスと一緒になった固体酸の比較的乾燥した状態での磨砕で、セルロースとヘミセルロースが効率的に分解されることである。しかしながら、いったん水を前処理したバイオマスに加えると、系の酸度が大幅に低下し、酵素や微生物の作用のためのｐＨの調整はほとんど必要とされない。したがって、固体酸は酵素や微生物に害を与えない。また、ｐＨの調整が不要なため、塩副生物は全く生じない。セルロース含有材料および固体酸材料の全自由水含有量は、前処理工程ａ）の間の撹拌の際に加水分解反応に必要とされる運動エネルギーを不必要に低下させないように、合計で約４０質量パーセント未満、典型的には約２質量パーセント〜約３０質量パーセントである。「自由水含有量」とは、セルロース含有材料および固体酸含有材料中の水の量を意味し、これはセルロース含有材料および固体酸材料内に含有されるが、いずれかの材料の構造または表面のヒドロキシルには関係しない。このように、加水分解反応を起こすのに十分な水分が混合物中にある。
【００３８】
磨砕、粉砕またはせん断は、当該技術分野で知られている方法によって行われ得る。例えば、撹拌は、適切な容器または反応器内で行われ得る。一実施形態では、撹拌は、ボール、ローラー、ジャー、ハンマーまたはシェーカーミルで行われる。ミルは一般的に、試料を１つ以上の磨砕要素とともにハウジングに入れ、そのハウジングに動きを与えることによって試料を磨砕する。ハウジングは典型的には通常、円筒形であり、磨砕要素は典型的にはスチールボールであるが、ロッド、シリンダー、または他の形状であってもよい。
【００３９】
場合により、固体酸触媒は、前処理工程の間に、バイオマスの存在下で（工程ａ）、室温２０℃〜約１６０℃の範囲の温度、例えば工程ａ）において約４０℃〜約１２０℃に加熱される。
【００４０】
バイオマスと固体酸触媒との比
使用されるバイオマスと固体酸触媒との質量比は、バイオマスの種類、磨砕技術、およびプロセスパラメータに応じて大きく変化し得る。例えば、乾燥固体酸触媒と乾燥バイオマスとの質量比は、約０．１対約１０〜約１０対約０．１、例えば約０．２対約５〜約５対約０．２、例えば、約０．５対約２〜約２対約０．５の範囲である。対象の特定の質量比は約１対約２〜約２対約１である。
【００４１】
さらに「乾燥」固体酸触媒または「乾燥」バイオマスが意味するものは、触媒およびバイオマスがいくらかの水を含有する可能性があるが、バイオマスおよび固体酸触媒からの含水率は上記のような範囲になるであろうことを意味する。すなわち、前処理段階（工程ａ）の間のバイオマスおよび固体酸触媒からの全含水率は、０．１〜約４０質量％、例えば約０．２〜約２５質量％または約０．５〜約２０質量％の含水率の範囲であるだろう。質量％はバイオマス等の全質量に基づくものであり、かつ質量％はバイオマスおよび固体酸触媒の全質量に基づくものである。セルロース系材料を加水分解するためには、いくらかの水が存在しなければならない。この水は前処理工程に直接添加され得るか、または単純に固体材料（バイオマスと固体酸触媒）中に存在し得る。
【００４２】
前処理工程ａ）の後、水が固体酸触媒で前処理したバイオマスに添加されてもよい。水は約８０℃〜約２４０℃の範囲の熱水であってもよい。熱水処理は、セルラーゼ酵素もしくはヘミセルラーゼ酵素、またはこれらの酵素を発現する生物を添加する前に、これがバイオマスマトリックスからさらなるリグニンおよび糖を抽出し得るので、工程ａ）とｂ）の間で行うことが有利であり得る。
【００４３】
工程ｂ）
バイオマスが固体酸触媒で前処理されると（工程ａ）、工程ｂ）では、水が固体酸触媒と共に前処理したバイオマスに加えられて、前処理したバイオマス、固体酸触媒を含む水性反応混合物を形成する。このことは、酵素がその加水分解機能を発揮するために必要である。さらに水を加えると、反応混合物のｐＨが上がる。工程（ｂ）は通常、酵素が反応する温度で行われる。この第２工程（ｂ）では、酵素を添加すると、温度範囲は約２０℃または３０℃〜約７５℃である。
【００４４】
固体酸触媒およびバイオマスは、工程ｂ）において、酵素による処理の前にまたはそれと一緒に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのタンパク質、およびまたはＴｗｅｅｎ８０およびＴｗｅｅｎ２０などの界面活性剤で処理され得る。
【００４５】
これらの添加剤は、バイオマスの加水分解の間、より低い濃度の酵素またはより効果的な酵素の使用を可能にし得る。
【００４６】
工程ｂ）は提案されるように水系条件下で行われる。工程（ｂ）における固体（バイオマス、固体酸触媒）の濃度は、約１０〜約６０質量％の固体の範囲にあるだろう。例えば、約１２〜約４５質量％の固形分、約１５〜約４０質量％の固形分が考えられる。固形分の質量％は、反応混合物の全質量を基準とする。
【００４７】
工程（ｂ）の利点は、対象の酵素、またはセルラーゼ酵素および／またはヘミセルラーゼ酵素を発現する生物が添加される前に、工程（ａ）において固体酸触媒が、前処理されたバイオマスから除去される必要がないことである。実際に、このことは、対象の酵素、またはセルラーゼ酵素および／またはヘミセルラーゼ酵素を発現する生物の存在下で固体酸触媒が存在し続ける際の明白な利点であると考えられる。
【００４８】
工程ｂ）が完了した後、反応混合物がろ過されて、固体酸触媒、酵素、セルラーゼ酵素および／またはヘミセルラーゼ酵素を発現する生物または残留バイオマスを除去し得る。あるいは、工程ｂ）の残留固形物は、使用済み反応混合物と共に発酵または培養培地と直接組み合わされて産物を産生し得る。固体酸触媒を工程ｃ）に運ぶことは、発酵生合成プロセスを妨げないだろう。
【００４９】
したがって、固体酸触媒の除去は、工程ｃ）の前に任意に行われる。
【００５０】
酵素
