(57)【要約】  本発明は式Ｉ、式中−同一または異なるＥ１およびＥ２は、それぞれ別々に、被分析物の少なくとも１つのエピトープを含むペプチド配列を表し；同一または異なるＸおよびＹは、それぞれ別々にリンキングアームを表す、−担体分子は可溶性であり、かつ−Ｚは、担体分子との結合前にチオール機能を有するアミノ酸誘導体を表す、ビエピトープ化合物に関する。本化合物を含有する組成物、およびかかる化合物または本化合物を含有する組成物の、イムノアッセイにおける対照または標準としての使用、本化合物または本化合物を含有する組成物を対照または標準として用いる方法、ならびに最後に、本化合物または本化合物を含有する組成物を含む、イムノアッセイ実施するためのキットにも関する。【選択図】なし
2018501238.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）のビエピトープ化合物であって、
2018501238.tif 000013
式中、
−  Ｅ１およびＥ２は、同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立して、被分析物の少なくとも１つのエピトープを含むペプチド配列を表し；かつ
−  ＸおよびＹは、同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立してリンカーアームを表し、
−  担体分子は可溶性であり、かつ
−  Ｚは、担体分子との結合前にチオール機能を有するアミノ酸誘導体を表す、化合物。
【請求項２】
リンカーアームＸおよびＹが、それぞれ、一方がＥ１またはＥ２とであり、他方がＺとである、二つのペプチド結合−ＣＯ−ＮＨ−を形成するアミノ酸誘導体である、請求項１に記載の式（Ｉ）のビエピトープ化合物。
【請求項３】
リンカーアームＸおよびＹが、同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立して１以上のアミノ酸誘導体を含む、請求項２に記載の式（Ｉ）のビエピトープ化合物。
【請求項４】
Ｚが、システイン誘導体、ホモシステイン誘導体およびペニシラミン誘導体から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の式（Ｉ）のビエピトープ化合物。
【請求項５】
担体分子が、その分子量が２０ｋＤａと７００ｋＤａとの間、好ましくは６０ｋＤａと２５０ｋＤａとの間であるタンパク質である、請求項１から４のいずれか一項に記載の式（Ｉ）のビエピトープ化合物。
【請求項６】
担体分子がウシ血清アルブミンである、請求項５に記載の式（Ｉ）のビエピトープ化合物。
【請求項７】
Ｅ１およびＥ２が、心筋トロポニンＩエピトープまたはプロディフェンシン−Ａ６エピトープの少なくとも１つを含むペプチド配列である、請求項１から６のいずれか一項に記載の式（Ｉ）のビエピトープ化合物。
【請求項８】
水、バッファーまたは生物学的流体溶液中に請求項１から７のいずれか一項に記載の式（Ｉ）のビエピトープ化合物を含有する組成物。
【請求項９】
イムノアッセイにおける対照または標準としての、請求項１から７のいずれか一項に記載の化合物または請求項８に記載の組成物の使用。
【請求項１０】
心筋トロポニンＩイムノアッセイまたはプロディフェンシン−Ａ６イムノアッセイにおける対照または標準としての、請求項１から７のいずれか一項に記載の化合物または請求項８に記載の組成物の使用。
【請求項１１】
被分析物を含有する可能性のある被検試料中で、イムノアッセイにより前記被分析物を検出するための方法であって、
ｉ．  前記被検試料を、被分析物の結合パートナーの１以上と接触させることによるイムノアッセイ検査、
ｉｉ．  陽性対照として請求項１から７のいずれか一項に記載の式（Ｉ）のビエピトープ化合物または請求項８に記載の組成物を、前記被分析物の結合パートナーの１以上と接触させることにより、イムノアッセイ検査の信頼性を検証する検査、
ｉｉｉ．  信頼性検証検査が陽性の場合、イムノアッセイ検査を読みとること、
ｉｖ．  ステップｉのイムノアッセイ検査により得られるシグナルが、イムノアッセイ検査の検出閾値より大きい場合に、被検試料中に前記被分析物が存在すると決定することを含む方法。
【請求項１２】
被分析物が心筋トロポニンＩまたはプロディフェンシン−Ａ６である、請求項１１に記載のイムノアッセイにより被分析物を検出するための方法。
【請求項１３】
被分析物を含有する可能性のある被検試料中で、イムノアッセイにより前記被分析物を定量化するための方法であって、
ｉ．  前記被検試料を、被分析物の結合パートナーの１以上と接触させることによるイムノアッセイ検査
ｉｉ．  陽性対照を、前記被分析物の結合パートナーの１以上と接触させることにより、イムノアッセイの信頼性を検証する検査、
ｉｉｉ．  信頼性検証検査が陽性の場合、イムノアッセイ検査を読みとること、および
ｉｖ．  イムノアッセイ検査のシグナルを、請求項１から７のいずれか一項に記載の式（Ｉ）のビエピトープ化合物または請求項８に記載の組成物を用いて事前に得た標準曲線と比較することにより、被検試料中の前記被分析物の量を決定することを含む方法。
【請求項１４】
陽性対照が、請求項１から７のいずれか一項に記載の式Ｉのビエピトープ化合物または請求項８に記載の組成物である、請求項１３に記載の、イムノアッセイにより定量化するための方法。
【請求項１５】
被分析物を含有する可能性のある被検試料中で、イムノアッセイにより被分析物を定量化するための方法であって、
ｉ．  被検試料を、被分析物の結合パートナーの１以上と、接触させることによるイムノアッセイ検査、
ｉｉ．  陽性対照として請求項１から７のいずれか一項に記載の式（Ｉ）のビエピトープ化合物または請求項８に記載の組成物を、前記被分析物の結合パートナーの１以上と接触させることにより、イムノアッセイ検査の信頼性を検証する検査、
ｉｉｉ．  信頼性検証検査が陽性の場合、イムノアッセイ検査を読みとること、および
ｉｖ．  イムノアッセイ検査と、標準曲線とを比較することにより、被検試料中の前記被分析物の量を決定することを含む方法。
【請求項１６】
被分析物が心筋トロポニンＩまたはプロディフェンシン−Ａ６である、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の、イムノアッセイにより定量化するための方法。
【請求項１７】
請求項１から７のいずれか一項に記載の式Ｉのビエピトープ化合物または請求項８に記載の組成物を含む、イムノアッセイを行うためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断または予後の分野に関する。特に、イムノアッセイの実施中に使用される、合成ビエピトープ化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
イムノアッセイは、臨床、食品、製剤および化学分析の分野で一般的に用いられる。従って、それらの目的は、これらの被分析物を含有する可能性のある試料中における、タンパク質（抗原／抗体）、ペプチド、またはハプテン（たとえばステロイドまたはビタミン）の形態での多くの被分析物の存在を決定することである。イムノアッセイは、検出する被分析物と、この被分析物の１以上の結合パートナーとの間での免疫学的反応に関与する、当業者に広く知られた検査である。かかるイムノアッセイの例としては、「サンドイッチ」原理あるいは「競合」原理により動作し得る、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＥＬＦＡ（酵素結合蛍光アッセイ）およびＲＩＡ（放射免疫アッセイ）などの方法、ならびに免疫組織化学、免疫細胞化学、免疫蛍光、ウエスタンブロットおよびドットブロットなどの免疫検出方法について言及され得る。「競合」法は、通常は、ハプテンなどの低分子のために用いられ、「サンドイッチ」法は、他の被分析物のために用いられる。
【０００３】
特に生物学的試験所において実行されるこれらのイムノアッセイは、結合パートナー、現出剤（revealing agent）あるいは希釈溶液などの検査に必要である試薬に加えて、研究される試料のための検査のものと類似している状況下、しばしば同時に、用いられ、イムノアッセイが正確に実行されたことを立証するのに役立つであろう、検査の陽性対照が、製造業者により提供されることが必要である。陽性対照が、実際、陽性であるとみとめられた場合、検査結果は、バリデーションが確認され、解釈することができる。陽性対照が、陽性であるとみとめられない場合、これは、イムノアッセイの実施が期待に沿って行われなかったことを示す。無効である検査の結果は、そのため、解釈されるべきでなく、分析は、再び始められるべきである。
【０００４】
前記被分析物を含有する可能性のある生物学的試料中での、イムノアッセイによる被分析物の定量化に関しては、検査に必要である上述の試薬および陽性対照に加えて、標準曲線の使用を必要とする。前記曲線は、ｉ）被分析物または用いられるイムノアッセイにおいて被分析物と同一の抗原反応性を有する化合物の、漸増および既知の量または濃度に対応する、標準（キャリブレータともよばれる）により生成するシグナルを測定することにより、ｉｉ）そして、当該量または当該濃度の関数としてのシグナルを与える曲線を描くときに、得られる。非常に多くの場合、定量的イムノアッセイの結果を容易に計算できるよう、シグナルと量または濃度との間のこの関係をできる限り信頼性高く表す数学的モデルを見出すことは、標準的な技法である。
【０００５】
これを行うため、対照または標準溶液は、探索される被分析物を模倣しなければならず、イムノアッセイに用いられる結合パートナーによって、同じように認識されなければならない。従って、イムノアッセイの方法がサンドイッチ法である場合、対照または標準溶液は、用いられる２つの結合パートナーの認識のための２つのエピトープを有する化合物を含まなければならない。用語「ビエピトープ化合物」は、そのため使用される。
【０００６】
ビエピトープ化合物の２つのエピトープが同一であることは、問題外ではない。検出されあるいは定量化される被分析物が、マルチマー、少なくともダイマーである場合、サンドイッチイムノアッセイの捕捉の際および検出の際に同一の結合パートナーを使用することが可能である。この場合、ビエピトープ化合物は、同一のエピトープを二倍含有するであろう。
【０００７】
