(57)【要約】  血管再生の方法は、内皮細胞を肺足場に送達すること、血管周囲細胞を肺足場に送達すること、および多段階培養プログラムを足場に提供することを含む。多段階培養プログラムは、例えば、４０〜１００ｎｇ／ｍｌの血管新生促進因子を有する血管新生培地を送達することを含む第１の段階、および例えば、０．５〜２％の血清および１〜２０ｎｇ／ｍｌの血管新生因子を有する安定化培地を送達することを含む第２の段階を含む。
2018526016.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管再生の方法であって、
（ａ）内皮細胞を肺足場に送達すること；
（ｂ）血管周囲細胞を前記肺足場に送達すること；
（ｃ）多段階培養プログラムを前記足場に提供すること
を含み、前記多段階培養プログラムは、
（１）４０〜１００ｎｇ／ｍｌの血管新生促進因子を有する血管新生培地を送達することを含む第１の段階、ならびに
（２）０．５〜２％の血清および１〜２０ｎｇ／ｍｌの血管新生因子を有する安定化培地を送達することを含む第２の段階
を含む方法。
【請求項２】
前記血管新生促進因子が、組換えヒトＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＡＮＧ１、ＥＧＦおよびＰＤＧＦの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記安定化培地が、ホルスコリンまたはヒドロコルチゾンの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記肺足場を包囲するバイオリアクター中で前記肺足場を維持することをさらに含み、前記バイオリアクターは、気管経路、動脈経路、および静脈経路を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記肺足場が、気道および血管系を含み、
（ａ）前記気道を前記気管経路に接続すること；
（ｂ）前記肺足場を前記動脈経路および前記静脈経路に接続すること；ならびに
（ｃ）前記肺足場に前記動脈経路および前記静脈経路を介して細胞を播種すること
をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
血管再生の方法であって、
（ａ）ＨＵＶＥＣおよび血管周囲支持ｈＭＳＣを肺足場に送達すること；
（ｂ）第１の段階の間に血管新生培地を前記肺足場に送達すること；ならびに
（ｃ）第２の段階の間に安定化培地を前記肺足場に送達すること
を含む方法。
【請求項７】
前記肺足場を包囲するバイオリアクター中で前記肺足場を維持することをさらに含み、前記バイオリアクターは、気管経路、動脈経路、および静脈経路を含み、前記ＨＵＶＥＣおよび血管周囲支持ｈＭＳＣを前記動脈経路および前記静脈経路に通して送達する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）から内皮細胞および血管周囲細胞を分化させる方法であって、
（ａ）前記ｈｉＰＳＣを少なくとも１つのＧＳＫ３阻害剤の存在下で培養すること；
（ｂ）前記ｈｉＰＳＣを完全分化培地の存在下で培養すること；
（ｃ）前記ｈｉＰＳＣをＴＧＦ−β１阻害剤が補給された前記分化培地により培養すること；および
（ｄ）ｈｉＰＳＣ由来血管周囲前駆細胞（ｈｉＰＳＣ−ＰＰＣ）とｈｉＰＳＣ由来内皮細胞（ｈｉＰＳＣ−ＥＣ）とを分離すること
を含む方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つのＧＳＫ３阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのＴＧＦ−β１阻害剤が、ＳＢ４３１５４２である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
４％以下のＯ２の低酸素培養条件を維持することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
十分な血管および培養の第１の段階の終了を示すＣＤ３１およびＶＥ−カドヘリン発現により定義される内皮被覆の増加のプラトーを計測することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
血管再生のための気道臓器バイオリアクター機器であって、
肺チャンバ；
前記肺チャンバに移動可能に連結され、肺足場への内皮細胞の送達および前記肺足場への血管周囲細胞の送達のために構成された少なくとも１つの進入経路；ならびに
ポンプに連結された制御モジュールを含み、前記制御モジュールは、多段階培養プログラムの施与を前記肺足場にもたらすように構成されており、前記多段階培養プログラムは、
第１の段階において、４０〜１００ｎｇ／ｍｌの血管新生促進因子を有する血管新生培地を送達すること、および
第２の段階において、０．５〜２％の血清および１〜２０ｎｇ／ｍｌの血管新生因子を有する安定化培地を送達すること
を含む機器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、機能的肺血管床の再生に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺移植は、末期肺疾患を罹患する患者に有効な治療選択である。しかしながら、ドナー数は増加する需要に一致しない一方、慢性免疫抑制および拒絶の効果が長期転帰を制限する。肺移植のための典型的な待機時間は２年以上であり得、待機リスト上の者について３０％の致死率をもたらす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本開示は、少なくとも部分的に、細胞を送達し、無細胞肺足場の血管コンパートメントに内皮および血管周囲細胞を再増殖させ、多段階培養プログラムを使用して肺血管床を成熟させることにより機能的肺血管床を再生し得るデバイス（例えば、バイオリアクター）および方法の開発に基づく。実施態様としては、以下の特徴部の１つ以上を挙げることができる。
【０００４】
第１の態様において、本明細書において、内皮細胞を肺足場に送達すること；血管周囲細胞を肺足場に送達すること；および多段階培養プログラムを足場に提供することを含み、多段階培養プログラムは、４０〜１００ｎｇ／ｍｌの血管新生促進因子を有する血管新生培地を送達することを含む第１の段階、ならびに０．５〜２％の血清および１〜２０ｎｇ／ｍｌの血管新生因子を有する安定化培地を送達することを含む第２の段階を含む血管再生の方法が提供される。
【０００５】
一部の実施形態において、血管新生促進因子は、組換えヒトＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＡＮＧ１、ＥＧＦおよびＰＤＧＦの少なくとも１つ以上、例えば、２、３、４、または５つ全てを含む。
【０００６】
一部の実施形態において、安定化培地は、ホルスコリンおよび／またはヒドロコルチゾンの少なくとも１つを含む。
【０００７】
一部の実施形態において、方法は、肺足場を包囲するバイオリアクター中で肺足場を維持することを含み、バイオリアクターは、気管経路、動脈経路、および静脈経路を含む。一部の実施形態において、肺足場は、気道および血管系を含み、方法は、気道を気管経路に接続すること；肺足場を動脈経路および静脈経路に接続すること；ならびに肺足場に動脈経路および静脈経路を介して細胞を播種することを含む。
【０００８】
本明細書において、ＨＵＶＥＣおよび血管周囲支持ｈＭＳＣを肺足場に送達すること；第１の段階の間に血管新生培地を肺足場に送達すること；および第２の段階の間に安定化培地を肺足場に送達することを含み得る血管再生の方法も提供される。
【０００９】
一部の実施形態において、方法は、肺足場を包囲するバイオリアクター中で肺足場を維持することを含み、バイオリアクターは、気管経路、動脈経路、および静脈経路を含み、ＨＵＶＥＣおよび血管周囲支持ｈＭＳＣを動脈経路および静脈経路に通して送達する。
【００１０】
さらに、本明細書において、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）から内皮および血管周囲細胞を分化させる方法が提供される。方法は、ｈｉＰＳＣを少なくとも１つのＧＳＫ３阻害剤の存在下で培養すること；ｈｉＰＳＣを完全分化培地の存在下で培養すること；ｈｉＰＳＣをＴＧＦ−β１阻害剤が補給された分化培地により培養すること；およびｈｉＰＳＣ由来血管周囲前駆細胞（ｈｉＰＳＣ−ＰＰＣ）とｈｉＰＳＣ由来内皮細胞（ｈｉＰＳＣ−ＥＣ）とを分離することを含む。
【００１１】
一部の実施形態において、少なくとも１つのＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である。一部の実施形態において、少なくとも１つのＴＧＦ−β１阻害剤は、ＳＢ４３１５４２である。
【００１２】
一部の実施形態において、方法は、４％以下のＯ２の低酸素培養条件を維持することを含む。
【００１３】
一部の実施形態において、方法は、十分な血管および培養の第１の段階の終了を示すＣＤ３１およびＶＥ−カドヘリン発現により定義される内皮被覆の増加のプラトーを計測することを含む。
【００１４】
種々の実施形態は、本明細書に記載の方法を実施するための機器およびシステムを提供する。一部の実施態様において、機器および／またはシステムは、記載の方法を実施するためのコンピュータ制御を含む制御システムを含み得る。制御システムは、１つ以上のプロセッサに連結しており、保存される指示を有する非一時的コンピュータ可読保存媒体を含み得、１つ以上のプロセッサにより実行された場合、１つ以上のプロセッサに、上記実施態様または本明細書に記載の実施形態のいずれか１つに従って血管再生のための動作を実施させる。
【００１５】
本明細書において使用される「機能的」肺組織は、空気から血流中への酸素の輸送、血流から空気中への二酸化炭素の放出、吸入空気の加湿、肺胞中の表面張力を減少させるためのサーファクタントの産生、ならびに吸入された粒子状物質を末梢気道から近位気道に除去するための粘液の産生および輸送を可能とすることを含む正常健康肺の機能のほとんどまたは全てを実行する。一部の実施形態において、「機能的」肺組織は、少なくとも、空気から血流中への酸素の輸送および血流から空気中への二酸化炭素の放出を可能とする。
【００１６】
本明細書において使用される用語「脱細胞化」および「無細胞」は、標準的な組織学的染色手順を使用する組織学的切片中の検出可能な細胞内物質、内皮細胞、上皮細胞、および核の完全またはほぼ完全な不存在として使用または定義される。好ましくは、必須ではないが、脱細胞化臓器または組織から残留細胞残屑も除去されている。
【００１７】
一部の実施態様において、本明細書に記載の組成物、装置、および方法は、天然細胞外マトリックス足場の血管再生を改善するための特定の利点を有し得る。例えば、ある実施態様は、細胞、例えば、内皮細胞または前駆細胞を、肺動脈および肺静脈の両方に通して送達し、慣用の動脈内皮送達方法から得られるものよりも２倍の内皮被覆をもたらし得る一方、肺全体にわたる均一な内皮被覆も提供する方法を提供し得る。他の例において、ある実施態様は、血管新生培地とそれに続く安定化培地を含み得る２段階臓器培養プログラムを提供し得る。この多段階組合せは、最初に効率的な内皮リモデリングを促進し、次いで血管安定化および障壁機能の機能性を促進するのに役立ち得る。２段階培養プログラムは、患者由来細胞源と組み合わせて臨床関連細胞源を使用して機能的肺血管系を生成することができる。
【００１８】
特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が以下に記載される。本明細書において挙げられる全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献は、参照により全体として組み込まれる。矛盾する場合、本明細書が、定義を含めて優先される。さらに、材料、方法および実施例は説明のためのものにすぎず、限定するものではない。
【００１９】
本発明の他の特徴部および利点は、以下の詳細な説明および以下の特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図３に示される灌流系および経肺圧制御モジュールを有する陰圧湿式換気系を含む例示的な肺バイオリアクターの模式図である。
【図２Ａ】図１に表される例示的な陽圧マニホールドの模式図である。
【図２Ｂ】図１に表される例示的な陽圧マニホールドの模式図である。
【図３】臓器培養チャンバに接続された肺圧制御モジュールの模式図である。
【図４】肺動脈（ＰＡ）に通す無細胞ラット肺のマイクロスフェア灌流の間に肺静脈（ＰＶ）、気管（Ｔｒ）および肺末梢（末梢）から回収された流体体積（３つのコンパートメントから回収された総容量に正規化）を示すグラフである。
【図５Ａ】直接カニューレ挿入された肺動脈（ＰＡ）および気管（Ｔｒ）、左心耳（ＬＡＡ）に通してカニューレ挿入されたＰＶ、ならびに結紮された大動脈（ＡＯ）を示す画像である。このカニューレ挿入方針は、ＰＡおよびＰＶの両方に通す灌流、ならびに気管（Ｔｒ）およびＰＶからの流体回収を可能とした。
【図５Ｂ】ＰＡに通して緑色蛍光マイクロスフェア（０．２μｍ）を灌流させた無細胞ラット肺の代表的なホールマウント画像を示す画像である。
【図５Ｃ】インプットのマイクロスフェア濃度に正規化された、肺動脈（ＰＶ）に通す灌流の間にＰＶ、気管（Ｔｒ）および肺末梢（末梢）から回収された流体中の０．２μｍおよび０．０２μｍのマイクロスフェアの濃度を示すグラフである。
【図５Ｄ】無細胞肺のＰＡおよびＰＶに通すマイクロスフェア灌流を示す図であり、灌流の間の血管進路に沿った流体漏出および静水圧の段階的低減を強調する。
【図５Ｅ】ＰＡに通す緑色蛍光マイクロスフェア（０．２μｍ）およびＰＶに通す赤色蛍光マイクロスフェア（０．２μｍ）を灌流させた無細胞ラット肺の代表的なホールマウント画像である。
【図５Ｆ】ＰＡ（ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ）に通し、またはＰＡおよびＰＶ（ｖｉ、ｖ、ｖｉ）に通すヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）送達１日後における再生肺の内皮被覆の代表的な画像である。上段パネルは、ＣＤ３１（赤色、内皮細胞）およびラミニン（緑色、肺マトリックス）の蛍光画像を示した（ｉ、ｖｉ）。中段パネルは、ラミニン（上段パネルのものから）のその被覆定量についての処理画像を示した（ｉｉ、ｖ）。下段パネルは、ＣＤ３１（上段パネルのものから）のその被覆定量についての処理画像を示した（ｉｉｉ、ｖｉ）。
【図５Ｇ】細胞送達１日後におけるラミニン（マトリックス）被覆に正規化されたＣＤ３１（内皮）被覆の定量を示すグラフである。
【図５Ｈ】ＰＡおよびＰＶに通すＨＵＶＥＣ送達１日後における無細胞ラット肺葉の内皮被覆を示す代表的な結合画像である（ＣＤ３１、赤色；ラミニン、緑色）。
【図６】蛍光標識ＨＵＶＥＣが播種された無細胞ラット肺のホールマウント画像である。
【図７Ａ】２段階培養方針を示す図である。
【図７Ｂ】血管新生または安定化培地中で２日間培養した場合のＨＵＶＥＣ  ｔｒａｎｓｗｅｌｌ透過性アッセイにおける５００ｋＤａデキストランの相対漏出を示すグラフである。漏出値を、ＨＵＶＥＣを用いないｔｒａｎｓｗｅｌｌのもの（「細胞なし」対照）に正規化した。
