(57)【要約】改善された保管安定性を有するイリノテカンリン脂質リポソームを、処置および製造の関連方法と共に提供する。このイリノテカンリポソームは、保管の間、および患者への投与前にｌｙｓｏ−ホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）の形成を低減させることができる。本開示は、保管の間にｌｙｓｏ−脂質形成の形成を低減するよう安定化されているリポソーム型カンプトテシン医薬製剤を含めた、カンプトテシン化合物を含む安定化医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
７．００〜７．５０のｐＨを有しており、かつ無水イリノテカン遊離塩基のグラム量にして、全リポソームリン脂質１ｍｍｏｌあたり５００ｍｇ（±１０％）のイリノテカン部分およびリポソーム型イリノテカン組成物１ｍＬあたり４．３ｍｇのイリノテカン部分に等価なイリノテカン部分の濃度で、コレステロールおよびリン脂質１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）およびメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）からなるベシクル中にイリノテカン八硫酸スクロースを封入するイリノテカンリポソームの分散液を含む、保管安定化リポソーム型イリノテカン組成物であって、前記保管安定化リポソーム型イリノテカン組成物は、４℃での最初の６か月の保管の間に、２０ｍｏｌ％未満のＬｙｓｏ−ＰＣを形成するほど安定化されている、保管安定化リポソーム型イリノテカン組成物。
【請求項２】
７．００〜７．５０のｐＨを有しており、かつ無水イリノテカン遊離塩基のグラム量にして、全リポソームリン脂質１ｍｍｏｌあたり５００ｍｇ（±１０％）のイリノテカン部分およびリポソーム型イリノテカン組成物１ｍＬあたり４．３ｍｇのイリノテカン部分に等価なイリノテカン部分の濃度で、コレステロールおよびリン脂質１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）およびメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）からなる単層ラメラ二重層ベシクル中にイリノテカン八硫酸スクロースを封入するイリノテカンリポソームの分散液を含む、保管安定化リポソーム型イリノテカン組成物であって、前記保管安定化リポソーム型イリノテカン組成物は、０．８５〜１．２のイリノテカン／スルフェート化合物のグラム当量比を有する、保管安定化リポソーム型イリノテカン組成物。
【請求項３】
４℃での最初の６か月の保管の間に、２０ｍｏｌ％未満のＬｙｓｏ−ＰＣを形成するほど安定化されている、保管安定化リポソーム型イリノテカン組成物であって、前記保管安定化リポソーム型イリノテカン組成物は、以下のステップ：
（ａ）０．４〜０．５Ｍのスルフェート濃度および５〜７の間のｐＨを有するＴＥＡ８ＳＯＳおよび／またはＤＥＡ８ＳＯＳから作製される溶液中で、脂質分散液を形成するステップであって、前記分散液中の脂質が、それぞれ約３：２：０．０１５のモル比のＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥである、ステップ、
（ｂ）前記脂質分散液を、少なくとも１つの０．１μｍの膜を通して６０〜７０℃の間で押し出して、リポソームを形成するステップ、
（ｃ）前記リポソームの外側にあるＴＥＡ８ＳＯＳおよび／またはＤＥＡ８ＳＯＳに由来するイオンを実質的に除去するステップ、
（ｄ）前記リポソームを６０〜７０℃の間の温度でイリノテカン遊離塩基またはイリノテカン塩を使用して作製される溶液に接触させて、これにより、イリノテカンを封入するリポソームの調製物を形成するステップ、
（ｅ）前記リポソームの外側にある前記ＴＥＡ８ＳＯＳおよび／またはＤＥＡ８ＳＯＳおよびイリノテカン成分に由来する物質を実質的に除去するステップ、ならびに
（ｆ）前記組成物のｐＨが７．０〜７．５になるように調整するステップ
を含む工程により作製される、保管安定化リポソーム型イリノテカン組成物。
【請求項４】
以下のステップ：
（ａ）０．４〜０．５Ｍのスルフェート濃度および５〜７の間のｐＨを有するＴＥＡ８ＳＯＳから作製される溶液中で、脂質分散液を形成するステップであって、前記分散液中の脂質が、それぞれ約３：２：０．０１５のモル比のＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥである、ステップ、
（ｂ）前記脂質分散液を、少なくとも１つの０．１μｍの膜を通して６０〜７０℃の間で押し出して、リポソームを形成するステップ、
（ｃ）前記リポソームの外側にあるＴＥＡ８ＳＯＳに由来するイオンを実質的に除去するステップ、
（ｄ）前記リポソームを６０〜７０℃の間の温度でイリノテカン遊離塩基またはイリノテカン塩を使用して作製される溶液に接触させて、これにより、イリノテカンを封入するリポソームの調製物を形成するステップ、
（ｅ）前記リポソームの外側にある前記ＴＥＡ８ＳＯＳおよびイリノテカン成分に由来する物質を実質的に除去するステップ、ならびに
（ｆ）前記組成物のｐＨが７．０〜７．５になるように調整するステップ
を含む工程により作製される、請求項１から３のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【請求項５】
前記脂質分散液が、少なくとも２つの積層されている０．１μｍのポリカーボネート膜を通して押し出される、請求項４に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【請求項６】
前記リポソームが、動的光散乱法により決定すると、１１０ｎｍの平均サイズを有し、サイズが、キュムラント法により決定される、請求項１から５のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【請求項７】
４．３ｍｇ／ｍｌの無水イリノテカン遊離塩基に等価なイリノテカン部分総含量を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【請求項８】
ステップ（ａ）において、前記リポソームが、０．４３〜０．４７Ｍの間のスルフェート濃度を有するＴＥＡ８ＳＯＳから形成され、
ステップ（ｄ）において、イリノテカン遊離塩基またはイリノテカン塩を使用して作製される前記溶液が、ＤＳＰＣ  １モルあたり、５００ｇ（±１０％）の無水イリノテカン遊離塩基に等価なイリノテカン部分含量を有しており、
ステップ（ｆ）において、前記組成物のｐＨが７．２〜７．３になるように調整する、
請求項３から６のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【請求項９】
約４℃で保管する前には、１ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）を含有し、約４℃で１８０日の保管後には、２０ｍｏｌ％またはそれより少ない（全リポソームリン脂質に対して）ｌｙｓｏ−ＰＣを含有する、請求項１から８のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項１０】
約４℃で６、９または１２か月の保管後に、２０ｍｏｌ％またはそれより少ない（全リポソームリン脂質に対して）ｌｙｓｏ−ホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）を含有する、請求項９に記載のリポソーム組成物。
【請求項１１】
合計で、６．１〜７．５ｍｇのＤＳＰＣ／ｍｌ、２〜２．４ｍｇのコレステロール／ｍｌおよび０．１１〜０．１３ｍｇのＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ／ｍｌを、いずれも水性等張緩衝液中に含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【請求項１２】
リポソーム型イリノテカンが、等張性のＨＥＰＥＳ水性緩衝液中に、２〜２０ｍＭの間の濃度で前記イリノテカンリポソームを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【請求項１３】
１３０〜１６０ｍＭの濃度で、塩化ナトリウムをさらに含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【請求項１４】
前記リポソーム中に封入されている前記イリノテカンが、八硫酸スクロースの塩として、ゲル状態または沈殿状態にある、請求項１から１３のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【請求項１５】
準弾性光散乱法によって測定すると、前記イリノテカンリポソームが９５〜１１５ｎｍの直径を有する、請求項１から１４のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【請求項１６】
合計で、６．８１ｍｇのＤＳＰＣ／ｍｌ、２．２２ｍｇのコレステロール／ｍｌおよび０．１２ｍｇのＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ／ｍｌ、４．０５ｍｇ／ｍＬのＨＥＰＥＳ水性緩衝液および８．４２ｍｇの塩化ナトリウム／ｍＬを含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【請求項１７】
７．２５のｐＨを有し、準弾性光散乱法によって測定すると、前記イリノテカンリポソームが１１０ｎｍの直径を有する、請求項１から１６のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【請求項１８】
約４℃で６か月の保管後に、１ｍｇ／ｍＬ未満のｌｙｓｏ−ホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）を形成する、請求項１から１７のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【請求項１９】
以下のステップ：
（ａ）約０．４５Ｍのスルフェート濃度および約６．５のｐＨを有するＴＥＡ８ＳＯＳの溶液中で脂質分散液を形成するステップであって、前記分散液中の脂質が、それぞれ、３：２：０．０１５のモル比の１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロールおよびメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）からなる、ステップ、
（ｂ）前記脂質分散液を、少なくとも１つの０．１μｍの膜を通して６０〜７０℃の間で押し出して、リポソームを形成するステップ、
（ｃ）前記リポソームの外側にあるＴＥＡ８ＳＯＳに由来するイオンを除去するステップ、
（ｄ）前記リポソームを６０〜７０℃の間の温度でイリノテカン塩酸塩三水和物を使用して作製される溶液に接触させて、全リポソームリン脂質１ｍｏｌあたり、約５００ｇ（±１０％）のイリノテカンを封入するリポソームの調製物を形成するステップ、
（ｅ）前記リポソームの外側にある前記ＴＥＡ８ＳＯＳおよびイリノテカン成分に由来する物質を除去するステップ、ならびに
（ｆ）前記組成物のｐＨが約７．３になるように調整するステップ
を含む工程により作製される、請求項１から１８のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【請求項２０】
合計で１００ｐｐｍ未満のＴＥＡを含む、請求項１から１９のいずれかに記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【請求項２１】
合計で３０〜１００ｐｐｍのＴＥＡまたはＤＥＡを含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【請求項２２】
約４℃で６か月の保管後に、前記イリノテカンのうちの少なくとも９８％が、前記イリノテカンリポソーム中に封入されている、請求項１から２１のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【請求項２３】
前記イリノテカンリポソーム内に、式（Ｉ）：
【化７】
2018530563.tif 000027
［式中、ｘは８である］
のイリノテカン組成物を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本特許出願は、米国仮特許出願第６２／２４２，８３５号（２０１５年１０月１６日出願）、同第６２／２４２，８７３号（２０１５年１０月１６日出願）、同第６２／２４４，０６１号（２０１５年１０月２０日出願）、および同第６２／２４４，０８２号（２０１５年１０月２０日出願）の利益を主張し、これらの米国仮特許出願の各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
技術分野
本開示は、保管の間にｌｙｓｏ−脂質形成の形成を低減するよう安定化されているリポソーム型カンプトテシン医薬製剤を含めた、カンプトテシン化合物を含む安定化医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
カンプトテシン化合物（イリノテカンまたはトポテカンなど）は、ヒト身体内の腫瘍および／またはがんを処置するために使用することができる。例えば、がんのある種の形態を処置するための、注射可能なリポソーム医薬製品は、カンプトテシン化合物を封入するリポソームの分散液として調製することができる。このリポソーム型カンプトテシン組成物は、コレステロールおよび１つまたは複数のリン脂質（「ＰＬ」）を含むリポソーム内に、ポリ陰イオン性捕捉剤と一緒にカンプトテシン化合物を封入することができる。しかし、１つまたは複数のリン脂質を有するカンプトテシンリポソームでは、リン脂質の加水分解、およびカンプトテシン中の活性なラクトン構造の加水分解が起こり得る。ホスファチジルコリン（「ＰＣ」＋）などのリポソームリン脂質の加水分解による分解により、リポソームからカンプトテシン化合物、例えばイリノテカンの放出が改変され得る。ＰＬ（ＰＣなど）の加水分解における第１のステップは、ｌｙｓｏ−ＰＬ（グリセリルホスホコリン脂肪酸モノエステルであるリゾホスファチジルコリン（「ｌｙｓｏ−ＰＣ」）など）の形成をもたらすことができる。
【０００４】
リポソーム型カンプトテシン（camptothicin）組成物は、少なくとも２つの点で、ｐＨにより影響を受ける。第１に、リポソーム型カンプトテシン（captothecin）（例えば、リポソーム型イリノテカン）のリン脂質の加水分解による分解は、ｐＨ依存性となる傾向があり、ｐＨ６．０または６．５が、ホスファチジルコリンの加水分解を最小限にすると考えられている。ｐＨが６．５を超える条件により、（１）カンプトテシン化合物、例えばイリノテカンの、活性が低い方のカルボキシレート形態への変換が高められ、（２）リポソーム中のｌｙｓｏ−ＰＣの量が増加する傾向がある。第２に、カンプトテシン化合物は、活性が低い方のカルボキシレート形態（中性およびアルカリ性ｐＨでは優勢である）と酸性ｐＨでは優勢となる一層活性なラクトン形態との間でｐＨ依存的変換を受ける。例えば、イリノテカンのカルボキシレート形態のラクトン形態への変換は、主に、ｐＨ６．０（イリノテカンの約８５％が、活性が高い方のラクトン形態にある）とｐＨ７．５（イリノテカンの約１５％のみが、活性が高い方のラクトン形態にある）との間で起こる。ｐＨ６．５では、イリノテカンの約６５％が、活性が高い方のラクトン形態にある。
【０００５】
ｐＨ６．５で調製されたリン脂質含有リポソーム型カンプトテシンの安定性は、冷蔵条件（２〜８℃）下での保管の間に、ｌｙｓｏ−ＰＣの形成によって悪影響を受けることが、予期せぬことに見いだされた。例えば、試料１２のイリノテカンリポソーム組成物（ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥを３：２：０．０１５となるモル比で含むイリノテカンリポソーム中に封入されているイリノテカン八硫酸スクロース、ｐＨ６．５で調製）は、続いて、製造後の冷蔵保管（２〜８℃）の最初の３か月間に３０ｍｏｌ％を超えるレベル（イリノテカンリポソーム組成物中のホスファチジルコリンの全量に対して）のｌｙｓｏ−ＰＣを生成した（および、３５ｍｏｌ％を超えるｌｙｓｏ−ＰＣが、最初の９か月間に生成した）。
【０００６】
したがって、安定化カンプトテシン医薬組成物が依然として必要とされている。例えば、製造後、２〜８℃で冷蔵保管の間に、より安定な、ｌｙｓｏ−ＰＣをそれほど生成しないイリノテカンの改善されたリポソーム製剤が必要とされている。本発明はこの必要性に対処するものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
本発明は、ｌｙｓｏ−リン脂質（「ｌｙｓｏ−ＰＬ」）（例えば、ｌｙｓｏ−ホスファチジルコリン、すなわち「ｌｙｓｏ−ＰＣ」）の形成速度が低下した、エステル含有リン脂質を含むカンプトテシンリポソーム組成物を含めた、安定性の改善された、新規カンプトテシン医薬組成物（例えば、リポソーム型イリノテカン）を提供する。本発明は、２〜８℃での長期の保管後に、ｌｙｓｏ−リン脂質量の低減を生じる、カンプトテシン化合物（例えば、イリノテカン）のリポソーム組成物を製造することができるという驚くべき認識に、一部、基づいている。このような安定化リポソーム組成物の製造は、リポソーム製造の間の指定パラメータ（捕捉剤の量に対する薬物対リン脂質の比、リポソーム調製物のｐＨ、およびリポソーム調製物中の捕捉剤の対イオンの量）を制御すると、カンプトテシンリポソーム調製物の保管の間に、ｌｙｓｏ−リン脂質の形成が相乗的に低減するという予想外の知見によって可能となる。本発明は、リポソーム組成物の開発に関連するコストを削減しながらも、一層強固な、改善されたこのような組成物の設計および特定に、かなり有益な情報を提供する。
【０００８】
１つまたは複数のリン脂質（ＰＥＧ含有リン脂質を含む）を含む安定化カンプトテシン組成物は、好ましくは、４℃での最初の６か月の保管の間に、２０ｍｏｌ％以下（全リポソームリン脂質に対して）のｌｙｓｏ−ＰＬを形成し、そして／または４℃での最初の９か月の保管の間に、２５ｍｏｌ％以下のｌｙｓｏ−ＰＬを形成する。安定化イリノテカンリポソームは、好ましくは、カンプトテシン組成物の製造後に、４℃での最初の９か月の保管の間に、１か月あたり、約２ｍｏｌ％未満（例えば、０．５〜１．５ｍｏｌ％）のｌｙｓｏ−ＰＬとなる平均速度でｌｙｓｏ−ＰＬを形成する。好ましい安定化カンプトテシン組成物は、コレステロールおよび１つまたは複数のリン脂質（ＰＥＧ含有リン脂質を含む）を含むリポソーム型イリノテカン組成物中に、イリノテカンまたはその塩（例えば、イリノテカン八硫酸スクロース）を含み、上記の安定化カンプトテシン組成物は、４℃での６か月の保管の間に、２０ｍｏｌ％以下（全リポソームリン脂質に対して）のｌｙｓｏ−ＰＣを形成し、そして／または４℃での９か月の保管の間（例えば、製造後、最初の６か月および／または９か月の安定性試験の間）に２５ｍｏｌ％以下のｌｙｓｏ−ＰＣを形成する。この安定化イリノテカンリポソームは、４℃での保管の間（製造後、最初の９か月の安定性試験の間）に、１か月あたり、ｌｙｓｏ−ＰＣを約２ｍｏｌ％未満（例えば、０．５〜１．５ｍｏｌ％）の速度でｌｙｓｏ−ＰＣを形成し得る。安定化ホスファチジルコリン含有イリノテカンリポソーム組成物は、製造後、２〜８℃での最初の９か月の安定性試験の間に、１ｍｇ未満のｌｙｓｏ−ＰＣを生成し得る。
【０００９】
第１の実施形態では、安定化リポソーム型カンプトテシン組成物は、６．５を超えるｐＨ（例えば、７．２５、７．３または７．５を含む７．０〜７．５）を有しており、かつ０．９より大きい（例えば、０．９〜１．１）イリノテカン／スルフェート化合物のグラム当量比（「ＥＲ」）を有する、イリノテカンおよびスルフェートのポリ陰イオン性捕捉剤（例えば、イリノテカンスクロソファート、すなわち「ＳＯＳ」）を封入するリポソームを含む。ＥＲは、イリノテカンＳＯＳリポソーム調製物に関して、リポソーム組成物の単位あたり（例えば、１ｍＬ）、リポソームにより共封入されているイリノテカン（Ｉ）およびスルフェート化合物（Ｓ）のモル量を決定して、以下の式：ＥＲ＝Ｉ／（ＳＮ）（式中、Ｎは、スルフェート化合物陰イオンの価数である（例えば、スクロソファートの場合、Ｎは８であり、遊離スルフェートＳＯ４２−の場合、Ｎは２である））を使用することにより算出することができる。好ましくは、スルフェート化合物（Ｓ）は、ＳＯＳ  １ｍｏｌあたり８個のスルフェート部分を含有する、八硫酸スクロースである。
【００１０】
第２の実施形態では、安定化リポソーム型カンプトテシン組成物は、約９９０より大きな（例えば、９９２〜１，０８７を含めた、９９０〜１，１００）安定比（「ＳＲ」）で調製したイリノテカンリポソームを含めた、好ましくは約９５０より大きな（例えば、９５０〜１０５０）ＳＲを有する、特定の比のカンプトテシン、陰イオン性捕捉剤およびリポソーム形成性リン脂質を使用して得られる。この実施形態は、以下により完全に説明されている通り、安定比により反映される、リポソーム安定性を説明する製造基準を提供する。本発明のこの実施形態は、リン脂質をベースとするカンプトテシン含有リポソームが、（１）カンプトテシン化合物（単数または複数）（例えば、イリノテカン、トポテカンなど）を（２）ポリ硫酸化陰イオン性捕捉剤（例えば、八硫酸スクロース）を封入するリポソームと反応させることによって作製されると、得られた薬物搭載リポソームの安定性は、捕捉剤−リポソーム中のスルフェート基の初期濃度、およびリポソーム中に封入されているカンプトテシンとリン脂質との比に依存するという発見に一部、基づいている。この安定比は、以下の通り定義される：ＳＲ＝Ａ／Ｂ（式中：Ａは、組成物中のリン脂質１モルあたりの、無水イリノテカン遊離塩基に等価なグラム数での、薬物搭載工程の間に捕捉剤リポソーム中に封入されているイリノテカン部分の量であり、Ｂは、モル／Ｌ（スルフェート基の濃度に基づく）で表される、捕捉剤リポソームを作製するために使用されたスクロソファート（または、他の捕捉剤）溶液中のスルフェート基の濃度である）。安定比は、ｐＨ６．５でさえも、リン脂質をベースとするカンプトテシン含有リポソーム中での、ｌｙｓｏ−ＰＣの形成の劇的な低下を驚くべきことに予測した。４℃で９か月の保管後に、約９９０の安定比で調製されたイリノテカンリポソーム（試料２）では、約２４ｍｏｌ％のｌｙｓｏ−ＰＣが生成したのに比べて、約９４２の安定比で調製されたホスファチジルコリン含有イリノテカンリポソーム（試料３）は、約３６ｍｏｌ％のｌｙｓｏ−ＰＣを生成した（すなわち、これらの条件下では、約５％の安定比の向上により、ｌｙｓｏ−ＰＣ生成が３４％低下した）。対照的に、イリノテカンリポソームの安定比を７２４（試料１２）から９４２（試料３）へと約３０％向上させることにより、４℃で９か月の保管後に、約１％さらに多くのｌｙｓｏ−ＰＣの生成をもたらした（例えば、試料３における３５．７ｍｏｌ％のｌｙｓｏ−ＰＣと、試料１２における３５．４ｍｏｌ％のｌｙｓｏ−ｐＣとを比較されたい）。
【００１１】
第３の実施形態では、２〜８℃で保管の間に生成するｌｙｓｏ−ホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）の量が低下したイリノテカンを封入するリポソームの新規な安定化組成物は、式（Ｉ）のイリノテカン組成物を含むことができ、式中、ｘは８である。
【化１】
2018530563.tif 000002
このリポソーム型イリノテカンは、リポソーム中に封入されている式（Ｉ）の組成物を含むことができる。好ましくは、式（Ｉ）の組成物は、コレステロールおよび１つまたは複数のリン脂質（例えば、ＰＥＧ含有リン脂質を含む）を含むリポソーム内で形成（例えば、沈殿）される。例えば、式（Ｉ）の化合物は、安定化リポソーム型イリノテカン組成物を形成する工程において、（１）カンプトテシン化合物（単数または複数）（例えば、イリノテカン、トポテカンなど）を（２）ポリ硫酸化陰イオン性捕捉剤（例えば、八硫酸スクロース）を封入するリポソームと反応させることによって、リポソーム内に形成することができる。好ましくは、リポソーム型イリノテカン組成物は、６．５より大きなｐＨ（例えば、７．２５、７．３および７．５を含む、７．０〜７．５）を有する。
【００１２】
好ましい安定化カンプトテシン組成物は、水性等張緩衝液中に、コレステロールおよびリン脂質１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）およびメトキシ末端ポリエチレングリコール−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（例えば、ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）を含むイリノテカンリポソーム内に封入されている、イリノテカンまたはその塩（例えば、イリノテカン八硫酸スクロース）を含むリポソーム型イリノテカン組成物を含み、前記リポソーム型イリノテカン組成物は、２〜８℃での最初の３か月の保管後に、１０ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）を含有する（または形成する）か、２〜８℃での最初の６か月（すなわち１８０日）の保管後に、２０ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）を含有する（または形成する）か、および／または２〜８℃での最初の９か月の保管後（例えば、製造後、最初の９か月の安定性試験の間）に、２５ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）を含有する（または形成する）。
【００１３】
イリノテカンリポソームは、３：２：０．０１５のモル比で、コレステロール、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）およびメトキシ末端ポリエチレングリコール−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（例えば、ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）を好ましくは含み、全リポソームリン脂質１ｍｍｏｌあたり５００ｍｇ（±１０％）のイリノテカンを封入する。安定化リポソーム型イリノテカン組成物は、リポソーム型イリノテカン組成物１ｍＬあたり、合計で約４．３ｍｇのイリノテカン部分を供給する、イリノテカンリポソームを好ましくは含み、イリノテカンの少なくとも約９８％が、イリノテカンリポソーム中に（例えば、上の式（Ｉ）の化合物などのイリノテカン八硫酸スクロースとして）封入されている。ある種の好ましいリポソーム組成物は、７．００〜７．５０（例えば、７．０、７．２５、７．３、７．５）のｐＨを有し、無水イリノテカン遊離塩基のグラム量にして、全リポソームリン脂質１ｍｍｏｌあたり５００ｍｇ（±１０％）、およびリポソーム型イリノテカン組成物１ｍＬあたり４．３ｍｇのイリノテカンに等価なイリノテカン部分の濃度で、コレステロールおよびリン脂質１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）およびメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）からなる単層ラメラ二重層ベシクル中にイリノテカン八硫酸スクロースを封入するイリノテカンリポソームの分散液を含む、保管安定化リポソーム型イリノテカン組成物であり、この保管安定化リポソーム型イリノテカン組成物は、４℃での最初の６か月の保管の間に、１ｍｇ／ｍＬ未満のＬｙｓｏ−ＰＣを形成するほど安定化されている。例えば、ある種の好ましい医薬リポソーム型イリノテカン組成物は、水性等張緩衝液中に、イリノテカン部分４．３ｍｇ／ｍＬでイリノテカン中に封入されているイリノテカンまたはその塩（例えば、イリノテカン八硫酸スクロース）、６．８１ｍｇ／ｍＬの１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、２．２２ｍｇ／ｍＬのコレステロールおよび０．１２ｍｇ／ｍＬのメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）を含み、前記リポソーム組成物は、２〜８℃で３か月の保管後に、１０ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）を含有し、２〜８℃で６か月（または１８０日）の保管後に、２０ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）を含有し、そして／または２〜８℃で９か月の保管後に、２５ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）を含有する。
【００１４】
一部の実施形態では、本リポソーム組成物は、イリノテカン部分を含有する溶液を、トリエチルアンモニウム（ＴＥＡ）およびイリノテカン八硫酸スクロース（ＳＯＳ）捕捉剤を０．４〜０．５Ｍの濃度（スルフェート基濃度に対して）でＴＥＡ８ＳＯＳ（好ましくは、ＴＥＡ８ＳＯＳ捕捉剤溶液）として封入する捕捉剤リポソームに、５００ｇ（±１０％）のイリノテカン部分／リン脂質１ｍｏｌをＰＬ含有捕捉剤リポソームに搭載して捕捉剤リポソームからＴＥＡ陽イオンを放出するのを可能にするのに有効な条件下で接触させて、ＳＯＳリポソームを形成するステップ、ならびに（ｂ）イリノテカンＳＯＳリポソームと２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）とを一緒にして、７．２５〜７．５０のｐＨを有するイリノテカンリポソーム組成物を得て、４℃で３か月の保管の間に、１０ｍｏｌ％未満（イリノテカンリポソーム組成物中の、ホスファチジルコリンの総量に対して）のｌｙｓｏ−ホスファチジルコリン（Ｌｙｓｏ−ＰＣ）を形成するほど安定化されているイリノテカンリポソーム組成物を得るステップを含む方法により作製される。
【００１５】
例えば、本発明は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロールおよびメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）からなる、直径がおよそ１１０ｎｍの単層ラメラ脂質二重層ベシクル中にイリノテカン八硫酸スクロース（ＳＯＳ）を封入する安定化イリノテカンリポソームを含む、イリノテカンリポソーム組成物を提供し、安定化イリノテカンリポソームは、（ａ）イリノテカンを、ＴＥＡ陽イオンおよびＳＯＳ捕捉剤を０．４〜０．５Ｍの濃度（スルフェート基濃度に対して）でＴＥＡ８ＳＯＳとして封入する捕捉剤リポソームに、５００ｇ（±１０％）のイリノテカン部分／リン脂質１ｍｏｌを捕捉剤リポソームに搭載して捕捉剤リポソームからトリエチルアンモニウム（ＴＥＡ）陽イオンを放出するのを可能にするのに有効な条件下で接触させて、イリノテカン八硫酸スクロース（ＳＯＳ）リポソームを形成するステップ、ならびに（ｂ）イリノテカンＳＯＳリポソームと２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）とを一緒にして、７．２５〜７．５０のｐＨを有するイリノテカンリポソーム組成物を得て、４℃で３か月の保管の間に、１０ｍｏｌ％未満（イリノテカンリポソーム組成物中の、ホスファチジルコリンの総量に対して）のｌｙｓｏ−ホスファチジルコリン（Ｌｙｓｏ−ＰＣ）を形成するほど安定化されているイリノテカンリポソーム組成物を得るステップを含む工程により得られる。
【００１６】
本リポソーム型イリノテカン組成物は、様々な形態のがんと診断された患者の処置において有用である。例えば、リポソーム型イリノテカンは、他の抗腫瘍剤なしに、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）を処置するために投与することができる。一部の実施形態では、本リポソーム型イリノテカン組成物は、他の抗腫瘍剤と組み合わせて投与される。例えば、リポソーム型イリノテカン組成物、５−フルオロウラシルおよびロイコボリン（他の抗腫瘍剤はなし）は、ゲムシタビンをベースとする治療後に、疾患進行を伴う膵臓の転移性腺癌と診断された患者を処置するために投与することができる。リポソーム型イリノテカン組成物、５−フルオロウラシル、ロイコボリンおよびオキサリプラチン（他の抗腫瘍剤はなし）は、以前に処置されなかった膵臓がんと診断された患者を処置するために投与することができる。リポソーム型イリノテカン組成物、５−フルオロウラシル、ロイコボリンおよびＥＧＦＲ阻害剤（例えば、ＭＭ−１５１などのオリゴクローナル抗体ＥＧＦＲ阻害剤）は、結腸直腸がんと診断された患者を処置するために投与することができる。
【００１７】
本明細書において特に明記しない限り、リポソーム組成物は、リン脂質１ｍｏｌあたり、４７１ｇまたは５００ｇ（±１０％）のどちらか一方のイリノテカン遊離塩基によってもたらされるものに等価な比の、リン脂質のモル数に対するグラム量で、イリノテカン（遊離塩基または塩の形態）の量を含有する。
【００１８】
