(57)【要約】  試料において標的物質を検出するために使用することができる新規なキメラ融合タンパク質を安定的に発現するバイオセンサー細胞株を含む、ユニバーサル抗体媒介バイオセンサーが提供される。該融合タンパク質は、抗体を、それらの結合特異性に関わらず結合する細胞外抗体結合ドメインと、抗原の結合によって細胞活性化を誘導するシグナル伝達ドメインとを有する。該融合タンパク質は任意の抗体のＦｃ領域に結合することから、細胞外シグナル伝達と細胞内活性化との間の普遍的な経路としてはたらくことができる。該バイオセンサーを使用して、試料における選択された抗原の存在を検出することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料において標的物質を検出する方法であって、
（ａ）試料と、標的物質に対して結合特異性を有する抗体、及びバイオセンサー細胞とを接触させることと、
（ｂ）細胞活性化について前記バイオセンサー細胞をアッセイすることと、
を含み、
前記バイオセンサー細胞が安定的にキメラ融合タンパク質を発現し、前記キメラ融合タンパク質がＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）抗体結合ドメインとシグナル伝達ドメインとを含む、
方法。
【請求項２】
前記試料が、空気試料、液体試料、野菜試料又は乾燥試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が、血液、血清、汗、尿、脳脊髄液、粘液、精液、便、気管支肺胞洗浄液、及び組織からなる群から選択される生体試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記物質が環境毒素、汚染物質、又は薬物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記物質が、生物兵器物質、アレルゲン、寄生虫抗原、真菌抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、細胞性抗原及び抗体からなる群から選択される、生物学的物質である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記バイオセンサー細胞が、キメラ融合タンパク質を安定的に発現する、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、Ｐ８１５、Ｋ５６２又はＣｏｓ−１細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞活性化が、細胞内のＣａ２＋レベルの増加である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＦｃγＲ抗体結合ドメインが、配列番号１若しくは配列番号３に示されるＦｃγＲＩ抗体結合ドメインである、又は配列番号１若しくは配列番号３の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＦｃγＲ抗体結合ドメインが、配列番号２若しくは配列番号４に示されるＦｃγＲＩＩＩ抗体結合ドメインである、又は配列番号２若しくは配列番号４の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記シグナル伝達ドメインが、配列番号５に示される免疫グロブリンアルファ（Ｉｇα）シグナル伝達ドメインである、又は配列番号５の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記シグナル伝達ドメインが、配列番号５に示される免疫グロブリンアルファ（Ｉｇα）シグナル伝達ドメインである、又は配列番号５の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記シグナル伝達ドメインが、配列番号６に示される膜Ｉｇである、又は配列番号６の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記シグナル伝達ドメインが、配列番号６に示される膜Ｉｇである、又は配列番号６の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）抗体結合ドメインとシグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を安定的に発現するバイオセンサー細胞。
【請求項１５】
前記キメラ融合タンパク質を安定的に発現する、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、Ｐ８１５、Ｋ５６２、又はＣｏｓ−１細胞である、請求項１４に記載のバイオセンサー細胞。
【請求項１６】
前記ＦｃγＲ抗体結合ドメインが、配列番号１若しくは配列番号３に示されるＦｃγＲＩ抗体結合ドメインである、又は配列番号１若しくは配列番号３の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体である、請求項１４に記載のバイオセンサー細胞。
【請求項１７】
前記ＦｃγＲ抗体結合ドメインが、配列番号２若しくは配列番号４に示されるＦｃγＲＩＩＩ抗体結合ドメインである、又は配列番号２若しくは配列番号４の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体である、請求項１４に記載のバイオセンサー細胞。
【請求項１８】
前記シグナル伝達ドメインが、配列番号５に示される免疫グロブリンアルファ（Ｉｇα）シグナル伝達ドメインである、又は配列番号５の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のバイオセンサー細胞。
【請求項１９】
前記シグナル伝達ドメインが、配列番号６に示される膜Ｉｇである、又は配列番号６の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のバイオセンサー細胞。
【請求項２０】
Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）抗体結合ドメインとシグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質。
【請求項２１】
前記ＦｃγＲ抗体結合ドメインが、配列番号１若しくは配列番号３に示されるＦｃγＲＩ抗体結合ドメインである、又は配列番号１若しくは配列番号３の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体である、請求項２０に記載のキメラ融合タンパク質。
【請求項２２】
前記ＦｃγＲ抗体結合ドメインが、配列番号２若しくは配列番号４に示されるＦｃγＲＩＩＩ抗体結合ドメインである、又は配列番号２若しくは配列番号４の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体である、請求項２０に記載のキメラ融合タンパク質。
【請求項２３】
前記シグナル伝達ドメインが、配列番号５に示される免疫グロブリンアルファ（Ｉｇα）シグナル伝達ドメインである、又は配列番号５の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体である、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のキメラ融合タンパク質。
【請求項２４】
前記シグナル伝達ドメインが、配列番号６に示される膜Ｉｇである、又は配列番号６の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体である、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のキメラ融合タンパク質。
【請求項２５】
配列番号８に示されるＦｃγＲＩ／Ｉｇα融合タンパク質である、又は配列番号８の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体である、請求項２０に記載のキメラ融合タンパク質。
【請求項２６】
配列番号１０に示されるＦｃγＲＩＩＩ／Ｉｇα融合タンパク質である、又は配列番号１０の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体である、請求項２０に記載のキメラ融合タンパク質。
【請求項２７】
配列番号２２に示されるＦｃγＲＩ／膜Ｉｇ融合タンパク質である、又は配列番号２２の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体である、請求項２０に記載のキメラ融合タンパク質。
【請求項２８】
配列番号２３に示されるＦｃγＲＩＩＩ／膜Ｉｇ融合タンパク質である、又は配列番号２３の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体である、請求項２０に記載のキメラ融合タンパク質。
【請求項２９】
請求項２０〜２８のいずれか一項に記載のキメラ融合タンパク質、又はその相補鎖をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項３０】
請求項２９に記載のポリヌクレオチド配列を含むクローニングベクター。
【請求項３１】
請求項２９に記載のポリヌクレオチド配列を含む細胞。
【請求項３２】
請求項３０に記載のクローニングベクターを含む細胞。
【請求項３３】
キメラ融合タンパク質を産生する方法であって、前記融合タンパク質の発現を促進する条件下で請求項３１に記載の細胞を培養することと、前記細胞又は細胞培養物から前記融合タンパク質を回収することとを含む、方法。
【請求項３４】
キメラ融合タンパク質を産生する方法であって、前記融合タンパク質の発現を促進する条件下で請求項３２に記載の細胞を培養することと、前記細胞又は細胞培養物から前記融合タンパク質を回収することとを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［配列表］
