(57)【要約】本発明はメディンに特異的に結合する抗体を提供する。抗体は、メディンのモノマー形態、誤って折り畳まれた形態、凝集した形態、原線維の形態、または沈着した形態に結合する能力を有する。抗体を用いてメディン、メディンの蓄積またはメディン沈着物の蓄積（たとえば、メディンアミロイドーシス）に関連する疾患を治療することができ、またはその予防を達成することができる。数ある用途の中で、メディンアミロイドーシスを診断するために、及びメディンの凝集を阻害するまたは低減するために抗体を使用することもできる。【選択図】図１Ａ及び１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトメディンへの結合について抗体１８Ｇ１または６Ｂ３と競合する単離されたモノクローナル抗体。
【請求項２】
ヒトメディンにて１８Ｇ１または６Ｂ３と同じエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
メディンと特異的に結合し、且つネイティブのラクトアドヘリンには特異的に結合しない、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
メディンと特異的に結合し、且つＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上に発現されたネイティブのラクトアドヘリンには特異的に結合しない、請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
メディンがラクトアドヘリンから切断される際に作り出される新エピトープを特異的に認識する、請求項２に記載の抗体。
【請求項６】
モノマーまたはオリゴマーのメディンと特異的に結合し、且つ密に凝集したメディンまたはメディンの沈着物には特異的に結合しない、請求項２に記載の抗体。
【請求項７】
密に凝集したメディンまたはメディンの沈着物と特異的に結合し、且つモノマーまたはオリゴマーのメディンには特異的に結合しない、請求項２に記載の抗体。
【請求項８】
モノクローナル抗体１８Ｇ１の３つの軽鎖ＣＤＲと３つの重鎖ＣＤＲとを含み、１８Ｇ１が、配列番号３を含むアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号３６を含むアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを特徴とするマウス抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
前記３つの重鎖ＣＤＲがＫａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合によって定義されたとおりであり（配列番号４、５及び６）、且つ前記３つの軽鎖ＣＤＲがＫａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合によって定義されたとおりである（配列番号８、９及び１０）、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
モノクローナル抗体６Ｂ３の３つの軽鎖ＣＤＲと３つの重鎖ＣＤＲとを含み、６Ｂ３が、配列番号１１を含むアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号２９を含むアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを特徴とするマウス抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
前記３つの重鎖ＣＤＲがＫａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合によって定義されたとおりであり（配列番号１２、１３及び１４）、且つ前記３つの軽鎖ＣＤＲがＫａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合によって定義されたとおりである（配列番号１６、１７及び１８）、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
１８Ｇ１またはそのキメラ形態、ベニア化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）形態またはヒト化形態である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１３】
６Ｂ３またはそのキメラ形態、ベニア化形態またはヒト化形態である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体がヒト化抗体である、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１５】
ヒトメディンに特異的に結合するヒト化またはキメラの１８Ｇ１抗体であり、その際、１８Ｇ１が、配列番号３の成熟重鎖可変領域と配列番号３６の成熟軽鎖可変領域とを特徴とするマウス抗体である、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１６】
１８Ｇ１の前記３つの重鎖ＣＤＲを含むヒト化成熟重鎖可変領域と１８Ｇ１の前記３つの軽鎖ＣＤＲを含むヒト化成熟軽鎖可変領域とを含む、請求項１５に記載のヒト化抗体。
【請求項１７】
前記ＣＤＲがＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合、ＡｂＭ及びＣｏｎｔａｃｔの群から選択される定義のものである、請求項１６に記載のヒト化抗体。
【請求項１８】
前記ヒト化成熟重鎖可変領域が１８Ｇ１の前記３つのＫａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合の重鎖ＣＤＲ（配列番号４〜６）を含み、前記ヒト化成熟軽鎖可変領域が１８Ｇ１の前記３つのＫａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合の軽鎖ＣＤＲ（配列番号８〜１０）を含む、請求項１６に記載のヒト化抗体。
【請求項１９】
前記ヒト化成熟重鎖可変領域が１８Ｇ１の前記３つのＫａｂａｔ重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１配列番号４の残基６〜１０；ＣＤＲ−Ｈ２配列番号５、ＣＤＲ−Ｈ３配列番号６）を含み、前記ヒト化成熟軽鎖可変領域が１８Ｇ１の前記３つのＫａｂａｔ軽鎖ＣＤＲ（配列番号８〜１０）を含む、請求項１７に記載のヒト化抗体。
【請求項２０】
前記ヒト化成熟重鎖可変領域が１８Ｇ１の前記３つのＣｈｏｔｈｉａ重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１配列番号４の残基１〜７；ＣＤＲ−Ｈ２配列番号５の残基３〜８、ＣＤＲ−Ｈ３配列番号６）を含み、前記ヒト化成熟軽鎖可変領域が１８Ｇ１の前記３つのＣｈｏｔｈｉａ軽鎖ＣＤＲ（配列番号８〜１０）を含む、請求項１７に記載のヒト化抗体。
【請求項２１】
前記ヒト化成熟重鎖可変領域が１８Ｇ１の前記３つのＡｂＭ重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１配列番号４；ＣＤＲ−Ｈ２配列番号５の残基１〜１０、ＣＤＲ−Ｈ３配列番号６）を含み、前記ヒト化成熟軽鎖可変領域が１８Ｇ１の前記３つのＡｂＭ軽鎖ＣＤＲ（配列番号８〜１０）を含む、請求項１７に記載のヒト化抗体。
【請求項２２】
前記ヒト化成熟重鎖可変領域が１８Ｇ１の前記３つのＣｏｎｔａｃｔ重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１配列番号３の残基３０〜３５；ＣＤＲ−Ｈ２配列番号３の残基４７〜５９、ＣＤＲ−Ｈ３配列番号３の残基９７〜１０８）を含み、前記ヒト化成熟軽鎖可変領域が１８Ｇ１の前記３つのＣｏｎｔａｃｔ軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１配列番号３６の残基３０〜３６；ＣＤＲ−Ｌ２配列番号３６の残基４６〜５５、ＣＤＲ−Ｌ３配列番号３６の残基８９〜９６）を含む、請求項１６に記載のヒト化抗体。
【請求項２３】
配列番号３４〜３５のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するヒト化成熟重鎖可変領域と配列番号３７〜３９のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するヒト化成熟軽鎖可変領域とを含む、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載のヒト化抗体。
【請求項２４】
以下の位置の少なくとも１つが特定されるようなアミノ酸によって占有される：Ｌ３位がＶによって占有され、Ｌ１０位がＳによって占有され、Ｌ１３位がＶによって占有され、Ｌ１５位がＰによって占有され、Ｌ１９位がＡによって占有され、Ｌ２０位がＳによって占有され、Ｌ２２位がＳによって占有され、Ｌ４２位がＱによって占有され、Ｌ７０位がＤによって占有され、Ｌ７７位がＲによって占有され、Ｌ７８位がＶによって占有され、Ｌ８０位がＡによって占有され、及びＬ８５位がＶによって占有される、請求項２３に記載のヒト化抗体。
【請求項２５】
以下の位置の少なくとも１つが特定されるようなアミノ酸によって占有される：Ｌ３位がＶによって占有され、Ｌ１０位がＳによって占有され、Ｌ１３位がＶによって占有され、Ｌ１５位がＰによって占有され、Ｌ１９位がＡによって占有され、Ｌ２０位がＳによって占有され、Ｌ２２位がＳによって占有され、Ｌ２４位がＫによって占有され、Ｌ２８位がＮによって占有され、Ｌ２９位がＶによって占有され、Ｌ４２位がＱによって占有され、Ｌ４６位がＬによって占有され、Ｌ７０位がＤによって占有され、Ｌ７７位がＲによって占有され、Ｌ７８位がＶによって占有され、Ｌ８０位がＡによって占有され、及びＬ８５位がＶによって占有される、請求項１７に記載のヒト化抗体。
【請求項２６】
Ｌ３、Ｌ１０、Ｌ１３、Ｌ１５、Ｌ１９、Ｌ２０、Ｌ２２、Ｌ４２、Ｌ７０、Ｌ７７、Ｌ７８、Ｌ８０、及びＬ８５位がそれぞれＶ、Ｓ、Ｖ、Ｐ、Ａ、Ｓ、Ｓ、Ｑ、Ｄ、Ｒ、Ｖ、Ａ、及びＶによって占有されるという条件である、請求項２４に記載のヒト化抗体。
【請求項２７】
以下の位置の少なくとも１つが特定されるようなアミノ酸によって占有される：Ｈ１がＥまたはＱによって占有され、Ｈ５位がＶまたはＱによって占有され、Ｈ１３位がＱまたはＫによって占有され、Ｈ１９位がＲまたはＫによって占有され、Ｈ４０位がＡまたはＴによって占有され、Ｈ４２位がＧまたはＤによって占有され、Ｈ４４位がＧまたはＲによって占有され、Ｈ４９位がＳまたはＡによって占有され、Ｈ７７位がＳまたはＴによって占有され、Ｈ８２ａ位がＮまたはＳによって占有され、Ｈ８３位がＲまたはＫによって占有され、Ｈ８４位がＡまたはＳによって占有され、Ｈ８９位がＶまたはＭによって占有され、Ｈ９３がＶまたはＡによって占有され、Ｈ１０８位がＴまたはＭによって占有され、Ｌ４５位がＱによって占有され、Ｌ６０位がＤによって占有され、及びＬ８３位がＬによって占有される、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載のヒト化抗体。
【請求項２８】
以下の位置の少なくとも１つが特定されるようなアミノ酸によって占有される：Ｈ１位がＥまたはＱによって占有され、Ｈ５位がＶまたはＱによって占有され、Ｈ１３位がＱまたはＫによって占有され、Ｈ１９位がＲまたはＫによって占有され、Ｈ４０位がＡまたはＴによって占有され、Ｈ４２位がＧまたはＤによって占有され、Ｈ４４位がＧまたはＲによって占有され、Ｈ４９位がＳまたはＡによって占有され、Ｈ５０位がＧによって占有され、６３位がＴによって占有され、Ｈ７７位がＳまたはＴによって占有され、Ｈ８２ａ位がＮまたはＳによって占有され、Ｈ８３位がＲによって占有され、Ｈ８４位がＡによって占有され、Ｈ８９位がＶまたはＭによって占有され、Ｈ９３がＶまたはＡによって占有され、Ｈ１０８位がＴまたはＭによって占有される、請求項１７または２５に記載のヒト化抗体。
【請求項２９】
Ｈ１、Ｈ５、Ｈ１３、Ｈ１９、Ｈ４０、Ｈ４２、Ｈ４４、Ｈ４９、Ｈ７７、Ｈ８２ａ、Ｈ８３、Ｈ８４、Ｈ８９、Ｈ９３、及びＨ１０８位がそれぞれＥ、Ｖ、Ｑ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｇ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｖ、及びＴによって占有されるという条件である、請求項２７に記載のヒト化抗体。
【請求項３０】
Ｌ４５位、Ｌ６０位及びＬ８３位の少なくとも１つがそれぞれＱ、Ｄ及びＬによって占有されるという条件である、請求項２７に記載のヒト化抗体。
【請求項３１】
Ｌ４５位がＱによって占有されるという条件である、請求項２７に記載のヒト化抗体。
【請求項３２】
Ｌ６０位及びＬ８３位がそれぞれＤ及びＬによって占有されるという条件である、請求項２７に記載のヒト化抗体。
【請求項３３】
配列番号３４〜３５のいずれか１つに対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域と配列番号３８〜３９のいずれか１つに対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域とを含む、請求項２３に記載のヒト化抗体。
【請求項３４】
配列番号３４〜３５のいずれか１つに対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域と配列番号３８〜３９のいずれか１つに対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域とを含む、請求項３３に記載のヒト化抗体。
【請求項３５】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号３４〜３５のいずれかのアミノ酸配列を有し、且つ前記成熟軽鎖可変領域が配列番号３８〜３９のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、請求項３４に記載のヒト化抗体。
【請求項３６】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号３４のアミノ酸配列を有し、且つ前記成熟軽鎖可変領域が配列番号３８のアミノ酸配列を有する、請求項３５に記載のヒト化抗体。
【請求項３７】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号３４のアミノ酸配列を有し、且つ前記成熟軽鎖可変領域が配列番号３９のアミノ酸配列を有する、請求項３５に記載のヒト化抗体。
【請求項３８】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を有し、且つ前記成熟軽鎖可変領域が配列番号３８のアミノ酸配列を有する、請求項３５に記載のヒト化抗体。
【請求項３９】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を有し、且つ前記成熟軽鎖可変領域が配列番号３９のアミノ酸配列を有する、請求項３５に記載のヒト化抗体。
【請求項４０】
ヒトメディンに特異的に結合するヒト化またはキメラの６Ｂ３抗体であり、その際、６Ｂ３は、配列番号１１の成熟重鎖可変領域と配列番号２９の成熟軽鎖可変領域とを特徴とするマウス抗体である、請求項３５に記載の抗体。
【請求項４１】
６Ｂ３の前記３つの重鎖ＣＤＲを含むヒト化成熟重鎖可変領域と６Ｂ３の前記３つの軽鎖ＣＤＲを含むヒト化成熟軽鎖可変領域とを含む、請求項４０に記載のヒト化抗体。
【請求項４２】
前記ＣＤＲがＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合、ＡｂＭ及びＣｏｎｔａｃｔの群から選択される定義のものである、請求項４１に記載のヒト化抗体。
【請求項４３】
前記ヒト化成熟重鎖可変領域が６Ｂ３の前記３つのＫａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合の重鎖ＣＤＲ（配列番号１２〜１４）を含み、且つ前記ヒト化成熟軽鎖可変領域が６Ｂ３の前記３つのＫａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合の軽鎖ＣＤＲ（配列番号１６〜１８）を含む、請求項４２に記載のヒト化抗体。
【請求項４４】
前記ヒト化成熟重鎖可変領域が６Ｂ３の前記３つのＫａｂａｔの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１配列番号１２の残基６〜１２；ＣＤＲ−Ｈ２配列番号１３、ＣＤＲ−Ｈ３配列番号１４）を含み、且つ前記ヒト化成熟軽鎖可変領域が６Ｂ３の前記３つのＫａｂａｔの軽鎖ＣＤＲ（配列番号１６〜１８）を含む、請求項４２に記載のヒト化抗体。
【請求項４５】
前記ヒト化成熟重鎖可変領域が６Ｂ３の前記３つのＣｈｏｔｈｉａの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１配列番号１２の残基１〜９；ＣＤＲ−Ｈ２配列番号１３の残基３〜７、ＣＤＲ−Ｈ３配列番号１４）を含み、且つ前記ヒト化成熟軽鎖可変領域が６Ｂ３の前記３つのＣｈｏｔｈｉａの軽鎖ＣＤＲ（配列番号１６〜１８）を含む、請求項４２に記載のヒト化抗体。
【請求項４６】
前記ヒト化成熟重鎖可変領域が６Ｂ３の前記３つのＡｂＭの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１配列番号１２；ＣＤＲ−Ｈ２配列番号１３の残基１〜９、ＣＤＲ−Ｈ３配列番号１４）を含み、且つ前記ヒト化成熟軽鎖可変領域が６Ｂ３の前記３つのＡｂＭの軽鎖ＣＤＲ（配列番号１６〜１８）を含む、請求項４２に記載のヒト化抗体。
【請求項４７】
前記ヒト化成熟重鎖可変領域が６Ｂ３の前記３つのＣｏｎｔａｃｔの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１配列番号１１の残基３０〜３７；ＣＤＲ−Ｈ２配列番号１１の残基４９〜６０、ＣＤＲ−Ｈ３配列番号１１の残基９８〜１０６）を含み、前記ヒト化成熟軽鎖可変領域が６Ｂ３の前記３つのＣｏｎｔａｃｔの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１配列番号２９の残基３０〜３６；ＣＤＲ−Ｌ２配列番号２９の残基４６〜５５、ＣＤＲ−Ｌ３配列番号２９の残基８９〜９６）を含む、請求項４２に記載のヒト化抗体。
【請求項４８】
配列番号２６〜２８のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するヒト化成熟重鎖可変領域と配列番号３１〜３２のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するヒト化成熟軽鎖可変領域とを含む、請求項４０〜４７のいずれか１項に記載のヒト化抗体。
【請求項４９】
以下の位置の少なくとも１つが特定されるようなアミノ酸によって占有される：Ｈ３がＱによって占有され、Ｈ５がＱによって占有され、Ｈ１０がＧによって占有され、Ｈ１５がＳによって占有され、及びＨ１９がＳによって占有される、請求項４８に記載のヒト化抗体。
【請求項５０】
Ｈ３、Ｈ５、Ｈ１０、Ｈ１５、及びＨ１９位がそれぞれＱ、Ｑ、Ｇ、Ｓ、及びＳによって占有されるという条件である、請求項４９に記載のヒト化抗体。
【請求項５１】
以下の位置の少なくとも１つが特定されるようなアミノ酸によって占有される：位置：Ｈ１がＥまたはＱによって占有され、Ｈ４４がＧによって占有され、Ｈ４８がＩまたはＬによって占有され、Ｈ４９がＧまたはＡによって占有され、Ｈ６７がＶまたはＬによって占有され、Ｈ７８がＦまたはＶによって占有され、Ｈ７９がＳまたはＶによって占有され、Ｈ８１がＫまたはＴによって占有され、Ｈ８２がＬまたはＭによって占有され、Ｈ８２ａがＳまたはＴによって占有され、Ｈ８２ｂがＳまたはＮによって占有され、Ｈ８２ｃがＶまたはＭによって占有され、Ｈ８３がＴまたはＤによって占有され、Ｈ８４がＡまたはＰによって占有され、Ｈ８５がＡまたはＶによって占有され、Ｈ８９がＶまたはＴによって占有され、Ｈ１０８がＴまたはＬによって占有され、Ｌ７１がＹまたはＦによって占有され、Ｌ８７がＦまたはＹによって占有され、Ｌ１００がＱまたはＧによって占有され、及びＬ１０４がＬまたはＶによって占有される、請求項４８〜５０のいずれかに記載のヒト化抗体。
【請求項５２】
以下の位置の少なくとも１つが特定されるようなアミノ酸によって占有される：位置：Ｈ１がＥまたはＱによって占有され、Ｈ３５がＧによって占有され、Ｈ３５ｂがＧによって占有され、Ｈ４４がＧまたはＡによって占有され、Ｈ４８がＩまたはＬによって占有され、Ｈ４９がＧまたはＡによって占有され、Ｈ５０がＨによって占有され、Ｈ５８がＹによって占有され、Ｈ６０がＮによって占有され、Ｈ６１がＩによって占有され、Ｈ６２がＡによって占有され、Ｈ６５がＮによって占有され、Ｈ６７がＶまたはＬによって占有され、Ｈ７８がＦまたはＶによって占有され、Ｈ７９がＳまたはＶによって占有され、Ｈ８１がＫまたはＴによって占有され、Ｈ８２がＬまたはＭによって占有され、Ｈ８２ａがＳまたはＴによって占有され、Ｈ８２ｂがＳまたはＮによって占有され、Ｈ８２ｃがＶまたはＭによって占有され、Ｈ８３がＴまたはＤによって占有され、Ｈ８４がＡまたはＰによって占有され、Ｈ８５がＡまたはＶによって占有され、Ｈ８９がＶまたはＴによって占有され、Ｈ１０２がＹによって占有され、Ｈ１０８がＴまたはＬによって占有され、Ｌ７１がＹまたはＦによって占有され、Ｌ８７がＦまたはＹによって占有され、Ｌ１００がＱまたはＧによって占有され、及びＬ１０４がＬまたはＶによって占有される、請求項４２に記載のヒト化抗体。
【請求項５３】
Ｈ１、Ｈ４４、Ｈ７９、Ｈ８１、Ｈ８２、Ｈ８２ｂ、Ｈ８２ｃ、Ｈ８３、Ｈ８４、Ｈ８５、及びＨ８９位がそれぞれＥ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ｌ、Ｓ、Ｖ、Ｔ、Ａ、Ａ、及びＶによって占有されるという条件である、請求項５１に記載のヒト化抗体。
【請求項５４】
Ｈ４８、Ｈ４９、Ｈ６７、Ｈ７８、Ｈ８２ａ、及びＨ１０８位がそれぞれＩ、Ｇ、Ｖ、Ｆ、Ｓ、及びＴによって占有されるという条件である、請求項５３に記載のヒト化抗体。
【請求項５５】
Ｌ７１、Ｌ８７、Ｌ１００、及びＬ１０４がそれぞれＹ、Ｆ、Ｑ、及びＬによって占有されるという条件である、請求項５１に記載のヒト化抗体。
【請求項５６】
配列番号２６〜２８の少なくとも１つに対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域と配列番号３１〜３２の少なくとも１つに対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域とを含む、請求項４８に記載のヒト化抗体。
【請求項５７】
配列番号２６〜２８に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域と配列番号３１〜３２に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域とを含む、請求項５６に記載のヒト化抗体。
【請求項５８】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号２６〜２８のいずれかのアミノ酸配列を有し、且つ前記成熟軽鎖可変領域が配列番号３１〜３２のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、請求項５７に記載のヒト化抗体。
【請求項５９】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号２６のアミノ酸配列を有し、且つ前記成熟軽鎖可変領域が配列番号３１のアミノ酸配列を有する、請求項５８に記載のヒト化抗体。
【請求項６０】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号２６のアミノ酸配列を有し、且つ前記成熟軽鎖可変領域が配列番号３２のアミノ酸配列を有する、請求項５８に記載のヒト化抗体。
【請求項６１】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号２７のアミノ酸配列を有し、且つ前記成熟軽鎖可変領域が配列番号３１のアミノ酸配列を有する、請求項５８に記載のヒト化抗体。
【請求項６２】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号２７のアミノ酸配列を有し、且つ前記成熟軽鎖可変領域が配列番号３２のアミノ酸配列を有する、請求項５８に記載のヒト化抗体。
【請求項６３】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号２８のアミノ酸配列を有し、且つ前記成熟軽鎖可変領域が配列番号３１のアミノ酸配列を有する、請求項５８に記載のヒト化抗体。
【請求項６４】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号２８のアミノ酸配列を有し、且つ前記成熟軽鎖可変領域が配列番号３２のアミノ酸配列を有する、請求項５８に記載のヒト化抗体。
【請求項６５】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６６】
前記抗体がベニア化抗体である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６７】
インタクトな抗体である、請求項１〜６６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６８】
結合断片である、請求項１〜６６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６９】
前記結合断片が単鎖抗体、Ｆａｂ、またはＦａｂ’２の断片である、請求項６８に記載の抗体。
【請求項７０】
Ｆａｂ断片または単鎖Ｆｖである、請求項１〜６６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７１】
前記アイソタイプがヒトＩｇＧ１である、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７２】
前記成熟軽鎖可変領域が軽鎖定常領域に融合され、且つ前記成熟重鎖可変領域が重鎖定常領域に融合される、請求項１５〜６４及び６６〜７１のいずれか１項に記載のヒト化抗体。
【請求項７３】
前記重鎖定常領域が、天然のヒト重鎖定常領域に比べてＦｃγ受容体への結合が低下している前記天然のヒト重鎖定常領域の変異形態である、請求項７２に記載のヒト化抗体。
【請求項７４】
前記重鎖定常領域がＩｇＧ１アイソタイプのものである、請求項７２または７３に記載のヒト化抗体。
【請求項７５】
前記定常領域にて少なくとも１つの突然変異を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７６】
前記突然変異が前記定常領域による補体結合または補体の活性化を低下させる、請求項７５に記載の抗体。
【請求項７７】
ＥＵ番号付けによる２４１、２６４、２６５、２７０、２９６、２９７、３１８、３２０、３２２、３２９及び３３１位の１以上にて突然変異を有する、請求項７６に記載の抗体。
【請求項７８】
３１８位、３２０位及び３２２位にてアラニンを有する、請求項７７に記載の抗体。
【請求項７９】
前記アイソタイプがヒトのＩｇＧ２またはＩｇＧ４のアイソタイプのものである、請求項１〜７３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８０】
前記抗体が少なくとも９５％ｗ／ｗ純粋である、請求項１〜７９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８１】
前記抗体が治療剤または細胞傷害剤にコンジュゲートされる、先行請求項のいずれかに記載の抗体。
【請求項８２】
請求項１〜８１のいずれかに定義の抗体と薬学上許容できる担体とを含む医薬組成物。
【請求項８３】
請求項１〜８２のいずれか１項に記載の抗体の前記重鎖及び／または軽鎖をコードする核酸。
【請求項８４】
請求項８３に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項８５】
請求項８４に記載の組換え発現ベクターによって形質転換される宿主細胞。
【請求項８６】
マウス抗体をヒト化する方法であって、前記方法が、
（ａ）１以上のアクセプター抗体を選択することと；
（ｂ）保持される前記マウス抗体のアミノ酸残基を特定することと；
（ｃ）前記マウス抗体の重鎖のＣＤＲを含むヒト化重鎖をコードする核酸と、前記マウス抗体の軽鎖のＣＤＲを含むヒト化軽鎖をコードする核酸とを合成することと；
（ｄ）宿主細胞にて前記核酸を発現させてヒト化抗体を産生させることとを含み、
その際、前記マウス抗体は６Ｂ３または１８Ｇ１であり、６Ｂ３は配列番号１１の成熟重鎖可変領域と配列番号２９の成熟軽鎖可変領域とを特徴とし、１８Ｇ１は配列番号３の成熟重鎖可変領域と配列番号３６の成熟軽鎖可変領域とを特徴とする、前記方法。
【請求項８７】
ヒト化抗体、キメラ抗体またはベニア化抗体の産生方法であって、前記方法が
（ａ）細胞が前記抗体を分泌するように、前記抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸で形質転換された前記細胞を培養することと；
（ｂ）細胞培養培地から前記抗体を精製することとを含み、
その際、前記抗体が、６Ｂ３または１８Ｇ１のヒト化形態、キメラ形態またはベニア化形態である、前記産生方法。
【請求項８８】
ヒト化抗体、キメラ抗体またはベニア化抗体を産生する細胞株の作出方法であって、前記方法が、
（ａ）抗体の重鎖及び軽鎖ならびに選択可能なマーカーをコードするベクターを細胞に導入することと；
（ｂ）増えたコピー数の前記ベクターを有する細胞を選択する条件下で前記細胞を増殖させることと；
（ｃ）前記選択した細胞から単一細胞を単離することと；
（ｄ）抗体の収率に基づいて選択される単一細胞からクローニングされる細胞を貯めることとを含み、
その際、前記抗体は６Ｂ３または１８Ｇ１のヒト化形態、キメラ形態またはベニア化形態である、前記作出方法。
【請求項８９】
