(57)【要約】  本発明は、有効にCD8+T細胞免疫およびCD4+T細胞免疫を刺激することができ、免疫診断あるいは予防性または治療性ワクチンに使用することができる人工多抗原融合タンパク質およびその製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の対象に施用される場合、前記対象において同時にCD4+T細胞とCD8+T細胞の免疫応答を刺激することができることを特徴とする人工多抗原融合タンパク質。
【請求項２】
前記人工多抗原融合タンパク質は、≧3個、好ましくは≧5個、より好ましくは≧10個の抗原領域を含有することを特徴とする請求項1に記載の人工多抗原融合タンパク質。
【請求項３】
前記の各抗原領域はウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、クラミジア抗原、腫瘍抗原、またはこれらの組み合わせ由来のものであることを特徴とする請求項2に記載の人工多抗原融合タンパク質。
【請求項４】
前記の人工多抗原融合タンパク質は、さらに、各抗原領域の間に位置する制限酵素切断部位配列を含むことを特徴とする請求項1に記載の人工多抗原融合タンパク質。
【請求項５】
前記の制限酵素切断部位配列はカテプシンの制限酵素切断部位を含み、かつ
好ましくは、前記のカテプシンの制限酵素切断部位は、カテプシンSの制限酵素切断部位（たとえばLeu-Arg-Met-Lysまたは類似の制限酵素切断部位）、カテプシンBの制限酵素切断部位（たとえばMet-Lys-Arg-Leuまたは類似の制限酵素切断部位）、カテプシンKの制限酵素切断部位（たとえばHis-Pro-Gly-Glyまたは類似の制限酵素切断部位）、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、
ことを特徴とする請求項4に記載の人工多抗原融合タンパク質。
【請求項６】
前記融合タンパク質は式Iの構造を有することを特徴とする請求項1に記載の人工多抗原融合タンパク質。
Y-(A-C)n-Z             (I)
（式中において、
Aは抗原領域である。
Cはカテプシンの制限酵素切断部位配列である。
nは≧3の正整数である。
Yはないか「Y0-B」で表される配列であるが、ここで、Y0はシグナルペプチド配列、タグ配列、膜透過エレメント配列、アジュバントエレメント配列、細胞壊死因子エレメント配列、または上記配列の任意の組み合わせで、Bはないか切断部位（cleavage site）配列である。
Zはないか、あるいはタグ配列、膜透過エレメント配列、アジュバントエレメント配列、細胞壊死因子エレメント配列、または上記配列の任意の組み合わせである。
付加条件は、Zがない場合、最後の一つの「A-C」におけるCはなくてもよい。）
【請求項７】
請求項1〜6のいずれかに記載の人工多抗原融合タンパク質と薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項1に記載の人工多抗原融合タンパク質の使用であって、予防性および/または治療性のワクチン組成物または薬物組成物の製造に使用されることを特徴とする使用。
【請求項９】
請求項1に記載の人工多抗原融合タンパク質の使用であって、特異性T細胞免疫を検出する試薬またはキットの製造に使用されることを特徴とする使用。
【請求項１０】
治療が必要な対象に、請求項1〜6のいずれかに記載の人工多抗原融合タンパク質、または請求項7に記載の組成物を施用する工程を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬の分野に関し、より具体的に、同時にCD4+とCD8+のT細胞免疫応答を刺激することができる、人工多抗原融合タンパク質およびその製法と使用に関する。本発明の人工多抗原融合タンパク質は、発現・精製後そのまま免疫診断または予防・治療性ワクチンに使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
人体が細菌・ウイルスに感染するか、癌細胞によって刺激されると、一連の体液免疫および細胞免疫の変化が生じる。細胞免疫は、腫瘍細胞と細胞に感染した細菌およびウイルスとに非常に重要である。人体が初めて上記外来刺激を受けた後、T細胞が感作され、記憶T細胞になる。人体が同じ抗原に再び接触すると、迅速にエフェクターT細胞反応を含む特異的免疫反応が生じ、様々なサイトカインが発生し、免疫的効果を発揮する（細胞免疫）。細胞免疫は細菌、ウイルスおよび腫瘍の抑制と排除において重要な役割を果たすため、細胞免疫のワクチンは細菌・ウイルスの感染の予防および腫瘍の治療にある程度の効果がある。
現在、臨床において、腫瘍と一部の細胞に感染する細菌およびウイルスには、有効な化学薬物がまだない。そのため、細胞免疫を刺激する治療性ワクチンは腫瘍および細菌・ウイルスの感染の抑制に非常に重要な作用を果たす。現在、米国FDAは既に前立腺癌を治療する治療ワクチンの市販を許可した。
【０００３】
また、細胞免疫に対するモニタリングは、疾患の治療、予後およびワクチンの有効性の評価に重要である。
通常の細胞免疫を検出する方法は酵素結合イムノスポット法（enzyme linked immunospot assay、ELISPOT）で、当該方法では、単一細胞のレベルでサイトカインを分泌するT細胞を検出することができる。たとえば、結核（TB）特異的抗原によって刺激された後サイトカインを分泌するT細胞の数を検出することによって、細胞免疫機能を評価することができる。結核にとって、細胞免疫の検査はTB感染の有無を診断する方法の一つである。2008年に、米国FDAはELISPOTの商品化キットT-SPOTの結核感染の診断への使用を許可した。これらの診断キットでは、基本的に、いずれも18〜20個のアミノ酸のポリペプチドの混合物が刺激源として使用される。これらのポリペプチドは末梢血の抗原提示細胞に取り込まれた後、加工されて自身のHLA抗原とともに細胞の表面に提示され、さらに記憶T細胞のT細胞受容体に認識される。T細胞が刺激された後、インターフェロン-γをはじめとするサイトカインが発生し、検出できるようになる。
【０００４】
人体に異なるクローンのT細胞が多く存在し、各クローンはいずれも異なる短鎖ペプチドとHLAの刺激が必要で、異なる人体にも異なるT細胞のクローンがあり、異なる人体のHLA抗原も異なる。あるHLAの人たちのT細胞を選別するには、この人たちのT細胞エピトープを同定し、選別する必要がある。HLA表現型の同定およびT細胞エピトープ配列の同定はいずれも手間がかかる作業である。すべての人およびある刺激源（タンパク質）のすべてのT細胞認識エピトープをカバーする最も使用される方法は、長さが18〜20個のアミノ酸、またはそれ以上のポリペプチドを合成するものである。しかしながら、臨床で使用するには、ポリペプチドごとに厳格な生産プロセスおよび品質検査の基準を確立する必要がある。TB検出のためのESAT6（96個のアミノ酸）およびCFP10（100個のアミノ酸）を例とすると、通常、二つのタンパク質抗原のすべてのエピトープをカバーするには、20個以上のポリペプチドの混合物が必要で、コストが増加し、キットが高価になるため、ある程度その普及が制限されている。一つの代わりになる案は限りのあるいくつかのポリペプチドを刺激源として選択するものであるが、異なる人のHLA多型によって、T細胞が認識する抗原エピトープが異なるため、この案ではコストが節約されるが、エピトープのカバー率も下がる。
【０００５】
予防・治療性ワクチンは抗原提示細胞、特に樹状細胞（DC）によって処理して提示された後、抗原特異的な細胞傷害性CD8+T細胞（CTL）およびヘルパーCD4+T細胞を刺激して活性化することができる。ヘルパーCD4+T細胞は有効に細胞傷害性CD8+T細胞を刺激して増幅し、そしてB細胞による抗体の生成を手伝うことができる。CD8+T細胞は標的抗原を含む標的細胞を特異的に認識して溶解させることができる。特異性CD8+T細胞の活性化は抗原が有効にMHCクラスI分子（ヒトではHLAクラスI抗原）によって提示されることに依存する。CD8+細胞傷害性T細胞は直接に腫瘍細胞またはウイルスなどに感染された細胞を認識して破壊することができるため、予防・治療性細胞免疫ワクチンの主な有効成分である。そのため、現在、ほとんどの治療性ワクチンの設計はどのように生体を刺激して特異的に腫瘍またはウイルスの抗原を認識するCD8+T細胞を生成させるかということを中心に行われている。