電子形式（ＡＳＣＩＩテキストファイル）の配列表は、本出願と同時に提出され、引用することにより本明細書の一部をなす。ＡＳＣＩＩテキストファイルのファイル名は、「２０１６＿０３２４Ａ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」であり、そのファイルは、２０１６年３月１１日に作成されたものであり、ファイルサイズは７４ＫＢである。
【背景技術】
【０００２】
食品安全性、ヘルスケア、農業試験及びバイオテロ防衛の分野において、目的の試料において、毒素、抗原、細菌及びウイルスを含む環境物質及び病原物質の存在を迅速かつ正確に同定する、手頃で高感度のアッセイに対する必要がますます高まっている。この目的のために、様々なバイオセンサー製品が商業的に開発され、売り出されている。
【０００３】
現在使用されているバイオセンサープラットフォームの具体例は、PathSensors, Inc.のＣＡＮＡＲＹ（商標）バイオセンサー技術である。Rider et al.（非特許文献１）の成果に基づくこのプラットフォームは、特定の空気感染性で、液状の（liquid-based）病原体の確実な同定を可能にする。ＣＡＮＡＲＹ（商標）バイオセンサーの生物学的バックボーンは、その同族の抗原又は病原物質を結合することができる、細胞外に結合された抗原特異的抗体を発現する、遺伝子操作されたＢ細胞で構成される。このシステムでは、抗原を含む試料がバイオセンサーの細胞外表面上の抗体と相互作用すると、細胞内シグナル伝達カスケードが活性化され、Ｂ細胞内のＣａ２＋放出をもたらす。ＣＡＮＡＲＹ（商標）システムでは、Ｂ細胞は、高い細胞内Ｃａ２＋レベルの存在下で細胞発光をもたらすＣａ２＋感受性発光タンパク質であるイクオリンを発現する。したがって、発光を使用して抗原結合を示すことができる。
【０００４】
ＣＡＮＡＲＹ（商標）システムを細菌、ウイルス及び毒素によるものを含む多くの特異抗原を効率的に同定するために使用することができる。しかしながら、抗原試験レパートリーの拡大は複雑で費用がかかる。選択されたあらゆる抗原を認識するために、種々の抗原又は病原体に特異的なバイオセンサーが構築されなければならならず、それは、ハイブリドーマ細胞株の産生、抗体をコードする核酸配列のクローニング、及び抗体によって同族の抗原（例えば病原体）の結合により発光するように遺伝子操作されたＢ細胞株の表面上の膜貫通型タンパク質としてのクローン化された抗体の発現を含む複数の工程を必要とする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Rider, TH,  Petrovick, MS, Nargi FE, et al., (2003) A B Cell-Based Sensor for Rapid Identification of Pathogens Science 301:213-215.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、広範囲の環境物質及び病原物質に対する複数の検査プラットフォームにおける使用に適合され得るユニバーサルバイオセンサーの開発が必要とされている。本発明は、この及び他の重要な目標に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
試料において標的物質を検出し定量するために使用することができるユニバーサル抗体媒介バイオセンサー、及び選択された標的物質から試料をスクリーニングするのにバイオセンサーを使用する方法が本明細書において提供される。
【０００８】
本発明のバイオセンサーは、概して新規なキメラ融合タンパク質を安定的に発現する細胞株を含む。該融合タンパク質は、シグナル伝達ドメイン（免疫グロブリンアルファ（Ｉｇα）の細胞内活性化ドメイン等）に融合された抗体結合ドメイン（Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）の細胞外ドメイン等）を含む。Ｎ末端細胞外抗体結合ドメインが抗体のＦｃ領域に結合する能力を有するのに対し、Ｃ末端細胞内シグナル伝達ドメインはＣａ２＋放出等の細胞プロセスを活性化する能力を有する。抗体結合ドメインに結合された抗体がそれらの同族の抗原によって架橋されると、かかる活性化が起こる。
【０００９】
キメラ融合タンパク質の抗体結合ドメインが抗体のＦｃ領域を結合することから、融合タンパク質によって結合され得る抗体は、抗体の抗原特異性によって制限されない。したがって、キメラ融合タンパク質は、選択された標的（例えば抗原又は病原物質）を認識し結合する任意の利用可能な抗体を結合する能力を有する。
【００１０】
本発明のバイオセンサーは、各選択された標的物質に対して個別のキメラ融合タンパク質の産生を必要とせずに、同じプラットフォームを使用して、広範囲の異なる標的物質の存在について試験する迅速かつ経済的な手段を提供する。このユニバーサルバイオセンサーは、商業的に入手可能な抗体、及びバイオセンサーと共に使用されるように特異的に産生された抗体とあわせて使用可能である。
【００１１】
融合タンパク質
第１の実施の形態では、本発明は、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）抗体結合ドメインと、膜貫通ドメインと、シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質に関する。融合タンパク質は、それらの抗体結合ドメインを介して抗体のＦｃ領域を認識し結合する能力を有する。また、融合タンパク質は、該融合タンパク質を発現する細胞の細胞内シグナル伝達カスケードを活性化する能力を有する。或る特定の態様では、細胞内シグナル伝達カスケードは、結果的に細胞内のＣａ２＋の放出をもたらす。
【００１２】
本実施の形態の或る特定の態様では、ＦｃγＲ抗体結合ドメインは、配列番号１若しくは配列番号３に示されるＦｃγＲＩ抗体結合ドメインである、又は配列番号１若しくは配列番号３の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体である。本実施の形態の他の或る特定の態様では、ＦｃγＲ抗体結合ドメインは、配列番号２若しくは配列番号４に示されるＦｃγＲＩＩＩ抗体結合ドメインである、又は配列番号２若しくは配列番号４の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体である。配列変異体は、元の抗体結合ドメインの抗体結合活性を保持する。
【００１３】
本実施の形態の或る特定の態様では、シグナル伝達ドメインは、配列番号５に示される免疫グロブリンアルファ（Ｉｇα）シグナル伝達ドメインである、又は配列番号５の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体である。本実施の形態の他の或る特定の態様では、シグナル伝達ドメインは、配列番号６に示される部分的な膜Ｉｇである、又は配列番号６の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体である。配列変異体は、元のシグナル伝達ドメインのシグナル伝達活性を保持する。
【００１４】
選択された態様では、融合タンパク質は、配列番号８に示されるＦｃγＲＩ／Ｉｇα融合タンパク質、配列番号１０に示されるＦｃγＲＩＩＩ／Ｉｇα融合タンパク質、配列番号２２に示されるＦｃγＲＩ／膜Ｉｇ融合タンパク質、又は配列番号２３に示されるＦｃγＲＩＩＩ／膜Ｉｇ融合タンパク質、又は配列番号８、配列番号１０、配列番号２２、若しくは配列番号２３の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体である。
【００１５】
本発明は、本明細書に定義される様々な実施の形態及び態様において提供される融合タンパク質の各々をコードするヌクレオチド配列、また同様にそれらの相補鎖を含む、ポリヌクレオチドを含む。また、本発明はポリヌクレオチドを含むクローニングベクター、及びポリヌクレオチド又は発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を含む。かかる宿主細胞は、哺乳動物又は非哺乳類の細胞であってもよい。本発明は、ポリヌクレオチド及び発現ベクターによってコードされる融合タンパク質の発現を促進する条件下で宿主細胞を培養することと、細胞又は細胞培養物から融合タンパク質を回収することとを含む、本明細書に定義される融合タンパク質を産生する方法を更に含む。
【００１６】
バイオセンサー細胞
第２の実施の形態では、本発明は、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）抗体結合ドメインと、膜貫通ドメインと、シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を安定的に発現するバイオセンサー細胞に関する。上記融合タンパク質は、それらの抗体結合ドメインを介して抗体のＦｃ領域を認識し結合する能力を有する。融合タンパク質は、該融合タンパク質を発現する細胞の細胞内シグナル伝達カスケードを活性化する能力を有する。或る特定の態様では、細胞内シグナル伝達カスケードは、結果的に細胞内のＣａ２＋の放出をもたらす。キメラ融合タンパク質は、膜内在性タンパク質として細胞の表面に安定的に発現される。
【００１７】
本実施の形態の或る特定の態様では、バイオセンサー細胞は、各々がキメラ融合タンパク質を安定的に発現する、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、Ｐ８１５、Ｋ５６２、又はＣｏｓ−１細胞である。
【００１８】
