(57)【要約】  本発明は、シナラ・スコリムスの滴定抽出物、シナラ・スコリムス抽出物の滴定画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記滴定画分の滴定混合物、又は前記画分の混合物、並びに、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化を特徴とする病理学的状態を予防及び／又は処置するためのそれらを含む組成物及びキットに関する。
2018501304.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種以上の抗腫瘍化合物又は抗炎症化合物と併用して、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸、及びシナロピクリンについて滴定した、シナラ・スコリムス（Ｃｙｎａｒａ  ｓｃｏｌｙｍｕｓ）の抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物であって、
総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の８重量％から１６重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から７重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から４重量％までを示すか、又は、
総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記画分の２５重量％から４８重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記画分の１１重量％から２１重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記画分の１重量％から１０重量％までを示す、
上記抽出物、画分、又は混合物。
【請求項２】
請求項１に記載の使用のための、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物であって、
前記総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の９重量％から１５重量％までを示し、前記クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から５．５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から３重量％までを示すか、又は、
前記総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記画分の２５重量％から３５重量％までを示し、前記クロロゲン酸が、乾燥形態の前記画分の１１重量％から１５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記画分の１重量％から８重量％までを示す、
上記抽出物、画分、又は混合物。
【請求項３】
前記抽出物、前記画分又は前記混合物が、乾燥形態、凍結乾燥形態又は流体形態であり、シナラの葉、頭状花又はそれらの混合物から得られる、請求項１又は２のいずれか一項に記載のシナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物。
【請求項４】
前記併用が、前記抽出物又は前記画分又は前記混合物を前記１種以上の抗腫瘍化合物及び／又は前記１種以上の抗炎症化合物と同時投与又は連続投与することによって実施される、請求項１から３までのいずれか一項に記載の使用のための、１種以上の抗腫瘍化合物又は抗炎症化合物と併用する、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物。
【請求項５】
前記１種以上の抗腫瘍化合物がシスプラチン、ドキソルビシン、ペメトレキセド、メトトレキサート、ビノレルビン、ゲムシタビン及びタキソールを含む群から選択される、請求項１から４までのいずれか一項に記載の使用のための、１種以上の抗腫瘍化合物と併用する、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物。
【請求項６】
前記病理学的状態が前立腺癌、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、メラノーマ、卵巣癌、乳癌、腎細胞癌、膵臓腺癌、肺癌、脳腫瘍、赤白血病、頭頚部扁平上皮癌、結腸癌、悪性胸膜中皮腫を含む群から選択される腫瘍病理学的状態である、請求項１から５までのいずれか一項に記載の使用のための、１種以上の抗腫瘍化合物と併用する、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物。
【請求項７】
前記脳腫瘍が神経膠腫、脳髄膜腫、髄芽細胞腫であり、前記リンパ腫がセザリー症候群、ＥＢＶ関連バーキットリンパ腫、Ｓａｍｉｒｉ  ＨＳＶ依存性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞関連リンパ腫であり；前記白血病がＨＴＬＶ−１−依存性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、巨核球性白血病、大顆粒リンパ球白血病（ＬＧＬ）である、請求項６に記載の使用のための、１種以上の抗腫瘍化合物と併用する、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物。
【請求項８】
前記病理学的状態がＳＴＡＴ３を阻害しない化学療法剤による処置に耐性の腫瘍である、請求項１から７までのいずれか一項に記載の使用のための、１種以上の抗腫瘍化合物と併用する、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物。
【請求項９】
前記炎症性疾患がヘリコバクター・ピロリ（Ｈ  ｐｙｌｏｒｉ）による感染、Ｂ型肝炎ウイルスによる感染、ＨＰＶ（ヒト乳頭腫ウイルス）による感染、エプスタイン−バールウイルス感染などのウイルス感染によって引き起こされる炎症である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の使用のための、１種以上の抗腫瘍化合物と併用する、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物。
【請求項１０】
ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための組成物であって、
活性医薬成分として、
ａ）総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸、及びシナロピクリンについて滴定した、シナラ・スコリムス（ｃｙｎａｒａ  ｓｃｏｌｙｍｕｓ）の抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物であって、
総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の８重量％から１６重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から７重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から４重量％までを示すか；又は、
総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記画分の２５重量％から４８重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記画分の１１重量％から２１重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記画分の１重量％から１０重量％までを示す、
上記抽出物、画分、又は混合物；
ｂ）１種以上の抗腫瘍化合物及び／又は抗炎症化合物、
並びに担体及び／又は希釈剤及び／又は添加剤
を含む組成物。
【請求項１１】
前記総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の９重量％から１５重量％までを示し、前記クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から５．５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から３重量％までを示すか；又は、
前記総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記画分の２５重量％から３５重量％までを示し、前記クロロゲン酸が、乾燥形態の前記画分の１１重量％から１５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記画分の１重量％から８重量％までを示す、
請求項１０に記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
前記１種以上の抗腫瘍化合物がシスプラチン、ドキソルビシン、ペメトレキセド、メトトレキサート、ビノレルビン、ゲムシタビン及びタキソールを含む群から選択される、請求項１０又は１１に記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
前記病理学的状態が前立腺癌、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、メラノーマ、卵巣癌、乳癌、腎細胞癌、膵臓腺癌、肺癌、脳腫瘍、赤白血病、頭頚部扁平上皮癌、結腸癌、悪性胸膜中皮腫を含む群から選択される腫瘍病理学的状態である、請求項１０から１２までのいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１４】
前記脳腫瘍が神経膠腫、脳髄膜腫、髄芽細胞腫であり、前記リンパ腫がセザリー症候群、ＥＢＶ関連バーキットリンパ腫、Ｓａｍｉｒｉ  ＨＳＶ依存性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞関連リンパ腫であり；前記白血病がＨＴＬＶ−１−依存性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、巨核球性白血病、大顆粒リンパ球白血病（ＬＧＬ）である、請求項１３に記載の使用のための組成物。
【請求項１５】
前記病理学的状態がＳＴＡＴを阻害しない化学療法剤による処置に耐性の腫瘍である、請求項１０から１４までのいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１６】
前記炎症性疾患及び／又は前腫瘍状態がヘリコバクター・ピロリ（Ｈ  ｐｙｌｏｒｉ）による感染、Ｂ型肝炎ウイルスによる感染、ＨＰＶ（ヒト乳頭腫ウイルス）による感染、エプスタイン−バールウイルス感染などのウイルス感染によって引き起こされる炎症である、請求項１０又は１１に記載の使用のための組成物。
【請求項１７】
ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物と１種以上の抗腫瘍化合物及び／又は１種以上の抗炎症化合物の同時投与又は連続投与用のキットであって、
−  総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の８重量％から１６重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から８重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から４重量％までを示す、総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸、及びシナロピクリンについて滴定された、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物の１つ以上のアリコートと、
−  １種以上の抗腫瘍化合物の１つ以上のアリコート及び／又は１種以上の抗炎症化合物の１つ以上のアリコートと
を含む、上記キット。
【請求項１８】
前記総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の９重量％から１５重量％までを示し、前記クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から５．５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から３重量％までを示す、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記１種以上の抗腫瘍化合物がシスプラチン、ドキソルビシン、ペメトレキセド、メトトレキサート、ビノレルビン、ゲムシタビン及びタキソールを含む群から選択される、請求項１７又は１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記病理学的状態が前立腺癌、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、メラノーマ、卵巣癌、乳癌、腎細胞癌、膵臓腺癌、肺癌、脳腫瘍、赤白血病、頭頚部扁平上皮癌、結腸癌、悪性胸膜中皮腫を含む群から選択される腫瘍病理学的状態である、請求項１７から１９までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項２１】
前記脳腫瘍が神経膠腫、脳髄膜腫、髄芽細胞腫であり、前記リンパ腫がセザリー症候群、ＥＢＶ関連バーキットリンパ腫、Ｓａｍｉｒｉ  ＨＳＶ依存性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞関連リンパ腫であり；前記白血病がＨＴＬＶ−１−依存性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、巨核球性白血病、大顆粒リンパ球白血病（ＬＧＬ）である、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記病理学的状態がＳＴＡＴを阻害しない化学療法剤による処置に耐性の腫瘍である、請求項１７から２１までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項２３】
前記炎症性及び／又は前腫瘍状態が（文献に記載されているように）ウイルス感染、例えば、ヘリコバクター・ピロリ（ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）による感染、Ｂ型肝炎ウイルスによる感染、ＨＰＶ（ヒト乳頭腫ウイルス）による感染、エプスタイン−バールウイルス感染によって引き起こされる炎症であり得る、請求項１７又は２０から２１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シナラ・スコリムス（Ｃｙｎａｒａ  ｓｃｏｌｙｍｕｓ）の滴定抽出物、シナラ・スコリムス抽出物の滴定画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記滴定画分の滴定混合物、又は１種以上の化学療法剤若しくは抗炎症薬と併用する前記画分の混合物、並びに、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化を特徴とする病理学的状態を予防及び／又は処置するためのそれらを含む組成物及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ここ数十年、多くの文献中の証拠において、多種多様な病状、例えば、腫瘍を促進する炎症性の病状、及び腫瘍そのものにおけるＳＴＡＴファミリーに属する転写因子の基本的な役割が開示されている。ＳＴＡＴタンパク質は細胞質転写因子であって、（ＪＡＫ又はヤヌスキナーゼタンパク質のファミリー作用による特定残基セリン及び／又はチロシンでの）リン酸化／活性化が２種のＳＴＡＴモノマーの二量体化、核内での二量体の移行、ＳＴＡＴ特異的標的遺伝子のＤＮＡエレメントへの結合、及び遺伝子転写の誘導を決定する因子である。ＳＴＡＴ因子のファミリーは、７種のメンバー（遺伝子ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ及びＳＴＡＴ６によってコードされている）から構成されており、分化、増殖、成長、アポトーシス及び細胞の炎症における役割をはじめとする様々な生物学的機能を備えている。これらの遺伝子によってコードされているタンパク質の１つの特徴は、二系統の役割、より詳しくは、細胞質におけるシグナル伝達の役割と核における転写因子の役割を有するということである。特に、ＳＴＡＴ３の構造的活性化と、またそれほどではないがＳＴＡＴ５の構造的活性化は、様々な腫瘍形成において、いくつかの細胞内経路、例えば、腫瘍の生存、及び腫瘍細胞の増殖に関与する経路、また、血管新生及び腫瘍自体の転移のプロセスに関与する経路などの制御解除と関連している。
【０００３】
Ｙｕ  Ｈ．らは、２００９年のＮａｔｕｒｅで公表した概説（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ９、７９８〜８０９：２００９）において、ＳＴＡＴ３の持続的活性化が癌を促進する炎症を誘導し、炎症及び腫瘍の微小環境にとって重要な遺伝子を制御することを報告した。ＳＴＡＴ３によって活性化される遺伝子は、前述の研究の表１及び表２で明らかにされている。また、天然物質のうち、いくつかのＳＴＡＴ３活性化阻害剤、例えば、ククルビタシン（ｃｕｒｃｕｂｉｔａｃｉｎ）、レスベラトロール、ガリエララクトン及びインジルビンなども記載されている。しかし、これらの物質が作用する作用機序は解明されていないと記載されている。
【０００４】
いずれの場合にも、その研究では、ＳＴＡＴ３のモジュレーションが癌処置の新たな、より効果的で非常に有利な方法であると述べられており、様々な腫瘍モデルにおけるＳＴＡＴ３遺伝子の除去が腫瘍増殖を抑制することが報告されている。
【０００５】
ＳＴＡＴ３の構造的活性化は、多数の腫瘍、例えば、乳癌、前立腺癌、頭頚部扁平上皮癌、多発性骨髄腫、リンパ腫及び白血病、脳腫瘍、結腸癌、ユーイング肉腫、胃癌、食道癌、卵巣癌、上咽頭癌及び膵癌などにおいて報告されている（下記表１）。多くのタイプの癌において、高レベルの活性化ＳＴＡＴ３が予後不良と結び付いていた。ＳＴＡＴ３の活性化は、アポトーシスを阻止し、細胞増殖及び細胞生存を増加させ、血管新生及び転移が促進され、抗腫瘍免疫応答が阻害される。ＳＴＡＴ３が構造的に活性化される腫瘍細胞系は、ＳＴＡＴ３の連続的活性化、「発癌遺伝子依存」として定義されている表現型を必要とする（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＰＡ  ａｎｄ  Ｇｒａｎｄｉｓ  ＲＧ、Ｍｏｌｌｎｔｅｒｖ；１１（１）；１８〜２６：２０１１）。
【０００６】
悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）は、胸腔中皮細胞由来の侵襲性の高い腫瘍である。化学療法（多くの場合、ペメトレキセドが使用される）によって手術不可能なＭＰＭ罹患患者の生存期間が改善されるが、その平均の全体生存期間はわずか１２か月である。近年、ＭＰＭに対する可能性のある分子治療標的が、ＭＰＭ罹患患者の胸膜液中に存在する高レベルＩＬ−６によって活性化されるインターロイキン−６シグナル経路（ＩＬ−６）／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３であると報告された。ＩＬ−６のその受容体への結合は、ＪＡＫ活性化を開始する受容体中の構造変化を引き起こし、次いでそれがＳＴＡＴ３転写因子の二量体化を開始し、ＳＴＡＴ３二量体は核内へ移行し、それによって、様々な標的遺伝子の転写活性化の開始が決定される。