【０００６】
現在、抗原提示細胞（APC）の細胞質内における抗原だけがプロテアソームによって小分子ペプチドに分解され、TAPタンパク質によって小胞体に輸送され、中では、CTLエピトープポリペプチドはMHC-I（HLA-I）類と結合して抗原提示細胞の表面に送られ、CD8+T細胞の特異性受容体と結合し、特異的に後者を活性化させるという観点が主流である。同時に、従来の考えでは、また、細胞質内で転写・翻訳して生成するタンパク質抗原だけがMHC-I（HLA-I）の提示経路に入ることができると思われている。これも現在治療性ワクチンの核心的な設計の策略で、すなわち、細胞質内で複製・転写・翻訳することができるワクチンを開発することである。タンパク質抗原が細胞によって呑み込まれる場合、この抗原は細胞質に入らず、エンドソームおよびリソソームに入るため、このタンパク質抗原は有効にCD8+T細胞を刺激することはできない。
【０００７】
現在、有効にCD8+T細胞免疫を刺激することができるワクチンは、主にDNAワクチン、エピトープポリペプチドワクチンおよび細菌またはウイルスベクターワクチンを含む。これらのワクチンには以下のようにいくつか明らかな欠点がある。DNAワクチンは細胞に入る効率が低く、かつある程度ゲノムに組み込む危険性がある。単一エピトープポリペプチドワクチンはカバーする人の範囲が非常に小さくてその適用範囲が小さくなる。細菌/ウイルスベクターワクチンは副作用が大きく、かつ生体にベクターそのものへの免疫が生じることによって標的抗原に対する免疫力を低下させやすい。また、多くの人は免疫前に既にこれらの細菌/ウイルスに対する免疫力を持っている可能性があるため、ワクチンが作用を発揮する前に消滅され、その使用範囲が大幅に縮小する。
【０００８】
タンパク質は自己複製ができないため、タンパク質ワクチンは安全なワクチンである。一般的に、タンパク質は全部抗原提示細胞（antigen presentation cells、APC）によって飲み込まれてエンドソームおよびリソソームに入り、これによって細胞質に入らず、細胞質のプロテアソームによって分解されてMHCクラスI分子に提示されることはないため、タンパク質抗原ワクチンはCTL反応を刺激しない。タンパク質はAPC細胞内に飲み込まれてリソソームに入り、小分子ペプチドに分解された後、そのうちの一部のポリペプチド（CD4エピトープ）はリソソーム膜におけるMHCクラスII分子と結合し、細胞の表面に提示されてCD4+T細胞を刺激する。CD4+はB細胞による抗体の生成を手伝うことができる。また、タンパク質ワクチンはB細胞を刺激することができる。そのため、従来では、タンパク質抗原は主に生体を刺激して抗体を生成させることに使用される。研究によって、APCは外部から抗原を摂取し、MHCクラスI分子に提示し、CTLを刺激することもできることが見出された。この過程は抗原交差提示と呼ばれる。しかし、この過程の効率は非常に低いため、CD8+T細胞免疫を刺激できるタンパク質ワクチンの設計に成功したことはない。
【０００９】
同様に、ヒトのHLAの制限によって、幅広いポリペプチド系ワクチンを製造するには、最適な方法はその配列がタンパク質のすべてのCD4とCD8エピトープをカバーするように、一連のポリペプチドを製造するものであるが、ポリペプチドごとに厳格な生産プロセスおよび品質検査の基準を確立する必要があるため、コストが高く、産業化ができない。
このように、現在、本分野では、満足できるようなCD8+T細胞免疫を刺激できるワクチンはまだない。そのため、本分野では、有効にCD8+T細胞免疫を刺激でき、品質管理が容易で安全性が高い新規なワクチンの開発が切望されている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の目的は、有効にCD8+T細胞免疫を刺激できる、品質管理が容易で安全性が高いといった特徴を有するタンパク質ワクチンを提供することである。
本発明の第一の側面では、哺乳動物の対象に施用される場合、前記対象において同時にCD4+T細胞とCD8+T細胞の免疫応答を刺激することができる、人工多抗原融合タンパク質を提供する。
もう一つの好適な例において、前記のCD4+T細胞の免疫応答とCD8+T細胞の免疫応答によって、前記のT細胞が細胞の表面に前記抗原を持つ標的細胞を認識するようになる。
【００１１】
もう一つの好適な例において、前記の人工多抗原融合タンパク質における抗原は、ウイルス、細菌、寄生虫、クラミジア、腫瘍細胞、またはこれらの組み合わせ由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記の人工多抗原融合タンパク質は、≧3個、好ましくは≧5個、より好ましくは≧10個の抗原領域を含有する。
もう一つの好適な例において、前記の抗原領域の数の上限は、≦200個、好ましくは≦100個、より好ましくは≦50個である。
もう一つの好適な例において、前記の各抗原領域は、それぞれ異なるか、部分的に同じものか、または完全に同じものである。
もう一つの好適な例において、前記の各抗原領域は同じか異なる病原体由来のもの、または同じか異なる種由来のものであるか、あるいは前記の各抗原領域は人工的配列（すなわち人工的に設計され、自然界に存在しない配列）である。
【００１２】
もう一つの好適な例において、前記の各抗原領域は一つのタンパク質または複数の異なるタンパク質由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記の各抗原領域はウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、クラミジア抗原、腫瘍抗原、またはこれらの組み合わせ由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記各抗原領域に、少なくとも一つ（好ましくは少なくとも2つ）のCD8+エピトープまたはCD8+T細胞免疫応答を刺激できるモチーフ配列と、少なくとも一つ（好ましくは少なくとも2つ）のCD4+エピトープまたはCD4+T細胞免疫応答を刺激できるモチーフ配列とが含まれる。
【００１３】
もう一つの好適な例において、前記の各抗原領域に、少なくとも一つ（好ましくは少なくとも2つ）の同時にCD8+エピトープとCD4+エピトープとしてのアミノ酸配列が含まれる。
もう一つの好適な例において、前記の各抗原領域の長さは8〜50個のアミノ酸、好ましくは10〜40個のアミノ酸、より好ましくは15〜35個のアミノ酸である。
もう一つの好適な例において、前記の人工多抗原融合タンパク質は、さらに、各抗原領域の間に位置する制限酵素切断部位配列を含む。
【００１４】
もう一つの好適な例において、前記の制限酵素切断部位配列は、カテプシンの制限酵素切断部位配列を含む。
もう一つの好適な例において、前記のカテプシンの制限酵素切断部位は、カテプシンSの制限酵素切断部位（たとえばLeu-Arg-Met-Lysまたは類似の制限酵素切断部位）、カテプシンBの制限酵素切断部位（たとえばMet-Lys-Arg-Leuまたは類似の制限酵素切断部位）、カテプシンKの制限酵素切断部位（たとえばHis-Pro-Gly-Glyまたは類似の制限酵素切断部位）、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記のカテプシンSの制限酵素切断部位は、Arg-Cys-Gly↓-Leu、Thr-Val-Gly↓-Leu、Thr-Val-Gln↓-Leu、X-Asn-Leu-Arg↓、X-Pro-Leu-Arg↓、X-Ile-Val-Gln↓およびX-Arg-Met-Lys↓からなる群から選ばれるが、ここで、各Xは独立に任意の一つの天然アミノ酸で、↓は酵素切断位置を表す。
【００１５】
もう一つの好適な例において、前記のカテプシンSの制限酵素切断部位は、X-Arg-Met-Lys(たとえばLeu-Arg-Met-Lys)、X-Ile-Val-Gln、またはこれらの組み合わせである。
もう一つの好適な例において、前記の人工多抗原融合タンパク質において、各抗原領域は前記の制限酵素切断部位配列によって直接連結している。
