(57)【要約】  ＰＳＣＡを標的とする、キメラ膜貫通免疫レセプターが記述される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原レセプターをエンコードする核酸分子であって、
前記キメラ抗原レセプターは：
ＰＳＣＡ結合ｓｃＦＶ又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント；
膜貫通ドメインであり：
ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
から選択される、膜貫通ドメイン；
共刺激ドメインであり：
４‐ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及び
ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
から選択される、共刺激ドメイン；
ＣＤ３ζシグナリングドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント；並びに
前記ｓｃＦｖと前記膜貫通ドメインとの間に位置する２０‐１５０個のアミノ酸を有するスペーサー領域、
を含む、
核酸分子。
【請求項２】
前記共刺激ドメインは：４‐ＩＢＢ共刺激ドメイン及び１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアントから成る群から選択される、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアントである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４膜貫通ドメインである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記キメラ抗原レセプターは、
二つの異なる共刺激ドメインであり：
ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
４‐ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及び
ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
から成る群から選択される、二つの異なる共刺激ドメイン、
を含む、
請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記キメラ抗原レセプターは、配列ＩＤ番号：３８のアミノ酸配列を有するＰＳＣＡ結合ｓｃＦｖを含む、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記キメラ抗原レセプターは：
ＰＳＣＡ結合ｓｃＦＶ又は１‐２個のアミノ酸改変を有するそのバリアント；
膜貫通ドメインであり：
ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１‐２個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１‐２個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１‐２個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及び
ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン又は１‐２個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
から選択される、膜貫通ドメイン；
４‐ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１‐２個のアミノ酸改変を有するそのバリアント；及び
ＣＤ３ζシグナリングドメイン又は１‐２個のアミノ酸改変を有するそのバリアント；並びに
前記ｓｃＦｖと前記膜貫通ドメインとの間に位置する２０‐１５０個のアミノ酸を有するスペーサー領域、
を含む、
請求項１に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記スペーサー領域は、配列ＩＤ番号：２‐１２又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそれらのバリアントから成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は請求項７記載の核酸分子。
【請求項９】
前記スペーサーは、ＩｇＧヒンジ領域を含む、請求項１又は請求項７に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記スペーサーは、１０‐５０個のアミノ酸を含む、請求項１又は請求項７に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記４‐１ＢＢ共刺激ドメインは、配列ＩＤ番号：２４又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそれらのバリアントのアミノ酸配列を含む、請求項１又は請求項７に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記ＣＤ３ζシグナリングドメインは、配列ＩＤ番号：２１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
３個から１５個のアミノ酸のリンカーが、前記共刺激ドメインと前記ＣＤ３ζシグナリングドメイン又はそれらのバリアントとの間に位置する、請求項１又は請求項７に記載の核酸分子。
【請求項１４】
当該核酸分子は、配列ＩＤ番号：２６‐３７又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそれらのバリアントから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１５】
前記１‐５個のアミノ酸改変は、置換である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１６】
前記１‐２個のアミノ酸改変は、置換である、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項１７】
キメラ抗原レセプターをエンコードする発現カセットを含むベクターによって導入されたヒトＴ細胞の集団であって、
前記キメラ抗原レセプターは：
ＰＳＣＡ結合ｓｃＦＶ又は１‐２個のアミノ酸改変を有するそのバリアント若しくは１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント；
膜貫通ドメインであり：
ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
から選択される、膜貫通ドメイン；
共刺激ドメインであり：
４ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及び
ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント、
から選択される、共刺激ドメイン；
ＣＤ３ζシグナリングドメイン又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアント；並びに
前記ｓｃＦｖと前記膜貫通ドメインとの間に位置する２０‐１５０個のアミノ酸を有するスペーサー領域、
を含む、
ヒトＴ細胞の集団。
【請求項１８】
配列ＩＤ番号：２６‐３７又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアントから選択されるアミノ酸配列を含むキメラ抗原レセプターを発現するベクターを含む、ヒトＴ細胞の集団。
【請求項１９】
前記１‐５個のアミノ酸改変は、置換である、請求項１８に記載のヒトＴ細胞の集団。
【請求項２０】
前記Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞の集団で構成される、請求項７に記載のヒトＴ細胞の集団。
【請求項２１】
患者の癌を処置する方法であって、
キメラ抗原レセプターをエンコードする発現カセットを含むベクターによって導入された自己又は同種のヒトＴ細胞の集団を投与するステップであり、キメラ抗原レセプターは、配列ＩＤ番号：２６‐３７又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアントから選択されるアミノ酸配列を含む、ステップ、
を含む、方法。
【請求項２２】
前記ヒトＴ細胞の集団は、セントラルメモリーＴ細胞を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記癌は、前立腺癌である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌は、前立腺癌の骨転位である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌は、膵臓癌である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記導入されたヒトＴ細胞は、
患者からＴ細胞を採取するステップ、
セントラルメモリーＴ細胞を単離するために前記Ｔ細胞を処理するステップ、及び
キメラ抗原レセプターをエンコードする発現カセットを含むウイルスベクターを用いて、前記セントラルメモリーＴ細胞の少なくとも一部分に導入するステップであり、キメラ抗原レセプターは、配列ＩＤ番号：２６‐３７又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアントから選択されるアミノ酸配列を含む、ステップ、
を含む方法によって調製される、
請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
配列ＩＤ番号：２６‐３７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％一致するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをエンコードする、核酸分子。
【請求項２８】
配列ＩＤ番号：２６‐３７又は１‐５個のアミノ酸改変を有するそのバリアントから選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを発現する、Ｔ細胞。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
前立腺癌（ＰＣａ）は、米国で３番目に多い癌の種類であり、今年診断されると予測される新規症例は２００，０００件を超える。ＰＣａ患者の約８０％において、腫瘍表現型は、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）の過剰発現を含む。さらに、ＰＳＣＡは骨転移性前立腺癌のほぼ１００％で発現され、それを理論的に魅力的な免疫療法標的にしている。Ｂ細胞悪性腫瘍（B-cell  malignancies）に対するＣＤ１９を標的とするＣＡＲｓを用いた最近の臨床試験は、印象的な結果を示しているが、他の抗原標的を用いてこの成功を再現することはつかみにくいままである。固形腫瘍に対する免疫療法は、そのような拘束性抗原発現（すなわち、Ｂ細胞悪性腫瘍についてのＣＤ１９）の欠如及びＣＡＲ効果を有意に妨げ得る免疫抑制微小環境の存在のために、より困難な腫瘍攻撃をもたらす。重要なことに、正常組織上での低レベルの抗原発現のために標的上（on-target）、腫瘍外（off-tumor）の毒性の実例が存在している。
【０００２】
所望の標的に結合することができるＣＡＲを作り出すために必要とされる基本的な構成要素は、合理的によく理解されているが、安全で効果的な治療における使用のために要求される品質を有するＣＡＲを設計することは挑戦的である。例えば、低レベルの標的を発現するか又は標的を全く発現しない非癌性細胞に対する過剰な活性を避けることは、重要である。望ましくない腫瘍外の影響を誘発し得る高レベルのサイトカイン産生を誘発することを避けることも、重要である。治療可能性に影響を及ぼし得る他の因子は、ＣＡＲを発現するＴ細胞の複製能力及び寿命、並びに頑健な抗腫瘍応答のために必要とされるＣＡＲを発現するＴ細胞の全体的なエフェクター機能を含むが、これらに限定されない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本明細書において記述されるものは、細胞外ドメイン、膜貫通領域及び細胞内シグナリングドメインを含む、キメラ膜貫通免疫レセプター（キメラ抗原レセプター又は“ＣＡＲｓ”である。細胞外ドメインは、ＰＳＣＡを標的とするｓｃＦｖを含む。本明細書において記述されるＣＡＲは、前立腺癌及び前立腺癌骨転位を処置するために有用である。
【０００４】
ＰＳＣＡを標的とするｓｃＦｖに加えて、細胞外ドメインは、例えば、ヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインの一部分を含む、スペーサーを含む。ＣＡＲの膜貫通部分は、例えば、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ３膜貫通ドメイン又は４ＩＢＢ膜貫通ドメインを含む。細胞内シグナリングドメインは、ヒトＣＤ３複合体のゼータ鎖（ＣＤ３ζ）からのシグナリングドメイン及び共刺激（costimulatory）ドメイン（例えば、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＣＤ２８ｇｇ又は４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメイン）を含む。細胞外ドメインは、Ｔ細胞の表面上に発現された場合に、ＣＡＲが、Ｔ細胞活性を、ＰＳＣＡを発現しているそれらの細胞に向けさせることを可能にする。そのような細胞は、前立腺癌細胞を含む。細胞内領域内にＣＤ３ζと直列に（ただし必ずしもすぐ隣でなくともよい）共刺激ドメインを含むことは、Ｔ細胞が共刺激シグナルを受けることを可能にする。Ｔ細胞、例えば患者特異的な、自己Ｔ細胞は、本明細書において記述されるＣＡＲｓを発現するように操作されてもよく、操作された（engineered）細胞は、ＡＣＴにおいて増やされ（expanded）、使用されてもよい。様々なＴ細胞サブセットが使用され得る。加えて、ＣＡＲは、ＮＫ細胞のような他の免疫細胞においても発現され得る。患者が本明細書に記載のＣＡＲを発現する免疫細胞を用いて処置される場合、その細胞は、自己（autologous）又は同種（allogenic）のＴ細胞であってもよい。いくつかの場合において、使用される細胞は、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋、又はＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋）である、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋のセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）であり、そのような細胞の使用は、他の種類の患者特異的Ｔ細胞の使用と比較して、養子移植後の細胞の長期の持続性を改善することができる。重要なことに、ＣＡＲの全体的な設計は、比較的低レベルのＰＳＣＡだけを発現する非癌性細胞を含む、非癌性細胞に対する望まれない活性を避ける。
【０００５】
ＰＳＣＡ  ｓｃＦｖは、以下の配列（sequence）を含んでもよい：
DIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCSASSSVRFIHWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWGSSPFTFGQGTKVEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLVEYGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDYYIHWVRQAPGKGLEWVAWIDPENGDTEFVPKFQGRATMSADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCKTGGFWGQGTLVTVSS（配列ＩＤ番号：３８）又は最大で５個のアミノ酸置換（substitutions）を有するそのバリアント（variant）。