イムノアッセイ検査において通常用いられる対照または標準溶液は、ヒトまたは動物起源してもよく、自然な状態のように被分析物を含有してもよい。これらの溶液は、凍結乾燥物から調製され、単位用量で凍結され、−２０℃または−８０℃で保存される。かかる保存は、流体の実験室実務のために適してはいない。さらに、これらの凍結乾燥した対照または標準溶液は、それらが使用されることを可能とするため、再溶解される必要がある。しかしながら、イムノアッセイ文脈において、検査の実施は素早くなくてはならず、この再溶解は時間の損失をもたらす。さらに、この再溶解を行うことは、希釈に起因するバイアスのため、測定エラーにつながる可能性がある。＋２／８℃で液体形態で保存される使用準備済の対照または標準溶液が、したがって特に推奨され、これは、利便性の明らかな理由のためである。それにもかかわらず、アッセイの実際の条件を代表するために、これらの使用準備済の対照または標準溶液は、関心のある被分析物の測定の範囲に応じて、たとえば約１ｐｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍＬといった低濃度の被分析物のみを含有し、これは、影響が及ぼされる＋２／８℃の温度においてそれらの安定性をもたらす。結果として、この欠点を克服するため、合成標準が用いられてきた。
【０００８】
欧州特許出願ＥＰ０６５００５３Ａは、１以上の受容体のための活性部位を含有し、樹木状の構造により互いに連結する合成標準について記載する。この出願は、トロポニンＴ合成標準についてより具体的に記載する。それにもかかわらず、これらの標準は、４℃で３週間を超えない、溶液中での安定時間を有する。
【０００９】
特許出願ＷＯ９８／２４８１６は、トロポニンＩをアッセイするための「サンドイッチ」イムノアッセイにおける標準として使用することができ、数か月間安定である合成ビエピトープ化合物を提供する。記載された式Σ−Ｅ１−Ｚ−Ｅ２−Ψの化合物は、最小のトロポニンＩエピトープを含む２つのペプチド配列Ｅ１およびＥ２を含み、これらのエピトープのそれぞれが、１から４０のアミノ酸を含む中央ペプチドであり得るリンカー基Ｚにより互いに結合している。それぞれのエピトープは、その端に、１から１０のアミノ酸のペプチド配列（ΣおよびΨ）も含み得る。それにもかかわらず、この特許出願において提案された溶液は、記載されたビエピトープ化合物が、イムノアッセイに用いられる結合パートナーと十分に免疫反応性であるように、容易に合成されないようなわずかな数でないアミノ酸を有さなくてはならないという欠点を有する。さらに、それらの独自にペプチドの特性が理由で、イムノアッセイで用いられる結合パートナーと最適な免疫反応性を有するために、大量の化合物が対照または標準溶液中に必要とされ、それは、この対照またはこの標準を含有するキットの製造業者にとってそして製造されたキットを使用する実験室にとってわずかではないコストを表す。
【００１０】
特許ＵＳ６１１４１８０は、溶液中でのその溶解性および／またはその安定性を増加させる目的で、ＢＳＡなどの担体分子により互いに連結された２つのトロポニンＩエピトープを含み、イムノアッセイにおける対照または標準として用いることのできる、合成化合物を提案する。しかしながら、この化合物の特別な構造により製造が難しくなり、担体分子と連結した２つのエピトープ間での等モル反応性の問題が生じる。
【発明の概要】
【００１１】
出願人は、驚くべきことに、先行技術に記載された欠点を克服する、「サンドイッチ」イムノアッセイに使用される合成化合物を実証した。実際、その合成は容易で、単純化されており、それは＋２／８℃、低濃度で安定であり、それは可溶性であり、かつそれはイムノアッセイにおいて用いられる結合パートナーとの卓越した免疫反応性を示す。さらに、化合物が対照または標準溶液中に存在する場合、大量のそれを使用する必要がなく、これはイムノアッセイにおいて用いられる結合パートナーと最適な免疫反応性を有するためである。最終的に、本発明による化合物の構築は、２つのエピトープの等モル反応性を保証する。ある点で（ａ  ｃｅｒｔａｉｎｅｓ）
【００１２】
従って、本発明の最初の主題は、式（Ｉ）のビエピトープ化合物であって、
2018501238.tif 000003
式中、
−  Ｅ１およびＥ２は、同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立して、被分析物の少なくとも１つのエピトープを含むペプチド配列を表し、
−  ＸおよびＹは、同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立してリンカーアームを表し、
−  担体分子は可溶性であり、かつ
−  Ｚは、担体分子との結合前にチオール機能を有するアミノ酸誘導体を表す、化合物である。
【００１３】
本発明のもう一つの主題は、水、バッファーまたは生物学的流体溶液中に式Ｉの化合物を含有する組成物に関する。
【００１４】
さらにもう一つの主題は、イムノアッセイにおける、かかるビエピトープ化合物のまたはこの化合物を含有するかかる組成物の、対照または標準またはアジャスターとしての使用に関する。
【００１５】
本発明のさらにもう一つの主題は、式Ｉのビエピトープ化合物またはこの化合物を含有する組成物を、対照および／または標準もしくはアジャスターとして用いるイムノアッセイ方法に関する。
【００１６】
最後に、本発明の最後の主題は、式（Ｉ）のビエピトープ化合物またはかかる化合物を含有する組成物を含む、イムノアッセイを行うためのキットである。
【００１７】
出願人は、このように、予想に反して、上記に言及した先行技術のすべての欠点を克服することを可能とする合成ビエピトープ化合物を開発した。本発明の化合物は、下記式（Ｉ）を有する化合物であって、
2018501238.tif 000004
式中、
−  Ｅ１およびＥ２は、同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立して、被分析物の少なくとも１つのエピトープを含むペプチド配列を表し、
−  ＸおよびＹは、同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立してリンカーアームを表し、
−  担体分子は可溶性であり、かつ
−  Ｚは、担体分子との結合前にチオール機能を有するアミノ酸誘導体を表す、化合物である。
【００１８】
本発明の化合物は、したがってビエピトープ化合物である。用語「ビエピトープ化合物」は、サンドイッチイムノアッセイにおいて、被分析物の抗原性認識を模倣するために、同一の被分析物の２つのエピトープを含む、化合物を意味することを意図する。当然ながら、合成ビエピトープ化合物は、決して、模倣する被分析物と同一の配列から成るわけではない。この合成化合物は、したがって、自然に存在するアミノ酸の配列、たとえば、タンパク質またはタンパク質断片に対応しない。本発明の化合物は、本出願の至るところで、明らかかつ同等の方法で、ビエピトープ化合物、非天然ビエピトープ化合物、合成ビエピトープ化合物または非天然合成ビエピトープ化合物として、言及されるであろう。
【００１９】
用語「イムノアッセイ」における接頭辞「イムノ」は、本出願において、たとえば、結合パートナーが必然的に抗体または抗体断片などの免疫学的起源のパートナーであることを厳密に示すようにみなされるべきではない。実際、当業者によく知られているように、この用語は、それにおいて結合パートナーが、免疫学的起源／性質のパートナーでなく、たとえば検出および／または定量化が望まれる被分析物の受容体からなる、検査および方法も指すようにより広く使用される。その起源またはその性質がどのようなものであっても、関心のある結合剤パートナーは、探索される被分析物と、好ましくは特異的に、結合する能力があるべきである。従って、用語「イムノ」は、省略せずに頭字語ＥＬＩＳＡに対応する用語に含まれるが、用語「ＥＬＩＳＡアッセイ」は、「リガンド結合アッセイ」としても広く知られる厳密な意味において非免疫学的である結合パートナーを用いるアッセイに対して用いることが知られた習慣である。明確性および統一性の利益のために、本出願において用語「イムノ」は、少なくとも１つの結合パートナーであって探索される被分析物との結合に適しているものを用い、後者を、好ましくは特異的に、検出および／または定量化する、任意の生物学的分析を意味するために使用され、これは前記結合パートナーが厳密な意味での免疫学的性質または起源でない場合でさえも使用される。
【００２０】
サンドイッチ型イムノアッセイ（あるいはより単純に「サンドイッチイムノアッセイ」）は、探索される被分析物と特異的に結合する「捕捉結合パートナー」と呼ばれる第一の結合パートナー、ならびに「検出結合パートナー」と呼ばれる第二の結合パートナーであって、標識され、かつ探索される被分析物と特異的に結合するようにも意図され、その結果捕捉結合パートナーおよび探索される被分析物間の結合を現出させ、その結果被分析物の存在を明らかにするものを使用する。言い換えれば、探索される被分析物は、前記第一および第二の結合パートナー間の「サンドイッチ中に」とらえられ、第一の（「捕捉」）結合パートナーは、探索される被分析物と比べて一般に過剰に存在する。捕捉結合パートナーは、たとえば、固体支持体上に（共有結合、吸着またはそのほかの適当な方法により）不動化され得る。
【００２１】
抗原決定基とも呼ばれるエピトープは、抗体の可変部分であるパラトープにより認識され得る抗原の最も小さい部分である。エピトープの構造は、抗体のパラトープに相補的である。含まれる構造は、連続エピトープとも呼ばれる線状エピトープの場合には、一次構造であってもよく、あるいは不連続エピトープとも呼ばれる構造エピトープの場合には、三次構造であってもよい。
【００２２】
線状エピトープの配列は、エピトープおよび抗体間の結合を、特異性の観点から著しく変化させない「保存的」修飾を含み得る。
【００２３】
ミモトープは、あるエピトープの三次元構造を模倣する高分子であり、しばしばペプチドである。前記エピトープを認識する抗体は、このエピトープを模倣するミモトープを認識しおよび結合する能力もある。タンパク質性質の抗原の場合には、ペプチドミモトープ（すなわち、線状である）が、構造エピトープを模倣するためにしばしば用いられる。本発明によれば、構造エピトープは、ミモトープと交換することができる。ミモトープもまた、用語エピトープの交換物として、本出願の範囲に含まれる。
【００２４】
よくあることだが、抗原がタンパク質性質である場合、線状エピトープおよびミモトープは、さまざまな長さのペプチド配列に対応する。線状エピトープの場合には、最小エピトープおよび最適エピトープの概念の間には、区別がされるべきである。最小エピトープは、対応する抗体により特異的に認識される、最も小さいサイズのペプチド配列に対応する。前記ペプチド配列のＮ末端のアミノ酸またはＣ末端のアミノ酸が欠失している場合、抗体の結合は、もはや可能ではなく、認識は失われる。最小のエピトープは、３から２０アミノ酸、より多くの場合には４から８アミノ酸を含有し得る。