本実施の形態の或る特定の態様では、ＦｃγＲ抗体結合ドメインは、配列番号１若しくは配列番号３に示されるＦｃγＲＩ抗体結合ドメインである、又は配列番号１若しくは配列番号３の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体である。本実施の形態の他の或る特定の態様では、ＦｃγＲ抗体結合ドメインは、配列番号２若しくは配列番号４に示されるＦｃγＲＩＩＩ抗体結合ドメインである、又は配列番号２若しくは配列番号４の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体である。配列変異体は、元の抗体結合ドメインの抗体結合活性を保持する。
【００１９】
本実施の形態の或る特定の態様では、シグナル伝達ドメインは、配列番号５に示される免疫グロブリンアルファ（Ｉｇα）シグナル伝達ドメインである、又は配列番号５の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体である。本実施の形態の他の或る特定の態様では、シグナル伝達ドメインは、配列番号６に示される部分的な膜Ｉｇである、又は配列番号６の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体である。配列変異体は、元のシグナル伝達ドメインのシグナル伝達活性を保持する。
【００２０】
物質を検出する方法
第３の実施の形態では、本発明は、試料において標的物質を検出する方法に関する。本方法は、（ａ）試料と、標的物質に対して結合特異性を有する抗体、及びバイオセンサー細胞とを接触させることと、（ｂ）細胞活性化についてバイオセンサー細胞をアッセイすることとを含み、バイオセンサー細胞が安定的にキメラ融合タンパク質を発現し、キメラ融合タンパク質がＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）抗体結合ドメインと、膜貫通ドメインと、シグナル伝達ドメインとを含む。
【００２１】
上記融合タンパク質は、それらの抗体結合ドメインを介して抗体のＦｃ領域を認識し結合する能力を有する。融合タンパク質は、該融合タンパク質を発現する細胞の細胞内シグナル伝達カスケードを活性化する能力を有する。或る特定の態様では、細胞内シグナル伝達カスケードは、結果的に細胞内のＣａ２＋の放出をもたらす。上記キメラ融合タンパク質は、膜内在性タンパク質として細胞の表面で安定的に発現される。
【００２２】
この実施の形態の或る特定の態様では、試料は、空気試料、液体試料、乾燥試料、野菜試料又は生体試料である。好ましい態様では、試料が空気試料である場合、エアロゾル、大気試料、人工呼吸器排出物、及びエンジン排気からなる群から選択される。好ましい態様では、試料が液体試料である場合、食品、飲料、水試料、医薬製剤、及びパーソナルケア製品からなる群から選択される。好ましい態様では、試料が乾燥試料である場合、食物、土壌、医薬製剤、可溶化スワブ試料、及びパーソナルケア製品からなる群から選択される。好ましい態様では、試料が野菜試料である場合、葉、果実、ナッツ、種子、花及び植物組織からなる群から選択される。好ましい態様では、試料が生体試料である場合、血液、血清、汗、尿、脳脊髄液、粘液、精液、便、気管支肺胞洗浄液、及び組織からなる群から選択される。
【００２３】
本実施の形態の或る特定の態様では、上記物質は環境毒素、汚染物質、薬物、又は生物学的物質である。好ましい態様では、物質が生物学的物質である場合、生物兵器物質、アレルゲン、寄生虫抗原、真菌抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、細胞性抗原及び抗体からなる群から選択される。
【００２４】
本実施の形態の或る特定の態様では、バイオセンサー細胞は、各々がキメラ融合タンパク質を安定的に発現する、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、Ｐ８１５、Ｋ５６２又はＣｏｓ−１細胞である。
【００２５】
本実施の形態の或る特定の態様では、細胞活性化は、細胞内のＣａ２＋レベルの増加である。
【００２６】
本実施の形態の或る特定の態様では、ＦｃγＲ抗体結合ドメインは、配列番号１若しくは配列番号３に示されるＦｃγＲＩ抗体結合ドメインである、又は配列番号１若しくは配列番号３の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体である。本実施の形態の他の或る特定の態様では、ＦｃγＲ抗体結合ドメインは、配列番号２若しくは配列番号４に示されるＦｃγＲＩＩＩ抗体結合ドメインである、又は配列番号２若しくは配列番号４の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体である。配列変異体は、元の抗体結合ドメインの抗体結合活性を保持する。
【００２７】
本実施の形態の或る特定の態様では、シグナル伝達ドメインは、配列番号５に示される免疫グロブリンアルファ（Ｉｇα）シグナル伝達ドメインである、又は配列番号５の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体である。本実施の形態の他の或る特定の態様では、シグナル伝達ドメインは、配列番号６に示される部分的な膜Ｉｇである、又は配列番号６の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体である。配列変異体は、元のシグナル伝達ドメインのシグナル伝達活性を保持する。
【００２８】
上記は、以下の本発明の詳細な説明をよりよく理解することができるように本発明の特徴及び技術的な利点を幅広く概説した。本発明の追加の特徴及び利点が本明細書に記載され、本発明の特許請求の範囲の主題をなす。本明細書に開示される任意の概念及び具体的な実施形態は、本発明の同じ目的を実施するため他の構造を修飾又は設計するための基礎として容易に利用可能であることが当業者に理解される。また、かかる等価な構築物は、添付の特許請求の範囲に述べられる本発明の趣旨及び範囲から逸脱しないことが当業者によって明確に理解されなければならない。本発明の構成及び操作方法の両方について、本発明の特性と考えられる新規な特徴は、更なる目的及び利点と共に、添付の図面と組み合せて考慮される場合に以下の記載からより良く理解されるであろう。しかしながら、あらゆる記載、図面、実施例等が解説及び説明の目的に対してのみ提供され、本発明の限定を定義することは何ら意図されないことが明確に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の融合タンパク質をコードするコンストラクトの図である（Cartoon representation）。コンストラクトＡはＦｃγＲＩ／Ｉｇα融合タンパク質をコードし、コンストラクトＢはＦｃγＲＩＩＩ／Ｉｇα融合タンパク質をコードする。これらの融合タンパク質は、ＦｃγＲＩ／Ｉｇα融合タンパク質がＦｃγＲＩ抗体結合ドメイン及び膜貫通ドメインを有するのに対して、ＦｃγＲＩＩＩ／Ｉｇα融合タンパク質がＦｃγＲＩＩＩ抗体結合ドメイン及び膜貫通ドメインを有する以外は同一である。コンストラクトＣは、ＦｃγＲＩ／膜Ｉｇ融合タンパク質をコードし、コンストラクトＤはＦｃγＲＩＩＩ／膜Ｉｇ融合タンパク質をコードする。これらの融合タンパク質は、ＦｃγＲＩ／膜Ｉｇ融合タンパク質がＦｃγＲＩ抗体結合ドメインを有するのに対し、ＦｃγＲＩＩＩ／膜Ｉｇ融合タンパク質がＦｃγＲＩＩＩ抗体結合ドメインを有する以外は同一である。これらの融合タンパク質の膜Ｉｇ部分は、膜関連抗体に由来するヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−膜貫通細胞内ドメインを含む。また、コンストラクトＥ及びコンストラクトＦは、ＦｃγＲＩ／Ｉｇα及びＦｃγＲＩＩＩ／Ｉｇαの融合タンパク質をそれぞれコードするが、これらのコンストラクトは２Ａペプチド及びＦｃＲγ鎖を更にコードする。
【図２】齧歯類ＦｃγＲＩの配列（配列番号１５）を示す図である。細胞外抗体結合領域はＮ末端にあり、網掛け配列は予測される膜貫通領域であり、細胞内領域はＣ末端にある。
【図３】齧歯類ＦｃγＲＩＩＩの配列（配列番号１６）を示す図である。細胞外抗体結合領域はＮ末端にあり、網掛け配列は予測される膜貫通領域であり、細胞内領域はＣ末端にある。
【図４】齧歯類免疫グロブリンアルファの配列（Ｉｇα、ＣＤ７９Ａ、配列番号１７）を示す図である。細胞外領域はＮ末端にあり、網掛け配列は予測される膜貫通領域であり、細胞内領域はＣ末端にある。
【図５】ＦｃγＲＩ／Ｉｇα融合タンパク質の配列（融合タンパク質Ａ、配列番号７及び配列番号８）を示す図である。ＦｃγＲＩの抗体結合ドメイン及び膜貫通ドメイン（網掛け配列）は、５’から３’の方向にＩｇαシグナル伝達ドメイン（下線）へと融合される。
【図６】ＦｃγＲＩＩＩ／Ｉｇα融合タンパク質の配列（融合タンパク質Ｂ、配列番号９及び配列番号１０）を示す図である。ＦｃγＲＩＩＩの抗体結合ドメイン及び膜貫通ドメイン（網掛け配列）は、５’から３’の方向にＩｇαシグナル伝達ドメイン（下線）へと融合される。
【図７】ヒトＩｇＧ２膜Ｉｇの部分配列（配列番号１８）を示す図である。ヒンジ領域の後に、５’から３’の方向にＣＨ２ドメイン（下線）、ＣＨ３ドメイン（二重下線）、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメイン（下線）が続く。
【図８】ＦｃγＲＩ／膜Ｉｇ融合タンパク質の配列（融合タンパク質Ｃ、配列番号２２）を示す図である。ＦｃγＲＩの抗体結合ドメインは、５’から３’の方向に部分的なヒトＩｇＧ２膜Ｉｇドメイン（下線）へと融合される。
【図９】ＦｃγＲＩＩＩ／膜Ｉｇ融合タンパク質の配列（融合タンパク質Ｄ、配列番号２３）を示す図である。ＦｃγＲＩＩＩの抗体結合ドメインは、５’から３’の方向に部分的なヒトＩｇＧ２膜Ｉｇドメイン（下線）へと融合される。
【図１０】２Ａペプチドの配列（配列番号２４）を示す図である。
【図１１】ＦｃＲγ鎖の配列（配列番号２５）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
Ｉ．定義