選択的条件下で前記細胞を増殖させることと、自然に発現し、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／１０６個の細胞／２４時間を分泌する細胞株をスクリーニングすることとをさらに含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
メディンが介在するアミロイドーシスを有するまたはそれを発症するリスクがある対象にてメディンの凝集を阻害するまたは低減する方法であって、請求項１〜８２のいずれか１項に記載の抗体の有効な投薬計画を前記対象に行い、それによって前記対象にてメディンの凝集を阻害するまたは低減する、前記方法。
【請求項９１】
前記アミロイドーシスが大動脈中膜アミロイドである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記抗体が６Ｂ３のヒト化バージョンである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記抗体が１８Ｇ１のヒト化バージョンである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
対象にてメディンの凝集または沈着に関連する疾患を治療するまたはその予防を達成する方法であって、請求項１〜８２のいずれか１項により定義される抗体の有効な投薬計画を行い、それによって前記疾患を治療するまたはその予防を達成する、前記方法。
【請求項９５】
前記疾患または疾病が膵炎、狼瘡、アルツハイマー病、肥満症、心疾患、マルファン症候群、大動脈瘤、または血管系を冒す炎症性の状態である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記疾患が血管系を冒す炎症性の状態である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記疾患が巨細胞性動脈炎である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記対象がマルファン症候群であると診断されている、請求項９４に記載の方法。
【請求項９９】
前記対象が大動脈瘤についての１以上のリスク因子を有する、請求項９４に記載の方法。
【請求項１００】
前記対象が、喫煙、高血圧症、アテローム性硬化症、二尖大動脈弁及び遺伝性結合組織障害のリスク因子の１以上を有する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記疾患が大動脈瘤である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
大動脈瘤を有するまたはそのリスクがある対象にて大動脈中膜アミロイドの形成を低減する方法であって、有効量の請求項１〜８２のいずれか１項により定義される抗体を前記対象に投与し、それによって前記対象にて大動脈中膜アミロイドの形成を低減することを含む、前記方法。
【請求項１０３】
大動脈瘤を有するまたはそのリスクがある対象にてメディンの凝集を阻害するまたは大動脈中膜アミロイドを低減する方法であって、有効量の請求項１〜８２のいずれか１項により定義される抗体を前記対象に投与し、それによって前記対象にてメディンの凝集を阻害するまたは大動脈中膜アミロイドを低減することを含む、前記方法。
【請求項１０４】
前記抗体が１８Ｇ１のヒト化バージョンである、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記抗体が６Ｂ３のヒト化バージョンである、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
大動脈中膜アミロイドを有する対象における大動脈の弾力性の改善方法であって、有効量の請求項１〜８２のいずれか１項により定義される抗体を前記対象に投与し、それによって前記対象にて大動脈の弾力性を改善することを含む、前記改善方法。
【請求項１０７】
前記対象が胸部大動脈にて大動脈中膜アミロイドを有する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
メディンの凝集または沈着に関連する疾患を有するまたはそのリスクがある対象における大動脈中膜アミロイドの検出方法であって、抗体が大動脈中膜アミロイドに結合する、有効量の請求項１〜８２のいずれか１項により定義される前記抗体を前記対象に投与することと、前記対象にて結合した抗体を検出することとを含む、前記検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、その全体が参照によって組み入れられる２０１５年１月２２日に出願された米国仮特許出願番号６２／１０６，６９０の米国特許法第１１９条（ｅ）のもとでの利益を主張する。
【０００２】
配列表への参照
ファイル４７３８１ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに書き込まれた配列表は３０．４キロバイトであり、２０１６年１月２１日に創られ、参照によって本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
幾つかの疾患は、疾患に特異的なタンパク質の異常な折り畳み及び／または凝集が原因で生じると考えられている。これらのタンパク質はアミロイドとして知られる病的診断蓄積物に蓄積することができ、それはある特定の組織染色によって視覚化される。アミロイドは炎症反応を引き出し、病変組織について複数の否定的な結果を有すると考えられている。加えて、異常に折り畳まれたタンパク質のより小さな凝集体が存在し、細胞傷害性の効果を発揮し得る。
【０００４】
ラクトアドヘリン／ＭＦＧ−Ｅ８の５０アミノ酸の切断断片であるメディンは凝集する（たとえば、アミロイド形成を被る）ことが知られる。メディンアミロイドの沈着物は大動脈瘤の患者及びマルファン症候群の患者に見られる。これら凝集体の病原性の性質は完全に理解されていない一方で、メディンは平滑筋細胞の機能を障害する可能性があり、それによって大動脈壁の完全性を弱めると考えられている。ラクトアドヘリン及び／またはメディンは膵炎、狼瘡、アルツハイマー病及び肥満症にも関与している。
【発明の概要】
【０００５】
態様の１つでは、本発明は、メディンに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、たとえば、完全長のメディンまたはメディンのＮ末端もしくはＣ末端の断片に特異的に結合する抗体を提供する。そのような抗体の例は、配列番号１のアミノ酸残基１〜５０の範囲内または配列番号１のアミノ酸残基４４〜５０の範囲内のエピトープに結合する。
【０００６】
一部のそのような抗体は、ヒトメディンへの結合について抗体１８Ｇ１または６Ｂ３と競合する。抗体はメディンと特異的に結合してもよいが、ネイティブのラクトアドヘリンと結合しなくてもよく、たとえば、メディンがラクトアドヘリンから切断される時に作り出される新エピトープを特異的に認識する抗体。他の抗体はメディン及び誤って折り畳まれたラクトアドヘリンと特異的に結合してもよいが、たとえば、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上に発現されるラクトアドヘリンの形態のようなネイティブのラクトアドヘリンと結合しなくてもよい。これらの抗体のある特定のものは、密に凝集したメディンまたはメディン沈着物と優先的に結合し、モノマーまたはオリゴマーのメディンには弱く結合するにすぎない。他の抗体はモノマーまたはオリゴマーのメディンと優先的に結合し、密に凝集したメディンまたはメディン沈着物には弱く結合するにすぎない一方で、さらに他の抗体はメディンの複数が凝集した形態（たとえば、オリゴマー、原線維、密に凝集した、沈着物）ならびにモノマーメディンに特異的に結合してもよい。
一部の抗体は、たとえば、配列番号３を含むアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号３６を含むアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを特徴とするマウス抗体のようなモノクローナル抗体１８Ｇ１の３つの軽鎖ＣＤＲと３つの重鎖ＣＤＲを含む。
一部の抗体は、ヒトメディンに特異的に結合するヒト化またはキメラの１８Ｇ１抗体であり、その際、１８Ｇ１は配列番号３の成熟重鎖可変領域と配列番号３６の成熟軽鎖可変領域とを特徴とするマウス抗体である。
一部の抗体は、１８Ｇ１の３つの重鎖ＣＤＲを含むヒト化成熟重鎖可変領域と１８Ｇ１の３つの軽鎖ＣＤＲを含むヒト化成熟軽鎖可変領域とを含むヒト化抗体である。
一部のそのような抗体では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合によって定義されるとおりであり、たとえば、重鎖ＣＤＲについては配列番号４、５及び６ならびに軽鎖ＣＤＲについては配列番号８、９及び１０である。一部のそのような抗体では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合、ＡｂＭ及びＣｏｎｔａｃｔの群から選択される定義のものである。
【０００７】
たとえば、抗体は、１８Ｇ１、またはそのキメラ形態、ベニア化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）形態またはヒト化形態であることができる。
【０００８】
一部のそのような抗体では、ヒト化成熟重鎖可変領域は１８Ｇ１の３つのＫａｂａｔ重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１配列番号４の残基６〜１０；ＣＤＲ−Ｈ２配列番号５、ＣＤＲ−Ｈ３配列番号６）を含み、ヒト化成熟軽鎖可変領域は１８Ｇ１の３つのＫａｂａｔ軽鎖ＣＤＲ（配列番号８〜１０）を含む。
【０００９】
一部のそのような抗体では、ヒト化成熟重鎖可変領域は１８Ｇ１の３つのＣｈｏｔｈｉａ重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１配列番号４の残基１〜７；ＣＤＲ−Ｈ２配列番号５の残基３〜８、ＣＤＲ−Ｈ３配列番号６）を含み、ヒト化成熟軽鎖可変領域は１８Ｇ１の３つのＣｈｏｔｈｉａ軽鎖ＣＤＲ（配列番号８〜１０）を含む。
【００１０】
一部のそのような抗体では、ヒト化成熟重鎖可変領域は１８Ｇ１の３つのＡｂＭ重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１配列番号４；ＣＤＲ−Ｈ２配列番号５の残基１〜１０、ＣＤＲ−Ｈ３配列番号６）を含み、ヒト化成熟軽鎖可変領域は１８Ｇ１の３つのＡｂＭ軽鎖ＣＤＲ（配列番号８〜１０）を含む。
【００１１】
一部のそのような抗体では、ヒト化成熟重鎖可変領域は１８Ｇ１の３つのＣｏｎｔａｃｔ重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１配列番号３の残基３０〜３５；ＣＤＲ−Ｈ２配列番号３の残基４７〜５９、ＣＤＲ−Ｈ３配列番号３の残基９７〜１０８）を含み、ヒト化成熟軽鎖可変領域は１８Ｇ１の３つのＣｏｎｔａｃｔ軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１配列番号３６の残基３０〜３６；ＣＤＲ−Ｌ２配列番号３６の残基４６〜５５、ＣＤＲ−Ｌ３配列番号３６の残基８９〜９６）を含む。
【００１２】
一部の抗体では、ヒト化成熟重鎖可変領域は配列番号３４〜３５のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、ヒト化成熟軽鎖可変領域は配列番号３７〜３９のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する。
【００１３】
一部の抗体では、以下の位置の少なくとも１つは特定されるようなアミノ酸によって占有される：Ｌ３位はＶによって占有され、Ｌ１０位はＳによって占有され、Ｌ１３位はＶによって占有され、Ｌ１５位はＰによって占有され、Ｌ１９位はＡによって占有され、Ｌ２０位はＳによって占有され、Ｌ２２位はＳによって占有され、Ｌ４２位はＱによって占有され、Ｌ７０位はＤによって占有され、Ｌ７７位はＲによって占有され、Ｌ７８位はＶによって占有され、Ｌ８０位はＡによって占有され、Ｌ８５位はＶによって占有される。
【００１４】
一部の抗体では、以下の位置の少なくとも１つは特定されるようなアミノ酸によって占有される：Ｌ３位はＶによって占有され、Ｌ１０位はＳによって占有され、Ｌ１３位はＶによって占有され、Ｌ１５位はＰによって占有され、Ｌ１９位はＡによって占有され、Ｌ２０位はＳによって占有され、Ｌ２２位はＳによって占有され、Ｌ２４位はＫによって占有され、Ｌ２８位はＮによって占有され、Ｌ２９位はＶによって占有され、Ｌ４２位はＱによって占有され、Ｌ４６位はＬによって占有され、Ｌ７０位はＤによって占有され、Ｌ７７位はＲによって占有され、Ｌ７８位はＶによって占有され、Ｌ８０位はＡによって占有され、Ｌ８５位はＶによって占有される。
【００１５】
一部の抗体では、Ｌ３、Ｌ１０、Ｌ１３、Ｌ１５、Ｌ１９、Ｌ２０、Ｌ２２、Ｌ４２、Ｌ７０、Ｌ７７、Ｌ７８、Ｌ８０、及びＬ８５位はそれぞれ、Ｖ、Ｓ、Ｖ、Ｐ、Ａ、Ｓ、Ｓ、Ｑ、Ｄ、Ｒ、Ｖ、Ａ、及びＶによって占有される。
【００１６】
一部の抗体では、以下の位置の少なくとも１つは特定されるようなアミノ酸によって占有される：Ｈ１位はＥまたはＱによって占有され、Ｈ５位はＶまたはＱによって占有され、Ｈ１３位はＱまたはＫによって占有され、Ｈ１９位はＲまたはＫによって占有され、Ｈ４０位はＡまたはＴによって占有され、Ｈ４２位はＧまたはＤによって占有され、Ｈ４４位はＧまたはＲによって占有され、Ｈ４９位はＳまたはＡによって占有され、Ｈ７７位はＳまたはＴによって占有され、Ｈ８２ａ位はＮまたはＳによって占有され、Ｈ８３位はＲまたはＫによって占有され、Ｈ８４位はＡまたはＳによって占有され、Ｈ８９位はＶまたはＭによって占有され、Ｈ９３位はＶまたはＡによって占有され、Ｈ１０８位はＴまたはＭによって占有され、Ｌ４５位はＱによって占有され、Ｌ６０位はＤによって占有され、Ｌ８３位はＬによって占有される。
【００１７】
一部の抗体では、以下の位置の少なくとも１つは特定されるようなアミノ酸によって占有される：Ｈ１位はＥまたはＱによって占有され、Ｈ５位はＶまたはＱによって占有され、Ｈ１３位はＱまたはＫによって占有され、Ｈ１９位はＲまたはＫによって占有され、Ｈ４０位はＡまたはＴによって占有され、Ｈ４２位はＧまたはＤによって占有され、Ｈ４４位はＧまたはＲによって占有され、Ｈ４９位はＳまたはＡによって占有され、Ｈ５０位はＧによって占有され、６３位はＴによって占有され、Ｈ７７位はＳまたはＴによって占有され、Ｈ８２ａ位はＮまたはＳによって占有され、Ｈ８３位はＲによって占有され、Ｈ８４位はＡによって占有され、Ｈ８９位はＶまたはＭによって占有され、Ｈ９３はＶまたはＡによって占有され、Ｈ１０８位はＴまたはＭによって占有される。
【００１８】
一部の抗体では、Ｈ１、Ｈ５、Ｈ１３、Ｈ１９、Ｈ４０、Ｈ４２、Ｈ４４、Ｈ４９、Ｈ７７、Ｈ８２ａ、Ｈ８３、Ｈ８４、Ｈ８９、Ｈ９３、及びＨ１０８位はそれぞれ、Ｅ、Ｖ、Ｑ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｇ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｖ、及びＴによって占有される。
【００１９】
一部の抗体では、Ｌ４５位、Ｌ６０位及びＬ８３位の少なくとも１つはそれぞれＱ、Ｄ及びＬによって占有される。一部のそのような抗体では、Ｌ４５位はＱによって占有される。一部のそのような抗体では、Ｌ６０位及びＬ８３位はそれぞれＤ及びＬによって占有される。
【００２０】
一部の抗体では、成熟重鎖可変領域は配列番号３４〜３５のいずれか１つに対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域は配列番号３８〜３９のいずれか１つに対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する。一部の抗体では、成熟重鎖可変領域は配列番号３４〜３５のいずれか１つに対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域は配列番号３８〜３９のいずれか１つに対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００２１】
一部の抗体では、成熟重鎖可変領域は配列番号３４〜３５のいずれかのアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域は配列番号３８〜３９のいずれか１つのアミノ酸配列を有する。一部の抗体では、成熟重鎖可変領域は配列番号３４のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域は配列番号３８のアミノ酸配列を有する。一部の抗体では、成熟重鎖可変領域は配列番号３４のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域は配列番号３９のアミノ酸配列を有する。一部の抗体では、成熟重鎖可変領域は配列番号３５のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域は配列番号３８のアミノ酸配列を有する。一部の抗体では、成熟重鎖可変領域は配列番号３５のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域は配列番号３９のアミノ酸配列を有する。
【００２２】
追加の抗体は、配列番号１１を含むアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号２９を含むアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを特徴とするマウス抗体のようなモノクローナル抗体６Ｂ３の３つの軽鎖ＣＤＲ及び３つの重鎖ＣＤＲを含む。一部のそのような抗体では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合によって定義されるとおりであり、たとえば、重鎖ＣＤＲについては配列番号１２、１３及び１４ならびに軽鎖ＣＤＲについては配列番号１６、１７及び１８である。
【００２３】
たとえば、抗体は、６Ｂ３またはそのキメラ形態、ベニア化形態またはヒト化形態であることができる。
【００２４】
一部の抗体は、ヒトメディンに特異的に結合するヒト化またはキメラの６Ｂ３抗体であり、その際、６Ｂ３は、配列番号１１の成熟重鎖可変領域と配列番号２９の成熟軽鎖可変領域とを特徴とするマウス抗体である。
【００２５】
一部の抗体は、６Ｂ３の３つの重鎖ＣＤＲを含むヒト化成熟重鎖可変領域と６Ｂ３の３つの軽鎖ＣＤＲを含むヒト化成熟軽鎖可変領域とを含む。
【００２６】
一部のそのような抗体では、ＣＤＲはＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合、ＡｂＭ及びＣｏｎｔａｃｔの群から選択される定義のものである。
【００２７】
一部のそのような抗体では、ヒト化成熟重鎖可変領域は６Ｂ３の３つのＫａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合の重鎖ＣＤＲ（配列番号１２〜１４）を含み、ヒト化成熟軽鎖可変領域は６Ｂ３の３つのＫａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合の軽鎖ＣＤＲ（配列番号１６〜１８）を含む。
【００２８】
一部のそのような抗体では、ヒト化成熟重鎖可変領域は６Ｂ３の３つのＫａｂａｔ重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１配列番号１２の残基６〜１２；ＣＤＲ−Ｈ２配列番号１３；ＣＤＲ−Ｈ３配列番号１４）を含み、ヒト化成熟軽鎖可変領域は６Ｂ３の３つのＫａｂａｔ軽鎖ＣＤＲ（配列番号１６〜１８）を含む。
【００２９】
一部のそのような抗体では、ヒト化成熟重鎖可変領域は６Ｂ３の３つのＣｈｏｔｈｉａ重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１配列番号１２の残基１〜９；ＣＤＲ−Ｈ２配列番号１３の残基３〜７；ＣＤＲ−Ｈ３配列番号１４）を含み、ヒト化成熟軽鎖可変領域は６Ｂ３の３つのＣｈｏｔｈｉａ軽鎖ＣＤＲ（配列番号１６〜１８）を含む。
【００３０】
一部のそのような抗体では、ヒト化成熟重鎖可変領域は６Ｂ３の３つのＡｂＭ重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１配列番号１２；ＣＤＲ−Ｈ２配列番号１３の残基１〜９；ＣＤＲ−Ｈ３配列番号１４）を含み、ヒト化成熟軽鎖可変領域は６Ｂ３の３つのＡｂＭ軽鎖ＣＤＲ（配列番号１６〜１８）を含む。
【００３１】
一部のそのような抗体では、ヒト化成熟重鎖可変領域は６Ｂ３の３つのＣｏｎｔａｃｔ重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１配列番号１１の残基３０〜３７；ＣＤＲ−Ｈ２配列番号１１の残基４９〜６０；ＣＤＲ−Ｈ３配列番号１１の残基９８〜１０６）を含み、ヒト化成熟軽鎖可変領域は６Ｂ３の３つのＣｏｎｔａｃｔ軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１配列番号２９の残基３０〜３６；ＣＤＲ−Ｌ２残基配列番号２９の４６〜５５；ＣＤＲ−Ｌ３配列番号２９の残基８９〜９６）を含む。
【００３２】
一部の抗体では、ヒト化成熟重鎖可変領域は配列番号２６〜２８のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ヒト化成熟軽鎖可変領域は配列番号３１〜３２のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００３３】
一部の抗体では、以下の位置の少なくとも１つは特定されるようなアミノ酸によって占有される：Ｈ３はＱによって占有され、Ｈ５はＱによって占有され、Ｈ１０はＧによって占有され、Ｈ１５はＳによって占有され、Ｈ１９はＳによって占有される。
【００３４】
一部の抗体では、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ１０、Ｈ１５、及びＨ１９位はそれぞれＱ、Ｑ、Ｇ、Ｓ、及びＳによって占有される。
【００３５】
一部の抗体では、以下の部分の少なくとも１つは特定されるようなアミノ酸によって占有される：Ｈ１位はＥまたはＱによって占有され、Ｈ４４位はＧによって占有され、Ｈ４８位はＩまたはＬによって占有され、Ｈ４９位はＧまたはＡによって占有され、Ｈ６７位はＶまたはＬによって占有され、Ｈ７８位はＦまたはＶによって占有され、Ｈ７９位はＳまたはＶによって占有され、Ｈ８１位はＫまたはＴによって占有され、Ｈ８２位はＬまたはＭによって占有され、Ｈ８２ａ位はＳまたはＴによって占有され、Ｈ８２ｂ位はＳまたはＮによって占有され、Ｈ８２ｃ位はＶまたはＭによって占有され、Ｈ８３位はＴまたはＤによって占有され、Ｈ８４位はＡまたはＰによって占有され、Ｈ８５位はＡまたはＶによって占有され、Ｈ８９位はＶまたはＴによって占有され、Ｈ１０８位はＴまたはＬによって占有され、Ｌ７１位はＹまたはＦによって占有され、Ｌ８７位はＦまたはＹによって占有され、Ｌ１００位はＱまたはＧによって占有され、Ｌ１０４位はＬまたはＶによって占有される。
【００３６】
一部の抗体では、以下の位置の少なくとも１つは特定されるようなアミノ酸によって占有される：Ｈ１位はＥまたはＱによって占有され、Ｈ３５位はＧによって占有され、Ｈ３５ｂ位はＧによって占有され、Ｈ４４位はＧまたはＡによって占有され、Ｈ４８位はＩまたはＬによって占有され、Ｈ４９はＧまたはＡによって占有され、Ｈ５０はＨによって占有され、Ｈ５８位はＹによって占有され、Ｈ６０位はＮによって占有され、Ｈ６１位はＩによって占有され、Ｈ６２位はＡによって占有され、Ｈ６５位はＮによって占有され、Ｈ６７位はＶまたはＬによって占有され、Ｈ７８位はＦまたはＶによって占有され、Ｈ７９位はＳまたはＶによって占有され、Ｈ８１位はＫまたはＴによって占有され、Ｈ８２位はＬまたはＭによって占有され、Ｈ８２ａ位はＳまたはＴによって占有され、Ｈ８２ｂ位はＳまたはＮによって占有され、Ｈ８２ｃ位はＶまたはＭによって占有され、Ｈ８３位はＴまたはＤによって占有され、Ｈ８４位はＡまたはＰによって占有され、Ｈ８５位はＡまたはＶによって占有され、Ｈ８９位はＶまたはＴによって占有され、Ｈ１０２位はＹによって占有され、Ｈ１０８位はＴによって占有され、Ｌ７１位はＹまたはＦによって占有され、Ｌ８７位はＦまたはＹによって占有され、Ｌ１００位はＱまたはＧによって占有され、Ｌ１０４位はＬまたはＶによって占有される。
【００３７】
一部の抗体では、Ｈ１、Ｈ４４、Ｈ７９、Ｈ８１、Ｈ８２、Ｈ８２ｂ、Ｈ８２ｃ、Ｈ８３、Ｈ８４、Ｈ８５、及びＨ８９位はそれぞれ、Ｅ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ｌ、Ｓ、Ｖ、Ｔ、Ａ、Ａ、及びＶによって占有される。
【００３８】
一部の抗体では、Ｈ４８、Ｈ４９、Ｈ６７、Ｈ７８、Ｈ８２ａ、及びＨ１０８位はそれぞれ、Ｉ、Ｇ、Ｖ、Ｆ、Ｓ、及びＴによって占有される。
【００３９】
一部の抗体では、Ｌ７１、Ｌ８７、Ｌ１００、及びＬ１０４位はそれぞれ、Ｙ、Ｆ、Ｑ、及びＬによって占有される。
【００４０】
一部の抗体は、配列番号２６〜２８の少なくとも１つに対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域と、配列番号３１〜３２の少なくとも１つに対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域とを含む。
【００４１】
一部の抗体は、配列番号２６〜２８に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域と、配列番号３１〜３２対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域とを含む。
【００４２】
一部の抗体では、成熟重鎖可変領域は配列番号２６〜２８のいずれかのアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域は配列番号３１〜３２のいずれか１つのアミノ酸配列を有する。
【００４３】
一部の抗体では、成熟重鎖可変領域は配列番号２６のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域は配列番号３１のアミノ酸配列を有する。一部の抗体では、成熟重鎖可変領域は配列番号２６のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域は配列番号３２のアミノ酸配列を有する。一部の抗体では、成熟重鎖可変領域は配列番号２７のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域は配列番号３１のアミノ酸配列を有する。一部の抗体では、成熟重鎖可変領域は配列番号２７のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域は配列番号３２のアミノ酸配列を有する。一部の抗体では、成熟重鎖可変領域は配列番号２８のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域は配列番号３１のアミノ酸配列を有する。一部の抗体では、成熟重鎖可変領域は配列番号２８のアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域は配列番号３２のアミノ酸配列を有する。
【００４４】
抗体は、インタクトなマウス抗体、キメラ抗体、ベニア化抗体またはヒト化抗体または結合断片、単鎖抗体Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’２断片または単鎖Ｆｖであることができる。抗体の幾つかはヒトのＩｇＧ１アイソタイプを有する一方で、他はヒトのＩｇＧ２またはＩｇＧ４のアイソタイプを有してもよい。一部の抗体は、軽鎖定常領域に融合させた成熟軽鎖可変領域及び重鎖定常領域に融合させた成熟重鎖可変領域を有する。一部の抗体の重鎖定常領域は、天然のヒト重鎖定常領域に比べてＦｃγ受容体への結合が低下している天然のヒト重鎖定常領域の変異形態である。
一部の抗体は、たとえば、定常領域による補体結合または補体の活性化を低下させる変異のような、たとえば、ＥＵ番号付けによる２４１、２６４、２６５、２７０、２９６、２９７、３１８、３２０、３２２、３２９及び３３１位の１以上での変異のような定常領域における少なくとも１つの変異を有してもよい。一部の抗体は、３１８位、３２０位及び３２２位でアラニンを有する。一部の抗体は少なくとも９５％ｗ／ｗ純粋であることができる。抗体は治療剤または細胞傷害剤とコンジュゲートさせることができる。
【００４５】
別の態様では、本発明は本明細書で開示されている抗体のいずれかと薬学上許容できる担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００４６】
別の態様では、本発明は、本明細書で開示されている抗体のいずれかの重鎖及び／または軽鎖をコードする核酸と、該核酸を含む組換え発現ベクターと、該組換え発現ベクターで形質転換される宿主細胞とを提供する。
【００４７】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書で記載されているいずれかの非ヒト抗体、たとえば、マウス抗体１８Ｇ１または６Ｂ３をヒト化する方法を提供する。そのような方法には、１以上のアクセプター抗体を選択することと、マウス重鎖のＣＤＲを含むヒト化重鎖をコードする核酸及びマウス抗体軽鎖のＣＤＲを含むヒト化軽鎖をコードする核酸を合成することと、該核酸を宿主細胞で発現させてヒト化抗体を産生させることとが関与し得る。
【００４８】
ヒト化抗体、キメラ抗体またはベニア化抗体のような、たとえば、１８Ｇ１または６Ｂ３のヒト化形態、キメラ形態またはベニア化形態のような抗体を作出する方法も提供される。そのような方法では、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸によって形質転換された細胞は、該細胞が抗体を分泌するように培養される。次いで抗体は細胞培養培地から精製することができる。
【００４９】
本明細書で開示されている抗体のいずれかを産生する細胞株は、抗体の重鎖及び軽鎖ならびに選択可能なマーカーをコードするベクターを細胞に導入し、多数のコピー数のベクターを有する細胞を選択するような条件下で細胞を増殖させ、選択した細胞から単一細胞を単離し、抗体の収率に基づいて選択された単一細胞からクローニングされた細胞を貯めることによって製作することができる。