もう一つの好適な例において、前記の各抗原領域を連結するための制限酵素切断部位配列は同じか、異なる。
もう一つの好適な例において、前記の各抗原領域を連結するための制限酵素切断部位配列は同じである。
もう一つの好適な例において、前記の各抗原領域自身は前記の制限酵素切断部位配列を含有しないか、あるいは前記の各抗原領域自身は前記の制限酵素切断部位配列を含有するが、前記抗原領域が酵素切断されてなる少なとも一つの酵素切断産物（または一部もしくは全部の酵素切断産物）はまだCD8+エピトープまたはCD4+エピトープとされる。
【００１６】
もう一つの好適な例において、前記の人工多抗原融合タンパク質は、さらに、以下の群から選ばれる一つまたは複数の任意のエレメントの配列を含む。
(a) タグ配列(たとえば精製用のもの、たとえば6His)、
(b) シグナルペプチド配列、
(c) 膜透過エレメント配列(たとえばCPP)、
(d) アジュバントエレメント配列(たとえばLRMK)、
(e) 細胞壊死因子エレメント配列。
【００１７】
もう一つの好適な例において、前記の人工多抗原融合タンパク質の長さは100〜2000個のアミノ酸、好ましくは150〜1500個のアミノ酸、より好ましくは200〜1000個のアミノ酸または300〜800個のアミノ酸である。
もう一つの好適な例において、前記の哺乳動物は、ヒト、家畜（たとえばウシ、ヒツジ、ブタ）、ペット（たとえばイヌ、ネコ）、齧歯動物、ウサギ、サルなどを含む。
もう一つの好適な例において、前記抗原融合タンパク質における前記抗原領域は一つまたは二つ、あるいはそれ以上の標的タンパク質の≧10％、≧20％、≧30％、≧40％、≧50％、≧60％、≧70％、≧80％、≧90％、より好ましくは100％の標的タンパク質のアミノ酸配列をカバーしている。
【００１８】
もう一つの好適な例において、前記融合タンパク質は、式Iの構造を有する。
Y-(A-C)n-Z             (I)
（式中において、
Aは抗原領域である。
Cはカテプシンの制限酵素切断部位配列である。
nは≧3の正整数である。
Yはないか「Y0-B」で表される配列であるが、ここで、Y0はシグナルペプチド配列、タグ配列、膜透過エレメント配列、アジュバントエレメント配列、細胞壊死因子エレメント配列、または上記配列の任意の組み合わせで、Bはないか切断部位（cleavage site）配列である。
Zはないか、あるいはタグ配列、膜透過エレメント配列、アジュバントエレメント配列、細胞壊死因子エレメント配列、または上記配列の任意の組み合わせである。
付加条件は、Zがない場合、最後の一つの「A-C」におけるCはなくてもよい。）
【００１９】
もう一つの好適な例において、前記の切断部位（cleavage site）配列はCと異なる（すなわちB≠C）。
もう一つの好適な例において、前記の切断部位配列はCと同じである（すなわちB＝C）。
もう一つの好適な例において、前記のnは、5〜100、より好ましくは6〜50、さらに好ましくは7〜30の任意の整数である。
【００２０】
本発明の第二の側面では、本発明の第一の側面に記載の人工多抗原融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含有する組成物を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の組成物は、薬物組成物およびワクチン組成物を含む。
もう一つの好適な例において、前記の組成物の剤形は、注射剤、凍結乾燥粉末、液体製剤、経口投与製剤、または経皮製剤を含む。
【００２１】
本発明の第三の側面では、本発明の第一の側面に記載の人工多抗原融合タンパク質の使用であって、予防性および/または治療性のワクチン組成物または薬物組成物の製造における使用を提供する。
もう一つの好適な例において、前記のワクチン組成物は、抗病原体（たとえばウイルス）のワクチン組成物、抗腫瘍のワクチン組成物を含む。
もう一つの好適な例において、前記薬物組成物は、細菌関連疾患、ウイルス関連疾患、自己免疫疾患、腫瘍関連疾患またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる疾患の治療および/または予防に使用される。
【００２２】
本発明の第四の側面では、本発明の第一の側面に記載の人工多抗原融合タンパク質の使用であって、特異性T細胞免疫を検出する試薬またはキットの製造に使用されることを特徴とする使用を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の特異性T細胞免疫はCD4+T細胞免疫およびCD8+T細胞免疫を含む。
もう一つの好適な例において、当該試薬またはキットは皮膚試験に使用されるものを含む。
【００２３】
本発明の第五の側面では、治療が必要な対象に、本発明の第一の側面に記載の人工多抗原融合タンパク質または本発明の第二の側面に記載の組成物を施用する工程を含む、方法（たとえば治療または予防方法）を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の方法は、病原体感染または腫瘍の治療および/または予防に使用される。
もう一つの好適な例において、前記の対象は、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物を含む。
もう一つの好適な例において、前記の施用の様態は、静脈注射、皮下注射、経口投与、経皮投与などを含む。
【００２４】
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な
技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１はpNIC28a-Bsa4発現ベクターのクローニングサイトの概略図を示す。
【図２】図２はESAT6/CFP10遺伝子を含有する大腸菌のPCR産物の電気泳動による同定(左)および精製されたESAT6/CFP10多抗原融合タンパク質のSDS-PAGE電気泳動分析(右)を示す。
【図３】図３はOVA:242-352遺伝子を含有する大腸菌のPCR産物の電気泳動による同定(左)および精製されたOVA:242-352多抗原融合タンパク質のSDS-PAGE電気泳動分析(右)を示す。
【図４】図４はHPV16-E7遺伝子を含有する大腸菌のPCR産物の電気泳動による同定(左)および精製されたHPV16-E7多抗原融合タンパク質のSDS-PAGE電気泳動分析(右)を示す。
【図５】図５はフローサイトメトリーによるHPV16-E7多抗原融合タンパク質で処理された正常者PBMCの分析を示し、2パラメーター散布図はPBMCにおけるCD54および抗原の分布を示す。CD54はPEで、抗原はFITCで標識された。
【図６】図６はESAT6/CFP10多抗原融合タンパク質、ESAT6/CFP10成熟タンパク質および商業化されたT-SPOT.TBにおける抗原がそれぞれ刺激された後形成したスポットを示す。結果から、全T細胞に対する刺激では、ESAT6/CFP10多抗原融合タンパク質は商業化されたT-SPOT.TBにおける抗原の効果に相当する（上）が、CD8+リンパ球に対する刺激では、ESAT6/CFP10多抗原融合タンパク質の効果はESAT6/CFP10成熟タンパク質よりも顕著に優れた（下）ことが示された。
【図７】図７はESAT6/CFP10多抗原融合タンパク質の皮膚テストの結果を示す。ここで、4群の不活性化マイコバクテリウム・ツベルクローシスH37Rv由来のタンパク質/ポリペプチドによる感作モルモットの皮膚テストの結果が示された。ホイール法によって陽性コントロール(PPD)、陰性コントロール、組み換えESAT6/CFP10多抗原融合タンパク質(「LRMK」と記する)、組み換えESAT6-CFP10成熟タンパク質(「E6-C10」と記する)を0.1mlずつ皮内注射し、注射後24時間の時点でそれぞれモルモットの各注射点の皮膚の腫れの面積を測定した。
【図８】図８はフローサイトメトリーによるDC2.4細胞におけるSIINFEKL-MHC-Iの分布の分析を示す。ヒストグラムは濃度100μg/mlの場合OVA(242-252)多抗原融合タンパク質におけるSIINFEKLペプチドが有効にDC細胞によって提示されることを示す(提示効率17.6％)。一方、同様にSIINFEKLペプチドを含有する元のタンパク質の断片はMHCクラスI分子に提示されなかった。
