(57)【要約】  本発明は、標的細胞への非ウイルス性ＲＮＡの転移のためのレトロウイルスシステム、及びより具体的には複数のＲＮＡを送達することができるレトロウイルス粒子に関する。より具体的には、本発明は、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質、エンベロープタンパク質、任意によりインテグラーゼ及び少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルス性ＲＮＡを含むレトロウイルス粒子であって、当該カプシド形成された非ウイルス性ＲＮＡがそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のＲＮＡ配列を含み、各カプシド形成配列が、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質に及び／又はインテグラーゼに導入された結合ドメインによって認識されている、レトロウイルス粒子に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質、エンベロープタンパク質、任意によりインテグラーゼ及び少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルス性ＲＮＡを含む、レトロウイルス粒子であって、当該カプシド形成された非ウイルス性ＲＮＡがそれぞれ、カプシド形成（encapsidation）配列に連結された目的のＲＮＡ配列を含み、各カプシド形成配列が、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質に及び／又はインテグラーゼに導入された結合ドメインによって認識されている、レトロウイルス粒子。
【請求項２】
ヌクレオカプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、任意によりインテグラーゼ及び少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルス性ＲＮＡを含み、当該カプシド形成された非ウイルス性ＲＮＡがそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のＲＮＡ配列を含み、各カプシド形成配列が、ヌクレオカプシドタンパク質に及び／又はインテグラーゼに導入された結合ドメインによって認識されている、請求項１に記載のレトロウイルス粒子。
【請求項３】
前記結合ドメインが、前記ヌクレオカプシドタンパク質に導入され、かつ、少なくとも２つの非ウイルス性のカプシド形成されたＲＮＡが、そのＲＮＡ配列によって区別される、請求項２に記載のレトロウイルス粒子。
【請求項４】
第２の結合ドメインが、前記ヌクレオカプシドタンパク質に導入される、請求項３に記載の粒子。
【請求項５】
結合ドメインが、前記インテグラーゼにも導入される、請求項３又は４に記載の粒子。
【請求項６】
レンチウイルス粒子である、請求項２から５のいずれか一項に記載のレトロウイルス粒子。
【請求項７】
−前記結合ドメインが、バクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質の配列であり、
−前記非ウイルス性ＲＮＡの前記カプシド形成配列が、ＭＳ２のステム−ループ配列であり、
−前記ヌクレオカプシドタンパク質が、Ｇａｇポリタンパク質に属するＨＩＶのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）であって、そのＮＣが、バクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質配列を挿入するために第２のジンクフィンガーで変異している、
請求項６に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項８】
−前記結合ドメインが、バクテリオファージＰＰ７のコートタンパク質の配列であり、
−前記非ウイルス性ＲＮＡの前記カプシド形成配列が、ＰＰ７のステム−ループ配列であり、
−前記ヌクレオカプシドタンパク質が、Ｇａｇポリタンパク質に属するＨＩＶのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）であって、そのＮＣが、バクテリオファージＰＰ７のコートタンパク質配列を挿入するために第２のジンクフィンガーで変異している、
請求項６に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項９】
前記結合ドメインが、前記インテグラーゼに導入される、請求項１又は２に記載のレトロウイルス粒子。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載の粒子を含有する組成物。
【請求項１１】
以下：
（ｉ）少なくとも１つの目的の配列を含み、当該配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、
（ｉｉ）カプシド形成配列が認識されることを可能にする結合ドメインを含む、キメラである、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質及び／又はインテグラーゼをコードする、カプシド形成プラスミド、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の粒子を生産するためのキット。
【請求項１２】
以下：
（ｉ）少なくとも２つの異なる非ウイルス性ＲＮＡ配列を含む発現プラスミドであって、各ＲＮＡ配列が目的の配列を含み、当該目的の配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、第１及び第２の発現プラスミド、
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む、請求項３から８のいずれか一項に記載の粒子を生産するためのキット。
【請求項１３】
以下：
（ｉ）少なくとも２つの目的の配列を含み、これら配列のそれぞれの上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、第１及び第２の発現プラスミド、
当該目的の配列が異なっており、かつ当該カプシド形成配列が同一であり、
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む、請求項１２に記載の粒子を生産するためのキット。
【請求項１４】
以下：
（ｉ）少なくとも１つの目的の配列を含み、当該配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミドを調製し、
（ｉｉ）カプシド形成配列が認識されることを可能にする結合ドメインを含む、キメラである、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質及び／又はインテグラーゼをコードする、カプシド形成プラスミドを調製し、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
を含む、請求項１１に記載のキットの製造方法。
【請求項１５】
以下：
（ｉ）少なくとも２つの異なる非ウイルス性ＲＮＡ配列を含む発現プラスミドであって、各ＲＮＡ配列が目的の配列を含み、当該目的の配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、第１及び第２の発現プラスミド、を調製し、
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミドを調製し、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
を含む、請求項１２に記載のキットの製造方法。
【請求項１６】
以下：
（ｉ）少なくとも２つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、これら配列のそれぞれの上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、第１及び第２の発現プラスミド、を調製し、
当該目的の配列が異なっており、かつ、当該カプシド形成配列が同一であり、
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードする、カプシド形成プラスミドを調製し、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
を含む、請求項１３に記載のキットの製造方法。
【請求項１７】
請求項１から９のいずれか一項に記載の粒子の製造方法であって、以下：
（ｉ）少なくとも１つの目的の配列を含み、当該配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、
（ｉｉ）カプシド形成配列が認識されることを可能にする結合ドメインを含む、キメラである、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質及び／又はインテグラーゼをコードする、カプシド形成プラスミド、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を細胞にコトランスフェクト（co-transfecting）し、そして、
前記粒子を含むトランスフェクトされた細胞の上清を採取するステップ、
を含む、方法。
【請求項１８】
請求項３から８のいずれか一項に記載の粒子の製造方法であって、以下：
（ｉ）少なくとも２つの異なる非ウイルス性ＲＮＡ配列を含む発現プラスミドであって、各ＲＮＡ配列が目的の配列を含み、当該目的の配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、第１及び第２の発現プラスミド、
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を細胞にコトランスフェクトし、そして、
前記粒子を含むトランスフェクトされた細胞の上清を採取するステップ、
を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の粒子の製造方法であって、以下：
（ｉ）少なくとも２つの目的の配列を含み、これら配列のそれぞれの上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、第１及び第２の発現プラスミド、
当該目的の配列が異なっており、かつ当該カプシド形成配列が同一であり、
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を細胞にコトランスフェクトし、そして、
前記粒子を含むトランスフェクトされた細胞の上清を採取するステップ、
を含む、方法。
【請求項２０】
前記上清が清澄化される、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２１】
前記上清がまた、濃縮及び／又は精製される、請求項２０に記載の製造方法。
【請求項２２】
請求項１７から２１のいずれか一項に記載の方法によって得られる組成物。
【請求項２３】
細胞に形質導入するための、請求項１から９のいずれか一項に記載の粒子の、あるいは請求項１０又は２２に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非ウイルス性ＲＮＡを標的細胞に転移するためのレトロウイルスシステムに関し、より具体的には、複数のＲＮＡを送達することができるレトロウイルス粒子に関する。本発明はまた、それらのレトロウイルス粒子を含有する組成物、その生産のためのキット、それらに関連する製造プロセス、並びに、当該粒子及び当該組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
標的細胞に複数のＲＮＡを導入することは、遺伝子治療におけるように、研究と開発両方の主要な柱である。
【０００３】
ウイルスに由来するベクターの使用は、遺伝子転移のための重要な方法となっている。ウイルスベクターは今日、以下の２つのカテゴリーに分類される：
―受容者のゲノム中にそれ自体を組み込む、組み込みベクター(integrating vectors)、並びに
―通常、染色体外遺伝エレメントを形成する、非組み込みベクター。
【０００４】
組み込みベクター、例えばガンマ−レトロウイルスベクター（ＲＶ）及びレンチウイルスベクター（ＬＶ）は安定に組み込まれる。非組み込みベクター、例えばアデノウイルス（ＡＤＶ）ベクター及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、急速に分裂する細胞から、迅速に排除される。特定のベクターの選択に影響を与えるいくつかの要因には、そのカプシド形成(encapsidation)能力、その宿主又は標的細胞範囲、その遺伝子発現プロファイル、その形質導入効率、及び、反復した形質導入が必要とされる場合に特に問題となる、その免疫応答を惹起する能力、が挙げられる。
【０００５】
遺伝子治療又は多数のイン・ビトロ、エクス・ビボ及びイン・ビボ用途におけるような特定の用途は、非組み込みベクターの使用を必要とする。
例として、以下のものが挙げられる：
・多能性細胞に特殊化した細胞の再プログラミングの誘導、並びに、幹細胞又は多能性細胞の特殊化細胞への分化の誘導、
・標的細胞における同時の、抗原又はタンパク質の発現（毒性か否か）、
・遺伝子工学システムの発現、例えばＣＲＥ若しくはＴＡＬＥＮタンパク質又はＣＲＩＳＰＲシステム、あるいはタンパク質又はＲＮＡ発現を必要とする任意の他のシステム。
【０００６】
標的細胞にＲＮＡを導入するための一つの方法は、レトロウイルス科(Retroviridae)ファミリーに属するウイルス（レトロウイルスファミリー又はＲＮＡウイルスの名でも示される）に基づくウイルスベクターを用いる。実際のところ、その複製サイクル中に、レトロウイルス科ファミリーのウイルスは、ＲＮＡによって構成されたそのゲノムを、標的細胞のゲノムに組み込まれることになる二本鎖ＤＮＡへと変換する能力を有している。このレトロウイルスファミリーの特定の例はガンマ−レトロウイルス及びレンチウイルス(lentiviruses)である。
【０００７】
レトロウイルスの複製サイクルは、膜受容体への結合を介して標的細胞（又は宿主）を認識する第１フェーズを含む。この認識フェーズは、膜との融合後に、宿主細胞へのレトロウイルスの侵入をもたらす。次に、レトロウイルスＲＮＡは、レトロウイルスによってコードされた逆転写酵素によって二本鎖ＤＮＡへとコピーされ、次に宿主細胞のゲノムに組み込まれる。次にこのウイルスゲノムは、細胞の他の全ての遺伝子と同様に宿主細胞によって転写される。このゲノムは、他のウイルスの生産を可能にする全てのタンパク質及び配列をコードしている。
【０００８】
より具体的には、３つの遺伝子：ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ、が全てのレトロウイルスについて共通である。
【０００９】
Ｇａｇはポリタンパク質をコードする遺伝子であり、切断によってこのポリタンパク質に由来するタンパク質は、複製時にウイルスの構築に関与する構造タンパク質である。これらの構造タンパク質はより具体的にはマトリックスタンパク質（ＭＡ）、カプシドタンパク質（ＣＡ）、及びヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）である。
【００１０】
Ｐｏｌは、インテグラーゼ、逆転写酵素及びプロテアーゼ酵素をコードする遺伝子である。
【００１１】
Ｅｎｖは、エンベロープ糖タンパク質をコードする遺伝子である。
【００１２】
したがって、これら３つの遺伝子は、レトロウイルスＲＮＡを二本鎖ＤＮＡへとコピーし、宿主細胞のゲノムにそのＤＮＡを組み込み、次に新たに合成されたレトロウイルスの構造：エンベロープ、カプシド及びヌクレオカプシドタンパク質、を生成することを可能にする。しかしながら、新たに合成されたレトロウイルスが完全であるためには、それらの構造のそれぞれの中にレトロウイルスＲＮＡの２つのコピーをカプシド形成することが必要である。この当該構造中のレトロウイルスＲＮＡの２つのコピーのカプシド形成は、レトロウイルスＲＮＡのコピーによって運ばれるＰｓｉ（「パッケージングシグナル(Packaging Signal)」）と呼ばれる、カプシド形成配列のヌクレオカプシドタンパク質による認識によって行われる。
【００１３】
レトロウイルスに由来するウイルスベクターが遺伝子治療の目的で使用される場合、ｇａｇ、ｐｏｌ及び／又はｅｎｖをコードする領域の少なくとも一部が、カプシド形成システムと目的の配列を発現するためのシステムとの間で解離する。ｇａｇ及びｐｏｌをコードする配列は、例えば、ウイルスベクターを生産するのに必要なタンパク質をｔｒａｎｓで提供するカプシド形成プラスミドによって運ばれる。目的の配列のようなカプシド形成配列は、レトロウイルスを非複製にするために、独立したシステムによって運ばれる。
【００１４】
しかしながら、特定の場合には、宿主細胞のゲノムへの目的のＲＮＡ配列のランダム組み込みは、オープンリーディングフェーズ（open reading phase）を阻害し、かつ重要な遺伝子の発現をブロックし得る。さらに、一部の用途、例えば細胞の再プログラミング又は幹細胞の分化のために、目的の配列の一過性発現を一時的に行うことが推奨される。
【００１５】
国際特許出願第２００７／０７２０５６号の出願は、ｅｎｖ、ｇａｇ、任意によりｇａｇ／ｐｏｌ、並びに、ｇａｇ若しくはｇａｇ／ｐｏｌに関連した対応するＲＮＡ結合ドメインによって認識される異種カプシド形成シグナルを含むＲＮＡ配列を含む、ウイルスベクターシステムについて記載している。このシステムは、非組み込みであり、かつ一過性発現を可能にするものとして本願に記載されている。
【００１６】
しかしながら、このようなシステムの効率は制限されたままである。特に、標的細胞がこれらのシステムによって転移された目的のＲＮＡを発現するためには、一般に、この目的のＲＮＡのいくつかのコピーを細胞に導入し、従って高いＭＯＩ（「感染多重度(multiplicity of infection)」を表す）を使用することが必要である。ＭＯＩは、感染する細胞の数に対する、導入されるベクターシステムの数の比に相当する。高ＭＯＩは実際に、同一細胞がいくつかの感染を受けることを可能にすることによって、細胞への目的のＲＮＡのいくつかのコピーの導入を可能にする。しかしながら、それは、転移した目的のＲＮＡの発現のレベルを可能にし得るが、高ＭＯＩの使用はまた、細胞が被った複数の感染のために、ある程度の毒性をもたらす。
【００１７】
それゆえ、依然としてより効率的かつ低毒性であるウイルスベクターシステムが必要とされている。
【発明の概要】
【００１８】
本発明者らの研究は、単一の感染で同一細胞にいくつかの目的のＲＮＡを送達することが可能であるベクターシステムの生産を可能にした。
【００１９】
したがって、本発明は、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質、エンベロープタンパク質、任意によりインテグラーゼ、及び少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルス性ＲＮＡを含む、レトロウイルス粒子であって、当該カプシド形成された非ウイルス性ＲＮＡがそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のＲＮＡ配列を含み、各カプシド形成配列が、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質に及び／又はインテグラーゼに導入された結合ドメインによって認識されている、レトロウイルス粒子に関する。
【００２０】
本発明に係るレトロウイルス粒子は、少なくとも２つの非ウイルス性ＲＮＡ、好ましくは３つを、単一感染によって細胞に導入することを可能にする。そのような粒子の細胞への導入は、イン・ビボ、イン・ビトロ又はエクス・ビボの方法によって行うことができる。
【００２１】
「Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質」とは、Ｇａｇポリタンパク質の切断から生じる任意のタンパク質を意味する。より具体的には、それは、ヌクレオカプシドタンパク質、マトリックスタンパク質（例えば、ＭｏＭｕＬＶ型マウスウイルス由来のレトロウイルス粒子における）、又はガンマ−レトロウイルスに特異的なｐ１２タンパク質である。
【００２２】
「エンベロープタンパク質」とは、シュードタイピング(pseudotyping)エンベロープタンパク質を含む、任意のエンベロープタンパク質を意味する。例として、両性(Ampho)エンベロープタンパク質、同種指向性エンベロープタンパク質、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）のエンベロープタンパク質、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）のエンベロープタンパク質、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）のエンベロープタンパク質、マウス乳がんウイルス（ＭｕＭＴＶ）のエンベロープタンパク質、ラウス肉腫ウイルス(Rous Sarcoma virus)（ＲＳＶ）のエンベロープタンパク質、麻疹ウイルス（ＭＶ）のエンベロープタンパク質、テナガザル白血病ウイルス(Gibbon leukemia virus)（ＧａｌＶ）のエンベロープタンパク質、ネコ内在性ウイルス(feline endogonous virus)（ＲＤ１１４）のタンパク質又は水胞性口炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）のエンベロープタンパク質、を挙げることができる。より具体的には、エンベロープタンパク質は、両性エンベロープタンパク質、同種指向性エンベロープタンパク質、モロニーマウス白血病ウイルスウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）のエンベロープタンパク質、ネコ免疫不全ウイルスウイルス（ＦＩＶ）のエンベロープタンパク質、ハーベイマウス肉腫ウイルスウイルス（ＨａＭｕＳＶ）のエンベロープタンパク質、マウス乳がんウイルス（ＭｕＭＴＶ）のエンベロープタンパク質、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のエンベロープタンパク質、麻疹ウイルス（ＭＶ）のエンベロープタンパク質、テナガザル白血病ウイルスのエンベロープタンパク質（ＧａｌＶ）又は水胞性口炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）のエンベロープタンパク質である。したがって、エンベロープタンパク質は、特定の細胞型又は特定の用途（エンベロープタンパク質のような表面受容体の使用）を標的とするために改変されてもよい。
