(57)【要約】開示されている主題は、式（Ｉ）の化合物：式（Ｉ）またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩を使用する方法およびそれらを含むキットを提供する。開示されている主題はさらに、がんの１つまたは複数の症状を治療する方法であって、それを必要とする対象に、式（Ｉ）の化合物を投与するステップを含む方法、およびそれらを調製するためのプロセスを提供する。本発明は、数ある中でも、複数のステップを組み合わせることによって、中間体材料を単離および精製せずに、製造コストを有意に低減させるための改善されたプロセスも提供する。
2018516947.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍の治療における使用のための式（Ｉ）の化合物であって、式（Ｉ）の化合物
【化２０】
2018516947.tif 000029
またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩を含む有効量の経口剤形が、それを必要とする対象に、約３００〜２，０００ｍｇ／日の投薬量で投与される、式（Ｉ）の化合物。
【請求項２】
前記投薬量が、約５００〜７００ｍｇ／日である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記投薬量が、約６〜１２ｍｇ／ｋｇ／日である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記経口剤形が、週に５から７日投与される、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記経口剤形が、連続する４週間にわたって週に５から７日投与されるか、または連続する３週間にわたって週に５から７日投与され、続いて、前記経口剤形が投与されない１週間の休薬となる、請求項１から４に記載の使用。
【請求項６】
投薬サイクルが、連続する３週間の治療に続く１週間の休薬、または連続する４週間の治療のいずれかからなり、前記経口剤形が、最大１２回の投薬サイクルにわたって投与される、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記経口剤形が、単回投与後、約７００〜１，１００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘをもたらす、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記経口剤形が、単回投与後、約８，０００〜１０，０００時・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）をもたらす、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記腫瘍が、膵臓、膀胱または結腸直腸がんである、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
放射線または抗腫瘍剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
代謝拮抗物質、ＤＮＡ断片化剤、ＤＮＡ架橋剤、挿入剤、タンパク質合成阻害剤、トポイソメラーゼＩ毒、トポイソメラーゼＩＩ毒、微小管指向剤、キナーゼ阻害剤、ポリフェノール、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、死受容体アゴニスト、免疫チェックポイント阻害剤、抗プログラム細胞死１（ＰＤ−１）受容体抗体および抗プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）抗体からなる群から選択される抗腫瘍剤を投与することをさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
ＰＤ−Ｌ１抗体を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
ＰＤ−１抗体を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
前記経口剤形が、固体である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
前記経口剤形が、錠剤である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記経口剤形が、カプセル剤である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記対象が、ヒトである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
治療を必要とする対象の、式（Ｉ）の化合物
【化２１】
2018516947.tif 000030
またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩による治療の有効性を予測する方法であって、
（ｉ）前記対象から腫瘍細胞または組織の試料を収集するステップと、
（ｉｉ）前記腫瘍細胞または組織におけるＵＣＫ２発現のレベルを測定するステップと
を含み、ここで、ＵＣＫ２の発現レベルが、式（Ｉ）の化合物による治療の有効性の可能性を示す、方法。
【請求項１９】
細胞をアポトーシスシグナルに対して増感させる方法であって、前記細胞を、有効量の、式（Ｉ）の化合物
【化２２】
2018516947.tif 000031
またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩と接触させるステップを含む方法。
【請求項２０】
がんの１つまたは複数の症状の治療における使用のための式（Ｉ）の化合物
【化２３】
2018516947.tif 000032
であって、前記式（Ｉ）の化合物またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩が、メチルトランスフェラーゼを阻害するためおよび対象における少なくとも１つの低メチル化された標的を上方調節するために有効な量で投与される、式（Ｉ）の化合物。
【請求項２１】
４−アミノ−１−（（１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−２−フルオロ−４，５−ジヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）シクロペンタ−２−エン−１−イル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オン１Ｈ２Ｏ（ＲＸ−３１１７−ＭＨ）の調製のためのプロセスであって、いかなる中間体も単離せずに、１つを超えるステップを伴う連続プロセスにおいて、ｔｅｒｔ−ブチル（（（３ａＲ，４Ｒ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）オキシ）ジフェニルシラン（ＡＳＭ１１）を４−アミノ−１−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オン（ＩＮＴ１４）に変換するステップを含むプロセス。
【請求項２２】
ｔｅｒｔ−ブチル（（（３ａＲ，４Ｒ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）オキシ）ジフェニルシラン（ＡＳＭ１１）を２−メチルテトラヒドロフランに溶解するステップと、
フッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムを添加して、反応溶液中で（（３ａＳ，４Ｒ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−オール）（ＩＮＴ１２）を形成するステップと、
有機相中でＩＮＴ１２を回収するステップと
をさらに含む、請求項２１に記載のプロセス。
【請求項２３】
前記有機相中でＩＮＴ１２を回収するステップが、
前記反応溶液を水溶液で洗浄するステップと、
ＩＮＴ１２を有する有機相から水性抽出物を分離するステップと、
前記水性抽出物を２−メチルテトラヒドロフランで洗浄して、前記水性抽出物からＩＮＴ１２を抽出するステップと、
抽出されたＩＮＴ１２を、ＩＮＴ１２を有する有機相と合わせるステップと
を含む、請求項２２に記載のプロセス。
【請求項２４】
トリエチルアミン、および２−メチル（methly）テトラヒドロフラン中の塩化メタンスルホニルを、前記有機相中の前記ＩＮＴ１２に添加して、第２の反応溶液中で（（３ａＲ，４Ｒ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イルメタンスルホネート）（ＩＮＴ１３）を形成するステップと、
ＤＭＳＯ中でＩＮＴ１３を回収するステップと
をさらに含む、請求項２２に記載のプロセス。
【請求項２５】
ＤＭＳＯ中でＩＮＴ１３を回収する前記ステップが、
ＤＭＳＯを、ＩＮＴ１３を伴う前記第２の反応溶液に添加するステップと、
少なくとも９０％ｗ／ｗの２−メチルテトラヒドロフランを蒸留によって除去するステップと
を含む、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２６】
２．５当量の炭酸セシウムおよびシトシンを、ＤＭＳＯ中の前記ＩＮＴ１３に添加して、第３の反応溶液中で４−アミノ−１−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オン（ＩＮＴ１４）を形成するステップ
をさらに含む、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２７】
反応温度を約３３から３７℃に維持するステップ
をさらに含む、請求項２６に記載のプロセス。
【請求項２８】
前記ＩＮＴ１４が、約９５：５超のＮ−対Ｏ−異性体の比を有する、請求項２６に記載のプロセス。
【請求項２９】
酸を、ＩＮＴ１４を伴う前記第３の反応溶液に添加して、４−アミノ−１−（（１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−２−フルオロ−４，５−ジヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）シクロペンタ−２−エン−１−イル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オン（ＲＸ−３１１７）を形成するステップと、
前記ＲＸ−３１１７を、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルおよび水で洗浄して、有機相およびＲＸ−３１１７を有する水性相を形成するステップと、
前記ＲＸ−３１１７を精製して、ＲＸ−３１１７−ＭＨを形成するステップと
をさらに含む、請求項２６に記載のプロセス。
【請求項３０】
前記洗浄するステップの前に、反応混合物にメタノールを投入し、前記反応混合物を蒸留して、検出されるアセトニドの面積が約１．０％未満になるまで前記アセトニドを除去するステップ
をさらに含む、請求項２９に記載のプロセス。
【請求項３１】
前記洗浄するステップが、
前記有機相から、ＲＸ−３１１７を有する水性相を分離するステップと、
ＲＸ−３１１７を有する水性相を、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで、前記水性相中で検出されるトリチルアルコールが約０．５％ｗ／ｗ未満になるまで洗浄するステップと、
塩基性アニオン樹脂を、ＲＸ−３１１７を有する水性相に添加して、スラリーを形成するステップと、
前記スラリーを濾過して、母液を保持するステップと、
前記母液を濃縮して、濃縮物を形成するステップと、
アセトニトリルを前記濃縮物に添加して、精製されたＲＸ−３１１７−ＭＨを形成するステップと
をさらに含む、請求項２９に記載のプロセス。
【請求項３２】
ｔｅｒｔ−ブチル（（（３ａＲ，４Ｒ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）オキシ）ジフェニルシラン（ＡＳＭ１１）から４−アミノ−１−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オン（ＩＮＴ１４）を調製するための連続プロセスであって、
前記ＡＳＭ１１を２−メチルテトラヒドロフランに溶解するステップと、
フッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムを添加して、（（３ａＳ，４Ｒ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−オール）（ＩＮＴ１２）を形成するステップと、
トリメチルアミン、および２−メチルテトラヒドロフラン中の塩化メタンスルホニルを、前記ＩＮＴ１２に添加して、（（３ａＲ，４Ｒ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イルメタンスルホネート）（ＩＮＴ１３）を形成するステップと、
炭酸セシウムおよびシトシンを、前記ＩＮＴ１３に添加して、４−アミノ−１−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オン（ＩＮＴ１４）を形成するステップと
を含み、
ここで、前記ステップが、ＩＮＴ１２もＩＮＴ１３も単離せずに、１つまたは複数の固定反応器内で実施される、連続プロセス。
【請求項３３】
４−アミノ−１−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オン（ＩＮＴ１４）から４−アミノ−１−（（１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−２−フルオロ−４，５−ジヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）シクロペンタ−２−エン−１−イル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オン１Ｈ２Ｏ（ＲＸ−３１１７−ＭＨ）を調製するための連続プロセスであって、
前記ＩＮＴ１４を酸と反応させて、４−アミノ−１−（（１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−２−フルオロ−４，５−ジヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）シクロペンタ−２−エン−１−イル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オン（ＲＸ−３１１７）を形成するステップと、
前記ＲＸ−３１１７を、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルおよび水で洗浄して、有機相およびＲＸ−３１１７を有する水性相を形成するステップと、
前記有機相から、ＲＸ−３１１７を有する水性相を分離するステップと、
ＲＸ−３１１７を有する水性相を、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで、前記水性相中で検出されるトリチルアルコールが約０．５％ｗ／ｗ未満になるまで洗浄するステップと、
強塩基性アニオン樹脂を、ＲＸ−３１１７を有する水性相に添加して、スラリーを形成するステップと、
前記スラリーを濾過して、母液を保持するステップと、
前記母液を濃縮して、濃縮物を形成するステップと、
アセトニトリルを前記濃縮物に添加して、精製されたＲＸ−３１１７−ＭＨを形成するステップと
前記精製されたＲＸ−３１１７−ＭＨを単離するステップと
を含み、
ここで、前記ステップが、１つまたは複数の固定反応器内で実施される、連続プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、２０１５年６月９日に出願された米国仮出願第６２／１７３，１７４号；２０１５年８月２７日に出願された米国仮出願第６２／２１０，７０８号；２０１６年２月１日に出願された米国仮出願第６２／２８９，８０１号；および２０１６年４月７日に出願された米国仮出願第６２／３１９，３６９号への優先権を主張し、これらの内容は、その全体が本明細書において参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
米国特許第７，４０５，２１４号（２００８年７月２９日発行）は、ＲＸ−３１１７、フルオロシクロペンテニルシトシンまたは４−アミノ−１−（（１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−２−フルオロ−４，５−ジヒドロキシ−３−ヒドロキシメチル−シクロペンタ−２−エニル）−１Ｈ−ピリミジン−２−オンとも称される、式（Ｉ）の化合物
【化１】
2018516947.tif 000003
を開示している。米国特許７，４０５，２１４号は、Ｄ−リボースからのＲＸ−３１１７の全１１ステップの合成も開示しており、合成は、工場生産における実装に課題をもたらす高価な触媒を使用する。
【０００３】
米国特許第９，１５０，５２０号（２０１５年１０月６日発行）は、（３Ｒ，４Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル−（５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−トリチルオキシメチル−４，６ａ−ジヒドロ（dihy-dro）−３ａＨ−シクロペンタ［１，３］ジオキソール−４−イルオキシ）−ジフェニル−シランから４−アミノ−１−（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ（d-ihydro）−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オンを介するＲＸ−３１１７の調製のための短経路を開示している。合成は、中間体が各ステップで単離されることを必要とする。故に、プロセスは、時間およびコストの制約により、最終製品の規模を拡大した生産には不十分である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第７，４０５，２１４号明細書
【特許文献２】米国特許第９，１５０，５２０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、例えば、ステップの数を低減させることおよび／または各中間体を精製する必要性を除去することにより、改善されたプロセスを提供することが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、式（Ｉ）の化合物の新たな使用およびそれを使用する方法を対象とする。本発明は、数ある中でも、複数のステップを組み合わせることによって、中間体材料を単離および精製せずに、製造コストを有意に低減させるための改善されたプロセスも提供する。加えて、本発明は、対象において式（Ｉ）の化合物を使用するための投薬量および曝露レベルを提供する。
【０００７】
本開示の一態様は、腫瘍の治療における使用のための式（Ｉ）の化合物を提供し、式（Ｉ）の化合物
【化２】
2018516947.tif 000004
またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩を含む有効量の経口剤形は、それを必要とする対象に、約３００〜２，０００ｍｇ／日の投薬量で投与される。
【０００８】
実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、一水和物として投与される。他の実施形態では、溶媒和物、水和物および塩のない式（Ｉ）の化合物が投与される。
【０００９】
方法の実施形態は、経口投薬を、週に５から７日投与することを含み得る。方法の実施形態は、経口投薬を、連続する４週間にわたって週に５から７日投与すること、または連続する３週間にわたって週に５から７日投与し、続いて、経口剤形が投与されない１週間の休薬を含むことができる。
【００１０】
方法の実施形態は、連続する３週間の治療に続く１週間の休薬、または連続する４週間の治療のいずれかからなる投薬サイクルを含み得、経口剤形は、最大１２回の投薬サイクルにわたって投与される。
【００１１】
方法の実施形態は、単回投与後、約７００〜１，１００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘをもたらす経口剤形を含むことができる。方法の実施形態は、単回投与後、約８，０００〜１０，０００時・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）をもたらす経口剤形を含むことができる。
【００１２】
方法の実施形態を使用して、膵臓、膀胱または結腸直腸がんを治療することを含め、腫瘍を治療することができる。
【００１３】
方法の実施形態は、経口剤形を、代謝拮抗物質、ＤＮＡ断片化剤、ＤＮＡ架橋剤、挿入剤、タンパク質合成阻害剤、トポイソメラーゼＩ毒、トポイソメラーゼＩＩ毒、微小管指向剤、キナーゼ阻害剤、ポリフェノール、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、死受容体アゴニスト、免疫チェックポイント阻害剤、抗プログラム細胞死１（ＰＤ−１）受容体抗体および抗プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）抗体からなる群から選択される第２の作用物質または抗腫瘍剤とともに投与することを含み得る。方法の実施形態は、ＰＤ−Ｌ１抗体を対象に投与することを含み得る。方法の実施形態は、ＰＤ−１抗体を対象に投与することを含み得る。方法の実施形態は、固体経口剤形を投与することを含み得る。第２の作用物質または抗腫瘍剤は、同じ経口剤形でまたは別個の経口剤形で投与され得る。
【００１４】
実施形態では、それを必要とする対象は、ヒト対象である。
【００１５】
本開示の別の態様は、それを必要とする対象の、式（Ｉ）の化合物
【化３】
2018516947.tif 000005
またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩による治療の有効性を予測する方法であって、（ｉ）対象から腫瘍細胞または組織の試料を収集するステップと、（ｉｉ）腫瘍細胞または組織におけるＵＣＫ２発現のレベルを測定するステップとを含み、ここで、ＵＣＫ２の発現レベルが、式（Ｉ）の化合物による治療の有効性の可能性を示す方法を提供する。
【００１６】
本開示の別の態様は、腫瘍細胞試料中におけるキナーゼ、ｐ５３またはＵＣＫ２タンパク質のレベルを測定するアッセイの使用により、腫瘍の治療における式（Ｉ）の化合物、または水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩の潜在的有効性を試験するためのキットである。
【００１７】
本開示の別の態様は、がんの１つまたは複数の症状の治療における使用のための式（Ｉ）の化合物
【化４】
2018516947.tif 000006
を提供し、式（Ｉ）の化合物またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩は、メチルトランスフェラーゼを阻害するためおよび対象における少なくとも１つの低メチル化された標的を上方調節するために有効な量で投与される。実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、一水和物として投与される。他の実施形態では、溶媒和物、水和物および塩のない式（Ｉ）の化合物が投与される。
【００１８】
本開示の別の態様は、４−アミノ−１−（（１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−２−フルオロ−４，５−ジヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）シクロペンタ−２−エン−１−イル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オン１Ｈ２Ｏ（ＲＸ−３１１７−ＭＨ）の調製のためのプロセスであって、いかなる中間体も単離せずに、１つを超えるステップを伴う連続プロセスで、ｔｅｒｔ−ブチル（（（３ａＲ，４Ｒ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）オキシ）ジフェニルシラン（ＡＳＭ１１）を４−アミノ−１−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オン（ＩＮＴ１４）に変換することによるプロセスを提供する。
【００１９】
方法の実施形態は、ｔｅｒｔ−ブチル（（（３ａＲ，４Ｒ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）オキシ）ジフェニルシラン（ＡＳＭ１１）を２−メチルテトラヒドロフランに溶解すること、フッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムを添加して、反応溶液中で（（３ａＳ，４Ｒ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−オール）（ＩＮＴ１２）を形成すること、および有機相中でＩＮＴ１２を回収することを含み得る。
【００２０】
有機相中でＩＮＴ１２を回収する実施形態は、反応溶液を水溶液で洗浄すること、ＩＮＴ１２を有する有機相から水性抽出物を分離すること、水性抽出物を２−メチルテトラヒドロフランで洗浄して、水性抽出物からＩＮＴ１２を抽出すること、および抽出されたＩＮＴ１２を、ＩＮＴ１２を有する有機相と合わせることを含み得る。
【００２１】
方法の実施形態は、トリエチルアミン、および２−メチルテトラヒドロフラン中の塩化メタンスルホニルを、有機相中のＩＮＴ１２に添加して、第２の反応溶液中で（（３ａＲ，４Ｒ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イルメタンスルホネート）（ＩＮＴ１３）を形成すること、およびＤＭＳＯ中でＩＮＴ１３を回収することを含み得る。