【０００７】
この経路は、造血の発生、免疫応答の発生、及び腫瘍形成の発生にとって重要である。さらに、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３系の機能障害が癌の発症に関係していることも実証された。
【０００８】
さらに、腫瘍の発症及び進行においてＳＴＡＴ３が果たす役割に関する概要は、これまでの文献に記載されている。ＳＴＡＴ３の構造的活性化は、血液腫瘍（多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫）と固形腫瘍（メラノーマ、卵巣癌、前立腺癌及び腎細胞癌、膵臓腺癌、肺癌、乳癌並びに脳腫瘍）の両方において観察されている。より詳細については、Ｔｕｒｋｓｏｎ  Ｊ  ａｎｄ  Ｊｏｖｅ  Ｒ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ；１９（５６）；６６１３〜２６：２０００から取得した下記の表３に、ＳＴＡＴ３の異常活性化に直接関係している多数の腫瘍を示す。特に、この異常活性化は、チロシンキナーゼ、例えば、ｖ−Ｓｒｃ、ｖ−Ｒｏｓ、ｖ−Ｆｐｓ、Ｅｔｋ／ＢＭＸ及びＬｃｋなどを変換する作用によって、或いはサイトカインのオートクリン又はパラクリン放出によって誘導される異常シグナルによって引き起こされると考えられる。ＳＴＡＴ３の構造的活性化は、アポトーシス阻害因子（例えば、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｍｃｌ−１）、細胞周期の制御因子（例えば、サイクリンＤ１／Ｄ２、ｃＭｙｃ）、及び血管新生の誘導因子（例えば、ＶＥＧＦ：血管内皮細胞増殖因子）をコードしている遺伝子の過剰発現をもたらす。最後に、最近、腫瘍形成における重要な役割を有していることとは別に、この転写因子の構造的活性化が化学療法剤により誘導される死滅に対する耐性を付与していることが明らかにされている（Ａｇｇａｒｗａｌ  Ｂ．Ｂ．ら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９１；１５１〜６９：２００６）。
【０００９】
様々な臨床研究からは、インビボにおいて、固形腫瘍は、腫瘍そのものを細胞死のシグナルに対して非感受性にし、しかも放射線療法及び化学療法処置に対して耐性をもたせる、Ｏ２が低レベルの環境において増殖及び発症すること；一方、低酸素は血管新生、増殖及び転移能力を促進することが明らかになっている。この文脈において、腫瘍の悪性度とは、低酸素及びＳＴＡＴ３の過剰活性化の両方による、ＨＩＦ−１α因子の活性化及び安定化に関連していると思われる。
【００１０】
この理由のため、ＳＴＡＴ３因子の標的化に基づいた抗癌治療が非常に好ましい（Ｎｉｕ  Ｇ．ら、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６（７）；１０９９〜１０５：２００８）。
【００１１】
下記に示す表１は、Ａｇｇａｒｗａｌ  Ｂ．Ｂ．ら、２００６の研究から取得したものであり、構造的に活性のあるＳＴＡＴ３を発現する腫瘍、ＳＴＡＴ３の活性化因子、ＳＴＡＴ３によって制御される遺伝子及びＳＴＡＴ３の阻害因子のリストを示す。
【表１】
2018501304.tif 000003
【００１２】
表２は、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＰＡ  ａｎｄ  Ｇｒａｎｄｉｓ  ＲＧ  ２０１１から取得したものであり、ＳＴＡＴ３を多数の腫瘍と関連付け、ＳＴＡＴ３が抗癌治療における効果的な標的対象であるという事実を確認している。
【表２】
2018501304.tif 000004
【００１３】
Ｔｕｒｋｓｏｎ  Ｊ  ａｎｄ  Ｊｏｖｅ  Ｒ  ２０００から取得した表３は、ＳＴＡＴ３の異常活性化に直接関連している多数の腫瘍を示している。
【表３】
2018501304.tif 000005
【００１４】
特に、ＳＴＡＴ３に関して、以下のことが多数の刊行物で実証されている：
１）ＳＴＡＴ３は、多くの場合、多数のヒト癌細胞、例えば、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病、肺癌、前立腺癌、頭頚部扁平上皮癌細胞及び他の腫瘍タイプなどで構造的に活性化（リン酸化）される。
２）ＳＴＡＴ３は、増殖因子（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−２３、ＩＬ−２１、ＩＬ−１１、ＨＧＦ）、発癌性キナーゼ（例えば、Ｓｒｃ）によって活性化される。
３）ＳＴＡＴ３は、増殖遺伝子（例えば、ｃ−ｍｙｃ、サイクリンＤ１）、アポトーシス抑制遺伝子（例えば、Ｂｃｌ−ＸＬ及びスルビビン）、サイトカインコード遺伝子、並びに、血管新生を促進する遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ）の発現、活性化された場合の細胞増殖及び血管新生の増加並びにアポトーシスの抑制を媒介する。
４）ＳＴＡＴ３の活性化はまた、化学耐性及び放射線耐性の現象とも関係している。
５）ＳＴＡＴ３の持続的活性化は、様々なヒトの癌において、増殖、生存、血管新生及び転移を増加させ、抗腫瘍免疫を阻害する。
【００１５】
また、特定の臓器又は特定の部位の慢性炎症は悪性転換を促すこと、並びに、ＳＴＡＴ３が癌につながる炎症の外因性及び内因性経路にとって重要であることも公知であり、実際、ＳＴＡＴ３は、慢性炎症に関連した悪性の特性を誘導することが知られている。
【００１６】
腫瘍形成におけるＳＴＡＴ３の重要な役割により、ＳＴＡＴ３の阻害剤は、癌の予防及び処置において多大なる可能性を有している。おそらく、ＳＴＡＴ３の活性化で最もよく知られている阻害剤の１つは、ＪＡＫ２の活性化を阻害する、ＡＧ４９０である。他のＳＴＡＴ３の阻害剤としては、小ペプチド、オリゴヌクレオチド及び小分子が挙げられる。一部の著者は、ＤＮＡへの結合、及び遺伝子制御の活性、並びに細胞形質転換を媒介する機序である、ＳＴＡＴ３のリン酸化／活性化を遮断するペプチドを同定している。ＳＴＡＴ３を遮断する様々な小分子としては、ＰＧＪ２、白金複合体、エタノール、サリチル酸ナトリウム、レチン酸、アチプリモド、ＰＳ−３４１及びスタチンが挙げられる。多くの植物ポリフェノールにおいて、ＳＴＡＴ３の活性化を抑制するそれらの能力が同定された。これらには、クルクミン、レスベラトロール、ククルビタシン、インジルビン、ピセアタンノール、パルテノライド、フラボピリドール、マグノロール及びエピガロカテキン−３−ガレートが含まれる。ＳＴＡＴ３活性化の抑制にこれらの分子が効を奏する方法は完全に明らかではない。例えば、クルクミンは、ＳＴＡＴ３活性化に全面的に関与している、ＪＡＫ２、Ｓｒｃ、Ｅｒｂ２及びＥＧＦＲの阻害効果と、発現がＳＴＡＴ３によって制御されている、Ｂｃｌ−ｘＬ、サイクリンＤ１、ＶＥＧＦ及びＴＮＦの発現の下方制御の効果が明らかになっている（Ａｇｇａｒｗａｌ  Ｂ．Ｂ．ら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９１；１５１〜６９：２００６）。
【００１７】
ＳＴＡＴ３のシグナル伝達カスケードへの干渉：ＳＴＡＴ３のリン酸化／活性化の阻害、ＳＴＡＴ３が関与する分子間相互作用の阻害、ＳＴＡＴ３の核内取り込み／排出の阻害、ＳＴＡＴ３によって媒介される転写の阻害を可能にする、様々な方策及び様々なメカニズムがある。化学療法剤とは別に、ＳＴＡＴ３を阻害することが既に述べられており、さらに他のものも記載されている（セツキシマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブなど）。これらについては様々な影響：緩やかな有効性、耐性の発生、骨髄抑制、胃腸レベルでの毒性、及び心臓血管系毒性をはじめとする様々な有害反応が報告されている（表４を参照）。
【００１８】
下記の表４は、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＰＡ  ａｎｄ  Ｇｒａｎｄｉｓ  ＲＧ  ２０１１から取得したものであり、ＳＴＡＴ３のシグナルの治療的介入に関する方法及び結果を報告している。
【表４】
2018501304.tif 000006
【００１９】
腫瘍進行に直接関与している細胞の亜集団において、より特異的な方法で特定の標的分子を阻害する化合物による標的化治療法である治療法は、癌処置において新たな展望を示す。細胞増殖及び死滅をコントロールする分子、例えば、増殖因子に対する受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）などは、このタイプの治療的アプローチの最良の対象の一つである。標的療法の時代は、転移性乳癌を処置するためのトラスツズマブ（ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体）と、慢性骨髄性白血病におけるイマチニブ（ｉｍａｔｉｂｉｎ）（ＢＣＲ−ＡＢＬの阻害因子）の承認で始まった。これらの処置効果に対する当初の熱意にもかかわらず、医師は、すぐに再発の問題に直面しなければならなかった。その理由は、癌に罹患している者には、多くの場合、代替経路が活性化することにより薬剤に対する耐性が出現したからである。腫瘍は、一般的に無秩序化された、多くの機序及び多くの遺伝子標的によって特徴づけられるので、併用療法を採用することは有利であり、応答及び許容性を増加させ、且つ耐性を低下させる合理的な方法となることから、癌処置における標準である。現在、低薬剤用量を使用することにより全身毒性を最小限にして、効果を最大化することを目的とした抗腫瘍薬剤の併用に対して関心が高まっている。
【００２０】
したがって、Ｓｒｃ及びＪＡＫを含む上流分子の薬理学的遮断によるＳＴＡＴ３リン酸化の阻害が腫瘍形成を低減させ、化学療法薬の必要用量の低下の可能性につながることがより多くの試験で結論付けられていることを考慮すると、ＳＴＡＴ３の構造的活性化又は誘導的活性化を遮断することができる天然由来分子などの薬理学的に安全で有効な治療薬は、癌処置において潜在的有効性を有している。
【００２１】
さらに、ＳＴＡＴ３の活性化は化学療法及び放射線療法に対する耐性にも関連するため、こうした活性化の阻害剤は、そのような耐性を制限し、化学療法及び放射線療法の効果を最適化するための大きな関心事でもある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明の発明者らは、アーティチョーク（シナラ・スコリムス）の抽出物がタンパク質ＳＴＡＴ３のリン酸化を選択的にモジュレートし、本質的には阻害し、その結果、転写因子としての細胞内のその後の作用を阻害できることを実証した。本出願の実験部分で明らかなように、本発明の発明者らは、多数の実験において、また様々な細胞系に対して、本明細書に記載の抽出物がＳＴＡＴ３の活性化（リン酸化）の有効な阻害剤であり、結果として、
−  腫瘍細胞系に対する有効な細胞障害作用を示し、
−  腫瘍細胞の再生を阻害することができ、したがって細胞増殖抑制剤として作用し、
−  腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、
−  多くの化学療法剤との相加効果及び相乗効果を有し、それによって、化学療法剤単独による処置又は抽出物単独による処置と比べて腫瘍細胞の生存能力（生存率）が低下し、
−  悪性胸膜中皮腫細胞及び非形質転換性中皮細胞に対し異なる方法で作用する
ことを実証した。
【００２３】
また本発明の発明者らは、臨床上での使用に適し得る標準化調製物を提供することができるように、いくつかの成分について抽出物を滴定してそれを特性決定し、次いで、シナラ・スコリムスの抽出物の異なる画分を単離し、同定ができるように同一成分についてそれらを滴定し、他方では、シナラ・スコリムスの抽出物の滴定と似た滴定を有する個々の画分を報告した実験において使用し、さらにまた、本抽出物の滴定と似た滴定を有する最終化合物が得られるように、それらの中の異なる画分を混合すること、又は異なる画分を前記抽出物と混合することができるよう実施例及び図面において報告した。
【００２４】
ＳＴＡＴ３因子に対するこうした抽出物の影響の見地から、本発明の発明者らは、シナラ・スコリムスの抽出物がＳＴＡＴ３へのＤＮＡへの結合を阻止し、それにより、通常、リン酸化ＳＴＡＴ３によって活性化される遺伝子発現の変化を阻止できることを実験によってさらに実証した。
【００２５】
言い換えれば、前記抽出物がリン酸化形態のタンパク質ＳＴＡＴ３をモジュレートし、本質的には阻害し、転写因子としての細胞内における前記タンパク質の連続的作用を阻止できることを証明した。特に、本開示の発明者らは、シナラ・スコリムスの抽出物がＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化を阻害できること、またＭＰＭ腫瘍細胞の培養におけるアポトーシスの再活性化を誘導できることを実証した。さらに、本発明の発明者らは、ＭＰＭ腫瘍細胞の培養に関する実験において、シナラ・スコリムスの抽出物は創傷治癒を抑制し、実際、腫瘍細胞の浸潤を阻止することも実証した。さらに、本発明の発明者らは、マウスの腫瘍細胞移植実験により、本発明の抽出物がインビボにおいてＭＰＭ細胞に対する抗腫瘍効果を発揮することも実証した。
【００２６】
したがって、本発明の第１の主題は、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分の混合物、又は前記画分の混合物であって、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の８重量％から１６重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から７重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から４重量％までを示し、前記抽出物、画分又は混合物が抗腫瘍及び／又は抗炎症活性を有する１種以上の活性化合物と併用して使用される、上記抽出物、上記画分又は上記混合物である。
【００２７】
本発明の第２の主題は、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、１種以上の抗腫瘍活性を有する薬剤と併用する、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分の混合物、又は前記画分の混合物であって、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の８重量％から１６重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から７重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から４重量％までを示す、上記抽出物、上記画分又は上記混合物と、担体及び／又は希釈剤及び／又は添加剤を含むか又はそれからなる組成物である。
【００２８】
本発明の第３の対象は、化学療法剤と併用してＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分の混合物、又は前記画分の混合物であって、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の８重量％から１６重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から７重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から４重量％までを示す、上記抽出物又は上記画分又は上記混合物と、抗炎症作用及び／又は抗腫瘍活性を有する１種以上の化合物（抗炎症化合物及び／又は抗腫瘍化合物）の同時投与又は連続投与用のキットであって、上記で定義したシナラ・スコリムスの抽出物、若しくはシナラ・スコリムスの抽出物の画分、若しくは前記抽出物と１つ以上の前記画分の混合物、若しくは前記画分の混合物の１つ以上のアリコート、又は、活性医薬成分として、上記で定義したシナラ・スコリムスの抽出物、若しくはシナラ・スコリムスの抽出物の画分、若しくは前記抽出物と１つ以上の前記画分の混合物、若しくは前記画分の混合物と、化学療法剤、若しくは化学療法剤と適切な医薬として許容可能な担体の混合物の１つ以上の別のアリコートを含む組成物の１つ以上のアリコートを含む、上記キットである。
【００２９】
本発明の第４の主題は、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態を予防及び／又は処置するための治療方法であって、それを必要とする個体に、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分の混合物、又は前記画分の混合物であって、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の８重量％から１６重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から７重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から４重量％までを示す、上記抽出物又は上記画分又は上記混合物、或いは上記で定義した医薬組成物の治療上有効な量を投与するステップを含む、上記治療方法である。
【００３０】
本明細書の目的において、シナラ・スコリムスという用語は、シナラ・カルドンクルス亜種スコリムス（Ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｃｏｌｙｍｕｓ）という用語に相当し、本明細書及び特許請求の範囲の任意の箇所においてそれらと置き換えることができる。
【００３１】
本明細書の目的において、「含む」という用語は、本明細書及び特許請求の範囲の任意の箇所において、「からなる」と置き換えることができる。
【００３２】
注：本図面において、使用されているシナラ属種の抽出物は、多くの場合、ＡＢＯ−１の略語で示されている。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＳＴＡＴ３、ｐ−ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）のリン酸化の阻害。        図１Ａは、２４時間、１００μｇ／ｍｌのシナラ・スコリムス（Ｃｙｎａｒａ  ｓｃｏｌｙｍｕｓ）抽出物で処置したＭＳＴＯ２１１Ｈから得た細胞溶解産物のウェスタンブロット解析である。定量は、対照のアクチンと比較して実施した。        図１Ｂは、ＭＳＴＯ２１１Ｈ細胞でのウェスタンブロットで得られたデータの棒グラフである。ｐ−ＳＴＡＴ３（リン酸化ＳＴＡＴ３）は黒色で示し、ＳＴＡＴ３は灰色で示す。        この図は、対照と比べ、抽出物がｐ−ＳＴＡＴ３の形成を阻害することを示している。
【図２】ｐ−ＳＴＡＴ３の列に２５−５０−７５μｇ／ｍｌのシナラ・スコリムス抽出物で処置したＭＳＴＯ２１１Ｈ細胞の細胞溶解産物のウェスタンブロット解析を、下列の対照アクチンとともに示す。この図は、抽出物がＳＴＡＴ３リン酸化を阻害すること、またこの阻害が用量依存性であることを示す。
