(57)【要約】  第１の材料及び第２の材料を含む組成物であって、前記第１の材料が、第１の架橋反応によって架橋可能であり、前記第２の材料が、第２の架橋反応によって架橋可能であり、前記第１の架橋反応及び前記第２の架橋反応が、共通の活性化剤によって誘導可能である、組成物。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の材料及び第２の材料を含む組成物であって、前記第１の材料が、第１の架橋反応によって架橋可能であり、前記第２の材料が、第２の架橋反応によって架橋可能であり、前記第１の架橋反応及び前記第２の架橋反応が、共通の活性化剤によって誘導可能である、組成物。
【請求項２】
前記第１の材料が、ポリマー、好ましくはバイオポリマーである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第１の材料が、ポリペプチド、ポリサッカライド又はポリヌクレオチドである、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記第１の材料が、ポリサッカライド、好ましくは、アルギン酸塩に由来するポリサッカライドである、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記第２の材料が、生体適合性の合成又は半合成ポリマーを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記第２の材料が、親水性ポリマーを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記第２の材料が、膨潤性ポリマーを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記第２の材料が、親水性ポリマーのコポリマー及びオリゴペプチドを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記オリゴペプチドが、前記第２の架橋反応のための基材であるか又は基材を提供する、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記オリゴペプチドが、少なくとも１つの更なる反応、例えば、酵素反応のための基材であるか又は基材を提供する、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記第２の材料が、生物学的機能を有する更なる生体分子、好ましくは、シグナル伝達分子、例えば、細胞接着性ペプチド又は増殖因子を更に含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第２の材料が、修飾又は未修飾のポリグリコールを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記第２の材料が、修飾又は未修飾のポリエチレングリコール、例えば、分枝状の修飾又は未修飾のポリエチレングリコールを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記第１の材料が、前記第１の架橋反応によって架橋される場合、第１の分解反応によって分解可能であり、前記第２の材料が、前記第２の架橋反応によって架橋される場合、前記第１の分解反応によって分解可能ではない、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記共通の活性化剤が、化学薬剤又は生物学的薬剤である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記共通の活性化剤が、化学薬剤である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記共通の活性化剤が、有機化合物、金属塩若しくは金属イオン、酸又は塩基である、請求項１５又は請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記共通の活性化剤が、金属イオン、好ましくは、アルカリ金属イオン又はアルカリ土類金属イオンである、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記共通の活性化剤が、カルシウムイオン、好ましくは、Ｃａ２＋である、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記共通の活性化剤が、酵素補因子である、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記第１の架橋反応及び前記第２の架橋反応が、異なる反応である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記第１の架橋反応及び前記第２の架橋反応が、互いに独立して行われる、請求項１から２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記第１の架橋反応が相対的に速く、好ましくは、約０．１〜１０秒の程度であり、前記第２の架橋反応が、相対的に遅く、好ましくは、約１０〜６０分の程度である、請求項１から２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
緩衝剤、好ましくは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤を更に含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
キレート剤、好ましくは、生体適合性のキレート剤を更に含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記キレート剤が、有機酸、例えば、クエン酸又はＥＤＴＡ、好ましくは、ＥＤＴＡを含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
界面活性剤、好ましくは、非イオン性プロピレングリコール由来の界面活性剤を更に含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
酵素、好ましくは、架橋酵素を更に含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記酵素が、トランスグルタミナーゼ、好ましくは、ＦＸＩＩＩａである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記酵素が、前記第２の架橋反応を媒介する、請求項２８又は請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記第１の架橋反応及び前記第２の架橋反応が、相互に両立する反応条件下で進行する、請求項１から３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記相互に両立する反応条件が、生理的条件である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
アルギン酸塩に由来するポリサッカライド、修飾又は未修飾のポリエチレングリコール及びトランスグルタミナーゼを含む組成物。
【請求項３４】
約０．３〜１．０％ｗ／ｖ、好ましくは、約０．５％ｗ／ｖの前記第１の材料を含む、請求項１から３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
約２．０〜３．５％ｗ／ｖ、好ましくは約２．５％ｗ／ｖの前記第２の材料を含む、請求項１から３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
請求項１から３５のいずれか一項に記載の組成物を含むバイオインク。
【請求項３７】
細胞、好ましくは、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞を更に含む、請求項３６に記載のバイオインク。
【請求項３８】
請求項１から３５のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項３６若しくは請求項３７に記載のバイオインクから形成されるハイドロゲル。
【請求項３９】
第１の架橋反応によって形成される架橋された第１の材料及び第２の架橋反応によって形成される第２の架橋された材料を含むハイドロゲルであって、前記第１の架橋反応及び前記第２の架橋反応が、共通の活性化剤によって誘導可能である、ハイドロゲル。
【請求項４０】
前記架橋された第１の材料が、ポリペプチド、ポリサッカライド又はポリヌクレオチドである、請求項３９に記載のハイドロゲル。
【請求項４１】
前記架橋された第１の材料が、ポリサッカライド、好ましくは、アルギン酸塩に由来するポリサッカライドである、請求項３９又は請求項４０に記載のハイドロゲル。
【請求項４２】
前記架橋された第２の材料が、生体適合性の合成又は半合成ポリマーを含む、請求項４１に記載のハイドロゲル。
【請求項４３】
前記第２の材料が、親水性ポリマーのコポリマー及びオリゴペプチドを含む、請求項３９から４２のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項４４】
前記オリゴペプチドが、前記第２の架橋反応のための基材であるか又は基材を提供する、請求項４３に記載のハイドロゲル。
【請求項４５】
前記オリゴペプチドが、少なくとも１つの更なる反応、例えば、酵素反応のための基材であるか又は基材を提供する、請求項４３又は請求項４４に記載のハイドロゲル。
【請求項４６】