【図７Ｃ】細胞送達１日後におけるＨＵＶＥＣ再生肺の被覆と比較した、ＥＧＭ−２中での１４日間の培養後のＨＵＶＥＣ再生肺および２段階培養（８日間）後のＨＵＶＥＣ−ｈＭＳＣ再生肺の内皮被覆の定量を示すグラフである。被覆は、ＣＤ３１の被覆をラミニンのものに正規化することにより定量した。
【図７Ｄ】２段階培養後のＨＵＶＥＣ−ｈＭＳＣ再生肺葉の内皮被覆を示す代表的な結合画像である（ＣＤ３１、赤色；ラミニン、緑色；ＤＡＰＩ、青色）。
【図７Ｅ】２段階培養の終了時におけるＨＵＶＥＣ−ｈＭＳＣ再生肺を特徴付けする画像である。（ｉ）相互接続血管ネットワーク構造が内皮細胞（ＣＤ３１、赤色）により形成され、個々のｈＭＳＣ（ＳＭ２２α、緑色）はネットワークに接着している。（ｉｉ）管腔表面上のＰＯＤＸＬ（緑色）および基底表面上のＣｏｌＩＶ（赤色）の局在化により示される頂側膜−基底膜極性の確立。（ｉｉｉ）細胞境界関連ＺＯ−１（赤色）の濃縮により示される内皮細胞間のタイトジャンクションの確立。
【図７Ｆ】ＩＶＰ−ＢＡＬアッセイの手順を示す図である。
【図７Ｇ】新鮮単離死体肺（死体）、６時間の低温虚血後の肺（６時間低温虚血）および無細胞肺（無細胞）に対するインビトロ灌流およびＢＡＬアッセイ後の血管内（ＰＶ流体）および血管外（肺末梢およびＢＡＬを含む気管からの流体）コンパートメント中のデキストラン量の定量を示すグラフである。
【図７Ｈ】培養の３、６、および８日目におけるＨＵＶＥＣ−ｈＭＳＣ再生肺に対するインビトロ灌流およびＢＡＬアッセイ後の血管内および血管外コンパートメント中のデキストラン量の定量を示すグラフである。
【図７Ｉ】ＨＵＶＥＣ−ｈＭＳＣ再生肺の毎日のＰＡ圧計測を示すグラフである（１日目の圧力値に正規化）。
【図７Ｊ】新鮮単離死体肺（死体）、６時間の低温虚血後の肺（６時間低温虚血）、無細胞肺（無細胞）および２段階培養の終了時におけるＨＵＶＥＣ−ｈＭＳＣ再生肺（再生）からの副肺の湿／乾比を示すグラフである。
【図７Ｋ】ＨＵＶＥＣ−ｈＭＳＣ再生肺の同所移植を示す画像である。代表的な写真は、再灌流前（左パネル）および後（右パネル）のＰＡおよびＰＶの吻合後の再生左肺グラフトを示した。
【図７Ｌ】再生血管ネットワーク（ＣＤ３１、紫色）に通して灌流させた０．２μｍマイクロスフェア（ＦＭＡ、緑色）を示す、移植３日後の再生左肺グラフトの蛍光マイクロ血管造影（ＦＭＡ）を示す画像である。
【図８】内皮細胞の血管コンパートメント特異的送達を示す画像である。動脈（Ａ）および静脈（Ｖ）の十分な再内皮化、ならびに気管支（Ｂ）中の内皮細胞の不存在を実証する、ＰＡおよびＰＶに通したＨＵＶＥＣ送達１日後における無細胞ラット肺のＣＤ３１免疫組織化学染色の代表的な画像（ＣＤ３１、褐色）。Ａｉ、肺胞；ＡＤ、肺胞管。
【図９Ａ】ｈｉＰＳＣからの内皮および血管周囲細胞分化を示すグラフである。（ａ）ｈｉＰＳＣからの内皮および血管周囲細胞分化の一般的手順を示す図。
【図９Ｂ】分化の終了時におけるＣＤ３１およびＣＤ１４０ｂ発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示すグラフである。２つの主要な細胞集団を観察することができる：ＣＤ３１＋ＣＤ１４０ｂ−内皮細胞（ｈｉＰＳＣ−ＥＣ、青色）およびＣＤ３１−ＣＤ１４０ｂ＋血管周囲前駆細胞（ｈｉＰＳＣ−ＰＰＣ、緑色）。
【図９Ｃ】分化全体からのＣＤ３１＋ＣＤ１４０ｂ−ｈｉＰＳＣ−ＥＣおよびＣＤ３１−ＣＤ１４０ｂ＋ｈｉＰＳＣ−ＰＰＣの定量を示すグラフである。エラーバーは、実験値の標準偏差を表した。
【図９Ｄ】内皮マーカーＣＤ３１（ｉ、赤色）およびＶＥ−カドヘリン（ｉｉ、赤色）の均一発現、ならびに血管周囲マーカーＣＤ１４０ｂ（ｉｉｉ、赤色）および平滑筋マーカーα−ＳＭＡ（ｉｖ、赤色）発現の不存在を示すｈｉＰＳＣ−ＥＣを特徴付けする一連の画像である。
【図９Ｅ】ＥＧＭ−ＦＢＳ−ＳＢ培地を使用するインビトロ拡張間のｈｉＰＳＣ−ＥＣの成長曲線を示すグラフである。
【図９Ｆ】細胞の半数超が周皮細胞マーカーＮＧ２を発現したこと（ｉ）、ＣＤ１４０ｂ（ｉｉ、赤色）の均一発現、および内皮マーカーＣＤ３１（ｉｉｉ、赤色）の不存在発現を示すｈｉＰＳＣ−ＰＰＣを特徴付けするグラフおよび画像系列である。
【図９Ｇ】ｈｉＰＳＣ−ＰＰＣの平滑筋分化を示す一連の画像である。ＥＧＭ−ＦＢＳ−ＳＢ培地中で培養した場合、ｈｉＰＳＣ−ＰＰＣは、低レベルの平滑筋マーカーα−ＳＭＡ（ｉ、緑色）およびカルポニン（ｉｉ、緑色）を発現した。６日後、ＳｍＧｍ−２、α−ＳＭＡ（ｉｉｉ、緑色）およびカルポニン（ｉｖ、緑色）発現における分化は高度に上昇した。
【図９Ｈ】ｈｉＰＳＣからのｈｉＰＳＣ−ＥＣおよびｈｉＰＳＣ−ＰＰＣ分化ならびにｈｉＰＳＣ−ＰＰＣの平滑筋様細胞へのさらなる分化をまとめた図である。
【図１０Ａ−Ｃ】内皮マーカー（ＶＥ−カドヘリンおよびＫＤＲ）の均一発現および造血マーカーＣＤ４５発現の不存在を実証する、精製ｈｉＰＳＣ−ＥＣ中のＶＥ−カドヘリン（ａ）、ＫＤＲ（ｂ）およびＣＤ４５（ｃ）のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。
【図１１Ａ】２段階培養後のｈｉＰＳＣ再生肺葉の代表的な結合画像である（ＣＤ３１、紫色；ｍＣｈｅｒｒｙ、黄色；ＤＡＰＩ、青色）。
【図１１Ｂ】ｈｉＰＳＣ−ＥＣ（ＣＤ３１、紫色）により形成される内皮ネットワークに接着する個々のｈｉＰＳＣ−ＰＰＣ（ＣＤ１４０ｂ、緑色）の存在を示す画像である。
【図１１Ｃ】管腔表面上のＰＯＤＸＬ（緑色）および基底表面上のＣｏｌＩＶ（赤色）の局在化により示される頂側膜−基底膜極性の確立を示す画像である。
【図１１Ｄ】培養の２、４、および６日目におけるｈｉＰＳＣ再生肺に対するインビトロ灌流およびＢＡＬアッセイ後の血管および非血管コンパートメント中のデキストラン量の定量を示すグラフである。
【図１１Ｅ】ｈｉＰＳＣ再生肺の毎日のＰＡ圧計測を示すグラフである（１日目の圧力値に正規化）。
【図１１Ｆ】２段階培養の終了時におけるｈｉＰＳＣ再生肺（ｉＰＳＣ−再生）からの副肺の湿／乾比を示すグラフである。
【図１１Ｇ】再生血管ネットワーク（ＣＤ３１、紫色）に通して灌流させた０．２μｍマイクロスフェア（ＦＭＡ、緑色）を示す、移植３日後のｈｉＰＳＣ再生左肺グラフトの蛍光マイクロ血管造影（ＦＭＡ）を示す画像である。
【図１２Ａ】ＰＡおよびＰＶの両方に通す内皮送達および灌流を可能とする無細胞ヒト肺葉における血管再生のためのバイオリアクター設定の画像である。
【図１２Ｂ】培養の間（ｉ）、レザズリン灌流直後（ｉｉ）、その間（ｉｉｉ）およびその終了時（ｉｖ）の再生ヒト肺葉の一連の代表的な画像である。点線は、レザズリン代謝により強調される再細胞化区域を示した（ｉｖ）。
【図１２Ｃ】２段階培養後のｈｉＰＳＣ再生ヒト肺葉の代表的な結合画像である（ＣＤ３１、紫色；マトリックス自己蛍光、緑色；ＤＡＰＩ、青色）。
【図１２Ｄ】ｈｉＰＳＣ−ＥＣ（ＣＤ３１、紫色）により形成される内皮ネットワークに接着する個々のｈｉＰＳＣ−ＰＰＣ（ｍＣｈｅｒｒｙ、黄色、左パネル；ＣＤ１４０ｂ、緑色、右パネル）の存在を示す画像である。
【図１２Ｅ】再生血管ネットワーク（ＣＤ３１、紫色）に通して灌流させた０．２μｍマイクロスフェア（ＦＭＡ、緑色）を示す、ｈｉＰＳＣ再生ヒト肺葉の蛍光マイクロ血管造影（ＦＭＡ）を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本文献は、肺血管床の再生に関与する方法および材料に関する。細胞を送達し、無細胞肺足場の血管コンパートメントに内皮および血管周囲細胞を再増殖させ、多段階培養プログラムを使用して肺血管床を成熟させることにより機能的肺血管床を再生し得るデバイス（例えば、バイオリアクター）および方法の開発が、本明細書に記載される。
【００２２】
生体人工肺組織の肺血管床（例えば、全臓器またはその一部）は、本明細書において提供される方法に従って生成または再生することができる。一部の実施形態において、方法は、本明細書において提供される生体人工肺組織をそれが必要とされる対象（例えば、ヒト患者）に移植することを含む。一部の実施形態において、生体人工肺組織は、疾患または損傷組織の部位に移植される。例えば、生体人工肺組織は、非機能的または機能不十分の肺に代えて（またはそれとともに）対象の胸腔中に移植することができ；肺移植を実施する方法は当技術分野において公知であり、例えば、Ｂｏａｓｑｕｅｖｉｓｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ａｎｄ  Ｌｕｎｇ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ６：６６−７８（２００９）；Ｃａｍａｒｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｍａｎｅｕｖｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ  ２００８；３４：１２０６−１２０９（２００８）；Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｒａｂｂｉｔｓ，”Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ．１１（１）：７−１１（２００５）；Ｖｅｎｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｖｏｌｖｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ３７（６）：２６８２−２６８３（２００５）；Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｅ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ３２（７）：１５２１−１５２２（２０００）；Ｇａｉｓｓｅｒｔ  ａｎｄ  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  ａｎｄ  Ｂｉｌａｔｅｒａｌ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｏｒｇａｎｓ，２ｄ  ｅｄ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９９６）参照。
【００２３】
方法は、対象の肺を部分的または完全に摘出するための外科手術の間に、および／または肺切除の間に本明細書において提供される生体人工肺またはその一部を移植することを含み得る。方法は、生存ドナーまたは死体から肺またはその一部を回収することおよび本明細書に記載のバイオリアクター中で肺を保存または再生することも含み得る。一部の場合、本明細書において提供される方法を使用して対象、例えば、ヒトまたは動物対象における肺組織および機能を置き換え、または補給することができる。
【００２４】
脱細胞化組織／臓器マトリックス
脱細胞化肺組織マトリックスを調製するための種々の方法および材料が存在する。任意の適切な材料を使用してそのようなマトリックスを調製することができる。ある実施形態において、組織マトリックスは、脱細胞化肺組織から発生させた無細胞組織足場であり得る。例えば、組織、例えば、ヒト肺、例えば、ヒト肺またはその一部の１つまたはペア、例えば、ヒト、ブタ、ウシ、霊長類、または鳥類死体肺またはその一部を、組織から天然細胞を除去する一方、組織または組織部分の形態統合性および血管系を維持し、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を保存するために適切な方法により脱細胞化することができる。哺乳動物肺組織を脱細胞化する方法は、例えば、Ｏ’Ｎｅｉｌｌ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｌｕｎｇ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｆｏｒ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．２０１３  Ｓｅｐ；９６（３）：１０４６−５５；Ｎｉｃｈｏｌｓ  ＪＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ  ｐｉｇ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ａ．２０１３  Ｓｅｐ；１９（１７−１８）：２０４５−６２；Ｇｉｌｐｉｎ  ＳＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｌｕｎｇｓ：Ｂｒｉｎｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｃａｌｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ；Ｓｏｎｇ  ＪＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｌｕｎｇ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１２  Ｆｅｂ；１２（２）：２８３−８；Ｇｕｙｅｔｔｅ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｈｏｌｅ  ｏｒｇａｎｓ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ９，１４５１−１４６８（２０１４）、およびＯｔｔ  ＨＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｌｕｎｇ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１０  Ａｕｇ；１６（８）：９２７−３３に記載されている。例示的な脱細胞化法は、組織（例えば、肺組織）を、例えば、液体窒素を使用する反復冷凍−解凍サイクルに供することを含み得る。他の場合、組織をアニオン性またはイオン性細胞破壊培地、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはＴｒｉｔｏｎＸに供することができる。組織は、ヌクレアーゼ溶液（例えば、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ）により処理し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水中で穏やかに撹拌しながら洗浄することもできる。例示的な方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Ｏ’Ｎｅｉｌｌ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｌｕｎｇ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｆｏｒ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ��ｇ．Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．２０１３  Ｓｅｐ；９６（３）：１０４６−５５。一部の場合、脱細胞化は、当技術分野において公知の方法および材料を使用して臓器または組織の血管、管、および／または空洞をフラッシュすることにより実施することができる。例えば、Ｍａｇｈｓｏｕｄｌｏｕ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏ−ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  ａ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ  ｉｎｔｒａ−ｔｒａｃｈｅａｌ  ｆｌｏｗ  ｏｆ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１３  Ｓｅｐ；３４（２８）：６６３８−４８に記載のとおりである。フラッシュ工程に続き、臓器または組織に、経路を介して上記の細胞破壊培地、例えば、脱イオン水中１％のＳＤＳを灌流させることができる。組織に通す灌流は、順行性または逆行性であり得、方向性を入れ替えて灌流効率を改善することができる。臓器または組織のサイズおよび重量、ならびに特定のアニオン性またはイオン性洗浄剤および細胞破壊培地中のアニオン性またはイオン性洗浄剤の濃度に応じて、組織には、一般に、細胞破壊培地を組織１０グラム当たり約２〜約１２時間灌流させる。洗浄を含め、臓器には、組織１０グラム当たり最大約１２〜約７２時間灌流させることができる。灌流は、一般に、流量および圧力を含む生理学的条件、例えば、５〜１００ｍｍＨｇの圧力、および資源生物または個体の生理学的心拍出量の０．１〜１０倍の流量に調整する。