【図９】図９はB16-HPV-E7担腫瘍マウスの生存率-時間曲線を示す(腫瘍細胞接種日は0日目)。
【図１０】図１０はB16-survivinマウスの生存率-時間関係を示す(腫瘍細胞接種日は0日目)。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明者は幅広く深く研究し、試行錯誤を繰り返したところ、初めて、CD8+T細胞免疫を刺激できる、生産コストが低くて品質管理が便利といった利点を有し、総合機能が優れたタンパク質ワクチンを開発した。また、既存のワクチンと比べ、本発明のワクチンは、さらに、同時に有効にCD4+T細胞免疫を刺激することができる。実験によって、本発明のタンパク質ワクチンは有効にMHCクラスI抗原提示経路によってCD8+細胞を刺激できることが証明された。これに基づき、本発明を完成させた。
具体的に、本発明者は実践を繰り返したところ、意外に、カテプシンの制限酵素切断部位によって連結した多抗原融合タンパク質ワクチンに基づき、非常に有効に抗原提示細胞によってMHC-I経路を介して提示されることを見出した。体外実験と体内実験では、当該タンパク質ワクチンは有効にCD8+T細胞を刺激することができ、かつ同時にCD4+T細胞を刺激する能力を持つことが示された。
【００２７】
用語
本明細書で用いられるように、用語「本発明のタンパク質」、「本発明の融合タンパク質」、「人工多抗原融合タンパク質」、「抗原融合タンパク質」、「本発明のCD4+T細胞とCD8+T細胞の免疫応答を刺激する融合タンパク質」は、入れ替えて使用することができ、式Iの構造を有する、有効に同時にCD4+T細胞とCD8+T細胞の免疫応答を活性化させる人工組み換えタンパク質をいう。
【００２８】
リソソームとMHC-I経路
短鎖断片のポリペプチド抗原（たとえば商業化されたT.SPOT.TBキットはヒト抗原提示細胞を刺激するための抗原である）は、リソソームに入ってMHC-I分子に提示されるだけでなく、提示細胞によって細胞質に吸収され、加工されてMHCクラスI分子にも提示される。一方、タンパク質系抗原は、まず、抗原提示細胞によって呑み込まれた後、初期ファゴソーム、後期ファゴソームを経て、最後にリソソームに入る。通常、リソソームに入ったタンパク質は完全にアミノ酸に分解される。しかし、タンパク質が次第に分解され、生成するポリペプチドがリソソームにあるMHC-II分子と結合して比較的に安定した複合体になり、細胞の表面に提示され、CD4+T細胞免疫を刺激する場合もある。通常の場合、タンパク質抗原は、リソソームから細胞質に漏れることはないため、MHC-I経路に入ってCD8+細胞を刺激することはない。本発明者は、意外に、本発明で特別に設計された抗原融合タンパク質は、CD8+T細胞を刺激できるだけでなく、元のCD4+T細胞を刺激する機能も維持することを見出した。
【００２９】
抗原提示細胞のリソソームにおける主なプロテアーゼはカテプシンSである。Leu-Arg-Met-Lysは、カテプシンSが好む配列である。発明では、Leu-Arg-Met-Lysで1組の抗原領域を連結して新しい人工多抗原融合タンパク質を構成し、そしてCD4+T細胞およびCD8+T細胞に対する刺激に使用することが好ましい。
普通の短鎖断片の抗原ポリペプチド（一般的に≦70aa、≦60aaまたはそれ以上短い）は直接抗原提示細胞によって細胞質に吸収されることによって、MHCクラスI分子に提示される。普通のタンパク質抗原は、抗原提示細胞によってリソソームに呑み込まれるだけで、そしてリソソームにおける普通の成熟タンパク質はMHC-IIだけと結合し、CD4+T細胞だけを刺激する。
【００３０】
これに対し、本発明の人工多抗原融合タンパク質は抗原提示細胞によってリソソームに呑み込まれた後、カテプシンSなどのカテプシンの制限酵素切断部位が存在するため、切断はまず連結配列から発生し、リソソーム内ですぐに1組（複数）のポリペプチドが生成することで、交差提示を実現・促進し、よって同時にCD8+T細胞とCD4+T細胞を刺激する。
本発明の試験では、本発明の融合タンパク質が細胞のリソソームに入った後、リソソームの機能を抑制しても、融合タンパク質はすぐになくなったことが示され、これはリソソームにおいて本発明のタンパク質またはその酵素切断産物は細胞質に漏れることを示す。
【００３１】
CD4+T細胞とCD8+T細胞の免疫応答を刺激する融合タンパク質
本発明において、複数のエピトープ（または抗原領域）を連結した一つの特異性細胞免疫の検出に使用されるか、予防・治療性ワクチンとしての単一のタンパク質、すなわち、多抗原融合タンパク質を提供する。
本発明の多抗原融合タンパク質に、少なくとも1個、好ましくは2個、3個、4個、5個またはそれ以上(たとえば6〜20の任意の一つの正整数)のCD8+T細胞エピトープが含まれる。
本発明の多抗原融合タンパク質に、少なくとも1個、好ましくは2個、3個、4個、5個またはそれ以上(たとえば6〜20の任意の一つの正整数)のCD4+T細胞エピトープが含まれる。
【００３２】
本発明において、抗原領域の配列は任意の免疫反応を刺激するポリペプチド由来のものでもよいが、好ましくはCD4+T細胞またはCD8+T細胞の反応を刺激できる配列（すなわちT細胞エピトープ）である。
カテプシンは1組のシステインプロテアーゼで、主な機能はリソソーム内におけるタンパク質を分解することである。カテプシン-S（cathepsin-S）の既知の主な機能はMHC-2の抗原提示過程に関与することである。
本発明の多抗原融合タンパク質において、これらのCD8+T細胞エピトープおよびCD4+T細胞エピトープを含有するポリペプチドの連結方法は、任意の抗原提示細胞におけるカテプシンの認識部位によるものでもよいが、好ましくはカテプシンCathepsin Sが好むLeu-Arg-Met-Lys配列を使用する。
【００３３】
もう一つの好適な例において、ほかのいくつかの提示細胞で発現が比較的に多いカテプシンBおよびカテプシンKの制限酵素切断部位を使用してもよい。たとえば、Met-Lys-Arg↓-LeuはカテプシンBの制限酵素切断部位で、そしてHis-Pro-Gly↓-GlyはカテプシンKの制限酵素切断部位であるが、効果が特に優れたのはカテプシンSの制限酵素切断部位である。 
もう一つの好適な例において、前記人工多抗原融合タンパク質は様々なカテプシンSの制限酵素切断部位を使用してもよいが、好適な制限酵素切断部位として、Arg-Cys-Gly↓-Leu、Thr-Val-Gly↓-Leu、Thr-Val-Gln↓-Leu、X-Asn-Leu-Arg↓、X-Pro-Leu-Arg↓、X-Ile-Val-Gln↓およびX-Arg-Met-Lys↓が含まれるが、これらに限定されず、ここで、Xは任意のアミノ酸で、↓は酵素切断位置を表す。
【００３４】
いずれのタンパク質も本発明に使用してもよいが、通常の場合、多抗原融合タンパク質がカバーする配列はタンパク質の40％以上を占め、好適な場合、抗原融合タンパク質がカバーする範囲はタンパク質抗原配列の少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、最も好ましくは100％である。
本発明の好適な例として、HPV16-E7多抗原融合タンパク質がカバーする範囲は100％である。もちろん、カバー率が下がっても、行ける場合もあるが、特に目標タンパク質におけるMHC-Iエピトープが少なくてかつ明確な場合である。たとえば、本発明の一つの好適な例において、OVAがカバーする範囲は40％で、これはOVAに単一のMHC-Iエピトープしかなく、選ばれる断片がこのエピトープを含むためである。
多抗原融合タンパク質は一つ以上の抗原タンパク質をカバーしてもよいが、もう一つの好適な例において、本発明の結核菌の抗原融合タンパク質はESAT6およびCFP10の二つのタンパク質配列をカバーし、これによって生産コストを削減することができ、品質管理に有利である。
【００３５】