【００２２】
ＤＭＳＯ中でＩＮＴ１３を回収する実施形態は、ＤＭＳＯを、ＩＮＴ１３を伴う第２の反応溶液に添加すること、および少なくとも９０％ｗ／ｗの２−メチルテトラヒドロフランを蒸留によって除去することを含み得る。
【００２３】
方法の実施形態は、２．５当量の炭酸セシウムおよびシトシンを、ＤＭＳＯ中のＩＮＴ１３に添加して、第３の反応溶液中で４−アミノ−１−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オン（ＩＮＴ１４）を形成することを含み得る。
【００２４】
方法の実施形態は、反応温度を約３３から３７℃に維持することを含み得る。
【００２５】
実施形態では、ＩＮＴ１４は、約９５：５超のＮ−対Ｏ−異性体の比を有する。
【００２６】
方法の実施形態は、酸を、ＩＮＴ１４を伴う第３の反応溶液に添加して、４−アミノ−１−（（１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−２−フルオロ−４，５−ジヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）シクロペンタ−２−エン−１−イル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オン（ＲＸ−３１１７）を形成すること、ＲＸ−３１１７を、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルおよび水で洗浄して、有機相およびＲＸ−３１１７を有する水性相を形成すること、ならびにＲＸ−３１１７を精製して、ＲＸ−３１１７−ＭＨを形成することを含み得る。
【００２７】
方法の実施形態は、洗浄するステップの前に、反応混合物にメタノールを投入し、反応混合物を蒸留して、検出されるアセトニドの面積が約１．０％未満になるまでアセトニドを除去することを含み得る。
【００２８】
洗浄するステップの実施形態は、有機相から、ＲＸ−３１１７を有する水性相を分離すること、ＲＸ−３１１７を有する水性相を、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで、水性相中で検出されるトリチルアルコールが約０．５％ｗ／ｗ未満になるまで洗浄すること、塩基性アニオン樹脂を、ＲＸ−３１１７を有する水性相に添加して、スラリーを形成すること、スラリーを濾過して、母液を保持すること、母液を濃縮して、濃縮物を形成すること、およびアセトニトリルを濃縮物に添加して、精製されたＲＸ−３１１７−ＭＨを形成することを含み得る。
【００２９】
本開示の別の態様は、ｔｅｒｔ−ブチル（（（３ａＲ，４Ｒ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）オキシ）ジフェニルシラン（ＡＳＭ１１）から４−アミノ−１−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オン（ＩＮＴ１４）を調製するための連続プロセスであって、ＡＳＭ１１を２−メチルテトラヒドロフランに溶解するステップと；フッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムを添加して、（（３ａＳ，４Ｒ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−オール）（ＩＮＴ１２）を形成するステップと；トリメチルアミン、および２−メチルテトラヒドロフラン中の塩化メタンスルホニルを、ＩＮＴ１２に添加して、（（３ａＲ，４Ｒ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イルメタンスルホネート）（ＩＮＴ１３）を形成するステップと；炭酸セシウムおよびシトシンを、ＩＮＴ１３に添加して、４−アミノ−１−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オン（ＩＮＴ１４）を形成するステップとを含み、ここで、ステップが、ＩＮＴ１２もＩＮＴ１３も単離せずに、１つまたは複数の固定反応器内で実施される、連続プロセスを提供する。
【００３０】
本開示の別の態様は、４−アミノ−１−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オン（ＩＮＴ１４）から４−アミノ−１−（（１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−２−フルオロ−４，５−ジヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）シクロペンタ−２−エン−１−イル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オン１Ｈ２Ｏ（ＲＸ−３１１７−ＭＨ）を調製するための連続プロセスであって、ＩＮＴ１４を酸と反応させて、４−アミノ−１−（（１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−２−フルオロ−４，５−ジヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）シクロペンタ−２−エン−１−イル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オン（ＲＸ−３１１７）を形成するステップと；ＲＸ−３１１７を、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルおよび水で洗浄して、有機相およびＲＸ−３１１７を有する水性相を形成するステップと；有機相から、ＲＸ−３１１７を有する水性相を分離するステップと；ＲＸ−３１１７を有する水性相を、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで、水性相中で検出されるトリチルアルコールが約０．５％ｗ／ｗ未満になるまで洗浄するステップと；強塩基性アニオン樹脂を、ＲＸ−３１１７を有する水性相に添加して、スラリーを形成するステップと；スラリーを濾過して、母液を保持するステップと；母液を濃縮して、濃縮物を形成するステップと；アセトニトリルを濃縮物に添加して、精製されたＲＸ−３１１７−ＭＨを形成するステップと；精製されたＲＸ−３１１７−ＭＨを単離するステップとを含み、ここで、ステップが、１つまたは複数の固定反応器内で実施される、連続プロセスを提供する。
【００３１】
本開示の別の態様は、細胞においてアポトーシスを誘発する方法であって、細胞を、有効量の、式（Ｉ）の化合物
【化５】
2018516947.tif 000007
またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩と接触させることによる方法を提供する。
【００３２】
本開示の別の態様は、細胞をアポトーシスシグナルに対して増感させる方法であって、細胞を、有効量の、式（Ｉ）の化合物
【化６】
2018516947.tif 000008
またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩と接触させることによる方法を提供する。
【００３３】
本開示の別の態様は、細胞におけるタンパク質キナーゼをモジュレートする方法であって、細胞を、有効量の、式（Ｉ）の化合物、またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩と接触させることによる方法を提供する。
【００３４】
本開示の別の態様は、非小細胞肺がん細胞を治療する方法であって、（ｉ）非小肺がん細胞（non-small  lung  cancer  cell）を有する対象を診断するステップと、（ｉｉ）対象に、有効量の、式（Ｉ）の化合物、またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩を投与するステップとによる方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、２４時間後のＧ１期におけるＡ５４９、ＳＷ１５７３、ＳＷ１５７３／Ｇ−およびＨ４６０細胞に対するＲＸ−３１１７（１μＭ）の効果を示す一連の棒グラフである。１μＭの用量では、ＲＸ−３１１７は、２４時間曝露後のＧ１期におけるＡ５４９、ＳＷ１５７３、ＳＷ１５７３／Ｇ−およびＨ４６０細胞の蓄積を誘発した。
【００３６】
【図２】図２は、２４時間および４８時間後のＳ期におけるＡ５４９、ＳＷ１５７３およびＳＷ１５７３／Ｇ−細胞に対するＲＸ−３１１７（５×ＩＣ５０）の効果を示す一連の棒グラフである。５×ＩＣ５０のより高い用量では、ＲＸ−３１１７は、Ｓ期におけるＡ５４９、ＳＷ１５７３およびＳＷ１５７３／Ｇ−細胞の蓄積を誘発した。
【００３７】
【図３】図３は、ＳＷ１５７３細胞におけるプロカスパーゼ９活性化に対する漸増濃度のＲＸ−３１１７の効果を示す一連のウエスタンブロットである。ＲＸ−３１１７は、ＳＷ１５７３細胞中のプロカスパーゼ９を減少させた。プロカスパーゼ９の低減は、カスパーゼの活性化およびそれに続くアポトーシス誘発を示す。
【００３８】
【図４】図４は、Ａ５４９細胞におけるプロカスパーゼ９活性化に対する漸増濃度のＲＸ−３１１７の効果を示す一連のウエスタンブロットである。ＲＸ−３１１７は、Ａ５４９細胞中のプロカスパーゼ９を減少させた。
【００３９】
【図５】図５は、４８時間後のＳＷ１５７３細胞におけるバイオマーカーγＨ２Ａ．Ｘ（リン酸化（phospho）Ｓ１３９）によって示される通りのＲＸ−３１１７によって誘発された二本鎖切断（ＤＳＢ）を示す一連のウエスタンブロットである。ＲＸ−３１１７は、４８時間後に、ＤＳＢリン酸化Ｓ１３９  Ｈ２Ａ．Ｘを表すマーカーによって示されるＤＳＢを誘発する。Ｃ＊は、２日後の５０μＭのエトポシドによるＤＮＡ損傷を意味し、これは、陽性対照として役立った。
【００４０】
【図６】図６は、２４時間後の漸増濃度のＲＸ−３１１７によって誘発される開裂されたＰＡＲＰを示す一連のウエスタンブロットである。
【００４１】
【図７】図７は、Ａ５４９細胞におけるｐ５３発現レベルに対する１μＭおよび５μＭのＲＸ−３１１７の効果を示す一連のウエスタンブロットである。１μＭおよび５μＭでは、ＲＸ−３１１７は、Ａ５４９細胞株中のｐ５３発現レベルを増大させた。
【００４２】
【図８】図８は、２４および４８時間後のＳＷ１５７３細胞におけるＣｈｋ１、Ｃｈｋ２、Ｃｄｋ１、Ｃｄｋ２およびｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ発現レベルに対する１０μＭのＲＸ−３１１７の効果を示す一連のウエスタンブロットである。ＳＷ１５７３細胞において、Ｃｈｋ１は、１０μＭのＲＸ−３１１７への４８時間の曝露後に増大し、ｐＣＤＣ２５Ｃは減少し、Ｃｄｋ２は増大する。
【００４３】
【図９】図９は、２４時間後のＳＷ１５７３細胞におけるｗｅｅ１発現レベルに対する漸増濃度のＲＸ−３１１７の効果を示す一連のウエスタンブロットである。漸増濃度のＲＸ−３１１７は、ｗｅｅ１に対して効果を有し、これは、ＳＷ１５７３細胞株において２４時間後に減少する。
【００４４】
【図１０】図１０は、２４時間（ｄ１）および４８時間（ｄ２）後のサブＧ１期におけるＰＩ染色、アポトーシスＡ５４９およびＳＷ１５７３細胞に対する５×ＩＣ５０のＲＸ−３１１７の効果を示す棒グラフである。
【００４５】
【図１１】図１１は、２４時間（ｄ１）、４８時間（ｄ２）、７２時間（ｄ３）および９６時間（ｄ４）後のサブＧ１期におけるアネキシンＶ染色、アポトーシスＡ５４９およびＳＷ１５７３細胞に対する５μＭ（Ａ５４９について）および１０μＭ（ＳＷ１５７３について）のＲＸ−３１１７の効果を示す棒グラフである。
【００４６】
【図１２】図１２は、用量１および用量７の後のピーク血漿中濃度Ｃｍａｘ（ｎｇ／ｍＬ）を示すグラフである。
【００４７】
【図１３】図１３は、用量１および用量７の後の血漿曝露をＡＵＣ０〜ｔ（ｎｇ・時／ｍＬ）で示すグラフである。
【００４８】
【図１４】図１４は、シチジン、ゲムシタビンおよび新規シチジン類似体ＲＸ−３１１７を表す構造式を示す。
【００４９】
【図１５】図１５は、ＲＸ−３１１７とのプレまたはポストキュベーションの放射線増感効果を示す棒グラフである。灰色のバーは、Ａ２７８０細胞に４Ｇｙを照射した対照を表し、黒色のバーは、４Ｇｙの照射後２４時間にわたる１μＭのＲＸ−３１１７とのインキュベーションを表す。白色／灰色のバーは、４Ｇｙの照射前の１μＭのＲＸ−３１１７との２４時間インキュベーションを表す。Ｐ．Ｅ．は、播種効率（plating  efficiency）を表す。
【００５０】
【図１６ＡＢ】図１６は、コロニー形成アッセイを使用して異なる線量の照射による１μＭのＲＸ−３１１７（ＳＷ１５７３細胞については５μＭのＲＸ−３１１７）の放射線増感効果を示す一連のグラフである。細胞は、ＲＸ−３１１７とともに２４時間にわたってプレインキュベートした。Ａ：Ａ２７８０細胞は、１．８の線量修飾係数（ＤＭＦ）を有していた。Ｂ：Ａ５４９細胞は、１．８のＤＭＦを有していた。Ｃ：Ｈ４６０細胞は、乏しい放射線増感効果を示した。Ｄ：ＳＷ１５７３細胞は、１．５のＤＭＦを有していた。Ｅ：ＳＷ１５７３／Ｇ−細胞は、１．４のＤＭＦを有していた。Ｆ：１μＭのＲＸ−３１１７とのインキュベーション２４時間後における、５日間にわたる２ＧｙによるＳＷ１５７３細胞の分割照射。
【図１６ＣＤ】図１６は、コロニー形成アッセイを使用して異なる線量の照射による１μＭのＲＸ−３１１７（ＳＷ１５７３細胞については５μＭのＲＸ−３１１７）の放射線増感効果を示す一連のグラフである。細胞は、ＲＸ−３１１７とともに２４時間にわたってプレインキュベートした。Ａ：Ａ２７８０細胞は、１．８の線量修飾係数（ＤＭＦ）を有していた。Ｂ：Ａ５４９細胞は、１．８のＤＭＦを有していた。Ｃ：Ｈ４６０細胞は、乏しい放射線増感効果を示した。Ｄ：ＳＷ１５７３細胞は、１．５のＤＭＦを有していた。Ｅ：ＳＷ１５７３／Ｇ−細胞は、１．４のＤＭＦを有していた。Ｆ：１μＭのＲＸ−３１１７とのインキュベーション２４時間後における、５日間にわたる２ＧｙによるＳＷ１５７３細胞の分割照射。
【図１６ＥＦ】図１６は、コロニー形成アッセイを使用して異なる線量の照射による１μＭのＲＸ−３１１７（ＳＷ１５７３細胞については５μＭのＲＸ−３１１７）の放射線増感効果を示す一連のグラフである。細胞は、ＲＸ−３１１７とともに２４時間にわたってプレインキュベートした。Ａ：Ａ２７８０細胞は、１．８の線量修飾係数（ＤＭＦ）を有していた。Ｂ：Ａ５４９細胞は、１．８のＤＭＦを有していた。Ｃ：Ｈ４６０細胞は、乏しい放射線増感効果を示した。Ｄ：ＳＷ１５７３細胞は、１．５のＤＭＦを有していた。Ｅ：ＳＷ１５７３／Ｇ−細胞は、１．４のＤＭＦを有していた。Ｆ：１μＭのＲＸ−３１１７とのインキュベーション２４時間後における、５日間にわたる２ＧｙによるＳＷ１５７３細胞の分割照射。
【００５１】
【図１７】図１７は、スフェロイドに対するＲＸ−３１１７の放射線増感効果を示す一連のグラフである。Ａ：ＳＷ１５７３、１５日かけて正規化したスフェロイド体積。対照；１μＭのＲＸ−３１１７処理；５日間にわたる２ＧｙのＲＴ処理；５日間にわたる２ＧｙのＲＴ処理および１μＭのＲＸ−３１１７とともにプレインキュベートした。Ｂ：Ａ５４９スフィア、１５日かけて正規化したスフェロイド体積。対照；１μＭのＲＸ−３１１７処理；５日間の２ＧｙのＲＴ処理；５日間にわたる２ＧｙのＲＴ処理および１μＭのＲＸ−３１１７とともに２４時間にわたってプレインキュベートした。
【００５２】
【図１８】図１８は、ＤＮＡ損傷のウエスタンブロット分析を示す。Ａ：０．１μＭ〜１０μＭから出発する漸増濃度のＲＸ−３１１７に４８時間にわたって曝露したＡ２７８０細胞におけるＤＳＢ損傷マーカーγＨ２Ａ．Ｘの発現。Ｂ：照射と組み合わせたＳＷ１５７３細胞におけるＤＮＡ損傷の時間依存性誘発。Ｃ＊は、２日後の５０μＭのエトポシドによるＤＮＡ損傷を意味し、これは、陽性対照として役立った。
【００５３】
【図１９】図１９は、細胞株におけるＲＸ−３１１７および放射線による細胞周期分布の撹乱を示す一連のヒストグラム（Ａ）棒グラフおよびウエスタンブロット（Ｂ）である。Ａ：４Ｇｙの放射線ありまたはなしで１μＭのＲＸ−３１１７で２４時間にわたって処理した細胞株の細胞期のヒストグラム。処理２４時間後に細胞を収穫した。Ｂ：薬物インキュベーション２４時間後および照射３０分後のウエスタンブロットによる細胞周期タンパク質分析。
【００５４】
【図２０】図２０は、ＳＷ１５７３細胞における細胞周期タンパク質の発現に対するＲＸ−３１１７および放射線の効果を示す一連のウエスタンブロットである。細胞に、ＲＸ−３１１７の存在下および非存在下で放射線照射（ＲＴ）した。発現は、オデッセイシステムを使用するウェスタンブロッティングによって測定した。
【００５５】
【図２１】図２１は、ＲＸ−３１１７の概要代謝経路を示す。
【００５６】
【図２２】図２２は、ＲＸ−３１１７による維持ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ１）の下方調節の機構の概略図を示す。
【００５７】
【図２３】図２３は、Ａ５４９細胞におけるＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂおよびβ−アクチン発現レベルに対する１μＭ、５μＭ、２５μＭおよび７５μＭのＲＸ−３１１７の効果を示す一連のウエスタンブロットである。ＲＸ−３１１７は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１の維持を下方調節する。
【００５８】
【図２４】図２４は、細胞周期タンパク質に対する潜在的効果：損傷誘発後のチェックポイントキナーゼＣｈｋ１およびＣｈｋ２による細胞周期の調節を示す図表である。
【００５９】
【図２５】図２５は、２４または４８時間にわたる５μＭ、１０μＭ、２０μＭおよび５０μＭのＡ５４９およびＳＷ１５７３細胞に対するＲＸ−３１１７の効果を示す一連のグラフおよび関連ウエスタンブロットである。細胞を収穫し、ウェスタンブロッティングを使用してタンパク質発現を測定した（ＡおよびＢ）。ＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲを使用して遺伝子発現を測定した（ＣおよびＤ）。ＲＸ−３１１７は、ＤＮＭＴ１タンパク質および遺伝子発現を下方調節する。
【００６０】
【図２６】図２６は、２４時間にわたるＡ２７８０卵巣がん細胞に対するＲＸ−３１１７（１μＭ）およびアザ−ｄＣ（５μＭ）の効果を示すウエスタンブロットおよびグラフである。核抽出物を単離し、ウエスタンブロット（Ａ）によりＤＮＭＴ１発現を、および方法において記述されている通りの市販のキットにより活性（Ｂ）を測定した。
【００６１】
【図２７】図２７は、Ａ５４９細胞に対するＲＸ−３７１１およびアザ−ｄＣの効果を示す。全体的なメチル化は、５−メチル−シトシンに対する抗体を持つＦＡＣＳ（Ａ）または免疫蛍光（Ｂ）を使用して測定した。対照細胞を１００％に設定した（Ａ）。ウエスタンブロット（Ｃ）は、Ａ５４９細胞におけるＭＧＭＴおよびＥ−カドヘリン、ならびにＲＸ−３１１７およびアザ−ｄＣへの曝露後のＳＷ１５７３細胞におけるｐ１６の発現を示す。
【００６２】
【図２８】図２８は、２４時間にわたるＭＴＸのＰＣＦＴ媒介輸送に対するＲＸ−３１１７の効果を示す。葉酸（ＦＡ）を添加して、ＲＦＣ媒介ＭＴＸ輸送を阻害するためにＰＣＦＴおよびＬ−ＬＶを阻害した。アザ−ＣｄＲおよびアザ−ＣＲが陽性対照として含まれていた。
【００６３】
【図２９】図２９は、実施例９において記述されているプロセスを使用して作製したＲＸ−３１１７の１Ｈ  ＮＭＲである。
【００６４】
【図３０】図３０は、実施例９において記述されているプロセスを使用して作製したＲＸ−３１１７の１３Ｃ  ＮＭＲである。
【００６５】
【図３１】図３１は、実施例９において記述されているプロセスを使用して作製したＲＸ−３１１７の１９Ｆ  ＮＭＲである。
【００６６】
【図３２】図３２は、実施例９において記述されているプロセスを使用して作製したＲＸ−３１１７の質量スペクトルである。
【００６７】
【図３３】図３３は、実施例９において記述されているプロセスを使用して作製したＲＸ−３１１７の質量スペクトル（ＥＳ−フィルターを用いる）である。
【００６８】
【図３４】図３４は、実施例９のプロセス（上段）に従って作製された、ならびに平面（plain）偏光（左列）および交差偏光（右列）下で実験室規模のプロセス（下段）を使用して調製された、ＲＸ−３１１７の微視的比較である。
【００６９】
【図３５】図３５は、実験室規模のプロセスを使用して作製されたＲＸ−３１１７（上のスペクトル）および実施例９において記述されているプロセスを使用して作製されたＲＸ−３１１７（下のスペクトル）を比較するＸ線粉末回折データである。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
定義
別段の定義がない限り、本明細書において使用されているすべての科学技術用語の意味は、開示されている主題が属する分野の当業者によって一般に理解されているものである。当業者ならば、本明細書において記述されているものと同様のまたは同等の任意の方法および材料を使用して、開示されている主題を実践するまたは試験することもできることが分かるであろう。
【００７１】
明らかに別段の指示がない限り、下記の用語は、本明細書において使用される場合、以下に示す意味を有する。これらの意味は、当技術分野において理解されている通りのこれらの用語の意味を、改変するのではなく補足することを意図している。
【００７２】
「Ｃｍａｘ」は、観察される最大血漿中濃度を指す。
【００７３】
「Ｔｍａｘ」は、Ｃｍａｘに到達する時間を指す。
【００７４】
「Ｔ１／２」は、薬物の血漿中濃度が、その元の値の半分に達するために必要とされる時間を指す。「終末Ｔ１／２」は、終末期におけるＴ１／２を指す。
【００７５】
「ＡＵＣ０〜ｔ」は、時刻ゼロから時刻ｔまでの血漿中濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ）を指し、ここで、「ｔ」は、測定可能な濃度を持つ最後の試料採取時点である。例えば、ＡＵＣ０〜２４またはＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）は、時刻ゼロから２４時間までのＡＵＣを指す。
【００７６】
「経口剤形」は、経口投与のために製剤化された医薬組成物を指す。経口剤形は、即時、持続、長時間、遅延または制御放出を提供するように製剤化され得る。経口剤形の例は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤およびゲルキャップ剤を含む。
【００７７】
「有効量」は、有効性および毒性の可能性のそのパラメーターならびに当業者の知識に基づき、状態を治療することまたは予防すること等の所望の効果を生成する、化合物または医薬組成物の量を指す。有効量は、１回または複数回用量で投与することができる。
【００７８】
「接触させること」は、アポトーシスを誘発することまたはタンパク質キナーゼをモジュレートすること等、化合物および細胞を、直接的にまたは間接的にのいずれかで、所望の効果を生成するために十分近接させることを指す。接触は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施されてよい。例えば、細胞を化合物と接触させることは、マイクロインジェクション、細胞を担持する対象に化合物を投与すること、または化合物を含む培地中で細胞をインキュベートすること等の公知の技術を使用して、化合物を細胞に直接送達することを伴ってよい。
【００７９】
「治療すること」は、臨床結果等の有益なまたは所望の結果に到達することを指す。一部の実施形態では、有益なまたは所望の結果は、下記のうちのいずれか１つまたは複数である：状態の発症または発生を阻害するまたは抑制すること、状態の重症度を低減させること、状態に関連する症状の数または重症度を低減させること、状態に罹患している対象のクオリティオブライフを増大させること、状態を治療するために必要とされる別の薬剤の用量を減少させること、状態のために対象が服用している別の薬剤の効果を強化すること、および状態を有する対象の生存を延長すること。
【００８０】
「予防すること」は、対象が有していないが発生するリスクのある状態を、対象が発生する確率を低減させることを指す。「リスクのある」は、状態の発生と相関しており、当技術分野において公知の測定可能なパラメーターである１つまたは複数のリスク因子を、対象が有することを表す。リスク因子の１つまたは複数を有する対象は、そのようなリスク因子のない対象よりも高い、状態を発生する確率を有する。
【００８１】
「対象」は、ヒトを含むがこれに限定されない、哺乳動物等の動物を指す。それ故、本明細書において開示されている方法は、ヒト療法および獣医用途において有用となり得る。一実施形態では、対象は、哺乳動物である。他の実施形態では、対象は、ヒトである。
【００８２】
「絶食した」は、治療前に少なくとも８時間にわたって絶食していた対象を指す。
【００８３】
「アポトーシス」または「アポトーシスプロセス」は、細胞が内部または外部シグナル（アポトーシスシグナル）を受け取った際に始まり、実行フェーズを始動させる一連の生化学的事象（シグナル伝達経路フェーズ）を介して進行する、プログラム細胞死プロセスを指す。実行フェーズにおいて、エフェクターカスパーゼは、重要な細胞タンパク質を開裂し、アポトーシスを特徴付ける形態変化につながる。これらの変化は、例えば、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞断片化、膜小胞（アポトーシス小体）の形成、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）断片化、クロマチン凝縮、染色体移動、細胞核内辺縁、ミトコンドリアの膨張、ミトコンドリアクリステの拡大、ミトコンドリア膜透過性遷移孔の開口、ミトコンドリアプロトン勾配の消失、および／または原形質膜小胞形成を含み得る。アポトーシスを検出および測定するために使用した例示的なアッセイは、核濃縮体（pyknotic  bodies）の顕微鏡検査、ならびに、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）、カスパーゼアッセイ、アネキシンアッセイおよびＤＮＡラダリング等の酵素アッセイを含む。アポトーシス細胞は、例えば、ＤＮＡ低倍数性について、ヨウ化プロピジウムで染色された細胞のＦＡＣＳ分析によって、定量化することができる。
