(57)【要約】少なくとも１種の化学的もしくは生化学的因子、または、化学的因子同士、生化学的因子同士、もしくはこれらの組み合わせによるＤＮＡ切断毒性作用に対する、個人から採取した組織の感受性を評価するための方法であって、前記少なくとも１種の化学的もしくは生化学的因子の作用濃度、または、前記化学的因子同士、または生化学的因子同士、もしくはこれらの組み合わせに含まれる化学的および／または生化学的因子の作用濃度を設定する工程（ａ）と、個人の評価対象組織から細胞を採取する工程（ｂ）と、細胞を分散および／または増幅して、細胞サンプルを得る工程（ｃ）と、細胞サンプルと、工程（ａ）で規定された作用濃度の少なくとも１種の化学的もしくは生化学的因子（または、化学的因子同士、生化学的因子同士、もしくはこれらの組み合わせ）とを、所定の時間にわたり接触させる工程（ｄ）と、ＤＮＡ二本鎖切断の数、当該数を表わすバイオマーカー、小核の数のうちの少なくとも１つを検出する工程（ｅ）とを含み、工程（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）は、連続して行わなければならず、工程（ａ）を工程（e）よりも前に行わなければならない、方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の化学的もしくは生化学的因子、または、化学的因子同士、生化学的因子同士、もしくはこれらの組み合わせによるＤＮＡ切断毒性作用に対する、被験者の組織サンプルの感受性を評価するための方法であって、
前記少なくとも１種の化学的もしくは生化学的因子の作用濃度、または、前記化学的因子同士、生化学的因子同士、もしくはこれらの組み合わせに含まれる化学的および／または生化学的因子の作用濃度を設定する工程（ａ）と、
被験者の評価対象組織から細胞をサンプル採取する工程（ｂ）と、
前記細胞を分散および／または増幅して、細胞サンプルを得る工程（ｃ）と、
前記細胞サンプルと、前記工程（ａ）で規定された前記作用濃度の前記少なくとも１種の化学的もしくは生化学的因子（または、前記化学的因子同士、生化学的因子同士、もしくはこれらの組み合わせ）とを、所定の時間にわたり接触させる工程（ｄ）と、
ＤＮＡ二本鎖切断の数、当該数を表わすバイオマーカー、小核の数のうちの少なくとも１つを検出する工程（ｅ）とを含み、
前記工程（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）は、連続して行わなければならず、前記工程（ａ）を前記工程（e）よりも前に行わなければならない、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
前記化学的もしくは生化学的因子、または、前記化学的因子同士、生化学的因子同士、もしくはこれらの組み合わせによるＤＮＡ切断毒性作用に対する、前記組織の感受性を表わす診断スコアを、前記ＤＮＡ二本鎖切断の数（および／または前記小核の数）および前記作用濃度を使用して求める工程（ｆ）をさらに含む、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法において、
二本鎖切断を検出する前記工程（ｅ）が、好適には、免疫蛍光検査、細胞遺伝学的試験、およびパルス電界電気泳動からなる群から選択される技術を使用して実施される、方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の方法において、
前記工程（ｅ）において、ｐＨ２ＡＸ、５３ＢＰ１、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＤＮＡ−ＰＫ、およびＭＤＣ１からなる群から選択されるバイオマーカーを検出する、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、
前記ｐＨ２ＡＸバイオマーカーを検出するとともに、好ましくは、該バイオマーカーの核病巣の数と大きさを検出する、方法。
【請求項６】
請求項４または５に記載の方法において、
細胞核の位置特定に適した対比染色を行うことにより、小核（ＭＮ）を定量化する、方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１つに記載の方法において、
前記工程（ｅ）において、前記作用濃度が、予め決定された基準濃度Ｃｒｅｆであり、
前記ＤＮＡ二本鎖切断の数をｐＨ２ＡＸ免疫蛍光検査により求め、ＤＡＰＩ対比染色の後に小核（ＭＮ）の数を検出し、
その後、前記細胞サンプルについて、ＮｐＨ２ＡＸ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）とＮＭＮ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）とを求め、
前記細胞サンプルについて、ＮｐＨ２ＡＸ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）≦２、または、ＮＭＮ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）≦２％であれば、
遺伝子毒性リスクが低いと推論し、および／または、遺伝子毒性リスクが「グループI」であるとし、
前記細胞サンプルについて、ＮｐＨ２ＡＸ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）＞８、または、
ＮＭＮ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）＞１０％であれば、
遺伝子毒性リスクが非常に高いと推論し、および／または、遺伝子毒性リスクが「グループIII」であるとし、
その他のすべての場合は、遺伝子毒性リスクが中程度であると推論し、および／または、遺伝子毒性リスクが「グループII」であるとする、方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１つに記載の方法において、
前記作用濃度が、好適には、予め決定された基準濃度Ｃｒｅｆであり、好適には、この決定は、
（i）いわゆる基準細胞（感受性グループI）を分散および／または増幅することにより細胞サンプルを準備し、該細胞サンプルを複数の分画に細分し、
（ii）試験対象である前記少なくとも１種の化学的または生化学的因子を、前記化学的または生化学的因子の濃度範囲（例えばｎＭからｍＭにわたる濃度範囲）から選択される複数の濃度で、所定の時間（好ましくは２４時間）にわたって、前記細胞サンプルの各分画にそれぞれ塗布し、
（iii）前記細胞サンプルの各分画について、細胞１個あたりのｐＨ２ＡＸ病巣の数、および／または、細胞１個あたりの小核の数を求め、
（iv）（好ましくは、ＤＡＰＩ対比染色を使用するｐＨ２ＡＸマーカー免疫蛍光検査により）前記ｐＨ２ＡＸマーカーを使用して、観察時間ｔおよび濃度Ｃにおいて得られる核病巣の平均数（この平均数をＮｐＨ２ＡＸ（ｔ，Ｃ）と呼ぶ）を求め、
観察時間ｔおよび濃度Ｃにおいて観察される細胞１００個あたりの小核の平均数（この平均数をＮＭＮ（ｔ，Ｃ）と呼ぶ）を求め、
好ましくは、一度に少なくとも５０個の核（ガウス標準誤差）について、または、５０個の核についての独立した３回の実験（平均値の標準誤差）について行われる測定される、各測定についての標準誤差σを求め、
式：ＮｐＨ２ＡＸ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）＋２σ＝２、または、ＮＭＮ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）＋２σ＝２％が成り立つ濃度としてのいわゆる基準濃度Ｃｒｅｆを求める方法により実施する、方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１つに記載に記載の方法において、
前記少なくとも１種の化学的因子が、金属または非金属陰イオン、非金属陽イオン、有機陰イオン、有機陽イオン、両性化合物、必要であれば中性無機化合物、必要であれば中性有機化合物、必要であれば有機金属化合物、不溶性化合物から選択される、方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１つに記載の方法において、
前記少なくとも１種の化学的または生化学的因子が、（水性または非水性の）液体媒体に溶解した状態、粒子形状、ナノ微粒子形状、細胞膜に固定された状態、気体の状態である、方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１つに記載の方法において、