本発明の人工多抗原融合タンパク質は天然タンパク質（たとえばウイルス、細菌、寄生虫のタンパク質または腫瘍抗原）と異なる。主な違いの一つは、天然タンパク質の空間構造を失ったことであるため、天然タンパク質の機能を有さず、たとえば病原体タンパク質（たとえばウイルスのカプシドタンパク質）の潜在の危害を避けた。
本発明の人工多抗原融合タンパク質は短鎖断片の抗原ポリペプチド(たとえば≦70または≦60のアミノ酸の抗原ペプチドおよびエピトープのポリペプチド)とも異なる。一つの主な違いは本発明のタンパク質の分子量が大きく、大分子タンパク質に属する（小分子ポリペプチドではない）ため、細胞に入る経路が違うことで、抗原提示の経路、T細胞を刺激する様態および機序のいずれも短鎖断片の抗原ポリペプチドと異なる。
【００３６】
製造方法およびエンジニアリング細胞
抗原タンパク質が確定すると、本発明のタンパク質は組み換え法による大量生産で得られる。この場合、通常、人工合成のコードするDNAを発現ベクターにクローンした後、細胞に導入し、さらに通常の方法で宿主細胞または発酵産物からを単離して得る。
一つの典型的な抗原融合タンパク質の製造方法は、以下の工程を含む。
タンパク質抗原のアミノ酸の順番に合わせて一つの人工多抗原融合タンパク質を構築し、当該多抗原融合タンパク質は一連の特定の長さの抗原領域を含有するかそれらからなるもので、ここで、各抗原領域の間は同じか異なるカテプシンの制限酵素切断部位（たとえばleu-Arg-Met-Lys）で連結する。
また、本発明の融合タンパク質を発現するための細胞も本発明に含まれる。「宿主細胞」は、原核細胞と真核細胞とを含む。よく使用される原核細胞は大腸菌である。よく使用される真核宿主細胞は、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞を含むが、これらに限定されない。本発明の好適な形態として、使用される宿主細胞は大腸菌、たとえばBL21（DE3）および酵母、ならびにCHO細胞である。
【００３７】
ワクチン組成物と薬物組成物
また、本発明は、本発明の融合タンパク質の使用を提供するが、たとえば免疫診断とワクチンの製造に使用される。
免疫診断は、皮膚試験およびT細胞酵素結合イムノスポットを含む。皮膚試験は被験個体に本発明の多抗原融合タンパク質で免疫させた後、当該個体の皮膚反応を観察することによって、当該個体が類似の抗原に感染したことがあるか判断する。本発明の好適な形態として、前記の免疫診断は本発明の融合タンパク質を刺激源として個体のT細胞免疫反応を検出することである。たとえば、個体のT細胞が本発明のESAT6-CFP10多抗原融合タンパク質による刺激を受けた後のインターフェロン-γの生成状況を観察することによって、患者が結核に感染したことがあるか、またはどの段階にあるか判断するか、あるいは予後に使用することができる。
ワクチンは予防性ワクチンと治療性ワクチンを含む。後者は主にT細胞、特にCD8+傷害性T細胞(CTL)の活性化と関連する。そして、CTL細胞の活性化はMHC-I分子によって制限される。本発明の一つの好適な例として、体外において、本発明のHPV16-E7多抗原融合タンパク質はヒト抗原提示細胞によって呑み込まれ、かつ抗原提示細胞を活性化させることができることが証明された。また、もう一つの好適な例において、本発明のOVA多抗原融合タンパク質をモデルとし、それが抗原提示細胞によって加工されてMHCクラスI分子に提示されることが証明された。
【００３８】
応用
本発明の融合タンパク質は抗原提示細胞自身のエンドソームおよびリソソームにおけるカテプシン（Cathepsin）認識配列を利用し、CD4+およびCD8+エピトープを含有する複数の抗原エピトープペプチドを連結して一つのタンパク質にし、発現・精製を経た後、直接免疫診断に、または予防・治療性ワクチンとして応用することができる。
本発明のタンパク質または組成物を予防・治療性ワクチンとする場合、直接単独であるいはアジュバントとともに動物体内に注射するか、体外で細胞治療方法と併用することができる。たとえば、DC/NK細胞の培養時に入れて刺激して特異性抗原提示細胞を生成させた後、前記抗原提示細胞で体内/体外で刺激して特異性CD8+T細胞（すなわちCTL）を生成させる。
本発明において、これらの体外感作の特異性抗原提示細胞および/または体外で生成するCTL抗原は相応する対象の体内に戻し、抗ウイルス、抗腫瘍などの様々な用途に使用する。
本発明において、本発明のタンパク質または前記体外感作の細胞（または相応する製剤）は、好ましくは静脈注射、灌注、皮下注射、経皮投与からなる群から選ばれる施用の様態で個体に投与される。
【００３９】
本発明の主な利点は以下の通りである。
(1)  初めて、本発明の人工多抗原融合タンパク質は有効にMHC-I分子に提示されることを見出した。
(2)  初めて、単一の多抗原融合タンパク質は複数の抗原短鎖ペプチドの代わりに、特異的にヒトT細胞を刺激してインターフェロン-γを放出させることができることを見出した。
(3)  初めて、本発明の抗原融合タンパク質は抗原提示細胞によって呑み込まれ、かつCD8+細胞を活性化させることができることを証明した。
(4)  本発明の融合タンパク質を利用すれば、免疫診断のための試薬と技術を開発することができる。たとえば、皮膚試験によって特異性細胞免疫を検出するか、またはELISPOT試験によって特異性細胞免疫を検出する。
(5)  本発明の融合タンパク質を利用すれば、治療性または予防性の薬物またはワクチンを開発することができ、本発明の融合タンパク質で感作させて製造するDC細胞および/またはCTL細胞製剤を含み、産業応用価値は計り知れない。
(6)  通常の1組の短鎖断片のポリペプチドを使用する案と比べ、本発明の方法および製品のコストが顕著に低下し、通常、少なくとも80％またはそれ以上低下し、かつ品質管理が容易で、大量の労力、物資および時間を省くことができる。
【００４０】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下述実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、例えばSambrookら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」(ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、1989) に記載の条件などの通常の条件に、或いは、メーカーのお薦めの条件に従う。    特に説明しない限り、百分率および部は重量百分率および重量部である。
【００４１】
実施例１
多抗原融合タンパク質のクローニング
タンパク質のアミノ酸の順番に基づいて抗原融合タンパク質を設計した。抗原融合タンパク質は一連の長さが25〜35個のアミノ酸のポリペプチド断片(短鎖断片の抗原ペプチド)が連結してなり、抗原ペプチドの間は同じカテプシンSが好む配列部位(Leu-Arg-Met-Lys)で連結している。
抗原融合タンパク質をコードするDNAをコドン最適化して適切な大腸菌が好むコドンにした。全人工合成の方法でDNAコード配列を製造し、かつ5'末端にTACTTCCAATCCATG(配列番号: 7)を、そして3'末端にTATCCACCTTTACTGTTA(配列番号: 8)配列を付加した。合成されたDNA分子をT4 DNAポリメラーゼおよびdCTPで30分間処理した。
【００４２】
通常のpNIC28-Bsa4ベクター(オックスフォード大学から入手；US8,148,100 B2；GenBank ID: EF198106)をBsaIで1時間酵素切断した。当該ベクターにおけるクローニングと発現に関連する要素を図1に示す。1％アガロースゲル電気泳動によって線状化したベクターを単離し、かつT4 DNAポリメラーゼおよびdGTPで30分間処理した。2種類のT4 DNAポリメラーゼ処理産物を混合した後、通常の感受性大腸菌DN5αに形質転換させ、プレートを作って単一クローンを選んで培養した。菌液はPCRによって陽性集落を同定した。
結果は図2、図3および図4に示すように、得られた融合タンパク質のコード配列およびタンパク質の分子量の大きさは設計または予測値と一致したことが示された。
各多抗原融合タンパク質のアミノ酸およびヌクレオチドのコードは以下の通りである。
【表Ａ】
2018501260.tif 000002