【００２３】
特定の受容体及び／又は細胞型を標的化するために、抗体、糖脂質及び／又は特定のリガンドによりエンベロープタンパク質を改変することもできる。
【００２４】
好ましくは、エンベロープタンパク質は、ＶＳＶ−Ｇタンパク質である。
【００２５】
「インテグラーゼ」とは、前記レトロウイルスの複製時にレトロウイルスによる感染細胞のＤＮＡへのレトロウイルスＤＮＡの組み込みを可能にする、ｐｏｌ遺伝子によってコードされた酵素タンパク質を意味する。
【００２６】
「カプシド形成配列」とは、結合ドメインによって特異的に認識されるＲＮＡモチーフ（三次元構造及び配列）を指す。好ましくは、カプシド形成配列はステム−ループモチーフである。さらにより好ましくは、レトロウイルス粒子のカプシド形成配列は、バクテリオファージＭＳ２の又はファージＰＰ７のＲＮＡステム−ループモチーフ、例えば、それぞれ、配列ｃｔａｇａａａａｃａｔｇａｇｇａｔｃａｃｃｃａｔｇｔｃｔｇｃａｇ（配列番号１）又は（ｃｔａｇａａｇｇａｇｃａｇａｃｇａｔａｔｇｇｃｇｔｃｇｃｔｃｃｃｔｇｃａｇ  配列番号５）から生じる配列である。ステム−ループモチーフ、より具体的にはバクテリオファージＭＳ２のＲＮＡステム−ループモチーフ、又はファージＰＰ７のＲＮＡのステム−ループモチーフは、単独で、又は数回、好ましくは２〜２５回、より好ましくは２〜１８回、例えば６〜１８回反復して使用され得る。
【００２７】
「結合ドメイン」とは、目的のＲＮＡ配列に連結されたカプシド形成配列に特異的に結合するタンパク質の全体又は一部を意味する。より具体的には、それは、カプシド形成配列に特異的に結合する、三次元構造によって定義された、突然変異体であるか否かにかかわらない、タンパク質である。好ましくは、結合ドメインは異種ドメインである。より好ましくは、結合ドメインは、バクテリオファージＭＳ２、ファージＰＰ７又はＱβファージのコートタンパク質、ＨＫ０２２プロファージのｎｕｎタンパク質、Ｕ１Ａタンパク質、あるいはｈＰｕｍタンパク質である。
【００２８】
より好ましくは、結合ドメインは、バクテリオファージＭＳ２の又はファージＰＰ７のコートタンパク質である。
【００２９】
さらにより好ましくは、結合ドメインがファージＰＰ７のコートタンパク質である場合、その配列は、アミノ酸６７から７５の欠失のために、自己構築に不十分である（ＰＣＰΔＦＧ）（Ｃｈａｏら、２００８）。好ましくは、ファージＰＰ７のコートタンパク質配列はヒト細胞のためにコドン最適化されており、すなわち、ＤＮＡの塩基が好ましくはヒト種に存在するアミノ酸をコードするように選択されている。
【００３０】
「各配列」とは、それらのカプシド形成配列が同一又は異なる結合ドメインによって認識されるかどうかに応じて、カプシド形成配列が同一又は異なっていてもよいことを意味する。実際に、本発明に係るレトロウイルス粒子は、１つ又はいくつかの結合ドメインを含み得る。いくつかの結合ドメインが導入される場合、それらはＧａｇポリタンパク質中及び／又はインテグラーゼ中であってもよい。
【００３１】
結合ドメインは、カプシド形成配列認識だけでなく、粒子中にカプシド形成配列を有するＲＮＡの（又は本件の場合、カプシド形成配列に連結された非ウイルス性ＲＮＡの）カプシド形成も可能にする。
【００３２】
「カプシド形成」とは、ウイルス粒子のウイルスカプシド中のＲＮＡのパッケージングを意味する。本発明においては、非ウイルス性ＲＮＡのカプシド形成は、非ウイルスカプシド形成シグナル、特にＰｓｉ以外の認識によって行われることに留意されたい。
【００３３】
「目的の配列」とは、ユーザーの目的を提示する機能をコードする配列をいう。より具体的には、２つのカプシド形成された非ウイルス性ＲＮＡのそれぞれによって運ばれる目的の配列は、同一又は異なっていてもよい。
【００３４】
本発明に係る粒子を用いることで、同一又は異なる非ウイルス性ＲＮＡを標的細胞に転移させることができる。
【００３５】
カプシド形成されたＲＮＡが非ウイルス性である場合、これらのＲＮＡは、ｐｏｌ遺伝子によってコードされたタンパク質を認識する部位を提示しない。
【００３６】
このことは、これら非ウイルス性ＲＮＡがレトロウイルスの複製サイクルの初期段階、すなわち、以下：
―逆転写酵素による二本鎖ＤＮＡへの一本鎖ウイルスＲＮＡのコピー；
―インテグラーゼによるＬＴＲ末端の認識による二本鎖ＤＮＡの成熟、及び、細胞質プレインテグレーション複合体（pre-integration complex）の核プレインテグレーション複合体への成熟、
に関与しないためである。
【００３７】
したがって、ｐｏｌ遺伝子によってコードされたこれらウイルスタンパク質（逆転写酵素、インテグラーゼ）は粒子において任意であり、したがってｐｏｌ遺伝子は存在するか、あるいは部分的に又は完全に欠失しているかのいずれかであり得る。好ましくは、ｐｏｌ遺伝子は存在するか、あるいは部分的に欠失しているかのいずれかである。
【００３８】
本発明に係るレトロウイルス粒子は、ウイルス及び非ウイルスの両方の遺伝物質を含むことに留意されたい：
―ｇａｇ遺伝子、これはウイルス性又はキメラであってもよい。より具体的には、結合ドメイン又はドメイン（複数）がその中に導入される場合、ｇａｇ遺伝子はキメラである。
―任意により、ｐｏｌ遺伝子、これはウイルス性又はキメラであってもよい。ｐｏｌ遺伝子がいくつかの酵素をコードする場合、それらの酵素に関連する配列は完全に又は部分的に欠失しており、存在しかつ非機能的であるか、あるいは、存在しかつ機能的であってもよい。より具体的には、結合ドメイン又はドメイン（複数）がインテグラーゼに導入される場合、ｐｏｌ遺伝子はキメラである。
―少なくとも２つの非ウイルス性ＲＮＡ、各非ウイルス性ＲＮＡは目的の配列及びカプシド形成配列のキャリアである。より具体的には、これら非ウイルス性ＲＮＡはいかなるウイルス配列も含まない。
【００３９】
より具体的には、本発明に係るレトロウイルス粒子は、標的細胞に、以下を誘導することができるＲＮＡを導入することを可能にする：
・標的細胞への、内因性又は外因性である１又は複数の目的のコーディング配列の転移。
・例えばｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＬｎｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡによる、遺伝子発現に対する影響を誘導することができるＲＮＡのような、１又は複数の非コーディングＲＮＡの転移。
・細胞ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡタイプ又は他のタイプ（ｍｉＲＮＡ等）、ウイルスＲＮＡのサブゲノムレプリコン（ＶＨＣ等）あるいは完全ウイルスＲＮＡゲノムの転移。
・標的細胞への内因性又は外因性であるコーディング又は非コーディング配列の同時発現。
・遺伝子工学システム、例えばＣＲＩＳＰＲシステムによる標的細胞のゲノム修飾への関与。
【００４０】
有利には、本発明に係るレトロウイルス粒子は、ヌクレオカプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、任意によりインテグラーゼ及び少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルス性ＲＮＡを含み、当該カプシド形成された非ウイルス性ＲＮＡはそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のＲＮＡ配列を含み、各カプシド形成配列が、ヌクレオカプシドタンパク質に及び／又はインテグラーゼに導入された結合ドメインによって認識されている。
【００４１】
「ヌクレオカプシドタンパク質」とは、ｇａｇ遺伝子によってコードされた構造タンパク質ＮＣを意味する。結合ドメインがヌクレオカプシドタンパク質に導入される場合、このタンパク質は、キメラｇａｇ遺伝子に由来するキメラタンパク質である。
【００４２】
結合ドメインがインテグラーゼに導入される場合、インテグラーゼはキメラｐｏｌ遺伝子に由来するキメラタンパク質である。
【００４３】
「キメラタンパク質」とは、組み合わされているいくつかの異なるタンパク質配列を含む組み換えタンパク質を指す。
【００４４】
第１の実施形態によれば、本発明に係るレトロウイルス粒子において、結合ドメインはヌクレオカプシドタンパク質に導入され、かつ、少なくとも２つの非ウイルス性のカプシド形成されたＲＮＡはそれらのＲＮＡ配列によって区別される。
【００４５】
この第１の実施形態は、標的細胞のゲノムにおける関連した組み込みイベントなしに、目的のＲＮＡの早期の一過性発現を可能にする。
【００４６】
実際のところ、第１の実施形態に係る粒子を標的細胞に接触して配置すると、レトロウイルス粒子の膜と標的細胞の膜とが結合し、粒子の内容物の標的細胞への放出を可能にすることになる。次にＲＮＡが細胞質中に放出され、細胞メカニズムは、それらＲＮＡが直接タンパク質（複数）に、すなわち追加のステップ、例えば逆転写、核への転座、又は標的細胞のゲノムへの組み込みなしに、翻訳されることを可能にする。
【００４７】
より具体的には、少なくとも２つの非ウイルス性ＲＮＡは同一のカプシド形成配列を有する。この場合、少なくとも２つの非ウイルス性のカプシド形成されたＲＮＡは、それらの目的のＲＮＡ配列によって互いに区別される、すなわち２つの非ウイルス性のカプシド形成されたＲＮＡに含まれた目的のＲＮＡ配列は異なっている。「異なる」とは、同一でないか、あるいは自然突然変異、又はマニピュレータ(manipulator)によって意図せず選択された突然変異から生じない差異を有する、目的の配列をいう。
【００４８】
あるいは、少なくとも２つの非ウイルス性ＲＮＡは２つの異なるカプシド形成配列を有する。これら少なくとも２つのカプシド形成配列は次に、少なくとも２つの異なる結合ドメインによって認識され、これらドメインの少なくとも１つがヌクレオカプシドタンパク質に導入される。この場合、少なくとも２つの非ウイルス性のカプシド形成されたＲＮＡは、同一又は異なる目的の配列を含んでもよい。
【００４９】
少なくとも２つの非ウイルス性ＲＮＡ、好ましくは３つの非ウイルス性ＲＮＡをカプシド形成することが可能である。
【００５０】
第１の実施形態の特定の実施形態によれば、第２の結合ドメインは、本発明に係るレトロウイルス粒子のヌクレオカプシドタンパク質に導入される。
【００５１】
例として、第１の結合ドメインがファージＰＰ７のコートタンパク質である場合、第２の結合ドメインはバクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質であり得る、あるいは、第１の結合ドメインがバクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質である場合、第２の結合ドメインはファージＰＰ７のコートタンパク質であり得る。
【００５２】
この場合、少なくとも２つの非ウイルス性のカプシド形成されたＲＮＡは異なるカプシド形成配列を有し、各カプシド形成配列はそれぞれ、ヌクレオカプシドタンパク質に導入される第１の及び第２の結合ドメインに対応する。
【００５３】
より具体的には、３つの非ウイルス性ＲＮＡがカプシド形成される場合：
―カプシド形成された非ウイルス性ＲＮＡの少なくとも２つが、第１の結合ドメインに対応する同一のカプシド形成配列を提示し、かつ単にそれらの目的のＲＮＡ配列によって互いに区別され、
―第３のカプシド形成された非ウイルス性ＲＮＡは、同一又は異なるカプシド形成配列を有してもよい。カプシド形成配列が異なる場合、これは、ヌクレオカプシドタンパク質に導入された第２の結合ドメインに対応し得る。
【００５４】
他の結合ドメインがまた、ヌクレオカプシドタンパク質に導入されてもよい。
【００５５】
ヌクレオカプシドタンパク質に導入された結合ドメイン又はドメイン（複数）に加えて、インテグラーゼに結合ドメインを導入することも可能である。
【００５６】
次に、インテグラーゼは、キメラｐｏｌ遺伝子に由来するキメラタンパク質である。
【００５７】
好ましくは、結合ドメインがインテグラーゼに導入される場合、結合ドメイン配列を挿入するために、インテグラーゼ配列はＣ−末端ドメインで突然変異している。さらにより好ましくは、インテグラーゼ配列は、バクテリオファージＭＳ２の又はファージＰＰ７のコートタンパク質の配列を導入するように、Ｃ−末端ドメインで突然変異している。
【００５８】
この場合、少なくとも２つの非ウイルス性のカプシド形成されたＲＮＡ異なるカプシド形成配列を有してもよく、各カプシド形成配列は、ヌクレオカプシドタンパク質に及びインテグラーゼにそれぞれ導入された結合ドメインに対応する。
【００５９】
より具体的には、３つの非ウイルス性ＲＮＡがカプシド形成される場合：
―カプシド形成された非ウイルス性ＲＮＡの少なくとも２つが、第１の結合ドメインに対応する同一のカプシド形成配列を提示し、かつ単にそれらの目的のＲＮＡ配列によって互いに区別され、
―第３のカプシド形成された非ウイルス性ＲＮＡは、インテグラーゼに導入された第２の結合ドメインに対応する異なるカプシド形成配列を有する。
【００６０】
他の結合ドメインがまた、インテグラーゼに導入されてもよい。
【００６１】
有利には、本発明に係るレトロウイルス粒子はレンチウイルス粒子である。
【００６２】
好ましくは、そのようなレンチウイルス粒子において：
―結合ドメインは、バクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質であり、
―非ウイルス性ＲＮＡのカプシド形成配列は、ＭＳ２のステム−ループ配列であり、
―ヌクレオカプシドタンパク質は、キメラＧａｇポリタンパク質に属するＨＩＶのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）であって、そのＮＣ配列は、バクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質配列を挿入するために、第２のジンクフィンガーで突然変異している。
【００６３】
有利には：
―エンベロープタンパク質は、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇタンパク質である。
―カプシド形成配列は、ＭＳ２ステム−ループ配列の２〜２５の反復、好ましくはステム−ループ配列の６〜１８の反復、さらにより好ましくは１０〜１４、例えば１２の反復を含む。好ましくは、当該ステム−ループ配列は、以下：ｃｔａｇａａａａｃａｔｇａｇｇａｔｃａｃｃｃａｔｇｔｃｔｇｃａｇ（配列番号１）である。
【００６４】
あるいは、好ましくは、そのようなレンチウイルス粒子において：
―結合ドメインは、ファージＰＰ７のコートタンパク質であり、
―非ウイルス性ＲＮＡのカプシド形成配列は、ＰＰ７のステム−ループ配列であり、
―ヌクレオカプシドタンパク質は、キメラＧａｇポリタンパク質に属するＨＩＶのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）であって、そのＮＣ配列は、ＰＰ７バクテリオファージのコートタンパク質配列を挿入するために、第２のジンクフィンガーで突然変異している。
【００６５】
有利には：
―エンベロープタンパク質は、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇタンパク質である。
―カプシド形成配列は、ＰＰ７ステム−ループ配列の２〜２５の反復、好ましくはステム−ループ配列の２〜１８の反復、さらにより好ましくは２〜１２、例えば６の反復を含む。好ましくは、ステム−ループ配列は、以下：ｃｔａｇａａｇｇａｇｃａｇａｃｇａｔａｔｇｇｃｇｔｃｇｃｔｃｃｃｔｇｃａｇ（配列番号５）である。
【００６６】
任意により、第１の結合ドメインがバクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質である場合、インテグラーゼに導入された第２の結合ドメインはファージＰＰ７のコートタンパク質であってもよく、あるいは、第１の結合ドメインがファージＰＰ７のコートタンパク質である場合、インテグラーゼに導入された第２の結合ドメインはバクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質であってもよい。
【００６７】
第２の実施形態によれば、本発明は、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質、好ましくはヌクレオカプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、インテグラーゼ及び少なくとも２つの非ウイルス性のカプシド形成されたＲＮＡを含む、レトロウイルス粒子であって、当該カプシド形成された非ウイルス性ＲＮＡがそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のＲＮＡ配列を含み、各カプシド形成配列が、インテグラーゼに導入された結合ドメインによって、及び任意により、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質、好ましくはヌクレオカプシドタンパク質に導入された結合ドメインによって認識されている、レトロウイルス粒子に関する。
【００６８】
この第２の実施形態は、標的細胞のゲノムにおける関連した組み込みイベントなしに、目的のＲＮＡの一過性発現を可能にする。
【００６９】
好ましくは、この第２の実施形態において、インテグラーゼ配列は、結合ドメイン配列を挿入するために、Ｃ−末端ドメインで突然変異している。
【００７０】
有利には、結合ドメインは異種ドメインである。より具体的には、結合ドメインは、バクテリオファージＭＳ２の、ファージＰＰ７の又はＱβファージのコートタンパク質、ＨＫ０２２プロファージのｎｕｎタンパク質、Ｕ１Ａタンパク質るいはｈＰｕｍタンパク質である。
【００７１】
好ましくは、インテグラーゼ配列は、バクテリオファージＭＳ２の又はファージＰＰ７のコートタンパク質を導入するように、Ｃ−末端ドメインで突然変異している。
【００７２】
少なくとも２つの非ウイルス性ＲＮＡは、同一のカプシド形成配列を提示してもしなくてもよい。
【００７３】
同様に、少なくとも２つの非ウイルス性のカプシド形成されたＲＮＡは、目的のＲＮＡ配列を提示してもしなくてもよい。
【００７４】
好ましくは、少なくとも２つの非ウイルス性のカプシド形成されたＲＮＡは、それらの目的のＲＮＡ配列によって互いに区別され、すなわち２つの非ウイルス性のカプシド形成されたＲＮＡに含まれた目的のＲＮＡ配列は異なっている。
【００７５】
より具体的には；少なくとも２つの非ウイルス性ＲＮＡは同一のカプシド形成配列を提示し、後者はインテグラーゼに導入された結合ドメインによって認識される。
【００７６】
少なくとも２つの非ウイルス性ＲＮＡ、好ましくは３つの非ウイルス性ＲＮＡをカプシド形成することが可能である。
【００７７】
第２の実施形態の特定の実施形態によれば、第２の結合ドメインは、本発明に係るレトロウイルス粒子のインテグラーゼに導入される。
【００７８】
例として、第１の結合ドメインがファージＰＰ７のコートタンパク質である場合、第２の結合ドメインはバクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質であり得る、あるいは、第１の結合ドメインがバクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質である場合、第２の結合ドメインはファージＰＰ７のコートタンパク質であり得る。
【００７９】
この場合、少なくとも２つの非ウイルス性のカプシド形成されたＲＮＡは異なるカプシド形成配列を有し、各カプシド形成配列はそれぞれインテグラーゼに導入された第１の及び第２の結合ドメインに対応する。
【００８０】
より具体的には、３つの非ウイルス性ＲＮＡがカプシド形成される場合：
―カプシド形成された非ウイルス性ＲＮＡの少なくとも２つが、第１の結合ドメインに対応する同一のカプシド形成配列を提示し、これら２つの非ウイルス性ＲＮＡはおそらく、それらの目的のＲＮＡ配列によって互いに区別可能であり、
―第３のカプシド形成された非ウイルス性ＲＮＡは、同一又は異なるカプシド形成配列を有してもよい。カプシド形成配列が異なる場合、これはインテグラーゼに導入された第２の結合ドメインに対応し得る。
【００８１】
他の結合ドメインがまた、インテグラーゼに導入されてもよい。
【００８２】
インテグラーゼに導入された結合ドメイン又はドメインに加えて、ヌクレオカプシドタンパク質に結合ドメインを導入することも可能である。
【００８３】
次に、ヌクレオカプシドタンパク質は、キメラｇａｇ遺伝子に由来するキメラタンパク質である。
【００８４】
この場合、少なくとも２つの非ウイルス性のカプシド形成されたＲＮＡは、異なるカプシド形成配列を有してもよく、各カプシド形成配列は、インテグラーゼに及びヌクレオカプシドタンパク質にそれぞれ導入された結合ドメインに対応する。
【００８５】
より具体的には、３つの非ウイルス性ＲＮＡがカプシド形成される場合：
―カプシド形成された非ウイルス性ＲＮＡの少なくとも２つが、インテグラーゼに導入された第１の結合ドメインに対応する同一のカプシド形成配列を提示し、これら２つの非ウイルス性ＲＮＡがおそらく、それらの目的のＲＮＡ配列によって互いに区別可能であり、
―第３のカプシド形成された非ウイルス性ＲＮＡが、ヌクレオカプシドタンパク質に導入された第２の結合ドメインに対応する、異なるカプシド形成配列を有する。