前記第２の材料が、生物学的機能を有する更なる生体分子、好ましくは、シグナル伝達分子、例えば、細胞接着性ペプチド又は増殖因子を更に含む、請求項３９から４５のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項４７】
前記架橋された第２の材料が、修飾又は未修飾のポリエチレングリコール、例えば、分枝状の修飾又は未修飾のポリエチレングリコールを含む、請求項３９から４６のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項４８】
前記架橋された第１の材料が、前記架橋された第２の材料の存在下で、選択的に分解可能である、請求項３９から４７のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項４９】
前記架橋された第１の材料が、生体適合性のプロセス中で、選択的に分解可能である、請求項４８に記載のハイドロゲル。
【請求項５０】
前記架橋された第１の材料が、酵素を使用して、選択的に分解可能である、請求項４９に記載のハイドロゲル。
【請求項５１】
前記架橋された第２の材料が、細胞が制御する機構によって、選択的に分解可能である、請求項３８から５０のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項５２】
前記架橋された第２の材料が、酵素、好ましくは、細胞が分泌するプロテアーゼ、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼを使用して、選択的に分解可能である、請求項３８から５１のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項５３】
請求項１から３５のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項３６若しくは請求項３７に記載のバイオインクから形成される構造体。
【請求項５４】
請求項３８から５２のいずれか一項に記載のハイドロゲルを含む構造体。
【請求項５５】
生細胞、好ましくは、生真核細胞、例えば、生哺乳動物細胞を更に含む、請求項５３又は請求項５４に記載の構造体。
【請求項５６】
前記生細胞が、前記第１の組成物又は前記架橋された第１の組成物中に存在する、請求項５５に記載の構造体。
【請求項５７】
請求項５３から５６のいずれか一項に記載の構造体を作成する方法であって、請求項１から３５のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項３６若しくは請求項３７に記載のバイオインクを、基材上に堆積させる工程を含み、前記基材が、前記第１の組成物中で前記第１の架橋反応及び前記第２の組成物中で前記第２の架橋反応を誘導するための共通の活性化剤を提供する、方法。
【請求項５８】
構造体を作成する方法であって、
ｉ．基材上に、少なくとも１つ、好ましくは複数の犠牲層を形成する工程と、
ｉｉ．前記基材又は前記第１の犠牲層上に、少なくとも１つ、好ましくは複数の永久層を形成する工程と
を含み、
前記少なくとも１つの犠牲層が、第１の組成物に由来し、前記少なくとも１つの永久層が、少なくとも１つの第２の組成物に由来し、
前記少なくとも１つの犠牲層が、前記第１の組成物の第１の架橋反応によって形成され、前記少なくとも１つの永久層が、前記第２の組成物の第２の架橋反応によって形成され、
前記第１の架橋反応及び前記第２の架橋反応が、前記共通の活性化剤によって誘導される、
方法。
【請求項５９】
前記基材が、前記第１の組成物中で前記第１の架橋反応及び前記第２の組成物中で前記第２の架橋反応を誘導するための前記共通の活性化剤を提供する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記共通の活性化剤が、化学薬剤、好ましくは、有機化合物、金属塩若しくは金属イオン、酸又は塩基である、請求項５８又は請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記共通の活性化剤が、金属イオン、好ましくは、アルカリ金属イオン又はアルカリ土類金属イオンである、請求項５７から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記共通の活性化剤が、カルシウムイオン、好ましくはＣａ２＋である、請求項５７から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記少なくとも１つの犠牲層が、前記少なくとも１つの永久層を分解しない反応によって分解可能である、請求項５７から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
選択的に除去する工程、特に、前記少なくとも１つの犠牲層を分解して、少なくとも１つの中空空間を得る工程を更に含む、請求項５７から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記少なくとも１つの犠牲層の前記選択的除去が、生体適合性のプロセスである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
酵素、好ましくは、アルギン酸リアーゼが、前記少なくとも１つの犠牲層を選択的に除去するために使用される、請求項６４又は請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記第１の組成物が、生細胞、好ましくは、哺乳動物細胞を更に含む、請求項５７から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記少なくとも１つの犠牲層の、選択的除去、好ましくは、分解において、前記生細胞が、前記少なくとも１つの永久層の少なくとも１つの表面上に、好ましくは、不均一な分布で堆積される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記少なくとも１つの犠牲層又は前記少なくとも１つの永久層が、押出によって又は印刷によって堆積される、請求項５７から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記少なくとも１つの犠牲層又は前記少なくとも１つの永久層が、印刷、好ましくは、熱又は圧電インクジェット印刷によって堆積される、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記第２の組成物が、生細胞、好ましくは、哺乳動物細胞を更に含む、請求項５７から７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記少なくとも１つの中空空間が、灌流可能なチャネルの、ネットワーク、特に、マイクロ流体ネットワークを形成する、請求項６４から７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記少なくとも１つの犠牲層及び前記少なくとも１つの永久層の前記堆積が、互いに整列及び同期化された、複数の計量分配ユニットによってもたらされる、請求項５８から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
請求項５７から７３のいずれか一項に記載の方法によって作製される構造体。
【請求項７５】
請求項７２又は請求項７３に従属している場合、灌流可能なチャネルの前記ネットワークが、灌流チャンバーの入口及び出口と接続可能である入口及び出口チャネルを更に含む、請求項７４に記載の構造体。
【請求項７６】
好ましくは、請求項７３に記載の方法において、複数の計量分配ユニットを整列及び同期化する方法であって、多成分の試験パターンが、堆積され、評価される、方法。
【請求項７７】
前記多成分の試験パターンが、好ましくは、異なる計量分配ユニットを用いて単一ドットを堆積させることによって得られる整列した線を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
多成分の試験パターンが、特に、顕微鏡的に画像化され、整列化の品質が、画像解析技術、特に、線形補間法によって評価される、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
鋳型として、請求項５３から５６のいずれか一項、請求項７４又は請求項７５に記載の構造体を使用する、人工組織を提供する方法。
【請求項８０】
前記人工組織が、脳組織、皮膚組織、眼組織、筋組織、肺組織、心臓組織、静脈組織、動脈組織、リンパ組織、乳房組織、胸腺組織、胃組織、肝臓組織、膵臓組織、腸組織、腎臓組織、膀胱組織、軟骨組織、腱組織及び骨組織を含むリストから選択される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
請求項７９又は請求項８０に記載の方法によって作製される人工組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第１の材料及び第２の材料を含む組成物であって、前記第１の材料が、第１の架橋反応によって架橋可能であり、前記第２の材料が、第２の架橋反応によって架橋可能であり、前記第１の架橋反応及び前記第２の架橋反応が、共通の活性化剤によって誘導可能である、組成物に関する。本発明は、そのような組成物を含むバイオインク、そのような組成物から形成されるハイドロゲル、及びそのような組成物又はハイドロゲルから形成される構造体にも関する。本発明は、独立請求項に記載の、そのようなハイドロゲルを含む構造体を作成する方法、同方法によって作製された生細胞を含有する構造体、そのような方法によって作製された人工組織、並びに複数の計量分配ユニットを整列及び同期化する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオプリンティング手法は、組織に似た、生きている三次元構築物に、生体材料及び細胞をパターン形成するそれらの大きな可能性のために、注目されており、創薬及び再生医療における幅広い応用を見出すことができる。その高い解像度及び生体適合性のために、インクジェット印刷は、本文脈において、特に興味深い。ハイドロゲルは、インクジェット印刷の優先的な材料の種類として既に明らかにされているが、十分なハイドロゲルバイオインクは、未だ開発されていない。理想的なバイオインクは、液体状態における特徴的な物理化学的性質を有し、計量分配の際に固体のハイドロゲルに非常に素早く変換し、機能的組織に細胞発生を導くために必要な生理活性の特徴も持つ。