【００２５】
最適エピトープは、対応する抗体について、特異的に認識されかつ可能な限り最良の反応性（最も強いシグナル）を有するペプチド配列に対応する。それは、非常に多くの場合、６から３０アミノ酸長のペプチド配列を含む。一般的な法則として、最適エピトープは、最小エピトープを含む。まれな場合において、最適エピトープおよび最小エピトープは、融合され得る。
【００２６】
本発明の化合物は、被分析物の少なくとも１つのエピトープを含む２つのペプチド配列Ｅ１およびＥ２を含有するようなものである。表現「被分析物の少なくとも１つのエピトープを含むペプチド配列」は、該ペプチド配列が少なくとも最小エピトープのアミノ酸から成ることを意味するよう意図される。本発明の一実施態様によれば、該ペプチド配列は、最大で、最適エピトープのアミノ酸から成る。当然ながら、最適エピトープの片側または両側に、抗原性の認識に大きすぎる効果を有さない、１、２、３、４または５個の追加のアミノ酸を付加することもできることを、当業者は知っている。かかる追加のアミノ酸もまた定義に含まれる。
【００２７】
これらのペプチド配列のアミノ酸は、被分析物の配列中に自然に見出されるアミノ酸であってもよく、あるいはアナログアミノ酸であってもよい。用語「アナログアミノ酸」は、二つのアミノ酸を意味するよう意図され、その交換は、自然に発生する、すなわちアミノ酸のファミリー中で起こる、保存的置換である。具体的には、アミノ酸は、一般に４つのファミリーすなわち（１）アスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性アミノ酸、（２）リジン、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸、（３）アラニン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファンなどの非極性アミノ酸、および（４）グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニンおよびチロシンなどの極性無電荷アミノ酸に分けられる。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、時には芳香族アミノ酸として分類される。たとえば、イソロイシンまたはバリンとロイシンの、グルタミン酸とアスパラギン酸の、セリンとトレオニンの、孤立した交換、あるいは構造的に関係する別のアミノ酸とアミノ酸の、同様の保存的交換は、生物学的活性または抗原性への大きな効果を有さないであろうことを、合理的に予測することができる。当業者は、当技術分野でよく知られたＨｏｐｐ／ＷｏｏｄｓおよびＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｅプロットを参照して、変化を許容することができるアミノ酸を容易に決定するであろう。一実施態様によれば、ペプチド配列のアミノ酸は、被分析物中に自然に見出されるアミノ酸である。もう一つの実施態様によれば、ペプチド配列Ｅ１またはペプチド配列Ｅ２あるいは両方は、ミモトープであり、その結果として、ペプチド配列のアミノ酸は、大部分は被分析物中に自然に見出されるアミノ酸と異なる。
【００２８】
用語「被分析物」は、試料中に含有され、分析により、検出され、同定されおよび／または定量化される生物学的起源の物質を示す。それは、１以上の分析の対象である、化学的、生物学的または生化学的物質を示すものとして、広い意味で理解されるべきである。被分析物の例としては、タンパク質またはペプチドについて言及され得る。
【００２９】
被分析物は、病理学的状況または培地中での微生物の存在を代表するであろう。用語「病理学的状況」は、環境的（感染性）、遺伝的および／または生物学的因子などの多数の因子に起因する疾患のため、患者の健康のいかなる損なわれた状態も意味するよう意図される。疾患の例としては、ウイルス、細菌または寄生生物などの微生物に起因する感染性疾患（肝炎、敗血症など）、自己免疫疾患、神経変性疾患、がん（乳、前立腺、結腸など）、心臓血管疾患（心筋梗塞など）などについて言及され得る。被分析物は、その結果、さまざまな疾患に関連する。被分析物の例としては、心筋梗塞のための被分析物としての使用される心筋トロポニンＩ、および結腸がん被分析物であるプロディフェンシン−Ａ６について言及され得る。これらの被分析物は、続いて、より詳細に記述されるであろう。一実施態様によれば、Ｅ１およびＥ２は、少なくとも１つの心筋トロポニンＩエピトープまたはプロディフェンシン−Ａ６エピトープを含むペプチド配列である。
【００３０】
中央のＺ基は、担体分子との結合前にチオール機能を有するアミノ酸誘導体である。用語「アミノ酸誘導体」は、結合対象のリンカーアームＸおよびＹと２つのペプチド結合−ＣＯ−ＮＨ−を形成する任意の分子を意味するよう意図される。これを行うため、対応するアミノ酸は、リンカーアームＸまたはＹとの結合前に、反応性基−ＮＨ２および反応性基−ＣＯＯＨを含む。リンカーアームＸおよびＹへの結合後、アミノ酸誘導体は、したがって−ＮＨ−基および−ＣＯ−基を含む。対応するアミノ酸は、担体分子との結合前に、チオール機能（−ＳＨ）をも含む。かかるＺ基の例としては、システイン誘導体、ホモシステイン誘導体およびペニシラミン誘導体が挙げられる。これらの誘導体の形成に用いられる、対応するアミノ酸は、当然ながら、当業者に既知のアミノ酸である、システイン、ホモシステインおよびペニシラミンである。
【００３１】
本発明の化合物の２つのリンカーアームＸおよびＹは、互いに同一または異なる。リンカーアームは、それぞれが、１つの手でＥ１またはＥ２と、もう１つの手で中央のＺ基と、２つのペプチド結合−ＣＯ−ＮＨ−を形成する能力により特徴づけられる。リンカーアームＸおよびＹは、したがって−ＮＨ−基および−ＣＯ−基を含むアミノ酸誘導体である。これを行うため、リンカーアームを形成するために用いられる化合物は、ペプチド配列Ｅ１またはＥ２とその結合の前に、反応性基−ＮＨ２および反応性基−ＣＯＯＨを含む。当然ながら、リンカーアームは、他の基、たとえば、そのように反応性でない、あるいはそれらが、たとえばトリチル、ｔ−ブチル、ｔ−ブチルエーテルベンジルまたはベンジルエステル基といった当業者に既知の保護基により保護されているため反応性でない側基を含むことができる。リンカーアームは、本発明のビエピトープ化合物に含まれる前に、それぞれが反応性基−ＣＯＯＨおよび反応性基−ＮＨ２を有する１以上の化合物からから得ることができる。これらの化合物は、「リンカーアームを形成するために使用されるモノマー」として言及されるであろう。
【００３２】
リンカーアームを形成するために使用されるモノマーは、生物学的タンパク質の合成に必要であり、当業者に既知である、タンパク質構成α−アミノ酸であり得る。これらのタンパク質構成α−アミノ酸は、遺伝的にコードされ得、この場合においては、２２のそれらがある。全ての生物において普遍的に分布している、２０個のタンパク質構成α−アミノ酸は、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシンおよびＬ−バリンである。他の２つのタンパク質構成アミノ酸は、さらにまれである。Ｌ−ピロリジンは、いくつかのメタン生成アーキアにおいてのみ見出され、Ｌ−セレノシステインは、オキシドレダクターゼファミリーのいくつかの酵素においてのみに存在する。
【００３３】
これらの２２の遺伝的にコードされたアミノ酸に加え、たとえばＬ−シトルリン、Ｌ−ピログルタミン酸、Ｌ−オルニチン、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、γ−アミノ酪酸およびドーモイ酸といった、酵素的修飾により上記から得ることができる、数十のほかの生物学的アミノ酸がある。
【００３４】
リンカーアームを形成するために使用されるモノマーは、人工アミノ酸としても知られ、すなわち非生物学的アミノ酸である、擬似アミノ酸でもあり得る。この場合において、唯一の必要なものは、化合物が、二つの遊離の機能、−ＣＯＯＨおよび−ＮＨ２を含むことである。
【００３５】
本発明の特定の一実施態様によれば、リンカーアームＸおよびＹは、同一でも異なっていてもよく、それぞれが１以上のアミノ酸誘導体（タンパク質構成α−アミノ酸、および／または生物学的アミノ酸および／または擬似アミノ酸など）を含む。リンカーアームは、１から６個のアミノ酸、好ましくは１から４個のアミノ酸から調製され得る。たとえば、リンカーアームは、配列ＧＧＧＳ、または配列ＳＧＧＧ、または配列ＧＳＧＳＧＳあるいは配列ＳＧＳＧＳＧを有し得る。
【００３６】
本発明の一実施態様によれば、式（Ｉ）中のＸおよびＹは、すなわち、Ｅ１／Ｅ２／Ｚとのペプチド結合の形成後、下記式（ＩＩ）：
−ＮＨ−Ｒ−ＣＯ−（ＩＩ）
［式中、Ｒは、基（−Ｃ（Ｒ’）Ｈ−Ｃ（Ｒ’’）Ｈ、（−Ｃ（Ｒ’）Ｈ−Ｃ（Ｒ’’）Ｈ−Ｏ−）、（−Ｃ（Ｒ’）Ｈ−）および（−Ｃ（Ｒ’）Ｈ−Ｏ−）から、独立に選択される１以上の基から成る基であり、Ｒ’およびＲ’’は、水素、ヒドロキシル基およびＣ１−Ｃ５アルキル基から、独立に選択される。］
のモノマーの１以上の誘導体を示す。一実施態様によれば、Ｒは、（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、（−ＣＨ２−Ｏ−）および（−ＣＨ２−）から、独立に選択される１以上の基から成る。特定の一実施態様によれば、Ｒ基は、１から６の基（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、好ましくは１から４の基（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）を含み得る。Ｒ基の非限定的な例としては、ペンタオキサオクタデカノイル、テトラオキサペンタデカノイル、トリオキサドデカノイル、トリオキサトリデカノイル、ジオキサオクタノイル、オキサペントイルおよびヘキサオキサヘニコサノイルならびにそれらの誘導体について言及され得る。式（ＩＩ）のモノマー誘導体を与えるために使用される化合物の例としては、擬似アミノ酸として知られる８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１３４９７８−９７−５）について言及され得る。たとえば、リンカーアームは、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸のダイマーまたはトリマー、（Ａｄｏ）２または（Ａｄｏ）３であり得る。
【００３７】