【００５０】
一部の細胞は、選択条件下で増殖させ、自然に発現し、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／１０６個の細胞／２４時間を分泌する細胞株についてスクリーニングすることができる。選択された細胞から単一細胞を単離することができる。次いで単一細胞からクローニングされた細胞を貯めることができる。単一細胞は、望ましい特性、たとえば、抗体の収率に基づいて選択することができる。例となる細胞株は１８Ｇ１または６Ｂ３を発現する細胞株である。
【００５１】
本発明は、本明細書で開示されている抗体の有効な投薬計画を対象に投与し、それによって対象にてメディンの凝集を阻害するまたは低減することを含む、メディンが介在するアミロイドーシスを有するまたはそれを発症するリスクがある対象にてメディン凝集を阻害するまたは低減する方法を提供する。アミロイドーシスの例は大動脈中膜アミロイドである。例となる抗体には６Ｂ３及び１８Ｇ１のヒト化バージョンが挙げられる。
【００５２】
提供されるのはまた、本明細書で開示されている抗体の有効な投薬計画を対象に投与し、それによって疾患を治療するまたは疾患の予防を達成することを含む、対象にてメディン、メディンの凝集または沈着に関連する疾患を治療するまたは疾患の予防を達成する方法である。そのような疾患の例には、膵炎、狼瘡、アルツハイマー病、肥満症、心疾患、マルファン症候群大動脈瘤、または血管系を冒す炎症状態が挙げられる。血管系を冒す炎症状態の例は巨細胞性動脈炎である。
【００５３】
一部の方法にはマルファン症候群と診断されている対象が含まれる。一部の対象は、大動脈瘤の１以上のリスク因子、たとえば、喫煙、高血圧症、アテローム性硬化症、二尖大動脈弁及び遺伝性結合組織障害を有する。一部の方法では、疾患は大動脈瘤である。
【００５４】
本発明はまた、本明細書で開示されている有効量の抗体を対象に投与し、それによって対象にて大動脈中膜アミロイド形成を低減することを含む、大動脈瘤を有するまたは大動脈瘤のリスクがある対象にて大動脈中膜アミロイド形成を低減する方法を提供する。
【００５５】
提供されるのはまた、本明細書で開示されている有効量の抗体を対象に投与し、それによって対象にてメディンの凝集を阻害し、または大動脈中膜アミロイドを低減することを含む、大動脈瘤を有するまたは大動脈瘤のリスクがある対象にてメディンの凝集を阻害するまたは大動脈中膜アミロイドを低減する方法である。たとえば、抗体は１８Ｇ１または６Ｂ３のヒト化バージョンであることができる。
【００５６】
本発明はまた、本明細書で開示されている有効量の抗体を対象に投与し、それによって対象の大動脈の弾力性を改善することを含む、大動脈中膜アミロイドを有する対象にて大動脈の弾力性を改善する方法も提供する。一部の対象は胸部大動脈にて大動脈中膜アミロイドを有する。
【００５７】
別の態様では、本発明は、本明細書で開示されている有効量の抗体を対象に投与することを含む、メディンの凝集または沈着に関連する疾患を有するまたはその疾患のリスクがある対象にて大動脈中膜アミロイドを検出する方法を提供し、その際、抗体は大動脈中膜アミロイドに結合し、対象にて結合した抗体を検出する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１Ａ−Ｂ】（Ａ）ラクトアドヘリンの中でのメディンの位置を示す図である。（Ｂ）ヒトの完全長メディンのアミノ酸配列ならびにヒト及びマウスメディンＣ末端に由来するペプチドを示す図である。
【図２Ａ−Ｂ】（Ａ）ラクトアドヘリン、完全長メディン、ならびにヒト及びマウスメディンＣ末端に由来するペプチドに対するマウス抗体６Ｂ３の結合曲線を示す図である。（Ｂ）ラクトアドヘリン、完全長メディン、ならびにヒト及びマウスメディンＣ末端に由来するペプチドに対するマウス抗体１８Ｇ１の結合曲線を示す図である。
【図３Ａ−Ｂ】（Ａ）ヒトのラクトアドヘリンに結合するが、メディンペプチドには結合しない市販のラクトアドヘリン抗体のウエスタンブロット解析を示す図である。（Ｂ）ヒトのラクトアドヘリン及びメディンペプチドに結合するマウス抗体６Ｂ３のウエスタンブロット解析を示す図である。
【図４Ａ−Ｂ】（Ａ）ヒトのラクトアドヘリン及びメディンペプチドに結合するマウス抗体６Ｂ３のウエスタンブロット解析を示す図である。（Ｂ）ヒトメディンペプチドに結合するが、ラクトアドヘリンには結合しないマウス抗体１８Ｇ１のウエスタンブロット解析を示す図である。
【図５】マウス抗体６Ｂ３及び１８Ｇ１の重鎖可変領域の配列比較を示す図である。Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合によって定義されるようなＣＤＲは太字である。アミノ酸残基がマウス抗体６Ｂ３とマウス抗体１８Ｇ１の重鎖可変領域の間で異なる位置を四角で囲む。
【図６】マウス抗体６Ｂ３及び１８Ｇ１の軽鎖可変領域の配列比較を示す図である。Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲは太字である。アミノ酸残基がマウス抗体６Ｂ３とマウス抗体１８Ｇ１の軽鎖可変領域の間で異なる位置を四角で囲む。
【図７】マウス６Ｂ３抗体、ヒトのアクセプター抗体及び６Ｂ３抗体のヒト化バージョンの重鎖可変領域の配列比較を示す図である。Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合によって定義されるようなＣＤＲは四角に囲む。
【図８】マウス６Ｂ３抗体、ヒトのアクセプター抗体及び６Ｂ３抗体のヒト化バージョンの軽鎖可変領域の配列比較を示す図である。Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲは四角に囲む。
【図９】マウス１８Ｇ１抗体、ヒトのアクセプター抗体及び１８Ｇ１抗体のヒト化バージョンの重鎖可変領域の配列比較を示す図である。Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合によって定義されるようなＣＤＲは四角に囲む。
【図１０】マウス１８Ｇ１抗体、ヒトのアクセプター抗体及び１８Ｇ１抗体のヒト化バージョンの軽鎖可変領域の配列比較を示す図である。Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲは四角に囲む。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ヒトメディンのアミノ酸配列を示す。
【００６０】
配列番号２は、ヒトメディンのＣ末端ペプチド免疫原のアミノ酸配列を示す。
【００６１】
配列番号３は、マウス１８Ｇ１抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
【００６２】
配列番号４は、マウス１８Ｇ１抗体のＫａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合のＣＤＲ−Ｈ１のアミノ酸配列を示す。
【００６３】
配列番号５は、マウス１８Ｇ１抗体のＫａｂａｔのＣＤＲ−Ｈ２のアミノ酸配列を示す。
【００６４】
配列番号６は、マウス１８Ｇ１抗体のＫａｂａｔのＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列を示す。
【００６５】
配列番号７は、マウス１８Ｇ１抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
【００６６】
配列番号８は、マウス１８Ｇ１抗体のＫａｂａｔのＣＤＲ−Ｌ１のアミノ酸配列を示す。
【００６７】
配列番号９は、マウス１８Ｇ１抗体のＫａｂａｔのＣＤＲ−Ｌ２のアミノ酸配列を示す。
【００６８】
配列番号１０は、マウス１８Ｇ１抗体のＫａｂａｔのＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列を示す。
【００６９】
配列番号１１は、マウス６Ｂ３抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
【００７０】
配列番号１２は、マウス６Ｂ３抗体のＫａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合のＣＤＲ−Ｈ１のアミノ酸配列を示す。
【００７１】
配列番号１３は、マウス６Ｂ３抗体のＫａｂａｔのＣＤＲ−Ｈ２のアミノ酸配列を示す。
【００７２】
配列番号１４は、マウス６Ｂ３抗体のＫａｂａｔのＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列を示す。
【００７３】
配列番号１５は、マウス６Ｂ３抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
【００７４】
配列番号１６は、マウス６Ｂ３抗体のＫａｂａｔのＣＤＲ−Ｌ１のアミノ酸配列を示す。
【００７５】
配列番号１７は、マウス６Ｂ３抗体のＫａｂａｔのＣＤＲ−Ｌ２のアミノ酸配列を示す。
【００７６】
配列番号１８は、マウス６Ｂ３抗体のＫａｂａｔのＣＤＲ−Ｌ１のアミノ酸配列を示す。
【００７７】
配列番号１９は、メディン抗体のカッパ軽鎖のＶＬのＰＣＲ増幅のためのＣＫ３’プライマーの核酸配列を示す。
【００７８】
配列番号２０は、１８Ｇ１抗体重鎖のＶＨのＰＣＲ増幅のための３’プライマーの核酸配列を示す。
【００７９】
配列番号２１は、６Ｂ３抗体重鎖のＶＨのＰＣＲ増幅のための３’プライマーの核酸配列を示す。
【００８０】
配列番号２２は、マウスメディンのＣ末端ペプチド免疫原のアミノ酸配列を示す。
【００８１】
配列番号２３は、６Ｂ３と１８Ｇ１マウス抗体の重鎖可変領域間でのコンセンサスアミノ酸配列（図５にて表示した「大半」）を示す。
【００８２】
配列番号２４は、６Ｂ３及び１８Ｇ１マウス抗体の軽鎖可変領域間でのコンセンサスアミノ酸配列（図６にて表示した「大半」）を示す。
【００８３】
配列番号２５は、重鎖可変アクセプター受託番号ＡＡＤ５３８６３．１のアミノ酸配列を示す。
【００８４】
配列番号２６は、ヒト化６Ｂ３抗体バージョン１の重鎖可変領域（Ｈｕ６Ｂ３ＶＨｖ１）のアミノ酸配列を示す。
【００８５】
配列番号２７は、ヒト化６Ｂ３抗体バージョン２の重鎖可変領域（Ｈｕ６Ｂ３ＶＨｖ２）のアミノ酸配列を示す。
【００８６】
配列番号２８は、ヒト化６Ｂ３抗体バージョン１の重鎖可変領域（Ｈｕ６Ｂ３ＶＨｖ３）のアミノ酸配列を示す。
【００８７】
配列番号２９は、マウス６Ｂ３抗体の軽鎖可変領域から配列番号１５で見いだされるＣ末端アルギニンを差し引いたアミノ酸配列を示す。
【００８８】
配列番号３０は、軽鎖可変アクセプター受託番号ＢＡＣ０１５５８．１のアミノ酸配列を示す。
【００８９】
配列番号３１は、ヒト化６Ｂ３抗体バージョン１の軽鎖可変領域（Ｈｕ６Ｂ３ＶＬｖ１）のアミノ酸配列を示す。
【００９０】
配列番号３２は、ヒト化６Ｂ３抗体バージョン２の軽鎖可変領域（Ｈｕ６Ｂ３ＶＬｖ２）のアミノ酸配列を示す。
【００９１】
配列番号３３は、重鎖可変アクセプター受託番号ＡＡＸ８２４９４．１のアミノ酸配列を示す。
【００９２】
配列番号３４は、ヒト化１８Ｇ１抗体バージョン１の重鎖可変領域（Ｈｕ１８Ｇ１ＶＨｖ１）のアミノ酸配列を示す。
【００９３】
配列番号３５は、ヒト化１８Ｇ１抗体バージョン２の重鎖可変領域（Ｈｕ１８Ｇ１ＶＨｖ２）のアミノ酸配列を示す。
【００９４】
配列番号３６は、マウス１８Ｇ１抗体の軽鎖可変領域から配列番号７で見いだされるＣ末端アルギニンを差し引いたアミノ酸配列を示す。
【００９５】
配列番号３７は、軽鎖可変アクセプター受託番号ＡＡＤ３９５０７．１のアミノ酸配列を示す。
【００９６】
配列番号３８は、ヒト化１８Ｇ１抗体バージョン１の軽鎖可変領域（Ｈｕ１８Ｇ１ＶＬｖ１）のアミノ酸配列を示す。
【００９７】
配列番号３９は、ヒト化１８Ｇ１抗体バージョン２の軽鎖可変領域（Ｈｕ１８Ｇ１ＶＬｖ２）のアミノ酸配列を示す。
【００９８】
定義
モノクローナル抗体または他の生物学的実体は通常、単離された形態で提供される。これは、抗体または他の生物学的実体が通常、介在するタンパク質及びその製造または精製から生じる他の混入物から少なくとも５０％ｗ／ｗ純粋であることを意味するが、モノクローナル抗体が過剰の薬学上許容できる担体（複数可）またはその使用を円滑にするように意図される他のビヒクルと合わせられる可能性を排除しない。モノクローナル抗体は介在するタンパク質及び製造または精製に由来する混入物から少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％純粋であることがある。単離されたモノクローナル抗体または他の生物学的実体はその精製の後、残っている優勢な高分子種であることが多い。
【００９９】
抗体のその標的抗原への特異的な結合は少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９または１０１０Ｍ−１の親和性を意味する。特異的な結合は、大きさで検出可能により高く、少なくとも１つの無関係な標的に対して生じる非特異的な結合から区別できる。特異的な結合は特定の官能基間または特定の空間的はめ合わせ（たとえば、鍵と鍵穴型）での結合の形成の結果であることができ、その際、非特異的な結合は普通、ファンデルワールス力の結果である。しかしながら、特異的な結合は抗体が１つの及びたった１つの標的と結合することを必ずしも意味しない。
【０１００】
基本的な抗体の構造単位はサブユニットの四量体である。各四量体には、ポリペプチド鎖の２つの同一の対が含まれ、各対は「軽」鎖（約２５ｋＤａ）１つと「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）１つとを有する。各鎖のアミノ末端部分には抗原認識に主として関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域が含まれる。この可変領域は最初に発現されて切断可能なシグナルペプチドに連結される。シグナルペプチドのない可変領域は成熟可変領域と呼ばれることがある。従って、たとえば、軽鎖成熟可変領域は軽鎖シグナルペプチドのない軽鎖可変領域を意味する。各鎖のカルボキシ末端部分は主としてエフェクター機能に関与する定常領域を規定する。
【０１０１】
軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定義する。軽鎖及び重鎖の範囲内で、可変領域と定常領域は約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖には約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含まれる。たとえば、一般にＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９，Ｃｈ．７（あらゆる目的でその全体が参照によって組み入れられる）を参照のこと。
【０１０２】
免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変領域（本明細書ではそれぞれ「軽鎖可変ドメイン」（「ＶＬドメイン」）または「重鎖可変ドメイン」（「ＶＨドメイン」）とも呼ばれる）は、３つの「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」によって中断される「フレームワーク」領域から成る。フレームワーク領域は抗原のエピトープへの特異的な結合についてＣＤＲを並べるのに役立つ。ＣＤＲには、抗原結合に主として関与する抗体のアミノ酸残基が含まれる。アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、ＶＬ及びＶＨのドメインは双方とも以下のフレームワーク領域（ＦＲ）とＣＤＲ領域：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４を含む。ＶＬドメインのＣＤＲ１、２、及び３は本明細書ではそれぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３とも呼ばれ；ＶＨドメインのＣＤＲ１、２、及び３は本明細書ではそれぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３とも呼ばれる。
【０１０３】
ＶＬ及びＶＨの各ドメインへのアミノ酸の割り当てはＣＤＲの従来の定義に従う。従来の定義には、Ｋａｂａｔの定義（Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９８７及び１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａの定義（Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７８−８８３，１９８９）；ＣＤＲ−Ｈ１がＣｈｏｔｈｉａとＫａｂａｔのＣＤＲの複合であるＣｈｏｔｈｉａとＫａｂａｔのＣＤＲの複合；オックスフォード分子の抗体モデル化ソフトウエアで使用されているＡｂＭの定義；及びＭａｒｔｉｎらのＣｏｎｔａｃｔの定義（ｂｉｏｉｎｆｏ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ）（表１を参照のこと）が挙げられる。Ｋａｂａｔは、異なる重鎖間または異なる軽鎖間での対応する残基が同一番号を割り当てられる広く使用されている番号付け様式（Ｋａｂａｔの番号付け）を提供している。抗体がＣＤＲのある特定の定義（たとえば、Ｋａｂａｔ）によるＣＤＲを含むと言われる場合、その定義は抗体に存在するＣＤＲ残基の最少数を特定する（すなわち、ＫａｂａｔのＣＤＲ）。別の従来のＣＤＲの定義の範囲内に入るが、特定された定義の外側にある他の残基も存在することを排除しない。たとえば、Ｋａｂａｔによって定義されるＣＤＲを含む抗体は、数ある可能性の中で、ＣＤＲがＫａｂａｔのＣＤＲ残基を含有し、他のＣＤＲ残基を含有しない抗体、及びＣＤＲ  Ｈ１が複合Ｃｈｏｔｈｉａ−ＫａｂａｔのＣＤＲ  Ｈ１であり、他のＣＤＲがＫａｂａｔのＣＤＲ残基を含有し、他の定義に基づく追加のＣＤＲ残基を含有しない抗体を含む。
【表１】
2018508193.tif 000003
【０１０４】
用語「抗体」はインタクトな抗体及びその結合断片を含む。通常、断片は、別々の重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）ｃ、Ｄａｂｓ、ナノボディ及びＦｖを含む標的への特異的な結合についてそれが由来するインタクトな抗体と競合する。断片は、組換えＤＮＡ法によって、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的な分離によって作出することができる。用語「抗体」はまた二重特異性抗体及び／またはヒト化抗体も含む。二重特異性または二官能性の抗体は２つの異なる重鎖／軽鎖の対及び２つの異なる結合部位を有する人工のハイブリッド抗体である（たとえば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７９：３１５−３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１５４７−５３（１９９２）を参照のこと）。一部の二重特異性抗体では、２つの異なる重鎖／軽鎖の対には、ヒト化６Ｂ３または１８Ｇ１の重鎖／軽鎖の対及び６Ｂ３または１８Ｇ１によって結合されるものとは異なるメディン上のエピトープに特異的な重鎖／軽鎖の対が含まれる。
【０１０５】
一部の二重特異性抗体では、重鎖／軽鎖の対の１つは以下でさらに開示されるようなヒト化された６Ｂ３または１８Ｇ１抗体であり、もう一方の重鎖／軽鎖の対は、脳血管関門で発現されている受容体、たとえば、インスリン受容体、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）受容体、レプチン受容体、またはリポタンパク質受容体、またはトランスフェリン受容体に結合する抗体に由来する（Ｆｒｉｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：４７７１−４７７５，１９９１；Ｆｒｉｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：３７３−３７７，１９９３）。そのような二重特異性抗体は、受容体が介在するトランスサイトーシスによって脳血管関門を横切って移行することができる。二重特異性抗体を操作して脳血管関門の受容体に対するその親和性を低下させることによって二重特異性抗体の脳での取り込みをさらに高めることができる。受容体に対する親和性の低下は脳におけるさらに広い分布を生じた（たとえば、Ａｔｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．３，８４ｒａ４３，２０１１；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．３，８４ｒａ４４，２０１１）。
【０１０６】
例となる二重特異性抗体は、（１）各軽鎖及び重鎖が短いペプチド結合を介して縦一列に２つの可変ドメインを含有する二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ−Ｉｇ）（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））分子の生成及び性状分析（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｄｕａｌ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＤＶＤ−ＩｇＴＭ）  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ），Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（２０１０））；（２）標的抗原のそれぞれに対して２つの結合部位を有する四価二重特異性抗体を生じる２つの単鎖ダイアボディの融合体であるＴａｎｄａｂ（タンデムダイアボディ）；（３）多価の分子を生じるダイアボディとのｓｃＦｖの組み合わせであるフレキシボディ；（４）Ｆａｂに適用すると、異なるＦａｂ断片に連結された２つの同一のＦａｂ断片から成る三価の二重特異性結合タンパク質を生じることができる、タンパク質キナーゼＡにおける「二量体化とドッキングドメイン」に基づいたいわゆる「ドックアンドロック」分子；または（５）たとえば、ヒトＦｃ領域の両末端に融合した２つのｓｃＦｖを含む、いわゆるスコーピオン分子であることもできる。二重特異性抗体を調製するのに有用な構築基盤の例には、ＢｉＴＥ（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、ＤＡＲＴ（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、Ｆｃａｂ及びＭａｂ２（Ｆ−ｓｔａｒ）、Ｆｃを操作したＩｇＧｌ（Ｘｅｎｃｏｒ）またはＤｕｏＢｏｄｙ（Ｆａｂアームの交換に基づく、Ｇｅｎｍａｂ）が挙げられる。
【０１０７】
用語「エピトープ」は抗体が結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、隣接するアミノ酸から、または１以上のタンパク質の三次折り畳みによって並置される非隣接アミノ酸から形成されことができる。隣接するアミノ酸から形成されるエピトープ（線形エピトープとしても知られる）は通常、変性溶媒への曝露で保持されるのに対して三次折り畳みによって形成されるエピトープ（立体エピトープとしても知られる）は通常、変性溶媒による処理の際に失われる。エピトープは通常その独特の空間立体構造にて少なくとも３、さらに普通は、少なくとも５、または８〜１０のアミノ酸を含む。エピトープの空間立体構造を決定する方法には、たとえば、Ｘ線結晶学及び二次元核磁気共鳴が挙げられる。たとえば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）におけるエピトープマッピングプロトコールを参照のこと。
【０１０８】
同じエピトープまたは重複するエピトープを認識する抗体は、一方の抗体の標的抗原への別の抗体の結合と競合する能力を示す単純な免疫アッセイにて特定することができる。抗体のエピトープはまた、接触残基を特定する抗原に結合した抗体のＸ線結晶学によっても特定することができる。或いは、一方の抗体の結合を減らすまたは排除する抗原におけるアミノ酸変異のすべてが他方の結合を減らすまたは排除するならば、２つの抗体は同一のエピトープを有する。一方の抗体の結合を減らすまたは排除するアミノ酸変異の幾つかが他方の結合を減らすまたは排除するならば、２つの抗体は重複するエピトープを有する。
【０１０９】
抗体間の競合は、試験下の抗体が共通抗原への参照抗体の特異的な結合を阻害するアッセイによって測定される（たとえば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：１４９５，１９９０を参照）。過剰の試験抗体（たとえば、少なくとも２×、５×、１０×、２０×、または１００×）が競合結合アッセイで測定される時に少なくとも５０％参照抗体の結合を阻害するならば、試験抗体は参照抗体と競合する。一部の試験抗体は少なくとも７５％、９０％または９９％参照抗体の結合を阻害する。競合アッセイによって特定される抗体（競合抗体）には、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体及び参照抗体が結合するエピトープと立体障害が生じるほど十分に近接した隣接エピトープに結合する抗体が挙げられる。
【０１１０】
用語「薬学上許容できる」は、担体、希釈剤、賦形剤または補助剤が製剤の他の成分と相溶性であり、その受入者に対して実質的に有害ではないことを意味する。
【０１１１】
用語「患者」には、予防処置または治療処置のいずれかを受けるヒト及び他の哺乳類対象が含まれる。
【０１１２】
対象が、リスク因子（たとえば、遺伝的、生化学的、家族歴、及び状況曝露）を有する個体を、そのリスク因子のない個体よりも疾患を発症する統計的に有意に高いリスクにさらす少なくとも１つの既知のリスク因子を有していれば、その個体は疾患の大きなリスクがある。
【０１１３】
用語「生体試料」は、生体供給源、たとえば、ヒトまたは哺乳類対象の中にある、またはそれから入手できる生体物質の試料を指す。そのような試料は、臓器、細胞小器官、組織、組織の切片、体液、末梢血、血漿、血清、細胞、たとえば、タンパク質及びペプチドのような分子、及びそれらに由来する部分または組み合わせであることができる。用語、生体試料は試料を処理することによって導出されるいずれの物質も包含することができる。導出される物質には細胞またはその子孫を挙げることができる。生体試料の処理には、濾過、蒸留、抽出、濃縮、固定、干渉する成分の不活化、等の１以上が関与してもよい。
【０１１４】
用語「対照試料」は、疾患に冒された細胞を含むことが知られていないまたは疑われていない生体試料を指す。対照試料は疾患に冒されていない個体から得ることができる。或いは、対照試料は疾患を患っている患者から得ることができる。そのような試料は、疾患を含むと考えられる生体試料と同時にまたは異なる機会に得ることができる。生体試料及び対照試料は双方とも同じ組織から得ることができる。好ましくは、対照試料は、正常で健常な細胞から本質的にまたは全体的に成り、疾患に冒された細胞を含むと考えられる生体試料との比較で使用することができる。好ましくは、対照試料における細胞は生体試料に存在すると考えられる癌と同じ組織起源を有する。好ましくは、生体試料に存在すると考えられる細胞は対照試料における細胞の型と同じ細胞型から生じる。
【０１１５】
用語「疾患」は、生理的な機能を損傷するいずれかの異常な状態を指す。該用語は、病因の性質にかかわらず、生理的な機能が損傷されるいずれかの障害、不健康、異常、病理、病気、病状または症候群を包含するのに広く使用される。
【０１１６】
用語「症状」は対象によって認識されるような変化した足取りのような疾患の自覚的証拠を指す。「兆候」は医師によって観察されるような疾患の客観的な証拠を指す。
【０１１７】
アミノ酸置換を保存的または非保存的に分類する目的で、アミノ酸は以下：第Ｉ群（疎水性側鎖）：ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；第ＩＩ群（中性の親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；第ＩＩＩ群（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；第ＩＶ群（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；第Ｖ群（鎖の配向に影響を与える残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び第ＶＩ群（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅのようにグループ分けされる。保存的な置換には同じクラス内のアミノ酸間の置換が関与する。非保存的な置換はこれらクラスの１つのメンバーを別のクラスのメンバーに交換することを構成する。
【０１１８】
配列同一性の比率はＫａｂａｔ番号付け様式によって最大限並べられた抗体の配列によって決定される。配列比較の後、被験抗体の領域（たとえば、重鎖または軽鎖の成熟可変領域全体）が参照抗体の同じ領域と比較されているのであれば、被験抗体の領域と参照抗体の領域との間での配列同一性の比率は、被験抗体の領域と参照抗体の領域双方で同一アミノ酸によって占められる位置の数をその２つの領域の並べた位置の総数で割り、ギャップをカウントに入れずに、比率に変換するために１００を乗じたものである。
【０１１９】
１以上の引用された要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物及び方法は具体的に引用されない他の要素を含んでもよい。たとえば、抗体を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」組成物は単独でまたは他の成分との組み合わせで抗体を含有してもよい。
【０１２０】
値の範囲の指定にはその範囲の中でのまたはその範囲を定義する整数すべて及びその範囲の中での整数によって定義される副範囲すべてを包含する。
【０１２１】