本明細書で使用する場合（および別段の指定がない限り）、「イリノテカン部分」とは、イリノテカンラクトン、すなわちイリノテカンラクトン遊離塩基無水物をもっぱら指す。
【００１９】
本明細書で使用する場合（および別段の指定がない限り）、用語「カンプトテシン」には、カンプトテシン、およびカンプトテシン誘導体（イリノテカン、トポテカン、ルルトテカン、シラテカン、エチリノテカンペゴル、ＴＡＳ１０３、９−アミノカンプトテシン、７−エチルカンプトテシン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、１０，１１−メチレンジオキシカンプトテシン、９−アミノ−１０，１１−メチレンジオキシカンプトテシン、９−クロロ−１０，１１−メチレンジオキシカンプトテシン、（７−（４−メチルピペラジノメチレン）−１０，１１−エチレンジオキシ−２０（Ｓ）−カンプトテシン、７−（４−メチルピペラジノメチレン）−１０，１１−メチレンジオキシ−２０（Ｓ）−カンプトテシンおよび７−（２−Ｎ−イソプロピルアミノ）エチル）−（２０Ｓ）−カンプトテシン、ならびにそれらの立体異性体、塩およびエステルを含む）が含まれる。
【００２０】
本明細書で使用する場合（および別段の指定がない限り）、「ＤＬＳ」は、動的光散乱法を指し、「ＢＤＰ」は、バルク薬製品を指す。
【００２１】
一部の実施形態では、本発明のリポソームは、リポソーム内に医薬品を捕捉する、１種または複数の作用剤（これ以降、捕捉剤と呼ぶ）を封入する。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「徐放性組成物」は、２週間毎に１回、イリノテカン遊離塩基７０ｍｇ／ｍ２に対応する用量でヒトに投与した場合、以下の薬物動態パラメータ：Ｃｍａｘ  ３７．２（８．８）μｇのイリノテカン（無水遊離塩基として）／ｍＬおよびＡＵＣ０−∞１３６４（１０４８）ｈ・μｇのイリノテカン／ｍＬ（イリノテカンの場合）；または（ＳＮ−３８の場合）、Ｃｍａｘ  ５．４（３．４）μｇのＳＮ−３８（無水遊離塩基として）／ｍＬ；ＡＵＣ０−∞６２０（３２９）ｈ・ｎｇのＳＮ−３８／ｍＬの８０〜１２５％をもたらすイリノテカン組成物を含む。
【００２３】
特に示さない限り、リポソーム調製物は、少なくとも１つの脂質二重層を有するベシクル（例えば、球状または実質的に球状）を含むことができ、多層ラメラおよび／または単層ラメラベシクル、ならびに薬学的に活性な化合物（例えば、カンプトテシン）および／もしくは捕捉剤（単数もしくは複数）を封入するベシクル、ならびに／またはそれらを封入しないベシクルを任意選択で含んでもよい。例えば、特に示さない限り、カンプトテシンリポソームを含む医薬リポソーム調製物は、カンプトテシン化合物（単数もしくは複数）および／または捕捉剤（単数もしくは複数）を含むまたは含まない単層ラメラおよび多層ラメラリポソームの混合物を含めた、カンプトテシン化合物を含まないリポソームを任意選択で含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】図１Ａは、八硫酸スクロースの塩として、ゲル状態または沈殿状態のイリノテカンを含有する水性空間を封入するイリノテカンリポソームの概略図を示す。
【００２５】
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａにおけるイリノテカンリポソームのエカトリアル断面図を示す。
【００２６】
【図２Ａ】図２Ａは、４℃で９か月の保管後の、液体イリノテカンリポソーム組成物の、安定比値対ｌｙｓｏ−ＰＣの相対量（ｍｏｌ％）のグラフであり、該リポソーム組成物は、製造後であるが保管前に指定ｐＨ値を有する。
【００２７】
【図２Ｂ】図２Ｂは、４℃で６か月の保管後の、液体イリノテカンリポソーム組成物の、安定比値対ｌｙｓｏ−ＰＣの相対量（ｍｏｌ％）のグラフであり、該リポソーム組成物は、製造後であるが保管前に指定ｐＨ値を有する。
【００２８】
【図２Ｃ】図２Ｃは、４℃で６か月の保管後の、液体イリノテカンリポソーム組成物の、安定比値対ｌｙｓｏ−ＰＣの相対量（ｍｏｌ％）のグラフであり、該リポソーム組成物は、製造後であるが保管前に指定ｐＨ値を有する。
【００２９】
【図３Ａ】図３Ａは、１０４７の安定比および６．５のｐＨを有する２種のイリノテカンリポソーム組成物の、４℃での保管月数に対する、ｌｙｓｏ−ＰＣの相対量（ｍｏｌ％）のグラフである。
【００３０】
【図３Ｂ】図３Ｂは、それぞれ９９２および９４２の安定比、ならびに製造後であるが保管前に６．５のｐＨを有する２種のイリノテカンリポソーム組成物の、４℃での保管月数に対する、ｌｙｓｏ−ＰＣの相対量（ｍｏｌ％）のグラフである。
【００３１】
【図３Ｃ】図３Ｃは、７８５の安定比、および製造後であるが保管前に６．５のｐＨを有するイリノテカンリポソーム組成物の、４℃での保管月数に対する、ｌｙｓｏ−ＰＣの相対量（ｍｏｌ％）のグラフである。
【００３２】
【図３Ｄ】図３Ｄは、０．６５Ｍのスルフェート基濃度のＴＥＡ８ＳＯＳを使用して調製した、約７２４の安定比を有する、製造後であるが保管前に６．５のｐＨを有する２種のイリノテカンリポソーム組成物の４℃での保管月数に対する、ｌｙｓｏ−ＰＣの相対量（ｍｏｌ％）のグラフである。
【００３３】
【図４Ａ】図４Ａは、約１０４７の安定比、および製造後であるが保管前に７．２５のｐＨを有する３種のイリノテカンリポソーム組成物の、４℃での保管月数に対する、ｌｙｓｏ−ＰＣの相対量（ｍｏｌ％）のグラフである。リポソーム試料５（白い正方形）は、５ｍｇ／ｍＬのイリノテカン塩酸塩三水和物によってもたらされるものに等価なイリノテカン部分の濃度で調製した一方、リポソーム試料１３（黒三角）も同様に、２０ｍｇ／ｍＬのイリノテカン塩酸塩三水和物で調製した。試料１３中のリポソームは、試料５と同じ方法で調製したが、最終リポソーム組成物中の１ミリリットルあたりのリポソーム構成成分（すなわち、リン脂質、コレステロール、イリノテカンおよびスクロソファート）は、試料５に比べて、４倍多かった。
【００３４】
【図４Ｂ】図４Ｂは、約１０４７の安定比、ならびに製造後であるが保管前に７．２５および７．５のｐＨ値を有する２種のイリノテカンリポソーム組成物の、４℃での保管月数に対する、ｌｙｓｏ−ＰＣの相対量（ｍｏｌ％）のグラフである。
【００３５】
【図４Ｃ】図４Ｃは、約７８５の安定比、ならびに製造後であるが保管前に７．２５および７．５のｐＨ値を有する２種のイリノテカンリポソーム組成物の、４℃での保管月数に対する、ｌｙｓｏ−ＰＣの相対量（ｍｏｌ％）のグラフである。
【００３６】
【図５】図５は、１０４６〜１０６４の安定比、および製造後であるが保管前に７．３のｐＨを有する３種のイリノテカンリポソーム組成物の、４℃での保管月数に対する、ｌｙｓｏ−ＰＣの濃度（ｍｇ／ｍＬ）のグラフである。
【００３７】
【図６】図６は、１０４６〜１０６４の安定比、および製造後であるが保管前に７．３のｐＨを有する３種のイリノテカンリポソーム組成物中の、４℃での保管月数に対する、ｌｙｓｏ−ＰＣの濃度（ｍｇ／ｍＬ）のグラフである。
【００３８】
【図７】図７は、様々な量の置換アンモニウム（プロトン化ＴＥＡ）を有するイリノテカンリポソーム組成物中の、４℃で保管の間の、推定されるｌｙｓｏ−ＰＣ形成速度（ｍｇ／ｍＬ／月）のグラフである。
【００３９】
【図８】図８は、様々な割合、すなわち１：９〜９：１までのグラム当量比で、水溶液中での、イリノテカン塩酸塩三水和物およびトリエチルアンモニウムスクロソファートを一緒にすることにより形成される沈殿物中のイリノテカンおよびスクロソファートのグラム当量のグラフである。ｘ軸は、無水イリノテカン遊離塩基のグラム当量に対する、試料中でのトリエチルアンモニウムスクロソファート（ＳＯＳ）の総量の相対グラム当量を示す。
【００４０】
【図９】図９は、４℃で１２〜３６か月の期間にわたって保管した、１２種の異なるイリノテカン八硫酸スクロースリポソーム生成物のロット番号の平均粒子サイズをプロットした、各試料に対して得られたデータへの線形回帰を含むグラフを示す。
【００４１】
【図１０】図１０は、図９に示されている、イリノテカン八硫酸スクロース生成物のロット番号の粒子サイズ多分散指数（ＰＤＩ）の、各試料に対して得られたデータへの線形回帰を含むグラフである。
【００４２】
【図１１Ａ】図１１Ａは、４℃で１２〜３６か月の期間にわたって保管した、１３種の異なるイリノテカン八硫酸スクロース生成物のロット番号のｐＨの、各試料に対して得られたデータへの線形回帰を含むグラフである。
【００４３】
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、４℃で１２か月の期間にわたって保管した、１６種の異なるイリノテカン八硫酸スクロース生成物のロット番号のｐＨの、各試料に対して得られたデータへの線形回帰を含むグラフである。
【００４４】
【図１２】図１２は、２種のイリノテカンリポソーム組成物中の３６か月にわたるｌｙｓｏ−ＰＣの濃度（ｍｇ／ｍＬ）、および各イリノテカンリポソーム試料から得られた各データ点への最良適合線形回帰のグラフである。
【００４５】
【図１３Ａ】図１３Ａは、方法Ａの場合の、フルスケールでの代表的なクロマトグラムである。
【００４６】
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、方法Ａの場合の、拡大スケールの代表的なクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
詳細な説明
安定化カンプトテシン組成物は、１つまたは複数のカンプトテシン化合物を封入するリポソームを含むことができる。リポソームは、化学療法薬を含めた、医薬品の投与に使用することができる。本発明は、カンプトテシン化合物の安定化リン脂質含有組成物、例えば、ｌｙｓｏ−リン脂質、例えば、ｌｙｓｏ−ＰＣをより少ない量で生成する、リポソーム型イリノテカンを提供する。
【００４８】
カンプトテシンリポソーム（lipomes）は、脂質組成物の内側に捕捉剤（例えば、リン脂質含有ベシクル）によりカンプトテシンを封入することができる。例えば、図１Ａは、約１１０ｎｍの直径、およびイリノテカンを封入する脂質膜を有するイリノテカンリポソームを図示している概略図を示す。この概略図中の脂質膜は、エステル含有リン脂質ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥを含有している。ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ脂質は、二重層膜の内部および外部脂質層中に位置しており、その結果として、そのＰＥＧ部分は、それぞれ、リポソーム内に、またはリポソームの外部表面に位置している。図１Ｂは、図１Ａ中に一般的に図示されているリポソームの特定の実施形態の断面図を示しており、この場合、単層ラメラ脂質二重層膜は、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥを含み、イリノテカン八硫酸スクロースを封入する。
【００４９】
４℃などの２〜８℃で長期の保管後でさえも、低いレベルのｌｙｓｏ−ＰＣを有する、エステル含有リン脂質を含む新規な安定化イリノテカンリポソーム組成物であって、イリノテカン八硫酸スクロース（ＳＯＳ）を封入するリポソーム（イリノテカン−ＳＯＳリポソーム）を含み、かつ冷蔵保管の間のｌｙｓｏ−ＰＣ形成をかなり低減する、安定化イリノテカンリポソーム組成物を作製することができることが、今般見いだされた。本発明は、いくつかの予想外の観察に一部、基づいている。第１に、イリノテカン−ＳＯＳリポソーム組成物は、封入されているイリノテカンの量が、共封入されているＳＯＳ捕捉剤の量に対して増加すると、冷蔵保管の間、驚くべきことに、実質的に少ないｌｙｓｏ−ＰＣを有する。第２に、イリノテカン−ＳＯＳリポソーム組成物は、製造後であるが、保管前に、イリノテカン−ＳＯＳリポソームを含有する水性媒体のｐＨが６．５より大きい場合、冷蔵保管の間、驚くべきことに、少ないｌｙｓｏ−ＰＣを有する。第３に、イリノテカン−ＳＯＳリポソーム組成物は、該組成物中でアッセイされるリポソーム捕捉剤の残留アンモニウム／置換アンモニウム陽イオンの量が、１００ｐｐｍ未満である場合、驚くべきことに、少ないｌｙｓｏ−ＰＣを有する。
リポソーム型カンプトテシン組成物の構成脂質
【００５０】
ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルセリンなどの、リポソームの構成物となり得る様々な脂質、とりわけリン脂質が当分野において公知であり、このような他のリン脂質を用いてリポソームを作製することは当分野における技量の範囲内にある。一部の実施形態では、本発明のリポソームは、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロールおよびメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）から構成される。本明細書に開示されているリポソーム調製物中に存在する脂質に関して、以下に好ましい実施形態を記載する。
【００５１】
リポソーム構成成分は、活性物質が腫瘍部位に送達されるまで活性物質を封入して保持する単層ラメラベシクルおよび／または多層ラメラベシクルを形成する、リポソーム二重層膜を生成するよう選択することができる。好ましくは、リポソームベシクルは単層ラメラである。リポソーム構成成分は、一緒にされると、ｉｎ  ｖｉｖｏでは低いタンパク質結合性を維持し、その結果、その循環寿命を延長しながらも、活性物質を能動的に搭載して保持することが可能なリポソームを生成するその特性のために選択される。
【００５２】
ＤＳＰＣは、好ましくは、イリノテカンを封入するリポソームの二重層中の主な脂質構成成分である（例えば、すべての脂質成分の総重量の７４．４％を占める）。ＤＳＰＣは、５５℃の相転移温度（Ｔｍ）を有する。
【００５３】
コレステロールは、すべての脂質成分の総重量の約２４．３％を好ましくは占めることができる。コレステロールは、リポソームリン脂質膜を安定化するのに有効な量で取り込まれ得、その結果、この膜が、血漿タンパク質によって破壊されて、循環からのリポソームの迅速なクリアランスを担う血漿中のオプソニンの結合度を低下させること、および二重層形成性リン脂質と組み合わされた溶質／薬物の透過性を低下させることをしない。
【００５４】
ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥは、すべての脂質二重層構成物の総重量の約１．３％を好ましくは占めることができる。イリノテカンリポソームの表面上のその量および存在は、リポソームの凝集を阻止する、最小限の立体障壁を実現するよう選択され得る。本発明のＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥによりコーティングされたリポソームは、サイズおよび薬物封入に関して、安定であることが示されている。
【００５５】
一部の実施形態では、リポソーム調製物の脂質膜は、以下の成分：１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、および２００の非ＰＥＧ−リン脂質分子毎におよそ１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質分子の比となるメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）から好ましくは構成される。
【００５６】
好ましい実施形態では、本発明のリポソームは、３：２：０．０１５のモル比で一緒にされた、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥの混合物から作製される。好ましい実施形態では、本発明のリポソーム調製物は、約６．８１ｍｇ／ｍＬの濃度の１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、約２．２２ｍｇ／ｍＬの濃度のコレステロール、および約０．１２ｍｇ／ｍＬの濃度のメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）を含む。
【００５７】
さらに好ましい実施形態では、本発明のリポソーム調製物は、６．８１ｍｇ／ｍＬの濃度の１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、２．２２ｍｇ／ｍＬの濃度のコレステロール、および０．１２ｍｇ／ｍＬの濃度のメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）を含む。
カンプトテシン組成物捕捉剤
【００５８】
一部の実施形態では、本発明のリポソームは、リポソーム内に医薬品を捕捉する１種または複数の作用剤（これ以降、捕捉剤と呼ぶ）を封入する。捕捉剤は、好ましくは、複数の負の荷電基を有するポリ陰イオン性化合物を含むか、または２つもしくはそれより多い、異なるこのような化合物の組合せを含む。非限定例では、ポリ陰イオン捕捉剤は、二価の陰イオン、三価の陰イオン、多価の陰イオン、ポリマー状多価陰イオン、ポリ陰イオン化ポリオールまたはポリ陰イオン化糖である。本発明の文脈では、ポリ陰イオン性捕捉剤は、そのヒドロキシル基が陰イオン性基により完全にもしくは部分的に修飾されまたは置きかえられている（陰イオン化されている）ポリオールまたは糖などの、ポリ陰イオン化ポリオールまたは糖とすることができる。非限定例では、ポリ陰イオン化ポリオールまたはポリ陰イオン化糖は、そこに連結している陰イオン性基と共に、ポリオール部分または糖部分を含むことができる。好ましくは、水性媒体中にある場合、ポリ陰イオン化糖またはポリ陰イオン化ポリオール捕捉剤の少なくとも１つの陰イオン性基は、ｐＨ３〜１２、好ましくはｐＨ６．５〜８のｐＨ範囲で、５０％を超えてイオン化しているか、あるいは代替として、陰イオン性基（単数または複数）が３もしくはそれ未満、好ましくは２もしくはそれ未満のｐＫａを有する。好ましい実施形態では、捕捉剤は、１．０またはそれ未満のｐＫａを有する、スルフェート部分を含有する。非限定例では、ポリ陰イオン捕捉剤は、単位あたり、例えば、炭素鎖中の炭素原子もしくは環あたり、または糖中の単糖単位あたり、負の荷電基の少なくとも２、３または４の電荷密度を有することができる。
【００５９】
本発明の一部の実施形態では、リポソーム組成物の放出速度は、捕捉剤として、ポリ陰イオン化糖またはポリ陰イオン化ポリオールと、１つまたは複数の他の一価または多価陰イオン、例えば、塩化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオンなどとの混合物を使用することによって向上することができる。徐放性組成物の放出速度を向上する別の非限定例では、様々な程度のポリ陰イオン化を有する、異なるポリ陰イオン化糖および／またはポリ陰イオン化ポリオールの混合物が、捕捉剤として使用されている。
【００６０】
一部の実施形態では、本発明のリポソーム内側のポリ陰イオン化度は、例えば、リポソームに捕捉されたカンプトテシンまたはカンプトテシン誘導体化合物による、リポソーム内側の全陰イオン（単数または複数）の、９０％より高い、もしくは９９％より高い、または０．１％〜９９％、１０％〜９０％、もしくは２０％〜８０％の間となる。
【００６１】
一部の実施形態では、捕捉剤は、硫酸化糖および／またはポリオールである。本発明の例示的な硫酸化糖には、非限定的に、六硫酸スクロース、七硫酸スクロースおよび八硫酸スクロースを含む、硫酸化スクロースである（Ochi.  K.ら、１９８０年、Chem.  Pharm.  Bull.、２８巻、６３８〜６４１頁を参照されたい）。同様に、塩基触媒の存在下で、オキシ塩化リンまたはジエチルクロロホスフェートとの反応により、ポリリン酸化ポリオールまたは糖となる。ポリリン酸化ポリオールはまた、天然源から単離される。例えば、六リン酸イノシトール（フィチン酸）などのポリリン酸イノシトールは、トウモロコシから単離することができる。本発明を実施するのに好適な、様々な硫酸化、スルホン化およびリン酸化糖およびポリオールは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，７８３，５６８号に開示されている。ポリオールおよび／または糖と、１分子より多いホウ酸との複合体形成により、やはり、ポリ陰イオン化（ポリホウ酸化）生成物となる。アルカリの存在下で、ポリオールおよび／または糖と二硫化炭素との反応により、ポリ陰イオン化（ポリジチオ炭酸化、ポリキサントゲン酸化）誘導体となる。ポリ陰イオン化ポリオールまたは糖誘導体は、遊離酸の形態で単離され得、好適な塩基により、例えば、水酸化アルカリ金属、水酸化アンモニウムにより、または好ましくは、ニートな形態、もしくは本発明の置換アンモニウムのポリ陰イオン性塩を与える置換水酸化アンモニウムの形態の、置換アミン、例えば本発明の置換アンモニウムに対応するアミンにより中和され得る。代替として、ポリ陰イオン化ポリオール／糖のナトリウム、カリウム、カルシウム、バリウムまたはマグネシウム塩を単離することができ、任意の公知の方法により、例えばイオン交換により、好適な形態、例えば置換アンモニウム塩の形態に変換することができる。硫酸化糖捕捉剤の非限定例は、非限定的に、六硫酸スクロース、七硫酸スクロースおよび八硫酸スクロース（ＳＯＳ）を含む、硫酸化スクロース化合物である。例示的なポリオール捕捉剤は、六リン酸イノシトール（フィチン酸もしくはＩＨＰとしても公知である）または他の二糖類の硫酸化形態などの、ポリリン酸イノシトールを含む。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態では、捕捉剤は、硫酸化ポリ陰イオンであり、その非限定例は、八硫酸スクロース（ＳＯＳ）である。スクロソファートもまた、八硫酸スクロースまたはスクロオクタスルフェート（ＳＯＳ）と呼ばれる。様々な塩、例えばアンモニウム、ナトリウムまたはカリウム塩の形態のスクロソファートを調製する方法が、本分野において周知である（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，９９０，６１０号）。八硫酸スクロース（スクロソファートとも呼ぶ）は、完全にプロトン化されている形態では、式（ＩＩ）の構造：
【化２】
2018530563.tif 000003
を有する、スクロースの完全置換スルフェートである。
【００６３】
様々な塩、例えばアンモニウム、ナトリウムまたはカリウム塩の形態のスクロソファートを調製する方法は、本分野において周知である（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第４，９９０，６１０号を参照されたい）。同様に、八硫酸ラクトースおよび八硫酸マルトースを生成する、他のジサッカライド、例えばラクトースおよびマルトースの硫酸化形態も想定される。
【００６４】
一部の実施形態では、本発明のリポソーム製剤は、イリノテカンまたはトポテカンなどのカンプトテシン化合物、およびＳＯＳなどの陰イオン性捕捉剤を含む。本発明のリポソームは、陰イオン性捕捉剤と化学量論比でカンプトテシン化合物を好ましくは含む。例えば、イリノテカンリポソーム製剤は、約８：１のモル比で、イリノテカンおよび八硫酸スクロースを封入することができる。リポソームの安定化組成物は、式（Ｉ）のイリノテカン組成物を封入することができ、式中、ｘは約８である：
【化３】
2018530563.tif 000004
このリポソーム型イリノテカンは、リポソーム中に封入されている式（Ｉ）の組成物を含むことができる。好ましくは、式（Ｉ）の組成物は、コレステロール、および１つまたは複数のリン脂質（例えば、ＰＥＧ含有リン脂質を含む）を含むリポソーム内で形成（例えば、沈殿）される。例えば、式（Ｉ）の化合物は、安定化リポソーム型イリノテカン組成物を形成する工程において、（１）カンプトテシン化合物（単数または複数）（例えば、イリノテカン、トポテカンなど）を（２）ポリ硫酸化陰イオン性捕捉剤（例えば、八硫酸スクロース）を封入するリポソームと反応させることによって、リポソーム内に形成することができる。好ましくは、リポソーム型イリノテカン組成物は、６．５より大きなｐＨ（例えば、７．２５、７．３および７．５を含む、７．０〜７．５）を有する。
【００６５】
好ましい安定化カンプトテシン組成物は、リポソーム型イリノテカンを含む。
【００６６】
安定化カンプトテシン組成物は、４．５〜５．５ｍｇ／ｍＬのイリノテカン塩酸塩三水和物（すなわち、３．９〜４．８ｍｇ／ｍＬの無水イリノテカン遊離塩基）によってもたらされるものに等価なイリノテカン部分の濃度で、イリノテカンまたはその塩を含有する高密度カンプトテシン化合物（単数または複数）のリポソーム製剤を含み、かつ、６．１３〜７．４９ｍｇ／ｍＬ（好ましくは、約６．８１ｍｇ／ｍＬ）の濃度のＤＳＰＣ、２〜２．４ｍｇ／ｍＬ（好ましくは、約２．２２ｍｇ／ｍＬ）の濃度のコレステロール、および０．１１〜０．１３ｍｇ／ｍＬ（好ましくは、約０．１２ｍｇ／ｍＬ）の濃度のＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥを含有しており、好適な量のカンプトテシン化合物（単数または複数）を、好ましくはより効力の高いラクトン形態で依然として供給しながらも、冷蔵保管（２〜８℃）の間、存在するとしても、ｌｙｓｏ−ＰＣの存在が少量であることによって特徴付けられる。本発明は、製造後、２０ｍｏｌ％より多いｌｙｓｏ−ＰＣのレベルの形成なしに、少なくとも最初の６か月間、好ましくは少なくとも最初の９か月間、冷蔵下（すなわち、２〜８℃）で保管され得る、医薬カンプトテシン化合物（単数または複数）のリポソーム組成物を含む。より好ましくは、本発明は、６．４〜７．２ｍｇ／ｍＬの（ＤＳＰＣ）、２．０９〜２．３５ｍｇ／ｍＬのコレステロールおよび約０．１１３〜０．１２７ｍｇ／ｍＬのＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥと共に、４．７〜５．３ｍｇ／ｍＬの間のイリノテカン塩酸塩三水和物（すなわち、４．１〜４．６ｍｇのイリノテカン部分の無水遊離塩基）（イリノテカンは、リポソーム内に封入されている八硫酸スクロース塩として存在することができる）によってもたらされるものに等価な量のイリノテカン部分を含有する組成物であって、２〜８℃で保管した場合、６もしくは９か月で２０ｍｏｌ％以下のｌｙｓｏ−ＰＣを含有し、または２〜８℃で保管した場合、２１か月で２ｍｇ／ｍＬ以下のｌｙｓｏ−ＰＣを含有する、組成物を提供する。
イリノテカン／スルフェート化合物のグラム当量比（ＥＲ）の算出
【００６７】
各イリノテカンリポソーム調製物について、イリノテカン／スルフェート化合物のグラム当量比（ＥＲ）は、リポソーム組成物の単位あたり（例えば、１ｍＬ）、リポソームにより共封入されているイリノテカン（Ｉ）およびスルフェート化合物（Ｓ）のモル量を決定して、以下の式：ＥＲ＝Ｉ／（ＳＮ）（式中、Ｎは、スルフェート化合物陰イオンの価数である（例えば、スクロソファートの場合、Ｎは８であり、遊離スルフェートＳＯ４２−の場合、Ｎは２である））を使用することにより算出することができる。例えば、７．３８ｍＭのイリノテカンおよび１．０１ｍＭのスクロソファート（Ｎ＝８）を含有するリポソーム型イリノテカンスクロソファート組成物は、７．３８／（１．０１×８）＝０．９１３のＥＲを有することになる。好ましくは、スルフェート化合物（Ｓ）は、ＳＯＳ  １ｍｏｌあたり８個のスルフェート部分を含有する、八硫酸スクロースである。リポソーム組成物は、７．１〜７．５のｐＨを有し、以下のＥＲ範囲：好ましくは、０．８５〜１．２、０．８５〜１．１、または最も好ましくは約１．０２などの０．９〜１．０５のうちの１つを有する。代替として、リポソーム組成物は、リン脂質１ｍｏｌあたり５００ｇ（±１０％）の無水イリノテカン遊離塩基によってもたらされるものに等価な量のイリノテカン部分を有し、以下のＥＲ範囲：好ましくは、０．８５〜１．１、最も好ましくは、約１．０２などの０．９〜１．０５のうちの１つを有する。
安定化カンプトテシン組成物のｐＨ
【００６８】
リポソーム組成物のｐＨは、例えば、約６．５〜８．０のｐＨ、またはそれらの間の任意の好適なｐＨ値（例えば、７．０〜８．０、および７．２５を含む）の組成物を調製することにより、所望の保管安定特性（例えば、４℃で１８０日間にわたり保管している間に、リポソーム内のｌｙｓｏ−ＰＣの形成が低減する）を実現するよう、調整され得るかまたはそうでない場合、選択され得る。一部の実施形態では、ｐＨは、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９または８．０である。特定のｐＨ値を有しており、無水（anhudrous）イリノテカン遊離塩基濃度（ｍｇ／ｍＬ）によってもたらされるものに等価なイリノテカン部分および様々な濃度の八硫酸スクロースを有するイリノテカンリポソームは、本明細書に記載されているさらなる詳細説明に提示されている通り調製した。より好ましくは、製造後であって保管前のｐＨは、７．１〜７．５の間、より一層好ましくは約７．２〜７．３の間、最も好ましくは約７．２５である。ｐＨは、標準的手段により、例えば、適宜、１Ｎ  ＨＣｌまたは１Ｎ  ＮａＯＨを使用することにより、調整することができる。
【００６９】
本発明の一部の実施形態では、製造後であるが保管前のリポソーム型イリノテカン調製物のｐＨは、６．５より大きく、好ましくは７．２〜７．３の間である。本発明の一部の実施形態では、ｐＨは、７．２〜７．５である。
安定化カンプトテシン組成物の化合物グラム当量比（「ＥＲ」）
【００７０】
安定化リポソーム型カンプトテシン組成物は、６．５より大きなｐＨを有することができ、０．９より大きな（例えば、０．９〜１．１）イリノテカン／スルフェート化合物のグラム当量比（「ＥＲ」）を有する、イリノテカンおよびスルフェートのポリ陰イオン性捕捉剤を封入するリポソームを含む。イリノテカンＳＯＳリポソーム調製物に関して、ＥＲは、リポソーム組成物の単位あたり（例えば、１ｍＬ）、リポソームにより共封入されているイリノテカン（Ｉ）およびスルフェート化合物（Ｓ）のモル量を決定して、以下の式：ＥＲ＝Ｉ／（ＳＮ）（式中、Ｎは、スルフェート化合物陰イオンの価数であり（例えば、スクロソファートの場合、Ｎは８であり、遊離スルフェートＳＯ４２−の場合、Ｎは２である）、Ｉは、リポソームイリノテカン組成物中の封入されているイリノテカンの濃度であり、Ｓは、リポソーム型イリノテカン組成物中に封入されている八硫酸スクロースのスルフェート基の濃度である）を使用することにより算出することができる。好ましくは、スルフェート化合物（Ｓ）は、ＳＯＳ  １ｍｏｌあたり８個のスルフェート部分を含有する、八硫酸スクロースである。
【００７１】
リポソーム型イリノテカン組成物中に封入されている八硫酸スクロースのスルフェート基濃度（Ｓ・Ｎ）を直接決定することが好ましいが、Ｓ・Ｎは、リポソームリン脂質濃度（Ｐ、ｍｏｌ／Ｌ）、リポソームの内部空間にあるＳＯＳスルフェート基濃度（捕捉剤リポソームを調製するために使用される溶液中のＳＯＳスルフェート基濃度；パラメータＢ、本明細書における安定比の定義を参照されたい）、およびリポソームリン脂質の単位あたりのリポソーム内部の（捕捉された）体積、すなわちリポソームベシクルの内部空間内に隔離されている体積（Ｖｅ、Ｌ／リン脂質１ｍｏｌ）から決定することができる：
Ｓ・Ｎ＝Ｐ・Ｖｅ・Ｂ
【００７２】
例として、１００ｎｍのポリカーボネートフィルターに通す押し出しによって得られる、ホスファチジルコリン−コレステロールリポソームの場合、捕捉される体積は、１．７Ｌ／リン脂質１ｍｏｌに近づき得る（Muiら、１９９３年、Biophys.  J.、６５巻、４４３〜４５３頁）。この場合、４７１ｇ／リン脂質１ｍｏｌおよび０．４５ＭのＳＯＳスルフェート基濃度で、ＳＯＳ封入リポソームにイリノテカン（分子量５８６．７）を定量的に搭載すると、
（４７１／５８６．７）／（１．７・０．４５）＝１．０４９
のＥＲとなる。
【００７３】
一方、０．６５Ｍのスルフェート基のＳＯＳ濃度では、ＥＲは、
（４７１／５８６．７）／（１．７・０．６５）＝０．７２６
となる。
【００７４】
同様に、５００ｇ（±１０％）／リン脂質１ｍｏｌおよび０．４５ＭのＳＯＳスルフェート基濃度で、ＳＯＳ封入リポソームにイリノテカン（分子量５８６．７）を定量的に搭載すると、約１．１１のＥＲとなる一方、０．６５Ｍのスルフェート基のＳＯＳ濃度では、ＥＲは約０．７７となる。
安定化カンプトテシン組成物の調製
【００７５】
安定化カンプトテシン組成物は、カンプトテシンリポソームを含むことができる。リポソームは、化学療法薬を含む医薬品の投与に使用されている。薬物封入リポソームに関連する様々な技法、およびその作製方法は、一般に、当分野において公知であり、したがって、本明細書では、さらになんら詳細に記載されていない。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第８，１４７，８６７号を参照されたい。
【００７６】