【０００６】
本明細書において記述されるものは、ＣＡＲをエンコードする（encoding）核酸分子であって：ＰＳＣＡに差し向けられたｓｃＦｖ（例えば、配列ＩＤ番号：１）又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（modifications）を有するそのバリアント；膜貫通ドメインであり：ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１‐１０個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変を有するそのバリアント、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変を有するそのバリアント、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変を有するそのバリアント、及びＣＤ３ζ膜貫通ドメイン又は１‐１０個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変を有するそのバリアント、から選択される、膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン（costimulatory  domain）；並びに、ＣＤ３ζシグナリングドメイン又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変を有するそのバリアント、を含む、核酸分子である。スペーサー領域（spacer  region）は、ｓｃＦｖと膜貫通ドメインとの間に位置する。スペーサー領域は、以下で更に詳細に記述され、ヒトＦｃ領域（human  Fc  region）の全て又は部分を含んでもよい。
【０００７】
いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列ＩＤ番号：２６‐３７から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する；キメラ抗原レセプターは、１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有する、配列ＩＤ番号：２６‐３７から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０００８】
また、キメラ抗原レセプターをエンコードする発現カセット（expression  cassette）を含むベクターによって導入された（transduced）ヒトＴ細胞の集団（population）も開示され、キメラ抗原レセプターは、ＰＳＣＡに差し向けられたｓｃＦＶを含み、それは４‐１ＢＢ共刺激ドメインを含む。様々な実施形態において、ヒトＴ細胞の集団は、配列ＩＤ番号：２６‐３７から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むキメラ抗原レセプター発現するベクターを含む；ヒトＴ細胞の集団は、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を含む（例えば、細胞のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％がＴＣＭ細胞であり；ＴＣＭ細胞のうちの少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％がＣＤ４＋であり、ＴＣＭ細胞のうちの少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％がＣＤ８＋細胞である）。
【０００９】
また、患者の癌を処置する方法であって、キメラ抗原レセプターをエンコードする発現カセットを含むベクターによって導入された自己又は同種のヒトＴ細胞の集団（例えば、Ｔ細胞を含む自己又は同種のＴ細胞であり、例えば、細胞のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％がＴＣＭ細胞であり；ＴＣＭ細胞のうちの少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％がＣＤ４＋であり、ＴＣＭ細胞のうちの少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％がＣＤ８＋細胞である）を、投与するステップ（administering）であり、キメラ抗原レセプターは、配列ＩＤ番号：２６‐３７から選択されるアミノ酸配列を含む、ステップ、を含む方法も記述されている。様々な実施形態において：ヒトＴ細胞の集団は、セントラルメモリーＴ細胞を含み；癌は、神経膠芽腫（glioblastoma）であり；導入されたヒトＴ細胞は、患者からＴ細胞を採取するステップ（obtaining）、セントラルメモリーＴ細胞を単離するためにＴ細胞を処理するステップ、及びキメラ抗原レセプターをエンコードする発現カセットを含むウイルスベクターを用いて、セントラルメモリーＴ細胞の少なくとも一部分に導入するステップであり、キメラ抗原レセプターは、配列ＩＤ番号：２６‐３７から選択されるアミノ酸配列を含む、ステップ、を含む方法によって調製される。
【００１０】
また：配列ＩＤ番号：２６‐３７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％一致するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをエンコードする、核酸分子；５個以下のアミノ酸の置換、削除又は挿入の存在を除いて配列ＩＤ番号：２６‐３７から選択されるアミノ酸配列と一致するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをエンコードする、核酸分子；５個以下のアミノ酸の置換の存在を除いて配列ＩＤ番号：２６‐３７から選択されるアミノ酸配列と一致するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをエンコードする、核酸分子；並びに、２個以下のアミノ酸の置換の存在を除いて配列ＩＤ番号：２６‐３７から選択されるアミノ酸配列と一致するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをエンコードする、核酸分子、も記述されている。
【００１１】
ＰＳＣＡを標的とするＣＡＲを発現するＴ細胞は、ホルモン不応性前立腺癌、骨、肝臓及び肺転移を含む前立腺癌の転移、並びに、膵臓、膀胱、結腸及び神経膠芽腫（原発性脳）を含むがこれらに限定されない、ＰＳＣＡを発現する他の癌を含む、前立腺癌の処置（treatment）において有用であり得る。したがって、本開示は、本明細書に記載のＣＡＲを発現するＴ細胞を使用して癌を処置するための方法を含む。
【００１２】
本開示はまた、本明細書に記載のＣＡＲｓのいずれかをエンコードする核酸分子（例えば、ＣＡＲｓのうちの一つをエンコードする核酸配列を含むベクター）及び本明細書に記載のＣＡＲｓのいずれかを発現する単離されたＴリンパ球を含む。
【００１３】
本明細書に記載のＣＡＲは、ＰＳＣＡ標的ドメイン（すなわち、ＰＳＣＡを認識するｓｃＦｖ又はそのバリアント）と膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域を含んでもよい。様々な異なるスペーサーが使用されてもよい。それらのいくつかは、ヒトＦｃ領域の少なくとも一部分、例えばヒトＦｃ領域のヒンジ部分若しくはＣＨ３ドメイン又はそのバリアントを含む。以下の表１は、本明細書に記載のＣＡＲｓにおいて使用され得る様々なスペーサーを提供する。
表１：スペーサーの例
【表１】
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【００１４】
いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）ヒンジ領域、すなわち、免疫グロブリンＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に入る配列、例えばＩｇＧ４ヒンジ又はＣＤ８ヒンジの全て又は部分を含む。いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリンＣＨ３ドメイン又はＣＨ３ドメインとＣＨ２ドメインの両方を含む。免疫グロブリンに由来する配列は、一つ又はそれ以上のアミノ酸改変、例えば１、２、３、４又は５個の置換、例えば標的外結合（off-target  binding）を低減する置換、を含んでもよい。
【００１５】
“アミノ酸改変”は、タンパク質若しくはペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入及び／又は削除を参照する。“アミノ酸置換”若しくは“置換”は、元の（parent）ペプチド若しくはタンパク質配列における特定の位置のアミノ酸の、他のアミノ酸による交換を参照する。置換は、非保存的（non-conservative）な方法で（すなわち、特定のサイズ又は特徴を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸から、他の分類に属するアミノ酸へコドンを変化させることによって）、或いは、保存的（conservative）な方法で（すなわち、特定のサイズ又は特徴を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸から、同じ分類に属するアミノ酸へコドンを変化させることによって）、結果として生じるタンパク質中のアミノ酸を変化させるように行われてもよい。そのような保存的な変化は、概して、結果として生じるタンパク質の構造及び機能のより小さな変化につながる。以下はアミノ酸の種々の分類の例である：１）無極性Ｒ基を有するアミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン；２）非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸：グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；３）荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸（ｐＨ６．０で負に帯電）：アスパラギン酸、グルタミン酸；４）塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に帯電）：リシン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０）。別の分類は、フェニル基を有するアミノ酸：フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンであり得る。
【００１６】
特定の実施形態において、スペーサーは、改変されていないスペーサーに存在するものと異なるアミノ酸残基によって置換された一つ又はそれ以上のアミノ酸残基を含むＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来する。一つ又はそれ以上の置換されたアミノ酸残基は、位置２２０、２２６、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３４、２３７、２３８、２３９、２４３、２４７、２６７、２６８、２８０、２９０、２９２、２９７、２９８、２９９、３００、３０５、３０９、２１８、３２６、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３６、３３９又はそれらの組み合わせの、一つ又はそれ以上のアミノ酸残基から選択されるが、これらに限定されない。以下で更に詳細に記述されるこの番号付け体系において、表１のＩｇＧヒンジ配列及びＩｇＧ４ヒンジリンカー（ＨＬ）配列の最初のアミノ酸が２１９であるように、表１のＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）スペーサーの最初のアミノ酸は２１９であり、表１のＩｇＧ４（ＨＬ‐ＣＨ３）スペーサーの最初のアミノ酸は２１９である。
【００１７】
いくつかの実施形態において、改変されたスペーサーは、以下のアミノ酸残基置換の一つ又はそれ以上を含むがこれらに限定されない、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４に由来する：Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｓ２２８Ｐ、Ｃ２２９Ｓ、Ｐ２３０Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｐ２４７Ｉ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｑ、Ｓ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｎ、Ｒ２９２Ｐ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｇ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｖ、Ｔ２９９Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｋ３２６Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｄ、Ａ３３９Ｑ、Ｐ３９６Ｌ又はそれらの組み合わせ。
【００１８】
特定の実施形態において、改変されたスペーサーは、改変されていないスペーサーに存在するものと異なるアミノ酸残基によって置換された一つ又はそれ以上のアミノ酸残基を含むＩｇＧ４領域に由来する。一つ又はそれ以上の置換されたアミノ酸残基は、位置２２０、２２６、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３４、２３７、２３８、２３９、２４３、２４７、２６７、２６８、２８０、２９０、２９２、２９７、２９８、２９９、３００、３０５、３０９、２１８、３２６、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３６、３３９又はそれらの組み合わせの、一つ又はそれ以上のアミノ酸残基から選択されるが、これらに限定されない。
【００１９】
いくつかの実施形態において、改変されたスペーサーは、以下のアミノ酸残基置換の一つ又はそれ以上を含むがこれらに限定されない、ＩｇＧ４領域に由来する：２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２８Ｐ、２２９Ｓ、２３０Ｓ、２３３Ｐ、２３４Ａ、２３４Ｖ、２３４Ｆ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３５Ｅ、２３６Ａ、２３７Ａ、２３８Ｓ、２３９Ｄ、２４３Ｌ、２４７Ｉ、２６７Ｅ、２６８Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９０Ｅ、２９０Ｎ、２９２Ｐ、２９７Ａ、２９７Ｑ、２９８Ａ、２９８Ｇ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２９９Ａ、３００Ｌ、３０５Ｉ、３０９Ｌ、３１８Ａ、３２６Ａ、３２６Ｗ、３２６Ｅ、３２８Ｆ、３３０Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、３３１Ｓ、３３２Ｅ、３３３Ａ、３３３Ｓ、３３３Ｓ、３３４Ａ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、３９６Ｌ又はそれらの組み合わせ。ここで、改変されていないスペーサーにおけるアミノ酸は、示された位置において上記の同定されたアミノ酸によって置換される。
【００２０】
本明細書において論じられる免疫グロブリン中のアミノ酸位置について、番号付けは、ＥＵインデックス又はＥＵ番号付け体系（Kabatら、1991  Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,  第５版、米国公衆衛生局、国立保健研究機構、ベスセダ、参照により全体が本明細書に組み込まれる）に従う。ＥＵインデックス若しくはKabatにおけるようなＥＵインデックス又はＥＵ番号付け体系は、ＥＵ抗体の番号付け（Edelmanら、1969  Proc  Natl  Acad  Sci  USA  63:  78-85）を参照する。
【００２１】