【図３】様々な用量のシナラ・スコリムス抽出物を用いたヒト悪性胸膜中皮腫細胞系でのクローン原性アッセイ（条件については実験の項目を参照のこと）である。        図３ａは、ヒト中皮腫細胞系ＭＳＴＯ２１１Ｈで実施したアッセイである。        図３ｂは、ヒト中皮腫細胞系ＮＣＩ−Ｈ２８で実施したアッセイである。        図３ｃは、ヒト中皮腫細胞系ＭＰＰ−８９で実施したアッセイである。        図３ｄは、ヒト中皮腫細胞系ＮＣＩ−Ｈ２０５２で実施したアッセイである。
【図４】本発明の抽出物は、３種の異なる炎症腫瘍系（ＨＣＴ１１６、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  Ｅ  ＤＵ１４５）が用量依存的に、それらのアイソタイプとは無関係にコロニーを形成する能力に影響を及ぼす。        図４ａは、結腸腫瘍細胞系ＨＣＴ１１６で実施したアッセイである。        図４ｂは、前立腺腫瘍細胞系ＤＵ１４５で実施したアッセイである。        図４ｃは、乳房腫瘍細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１で実施したアッセイである。
【図５】悪性胸膜中皮腫細胞系（ＭＳＴＯ２１１Ｈ、ＭＰＰ−８９、ＮＣＩ−Ｈ２８）でのＡＴＰｌｉｔｅアッセイを使用する細胞生存能力アッセイである（条件については実験の項目を参照のこと）。このアッセイは、細胞生存能力が様々な中皮腫細胞系において用量依存的に本発明のシナラ・スコリムス抽出物によって阻害されることを示す。
【図６】正常中皮腫細胞（ＨＭＣ）をシナラ・スコリムス抽出物で処置して得られた増殖曲線と比較した図５の３種の生存能力曲線の比較（図６ａ：ＭＳＴＯ２１１Ｈ、図６ｂ：ＭＭＰ−８９、図６ｃ：ＮＣＩ−Ｈ２８）である。悪性中皮腫細胞系（ＭＰＭ）は、明らかに、ＨＭＣと比べ、シナラ・スコリムス抽出物の抗増殖作用を示す。
【図７】示した抽出物のシナロピクリンの含量で、様々な処置時間（２４時間及び４８時間）、各種濃度のアーティチョーク抽出物（５０〜６００μｇ／ｍｌ）で処置した、コンフルエントな前立腺腺癌細胞系ＤＵ−１４５における細胞活性のアッセイである。細胞の密集度は、構造的に活性化されたＳＴＡＴ３のレベルを増加させ、細胞自体を死滅耐性にさせる。生存能力は、ＷＳＴ−１アッセイを使用して分析した（ＷＳＴ−１試験、条件については実験の項目を参照のこと）。図は、抽出物が時間依存的及び用量依存性的に生存能力を阻害することを示す。正方形は、０〜６００μｇ／ｍｌの抽出物用量と、μｇ／ｍｌ及びμΜで表される様々な濃度（１００、２００、３００、４００、５００、６００μｇ／ｍｌ）の抽出物のシナロピクリンのそれぞれの含量での２４時間にわたる傾向を示し、円形は４８時間にわたる傾向を示す。        ＳＴＡＴ３の活性化が高レベル細胞：得られた結果は、抽出物が２４時間では細胞生存能力をＥＣ５０＝３８０μｇ／ｍｌで阻害し、４８時間では細胞生存能力をＥＣ５０＝１００μｇ／ｍｌで阻害することを示す。
【図８】各種処置時間（２４時間又は４８時間）、様々な濃度のシナロピクリン（０〜７０μｍ）で処置した、コンフルエントな前立腺腺癌細胞系ＤＵ−１４５における細胞生存能力のアッセイである。密集度は、構造的に活性化されたＳＴＡＴ３のレベルを増加させ、細胞を死滅耐性にする。生存能力は、ＷＳＴ−１アッセイを使用して分析した（ＷＳＴ−１試験、条件については実験の項目を参照のこと）。図は、シナロピクリンが時間依存的及び用量依存性的に細胞生存能力を阻害することを示す。正方形は、異なる濃度：１０、２０、３０、４０、５０、６０μΜのシナロピクリンでの２４時間の傾向を示し、三角形は４８時間の傾向を示す。        示したデータは、シナロピクリンがアーティチョーク抽出物ほど有効ではないことを示す。図からは、シナロピクリンが時間依存的及び用量依存的に細胞生存能力及び増殖を阻害するものの、アーティチョーク抽出物と比べ、その効果ははるかに低いことを示す（比較として図８を参照のこと）。例えば、約９０％に相当する生存能力低下の効果を得るためには、シナロピクリンが凍結乾燥抽出物内に含有されている場合、４８時間では、０．９４〜２．８２μΜに対して５０μΜでの処置が必要である。
【図９】各種処置時間（２４−４８−７２時間）、様々な濃度のアーティチョーク抽出物で処置した、構造的に活性化されたＳＴＡＴ３のレベルが低い、コンフルエントでない細胞系ＤＵ−１４５における細胞生存能力のアッセイである。生存能力は、ＷＳＴ−１アッセイを使用して分析した（ＷＳＴ−１試験、条件については実験の項目を参照のこと）。円形は、５０μｇ／ｍｌのシナラ・スコリムスによる処置を示し、正方形は１００μｇ／ｍｌでの処置を示し、三角形は２００μｇ／ｍｌでの処置を示す。図は、細胞系ＤＵ１４５の細胞生存能力がシナラ・スコリムス２００μｇ／ｍｌによってどの程度大幅に損なわれるかを示す。得られた結果は、２００μ／ｍｌの抽出物が２４時間で６０％まで細胞生存能力を阻害することを示す。ＳＴＡＴ３の活性化レベルが高い細胞の実験に関する図８と比べた場合、この実験のＥＣ５０は極めて低く（２４時間で約２００対３８０μｇ／ｍｌ）、ＳＴＡＴ３の活性化レベルが低い（コンフルエントでない）細胞における本発明の抽出物の効果はより大きいことが明らかである。したがって、こうした実験から、ＳＴＡＴ３が活性である細胞は悪性度が高いことが確認される。ＳＴＡＴ３のリン酸化の阻害は、細胞生存能力を低減する重要な機序である。
【図１０】中皮腫細胞系ＭＰＭ（図１０ａ  ＭＳＴＯ２１１Ｈ及び図１０ｂ  ＮＣＩ−Ｈ２０５２）と転換中皮腫細胞（図１０ｃ  ＨＭＣ）でのペメトレキセド（ＰＭＴＸ）と併用してアーティチョーク抽出物で処置した後の細胞生存能力アッセイ（ＡＴＰＩｉｔｅアッセイ）。ＰＭＴＸによる処置はＭＰＭ細胞には細胞障害性であり、且つ非腫瘍細胞には毒性が高い。本発明の抽出物＋ＰＭＴＸによる細胞の併用処置は、ＭＰＭ細胞系における細胞生存能力に有意な効果があり、一方、非形質転換細胞（ＨＣＭ）ではペメトレキセドによって誘発される死滅率を低減した。結果として、本発明のアーティチョーク抽出物は、腫瘍細胞のみをペメトレキセド感受性にすることが明らかである。
【図１１】ヒト前立腺腫瘍細胞系ＤＵ１４５での様々な化学療法剤：ドキソルビシン、タキソール、シスプラチンと併用してアーティチョーク抽出物による処置後の細胞生存能力アッセイＷＳＴ−１（条件については実験の項目を参照のこと）。生存能力は、ＷＳＴ−１アッセイを使用して分析した（ＷＳＴ−１試験、条件については実験の項目を参照のこと）。          図１１ａは、２つの異なる用量のアーティチョーク抽出物（１００及び２００μｇｍｌ）を使用し、１０μｇ／ｍｌのシスプラチン単独、並びに１０μｇ／ｍｌのシスプラチンと併用するアーティチョーク抽出物（１００及び２００μｇ／ｍｌ）で２４時間処置した後の細胞生存能力を示す。          図１１ｂは、ヒト癌細胞ＤＵ１４５において、２つの異なる用量のアーティチョーク抽出物（１００及び２００μｇｍｌ）を使用し、１μｇ／ｍｌのドキソルビシン、並びに１μｇ／ｍｌのドキソルビシンと併用するアーティチョーク抽出物（１００及び２００μｇ／ｍｌ）で２４時間処置した後の細胞生存能力を示す。          図１１ｃは、ヒト癌細胞ＤＵ１４５において、２つの異なる用量のアーティチョーク抽出物（１００及び２００μｇ／ｍｌ）を使用し、３００ｎＭのタキソール、並びに３００ｎＭのタキソールと併用するアーティチョーク抽出物（１００及び２００μｇ／ｍｌ）で２４時間処置した後の細胞生存能力を示す。          すべての実験において、本発明の基礎を形成する抽出物は３種の化学療法剤の細胞毒性を増強し、シスプラチンの場合に効果が大きい。
【図１２】ヒト癌細胞ＤＵ１４５におけるアーティチョーク抽出物とシスプラチンとの併用による処置後の細胞生存能力のアッセイ（条件については実験の項目を参照のこと）である。図は、様々な濃度のアーティチョーク抽出物と１５μｇ／ｍｌの一定濃度のシスプラチンでのアーティチョーク抽出物（黒色）、シスプラチン（薄灰色）及びアーティチョーク＋シスプラチン（白色）の間の比較を示す。          シナロピクリンの相対濃度を図に示す。          本発明の基礎を形成する抽出物はシスプラチンの細胞毒性を増強し、２００μｇ／ｍｌの用量で効果の高い。
【図１３】ヒト癌細胞ＤＵ１４５におけるアーティチョーク抽出物とドキソルビシンの併用による処置後の生存能力アッセイである（条件については実験の項目を参照のこと）。図は、様々な濃度のアーティチョーク抽出物と２μｇ／ｍｌの一定濃度のドキソルビシンでのアーティチョーク抽出物（黒色）、ドキソルビシン（薄灰色）及びアーティチョーク＋ドキソルビシン（白色）の間の比較を示す。          シナロピクリンの相対濃度は図１３で報告したのと同様である。          本発明の基礎を形成する抽出物はドキソルビシンの細胞毒性を増強し、２００μｇ／ｍｌの用量で効果が大きい。
【図１４】ヒト癌細胞ＤＵ１４５におけるシナロピクリンとシスプラチンの併用による処置後の生存能力アッセイである（条件については実験の項目を参照のこと）。図は、様々な濃度のシナロピクリンと１５μｇ／ｍｌの一定濃度のシスプラチンでのシナロピクリン（黒色）、シスプラチン（薄灰色）及びシナロピクリン＋シスプラチン（白色）の間の比較を示す。          細胞生存能力を２０％未満に低減する効果を得るためには、アーティチョーク抽出物中に存在する濃度よりも４０倍以上のシナロピクリンモル濃度が必要であると思われる（図１２を参照）。
【図１５】ヒト癌細胞ＤＵ１４５におけるシナロピクリン及びドキソルビシンの併用による処置後の生存能力アッセイである（条件については実験の項目を参照のこと）。図は、様々な濃度のシナロピクリンと２μｇ／ｍｌの一定濃度のドキソルビシンでのシナロピクリン（黒色）、ドキソルビシン（薄灰色）及びシナロピクリン＋ドキソルビシン（白色）の間の比較を示す。          細胞生存能力を２０％未満に低減する効果を得るためには、アーティチョーク抽出物中に存在する濃度よりも２５倍以上のシナロピクリンモル濃度が必要であると思われる（図１３を参照）。
【図１６】ヒト中皮腫細胞系ＭＳＴＯ２２１Ｈにおける創傷治癒アッセイである（条件については実験の項目を参照のこと）。          図１６ａは、濃度６μｇ／ｍｌの担体単独、及び生成物を含む対照プレートにおける３６ｈの創傷治癒を示す。          図１６ｂは、示した時間、本発明の抽出物で、また担体で処置した創傷を閉じる効果に関する棒グラフを示す（細胞数の定量を％で示す）。
【図１７】シナラ・スコリムス抽出物は、ＤＵ１４５細胞のＳＴＡＴ３経路をモジュレートする：特に、図は、抽出物がＤＵ−１４５細胞のＳＴＡＴ３の構造的活性化を阻害し、またＤＮＡへのＳＴＡＴ３の結合を阻害することを示す。          １７ａ）ウェスタンブロット：シナラ・スコリムス抽出物（２００μｇ／ｍｌ）は、タンパク質の発現を変化させることなく、処置の２〜４時間後にＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害する。          １７ｂ）ＥＭＳＡ：シナラ・スコリムス抽出物（２００μｇ／ｍｌ）は、ＤＵ−１４５細胞系における処置の２〜４時間後にＤＮＡへのＳＴＡＴ３の結合を阻害する（図１７ｂ）。
【図１８】シナラ・スコリムス抽出物は、ＫＡＲＰＡＳ細胞におけるＳＴＡＴ３経路をモジュレートする：特に、図は、抽出物がＫＡＲＰＡＳ細胞のＳＴＡＴ３の構造的活性化を阻害し、またＤＮＡへのＳＴＡＴ３の結合を阻害することを示す。          １８ａ）ウェスタンブロット：シナラ・スコリムス抽出物（２００μｇ／ｍｌ）は、ＫＡＲＰＡＳ細胞系におけるタンパク質の発現を変化させることなく、処置の２〜４時間後にＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害する。          １８ｂ）ＥＭＳＡ：シナラ・スコリムス抽出物（２００μｇ／ｍｌ）は、ＫＡＲＰＡＳ細胞系における処置の２〜４時間後にＤＮＡへのＳＴＡＴ３の結合を阻害する。          使用したシナラ・スコリムス抽出物は０．１８１％のシナロピクリンを含有し、したがって、２００μｇ／ｍｌの抽出物は１．２μΜのシナロピクリンを含有している。
【図１９】シナロピクリンは、ＤＵ−１４５細胞のＳＴＡＴ３経路をモジュレートする。  シナロピクリンは、ＤＵ−１４５細胞において、ＳＴＡＴ３のリン酸化とＤＮＡに結合するその能力の両方を阻害し、ＥＣ５０＝２５μΜ（２５μΜシナロピクリン＝約０．７４μｇ／ｍｌ）である。          ウェスタンブロット：２５μΜのシナロピクリンは、ＤＵ−１４５細胞のＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害する（図１９ａ）。          ＥＭＳＡ：２５μＭのシナロピクリンは、ＤＵ−１４５細胞においてＤＮＡへのＳＴＡＴ３の結合を阻害する（図１９ｂ）。
【図２０】シナロピクリンは、ＫＡＲＰＡＳ細胞のＳＴＡＴ３経路をモジュレートする。  シナロピクリンは、ＫＡＲＰＡＳ細胞において、ＳＴＡＴ３のリン酸化とＤＮＡに結合するその能力の両方を阻害し、ＥＣ５０＝２５μΜ（２５μΜシナロピクリン＝約０．７４μｇ／ｍｌ）である。          ウェスタンブロット：シナロピクリン（２５μΜ）は、ＤＵ−１４５細胞のＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害する（図１９ａ）。          ＥＭＳＡ：シナロピクリン（２５μＭ）は、ＤＵ−１４５細胞においてＤＮＡへのＳＴＡＴ３の結合を阻害する（図１９ｂ）。
【図２１】細胞周期に対するシナラ・スコリムス抽出物の影響の評価（ＦＡＣＳ法）である。抽出物は、４８時間の処置の後（図２１ａ）及び７２時間の処置の後（図２１ｂ）の両方において、サブＧ１期の細胞割合を増加させ、ＭＰＭ細胞（ＭＳＴＯ２１１Ｈ）の死滅を誘導する。
【図２２】アポトーシスの誘導を評価するアッセイ（ウェスタン法）である。本発明の抽出物は、用量１００μｇ／ｍｌで、細胞系ＭＳＴＯ２１１ＨのＰＡＲＰ形態、並びにカスパーゼ３及び７切断形態などのいくつかのアポトーシスマーカーのレベル上昇によって明らかなように、アポトーシスを誘導する。
【図２３】アネキシンＶのレベル測定によるアポトーシス誘導を評価するアッセイである。本発明の抽出物は、時間依存的及び用量依存的に、アネキシンＶの呈色で判定したとおり、細胞系ＭＳＴＯ２１１Ｈにおいてアポトーシスを誘導する。
【図２４】様々な濃度のシナロピクリン：三角形１２．５μΜ、正方形２５μΜ、菱形５０μΜで処置した後のＧＳＨの細胞内濃度の分析である（条件については実験の項目を参照のこと）。          シナロピクリンは、ＧＳＨの細胞内濃度の時間依存的及び用量依存的減少を決定する。
【図２５】ＳＴＡＴ３のグルタチオン化のアッセイである（条件については実験の項目を参照のこと）。シナロピクリンは、ＳＴＡＴ３のグルタチオン化を決定する。レーン１は対照、レーン２はＧＳＨ  １ｍＭ、レーン３はジアミド０．５ｍＭ、レーン４はＧＳＳＧ、レーン５はシナロピクリン１２μＭ、レーン６はシナロピクリン２５μΜである。          この実験で得られたデータは、シナロピクリンがＧＳＨの細胞内濃度を低下させること（図２６）と、酸化還元状態の変化がＳＴＡＴ３のグルタチオン化を誘導し、そのリン酸化を妨げること（図２７）を示す。グルタチオンエチレンエステルを用いる前処置によってＧＳＨの生理学的値が回復すると、シナロピクリンがＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害する能力は反転する。          図２６及び図２７は、６〜７週齢の雌ＣＤ１ヌードマウス（ＭＰＭ腫瘍移植）で実施した、細胞系ＭＳＴＯ２１１Ｈにおけるアーティチョーク抽出物の抗腫瘍活性の評価に関する。
【図２６】ＭＰＭ細胞系移植に対するアーティチョークの効果である。          ＭＳＴＯ２１１Ｈは、２４時間、アーティチョーク抽出物で前処置を行った。次いで、それらをＣＤ１ヌードマウスに接種した。アーティチョーク抽出物による前処置は腫瘍移植に影響を及ぼし、腫瘍体積の統計的有意差（ｐ＝０．０１）を誘導した。
【図２７】ＭＰＭ細胞移植に対するアーティチョーク抽出物の効果である。ＭＳＴＯの異種移植片を有するＣＤ１マウスを３週間、アーティチョーク抽出物の量を増やしながら処置した。用量依存的治療効果がアーティチョーク抽出物に対して確認された。ペメトレキセド（ＰＭＴＸ）は、既知の治療薬濃度でポジティブ対照として使用した。図は、既知の治療薬濃度のペメトレキセドと比べた本発明の抽出物の効果を示す＊ｐ＜０．０１。
【図２８】悪性胸膜中皮腫細胞系でのＡＴＰｌｉｔｅアッセイを使用する３種の生存能力曲線の比較である（図２８ａ及び図２８ｂ  ＭＳＴＯ２１１Ｈ、図２８ｃ及び図２８ｄ  ＭＭＰ−８９）。  グラフａ及びｃにおいて、アッセイは、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の抽出物又は画分の混合物（ミックス）の９重量％から１５重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の抽出物若しくは画分の混合物の３．５重量％から５．５重量％までを示し、シナロピクリンが、乾燥形態の抽出物若しくは画分の混合物の０．２重量％から３重量％までを示す、シナラ・スコリムスの様々な抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分のミックスにより実施される。  グラフｂ及びグラフｄにおいて、アッセイは、グラフａ及びグラフｃでも報告した滴定抽出物を用いて、下記で述べた画分３、画分４及び画分５と共に実施した。  明らかに、画分３及び画分４は、上記のように滴定した全抽出物又はミックスと少なくとも同程度有効であるが、画分５は単独では全く効果がない。
【図２９】様々な濃度のドキソルビシンで２４時間処置した、正常酸素状態及び慢性低酸素状態下で培養したＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞による処置を示す。得られたデータは、ＣｈＲ−ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞が正常酸素状態下で培養した親細胞に対して薬剤耐性が高いことを示す。
【図３０】本発明に記載の滴定抽出物による処置を示す。正常酸素状態下及び慢性低酸素状態下で培養したＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を、１００ｍｇ／ｍｌ濃度で５０％ＥｔＯＨに溶解させた本発明に記載の滴定抽出物の様々な濃度で２４時間処置した。得られた結果は、本抽出物が用量依存的に細胞の生存能力を阻害することを示す（ＥＣ５０＝３００ｕｇ／ｍＬ）。
【図３１】本発明に記載の滴定抽出物及びドキソルビシンによる処置を示す。化学療法処置に対し細胞を感受性にする目的で、ＣｈＲ−ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を０．２５ｕｇ／ｍＬのドキソルビシンと併用して漸増量の本発明に記載の抽出物で処置し、細胞生存能力について、下記の実験の項目で示したトリパンブルーを用いて評価した。この種の実験では、試験細胞において２０％の致死率を誘導し得るドキソルビシンの量を使用した。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
したがって、本出願は、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、１種以上の抗腫瘍薬又は抗炎症薬と併用する、総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸、及びシナロピクリンについて滴定した、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物であって、