前記少なくとも１種の生化学的因子が、（必要であれば組換）ペプチド、抗体、抗原、（必要であれば非活性化）ウイルス、ウイルス断片、細胞断片から選択される、方法。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれか１つに記載の方法において、
（i）サンプル採取された上記組織からの細胞を、単離および／または増幅し、これら増幅した細胞が「前記細胞サンプル」を構成し、
（ii）上記細胞サンプルについて、ｐＨ２ＡＸマーカーを使用して得られる核病巣の平均数を観察時間ｔにおいて求め（これら平均数をＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）とし、前記観察時間はｔ＝０（前記少なくとも１種の化学的もしくは生化学的因子（または化学的因子同士、生化学的因子同士、もしくはこれらの組み合わせ）に対する非暴露状態である、ｔ０）および、少なくとも、前記細胞サンプルと前記作用濃度の前記少なくとも１種の化学的もしくは生化学的因子（または化学的因子同士、生化学的因子同士、もしくはこれらの組み合わせ）とを、所定時間にわたり接触（この接触を「遺伝子毒性暴露」と呼ぶ）させた後のｔ４であり、
（iii）少なくとも前記平均数ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）を使用して、前記サンプルの遺伝子毒性暴露に対する感受性グループを判定する、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、
前記細胞サンプルについて、好ましくは少なくともｔ０およびｔ４である時間ｔにおいて観察される細胞１００個あたりの小核の平均数［％で表わす］（この平均数をＮＭＮ（ｔ）と呼ぶ）をさらに求める、方法。
【請求項１４】
請求項１３または１４に記載の方法において、
ｔ４は、ＤＮＡ切断のレベルがその残留値に到達する時間を表す固定値であり、１２時間以上でなくてはならず、好ましくは１２時間〜４８時間であり、より優先的には約２４時間である、方法。
【請求項１５】
請求項８から１４のいずれか１つに記載の方法において、
前記いわゆる基準細胞が、ＨＦ１９細胞株、ＩＭＲ９０細胞株、４８ＢＲ細胞株、７０ＢＲ細胞株、１４２ＢＲ細胞株、１５５ＢＲ細胞株、ＭＲＣ５細胞株、１ＢＲ３細胞株、１４９ＢＲ細胞株、およびＭＲＣ９細胞株から選択され、より好ましくは、１ＢＲ３細胞株、１４９ＢＲ細胞株、およびＭＲＣ９細胞株から選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毒物学の分野に関し、より具体的には遺伝毒性検査方法の分野に関する。より具体的には、本発明は、直接的または間接的にＤＮＡを切断する化学的因子（具体的には、ある種の金属、殺虫剤、および化学療法用のある種の活性物質）への暴露後の細胞毒性の予測方法に関する。この方法は、複数の細胞パラメータと酵素パラメータとの決定および相互検証、ならびに、評価基準に基づくものである。
【背景技術】
【０００２】
ますます多くの文献データによって、二本鎖切断（ＤＳＢ）が、修復されない場合には、細胞死亡率および細胞毒性と最も相関性が高いＤＮＡ損傷であり、修復が不十分な場合には、ゲノムの不安定さと癌リスクに最も相関性が高いＤＮＡ損傷であることが報告されている（Jeggo，Lobrich、"DNA double-strand breaks: their cellular and clinical impact?", Oncogene 26(56) p.7717-7719 (2007年); Joubert、他、"Radiation biology: major advances and perspectives for radiotherapy", Cancer Radiotherapy 15(5) p.348-354 (2011年)）。このような結論は、もともとは放射線誘導ＤＳＢについて確立されたものであるが、すべてのＤＮＡ切断治療について有効であると考えられる。したがって、ＤＳＢの定量化とＤＳＢ修復経路の機能性とに基づいた、毒性リスクおよび発癌性リスクの評価が有望視されている。しかし、ＤＳＢの判定、および、それを制御する修復モデルと信号モデルとは、放射線生物学者や遺伝毒物学者の総意を得るまでには至っていない。反対に、いくつかの研究においては、非修復ＤＳＢの数とヒトの細胞の細胞放射線感受性との間の定量的相関が免疫蛍光検査を利用して示され、現在のパラダイムと対立する分子モデルが提案されている（Joubert、外、"DNA double-strand break repair defects in syndromes associated with acute radiation response: at least two different assays to predict intrinsic radiosensitivity?", Int.J.Radiation Biology 84(2), p.1-19 (2008年); Joubert、外、（2011年の上記記事））。より最近では、同じ研究者グループにより、金属（具体的には、Ｐｂ，Ｃｄ，Ａｌ）に対するヒト組織の特定の反応が発表された（Viau、外、"Cadmium inhibits non-homologous end-joining and over-activates the MRE11-dependent repair pathway", Mutation Research 654 p.13-21 (2008年); Gastaldo、外、"Lead contamination results in late and slowly repairable DNA double-strand breaks and impacts upon the ATM-dependent signaling pathways", Toxicology Letters 173, p.201-214 (2007年); Gastaldo、外、"Induction and repair rate of DNA damage: A unified model for describing effects of external and internal irradiation and contamination with heavy metals", J Theoretical Biology 251 p.68-81 (2008年)）。
【０００３】
毒性および癌は、物理的因子（Ｘ線、粒子、紫外線、熱）、化学的因子（アルキル化剤、化学療法に使用されるある種の活性物質、ある種の金属）、生物学的因子（ある種のウイルスまたはバクテリア）等の様々な外的因子により引き起こされ得る。これらの遺伝子毒性ストレス要因のうち、電離放射線は、その生物学的作用についての記載が最も豊富な外的因子である（Thomas、外、"Impact of dose-rate on the low-dose hyper-radiosensitivity and induced radioresistance response", International Journal of Radiation Biology, 89(10) p813-822 (2013年); Colin C.、外, "MRE11 and H2AX biomarkers in the response to low-dose exposure: balance between individual susceptibility to radiosensitivity and to genomic instability", International Journal of Low Radiation: 8(2)p96-106 (2011年)); Joubert A.、外、“Irradiation in the presence of iodinated contrast agent results in radiosensitization of endothelial cells: consequences for computed tomography therapy”, International Journal of Radiation: Oncology Biology Physics, 62(5) p1486-1496 (2005年)）。しかし、その他のすべてのストレス要因については、対ストレス反応の分子モデルおよび細胞モデルの検証、および、パラメータの明確な特定がなされなければならないことが、毒性および発癌性のリスク評価の歴史により示されている。個人的要因が、考慮すべき主要な要因の１つであることは明らかであると言えるが、当該モデルの妥当性が再び問われる（DorrおよびHendry、"Consequential late effects in normal tissues" Radiother Oncol. 61(3):223-31 (2001年); Granzotto、外、"Individual susceptibility to radiosensitivity and to genomic instability: its impact on low-dose phenomena" Health Phys. 100(3):282 (2011年)）。したがって、何らかの遺伝子毒性ストレスに関連するリスクについて信頼性のある診断を行うためには、妥当なパラメータを使用した、十分な数の個人についての確固たるプレデータ、細胞モデルが必要である。