様々な膜貫通ドメインが使用されてもよい。表２は、適切な膜貫通ドメインの例を含む。スペーサードメインが存在する場合には、膜貫通ドメインは、スペーサードメインに対してカルボシキ末端に位置する。
表２：膜貫通ドメインの例
【表２】
2018530333.tif 000004
【００２２】
本明細書に記載のＣＡＲの多くは、一つ又はそれ以上の（例えば、二つの）共刺激ドメインを含む。（複数の）共刺激ドメインは、膜貫通ドメインとＣＤ３ζシグナリングドメインとの間に位置する。表３は、ＣＤ３ζシグナリングドメインと一緒に、適切な共刺激ドメインの例を含む。
表３：ＣＤ３ζシグナリングドメイン及び共刺激ドメインの例
【表３】
2018530333.tif 000005
【００２３】
本明細書に記載の研究に使用されるＰＳＣＡ‐ＣＡＲは、表４に要約されるものであり（未成熟、ＧＭＣＳＦＲａシグナル配列を含む）、その中で、各ＣＡＲについてのスペーサードメイン及び（複数の）共刺激ドメインが示されている。これらの全ては、Ａ１１  ＰＳＣＡ  ｓｃＦｖを含む。ＩｇＧ４（ＨＬ‐ＣＨ３）スペーサーはまた、ＩｇＧ４ΔＣＨ２スペーサーとも呼ばれる。配列ＩＤ番号：２６、２７、２８、２９、３０及び３１についての成熟配列（ＧＭＣＳＦＲａシグナル配列を欠く）は、配列ＩＤ番号：３２、３３、４３、３５、３６及び３７である。
表４：ＰＳＣＡを標的とするＣＡＲの例
【表４】
2018530333.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１：様々なスペーサー領域（上で更に詳細に記述された）を備え：ＣＤ２８膜貫通ドメイン及びＣＤ２８共刺激ドメイン；又は、ＣＤ４膜貫通ドメイン及び４‐ＩＢＢ共刺激ドメインのいずれかを有する、ＣＡＲコンストラクトの模式図。コンストラクトは、ＭＢ１  ｓｃＦｖ又はＡ１１  ｓｃＦｖを使用した。全てのコンストラクトはＣＤ３ζ細胞溶解性（cytolytic）ドメインを使用した。Ｔ２Ａスキップ配列は、コンストラクトの発現を評価するために使用される切断型（truncated）ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）タンパク質からＣＡＲを分離する。
【００２５】
【図２】図２：図１の様々なコンストラクトについてのｔＣＤ１９及びｓｃＦｖ（プロテインＬ）発現データの測定。
【００２６】
【図３】図３Ａ‐Ｅ：ヒト前立腺癌細胞株に対する二つの異なるＰＳＣＡ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞の生体外での（In  vitro）特徴付け。（Ａ）ＰＳＣＡを発現するように操作された腫瘍細胞（ＬＣＬ、ＰＣ‐３、及びＤＵ１４５）におけるＰＳＣＡの発現。（Ｂ‐Ｃ）フローサイトメトリーによって測定された、腫瘍標的との５時間の共培養に続いてのＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＣＤ１０７ａ脱顆粒（degranulation）及びＩＦＮγ産生。（Ｄ−Ｅ）ＥＬＩＳＡによって測定された、組換えＰＳＣＡタンパク質又は腫瘍標的を用いた２４時間の培養に続いてのＣＡＲ  Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生
【００２７】
【図４】図４Ａ‐Ｅ：４‐１ＢＢ共刺激ドメインを含むＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓは、優れた特異性、増殖及び腫瘍細胞死滅能力を示す。フローサイトメトリーによって測定された、腫瘍標的（ＤＵ１４５、ＰＣ‐３、ＤＵ１４５‐ＰＳＣＡ及びＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ）との７２時間の共培養に続いてのＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ｚ又はＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞における腫瘍死滅（Ａ）及びＰＤ‐１誘導（induction）（Ｂ）。（Ｃ）エフェクター：腫瘍（Ｅ：Ｔ）比が０．２５：１から４：１での、腫瘍死滅。（Ｄ）腫瘍標的との７２時間の共培養に続いてのＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＦＳＥ増殖。（Ｅ）腫瘍標的（ＤＵ１４５、左；ＤＵ１４５‐ＰＳＣＡ、右）との１、２又は３日間の共培養に続いてのＣＡＲ  Ｔ細胞における腫瘍死滅及びＰＤ‐１誘導の動態。
【００２８】
【図５】図５Ａ‐Ｂ：細胞外スペーサーは、生体外（in  vitro）ＰＳＣＡ‐ＣＡＲ機能性を規定する（dictates）。（Ａ）フローサイトメトリーによって測定された、腫瘍標的（ＤＵ１４５及びＤＵ１４５‐ＰＳＣＡ）との５時間の共培養に続いての、ＰＳＣＡ（ＥＱ）ＢＢｚ、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢｚ及びＰＳＣＡ（Ｌ）ＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＣＤ１０７ａ脱顆粒及びＩＦＮγ産生。（Ｂ）ＥＬＩＳＡによって測定された、組換えＰＳＣＡタンパク質又は腫瘍標的を用いた２４時間の培養に続いてのＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＩＦＮγ。
【００２９】
【図６】図６Ａ‐Ｄ：ＰＳＣＡ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞は、前立腺癌異種移植（xenograft）及び同所性（orthotopic）モデルにおいて効能のある（potent）抗腫瘍効果を示す。（Ａ）ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ（２×１０６）細胞は、ＮＳＧ雄マウスに皮下注射され、腫瘍が約３０（〜３０）‐５０ｍｍ３に達したときに、ＣＡＲ  Ｔｃｍ（５×１０６）は腫瘍内に注射され、腫瘍成長がキャリパー（caliper）測定によって監視された。（Ｂ）ＤＵ１４５‐ＰＳＣＡ（２×１０６）細胞は、ＮＳＧ雄に皮下注射され、ＣＡＲ  ＰＢＭＣ細胞（５×１０６）細胞は静脈内に送り込まれた（intravenously  delivered）。（Ｃ）ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ（２×１０５）細胞は、ＮＳＧ雄に脛骨内に（intratibially）注射され、ＣＡＲ  ＰＢＭＣ細胞（２×１０６又は５×１０６）は、静脈内に送り込まれた。（Ｄ）各群における腫瘍注射後５８日目における、血液中のＣＡＲ  Ｔ細胞持続性。
【００３０】
【図７】図７Ａ‐Ｄ：ＣＤ２８又は４‐１ＢＢ共刺激ドメインを含むＰＳＣＡ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞。（Ａ）ＰＳＣＡを標的とするヒト化ｓｃＦｖ（Ａ１１クローン）を含むＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓを有するレンチウイルス発現カセットの図であり、１２９アミノ酸改変ヒトＩｇＧ４  Ｆｃリンカー（ＣＨ２ドメインの欠損、ΔＣＨ２）、膜貫通ドメイン（ＣＤ２８又はＣＤ４のいずれか）、細胞質ＣＤ２８又は４‐１ＢＢ共刺激ドメイン、及び細胞溶解性ＣＤ３ｚドメインを有する。切断型非シグナリングＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）は、ＣＡＲ発現細胞を追跡するためのＴ２Ａリボソームスキップ配列によってＣＡＲから分離される。（Ｂ）モック（導入されていない）、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ、又はＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＡＲｓのレンチウイルス導入を検出するために、ＣＤ１９ｔ発現について（上端）、又は、ｓｃＦｖを検出するために、タンパク質Ｌについて（下端）、フローサイトメトリーによって評価された。（Ｃ）２５日間の培養にわたっての、モック及びＰＳＣＡ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞のエクスビボ増殖動態（Ex  vivo  expansion  kinetics）。（Ｄ）フローサイトメトリーによって決定された、エクスビボ増殖の終わりにおける、ＰＳＣＡ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞の表示された細胞表面マーカーの細胞表面発現。全てのデータは、少なくとも二つの独立した実験の代表である。
【００３１】
【図８】図８Ａ‐Ｇ：生体外（in  vitro）のＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓにおいて、４‐１ＢＢ共刺激ドメインを含むＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓは、ＣＤ２８共刺激と比較して、優れた腫瘍標的化（targeting）を示す。（Ａ）フローサイトメトリーによって決定された、ヒト前立腺癌細胞株におけるＰＳＣＡ発現のヒストグラム。ＤＵ１４５及びＰＣ‐３細胞株は、ＥＦ１αプロモーターの制御下で、ヒトＰＳＣＡを過剰発現するようにレンチウイルスによって（lentivirally）導入された（材料及び方法を参照）。ＰＣ‐３‐ＰＧＫ１００ｐ細胞株は、表示された変異体ＰＧＫプロモーター（mutant  PGK  promoter）の制御下でヒトＰＳＣＡを発現することによって生成された。ＬＡＰＣ‐９細胞は内因的にヒトＰＳＣＡを発現する。（Ｂ）ＰＣ‐３又はＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ腫瘍細胞との３日間の共培養に続いて光学顕微鏡によって評価された、１：１のエフェクター：標的比でのモック、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ、又はＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を比較する腫瘍死滅アッセイのスナップショット画像。（Ｃ）表示された腫瘍標的との３日間の共培養に続いてフローサイトメトリーによって評価された、（Ｂ）と同様の腫瘍死滅アッセイ。（Ｄ）表示された腫瘍標的との３日間の共培養に続いての、ＰＳＣＡ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＰＤ‐１発現の代表的なゼブラプロット（zebra  plots）。（Ｅ）表示された腫瘍標的との３日間の共培養に続いての、ＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞におけるＰＤ‐１発現の定量化。（Ｆ）ＤＵ１４５との共培養の１、２又は３日目におけるＰＳＣＡ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞を比較する腫瘍死滅アッセイ。腫瘍標的なしに培養されたＴ細胞と比較した、Ｔ細胞におけるＰＤ‐１発現。（Ｇ）ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ又はＰＣ‐３‐ＰＧＫ１００ｐとの３日間の共培養に続いてフローサイトメトリーによって評価された、異なるエフェクター：標的比を用いた腫瘍死滅アッセイ。データは、群当たりｎ＝２±ＳＤとして示されている。全てのデータは、少なくとも二つの独立した実験の代表である。
【００３２】
【図９】図９Ａ‐Ｆ：ＰＳＣＡ‐ＢＢζ  ＣＡＲｓは、生体外（in  vitro）で抗原依存性サイトカイン産生を示す。（Ａ）ＤＵ１４５又はＤＵ１４５‐ＰＳＣＡ腫瘍細胞とともに一晩培養されたＰＳＣＡ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞からの上清中の、ＥＬＩＳＡによって定量化されたＩＦＮγ産生。（Ｂ）ＰＣ‐３、ＰＣ‐３‐ＰＧＫ１００ｐ又はＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ腫瘍細胞とともに一晩培養されたＰＳＣＡ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞からの、（Ａ）と同じもの。（Ｃ）様々なタンパク質濃度のプレート結合組換えヒトＰＳＣＡ上で一晩培養されたＰＳＣＡ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞からの上清中の、ＥＬＩＳＡによって定量化されたＩＦＮγ産生。（Ｄ）表示された腫瘍標的との４‐６時間の共培養に続いての、ＰＳＣＡ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＣＤ１０７ａ脱顆粒を示す代表的なゼブラプロット。（Ｅ）（Ｄ）からのＰＳＣＡ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＣＤ１０７ａ脱顆粒の定量化。（Ｆ）表示された腫瘍標的との３日間の共培養に続いての、モック、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ、又はＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞における、ＣＤ１３７発現の代表的なゼブラプロット。  データは、群当たりｎ＝２±ＳＤとして示されている。全てのデータは、少なくとも二つの独立した実験の代表である。
【００３３】
【図１０】図１０Ａ‐Ｆ：前立腺癌の皮下及び同所骨転移性ヒト異種移植モデルにおけるＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の頑健な治療効果。（Ａ）第３４日目に腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射によって、表示された投与量（doses）のモック又はＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて処置された、第０日目の皮下ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ（２．５×１０６）腫瘍を有するＮＳＧマウスにおける腫瘍体積（ｍｍ３）。群あたりＮ＝４匹のマウス。データは、少なくとも二つの独立した実験の代表である。（Ｂ）大きな腫瘍（約５００ｍｍ３）を有するマウスは、第５１日目に静脈内（i.v.）注射によって５ｘ１０６のモック又はＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて処置された。群あたりＮ＝３匹のマウス。データは、少なくとも二つの独立した実験の代表である。（Ｃ）ヒトＣＤ３（上方のパネル）及びグランザイムＢ（下方のパネル）によって染色された、静脈内Ｔ細胞処置の１１日後に採取されたＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ腫瘍の免疫組織化学。（Ｄ）右後肢にＰＣ‐３（野生型）細胞（０．２×１０６）、左後肢にＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ細胞（０．２×１０６）による、脛骨内（intratibial）腫瘍を有するマウス。第１４日目に、マウスは、静脈内注射によって、５×１０６のホタルルシフェラーゼ陽性（約３０％）モック又はＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて処置された。Ｔ細胞輸送（trafficking）は、４時間、１日、２日及び４日目に、非侵襲的光学的画像化（Xenogen）によって監視された。フラックス画像の定量化は、ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ／ＰＣ‐３（野生型）の比を示す。群あたりＮ＝４‐６匹のマウス。（ｅ）脛骨内（左後肢）ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ‐ｅＧＦＰ‐ｆｆｌｕｃ（０．２×１０６）を有するＮＳＧマウス。腫瘍成長動態は、非侵襲的光学的画像化（Xenogen）によって監視された。第１４日目に、マウスは、５×１０６のモック又は様々な投与量のＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて、静脈内注射された。第１３日目（処置前）及び第３３日目のマウスの代表的なフラックス画像が示されている。（Ｆ）腫瘍のみ、モックＴ細胞（５×１０６）及びＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（５×１０６、２．５×１０６、１×１０６、０．５×１０６）群からの、（腫瘍注射部位における関心領域（ＲＯＩ）を用いた）フラックス画像の定量化。ＣＡＲ群について、群あたりＮ＝４匹のマウス。データは、少なくとも二つの独立した実験の代表である。