セルロースとヘミセルロースは、自然界において一番目および二番目に豊富な多糖類である。セルロースは、リグノセルロース系バイオマス（ＬＢＭ）、例えば、硬材、軟材、トウモロコシ繊維、トウモロコシ茎葉、小麦わら、稲わら、およびサトウキビバガスの、だいたい３０〜６０％を構成し、ヘミセルロースは約２０〜３５％を構成する。セルロースは、１，４−ベータ−グリコシド結合を通して連結された数百〜数千のＤ−グルコース単位から構成されたほぼ均質なポリマーであり、ヘミセルロースはペントース（キシロース、アラビノース）、ヘキソース（マンノース、グルコース、ガラクトース）、および糖酸の異種ポリマーである。硬材のヘミセルロースは主としてキシランを含有し、軟材のヘミセルロースは主としてグルコマンナンを含有する。したがって、ほとんどの植物材料のキシランは、１，４−結合ベータ−Ｄ−キシロピラノース単位のホモポリマー骨格鎖を有するヘテロ多糖類である。キシランは、キシロースに加えて、アラビノース、グルクロン酸またはその４−Ｏ−メチルエーテル、および酢酸、フェリチン酸、およびｐ−クマル酸も含有し得る。分岐の頻度と組成は、キシランの供給源に依存し、主鎖はＯ−アセチル，アルファ−アラビノフラノシル、アルファ−１，２−結合グルクロン酸または４−Ｏ−メチルグルクロン酸置換基からなる。
【００５１】
セルロースとヘミセルロースの両方の成分を効率的にそれらの単糖、二糖、またはオリゴ糖成分に変換するためには、まずこれらの成分がリグノセルロース／セルロース複合体から抽出されなければならない。前処理工程（ａ）は、複合体の抽出に役立つ。固体酸触媒（工程ｂ）の存在下でセルラーゼとヘミセルラーゼを用いるこれらの成分の酵素的糖化は、ごくわずかな基質の損失と副生物の発生を伴い、さらに糖類を分解する。
【００５２】
セルロースはホモポリマーではあるが、はるかに嵩高で結晶質でコンパクトな分子であり、ヘミセルロースの構造は、ペントース、いくらかのヘキソース、および側鎖基、例えば、アセチルおよびウロン酸で構成されているので、より複雑である。このように、セルロースとヘミセルロースの酵素加水分解作用は、２つの酵素の組み合わされた作用を必要とする。セルロースの加水分解のためには、セルロースの結晶構造を部分的または完全に非晶質にする必要があり、その後、エキソ、エンドセルラーゼ、およびセロビアーゼの混合物が高分子セルロースをより小さなオリゴマー分子およびモノマー分子に変換するために必要である。一方、ヘミセルロースの場合、側鎖基の存在は、主要な骨格解重合酵素、すなわち、エキソおよびエンドキシラナーゼ、およびマンナナーゼの作用を妨げる。この問題に対処するために、側鎖を加水分解する能力を有するアクセサリ酵素、例えば、アルファ−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、アルファ−グルクロニダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、およびｐ−クマル酸エステラーゼは、ヘミセルラーゼを完全に分解して高収率の単糖類を得るために主要ヘミセルラーゼとともに存在してもよい（BielyおよびTenkanen、１９９８年）。
【００５３】
したがって、セルロースおよびヘミセルロースを解重合または加水分解するために使用されるセルラーゼおよびヘミセルラーゼ調製物は、それぞれ無数の主要酵素および副酵素を含有し、そのすべてが一緒に作用する。
【００５４】
工程ｂ）におけるセルラーゼおよび／またはヘミセルラーゼの添加量はかなり異なるであろう。組換え技術を用いた細胞溶解酵素も使用され得る。セルラーゼ／ヘミセルラーゼによる前処理セルロース／ヘミセルロースの処理は、通常、２０℃〜７５℃の間の温度で行われる。セルラーゼはｐＨ約３〜７の範囲で活性である。糖化工程は１４４時間まで継続され得る。セルロース／ヘミセルロース酵素の投与量は、十分に高いレベルのセルロースとヘミセルロースの変換を達成する。例えば、適切なセルロース／ヘミセルラーゼの投与量は、典型的にはセルロース１グラムあたり１〜５０枚の間の濾紙単位（Filter Paper Units；ＦＰＵまたはＩＵ）である。ＦＰＵは標準測定値であり、Ghose（1987年、Pure and Appl. Chem. 59:257-268）に従って定義され、測定される。さらに、工程ｂ）において、工程ａ）の処理バイオマスを、１つ以上のセルラーゼ酵素および／またはヘミセルラーゼ酵素を発現する生物と組み合わせることが可能である。これは固体酸触媒の存在下で行われ得る。工程ａ）のバイオマスの処理後に、固体酸触媒を除去する必要はない。なぜなら、このことはセルロース酵素および／またはヘミセルラーゼ酵素を発現する生物に悪影響を及ぼさないからである。
【００５５】
セルロースおよび／またはヘミセルロース酵素を発現するこの生物は、工程ｃ）において産物を産生するのと同じ原核生物または真核生物であり得る。下記を参照されたい。
【００５６】
原核生物または真核生物
微生物を利用して産物を生合成的に製造する場合、これは天然微生物または人工微生物（例えば、遺伝子組換え微生物（ＧＭＯ））であり得る。例えば、微生物は、細菌、例えば、セルロース分解性細菌、真菌、例えば、酵母、植物または原生生物、例えば、藻類、原虫または真菌様原生生物、例えば、粘菌、原生生物（例えば、動物（例えば、原生動物、例えば、鞭毛虫、アメイボイド（アメーバ）、繊毛虫および胞子虫）および植物（例えば、藻類、例えば、胞状、クロロニトロセルロース、クリプトモナス、ユーグレナ藻、緑膿菌、ハプト藻、赤藻、ストラメノパイル海藻、および緑色植物亜界））、海藻、プランクトン（例えば、マクロプランクトン、メソプランクトン、マイクロプランクトン、ナノプランクトン、ピコプランクトン、およびフェムトプランクトン（femptoplankton））、植物プランクトン、および／またはこれらの混合物であり得る。一部の実施形態では、微生物は白色腐朽菌である。場合によっては、微生物には単細胞および／または多細胞生物が含まれ得る。生物が適合する場合、混合物が使用され得る。
【００５７】
一般的に、様々な微生物は、材料を操作、変換、生物変換、または発酵させることによって、多くの有用な産物を産生し得る。例えば、アルコール、有機酸、炭化水素、水素、タンパク質、炭水化物、脂肪／油／脂質、アミノ酸、ビタミン類、またはこれらの材料の混合物は、発酵または他のプロセスによって生成され得る。