【００８４】
「アポトーシスを誘発すること」は、アポトーシスを直接的にまたは間接的に引き起こすことを指し、アポトーシスを受ける所与の細胞集団における細胞数の増大、細胞がアポトーシスを受ける速度の増大、またはアポトーシスの１つもしくは複数の形態学的特徴の発症の、強度、数もしくは速度の増大によって、特徴付けられてよい。
【００８５】
「増感させること」は、アポトーシスシグナルに対する細胞の感受性を増大させること、または該シグナルに応答する細胞の耐性を低減させることを指す。
【００８６】
「アポトーシスシグナル」は、アポトーシスシグナル伝達経路を活性化する刺激を指す。
【００８７】
「アポトーシスシグナル伝達経路」は、アポトーシス細胞死を始動させる一連の分子シグナルを指す。経路は、シグナルの受信から出発し、アポトーシスの実行フェーズが始動した際に終了する。
【００８８】
「モジュレートすること」は、タンパク質キナーゼ等の生体分子の発現および／または活性を改変することを指す。一実施形態では、モジュレートすることは、生体分子の発現および／または活性を増大させることを指す。他の実施形態では、モジュレートすることは、生体分子の発現および／または活性を減少させることを指す。
【００８９】
「タンパク質キナーゼ」は、リン酸化によって他のタンパク質を修飾するキナーゼ酵素を指す。タンパク質キナーゼの例は、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ（例えば、チェックポイントキナーゼ１、チェックポイントキナーゼ２）、チロシン特異的タンパク質キナーゼ、ヒスチジン特異的タンパク質キナーゼ、および混合キナーゼ（例えば、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ）を含む。一実施形態では、タンパク質キナーゼは、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼである。一実施形態では、タンパク質キナーゼは、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼである。他の実施形態では、タンパク質キナーゼは、チェックポイントキナーゼ１（Ｃｈｋ１）またはチェックポイントキナーゼ２（Ｃｈｋ２）である。他の実施形態では、タンパク質キナーゼは、Ｃｈｋ１である。他の実施形態では、タンパク質キナーゼは、Ｃｈｋ２である。
【００９０】
「ｐ５３」は、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。
【００９１】
「ＵＣＫ２」は、腫瘍細胞または組織において主に発現されるウリジンシチジンキナーゼ２を指す。
【００９２】
「腫瘍細胞」は、腫瘍に由来する細胞を指す。
【００９３】
「腫瘍」は、良性であるか悪性であるかにかかわらず、組織または細胞の異常増殖を指す。例は、前立腺、肺、脳、乳房、腎臓、肝臓、肺、腸、リンパ、筋肉、骨、骨髄、子宮、卵巣、膣、外陰部、膵臓、副腎、中枢神経系、末梢神経系、頸部、膀胱、子宮内膜、喉、食道、喉頭、甲状腺、血液、陰茎（penal）、精巣、胸腺、皮膚、脊椎、胃、胆管、小腸、肝胆道、結腸直腸、結腸、直腸、肛門、内分泌腺、目および胆嚢において見られる腫瘍を含む。
【００９４】
「がん」は、悪性腫瘍を指す。がん細胞は、周囲組織に浸潤する場合もしない場合もあり、それ故、新たな身体部位に転移する場合もしない場合もある。がんは、上皮細胞のがんである癌腫を包含し、癌腫は、扁平上皮細胞癌、腺癌、黒色腫および肝細胞腫を含む。がんは、間葉起源の腫瘍である肉腫も包含し、肉腫は、骨肉腫、白血病およびリンパ腫を含む。がんは、１つまたは複数の新生物細胞型を伴う場合がある。
【００９５】
「抗腫瘍剤」は、腫瘍を治療するまたは予防するために有用な任意の作用物質を指す。抗腫瘍剤の例は、下記の医薬組成物において記述されている活性剤を含む。実施形態では、ＲＸ−３１１７に加えて、抗腫瘍剤が、代謝拮抗物質、ＤＮＡ断片化剤、ＤＮＡ架橋剤、挿入剤、タンパク質合成阻害剤、トポイソメラーゼＩ毒、トポイソメラーゼＩＩ毒、微小管指向剤、キナーゼ阻害剤、ポリフェノール、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、死受容体アゴニスト、免疫チェックポイント阻害剤、抗プログラム細胞死１（ＰＤ−１）受容体抗体および抗プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）抗体から選択される。他の実施形態では、追加の抗腫瘍剤は、ＰＤ−１受容体抗体である。他の実施形態では、追加の抗腫瘍剤は、ペムブロリズマブである。他の実施形態では、追加の抗腫瘍剤は、ニボルマブである。他の実施形態では、追加の抗腫瘍剤は、デュルバルマブ（duryalumab）である。他の実施形態では、追加の抗腫瘍剤は、ニボルマブおよびペムブロリズマブの組合せである。
【００９６】
「放射線」は、腫瘍を治療するまたは予防するために有用な任意の放射線を指す。放射線の例は、Ｘ線、ガンマ線および荷電粒子を含む。放射線は、外部ビーム放射線療法（ＥＢＲＴ、ＸＢＲＴまたは遠隔療法）、小線源療法（内部放射線療法または密封線源療法）、術中放射線療法または全身放射線療法等の任意の形態の放射線療法によって送達されてよい。
【００９７】
「単離」は、クロマトグラフィー、蒸留、濾過、抽出、乾燥または再結晶によって等、精製によって中間体が反応混合物から分離される任意のプロセスを指す。
【００９８】
「固定反応器または容器」は、動かすことができない計画で固定の場所にある反応器系を指す。
【００９９】
「等」は、「等であるがこれらに限定されない」と同じ意味を有する。同様に、「を含む（include）」は、「を含む（include）がこれらに限定されない」と同じ意味を有し、一方、「を含む（including）」は、「を含む（including）がこれらに限定されない」と同じ意味を有する。
【０１００】
単数形「ａ」、「または」および「ｔｈｅ」は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、複数の参照物を含む。故に、例えば、「化合物」への言及は、１つまたは複数の化合物および／またはその同等物を含んでよい。
【０１０１】
本明細書において開示されている任意の数値範囲は、別段の定めがない限り、上限および下限ならびに各介在値を包含する。
【０１０２】
実用的な実施例以外では、または別段の指示がある場合、数値（原料の分量、反応条件を表現する数字等）は、本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、用語「約」によって修飾される。したがって、それに反する指示がない限り、そのような数字は、取得が求められる所望の特性に応じて変動し得る近似値である。少なくとも、同等物の教義の適用を請求項の範囲に限定しようとする試みとしてではなく、各数値パラメーターは、有効桁の数および通常の丸め技術を考慮して解釈されるべきである。
【０１０３】
開示されている主題の範囲を説明している数値パラメーターは近似値であるが、実用的な実施例において説明されている数値は、可能な限り正確に報告される。しかしながら、任意の数値は、そのそれぞれの試験測定において見られる標準偏差から必然的に生じるある特定の誤差を本質的に含有する。
アポトーシスを誘発するまたは細胞をアポトーシスシグナルに対して増感させる方法
【０１０４】
本開示の一態様は、アポトーシスを誘発する方法であって、有効量の、式（Ｉ）の化合物（ＲＸ−３１１７）
【化７】
2018516947.tif 000009
またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩を投与するステップによる方法を提供する。実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、一水和物または遊離形態として投与されてよい。
【０１０５】
本開示の別の態様は、細胞においてアポトーシスを誘発する方法であって、細胞を、有効量の、式（Ｉ）の化合物、またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩と接触させるステップによる方法を提供する。
【０１０６】
一実施形態では、方法は、一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を介してアポトーシスを誘発する。他の実施形態では、方法は、ＳＳＢを介してアポトーシスを誘発する。他の実施形態では、方法は、ＤＳＢを介してアポトーシスを誘発する。
【０１０７】
本開示の別の態様は、細胞をアポトーシスシグナルに対して増感させる方法であって、細胞を、有効量の、式（Ｉ）の化合物、またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩と接触させることによる方法を提供する。
【０１０８】
本明細書において提供される任意の方法の一実施形態では、細胞は、腫瘍細胞である。他の実施形態では、細胞は、悪性腫瘍細胞である。他の実施形態では、細胞は、肺がん細胞である。他の実施形態では、細胞は、非小細胞肺がん細胞である。他の実施形態では、細胞は、膵臓がん細胞である。他の実施形態では、細胞は、膀胱がん細胞である。他の実施形態では、細胞は、結腸直腸がん細胞である。他の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞または哺乳動物における細胞である。他の実施形態では、細胞は、ヒト細胞またはヒトにおける細胞である。
タンパク質キナーゼをモジュレートする方法
【０１０９】
本開示の別の態様は、細胞におけるタンパク質キナーゼをモジュレートする方法であって、細胞を、有効量の、式（Ｉ）の化合物、またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩と接触させるステップを含む方法を提供する。実施形態では、タンパク質キナーゼは、タンパク質キナーゼを増大させることにより、モジュレートされる。増大は、例えば、５％またはそれ超、１０％またはそれ超、２０％またはそれ超、２５％またはそれ超、３０％またはそれ超、４０％またはそれ超、５０％またはそれ超、６０％またはそれ超、７０％またはそれ超、７５％またはそれ超、８０％またはそれ超、９０％またはそれ超、あるいは９５％またはそれ超であってよい。
【０１１０】
実施形態では、タンパク質キナーゼは、チェックポイントタンパク質キナーゼである。他の実施形態では、タンパク質キナーゼは、チェックポイントキナーゼ１（Ｃｈｋ１）またはチェックポイントキナーゼ２（Ｃｈｋ２）である。他の実施形態では、タンパク質キナーゼは、Ｃｈｋ１である。他の実施形態では、タンパク質キナーゼは、Ｃｈｋ２である。
【０１１１】
実施形態では、細胞は、哺乳動物におけるものである。他の実施形態では、細胞は、ヒトにおけるものである。
【０１１２】
実施形態では、方法は、タンパク質キナーゼ発現レベルを増大させる。
非小細胞肺がんを治療するまたは予防する方法
【０１１３】
本開示の別の態様は、非小細胞肺がんを治療するまたは予防する方法であって、
（ｉ）非小肺がん細胞を有する対象を診断するステップと、
（ｉｉ）対象に、有効量の、式（Ｉ）の化合物、またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩を投与するステップと
による方法を提供する。
治療の有効性を予測する方法
【０１１４】
本開示の別の態様は、それを必要とする対象の、式（Ｉ）の化合物、またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩による治療の有効性を予測する方法であって、
（ｉ）対象から腫瘍細胞または組織の試料を収集するステップと、
（ｉｉ）試料中におけるタンパク質キナーゼまたはｐ５３発現レベルのうちの一方を測定するステップと、
（ｉｉｉ）腫瘍細胞または組織を、式（Ｉ）の化合物と接触させるステップと、
（ｉｖ）式（Ｉ）の化合物との接触後、腫瘍細胞または組織におけるタンパク質キナーゼまたはｐ５３発現レベルのうちの一方を測定するステップであって、ここで、タンパク質キナーゼまたはｐ５３発現レベルの増大が、有効性の可能性を示すステップと
による方法を提供する。
【０１１５】
実施形態では、腫瘍細胞または組織を式（Ｉ）の化合物と接触させることは、腫瘍細胞または組織の試料を接触させることによって遂行される。そのような実施形態では、式（Ｉ）の化合物との接触後の腫瘍細胞または組織におけるタンパク質キナーゼまたはｐ５３発現レベルのうちの一方を測定することは、試料に対して行われる。他の実施形態では、腫瘍細胞または組織を式（Ｉ）の化合物と接触させることは、式（Ｉ）の化合物を対象に投与することによって遂行される。そのような実施形態では、式（Ｉ）の化合物との接触後の腫瘍細胞または組織におけるタンパク質キナーゼまたはｐ５３発現レベルのうちの一方を測定することは、対象から腫瘍細胞または組織の第２の試料を収集し、第２の試料中におけるタンパク質キナーゼまたはｐ５３発現レベルのうちの一方を測定することによって行われる。
【０１１６】
実施形態では、方法は、タンパク質キナーゼまたはｐ５３発現レベルのうちの一方において増大が検出される場合、対象に式（Ｉ）の化合物を投与することをさらに含む。タンパク質キナーゼは、タンパク質キナーゼの量が統計学的に有意な量だけ大きくなった場合に、増大したとみなされる。故に、増大は、５％またはそれ超、１０％またはそれ超、２０％またはそれ超、あるいは２５％またはそれ超であってよい。他の実施形態では、方法は、ステップ（ｉｉ）および（ｉｖ）において、試料中のタンパク質Ｃｄｃ２５Ｃまたはｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ発現レベルを測定するステップをさらに含み、ここで、タンパク質Ｃｄｃ２５Ｃまたはｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ発現レベルの減少は、有効性の可能性を示す。タンパク質Ｃｄｃ２５Ｃまたはｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ発現レベルは、タンパク質Ｃｄｃ２５Ｃまたはｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ発現レベルが統計学的に有意な量だけ低減した場合に、減少したとみなされる。故に、低減は、５％またはそれ超、１０％またはそれ超、２０％またはそれ超、あるいは２５％またはそれ超であってよい。他の実施形態では、方法は、タンパク質キナーゼまたはｐ５３発現レベルのうちの一方において増大が、およびタンパク質Ｃｄｃ２５Ｃまたはｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ発現レベルにおいて減少が検出される場合、対象に式（Ｉ）の化合物を投与することをさらに含む。実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、一水和物として投与される。他の実施形態では、溶媒和物、水和物および塩のない式（Ｉ）の化合物が投与される。
【０１１７】
実施形態では、方法は、ステップ（ｉｉ）および（ｉｖ）において、タンパク質キナーゼ発現レベルを測定することを含む。他の実施形態では、タンパク質キナーゼは、チェックポイントキナーゼである。他の実施形態では、タンパク質キナーゼは、Ｃｈｋ１またはＣｈｋ２である。他の実施形態では、タンパク質キナーゼは、Ｃｈｋ１である。他の実施形態では、タンパク質キナーゼは、Ｃｈｋ２である。
【０１１８】
本開示の別の態様は、それを必要とする対象の、式（Ｉ）の化合物、またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩による治療の有効性を予測する方法であって、
（ｉ）対象から腫瘍細胞または組織の試料を収集するステップと、
（ｉｉ）腫瘍細胞または組織におけるＵＣＫ２発現のレベルを測定するステップと
による方法であって、ここで、ＵＣＫ２の発現レベルが、式（Ｉ）の化合物による治療の有効性の可能性を示す、方法を提供する。
【０１１９】
実施形態では、方法は、ＵＣＫ２の発現増大が腫瘍細胞または組織において測定される場合、対象に式（Ｉ）の化合物を投与することをさらに含む。実施形態では、ＵＣＫ２発現は、ベータ−アクチンに対して正規化したＵＣＫ２のタンパク質レベルをイムノブロットすることによって測定される。ＵＣＫ２は、ＵＣＫ２発現の量が所定のレベルと比較して統計学的に有意な量だけ大きくなった場合に、増大した発現レベルを有するとみなされる。故に、増大は、５％またはそれ超、１０％またはそれ超、２０％またはそれ超、あるいは２５％またはそれ超であってよい。実施形態では、所定のレベルは、非腫瘍細胞におけるＵＣＫ２発現のレベルであってよい。実施形態では、所定のレベルは、対象の非腫瘍細胞におけるＵＣＫ２発現のレベルであってよい。
【０１２０】
実施形態では、対象は、哺乳動物である。他の実施形態では、対象は、ヒトである。
【０１２１】
実施形態では、腫瘍細胞は、肺がん細胞である。他の実施形態では、腫瘍細胞は、非小細胞肺がん細胞である。
腫瘍を治療するまたは予防する方法
【０１２２】
本開示の別の態様は、腫瘍を治療するまたは予防する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、式（Ｉ）の化合物
【化８】
2018516947.tif 000010
またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩を、約３００〜２，０００ｍｇ／日の投薬量で含む経口剤形を投与するステップによる方法を提供する。他の実施形態では、投薬量は、約４００〜８００ｍｇ／日である。他の実施形態では、投薬量は、約５００〜７００ｍｇ／日である。他の実施形態では、投薬量は、約３００ｍｇ／日である。他の実施形態では、投薬量は、約４００ｍｇ／日である。他の実施形態では、投薬量は、約５００ｍｇ／日である。他の実施形態では、投薬量は、約６００ｍｇ／日である。他の実施形態では、投薬量は、約７００ｍｇ／日である。他の実施形態では、投薬量は、約８００ｍｇ／日である。
【０１２３】
約３００〜２，０００ｍｇ／日の投薬量は、約６０〜８０ｋｇの体重またはボディマスを有する成人に基づく。故に、投薬量は、約５〜３３ｍｇ／ｋｇ／日の範囲となり得る。対象の体重に基づく追加の投薬量は、これらの値から容易に算出され得る。同様に、当業者ならば、ヒト投薬量との公知の相関関係に基づき、他の種のための投薬量を算出することができるであろう。
【０１２４】
実施形態では、経口剤形は、週に３〜７日投与される。他の実施形態では、経口剤形は、週に４〜７日投与される。他の実施形態では、経口剤形は、週に５〜７日投与される。他の実施形態では、経口剤形は、週に５または７日投与される。他の実施形態では、経口剤形は、週に３日投与される。他の実施形態では、経口剤形は、週に４日投与される。他の実施形態では、経口剤形は、週に５日投与される。他の実施形態では、経口剤形は、週に６日投与される。他の実施形態では、経口剤形は、週に７日投与される。
【０１２５】
実施形態では、総１日用量は、１回または複数回用量で投与される。他の実施形態では、経口剤形は、１日１回投与される。他の実施形態では、経口剤形は、１日２回投与される。他の実施形態では、経口剤形は、１日３回投与される。他の実施形態では、経口剤形は、１日４回投与される。
【０１２６】
実施形態では、経口剤形は、最大約２０，０００ｍｇ／月の投薬量で投与される。総月用量は、週に１〜７日、３週間、続いて、１週間の休止（「休薬週」）、または休止なしに４週間にわたってのいずれかで投与され得る。治療の各週について、経口剤形は、週に１〜７日投与されてよい。一実施形態では、経口剤形は、３週間にわたって投与され、続いて、１週間の休止である。他の実施形態では、経口剤形は、週に３〜７日、３週間にわたって投与され、続いて、１週間の休止である。他の実施形態では、経口剤形は、週に５〜７日、３週間にわたって投与され、続いて、１週間の休止である。他の実施形態では、経口剤形は、毎日、３週間にわたって投与され、続いて、１週間の休止である。他の実施形態では、経口剤形は、毎日、２８日間にわたって投与される。各投薬サイクルは、３週間の治療、続いて、１週間の休止、または連続（continuous）／連続する（consecutive）４週間の治療のいずれかからなる。投薬サイクルは、当業者によって決定される通り、必要な限り頻繁に繰り返されてよい。一実施形態では、経口剤形は、最大１２回の投薬サイクルにわたって投与される。他の実施形態では、経口剤形は、最大６回の投薬サイクルにわたって投与される。
【０１２７】
実施形態では、経口剤形は、約３００〜２，０００ｍｇ／日の投薬量で週に５〜７日投与される。他の実施形態では、投薬量は、約４００〜８００ｍｇ／日、週に５〜７日である。他の実施形態では、投薬量は、約５００〜７００ｍｇ／日、週に５〜７日である。他の実施形態では、投薬量は、約５００〜７００ｍｇ／日、週に５または７日である。他の実施形態では、投薬量は、約５００ｍｇ／日、週に５日である。他の実施形態では、投薬量は、約５００ｍｇ／日、週に７日である。他の実施形態では、投薬量は、約６００ｍｇ／日、週に５日である。他の実施形態では、投薬量は、約６００ｍｇ／日、週に７日である。他の実施形態では、投薬量は、約７００ｍｇ／日、週に５日である。他の実施形態では、投薬量は、約７０ｍｇ／日、週に７日である。
【０１２８】
実施形態では、経口剤形は、１日１回、約４００ｍｇ／日で週に５日投与される。他の実施形態では、経口剤形は、１日１回、約５００ｍｇ／日で週に５日投与される。他の実施形態では、経口剤形は、１日１回、約６００ｍｇ／日で週に５日投与される。他の実施形態では、経口剤形は、１日１回、約７００ｍｇ／日で週に５日投与される。他の実施形態では、経口剤形は、１日１回、約８００ｍｇ／日で週に５日投与される。
【０１２９】
実施形態では、経口剤形は、１日１回、約４００ｍｇ／日で週に７日投与される。他の実施形態では、経口剤形は、１日１回、約５００ｍｇ／日で週に７日投与される。他の実施形態では、経口剤形は、１日１回、約６００ｍｇ／日で週に７日投与される。他の実施形態では、経口剤形は、１日１回、約７００ｍｇ／日で週に７日投与される。他の実施形態では、経口剤形は、１日１回、約８００ｍｇ／日で週に７日投与される。
【０１３０】
実施形態では、経口剤形は、約３〜３５ｍｇ／ｋｇ／日で週に５〜７日投与される。他の実施形態では、経口剤形は、約３〜３５ｍｇ／ｋｇ／日で週に５日投与される。他の実施形態では、経口剤形は、約３〜３５ｍｇ／ｋｇ／日で週に６日投与される。他の実施形態では、経口剤形は、約３〜３５ｍｇ／ｋｇ／日で週に７日投与される。他の実施形態では、経口剤形は、約６〜１２ｍｇ／ｋｇ／日で週に５〜７日投与される。他の実施形態では、経口剤形は、約６〜１２ｍｇ／ｋｇ／日で週に５日投与される。他の実施形態では、経口剤形は、約６〜１２ｍｇ／ｋｇ／日で週に６日投与される。他の実施形態では、経口剤形は、約６〜１２ｍｇ／ｋｇ／日で週に７日投与される。
【０１３１】
一部の実施形態では、経口剤形は、固体である。他の実施形態では、経口剤形は、錠剤である。他の実施形態では、経口剤形は、カプセル剤である。他の実施形態では、経口剤形は、即時放出である。他の実施形態では、経口剤形は、長時間放出である。
【０１３２】
実施形態では、経口剤形は、対象が少なくとも約８時間にわたって絶食した後に投与される。他の実施形態では、対象は、投与後少なくとも約１時間にわたって絶食し続ける。他の実施形態では、経口剤形は、対象に、食物とともに投与される。
【０１３３】
実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、一水和物として投与される。他の実施形態では、溶媒和物、水和物および塩のない式（Ｉ）の化合物が投与される。
【０１３４】
実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約３〜２０時間のＴ１／２を提供する。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約５〜１０時間のＴ１／２を提供する。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約６〜９時間のＴ１／２を提供する。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約９〜１１時間のＴ１／２を提供する。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約６〜７時間のＴ１／２を提供する。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約６時間のＴ１／２を提供する。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約７時間のＴ１／２を提供する。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約８時間のＴ１／２を提供する。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約９時間のＴ１／２を提供する。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約１０時間のＴ１／２を提供する。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約１１時間のＴ１／２を提供する。
【０１３５】