総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の８重量％から１６重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から７重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から４重量％までを示し、又は、
総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記画分の２５重量％から４８重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記画分の１１重量％から２１重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記画分の１重量％から１０重量％までを示す、上記抽出物、上記画分又は上記混合物に関する。
【００３５】
上述したものの特定の実施形態において、本出願は、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、１種以上の抗腫瘍薬又は抗炎症薬と併用する、総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸、及びシナロピクリンについて滴定した、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物であって、
総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の９重量％から１５重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から５．５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から３重量％までを示し、又は、
総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記画分の２５重量％から３５重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記画分の１１重量％から１５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記画分の１重量％から８重量％までを示す、上記抽出物、上記画分又は上記混合物に関する。
【００３６】
前述のように、異常活性化又は構造的活性化は、血液中及び組織中の炎症性及び／又は腫瘍原性作用の原因となるこの因子の異常リン酸化又は構造的リン酸化に関わっていると思われる。
【００３７】
以下の記載、特許請求の範囲及び図面において、「ＳＴＡＴ３」という用語は、ＳＴＡＴ３転写のシグナル及び活性化の形質導入因子を意味する（シグナル伝達兼転写活性化因子３）。慣例的には、遺伝子について言及する場合、イタリック体の大文字が使用されるが、タンパク質は非イタリック体の大文字によって表示される。
【００３８】
炎症及び腫瘍は、発癌経路及び環境経路と密接に関連しており、ＳＴＡＴ３因子（シグナル伝達兼転写活性化因子３）のリン酸化は、それらの活性化と核の置換をもたらし、そこでは、それは、多数のサイトカイン、ケモカイン、及び炎症に関連する他の伝達物質の転写の活性化因子として作用し、それにより癌を促進することは、文献において既知である。
【００３９】
したがって、ＳＴＡＴ３の活性化阻害因子は、ＳＴＡＴ３因子の構造的活性化が存在するそれらのすべての病状に対して予防効果及び／又は治療効果を有する因子である。
【００４０】
本発明の目的におけるアーティチョーク又はシナラ・スコリムスは、シナラ属（シナラ属種）、特にシナラ・カルドンクルス亜種スコリムス（Ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｃｏｌｙｍｕｓ）に属する植物を意味する。
【００４１】
本発明を実施する目的において、抽出物は、葉及び／若しくは頭状花の抽出物又はその混合物であってもよく、新鮮なものでも乾燥されたものであってもよい。
【００４２】
「頭状花」という用語は、植物によって形成される花の頂部、例えば、アーティチョークそのもの（食品として一般に使用されている部分）を意味する。抽出物は、流体抽出物、又は既知の乾燥技術によって凍結乾燥又は乾燥された抽出物であってよい。抽出物は、以下の溶媒：水、エタノール、メタノール、アセトン又はイソプロパノールによる抽出によって、それぞれの場合、純粋な形態又は相互の混合物で取得することができる。アルコールはメタノール、エタノール、イソプロパノールであってよく、好ましくはエタノールである。エタノールは、純粋な形態で、又は以下のパーセンテージの水との混合物で使用することができる：９６％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％。本発明の限定されない実施形態において、抽出で使用される溶媒は、５０：５０の割合のエチルアルコールと水によって形成される混合物であってもよい。流体抽出物は、１：２〜１：１００の薬剤／溶媒比率で、好ましくは１：１０の比でアーティチョークの葉を浸出／温浸するヒドロアルコール抽出によって調製することができる。抽出時間は当業者によって一般に使用されている時間であり、例えば、最低１時間から約８時間までであってよい。抽出温度は通常コントロールされ、好ましくは、例えば約５０℃の温度であってよい。水性アルコール抽出物からのアルコール蒸発とその後の水性濃縮物の乾燥は、凍結乾燥又は乾燥によって実施し、凍結乾燥抽出物又は乾燥抽出物を得ることができる。
【００４３】
こうした抽出物の調製は、一般に当業者には公知であり、本開示において特に詳細に記述する必要はない。本発明の実施目的において、従来の技術に従って調製される、上記に示したうちのすべての抽出物を使用することができる。
【００４４】
特に、本発明の目的において、本抽出物は、上述の滴定基準が満たされる限り、シナラ・スコリムスの抽出物の画分によって、若しくはシナラ・スコリムスの抽出物の画分の混合物によって、又はシナラ・スコリムスの抽出物の混合物及び上述の抽出物の１つ以上の画分の混合物によって置き換えることもできる。
【００４５】
気候条件、環境条件から、栽培地及び／又は栽培技術の違いから生じ得る、或いは栽培植物の異なる品種によっても生じ得る植物抽出物の多様性を考えると、臨床上の使用において、生成物を標準化すること、及び定義した特徴を有する生成物が得られる標準化パラメーターを同定することが重要である。
【００４６】
したがって、本発明の発明者らは、臨床診療において使用される最終生成物を標準化することができるパラメーターを同定するため、実験で使用される抽出物、例えば、図面及び実験プロトコルにおいて報告したものを特性決定した。
【００４７】
次いで、使用した抽出物をいくつかの活性成分について滴定し、また上記で示したパラメーターの範囲内にある最終生成物を得るために、様々な技術を用いて画分化を行い、同一成分について滴定及び滴定可能であり、それにより、個々の画分を使用することも、又は２つ以上の前記画分を混合することもできる抽出物の画分を得ることが可能である。
【００４８】
パラメーターの滴定は、例えば、乾燥、脱水又は凍結乾燥（フリーズドライ）した乾燥サンプルで実施する。
【００４９】
本発明によれば、総カフェオイルキナ酸は、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の８重量％から１６重量％まで、又は９重量％から１５重量％まで、例えば、約８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％を示す。本明細書での「約」という表示は、８から１６までの非整数も意味し、例えば、１６までの８．１；８．２；８．３等は本発明に包含される。
【００５０】
好ましい実施形態において、総カフェオイルキナ酸は、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の１１重量％から１３重量％まで、例えば、約１１％、１２％、１３％を示し、１１から１３までの非整数も含まれる。
【００５１】
本発明によれば、総カフェオイルキナ酸は、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から７重量％まで、又は３．５重量％から５．５重量％まで、又は４．５重量％から５．５重量％まで、例えば、約４．５％、４．６％、４．７％、４．８％、４．９及び５．０％、５．１％、５．２％、５．３％、５．４％、５．５％を示す。
【００５２】
本発明によれば、総シナロピクリンは、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から４重量％まで、又は０．２重量％から３重量％までを示す。シナロピクリンは分解する傾向があるので、最初のシナロピクリン含量（すなわち、ちょうど抽出又は画分が行われた時）は、好ましくは２％から３％までの範囲である。いかなる場合においても、抽出物、画分又は画分の混合物が、抽出から又は画分化から＋４℃から＋４０℃までの範囲の温度、好ましくは２５℃で保存された場合に、抽出から＋３６か月で少なくとも０．２％に等しいシナロピクリン含量に達することが許容される。
【００５３】
また本発明は、シナラ・スコリムスの抽出物の画分であって、上記で示した成分のそれぞれ１つの重量パーセンテージ（パーセント）が上記で報告したものの約２倍である上記画分、したがって、総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸及びシナロピクリンについて滴定した画分であって、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記画分の２５重量％から４８重量％まで、又は２５重量％から３５重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記画分の１１重量％から２１重量％まで、又は１１重量％から１５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記画分の１重量％から１０重量％まで、又は１重量％から８重量％までを示す画分に関する。
【００５４】
この画分は、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の８重量％から１６重量％まで、又は９重量％から１５重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から７重量％まで、又は３．５重量％から５．５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態中の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から４重量％まで、又は０．２重量％から又は３重量％までを示す、総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸及びシナロピクリンについて滴定した抽出物、画分及び画分の混合物に関する記述で示した組成物及びキット及び治療方法としてのすべての使用及び実施に適している。
【００５５】
本発明によれば、シナラ・スコリムスの抽出物の多数の画分は、下記で示した様々な方法によって得ることができる。いったん得られた画分は、総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸、及びシナロピクリンについて滴定され、その後、本明細書に記載の最適な滴定濃度によって、単独使用が可能な画分、又は上記で定義した３種の滴定成分のそれぞれ１つの重量濃度を有する画分の混合物を選択することができる。
【００５６】
例として、様々な画分は、以下に列挙した様々な方法及びステップに従って取得することができる：
【００５７】
１．シナラ・スコリムスの乾燥させた葉及び／又は頭状花を分別し、３５℃から４５℃の範囲の温度で４時間から１０時間の間、９６°のエチルアルコールと接触させる。アルコール部分を葉及び／又は頭状花から単離し、濾過して植物残留物を除去する。清澄化したアルコール溶液を回収する。
【００５８】
２．植物残留物を水でさらに抽出し、好ましくは脱塩し、水性成分を回収し、さらにそれを濾過して残留植物部分を除去する。清澄化した水溶液を回収する。
【００５９】
３．回収した清澄（アルコール性及び水性）溶液を混合し、４０°から６０°の範囲のアルコール溶液（本発明において、アルコールに関し、記号°はアルコール度数を示す）を取得し、沈殿及び遠心分離の処理を行い、上清を回収しこれを濾過する。
【００６０】
４．上清の除去後に得られた沈殿物を回収し、これが抽出物の第１の画分に相当する。次いでこれを、例えば、凍結乾燥により乾燥させ、滴定することができる。得られた第１の画分において、平均で、総カフェオイルキナ酸は抽出物の乾燥画分総重量の約２〜３％を示し、クロロゲン酸は抽出物の乾燥画分総重量の約０．２〜０．６％を示し、シナロピクリンは抽出物の乾燥画分総重量の約０．１〜０．３％を示す。
【００６１】
５．項目３で上述したように沈殿及び遠心分離の処理を行った４０°〜５０°水性アルコール画分の上清を真空下で濃縮し、アルコールを除去し、したがって、画分をアルコール０°にし、得られた濃縮水溶液に沈殿及び遠心分離の処理を行い、清澄化のため上清を濾過する。
【００６２】
６．上清の除去後に得られた沈殿物を回収し、これが抽出物の第２の画分に相当する。次いでこれを、例えば、凍結乾燥により乾燥させ、滴定することができる。
得られた第２の画分において、平均で、総カフェオイルキナ酸は抽出物の乾燥画分総重量の約１〜２．５％を示し、クロロゲン酸は抽出物の乾燥画分総重量の約０．０５〜０．１％を示し、シナロピクリンは抽出物の乾燥画分総重量の約０．３〜０．５％を示す。
【００６３】
７．遠心分離後の上清から得られ、項目５で濾過した濾液は水溶液であり、これを、例えば真空の下で濃縮し、次いで、例えば凍結乾燥によって乾燥させると、これはしたがって第３の画分に相当する。得られた第３の画分において、平均で、総カフェオイルキナ酸は抽出物の乾燥画分総重量の約１２〜１４％を示し、クロロゲン酸は抽出物の乾燥画分総重量の約５〜７％を示し、シナロピクリンは抽出物の乾燥画分総重量の約２．５〜３．５％を示す。
【００６４】
８．或いは、遠心分離後に上清から得られ、項目５で濾過された濾液は水溶液であり、これを高多孔性吸着樹脂上に吸着させる。
【００６５】
９．次いで、樹脂吸着画分を回収し、濃縮し、例えば凍結乾燥によって乾燥させると、これは第４の画分に相当する。
得られた第４の画分において、平均で、総カフェオイルキナ酸は抽出物の乾燥画分総重量の約２９〜３２％を示し、クロロゲン酸は抽出物の乾燥画分総重量の約１３〜１５％を示し、シナロピクリンは抽出物の乾燥画分総重量の約３〜４．５％を示す。
【００６６】
１０．樹脂に吸着されていない画分を例えば凍結乾燥によって乾燥させ、これが第５の画分に相当する。
得られた第４の画分において、平均で、総カフェオイルキナ酸は抽出物の乾燥画分総重量の約０．５〜０．７％を示し、クロロゲン酸は抽出物の乾燥画分総重量の約０．１〜０．２％を示し、シナロピクリンは抽出物の乾燥画分総重量の約０．０４〜０．０６％を示す。
【００６７】
本発明によれば、工程８は、芳香族物質又は高度不飽和部分を高含有する物質、又はアルキル基若しくはシクロアルキル基を高含有する物質を吸着し、非関連物質、例えば、多くの極性非芳香族物質を溶離させることが可能なカラム又は樹脂を用いたベッドで行うことができる。樹脂吸着分は、他での使用のため、好適な溶媒等、例えばエタノール又は水性アルコール溶媒などにより脱着される。
【００６８】
適切なクロマトグラフィー樹脂は、例えば、スチレン−ジビニルベンゼンコポリマー等の高多孔性吸着樹脂、例えば、アンバーライトＸＡＤ−２、セドリットＰＡＤ−ＩＩ、ＡＤＳ  ＴＱ  ３１８であってもよい。
【００６９】
特に、樹脂は、芳香族物質及び／又は非極性物質を吸着し得る樹脂等、例えば疎水性吸着樹脂であり、樹脂は、スチレン及び活性基を含まないＤＶＢの重合によって得られる、均等係数が≦１．５である直径０．２ｍｍ〜０．８ｍｍのミクロスフェアからなり、好ましくは芳香族性質の有機物質の吸着及び選択的溶出を可能にする、約１．３ｍｌ／ｇに等しい細孔容積関連パラメーターを有する高多孔性物理的構造を特徴とする。
【００７０】
以下の表は、報告した実験（ＡＢＯ−１）で使用したシナラ・スコリムスの抽出物及び上記で報告した方法に従って得られるその画分（すなわち、第１、第２、第３、第４及び第５の画分）について得た正確な滴定データを報告する。
【００７１】
【表Ａ】
2018501304.tif 000007
【００７２】
したがって、例として、画分の混合物は、約１２％までの画分１、約６％までの画分２、及び約８２％までの画分３を含む混合物であってもよく、また約１２％までの画分１、約６％までの画分２、約５５％までの画分４及び約２７％までの画分５を含む混合物であってもよい。
【００７３】
当業者は、得られた画分を滴定することによって、上記で示した最適な滴定を有する化合物を得るために画分の混合物を再構成する方法又は医薬的活性成分が特に不足している抽出物を補う方法を確実に理解するであろう。
【００７４】
画分３及び画分４は、図２８で報告したデータから明らかなように、そのように有用である。本発明において、［イタリア語の］用語「活性医薬成分」は、英語の用語「活性医薬成分」（ＡＰＩ）に相当する。
【００７５】
また用語「活性医薬成分」は、薬理活性を有する分子のセットを意味した用語「活性成分」（又は「有効成分」）と置き換えることもできる。
【００７６】
本明細書の目的において、本発明の「活性医薬成分」としてとは、次のことを意味する。
ａ．総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸、及びシナロピクリンについて滴定した、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物であって、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の８重量％から１６重量％まで、又は９重量％から１５重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から７重量％まで、又は３．５重量％から５．５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から４重量％まで、又は０．２重量％から３重量％までを示す、上記抽出物、画分、又は混合物（上述の詳細な実施形態が含まれる）。
ｂ．総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸、及びシナロピクリンについて滴定したシナラ・スコリムスの抽出物の画分であって、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記画分の２５重量％から４８重量％まで、又は２５重量％から３５重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記画分の１１重量％から２１重量％まで、又は１１重量％から１５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記画分の１重量％から１０重量％まで、又は重量％から８重量％までを示す、上記画分。
【００７７】
本発明によれば、総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸、及びシナロピクリンについて滴定した、シナラ・スコリムスの抽出物又はその画分、又はその画分の混合物は、上記の詳細及び特許請求の範囲で記載されているように、活性医薬成分として、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする疾患の予防及び／又は処置で使用することができる。