一部の実施形態では、ベシクル内に１つまたは複数のカンプトテシン化合物を封入するリポソームは、少なくとも１つのリン脂質を含む。カンプトテシン化合物は、例えば、（ａ）リン脂質（単数または複数）を含むリポソームベシクル内に陰イオン性捕捉剤および陽イオンを封入する捕捉剤リポソームを形成するステップ、ならびに（ｂ）次いで、捕捉剤リポソームにカンプトテシン化合物（単数または複数）を搭載して、捕捉剤を含むリポソームの内側にカンプトテシン化合物を保持するのに有効な条件下で、捕捉剤リポソームをカンプトテシン化合物（単数または複数）に接触させて、カンプトテシンリポソームを形成するステップを含む、多ステップ工程で、リポソーム内に搭載することができるかまたはそうでない場合は捕捉することができる。
【００７７】
カンプトテシン化合物（単数または複数）は、カンプトテシン化合物（単数または複数）を捕捉剤リポソームに進入させて、カンプトテシンリポソームの形成を引き起こす、リポソーム膜にかかる勾配を使用して、捕捉剤リポソームに搭載することができる。好ましくは、捕捉剤リポソームは、リポソームの脂質構成成分の相転移温度より高く加熱した場合に、捕捉剤リポソーム中で、カンプトテシン化合物（単数または複数）のアンモニウム／置換アンモニウムへの交換をもたらすのに有効な、アンモニウムまたは置換アンモニウムなどの膜通過性陽イオンの膜貫通濃度勾配を有する。好ましくは、捕捉剤は、捕捉剤リポソームを取り囲む媒体中よりも、捕捉剤リポソーム中で高い濃度を有する。さらに、捕捉剤リポソームは、アンモニウム／置換アンモニウム陽イオンによって生成される勾配に加えて、１つまたは複数の膜貫通勾配を含むことができる。例えば、捕捉剤リポソーム組成物に含有されているリポソームは、膜貫通ｐＨ勾配、イオン勾配、電気化学ポテンシャル勾配、および／または溶解度勾配を、さらにまたは代替として含むことができる。
【００７８】
一部の実施形態では、リポソームを調製するために使用される捕捉剤（例えば、ＳＯＳおよび／または別の硫酸化ポリオール捕捉剤（その許容される塩を含む））は、０．３〜０８、０．４〜．０５、０．４５〜０．５、０．４５〜．０４７５、０．４５〜０．５、０．３、０．４、０．４５、０．４７５、０．５、０．６、０．７または０．８Ｍのスルフェート基の濃度（例えば、これらの指定値±１０％）を有する。好ましい実施形態では、リポソームを調製するために使用される捕捉剤はＳＯＳであり、約０．４５または約０．４７５Ｍのスルフェート基の濃度を有する。より好ましい実施形態では、リポソームを調製するために使用される捕捉剤はＳＯＳであり、０．４５Ｍまたは０．４７５Ｍのスルフェート基の濃度を有する。
【００７９】
好ましくは、カンプトテシン化合物（単数または複数）は、搭載中に、好適な温度、例えば、構成成分であるリン脂質の一次相転移温度より高い温度で、水性媒体中、捕捉剤リポソームと共にカンプトテシン化合物（単数または複数）をインキュベートすることにより、捕捉剤リポソームに搭載される一方、カンプトテシン化合物（単数または複数）を搭載した後は、構成成分であるリン脂質の一次相転移温度未満、好ましくは、ほぼ室温に低下される。インキュベート時間は、通常、構成成分である脂質、リポソームに搭載されるカンプトテシン化合物（単数または複数）の性質、およびインキュベート温度に基づく。通常、数分（例えば、３０〜６０分間）から数時間のインキュベート時間で十分である。
【００８０】
８５％を超える、通常、９０％を超える、高い捕捉効率が達成されるので、多くの場合、捕捉されていない実体を除去する必要がない。しかし、このようなことが必要な場合、捕捉されていないカンプトテシン化合物（単数または複数）は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、透析、限外濾過、吸着および沈殿などの様々な手段によって組成物から除去することができる。
【００８１】
一部の実施形態では、カンプトテシンリポソームは、イリノテカンリポソームである。イリノテカンリポソームは、（ａ）トリエチルアミン（ＴＥＡ）をスクロソファートのトリエチルアンモニウム塩（ＴＥＡ−ＳＯＳ）として含有するリポソームを調製するステップ、および（ｂ）続いて、イリノテカンがリポソームに進入して、対応する量のＴＥＡがリポソームから出て行く（これにより、得られたリポソームを横切るＴＥＡの濃度勾配を排除または低減される）ことが可能となるのに有効な条件下で、ＴＥＡ−ＳＯＳリポソームをイリノテカンに接触させるステップを含む、工程により調製することができる。
カンプトテシンリポソームの薬物搭載中のリポソーム外イオン強度
【００８２】
本発明の一部の実施形態では、リポソームのカンプトテシン搭載は、５０ｍＭのＮａＣｌに等価なもの未満、またはより好ましくは３０ｍＭのＮａＣｌに等価なもの未満のイオン強度で、水溶液中で行われる。薬物搭載後に、一層高い濃度の塩溶液、例えばＮａＣｌ溶液を添加して、イオン強度を、５０ｍＭのＮａＣｌに等価なものより高い、またはより好ましくは、１００ｍＭのＮａＣｌに等価なものよりも高い、好ましくは約１４０〜１６０ｍＭの間のＮａＣｌに等価にまで高めることができる。
捕捉剤陽イオン
【００８３】
本発明の陽イオンは、上記の脂質構成成分の相転移温度より高く加熱した場合に、捕捉剤リポソームへのカンプトテシン化合物（単数または複数）の搭載を実現するのに有効な量で、捕捉剤リポソームに封入することができる。陽イオンは、リポソームにカンプトテシン化合物（単数または複数）を搭載している間に、陽イオンが捕捉剤リポソームから出て行くことができるよう、選択される。リポソーム外の陽イオンは、カンプトテシン化合物（単数または複数）が搭載されたリポソームの調製後に除去することができる。
【００８４】
本発明の一部の実施形態では、捕捉剤と一緒になったリポソーム中の陽イオンは、置換アンモニウム化合物である。本発明の一部の実施形態では、置換アンモニウム化合物は、少なくとも約８．０のｐＫａを有する。本発明の一部の実施形態では、置換アンモニウム化合物は、周囲温度の水溶液中で決定すると、少なくとも約８．０、少なくとも約８．５、少なくとも約９．０、少なくとも９．５、少なくとも１０．０、少なくとも１０．５、または少なくとも１１．０のｐＫａを有する。本発明の一部の実施形態では、置換アンモニウム化合物は、約８．０〜１２．０、約８．５〜１１．５、または約９．０〜１１のｐＫａを有する。好ましい実施形態では、ｐＫａは、およそＴＥＡのｐＫａ、またはおよそＤＥＡのｐＫａである。
【００８５】
そのような置換アンモニウム化合物の非限定例は、以下の式の化合物：Ｎ（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）（Ｒ４）＋（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、独立して、水素、または合計で最大１８個の炭素原子を有する有機基であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つは、最大で８個の炭素原子を有する炭化水素基である有機基であり、これは、アルキル、アルキリデン、複素環式アルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニルもしくはシクロアルケニル基、またはそれらのヒドロキシル置換誘導体とすることができ、その炭化水素部分に、エーテル結合、エステル結合、チオエーテル結合、アミン結合またはアミド結合を形成する、１個または複数のＳ、ＯまたはＮ原子を任意選択で含む）である。置換アンモニウムは、立体的障害のあるアンモニウム化合物（例えば、アンモニウム窒素原子に直接、結合している二級または三級炭素原子を有する有機基の少なくとも１つを有する）とすることができる。同様に、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうちの少なくとも１つは水素でなければならない。好ましくは、置換アンモニウム陽イオンは、トリエチルアンモニウム（プロトン化ＴＥＡ）またはジエチルアンモニウム（プロトン化ＤＥＡ）である。
【００８６】
カンプトテシン化合物は、カンプトテシン化合物リポソームを形成するのに有効な条件下で、陰イオン性捕捉剤を封入するリポソームに搭載されるので、捕捉剤リポソーム内の置換アンモニウム陽イオンの濃度を低減することができる。本発明のリポソームは、陰イオン性捕捉剤、およびアンモニウムまたは置換アンモニウム陽イオンを含むことができ、アンモニウムまたは置換アンモニウム陽イオンは、続いて、除去され、そして／またはその後の薬物搭載ステップにおいて、リポソームに搭載されるカンプトテシン化合物によって置きかえられる。
【００８７】
好ましい実施形態では、カンプトテシン化合物リポソーム内のアンモニウムまたは置換アンモニウム陽イオンの濃度は、リン脂質を含有するカンプトテシンリポソーム調製物の長期間の冷蔵保管後に、少ない量のｌｙｓｏ−ＰＣをもたらすほど十分に低い。例えば、図７中のデータを含めて、実施例３において議論されている通り、約１００ｐｐｍ未満、好ましくは２０〜８０ｐｐｍの間、好ましくは約５０ｐｐｍ未満、より一層好ましくは約４０ｐｐｍ未満、より一層好ましくは３０ｐｐｍ未満の置換アンモニウム陽イオンを有するイリノテカンＳＯＳリポソーム調製物において、ｌｙｓｏ−ＰＣ形成量の低下が観察された。
【００８８】
一部の実施形態では、イリノテカンＳＯＳリポソーム（試料２４〜２９など；実施例の表１０）は、１００ｐｐｍ未満、または約１５〜１００ｐｐｍの置換アンモニウムＳＯＳ捕捉剤の対イオンを含む。一部の実施形態では、イリノテカンＳＯＳリポソーム（試料２４〜２９など；実施例の表１０）は、約１５〜８０ｐｐｍの置換アンモニウムを含む。一部の実施形態では、イリノテカンＳＯＳリポソームは、約４０〜８０ｐｐｍの置換アンモニウムを含む。一部の実施形態では、イリノテカンＳＯＳリポソーム（試料２４〜２９など；実施例の表１０）は、約８０〜１００ｐｐｍの置換アンモニウムを含む。好ましい実施形態では、上記のｐｐｍ濃度のいずれかで存在する置換アンモニウムは、ＴＥＡまたはＤＥＡに由来する。
安定化カンプトテシン組成物の安定比
【００８９】
リン脂質をベースとするカンプトテシン含有リポソームが、（１）カンプトテシン薬物を、（２）ポリ硫酸化陰イオン性捕捉剤を封入するリポソームと反応させることにより作製される場合、得られる薬物搭載リポソームの安定性は、以下に定義されている通り、少なくとも約９５０の安定比により定義されている、カンプトテシン、陰イオン性捕捉剤およびリポソーム形成性リン脂質の比に依存する。この安定比は、捕捉剤−リポソーム中のスルフェート基の初期濃度、およびリポソーム中に封入されているカンプトテシンとリン脂質との比に依存する。本明細書で使用する場合、この安定比（「ＳＲ」）は、以下の通り、定義される：
ＳＲ＝Ａ／Ｂ
（式中、
ａ．  Ａは、組成物中のリン脂質１モルあたりの、無水イリノテカン遊離塩基に対するグラム当量での、薬物搭載工程の間に捕捉剤リポソーム中に封入されたイリノテカン部分の量であり、
ｂ．  Ｂは、モル／Ｌ（スルフェート基の濃度に基づく）で表される、捕捉剤リポソームを作製するために使用されたスクロソファート（または、他の捕捉剤）溶液中のスルフェート基の濃度である）。
【００９０】
安定比の決定に関しては、リポソーム調製物中のリン脂質のモル数は、実施例中に記載されているものなどの、アッセイによって決定される。これにしたがって、イリノテカン部分の量（上記のＡ）は、リポソーム搭載を行うために算出される。
【００９１】
安定比の決定に関しては、モル／Ｌで表されるスクロソファート（または他の捕捉剤）溶液中のスルフェート基の濃度Ｂは、脂質（これは、通常、脂質に添加される捕捉剤溶液の体積の１０％またはそれ未満の体積のアルコールに通常溶解される）に添加される溶液中のスクロソファート（または、本明細書に開示されている他の捕捉剤）（モル／Ｌ）の濃度として算出される。したがって、スクロソファートの場合、スルフェート基の濃度Ｂは、スクロソファートの濃度に８（１つのスクロソファート分子中のスルフェート基の数）をかけたものであるか、または使用される特定の捕捉剤のスルフェート基の数に従って積算される。（実施例１を参照されたい）。
【００９２】
本発明の一部の実施形態では、安定比およびｐＨは、どちらも、６．５より大きく増加させる。したがって、本発明のある特定の好ましい実施形態では、安定比は、９４２〜１１３０であり、ｐＨは、７．２〜７．５であり、イリノテカンおよびＳＯＳ捕捉剤は、約８：１のモル比でリポソーム組成物中に存在する。好ましくは、安定比は、９４２〜１１３０であり、ｐＨは、約７．２５であり、イリノテカン組成物およびＳＯＳ捕捉剤は、８：１のモル比でリポソーム中に存在する。他のカンプトテシン化合物を封入するリポソームの製剤中の、ｌｙｓｏ−ＰＬ、特にｌｙｓｏ−ＰＣの量は、同様に制御することができる。
【００９３】
例えば、新規な安定化イリノテカンリポソーム調製物は、他の工程に従って調製した、イリノテカンＳＯＳリポソームに比べて、８０％少ないｌｙｓｏ−ＰＣを有することができる（例えば、９か月の冷蔵保管後に、比較試料１２に観察されるものよりもｌｙｓｏ−ＰＣが８０％少ない）。試料１２の（比較）リポソーム型イリノテカンは、０．６５Ｍのスルフェート基濃度で、８：１のモル比のトリエチルアミン（ＴＥＡ）および八硫酸スクロース（「ＳＯＳ」または「スクロソファート」）［（ＴＥＡ）８ＳＯＳ］の存在下、３：２：０．０１５のモル比を有する１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロールおよびメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）の脂質混合物を加熱することにより、約７２４の安定比で調製され、ＴＥＡ−ＳＯＳ捕捉剤リポソームが生成された。ＴＥＡ−ＳＯＳ捕捉剤リポソーム中に封入されない（ＴＥＡ）８ＳＯＳを除去した後、ＴＥＡが除去されて、ＴＥＡ−ＳＯＳ捕捉剤リポソーム調製物中にリン脂質１モルあたり５００ｇ（±１０％）の無水イリノテカン遊離塩基によりもたらされるイリノテカンの総量がリポソームに搭載される条件下で、イリノテカンの溶液を使用して、ＴＥＡ−ＳＯＳ捕捉剤リポソームを含有する得られた調製物にイリノテカンを搭載した。イリノテカンリポソーム組成物のｐＨは、６．５（本明細書の実施例の項目の小項目「ｐＨ測定」に準拠して測定）であり、イリノテカンリポソーム組成物１ｍＬあたり、イリノテカンリポソーム中に４．３ｍｇのイリノテカン部分を有した。これらのホスファチジルコリン含有リポソーム型イリノテカン組成物は、３か月の冷蔵保管（２〜８℃）の間、３０ｍｏｌ％（イリノテカンリポソーム組成物中のホスファチジルコリンの総量に対して）を超えるレベルのｌｙｓｏ−ＰＣを生成した（および９か月間に生成するｌｙｓｏ−ＰＣは、３５ｍｏｌ％を超える）。
例示的な実施形態における、安定比およびＬｙｓｏ−ＰＣ量の算出
【００９４】
一連の異なるイリノテカンリポソーム調製物は、本明細書に記載されている方法に準拠して作製した（各試料の調製および特徴付けに関する追加の実験詳細は、以下の実施例中に含まれている）。イリノテカンリポソーム調製物の各々において測定されるｌｙｓｏ−ＰＣの量は、表１Ａ（９か月の冷蔵保管後に行ったｌｙｓｏ−ＰＣ測定値）および表１Ｂ（表１Ａに列挙されている試料のサブセットについて、６か月の冷蔵保管後に行ったｌｙｓｏ−ＰＣ測定値）にまとめられている。イリノテカンリポソーム調製物はそれぞれ、八硫酸スクロース捕捉剤によりイリノテカンを封入する、約１１０±２０ｎｍ、好ましくは１１０±１０ｎｍの直径の単層ラメラ二重層リポソームを含有した。リポソームは、３：２：０．０１５のモル比を有する、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥの混合物から形成され、次に、リン脂質１モルあたり、約４７１ｇのイリノテカン部分の濃度（５００ｇ（±１０％）の無水イリノテカンＨＣｌに等価なイリノテカン部分の量をもたらす、イリノテカンまたはその塩）でイリノテカンを搭載した。イリノテカンリポソーム調製物はそれぞれ、異なる量のＳＯＳ捕捉剤を含有し、異なるｐＨ値で製剤化した。ｌｙｓｏ−ＰＣの量は、９か月の連続的な冷蔵保管（４℃）の後のすべての試料の測定を含め、様々な時間において、各イリノテカンリポソーム調製物で測定した。表１Ａ中の試料はすべて、ＳＯＳに対する、プロトン化ＴＥＡの対イオンを使用して搭載した（すなわち、表１Ａに指定されている通り、様々な濃度のＴＥＡ８ＳＯＳを封入するリポソームにイリノテカンを搭載する）。
【表１Ａ】
2018530563.tif 000005
a  本明細書に記載されている方法Bに準拠して測定
【００９５】
図２Ａは、４℃で９か月の保管後の、表１Ａ中の各試料において測定されたｌｙｓｏ−ＰＣの量を図示するプロットを示す。試料１２は、表１Ａおよび図２Ａにおいて、比較物として印を付けている。約９００より大きな安定比と６．５より大きなｐＨ（例えば、７．２５および７．５）の両方を有する試料は、４℃で９か月の冷蔵保管後に、２０ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ＰＣを含有した。図２Ｃは、４℃で６か月の保管後の、液体イリノテカンリポソーム組成物の、安定比値対ｌｙｓｏ−ＰＣの相対量（ｍｏｌ％）のグラフである（表６のデータ）。白丸で示されたデータ点は、製造後であるが保管前に測定された、６．５より大きなｐＨ（７．２５または７．５）を有するイリノテカン試料に相当する。菱形で示されたデータ点は、製造後であるが保管前に測定された、６．５のｐＨを有するイリノテカン試料に相当する。安定比は、各試料の製造中に、本明細書で定義されている通りに算出した。ｌｙｓｏ−ＰＣのｍｏｌ％は、各試料の製造後、最初の６か月の保管後に測定した。
【表１Ｂ】
2018530563.tif 000006
b  本明細書に記載されている方法Bに準拠して測定
【００９６】
図２Ｂは、４℃で６か月の保管後の、表１Ｂ中の各試料において測定されたｌｙｓｏ−ＰＣの量を図示するプロットを示す。約９８９より大きな安定比と６．５より大きなｐＨ（例えば、７．２５および７．５）の両方を有する試料は、４℃で６か月の冷蔵保管後に、２０ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ＰＣを含有した。
【００９７】
図３Ａ〜３Ｄは、６．５のｐＨを有する、表１Ａおよび１Ｂから選択される、イリノテカンリポソーム調製物中のｌｙｓｏ−ＰＣのｍｏｌ％を示すプロットである。Ｌｙｓｏ−ＰＣは、０、１、３、６、９および／または１２か月間の、４℃での各試料の保管後に決定した。これらのプロットは、各試料中の経時的な、ｌｙｓｏ−ＰＣ（ｍｏｌ％）の増加速度に関する推定値としての、データへの線形回帰線を含む。各図に関する、傾き、ｙ切片およびＲ２値のまとめは、以下の表１Ｃに示されている。
【表１Ｃ】
2018530563.tif 000007
【００９８】
一部の実施形態では、直径が約１００ｎｍ（例えば、１００±２０ｎｍ）のリポソーム中に封入されているイリノテカンＳＯＳを含有するイリノテカンリポソーム調製物の安定性は、安定比が９４２を超えるイリノテカンリポソームではかなり向上する。全リン脂質に対して５００ｇ（±１０％）のイリノテカン部分（上で説明した通り、無水遊離塩基に対して）となる一定の薬物搭載比を維持するが、ＳＯＳ捕捉剤の濃度を変えることにより、リポソーム調製物中のｌｙｓｏ−ＰＣの形成に及ぼす安定比の影響を評価した。表２は、（比較）試料１２（６．５）と同じｐＨであるが、様々な濃度のＳＯＳ捕捉剤（すなわち、異なる安定比）で製剤化した、表１中のイリノテカンリポソーム調製物において検出されたｍｏｌ％  ｌｙｓｏ−ＰＣの量をまとめたものを提示している。表２は、ＳＯＳ捕捉剤およびイリノテカンを含有するイリノテカンリポソームに関して、９４２よりも大きな安定比を有すると、冷蔵保管の間のｌｙｓｏ−ＰＣの形成が低減することを例示している。比較物であるイリノテカンリポソーム調製物に比べて、ＳＯＳ捕捉剤の量を最大で３０％減量する（すなわち、安定比を増加させる）と、９か月の冷蔵保管後に、ｌｙｓｏ−ＰＣの量は約１％とわずかに増加した。しかし、９４２より大きな安定比を有するイリノテカンリポソーム調製物において、ＳＯＳ捕捉剤の量を増加させると、４℃で９か月の冷蔵保管後に存在するｌｙｓｏ−ＰＣの量（ｍｏｌ％）は、かなりかつ予期せぬほど低下する。例えば、その後に、安定比を９４２を超えて５％刻みで増加させる（すなわち、試料２では、９９２の安定比）と、試料３と比べて、存在しているｌｙｓｏ−ＰＣの量（ｍｏｌ％）は３４％と劇的に低下し、これは、試料１２と比べて（４℃で９か月の冷蔵保管時に測定される）３３％のｌｙｓｏ−ＰＣ量（ｍｏｌ％）低下に等価である。総合的に、４℃で９か月の冷蔵保管後に、比較物試料１２と比べると、イリノテカンリポソームの安定比を９４２よりも大きく向上させることにより、約２８〜５１％のｌｙｓｏ−ＰＣ（ｍｏｌ％）の低下が達成された。一部の実施形態では、イリノテカンＳＯＳリポソーム組成物は、９４２より大きな安定比を有する。好ましい実施形態では、イリノテカンＳＯＳリポソーム調製物は、９４２〜１１３０、またはそれより大きな安定比（例えば、９９２〜１０４７の安定比）を有する。
【表２】
2018530563.tif 000008
【００９９】
表２は、冷蔵保管の間のリポソーム内ｌｙｓｏ−ＰＣの形成を低減するためには、ＳＯＳ捕捉剤およびイリノテカンを含有するイリノテカンリポソームをｐＨ６．５で安定化する際に、９４２より大きな（好ましくは、９５０より大きな、最も好ましくは９９２より大きな）安定比を有することが重要であることを例示している。全体として、４℃で６か月間の保管の間の約２８〜５１％のリポソーム内ｌｙｓｏ−ＰＣの低下は、９５０より大きな（例えば、９５０〜１０５０）安定比を有する、ｐＨ６のイリノテカンリポソーム組成物を調製することによって実現された。捕捉剤リポソームを調製する際に使用されるＳＯＳ捕捉剤の濃度を、比較物であるイリノテカンリポソーム調製物（試料３と１２を比較）を調製するために使用されるＳＯＳ捕捉剤の対応する濃度と比べて、最大で３０％低下させる（すなわち、安定比の向上）と、９か月の冷蔵保管後に、ｌｙｓｏ−ＰＣの量は約１％とわずかに増加した。しかし、９９２またはそれより大きな安定比を有するイリノテカンリポソーム調製物を形成するために、イリノテカンの搭載前に、捕捉剤リポソームを形成するために使用されるＳＯＳ捕捉剤の量を増加させると、製造後に得られるイリノテカンリポソームの最初の９か月の冷蔵保管後に、ｌｙｓｏ−ＰＣ形成は、かなりかつ予期せぬほど低下した。例えば、表２中のデータは、安定比を９４２を超えて５％向上させると、４℃で９か月の保管後に、ＬｙｓｏＰＣは３４％減少したことを示している（試料２を試料３と比較する）。安定比を９９２（試料２）から１０４７（ＳＲが６％増加）まで向上させると、４℃で９か月の保管後に生成したＬｙｓｏ−ＰＣは２６％低下し（試料６を試料２と比較する）、４℃で９か月の保管後に生成したＬｙｓｏ−ＰＣは８％増加した（試料１を試料２と比較する）。したがって、好ましいイリノテカンＳＯＳリポソーム組成物は、１０００〜１２００またはそれより大きな安定比（例えば、１０５３〜１１１の安定比）を有するイリノテカンＳＯＳリポソーム調製物を含めて、１０００より大きな安定比を有する。
【０１００】
本発明の一部の実施形態では、直径が約１００±２０ｎｍ、好ましくは１００±１０ｎｍのリポソーム中に封入されているイリノテカンＳＯＳを含有するイリノテカンリポソーム調製物の安定性は、製造後であるが保管前に、ｐＨ６．５よりも大きく、調製物のｐＨを向上させることによって、かなり向上する。リン脂質１ｍｏｌあたり４７１ｇまたは５００ｇのイリノテカン部分（上で説明した通り、無水遊離塩基に対して）の一定の薬物搭載比を維持するが、イリノテカンリポソーム組成物の最終ｐＨのｐＨを変えることにより、リポソーム調製物中のｌｙｓｏ−ＰＣの形成に及ぼすｐＨの影響を評価した。表３は、異なるｐＨ値で製剤化した、表１中の、イリノテカンリポソーム調製物中のｌｙｓｏ−ＰＣの量をまとめたものを提示している。表３Ａは、リン脂質１モルあたり合計で４７１ｇのイリノテカン部分（上で説明した通り、無水遊離塩基に対して）を用いてリポソームを搭載（０．６Ｍのスルフェート基濃度でＴＥＡ８ＳＯＳを封入）することにより形成されたイリノテカンリポソーム調製物に関して、表１からのデータを報告している（すなわち、安定比は、４７１／０．６、すなわち７８５である）。ｌｙｓｏ−ＰＣ形成の％変化は、試料４と試料９の両方に関して算出した（これらのどちらも、製造後であるが保管前に、ｐＨ６．５を有した）。表３Ｂは、リン脂質１モルあたり合計で４７１ｇのイリノテカン部分（上で説明した通り、無水遊離塩基に対して）を用いてリポソームを搭載（０．４５Ｍのスルフェート基濃度でＴＥＡ８ＳＯＳを封入）することにより形成されたイリノテカンリポソーム調製物に関して、表１からのデータを報告している（例えば、安定比は、４７１／０．４５、すなわち１０４７である）。ｌｙｓｏ−ＰＣ形成の％変化は、試料１と試料６の両方に関して算出した（これらのどちらも、製造後であるが保管前に、６．５のｐＨを有した）。
【表３Ａ】
2018530563.tif 000009
【表３Ｂ】
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【０１０１】
上記の表３Ａおよび３Ｂ中のデータでは、ｐＨを６．５から７．２５または７．５まで向上すると、７８５の安定比を有するイリノテカンＳＯＳリポソームの場合、ｌｙｓｏ−ＰＣの量が約１５〜２０％低下し（表３Ａ）、１０４７の安定比を有するイリノテカンＳＯＳリポソームでは、約２０〜７０％低下した（表３Ｂ）。これは、ホスファチジルコリンの加水分解を最小化するために最適なｐＨが６．５であるということを示す、以前の報告（Grit,  Mら、「Hydrolysis  of  partially  saturated  egg  phosphatidylcholine  in  aqueous  liposome  dispersions  and  the  effect  of  cholesterol  incorporation  on  hydrolysis  kinetics」、The  Journal  of  pharmacy  and  pharmacology（１９９３年）、４５巻、６号、４９０〜４９５頁）を鑑みると予想外のことであった。
【０１０２】
図４Ａ〜４Ｃは、表１Ａおよび１Ｂから選択される、７．２５または７．５のｐＨを有する、イリノテカンリポソーム調製物における、０、１、３、６および／または９か月後に４℃での各試料の保管後に測定された、ｌｙｓｏ−ＰＣのｍｏｌ％を示すプロットを図示している。これらのプロットは、各試料中の経時的な、ｌｙｓｏ−ＰＣの増加速度に関する、線形回帰線を含む。各図に関する、傾き、ｙ切片およびＲ２値のまとめは、以下の表４に示されている。より少ない量のｌｙｓｏ−ＰＣが、９４２より大きな（例えば、１０４７）安定比および７．２５または７．５のｐＨを有する、イリノテカンリポソーム調製物試料において観察された（例えば、図４Ａおよび４Ｃ中、ｐＨ７．２５において、試料５、７および１３と試料１０とを比較するか、またはｐＨ７．５において、図４Ｂ中の試料８と図４Ｃ中の試料１１とを比較する）。同様に、９４２より小さな安定比を有するイリノテカンリポソーム調製物では、さらに多くのｌｙｓｏ−ＰＣが９か月後に測定された（例えば、試料１０および１１では７８５であり、どちらも、６．５より大きなｐＨの場合でさえも、６か月後に２０ｍｏｌ％より多いｌｙｓｏ−ＰＣを有した）。
【表４】
2018530563.tif 000011
【表５】
2018530563.tif 000012
追加のカンプトテシン組成物
【０１０３】
カンプトテシン組成物は、カンプトテシン組成物の製造の後（例えば、カンプトテシン組成物が、医薬品投与するための滅菌容器に密封されるときに開始）の冷蔵保管（すなわち２〜８℃）期間後、少量のｌｙｓｏ−リン脂質を生成する、１つまたは複数のカンプトテシン化合物および１つまたは複数のリン脂質を含む徐放性組成物とすることができる。
【０１０４】
安定化徐放性組成物は、カンプトテシン化合物およびリン脂質、または加水分解されてｌｙｓｏ−リン脂質を形成することができる他の構成成分（単数または複数）を含むマトリックス組成物を含むことができる。このマトリックス組成物は、リン脂質（単数または複数）、ならびにコレステロールおよびＰＥＧに共有結合により連結している脂質などの他の構成成分を含むベシクル内に、１つまたは複数のカンプトテシン化合物を封入するリポソームとして構成され得る。
【０１０５】
本発明の一部の実施形態では、マトリックス組成物は、例えば、ある量の陰イオン性捕捉剤およびある量のカンプトテシン化合物、ならびにマトリックス組成物を含有する媒体中で、該マトリックス組成物中のｌｙｓｏ−リン脂質形成の量を低下させるのに有効な、特定のｐＨによりマトリックス組成物を調製することによって安定化される。
【０１０６】
本発明の一部の実施形態では、徐放性組成物は、トリエチルアンモニウムスクロソファート（ＳＯＳ）、ならびに脂質および／または生体適合性ポリマー（例えば、シクロデキストリン、ＰＧＡ（ポリグリコール酸）、および／またはＰＬＧＡ（ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸））などの生分解性ポリマー）を含む組成物と放出可能となるよう会合しているイリノテカンを含むナノ粒子である。
【０１０７】
他の例では、徐放性製剤は、トポテカン、エチリノテカンおよび／またはイリノテカンなどの放出可能となるよう会合している化合物を含むマトリックス組成物（例えば、カンプトテシンまたはカンプトテシン誘導体化合物を放出可能となるよう捕捉または保持するナノ粒子またはポリマー）である。マトリックス組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または機能的に等価な材料などの生体適合性ポリマーを含むことができる。好ましい実施形態では、生体適合性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）である。より好ましい実施形態では、生体適合性ポリマーは、メトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）である。
【０１０８】
一部の実施形態では、徐放性製剤は、シクロデキストリンまたはシクロデキストリン類似体（例えば、硫酸化シクロデキストリン）などの生体適合性ポリマーにコンジュゲートされているカンプトテシン化合物を含むことができる。例えば、徐放性製剤は、カンプトテシン化合物（例えば、イリノテカンおよび／またはＳＮ−３８）に化学的に結合されているシクロデキストリン含有ポリマーを含むことができる。シクロデキストリン−カンプトテシンコンジュゲート化合物は、薬学的に許容される用量で投与することができる。カンプトテシン−シクロデキストリンコンジュゲートの例には、シクロデキストリン含有ポリマーコンジュゲートおよび関連中間体が含まれる。
【０１０９】
本発明の一部の実施形態では、脂質および／または生体適合性ポリマーを含む徐放性組成物は、保管の間、カンプトテシン化合物（単数または複数）を保持して、次に、患者の身体内で該化合物を放出するよう製剤化されているシクロデキストリン含有組成物などの、脂質マトリックスおよび／または錯化剤（単数もしくは複数）を含む。
【０１１０】
本発明の一部の実施形態では、マトリックス組成物は、冷蔵保管の間に、ｌｙｓｏ−ＰＣの形成を低減するよう安定化されている、ホスファチジルコリン誘導体などのリン脂質を含む。
【０１１１】
好ましくは、徐放性組成物は、以下のステップ：（ａ）捕捉剤を含むマトリックス組成物を形成するステップ、ならびに（ｂ）対象への投与時に、対象の身体内でカンプトテシン化合物の所望の放出が可能となるよう、マトリックス組成物と会合している捕捉剤およびカンプトテシン化合物を含む、得られる徐放性組成物中にカンプトテシン化合物を安定して保持するのに有効な条件下で、マトリックスをカンプトテシン化合物に接触させるステップを含む多ステップ工程によって調製される。
【０１１２】
好ましい実施形態では、本発明の徐放性組成物は、４℃で６か月の冷蔵保管時に、約１ｍｇ／ｍＬ未満（または、約２０ｍｏｌ％未満）のｌｙｓｏ−ＰＣを含有する一方で、１ｍＬあたり４．３ｍｇ／ｍＬの無水イリノテカン遊離塩基によってもたらされるものに等価なイリノテカン部分の濃度で、イリノテカンまたはその塩を含有する。好ましい実施形態では、本発明の徐放性組成物は、２〜８℃、より一層好ましくは約４℃で１２か月の冷蔵保管時に、約２ｍｇ／ｍＬ未満（または、約３０ｍｏｌ％未満）のｌｙｓｏ−ＰＣを含有する一方で、１ｍＬあたり４．３ｍｇ／ｍＬの無水イリノテカン遊離塩基によってもたらされるものに等価なイリノテカン部分の濃度で、イリノテカンまたはその塩を含有する。
【０１１３】