【０００４】
現在、ある種の金属およびメタロイド（例えば、Ａｌ，Ｃｄ，Ｕ，Ａｓ，ＳｅおよびＳｂ）による遺伝子毒性作用、ならびに、それら金属やメタロイドの関連ナノ微粒子形状についての研究がさかんに文献発表されている（Polya およびCharlet, "Increasing arsenic risk?", Nature Geoscience 2, p.383-384 (2009年); Akhter、外、"Cancer targeted metallic nanoparticle: targeting overview, recent advancement and toxicity concern", Curr. Pharm. Des. 17(18),p.1834-1850 (2011年); Almeida、外、"In vivo biodistribution of nanoparticles", Nanomedicine (Lond) 6(5), p.815-835 (2011年); Pereira、外、"Genotoxicity of uranium contamination in embryonic zebrafish cells", Aquatic Toxicology 109, p.11-16 (2012年); Pereira、外、"Comparative genotoxicity of aluminium and cadmium in embryonic zebrafish cells", Mutation Research 750, p.19-26 (2013年)）。特に、半導体産業が引き起こす水を介しての暴露、および、殺虫剤に関しての発表が増えている（Garaj-VrhovacおよびZeljezic、"Evaluation of DNA damage in workers occupationally exposed to pesticides using single-cell gel electrophoresis (SCGE) assay. Pesticide genotoxicity revealed by comet assay", Mutation Research 469(2), p.279-285 (2000年); Garaj-Vrhovac、外、"Efficacity of HUMN criteria for scoring the micronucleus assay in human lymphocytes exposed to a low concentration of p,p'-DDT", Braz J Med Biol Res 41(6), p.473-376 (2008年); Guilherme、外、"Differential genotoxicity of Roundup(R) formulation and its constituents in blood cells of fish (Anguilla Anguilla): considerations on chemical interactions and DNA damaging mechanisms", Ecotoxicology 21(5), p1381-90. (2012年)）。しかし、産業発展、大気汚染、および農業生産高の増大の必要性を考慮すれば、これらの２種類の因子が、重大な社会的課題であることは明らかである。実際に、環境的背景においても職業的背景においても、これら２種類の因子は健康に関わる問題の中心である。科学者らの間では、ある種のナノ微粒子酸化化合物が、遺伝子毒性と発癌現象を引き起こすのではないかとの疑いがもたれている。ナノ微粒子が有する特定の生物学的作用についての研究は、当然、そのような技術が人間と環境とに及ぼす作用についての研究立案に含まれる。
【０００５】
電離放射線に対する組織の感受性の問題は、ＤＮＡ損傷修復メカニズムの問題から切り離すことができないことも知られている。実際、細胞レベルでは、電離放射線はある種の化学結合を切断して、（特に過酸化によって）遊離基や、ＤＮＡ損傷の原因となるその他の反応種を発生させる。内因性攻撃または外因性攻撃（例えば、電離放射線および遊離基）によってＤＮＡが傷つけられると、受けたエネルギーに応じて各種のＤＮＡ損傷（具体的には、塩基損傷、一本鎖切断、および二本鎖切断（ＤＳＢ））が引き起こされ得る。非修復ＤＳＢは、細胞死および毒性に関連し、より具体的には、放射線感受性に関係する（電離放射線への暴露の場合）。修復が不十分なＤＳＢは、ゲノムの不安定さ、突然変異を促進する現象、および癌の素因に関係する。身体は、それぞれの種類のＤＮＡ損傷について、特定の修復システムを備えている。ＤＳＢに関しては、哺乳類は２つの主要な修復方法を備えている。すなわち、縫合修復（鎖の連結）および組換修復（相同鎖または非相同鎖の挿入）である。
【０００６】
電離放射線に対する組織の感受性は、各臓器または各個人によって大きく変動することも知られている。FertilおよびMalaiseにより、「内因性放射線感受性」が概念化された（"Inherent cellular radiosensibility as a basic concept for human tumor radiotherapy", Int.J. Radiation Oncology Biol. Phys. 7, p.621-629 (1981年); "Intrinsic radiosensitivity of human cell lines is correlated with radioresponsiveness of human tumors: Analysis of 101 published survival curves", Int.J. Radiation Oncology Biol. Phys. 11, p. 1699-1707 (1985年)）。したがって、放射線治療の作用と副作用とについてのさまざまな研究により、特に高い放射線抵抗性を示す人が存在する一方で、放射線感受性を示す人も存在し、また、その放射線感受性は、臨床的に認識されるが重視するほどではない副作用のレベルから、致命的作用までの範囲にわたり得ることがわかっている。放射線感受性が極端に高い稀なケースは、遺伝的起源であることが実証されたようであるが、そのようなケースを別にしても、放射線感受性は、概して、遺伝的素因に端を発するものであると考えられている。つまり、放射線感受性は、個人に特有のものである。
【０００７】
放射線感受性にあてはまることは、癌に対する素因にもあてはまり、より具体的には、放射線誘発癌にあてはまる。したがって、生物学的に過剰な線量は、毒性リスクと発癌リスクの両方を増大させる。よって、ＤＮＡ切断遺伝子毒性因子への暴露に起因する上記リスクと生物学的過剰線量とを判定可能な予測試験方法を利用できることは、有用であると言える。
【０００８】
Joubertらの刊行物（"DNA double-strand break repair defects in syndromes associated with acute radiation response; At least two different assays to predict intrinsic radiosensitivity?", published in Int. J. Radiation Biology 84(2), p.107-125 (2008年)）では、ヒトの放射線感受性を３つのグループに分類することが提案された。すなわち、グループI（放射線抵抗性があり、癌リスクの低いグループ）と、グループII(中等度の放射線感受性があり、癌リスクが高いグループ）と、グループIII（放射線感受性が過剰であり、癌リスクが高いグループ）である。この分類は、分子的な評価基準に基づいており、ヒトの放射線感受性のすべてのケースを説明できる。金属や殺虫剤のような化学的因子が誘発する遺伝子毒性ストレスについては、このような個人的要因を考慮した分類は存在しない。
