(57)【要約】担体分子組成物。特定の実施形態は少なくとも１つの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含む担体分子を含み得、該担体分子は、少なくとも１つの疎水性ドメインを含み得、該担体はミセルおよびリポソームの１つ中で生物学的に活性な分子と非共有的に結合する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含む担体分子（当該担体分子は少なくとも１つの疎水性ドメインを含む）を含む組成物であって、該担体は、ミセルおよびリポソームの１つ中で生物学的に活性な分子と非共有的に結合することを特徴とする、組成物。
【請求項２】
該担体分子が両親媒性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
該担体分子が少なくとも１つの炭水化物部分を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
該担体分子が少なくとも１つのアルキル鎖を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
該担体分子が少なくとも３つの疎水性アミノ酸を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
該担体分子が少なくとも１つのフェニルアラニンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
該担体分子がパルミトイル−ｇｌｙｐ−ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号５）、オクタノイル−ｇｌｙｐ−ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号６）、オレイル−ｇｌｙｐ−ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号７）、およびそれらの任意の組み合わせ（ｐは０〜２０の整数である）の１つを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
該担体分子がＦＦＦＩＬＶＦ−ｇｌｙｐ−ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号１）、ＦＬＶＦＦＦ−ｇｌｙｐ−ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号２）、ＫＫＲＰＫＰＧ−ｇｌｙｐ−ＦＬＶＦＦＦ（配列番号３）、およびそれらの任意の組み合わせ（ｐは０〜１０の整数である）からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
該少なくとも１つのＣＰＰが、式（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号８）を有するフラグメント、式（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号９）を有するフラグメント、式（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号１０）を有するフラグメント（下付き文字ｐおよびｑは各々独立して０〜２０の整数である）からなる群から選択されるＨＩＶ−ＴＡＴフラグメント；ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号１７）；ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１５）、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
該生物学的に活性な分子が、ＶＧＶＡＰＧ（配列番号２６）；パルミトイル−ＴＴＳ；レチノイン酸レチニル；レチノイン酸；ステロイドおよびステロイド化合物；ヒドロキノン；ヒアルロン酸；非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えばナプロキセン、イブプロフェン、およびアセトアミノフェン；皮膚引き締めペプチド；光活性化可能な部分および化合物；紫外線（ＵＶ）光を吸収、ブロック、または反射する化合物；ビタミン；コレステロール；神経伝達物質（アセチルコリンなど）の機能を遮断、影響、または妨害する薬物；およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
該生物学的に活性な分子が：Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧからなる群から選択されるボツリヌス毒素血清型；組換えボツリヌス毒素；修飾ボツリヌス毒素；ボツリヌス毒素のフラグメント；およびそれらの任意の組み合わせ；からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
生物学的に活性な分子、および
少なくとも１つの親油性ドメインおよび少なくとも１つの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含む担体分子
を含む組成物であって；
該担体分子はさらに、
少なくとも１つの炭水化物部分、
少なくとも１つのアルキル鎖、
少なくとも三つの疎水性アミノ酸、および
これらの任意の組み合わせ
の１つを含み；
該担体分子と該生物学的に活性な分子は非共有的に結合する、組成物。
【請求項１３】
該担体分子が、パルミトイル−ｇｌｙｐ−ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号５）、オクタノイル−ｇｌｙｐ−ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号６）、オレイル−ｇｌｙｐ−ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号７）、およびそれらの任意の組み合わせ（ｐは０〜２０の整数である）の１つを含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