【００４３】
配列番号：1
MAEMKTDAAT LAQEAGNFER ISGDLKTQID QVESTLRMKT QIDQVESTAG SLQGQWRGAA        60
GTAAQAAVVR FQELRMKAQA AVVRFQEAAN KQKQELDEIS TNIRQAGVQY SRLRMKIRQA       120
GVQYSRADEE QQQALSSQMG FLRMKMTEQQ WNFAGIEAAA SAIQGNVTSI HSLLDEGKQS       180
LRMKHSLLDE GKQSLTKLAA AWGGSGSEAY QGVQQKWDAL RMKYQGVQQK WDATATELNN       240
ALQNLARTIS EAGQAMASLR MKISEAGQAM ASTEGNVTGM FA                          282
【００４４】
配列番号：2
caaatcgatc aagtggaaag taccgcaggt agcctgcagg gtcagtggcg tggtgcagca       180
ggcaccgcag cacaggcagc agttgttcgt tttcaagaac tgcgcatgaa agcccaggca       240
gccgtggtgc gcttccaaga agccgcaaat aaacagaaac aagagctgga tgaaatcagc       300
accaatattc gtcaggcagg cgttcagtat agccgtttac ggatgaaaat tcgtcaagcc       360
ggtgtgcagt attcacgtgc agatgaagaa cagcagcaag cactgagcag ccagatgggt       420
tttttaagaa tgaaaatgac cgagcagcag tggaattttg caggtattga agcagccgca       480
agcgcaattc agggtaatgt taccagcatt catagcctgc tggacgaagg taaacagagc       540
ctgcggatga agcatagtct gttagatgaa ggcaaacagt cactgaccaa actggcagca       600
gcatggggtg gtagcggtag cgaagcatat cagggtgttc agcagaaatg ggatgcatta       660
cgtatgaagt atcagggcgt gcaacaaaag tgggacgcaa ccgcaaccga actgaataat       720
gcactgcaga atctggcacg taccattagt gaagccggtc aggcaatggc cagcttacgc       780
atgaagattt ctgaagcagg ccaagctatg gcaagcaccg aaggcaatgt gaccggtatg       840
tttgcataa                                                               849
【００４５】
配列番号：3
MLVLLPDEVS GLEQLESIIN FEKLTEWTSS LRMKLESIIN FEKLTEWTSS NVMEERKIKV        60
YLPRMKMEEK YNLTSVLMAM GITDVFSSSA NLSGISSAES LKISQAVHAA HAEINEAGRL       120
RMKISQAVHA AHAEINEAGR EVVGSAEAGV DA                                     152
【００４６】
配列番号：4
atgctggttc tgctgccgga tgaagttagc ggtctggaac agctggaaag cattatcaat        60
tttgaaaaac tgaccgaatg gaccagcagc ctgcgtatga aactggaatc catcattaac       120
ttcgagaaac tgacagagtg gacaagcagc aatgttatgg aagaacgtaa aatcaaagtg       180
tacctgcctc gcatgaaaat ggaagagaaa tataacctga ccagcgttct gatggcaatg       240
ggtattaccg atgtttttag cagcagcgca aatctgagcg gtattagcag cgcagaaagc       300
ctgaaaatta gccaggcagt tcatgcagca catgccgaaa ttaatgaagc aggtcgtctg       360
cggatgaaaa tttcacaggc cgtgcatgct gcccatgcag aaatcaacga agctggccgt       420
gaagttgttg gtagtgccga agccggtgtt gatgcataa                              459
【００４７】
配列番号：5
MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYCYEQLND SSEEELRMKE QLNDSSEEED EIDGPAGQAE        60
PDRAHYNIVT FCCKLRMKHY NIVTFCCKCD STLRLCVQST HVDIRTLEDL LMGLRMKIRT       120
LEDLLMGTLG IVCPICSQKP                                                   140
【００４８】
配列番号：6
atgcatggtg ataccccgac cctgcatgaa tatatgctgg atctgcaacc ggaaaccacc        60
gatctgtatt gttatgagca gctgaatgat agcagcgaag aggaattacg catgaaggaa       120
cagctgaacg attcaagcga agaagaggac gaaattgacg gtccggcagg tcaggcagaa       180
ccggatcgtg cacattacaa cattgttacc ttttgttgca aactgagaat gaaacactac       240
aatatcgtga ccttctgctg taaatgtgat agcaccctgc gtctgtgtgt tcagagcacc       300
catgttgata ttcgtacatt agaggacctg ctgatgggcc tgcggatgaa aattcgtacc       360
ctggaagacc tgttaatggg caccctgggt attgtttgtc cgatttgtag ccagaaaccg       420
taa                                                                     423
【００４９】
また、LC-MS分析でも、精製されたTB-抗原融合タンパク質の分子量の測定値(30974Da)、OVA抗原融合タンパク質(16589Da)およびHPV16-E7 抗原融合タンパク質(16231Da)はいずれも予測値と一致したことが示された。
【００５０】
実施例2
抗原融合タンパク質の発現
測定によって人工多抗原融合タンパク質コード配列を含有すると確認された陽性集落のプラスミドDNAを抽出し、通常の方法で大腸菌BL21（DE3）を形質転換させた。
形質転換された単一集落を低塩LB培養液に接種して37℃で一晩培養し、低塩LB培養液に1:100で培養物を希釈してOD600 = 1.0になるまで37℃で振とう培養した後、18℃に下げて0.2mMのIPTGを入れてタンパク質の誘導発現を行い、続いて18℃で16時間振とう培養した後、4000rpmで遠心、菌体を収集し、かつリン酸緩衝液に再懸濁させた。
【００５１】
実施例3 
抗原融合タンパク質の精製
（a）ESAT6-CFP10およびOVA抗原融合タンパク質の精製