Ｒ基の基の他の例としては、残基形態での、すなわち、それらの−ＣＯＯＨおよび−ＮＨ２基を有さないが、ＮＨ−基および−ＣＯ−基を含む、上記に言及した生物学的アミノ酸誘導体について言及され得る。したがって、たとえば、リンカーアームを形成する化合物が、式（ＣＨ３）２ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯＯＨのロイシンである場合、その結果、式（ＩＩ）の化合物のＲは、
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であるだろう。
それぞれのリンカーアームは、２つの末端の−ＣＯおよび−ＮＨ基の間に、１０から６０Å、好ましくは２０から３０Åのサイズを有し、これは本発明の特定の一実施態様を構成する。
【００３８】
リンカーアームＸおよびＹを形成するために使用されるモノマーは、それらが本発明のビエピトープ化合物に含まれる前は、反応性基−ＣＯＯＨおよび−ＮＨ２を有し、それがペプチド結合を形成を可能とするので、配列Ｅ１−Ｘ−Ｚ−Ｙ−Ｅ２は、
―  容易で、素早く規格化され、再現可能であり、単純化された合成、
―  Ｅ１およびＥ２について等モルである化合物の生産、
の利点を有するペプチド合成により生み出され得るようなペプチド（ビエピトープペプチドとして後述する）であるとみなすことができる。
【００３９】
ビエピトープペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３により記載された固相ペプチド合成などの、当業者に周知の手順に従って得られる。この技術に対する改変は、Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｎｏｂｌｅ，１９９０により、レビューされ、議論されてきた。かかる合成は、それに対して最初のＣ末端アミノ酸を付着させた固相を用い、この文脈において、固相により掲示される−ＮＨ２基と付加される新しいアミノ酸の−ＣＯＯＨ基との間の反応を促進するために、ペプチドを形成するように付加される新しいアミノ酸の各−ＮＨ２基は、当業者に周知であるように、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）型の保護基で保護される。
【００４０】
本発明によれば、ビエピトープペプチドの長さは、１００アミノ酸に対応する長さを超えない、好ましくは２０から３０アミノ酸に対応する長さを超えず、より好ましくは、２５から２７アミノ酸に対応する長さを超えない。
【００４１】
ビエピトープペプチドは、Ｚ基を介して、担体分子と結合する。担体分子は、ビエピトープ化合物を安定化する役割を有し、前記ビエピトープ化合物の被分析物の少なくとも１つのエピトープを含むペプチド配列Ｅ１およびＥ２を、より入手しやすくすることを可能にし、これは一方で同時にＥ１およびＥ２間での等モル反応性を保存する。
【００４２】
用語「担体分子」は、ペプチドとカップリングされ得る、任意の可溶性分子を意味するよう意図される。可溶性分子としてはウシ血清アルブミン、イムノグロブリンＧおよびサイログロブリンなどのタンパク質、およびポリリジンなどのポリマーについて言及され得る。一実施態様によれば、担体分子が、その分子量が２０ｋＤａと７００ｋＤａとの間、好ましくは、６０ｋＤａと２５０ｋＤａとの間であるタンパク質である。
【００４３】
ポリリジンは、当業者に既知のポリマーである。それらは、たとえばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である。
【００４４】
ウシ血清アルブミンおよびサイログロブリンは、当業者に既知である。イムノグロブリンＧに関して、それは、干渉問題を避けるために、イムノアッセイの抗体を得るために用いられる種または分析される試料が由来する種のいずれにも由来しないように選択されるべきである。例としては、ウサギ、マウス、ウマ、ヤギ、ブタなどイムノグロブリンＧ（包括的でないリスト）について言及され得る。
【００４５】
一実施態様によれば、担体分子はウシ血清アルブミンである。
【００４６】
もう一つの実施態様によれば、抗体がマウス由来であり分析される試料がヒト由来であるイムノアッセイにおいて、担体分子は、ウサギイムノグロブリンＧである。
【００４７】
Ｚ基のレベルでの、ビエピトープペプチドおよびタンパク質性質の担体分子の間のカップリングは、当業者に周知の方法に従って、共有原子価により起こり得る。Ｚ基の側鎖に存在するスルフヒドリル（sulfhydril）基（−ＳＨ）は、マレイミド、ハロアセチルおよびピリジルジスルフィド基について反応性である。従って、第一のステップにおいて、担体分子の接近可能なアミン基（−ＮＨ２）のレベルで反応する能力があり、結果として、担体分子の表面に、マレイミド類またはハロアセチル類から選択される反応性基を導入する能力があるであろうモル過剰の架橋剤との反応により、担体分子は活性化されるべきである。これらの基は、それらが、安定であるチオエーテル結合を介したカップリングを得ることを可能とするため、好ましい。マレイミド基を導入することを可能とする架橋剤の中では、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートあるいはスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートについて包括的でなく言及され得る。ハロアセチル基を導入することを可能とする架橋剤の中では、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエートおよびスルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエートについて包括的でなく言及され得る。活性化された担体分子は、その後、過剰な架橋剤および副生成物を取り除くために、たとえばゲルろ過クロマトグラフィーといった脱塩または透析により、精製される。最後に、活性化された担体分子を、相対的に中央位置にＺ基を含むビエピトープペプチドの存在下に置く。マレイミドまたはハロアセチル基は、安定な共有結合性チオエーテル結合を形成するよう、ビエピトープペプチドのＺ基のスルフヒドリル基（−ＳＨ）と反応する。マレイミドおよびスルフヒドリル基の間の反応は、中性のｐＨ（ｐＨ６．５から７．５）に近い条件下で実行されるべきであり、カップリング部位に対する競合を避けるため、たとえばほとんどの還元剤といった外来のチオールを反応バッファーの組成物から排除するべきである。ハロアセチルおよびスルフヒドリル基の間の反応は、ｐＨ７．２から９で実行されるべきである。チロシン、ヒスチジンおよびトリプトファンと反応する能力がある遊離ヨウ素の生成を制限するため、暗所で反応を実行することが好ましい。当業者に既知であるかかる方法は、たとえば、Shan S. Wongによる「Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking」CRC Press Inc., Boca Raton, Florida, United States, 1991に記載されている。
【００４８】
Ｚ基上でのビエピトープペプチドのカップリングを促進するため、リンカーアームＸ／Ｙおよび／またはペプチド配列Ｅ１／Ｅ２がチオール機能を有するアミノ酸誘導体を含有する場合、前記ペプチドの形成のため、前記ペプチドの合成のステップの間および担体分子とのカップリングのステップの間に安定である保護基を用いて、このチオール機能のレベルで保護されているアミノ酸誘導体を使用するのは賢明である。従って、基Ｚを与えるために用いられるアミノ酸のみが、反応性なチオール機能を有するであろう。アームＸ／Ｙのおよび／またはペプチド配列Ｅ１／Ｅ２のチオール機能を保護するかかるステップを避けるため、ＸもしくはＹまたはＥ１もしくはＥ２のいずれもチオール機能を有するアミノ酸誘導体を含有しないことが賢明であり、これは、本発明の特定の一実施態様を構成する。
【００４９】
それらのチオール機能のレベルで保護されたアミノ酸は、たとえば、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（登録商標）から入手可能である。
【００５０】
担体分子とビエピトープペプチドのカップリング後、チオール機能は、当業者に既知の技術によって、任意に脱保護されるであろう。保護基としては、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）の存在下、水性媒体（０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム）中で容易に除去されるｔ−ブチルチオ基について言及され得る。カップリングアームＸ／Ｙのみが、チオール機能を有するアミノ酸誘導体を含有する場合、かかる脱保護は、必要でないであろうし、アドバイスされないであろう。ペプチド配列Ｅ１／Ｅ２が、チオール機能を有するアミノ酸誘導体を含有する場合、これがエピトープ認識に影響を及ぼすならば、かかる脱保護が必要となるであろう。
【００５１】
カップリングアームおよび／またはペプチド配列が、チオール機能を有するアミノ酸誘導体を含有しないことも可能である。従って、本発明のビエピトープ化合物は、下記の特徴の１以上を含む：
−  リンカーアームＸは、チオール機能を有するアミノ酸誘導体を含まない、
−  リンカーアームＹは、チオール機能を有するアミノ酸誘導体を含まない、
−  ペプチド配列Ｅ１は、チオール機能を有するアミノ酸誘導体を含まない、および
−  ペプチド配列Ｅ２は、チオール機能を有するアミノ酸誘導体を含まない。
【００５２】
特定の一実施態様によれば、ペプチド配列Ｅ１およびＥ２は、チオール機能を有するアミノ酸誘導体を含まない。さらにもう一つの実施態様によれば、Ｘ、Ｙ、Ｅ１およびＥ２の中のいずれの要素も、チオール機能を有するアミノ酸誘導体を含まない。
【００５３】
本発明の化合物は、イムノアッセイにおけるその実施のため、組成物中に含有され得、これは、水中、バッファー中または生物学的流体中に溶解した前記式（Ｉ）の化合物を含みあるいは含有し、これは本発明のもう一つの主題を構成する。
【００５４】
水中に溶解した式（Ｉ）のビエピトープ化合物を含有する組成物は、前記化合物と、水であって溶液の全体積に対して少なくとも５０％の体積を表す主要な溶媒との、完全な溶解により得られる透明な液体溶液である。溶媒の量は、当然ながら、関与する被分析物に依存し、当業者によって容易に決定されるであろう。
【００５５】
式（Ｉ）の化合物は、バッファー中に溶解されていてもよい。使用されるバッファーは、当業者に周知であり、関与する被分析物に依存する。バッファーの例としては、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファーなどのバッファーについて言及され得る。