【００３４】
【図１１】図１１Ａ‐Ｄ：前立腺癌患者由来骨転位異種移植モデルにおける、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の耐久性のある抗腫瘍効果。（Ａ）脛骨内（左後肢）ＬＡＰＣ‐９‐ｅＧＦＰ‐ｆｆｌｕｃ（０．１５×１０６）を有するＮＳＧマウス。腫瘍成長動態は、非侵襲的光学的画像化（Xenogen）によって監視された。第１４日目に、マウスは、５×１０６個のモック又はＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ又はＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて、静脈内注射された。表示された日におけるマウスの代表的なフラックス画像が示されている。（Ｂ）各処置群からの、脛骨におけるＲＯＩを用いた（上方のパネル）、又は全身からの（下方のパネル）、フラックス画像の定量化。（Ｃ）腫瘍注射後７６日目に処置マウス（群あたりｎ＝２‐３）から採取された血清からの、ＥＬＩＳＡによって決定されたＰＳＡレベル。（Ｄ）腫瘍注射後の２４日目及び７６日目のマウスの末梢血のフローサイトメトリー分析（群あたりｎ＝２‐３）。データは、二つの独立した生体内（in  vivo）実験から集められる。
【００３５】
【図１２】図１２：ＰＢＭＣ及びＴＣＭ集団の細胞表面表現型。（ａ）ＰＢＭＣ及びＴＣＭの開始集団は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ１４、ＣＤ２５及びＣＤ９５の発現についてフローサイトメトリーによって分析された。代表的なＦＡＣＳプロットが示されている。
【００３６】
【図１３】図１３：腫瘍細胞株におけるＰＳＣＡのｍＲＮＡ発現分析。（ａ）ＰＳＣＡ発現を定量化するために、様々な前立腺及び非前立腺癌細胞株で実施されたｑＰＣＲ。ＰＳＣＡ  ｍＲＮＡは、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡに対して正規化された。
【００３７】
【図１４】図１４Ａ‐Ｃ：ＭＢ１  ｓｃＦｖ‐含有とＡ１１  ｓｃＦｖ‐含有のＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓの比較。（Ａ）ＰＳＣＡを標的とするヒト化ＭＢ１又はＡ１１  ｓｃＦｖを含むＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓを有するレンチウイルス発現カセットの図であり、１２９アミノ酸改変ヒトＩｇＧ４  Ｆｃリンカー（ＣＨ２ドメインの欠損、ΔＣＨ２）、ＣＤ４膜貫通ドメイン、細胞質４‐１ＢＢ共刺激ドメイン、及び細胞溶解性ＣＤ３ζドメインを有する。切断型非シグナリングＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）は、ＣＡＲ発現細胞を追跡するためのＴ２Ａリボソームスキップ配列によってＣＡＲから分離される。（Ｂ）フローサイトメトリーによって決定された、ＣＡＲｓのレンチウイルス導入を検出するためのＣＤ１９（上端）又はｓｃＦｖを検出するためのタンパク質Ｌ（下端）を発現する、モック（導入されていない）、ＰＳＣＡ‐ＭＢ１‐（ΔＣＨ２）ＢＢζ、又はＰＳＣＡ‐Ａ１１‐（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞。（Ｃ）表示された腫瘍標的との３日間の共培養に続いてフローサイトメトリーによって評価された腫瘍死滅アッセイ。
【００３８】
【図１５】図１５：ＰＢＭＣ又はＴＣＭのいずれかに導入されたＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞によるサイトカイン産生。様々なタンパク質濃度のプレート結合組換えヒトＰＳＣＡ上で培養されたＰＳＣＡ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞からの上清中の、ＥＬＩＳＡによって定量化されたＩＦＮγ産生。
【００３９】
【図１６】図１６：プレート結合ＯＫＴ３に対するモック、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ、及びＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化（Activation）及び消耗性（exhaustive）表現型。プレート結合ＯＫＴ３（１０μｇ／ｍＬ）との２日間のインキュベーションに続く、Ｔ細胞における、フローサイトメトリーによるＣＤ１３７及びＰＤ１の発現。
【００４０】
【図１７】図１７Ａ‐Ｄ：ＨＥＲ２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＰＳＣＡ陰性腫瘍再発の処置。（Ａ）ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ処置された、ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ腫瘍を有するマウスにおける腫瘍再発の動態。各々の線は、群ごとに個別のマウスを表す。群あたりＮ＝４。データは、少なくとも二つの独立した研究の代表である。（Ｂ）ヒトＰＳＣＡ、ＣＤ３及びＨＥＲ２によって染色された、モック処置（主要エンドポイント）又は再発性ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ処置腫瘍から採取されたＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ腫瘍の免疫組織化学。（Ｃ）フローサイトメトリーによって評価された、ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ腫瘍細胞におけるＨＥＲ２発現。（Ｄ）第２４日目（“第１回目ｔｘ”）に５ｘ１０６のモック又はＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて静脈内に処置された、ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ腫瘍を有するマウス（群あたりＮ＝６）における腫瘍体積（ｍｍ３）。ＣＡＲ  Ｔ細胞処置マウスが腫瘍再発（５０‐１００ｍｍ３）を示した第８１日目に、マウスは、５×１０６のモック、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ、又はＨＥＲ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞のいずれかの腫瘍内注射を受ける第２の処置（“第２回ｔｘ”）に割り当てられた（群あたりＮ＝２）。
【００４１】
【図１８】図１８：ＰＳＣＡｓｃＦｖ‐ＩｇＧ４（ＨＬ‐ＣＨ３）‐ＣＤ４ｔｍ‐４ＩＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２６）。
【００４２】
【図１９】図１９：ＰＳＣＡｓｃＦｖ‐ＩｇＧ４（ＥＱ）‐ＣＤ２８ｔｍ‐ＣＤ２８ｇｇ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２７）。
【００４３】
【図２０】図２０：ＰＳＣＡｓｃＦｖ‐Ｌ‐ＣＤ４ｔｍ‐４ＩＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２８）。
【００４４】
【図２１】図２１：ＰＳＣＡｓｃＦｖ‐ＩｇＧ４（ＨＬ‐ＣＨ３）‐ＣＤ２８ｔｍ‐ＣＤ２８ｇｇ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２９）
【００４５】
【図２２】図２２：ＰＳＣＡｓｃＦｖ‐ＩｇＧ４（ＥＱ）‐ＣＤ４ｔｍ‐４ＩＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３０）
【００４６】
【図２３】図２３：ＰＳＣＡｓｃＦｖ‐Ｌ‐ＣＤ２８ｔｍ‐４ＩＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３１）
【発明を実施するための形態】
【００４７】
以下に記述されるものは、ＰＳＣＡを標的とする様々なキメラ抗原レセプター（chimeric  antigen  receptors）の構造、構築及び特徴付けである。キメラ抗原（ＣＡＲ）は、最低限、細胞外認識ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内シグナリングドメインを含む組換え生体分子である。したがって、用語“抗原”は、抗体に結合する分子に限定されず、標的に特異的に結合することができる任意の分子である。例えば、ＣＡＲは、細胞表面レセプターに特異的に結合するリガンドを含んでもよい。細胞外認識ドメイン（細胞外ドメイン又は単にそれが含む認識要素によっても呼ばれる）は、標的細胞の細胞表面上に存在する分子に特異的に結合する認識要素を含む。膜貫通領域は、膜中にＣＡＲをつなぐ。細胞内シグナリングドメインは、ヒトＣＤ３複合体のゼータ鎖からのシグナリングドメインを含み、任意的に一つ又はそれ以上の共刺激シグナリングドメインを含む。ＣＡＲｓは、ＭＨＣ拘束から独立して、抗原に結合すること及びＴ細胞活性化を導入することの両方である。したがって、ＣＡＲｓは、彼ら／彼女らのＨＬＡ遺伝子型にかかわらず、抗原陽性腫瘍を有する患者の集団を処置することができる“普遍的な（universal）”免疫レセプターである。腫瘍特異的ＣＡＲを発現するＴリンパ球を使用する養子免疫療法（Adoptive  immunotherapy）は、癌の処置のための強力な治療戦略であり得る。
【００４８】
発明者らは、適切な活性及び特異性を有し一方では過剰なサイトカイン産生を誘発しないＣＡＲを同定するために、多種多様なＰＳＣＡ  ＣＡＲを生成し、いくつかのアッセイで試験した。
【００４９】
いくつかの場合において、本明細書に記載のＣＡＲは、ＣＡＲ翻訳領域（open  reading  frame）の後にＴ２Ａリボソームスキップ配列、及び細胞質シグナルシグナリングテールを欠く（アミノ酸３２３で切断された）、切断型ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）が続くベクターを使用して産生されてもよい。この配置において、ＣＤ１９ｔの同時発現は、不活性で非免疫原性の表面マーカーを提供し、それは、遺伝子改変細胞の正確な測定を可能にし、遺伝子改変細胞の正の選択（positive  selection）、並びに、養子移植に続いての生体内（in  vivo）での効率的な細胞追跡及び／又は治療用Ｔ細胞（therapeutic  T  cells）の画像化ができるようにする。ＣＤ１９ｔの同時発現は、治療用細胞を選択的に除去し、それにより自殺スイッチとして機能するための、臨床的に利用可能な抗体及び／又は免疫毒素試薬を使用する、導入された細胞の生体内（in  vivo）での免疫学的標的化のためのマーカーを提供する。
【００５０】
本明細書に記載のＣＡＲは、当分野において知られる任意の手段によって産生されてもよいが、好ましくは、それは組換えＤＮＡ技術を使用して産生される。キメラレセプターのいくつかの領域をエンコードする核酸は、便利であるように、当分野において知られる分子クローニングの標準的な技術（ゲノムライブラリースクリーニング、ＰＣＲ、プライマー補助ライゲーション、部位特異的突然変異誘発など）によって、調製され、完全なコード配列に組み立てられてもよい。結果として生じるコード領域は、好ましくは発現ベクターの中に挿入され、適切な発現宿主細胞株、好ましくはＴリンパ球細胞株、最も好ましくは自己Ｔリンパ球細胞株を変換する（transform）ために使用される。
【００５１】
選択されていないＰＢＭＣ又は富化された（enriched）ＣＤ３  Ｔ細胞又は富化されたＣＤ３又はメモリーＴ細胞サブセットを含む、患者から単離された様々なＴ細胞サブセットは、ＣＡＲ発現のためにベクターを用いて導入され得る。セントラルメモリーＴ細胞は、一つの有用なＴ細胞サブセットである。セントラルメモリーＴ細胞は、所望のレセプターを発現する細胞を免疫磁気的に（immunomagnetically）選択するために、例えばCliniMACS（登録商標）装置を使用して、ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋細胞を選択することによって、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単離されてもよい。セントラルメモリーＴ細胞について富化された細胞は、例えば、ＣＡＲ、並びに、生体内（in  vivo）検出及び潜在的な生体外（ex  vivo）選択の両方のための非免疫原性の表面マーカーである切断型ヒトＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）の発現を指示するＳＩＮレンチウイルスベクターを用いて導入された、抗ＣＤ３／ＣＤ２８によって活性化されてもよい。活性化／遺伝的に改変されたセントラルメモリーＴ細胞は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５を用いて生体外（in  vitro）で増やされ、次いで凍結保存されてもよい。
【実施例１】
【００５２】
実施例１：ＰＳＣＡを標的とするＣＡＲの構築
図１は、様々なＣＡＲ発現するために使用される、発現ベクターの翻訳領域内の要素（上方のパネル）及び結果として生じるＣＡＲ（下方のパネル）を模式に描写する。ＣＡＲは、ＰＳＣＡを標的とするＭＢ１  ｓｃＦｖを使用した。Ａ１１  ｓｃＦｖは使用されなかったが、適切な代替物である。３つの異なるスペーサーが使用された：ＩｇＧ４（ＥＱ）、これは、ＣＨ３、ＣＨ４及びヒンジ領域を含むＩｇＧ４  Ｆｃ領域を含み、ネイティブなＦｃレセプターへの結合を低下させる二つのアミノ酸置換を有する；ＩｇＧ４（ＨＬ‐ＣＨ３）、これは
ＩｇＧ４（ＥＱ）に類似するが、ＣＨ２ドメインを欠き、ヒンジ領域とＣＨ３領域との間に位置する短いリンカー配列を有する；並びに、短いリンカー配列であるＬ。全３つのスペーサーは、表１に詳細に記載されている。二つの代替的な膜貫通ドメインが使用された：ＣＤ４及びＣＤ２８、両方が表２に詳細に記載されている。二つの代替的な共刺激ドメインが使用された：ＣＤ２８共刺激ドメインのバリアントであるＣＤ２８ｇｇ、及び４−ＩＢＢ。両方が表３に詳細に記載されている。ＣＡＲの全ては、表３にも記載されている、ＣＤ３ζ細胞質シグナリングドメインを含んでいた。ＣＡＲコード配列には、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列、及び表面の、シグナル伝達において機能しない、マーカーとしての切断型ＣＤ１９の同時発現を可能にする切断型ＣＤ１７配列が続いた。
【００５３】
ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞を含むバルクのセントラルメモリーＴ細胞は、表４に描写される６つの異なるＣＡＲのうちの一つを発現するレンチウイルスを用いて導入された。したがって、ＣＡＲは、４‐ＩＢＢ共刺激ドメイン（及びＣＤ４膜貫通ドメイン）又はＣＤ２２ｇｇ共刺激ドメイン（及びＣＤ２８膜貫通ドメイン）のいずれか、及び３つの異なるスペーサードメイン：ＩｇＧ４（ＥＱ）、ＩｇＧ４（ＨＬ‐ＣＨ３）又はＬ（図２においてＥＱ、ΔＣＨ２又はＬと表わされる）のうちの一つ、を含んだ。ＦＡＣＳは、ＣＡＲの検出のためのＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）及び安定性を決定するためのｓｃＦｖの検出のためのタンパク質Ｌを発現するＴ細胞を測定するために、実行された。この分析の結果が、図２に描写されている。
【実施例２】
【００５４】
実施例２：ＰＳＣＡを発現する前立腺癌細胞
二つの異なる前立腺癌腫瘍細胞株、ＰＣ‐３及びＤＵ１４５は、ＰＳＣＡを発現するように操作された。図３Ａは、元の細胞及び操作された細胞並びにＬＣＬ細胞についてのＰＳＣＡ発現データを提供する
【実施例３】
【００５５】
実施例３：様々なＰＳＣＡ標的Ｔ細胞によるＩＮＦγ産生