実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約２〜６時間のＴｍａｘを提供する。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約４〜６時間のＴｍａｘを提供する。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約２〜４時間のＴｍａｘを提供する。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約２時間のＴｍａｘを提供する。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約３時間のＴｍａｘを提供する。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約４時間のＴｍａｘを提供する。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約５時間のＴｍａｘを提供する。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約６時間のＴｍａｘを提供する。
【０１３６】
実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約３０〜３，０００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘをもたらす。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約６００〜２，０００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘをもたらす。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約７００〜１，５００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘをもたらす。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約６００〜１，１００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘをもたらす。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約７００〜１，１００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘをもたらす。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約６００〜７００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘをもたらす。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約７００〜８００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘをもたらす。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約８００〜９００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘをもたらす。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約９００〜１，０００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘをもたらす。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約１，０００〜１，１００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘをもたらす。
【０１３７】
実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約２００〜１８，０００時・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）をもたらす。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約７，０００〜１４，０００時・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）をもたらす。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約８，０００〜１２，０００時・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）をもたらす。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約８，０００〜１０，０００時・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）をもたらす。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約８，０００〜９，０００時・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）をもたらす。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約９，０００〜１０，０００時・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）をもたらす。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約１０，０００〜１１，０００時・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）をもたらす。他の実施形態では、経口剤形は、単回投与後、約１１，０００〜１２，０００時・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）をもたらす。
【０１３８】
実施形態では、腫瘍は、卵巣がん；転移性乳がん；膵臓の腺癌；結腸直腸腺癌または食道、胃、膵臓、小腸、肝胆道、結腸、直腸もしくは肛門のがん等の消化器がん；転移性膀胱がん、筋肉浸潤性膀胱がんまたは非筋肉浸潤性膀胱がん等の膀胱がん；頸部がん；肺がん；非小細胞肺がん；あるいは腎細胞癌である。他の実施形態では、腫瘍は、膵臓、膀胱または結腸直腸がんである。他の実施形態では、腫瘍は、膵臓がんである。他の実施形態では、がんは、膀胱がんである。他の実施形態では、がんは、結腸直腸がんである。他の実施形態では、がんは、結腸がんである。他の実施形態では、がんは、直腸がんである。他の実施形態では、腫瘍は、非小細胞肺がんであり、式（Ｉ）の化合物、またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩は、シスプラチンとともに投与される。他の実施形態では、腫瘍は、ゲムシタビンに耐性がある。Yangら、Anticancer  Research、３４巻：６９５１〜６９６０頁（２０１４年）を参照されたい（ゲムシタビンに耐性がある腫瘍においても、種々の異種移植片モデルにおいてＲＸ−３１１７の有効性を示している）。
【０１３９】
実施形態では、対象は、哺乳動物である。他の実施形態では、対象は、ヒトである。
治療の有効性を試験するためのキット
【０１４０】
本開示の別の態様は、腫瘍細胞の試料中におけるタンパク質キナーゼ、ｐ５３またはＵＣＫ２発現レベルのうちの１つを測定するアッセイを使用して、腫瘍の治療における式（Ｉ）の化合物
【化９】
2018516947.tif 000011
または水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩の潜在的有効性を試験するためのキットを提供する。
【０１４１】
実施形態では、キットは、腫瘍細胞の試料中におけるタンパク質Ｃｄｃ２５Ｃまたはｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ発現レベルを測定するアッセイをさらに含む。
【０１４２】
任意の実施形態では、腫瘍細胞は、肺がん細胞である。他の実施形態では、腫瘍細胞は、非小細胞肺がん細胞である。他の実施形態では、腫瘍細胞は、膵臓がん細胞または膀胱がん細胞である。
医薬組成物
【０１４３】
本明細書において提供される方法およびキットのいずれかにおいて、式（Ｉ）の化合物は、医薬組成物中にあってよい。そのような医薬組成物は、任意の適切な単位剤形として調製され得る。例えば、医薬組成物は、下記に適したものを含む固体または液体形態での投与のために製剤化され得る：（１）経口投与、例えば、飲薬、錠剤（オーバーカプセル化錠剤を含む、口腔内、舌下および全身吸収を標的としたもの等）、カプセル剤（乾式充填、硬質ゼラチン、軟質ゼラチンまたはオーバーカプセル化カプセル剤等）、カプレット剤、ボーラス剤、散剤、サシェ剤、顆粒剤、ペースト剤、口腔スプレー、口内錠、ロゼンジ剤、ペレット剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、液体、リポソーム、乳剤およびマイクロ乳剤、あるいは（２）例えば、滅菌溶液または懸濁液としての、例えば、皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外注射による、非経口投与。加えて、医薬組成物は、即時、持続、長時間、遅延または制御放出のために製剤化され得る。
【０１４４】
一実施形態では、医薬組成物は、経口投与のために製剤化される。実施形態では、医薬組成物は、錠剤またはカプセル剤形態である。他の実施形態では、医薬組成物は、錠剤形態である。他の実施形態では、医薬組成物は、カプセル剤形態である。他の実施形態では、錠剤またはカプセル剤は、即時放出のために製剤化される。他の実施形態では、錠剤またはカプセル剤は、持続、長時間、遅延または制御放出のために製剤化される。
【０１４５】
錠剤は、任意選択で１つまたは複数の副原料とともに、圧縮または成型によって作製され得る。圧縮錠剤は、結合剤、滑沢剤、不活性賦形剤、保存剤、表面活性または分散剤と任意選択で混合した、散剤または顆粒剤等の易流動性形態の化合物（Ｉ）を、好適なマシン内で圧縮することによって調製され得る。成型錠剤は、不活性液体賦形剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を、好適なマシン内で成型することによって作製され得る。錠剤は、任意選択でコーティングされていても切り込み線が入れられていてもよく、化合物（Ｉ）の、持続、長時間、遅延または制御放出を提供するように製剤化され得る。そのような持続、長時間、遅延または制御放出組成物を製剤化する方法は、当技術分野において公知であり、米国特許第４，３６９，１７４号、同第４，８４２，８６６号を含むがこれらに限定されない発行された米国特許、ならびにその中で引用されている参考文献において開示されている。コーティングは、腸への化合物の送達のために使用され得る（例えば、米国特許第６，６３８，５３４号、同第５，２１７，７２０号、同第６，５６９，４５７号、およびその中で引用されている参考文献を参照）。錠剤に加えて、カプセル剤、顆粒剤およびゲルキャップ剤等の他の剤形が、化合物（Ｉ）の、持続、長時間、遅延または制御放出を提供するために製剤化され得る。
【０１４６】
実施形態では、医薬組成物は、非経口投与のために製剤化される。非経口投与に好適な医薬組成物の例は、例えば、製剤を意図されているレシピエントの血液と等張にする、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤および／または溶質をそれぞれ含有する、水性滅菌注射溶液および非水性滅菌注射溶液；ならびに、例えば、懸濁化剤および／または増粘剤をそれぞれ含有する、水性滅菌懸濁液および非水性滅菌懸濁液を含む。製剤は、単位用量または複数回用量容器、例えば、密封したアンプルまたはバイアルで提示することができ、使用直前に水等の滅菌液体担体を添加するだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵することができる。一実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与のために製剤化される。
【０１４７】
実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される添加剤をさらに含む。薬学的に許容される添加剤は、それ自体は治療剤ではないが、患者への治療剤の送達のための担体、賦形剤、アジュバント、結合剤および／またはビヒクルとして使用される、あるいはその取り扱いもしくは貯蔵特性を改善するため、または投与用の単位剤形への化合物もしくは医薬組成物の形成を可能にするもしくは容易にするために医薬組成物に添加される、任意の物質であってよい。薬学的に許容される添加剤は、医薬品分野において公知であり、例えば、Remington:  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy、第２１版（Lippincott  Williams  &  Wilkins、Baltimore、MD、２００５年）において開示されている。当業者には公知であるように、薬学的に許容される添加剤は、様々な機能を提供することができ、湿潤剤、緩衝剤、懸濁化剤、滑沢剤、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、保存剤、界面活性剤、着色剤、香味剤および甘味剤として記述され得る。薬学的に許容される添加剤の例は、限定されないが、（１）ラクトース、グルコースおよびスクロース等の糖；（２）コーンスターチおよびバレイショデンプン等のデンプン；（３）セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロース等；（４）トラガカント粉末；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）ココアバターおよび坐剤ワックス等の添加剤；（９）ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油等の油；（１０）プロピレングリコール等のグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール等のポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル等のエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム等の緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；ならびに、（２２）医薬製剤において用いられる他の非毒性の適合性物質を含む。
【０１４８】
一部の実施形態では、医薬組成物は、ＲＸ−３１１７に加えて、少なくとも１つの活性剤をさらに含む。活性剤は、抗新生物薬、化学療法薬、細胞毒性薬、放射線治療（外部ビーム放射線療法、内部放射線療法または全身放射線療法）、あるいは、アポトーシスを誘発する、細胞をアポトーシスに対して増感させる、タンパク質キナーゼをモジュレートする、または新生物、腫瘍もしくはがんを治療することができる任意の他の作用物質であってよい。活性剤の例は、（１）シタラビン、フルダラビン、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（deoxyuiridine）、ゲムシタビン、ヒドロキシウレアまたはメトトレキサート等の代謝拮抗物質；（２）ブレオマイシン等のＤＮＡ断片化剤、（３）クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミドおよびナイトロジェンマスタード等のＤＮＡ架橋剤；（４）アドリアマイシン（ドキソルビシン）およびミトキサントロン等の挿入剤；（５）Ｌ−アスパラギナーゼ、シクロヘキシミド、ピューロマイシンおよびジフテリア毒素等のタンパク質合成阻害剤；（６）カンプトテシンおよびトポテカン等のトポイソメラーゼＩ毒；（７）エトポシド（ＶＰ−１６）およびテニポシド等のトポイソメラーゼＩＩ毒；（８）コルセミド、コルヒチン、パクリタキセル、ビンブラスチンおよびビンクリスチン等の微小管指向剤；（９）フラボピリドール、スタウロスポリン（staurosporin）および７−ヒドロキシスタウロスポリン等のキナーゼ阻害剤；（１０）ケルセチン、レスベラトロール、ピセタノール、没食子酸エピガロカテキン（epigallocatechine）、テアフラビン、フラバノール、プロシアニジン、ベツリン酸およびそれらの誘導体等のポリフェノール；（１１）グルココルチコイドおよびフェンレチニド等のホルモン；（１２）タモキシフェン、フィナステリドおよびＬＨＲＨアンタゴニスト等のホルモンアンタゴニスト；ならびに（１３）死受容体アゴニスト、例えば、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）、ＬＴ−β（リンホトキシン−β）、ＴＲＡＩＬ（Ａｐｏ２Ｌ、ＤＲ４リガンド）、ＣＤ９５（Ｆａｓ、ＡＰＯ−１）リガンド、ＴＲＡＭＰ（ＤＲ３、Ａｐｏ−３）リガンド、ＤＲ６リガンドならびにそれらの断片および誘導体等を含む。
【０１４９】
実施形態では、医薬組成物中における式（Ｉ）の化合物、または水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩の量は、約０．１重量％から約１００重量％の間である。他の実施形態では、量は、約０．５重量％から約９９．５重量％の間である。実施形態では、量は、約１０重量％から約９５重量％の間である。実施形態では、量は、約１５重量％から約９０重量％の間である。実施形態では、量は、約８０重量％から約９０重量％の間である。実施形態では、量は、約８０重量％から約８５重量％の間である。実施形態では、量は、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％である。実施形態では、医薬組成物は、経口剤形である。実施形態では、医薬組成物は、錠剤である。
投与方法
【０１５０】
本明細書において提供される方法のいずれかにおいて、化合物または医薬組成物の投与は、経口的にまたは非経口的に等、当技術分野において公知の許容されているモードを介するものであってよい。用語「非経口的に」は、限定されないが、皮下に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、膀胱内に、髄腔内に、脳室内に、胸骨内に、頭蓋内に、骨内注射によっておよび注入技術によってを含む。一実施形態では、化合物または医薬組成物は、経口的に投与される。他の実施形態では、化合物または医薬組成物は、非経口的に投与される。他の実施形態では、化合物または医薬組成物は、静脈内に投与される。
【０１５１】
一実施形態では、化合物または医薬組成物は、上記の腫瘍を治療するまたは予防する方法において等、本明細書において開示されている通りの用量または投薬量で経口的に投与される。本明細書において開示されている方法のいずれかにおいて、化合物または医薬組成物は、体重ベースの用量に基づき投与される。他の実施形態では、有効量は、約０．０１から約１００ｍｇ／ｋｇ／日または約３から約３５ｍｇ／ｋｇ／日である。実施形態では、有効量は、約６から１２ｍｇ／ｋｇ／日である。
【０１５２】
用量レベルは、静脈内投与のために調整され得る。そのような場合、化合物または医薬組成物は、約０．０１μｇ／ｋｇ／分から約１００μｇ／ｋｇ／分の間の量で投与され得る。
組合せ療法
【０１５３】
本明細書において提供される腫瘍を治療するまたは予防する方法のいずれかにおいて、方法は、ＲＸ−３１１７を、１つまたは複数の追加の抗腫瘍剤または放射線とともに対象に投与することをさらに含んでよい。一実施形態では、方法は、放射線を対象に投与することをさらに含む。他の実施形態では、方法は、１つまたは複数の追加の抗腫瘍剤を対象に投与することをさらに含む。
【０１５４】
追加の抗腫瘍剤または放射線は、式（Ｉ）の化合物、またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩の投与の前、後または最中に投与されてよい。一実施形態では、追加の抗腫瘍剤または放射線は、式（Ｉ）の化合物、またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩の投与の前に投与される。他の実施形態では、追加の抗腫瘍剤または放射線は、式（Ｉ）の化合物、またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩の投与の後に投与される。他の実施形態では、追加の抗腫瘍剤または放射線は、式（Ｉ）の化合物、またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩の投与の最中に投与される。他の実施形態では、追加の抗腫瘍剤および式（Ｉ）の化合物、またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩は、同時投与のために医薬組成物に製剤化される。
放射線増感効果
【０１５５】
ＲＸ−３１１７の放射線増感効果を、Ａ２７８０卵巣がん細胞およびＮＳＣＬＣ細胞株において研究した。ＲＸ−３１１７は、スケジュール依存性放射線増感効果を有するが、パルスおよび分割照射で観察されるプレインキュベーション（線量修飾係数：１．４〜１．８）においてのみであることが分かった。放射線増感（Radiosensitizion）は、３次元スフェロイドモデルにおいても見られた。低放射線増感濃度では、放射線と組み合わせたＲＸ−３１１７は、Ｓ期における細胞の蓄積につながり、これには、ｐ−Ｃｈｋ２およびｐ−ｃｄｃ２５Ｃ等のすべての細胞周期タンパク質の増大が付随していた。加えて、ＲＸ−３１１７は、ＤＮＡ損傷による細胞死滅を引き起こした。結論として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験は、ＲＸ−３１１７の放射線増感効果を示した。
【０１５６】
肺がん患者は、標準的に外科手術で治療されており、進行疾患の患者は、化学療法を受けている（Baas  P、Belderbos  JSA、Senan  S、Kwa  HB、van  Bochove  A、van  Tinteren  H、Burgers  JAおよびvan  Meerbeeck  JP:  Concurrent  chemotherapy  (carboplatin,  paclitaxel,  etoposide)  and  involved-field  radiotherapy  in  limited  stage  small  cell  lung  cancer:  a  Dutch  multicenter  phase  II  study.  Br  J  Cancer  ９４巻：６２５〜３０頁、２００６年）。該疾患を治療するために、シチジン類似体、ゲムシタビンおよびシスプラチンの組合せがクリニックにおいて使用されている（El-Naggar  M、Ebbing  E、Bijnsdorp  I、van  den  Berg  JおよびPeters  GJ:  Radiosensitization  by  thymidine  phosphorylase  inhibitor  in  thymidine  phosphorylase  negative  and  overexpressing  bladder  cancer  cell  lines.  Nucleosides  Nucleotides  Nucleic  Acids  ３３巻：４１３〜２１頁、２０１４年）。しかしながら、耐性は限定要因であり、したがって、耐性機構を迂回し、理想的には有効な組合せ特性を示す、新規薬物が必要である。
ＲＸ−３１１７作用の機構
【０１５７】
ＲＸ−３１１７は、シチジンの類似体である（図１４）。これは、酸素および二重結合の代わりに炭素−フッ素結合からなるリボース分子上の修飾を有する（Choi  WJ、Chung  H-J、Chandra  G、Alexander  V、Zhao  LX、Lee  HW、Nayak  A、Majik  MS、Kim  HO、Kim  J-H、Lee  YB、Ahn  CH、Lee  SKおよびJeong  LS:  Fluorocyclopentenyl-cytosine  with  broad  spectrum  and  potent  antitumor  activity.  J  Med  Chem  ５５巻：４５２１〜５頁、２０１２年）。図２１に示されている通り、ＲＸ−３１１７は、ヒト受動拡散型ヌクレオシド輸送体（ｈＥＮＴ）を介して細胞に入る（Peters  GJ、Smid  K、Vecchi  L、Kathmann  I、Sarkisjan  D、Honeywell  RJ、Losekoot  N、Ohne  O、Orbach  A、Blaugrund  E、Jeong  LS、Lee  YB、Ahn  C-HおよびKim  DJ:  Metabolism,  mechanism  of  action  and  sensitivity  profile  of  fluorocyclopentenylcytosine  (RX-3117).  Invest  New  Drugs  ３１巻：１４４４〜５７頁、２０１３年）。細胞において、ＲＸ−３１１７は、ウリジン／シチジンキナーゼ２（ＵＣＫ２）によってリン酸化されて、そのモノホスフェート形態となる、すなわち、ＲＸ−３１１７は、ＵＣＫ２によって活性化されて、ＲＸ−３１１７  ＭＰとなる。ＲＸ−３１１７トリ−ホスフェート（ＲＸ−３１１７  ＴＰ）は、ＲＮＡに組み込まれる。そのＲＸ−３１１７ジ−ホスフェート（ＲＸ−３１１７  ＤＰ）は、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）によってデオキシ−ジ−ホスフェート（ｄＲＸ−３１１７  ＤＰ）に還元された後、ＤＮＡに組み込まれる。ＲＸ−３１１７は、シチジンデアミナーゼ（ＣＤＡ）には不十分な基質である（同上）。ゲムシタビン耐性マウスモデルにおける、ＲＸ−３１１７による強力な腫瘍増殖阻害が近年実証された（Yang  MY、Lee  YB、Ahn  C-H、Kaye  J、Fine  T、Kashi  R、Ohne  O、Smid  K、Peters  GJおよびKim  DJ:  A  novel  cytidine  analog,  RX-3117,  shows  potent  efficacy  in  xenograft  models,  even  in  tumors  that  are  resistant  to  gemcitabine.  Anticancer  Res  ３４巻：６９５１〜９頁、２０１４年）。ＲＸ−３１１７の放射線増感効果を調査し、結果を以下に示した。