特に指定のない限り、技術用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は例えば、Benjamin Lewin, Genes VII, Oxford University Press刊行, 2000(ISBN019879276X)、Kendrew et al.（編）；The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Publishers刊行, 1994(ISBN0632021829)、及びRobert A. Meyers（編）, Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, Wiley, John & Sons, Inc.刊行, 1995(ISBN0471186341)、並びに他の同様の技術的参照文献に見ることができる。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「a」又は「an」は１つ以上を意味する場合がある。本明細書中で使用される場合、「a」又は「an」という単語は、「を含む（comprising）」という単語とともに使用される場合に１つ又は２つ以上を意味する場合がある。本明細書中で使用される場合、「別の」は少なくとも２つ目又はそれ以上を意味する場合がある。さらに、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単数形の用語は複数のものを含み、複数形の用語は単数のものを含む。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「約」は、明示されているか否かを問わず、例えば整数、分数及びパーセンテージを含む数値を指す。「約」という用語は一般に、当業者が列挙した値と同等である（例えば、同じ機能又は結果を有する）と考え得る数値の範囲（例えば、列挙した値の±５％〜１０％）を指す。場合によっては、「約」という用語は、最も近い有効数字まで四捨五入した数値を含み得る。
【００３３】
ＩＩ．本発明
上に簡潔に要約されるように、本発明は、表面に新規なキメラ融合タンパク質を安定的に発現する細胞株を含む、ユニバーサル抗体媒介バイオセンサーに関する。融合タンパク質はそれらの抗原結合特異性に関わらずに抗体を結合することができ、表面に融合タンパク質を発現する細胞は、同族の抗原によって結合される抗体の架橋により活性化され得る。融合タンパク質が任意の抗体のＦｃ領域に結合することから、それらは細胞外シグナル伝達と細胞内活性化との間の普遍的な経路としてはたらくことができる。このバイオセンサーを使用して、試料と（ｉ）バイオセンサー細胞、及び（ｉｉ）抗原に対する結合特異性を有する抗体とを接触させることによって、試料中の選択された抗原の存在を検出することができる。一旦添加されれば、抗体は、融合タンパク質の抗体結合ドメインによる抗体のＦｃ領域の結合を介して、キメラ融合タンパク質によって結合される。抗体による抗原の認識及び結合は抗体架橋をもたらし、それが融合タンパク質によるシグナルとしてバイオセンサー細胞中へと広がり、該細胞にて融合タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインが細胞活性化を引き起こす。その後、かかる活性化をアッセイし、所望に応じて、定量することができる。細胞活性化のレベルに基づき、試料中の抗原の存在に関して結論を引き出すことができる。非常におおまかに言えば、本発明のバイオセンサー細胞を使用して、細胞活性化が起こる場合、抗原が試料中に存在すると考えられる。
【００３４】
本発明のユニバーサル抗体媒介バイオセンサーは、膜内在性タンパク質として新規なキメラ融合タンパク質を安定的に発現する細胞株を含み、バイオセンサー細胞の個々の構成要素は、（ｉ）融合タンパク質の細胞外抗体結合ドメインと、（ｉｉ）融合タンパク質の膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）融合タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインと、（ｉｖ）膜内在性タンパク質として表面に安定的に融合タンパク質を発現する細胞株とを含む。これらの要素を以下の段落で検討する。
【００３５】
抗体結合ドメイン
本発明のキメラ融合タンパク質は、それらのアミノ末端において、細胞外抗体結合ドメインを含む。例示的な抗体結合ドメインとして、限定されないが、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩ等のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）の抗体結合ドメインが挙げられる。異なるＦｃγＲサブタイプは、異なる抗体アイソタイプ（定常領域）に対して親和性が変化することから、本発明のバイオセンサーは、融合タンパク質中の抗体結合ドメインのアイデンティティーに基づき変化し得る。例えば、齧歯類ＦｃγＲＩ抗体結合ドメインは、齧歯類ＩｇＧ２ａだけでなく、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の免疫グロブリンの定常領域に対しても高親和性を有する。齧歯類ＦｃγＲＩの抗体結合ドメインは、非常に高い親和性（１０８Ｍ−１超）で齧歯類ＩｇＧ２ａアイソタイプを結合する［２］。交差種結合研究は、ＩｇＧ４よりもＩｇＧ１及びＩｇＧ３のより強い結合によって、ヒトＦｃγＲＩが商業的に入手可能なヒトｍＡｂに結合することができることを実証した［３］。齧歯類ＦｃγＲＩＩＩ抗体結合ドメインは、齧歯類ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂの定常領域に対して、並びにヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４免疫グロブリンに対してより低い親和性（３×１０４Ｍ−１〜６×１０５Ｍ−１）を有する［３］が、本発明の融合タンパク質においても使用可能である。ＦｃγＲＩとＦｃγＲＩＩＩとの間で、全てのマウス及びヒトのＩｇ（齧歯類ＩｇＧ３を除く）は、これらの２つのＦｃ受容体のうちの１つに結合することができる。さらに、ポリクローナル抗体も、これらのＦｃγＲに結合することができる［４］。
【００３６】
したがって、当業者は、アッセイされる特定の物質及び特定の実験条件に応じて、異なるＦｃγ受容体の抗体結合ドメインが、異なる条件に好ましいものとなることを理解する。このように、本発明は、概して、本明細書に定義されるＦｃγ受容体の抗体結合ドメインを含む新規なキメラ融合タンパク質、及びこれらの融合タンパク質を安定的に発現する細胞株に関する。
【００３７】
第１の態様では、キメラ融合タンパク質に使用されるＦｃγ受容体の抗体結合ドメインは、Ｆｃγ受容体の抗体結合ドメイン及び膜貫通ドメインの両方を含む。好適なＦｃγ受容体の抗体結合ドメイン／膜貫通ドメインとして、限定されないが、配列番号１に示されるマウスＦｃγＲＩの抗体結合ドメイン／膜貫通ドメイン（アミノ酸２８７〜３１９は予測される膜貫通ドメインに相当する）、及び配列番号２に示されるマウスＦｃγＲＩＩＩの抗体結合ドメイン／膜貫通ドメイン（アミノ酸２０８〜２３３は予測される膜貫通ドメインに相当する）が挙げられる。
【００３８】
第２の態様では、キメラ融合タンパク質に使用されるＦｃγ受容体の抗体結合ドメインは、膜貫通ドメインを欠き、例えば、融合タンパク質の膜貫通ドメインは代替的な起源に由来する。キメラ融合タンパク質に使用され得る膜貫通ドメインを欠く好適なＦｃγ受容体の抗体結合ドメインとして、限定されないが、配列番号３に示されるマウスＦｃγＲＩの抗体結合ドメイン、及び配列番号４に示されるマウスＦｃγＲＩＩＩの抗体結合ドメインが挙げられる。
【００３９】
シグナル伝達ドメイン
本発明のキメラ融合タンパク質は、それらのカルボキシ末端において、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。好適なシグナル伝達ドメインは、他の状況において細胞の活性化を誘導することが知られているものを含む。例えば、Ｂ細胞は、生得的に、膜貫通型タンパク質ＣＤ７９との複合体の形成によって抗原のＢ細胞受容体（ＢＣＲ）結合を変換する。ＣＤ７９は、Ｂ細胞の表面でヘテロダイマーを形成する２つの異なる鎖、すなわち免疫グロブリン−アルファ（Ｉｇα）及び免疫グロブリン−ベータ（Ｉｇβ）で構成される。Ｉｇα及びＩｇβは、細胞外ドメイン、単一の膜貫通ドメイン及び細胞質シグナル伝達ドメインを有する。Ｉｇα又はＩｇβの細胞内シグナル伝達領域のいずれかに融合されたＣＤ８タンパク質の細胞外領域及び膜貫通領域を有する融合タンパク質は、シグナル伝達能力を有することが実証されている［５］。他の研究によって、プロテインキナーゼがＣＤ８／Ｉｇα融合タンパク質のより強力な活性化因子であることが実証されている。同じ研究から、ＣＤ８架橋後にＣＤ８／Ｉｇα融合タンパク質によるＣａ２＋シグナル伝達を観察することができたことが更に実証された。これらの研究に基づき、一態様では、本発明の融合タンパク質は、Ｉｇαの細胞質シグナル伝達ドメインに融合された抗体結合ドメインを含む［６］。
【００４０】
したがって、第１の態様では、本発明のキメラ融合タンパク質に使用され得るシグナル伝達ドメインとして、限定されないが、配列番号５に示されるマウスＩｇαのシグナル伝達ドメインが挙げられる。
【００４１】
融合タンパク質と抗体との間の結合親和性が相当変動的となり得ることから、融合タンパク質及び抗体に使用される抗体結合ドメイン及び抗体のアイデンティティー（identity）に応じて、抗体に対する融合タンパク質の結合力（avidity）に更に微妙な差異を提供することができる代替的なシグナル伝達ドメインを有することが重要である。例えば、シグナル伝達ドメインは、架橋及び二量体化を補助し得る。２つの抗体結合ドメインを接近して置くことは、最大の架橋可能性を増加させると考えられる。抗体結合ドメインがシグナル伝達ドメインとして修飾された膜関連ＩｇＧ分子に連結される場合、２つの抗体結合ドメインの接近を達成することができる。したがって、第２の態様では、シグナル伝達ドメインは、ヒンジ領域に続いてＣＨ２、ＣＨ３、ＩｇＧ抗体の膜貫通領域及び細胞内領域を含む部分的な膜Ｉｇペプチドである（図１の融合タンパク質Ｃ及びタンパク質Ｄを参照されたい）。具体的な例では、かかるシグナル伝達ドメインは、配列番号６に示される。このシグナル伝達ドメインが膜貫通領域を含むことから、配列番号３に示されるＦｃγＲＩの抗体結合ドメイン、又は配列番号４に示されるＦｃγＲＩＩＩの抗体結合ドメイン等の膜貫通ドメインを欠く抗体結合ドメインとあわせて使用され得る。