図３Ｂ‐Ｅは、フローサイトメトリーによって測定された、腫瘍標的（ＤＵ１４５細胞、ＰＣ３細胞、ＰＳＣＡ発現ベクターを用いてトランスフェクトされたＤＵ１４５細胞、又はＰＳＣＡ発現ベクターを用いてトランスフェクトされたＰＣ３細胞）との５時間の共培養に続いての、二つの異なるＣＡＲについてのＩＦＮγ産生データ及びＣＤ１０７ａ脱顆粒データを提供する。図４Ｄ‐Ｅは、ＥＬＩＳＡによって測定された、組み換えＰＳＣＡ又は腫瘍標的を用いた２４時間の培養に続いてのＣＡＲ  Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生についてのデータを提供する。ここでも、４‐ＩＢＢ共刺激ドメインを有するＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを有するＣＡＲよりも少ないＩＦＮγ及びより低いレベルの脱顆粒マーカーを産生することをみることができる。
【００５６】
脱顆粒及び細胞内ＩＦＮγ産生のこの評価は、ＣＤ２２ｇｇ共刺激ドメインを含む全てのＣＡＲは、野生型ＤＵ１４５細胞及び野生型ＰＣ３細胞に対する非特異的活性を提示し、一方で、４‐ＩＢＢ共刺激ドメインを有するＣＡＲｓは、はるかに低い非特異的活性を提示することを明らかにした。加えて、ＣＤ２２ｇｇ共刺激ドメインを含むＣＡＲは、全体的として４‐ＩＢＢ共刺激ドメインを有するＣＡＲｓよりも多くのサイトカインを産生する。
【実施例４】
【００５７】
実施例４：様々なＣＡＲによる細胞死滅
ＣＤ２８共刺激ドメインを有するＣＡＲと４‐ＩＢＢ共刺激ドメインを有するＣＡＲの比較（図３Ａに記載）は、４‐１ＢＢ共刺激ドメインを含むＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓは優れた特異性、増殖及び腫瘍細胞死滅能力を示すことを実証した。この分析の結果は、図４Ａ‐Ｅに示されている。ＰＳＣＡ発現コンストラクトを用いてトランスフェクトされていない細胞のより少ない死滅によって示されるように（図４Ａ）、腫瘍死滅は、ＣＤ２８共刺激ドメインを有するＣＡＲよりも、４‐ＩＢＢ共刺激ドメインを有するＣＡＲに関して、より特異的であった。４‐ＩＢＢを有するＣＡＲはまた、より低いレベルのＰＤ‐１誘導を提示した（図４Ｂ）。死滅及びＰＤ‐１誘導は、腫瘍標的（ＤＵ１４５、ＰＣ‐３、ＤＵ１４５‐ＰＳＣＡ及びＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ）との７２時間の共培養に続いて測定された。図４Ｃは、０．２５：１から４：１のエフェクター：腫瘍（Ｅ：Ｔ）比を用いた腫瘍死滅の分析の結果を示す。図４Ｄは、腫瘍標的との７２時間の共培養に続いての、ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖の分析の結果を描写し、図４Ｅは、腫瘍標的（ＤＵ１４５、左；ＤＵ１４５‐ＰＳＣＡ、右）との１、２又は３日間の共培養に続いてのＣＡＲ  Ｔ細胞における腫瘍死滅及びＰＤ‐１誘導の動態を示す。
【実施例５】
【００５８】
実施例５：ＣＡＲ機能に対するスペーサーの影響
図５Ａ‐Ｂに描写される研究は、スペーサー領域がＣＤ１０７ａ発現（脱顆粒）及びＩＦＮ−γ産生に影響を与え得ることを示す。ここでのＣＡＲは全て、ＣＤ４膜貫通ドメイン及び４‐ＩＢＢ共刺激ドメインを含む。
【実施例６】
【００５９】
実施例６：前立腺癌異種移植及び同所性モデルにおける抗腫瘍効果
上述の二つのＰＳＣＡ‐ＣＡＲ  Ｔは、前立腺癌異種移植及び同所性モデルにおいて効能のある抗腫瘍効果を示す。ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ（２×１０６）細胞は、ＮＳＧ雄マウスに皮下注射され、腫瘍が約３０‐５０ｍｍ３に達したときに、ＣＡＲ  Ｔｃｍ（５×１０６）は腫瘍内に注射され、腫瘍成長がキャリパー測定によって監視された（図６Ａ）。ＤＵ１４５‐ＰＳＣＡ（２×１０６）細胞は、ＮＳＧ雄に皮下注射され、ＣＡＲ  ＰＢＭＣ細胞（５×１０６）細胞は静脈内に送り込まれた（図６Ｂ）。同所性（orthotopic）モデルを作り出すために、ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ（２×１０５）細胞は、ＮＳＧ雄に脛骨内に注射され、ＣＡＲ  ＰＢＭＣ細胞（２×１０６又は５×１０６）は、静脈内に送り込まれた（図６Ｃ）。パネルＢからの各群における腫瘍注射後５８日目における、血液中のＣＡＲ  Ｔ細胞持続性が評価された（図６Ｄ）。
【実施例７】
【００６０】
実施例７：４‐１ＢＢドメインを含むＰＳＣＡ標的ＣＡＲは、ＣＤ２８ドメインと比較して、優れた選択性（selectivity）を示し、Ｔ細胞消耗（exhaustion）を低減する
１Ｇ８（Ａ１１クローン）に由来するヒト化ＰＳＣＡｓｃＦｖ、ΔＣＨ２細胞外スペーサー、ＣＤ３ζ細胞溶解性ドメイン、及びＣＤ１９ｔ細胞トラッカーを含み、それらの共刺激ドメインのみが異なる（４‐１ＢＢ対ＣＤ２８が比較された（図７Ａ）、二つのＰＳＣＡ‐ＣＡＲコンストラクト［Lepinら  2010  Eur  J  Nucl  Med  Mol  Imaging  37:529）。本実施例及び実施例８‐１１は、特に示されない限り、ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞において操作されたＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓを使用した研究を記述する。例えば、異なる開始細胞表面Ｔ細胞表現型を有するセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が、いくつかの研究において使用された（図１２）。
【００６１】
両方のＰＳＣＡ−ＣＡＲｓは、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζと比較してＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζに関してより低いレベルであるにもかかわらず、ｓｃＦｖ及びＣＤ１９ｔのフローサイトメトリー検出によって決定されるように安定して発現された（図７Ｂ）。これらのＣＡＲ  Ｔ細胞は、匹敵するエクスビボＴ細胞増殖動態（図７Ｃ）及び類似の細胞表面Ｔ細胞表現型（図７Ｄ）を提示した。
【００６２】
次に、ＥＦ１αプロモーターの制御下でヒトＰＳＣＡ遺伝子を発現するように安定に操作された、いくつかのヒト前立腺癌細胞株、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ及びＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の腫瘍死滅能力（図８Ａ）。ＰＣ‐３腫瘍細胞も、低抗原密度細胞株（ＰＧＫ１００ｐと表される）を導き出すために、変異体ＰＧＫプロモーター（Frigaultら、2015  Cancer  Immunol  Res  3:356）によって駆動されるＰＳＣＡを用いて操作された。ＬＡＰＣ‐９は、内因的にＰＳＣＡを発現する、骨転移性前立腺癌を有する患者に由来する原発腫瘍異種移植片（primary  tumor  xenograft）である（Craftら、1999  Cancer  Res  59:503）。ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ又はＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、様々な腫瘍標的と共培養された。細胞画像化は、両方のＣＡＲｓが類似の動態で死滅させたことを定性的に示した（図８Ｂ）。別の腫瘍死滅アッセイにおいて、フローサイトメトリーは、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ及びＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞による腫瘍死滅を定量化するために使用された。ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ及びＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の両方が、同様の有効性でＰＳＣＡ発現腫瘍細胞を死滅させたが、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζは、野生型非ＰＳＣＡ発現ＤＵ１４５及びＰＣ‐３腫瘍細胞の標的化を示した（図８Ｃ）。ＰＳＣＡ発現の定量的リアルタイムＰＣＲ分析は、全ての腫瘍標的に対して実行され、野生型ＤＵ１４５及びＰＣ‐３細胞においてＰＳＣＡタンパク質の発現がフローサイトメトリーによって検出不能であったが、これらの株においてｍＲＮＡ発現が検出され（図１３）、それがＣＤ２８含有ＣＡＲｓ（CD28-containing  CARs）による標的化に寄与した可能性が高いことを示した。
【００６３】
代替的なＰＳＣＡ  ｓｃＦｖ、ＭＢ１［３３］の影響が調べられた。（図１４Ａ）。ＭＢ１及びＡ１１ベースの４‐１ＢＢを含むＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓの両方が同様の安定性で発現された（図１４Ｂ）が、ＭＢ１  ｓｃＦｖ含有ＣＡＲｓは、Ａ１１  ｓｃＦｖ含有ＣＡＲｓと比較して、野生型腫瘍細胞の有意な標的化を示した（図１４Ｃ）。これらのデータは、抗原標的化及び共刺激ドメインがＣＡＲｓの腫瘍選択性を提供するために一斉に働く（work  in  concert）こと、並びに一つのドメインの非選択性が、他のドメインによって駆動される選択性に優先し得る（override）ことを示唆している。
【００６４】
強化された選択性及び野生型非ＰＳＣＡ発現腫瘍細胞の死滅の欠如に加えて、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、プログラム死‐１（ＰＤ‐１）の低減された発現によって示されるように、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、より少ない消耗（exhaustion）の形跡を提示した（図８Ｄ）。ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζとＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζとの間のＰＤ‐１発現の差異は、主にＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ８＋サブセットにおいて見られた（図８Ｅ）。加えて、同様の傾向は、より低い頑健性にかかわらず、ＬＡＧ３及びＴＩＭ３を含む他の消耗マーカーによっても観察された（データは示されていない）。
【００６５】
腫瘍細胞との共培養の１、２及び３日における、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ及びＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζの死滅能力がＰＤ‐１発現の動態を調べるために使用された、時系変化死滅アッセイ（図８Ｆ）。これらのデータは、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ及びＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζがＤＵ１４５‐ＰＳＣＡを等しく死滅させることを定量的に確認したが、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζはより高いＰＤ‐１発現を有した。
【００６６】
他の研究において、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ及びＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζは、低ＰＳＣＡ発現腫瘍株（ＰＣ‐３‐ＰＧＫ１００ｐ）及び高ＰＳＣＡ発現腫瘍株（ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ）に対して、様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で共培養された。この研究は、より低いＥ：Ｔ比では、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζは、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζと比較して、高ＰＳＣＡ発現腫瘍細胞に関してより選択的であったことを示した（図８Ｇ）。同様の発見は、ＰＢＭＣ由来又はＴＣＭ由来のＰＳＣＡ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞のいずれを使用しても観察された（データは示されていない）。あわせて、これらのデータは、４‐１ＢＢ共刺激が、ＰＳＣＡ発現が低い方の細胞に対する活性を最小化しながら、高ＰＳＣＡ発現腫瘍細胞の効能があり且つ選択的な死滅を可能にし、一方ではＣＤ２８含有ＣＡＲｓはそのような標的化選択性を欠くことを示唆する。
【実施例８】
【００６７】
実施例８：４‐１ＢＢ含有ＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓは、ＣＤ２８含有ＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓと比較して、減衰されるが選択的なサイトカイン産生を示す
ＣＤ２８含有ＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓと４‐１ＢＢ含有ＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓとの間の差異を更に調べるために、それらのそれぞれのＴ細胞活性化及びサイトカイン産生を比較するための研究が行われた。これらの研究は、ＤＵ１４５‐ＰＳＣＡ腫瘍細胞との一晩の共培養に続いての、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較したＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生の有意な減衰を明らかにした（図９Ａ）。サイトカイン産生の同様の減衰は、ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡに対する４‐１ＢＢ含有ＣＡＲｓについても観察された。ＣＤ２８含有ＰＳＣＡ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞は、低ＰＳＣＡ発現腫瘍細胞及び高ＰＳＣＡ発現腫瘍細胞に対して同等のＩＦＮγレベルを産生したが、４‐１ＢＢ含有ＣＡＲ  Ｔ細胞は、低ＰＳＣＡ発現腫瘍細胞に対してより低いＩＦＮγを産生した（図９Ｂ）。腫瘍細胞によるサイトカイン産生に対する潜在的な非ＣＡＲ媒介効果を除外するために、プレート結合組換えヒトＰＳＣＡタンパク質に対するＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞による同様のＩＦＮγ測定が実行された。ＣＤ２８含有ＣＡＲ  Ｔ細胞は、低レベル又は高レベルのＰＳＣＡに対して飽和応答を示したが、４‐１ＢＢ含有ＰＳＣＡ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生は、抗原密度に左右された（図９Ｃ）。同様のサイトカイン応答は、ＰＳＣＡ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞を生成するために使用されるＴ細胞サブセットから独立して観察された（図１５）。
【００６８】
４‐１ＢＢ含有ＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓは、ＰＳＣＡ発現腫瘍細胞に対するＣＤ１０７ａ脱顆粒において、ＣＤ２８含有ＣＡＲｓと比較してわずかな減少を示した（図９Ｄ及び図９Ｅ）。ＣＤ１０７ａ発現によって測定される、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζによる非ＰＳＣＡ発現腫瘍細胞の有意な標的化が観察された。ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ及びＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化状態は、３日間の腫瘍死滅アッセイにおける４‐１ＢＢ（ＣＤ１３７）発現によって測定されたときに匹敵するものであった（図９Ｆ）。ＰＳＣＡ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞の差異がＴ細胞活性の固有欠陥（intrinsic  defect）ではなく抗原標的化によるものであることを確かにするために、我々は、プレート結合抗ヒトＣＤ３抗体、ＯＫＴ３を用いて刺激されたＴ細胞における同様の活性化（ＣＤ１３７）及び消耗（ＰＤ‐１）を確認した（図１６）。