本徐放性組成物は、リポソームを含むことができる。リポソームは、通常、水性内部を取り囲む、１つまたは複数の脂質二重層を含有するベシクルを含む。リポソーム組成物は、通常、リポソームの外部の水性流体などの、媒体中にリポソームを含む。リポソーム脂質は、水性媒体と接触すると、リン脂質、例えば、ホスファチジルコリンなどの、二重層膜を自発的に形成する両親媒性脂質構成成分を含むことができる。リポソームはまた、ステロール、例えばコレステロールなどの、膜硬化性構成成分も含むことができる。一部の場合、リポソームはまた、リポソームが凝集する傾向を低減し、有益な他の効果をやはり有することができる、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質誘導体などの、親水性ポリマーにコンジュゲートされている脂質を含む。このようなＰＥＧ−脂質の１つは、Ｎ−（メトキシ−ＰＥＧ）−オキシカルボニル−ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミンであり、この場合、ＰＥＧ部分は、約２０００の分子量を有し、すなわちＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥである。リポソームは、通常、ミクロンまたはミクロン以下の範囲のサイズを有しており、イリノテカンなどの抗がん薬を含めた、医薬品物質を輸送し、様々な有益な方法でその医薬品特性を変化させる能力があることが十分に認識されている。医薬品リポソーム組成物を調製および特徴付ける方法は、本分野において公知である（例えば、すべての目的のため、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている、Lasic  D.、Liposomes:  From  physics  to  applications、Elsevier、Amsterdam、１９９３年；G.  Gregoriadis（編）、Liposome  Technology、第３版、１〜３巻、CRC  Press、Boca  Raton、２００６年；Ｈｏｎｇら、米国特許第８，１４７，８６７号を参照されたい）。
【０１１４】
一部の実施形態では、リポソームは、本明細書における１つもしくは複数の実施例、または他の実施形態に記載されている通り調製されるが、最終的なリポソーム組成物の濃度が高められて、その結果、この製剤は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｍｇ／ｍＬの濃度のイリノテカン塩酸塩三水和物に等価なイリノテカン部分の濃度を含有している。一部の実施形態では、イリノテカン部分の濃度は、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０または４０〜５０ｍｇ／ｍＬの間のイリノテカン塩酸塩三水和物に等価である。一部の実施形態では、この項目で明記されているリポソーム組成物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第８，６５８，２０３号に記載されている通り、哺乳動物における、脳腫瘍または他の任意の状態を処置するために使用される。
【０１１５】
イリノテカンを封入するリポソームの製剤は、リポソームを含有する注射可能な製剤とすることができる（後で、患者への投与前に、薬学的に許容される希釈剤により希釈することができる注射可能な製剤を含む）。一部の実施形態では、イリノテカンまたはその塩の量は、１つまたは複数の捕捉剤を含有するリポソームに添加され、この場合、イリノテカンは、無水イリノテカン遊離塩基のグラム量にして、１ｍｏｌのリン脂質あたり、２００ｇ、３００ｇ、４００ｇ、５００ｇ、６００ｇまたは７００ｇに等価なイリノテカン部分の濃度で存在する。一部の実施形態では、イリノテカンは、薬物搭載工程の間、無水イリノテカン遊離塩基のグラム量にして、１ｍｏｌのリン脂質あたり、２００〜３００ｇ、４００〜５５０ｇ、４５０〜６００ｇまたは６００〜７００ｇに等価なイリノテカン部分の濃度で存在する。好ましくは、全イリノテカンのリポソームリン脂質１ｍｏｌあたり、４７１ｇのイリノテカン部分を含めた、リポソームリン脂質１ｍｏｌあたり、イリノテカンリポソームに搭載される約５００ｇ（±１０％）部分。本明細書における具体例は、全リポソームリン脂質１ｍｏｌあたり、４７１ｇのイリノテカン部分を含有する安定化イリノテカンリポソーム、および全リポソームリン脂質１ｍｏｌあたり５００ｇのイリノテカン部分を含有するイリノテカンリポソームの測定を含む。
【０１１６】
一部の実施形態では、リポソーム調製物中の無水イリノテカン遊離塩基によってもたらされるものに等価なイリノテカン部分の濃度は、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．３、約４．５、約５．０、約５．５または約６．０ｍｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、リポソーム調製物中の無水イリノテカン遊離塩基によってもたらされるものに等価なイリノテカン部分の濃度は、２．５〜３．５、３．５〜４．５、４．５〜５．５または５．５〜６．５ｍｇ／ｍＬである。最も好ましくは、４．５〜５．５ｍｇ／ｍＬである。好ましい実施形態では、リポソーム調製物中のイリノテカン部分の濃度は、１ｍＬあたり約４．３ｍｇ／ｍＬの無水イリノテカン遊離塩基であり、より好ましい実施形態では、１ｍＬあたり４．３ｍｇ／ｍＬの無水イリノテカン遊離塩基である。リポソーム調製物は、約１０ｍＬの体積を有するリポソーム調製物中に約４３ｍｇの無水イリノテカン遊離塩基を含有するバイアルとすることができ、この調製物は、続いて、患者への静脈内投与前に、（例えば、薬学的に許容される希釈剤５００ｍＬに）希釈することができる。
【０１１７】
したがって、本発明の一部の実施形態は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロールおよびメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）からなる、単層ラメラ脂質二重層ベシクル中にイリノテカン八硫酸スクロース（ＳＯＳ）を封入する安定化イリノテカンリポソームを含む、イリノテカンリポソーム調製物を生成する方法であって、（ａ）イリノテカンを含有する溶液を、イリノテカンを含まない、トリエチルアンモニウム（ＴＥＡ）陽イオンおよび０．４〜０．５Ｍのスルフェート濃度の（ＴＥＡ８ＳＯＳからもたらされる）八硫酸スクロース（ＳＯＳ）捕捉剤を封入する捕捉剤リポソームに、リン脂質１ｍｏｌあたり５００ｇ（±１０％）のイリノテカン部分を捕捉剤リポソームに搭載するのに有効な条件下で接触させて、イリノテカンＳＯＳリポソームを形成するステップ、ならびに（ｂ）イリノテカンＳＯＳリポソームと２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）とを一緒にして、７．２５〜７．５０のｐＨを有するイリノテカンリポソーム調製物を得て、４℃で３か月の保管の間に、１０ｍｏｌ％未満（イリノテカンリポソーム中の、ホスファチジルコリンの総量に対して）のｌｙｓｏ−ホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）を形成するほど安定化されているイリノテカンリポソーム調製物を得るステップを含む方法を提供する。
【０１１８】
保管安定化イリノテカンリポソームは、ＴＥＡ含有リポソームが形成されるステップ、その後の、ＴＥＡがリポソームを出て行くにつれて、リポソーム内にイリノテカンが搭載されるステップを含む、複数のステップで調製することができる。第１のステップは、ＴＥＡスクロソファートの溶液中で、リポソーム脂質を水和および分散することにより、ＴＥＡ−スクロソファート含有リポソームを形成するステップを含むことができる。これは、例えば、加熱エタノールにＤＳＰＣおよびコレステロールを含む脂質を溶解させ、そして溶解して加熱した脂質溶液を、リポソーム脂質の転移温度（Ｔｍ）より高い温度、例えば６０℃またはそれより高い温度でＴＥＡ−スクロソファート水溶液に分散させることにより行うことができる。この脂質分散液は、定められたポーズサイズ、例えば１００ｎｍを有する、トラックエッチングしたポリカーボネート膜を通しての押し出しによって、７５〜１２５ｎｍ（８０〜１２０ｎｍ、または一部の実施形態では、９０〜１１５ｎｍなど）の平均サイズを有するリポソームに形成することができる。ＴＥＡ−スクロソファートは、約０．４０〜０．５０Ｍのスルフェート濃度、ならびに分散および押し出しステップの間に、リポソームリン脂質の許容されない分解を防止するために選択されるｐＨ（例えば、約６．５）（例えば、これらのステップの間に、リポソームリン脂質の分解を最小化するよう選択されるｐＨ）を有することができる溶液を得るよう、スクロソファートの各モル当量に対して少なくとも８モル当量のＴＥＡを含むことができる。次に、捕捉されていないＴＥＡ−ＳＯＳは、イリノテカンの封入前に、例えば、透析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換または限外濾過によってリポソーム分散液から除去することができる。これらのリポソームは、ｍｇ／ｍＬ／月、すなわち、単位時間にわたるｌｙｓｏ−ＰＣへの％ＰＣ変換率（例えば、ｍｏｌ％  ｌｙｓｏ−ＰＣ／月）で測定される、４℃またはより一般には５±３℃で１８０日後に、ｌｙｓｏ−ＰＣ形成が所与の最大レベル未満となるレベルまで、得られるリポソーム組成物中のＴＥＡ量を低下させるほど十分にイリノテカンをリポソームに搭載することによって安定化することができる。次に、搭載工程の間に、リポソームから外部媒体に交換されたＴＥＡは、捕捉されていないイリノテカンのいずれとも一緒になって、通常、任意の好適な公知工程（単数または複数）によって（例えば、ゲルクロマトグラフィー、透析、透析濾過、イオン交換または限外濾過によって）、リポソームから除去される。リポソーム外部媒体は、所望のｐＨで緩衝化されている、注射可能な等張性流体（例えば、等張性塩化ナトリウム溶液）と交換され得る。
【０１１９】
一部の実施形態では、ＴＥＡの量が約２５ｐｐｍ未満または約２０ｐｐｍ程度に低い場合、４℃で１８０日後に、約３．９〜４．７ｍｇ／ｍＬのイリノテカンおよび２０％未満のｌｙｓｏ−ＰＣを含有するイリノテカンリポソーム組成物を得ることができる。リポソームの外側のイリノテカンリポソーム組成物のｐＨを向上すると、やはり２５ｐｐｍを超えるＴＥＡを含有するイリノテカンスクロソファートリポソームを保管安定化することができ、４℃で１８０日後に、２０％未満のさらなるｌｙｓｏ−ＰＣ形成を有するイリノテカンリポソームとなる。例えば、約４〜５ｍｇのイリノテカン／ｍＬ、および１００ｐｐｍのＴＥＡを含有し、かつリポソームの外側が約７〜８のｐＨを有するイリノテカンリポソーム組成物もまた、４℃で１８０日後に、２０％未満のｌｙｓｏ−ＰＣ形成を有し得る。別の例では、約３．９〜４．７ｍｇ／ｍＬのイリノテカンを含有し、リポソームの外側媒体のｐＨが７〜８の範囲で、約２５ｐｐｍ未満（または、好ましくは２０ｐｐｍ未満）の量の残留ＴＥＡを含むリポソーム組成物では、４℃で１８０日間にわたり、リポソーム組成物中に蓄積されるｌｙｓｏ−ＰＣの量は、１０ｍｏｌ％またはそれより少ないものとなり得る。
【０１２０】
したがって、本発明は、少なくとも９９０（例えば、９９０〜１１００または約１１１１）のＬｙｓｏ−ＰＣ安定比を有するリン脂質リポソーム中に、封入されているイリノテカンスクロソファートを含む、イリノテカンリポソーム組成物を提供する。
【０１２１】
本発明はまた、イリノテカンリポソーム組成物を提供し、該組成物は、３：２のモル比、およびベシクル中に４００〜６００ｇのイリノテカン／リン脂質１ｍｏｌとなる比で、ＤＳＰＣおよびコレステロールを含むベシクルに封入されている、無水イリノテカン遊離塩基によってもたらされるものに等価である４．３ｍｇ／ｍＬ（±１０％）の部分および０．４〜０．５Ｍ濃度のスルフェートを含む。
【０１２２】
本発明はまた、合計でイリノテカン部分約４．３ｍｇ／ｍＬを含むイリノテカンリポソーム組成物を提供し、イリノテカンの少なくとも９８％は、リポソーム組成物内に、約８：１のイリノテカン：八硫酸スクロース（ＳＯＳ）のモル比で、ＳＯＳと共に封入されており、リポソームは、７５〜１２５ｎｍの平均サイズを有する。安定化高密度イリノテカンリポソームのサイズは、好ましくは約１１０ｎｍ（±２０ｎｍ）、より好ましくは１１０ｎｍ（±１０ｎｍ）（リポソーム薬物搭載後に測定される）である。好ましくは、医薬組成物中のイリノテカンの少なくとも約９５％は、リポソーム内に封入される。リポソームは、好ましくは、３：２のモル比でＤＳＰＣおよびコレステロールを含む。
【０１２３】
本発明はまた、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロールおよびメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）からなる単層ラメラ脂質二重層ベシクル中に、イリノテカン八硫酸スクロース（ＳＯＳ）を封入する安定化イリノテカンリポソームを含む、医薬品を生成する方法であって、（ａ）捕捉剤リポソームにイリノテカン部分を搭載し、捕捉剤リポソームからトリエチルアンモニウム（ＴＥＡ）陽イオンを放出するのを可能にするのに有効な条件下で、イリノテカンを、イリノテカンを含まないＴＥＡ８ＳＯＳとしての、ＴＥＡ陽イオンおよび０．４〜０．５Ｍのスルフェート濃度のＳＯＳ捕捉剤を封入する捕捉剤リポソームに接触させて、イリノテカン八硫酸スクロース（ＳＯＳ）リポソームを形成するステップ、（ｂ）イリノテカンＳＯＳリポソームと２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）とを一緒にして、７．２５〜７．５０のｐＨを有するイリノテカンリポソーム調製物を得て、４℃で３か月の保管の間に、１０ｍｏｌ％未満（イリノテカンリポソーム中の、ホスファチジルコリンの総量に対して）のｌｙｓｏ−ホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）を形成するほど安定化されているイリノテカンリポソーム調製物を得るステップ、ならびに（ｃ）医薬品としてイリノテカンＳＯＳリポソームとＨＥＰＥＳとの組合せ物を製剤化するステップを含む方法を提供することができる。
【０１２４】
これらの方法の一部の実施形態では、イリノテカンリポソーム調製物中のイリノテカンＳＯＳリポソームは、合計で１００ｐｐｍ未満のＴＥＡを含有する。一部の実施形態では、単層ラメラ脂質二重層ベシクルは、６．８１ｍｇ／ｍＬの１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、２．２２ｍｇ／ｍＬのコレステロールおよび０．１２ｍｇ／ｍＬのメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）からなる。一部の実施形態では、イリノテカンリポソーム調製物は、合計の安定化イリノテカンリポソームリン脂質１ｍｏｌあたり、合計で５００ｇ（±１０％）のイリノテカンを含み、イリノテカンリポソーム調製物中のイリノテカンの少なくとも９８％は、イリノテカンリポソーム内に封入されている。一部の実施形態では、イリノテカンリポソーム調製物は、４．０５ｍｇ／ｍＬの２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）をさらに含む。一部の実施形態では、イリノテカンリポソーム調製物は、８．４２ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウムをさらに含む。一部の実施形態では、イリノテカンリポソーム調製物は、約４．３ｍｇ／ｍＬの無水イリノテカン遊離塩基によってもたらされるものに等価なイリノテカン部分の濃度を有する。一部の実施形態では、安定化イリノテカンリポソームは、ｘ＝８である式（Ｉ）の化合物中に、イリノテカンおよびＳＯＳを封入する。
【０１２５】
一部の実施形態では、本組成物は、２〜８℃で３か月の保管後に、２ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ＰＣを含有する。一部の実施形態では、本組成物は、２〜８℃で３か月の保管後に、５ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ＰＣを含有する。一部の実施形態では、本リポソーム組成物は、２〜８℃で６か月の保管後に、１０ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ＰＣを含有する。一部の実施形態では、本組成物は、２〜８℃で９か月の保管後に、１０ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ＰＣを含有する。一部の実施形態では、本組成物は、２〜８℃で６か月の保管後に、５ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ＰＣを含有する。一部の実施形態では、本組成物は、２〜８℃で９か月の保管後に、５ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ＰＣを含有する。一部の実施形態では、本組成物は、２〜８℃で６か月の保管後に、２ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ＰＣを含有する。一部の実施形態では、本組成物は、２〜８℃で９か月の保管後に、２ｍｏｌ％より少ないｌｙｓｏ−ＰＣを含有する。一部の実施形態では、本組成物は、２〜８℃で１２か月の保管後に、１０ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ＰＣを含有する。一部の実施形態では、本組成物は、２〜８℃で１２か月の保管後に、５ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ＰＣを含有する。一部の実施形態では、本組成物は、２〜８℃で１２か月の保管後に、２ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ＰＣを含有する。一部の実施形態では、本組成物は、２〜８℃で２４か月の保管後に、１０ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ＰＣを含有する。一部の実施形態では、本組成物は、２〜８℃で２４か月の保管後に、５ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ＰＣを含有する。一部の実施形態では、本組成物は、２〜８℃で２４か月の保管後に、２ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ＰＣを含有する。一部の実施形態では、本組成物は、１００ｐｐｍ未満の置換アンモニウムを含有する。一部の実施形態では、本組成物は、プロトン化ＴＥＡまたはＤＥＡである置換アンモニウム化合物を２０〜８０ｐｐｍの間で含有する。
【０１２６】
他の実施形態では、安定化カンプトテシン組成物は、カンプトテシン組成物を調製するための、１つまたは複数の構成成分のバイアルを含むキットとして提供される。例えば、リポソーム型イリノテカンの調製用のキットは、以下を含むことができる（個別の容器、または同一容器の個別の部分に保管される）：
・  イリノテカン溶液（例えば、注射用のイリノテカンＨＣｌ）、
・  捕捉剤を封入するリポソーム（例えば、八硫酸スクロース溶液から形成されている捕捉剤リポソーム）、ならびに
・  イリノテカン溶液および捕捉剤リポソームを一緒にして、リポソーム型イリノテカンリポソーム中に封入されている治療有効量のイリノテカン（例えば、捕捉剤リポソーム中の全リン脂質１ｍｏｌあたり５００ｇ（±１０％）のイリノテカン、およびリポソーム型イリノテカン組成物１ｍＬあたり、４．３ｍｇの全イリノテカン）を含むリポソーム型イリノテカン組成物を形成するための指示書。
カンプトテシン組成物の治療的使用
【０１２７】
本発明の、本明細書に開示されているイリノテカンリポソーム、ならびに他の組成物および調製物を含む、カンプトテシン組成物は、治療、および処置の方法、ならびにまたはがんなどの疾患の処置のための医薬の調製に使用することができる。一部の実施形態では、治療は、がんを処置するためのカンプトテシン（camptothecini）組成物の投与を含む。例えば、がんは、基底細胞がん、髄芽腫がん、肝臓がん、横紋筋肉腫、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮下もしくは眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性もしくは急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓もしくは尿管がん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系の新生物、原発性中枢神経系リンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマおよび下垂体腺種、またはこれらのがんの１つもしくは複数の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、がんは、例えば、疾患進行がゲムシタビンをベースとする治療の後に起こった、膵臓がん、任意選択で膵臓の転移性腺癌などの膵臓の腺癌である。一部の実施形態では、がんは卵巣がんである。一部の実施形態では、がんは小細胞肺がんである。一部の実施形態では、がんは胆管がんである。
【０１２８】
治療として使用する場合、本リポソーム組成物は、１つまたは複数の他の化合物または組成物を含む処置レジメンで使用されてもよい。１つまたは複数の他の化合物または組成物を含むリポソーム組成物の投与は、同時に、個別にまたは逐次とすることができる。１つまたは複数の他の化合物または組成物は、さらなる治療剤、例えば、さらなる抗がん剤であってもよく、治療剤の負の副作用を改善するよう設計されている化合物であってもよい。一部の実施形態では、本リポソーム組成物は、ロイコボリンと一緒に投与される。一部の実施形態では、本リポソーム組成物は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）と一緒に投与される。一部の実施形態では、本リポソーム組成物は、ロイコボリンおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）と一緒に投与される。この三成分レジメン（ｔｈｒｅｅ-ｗａｙ  ｒｅｇｉｍｅｎ）は、前の段落において議論されている通り、膵臓がんを処置するために使用することができる。５−ＦＵは、２４００ｍｇ／ｍ２の用量で投与することができ、ロイコボリンは、２００ｍｇ／ｍ２（ｌ体）または４００ｍｇ／ｍ２（ｌ＋ｄラセミ体）の用量で投与することができる。一部の実施形態では、本組成物はまた、ゲムシタビンとの処置レジメンで投与される。
【０１２９】
リポソーム組成物が卵巣がんを処置するために使用される一部の実施形態では、本リポソーム組成物は、ＰＡＲＰ（ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ）阻害剤と一緒に投与される。
【０１３０】
一部の実施形態では、徐放性マトリックスは、捕捉剤を保持するよう構成されている、ナノ粒子（例えば、シリカもしくはポリマー）またはポリマー凝集体（例えば、ＰＥＧポリマー）とすることができる。薬物搭載の間に、マトリックスは、カンプトテシン化合物と捕捉剤の両方を維持して、安定した徐放性製剤を形成するのに有効な条件下で、カンプトテシン化合物に接触させることができる。
【０１３１】
一部の実施形態では、安定化カンプトテシン組成物は、対流強化送達治療の間に患者へ実質内投与するために製剤化されたイリノテカンＳＯＳリポソーム調製物である。最終リポソーム調製物中の無水イリノテカン遊離塩基によってもたらされるものに等価なイリノテカン部分の濃度は、約１７、約２０、約２５、約３０、約３５または約４０ｍｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、最終リポソーム調製物中の無水イリノテカン遊離塩基によってもたらされるものに等価なイリノテカン部分の濃度は、１７〜２０、１７〜２５、１７〜３０、１７〜３５または１７〜４０ｍｇ／ｍＬである。最も好ましくは、イリノテカンリポソーム調製物中の無水イリノテカン遊離塩基によってもたらされるものに等価なイリノテカン部分（例えば、イリノテカン八硫酸スクロースとして）の合計濃度の合計は、１７ｍｇ／ｍＬまたは３５ｍｇ／ｍＬである。リポソーム調製物は、患者に局所投与するため（例えば、対流強化送達治療の一部として脳内の場所への、グリオーマと診断された患者の脳）に、約１７ｍｇ／ｍＬもしくは約３５ｍｇ／ｍＬまたは１７〜３５ｍｇ／ｍｌの無水イリノテカン遊離塩基によってもたらされるものに等価なイリノテカン部分の濃度で、リポソーム調製物中にイリノテカン八硫酸スクロースリポソームを入れる滅菌容器中に存在することができる。イリノテカンリポソームの１７〜３５ｍｇ／ｍＬの濃度は、イリノテカンリポソーム調製物１ｍＬあたり、２０〜４０ｍｇのイリノテカン塩酸塩三水和物中に存在している、無水イリノテカン遊離塩基の量として、等価に表すことができる。例えば、リポソーム型イリノテカン調製物は、全量で、１７ｍｇ、２６ｍｇ、５２ｍｇまたは７０ｍｇの全無水イリノテカン遊離塩基によってもたらされるものに等価なイリノテカン部分をもたらす用量で、患者の脳に投与（例えば、腫瘍内の場所に外科手術により留置される１つまたは複数のカテーテルにより）することができる。患者の脳内の腫瘍内の場所に送達されるイリノテカンリポソーム調製物のイリノテカンの全体積は、約２〜４時間（例えば、２〜３時間、３〜４時間または２〜４時間）の期間にわたり、約１〜２ｍＬ（例えば、１．０、１．５または２．０ｍＬ）とすることができる。
【０１３２】
イリノテカンリポソームは、３：２のモル比で、ＤＳＰＣを含む脂質およびコレステロールから形成されるベシクル内に封入されているイリノテカンスクロソファートを好ましくは含有する。このベシクルはまた、ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥなどのポリエチレン−グリコール（ＰＥＧ）により誘導されているリン脂質を含有することもできる。ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥの量は、リポソーム脂質の１ｍｏｌ％未満（例えば、３：２：０．０１５のモル比のＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥからなるベシクル中に、約０．３ｍｏｌ．％）とすることができる。ＰＥＧは、イリノテカンを取り囲むリポソーム脂質ベシクルの内側および外側の両方に分布され得る。封入されているイリノテカンは、好ましくは、イリノテカンスクロソファート（ＣＡＳレジストリー番号１３６１３１７−８３−０）などの、スクロースの硫酸エステル（スクロソファート）との塩の形態にある。好ましくは、イリノテカンリポソーム組成物中のイリノテカンのうちの、少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも約９８％が、リポソームベシクル内に封入されており、イリノテカン部分の濃度は、イリノテカンリポソーム組成物１ｍＬあたり、合計で約３．８７〜４．７３ｍｇのイリノテカン（無水遊離塩基）である。イリノテカンリポソーム組成物のｐＨは、リポソームの外側では、好ましくは約６．５〜８．０であるか、または約６．６〜８．０、６．７〜８．０、６．８〜８．０、６．９〜８．０もしくは７．０〜８．０、好ましくは、約７．２〜７．６である。一部の実施形態では、ｐＨは、約７．２〜７．５である。一部の実施形態では、ｐＨは、約７．２５である。他の実施形態では、ｐＨは、約７．２５〜７．５である。他の実施形態では、ｐＨは、約７．４〜７．５である。
組合せ実施形態
【０１３３】
本明細書において番号が付与されている実施形態に由来する特色は、組成物を言及している実施形態と調製物を言及している実施形態の両方を含めた、本明細書で開示されている他の実施形態からの特色と組み合わせることができる。
【０１３４】
上で説明した方法は、本明細書のどこかで説明されている組成物および調製物の生成に関するので、このような組成物および調製物の実施形態と共通する特色を共有する。組成物および調製物に関して開示されている特色はまた、前の段落に開示されている方法と組み合わされてもよい。したがって、上述の小項目、および以下の番号付けされた実施形態の項目中などの本明細書のどこかにある特色は、この小項目の段落中の方法に開示されている特色と組み合わせることができる。
【０１３５】
例えば、以下は、本明細書に開示されているおよび／または例示されている実施形態の様々な組合せの例である：
・  ４℃で１８０日間の保管後に、約３．９〜４．７ｍｇ／ｍｌのイリノテカン部分および２０％未満のｌｙｓｏ−ＰＣを含有する、イリノテカンリポソーム組成物。
・  少なくとも９９０（例えば、９９０〜１１００または約１１１１）のｌｙｓｏ−ＰＣ安定比を有するリン脂質リポソーム中に封入されているイリノテカンスクロソファートを含む、イリノテカンリポソーム組成物。
・  イリノテカンリポソーム組成物であって、３：２のモル比のＤＳＰＣおよびコレステロールを含むベシクル中に封入されており、該ベシクル中に４５０〜５５０ｇのイリノテカン／全リン脂質１ｍｏｌとなる比で、４．３ｍｇ／ｍＬ（±１０％）のイリノテカン部分および０．４〜０．５Ｍ濃度のスルフェートを含むイリノテカンリポソーム組成物。
・  合計でイリノテカン部分約４．３ｍｇ／ｍＬを含むイリノテカンリポソーム組成物であって、イリノテカンの少なくとも９８％が、リポソーム組成物内に、約８：１のイリノテカン：八硫酸スクロース（ＳＯＳ）のモル比で、ＳＯＳと共に封入されており、リポソームが、７５〜１２５ｎｍの平均サイズを有する、イリノテカンリポソーム組成物。
・  イリノテカンリポソームが、イリノテカンをリン脂質リポソーム内に封入されているトリエチルアンモニウム（ＴＥＡ）スクロソファートに接触させるステップを含む工程により得られる、前述のいずれかの実施形態の組成物。
・  ＴＥＡ−ＳＯＳの濃度が、約０．４０〜０．５０Ｍである、前述の実施形態の組成物。
・  リポソームのサイズが、約１１０ｎｍ（±１０％）である、前述の実施形態のいずれかの組成物。
・  約４３３ｇのイリノテカン部分／リン脂質１ｍｏｌを含む、前述の実施形態のいずれかの組成物。
・  イリノテカンリポソーム組成物が、約１００ｐｐｍ未満のトリエチルアミンを含有する、前述の実施形態のいずれかの組成物。
・  イリノテカンリポソーム組成物が、液体中のリポソームの溶液であり、イリノテカンリポソームの外側の液体が、約７．０〜８．０、例えば７．２５などの７．２５〜７．５のｐＨを有しており、任意選択で、イリノテカンリポソームの外側の液体が、薬学的に許容される注射可能な流体である、前述の実施形態のいずれかの組成物。
・  ４．５〜５．５ｍｇ／ｍＬのイリノテカン塩酸塩三水和物によってもたらされるものに等価な量のイリノテカン部分を含む、前述のいずれかの実施形態の組成物。
・  イリノテカンリポソーム組成物中のイリノテカンのうちの少なくとも約９５％が、リポソーム内に封入されている、前述のいずれかの実施形態の組成物。
・  リポソームが、３：２：０．０１５のモル比で、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥを含むなどの、３：２のモル比でＤＳＰＣおよびコレステロールを含む、前述の実施形態のいずれかの組成物。
・  ９９０〜１２００の安定比を有する、前述の実施形態のいずれかの組成物。
・  少なくとも０．９、少なくとも０．９５、少なくとも０．９８、少なくとも０．９９または実質的に１．０の、リポソームに封入されているイリノテカン／スクロソファートのグラム当量比を有する、前述の実施形態のいずれかの組成物。
・  リポソームリン脂質が、約４℃で１８０日間の保管後に、２０ｍｏｌ％以下のｌｙｓｏ−ＰＣを含有する、前述の実施形態のいずれかの組成物。
・  イリノテカンリポソーム組成物が、イリノテカンリポソームの外側に約７．０〜８．０のｐＨを有する薬学的に許容される注射可能な流体をさらに含んでおり、遊離塩基として算出すると４．３ｍｇ／ｍＬのイリノテカンを含み、かつイリノテカンを、約０．４０〜０．５０Ｎとなる封入されているトリエチルアンモニウム（ＴＥＡ）スクロソファートの濃度を任意選択で有するリン脂質リポソーム内に封入されているＴＥＡスクロソファートに接触させるステップを含む工程によって任意選択で得られる、前述の実施形態のいずれかの組成物。
・  上記組成物が、約４３３ｇのイリノテカン部分／リン脂質１ｍｏｌを含み、かつリン脂質リポソーム内に封入されているトリエチルアンモニウムを約１００ｐｐｍ以下含む、前述のいずれかの実施形態の組成物。
・  少なくとも０．９の、封入されているイリノテカン／スクロソファートのグラム当量比を有する、前述のいずれかの実施形態の組成物。
・  封入されているイリノテカンスクロソファートのうちの、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％（言い換えると、実質的にすべて）などの少なくとも９０％が、スクロソファート１分子あたり８分子のイリノテカンを含む化学量論塩の沈殿形態またはゲル形態にある、前述のいずれかの実施形態の組成物。
・  封入されているイリノテカンスクロソファートのうちの、少なくとも９９％などの少なくとも９８％が、スクロソファート１分子あたり８分子のイリノテカンを含む化学量論塩の沈殿形態またはゲル形態にある、前述のいずれかの実施形態の組成物。