【０００９】
Ｈ２ＡＸまたはｐＨ２ＡＸが、特にＤＮＡ切断因子が使用される場合に、ＤＮＡ損傷の検出および修復のマーカーとして使用されることは、多くの文献に記載されている。
【００１０】
国際公開第２０１４／１５２８７３号には、ヒストンＨ２ＡＸの発現を定量化することにより、化学療法に使用される活性物質の遺伝子毒性を定量化する方法が記載されている。
【００１１】
国際公開第２００５／１１３８２１号には、毒性が最小であるタバコ製品を特定するための方法において、ＤＮＡ二本鎖切断の検出手段としてｐＨ２ＡＸマーカーを使用することが記載されている。これらの方法では、タバコの煙を所定の時間（１５分、２０分、３０分、４０分、または１時間）細胞と接触させる。そして、ｐＨ２ＡＸ病巣の有無が、免疫蛍光検査により検証される。しかし、この方法は、そこに含まれるＤＮＡ切断因子が正確には知られていない化学品のカクテルに関連するものである。
【００１２】
国際公開第２００５／１１３８２１号（Vector Tobacco／New York Medical University）には、ｐＨ２ＡＸマーカーを使用して、ＤＮＡ二本鎖切断の検出およびタバコの毒性を評価を行うことが記載されている。Ｈ２ＡＸの発現レベルを利用して、ＤＮＡ二本鎖切断の検出および抗癌剤の有効性の評価を行う別の方法が、国際公開第２０１４／１５２８７３号（Pioma）に記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
出願人は、従来技術がこのように広範囲にわたるのにも関わらず、ＤＮＡ切断を引き起こす化学的因子への暴露に関する、生物学的に過剰な用量およびリスクを定量化する方法が存在しないことに注目した。これらの因子に係る、個人のための遺伝子毒物学的予測方法を提供するという問題には、実効的な解決手段がいまだ無い。本発明は、ＤＮＡ切断を引き起こす化学的因子への暴露に関する毒性リスクを予測するための新規な方法を提案することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明者らは、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）が、その非修復時には、遺伝子毒性を最も好適に予測する損傷であり、その一方、不十分な修復時には、ゲノムの分安定さを最も好適に予測する損傷であるという知見を得、この知見に基づき本発明の方法を完成させた。本発明の範囲において、発明者らは、ＤＳＢが、縫合と呼ばれる主要な修復方法、および／または、ＭＲＥ１１依存組換と呼ばれる不完全な修復方法により対処されることを発見した。この２つの修復方法の間の平衡は、個人的要因であって、ＡＴＭタンパク質によって制御される。ｐＨ２ＡＸマーカーは、縫合修復方法により認識されたＤＳＢ部位を示す。ＭＲＥ１１マーカーは、ＭＲＥ１１に依存した不完全な修復により対処されたＤＳＢを示す。ｐＡＴＭマーカーは、Ｈ２ＡＸのリン酸化による縫合経路の活性化と、ＭＲＥ１１依存経路の阻害とに関する情報を提供する。
【００１５】
発明者らは、さらに、酸化型のストレスの後、特に、ＤＳＢを誘発するとともに細胞質内での酸化を引き起こすストレスの後に、ＡＴＭタンパク質の細胞質型が細胞核内で移動することを観察した。
【００１６】
発明者らは、これらのモデルが、金属、殺虫剤、ナノ微粒子およびある種の化学療法用薬剤といった、多数の化学的・生化学的ＤＮＡ切断因子に有効であることを示した。
【００１７】
外因性遺伝子毒性攻撃に起因するＤＮＡ損傷に対処するためには、以下を考慮する必要がある。
・ＤＮＡの自然状態、および
・ＤＮＡのストレス起因状態
さらには、遺伝子毒性ストレスへの暴露後には、ＤＮＡ修復を考慮する必要がある。ＤＮＡ修復の動態は、ストレスの種類だけでなく、潜在的には影響を受けた組織の種類にも依存する。ＤＮＡ修復の有効性と速度は個々人により変動し、さらには、例外的な感受性に繋がる特定の遺伝的条件が存在することが知られている。
【００１８】
最終的には、被験者間の差異のより良い把握のためには、生物学的用量または基準濃度に基づいたシステムを構築し、同じ基準における現象をより適切に定量化することが必要である。
【００１９】
本発明によれば、上記問題は、以下に基づく方法によって解決される。
（i）非形質変換細胞を分散および／または増幅して、細胞サンプルを準備する。非形質変換細胞は、被験者からサンプル採取されたものであり、例えば、当該被験者の皮膚生検材料であってもよく、対照とするＤＮＡ切断ストレスに耐性があると考えられる、いわゆる基準細胞（例えば、グループIの被験者の細胞）であってもよい。
（ii）基準細胞（グループI）の細胞サンプルを所定のストレスに暴露した後、基準濃度を決定する。なお、この工程は実施済みであってもよいし、発明の実験データベースに含まれていてもよい。
（iii）休止状態のヒト細胞に有効な機械的モデルを規定する。
（iv）当該被験者の細胞について、上記基準濃度における、機能性ＤＳＢ認識、修復、信号発信テストを実施する。
【００２０】
上記のいわゆる基準対照細胞は、当該のＤＮＡ切断ストレスに対し耐性があると考えられる細胞である。好ましくは、これらの細胞は、化学的因子が誘発するストレスおよび放射線に耐性があることが好ましい（例えば、グループIの被験者の細胞）。遺伝子毒性の研究において、対照として通常使用される市販の細胞を使用可能である。具体的には、１ＢＲ３細胞株（Killalea、外、"Factors in post dialysis CAPD fluid affecting 3H cholesterol efflux from human skin fibroblasts", Biochemical Society Transactions 25 p123S (1997年)）、１４９ＢＲ細胞株およびＭＲＣ９細胞株（Watanabe，外、"Comparison of lung cancer cell lines representing four histopathological subtypes with gene expression profiling using quantitative real-time PCR", Cancer Cell International 10(2) p1-12 (2010年)）などが挙げられる。さらに、ＨＦ１９，ＩＭＲ９０，４８ＢＲ, ７０ＢＲ, １４２ＢＲ, １５５ＢＲおよびＭＲＣ５等の細胞を、いわゆる基準参照細胞として使用してもよい。
【００２１】
したがって、本発明の第１の目的は、ＤＮＡ切断ストレスに対する被験者の感受性を、該被験者からサンプル採取した細胞（好ましくは皮膚細胞）から得られた細胞サンプルを使用して予測するための方法を提供し、実験を行う基準濃度を規定することである。この方法は、以下を含む。
【００２２】
（いわゆる基準を規定する工程）
（i）研究対象の化学的または生化学的因子によって基準濃度が予め決定されていない場合には、いわゆる基準細胞（感受性グループI）を分散および／または増幅することによって細胞サンプルを準備し、ＤＮＡ切断因子を、ＤＮＡ切断因子の広い濃度範囲（例えば、ｎＭからｍＭにわたる）内の複数の濃度で、所定の時間（好ましくは２４時間）にわたって上記細胞サンプルに塗布する。ＤＡＰＩ対比染色を用いたｐＨ２ＡＸ免疫蛍光検査を行う。この検査によって、細胞サンプルについて、塗布されたすべての濃度における小核の分析も可能である。
（ii）ｐＨ２ＡＸマーカーを使用して、観察時間ｔおよび濃度Ｃにおいて得られる核病巣の平均数（この平均数を、ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ，Ｃ）と呼ぶ）、または観察時間ｔおよび濃度Ｃにおいて観察される細胞１００個あたりの小核の平均数（この平均数を、ＮＭＮ（ｔ，Ｃ）と呼ぶ）、または一度に少なくとも５０個の核（ガウス標準誤差）について、または、５０個の核についての独立した３回の実験（平均値の標準誤差）について行わなければならないこれらの各測定についての誤差に相当する標準誤差σ、を求め、
（iii）いわゆる基準濃度Ｃｒｅｆは、式：ＮｐＨ２ＡＸ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）＋２σ＝２、または、ＮＭＮ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）＋２σ＝２％が成り立つ濃度である。
【００２３】
（いわゆるリスク評価工程）