【実施例９】
【００６９】
実施例９：ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、皮下前立腺癌モデルにおいて頑健な治療効果を示す
この研究において、皮下ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ腫瘍を有するマウスは、５×１０６のＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の単一の腫瘍内注射を用いて処置された。腫瘍内Ｔ細胞注射に続いて、２週間以内に完全な腫瘍退縮（regression）が観察された。腫瘍退縮は３０日以上にわたって明白であったが、原発腫瘍と同様の動態を有する動物の大部分において腫瘍がやがて再発した（図１７Ａ）、我々は以下でこれに取り組むであろう。ＣＡＲ  Ｔ細胞の全身療法がこの固形腫瘍モデルにおいて達成可能であったかどうかを確立するために、様々な投与量のＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が静脈内に送り込まれた。５×１０６のＰＳＣＡ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞が腫瘍の完全な退縮を示したが、０．２５ｘ１０６の小さなＣＡＲ投与量においては、同様であるが遅延した治療効果が観察された（図１０Ａ）。この発見を大きな腫瘍の負担（large  tumor  burden）にまで広げるために、大きなＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ腫瘍（約５００ｍｍ３）は、５×１０６のＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の単一の静脈内注射を用いて処置された。ここで、急速な腫瘍退縮が観察された（図１０Ｂ）。ヒトＴ細胞の有意な腫瘍浸潤はＣＡＲ  Ｔ細胞注入に続いて１１日目に観察され（図１０Ｃ、上方のパネル）、それはまた、Ｔ細胞活性のマーカーであるグランザイムＢも発現した（図１０Ｄ、下方のパネル）。モック処理されたマウスからの腫瘍は、同じ時点でヒトＴ細胞又はグランザイムＢ発現をほとんど示さなかった。
【００７０】
単一の抗原特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞治療に続く再発は、固形腫瘍の不均一な抗原プロファイル（heterogenic  antigen  profile）を与えられると予想される現象であり得るが、抵抗／再発の根底にある機構は未だ探究されている。図１０Ａで観察された遅延された腫瘍再発をよりよく理解するために、免疫組織化学は、腫瘍細胞上の抗原の継続的な存在及びＰＳＣＡ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性を評価するために使用された。興味深いことに、モック処置された腫瘍はＰＳＣＡに関して高度に陽性であったが、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞処置に続いて再発した腫瘍はＰＳＣＡ陰性であった（図１７Ｂ、上方のパネル）。しかしながら、同じ再発腫瘍において、ヒトＴ細胞は、これらの腫瘍はＣＡＲ  Ｔ細胞注入の少なくとも２ヶ月後に採取されたにもかかわらず、豊富であった（図１７Ｂ、中間のパネル）。ＰＣ‐３細胞も生体外（in  vitro）でＨＥＲ２を発現し（図１７Ｃ）、モック処置及びＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ処置された再発腫瘍の両方が、生体内（in  vivo）で同等のレベルでＨＥＲ２を発現したことが確認された（図１７Ｂ、下方のパネル）。腫瘍がＰＳＣＡ陰性であり、且つ依然としてＣＡＲ  Ｔ細胞治療に対して感受性であるかどうかを決定するために、再発腫瘍は、モック、ＰＳＣＡ指向性又はＨＥＲ２指向性のＣＡＲ  Ｔ細胞のいずれかを用いた腫瘍内注射によって処置された。再発性のＰＳＣＡ陰性腫瘍はＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓに対して非応答性であったが、それらはＨＥＲ２‐ＣＡＲ  Ｔ細胞処置に対して感受性であった（図１７Ｄ）。
【実施例１０】
【００７１】
実施例１０：ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、骨に通行（traffic）し、骨転移性前立腺癌において抗腫瘍効果を提示する
細胞免疫療法にとっての主要な障害の一つは、固形腫瘍におけるＴ細胞の有効な輸送及び生存を妨げる免疫抑制的な微小環境である。骨転移性前立腺腫瘍における輸送及び抗原依存性ＣＡＲ  Ｔ細胞増殖を直接的に評価するために、ホタルルシフェラーゼ標識されたＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、脛骨内野生型ＰＣ‐３（解剖学的右脛骨）腫瘍及びＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ（解剖学的左脛骨）腫瘍を有するマウスに静脈内注射された。興味深いことに、モック及びＰＳＣＡ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞は両方の腫瘍に対して等しい初期の輸送を示したが（Ｔ細胞注入の４時間後）、ＰＳＣＡ‐ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｔ細胞注射に続いて第１日目にＰＳＣＡ発現腫瘍において優勢に見出され、それは４日間の動的画像化にわたって増大し（図１０Ｄ）、ＰＳＣＡ陽性腫瘍における抗原依存性の輸送及び／又はＣＡＲ  Ｔ細胞増殖を示している。次に、ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ腫瘍細胞が脛骨内空間の中に注入された研究が行われた。腫瘍移植後１４日目に、これらの癌を有するマウスは、段階的に減少する投与量（dose  de-escalation）のＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（０．５×１０６から５×１０６）を用いて静脈内処置された（図１０Ｅ）。５×１０６又は２．５×１０６のＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて処置された大多数のマウスは完全な腫瘍退縮を示したが、１×１０６又は０．５×１０６のＣＡＲ  Ｔ細胞のいずれかを用いて処置されたマウスは、より不均一な治療応答を有した（図１０Ｆ）。同所性研究からの有効な投与量が、０．２５×１０６の小さなＣＡＲ  Ｔ細胞投与量を用いて完全な退縮が観察された皮下モデルにおいて使用される投与量と比較された場合に、このモデルの臨床的関連性（clinical  relevance）は明らかである。これらのモデルにおいて観察される全体的な治療における食い違い（discrepancy）は、これらの腫瘍微小環境におけるＣＡＲ  Ｔ細胞の浸潤及び生存の差によるものである可能性が高い。
【実施例１１】
【００７２】
実施例１１：４‐１ＢＢ共刺激は、臨床的に関連する骨転移性前立腺癌モデルにおいて、ＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓの優れた持続性、及び耐久性のある抗腫瘍応答を提供する
上記の研究は、内因性ＰＳＣＡ発現骨転移性前立腺癌患者由来の腫瘍異種移植片、ＬＡＰＣ‐９を使用して拡張された。腫瘍移植後１４日目に、５×１０６のＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の単一の静脈内注射によって処置されたマウスは、脛骨内の腫瘍部位において腫瘍のほぼ完全な退縮を示した（図１１Ａ）。脛骨内の腫瘍は効果的に標的化されていたが、ＬＡＰＣ‐９腫瘍は体内の他の部位に播種され、それは、免疫組織化学によって確認されたときに様々なリンパ節（腋窩部及び鼠径部）並びに胸腺において特に明白であることが見出された（データは示されていない）。これらは、骨における初期の腫瘍退縮後数週間にわたって見かけ上成長したが、それらは、最終的にＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞によって根絶された。
【００７３】
ＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓの完全な抗腫瘍活性のための持続性のＴ細胞に対する要求に基づいて、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は４‐１ＢＢ共刺激ドメインのいずれかを含むＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓを比較する研究が行われた。ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ及びＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の両方が骨転移の劇的な退縮を示したが、ＣＤ２８含有ＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓを受容したマウスは転移性疾患ばかりでなく原発腫瘍部位における再発も示し、一方では４‐１ＢＢ含有ＰＳＣＡ‐ＣＡＲ処置されたマウスは完全な抗腫瘍応答を示した（図１１Ａ及び図１１Ｂ）。ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞処置されたマウスにおける腫瘍再発は、ＣＡＲ  Ｔ細胞処置後７６日目に血液中のＰＳＡレベルを定量化することによって確認された（図１０Ｃ）。ＣＡＲ  Ｔ細胞は処置された動物の血液中で定量化され、ＣＡＲ  Ｔ細胞は腫瘍注射後２４日目に両方の群において観察されたが、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζＣＡＲ  Ｔ細胞は７６日目に有意により豊富であり、より大きな持続性を示す（図１０Ｄ）。全体的に、これらの研究は、前立腺癌の同所性骨転移モデルを含む、複数の腫瘍系において、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞による、効能があり且つ耐久性のある抗腫瘍効果を示す。
【実施例１２】
【００７４】
実施例１２：ＣＡＲの発現のために使用されたｅｐＨＩＶ７の構築及び構造
ｐＨＩＶ７プラスミドは、様々なＣＡＲ発現ベクターがシティ・オブ・ホープ（ＣＯＨ）のＴ細胞治療研究所（ＴＣＴＲＬ）において導き出された、元のプラスミドである。ＣＡＲの発現に使用されたｅｐＨＩＶ７ベクターは、ｐＨＩＶ７ベクターから産生された。重要なことに、このベクターは、ＣＡＲの発現を駆動するためにヒトＥＦ１プロモーターを使用する。ベクターの５’配列及び３’配列の両方は、以前にＨＸＢｃ２プロウイルスから導き出されたように、ｐｖ６５３ＲＳＮから導き出された。ポリプリントラクトＤＮＡフラップ配列（ｃＰＰＴ）は、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙからのＨＩＶ‐１系統ｐＮＬ４‐３から導き出された。ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列は以前に記述されている。
【００７５】
ｐＨＩＶ７の構築は、以下のように実行された。簡潔に、介在ＳＬ３−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）とともにｇａｇ−ｐｏｌプラス５’及び３’末端反復配列（ＬＴＲｓ）から６５３ｂｐを含む、ｐｖ６５３ＲＳＮは、以下のようにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングされた：ステップ１において、５’ＬＴＲからｒｅｖ‐応答配列（ＲＲＥ）までの配列はｐ５’ＨＩＶ−１５１を作製し、次いで５’ＬＴＲがＴＡＴＡボックスの上流の配列を除去することによって改変され、最初にＣＭＶエンハンサーに連結され（ligated）、次いでＳＶ４０複製開始点（origin  of  replication）連結された（ｐ５’ＨＩＶ‐２）。ステップ２において、３’ＬＴＲをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングしてｐ３’ＨＩＶ−１を作製した後に、３’ＬＴＲエンハンサー／プロモーターにおける４００ｂｐ削除が行われ、ＨＩＶ  Ｕ３におけるシス調節エレメントを除去し、ｐ３’ＨＩＶ‐２を形成した。ステップ３において、ｐＨＩＶ‐３を作製するために、ｐ５’ＨＩＶ‐３及びｐ３’ＨＩＶ‐２から単離された断片が結合された。ステップ４において、ｐ３’ＨＩＶ‐３を生成するために、ｐ３’ＨＩＶ‐２が余分な上流のＨＩＶ配列を除去することによって更に改変され、また、ｐ３’ＨＩＶ‐４を作製するために、ＷＰＲＥを含む６００ｂｐのＢａｍＨＩ‐ＳａｌＩ断片がｐ３’ＨＩＶ‐３に加えられた。ステップ５において、て、ｐＨＩＶ‐６を作製するために、ｐＨＩＶ‐３ＲＲＥはＰＣＲによりサイズを減少され、ｐＨＩＶ‐３からの５’断片（示さず）及びｐ３’ＨＩＶ‐４に連結された。ステップ６において、ｐＨＩＶ‐７を作製するために、ＨＩＶ‐１  ｐＮＬ４‐３（５５）由来のｃＰＰＴ  ＤＮＡフラップ配列を含む１９０ｂｐのＢｇｌＩＩ‐ＢａｍＨＩ断片は、ｐＮＬ４‐３から増幅され、ｐＨＩＶ６のＲＲＥ配列とＷＰＲＥ配列の間に配置された。この元のプラスミドｐＨＩＶ７‐ＧＦＰ（ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質）は、４プラスミド系を使用して元のベクターをパッケージングするために使用された。
【００７６】
パッケージングシグナル、ｐｓｉΨ、は、ベクターへのウイルスゲノムの効率的なパッケージングのために要求される。ＲＲＥ及びＷＰＲＥは、ＲＮＡ転写物の輸送及び導入遺伝子の発現を増強する。フラップ配列は、ＷＰＲＥと組み合わせて、哺乳動物細胞におけるレンチウイルスベクターの導入効率を増強することが実証されている。
【００７７】
ヘルパー機能（ウイルスベクターの産生のために要求される）は、組換えによる複製コンピテントレンチウイルスの生成の可能性を減少させるために、３つの別個のプラスミドに分割された：１）ｐＣｇｐはウイルスベクターアセンブリのために要求されるｇａｇ／ｐｏｌタンパク質をエンコードする；２）ｐＣＭＶ‐Ｒｅｖ２は、効率的なパッケージングのためのウイルスゲノムの輸送を助けるためにＲＲＥ配列に作用する、Ｒｅｖタンパク質をエンコードする；３）ｐＣＭＶ‐Ｇは、ウイルスベクターの感染性のために要求される、水疱性口内炎（vesiculo-stomatitis）ウイルス（ＶＳＶ）の糖タンパク質をエンコードする。
【００７８】
ｐＨＩＶ７にエンコードされたベクターゲノムとヘルパープラスミドとの間に最小限のＤＮＡ配列相同性が存在する。相同性の領域は、ｐＣｇｐヘルパープラスミドのｇａｇ／ｐｏｌ配列中に位置する、約６００ヌクレオチドのパッケージングシグナル領域；全３種のヘルパープラスミド中のＣＭＶプロモーター配列；及び、ヘルパープラスミドｐＣｇｐ中のＲＲＥ配列を含む。複数の組換え事象を要求するので、これらの領域の相同性のために複製コンピテント組換えウイルスが生成される可能性は極めて低い。加えて、如何なる結果として生じる組換え体も、レンチウイルス複製のために要求される機能的ＬＴＲ及びｔａｔ配列を有していないであろう。
【００７９】
ＣＭＶプロモーターがＥＦ１α‐ＨＴＬＶプロモーター（ＥＦ１ｐ）によって置き換えられ、新しいプラスミドがｅｐＨＩＶ７と名付けられた。ＥＦ１ｐは、５６３ｂｐを有し、ＣＭＶプロモーターが切除された後に、ＮｒｕＩ及びＮｈｅＩを使用してｅｐＨＩＶ７に導入された。
【００８０】