【０００３】
バイオプリンティングのためのバイオインクの設計は、複数の技術的及び生物学的な挑戦を必要とする。ハイドロゲルは、我々の組織内の天然の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と生物物理学的に類似しているので、それらは、三次元構造体を構築するための理想的なバイオインクの候補であると考えることができる。しかしながら、機能性ハイドロゲルバイオインクの設計は、印刷、及び組織の形成をもたらす細胞増殖プロセスの全体も考慮に入れなければならない。第一に、バイオインクは、最適な液滴の生成に向けた特定の流体力学の要件を満たさなければならない。更にまた、衝撃の際に適した三次元の液滴の充填も考慮に入れなければならない。本質的には、液体から固体への変換（即ち、バイオインクの架橋）は、三次元プロファイルを保持できるように、液滴が「凝固」するために十分に速くなければならない。そのような速い反応速度は、三次元の物体を構築する迅速なプロトタイプ製造モードを維持しながら、１つの層を前の層の上に印刷することも可能にする。これらの技術的なバイオインクの要件に加えて、それらの液体形状のバイオインクが完全に細胞適合性であること、及び生理的条件下で架橋反応が行われることが重要である。これにより、バイオインクに曝露した細胞に及ぼされるストレスの量が最小化される。三次元印刷の後、架橋されたハイドロゲルバイオインクの生理活性は重要な役割を果たす。三次元マトリックスは、細胞のための指令的な合図、例えば、組織特異的な接着性リガンド及び増殖因子を提供しなければならず、これは、細胞の自己組織を組織様構造体に誘導するのに役立つ。最後に、同じく重要なことは、ハイドロゲルバイオインクの分解性である。理想的には、細胞は、それらの人工的な微小環境を分解し、且つそれら自身でそれを置き換えることができなければならない。
【０００４】
組織は、細胞及び組織特異的な細胞外マトリックス内に包埋された種々の細胞のタイプを抱える多成分の存在物である。これらのマトリックスは、組織の機能にとって重要な、特徴的な三次元の組織学的構造を有する。更にまた、組織は、細胞が、それらの細胞外マトリックスを、移動、増殖、特殊化及び能動的に再構築することによって自己組織化する、動的な存在物である。
【０００５】
組織の一部の機能性の取得を可能にする程度に、体外で空間的及び時間的に組織の複雑性を再現することは、現代の組織工学における最も刺激的な挑戦の一つである。この複雑性をインビボで再現するには、２つの重要な側面を必要とする。第１に、生理学的な細胞外の環境を模倣することができる生体材料を製剤化し、それ自体が、組織中でのように、生理的な細胞の挙動及び細胞の細胞組織化を促進する。第２に、細胞の組織化及び形態形成は、インビトロの培養系において限界があるので、インビボ様の三次元的な方法で、組織の構築ブロックを配置する必要がありうる。
【０００６】
インクジェット印刷のプラットフォームは、堆積を支援するコンピューターを使用して、組織の三次元構造を再構築するための非常に効率的な手段である。液滴のオンデマンドシステムは、特に、三次元構造体を生成するために、連続した層に幅広い範囲の軟性の生体材料を堆積させる可能性を与える。
【０００７】
Ｐａｔａｋｙらは、三次元の組織様形状へのいわゆるハイドロゲルバイオインクの微小液滴の印刷を報告している（Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．、２０１２、２４、３９１〜３９６）。一般的に、微小液滴から層ごとに顕微鏡的な構造体を印刷するためには、計量分配された液滴は、ある程度、それらの三次元構造を保持しなければならない。この目的のために、彼らのシステムは、Ｃａ２＋のリザーバーとして働く含水ゼラチン基材から構成される印刷装置に依存し、そこから、Ｃａ２＋イオンが、印刷されたアルギン酸塩含有液滴に上向きに拡散して、迅速なゲル化を誘導した。この技術は、組織様構造体の迅速な形成を可能にするが、単一成分のバイオプリンティングに限定されていた。更にまた、空洞で通常見出される「突出した」構造モチーフの構築は、非常に限定されていた。
【０００８】
Ｋｏｌｅｓｋｙらは、脈管構造、複数のタイプの細胞及び細胞外マトリックスで満たされた、設計された組織様構築物を作製する方法を開示した（Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．、２０１４、２６、３１２４〜３１３０）。この目的のために、彼らは、独立して制御される４つのプリントヘッドを有する三次元バイオプリンターを構築した。中空の空洞を作成するために、特定の温度より低く冷却すると水溶性になる特殊な不堅牢インクが使用された。固体部分及び細胞外マトリックスを作成するために、光重合可能なゼラチンメタクリレートを、バルクのマトリックス及び細胞担体として使用した。この相補的な挙動を利用することによって、三次元の血管ネットワークを印刷した。内皮細胞を導入するために、血管壁を裏打ちし、流体の拡散に対する障壁を提供して、恒常性機能を同時に促進し、様々な組織に特異的な血管の微小環境を確立するのを助けながら、作製された二分枝の血管ネットワークにヒトの静脈内皮細胞の懸濁液を注入して、ほぼコンフルエントな層を得た。更にまた、複数のタイプの細胞を有する設計された組織様構築物が作製された。この手法は、バイオプリンティングに基づく血管形成された異種性の組織構築物の生成を可能にしたが、余分な工程で内皮細胞をシステムに導入しなければならないという欠点があった。更に、このシステムは、約１ｍｍの印刷された構造体中の管の直径による限定的な印刷解像度に苦しんだ。したがって、毛細血管等の生理学的に適切な微小血管は作製できなかった。
【０００９】
米国特許出願公開第２０１１／０２１２５０１号は、三次元の多層の組織様のハイドロゲル構造体、及びその作成方法を記載している。この方法はまた、架橋可能な材料の液滴のオンデマンド印刷に依存していた。幾つかの実施形態において、形成された三次元の多層ハイドロゲル構築物は、チャネルを更に含んでいた。これらのチャネルは、構築物中の細胞に栄養を与えるために、培養液、血漿、人工血液又は血液等の流体で灌流することができる。チャネル又は空隙の形成は、犠牲材料の除去にも依存していた。しかしながら、この方法は、ハイドロゲルの前駆材料の堆積と続く噴霧された架橋材料の応用に依存していた。このことは、この方法を、かなり信頼性の低い厄介なものにした。更に、このシステムは、かなり限定的な印刷解像度を提供した。したがって、例えば、体内の血管の最小システムである、生理学的に非常に適切な微小血管は、作製できなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１１／０２１２５０１号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．、２０１２、２４、３９１〜３９６
【非特許文献２】Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．、２０１４、２６、３１２４〜３１３０
【非特許文献３】Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２００７、８、３０００〜３００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の基本的な課題は、従来技術の欠点を克服することである。特に、本発明の基本的な課題は、バイオプリンティング等の応用に適切な改善された組成物を提供することである。本発明の基本的な課題は、任意選択で生細胞を含有する構造体を、特に、三次元バイオプリンティング技術によって、構築するための改善された方法を提供することでもある。本方法は、多成分について、異なる種類の細胞外マトリックス又は細胞のタイプの印刷を可能にしなければならない。様々な応用分野において有用で、高解像度の印刷を可能にしなければならない。本方法は、迅速でコスト効率が高くなければならず、複雑な組織様構造体の作成を可能にしなければならない。本文脈において、本発明の基本的な課題は、そのような方法で使用するためのハイブリッドのハイドロゲル組成物を提供することでもある。更にまた、本発明の基本的な課題は、複数の計量分配ユニットを整列及び同期化するための改善された方法を提供することである。更に、本発明の基本的な課題は、生細胞を含有する構造体であって、これらの構造体が改善された性質を有する、構造体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
これらの課題は、独立請求項に記載の、方法、構造体及び組成物によって解決される。
【００１４】
したがって、第一の態様から見ると、本発明は、第１の材料及び第２の材料を含む組成物であって、前記第１の材料が、第１の架橋反応によって架橋可能であり、前記第２の材料が、第２の架橋反応によって架橋可能であり、前記第１の架橋反応及び前記第２の架橋反応が、共通の活性化剤によって誘導可能である、組成物を提供する。