【００７８】
こうした疾患は、例えば、また文献に記載されているように、炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍のタイプの疾患であり得る。
【００７９】
本発明の目的において、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする病理学的状態は、（文献に記載されているように）ウイルス感染、例えば、（Ｙｕら、２００９において報告されている）ヘリコバクター・ピロリによる感染、Ｂ型肝炎ウイルスによる感染、ＨＰＶ（ヒト乳頭腫ウイルス）による感染、エプスタイン−バールウイルスによる感染などによって引き起こされ得る。
【００８０】
既に記載のように、「ＳＴＡＴ３」という用語はこのように、ヒトにおいてＳＴＡＴ３遺伝子によってコードされている、ヒト転写因子「シグナル伝達兼転写活性化因子３」を示す。
【００８１】
本発明は、この遺伝子があらゆる場合において構造的又は異常的に活性化される、（例えば下記の）本明細書に詳細に定義されているヒトにおける病理学的状態に関する。
【００８２】
ＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化が存在する前腫瘍病理学的状態は、文献で報告されているように、腫瘍切除後の病理学的状態、したがって腫瘍が改善され得るという意味での前腫瘍であるか、又は細胞の一部に炎症から悪性の特性の発症までの変化がある病理学的状態であり得る。
【００８３】
本発明によれば、腫瘍病理学的状態は、従来技術において報告されているＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化を特徴とするすべての腫瘍、例えば、前立腺癌、多発性骨髄腫、リンパ腫、メラノーマ、卵巣癌、乳癌、腎細胞癌、膵臓腺癌、肺癌、脳腫瘍、赤白血病、頭頚部扁平上皮癌、結腸癌、中皮腫（これは悪性胸膜中皮腫又はＭＰＭを意味するものとする）であり得る。
【００８４】
より詳しくは、前記脳腫瘍は、例えば、神経膠腫、脳髄膜腫、髄芽細胞腫であってよく、前記リンパ腫は、セザリー症候群、ＥＢＶ関連バーキットリンパ腫、Ｓａｍｉｒｉ  ＨＳＶ依存性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞関連リンパ腫であってもよい；前記白血病は、ＨＴＬＶ−１−依存性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、巨核球性白血病、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）であってもよい。
【００８５】
本発明の限定されない例によれば、上記で定義したシナラ属種の抽出物は、上記表１に挙げたＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化を特徴とするいずれか１つの病理学的状態の予防及び／又は処置で使用することができる。
【００８６】
本発明に記載の「構造的活性化」又は「異常活性化」という用語は、通常、正常細胞においては存在していない、（例えば、参考文献に記載されているような）ＳＴＡＴ３に関する文献内のこうした用語に起因する意味、又は、この因子の持続的な活性化の認識内で理解されたい。
【００８７】
特異性は、ＳＴＡＴ３を阻害しない化学療法剤による処置に対して耐性のある腫瘍病変の処置において本発明の活性医薬成分によって示されるＳＴＡＴ３の活性化及び活性の阻害に存在する。ＳＴＡＴ３を阻害しない化学療法剤の限定されない例は、構造的に活性化されたｐＳＴＡＴ３と化学療法に対し高耐性を有する腫瘍である中皮腫で使用される化学療法薬が挙げられる。一般に使用される薬剤の例は、チミジル酸シンターゼの阻害剤であるペメトレキセド；ジヒドロ葉酸還元酵素の競合的及び可逆的阻害剤であるメトトレキサート；ピリミジンヌクレオチドの生合成経路における偽基質として作用することによりＤＮＡの合成を阻害するゲムシタビン；微小管の形成を阻害する、チューブリンのモノマーに結合する抗有糸分裂薬であるビノレルビン；ＤＮＡにおけるインターフィラメントとイントラフィラメントの架橋形成によってＤＮＡに結合する細胞周期のすべての段階に干渉することができる薬剤であるシスプラチンが代表として示される。
【００８８】
また、ＳＴＡＴ３の構造的活性化が知られている腫瘍細胞系で得られた下記及び図面で示した実験データは、本明細書に開示されているように滴定した、シナラ・スコリムスの抽出物若しくはそれらの画分又はそれらの画分の混合物が１種以上の抗腫瘍薬と有利に関連付けられ、それによって、薬剤自体の抗腫瘍効果も相乗的に増加することを示す。
【００８９】
したがって、本明細書に記載され、また特許請求されているシナラ・スコリムスの抽出物若しくはそれらの画分、又はそれらの画分の混合物は、抗腫瘍活性を有する１種以上の化合物及び／又は抗炎症作用を有する１種以上の化合物と併用して、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性、前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置で使用される。
【００９０】
実施形態に従い、抗腫瘍活性を有する化合物は化学療法剤であってもよく、シスプラチン、ドキソルビシン、ペメトレキセド、メトトレキサート、ビノレルビン、ゲムシタビン及びタキソールを含む群から選択することができる。
【００９１】
また本発明は、ＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする腫瘍又は前腫瘍病理学的状態を予防及び／又は処置するための１種以上の化学療法剤と併用する、本明細書で開示した内容に従って滴定したシナラ・スコリムスの抽出物の抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物の使用を含む。
【００９２】
特に、本発明による抽出物、画分又は混合物は、総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸、及びシナロピクリンについて滴定され、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物（ミックス）の８重量％から１６重量％まで、又は９重量％から１５重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から７重量％まで、又は３．５重量％から５．５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から４重量％まで、又は０．２重量％から３重量％までを示し、或いは、画分は、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記画分の２５重量％から４８重量％まで、又は２５重量％から３５重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記画分の１１重量％から２１重量％まで、又は１１重量％から１５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記画分の１重量％から１０重量％まで、又は１重量％から８重量％までを示す画分である。
【００９３】
上記で提供した総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸及びシナロピクリンの滴定範囲の詳細な記載はまた、この特定の実施形態に適用する。
【００９４】
１種以上の化学療法剤との併用は同時併用若しくは連続併用であってよく、又は、本発明の活性医薬成分と化学療法剤は、（単回投与若しくは個別投与において）同時に、又は数分の一定時間にわたって投与することができるか、或いは、治療的処置の日又は期間にわたって、連続して、又はそれぞれを数分以上離して異なる時間に投与することができる。
【００９５】
投与計画は、患者の性別、年齢、疾患の状態、体重及び病歴に基づき、処置を行う医師によって決定される。
【００９６】
上述のような単独及び併用の両方において、処置は、例えば、上記に示した腫瘍原性作用を有し得ることが知られている感染症の場合、又は前記腫瘍が変性するのを予防するような腫瘍の切除の場合に予防することができる。
【００９７】
本発明の活性医薬成分は、上記のような同一目的に使用することができる組成物で製剤化することができる。
【００９８】
したがって、本発明は、さらに、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、活性医薬成分として、上述の記載及び特許請求の範囲のような総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸、及びシナロピクリンについて滴定した、シナラ・スコリムスの抽出物、それらの画分、又はそれらの画分の混合物又は前記抽出物と１つ以上の前記それらの画分の混合物の混合物、１種以上の抗腫瘍薬及び／又は１種以上の抗炎症薬と、担体及び／又は希釈剤及び／又は添加剤を含む組成物に関する。
【００９９】
本組成物は、例えば、単独の活性成分として、総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸、及びシナロピクリンについて滴定した、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物であって、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の８重量％から１６重量％まで、又は９重量％から１５重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から７重量％まで、又は３．５重量％から５．５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から４重量％まで、又は０．２重量％から３重量％までを示す上記抽出物、上記画分又は上記混合物と、１種以上の抗腫瘍薬及び／又は１種以上の抗炎症薬を含有し得る。
【０１００】
或いは、本組成物は、単独の活性成分として、シナラ・スコリムスの抽出物の画分であって、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記画分の２５重量％から４８重量％まで、又は２５重量％から３５重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記画分の１１重量％から２１重量％まで、又は１１重量％から２５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記画分の１重量％から１０重量％まで、又は１重量％から８重量％までを示す上記画分と、１種以上の抗腫瘍薬及び／又は１種以上の抗炎症薬を含み得る。
【０１０１】
さらに、本組成物は選択した製剤のタイプに適した添加剤を含むことができる。
【０１０２】
当業者は最良の製剤を容易に同定することができる。
【０１０３】
本組成物は、凍結乾燥形態、乾燥形態又は流体形態の本明細書で定義した本発明のアーティチョーク由来の活性医薬成分を含み得る。
【０１０４】
既に記載のように、抽出物及びそれらの画分は、上述の方法に従って、新鮮な、又は乾燥させたアーティチョークの葉、又はアーティチョークの頭状花、又は前述の部分の混合物の抽出によって得ることができる。
【０１０５】
本発明によれば、上記で定義した組成物は、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする病状の予防及び／又は処置で使用することができる。
【０１０６】
このような疾患は、例えば、また文献に記載されているように、炎症性疾患及び／又は前腫瘍疾患及び／又は腫瘍疾患であり得る。本発明の組成物で使用することができる様々な病理学的状態の定義は、本発明の抽出物の治療的使用に関して上記で規定したものと同じである。
【０１０７】
本発明の目的において、本組成物は、既に上記で定義したＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする病理学的状態、ＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする、既に上記で定義した腫瘍病理学的状態、及び本明細書の範囲内において既に前述で説明したようなＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化が存在する前腫瘍病理学的状態を処置することができる。
【０１０８】
単なる例示として、本組成物は硬質ゼラチンカプセルの形態で製造することができ、凍結乾燥形態の上記で定義した３０％から６０％までのアーティチョーク由来の活性成分と、７０％から４０％までの適切な薬理学的に不活性な添加剤（例えば微結晶性セルロース等）を含有する。
【０１０９】
カプセルは、例えば３００〜５００ｍｇの最終重量を有するカプセルであり得る。
【０１１０】
本明細書に記載の活性化合物は凍結乾燥形態、乾燥形態又は流体形態であり得るので、当業者は選択した使用に適した医薬組成物を容易に製造することができる。
【０１１１】
本発明の限定されない例によれば、本明細書で定義した組成物は、上記表１に挙げたＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化を特徴とするいずれか１つの病理学的状態の予防及び／又は処置において使用することができる。
【０１１２】
したがって、本発明はさらに、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍タイプの病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、本発明の活性医薬成分に加えて、１種以上の抗腫瘍活性を有する化合物（抗腫瘍化合物）及び／又は抗炎症作用を有する化合物（抗炎症化合物）を含む組成物に関する。
【０１１３】
実施形態によれば、抗腫瘍活性を有するこうした化合物（抗腫瘍化合物）は、例えば、シスプラチン、ドキソルビシン、ペメトレキセド、メトトレキサート、ビノレルビン、ゲムシタビン及びタキソールを含む群から選択される化学療法剤であってよい。
【０１１４】
こうした薬剤は、標準の用量で、又は化学療法において一般に使用されている用量よりも少ない用量で使用することができる。
【０１１５】
本発明の組成物は、単位投与用量で、又は各患者のそれぞれのニーズに適合した治療法をさらに可能にする目的で処置を行う医師によって投薬可能な方法で製剤化することができる。
【０１１６】
したがって、本発明は、ＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする腫瘍及び／又は炎症性及び／又は前腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置における、任意選択で、抗腫瘍活性を有する１種以上のさらなる活性成分及び／又は抗炎症作用を有する１種以上のさらなる活性医薬成分と併用する、単独の活性医薬成分として本発明の活性医薬成分を含む組成物の使用を意図する。
【０１１７】
こうしたさらなる活性成分は、例えば、化学療法化合物であってもよく、また、病理学的状態は、前腫瘍又は腫瘍の病理学的状態であってもよい。
【０１１８】
１種以上の化学療法剤との併用は同時併用若しくは連続併用であってよく、又は、本発明の活性医薬成分と化学療法剤は、（単回投与若しくは個別投与において）同時に、又は数分の一定時間にわたって投与することができるか、或いは、治療的処置の日又は期間にわたって、連続して、又はそれぞれを数分以上離して異なる時間に投与することができる。
【０１１９】
投与計画は、患者の性別、年齢、疾患の状態、体重及び病歴に基づき、処置を行う医師によって決定される。
【０１２０】
記載の処置は、例えば、上記に示した腫瘍原性作用を有し得ることが知られている感染症の場合、又は前記腫瘍が変性するのを予防するような腫瘍の切除の場合に予防することができる。上述の（任意選択で１種以上の抗腫瘍薬及び／又は１種以上の抗炎症薬と併用して本発明の活性医薬成分及び少なくとも１種の医薬として許容可能な賦形剤又はアジュバントからなる）組成物において、少なくとも１種の医薬として許容可能な賦形剤又はアジュバントは、通常の製薬業若しくは化粧品業で、又は食品産業で技術的に使用されている添加剤又はアジュバントの中から選択することができる。使用される添加剤は、希釈剤、可溶化剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、スリップ剤及び抗接着剤のカテゴリーに属するものであってよい。
【０１２１】
必要に応じて、本組成物は、製薬、化粧品及び食品産業において一般に使用されている着香料、着色剤及び保存剤を含有していてもよい。
【０１２２】
本組成物は、経口投与（例えば、粉末、顆粒、カプセル剤、ハード又はソフトゼラチンのカプセル、錠剤、シロップ剤、ドロップ、溶液及び経口エマルジョン）、吸入（例えば、エアロゾル、液体及び粉末噴霧剤）、局所投与（ゲル剤、軟膏剤、エマルジョン、泥膏、フォーム剤、局所使用の無水固形剤型、及び貼付剤）、並びに当業者によって現在使用され既知である技術による非経口投与（例えば、皮下使用、筋肉内使用、静注使用又は皮内使用）向けの製剤を調製する当業者によって適切であると考えられるすべての製剤であってよい。すべての製剤において、技術上の添加剤又はアジュバントの使用は、製薬実務において一般に使用されているものに基づいて使用する物質を選択することにより決定される。
【０１２３】
抗腫瘍活性を有する薬剤を併用する、又は併用しない本活性医薬成分をベースとした製剤の調製において、当業者は、治療法での使用に適し得る安定製剤を得るために、従来技術により有用であると考えられるいずれかの添加剤を使用することができる。例えば、希釈剤のカテゴリーにおいて、固形剤において希釈剤を使用することが可能であり、例えば、糖、多価アルコール（例えばラクトース、マンニトール、ソルビトール）、セルロース、無機酸の塩類（例えば第二リン酸カルシウム）、ナトリウム、カリウム及びカルシウムの塩類の形態のクエン酸塩、炭酸塩及び重炭酸塩をはじめとする有機酸の塩類、或いは液体の形態の希釈剤、例えば水、経口用途の食用油（ヒマワリ油、オリーブ油、トウモロコシ油、スイートアーモンド油、落花生油）又は局所製剤で使用される油（ホホバ油、短鎖、中鎖又は長鎖トリグリセリド）、多価アルコール（グリセリン、プロピレングリコール、ヘキシレングリコール）がある。
【０１２４】
崩壊剤のカテゴリーにおいて、例えば、天然又は加工デンプン（トウモロコシデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン）、クロスカルメロースナトリウム、グリコール酸ナトリウムデンプン、クロスポビドン；ゴム系の天然産物を含む使用可能な結合剤（グアーガム、キサンタンガム、アラビアゴム）、スクロース及び合成品、例えば、ポリビニルピロリドン及びセルロースの半合成誘導体を使用することができる。
【０１２５】
ステアリン酸及びそれらの塩、例えばマグネシウムの塩、エチレングリコールのポリマー、トリグリセリド及び滑沢剤としての天然又は合成ワックスが有効であることが判明している。
【０１２６】
界面活性剤は、水でより溶解し得るか、洗浄可能である本発明の基剤を形成する製剤に含まれる１種以上の活性成分を調製するために使用され、これらの活性成分は、単独で作用するか、１種以上の希釈剤によって担持される。例えば、ソルビタンエステル、ソルビタンポリオキシエチレンエステル、スクロースエステル及びラウリル硫酸ナトリウムを挙げることができる。