【００２５】
別の例示的方法において、脱細胞化法は、洗浄剤、例えば、（１）０．１％のＳＤＳ（２）２％のデオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）、または（３）８ｍｍｏｌ／リットルの（３）３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）（ｐＨ１２）洗浄剤を３０ｃｍＨ２Ｏの定圧において肺動脈に通して灌流させることを含む。３つ全ての洗浄剤についてのプロトコルは、以下を含む：
１．リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）による１０分間の初回順行洗浄、
２．混濁半透明マトリックス（脱細胞化を示す）を可視化するために要求される時間とその初回時間の追加の２０％（例えば、７０分＋１４分）にわたる洗浄剤灌流、
３．１５分間の脱イオンＨ２Ｏ洗浄、および
４．抗菌薬および抗真菌薬を添加する追加の１７２時間のＰＢＳ洗浄。
【００２６】
この脱細胞化法は、例えば、脱イオンＨ２Ｏに続く１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘの追加の洗浄を含み得る。ＳＤＣプロトコルは、ＳＤＣ前の０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ灌流およびＳＤＣ後の１ｍｏｌ／リットルのＮａＣｌ洗浄を含み得る。
【００２７】
同様に、ブタおよびヒト肺脱細胞化法は、定圧において肺動脈に通す洗浄剤または他の脱細胞化剤の灌流と、それに続くＨ２Ｏ、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ溶液、およびＰＢＳによる連続洗浄を含み得る。ラット肺と同様に、脱細胞化は、混濁半透明マトリックスの目視調査および外観に基づき完了したとみなすことができる。出発臓器の変動性は、主に回収の間の予備フラッシュの拡張性に起因し、任意の得られる塊状物は、要求される灌流の長さに寄与し得る。一般に、脱細胞化灌流の時間は、例えば、４〜７日間で変動し得る。
【００２８】
脱細胞化組織は、本質的に、血管樹のＥＣＭ構成成分を含め、組織の全てまたはほとんどの領域の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成成分からなり得る（例えば、少なくとも８５％純粋、９０％純粋、９２％純粋、９５％純粋、９６％純粋、９７％純粋、９８％純粋、および９９％純粋、重量基準）。ＥＣＭ構成成分は、以下のいずれかまたは全てまたは以下の任意の組合せを含み得る：明確な構造、例えば、基底膜として組織化されたままであり得るフィブロネクチン、フィブリリン、ラミニン、エラスチン、コラーゲンファミリーのメンバー（例えば、コラーゲンＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ）、グリコサミノグリカン、基質、細網線維およびトロンボスポンジン。ある実施形態において、脱細胞化肺組織マトリックスは、インタクトな脱細胞化血管系を保持する。実質的にインタクトな脱細胞化血管系の保存は、移植時における対象の血管系への組織マトリックスの接続を可能とする。さらに、脱細胞化組織マトリックスは、例えば、照射（例えば、ＵＶ、ガンマ）によりさらに処理して脱細胞化組織マトリックス上またはその中に残留するあらゆるタイプの微生物の存在を低減させ、または排除することができる。
【００２９】
物理的、化学的および酵素的手段を使用して脱細胞化組織マトリックスを得る方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２９（８）：１０６５−７４（２００８）；Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２７（９）：３６７５−８３（２００６）；Ｔｅｅｂｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｅｎｄｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１９：３８１−８６（２０００）参照。米国特許出願公開第２００９／０１４２８３６号明細書；同第２００５／０２５６５８８号明細書；同第２００７／０２４４５６８号明細書；および同第２００３／００８７４２８号明細書も参照。
【００３０】
気道臓器バイオリアクター機器
本明細書に記載の生体人工肺組織（例えば、全臓器またはその一部）は、肺組織成長、保存、修復、改変、またはそれらの組合せに寄与する現実的な環境を提供するように構成されたバイオリアクターを使用して生成することができる。例示的な気道臓器バイオリアクターを図１〜３に提示する。本明細書全体にわたり、肺は、臓器または気道臓器の一例として提供する。他の例は、階層血管系構造、例えば、葉または区域を含む肺の一部を含み得る。図１〜３に提示される例示的なバイオリアクターは、生存ドナーまたは死体から回収された肺を支持し得る。本明細書に記載のバイオリアクターのいずれも、伏臥位での肺の培養を許容するように構成することができる。
【００３１】
図１を参照すると、バイオリアクター１００の構成要素は、肺チャンバ１０１、インキュベーターチャンバ１０２、培地容器１０３、動脈灌流ポンプ１０４、排出ポンプ１０５、動脈圧センサ１０６、チャンバ圧センサ１０７、気管圧センサ１０８、静脈圧センサ１０９、動脈経路１１０、静脈経路１１１、気管経路１１２、滅菌フィルタ１１３、酸素供給器１１４、制御モジュール１１５、静脈弁１１６、フィルタ閉塞器１１７、平衡化経路１１８、経肺圧制御（ＰＰＣ）モジュール３００、および陽圧マニホールド（ＰＰＭ）２００を含む。
【００３２】
肺チャンバ１０１内で、細胞マトリックスに細胞および培地を順行灌流させて肺マトリックス中での播種細胞の成長を可能とする。灌流は、肺動脈への動脈経路１１０に通して、および肺静脈への静脈経路１１１に通して行う。この構成は、細胞および培地が動脈側および静脈側の両方から毛細血管床に到達するのを許容し、培地が無細胞基底膜を通り拡散し、気管を介して、または胸膜を通過してマトリックスを流出するのを許容する。
【００３３】
細胞および／または培地は、動脈経路１１０および静脈経路１１１を通り肺血管系を介して流動する。再循環させるため、培地は酸素供給器１１４を通過する。酸素供給された培地は、動脈灌流ポンプ１０４を通り流動する。このポンプは、動脈圧センサ１０６および静脈圧センサ１０９それぞれからの圧力測定値に基づき速度を制御する制御モジュール１１５により制御される。動脈および静脈灌流圧を細胞のサイズおよび数に基づき改変して細胞送達を最適化することができる。制御モジュール１１５はまた、データ（例えば、動脈圧センサ１０６、および静脈圧センサ１０９からの抵抗測定値を記録し得る。培地は回路を完了し、動脈経路１１０に戻る。初回順行播種の間、培地は、その毛細血管床への到達前または到達時に肺マトリックスを通り拡散する。培地を足場に通してガイドするため、陽圧マニホールド２００は、肺内圧を改変し得る。一部の場合、逆行播種を使用することができる。
【００３４】
肺の脱細胞化後、マトリックスは生理学的条件に耐えるために十分であり（例えば、血管耐性は、肺マトリックスの再内皮化に起因して増加する）、バイオリアクター１００は順行灌流に切り替わる。血管系耐性は、動脈圧センサ１０６により経時的に計測される。血管系が集合した場合、血管膜を通過する拡散は減少し、動脈センサ１０６により計測される圧力の増加（すなわち、血管耐性の増加）をもたらす。一部の例において、粒子（例えば、マイクロスフェア）をバイオリアクター１００に通して灌流させ、その進行をモニタリングして血管膜を通過する拡散率を測定する。
【００３５】
バイオリアクター１００は、流動灌流系および陰圧換気を組み合わせる。肺マトリックスは、肺チャンバ１０１中に配置される。流動灌流系は、肺の肺動脈に接続された動脈経路１１０を使用する。培地は培地容器１０３により吸引され、酸素供給器１１４を通過する。酸素供給器１１４は、空気とインキュベーターチャンバ１０２を包囲する環境とを交換する。酸素供給器１１４を通り通過した後、動脈圧センサ１０６は動脈圧を記録し、このデータを制御モジュール１１５に伝送する。次いで、動脈圧測定値は、容器から肺動脈に培地をポンプ輸送するローラーポンプを調節する。次いで、培地は退出経路を通り肺チャンバ１０１の外を循環し、排出ポンプ１０５を使用して培地容器１０３中にポンプ輸送される。排出ポンプ１０５は二方向性であり、それを使用して培地を培地容器１０３および肺チャンバ１０１間で循環させることができる。この再循環は、肺チャンバ１０１中の正確なｐＨを維持するためにも役立つ。制御モジュール１１５は、チャンバ圧センサ１０７に記録された圧力測定値に基づき排出ポンプ１０５、例えば、速度および／または方向を制御する。肺チャンバ１０１中のチャンバ圧が変動する場合、液体は気管経路１１２中および外を流動する。静脈経路１１１は培地容器１０３に対して開口しているため、静脈圧は、チャンバ圧に平衡化し、したがって、動脈から組織中への流体の流動をもたらし得る経肺圧勾配を防止する。チャンバ圧をモニタリングし、それに応じてポンプ輸送することにより、肺チャンバ１０１中の培地レベルを維持することができる。
【００３６】
図１に示されるとおり、バイオリアクター１００は、気管圧センサ１０８および静脈圧センサ１０９も含む。気管圧センサ１０８は、気道（例えば、気管）内の圧力を計測する。
【００３７】
バイオリアクター１００は、静脈圧センサ１０９も使用して静脈経路１１１と培地容器１０３との間の培地交換率を能動的にモニタリングし得る。系中への静脈の後負荷は、静脈弁１１６が閉口された場合に容器のレベルにより、または開口位置である場合に静脈弁１１６に取り付けることができる抵抗弁により制御される。例えば、静脈弁１１６は、一般に開口位置である。低い圧力測定値（例えば、＜−５ｍｍＨｇ）は、静脈弁１１６の閉口を誘発し得（例えば、自動的または操作者による）、したがって、より多くの静脈背圧を提供して後毛細血管の血管虚脱を防止する。圧力測定値が高い場合（例えば、＞２０ｍｍＨｇ、静脈弁１１６は開口して静脈の後負荷を低減させ、間質腔および気道中への流体移動を最小化し得る。
【００３８】
さらに図１を参照すると、培地チャンバ１０３中の圧力は、滅菌フィルタ１１３を通り周囲環境（例えば、インキュベーターチャンバ１０２）と平衡化される。この交換は、インキュベーターチャンバ１０２と培地容器１０３との間の気体（例えば、二酸化炭素）の交換も許容し、それは系中の培地の適切なｐＨ値を維持するために役立つ。培地容器１０３の高さは、肺チャンバ１０１の高さに対して調整することができる。これは、陽圧湿式呼吸圧（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｗｅｔ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）をもたらし、肺に関する気管気道内圧に影響する。例えば、培地容器１０３は、培地中に浸漬させた肺よりも４ｃｍ高く設定される。これは、陽圧気道内圧をもたらす。
【００３９】
一般に、本明細書に記載のセンサのいずれかにより記録される圧力は、培養臓器に依存する生理学的範囲内である。例えば、動脈範囲は平均１０〜３５ｍｍＨｇであり得、肺チャンバ１０１は平均−４０〜４０ｍｍＨｇであり得る。
【００４０】
肺チャンバ１０１と培地容器１０３と滅菌フィルタ１１３上のフィルタ閉塞器１１７との間の圧力平衡化経路１１８は、肺チャンバ１０１と培地容器１０３との間の圧力を平衡化する。これは、呼吸サイクルの全ての段階の間の両方のチャンバにわたる等しい圧力を確保する。この改変は、本明細書において考察される全てのバイオリアクター（小型動物および大型動物／ヒトの両方）に適用することができ、陽圧および陰圧換気モードならびに湿式および乾式換気（ｗｅｔ  ａｎｄ  ｄｒｙ  ｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｎ）モードの両方で使用することができる。この圧力平衡化経路１１８の導入は、二方向性経肺勾配の作出を可能とする。換言すると、肺は、Ｐｐｍ２００を介して内側から圧縮し（それにより、陽圧気道内圧を作出する）、ＰＰＣモジュール３００を介して外側から圧縮することができる（それにより、陽圧チャンバ圧を作出する）。
【００４１】
この二方向性経肺勾配の目的は、長期単離肺培養にわたる間質浮腫の形成を防止することおよび間質液を血管系中に押圧し、したがって、肺機能（例えば、コンプライアンス、拡散、重量およびサイズ）を改善することにより既に形成された浮腫（例えば、既に損傷した肺中のもの）を治療することである。この勾配は、静脈圧をチャンバ圧に対して調整することができる場合に達成することができる。培地容器１０３の高さを調整し、それにより静脈カニューレ中の水柱の高さを調整し、肺静脈を培地容器１０３に戻して排出させることにより、静脈圧をチャンバ圧よりも高いまたは低い一定レベルに保持することができる。本質的には、２つのチャンバ間の平衡化は、陰圧換気の間の一定肺静脈排出を可能とする。対照的に、平衡化が維持されず、Ｐｖが一定に保持される場合、肺チャンバ１０１中の陰圧は、静脈流中の静脈排出または逆流（例えば、部分的または完全）の減少をもたらす一方、肺チャンバ１０１中の陽圧は、肺静脈を崩壊させ、流出障害をもたらす。
【００４２】
陽圧マニホールド２００は気管経路１１２に接続されており、吸気および呼気全体にわたりバイオリアクター１００が陰圧換気を生成し、陽圧気道内圧を生成および維持することを可能とする（気管経路１１２を介する）。バイオリアクター１００は、さらに、大型マトリックスサイズ（例えば、ヒト成人肺およびヒト幼児肺）に適合するように、ならびに平衡化経路１１８およびフィルタ閉塞器１１７の追加に起因する長期培養のために構成される。
【００４３】