【００８６】
他の結合ドメインがまた、ヌクレオカプシドタンパク質に導入されてもよい。
【００８７】
有利には、本発明に係るレトロウイルス粒子は、レンチウイルス粒子である。
【００８８】
レトロウイルス粒子がレンチウイルス粒子である場合、標的細胞、特に静止細胞のゲノムにおける関連した組み込みイベントなしに、目的のＲＮＡを一時的に発現することが可能である。
【００８９】
実際のところ、組み込み反応それ自体の役割とは別に、インテグラーゼ（ＩＮ）は、レトロウイルスの複製サイクルの異なるステップ、例えばウイルス粒子の形態形成、逆転写及びプレインテグレーション複合体（ＰＩＣ）の核取り込み、に関与する。
【００９０】
より具体的には、レンチウイルスにおいて、インテグラーゼは、ＰＩＣによって核に局在することを可能にする核局在配列（ＮＬＳ）を含む。それゆえ、非ウイルス性ＲＮＡのカプシド形成がレンチウイルスのインテグラーゼによって運ばれた結合ドメインによって行われる場合、カプシド形成された非ウイルス性ＲＮＡは標的細胞の核へと輸送されることになる。実際のところ、第２の実施形態に係るレンチウイルス粒子を標的細胞に接触して配置すると、当該粒子の膜及び標的細胞の膜は結合し、カプシドの内容物の標的細胞中への放出を可能にすることになる。次に、ＲＮＡは、ＰＩＣを介して、核内へのＲＮＡの取り込みを可能にすることになるインテグラーゼによって引き受けられる。この引き受けは特に特定の用途、例えば静止細胞における発現に有利である。レンチウイルス以外のレトロウイルス粒子の場合、インテグラーゼはこれらＮＬＳを含まず、それゆえ細胞質内に局在することが見出されている。しかしながら、インテグラーゼの、従ってこのインテグラーゼによって引き受けられるＲＮＡの、核局在を誘導するために、このタイプのインテグラーゼに、ＮＬＳ配列を追加することが可能である。
【００９１】
この引き受けはまた、特に、標的細胞のゲノムと特異的にハイブリダイズすることになるＲＮＡガイドを招く、ＣＲＩＳＰＲシステムに有用である。一度ハイブリダイズすると、これらＲＮＡガイドはエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）をガイドし、それは標的細胞ゲノムの特定の遺伝子座の改変を可能にする。
【００９２】
より具体的には、そのようなレンチウイルス粒子において：
―結合ドメインは、バクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質であり、
―非ウイルス性ＲＮＡのカプシド形成配列は、ＭＳ２のステム−ループ配列であり、
―インテグラーゼは、キメラ酵素タンパク質であり、その配列は、バクテリオファージＭＳ２コートタンパク質配列を挿入するために、Ｃ−末端ドメインで突然変異している。
【００９３】
あるいは、より具体的には、そのようなレンチウイルス粒子において：
―結合ドメインは、ファージＰＰ７のコートタンパク質であり、
―非ウイルス性ＲＮＡのカプシド形成配列は、ＰＰ７のステム−ループ配列であり、
―インテグラーゼは、キメラ酵素タンパク質であり、その配列は、ファージＰＰ７のコートタンパク質配列を挿入するために、Ｃ−末端ドメインで突然変異している。
【００９４】
任意により、ヌクレオカプシドに導入された第２の結合ドメインは、第１の結合ドメインがバクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質である場合、ファージＰＰ７のコートタンパク質であってもよく、あるいは、第１の結合ドメインがファージＰＰ７のコートタンパク質である場合、インテグラーゼに導入された第２の結合ドメインはバクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質であってもよい。
【００９５】
実際のところ、インテグラーゼ（ＩＮ）は、３つの異なる機能的ドメインから構成され、それぞれが完全な組み込み反応を確実にするために不可欠である。Ｎ−末端ドメインは、ＩＮの折り畳み構造を安定化し、かつ酵素の触媒活性を増大させる、ジンクフィンガータイプモチーフを含む。ＩＮの中央ドメインは、酵素の触媒活性に寄与するＤＤＥアミノ酸モチーフを含む。この制御ドメインはまた、レトロウイルスＤＮＡの各末端に保存されたヌクレオチド配列の認識に関与している。Ｃ−末端ドメインは、レトロウイルスファミリーにおいて最も保存されていない。それはＤＮＡへの結合活性を有し、かつ、鎖転移のための３’末端の成熟反応に不可欠である。組み込み反応それ自体の役割のほかに、ＩＮは、レトロウイルスの複製サイクルの異なるステップ、例えば、ウイルス粒子の形態形成、逆転写及びプレインテグレーション複合体の核取り込みに関与する。
【００９６】
Ｐｅｔｉｔらによって記載されたように（１９９９；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｐ５０７９−５０８８）、ＩＮのＣ−末端における外因性配列の挿入は、標的細胞の産生及び形質導入のステップを妨げないが、Ｎ−末端における同一の挿入は形質導入イベントの検出を可能にしない。
【００９７】
したがってレトロウイルス粒子は、インテグラーゼタンパク質（図Ｉ参照）又はファージＰＰ７のコートタンパク質（図ＸＸＸＶＩＩ参照）との組み合わせで、バクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質を含むように改変された。ｐ８．７４カプシド形成プラスミド、インテグラーゼタンパク質をコードするｐｏｌ遺伝子のキャリアは、アセンブリＰＣＲ(assembly PCR)によってインテグラーゼのＣ−末端にコートタンパク質をコードする配列を挿入するために改変される。ｐ８．７４プラスミドはＰＣＲによって線状化され、次に、ＰＣＲによって予め増幅されたコート配列が、インテグラーゼのＣ−末端で、末端から末端に直接、又はリンカーに加えてのいずれかで、クローニングされる。
【００９８】
有利には：
―エンベロープタンパク質は、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質のためのＶＳＶ−Ｇタンパク質コーディングである。
―カプシド形成配列は、導入される結合ドメインに従って、ＭＳ２の及び／又はＰＰ７のステム−ループ配列の２〜２５の反復を含み、好ましくは２〜１８の反復、より好ましくは２〜１８の反復、例えばステム−ループ配列の６〜１８の反復、さらにより好ましくはＭＳ２のステム−ループ配列について、１０〜１４、例えば１２の反復を含む。
―好ましくは、結合ドメインがＭＳ２のコートタンパク質である場合、ステム−ループ配列は、以下：ｃｔａｇａａａａｃａｔｇａｇｇａｔｃａｃｃｃａｔｇｔｃｔｇｃａｇ（配列番号１）であり、及び／又は、結合ドメインがＰＰ７のコートタンパク質である場合、ステム−ループ配列は、以下：ｃｔａｇａａｇｇａｇｃａｇａｃｇａｔａｔｇｇｃｇｔｃｇｃｔｃｃｃｔｇｃａｇ（配列番号５）である。
【００９９】
本発明に係るレンチウイルス粒子のいくつかの例を、以下の例でより詳細に説明する：
―ＭＳ２ＲＬＰ又はＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ  １２Ｘ粒子は、ヌクレオカプシドにおけるバクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質の挿入によって、１２回反復した、バクテリオファージＭＳ２のステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
―ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ  ２Ｘ粒子は、ヌクレオカプシドにおけるバクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質の挿入によって、２回反復した、バクテリオファージＭＳ２のステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
―ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ  ６Ｘ粒子は、ヌクレオカプシドにおけるバクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質の挿入によって、６回反復した、バクテリオファージＭＳ２のステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
―ＭＳ２（ＩＮ）−ＲＬＰ  ２Ｘ粒子は、インテグラーゼにおけるバクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質の挿入によって、２回反復した、バクテリオファージＭＳ２のステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
―ＭＳ２（ＩＮ）−ＲＬＰ  ６Ｘ粒子は、インテグラーゼにおけるバクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質の挿入によって、６回反復した、バクテリオファージＭＳ２のステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
―ＭＳ２（ＩＮ）−ＲＬＰ  １２Ｘ粒子は、インテグラーゼにおけるバクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質の挿入によって、１２回反復した、バクテリオファージＭＳ２のステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
―ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ  ２Ｘ粒子は、ヌクレオカプシドにおけるファージＰＰ７のコートタンパク質の挿入によって、２回反復した、ファージＰＰ７のステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
―ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ  ６Ｘ粒子は、ヌクレオカプシドにおけるファージＰＰ７のコートタンパク質の挿入によって、６回反復した、ファージＰＰ７のステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
―ＰＰ７ＲＬＰ又はＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ  １２Ｘ粒子は、ヌクレオカプシドにおけるファージＰＰ７のコートタンパク質の挿入によって、１２回反復した、ファージＰＰ７のステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
―ＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ  ２Ｘ粒子は、インテグラーゼにおけるファージＰＰ７のコートタンパク質の挿入によって、２回反復した、ファージＰＰ７のステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
―ＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ  ６Ｘ粒子は、インテグラーゼにおけるファージＰＰ７のコートタンパク質の挿入によって、６回反復した、ファージＰＰ７のステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
―ＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ  １２Ｘ粒子は、インテグラーゼにおけるファージＰＰ７のコートタンパク質の挿入によって、１２回反復した、ファージＰＰ７のステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子である。
【０１００】
好ましくは、レンチウイルス粒子は、２〜２５回、より好ましくは２、６又は１２回反復した、バクテリオファージＭＳ２の又はＰＰ７ファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成される。
【０１０１】
さらにより好ましくは、本発明に係る粒子は、ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ  １２Ｘ、ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ  ６Ｘ、ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ  ２Ｘ、ＭＳ２（ＩＮ）−ＲＬＰ  １２Ｘ、ＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ  ６Ｘ及びＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ  ２Ｘから選択される。
【０１０２】
本発明はまた、本発明に係る粒子を含有する組成物に関する。
【０１０３】
より具体的には、本発明に係る組成物は、濃縮された組成物である。有利には、当該組成物はまた、精製される。これら組成物は、国際特許出願第２０１３／０１４５３７号に記載の方法に従って、濃縮及び精製されてもよい。
【０１０４】
典型的には、本発明に係る組成物は、粗上清に対して、３０％未満のＤＮＡ夾雑物及び４５％未満のタンパク質夾雑物を含む。より具体的には、本発明に係る組成物は、粗上清に対して、３０％未満のＤＮＡ夾雑物及び２％未満のタンパク質夾雑物を含む。
【０１０５】
「粗上清」とは、清澄化後に、本発明に係るレトロウイルス粒子を含む、細胞培養上清をいう。そのような清澄化ステップは、より具体的には、本発明に係る粒子の製造方法で後述する。上清の採取を数回行う場合、粗上清は、採取され、合わされ（又は「プールされ」）、次に清澄化された全ての上清に対応する。
【０１０６】
任意により、本発明に係る組成物は、粗上清に対して、１％未満のＤＮＡ夾雑物及び１％未満のタンパク質夾雑物を含む。
【０１０７】
本発明はまた、本発明に係る粒子の生産のためのキット、及びそれらキットの製造方法に関する。
【０１０８】
より具体的には、本発明は、本発明に係る粒子を生産するためのキットであって、以下：
（ｉ）少なくとも１つの目的の配列を含み、当該配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、
（ｉｉ）カプシド形成配列が認識されることを可能にする結合ドメインを含む、キメラである、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質及び／又はインテグラーゼをコードする、カプシド形成プラスミド、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む、キットに関する。
【０１０９】
そのようなキットはまた、キット中に含まれるプラスミドの使用のための指示書を含んでもよい。
【０１１０】
より具体的には、キットが第１の実施形態に係る粒子に関する場合、本キットは、以下：
（ｉ）少なくとも２つの異なる非ウイルス性ＲＮＡ配列を含む発現プラスミドであって、各ＲＮＡ配列が目的の配列を含み、当該目的の配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、第１及び第２の発現プラスミド、
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む。
【０１１１】
目的の配列が異なる、及び／又はカプシド形成配列が異なるために、少なくとも２つの非ウイルス性ＲＮＡ配列は異なっている。
【０１１２】
好ましくは、第１の実施形態に係る粒子を生産するキットは、以下：
（ｉ）少なくとも２つの目的の配列を含み、これら配列のそれぞれの上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、第１及び第２の発現プラスミド、
当該目的の配列が異なっており、かつ当該カプシド形成配列が同一であり、
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む。
【０１１３】
有利には；当該キットは、レンチウイルス粒子を生産する。
【０１１４】
好ましくは：
―発現プラスミドにおいて、カプシド形成配列は、ＭＳ２ステム−ループ配列の２〜２５の反復を含み、好ましくはステム−ループ配列の６〜１８の反復、さらにより好ましくは１０〜１４、例えば１２の反復を含む。有利には、ステム−ループ配列は、以下：ｃｔａｇａａａａｃａｔｇａｇｇａｔｃａｃｃｃａｔｇｔｃｔｇｃａｇ（配列番号１）である。
―カプシド形成プラスミドにおいて、ヌクレオカプシドタンパク質はＧａｇポリタンパク質に属するＨＩＶのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）であって、そのＮＣは、バクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質配列を挿入するために、第２のジンクフィンガーで突然変異している。
―エンベローププラスミドにおいて、エンベロープタンパク質は、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするタンパク質ＶＳＶ−Ｇである。
【０１１５】
あるいは、好ましくは：
―発現プラスミドにおいて、カプシド形成配列は、ＰＰ７ステム−ループ配列の２〜２５の反復を含み、好ましくはステム−ループ配列の２〜１８の反復、さらにより好ましくは２〜１２、例えば６の反復を含む。有利には、ステム−ループ配列は、以下：ｃｔａｇａａｇｇａｇｃａｇａｃｇａｔａｔｇｇｃｇｔｃｇｃｔｃｃｃｔｇｃａｇ（配列番号５）である。
―カプシド形成プラスミドにおいて、ヌクレオカプシドタンパク質は、Ｇａｇポリタンパク質に属するＨＩＶのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）であって、そのＮＣは、ファージＰＰ７のコートタンパク質配列を挿入するために、第２のジンクフィンガーで突然変異している。
―エンベローププラスミドにおいて、エンベロープタンパク質は、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするタンパク質ＶＳＶ−Ｇである。
【０１１６】
任意により、キットは、カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含む、キメラインテグラーゼをコードする、第２のカプシド形成プラスミドを含む。第２の結合ドメインは、キメラヌクレオカプシドタンパク質の結合ドメインと同一又は異なってもよい。
【０１１７】
異なる結合ドメインの例として：
―ヌクレオカプシドに導入される結合ドメインは、ＭＳ２のコートタンパク質であってもよく、かつインテグラーゼに導入される結合ドメインは、ＰＰ７のコートタンパク質であってもよく、あるいは
―ヌクレオカプシドに導入される結合ドメインは、ＰＰ７のコートタンパク質であってもよく、かつインテグラーゼに導入される結合ドメインは、ＭＳ２のコートタンパク質であってもよい。
【０１１８】
いくつかの結合ドメインが、キメラタンパク質のそれぞれに導入されてもよい。
【０１１９】
あるいは、キットが第２の実施形態に係る粒子に関する場合、本キットは、以下：
（ｉ）少なくとも１つの目的の配列を含み、当該配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラインテグラーゼをコードする、カプシド形成プラスミド、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む。
【０１２０】
本発明に係るキットを製造するための方法も提供される。典型的には、本発明に係るキットを製造するための方法は、以下：
（ｉ）少なくとも１つの目的の配列を含み、当該配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミドを調製し、
（ｉｉ）カプシド形成配列が認識されることを可能にする結合ドメインを含む、キメラである、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質及び／又はインテグラーゼをコードする、カプシド形成プラスミドを調製し、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
を含む。
【０１２１】
より具体的には、当該方法が、第１の実施形態に係る粒子に関するキットに関連する場合、当該方法は、以下：
【０１２２】
（ｉ）少なくとも２つの異なる非ウイルス性ＲＮＡ配列を含む発現プラスミドであって、各ＲＮＡ配列が目的の配列を含み、当該目的の配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、第１及び第２の発現プラスミド、を調製し、
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミドを調製し、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
を含む。
【０１２３】
目的の配列が異なる、及び／又はカプシド形成配列が異なるために、少なくとも２つの非ウイルス性ＲＮＡ配列は異なっている。
【０１２４】
好ましくは、本方法は、以下：
（ｉ）少なくとも２つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、これら配列のそれぞれの上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、第１及び第２の発現プラスミド、を調製し、
当該目的の配列が異なっており、かつ当該カプシド形成配列が同一であり、
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードする、カプシド形成プラスミドを調製し、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
を含む。
【０１２５】