野生型ウイルスの病原性に必要であり、標的細胞の増殖性感染のために要求されるｇａｇ／ｐｏｌ及びｒｅｖを除くレンチウイルスゲノムは、この系から除かれている。加えて、ＣＬＲＸ‐ＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）‐ＣＤ２８‐ゼータ‐Ｔ２ＡＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７ベクターコンストラクトはインタクトな３’ＬＴＲプロモーターを含まず、そのため、標的細胞における、結果として生じ発現及び逆転写されるＤＮＡプロウイルスゲノムは、不活性なＬＴＲｓを有するであろう。この設計の結果として、一切のＨＩＶ‐１由来の配列はプロウイルスから転写されず、治療用の配列のみがそれぞれのプロモーターから発現されるであろう。ＳＩＮベクターにおけるＬＴＲプロモーター活性の除去は、宿主遺伝子の意図しない活性化の可能性を有意に減少させると予想される。
【実施例１３】
【００８１】
実施例１３：Ｔ細胞の導入のためのベクターの産生
ＣＡＲを発現する各プラスミドについて、十分な量のプラスミドＤＮＡを産生するために発酵槽に接種する（inoculate）ために使用される、シードバンクが生成された。プラスミドＤＮＡは、レンチウイルスベクターの産生におけるその使用に先立って、同一性、無菌性及びエンドトキシンについて試験された。
【００８２】
簡潔に、細胞は、無菌性及びウイルス汚染が存在しないこと確認するために試験された２９３Ｔ作業細胞（ＷＣＢ）から増やされた。２９３Ｔ  ＷＣＢからの２９３Ｔ細胞のバイアルが解凍された。ベクター産生及び細胞トレイン維持のために適切な数の１０層細胞ファクトリー（ＣＦｓ）を蒔くために十分な数の細胞が存在するまで、細胞は生育され及び増やされた。単一の細胞のトレインが産生のために使用されてもよい。
【００８３】
レンチウイルスベクターは、１０ＣＦｓまでのサブバッチで産生された。同じ週に２つのサブバッチを産生されてもよく、約２０Ｌのレンチウイルス上清／週の産生につながる。一つのロットの産物を産生するために、全てのサブバッチから生成された物質は、下流の処理段階の間プールされた。２９３Ｔ細胞は、２９３Ｔ培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）中でＣＦｓ中に蒔かれた（plated）。ファクトリーは、３７℃のインキュベーター内に置かれ、ＣＦの全層上に細胞の均一な分布を得るために水平にならされた。２日後、細胞は、Ｔｒｉｓ：ＥＤＴＡ、２Ｍ  ＣａＣｌ２、２Ｘ  ＨＢＳ、及び４つのＤＮＡプラスミドの混合物を伴う、ＣａＰＯ４法を使用して、上述の４つのレンチウイルスプラスミドを用いてトランスフェクトされた。トランスフェクションの３日後、分泌されたレンチウイルスベクターを含む上清は、回収され、精製され、濃縮された。上清がＣＦｓから除去された後に、生産最終細胞が各ＣＦから回収された。細胞は各ファクトリーからトリプシン処理され、遠心分離により回収された。細胞は凍結培地に再懸濁され、凍結保存された。これらの細胞は、複製コンピテントレンチウイルス（ＲＣＬ）試験のために後に使用された。
【００８４】
ベクターを精製及び製剤化（formulate）するために、粗製上清は細胞片を除去するための膜濾過によって清澄化された。宿主細胞ＤＮＡ及び残留プラスミドＤＮＡは、エンドヌクレアーゼ消化（Benzonase（登録商標））によって分解された。ウイルス上清は０．４５μｍのフィルターを使用して細胞片から清澄化された。清澄化された上清は予め秤量した容器に回収され、その中にBenzonase（登録商標）を加えられた（最終濃度５０Ｕ／ｍＬ）。残留プラスミドＤＮＡ及び宿主ゲノムＤＮＡのエンドヌクレアーゼ消化は、３７℃で６時間実行された。最初の接線流限外濾過（ＴＦＦ）濃度のエンドヌクレアーゼ処理された上清は、ウイルスを約２０倍濃縮しながら、粗製上清から残留低分子量成分を除去するために使用された。清澄化されたエンドヌクレアーゼ処理ウイルス上清は、フラックス速度（flux  rate）を最大化しながら、せん断速度を約４，０００秒−１又はそれ以下に維持するように設計された流速で、５００ｋＤのＮＭＷＣＯを有する中空繊維カートリッジを通して循環させられた。ヌクレアーゼ処理された上清のダイアフィルトレーションは、カートリッジの性能を維持するために濃縮プロセスの間に開始された。ダイアフィルトレーション緩衝液としてのＰＢＳ中に４％ラクトースを使用して、８０％透過物置換率が確立された。ウイルス上清は標的体積にされて、粗製上清の２０倍濃度を示し、ダイアフィルトレーションは１００％の透析液置換率で４回の追加交換容量にわたって続けられた。
【００８５】
ウイルス産物の更なる濃縮は、高速遠心分離技術を使用することによって達成された。レンチウイルスの各サブバッチは、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−２６  ｐｌｕｓ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅを６０００ＲＰＭ（６，０８８ＲＣＦ）、６℃、１６‐２０時間で使用してペレット化された。次いで、各サブバッチからのウイルスペレットは、ＰＢＳ中の４％ラクトースで５０ｍＬ体積に再構成された。この緩衝液中の再構成されたペレットは、ウイルス調製のための最終製剤を代表する。ベクター濃縮プロセス全体は、約２００倍の体積減少をもたらした。全てのサブバッチの完了に続き、次に物質は−８０℃に置かれ、その間に各サブバッチからの試料が無菌性について試験された。サンプル無菌性の確認に続き、サブバッチを頻繁に撹拌しながら３７℃で急速に解凍された。次いで、物質はプールされ、クラスＩＩ型Ａ／Ｂ３バイオセーフティーキャビネット内でウイルスベクタースイートに手動で分注された。無菌ＵＳＰクラス６、雄ネジＯリングクリオバイアル内の、１ｍＬの濃縮レンチウイルスの充填構成が使用された。ＣＯＨの応用技術開発センター（ＣＡＴＤ）の品質システム（ＱＳ）は、ＣＢＧのための方針と標準的な運用手順に従い、現在のグッド・マニュファクチャリング・プラクティス（ｃＧＭＰｓ）に従って全ての資料をリリースした。
【００８６】
レンチウイルスベクター調製物の純度を確実にするために、それは、残留宿主ＤＮＡ汚染物質、並びに残留宿主及びプラスミドＤＮＡの移入について試験された。他の試験の中でも、正しいベクターが存在することを確実にするために、ＲＴ‐ＰＣＲによってベクター同一性が評価された。全ての放出基準は、この研究での使用を意図したベクターについて満たされた。
【実施例１４】
【００８７】
実施例１４：ＰＳＣＡを標的とするＣＡＲの発現に適したＴ細胞の調製
Ｔリンパ球は、白血球フェレーシスによって患者から得られ、適切な同種又は自己のＴ細胞サブセット、例えばセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）がＣＡＲを発現するように遺伝的に変更され、次いで抗癌治療を達成するために、任意の臨床的に許容される手段によって患者に投与して戻された。
【００８８】
適切なＴＣＭは、以下のように生成されてもよい。合意された研究参加者から得られたアフェレーシス産物は、フィコール処理され（ficolled）、洗浄され、一晩インキュベートされる。次いで細胞は、ＧＭＰ等級の抗ＣＤ１４、抗ＣＤ２５及び抗ＣＤ４５ＲＡ試薬（Miltenyi  Biotec）及びＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）分離装置を使用して、単球、調節性Ｔ細胞及びナイーブＴ細胞集団を枯渇させる。枯渇に続いて、陰性画分細胞（negative  fraction  cells）は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）分離装置上でＤＲＥＧ５６‐ビオチン（ＣＯＨ臨床等級）及び抗ビオチンマイクロビーズ（Miltenyi  Biotec）を使用して、ＣＤ６２Ｌ＋ＴＣＭ細胞について富化される（enriched）。
【００８９】
富化に続いて、ＴＣＭ細胞は、完全Ｘ−Ｖｉｖｏ１５プラス５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ‐２及び０．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ‐１５中に処方され、テフロン（登録商標）細胞培養バッグに移され、Ｄｙｎａｌ  Ｃｌｉｎ（商標）Ｖｉｖｏ  ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて刺激される。刺激後の最大５日目まで、細胞は、１．０から０．３の感染多重度（ＭＯＩ）で所望のＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターを用いて導入される。培養は、細胞増殖のための要求に応じた完全Ｘ‐Ｖｉｖｏ１５並びにＩＬ‐２及びＩＬ‐１５サイトカインの追加を伴い（細胞密度を３×１０５と２×１０６生存細胞／ｍＬの間に保ち、サイトカイン補充は培養の毎週月曜日、水曜日及び金曜日）、最大で４２日間維持される。細胞は、典型的には、２１日以内にこれらの条件下で約１０９細胞まで増える。培養期間の終わりに、細胞は採取され、２回洗浄され、臨床等級の凍結保存培地（Cryostore  CS5,  BioLife  Solutions）中に処方される。
【００９０】
Ｔ細胞注入の日に、凍結保存及び放出された産物は、解凍され、洗浄され、再輸液のために処方される。放出された細胞産物を含む低温保存バイアルは、液体窒素貯蔵から取り出され、解凍され、冷却され、ＰＢＳ／２％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）洗浄緩衝液で洗浄される。遠心分離後、上清は除去され、細胞は保存料無添加の通常生理食塩水（ＰＦＮＳ）／２％ＨＳＡ輸液希釈液（infusion  diluent）に再懸濁される。品質管理試験のために試料が取り出される。
【００９１】
実施例７‐１１において使用される技術
細胞株：ヒト転移性前立腺癌細胞株ＤＵ１４５（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ‐８１）及びＰＣ‐３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ‐１４３５）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Hyclone）を含むＲＰＭＩ‐１６４０（Lonza）、並びに１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び０．２５μｇ／ｍＬのファンギゾンを含む１Ｘ抗生物質‐抗真菌剤（Gibco）（完全ＲＰＭＩ）中で培養された。ヒト線維肉腫細胞株、ＨＴ１０８０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ‐１２１）、及びヒト胎性腎臓細胞、２９３Ｔ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−３２１６）は、１０％ＦＢＳ、１Ｘ抗生物質‐抗真菌剤、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Irvine  Scientific）、及び２ｍＭ  Ｌ‐グルタミン（Fisher  Scientific）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Life  Technologies)）（完全ＤＭＥＭ）中で培養された。ヒト前立腺癌異種移植片ＬＡＰＣ‐９（Robert  Reiter博士、ＵＣＬＡからの親切な贈り物）は、２０％ＦＢＳ及び１Ｘ抗生物質‐抗真菌剤を含有するイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、Irvine  Scientific）（完全ＩＭＤＭ）中で培養された。ＬＡＰＣ‐９細胞は雄のＮＯＤ．Ｃｇ‐Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊ１／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス内で継代培養され、単一細胞懸濁液は、以前に記載されたように調製された（Craftら、1999  Cancer  Res  59:5030）。簡潔には、腫瘍組織が採取され、ペトリ皿で細かく刻まれ、１％プロナーゼＥ（Roche）を用いて消化された。完全ＩＭＤＭによる洗浄に続き、単一細胞懸濁液は、４０μｍ細胞ストレーナ（Falcon）を通して濾過され、再度洗浄され、直ちに凍結された。ＥＢＣＬ転換リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）、並びに膜係留ＣＤ３イプシロン特異的ｓｃＦｖアゴニストＯＫＴ３（ＬＣＬ‐ＯＫＴ３（Wangら、2011  Blood  117:1888）を含むＬＣＬ細胞は、完全ＲＰＭＩ中で培養された。全ての細胞は３７℃、５％ＣＯ２で培養された。ＤＵ１４５及びＰＣ‐３細胞は、ＳＴＲプロファイリングによって認証され、マイコプラズマ陰性を確認された（DDC  Medical、オハイオ）。
【００９２】
ＤＮＡコンストラクト及びレンチウイルスの産生：ＤＵ１４５及びＰＣ‐３腫瘍細胞は、ＥＦ１αプロモーターの制御下でヒトＰＳＣＡ遺伝子（アクセッション番号：NM_005672.4）を有するｅｐＨＩＶ７レンチウイルスを用いて導入することによって、ＰＳＣＡを発現するように操作された。ＰＳＣＡ＋細胞は、後述されるようにマウス抗ヒトＰＳＣＡ抗体（１Ｇ８）で染色され（‘細胞内／細胞外染色及びフローサイトメトリー’の節を参照）、次いでＦＡＣＳはBD  FACSAria（商標）特別注文Special  Order  Research  Product  (SORP)  cell  sorterを使用して選別された。低ＰＳＣＡ発現の腫瘍細胞の生成のために、ＰＳＣＡ遺伝子は、以前に記載されたように（Frigaultら、2015  Cancer  Immunol  Res  3:356）、ＰＧＫプロモーターの変異型の制御下に置かれた。Ａ１１  ｓｃＦｖ（Lepinら、2010  Eur  J  Nucl  Med  Mol  Imaging  37:529）配列は、Anna  Wu及びRobert  Reiter両博士（ＵＣＬＡ）によって親切にも提供された。ＭＢ１  ｓｃＦｖ配列は、以前に公開された（Feldmannら、2012  J  Immunol  189:3249）。Ｔ２Ａリボソームスキップ配列によって分離された切断型ＣＤ１９遺伝子（ＣＤ１９ｔ）を有するＣＡＲコンストラクトは、ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスバックボーン中にクローニングされた。抗原標的化ドメインは、Ａ１１又はＭＢ１  ｓｃＦｖのいずれかを含んでいた。細胞外スペーサードメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃスペーサーの１２９アミノ酸中長ＣＨ２決失型（ΔＣＨ２）を含んでいた（Jonnalagaddaら、2015  Mol  Ther  23:757）。細胞内共刺激シグナリングドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインを有するＣＤ２８又はＣＤ４膜貫通ドメインを有する４‐１ＢＢのいずれかのそれを含んでいた。ＣＤ３ζ細胞溶解性ドメインは以前に記載されている（Cooperら、2003  Blood  101:1637）。
【００９３】
レンチウイルスは、パッケージングプラスミド及び所望のＣＡＲレンチウイルスバックボーンプラスミドでのトランスフェクションの１日前に、Ｔ−２２５組織培養フラスコに２９３Ｔ細胞をプレーティングすることによって生成された。上清は３日から４日後に回収され、濾過され、遠心分離して細胞片を除去され、混入している核酸を除去するために２ｍＭのマグネシウム及び２５Ｕ／ｍＬのBenzonase（登録商標）エンドヌクレアーゼ（EMD  Millipore）と共にインキュベートされた。上清は合わせられ、４℃で一晩の高速遠心分離（６０８０ｇ）によって濃縮された。次いでレンチウイルスペレットは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）‐ラクトース溶液（ＰＢＳの１００ｍＬあたり４ｇのラクトース）に再懸濁され、アリコートに分けられ、後で使用するために−８０℃で保存された。ＣＤ１９ｔ発現によって決定されるレンチウイルス力価は、ＨＴ１０８０細胞を使用して定量化された。
【００９４】