【００５８】
産生され得る産物の例としては、単官能性および多官能性のＣ１〜Ｃ６アルキルアルコール、単官能性および多官能性カルボン酸、Ｃ１〜Ｃ６炭化水素、およびそれらの組み合わせが挙げられる。適切なアルコールの具体例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，４−ブタンジオール、グリセリン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。適切なカルボン酸の具体例としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、オレイン酸、リノール酸、グリコール酸、乳酸、ガンマ−ヒドロキシ酪酸、およびそれらの組み合わせが挙げられる。適切な炭化水素の例としては、メタン、エタン、プロパン、ペンタン、ｎ−ヘキサン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、微生物は原核細胞である。適切な原核細胞としては、グラム陽性、グラム陰性およびグラム可変細菌細胞、好ましくはグラム陰性が挙げられる。
したがって、本発明で使用され得る微生物としては、これらに限定されないが、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）、グルコノバクター・アサイ（Gluconobacter asaii）、アクロモバクター・デルマーベ（Achromobacter delmarvae）、アクロモバクター・ビスコーサス（Achromobacter viscosus）、アクロモバクター・ラクティカム（Achromobacter lacticum）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）、アルカリゲネス・フェーカリス（Alcaligenes faecalis）、アルスロバクター・シトレウス（Arthrobacter citreus）、アルスロバクター・ツメッセンス（Arthrobacter tumescens）、アルスロバクター・パラフィネウス（Arthrobacter paraffineus）、アルスロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Arthrobacter hydrocarboglutamicus）、アルスロバクター・オキシダンス（Arthrobacter oxydans）、オーレオバクテリウム・サペルダエ（Aureobacterium saperdae）、アゾトバクター・インディカス（Azotobacter indicus）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・グロボサム（Brevibacterium globosum）、ブレビバクテリウム・フスカム（Brevibacterium fuscum）、ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム（Brevibacterium ketoglutamicum）、ブレビバクテリウム・ヘルコルム（Brevibacterium helcolum）、ブレビバクテリウム・プシルム（Brevibacterium pusillum）、ブレビバクテリウム・テスタアセウム（Brevibacterium testaceum）、ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseum）、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム（Brevibacterium immariophilium）、ブレビバクテリウム・リネンス（Brevibacterium linens）、ブレビバクテリウム・プロトファルミエ（Brevibacterium protopharmiae）、コリネバクテリウム・アセトフィラム（Corynebacterium acetophilum）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エルビニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、エルビニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）、エルビニア・ヘルビコーラ（Erwinia herbicola）、エルビニア・クリザンセミ（Erwinia chrysanthemi）、フラボバクテリウム・ペレグリナム（Flavobacterium peregrinum）、フラボバクテリウム・フカタム（Flavobacterium fucatum）、フラボバクテリウム・アウランティナム（Flavobacterium aurantinum）、フラボバクテリウム・レナヌム（Flavobacterium rhenanum）、フラボバクテリウム・セワネンセ（Flavobacterium sewanense）、フラボバクテリウム・ブレベ（Flavobacterium breve）、フラボバクテリウム・メニンゴセプティカム（Flavobacterium meningosepticum）、ミクロコッカス属ＣＣＭ８２５（Micrococcus sp. CCM825）、モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii）、ノカルディア・オパカ（Nocardia opaca）、ノカルディア・ルゴーサ（Nocardia rugosa）、プラノコッカス・ユーシナタス（Planococcus eucinatus）、プロテウス・レ��トゲリ（Proteus rettgeri）、プロピオニバクテリウム・シャーマニ（Propionibacterium shermanii）、シュードモナス・シンキサンタ（Pseudomonas synxantha）、シュードモナス・アゾトフォルマンス（Pseudomonas azotoformans）、