・  約１００ｐｐｍ以下のトリエチルアンモニウム（ＴＥＡ）を有する、前述の実施形態のいずれかのイリノテカンリポソーム組成物。
・  約２０ｐｐｍ以下のトリエチルアンモニウム（ＴＥＡ）を有する、前述の実施形態のいずれかのイリノテカンリポソーム組成物。
・  約１０ｍＬの全体積を有する、前述の実施形態のいずれかのイリノテカンリポソーム組成物。
・  ６．８１ｍｇ／ｍＬの１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、２．２２ｍｇ／ｍＬのコレステロールおよび０．１２ｍｇ／ｍＬのメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）を含む、前述の実施形態のいずれかのイリノテカンリポソーム組成物。
・  イリノテカンリポソームの内側および外側の両方に、ポリエチレングリコールを含む、前述の実施形態のいずれかのイリノテカンリポソーム組成物。
・  患者の身体の表面積１ｍ２あたり、７０ｍｇのイリノテカンを送達するのに十分な、イリノテカンの用量を含む、患者に投与するために製剤化された、安定化されている注射可能な単位用量のイリノテカンリポソーム組成物であって、
ｏ  イリノテカンのうちの少なくとも９９％が、リン脂質およびコレステロールを含むベシクル中に封入されており、最大２０ｍｏｌ．％のリン脂質が、ｌｙｓｏ−ＰＣであり、残りはＤＳＰＣであり、ベシクルが、７．０〜８．０の範囲のｐＨを有する注射可能な流体にあるか、または
ｏ  注射可能な単位用量のリポソーム組成物が、上の実施形態のいずれか１つのリポソーム組成物の単位用量である、
安定化されている注射可能な単位用量のイリノテカンリポソーム組成物。
・  注射可能なイリノテカンリポソーム単位剤形であって、
ｏ  単位剤形中のイリノテカンうちの少なくとも約９８％がリン脂質を含むリポソーム中に封入されており、前記リン脂質が、約２０ｍｏｌ．％以下のｌｙｓｏ−ＰＣを含有する、イリノテカン、および
ｏ  上の実施形態のいずれか１つによるリポソーム組成物
を含む、注射可能なイリノテカンリポソーム単位剤形。
・  イリノテカンが、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロールおよびメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）から実質的になる脂質膜により取り囲まれているベシクル中に封入されている、上の実施形態に開示されている単位剤形。
・  上記単位剤形が、少なくとも約６．８１ｍｇ／ｍＬの１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、約２．２２ｍｇ／ｍＬのコレステロールおよび約０．１２ｍｇ／ｍＬのメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）Ｌを含む、実施形態２９または３０の単位剤形。
・  上記単位剤形が、バッファとして、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、および等張試薬として塩化ナトリウムをさらに含む、実施形態２９〜３１のいずれかの単位剤形。
・  治療に使用するための、実施形態１〜２７のいずれか１つによるリポソーム組成物、または実施形態２９〜３２のいずれか１つによる単位用量。
・  がんの処置に使用するための、本明細書の実施形態に開示されているリポソーム組成物または単位用量。
・  がんが、基底細胞がん、髄芽腫がん、肝臓がん、横紋筋肉腫、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮下もしくは眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性もしくは急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓もしくは尿管がん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系の新生物、原発性中枢神経系リンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマおよび下垂体腺種、またはこれらのがんの１つもしくは複数の組合せからなる群から選択される、本明細書の実施形態に開示されている使用のための、リポソーム組成物または単位用量。
・  がんが、例えば、疾患進行が、ゲムシタビンをベースとする治療の後に起こった、膵臓がん、任意選択で膵臓の転移性腺癌などの膵臓の腺癌である、上の実施形態のいずれかによるリポソーム組成物または単位用量。
・  がんが結腸がんである、上の実施形態のいずれかによるリポソーム組成物または単位用量。
・  リポソーム組成物または単位用量が、ロイコボリンおよび／または５−フルオロウラシル（flurouracil）と一緒に使用するためのものであり、任意選択で、リポソーム組成物もしくは単位用量、ロイコボリンおよび／または５−フルオロウラシルの投与が、同時に、個別にまたは逐次である、上の実施形態のいずれかによる、リポソーム組成物または単位用量。
・  リポソームが、８０ｍｇ／ｍ２のイリノテカン塩酸塩三水和物に等価なイリノテカンの量をもたらす用量で投与される、上の実施形態のいずれか１つによる、リポソーム組成物または単位用量。
・  それを必要としている患者における、ゲムシタビンをベースとする治療後の疾患進行後に、膵臓の転移性腺癌を処置する方法であって、患者に、８０ｍｇ／ｍ２のイリノテカン塩酸塩三水和物に等価なイリノテカンの量をもたらす量で、約２０％未満のｌｙｓｏ−ＰＣを含有するリン脂質を含むリポソーム中に封入されている単位剤形中に少なくとも約９８％のイリノテカンを含む、本明細書の実施形態のいずれかの注射可能なイリノテカンリポソーム単位剤形または上の実施形態のいずれかによる単位用量を静脈投与するステップを含む、方法。
・  ７．００〜７．５０のｐＨを有しており、かつ無水イリノテカン遊離塩基のグラム量にして、全リポソームリン脂質１ｍｍｏｌあたり５００ｍｇのイリノテカンおよびリポソーム型イリノテカン組成物１ｍＬあたり４．３ｍｇのイリノテカンに等価なイリノテカン部分の濃度で、コレステロールおよびリン脂質１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）およびメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）からなる単層ラメラ二重層ベシクル中にイリノテカン八硫酸スクロースを封入するイリノテカンリポソームの分散液を含む、保管安定化リポソーム型イリノテカン組成物であって、４℃で６か月の保管の間に、１ｍｇ／ｍＬ未満のＬｙｓｏ−ＰＣを形成するほど安定化されている、保管安定化リポソーム型イリノテカン組成物。
・（ａ）０．４〜０．５Ｍのスルフェート濃度、および５〜７の間のｐＨを有するＤＥＡ８ＳＯＳから作製される溶液中で、脂質分散液を形成するステップであって、前記分散液中の脂質が、それぞれ約３：２：０．０１５のモル比のＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥである、ステップ、
（ｂ）脂質分散液を、少なくとも１つの０．１μｍの膜を通して６０〜７０℃の間で押し出して、リポソームを形成するステップ、
（ｃ）リポソームの外側にあるＤＥＡ８ＳＯＳおよび／またはＤＥＡ８ＳＯＳに由来するイオンを実質的に除去するステップ、
（ｄ）リポソームを６０〜７０℃の間の温度でイリノテカン遊離塩基またはイリノテカン塩を使用して作製される溶液に接触させて、これにより、イリノテカンを封入するリポソームの調製物を形成するステップ、
（ｅ）リポソームの外側にあるＴＥＡ８ＳＯＳおよび／またはＤＥＡ８ＳＯＳならびにイリノテカン成分に由来する物質を実質的に除去するステップ、ならびに
（ｆ）組成物のｐＨが７．０〜７．５になるように調整するステップ
を含む工程により作製される、上の実施形態のリポソーム型イリノテカン組成物。
・  脂質分散液が、少なくとも２つの積層されている０．１μｍのポリカーボネート膜を通して押し出される、上の実施形態のいずれかのリポソーム型イリノテカン組成物。
・  リポソームが、動的光散乱法により決定すると、１１０ｎｍの平均サイズを有し、このサイズが、キュムラント法により決定される、上の実施形態のいずれかのリポソーム型イリノテカン組成物。
・  ４．３ｍｇ／ｍｌの無水イリノテカン遊離塩基に等価なイリノテカン部分総含量を有する、上の実施形態のいずれかのリポソーム型イリノテカン組成物。
・  ステップ（ａ）において、リポソームが、０．４３〜０．４７Ｍの間のスルフェート濃度を有するＤＥＡ８ＳＯＳから形成され、
ステップ（ｄ）において、イリノテカン遊離塩基またはイリノテカン塩を使用して作製される溶液が、ＤＳＰＣ  １モルあたり、５００ｇ（±１０％）の無水イリノテカン遊離塩基に等価なイリノテカン部分の含量を有しており、
ステップ（ｆ）において、組成物のｐＨが７．２〜７．３になるように調整する、
上の実施形態のいずれかのリポソーム型イリノテカン組成物。
・  約４℃で保管する前には、１ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）を含有し、約４℃で１８０日の保管後には、２０ｍｏｌ％またはそれより少ない（全リポソームリン脂質に対して）ｌｙｓｏ−ＰＣを含有する、これまでの実施形態のいずれか１つのリポソーム組成物。
・  約４℃で６、９または１２か月の保管後に、２０ｍｏｌ％またはそれより少ない（全リポソームリン脂質に対して）ｌｙｓｏ−ホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）を含有する、上の実施形態のいずれかのリポソーム組成物。
・  合計で、６．１〜７．５ｍｇのＤＳＰＣ／ｍｌ、２〜２．４ｍｇのコレステロール／ｍｌおよび０．１１〜０．１３ｍｇのＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ／ｍｌをすべて水性等張緩衝液中に含む、上の実施形態のいずれかのリポソーム型イリノテカン組成物。
・  リポソーム型イリノテカンが、等張性のＨＥＰＥＳ水性緩衝液中、２〜２０ｍＭの間の濃度でイリノテカンリポソームを含む、上の実施形態のいずれかのリポソーム型イリノテカン組成物。
・  １３０〜１６０ｍＭの濃度で、塩化ナトリウムをさらに含む、上の実施形態のいずれかのリポソーム型イリノテカン組成物。
・  リポソーム中に封入されているイリノテカンが、八硫酸スクロースの塩として、ゲル状態または沈殿状態にある、上の実施形態のいずれかのリポソーム型イリノテカン組成物。
・  準弾性光散乱法によって測定すると、イリノテカンリポソームが９５〜１１５ｎｍの直径を有する、上の実施形態のいずれかのリポソーム型イリノテカン組成物。
・  合計で、６．８１ｍｇのＤＳＰＣ／ｍｌ、２．２２ｍｇのコレステロール／ｍｌおよび０．１２ｍｇのＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ／ｍｌ、４．０５ｍｇ／ｍＬのＨＥＰＥＳ水性緩衝液および８．４２ｍｇの塩化ナトリウム／ｍＬを含む、上の実施形態のいずれかのリポソーム型イリノテカン組成物。
・  準弾性光散乱法によって測定すると、イリノテカンリポソームが１１０ｎｍの直径を有する、７．２５のｐＨを有する、上の実施形態のいずれかのリポソーム型イリノテカン組成物。
・  約４℃で６か月の保管後に、１ｍｇ／ｍＬ未満のｌｙｓｏ−ホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）を形成する、上の実施形態のいずれかのリポソーム型イリノテカン組成物。
・  以下のステップ：
（ａ）約０．４５Ｍのスルフェート濃度、および約６．５のｐＨを有する、ＤＥＡ８ＳＯＳの溶液中で脂質分散液を形成するステップであって、前記分散液中の脂質が、それぞれ、３：２：０．０１５のモル比で、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロールおよびメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）からなる、ステップ、
（ｂ）脂質分散液を、少なくとも１つの０．１μｍの膜を通して６０〜７０℃の間で押し出して、リポソームを形成するステップ、
（ｃ）リポソームの外側にあるＤＥＡ８ＳＯＳに由来するイオンを除去するステップ、
（ｄ）リポソームを６０〜７０℃の間の温度でイリノテカン塩酸塩三水和物を使用して作製した溶液に接触させて、全リポソームリン脂質１ｍｏｌあたり、約５００ｇ（±１０％）のイリノテカンを封入するリポソームの調製物を形成するステップ、
（ｅ）リポソームの外側にあるＴＥＡ８ＳＯＳおよびイリノテカン成分に由来する物質を除去するステップ、ならびに
（ｆ）組成物のｐＨが約７．３になるように調整するステップ
を含む工程により作製される、上の実施形態のいずれかのリポソーム型イリノテカン組成物。
・  合計で１００ｐｐｍ未満のＤＥＡを含む、上の実施形態のいずれかのリポソーム型イリノテカン組成物。
・  合計で１００ｐｐｍ未満のＤＥＡを含む、上の実施形態のいずれかのリポソーム型イリノテカン組成物。
・  約４℃で６か月の保管後に、イリノテカンのうちの少なくとも９８％が、イリノテカンリポソーム中に封入されている、上の実施形態のいずれかのリポソーム型イリノテカン組成物。
・  １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロールおよびメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）からなる、直径がおよそ１１０ｎｍの単層ラメラ脂質二重層ベシクル中にイリノテカン八硫酸スクロース（ＳＯＳ）を封入する安定化イリノテカンリポソームを含む、イリノテカンリポソーム調製物であって、安定化イリノテカンリポソームが、
（ａ）捕捉剤リポソームに全リポソームリン脂質１ｍｏｌあたり５００ｇ（±１０％）のイリノテカン部分を搭載し、捕捉剤リポソームからジエチルアンモニウム（ＤＥＡ）陽イオンを放出するのを可能にするのに有効な条件下で、イリノテカンを、イリノテカンを含まないＴＥＡ８ＳＯＳとしての、ＤＥＡ陽イオンおよび０．４〜０．５Ｍの濃度（スルフェート基濃度に対して）のＳＯＳ捕捉剤を封入する捕捉剤リポソームに接触さして、イリノテカン八硫酸スクロース（ＳＯＳ）リポソームを形成するステップ、ならびに
（ｂ）イリノテカンＳＯＳリポソームと２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）とを一緒にして、７．２５〜７．５０のｐＨを有するイリノテカンリポソーム調製物を得て、４℃で３か月の保管の間に、１０ｍｏｌ％未満（イリノテカンリポソーム中の、ホスファチジルコリンの総量に対して）のｌｙｓｏ−ホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）を形成するほど安定化されているイリノテカンリポソーム調製物を得るステップ
を含む工程により得られる、イリノテカンリポソーム調製物。
・  イリノテカンリポソーム調製物中のイリノテカンＳＯＳリポソームが、合計で１００ｐｐｍ未満のＴＥＡを含有する、上の実施形態のいずれかのイリノテカンリポソーム調製物。
・  単層ラメラ脂質二重層ベシクルが、６．８１ｍｇ／ｍＬの１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、２．２２ｍｇ／ｍＬのコレステロールおよび０．１２ｍｇ／ｍＬのメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）からなる、上の実施形態のいずれかのイリノテカンリポソーム調製物。
・  すべての安定化イリノテカンリポソームのリン脂質１ｍｏｌあたり、合計で５００ｍｇのイリノテカンを含み、イリノテカンリポソーム調製物中のイリノテカンの少なくとも９８％が、イリノテカンリポソーム内に封入されている、上の実施形態のいずれかのイリノテカンリポソーム調製物。
・  上記イリノテカンリポソーム調製物が、約７．２５〜７．５０のｐＨで、約４．０５ｍｇ／ｍＬの２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）をさらに含む、上の実施形態のいずれかのイリノテカンリポソーム調製物。
・  上記イリノテカンリポソーム調製物が、約８．４２ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウムをさらに含む、上の実施形態のいずれかのイリノテカンリポソーム調製物。
・  イリノテカンリポソーム調製物１ｍＬあたり、合計で約４．３ｍｇのイリノテカンを有する、上の実施形態のいずれかのイリノテカンリポソーム調製物。
・  イリノテカンリポソームが、イリノテカンをリン脂質リポソーム内に封入されているアンモニウムに接触させるステップを含む工程により得られる、前述のいずれかの実施形態の組成物。
・  １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロールおよびメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）からなる、直径がおよそ１１０ｎｍの単層ラメラ脂質二重層ベシクル中にイリノテカン八硫酸スクロース（ＳＯＳ）を封入する安定化イリノテカンリポソームを含む、イリノテカンリポソーム調製物であって、安定化イリノテカンリポソームが、
（ａ）捕捉剤リポソームに全リポソームリン脂質１ｍｏｌあたり５００ｇ（±１０％）のイリノテカン部分を搭載し、捕捉剤リポソームからアンモニウム陽イオンを放出するのを可能にするのに有効な条件下で、イリノテカンを、アンモニウム陽イオンおよびＳＯＳ捕捉剤を封入する捕捉剤リポソームに接触させて、イリノテカン八硫酸スクロース（ＳＯＳ）リポソームを形成するステップ、ならびに
（ｂ）イリノテカンＳＯＳリポソームと２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）とを一緒にして、７．２５〜７．５０のｐＨを有するイリノテカンリポソーム調製物を得て、４℃で３か月の保管の間に、１０ｍｏｌ％未満（イリノテカンリポソーム中の、ホスファチジルコリンの総量に対して）のｌｙｓｏ−ホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）を形成するほど安定化されているイリノテカンリポソーム調製物を得るステップ
を含む工程により得られる、イリノテカンリポソーム調製物。
・  ４℃で３か月の保管の間に、１０ｍｏｌ％未満（リポソーム中のホスファチジルコリンの総量に対して）のｌｙｓｏ−ホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）を形成するほど安定化されている、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロールおよびメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）を含むリポソーム中に、イリノテカンおよび／またはＳＮ−３８を含む安定化リポソームを含む、ＳＮ３８リポソーム調製物。
・  ｘが８である式（Ｉ）の化合物において、安定化イリノテカンリポソームが、３０〜１００ｐｐｍのＴＥＡまたはＤＥＡ、イリノテカンおよびＳＯＳを封入する、上の実施形態のいずれかのイリノテカンリポソーム調製物。
【化４】
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【０１３６】
一実施形態では、本明細書に開示されているイリノテカンリポソーム組成物は、少なくとも９９０（例えば、９９０〜１１００または約１１１１）のＬｙｓｏ−ＰＣ安定比を有するリン脂質リポソーム中に封入されているイリノテカンスクロソファートを含む安定化イリノテカンリポソーム組成物であり、該リポソーム組成物は、以下の特色のうちの少なくとも１つを含む：
（ｉ）リポソームのサイズは、約１１０ｎｍ（±１０％）である、
（ｉｉ）この組成物は、約４３３ｇまたは少なくとも約４３３ｇのイリノテカン部分／リン脂質１ｍｏｌを含む、
（ｉｉｉ）この組成物は、約１００ｐｐｍ未満のトリエチルアミンを含有する、
（ｉｖ）この組成物は、イリノテカンリポソームの外側に約７．２５のｐＨを有する薬学的に許容される注射可能な流体を含む、
（ｖ）リポソームは、３：２のモル比でＤＳＰＣおよびコレステロールを含む、
（ｖｉ）この組成物は、少なくとも０．９、少なくとも０．９５、少なくとも０．９８、または実質的に１．０の、リポソームにより封入されているイリノテカン／スクロソファートのグラム当量比を有する、ならびに
（ｖｉｉ）封入されているイリノテカンスクロソファートのうちの、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％（言い換えると、実質的にすべて）などの少なくとも９０％が、スクロソファート１分子あたり８分子のイリノテカンを含む、化学量論塩の沈殿形態またはゲル形態にある。
【０１３７】
一実施形態では、本明細書に開示されているイリノテカンリポソーム組成物は、少なくとも９９０（例えば、９９０〜１１００または約１１１１）のＬｙｓｏ−ＰＣ安定比を有するリン脂質リポソーム中に封入されているイリノテカンスクロソファートを含む安定化イリノテカンリポソーム組成物であり：
（ｉ）リポソームのサイズは、約１１０ｎｍ（±１０％）であり、
（ｉｉ）この組成物は、約４３３ｇまたは少なくとも約４３３ｇのイリノテカン部分／リン脂質１ｍｏｌを含み、
（ｉｉｉ）この組成物は、約１００ｐｐｍ未満のトリエチルアミンを含有し、
（ｉｖ）この組成物は、イリノテカンリポソームの外側に約７．２５のｐＨを有する薬学的に許容される注射可能な流体を含み、
（ｖ）リポソームは、３：２のモル比でＤＳＰＣおよびコレステロールを含み、
（ｖｉ）この組成物は、少なくとも０．９、少なくとも０．９５、少なくとも０．９８、または実質的に１．０の、リポソームにより封入されているイリノテカン／スクロソファートのグラム当量比を有し、
（ｖｉｉ）封入されているイリノテカンスクロソファートのうちの、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％（言い換えると、実質的にすべて）などの少なくとも９０％が、スクロソファート１分子あたり８分子のイリノテカンを含む、化学量論塩の沈殿形態またはゲル形態にある。
【０１３８】
実施形態１：７．００〜７．５０のｐＨを有しており、かつ無水イリノテカン遊離塩基のグラム量にして、全リポソームリン脂質１ｍｍｏｌあたり５００ｍｇ（±１０％）のイリノテカン部分およびリポソーム型イリノテカン組成物１ｍＬあたり４．３ｍｇのイリノテカン部分に等価なイリノテカン部分の濃度で、コレステロールおよびリン脂質１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）およびメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）からなるベシクル中にイリノテカン八硫酸スクロースを封入するイリノテカンリポソームの分散液を含む、保管安定化リポソーム型イリノテカン組成物であって、前記保管安定化リポソーム型イリノテカン組成物は、４℃での最初の６か月の保管の間に、２０ｍｏｌ％未満のＬｙｓｏ−ＰＣを形成するほど安定化されている、保管安定化リポソーム型イリノテカン組成物。
【０１３９】
実施形態２：７．００〜７．５０のｐＨを有しており、かつ無水イリノテカン遊離塩基のグラム量にして、全リポソームリン脂質１ｍｍｏｌあたり５００ｍｇ（±１０％）のイリノテカン部分およびリポソーム型イリノテカン組成物１ｍＬあたり４．３ｍｇのイリノテカン部分に等価なイリノテカン部分の濃度で、コレステロールおよびリン脂質１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）およびメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）からなる単層ラメラ二重層ベシクル中にイリノテカン八硫酸スクロースを封入するイリノテカンリポソームの分散液を含む、保管安定化リポソーム型イリノテカン組成物であって、前記保管安定化リポソーム型イリノテカン組成物は、０．８５〜１．２のイリノテカン／スルフェート化合物のグラム当量比を有する、保管安定化リポソーム型イリノテカン組成物。
【０１４０】
実施形態３：４℃での最初の６か月の保管の間に、２０ｍｏｌ％未満のＬｙｓｏ−ＰＣを形成するほど安定化されている、保管安定化リポソーム型イリノテカン組成物であって、前記保管安定化リポソーム型イリノテカン組成物は、以下のステップ：
（ａ）０．４〜０．５Ｍのスルフェート濃度および５〜７の間のｐＨを有するＴＥＡ８ＳＯＳおよび／またはＤＥＡ８ＳＯＳから作製される溶液中で、脂質分散液を形成するステップであって、前記分散液中の脂質が、それぞれ約３：２：０．０１５のモル比のＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥである、ステップ、
（ｂ）前記脂質分散液を、少なくとも１つの０．１μｍの膜を通して６０〜７０℃の間で押し出して、リポソームを形成するステップ、
（ｃ）前記リポソームの外側にあるＴＥＡ８ＳＯＳおよび／またはＤＥＡ８ＳＯＳに由来するイオンを実質的に除去するステップ、
（ｄ）前記リポソームを６０〜７０℃の間の温度でイリノテカン遊離塩基またはイリノテカン塩を使用して作製される溶液に接触させて、これにより、イリノテカンを封入するリポソームの調製物を形成するステップ、
（ｅ）前記リポソームの外側にある前記ＴＥＡ８ＳＯＳおよび／またはＤＥＡ８ＳＯＳおよびイリノテカン成分に由来する物質を実質的に除去するステップ、ならびに
（ｆ）前記組成物のｐＨが７．０〜７．５になるように調整するステップ
を含む工程により作製される、保管安定化リポソーム型イリノテカン組成物。
【０１４１】
実施形態４：以下のステップ：
（ａ）０．４〜０．５Ｍのスルフェート濃度および５〜７の間のｐＨを有するＴＥＡ８ＳＯＳから作製される溶液中で、脂質分散液を形成するステップであって、前記分散液中の脂質が、それぞれ約３：２：０．０１５のモル比のＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥである、ステップ、
（ｂ）前記脂質分散液を、少なくとも１つの０．１μｍの膜を通して６０〜７０℃の間で押し出して、リポソームを形成するステップ、
（ｃ）前記リポソームの外側にあるＴＥＡ８ＳＯＳに由来するイオンを実質的に除去するステップ、
（ｄ）前記リポソームを６０〜７０℃の間の温度でイリノテカン遊離塩基またはイリノテカン塩を使用して作製される溶液に接触させて、これにより、イリノテカンを封入するリポソームの調製物を形成するステップ、
（ｅ）前記リポソームの外側にある前記ＴＥＡ８ＳＯＳおよびイリノテカン成分に由来する物質を実質的に除去するステップ、ならびに
（ｆ）前記組成物のｐＨが７．０〜７．５になるように調整するステップ
を含む工程により作製される、実施形態１から３のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【０１４２】
実施形態５：前記脂質分散液が、少なくとも２つの積層されている０．１μｍのポリカーボネート膜を通して押し出される、実施形態４に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【０１４３】
実施形態６：前記リポソームが、動的光散乱法により決定すると、１１０ｎｍの平均サイズを有し、サイズが、キュムラント法により決定される、前記実施形態のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【０１４４】
実施形態７：４．３ｍｇ／ｍｌの無水イリノテカン遊離塩基に等価なイリノテカン部分総含量を有する、前記実施形態のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【０１４５】
実施形態８：ステップ（ａ）において、前記リポソームが、０．４３〜０．４７Ｍの間のスルフェート濃度を有するＴＥＡ８ＳＯＳから形成され、
ステップ（ｄ）において、イリノテカン遊離塩基またはイリノテカン塩を使用して作製される前記溶液が、ＤＳＰＣ  １モルあたり、５００ｇ（±１０％）の無水イリノテカン遊離塩基に等価なイリノテカン部分含量を有しており、
ステップ（ｆ）において、前記組成物のｐＨが７．２〜７．３になるように調整する、
実施形態３から６のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【０１４６】
実施形態９：  約４℃で保管する前には、１ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）を含有し、約４℃で１８０日の保管後には、２０ｍｏｌ％またはそれより少ない（全リポソームリン脂質に対して）ｌｙｓｏ−ＰＣを含有する、前記実施形態のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【０１４７】
実施形態１０：  約４℃で６、９または１２か月の保管後に、２０ｍｏｌ％またはそれより少ない（全リポソームリン脂質に対して）ｌｙｓｏ−ホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）を含有する、実施形態９に記載のリポソーム組成物。
【０１４８】
実施形態１１：合計で、６．１〜７．５ｍｇのＤＳＰＣ／ｍｌ、２〜２．４ｍｇのコレステロール／ｍｌおよび０．１１〜０．１３ｍｇのＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ／ｍｌを、いずれも水性等張緩衝液中に含む、前記実施形態のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【０１４９】
実施形態１２：リポソーム型イリノテカンが、等張性のＨＥＰＥＳ水性緩衝液中に、２〜２０ｍＭの間の濃度で前記イリノテカンリポソームを含む、前記実施形態のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【０１５０】
実施形態１３：１３０〜１６０ｍＭの濃度で、塩化ナトリウムをさらに含む、前記実施形態のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【０１５１】
実施形態１４：前記リポソーム中に封入されている前記イリノテカンが、八硫酸スクロースの塩として、ゲル状態または沈殿状態にある、前記実施形態のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【０１５２】
実施形態１５：準弾性光散乱法によって測定すると、前記イリノテカンリポソームが９５〜１１５ｎｍの直径を有する、前記実施形態のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【０１５３】
実施形態１６：合計で、６．８１ｍｇのＤＳＰＣ／ｍｌ、２．２２ｍｇのコレステロール／ｍｌおよび０．１２ｍｇのＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ／ｍｌ、４．０５ｍｇ／ｍＬのＨＥＰＥＳ水性緩衝液および８．４２ｍｇの塩化ナトリウム／ｍＬを含む、前記実施形態のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【０１５４】
実施形態１７：７．２５のｐＨを有し、準弾性光散乱法によって測定すると、前記イリノテカンリポソームが１１０ｎｍの直径を有する、前記実施形態のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【０１５５】
実施形態１８：約４℃で６か月の保管後に、１ｍｇ／ｍＬ未満のｌｙｓｏ−ホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）を形成する、前記実施形態のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【０１５６】
実施形態１９：以下のステップ：
（ａ）約０．４５Ｍのスルフェート濃度および約６．５のｐＨを有するＴＥＡ８ＳＯＳの溶液中で脂質分散液を形成するステップであって、前記分散液中の脂質が、それぞれ、３：２：０．０１５のモル比の１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロールおよびメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）からなる、ステップ、
（ｂ）前記脂質分散液を、少なくとも１つの０．１μｍの膜を通して６０〜７０℃の間で押し出して、リポソームを形成するステップ、
（ｃ）前記リポソームの外側にあるＴＥＡ８ＳＯＳに由来するイオンを除去するステップ、
（ｄ）前記リポソームを６０〜７０℃の間の温度でイリノテカン塩酸塩三水和物を使用して作製される溶液に接触させて、全リポソームリン脂質１ｍｏｌあたり、約５００ｇ（±１０％）のイリノテカンを封入するリポソームの調製物を形成するステップ、