図２Ａを参照すると、陽圧マニホールド２００は、気管経路の一部３０４（例えば、図１に示される気管経路１１２の一部）、圧力容器３０２、圧力放出弁３０１、圧縮器３０３（例えば、加圧気体源）、インフレータブル呼吸バッグ３０６、およびマニホールド圧センサ３０８を含む。気管経路３０４は、肺の気道に接続されている（示さず）。圧縮器３０３は陽圧を圧力容器３０２に提供し、圧力容器３０２中の圧力レベルは圧力放出弁３０１により改変することができる（例えば、圧力を低減させることができる）。ある実施形態において、陽圧マニホールド２００は、気道中の吸気および呼気関連圧力変動（例えば、気管圧センサ１０８により、またはマニホールド圧センサ３０８により記録される）に応答して圧力容器３０２中の圧力を能動的に調節するコンピュータ化システムである。インフレータブル呼吸バッグ３０６は、圧力容器３０２に取り付けられており、吸気および呼気の間の急激な体積変化を調整する一方、チャンバ、気管、および肺中の圧力を一定に保持する。インフレータブル呼吸バッグ３０６の体積は、培養されている肺のサイズに応じて変動し得る。例えば、インフレータブル呼吸バッグ３０６の体積は、２５０ｃｃ〜４０００ｃｃ、少なくとも２５０ｃｃ、４０００ｃｃ未満、３００ｃｃ〜３５００ｃｃ、４００ｃｃ〜３０００ｃｃ、５００ｃｃ〜２５００ｃｃ、６００ｃｃ〜２０００ｃｃ、７００ｃｃ〜１５００ｃｃ、および８００ｃｃ〜１０００ｃｃであり得る。インフレータブル呼吸バッグ３０６の材料は、任意のフレキシブルな空気不透過性および滅菌可能な材料（例えば、ラテックスまたはゴム）であり得る。マニホールド圧センサ３０８は、呼気終末圧のモニタリングおよび換気経路における流動計算の実現の両方を容易にする。
【００４４】
図２Ｂを参照すると、陽圧マニホールド２００は、吸気弁３２２、および呼気弁３２４および呼気圧放出弁３２６も含み得る。気管経路３０４は、肺の気道に接続されている（示さず）。図３Ａを参照して記載されるとおり、圧縮器３０３は陽圧を圧力容器３０２に提供し、圧力容器３０２中の圧力レベルを圧力放出弁３２４により改変することができる（例えば、圧力を低減させることができる）。気管経路３０４は、吸気弁３２２および呼気弁３２４にも接続されている。吸気弁３２２および呼気弁３２４は、流体、例えば、空気が一方向で流動することを可能とし、逆流を防止する一方向弁である。呼気段階の間、空気は気管経路３０４から呼気弁３２４および呼気圧弁３２６を通り排出系統（示さず）に流動する。呼気流体は、吸気弁３２２に起因して圧力容器３０１には流入しない。吸気段階の間、空気は圧力容器から吸気弁３２２を通り気管経路３０４を介して肺の気道に流動する。呼気圧放出弁３２４は、呼気経路が吸入段階の間に陽圧を保持することを確保し、したがって、空気が吸入段階の間に呼気経路を通り流動するのを防止する。
【００４５】
図３を参照すると、経肺圧制御モジュール３００は、入口圧力弁７０３、入口圧力容器７０５、入口圧縮器７０１、入口経路７０７、出口圧力弁７０４、出口圧力容器７０６、出口圧縮器７０２、出口経路７０８、およびＰＰＣ制御器７０９を含む。入口経路７０７および出口経路７０８は、チャンバ圧センサ７１０を含む肺チャンバ１０１に接続されている。入口および出口圧縮器７０１、７０２は、入口および出口圧力容器７０５、７０６に気体（例えば、空気）を入れる。入口および出口圧力弁７０３、７０４（例えば、ソレノイド弁）ならびに入口および出口圧縮器７０１、７０２は、ＰＰＣ制御器７０９により制御される。吸気段階の間、出口弁７０４は開口し、肺チャンバ１０１中で陰圧を生成する。陰性目標圧がチャンバ圧センサ７１０により記録されると（例えば、−２０ｃｍＨ２Ｏ）、出口弁７０４は閉口する。チャンバ圧力は、吸気および呼気の間で−５０〜＋１００ｃｍＨ２Ｏの範囲であり得る。肺コンプライアンスが正常肺のものに接近すると、チャンバ圧は、胸腔内圧の生理学的範囲（例えば、−１０〜＋２５ｃｍＨ２Ｏ）をより厳密に模倣する。適切なプラトー段階後、入口圧力弁７０３が開口し、肺チャンバ１０１内側で陽圧の生成を可能とする呼気段階が開始する。陽圧目標圧がチャンバ圧センサ７１０により記録されると（例えば、２５ｃｍＨ２Ｏ）、入口弁７０３が閉口する。入口および出口圧力容器７０５、７０６は、肺チャンバ１０１中の圧力の急速な調整を可能とするように適切にサイズ化される。入口および出口圧力容器７０５、７０６は、入口または出口圧縮器７０１、７０２により生成される振動アーティファクトを防止し、および／または低減させる。一部の実施形態において、圧力平衡の傾きは、入口経路７０７および／または出口経路７０８中に配置される追加の抵抗弁（示さず）により調整することができる。換気は圧力制御（ＰＣ）または体積制御（ＶＣ）することができる。
【００４６】
他の例示的なバイオリアクターおよび方法は、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２０６０５号明細書（２０１５年３月１３日出願、表題Ｌｕｎｇ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）、および米国特許第９，００５，８８５号明細書（２／２４／２０１２年２月２４日出願、表題Ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｌｕｎｇ）（それらの内容は、参照により全体として本明細書にそれぞれ組み込まれる）に記載されている。
【００４７】
細胞播種
本明細書に記載の方法の一部において、肺組織マトリックス、例えば、脱細胞化肺組織マトリックスまたは人工肺マトリックスに、細胞、例えば、分化または再生可能な細胞を播種する。
【００４８】
任意の適切な再生可能な細胞タイプ、例えば、ナイーブまたは未分化細胞タイプを使用して肺組織マトリックスに播種することができる。細胞は、種々のステージ、例として、限定されるものではないが、幹細胞ステージ（例えば、誘導後）、前駆細胞ステージ、血管芽細胞ステージ、または分化ステージ（例えば、ＣＤ３１＋、ｖＷＦ＋、ＣＤ１４０ｂ＋）において播種することができる。本明細書において使用される再生可能な細胞としては、限定されるものではないが、前駆細胞、プレカーサー細胞、および「成体」由来幹細胞、例として、臍帯細胞（例えば、ヒト臍静脈内皮細胞）、胎盤由来細胞、および胎児幹細胞を挙げることができる。再生可能な細胞としては、分化または委任細胞タイプを挙げることもできる。本明細書において提供される方法および材料に適切な幹細胞としては、ヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および誘導体（例えば、未分化、分化内胚葉、前方化内胚葉、ＴＴＦ−１陽性肺前駆細胞、内皮前駆細胞、および中胚葉性前駆細胞、血管周囲細胞、筋肉前駆細胞）、ヒト間葉幹細胞、ヒト臍静脈内皮細胞、多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）、ｉＰＳ由来間葉細胞、または胚性幹細胞を挙げることができる。一部の場合、他の組織に由来する再生可能な細胞を使用することもできる。例えば、皮膚、骨、筋肉、骨髄、滑膜、胎盤、または脂肪組織に由来する再生可能な細胞を使用して幹細胞播種組織マトリックスを発生させることができる。
【００４９】
一部の場合、本明細書において提供される肺組織マトリックスに、代替的に、またはさらに分化細胞タイプ、例えば、（好ましくは、ヒト）上皮細胞および内皮細胞を播種することができる。例えば、肺マトリックスに、血管系を介して（例えば、動脈経路１１０、静脈経路１１１、または動脈経路１１０および静脈経路１１１の両方に通して）内皮細胞を播種し、気道を介して（例えば、気管経路１１２に通して）上皮細胞を播種することができる。肺マトリックスに、１つ以上の細胞タイプ（例えば、上皮および間葉細胞、成体末梢血由来内皮細胞、臍帯血由来内皮細胞、ｉＰＳ由来上皮および内皮細胞、前駆段階の細胞（例えば、平滑筋）、成体肺由来細胞混合物（例えば、ラットヒト）、市販の末梢気道上皮細胞または肺胞上皮細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞由来上皮細胞、および／またはヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のタイプの１つ以上）を播種することもできる。
【００５０】
肺動脈および肺静脈の両方に通す無細胞肺足場中への血管関連細胞および／または培地の送達は、細胞分布および分布を改善するために役立つ。例えば、肺チャンバ１０１内で、細胞マトリックスに細胞および培地を順行灌流させて肺マトリックス上での播種細胞の成長を可能とする。灌流は、肺動脈への動脈経路１１０に通して、および肺静脈への静脈経路１１１に通して行う。この構成は、細胞および培地が動脈側および静脈側の両方から毛細血管床に到達するのを許容し、培地が無細胞基底膜を通り拡散し、気管を介して、または胸膜を通過してマトリックスを流出するのを許容する。
【００５１】
一部の場合、本明細書において提供される脱細胞化または人工肺組織マトリックスに、上記の細胞タイプおよび細胞密度を灌流播種により播種することができる。例えば、流動灌流系を使用して組織マトリックス中で保存される血管系を介して（例えば、動脈経路１１０に通して）肺チャンバ１０１内で脱細胞化肺組織マトリックスに播種することができる。一部の場合、自動化流動灌流系を適切な条件下で使用することができる。このような灌流播種法は播種効率を改善し、組成物全体にわたる細胞のより均一な分布を提供し得る。定量的生化学的および画像分析技術を使用して静置または灌流播種法に続く播種細胞の分布を評価することができる。細胞は、動脈および静脈経路を介して（内皮細胞）または気道（気管）経路に通して（上皮細胞）マトリックス中に導入することができる。組織マトリックスに、少なくとも１つの細胞タイプをインビトロで任意の適切な細胞密度において播種することができる。マトリックスの播種のための細胞密度は、少なくとも１×１０３個の細胞／マトリックス１グラムであり得る。細胞密度は、約１×１０５〜約１×１０１０個の細胞／マトリックス１グラム（例えば、少なくとも１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、１００，０００，０００、１，０００，０００，０００、または１０，０００，０００，０００個の細胞／マトリックス１グラム）の範囲であり得、それを使用することができる。
【００５２】
一部の場合、本明細書において提供される脱細胞化または人工肺組織マトリックスに、上記の細胞タイプおよび細胞密度を灌流播種により播種することができる。例えば、流動灌流系を使用して組織マトリックス中で保存される血管系を介して（例えば、動脈経路１１０に通して）脱細胞化肺組織マトリックスに播種することができる。一部の場合、自動化流動灌流系を適切な条件下で使用することができる。このような灌流播種法は播種効率を改善し、組成物全体にわたる細胞のより均一な分布を提供し得る。定量的生化学的および画像分析技術を使用して静置または灌流播種法に続く播種細胞の分布を評価することができる。
【００５３】
一部の場合、組織マトリックスに１つ以上の成長因子を含浸させて播種された再生可能な細胞の分化を刺激することができる。例えば、組織マトリックスに、本明細書において提供される方法および材料に適切な成長因子、例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＴＧＦ−β成長因子、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−４）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂ−ＦＧＦ）、例えば、ＦＧＦ−１０、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、または成長分化因子−５（ＧＤＦ−５）を含浸させることができる。例えば、Ｄｅｓａｉ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｏｓｏ，Ｒｅｓｐｉｒｅ．Ｒｅｓ．３：２（２００２）参照。これらの成長因子をカプセル封入して時間的放出を制御することができる。足場の異なる部分を異なる成長因子により向上させて成長因子刺激の空間的制御を追加することができる。
【００５４】
播種された組織マトリックスは、播種後一定期間（例えば、数時間〜約１４日間以上）インキュベートして組織マトリックス中の細胞の固定および透過を改善することができる。播種された組織マトリックスは、再生可能な細胞の少なくとも一部が無細胞組織マトリックス内またはその上で増殖および／または分化し得る条件下で維持することができる。このような条件としては、限定されるものではないが、適切な温度（３５〜３８摂氏度）および／または圧力（例えば、大気圧）、電気的および／または機械的活動（例えば、１〜２０ｃｍＨ２Ｏの呼気終末陽圧、５〜５０ｃｍＨ２Ｏの平均気道内圧、および５〜６５ｃｍＨ２Ｏのピーク吸気圧を伴う陽圧または陰圧を介する換気）、適切量の流体、例えば、Ｏ２（１〜１００％のＦｉＯ２）および／またはＣＯ２（０〜１０％のＦｉＣＯ２）、適切量の湿度（１０〜１００％）、ならびに滅菌または準滅菌条件を挙げることができる。このような条件としては、湿式換気、湿式乾式換気（ｗｅｔ  ｔｏ  ｄｒｙ  ｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｎ）および乾式換気を挙げることもできる。一部の場合、栄養サプリメント（例えば、栄養素および／または炭素源、例えば、グルコース）、外因性ホルモン、または成長因子を播種された組織マトリックスに添加することができる。組織学的検査および細胞染色を実施して播種細胞繁殖をアッセイすることができる。任意の適切な方法を実施して播種細胞分化についてアッセイすることができる。一般に、本明細書に記載の方法は、例えば、本明細書に記載の気道臓器バイオリアクター機器中で実施される。
【００５５】
したがって、本明細書に記載の方法を使用して体外デバイスまたは移植可能な肺組織グラフトのいずれかとしてガス交換を患者に提供し得る肺を生成することができる。本明細書に記載のとおり、移植可能な組織は、好ましくは、患者の血管系に接続することができる十分にインタクトな血管系を保持する。
【００５６】
本明細書に記載の生体人工肺組織は、包装材料と組み合わせて製品またはキットを生成することができる。製品を生産するための構成要素および方法が存在する。生体人工組織に加えて、製品またはキットは、例えば、１つ以上の接着防止剤、滅菌水、医薬担体、緩衝液、ならびに／またはインビトロでおよび／もしくは移植後に機能的肺組織の発生を促進するための他の試薬をさらに含み得る。さらに、それに含有される組成物をいかに使用することができるかを記載する印刷説明書をそのような製品中に含めることができる。製品またはキットの構成要素は、種々の好適な容器中で包装することができる。
【００５７】
多段階培養プログラムを使用する血管成熟
単離臓器培養における血管成熟を容易にするため、２段階培養プログラムを使用して無細胞肺足場をベースとして肺血管系全体または血管系の一部を再生させることができる。例えば、血管周囲支持細胞との組合せで、再生細胞を高い血管新生状態から低い血管新生状態に移行させる２段階培養プログラムは、典型的な血管発生のインビボ管腔形成に類似する再生肺における血管成熟プロセスを促進するために役立ち得る。