【００６０】
シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas jluorescens）、シュードモナス・オバリス（Pseudomonas ovalis）、シュードモナス・ストゥツェルリ（Pseudomonas stutzeri）、シュードモナス・アシドボランス（Pseudomonas acidovolans）、シュードモナス・ムシドレンス（Pseudomonas mucidolens）、シュードモナス・テストステロニ（Pseudomonas testosteroni）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）、ロドコッカス属ＡＴＣＣ１５５９２（Rhodococcus sp. ATCC 15592）、ロドコッカス属ＡＴＣＣ１９０７０（Rhodococcus sp. ATCC 19070）、スポロサルシナ・ウレア（Sporosarcina ureae）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、ビブリオ・メッシュニコビ（Vibrio metschnikovii）、ビブリオ・チロゲネス（Vibrio tyrogenes）、アクチノマドゥラ・マドゥラ（Actinomadura madurae）、アクチノマイセス・ビオラセオクロモゲネス（Actinomyces violaceochromogenes）、キタサトスポリア・パルロサ（Kitasatosporia parulosa）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・フラベラス（Streptomyces flavelus）、ストレプトマイセス・グリセオラス（Streptomyces griseolus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・オリバセウス（Streptomyces olivaceus）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Streptomyces tanashiensis）、ストレプトマイセス・バージニエ（Streptomyces virginiae）、ストレプトマイセス・アンチビオティカス（Streptomyces antibioticus）、ストレプトマイセス・カカオイ（Streptomyces cacaoi）、ストレプトマイセス・ラベンデュレ（Streptomyces lavendulae）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）、アエロモナス・サルモニシダ（Aeromonas salmonicida）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・チアミノリティカス（Bacillus thiaminolyticus）、エシェリヒア・フロインディ（Escherichia freundii）、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Microbacterium ammoniaphilum）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、サルモネラ・ショットムレリ（Salmonella schottmulleri）、キサントモナス・シトリ（Xanthomonas citri）、シネコシスティス属（Synechocystis sp.）、シネココックス・エロンガツス（Synechococcus elongatus）、テルモシネココックス・エロンガツス（Thermosynechococcus elongatus）、ミクロシスチス・アエルギノサ（Microcystis aeruginosa）、ノストク属（Nostoc sp.）、Ｎ．コミュン（N. commune）、Ｎ．スファエリクム（N. sphaericum）、ノストク・プンクチホルム（Nostoc punctiforme）、スピルリナ・プラテンシス（Spirulina platensis）、リングビア・マジュスクラ（Lyngbya majuscula）、Ｌ．ラゲレイミイ（L. lagerheimii）、ホルミジウム・テヌ（Phormidium tenue）、アナバエナ属（Anabaena sp.）、レプトリングビア属（Leptolyngbya sp）等が挙げられる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、微生物は真核細胞である。適切な真核細胞としては、酵母細胞、例えばサッカロマイセス属（Saccharomyces sp.）、例えばサッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）、ハンゼヌラ属（Hansenula sp.）、例えばハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces sp.）、例えばシゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイウェロマイセス属（Kluyveromyces sp.）、例えばクルイウェロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）およびクルイウェロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、ヤロウィア属（Yarrowia sp.）、例えばヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ピキア属（Pichia sp.）