あるいは、方法が、第２の実施形態に係る粒子に関するキットに関連する場合、本方法は、以下：
（ｉ）少なくとも１つの目的の配列を含み、当該配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミドを調製し、
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラインテグラーゼをコードする、カプシド形成プラスミドを調製し、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
を含む。
【０１２６】
本発明はまた、本発明に係る粒子を製造するための方法に関する。
【０１２７】
そのような方法は、以下：
（ｉ）少なくとも１つの目的の配列を含み、当該配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、
（ｉｉ）カプシド形成配列が認識されることを可能にする結合ドメインを含む、キメラである、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質及び／又はインテグラーゼをコードする、カプシド形成プラスミド、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を細胞にコトランスフェクトし、そして、
前記粒子を含むトランスフェクトされた細胞の上清を採取する、ステップ、
を含む。
【０１２８】
本発明に係る粒子の製造方法に用いられる細胞はプロデューサー細胞であり、すなわち、レトロウイルス粒子を形成するのに必要な遺伝物質を有するプラスミドで一度トランスフェクトされた細胞が、前記粒子の形成を可能にする。プロデューサー細胞の例として、ＨＥＫ２９３Ｔが挙げられる。
【０１２９】
「コトランスフェクトする（co-transfecting）ステップ」とは、粒子の製造方法のプラスミドの群と接触してプロデューサー細胞を配置することによって、トランスフェクションが実行される、トランスフェクトするステップを意味する。
【０１３０】
より具体的には、製造方法が第１の実施形態に係る粒子の生産に関する場合、当該方法は、以下：
（ｉ）少なくとも２つの異なる非ウイルス性ＲＮＡ配列を含む発現プラスミドであって、各ＲＮＡ配列が目的の配列を含み、当該目的の配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、第１及び第２の発現プラスミド、
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド，
を細胞にコトランスフェクトし、そして、
前記粒子を含むトランスフェクトされた細胞の上清を採取する、ステップ、
を含む。
【０１３１】
目的の配列が異なる、及び／又はカプシド形成配列が異なるために、少なくとも２つの非ウイルス性ＲＮＡ配列は異なっている。
【０１３２】
好ましくは、この粒子の製造方法は、以下：
（ｉ）少なくとも２つの目的の配列を含み、これら配列のそれぞれの上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、第１及び第２の発現プラスミド、
当該目的の配列が異なっており、かつ当該カプシド形成配列が同一であり、
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を細胞にコトランスフェクトし、そして
前記粒子を含むトランスフェクトされた細胞の上清を採取する、ステップ、
を含む。
【０１３３】
あるいは、当該製造方法が第２の実施形態に係る粒子の生産に関する場合、本方法は、以下：
（ｉ）少なくとも１つの目的の配列を含み、当該配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラインテグラーゼをコードする、カプシド形成プラスミド、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を細胞にコトランスフェクトし、そして
前記粒子を含むトランスフェクトされた細胞の上清を採取する、ステップ、
を含む。
【０１３４】
好ましくは、本発明に係る粒子を製造するための全ての方法は、国際特許出願第２０１３／０１４５３７号に記載された方法に従って行われる。
【０１３５】
より具体的には、粒子を製造するためのこれらの方法は、無血清培地で培養されたプロデューサー細胞で行われ、かつ、酪酸ナトリウムによる誘導は行われない。
【０１３６】
有利には、上清は数回、例えば３〜６回、特定の時間間隔で、例えばレトロウイルス粒子の半減期のオーダーの時間間隔で、回収される。典型的には、上清の採取は、４〜５回、６〜１８時間、好ましくは８〜１６時間、例えば８時間、１２時間及び／又は１６時間のオーダーの時間間隔で、行われる。好ましくは、この採取は、細胞の培地の交換後に行われ、この交換は好ましくはトランスフェクション後２４時間で行われる。
【０１３７】
本発明に係る粒子を製造するための方法はまた、上清が清澄化されるステップを含む。
【０１３８】
好ましくは、上清の清澄化は遠心分離機によって行われる。
【０１３９】
さらにより好ましくは、本発明に係る粒子を製造するこれらの方法はさらに、上清が濃縮及び／又は精製されるステップを含む。
【０１４０】
好ましくは、濃縮及び精製は、遠心分離ユニットでの正面(frontal)限外濾過によって行われる。
【０１４１】
有利には、上清は、１又は複数の追加の精製ステップを受ける。これら精製ステップは好ましくは、接線(tangential)限外濾過によって、及び／又は透析濾過によって行われる。さらにより好ましくは、上清は、接線限外濾過のステップに次いで、透析濾過のステップを受ける。
【０１４２】
接線限外濾過は有利には、ポリスルホン中空繊維カートリッジを用いて行われる。
【０１４３】
任意により、組成物は次に、イオン交換クロマトグラフィー、特に陰イオン交換クロマトグラフィーのステップを受けてもよい。次にこのクロマトグラフィーステップで得られた溶出液を回収し、次に中央遠心分離ユニットでの正面限外濾過によって再度濃縮する。そのような方法によって得られる組成物は、粗上清に対して、１％未満のＤＮＡ夾雑物及び１％未満のタンパク質夾雑物を含有する。
【０１４４】
本発明はまた、本発明に係る粒子の製造方法のいずれか１つによって得ることができる組成物に関する。
【０１４５】
典型的には、これら組成物は、粗上清に対して、３０％未満のＤＮＡ夾雑物及び４５％未満のタンパク質夾雑物を含有する。より具体的には、本発明に係る組成物は、粗上清に対して、３０％未満のＤＮＡ夾雑物及び２％未満のタンパク質夾雑物を含有する。
【０１４６】
任意により、本発明に係る組成物は、粗上清に対して、１％未満のＤＮＡ夾雑物及び１％未満のタンパク質夾雑物を含有する。
【０１４７】
最後に、本発明は、本発明に係る粒子の使用、又は細胞に形質導入するための本発明に係る組成物の使用に関する。
【０１４８】
本発明に係る粒子及び組成物の使用は、一時的に初代細胞及び不死化株を改変するために、初代細胞及び不死化株に形質導入するのに特に有利である。当該細胞は哺乳動物の細胞又は他の真核生物の細胞であってもよい。特に、これら細胞の形質導入はイン・ビボ、イン・ビトロ又はエクス・ビボで行われ得る。
【０１４９】
本発明は、それぞれ代表する図面を参照して、例示によって与えられた以下の例に照らしてより良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】図Ｉは、結合ドメインをインテグラーゼ配列に挿入するためのレンチウイルスカプシド形成プラスミドｐ８．７４の改変を示す図であり、このカプシド形成プラスミドは本発明に係るレンチウイルス粒子の生産に使用される；
【図２】図ＩＩは、目的のＲＮＡ配列として、ルシフェラーゼ（図ＩＩａ）、蛍光レポーター（図ＩＩｂ）又はＣＲＥ（図ＩＩｃ）を有する発現プラスミド構築についての異なる図を提示し、これら発現プラスミドは本発明に係るＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子の生産に使用される；
【図３ａ】図ＩＩＩは、ＭＳ２Ｃｏａｔ結合ドメインをヌクレオカプシド配列に挿入するための、レンチウイルスカプシド形成プラスミドｐ８．７４の改変（ＩＩＩａ）、及びそれらから得られるプラスミド構築（ＩＩＩｂ）を示す図を提示し、このカプシド形成プラスミドは本発明に係るＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子の生産に使用される；
【図３ｂ】図ＩＩＩは、ＭＳ２Ｃｏａｔ結合ドメインをヌクレオカプシド配列に挿入するための、レンチウイルスカプシド形成プラスミドｐ８．７４の改変（ＩＩＩａ）、及びそれらから得られるプラスミド構築（ＩＩＩｂ）を示す図を提示し、このカプシド形成プラスミドは本発明に係るＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子の生産に使用される；
【図４】図ＩＶは、エンベローププラスミド構築の図である；
【図５】図Ｖは、目的の配列として、ルシフェラーゼ（図Ｖａ）、蛍光レポーター（図Ｖｂ）又はＣＲＥ（図Ｖｃ）を有する、組み込みレンチウイルス発現プラスミド構築の異なる図を提示する；
【図６】図ＶＩは、カプシド形成プラスミドの構築の図であり、このカプシド形成プラスミドは組み込みレンチウイルスベクター（ＩＬＶ）の生産に使用される；
【図７】図ＶＩＩは、カプシド形成プラスミドの構築の図であり、このカプシド形成プラスミドは組み込み欠損（integration-deficient）レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）の生産に使用される；
【図８】図ＶＩＩＩは、レンチウイルスベクター（ＩＬＶ、ＩＤＬＶ）及び本発明に係るＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子によって形質導入された、ＨＣＴ１１６細胞におけるＺｓＧｒｅｅｎＩについての発現動態を示す；
【図９】図ＩＸは、レンチウイルスベクター（ＩＬＶ、ＩＤＬＶ）及び本発明に係るＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子によって形質導入されたＨＣＴ１１６細胞、並びにルシフェラーゼ発現プラスミド（ｐＬｕｃ）によってトランスフェクトされたＨＣＴ１１６細胞における、ルシフェラーゼの発現動態を示す；
【図１０】図Ｘは、ＩＬＶベクター及び本発明に係るＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子による包皮線維芽細胞の形質導入後の、ルシフェラーゼ発現の用量効果を示す；
【図１１】図ＸＩは、包皮線維芽細胞の形質導入に対する、本発明に係るＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子の組成物の純度（血清有り又は無しでの生産）の影響を示す；
【図１２】図ＸＩＩは、ＨＣＴ１１６細胞の形質導入に対する、本発明に係るＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子の組成物の純度（血清有り又は無しでの生産）の影響を示す；
【図１３】図ＸＩＩＩは、本発明に係るＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子及びＩＬＶベクターによる包皮線維芽細胞の形質導入時のＢＸ７９５の存在の影響を示す；
【図１４】図ＸＩＶは、本発明に係るＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子及びＩＬＶベクターによるＢＸ７９５細胞の形質導入時のＢＸ７９５の存在の影響を示す；
【図１５】図ＸＶ、ＸＶＩ及びＸＶＩＩは、本発明に係るＭＳ２ＲＬＰ粒子の、精製されたか否かの懸濁液、並びにＩＬＶベクターの精製懸濁液の注入後の、マウスにおけるイン・ビボでの生物発光によるルシフェラーゼの発現動態を示し、図ＸＶは所与の時間での各動物の写真を表し、図ＸＶＩ及びＸＶＩＩは、それらの時間でのルシフェラーゼ発現の測定値を表すグラフである；
【図１６】図ＸＶ、ＸＶＩ及びＸＶＩＩは、本発明に係るＭＳ２ＲＬＰ粒子の、精製されたか否かの懸濁液、並びにＩＬＶベクターの精製懸濁液の注入後の、マウスにおけるイン・ビボでの生物発光によるルシフェラーゼの発現動態を示し、図ＸＶは所与の時間での各動物の写真を表し、図ＸＶＩ及びＸＶＩＩは、それらの時間でのルシフェラーゼ発現の測定値を表すグラフである；
【図１７】図ＸＶ、ＸＶＩ及びＸＶＩＩは、本発明に係るＭＳ２ＲＬＰ粒子の、精製されたか否かの懸濁液、並びにＩＬＶベクターの精製懸濁液の注入後の、マウスにおけるイン・ビボでの生物発光によるルシフェラーゼの発現動態を示し、図ＸＶは所与の時間での各動物の写真を表し、図ＸＶＩ及びＸＶＩＩは、それらの時間でのルシフェラーゼ発現の測定値を表すグラフである；
【図１８】図ＸＶＩＩＩは、ＩＬＶベクター又は本発明に係るＭＳ２ＲＬＰ粒子で形質導入された、あるいはＣｒｅリコンビナーゼの発現を可能にするｐＣｒｅプラスミドでトランスフェクトされた、ＨＣＴ１１６−Ｌｏｘ−ｄｓＲｅｄ−Ｌｏｘ細胞における蛍光の消失を示す図である；
【図１９】図ＸＩＸは、ＩＬＶベクター又は本発明に係るＭＳ２ＲＬＰ粒子による形質導入後の、あるいはｐＣｒｅプラスミドでトランスフェクトされた、ＨＣＴ１１６−Ｌｏｘ−ｄｓＲｅｄ−Ｌｏｘ細胞におけるＣｒｅ  ＤＮＡのコピー数の定量化を示す図である；
【図２０】図ＸＸは、本発明に係るＭＳ２ＲＬＰ粒子による、ＨＣＴ１１６細胞におけるいくつかのＲＮＡ（ＲＮＡ  ＺｓＧｒｅｅｎｌ＋ｍＣｈｅｒｒｙ＋ｍｔＢＦＰ）の転移動態を示す；
【図２１】図ＸＸＩは、本発明に係るＭＳ２ＲＬＰ粒子又はＩＤＬＶベクターによる、ＨＣＴ１１６細胞におけるいくつかのＲＮＡ（ＲＮＡ  ＺｓＧｒｅｅｎｌ＋ｍＣｈｅｒｒｙ＋ｍｔＢＦＰ）の転移動態の比較を示す；
【図２２】図ＸＸＩＩは、ＩＬＶ組み込みベクターによる、ＨＣＴ１１６細胞におけるいくつかのＲＮＡ（ＲＮＡ  ＺｓＧｒｅｅｎｌ＋ｍＣｈｅｒｒｙ＋ｍｔＢＦＰ）の転移動態を示す；
【図２３】図ＸＸＩＩＩは、トランスフェクション後４８時間での、ＨＣＴ１１６細胞におけるＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ−１２Ｘ  ＺｓＧｒｅｅｎＩ粒子の生産のための方法の影響を示す；
【図２４】図ＸＸＩＶは、目的のＲＮＡ配列として、本発明に係る、２回反復したＭＳ２ステム−ループモチーフを含む、ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ  ２Ｘレンチウイルス粒子の生産のために使用されるルシフェラーゼを有する、発現プラスミドの図を提示する；
【図２５】図ＸＸＶは、目的のＲＮＡ配列として、本発明に係る、６回反復したＭＳ２ステム−ループモチーフを含む、ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ  ６Ｘレンチウイルス粒子の生産のために使用されるルシフェラーゼを有する発現プラスミドの図を提示する；
【図２６】図ＸＸＶＩは、目的のＲＮＡ配列として、本発明に係る、１２回反復したＭＳ２ステム−ループモチーフを含む、ＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子の生産のために使用されるルシフェラーゼを有する、発現プラスミドの図を提示する；
【図２７】図ＸＸＶＩＩは、１０ｐｇ  ｐ２４／細胞の用量で、本発明に係る、２回、６回又は１２回反復したＭＳ２ステム−ループモチーフを含む、ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ−Ｌｕｃレンチウイルス粒子によって形質導入された、ＨＣＴ１１６細胞におけるルシフェラーゼＲＮＡの転移動態を示す；
【図２８】図ＸＸＶＩＩＩは、図Ｉに記載されたインテグラーゼ配列中に結合ドメインを挿入するために、ｐ８．７４レンチウイルスカプシド形成プラスミドの改変によって得られた本発明に係るＭＳ２（ＩＮ）−ＲＬＰレンチウイルス粒子の生産に使用される、カプシド形成プラスミドの図を提示する；
【図２９】図ＸＸＩＸは、５ｐｇ  ｐ２４／細胞の用量で、本発明に係る、２回、６回又は１２回反復したＭＳ２ステム−ループモチーフを含むＭＳ２（ＩＮ）−ＲＬＰ−Ｌｕｃレンチウイルス粒子によって形質導入された、ＨＣＴ１１６細胞におけるルシフェラーゼＲＮＡの転移動態を示す；
【図３０】図ＸＸＸは、目的のＲＮＡ配列として、本発明に係る、１２回反復したＰＰ７ステム−ループモチーフを含む、ＰＰ７ＲＬＰレンチウイルス粒子の生産のために使用されるルシフェラーゼを有する発現プラスミドの図を提示する；
【図３１】図ＸＸＸＩは、ヌクレオカプシド配列中にＣｏａｔＰＰ７結合ドメインを挿入するための、ｐ８．７４レンチウイルスカプシド形成プラスミドの改変を示す図を提示する；
【図３２】図ＸＸＸＩＩは、本発明に係るＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰレンチウイルス粒子の生産に使用されるカプシド形成プラスミドの図を提示する；
【図３３】図ＸＸＸＩＩＩは、ＨＣＴ１１６細胞の形質導入に対する、本発明に係るＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ−Ｌｕｃ  １２Ｘ粒子の用量効果を示す；
【図３４】図ＸＸＸＩＶは、本発明に係るＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ  ２Ｘ又はＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ  ２Ｘ粒子の生産のための、ルシフェラーゼ（図ＸＸＸＩＶａ）又は蛍光レポーター（図ＸＸＸＩＶｂ）のための発現カセットを含む、２回反復したＰＰ７ステム−ループモチーフを有する発現プラスミドの図を提示する；
【図３５】図ＸＸＸＶは、本発明に係るＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ  ６Ｘ又はＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ  ６Ｘ粒子の生産のための、６回反復したＰＰ７ステム−ループモチーフを有する、ルシフェラーゼのための発現プラスミドの図を提示する；
【図３６】図ＸＸＸＶＩは、１０ｐｇ  ｐ２４／細胞の用量で、ＰＰ７ステム−ループモチーフが２回、６回又は１２回反復される、ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ−Ｌｕｃ粒子によって形質導入されたＨＣＴ１１６細胞におけるルシフェラーゼＲＮＡの転移動態を示す；
【図３７】図ＸＸＸＶＩＩは、インテグラーゼ配列中に結合ドメインを挿入するための、ｐ８．７４レンチウイルスカプシド形成プラスミドの改変の図を提示する；
【図３８】図ＸＸＸＶＩＩＩは、図ＸＸＸＶＩＩに示されたｐ８．７４レンチウイルスカプシド形成プラスミドを改変することによって得られた、本発明に係るＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰレンチウイルス粒子の生産のために使用される、カプシド形成プラスミドの図を提示する；
【図３９】図ＸＸＸＩＸは、２．８ｐｇ  ｐ２４／細胞の用量で、本発明に係る、２回、６回又は１２回反復されるＰＰ７ステム−ループモチーフを含むＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ−Ｌｕｃレンチウイルス粒子によって形質導入されたＲＮＡ  ＨＣＴ１１６細胞における、ルシフェラーゼの転移動態を示す；そして
【図４０】図ＸＬは、ＨＣＴ１１６細胞内への、ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ  ２Ｘ粒子による、ＺｓＧｒｅｅｎｌ＋ｍＣｈｅｒｒｙ＋ｍｔＢＦＰ  ＲＮＡの転移を示す。
【実施例】
【０１５１】
実施例１：  ＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子の構築
Ｉ．装置及び方法
１．プラスミド構築
１．１  ＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子の生産のためのプラスミド
目的の配列のための発現プラスミド：発現プラスミドは、ＲＮＡ安定化又はイントロン配列の有無に関わらず、プロモーター−目的の配列−ポリＡ発現カセットを有する（図ＩＩ参照）。レンチウイルス粒子にｍＲＮＡを輸送するために、ＭＳ２  ＲＮＡのステム−ループモチーフの１２の反復（ｃｔａｇａａａａｃａｔｇａｇｇａｔｃａｃｃｃａｔｇｔｃｔｇｃａｇ、配列番号１）を、レポーター遺伝子の下流の発現カセット内に挿入した。使用されるプロモーターは、ＣＭＶ（図ＩＩａ）又はＥＦ１（図ＩＩｂ及びＩＩｃ）のプロモーターであってもよいが、他のプロモーターが使用されてもよい。目的の配列は、レポータータンパク質、例えば天然のホタルルシフェラーゼ（図ＩＩａ）、緑色（ＺｓＧｒｅｅｎＩ）、赤色（ｍＣｈｅｒｒｙ）又は青色（ｍｔＢＦＰ）蛍光タンパク質（図ＩＩｂ）をコードするＤＮＡ、あるいはタンパク質、例えばＣＲＥタンパク質（図ＩＩｃ）をコードするｃＤＮＡであり得る。目的の配列はまた、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＬｎｃＲＮＡの配列又はｃｉｒｃＲＮＡの配列であってもよい。
【０１５２】
・カプシド形成プラスミド：レンチウイルス粒子を、第２のＺｎフィンガードメインの代わりに、及びそれに代えて、ヌクレオカプシドタンパク質内にバクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質配列を含むように改変した。ＭＳ２ＲＬＰ粒子の生産のために使用された、ｐ８．７４カプシド形成プラスミド（図ＩＩＩ）、構造的及び機能的タンパク質（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）をコードするキャリアを、図ＩＩＩａに示された戦略に従って改変する：このｐ８．７４プラスミドを使用して、ＰＣＲ構築によって、ｐ８．７４ΔＺＦヌクレオカプシドタンパク質の第２のジンクフィンガーを欠いたプラスミドを生成する。第２のジンクフィンガーは、ＨｐａＩクローニングによってファージＭＳ２のコートタンパク質で置換され、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔプラスミドを生成する。それによって図ＩＩＩｂに示された構築が得られる。Ｐｏｌをコードする配列は、ＭＳ２ＲＬＰの機能を変更することなく、例えば逆転写酵素（ＲＴ）又はインテグラーゼ（ＩＮ）をコードする配列のような、いくつかの機能的エレメントにおいて欠失又は突然変異していてもよい。