【００５６】
組成物が生物学的流体を含有する場合、前記流体は、検査することが望まれる試料に対応し得る。例としては、全血またはたとえば血清もしくは血漿といったその派生物、尿、唾液および浸出液について言及され得る。
【００５７】
本発明の組成物中の式（Ｉ）の化合物の量は、関与する被分析物、および対応する測定範囲に依存する。それは、当業者により容易に決定されるであろう。従って、それは、約１ｐｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌであり得る。
【００５８】
特にＥ１、Ｅ２、Ｘ、Ｙ、Ｚ、担体分子および被分析物の選択に関して、以前に記載した同一の特徴および選択は、本発明の組成物に対しても適用される。
【００５９】
当然ながら、本発明の組成物は、塩、ＢＳＡまたはデキストランもしくはポリエチレングリコール型の合成ポリマーなどのフィラータンパク質、または界面活性剤などの、当業者に周知のほかの化合物を含み得る。
【００６０】
以前に示したように、本発明の化合物および組成物は、それらが容易に合成され、＋２／８℃で安定であり、イムノアッセイの条件下で可溶性であるため、特に有利である。さらに、本発明の化合物は、予想に反して、イムノアッセイにおいて用いられる結合パートナーに対して、特に高い免疫反応性を有し、すなわち、対照、標準および／またはアジャスターとしてそれらを使用することが望まれる場合、それらが、イムノアッセイ条件下で同一の時間において安定である一方で、対照、標準およびアジャスター溶液中で低い量で含有され得るように、結合パートナーがそれらを特によく認識する。
【００６１】
従って、本発明のもう一つの主題は、かかるビエピトープ化合物または、この化合物を含有するかかる組成物の、イムノアッセイにおける、対照または標準もしくはアジャスターとしての使用に関する。
【００６２】
用語「式（Ｉ）の化合物、またはこの化合物を含有する組成物の、対照としての使用」は、とりわけ、イムノアッセイが予想に従って動作すること（陽性対照とも呼ばれる）および被検試料中の被分析物の検出が偽陰性でないことを検証するための、その使用を意味するよう意図される。
【００６３】
表現「式（Ｉ）の化合物、またはこの化合物を含有する組成物の、標準としての使用」は、標準範囲を確立するためのその使用を意味するよう意図される。被分析物の定量化を実行し得るための必要なステップである標準範囲の確立は、以前に記載されているように当業者に周知であるステップである。それは、被分析物の漸増する既知の量または濃度により生成されたシグナルを測定すること、量または濃度の関数としてシグナルを与える曲線をプロットすること、およびこの関係をできる限り信頼性高く表す数学的モデルを見出すことにある。これを行うため、いくつかの本発明の水性組成物が使用され、それぞれは、異なる濃度の被分析物を含有する。数学的モデルは、被検試料中に含有される被分析物の未知の量または濃度を、外挿により決定するために使用されるであろう。
【００６４】
表現「特定の標準である、キャリブレータとも呼ばれるアジャスターとしての、式（Ｉ）の化合物またはこの化合物を含有する組成物の使用」は、被分析物のイムノアッセイの測定を調整するための、その使用を意味するよう意図される。この場合、被分析物の濃度は、固定されかつ既知である。アジャスターによりイムノアッセイにおける使用の間に生成されたシグナルもまた既知である。アジャスターは、イムノアッセイの実施の間に実際に生み出された測定（シグナル）が、期待値に対応することを検証するのに役立つ。これが上記の場合でない場合、アジャスターは、デリベーション（derivation）を測定するために役立ち、それは、適当である場合には、数学的に補正するあるいは測定機器への物理的な介入により補正すること（調整）が可能であるだろう。利便性のため、用語「標準」は、本出願において、用語「アジャスター」を含むであろう。
【００６５】
以前に示されたように、被分析物は、試料中に含有される、生物学的、化学的または生化学的起源の任意の物質であり、それは、分析により、検出され、同定され、および／または定量化される。
【００６６】
第一の実施態様によれば、被分析物は、心筋トロポニンＩであり、式（Ｉ）の化合物またはそれを含有する組成物は、心筋トロポニンＩイムノアッセイにおいて、対照、標準またはアジャスターとして使用される。
【００６７】
トロポニンは、３つのタンパク質、トロポニンＩ、ＴおよびＣから成る筋細線維のタンパク質複合体であることが知られている。このタンパク質複合体は、ミオシンおよびアクチンと相互作用することにより、Ｃａ２＋イオン介在性筋肉収縮の制御に寄与することを可能とする。
【００６８】
心筋トロポニンＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｐ１９４２９）は、ミオシンおよびアクチン間の結合の阻害の原因となるトロポニンサブユニットである。
【００６９】
心筋トロポニンＩエピトープおよびミモトープは、当業者に既知である。本発明の一つの特定の様式において、ペプチド配列Ｅ１およびＥ２は、以下の配列から選択される。
配列１：ＡＴＥＰＨＡＫＫＫ
配列２：ＡＧＬＧＦＡＥＬＱＤＬ
配列３：ＫＩＳＡＳＲＫＬＱＬＫＴ
アミノ酸の置換、欠失または挿入により前記ペプチド配列から派生するペプチド配列もまた、それらが問題となる抗体により認識される能力を保持する限りにおいて、本発明の分野に属する。
【００７０】
もう一つの実施態様によれば、式（Ｉ）の化合物またはそれを含有する組成物は、プロディフェンシン−Ａ６イムノアッセイにおいて、対照、標準またはアジャスターとして使用される。
【００７１】
ディフェンシンは、微生物の攻撃に対する宿主防御に関与する抗微生物性ペプチドのファミリーである。それらは、成熟形態において、３０から４０アミノ酸から成り、膜を選択的に脱凝集させる特性を有する。ほかの真核生物タンパク質のように、ディフェンシンは、成熟タンパク質形態だけでなく、前駆体形態としてもまた存在し得る。用語「プロディフェンシン」は、そのため使用される。プロディフェンシン−Ａ６（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｑ０１５２４）は、特に、出願人による特許出願ＷＯ２０１０／１１２７７７において、がんの、特に結腸直腸がんの文脈においてマーカーとしての使用の可能性が記載されている。
【００７２】
プロディフェンシン−Ａ６タンパク質のエピトープおよびミモトープは、既知であり、たとえば特許出願ＷＯ２０１０／１１２７７７に記載されている。本発明の一つの特定の様式において、ペプチド配列Ｅ１およびＥ２は、以下の配列のグループから独立に選択され、Ｅ１が１つのグループから選択される場合、Ｅ２は別のグループから選択されることが考慮される。
グループ１：
−  配列４：ＮＹＶＴＰＰＷＡＩＦＲＨ
−  配列５：ＷＴＧＶＬＳＰＴＱＥＹＲ
−  配列６：ＳＨＬＴＰＰＷＭＤＹＲＶ
−  配列７：ＶＭＡＶＴＣＳＴＣＤＳＲ
−  配列８：ＬＴＰＰＴＥＤＬＲＰＰＤ
グループ２：
−  配列９：ＹＧＮＨＳＣＴＨＩＧＨＣ
−  配列１０：ＧＰＳＹＴＣＬＨＦＧＨＣ
−  配列１１：ＴＥＲＥＶＨＮＷＦＰＦＨ
グループ３：
−  配列１２：ＹＰＨＰＷＳＭＨＶＩＲＡ
−  配列１３：ＴＴＴＰＨＰＷＡＬＦＡＶ
−  配列１４：ＴＰＨＰＷＱＲＷＶＶＹＳ
−  配列１５：ＥＤＶＬＲＷＨＰＥＷＰＧ
グループ４：
−  配列１６：ＹＨＥＴＷＰＰＫＳＡＱＬ
−  配列１７：ＹＨＤＮＷＰＱＰＳＲＳＷ
−  配列１８：ＱＨＮＨＱＲＨＧＡＭＧＡ
−  配列１９：ＹＨＤＭＷＰＭＳＧＲＭＡ
−  配列２０：ＹＨＤＮＷＰＰＬＮＧＡＲ
−  配列２１：ＹＨＤＭＷＰＡＩＱＬＳＰ
−  配列２２：ＹＨＥＫＦＰＧＰＶＶＬＰ
グループ５：
−  配列２３：ＱＡＥＤＤＰＬＱＡＫ
【００７３】
これらの対照、標準および／またはアジャスターは、イムノアッセイにより、前記被分析物を含有する可能性のある被検試料中の被分析物の検出および／または定量化するための方法における使用に特に適している。
【００７４】
従って、本発明のもう一つの主題は、
ｉ．  前記被検試料を、被分析物の結合パートナーの１以上と接触させることによるイムノアッセイ検査、
ｉｉ．  陽性対照として、以前に定義した式Ｉのビエピトープ化合物または以前に定義した組成物を、前記被分析物の結合パートナーの１以上と接触させることにより、イムノアッセイ検査の信頼性を検証する検査、
ｉｉｉ．  信頼性検証検査が陽性の場合、イムノアッセイ検査を読みとること、
ｉｖ．  ステップｉのイムノアッセイ検査により得られるシグナルが、イムノアッセイ検査の検出閾値より大きい場合に、被検試料中に前記被分析物が存在すると決定すること、を含む、イムノアッセイにより、前記被分析物を含有する可能性のある被検試料中の被分析物を検出するための方法に関する。
【００７５】
本発明の文脈において、被検試料は、さまざまな起源であってもよく、たとえば、食品、環境的、生物学的、獣医学的、臨床的、製薬学的または化粧品起源であってもよい。
【００７６】
食品起源の試料の中では、乳製品（ヨーグルト、チーズなど）、肉、魚、卵、果物、野菜、水、飲料（牛乳、フルーツジュース、ソーダなど）の試料について、非包括的に言及され得る。当然ながら、食品起源のこれらの試料は、ソース、またはより手の込んだ料理、または変形されていない、あるいは部分的に変形された原材料に由来してもよい。食品試料は、油かすまたはアニマルミールなどの動物飼料に由来してもよい。これらの試料の全ては、それらが液体でない場合、液体形態になるように前処理される。
【００７７】
以前に示されたように、試料は、環境的起源のものであってもよく、たとえば表面採取物、採水物などのものから成ってもよい。
【００７８】
試料は、ヒトまたは動物起源の生物学的試料から成ってもよく、これは、生物学的流体（尿、全血またはたとえば血清もしくは血漿といったその派生物、唾液、膿、脳脊髄液など）の採取物、排せつ物（たとえば、コレラ性下痢）、鼻、喉、皮膚、傷、臓器、組織または単離された細胞の採取物、あるいはぬぐい液試料に対応してもよい。このリストは、明らかに包括的ではない。
【００７９】
一般に、用語「試料」は、分析目的のため１以上の実在物からとった、部分または量、より具体的には小さな部分または少量に言及する。この試料は、任意に、特に出発実在物が固体状態である場合、たとえば混合、希釈あるいは粉砕工程を含む、前処理を受けたものであり得る。
【００８０】
分析される試料は、検出され、特徴づけられまたはモニターされる微生物または疾患の存在を代表する少なくとも１つの被分析物を、一般に含有してもよく、あるいは含有が疑われてもよい。