、例えばピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピキア・スチピチス（Pichia stipites）およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）、チゴサッカロミセス属（Zygosaccharomyces sp.）、例えばチゴサッカロミセス・ルキシー（Zygosaccharomyces rouxii）およびチゴサッカロミセス・ベイリイ（Zygosaccharomyces bailii）、カンジダ属（Candida sp.）、例えばカンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）、カンジダ・ユティリス（Candida utilis）、カンジダ・フレイスクッシイ（Candida freyschussii）、カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）およびカンジダ・ソノレンシス（Candida sonorensis）、シュワニオミセス属（Schwanniomyces sp.）、例えばシュワニオミセス・オクシデンタリス（Schwanniomyces occidentalis）、アークスラ属（Arxula sp.）、例えばアークスラ・アデニニボランス（Arxula adeninivorans）、オガタエア属（Ogataea sp.）、例えばオガタエア・ミニュータ（Ogataea minuta）、クレブシエラ属（Klebsiella sp.）、例えばクレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）が挙げられる。
【００６２】
多くの細菌工業株が、本明細書に開示された方法での使用に特に適している。いくつかの実施形態では、微生物は、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属の種、例えば、Ｃ．アセトフィルム（C. acetophilum）、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）、Ｃ．コールナエ（C. callunae）、Ｃ．アセトアシドフィラム（C. acetoacidophilum）、Ｃ．アセトグルタミカム（C. acetoglutamicum）である。いくつかの実施形態では、微生物は、バチルス属の種、例えば、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、Ｂ．アントラシス（B. anthracis）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．スブチリス（B. subtilis）、Ｂ．レンチルス（B. lentils）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．プミルス（B. pumilus）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、Ｂ．コアグランス（B. coagulans）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．フィルムス（B. firmus）、Ｂ．アルカオフィウス（B. alkaophius）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．クラウシー（B. clausii）、Ｂ．ステアロサーモフイルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．ハロデュランス（B. halodurans）、Ｂ．スブチリス（B. subtilis）、Ｂ．プミルス（B. pumilus）、およびＢ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）である。いくつかの実施形態では、微生物は、エルウィニア（Erwinia）属の種、例えばＥ．ウレドボラ（E. uredovora）、Ｅ．カロトボラ（E. carotovora）、Ｅ．アナナス（E. ananas）、Ｅ．ヘルビコーラ（E. herbicola）、Ｅ．プンクタータ（E. punctata）およびＥ．テレウス（E. terreus）である。いくつかの実施形態では、微生物はエシェリキア属の種であり、例えば、大腸菌（E. coli）である。他の実施形態では、微生物は、パントエア（Pantoea）属の種、例えば、Ｐ．シトレア（P. citrea）またはＰ．アグロメランス（P. agglomerans）である。さらに他の実施形態では、微生物は、ストレプトマイセス（Streptomyces）属の種、例えばＳ．アンボファシエンス（S. ambofaciens）、Ｓ．アクロモゲネス（S. achromogenes）、Ｓ．アベルミチリス（S. avermitilis）、Ｓ．セリカラー（S. coelicolor）、Ｓ．オーレオファシエンス（S. aureofaciens）、Ｓ．アウレウス（S. aureus）、Ｓ．フンジシディカス（S. fungicidicus）、Ｓ．グリセウス（S. griseus）またはＳ．リビダンス（S. lividans）である。さらなる実施形態では、微生物はザイモモナス（Zymomonas）属の種、例えばＺ．モビリス（Z. mobilis）またはＺ．リポリティカ（Z. lipolytica）である。さらなる実施形態では、微生物は、ロドコッカス（Rhodococcus）属の種、例えば、Ｒ．オパカス（R. opacus）である。
【００６３】
発酵