【００５８】
細胞（例えば、ＨＵＶＥＣ、ｈＭＳＣ、ｈｉＰＳＣ−ＥＣおよび／またはｈｉＰＳＣ−ＰＰＣ）は、灌流播種を使用して無細胞肺足場上に播種することができる（例えば、他箇所に記載のＰＡおよびＰＶの両方から）。場合により、静置培養に続き灌流播種を行って血管基底膜への細胞の初回付着を可能とすることができる。ＰＡに通す培地の灌流は、培養の終了まで継続し得る。
【００５９】
第１の段階の間、他箇所に記載の血管新生培地を、播種された肺足場に送達する。第２の段階の間、播種された肺足場を、他箇所に記載の安定化培地中で培養する。一部の例において、第１の段階は第２の段階よりも長い。例えば、第１の段階は６日間であり得る一方、第２の段階は２日間のみである。ＣＤ３１およびＶＥ−カドヘリン発現により定義されるプラトーに到達するための内皮被覆の増加は、培養の第１の段階の主目的である十分な血管リモデリングが達成されたことを示す。
【００６０】
２段階培養プログラムを使用して天然血管系単位の組織化を再現することができ、内皮細胞は相互接続ネットワークを形成し、血管周囲細胞は血管ネットワーク周囲に個々に接着する。これは、単一細胞懸濁液として無細胞血管床中への内皮細胞の送達を許容し、次いでそれらの内皮細胞は付着およびリモデリングを受ける。これは、内皮被覆の増加ならびに灌流流体の流動を包囲し、それに耐え得る連続的および極性化血管腔の形成をもたらす。再生肺におけるインビトロ血管成熟の間のこれらの形態的変化は、インビボ血管発生の間の管腔形成のプロセスに類似する。
【００６１】
細胞播種−臨床関連内皮および血管周囲細胞の誘導
本明細書に記載の方法の一部において、肺組織マトリックス、例えば、脱細胞化肺組織マトリックスまたは人工肺マトリックスに、細胞、例えば、分化または再生可能な細胞を播種する。無細胞肺足場中への効率的な内皮送達および単離臓器培養条件は、効率的な血管成熟に寄与し得る。
【００６２】
臓器再生のための患者由来細胞の使用は、容易に臨床用途に転換する。それというのも、ｈｉＰＳＣは、臓器再構築に必要な全ての細胞タイプを単一細胞源から生成する潜在性を提供するためである。例えば、ｈｉＰＳＣ由来血管細胞タイプを使用して肺血管系を再生させることができる。ｈｉＰＳＣ由来血管細胞タイプは、高度に効率的な内皮分化を受け、総分化細胞のかなりの部分（例えば、総分化細胞の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０％）を構成する周皮細胞の生成を伴う。
【００６３】
ヒト胚性幹細胞およびｉＰＳＣからの血管細胞分化は、三次元胚様体および二次元細胞培養の両方を使用し得る。例えば、ｈｉＰＳＣは、二次元表面（例えば、６ウェルプレート、またはコラーゲンコートされた６ウェルプレート）上に播種することができる。播種の間、細胞を阻害剤（例えば、ＧＳＫ−３阻害剤、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、プルバラノールＡ、オロモウシン、アルステルパウロン、ケンパウロン、ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン（ＴＤＺＤ−８）、２−チオ（３−ヨードベンジル）−５−（１−ピリジル）−［１，３，４］−オキサジアゾール（ＧＳＫ３阻害剤ＩＩ）、２，４−ジベンジル−５−オキソチアジアゾリジン−３−チオン（ＯＴＤＺＴ）、（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）、α４ジブロモアセトフェノン（すなわち、Ｔａｕタンパク質キナーゼＩ（ＴＰＫＩ）阻害剤）、２−クロロ−１−（４，５−ジブロモ−チオフェン−２−イル）−エタノン、Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）ウレア（ＡＲ−Ａ０１４４１８）、インジルビン−５−スルホンアミド；インジルビン−５−スルホン酸（２−ヒドロキシエチル）−アミドインジルビン−３’−モノキシム；５−ヨード−インジルビン−３’−モノキシム；５−フルオロインジルビン；５，５’−ジブロモインジルビン；５−ニトロインジルビン；５−クロロインジルビン；５−メチルインジルビン、５ブロモインジルビン、４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン（ＴＤＺＤ−８）、２−チオ（３−ヨードベンジル）−５−（１−ピリジル）−［１，３，４］−オキサジアゾール（ＧＳＫ３阻害剤ＩＩ）、２，４−ジベンジル−５−オキソチアジアゾリジン−３−チオン（ＯＴＤＺＴ）、（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）、α４ジブロモアセトフェノン（すなわち、Ｔａｕタンパク質キナーゼＩ（ＴＰＫＩ）阻害剤）、２−クロロ−１−（４，５−ジブロモ−チオフェン−２−イル）−エタノン、（ｖｉ）Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）ウレア（ＡＲ−Ａ０１４４１８）、Ｈ−ＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ２（Ｌ８０３）およびＭｙｒ−Ｎ−ＧＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ２（Ｌ８０３−ｍｔｓ））により処理することができ；一部の実施形態において、ＧＳＫ３−ベータ阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１（例えば、５〜２０ｕＭ、例えば、１０〜１５ｕＭ、例えば、約１２μＭにおいて使用、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ））であり、培地（例えば、ｍＴｅＳＲＴＭ））を使用することができる（例えば、１〜２４時間）。細胞の９０％超におけるＢｒａｃｈｙｕｒｙ遺伝子（中胚葉性前駆細胞マーカー）の発現は、この段階の完了を示す。
【００６４】
細胞を分化させるため、細胞を完全分化培地（例えば、ＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ））中に配置する。分化培地は、補給血清または血清代用物、化合物、アミノ酸、培地サプリメント、および／またはタンパク質（例えば、ＢＩＴ９５００（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、モノチオグリセロール（４５０ｍＭ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１％のＧｌｕｔａＭＡＸ、１％のＰ／Ｓ、組換えヒトＢＭＰ４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、ＶＥＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）およびｂＦＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ））も含み得る。
【００６５】
次いで、ｈｉＰＳＣ由来内皮細胞（ｈｉＰＳＣ−ＥＣ）および／またはｈｉＰＳＣ由来血管周囲前駆細胞（ｈｉＰＳＣ−ＰＰＣ）を、それらの内皮のアイデンティティも増殖潜在性も損失させずにヒトサイズ化肺エンジニアリングに十分なスケールに拡張することができる。例えば、分化細胞を、単一細胞に解離させ（例えば、酵素的細胞解離試薬、例えば、トリプシンまたはＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ）を使用することによる）、１つ以上の抗体またはアイソタイプ対照（例えば、抗ヒトＣＤ３１−ＢＶ６０５、ＣＤ１４０ｂ＋、およびＣＤ１４０ｂ−ＰＥ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））により染色し、分離することができる（例えば、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による）。
【００６６】
分離後、ｈｉＰＳＣおよびｈｉＰＳＣ−ＰＰＣを、コラーゲンＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）コートフラスコ中で、例えば、２０％の規定ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、およびＴＧＦβ受容体Ｉ（ＡＬＫ５）阻害剤、例えば、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ５２５３３４、ＳＤ−２０８、ＥＷ−７１９７、ＳＢ５０５１２４、またはガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９）の１つ以上が補給されたヒドロコルチゾンを有さないＥＧＭ−２であるＥＧＭ−ＦＢＳ−ＳＢ培地を使用して培養することができ；一部の実施形態において、阻害剤はＳＢ４３１５４２（例えば、５〜２０μＭ、例えば、８〜１５μＭ、例えば、１０μＭ）である。
【００６７】
平滑筋細胞様表現型への分化のため、細胞の９０％超におけるａ−ＳＭＡおよびカルポニンタンパク質の上方調節まで（例えば、６日間）、ｈｉＰＳＣ−ＰＰＣをＳｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ−２（ＳｍＧｍ２，Ｌｏｎｚａ）中で培養した。
【００６８】
血管機能のインビトロおよびインビボ特徴付け
任意の適切な方法を実施して移植前または後の肺機能についてアッセイすることができる。例えば、組織治癒を評価し、機能性を評価し、および細胞内方成長を評価する方法を実施することができる。一部の場合、組織の一部を回収し、固定剤、例えば、中性緩衝ホルマリンなどにより処理することができる。このような組織の一部は、組織学的分析のために脱水し、パラフィン中で包埋し、ミクロトームにより切片化することができる。切片は、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨおよびＥ）により染色し、次いで形態および細胞充実性の顕微鏡評価のためにガラススライド上でマウントすることができる。例えば、組織学的検査および細胞染色を実施して播種細胞繁殖を検出することができる。アッセイとしては、移植組織マトリックスの機能的評価または画像化技術（例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、超音波、または磁気共鳴画像化（例えば、造影ＭＲＩ））を挙げることができる。アッセイは、静止および生理学的ストレス下での機能的試験（例えば、全身プレチスモグラフィー、肺機能試験）をさらに含み得る。細胞を播種したマトリックスの機能性は、種々の方法、例えば、組織学的検査、電子顕微鏡、および機械的試験（例えば、体積およびコンプライアンスの）を使用してアッセイすることができる。ガス交換を別の機能性アッセイとして計測することができる。細胞増殖についてアッセイするため、チミジンキナーゼ活性を、例えば、チミジン取り込みを検出することにより計測することができる。一部の場合、血液試験を実施して血中の酸素レベルに基づき肺の機能を評価することができる。あるいは、またはさらに、蛍光標識デキストラン溶液を使用するエクスビボ灌流を実施して血管統合性および灌流可能性を示した血管内デキストラン保持率を定量することができる。新鮮単離死体ラット肺は、１００％の血管内デキストラン保持率を有する。移植に適合性である臨床関連低グレード損傷モデルである６時間の低温虚血後の死体肺は、典型的には、約８７．０％±５．４％（例えば、８０．６％〜９２．９％の範囲）の血管内デトラン（ｄｅｔｒａｎ）保持率を有する。
【００６９】
培養の間の機能性アッセイを容易にするため、本明細書に記載のバイオリアクター機器の任意の経路は、機能性パラメータ（例えば、ｐＨ、グルコース、乳酸塩、Ｎａ、Ｋ、Ｃａ、Ｃｌ、重炭酸塩、Ｏ２、ＣＯ２、飽和度）の単一またはリアルタイム計測を可能とするためのサンプリングポートを含み得る。代謝産物を使用して比色アッセイを使用して細胞数および生存率をモニタリングすることもでき、生化学的アッセイを使用して細胞成熟をモニタリングすることができる（例えば、サーファクタントタンパク質の計測など）。例えば、サーファクタントの濃度増加は、培養肺が乾式換気に耐えるために十分な上皮細胞を有することを示し得る。一部の場合、内皮障壁機能を血管成熟のマーカーとして使用することができる。肺に、異なるサイズの分子（例えば、規定サイズのデキストランおよびアルブミン）、マイクロビーズまたはマイクロスフェア（０．２〜５ｕｍの増加サイズ）および単離赤血球を灌流させることができる。次いで、気管支肺胞洗浄液をサンプリングして肺胞腔中へのそれらのマーカーの漏出を評価することができる。例えば、５００ｋＤａデキストランを気管支肺胞洗浄アッセイとの組合せで使用して血管コンパートメント内に保持されるデキストランの割合を決定することができる。保持されるデキストランの割合の増加は、障壁機能の改善を示す。それというのも、デキストランに対する障壁機能は生存および機能的内皮に依存的である一方、デキストランは一定灌流の間に経時的に露出血管基底膜（例えば、無細胞肺中）を通過して拡散するためである。例えば、死体肺は血管コンパートメント内のデキストランの実質的に全てを保持し得る一方、無細胞肺はわずかな割合のデキストランを保持し得る（例えば、１０．０％±８．０％、例えば、３〜２０％、例えば、３．１％〜１８．７％）。許容される最小値（例えば、４ｕｍマイクロビーズの＞１０％（例えば、１０％〜１００％または２０％〜１００％は、肺が乾式換気に耐えるために十分でないことを示す）、または０．２ｕｍマイクロビーズの２０％超（２０％〜１００％、または３０％〜１００％は、肺が乾式換気に耐えるために十分でないことを示す）よりも多い肺胞腔中へのこれらのマーカーの漏出は、肺が乾式換気に耐えるために十分に成熟でないことを示す。
【００７０】
一部の場合、分子生物学技術、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを使用して代謝産物（例えば、サーファクタントタンパク質ｍｕｃｉｎ−１）および分化マーカー（例えば、ＴＴＦ−１、ｐ６３、サーファクタントタンパク質Ｃ）の発現を定量することができる。任意の適切なＲＴ−ＰＣＲプロトコルを使用することができる。手短に述べると、生物試料（例えば、腱試料）をホモジナイズし、クロロホルム抽出を実施し、スピンカラム（例えば、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））または他の核酸結合基板を使用してトータルＲＮＡを抽出することにより、トータルＲＮＡを回収することができる。他の場合、抗体および標準的なイムノアッセイを使用して肺細胞タイプおよびそのような細胞タイプについての分化の異なるステージに関連するマーカーを検出することができる。
【実施例】
【００７１】
以下の具体的な実施例は、本発明をさらに説明する。
【００７２】
実施例１
無細胞肺血管床の試験