（i）被験者の細胞を分散および／または増幅することにより細胞サンプルを準備する。この細胞サンプルに、上記で既定した基準濃度Cｒeｆを所定の時間（好ましくは２４時間）にわたり塗布する。ＤＡＰＩ対比染色によりｐＨ２ＡＸ免疫蛍光検査の判定を行う。
（v）上記細胞サンプルについて、ＮｐＨ２ＡＸ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）とＮＭＮ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）とを求める。
（vi）細胞サンプルについて、ＮｐＨ２ＡＸ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）≦２、または、ＮＭＮ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）≦２％であれば、遺伝子毒性リスクは低いと考えられ、「グループI」とされる。
（vii）細胞サンプルについて、ＮｐＨ２ＡＸ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）＞８、または、ＮＭＮ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）＞１０％であれば、遺伝子毒性リスクは非常に高いと考えられ、「グループIII」とされる。
（viii）その他のすべての場合では、遺伝子毒性リスクは中程度と考えられ、「グループII」とされる。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、少なくとも１種の化学的もしくは生化学的因子、または、化学的因子同士、生化学的因子同士、もしくはこれらの組み合わせによるＤＮＡ切断毒性作用に対する、被験者からサンプル採取された組織の感受性を評価するための方法である。この方法は、
上記少なくとも１種の化学的もしくは生化学的因子の作用濃度、または、上記化学的因子同士、生化学的因子同士、もしくはこれらの組み合わせに含まれる化学的因子、生化学的因子、またはこれらの因子の作用濃度を設定する工程（ａ）と、
被験者の評価対象組織から細胞をサンプル採取する工程（ｂ）と、
上記細胞を分散および／または増幅して、細胞サンプルを得る工程（ｃ）と、
上記細胞サンプルと、前記工程（ａ）で規定された上記作用濃度の上記少なくとも１種の化学的もしくは生化学的因子（または、前記化学的因子同士、生化学的因子同士、もしくはこれらの組み合わせ）とを、所定の時間にわたり接触させる工程（ｄ）と、
ＤＮＡ二本鎖切断の数、当該数を表わすバイオマーカー、小核の数のうちの少なくとも１つを検出する工程（ｅ）とを含み、
上記工程（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）は、連続して行わなければならず、上記工程（ａ）を前記工程（e）よりも前に行わなければならない。
【００２５】
このような化学的因子は、例えば、金属または非金属陰イオン、非金属陽イオン、有機陰イオン、有機陽イオン、両性化合物、必要であれば中性無機化合物、必要であれば中性有機化合物、必要であれば有機金属化合物、不溶性化合物であってもよい。また、上記化学的因子は、例えば、（水性または非水性の）液体媒体に溶解した状態、粒子形状、ナノ粒子形状、細胞膜に固定された状態、気体の状態であってもよい。
【００２６】
上記生化学的因子は、例えば、（必要であれば組換）ペプチド、抗体、抗原、（必要であれば非活性化）ウイルス、ウイルス断片、細胞断片であってもよい。
【００２７】
好適には、本発明の方法は、上記化学的もしくは生化学的因子、または、上記化学的因子同士、生化学的因子同士、もしくはこれらの組み合わせによるＤＮＡ切断毒性作用に対する、上記組織の感受性を表わす診断スコアを、上記ＤＮＡ二本鎖切断の数（および／または前記小核の数）および前記作用濃度を使用して求める工程（ｆ）をさらに含む。
【００２８】
本発明の方法によれば、二本鎖切断を検出する上記工程（ｅ）が、好適には、免疫蛍光検査、細胞遺伝学的試験、およびパルス電界電気泳動からなる群から選択される技術を使用して実施される。
【００２９】
ある実施形態では、上記工程（ｅ）において、ｐＨ２ＡＸ、５３ＢＰ１、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＤＮＡ−ＰＫ、およびＭＤＣ１からなる群から選択されるバイオマーカーを検出する。好適には、ｐＨ２ＡＸバイオマーカーを検出するとともに、好ましくは、該バイオマーカーの核病巣の数と大きさを検出する。特に好ましい実施形態では、細胞核の位置特定に適した対比染色を行うことにより、小核（ＭＮ）を定量化する。
【００３０】
本発明の上記工程（ｅ）において、好適には、作用濃度が予め決定された基準濃度Ｃｒｅｆである。ある実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断の数をｐＨ２ＡＸ免疫蛍光検査により求め、ＤＡＰＩ対比染色の後に小核（ＭＮ）の数を検出し、その後、上記細胞サンプルについて、ＮｐＨ２ＡＸ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）とＮＭＮ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）とを求める。上記細胞サンプルについて、ＮｐＨ２ＡＸ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）≦２、または、ＮＭＮ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）≦２％であれば、遺伝子毒性リスクが低いと考え、および／または、遺伝子毒性リスクが「グループI」であるとする。上記細胞サンプルについて、ＮｐＨ２ＡＸ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）＞８、または、ＮＭＮ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）＞１０％であれば、遺伝子毒性リスクが非常に高いと考え、および／または、遺伝子毒性リスクが「グループIII」であるとする。その他のすべての場合では、遺伝子毒性リスクが中程度であると考え、および／または、遺伝子毒性リスクが「グループII」であるとする。
【００３１】
本発明の上記工程（ｅ）において、好適には、作用濃度が予め決定された基準濃度Ｃｒｅｆである。好適には、この決定は、
（i）いわゆる基準細胞（感受性グループI）を分散および／または増幅することにより細胞サンプルを準備し、該細胞サンプルを複数の分画に細分し、
（ii）試験対象である上記少なくとも１種の化学的または生化学的因子を、上記化学的または生化学的因子の濃度範囲（例えば、ｎＭからｍＭにわたる濃度範囲）から選択される複数の濃度で、所定の時間（好ましくは２４時間）にわたって、前記細胞サンプルの各分画にそれぞれ塗布し、
（iii）前記細胞サンプルの各分画について、細胞１個あたりのｐＨ２ＡＸ病巣の数、および／または、細胞１個あたりの小核の数を求め、
（iv）（好ましくは、ＤＡＰＩ対比染色を使用したｐＨ２ＡＸマーカー免疫蛍光検査により）ｐＨ２ＡＸマーカーを使用して、観察時間ｔおよび濃度Ｃにおいて得られる核病巣の平均数（ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ，Ｃ））を求め、
観察時間ｔおよび濃度Ｃにおける、細胞１００個あたりの小核の平均数（この平均数をＮＭＮ（ｔ，Ｃ）と呼ぶ）を求め、
好ましくは、一度に少なくとも５０個の核（ガウス標準誤差）について、または、５０個の核についての独立した３回の実験（平均値の標準誤差）について行われる、これら測定についての標準誤差σを求め、
式：ＮｐＨ２ＡＸ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）＋２σ＝２、または、ＮＭＮ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）＋２σ＝２％が成り立つ濃度としてのいわゆる基準濃度Ｃｒｅｆを求める方法により実施する。
【００３２】
好適には、上記のいわゆる基準細胞が、ＨＦ１９細胞株、ＩＭＲ９０細胞株、４８ＢＲ細胞株、７０ＢＲ細胞株、１４２ＢＲ細胞株、１５５ＢＲ細胞株、ＭＲＣ５細胞株、１ＢＲ３細胞株、１４９ＢＲ細胞株、およびＭＲＣ９細胞株から選択され、より好ましくは、１ＢＲ３細胞株、１４９ＢＲ細胞株、およびＭＲＣ９細胞株から選択される。
【００３３】
少なくとも１種の化学的もしくは生化学的因子、または、化学的因子同士、生化学的因子同士、もしくはこれらの組み合わせによるＤＮＡ切断毒性作用に対する、被験者の組織サンプルの感受性を評価するための方法の一実施形態によれば、