【０１５３】
・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：このプラスミドはエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を運び、それは水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶＧであり得る（図ＩＶ）。
【０１５４】
１．２  組み込みレンチウイルスベクターＩＬＶの生産のためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：発現プラスミドは、プロモーター−目的の配列発現カセットを運ぶ（図Ｖ）。このプラスミドは、ＷＰＲＥ天然配列（ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element)を意味するＷＰＲＥ）又はｃＰＰＴ／ＣＴＳ配列のような、他のエレメントを含んでもよい。ウイルスの病原性は、導入遺伝子によるレトロウイルス複製に必要とされるウイルスゲノムの領域の置換によって除去される。
【０１５５】
・カプシド形成プラスミド：ｐ８．７４、カプシド形成プラスミド（構造的及び機能的タンパク質（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）をコードする遺伝子のキャリアである）を、組み込みレンチウイルスベクターの生産に使用する（図ＶＩ）。
【０１５６】
・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：このプラスミドは、ＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子の生産に使用されたエンベローププラスミドと同一である（図ＩＶ）。
【０１５７】
１．３  組み込み欠損レンチウイルスベクターＩＤＬＶ：突然変異体Ｄ６４Ｌの生産のためのプラスミド
３のプラスミドは、カプシド形成プラスミドがインテグラーゼをコードするｐｏｌ配列のＤ６４Ｌ突然変異を含む以外は、ポイント１．２に記載したものと同一である（図ＶＩＩ）。単一アミノ酸上のこの突然変異は、組み込みの阻害を誘導する（Nightingaleら、２００６及びApoloniaら、２００７）。インテグラーゼ（ＩＮ）上でのＤ６４Ｌ突然変異は、部位特異的突然変異誘発によってｐ８．７４プラスミドに導入された。突然変異は配列決定によって確認した。
【０１５８】
１．４  ｐＬｕｃ及びｐＣｒｅプラスミド
これらの発現プラスミドは、対照のためにトランスフェクションに直接使用された、ＩＬＶ及びＩＤＬＶベクターの生産のために使用されたものと同様である（ｐＬｕｃについて図Ｖｂ、及びｐＣｒｅについて図Ｖｃ）。
【０１５９】
２．バッチ生産
細胞へのプラスミドのトランスフェクション後に、上清を採取し、粗生成物で、又は国際特許出願第２０１３／０１４５３７号に記載の方法に従って濃縮／精製して、使用した。
【０１６０】
２．１  レンチウイルスベクター及びレンチウイルス粒子の生産
５％ＣＯ2で湿潤雰囲気下、３７℃で、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１％ウルトラグルタミン(ultraglutamine)（ＰＡＡ）で補充した、ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium）（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ、ペイズリー、ＵＫ）で培養した、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１１２６８）を用いて、１０−スタックのＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（６３６０ｃｍ2、Corning）で、生産を行う。血清影響試験アッセイのために、ＤＭＥＭを１０％ＳＶＦで補充する。特に、酪酸ナトリウムによる誘導は行わない。各バッチについて（ＭＳ２ＲＬＰ、ＩＬＶ及びＩＤＬＶ）、トランスフェクション混合物は、以下の３つのプラスミドから構成される：
―形成されるものが粒子（ＭＳ２ＲＬＰ）であるかベクター（ＩＬＶ、ＩＤＬＶ）であるかに応じて、上述の発現プラスミドの１つ、
―ｐ８．７４ΔＺＦＣｏａｔ（ＭＳ２ＲＬＰ）、ｐ８．７４（ＩＬＶ）、又は位置Ｄ６４Ｌ（ＩＤＬＶ）で突然変異したｐ８．７４、並びに
―エンベロープＶＳＶ−Ｇを有するｐＥＮＶ。
【０１６１】
リン酸カルシウムによる標準的なトランスフェクション後２４時間、培養上清を新鮮な未補充ＤＭＥＭ培地で交換する。細胞を３７℃／５％ＣＯ2でインキュベートする。培地の交換後に、上清を４回採取する（トランスフェクション後３２時間、４８時間、５６時間及び７２時間）。各回収物を、０．４５μｍフィルターで（Stericup、Millipore）精密ろ過する前に、５分間の３０００ｇでの遠心分離によって清澄化する。次に全ての回収物をプールして、粗上清を構成する。
【０１６２】
２．２  レンチウイルスベクター及びレンチウイルス粒子の濃縮及び精製
ベクター及び粒子を以下の２つの方法に従って濃縮及び精製する：
・方法Ｐ１は、遠心分離中央ユニットでの上清の正面限外濾過の実施を対象とする。
・Ｐ２方法は、上清の接線限外濾過、次に透析濾過の実施を対象とする。粗上清を、ポリスルホン中空繊維カートリッジの使用による接線限外濾過によって、濃縮及び精製する。上清を、ＤＭＥＭ又はＴＳＳＭ緩衝液に対して連続モードで２０ダイアボリューム(diavolumes)での透析濾過によって処理する。透析濾過後に、保持液を回収し、次に中央遠心分離ユニットでの正面限外濾過によって再度濃縮する。
【０１６３】
３．滴定
３．１  ｑＰＣＲによる機能性粒子の滴定
ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２４７）を、１０％ＳＶＦ、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン(Stretomycin)、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び２ｍＭのＬ−Ｇｌｎで補充した、１００μＬのＤＭＥＭ中の９６−ウェルプレートに播種し、次に３７℃／５％ＣＯ2に２４時間インキュベートする。各ベクターについて、並びに内部キャリブレーション参照について６連希釈を行う。細胞を、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）８μｇ／ｍＬ(Sigma)の存在下で連続希釈によって形質導入し、次に、３７℃／５％ＣＯ2で３日間インキュベートする。試料の各シリーズについて、１つのウェルの非形質導入細胞を対照として加える。細胞を次にトリプシン処理し、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇＤＮＡ抽出キット（Macherey-Nagel）を用いてゲノムＤＮＡの抽出後に、力価（形質導入ユニット(Transduction Unit)／ｍＬ）をｑＰＣＲによって決定する。ｑＰＣＲによって得られた力価（ＴＵ／ｍＬ）を、その力価がＦＡＣＳによって予め決定された内部キャリブレーション参照によって正規化する。
【０１６４】
３．２  Ｐ２４  Ｅｌｉｓａ試験による物理的粒子の量子化
ＨＩＶ−１  ｐ２４  ＥＬＩＳＡキット(Perkin Elmer)を用いて推奨に従って、ウイルス上清中にｐ２４カプシドタンパク質を直接検出する。捕捉されたｐ２４タンパク質をビオチン化ポリクローナル抗体と複合体化し、次にストレプトアビジン−ＨＲＰペルオキシダーゼコンジュゲートによって検出する。得られた複合体を、捕捉されたｐ２４の量に直接比例する黄色の発色を生じる基質オルト−フェニレンジアミン−ＨＣｌ（ＯＰＤ）とのインキュベーション後に、分光光度法によって検出する。各ウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダーＳｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１  Ｈｙｂｒｉｄ(Biotek)を用いて定量化し、ｐ２４タンパク質キャリブレーション参照範囲の吸光度に対して較正する。ｍＬ当たりの物理的粒子で発現されたウイルス力価を、１ｐｇのｐ２４タンパク質が１０4個の物理的粒子に対応することを知って得られたｐ２４タンパク質濃縮物から計算する。
【０１６５】
４．モノ形質導入(Monotransduction)
本実施例は、レンチウイルスベクター又は上記で生産されたレンチウイルス粒子によるモノ形質導入のための条件の開発に関する。
【０１６６】
５．ＺｓＧｒｅｅｎＩについての発現動態
２４−ウェルプレート(Corning)に２５０００細胞／ｃｍ2で前日に播種したＨＣＴ１１６細胞を、８μｇ／ｍＬのＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）の存在下で１０００００ＰＰ／細胞に形質導入する。形質導入後８時間及び２４時間で、細胞をトリプシン処理し、フローサイトメトリーによって分析して、蛍光細胞のパーセンテージを測定する。各アッセイを三連で実施する。
【０１６７】
６．ルシフェラーゼについての発現動態
６．１  ＨＣＴ１１６細胞
ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２４７）を６又は２４−ウェルプレートに播種し、３７℃／５％ＣＯ2で２４時間インキュベートする。ＩＬＶ若しくはＩＤＬＶベクター又はＭＳ２ＲＬＰ粒子による形質導入を、４μｇ／ｍＬのＰｏｌｙｂｒｅｎｅの存在下で行う。形質導入上清を４時間後に除去し、新鮮な補充した増殖培地で置き換える。形質導入後４時間〜２４時間で、細胞を採取し、供給者の推奨に従ってキットＯｎｅＧｌｏルシフェラーゼアッセイ(Promega)を使用して、及びＳｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１  Ｈｙｂｒｉｄマイクロプレートリーダー(Biotek)を使用して、ルシフェラーゼの発現を分析する。この試験は三連で実施される。並行して、ＨＣＴ１１６細胞をｐＬｕｃプラスミドでトランスフェクトする。このために、５００００個のＨＣＴ１１６細胞を、ＰＥＩ  ＰＲＯ（登録商標）(Polyplus Transfection)を用いて、２．６μｇのｐＬｕｃプラスミドでトランスフェクトする。
【０１６８】
６．２  包皮線維芽細胞
６−ウェルプレート(Corning)中に１０，０００細胞／ｃｍ2で前日に播種した包皮線維芽細胞を、４μｇ／ｍＬのＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）の存在下で形質導入する。細胞を、ＭＳ２ＲＬＰ−Ｌｕｃにより２０００００及び５０００００ＰＰ／細胞に、又はＬｕｃ組み込みレンチウイルスベクターによりＭＯＩ５で、形質導入した。
【０１６９】
ＭＳ２ＲＬＰ−Ｌｕｃによって形質導入された細胞を形質導入後８時間でトリプシン処理し、不透明な黒底９６−ウェルプレートの１００μＬの完全培地中に移す。ＩＬＶ  Ｌｕｃによって形質導入された細胞を形質導入後２４時間でトリプシン処理し、不透明な黒底９６−ウェルプレートの１００μＬの完全培地中に移す。ルミノメーターで読み取る３分前に、１００μＬの試薬Ｏｎｅ  Ｇｌｏルシフェラーゼ(Promega)をウェル毎に添加して、分析する。
【０１７０】
６．３マウスにおいて
イン・ビボでの生物発光によるルシフェラーゼについての発現動態測定を行った。
【０１７１】
３つのグループのＢａｌｂ／ｃ雄マウス：精製したｒＬＶ−ＥＦ１−Ｌｕｃ組み込み型レンチウイルスの懸濁液を受けた第１のグループ（ｎ＝２）、Ｐ２方法に従って生産されたＭＳ２ＲＬＰ−Ｌｕｃ粒子の懸濁液を受けた第２のグループ（ｎ＝４）、及び方法Ｐ１に従って生産されたＭＳ２ＲＬＰ−Ｌｕｃ粒子の懸濁液を受けた最後のグループ（ｎ＝４）、を比較した。非注入動物は、バックグラウンドノイズを決定するための陰性対照としての役割を果たした。
【０１７２】
全身注射後５時間〜２４時間（図ＸＶ Ａ）、及び４８時間〜１６８時間（図ＸＶ Ｂ）で測定を実施する。ルシフェラーゼの発現の各測定を、Ａｎｄｏｒカメラ及びＳｏｌｉｓイメージングソフトウェアを用いて、３００ｍｇ／ｋｇのＤ−ルシフェリン(Promega)の腹腔内注射後１５分で行った。捕捉時間は５分であり、得られた画像を処理してＩｍａｇｅＪソフトウェアで正規化した。図ＸＶは、所与の時間での各動物の画像を示す。グラフ（図ＸＶＩ及びＸＶＩＩ）は、これらの時間での相対発光単位（ＲＬＵ）におけるルシフェラーゼ発現の測定値を表す。
【０１７３】
７．形質導入のための粒子の純度の影響
７．１  包皮線維芽細胞
２４−ウェルＣｅｌｌＢｉｎｄ(Corning)中に１００００細胞／ｃｍ2で前日に播種した包皮線維芽細胞を、４μｇ／ｍＬのＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）の存在下で形質導入する。細胞を、２種類の品質の上清：血清の存在下で生産され、次にＰ２方法で得られたバッチ、に対して、血清を含まずに生産され、次にＰ２方法で得られたバッチ、を用いて、５０００００ＰＰ／細胞で形質導入した。形質導入後８時間に、細胞をトリプシン処理し、不透明な黒底９６−ウェルプレートの１００μＬの完全培地中に移す。ルミノメーターでの読み取りの３分前に、１００μＬの試薬Ｏｎｅ  Ｇｌｏルシフェラーゼ(Promega)をウェル毎に添加して、分析する。
【０１７４】
７．２  ＨＣＴ１１６細胞
２４−ウェルＣｅｌｌＢｉｎｄ(Corning)中に２５０００細胞／ｃｍ2で前日に播種した細胞を、４μｇ／ｍＬのＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）の存在下で形質導入する。細胞を、２種類の品質の上清：血清の存在下で生産され、次にＰ１方法で得られたバッチ、に対して、血清を含まずに生産され、次にＰ１方法で得られたバッチ、を用いて、１０００００ＰＰ／細胞で形質導入した。形質導入後８時間に、細胞をトリプシン処理し、不透明な黒底９６−ウェルプレートの１００μＬの完全培地中に移す。ルミノメーターでの読み取りの３分前に、１００μＬの試薬Ｏｎｅ  Ｇｌｏルシフェラーゼ(Promega)をウェル毎に添加して、分析する。
【０１７５】
８．ＢＸ７９５の影響
８．１  包皮線維芽細胞
６−ウェルＣｅｌｌＢｉｎｄ(Corning)中に１０，０００細胞／ｃｍ2で前日に播種した包皮線維芽細胞を、４μｇ／ｍＬのＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）の存在下で形質導入する。細胞を、ＭＳ２ＲＬＰ粒子について５０００００ＰＰ／細胞、及びＩＬＶについてＭＯＩ  ５に形質導入した。形質導入後８時間で、細胞をトリプシン処理し、不透明な黒底９６−ウェルプレートの１００μＬの完全培地中に移す。ルミノメーターでの読み取りの３分前に、１００μＬの試薬Ｏｎｅ  Ｇｌｏルシフェラーゼ(Promega)をウェル毎に添加して、分析する。
【０１７６】
８．２  ＨＣＴ１１６細胞
６−ウェルＣｅｌｌＢｉｎｄ(Corning)中に２５，０００細胞／ｃｍ2で前日に播種したＨＣＴ１１６細胞を、４μｇ／ｍＬのＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）の存在下で形質導入する。細胞を、ＭＳ２ＲＬＰについて１０００００ＰＰ／細胞、及びＩＬＶについてＭＯＩ  ５に形質導入した。形質導入後８時間で、細胞をトリプシン処理し、不透明な黒底９６−ウェルプレートの１００μＬの完全培地中に移す。ルミノメーターでの読み取りの３分前に、１００μＬの試薬Ｏｎｅ  Ｇｌｏルシフェラーゼ(Promega)をウェル毎に添加して、分析する。
【０１７７】
９．ＣＲＥリコンビナーゼのイン・ビトロ発現
第１のフェーズでは、ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２４７）を、４μｇ／ｍＬのＰｏｌｙｂｒｅｎｅの存在下でＭＯＩ２０で、ＩＬＶ−ＥＦ１−Ｌｏｘ−ｄｓＲｅｄ−Ｌｏｘレンチウイルスベクターによって形質導入する。６日後、このポリクローナル集団を、ウェル当たり０．５細胞の比率で９６−ウェルプレートに細胞を播種することによる限界希釈を用いてクローニングする。ＨＣＴ１１６−ｌｏｘ−ｄｓＲｅｄ−ｌｏｘ−ｃｌｏｎｅ  １４モノクローナル株を、ｄｓＲｅｄの発現レベルに基づいて、サイトメトリーによって選択した（MACS Quant VYB、Miltenyi）。
【０１７８】
第２のフェーズでは、ポリクローナル及びモノクローナル細胞株を、４μｇ／ｍＬのＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）の存在下で、ＭＯＩ  ５でのＩＬＶ−Ｃｒｅベクター、又は２5物理的粒子(Physical Particles)（ＰＰ）／細胞の用量でのＭＳ２ＲＬＰ−Ｃｒｅ粒子により、形質導入した。
【０１７９】
ＭＳ２ＲＬＰ−Ｃｒｅ粒子により、又はＩＬＶ−Ｃｒｅベクターにより形質導入されたＨＣＴ１１６−Ｌｏｘ−ｄｓＲｅｄ−Ｌｏｘモノクローナル及びポリクローナル細胞を、３７℃／５％ＣＯ2で１４日間インキュベートした。形質導入後１４日に、ｄｓＲｅｄの発現をフローサイトメトリーにより分析する。非形質導入細胞（ＮＴ）は対照の役割を果たす。このアッセイは三連で実施される。並行して、ＨＣＴ１１６−Ｌｏｘ−ｄｓＲｅｄ−Ｌｏｘモノクローナル及びポリクローナル細胞をｐＣｒｅプラスミドによってトランスフェクトした。このために、５００００  ＨＣＴ１１６−Ｌｏｘ−ｄｓＲｅｄ−Ｌｏｘ細胞を、ＰＥＩ  ＰＲＯ（登録商標）(Polyplus Transfection)を用いて、２．６μｇのｐＣｒｅプラスミドでトランスフェクトする。
【０１８０】
ＩＬＶ−Ｃｒｅベクターにより、又はＭＳ２ＲＬＰ−Ｃｒｅ粒子により形質導入されたか、あるいはｐＣＲＥプラスミドによりトランスフェクトされた、ＨＣＴ１１６−Ｌｏｘ−ｄｓＲｅｄ−Ｌｏｘ細胞からのＤＮＡの抽出後に、細胞内に組み込まれたコピーの数を、Ｃｒｅリコンビナーゼの短い配列：
ｇｃａｔｔｔｃｔｇｇｇｇａｔｔｇｃｔｔａｔａａｃａｃｃｃｔｇｔｔａｃｇｔａｔａｇｃｃｇａａａｔｔｇｃｃａｇｇａｔｃａｇｇｇｔｔａａａｇａｔａｔｃｔｃａｃｇｔａｃｔｇａｃｇｇｔｇｇｇａｇａａｔ（配列番号２）
以下の対のｑＰＣＲオリゴヌクレオチドを有する：
Ｑ−ＣＲＥ−Ｆ：  ５’−  ＧＣＡＴＴＴＣＴＧＧＧＧＡＴＴＧＣＴＴＡ−３’（配列番号３）
Ｑ−ＣＲＥ−Ｒ：  ５’−  ＡＴＴＣＴＣＣＣＡＣＣＧＴＣＡＧＴＡＣＧ−３’（配列番号４）、
を検出することによって、ｑＰＣＲにより測定する。
【０１８１】
ＩＩ．結果
１．レンチウイルス粒子生産レベル
第１のアッセイは、ＭＳ２ＲＬＰ粒子及びＩＤＬＶ又はＩＬＶベクターのそれぞれの生産レベルを比較することからなる。各タイプの粒子のバッチを生産し、粒子の力価をＰ２４  Ｅｌｉｓａ試験によって測定した。結果を以下の表１に示す：
【０１８２】
【表１】
2018516558.tif 000002
【０１８３】
これらの結果は、接線限外濾過の同一技術によって濃縮された後に、３つのタイプの粒子が同等の力価（ＰＰ／ｍｌ  ＋／−）を示すことを示している。それゆえ、カプシド形成の改変又はインテグラーゼの突然変異は、レンチウイルス粒子の生産不足につながらない。
【０１８４】
２．標的細胞における発現動態
試験の第１シリーズは、長い半減期を特徴とする緑色蛍光タンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎＩ）をコードするシングルタイプのＲＮＡを運ぶＭＳ２ＲＬＰ粒子を用いて行われた。ＭＳ２ＲＬＰ粒子により得られた結果を図ＶＩＩＩに提示し、ＲＮＡの転移が（形質導入後８時間のように）早期に検出されることを示している。得られた結果は、ＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子、あるいはＩＬＶ又はＩＤＬＶ−Ｄ６４Ｌレンチウイルスベクターによって２４時間で、同程度のパーセンテージの陽性ＨＣＴ１１６細胞を示す。陽性細胞のパーセンテージは、ＭＳ２ＲＬＰ粒子について８時間の時点で、ただしＩＬＶ及びＩＤＬＶ−Ｄ６４Ｌベクターについては２４時間の時点で検出可能である。したがって、これらＭＳ２ＲＬＰ粒子は機能的であり、コーディング配列を細胞集団内に導入するためのＩＬＶ又はＩＤＬＶ−Ｄ６４Ｌの能力と同等の能力を示す。
【０１８５】
組み込みレンチウイルスシステムの場合、ＲＮＡはＲＴによってレトロ転写(retrotranscribed)される。次に、宿主細胞ゲノムへのその組み込みの前に、ｃＤＮＡが核内に移行される。このステップ以後にのみ、導入遺伝子の転写、次に翻訳が行われる。非組み込みレンチウイルスシステム（ＩＮ上の突然変異）の場合、ＲＮＡはＲＴによってレトロ転写される。次に、ｃＤＮＡが核内に移行された後に、ＲＮＡに転写され、次にタンパク質として翻訳される。
【０１８６】
これらすべての中間ステップが存在しないために、ＭＳ２ＲＬＰ粒子のみが、導入遺伝子の早期発現が可能である。送達されたＲＮＡは、細胞機構によって直接タンパク質として翻訳される。
【０１８７】
試験の第２のシリーズは、短い半減期を特徴とするルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードするシングルタイプのＲＮＡを運ぶＭＳ２ＲＬＰ粒子を用いて行われた。ＭＳ２ＲＬＰ粒子により得られた結果を図ＩＸに提示し、ルシフェラーゼの最適活性が早期に検出されることを示している。