本実施例の目的は、インビトロマイクロスフェア灌流アッセイを使用して全肺足場中の無細胞血管床の灌流特性を同定することである。ＰＶ、気管および肺末梢から回収されるマイクロスフェアを定量することにより、本発明者らは、脱細胞化後の血管基底膜の連続性および統合性の両方を実証し、それにより無細胞肺足場におけるコンパートメント特異的細胞送達の可能性を裏付けた。マイクロスフェア定量は、流体駆動静水圧損失が低い導通効率の主な理由であるが、粒子漏出はその主な理由でないことをさらに示した。これらの知見を再細胞化に適用することにより、効率的および均一な内皮被覆が動脈および静脈細胞送達の組合せにより達成される。
【００７３】
方法
死体肺を、雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２５０〜３００ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から全身ヘパリン化後に外植した。肺動脈（ＰＡ）に１８Ｇカニューレ（ＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ）をカニューレ挿入し、肺静脈（ＰＶ）にチップバスケットを有するミニボールカニューレ（ｍｉｎｉｂａｌｌ  ｃａｎｎｕｌａ  ｗｉｔｈ  ｔｉｐ  ｂａｓｋｅｔ）（１．９ｍｍ  ＩＤ）（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して左心耳（ＬＡＡ）に通してカニューレ挿入し、大動脈を結紮した。脱細胞化は、ＰＡ（定圧、４０ｍｍＨｇ）にヘパリン化（１０単位／ｍｌ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１０分間）、脱イオン水中０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（２時間）、脱イオン水（１５分間）および脱イオン水中１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（１０分間）を連続的に灌流させることにより行った。得られた足場を、抗生物質および抗有糸分裂薬（ａｎｔｉｍｙｔｏｔｉｃｓ）を含有するＰＢＳにより７２時間洗浄して残留洗浄剤および細胞残屑を除去した。全ての試薬はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製である。
【００７４】
ＰＡからのマイクロスフェア灌流後の脱細胞化ラット肺のホールマウント画像化のため、脱細胞化肺にＰＡに通して２０ｍｍＨｇ下で、１：１００希釈緑色ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（０．２μｍ、５０５／５１５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する３０ｍｌのＰＢＳを灌流させた。ＰＡおよびＰＶの両方からのマイクロスフェア灌流後の脱細胞化肺のホールマウント画像化のため、脱細胞化肺にＰＡに通して、ＰＶカニューレを開口させて１：１００希釈緑色ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（０．２μｍ、５０５／５１５）を含有する３０ｍｌのＰＢＳを灌流させ、次いでＰＶに通して、ＰＡカニューレを開口させて１：１００希釈赤色ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（０．２μｍ、５８０／６０５）を含有する３０ｍｌのＰＢＳを灌流させた。マイクロスフェア灌流後に個々の葉を脱細胞化肺から解剖し、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２００顕微鏡を４倍の倍率で使用して画像化した。
【００７５】
脱細胞化ラット肺中のマイクロスフェア灌流および漏出の定量のため、気管にも１８Ｇカニューレ（ＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ）をカニューレ挿入した。脱細胞化肺にＰＡに通して、４０ｍｍＨｇ下で、１：１０希釈緑色ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（０．２μｍ、５０５／５１５）および赤色ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（０．０２μｍ、５８０／６０５）の混合物を含有する３０ｍｌのＰＢＳを灌流させた。灌流の間、ＰＶカニューレおよび肺末梢から排出させた流体を回収した。灌流の間、気管カニューレを閉口させ、灌流後に気管カニューレを解放することにより気道中で蓄積した流体を回収した。３つのコンパートメント（ＰＶ、気管および末梢）全てから回収された流体の体積を計測し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒを０．２μｍ緑色ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓについては４８５ｎｍ（ｅｘ）／５３８ｎｍ（ｅｍ）および０．０２μｍ赤色ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓについては５４４ｎｍ（ｅｘ）／５９０ｎｍ（ｅｍ）において使用してそれらの蛍光強度を計測した。
【００７６】
結果：
得られた全肺足場中の無細胞肺血管床の特性を試験するため、左心耳を介するＰＶ、気管、およびＰＡにカニューレ挿入した（図５Ａ）。予測されるとおり、脱細胞化は、障壁機能のほぼ完全な損失、ならびに晶質溶液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のＰＡおよびＰＶから間質腔への血管基底膜を通過する自由濾過、胸膜を通過する自由濾過、ならびに肺胞腔および気道中への自由濾過をもたらした。ＰＡ中に灌流させたＰＢＳの大多数が肺末梢および気管から排出した一方、体積の１２．４％±０．７％のみをＰＶから回収することができた（図１１）。これは、脱細胞化の間、ＰＡに通して灌流させた洗浄剤が肺血管系に透過し、肺実質全体において細胞構成成分を効率的に溶解させた観察と一致する。
【００７７】
血管基底膜の連続性および統合性を試験するため、および微粒子要素を含有する溶液の灌流をモデリングするため、無細胞全肺に、蛍光マイクロスフェア（０．２μｍ）を含有するＰＢＳを灌流させた。ＰＡに通す生理学的圧力（２０ｍｍＨｇ）下での灌流の間の気道中への、または胸膜を通過するマイクロスフェアの明らかな漏出も、ＰＶからの明らかなマイクロスフェア排出も観察されなかった。肺ホールマウントを使用して、灌流させたマイクロスフェアの肺内捕捉（図５Ｂ）が確認された。ＰＡに通す灌流圧が２０ｍｍＨｇから４０ｍｍＨｇに増加した場合、マイクロスフェアは、インプットに近い濃度（７４．６％±２０．８％）において、気管（Ｔｒ、２２．７％±１２．２％、ｐ＜０．０５）および肺末梢（末梢、５．７％±５．１％、ｐ＜０．０５）から回収された流体のものよりも有意に多くＰＶから回収することができた（図５Ｃ）。この知見は、脱細胞化後の肺血管基底膜の保存された統合性および連続性を裏付けた。しかしながら、ＰＶから回収されたマイクロスフェアの総量は、総注入量の１０．３％±０．９％にすぎなかった。これは、マイクロスフェアが、動脈側から灌流させた場合、効率的に毛細血管床を通過しないことを示した。この非効率性は、血管床内の静水圧の急速な損失に関連し得る。それというのも、水相は極めて透過可能な基底膜を通り拡散し、残留溶液中の血管内マイクロスフェア濃度が増加するためである（図５Ｄ）。
【００７８】
ＰＡおよびＰＶを介して異なる色により標識されたマイクロスフェアを連続的に灌流させることにより、動脈マイクロスフェアも静脈マイクロスフェアも、肺胞腔中へも気道中へも漏出しなかったことが明らかである。その代わり、マイクロスフェア混濁血管チャネルは、一般に、相互排他的であった（図５Ｅ）。これは、効率的な血管細胞送達が、肺血管床全体に到達する動脈側および静脈側の両方からの灌流から利益を受けることを示す。
【００７９】
結論：
マイクロメートル直径粒子は、生理学的圧力下で無細胞肺毛細血管床を効率的に通過しないことを見出した。
【００８０】
実施例２
内皮送達の改善
本実施例の目的は、無細胞ラット肺足場上の生存内皮の再確立を実証すること、および脱細胞化後の血管基底膜の統合性を裏付けることである。
【００８１】
方法
脱細胞化ラット肺中への細胞播種を本明細書に記載のものと類似するバイオリアクター中で実施し、ＰＡおよびＰＶの両方からの細胞送達および灌流を可能とした。気管にカニューレ挿入し、ＰＡの高さよりも約５ｃｍ高いポートに通してバイオリアクターの内側に開口した。脱細胞化肺足場を、ヒトフィブロネクチン（２．５μｇ／ｍｌ）を有する１００ｍｌのハンクス平衡塩溶液による１ｍｌ／分における灌流により１時間プライミングし、ハンクス平衡塩溶液により１時間洗浄し、それぞれの培養培地中で少なくとも１時間平衡化してから細胞播種した。ＰＡに通す内皮送達のため、１００ｍｌのＥＧＭ−２を有する単一播種チャンバ中で４０００万個のＨＵＶＥＣを再懸濁させ、３０ｍｍＨｇ重力下でＰＡに通して播種した（ｎ＝３）。ＰＡおよびＰＶに通す内皮送達のため、４０００万個のＨＵＶＥＣを２つの別個の播種チャンバ（それぞれ１００ｍｌのＥＧＭ−２中２０００万個のＨＵＶＥＣを有する）中で再懸濁させ、３０ｍｍＨｇ重力下でＰＡおよびＰＶに通して同時に播種した（ｎ＝３）。２時間の静置培養を実施して細胞付着を可能とし、次いで灌流を１ｍｌ／分においてＰＡおよびＰＶの両方から開始した。組織学的分析のために培養の１日後に再播種肺を回収した。
【００８２】
Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２００顕微鏡を使用してＣＤ３１およびラミニンの蛍光画像を同一の視野から別個に撮影した。ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して画像を二値画像に変換し、骨組化し、拡大した。ＩｍａｇｅＪを使用して処理画像のピクセル数を計数し、それは視野全体における内皮細胞（ＣＤ３１）または肺マトリックス（ラミニン）のいずれかの被覆を示した。再生肺の内皮被覆を、ラミニン被覆に正規化されたＣＤ３１被覆として定義した。それぞれの再生肺について、写真を５つの代表的な視野から４倍の倍率で撮影した。それぞれの肺の内皮被覆を、５つの視野からのものの平均被覆として提示した。内皮被覆を、ＰＡからＨＵＶＥＣが播種された無細胞ラット肺に対して培養の１日後に定量し（ｎ＝３）、ＰＡおよびＰＶからＨＵＶＥＣが播種された無細胞ラット肺に対して培養の１日後に定量した（ｎ＝３）。
【００８３】
結果：
無細胞ラット肺足場上の生存内皮を再確立するため、蛍光標識ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をＰＡに通す灌流を介して播種した。これは、マイクロスフェア灌流を用いて既に観察されたものと類似する生着細胞の分布パターンをもたらした（図６および図５Ｂ）。これは、ＰＡ単独からのＨＵＶＥＣ送達１日後における斑点状の内皮分布を示す組織学的評価によっても裏付けられた（図５Ｆ）。
【００８４】
細胞生着および分布を改善するため、内皮細胞を無細胞肺足場中にＰＡおよびＰＶの両方に通す灌流により送達した。再播種無細胞ラット肺の内皮被覆を定量的に評価するため、豊富な肺細胞外マトリックスタンパク質ラミニンについての免疫染色と、ＣＤ３１染色（図５Ｆ−Ｉ）により標識される再内皮化の区域との間の重複の程度を計測する。
【００８５】
動脈および静脈送達の組合せは、内皮細胞のより大きな被覆およびより均一な分布をもたらした（図５Ｆ−ｉｖ、Ｈ）。播種１日後に得られた内皮被覆の定量は、動脈および静脈送達の組合せから得られた内皮被覆が、動脈送達単独により産生されたものよりも有意に高いことを示した（３３．２％±２．９％対１６．３％±１．４％、ｐ＜０．０１）（図５Ｇ）。マイクロスフェア灌流下で観察されるとおり、定圧下での動脈および静脈内皮送達の組合せは、主要気道枝中の内皮細胞の不存在下で血管コンパートメントに高度に特異的であり（図８）、それにより脱細胞化後の血管基底膜の統合性を裏付けた。
【００８６】
実施例３
インビトロ培養の間の血管成熟
本実施例の目的は、複雑な三次元足場（例えば、無細胞肺足場）中でインビボ血管発生を厳密に模倣する効率的および能動的な血管リモデリングを実証することである。細胞送達および保持後、内皮細胞が充填された無細胞血管床から、灌流可能な血管腔への移行は、インビボ血管発生を厳密に模倣する能動的な血管リモデリングに依存する。
【００８７】
方法
ＨＵＶＥＣを用いて再生させる無細胞ラット肺の長期インビトロ培養のため、約４０００万個のＨＵＶＥＣを無細胞肺足場中に上記のとおりＰＡおよびＰＶの両方からに播種し、ＥＧＭ−２中で１４日間培養し（ｎ＝３）、ＰＡおよびＰＶの両方から１ｍｌ／分においてそれぞれの側から灌流させた。培地を１日おきに交換した。
【００８８】
ＨＵＶＥＣおよびｈＭＳＣを用いて再生させる無細胞ラット肺（ＨＵＶＥＣ−ｈＭＳＣ肺と称される）の２段階培養のため、４０００万個のＨＵＶＥＣを２０００万個のｈＭＳＣと混合し、無細胞肺足場中に上記のとおりＰＡおよびＰＶの両方から播種した。２時間の静置培養後、灌流を１ｍｌ／分においてＰＡおよびＰＶの両方から再開した。１日目から開始して、ＰＶカニューレを解放し、灌流をＰＡ単独からの４ｍｌ／分に切り替え、それを培養の終了まで保持した。ＨＵＶＥＣ−ｈＭＳＣ再生肺を合計８日間培養し、最初の６日間は血管新生培地中で、後続の２日間は安定化培地中で培養した。
【００８９】
血管新生培地は、１０％のＦＢＳ、１％のインスリン−トランスフェリン−セレン（Ｇｉｂｃｏ）、アスコルビン酸（５０ｍｇ／ｍｌ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、組換えヒトＶＥＧＦ（４０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（４０ｎｇ／ｍｌ）および１％のＰ／Ｓが補給されたＭｅｄｉｕｍ１９９（Ｇｉｂｃｏ）であった。
【００９０】
安定化培地は、２％のＦＢＳ、１％のインスリン−トランスフェリン−セレン、アスコルビン酸（５０ｍｇ／ｍｌ）、組換えヒトＶＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ホルスコリン（１０μＭ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ヒドロコルチゾン（１１０ｎＭ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）および１％のＰ／Ｓが補給されたＭｅｄｉｕｍ１９９であった。機能的および組織学的評価のためにＨＵＶＥＣ−ｈＭＳＣ再生肺を８日目に回収した。
【００９１】
結果：