（ｅ）前記リポソームの外側にある前記ＴＥＡ８ＳＯＳおよびイリノテカン成分に由来する物質を除去するステップ、ならびに
（ｆ）前記組成物のｐＨが約７．３になるように調整するステップ
を含む工程により作製される、前記実施形態のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【０１５７】
実施形態２０：合計で１００ｐｐｍ未満のＴＥＡを含む、前記実施形態のいずれかに記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【０１５８】
実施形態２１：合計で３０〜１００ｐｐｍのＴＥＡまたはＤＥＡを含む、前記実施形態のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【０１５９】
実施形態２２：約４℃で６か月の保管後に、前記イリノテカンのうちの少なくとも９８％が、前記イリノテカンリポソーム中に封入されている、前記実施形態のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【０１６０】
実施形態２３：前記イリノテカンリポソーム内に、式（Ｉ）：
【化５】
2018530563.tif 000014
（式中、ｘは８である）
のイリノテカン組成物を含む、前記実施形態のいずれか一項に記載のリポソーム型イリノテカン組成物。
【実施例】
【０１６１】
いくつかのイリノテカンリポソーム調製物の合成および特徴付けが、以下の実施例中に記載されている。実施例中に特に示さない限り、これらのイリノテカンリポソームは、以下の多ステップ工程により得ることができる。したがって、本発明はまた、この小項目中および実施例中に説明されている調製方法、ならびにそれらの変形および組合せの範囲内で、イリノテカンリポソームを作製する方法も提供する。
【０１６２】
最初に、リポソーム形成性脂質を、加熱エタノール中に溶解させる。これらの脂質は、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥを含んだ。特に示さない限り、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥは、３：２：０．０１５のモル比で存在する。得られたエタノール−脂質組成物は、置換アンモニウムイオンおよびポリ陰イオン捕捉剤（ＳＯＳ）を含有する、適切なサイズにされた（例えば、８０〜１２０ｎｍまたは９５〜１１５ｎｍなど）、実質的に単層のラメラリポソームを形成するのに有効な条件下で、置換アンモニウムおよびポリ陰イオンを含有する水性媒体中に分散する。このリポソーム分散液は、例えば、エタノール性脂質溶液と、置換アンモニウムイオンおよびポリ陰イオンを含有する水溶液とを、脂質転移温度より高い温度、例えば６０〜７０℃で混合し、得られた脂質懸濁液（多層ラメラリポソーム）を、定められた細孔サイズ、例えば５０ｎｍ、８０ｎｍ、１００ｎｍまたは２００ｎｍを有する、１つまたは複数のトラックエッチングした、例えばポリカーボネートの膜フィルターを通して加圧下で押し出すことにより形成することができる。好ましくは、置換アンモニウムは、プロトン化されているトリエチルアミン（ＴＥＡ）またはジエチルアミン（ＤＥＡ）であり、ポリ陰イオンは、八硫酸スクロース（ＳＯＳ）であり、好ましくは、これらは化学量論比で一緒にされている（例えば、ＴＥＡ８ＳＯＳ）。ＴＥＡ８ＳＯＳの濃度は、リポソームに搭載されているイリノテカンの量に基づいて選択することができる（例えば、リポソームを横切る濃度搭載勾配を実質的にもしくは完全に排除するように、ならびに／または約１：８のモル比でＳＯＳおよびイリノテカンを含有するリポソームをもたらすように）。例えば、４７１ｇまたは５００ｇのイリノテカン部分／リン脂質１ｍｏｌを有するイリノテカンＳＯＳリポソームを調製するために、使用されるＴＥＡ８ＳＯＳは、約０．４〜０．５Ｍのスルフェート基（例えば、０．４５Ｍもしくは０．４７５Ｍのスルフェート基、または０．４５Ｍもしくは０．４７５ＭのＳＯＳ）の濃度を、好ましくは有する。次に、すべてのまたは実質的にすべての、捕捉されていないＴＥＡまたはＳＯＳは、除去される（例えば、ゲル濾過、透析または限外濾過／透析濾過による）。
【０１６３】
次に、得られた捕捉剤リポソーム（例えば、ＴＥＡ８ＳＯＳまたはＤＥＡ８ＳＯＳなどの置換アンモニウム化合物を封入する）を、捕捉剤リポソームにイリノテカンを搭載するのに有効な条件下（すなわち、ＴＥＡがリポソームを出て行くのと交換に、イリノテカンがリポソームに進入することが可能となる条件）で、イリノテカン溶液と接触させる。イリノテカン搭載溶液（例えば、対応する量のイリノテカン−ＨＣｌ三水和物を使用して調製することができる、無水イリノテカン−ＨＣｌを１５ｍｇ／ｍｌ）は、浸透剤（例えば、５％デキストロース）および６．５のｐＨ（特に明記しない限り、この本明細書に明記されているｐＨ値は、室温で決定した）を好ましくは含有する。薬物搭載は、組成物の温度をリポソーム脂質の転移温度より高くすることにより（例えば、６０〜７０℃）促進されて、置換アンモニウム化合物（例えば、ＴＥＡ）およびイリノテカンの膜貫通交換が加速される。一部の実施形態では、リポソーム内のイリノテカンスクロソファートは、ゲル状態または沈殿状態にある。
【０１６４】
リポソームを横切る置換アンモニウム化合物（例えば、ＴＥＡまたはＤＥＡ）との交換によるイリノテカンの搭載は、置換アンモニウム化合物（例えば、ＴＥＡ）のすべてまたは実質的にすべてがリポソームから除去されて、これにより、リポソームにかかる濃度勾配のすべてまたは実質的にすべてが排除されるまで、好ましくは継続される。好ましくは、イリノテカンリポソーム搭載工程は、イリノテカンとＳＯＳのグラム当量比が、少なくとも０．９、少なくとも０．９５、０．９８、０．９９または１．０（または、約０．９〜１．０、０．９５〜１．０、０．９８〜１．０もしくは０．９９〜１．０の範囲）となるまで継続する。好ましくは、イリノテカンリポソーム搭載工程は、ＴＥＡのうちの少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、またはそれより多くが、リポソーム内部から除去されるまで継続する。本発明の一部の実施形態では、ＴＥＡ８ＳＯＳを使用してこの方法で調製されるイリノテカンＳＯＳリポソーム組成物は、１００ｐｐｍ未満のＴＥＡを含有する。本発明の一部の実施形態では、ＴＥＡ８ＳＯＳを使用してこの方法で調製されるイリノテカンＳＯＳリポソーム組成物は、２０〜１００ｐｐｍ、２０〜８０ｐｐｍ、４０〜８０ｐｐｍまたは４０〜１００ｐｐｍのＴＥＡを含有する。
【０１６５】
リポソーム外イリノテカンおよび置換アンモニウム化合物（例えば、ＴＥＡまたはＤＥＡ）を除去して、最終のイリノテカンリポソーム生成物を得ることができる。この除去は、様々な方法によって促進することができ、その非限定例は、ゲル（サイズ排除）クロマトグラフィー、透析、イオン交換および限外濾過／透析濾過の方法を含む。リポソーム外部媒体は、注射可能な、薬理学的に許容可能な流体、例えば、緩衝化されている（７．１〜７．５の間のｐＨ、好ましくは７．２〜７．３の間のｐＨ）等張性生理食塩水により置きかえられる。最後に、リポソーム組成物は、例えば、０．２ミクロンの濾過により滅菌し、単回用量向けバイアルに分注してラベルを取り付けて、使用するまで例えば２〜８℃で冷蔵庫に保管する。リポソーム外部媒体は、残存するリポソーム外イリノテカンおよびアンモニウム／置換アンモニウムイオン（例えば、ＴＥＡ）を除去するのと同時に薬理学的に許容される流体により置きかえることができる。
捕捉剤の定量
【０１６６】
本発明の目的で、リポソーム捕捉剤および置換アンモニウム化合物対イオン（例えば、ＴＥＡ８ＳＯＳ）は、リポソームの調製に使用される濃度に基づいて定量され、捕捉剤のスルフェート基の数に基づいて算出される。例えば、ＳＯＳの各分子は８つのスルフェート基を有するので、０．１ＭのＴＥＡ８ＳＯＳは、本明細書では、０．８Ｍ／Ｌのスルフェートとして表される。異なる捕捉剤が使用される場合には、この算出は、捕捉剤１分子あたりの陰イオン性基（例えば、スルフェート基）の数に応じて調節される。
イリノテカンリポソーム調製物中のＬｙｓｏ−ＰＣの定量
【０１６７】
図１１Ｂおよび１２のデータを得るために試験したイリノテカン八硫酸スクロースリポソーム調製物中のｌｙｓｏ−ＰＣの量は、ＨＰＬＣ法（「方法Ａ」）によって得られ、この方法は、実施例９に記載されている。
【０１６８】
異なる分取（ＴＬＣ）法（本明細書では、「方法Ｂ」）を使用して、本明細書の試料１〜２３からｌｙｓｏ−ＰＣ測定値を得て、ｌｙｓｏ−リン脂質は、直前に議論されているＨＰＬＣ法（方法Ａ）ではなく、以下のＴＬＣ法、次いでホスフェート分析により決定した。方法Ｂによってｌｙｓｏ−ＰＣを測定するために、以下のステップに従った。水で平衡にしたＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、およそ５００ｎｍｏｌのリン脂質（ＰＬ）を含有するリポソーム試料のアリコート（例えば、１０ｍＭのＰＬリポソーム溶液０．０５ｍＬ）を脱塩した。水を用いてカラムからこの試料を溶出し、およそ１５０ｎｍｏｌずつのＰＬを含有する３つの部分に分割し、次に、遠心濃縮器（Ｓａｖａｎｔ  Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ、モデル番号ＳＶＣ１００Ｘ）を使用して真空下で乾燥した。乾燥脂質を３０μｌのクロロホルム／メタノール（５／１、体積／体積）に溶解し、ガラス製シリンジを使用して、順相シリカゲルＴＬＣプレート（ＡｎａｌｔｅｃｈによるＵｎｉｐｌａｔｅ、カタログ番号４４９２１）の非吸着領域に適用した。ＴＬＣは、クロロホルム／メタノール／３０％水酸化アンモニウム／水（６０／４０／２．５／３．７５、体積／体積／体積／体積）からなる移動相を用いて行い、脂質は、ヨウ素蒸気を使用して可視化した。ＰＬの決定は、その後のホスフェート分析用に、ＴＬＣ上のリン脂質およびｌｙｓｏ−リン脂質に対応するスポットを削り取って、別の１２×７５ｍｍのボロシリケート管に入れることにより行った。
【０１６９】
リポソームにより共封入されているイリノテカンおよびスルフェート化合物のモル量の定量は、本実施例に提示されている。
材料
【０１７０】
実施例１中の試料１〜５および１３、ならびに実施例２中の試料１２および１４〜１８の調製に関しては、米国薬局方ＧＭＰグレードのイリノテカン塩酸塩（（＋）−７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン１０−［１，４'−ビピペリジン］−１'−カルボキシレート一塩酸塩三水和物（ＣＡＳレジストリー番号１００２８６−９０−６））は、ＳｉｎｏＰｈａｒｍ（Ｔａｉｐｅｉ、台湾）から購入した。１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）およびメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ−２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）はＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ、米国）から購入した。超高純度コレステロール（Ｃｈｏｌ）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、米国）から得た。八硫酸スクロースはＥｕｔｉｃａｌｓ（Ｌｏｄｉ、イタリア）から得た。
【０１７１】
実施例１中の試料６〜１１の調製に関しては、イリノテカン塩酸塩三水和物は、ＰｈａｒｍａＥｎｇｉｎｅ（台湾）から得た。１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）およびメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ−２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ、米国）から購入した。超高純度コレステロール（Ｃｈｏｌ）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、米国）から得た。八硫酸スクロースはＥｕｔｉｃａｌｓ（Ｌｏｄｉ、イタリア）から得た。
【０１７２】
実施例８中の試料１９〜２３の調製に関しては、ビノレルビン（ＶＮＢ）は、酒石酸ビノレルビン１０ｍｇ／ｍＬの溶液（Ｇｌａｘｏ−ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）として薬局から得て、トポテカン（ＴＰＴ）粉末は、Ｔａｉｗａｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｔａｉｐｅｉ、台湾）からの無償品として得た。
【０１７３】
分析用およびより純度の高い他のすべての化学品は、一般的な供給業者から得た。
【０１７４】
方法：以下に特に明記されていない限り、試料１〜５および１３（実施例１）、ならびに試料６〜１１および１９〜２３（実施例２）、ならびに試料１２および１４〜１８（実施例３）の調製に、以下の方法を使用した。
八硫酸スクローストリエチルアンモニウム調製
【０１７５】
八硫酸スクローストリエチルアンモニウム（ＴＥＡ８ＳＯＳ）および八硫酸スクロースジエチルアンモニウム（ＤＥＡ８ＳＯＳ）は、イオン交換クロマトグラフィーを使用して、八硫酸スクロースのナトリウム塩から調製した。手短に言えば、１５ｇの八硫酸スクロース（ナトリウム塩）を水に溶解して、２．６４Ｍのスルフェート濃度を得た。Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ−８Ｘ−２００陽イオン交換樹脂を使用して、八硫酸スクロースの酸性体を調製した。規定の樹脂を２体積分の１Ｎ  ＮａＯＨにより２回、次に、ｄｄＨ２Ｏ（２度蒸留した水）により洗浄して中性ｐＨにし、２体積分の１Ｎ  ＨＣｌにより２回、洗浄し、最後にｄｄＨ２Ｏにより洗浄して中性にし、次に、繰り返した。カラムを４５０ｍＬの体積の樹脂に注ぎ入れ、３体積分の３Ｎ  ＨＣｌにより洗浄し、次に、導電率が１μＳ／ｃｍ未満に到達するまで、ｄｄＨ２Ｏによりすすいだ。八硫酸スクロース（ナトリウム塩）溶液（カラム容量のおよそ１０％）をカラムにロードし、ｄｄＨ２Ｏにより溶出した。電気伝導度検出器を使用して、カラム溶離液をモニタリングし、カラムからの八硫酸スクロースの溶出を検知した。次に、酸性八硫酸スクロースをトリエチルアミンまたはジエチルアミンにより滴定して、６〜７の間のｐＨにし、B.  Sorboら、Methods  in  Enzymology、１４３巻：３〜６頁、１９８４年（スルフェート決定を参照されたい）から修正された方法を使用して、スルフェート含量を決定した。最後に、溶液を０．６５Ｍのスルフェートに対応するスルフェート濃度に希釈した。ｐＨは、通常、６〜７の範囲であった。残留ナトリウムは、ナトリウム電極を使用して決定し、１ｍｏｌ％より多い残留ナトリウムを有する溶液はどれも、さらに利用しなかった。
スルフェート基の決定
【０１７６】
八硫酸スクロース溶液中のスルフェート含量は、濁度測定をベースとするアッセイを用いて決定した。溶液は、（１）１００ｍＬの水中の、１５ｇのＰＥＧ６０００および１．０２ｇの酢酸バリウム、（２）１ｍＬの水中の１４２ｍｇの硫酸ナトリウム、（３）バリウム作業溶液：撹拌しながら、１００ｍＬのバリウム溶液に、硫酸ナトリウム溶液０．１ｍＬを滴下して加える。この溶液は、使用前に１時間、平衡にすべきであり、１週間より長く保管することはできない、（４）０．４Ｍのクエン酸三ナトリウム溶液；（１１８ｍｇのクエン酸三ナトリウム／水１ｍＬ）、ならびに（５）１Ｎ硫酸から水中で希釈した１０ｍＭの標準スルフェートからなる。ボロシリケート試験管を使用して、標準品および溶液を最終体積１００μｌになるよう作製した。標準品は、０．２〜１μｍｏｌのスルフェート（１０ｍＭの標準品を２０〜１００μｌ）の範囲で作製した。０．６Ｍのスルフェート溶液の試料に関しては、１／１００の希釈液および１００μｌ（０．６μｍｏｌ）の体積を使用した。１００μｌの試料／標準品はそれぞれ、７０％の過塩素酸１００μｌにより処理し、１１０〜１２０℃で１２分間、加熱した。冷却後、０．４Ｍのクエン酸三ナトリウム溶液０．８ｍＬを加え、次いでボルテックスした。撹拌したバリウム作業溶液から０．２５ｍＬの体積を各管に移送し、直ちにボルテックスした。試料／標準品はすべて、１時間、平衡にして、その後にボルテックスし、６００ｎｍで吸光度を測定した。ＯＤ６００に対するＳＯ４濃度の一次標準曲線を使用して、未知のＳＯ４濃度を決定した。
ＨＰＬＣによる八硫酸スクロースの決定
【０１７７】
試料中の八硫酸スクロースの濃度（ｍｇ／ｍＬ）は、既知の濃度の標準品から生成した八硫酸スクロースのピークの面積に基づいて算出することができる。次に、八硫酸スクロースの算出された濃度を使用して、試料中のスルフェートの濃度（ｍＭ）を算出する。
【０１７８】
分析すべき試料は、４０℃のカラム温度で１．００ｍＬ／分で溶出した、０．６０Ｍの硫酸アンモニウム（ｐＨ３．０）の移動相を使用する、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｂｏｎｄｃｌｏｎｅ  １０μ  ＮＨ２、３００×３．９０ｍｍ、ＰＮ  ００Ｈ−３１２８−Ｃ０またはＷａｔｅｒｓ  μＢｏｎｄａｐａｋ  ＮＨ２  １０μｍ  １２５Å、（３．９ｍｍ×３００ｍｍ）、部品番号ＷＡＴ０８４０４０を使用するＨＰＬＣによりクロマトグラフィーにかける。試料は、例えば、屈折率検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣを使用する、やはり４０℃の屈折率検出器によって検出する。米国薬局方八硫酸スクロースカリウム七水和物（ＣＡＳ７６５７８−８１−９、カタログ番号１５５１１５０）を参照標準品として使用する。
【０１７９】
ＳＯＳアッセイ標準品およびアッセイ対照試料は、ベースラインからベースラインまでの積分値を使用して積分する。次に、ＴＥＡ−ＳＯＳ試料は、ベースラインからベースラインまでの積分値を使用して積分する。これは、空隙体積の谷より前のベースラインから始めてＳＯＳのテールの終わりまで手作業で行い得、次に、ＴＥＡピークの開始時点と２つのピークの間の低い点とに線を引き得る。注：空隙体積の谷より前の始まりからＳＯＳのすその終わりまでの単一ベースラインが、ＴＥＡのピークとＳＯＳのピークとの間の低い点を交差する場合、ベースラインからベースラインのアプローチに近似する２本の別の線を使用してもよい。ＴＥＡ−ＳＯＳ試料は、ＳＯＳピークの保持時間に対して、およそ０．４５の相対保持時間のＴＥＡピークを示す。
薬物分析
【０１８０】
イリノテカンのＨＰＬＣ分析は、Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｃ１８ガードカラムを前に取り付けた、Ｃ１８逆相シリカカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｃ１８カラム、内径２５０ｍｍ×４ｍｍ、粒子サイズ５μｍ）を使用して、Ｄｉｏｎｅｘシステムで行った。試料注入体積５０μｌを使用して、０．２１Ｍの水性酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ５．５）およびアセトニトリル（７３：２７、体積：体積）からなる移動相による流速１．０ｍＬ／分の定組成でカラムから溶出した。イリノテカンおよびＳＮ−３８は、通常、それぞれ、５．１分および７．７分に溶出した。ダイオードアレイ検出器を使用して、３７５ｎｍの吸光度によりイリノテカンを検出し、ＳＮ−３８は、蛍光（３７０ｎｍで励起および５３５ｎｍで発光）により検出した。
ホスフェートの決定
【０１８１】
試料１〜２３を分析するため、以下のホスフェート決定方法を使用した。改変Ｂａｒｔｌｅｔｔホスフェートアッセイを使用して、リン脂質（ＰＬ）を測定することができる。１０〜４０ｎｍｏｌのホスフェートの範囲の標準品を、１２×７５ｍｍのボロシリケート管に入れて、試料として正確に処理した。硫酸（６ＭのＨ２ＳＯ４を１００μｌ）を加熱ブロックに入れた各管に加え、４５分間、１８０℃まで加熱した。過酸化水素（３０％溶液を２０μｌ）を各管に加え、次に、１５０℃で３０分間、加熱した。続いて、モリブデン酸アンモニウム（２．２ｇ／ｌ溶液を０．９５ｍＬ）およびアスコルビン酸（１０％水溶液を５０μｌ）を各管に加えた。ボルテックス後に、これらの管を１５分間、沸騰水中で展開し、次に、室温まで冷却した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を使用するｌｙｓｏ脂質分析については、シリカを、１０００ｒｐｍでの遠心分離により５分間、ペレット化し、８２３ｎｍの吸光度を読み取ることにより、上澄み液中で青色を測定した。シリカを含有していない試料は、遠心分離ステップを省略することができる。
薬物滞留性および安定性
【０１８２】
リポソーム型イリノテカンの安定性（薬物滞留性に関して）は、ＰＤ−１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５）サイズ排除カラムを使用して、リポソーム外のイリノテカンからリポソーム型イリノテカンを分離することにより決定した。薬物漏出は、リポソーム外のイリノテカンの分離前およびその後に、イリノテカン（ＨＰＬＣ）とＰＬ（リン脂質決定で記載している）との比を比較することにより決定した。イリノテカンの分解は、ＨＰＬＣ分析後に、クロマトグラム中のさらなるピークを観察することによって決定した。イリノテカン対リン脂質の比、および薬物の封入効率は、それぞれ、以下の式１および２を使用して算出する。
【数１】
2018530563.tif 000015
（式中、（イリノテカン対リン脂質の比）ＡＣは、Ｇ−２５サイズ排除カラムで精製した後の薬物対リン脂質の比であり、（イリノテカン対リン脂質の比）ＢＣは、カラムで精製する前の薬物対リン脂質の比である。）
リポソーム組成物中の封入されているイリノテカンおよび遊離イリノテカンの決定
【０１８３】
実施例３および４のイリノテカンスクロソファートリポソーム組成物中において、リポソームにより封入されているイリノテカンおよび遊離（封入されていない）イリノテカンは、カートリッジ吸着方法を使用して決定した。Ｏａｓｉｓ  ６０ｍｇ  ３ｃｃ  ＨＬＢカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）を、２ｍＬのメタノール、１ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水（ＨＢＳ；５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）、および通常生理食塩水中の１０％ヒト血清アルブミン０．５ｍＬ、次いで、ＨＢＳ  １ｍＬを逐次、通すことによりコンディショニングした。リポソーム型イリノテカンスクロソファート組成物は、通常生理食塩水により約２．２ｍｇ／ｍＬのイリノテカンになるよう希釈し、０．５ｍＬというアリコートをカートリッジ上に適用した。溶出液を採集し、カートリッジは、ＨＢＳの２つの分量（１．５ｍＬ、３ｍＬ）によりすすぎ、洗液を溶出液と一緒にして、リポソームフラクションを作製した。さらに、カートリッジを１．５ｍＬのＨＢＳによりすすぎ、３ｍＬの２つの分量のメタノールＨＣｌ（９０体積％のメタノール、１０体積％の１８ｍＭのＨＣｌ）により溶出した。溶出液を一緒にして、遊離薬物フラクションを作製した。リポソーム薬物フラクションを２５ｍＬメスフラスコに移し、遊離薬物フラクションを１０ｍＬメスフラスコに移し、メタノールＨＣｌを用いて、印のあるところまで満たし、十分に混合して、リポソームフラクションのフラスコを６０℃で１０分間、加熱して、薬物を溶解した。冷却すると、溶液を濾過し、両方のフラクション中のイリノテカンを、２５４ｎｍでのＵＶ検出を用いて、２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ３．０）とメタノールとの混合物（６０：４０体積基準）により定組成で溶出した、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）カラムで逆相ＨＰＬＣを使用して定量した。薬物ピークを積分し、試料中のイリノテカンの量は、イリノテカン塩酸塩三水和物の米国薬局方の参照標準品を使用して同一条件下で得た、一次標準曲線と比較することによって算出した。薬物の封入比は、試料中の遊離薬物および封入薬物の合計に対する、封入薬物の百分率として算出した。
ｐＨ測定
【０１８４】
ｐＨは、電位差滴定標準ガラス電極法を使用して、周囲温度（すなわち、２０〜２５℃）で常に測定した。したがって、リポソーム製剤のｐＨは、リポソーム製剤にガラス電極を挿入して、ｐＨの読取り値を得ることにより測定した。
ＴＥＡ／ＤＥＡのｐｐｍの試料分析
【０１８５】
キャピラリーガスクロマトグラフィー（ＧＣ）カラム（５０ｍ×０．３２ｍｍ×５μｍ  Ｒｅｓｔｅｋ  Ｒｔｘ−５（５％フェニル−９５％ジメチルポリシロキサン））で勾配温度溶出を利用する、ヘッドスペースＧＣ分離、次いで、水素炎イオン化検出（ＦＩＤ）により試料分析を行った。試料調製品および標準調製品を分析して、得られたピークの面積応答を比較した。残留アミン（例えば、ＴＥＡまたはジエチルアミン（ＤＥＡ））の量は、外部標準品を使用して定量した。ＴＥＡの場合、標準品は、≧９９％であった。他の試薬には、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、水酸化ナトリウムおよび脱イオン（ＤＩ）水が含まれる。
【０１８６】
ＧＣ条件は、以下とした：キャリアガス：ヘリウム；カラム流速：２０ｃｍ／秒（１．２４ｍＬ／分）；スプリット比：１０：１（システム適合基準をすべて満たす限り、調節することができる）；注入モード：スプリット１０：１；ライナー：２ｍｍの直線スロット（推奨されるが必要ではない）；注入ポート温度：１４０℃、検出器温度：２６０℃（ＦＩＤ）；初期カラムオーブン温度：４０℃；カラムオーブン温度プログラム：
速度(℃/分)  温度(℃)    保持時間(分)
n/a          400          0
2            100          0
20            240        17
実施時間は54分間
【０１８７】
ヘッドスペースパラメータ：プラテン温度：９０℃；試料ループ温度：１００℃；トランスファーライン温度：１００℃；平衡時間：６０分間；注入時間：１分間；バイアル圧力：１０ｐｓｉ；加圧時間：０．２分間；振とう：オン（中度）；注入体積：１．０ｍＬのヘッドスペース；ＧＣサイクル時間：６０分間（推奨されるが必要ではない）。
【０１８８】
ＴＥＡが検出されない場合、「何も検出されず」と報告する。ＴＥＡの結果が＜３０ｐｐｍである場合、＜ＱＬ（３０ｐｐｍ）と報告する。ＴＥＡの結果が≧３０ｐｐｍの場合、整数にして報告する。
リポソームサイズの決定
【０１８９】
リポソーム粒子サイズは、キュムラント法を使用し、水性緩衝液（例えば、１０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．７）中、２３〜２５℃で、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＺｅｔａＳｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（商標）または類似機器を使用する、動的光散乱法（ＤＬＳ）を使用して測定した。ｚ−平均粒子サイズおよび多分散指数（ＰＤＩ）を記録した。機器性能は、１００ｎｍのポリマーのＮａｎｏｓｐｈｅｒｅ  ＮＩＳＴトレーサブル標準品（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ３０００  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓｉｚｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｐ／Ｎ  ３１００Ａ、または流体力学的径を含む分析証明書に等価なもの）を使用して確認した。本明細書で使用する場合、「ＤＬＳ」は、動的光散乱法を指し、「ＢＤＰ」は、バルク薬製品を指す。
（実施例１）
リポソーム型イリノテカン調製物の保管安定性に及ぼすＳＯＳ捕捉剤濃度およびｐＨの影響
【０１９０】
この検討の目標は、とりわけ、ある特定の期間、約４℃で保管した場合の、イリノテカンおよび八硫酸スクロース（ＳＯＳ）捕捉剤を封入するリポソームの物理的および化学的安定性のいかなる変化も決定することであった。この検討の場合、リン脂質の全ｍｏｌ数あたり４７１ｇのイリノテカン部分の比を維持しながら、ＳＯＳ捕捉剤のリポソーム濃度を低下させた。
【０１９１】
一連のイリノテカンＳＯＳリポソーム調製物は、異なる濃度のＳＯＳ捕捉剤を使用する、および異なるｐＨ値に最終リポソーム調製物のｐＨを調整する、多ステップ工程で調製した。イリノテカンＳＯＳリポソーム調製物はそれぞれ、５ｍｇ／ｍＬのイリノテカン塩酸塩三水和物に等価なイリノテカン部分の濃度を含有した。試料１〜５および１３のイリノテカンＳＯＳリポソーム調製物は、実施例１の多ステップ工程により調製した。
【０１９２】
ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）およびＰＥＧ−ＤＳＰＥは、それぞれ、３：２：０．０１５のモル比に相当する量（例えば、１２６４ｍｇ／４１２．５ｍｇ／２２．４４ｍｇ）で秤量した。脂質をクロロホルム／メタノール（４／１、体積／体積）に溶解して、完全に混合し、４つのアリコート（Ａ〜Ｄ）に分割した。各試料を６０℃で回転式蒸発器を使用して、蒸発乾固した。室温で１２時間、真空下（１８０μｔｏｒｒ）に置くことによって、脂質から残留クロロホルムを除去した。乾燥脂質を６０℃でエタノールに溶解し、適切な濃度の事前加温したＴＥＡ８ＳＯＳを加えて、最終的なアルコール含量を１０％（体積／体積）とした。脂質濃度は、およそ７５ｍＭであった。この脂質分散液をＬｉｐｅｘ  ｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ押出器（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ、カナダ）を使用して、１０回、２つの積層した０．１μｍのポリカーボネート膜（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ（商標））を通して約６５℃で押し出して、９５〜１１５ｎｍの典型的な平均直径を有するリポソームを生成した（準弾性光散乱法によって決定した；「リポソームサイズの決定」の小項目を参照されたい）。押し出したリポソームのｐＨは、必要に応じて調整し、押し出し中にｐＨの変化を修正した。リポソームは、イオン交換クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーとを組み合わせることにより精製した。まず、Ｄｏｗｅｘ（商標）ＩＲＡ９１０樹脂を１Ｎ  ＮａＯＨにより処理し、次いで、脱イオン水により３回、洗浄し、次に、３Ｎ  ＨＣｌにより３回、洗浄し、次に、水により複数回、洗浄した。調製した樹脂にリポソームを通して、溶出したフラクションの導電率をフローセル導電率計測器（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を使用することにより測定した。フラクションは、導電率が１５μＳ／ｃｍ未満である場合、さらなる精製が許容可能であると見なした。次に、リポソーム溶出液を脱イオン水により平衡にしたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに適用し、採集したリポソームフラクションの導電率（通常、１μＳ／ｃｍ未満）を測定した。膜通過等張性は、５％（重量／重量）の最終濃度まで４０％デキストロース溶液を添加することにより達成し、保存溶液（０．５Ｍ、ｐＨ６．５）からのバッファ（Ｈｅｐｅｓ）を１０ｍＭの最終濃度になるまで加えた。
【０１９３】
各回分の分析証明書から得られた水分含量および不純物レベルを考慮して、イリノテカンの保存溶液は、イリノテカン・ＨＣｌ三水和物の粉末を脱イオン水に溶解して、１５ｍｇ／ｍＬの無水イリノテカン−ＨＣｌにすることにより調製した。薬物搭載は、リポソームリン脂質１ｍｏｌあたり５００ｇの無水イリノテカンＨＣｌ（４７１ｇの無水イリノテカン遊離塩基に相当する）の量でイリノテカンを加えて、熱水浴中、３０分間、６０±０．１℃に加熱することにより開始した。この溶液を、水浴から取り出した際に、氷冷水に浸けることにより、急速に冷却した。リポソーム外薬物は、Ｈｅｐｅｓにより緩衝化した生理食塩水（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１４５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）により平衡にして、溶出した、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ７５カラムを使用し、サイズ排除クロマトグラフィーにより除去した。ＨＰＬＣによりイリノテカンについて、およびＢａｒｔｌｅｔｔの方法（小項目「ホスフェートの決定」を参照されたい）によりホスフェートについて試料を分析した。保管については、試料を４ｍＬのアリコートに分割し、１Ｎ  ＨＣｌまたは１Ｎ  ＮａＯＨを使用してｐＨを調整し、無菌条件下で滅菌濾過し、滅菌クリアガラス製バイアルに充填して、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）製の裏打ちしたねじ付キャップを用いて、アルゴン下で密封し、４℃にサーモスタット制御した冷蔵庫に入れた。定めた時間点に、アリコートを各試料から抜き取り、外観、リポソームサイズ、薬物／脂質比、ならびに薬物および脂質の化学的安定性に関して試験した。