（i）サンプル採取された上記組織からの細胞を、単離および／または増幅し、これら増幅した細胞が「細胞サンプル」を構成し、
（ii）上記細胞サンプルについて、ｐＨ２ＡＸマーカーを使用して得られる核病巣の平均数を観察時間ｔにおいて求め（これら平均数をＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）とし、観察時間はｔ＝０（上記少なくとも１種の化学的もしくは生化学的因子（または化学的因子同士、生化学的因子同士、もしくはこれらの組み合わせ）に対する非暴露状態である、ｔ０）および、少なくとも、上記細胞サンプルと、作用濃度の上記少なくとも１種の化学的もしくは生化学的因子（または化学的因子同士、生化学的因子同士、もしくはこれらの組み合わせ）とを、所定時間にわたり接触（この接触を「遺伝子毒性暴露」と呼ぶ）させた後のｔ４であり、
（iii）少なくとも上記平均数ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）を使用して、上記サンプルの遺伝子毒性暴露に対する感受性グループを判定する。
【００３４】
ｔ４は、ＤＮＡ切断のレベルがその残留値に到達する時間を表す固定値であり、１２時間以上でなくてはならず、好ましくは１２時間〜４８時間であり、より優先的には約２４時間である。
【００３５】
ある実施形態では、上記細胞サンプルについて、観察時間ｔにおいて観察される細胞１００個あたりの小核の平均数［％で表わす］（この平均数をＮＭＮ（ｔ）と呼ぶ）を求める。時間ｔは、少なくとも、ｔ０（生物学的吸収用量Ｄへの非暴露状態）およびｔ４（生物学的吸収用量Ｄへの暴露後）である。
【００３６】
本発明の範囲において、グループ評価基準が、臨床的評価基準に従って定義される。グループ I＝臨床兆候無し、グループ II＝臨床兆候有り、グループIII＝致命的影響
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１中、（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）は、細胞サンプルを所定の濃度のグリホサート（ＣＡＳ  Ｎｏ．１０７１−８３−６）に接触させてから２４時間のｐＨ２ＡＸ病巣の数の変動を、線維芽細胞株１ＢＲ３（図１中の（Ａ）），１４９ＢＲ（図１中の（Ｂ））および０４ＰＳＬ（図１中の（Ｃ））に対する当該グリホサート濃度ごとに示す。
【図２】図２中、（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）は、細胞サンプルを所定の濃度の５ＦＵに接触させてから２４時間のｐＨ２ＡＸ病巣の数の変動を、線維芽細胞株ＭＲＣ９（図２中の（Ａ）），０３ＨＬＳ（図２中の（Ｂ））およびＧＭ０２７１８（図２中の（Ｃ））に対する当該５ＦＵの濃度ごとに示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
ヒトである患者に適した複数の代替的実施形態を包含する一実施形態について、以下に説明する。
試験の準備
細胞サンプルの採取および細胞サンプルの操作の前に、（例えば、細胞学的分析研究施設に所属する）各オペレータは、患者のＨＩＶまたはＣ型肝炎への感染の可能性について（典型的には、医師から）通知を受ける。これにより、オペレータが、採取中、操作中、および細胞培養の管理中に、適度に高められた生物学的安全対策を取ることができる。
【００３９】
作業者は、細胞サンプルを準備するための組織サンプルを患者から採取する。好ましくは、生検により皮膚サンプルを採取する。好適には、このサンプル採取は、「皮膚パンチ」生検として知られる方法によって行ってもよい。この組織サンプルを、無菌２０％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地に配置する。組織サンプルは、すぐに専門の実験室に移す。ここで、サンプルを３８時間を超える時間、室温に置いたままにしてはならない。
【００４０】
サンプルとして採取された組織は、以下の工程により、単離および／または増幅される。
【００４１】
ある実施形態では、組織サンプル（典型的には生検材料）を、受領後すぐに、増幅可能な細胞株の形に株化する。株化は、Elkindらによる刊行物（"The radiobiology of cultured mammalian cell", Gordon and Breach (1967年)）により強調されるように、ウイルス性または化学的形質転換剤を使用せずに、培養研究施設に公知の補助的手順に従って行われる。十分な数の細胞を得たのち（典型的には１〜３週間後）、本発明の方法で第１の実験を実施する。細胞サンプルを準備し、細胞をペトリ皿内のカバーガラス上に接種する。これらのカバーガラスの一部を、濃度が異なる金属、殺虫剤、またはその他の任意のＤＮＡ切断化学的因子または生化学的因子で汚染する。その他の部分は汚染しない。この部分は、自然状態を表わす。汚染中、細胞は培養インキュベータ内で３７℃に維持される。
【００４２】
汚染細胞については、ＤＮＡ切断化学的因子または生化学的因子を添加しての培養時間経過後の状態に対応する特徴を獲得する。この特徴は、マーカーｐＨ２ＡＸに対応する病巣により表される。次いで、カバーガラス上の細胞を固定し、溶解し、ハイブリダイズする。以下の公知の手順（Bodgi，外、"A single formula to describe radiation-induced protein relocalization: towards a mathematical definition of individual radiosensitivity", J Theor Biol. 21 p 333:135-45.2013年）を実施する。
【００４３】
細胞を、３％パラホルムアルデヒドおよび２％スクロース中で、室温で１５分間固定し、さらに、２０ｍＭのｐＨ７．４のヘペス緩衝液（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、３００ｍＭのスクロース、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（化学式ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ（式中ｘ＝９〜１０）で表される非イオン界面活性剤（ＣＡＳ  Ｎｏ．９００２−９３−１、例えばＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製））で３分間透過化処理する。その後、免疫学的染色に先立ち、カバーガラスを、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳとして知られる）中で洗浄する。インキュベーションは、２％ウシ血清アルブミン（頭文字のＢＳＡまたはフラクションＶとして知られる（例えばＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製））を添加したＰＢＳ中で、３７℃で４０分間行った。インキュベーションの後、ＰＢＳで洗浄を行った。一次抗体である抗ｐＨ２ＡＸは、１：８００の濃度で使用する。抗マウス二次抗体ＦＩＴＣまたは抗ウサギ二次抗体ＴＲＩＴＣ（１：１００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用したインキュベーションを、２％ＢＳＡ中で、３７℃で２０分間行った。核を標識するために、カバーガラスをＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）含有のＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄTMで処理した。ＤＡＰＩでの着色は、間接的に、フェーズＧ１にある細胞（核のＤＡＰＩ着色が均一）の個数、フェーズＳにある細胞（核が多数のｐＨ２ＡＸ病巣を有する）の個数、および、フェーズＧ２にある細胞（核のＤＡＰＩ着色が不均一）の個数、および中期（染色体が見える）にある細胞の個数の判定も可能にする。
【００４４】
免疫蛍光顕微鏡（例えばオリンパスモデル）にセットした上記カバーガラスから結果を得る。読取りは、直接的（典型的には、各点につき、Ｇ０／Ｇ１にある細胞少なくとも５０個について病巣をカウントする）であってもよく、専用の画像解析ソフトウェアを使用して行ってもよく、または、自動化顕微鏡で行ってもよい。ソフトウェアまたは自動化顕微鏡法は、手動測定により較正されることが好ましい。
【００４５】