段階Ｉの間、肺を高レベルの血清および血管新生成長因子（血管新生培地と称される）に曝露して内皮生存、遊走および血管リモデリングを促進した。しかしながら、血管新生促進因子は、内皮透過性の増加および障壁機能の減少をもたらし得る。この傾向を弱めるため、培養の段階２は、内皮透過性を低減させ、障壁機能を改善するより低いレベルの血清および血管新生成長因子（例えば、ホルスコリンおよびヒドロコルチゾン）を含有する安定化培地を使用して予め形成された血管系を安定化させ、障壁機能を強化する（図７Ａ）。血管新生培地は、１０％のＦＢＳ、１％のインスリン−トランスフェリン−セレン（Ｇｉｂｃｏ）、アスコルビン酸（５０ｍｇ／ｍｌ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、組換えヒトＶＥＧＦ（４０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（４０ｎｇ／ｍｌ）および１％のＰ／Ｓが補給されたＭｅｄｉｕｍ１９９（Ｇｉｂｃｏ）であった。安定化培地は、２％のＦＢＳ、１％のインスリン−トランスフェリン−セレン、アスコルビン酸（５０ｍｇ／ｍｌ）、組換えヒトＶＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ホルスコリン（１０μＭ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ヒドロコルチゾン（１１０ｎＭ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）および１％のＰ／Ｓが補給されたＭｅｄｉｕｍ１９９であった。
【００９２】
例えば、血管新生誘導因子または阻害剤への短時間曝露後の障壁機能に対する培地の効果を試験するため、デキストランｔｒａｎｓｗｅｌｌ透過性アッセイを使用した。再生肺の長期インビトロ培養の間の内皮透過性に対する培地の機能を評価するため、デキストランｔｒａｎｓｗｅｌｌ透過性アッセイを、血管新生培地および安定化培地にＨＵＶＥＣ単層を２日間曝露させることにより改変してそれらの慢性効果を試験した。安定化培地中で培養されたＨＵＶＥＣ単層は、血管新生培地中で培養されたものと比較して有意に改善された障壁機能を示した（図７Ｂ）。
【００９３】
無細胞ラット肺足場をベースとして肺血管系を再生させるため、ＨＵＶＥＣおよび血管周囲支持ｈＭＳＣを同時播種し、再生肺（ＨＵＶＥＣ−ｈＭＳＣ肺と称される）を血管新生培地中で６日間培養し、次いで安定化培地中で２日間培養した。血管リモデリングおよび再生に対するこの同時播種および培養方針の効力を評価するため、内皮被覆を定量した。内皮送達１日後におけるものと比較した２段階培養の終了時におけるＨＵＶＥＣ−ｈＭＳＣ肺の内皮被覆の有意な増加（５４．０％±５．０％対３３．２％±２．９％、ｐ＜０．０１）（図７Ｃ）。広視野結合画像は、肺全体にわたる内皮被覆の均一性をさらに裏付けた（図７Ｄ）。比較として、無細胞ラット肺足場に、血管周囲細胞を用いずにＨＵＶＥＣのみを播種し、この再生肺（ＨＵＶＥＣ肺と称される）を慣用のＥＧＭ−２培地中で１４日間培養した。内皮細胞は培養期間全体にわたりＨＵＶＥＣ肺中で生存したままであったが、慣用の培養の終了時における内皮被覆は、播種１日後におけるものと比較してわずかに増加したにすぎず（３４．５％±１．６％対３３．２％±２．９％、ｐ＝０．５５）、２段階培養後のＨＵＶＥＣ−ｈＭＳＣ肺中のものよりも有意に低かった（３４．５％±１．６％対５４．０％±５．０％、ｐ＜０．０１）。これは、再生肺培養における血管リモデリングの促進において血管周囲支持細胞および成長因子刺激を含める利益を実証する（図７Ｃ）。
【００９４】
２段階培養の終了時におけるＨＵＶＥＣ−ｈＭＳＣ再生肺において、内皮細胞は相互接続されてネットワークを形成した一方、ｈＭＳＣは血管ネットワークに接着している個々の細胞として出現した（図７Ｅ〜Ｉ）。これは、天然肺における内皮−周皮細胞組織化を厳密に模倣した。頂側膜−基底膜極性の確立は、血管腔形成についての主要な形態学的布石の１つである。血管腔表上のポドカリキシン様（ＰＯＤＸＬ）および基底表面上のコラーゲンＩＶ（ＣＯＬＩＶ）の特異的局在化は、培養の終了時においてＨＵＶＥＣ−ｈＭＳＣ再生肺中で観察することができる（図７Ｅ−ｉｉ）。これは、大血管および毛細血管レベルの両方における管腔形成を裏付けた。障壁特性を評価するため、タイトジャンクションをＺＯ−１染色、および２段階培養の終了までの内皮境界におけるＺＯ−１タンパク質の濃縮観察により試験した（図７Ｅ−ｉｉｉ）。
【００９５】
実施例４
血管機能のインビトロおよびインビボ評価
本実施例の目的は、単離臓器培養の間の再生肺の血管機能を評価する非侵襲的方法を実証することである。
【００９６】
方法
試験肺を１５０ｃｍペトリ皿の頂部上に伏臥位で配置し、ＰＡを灌流経路に接続させ、ＰＶカニューレを肺の高さに開口させ、気管カニューレをＰＡのものよりも約５ｃｍ高い高さに開口させた。２５ｍｌのＰＢＳまたは５００ｋＤａデキストラン（０．２ｍｇ／ｍｌ）を含有する培地を肺中に２０ｍｍＨｇに等しい重力下で灌流させた。灌流の間、ＰＶカニューレおよび肺末梢から排出させた流体をそれぞれＰＶ流体および末梢流体として回収した。灌流後、気管カニューレを下げ、気道中に蓄積した流体が別個のペトリ皿中に気管流体として排出することを可能とした。次いで、シリンジを使用して５ｍｌのブランク灌流液を気管カニューレ中に投与した。シリンジの除去後に気管カニューレから受動的に排出された流体をＢＡＬ流体として回収した。ＰＶ、末梢、気管およびＢＡＬ流体中のデキストランの総量を、蛍光強度および体積の計測により定量した。
【００９７】
デキストラン濃度は、蛍光強度から標準曲線に基づき計算した。ＰＶ流体中のデキストランを血管内デキストランと称した一方、末梢、気管およびＢＡＬ流体中のデキストランを血管外デキストランと称した。デキストラン灌流およびＢＡＬアッセイを、新鮮単離死体ラット肺（ｎ＝３）に対して、無細胞ラット肺（ｎ＝３）に対して、および６時間の低温虚血への曝露後の死体ラット肺（ｎ＝４）に対して実施した。６時間の低温虚血は、新鮮単離ラット肺を氷冷ＰＢＳ中で４℃において６時間インキュベートすることにより生成した。デキストラン灌流およびＢＡＬアッセイは、ＨＵＶＥＣ−ｈＭＳＣ再生ラット肺に対しても培養の３、６および８日目に実施し（ｎ＝３）、ｈｉＰＳＣ再生ラット肺に対しては培養の２、４および６日目に実施した（ｎ＝３）。
【００９８】
ＨＵＶＥＣ−ｈＭＳＣ（ｎ＝３）およびｈｉＰＳＣ（ｎ＝３）再生ラット肺中のＰＡ圧は、ＰｒｅｓｓｕｒｅＭＡＴ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｕｓｅ  Ｓｅｎｓｏｒ（ＰｅｎｄｏＴＥＣＨ）を使用して毎日計測し、ＨＡＲＴ−Ｒｅｇｅｎソフトウェア（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して記録した。それぞれの計測前、ＰＡ灌流を５〜１０分間中断し、圧力がベースラインに戻り、安定化することを可能とし、ベースライン圧を５分間記録した。次いで、ＰＡ灌流を４ｍｌ／分において再開し、ＰＡ圧を２時間記録した。それぞれの計測の終了時、ＰＡ灌流を再度５分間中断して記録前後の圧力ベースラインの有意なドリフトが存在しないことを確保した。ＰＡ圧は、灌流の間の平均圧力をベースラインのものだけ差し引くことにより計算した。
【００９９】
湿／乾比を計測するため、それぞれの肺の副葉を解剖し、乾燥プラスチック表面上に３０秒間配置し、流体が主要血管から排出することを可能とし、次いで湿重量を計測した。同一副葉の乾重量を、一晩凍結乾燥させた後に計測した。湿／乾比は、湿重量を乾重量により割ることにより計算した。湿／乾比の計測は、デキストラン灌流およびＢＡＬアッセイ直後、死体ラット肺（ｎ＝３）に対して、無細胞ラット肺（ｎ＝３）に対して、および６時間の低温虚血への曝露後の死体ラット肺（ｎ＝４）に対して実施した。湿／乾比の計測は、培養の終了時にＨＵＶＥＣ−ｈＭＳＣ（ｎ＝３）およびｈｉＰＳＣ（ｎ＝３）再生肺に対して実施した。
【０１００】
再生ラット肺の同所移植を、免疫抑制を用いてＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（３５０〜４００ｇ）に対して実施した。免疫抑制は、移植前日から開始する９０％のオリーブ油（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および１０％のエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で調製されたシクロスポリンＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の１０ｍｇ／ｋｇ／日における皮下注射により達成した。同所移植は、改変して既に記載されているとおり実施した２。手短に述べると、再生肺グラフト（ＨＵＶＥＣ−ｈＭＳＣ再生肺についてｎ＝３およびｈｉＰＳＣ再生肺についてｎ＝３）を、移植直前に２０ｍｍＨｇ下で１００ｍｌの氷冷ヘパリン化（１０単位／ｍｌ）ＰＢＳによりフラッシュした。再生左肺を解剖し、左主要気管支を結紮し、１６Ｇカフを左主要ＰＡおよびＰＶ中で配置した。レシピエントラットを加熱パッド上で右側臥位で配置し、５％のイソフルラン（Ａｂｂｏｔｔ）により麻酔し、１６Ｇ気管内チューブ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を挿管し、１００％のＯ２（Ａｉｒｇａｓ）を供給するげっ歯類換気装置（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）により換気した。全身ヘパリン化は、皮下注射を介して実施した。左前開胸術後、左主要気管支を識別し、結紮し、結紮の遠位側で切開した。左主要ＰＡおよびＰＶを識別し、円周方向に解剖し、左門近くで切開した。肺動脈および静脈カフをレシピエントの血管中に挿入し、７−０絹縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ）により固定した。移植２時間後にエノキサパリン（２ｍｇ／ｋｇ、ＮＯＶＡＰＵＬＳ）を皮下投与し、次いで１日２回投与した。移植３日後、レシピエントラットを安楽死させ、再生グラフトを解剖した。グラフトの灌流可能性を蛍光マイクロ血管造影により分析した。
【０１０１】
結果
単離臓器培養の間の再生肺の血管機能を評価する非侵襲的方法を、連続的気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を使用して実施して再生肺の灌流可能性および障壁機能を試験した。肺微小血管水透過性および血管灌流可能性を試験するためのトレーサーとして５００ｋＤａのデキストランが使用されており、その溢出は巨大分子漏出を示す。ＦＩＴＣコンジュゲート５００ｋＤａデキストランをインビトロ肺灌流のためのトレーサーとして使用して肺血管灌流可能性および脱細胞化前後の漏出を評価し、無細胞足場の再内皮化後の潜在的な変化を評価した。デキストラン溶液を、ＰＡに通して２０ｍｍＨｇ下で灌流させ、次いで５ｍｌのブランク灌流液を気管中に投与して気道コンパートメント中に漏出したデキストランを回収した（図７Ｆ）。次いで、ＰＶ、気管（ＢＡＬを含む）および肺末梢から排出したデキストランの総量を、蛍光強度および体積の計測により定量した。
【０１０２】
原理の証明として、このインビトロ灌流およびＢＡＬアッセイを新鮮単離死体肺に対して、６時間の低温虚血への曝露後の肺に対して、および無細胞肺に対して実施した。死体肺は、血管コンパートメント内で１００．０％±０．０％のデキストランを保持した一方、無細胞肺のそれは１０．０％±８．０％（ｐ＜０．０１、死体肺と比較）（図７Ｇ）であり、それは予測されたものであった。それというのも、デキストランに対する障壁機能が生存および機能的内皮に依存的である一方、デキストランが一定灌流の間に経時的に露出血管基底膜を通過して拡散するためである。６時間の低温虚血後の肺は、障壁機能の減衰および８７．０％±５．４％のデキストランの保持率を示し、それは死体肺のものよりも有意に低く（ｐ＜０．０５）、無細胞肺のものよりも有意に高かった（ｐ＜０．０１）（図７Ｇ）。次に、インビトロ灌流およびＢＡＬアッセイを、ＨＵＶＥＣ−ｈＭＳＣ再生肺に対して２段階インビトロ培養の間の３つの異なる時点（３、６および８日目）において実施した。ＨＵＶＥＣ−ｈＭＳＣ再生肺のデキストラン保持率は、培養期間にわたり、３日目の５２．８％±４．２％から、６日目の７５．９±３．１％、８日目の８０．２％±５．３％に徐々に増加した（図７Ｈ）。培養の終了時におけるＨＵＶＥＣ−ｈＭＳＣ再生肺中のデキストラン保持率は、無細胞肺のものよりも有意に高く（ｐ＜０．０１）、死体肺のものよりも有意に低く（ｐ＜０．０５）、６時間の低温虚血後の肺のものよりもわずかに低いが有意に異なることはなかった（ｐ＝０．１６）。観察された培養にわたる血管コンパートメント内のデキストラン保持率の増加は、血管成熟を伴う障壁機能の改善を示した。
【０１０３】
障壁機能の改善と並行して、培養の間の血管耐性の定常減少が生じた。例えば、定速灌流（４ｍｌ／分）下での毎日のＰＡ圧モニタリングにより、培養期間にわたるＰＡ圧の定常減少および１日目と比較した培養の終了時における４８．２％±１５．０％への到達（ｐ＜０．０５）が明らかになった（図７Ｉ）。球状グラフト流体ホメオスタシスのマーカーとして、単離臓器培養の終了時における湿乾比を計測した。再生肺の湿／乾比は２６．６±１．９であり、それは無細胞肺のものよりも有意に低く（５５．７±７．９、ｐ＜０．０５）、死体肺のものよりも有意に高く（９．２±０．２、ｐ＜０．０１）、６時間の低温虚血後の肺よりも有意に高かった（１２．８±２．０、ｐ＜０．０１）（図７Ｊ）。これは、肺流体バランスが内皮、間質、および上皮機能、例えば、肺胞内液の能動的吸収、およびリンパ管を介する間質液の除去に依存する事実により説明することができる２６，２７。本実験において、能動的構成要素の１つのみ、内皮が再生された。
【０１０４】
別の実験において、ＨＵＶＥＣ−ｈＭＳＣ再生左肺を、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット中に同所位置で免疫抑制を用いて移植した。再生グラフト全体にわたる均一血液灌流は、再灌流直後に観察することができる（図７Ｋ）。肺血管は、蛍光マイクロ血管造影により確認されるとおり移植３日後に灌流可能なままであった（図７Ｌ）。
【０１０５】
実施例５
臨床関連内皮および血管周囲細胞の誘導ならびに小型動物モデルにおける肺血管再生のためのそれらの使用
本実施例の目的は、二次元培養をベースとするスケーラブルな細胞分化プロトコルを実証することである。例示的なスケーラブル細胞分化プロトコルは、分化前の間のＣＨＩＲ９９０２１によるＷｎｔ活性化、分化の終了時におけるＳＢ４３１５４２によるＴＧＦ−β阻害および分化全体の間の低酸素培養を取り込む。低酸素培養条件は、細胞を培養するインキュベーター中４％のＯ２として定義される。
【０１０６】
方法−臨床関連内皮および血管周囲細胞の誘導