該担体分子がＦＦＦＩＬＶＦ−ｇｌｙｐ−ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号１）、ＦＬＶＦＦＦ−ｇｌｙｐ−ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号２）、ＫＫＲＰＫＰＧ−ｇｌｙｐ−ＦＬＶＦＦＦ（配列番号３）、およびそれらの任意の組み合わせ（ｐは０〜１０の整数である）からなる群から選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
該少なくとも１つのＣＰＰが式（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号８）を有するフラグメント、式（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号９）を有するフラグメント、式（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号１０）を有するフラグメント（下付き文字ｐおよびｑは各々独立して０〜２０の整数である）からなる群から選択されるＨＩＶ−ＴＡＴフラグメント；ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号１７）；ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１５）、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
該生物学的に活性な分子が、ＶＧＶＡＰＧ（配列番号２６）；パルミトイル−ＴＴＳ；レチノイン酸レチニル；レチノイン酸；ステロイドおよびステロイド化合物；ヒドロキノン；ヒアルロン酸；非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えばナプロキセン、イブプロフェン、およびアセトアミノフェン；皮膚引き締めペプチド；光活性化可能な部分および化合物；紫外線（ＵＶ）光を吸収、ブロック、または反射する化合物；ビタミン；コレステロール；神経伝達物質（アセチルコリンなど）の機能を遮断、影響、または妨害する薬物；およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
該生物学的に活性な分子が：Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧからなる群から選択されるボツリヌス毒素血清型；組換えボツリヌス毒素；修飾ボツリヌス毒素；ボツリヌス毒素のフラグメント；およびそれらの任意の組み合わせ；からなる群から選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１８】
患者にボツリヌス毒素を投与するためのキットであって；
該キットは、
ボツリヌス毒素、
その経皮送達のための有効量の担体分子（該担体分子は少なくとも１つの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含み、かつ、少なくとも１つの疎水性ドメインを含む）、
４．０〜８．３のｐＨを維持するように調整されたｐＨ緩衝系、および
該ボツリヌス毒素、該担体分子、および該ｐＨ緩衝系を含むデバイス（該デバイスは患者の皮膚を介して患者にボツリヌス毒素を投与するのに適合されている）
を含み；
該担体分子は、ミセルおよびリポソームの１つ中で、ボツリヌス毒素と非共有的に結合し；および
該デバイス、該担体分子、該ｐＨ緩衝系、およびその任意の組み合わせの１つは、該ボツリヌス毒素の制御放出を提供するように適合されている、キット。
【請求項１９】
該デバイスが、皮膚パッチである、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
該ボツリヌス毒素、該担体分子、および該ｐＨ緩衝系が、該デバイスに結合された液体、ゲル、クリーム、ローション、および軟膏中に含まれる、請求項１８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、Ｔａｎらの「Carrier Molecule Compositions and Related Methods」と題する、２０１４年１２月８日に出願のされた米国仮特許出願第６２／０８８，８１３号（’８１３仮出願）の出願日の利益を主張し、その開示内容の全ては、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
ＡＳＣＩＩテキスト形式で２０１５年１２月８日に提出されたＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ００３＿ＳＴ２５．ｔｘｔ（２０１５年１２月８日作成。サイズ１１，５１５バイト）の配列表は参照することにより、その全ては本明細書に組み込まれる。
バックグラウンド
【０００３】
技術分野
本明細書の態様は概して、生物学的に活性な分子を送達するために使用される組成物および方法に関する。より具体的な実施形態として、生物学的に活性な分子を経皮的に送達することができる組成物が含まれる。
【背景技術】
【０００４】
バックグラウンド