【０１９４】
実施例１に関し、リポソームサイズ分布は、９０度の角度でのＣｏｕｌｔｅｒ  Ｎａｎｏ−Ｓｉｚｅｒを使用する動的光散乱法によって希釈試料中で決定し、キュムラント法によって得た平均±標準偏差（ｎｍ）として表した。
【０１９５】
試料１〜５および１３のイリノテカンリポソーム調製物は、以下の通り、さらに得た。新しく押し出したリポソームは、２つの群を含み、それぞれは、（Ａ）０．４５Ｍのスルフェート基（１１２．０±１６ｎｍ）、（Ｂ）０．４７５Ｍのスルフェート基（１０５．０±１６ｎｍ）、（Ｃ）０．５Ｍのスルフェート基（９７±３０ｎｍ）および（Ｄ）０．６Ｍのスルフェート基（１１３±１０ｎｍ）の濃度で、捕捉剤としてＴＥＡ８ＳＯＳを取り込ませた。試料１〜５および１３は、全リポソームリン脂質１ｍｏｌあたり４７１ｇの無水イリノテカン遊離塩基の初期比で搭載させ、実施例１の説明で上に記載されている通り精製した（５００ｇの無水イリノテカンＨＣｌに等価）。試料１、５および１３は、押し出した試料（Ａ）から誘導した。試料２は、押し出した試料（Ｂ）に由来した。試料３および４は、それぞれ、押し出した試料（Ｃ）および（Ｄ）に由来した。精製後、ｐＨ調整は、殺菌およびバイアルへの充填前に、１Ｎ  ＨＣｌまたは１Ｎ  ＮａＯＨを使用して行った。試料１〜５からのデータは、表７（実施例１）に示されており、試料１３からのデータは、表８（実施例２）に示されている。
【０１９６】
試料６〜１１のイリノテカンリポソーム調製物は、以下の通り、さらに得た。新しく押し出したリポソームは、２つの群を含み、それぞれは、（Ａ）０．４５Ｍのスルフェート基（１１６±１０ｎｍ）および（Ｂ）０．６Ｍのスルフェート基（１１５．０±９．０ｎｍ）の濃度で、捕捉剤としてＴＥＡ８ＳＯＳを取り込ませた。試料６〜８は、押し出した試料（Ａ）から誘導し、試料９〜１１は押し出した試料（Ｂ）に由来した。精製後、ｐＨ調整は、適宜、１Ｎ  ＨＣｌまたは１Ｎ  ＮａＯＨを添加することにより、必要に応じて行った。試料１２を、実施例２に記載されている通り調製した。比較目的のため、表７に含まれている。
【０１９７】
ある特定のイリノテカン（irinotacne）リポソーム組成物に関する、リポソーム外ｐＨ値、イリノテカン遊離塩基の濃度（ｍｇ／ｍＬ）および八硫酸スクロースの様々な濃度を有するイリノテカンリポソームが、以下の表６（４℃で６か月の保管）および表７に列挙されており、本明細書に記載されている通り、より詳細に提示されている通りに調製した。
【０１９８】
図４Ａ〜４Ｃは、６．５より大きなｐＨ（すなわち、各図に示されている通り、７．２５または７．５）を有する、表７から選択されるイリノテカンリポソーム調製物中のｌｙｓｏ−ＰＣのｍｏｌ％を示すプロットである。Ｌｙｓｏ−ＰＣは、最初の１、３、６および／または９か月間、４℃での各試料の保管後に、本明細書に開示されている方法Ｂ（ＴＬＣ）を用いて決定した。これらのプロットは、各試料中の経時的な、ｌｙｓｏ−ＰＣ（ｍｏｌ％）の増加速度に関する推定値としての、各試料に関するデータへの線形回帰線を含む。驚くべきことに、イリノテカンリポソーム調製物のｐＨを６．５より大きく（例えば、７．２５および７．５）向上させると、同等の安定比で形成されたイリノテカンリポソームと比べて、４℃で冷蔵保管の間に測定されたＬｙｓｏ−ＰＣの量が低下した。この傾向は、リポソーム型イリノテカンの様々な濃度で明白であった。例えば、イリノテカン部分約４．３ｍｇ／ｍＬの強度で調製されるリポソーム型イリノテカン組成物については、試料５および７において測定されたｍｏｌ％  ｌｙｓｏ−ＰＣレベルは、ｐＨ６．５における試料１に関して測定されたｍｏｌ％  ｌｙｓｏ  ＰＣレベル（表７中のデータ）と比べて、すべてのデータ点（製造後、４℃での最初の１、６および９か月の保管後）でかなり低かった。同様に、イリノテカン部分約１８．８ｍｇ／ｍＬの強度で調製されるリポソーム型イリノテカン組成物については、試料１３において測定されたｍｏｌ％  ｌｙｓｏ−ＰＣレベルは、ｐＨ６．５における試料１２または試料１４のどちらか一方に関して測定されたｍｏｌ％  ｌｙｓｏ  ＰＣレベル（表８中のデータ）と比べて、すべてのデータ点（製造後、４℃での最初の１および９か月の保管後）でかなり低かった。
【表６】
2018530563.tif 000016
【０１９９】
実施例１における比較安定性検討からのさらなる結果を以下の表７に提示している。ｌｙｓｏ−ＰＣのｍｏｌ％は、表７に示されている通り、４℃で１、３、６、９および／または１２か月間、リポソーム調製物を保管した後に決定した。各試料に関し、表７は、スルフェート基のモル濃度として表される、リポソームを調製するために使用されるＳＯＳの濃度を提示している（ＳＯＳ  １分子は、８つのスルフェート基を含む）。特に示さない限り、表７中のイリノテカンリポソームはすべて、それぞれ、全リポソームリン脂質１モルあたり４７１ｇのイリノテカン部分（５００ｇの無水イリノテカンＨＣｌ塩中のイリノテカン部分の量に等価）の、イリノテカン部分（上で説明した通り、無水遊離塩基に対して）と全リン脂質との比を使用して調製した。表７はまた、リン脂質１ｍｏｌあたり４７１ｇのイリノテカン部分（無水遊離塩基に対して）を、リポソームを調製するために使用したスルフェート基の濃度（モル／Ｌ）によって除算した比として算出した、各試料の安定比を含む。表７に記載されている試料のリポソームはそれぞれ、約８９〜１１２ｎｍの間の測定サイズ（体積加重平均）、および少なくとも８７．６％のイリノテカン封入効率を有した。封入効率は、小項目「薬物滞留性および安定性」に準拠して、決定した。
【表７】
2018530563.tif 000017
c  本明細書に記載されている方法Bに準拠して測定
【０２００】
この保管安定性検討からの結果は、無水イリノテカン遊離塩基（ｇ）対全リポソームリン脂質（ｍｏｌ）との比を一定に保ちながら、リポソームの調製に使用したＳＯＳ捕捉剤の濃度（スルフェートのモル濃度として測定）を低下させると、４℃で６か月および９か月の冷蔵保管後のイリノテカンリポソーム調製物において検出されるｌｙｓｏ−ＰＣの量によって測定すると、イリノテカンＳＯＳリポソームの保管安定性が一層、向上することを実証した。６．５のｐＨ（本明細書に記載されている「ｐＨ測定」方法を参照されたい）に製造されたリポソーム調製物では、リポソーム製造中にＳＯＳ捕捉剤の濃度を低下させると、４℃で保管後のリポソーム調製物において検出されるｌｙｓｏ−ＰＣの量の低下をもたらす。
【０２０１】
理論によって拘泥されるものではないが、調製中にリポソーム外の捕捉剤から一旦、精製されると、リポソームの内部空間が酸性化されると考えられる。これは、リポソーム外のＴＥＡ８ＳＯＳを除去した後に、捕捉剤の塩であるアミン構成成分がリポソームの内側から外側に向かって再分布し、それが起こるたびに水素イオンがリポソーム内に蓄積することを伴うからであり得る。プロトン化することが可能なイリノテカンなどの添加された薬物もやはり、リポソームの外部と内部空間との間に分布する。リポソームの内部に分布している薬物のプロトン化、およびプロトン化薬物のスクロソファートへの結合は、薬物のリポソーム内部への搭載をもたらし、リポソーム内のＴＥＡと水素イオンの両方の濃度の低下をもたらし、リポソーム内の酸性化の程度を低下させる。イリノテカンリポソームの場合、０．６Ｍのスルフェート濃度のＳＯＳを用いる、イリノテカン塩酸塩５００ｇ（すなわち、イリノテカン４７１ｍｇ）／リポソームリン脂質１ｍｏｌとなる薬物搭載では、過剰のリポソーム内ＴＥＡの排出は不完全となると仮定される。リポソーム中に薬物を保持するための基本ではないが、このことは、酸性のリポソーム内部をもたらす可能性があり、このことは、試料７および１３の場合に見られる通り、リポソームの薬物および脂質構成成分の分解に寄与することがある。対照的に、試料８および５は、５００ｇのイリノテカン塩酸塩（すなわち、４７１ｍｇのイリノテカン部分）／ｍｏｌの同一の薬物搭載量を有するが、それぞれ、０．４５Ｍのスルフェートおよび０．４７５Ｍのスルフェートというより低いＳＯＳ濃度を有する。これらの具体的な例では、測定されたｌｙｓｏ脂質のレベルは、一層低い。最後に、最も安定なリポソーム製剤は、より高い薬物／捕捉剤比とより高い外部ｐＨ（すなわち、ｐＨ７．２５）を合わせ持つことは明白である。
【０２０２】
試料１〜１１のイリノテカンリポソームは、沈殿がないこと、および比較的狭く、再現性の高い粒子サイズ分布となることにより判断すると、４℃で最大、９か月間、良好なコロイド安定性を保持しており、この場合、イリノテカン部分の濃度は、４．７１ｍｇ／ｍＬの無水イリノテカン遊離塩基に相当する。イリノテカンは、長期間の保管にわたり、最小限の漏出（＜１０％）を伴って、有効かつ安定的に捕捉された（本明細書に記載されている「薬物滞留性および安定性」方法を参照されたい）。
【０２０３】
試料１および２は、リン脂質１モルあたり、約４７１ｇのイリノテカン部分（上で説明した通り、無水遊離塩基に対して）という同一の初期搭載量を有するが、それぞれ、０．４５Ｍのスルフェート基および０．４７５Ｍのスルフェート基というより低いＳＯＳ濃度を有した。同様に、試料６、７および８は、０．４５Ｍのスルフェートとなるより低いＳＯＳ濃度を有したが、イリノテカン部分（上で説明した通り、無水遊離塩基に対して）４７１ｇ／リン脂質１ｍｏｌという同一薬物搭載量により、かなり低いｌｙｓｏ−脂質含量がもたらされている（９か月後に７〜１７％）。
【０２０４】
６．５のｐＨの試料において、ｌｙｓｏ−ＰＣレベルの増加が、リポソームの製造中、薬物搭載量または捕捉剤濃度に関わりなく測定され、一部の試料（１、２および３）の場合、リン脂質は最大３５ｍｏｌ％に到達した。ｐＨを７．２５に調整すると、リポソームはｌｙｓｏ−ＰＣ形成をそれほど受けなくなり、レベルは、全ＰＣが９．７２％に到達した（例えば、試料１および１３におけるｌｙｓｏ−ＰＣレベルを比較）。９か月後に、７〜８ｍｏｌ％のｌｙｓｏ−脂質を有する試料７および８において見られる通り、より高い薬物対捕捉剤濃度の比、およびより高いｐＨを有する試料は、それほどｌｙｓｏ−脂質を形成しなかった。より高い薬物捕捉剤比とより高いｐＨとを組み合わせると（例えば、試料１２との比較）、ｌｙｓｏ−脂質形成が低下した。最も安定なリポソーム製剤は、より高い薬物／捕捉剤比（すなわち、イリノテカン遊離塩基の量に関して定義されている９４２より大きな安定比）と６．５より高い外部ｐＨとを合わせ持つ（例えば、試料１と１３とを比較）。
【０２０５】
さらに、９か月にわたる、イリノテカンリポソーム調製物１〜１１において測定された％ＳＮ３８は、約０．０５％のＳＮ３８ほど大きくない（すなわち、イリノテカンとＳＮ３８とを比較することによるＳＮ３８の相対量）一方、試料１２のイリノテカンリポソーム調製物は、同じ期間にわたって測定される０．２０〜０．５０％のＳＮ３８を有した（本明細書に記載されている「薬物分析」方法により決定される）。試料１〜５および１３のそれぞれにおいて、イリノテカンは、リポソームからの低い漏出（１３％未満；本明細書に記載されている「薬物滞留性および安定性」方法により決定した）を伴って安定的に捕捉されており、０．１％未満と活性な細胞毒性ＳＮ−３８への変換率は低く、より高いｐＨ（７．２５）で保管した試料では、０．０５％未満であった。
（実施例２）
液体調製物中のイリノテカンリポソームの濃度の増加
【０２０６】
この保管安定性検討の目的は、４℃で保管した場合の、リポソーム型イリノテカンＳＯＳの物理的および化学的安定性のなんらかの変化を決定することであった。この検討の間に、リポソーム調製物に使用された八硫酸スクロース（ＳＯＳ）捕捉剤の濃度は、以下：（１）イリノテカンリポソームの調製中の、ＳＯＳ捕捉剤の初期対イオン（ＴＥＡ８ＳＯＳまたはＤＥＡ８ＳＯＳを使用）、（２）無水イリノテカン遊離塩基の量（グラム）とリン脂質の量（ｍｏｌ）との比（リン脂質１モルあたり、約４７１ｇまたは７０７ｇのイリノテカン部分（上で説明した通り、無水遊離塩基に対して））、（３）液体イリノテカン調製物中の無水イリノテカン遊離塩基の濃度（液体イリノテカンリポソーム調製物中の４．７ｍｇ／ｍＬまたは１８．８ｍｇ／ｍＬで封入されているイリノテカン（イリノテカン塩酸塩三水和物に由来するイリノテカン部分の等価な濃度に対して））、（４）イリノテカンリポソーム調製物が調整されるｐＨ（ｐＨ６．５または７．２５）、および（５）イリノテカンリポソーム調製物のバッファ（ＨＥＰＥＳまたはヒスチジン）を変えながら０．６５Ｍのスルフェート基濃度で維持した。
【０２０７】
検討した製剤パラメータは、以下を含む：リポソームサイズ、イリノテカンリポソーム中の薬物対リン脂質の比、イリノテカン薬物封入効率および一般的な外観、イリノテカン分解生成物の存在ならびにｌｙｓｏ−ＰＣ（ｍｏｌ％）形成。
【０２０８】
一連のイリノテカンＳＯＳリポソーム調製物は、封入されているイリノテカンに比べて、異なる濃度のＳＯＳ捕捉剤を使用する、および異なるｐＨ値に最終リポソーム調製物のｐＨを調整する多ステップ工程で調製した。ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）およびＰＥＧ−ＤＳＰＥは、それぞれ、３：２：０．０１５のモル比に相当する量（７３０．９ｍｇ／２３８．５ｍｇ／１３．０ｍｇ）で秤量した。脂質をクロロホルム／メタノール（４／１、体積／体積）に溶解して、完全に混合し、２つのアリコートに分割した。各試料を６０℃で回転式蒸発器を使用して蒸発乾固した。室温で１２時間、真空下（１８０μｔｏｒｒ）に置くことによって、脂質から残留クロロホルムを除去した。乾燥脂質を６０℃でエタノールに溶解し、事前加温したＴＥＡ８ＳＯＳまたはＤＥＡ８ＳＯＳ（０．６５Ｍのスルフェート基の濃度で）を加えて、最終的なアルコール含量を１０％（体積／体積）とし、試料をそれぞれ、ＡおよびＢと表した。脂質濃度は、およそ７５ｍＭであった。脂質分散液は、０．１μｍのポリカーボネート膜（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ（商標））を通して１０回、押し出して、９５〜１１５ｎｍの典型的な平均直径を有するリポソームを生成した。押し出したリポソームのｐＨは、必要に応じて、選択した調製物のｐＨに調整した（１Ｎ  ＮａＯＨにより）。リポソームは、イオン交換クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーとを組み合わせることにより精製した。まず、Ｄｏｗｅｘ（商標）ＩＲＡ９１０樹脂を１Ｎ  ＮａＯＨにより処理し、次いで、脱イオン水により３回、洗浄し、次に、３Ｎ  ＨＣｌにより３回、洗浄し、次に、水により複数回、洗浄した。溶出したフラクションの導電率をフローセル導電率計測器（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を使用することにより測定した。フラクションは、導電率が１５μＳ／ｃｍ未満である場合、さらなる精製が許容可能であると見なした。次に、リポソーム溶出液を脱イオン水により平衡にしたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに適用し、採集したリポソームフラクションの導電率（通常、１μＳ／ｃｍ未満）を測定した。膜通過等張性は、５％（重量／重量）の最終濃度まで４０％デキストロース溶液を添加することにより達成し、保存溶液（０．５Ｍ、ｐＨ６．５）からのバッファ（Ｈｅｐｅｓ）を１０ｍＭの最終濃度になるまで加えた。
【０２０９】
各回分の分析証明書から得られた水分含量および不純物レベルを考慮して、イリノテカンの保存溶液は、イリノテカン・ＨＣｌ三水和物の粉末３２６．８ｍｇを脱イオン水２０．０ｍＬに溶解して、１５ｍｇ／ｍＬの無水イリノテカン−ＨＣｌにすることにより調製した。薬物搭載は、５００ｇ／ｍｏｌまたは７５０ｇ／リン脂質１ｍｏｌで無水イリノテカン遊離塩基を加えて、熱水浴中、３０分間、６０±０．１℃に加熱することにより開始した。この溶液を、水浴から取り出した際に、氷冷水に浸けることにより、急速に冷却した。リポソーム外薬物は、試料Ａの場合、Ｈｅｐｅｓにより緩衝化した生理食塩水（１０ｍＭ）（ＨＢＳ）（ｐＨ６．５）、および試料Ｂの場合、ヒスチジンにより緩衝化したｐＨ７．２５の生理食塩水により平衡にして溶出した、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ７５カラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィーにより除去した。ＨＰＬＣによりイリノテカンについて、およびＢａｒｔｌｅｔｔの方法（ホスフェートの決定を参照されたい）によりホスフェートについて試料を分析した。
【０２１０】
保管については、試料を４ｍＬのアリコートに分割し、必要な場合、１Ｎ  ＨＣｌまたは１Ｎ  ＮａＯＨを使用してｐＨを調整し、無菌条件下で滅菌濾過し、滅菌クリアガラス製バイアルに充填して、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）製の裏打ちしたねじ付キャップを用いて、アルゴン下で密封し、４℃にサーモスタット制御した冷蔵庫に入れた。定めた時間点に、アリコートを各試料から抜き取り、外観、サイズ、薬物／脂質比、ならびに薬物および脂質の化学的安定性に関して試験した。
【０２１１】
リポソームサイズは、９０度の角度でのＣｏｕｌｔｅｒ  Ｎａｎｏ−Ｓｉｚｅｒを使用する動的光散乱法によって希釈試料中で決定し、キュムラント法によって得た平均±標準偏差（ｎｍ）として表した。
【０２１２】
比較安定性検討からの結果が、表８（ＴＥＡ８ＳＯＳ捕捉剤の出発原料を使用して調製した試料の場合）および表９（ＤＥＡ８ＳＯＳ捕捉剤の出発原料を使用して調製した試料の場合）に提示されている。
【表８】
2018530563.tif 000018
d  本明細書に記載されている方法Bに準拠して測定
【０２１３】
試料１３（実施例２、表８）は、試料１〜５（実施例１）よりも４倍高い濃度（２０ｍｇのイリノテカン／ｍＬ）で保管し、依然として良好なコロイド安定性を保持しており、観察可能な凝集も沈殿もなかった。
【表９】
2018530563.tif 000019
e  本明細書に記載されている方法Bに準拠して測定
【０２１４】
新しく押し出したリポソームサイズは、（Ａ）０．６５ＭのスルフェートのＴＥＡ８ＳＯＳ（１１３．０±２３．８ｎｍ）、または（Ｂ）０．６５Ｍのスルフェート基のＤＥＡ８ＳＯＳ（１０３．２±２１．１ｎｍ）のどちらかを封入した（唯一の例外は、試料１３であり、これは、０．４５Ｍのスルフェート基を有した）。（Ａ）から、試料１２および１４、ならびに試料（Ｂ）から試料１５〜１８を誘導し、試料１２、１４、１５および１６は、全リポソームリン脂質１ｍｏｌあたり、４７１ｇの無水イリノテカン遊離塩基（５００ｇの無水イリノテカンＨＣｌに等価）で搭載されており、試料１６〜１８は、リン脂質１ｍｏｌあたり７５０ｇのイリノテカン部分（上で説明した通り、無水遊離塩基に対して）で搭載されている。精製後、ｐＨ調整は、適宜、ならびに表７および８に記載されている通り、１Ｎ  ＨＣｌまたは１Ｎ  ＮａＯＨを使用して行い、ｐＨ６．５または７．２５のどちらかにした。試料１２は、実施例１に記載されている通り調製し、比較目的のため、表８に含まれている。
【０２１５】
これらのデータは、沈殿がないこと、および比較的狭く、再現性の高い粒子サイズ分布となることにより判断すると、これらのリポソームが４℃で最大１年の良好なコロイド安定性を保持していることを示した。第２に、コロイド安定性はまた、高いｐＨおよび薬物対リン脂質の高い比で保管した場合、濃度が一層高い試料の場合にも良好であったことは明白であり、２０ｍｇ／ｍＬおよび４０ｍｇ／ｍＬのイリノテカン塩酸塩三水和物に等価なイリノテカン部分の濃度では、リポソームは安定であり、凝集体形成に耐性があることを示している。
【０２１６】
すべての場合において、イリノテカンは、リポソーム中で、低い漏出および活性な細胞毒性ＳＮ−３８への低い変換率（すなわち、イリノテカンとＳＮ３８との比較によるＳＮ３８の相対量）を伴って、安定的に捕捉された。すなわち、すべての場合において、０．５ｍｏｌ％未満であり、試料１２は例外で０．１ｍｏｌ％未満のＳＮ−３８となった。データは、本明細書に記載されている「薬物滞留性および安定性」方法および「薬物分析」方法によって得られた。
【０２１７】
試料１２および１４の場合、ｌｙｓｏ−ＰＣのレベルの増加は、ｐＨ６．５に調整され、リン脂質１モルあたり、４７１ｇのイリノテカン部分の比（上で説明した通り、５００ｇの無水イリノテカンＨＣｌの等価な量を使用して）で調製された試料において測定され、（全ホスファチジルコリンの）３６〜３７ｍｏｌ％に到達した一方、ｐＨを７．２５に調整すると、リポソームはｌｙｓｏ−脂質形成をそれほど受けなくなり、試料１５の場合、ｌｙｓｏ−ＰＣレベルは、１年後にわずか（全ホスファチジルコリンの）１１ｍｏｌ％にしか近づかない。
【０２１８】
リポソームのｐＨを６．５から７．２５に変えると、コロイド安定性または薬物漏出に及ぼす有害な影響はなかった。
（実施例３）
様々な量のＴＥＡ（ＳＯＳ捕捉剤対イオン）を有する安定化イリノテカンリポソームの保管安定性
【０２１９】
イリノテカンリポソームは、イリノテカンを、八硫酸スクロース（ＳＯＳ）および置換アンモニウム対イオン（例えば、プロトン化ＴＥＡ）を封入するリポソームに搭載することにより調製した。薬物が搭載されているイリノテカンＳＯＳリポソーム中に置換アンモニウムの残留量を変えた影響は、様々な量の封入されている残留置換アンモニウムイオンを含有する複数のイリノテカンＳＯＳリポソームを作製し、４℃で６か月間、冷蔵下でこれらのイリノテカンＳＯＳリポソームを保管し、次に、これらのイリノテカンＳＯＳリポソーム中のＬｙｓｏ−ＰＣの量（ｍｏｌ％）を測定することにより評価した。
【０２２０】
これらのデータは、イリノテカンＳＯＳリポソーム内の置換アンモニウムイオンの量を低減すると、４℃で６か月の冷蔵保管後に、ｌｙｓｏ−ＰＣはより低いレベルになることを実証した。特に、１００ｐｐｍ未満の置換アンモニウムを有する（例えば、２０〜１００ｐｐｍのＴＥＡ）イリノテカンＳＯＳリポソームは、４℃で６か月の冷蔵保管後に、ｌｙｓｏ−ＰＣ形成はより低いレベルとなることを示した。
【０２２１】
リポソーム型イリノテカンスクロソファートの６つのロット（試料２４〜２９）は、本明細書に記載されているプロトコールに従い、本発明のある特定の実施形態に準拠して調製し、１０４６〜１０６４の安定比、それぞれ３：２：０．０１５のモル比のＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥの脂質組成を有した。
【０２２２】
表１０中のｌｙｓｏ−ＰＣの量は、ＨＰＬＣによって決定した（本明細書における方法Ａ）。
【表１０】
2018530563.tif 000020
f  本明細書に記載されている方法Aに準拠して測定
g本明細書に記載されている方法Aに準拠して測定
【０２２３】
リポソーム（１００〜１１５ｎｍ）は、１００ｎｍのポリカーボネート膜（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）を通してＴＥＡ−ＳＯＳ溶液（０．４〜０．５Ｍのスルフェート）中で分散させた脂質を押し出すことにより得られ、浸透圧のバランスを取ったデキストロース溶液に対して、タンジェンシャルフローダイアフィルトレーション（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）緩衝液交換することにより、リポソーム外ＴＥＡ−ＳＯＳから精製し、温度を６８℃まで昇温させて３０分間撹拌することによりイリノテカンを搭載し、迅速に冷却し、緩衝化されている生理学的塩化ナトリウム溶液に対して、タンジェンシャルフローダイアフィルトレーション緩衝液交換することによって、リポソーム外ＴＥＡおよび任意の封入されていない薬物から精製した。イリノテカンスクロソファートリポソーム組成物は、０．２μｍの膜フィルターに通すことによりフィルター滅菌し、滅菌ガラス製バイアルに無菌で分注し、冷蔵条件（５±３℃）下で、インキュベートした。およそ０、３、６、９か月、および一部の場合、１２か月の冷蔵保管時間において、各ロットの二連のバイアルを抜き取り、蒸発散乱検出器を用いるＨＰＬＣ方法を使用して、蓄積したｌｙｓｏ−ＰＣの量に関して分析した。リポソーム組成物はまた、粒子サイズ、イリノテカンおよびリポソームリン脂質の濃度、リポソーム組成物のｐＨ、イリノテカン／スクロソファートのグラム当量比（Ｉｒｉ／ＳＯＳ比）ならびに残留トリエチルアンモニウム（プロトン化ＴＥＡ）（トリエチルアミンとして）により特徴付けた。平均粒子サイズ（Ｄ）および多分散指数（ＰＤＩ）は、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＺｅｔａＳｉｚｅｒ  ＮａｎｏＺＳ（商標）を使用して、ＤＬＳ方法によって決定した。リポソーム組成物中のイリノテカン濃度は、ＨＰＬＣによって決定した。全リン脂質は、硫酸／過酸化水素混合物中のリポソームの消化後に、ブルーリンモリブデン酸塩方法によって分光測光法により決定した。
【０２２４】
薬物／脂質（ＤＬ）比は、リポソーム調製物中の薬物量（無水遊離塩基として）（ｇ）をリポソームリン脂質のモル量によって除算することにより算出した。リポソームにより捕捉されているＳＯＳは、通常の生理食塩水により溶出する、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５ゲル−クロマトグラフィーカラム（ＰＤ−１０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にリポソームを通した後に定量した。イリノテカン／ＳＯＳのグラム当量比を決定するために、三連で溶出したリポソームフラクションの０．１ｍＬのアリコートを、７０％過塩素酸０．０５ｍＬと混合し、１時間、９５〜１００℃で加水分解し、１Ｍの酢酸ナトリウム０．８ｍＬで中和して濾過し、不溶性脂質生成物を除去し、濾液中のスクロソファートにより誘導されるスルフェート基の量を、実質的に方法に記載されている通り、バリウム−ＰＥＧ試薬を使用して、比濁法により定量した。別の組の同一のリポソーム溶出液の三連のアリコートを７０％の酸性にした（０．１ＭのＨＣｌ）水性イソプロパノール中に溶解し、３６５ｎｍで分光測光法によりイリノテカンについてアッセイした。イリノテカン／スクロソファートのグラム当量比（Ｉｒｉ／ＳＯＳ比）は、測定された薬物のモル濃度を測定されたスルフェート基のモル濃度で除算することにより、個々の溶出されたリポソームフラクションにおいて算出した。ｐＨは、小項目「ｐＨ測定」中で記載されている通り測定した。キャピラリーガスクロマトグラフィー（ＧＣ）カラムで勾配温度溶出を利用する、ヘッドスペースＧＣ分離、次いで、水素炎イオン化検出（ＦＩＤ）によりＴＥＡを定量した。結果は、ＴＥＡのｐｐｍ（百万分率）として表される。ＴＥＡのレベルは、標準品に対して外部定量によって決定する。
【０２２５】
５、６、７、１０、１１Ａ、１１Ｂおよび１２におけるデータは、０．４〜０．５ＭのＴＥＡ８ＳＯＳ捕捉剤リポソームに、全リン脂質１ｍｏｌあたり約４００〜６００ｍｇ（例えば、約５００ｇ）のイリノテカン部分を搭載することにより調製したリポソーム型イリノテカン試料から得（約１０００〜１２００の範囲の安定比）、製造後、約７．０〜７．５（例えば、約７．２５）のｐＨであった。これらのリポソーム型イリノテカン試料のそれぞれにおけるｌｙｓｏ−ＰＣの量は、実施例９のＨＰＬＣ方法を使用して、図５〜７に示されている時間点で測定した。
【０２２６】
ｌｙｓｏ−ＰＣ蓄積データ（ｍｇ、ｌｙｓｏ−ＰＣ／リポソーム組成物のｍＬ）は、図５（試料２４〜２６／ロット１〜３）または図６（試料２７〜２９／ロット４〜６）に示されている通り、保管時間に対してプロットした。直線相関が観察され、ｌｙｓｏ−ＰＣ蓄積は、約０．００８ｍｇ／ｍＬ／月〜約０．０６ｍｇ／ｍＬ／月と様々であり、より大きい速度は、より高いＴＥＡ量を有する組成物に特徴的である。保管の１８０日目（約６か月）までに蓄積されたｌｙｓｏ−ＰＣの量は、多点データの線形近似から決定し（図５Ａおよび５Ｂ）、５２３．７ｇ／ｍｏｌに等しいｌｙｓｏ−ＰＣの分子量をとるＰＣのｍｏｌ％として表した。６つのロット（試料２４〜２９；表１０を参照されたい）はすべて、冷蔵保管の１８０日目で２０ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ＰＣを蓄積した。２０ｐｐｍ未満のＴＥＡおよび０．９８より大きなＩｒｉ／ＳＯＳのグラム当量比を有するロットは、最小のｌｙｓｏ−ＰＣ蓄積（１８０日目で、約０．０１５ｍｇ／ｍＬ／月未満のｌｙｓｏ−ＰＣ  −  ３．０ｍｏｌ％またはそれより少ない）を示した。８０ｐｐｍ未満のＴＥＡを有するロットは、約０．０３ｍｇ／ｍＬ／月またはそれより小さな速度でｌｙｓｏ−ＰＣを蓄積し、１８０日目で、７ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ＰＣを有した。１００ｐｐｍの残留ＴＥＡを有するロットは、約０．０６ｍｇ／ｍＬ／月の速度でｌｙｓｏ−ＰＣを蓄積し、１８０日目で、約１０ｍｏｌ％のｌｙｓｏ−ＰＣを有した。
【０２２７】
図７は、データから誘導される線形回帰線と一緒にした、安定化イリノテカンスクロソファートリポソーム組成物中の、ＴＥＡ含量（ｐｐｍ）に対してプロットした、５±３℃で保管したｌｙｓｏ−ＰＣ蓄積（ｍｇ／ｍＬ／月）の速度を示すグラフである。リポソーム型イリノテカンスクロソファートの５つの追加のロットを、実施例３と同様に調製した。調製物は、１ｍＬあたり約４．３ｍｇ／ｍＬの無水イリノテカン遊離塩基となるイリノテカン部分で保管し（無水遊離塩基に対して、上で説明されている通り）、実施例３に記載されている通り、ｌｙｓｏ−ＰＣ形成およびＴＥＡ含量について定期的に分析した。ｌｙｓｏ−ＰＣ蓄積の速度は、各ロットに関して保管時間にわたりｌｙｓｏ−ＰＣデータに当てはめることにより得られる線形回帰線の傾きとして算出され、ＢＤＰ／ＤＰの対のロットの平均したＴＥＡの読取り値と共にＴＥＡ含量に対してプロットした（図６）。グラフから得られる通り、約２５ｐｐｍまたはそれ未満のＴＥＡを有する調製物は、０．０２ｍｇ／ｍＬ／月未満の速度でｌｙｓｏ−ＰＣを蓄積した（１８０日間の期間にわたり、２．５ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ＰＣの増加）。約７０ｐｐｍ未満のＴＥＡを有する調製物は、０．０３３ｍｇ／ｍＬ／月未満の速度でｌｙｓｏ−ＰＣを蓄積し（１８０日間の期間にわたり、４．３ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ＰＣの増加）、すべての調製物は、約１００ｐｐｍ未満のＴＥＡを有しており、０．０６２ｍｇ／ｍＬ／月未満の速度でｌｙｓｏ−ＰＣを蓄積した（１８０日間の期間にわたり、８．０ｍｏｌ％未満のｌｙｓｏ−ＰＣの増加）。
【０２２８】
試料２４、２５および２８はそれぞれ、２０ｐｐｍ未満（例えば、約１０〜２０ｐｐｍ）の置換アンモニウムイオン（プロトン化ＴＥＡ）を有し、４℃で６か月の冷蔵保管後に、最低量のｌｙｓｏ−ＰＣ（２．２〜３ｍｏｌ％のｌｙｓｏ−ＰＣ）が観察された。試料２６と２７とを比較すると、イリノテカンＳＯＳリポソーム中の残留置換アミン捕捉剤対イオン（例えば、プロトン化ＴＥＡ）の量を約３９ｐｐｍから７９ｐｐｍ（１０３％の増加）まで増加させると、１８０日後に観察されるｌｙｓｏ−ＰＣの量の予期せぬ低下を伴った（６．９ｍｏｌ％から５．４ｍｏｌ％へと２２％のｌｙｓｏ−ＰＣの低下）。しかし、イリノテカンＳＯＳリポソーム中の残留置換アンモニウムイオン（例えば、プロトン化ＴＥＡ）の量が７９ｐｐｍ（試料２７）から１００ｐｐｍ（試料２９）までさらに増加させると（すなわち、２７％の増加）、４℃で６か月の冷蔵保管後に、観察されるｌｙｓｏ−ＰＣの量は、さらに８７％の増加（すなわち、試料２７での５．４ｍｏｌ％から試料２９での１０．１ｍｏｌ％まで）を伴った。
（実施例４）
イリノテカンとスクロソファートとの相互作用
【０２２９】
図８は、実施例４に記載されている様々なスクロソファート（ＳＯＳ）の割合で、水溶液中でイリノテカン塩酸塩とトリエチルアンモニウムスクロソファートを一緒にすることにより形成される沈殿物中のイリノテカンとスクロソファートのグラム当量を示すグラフである。
【０２３０】