【００１５】
更なる態様から見ると、本発明は、上に記載の組成物を含むバイオインクを提供する。
【００１６】
更なる態様から見ると、本発明は、上に記載の組成物又は上に記載のバイオインクから形成されるハイドロゲルを提供する。
【００１７】
更なる態様から見ると、本発明は、第１の架橋反応によって形成される架橋された第１の材料及び第２の架橋反応によって形成される第２の架橋された材料を含むハイドロゲルであって、前記第１の架橋反応及び前記第２の架橋反応が、共通の活性化剤によって誘導可能である、ハイドロゲルを提供する。
【００１８】
更なる態様から見ると、本発明は、上に記載の組成物又は上に記載のバイオインクから形成される構造体を提供する。
【００１９】
更なる態様から見ると、本発明は、上に記載のハイドロゲルを含む構造体を提供する。
【００２０】
更なる態様から見ると、本発明は、上に記載の構造体を作成する方法であって、上に記載の組成物又は上に記載のバイオインクを、基材上に堆積させる工程を含み、前記基材が、前記第１の組成物中で前記第１の架橋反応及び前記第２の組成物中で前記第２の架橋反応を誘導するための共通の活性化剤を提供する、方法を提供する。
【００２１】
更なる態様から見ると、本発明は、構造体を作成する方法であって、
ｉ．基材上に、少なくとも１つ、好ましくは複数の犠牲層を形成する工程と、
ｉｉ．前記基材又は前記第１の犠牲層上に、少なくとも１つ、好ましくは複数の永久層を形成する工程と
を含み、
前記少なくとも１つの犠牲層が、第１の組成物に由来し、前記少なくとも１つの永久層が、少なくとも１つの第２の組成物に由来し、
前記少なくとも１つの犠牲層が、前記第１の組成物の第１の架橋反応によって形成され、前記少なくとも１つの永久層が、前記第２の組成物の第２の架橋反応によって形成され、
前記第１の架橋反応及び前記第２の架橋反応が、前記共通の活性化剤によって誘導される、
方法を提供する。
【００２２】
更なる態様から見ると、本発明は、上に記載の方法によって作製される構造体を提供する。
【００２３】
更なる態様から見ると、本発明は、複数の計量分配ユニットを整列及び同期化する方法であって、多成分の試験パターンが、堆積され、評価される、方法を提供する。
【００２４】
更なる態様から見ると、本発明は、鋳型として、上に記載の構造体を使用する、人工組織を提供する方法を提供する。
【００２５】
更なる態様から見ると、本発明は、上に記載の方法によって作製される人工組織を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１ａ】本発明による液滴ごとの堆積によって、生細胞を含有する構造体を構築する方法の略図である。
【図１ｂ】本発明による液滴ごとの堆積によって、生細胞を含有する構造体を構築する方法の略図である。
【図１ｃ】本発明による液滴ごとの堆積によって、生細胞を含有する構造体を構築する方法の略図である。
【図１ｄ】本発明による液滴ごとの堆積によって、生細胞を含有する構造体を構築する方法の略図である。
【図２】本発明による複数の計量分配ユニットを整列及び同期化する方法のフローチャートである。
【図３】本発明による整列及び同期化する方法における吐出較正プロセスを示す図である。
【図４】本発明による整列及び同期化する方法における整列パターン形成工程の略図である。
【図５】本発明による整列及び同期化する方法における線形補間工程の略図である。
【図６】本発明による整列及び同期化する方法における線形補間による多成分の試験パターンを示す図である。
【図７】本発明による方法によって適切な整列化を達成した際に印刷された試験パターンを示す図である。
【図８】本発明による灌流可能なチャネルのネットワークのための灌流チャンバーを示す図である。
【図９】本発明による灌流可能なチャネルのネットワークのための灌流チャンバーの灌流システムを示す図である。
【図１０】図９による灌流チャンバーの断面図である。
【図１１】図１０による断面の部分拡大図である。
【図１２】ハイブリッドのハイドロゲル混合物の形成の略図である。
【図１３】三次元の細胞応答を増強するためのゲルの性質の動的制御の略図である。
【図１４】ハイブリッドのハイドロゲル組成物のモジュール方式及びコンビナトリアル方式での調製の略図である。
【図１５ａ】液滴の堆積におけるアルギン酸塩−ＰＥＧ系のハイブリッドのハイドロゲルシステムの応用の略図である。
【図１５ｂ】液滴の堆積におけるアルギン酸塩−ＰＥＧ系のハイブリッドのハイドロゲルシステムの応用の略図である。
【図１５ｃ】液滴の堆積におけるアルギン酸塩−ＰＥＧ系のハイブリッドのハイドロゲルシステムの応用の略図である。
【図１５ｄ】液滴の堆積におけるアルギン酸塩−ＰＥＧ系のハイブリッドのハイドロゲルシステムの応用の略図である。
【図１５ｅ】液滴の堆積におけるアルギン酸塩−ＰＥＧ系のハイブリッドのハイドロゲルシステムの応用の略図である。
【図１６】本発明による灌流可能なチャネルのネットワークを示す図である。
【図１７】本発明による灌流可能なチャネルのネットワークにおける細胞増殖を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の組成物は、第１の材料及び第２の材料を含み、第１の材料が、第１の架橋反応によって架橋可能であり、第２の材料が、第２の架橋反応によって架橋可能であり、第１の架橋反応及び第２の架橋反応が、共通の活性化剤によって誘導可能である。
【００２８】
第１及び第２の架橋反応は、実質的に互いに互換可能である。本文脈において、「実質的に互いに互換可能」という語句は、２つ以上の反応、例えば、化学反応に関連し、これは、実質的に異なる生成物の分布をもたらすことなく、又は任意の他の実質的に有害な効果を互いに有することなく、同じ環境内で同時に進行することができる。
【００２９】
好ましくは、第１の材料は、ポリマーであり、より好ましくは、バイオポリマーである。本文脈において、バイオポリマーという用語は、ポリペプチド、ポリサッカライド又はポリヌクレオチドを指す。より好ましくは、第１の材料は、ポリサッカライドであり、更により好ましくは、アルギン酸塩に由来するポリサッカライドである。本文脈において、アルギン酸塩という用語は、海藻から抽出されうる天然のポリサッカライドを指す。これは、（１−４）結合したβ−Ｄ−マンヌロン酸塩（Ｍ残基）及びα−Ｌ−グルロン酸塩（Ｇ残基）のＣ−５エピマーの２つのモノマーの直線状の配列によって特徴付けられる。アルギン酸塩鎖は、規則的な形状によって特徴付けられ、負電荷の集積をもたらすＧモノマー（Ｇ−ブロック）のブロックからなる。
【００３０】
好ましい組成物において、第２の材料は、生体適合性の合成又は半合成ポリマーを含む。好ましくは、第２の材料は、親水性ポリマーを含む。好ましくは、第２の材料は、膨潤性ポリマーを含む。
【００３１】
好ましくは、第２の材料は、親水性ポリマーのコポリマー及びオリゴペプチドを含む。好ましくは、オリゴペプチドは、前記第２の架橋反応のための、基材であるか又は基材を提供する。好ましくは、オリゴペプチドはまた、少なくとも１つの更なる反応、例えば、酵素反応のための、基材であるか又は基材を提供する。
【００３２】
より好ましくは、第２の材料は、修飾又は未修飾のポリグリコールを含み、更により好ましくは、修飾又は未修飾のポリエチレングリコール、例えば、分枝状若しくは非分枝状の修飾又は未修飾のポリエチレングリコールを含む。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、酵素的に架橋するために修飾することができる、合成の高親水性ポリマーである。更に、所望により、組成物中でポリエチレングリコールを修飾することによって、組成物に様々な生理活性分子を繋ぎ止めることが可能である。したがって、好ましい組成物において、第２の材料は、生物学的機能を有する更なる生体分子、好ましくは、シグナル伝達分子、例えば、細胞接着性ペプチド又は増殖因子を更に含む。そのような生体分子の例としては、限定されないが、ＲＤＧ等の細胞接着性ペプチド、又はＶＥＧＦ等の増殖因子が挙げられる。
【００３３】
好ましい第２の材料の例は、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２００７、８、３０００〜３００７に記載されている。
【００３４】
好ましい組成物において、第１の材料は、第１の架橋反応によって架橋される場合、分解可能であり、第２の材料は、第２の架橋反応によって架橋される場合、分解可能ではない。言い換えれば、架橋される場合、第１の材料は、第２の材料の存在下で、架橋される場合、この第２の材料の分解を伴わず、又は実質的に伴わず、分解されてよい。
【００３５】
好ましい組成物において、共通の活性化剤は、化学薬剤若しくは生物学的薬剤、又は物理的刺激である。本文脈において、「活性化剤」という用語は、反応開始を引き起こすことができる、任意の化学種若しくは生物種、又は物理的刺激を指す。化学的活性化剤は、触媒、酸、塩基、又は金属塩若しくは金属イオンであってよい。化学的活性化剤はまた、酵素補因子であってよい。生物学的活性化剤は、酵素であってよい。物理的活性化剤は、熱又はＵＶ照射であってよい。
【００３６】
好ましくは、共通の活性化剤は、化学薬剤、例えば、有機化合物、金属塩若しくは金属イオン、酸又は塩基である。より好ましくは、共通の活性化剤は、金属イオンであり、好ましくは、アルカリ金属イオン又はアルカリ土類金属イオンである。更により好ましくは、共通の活性化剤は、カルシウムイオン、例えば、Ｃａ２＋である。
【００３７】
Ｃａ２＋をアルギン酸塩溶液に添加すると、２つの異なるＧ−ブロックと迅速に相互作用して、最終的にハイドロゲルの形成をもたらす、架橋の生成をもたらす。