生物学的に活性な分子は、ヒトまたは動物の体内で様々な生化学的変化を遂行、関与、または開始することができる。例えば、ボツリヌス毒素は、筋肉の麻痺を引き起こし、皮膚のしわを治療するために使用される神経毒として作用する生物学的に活性な分子である。ボツリヌス毒素は、通常、注射によって皮膚に投与される。皮膚の構造、皮膚のしわ、しわの治療方法、およびボツリヌス毒素に関する更なる背景情報は以下の参考文献に見出すことができ、これらの各々の開示は参照によりその全ては本明細書に組み込まれる：Inlander, Skin, New York, N.Y.: People’s Medical Society, p. 1-7 (1998); Benedetto, International Journal of Dermatology, V. 38, p. 641-655 (1999); Stegman et al., “The Skin of the Aging Face,” Cosmetic Dermatological Surgery, 2nd ed., St. Louis, Mo.: Mosby Year Book: p. 5-15 (1990); Lamanna, Science, V. 130, p. 763-772 (1959); Baron et al., Bailey ＆ Scotts Diagnostic Microbiology, St. Louis, Mo.: Mosby Year Book, p. 504-523 (1994); Carruthers and Carruthers, Adv. Dermatol., V. 12, p. 325-348 (1997); Markowitz, Hunters Tropical Medicine, 7th Ed., Philadelphia: W. B. Saunders, p. 441-444 (1991); Schantz and Scott, Biomedical Aspects of Botulinum, New York: Academic Press, p. 143-150 (1981); and Scott, Ophthalmol, V. 87, p. 1044-1049 (1980)。
【発明の概要】
【０００５】
概要
組成物の実施形態は、少なくとも１つの細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）を含む担体分子を含み、当該担体分子は少なくとも１つの疎水性ドメインを含み得、当該担体はミセルおよびリポソームの１つにおいて生物学的に活性な分子と非共有的に結合している。
【０００６】
組成物の実施形態は、以下のうちの１つ、全て、またはいずれかを含み得る：
【０００７】
該担体分子は、両親媒性でありうる。
【０００８】
該担体分子は、少なくとも１つの炭水化物部分を含みうる。
【０００９】
該担体分子は、少なくとも１つのアルキル鎖を含みうる。
【００１０】
該担体分子は、少なくとも３つの疎水性アミノ酸を含みうる。
【００１１】
該担体分子は、少なくとも１つのフェニルアラニンを含みうる。
【００１２】
該担体分子は、パルミトイル−ｇｌｙｐ−ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号５）、オクタノイル−ｇｌｙｐ−ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号６）、オレイル−ｇｌｙｐ−ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号７）（ｐは０〜２０の整数である）またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【００１３】
該担体分子は、ＦＦＦＩＬＶＦ−ｇｌｙｐ−ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号１）、ＦＬＶＦＦＦ−ｇｌｙｐ−ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号２）、ＫＫＲＰＫＰＧ−ｇｌｙｐ−ＦＬＶＦＦＦ（配列番号３）（ｐは０〜１０の整数である）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されうる。
【００１４】
該少なくとも１つのＣＰＰは式（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号８）を有するフラグメント、式（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号９）を有するフラグメント、式（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号１０）を有するフラグメント（下付き文字ｐおよびｑは各々独立して０〜２０の整数である）からなる群から選択されるＨＩＶ−ＴＡＴフラグメント；ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号１７）；ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１５）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されうる。
【００１５】
該生物学的に活性な分子は、ＶＧＶＡＰＧ（配列番号２６）；パルミトイル−ＴＴＳ；レチノイン酸レチニル；レチノイン酸；ステロイドおよびステロイド化合物；ヒドロキノン；ヒアルロン酸；非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えばナプロキセン、イブプロフェン、およびアセトアミノフェン；皮膚引き締めペプチド；光活性化可能な部分および化合物；紫外線（ＵＶ）光を吸収、ブロック、または反射する化合物；ビタミン；コレステロール；神経伝達物質（アセチルコリンなど）の機能を遮断、影響、または妨害する薬物；またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されうる。
【００１６】
該生物学的に活性な分子は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧからなる群から選択されるボツリヌス毒素血清型；組換えボツリヌス毒素；修飾ボツリヌス毒素；ボツリヌス毒素のフラグメント；またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されうる。
【００１７】
組成物の実施形態は、生物学的に活性な分子、および少なくとも１つの親油性ドメインおよび少なくとも１つのＣＰＰを含む担体分子を含み得、該担体分子は、少なくとも１つの炭水化物部分、少なくとも１つのアルキル鎖、少なくとも３つの疎水性アミノ酸、またはそれらの任意の組合せを含む。当該担体分子と生物学的に活性な分子は、非共有的に結合しうる。