イリノテカン塩酸塩の溶液が、トリエチルアンモニウムスクロソファートを含有するリポソームと一緒にされる場合、水素イオンは捕捉され得、イリノテカンスクロソファート塩が形成され得る。イリノテカンとトリエチルアンモニウムスクロソファートとの間の反応を検討するため、本発明者らは、２５ｍＭ（１６．９３ｍｇ／ｍＬ）のイリノテカン塩酸塩三水和物（米国薬局方）水溶液および２５０ｍｅｑ／Ｌ（３１．２５ｍＭ）のトリエチルアンモニウムスクロソファート（ＴＥＡ−ＳＯＳ）溶液を調製した（「方法」の項目に実質的に記載されている通り）。イリノテカン塩酸塩溶液のアリコートを水により希釈し、６５℃に加熱し、ＴＥＡ−ＳＯＳ溶液のアリコートと一緒にして、両方の化合物を合わせると全体が２５ｍｅｑ／Ｌに等しいグラム当量濃度で、９：１〜１：９の間のグラム当量比となる一連のイリノテカン−ＳＯＳを生成した。この試料をボルテックスすることにより迅速に混合し、３０分間、６５℃でインキュベートし、氷水で冷却し、４〜６℃で一晩、平衡にした。すべての試料において、沈殿が観察された。その翌日、試料を１００００×ｇで５分間、および１４０００×ｇでさらに５分間、遠心分離にかけて、濁りのない上澄み液（白色からわずかに褐色の多量のゆるい沈殿物の上）を単離し、実施例に実質的に記載されている通り、沈殿していないイリノテカンおよびＳＯＳの量を分析して、沈殿物の量および組成を決定した。結果は、試料中のＳＯＳのグラム当量パーセントに対してプロットした（図８）。ＳＯＳが２０〜８０当量％の範囲では、両方の構成成分に関するグラフは、５０当量％の値で出会う２つの直線分岐からなり、このことは、イリノテカンおよびスクロソファートが、スクロソファートの１つの硫酸エステル基あたり１つのイリノテカン分子の化学量論を有する不溶性塩（すなわち、１つのスクロソファート（ＳＯＳ）分子あたり、８つの分子のイリノテカン（ＩＲＩ））を形成したことを示している：
8  IRI.HCl＋TEA8SOS→(IRI.H)8SOS↓＋TEACl
【０２３１】
プロトン化イリノテカン分子とスクロソファート陰イオンの分子サイズおよび形状に顕著な差異があるにもかかわらず、それらの塩は、どちらか一方の構成成分が大過剰にある場合でさえも、近い化学量論（１つのスクロソファート分子に対して８つの分子のプロトン化イリノテカン）を驚くほど維持していた（図８）。したがって、イリノテカンスクロソファートは、溶解性に乏しい、沈殿形態またはゲル形態で、リポソーム中に存在することができる。沈殿した塩は、その厳格な化学量論を維持するという事実は、その工程が、スクロソファートのほとんどすべてまたは実質的にすべてのスルフェート基が薬物分子に結合している状態まで進むことを可能にする。実施例６のイリノテカン−スクロソファートのグラム当量比の測定と一致して、一部の実施形態では、本発明の安定なリポソームを得るためのイリノテカンを搭載する工程は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％、および一部の場合、実質的にすべての遊離リポソームスクロソファートが、そのイリノテカン塩の沈殿および／またはゲル化によりリポソーム水相から失われるまで、化学量論の薬物塩のリポソーム沈殿物を含むことができる。
（実施例５）
イリノテカンスクロソファートの調製および溶解度決定。
【０２３２】
１．６４ｇのイリノテカン塩酸塩三水和物の量を１Ｎ  ＨＣｌ  ０．００８ｍＬにより酸性にした水１６０ｍＬに加え、薬物が溶解するまで、撹拌しながら６５℃の水浴上で加熱した。強力に撹拌しながら、０．４６Ｍ（スルフェート濃度に基づく）のトリエチルアンモニウムスクロソファート５ｍＬを加え、５分間、さらに撹拌した。４〜６℃で一晩、保管した後、黄色の油状沈殿物は固化して、脆い塊になった。この塊をガラス棒により粉末にし、ふわふわとしたオフホワイトの沈殿物が得られ、２５日間、冷蔵下でインキュベートした。この沈殿物を遠心分離により分離し、上澄み溶液を廃棄した。ペレットを５体積分の脱イオン水に再懸濁させて、遠心分離により沈殿させた。懸濁液のｐＨが約５．８になるまで、この洗浄ステップをさらに２回、繰り返した。最後に、このペレットを等体積の脱イオン水に再懸濁すると、約２６ｍＬ、または４６．０ｍｇ／ｍＬ（遊離塩基）（理論の８４％収率）となるイリノテカン含量を有する生成物が得られた。生成物のアリコートを１Ｎ  ＨＣｌに溶解し、イリノテカン（７０％水性イソプロパノール−０．１Ｎ  ＨＣｌ中、３６５ｎｍでの分光測光法による）について、および硫酸バリウム比濁アッセイを使用して、希釈（１：４）過塩素酸中で加水分解した後のスルフェートについて分析した。イリノテカンとＳＯ４とのモル比は、１．０２０±０．０１１であることが分かった。イリノテカンスクロソファート懸濁液のアリコートを脱イオン水に加えて、０．９３、１．８５および３．７１ｍｇ／ｍＬの最終薬物塩濃度にした。この試料を４〜６℃で２２時間、かき混ぜながらインキュベートし、この固体材料を１４０００ｇで１０分間、遠心分離により除去し、上済み液をイリノテカンについて分光測光法により分析した。溶液中のイリノテカンの濃度は、それぞれ、５８．９±０．９０マイクロｇ／ｍＬ、６３．２±０．６マイクロｇ／ｍＬおよび６３．４±１．３マイクロｇ／ｍＬであることが分かり、これらは、平均で、イリノテカンスクロソファートのモル溶解度が、１．３２×１０−５Ｍであることに相当する。
（実施例６）
様々なイリノテカンリポソーム
【０２３３】
この実施例の実験はすべて、２５ｍｍの押し出し器、中空繊維、または初期透析濾過ステップに設定したタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）、マイクロスケールでの薬物搭載、および最後に透析濾過するために設定したＴＦＦ、次いでＥＡＶ濾過を使用して行った。薬物を搭載した材料の体積に制限があるために、希釈後の最終濾過は、２つのＥＢＡフィルターの代わりに、バイオセーフティーキャビネット中で、２０ｃｍ２のＥＡＶフィルターを使用して行った。
【表１１】
2018530563.tif 000021
h  本明細書に記載されている方法Aに準拠して測定
【０２３４】
表１１を参照して、異なる量のｌｙｓｏ−ＰＣを有する一連の異なるイリノテカンリポソームを調製した。他に示さない限り、イリノテカンリポソームは、３：２：０．０１５のモル比で、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＰＥＧ２０００ＤＳＰＥからなるベシクル中に、イリノテカン八硫酸スクロースを封入した。
【０２３５】
試料３０（ロット１）は、実施例１に記載されている通りリポソームを調製し（この実施例に示されている場合を除く）、次に、リポソームを押し出した後、７２℃で８時間、押し出したリポソームを保持し、８時間の終了時にｐＨを６．２〜６．９に調整することにより得て、約４５ｍｏｌ％のｌｙｓｏ−ＰＣ（すなわち約１．７ｍｇ／ｍＬ）を有する組成物とした。ＭＬＶ調製の時間を、時間０と見なした。この実験は、ベースライン実験１からアリコートを使用して行った。試料３０（ロット１）の組成物は、より低いＤＳＰＣ：コレステロールのｍｏｌ比（他の試料での３：１の代わりに約２：１）を有するリポソームを用いて調製した。得られたイリノテカンリポソーム組成物は、高レベルのｌｙｓｏ−ＰＣを有した（すなわち、１ｍｇ／ｍＬより多い、および４０ｍｏｌ％より多いｌｙｓｏ−ＰＣ）。
【０２３６】
試料３１ａおよび３１ｂ（ロット２ａおよび２ｂ）は、イリノテカン薬物の搭載前のリポソーム中のＴＥＡ−ＳＯＳ溶液濃度を向上させた影響、および得られたイリノテカンリポソーム組成物の特徴に及ぼす、イリノテカン薬物搭載比を１５％低下させた影響を試験するために修正を加え、実施例１の工程を使用して調製した。試料３１ａ（２ａ）の材料は、０．５Ｍのスルフェート基濃度でＴＥＡ−ＳＯＳの溶液を封入するＤＳＰＣおよびコレステロール（表１１に提示されている比で）を含むベシクルを有するリポソームを形成して多層ラメラベシクル（ＭＬＶ）を形成し、これらのリポソームを５１０ｇの無水イリノテカン遊離塩基／ｍｏｌ（ＰＬ）の量のイリノテカン塩酸塩溶液に接触させて薬物をリポソームに搭載することにより得た。試料３１ｂ（２ｂ）の材料は、４０℃で１週間、試料３１ａ（２ａ）のリポソーム組成物を維持し、次に、この試料を再度、分析することにより得た。得られた、試料３１ａおよび３１ｂ（２ａおよび２ｂ）のイリノテカンリポソーム組成物はどちらも、非常に低いレベルのｌｙｓｏ−ＰＣを含有した（すなわち、試料３１ａ（２ａ）中では、約０．０６ｍｇ／ｍＬ未満または４ｍｏｌ％、および試料３１ｂ（２ｂ）では、約０．１７５ｍｇ／ｍＬ）。
【０２３７】
試料３２ａおよび３２ｂ（それぞれ、ロット３ａおよび３ｂ）は、製剤の緩衝液のｐＨとイリノテカン薬物の搭載比の低下とを組み合わせた影響を検討するために選択した修正を用いて、実施例１の工程を使用して調製した。試料３２ａ（３ａ）の材料は、ＴＥＡ−ＳＯＳ溶液の溶液を封入するＤＳＰＣおよびコレステロール（表１０に提示されている比で）を含むベシクルを有するリポソームを形成して、ＭＬＶを形成し、約６．５０のｐＨ（試料３０（１）での約７．２５のｐＨの代わり）をもたらすよう選択された緩衝液中で、これらのリポソームをイリノテカンに接触させて、薬物をリポソームに搭載し、表１１に示されているイリノテカン薬物搭載比（試料３３（４）および３４（５）よりも小さなイリノテカン薬物搭載比）でリポソーム内にイリノテカン八硫酸スクロースを形成することにより得た。試料３２ｂ（３ｂ）の材料は、４０℃で１週間、試料３ａの組成物を維持し、次に、この試料を再度、分析することにより得た。得られたイリノテカンリポソーム組成物３２ａ（３ａ）および３２ｂ（３ｂ）はどちらも、それぞれ、０．０７６ｍｇ／ｍＬおよび０．５７３ｍｇ／ｍＬという低いレベルのｌｙｓｏ−ＰＣを含有した。
【０２３８】
試料３３（４）および３４（５）は、実施例１に記載されている方法に従って調製した。試料３３（４）および３４（５）の材料は、ＴＥＡ−ＳＯＳ溶液の溶液を封入するＤＳＰＣおよびコレステロール（表１１に提示されている比で）を含むベシクルを有するリポソームを形成してＭＬＶを形成し、約７．２５のｐＨ（試料３ａおよび３ｂでの約６．５のｐＨの代わり）をもたらすよう選択された緩衝液中で、これらのリポソームをイリノテカンに接触させて、薬物をリポソームに搭載し、５００ｇのイリノテカン部分（無水遊離塩基に対する）／リン脂質１ｍｏｌでリポソーム内にイリノテカン八硫酸スクロースを形成することにより得た。得られたイリノテカンリポソーム組成物３ａおよび３ｂはどちらも、それぞれ、０．２４ｍｇ／ｍＬおよび０．７９ｍｇ／ｍＬという低いレベルのｌｙｓｏ−ＰＣを含有した。
【０２３９】
図１２は、試料３３（４）（円、下側の線）および試料３４（５）（「＋」のデータ点、上側の線）において測定された、ｌｙｓｏ−ＰＣの量を示すグラフである。ｌｙｓｏ−ＰＣ形成速度は、試料３３（４）より試料３４（５）における方が大きかった。図１２におけるデータ点への直線当てはめは、以下の通りであった：
試料３３（４）：ｌｙｓｏ−ＰＣ、ｍｇ／ｍＬ＝０．０５１３５９６＋０．００８４７１４×蓄積期間（Ａｇｅ）
試料３４（５）：ｌｙｓｏ−ＰＣ、ｍｇ／ｍＬ＝０．１７６６７３６＋０．０２７９７８３×蓄積期間
試料３３および３４における、イリノテカンリポソーム調製物の合計のｌｙｓｏ−ＰＣ濃度は、それぞれ、２２か月で、０．２４ｍｇ／ｍＬおよび０．７９ｍｇ／ｍＬであった。
（実施例７）
イリノテカンリポソーム注射剤（ＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標））
【０２４０】
保管に安定なイリノテカンリポソーム調製物の好ましい例の１つは、ＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）（イリノテカンリポソーム注射剤）（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）として上市されている製品である。ＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）製品は、静脈内使用向けに、イリノテカン塩酸塩三水和物をリポソーム分散液に製剤化した、トポイソメラーゼ阻害剤である。ＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）製品は、ゲムシタビンをベースとする治療後に疾患進行した後に、膵臓の転移性腺癌を有する患者を処置するために、フルオロウラシルおよびロイコボリンと組み合わせて適応されている。
【０２４１】
ＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）製品の推奨用量は、２週間毎に１回、９０分間にわたる、静脈内注入によって投与される、７０ｍｇ／ｍ２である。ＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）製品は、ある特定の形態の膵臓がんを処置するために、ロイコボリンおよびフルオロウラシルと組み合わせて投与される。ＵＧＴ１Ａ１＊２８アレルが同型接合体であることが知られている、これらの膵臓がん患者における、ＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）製品の推奨される開始用量は、９０分間かけて、静脈内注入により投与される５０ｍｇ／ｍ２である。その後のサイクルでは、ＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）製品の用量を耐容される７０ｍｇ／ｍ２まで増量する。標準の上限界を超える血清ビリルビンを有する患者の場合、ＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）製品の推奨用量はない。
【０２４２】
ＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）製品は、患者に以下の通り投与される。まず、ＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）製品の算出した体積をバイアルから減算する。次に、この量のＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）製品を５００ｍＬの５％のデキストロース注射液（米国薬局方）または０．９％塩化ナトリウム注射液（米国薬局方）に希釈し、穏やかにひっくり返すことにより混合する。この希釈液は、光から保護されるべきである。次に、この希釈液を、室温で保管した場合、調製の４時間以内に、または冷蔵条件［２℃〜８℃（３６ｏＦ〜４６ｏＦ）］下で保管した場合、調製の２４時間以内に投与する。この希釈溶液を投与前に室温に戻すことができ、凍結すべきではない。次に、この希釈液を、インラインフィルターを使用することなく、９０分間かけて、注入し、未使用部分は廃棄する。
【０２４３】
ＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）製品は、静脈内使用向けに、トポイソメラーゼ阻害剤であるイリノテカン塩酸塩三水和物がリポソーム分散液に製剤化されたものである。イリノテカン塩酸塩三水和物の化学名は、（Ｓ）−４，１１−ジエチル−３，４，１２，１４−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−３，１４−ジオキソ１Ｈ−ピラノ［３’，４’：６，７］−インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−９−イル−［１，４’ビピペリジン］−１’−カルボキシレート一塩酸塩三水和物である。実験式は、Ｃ３３Ｈ３８Ｎ４Ｏ６・ＨＣｌ・３Ｈ２Ｏであり、分子量は、６７７．１９ｇ／モルである。その分子構造は、以下である：
【化６】
2018530563.tif 000022
【０２４４】
ＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）製品は、白色からわずかに黄色の不透明な等張性の滅菌リポソーム分散液として供給されている。１０ｍＬ単回用量バイアルはそれぞれ、１ｍＬあたり、４．３ｍｇ／ｍＬの無水イリノテカン遊離塩基の濃度で、４３ｍｇのイリノテカン遊離塩基の当量を含有する（すなわち、イリノテカン部分４．３ｍｇ／ｍＬ）。リポソームは、八硫酸スクロースの塩として、ゲル状態または沈殿状態のイリノテカンを含有する水性空間を封入する、直径がおよそ１１０ｎｍの単層ラメラ脂質二重層ベシクルである。ベシクルは、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）６．８１ｍｇ／ｍＬ、コレステロール２．２２ｍｇ／ｍＬおよびメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）０．１２ｍｇ／ｍＬから構成される。ｍＬはそれぞれ、バッファとして、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）４．０５ｍｇ／ｍＬ、および等張試薬として、塩化ナトリウム８．４２ｍｇ／ｍＬも含有する。
【０２４５】
イリノテカンリポソーム注射剤は、脂質二重層ベシクルまたはリポソーム中に封入されているトポイソメラーゼ１阻害剤である。トポイソメラーゼ１は、一本鎖切断を誘発することにより、ＤＮＡにおけるねじれ歪みを緩和する。イリノテカンおよびその活性な代謝産物であるＳＮ−３８は、トポイソメラーゼ１−ＤＮＡ複合体に可逆的に結合し、一本鎖切断の再ライゲーションを阻止して、曝露時間依存性の二本鎖ＤＮＡ損傷および細胞死をもたらす。ヒト腫瘍異種移植片を有するマウスの場合、イリノテカンＨＣｌより５倍少ないイリノテカンＨＣｌ当量用量で投与されるイリノテカンリポソームは、同様のＳＮ−３８の腫瘍内曝露を実現した。
【０２４６】
全イリノテカンおよび全ＳＮ−３８の血漿薬物動態は、集団薬物動態解析を使用して、単剤として、または併用化学療法の一部として、５０〜１５５ｍｇ／ｍ２の間の用量および３５３名のがん患者で、ＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）製品の投与を受けるがん患者において評価した。
【０２４７】
単剤として、または併用化学療法の一部として、７０ｍｇ／ｍ２でＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）製品を投与した後の、全イリノテカンおよび全ＳＮ−３８の薬物動態パラメータは、以下に示されている。
【表１２】
2018530563.tif 000023
【０２４８】
５０〜１５５ｍｇ／ｍ２の用量範囲にわたり、全イリノテカンのＣｍａｘおよびＡＵＣは用量と共に増加する。さらに、全ＳＮ−３８のＣｍａｘは、用量と比例して増加する。しかし、全ＳＮ−３８のＡＵＣは、用量とともに比例的未満で増加する。
【０２４９】
イリノテカンリポソームの直接測定により、イリノテカンの９５％はリポソームに封入されているままであり、すべての形態と封入形態との間の比は、投薬後の０〜１６９．５時間の時間と共に変化することはないことを示した。
【０２５０】
ＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）製品は、２℃〜８℃（３６ｏＦ〜４６ｏＦ）で保管すべきであり、光から保護すべきであり、凍結すべきではない。
【０２５１】
複数のＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）製品調製物を長期安定性に関して検討し、２〜８℃（冷蔵条件）で１２〜３６か月の保管にわたり分析した。結果を、以下に記載されている通り、図９、１０、１１Ａおよび１１Ｂのグラフにプロットしている。一検討では、粒子サイズ（図９）および粒子サイズ分布（図１０）は、１２〜３６か月にわたり、１２種のＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）製品調製物について測定した。すべての試料に関して、ＰＤＩは、十分に０．１未満および約０．０５未満のままであった。別の検討では、ｐＨ（図１１Ａ）を、１２〜３６か月にわたり、１３種の異なるＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）製品調製物について測定した。ｐＨは、すべての試料に関して、検討中、６．８より高いままであった。別の検討では、ｌｙｓｏ−ＰＣの量（図１１Ｂ）を、冷蔵保管の間、１６種の異なるＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）製品調製物について、１２か月にわたり測定した。ｌｙｓｏ−ＰＣの量は、すべての試料に関して、１ｍｇ／ｍＬ未満のままであった。
【０２５２】
保管の異なる時間点におけるＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）製品の実施形態における、イリノテカン遊離塩基濃度を決定する目的で、イリノテカン遊離塩基は、「実施例」の項目に提示されている通り定量する。保管の異なる時間点におけるＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）製品の実施形態の脂質組成を決定する目的で、脂質は、当分野において標準的な標準ＨＰＬＣ法を使用して定量する。
【０２５３】
保管の異なる時間点におけるＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）製品の実施形態のリポソームの平均粒子サイズ（Ｄ）および多分散指数（ＰＤＩ）を決定する目的で、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＺｅｔａＳｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（商標）と組み合わせたＤＬＳ方法を使用した。
【０２５４】
保管の異なる時間点におけるＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）製品の実施形態における、ｌｙｓｏ−ＰＣの存在を決定する目的で、ｌｙｓｏ−ＰＣは、「実施例」の項目に記載されている通り定量する。さらに、本発明の文脈内において、ｌｙｓｏ−ＰＣが本明細書に記載されているＨＰＬＣによって定量することができることもやはり企図されている。
（実施例８）
トポテカンおよびビノレルビンリポソーム
【０２５５】
この保管安定性検討の目的は、４℃で保管した場合の、八硫酸スクロース捕捉剤により調製された、トポテカン（ＴＰＴ）リポソームおよびビノレルビン（ＶＮＢ）リポソームの物理的および化学的安定性のなんらかの変化を決定することであった。具体的には、この検討は、リポソーム製造の間に、リン脂質１ｍｏｌあたりのトポテカンまたはビノレルビンとリン脂質との比を以下に示されているように維持しながら、八硫酸スクロース（ＳＯＳ）捕捉剤濃度を、０．６Ｍから０．４５Ｍのスルフェート基へと低減すると、リポソーム試料中に存在するｌｙｓｏ−ＰＣの量に影響を及ぼすかどうかを試験した。同様に、ｐＨを６．５から７．５に向上すると、リポソーム組成物中のｌｙｓｏ−ＰＣの存在が低減するかどうかを決定するため、このようなｐＨ向上の影響を試験した。３：２：０．０１５のモル比でＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）およびＰＥＧ−ＤＳＰＥを含有するリポソーム中に、ＳＯＳ捕捉剤を用いて、ＴＰＴおよびＶＮＢを封入した。検討した製剤パラメータは、以下を含む：溶液ｐＨ（６．５〜７．５）、リポソーム調製の間の八硫酸スクロース捕捉剤の濃度（０．４５〜０．６Ｍのスルフェート）、封入薬物（ＴＰＴまたはＶＮＢ）、および薬物と脂質との比（リポソーム搭載の間のリン脂質１ｍｏｌあたり５００ｇのＴＰＴ  ＨＣｌ；ＶＮＢの場合、リポソーム搭載の間のリン脂質１ｍｏｌあたり３５０〜４５０ｇのＶＮＢ部分）。この安定性検討中にモニタリングされたリポソームの様々な物理化学特性は、以下であった：リポソームサイズ、薬物とリン脂質との比、薬物封入効率、一般的な外観およびｌｙｓｏ−脂質形成。
【０２５６】
ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）およびＰＥＧ−ＤＳＰＥは、それぞれ、３：２：０．０１５のモル比に相当する量（７９０．１５ｍｇ／２５７．８ｍｇ／１４．０ｍｇ）で秤量した。脂質をクロロホルム／メタノール（４／１、体積／体積）に溶解して、完全に混合し、２つのアリコート（ＡおよびＢ）に分割した。各試料を６０℃で回転式蒸発器を使用して、蒸発乾固した。室温で１２時間、真空下（１８０μｔｏｒｒ）に置くことによって、脂質から残留クロロホルムを除去した。乾燥脂質を６０℃でエタノールに溶解し、適切な濃度の事前加温したＴＥＡ８ＳＯＳを加えて、最終的なアルコール含量を１０％（体積／体積）とした。全リン脂質濃度は、およそ７５ｍＭであった。脂質溶液は、０．１μｍのポリカーボネート膜（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ（商標））を通して１０回、押し出して、９５〜１１５ｎｍの典型的な平均直径を有するリポソームを生成した。押し出したリポソームのｐＨは、必要に応じて、必要な場合、ｐＨ６．５に調整した（１Ｎ  ＮａＯＨにより）。リポソームは、イオン交換クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーとを組み合わせることにより精製した。まず、Ｄｏｗｅｘ（商標）ＩＲＡ９１０樹脂を１Ｎ  ＮａＯＨにより処理し、次いで、脱イオン水により３回、洗浄し、次に、３Ｎ  ＨＣｌにより３回、洗浄し、次に、水により複数回、洗浄した。溶出したフラクションの導電率をフローセル導電率計測器（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を使用することにより測定した。フラクションは、導電率が１５μＳ／ｃｍ未満である場合、さらなる精製が許容可能であると見なした。次に、リポソーム溶出液を脱イオン水により平衡にしたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに適用し、採集したリポソームフラクションの導電率（通常、１μＳ／ｃｍ未満）を測定した。４０％デキストロース溶液を加えて、５％（重量／重量）の最終濃度を達成し、保存溶液（０．５Ｍ、ｐＨ６．５）からのバッファ（Ｈｅｐｅｓ）を１０ｍＭの最終濃度になるまで加えた。
【０２５７】
トポテカン塩酸塩の保存溶液は、１０ｍＬの脱イオン水中に５０ｍｇを溶解することにより調製した。薬物は、表１３の結果に各製剤に関して表示されている薬物／脂質の比でリポソーム溶液に加えた。ＴＰＴ搭載に関しては、ｐＨは搭載前に、ｐＨ６．０に調整した。ビノレルビンは、薬局から市販の米国薬局方注射溶液から直接添加し、得られた混合物のｐＨは、加熱前に、１Ｎ  ＮａＯＨを用いて、６．５に調整した。薬物搭載は、リポソーム／薬物混合物を３０分間、６０℃に加熱することによって開始した。この溶液を、水浴から取り出した際に、氷冷水に浸けることにより、急速に冷却した。リポソーム外薬物は、Ｈｅｐｅｓ（１０ｍＬ）により緩衝化した生理食塩水（ＨＢＳ）（ｐＨ６．５）により平衡にして溶出した、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ７５カラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィーにより除去した。ＨＰＬＣによりイリノテカンについて、およびＢａｒｔｌｅｔｔの方法（ホスフェートの決定を参照されたい）によりホスフェートについて試料を分析した。
【０２５８】
保管については、試料を４ｍＬのアリコートに分割し、必要な場合、１Ｎ  ＨＣｌまたは１Ｎ  ＮａＯＨを使用してｐＨを調整し、無菌条件下で滅菌濾過し、滅菌クリアガラス製バイアルに充填して、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）製の裏打ちしたねじ付キャップを用いてアルゴン下で密封し、４℃にサーモスタット制御した冷蔵庫に入れた。定めた時間点に、アリコートを各試料から抜き取り、外観、サイズ、薬物／脂質の比、ならびに薬物および脂質の化学的安定性に関して試験した。リポソームサイズは、９０度の角度でのＣｏｕｌｔｅｒ  Ｎａｎｏ−Ｓｉｚｅｒを使用する動的光散乱法によって希釈試料中で決定し、キュムラント法によって得た平均±標準偏差（ｎｍ）として表した。
【０２５９】
比較安定性検討からの結果を表１３に提示している。
【表１３】
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i  本明細書に記載されている方法Bに準拠して測定
j  全リン脂質1molあたり500gのトポテカンHCl
【０２６０】
トポテカンを搭載したリポソーム中のｌｙｓｏ−脂質の生成に及ぼす保管媒体のｐＨの影響は、試料１９および２０では観察されなかった。試料１９をｐＨ６．５で保管し、試料２０をｐＨ７．２５で保管した場合でさえも、試料１９と２０における製剤のどちらも、９か月後に３０ｍｏｌ％に近いｌｙｓｏ−脂質を示した。
【０２６１】
両方のリポソーム型カンプトテシンとは対照的に、リポソーム型ビノレルビンは、測定されたｌｙｓｏ−脂質の最高の量が試料２１においてであり、９か月後に９．５ｍｏｌ％のｌｙｓｏ−脂質を有したという点で、脂質の加水分解に対して一層抵抗性があった。本発明者らは、それほど顕著ではないが、安定比および保管媒体のｐＨへの依存性を検出することもできる。安定比がより高いと、脂質の加水分解が低減された（試料２１と２３とを比較）。７．２５のｐＨもやはり、観察される脂質の加水分解の量を低減させた（試料２１と２２とを比較）。
（実施例９）
Ｌｙｓｏ−ＰＣを測定するためのＨＰＬＣ方法（「方法Ａ」）
【０２６２】
図１１Ｂおよび１２のデータを得るために試験したイリノテカン八硫酸スクロースリポソーム調製物中のｌｙｓｏ−ＰＣの量は、蒸発光散乱法による検出を用いるＨＰＬＣを使用して得た。好適なＨＰＬＣ方法（本明細書において「方法Ａ」と呼ばれる）は、薬物生成物中の、ステアリン酸、ｌｙｓｏ−ＰＣ、コレステロールおよびＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）の量を測定するために使用される定量的方法である。リポソームは、メタノール−テトラヒドロフラン溶液を使用すると、それらの個々の脂質構成成分に解離される。これらの脂質構成成分は、蒸発光散乱検出器を装備した逆相高圧液体クロマトグラフィーを使用して定量する。
試料および標準品の調製
標準品の調製：
ＬｙｓｏＰＣ
【０２６３】
５点標準曲線は、適量のＬｙｓｏＰＣを８５：１５のメタノール−テトラヒドロフランを用いて、４、８、２０、３２および４０μｇ／ｍＬの目標最終濃度まで希釈することにより調製する。
ステアリン酸
【０２６４】
５点標準曲線は、適量のステアリン酸を８５：１５のメタノール−テトラヒドロフランを用いて、２、４、１０、１６および２０．４μｇ／ｍＬの目標最終濃度まで希釈することにより調製する。
コレステロール
【０２６５】
５点標準曲線は、適量のコレステロールを８５：１５のメタノール−テトラヒドロフランを用いて、９０、１４４、１８３．７、２２４．９および２６６．６μｇ／ｍＬの目標最終濃度まで希釈することにより調製する。
ＤＳＰＣ
【０２６６】
５点標準曲線は、適量のＤＳＰＣを８５：１５のメタノール−テトラヒドロフランを用いて、２２０、３５２、４４９、５４９．８および６５１．７μｇ／ｍＬの目標最終濃度まで希釈することにより調製する。
アッセイ対照
【０２６７】
アッセイ対照は、希釈剤（８５：１５のメタノール−テトラヒドロフラン）中に、ステアリン酸を９．０μｇ／ｍＬおよび１８．０μｇ／ｍＬの目標最終濃度まで希釈することにより調製する。
試料調製：
【０２６８】
試料は、８５：１５のメタノール−テトラヒドロフラン溶液中に、各試料を４７５μｇ／ｍＬの目標最終ＤＳＰＣ濃度まで希釈することにより調製する。
溶液安定性
【０２６９】
試験用試料の標準品およびアッセイ対照は、周囲温度で保管した場合、最大４８時間、溶液中で許容可能な安定性があることを実証した。
機器および機器パラメータ
【０２７０】
好適な高圧クロマトグラフィーシステムは、適切なピーク検出を確実とするよう、必要な場合、操作全体を通して、ゲインおよびフィルター設定を変更することが可能な蒸発光散乱検出器を装備した。機器操作パラメータは、表１４に列挙されている。
【表１４】
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【表１５】
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【０２７１】
各脂質濃度は、標準曲線に対して試料ピーク面積を分析することにより決定する。二次多項式（二次曲線）の傾向線を使用して、ｌｙｓｏ−ＰＣおよびステアリン酸の脂質濃度を算出する。直線の傾向線を使用して、ＤＳＰＣおよびコレステロールの脂質濃度を算出する。
【０２７２】
代表的なクロマトグラムが、図１３Ａおよび図１３Ｂに示されている。
【０２７３】
本明細書に引用されている参照はすべて、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【国際調査報告】
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