文脈から別段明らかではない限り、用語「約」は、たとえば、言及される値の測定の標準誤差（たとえば、ＳＥＭ）の範囲内の値のようなごくわずかな変動を包含する。
【０１２２】
統計的な有意性はｐ≦０．０５を意味する。
【０１２３】
冠詞の単数形態、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別段明瞭に指示しない限り、複数の参照を含む。たとえば、用語「ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ（１つの化合物）」または「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ（少なくとも１つの化合物）」はその混合物を含めて複数の化合物を含むことができる。
【０１２４】
詳細な説明
Ｉ．一般
本発明はメディンに特異的に結合する抗体を提供する。抗体は、メディンのモノマー形態、誤って折り畳まれた形態、凝集した形態または原線維の形態に結合する能力を有する。抗体は、メディン、メディンの蓄積またはメディン沈着物の蓄積に関連する疾患または障害を治療するまたはその予防を達成するのに使用することができる。たとえば、大動脈瘤を治療するアプローチの１つは、モノクローナル抗体を用いてメディンを隔離し、それによって凝集を阻止し、または大動脈からアミロイド沈着物を取り除いてもよい。抗体は、数ある用途の中で、メディンアミロイドーシスを診断するのに、及びメディンの凝集を抑制するまたは減らすために使用することもできる。
【０１２５】
ＩＩ．標的分子
メディンは、ラクトアドヘリンの酵素切断によって形成される５０アミノ酸のペプチドであり、配列番号１の配列を有する。ラクトアドヘリンは、乳脂肪小球−ＥＧＦ因子８（ＭＦＧ−Ｅ８）、ＳＥＤ１、ＰＡＳ６／７及びＰ４７としても知られる３６４アミノ酸の糖タンパク質である。メディンは未知の過程によって切断され、エラスチンへの平滑筋のラクトアドヘリンによる固定を妨害し、それによって大動脈の弾力性の低下または「硬化」を招くと考えられている。老人性の大動脈アミロイド沈着の主要成分はメディンである（Ｈａｇｇｑｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９６：８６６９−８６７４（１９９９））。研究は、成熟アミロイド原線維ではなくメディンの前線維オリゴマー凝集体が周辺細胞にとって毒性であることを示している（Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．８７：１１９５−１２０５（２００７））。文脈から別段明らかでない限り、メディン、ラクトアドヘリンまたはそれらの断片に対する参照は、そのアイソフォーム、変異体、対立遺伝子変異体を含む天然のヒトのアミノ酸配列を含む。
【０１２６】
ＩＩＩ．メディンアミロイドーシス
加齢、高血圧症、糖尿病またはアテローム性硬化症に伴って見られる炎症性リモデリングの間に動脈壁においてラクトアドヘリンの蓄積が起きる。動脈壁では、ラクトアドヘリンのシグナル伝達が血管平滑筋細胞の浸潤、増殖、及び炎症性分子の分泌を促進する。老人性大動脈アミロイド沈着の分析は、ラクトアドヘリンのＣ末端領域の内部切断産物であるメディンが主成分であることを明らかにした。メディンは、エラスチンへの平滑筋のラクトアドヘリンによる固定を妨害し、それによって大動脈の弾力性の低下または「硬化」を招くと考えられている。メディンアミロイドの沈着は、５５歳を超えた患者の大動脈では非常に一般的であり、報告の１つは９７％の発生率を推定している。メディンアミロイドの最高の有病率は胸部大動脈で見られる。これはこれらの血管における高レベルのエラスチンによる可能性がある。沈着は、エラスチン線維にごく近接した細胞外空間で見られている。メディンは、ラクトアドヘリンが発現されている他の組織ではあまり豊富ではない、または検出されていない。
【０１２７】
ラクトアドヘリン及び／またはメディンは、マルファン症候群（大動脈のエラスチン線維を冒し、最終的に動脈瘤を招き得る遺伝性疾患）、膵炎、狼瘡、アルツハイマー病及び肥満症にも関係している。
【０１２８】
大動脈瘤は、破裂、重度の内部出血及び死を招き得る構造枠組みと動脈の強度の低下を特徴とする。胸部動脈瘤は、米国で毎年１５，０００人を冒し、破裂して病院に到着したたった約２０〜３０％の患者が助かっているにすぎない。動脈瘤の最も一般的な型は血管径の進行性の増大と壁厚の低下を伴う変性の性質である。動脈瘤のリスク因子には、喫煙、高血圧、アテローム性硬化症、二尖大動脈弁及び遺伝性結合組織疾患が挙げられる。
【０１２９】
ラクトアドヘリン及び／またはメディンはまた、血管系を冒す炎症性の状態、たとえば、血管壁の炎症性の状態、たとえば、ＧＣＡ（巨細胞性動脈炎）でも役割を担い得る。
【０１３０】
ＩＶ．抗体
Ａ．結合特異性及び機能特性
本発明は、メディン内でのエピトープに結合するモノクローナル抗体を提供する。一部のそのようなエピトープはラクトアドヘリンのネイティブな形態には埋め込まれ、誤って畳まれたラクトアドヘリンでは露出される。一部のエピトープは、メディンを生じるラクトアドヘリンの切断の際に露出される新エピトープである。一部のエピトープはメディンのＣ末端領域に位置する。エピトープは、配列番号１に由来する２〜５、３〜５、３〜６、３〜７、３〜９、４〜９または５〜９の隣接するアミノ酸のエピトープのように線状であることができる。一部のエピトープは配列番号２内にある。エピトープは、たとえば、配列番号１の残基１〜５０内のアミノ酸の２以上の非隣接セグメントを含む立体構造エピトープであることができる。１８Ｇ１及び６Ｂ３と称される抗体は２つのそのような例となるマウス抗体である。これらの抗体の重鎖及び軽鎖の成熟可変領域の配列はそれぞれ、配列番号３及び７、及び１１及び１５と呼ばれる。配列番号２９は配列番号１５で見られるＣ末端アルギニンが差し引かれたマウス６Ｂ３抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。配列番号３６は配列番号７で見られるＣ末端アルギニンが差し引かれたマウス１８Ｇ１抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。配列番号７及び配列番号２９におけるＣ末端Ａｒｇは可変領域を定常領域に連結する際に含められることがある。実施例に詳細に記載されているように、抗体は完全長メディンまたはメディンのＣ末端断片に対して作られ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ解析、ウエスタンブロット解析及び免疫組織化学法を含む多数の実験技法によってスクリーニングされた。
【０１３１】
一部の抗体はメディン（配列番号１）の残基４４〜５０内でのエピトープに特異的に結合する。そのような抗体の１つが１８Ｇ１及びそのキメラ形態、ベニア化形態及びヒト化形態である。文脈から別段明らかではない限り、１８Ｇ１への参照は、マウスの形態、キメラ形態、ベニア化形態またはヒト化形態のいずれかを参照して理解されるべきである。１８Ｇ１はメディンペプチドと特異的に結合するが、ラクトアドヘリンと特異的に結合しない。
【０１３２】
一部の抗体は１８Ｇ１のそれとは異なるエピトープに特異的に結合する。たとえば、６Ｂ３及びそのキメラ形態、ベニア化形態及びヒト化形態はメディン（配列番号１）の残基１〜５０内で結合する。文脈から別段明らかではない限り、６Ｂ３への参照はマウスの形態、キメラ形態、ベニア化形態またはヒト化形態のいずれかを参照して理解されるべきである。６Ｂ３は、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットにて完全長メディンペプチド及び合成ラクトアドヘリンポリペプチドの双方と結合するが、ヒトメディンのＣ末端ペプチド（配列番号２）と結合しない。興味深いことに、６Ｂ３が細胞上に発現されているラクトアドヘリンと結合しないということは、ラクトアドヘリンのメディン領域がネイティブのラクトアドヘリン分子の内部に隠されている可能性があり、ラクトアドヘリンが誤って折り畳まれるまたは変性される場合にのみ露出されることを示唆している。
【０１３３】
一部の抗体、たとえば、６Ｂ３及び１８Ｇ１はモノマー形態ならびにメディンのマルチマー及びオリゴマー形態と特異的に結合する。一部の抗体は、動脈瘤で見いだされる密に凝集した物質またはアミロイド沈着物のようなチオフラビンＳ陽性構造と特異的に結合する（たとえば、６Ｂ３）一方で、他の抗体はそうしない（たとえば、１８Ｇ１）。一部の抗体は、チオフラビンＳ陰性構造である緩い原線維に特異的に結合する（たとえば、１８Ｇ１）。一部の抗体は、エラスチン線維と平滑筋細胞を含有する大動脈の領域である中膜を散在性に染色することができる（たとえば、１８Ｇ１）。一部の抗体は、動脈瘤のアミロイド沈着物及びチオフラビンＳ陽性構造に近接するチオフラビンＳ陰性の緩い原線維構造の双方と結合することができる（たとえば、６Ｂ３）。
【０１３４】
本発明の一部の抗体は、６Ｂ３または１８Ｇ１と称する抗体と同じまたは重複するエピトープに結合する。そのような結合特異性を有する他の抗体は、メディンまたは所望のエピトープを含むその一部でマウスを免疫し、メディンまたはその断片への結合について、任意で６Ｂ３または１８Ｇ１との競合にて、得られた抗体をスクリーニングすることによって作出することができる。そのようなアッセイによって特定される抗体を次いで、実施例または別の方法で記載されているように結合特異性についてスクリーニングすることができる。抗体はまた、メディン抗原の変異誘発形態に比べた野生型のメディンまたはその断片への差別的な結合についてスクリーニングすることもできる。そのような変異体に対するスクリーニングは、結合特異性をさらに正確に定義して、その結合が特定の残基の変異誘発によって阻害され、且つ他の例となる抗体の機能特性を共有すると思われる抗体の特定を可能にする。変異は、メディン全体にわたる、またはエピトープが存在することが知られるその区域を介した、アラニン（またはアラニンがすでに存在するのであればセリン）を用いた一度に１残基の、またはさらに広く空間を開けた間隔での系統的な代替置換であることができる。同じセットの変異が２つの抗体の結合を有意に低下させるのであれば、２つの抗体は同一エピトープと結合する。
【０１３５】
選択されたマウス抗体（たとえば、６Ｂ３または１８Ｇ１）の特異性を有する抗体は、ファージディスプレイ法の変形を用いても作出することができる。ＷｉｎｔｅｒのＷＯ９２／２０７９１を参照のこと。この方法はヒト抗体を作出するのに特に好適である。この方法では、選択されたマウス抗体の重鎖または軽鎖の可変領域のいずれかが出発物質として使用される。たとえば、軽鎖可変領域が出発物質として選択されるのであれば、メンバーが同じ軽鎖可変領域（すなわち、マウスの出発物質）と異なる重鎖可変領域を表示するファージライブラリを構築する。重鎖可変領域は、たとえば、再構成されたヒトの重鎖可変領域のライブラリから得ることができる。メディンに対する強い特異的な結合（たとえば、少なくとも１０８及び好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１）を示すファージが選択される。次いでこのファージに由来する重鎖可変領域は、さらなるファージライブラリを構築するための出発物質として役立つ。このライブラリでは、各ファージは同じ重鎖可変領域（すなわち、最初のファージライブラリから特定される領域）及び異なる軽鎖可変領域を示す。軽鎖可変領域は、たとえば、ヒトの再構成された可変軽鎖領域のライブラリから得ることができる。再び、メディンに対する強い結合特異性を示すファージが選択される。得られる抗体は普通、マウスの出発物質と同じまたは類似するエピトープ特異性を有する。
【０１３６】
６Ｂ３の重鎖のＫａｂａｔのＣＤＲは以下（ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１２の残基６〜１２；ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１３、ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１４）のように名付けられ、６Ｂ３の軽鎖のＫａｂａｔのＣＤＲはそれぞれ配列番号１６〜１８と名付けられている。１８Ｇ１の重鎖のＫａｂａｔのＣＤＲは以下（ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号４の残基６〜１０；ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号５、ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号６）のように名付けられ、１８Ｇ１の軽鎖のＫａｂａｔのＣＤＲはそれぞれ配列番号８〜１０と名付けられている。
【０１３７】
６Ｂ３の重鎖のＫａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合のＣＤＲはそれぞれ配列番号１２〜１４と名付けられ、６Ｂ３の軽鎖のＫａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合のＣＤＲはそれぞれ配列番号１６〜１８と名付けられている。１８Ｇ１の重鎖のＫａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合のＣＤＲはそれぞれ配列番号４〜６と名付けられ、１８Ｇ１の軽鎖のＫａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合のＣＤＲはそれぞれ配列番号８〜１０と名付けられている。
【０１３８】
表１１は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＣｈｏｔｈｉａとＫａｂａｔの複合（本明細書では「Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合」とも呼ばれる）、ＡｂＭ及びＣｏｎｔａｃｔによって定義されたような１８Ｇ１のＣＤＲを示す。表１２は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＣｈｏｔｈｉａとＫａｂａｔの複合（本明細書では「Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合」とも呼ばれる）、ＡｂＭ及びＣｏｎｔａｃｔによって定義されたような６Ｂ３のＣＤＲを示す。
【表２】
2018508193.tif 000004
【表３】
2018508193.tif 000005
【０１３９】
他の抗体は、たとえば、６Ｂ３または１８Ｇ１のような例となる抗体の重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡの変異誘発によって得ることができる。成熟重鎖可変領域及び／または成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列にて６Ｂ３または１８Ｇ１に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、且つその機能的特性を維持する、及び／または少数の機能的に重要ではないアミノ酸の置換（たとえば、保存的置換）、欠失または挿入によって各抗体とな異なるモノクローナル抗体も本発明に含まれる。６Ｂ３または１８Ｇ１の相当するＣＤＲに対して９０％、９５％、９９％または１００％同一であるＫａｂａｔによって定義されたような少なくとも１、２、３、４、５及び好ましくは６すべてのＣＤＲを有するモノクローナル抗体も含まれる。
【０１４０】
本発明はまた、６Ｂ３または１８Ｇ１に全体としてまたは実質的に由来する一部のまたはすべての（たとえば、３、４、５及び６）ＣＤＲを有する抗体も提供する。そのような抗体は、６Ｂ３または１８Ｇ１の重鎖可変領域に全体としてまたは実質的に由来する少なくとも２つ、及び普通３つすべてのＣＤＲを有する重鎖可変領域、及び／または６Ｂ３または１８Ｇ１の軽鎖可変領域に全体としてまたは実質的に由来する少なくとも２つ、及び普通３つすべてのＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含むことができる。抗体は重鎖及び軽鎖の双方を含むことができる。ＣＤＲは、ＣＤＲＨ２（Ｋａｂａｔによって定義される時）が６、５、４、３、２または１未満の置換、挿入または欠失を有することができることを除いてそれが４、３、２または１未満の置換、挿入または欠失を含有場合、対応するＣＤＲに実質的に由来する。そのような抗体は、成熟重鎖可変領域及び／または軽鎖可変領域のアミノ酸配列にて６Ｂ３または１８Ｇ１に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有することができ、且つその機能的特性を維持することができ、及び／または少数の機能的に重要ではないアミノ酸の置換（たとえば、保存的置換）、欠失または挿入によって６Ｂ３または１８Ｇ１と異なることができる。
【０１４１】
Ｂ．非ヒト抗体
メディンに対する他の非ヒト抗体、たとえば、マウス、モルモット、霊長類、ウサギまたはラットの抗体の作出は、たとえば、メディンまたはその断片、たとえば、配列番号２または配列番号２２のアミノ酸配列を有するペプチドで動物を免疫することによって達成することができる。Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ＣＳＨＰ  ＮＹ，１９８８）（あらゆる目的で参照によって組み入れられる）を参照のこと。そのような免疫原は天然の供給源から、ペプチド合成によって、または組換え発現によって得ることができる。任意で、キャリアタンパク質と融合させた、またはさもなければそれと複合体化した免疫原を投与することができる。任意で、免疫原をアジュバントと共に投与することができる。以下に記載されているように幾つかの種類のアジュバントを使用することができる。完全フロイントアジュバントとその後の不完全アジュバントが実験動物の免疫には好まれる。ウサギまたはモルモットは通常、ポリクローナル抗体を作製するのに使用される。マウスは通常、モノクローナル抗体を作製するのに使用される。抗体はメディンまたはその所望の断片への特異的な結合についてスクリーニングされる。そのようなスクリーニングは、メディン変異体の収集物に対する抗体の結合を測定し、どのメディン変異体が抗体に結合するかを判定することによって達成することができる。結合は、たとえば、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳまたはＥＬＩＳＡによって評価することができる。
【０１４２】
Ｃ．ヒト化抗体
ヒト化抗体は、非ヒト「ドナー」抗体に由来するＣＤＲがヒトの「アクセプター」抗体の配列に移植される遺伝子操作された抗体である（たとえば、Ｑｕｅｅｎ，ＵＳ５，５３０，１０１及び５，５８５，０８９；Ｗｉｎｔｅｒ，ＵＳ５，２２５，５３９；Ｃａｒｔｅｒ，ＵＳ６，４０７，２１３；Ａｄａｉｒ，ＵＳ５，８５９，２０５；ならびにＦｏｏｔｅ，ＵＳ６，８８１，５５７を参照のこと）。アクセプター抗体の配列は、たとえば、成熟ヒト抗体配列、そのような配列の複合物、ヒト抗体配列のコンセンサス配列、または生殖系列領域の配列であることができる。従って、ヒト化抗体は、ドナー抗体に全体としてまたは実質的に由来する少なくとも３、４、５またはすべてのＣＤＲを有する、及び存在するならば、ヒト抗体配列に全体としてまたは実質的に由来する可変領域フレームワーク配列及び定常領域を有する抗体である。同様に、ヒト化重鎖は、ドナー抗体重鎖に全体としてまたは実質的に由来する少なくとも１、２及び普通３すべてのＣＤＲ、及び存在するならば、ヒト重鎖可変領域フレームワーク及び定常領域の配列に実質的に由来する重鎖可変領域フレームワーク配列及び重鎖定常領域を有する。同様に、ヒト化軽鎖は、ドナー抗体軽鎖に全体としてまたは実質的に由来する少なくとも１、２及び普通３すべてのＣＤＲ、及び存在するならば、ヒト軽鎖可変領域フレームワーク及び定常領域の配列に実質的に由来する軽鎖可変領域フレームワーク配列及び軽鎖定常領域を有する。ナノボディ及びｄＡｂｓ以外、ヒト化抗体はヒト化重鎖及びヒト化軽鎖を含む。ヒト化抗体におけるＣＤＲは、対応する残基（任意の従来の定義によって定義されるが、好ましくはＫａｂａｔによって定義されるような）の少なくとも８５％、９０％、９５％または１００％が各ＣＤＲ間で同一である場合、非ヒト抗体における対応するＣＤＲに実質的に由来する。抗体鎖の可変領域フレームワーク配列または抗体鎖の定常領域は、Ｋａｂａｔによって定義される対応する残基の少なくとも８５％、９０％、９５％または１００％が同一である場合、それぞれヒト可変領域フレームワーク配列またはヒト定常領域に実質的に由来する。
【０１４３】
ヒト化抗体はマウス抗体に由来する６つのＣＤＲ（任意の従来の定義によって定義されるが、好ましくはＫａｂａｔによって定義されるような）すべてを組み込むことが多いが、それらは、マウス抗体に由来するすべてより少ないＣＤＲ（たとえば、少なくとも３、４または５つのＣＤＲ）で作製することもできる（たとえば、Ｐａｓｃａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６，２００２；Ｖａｊｄｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３２０：４１５−４２８，２００２；Ｉｗａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１０７９−１０９１，１９９９；Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４：１４３２−１４４１，２０００）。
【０１４４】
一部の抗体では、ＣＤＲのごく一部、つまり、ＳＤＲと呼ばれる結合に必要とされるＣＤＲ残基のサブセットがヒト化抗体で結合を保持するのに必要とされる。抗原に接触せず、ＳＤＲ内にはないＣＤＲ残基を、分子モデル化によって及び／または経験的に、またはＧｏｎｚａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：８６３，２００４にて記載されたようにＣｈｏｔｈｉａの超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１，１９８７）の外側にあるＫａｂａｔのＣＤＲの領域から以前の研究に基づいて特定することができる（たとえば、ＣＤＲ  Ｈ２における残基Ｈ６０〜Ｈ６５は必要とされないことが多い）。そのようなヒト化抗体では、１以上のドナーＣＤＲ残基が存在しないまたはドナーＣＤＲ全体が削除されている位置で、その位置を占有するアミノ酸はアクセプター抗体配列にて対応する位置（Ｋａｂａｔの番号付けによる）を占有するアミノ酸であることができる。ＣＤＲにおけるドナーアミノ酸のアクセプターによるそのような置換の数に含まれるものは競合する結果の均衡を反映する。そのような置換はヒト化抗体におけるマウスのアミノ酸の数を減らすことにおいて潜在的に有利であり、その結果、潜在的な免疫原性を低下させる。しかしながら、置換は親和性の変化を生じることもでき、親和性の有意な低下は好ましくは回避される。ＣＤＲ内での置換の位置及び置換するアミノ酸は実験的に選択することもできる。
【０１４５】
ヒトのアクセプター抗体の配列を多数の既知のヒト抗体配列の中から任意で選択して、ヒトアクセプター配列の可変領域フレームワークとドナー抗体鎖の対応する可変領域フレームワークとの間での程度の高い配列同一性（たとえば、６５〜８５％同一性）を提供することができる。
【０１４６】
重鎖のためのアクセプター配列の例は、ＮＣＢＩ受託コードＡＡＤ５３８６３．１を持つヒト成熟重鎖可変領域（配列番号２５）である。このアクセプターは、マウス６Ｂ３重鎖と同じ基準形態を有するＣＤＲのＣＤＲ−Ｈ１及びＣＤＲ−Ｈ２を含み、Ｋａｂａｔのヒト重鎖亜群１のメンバーである。軽鎖のためのアクセプター配列の例は、ＮＣＢＩ受託コードＢＡＣ０１５５８．１を持つヒト成熟軽鎖可変領域（配列番号２５）である。このアクセプターは、ＣＤＲ−Ｌ１及びＣＤＲ−Ｌ２についてマウス６Ｂ３と同じ基準クラスを有する。ＢＡＣ０１５５８．１はＫａｂａｔのヒトカッパ亜群２のメンバーである。重鎖のためのアクセプター配列の例は、ＮＣＢＩ受託コードＡＡＸ８２４９４．１を持つヒト成熟重鎖可変領域（配列番号３３）である。このアクセプターは、マウス１８Ｇ１重鎖と同じ基準形態を有するＣＤＲのＣＤＲ−Ｈ１及びＣＤＲ−Ｈ２を含み、Ｋａｂａｔのヒト重鎖亜群１のメンバーである。軽鎖のためのアクセプター配列の例は、ＮＣＢＩ受託コードＡＡＤ３９５０７．１を持つヒト成熟軽鎖可変領域（配列番号３７）である。このアクセプターは、ＣＤＲ−Ｌ１及びＣＤＲ−Ｌ２についてマウス１８Ｇ１と同じ基準クラスを有する。ＡＡＤ３９５０７．１はＫａｂａｔのヒトカッパ亜群２のメンバーである。
【０１４７】
１を超えるヒトのアクセプター抗体の配列が選択されるのであれば、それらアクセプターの複合物またはハイブリッドを使用することができ、ヒト化軽鎖及び重鎖の可変領域における異なる位置で使用されるアミノ酸は使用されるヒトのアクセプター抗体の配列のいずれかから取ることができる。
【０１４８】
ヒトの可変領域フレームワーク残基に由来するある特定のアミノ酸を、ＣＤＲの立体構造及び／または抗原への結合に対するその考えられる影響に基づいて置換のために選択することができる。そのような考えられる影響の検討は、モデル化、特定の位置でのアミノ酸の特徴の検査、または特定のアミノ酸の置換または変異誘発の効果の実験的観察による。
【０１４９】
たとえば、アミノ酸がマウスの可変領域フレームワーク残基と選択されたヒト可変領域フレームワーク残基との間で異なる場合、アミノ酸が
（１）抗原と直接非共有結合で結合する；
（２）Ｃｈｏｔｈｉａによって定義されるが、Ｋａｂａｔによって定義されないＣＤＲ領域に隣接するまたはＣＤＲの中にある；
（３）さもなければ、ＣＤＲ領域と相互作用する（たとえば、ＣＤＲ領域の約６Åの範囲内にある）、（たとえば、相同の既知の免疫グロブリン鎖の解決済みの構造にて軽鎖または重鎖をモデル化することによって特定される）；または
（４）ＶＬ−ＶＨの界面にて関与する残基である
ことが無理なく予想されるならば、ヒトのフレームワークのアミノ酸をマウス抗体に由来する等価のフレームワークのアミノ酸によって置換することができる。
【０１５０】
ＱｕｅｅｎのＵＳ５，５３０，１０１によって定義されるクラス（１）〜（３）に由来するフレームワーク残基は交互にカノニカル残基及びバーニヤ残基と呼ばれることがある。ＣＤＲループの立体構造を定義するのに役立つフレームワーク残基はカノニカル残基と呼ばれることがある（Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｔｈｏｒｎｔｏｎ＆Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００−８１５（１９９６））。抗原結合ループの立体構造を支え、且つ抗体の抗原へのはめこみを微調整することにて役割を担うフレームワーク残基はバーニヤ残基と呼ばれることがある（Ｆｏｏｔｅ及びＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２４：４８７−４９９（１９９２））。
【０１５１】
置換の候補である他のフレームワーク残基は潜在的なグリコシル化部位を作り出す残基である。置換のさらに他の候補は、その位置でヒト免疫グロブリンにとって普通ではないヒトのアクセプターのフレームワークのアミノ酸である。これらのアミノ酸は、マウスのドナー抗体の等価の位置に由来するまたはさらに典型的なヒト免疫グロブリンの等価の位置に由来するアミノ酸で置換することができる。
【０１５２】
置換の候補である他のフレームワーク残基は、グルタミン酸（Ｅ）で置換されてピログルタミン酸塩変換の潜在力を最小化してもよいＮ末端のグルタミン残基（Ｑ）である（Ｌｉｕ，Ｙ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８６：１１２１１−１１２１７）。グルタミン酸（Ｅ）のピログルタミン酸塩（ｐＥ）への変換はグルタミン（Ｑ）からよりもゆっくり生じる。グルタミンからｐＥへの変換における１級アミンの喪失のために、抗体はさらに酸性になる。不完全な変換は、電荷に基づく分析法を用いて複数のピークとして観察され得る抗体における不均質性を生じる。不均質性の差異は工程制御の欠如を示し得る。Ｎ末端のグルタミンからグルタミン酸塩への置換を伴う例となるヒト化抗体は、Ｈｕ６Ｂ３ＶＨｖ２（配列番号２７）、Ｈｕ６Ｂ３ＶＨｖ３（配列番号２８）及びＨｕ１８Ｇ１ＶＨｖ２（配列番号３９）である。
【０１５３】
例となるヒト化抗体は６Ｂ３及び１８Ｇ１と名付けられたマウスメディン抗体のヒト化形態である。マウス６Ｂ３抗体はそれぞれ、配列番号１１及び配列番号２９を含むアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域及び成熟軽鎖可変領域を含む。マウス１８Ｇ１抗体はそれぞれ、配列番号３及び配列番号３６を含むアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域及び成熟軽鎖可変領域を含む。
【０１５４】
例となるヒト化抗体はそれぞれＨｕ６Ｂ３及びＨｕ１８Ｇ１と名付けられたマウス６Ｂ３及び１８Ｇ１抗体のヒト化された形態である。
【０１５５】
マウス抗体６Ｂ３はそれぞれ、配列番号１１及び配列番号２９を含むアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域及び成熟軽鎖可変領域を含む。本発明は３つの例となるヒト化成熟重鎖可変領域：Ｈｕ６Ｂ３ＶＨｖ１（配列番号２６）、Ｈｕ６Ｂ３ＶＨｖ２（配列番号２７）、及びＨｕ６Ｂ３ＶＨｖ３（配列番号２８）を提供する。本発明はさらに２つの例となるヒト成熟軽鎖可変領域：Ｈｕ６Ｂ３ＶＬｖ１（配列番号３１）及びＨｕ６Ｂ３ＶＬｖ２（配列番号３２）を提供する。図７及び図８はそれぞれ、マウス６Ｂ３、ヒトアクセプター抗体及び種々のヒト化抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列比較を示す。
【０１５６】
マウス抗体１８Ｇ１はそれぞれ、配列番号３及び配列番号３６を含むアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域及び成熟軽鎖可変領域を含む。本発明は２つの例となるヒト化成熟重鎖可変領域：Ｈｕ１８Ｇ１ＶＨｖ１（配列番号３４）及びＨｕ１８Ｇ１ＶＨｖ２（配列番号３５）を提供する。本発明はさらに２つの例となるヒト成熟軽鎖可変領域：Ｈｕ１８Ｇ１ＶＬｖ１（配列番号３８）及びＨｕ１８Ｇ１ＶＬｖ２（配列番号３９）を提供する。図９及び図１０はそれぞれ、マウス１８Ｇ１、ヒトアクセプター抗体及び種々のヒト化抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列比較を示す。