【００１８】
組成物の実施形態は、以下のうちの１つ、全て、またはいずれかを含み得る：
【００１９】
該担体分子はパルミトイル−ｇｌｙｐ−ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号５）、オクタノイル−ｇｌｙｐ−ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号６）、オレイル−ｇｌｙｐ−ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号７）、またはそれらの任意の組み合わせ（ｐは０〜２０の整数である）を含み得る。
【００２０】
該担体分子はＦＦＦＩＬＶＦ−ｇｌｙｐ−ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号１）、ＦＬＶＦＦＦ−ｇｌｙｐ−ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号２）、ＫＫＲＰＫＰＧ−ｇｌｙｐ−ＦＬＶＦＦＦ（配列番号３）（ｐは０〜１０の整数である）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されうる。
【００２１】
該少なくとも１つのＣＰＰは、式（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号８）を有するフラグメント、式（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号９）を有するフラグメント、式（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号１０）を有するフラグメント、（下付き文字ｐおよびｑは各々独立して０〜２０の整数である）からなる群から選択されるＨＩＶ−ＴＡＴフラグメント；ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号１７）；ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１５）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されうる。
【００２２】
該生物学的に活性な分子は、ＶＧＶＡＰＧ（配列番号２６）；パルミトイル−ＴＴＳ；レチノイン酸レチニル；レチノイン酸；ステロイドおよびステロイド化合物；ヒドロキノン；ヒアルロン酸；非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えばナプロキセン、イブプロフェン、およびアセトアミノフェン；皮膚引き締めペプチド；光活性化可能な部分および化合物；紫外線（ＵＶ）光を吸収、ブロック、または反射する化合物；ビタミン；コレステロール；神経伝達物質（アセチルコリンなど）の機能を遮断、影響、または妨害する薬物；またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されうる。
【００２３】
該生物学的に活性な分子は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧからなる群から選択されるボツリヌス毒素血清型；組換えボツリヌス毒素；修飾ボツリヌス毒素；ボツリヌス毒素のフラグメント；またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されうる。
【００２４】
患者にボツリヌス毒素を投与するためのキットは、ボツリヌス毒素、その経皮送達に有効量の担体分子を含み得、該担体分子は少なくとも１つのＣＰＰを含み、少なくとも１つの疎水性ドメインを含む。４．０〜８．３の間にｐＨを維持するように調整されたｐＨ緩衝系が、ボツリヌス毒素、担体分子、およびｐＨ緩衝系を含むデバイスとともに含まれ得る。当該デバイスは、患者の皮膚を介して患者にボツリヌス毒素を投与するように適合されうる。担体分子は、ミセルおよびリポソームの１つ中においてボツリヌス毒素と非共有的に結合していてもよい。デバイス、担体分子、ｐＨ緩衝系、またはそれらの任意の組み合わせは、ボツリヌス毒素の制御放出を提供するように構成されうる。
【００２５】
キットの実施形態は、以下のうちの１つ、全て、またはいずれかを含み得る：
【００２６】
デバイスは皮膚パッチでありうる。
【００２７】
ボツリヌス毒素、担体分子およびｐＨ緩衝系は、デバイスに結合された液体、ゲル、クリーム、ローションおよび軟膏に含まれうる。
【００２８】
前述のおよび他の態様、特徴、および利点は、明細書および図面、ならびにクレームから当業者に明らかであろう。
【００２９】
説明
この開示、その態様および実施形態は、本明細書に開示される特定の構成要素、アセンブリ手順または方法要素に限定されない。本開示から、特定の実施形態と共に使用される、意図された担体分子組成物、キット、および関連する方法の実施形態と一致する、当技術分野で公知の多くの追加的な構成要素、アセンブリ手順および／または方法要素は、明らかになるであろう。したがって、例えば、特定の実施形態が開示されているが、そのような実施形態および実施構成要素は、意図された操作および方法と一致する、当該担体分子組成物、キット、および関連する方法、ならびに構成要素および方法の実施の技術分野において公知である任意の形状、サイズ、スタイル、タイプ、モデル、バージョン、測定、濃度、材料、量、方法要素、ステップなどを含みうる。
【００３０】
皮膚は、体の最大の臓器であり、表皮および真皮を含む様々な層を含む。表皮はケラチノサイトからなり、分化の状態に基づいていくつかの層に分けられる。表皮は、角質層と、顆粒メルピギー（granular melphigian）および基底細胞からなる生存表皮とにさらに分類することができる。角質層は吸湿性であり、そのフレキシビリティーおよび柔軟性を維持するために少なくとも１０重量％の水分を必要とする。吸湿性は、部分的にケラチンの保水能力に起因する。角質層が柔らかさとフレキシビリティーを失うと、荒れたり脆くなり、乾燥した肌になる。真皮は皮膚の３つの層のうち最も厚く、様々な汗腺や皮脂腺、毛包、神経終末、血管やリンパ管などの皮膚の構造の大部分を含む。真皮の主要成分はコラーゲンおよびエラスチンである。