【０１８８】
ルシフェラーゼの発現は一過性であり、それは８時間〜２４時間に次第に減少した。対照的に、蛍光の発現は検出可能なままであるか、又はさらにこのタイプの動態にわたって安定なままである。これらの結果は、使用されたレポータータンパク質の半減期を考慮しなければならない。レポーター遺伝子の検出がこの半減期に比例していることは明らかである。半減期が長いほど、タンパク質に関連する活性は長くなる。
【０１８９】
図Ｘにおいて、ルシフェラーゼ発現強度が形質導入に使用されるＰＰ／細胞比に応じて変化することを観察することも可能である。この用量効果は、特に包皮線維芽細胞において示されている。
【０１９０】
したがって、生物学的活性をもたらすことができる有意なレベルの発現を誘導するために、形質導入する細胞に適用するためのＭＳ２ＲＬＰ粒子の高用量を達成できることが重要である。粒子の濃度は成功のための重要な因子であると考えられる。包皮線維芽細胞において、高用量、すなわち５０００００ＰＰ／細胞での粒子によって誘導されたルシフェラーゼの発現は、５の感染多重度（ＭＯＩ）で従来の組み込みレンチウイルスベクターにより得られた発現と同等である。ＭＳ２ＲＬＰ粒子によるＨＣＴ１１６の形質導入のための最適用量の決定を、５００００、１０００００及び２０００００ＰＰ／細胞の用量を試験することによって、包皮線維芽細胞と同一の条件下で行った。選択された用量は、最良のルシフェラーゼＲＮＡ転移が得られる、１０００００ＰＰ／細胞である。結果は、形質導入方法が標的細胞の許容性に応じて適合されなければならないことを示している。
【０１９１】
これらの結果を、注入後５時間でルシフェラーゼ発現の検出を示すＭＳ２ＲＬＰ−Ｌｕｃ粒子のイン・ビボ注入のアッセイによって確認する。
【０１９２】
３．形質導入効果に対する、ＭＳ２ＲＬＰ粒子の懸濁液の生産及び純度の影響
標的細胞タイプに従って、運ばれたＲＮＡを発現する多数の細胞を得るために、粒子の用量を増加できることが重要である。国際特許出願第２０１３／０１４５３７号に示されたように、精製された粒子を用いて標的細胞の生存率に影響することなく粒子の用量を増加することが可能である。実際のところ、レンチウイルス粒子のバッチの最終純度は、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）の存在によって影響を受ける。
【０１９３】
ルシフェラーゼ発現に対するＭＳ２ＲＬＰ粒子の懸濁液の純度の影響を評価するために、本発明者らは、以下の２つのタイプの上清バッチの純度の関数としてルシフェラーゼ発現を比較した：
―血清を用いて生産したＭＳ２ＲＬＰ粒子から濃縮した上清、
―血清を含まずに生産したＭＳ２ＲＬＰ粒子から濃縮した上清。
【０１９４】
この試験は、ＨＣＴ１１６許容不死化細胞（図ＸＩＩ）、及び、より許容性でなく、かつ繊細な初代細胞、包皮線維芽細胞（図ＸＩ）の両方に対して行った。
【０１９５】
得られた結果は、バッチの純度が、高用量での繊細な初代細胞の形質導入の効果に高い影響を有することを示す。５０００００ＰＰ／細胞において、ルシフェラーゼの活性は血清を含まないバッチにより約８０％増加しているので、純度の影響は多大である（図ＸＩ）。ＦＣＳの存在下では、対照的に、発光発現が減少している。
【０１９６】
非常に耐性のＨＣＴ１１６不死化細胞に対して、純度の影響はルシフェラーゼの活性について検出できない（図ＸＩＩ）。対照的に、血清の存在下で生産されたバッチは、血清を含まずに生産されたバッチよりも非常に弱い再現性を示す、不均一な結果を示す。それゆえ、この結果は、血清の非存在下で粒子のバッチを生産する選択を正当化する。
【０１９７】
これらアッセイは、細胞及び組織レベルで表現型の誘導と適合する高レベルの発現を得るために、これらレンチウイルス粒子を濃縮する必要性を示し、さらに、遺伝子転移の有効性に対するこれらバッチの純度の影響を示している。
【０１９８】
４．ＭＳ２ＲＬＰ粒子による遺伝子転移のための最適条件の同定
ＲＮＡ転移の有効性を高めるために、ナチュラルキラーＮＫ細胞の形質導入有効性を高める、Ｓｕｔｌｕら（２０１２）によって得られた結果を置き換えた。より具体的には、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）及び／又はＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）に基づく抗ウイルス応答が、特定の細胞におけるＲＮＡ転移の有効性を制限し得る、という仮説を立てた。この仮説を試験するために、ＭＳ２ＲＬＰ粒子を細胞に接触させて配置する間に、小さなシグナル伝達分子のＴＬＲ及びＲＬＲの阻害剤を使用した。ＢＸ７９５分子はＢＫ１／ＩＫＫε複合体の阻害剤であり、それはＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ−５、及びＴＬＲ３のシグナル伝達経路における共通のメディエーターとして作用する。
【０１９９】
６μＭの濃度でのＢＸ７９５分子の使用は、ＨＣＴ１１６細胞（図ＸＩＶ）及び包皮線維芽細胞（図ＸＩＩＩ）の形質導入の有効性をかなり高める。観察時間（ＭＳ２ＲＬＰ粒子について８時間、ＩＬＶについて２４時間）は、各粒子の機能を考慮する（図ＶＩＩＩ及びＩＸ）。包皮線維芽細胞におけるようにＨＣＴ１１６細胞においてＭＳ２ＲＬＰ粒子とＢＸ７９５の使用との間に相乗効果を観察することができるが、一方でＢＸ７９５はこれら２つの細胞タイプにおいて組み込みレンチウイルスベクターＩＬＶに負の影響を誘導する。この影響は、これら２つのタイプの粒子によって送達されるＲＮＡ分子の数の差につながり得る。
【０２００】
５．イン・ビボでのルシフェラーゼＭＳ２ＲＬＰ粒子による遺伝子転移の研究
ＭＳ２ＲＬＰ−Ｌｕｃ粒子のイン・ビボでの注入は、全身注入した様々なマウス器官における導入遺伝子、本件の場合はルシフェラーゼの、発現動態を明らかにすることを対象とする。精製したＩＬＶ−ＥＦ１−Ｌｕｃ組み込みベクターの懸濁液を陽性対照として使用する。測定を注入後５時間及び７日までの時点で行う。静脈内投与は、注入された懸濁液の希釈、従って、考慮すべき生物発光シグナルの分散を引き起こす。それゆえ、全身のシグナルの分布を考慮するために、分析は動物全体に対して行う。血清の存在下で方法Ｐ１に従って生産されたＭＳ２ＲＬＰ−Ｌｕｃ粒子の懸濁液、及びＰ２方法に従って精製したＭＳ２ＲＬＰ−Ｌｕｃ粒子の懸濁液を試験する。精製がより低い血清の存在下でのｐ２方法に従ったＭＳ２ＲＬＰ−Ｌｕｃ粒子の懸濁液の注入は、サンプリング及び注入の両方に困難をもたらした。実際のところ、血清の存在下でＰ１方法によって得られたＭＳ２ＲＬＰ−Ｌｕｃ粒子のこの懸濁液は、高い粘度の褐色懸濁液を特徴とし、イン・ビボ注入に使用される２９Ｇ針でのサンプリングが特に困難である。この困難は、懸濁液の尾静脈への送達時に発生する。血清の存在下でＰ１方法によって得られたＭＳ２ＲＬＰ−Ｌｕｃ粒子の懸濁液の使用は、動物の尾部領域に（すなわち注入部位に）局在するようになり、かつ動物の全身循環を通過しない、粒子の貧しい投与をもたらした（図ＸＶ Ａ）、Ｈ５及びＨ８時間のグループ「血清の存在下でＰ１方法に従って生産されたＭＳ２ＲＬＰ−Ｌｕｃ」）。それゆえ、血清の存在下でＰ１方法によって得られたＭＳ２ＲＬＰ−Ｌｕｃ粒子の懸濁液は、イン・ビボ研究には使用することができない。
【０２０１】
ＭＳ２ＲＬＰ−Ｌｕｃ粒子の精製懸濁液の通常投与は、注入後５時間で８１８ＵＬＲのルシフェラーゼ発現を引き起こすことが可能であった。このシグナルは８時間の時点でまだ見られるが、その後の時点で消失する（図ＸＶ Ａ、ＸＶＩ及びＸＶＩＩ）、「精製されたＭＳ２ＲＬＰ−Ｌｕｃ」グループ）。生物発光シグナルは主に肝臓及び脾臓に見られる（図ＸＶ Ａ）、「精製されたＭＳ２ＲＬＰ−Ｌｕｃ」グループ）。比較すると、５時間で、これらの短時間では逆転写及び組み込み不完全であるため、ＩＬＶ−ＥＦ１−Ｌｕｃ組み込みウイルスベクターの精製懸濁液を受けた動物で測定された輝度は有意ではない。対照的に、初期段階で（注入後５時間）、ＭＳ２ＲＬＰ−Ｌｕｃ粒子の精製懸濁液で得られたシグナルは有意であり、ＩＬＶ−ＥＦ１−Ｌｕｃ組み込みウイルスベクターの精製懸濁液で得られたシグナルよりも２倍高い発現レベルを達成する。５時間後に、ＭＳ２ＲＬＰ−Ｌｕｃ粒子の精製懸濁液は、１６８時間後のＩＬＶ−ＥＦ１−Ｌｕｃ組み込みウイルスベクターの精製懸濁液のものと同等の発現レベルを達成する（図ＸＶ Ｂ及びＸＶＩ）グループ「精製したＩＬＶ−ＥＦ１−Ｌｕｃ」。ＭＳ２ＲＬＰ−Ｌｕｃ粒子の精製懸濁液は、レンチウイルス形質導入組み込みメカニズムから得られる発現レベルと同等の、イン・ビボでの最適化された一過性発現を得ることを可能にする。細胞のゲノムへの導入遺伝子の非組み込みのために、発現は一過性である。したがって濃縮／精製の方法は、イン・ビボ注入後に有効なＭＳ２ＲＬＰ粒子の懸濁液を得ることを可能にする。
【０２０２】
異なる粒子の機能性の比較
ＨＣＴ１１６−Ｌｏｘ−ｄｓＲｅｄ−Ｌｏｘ細胞を、前もって、以下の配列：ＥＦ１−Ｌｏｘ−ＤｓＲｅｄ−Ｌｏｘ、を有するレンチウイルスベクターを組み込むことによる形質導入によって、生成した。ポリクローナル蛍光株を得た後に、モノクローナル株を限界希釈によって得た。組み込まれたＬｏｘ−ＤｓＲｅｄ−Ｌｏｘ配列のコピー数は、ポリクローナル及びモノクローナル株におけるｑＰＣＲによって定量化されることに留意すべきである。組み込まれたコピー数は、平均でポリクローナル株について６、及びモノクローナル株について１３コピーである。
【０２０３】
これら２つの株を、Ｃｒｅリコンビナーゼ酵素をコードする配列を運ぶＭＳ２ＲＬＰ粒子によって形質導入した。並行して、これらＨＣＴ１１６−Ｌｏｘ−ｄｓＲｅｄ−Ｌｏｘ細胞を、同一のＣｒｅ配列を運ぶＩＬＶレンチウイルスベクターによって形質導入した。
【０２０４】
ＭＳ２ＲＬＰ−Ｃｒｅ粒子、ＩＬＶ−Ｃｒｅベクターによって形質導入された、ＨＣＴ１１６−Ｌｏｘ−ｄｓＲｅｄ−Ｌｏｘモノクローナル及びポリクローナル細胞を、サイトメーター分析の前に、３７℃／５％ＣＯ2で１４日間インキュベートした。フローサイトメトリーによる蛍光細胞のパーセンテージの定量化の結果を、図ＸＶＩＩＩに示す。結果は、ＭＳ２ＲＬＰ−Ｃｒｅ粒子と接触して配置されたポリクローナル及びモノクローナル集団内で、蛍光が実質的に消失したことを示している。実際のところ、蛍光細胞のパーセンテージは、１００％から１０％未満まで推移した。結果は、ＩＬＶ−Ｃｒｅ組み込みベクター（１５％減少）で、並びにプラスミドのトランスフェクションの条件（減少無し）において、より効果的でなかった。
【０２０５】
ＭＳ２ＲＬＰ−Ｃｒｅ粒子により、ＩＬＶ−Ｃｒｅベクターにより、又はｐＣｒｅプラスミドによって、ＨＣＴ１１６細胞中にＣＲＥリコンビナーゼをコードする核酸の転移後の組み込みイベントを検証した。そのために、本発明者らは、ＩＬＶベクター、ＭＳ２ＲＬＰ粒子又はＣＲＥタンパク質をコードするプラスミドと接触して配置されたＨＣＴ１１６−Ｌｏｘ−ｄｓＲｅｄ−Ｌｏｘ細胞において、異なるタイプの粒子及びプラスミドによって運ばれたゲノムの残存コピー数を定量化した。そのために、野生型及び改変されたＨＣＴ１１６細胞のＤＮＡの全体を、形質導入の６日及び１４日後に調製し、ＣＲＥリコンビナーゼをコードするＤＮＡをｑＰＣＲによって測定した。
【０２０６】
図ＸＩＸに示された結果は、組み込みレンチウイルスベクターによる組み込みイベントの数が、６日目で細胞当たり４コピーであることを示している。この数は使用した感染多重度（ＭＯＩ）と一致している。トランスフェクション対照は、細胞中に存在するプラスミドの検出に対応する、６日目での多数のＤＮＡコピーを示し、次に、標的細胞のゲノムへのプラスミドの組み込みが存在しないために、１４日目でＣｒｅＤＮＡのコピーの完全な消失を示す。
【０２０７】
ＭＳ２ＲＬＰ粒子では、組み込みイベントは検出されていない。実際のところ、発現は逆転写酵素又はＬＴＲ末端に依存しないので、これら粒子は標的細胞の内側にＲＮＡを送達し、当該ＲＮＡは直接タンパク質に翻訳されるか、又は細胞の核へとタンパク質によって取り込まれるかのいずれかであり、かつ、ＤＮＡ種を生成しない。
【０２０８】
実施例２：ＭＳ２ＲＬＰ粒子での単一形質導入によるいくつかの異なるＲＮＡの転移
Ｉ．装置及び方法
１．モノ−及びトリ−形質導入
本実施例は、単一タンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎＩ、ｍＣｈｅｒｒｙ又はｍｔＢＦＰ）の発現を可能にするシングルタイプのＲＮＡの転移、又はいくつかの異なるタンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎＩ＋ｍＣｈｅｒｒｙ＋ｍｔＢＦＰ）の発現を可能にするいくつかのタイプのＲＮＡの転移のいずれかを可能にする、ＭＳ２ＲＬＰ粒子又はＩＤＬＶベクターを用いて行う。
【０２０９】
ＭＳ２ＲＬＰ粒子及び非組み込みレンチウイルスベクターＩＤＬＶを、以下の条件で生産する：
―カプシド形成及びエンベローププラスミドに加えて、（実施例１に記載のように）ＺｓＧｒｅｅｎＩ、又はｍＣｈｅｒｒｙ、又はｍｔＢＦＰのいずれかをコードする単一発現プラスミドによる、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによって、粒子を生産する、
―カプシド形成及びエンベローププラスミドに加えて、単一発現プラスミドでの粒子生産に使用される発現プラスミドの総量と同等の、発現プラスミドの総量のために、等モル量で加えた、ＺｓＧｒｅｅｎＩ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びｍｔＢＦＰをそれぞれコードする３つの発現プラスミドによる、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによって、粒子を生産する。
【０２１０】
ＨＣＴ１１６粒子を、以下のいずれかにより、ＭＳ２ＲＬＰ粒子によって形質導入した：
―独立してＭＳ２ＲＬＰ粒子ＺｓＧｒｅｅｎＩ、ｍＣｈｅｒｒｙ又はｍｔＢＦＰの３タイプでの形質導入により、
―ＺｓＧｒｅｅｎＩ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びｍｔＢＦＰを同時にコードする３つの発現プラスミドを用いて生産された粒子でのモノ−形質導入により。
【０２１１】
並行して、ＨＣＴ１１６細胞を、以下のいずれかにより、ＩＤＬＶベクターによって形質導入する：
―独立してＩＤＬＶベクターＺｓＧｒｅｅｎＩ、ｍＣｈｅｒｒｙ又はｍｔＢＦＰの３つのタイプでの形質導入により、
―同時にＺｓＧｒｅｅｎＩ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びｍｔＢＦＰをコードする３つの発現プラスミドを用いて生産されたＩＤＬＶベクターでのモノ−形質導入により。
【０２１２】
蛍光細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって定量化した。
【０２１３】
ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２４７）を９６−ウェルプレートに播種し、３７℃／５％ＣＯ2で２４時間インキュベートする。ＭＳ２ＲＬＰ粒子又はＩＤＬＶベクターによる形質導入を、４μｇ／ｍＬのＰｏｌｙｂｒｅｎｅの存在下で行う。形質導入後異なる時点（８時間、２４時間及び４８時間）で、細胞を採取し、ＺｓＧｒｅｅｎＩ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びｍｔＢＦＰを発現する細胞のパーセンテージをサイトメトリー（Macs Quant VYB、Miltenyi Biotec）によって定量化する。細胞防御機構阻害剤である、ＢＸ７９５(InvivoGen)を、６μＭの濃度で使用する。各アッセイを三連で行う。
【０２１４】
ＩＩ．結果
１．ＭＳ２ＲＬＰ粒子での単一形質導入におけるいくつかの異なるＲＮＡを転移する能力
以下のアッセイの目的は、いくつかの異なるＲＮＡを標的細胞に転移させるＭＳ２ＲＬＰ粒子の能力を実証し、従って標的細胞に対する形質導入の数の削減を可能にすることである。したがって、ＲＮＡ種ごとに１つの形質導入を行うようにさせるよりもむしろ、単一形質導入でいくつかの異なるＲＮＡを転移させることを可能にする。このために、本発明者らは、実施例１で定義した最適条件下でＭＳ２ＲＬＰ粒子の３つの精製バッチを生成した、すなわち国際特許出願第２０１３／０１４５３７号に記載の方法に従って血清を含まずに生産した精製バッチを生成した。ＭＳ２ＲＬＰ粒子の生産フェーズにおいて、いくつかの異なるタイプのＲＮＡを含むＭＳ２ＲＬＰ粒子のバッチを得るために、カプシド形成及びエンベローププラスミドと共に、蛍光レポーターをコードする３つのタイプのプラスミドを等モル量で同時に使用した（ＺｓＧｒｅｅｎＩ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びｍｔＢＦＰ）。次に、ＨＣＴ１１６細胞をＢＸ７９５の存在下で形質導入し、異なるＲＮＡの転移を形質導入後８時間、２４時間及び４８時間で観察する。
【０２１５】
図ＸＸは、２つの異なる用量（１０００００ＰＰ／細胞及び３０００００ＰＰ／細胞）でのＭＳ２ＲＬＰ粒子によるＨＣＴ１１６細胞の単一形質導入後の、あるいは、３０００００ＰＰ／細胞の最終用量での実施例１に従って生産されたＺｓＧｒｅｅｎＩ又はｍＣｈｅｒｒｙ又はｍｔＢＦＰを発現するＭＳ２ＲＬＰ粒子の３つ同時の形質導入後の、緑色、赤色及び青色のトリ−蛍光（tri-fluorescent）細胞の割合を示す。
【０２１６】
８時間で単一蛍光又は発光タンパク質の発現を検出することが可能であることを示す実施例１の結果とは対照的に、１０００００ＰＰ／細胞の用量で、形質導入後８時間での３つの蛍光の発現は検出できない。しかしながら、４８％の細胞が、形質導入後２４時間でトリ−蛍光性である。このトリ−蛍光細胞の割合は増加し、形質導入後４８時間で６０％に達する。したがって、結果は、ＭＳ２ＲＬＰ粒子が標的細胞の単一形質導入で少なくとも３タイプのＲＮＡを輸送及び転移させることができることを示している。
【０２１７】
ＭＳ２ＲＬＰ粒子の用量の増加は、特に形質導入後４８時間で、トリ−蛍光細胞（図ＸＸ、３０００００ＰＰ／細胞）の数の減少につながることが観察されているので、細胞当たりの粒子の最適用量の決定は重要である。正確には、３０００００ＰＰ／細胞でのトリ−蛍光細胞の割合が形質導入後８時間で、１０００００ＰＰ／細胞よりもわずかに多いが（５％のトリ−蛍光細胞）、トリ−蛍光細胞の割合は、形質導入後２４時間で４８％から４０％のトリ−蛍光細胞へと減少し始める。この使用された２つの用量の間での転移有効性の違いは全て、形質導入後４８時間でより大きい：実際のところ、１０００００ＰＰ／細胞の用量について６０％のトリ−蛍光細胞に対するように、４３％のトリ−蛍光細胞が３０００００ＰＰ／細胞の用量について観察される。
【０２１８】
並行して、実施例１に従って個々に生産されたＭＳ２ＲＬＰ粒子のバッチでのＨＣＴ１１６細胞の３つ同時の形質導入を行った。使用された用量は各タイプの蛍光について１０００００ＰＰ／細胞、すなわち３０００００ＰＰ／細胞の総量である。結果は、１つのＲＮＡ種のみを運ぶ粒子の３つ同時の形質導入によって得られたトリ−蛍光細胞のパーセンテージが、３種のＲＮＡを運ぶ粒子による単一形質導入によって誘導されたものよりも小さいことを示す。実際のところ、わずか７％のトリ−蛍光細胞が形質導入後８時間で検出され、次に形質導入後２４時間で２０％のトリ−蛍光細胞、すなわち、１０００００ＰＰ／細胞での単一形質導入により得られたレベルのわずか４２％、及び３０００００ＰＰ／細胞での単一形質導入により得られたレベルの５０％；そして最後に、形質導入後４８時間で２３％のトリ−蛍光細胞、すなわち１０００００ＰＰ／細胞での単一形質導入により得られたパーセンテージの３８％、及び３０００００ＰＰ／細胞での単一形質導入により得られたパーセンテージの５４％、が検出される。結論として、トリ−形質導入は、３つ同時の形質導入によって得られたパーセンテージと同じくらい高い、三色（tri-colored）細胞のパーセンテージを得ることができない。
【０２１９】
ＭＳ２ＲＬＰ粒子の同一のバッチの単一形質導入における異なるタイプのＲＮＡの転移能力の発覚は、標的細胞へのこれら異なるＲＮＡの同時の転移に対する著しい進歩を表す。このＭＳ２ＲＬＰ粒子の新たな特性は、実行する形質導入の数の最適化を直接もたらし、非常に多数の形質導入によって、並びに非常に多量の粒子と接触して細胞を配置することの両方によって、標的細胞の生存率を低下させないことを可能にする。
【０２２０】
２．ＩＤＬＶベクターとの比較
上記ポイント１と同一のアッセイを、並行して別のタイプの粒子：インテグラーゼコーディング配列（ＩＤＬＶ）上の位置６４における突然変異による組み込み欠損である、ウイルスベクター、で再現した。
【０２２１】
図ＸＸＩは、３０００００ＰＰ／細胞の総用量で実施例１に従って生産されたＺｓＧｒｅｅｎＩ又はｍＣｈｅｒｒｙ又はｍｔＢＦＰを発現するＩＤＬＶベクターによるＨＣＴ１１６細胞の３つの形質導入との比較での、３発現プラスミドＺｓＧｒｅｅｎＩ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びｍｔＢＦＰで生産されたＭＳ２ＲＬＰ粒子によるＨＣＴ１１６細胞の単一形質導入後の、緑色、赤色及び青色のトリ−蛍光細胞の割合を示す。
【０２２２】
ＭＳ２ＲＬＰ粒子について使用された用量と同一の用量で、単一形質導入を行うことを可能にするために、ＩＤＬＶベクターをＭＳ２ＲＬＰ粒子と同一の条件で生産する。１０００００ＰＰ／細胞の用量で単一形質導入後２４時間で、トリ−蛍光細胞の割合は、ＭＳ２ＲＬＰ粒子によって得られた割合と比較して、ＩＤＬＶベクターの使用の場合にわずかに大きい（それぞれ５６％及び４８％）。この傾向は、１０００００ＰＰ／細胞の用量で単一形質導入後４８時間で確認される（それぞれ８０％及び６０％）。
【０２２３】