超音波法で細胞を分解させ、遠心して封入体を収集した。封入体を変性緩衝液（pH7.4のHEPES緩衝液において8M尿素）で溶解させた後、Ni-NTAカラムを通させ、ヒスチジン標識を含有する抗原融合タンパク質がカラムに結合し、十分な洗浄で不純物のタンパク質を除去した後、抗原融合タンパク質は尿素を含有する溶離緩衝液で溶離させた。溶離された抗原融合タンパク質はまず0.5Mアルギニンを含有するPBS（pH9.5）で8倍希釈し、その後、PBSを透析して尿素を十分に除去した（図2右と図3右）。
(b)HPV16-E7 抗原融合タンパク質の精製
超音波法で細胞を分解させ、遠心して目標タンパク質を含む上清を収集し、Ni-NTAカラムを通させ、ヒスチジン標識を含有する抗原融合タンパク質がカラムに結合し、十分な洗浄で不純物のタンパク質を除去した後、HPV16-E7抗原融合タンパク質はイミダゾールを含有する溶離緩衝液で溶離させた（図4右）。
【００５２】
実施例4
抗原提示細胞の抗原融合タンパク質に対する摂取
献血ボランティア由来の血液からFicollでヒト末梢血リンパ球PBMCを単離した後、洗浄して細胞培養液で細胞濃度を2 ×106/mlにし、5mlの細胞懸濁液を取って細胞培養瓶に置き、HPV16-E7抗原融合タンパク質(50μg/ml)あるいは同時にFITC-HPV16-E7(5μg/ml)を入れ、37℃、5％CO2で24時間培養した後続いて12時間培養した。細胞を抗ヒトCD54抗体で4℃で30分間染色した後フローサイトメーターで分析した。13時間処理した細胞をEDTA処理を経て得、1mlの冷たいFACS緩衝液(PBSにおいて2％ FCS)で2回洗浄した。その後、濃度が0.6μg/mlになるようにPEで標識されたモノクローナル抗体25.D-16を入れた。4℃で30分間インキュベートし、細胞をFACS緩衝液で3回洗浄し、最後に細胞を0.2mlのFACS固定緩衝液(BD)に再懸濁させてフローサイトメーターで分析した。
結果から、多抗原融合タンパク質を呑み込んだ主な細胞はCD54陽性細胞であったことが示された(図5)。
【００５３】
実施例5
抗原融合タンパク質による患者のインターフェロンγ分泌T細胞の検出
本実施例において、インターフェロンγ放出の検出によって、TB-抗原融合タンパク質のCD8+T細胞に対する刺激能力をテストした。方法は以下の通りである。
結核菌の喀痰塗抹陽性患者の末梢血の単核細胞を単離した後、細胞濃度を5×106個活細胞/mlに調整した。それぞれ50ulの上記細胞懸濁液を取って陰性ウェル、陽性ウェル(CONAを刺激源とする)、検出ウェル(TB-抗原融合タンパク質を刺激源とする)およびコントロールウェル(市販の牛津免疫技術公司のT-SPOT.TBキットにおける抗原T-spot AおよびT-spot Bを刺激源とするか、あるいは成熟したCFP10-ESAT6融合天然タンパク質(TB-ESAT6-CFP10と記する)をコントロール刺激源とする)に入れた。
37℃、5％ CO2で16〜20時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、さらに50 μlの標識抗体使用液を入れ、2〜8℃で60分間インキュベートした後、プレートを洗浄し、50 μlのBCIP INBT基質溶液を入れ、室温で光を避けてインキュベートし、乾燥し、計数した。結果の判断は、T-SPOT.TBキットの説明書に従って行われた。ブランクコントロールウェルのスポットが0〜5個の場合、(抗原を入れたウェルにおけるスポット数-ブランクコントロールウェルにおけるスポット数)≧ 6で、あるいはブランクコントロールウェルのスポットが6〜10個の場合、抗原を入れたウェルにおけるスポット数≧ブランクコントロールウェルにおけるスポット数の2倍である。
【００５４】
検出結果から、ESAT6/CFP10抗原融合タンパク質による刺激はT-SPOT.TBキットにおける抗原による刺激と効果が一致したことが示された(図6、上)。
また、特異性抗CD4の磁気ビーズで患者のCD4+T細胞を除去した後、残ったT細胞は主にCD8+T細胞になり、これに基づいて多抗原融合タンパク質とCFP10成熟タンパク質の違いを比較した。
結果から、本発明のTB-抗原融合タンパク質はCD8+T細胞に対して顕著な刺激効果があったに対し、野生型配列のESAT6-CFP10成熟タンパク質はCD8+T細胞に対して顕著な刺激効果はほとんどなかったことが示された(図6、下)。
【００５５】
実施例6
抗原融合タンパク質負荷DCによる体外における特異性CD8+T細胞の誘導
以下のように抗原負荷DC細胞を製造した。単離された末梢血単核細胞(PBMC)に対し、一部を凍結して保存し、残りの細胞を細胞濃度が1×107個細胞/mLになるように調整し、通常のAIM-V培地で2時間培養した後、懸濁細胞を除去し(別途に凍結保存)、GM-CSF (1000IU/ml)、IL-4 (50IU/ml)を含有するAIM-V培地を入れて続いて37℃、5％ CO2で培養し、3日目にHPV16-E7抗原融合タンパク質(50μg/ml)または組み換えHPV16-E7タンパク質(50μg/ml)を入れた。
以下のように抗原負荷DCによって体外においてCD8+T細胞を感作させた。5日目に付着DC細胞を収集し、同時に凍結保存したPBMCを蘇生させ、そのうちのCD8陽性細胞をCD8磁気ビーズで分離し、かつCD8陰性細胞を凍結保存した。CD8陽性細胞：DC細胞を5:1の比率で共培養し、かつIL-2 100IU/ml、IL-7 25IU/mlを追加した。また、2日おきに1回IL-2 (100IU/ml)およびIL-7(25IU/ml)を追加したか、あるいは液の半分を入れ替えた。7日目に凍結保存したCD8陰性細胞を蘇生させ、マイトマイシンで処理した後1/10のCD8+T細胞数でCD8陰性細胞を入れて二次刺激を行い、相応するタンパク質50μg/mlを追加し、IL-2 100IU/ml、IL-7 25IU/mlを追加した。2日おきにIL-2 100IU/mlおよびIL-7 25IU/mlを追加した。
【００５６】
以下のように抗原提示細胞を製造した。1日目に別途に凍結保存した細胞を取り出して蘇生させ、CD19モノクローナル抗体に被覆されたプレートで2h培養し、非付着細胞を捨てた後、培地でCD19陽性細胞を懸濁させ、そして細胞濃度が5x105/mlになるように調整し、2ml取り、37℃、5％CO2で48h培養した後、濃度が100μg/mlになるようにIL-4を追加した。
以下のようにインターフェロンγ放出の検出によって多抗原融合タンパク質負荷DCで体外で特異性CD8+T細胞を誘導する効果を評価した。96ウェルプレートにおいて、CD19陽性細胞5×104个/50μlを入れ、同時に50μg/mlまで相応するタンパク質(HPV16-E7抗原融合タンパク質(配列番号：5)または通常の組み換えHPV16-E7タンパク質)を入れ、37℃、5％CO2で続いて2hインキュベートした。遠心して上清を除去した後、新鮮な培地50μlを入れて細胞を再懸濁させ、かつCD8陽性細胞5x104个/50μlを入れ、37℃、5％CO2で18hインキュベートした。ELISAによって上清におけるIFN-γの濃度を検出した。
【００５７】
結果は表1に示すように、抗原融合タンパク質HPV16-E7をDCに負荷させた後、体外でCD8+T細胞を感作させて再び活性化することができ、当該抗原融合タンパク質の効果はコントロールのHPV-E7タンパク質よりも遥かに高く、すなわち、コントロールとしての組み換えHPV16-E7タンパク質と比べ、本発明の融合タンパク質のインターフェロンγ放出量が372.5％向上した。((152.7-58.2)/(2.5-(-17.5))-1)×100％＝372.5％)。
【表１】
2018501260.tif 000003
【００５８】
実施例7
結核病皮膚感作性試験
体重が250gくらいのモルモットに対し、PPD 0.1 mlで皮内注射し、皮膚試験の反応を24時間観察した。皮膚試験の反応が陰性のモルモットをランダムに5群に分け、後肢鼠径部において、40mg/mlのマイコバクテリウム・ツベルクローシスH37Rv懸濁液0.2mlを皮下注射し、週に1回、計5回免疫させた。5回目の免疫から1週間後、モルモットをランダムに5群に分け、モルモットの背部の毛を抜き、ホイール法によって陽性コントロール(PPD)、陰性コントロール（結核と無関係の組み換えタンパク質）、組み換えESAT6/CFP10タンパク質および組み換えESAT6-CFP10-抗原融合タンパク質の混合液(1mg/ml、0.1mg/ml)を0.1mlずつ皮内注射し、注射後24時間の時点でモルモットの背部の各注射点の皮膚の腫れの縦、横の直径の大きさ（mm）を測定し、その平均値を記録した。