【００３８】
ポリエチレングリコールは、例えば、フィブリノゲンをフィブリンゲルに架橋する血液凝固のカスケードにおいて作用する重要な酵素である、ＦＸＩＩＩａ等のトランスグルタミナーゼによって、酵素的に架橋することができる。トランスグルタミナーゼは、Ｃａ２＋の存在中でのみ活性である。この補因子が存在しない場合、酵素は、反応を行うことができない。そのため、カルシウムが媒介するトランスグルタミナーゼの作用は、ポリマーのハイドロゲルネットワークへの架橋をもたらす。
【００３９】
好ましい組成物において、第１の架橋反応及び第２の架橋反応は、同じ反応であってよく、又は異なる反応である。好ましくは、第１の架橋反応及び第２の架橋反応は、異なる反応である。幾つかの好ましい組成物において、第１の架橋反応及び第２の架橋反応は、互いに独立して行われる。
【００４０】
好ましい組成物において、第１の架橋反応は相対的に速く、好ましくは、約０．１〜１０秒の程度、例えば、約１秒であり、第２の架橋反応は相対的に遅く、好ましくは、約１０〜６０分の程度、例えば、約１５〜３０分である。
【００４１】
好ましい組成物は、緩衝剤、好ましくは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤を更に含む。組成物は、好ましくは、界面活性剤、好ましくは、非イオン性プロピレングリコール由来の界面活性剤を含んでいてよい。好ましい界面活性剤は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃの商品名で入手可能である。
【００４２】
更に好ましい組成物は、酵素、好ましくは、架橋酵素を含む。上記のように、組成物中に存在する好ましい酵素は、トランスグルタミナーゼ、例えば、ＦＸＩＩＩａである。ＦＸＩＩＩａは、ポリエチレングリコールを酵素的に架橋することができる。トランスグルタミナーゼは、Ｃａ２＋の存在下でのみ活性である。この活性化剤が存在しない場合、酵素は、反応を行うことができない。そのため、カルシウムが媒介するトランスグルタミナーゼの作用は、ポリマー、例えば、ポリエチレングリコールの架橋をもたらす。
【００４３】
上記の組成物（例えば、アルギン酸塩及びＰＥＧを含む）は、液体状態で、長期間保存できることが望ましい。これは、妥当な有効期間を有する組成物を提供することによって、溶液の保管を可能にする。これは、結果として、記載の組成物が、液滴ごとの堆積装置（三次元プリンター）で用いることができることを意味する。しかしながら、前記の組成物において、カルシウムの残量は、調製の際、数分以内に架橋をもたらしうる。これは、計量分配ユニット内で架橋をもたらしうるので、目詰まりの原因となり、適切な堆積をしないようにする。この場合、そのように有害なカルシウムの主要な供給源は、ＦＸＩＩＩａの保存溶液である。フィブロガミン（ＦＸＩＩＩａの不活性型）の活性化の間、カルシウムは、フィブロガミンを活性化する酵素である、トロンビンを希釈するために使用される緩衝剤溶液中に存在する。トロンビン溶液は、２２．５ミリモル／リットルのカルシウムを含有し、これは、後に、フィブロガミン溶液に添加されると、１０倍に希釈される。これにより、２．２５ミリモル／リットルの最終カルシウム濃度がもたらされる。
【００４４】
したがって、好ましい組成物において、キレート剤が存在する。好ましくは、キレート剤は、生体適合性のキレート剤、特に、エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）又はクエン酸である。適切な濃度で添加されたキレート剤は、カルシウムイオンを捕捉し、外因性のカルシウム源に曝露されるまで、架橋反応は抑制される。このようなカルシウム源は、カルシウム溶液、又はカルシウム放出性の固体基材であってよい。好ましくは、キレート剤の濃度は、組成物の架橋の動態に影響を与えない。即ち、正に帯電したイオンが提供されると、第１の架橋反応及び第２の架橋反応は、更なる遅延なしに行われる。更にまた、キレート剤は、好ましくは、細胞が組成物中に分散された場合、細胞の生存率に影響を与えない。
【００４５】
好ましくは、第１の架橋反応及び第２の架橋反応は、相互に両立する反応条件下、例えば、生理的条件下で進行する。言い換えると、第１の架橋反応を誘導するのに必要な反応条件は、第２の架橋反応を誘導するのに必要な反応条件と、類似しているか、又は少なくとも両立する。
【００４６】
好ましい組成物は、アルギン酸塩に由来するポリサッカライド、修飾又は未修飾のポリエチレングリコール及びトランスグルタミナーゼを含む。好ましくは、第１の材料、例えば、アルギン酸塩は、組成物中に、約０．３〜１．０％ｗ／ｖ、より好ましくは約０．５％ｗ／ｖで存在する。好ましくは、第２の材料、例えば、ポリエチレングリコールは、組成物中に、約２．０〜３．５％ｗ／ｖ、より好ましくは約２．５％ｗ／ｖで存在する。
【００４７】
本発明の組成物は、バイオプリンティングの応用において、バイオインクとして使用することができる。したがって、本発明の別の態様は、上に記載の組成物を含むバイオインクである。好ましくは、バイオインクは、細胞、好ましくは、哺乳動物細胞を更に含む。
【００４８】
一般的に、上記の第１及び第２の材料の架橋は、共通の活性化剤、例えば、カルシウムイオンへの曝露によって、２つの方法：１）カルシウム含有緩衝剤を前駆体混合物に添加する、又は２）カルシウムを、イオンを貯えた固体基材からの拡散によって前駆体溶液に送達する、で引き起こされてよい。このようにして、ハイブリッドのハイドロゲルの三次元構造体を、相加的な方法で、基材から作製することができる。更なる生物学的な活性成分、例えば、生細胞又は細胞外マトリックス成分を、混合物に添加することができる。所望により、これらの追加成分を、共有結合性又は親和性の結合の相互作用のいずれかによって、形成されるハイドロゲルマトリックスに繋ぎ止めることができる。
【００４９】
したがって、本発明の更なる態様は、上に記載の組成物又は上に記載のバイオインクから形成されるハイドロゲルである。
【００５０】
本発明の更なる態様は、第１の架橋反応によって形成される架橋された第１の材料及び第２の架橋反応によって形成される第２の架橋された材料を含むハイドロゲルであって、第１の架橋反応及び第２の架橋反応が、共通の活性化剤によって誘導可能である、ハイドロゲルである。
【００５１】
好ましくは、ハイドロゲルにおいて、架橋された第１の材料は、ポリペプチド、ポリサッカライド又はポリヌクレオチドであり、より好ましくは、ポリサッカライド、例えば、アルギン酸塩に由来するポリサッカライドである。
【００５２】
好ましくは、架橋された第２の材料は、生体適合性の合成又は半合成ポリマーを含み、好ましくは、修飾又は未修飾のポリエチレングリコールを含む。好ましくは、第２の材料は、親水性ポリマーのコポリマー及びオリゴペプチドを含み、好ましくは、第２の架橋反応のための、基材であるか又は基材を提供するオリゴペプチドを含む。
【００５３】
好ましいハイドロゲルにおいて、第２の材料は、親水性ポリマーのコポリマー及びオリゴペプチドを含み、オリゴペプチドは、少なくとも１つの更なる反応、例えば、酵素反応のための、基材であるか又は基材を提供する。幾つかの好ましいハイドロゲルにおいて、第２の材料は、生物学的機能を有する更なる生体分子、好ましくは、シグナル伝達分子、例えば、細胞接着性ペプチド又は増殖因子を更に含む。
【００５４】
上述のハイドロゲルにおいて、第１の架橋された材料は、アルギン酸塩に由来していてよい。更にまた、第２の架橋された材料は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のコポリマー及びオリゴペプチドであってよく、第２の架橋反応は、好ましくは、架橋酵素によって、特に、トランスグルタミナーゼによって媒介されてよい。これらの２つの独立したハイドロゲルシステムは、架橋を可能にするカルシウム（Ｃａ２＋）を共通の存在物として共有する。共通の活性化剤は、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）であってよい。
【００５５】
好ましいハイドロゲルにおいて、架橋された第２の材料は、細胞が制御する機構によって選択的に分解可能である。本文脈において、細胞が制御する機構は、ハイドロゲル内で細胞の制御下にあるプロセスを指し、例えば、天然の細胞外マトリックスの分解中に生じる、及びインビボで、ＥＣＭ内で細胞によって再構築する等である。好ましくは、この細胞が制御する機構は、架橋された第２の材料の酵素的な分解であり、即ち、架橋された第２の材料は、酵素、好ましくは、細胞が分泌するプロテアーゼ、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼを使用して、選択的に分解可能である。この方法において、架橋された第２の材料は、組織の細胞外マトリックスに類似した、細胞がハイドロゲルを再構築し、組織に発達しうるような方法で、細胞によって分解されてよい。
【００５６】
上述の種類のハイブリッドのハイドロゲルネットワークは、様々な細胞のタイプ、特に、哺乳動物細胞のタイプの挙動を動的に制御することが可能な、適合可能なマトリックス組成物を構成する。ハイブリッドのハイドロゲルネットワークは、複数の細胞特異的な微小環境を作成するために、相乗的に相互作用することが可能である。
【００５７】