発酵条件は、設計された生物または自然の生物によって異なるだろう。いくつかの実施形態では、工程ｃ）で使用される微生物は、バッチ発酵、フェッドバッチ発酵または連続発酵の条件下で増殖する。従来のバッチ発酵は、培地の組成が発酵の開始時に設定され、発酵中に人工的な変化を受けない閉鎖系である。バッチシステムの変形がフェッドバッチ発酵である。この変形では、発酵が進むにつれて基質が段階的に添加される。異化代謝産物の抑制が細胞の代謝を阻害する可能性があり、培地中の基質の量を制限することが望ましい場合には、フェッドバッチシステムが有用である。バッチおよびフェッドバッチ発酵は一般的であり、当該技術分野においてよく知られている。連続発酵も可能であり、これは所定の発酵培地をバイオリアクターに連続的に添加し、等量の条件培地（例えば、所望の最終産物を含む）を処理のために同時に除去するシステムである。連続発酵は一般に一定の高密度で培養を維持し、その際、細胞は主に最終産物の生産が増加する増殖期にある。連続発酵システムは、定常状態の増殖条件を維持することを目指している。連続発酵プロセスのための栄養素と増殖因子の調整方法、ならびに産物の形成速度を最大にするための技術は、工業微生物学の分野ではよく知られている。
【００６４】
いくつかの実施形態では、発酵は、約１０℃〜約６０℃、約１５℃〜約５０℃、約２０℃〜約４５℃、約２５℃〜約４５℃、約３０℃〜約４５℃および約２５℃〜約４０℃の範囲の温度で行われる。好ましい実施形態では、温度は約３４℃、３５℃または３６℃である。最も好ましい実施形態では、温度は約３７℃または３８℃である。
【００６５】
いくつかの他の実施形態では、発酵は、約８時間〜２４０時間、約８時間〜約１６８時間、約１０時間〜約１４４時間、約１５時間〜約１２０時間、または約２０時間〜約７２時間の範囲内の時間行われる。好ましくは、発酵は約２０時間〜約６０時間行われる。
【００６６】
いくつかの他の実施形態では、発酵は、約４〜約９の範囲、約４．５〜約８．５の範囲、約５〜約８の範囲、または約５．５〜約７．５の範囲のｐＨで行われる。好ましくは、発酵は５または７のｐＨで行われるだろう。
【００６７】
発酵産物
発酵産物は、その産物を産生するために使用される生物に依存するだろう。メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，４−ブタンジオール、グリセリン、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸またはコハク酸塩、グルタル酸、オレイン酸、リノール酸、グリコール酸、乳酸または乳酸塩、ガンマ−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシアルカン酸、アラニン、メタン、エタン、プロパン、ペンタン、ｎ−ヘキサン、ピルビン酸塩、アスパラギン酸塩、リンゴ酸塩、バリン、ロイシンおよびそれらの組み合わせなどの様々な産物を産生するための多くの様々な生物、原核生物と真核生物の両方が当該技術分野で知られている。
【００６８】
固体酸触媒のリサイクル
固体酸触媒は、工程ｂ）の後にリサイクルされ得る。あるいは、これは産物の製造において発酵工程ｃ）まで行われ、産物から分離され、再利用され得る。
【００６９】
触媒がカオリンである場合、工程ｂ）または工程ｃ）で分離した後の別の使用は、セメント質系におけるポゾラン材料としての使用である。理論に縛られることを望まないが、機械的作業をカオリン表面で行うことにより、表面結晶性を潜在的に乱し、このカオリンをポゾラン材料として使用することができる。工程ｂ）または工程ｃ）で分離した後のカオリン触媒のポゾラン特性を、高温で焼成してメタカオリンを生成することにより改善することができる。場合により、使用済みカオリン触媒をポゾランメタカオリン材料に変換するため（すなわち、工程ｂ）または工程ｃ）における分離後）に必要な熱エネルギーは、未使用のカオリン触媒をメタカオリンに変換するために必要な熱エネルギーよりも低い。
【００７０】
メタカオリンは、セメント系でポゾラン材料として作用するカオリンから製造された高価値製品である。このメタカオリンのポゾラン活性は、供給カオリンよりも顕著に高い。このことは、セルロース材料をメカノケミカル活性化によって糖に変換するために使用されるプロセスによって製造された生成物のメタカオリンがセメント系システムに高い持続可能性の利点をもたらすことを意味する。
【００７１】
また、リグニン副生物と混合されたカオリンの他の可能性のある使用、例えば、リグニンから価値のある化学物質を得るためのリグニンの分離またはカオリンと抽出されたリグニンとの混合物の充填剤としての使用もあり得る。
【実施例】
【００７２】
実施例
実施例１：粉砕バイオマス／カオリン粉末の発酵プロセス
１．大きな材料を取り除くために８番メッシュを用いて鋸屑を篩い分ける。
２．乾燥質量２５ｇのカオリン粘土（ミドルジョージア由来の三方晶系（tertiary）カオリン）、乾燥質量２５ｇの混合した硬材の鋸屑、および１６００ｇの磨砕媒体、３ｍｍのイットリア安定化酸化ジルコニウムを混合する。
３．水浴を１００℃に加熱する。
４．混合容器を密閉して水浴中に置く。
５．ドリルプレスで動く混合刃を用いて混合を開始する。
６．１９２０ｒｐｍで１時間混合する。
７．乾式粉砕を停止する。
８．磨砕媒体を取り除く。
９．粉砕されたバイオマスとカオリンの混合物３ｇ、４ｇおよび５ｇを各発酵瓶に秤量し、それぞれ１５％、２０％および２５％の固形分濃度で発酵させる。
１０．酵母エキス０．２ｇとトリプトン０．４ｇを発酵栄養素として各発酵瓶に添加する。
１１．炭酸カルシウム０．１ｇを緩衝剤として各発酵瓶に加える。
１２．水を各発酵瓶に加えて、各発酵瓶で発酵容量を１７．３３ｍｌにする；瓶を手で振って、瓶内の内容物をよく混ぜる。
１３．酵素０．６７ｍｌ（KerryのBiocellulase W）を各発酵瓶に加える。
１４．S. cerevisiae種培養液２ｍｌ（振とうフラスコで一晩培養）を各発酵瓶に加える。
１５．発酵瓶をラバーストッパーとアルミシールで封止する。
１６．発酵瓶を３５℃のシェーカーに入れ、２００ｒｐｍで６日間振とうする。
１７．発酵の終わりに、各瓶から試料を採取し、エタノール、グルコース、キシロースおよび副生物の濃度を測定するためにＨＰＬＣ分析に供する。
【００７３】