【００４２】
キメラ融合タンパク質
抗体結合ドメインとシグナル伝達ドメインとの異なる組み合わせの使用により、特定の抗体に対する融合タンパク質の親和性を調整することができ、また細胞活性化のレベルを制御することができることは明らかであろう。本発明の範囲に含まれるキメラ融合タンパク質の具体例として、表１に提供されるものが挙げられる。６個の各融合タンパク質が図１に表される。
【００４３】
【表１】
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【００４４】
したがって本発明は、配列番号８に示されるＦｃγＲＩ／Ｉｇα融合タンパク質、配列番号１０に示されるＦｃγＲＩＩＩ／Ｉｇα融合タンパク質、配列番号２２に示されるＦｃγＲＩ／膜Ｉｇ融合タンパク質、及び配列番号２３に示されるＦｃγＲＩＩＩ／膜Ｉｇ融合タンパク質を含む。
【００４５】
異なる抗体結合ドメインは異なるシグナル伝達ドメインと一対となり得ることから、本発明はまた、配列番号１又は配列番号３に示されるＦｃγＲＩの抗体結合ドメインを含む融合タンパク質、及び配列番号２又は配列番号４に示されるＦｃγＲＩＩＩの抗体結合ドメインを含む融合タンパク質を含むことが理解される。同様に、本発明は、配列番号５に示されるＩｇαのシグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質、及び配列番号６に示される膜Ｉｇのシグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質を含む。
【００４６】
タンパク質の結合又はシグナル伝達の活性に影響を及ぼすことなく、小さな変更を本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列に行うことができることが当業者に容易に理解される。例えば、融合タンパク質の結合活性を維持しながら、小さな変更を融合タンパク質の抗体結合ドメインに行うことができる。同様に、融合タンパク質のシグナル伝達活性を維持しながら、小さな変更を融合タンパク質のシグナル伝達ドメインに行うことができる。さらに、融合タンパク質の結合及びシグナル伝達の活性を維持しながら、小さな変更を融合タンパク質の抗体結合ドメイン及びシグナル伝達ドメインの両方に行うことができる。幾つかの例では、特定の結合親和性（例えば低、中、又は高）が好ましい場合があることから、かかる小さな変更を抗体に対する抗体結合ドメインの親和性を変更するために使用することができる。同様に、幾つかの例では、細胞の活性化の特定のタイプ又はレベル（例えば低、中、又は高）が好ましい場合があることから、かかる小さな変更を細胞のシグナル伝達ドメインのシグナル伝達活性を変更するために使用することができる。
【００４７】
したがって、本発明は、１以上のアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換を有し、また元の融合タンパク質の結合及びシグナル伝達の活性を保持する、本明細書に開示される融合タンパク質の配列変異体を含む。特に、本発明は、配列番号８、配列番号１０、配列番号２２、又は配列番号２３に示されるアミノ酸配列の全長に対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列変異体を含む。
【００４８】
また、本発明は、ＦｃγＲＩの抗体結合ドメインを含む配列変異体を含み、ここで、該ドメインは、アミノ酸配列の全長に対して、配列番号１又は配列番号３と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。
【００４９】
また、本発明は、ＦｃγＲＩＩＩの抗体結合ドメインを含む配列変異体を含み、ここで、該ドメインは、アミノ酸配列の全長に対して、配列番号２又は配列番号４と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。
【００５０】
さらに、本発明は、Ｉｇαのシグナル伝達ドメインを含む配列変異体を含み、ここで、該ドメインは、アミノ酸配列の全長に対して、配列番号５と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。
【００５１】
さらに、本発明は、膜Ｉｇのシグナル伝達ドメインを含む配列変異体を含み、ここで、該ドメインは、アミノ酸配列の全長に対して、配列番号６と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。
【００５２】
ポリヌクレオチド
本発明は、本明細書において提供される融合タンパク質の各々をコードするヌクレオチド配列、また同様にそれらの相補鎖を含むポリヌクレオチドを含む。また、本発明は、ポリヌクレオチドを含むクローニングベクター、及びポリヌクレオチド又は発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を含む。かかる宿主細胞は、哺乳動物の細胞、又は限定されないがＥ．コリ（E. coli）及び昆虫細胞を含む非哺乳動物の細胞であってもよい。本発明は、ポリヌクレオチド及び発現ベクターによってコードされる融合タンパク質の発現を促進する条件下で宿主細胞を培養することと、細胞又は細胞培養物から融合タンパク質を回収することとを含む、本明細書に定義される融合タンパク質を産生する方法を更に含む。
【００５３】
融合タンパク質をコードするコンストラクト
齧歯類のＦｃγＲＩ（配列番号１５）及びＦｃγＲＩＩＩ（配列番号１６）に対する配列は、クローニングされ、確認されている。抗体結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及びシグナル伝達ドメインをコードする配列を発現ベクターへと操作することによって融合タンパク質の発現に対してキメラ融合タンパク質をコードする核酸コンストラクトを作製してもよい。例えば、ＦｃγＲ受容体の抗体結合ドメイン及び膜貫通ドメインを、例えば、ＰＣＲを使用する「ＳＯＥｉｎｇ」によって、シグナル伝達ドメインをコードする配列とインフレームで融合してもよい［１５］。ＦｃＲ−γ鎖が必要な場合に（以下で検討される）コンストラクトを完成させるため、シグナル伝達ドメインのＣ末端及びＦｃＲ−γ鎖のＮ末端は、ＰＣＲによって２Ａペプチドをコードする配列に付着される。ＦｃγＲ−膜Ｉｇコンストラクトの構築のため、ＦｃγＲ配列のＣ末端の制限酵素部位を、Ｎ末端において適合する制限酵素部位を含むＩｇ定常領域に連結させるため使用してもよい。
【００５４】
本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドコンストラクトは、選択された細胞株において一過性に又は安定的に発現されてもよい。該コンストラクトを、限定されないが、標準的なトランスフェクションキット（例えば、Ｆｕｇｅｎｅ（商標）又はＮｅｏｎ（商標）システムエレクトロポレーション）又はレトロウイルス形質導入法を含む、当業者によく知られている技術を使用して選択された細胞株へとトランスフェクトすることができる。
【００５５】
また、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩのいずれかに対する蛍光標識抗体による染色、及びフローサイトメトリーを使用する分析を含む、当業者によく知られている標準的な技術を使用して、細胞表面での融合タンパク質の発現を確認することができる。
【００５６】
好適な発現ベクターとして、限定されないが、プラスミドｐｃＤＮＡ  ３．１＋又は−（ｈｙｇｒｏ）、ｐｃＤＮＡ３．１＋又は−（ネオマイシン）、ｐｄｉｓｐｌａｙ（Ｐｕｒｏ）、ｐＩＲＥＳ（ネオマイシン）、ｐＩＲＥＳ  Ｐｕｒｏ２、ｐＱＣＸＩＰ（ｐｕｒｏ）、ｐＱＣＸＩＮ（ネオマイシン）、及びｐＱＣＸＩＨ（ｈｙｇｒｏ）が挙げられる。
【００５７】
発現ベクターは１つの連続配列に融合タンパク質及びＦｃＲγ鎖を共にコードすることができるため、コーディング配列は単一のプロモーターの制御下にあってもよい。代替的には、発現ベクターは、別々のプロモーターの制御下で、融合タンパク質及びＦｃＲγ鎖をコードしてもよい。
【００５８】
細胞
本発明の融合タンパク質を発現するため使用され、したがって本発明のバイオセンサー細胞として役立つ可能性のある細胞株は、膜内在性タンパク質として細胞表面に該融合タンパク質を安定的に発現することができるという点、及びシグナル伝達ドメインの活性化を検出することができるという点でのみ制限される。好適な細胞株として、限定されないが、リンパ細胞及び非リンパ細胞が挙げられる。
【００５９】
したがって、本発明は、表面に本明細書に定義される１以上の融合タンパク質を安定的に発現する細胞を含む。幾つかの例では、これらの細胞は、本明細書において「バイオセンサー細胞」と名付けられる。特定の実施形態では、本発明は、配列番号８に示されるＦｃγＲＩ／Ｉｇα融合タンパク質、配列番号１０に示されるＦｃγＲＩＩＩ／Ｉｇα融合タンパク質、配列番号２２に示されるＦｃγＲＩ／膜Ｉｇ融合タンパク質、配列番号２３に示されるＦｃγＲＩＩＩ／膜Ｉｇ融合タンパク質、及び配列番号８、配列番号１０、配列番号２２、又は配列番号２３の全長に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体の１以上（正：one or more）を表面に安定的に発現するバイオセンサー細胞を含む。上記バイオセンサー細胞を作製するために使用される細胞は、本明細書に定義される細胞のいずれであってもよい。
【００６０】