そのようなハイブリッドのハイドロゲルは、生物活性部分の付加及び／又は物理的ハイドロゲル特性の改変によって、生理学的な細胞の環境を模倣するために、ネットワーク組成物を適応させる。特に、ハイブリッドのハイドロゲルネットワークの性質の適応は、システムのコンビナトリアルな性質によって達成することができ、これにより、ポリマーネットワークと更なる成分の両方の、固体の内容物及び構造物を、独立して変更することができる、そのようなハイブリッドのハイドロゲルネットワークは、ハイブリッドの生体材料の機械的性質の動的制御のための、高モジュール方式の２工程の分解プロセスを可能にする。更にまた、ハイブリッドのハイドロゲルネットワークは、ゲルの欠損の生成を経て、宿主細胞に、より許容される微小環境を提供するために、ポリマーネットワークの１つを選択的に除去することにより、細胞環境の動的制御を可能にする。上述の種類のハイブリッドのハイドロゲルネットワークは、細胞生物学、発生生物学、幹細胞バイオテクノロジー、創薬、疾患モデル、医薬品開発、組織工学及び再生医療における多用途の応用を有する。そのため、ハイブリッドのハイドロゲルは、生物学的に関連する応用に対して、付加的な製造の応用において活用することができる。
【００５８】
したがって、好ましい実施形態において、ハイドロゲルの架橋された第１の材料は、前記架橋された第２の材料の存在下で、選択的に除去可能、例えば分解可能である。好ましくは、架橋された第１の材料は、生体適合性のプロセス中で、例えば、アルギン酸リアーゼ等の酵素を使用して、選択的に分解可能である。本文脈において、生体適合性のプロセスという用語は、プロセスの間、及び／又はプロセスが行われた後のいずれかで、ハイドロゲル中に配置された細胞の生存及び維持を可能にするプロセスを指す。例えば、アルギン酸リアーゼを使用する酵素的なプロセスによる第１の材料の分解は、細胞がそのような分解後にハイドロゲル中で維持されうるので、生体適合性である。本文脈において、架橋された第１の材料の選択的除去とは、架橋された第１の材料が、架橋された第２の材料に実質的に影響を及ぼすことなく、構造体から除去されることを意味する。選択的除去は、様々な外因性の処理、例えば、適切な溶媒への溶解、又は化学的若しくは生物学的分解によって達成することができる。好ましくは、選択的除去は、生体適合性のプロセスである。好ましい実施形態において、酵素、より好ましくは、リアーゼが、架橋された第１の材料の選択的除去のために使用される。特に好ましくは、アルギン酸リアーゼが、架橋された第２の材料の選択的除去のために使用される。
【００５９】
本発明の更なる態様は、上で定義した組成物又は上で定義したバイオインクから形成される構造体である。
【００６０】
本発明の別の態様は、上に記載のハイドロゲルを含む構造体である。好ましくは、構造体は、生細胞、好ましくは、生哺乳動物細胞を更に含む。好ましくは、生細胞は、第１の組成物、又は架橋された第１の組成物中に存在する。
【００６１】
本発明の更なる態様は、上に記載の構造体を作成する方法であって、上に記載の組成物又は上に記載のバイオインクを、基材上に堆積させる工程を含み、基材が、第１の組成物中で第１の架橋反応及び第２の組成物中で第２の架橋反応を誘導するための共通の活性化剤を提供する、方法である。好ましくは、共通の活性化剤は、上に記載のものであり、例えば、最も好ましくは、カルシウム（Ｃａ２＋）イオンである。
【００６２】
本発明のより更なる態様は、構造体を作成する方法であって、
ｉ．基材上に、少なくとも１つ、好ましくは複数の犠牲層を形成する工程と、
ｉｉ．前記基材又は前記第１の犠牲層上に、少なくとも１つ、好ましくは複数の永久層を形成する工程と
を含み、
少なくとも１つの犠牲層が、第１の組成物に由来し、少なくとも１つの永久層が、少なくとも１つの第２の組成物に由来し、
少なくとも１つの犠牲層が、第１の組成物の第１の架橋反応によって形成され、少なくとも１つの永久層が、第２の組成物の第２の架橋反応によって形成され、
第１の架橋反応及び第２の架橋反応が、共通の活性化剤によって、誘導される、
方法である。好ましくは、共通の活性化剤は、上に記載のものであり、例えば、最も好ましくは、カルシウム（Ｃａ２＋）イオンである。
【００６３】
好ましくは、第１の犠牲層は、基材上に、直接的に堆積される。本文脈において、基材層上の層の直接的な堆積とは、他の層が基材層上に予め堆積されておらず、直接的に堆積された層が基材層と直接接触していることを意味する。一方、基材層上の層の間接的な堆積とは、少なくとも１つの他の層が基材層上に予め堆積されており、間接的に堆積された層が基材層と直接接触していないことを意味する。
【００６４】
好ましい方法において、基材は、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）の供給源であり、犠牲層は、アルギン酸塩を含有する第１の組成物に由来することができる。一例として、基材は、高濃度のカルシウム塩、特に、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を含有するゼラチンプレートであってよい。そのような基材と共に、巨視的な構造体は、アルギン酸塩を含有する組成物の堆積によって、微小液滴から層ごとの様式で印刷することができる。含水ゼラチン基材は、カルシウムイオンのリザーバーとして働き、そこからカルシウム（Ｃａ２＋）は、印刷された液滴に上向きに拡散して、ゲル化を誘導する。
【００６５】
好ましい方法において、少なくとも１つの犠牲層は、少なくとも１つの永久層を分解しない反応によって分解可能である。
【００６６】
好ましくは、本方法は、少なくとも１つの犠牲層を、選択的に除去、特に、分解して、少なくとも１つの中空空間を得る工程を更に含む。
【００６７】
好ましくは、少なくとも１つの犠牲層の、選択的除去、例えば、分解は、生体適合性のプロセス中で、引き起こすことができる。好ましくは、選択的除去は、酵素的に、即ち、酵素を使用して行われる。特に、少なくとも１つの犠牲層の、選択的除去、例えば、分解は、アルギン酸リアーゼによって引き起こすことができる。酵素的な分解は、通常、非常に高い選択性を示し、これによって、永久層の損傷を最小限にして、犠牲層を効果的に除去することを可能にする。
【００６８】
好ましい方法において、第１の組成物は、生細胞を含む。好ましくは、生細胞は、真核細胞であり、好ましくは、哺乳動物細胞である。しかしながら、本方法は、この種類の細胞に限定されず、多細胞の生物体に属する任意の他の種類の細胞をこの方法に用いることができる。好ましくは、犠牲層の、除去、例えば、分解の際に、生細胞は、遊離し、好ましくは、不均一な分布で、永久層の内部又は外部の表面に接着する。
【００６９】
この方法を使用することによって、脈管構造に相当する中空空間を含む三次元組織様構造体を、効果的に作成することができる。注目すべきことに、永久層に接着する、細胞、特に、内皮細胞を導入するために、余分な工程は必要としない。更にまた、犠牲層の除去の際に、遊離細胞は、制御された沈降を受けてよく、不均一な細胞の分布は中空空間が達成されうる。
【００７０】
好ましい方法において、少なくとも１つの犠牲層及び永久層は、押出によって又は印刷によって堆積される。好ましくは、少なくとも１つの犠牲層及び永久層は、印刷、特に、液滴ごとの堆積によって、好ましくは、熱又は圧電インクジェット技術によって堆積される。液滴ごとの堆積は、他の三次元バイオプリンティング方法よりも、高効率及び数倍高い解像度で、複雑な三次元組織様構造を作成するための非常に効率的な手段を提供する。
【００７１】
更にまた、生細胞は、第２の組成物の一部を、追加的に形成することができる。そのような応用において、所望のタイプの細胞を、例えば、脈管構造様の空洞を覆う内皮細胞と一緒に、バルクの細胞外マトリックスに導入することができる。このようにして、組織様の灌流可能な構造体を作成することができる。
【００７２】
犠牲層及び永久層の堆積は、互いに整列及び同期化された複数の計量分配ユニットによって、影響がもたらされうる。複数の計量分配ユニットの存在は、多成分の堆積のために必要である。堆積プロセスにおいて高解像度を達成するためには、計量分配ユニットを互いに整列及び同期化することが必要である。
【００７３】
好ましい方法において、少なくとも１つの中空空間は、灌流可能なチャネルの、ネットワーク、特に、マイクロ流体ネットワークを形成することができる。本文脈において、「マイクロ流体ネットワーク」という用語は、１ｍｍ未満の直径を有するチャネルのネットワークを指す。そのような灌流可能なネットワーク、特に、マイクロ流体ネットワークは、設計された組織の生体機能の付与、サポート又は維持において重要な役割を果たす。灌流する微小血管系に近接せずに、必須の栄養分、増殖因子及びシグナル因子、並びに廃棄物の運搬を提供することにより、バルクの組織構築物内のほとんどの細胞は、通常、生き残ることができない。
【００７４】
本発明の更なる態様は、上に記載の方法によって作製される構造体である。
【００７５】
好ましい構造体は、上に記載の方法によって作製される、灌流可能なチャネルのネットワーク、好ましくは、マイクロ流体ネットワークを含有するものである。
【００７６】
更にまた、そのような好ましい構造体における灌流可能なチャネルのネットワークは、灌流チャンバーの入口及び出口と接続可能である入口及び出口チャネルを含むことができる。そのような灌流チャンバーにおいて、入口及び出口は、ネットワークを横切る対流を維持するために、ポンプ装置、例えば、蠕動ポンプ又はシリンジに接続することができる。
【００７７】
一実施形態において、生細胞を含有するそのような構造体は、生細胞が、不均一な分布でチャネル壁に接着される、上側及び底側を有するネットワークであってよい。ネットワークは、細胞密度が、上側に面するチャネル壁の部分よりも、底側に面するチャネル壁の部分において、より高いことを特徴とする。
【００７８】