24時間皮膚反応の結果は図7に示すように、TB-抗原融合タンパク質群(配列番号:1)の平均皮膚硬結直径はPPDおよびESAT6-CFP10天然タンパク質よりも大きかった。コントロール群では、モルモットの局部の皮膚に腫れ、硬結反応がなかった。これは、TB-抗原融合タンパク質は皮膚試験に使用して有効に結核の感染を検出することができることを示す。
図では、E6-C10はESAT6-CFP10-天然タンパク質を、LRMKはTB-抗原融合タンパク質を表し、ここで、各抗原領域の間はカテプシンSの制限酵素切断部位で連結し、配列は配列番号:1で表され、TEVは配列番号：1におけるすべてのカテプシンSの制限酵素切断部位の代わりにTEV制限酵素切断部位(非カテプシンの制限酵素切断部位)を使用したコントロールタンパク質を表す)。
【００５９】
実施例8
抗原提示細胞の抗原融合タンパク質および普通の抗原に対する処理と提示機序
抗原提示細胞が摂取して抗原融合タンパク質によって活性化された後、有効にT細胞エピトープをMHC-I分子に提示することができることを確認するためである。(MHC-I分子に提示しなければ、CD8+T細胞を活性化し、細胞傷害反応が生じ、細菌/ウイルスに感染した細胞または癌細胞を殺傷することはない)。本実施例において、オボアルブミン(OVA)の242〜352番目のアミノ酸配列(当該配列はMHC-IエピトープSIINFKLを含む)に合わせてOVA抗原融合タンパク質を設計・発現・精製した。同時に、当該エピトープを含有するOVAタンパク質断片255-340をコントロールとした。マウス樹状細胞系(DC2.4)を抗原提示細胞としてOVA抗原融合タンパク質におけるSIINFEKLの提示の状況を研究した。最後に、T細胞受容体様抗体(SIINFEKL/MHC-I複合体を認識する)で検出した。
OVAタンパク質断片100μg/ml(またはOVA抗原融合タンパク質(配列番号:3) 30 μg/ml)をDC2.4細胞と混合し、10％熱不活性化牛胎児血清(sigma)、2mMのL-グルタミンを含むRPMI 1640(Sigma)で13時間培養した後、PEで標識された市販の25.D1-16抗体で染色した(当該モノクローナル抗体25.D1-16はSIINFEKLが結合したMHC-I分子を特異的に認識する)。1mlの冷たいFACS緩衝液(PBSにおいて2％ FCS)で2回洗浄した。その後、濃度が0.6μg/mlになるようにPEで標識されたモノクローナル抗体25.D1-16を入れた。4℃で30分間インキュベートし、細胞をFACS緩衝液で3回洗浄し、最後に細胞を0.2mlのFACS固定緩衝液(BD)に再懸濁させてフローサイトメーターで分析した。
【００６０】
結果を図8に示す。図では、青のピーク(矢印で指す)はDC＋PBSである。
陽性コントロールとして、オクタペプチド(SIINFEKL)は直接細胞の表面のMHC-I分子と結合することができるため、80％以上の細胞染色は陽性であった(図8におけるC1とC2)。
OVA天然タンパク質におけるSIINFEKLペプチドはDC細胞によって加工されてMHC-I分子に提示されることができなかった(図8におけるA1とA2)。(注：図8A2における青のピークと赤のピークはほとんど重なった。)
意外なことに、同じ大分子量のタンパク質ではあるが、OVA-抗原融合タンパク質(配列番号:3)におけるSIINFIKLペプチドは有効にマウス樹状細胞系DC2.4によって加工されて細胞の表面に提示されることで、約17.6％と高い比率の細胞は25.D1-16抗体染色が陽性であった(図8におけるB1とB2)。
【００６１】
実施例9 
抗原融合タンパク質で免疫されたC57/BL6マウスのSurvivinまたはHPV-E7過剰発現のマウス黒色腫細胞B16に対する抗腫瘍作用。
抗原溶液2mg/ml(コントロール群：組み換えHPV-E7タンパク質、組み換えSurvivinタンパク質、実験群：HPV-E7抗原融合タンパク質(配列番号:5)、Survivin抗原融合タンパク質)と1mg/ml MPLを等体積で混合して免疫懸濁液を調製した後、それぞれ10匹のランダムに分けた週齡が7〜8週で、体重が25グラムのC57/B6雌マウスに、0日目、21日目および42日目で頸部で免疫懸濁液100μlを皮下注射した。
各免疫させたマウスに対し、注射器(BD)でマウスの右側の側腹部に100μlの均一に混合したヒトHPV-E7またはSurvivinをトランスフェクトして安定したマウスB16細胞を皮下接種し、注射の細胞量は7×105個細胞で、そして統計を開始し、マウスの生存状況を評価した。結果を図9および図10に示す。
【００６２】
結果から、組み換えHPV-E7タンパク質コントロール群と比べ、本発明のHPV-E7抗原融合タンパク質は顕著にマウスの生存率を向上させ(図9)、25日目でも50％のマウスが生存していたが、組み換えタンパク質コントロール群では全部死亡したことが示された。
組み換えSurvivinタンパク質と比べ、本発明のSurvivin抗原融合タンパク質は顕著にマウスの生存率を向上させ(図10)、25日目でも70％のマウスが生存していたが、組み換えタンパク質コントロール群では40％しか生存していなかった。
【００６３】
検討
本発明の前に、臨床ではタンパク質抗原をCD8+細胞免疫を刺激するワクチンとして使用することに成功したことはなかった。
タンパク質系ワクチンの生産および品質管理はいずれも既に成熟の技術でかつ多くの臨床用薬およびワクチン（刺激抗体）はいずれもタンパク質である。タンパク質を生産する成熟の方法によって、CD8+T細胞免疫を刺激できるワクチンの生産することができれば、非常に理想的である。しかし、どのようにタンパク質抗原の提示をエンドソーム-リソソーム-MHC-II経路から細胞質-MHC-I経路に転換させるかは、非常に挑戦的な課題である。たくさんの免疫学者およびワクチン学者は試みているが、未だに突破がない。
【００６４】
主な障害は以下のものを含む。
1．リソソームに多くの酵素が含まれ、これらの機能は一般的にはタンパク質を完全に分解することで、タンパク質をポリペプチドではなく、アミノ酸に分解し、通常の組み換えタンパク質抗原は完全に分解されてT細胞を刺激することができない。
2．リソソーム膜の作用はリソソーム内における酸性物質を細胞質と隔離することであるため、リソソームは漏れにくい細胞内小器官である。通常の発現タンパク質または組み換えタンパク質は完全に分解されなくても、リソソームから逃げるかまたは漏れることが可能であるかは未知である。
3．CD4+T細胞を刺激できるタンパク質抗原に対し、CD8+抗原を添加した融合タンパク質が分解されて細胞質に漏れる（CD8+T細胞を刺激する）と、元のCD4+T細胞を刺激する機能が低下または消失するかも、未知である。
【００６５】
本発明において、本発明者は酵素学の原理および生物組み換え技術に基づいて多くの抗原融合タンパク質を設計し、大量の選別を行ったところ、一連の抗原領域を含む長鎖ペプチドの間をカテプシンの制限酵素切断部位で連結するという、新規な抗原融合タンパク質の構造を確立した。細胞がリソソームに抗原融合タンパク質を呑み込むと、リソソームにおけるカテプシンが抗原融合タンパク質を異なるエピトープを含むポリペプチドに分解する。
本発明の実験では、意外に、本発明のこの特定の構造の融合タンパク質が分解された後、分解後のポリペプチドがリソソームから漏れて細胞質に入り、加工されてMHCクラスI分子に提示されることによって、MHC-I抗原提示経路が始まってCD8+細胞を刺激し、かつ元のCD4+T細胞を刺激する機能が保留または向上することが実証された。
【００６６】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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