リンパ細胞
ＣＤ８／Ｉｇα融合タンパク質を発現するリンパ細胞は、抗ＣＤ８抗体との架橋が、Ｂ細胞及びＴ細胞の両方における細胞内Ｃａ２＋の放出、及びＩｇαのリン酸化を刺激することを実証するため使用されてきた［５、６、１０］。通常、内因性Ｉｇα／Ｉｇβ経路を使用してシグナル伝達を行う、マウス及びヒトのＢ細胞株は、本明細書に記載される融合タンパク質の発現に特に有用である。バイオセンサー細胞の産生に使用され得る好適なＢ細胞株として、限定されないが、Ｒａｍｏｓ細胞株、Ｒａｊｉ細胞株、ＩＩＡＩ．６細胞株、及びＣ６０４細胞株が挙げられる。他の好適なＢ細胞株としてＡ２０及びＬＫ３５．２が挙げられる。
【００６１】
本発明の融合タンパク質のいずれかをコードするコンストラクトの適切な発現は、蛍光標識抗体及びフローサイトメトリーを使用して確認され得る。後の研究のため、限界希釈を使用して細胞をクローニングし、それらのフローサイトメトリー発現プロファイルに基づいて選択してもよい。
【００６２】
Ｂ細胞株にはＦｃγＩＩｂ抑制性受容体を発現するものもあれば、Ｒａｍｏｓ、及びＩＩＡ１．６のＢ細胞のように、それらの細胞表面に該タンパク質を発現しないものもある［１１、１２］。ＦｃγＩＩｂ受容体の抑制活性が特定の細胞株において問題である場合、ｓｉＲＮＡコンストラクトを使用して、細胞においてＦｃγＲＩＩｂの発現を安定的に阻害すること［１３］、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して、これらの細胞株においてＦｃγＲＩＩｂ遺伝子をノックアウトすることができる［１４］。
【００６３】
抗ＣＤ８抗体との架橋の後、Ｉｇαシグナル伝達ドメインに融合されたＣＤ８発現Ｔ細胞は、Ｃａ２＋を放出し［５］、これは、Ｔ細胞におけるシグナル伝達機構もまたＩｇαによって作動可能であることを示す。したがって、本発明の融合タンパク質は、マウス又はヒトのＴ細胞においても発現され得る。バイオセンサー細胞の産生に使用され得る好適なＴ細胞株として、限定されないが、Ｊｕｒｋａｔ細胞株、ＤＯ−１１．１０細胞株、及びＢＷ５１４７細胞株が挙げられる。また、融合タンパク質を発現する、単球（例えばＵ９３７細胞株）、マクロファージ、筋芽細胞（例えばＫＧ！細胞株）、及び赤芽球（例えばＫ５６２細胞株）を、バイオセンサー細胞として使用してもよい。これらの細胞が本来ＦｃγＲを発現しないことから、抑制性ＦｃγＲＩＩｂによって引き起こされる阻害はないであろう。また、フローサイトメトリーを使用し、ＦｃγＲに対して蛍光標識されたｍＡｂを使用して、適切な発現を判定することができる。
【００６４】
非リンパ細胞
ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、Ｐ８１５細胞、Ｋ５６２細胞及びＣｏｓ−１細胞等の選択されたタンパク質の細胞表面発現に関するアッセイで一般に使用される、樹立されて十分に特性評価された多数の非リンパ細胞株が存在する。これらの細胞株は、これらの細胞において安定した発現を確立するのが容易であり、明確な成長特性を有することから、外来タンパク質を発現するために慣例的に使用される。しかしながら、非リンパ細胞は、Ｆｃγ受容体発現細胞で発現される二次タンパク質であるＦｃＲガンマ鎖（ＦｃＲγ鎖）を発現することができない。ＦｃＲγ鎖は、Ｆｃγ受容体シグナル伝達に必要である［７］。非リンパ細胞は、ＦｃＲ−γ鎖を発現しないが、かかる細胞はなおも融合タンパク質発現に対する優れた候補としてはたらき、ＦｃＲ−γ鎖を共発現するように操作される場合、本発明のバイオセンサー細胞として使用することができる。
【００６５】
非リンパ細胞を、当業者によく知られている技術によってＦｃＲ−γ鎖を発現するように操作することができる。簡便な１つの技術は、本発明の融合タンパク質をコードするコンストラクト上にＦｃＲ−γ鎖をコードする遺伝子を含むことであり、ここでは２つのコーディング配列が同じ又は別々のプロモーターの制御下にある。別の簡便な技術は、融合タンパク質及びＦｃＲ−γ鎖の発現を同じプロモーターの制御下に置くことである。特に、２つの追加要素が、融合タンパク質をコードするコンストラクトに付加され得る。第１の要素は、ＦｃＲ−γ鎖それ自体（配列番号２５）である。ＦｃＲ−γ鎖は、細胞膜中の正確な確認を採用できることが必要であるため、融合タンパク質の一部とはなり得ない。第２の要素は、口蹄疫ウイルスにおいて最初に記載された容易に切断可能なペプチドである操作された２Ａペプチドであることから、この問題に対処する［８］。試験した種々様々な細胞においてより効率的に切断するブタのテッショウウイルス（Teschovirus）で発見された本来の２Ａペプチドの変異体［９］を本明細書で使用する（配列番号２４）。したがって、ＦｃＲ−γ鎖は、本発明の融合タンパク質をコードするコンストラクトを、シグナル伝達ドメインのＣ末端に２Ａペプチド配列、続いてＦｃＲ−γ鎖を含むように操作することによって非リンパ細胞に対して提供され得る（図１のコンストラクトＥ及びコンストラクトＦを参照されたい）。
【００６６】
本発明のバイオセンサー細胞の産生に使用され得る非リンパ細胞株として、限定されないが、ＨＥＫ２９３細胞株、ＣＨＯ細胞株、Ｐ８１５細胞株、Ｋ５６２細胞株、及びＣｏｓ−１細胞株が挙げられる。
【００６７】
抗体
本明細書における考察から明らかなように、標的物質の検出において本発明のバイオセンサー細胞と共に使用され得る抗体のアイデンティティーは、（ｉ）抗体が本発明の融合タンパク質によって結合され得る点、及び（ｉｉ）抗体が標的物質に結合可能である点においてのみ制限される。一旦特定の標的物質が検出のため選択されれば、該物質に対して結合特異性を有する抗体が商業的に入手可能かどうかを容易に判断することができる。入手可能でない場合は、必要とされる結合特異性を有する抗体を日常的な方法を使用して作製することができる。
【００６８】
明らかなように、抗体はモノクローナルであってもよくポリクローナルであってもよい。抗体は組み換え体であってもよい。また、好適な抗体として、限定されないが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、及び一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体等の元となる抗体の結合特異性を保持するフラグメントが挙げられる。
【００６９】
上記抗体は、限定されないが、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ）、金属（例えば、電子顕微鏡用途に対する金）、蛍光マーカー（例えば、ＣＹＥ色素、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン（正：phycoerythrin）、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド（正：phthalaldehyde）及びフルオレサミンを含む免疫蛍光法及びフローサイトメトリーの用途に対する）、蛍光発光金属（例えば１５２Ｅｕ）、放射性マーカー（例えば３Ｈ、１３１Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ及び１２５Ｉを含む診断目的用放射性同位元素）、化学発光マーカー（例えばルミノール、ルシフェリン、イソルミノール、セロマティック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステル）及び、タンパク質タグ（例えばビオチン、フィコビリタンパク質、ｃ−Ｍｙｃ、ＨＡ、ＶＳＶ−Ｇ、ＨＳＶ、ＦＬＡＧ、Ｖ５又はＨＩＳ）を含む検出可能な標識に複合体化されてもよい。
【００７０】
また、抗体は、標的物質に曝露された後に試料からの抗体の単離／分離に使用することができる部分に対して複合体化されてもよく、又はそれに被覆されてもよい。かかる部分として、限定されないが、様々な直径の磁気ビーズ、アガロースビーズ、及びポリスチレンビーズが挙げられる。
【００７１】
試料
標的物質の存在についてスクリーニングされ得る試料は、抗体による試料中に存在する標的物質の結合を可能とするという点においてのみ同様に制限される。好適な試料として、限定されないが、空気試料、液体試料、乾燥試料、野菜試料、及び生体試料が挙げられる。好適な空気試料として、限定されないが、エアロゾル、大気試料、人工呼吸器排出物、及びエンジン排気が挙げられる。好適な液体試料として、限定されないが、食品、飲料、水試料、医薬製剤、及びパーソナルケア製品が挙げられる。好適な乾燥試料として、限定されないが、食物、土壌、医薬製剤、可溶化スワブ試料、及びパーソナルケア製品が挙げられる。好適な野菜試料として、限定されないが、葉、果実、ナッツ、種子、花及び植物組織が挙げられる。好適な生体試料として、限定されないが、血液、血清、汗、尿、脳脊髄液、粘液、精液、便、気管支肺胞洗浄液、及び組織が挙げられる。
【００７２】
物質
本発明のバイオセンサーを使用して、多様な異なる標的物質を検出することができる。当業者に明らかなように、標的物質に対する唯一の制限は、抗体による該物質の結合が可能でなくてはならないことである。標的物質は、限定されないが、生物兵器物質、アレルゲン、寄生虫抗原、真菌抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、細胞性抗原、及び抗体等の生物学的な起源のものが挙げられる。例示的な生物兵器物質として、限定されないが、リシン、炭疽菌芽胞、ボツリヌス毒素、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens：ウェルシュ菌）毒素、サキシトキシン、及びトリコテシン・マイコトキシンが挙げられる。例示的なアレルゲンとして、限定されないが、ツリーナッツ（tree nuts）、ピーナッツ及び動物のフケが挙げられる。例示的な細胞性抗原として、限定されないが、ヒト、霊長動物、又は限定されないが、家畜又はイヌ若しくはネコ等のコンパニオン動物等の他の哺乳動物等の被験体における疾患又は病状に関連する抗原が挙げられる。また、標的物質は、植物及び作物の物質、水生病原体、又は、病因物質、薬物及び他の化学物質、並びに限定されないが毒素及び汚染物質等の環境に見られる分子を含む。