【０１５８】
ＲＸ−３１１７は、クリニックにおいて広く使用されている、ゲムシタビンおよびアザシチジン等の他の類似体と同様に、ピリミジン類似体としてカテゴライズされる（Peters  GJ:  Novel  developments  in  the  use  of  antimetabolites.  Nucleosides  Nucleotides  Nucleic  Acids  ３３巻：３５８〜７４頁、２０１４年）。ゲムシタビンは、イオン化誘起ＤＮＡ損傷修復を増大させる、強力な放射線増感剤である（Morgan  M  a、Parsels  L  a、Maybaum  JおよびLawrence  TS:  Improving  gemcitabine-mediated  radiosensitization  using  molecularly  targeted  therapy:  a  review.  Clin  Cancer  Res  １４巻：６７４４〜５０頁、２００８年）。
【０１５９】
加えて、シチジン類似体５−アザシチジン（アザ−Ｃ、Ｖｉｄａｚａ（商標））および５−アザ−２’−デオキシ−シチジン（デシタビン、Ｄａｃｏｇｅｎ（登録商標））は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の治療のためにクリニックにおいて使用されている（Peters  GJ:  Novel  developments  in  the  use  of  antimetabolites.  Nucleosides  Nucleotides  Nucleic  Acids  ３３巻：３５８〜７４頁、２０１４年）。これらの薬物の抗腫瘍効果の２つの主な機構は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）阻害ならびにＲＮＡおよび／またはＤＮＡへの細胞毒性組み込みである（Kaminskas  E、Farrell  A、Abraham  S、Baird  A、Hsieh  L-S、Lee  S-L、Leighton  JK、Patel  H、Rahman  A、Sridhara  R、Wang  Y-CおよびPazdur  R:  Approval  summary:  azacitidine  for  treatment  of  myelodysplastic  syndrome  subtypes.  Clin  Cancer  Res  １１巻：３６０４〜８頁、２００５年）。細胞への取り込み後、アザ−Ｃを、ＵＣＫ２によりリン酸化して５−アザシチジンモノホスフェート（アザ−ＣＭＰ）とし、ピリミジンヌクレオチドキナーゼによりアザ−ＣＤＰおよびアザ−ＣＴＰとする。しかしながら、アザ−Ｃは、ＣＤＡによる脱アミノ化によって不活性化される。ＲＲは、アザ−ＣＤＰを還元してアザ−ｄＣＤＰとし、これを、ヌクレオシド二リン酸キナーゼによってリン酸化して、アザ−ｄＣＴＰとする。次いで、アザ−ｄＣＴＰをＤＮＡに組み込み、ＤＮＡ合成阻害をもたらす（Vesely  J:  Mode  of  action  and  effects  of  5-azacytidine  and  of  its  derivatives  in  eukaryotic  cells.  Pharmacol  Ther  ２８巻：２２７〜３５頁、１９８５年）。アザ−ｄＣＴＰのＤＮＭＴとの化学量論的結合は、ＤＮＡ低メチル化をもたらすであろう（Jones  PA:  Effects  of  5-azacytidine  and  its  2'-deoxyderivative  on  cell  differentiation  and  DNA  methylation.  Pharmacol  Ther  ２８巻：１７〜２７頁、１９８５年）。アザ−ｄＣＴＰは、５−アザ−２’−デオキシシチジンから、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）およびヌクレオチドキナーゼによって触媒される直接リン酸化によって形成することもできる。ＣｐＧアイランドにおけるＤＮＡ高メチル化については、ＭＤＳを含む異なる悪性腫瘍において記述されている（Kaminskas  E、Farrell  A、Abraham  S、Baird  A、Hsieh  L-S、Lee  S-L、Leighton  JK、Patel  H、Rahman  A、Sridhara  R、Wang  Y-CおよびPazdur  R:  Approval  summary:  azacitidine  for  treatment  of  myelodysplastic  syndrome  subtypes.  Clin  Cancer  Res  １１巻：３６０４〜８頁、２００５年）。他方では、アザ−ＣＴＰは、細胞質および核ＲＮＡタンパク質合成のＲＮＡ撹乱代謝に組み込まれる（Glover  ABおよびLeyland-Jones  B:  Biochemistry  of  azacitidine:  a  review.  Cancer  Treat  Rep  ７１巻：９５９〜６４頁、１９８７年）。アザシチジンに対する耐性の１つの機構は、ＵＣＫ２遺伝子における点突然変異であり、これは、不活性代謝物をもたらす（Sripayap  P、Nagai  T、Uesawa  M、Kobayashi  H、Tsukahara  T、Ohmine  K、Muroi  KおよびOzawa  K:  Mechanisms  of  resistance  to  azacitidine  in  human  leukemia  cell  lines.  Exp  Hematol  ４２巻：２９４〜３０６頁ｅ２、２０１４年）。アザ−ｄＣＴＰに対する耐性の根底にある機構は、ｄＣＫの欠損である（Peters  GJ:  Novel  developments  in  the  use  of  antimetabolites.  Nucleosides  Nucleotides  Nucleic  Acids  ３３巻：３５８〜７４頁、２０１４年）。
【０１６０】
図２２に示されている通り、ＲＸ−３１１７は、ＤＮＭＴ１を下方調節することもできる（Peters  GJ、Smid  K、Vecchi  L、Kathmann  I、Sarkisjan  D、Honeywell  RJ、Losekoot  N、Ohne  O、Orbach  A、Blaugrund  E、Jeong  LS、Lee  YB、Ahn  C-HおよびKim  DJ:  Metabolism,  mechanism  of  action  and  sensitivity  profile  of  fluorocyclopentenylcytosine  (RX-3117).  Invest  New  Drugs  ３１巻：１４４４〜５７頁、２０１３年）が、アザ−Ｃとは異なった形で作用するように思われる。さらに、すべてではないがいくつかのシチジン類似体が放射線増感効果を示す。それにより、ＲＸ−３１１７の潜在的放射線増感効果ならびに細胞周期効果および細胞死滅等の潜在的機構が評価された。したがって、ＲＸ−３１１７は、放射線増感効果を有することが示された。
【０１６１】
ＲＸ−３１１７とのプレインキュベーションは、最良の放射線増感効果を有し、試験した５つの細胞株うちの４つが、ＲＸ−３１１７によって増感された。ゲムシタビン耐性ＳＷ１５７３／Ｇ−は、その野生型とほぼ同じ有効性でＲＸ−３１１７によって増感された。ＲＸ−３１１７は、２つのスフェロイドモデルにおいても放射線増感効果を示した。
【０１６２】
ヌクレオシド類似体は、照射により誘発される細胞死滅を強化することが示された（Shewach  DSおよびLawrence  TS:  Antimetabolite  radiosensitizers.  J  Clin  Oncol  ２５巻：４０４３〜５０頁、２００７年）。放射線増感効果は、デオキシリボヌクレオチド生合成（ＤＮＡ複製に必要である）またはＤＮＡポリメラーゼ（Shewach  DSおよびLawrence  TS:  Antimetabolite  radiosensitizers.  J  Clin  Oncol  ２５巻：４０４３〜５０頁、２００７年；Lawrence  TS、Blackstock  AWおよびMcGinn  C:  The  mechanism  of  action  of  radiosensitization  of  conventional  chemotherapeutic  agents.  Semin  Radiat  Oncol  １３巻：１３〜２１頁、２００３年）を標的とすることによって行われると考えられる。デオキシヌクレオチドプール脱調節の例は、ＴＳ阻害剤５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（ＦｄＵｒｄ）である。ＴＳ阻害剤は、デオキシヌクレオチドプール不均衡を引き起こし、ＤＮＡ合成阻害およびＳ期停止をもたらす（Hwang  HS、Davis  TW、Houghton  J  aおよびKinsella  TJ:  Radiosensitivity  of  thymidylate  synthase-deficient  human  tumor  cells  is  affected  by  progression  through  the  G1  restriction  point  into  S-phase:  implications  for  fluoropyrimidine  radiosensitization.  Cancer  Res  ６０巻：９２〜１００頁、２０００年）。デオキシヌクレオチドプールにおける不均衡は、誤ったヌクレオチドの組み込みを引き起こす（Ingraham  HA、Tseng  BYおよびGoulian  M:  Nucleotide  levels  and  incorporation  of  5-fluorouracil  and  uracil  into  DNA  of  cells  treated  with  5-fluorodeoxyuridine.  Mol  Pharmacol  ２１巻：２１１〜６頁、１９８２年）。放射線増感効果を実現するために必要とされる濃度は、必ずしも、細胞毒性効果に必要な濃度であるとは限らない。より低い濃度の薬物により、放射線増感を確立することができる（Hwang  HS、Davis  TW、Houghton  J  aおよびKinsella  TJ:  Radiosensitivity  of  thymidylate  synthase-deficient  human  tumor  cells  is  affected  by  progression  through  the  G1  restriction  point  into  S-phase:  implications  for  fluoropyrimidine  radiosensitization.  Cancer  Res  ６０巻：９２〜１００頁、２０００年）。低用量のＲＸ−３１１７は、３次元モデルおよび分割照射スケジュールでのコロニー形成アッセイにおいて、放射線増感効果を誘発した。また、ＲＸ−３１１７によって誘発された二本鎖ＤＮＡ切断は、用量依存性であった。
【０１６３】
ＲＸ−３１１７は、５つの細胞株のうちの４つにおいて強力なスケジュール依存性放射線増感剤であることが示され、ＮＳＣＬＣにおいて組合せ治療が検討される臨床応用に可能性がある。この組合せ治療は、他の腫瘍型（前立腺、皮膚、頭頸部、喉、喉頭、乳房、脳、結腸直腸、骨、白血病、卵巣および子宮がん等）に適用されてよい。
ＲＸ−３１１７を作製するためのプロセスの改善
【０１６４】
米国特許第７，４０５，２１４号は、Ｄ−リボースからのＲＸ−３１１７の１１ステップ合成を開示している。合成は、大規模な工場生産における実装に課題をもたらす高価な触媒を使用する。米国特許第９，１５０，５２０号は、（３Ｒ，４Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル−（５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−トリチルオキシメチル−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［１，３］ジオキソール−４−イルオキシ）−ジフェニル−シラン（ＡＳＭ１１）から４−アミノ−１−（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オン（ＩＮＴ１４）を介するＲＸ−３１１７の調製のためのより短い経路を開示している合成を改善した。しかしながら、ＡＳＭ１１からＩＮＴ１４への前合成は、各ステップにおいて中間体が単離されることを必要とした。故に、プロセスでは、特に商業的製造に規模拡大する場合、コストおよび時間の制約がある。
【０１６５】
本発明は、大規模な生産のために商業的に実行可能な、ＲＸ−３１１７を調製する改善されたプロセスを提供する。プロセスは、中間体材料のそれぞれを単離するという要件なしに、ＡＳＭ１１からＩＮＴ１４への合成を短縮し、それにより、効率を改善しながらコストを低減させる。より具体的には、本発明は、ＡＳＭ１１からＩＮＴ１４への合成を短縮するための３つの段階を持つ連続プロセスを提供する。本発明は、製造コストを有意に低減させるために、固定容器内でＲＸ−３１１７一水和物（ＲＸ−３１１７−ＭＨ）を生じさせるためのプロセスも提供する。３つのステップを単一のステップに短縮することにより、本発明のプロセスは、中間体を濃縮して残留物とする要件を除去する。これらの改善は、当業者に容易に明らかなものではない試薬で代用する場合の予期しない利益に基づくものである。
【０１６６】
さらに、本発明は、シトシンを（３ａＲ，４Ｒ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イルメタンスルホネート（ＩＮＴ１３）に添加してＩＮＴ１４を作製する段階３において、窒素対酸素（Ｎ／Ｏ）選択性を増大させるための最適化された反応および単離条件を提供する。改善されたプロセスにおいて、Ｎ−対Ｏ−異性体の比は、以前に最適化された８８：１２の値から、９９．０３：０．９７に改善された。本発明の固定容器製造プロセスは、一水和物形態の所望の生成物の、規模を拡大した製造の作業のコスト利益を実現する。
【０１６７】
以下のスキーム１は、ＲＸ−３１１７ＭＨを調製するための改善されたプロセスを例証する。
【化１０】
2018516947.tif 000012
段階１−ＩＮＴ１２を形成するＡＳＭ１１の脱保護のためのプロセス改善
【０１６８】
プロセスの段階１では、２−メチル−テトラヒドロフランをプロセス溶媒として使用した。この修飾により、中間体（３ａＳ，４Ｒ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−オール（ＩＮＴ１２）を濃縮する必要なしにワークアップを実施することが可能になり、中間体の、前プロセスにおいて使用したメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）への溶媒交換を回避する。
【０１６９】
加えて、反応プロセス内制御（ＩＰＣ）は、ＴＬＣを使用することから定量的１Ｈ  ＮＭＲ法に変更した。化学的乾燥の代わりに水の共沸除去を使用することによって、プロセスをさらに最適化した。プロセス溶媒としての２−メチル−テトラヒドロフランの使用により、さらなる単離も精製もなしに、プロセスの段階２において溶液中のＩＮＴ１２を直接使用することが可能になった。
段階２−ＩＮＴ１３を形成するＩＮＴ１２のメシル化のためのプロセス改善
【０１７０】
２−メチル−テトラヒドロフラン中のＩＮＴ１２の溶液を、段階２に直接持ち込んで、（３ａＲ，４Ｒ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イルメタンスルホネート（ＩＮＴ１３）を調製した。この改善されたプロセスは、環境的に望ましくないジクロロメタンの反応溶媒としての使用を除外した。さらに、プロセスは、残留トリエチルアミンをさらに制御するために、塩化アンモニウム洗浄液を使用した。ワークアップ体積は、１２．５体積の最大プロセス体積に低減し、１４体積からの低減であった。ここでも、化学的乾燥の代わりに水の共沸除去を使用することによって、プロセスをさらに最適化した。プロセス溶媒としての２−メチル−テトラヒドロフランの使用により、プロセスの段階３において溶液中のＩＮＴ１３を直接使用することが可能になった。
段階３−ＩＮＴ１４を形成するＩＮＴ１３へのシトシンの添加のためのプロセス改善
【０１７１】
２−メチル−テトラヒドロフラン中のＩＮＴ１３の溶液を、段階３に直接持ち込んで、ＩＮＴ１４を作製した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を反応溶媒として保持し、２−メチル−テトラヒドロフランの除去を蒸留によって実施した。２−メチル−テトラヒドロフラン対生成物を２７％ｗ／ｗに指定すると、段階３の反応を首尾よく実施することが可能となることが分かった。本発明者らは、塩基（無機およびアミン）のスクリーニングを行い、炭酸セシウムが最も高い化学選択性および最も急速な反応速度を供与することを見出した。本発明者らは、反応溶媒のスクリーニングも行い、ＤＭＳＯが反応に最も好適な溶媒であることを見出した。
【０１７２】
さらに、本発明者らは、ＩＮＴ１４のＮ−対Ｏ−異性体の選択性に対する、試薬投入、温度および濃度の影響を研究した。本発明の改善されたプロセスに従って、Ｎ−対Ｏ−異性体の比は、ＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーを使用して単離された、以前に最適化された８８：１２から、溶媒抽出および再結晶／沈殿を使用して、９９．０３：０．９７に改善された。本発明のプロセスは、カラムクロマトグラフィーの必要性を除外し、９９％を超える所望のＮ−異性体も提供する。特に、本発明者らは、化学選択性が、主として反応温度によって影響を受けることを見出した。特に、反応温度を低下させることにより、生成物への変換速度は減速した。反応条件は、塩基およびシトシンの投入を２．０当量から２．５当量に増大させることにより、さらに改善された。反応温度を、４０℃から３５℃に低減させた。加えて、スループットを改善するために、全プロセス体積を２２体積から１２．５体積に低減させるようにワークアップ手順を修正した。ワークアップ溶媒を酢酸エチルから酢酸イソプロピルに変更して、溶媒を交換するという要件なしに、反応混合物を単離に直接移行させた。ＩＮＴ１４は酢酸処理後により可溶性になることが分かったため、互変異性から出発するようにワークアップ手順も修正した。ＩＮＴ１４の単離は、高体積の酢酸イソプロピルから生成物を最初に沈殿した後、体積を低減させｎ−ヘプタンを添加するように修正した。この改善は、単離前の油汚染および容器への接着を防止することが分かった。故に、選択性を増大させた、全体的に改善された合成は、複数の反応パラメーターを同時に変更することによって実現された。温度および濃度の修正は、Ｎ／Ｏアルキル化の変換速度および化学選択性に対して好影響を有することが分かった。
段階４−ＩＮＴ１４を脱保護してＲＸ−３１１７無水物を形成するためのプロセス
【０１７３】
エタノール中２Ｍ  ＨＣｌの元の条件は、生成物に最も好適であることがわかり、保持した。しかしながら、反応温度を６０℃から５０℃に低減させて、可溶性を補助することにより、プロセスは改善された。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）洗浄液を使用して、トリチルアルコール副生成物を除去した。水性相中の生成物を、樹脂塩放出後に、段階５の単離に直接持ち込んだ。
段階５−ＲＸ−３１１７一水和物を単離するためのプロセス
【０１７４】
ＲＸ−３１１７ＭＨの溶液を、段階５に直接持ち込んだ。組み合わせた段階４および段階５は、手順に若干の修正を加えて、収率および操作性を規模に合わせて最適化した。ＲＸ−３１１７−ＭＨを空気下のフィルター上で乾燥させ、これにより、水含有量を保持しながら、アセトニトリル分量をＩＣＨガイドライン未満に制御した。この改善されたプロセスは、生成物をまず乾燥させ、次いで再水和させて結晶性生成物を生じさせるという時間のかかる要件を除去した。改善されたプロセスを使用して単離された生成物は、（９９．８３％）の純度を有し、これは、少ない分量の生成物のカスタム合成に相当する純度であった。
ＲＸ−３１１７の出発材料を作製するためのプロセスの他の改善
【０１７５】
ＲＸ−３１１７の出発材料の合成のための他のプロセス改善が可能である。異なる中間体および保護基を使用するＡＳＭ１１の合成（Synthesie）を、それぞれスキーム２および３において以下で示す。
ブロモ中間体によるＡＳＭ１１の合成
【化１１】
2018516947.tif 000013
【０１７６】
米国特許第９，１５０，５２０号では、ＲＸＮ−２をＲＸＮ−３に変換するための反応のステップ３において、ヨードホルムを使用した。本発明において、ブロモホルムまたは混合ブロモ−ヨードメタンの使用は、ヨード中間体の代わりにブロモ中間体を生じさせる。ブロモ中間体（bormointermediates）は、そのヨード誘導体よりも安定であり得る。したがって、全収率および純度が結果として増大し得る。
５−ヒドロキシル基のベンジル保護によるＡＳＭ１１Ｂｎの合成
【化１２】
2018516947.tif 000014
【０１７７】
予想外にも、初期に中間体中に置かれる保護基の変更は、途中で多数のステップの修正を必要とすることなく、プロセスの後期に行われる反応ステップに対して劇的な効果を有し得る。例えば、ステップ２においてトリチル保護基をベンジルに変更することは、反応のステップ１０におけるフッ素化での収率を改善し得る。これらの改善は、全体的な手順のさらなる修正なしに為され得る。
閉環メタセシスによるＡＳＭ１１の合成
【０１７８】
本発明の発明者らは、閉環メタセシスの行使によるＡＳＭ１１の合成のためのスキームも開発した。スキーム４において、閉環メタセシス反応を使用して、５員環部分を形成する。グラブス触媒のルテニウムは回収可能であり、廃棄物およびコストを低減させることにより、規模を拡大したプロセスをさらに改善する。
【化１３】
2018516947.tif 000015
閉環メタセシスによる中間体ＲＸＮ−６の合成
【０１７９】
中間体ＲＸＮ−６の合成は、ＲＸＮ−５を含む閉環メタセシスによって、フッ素化ＲＸＮ−６を作製することにより５員環にフッ素原子を導入するために、遂行され得る。スキーム５に示されている通り、閉環メタセシス反応を使用して、５員環部分（フルオロ−ＲＸＮ−６）を形成する。スキーム４と同様に、グラブス触媒のルテニウムは回収可能である。
【化１４】
2018516947.tif 000016
エポキシドを介する求核フッ素化による中間体ＲＸＮ−６の合成
【０１８０】
エポキシドを介する代替的求核フッ素化による中間体ＲＸＮ−６の合成が提供され得る。スキーム６は、出発材料（３ａＲ，６ａＲ）−６−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチル−３ａ，６ａ−ジヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−オンからのエポキシド環の形成を示す。エポキシドは、例えばフッ化カリウムを使用する求核フッ素化によって開かれる。代替として、他のフッ化物源、例えば、フッ化テトラブチルアンモニウムを使用して、エポキシド環を開くこともできる。水の除去はこのプロセスにおいて難しいステップであり、例えばカルボメトキシスルファモイルトリエチルアンモニウム塩等の代替的な脱水剤を使用して、修飾された中間体フルオロ（Flouro）−ＲＸＮ６−ＴＢＤＰＳにたどり着くことができる。
【化１５】
2018516947.tif 000017
アルドール縮合による中間体ＲＸＮ６の合成
【０１８１】
中間体ＲＸＮ６の合成は、フッ素化ＲＸＮ−６を作製することにより５員環にフッ素原子を導入するためのアルドール縮合を使用して遂行することもできる。スキーム７に示されている通り、フッ素原子は、初期に導入されて、ＲＸＮ６のフッ素化誘導体（フルオロ−ＲＸＮ６）を形成する。内部アルドール縮合は、所定の位置にビニルフッ素部分を持つ５員環を形成することができる。
【化１６】
2018516947.tif 000018
中間体フルオロ−ＲＸＮ６の代替合成
【０１８２】
中間体フルオロ−ＲＸＮ−６の合成のための追加の代替を、スキーム８および９に示す。スキーム８において、Ｄ−リボラクトン（ribolactone）１をホスホネート２と反応させて中間体３を発生させることによって、より短い経路が得られる。本発明者らは、Ｄ−リボラクトン誘導体１はジメチルフルオロアルキルホスホネートと容易に反応しないが、ジメチルカルボアルコキシメチルスルホネートを使用してより良好な反応性が得ることができることを見出した。次いで、中間体３はハンスディーカー（Hundsdiecker）ヨード脱カルボキシル化を受けて中間体４を形成し、次いで、これが、フッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）を使用する求核置換を受けることができる。