【０１５７】
ＣＤＲの立体構造及び／または抗原への結合に対する考えられる影響、重鎖と軽鎖の間での相互作用に、定常領域との相互作用に介在すること、所望のまたは所望ではない翻訳後修飾のための部位であること、ヒト可変領域配列における位置のために普通ではない残基なので免疫原性の可能性があること、凝集能を得ること等の理由、及び他の理由で、以下の２６の可変領域フレームワークの位置が、実施例にてさらに特定されるような２つの例となるＨｕ６Ｂ３成熟軽鎖可変領域及び３つの例となるＨｕ６Ｂ３成熟重鎖可変領域における置換についての候補と見なされた：Ｌ７１（Ｆ７１Ｙ）、Ｌ８７（Ｙ８７Ｆ）、Ｌ１００（Ｇ１００Ｑ）、Ｌ１０４（Ｖ１０４Ｌ）、Ｈ１（Ｑ１Ｅ）、Ｈ３（Ｔ３Ｑ）、Ｈ５（Ｋ５Ｑ）、Ｈ１０（Ａ１０Ｇ）、Ｈ１５（Ｔ１５Ｓ）、Ｈ１９（Ｔ１９Ｓ）、Ｈ４４（Ａ４４Ｇ）、Ｈ４８（Ｌ４８Ｉ）、Ｈ４９（Ａ４９Ｇ）、Ｈ６７（Ｌ６７Ｖ）、Ｈ７８（Ｖ７８Ｆ）、Ｈ７９（Ｖ７９Ｓ）、Ｈ８１（Ｔ８１Ｋ）、Ｈ８２（Ｍ８２Ｌ）、Ｈ８２ａ（Ｔ８２ａＳ）、Ｈ８２ｂ（Ｎ８２ｂＳ）、Ｈ８２ｃ（Ｍ８２ｃＶ）、Ｈ８３（Ｄ８３Ｔ）、Ｈ８４（Ｐ８４Ａ）、Ｈ８５（Ｖ８５Ａ）、Ｈ８９（Ｔ８９Ｖ）、及びＨ１０８（Ｌ１０８Ｔ）。同様に、以下の３１の可変領域フレームワークの位置は、実施例にてさらに特定されるような２つの例となるＨｕ１８Ｇ１成熟軽鎖可変領域及び２つの例となるＨｕ１８Ｇ１成熟重鎖可変領域における置換についての候補と見なされた：Ｌ３（Ｑ３Ｖ）、Ｌ１０（Ｆ１０Ｓ）、Ｌ１３（Ａ１３Ｖ）、Ｌ１５（Ｖ１５Ｐ）、Ｌ１９（Ｖ１９Ａ）、Ｌ２０（Ｔ２０Ｓ）、Ｌ２２（Ｔ２２Ｓ）、Ｌ４２（Ｋ４２Ｑ）、Ｌ４５（Ｋ４５Ｑ）、Ｌ６０（Ｓ６０Ｄ）、Ｌ７０（Ｅ７０Ｄ）、Ｌ７７（Ｓ７７Ｒ）、Ｌ７８（Ｌ７８Ｖ）、Ｌ８０（Ｐ８０Ａ）、Ｌ８３（Ｆ８３Ｌ）、Ｌ８５（Ｔ８５Ｖ）、Ｈ１（Ｑ１Ｅ）、Ｈ５（Ｑ５Ｖ）、Ｈ１３（Ｋ１３Ｑ）、Ｈ１９（Ｋ１９Ｒ）、Ｈ４０（Ｔ４０Ａ）、Ｈ４２（Ｄ４２Ｇ）、Ｈ４４（Ｒ４４Ｇ）、Ｈ４９（Ａ４９Ｓ）、Ｈ７７（Ｔ７７Ｓ）、Ｈ８２ａ（Ｓ８２ａＮ）、Ｈ８３（Ｋ８３Ｒ）、Ｈ８４（Ｓ８４Ａ）、Ｈ８９（Ｍ８９Ｖ）、Ｈ９３（Ａ９３Ｖ）、及びＨ１０８（Ｍ１０８Ｔ）。
【０１５８】
ここで、他のどこでも同じように、最初に言及される残基は、ＣＤＲ−Ｈ１の場合、ＫａｂａｔのＣＤＲまたはＣｈｏｔｈｉａ−Ｋａｂａｔ複合のＣＤＲをヒトアクセプターのフレームワークに移植することによって形成されるヒト化抗体の残基であり、２番目に言及される残基はそのような残基を置き換えると見なされる残基である。従って、可変領域フレームワークの範囲内で、最初に言及される残基はヒト由来であり、ＣＤＲの範囲内で最初に言及される残基はマウス由来である。
【０１５９】
例となるＨｕ６Ｂ３抗体には、例となる成熟重鎖及び軽鎖の可変領域のいずれかの並べ替え及び組み合わせが含まれる（たとえば、ＶＨｖ１／ＶＬｖ１またはＨ１Ｌ１、ＶＨｖ１／ＶＬｖ２またはＨ１Ｌ２、ＶＨｖ２／ＶＬｖ１またはＨ２Ｌ１、ＶＨｖ２／ＶＬｖ２またはＨ２Ｌ２、ＶＨｖ３／ＶＬｖ１またはＨ３Ｌ１、ＶＨｖ３／ＶＬｖ２またはＨ３Ｌ２）。
【０１６０】
本発明は、ヒト化成熟重鎖可変領域がＨｕ６Ｂ３ＶＨｖ１、Ｈｕ６Ｂ３ＶＨｖ２及びＨｕ６Ｂ３ＶＨｖ３（配列番号２６〜２８）のいずれか１つに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を示し、且つヒト化成熟軽鎖可変領域がＨｕ６Ｂ３ＶＬｖ１またはＨｕ６Ｂ３ＶＬｖ２（配列番号３１〜３２）に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を示すヒト化６Ｂ３抗体の変異体を提供する。一部のそのような抗体では、配列番号２６〜２８及び配列番号３１〜３２において見いだされる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６すべての復帰突然変異または他の突然変異は保持される。
【０１６１】
一部のヒト化６Ｂ３抗体では、ＶＨ領域における以下の位置の少なくとも１つが特定されるようなアミノ酸によって占有される：Ｈ３はＱによって占有され、Ｈ５はＱによって占有され、Ｈ１０はＧによって占有され、Ｈ１５はＳによって占有され、Ｈ１９はＳによって占有される。一部の抗体では、ＶＨ領域におけるＨ３、Ｈ５、Ｈ１０、Ｈ１５、及びＨ１９位はそれぞれ、Ｑ、Ｑ、Ｇ、Ｓ、及びＳによって占有される。一部のヒト化６Ｂ３抗体では、ＶＨ領域における位置の少なくとも１つが特定されるようなアミノ酸によって占有される：Ｈ１はＥまたはＱによって占有され、Ｈ４４はＧによって占有され、Ｈ４８はＩまたはＬによって占有され、Ｈ４９はＧまたはＡによって占有され、Ｈ６７はＶまたはＬによって占有され、Ｈ７８はＦまたはＶによって占有され、Ｈ７９はＳまたはＶによって占有され、Ｈ８１はＫまたはＴによって占有され、Ｈ８２はＬまたはＭによって占有され、Ｈ８２ａはＳまたはＴによって占有され、Ｈ８２ｂはＳまたはＮによって占有され、Ｈ８２ｃはＶまたはＭによって占有され、Ｈ８３はＴまたはＤによって占有され、Ｈ８４はＡまたはＰによって占有され、Ｈ８５はＡまたはＶによって占有され、Ｈ８９はＶまたはＴによって占有され、Ｈ１０８はＴまたはＬによって占有され、Ｌ７１はＹまたはＦによって占有され、Ｌ８７はＦまたはＹによって占有され、Ｌ１００はＱまたはＧによって占有され、及びＬ１０４はＬまたはＶによって占有される。
【０１６２】
一部のヒト化６Ｂ３抗体では、ＶＨ領域における以下の位置の少なくとも１つが特定されるようなアミノ酸によって占有される：Ｈ１はＥまたはＱによって占有され、Ｈ３５はＧによって占有され、Ｈ３５ｂはＧによって占有され、Ｈ４４はＧまたはＡによって占有され、Ｈ４８はＩまたはＬによって占有され、Ｈ４９はＧまたはＡによって占有され、Ｈ５０はＨによって占有され、Ｈ５８はＹによって占有され、Ｈ６０はＮによって占有され、Ｈ６１はＩによって占有され、Ｈ６２はＡによって占有され、Ｈ６５はＮによって占有され、Ｈ６７はＶまたはＬによって占有され、Ｈ７８はＦまたはＶによって占有され、Ｈ７９はＳまたはＶによって占有され、Ｈ８１はＫまたはＴによって占有され、Ｈ８２はＬまたはＭによって占有され、Ｈ８２ａはＳまたはＴによって占有され、Ｈ８２ｂはＳまたはＮによって占有され、Ｈ８２ｃはＶまたはＭによって占有され、Ｈ８３はＴまたはＤによって占有され、Ｈ８４はＡまたはＰによって占有され、Ｈ８５はＡまたはＶによって占有され、Ｈ８９はＶまたはＴによって占有され、Ｈ１０２はＹによって占有され、Ｈ１０８はＴまたはＬによって占有され、Ｌ７１はＹまたはＦによって占有され、Ｌ８７はＦまたはＹによって占有され、Ｌ１００はＱまたはＧによって占有され、及びＬ１０４はＬまたはＶによって占有される。
【０１６３】
一部のヒト化６Ｂ３抗体では、ＶＨ領域におけるＨ１、Ｈ４４、Ｈ７９、Ｈ８１、Ｈ８２、Ｈ８２ｂ、Ｈ８２ｃ、Ｈ８３、Ｈ８４、Ｈ８５、及びＨ８９位はそれぞれ、Ｅ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ｌ、Ｓ、Ｖ、Ｔ、Ａ、Ａ、及びＶによって占有される。一部のヒト化６Ｂ３抗体では、ＶＨ領域におけるＨ３、Ｈ５、Ｈ１０、Ｈ１５、及びＨ１９位はそれぞれＨｕ６Ｂ３ＶＨｖ１におけるように、Ｑ、Ｑ、Ｇ、Ｓ、及びＳによって占有される。一部のヒト化６Ｂ３抗体では、ＶＨ領域におけるＨ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ１０、Ｈ１５、Ｈ１９、Ｈ４４、Ｈ７９、Ｈ８１、Ｈ８２、Ｈ８２ｂ、Ｈ８２ｃ、Ｈ８３、Ｈ８４、Ｈ８５、Ｈ８９位はそれぞれＨｕ６Ｂ３ＶＨｖ２におけるように、Ｅ、Ｑ、Ｑ、Ｇ、Ｓ、Ｓ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ｌ、Ｓ、Ｖ、Ｔ、Ａ、Ａ、及びＶによって占有される。一部のヒト化６Ｂ３抗体では、ＶＨ領域におけるＨ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ１０、Ｈ１５、Ｈ１９、Ｈ４４、Ｈ４８、Ｈ４９、Ｈ６７、Ｈ７８、Ｈ７９、Ｈ８１、Ｈ８２、Ｈ８２ａ、Ｈ８２ｂ、Ｈ８２ｃ、Ｈ８３、Ｈ８４、Ｈ８５、Ｈ８９、及びＨ１０８位はそれぞれＨｕ６Ｂ３ＶＨｖ３におけるように、Ｅ、Ｑ、Ｑ、Ｇ、Ｓ、Ｓ、Ｇ、Ｉ、Ｇ、Ｖ、Ｆ、Ｓ、Ｋ、Ｌ、Ｓ、Ｓ、Ｖ、Ｔ、Ａ、Ａ、Ｖ、及びＴによって占有される。一部のヒト化６Ｂ３抗体では、ＶＬ領域におけるＬ７１、Ｌ８７、Ｌ１００、及びＬ１０４位はそれぞれＨｕ６Ｂ３ＶＬｖ２におけるように、Ｙ、Ｆ、Ｑ、及びＬによって占有される。
【０１６４】
そのようなヒト化抗体のＣＤＲ領域は６Ｂ３マウスドナー抗体のＣＤＲ領域と同一であるまたは実質的に同一である。ＣＤＲ領域は従来の定義（たとえば、ＣｈｏｔｈｉａまたはＣｈｏｔｈｉａとＫａｂａｔの複合）によって定義することができるが、好ましくはＫａｂａｔによって定義されるとおりである。
【０１６５】
可変領域フレームワークの位置は特に述べられない限り、Ｋａｂａｔの番号付けに従う。他のそのような変異体は通常、少数（たとえば、通常、１、２、３、５、１０または１５未満）の置換、欠失または挿入によって例となるＨｕ６Ｂ３の重鎖及び軽鎖の配列とは異なる。そのような差異は普通、フレームワークの中にあるが、ＣＤＲにて生じることもできる。
【０１６６】
例となるＨｕ１８Ｇ１抗体には、例となる成熟重鎖及び軽鎖の可変領域のいずれかの並べ替えまたは組み合わせが含まれる（たとえば、ＶＨｖ１／ＶＬｖ１またはＨ１Ｌ１、ＶＨｖ１／ＶＬｖ２またはＨ１Ｌ２、ＶＨｖ２／ＶＬｖ１またはＨ２Ｌ１、ＶＨｖ２／ＶＬｖ２またはＨ２Ｌ２）。
【０１６７】
本発明は、ヒト化成熟重鎖可変領域が、Ｈｕ１８Ｇ１ＶＨｖ１または１８Ｇ１ＶＨｖ２（配列番号３４〜３５）に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を示し、且つヒト化成熟軽鎖可変領域が、Ｈｕ１８Ｇ１ＶＬｖ１またはＨｕ１８Ｇ１ＶＬｖ２（配列番号３８〜３９）に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を示すヒト化１８Ｇ１抗体の変異体を提供する。一部のそのような抗体では、配列番号３４〜３５及び配列番号３８〜３９において見いだされる復帰突然変異または他の突然変異の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３１すべてが保持される。
【０１６８】
一部のヒト化１８Ｇ１抗体では、ＶＬ領域における以下の位置の少なくとも１つが特定されるようなアミノ酸によって占有される：Ｌ３位はＶによって占有され、Ｌ１０位はＳによって占有され、Ｌ１３位はＶによって占有され、Ｌ１５位はＰによって占有され、Ｌ１９位はＡによって占有され、Ｌ２０位はＳによって占有され、Ｌ２２位はＳによって占有され、Ｌ４２位はＱによって占有され、Ｌ７０位はＤによって占有され、Ｌ７７位はＲによって占有され、Ｌ７８位はＶによって占有され、Ｌ８０位はＡによって占有され、及びＬ８５位はＶによって占有される。
【０１６９】
一部のヒト化１８Ｇ１抗体では、以下の位置の少なくとも１つが特定されるようなアミノ酸によって占有される：Ｌ３位はＶによって占有され、Ｌ１０位はＳによって占有され、Ｌ１３位はＶによって占有され、Ｌ１５位はＰによって占有され、Ｌ１９位はＡによって占有され、Ｌ２０位はＳによって占有され、Ｌ２２位はＳによって占有され、Ｌ２４位はＫによって占有され、Ｌ２８位はＮによって占有され、Ｌ２９位はＶによって占有され、Ｌ４２位はＱによって占有され、Ｌ４６位はＬによって占有され、Ｌ７０位はＤによって占有され、Ｌ７７位はＲによって占有され、Ｌ７８位はＶによって占有され、Ｌ８０位はＡによって占有され、及びＬ８５位はＶによって占有される。
【０１７０】
一部のヒト化１８Ｇ１抗体では、ＶＬ領域におけるＬ３、Ｌ１０、Ｌ１３、Ｌ１５、Ｌ１９、Ｌ２０、Ｌ２２、Ｌ４２、Ｌ７０、Ｌ７７、Ｌ７８、Ｌ８０、及びＬ８５位はそれぞれ、Ｖ、Ｓ、Ｖ、Ｐ、Ａ、Ｓ、Ｓ、Ｑ、Ｄ、Ｒ、Ｖ、Ａ、及びＶによって占有される。一部のヒト化１８Ｇ１抗体では、以下の位置の少なくとも１つが特定されるようなアミノ酸によって占有される：Ｈ１はＥまたはＱによって占有され、Ｈ５位はＶまたはＱによって占有され、Ｈ１３位はＱまたはＫによって占有され、Ｈ１９位はＲまたはＫによって占有され、Ｈ４０位はＡまたはＴによって占有され、Ｈ４２位はＧまたはＤによって占有され、Ｈ４４位はＧまたはＲによって占有され、Ｈ４９位はＳまたはＡによって占有され、Ｈ７７位はＳまたはＴによって占有され、Ｈ８２ａ位はＮまたはＳによって占有され、Ｈ８３位はＲまたはＫによって占有され、Ｈ８４位はＡまたはＳによって占有され、Ｈ８９位はＶまたはＭによって占有され、Ｈ１０８位はＴまたはＭによって占有され、Ｌ４５位はＱによって占有され、Ｌ６０位はＤによって占有され、及びＬ８３位はＬによって占有される。
【０１７１】
一部のヒト化１８Ｇ１抗体では、以下の位置の少なくとも１つが特定されるようなアミノ酸によって占有される：Ｈ１はＥまたはＱによって占有され、Ｈ５位はＶまたはＱによって占有され、Ｈ１３位はＱまたはＫによって占有され、Ｈ１９位はＲまたはＫによって占有され、Ｈ４０位はＡまたはＴによって占有され、Ｈ４２位はＧまたはＤによって占有され、Ｈ４４位はＧまたはＲによって占有され、Ｈ４９位はＳまたはＡによって占有され、Ｈ５０位はＧによって占有され、Ｈ６３位はＴによって占有され、Ｈ７７位はＳまたはＴによって占有され、Ｈ８２ａ位はＮまたはＳによって占有され、Ｈ８３位はＲによって占有され、Ｈ８４位はＡによって占有され、Ｈ８９位はＶまたはＭによって占有され、Ｈ９３はＶまたはＡによって占有され、Ｈ１０８位はＴまたはＭによって占有される。
【０１７２】
一部のヒト化１８Ｇ１抗体では、ＶＬ領域におけるＬ４５位、Ｌ６０位及びＬ８３位の少なくとも１つがそれぞれＱ、Ｄ及びＬによって占有される。
【０１７３】
一部のヒト化１８Ｇ１抗体では、ＶＨ領域におけるＨ１、Ｈ５、Ｈ１３、Ｈ１９、Ｈ４０、Ｈ４２、Ｈ４４、Ｈ４９、Ｈ７７、Ｈ８２ａ、Ｈ８３、Ｈ８４、Ｈ８９、Ｈ９３、及びＨ１０８位がそれぞれＨｕ１８Ｇ１ＶＨｖ２におけるように、Ｅ、Ｖ、Ｑ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｇ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｖ、及びＴによって占有される。一部のヒト化１８Ｇ１抗体では、ＶＬ領域におけるＬ３、Ｌ１０、Ｌ１３、Ｌ１５、Ｌ１９、Ｌ２０、Ｌ２２、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｌ７０、Ｌ７７、Ｌ７８、Ｌ８０、及びＬ８５位はそれぞれＨｕ１８Ｇ１ＶＬｖ１におけるように、Ｖ、Ｓ、Ｖ、Ｐ、Ａ、Ｓ、Ｓ、Ｑ、Ｑ、Ｄ、Ｒ、Ｖ、Ａ、及びＶによって占有される。一部のヒト化１８Ｇ１抗体では、ＶＬ領域におけるＬ３、Ｌ１０、Ｌ１３、Ｌ１５、Ｌ１９、Ｌ２０、Ｌ２２、Ｌ４２、Ｌ６０、Ｌ７０、Ｌ７７、Ｌ７８、Ｌ８０、Ｌ８３、及びＬ８５位はそれぞれＨｕ１８Ｇ１ＶＬｖ２におけるように、Ｖ、Ｓ、Ｖ、Ｐ、Ａ、Ｓ、Ｓ、Ｑ、Ｄ、Ｄ、Ｒ、Ｖ、Ａ、Ｌ、及びＶによって占有される。
【０１７４】
そのようなヒト化抗体のＣＤＲ領域は、１８Ｇ１マウスドナー抗体のＣＤＲ領域と同一であるまたは実質的に同一であることができる。ＣＤＲ領域は従来の定義（たとえば、ＣｈｏｔｈｉａまたはＣｈｏｔｈｉａとＫａｂａｔの複合）によって定義することができるが、好ましくはＫａｂａｔによって定義されるとおりである。
【０１７５】
可変領域フレームワークの位置は、特に述べられない限り、Ｋａｂａｔの番号付けに従う。他のそのような変異体は通常、少数（たとえば、通常、１、２、３、５、１０または１５未満）の置換、欠失または挿入によって例となるＨｕ１８Ｇ１の重鎖及び軽鎖の配列とは異なる。そのような差異は普通、フレームワークの中にあるが、ＣＤＲにて生じることもできる。
【０１７６】
ヒト化された６Ｂ３または１８Ｇ１の変異体における追加の変異の可能性は可変領域フレームワークにおける追加の復帰突然変異である。ヒト化ｍＡｂにてＣＤＲと接触していないフレームワーク残基の多くは、ドナーマウスｍＡｂまたは他のマウスもしくはヒトの抗体の相当する位置に由来するアミノ酸の置換に対応することができ、多くの潜在的にＣＤＲに接触した残基でさえも置換を受け入れる。ＣＤＲ内のアミノ酸でさえ、たとえば、可変領域フレームワークを供給するのに使用されるヒトアクセプター配列の相当する位置で見いだされる残基によって変えられてもよい。加えて、たとえば、重鎖及び／または軽鎖のために交互のヒトアクセプター配列を使用することができる。異なるアクセプター配列が使用されるのであれば、相当するドナー及びアクセプターの残基が復帰突然変異がなくてもすでに同一であるので、上記で推奨される１以上の復帰突然変異を実施しなくてもよい。
【０１７７】
好ましくは、ヒト化した６Ｂ３または１８Ｇ１の変異体における置換または復帰突然変異（保存的であろうとなかろうと）は、ヒト化ｍＡｂの結合親和性または効力に対して実質的な効果を有さず、すなわち、メディンに結合するその能力（たとえば、変異体ヒト化６Ｂ３または１８Ｇ１抗体の本実施例で記載されているアッセイの一部またはすべてにおける効力）は、マウス６Ｂ３または１８Ｇ１抗体のそれと本質的に同じであり、すなわち、実験誤差の範囲内である。
【０１７８】
Ｄ．キメラ抗体及びベニア化抗体
本発明はさらに、非ヒト抗体、特に実施例のメディン抗体のキメラ形態及びベニア化形態を提供する。
【０１７９】
キメラ抗体は、非ヒト抗体（たとえば、マウス）の軽鎖及び重鎖の成熟可変領域がヒトの軽鎖及び重鎖の定常領域と組み合わせられる抗体である。そのような抗体はマウス抗体の結合特異性を実質的にまたは全体として保持し、およそ３分の２はヒト配列である。
【０１８０】
ベニア化抗体は、ＣＤＲの一部及び普通全部と非ヒト抗体の非ヒト可変領域フレームワーク残基の一部を保持するが、Ｂ細胞またはＴ細胞のエピトープに寄与し得る他の可変領域フレームワーク残基、たとえば、露出した残基（Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９，１９９１）をヒト抗体配列の対応する位置に由来する残基で置き換えるヒト化抗体の型である。結果は、ＣＤＲが全体としてまたは実質的に非ヒト抗体に由来し、非ヒト抗体の可変領域フレームワークが置換によってさらにヒト様にされる抗体である。６Ｂ３及び１８Ｇ１抗体のベニア化形態は本発明に含められる。
【０１８１】
Ｅ．ヒト抗体
以下に記載されている種々の技法によってメディンに対するヒト抗体が提供される。一部のヒト抗体は、競合結合実験によって、Ｗｉｎｔｅｒの、上記のまたは他のやり方のファージディスプレイ法によって、特定のマウス抗体、たとえば、実施例に記載されているマウスモノクローナル抗体の１つと同じエピトープ特異性を有するように選択される。ヒト抗体はまた、たとえば、メディンのＣ末端断片のようなメディンの断片のみを用いることによって特定のエピトープ特異性についてスクリーニングすることができる。
【０１８２】
ヒト抗体を作り出す方法には、Ｏｅｓｔｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ２：３６１−３６７（１９８３）；Ｏｅｓｔｂｅｒｇ，米国特許第４，６３４，６６４号；及びＥｎｇｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，６３４，６６６号のトリオーマ法、ヒトの免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスの使用（たとえば、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９３／１２２２７（１９９３）；ＵＳ５，８７７，３９７；ＵＳ５，８７４，２９９；ＵＳ５，８１４，３１８；ＵＳ５，７８９，６５０；ＵＳ５，７７０，４２９；ＵＳ５，６６１，０１６；ＵＳ５，６３３，４２５；ＵＳ５，６２５，１２６；ＵＳ５，５６９，８２５；ＵＳ５，５４５，８０６；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）；及びＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，ＷＯ９１／１０７４１（１９９１）を参照）及びファージディスプレイ法（たとえば、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９１／１７２７１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９２／０１０４７；ＵＳ５，８７７，２１８；ＵＳ５，８７１，９０７；ＵＳ５，８５８，６５７；ＵＳ５，８３７，２４２；ＵＳ５，７３３，７４３；及びＵＳ５，５６５，３３２を参照）；及びＷＯ２００８／０８１００８にて記載された方法（たとえば、ヒトから単離されたメモリＢ細胞を、たとえば、ＥＢＶと共に不動化すること、所望の特性をスクリーニングすること、及び組換え形態をクローニングし、発現させること）が挙げられる。
【０１８３】
Ｆ．定常領域の選択
キメラ抗体、ベニア化抗体またはヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域はヒト定常領域の少なくとも一部に連結することができる。定常領域の選択はある程度、抗体依存性細胞介在性の細胞傷害性、抗体依存性の細胞性貪食作用及び／または補体依存性の細胞傷害性が所望であるかどうかに左右される。たとえば、ヒトのアイソタイプＩｇＧ１及びＩｇＧ３は補体依存性の細胞傷害性を有するが、ヒトのアイソタイプＩｇＧ２及びＩｇＧ４は有さない。ヒトのＩｇＧ１及びＩｇＧ３はヒトのＩｇＧ２及びＩｇＧ４よりも強い細胞介在性のエフェクター機能も誘導する。軽鎖定常領域はラムダまたはカッパであることができる。定常領域の番号付け様式には、ＥＵ番号付け（Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，６３，７８−８５（１９６９））、Ｋａｂａｔの番号付け（Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  （Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１）、ＩＭＧＴユニーク番号付け（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，ＩＭＧＴ  ｕｎｉｑｕｅ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｉｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｃ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９，１８５−２０３（２００５）、及びＩＭＧＴエクソン番号付け（Ｌｅｆｒａｎｃ，上記）が挙げられる。軽鎖及び／または重鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端における１個または数個のアミノ酸、たとえば、重鎖のＣ末端リジンは分子の一部またはすべてにおいて欠落してもよいし、誘導体化されてもよい。定常領域にて置換を行って、たとえば、補体介在性の細胞傷害性またはＡＤＣＣのようなエフェクター機能を低下させるまたは高めることができ（たとえば、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６２４，８２１号；Ｔｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８３４，５９７号；及びＬａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：４００５，２００６）、またはヒトにて半減期を延ばすことができる（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：６２１３，２００４）。例となる置換には、抗体の半減期を増やすための２５０位でのＧｌｎ及び／または４２８位でのＬｅｕ（定常領域についてこの段落ではＥＵ番号付けを使用する）が挙げられる。２３４位、２３５位、２３６位及び／または２３７位のいずれかまたはすべてにおける置換はＦｃγ受容体、特にＦｃγＲＩ受容体についての親和性を低下させる（たとえば、ＵＳ６，６２４，８２１を参照）。ヒトＩｇＧ１の２３４位、２３５位及び２３７位におけるアラニン置換はエフェクター機能を低下させるのに使用することができる。一部の抗体は、エフェクター機能を低下させるためにヒトＩｇＧ１の２３４位、２３５位及び２３７位にてアラニン置換を有する。任意で、ヒトＩｇＧ２における２３４位、２３６位及び２３７位がアラニンで置換され、２３５位がグルタミンで置換される（たとえば、��Ｓ５，６２４，８２１を参照）。一部の抗体では、ヒトＩｇＧ１のＥＵ番号付けによる２４１位、２６４位、２６５位、２７０位、２９６位、２９７位、３２２位、３２９位、及び３３１位の１以上での突然変異が使用される。一部の抗体では、ヒトＩｇＧ１のＥＵ番号付けによる３１８位、３２０位及び３２２位の１以上での突然変異が使用される。一部の抗体では、２３４位及び／または２３５位がアラニンで置換され、及び／または３２９位がグリシンで置換される。一部の抗体では、２３４位及び２３５位がアラニンで置換される。一部の抗体では、アイソタイプはヒトのＩｇＧ２またはＩｇＧ４である。
【０１８４】
抗体は、２つの軽鎖と２つの重鎖を含有する四量体として、別々の重鎖、軽鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖとして、または単鎖抗体として発現させることができ、その際、重鎖及び軽鎖の成熟可変領域がスペーサーを介して連結される。
【０１８５】
ヒトの定常領域は、異なる個体間でアロタイプ変異及び同型アロタイプ変異を示し、すなわち、定常領域は１以上の多型の位置にて異なる個体で異なり得る。同型アロタイプは、同型アロタイプを認識する血清が１以上の他のアイソタイプの非多型領域に結合するという点でアロタイプと異なる。従って、たとえば、別の重鎖定常領域は、Ｃ末端リジンを持とうと持つまいとＩｇＧ１  Ｇ１ｍ３のものである。ヒト定常領域への参照には、天然のアロタイプを持つ定常領域または天然のアロタイプにおける位置を占有する残基の並べ替えが含まれる。
【０１８６】
Ｇ．組換え抗体の発現
抗体を発現する細胞株（たとえば、ハイブリドーマ）を用いてキメラ抗体及びヒト化抗体を製造する多数の方法が知られる。たとえば、抗体の免疫グロブリン可変領域をクローニングし、周知の方法を用いて配列決定することができる。方法の１つでは、ハイブリドーマ細胞から調製されたｍＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲによって重鎖可変ＶＨ領域をクローニングする。５’プライマーとしての翻訳開始コドンを包含するＶＨ領域リーダーペプチドとｇ２ｂ定常領域特異的な３’プライマーに対してコンセンサスプライマーを採用する。例となるプライマーはＳｃｈｅｎｋらによる米国特許公開ＵＳ２００５／０００９１５０に記載されている（以後、「Ｓｃｈｅｎｋ」）。複数の独立して導出したクローンの配列を比較して増幅の間に変化が導入されていないことを保証することができる。ＶＨ領域の配列は、５’ＲＡＣＥ  ＲＴ−ＰＣＲ法及び３’のｇ２ｂ特異的プライマーによって得られるＶＨ断片を配列決定することによって決定するまたは確認することもできる。
【０１８７】
軽鎖可変ＶＬ領域は類似の方法でクローニングすることができる。アプローチの１つでは、翻訳開始コドンを包含するＶＬ領域とハイブリッド形成するように設計された５’プライマーとＶ−Ｊ接合領域の下流のＣｋ領域に特異的な３’プライマーとを用いて、ＶＬ領域の増幅のためにコンセンサスプライマーのセットを設計する。第２のアプローチでは、５’ＲＡＣＥ  ＲＴ−ＰＣＲ法を採用してＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングする。例となるプライマーは上記Ｓｃｈｅｎｋにて記載されている。次いでクローニングした配列をヒト（または他の非ヒト種）の定常領域をコードする配列と組み合わせる。
【０１８８】
アプローチの１つでは、重鎖及び軽鎖の可変領域を再操作してＶＤＪまたはＶＪの各接合部の下流にスプライスドナーの配列をコードし、たとえば、重鎖についてはｐＣＭＶ−ｈγ１及び軽鎖についてはｐＣＭＶ−Ｍｃ１のような哺乳類の発現ベクターにクローニングする。これらのベクターは、挿入された可変領域カセットの下流のエクソン断片としてヒトのγ１及びＣｋ定常領域をコードする。配列の検証に続いて、重鎖及び軽鎖の発現ベクターをＣＨＯ細胞に同時形質移入してキメラ抗体を作出することができる。形質移入の４８時間後に馴化培地を回収し、抗体産生についてウエスタンブロット解析によって、または抗原結合についてＥＬＩＳＡによってアッセイする。キメラ抗体は上述のようにヒト化される。
【０１８９】
キメラ抗体、ベニア化抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体は通常、組換え発現によって作出される。組換えポリヌクレオチド構築物は通常、たとえば、プロモーターのような天然に会合したまたは異種の発現制御エレメントを含む、抗体鎖のコーディング配列に操作可能に連結される発現制御配列を含む。発現制御配列は、真核または原核の宿主細胞を形質転換するまたは形質移入することができるベクターにおけるプロモーター系であることができる。ベクターがいったん適当な宿主に組み込まれると、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベルの発現ならびに交差反応する抗体の回収及び精製に好適な条件下で維持される。
【０１９０】
これらの発現ベクターは通常、エピソームとしてまたは宿主の染色体ＤＮＡの一体部分として宿主生物で複製可能である。一般に、発現ベクターは選択マーカー、たとえば、アンピシリン耐性またはハイグロマイシン耐性を含有して所望のＤＮＡ配列で形質転換されたそれら細胞の検出を可能にする。
【０１９１】