【００７３】
細胞活性化の検出
本発明のバイオセンサー細胞を、試料中の標的物質を検出するため、場合によっては定量するためのアッセイにおいて使用することができる。上に記載されるように、抗体による該物質の結合により、またバイオセンサー細胞によって発現される融合タンパク質による抗体結合によって、細胞表面で架橋が生じ、融合タンパク質のシグナル伝達ドメインが細胞内の活性化シグナルとして結合を伝達する。例として、抗原を含む試料がバイオセンサーの細胞外表面の抗体と相互作用する場合、細胞内シグナル伝達カスケードが活性化される。
【００７４】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、Ｂ細胞の抗原受容体（膜結合型Ｉｇ）は、Ｉｇα及びＩｇβのタンパク質のジスルフィド結合膜貫通ヘテロダイマーに非共有結合的に会合される［１６］。抗原結合によるＢ細胞受容体の架橋の後、Ｉｇα及びＩｇβを含む幾つかのタンパク質は、プロテインキナーゼによってチロシン残基に対してリン酸化される［１７、１８］。リン酸化後の最初の下流の出来事のうちの１つは、細胞内貯蔵からのＣａ２＋放出に続く、細胞膜中のＣａ２＋チャネルを通る外因性Ｃａ２＋の流入である［１９］。細胞内のカルシウムレベルのかかる変化は、本明細書において意図される、アッセイ可能な細胞活性化の一種である。細胞内Ｃａ２＋レベルの変化は、細胞内に効率的に充填することが可能な様々な化学的蛍光化合物によって、細胞において容易に検出され得る。
【００７５】
生物学におけるＣａ２＋の重要性により、細胞のＣａ２＋活性を分析するために多数の技術が確立されており、本発明のバイオセンサー細胞における細胞活性化のアッセイに使用され得る。一般的な方法は、他のタイプの指標（indicator：指示薬）と比較して、それらのシグナルが細胞内Ｃａ２＋濃度の所与の変化に対して非常に大きいことから、蛍光化学Ｃａ２＋指標プローブの使用である［２０］。例えば、細胞活性化は、生細胞内部のＣａ２＋濃度を測定するため使用される感受性非レシオメトリック（non-ratiometric）化合物である、Ｆｌｕｏ−４のメチルエステルであるＦｌｕｏ−４ＡＭでバイオセンサー細胞をロードすることにより、本発明のバイオセンサー細胞においてモニター及びアッセイされてもよい［２１］。大半の化学的蛍光指標は、膜透過性ではない。しかしながら、Ｆｌｕｏ−４のメチルエステル形態は、受動的に原形質膜を横切って拡散することができ、一旦細胞内に入ると、細胞内エステラーゼはプローブからメチルエステル基を切断して膜不透性プローブをもたらす。本発明の細胞との使用に対する別のプローブの選択肢は、レシオメトリックなＣａ２＋測定を可能とするＵＶ励起Ｃａ２＋指標である、Ｆｕｒａ  ２である。抗体による標的物質の結合によって、Ｃａ２＋レベルの顕著な変化を引き起こすシグナルがバイオセンサー細胞のシグナル伝達ドメインへと伝達され、これを細胞蛍光の変化を測定するための分光計を使用してアッセイされ及び／又は定量することができる。
【００７６】
また、Ｃａ２＋結合発光タンパク質は、生物学的プロセスに由来する光の産生である生物発光を生成することができる。いくつかのＣａ２＋結合発光タンパク質（例えば、イクオリン、オベリン、マイトロコミン及びクライティン）が細胞内のＣａ２＋濃度を測定するために使用され［２４］、細胞の活性化の変化をアッセイするためにそれらの各々を本発明のバイオセンサー細胞と共に使用してもよい。Ｃａ２＋結合によるこれらの発光タンパク質の発光は可視スペクトルにあり、器具の使用又は検出の点から簡易であり、光退色によって影響されない。
【００７７】
標的物質の結合（すなわち、細胞活性化）は細胞におけるＣａ２＋レベルの変化を測定することに基づいて本明細書に例示されるが、発光タンパク質を使用する発光を含む、他の手段を標的物質結合の変化をアッセイするために使用することができることに留意されたい。
【実施例】
【００７８】
ＩＩＩ．実施例
実施例１：融合タンパク質をコードするコンストラクトの産生及び発現
商業的に入手可能な齧歯類ＦｃγＲＩ及びＩｇαのｃＤＮＡを得た。２つの遺伝子の重複配列を提供するＰＣＲプライマーを使用して２つの配列をつなぎ合わせて、配列分析によって確認されたフレーム融合のＦｃγＲＩ／Ｉｇαを生じた。代替的には、ＦｃγＲＩの抗体結合ドメイン及び／又は膜貫通ドメインを、受容体をコードするｃＤＮＡに由来するプライマーを用いて増幅し、またＩｇαの細胞内シグナル伝達ドメインを同様に増幅する。
【００７９】
増幅フラグメントをゲル精製する。増幅産物（例えばＦｃγＲＩ及びＩｇα）を混合し、５分間沸騰させることにより変性させ、増幅前に３０分間室温において、全長融合タンパク質をコードする配列を作製した。これらの配列をゲル精製し、好適なプロモーターを含む発現ベクター（例えば、哺乳動物細胞においてｃＤＮＡを発現するためのプラスミド）へクローニングし、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＸ又は他の好適なトランスフェクション試薬を使用して、選択された細胞株へとトランスフェクトし、好適な選択マーカーを使用して選択した。個々のクローンをシーケンシングして、適切な融合タンパク質が発現されていることを確認した。融合タンパク質の適切な表面発現は、標識化抗Ｆｃ受容体抗体（例えば抗ＣＤ６４抗体染色）及びフローサイトメトリーを使用して判定される。ＦｃγＲＩ−Ｉｇα融合タンパク質をコードする例示的なコンストラクトは、５’から３’の方向にＦｃγＲＩの抗体結合ドメイン及び膜貫通ドメイン（配列番号１９）をコードし、Ｉｇαシグナル伝達ドメインをコードする配列（配列番号２１）をコードするものである。
【００８０】
ＦｃγＲＩＩＩ−Ｉｇα融合タンパク質をコードする別の例示的なコンストラクトは、５’から３’の方向にＦｃγＲＩＩＩの抗体結合ドメイン及び膜貫通ドメイン（配列番号２０）をコードし、Ｉｇα細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列（配列番号２１）をコードするものである。２つの遺伝子のオーバーラップを提供する、商業的に得られる齧歯類ＦｃγＲＩＩＩ  ｃＤＮＡ及びＩｇα  ｃＤＮＡのＰＣＲプライマーを使用して、２つの配列をつなぎ合わせた。生成物は、配列分析によって確認されたフレーム融合のＦｃγＲＩＩＩ／Ｉｇαをもたらした。
【００８１】
代替的なアプローチを使用して、図１においてＥ及びＦとして示されるコンストラクトを産生するため２Ａペプチド及びＦｃＲ−γ鎖と共に、ＦｃγＲ受容体を入れた。オーバーラップ伸長によるＰＣＲ増幅を使用して２Ａ配列をＦｃＲ−γ鎖と融合させ、制限酵素部位を２Ａ及びＦｃＲγ鎖のｃＤＮＡの末端に配置した。ＰＣＲを使用し、ＦｃγＲを２Ａ部位に連結するため、また後の発現ベクター中へのクローニングのために使用され得る、それらの末端に制限酵素部位を含むプライマーを用いて、ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩの両方のｃＤＮＡを増幅した。ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化し、ゲルから生成物を溶出させた。フラグメントを連結して発現ベクターへクローニングし、配列決定した。
【００８２】
以下の実施例は、本発明のユニバーサルバイオセンサー細胞を実際に使用することができる幾つかの例を提供する。これらの実施例は、上記バイオセンサーを利用することができる可能性のある方法のごく一部に過ぎない。上記バイオセンサーを、単一ウェルの又は複数ウェルのアッセイフォーマットに容易に適合させることができる。細胞株、コンストラクト及びＣａ２＋指標の組み合わせは、調査されている物質、抗原又は病原体、及び抗体アイソタイプの有効性に応じて変化可能であり、経験的に決定されなければならない場合もあることに留意されたい。
【００８３】
実施例２：葉及び根の試料に由来する植物ウイルスの検出
植物病原体は、感染、並びに結果的な食物及び飼料の収穫高の損失が経済及び食糧安全保障に影響を与えることから、ウイルス性であるか細菌性であるかにかかわらず、非常に重要である。したがって、作物の管理及び輸入作物のモニタリングを支援するために植物病原体を明らかにすることと同様に、定期的に検出することができるアッセイを整備することが重要である。農場における国内作物の試験を記載する。
【００８４】
葉又は根の試料を疑わしい植物から収集する。試料に含まれる任意のウイルス粒子を放出するため、試料を完全に粉砕する。その後、ウイルス粒子（すなわち、標的物質）を捕捉するため、商業的に入手可能なウイルス特異抗体で被覆された磁気ビーズを、試料マトリクスと混合する。ビーズを植物試料から磁気的に分離し、十分に洗浄し、本発明のユニバーサルバイオセンサー細胞とインキュベートすることができる。
【００８５】
また、例えば、ＦｃＲ−γ鎖をコードするコンストラクトからＦｃγＲＩ／Ｉｇα又はＦｃγＲＩＩＩ／Ｉｇαの融合タンパク質のいずれかを発現するＲａｍｏｓ  Ｂ細胞（すなわち、図１のコンストラクトＥ及びコンストラクトＦ）を使用してもよい。選択されたバイオセンサー細胞を高密度（およそ１０６細胞／ｍＬ）まで生育させ、成長培地をフェノールレッド不含浸透圧平衡塩溶液（すなわち、ＨＢＳＳ、ＰＢＳ）で置き換える。細胞をプロベネシド（およそ１ｍＭ〜２．５ｍＭ）の存在下でＦｌｕｏ−４  ＡＭ溶液（およそ２μＭ〜９μＭ）中、およそ３０分間〜６０分間に亘りロードする。細胞から漏出する指標を最小限にするためにプロベネシドを使用する。細胞を十分に洗浄して残留するＣａ２＋指標を除去する。プロベネシドを含む少量のＨＢＳＳ中の約１×１０６〜５×１０６のＦｌｕｏ−４  ＡＭをロードした細胞を、暗部の（with dark sides）９６ウェルプレートの複数のウェルに移す。その後、該細胞を含むプレートを蛍光プレートリーダーに挿入する。