【００８１】
イムノアッセイにより被分析物を検出するためのこの方法のステップは、以前に記載されてきた、当業者に周知のステップである。特に、第一のステップは、被検試料を、被分析物の結合パートナーの１以上、好ましくはサンドイッチ検査のために２つの結合パートナーと接触させることにある。以前に記載されたように、２つのパートナーの１つは、コンジュゲートまたはトレーサーを形成するため、標識とカップリングされ得る。ほかの結合パートナーは、当業者に既知であるように、固体支持体上に捕捉され得る。そのため、用語「捕捉パートナー」は、後者のために、「検出パートナー」は前者のために使用される。
【００８２】
コンジュゲートにより発せられる、測定されたシグナルは、したがって、生物学的試料中の被分析物の量に比例する。
【００８３】
興味のある被分析物の結合パートナーは、被分析物に対して結合能力がある任意の分子である。被分析物の結合パートナーの例として、当業者に周知の、（モノクローナルまたはポリクローナル）抗体および抗体断片などの、免疫学的性質または起源の結合パートナー、ｎａｎｏｆｉｔｉｎ、存在する場合には被分析物の受容体、アプタマー、ＤＡＲＰｉｎｓまたは前記被分析物と相互作用を有することが知られているほかの任意の分子などの、免疫学的性質または起源でない結合パートナーについて言及され得る。
【００８４】
Ｎａｎｏｆｉｔｉｎ（商品名）は、低分子タンパク質であり、抗体のように、生物学的標的に対する結合能力があり、したがって、それを検出し、それを捕捉し、あるいは生物内でそれを極めて単純に標的とすることを可能とする。
【００８５】
アプタマーは、「Systematic Evolution of Ligands by Exponentiel Enrichment」（Ellington AD and Szostak JW., 1990）のためＳＥＬＥＸと呼ばれるｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択の組合せ的手法により、１０１５の異なる配列を含有するライブラリー中で同定される、オリゴヌクレオチド、一般にＲＮＡまたはＤＮＡである。多くのアプタマーは、ＲＮＡ化合物であるが、これは、ＲＮＡの、さまざまな複雑な構造を選択し、それにより、その表面にさまざまな形状の空洞を作り出すことを可能とし、さまざまなリガンドと結合することを可能とする能力のためである。それらは、生物工学、診断または治療応用において使用され得る、興味のある生化学なツールである。それらの選択性およびそれらのリガンド結合特性は、抗体のものに匹敵する。
【００８６】
Designed Ankyrin Repeat ProteINS（Boersma YL and Plutckthun A,2011）についての「ＤＡＲＰｉｎｓ」は、抗体を模倣することを可能とし、標的タンパク質に対して高い親和性および高い選択性をもって結合することができる別のクラスのタンパク質である。それらは、細胞形質膜の「脊柱」を構成するスペクトリン／アクチンネットワークに不可欠な膜タンパク質と結合することを可能とするアダプタータンパク質であるアンキリンタンパク質のファミリーに由来する。アンキリンの構造はおよそ３３アミノ酸のユニットの繰り返しに基づき、同じことはＤＡＲＰｉｎｓにも当てはまる。それぞれのユニットは、へリックス−ターン−へリックス型の二次構造を有する。ＤＡＲＰｉｎｓは、少なくとも３つ、好ましくは４から５の繰り返しユニットを含有し、組合せ的ライブラリーのスクリーニングにより得られる。
【００８７】
用語「標識」は、特に、化学修飾なしに直接的に、あるいはかかる基を含むような化学修飾後に、結合パートナーの基と反応性である基を含有する任意の分子であって、その分子が直接的にあるいは間接的に検出可能なシグナルを生成する能力がある分子を意味するよう意図される。これらの直接的な検出標識の非限定的なリストは、
・セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼまたはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼなどの、たとえば、測色、蛍光または発光によって検出可能なシグナルを生み出す酵素、
・蛍光、発光または染料化合物などの発色団、
・３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉなどの放射性分子、
・Ａｌｅｘａまたはフィコシアニンなどの蛍光分子、および
・アクリジニウムまたはルテニウムに基づく有機金属誘導体などの、電気化学発光塩、から成る。
【００８８】
間接的な検出システム、たとえば、抗リガンドと反応する能力があるリガンドが、使用され得る。リガンドは、そのため、結合パートナーと、コンジュゲートを構成するための標識に対応する。
【００８９】
リガンド／抗リガンドのペアは、当業者に周知であり、これは、たとえば、以下のペア：ビオチン／ストレプトアビジン、ハプテン／抗体、抗原／抗体、ペプチド／抗体、糖／レクチン、ポリヌクレオチド／それに対し相補的なポリヌクレオチドを用いる場合である。
【００９０】
抗リガンドは、そのため、以前に記載された直接的な検出標識により直接的に検出可能であってもよく、あるいは、それ自身が、ほかのリガンド／抗リガンドのペアなどにより検出可能であってもよい。
【００９１】
これらの間接的な検出システムは、ある条件下で、シグナルの増幅をもたらし得る。このシグナル増幅技術は、当業者に周知であり、出願人による先の特許出願ＦＲ２７８１８０２またはＷＯ９５／０８０００が参照され得る。
【００９２】
使用される標識の型に応じて、当業者は、標識の可視化、または、たとえば、分光光度計、分光蛍光光度計、濃度計あるいは高解像度のカメラといった、任意の型の適当な測定デバイスにより検出可能なシグナルの発生、を可能にする試薬を添加するであろう。
【００９３】
イムノアッセイ検査の信頼性を検証する検査であるステップは、以前に記載したとおりである。
【００９４】
イムノアッセイ検査ｉ）および検証検査ｉｉ）は、任意の順で、同時にまたは引き続いて、任意に同一の固体支持体上で、実行され得る。
【００９５】
イムノアッセイ検査の読み取りも用いられる検査に依存する、当業者に周知のステップである。
【００９６】
最後に、最後のステップは、ステップｉのイムノアッセイ検査により得られるシグナルが、イムノアッセイ検査の検出閾値より大きい場合に、被検試料中に前記被分析物の存在の決定から成る。このステップは当業者に周知である。
【００９７】
検出に加えて、本発明の化合物は、被検試料中の被分析物の定量化にも適している。従って、本発明のもう一つの主題は、被分析物を含有する可能性のある被検試料中で、イムノアッセイにより被分析物を定量化するための方法であって、
ｉ．  前記被検試料を、被分析物の結合パートナーの１以上と接触させることによるイムノアッセイ検査
ｉｉ．  陽性対照を、前記被分析物の結合パートナーの１以上と接触させることにより、イムノアッセイ検査の信頼性を検証する検査、
ｉｉｉ．  信頼性検証検査が陽性の場合、イムノアッセイ検査を読みとること、および
ｉｖ．  イムノアッセイ検査のシグナルを、以前に定義した式Ｉのビエピトープ化合物または以前に定義した組成物を用いて事前に得た標準曲線と比較することにより、被検試料中の前記被分析物の量を決定すること、を含む方法。
【００９８】
定量化方法の前記ステップは、以前に定義した。特に、イムノアッセイ検査ｉ）および検証検査ｉｉ）は、任意の順で、同時にまたは引き続いて、任意に同一の固体支持体上で、実行され得る。
【００９９】
この定量化方法において、陽性対照は、用いられるイムノアッセイにおいて被分析物に匹敵する抗原反応性を有する、対照として使用される任意の化合物であってよい。一実施態様によれば、陽性対照は、以前に定義されたビエピトープ化合物または組成物である。
【０１００】
標準曲線は、本発明の化合物または組成物を用いて準備される。それにもかかわらず、ほかの任意の適当な標準溶液が用いられ得る。従って、本発明のもう一つの主題は、前記被分析物を含有する可能性のある被検試料中で、イムノアッセイによる被分析物を定量化するための方法であって、
ｉ．  前記被検試料を、被分析物の結合パートナーの１以上と接触させることによるイムノアッセイ検査、
ｉｉ．  陽性対照として、以前に定義された式Ｉのビエピトープ化合物または以前に定義された組成物を、前記被分析物の結合パートナーの１以上と接触させることにより、イムノアッセイ検査の信頼性を検証する検査、
ｉｉｉ．  信頼性検証検査が陽性の場合、イムノアッセイ検査を読みとること、および
ｉｖ．  イムノアッセイ検査のシグナルと、標準曲線とを比較することにより、被検試料中の前記被分析物の量を決定することを含む方法に関する。
【０１０１】
特に特定の化合物および被分析物の選択に関する、イムノアッセイのさまざまなステップに対して以前に記載した同一の特徴および選択は、本発明の検出方法および定量化方法に対しても適用される。
【０１０２】
特に、これらの全ての検出および定量化方法において、被分析物は、心筋トロポニンＩまたはプロディフェンシン−Ａ６であってもよい。
【０１０３】
本発明のイムノアッセイ方法は、本発明の化合物または組成物を含む診断キットの使用に関与し、これは、本発明のもう一つの主題を構成する。
【０１０４】
上記のような本発明の化合物または組成物に加えて、本発明によるキットは、イムノアッセイにより興味のある被分析物の存在を検出するまたは定量化するための方法の実施に必要である化合物も含有し得、たとえば、サンドイッチ型イムノアッセイにより、結合パートナー並びに結合パートナーおよび興味のある被分析物の間の反応を実証するために必要である全ての化合物などを含有し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
本発明は、非限定的具体例として提供される以下の実施例によって、さらには図によって、より明確に理解されるであろう。
【図１】先行技術によるビエピトープ化合物（ＲＥＦ化合物）、本発明によるビエピトープ化合物（化合物１）および本発明のビエピトープ化合物１に対応するビエピトープペプチドであるが担体分子とカップリングされていない（非カップリングペプチド１）により発せられる、ＶＩＤＡＳ（登録商標）自動デバイスにより決定された蛍光シグナルＲＦＶを、その濃度の関数として与えるグラフである。
【図２】先行技術によるビエピトープ化合物（ＲＥＦ化合物）、および本発明によるビエピトープ化合物（化合物１および３）により発せられる、ＶＩＤＡＳ（登録商標）自動デバイスにより決定された蛍光シグナルＲＦＶを、その濃度の関数として与えるグラフである。