大腸菌は、抗体、特に抗体断片を発現させるのに有用な原核細胞宿主の１つである。酵母のような微生物も発現に有用である。サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）は、所望のような発現制御配列、複製開始点、終結配列等を有する好適なベクターを伴う酵母宿主である。典型的なプロモーターには、３−ホスホグリセレートキナーゼ及び他の解糖酵素が含まれる。誘導性の酵母プロモーターには、とりわけ、アルコール脱水素酵素、イソチトクロームＣ及びマルトースやガラクトースの利用に関与する酵素に由来するプロモーターが挙げられる。
【０１９２】
免疫グロブリンまたはその断片をコードするヌクレオチドのセグメントを発現させるのに哺乳類細胞を使用することができる。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ，１９８７）を参照のこと。インタクトな異種タンパク質を分泌することができる多数の好適な宿主細胞株が開発されており、それには、ＣＨＯ細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌ細胞、及びＳｐ２／０やＮＳ０を含む非抗体産生性の骨髄腫が挙げられる。細胞は非ヒトであることができる。これらの細胞のための発現ベクターには、たとえば、複製開始点、プロモーター、エンハンサー（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））のような発現制御配列、及び、たとえば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位のような必要なプロセッシング情報部位、及び転写終結配列が含まれる。発現制御配列は、内在性遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス等に由来するプロモーターを含むことができる。Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照のこと。
【０１９３】
或いは、抗体をコードする配列を、トランスジェニック動物のゲノムに導入し、その後トランスジェニック動物の乳で発現させるために導入遺伝子に組み込むことができる（たとえば、米国特許第５，７４１，９５７号；米国特許第５，３０４，４８９号；及び米国特許第５，８４９，９９２号を参照のこと）。好適な導入遺伝子には、たとえば、カゼインまたはベータラクトグロブリンのような乳腺特異的な遺伝子に由来するプロモーター及びエンハンサーと操作可能に連結された軽鎖及び／または重鎖のコーディング配列が挙げられる。
【０１９４】
細胞宿主の種類に応じた方法によって、対象とするＤＮＡセグメントを含有するベクターを宿主細胞に移すことができる。たとえば、塩化カルシウム形質移入は一般に原核細胞に利用されるのに対してリン酸カルシウム処理、エレクトロポレーション、リポフェクション、遺伝子銃、またはウイルスに基づく形質移入を他の細胞宿主に使用することができる。哺乳類細胞を形質転換するのに使用される他の方法には、ポリブレンの使用、原形質融合、リポソーム、エレクトロポレーション及び微量注入が挙げられる。トランスジェニック動物の作出については、導入遺伝子を受精した卵母細胞に微量注入することができ、または胚性幹細胞のゲノムに組み込み、そのような細胞の核を除核した卵母細胞に移すことができる。
【０１９５】
抗体の重鎖及び軽鎖をコードするベクター（複数可）を細胞培養物に導入して、無血清培地にて増殖生産性及び産物の質について細胞のプールをスクリーニングすることができる。次いで一番産生している細胞プールをＦＡＣＳに基づく単一細胞クローニングに供してモノクローナル株を生成することができる。７．５ｇ／Ｌ培養物を超える産物力価に相当する１日当たり細胞当たり５０ｐｇまたは１００ｐｇを上回る特定の生産性を使用することができる。単一細胞クローンによって産生される抗体は、濁度、濾過特性、ＰＡＧＥ、ＩＥＦ、ＵＶ走査、ＨＰ−ＳＥＣ、炭水化物−オリゴ糖マッピング、質量分光分析、及びＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅのような結合アッセイについても調べることができる。次いで選択されたクローンを複数のバイアルに貯め、その後の使用のために凍結保存する。
【０１９６】
いったん発現されると、プロテインＡ捕捉、ＨＰＬＣ精製、カラムクロマトグラフィ、ゲル電気泳動等を含む、当該技術の標準手順に従って抗体を精製することができる（一般に、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９８２）を参照のこと）。
【０１９７】
コドンの最適化、プロモーターの選択、転写エレメントの選択、ターミネータの選択、無血清単一細胞クローニング、細胞貯蔵、コピー数の増幅のための選択マーカーの使用、ＣＨＯターミネータ、またはタンパク質力価の改善を含む、抗体の市販の製造のための方法を採用することができる（たとえば、ＵＳ５，７８６，４６４；ＵＳ６，１１４，１４８；ＵＳ６，０６３，５９８；ＵＳ７，５６９，３３９；Ｗ０２００４／０５０８８４；Ｗ０２００８／０１２１４２；Ｗ０２００８／０１２１４２；Ｗ０２００５／０１９４４２；Ｗ０２００８／１０７３８８；Ｗ０２００９／０２７４７１；及びＵＳ５，８８８，８０９を参照のこと）。
【０１９８】
Ｈ．抗体のスクリーニングアッセイ
抗体は、結合アッセイ、機能選抜、メディンに関連する疾患の動物モデルにおける選抜、及び臨床試験を含む幾つかの選抜の対象となることができる。結合アッセイは、メディン（またはその断片、たとえば、配列番号１のアミノ酸残基４４〜５０）に対する特異的な結合、及び任意で親和性及びエピトープ特異性について調べる。そのような選抜は、例となる抗体、たとえば、６Ｂ３または１８Ｇ１との競合にて実施されることがある。任意で、抗体またはメディン標的のいずれかがそのようなアッセイで不動化される。
【０１９９】
動物モデルの選抜は、たとえば、１２９／ＳｖＥマウスにＣａＣｌ２を反管腔側で投与することによって作り出されるもののような胸部大動脈瘤のマウスモデル（Ｉｋｏｎｏｍｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｕｒｇ.Ｒｅｓ．１１５：１５７−１６３（２００３））またはたとえば、コラゲナーゼの外膜内注入と結晶性ＣａＣｌ２の外膜周囲の適用を介して作り出されるもののような胸部大動脈瘤のブタモデル（Ｅｃｋｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１２８：Ｓ１８６−１９３（２０１３））のようなメディンに関連するヒト疾患を模倣する動物モデルにて兆候または症状を治療的にまたは予防的に処置する抗体の能力を調べる。弾力性の層状分解及びコラーゲン含量の低下のような大動脈の構造変化は、磁気共鳴画像解析（ＭＲＩ）ならびに生化学的及び組織学的な測定によって評価することができる。動物モデルにおける試験を円滑にするために、動物モデルに適した定常領域を有するキメラ抗体を使用することができる（たとえば、マウス−ラットのキメラがラットにおける抗体を調べるのに使用され得る）。抗体のヒト化バージョンは、対応するマウス抗体またはキメラ抗体が適当な動物モデルで有効であり、ヒト化抗体が類似の結合親和性（たとえば、実験誤差の範囲内、たとえば、１．５、２または３の倍数による）を有するのであれば、有効であるだろうと結論付けることができる。
【０２００】
臨床試験は、メディンに関連する疾患を有するヒトにおける安全性及び有効性を調べる。
【０２０１】
Ｉ．核酸
本発明はさらに、上述の重鎖及び軽鎖（たとえば、配列番号３、３６、１１及び２９）のいずれかをコードする核酸を提供する。任意で、そのような核酸はさらに、シグナルペプチドをコードし、定常領域に連結されるシグナルペプチドと共に発現させることができる。核酸のコーディング配列は、たとえば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナル等のようなコーディング配列の発現を確実にする調節性配列に操作可能に連結することができる。重鎖及び軽鎖をコードする核酸は単離された形態で存在することができ、１以上のベクターにクローニングすることができる。核酸は、たとえば、重複するオリゴヌクレオチドの固相合成またはＰＣＲによって合成することができる。重鎖及び軽鎖をコードする核酸は、たとえば、１つの発現ベクター内で１つの連続した核酸として連結することができ、または別々に、たとえば、それぞれそれ自体の発現ベクターにクローニングすることができる。
【０２０２】
Ｊ．コンジュゲート抗体
メディンのような抗原に特異的に結合するコンジュゲート抗体は大動脈瘤、マルファン症候群、膵炎、アルツハイマー病及び肥満症に有用である。たとえば、そのような抗体は他の治療に役立つ部分、他のタンパク質、他の抗体及び／または検出可能な標識とコンジュゲートすることができる。ＷＯ０３／０５７８３８；ＵＳ８，４５５，６２２を参照のこと。そのような治療に役立つ部分は、たとえば、大動脈瘤、マルファン症候群、膵炎、アルツハイマー病及び肥満症のような患者における望ましくない状態または疾患を治療する、それと闘う、それを改良する、予防するまたは改善するのに使用することができる作用物質であることができる。治療に役立つ部分には、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、放射性治療剤、免疫調節剤、または抗体の活性を助長するまたは高めるいずれかの生物学的に活性のある作用物質を挙げることができる。細胞傷害剤は細胞に対して毒性であるいずれかの作用物質であることができる。細胞増殖抑制剤は細胞増殖を阻害するいずれかの作用物質であることができる。免疫調節剤は免疫応答の発生または維持を刺激するまたは阻害するいずれかの作用物質であることができる。放射性治療剤は放射線を発するいずれかの分子または化合物であることができる。そのような治療に役立つ部分が、本明細書に記載されている抗体のような腫瘍特異的な抗体に結合されるならば、結合された治療に役立つ部分は正常細胞よりも腫瘍細胞または癌細胞に特異的な親和性を有するであろう。その結果、コンジュゲート抗体の投与は、周囲の正常で健常な組織に対する最小の損傷で癌細胞を直接標的とする。これは、毒性が強すぎてそれ自体で投与できない治療に役立つ部分に特に有用であることができる。加えて、さらに少量の治療に役立つ部分を使用することができる。
【０２０３】
一部のそのような抗体は修飾されて免疫毒素として作用することができる。たとえば、米国特許第５，１９４，５９４号を参照のこと。たとえば、抗体には二官能性試薬無水Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸を、及びリシンには３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸スクシンイミジルを用いることによって、植物に由来する細胞性の毒素であるリシンを抗体にカップリングすることができる。Ｐｉｅｔｅｒｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８（１６）：４４６９−４４７６（１９９８）を参照のこと。カップリングは、リシンのＢ鎖結合活性の喪失を生じる一方で、リシンのＡ鎖の毒性能も抗体の活性も損傷しない。同様に、リボソーム集合の阻害剤であるサポリンは、化学的に挿入されたスルフヒドリル基間のジスルフィド結合を介して抗体にカップリングすることができる。Ｐｏｌｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１８：１２１５−１２２２（２００４）を参照のこと。
【０２０４】
一部のそのような抗体は放射性同位元素に連結することができる。放射性同位元素の例には、イットリウム９０（９０Ｙ）、インジウム１１１（１１１Ｉｎ）、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、放射性銀−１１１、放射性銀−１９９、及びビスマス２１３が挙げられる。放射性同位元素の抗体への結合は従来の二官能のキレートで実施されてもよい。放射性銀−１１１及び放射性銀−１９９の結合については、イオウ系リンカーが使用されてもよい。Ｈａｚｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４−２５：１−７（１９９４）を参照のこと。銀放射性同位元素の結合には免疫グロブリンをアスコルビン酸で還元することが関与してもよい。１１１Ｉｎ及び９０Ｙのような放射性同位元素については、イブリツモマブチウキセタンを使用することができ、そのような同位元素と反応してそれぞれ１１１Ｉｎ−イブリツモマブチウキセタン及び９０Ｙ−イブリツモマブチウキセタンを形成するであろう。Ｗｉｔｚｉｇ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４８，Ｓｕｐｐｌ.１：Ｓ９１−Ｓ９５（２００１）を参照のこと。
【０２０５】
一部のそのような抗体は他の治療に役立つ部分に連結することができる。そのような治療に役立つ部分は、たとえば、細胞傷害性または細胞増殖抑制性であることができる。たとえば、抗体を、マイタンシン、ゲルダナマイシンのような毒性の化学療法剤、チューブリン結合剤（たとえば、オーリスタチン）のようなチューブリン阻害剤、またはカリケアマイシンのようなマイナーグルーブ結合剤とコンジュゲートすることができる。
【０２０６】
抗体を他のタンパク質またはペプチドにカップリングすることもできる。たとえば、抗体はフィノマーにカップリングすることができる。フィノマーはヒトのＦｙｎのＳＨ３ドメインに由来する小型の結合タンパク質（たとえば、７ｋＤａ）である。それらは安定で且つ可溶性であることができ、それらはシステイン残基及びジスルフィド結合を欠くことができる。フィノマーを操作して抗体と同じ親和性及び特異性で標的分子に結合することができる。それらは抗体に基づく多重特異性融合タンパク質を作り出すのに好適である。たとえば、フィノマーを抗体のＮ末端及び／またはＣ末端に融合して異なる構造を持つ二重特異性及び三重特異性のＦｙｎｏｍＡｂを作り出すことができる。フィノマーは、最適な特性を持つフィノマーの効率的な選択を可能にする、ＦＡＣＳ、Ｂｉａｃｏｒｅ、及び細胞に基づいたアッセイを用いたスクリーニング法を介してフィノマーのライブラリを用いて選択することができる。フィノマーの例は、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：３１９６−３２０４（２００７）；Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２０：５７−６８（２００７）；Ｓｃｈｌａｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ．４：４９７−５０８（２０１１）；Ｂａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６９（Ｐｔ６）：１１２４−１１３７（２０１３）；及びＢｒａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１３：２０３０−２０３９（２０１４）にて開示されている。
【０２０７】
本明細書で開示されている抗体は１以上の他の抗体にカップリングされ、またはコンジュゲートされる（たとえば、抗体のヘテロコンジュゲートを形成するように）こともできる。そのような他の抗体は、メディンの中での異なるエピトープに結合することができる、または異なる標的抗原に結合することができる。
【０２０８】
抗体は検出可能な標識とカップリングすることもできる。そのような抗体は、たとえば、血管壁の弾力性の低下または肥厚の増大を診断するために、大動脈瘤になる傾向をモニタリングするために、及び／または治療の有効性を評価するための使用することができる。そのような抗体は、大動脈瘤を有するもしくは大動脈瘤に罹り易い対象にて、またはそのような対象から得られる適当な生体試料にてそのような判定を行うのに特に有用である。メディン抗体にカップリングされてもよいまたは連結されてもよい代表的な検出可能な標識には、たとえば、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼのような種々の酵素；たとえば、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンのような補欠分子族；たとえば、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンのような蛍光物質；たとえば、ルミノールのような発光物質；たとえば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンのような生物発光物質；たとえば、放射性銀−１１１、放射性銀−１９９、ビスマス２１３、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ、）、炭素（１４Ｃ、１１Ｃ）、イオウ（５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ、）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、６４Ｃｕ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、及び１１７Ｔｉｎのような放射性物質；種々のポジトロン放出断層撮影を用いたポジトロン放出金属；非放射性常磁性金属イオン；及び特定の放射性同位元素に放射性標識されるまたはコンジュゲートされる分子が挙げられる。
【０２０９】
抗体への放射性同位元素の連結は従来の二官能性キレートで行われてもよい。放射性銀−１１１及び放射性銀−１９９の結合については、イオウ系リンカーが使用されてもよい。Ｈａｚｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４−２５：１−７（１９９４）を参照のこと。銀の放射性同位元素の結合にはアスコルビン酸によって免疫グロブリンを還元することが関与してもよい。１１１Ｉｎ及び９０Ｙのような放射性同位元素については、イブリツモマブチウキセタンを使用することができ、そのような同位元素と反応してそれぞれ１１１Ｉｎ−イブリツモマブチウキセタン及び９０Ｙ−イブリツモマブチウキセタンを形成するであろう。Ｗｉｔｚｉｇ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４８，Ｓｕｐｐｌ.１：Ｓ９１−Ｓ９５（２００１）を参照のこと。
【０２１０】
当該技術で既知の技法を用いて、治療に役立つ部分、他のタンパク質、他の抗体及び／または検出可能な標識は、マウスの、キメラの、ベニアの、またはヒト化されたメディン抗体に直接または中間体（たとえば、リンカー）を介して間接的にカップリングされてもよく、またはコンジュゲートされてもよい。たとえば、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８５）；及びＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。好適なリンカーには、たとえば、切断できるリンカー及び切断できないリンカーが挙げられる。酸性もしくは還元の条件下で、特定のプロテアーゼへの曝露にて、または他の定義された条件下で、カップリングされた治療に役立つ部分、タンパク質、抗体及び／または検出可能な標識を解放する様々なリンカーを採用することができる。
【０２１１】
Ｖ．治療用途
上記抗体は、少なくともある程度メディンが介在する疾患を有するまたはそのリスクがある患者にて疾患を治療するのにまたはその予防を達成するのに使用することができる。一部のそのような疾患では、たとえば、マルファン症候群の対象または大動脈瘤のリスクがある対象では、抗体は弾力性の劣化を低減してもよいし、及び／または大動脈中膜アミロイド沈着を低減してもよい。
【０２１２】
メカニズムの理解は実践に必要とされないが、以下のメカニズム：遊離メディンの隔離、メディンの凝集を阻害することもしくは低減すること、メディン原線維の形成を阻害することもしくは低減すること、大動脈中膜アミロイド沈着物を低減すること、凝集した中膜アミロイド沈着物を一掃すること、メディンの非毒性の立体構造を安定化すること、及び／または血管の弾力性を保つことのいずれかまたはすべてがメディンに関連する疾患の治療に寄与し得ると考えられている。抗体／薬剤のコンジュゲートは、通常癌細胞内に取り込まれた後、結合された作用物質の細胞傷害性または細胞増殖阻害性の効果を含む、作用の追加のメカニズムを有することができる。抗体／薬剤のコンジュゲートはまた、腫瘍に関連するマクロファージの毒性も誘導してもよい。
【０２１３】
抗体は、発症を遅らせる、重症度を軽減する、さらなる悪化を抑制する、及び／または治療される疾病の少なくとも１つの兆候または症状を改善する投与量、投与の経路及び投与の頻度を意味する有効な投薬計画で投与される。患者がすでに疾病を患っているのであれば、投薬計画は治療上有効な投薬計画と呼ばれることができる。患者が一般集団に比べて疾病のリスクが高いが、未だ症状を経験していないのであれば、投薬計画は予防上有効な投薬計画と呼ばれることができる。一部の例では、治療上または予防上の有効性は、個々の患者における過去対照または過去の経験と比べて同じ患者にて観察され得る。他の例では、治療上または予防上の有効性は、未治療の患者の対照集団と比べた治療された患者の集団における前臨床試験または臨床試験にて実証することができる。
【０２１４】
抗体についての例となる投与量は、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、または０．５〜５ｍｇ／ｋｇ体重（たとえば、０．５、１、２、３、４または５ｍｇ／ｋｇ）、または固定投与量としての１０〜１５００ｍｇである。投与量は、患者の状態及び以前の治療に対する応答、あれば、数ある因子の中で、処置が予防的なのかまたは治療的なのか、ならびに疾病が急性なのかまたは慢性なのかに左右される。
【０２１５】
投与は、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、クモ膜下、腹腔内、局所、鼻内または筋肉内であることができる。一部の抗体は静脈内または皮下の投与によって全身循環に投与することができる。静脈内投与は、たとえば、３０〜９０分の時間にわたる点滴によることができる。
【０２１６】
投与の頻度は、数ある因子の中で循環における抗体の半減期、患者の状態及び投与の経路に左右される。頻度は、１日１回、週に１回、月に１回、３ヵ月に１回、または患者の状態における変化もしくは治療される疾患の進行に対応して不規則な間隔であることができる。より頻繁なまたはそれほど頻繁ではない投薬も可能ではあるが、静脈内投与の例となる頻度は治療の継続した原因に対して週１回〜３ヵ月に１回の間である。皮下投与については、より頻繁なまたはそれほど頻繁ではない投薬も可能ではあるが、例となる投薬の頻度は１日１回〜月に１回である。
【０２１７】
投与される投薬の回数は疾病が急性であるか慢性であるか、及び疾病の治療への応答に左右される。急性の疾病または慢性疾病の急性増悪については、１〜１０回の間の投与が十分であることが多い。時には、任意で分割される形態の単回ボーラス投与が急性の疾病または慢性疾病の急性増悪にとって十分である。急性の疾病または急性増悪の再発について治療を繰り返すことができる。慢性疾病については、定期的な間隔で、たとえば、週に１回、２週間に１回、月に１回、３ヵ月に１回、６ヵ月ごとに少なくとも１、５または１０年間、または患者の生涯にわたって抗体を投与することができる。
【０２１８】
ＶＩ．医薬組成物及び使用方法
本明細書で提供されるのは、メディンに関連する疾患または状態（たとえば、大動脈瘤、大動脈壁の層を弱め、胸部大動脈瘤のリスクを高める、マルファン症候群、ロイス・ディエツの及び他の家族性結合組織疾患、他の非特異的な結合組織疾患（動脈瘤の家族歴を特徴とする）を含む疾患、二尖大動脈弁の存在、感染症、炎症性疾患、及びたとえば、膵炎、アルツハイマー病、狼瘡、肥満症のような他の疾患）を診断する、モニターする、治療するまたはその予防を達成する幾つかの方法である。そのような方法で使用するために上述の抗体を医薬組成物に組み込むことができる。一般に、抗体または抗体を含有する医薬組成物はそれを必要とする対象に投与される。治療可能である患者には、症状を示していないが、メディンに関連する疾患のリスクがある個人、ならびに現在症状を示している患者が挙げられる。従って、医薬組成物は、大動脈瘤の既知の遺伝的リスクを有する個人、たとえば、マルファン症候群の対象に予防的に投与することができる。そのような個人には、そのような疾患を経験している親戚を有する者及びリスクが遺伝子マーカーまたは生化学マーカーによって判定される者が挙げられる。対象の特定は臨床環境にて、または対象に自宅のようなどこかで対象自身の自己試験キットの使用を介して発生し得る。家族歴、遺伝子試験または医療スクリーニングで保証されるように、治療はどんな年齢（たとえば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、または７０歳）でも開始することができる。しかしながら普通、患者が４０、５０、６０または７０歳に達するまで治療を開始する必要はない。治療は通常ある期間にわたって複数の投与量を必要とし、治療剤（たとえば、メディンの切り詰め形態）に対する抗体または活性化されたＴ細胞もしくはＢ細胞の応答を試験することにより経時的にモニターすることができる。応答が落ちると、追加免疫投薬が指示される。
【０２１９】
患者が症状をほとんど感じないので胸部大動脈瘤は気付かれずに進むことが多いが、考えられる警告の兆候には、顎、首及び上背における痛み、胸または背中の痛み、咳、嗄声、または呼吸困難が挙げられる。一部の疾患については、対象はＭＲＩのような画像化法を用いて特定することができ、またはメディンと特異的に結合する抗体を用いた画像化が将来利用可能であり得る。
【０２２０】
予防用途では、抗体またはその医薬組成物は、リスクを減らす、重症度を減らすまたは疾患の少なくとも１つの兆候もしくは症状の発症を遅らせるのに有効な投薬計画（用量、投与の頻度または経路）で疾患に罹り易いまたはさもなければ疾患のリスクがある対象に投与される。治療用途では、抗体または抗体を誘導する免疫原が、疾患の少なくとも１つの兆候もしくは症状を改善するまたはそのさらなる悪化を少なくとも抑制するのに有効な投薬計画（用量、投与の頻度または経路）で疾患の疑いがある対象または疾患をすでに患っている対象に投与される。
【０２２１】
個々の治療された対象が本明細書で開示されている方法によって治療されなかった比較対象の対照集団における平均の転帰よりも良好な転帰を達成するならば、またはｐ＜０．０５または０．０１またはさらに０．００１レベルでの対照臨床試験（たとえば、第ＩＩ相、第ＩＩ／ＩＩＩ相または第ＩＩＩ相の試験）または動物モデルにて対照の対象に対比して治療された対象において投薬計画についてさらに良好な転帰が実証されれば、投薬計画は治療上または予防上有効であると見なされる。
【０２２２】
有効な用量は、たとえば、投与の手段、標的部位、対象の生理的な状態、対象がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬物、及び処置が治療的かまたは予防的かのような多数の様々な因子に応じて変化する。
【０２２３】
抗体についての例となる用量範囲は、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、または０．５〜５ｍｇ／ｋｇ体重（たとえば、０．５、１、２、３、４または５ｍｇ／ｋｇ）または固定投与量として１０〜１５００ｍｇであることができる。投与量は、数ある因子の中で、患者の状態及び前の治療への応答、あれば、処置が予防的かまたは治療的か、及び疾病が急性かまたは慢性かに左右される。
【０２２４】
抗体はそのような用量で毎日、隔日で、週に１回、２週間ごとに、月に１回、３ヵ月に１回、または実験的な分析によって決定される他のいずれかのスケジュールに従って投与することができる。例となる治療は長期に、たとえば、少なくとも６ヵ月にわたる複数の用量での投与を必要とする。追加の例となる治療投薬計画は、２週ごとに１回または月に１回または３〜６ヵ月ごとに１回の投与を必要とする。
【０２２５】
抗体は末梢的な経路を介して投与することができる。投与の経路には、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、クモ膜下、腹腔内、鼻内または筋肉内が挙げられる。抗体の投与の経路は静脈内または皮下であることができる。静脈内投与は、たとえば、３０〜９０分の時間にわたる点滴によることができる。この種の注射は最も通常、腕または足の筋肉にて実施される。一部の方法では、作用物質は沈着物が蓄積している特定の組織に直接注入され、たとえば、頭蓋内注入である。
【０２２６】
非経口投与のための医薬組成物は、無菌であり、且つ実質的に等張（２５０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ水）であり、ＧＭＰ条件下で製造することができる。医薬組成物は、単位剤形（すなわち、単回投与用の用量）で提供され得る。１以上の生理的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤または補助剤を用いて医薬組成物を製剤化することができる。製剤化は選択される投与の経路に左右される。注射用には、抗体は水溶液、たとえば、ハンクス溶液、リンガー溶液、または生理的な生理食塩水または酢酸緩衝液（注射部位での不快感を減らすための）のような生理的に適合性の緩衝液にて製剤化することができる。溶液は、たとえば、懸濁剤、安定剤及び／または分散剤のような調合剤を含有することができる。或いは、抗体は、使用前に好適なビヒクル、たとえば、無菌の発熱物質を含まない水で構成するための凍結乾燥形態であることができる。
【０２２７】
治療される疾患の治療または予防に有効な別の作用物質と併用で投薬計画を行うことができる。
【０２２８】
治療の後、対象の状態を評価してそのような治療の進捗または有効性を判定することができる。
【０２２９】
Ａ．診断及びモニタリングの方法
提供されるのはまた、メディンに関連する疾患を患っているまたはそれに罹り易い患者にてメディンに対する免疫応答を検出する方法である。方法を用いて、本明細書で提供される作用物質による治療的または予防的処置の経過をモニターすることができる。たとえば、方法を用いて能動免疫（たとえば、免疫原の投与に応答して産生される抗体）及び受動免疫（たとえば、投与された抗体のレベルを測定すること）をモニターすることができる。
【０２３０】