本発明の更なる態様は、好ましくは、上に記載の方法における複数の計量分配ユニットを整列及び同期化する方法に関する。そのような整列及び同期化する方法において、多成分の試験パターンが、堆積され、評価される。更により好ましい実施形態において、多成分の試験パターンは、異なる計量分配ユニットを用いて単一ドットを堆積させることによって好ましく得られる、整列した線を含む。更にまた、多成分の試験パターンは、特に、顕微鏡的に、画像化することができる。整列化の品質は、画像解析技術、特に、線形補間法によって評価することができる。これにより、予め設定された判断基準：
・補間（Ｒ２）の必要な品質は０．９９９超であってよい
・必要な傾きの変動は０．２５°未満であってよい
・トレンドラインの必要なパターン誘導は１０μｍより短くてよい
に従って、計量分配ユニットの非常に正確な整列化を可能にする。
【００７９】
更にまた、吐出速度及び液滴の直径は、印刷パラメーターの調整によって調節することができる。犠牲層及び永久層が熱又は圧電インクジェット技術によって堆積される場合、調整されるパラメーターは、電圧、パルス長及び周波数を含むリストから選択することができる。
【００８０】
本発明の更なる態様は、鋳型として、上に記載の構造体を使用する、人工組織を提供する方法である。したがって、本発明による生細胞を含有する構造体は、人工組織を提供するために使用することができる。好ましい方法において、人工組織は、脳組織、皮膚組織、眼組織、筋組織、肺組織、心臓組織、静脈組織、動脈組織、リンパ組織、乳房組織、胸腺組織、胃組織、肝臓組織、膵臓組織、腸組織、腎臓組織、膀胱組織、軟骨組織、腱組織、骨組織を含むリストから選択することができる。
【００８１】
本発明の更なる態様は、上に記載の方法によって作製される人工組織である。好ましい人工組織は、脳組織、皮膚組織、眼組織、筋組織、肺組織、心臓組織、静脈組織、動脈組織、リンパ組織、乳房組織、胸腺組織、胃組織、肝臓組織、膵臓組織、腸組織、腎臓組織、膀胱組織、軟骨組織、腱組織、骨組織を含むリストから選択することができる。
【００８２】
本発明の更なる利点及び特徴を、以下の幾つかの実施形態の説明及び図面から明らかにする。
【００８３】
本発明の詳細な説明
図１ａ〜図１ｄは、本発明による液滴ごとの堆積によって、生細胞を含有する構造体を構築する方法の略図を示す。この方法を行う装置１は、第１の組成物を計量分配するための第１の計量分配ユニット２、及び第２の組成物を計量分配するための第２の計量分配ユニット３を含む。図１ａにおいて、第１の永久層５は、液滴６の形状で第２の組成物を計量分配することによって、基材層４上に計量分配される。図１ｂは、後の段階での同じ堆積プロセスを示す。永久層５に加えて、犠牲層８は、液滴７の形状で第１の計量分配ユニット２から計量分配されている。図１ｃにおいて、計量分配プロセスは、永久層５によって全体が覆われた犠牲層８によって完了する。図１ｄは、完成した生細胞を含有する構造体を示す。犠牲層８が除去されて中空空間９が提供されていることが分かる。この分解プロセスの過程において、生細胞１０は、不均一な細胞分布を提供するために、遊離し、中空空間９の底面に沈降している。
【００８４】
図２は、本発明による複数の計量分配ユニットを整列及び同期化する方法のフローチャートを示す。本方法は、計量分配装置の吐出較正から開始する。この工程において、計量分配ユニットを整列させ、所望の液滴容積が正しい位置に計量分配されるように、計量分配パラメーターを調整する。続く整列パターン形成工程において、複数成分の試験パターンを堆積させる。次いで、この試験パターンを線形補間工程に供し、ここでパターンが評価される。この評価の判断基準は、補間の品質（Ｒ２）、傾きの変動、又はトレンドラインからのパターン誘導であってよい。これらのパラメーターの終了後、パターン形成を開始するために、予め設定した要件が満たされていれば、決定する。満たされていない場合、吐出較正工程で、手順を再度開始しなければならない。補間パラメーターの要件は、例えば、０．９９９の補間（Ｒ２）品質、０．２５°未満の傾きの変動、又は１０μｍより短いパターン誘導であってよい。
【００８５】
図３は、図２の吐出較正工程の段階を説明する。特殊なカメラによる計量分配ユニット２及び３（この場合、インクジェット計量分配装置）の位置の記録並びにそれらの相対位置の計算後、それらの操作パラメーターは、等しい直径の液滴６及び７が同一の吐出速度で達成されるように、調整される。
【００８６】
図４は、スキーム２による整列パターン形成工程の模式的な例を示す。この工程において、複数成分の試験パターンは、計量分配ユニット２及び３の両方によって、基材層４上に堆積される。例に示すように、試験パターンは、異なる計量分配ユニットを用いて単一ドットを堆積させることによって得られる整列した線を含む。堆積後、整列パターンは画像化され、得られた画像は画像処理技術によって処理される。
【００８７】
図５は、スキーム２による線形補間の模式的な例を示す。幾つかの線１２が整列パターンを介して引かれていることが分かる。
【００８８】
図６は、画像化された整列パターンの処理を示す。パターンの単一ドット１１の位置は、画像処理技術によって決定され、ドットパターン上に、補間線１２が引かれている。
【００８９】
図７は、記載の方法によって整列及び同期化された複数の堆積ユニットを使用して、２つの異なる成分の堆積によって作製された試験パターンを示す。
【００９０】
図８は、本発明による生細胞を含有する構造体１５のための灌流チャンバー１３を示す。構造体１５は、灌流システム１４中に保持される。この灌流システム１４は、カバー１７を有するフレーム１６中に存在する。
【００９１】
図９は、図８の灌流システム１４の詳細な表示を示す。灌流システム１４は、灌流システムを外部装置に接続するために、それぞれ、入口又は出口として機能しうる幾つかの出入口１８を含むことが分かる。例えば、そのような外部装置は、一定の灌流の流量を確立するための、蠕動ポンプ又はシリンジであってよい。
【００９２】
図１０は、灌流システム１４の断面を示す。灌流システム１４は、底板１９及び上板２０を含み、その間に構造体１５が配置されていることが分かる。
【００９３】
図１１は、図１０において丸で囲まれた部分の断面の拡大を提示する。上板の出入口１８は、チャネル２１及び２２を介して構造体１５に接続されていることが分かる。
【００９４】
図１２は、ハイブリッドのハイドロゲルネットワーク２７の調製の概略図を提示する。ネットワーク２７は、独立して硬化可能な２つのハイドロゲルネットワーク、即ち、主要マトリックス２３及びモジュレーターマトリックス２４から構成される。示したハイブリッドのハイドロゲルシステムは、主要マトリックス２３のみが、ハイブリッドのゲルを、特定の細胞のタイプに対して特異的な機能性にするか又は特定の細胞機能を制御するように、更なる因子２５、特に、細胞外マトリックス成分又は増殖因子等の生物学的活性部分と付着するために利用されるような方法で設計される。モジュレーターマトリックス２４、この場合、アルギン酸塩は、このハイドロゲルシステムにおいて一時的な機械的機能性のみを有する。そのため、架橋剤２６によって前駆体２９及び３０の架橋が完了した後、モジュレーターマトリックス２４は、より許容されるマトリックスを生成させるために、分解によって選択的に除去することができる。主要マトリックスの前駆体２９及びモジュレーターマトリックスの前駆体３０は、特異的なハイドロゲルの特徴及び生物学的機能を標的にするために、異なる比率で混合することができる。増殖因子又はペプチド接着性リガンド若しくは領域等の更なる生物学的活性因子２５は、特異的な細胞タイプ及び細胞機能に対して微小環境を適応させるために、予備硬化混合物に添加することができる。カルシウムを混合物に添加する場合、これが両方のネットワークの架橋を引き起こす。本システムにおいて、アルギン酸塩の架橋は、ミリ秒から秒の時間枠で起こり、後のポリエチレングリコールの架橋に先行し、これは数分以内に進行する。
【００９５】
モジュレーターマトリックス２４の選択的分解の概念を、図１３において、概説する。モジュレーターマトリックス２４の選択的分解は、主要マトリックス２３の生理学的機能性を増強するので、カプセル化細胞３１のより良好な生物学的な性能を促進する。具体的には、三次元細胞の移動、増殖、自己再生及び分化を促進するために、モジュレーターマトリックス２４を使用して、ハイブリッドのマトリックス２７中で欠損を生成することができる。更に、ハイブリッド鎖は、１つのモジュレーターネットワークだけを標的にすることによって、劇的に修飾することができる。
【００９６】
具体的には、アルギン酸塩は、酵素的な分解戦略を使用して、好ましくは、アルギン酸リアーゼを介して、選択的に切断することができる。これにより、主要マトリックス２３の重要な生化学的性質に影響を与えることなく、ハイブリッドのマトリックス２７の全体の硬化度を改変することを可能にする。この戦略は、所望の時点でのハイブリッドのマトリックス２７内の細胞の挙動を制御するために重要である。実際に、アルギン酸塩の除去は、主要マトリックス２３の全体的な軟化、及びハイドロゲルマトリックス内に欠損の導入をもたらす。そのような微小環境の変化は、細胞増殖及び三次元の移動の大幅な改善をもたらす。更なる有利な効果として、アルギン酸塩の分解は、細胞が、生理活性ネットワーク（主要マトリックス２３）とより多く相互作用することを可能にし、これは、より顕著な生物学的効果をもたらす。
【００９７】
図１４に概説するように、ハイブリッドのハイドロゲルシステム２７への主要マトリックス２３とモジュレーターマトリックス２４の融合は、人体における細胞の微小環境の動的機械的性質及び生化学的性質を再現する、細胞の微小環境の形成を可能にしうる。一方、多数の生物学的活性分子２８を、天然の細胞の微小環境を模倣するために、ポリ（エチレングリコール）系ネットワークに組み込むことができる。他方で、ハイブリッドのゲルの機械的性質は、天然由来のアルギン酸塩及び合成ポリマー両方の、ポリマー濃度、分子量及び機能性を改変することによって、調整することができる。２つの成分は、目的の細胞の微小環境の硬化度を正確且つ動的に標的にするために、独立して修飾することができる。この戦略は、主要マトリックス２３、モジュレーターマトリックス２４及び更なる因子が、互いに独立して調整され、組合せであることができる材料をもたらす。特異的な細胞期間の生物学的な要件をより良く適合させるために、それはカプセル化される。