【図３】先行技術によるビエピトープ化合物（ＲＥＦ化合物）、および本発明によるビエピトープ化合物（化合物１および４）により発せられる、ＶＩＤＡＳ（登録商標）自動デバイスにより決定された蛍光シグナルＲＦＶを、その濃度の関数として与えるグラフである。
【実施例】
【０１０６】
実施例１：ペプチド合成
ペプチド合成は、アプライドバイオシステムズ（フォスターシティ、ＣＡ、米国）からのＡＢＩ４３３Ａシンセサイザ、またはＣＥＭ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（マシューズ、ＮＣ、米国）からのＬｉｂｅｒｔｙシンセサイザのいずれかを用いて実行した。Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ  ｒｅｓｉｎ（Ｃａｔ．Ｎｏ．８５５００３、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（登録商標）、メルクミリポア、モルスアイム、フランス）を、重合固相支持体として用いた。
【０１０７】
化学合成の最後に、トリフルオロ酢酸−エタンジチオール−トリイソプロピルシラン−水（９４／２．５／１／２．５  Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ）の混合物の存在下、およそ２時間、ペプチドを脱保護し、ポリマーから開裂させた。ろ過によるポリマーの排除後、０℃でジエチルエーテルからの沈殿により、ペプチドを単離した。
【０１０８】
純度を増加させるため、Ｖｙｎａｃ  Ｄｅｎａｌｉ（商標）１２０Å  Ｃ１８，１０μｍカラム（Ｍａｎｄｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ．、ゲルフ、オンタリオ、カナダ）上での逆相分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりペプチドを精製した。各ペプチドは、０．１％のトリフルオロ酢酸を含有する水溶液中のアセトニトリル（０から９５％）の段階的勾配を用いて溶出され、ステップのアセトニトリルのパーセンテージは、興味のあるペプチドに対応するピークの単離を最適化するように選択された。この最後のステップ後、得られたペプチドを検証し、特徴付けするために、２つの異なる分析技術が実行された。
【０１０９】
Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＲＰ−１８  ｅｎｃａｐｐｅｄ逆相カラム（メルクミリポア、モルスアイム、フランス）上、それぞれのペプチドに対する分析ＨＰＬＣプロファイルが生成された。０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水性溶液中のアセトニトリル（０から１００％）の直線勾配により溶出は実行され、２１４ｎｍでの吸光度を測定することによりモニターされた。この分析は、ペプチドの純度のレベルを決定することを可能とする。
【０１１０】
それぞれのペプチドも、Ａｃｃｕｒａｔｅ−Ｍａｓｓ  Ｑ−ＴＯＦ  ＬＣ／ＭＳ  ６５４０ＵＨＤマススペクトロメーター（アジレント・テクノロジー）と連結したＺｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８  ＲＲＨＤ  ２．１×５０ｍｍカラム、粒子径１．８μｍ（アジレント・テクノロジー、サンタクララ、ＣＡ、米国）上の液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳ）により分析された。この分析は、ペプチドのモル質量を決定することを可能とする。
【０１１１】
合成したペプチドの配列および特徴づけ結果を表１に示す。
2018501238.tif 000006
略称ＴｎＩは、心筋トロポニンＩに、ＰＤＥＦ−Ａ６はプロディフェンシン−Ａ６に対応する。略称Ａｄｏは、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１３４９７８−９７−５）に対応する。
【０１１２】
2018501238.tif 000007
略称ＴｎＩは、心筋トロポニンＩに、ＰＤＥＦＡ６はプロディフェンシン−Ａ６に対応する。略称Ａｄｏは、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１３４９７８−９７−５）に対応する。略称ＢＳＡは、ウシ血清アルブミンに対応する。ＩｇＧは、ウサギイムノグロブリンＧである。
【０１１３】
実施例２：ビエピトープ化合物の調製
ビエピトープ化合物は、一方である実施例１において得られたペプチドと、もう一方である担体分子との間の共有結合性カップリングを実行することにより得られた。表２は、調製されたさまざまな、本発明によるビエピトープ化合物を詳細に示す。これらの化合物のすべては、式Ｉに対応する。表３は、行われたすべてのカップリングを要約し、ペプチドおよび担体分子のペアを特定した。
【０１１４】
カップリングのための手順は、以下のとおりである：
最初に、担体分子として選択されたタンパク質を、過剰な、スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ＣＡＳ  Ｎｏ．：９２９２１−２４−９、Ｃａｔ．Ｎｏ．２２３２２、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ヴィルボン・シュール・イェヴェット、フランス）の存在下で、活性化させた。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｐｒｏｌｉａｎｔ  Ｈｅａｌｔｈ＆Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、アンケニー、ＩＡ、米国）に対し、１／２０のＢＳＡ／ＳＭＣＣモル比が選択された。従って、ＢＳＡは、１０ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）ｐＨ７．２に希釈され、用事調製された２５ｍｇ／ｍｌスルホ−ＳＭＣＣ水溶液５３μｌが滴下された。ウォーターバス中での、３０℃±２℃、１時間±５分間の、おだやかな磁気攪拌を伴うインキュベーション後、ＢＳＡ−ＳＭＣＣは、１２から１４ｋＤａのカットオフ閾値を有する透析チューブ中、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．８に対し透析された。透析は、常温で行われ、透析バスは、１時間ごとに３回、交換された。透析後、ＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液のタンパク質濃度は、２８０ｎｍで吸光度を測定することにより決定され、この濃度は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．８中５ｍｇ／ｍｌに調整された。このステップは、担体分子の表面を修飾することを可能とし、これはその時からマレイミド型のいくつかの反応性基を有する。
【０１１５】
カップリングされるペプチドは、純度が考慮に入れられ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．８中に、５ｍｇ／ｍｌで溶解された。ＢＳＡ／ペプチドモル比１／１０が選択された。従って、５ｍｇ／ｍｌの濃度のＢＳＡ−ＳＭＣＣ２．３５ｍｇ（０．４７ｍｌ）を、５ｍｇ／ｍｌの濃度のペプチド１ｍｇ（２００μｌ）に対して添加した。この混合物は、ホイール上で、２／８℃で最低１６時間、インキュベートされた。用時調製した、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．８中の０．１Ｍの２−メルカプトエチルアミン（ＣＡＳ  Ｎｏ．：６０−２３−１、システアミン）を添加することにより、その後反応を妨げた。ホイール上で、実験室温度での２０±５分間のインキュベーション後、ペプチド−ＢＳＡコンジュゲートは、１２から１４ｋＤａのカットオフ閾値を有する透析チューブ中で、ＰＢＳバッファーｐＨ７．２に対して透析された。透析は２／８℃で最低１６時間継続し、透析後、タンパク質濃度を、ＰＢＳバッファーｐＨ７．２中、２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡの理論濃度に調整した。ペプチド−ＢＳＡコンジュゲートの濃度は、そのため、２８０ｎｍでの吸光度測定により決定された。このステップは、チオエーテル結合を形成させるため、カップリングされるペプチド配列に依存して、末端または中央のシステインのレベルで、ペプチドのマレイミド基およびスルフヒドリル（ｓｕｌｆｈｙｄｒｉｌ）基（−ＳＨ）間の反応を可能にする。
【０１１６】
化合物１、２、４および５は、すべて、上記の手順の適用により得られた。特許ＵＳ６１１４１８０に記載されたビエピトープ化合物に対応するＲＥＦ化合物について、２つのペプチド（ペプチド２およびペプチド３）をＢＳＡ−ＳＭＣＣの存在下に同時に置き、それぞれのペプチドを１／１０の理論上のＢＳＡ／ペプチドモル比でカップリングさせたことを除いては同一の手順を適用した。化合物３については、ペプチド１は、ウサギポリクローナルイムノグロブリンＧ（ビオメリュー）とカップリングされた。手順は、ＢＳＡがほかの担体分子と交換されることを除いては、同一である。理論上の担体分子／ペプチドモル比は１／１０であった。
2018501238.tif 000008
【０１１７】
実施例３：本発明によるビエピトープ化合物１の免疫反応性の研究
化合物のビエピトープ性質の研究は、ＶＩＤＡＳ（登録商標）イムノ分析自動デバイス（ビオメリュー）を用いる心筋トロポニンＩイムノアッセイにより、実行された。使い捨てのチップは、反応のための固相、およびピペッティングシステムのいずれとしても役立つ。カートリッジは、１０ウェルから構成される。（密封され、標識されたアルミニウムのシートでカバーされているＸ０からＸ９。第一のウェル（Ｘ０）は、試料の導入を容易にするために、事前に切られた部分を含む。最後のウェル（Ｘ９）は、その中で基質の蛍光が測定される光学キュベットである。分析に必要であるさまざまな試薬は、中間のウェルに含有された。検査のすべてのステップは、機器により自動的に実行された。それらは、反応媒体の吸引／吹き戻しの一連のサイクルから成る。心筋トロポニンＩイムノアッセイは、シングルステップサンドイッチ検査によって実行された。
【０１１８】
ａ）チップの感作および不動態化