提供されるのはまた、たとえば、対象に由来する試料にてメディンを測定することによって、または対象におけるメディンの生体内画像化によって対象におけるメディンの沈着または凝集を検出する方法である。そのような方法は、メディンに関連する疾患またはその罹り易さを診断するまたはその診断を確定するのに有用である。方法は、無症状の対象にも使用することができる。メディンの存在は将来の症状を示す疾患の罹り易さを示す。方法はまた、たとえば、マルファン症候群または大動脈瘤のようなメディンに関連する疾患であると以前診断されている対象において疾患の進行及び／または治療への応答をモニターするのにも有用である。
【０２３１】
生体内での画像化法は、対象にてメディンに結合する抗体のような試薬を投与し、次いでそれが結合した後、試薬を検出することによって機能することができる。抗体は通常メディンのエピトープに結合する。所望であれば、完全長の定常領域を欠いている抗体断片、たとえばＦａｂを用いることによってクリア応答を回避することができる。一部の方法では、同じ抗体が治療用及び診断用の試薬の双方として役立つことができる。
【０２３２】
静脈内注射によって、または理に適うと思われる他の経路を介して対象の体内に診断用試薬を投与することができる。試薬の用量は治療法と同じ範囲内にすべきである。通常、一部の方法では、メディンに対する親和性を持つ一次試薬は標識されず、二次標識剤を用いて一次試薬に結合させるが、試薬は標識される。標識の選択は検出の手段に左右される。たとえば、蛍光標識は光学検出に好適である。常磁性標識の使用は外科的介入のない断層撮影検出に好適である。放射性標識はＰＥＴまたはＳＰＥＣＴを用いても検出することができる。
【０２３３】
診断は、対応するベースライン値と標識された病巣の数、サイズ及び／または強度を比較することによって行われる。ベースライン値は病気ではない個体の集団における平均値を表すことができる。ベースライン値はまた同じ対象で測定された以前の値を表すこともできる。たとえば、ベースライン値は治療を開始する前に対象で測定することができ、その後測定された値をベースライン値と比べることができる。ベースラインに比べた値の低下は治療への積極的な応答を一般に示唆する。
【０２３４】
Ｂ．受動免疫
受動免疫に続く抗体プロファイルは通常、抗体濃度の即時のピークを示し、指数的な減衰がそれに続く。さらなる投薬がないと、減衰は投与された抗体の半減期に応じて数日から数カ月の期間内に治療前のレベルに近づく。たとえば、一部のヒト抗体の半減期は約２０日である。
【０２３５】
一部の方法では、対象におけるメディンに対する抗体のベースライン測定は投与前に行われ、第２の測定はその後近いうちに行われてピークの抗体レベルを決定し、１以上のさらなる測定を周期的に行って抗体レベルの減衰をモニターする。抗体のレベルがベースラインまたはベースラインを差し引いたピークの所定の比率（たとえば、５０％、２５％または１０％）に低下したら、抗体のさらなる用量の投与を投与する。一部の方法では、ピークレベルまたはバックグランドを差し引いたその後測定されたレベルを以前決定した参照レベルと比較して他の対象にて有益な予防的または治療的処置投薬計画を構成する。測定された抗体レベルが参照レベルより有意に低ければ（たとえば、治療から利益を得る集団にて平均値から参照値の１または好ましくは２標準偏差を差し引いたものより低い）、抗体の追加の用量の投与が指示される。
【０２３６】
ＩＸ．キット
本発明はさらに、本明細書で開示されているメディン抗体または他のアンタゴニスト及び関連する素材、たとえば、使用のための指示書（たとえば、添付文書）を含むキット（たとえば、容器）を提供する。使用のための指示書は、たとえば、メディン抗体及び任意で１以上の追加の作用物質の投与のための指示書を含有してもよい。メディン抗体の容器は単位用量、バルク包装（たとえば、複数回用量包装）またはサブユニット用量であってもよい。
【０２３７】
添付文書は、治療薬の使用に関する適応症、用法、投与量、投与、禁忌症及び／または警告についての情報を含有するそのような治療薬の商業包装に通例含まれる指示書を指す。
【０２３８】
キットはまた、薬学上許容できる緩衝液、たとえば、注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第２の容器も含むことができる。それはまた、他の緩衝液、希釈剤、充填剤、針及び注射器を含む、商業的な観点及びユーザーの観点から望ましい他の物質も含むことができる。
【０２３９】
Ｘ．他の用途
抗体は、臨床診断もしくは治療の背景でまたは研究にてメディンまたはその断片を検出するのに使用することができる。たとえば、抗体を用いて、生体試料がメディンを含むという徴候として生体試料または生検にてメディンの存在を検出することができる。抗体の生体試料への結合を抗体の対照試料への結合と比較することができる。対照試料及び生体試料は同じ組織起源の細胞を含む。対照試料及び生体試料は同じ時または異なる時に同じ個体または異なる個体から得ることができる。所望であれば、複数の生体試料及び複数の対照試料を複数の時に評価して試料間の差異に無関係な無作為の変動から守る。次いで生体試料（複数可）と対照試料（複数可）の間での直接比較を行って生体試料（複数可）への抗体の結合（すなわち、メディンの存在）が対照試料（複数可）への抗体の結合に比べて増加するのか、低下するのか、または同じなのかを判定することができる。対照試料に比べた生体試料（複数可）への抗体結合の増大は生体試料（複数可）におけるメディンの存在を示す。一部の例では、増大した抗体結合は統計的に有意である。任意で、生体試料への抗体結合は、対照試料への抗体結合よりも少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍高い。
【０２４０】
加えて、抗体を用いて生体試料または生検にてメディンの存在を検出し、メディンに関連する疾患であると診断された患者を治療するために使用されている治療剤の有効性をモニターし、評価することができる。メディンに関連する疾患であると診断された患者に由来する生体試料を評価して治療剤による治療法を開始する前に試料への抗体の結合についてのベースライン（すなわち、試料におけるメディンの存在についてのベースライン）を確立する。一部の例では、患者に由来する複数の生体試料を複数の時に評価してベースライン及び治療に無関係な無作為の変動の尺度の双方を確立する。次いで治療剤を投薬計画で投与する。投薬計画には、ある期間にわたる作用物質の複数の投与が含まれてもよい。任意で、患者に由来する複数の生体試料にて複数の時に抗体の結合（すなわち、メディンの存在）を評価して無作為な変動の尺度を確立し、且つ免疫療法への応答の傾向を示す。次いで生体試料への抗体結合の種々の評価を比較する。２つの評価しか行われないのであれば、２つの評価間で直接比較を行って２つの評価間で抗体結合（すなわち、メディンの存在）が増えているのか、減っているのか、または同じままなのかを判定することができる。２を超える測定が行われるのであれば、治療剤による治療前に開始し、治療の経過を介して進む経時変化として測定値を分析することができる。生体試料への抗体結合（すなわち、メディンの存在）が減っている患者では、治療剤は患者にてメディンの毒性、凝集または沈着を治療するのに有効だったと結論付けることができる。抗体結合の低下は統計的に有意であることができる。任意で、結合は、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％低下する。抗体結合の評価はメディンに関連する疾患の他の兆候及び症状を評価することと併せて行うことができる。
【０２４１】
抗体は、メディン、その断片または誤って折り畳まれたラクトアドヘリンを検出することにおいて実験室研究のための研究試薬として使用することもできる。そのような使用では、抗体は蛍光分子、スピン標識分子、酵素または放射性同位元素で標識することができ、必要な試薬すべてを伴ったキットの形態で提供されてメディンまたはその断片の検出アッセイを行うことができる。抗体を用いて、たとえば、アフィニティクロマトグラフィによってメディンまたはメディンの結合相手を精製することもできる。
【０２４２】
上記及び下記で引用されている特許出願、ウェブサイト、他の出版物、受託番号等はすべて、各個々の項目が参照によって具体的に且つ個々にそのように組み入れられるように指示されたようにと同じ程度にあらゆる目的でその全体が参照によって組み入れられる。配列の異なるバージョンが時を異にして受託番号と関連付けられるのであれば、本出願の有効な出願日にて受託番号と関連付けられたバージョンが意図される。有効な出願日は、実際の出願日または該当する場合受託番号を参照する優先出願の出願日のうち早い方を意味する。同様に、出版物、ウェブサイト等の異なるバージョンが時を異にして公開されるのであれば、別段指示されない限り、出願の有効な出願日で最も最近公開されたバージョンが意図される。本発明の任意の特徴、工程、要素、実施形態または態様は特に指示されない限り、他との組み合わせで使用することができる。本発明は、明瞭さ及び理解の目的で説明及び例示のために少し詳細に記載されてきたが、ある特定の変更及び改変が添付のクレームの範囲内で実践されてもよいことは明らかであろう。
【実施例】
【０２４３】
実施例１．メディンモノクローナル抗体の特定
マウスをＣ末端ペプチドまたは完全長のヒトメディンで免疫し、ハイブリドーマをクローニングし、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、Ｂｉａｃｏｒｅ及び免疫細胞化学を用いて活性について抗体をスクリーニングした。
【０２４４】
当初のＥＬＩＳＡ試験は、完全長５０ａａのメディンに対して作られた抗体（たとえば、６Ｂ３）はメディンペプチドとラクトアドヘリンポリペプチドの双方と結合する一方で、Ｃ末端ペプチドに対して作られた抗体（たとえば、１８Ｇ１）はメディンに特異的であると思われることを明らかにした。
【０２４５】
それに続く試験はこれらの観察を裏付け、１８Ｇ１は、ラクトアドヘリンからメディンが切断される際に作り出された新エピトープである、メディンのＣ末端を認識することを明らかにした。
【０２４６】
ウエスタンブロットのデータは、６Ｂ３及び１８Ｇ１の双方がメディンのモノマー形態及びオリゴマー形態の双方と結合することができることも示した。
【０２４７】
内在性のヒトメディンについての特異性を評価するために、動脈瘤またはマルファン症候群の患者に由来する胸部大動脈試料で一連の免疫組織化学試験を行った。染色の強度及びパターンは抗体特異的であると思われたが、結果は抗メディン抗体が内在性のメディンと結合することができることを明らかにした。６Ｂ３は患者の動脈瘤にて及びその周囲にて密に凝集した（チオフラビンＳ＋）物質またはアミロイド沈着物を高親和性で染色した一方で、１８Ｇ１は特異的な染色をほとんどまたは全く示さなかった。対照的に、１８Ｇ１は、エラスチン線維と平滑筋細胞を含有する大動脈の領域である中膜における構造を広く染色した。
【０２４８】
これらのデータは、抗メディン抗体が動脈瘤及びマルファン患者試料に存在する内在性のメディンペプチドを検出することができることを実証し、抗体エピトープが検出されるメディンのサイズ（モノマー、ダイマー、トリマー等）及び凝集状態（オリゴマー、プロト原線維、凝集体）を決定することにおいて重要な役割を担うことができることを示した。
【０２４９】
具体的に、メディンに対するモノクローナル抗体は材料及び方法にて記載されているように生成された。
【０２５０】
抗メディン抗体クローンの性状分析
完全長ヒトメディン（５０ａａ、図１Ａ及びＢ）またはＣ末端ヒトペプチド（７ａａ、図１Ｂ）によるマウスの免疫によって対象とする抗メディンモノクローナル抗体のパネルを生成した。これら抗体のクローニングから生じるＩｇＧを先ず、ヒトのラクトアドヘリンポリペプチド及びヒトメディンペプチド（５０ａａ）への結合を測定するアッセイである二叉ＥＬＩＳＡにて評価した。この最初の選抜の結果は、完全長メディンペプチドに対して作った抗体のほとんどすべてがメディン及びラクトアドヘリンの双方と結合できる一方で、Ｃ末端ペプチドに対して作った抗体は大部分メディンに特異的であることを明らかにした（データは示さず）。ＥＬＩＳＡで使用されたラクトアドヘリンは合成ポリペプチドであり、正しく折り畳まれるとは思えなかったので、ネイティブのラクトアドヘリンを発現するヒトの乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞で追加のＦＡＣＳ試験を行った。興味深いことに、これらの試験の結果は、完全長のペプチドに対して作った抗体はラクトアドヘリンが細胞で発現され、正しく折り畳まれるとメディンと結合できないことを示した（データは示さず）。これらのデータは、メディンペプチドがラクトアドヘリン分子の内部に隠され、ラクトアドヘリンが誤って折り畳まれたまたは変性させられた場合にのみ露出する可能性があることを示唆した。
【０２５１】
この最初の選抜の結果に基づいて、完全長のメディン抗体及びＣ末端のメディン抗体の亜集団を四叉ＥＬＩＳＡでさらにスクリーニングした。このアッセイは、ヒトのラクトアドヘリン、完全長のヒトメディン（５０ａａ）、ヒトのＣ末端ペプチド及びマウスのＣ末端ペプチドへの結合に注目した。図２に示すように、対象とする各抗体について完全滴定曲線を生成した。これらの曲線の比較は抗体間で気付かれる差異の一部を強調した。完全長のヒトメディンに対して作った６Ｂ３のような抗体は完全長メディン及びラクトアドヘリンポリペプチドに結合したが、Ｃ末端ペプチドには結合しなかった（図２Ａ）。このデータは、これらの抗体についてのエピトープはＣ末端ドメインにはないことを示した。対照的に、１８Ｇ１のようなＣ末端抗体は完全長のメディン及びＣ末端ペプチドと結合できるが、ラクトアドヘリンに対する親和性をほとんどから全く有さなかった（図２Ｂ）。これらの観察は、１８Ｇ１のような抗体は、メディンがラクトアドヘリンポリペプチドから切断される際に作り出される新エピトープであるメディンのＣ末端を認識し得ることを示す最初のことであった。
【０２５２】
ウエスタンブロットによる抗メディン抗体の性状分析
ＥＬＩＳＡ試験の結果は、一部の抗メディンモノクローナル抗体が完全長のラクトアドヘリン及び切断されたメディンペプチドに差別的に結合し得ることを示した。抗メディン抗体の選択性をさらに良く理解し、メディンのマルチマー形態またはオリゴマー形態も認識されるのかどうかを知るために、ウエスタンブロット解析を使用した。図３Ａに示すように、市販の抗ラクトアドヘリン抗体の使用は約４６ｋＤａにて優勢なラクトアドヘリンのバンドを示したが、５０ａａのメディンペプチドを認識しなかった。しかしながら、抗メディン抗体６Ｂ３を使用すると、抗ラクトアドヘリン抗体で検出されたものに類似するバンドである明白なラクトアドヘリンのバンドが見られた（図３Ａ及び３Ｂ）。対照的に、６Ｂ３はメディンの予測されるモノマー形態に相当する３〜４．５ｋＤａのバンドを含むメディン試料における幾つかのバンドも認識した（図３Ｂ）。加えて、より高分子量の幾つかのより弱いメディンのバンドも観察された。メディンは凝集する傾向があるので、これらのバンドはメディンのマルチマーまたはオリゴマーを表すと思われる。完全長メディン抗体とＣ末端メディン抗体（６Ｂ３と１８Ｇ１、図４）の比較はさらに、これらの抗体間での差異を強調した。６Ｂ３は５０ａａのメディンペプチドと同様にラクトアドヘリンペプチドに埋め込まれたメディンを認識した（図４Ａ）のに対して、１８Ｇ１は切断されたメディンペプチドしか認識しなかった（図４Ｂ）。１８Ｇ１がメディンモノマー及びメディンのマルチマーの双方を認識する能力で６Ｂ３と同一に見えるのは注目に値する。
【０２５３】
その後、Ｂｉａｃｏｒｅ解析を用いてメディンに対する抗体の結合親和性を確かめ、完全長メディンに対比するラクトアドヘリンへの抗体の選択性を判定した。
【０２５４】
表２は完全長メディンへの６Ｂ３及び１８Ｇ１の結合親和性のＢｉａｃｏｒｅ解析を示す。６Ｂ３及び１８Ｇ１はメディンに対してそれぞれ１ｎＭ及び１２ｎＭの親和性を有した。ラクトアドヘリンに対する親和性はまだ決定されていない。
【表４】
2018508193.tif 000006
【０２５５】
実施例２．抗体及び病状に特異的な実験
ヒト組織による抗メディン抗体の免疫組織化学的な性状分析
ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットのデータは、抗メディン抗体が、生体内で見いだされ、大動脈のアミロイド斑に沈着すると考えられる予測された形態（Ｈａｇｇｑｖｉｓｔら）である完全長のヒトメディンと結合できることを明瞭に示した。内在性のヒトメディンに対する６Ｂ３及び１８Ｇ１の特異性をさらに評価するために、動脈瘤患者の胸部大動脈試料で一連の免疫組織化学試験を行った。染色の強度及びパターンは抗体特異的であると思われたが、これらの試験の結果は評価された抗メディン抗体はすべて内在性のメディンと結合できることを実証した。組織を染色するのに抗体６Ｂ３を使用した場合、免疫反応性は患者の動脈瘤における及びその周辺の領域に限局した。特に、６Ｂ３は密に凝集した物質またはアミロイド沈着物を高親和性で染色した。これらの沈着物が誤って折り畳まれたアミロイドタンパク質のマーカーであるチオフラビンＳによっても染まったという知見は、６Ｂ３が以前記載された（Ｈａｇｇｑｖｉｓｔら；Ｐｅｎｇら）メディン凝集体を染めたことを示唆した。興味深いことに、６Ｂ３は、密な凝集体のごく近傍で見られる緩い原線維のチオフラビンＳ陰性の構造も染色した。これら沈着物の正確な性質は未知である一方で、これらはさらに大きなチオフラビンＳ陽性の構造体に集合するメディンのオリゴマーまたはマルチマーであるかもしれない可能性がある。
【０２５６】
抗体１８Ｇ１で見られた染色のパターンは６Ｂ３とは明確に異なった。最も目立った差異は、動脈瘤において及びその周辺で見られるチオフラビンＳ陽性の密な凝集体の１８Ｇ１染色の欠如だった。凝集体に関連する緩い原線維沈着物は依然として免疫反応性なので、染色の欠如は全く特筆すべきである。目立った拡散性の１８Ｇ１染色は、エラスチン線維と平滑筋細胞を含有する大動脈の領域である中膜でも検出された。以前の試験管内の研究がメディンはエラスチンと平滑筋細胞との間の連結に結合し、それを破壊することを示唆しているので（Ｐｅｎｇら）、中膜で観察された１８Ｇ１の染色は驚くべきではなかった。
【０２５７】
これらの観察に基づいて、大動脈におけるエラスチン線維を冒し、最終的に動脈瘤をもたらし得る遺伝性疾患であるマルファン症候群の患者に由来する試料で追加の試験を行った。染色の程度及びシグナルの分布で明瞭な差異が言及されたが、当初の試験は６Ｂ３及び１８Ｇ１の双方がマルファン患者に由来する大動脈における構造体を染色することを示した。動脈瘤患者の組織試料で見られるように、６Ｂ３は、マルファン患者の大動脈で見られる密に凝集したアミロイド沈着物及び緩い原線維沈着物を主として染色した。しかしながら、これらの構造体は評価された試料にてあまり優勢ではないと思われたので、染色も減衰されると思われた。対照的に、マルファン患者の組織にて１８Ｇ１と共に見られた免疫反応性は広く分布し、且つシグナルが非常に強かった。特異的な１８Ｇ１染色は中膜全体にわたって存在し、エラスチン線維及び平滑筋細胞に明瞭に関連した。加えて、中程度の染色は内膜、外膜でも検出され、脂肪細胞と関連した。合わせて、これらのデータは、抗メディン抗体は動脈瘤及びマルファン患者の試料に存在する内在性のメディンペプチドを検出できることを実証し、抗体のエピトープがメディンのサイズ（モノマー、ダイマー、トリマー等）及び凝集状態（オリゴマー、プロト原線維、凝集体）を決定することにおいて重要な役割を担うことができることを明らかにした。
【０２５８】
実施例３．抗体の配列解析
メディン及びラクトアドヘリンの結合アッセイ、組織染色及び他の試験管内アッセイ（データは示さず）から生成されたデータに基づいて、さらなる解析のために幾つかの抗体を選択した。第１の工程として、１８Ｇ１及び６Ｂ３の可変領域の完全なアミノ酸配列を決定した（図５及び６）。この作業の結果は、メディンに対するそれらの親和性にもかかわらず、これらの抗体の間での差異を強調した。
【０２５９】
実施例４．材料及び方法
抗メディンモノクローナル抗体の生成
ＲＩＢＩアジュバント（Ｓｉｇｍａ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共にＫＬＨにコンジュゲートした１０、２５、または５０μｇの完全長のヒトメディン（図１Ａ及びＢを参照）（配列番号１）またはヒトＣ末端ペプチド（図１Ｂ）（配列番号２）によって毎週、４〜１０週間、マウスを免疫した。融合の３〜４日前、完全長のヒトメディンについて最高力価で選択したマウスに対して生理食塩水溶液における免疫原の最終的なＩＶ追加免疫を与えた。Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５）によって記載された改変された手順及び電気融合を用いて融合を行った。選択培地における融合細胞を９６穴プレートに播き、ＥＬＩＳＡ選抜を用いて７〜１０日後にスクリーニングした。
【０２６０】
ＥＬＩＳＡ
一次選抜として直接ＥＬＩＳＡ法を用いてハイブリドーマの選択を行った。手短には、９６穴プレート（ＣｏｓｔａｒのＲＩＡ／ＥＩＡプレート）を完全長のヒトメディン（図１Ｂ）で被覆し、室温で１時間インキュベートした。次いで１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）／ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）によって室温でプレートをブロックした。約１５分後、プレートを空にし、次いで融合プレートまたはクローニングプレートからの上清を加え、室温で１時間インキュベートした。インキュベートと洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％のツイーン２０）における洗浄の後、１：２,０００に希釈し、室温で１時間インキュベートした西洋ワサビのペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）にコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体によって抗体結合を検出した。次いで、基質としてのＡＢＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって西洋ワサビのペルオキシダーゼのレベルを視覚化し、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍで読み取った。約１．０ＯＤ単位のウェルを陽性と見なした。
【０２６１】
対象とする抗体をさらに性状分析するために、ＥＬＩＳＡ滴定曲線を生成して、ヒトのラクトアドヘリン（図１Ａ、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）、完全長のヒトメディンペプチド（５０ａａ、図１Ａ及びＢ）またはヒトもしくはマウスのＣ末端ペプチド（図１Ｂを参照）に対する抗体結合を判定した。２．５ｕｇ／ｍＬ、５０ｕＬ／ウェルでの完全長のヒトメディン、ヒトＣ末端ペプチド−ＯＶＡ、マウスＣ末端ペプチド−ＯＶＡ、及びラクトアドヘリンでプレートを被覆し、室温で約１時間インキュベートした。次いで室温にて１％のＢＳＡ／ＰＢＳでプレートをブロックした。約１５分後、プレートを空にし、次いで対象とする抗体をプレートに加え、室温での１時間のインキュベートの後、洗浄緩衝液でプレートを洗浄した。０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＴＢＳ−Ｔにて１：２,０００に希釈した西洋ワサビのペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）にコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体である検出抗体をプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。最終的に、プレートを洗浄し、次いでＡＢＴＳ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に室温で１５分間インキュベートし、シグナルを視覚化し、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍで読み取った。
【０２６２】
ウエスタンブロット
ウエスタンブロット解析を用いて、完全長のメディンペプチド（図１Ａ及びＢ）またはラクトアドヘリン（図１Ａ）への抗メディンモノクローナル抗体のパネルの結合をさらに評価した。手短には、０．２−１ｕｇのラクトアドヘリン（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．；カタログ番号１０８５３−Ｈ０８Ｂ）またはメディンペプチド（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ、カタログ番号：３６６５８７）を１×ＬＤＳ試料緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で希釈し、１０％のＮｕＰＡＧＥビス−トリスゲルに負荷し、２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸緩衝液での９０Ｖの定電圧で１０５分間の電気泳動に供した。電気泳動の後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをニトロセルロース濾紙（ｉＢｌｏｔ、Ｐ７プログラム）上にブロットし、ブロッキング緩衝液（Ｌｉｃｏｒ）で３０分間ブロックした。次いでブロッキング緩衝液中の０．５ｕｇ／ｍｌのウサギ抗ラクトアドヘリン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ｓｃ−３３５４６）またはマウス抗メディン抗体（６Ｂ３及び１８Ｇ１を含む）にて室温で１時間（または４℃で一晩）、濾紙をインキュベートし、その後１×ＴＢＳによる１０分間の洗浄を３回行った。ブロッキング緩衝液で１：２０，０００に希釈した適当なＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷをコンジュゲートした二次抗体（ヤギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギ、Ｏｄｙｓｓｅｙ）に濾紙を入れた。室温で１時間二次抗体溶液にて濾紙をインキュベートした後、濾紙を洗浄し、Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＣＬｘ赤外線撮像装置（Ｌｉｃｏｒ）で画像化した。
【０２６３】
免疫組織化学
胸部大動脈瘤またはマルファン症候群の患者に由来するヒト大動脈試料を入手し、ホルマリンで固定し、パラフィンワックスに包埋し、５〜６μｍの切片に切り、顕微鏡スライド上で集めた。染色時に、切片を載せたスライドを６０℃で２０分間乾燥させ、キシレンで処理し（２×１０分間）、段階的な一連のエタノールすすぎによって再水和した。次いで、組織切片を０．０１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４；Ｓｉｇｍａ）で５分間すすぎ、グルコースオキシダーゼブロッキング溶液（Ａｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．１９：４２６）にて３７℃で６０分間インキュベートした。その後、スライドをＰＢＳですすぎ（３×５分間）、６Ｂ３または１８Ｇ１（１％ＢＳＡ／０．３％トリトンＸ１００／ＰＢＳにて.２５〜１μｇ／ｍｌに希釈された）のような抗メディン抗血清と共に４℃で２４〜７２時間インキュベートした。染色を視覚化するために切片をＰＢＳで洗浄し（３×１０分間）、次いで抗マウス標識ポリマーＤＡＢ染色システム（室温で３０分間、Ｄａｋｏ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ）と共にインキュベートした。１０分間のＤＡＢ反応（１００ｍｇの３,３’−ジアミノベンジジン、２５０ｍｌのＴｒｉｓ、３０μｌの３０％Ｈ２Ｏ２）の前に、切片をＰＢＳ（３×１０分間）及び０．０５ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６、１×１０分間）で洗浄した。次いで、切片をＴｒｉｓに移し（２×５分間）、Ｈ２Ｏですすぎ（１分間）、Ｍｙｅｒのヘマトキシリン（Ｄａｋｏ）で染色した。次いでＣｙｔｏｓｅａｌ  ６０（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａｌｌｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で切片にカバースリップを載せた。追加の切片をヘマトキシリン工程の後にチオフラビンＳ（５分間、０．５ｇ／５０ｍｌのＨ２Ｏ）で染色して組織にて凝集したアミロイド沈着物を視覚化した。これらのスライドを７０％エタノール（５分間）及びＨ２Ｏ（２×３０秒間）ですすぎ、Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でカバースリップを載せた。スライドを明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡によって視覚化し、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウエアを用いてデジタル画像を取得した。
【０２６４】
ＢｉａＣｏｒｅ
ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの抗マウスキットで提供された指示書に従って、アミンのカップリングを介して抗マウス抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をセンサーチップＣ５（デキストラン鎖を欠く）上に不動化した。次いで、３０〜５０ＲＵにて検体の最大結合を確保するレベルで対象とする抗メディンモノクローナル抗体をチップ上に捕捉した。広げた濃度範囲の大きさに応じて、２倍または３倍の希釈でランニング緩衝液（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水＋０．０５％Ｐ−２０、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）にて３０ｕｌ／分で捕捉されたリガンド上に種々の濃度の検体、完全長のヒトメディン（５０ａａ、図１Ａ及びＢ）を通した。各濃度について、さらに高い検体濃度が会合の間に平衡に達するのに、ならびに少なくとも１０％のシグナルが解離の間に崩壊するのに必要とされる時間の間、反応は進行した。少なくとも１つの濃度（最高または最低ではない）を２つ組で実行した。検体の濃度範囲は、ＫＤを少なくとも１０倍上回るからＫＤを１０倍下回るに及ぶ予備実験に基づいて選択した。データは、メディン抗体を含有しない無関係なセンサー及び抗マウスセンサーからの抗体の解離を説明するメディンの０ｎＭ濃度の双方を二重参照した。次いでＢｉａｃｏｒｅソフトウエアを用いて全体的な１：１の適合でデータを解析した。