【０１２７】
スリップ剤は、例えば、コロイダルシリカ、沈降性シリカから選択することができ、一方、使用可能な付着防止剤としては、例えば、タルク又はデンプンが挙げられる。
【０１２８】
注射用製剤の調製において、活性物質（単数又は複数）を有効に可溶化又は分散させることができる添加剤を選択することができる。例えば、注射よる投与に適したｐＨ及び浸透圧を得るために、水とともに、他の水溶性担体、例えば、多価アルコール及び有機酸又は無機酸の塩を使用することができる。
【０１２９】
特定の事例において、非水溶性担体、例えば油、又は注射での使用について承認されている合成物質を使用することができる。
【０１３０】
当業者は、公知の通常の調製スキーマを使用して、すべての製剤を調製することができる。
【０１３１】
単なる例ではあるが、カプセル剤の製剤は、本発明の活性医薬成分を事前に粉砕し、通常のミキサーで得られた粉末と、１種以上の抗腫瘍薬及び製剤の調製に選択した添加剤、例えば、上述のもの又は市販の経口使用が承認されているものから選択される希釈剤、崩壊剤、滑沢剤及びスリップ剤とを一緒に混合することによって簡易に製造することができる。
【０１３２】
錠剤の場合には、従来技術による造粒方法のアジュバントとして水を使用し、混合物の一部又は全部を、事前に水に溶解させておいた結合剤、又は混合物に入れておいた結合剤とともに造粒することが必要である。
【０１３３】
顆粒剤は、乾燥させ、篩にかけ、さらに、当業者に公知のものに従い、錠剤を得るのに好適な混合物を得るための他の粉末と混合することができる。
【０１３４】
非経口使用の場合には、本組成物はまた、所定の操作要件に従って簡単に混和できる個別の容器中の活性成分とともに提供することができる。
【０１３５】
本明細書に記載の組成物の使用を容易にするために、これらは、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする特定の病理学的状態の予防的及び／又は治療的使用に有効な、本発明の活性医薬成分及び任意選択で１種以上の抗腫瘍薬及び／又は１種以上の抗炎症薬を含有する単位投与用量の形態で提供することができる。
【０１３６】
本発明はさらに、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、本発明の活性医薬成分と抗腫瘍活性を有する１種以上の化合物及び／又は抗炎症作用を有する１種以上の化合物の同時投与又は連続投与用のキットであって、前記キットが本明細書で定義した本発明の活性医薬成分の１つ以上のアリコートと、抗腫瘍活性を有する１種以上の化合物の１つ以上のアリコート及び／又は抗炎症作用を有する１種以上の化合物の１つ以上のアリコートを含む、上記キットに関する。
【０１３７】
或いは、本キットは、単独の活性医薬成分として、本明細書で定義した本発明の活性医薬成分と、抗腫瘍活性を有する１種以上の化合物の１つ以上のアリコート及び／又は抗炎症作用を有する１種以上の化合物の１つ以上のアリコートを含有する組成物の１つ以上のアリコートを含んでいてもよい。
【０１３８】
上述のように、こうした化合物は、例えば、シスプラチン、ドキソルビシン、ペメトレキセド、メトトレキサート、ビノレルビン、ゲムシタビン及びタキソールを含む群から選択される化学療法剤であってよい。
【０１３９】
本発明のキット又は組成物で処置又は予防することができる病状は、上記で既に示したものであり、例えば、（文献に記載されているような）ウイルス感染、例えば、ヘリコバクター・ピロリによる感染、Ｂ型肝炎ウイルスによる感染、ＨＰＶ（ヒト乳頭腫ウイルス）による感染、（Ｙｕら、２００９に報告されているような）エプスタイン−バールウイルスによる感染によって引き起こされ得る、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする病理学的状態、或いは従来技術において報告されているＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化を特徴とするすべての腫瘍によって示され得る腫瘍病理学的状態である。
【０１４０】
こうした腫瘍の限定されない例は、前立腺癌、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、メラノーマ、卵巣癌、乳癌、腎細胞癌、膵臓腺癌、肺癌、脳腫瘍、赤白血病、頭頚部扁平上皮癌、結腸癌、中皮腫を含む。
【０１４１】
より詳しくは、前記脳腫瘍は、例えば、神経膠腫、脳髄膜腫、髄芽細胞腫であってよく、前記リンパ腫は、セザリー症候群、ＥＢＶ関連バーキットリンパ腫、Ｓａｍｉｒｉ  ＨＳＶ依存性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞関連リンパ腫であってよい；前記白血病は、ＨＴＬＶ−１−依存性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、巨核球性白血病、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）であってもよい。
【０１４２】
ＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化が存在する前腫瘍病理学的状態は、文献において報告されているような、腫瘍の切除後の病理学的状態、したがって、腫瘍が変性し得るという意味での前腫瘍であり得るか、又は細胞の一部に炎症から悪性の特性の発症までの変化がある病理学的状態であり得る。
【０１４３】
最後に、本明細書はまた、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態を予防及び／又は処置する治療方法であって、それを必要とする個体に、治療上有効な量の本発明の活性医薬成分又は単独の活性医薬成分として本発明の活性医薬成分を含む医薬組成物を、任意選択で、１種以上の抗腫瘍及び／又は抗炎症化合物と併用して投与するステップを含む、上記治療方法に関する。
【０１４４】
本発明の基礎を形成する方法は、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態を示す対象に、本明細書で定義した活性医薬成分の治療上有効な量を、任意選択で、１種以上の抗腫瘍薬又は抗炎症薬と併用して投与することにより；或いは、任意選択で、１種以上の抗腫瘍薬及び／又は抗炎症薬をさらに含む、本明細書で定義した組成物の治療上有効な量を投与することにより、或いは、本明細書で定義したキットを使用して、本抽出物と１種以上の抗腫瘍及び／又は抗炎症薬を投与することにより実施することができる。
【０１４５】
上述の投与は、医師によって選択される投与計画に従って、同時に又は連続して実施することができる。
【０１４６】
本発明に記載の抽出物の効果を証明する多くの実験データを報告した。
【０１４７】
本発明の特定の実施形態において、中皮腫（特に悪性胸膜中皮腫）は、本発明に記載の病変からは除外される。
【０１４８】
使用した細胞系
−  Ｌ４２８ヒトリンパ腫細胞系。ＤＳＭＺ  ＡＣＣ１９７から入手可能。
−  構造的に活性化されたＳＴＡＴ３を有するＫＡＲＰＡＳ−２９９ヒトリンパ腫細胞系。Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  ＃６０７２６０４から入手可能。
１９８６年に非ホジキンＴ細胞リンパ腫細胞を用いて２５歳のヒト末梢血から樹立され、現在、リンパ芽球性リンパ腫細胞系として分類されている、ヒトＴ細胞性リンパ腫細胞系。Ｋａｒｐａｓ２９９は、チロシン７０５及びセリン７２７でリン酸化されたＳｔａｔ３を発現する。
−  構造的に活性化されたＳＴＡＴ３を有するＭＳＴＯ２１１Ｈヒト肺二相性中皮腫細胞系。ＡＴＣＣ  ＃ＣＬＲ−２０８１から入手可能。
【０１４９】
過去にいかなる治療も受けていなかった中皮腫（二相性悪性腫瘍）のある６２歳のヒト胸膜流出から樹立された、ヒト中皮腫細胞系。細胞系ＭＳＴＯ２１１Ｈは高レベルのｐＳｔａｔ３を発現する（Ｔｓａｏら、悪性胸膜中皮腫組織におけるｃ−Ｓｒｃ発現及び活性化の阻害は、アポトーシス、細胞周期停止、遊走及び浸潤の低下を導く（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃ−Ｓｒｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｌｅｕｒａｌ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ，ａｎｄ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ．）、ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ  ２００７；６：１９６２〜１９７２）。
−  ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−８１から入手可能なＤＵ−１４５ヒト癌細胞系。
細胞系ＤＵ１４５は、転移性の可能性の高いＰＣ３細胞と比べ、転移性の可能性が中程度のヒト前立腺癌細胞系である。ＤＵ１４５細胞は、ホルモン非感受性で、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）を発現しない。細胞系ＤＵ１４５は、構成的にｐＳｔａｔ３を発現する。
−  ＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞系。ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２４７から入手可能。
−  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳房腺癌細胞系。ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−２６から入手可能。１９７３年に患者から確立された乳がん細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、上皮様の形態を示し、表現型的には、紡錘状細胞を示す。インビトロにおいて、細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、高レベルのｐＳＴＡＴ３を発現する（Ｂｅｒｉｓｈａ  Ｊら、「Ｓｔａｔ３は、乳癌においてインターロイキン−６／糖タンパク質１３０／ヤヌスキナーゼ経路を介してチロシン−リン酸化される（Ｓｔａｔ３  ｉｓ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６／ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  １３０／Ｊａｎｕｓ  ｋｉｎａｓｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．）」。Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００７，９：Ｒ３２）。
−  ＮＣＩ−Ｈ２０５２ヒト中皮腫細胞系。この細胞系はｐＳＴＡＴ３を発現する（Ｔｓａｏら、「悪性胸膜中皮腫組織におけるｃ−Ｓｒｃの発現及び活性化を阻害すると、アポトーシス、細胞周期停止、並びに遊走及び浸潤の減少が生じる（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃ−Ｓｒｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｌｅｕｒａｌ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ，ａｎｄ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ．）」。ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ  ２００７；６：１９６２−１９７２）。ＡＴＣＣ番号ＣＬＲ−５９１５から入手可能。
−  ＮＣＩ−ｈ２８ヒトステージ−４中皮腫細胞系。ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−５８２０から入手可能。
−  ＭＰＰ−８９ヒト中皮腫細胞系。ＣＡＢＲＩから入手可能、アクセス番号ＩＣＬＣ  ＨＴＬ０００１２。
【０１５０】
以下の実施例は、本発明のシナラ・スコリムス抽出物によって次に記載のことがどの程度可能であるかを示す：
非形質転換中皮細胞（ＨＭＣ）にはそれほど強く作用することなく、中皮腫細胞（ＭＳＴＯ２１１Ｈ、ＭＰＰ−８９、ＮＣＩ−Ｈ２０５２、ＮＣＩ−Ｈ２８）の生存能力を用量依存的に低減する；
同一細胞系に対するクローン原性生存アッセイにおいてコロニーの形成能力を低下させ、アポトーシスアッセイにおいて悪性中皮腫細胞ＭＭの細胞死を誘導する；
創傷治癒アッセイにおいてＭＭ細胞の遊走及び増殖を阻害する；
ペメトレキセドなどの化学療法剤による連続処置でＭＭ細胞を感受性にする；
ＭＭ細胞のＤＮＡの損傷は誘導するが、ＨＭＣ細胞のＤＮＡの損傷は誘導しない；
抽出物で前処置した細胞においてＭＳＴＯ細胞による腫瘍移植の可能性を低減する；
ＭＳＴＯの異種間臓器移植の処置において用量依存的な効果を有する。
【実施例】
【０１５１】
１．  ウェスタンブロットによるＳＴＡＴ３のリン酸化の分析。結果は図１〜図３に報告した。
１．１．  細胞溶融及びウェスタンブロッティング。
細胞を氷中で３０分間、プロテアーゼ及びホスファターゼの阻害剤（５ｍＭ  ＰＭＳＦ、３ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＮａＶＯ４）を補充した溶融バッファーＮＰ４０（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶融させた。タンパク質の全抽出物の等量（３０μｇ）を８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で変性させることによって分解させ、２時間ニトロセルロース膜に移した。１時間、０．０５％のＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０に溶解させた５％のミルク溶液で膜をブロックし、特異的一次抗体とインキュベートした。一次抗体は以下のものを使用した：抗ベータアクチン（Ａ−２２２８、ＳＩＧＭＡ）、抗ｐＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ−７０５）（ｓｃ８０５９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）及び抗ＳＴＡＴ３（ｓｃ７１７９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）。二次抗体をペルオキシダーゼ結合されており（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、化学発光にはＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）を使用した。
【０１５２】
１．２．  ＭＰＭの細胞系、及び一般的に市販されている中皮細胞（ＨＭＣ）のシナラ・スコリムス抽出物による処置
ＭＰＭの細胞系（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ、ＮＣＩ−Ｈ２８、ＮＣＩ−Ｈ２０５２、ＭＰＰ８９）はＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から取得し、一方、ＨＭＣ（ヒト中皮細胞）はＴｅｂｕ−Ｂｉｏ（Ｆｒａｎｃｅ）から取得した。すべての細胞系は、所定の培地中、３７℃及び５％ＣＯ２で単層において増殖させた。アーティチョーク抽出物は、３０ｍｇ／ｍｌの初期濃度で、比率１：１の注射用溶液用の水及びエタノールの溶液中に都合よく溶解させた。次いで、抗腫瘍特性を試験するため、図面に示したように、生成物を様々な細胞系の培地に、様々な濃度及び様々な回数で直接添加した。
【０１５３】
１．３．  結果
図１〜２に示した結果は、抽出物で処置されていない対照と比べた場合に、アッセイした抽出物がどのようにＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害するかを示している。
【０１５４】
図１及び図２は、本明細書によるシナラ・スコリムスの抽出物で処置したＭＳＴＯ２１１Ｈの細胞に対して得られたデータを示す。
【０１５５】
図１は、担体単独で処置した対照と、シナラ・スコリムスの抽出物（２４時間培養した培地１００μｇ／ｍｌ）で処置した対照（対照アクチン）のデータを示し、図２は、様々な濃度のシナラ・スコリムスの抽出物：２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、７５μｇ／ｍｌで２４時間処置した細胞を含むデータを示す。
【０１５６】
図１に関し、担体単独で処置した対照とシナラ・スコリムスの抽出物（２４時間培養した培地１００μｇ／ｍｌ）で処置した対照（対照アクチン）のデータを示す。
【０１５７】
２．シナラ・スコリムス抽出物及びシナロピクリンは、ＤＵ１４５細胞及びＫＡＲＰＡＳ細胞でのＳＴＡＴ３の構造的活性化を阻害する：
図１７〜図２０から明らかなように、シナラ・スコリムス抽出物及びシナロピクリンはともにＤＵ１４５細胞及びＫＡＲＰＡＳ細胞でＳＴＡＴ３に作用する。０．１８１％のシナロピクリンを含有する抽出物２００μｇ／ｍｌは、１．２μΜのシナロピクリンを含有する。図は、２５μΜのシナロピクリンで確認された効果は、２００μｇ／ｍｌの抽出物（シナロピクリンの力価は０．１８１％と等しく、言い換えると、１．２μΜのシナロピクリンを含んでいる）で確認された効果と同じであることを示す。使用した抽出物の用量は１．２ｍＭのシナロピクリンを含有しているので、得られたデータは、抽出物がシナロピクリンよりも有効であることを示している。
【０１５８】
３．  悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）の細胞に対するクローン原性アッセイ
ＭＰＭ細胞（ＭＳＴＯ２１１Ｈ、ＮＣＩ−Ｈ２８；ＭＰＰ−８９；ＮＣＩ−Ｈ２０５２）を１ウェル当たり２００個の細胞で接種し、本明細書による様々な増殖濃度のシナラ・スコリムス抽出物（対照担体単独；１２．５μｇ／ｍｌ；２５μｇ／ｍｌ；５０μｇ／ｍｌ；１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ）で処置した。各ポイントは、６ウェルのマルチウェルに二連でプレーティングした。形成されたコロニーは、１５〜２１日後にクリスタルバイオレットを用いて染色した。クローン原性アッセイとして知られているコロニー形成アッセイは、腫瘍細胞が単一細胞からコロニーを形成する能力の観点から抗腫瘍化合物の効果を評価する際に使用されている技術である。コロニーは、単一細胞に由来する５０個以上の細胞（クローン）の群であると考えられる。
【０１５９】
図３ａ〜図３ｄに示した実験結果は、本発明の抽出物がアッセイしたすべてのＭＰＭ細胞系におけるコロニー形成を用量依存的に阻害する、用量依存的能力を示す。
【０１６０】
さらに、同様のアッセイをＨＣＴ１１６結腸癌細胞、ＤＵ１４５前立腺癌細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞に対して実施した。この場合もまた、図４ａ、ｂ、ｅ及びｃで示したデータからは、本発明の抽出物がコロニー形成を用量依存的に阻害する効果を有することが明らかである。
【０１６１】
４．  ＡＴＰｌｉｔｅ（商標）細胞活性アッセイ