診断の根拠として使用するのに十分な統計的信頼度を有する結果を得るために、少なくとも３回の個別の一連の実験（暴露）を行い、規定の時間について各病巣数の平均を計算する。
生物学的・臨床的パラメータの判定
総論および使用マーカー
本発明は、とりわけ、非汚染（自然状態）細胞上のｐＨ２ＡＸマーカーおよび汚染細胞上のｐＨ２ＡＸマーカーのうちの一方について得られたデータの利用を基本とする。本発明の方法は、所定の汚染時間におけるこのマーカーでの標識の研究に基づくものである。つまり、汚染の中断からの規定の時間間隔後にサンプルを標識し、サンプルの免疫蛍光を調査する。
【００４６】
サンプル採取がｎ＝３（ガウスタイプの「標準誤差ＳＥ」ではない）であれば、各マーカーを使用して得られる各点と各用量の平均は、平均値の標準誤差（「ＳＥＭ」と呼ばれる）を使用して計算される。
【００４７】
ｐＨ２ＡＸは、ヒストンＨ２ＡＸのＸ変異体のセリン４３９におけるリン酸化型を指し、本願出願人の知見によれば、ＤＮＡの二本鎖切断（ＤＳＢ）の数を標識する。ＤＳＢは、主要かつ信頼できる修復方法、すなわち、縫合により認識される。実質的に、マーカーｐＨ２ＡＸは、もっぱら核病巣の形をとって核状であり、病巣の個数と大きさのみが分析される。
【００４８】
ＤＡＰＩ（当業者には公知のＤＮＡマーカー）を使用した対比染色により、細胞質または核内局在を位置づける核の位置を特定することができ、これにより小核を定量化できる。小核は、病巣についての相補的細胞マーカーである。
生物学的・臨床的パラメータ
以下のように、定義付けおよび決定を行う。
・ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）：マーカーｐＨ２ＡＸを使用して、観察時間ｔ０（非汚染）またはｔ４において得られる核病巣の平均個数。ここで、パラメータＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）の決定は本発明の方法の範囲において必須である。
・ＮＭＮ（ｔ）：自然に（ｔ＝ｔ０、すなわち、非汚染で）観察される、または、汚染後のｔ＝ｔ４において観察される、細胞１００個あたりの小核の数（％で表わす）
本発明の方法は、所定の金属に対する細胞の感受性は対象細胞に従って変動することを示す。例えば、１００μＭのアルミニウムで汚染された星状細胞に見られる切断（ＨＡ細胞、Ｈ２ＡＸ病巣は２）は、同じ濃度についての内皮細胞の切断（ＨＭＥＣ細胞、Ｈ２ＡＸ病巣は３.７）に比較して少ない（表１参照）。さらに、同じ金属について、本発明者らは、提案された単一毒性尺度と、例えば、鉛の場合（鉛中毒）やカドミウムの場合（イタイイタイ病）の場合について記載されたある種の臨床兆候との間には、対応関係があることを示した（表３参照）。
【００４９】
また、本発明の方法によれば、銅で汚染された細胞では、最も高濃度（１ｍＭ）の試験において、（試験対象の細胞の種類により２〜２１個の範囲にわたる）Ｈ２ＡＸ病巣によって可視化された多数のＤＮＡ切断が見られることがわかった（表１および表２を参照）。
【００５０】
本発明の方法は非常に感受性が高いので、非常に低濃度のＤＮＡ切断化学的因子が組織に与える影響を特徴付けることができる。この低濃度は、具体的には、飲用水中の化学的因子の規制値のオーダーであって、例えば、銅では２ｍＭオーダー（２ｍｇ／Ｌ）、アルミニウムでは２００μｍオーダー、カドミウムでは５μｍオーダー、Ｐｂ（鉛）では１０μＭオーダーである。
予測的評価
これは、測定した生物学的データを使用して、臨床的パラメータを予測することを目的とする。
【００５１】
スコアの数学的値またはスコアに相関する数式から直接的に導出される定量的診断は、以下の基準に関連する。
【００５２】
（ｉ）グループI，II，またはIIIへの患者の分類（ＧＲＯＵＰと呼ばれる基準）
感受性グループ（ＧＲＯＵＰ）の定義は、本発明に係るのスコアと、既知の遺伝的症候群から類推される患者の臨床プロフィールとに基づいて、医師が判定を行う際の補助となる。これらのグループは、当初、上記のJoubertらの刊行物（(Int. J. Radiat. Biol. 84(2), p. 107-125 (2008年)）に定義された。
【００５３】
本発明では、以下のように考察される。
【００５４】
細胞サンプルについて、ＮｐＨ２ＡＸ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）＜＝２、または、ＮＭＮ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）＜＝０.５％，好ましくは、ＮＭＮ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）＜＝１％、さらに好ましくは、ＮＭＮ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）＜＝２％であれば、遺伝子毒性リスクが低いと考えられ、または、遺伝子毒性リスクが「グループI」であるとされる。
【００５５】
細胞サンプルについて、ＮｐＨ２ＡＸ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）＞８、または、ＮＭＮ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）＞１０％であれば、遺伝子毒性リスクが非常に高いと考えられ、または、遺伝子毒性リスクが「グループIII」であるとされる。
【００５６】
その他のすべての場合では、遺伝子毒性リスクが中程度であると考えられ、また遺伝子毒性リスクが「グループII」であるとされる。
実施例
実施例１
対照線維芽細胞株についての、グリホサート（化学的因子）の基準濃度の決定
市販の１ＢＲ３および１４９ＢＲ対照線維芽細胞を、所望の細胞数を得られるまで、供給会社（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）の推奨に従って増幅した。十分な数の細胞を得たのち（概ね１〜３週間後）、本発明の方法で第１の実験を実施した。細胞をペトリ皿内のカバーガラス上に接種した。これらのカバーガラスの一部を、下記の表１に示す濃度のグリホサート（ＣＡＳ  Ｎｏ．１０７１−８３−６）を含む試験培地に接触させた。
【００５７】
【表１】
2018530313.tif 000002
【００５８】
所定濃度のグリホサートとの接触後、細胞を培養インキュベータ内で３７℃で保存した。表１に示す所定濃度のグリホサートとの接触の２４時間後、ｐＨ２ＡＸマーカーを使用して得られた核病巣の平均数を求めた。免疫蛍光顕微鏡（オリンパスモデル）にセットした上記カバーガラスから結果を得た。読取りは、各点につき、ｐＨ２ＡＸマーカーを利用して、Ｇ０／Ｇ１にある少なくとも５０個の細胞の病巣をカウントすることにより直接的に、または、専用の画像解析ソフトウェア（imageJ）を使用して行った。
【００５９】
診断の根拠として使用するのに十分な統計的信頼度を有する結果を得るために、３回の個別の一連の実験を行った。対照細胞と所定濃度のグリホサートとの接触から２４時間後の各病巣数の平均と平均値の標準誤差（「ＳＥＭ」またはσ）を計算した。計算値を表１に示す。
【００６０】
このように、対照皮膚細胞サンプル１ＢＲ３および１４９ＢＲ（表１参照）について、基準濃度を決定した。基準濃度は、次式の濃度として決定した。
【００６１】
ＮｐＨ２ＡＸ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）＋２σ＝２
式中、σは対照細胞と所定濃度のグリホサートとの接触から２４時間後のｐＨ２ＡＸ病巣の数の測定の標準誤差であり、これらの測定は５０個の細胞についての３回の個別の実験により実施した（平均の標準誤差）。
【００６２】
図１は、対照細胞１ＢＲ３（図１中（Ａ）を参照）および１４９ＢＲ（図１中（Ｂ）を参照）の、グリホサートとの接触後２４時間における細胞１個あたりのｐＨ２ＡＸ病巣数の変動を、使用されたグリホサートの濃度ごとに示している。２種類の対照細胞１４９ＢＲおよび１ＢＲ３について、式：ＮｐＨ２ＡＸ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）＋２σ＝２で規定される濃度Ｃｒｅｆは、１００μＭである。
試験の準備(細胞株０４ＰＳＬ)
当業者には公知方法である「皮膚パンチ」生検によって、患者から皮膚細胞サンプルを採取した。この細胞サンプルを、２０％無菌ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地に配置した。３８時間超える時間、室温に置いたままにしないように、細胞サンプルを、すぐに専門の実験室に移した。
【００６３】