【化１７】
2018516947.tif 000019
【０１８３】
スキーム９（以下）は、Ｄ−リボラクトン１を、求電子フッ素化試薬を介して調製されるアルキルフェニルスルホン７と反応させて、中間体８を形成することによる、さらに短い経路を提供する。Ｄ−リボラクトン誘導体は、フルオロアルキルホスホネートよりも容易にリチオフルオロアルキルスルホン７と反応する。中間体８を中間体９に変換でき、これが脱離を起こし、Ｆ−ＲＸＮ６を形成することになる。代替として、より効率的であるがより高価な選択肢は、リチオフルオロアルキルスルホン７の代わりにフッ素化テトラゾリルスルホン１０を使用することである。
【化１８】
2018516947.tif 000020
異なるキラル源を使用する合成
【０１８４】
本発明の合成は、異なるキラル源を出発材料として使用することによって実現することもできる。
【０１８５】
スキーム１０（以下）において、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２，３，４，５−テトラオールを代替的キラル出発材料として使用して、ＡＳＭ−１１を発生させる。
【化１９】
2018516947.tif 000021
【実施例】
【０１８６】
下記の例は、例証を目的として提示されるものであり、開示されている主題の範囲を限定する役割を果たすものではない。
【０１８７】
本明細書において使用される細胞株Ａ５４９、ＳＷ１５７３およびＳＷ１５７３／ＧのＩＣ５０値は、Petersら、「Metabolism,  mechanism  of  action  and  sensitivity  profile  of  fluorocyclopentenylcytosine  (RX-3117)」、Investigational  New  Drugs、２０１３年１２月、３１巻、６号、１４４４〜１４５７頁（http://link.springer.com/article/10.1007/s10637-013-0025-xにおいてオンラインで利用可能）において報告されている通り、それぞれ、８．３μＭ、１３．７μＭおよび７．３μＭである。
（実施例１）
非小細胞肺がん細胞株に対するＲＸ−３１１７の効果
【０１８８】
ヒト非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）細胞株Ａ５４９（腺癌）、ＳＷ１５７３（歯槽癌）およびＳＷ１５７３／Ｇ−（ゲムシタビンに耐性があるＳＷ１５７３細胞株）ならびにＨ４６０（大細胞癌）における細胞周期調節および細胞死に対するＲＸ−３１１７の効果をアセスメントした。Ａ５４９およびＨ４６０細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から入手した。Ｊｏｈａｎ  ｖａｎ  Ｒｉｊｎ博士から入手したＳＷ１５７３細胞株（Keiserら、Cancer  Research、４９巻：２９８８〜２９９３頁（１９８９年）を参照）も、ＳＷ１５７３／Ｇ−の親細胞株として役立った。Ａ５４９、ＳＷ１５７３およびＳＷ１５７３／Ｇ−ならびにＨ４６０を、Ｔ２５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  ＧｍｂＨ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内で指数関数的増殖中に保ち、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）１％ストレプトマイシンおよびペニシリン２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを補充したダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ）またはＲＰＭＩ１６４０（Ａ５４９）中で培養し、５％ＣＯ２の雰囲気で飽和した３７℃の水中に維持した。細胞周期分布のために、１．５×１０５細胞をＴ２５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  ＧｍｂＨ）中に播種し、７２時間にわたって培養し、その後、１μＭのＲＸ−３１１７を添加し、２４時間にわたってインキュベートした。次いで、細胞を収穫した。処理後、培地を１５ｍｌのチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  ＧｍｂＨ）内に収集した。細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、３７℃でトリプシン処理（Ｌｏｎｚａ）した。収集された培地を使用して、対応する試料のトリプシンを不活性化し、再度１５ｍｌのチューブ内に収集した。細胞を、標準的な遠心分離プログラムを用い、４℃および１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。培地を除去し、ペレットを１ｍｌのＰＢＳ／０．０１％ＢＳＡで洗浄し、遠心分離した。上清の除去後、細胞を１ｍｌの７０％エタノールで固定し、−２０℃で少なくとも２４時間にわたってインキュベートした。その後、細胞を遠心分離し、１ｍｌのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで洗浄し、ＦＡＬＣＯＮ  ＦＡＣＳチューブ（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）に移した。細胞を遠心分離し、上清を除去し、続いて、０．５μｇのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）、０．１％クエン酸三ナトリウム（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｌａｂｏｒｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）、０．１％トリトンＸ−１００ＴＭ（Ｍｅｒｃｋ）および０．１ｍｇ／ｍｌのＲＮアーゼ（Ｓｉｇｍａ）（ＰＩ溶液）を試料に添加した。その後、少なくとも１５分間にわたって、細胞を氷上でＰＩ溶液とともにインキュベートして、ＤＮＡを染色した後、分析を開始した。ＰＩ溶液で染色した細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｏｕｎｔ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって分析した。データは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）プロソフトウェアを用いて分析した。
【０１８９】
細胞周期停止の機構は、ウェスタンブロッティングを使用して細胞周期タンパク質発現を測定することにより、調査した。異なる処理条件中のタンパク質発現に対するＲＸ−３１１７の影響力を、ウエスタンブロットによって分析した。４％プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有する細胞溶解緩衝液１×（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、細胞を氷上で３０分間にわたって溶解させ、４℃で１４，０００ｒｐｍにて１０分間にわたって遠心分離した。タンパク質含有上清を収集し、バイオ・ラッドアッセイを実施して、Lemosら、Pharmacogenomics、１２巻（２号）：１５９〜７０頁（２０１１年）において記述されている通りに、タンパク質量を決定した。下記の抗体をタンパク質発現に使用した：ＤＮＭＴ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１０００  ５０３２Ｓ番）、ＤＮＭＴ３Ａ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  １：１０００  ２１６０Ｓ番）、ＤＮＭＴ３Ｂ（Ａｂｃａｍ、１；１０００）、Ｃｈｋ２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  １：１０００  ６３３４Ｐ番）、Ｃｈｋ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  １：１０００）、ｐ−ＣＤＣ２５Ｃ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  １：１０００  ４９０１Ｓ番）、Ｃｄｋ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  １：１０００  ９１１２Ｓ番）、Ｃｄｋ２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  １：１０００  ２５４６Ｓ番）、ｗｅｅ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  １：１０００）、Ｓ１３９−γＨ２Ａ．Ｘ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１０００）、βアクチン（Ｓｉｇｍａ、１：１０，０００）、カスパーゼ９（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１０００）、ＰＡＲＰ（Ｒｏｃｈｅ  ２００３、１：１０００）、ｐ５３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１０００、９２８２番）。抗体を、ロックランド緩衝液（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｎｃ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、ＵＳＡ）および０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を補充したＰＢＳの１：１溶液中で希釈した。タンパク質を２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。蛍光シグナル二次抗体には、ヤギ抗マウス赤外色素およびヤギ抗ウサギ赤外色素を使用した。タンパク質は、オデッセイ赤外線イメージャー（Ｌｉ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ、ＵＳＡ）によって検出した。
本明細書において使用される略語は、下記を表す：
ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン
ＨＥＰＥＳ＝２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸
ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水
ＰＶＤＦ＝二フッ化ポリビニリデン
ＲＰＭ＝毎分回転数
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＝ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
細胞周期
【０１９０】
１μＭの用量で、ＲＸ−３１１７は、２４時間の曝露後、Ｇ１期においてＡ５４９、ＳＷ１５７３、ＳＷ１５７３／Ｇ−およびＨ４６０細胞の蓄積を誘発した（図１）。５×ＩＣ５０のより高用量では、ＲＸ−３１１７は、Ｓ期においてＡ５４９、ＳＷ１５７３およびＳＷ１５７３／Ｇ−細胞の蓄積を誘発した（図２）。
カスパーゼ活性化
【０１９１】
ＲＸ−３１１７は、漸増濃度のＲＸ−３１１７への２４時間の曝露後、ＳＷ１５７３細胞およびＡ５４９細胞においてプロカスパーゼ９を減少させた。プロカスパーゼ９の低減は、カスパーゼの活性化およびそれに続くアポトーシス誘発を示す（図３および４）。
ＤＮＭＴタンパク質
【０１９２】
ＲＸ−３１１７は、より高用量ではＡ５４９細胞におけるＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）の維持を下方調節し（図２３）、Ａ５４９細胞におけるＤＮＭＴ３ＡおよびＤＮＭＴ３Ｂ発現レベルを増大させた。この下方調節についての提案機構を図２２に示す。
ＤＮＡ損傷
【０１９３】
ＲＸ−３１１７は、４８時間の曝露後にＳＷ１５７３細胞においてバイオマーカーγＨ２Ａ．Ｘ（リン酸化Ｓ１３９）によって示される通り、二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘発した（図５）。ＲＸ−３１１７は、漸増濃度のＲＸ−３１１７への２４時間の曝露後に、開裂されたＰＡＲＰを誘発した（図６）。開裂されたＰＡＲＰは、アポトーシス細胞における活性化したカスパーゼ活性を示す。１μＭおよび５μＭでは、ＲＸ−３１１７は、Ａ５４９細胞においてｐ５３発現レベルを増大させた（図７）。１０μＭでは、ＲＸ−３１１７は、Ｃｈｋ１およびＣｄｋ２発現レベルを増大させ、一方、４８時間の曝露後、ＳＷ１５７３細胞においてｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ発現レベルを減少させた（図８）。ＲＸ−３１１７によって誘発されるＤＮＡ損傷は、Ｃｈｋ１経路を始動させる。ＡＴＲ／Ｃｈｋ１経路は、ＤＮＡ複製ストレスおよびＤＳＢによって誘発される。ＲＸ−３１１７は、漸増濃度のＲＸ−３１１７への２４時間の曝露後、ＳＷ１５７３細胞においてｗｅｅ１発現レベルを減少させた（図９）。図２４は、細胞周期タンパク質に対する潜在的効果、ならびに損傷誘発後のチェックポイントキナーゼＣｈｋ１およびＣｈｋ２による細胞周期の調節を示す図表であり、ＲＸ−３１１７は、これらの経路のいくつかに沿って活性を有する場合がある。
アポトーシス誘発
【０１９４】
５×ＩＣ５０の用量で、ＲＸ−３１１７は、２４および４８時間の曝露後、サブＧＩ期のＰＩ染色されたＡ５４９およびＳＷ１５７３細胞においてアポトーシスを誘発した（図１０）。５μＭ（Ａ５４９について）および１０μＭ（ＳＷ１５７３について）では、ＲＸ−３１１７は、２４、４８、７２および９６時間の曝露後、サブＧＩ期のアネキシンＶ染色されたＡ５４９およびＳＷ１５７３細胞においてアポトーシスを誘発した（図１１）。
結果
【０１９５】
結果は、細胞周期停止が、時間、濃度および細胞株依存性であったことを示唆している。Ａ５４９、Ｈ４６０およびＳＷ１５７３細胞において、１μＭのＲＸ−３１１７への２４時間の曝露は、Ｇ１期（約２０〜４０％）およびＳ期（より少ない程度まで）においては細胞の蓄積を増大させたが、Ｇ２／Ｍ期においては細胞の蓄積を減少させた。故に、低用量のＲＸ−３１１７はＧ１蓄積を誘発し、高用量のＲＸ−３１１７はＳ期蓄積を誘発する。２４時間の曝露では、細胞死滅は観察されなかったが、γＨ２ＡＸ誘発が付随する４８時間の曝露では細胞死滅が観察された（ＳＷ１５７３において１５％およびＡ５４９細胞において８％）。Ａ５４９細胞において、細胞周期分布に対するＲＸ−３１１７の効果は、４８時間の曝露で最も顕著であり、Ｓ期に４５％の蓄積があった。Ｓ期蓄積は、時間依存性である。ＲＸ３１１７による処理は、ｐ５３、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２およびＣｄｋ２発現レベルを増大させたが、Ｃｄｃ２５Ｃおよびｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ発現レベルを減少させた。ＲＸ−３１１７は、４８時間後に大部分がｗｅｅ１発現レベルを増大させた。ＲＸ−３１１７は、ＳＳＢおよびＤＳＢを介してアポトーシスを誘発するように思われた。ＳＷ１５７３細胞中の開裂されたＰＡＲＰは、アポトーシス細胞において上方調節されたカスパーゼ活性を示す。Ａ５４９細胞におけるプロカスパーゼ９の低減は、カスパーゼの活性化およびそれに続くアポトーシス誘発を示す。結論として、ＲＸ−３１１７によって誘発されたＤＮＡ損傷は、一方でアポトーシスを始動させ、他方でＣｈｋ１およびＣｈｋ２発現レベルを増大させた。いずれの作用機構にも限定されることなく、リン酸化されたＣｈｋ１およびＣｈｋ２は、Ｃｄｃ２５Ｃのリン酸化を始動させ、その分解を招いた可能性があり、これがＣｄｋ１レベルの減少をもたらし、故にＳ期において細胞を蓄積したと考えられている。
（実施例２）
同系ＭＣ３８マウス結腸がん異種移植片モデルにおけるＲＸ−３１１７の有効性
【０１９６】
後述するプロトコールに準拠し、ＭＣ３８マウス結腸がんを持つ雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用して、同系モデルにおける腫瘍増殖に対するＲＸ−３１１７の効果を検査した。腫瘍増殖を、治療群において、対照（ビヒクル処理）群と比較して測定した（投薬スキームおよび治療レジメンについては以下の表１を参照）。この研究の結果（表２）は、プログラム死受容体１（ＰＤ−１）阻害剤、ＲＭＰ１−１４へのＲＸ−３１１７の添加が、腫瘍増殖の阻害において相加効果を有していたことを実証している（８０％ＲＸ−３１１７単独、９３％ＲＭＰ１−１４単独、対９９％の２つの作用物質の組合せ）。２つの作用物質の組合せは、ＲＭＰ１−１４単独群において４匹の動物に部分退縮および完全退縮があり、２匹が腫瘍無増悪生存期間を示したのと比較して、より多くの数のマウス（９匹のマウス）に部分退縮および完全退縮があり、７匹の動物が腫瘍無増悪生存期間を示すという結果ももたらした。すべての結果は、組合せ群のマウスにいかなる有害作用もなく得られた。
【０１９７】
簡潔に述べると、方法は次のように記述される。細胞を指数関数的増殖中に収穫し、リン酸緩衝生理食塩水で再懸濁した。各試験動物には、右脇腹への１×１０６腫瘍細胞の皮下（ｓ．ｃ．）注射を受けさせ、平均腫瘍サイズが６０〜１００ｍｍ３の標的範囲に近づく間、腫瘍増殖をモニターした。各動物がこの標的範囲に達したら、表１に基づいて投薬を開始した。
【表１】
2018516947.tif 000022
【表２】
2018516947.tif 000023
【０１９８】
腫瘍は、キャリパーを使用して２次元で測定し、体積は、式：
【数１】
2018516947.tif 000024
［式中、ｗ＝腫瘍の幅であり、ｌ＝長さ（単位ｍｍ）である］を使用して算出した。腫瘍重量は、１ｍｇが１ｍｍ３の腫瘍体積と同等であると仮定して推定されてよい。
【０１９９】
４５日目のデータを使用して、治療有効性を決定した。４５日目における、動物の数ｎに対するＭＴＶ（ｎ）、腫瘍体積の中央値を、各群について決定した。腫瘍増殖阻害パーセント（％ＴＧＩ）は、対照群のＭＴＶのパーセンテージとして表現される、指定対照群（ビヒクル投与）のＭＴＶと薬物治療群のＭＴＶとの間の差異として定義される：
【数２】
2018516947.tif 000025
【０２００】
ＴＧＩ分析のためのデータセットは、治療関連（ＴＲ）または非治療関連（ＮＴＲ）原因により死亡したものを除いて、群中のすべての動物を含む。このアッセイにおいて少なくとも６０％のＴＧＩを生成する作用物質を、潜在的に治療的に活性であるとみなす。
【０２０１】
研究プロトコールは、治療群対対照群におけるエンドポイントまでの時間（ＴＴＥ）の中央値に基づき、腫瘍増殖遅延アッセイを特定する。各動物は、その腫瘍が１５００ｍｍ３の体積エンドポイントに達したら、腫瘍進行（ＴＰ）のために安楽死させた。各マウスについてのエンドポイントまでの時間（ＴＴＥ）を、下記の方程式を用いて算出した：
【数３】
2018516947.tif 000026
【０２０２】
［式中、ｂは切片であり、ｍは、対数変換された腫瘍増殖データセットの線形回帰によって得られた線の傾きである］。データセットは、研究エンドポイント体積を超える第１の観察およびエンドポイント体積の到達の直前の３つの連続する観察から構成される。エンドポイントに達しなかった動物はいずれも研究の終わりに安楽死させ、研究の最終日（７１日目）と等しいＴＴＥ値を割り当てた。対数変換により算出されたＴＴＥが、エンドポイントに達する日よりも前であるまたは腫瘍体積エンドポイントに達する日を超える事例においては、ＴＴＥに近似するように線形補間を実施する。治療関連（ＴＲ）原因により死亡したと決定された動物にはいずれも、死亡日と等しいＴＴＥ値を割り当てる。非治療関連（ＮＴＲ）原因により死亡した動物はいずれも、ＴＴＥ分析から排除する。
【０２０３】
治療有効性は、退縮応答の数から決定した。治療は、動物において、腫瘍の部分退縮（ＰＲ）または完全退縮（ＣＲ）を引き起こし得る。ＰＲ応答において、腫瘍体積は、研究過程中の３つの連続する測定について、そのＤ１体積の５０％またはそれ未満であり、これらの３つの測定のうちの１つまたは複数についての１３．５ｍｍ３と等しいまたはそれより大きい。ＣＲ応答において、腫瘍体積は、研究過程中の３つの連続する測定について、１３．５ｍｍ３未満である。研究の最終日にＣＲ応答があった動物はいずれも、追加で腫瘍無増悪生存者として分類した。
【０２０４】
毒性アセスメントのために、動物を、研究の最初の５日間にわたって毎日およびその後週に２回秤量した。マウスには、任意の有害な治療関連副作用の明白な徴候が頻繁に観察され、観察された場合、毒性の臨床徴候を記録する。
【０２０５】
許容される毒性は、研究中において２０％未満である群平均体重減少および１０匹の治療された動物の中で１匹を超えない治療関連（ＴＲ）死として定義される。より大きい毒性をもたらすあらゆる投薬レジメンは、最大耐用量（ＭＴＤ）を上回るとみなされる。死亡は、臨床徴候および／または剖検から明らかなように、治療の副作用に起因する場合、あるいは、投薬期間中または最終用量から１４日以内の不明の原因による場合、ＴＲとして分類される。死亡が治療の副作用に関連するという根拠がない場合、死亡は非治療関連（ＮＴＲ）として分類される。
【０２０６】
統計的および図形的分析のために、ウィンドウズ（登録商標）用のプリズム６．０５（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いた。複数の群についてのＭＴＶ値を、ノンパラメトリッククラスカル・ワリス検定およびダンの事後多重比較検定により比較する。両側統計分析をＰ＝０．０５で行った。プリズムは、結果を、Ｐ＞０．０５では有意でない（ｎｓ）、０．０１＜Ｐ≦０．０５では有意（「＊」の記号で示す）、０．００１＜Ｐ≦０．０１では非常に有意（「＊＊」）、およびＰ≦０．００１では極めて有意（「＊＊＊」）として報告する。統計的検定は有意性の検定であり、群間の差異の大きさの推定を提供するものではないため、すべてのレベルの有意性が、この報告書の本文内に有意または有意でないのいずれかとして記述される。
【０２０７】
「箱ひげ」図表は、Ｄ１５における群ごとの個々の腫瘍体積の分布を示すように構築された。箱は、観察の２５番目から７５番目のパーセンタイルを表し、横線は中央値に対応し、「ひげ」は、最大および最小値を示す。腫瘍体積の群中央値を、時間の関数としてプロットした。群平均ＢＷ変化を、Ｄ１からの変化パーセント、±ＳＥＭとしてグラフ化する。ＮＴＲ原因により死亡した動物は、すべての図形表現から排除される。
【０２０８】
生存は、ＴＴＥ値に基づき、カプラン・マイヤー法によって分析した。対数順位（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）およびゲーハン・ブレスロー・ウィルコクソン検定は、ＴＴＥ値に基づき、２つの群の全生存経験（生存曲線）間の差異の有意性を決定するものである。カプラン・マイヤープロットおよび統計的検定は、同じデータセットを共同使用し、ＮＴＲ死亡として記録されているいかなる動物も排除する。散布プロットは、個々のマウスについてのＴＴＥ値を群ごとに示すように構築されており、このプロットは、他のすべての数字から排除されるＮＴＲ死亡を示す。群平均腫瘍体積を、時間の関数としてプロットする。動物が腫瘍サイズまたはＴＲ死亡を理由として研究から外れる場合、その最後に記録された腫瘍体積は、それに続く時点における体積の中央値を算出するために使用されるデータとともに含まれる。腫瘍増殖曲線は、同じ群内で２つのＴＲ死亡が出現した後に切り取る。研究過程にわたる群平均ＢＷ変化を、１日目からの変化パーセント、±ＳＥＭとしてグラフ化する。腫瘍増殖およびＢＷ変化曲線は、群中のアセスメント可能なマウスの半分超が研究から外れた後に切り取る。
（実施例３）
ヒトにおけるＲＸ−３１１７の薬物動態、安全性および忍容性
【０２０９】
ファースト・イン・ヒューマン非盲検探索的研究において、ＲＸ−３１１７の、薬物動態、安全性および忍容性を評価した。研究持続期間は、１４〜１５日（７日のスクリーニング期間；３日の治療期間；４（＋１）日の安全性フォローアップ期間）であった。組織学的に確かめられた固形腫瘍を持つ９人の成人男性および女性対象が、研究に登録し、完了した。対象に、ＲＸ−３１１７（ｎ＝用量当たり３人の対象）を、単回経口用量（５０ｍｇまたは１００ｍｇ）としてまたは単回静脈内用量（２０ｍｇ）として受けさせた。
薬物動態（ＰＫ）
【０２１０】
経口ＲＸ−３１１７の絶対バイオアベイラビリティ（Ｆ）は、５０および１００ｍｇ用量について、それぞれ５５．６７％および３３．４２％であった。平均Ｔｍａｘは、５０および１００ｍｇ用量について、それぞれ２．１６時間および２．４９時間であった。平均Ｃｍａｘは、５０および１００ｍｇ用量について、それぞれ３０３．３ｎｇ／ｍＬおよび３１１．４３ｎｇ／ｍＬであった。１００ｍｇ用量と比較して大きい５０ｍｇ用量の絶対バイオアベイラビリティおよびＣｍａｘ結果は、血漿中におけるＲＸ３１１７の経口バイオアベイラビリティが用量に比例していない場合があることを示唆している。５０ｍｇおよび１００ｍｇ用量のＴ１／２は、それぞれ１３．９５時間および２０．９２時間であり、ＲＸ−３１１７が、試験された用量で、一部のパラメーターに対しては用量比例性を示すが他のものに対しては示さない場合があることを示していた。
【０２１１】
静脈内ＲＸ−３１１７の血漿ＰＫプロファイルは、経口ＲＸ−３１１７の血漿ＰＫプロファイルと異なっていた。２０ｍｇ用量の静脈内ＲＸ−３１１７は、ボーラス注入（Ｔｍａｘ＝０．２５時間）後に急速に回復した。２０ｍｇ用量の静脈内ＲＸ−３１１７は、１１４３．６３ｎｇ／ｍＬの平均Ｃｍａｘを有し、これは、経口用量のピーク濃度のおよそ４倍の増大であった。