様々な濃度の本発明の抽出物に暴露した後の各種細胞系の活性を、ＡＴＰｌｉｔｅ（商標）アッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を製造者の説明書に従って使用し、評価した。表示されている場合、「担体」という用語は、処置で用いる同一容量で使用される濃度１：１の注射溶液用の水とエタノールの溶液を意味する。
【０１６２】
ＡＴＰＬｉｔｅ（商標）は、ホタル（フォチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ））ルシフェラーゼの活性に基づいたアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のレベルをモニタリングする系である。この発光アッセイは、培地中に含まれている可能性物質で処置した培養哺乳動物細胞の増殖を定量的に評価するための比色定量試験、蛍光定量試験及び放射性同位体試験に代わるものである。ＡＴＰのモニタリングは、実際、広範囲の薬剤、生物学的応答調節物質及び生物学的化合物の細胞増殖抑制効果及び抗増殖効果を評価するために使用されている。ＡＴＰＬｉｔｅ（商標）アッセイの系は、ＡＴＰルシフェラーゼ及びＤ−ルシフェリンを添加する反応によって生じる光の生成に基づいている。放出された光は、ある一定範囲内でＡＴＰ濃度に比例する。細胞内のＡＴＰ量は、細胞の生存能力と相関する。
【０１６３】
ＭＰＭ細胞系（ＭＳＴＯ２１１Ｈ、ＭＰＰ８９、ＮＣＩ−Ｈ２８）及びＨＭＣ細胞（ドナーの好意によって提供された非形質転換中皮細胞）の様々なタイプの細胞生存能力は、様々な濃度の本発明に記載の抽出物（対照担体単独；１２．５μｇ／ｍｌ；２５μｇ／ｍｌ；５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ）を使用した処置後にアッセイした。
【０１６４】
アッセイの結果を示す図５のグラフは、本抽出物が細胞生存能力を用量依存的に有意に低下させることができることを示す。
【０１６５】
これに対し、細胞生存能力に対する効果を非形質転換中皮細胞（ＨＭＣ）においてもアッセイしたところ、本発明の基礎を形成する抽出物は、腫瘍細胞系と比べた場合、細胞毒性が低いことが示された（図６ａ〜図６ｃ）。
【０１６６】
５．  細胞生存能力及び増殖のＷＳＴアッセイ、本発明の抽出物とシナロピクリンの間の細胞障害効果の比較。
細胞毒性は、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼが黄色に着色されたＷＳＴ分子（テトラゾリウム塩）からテトラゾール環を分離させ、オレンジ色のホルマザン塩を生じさせる能力を利用するＷＳＴアッセイ（ＷＳＴ＝水溶性テトラゾリウム塩）を使用してアッセイした。試験物質を用いて細胞を処置した後に生成されるホルマザンの量は分光光度計を使用して測定するが、これは生細胞数に比例する。ＷＳＴ−１及び特にＷＳＴ−８（２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムは、ＭＴＴにおいて都合がよい。その理由は、電子伝達物質としてのＰＭＳと結合し、細胞外で還元し、水溶性ホルマザンを生成するからである。最後に、ＷＳＴアッセイは、（１）（可溶化段階を必要とするＭＴＴとは異なり）直接測定することができる、（２）ＭＴＴよりも有効なシグナルを提供する、（３）（細胞内に蓄積する不溶性ホルマザンを生成する、ＭＴＴとは異なり）細胞に対する毒性を低減する。
【０１６７】
以下のＷＳＴアッセイを実施した：
５．１  ２４−４８−７２時間でのシナラ・スコリムス抽出物５０、１００及び２００μｇ／ｍｌを使用した細胞系ＤＵ１４５におけるＷＳＴ−１アッセイを図９に示した。
【０１６８】
５．２  ２４及び４８時間でのシナラ・スコリムス抽出物（シナロピクリン＝１．３６１％）０−１００−２００−３００−４００−５００−６００μｇ／ｍｌを使用した細胞系ＤＵ１４５におけるＷＳＴ−１アッセイ。これは、時間依存的及び用量依存的に、ＤＵ１４５細胞の活性を阻害する。このアッセイを示す図７は、濃度１００μｇ／ｍｌ；２００μｇ／ｍｌ；３００μｇ／ｍｌ；４００μｇ／ｍｌ；５００μｇ／ｍｌ；６００μｇ／ｍｌ（それぞれ、０．４７μΜ、０．９４μΜ；１．４１μΜ；１．８８μΜ；２．３５μΜ及び２．８２μΜのシナロピクリンを含む）のアッセイ抽出物の、μｇ／ｍｌ及びμΜの両方で表したシナロピクリン含量も示す。
【０１６９】
５．３  シナロピクリン０−１０−２０−３０−４０−５０−６０μΜが細胞系ＤＵ１４５において用量依存的及び時間依存的にＤＵ−１４５細胞の活性を阻害する、２４及び４８時間でのＷＳＴ−１アッセイ。結果は図８に示す。
【０１７０】
図７及び図８の比較により、アッセイした抽出物はシナロピクリンよりも４０倍以上有効であることが明らかである。
【０１７１】
６．  化学療法剤との同時処置における細胞生存能力アッセイ
細胞系ＭＳＴＯ２１１Ｈ及びＮＣＩ−Ｈ２０５２を使用し、シナラ・スコリムス抽出物＋抗腫瘍薬の併用効果を評価した。
【０１７２】
図１０に示したアッセイは、製造者の説明書に従ってＡＴＰＩｉｔｅ（商標）アッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用し実施した。
【０１７３】
濃度１：１の注射溶液用の水とエタノールの溶液は、処置で使用した同一容量で用いた。
【０１７４】
試薬：
ペメトレキセド（Ａｌｉｍｔａ、Ｌｉｌｌｙ）は、製造者の説明書に従い希釈した。
【０１７５】
６．１  シナラ属種の抽出物とペメトレキセドの併用に関するＡＴＰＩｉｔｅ（商標）アッセイ
図１０は、ペメトレキセド、及びシナラ属種の抽出物を併用したペメトレキセドで処置した７２時間後のＭＳＴＯ２１１Ｈに関する生存能力曲線を示す。図ａは、ＭＳＴＯ２１１Ｈ細胞に対する非細胞障害用量（６μｇ／ｍｌ）の抽出物及びペメトレキセドを用いた処置を示し、図ｂは、ＮＣＩ−Ｈ２０５２細胞に対する非細胞障害性用量（６μｇ／ｍｌ）の抽出物による処置及び（様々な濃度の）ペメトレキセドを用いた処置を示し、図ｃは、非形質転換ＨＭＣ細胞に対する非細胞障害性用量（６μｇ／ｍｌ）の抽出物による処置及び（様々な濃度の）ペメトレキセドによる処置を示す。アッセイした化合物の濃度を横座標上にプロットし、パーセンテージで表した細胞生存能力を縦座標上にプロットしている。
【０１７６】
図１０ａ及び図１０ｂは、抽出物による処置は、ペメトレキセドによる処置に対し腫瘍系をどのように感受性にするかを示す。二重処置の曲線において、ちょうど１０μΜのペメトレキセド濃度が被アッセイ系の細胞生存能力を低下させるのに十分であることが明らかである。非腫瘍細胞系において、本抽出物がペメトレキセドに対する保護作用を有することを示していることは興味深い。
【０１７７】
６．２  ＷＳＴ−１アッセイによる細胞生存能力の評価
このアッセイは、抽出物の効果とシナロピクリンの効果を比較するため、抽出物の代わりに様々な用量のシナロピクリンを並行して実施した。
【０１７８】
図１１は、ＤＵ１４５細胞をシスプラチン（図ａ）、ドキソルビシン（図ｂ）及びタキソール（図ｃ）とともに、担体単独（ｃｎｔｒ）、及び異なる２種の濃度のシナラ・スコリムス抽出物（ａｂｏ−１）、及び薬剤単独、及び薬剤と併用する異なる２種の濃度のシナラ・スコリムス抽出物（ａｂｏ−１）を用いてインキュベートすることにより得られたデータを示す。
【０１７９】
図１１に示した実験で使用した抽出物は、シナロピクリンで０．１８１％の含量を有していた。したがって、図は、１００μｇ／ｍｌ及び２００μｇ／ｍｌの抽出物がそれぞれ、０．１８μｇ／ｍｌ及び０．３６μｇ／ｍｌのシナロピクリンに相当するシナロピクリンの濃度を示す。
【０１８０】
図１２は、シナラ・スコリムス抽出物（シナロピクリン＝１．３６１％）の濃度増加と１５μｇ／ｍｌの一定濃度のシスプラチンとの間の関連性を示し、図１３は、シナラ・スコリムス抽出物（シナロピクリン＝１．３６１％）と２μｇ／ｍｌの一定濃度のドキソルビシンとの間の関連性を示す。
【０１８１】
また図は、抽出物単独（黒色）又は薬剤単独（白色）による処置に関する値も示す。
【０１８２】
図１４及び図１５は、図１２及び図１３と同様に、本発明の抽出物の代わりにシナロピクリンで実施した同一実験の結果を示し、抽出物がシナロピクリンよりもどの程度有意に有効であるかを示す。
【０１８３】
したがって、図１４は、濃度増加のシナロピクリンと１５μｇ／ｍｌの一定濃度のシスプラチンとの関連性を示し、また図１５は、２μｇ／ｍｌの一定濃度のシナロピクリンとドキソルビシンの間の関連性を示す。
【０１８４】
また図は、シナロピクリン単独（黒色）及び薬剤単独（白色）による処置に関する値も示す。
【０１８５】
７．  創傷治癒アッセイ
創傷治癒アッセイ（図１６ａ〜ｂ）は、インビトロでの細胞指向性遊走を研究するために開発された、簡単で、安価な、最初の方法の１つである。この方法は、インビボにおける創傷治癒の間の細胞遊走を模倣する。基本的なステップは、細胞単層に「創傷」を生じさせ、次いで、「創傷」を閉じるのに必要な細胞遊走の間、開始時及び一定の間隔で画像を取り込むことにより「創傷」の特定領域をモニタリングすることを含む。９５％の密集度により培養されたＭＳＴＯ２１１Ｈ細胞を６ウェルのプレートに接種し、１０マイクロリットルの滅菌ピペットによって穴を開けることによって「創傷」（又は切り込み）を調製し、細胞を取り除いた。創傷後の示した時間にデジタル顕微鏡写真を得た。最後の棒グラフは、示した時間に担体又はＡＢＯ１で処置した切り込みを閉じる効果（定量した細胞の数を％で表示）を示す。
【０１８６】
８．アポトーシス誘導の評価アッセイ
図（２２〜２３）を参照されたい。
８．１  ウェスタンブロッティング
１．１の項目で述べたものと同じ技術を使用し、以下の一次抗体を使用した：抗ベータアクチン（Ａ−２２２８、ＳＩＧＭＡ）、抗カスパーゼ−３（３１Ａ１０６７、Ａｌｅｘｉｓ）、抗カスパーゼ−７（＃９４９２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）及び抗ＰＡＲＰ（＃９５４２Ｓ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）。
【０１８７】
８．２  ＦＡＣＳ分析、並びにＰＩ染色及びＰＩ／アネキシンＶ染色分析
細胞周期に対する本発明抽出物の効果を判定するために、ＦＡＣＳ分析を実施した。
【０１８８】
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）による染色については、１０４細胞／ｍｌの密度で細胞を６ウェルプレートに接種した。２４時間後、様々な時間間隔で腫瘍細胞を提示濃度の本発明抽出物を用いて処置した。懸濁液中の細胞を収集し、付着細胞をＰＢＳで洗浄し、凍結エタノール（７０％ｖ／ｖ）で固定し、−２０℃で保存した。分析については、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ  １Ｚ、ＰＩ（２５ｍｇ／ｍｌ）及びＲＮａｓｉ  Ａ（２００ｍｇ／ｍｌ）の溶液に懸濁した。
【０１８９】
ＰＩ／アネキシンＶ二重染色法については、処置細胞を収集し、結合バッファー（ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、ＣａＣｌ２  ２．５ｍＭ、ＮａＣｌ  １４０ｍＭ）に再懸濁した。細胞のアリコートをアネキシンＶ  ＦＩＴＣ及びＰＩ（５ｍｇ／ｍＬ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに１５分間インキュベートした。
【０１９０】
すべてのＦＡＣＳ分析の間、１０５の事象を各々のサンプルについて分析した。フローサイトメトリー分析は、ＧｕａｖａＥａｓｙＣｙｔｅ  ８ＨＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フローサイトメーターで実施した。
【０１９１】
図２３から明らかなように、本発明の抽出物は、アネキシンＶ染色法で判定したとおり、時間依存的及び用量依存的にＭＳＴＯ２１１Ｈの細胞でアポトーシスを誘導する。
【０１９２】
９．グルタチオンに関するアッセイ
還元型及び酸化型グルタチオンの間の割合の変化によって引き起こされる細胞の酸化還元状態の変化は、ＳＴＡＴ３のグルタチオン化、チロシンにおけるそれらのリン酸化の防止と最終的なそれらの活性化を決定する（Ｂｕｔｔｕｒｉｎｉ  Ｅら、ＬｏＳＯｎｅ．２０１１；６（５）：ｅ２０１７４．）。
【０１９３】
９．１  ＧＳＨの細胞内分析。
ＧＳＨの細胞内濃度は、比色法によって評価した。１０％トリクロロ酢酸を用いてタンパク除去した細胞抽出液をジチオニトロベンゼン（ＤＴＮＢ）により処置し、ＧＳＨとの反応後に放出されるＴＮＢの量を４１２ｎｍの吸光度で分析することにより評価した。
【０１９４】
９．２  ＳＴＡＴ３のグルタチオン化
ＳＴＡＴ３は、タンパク質細胞抽出液を抗ＳＴＡＴ３抗体と一晩インキュベートすることにより免疫沈降させた。得られたタンパク質は、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって単離し、ＰＶＤＦ膜上に転写した。グルタチオン化ＳＴＡＴ３は、抗ＧＳＨ抗体を使用して認識した。
【０１９５】
図２４及び図２５に示したデータは、シナロピクリンがＧＳＨの細胞内濃度を低下させること（図２４）、また、酸化還元状態の変化がＳＴＡＴ３のグルタチオン化を誘導し、それらのリン酸化を阻止すること（図２５）を実証している。グルタチオンエチレンエステルによる前処置によるＧＳＨの生理学的値の回復は、ＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害するシナロピクリンの能力を反転させる。
【０１９６】
１０．  本発明の抽出物による処置又は未処置腫瘍細胞の移植
第１移植実験の説明。
ＭＳＴＯ２１１Ｈ細胞を２４時間、５０μｇ／ｍｌ濃度のアーティチョークで処置した。ＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に２×１０６細胞の懸濁液を収集し、４週齢の雌ヌードマウスの右臀部に接種した。腫瘍の体積は、週に２回、２１日目までモニターした。マウスを屠殺し、塊を除去した。
【０１９７】
１１．  マウスにおける腫瘍細胞の移植とシナラ・スコリムス及びペメトレキセドによる処置（図２７）
第２移植実験の説明。
細胞を移植までに増殖させ、それらの活性及び混成の観点から評価した。すなわち、細胞を計数し、２０×１０６／ｍｌの濃度でＰＢＳに再懸濁した。Ｍａｔｒｉｇｅｌを懸濁液に加え、ＰＢＳ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  １／１の最終濃度１０×１０６細胞／ｍｌを得た。ＭＳＴＯ細胞を４８匹のマウスの皮下に接種した。
【０１９８】
腫瘍が６０ｍｍ３の平均体積に達した時、異なる処置を受ける一群当たり６匹の動物によって形成される８群にマウスを分けた。
【０１９９】
２群は、３週間の間、週７日間、飲用水中のアーティチョークを摂取した；他の群は、３週間の間、週５日、ペメトレキセドを腹腔内投与した。
【０２００】
これらの群を下記の表５に概説した：
【表５】
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【０２０１】
腫瘍の進行が出現したならば（すなわち、腫瘍が６０ｍｍ３に達した時）、処置は、以下のように投与するＡｂｏ１及びペメトレキセドで開始した：連続５日間、マウス１匹当たり８８ｍｌで用量１００ｍｇ／ｋｇのペメトレキセドを腹腔内投与、濃度が２５、５０及び７５マイクログラム／ｍｌの飲用水中アーティチョーク抽出物を投与。３週間の間、隔日で測定した。
【０２０２】
マウスに対し、あらゆる徴候を評価するため、毎日モニターした；体重は週に２回モニターした。
【０２０３】
実験の終了時に（接種４２日後）、腫瘍塊を回収し、１０％ホルマリンに固定した（２４時間後に７０％エタノールに移した）。
【０２０４】
腫瘍直径は週２回、Ｍｉｔｕｔｏｙｏキャリパーを使用して測定した。
【０２０５】
１２．低酸素モデルの生成
ここ数年の科学文献には、腫瘍自体の発生及び進行における腫瘍微小環境の関連性が記載されている。不十分で異常な血管発生の後に、ほとんどの固形腫瘍は正常組織の酸素レベルよりも低い酸素レベルを示し、より転移性の形質及び治療に対する強い耐性に関連する適応変化を誘導する低酸素領域が結果的に形成される。
【０２０６】
これに関して、低酸素誘導転写因子（ＨＩＦ−１）は、ストレスに対する細胞応答を介在し、解糖制御、グルコース輸送、細胞生存及び増殖、血管新生及び転移に関与する多くの遺伝子の発現を調節する。
【０２０７】
腫瘍におけるＨＩＦ−１活性の増加は次の２つの付随する要因に起因する：ＨＩＦ−１αの高発現、タンパク質の調節サブユニット、及びＳＴＡＴ３の構造的活性化が、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ系の制御解除をもたらし、ＧＳＨ増加を引き起こし、腫瘍細胞の生存率が高くなり、また化学療法剤に対するそれらの耐性が高くなる。
【０２０８】
腫瘍環境において変化した様々な代謝経路及びシグナル伝達経路のうち、低酸素誘導適応事象を調節し細胞死を誘導するために２つの主要な標的：ＨＩＦ−１α系及びＧＳＨ／ＧＳＳＧ系が選抜された。本発明者らは、シナラ・スコリムスの抽出物がＳＴＡＴ３の強力な阻害剤であり、アポトーシスを誘導し、いくつかの腫瘍系をいくつかの化学療法剤に対してより感受性にすることを証明した。
【０２０９】
様々なヒト腫瘍由来のいくつかの細胞系を、様々なパーセントでガスの混合物（Ｏ２、ＣＯ２及びＮ）が吹きこまれるＲＵＳＫＩＮインキュベーターを使用して低酸素下で培養した。
【０２１０】
２つの低酸素モデルが生成された：
−  急性ＨＹＰＯＸＩＡ  ４８時間までＯ２＜２％
−  慢性ＨＹＰＯＸＩＡ  長時間Ｏ２＜２％。
【０２１１】
１２．１  細胞培養
ヒト乳癌細胞系Ｔ４７−Ｄ及びＭＤＡ−ＭＢ２３１、ヒト結腸直腸腺癌細胞系ＨＴ−２９、ヒト前立腺癌細胞系ＤＵ１４５、ヒト子宮頸癌細胞系ＨｅＬａ、ヒト肝臓癌腫細胞系ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、ＤＭＥＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）中、３７℃の５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。
【０２１２】
この培地を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｃａｍｂｒｅｘ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、ペニシリン１００ＵＩ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍｌ及びゲンタマイシン４０ｍｇ／ｍｌと一緒にした。
【０２１３】
慢性低酸素症モデルを確立するため、上記細胞系を、マルチガスインキュベーター（Ｒｕｓｋｉｎｎ  Ｃ３００、Ｒｕｓｋｉｎｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．、Ｂｒｉｄｇｅｎｄ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して、Ｎでバランスをとった５％ＣＯ２及び１％Ｏ２雰囲気中、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養した。それぞれの細胞継代を通じて生存した細胞を選択し、少なくとも３か月間及び６か月までの間、再酸化サイクル及び低酸素サイクルで培養した。
【０２１４】
１２．２  細胞生存能力
ＷＳＴ−１