【０２６５】
配列決定
各メディンモノクローナル抗体の可変ドメインの配列を決定するために、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｍＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７２０２２）を用いて１×１０７個のハイブリドーマ細胞から全ｍＲＮＡを抽出した。次いで８０μｇの全ｍＲＮＡを鋳型として用い、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号６３４９１３）を用いて二本鎖ｃＤＮＡを生成した。配列決定用に可変領域重鎖（ＶＨ）及び可変領域軽鎖（ＶＬ）のＤＮＡを増幅するために、ＶＨ及びＶＬ双方の増幅のための５’プライマーとしてＭａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ増幅キットに含まれている万能アダプタープライマーを用いることによってＰＣＲを行った。対象とする抗メディンモノクローナル抗体はカッパ軽鎖を有するので、ＣＫ  ３’プライマーＡＣＴＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧ（配列番号１９）をＶＬのＰＣＲ増幅に用いた。ＶＨの増幅については、以下の３’プライマーをそれぞれ用いた：
１８Ｇ１（重鎖はガンマ２ａである）：
ＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＣＧＡＴＧＧ（配列番号２０）
６Ｂ３（重鎖はガンマ２ｂである）：
ＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧ（配列番号２１）
【０２６６】
次いで、ＰＣＲ産物をゲル精製し、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲクローニングキット（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ、カタログ番号Ｋ２８００−２０）を用いてＴｏｐｏ  ４ベクターにクローニングし、配列決定のためにＥｌｉｍｂｉｏに送付した。
【０２６７】
実施例５  ヒト化６Ｂ３抗体の設計
ヒト化のための出発点またはドナー抗体はマウス抗体６Ｂ３だった。成熟ｍ６Ｂ３の重鎖可変アミノ酸配列は配列番号１１として提供されている。成熟ｍ６Ｂ３の軽鎖可変アミノ酸配列は配列番号２９として提供されている。重鎖のＫａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１２〜１４として提供されている。軽鎖のＫａｂａｔのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１６〜１８として提供されている。全体を通してＫａｂａｔの番号付けが使用されている。
【０２６８】
６Ｂ３の可変カッパ（Ｖｋ）はヒトのＫａｂａｔ亜群１に相当するマウスのＫａｂａｔ亜群５に属し、可変重鎖（Ｖｈ）はヒトのＫａｂａｔ亜群１に相当するマウスのＫａｂａｔ亜群１ｂに属する（Ｋａｂａｔ、１９９１、上記）。
【０２６９】
Ｖｋにおいて１１残基のＣＤＲ−Ｌ１は標準クラス２に属し；７残基のＣＤＲ−Ｌ２はクラス１に属し；９残基のＣＤＲ−Ｌ３はクラス１に属する［Ｍａｒｔｉｎ，ＡＣ，ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，ＪＭ．１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００−１５．］。１２残基のＣＤＲ−Ｈ１はクラス３に属し；１６残基のＣＤＲ−Ｈ２はクラス１に属する［Ｍａｒｔｉｎ＆Ｔｈｏｒｎｔｏｎ、上記）。ＣＤＲ−Ｈ３は標準クラスを有さない。（Ｓｈｉｒａｉ，Ｈ.  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５５：１８８−１９７）
【０２７０】
軽鎖Ｖ４４は通常プロリンなので、この界面残基は復帰突然変異について特に標的とされることを除いて、Ｖｋ及びＶｈのドメイン間での界面の残基は一般的に見いだされるものである。
【０２７１】
ＰＤＢデータベース（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：Ｄ２３３−Ｄ２３７）にてタンパク質配列について検索を行い、６Ｂ３の大まかな構造モデルを提供する構造を見いだした。我々は、それが理に適って良好な解像度（２．５Ａ）を有し、ループについて同じ標準構造を保持する６Ｂ３のＶｋに全体的な構造類似性を有するので、Ｖｋ構造についての抗体ｆａｂ（ｐｄｂコード３ＣＦＤ）（Ｄｅｂｌｅｒ，ＥＷ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８；３１９：１２３２−１２３５）の結晶構造を用いた。ｐｄｂコード３ＭＢＸを持つ抗体ｆａｂ（Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；４７：２４２２−２４２６）をＶｈ構造に用いた。それは良好な配列類似性及び理に適って良好な解像度（１．６Ａ）を有した。加えて、ＣＤＲ−Ｈ１及びＨ２は６Ｂ３のＶｈと同じ標準構造を有した。我々はＢｉｏｌｕｍｉｎａｔｅソフトウエアを用いて６Ｂ３の大まかな構造をモデル化した。このソフトウエアはＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社からライセンスを受けている。
【０２７２】
ＮＣＢＩの非冗長タンパク質配列データベースの検索によってマウスのＣＤＲを移植する好適なヒトフレームワークの選択が可能になった。Ｖｋについては、ＮＣＢＩ受託コードＢＡＣ０１５５８．１（ＧＩ：２１６６９０６７）（Ａｋａｈｏｒｉ，Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔ  Ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ（２５−ＪＵＮ−２００１）Ｙｏｓｈｉｋａｚｕ  Ｋｕｒｏｓａｗａ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｕｊｉｔａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ｋｕｔｓｕｋａｋｅ−ｃｈｏ，Ｔｏｙｏａｋｅ，４７０−１１９２，Ｊａｐａｎ）を持つヒトカッパ軽鎖が選ばれた。これはＣＤＲ−Ｌ１及びＬ２について同じ標準クラスを有する。それは、Ｋａｂａｔのヒトカッパ亜群２のメンバーである。Ｖｈについては、再び同じ標準クラスを持つヒトＩｇ重鎖ＡＡＤ５３８６３．１（ＧＩ：５８３４１９４）（Ｗａｎｇ，Ｘ．ａｎｄ  Ｓｔｏｌｌａｒ，Ｂ．Ｄ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９，９３，１３２−１４２）が選ばれた。それはＫａｂａｔのヒト重鎖亜群１のメンバーである。
【０２７３】
ＩＭＧＴドメインＧａｐＡｌｉｇｎツールを用いて、抗体のヒト化過程から生じる重鎖及び軽鎖の変異配列をヒトの生殖系列の配列に対してさらに並べ、ＷＨＯ  ＩＮＮ委員会指針（（インターネット）２０１４：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｉｎｎ／ＢｉｏＲｅｖ２０１４．ｐｄｆから入手可能なＷＨＯ−ＩＮＮ：生体物質及びバイオテクノロジー物質のための国際一般的名称（ＩＮＮ）（ＷＨＯ−ＩＮＮ：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｎｏｎｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ  ｎａｍｅｓ（ＩＮＮ）ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）（概説））によって要点が述べられたように重鎖及び軽鎖のヒトらしさを評価した。対応するヒト生殖系列の配列と並ぶように残基を変え、可能であれば、ヒトらしさを向上させた。
【０２７４】
６Ｂ３ＶＨをヒト生殖系列の配列ＩＧＨＶ４−３０−３＊０１に対して並べ、６Ｂ３ＶＬをＩＧＫＶ１−ＮＬ１＊０１に対して並べた。
【０２７５】
異なる置換の並べ替えを含有する、３つのヒト化重鎖可変領域の変異体及び２つのヒト化軽鎖可変領域の変異体を構築した（Ｈｕ６Ｂ３ＶＨｖ１、Ｈｕ６Ｂ３ＶＨｖ２、及びＨｕ６Ｂ３ＶＨｖ３、（それぞれ、配列番号２６〜２８、）ならびにＨｕ６Ｂ３ＶＬｖ１及びＨｕ６Ｂ３ＶＬｖ２（それぞれ、配列番号３１〜３２）（表３及び４）。選択されたヒトフレームワークに基づいた復帰突然変異及び他の突然変異を持つ例となるヒト化Ｖｈ及びＶｋの設計をそれぞれ表３及び４で示す。表３及び４における灰色の陰影部分はＫａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合によって定義されたようなＣＤＲを示す。配列番号２６〜２８及び３２は表５で示すような復帰突然変異及び他の突然変異を含有する。Ｈｕ６Ｂ３ＶＨｖ１、Ｈｕ６Ｂ３ＶＨｖ２、及びＨｕ６Ｂ３ＶＨｖ３におけるＨ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ１０、Ｈ１５、Ｈ１９、Ｈ４４、Ｈ４８、Ｈ４９、Ｈ６７、Ｈ７８、Ｈ７９、Ｈ８１、Ｈ８２、Ｈ８２ａ、Ｈ８２ｂ、Ｈ８２ｃ、Ｈ８３、Ｈ８４、Ｈ８５、Ｈ８９、及びＨ１０８位、及びＨｕ６Ｂ３ＶＬｖ１及びＨｕ６Ｂ３ＶＬｖ２におけるＬ７１、Ｌ８７、Ｌ１００、及びＬ１０４位でのアミノ酸は表６でリストにされている。
【表５】
2018508193.tif 000007
2018508193.tif 000008
2018508193.tif 000009
2018508193.tif 000010
2018508193.tif 000011
【表６】
2018508193.tif 000012
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2018508193.tif 000014
2018508193.tif 000015
2018508193.tif 000016
【表７】
2018508193.tif 000017
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【表８】
2018508193.tif 000019
【０２７６】
マウス６Ｂ３のＶｈ配列（配列番号１１）のヒトアクセプター配列（ＡＡＤ５３８６３．１；配列番号２５、及びＨｕ６Ｂ３ＶＨｖ１、Ｈｕ６Ｂ３ＶＨｖ２、及びＨｕ６Ｂ３ＶＨｖ３、（それぞれ配列番号２６〜２８）との配列比較を図７にて示す。Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合によって定義されたようなＣＤＲ領域を四角で囲む。カノニカル残基、バーニア残基または界面残基がマウス配列とヒトアクセプター配列との間で異なる位置が置換の候補である。カノニカル／ＣＤＲの相互作用残基の例には表３におけるＫａｂａｔ残基Ｈ４８が挙げられる。界面／パッキング（ＶＨ＋ＶＬ）の残基の例には表３におけるＫａｂａｔ残基Ｈ３５、Ｈ３７、Ｈ３９、Ｈ４５、Ｈ４７、Ｈ９３、Ｈ９５、Ｈ１０１、及びＨ１０３が挙げられる。
【０２７７】
マウス６Ｂ３のＶｋ配列（配列番号２９）のヒトアクセプター配列（ＢＡＣ０１５５８．１；配列番号３０）及びＨｕ６Ｂ３ＶＬｖ１及びＨｕ６Ｂ３ＶＬｖ２（それぞれ配列番号３１及び３２）との配列比較を図８にて示す。Ｋａｂａｔによって定義されたようなＣＤＲ領域を四角で囲む。カノニカル残基、バーニア残基または界面残基がマウス配列とヒトアクセプター配列との間で異なる位置が置換の候補である。界面／パッキング（ＶＨ＋ＶＬ）の残基の例には表４におけるＫａｂａｔ残基Ｌ３４、Ｌ３６、Ｌ３８、Ｌ４４、Ｌ４６、Ｌ８７、Ｌ８９、Ｌ９１、Ｌ９６、及びＬ９８が挙げられる。
【０２７８】
置換の候補としての軽鎖可変領域における表５及び６で示した位置の選択についての論理的な根拠は以下のとおりである。
【０２７９】
Ｆ７１Ｙ；Ｙ８７Ｆ；Ｇ１００Ｑ及びＶ１０４Ｌは頻度／生殖系列を調整する変異である。
【０２８０】
置換の候補としての重鎖可変領域における表５及び６で示した位置の選択についての論理的な根拠は以下のとおりである。
【０２８１】
Ｑ１Ｅは、ピログルタミン酸塩の形成能を低減する安定性を向上させる変異である（Ｌｉｕ、２０１１、上記）。
【０２８２】
Ｔ３Ｑ；Ｋ５Ｑ；Ａ１０Ｇ；Ｔ１５Ｓ；Ｔ１９Ｓ；Ａ４４Ｇ；Ｌ４８Ｉ；Ａ４９Ｇ；Ｌ６７Ｖ；Ｖ７８Ｆ；Ｖ７９Ｓ；Ｔ８１Ｋ；Ｍ８２Ｌ；Ｔ８２ａＳ；Ｎ８２ｂＳ；Ｍ８２ｃＶ；Ｄ８３Ｔ；Ｐ８４Ａ；Ｖ８５Ａ；Ｔ８９Ｖ、及びＬ１０８Ｔは頻度に基づく復帰突然変異または生殖系列を調整する突然変異である。
【０２８３】
これらのヒトフレームワークに基づく設計は以下のとおりだった：
【０２８４】
ＶＡＲＩＡＢＬＥ  ＫＡＰＰＡ
【０２８５】
＞Ｈｕ６Ｂ３ＶＬｖ１
【０２８６】
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＦＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＫＴＬＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
【０２８７】
＞Ｈｕ６Ｂ３ＶＬｖ２
【０２８８】
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＦＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰ  ＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＧＫＴＬＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
【０２８９】
ＶＡＲＩＡＢＬＥ  ＨＥＡＶＹ
【０２９０】
＞Ｈｕ６Ｂ３ＶＨｖ１
【０２９１】
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＤＭＧＶＧＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＷＷＮＤＮＫＹＹＮＩＡＬＫＮＲＬＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＶＧＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２９２】
＞Ｈｕ６Ｂ３ＶＨｖ２
【０２９３】
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＤＭＧＶＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＡＨＩＷＷＮＤＮＫＹＹＮＩＡＬＫＮＲＬＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＶＳＬＫＬＴＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＶＧＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２９４】
＞Ｈｕ６Ｂ３ＶＨｖ３
【０２９５】
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＤＭＧＶＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＨＩＷＷＮＤＮＫＹＹＮＩＡＬＫＮＲＶＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＶＧＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
【０２９６】
実施例６  ヒト化１８Ｇ１抗体の設計
ヒト化のための出発点またはドナー抗体はマウス抗体１８Ｇ１だった。成熟ｍ１８Ｇ１の重鎖可変のアミノ酸配列は配列番号３として提供される。成熟ｍ１８Ｇ１の軽鎖可変のアミノ酸配列は配列番号３６として提供される。重鎖のＫａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号４〜６として提供される。軽鎖のＫａｂａｔのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号８〜１０として提供される。全体を通してＫａｂａｔの番号付けが使用される。
【０２９７】
１８Ｇ１の可変カッパ（Ｖｋ）はヒトＫａｂａｔ亜群１に相当するマウスＫａｂａｔ亜群５に属し、可変重鎖（Ｖｈ）はヒトＫａｂａｔ亜群３に相当するマウスＫａｂａｔ亜群３ｄに属する（Ｋａｂａｔら、１９９１、上記）。
【０２９８】
１１残基のＣＤＲ−Ｌ１は標準クラス２に属し；７残基のＣＤＲ−Ｌ２はクラス１に属し；９残基のＣＤＲ−Ｌ３はＶｋにおけるクラス１に属する（Ｍａｒｔｉｎ＆Ｔｈｏｒｎｔｏｎ、上記）。１２残基のＣＤＲ−Ｈ１はクラス３に属し；１６残基のＣＤＲ−Ｈ２はクラス１に属する（Ｍａｒｔｉｎ＆Ｔｈｏｒｎｔｏｎ、上記）。ＣＤＲ−Ｈ３は標準クラスを有さない（Ｓｈｉｒａｉ、上記）。
【０２９９】
ＶｋドメインとＶｈドメインの間の界面における残基は一般に見いだされるものであり；従って、界面残基のどれもが復帰突然変異について具体的に対象とされない。
【０３００】
ＰＤＢデータベース（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ、上記）にてタンパク質配列について検索を行い、１８Ｇ１の大まかな構造モデルを提供する構造を見いだした。我々は、それが理に適って良好な解像度（２．５Ａ）を有し、ループについて同じ標準構造を保持する１８Ｇ１のＶｋに全体的な構造類似性を有するので、Ｖｋ構造についての抗体ｆａｂ（ｐｄｂコード３ＣＬＥ）（Ｎｉｓｈｉａｍａ，Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔ  ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ，２００８）の結晶構造を用いた。ｐｄｂコード２ＺＵＱ（Ｉｎａｂａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２００９；２８：７７９−７９１）を持つ抗体ｆａｂをＶｈ構造に用いた。それは良好な全体的な配列類似性及び理に適って良好な解像度（３．３Ａ）を有した。加えて、ＣＤＲ−Ｈ１及びＨ２は１８Ｇ１のＶｈと同じ標準構造を有した。我々はＢｉｏｌｕｍｉｎａｔｅソフトウエアを用いて１８Ｇ１の大まかな構造をモデル化した。このソフトウエアはＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社からライセンスを受けている。
【０３０１】
ＮＣＢＩの非冗長タンパク質配列データベースの検索によってマウスのＣＤＲを移植する好適なヒトフレームワークの選択が可能になった。Ｖｋについては、ＮＣＢＩ受託コードＡＡＤ３９５０７．１（ＧＩ：５０８１７２３）（Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋ，Ｅ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｌｏｏｄ，９５，５５８−５６３）を持つヒトカッパ軽鎖が選ばれた。これはＣＤＲ−Ｌ１及びＬ２について同じ標準クラスを有する。それはＫａｂａｔのヒトカッパ亜群２のメンバーである。Ｖｈについては、再び同じ標準クラスであるヒトＩｇ重鎖ＡＡＸ８２４９４．１（ＧＩ：６２４２１４６１）（Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４，３２２２−３２３１）が選ばれた。それはＫａｂａｔのヒト重鎖亜群１のメンバーである。
【０３０２】
ＩＭＧＴドメインＧａｐＡｌｉｇｎツールを用いて、抗体のヒト化過程から生じる重鎖及び軽鎖の変異体配列をさらに、ヒトの生殖系列の配列に対して並べ、ＷＨＯ  ＩＮＮ委員会指針（ＷＨＯ  ＩＮＮ、上記）によって要点が述べられたように重鎖及び軽鎖のヒトらしさを評価した。対応するヒト生殖系列の配列に合わせるように残基を変え、可能であるならば、ヒトらしさを向上させた。
【０３０３】
１８Ｇ１のＶＨをヒト生殖系列の配列ＩＧＨＶ３−１３＊０１に対して並べ、１８Ｇ１のＶＬをＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０２に対して並べた。
【０３０４】
置換の様々な並べ替え（Ｈｕ６Ｂ３ＶＨｖ１及びＨｕ１８Ｇ１ＶＨｖ２、（それぞれ配列番号３４〜３５）及びＨｕ１８Ｇ１ＶＬｖ１及びＨｕ１８Ｇ１ＶＬｖ２（それぞれ配列番号３８〜３９））を含有する２つのヒト化重鎖可変領域変異体及び２つのヒト化軽鎖可変領域変異体を構築した（表７及び８）。選択されたヒトフレームワークに基づく復帰突然変異及び他の突然変異を伴った例となるヒト化Ｖｈ及びＶｋの設計を表９にて示す。表７及び８における灰色の陰影部分は、Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合によって定義されたようなＣＤＲ配列番号３５、３８及び３９が表９で示されるような復帰突然変異及び他の突然変異を含有することを示す。Ｈｕ１８Ｇ１ＶＨｖ１及びＨｕ１８Ｇ１ＶＨｖ２におけるＨ１、Ｈ５、Ｈ１３、Ｈ１９、Ｈ４０、Ｈ４２、Ｈ４４、Ｈ４９、Ｈ７７、Ｈ８２ａ、Ｈ８３、Ｈ８４、Ｈ８９、Ｈ９３、及びＨ１０８位、ならびにＨｕ１８Ｇ１ＶＬｖ１及びＨｕ１８Ｇ１ＶＬｖ２におけるＬ３、Ｌ１０、Ｌ１３、Ｌ１５、Ｌ１９、Ｌ２０、Ｌ２２、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｌ６０、Ｌ７０、Ｌ７７、Ｌ７８、Ｌ８０、Ｌ８３、及びＬ８５位でのアミノ酸は表１０にてリストにされている。
【表９】
2018508193.tif 000020
2018508193.tif 000021
2018508193.tif 000022
2018508193.tif 000023
2018508193.tif 000024
【表１０】
2018508193.tif 000025
2018508193.tif 000026
2018508193.tif 000027
2018508193.tif 000028
2018508193.tif 000029
【表１１】
2018508193.tif 000030
【表１２】
2018508193.tif 000031
2018508193.tif 000032
【０３０５】
マウス１８Ｇ１のＶｈ配列（配列番号３）のヒトアクセプター配列（ＡＡＸ８２４４９４．１；配列番号３３、及びＨｕ１８Ｇ１ＶＨｖ１及びＨｕ１８Ｇ１ＶＨｖ２（それぞれ配列番号３４及び３５）との配列比較を図９にて示す。Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ複合によって定義されたようなＣＤＲ領域を四角で囲む。カノニカル残基、バーニア残基または界面残基がマウス配列とヒトアクセプター配列の間で異なる位置が置換の候補である。カノニカル／ＣＤＲ相互作用残基の例には表７におけるＫａｂａｔ残基Ｈ４８が挙げられる。界面／パッキング（ＶＨ＋ＶＬ）残基の例には表７におけるＫａｂａｔ残基Ｈ３５、Ｈ３７、Ｈ３９、Ｈ４５、Ｈ４７、Ｈ９１、Ｈ９３、Ｈ９５、Ｈ１０１、及びＨ１０３が挙げられる。
【０３０６】
マウス１８Ｇ１のＶｋ配列（配列番号３６）のヒトアクセプター配列（ＡＡＤ３９５０７．１；配列番号３７）、及びＨｕ１８Ｇ１ＶＬｖ１及びＨｕ１８Ｇ１ＶＬｖ２（それぞれ配列番号３８及び３９）との配列比較を図１０にて示す。Ｋａｂａｔによって定義されたようなＣＤＲ領域を四角で囲む。カノニカル残基、バーニア残基または界面残基がマウス配列とヒトアクセプター配列との間で異なる位置が置換の候補である。界面／パッキング（ＶＨ＋ＶＬ）残基の例には、表８におけるＫａｂａｔ残基Ｌ３４、Ｌ３６、Ｌ３８、Ｌ４４、Ｌ４６、Ｌ８７、Ｌ８９、Ｌ９１、Ｌ９６、及びＬ９８が挙げられる。
【０３０７】
置換の候補として軽鎖可変領域において表９及び１０で示される位置の選択についての論理的根拠は以下のとおりである。Ｑ３Ｖ；Ｆ１０Ｓ；Ａ１３Ｖ；Ｖ１５Ｐ；Ｖ１９Ａ；Ｔ２０Ｓ；Ｔ２２Ｓ；Ｋ４２Ｑ；Ｋ４５Ｑ；Ｓ６０Ｄ；Ｅ７０Ｄ；Ｓ７７Ｒ；Ｌ７８Ｖ；Ｐ８０Ａ；Ｆ８３Ｌ，及びＴ８５Ｖは生殖系列を調整する突然変異または頻度に基づく復帰突然変異である。
【０３０８】
置換の候補として重鎖可変領域において表９及び１０で示される位置の選択についての論理的根拠は以下のとおりである。
【０３０９】
Ｑ１Ｅは、ピログルタミン酸塩の形成能を低減する安定性を向上させる突然変異である（Ｌｉｕ、上記）。
【０３１０】
Ｑ５Ｖ；Ｋ１３Ｑ；Ｋ１９Ｒ；Ｔ４０Ａ；Ｄ４２Ｇ；Ｒ４４Ｇ；Ａ４９Ｓ；Ｔ７７Ｓ；Ｓ８２ａＮ；Ｋ８３Ｒ；Ｓ８４Ａ；Ｍ８９Ｖ、Ａ９３Ｖ、及びＭ１０８Ｔは頻度に基づく復帰突然変異または生殖系列を調整する突然変異である。
【０３１１】
これらのヒトフレームワークに基づく設計は以下である：
【０３１２】
可変カッパ
【０３１３】
＞ｈｕ１８Ｇ１ｖｋバージョン１
【０３１４】
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＶＳＰＧＤＲＡＳＩＳＣＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＱＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＶＱＡＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＮＳＦＰＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
【０３１５】
＞ｈｕ１８Ｇ１ｖｋバージョン２
【０３１６】
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＶＳＰＧＤＲＡＳＩＳＣＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＱＹＮＳＦＰＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
【０３１７】
可変重鎖
【０３１８】
１８Ｇ１ｖｈバージョン１
【０３１９】
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＴＰＤＫＲＬＥＷＶＡＧＩＳＳＧＤＹＹＴＹＹＰＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＲＧＮＴＧＰＲＶＧＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
【０３２０】
＞１８Ｇ１ｖｈバージョン２
【０３２１】
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＳＧＤＹＹＴＹＹＰＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＧＲＧＮＴＧＰＲＶＧＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
【表１３】
2018508193.tif 000033
2018508193.tif 000034
2018508193.tif 000035
2018508193.tif 000036
2018508193.tif 000037
2018508193.tif 000038
2018508193.tif 000039
2018508193.tif 000040
2018508193.tif 000041
2018508193.tif 000042
2018508193.tif 000043
2018508193.tif 000044
2018508193.tif 000045
2018508193.tif 000046
2018508193.tif 000047
2018508193.tif 000048
2018508193.tif 000049
2018508193.tif 000050
2018508193.tif 000051
2018508193.tif 000052
2018508193.tif 000053
2018508193.tif 000054
2018508193.tif 000055
2018508193.tif 000056
2018508193.tif 000057
2018508193.tif 000058
2018508193.tif 000059
2018508193.tif 000060
2018508193.tif 000061
2018508193.tif 000062
【図１Ａ】
2018508193.tif 000063
【図１Ｂ】
2018508193.tif 000064
【図２Ａ−Ｂ】
2018508193.tif 000065
【図３Ａ−Ｂ】
2018508193.tif 000066
【図４Ａ−Ｂ】
2018508193.tif 000067
【図５】
2018508193.tif 000068
【図６】
2018508193.tif 000069
【図７】
2018508193.tif 000070
【図８】
2018508193.tif 000071
【図９】
2018508193.tif 000072
【図１０】
2018508193.tif 000073
【配列表】
2018508193000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成29年10月16日(2017.10.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018508193000001.app
【国際調査報告】
2018508193.tif 000104
2018508193.tif 000105