安全性および忍容性
【０２１２】
ＲＸ−３１１７は、すべての対象において安全かつ忍容性良好であった。有害事象（ＡＥ）、治療中に発生した有害事象（ＴＥＡＥ）または重篤な有害事象（ＳＡＥ）のいずれも出現しなかった。
【０２１３】
結果は、ＲＸ−３１１７が、経口バイオアベイラビリティを持つ安全かつ忍容性良好であり、より高用量の研究を裏付けるものであることを示す。
（実施例４）
異なる経口用量におけるＲＸ−３１１７の薬物動態、安全性および忍容性
【０２１４】
非盲検用量設定研究において、種々の経口用量でのＲＸ−３１１７の薬物動態（ＰＫ）を評価した。進行性悪性腫瘍を持つ対象に、ＲＸ−３１１７を、３０ｍｇ（Ｎ＝１）、６０ｍｇ（Ｎ＝１）、１００ｍｇ（Ｎ＝３）、１５０ｍｇ（Ｎ＝３）、２００ｍｇ（Ｎ＝３）、５００ｍｇ（Ｎ＝３）、１０００ｍｇ（Ｎ＝３）、１５００ｍｇ（Ｎ＝４）および２０００ｍｇ（Ｎ＝現在まで５）の１日用量で含有するカプセル剤を、週に３回（ＴＩＷＫ）３週間にわたり、４週間のサイクルごとに１週間の休薬をおいて投与した。継続した安全性プロファイルに基づいて、週のＲＸ−３１１７曝露を強化するために、より高頻度の投薬も実装した。上で論じたＴＩＷＫ投薬スキームに加えて、対象にはさらに、５００ｍｇおよび７００ｍｇを週に５回および５００ｍｇを週に７回、３週間にわたり、４週間のサイクルごとに１週間の休薬をおいて受けさせた。用量増加は、用量あたり１人の対象を治療する加速設計から始まり（Simonら、J.  Natl.  Cancer  Inst.、８９巻（１５号）：１１３８〜４７頁（１９９７年））、その後、単一の関連グレード２またはそれ超の有害事象の出現後に、修正フィボナッチ数列を使用する標準的な３＋３設計が続く。表３は、投薬スケジュールをまとめたものである。
【表３】
2018516947.tif 000027
薬物動態（ＰＫ）
【０２１５】
ＰＫデータを表４に提示する。
【０２１６】
ＲＸ−３１１７は、著しい時間差なしに、２から３時間で通常は観察される中央値Ｔｍａｘで急速に吸収された。Ｔｍａｘ後、消失は、最初の８時間で観察されたＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）の約半分、および２４時間での８０％超で二相性となった。見かけの終末Ｔ１／２は、用量依存性または時間依存性薬物動態のいずれも呈さず、用量範囲６０から２０００ｍｇについての平均値は、第１回用量後、１１．６から１６．７時間の範囲、および第７回用量（投薬の１５日目）後、１２．３から２０．２時間であった。ＣｍａｘおよびＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）は、用量とともにかなり直線的に増大したが、比例的様式というほどではなく、１５００ｍｇ用量でおそらくプラトーに達したと思われる（図１２および１３）。３０から２０００ｍｇの用量範囲にわたり、平均Ｃｍａｘは、第１回用量後、３２から１８５８ｎｇ／ｍＬ、および第７回用量後、９９から１７０３ｎｇ／ｍＬの範囲となった（図１２）。同じ用量範囲にわたり、平均ＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）は、第１回用量後、１６４から２０，５４４時・ｎｇ／ｍＬ、および第７回用量後、７０２から２０，９１９時・ｎｇ／ｍＬの範囲となった（図１３）。蓄積は、概して最小であった。
【０２１７】
ＰＫデータは、用量最大１０００ｍｇ  ＴＩＷＫでの曝露における用量依存性増大を示す。５００ｍｇ  ＴＩＷＫより大きい用量で、第７回用量後のＣｍａｘおよびＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）は、第１回用量後に測定されたものより一貫して低い（図１２および１３）。１０００ｍｇを上回る用量におけるＣｍａｘおよびＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）値のプラトーにより、より高頻度の投薬スケジュールを使用して、週の曝露を強化した（表４）。この研究の結果に基づいて、ＲＸ−３１１７の最大耐用量（ＭＴＤ）を、３週間にわたり、４週間のサイクルごとに１週間の休薬をおいて与えられる、１日７００ｍｇで週に５日であると決定した。次いで、このＭＴＤを、フォローアップ有効性研究に使用した。
【表４】
2018516947.tif 000028
安全性および忍容性
【０２１８】
最も頻繁に観察された有害事象は、軽度から中等度の疲労および吐き気、軽度の下痢、軽度の嘔吐、軽度の食欲不振、ならびに中等度の脱水であった。用量制限毒性は、グレード３の貧血、血小板減少症に限定された。
（実施例５）
ヒトにおけるＲＸ−３１１７の有効性、安全性および忍容性
【０２１９】
種々の用量および頻度でのＲＸ−３１１７の、有効性、安全性および忍容性を評価した（上記実施例４を参照）。進行性悪性腫瘍を持つ対象に、ＲＸ−３１１７を種々の用量で含有するカプセル剤を、ＴＩＷＫから週に７回、３週間にわたり、４週間のサイクルごとに１週間の休薬をおいて投与した。用量増加は、用量あたり１人の対象を治療する加速設計から始まり（Simonら、J.  Natl.  Cancer  Inst.、８９巻（１５号）：１１３８〜４７頁（１９９７年））、その後、単一の関連グレード２またはそれ超の有害事象の出現後に、修正フィボナッチ数列を使用する標準的な３＋３設計が続く。表４（上記）は、投薬スケジュールをまとめたものである。
【０２２０】
対象を、ＲＸ−３１１７の有効性、安全性および忍容性についてアセスメントした。合計４８人の対象が登録した（３０人の女性、１８人の男性）。１７人の対象が、１から１０サイクルにわたって安定な疾患を経験し、１０人の対象が、８２から２７６日、治療を受けた。腫瘍負荷の低減は、膵臓（腫瘍体積およびＣＡ１９−９のバイオマーカー）、乳房および中皮腫のがんを持つ３人の対象において見られた。最も高頻度な関連有害事象は、中等度から重度の貧血、軽度から中等度の疲労および吐き気、軽度の下痢、嘔吐、ならびに食欲不振であった。
【０２２１】
この研究の別の段階において、ＲＸ−３１１７は、再発性もしくは難治性膵臓がんまたは進行性膀胱がん（筋肉浸潤性膀胱がんを含む）を持つがん患者における第Ｉｂ／ＩＩａ相治験で評価されている。第Ｉｂ／ＩＩａ相治験は、これらの標的患者集団におけるＲＸ−３１１７の安全性および有効性を評価する多施設研究である。副次的エンドポイントは、安全性および薬物動態分析を含む。治験中の患者は、７００ｍｇのＲＸ−３１１７の１日経口用量を、週に５回３週間にわたって、２８日サイクルおよび４回の治療サイクルで、または疾患が進行するまで、受けている。
（実施例６）
卵巣および肺がん細胞株におけるフルオロシクロペンテニル−シトシン（ＲＸ−３１１７）の放射線増感効果
薬物および化学物質
【０２２２】
ＲＸ−３１１７のストック溶液を、脱イオン水中で作製した。使用したその他すべての化学物質は、標準品質および市販のものであった。
細胞培養
【０２２３】
ヒトＮＳＣＬＣ細胞株Ａ５４９（腺癌）、Ｈ４６０（大細胞癌）、ＳＷ１５７３（歯槽癌）およびＳＷ１５７３／Ｇ−（ゲムシタビンに耐性があるＳＷ１５７３細胞株）ならびに卵巣がん細胞株Ａ２７８０を、Ｔ２５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  ＧｍｂＨ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内で指数関数的増殖中に保ち、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ストレプトマイシンおよびペニシリンを補充したダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ）またはＲＰＭＩ１６４０中で培養し、５％ＣＯ２の飽和雰囲気下、３７℃に維持した。トリプシンＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）を使用して、細胞を収穫した。Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）Ｚ（商標）シリーズカウンターを使用して、細胞を計数した。
コロニー形成アッセイ
【０２２４】
指数関数的に増殖しているＡ２７８０、ＳＷ１５７３、Ａ５４９、Ｈ４６０およびＳＷ１５７３／Ｇ−細胞を、２４時間にわたって１μＭのＲＸ−３１１７に曝露するかまたは未処理（対照）とし、６０Ｃｏ源（ガンマセル２００、Ａｔｏｍｉｃ  Ｅｎｅｒｇｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ，Ｌｔｄ）を使用して単回線量のγ−放射線（０〜６Ｇｙ）を照射した。その後、５００細胞／Ｔ２５フラスコを播種し、コロニーを形成させた。１０日後、コロニーを１００％エタノールで固定し、コロニー計数のために１０％ギムザ染色液（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＢＶ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で染色した。形成されたコロニーの数を播種された細胞の数で割ることによって播種効率（ＰＥ）を算出し、対照によって誘発された細胞毒性に対して正規化した。放射線に対するＲＸ−３１１７の効果を例証するために、線量修飾係数（ＤＭＦ）を先に記述された通りに算出した（Bijnsdorp  I  V、van  den  Berg  J、Kuipers  GK、Wedekind  LE、Slotman  BJ、van  Rijn  J、Lafleur  MVMおよびSminia  P:  Radiosensitizing  potential  of  the  selective  cyclooygenase-2  (COX-2)  inhibitor  meloxicam  on  human  glioma  cells.  J  Neurooncol  ８５巻：２５〜３１頁、２００７年）。
スフェロイドアッセイ
【０２２５】
ＮＳＣＬＣ細胞株Ａ５４９およびＳＷ１５７３を、低接着２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）中、１００，０００細胞／ウェルの密度で播種し、スフェロイドを形成させた。３日後、単一のスフェロイドを新たな２４ウェル低接着プレートに移した（１つのスフェロイド／ウェル）。移した直後に処理を開始し、Ａ５４９およびＳＷ１５７３細胞については、１μＭのＲＸ−３１１７を、分割２Ｇｙ照射（５日間の単回２Ｇｙ線量）と組み合わせた。０日目（照射前）ならびに３、６、９および１５日後に、位相差顕微鏡（ライカＤＭＩ３００Ｂユニバーサルグラブ６．３ソフトウェア、Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｌａｂｓ）を使用して写真を撮影した。測定は、スフェロイド体積算出（Ｖ＝４／３π（Ｄ／２）３）のためのイメージＪソフトウェア（イメージＪ１．４５ｓ、Ｗａｙｎｅ  Ｒａｓｂａｎｄ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）によって、Ｇａｌｖａｎｉらによって先に記述された通りに行った（Galvani  E、Giovannetti  E、Saccani  F、Cavazzoni  A、Leon  LG、Dekker  H、Alfieri  R、Carmi  C、Mor  M、Ardizzoni  A、Petronini  PGおよびPeters  GJ:  Molecular  mechanisms  underlying  the  antitumor  activity  of  3-aminopropanamide  irreversible  inhibitors  of  the  epidermal  growth  factor  receptor  in  non-small  cell  lung  cancer.  Neoplasia  １５巻：６１〜７２頁、２０１３年）。
フローサイトメトリー分析
【０２２６】
細胞周期分布およびアポトーシスは、細胞を、平底６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  ＧｍｂＨ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中、５，０００細胞の密度で播種することによって分析し、２４時間にわたって接着させた。その後、５×ＩＣ５０の細胞毒性濃度を添加した。曝露時間は２４時間および４８時間であり、比較のために、対照群を含めた。各時点において、付着および浮遊細胞の総量を、丸底ＦＡＬＣＯＮチューブ（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）内に収穫した。遠心分離後、細胞ペレットを、１．０ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液（５０ｕｇ／ｍｌのＰＩ、０．１％クエン酸ナトリウム、０．１％トリトンＸ−１００、０．１ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ）または１０ｕｌのアネキシンＶ（カタログ番号３１４９００１４、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ）に再懸濁し、３０分間にわたって氷上に放置した。その後、ＦＡＣＳキャリバー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｏｕｎｔ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、試料を分析した。データ分析のために、サブＧ１期における細胞（アポトーシス細胞）の量を推定するためのＤＮＡヒストグラム上のゲートを使用して、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ（商標）ソフトウェアを実行した。
タンパク質発現分析
【０２２７】
異なる処理条件中のタンパク質発現に対するＲＸ−３１１７の影響力を、ウエスタンブロットによって分析した。４％プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有する１×細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、細胞を氷上で３０分間にわたって溶解させ、４℃で１４，０００ｒｐｍにて１０分間にわたって遠心分離した。バイオ・ラッドアッセイを実施して、先に記述された通りに、収集された上清中のタンパク質量を決定した（Lemos  C、Kathmann  I、Giovannetti  E、Calhau  C、Jansen  GおよびPeters  GJ:  Impact  of  cellular  folate  status  and  epidermal  growth  factor  receptor  expression  on  BCRP/ABCG2-mediated  resistance  to  gefitinib  and  erlotinib.  Br  J  Cancer  １００巻：１１２０〜７頁、２００９年）。下記の抗体をタンパク質発現に使用した：γＨ２Ａ．Ｘ（カタログ番号９７１８、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１０００）、β−アクチン（Ｓｉｇｍａ、１：１０，０００）、Ｃｄｃ２５Ｃ  Ｓｅｒ２１６（カタログ番号４９０１、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１０００）、Ｃｄｋ１  Ｔｙｒ１５（カタログ番号９１１１、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１０００）、Ｃｈｋ１  Ｔｈｒ６８（カタログ番号２１９７Ｓ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１０００）、ヒストン３（カタログ番号４４９９、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。抗体を、ロックランド緩衝液（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｎｃ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）および０．０５％ツイーン２０を補充したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の１：１溶液中で希釈した。タンパク質を２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で分離し、二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写した。蛍光シグナル二次抗体には、ヤギ抗マウス赤外色素およびヤギ抗ウサギ赤外色素を使用した。タンパク質は、オデッセイ赤外線イメージャー（Ｌｉ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）によって検出した。
結果
ＲＸ−３１１７の放射線増感効果
【０２２８】
放射線に対するＲＸ−３１１７の効果を調査するために、コロニー形成アッセイを実施した。最初に、本発明者らは、ＲＸ−３１１７とのプレまたはポストインキュベーションが、放射線の効果を強化するか否かを検査した。４Ｇｙと一緒にしたＲＸ−３１１７による処理前および後を、Ａ２７８０細胞において比較した。
【０２２９】
コロニー形成アッセイデータは、ＲＸ−３１１７とのプレインキュベーションが、放射線増感効果に最も有効な条件であることを示した。１μＭのＲＸ−３１１７とのプレインキュベーションは、対照と比較して５倍低い播種効率を有していた（図１５）。
【０２３０】
プレインキュベーションスケジュールを使用して、潜在的な放射線増感効果を、Ａ２７８０細胞ならびに非小細胞肺がん細胞株Ａ５４９、ＳＷ１５７３およびＳＷ１５７３／Ｇ−ならびにＨ４６０において調査した。概して、すべての細胞株は、ＲＸ−３１１７および放射線で処理した場合に放射線増感効果を示した。最も大きい放射線増感は、１．８のＤＭＦを持つＡ２７８０およびＡ５４９細胞株ならびに１．５のＤＭＦを持つＳＷ１５７３において観察された（図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｄ）。ゲムシタビン耐性細胞株ＳＷ１５７３／Ｇ−は１．４のＤＭＦを有していた（図１６Ｅ）が、Ｈ４６０細胞は乏しい放射線増感効果を示した。分割放射線はクリニックにおいて標準的な手順であるため、ＳＷ１５７３細胞における５日間の２Ｇｙ照射の分割線量も研究した。５回の２Ｇｙの分割放射線療法の前の１μＭのＲＸ−３１１７とのインキュベーションは、最も低いコロニー成長を示した（図１６Ｆ）。
【０２３１】
スフェロイドアッセイを使用する３次元モデルにおける照射と組み合わせたＲＸ−３１１７の放射線増感能力も調査した。スフィア形成アッセイは、ＳＷ１５７３およびＡ５４９スフェロイドにおけるスフィアに対するＲＸ−３１１７の放射線増感効果を明らかにした（図１７）。ＳＷ１５７３スフィアは、１μＭのＲＸ−３１１７単独および放射線療法（ＲＴ）単独（２Ｇｙ  ５日間）の両方によって高度に影響され、組合せにより効果は強化された。Ａ５４９細胞において、ＲＸ−３１１７処理または照射単独では体積増殖に対して小さな効果しか有さなかったのに対し、１μＭのＲＸ−３１１７は、２Ｇｙによる５日間照射の効果を強化した（図１７）。
アポトーシス開始
【０２３２】
アポトーシスを誘発するＲＸ−３１１７の可能性を、ＮＳＣＬＣ細胞株において研究した。アポトーシス細胞の量は、２４時間、４８時間および７２時間の曝露後に、アネキシンＶ染色（図１８）によって測定した。アネキシンＶ細胞膜染色は、Ａ５４９細胞およびＳＷ１５７３細胞について、アポトーシス細胞の段階的増大を示し、これは、Ａ５４９よりもＳＷ１５７３細胞により顕著であった。
ＤＮＡ損傷開始
【０２３３】
ＤＮＡ損傷は、細胞死の特質である。ＤＮＡ損傷は、γＨ２Ａ．Ｘ発現の評価によって研究した。０．１μＭから出発して１０μＭまでＲＸ−３１１７濃度を段階的に増大させたＡ２７８０細胞株において、ＲＸ−３１１７は、用量依存性様式でγＨ２Ａ．Ｘ  Ｓ１３９の誘発を示した（図１８Ａ）。ＳＷ１５７３細胞株において、二本鎖切断損傷マーカーは、４８時間の曝露後、０．３μＭのＲＸ−３１１７まで増大した（図１８Ｂ）。０．３μＭのＲＸ−３１１７および照射の組合せは、より顕著なγＨ２Ａ．Ｘ  Ｓ１３９タンパク質発現を示した（図１８Ｂ）。予期した通り、放射線は、γＨ２Ａ．Ｘの発現の即時の増大を引き起こし、ＲＸ−３１１７の存在下では、修復が遅延した。
細胞周期分布および細胞死に対するＲＸ−３１１７および放射線による処理の効果
【０２３４】
細胞周期分布における撹乱は、他のヌクレオシド類似体の放射線増感効果に関与することが報告されている（Shewach  DSおよびLawrence  TS:  Antimetabolite  radiosensitizers.  J  Clin  Oncol  ２５巻：４０４３〜５０頁、２００７年）ため、放射線と組み合わせたＲＸ−３１１７の効果は、ＮＳＣＬＣ細胞においてＦＡＣＳ分析を使用して調査した。１μＭのＲＸ−３１１７の比較的低い濃度では、Ｓ期の小さいがかろうじて有意な（ｐ＜０．０５）細胞株依存性増大が、４つの細胞株のうちの３つにおいて見られた。すべての細胞株において、Ｇ１期における増大が見られ（図１９Ａ）、Ｇ２／Ｍ期の強い減少が見られた。４Ｇｙの放射線は、Ｓ期において細胞の量の明らかな減少、ＳＷ１５７３細胞の両方においてはＧ２／Ｍ期における増大を引き起こし、Ａ５４９細胞においては効果がなかったが、Ｈ４６０細胞においては減少を引き起こした（図１９Ａ）。放射線およびＲＸ−３１１７の組合せは、両方のＳＷ１５７３変異体においてＳ期の細胞の数の増大につながったが、Ｈ４６０細胞においては減少した。Ａ５４９細胞において、細胞死滅（サブＧ１）は明らかに増大したが、他の細胞においては増大しなかった（図１９Ａ）。
【０２３５】
これらの現象の一部を理解するために、一部の必須細胞周期タンパク質の発現に対するＲＸ−３１１７および放射線の効果も調査した（図１９Ｂおよび図２０）。ＳＷ１５７３において、ＲＸ−３１１７および放射線両方の効果を、種々の細胞周期チェックポイントタンパク質において検査した（図２０）。放射線は、４８時間後、ｗｅｅ１、Ｃｈｋ２、ＣＤＣ２５ｃおよびｐ−ＣＤＣ２５ｃにおいて興味深い減少を引き起こした。両方のＳＷ１５７３細胞において、放射線は、Ｃｈｋ２のリン酸化の増大を引き起こした（図１９Ｂ）。ほぼすべての細胞株（ゲムシタビン耐性ＳＷ−１５７３／Ｇを除く）において、ＲＸ−３１１７は、Ｃｄｋ１のリン酸化を減少させ、同様に、放射線は、２４時間以内にｃｄｃ−２５Ｃ（ＳＷ１５７３／Ｇ−以外において）のリン酸化を増大させた（図１９Ｂ）。ＲＸ−３１１７と組み合わせると、この効果は維持された（図１９Ｂ）。
（実施例７）
ＲＸ−３１１７によるＤＮＡメチルトランスフェラーゼの阻害は低メチル化された標的の上方調節につながる
【０２３６】
ＲＸ−３１１７は、アザシチジン（アザ−ＣＲ）およびアザ−デオキシシチジン（アザ−ＣｄＲ）に似ている。ＲＸ−３１１７は、ヒト受動拡散型ヌクレオシド輸送体（ｈＥＮＴ）によって取り込まれ、ウリジン−シチジンキナーゼ２（ＵＣＫ２）によって活性化されて、ＲＸ−３１１７−ＭＰとなる（図２１）。ＲＸ−３１１７は、ヒト受動拡散型ヌクレオシド輸送体（ｈＥＮＴ）によって取り込まれ、ウリジン−シチジンキナーゼ２（ＵＣＫ２）によって活性化されて、ＲＸ−３１１７−ＭＰとなる。ＲＸ−３１１７は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）を下方調節する（Choi  W.J.ら、J.  Med.  Chem.  ５５巻（２０１２年）４５２１〜４５２５頁；Peters  G.J.ら、Invest  New  Drugs  ３１巻（２０１３年）１４４４〜１４５７頁）。ＤＮＭＴ１は、Ｓ期において新たに合成されたＤＮＡ中でメチル化を維持することを司り、ヘミメチル化されたＤＮＡ中のシトシン残基をメチル化する。ＲＸ−３１１７の脱アミノ化の速度は、ゲムシタビンよりもはるかに遅い。
【０２３７】
ＲＸ−３１１７は、第Ｉ相臨床研究において現在評価されている、経口的に生物学的に利用可能な新規シチジン類似体である。最大耐用量は、２，０００ｍｇ／日よりも高い。ＲＸ−３１１７によるＤＮＭＴ１の下方調節は、異なる組織学的背景を持つ種々の細胞株において示されてきた。現在、ＵＣＫ２およびＤＮＭＴ１の両方が、潜在的バイオマーカーとして評価されている。この実施例において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質および酵素活性、ならびに、ｐ１６ＩＮＫ４Ａ、メチルグアニンメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）およびプロトン共役葉酸輸送体（ＰＣＦＴ）を含む抑制標的遺伝子の再活性化における、ＤＮＭＴ１に対するＲＸ−３１１７の効果を決定した。ＰＣＦＴは、葉酸、メトトレキサート（ＭＴＸ）およびペメトレキセド（ＰＭＸ）をｐＨ５．５および７．４で輸送し、遺伝子は、高度にメチル化されている。加えて、プロトン共役葉酸輸送体（ＰＣＦＴ）を含む、遺伝子がメチル化によって調節されることが公知であるタンパク質の機能が研究される。Ａ５４９細胞株における、Ｅ−カドヘリン（接着分子）、ｐ１６ＩＮＫ（腫瘍抑制タンパク質）およびＯ−６メチルグアニンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）（ＤＮＡ修復遺伝子）の発現も研究した。
方法
【０２３８】