細胞生存能力（生存率）は、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼによって  テトラゾリウム塩４−［３−（４−ヨードフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾリウム］−１，３−ベンゼンジスルホナートＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）をホルマザンに切断することに基づく比色測定法によって測定した。
【０２１５】
トリパンブルー／Ｃｏｕｎｔｅｓｓ
細胞生存能力は、自動Ｃｏｕｎｔｅｓｓ細胞カウンター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））を使用して、０．４％トリパンブルー排除試験により評価した。
【０２１６】
１２．３  増殖アッセイ
ＣＦＳＥ増殖アッセイを用いて、色素希釈による増殖細胞の異なる世代をモニターした。ＣＦＳＥは、細胞に入り、タンパク質のアミノ基に結合する細胞膜透過性蛍光分子であり、細胞内部に色素が長期間保持される。連続の細胞分裂によって、それぞれの娘細胞は親の蛍光の約半分を受け取る。
【０２１７】
フローサイトメトリーによる細胞集団蛍光強度を解析することにより、標識から細胞又は細胞群が進行した世代の数を判定することができる。細胞のそれぞれの世代は、フローサイトメトリーヒストグラム上に異なるピークとして出現する。
【０２１８】
細胞をＰＢＳで２回洗浄し、遠心分離にかけ、次いで、０．１％ＰＢＳ／ＢＳＡに再懸濁し、１×１０６の細胞密度に調整した。１０μＭ濃度の色素を細胞懸濁液に添加し、全体を光から保護して３７℃で１０分間インキュベートした。氷上で５分間インキュベーションした後、細胞を０．１％ＰＢＳ／ＢＳＡで３回洗浄して溶液中に残っている遊離色素を除去し、培地に再懸濁し、１００，０００個の細胞アリコートで分配しマルチウェルプレートで染色した。２４時間、４８時間及び７２時間後に、細胞を回収し、４８８ｎｍ励起光源を装備したＦＡＣＳによって解析した。
【０２１９】
１２．４  細胞周期解析
細胞周期解析は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）含有量の単変量解析を実施することにより得た。
【０２２０】
細胞を２４時間、４８時間及び７２時間で回収し、二本鎖ＤＮＡと結合した後、ＤＮＡ質量に比例した蛍光シグナルを放出する（細胞透過性）蛍光色素Ｖｉｂｒａｎｔ  Ｏｒａｎｇｅで染色した。フローサイトメトリーを使用して個々の細胞の蛍光強度を測定した。この手法を使用することによって、細胞周期相Ｇ１／Ｇ０、Ｓ及びＧ２／Ｍを示すため、度数分布ヒストグラム又はＤＮＡ度数ヒストグラムを作製することができる。
【０２２１】
１２．５  Ｌ−乳酸塩、ピルビン酸塩及びグルコースの定量
Ｌ−乳酸塩、ピルビン酸塩及びグルコースは、Ｌ−乳酸アッセイ（Ｍｅｇａｎｚｙｍｅ）及びグルコース比色アッセイ（Ｃａｙｍａｎ）の手順に従って、特定の酵素反応を実施した後、分光光度計によって、低酸素状態細胞及び正常酸素状態細胞両方の上清において定量した。
【０２２２】
１２．６  ウェスタンブロッティング解析
４２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％のＮｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０（ＮＰ−４０）、２０％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｌａｃｅ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）及びホスファターゼ阻害剤カクテルを含有する２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７、４中４℃で細胞をホモゲナイズした。細胞溶解産物のアリコートを、７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにロードした（１レーン当たりの４０μｇの総タンパク質）。電気泳動は、０．２５ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．３、１．９２Ｍグリシン及び１％ＳＤＳを含有するランバッファーを用いて１００Ｖで実施した。溶解したタンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）上にエレクトロブロッティングし、適切な抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。すすいだ後、膜をペルオキシダーゼ結合抗ウサギ又は抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び化学発光検出システム（Ｋｉｔ  Ｉｍｍｕｎ−Ｓｔａｒ（商標）ＷｅｓｔｅｒｎＣ（商標）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて発色させた。ブロッティングに供したタンパク質を検出し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ画像システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して定量した。
【０２２３】
１２．７  急性低酸素症
以下の表で示した細胞系を、３つの異なるＯ２濃度（０．５％、１％及び２％）の雰囲気下で、３７℃のＲｕｓｋｉｎキャビネット内で２４時間又は４８時間培養し、生存細胞中に存在するミトコンドリアデヒドロゲナーゼによるテトラゾリウム塩の還元に基づくＷＳＴ−１比色アッセイ及び、ＣＯＵＮＴＥＳＳ／ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮによるカウントに関連したトリパンブルーの両方を用いて細胞生存能力を解析した。
【０２２４】
【表Ｂ】
2018501304.tif 000009
【０２２５】
１２．８  慢性低酸素症
固形腫瘍内部に存在する慢性低酸素症の状態を再現するため、上記の表に示したすべての細胞系を、１％のＯ２雰囲気下で３７℃にてＲｕｓｋｉｎキャビネット内で数か月培養した。培地は死滅細胞を除去するため３日毎に交換し、約１０〜１５日毎に細胞を正常酸素状態下のインキュベーター内に２４時間置いた。解析したすべての細胞のうち、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞系のみが低酸素環境に順応し生存した。慢性低酸素症に適応したＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞系をＣｈＲ−ＭＤＡ−ＭＢ２３１（慢性低酸素症性耐性）と命名した。
【０２２６】
これらの細胞は成長が遅く、数か月後には完全に異なる形態を示す。この変化をより明確に強調するため、細胞を細胞膜に特異的なＣｅｌｌ−ｍａｓｋ色素で処置し、共焦点顕微鏡を用いて撮影した。ＣｈＲ−ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞は、親細胞に比べより紡錘形の形状を有する。
【０２２７】
代謝及び細胞増殖を解析した。ＣｈＲ−ＭＤＡ−ＭＢ２３１のエネルギー代謝解析は、これらの細胞はグルコースを消費せず、正常酸素状態下で培養した細胞と比べてわずかなピルビン酸塩を産生するが、産生される乳酸塩の濃度は変わらないことを示す。これらの結果からは、慢性低酸素症細胞ＣｈＲ−ＭＤＡ−ＭＢ２３１が非常に遅くなった代謝を有することが明らかであった。次いで、ＣｈＲ−ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞をＣＦＳＥで処置し、それぞれの細胞分裂で娘細胞に分配する蛍光体がその蛍光の半分になり、それによって細胞分裂の数をモニターすることができる。得られた結果は、細胞が非常にゆっくりと増殖することを示す。最後に、細胞周期に関する細胞蛍光測定研究は、これらの細胞が細胞周期のＧ０／Ｇ１期において静止していることを示している。これらの細胞は、さらにアノイキス（ａｎｏｉｋｉｓ）によって死滅することはないが、癌幹細胞の典型的な特徴である腫瘍塊（ｔｕｍｏｕｒｓｐｈｅｒｅｓ）を形成する。
【０２２８】
要約すると、本明細書で報告した慢性低酸素症細胞モデルは、インビボで腫瘍に長期間生存し、治療法を回避し、環境の変化後に転移及び再発を引き起こす可能性のある、休止細胞の典型的な特徴を示す。いくつかの研究において、それらはまた癌幹細胞として同定されている。
【０２２９】
１３．低酸素条件下で本発明の滴定抽出物によって誘導される化学療法剤に感受性のある腫瘍細胞
作製したモデルは、典型的な化学療法剤との併用で使用される植物抽出物に関する試験に適したように思われる。次いで、細胞をドキソルビシン、植物抽出物又はそれらの併用で処置し、細胞生存能力を添付の材料及び方法に記載のようにトリパンブルー／Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって解析した。以下の処置を実施した：
【０２３０】
１３．１  ドキソルビシンによる処置
正常酸素状態及び慢性低酸素状態下で培養したＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を、様々な濃度のドキソルビシン（乳癌の処置における選択薬剤）で２４時間処置した。得られたデータからは、ＣｈＲ−ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞が正常酸素状態下で培養した親のものと比べ、薬剤に対してより耐性であることが明らかである。
ＭＤＡ−ＭＢ２３１  ＥＣ５０＝０．２５μｇ／ｍＬ及びｃｈＭＤＡＭＢ２３１  ＥＣ５０＝１μｇ／ｍＬ（図２９）。
【０２３１】
１３．２  本発明による滴定抽出物による処置
正常酸素状態及び慢性低酸素状態下で培養したＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を、１００ｍｇ／ｍｌ濃度で５０％ＥｔＯＨに溶解させた様々な濃度の本発明による滴定抽出物で２４時間処置した。得られた結果から、使用した抽出物が用量依存的に細胞生存能力を阻害することが明らかである（図３０）（ＥＣ５０＝３００ｕｇ／ｍＬ）。
【０２３２】
１３．３  本発明に記載の滴定抽出物及びドキソルビシンによる処置
細胞を化学療法処置に対して感受性にするため、ｃｈＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を、図３１に示した０．２５ｕｇ／ｍｌのドキソルビシンを併用して、本発明に記載の漸増量の滴定抽出物で処置し、細胞生存能力を下記に示したトリパンブルーにより評価した。このタイプの実験においては、実験下の細胞に２０％の致死率を誘導し得るドキソルビシン量を使用した。
【０２３３】
結果から、本抽出物がドキソルビシンによる処置に対して細胞を感受性にすることが明らかである。
【０２３４】
１４．シナラ・スコリムス中のクロロゲン酸及びシナロピクリンの定量
サンプル調製：０．２５ｇの凍結乾燥抽出物（葉粉砕物０．５ｇ）を秤量し、５０ｍｌの７５％ＭｅＯＨ／０．１％ＨＣＯＯＨで、光から保護して１５分間超音波下にて抽出する。遠心分離を行い、１００ｍｌメスフラスコにデカントする。残留物について同じ条件下で第２の抽出を繰り返す。遠心分離を行い、同じ１００ｍｌフラスコにデカントする。２０℃の再統合した有機抽出物を同じ抽出溶媒を用いて容量にする。０．４５μｍ酢酸セルロースフィルターで濾過し、ＵＨＰＬＣシステム又はＨＰＬＣシステムに注入する。
【０２３５】
クロマトグラフィー条件（ＵＨＰＬＣ）：
カラム：Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０  ＥＣ−Ｃ１８、３×１００ｍｍ  ２．７μｍ＋インラインフィルター  ４．６ｍｍ、０．２μｍ
フィルター；カラム温度：３０℃±０．８℃
検出器：ダイオードアレイ検出器
クロロゲン酸：波長＝３２５ｎｍ−帯域幅４。
シナロピクリン：波長＝２１２ｎｍ−帯域幅４。
流速：０．４３ｍｌ／分。
注入量：５μｌ
移動相：Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＨＣＯＯＨ、Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＨＣＯＯＨ。
溶出条件：
【表Ｃ】
2018501304.tif 000010
【０２３６】
標準品調製：
標準品：シナロピクリン−可溶化溶媒：ＨＰＬＣ用のＭｅＯＨ。
作業濃度：０．００４０４ｍｇ／ｍｌから０．０６４６２４ｍｇ／ｍｌ。
保管条件：作業溶液は−２０℃で保存され、光から保護されている。
標準品：クロロゲン酸−可溶化溶媒：ＨＰＬＣ用の５０％ＭｅＯＨ。
作業濃度：０．０２５４８ｍｇ／ｍｌから０．１０１９２ｍｇ／ｍｌ。
保管条件：作業溶液は＋４℃で保存され、光から保護されている。
クロマトグラフィー条件（ＨＰＬＣ方法）：
カラム：Ｌｕｎａ  Ｃ１８  １５０×４．６ｍｍ  ５μｍ
カラム温度：３０℃±０．８℃
検出器：ダイオードアレイ検出器
クロロゲン酸：波長＝３２５ｎｍ−帯域幅４。
Ｒｅｆ．オフ
シナロピクリン：波長＝２１２ｎｍ−  帯域幅４。
Ｒｅｆ．オフ
流速：０．５ｍｌ／分
注入量：１０μｌ
移動相：Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＨＣＯＯＨ、Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＨＣＯＯＨ
溶出条件：
【表Ｄ】
2018501304.tif 000011
【０２３７】
計算：固体生成物中のクロロゲン酸の含量パーセントは次式により計算される：
【数１】
2018501304.tif 000012
【０２３８】
式中、
ＡＣ＝サンプル中のクロロゲン酸に関連するピーク面積；
Ａｓｔ＝標準品中のクロロゲン酸に関連するピーク面積；
ｃｏｎｃ．ｓｔ＝標準品中のクロロゲン酸の濃度（ｍｇ／ｍｌ）；
Ｖ＝抽出物の総体積（ｍｌ）；
ｐ＝サンプル重量（グラム）；
Ｆ＝希釈係数。
固形生成物中のシナロピクリンの含量パーセントは同じ式で計算する。
【０２３９】
１５．シナラ・スコリムス中のクロロゲン酸として示される総カフェオイルキナ酸の定量。
サンプルの調製：凍結乾燥した抽出物サンプルの０．３０ｇ±０．０１５ｇを正確に秤量する（粉砕した葉の場合は０．５０ｇ）。４０ｍｌの超純水Ｈ２Ｏを添加し、９５℃±２℃の温度の磁気撹拌下に置く。沸騰温度に達したら、５０ｍｌの遠心チューブに綿を通して濾過する。２ｍｌの飽和酢酸鉛溶液を（まだ温かい）溶液に加える。
【０２４０】
冷却し、遠心分離を行い、上清を廃棄する。残留物に５ｍｌの超純粋Ｈ２Ｏを加え、遠心チューブを撹拌する。再度遠心分離を行い、上清を廃棄する。７０ｍｌの希酢酸（１１．４ｍｌを超純粋Ｈ２Ｏで１００ｍｌにしたもの）で残留物を抽出し、ゆっくりと撹拌しながら沸騰するまで加熱する。また温かい溶液を、綿を通して濾過し、２ｍｌの硫酸の溶液（２００ｍｌ／ｌ）を加える。遠心分離を行い、１００ｍｌのメスフラスコに透明な溶液をデカントする。残留物に５ｍｌの希酢酸を加える。遠心分離を行い、同じ１００ｍｌのメスフラスコに透明な溶液をデカントする。室温で、希酢酸で１００ｍｌの容量にする。
試験溶液：１ｍｌの溶液をとる。メスフラスコによって、メタノールで２５ｍｌにし、撹拌する。
基準溶液：１ｍｌの酢酸をとる。メスフラスコによって、メタノールで２５ｍｌにし、撹拌する。
【０２４１】
分光光度測定：
ブランクとして基準溶液を使用し、３２５ｎｍで試験溶液の吸光度を測定する。
Ａ１％、１ｃｍ（ヨーロッパ薬局方Ｅｄ８．０，２．２．２５で定義されている）の定義＝長さ１ｃｍのセルに入れた、濃度１０ｇ／リットルで溶解させた基準物質を所定の波長で測定した比吸光度
３２５ｎｍでのクロロゲン酸の値をＡ１％、１ｃｍを４８５と仮定すると、クロロゲン酸として示されるカフェオイルキナ酸のパーセントは、次式により計算される：
計算：
【数２】
2018501304.tif 000013
式中
Ａ＝３２５ｎｍでのサンプルの吸光度。
Ｖｅ＝抽出物の最終体積。
Ｖｆ＝希釈液の最終体積。
ｐ＝サンプル重量グラム。
Ｖｐ＝最終希釈のために得たサンプル容量。
Ａ１％、１ｃｍ＝４８５（Ａ１％、波長３２５ｎｍでの１ｃｍのクロロゲン酸）。
【０２４２】
参考文献
2018501304.tif 000014
【図１ａ】
2018501304.tif 000015
【図１ｂ】
2018501304.tif 000016
【図２】
2018501304.tif 000017
【図３ａ】
2018501304.tif 000018
【図３ｂ】
2018501304.tif 000019
【図３ｃ】
2018501304.tif 000020
【図３ｄ】
2018501304.tif 000021
【図４ａ】
2018501304.tif 000022
【図４ｂ】
2018501304.tif 000023
【図４ｃ】
2018501304.tif 000024
【図５】
2018501304.tif 000025
【図６ａ】
2018501304.tif 000026
【図６ｂ】
2018501304.tif 000027
【図６ｃ】
2018501304.tif 000028
【図７】
2018501304.tif 000029
【図８】
2018501304.tif 000030
【図９】
2018501304.tif 000031
【図１０ａ】
2018501304.tif 000032
【図１０ｂ】
2018501304.tif 000033
【図１０ｃ】
2018501304.tif 000034
【図１１ａ】
2018501304.tif 000035
【図１１ｂ】
2018501304.tif 000036
【図１１ｃ】
2018501304.tif 000037
【図１２】
2018501304.tif 000038
【図１３】
2018501304.tif 000039
【図１４】
2018501304.tif 000040
【図１５】
2018501304.tif 000041
【図１６ａ】
2018501304.tif 000042
【図１６ｂ】
2018501304.tif 000043
【図１７】
2018501304.tif 000044
【図１８】
2018501304.tif 000045
【図１９】
2018501304.tif 000046
【図２０】
2018501304.tif 000047
【図２１ａ】
2018501304.tif 000048
【図２１ｂ】
2018501304.tif 000049
【図２２】
2018501304.tif 000050
【図２３】
2018501304.tif 000051
【図２４】
2018501304.tif 000052
【図２５】
2018501304.tif 000053
【図２６】
2018501304.tif 000054
【図２７】
2018501304.tif 000055
【図２８ａ】
2018501304.tif 000056
【図２８ｂ】
2018501304.tif 000057
【図２８ｃ】
2018501304.tif 000058
【図２８ｄ】
2018501304.tif 000059
【図２９】
2018501304.tif 000060
【図３０】
2018501304.tif 000061
【図３１】
2018501304.tif 000062
【国際調査報告】
2018501304.tif 000063
2018501304.tif 000064
2018501304.tif 000065
2018501304.tif 000066