【００９８】
図１５ａ〜図１５ｅは、液滴の堆積におけるアルギン酸塩−ＰＥＧ系のハイブリッドのハイドロゲルシステムの応用の略図を提示する。図１５ａにおいて、上記の前駆体混合物を含む液滴３２は、計量分配ユニット２によって、基材層４上に堆積される。この場合、液滴は、０．５％のアルギン酸塩及び３％のＴＧ−ＰＥＧを含有する。図１５ｂは、堆積後の第１の段階を、計量分配された液滴３４と基材層４の間の接触部分の部分拡大によって表す。Ｃａ２＋イオン３３が、基材層４から計量分配された液滴３４に拡散して、ゲル化を誘導することが分かる。Ｃａ２＋に曝露されると、ハイドロゲルネットワークのアルギン酸塩部分の迅速な架橋が行われる。図１５ｃにおいて、アルギン酸塩についての架橋は、実質的に完了しているが、ＰＥＧの架橋はまだ完了していない。図１５ｄにおいて、ＰＥＧの架橋反応も、実質的に完全な変換を達成し、ハイブリッドのハイドロゲルネットワークが完全に確立される。図１５ｅは、アルギン酸塩マトリックスの除去後のＰＥＧ系ハイドロゲル液滴を示す。
【００９９】
図１６は、印刷されたマイクロ流体ネットワークの縦断面を表す。共焦点顕微鏡は、印刷されたネットワーク全体にわたって適切な結合性の保証を可能にした。永久インクは緑色で示される一方、犠牲層は、構造体から以前に除去されていた。スケールバーは１ｍｍである。
【０１００】
図１７は、記載のバイオプリンティング方法の全体の例を表す。ハイブリッドのハイドロゲルは、永久マトリックスとして使用された。細胞を、犠牲材料、特にアルギン酸塩中に分散させた。培養の最初の５日間で、我々は細胞塊の有意な増加を観察し、実際に、細胞は、犠牲材料の除去から残った空の空間を完全に覆った。右側のグラフは、印刷及び犠牲材料の除去において、培養の最初の週の間の細胞増殖の評価を表す。
【実施例】
【０１０１】
材料
・全ての試薬は、特に断りのない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＡＧ社（ブーフス、スイス）から購入した。
・Ａｕｔｏｄｒｏｐ  ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｍｉｃｒｏｄｒｏｐ  ＧｍｂＨ社、ノルダーシュテット、ドイツ）を、ロボットディスペンサーとして使用した。それは、７０μｍに等しい出口の直径によって特徴付けられるＭＤ−Ｋ−１３０ノズルを備えていた。
・データ解析は、エクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社、レドモンド、米国）、又は画像解析にも使用したＭａｔｌａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ社、ナティック、米国）のいずれかを使用して行った。
【０１０２】
ハイドロゲル前駆体の調製の調製例
この実施例は、アルギン酸塩と混合されたＰＥＧ  ＦＸＩＩＩａ（３％ｗ／ｖ）に基づく。Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、第８巻、３０００〜３００７頁、２００７年１０月に記載のトランスグルタミナーゼブレンドに、ｉ）カルシウムを除去した、ｉｉ）ＥＤＴＡ（０．６ｍＭ）を添加した、及びｉｉｉ）全酵素濃度を３０Ｕ／ｍＬに増加させた、という３つの主要な変化を導入して、アルギン酸塩を０．５％ｗ／ｖの濃度で添加した。１８．７５μＬのＰＥＧ溶液（１３．３３％ｗ／ｖのストック）、２５μＬのアルギン酸塩溶液（２％ｗ／ｖのストック）、９．０９μＬのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤溶液（ＴＢＳ  １１ｘのストック）、０．３３μＬのＥＤＴＡ（２００ｍＭのストック）、３１．８３μＬの水、及び１５μＬのＦＸＩＩＩａ溶液（２００Ｕ／ｍＬのストック）を組み合わせることによって、１００μＬのＤＮゲル前駆体溶液の一定分量を調製した。
【０１０３】
修飾ポリエチレングリコールを、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２００７、８、３０００〜３００７に述べられるようにして調製した。
【０１０４】
ハイドロゲル作製の調製例
カルシウムの非存在は、カルシウム放出性基材（１％アガロースを補充した２％ゼラチン）上に、ゲル前駆体溶液を鋳造又は印刷することによって処理して、架橋を生じさせた。ハイドロゲル基材を、０．２ｇのゼラチン及び０．１ｇのアガロースを、２０ｍＭの塩化カルシウム及び０．９％の塩化ナトリウム溶液（１０ｍＬ）に溶解することによって、調製した。ブレンドを煮沸することによって、基材を架橋させ、次いで、それを型に鋳造して、冷却した。ハイドロゲル前駆体溶液の架橋は、手動で鋳造された試料及び印刷された試料について、別々に行った。手動で鋳造されたゲルは、室温で５分間架橋させ、次いで制御された雰囲気（３７℃、湿度１００％、５％ＣＯ２）に４５分間おき、一方、印刷された試料（室温）は、直ぐに、１５分又は３０分間の細胞培養環境のための、続く堆積に移した。
【０１０５】
ハイドロゲル構造体からのアルギン酸塩の選択的除去の例
未修飾のアルギン酸塩を最終のハイドロゲルから、２工程の方法で除去した。ＰＥＧの架橋後、試料を、制御された雰囲気（湿度１００％、及び５％ＣＯ２）で、アルギン酸リアーゼ溶液（１Ｕ／ｍｌ）に、３７℃で２時間浸漬した。１ｘのＰＢＳで２回洗浄後、試料を１０ｍＭのＥＤＴＡに１時間浸漬し、細胞培養条件（３７℃、湿度１００％及び５％ＣＯ２）で維持した。更に洗浄後、試料を適切な条件で、保管／培養した。
【０１０６】
細胞培養
赤色蛍光線維芽細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１％ペニシリン／ストレプトアビジン及び５０ｍＭのＨＥＰＥＳを添加したダルベッコ改変イーグル培地で培養した。培養フラスコを、３７℃、湿度１００％及び５％ＣＯ２で保管した。
【０１０７】
バイオインク調製の例
バイオインクを調製するために、１Ｅ６細胞／ｍＬを、ゲル製剤に添加した。細胞溶液を以下のようにして調製した。線維芽細胞を、１ｘのＰＢＳで２回洗浄し、次いで、トリプシンと共に５分間インキュベートした。次いで、細胞培養液を添加して、酵素の作用をブロックした。次いで、懸濁液をコニカルチューブに移し、細胞を遠心沈殿した（１３００ＲＰＭ、５分間）。上澄み液を除去し、細胞を、１．５ｍＭのＥＤＴＡを含有する１ｘのＰＢＳに、再懸濁（６Ｅ６細胞／ｍＬ）した。バイオインクを、前述のプロトコルに従って得たが、水の一部を、細胞懸濁液（１６．６７μＬ）及びリジン−ＲＧＤリガンド（最終濃度５０ｍＭ）で置換した。対照として、アルギン酸塩系バイオインク：１Ｅ６細胞／ｍＬを含有するアルギン酸塩０．８％ｗ／ｖを調製した。
【符号の説明】
【０１０８】
１  装置
２  第１の計量分配ユニット
３  第２の計量分配ユニット
４  基材層
５  永久層
６  液滴
７  液滴
８  犠牲層
９  中空空間
１０  生細胞
１１  単一ドット
１２  線
１３  灌流チャンバー
１４  灌流システム
１５  構造体
１６  フレーム
１７  カバー
１８  出入口
１９  底板
２０  上板
２１  チャネル
２２  チャネル
２３  主要マトリックス
２４  モジュレーターマトリックス
２５  更なる因子
２６  架橋剤
２７  ハイドロゲルネットワーク
２８  生物学的活性分子
２９  前駆体
３０  前駆体
３１  カプセル化細胞
３２  液滴
３３  Ｃａ２＋イオン
３４  液滴
【図１ａ】
2018507004.tif 000003
【図１ｂ】
2018507004.tif 000004
【図１ｃ】
2018507004.tif 000005
【図１ｄ】
2018507004.tif 000006
【図２】
2018507004.tif 000007
【図３】
2018507004.tif 000008
【図４】
2018507004.tif 000009
【図５】
2018507004.tif 000010
【図６】
2018507004.tif 000011
【図７】
2018507004.tif 000012
【図８】
2018507004.tif 000013
【図９】
2018507004.tif 000014
【図１０】
2018507004.tif 000015
【図１１】
2018507004.tif 000016
【図１２】
2018507004.tif 000017
【図１３】
2018507004.tif 000018
【図１４】
2018507004.tif 000019
【図１５ａ】
2018507004.tif 000020
【図１５ｂ】
2018507004.tif 000021
【図１５ｃ】
2018507004.tif 000022
【図１５ｄ】
2018507004.tif 000023
【図１５ｅ】
2018507004.tif 000024
【図１６】
2018507004.tif 000025
【図１７】
2018507004.tif 000026
【国際調査報告】
2018507004.tif 000027
2018507004.tif 000028
2018507004.tif 000029
2018507004.tif 000030
2018507004.tif 000031