Ｔ細胞単離、レンチウイルス導入及びエクスビボ増殖：白血球アフェレーシス産物（Leukapheresis  products）は、シティ・オブ・ホープ（ＣＯＨ）の内部審査委員会（ＩＲＨ）の承認を受けたプロトコルの下で、合意された研究参加者（健常ドナー）から得られた。白血球アフェレーシスの当日、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、Ficoll-Paque（GE  Healthcare）上での密度勾配遠心分離、続いてＰＢＳ／ＥＤＴＡ（Miltenyi  Biotec）中での複数回の洗浄によって、単離された。細胞は、室温（ＲＴ）で回転機上に一晩休められ、続いて洗浄され、完全Ｘ−ＶＩＶＯ中に再懸濁された。全ＰＢＭＣを利用する研究のために、細胞は、直ちにCryoStor（登録商標）CS5凍結保存培地（BioLife  Solutions）中で凍結された。最大で５ｘ１０９のＰＢＭＣは、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ２５、及び抗ＣＤ４５ＲＡマイクロビーズ（Miltenyi  Biotec）とともに、ＲＴで３０分間インキュベートされ、CliniMACS（登録商標）システム（Miltenyi  Biotec）を製造者のプロトコルに従って使用して磁気的に枯渇させられた。次いで枯渇したＰＢＭＣは、ビオチン化抗ＣＤ６２Ｌ抗体（シティ・オブ・ホープの生物医学・遺伝センター製）とともに室温で３０分間インキュベートされ、次いで抗ビオチンマイクロビーズ（Miltenyi  Biotec）とともに室温で３０分間更にインキュベートされることによって、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）について富化された。次いでＴＣＭは、autoMACS（登録商標）システム（Miltenyi  Biotec）を用いて製造者のプロトコルに従って使用して、磁気的に富化された。ＴＣＭを利用する研究のために、細胞は、上述のように直ちに凍結された。ＰＢＭＣ及びＴＣＭの純度及び表現型は、フローサイトメトリーによって確認された。
【００９５】
新たに解凍されたＰＢＭＣ又はＴＣＭは、１回洗浄され、１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトＩＬ‐２（rhIL-2、Novartis  Oncology）及び０．５ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ‐１５（rhIL-15、CellGenix）を含む１０％ＦＢＳを含むＸ‐ＶＩＶＯ‐１５（Lonza）（完全Ｘ‐ＶＩＶＯ）中で培養された。ＣＡＲレンチウイルス導入のために、Ｔ細胞は、ビーズ刺激の当日か又は翌日のいずれかに、ＣＤ３／ＣＤ２８  Dynabeads（登録商標）（Life  Technologies）、硫酸プロタミン（APP  Pharmaceuticals）、（上述のような）サイトカイン混合物、及び様々なＭＯＩの所望のレンチウイルスと共に培養された。スピンオキュレーション（Spinoculation）は、ブレーキなしで３２℃、２０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離によって実行された。次いで細胞は、２〜３日毎に新しいサイトカインを含む完全Ｘ‐ＶＩＶＯ中で培養及び補充された。７‐９日後に、ビーズは磁気的に除去され、所望の細胞収率を達成するために、細胞は、サイトカインを含む完全Ｘ‐ＶＩＶＯ中で更に増やされた。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、EasySep（商標）CD19  Positive  Enrichment  KitＩ又はＩＩ（StemCell  Technologies）を製造者のプロトコルに従って使用して、ＣＤ１９ｔについて正に選択された。更なる増殖に続いて、生体外（in  vitro）機能アッセイ及び生体内（in  vivo）腫瘍モデルに先立って、細胞は凍結された。ＣＡＲ  Ｔ細胞の純度及び表現型は、フローサイトメトリーによって確認された。
【００９６】
細胞内／細胞外染色及びフローサイトメトリー：フローサイトメトリー分析のために、細胞は、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳ及び１×抗生物質−抗真菌剤を含み、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、又はフェノールレッド（HBSS-/-,  Life  Technologies）を含有しないハンクス平衡塩類溶液）中に再懸濁された。ＰＳＣＡ染色のために、Robert  Reiter博士、ＵＣＬＡによってマウス抗ヒトＰＳＣＡ抗体（１Ｇ８）が親切にも提供された。ＣＡＲ  ｓｃＦｖを検出するために、ビオチン化タンパク質Ｌ（GenScript  USA）が以前に記載されたように使用された［３５］。細胞は、二次染色に進む前に、暗所で一次抗体とともに４℃で３０分間インキュベートされた。細胞外及び二次染色のために、細胞は、BioLegend、eBioscience、BD  Biosciences又はFisher  Scientificから購入された、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（ＰｅｒＣＰ）、ＰｅｒＣＰ‐Ｃｙ５．５、ＰＥ‐Ｃｙ７、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）及びＡＰＣ−Ｃｙ７（又はＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ７８０）抱合型（conjugated）抗体（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２５、マウス又はヒト特異的ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ９５、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１３７、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３）、ＰＤ‐１（ＣＤ２７９）、ＴＩＭ３（ＣＤ３６６）、ＣＣＲ７、ＩＦＮγ、ヤギ抗マウスＩｇ及びストレプトアビジン）を用いた暗所での４℃、３０分間のインキュベーションに先立って、２回洗浄された。細胞生存率は、４’，６‐ジアミジノ‐２‐フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Sigma）を使用して測定された。細胞内染色のために、細胞は、固定され、透過処理され（permeabilized）、PE  Active-Caspase-3  Apoptosis  kit（BD  Biosciences）製造者のプロトコルに従って処理された。次いで細胞は、フルオロフォア抱合抗体と共に暗所で４℃、３０分間インキュベートされ、ＦＡＣＳ緩衝液中での再懸濁及びMACSQuant   Analyzer  10（Miltenyi  Biotec）上での取得に先立って、２回洗浄された。データは、FlowJo  software（v10,  TreeStar）を用いて分析された。
【００９７】
生体外（In  Vitro）細胞機能アッセイ：脱顆粒アッセイ及び細胞内サイトカインアッセイのために、ＣＡＲ  Ｔ細胞及び腫瘍標的は、丸底９６ウェル組織培養処理プレート（Corning）において外因性サイトカインを含まない完全Ｘ−ＶＩＶＯ中で、様々なエフェクター：標的比で共培養された。ＦＩＴＣ−ＣＤ１０７ａが培養物に添加され、３７℃で４‐６時間インキュベートした後、細胞は固定され、上述のようなフローサイトメトリーによる分析の前に透過処理された。腫瘍死滅アッセイのために、ＣＡＲ  Ｔ細胞及び腫瘍標的は、１‐５日間にわたり、９６ウェルプレートにおいて外因性サイトカインを含まない完全Ｘ−ＶＩＶＯ中で様々なエフェクター：標的比で共培養され、上述のようなフローサイトメトリーによって分析された。ＣＡＲ  Ｔ細胞による腫瘍死滅は、ＣＤ４５陰性細胞計測数をモックＴ細胞によって観察されたものに対して比較することによって計算された。
【００９８】
ＥＬＩＳＡ及びマルチプレックスサイトカインアッセイ：様々な濃度の組換えヒトＰＳＣＡタンパク質（アミノ酸２３‐９５；Abnova）は、高親和性９６ウェル平底プレート（Corning）上で４℃、１ＸＰＢＳ中で一晩コーティングされた。ウェルは１Ｘ  ＰＢＳで２回洗浄され、１０％ＦＢＳで１時間ブロックされ、再度洗浄された。ＣＡＲ  Ｔ細胞（２００μＬ中５×１０３）は、コートされたウェルに加えられた。指定されている場合、腫瘍標的（５×１０３）が非コートウェル中のＴ細胞とともにインキュベートされた（最終容量２００μＬ）。３７℃で一晩のインキュベーションに続いて、上清が採取され、ヒトＩＦＮγ  ELISA  Ready-SET-GO！（登録商標）（eBioscience）製造者プロトコルに従って処理された。プレートは、Wallac  Victor3  1420  Multilabel  Counter（Perkin-Elmer）及びWallac  1420  Workstation  softwareを使用して、４５０ｎｍで読み取られた。代替的に、上清は、Multiplex  Bead  Immunoassay  Kit（Invitrogen）を製造者のプロトコルに従って使用して、複数のサイトカインについて分析された。マウス血清に対するヒトＰＳＡ／ＫＬＫ３  ＥＬＩＳＡ（Abcam）は製造者のプロトコルに従って行われた。
【００９９】
定量的ＰＣＲ：腫瘍細胞（０．２５×１０６／ｍＬでプレーティングされた）は、ＲＮＡ単離の前に１日間培養された。ＲＮＡは、RNeasy（登録商標）Mini  Kit  column  purification（Qiagen）を使用して抽出された。ｃＤＮＡは、SuperScript（商標）IV  First-Strand  Synthesis  System（Invitrogen）を使用して調製された。ＲＮＡプライマーは、ＰＳＣＡ（Hs04166224_g1,  Life  Technologies）又はＧＡＰＤＨ（Hs02758991_g1,  Life  Technologies）のいずれかに特異的な、TaqMan（登録商標）Gene  Expression  Assaysを使用して生成された。ｑＰＣＲは、ViiA（商標）7  Real-Time  PCR  System（Thermo  Fisher）上で実行された。プライマーセットは、単一の融解曲線（melting  curve）ピークを有する特定のダイナミックレンジにわたる標準曲線を使用して検証された。
標的遺伝子の発現は、ＧＡＰＤＨに対して正規化された。
【０１００】
生体内（In  Vivo）腫瘍研究：全ての動物実験は、シティ・オブ・ホープの施設動物ケア及び使用委員会の承認を受けたプロトコルの下で実行された。皮下腫瘍研究のために、ＰＣ‐３及びＤＵ１４５細胞（２．５×１０６）は、ＨＢＳＳ−／−中に調製され、雄ＮＳＧマウスの左脱毛腹部に皮下注射した。腫瘍成長は、キャリパー測定を介して週３回監視された。ひとたび腫瘍体積が５０‐５００ｍｍ３に達すると、ＣＡＲ  Ｔ細胞はＰＢＳ中に調製され、腫瘍内（ｉ．ｔ．）又は静脈内（ｉ．ｖ．）のいずれかに注射された。ひとたび腫瘍が直径１５ｍｍに達するとマウスは安楽死させられ、腫瘍は採取され、後述されるように免疫組織化学のために処理された。皮下腫瘍が再発した場合、マウスは、ＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓ又はＨＥＲ２‐ＣＡＲｓのいずれかを用いた腫瘍内注射によって処置された。末梢血は、ヘパリン処理されたた毛細管（Chase  Scientific）を通して、ヘパリン／ＰＢＳ溶液（１０００単位／ｍＬ、Sagent  Pharmaceuticals）を含むポリスチレンチューブの中に、イソフルラン麻酔したマウスの後眼窩（ＲＯ）出血から収集された。マウス１匹あたり約１５０μＬの血液が収集された。血液は、製造者のプロトコルに従って1X  Red  Cell  Lysis  Buffer（Sigma）を用いて溶解され、次いで洗浄され、染色され、上述されたようにフローサイトメトリーによって分析された。
【０１０１】
同所性脛骨内腫瘍研究のために、ＬＡＰＣ‐９及びＰＣ‐３‐ＰＳＣＡは、強化された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）／ホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）を有するレンチウイルスを用いて導入され、ひとたびマウスに移植されると非侵襲的光学的画像化（Xenogen）することを可能にした（結果として生じた株は、ＬＡＰＣ‐９‐ｅＧＦＰ‐ｆｆｌｕｃ及びＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ‐ｅＧＦＰ‐ｆｆｌｕｃと命名された）。簡潔に、これらの株は、ポリブレン（４ｍｇ／ｍＬ、Sigma）及びｅＧＦＰ‐ｆｆｌｕｃレンチウィルス（上記参照）とともにインキュベートされ、BD  FACSAria（商標）  SORP  cell  sorterを使用したＧＦＰ＋細胞についての細胞選別が続いた。新たに選別されたＬＡＰＣ‐９‐ｅＧＦＰ‐ｆｆｌｕｃ細胞は、上述されたようにＮＳＧマウス内で継代培養された。ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ‐ｅＧＦＰ‐ｆｆｌｕｃ細胞（２×１０５）又はＬＡＰＣ‐９‐ｅＧＦＰ‐ｆｆｌｕｃ細胞（１．５×１０５）は、皮下モデルと同様に調製された。マウスは、腫瘍注射に先立ってケタミン／キシラジン及び気体イソフルランの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって麻酔された。腫瘍細胞（３０μＬのＨＢＳＳ−／−中）は、マウス後肢の脛骨内空間に注射された。１４日後に、マウスは、ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて静脈内注射された。腫瘍成長は、隔週の光学的画像化（IVIS,  Xenogen）を介して監視され、フラックスシグナルはLiving  Image  software（Xenogen）を用いて分析された。画像化のために、マウスは、ＰＢＳ中に懸濁された１５０μＬのＤ‐ルシフェリンカリウム塩（Perkin  Elmer）を用いて、４．２９ｍｇ／マウスで腹腔内注射された。
【０１０２】
Ｔ細胞輸送研究のために、マウスは、右脛骨内空間に野生型ＰＣ‐細胞（２×１０５）を用いて、またび左脛骨内空間にＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ細胞（２×１０５）を用いて、移植された。１４日後に、マウスは、ｅＧＦＰ‐ｆｆｌｕｃを有するレンチウイルスで同時導入された（co-transduced）５×１０６のモック又はＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて静脈内注射された。Ｔ細胞は、ＣＡＲ富化され、フローサイトメトリーによって約３０％ｅＧＦＰ＋であると決定された。Ｔ細胞輸送は、Ｔ細胞注入の４時間後、１日後、２日後及び４日後に、非侵襲的光学的画像化（Xenogen）によって監視された。フラックスシグナルは、上述のように分析された。
【０１０３】
免疫組織化学：腫瘍組織は、４％パラホルムアルデヒド（Boston  BioProducts）中で最大で３日間まで固定され、更なる処理まで７０％エタノール中に保存された。組織学は、シティ・オブ・ホープの組織学コアによって実行された。簡潔に、パラフィン包埋切片（１０μｍ）は、マウス抗ヒトＣＤ３（DAKO）、マウス抗ヒトＰＳＣＡ（Abcam）、ラット抗ヒトＨＥＲ２（DAKO）、及びラット抗ヒトグランザイムＢ（eBioscience）を用いて染色された。画像は、Nanozoomer  2.0HT  digital  slide  scanner及び関連するNDP.view2  software（Hamamatzu）を使用して取得された。
【０１０４】
統計学的分析：特に断らない限り、データは平均±ＳＥＭとして示されている。複数の群の間での統計的比較は、ｐ値を計算するために、不対両側スチューデントｔ検定を使用して実行された。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意ではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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