図１は、粉砕した乾燥バイオマスと乾燥カオリン粘土混合物を用いた同時糖化発酵（ＳＳＦ）プロセスを示すグラフである。発酵は、酵母菌株S. cerevisiaeを用いて、それぞれ１５％、２０％および２５％の固形分濃度にて３５℃で行った。セルラーゼ酵素を、粉砕した乾燥バイオマス１グラムあたり１０ｍｇのタンパク質で負荷した。全発酵時間は１４４時間である。
【００７４】
実施例２
トウモロコシ繊維を、カオリン粒子を用いて、トウモロコシ繊維とカオリンとの質量比３：１で、１００℃で１時間磨砕した。酵素加水分解を、固形分負荷５％、酵素負荷１０ｍｇ／ｇトウモロコシ繊維、温度５０℃、およびクエン酸塩緩衝液５０ｍＭを用いて５に制御されたｐＨで行った。試料を２４時間の加水分解時間で採取し、グルコースとキシロースの濃度をＨＰＬＣ分析により測定した。図２は、カオリン処理したトウモロコシ繊維の酵素加水分解を示す棒グラフである。
【００７５】
実施例３
鋸屑試料とカオリン粒子を一緒に、バイオマス／カオリンの質量比１：１で、１００℃で１時間磨砕することによって乾燥試料を生成した。沸騰水を磨砕した乾燥カオリン／バイオマス混合物に加え、これを一定温度で一定時間撹拌することにより液体抽出物を生成した。ＳＳＦ（同時糖化発酵）を、２５％固形分濃度で酵母菌株S. cerevisiaeを用いて３５℃で行い、セルラーゼ酵素を、粉砕した乾燥バイオマス１グラムあたり１０ｍｇのタンパク質で負荷した。全発酵時間は１４４時間であった。エタノールと残留糖をＨＰＬＣで測定した。潜在エタノールを、残留糖から理論転化収量の９０％で計算した。図３は、同等のバイオマス固形分負荷で、磨砕した乾燥鋸屑試料および液体抽出試料を用いて、ＳＳＦを比較した棒グラフである。
【００７６】
添付の特許請求の範囲の組成物および方法は、本明細書に記載された特定の組成物および方法によって範囲が限定されるものではなく、特許請求の範囲のいくつかの態様の例示として意図されており、かつ機能的に等価な組成物および方法が特許請求の範囲内に入ることが意図されている。本明細書に示されかつ説明されたものに加えて、組成物および方法の様々な改変は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図されている。さらに、本明細書に開示された特定の代表的な材料および方法工程のみが具体的に記載されているが、これらの材料および方法工程の他の組み合わせも、特に記載されてなくても、添付の特許請求の範囲内に入ることも意図されている。したがって、工程、要素、構成要素、または成分の組み合わせは、本明細書では明示的に言及され得るが、明示されていなくても、これらの工程、要素、構成要素、および成分の他の組み合わせも含まれる。
【図１】
2018516540.tif 000002
【図２】
2018516540.tif 000003
【図３】
2018516540.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成29年12月14日(2017.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオマスから糖類を放出させる方法であって、
ａ）バイオマスを固体酸触媒で前処理する工程、
ｂ）前記前処理したバイオマス、工程ａ）の固体酸触媒、および１つ以上のセルラーゼ酵素および／またはヘミセルラーゼ酵素またはそれらの混合物、または１つ以上のセルラーゼ酵素および／またはヘミセルラーゼ酵素を発現可能な生物を含む、水性反応混合物を形成する工程
を含み、
前記固体酸触媒が粘土由来である、前記方法。
【請求項２】
ｃ）工程ｂ）における前記反応混合物の存在下でまたは工程ｂ）における前記反応混合物の水性抽出物の存在下で原核生物または真核生物を培養して産物を形成する工程
をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記バイオマスが植物由来の有機物である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
工程ａ）を実質的に乾燥した条件下で行い、乾燥条件は約０．１〜約４０質量％、例えば、約０．２〜約２５質量％または約０．５〜約２０質量％の含水率の範囲であり、質量％はバイオマスおよび固体酸触媒の全質量を基準とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記植物由来の有機物が、トウモロコシ、紙、紙製品、紙屑、木材、パーティクルボード、鋸屑、農業廃棄物、下水、サイレージ、草、籾殻、バガス、綿、ジュート、麻、亜麻、竹、サイザル、アバカ、わら、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、スイッチグラス、アルファルファ、干し草、籾殻、椰子の毛、綿、合成セルロース、海藻、藻類およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
前記粘土が、カオリナイト、ハロイサイト、アタパルジャイト、モンモリロナイト、イライト、ナクライト、ディッカイト、アナウキサイト、カオリン、メタカオリン、ベントナイト、および酸性ベントナイトゼオライトからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記乾燥固体酸触媒と乾燥バイオマスとの質量比が約０．１対約１０〜約１０対約０．１、例えば、約０．２対約５〜約５対約０．２、例えば、約０．５対約２〜約２対約０．