受領後すぐ、培養研究施設および当業者に公知の方法により、上記の生検による細胞サンプルを増幅可能な０４ＰＳＬ細胞株に株化した。具体的には、トリプシン分散液を使用して、細胞を補充培地に再度希釈する。所望の数の細胞が得られるまで、同様の作業を行う。十分な数の細胞を得たのち（概ね１〜３週間後）、本発明の方法で第１の実験を実施した。０４ＰＳＬ細胞株を、ペトリ皿内のカバーガラス上に接種した。これらのカバーガラスの一部を、濃度１００μＭのグリホサートに接触させた。検証のため、これらのカバーガラスの別の部分を所定の濃度のグリホサートに接触させた（表１、図１中の（Ｃ）を参照）。
【００６４】
所定濃度のグリホサートとの接触後、細胞を培養インキュベータ内で３７℃で保存した。表１に示す所定濃度のグリホサートとの接触の２４時間後、ｐＨ２ＡＸマーカーを使用して得られた核病巣の平均数を求めた。免疫蛍光顕微鏡（オリンパスモデル）にセットした上記カバーガラスから結果を得た。読取りは、各点につき、ｐＨ２ＡＸマーカーを利用して、Ｇ０／Ｇ１にある少なくとも５０個の細胞の病巣をカウントすることにより直接的に、または、専用の画像解析ソフトウェア（imageJ）を使用して行った。
【００６５】
診断の根拠として使用するのに十分な統計的信頼度を有する結果を得るために、３回の個別の一連の実験を行った。対照細胞と所定濃度のグリホサートとの接触から２４時間後の各病巣数の平均と平均値の標準誤差（「ＳＥＭ」またはσ）を計算した。計算値を表１および図１中（Ｃ）に示す。
０４ＰＳＬ細胞株の遺伝子毒性リスクの判定
グリホサート濃度１００μＭにおいて、０４ＰＳＬ細胞株について得られたｐＨ２ＡＸ病巣の数は約7個であり、この数は式：２＜ＮｐＨ２ＡＸ（２４ｈ）＜８が妥当であることを示す。したがって、０４ＰＳＬ細胞株については、グリホサートに関連する遺伝子毒性リスクは「グループII」、または、中程度である。０４ＰＳＬ細胞株は、化学感受性を有する。
実施例２
対照線維芽細胞株についての、化学療法用薬剤５ＦＵ（化学的因子）の基準濃度の決定
市販のＭＲＣ９対照線維芽細胞を、所望の細胞数を得られるまで、供給会社（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）の推奨に従って増幅した。十分な数の細胞を得たのち（概ね１〜３週間後）、本発明の方法で第１の実験を実施した。細胞をペトリ皿内のカバーガラス上に接種した。これらのカバーガラスの一部を、下記の表２に示す濃度の５ＦＵを含む試験培地に接触させた。
【００６６】
【表２】
2018530313.tif 000003
【００６７】
所定濃度の５ＦＵとの接触後、細胞を培養インキュベータ内で３７℃で保存した。表２に示す所定濃度の５ＦＵとの接触の２４時間後、ｐＨ２ＡＸマーカーを使用して得られた核病巣の平均数を求めた。免疫蛍光顕微鏡（オリンパスモデル）にセットした上記カバーガラスから結果を得た。読取りは、各点につき、ｐＨ２ＡＸマーカーを利用して、Ｇ０／Ｇ１にある少なくとも５０個の細胞の病巣をカウントすることにより直接的に、または、専用の画像解析ソフトウェア（imageJ）を使用して行った。
【００６８】
診断の根拠として使用するのに十分な統計的信頼度を有する結果を得るために、３回の個別の一連の実験を行った。対照細胞と所定濃度の５ＦＵとの接触から２４時間後の各病巣数の平均と平均値の標準誤差（「ＳＥＭ」またはσ）を計算した。計算値を表２に示す。
【００６９】
このように、対照皮膚細胞サンプルＭＲＣ９（表２、図２中（Ａ）を参照）について、基準濃度を決定した。この基準濃度は、次式の濃度として決定した。
【００７０】
ＮｐＨ２ＡＸ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）＋２σ＝２
式中、σは対照細胞と所定濃度のグリホサートとの接触から２４時間後のｐＨ２ＡＸ病巣の数の測定の標準誤差であり、これらの測定は５０個の細胞についての３回の個別の実験により実施した（平均の標準誤差）。
【００７１】
図２は、対照細胞ＭＲＣ９（図２中（A）を参照）の、５ＦＵとの接触後２４時間における細胞１個あたりのｐＨ２ＡＸ病巣数の変動を、使用された５ＦＵの濃度ごとに示している。対照細胞株ＭＲＣ９について、式：ＮｐＨ２ＡＸ（２４ｈ，Ｃｒｅｆ）＋２σ＝２で規定される濃度Ｃｒｅｆは、３０μＭである。
試験の準備（細胞株ＧＭ０２７１８および０３ＨＬＳ）
ＧＭ０２７１８細胞株を、所望の細胞数を得られるまで、供給会社（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の推奨に従って増幅した。
【００７２】
０３ＨＬＳ細胞株については、当業者には公知方法である「皮膚パンチ」生検によって、患者から皮膚細胞サンプルを採取した。この細胞サンプルを、２０％無菌ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地に配置した。３８時間超える時間、室温に置いたままにしないように、細胞サンプルを、すぐに専門の実験室に移した。
【００７３】
受領後すぐ、培養研究施設および当業者に公知の方法により、上記の生検による細胞サンプルを増幅可能な０３ＨＬＳ細胞株に株化した。具体的には、トリプシン分散液を使用して、細胞を補充培地に再度希釈する。所望の数の細胞が得られるまで、同様の作業を行う。
【００７４】
十分な数の細胞を得たのち（概ね１〜３週間後）、本発明の方法で第１の実験を実施した。ＧＭ０２７１８細胞株または０３ＨＬＳ細胞株を、ペトリ皿内のカバーガラス上に接種した。これらのカバーガラスの一部を、濃度３０μＭの５ＦＵに接触させた。検証のため、これらカバーガラスの別の部分を所定の濃度の５ＦＵに接触させた（ＧＭ０２７１８細胞株については、表２および図２中の（Ｂ）を、０３ＨＬＳ細胞株については、図２中の（Ｃ）を参照）。
【００７５】
所定濃度の５ＦＵとの接触後、細胞を培養インキュベータ内で３７℃で保存した。表２に示す所定濃度の５ＦＵとの接触の２４時間後、ｐＨ２ＡＸマーカーを使用して得られた核病巣の平均数を求めた。免疫蛍光顕微鏡（オリンパスモデル）にセットした上記カバーガラスから結果を得た。読取りは、各点につき、ｐＨ２ＡＸマーカーを利用して、Ｇ０／Ｇ１にある少なくとも５０個の細胞の病巣をカウントすることにより直接的に、または、専用の画像解析ソフトウェア（imageJ）を使用して行った。
【００７６】
診断の根拠として使用するのに十分な統計的信頼度を有する結果を得るために、３回の個別の一連の実験を行った。対照細胞と所定濃度の５ＦＵとの接触から２４時間後の各病巣数の平均と平均値の標準誤差（「ＳＥＭ」またはσ）を計算した。計算値を、細胞株ＧＭ０２７１８については表２および図２中（Ｂ）に、細胞株０３ＨＬＳについては図２中（Ｃ）に示す。
ＧＭ０２７１８細胞株および０３ＨＬＳ細胞株の遺伝子毒性リスクの判定
５ＦＵの濃度３０μＭにおいて、ＧＭ０２７１８細胞株および０３ＨＬＳ細胞株について得られたｐＨ２ＡＸ病巣の数は、それぞれ、約２.３８個および２.５９個であり、これら数は式：２＜ＮｐＨ２ＡＸ（２４ｈ）＜８が妥当であることを示す。したがって、ＧＭ０２７１８細胞株および０３ＨＬＳ細胞株については、５ＦＵに関連する遺伝子毒性リスクは「グループII」、または、中程度である。ＧＭ０２７１８細胞株および０３ＨＬＳ細胞株は、化学的感受性を有する。
その他の実施例
以下の表は、上記の「発明の詳細な説明」に記載の通りに実施した数々の実験の結果をまとめたものである。
【００７７】
表３および表４中、「ｐＨ２ＡＸ」は、細胞サンプルと濃度Ｃ（ＮｐＨ２ＡＸ（２４ｈ，Ｃ））の化学的因子との接触後２４時間において、ｐＨ２ＡＸマーカーを使用して得られた核病巣の平均数（ＮＭＮ（２４ｈ，Ｃ））を示す。また、「小核」は、細胞サンプルと濃度Ｃの化学的因子との接触後２４時間において観察された、細胞１００個あたりの小核の平均数（ＮＭＮ（２４ｈ，Ｃ））を示す。
【００７８】
【表３】
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【００７９】
【表４】
2018530313.tif 000005
【００８０】
上記の表４の実験データを使用して、基準濃度Ｃｒｅｆを求めた。具体的には、Ｐｂ（ＮＯ３）２の基準濃度（Ｃｒｅｆ＜１μＭ）およびＣｄＣｌ２の基準濃度（Ｃｒｅｆ＝１０μＭ）を求めた。具体的には、Ｐｂ（ＮＯ３）２およびＣｄＣｌ２について、これらのデータを以下の表５中の観察された臨床兆候と相関させた。
【００８１】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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