内皮および血管周囲細胞分化を、低（４％）酸素下で実施した。−２日目、ＢＪＲｉＰＳ細胞をａｃｃｕｔａｓｅ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により単一細胞に解離させ、１０μＭのＲｏｃｋ阻害剤（Ｙ−２７６３２、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を有するｍＴｅＳＲ（商標）１中で再懸濁させ、コラーゲンＩＶ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりコートされた６ウェルプレート上に２００，０００個の細胞／ウェルにおいて播種した。−１日目、ＢＪＲｉＰＳ細胞をＣＨＩＲ９９０２１（１２μＭ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）によりｍＴｅＳＲ（商標）１中で２４時間処理した。０日目から開始して、ＢＪＲｉＰＳ細胞を完全分化培地中で分化させ、培地を１日おきに交換した。完全分化培地は、２０％のＢＩＴ９５００（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、モノチオグリセロール（４５０μＭ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％のＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１％のＧｌｕｔａＭＡＸ、１％のＰ／Ｓ、組換えヒトＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）およびｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）が補給されたＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）であった１。４日目から６日目まで、完全分化培地にＳＢ４３１５４２（１０μＭ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）をさらに補給した。
【０１０７】
分化６日目、ＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して細胞を単一細胞に解離させ、ヒトＣＤ３１−ＢＶ６０５およびＣＤ１４０ｂ−ＰＥ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）または適切なアイソタイプ対照により染色し、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により分離した。ＢＪＲｉＰＳ由来内皮細胞（ｈｉＰＳＣ−ＥＣ）をＣＤ３１＋ＣＤ１４０ｂ−集団として定義し、ＢＪＲｉＰＳ由来血管周囲前駆細胞（ｈｉＰＳＣ−ＰＰＣ）をＣＤ３１−ＣＤ１４０ｂ＋集団として定義した。ＦＡＣＳ単離後、ｈｉＰＳＣ−ＥＣおよびｈｉＰＳＣ−ＰＰＣを２０％の規定ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）および１％のＰ／Ｓが補給されたヒドロコルチゾンを有さないＥＧＭ−２であるＥＧＭ−ＦＢＳ−ＳＢ培地を使用してコラーゲンＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）コートフラスコ中で培養した。平滑筋細胞様表現型への分化のため、ｈｉＰＳＣ−ＰＰＣをＳｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ−２（ＳｍＧｍ２、Ｌｏｎｚａ）中で６日間培養した。
【０１０８】
ｈｉＰＳＣ−ＥＣの成長曲線を作成するため、１５０，０００個のｈｉＰＳＣ−ＥＣをコラーゲンＩコートＴ７５フラスコ上にトリプリケートで播種し、ＥＧＭ−ＦＢＳ−ＳＢ培地中で培養した。それぞれの細胞継代の間、それぞれのフラスコの細胞数を計数し、次の継代のために１５０，０００個のｈｉＰＳＣ−ＥＣを播種した。
【０１０９】
結果−臨床関連内皮および血管周囲細胞の誘導
成体肺中で、ＣＤ３１およびＣＤ１４０ｂは内皮細胞および周皮細胞をそれぞれ標識する。分化した細胞を両方のマーカーの発現についてフローサイトメトリーによりアッセイした。分化の終了時、得られた細胞混合物は、２つの主要な細胞タイプから構成された：ＣＤ３１＋ＣＤ１４０ｂ−内皮細胞（ｈｉＰＳＣ−ＥＣ、５５．１％±４．２％）およびＣＤ３１−ＣＤ１４０ｂ＋血管周囲前駆細胞（ｈｉＰＳＣ−ＰＰＣ、２２．１％±２．９％）。これら２つの血管細胞タイプは分化全体の７７．２％±６．３％を構成し（図９Ｂ、Ｃ）、血管細胞タイプへのこの分化の高効率および特異性を実証した。ｈｉＰＳＣ−ＥＣは、内皮マーカー（ＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリンおよびＫＤＲ）を均一に発現したが、血管周囲マーカー（ＣＤ１４０ｂ）も、平滑筋マーカー（α−平滑筋アクチン、α−ＳＭＡ）も、造血マーカー（ＣＤ４５）も発現しなかった（図９Ｄおよび図１０Ａ〜Ｃ）。
【０１１０】
ＦＢＳ補給ＥＧＭ−２培地は、ヒト血液由来内皮前駆細胞の拡張を支持することが示されている（Ｍｅｌｅｒｏ−Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  １０９，４７６１−４７６８（２００７））。ＳＢ４３１５４２は、ヒト胚性幹細胞由来内皮細胞のインビトロ拡張を改善することが示されている。（Ｊａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＴＧＦｂｅｔａ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｓ  Ｉｄ１  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８，１６１−１６６（２０１０））。ヒト肺は、２２００億個の細胞を含有することが予測され、その３０％は毛細血管内皮細胞である。本明細書において、記載される培地は、２０％のＦＢＳおよびＳＢ４３１５４２の両方をＥＧＭ−２へのサプリメントとして組み合わせる（ＥＧＭ−ＦＢＳ−ＳＢ培地と称される）。このＥＧＭ−ＦＢＳ−ＳＢ培地は、精製ｈｉＰＳＣ−ＥＣの、ヒトサイズ化肺のエンジニアリングに十分なレベルへの効率的な拡張を可能とした（図９Ｅ）。
【０１１１】
拡張の終了まで、ｈｉＰＳＣ−ＥＣは内皮マーカーの均一な発現を維持した。精製ｈｉＰＳＣ−ＰＰＣはＣＤ１４０ｂを均一に発現したが、内皮ＣＤ３１を均一に発現しなかった。ｈｉＰＳＣ−ＰＰＣの半数超は、周皮細胞マーカーＮＧ２も発現した（図９Ｆ）。
【０１１２】
周皮細胞は、平滑筋細胞および他の間葉細胞になる可塑性を有する多能性細胞であり、それはインビボ血管リモデリングおよびインビトロ分化の間に観察されている。この潜在性を示すため、平滑筋分化をｈｉＰＳＣ−ＰＰＣにおいて、培養培地をＳｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ−２（ＳｍＧｍ−２）に切り替えることにより誘導した。拡張培地（ＥＧＭ−ＦＢＳ−ＳＢ）中で拡張される細胞の目標数に応じて数日〜数週間培養した場合、ｈｉＰＳＣ−ＰＰＣは増殖性のままであり、低レベルの平滑筋マーカー（α−ＳＭＡおよびカルポニン）を発現した。培養期間は、拡張から達成すべき細胞の目標数に応じて数日間〜数週間の範囲であり得る。ＳｍＧｍ−２中での６日間の培養後、ｈｉＰＳＣ−ＰＰＣは増殖性が低くなり、高レベルのα−ＳＭＡおよびカルポニンを発現した（図９Ｇ、Ｈ）。
【０１１３】
方法−ｈｉＰＳＣ−ＥＣおよびｈｉＰＳＣ−ＰＰＣを用いて再生させる無細胞ラット肺葉の２段階培養
４０００万個のｈｉＰＳＣ−ＥＣを２０００万個のｍＣｈｅｒｒｙ標識ｈｉＰＳＣ−ＰＰＣと混合し、無細胞肺足場中に上記のとおりＰＡおよびＰＶの両方から播種した。２時間の静置培養後、灌流を１ｍｌ／分においてＰＡおよびＰＶの両方から再開させた。１日目から開始して、ＰＶカニューレを解放し、灌流をＰＡ単独からの４ｍｌ／分に切り替え、それを培養終了まで維持した。ｈｉＰＳＣ再生肺を、最初の４日間の間、ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ、５０ｎｇ／ｍｌ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が補給された血管新生培地中で培養し、次いでさらに２日間、安定化培地中で培養した。６日目に機能的および組織学的評価のためにｈｉＰＳＣ再生肺を回収した。
【０１１４】
ｈｉＰＳＣ由来細胞を使用して肺血管系を再生させるため、無細胞ラット肺にｈｉＰＳＣ−ＥＣおよびＰＰＣを同時播種し、それらのｈｉＰＳＣ再生肺を連続的に、血管新生培地を用いて連続灌流下で４日間培養し、さらに２日間安定化させた。ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）は、効率的な血管リモデリングを容易にすることが示されており、したがって、血管新生培地に、ｈｉＰＳＣ再生肺培養のためのＰＭＡを補給して内皮生存および血管リモデリングを促進した。
【０１１５】
結果：ｈｉＰＳＣ−ＥＣおよびｈｉＰＳＣ−ＰＰＣを用いて再生させる無細胞ラット肺葉の２段階培養
培養の終了まで、生存内皮ネットワークは肺全体にわたり存在した。さらに、血管周囲腔中へのｈｉＰＳＣ−ＰＰＣのホーミングは、トランスジェニックｍＣｈｅｒｒｙ標識およびＣＤ１４０ｂ発現の両方により確認した（図１１Ａ、Ｂ）。生理学的頂側膜−基底膜極性をｈｉＰＳＣ再生肺中で再確立させ、ｈｉＰＳＣ由来血管細胞を使用する血管腔形成を示した（図１１Ｃ）。ＨＵＶＥＣ−ｈＭＳＣ再生肺における機能的なリードアウトと同様に、ｈｉＰＳＣ再生肺におけるデキストラン保持率は培養期間にわたり徐々に増加し、２日目に３９．６％±１．２％、４日目に６１．２％±４．２％および６日目に６７．３％±２．５％に達した（図１１Ｄ）。毎日のＰＡ圧モニタリングは、１日目と比較して３日目に６４．８％±１０．６％に達した培養の最初の３日間の間のＰＡ圧の定常減少を示し、それはその後も安定したままであった（図１１Ｅ）。ｈｉＰＳＣ再生肺の湿／乾比は２５．１±６．１（図１１Ｆ）であり、それはＨＵＶＥＣ−ｈＭＳＣ再生肺のものと有意に異なることはなかった（ｐ＝０．８３）。ｈｉＰＳＣ再生左肺内の灌流可能な血管は、蛍光マイクロ血管造影により示されるとおり同所移植の３日後において検出することができる（図１１Ｇ）。
【０１１６】
まとめると、ｈｉＰＳＣ由来血管細胞を使用して無細胞ラット肺をベースとして肺血管系を再生させ、一次ヒト内皮および血管周囲細胞を使用して達成されたものと類似する形態学的および機能的布石を達成した。
【０１１７】
実施例６
ヒトスケールの肺血管系の再生および肺組織の機能性の評価
本実施例の目的は、ヒトスケールの肺血管系を再生させる能力を実証し、肺組織の機能性を評価することである。スケーラブル細胞分化プロトコルは、分化前の間のＣＨＩＲ９９０２１によるＷｎｔ活性化、分化の終了時におけるＳＢ４３１５４２によるＴＧＦ−β阻害および分化全体の間の低酸素培養を取り込む。
【０１１８】
方法−ｈｉＰＳＣ−ＥＣおよびｈｉＰＳＣ−ＰＰＣを用いて再生させる無細胞ヒト肺葉の２段階培養
脱細胞化ヒト肺の右上葉を解剖し、バーブ型ルアーアダプター（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）を使用して主要ＰＡおよびＰＶの両方にカニューレ挿入した。無細胞ヒト肺葉を、ヒトフィブロネクチン（２．５μｇ／ｍｌ）を有する１Ｌのハンクス平衡塩溶液によるＰＡおよびＰＶの両方からの１０ｍｌ／分における灌流により１時間プライミングし、次いでハンクス平衡塩溶液により１時間洗浄し、培地中で平衡化した。２億８２００万個のｈｉＰＳＣ−ＥＣおよび１億２５００万個のｍＣｈｅｒｒｙ−標識ｈｉＰＳＣ−ＰＰＣを混合し、１Ｌの培地中で再懸濁させ、２つの播種チャンバ（それぞれ、５００ｍｌの細胞懸濁液を有する）中に分離した。細胞を５０ｍｍＨｇに等しい重力下でＰＡおよびＰＶの両方から同時に播種した。２時間の静置培養後、灌流を１０ｍｌ／分においてＰＡおよびＰＶの両方から再開した。ｈｉＰＳＣ再生ヒト肺葉を血管新生培地（ＰＭＡ、５０ｎｇ／ｍｌを含有）中で最初の４日間培養し、次いで安定化培地中でさらに２日間培養した。６日目に機能的および組織学的評価のためにｈｉＰＳＣ再生ヒト肺葉を回収した。
【０１１９】
方法−再生ヒト肺中のレザズリン灌流
ｈｉＰＳＣ再生ヒト肺葉中で生存細胞を可視化するため、レザズリン灌流を培養の６日目に実施した。手短に述べると、４０ｍｌのＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を約１．５Ｌの培養培地中で希釈し、再生ヒト肺葉に通して１０ｍｌ／分においてＰＡおよびＰＶの両方から２時間灌流させた。
【０１２０】
結果−再生ヒト肺中のレザズリン灌流
げっ歯類モデルを使用する本明細書に記載の方法を、ヒトサイズ化肺の肺血管系の再生にアップスケールした。例えば、上記のとおり生成した２億８２００万個のｈｉＰＳＣ−ＥＣおよび１億２５００万個のｈｉＰＳＣ−ＰＰＣの混合物を、無細胞ヒト肺葉の主要ＰＡおよびＰＶ中に送達した（図１２Ａ、Ｂ）。再播種ヒト肺葉を血管新生培地（ＰＭＡを含有）中で４日間培養し、次いで安定化培地中でさらに２日間培養した。葉全体にわたる血管細胞の一般的分布を可視化し、それらの生存を評価するため、レザズリン灌流アッセイを開発した。レザズリンベース試薬は、生存細胞により代謝可能になる場合に赤色に変化し、したがって、生存細胞の分布を示す。２時間のレザズリン灌流後、再生ヒト肺葉の推定６０％超が、細胞化を示す赤色により強調された（図１２Ｂ−ｉｖ）。これは、培養の終了時における組織学的分析により裏付けられ、ラット肺再生において達成されたものと類似する最適な内皮分布を示した（図１２Ｃ）。血管ネットワーク周囲のｈｉＰＳＣ−ＰＰＣの厳密な会合も、トランスジェニックｍＣｈｅｒｒｙ標識およびＣＤ１４０ｂ染色の両方により示される再生ヒト肺葉中で再現された（図１２Ｄ）。血管腔構造は容易に検出することができ（図１２Ｃ）、その灌流可能性は蛍光マイクロ血管造影により実証された（図１２Ｅ）。まとめると、本明細書に記載の、および無細胞ラット肺をベースとする細胞送達および臓器培養方針をアップスケールしてｈｉＰＳＣ由来細胞を使用してヒト肺血管系を再生させることができる。
【０１２１】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明とともに記載した一方、上記の説明は本発明を説明するものであり、その範囲を限定するものではないことを理解すべきである。本発明の主旨および範囲から逸脱せずに種々の改変を行うことができることを理解されたい。したがって、他の実施形態は以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
2018526016.tif 000003
【図２Ａ】
2018526016.tif 000004
【図２Ｂ】
2018526016.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
2018526016.tif 000008
【図５Ｂ】
2018526016.tif 000009
【図５Ｃ】
2018526016.tif 000010
【図５Ｄ】
2018526016.tif 000011
【図５Ｅ】
2018526016.tif 000012
【図５Ｆ】
2018526016.tif 000013
【図５Ｇ】
2018526016.tif 000014
【図５Ｈ】
2018526016.tif 000015
【図６】
2018526016.tif 000016
【図７Ａ】
2018526016.tif 000017
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図７Ｋ】
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【図７Ｌ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図１０Ａ−Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【国際調査報告】
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