形質導入後２４時間で、ＩＤＬＶベクターによるＨＣＴ１１６細胞の単一形質導入は、ＩＤＬＶベクターによるトリ−形質導入後に得られたものと同等の三色細胞のパーセンテージをもたらす。この傾向は、２つの形質導入方法間で最小の差異を有して、形質導入後４８時間で安定なままである（トリ−形質導入について７１％に対して、単一形質導入について８１％）。したがって、ＭＳ２ＲＬＰ粒子で得られた結果に反して、３発現プラスミドで生産されたＩＤＬＶベクターは、トリ−形質導入と比較して、それらの形質導入の時点で三色細胞のパーセンテージの顕著な増加を可能にしない。ＭＳ２ＲＬＰ粒子のこの利点はおそらく、ＩＤＬＶ又はＩＬＶよりも多くのＲＮＡ分子をカプシド形成するそれらの能力によって説明される（厳密には２分子のみをカプシド形成する）。したがって、いくつかのレンチウイルス粒子による同一細胞の形質導入を必要としないので、３の異なる導入遺伝子の発現は促進される。
【０２２４】
また、形質導入後８時間でのトリ−蛍光細胞のパーセンテージは、３つの形質導入の場合又はモノ−形質導入の場合の３０００００ＰＰ／細胞でのＩＤＬＶベクターにより唯一検出可能であることに留意されたい。対照的に、３０００００ＰＰ／細胞では、ＭＳ２ＲＬＰ粒子は、形質導入後８時間でトリ−蛍光細胞が検出されることを可能にする（図ＸＸ）。
【０２２５】
ＩＤＬＶベクターによる３つのモノ−形質導入の場合、トリ−蛍光細胞の割合は、１０００００ＰＰ／細胞でのＭＳ２ＲＬＰ粒子の単一形質導入の場合よりも（それぞれ２４時間及び４８時間のトリ−蛍光細胞）、３つの形質導入後２４時間及び４８時間でわずかに大きい（それぞれ６０％及び７０％のトリ−蛍光細胞）。この転移の差は、ＭＳ２ＲＬＰ粒子についての最適用量よりも３倍大きい、ＩＤＬＶベクターに使用される用量について約２０％であることに留意することが重要である。
【０２２６】
さらに、ＩＤＬＶ粒子は、組み込み欠損ではあるが、標的細胞のゲノムにおける残基組み込み（residual integrations）を避けることができない（Nightingaleら、２００６及びApoloniaら、２００７）。これにより、残基組み込みイベントの確率は、使用されるＩＤＬＶ粒子の用量と共に増加する。それゆえ、ＭＳ２ＲＬＰ粒子の使用は、それらの性質により、どの組み込みが使用されても、残基組み込みが完全に存在しないことによってこの制約を避けることはできない。
【０２２７】
３．ＩＬＶベクターとの比較
図ＸＸ及びＸＸＩＩは、トリ−形質導入、対、単一形質導入の定量的影響を確認することを可能にする条件（非飽和条件）における、２つのウイルスＲＮＡ分子のカプシド形成の特徴である、ＭＳ２ＲＬＰ粒子及びＩＬＶベクターについての形質導入プロファイルを示す。
【０２２８】
ＩＬＶベクターによるＨＣＴ１１６細胞の形質導入、形質導入後２４時間での観察（図ＸＸＩＩ）
異なる蛍光タンパク質をそれぞれコードする異なるベクターのバッチの使用を含むＭＯＩ５でのＩＬＶベクターによる細胞のトリ−形質導入は（ＭＯＩ最終＝３＊５＝１５）、３色発現細胞の７．５％を得ることを可能にする。比較として、同一の用量（ＭＯＩ１５）での単一形質導入は、３色を発現するわずか０．８％の細胞を得ることを可能にする。したがって、３色発現細胞のパーセンテージはトリ−形質導入と単一形質導入との間で減少するので、それゆえ、単一形質導入はＩＬＶの使用に最も適合した方法ではない。
【０２２９】
この差異は他の用量でも確認される。ＭＯＩ２０で異なる蛍光タンパク質をそれぞれコードする異なるベクターのバッチの使用を含むベクターによる細胞のトリ−形質導入は（ＭＯＩ最終＝３＊２０＝６０）、３色発現細胞の約７５％を得ることを可能にするが、ＭＯＩ６０での単一形質導入では、わずか３８％の細胞が３色を発現する。
【０２３０】
使用されたＩＬＶ用量が最適用量を超えて、例えばＭＯＩ１２０に増加した場合であっても、ＩＬＶの単一形質導入は、ＭＯＩ１２０でのトリ−形質導入において得られる３色発現細胞のパーセンテージも（６１．７％対８３．３％）、ＭＯＩ６０でのトリ−形質導入において得られる３色発現細胞のパーセンテージも（６１．７％対７５．６％）、達成することができない。
【０２３１】
使用されたＭＯＩ５、１０、２０、６０は、測定すべき実際の形質導入の差異を測定することを可能にする、非飽和形質導入条件での動作を可能にする。
【０２３２】
ＭＳ２ＲＬＰ粒子によるＨＣＴ１１６細胞の形質導入、形質導入後２４時間での観察（図ＸＸ）
ＭＳ２ＲＬＰ粒子の各バッチについて１０ｐｇ／細胞の用量で異なる蛍光タンパク質をそれぞれコードする異なるベクターのバッチの使用を含む、ＭＳ２ＲＬＰ粒子による細胞のトリ−形質導入（最終用量＝３＊１０ｐｇ＝３０ｐｇ／細胞）は、３色発現細胞の２０％を得ることを可能にする。同一の用量（３０ｐｇ／細胞）でのＭＳ２ＲＬＰ粒子による細胞の単一形質導入に関して、これは３色発現細胞の２倍の数、すなわち４０％を得ることを可能にする。したがって、３色発現細胞のパーセンテージはトリ−形質導入と単一形質導入との間で２倍になるので、それゆえ、単一形質導入はＭＳ２ＲＬＰ粒子の使用に最も適合した方法である。この結果はＩＬＶベクターにより得られた結果の反対である。
【０２３３】
したがって、ＭＳ２ＲＬＰ粒子は、ＩＬＶベクターの使用によって得られる異なる形質導入プロファイルを示し、それはベクター又は粒子の形成のモードの違いによって説明される。実際のところ、ＭＳ２ＲＬＰ粒子は、非ウイルス性ＲＮＡのためのそれらの異種リクルートメント(recruitment)システムによってＩＬＶベクターとは異なる。ＩＬＶ組み込みレンチウイルスベクターの場合、Ｐｓｉ配列によって媒介されるカプシド形成システムによるリクルートメントは、粒子中のＲＮＡウイルス分子の数を２つに制限する。ＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子中のＲＮＡ分子の数の定量化の本発明者らの結果は、平均して、６ＲＮＡ分子がＭＳ２ＲＬＰ粒子中にカプシド形成されることを推定した。これらの差分カプシド形成は、ＩＬＶとＭＳ２ＲＬＰとの間の複数配列による形質導入の差異を説明し得る。
【０２３４】
さらに、最適使用用量である１０ｐｇ／細胞での単一形質導入におけるＭＳ２ＲＬＰ粒子により、４８％の細胞が３色を発現して得られるが、一方で、３倍多い用量でのトリ−形質導入においては（すなわち３０パッセージ(passage)／細胞）、わずか２０％の細胞が３色を発現して得られる、すなわち２．５倍少ない細胞が３色を発現する。
【０２３５】
結論として、これら最後の結果は、ＭＳ２ＲＬＰ粒子のみが、組み込みイベントを誘導することなく形質導入後又は注入後短時間（５〜８時間）で、単一組成物の粒子に基づいて、２種を超えるＲＮＡを標的細胞に導入することができることを示している。
【０２３６】
実施例３：実施例１に記載の方法Ｐ１又はＰ２に従って生産されたＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎ粒子によるＨＣＴ１１６細胞の形質導入有効性の比較
Ｉ．装置及び方法
本実施例は、単一タンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎＩ）に対する発現を認めるシングルタイプのＲＮＡの転移を可能にするＭＳ２ＲＬＰ粒子を用いて実行する。
【０２３７】
粒子を、カプシド形成及びエンベローププラスミドに加えて、（実施例１に記載のように）ＺｓＧｒｅｅｎＩをコードする単一発現プラスミドでのＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによって生産し、そして実施例１に記載の生産方法Ｐ１又はＰ２に続く。
【０２３８】
ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２４７）を９６−ウェルプレートに５０００小細胞（cellules）／ｃｍ2で播種し、２４時間３７℃／５％ＣＯ2でインキュベートする。
【０２３９】
ＭＳ２ＲＬＰ粒子による形質導入を、異なる量のＭＳ２ＲＬＰ粒子／細胞（（１０、２０及び３０ｐｇ  ｐ２４／細胞）を用いて、４μｇ／ｍＬのＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）の存在下で実行する。形質導入後４８時間で、細胞を採取し、ＺｓＧｒｅｅｎＩを発現する細胞のパーセンテージ並びに蛍光強度をサイトメトリー（Macs Quant VYB、Miltenyi Biotec）によって定量化する。細胞防御阻害機構、ＢＸ７９５(InvivoGen)を６μＭの濃度で使用する。各アッセイを三連で行う。
【０２４０】
ＩＩ．結果
本アッセイの目的は、方法Ｐ１又はＰ２に従って生産されたＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎ粒子によるＨＣＴ１１６細胞の形質導入の有効性を比較することである。図ＸＸＩＩＩに示された結果は、どの生産方法が使用されても形質導入された細胞のパーセンテージは同一であるため、ＲＮＡ転移能力は生産方法による影響を受けないことを示している。しかしながら、導入遺伝子の発現のみが生産方法による影響を受ける。実際のところ、精製された粒子は、ＭＳ２ＲＬＰ粒子のどの用量が使用されても、目的のタンパク質の最も高い発現レベルを得ることを可能にする。
【０２４１】
実施例４：ヌクレオカプシドを改変することによるＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子の構築、及びＭＳ２  ＲＮＡのステム−ループモチーフの反復の数の試験
Ｉ．装置及び方法
１．プラスミド構築
・目的の配列のための発現プラスミド：発現プラスミドは、ＲＮＡ安定化又はイントロン配列の有無に関わらず、プロモーター−目的の配列−ポリＡ発現カセットを有する（図ＩＩ参照）。レンチウイルス粒子にｍＲＮＡを輸送するために、ＭＳ２  ＲＮＡのステム−ループモチーフのいくつかの反復（ｃｔａｇａａａａｃａｔｇａｇｇａｔｃａｃｃｃａｔｇｔｃｔｇｃａｇ、配列番号１）を、レポーター遺伝子の下流の発現カセット内に挿入した：
―２の反復（図ＸＸＩＶ）
―６の反復（図ＸＸＶ）
―１２の反復（図ＸＸＶＩ）
【０２４２】
選択された目的の配列は天然ホタルルシフェラーゼの配列である。
【０２４３】
・カプシド形成プラスミド：カプシド形成プラスミドは、実施例１に記載のものである（図ＩＩＩｂ）。
【０２４４】
・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：カプシド形成プラスミドは、実施例１に記載のものである（図ＩＶ）。
【０２４５】
２．レンチウイルス粒子の生産、濃縮／精製及び滴定
レンチウイルス粒子を実施例１に記載のように生産し、実施例１に記載のように方法Ｐ１に従って濃縮及び精製する。
【０２４６】
３．ルシフェラーゼについての発現動態
ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２４７）を９６−ウェルプレートに播種し、２４時間３７℃／５％ＣＯ2でインキュベートする。ＭＳ２ＲＬＰ２Ｘ、６Ｘ、１２Ｘ粒子による形質導入を、１００  ０００ＰＰ／細胞（１０ｐｇ  ｐ２４／細胞）の用量で、４μｇ／ｍＬのＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）の存在下で行う。形質導入上清を４時間後に除去し、新鮮な補充した増殖培地で置き換える。形質導入後４時間、８時間、２４時間、３２時間、及び４８時間で、細胞を採取し、供給業者の推奨に従ってキットＯｎｅＧｌｏルシフェラーゼアッセイ(Promega)を使用して、及びＳｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１  Ｈｙｂｒｉｄマイクロプレートリーダー(Biotek)を使用して、ルシフェラーゼの発現を分析する。各試験を三連で実施する。対照は非形質導入ＨＣＴ１１６細胞によって行われる。
【０２４７】
ＩＩ．結果
結果を図ＸＸＶＩＩに示す。本アッセイの目的は、送達するＲＮＡの発現レベルが影響を受けることなく、発現プラスミド上のＭＳ２配列の反復モチーフの数を削減することが可能であると確認することである。ルシフェラーゼの発現動態は、４時間〜８時間に発光シグナルの増加を示し、短い半減期を有するタンパク質の場合、反復されるＭＳ２配列のモチーフの数がいくつであっても、最大発現は早期に達成されることを示している。８時間後、ルシフェラーゼの活性は、４８時間で形質導入後４時間と同一のレベルを達成するまで減少する（１００００〜２００００ＵＲＬ）。ＭＳ２配列の２及び６反復モチーフを有する構築は、経時的に同一のルシフェラーゼ発現プロファイルを示す。しかしながら、ＭＳ２配列の１２反復モチーフを有する構築によるルシフェラーゼの発現は、２又は６反復モチーフを有する構築よりも３０％高い。それゆえ、ＭＳ２ＲＬＰ粒子は、どのような反復モチーフの数を使用しても、ＲＮＡを送達するのに有効である。用途に応じて、ＭＳ２モチーフの反復の数は適合されなければならないであろう。
【０２４８】
実施例５：ルシフェラーゼを改変することによるＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子の構築、及びＭＳ２  ＲＮＡのステム−ループモチーフの反復の数についての試験
Ｉ．装置及び方法
１．プラスミド構築
・目的の配列のための発現プラスミド：発現プラスミドは、ＲＮＡ安定化又はイントロン配列の有無に関わらず、プロモーター−目的の配列−ポリＡ発現カセットを有する（図ＩＩ参照）。レンチウイルス粒子にｍＲＮＡを輸送するために、ＭＳ２  ＲＮＡのステム−ループモチーフのいくつかの反復（ｃｔａｇａａａａｃａｔｇａｇｇａｔｃａｃｃｃａｔｇｔｃｔｇｃａｇ、配列番号１）を、レポーター遺伝子の下流の発現カセット内に挿入した：
―２の反復（図ＸＸＩＶ）
―６の反復（図ＸＸＶ）
―１２の反復（図ＸＸＶＩ）
【０２４９】
使用されたプロモーターはＣＭＶ（図ＩＩａ）又はＥＦ１（図ＩＩｂ）のプロモーターであってもよいが、他のプロモーターが使用されてもよい。目的の配列は、レポータータンパク質、例えば天然ホタルルシフェラーゼ（図ＩＩａ）、緑色（ＺｓＧｒｅｅｎＩ）、赤色（ｍＣｈｅｒｒｙ）又は青色（ｍｔＢＦＰ）蛍光タンパク質（図ＩＩｂ）をコードするＤＮＡ、あるいはタンパク質、例えばＣＲＥタンパク質をコードするｃＤＮＡ（図ＩＩｃ）であり得る。目的の配列はまた、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＬｎｃＲＮＡの配列又はｃｉｒｃＲＮＡの配列であってもよい。
【０２５０】
・カプシド形成プラスミド：レンチウイルス粒子を、インテグラーゼ内に、バクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質の配列を含むように改変した。ＭＳ２ＲＬＰ粒子の生産に使用されたｐ８．７４カプシド形成プラスミド（図ＶＩ）、構造的及び機能的タンパク質（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）をコードする遺伝子のキャリアを、図Ｉに示した戦略に従って改変する：このｐ８．７４プラスミドを使用して、ＰＣＲ構築により、ファージＭＳ２のコートタンパク質がインテグラーゼのＣ−末端ドメインとマージされている、プラスミドを生成する。ＨｐａＩクローニングによって得られるこのマージは、線状Ｃｏａｔｐ８．７４−ＰＯＬ−ＭＳ２プラスミドを生成することを可能にする（図ＸＸＶＩＩＩ）。したがって、図Ｉに示したように構築が得られる（ｐ８．７４．ＩＮ−ｃｏａｔ）。Ｐｏｌコーディング配列は、例えば逆転写酵素（ＲＴ）をコードする配列のような、特定の機能的エレメントにおいて欠失又は突然変異していてもよい。
【０２５１】
・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：このプラスミドはエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を運び、それは水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶＧであり得る（図ＩＶ）。
【０２５２】
２．レンチウイルス粒子の生産、濃縮／精製及び滴定
レンチウイルス粒子を実施例１に記載のように、Ｐ１方法に従って生産する。
【０２５３】
３．ルシフェラーゼについての発現動態
ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２４７）を９６−ウェルプレートに播種し、２４時間３７℃／５％ＣＯ2でインキュベートする。Ｐ１方法に従って生産されたＭＳ２（ＩＮ）−ＲＬＰ２Ｘ、６Ｘ、１２Ｘ粒子による形質導入を５ｐｇ  ｐ２４／細胞の用量で、８μｇ／ｍＬのＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）の存在下で行う。形質導入上清を４時間後に除去し、新鮮な補充した増殖培地で置き換える。形質導入後４時間、８時間、２４時間、３２時間、及び４８時間で、細胞を採取し、供給業者の推奨に従ってキットＯｎｅＧｌｏルシフェラーゼアッセイ(Promega)を使用して、及びＳｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１  Ｈｙｂｒｉｄマイクロプレートリーダー(Biotek)を使用して、ルシフェラーゼの発現を分析する。この試験は三連で実施される。対照は非形質導入ＨＣＴ１１６細胞によって行われる。
【０２５４】
ＩＩ．結果
結果を図ＸＸＩＸに示す。本アッセイの目的は、インテグラーゼ中にＭＳ２−Ｃｏａｔを有するレンチウイルス粒子内にＲＮＡを転移させること、並びに、送達するＲＮＡの発現レベルが影響を受けることなく、発現プラスミド上のＭＳ２配列の反復モチーフの数を削減することが可能であると確認することである。ルシフェラーゼの最大発現は、ＭＳ２配列の反復モチーフの数がいくつであっても、早期に達成される。ルシフェラーゼ発現動態の最も強い発光シグナルは４時間及び２４時間までの時点で得られる。２４時間後、ルシフェラーゼ活性は、４／８／２４時間での条件よりも２〜４倍弱いシグナルに達するまで低下する。したがってＭＳ２（ＩＮ）−ＲＬＰ粒子は、ＭＳ２配列の反復モチーフの数がいくつであっても、ＲＮＡを送達することを可能にする。
【０２５５】
実施例６：ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰレンチウイルス粒子の構築、及びＨＣＴ１１６細胞の形質導入に対するＰＰ７ＲＬＰ粒子の用量効果についての試験
Ｉ．装置及び方法
１．プラスミド構築
１．１  ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ  Ｌｕｃ  １２Ｘレンチウイルス粒子の生産のためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：発現プラスミドは、ＲＮＡ安定化又はイントロン配列の有無に関わらず、プロモーター−目的の配列−ポリＡ発現カセットを有する（図ＸＸＸ参照）。レンチウイルス粒子にｍＲＮＡを輸送するために、ＰＰ７  ＲＮＡのステム−ループモチーフの１２の反復（ｃｔａｇａａｇｇａｇｃａｇａｃｇａｔａｔｇｇｃｇｔｃｇｃｔｃｃｃｔｇｃａｇ  配列番号５）を、レポーター遺伝子の下流の発現カセット内に挿入した。
【０２５６】
使用されたプロモーターはＣＭＶ又はＥＦ１のプロモーターであってもよいが（図ＸＸＸ）、他のプロモーターが使用されてもよい。目的の配列は、レポータータンパク質、例えば天然ホタルルシフェラーゼ（図ＩＩａ）、緑色（ＺｓＧｒｅｅｎＩ）、赤色（ｍＣｈｅｒｒｙ）又は青色（ｍｔＢＦＰ）蛍光タンパク質（図ＩＩｂ）をコードするＤＮＡ、あるいはタンパク質、例えばＣＲＥタンパク質をコードするｃＤＮＡ（図ＩＩｃ）であり得る。目的の配列はまた、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＬｎｃＲＮＡの配列又はｃｉｒｃＲＮＡの配列であってもよい。
【０２５７】
・カプシド形成プラスミド：レンチウイルス粒子を、第２のＺｎフィンガードメインの代わりに、及びそれに代えて、ヌクレオカプシドタンパク質内にバクテリオファージＰＰ７のコートタンパク質配列を含むように改変した。ＰＰ７ＲＬＰ粒子の生産に使用されたｐ８．７４カプシド形成プラスミド、構造的及び機能的タンパク質（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）をコードする遺伝子のキャリアを、図ＸＸＸＩに示された戦略に従って改変する：このｐ８．７４プラスミドを使用して、ＰＣＲ構築によって、ｐ８．７４ΔＺＦヌクレオカプシドタンパク質の第２のジンクフィンガーを欠いたプラスミドを生成する。第２のジンクフィンガーはＨｐａＩクローニングによってファージＰＰ７のコートタンパク質で置換され、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＰＰ７−Ｃｏａｔプラスミドを生成する。それによって図ＸＸＸＩＩに示された構築が得られる。Ｐｏｌをコードする配列は、ＰＰ７ＲＬＰの機能を変更することなく、例えば逆転写酵素（ＲＴ）又はインテグラーゼ（ＩＮ）をコードする配列のようないくつかの機能的エレメントにおいて欠失又は突然変異していてもよい。
【０２５８】
・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：このプラスミドはエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を運び、それは水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶＧであり得る（図ＩＶ）。
【０２５９】
１．２  ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ  Ｌｕｃ  １２Ｘレンチウイルス粒子の生産のためのプラスミド
使用されたプラスミドは、実施例１で使用したプラスミドと同一である。
【０２６０】
２．レンチウイルス粒子の生産、濃縮／精製及び滴定
レンチウイルス粒子を実施例１に記載のように、Ｐ１方法に従って生産する。
【０２６１】
３．ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ−Ｌｕｃ粒子の用量効果
ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２４７）を９６−ウェルプレートに播種し、２４時間３７℃／５％ＣＯ2でインキュベートする。Ｐ１方法に従って生産したＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ−Ｌｕｃ−１２Ｘ粒子による形質導入を、０〜２０ｐｇ  ｐ２４／細胞の範囲の用量で、８μｇ／ｍＬのＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）の存在下で行う。形質導入後４時間で、細胞を採取し、供給業者の推奨に従ってキットＯｎｅＧｌｏルシフェラーゼアッセイ(Promega)を使用して、及びＳｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１  Ｈｙｂｒｉｄマイクロプレートリーダー(Biotek)を使用して、ルシフェラーゼの発現を分析する。この試験は三連で実施される。対照は非形質導入ＨＣＴ１１６細胞によって行われる。
【０２６２】
ＩＩ．結果
結果を図ＸＸＸＩＩＩに示す。本アッセイの目的は、第１のフェーズにおいて、ＰＰ７バクテリオファージのＲＮＡ／タンパク質相互作用システムが、ＲＬＰ粒子の形成時にＲＮＡカプシド形成を可能にするか否かを確認することである。第２のフェーズにおいて、このアッセイは、ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ粒子の使用の最良の実験条件を決定することを可能にする。
【０２６３】
図ＸＸＸＩＩＩは、１ｐｇ  ｐ２４／細胞の用量で、ルシフェラーゼ活性が強く検出されることを示す。ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰの用量が増加するほど、ルシフェラーゼ活性は高くなる。さらに、ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰと同一の用量で使用されたＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰベクターと比較して、ルシフェラーゼ活性シグナルは非常に高度に匹敵する。
【０２６４】
このアッセイは、ＰＰ７配列の１２反復モチーフにより、ＰＰ７バクテリオファージのコートタンパク質によるＲＮＡカプシド形成システムが、バクテリオファージＭＳ２により生じるシステムと等しく十分に動作すること、並びに、目的のタンパク質の非常に高い発現を得るために、１０ｐｇ  ｐ２４／細胞の用量が適合され得ることを示す。
【０２６５】
実施例７：ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰレンチウイルス粒子の構築、及びＰＰ７  ＲＮＡのステム−ループモチーフの反復の数の試験
Ｉ．装置及び方法
１．プラスミド構築
１．１  ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰレンチウイルス粒子の生産のためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：発現プラスミドは、ＲＮＡ安定化又はイントロン配列の有無に関わらず、プロモーター−目的の配列−ポリＡ発現カセットを有する（図ＸＸＸ参照）。レンチウイルス粒子にｍＲＮＡを輸送するために、ＰＰ７ＲＮＡのステム−ループモチーフのいくつかの反復（ｃｔａｇａａｇｇａｇｃａｇａｃｇａｔａｔｇｇｃｇｔｃｇｃｔｃｃｃｔｇｃａｇ  配列番号５）を、レポーター遺伝子の下流の発現カセット内に挿入した。
―２の反復（図ＸＸＸＩＶａ）
―６の反復（図ＸＸＸＶ）
―１２の反復（図ＸＸＸ）
【０２６６】
使用されるプロモーターはＣＭＶ又はＥＦ１（図ＸＸＸ）のプロモーターであってもよいが、他のプロモーターが使用されてもよい。目的の配列は、レポータータンパク質、例えば天然ホタルルシフェラーゼ（図ＸＸＸＩＶａ）、緑色（ＺｓＧｒｅｅｎＩ）、赤色（ｍＣｈｅｒｒｙ）又は青色（ｍｔＢＦＰ）蛍光タンパク質（図ＸＸＸＩＶｂ）をコードするＤＮＡ、あるいはタンパク質、例えばＣＲＥタンパク質をコードするｃＤＮＡであり得る。目的の配列はまた、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＬｎｃＲＮＡの配列又はｃｉｒｃＲＮＡの配列であってもよい。
【０２６７】
・カプシド形成プラスミド：レンチウイルス粒子を、第２のＺｎフィンガードメインの代わりに、及びそれに代えて、ヌクレオカプシドタンパク質内にバクテリオファージＰＰ７のコートタンパク質配列を含むように改変した。ＰＰ７ＲＬＰ粒子の生産に使用されたｐ８．７４カプシド形成プラスミド、構造的及び機能的タンパク質（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）をコードする遺伝子のキャリアを、図ＸＸＸＩに示した戦略に従って改変する：このｐ８．７４プラスミドを使用して、ＰＣＲ構築によって、ｐ８．７４ΔＺＦヌクレオカプシドタンパク質の第２のジンクフィンガーを欠いたプラスミドを生成する。第２のジンクフィンガーはＨｐａＩクローニングによってファージＰＰ７のコートタンパク質で置換され、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＰＰ７−Ｃｏａｔプラスミドを生成する。それによって、図ＸＸＸＩＩに示された構築が得られる。Ｐｏｌをコードする配列は、ＰＰ７ＲＬＰの機能を変更することなく、例えば逆転写酵素（ＲＴ）又はインテグラーゼ（ＩＮ）をコードする配列のようないくつかの機能的エレメントにおいて欠失又は突然変異していてもよい。
【０２６８】
・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：このプラスミドはエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を運び、それは水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶＧであり得る（図ＩＶ）。
【０２６９】
１．２  ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ  Ｌｕｃ  １２Ｘレンチウイルス粒子の生産のためのプラスミド
使用されたプラスミドは、実施例１で使用したプラスミドと同一である。
【０２７０】
２．レンチウイルス粒子の生産、濃縮／精製及び滴定
レンチウイルス粒子を実施例１に記載のように、Ｐ１方法に従って生産する。
【０２７１】
３．ルシフェラーゼについての発現動態
ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２４７）を９６−ウェルプレートに播種し、２４時間３７℃／５％ＣＯ2でインキュベートする。Ｐ１方法に従って生産されたＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ−Ｌｕｃ−２Ｘ、６Ｘ、１２Ｘ粒子による形質導入を、１０ｐｇ  ｐ２４／細胞の用量で、８μｇ／ｍＬのＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）の存在下で行う。形質導入上清を４時間後に除去し、新鮮な補充した増殖培地で置き換える。形質導入後４時間、８時間、２４時間、３２時間、及び４８時間で、細胞を採取し、供給業者の推奨に従ってキットＯｎｅＧｌｏルシフェラーゼアッセイ(Promega)を使用して、及びＳｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１  Ｈｙｂｒｉｄマイクロプレートリーダー(Biotek)を使用して、ルシフェラーゼの発現を分析する。この試験は三連で実施される。対照は非形質導入ＨＣＴ１１６細胞によって行われる。
【０２７２】
ＩＩ．結果
結果を図ＸＸＸＶＩに示す。本アッセイの目的は、いくつかの所与の時間で、カプシド形成能力に対する、従って標的細胞へのＲＮＡの転移に対する、ＰＰ７配列の反復モチーフの数の改変の影響を示すことである。２回、６回又は１２回反復したＰＰ７モチーフを含むＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ粒子は、ＭＳ２モチーフを１２回含むＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ粒子によって得られたものに匹敵する割合で、ＲＮＡの転移を可能にする。したがってＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ粒子は、使用された反復モチーフの数がいくつであっても、ＲＮＡの送達に効果的である。それゆえ、用途の種類に応じて、反復の数は適用され得る。結果は、アッセイの条件下で、２回又は６回反復したＰＰ７モチーフを含むＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ粒子が、ＭＳ２モチーフを１２回含むＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ粒子の使用によって得られるものよりも効果的なＲＮＡの転移を可能にすることを示す。ルシフェラーゼの発現動態は、４時間〜８時間に発光シグナルの増加を示し、短い半減期を有するタンパク質の場合、反復されるＰＰ７配列のモチーフの数がいくつであっても、最大発現は早期に達成されることを示している。２４時間後、ルシフェラーゼ活性は、３２時間及び４８時間で、形質導入後８時間の条件よりも４〜５低い強度の発光シグナルを達成するまで減少する。
【０２７３】
実施例８：インテグラーゼを改変することによるＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰレンチウイルス粒子の構築、及びＰＰ７  ＲＮＡのステム−ループモチーフの反復の数についての試験
Ｉ．装置及び方法
１．プラスミド構築
・目的の配列のための発現プラスミド：発現プラスミドは、ＲＮＡ安定化又はイントロン配列の有無に関わらず、プロモーター−目的の配列−ポリＡ発現カセットを有する（図ＸＸＸ参照）。レンチウイルス粒子にｍＲＮＡを輸送するために、ＰＰ７ＲＮＡのステム−ループモチーフのいくつかの反復（ｃｔａｇａａｇｇａｇｃａｇａｃｇａｔａｔｇｇｃｇｔｃｇｃｔｃｃｃｔｇｃａｇ  配列番号５）を、レポーター遺伝子の下流の発現カセット内に挿入した。
―２の反復（図ＸＸＸＩＶａ）
―６の反復（図ＸＸＸＶ）
―１２の反復（図ＸＸＸ）
【０２７４】
使用されるプロモーターはＣＭＶ又はＥＦ１のプロモーターであってもよいが（図ＸＸＸ）が、他のプロモーターが使用されてもよい。目的の配列は、レポータータンパク質、例えば天然ホタルルシフェラーゼ（図ＸＸＸＩＶａ）、緑色（ＺｓＧｒｅｅｎＩ）、赤色（ｍＣｈｅｒｒｙ）又は青色（ｍｔＢＦＰ）蛍光タンパク質（図ＸＸＸＩＶｂ）をコードするＤＮＡ、あるいはタンパク質、例えばＣＲＥタンパク質をコードするｃＤＮＡであり得る（図ＸＸＸＩＶｃ）。目的の配列はまた、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＬｎｃＲＮＡの配列又はｃｉｒｃＲＮＡの配列であってもよい。
【０２７５】
・カプシド形成プラスミド：レンチウイルス粒子を、インテグラーゼ内に、バクテリオファージＰＰ７のコートタンパク質の配列を含むように改変した。ＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ粒子の生産に使用されたｐ８．７４カプシド形成プラスミド、構造的及び機能的タンパク質（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）をコードする遺伝子のキャリアを、図ＸＸＸＶＩＩに示した戦略に従って改変する：このｐ８．７４プラスミドを使用して、ＰＣＲ構築により、ファージＰＰ７のコートタンパク質がインテグラーゼのＣ−末端ドメインとマージされている、プラスミドを生成する。ＨｐａＩクローニングによって得られるこのマージは、Ｃｏａｔｐ８．７４−ＰＯＬ−ＭＳ２プラスミドを生成することを可能にする。それによって図ＸＸＸＶＩＩＩに示された構築が得られる。Ｐｏｌコーディング配列は、例えば逆転写酵素（ＲＴ）をコードする配列のような、特定の機能的エレメントにおいて欠失又は突然変異していてもよい。
【０２７６】
・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：このプラスミドはエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を運び、それは水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶＧであり得る（図ＩＶ）。
【０２７７】
２．レンチウイルス粒子の生産、濃縮／精製及び滴定
レンチウイルス粒子を実施例１に記載のように、Ｐ１方法に従って生産する。
【０２７８】
３．ルシフェラーゼについての発現動態
ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２４７）を９６−ウェルプレートに播種し、２４時間３７℃／５％ＣＯ2でインキュベートする。Ｐ１方法に従って生産されたＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ−Ｌｕｃ−２Ｘ、６Ｘ、１２Ｘ粒子による形質導入を２．８  ｐｇ  ｐ２４／細胞の用量で、８μｇ／ｍＬのＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）の存在下で行う。形質導入上清を４時間後に除去し、新鮮な補充した増殖培地で置き換える。形質導入後４時間、８時間、２４時間、３２時間、及び４８時間で、細胞を採取し、供給業者の推奨に従ってキットＯｎｅＧｌｏルシフェラーゼアッセイ（Promega）を使用して、及びＳｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１  Ｈｙｂｒｉｄマイクロプレートリーダー（Biotek）を使用して、ルシフェラーゼの発現を分析する。この試験は三連で実施される。対照は非形質導入ＨＣＴ１１６細胞によって行われる。
【０２７９】
ＩＩ．結果
結果を図ＸＸＸＩＸに示す。本アッセイの目的は、インテグラーゼ中にＰＰ７−Ｃｏａｔを有するレンチウイルス粒子にＲＮＡを輸送することが可能であると確認すること、並びに、いくつかの所与の時間で、カプシド形成能力に対する、従って標的細胞へのＲＮＡの転移に対する、ＰＰ７配列の反復モチーフの数の改変の影響を示すことである。ルシフェラーゼの最大発現は、ＰＰ７配列の反復モチーフの数がいくつであっても、８時間で達成される。８時間後、ＰＰ７配列の反復モチーフの数がいくつであっても、ルシフェラーゼ活性は減少し、そして異なる反復モチーフの数の間でのルシフェラーゼ活性の差異は統計的に有意ではない。それゆえ、ＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ粒子はＲＮＡが送達されることを可能にする。
【０２８０】
実施例９：ＰＰ７ＲＬＰ粒子での単一形質導入によるいくつかの異なるＲＮＡの転移
Ｉ．装置及び方法
１．モノ−及びトリ−形質導入
本実施例は、単一タンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎＩ、ｍＣｈｅｒｒｙ又はｍｔＢＦＰ）の発現を可能にするシングルタイプのＲＮＡの転移、又はいくつかの異なるタンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎＩ＋ｍＣｈｅｒｒｙ＋ｍｔＢＦＰ）の発現を可能にするいくつかのタイプのＲＮＡの転移のいずれかを可能にする、ＰＰ７ＲＬＰ粒子又はＩＬＶベクターを用いて行う。
【０２８１】
ＰＰ７ＲＬＰ粒子及び組み込みレンチウイルスベクターＩＬＶを、以下の条件で生産する：
―カプシド形成及びエンベローププラスミドに加えて、（実施例１に記載のように）ＺｓＧｒｅｅｎＩ、又はｍＣｈｅｒｒｙ、又はｍｔＢＦＰのいずれかをコードする単一発現プラスミドによる、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによって、粒子を生産する、
―カプシド形成及びエンベローププラスミドに加えて、単一発現プラスミドでの粒子生産に使用される発現プラスミドの総量と同等の、発現プラスミドの総量のために、等モル量で加えた、ＺｓＧｒｅｅｎＩ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びｍｔＢＦＰをそれぞれコードする３つの発現プラスミドによる、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによって、粒子を生産する。
【０２８２】
ＨＣＴ１１６粒子を、以下のいずれかにより、ＰＰ７ＲＬＰ粒子によって形質導入した：
―独立して３タイプのＰＰ７ＲＬＰ粒子、ＺｓＧｒｅｅｎＩ、ｍＣｈｅｒｒｙ又はｍｔＢＦＰでの形質導入により、あるいは、同一時点でＰＰ７ＲＬＰ粒子の３タイプの同時形質導入（co-transduction）により、
―同時にＺｓＧｒｅｅｎＩ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びｍｔＢＦＰをコードする３つの発現プラスミドを用いて生産された粒子でのモノ−形質導入により。
【０２８３】
並行して、ＨＣＴ１１６細胞を、以下のいずれかにより、ＩＬＶベクターによって形質導入する：
―独立して３タイプのＩＬＶベクター、ＺｓＧｒｅｅｎＩ、ｍＣｈｅｒｒｙ又はｍｔＢＦＰでの形質導入により、あるいは、同一時点でＩＬＶ粒子の３タイプの同時形質導入により、
―同時にＺｓＧｒｅｅｎＩ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びｍｔＢＦＰをコードする３つの発現プラスミドを用いて生産されたＩＬＶベクターでのモノ−形質導入により。
【０２８４】
蛍光細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって定量化した。
【０２８５】
ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２４７）を２４−ウェルプレートに播種し、２４時間３７℃／５％ＣＯ2でインキュベートする。ＰＰ７ＲＬＰ粒子又はＩＬＶベクターによる形質導入を、８μｇ／ｍＬのＰｏｌｙｂｒｅｎｅの存在下で行う。形質導入後２４時間で、細胞を採取し、ＺｓＧｒｅｅｎＩ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びｍｔＢＦＰを発現する細胞のパーセンテージをサイトメトリー（Macs Quant VYB、Miltenyi Biotec）によって定量化する。細胞防御阻害機構、ＢＸ７９５（InvivoGen）、を６μＭの濃度で使用する。各アッセイを三連で行う。
【０２８６】
ＩＩ．結果
１．ＩＬＶとの比較における、ＰＰ７ＲＬＰ粒子での単一形質導入においていくつかの異なるＲＮＡを転移させる能力
以下のアッセイの目的は、標的細胞内にいくつかの異なるＲＮＡを転移させるＰＰ７ＲＬＰ粒子の能力を実証し、従って標的細胞における形質導入の数の削減を可能にすることである。したがって、ＲＮＡ種ごとに１つの形質導入を行うようにするよりもむしろ、単一形質導入でいくつかの異なるＲＮＡを転移させることを可能にする。このために、ＰＰ７ＲＬＰ粒子の精製バッチを実施例１で定義した最適条件下で生成した、すなわち国際特許出願第２０１３／０１４５３７号に記載の実施例１の方法Ｐ１に従って血清を含まずに生産した精製バッチを生成した。ＰＰ７ＲＬＰ粒子の生産フェーズにおいて、いくつかの異なるタイプのＲＮＡを含むＰＰ７ＲＬＰ粒子のバッチを得るために、カプシド形成及びエンベローププラスミドと共に、蛍光レポーターをコードする３つのタイプのプラスミドを、等モル量で同時に使用した（ＺｓＧｒｅｅｎＩ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びｍｔＢＦＰ）。次に、ＨＣＴ１１６細胞をＢＸ７９５の存在下で形質導入し、異なるＲＮＡの転移を形質導入後２４時間で観察する。
【０２８７】
図ＸＬは、２つの異なる用量（１０ｐｇ  ｐ２４／細胞及び３０ｐｇ  ｐ２４／細胞）でのＰＰ７ＲＬＰ粒子によるＨＣＴ１１６細胞の単一形質導入後の、あるいは、３０ｐｇ  ｐ２４／細胞最終用量での実施例１に従って生産されたＺｓＧｒｅｅｎＩ又はｍＣｈｅｒｒｙ又はｍｔＢＦＰを発現するＰＰ７ＲＬＰ粒子の３つ同時の形質導入後の、緑色、赤色及び青色のトリ−蛍光細胞の割合を示す。
【０２８８】
３ＲＮＡ種を運ぶ粒子を含むＰＰ７ＲＬＰバッチを用いて３０ｐｇ  ｐ２４／細胞の用量で細胞を形質導入する場合、８８％の細胞がトリ−蛍光であるが、一方で、異なる蛍光タンパク質をそれぞれ含む３バッチのコトランスフェクションによって得られたＩＬＶベクターのバッチによって細胞を形質導入する場合、わずか１％の細胞が蛍光である。
【０２８９】
したがって結果は、ＰＰ７ＲＬＰ粒子が、標的細胞の単一形質導入において少なくとも３タイプのＲＮＡを輸送及び転移することができることを示す。これら粒子は、ＩＬＶベクターよりもはるかに効果的に複数のＲＮＡの転移を可能にする。
【０２９０】
したがって、複数のＲＮＡによる細胞の形質導入はＰＰ７ＲＬＰ粒子によって、ＩＬＶよりもはるかに効率的かつ単純であり、結果として少なくとも７０％よりも大きい。
【０２９１】
単一ＲＮＡ種をそれぞれ含むＰＰ７ＲＬＰの３つ別個のバッチを用いて３０ｐｇ  ｐ２４／細胞の総用量で同時に細胞を形質導入する場合、９１％の細胞がトリ−蛍光である。モノ−形質導入又はマルチ−形質導入におけるいくつかの導入遺伝子の同時発現の有効性の比較は、ＰＰ７ＲＬＰベクターについての同等の有効性を示す（それぞれ８８％対９１％）。
【０２９２】
したがってこの有効性は、独立して生産された粒子のバッチの使用と比較して、感染多重度を減少させることができる。それによって細胞毒性のリスクが大幅に減少される。これは、非常に多数の形質導入によって、並びに非常に多量の粒子と接触して細胞を配置することの両方によって、標的細胞の生存率を低下させないことを可能にする。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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