この研究では、下記の細胞株を使用した：（１）還元型葉酸担体（ＲＦＣ）の欠損を特徴とする、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞およびそのＭＴＸ耐性変異体ＣＥＭ−ＭＴＸ（Jansen  G.ら、JBC  ２７３巻（１９９８年）３０１８９〜３０１９８頁）。ＣＥＭ細胞中のＰＣＦＴ遺伝子は、高度にメチル化されている（Gonen  N.ら、BBRC  ３７６巻（２００８年）７８７〜９２頁）。；（２）１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えたＲＰＭＩ培地中で培養されたＣＥＭ細胞；ならびに（３）１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ培地中で培養されたＡ５４９およびＳＷ１５７３非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）ならびにＡ２７８０卵巣がん細胞株。
【０２３９】
ＤＮＭＴ１タンパク質発現は、２４または４８時間にわたってＲＸ−３１１７に曝露後、ウェスタンブロッティングによって測定した。ＤＮＭＴ１  ＲＮＡ発現は、ＲＸ−３１１７に２４および４８時間曝露後、リアルタイムＰＣＲによって測定した。ＤＮＭＴ酵素活性は、単離された核において、１μＭのＲＸ−３１１７または５μＭのアザ−ＣｄＲ曝露後、メチル化されたＤＮＡと結合するＣｐＧ結合（dinding）ドメインの能力を使用する、ＥｐｉＧｅｎｔｅｋによって提供されているＤＮＡメチルトランスフェラーゼアッセイキットを使用して、測定した。Ａ５４９細胞において、全体的なメチル化に対する５μＭのＲＸ−３１１７の効果を、５−メチル−シトシンに対する特異的抗体を用いて測定した。オデッセイ赤外線イメージャーを使用する適切な赤外色素を使用して、ウエスタンブロットにおけるバンドを可視化した。
【０２４０】
ＭＴＸ輸送は、ＣＥＭ野生型およびＣＥＭ−ＭＴＸ細胞株において、放射性標識されたＭＴＸを使用して測定した。ＣＥＭ細胞は、高いＲＦＣ活性を有する。ＣＥＭ−ＭＴＸは、ＲＦＣ媒介輸送において完全に欠損している。ＣＥＭ細胞は、高度にメチル化されたＰＣＦＴ輸送体および非常に低いＰＣＦＴ媒介輸送を有する（Gonen  N.ら、BBRC  ３７６巻（２００８年）７８７〜９２頁）。ｐＨ７．４のＭＴＸ輸送は、主にＲＦＣ媒介され、ＰＣＦＴによるのは２％未満である。葉酸を使用して、ＰＣＦＴ媒介輸送を阻害した。Ｌ−ロイコボリン（Ｌ−ＬＶ）を添加して、ＲＦＣ媒介輸送を完全に阻害した。ＣＥＭおよびＣＥＭ−ＭＴＸ細胞を、２９．６μＭのＲＸ−３１１７におよび０．１９μＭのアザ−ＣｄＲに陽性対照として曝露した。２４時間後、２μＭの［３’，５，’７−３Ｈ］−ＭＴＸを使用する３分間取り込みアッセイで、薬物へのＭＴＸ輸送を測定した。
【０２４１】
統計は、スチューデントのｔ検定を使用して行った。
結果
【０２４２】
Ａ５４９およびＳＷ１５７３等の中等度に感受性の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）細胞株において、５〜５０μＭのＲＸ−３１１７は、２４時間の曝露後には５〜２０％および４８時間後には９０％超、ＤＮＭＴ１タンパク質発現を下方調節した（図２５ＡおよびＢ）。ＤＮＭＴ１  ｍＲＮＡは、２４時間の曝露後には影響されなかったが、４８時間後には中等度に影響された（図２５ＣおよびＤ）。
【０２４３】
感受性卵巣がん細胞株Ａ２７８０において、タンパク質下方調節は、１μＭのＲＸ−３１１７で２４時間後に既に観察された（図２６ＡおよびＢ）。ＤＮＭＴ１活性は、１μＭのＲＸ−３１１７により３２％阻害され、これは、５μＭの参照化合物５−アザ−２’−デオキシシチジンによる阻害パーセントと同様であった（ＤＡＣ、３１％）。
【０２４４】
Ａ５４９細胞において、５μＭのＲＸ−３１１７は、ＤＮＡの全体的なメチル化（５−メチルシトシンに対する抗体によって検出された）を４８時間の曝露後に２５％減少させたのに対し、５μＭのＤＡＣは、９％のみ阻害した（図２７Ａ）。メチル化によって影響されることが公知であるいくつかの遺伝子について、タンパク質発現および活性を評価した。Ａ５４９細胞をＲＸ−３１１７に曝露し、５−メチル−シトシンに対する抗体を用いる免疫蛍光を使用して測定した（図２７Ｂ）。Ａ５４９およびＳＷ１５７３細胞において、５μＭのＲＸ−３１１７への２４時間の曝露は、細胞周期タンパク質ｐ１６ＩＮＫ４ＡのおよびＤＮＡ修復酵素ＭＧＭＴの発現を増大させた。図２７Ｃは、ＲＸ−３１１７およびアザ−ｄＣへの曝露後の、ＭＧＭＴ、Ｅ−カドヘリンおよびｐ１６ＩＮＫ４の発現を示す。
【０２４５】
ＰＣＦＴについては、高度にメチル化されたＰＣＦＴプロモーターを有するＣＣＲＦ−ＣＥＭ白血病細胞において、および還元型葉酸担体（ＲＦＣ）が欠損しているＣＥＭ−ＭＴＸ細胞において、ＲＸ−３１１７の機能活性を評価した。ＰＣＦＴは、葉酸ならびに葉酸類似体メトトレキサート（ＭＴＸ）およびペメトレキセドの取り込みを司る、特異的な葉酸輸送体である。２９．６μＭのＲＸ−３１１７またはＤＡＣのいずれかを陽性対照として用いるＣＥＭおよびＣＥＭ−ＭＴＸ細胞両方のインキュベーションは、ＭＴＸのＰＣＦＴ媒介輸送を著しく増大させた。これは、ＣＥＭ−ＭＴＸ細胞においてより顕著であり、ＣＥＭ細胞における４倍増大と比較すると、ＲＸ−３１１７およびＤＡＣの両方について１０〜１１倍増大であった。ＲＦＣ媒介ＭＴＸ輸送を阻害するために、葉酸（ＦＡ）を添加して、ＰＣＦＴおよびＬ−ＬＶを阻害した。アザ−ＣｄＲおよびアザ−ＣＲを陽性対照として含めた（図２８Ａ、ＢおよびＣ）。
結論
【０２４６】
結論として、ＲＸ−３１１７は、ＤＮＡメチル化を減少させることにより、ＤＮＭＴ１タンパク質およびＲＮＡ発現を下方調節する。ＲＸ−３１１７媒介低メチル化は、ＭＧＭＴ、Ｅ−カドヘリン、ＰＣＦＴおよび腫瘍抑制遺伝子ｐ１６ＩＮＫ４Ａの発現を増大させる。ＰＣＦＴは、ＭＴＸの輸送を媒介した。これらのデータは、ＲＸ−３１１７の新規機構としてＤＮＭＴ１阻害を明示する。ＲＸ−３１１７は、新たなエピジェネティック調節因子である。
（実施例８）
ＲＸ−３１１７の潜在的な予測バイオマーカーとしてのＵＣＫ２タンパク質発現の評価
背景
【０２４７】
新規の経口的に生物学的に利用可能なヌクレオシド類似体、ＲＸ−３１１７は、腫瘍組織において主に発現されると考えられるウリジンシチジンキナーゼ２（ＵＣＫ２）によって細胞内で活性化されるプロドラッグである。ＲＸ−３１１７は、進行性膵臓および膀胱がんを持つ患者における第Ｉｂ／ＩＩａ相多施設非盲検臨床研究において、現在評価されている。この研究では、マウス異種移植片モデルにおけるＵＣＫ２組織タンパク質発現とＲＸ−３１１７の有効性との間の関係、および正常組織と比べたヒトがん組織のパネルにおけるＵＣＫ２タンパク質発現も研究した。
方法
【０２４８】
腫瘍組織におけるＵＣＫ２タンパク質発現は、クローン２２−１ウサギモノクローナル抗体を使用するイムノブロッティングによって分析した。クローン２２−１を用いるＵＣＫ２の免疫組織化学（ＩＨＣ）のための検証された手順を、ヒトホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）がんおよび正常組織のパネルにおいて実施した。
結果
【０２４９】
ベータ−アクチンに対して正規化したＵＣＫ２のイムノブロッティングタンパク質レベルおよび対応する腫瘍増殖阻害（５００ｍｇ／ｋｇの経口ＲＸ−３１１７用量、ＴＩＷＫ）は、それぞれ、ＭｉａＰａＣａ２において５７および６７％、ＢｘＰＣ３において３０および−５％、Ｃｏｌｏ−２０５において１９９および９２％、Ｃａｋｉ−１において２１および９０％、Ａ５４９において２および３９％、ならびにＨ４６０において１４６および７９％であった。これらのデータは、ＵＣＫ２依存性様式の抗腫瘍有効性の傾向を示す。ＵＣＫ２のＩＨＣは、がん組織におけるＵＣＫ２の陽性染色が、２０／２０膀胱がん組織（１００％頻度）、１９／２０ＣＲＣ組織（９５％頻度）、１８／２０ＮＳＣＬＣ組織（９０％頻度）および１９／２０膵臓がん組織（９５％頻度）において観察されたことを示した。がん組織対正常組織におけるＵＣＫ２の平均Ｈスコアは、それぞれ、肺において１０４対９、膀胱において９７対２０、膵臓において６７対４１、および結腸において３９対２１であった。
結論
【０２５０】
現在のデータは、異種移植片モデルにおけるＵＣＫ２タンパク質発現レベルとＲＸ−３１１７の抗腫瘍活性の程度との間の相関関係の傾向を示した。該データは、ヒトがん組織における、それらの正常組織と比較して高いＵＣＫ２タンパク質発現レベルも裏付けている。これは、ＲＸ−３１１７活性が、腫瘍組織に特異的であり得、ヒトがん組織におけるＵＣＫ２発現の定量化が、今後の臨床研究においてＲＸ−３１１７に対するそれらの感受性で患者を選択するための予測バイオマーカーとして有用となり得ることを示唆している。
（実施例９）
ＲＸ−３１１７一水和物の合成
固定反応器内における段階１から３の連続反応によるＡＳＭ１１からのＩＮＴ１４の調製
【０２５１】
ＡＳＭ１１、ｔｅｒｔ−ブチル（（（３ａＲ，４Ｒ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）オキシ）ジフェニルシラン（３７．６５ｋｇ、１重量、１当量、５５ｍｏｌ）を、２−メチルテトラヒドロフラン（４．０体積、３．４重量）に溶解した。ＴＨＦ（テトラヒドロフラン、１．６１体積、１．４５重量、１．１当量）中のＴＢＡＦ（フッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム）１．０Ｍを、反応容器に一度に（穏やかな発熱添加制御）、１５から４５分かけて、１８から２３℃に維持しながら添加した。２−メチルテトラヒドロフラン（１．０体積、０．９重量）を容器にラインリンス（line  rinse）として、１８から２３℃に維持しながら投入し、得られた溶液を、１８から２３℃で、１Ｈ  ＮＭＲによって完了するまで６時間にわたって撹拌した。反応混合物に８％ｗ／ｗの炭酸水素ナトリウム（３．０体積）を投入し、１８から２３℃で５から１０分間にわたって撹拌し（注意：穏やかな発熱）、相を分離させ、下部の水性相（２×２．０体積）を除去した。第１の８％ｗ／ｗの炭酸水素ナトリウム（sodium  hydrogen  carbonated）抽出により、乳白色の水性層が得られ、静置時間の延長でエマルションは取り除かれなかった。調査は、エマルションが水性層に閉じ込められており、低い有機含有量を有することを示し、故に、プロセスを続けた。第１の抽出の全分離は、５時間２９分であった。第２の８％ｗ／ｗの炭酸水素ナトリウム抽出は、５２分しかかからず問題なく分離した。水性相を２−メチルテトラヒドロフラン（２．０体積、１．７重量）で抽出し、ライン（line）を２−メチルテトラヒドロフラン（２．０体積、１．７重量）ですすいだ。ＩＮＴ１２を含有する合わせた有機相を、４０から５０℃に加熱し、減圧下、４０から５０℃で約４体積に濃縮した。分析のために試料採取を実施し、水含有量が０．２％ｗ／ｗ以下となるまで、カール・フィッシャーによって分析した。プロセスは、９９．０％の全収率に相当する、１５．３％ｗ／ｗのＩＮＴ１２  ＡＳＭ１１−アルコールを含有する２−メチルテトラヒドロフラン中、１５８．８ｋｇ正味重量のＩＮＴ１２  ＡＳＭ１１−アルコールを生じた。９２．８３％面積純度のＩＮＴ１２  ＡＳＭ１１−アルコール（（３ａＳ，４Ｒ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−オール）を、ＨＰＬＣ分析によって決定した。
【０２５２】
ＩＮＴ１２溶液を容器に戻し、０から５℃に冷却し、トリエチルアミン（０．４１体積、０．３０重量、２．０当量）を投入した。ラインを２−メチルテトラヒドロフラン（１．０体積、０．９重量）ですすいだ後、溶液に、２−メチルテトラヒドロフラン（１．０体積、０．９重量）中で希釈した（ヘッダー容器内で慎重に混合する）塩化メタンスルホニル（０．１７体積、０．２５重量、１．５当量）を、０から５℃に維持しながら、少なくとも３０分かけて投入した（発熱）。追加の２−メチルテトラヒドロフラン（０．５体積、０．４重量）を、ラインリンスとして、０から５℃に維持しながら添加した。容器の内容物を、１時間後に１Ｈ  ＮＭＲによって反応が完了するまで、０から５℃で撹拌した。代表的な試料を１時間後に除去し、必要ならばその後およそ２時間毎に反応容器から確認することとし、分析して残りのＩＮＴ１２を確認した。１Ｈ  ＮＭＲ分析により１００％変換を確認した後、０から１０℃に維持しながら水（４．０体積）を投入し、反応混合物を１８から２３℃に加温し、１８から２３℃で５から１０分間にわたって撹拌した。容器内の上部の有機相を分離し、１８から２３℃に維持しながら、８％ｗ／ｗの炭酸水素ナトリウム溶液（４．０体積）を投入した。得られた二相溶液を、１８から２３℃で１から２時間にわたって撹拌し、分離された有機相に、２０％ｗ／ｗの塩化アンモニウム水溶液（２．０体積）および２−メチルテトラヒドロフラン（２．０体積、１．７重量）を投入した。必要に応じて、温度を１８から２３℃に調整した。２０％ｗ／ｗの塩化アンモニウム洗浄液は、おそらく前ステップからの残留炭酸水素ナトリウムとの反応によるものであろう、激しいガス発生をもたらした。１８から２３℃で５から１０分間にわたって撹拌した後、上部の有機相を分離し、１８から２３℃に調整した精製水（２．０体積）を投入した。ＩＮＴ１３を含有する分離された有機相を、減圧下、３５から４５℃で約２体積に濃縮した。分析のために試料採取を実施した。プロセスは、９４．９％の全収率に相当する、３４．９％ｗ／ｗのＩＮＴ１３  ＡＳＭ１１−メシレートを含有する２−メチルテトラヒドロフラン中、７８．４ｋｇ正味重量のＩＮＴ１３  ＡＳＭ１１−メシレートを生じた。６２．９１％面積純度のＩＮＴ１３  ＡＳＭ１１−メシレート（（３ａＲ，４Ｒ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イルメタンスルホネート）を、ＨＰＬＣ分析によって決定し、３２．２３％面積のＴＢＤＰＳ副生成物が存在した。
【０２５３】
引き続き、ＩＮＴ１３溶液にＤＭＳＯ（３．８体積、４．２重量）を投入し、４０から４５℃に加熱して、減圧下、４５℃以下で、それ以上溶媒（２−メチルテトラヒドロフラン）が蒸留されなくなるまで、有機相を濃縮した。濃縮を５時間２５分間にわたって続け、１Ｈ  ＮＭＲによるＩＰＣは、８．３％ｗ／ｗの２−メチルテトラヒドロフラン（methyltetrahdrofuran）含有量を示した。溶液を２７から３３℃に冷却した後、炭酸セシウム（１．２重量）およびシトシン（０．４１重量）を投入した。反応混合物を３３から３７℃に加熱し、ＨＰＬＣによって完了するまで撹拌した。Ｎ／Ｏ−アルキル化比率分析のための試料採取を、２４時間後およびその後適切な時点で、反応容器から実施した。３３時間４７分後、９９．５％変換のＩＰＣ結果で、反応は完了したとみなされた。Ｎ−対Ｏ−異性体の比は、９９．０３：０．９７であった。完了したら、混合物に、酢酸イソプロピル（２．０体積、１．７重量）および精製水（４．０体積、４．０重量）を５０℃以下に維持しながら（水添加は発熱性である）投入した。５から１５分間にわたって撹拌した後、二相混合物を１０分間にわたって静置させ、次いで、上部の有機相を分離した。水性相を２回再抽出して、４０から５０℃で５から１５分間にわたって撹拌し、再度１０分間にわたって静置させた後で分離することにより、すべての生成物を酢酸イソプロピル（２．０体積、１．７重量ずつ）とともに回収した。合わせた有機相を２５から３０℃に冷却し、１０％ｖ／ｖの酢酸（３．０体積）および２６％ｗ／ｗのブライン溶液（１．０体積）を２５から３０℃に維持しながら投入し、二相溶液を、２５から３０℃で３０から６０分間にわたって撹拌した。上部の有機相を、１０％ｖ／ｖの酢酸（３．０体積）および２６％ｗ／ｗのブライン溶液（１．０体積）で、２５から３０℃に維持しながら３回洗浄した。各洗浄ステップにおいて、上部の有機溶液を１Ｈ  ＮＭＲ分析によって試料採取した。有機相を、２５から３０℃の約３％ｗ／ｗのブライン溶液（３×２．０体積）で再度洗浄し、１Ｈ  ＮＭＲによる酢酸含有量のために試料採取した。ＩＮＴ１４を含有する有機相を３５から４５℃に加熱し、減圧下、３５から４５℃で約５体積に濃縮した。溶液に、酢酸イソプロピル（３．０体積、２．６重量）を投入し、減圧下、３５から４５℃で約５体積に濃縮した。溶液に、酢酸イソプロピル（５．０体積、４．４重量）を再度投入し、５７から６３℃に調整し、５７から６３℃で１．５から３時間にわたって撹拌し、ＨＰＬＣにより、結晶化／沈殿について確認した。スラリーを３５から４５℃に冷却し、減圧下、３５から４５℃で約５体積に濃縮した。スラリーを、１．０から２．０時間かけて１８から２３℃にさらに冷却し、１８から２３℃に維持しながら３０から９０分かけてｎ−ヘプタン（７．０体積、４．８重量）を投入した。１８から２３℃で１から２時間および０から５℃で１から２時間後、スラリーを２０μＭの布に通して濾過し、予混合したｎ−ヘプタン／酢酸イソプロピル（５：１、２×１．０体積）により０から５℃で洗浄した。ＩＮＴ１４を含有する生成物を、真空下、最大５５℃で乾燥させ、１Ｈ  ＮＭＲによってアッセイした。合格基準は、��．０％ｗ／ｗ以下の酢酸イソプロピルおよび２．０％ｗ／ｗ以下のｎ−ヘプタンであった。プロセスは、全８２％および６４％ｗ／ｗの収率に相当する、２４．２７ｋｇ正味重量のＩＮＴ１４、４−アミノ−１−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オン（４５ｍｏｌ、９３．２５％純度）を生じた。
固定反応器内における段階４から５の連続反応によるＩＮＴ１４からのＲＸ−３１１７一水和物の調製
【０２５４】
ＩＮＴ１４、４−アミノ−１−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−５−フルオロ−２，２−ジメチル−６−（（トリチルオキシ）メチル）−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オン（２４．２７ｋｇ、４５ｍｏｌ、１．０重量）、続いて、メタノール（７．５体積、５．９重量）を容器に投入し、反応混合物の温度を１８から２３℃に調整した。反応容器に、２Ｍ  ＨＣｌ（１．１体積、１．２当量）を、５０℃未満の温度に維持しながら添加した。スラリー混合物を４５から５５℃に加熱し、４５から５５℃（標的５０℃）で２から２．５時間にわたって撹拌した。容器容積に留意し、反応混合物を、減圧下、４５から５５℃に維持しながら、かつＭｅＯＨ（５．０体積、４．０重量）の添加によって一定体積を維持しながら、蒸留させた。混合物を試料採取し、ＨＰＬＣによって１．０％以下の面積のアセトニド中間体が存在するまで、４５から５０℃での蒸留によって一定体積を維持しながら、ＭｅＯＨ（２．５体積  ２．０重量）を投入し続けた。変換が完了したら、反応混合物を２５から３０℃に冷却させた。反応混合物を、減圧下、３５から４５℃に維持しながら５体積に濃縮した。反応混合物を２５から３０℃に冷却した。反応容器に、ＴＢＭＥ（メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル）（５．０体積、３．７重量）および水（５．０体積）を、２５から３０℃に維持しながら投入した。二相溶液を２５から３０℃で１０から２０分間にわたって撹拌し、下部の水性相を保持しながら、２５から３０℃で相を分離した。保持された下部の相を容器に移し、２５から３０℃に維持しながらＴＢＭＥ（５．０体積、３．７重量）を再投入した。二相溶液を２５から３０℃で１０から２０分間にわたって撹拌した後、下部の水性相を分離した。下部の水性相を容器に戻し、ラインを注射用水（０．５体積、０．５重量）ですすいだ。１Ｈ  ＮＭＲアッセイによってトリチルアルコールの除去を確認し、０．３％ｗ／ｗ／トリチルアルコール含有量であった。アッセイ結果が０．５％ｗ／ｗ以下のトリチルアルコールでなければ、水性相にＴＢＭＥ（５．０体積、３．７重量）を投入し、２５から３０℃で１０から２０分間にわたって撹拌し、次いで、分離を繰り返した。合わせた水溶液を１８から２３℃に調整し、前処理したアンバーセップ９００（ＯＨ形態）樹脂（バルク処理した材料の６分の５）を投入し、１５分間にわたって撹拌して、ｐＨを確認した。ｐＨが８．０未満であれば、さらなるアンバーセップ９００樹脂（ＯＨ形態）を添加し、溶液を３０から４５分間にわたって１８から２３℃で撹拌した。スラリーを濾過し、注射用水（２×４．０体積）で１回の洗浄につき１５から３０分間にわたって洗浄した。フィルター上の樹脂濾過ケーキを、注射用水（３×４．０体積）で、各洗浄においてＨＰＬＣアッセイにより１．０％以下の結果が得られるまで、１回の洗浄につき１５から３０分間にわたってさらに洗浄した。母液および１．０％以上を含有して得られた任意の洗浄液を、１μｍのフィルターを介して浄化した。溶液を４０から４５℃に加熱し、減圧下、４０から４５℃で１．５体積に濃縮した。水溶液を２から３時間かけて１８から２３℃に冷却した後、混合物を６０分間にわたって熟成させ、１８から２３℃に維持しながら、ほぼ一定の速度で、１．５から２時間かけてアセトニトリル（９．５体積）を投入した。スラリーを１８から２３℃で２時間にわたって熟成させ、０から５℃で９０分間にわたって冷却した。固体を２０μｍの布に通して濾過し、ＭｅＣＮ／水（５：１、１．５体積）で洗浄し、空気雰囲気下、ＧＣによりＭｅＣＮ含有量が４００ｐｐｍ未満になるまで乾燥させた。プロセスは、全６６％および３４％ｗ／ｗの収率に相当する、８．２０ｋｇ（９９．８３％純度）正味重量のＲＸ−３１１７一水和物、４−アミノ−１−（（１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−２−フルオロ−４，５−ジヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）シクロペンタ−２−エン−１−イル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オン１Ｈ２Ｏ（２９．８ｍｏｌ、９９．８３％純度）を生じた。
【０２５５】
図２９は、実施例９において記述されているプロセスを使用して作製されたＲＸ−３１１７を示す１Ｈ  ＮＭＲである。1H-  NMR  (400  MHz,  DMSOd6),  δ  7.40ppm,  (d,  J=7.3Hz,  1H)  CHシトシン,  δ  7.20ppm,  (広幅d,  J=9.1Hz,  2H)  NH2,  δ  5.74ppm,  (d,  J-7.3Hz,  1H)  CHシトシン,  δ  5.30ppm,  広幅s,  1H,  CH,  δ  5.15ppm,  (d,  J=7.1Hz,  1H)  (OH),  δ  5.00ppm,  (d,  J-6.1Hz,  1H)  (OH),  δ  4.80ppm,  (q,  J=5.3Hz,  1H)(OH),  δ  4.48ppm,  (q,  J=5.3Hz,  1H)  CH,  δ  4.17ppm,  (dd,  J=9.1Hz,  3.8Hz,  1H)  CH,  δ  4.13ppm,  (dt,  J=6.1Hz,  5.8Hz,  1H)  CH,  δ  3.91ppm,  (広幅d,  J=12.9Hz,  2.8Hz,  1H)  CH.
【０２５６】
図３０は、実施例９において記述されているプロセスを使用して作製されたＲＸ−３１１７の１３Ｃ  ＮＭＲである。
【０２５７】
図３１は、実施例９において記述されているプロセスを使用して作製されたＲＸ−３１１７の１９Ｆ  ＮＭＲである。
【０２５８】
図３２は、実施例９において記述されているプロセスを使用して作製されたＲＸ−３１１７の質量スペクトルである。質量スペクトルは、ＲＸ−３１１７のプロトン化種（Ｍ＋Ｈ）ならびにｍ／ｚ＝２８０．０のＲＸ−３１１７プラスナトリウム付加物（Ｍ＋ナトリウム）（この分析法中に見られた普通種）を示すＥＳ＋フィルターを使用して行った。ナトリウムは、製造プロセスではなく分析法からのものである。
【０２５９】
図３３は、実施例９において記述されているプロセスを使用して作製されたＲＸ−３１１７の質量スペクトルである。質量スペクトルは、分析プロセス中にＲＸ−３１１７のＭ−Ｈ種を示すＥＳ−フィルターを使用して行った。ＥＳ−およびＥＳ＋フィルター法は、一緒に、ＲＸ−３１１７の完全な質量スペクトルの根拠を提供する。
【０２６０】
上記の大規模合成プロセスに従って調製された材料の結晶特性を検証するために、実験室規模の高純度プロセスによって調製された結晶との微視的比較、およびＸ線粉末回折パターンの比較を行った。図３４は、実施例９のプロセス（上段）に従って作製され、実験室規模のプロセス（下段）を使用して平面偏光（左列）および交差偏光（右列）下で調製された、ＲＸ−３１１７の微視的比較である。図３５は、実験室規模を使用して作製されたＲＸ−３１１７（上のスペクトル）と実施例９において記述されているプロセスを使用して作製されたＲＸ−３１１７（下のスペクトル）とを比較するＸ線粉末回折データである。以上のように、結晶構造に有意差はない。
【０２６１】
開示されている主題の具体的な実施形態は、任意の組合せの上記および下記に示す実施形態の１つまたは複数を対象とし得ることが、当業者には明らかであろう。
【０２６２】
本発明を例証および例としてある程度詳細に開示してきたが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、変更が為され得、同等物で代用し得ることが、当業者には明らかである。したがって、記述および例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【０２６３】
本明細書において開示されているすべての参考文献、刊行物、特許および特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６ＡＢ】
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【図１６ＣＤ】
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【図１６ＥＦ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【国際調査報告】
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