５の範囲である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前処理工程ａ）の間にバイオマスを用いて固体酸触媒に熱を適用する、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記適用される熱が、工程ａ）において約２０℃〜約１６０℃、例えば約４０℃〜約１２０℃の範囲である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前処理工程ａ）の後であるが工程ｂ）の酵素の添加前に水を加える、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記加えられる水が約６０℃〜約２４０℃、例えば約８０℃〜約１６０℃の温度範囲である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記生物が原核生物でありかつ細菌である、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記細菌がグラム陽性またはグラム陰性である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記細菌がコリネバクテリウム属、バチルス属、エルウィニア属、エシェリキア属、パントエア属、ストレプトマイセス属、ザイモモナス属およびロドコッカス属からなる群から選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記生物が真核生物である、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記真核生物が、サッカロマイセス属、ハンセヌラ属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロマイセス属、ヤロウィア属、ピキア属、ジゴサッカロマイセス属、カンジダ属、シュワニオミセス属、アークスラ属、オガタエア属およびクレブシエラ属から選択される酵母である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記産物が、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，４−ブタンジオール、グリセリン、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸またはコハク酸塩、ｎ−ブチルアクリレート、セバシン酸、グルタル酸、オレイン酸、リノール酸、グリコール酸、乳酸または乳酸塩、ガンマ−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシアルカン酸、アラニン、メタン、エタン、プロパン、ペンタン、ｎ−ヘキサン、ピルビン酸塩、アスパラギン酸塩、リンゴ酸塩、バリン、ロイシンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２から１６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
工程ｂ）において前記酵素による処理の前にまたはそれと一緒に、前記固体酸触媒とバイオマスを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのタンパク質およびまたはＴｗｅｅｎ８０およびＴｗｅｅｎ２０などの界面活性剤で処理する、請求項１から１７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
工程ｂ）に続いて、固体酸触媒を工程ｂ）の反応混合物から分離して水性抽出物を形成し、前記水性抽出物を原核生物または真核生物を用いて培養して産物を形成する、請求項２から１８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
前記固体酸触媒を、工程ｂ）の反応混合物から分離し、リサイクルする、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
原核生物または真核生物を培養して産物を形成することを、工程ｂ）の反応混合物のバイオマス、固体酸触媒および酵素の存在下で行う、請求項２から１８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
前記固体酸触媒がカオリンである、請求項１から２１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
前記カオリンを前記培養産物から単離してポゾラン材料を準備する、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記培養産物から単離したカオリンを燃焼してメタカオリンを形成する、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
生合成反応混合物であって、
ａ）固体酸触媒を用いて前処理されたバイオマスであり、前記固体酸触媒が粘土由来である、前記バイオマスおよび
ｂ）１つ以上のセルラーゼ酵素および／またはヘミセルラーゼ酵素またはそれらの組み合わせ、または１つ以上のセルラーゼ酵素および／またはヘミセルラーゼ酵素を発現可能な生物
を含む、前記生合成反応混合物。
【請求項２６】
前記混合物が、原核生物または真核生物を有する発酵ブロスをさらに含有する、請求項２５記載の生合成反応混合物。
【請求項２７】
ポゾラン材料であって、
ａ）バイオマスをカオリン固体酸触媒で前処理する工程
を含む方法から製造された前記ポゾラン材料。
【請求項２８】
前記ポゾラン材料の製造方法が、
ｂ）前記前処理したバイオマス、工程ａ）のカオリン固体酸触媒、および１つ以上のセルラーゼ酵素および／またはヘミセルラーゼ酵素またはそれらの混合物、または１つ以上のセルラーゼ酵素および／またはヘミセルラーゼ酵素を発現可能な生物を含む水性反応混合物を形成する工程、および
ｃ）カオリン固体酸触媒を単離してポゾラン材料を準備する工程
をさらに含む、請求項２７記載のポゾラン材料。
【請求項２９】
前記ポゾラン材料の製造方法が、前記カオリンを加熱してメタカオリンを形成することをさらに含む、請求項２７または２８記載のポゾラン材料。
【国際調査報告】
2018516540.tif 000005
2018516540.tif 000006
2018516540.tif 000007
2018516540.tif 000008
2018516540.tif 000009