【００８６】
ロードした細胞を含む幾つかのウェルを短時間５３５ｎｍで光学的に測定して、ベースラインバックグラウンド蛍光レベルを確立する。細胞にＦｌｕｏ−４  ＡＭがロードされることを確実にするため、それらのウェルに薬学的化合物（すなわち、およそ１００μＭ〜２００μＭのＡＴＰ、およそ３０μＭ〜６０μＭのカルバコール、又はおよそ０．１μＭ〜２μＭのイオノマイシン）を添加して、細胞内Ｃａ２＋レベルの増加を促進する。架橋二次抗体とのＦｃγＲ抗体の使用等の他の対照を使用して、同様に指標ローディングを確認する。
【００８７】
Ｆｌｕｏ−４ローディングを確認した後、ロードした細胞を含むウェルを商業的に入手可能なウイルス特異抗体（使用するコンストラクトと適合し、理想的には捕捉ビーズに使用されるものとは異なるアイソタイプ）と共におよそ３０分間〜６０分間インキュベートする。その後、ウイルスで被覆された捕捉ビーズの希釈系列を細胞に添加し、数分間の間、蛍光変化を測定する。また、シグナルの特異性を確実にするため、陽性対照（規定のウイルス含有溶液の添加）及び陰性対照（ウイルスを含まない同様の溶液の添加、又は交差反応しない無関係の抗原の溶液の添加）の両方と共に細胞を試験する。細胞蛍光の増加は、選択されたウイルスが試料中に存在することを示す。幾つかの例では、細胞蛍光の変化量は試料中に存在する選択されたウイルス量と相関するため、試料中のウイルス量の定量を可能となる。
【００８８】
実施例３：スワブ試料からのサルモネラの検出
サルモネラ属の一種は、最も一般的な食品媒介病原体のうちの１つであり、幼い子供、老人及びその他免疫系が弱った者において重篤で、時に致命的なサルモネラ症疾患を引き起こす場合がある。サルモネラ汚染が感染した動物又はヒトの糞便との接触から生じることから、幅広い食品が、生産される卵及び肉から、また水さえからも汚染される可能性がある。現在のサルモネラ検出法として、時間がかかり、専門知識を必要とするＰＣＲ又は細菌培養が挙げられる。したがって、単純で迅速な検出アッセイが、大発生及び製品回収を予防するための食品の品質モニタリングに望ましい。鶏卵加工施設におけるサルモネラに対する試験を記載する。
【００８９】
施設内の作業面及び卵殻の外表面からスワブ試料を採取する。その後、ユニバーサルバイオセンサーによって直接試験が可能な試料マトリックスへとサルモネラを抽出するため、スワブを生体適合性の溶液に浸漬する。本実施例において、ＦｃγＲＩ／膜Ｉｇ又はＦｃγＲＩＩＩ／膜Ｉｇの融合タンパク質（図１のコンストラクトＣ及びコンストラクトＤを参照されたい）を発現するＣ６０４  Ｂ細胞が、本発明のバイオセンサー細胞として使用される。Ｂ細胞であるＣ６０４細胞は、シグナル伝達能力を提供するための内因性のＩｇα及びＩｇβを有する。
【００９０】
Ｃ６０４細胞を高密度（およそ１０６細胞／ｍＬ）まで生育し、培地をフェノールレッド不含ＨＢＳＳで置き換える。プロベネシド（およそ１ｍＭ〜２．５ｍＭ）の存在下、Ｆｌｕｏ−４  ＡＭ溶液（およそ１μＭ〜５μＭ）において、およそ３０分間〜６０分間に亘り細胞をロードする。残留Ｃａ２＋指標を除くため、細胞を十分に洗浄する。プロベネシドを含む少量のＨＢＳＳ中の１×１０６〜５×１０６のＦｌｕｏ−４をロードした細胞を９６ウェルプレートの複数のウェルに移す。プレートを蛍光プレートリーダーに挿入し、ベースラインバックグラウンド蛍光を確立する。陽性対照として、Ｃａ２＋応答を刺激するため抗マウスＩｇＭ（およそ５ｎｇ／μＬ〜７ｎｇ／μＬ）を、細胞を含むウェルのサブセットに添加する。ローディングを確認するために他の対照を使用する（二次クロスリンカー抗体との抗ＦｃγＲＩ抗体の使用等）。
【００９１】
商業的に入手可能な（ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩと適合するアイソタイプの）抗サルモネラ抗体を３０分間〜６０分間に亘り細胞と共にインキュベートする。その後、サルモネラを含む試料の希釈系列を細胞に添加し、蛍光の変化を１分間〜２分間の間測定する。また、細胞をシグナルの特異性を確実にするために陽性対照及び陰性対照の両方で試験する。細胞蛍光の増加は、試料中のサルモネラの存在を示す。幾つかの例では、細胞蛍光の変化量は、試料の中に存在するサルモネラ量と相関するため、試料中のサルモネラ量の定量を可能にする。
【００９２】
実施例４：食品サンプルからのリステリアの検出
リステリア（すなわち、Ｌ．モノサイトゲネス）は、およその２０％の致死率を伴う重篤な細菌性疾患であるリステリア症の病因物質であり、妊婦、乳児及び免疫系の弱った者に最も危険な食品媒介病原体である。リステリアは生食肉製品（正：product）及び乳製品、並びに加工調理済み食品を汚染する場合がある。したがって、細菌を検出し、その存在をモニターする能力は、病原体の大発生及び製品回収を予防するために望ましい。すぐに食べられる食品（すなわち、デリ・ミート（deli meat）及びホットドッグ）を生産する食肉加工工場におけるリステリアの検出に対するユニバーサルバイオセンサー細胞の使用が記載される。
【００９３】
実施例３に同様に記載されるように、製品の汚染可能性をモニターし、汚染除去手順の有効性を評価するため、工場の作業表面及び設備を食肉加工の前、その最中及びその後に拭き取る。追加的に、加工肉の試料を試験してもよい。試料をＰＢＳ中でホモジナイズし、商業的に入手可能なリステリア特異抗体で被覆された極小磁気ビーズと混合する。ビーズを試料中に存在する任意のリステリアに結合させ、磁気的に試料から分離し、十分に洗浄し、作製したユニバーサルバイオセンサーに添加する。
【００９４】
ＦｃＲ−γ鎖と共に、ＦｃγＲＩ／Ｉｇα又はＦｃγＲＩＩＩ／Ｉｇαの融合タンパク質のいずれかを安定的に発現するＣＯＳ−１細胞及び生物発光タンパク質（bioluminescent photoprotein）であるイクオリンをバイオセンサー細胞として使用し、高密度（およそ１０６細胞／ｍＬ）まで生育させる。５時間〜１６時間に亘り、およそ２μＭ〜８μＭのセレンテラジン（イクオリンに必要な基質）と共に細胞をインキュベートする。十分に洗浄して過剰なセレンテラジンを除去した後、細胞を９６ウェルプレートの複数のウェルに蒔く。その後、３０分間〜６０分間に亘り、商業的に入手可能なリステリア特異抗体（使用されるコンストラクトと適合性のアイソタイプ、及び好ましくは捕捉ビーズに使用されるものとは異なる抗体）と共に細胞をインキュベートする。そのプレートを発光プレートリーダーに挿入し、ベースラインバックグラウンド発光レベルを測定する。セレンテラジンローディングの成功及びＣａ２＋応答性の確認を０．１５μＭ〜１００μＭのＡＴＰの添加によって得る。その後、リステリアで被覆された捕捉ビーズを種々の希釈で細胞に添加し、発光シグナルの変化を１分間〜２分間の間記録する。発光の増加は、試料中のリステリアの存在を示す。幾つかの例では、発光の変化量は試料中に存在するリステリア量と相関するため、試料中のリステリア量の定量を可能とする。
【００９５】
実施例５：空気試料からのＢ．アンスラシス（B. anthracis）芽胞の検出
炭疽菌は、細菌バシラス・アンスラシス（Bacillus anthracis）の芽胞によって引き起こされる急性で致死性の疾患である。自然の土壌細菌は、放牧で育成された動物、また加工処理されていない動物の皮及び毛に由来する感染した肉との接触を通して伝染され得る。最近では、Ｂ．アンスラシスは生物兵器、及びテロ攻撃で使用するために武器化されてきた。この点において、Ｂ．アンスラシス芽胞の確実で迅速な検出は極めて重要である。被検試料は、疑わしい区域をふき取ることにより、又は溶液中での分析のためＰＢＳに疑わしい粉末を直接懸濁することにより得られてもよい。代替的には、エアロゾル試料を疑わしい区域で収集し、また微粒子を表面に濃縮して、ユニバーサルバイオセンサー細胞に曝露してもよい。好適なエアロゾルサンプリング装置（ＢｉｏＦｌａｓｈ  Ｅ）をPathSensors, Inc.から購入する。
【００９６】
本実施例では、ＦｃγＲＩ／Ｉｇα又はＦｃγＲＩＩＩ／Ｉｇαの融合タンパク質及びＦｃＲγ鎖を発現するヒトＴ細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞をバイオセンサー細胞として使用する。３０分間〜６０分間に亘り、Ｉｎｄｏ−１  Ｃａ２＋指標（およそ１μＭ〜５μＭ）で該細胞をロードする。十分に洗浄した後、細胞を商業的に入手可能なＢ．アンスラシス特異抗体（使用されるコンストラクトと適合するアイソタイプ）とインキュベートし、エアロゾルサンプリング機内部のチャンバーに充填した。４０５ｎｍでベースラインバックグラウンド蛍光を確立した。Ｃａ２＋指標のローディングの成功の確認は、およそ１μｇ／ｍＬ〜５μｇ／ｍＬのイオノマイシンの添加によって得られる。その後、モニターした区域に由来する空気を上記機械に通過させ、粒子状の物体を内面に濃縮する。その後、バイオセンサーを試験面に解放し、存在する可能性のある任意のＢ．アンスラシス芽胞に結合させる。４０５ｎｍの蛍光シグナルの変化を１分間〜２分間に亘り記録する。細胞蛍光の増加は、試料中の炭疽菌の存在を示す。幾つかの例では、細胞蛍光の変化量は、試料中に存在する炭疽菌量と相関するため、試料中の炭疽菌量の定量を可能とする。
【００９７】
本発明はその或る特定の実施形態を参照して記載されているが、当業者は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な修飾を行い得ることを理解する。添付の特許請求の範囲は、記載される具体的な実施形態に限定されない。
【００９８】
参考資料
本明細書で言及される全ての特許及び出版物は、本発明の属する技術分野の当業者の技術水準の指標である。各々の引用される特許及び出版物はその全体が引用することにより本明細書の一部をなす。以下の参考資料は、全て本出願で引用されている。
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018507703.tif 000020
2018507703.tif 000021