使用された抗体の特徴および供給元を表４に示す。チップは、ＰＢＳバッファー、ｐＨ６．２中で２．５μｇ／ｍｌにそれぞれ希釈された１９Ｃ７およびＢ９０モノクローナル抗体溶液３００μｌを用いて感作した。感作溶液を用いて＋１８／２５℃でのおよそ２０ｈのインキュベーション後、チップを空にした。１０ｇ／ｌのウシ血清アルブミンを含有するこの同一溶液３００μｌを、その後、添加した。不動態化は、＋１８／２５℃で一晩継続する。チップを空にし、乾燥して、その後、使用まで湿気の無い環境にて＋４℃で保存される。
2018501238.tif 000009
ＮＡ：入手可能でない。略称ＴｎＩは、心筋トロポニンＩに対応し、略称ＴｎＣは、心筋トロポニンＣに対応する。略称Ｃａｔ．Ｎｏ．は、供給元のカタログ参照に対応する。
【０１１９】
ｂ）イムノアッセイ手順
検査化合物は、ＰＢＳ−ＢＳＡバッファー中、さまざまな濃度で希釈され、試料としてアッセイされた。
このチップ上で捕捉抗体が不動化されているため、ＶＩＤＡＳ（登録商標）チップが試料と接触するとすぐ、免疫学的反応が開始する。自動デバイスは、被検試料（１３５μｌ）を、２７０μｌのコンジュゲート溶液と混合する。この溶液は、アルカリホスファターゼとカップリングされたＦａｂ’断片の形態の、２つのモノクローナル抗体３Ｄ５Ｆ７および７Ｂ９を含有する。これらのコンジュゲートを、１５０ｍＭのＮａＣｌおよびフィラータンパク質も含有する１００ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６．４中、およそ０．７５μｇ／ｍｌで希釈した。
【０１２０】
インキュベーションは、３７℃で６．８分続き、一方の手でのチップに吸着した抗体との、もう一方の手でのコンジュゲートとの、心筋トロポニンＩのまたは心筋ＴｎＩビエピトープ化合物もしくは心筋ＴｎＩペプチドの特異的な結合を可能にする。非結合成分は、その後、３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する２００ｍＭ  ＴｒｉｓバッファーｐＨ７．８を用いる３回の洗浄により取り除かれる。最終的な現出ステップの間、４−メチルウンベリフェリルホスフェート基質は、チップ中で、吸い上げられ、その後、吹き戻される；コンジュゲートの酵素は、この基質の４−メチルウンベリフェロンへの加水分解のための反応を触媒し、その発せられる蛍光が、４５０ｎｍで測定される。蛍光シグナル（ＲＦＶ＝相対的蛍光値）の値は、試料中に存在する抗原の濃度に比例する。
【０１２１】
表５は、ＲＥＦビエピトープ化合物（先行技術）、本発明によるビエピトープ化合物１および非カップリングペプチド１（実施例１）の免疫反応性を比較する際の、ＶＩＤＡＳ（登録商標）自動デバイスにより決定された蛍光シグナル（ＲＦＶ＝相対的蛍光値）を要約する。図１は、グラフ形態での、これらの同一のデータを表す。リマインダーとして、ペプチド１は、１つが以前に記載されたイムノアッセイのＢ９０捕捉抗体により認識され、もう１つが３Ｄ５Ｆ７検出抗体により認識される、２つの心筋ＴｎＩエピトープを含む。本発明による化合物１において、ペプチド１を、そのより良い抗原提示および改善された安定性を確保するため、ＢＳＡ上の中央のシステインを介してカップリングさせた。ＲＥＦ化合物は、ＢＳＡともカップリングさせた、同一の２つのＴｎＩエピトープを有する。化合物１と違い、２つのエピトープのそれぞれは、末端システインのレベルでＢＳＡとカップリングしている個別のペプチド（ペプチド２および３）の形態である。化合物１、特許ＵＳ６１１４１８０に記載されるビエピトープ化合物に対応するＲＥＦ化合物、および、特許出願ＷＯ９８／２４８１６に記載の合成ビエピトープ化合物に対応するペプチド１、はいずれも心筋ＴｎＩイムノアッセイにおいて反応性であったが、それらの反応性のレベルは、非常に異なっていた。従って、およそ１０００ＲＦＶのシグナルを得るため、１１１８μＭのＲＥＦ化合物と比較して、２１μＭの化合物１が必要であり、すなわち、およそ５０分の１である。化合物１は、ＲＥＦ化合物よりはるかによい免疫反応性を示した。さらに、化合物１を用いて得られるＶＩＤＡＳ（登録商標）シグナルの良いダイナミクスは、ＲＥＦ化合物を用いては、はるかに高い濃度のこの化合物を検査する場合でさえ、再現されない。非カップリングペプチド１は、ＢＳＡとカップリングされた２つのビエピトープ化合物よりもはるかに低く認識された。
2018501238.tif 000010
略称［ｃ］は、μＭでの化合物の濃度に対応する。略称Ｓは、ＲＦＶにおけるシグナルに対応する。
【０１２２】
実施例４：さまざまな担体分子を用いる、本発明によるビエピトープ化合物の免疫反応性の比較
本実施例において、心筋ＴｎＩの２つの異なるエピトープを含むペプチド１を、２つの異なる担体分子：ＢＳＡ（化合物１）およびウサギイムノグロブリンＧ（化合物３）とカップリングさせた。これらのビエピトープ化合物を得ることは、実施例２において記載されている。心筋ＴｎＩイムノアッセイにおける、これらの化合物の免疫反応性の比較は、実施例３に記載されたように、実行され、結果が上記表５および図２に示され、これは、先行技術によるビエピトープ化合物（ＲＥＦ化合物）および本発明によるビエピトープ化合物（化合物１および３）といったさまざまな化合物により発せられるＲＦＶ蛍光シグナルを、それらの濃度の関数として与えるグラフを表す。結果は、化合物１および３がいずれも心筋ＴｎＩイムノアッセイにおいて反応性であって同等の反応性を示し、それはＲＥＦ化合物に対して観察されたものよりはるかに大きいことを示す。
【０１２３】
実施例５：さまざまなスペーサーアームを用いる本発明によるビエピトープ化合物の免疫反応性の比較
本実施例において、比較されるビエピトープ化合物は、スペーサーアームについてのみ異なる。化合物１の場合には、２つのスペーサーアームが同一であり、それは人工アミノ酸Ａｄｏのダイマーである。化合物４は、アームＸとしてＧＧＧＳ配列、およびアームＹとしてＳＧＧＧ配列を含む。リマインダーとして、２つの化合物は、２つの心筋ＴｎＩエピトープを有し、担体分子はＢＳＡである。これらのビエピトープ化合物を得ることは、実施例２に記載されている。心筋ＴｎＩイムノアッセイにおけるこれらの化合物の免疫反応性の比較が、実施例３に記載のとおり実行され、結果を上記表５および図３に示した。先行技術によるビエピトープ化合物（ＲＥＦ化合物）および本発明によるビエピトープ化合物（化合物１および４）といったさまざまな化合物により発せられるＲＦＶ蛍光シグナルを、それらの濃度の関数として与えるグラフを表す。結果は、ＧＧＧＳおよびＳＧＧＧアームを含む化合物４が、Ａｄｏアームを含む化合物１よりは低いが、ＲＥＦ化合物よりはるかによく認識されることを示す。
【０１２４】
実施例６：安定性検査
化合物１および２は、表６において示されたさまざまなバッファー中、３．７５ｎｇ／ｍｌに希釈された。第一のアッセイは、溶液が調製された日である、Ｄ０に実行された。得られた値は、安定性をモニターするための参照として役立った。ビエピトープ化合物の希釈された溶液は、＋２／８℃で保存され、Ｄ７（調製７日後）にアッセイされた。以下の表６は、イムノアッセイのＲＦＶシグナルにおける、Ｄ０およびＤ７（シグナルＤ７／シグナルＤ０×１００）間での変化を示す。化合物１および２は、安定であり、それらが＋２／８℃で１週間保存される場合もその抗原性特性は保存される。
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【０１２５】
第二のステップにおいて、より長い期間の安定性研究が、５０ｇ／ｌのＢＳＡを含有するＰＢＳ  ｐＨ６．２中に希釈された化合物１のみについて実行された。＋２／８℃で保存する場合、化合物１は、希釈溶液中で安定である：イムノアッセイのシグナルの９７％が１月、９４％が３月、さらに９０％が６月保存時に、見出された。＋１８／２５℃で保存する場合、希釈溶液中、およそ１月間（８８％のシグナルが見出された）、化合物１は安定である。化合物１は、−２０℃での、少なくとも３回の凍結／融解サイクルに、その抗原性特性のいかなる低下も伴わずに耐える能力があることに気が付くことも重要である。より多い回数の凍結／融解サイクルは、検査しなかった。
【０１２６】
これらの結果のすべては、本発明による化合物１の溶液の卓越した安定性を実証する。
【０１２７】
実施例７：ミモトープを含む本発明によるビエピトープ化合物５の免疫反応性の研究
ビエピトープ化合物５は、プロディフェンシンＡ６イムノアッセイ中の対照および／または標準および／またはアジャスターとして動作するために設計された。化合物５は、線状エピトープ（ＱＡＥＤＤＰＬＱＡＫＬ）およびミモトープ（ＷＴＧＶＬＳＰＴＱＥＹＲ）を結合させる。プロディフェンシンＡ６イムノアッセイは、出願ＷＯ２０１０／１１２７７７に記載されたプロトコルに従って、すなわち、配列ＥＤＤＰＬＱの線状最小エピトープを認識する１２Ｈ４Ｅ１クローン（ビオメリュー）を捕捉抗体として用い、エピトープが線状ではなく配列ＷＴＧＶＬＳＰＴＱＥＹＲのミモトープである１Ｈ８Ｃ９クローン（ビオメリュー）を検出抗体として用いて、ＶＩＤＡＳ（登録商標）自動イムノ分析デバイス（ビオメリュー）を用いて実行された。これらのエピトープ／ミモトープは、化合物５中に見出されるものである。
【０１２８】
以下の表７は、さまざまな濃度の化合物５（分子のモル質量：９８１５５ダルトン）が検査される場合の、ＶＩＤＡＳ（登録商標）自動デバイスにより決定された蛍光シグナル（ＲＦＶ＝相対的蛍光値）を要約する。化合物５は、実際、プロディフェンシンＡ６イムノアッセイにおいて、反応性である。
2018501238.tif 000012
【０１２９】
文献参照
- Boersma YL and Plutckthun A, 2011, Curr. Opin. Biotechnol, 22 : 849-857
- Ellington AD and Szostak JW., 1990, Nature, 346: 818-822
- Fields and Noble, 1990, Int J Pept Protein Res., 35:161-214
- Merrifield 1963, J Am Chem Soc. 85:2149-2154
- Shan S. Wong, 1991, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking ≫, CRC Press Inc., Boca Raton, Florida, United States
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018501238.tif 000018
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2018501238.tif 000021
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