【００３１】
皮膚のｐＨは、両性アミノ酸、乳酸、および皮脂腺の分泌物由来の脂肪酸のために通常５〜６である。用語「酸外套」は、皮膚の大部分の領域に水溶性物質が存在することを意味する。皮膚の緩衝能は、皮膚の角質層に貯蔵されているこれらの分泌物の一部に起因する。
【００３２】
皮膚の主要機能の１つは、水および正常恒常性に潜在的に有害な物質の輸送に対する障壁を提供することである。身体は、頑丈な半透性の皮膚がなければ急速に水分を失うであろう。皮膚は体内への有害物質の侵入を防ぐのに役立つ。ほとんどの物質は当該障壁に浸透することはできないが、皮膚の透過性を選択的に高めるための戦略が開発されており、様々な成功を納めている。
【００３３】
個体が老化するにつれて、環境損傷、重力の絶え間ない引っ張り、および顔面筋肉の収縮によって引き起こされる顔面の繰り返し運動から蓄積する生化学的、組織学的、および生理学的変化を含む様々な要因の作用の結果として、皮膚のしわが始まる。
【００３４】
ボツリヌス毒素（また、ボツリヌス毒素又はボツリヌス神経毒として知られている）は、グラム陽性菌、Clostridium botulinumによって産生される神経毒である。いずれの理論にも拘束されることなく、神経筋接合部を横切るアセチルコリンのシナプス伝達または放出を阻害することにより、ならびに他のメカニズムを介して、筋肉の弛緩性の麻痺を引き起こすと考えられている。
【００３５】
ボツリヌス毒素は、違いはあるものの血清学的には関連する８つの神経毒に分類される。これらのうち、ボツリヌス神経毒素血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧの７つが麻痺を引き起こすことができる。これらの活性ボツリヌス毒素血清型の７つすべてについてのボツリヌス毒素タンパク質分子の分子量は約１５０キロダルトン（ｋＤ）である。当該バクテリアによって放出されるとき、ボツリヌス毒素は、問題の１５０ｋＤボツリヌス毒素タンパク質分子と関連する非毒素タンパク質とを一緒に含む複合体である。約１５０ｋＤより大きい分子量を有する当該複合体は、非毒素ヘマグルチニン（hemaglutinin）タンパク質と非毒素非ヘマグルチニンタンパク質を含有すると考えられている。これらの２つの非毒素タンパク質（当該関連神経毒複合体はボツリヌス毒素分子と共にこれらを含む）は、毒素が摂取されたときにボツリヌス毒素分子への変性に対する安定性および消化酸に対する保護を提供するように作用し得る。
【００３６】
ボツリヌス毒素は筋肉麻痺を引き起こし、シナプス伝達を妨害することができるので、しわなどの様々な美容的皮膚症状ならびに他の身体的および神経学的症状を治療するために効果的に使用することができる。本明細書で使用されるように、生物学的に活性な分子は、非限定的な例として、ボツリヌス毒素と同様に、生物組織および／または細胞と化学的に相互作用して所望の生物学的効果を生じる分子である。ボツリヌス毒素は、生物学的に活性な分子の例である。生物学的に活性な分子の他の例には、レチノイン酸、ステロイド、ヒドロキノン、ヒアルロン酸、および非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（例えばアセトアミノフェン、イブプロフェン、およびナプロキセン）が挙げられる。
【００３７】
生物学的に活性な分子を細胞および他の組織へ輸送するおよび／または輸送することを促進するように作用する担体分子の組成物の実施形態が本明細書に開示される。様々な担体分子組成物を含む様々なキットの実施形態、および担体分子組成物を使用して生物学的に活性な分子を投与する様々な方法の実施形態も開示される。
【００３８】
本明細書中に開示される担体分子の実施形態は、少なくとも１つの親油性ドメインおよび少なくとも１つの細胞浸透性ペプチドを含む。種々の実施形態において、親油性ドメインは疎水性ドメインである。担体分子の実施形態はまた、担体分子が１つ以上の生物学的に活性な分子と直接的および／または非共有的に結合するように設計される。特定の実施形態では、担体分子は、別の分子の１つ以上の疎水性、親油性または両親媒性部分と非共有的に結合する。そのような分子は、生物学的に活性な分子、または生物学的に活性な分子を含有する、当該担体分子のための送達系の一部であり得る。
【００３９】
特定の実施形態では、担体分子組成物は、ボツリヌス毒素である生物学的に活性な分子と組み合わせて使用されうる。そのような実施形態には、針または注射による経皮送達を使用することなく、皮膚または上皮を通じたボツリヌス毒素の輸送または送達を可能にするものが含まれ得る。これらの組成物の実施形態は、本明細書に記載されているように、様々な治療的、審美的および／または美容目的のために対象にボツリヌス毒素を提供するための局所適用として使用されうる。
【００４０】
そのような実施形態では、組成物は、少なくとも１つの親油性ドメインおよび／または疎水性ドメインおよび少なくとも１つの細胞浸透性タンパク質／ペプチド（ＣＰＰ）を有する担体分子と結合するボツリヌス毒素を含む。これらの実施形態では、担体分子とボツリヌス毒素との間の結合は非共有的である。様々な他の実施形態において、担体分子と生物学的に活性な分子との間の結合は、非共有結合でありうる。特定の実施形態では、親油性ドメインはポリカチオンまたはポリアニオンでなくてよい。様々な実施形態において、親油性ドメインは生物学的活性そのものを発揮せず、単に生物学的に活性な分子の輸送を促進するだけである。
【００４１】
様々な実施形態において、様々な分子が担体分子として使用され得る。担体分子は、親油性または両親媒性であることを含む広範囲の特性のいずれかを有していてもよい。特定の実施形態では、担体分子は、炭水化物部分を含みうる。様々な実施形態に含まれ得る炭水化物部分の例は、非限定的な例として、ヘプタン酸、オクタン酸、パルミチン酸、オレイン酸、および任意の他の脂肪酸、脂肪アルコール、または他の炭水化物化合物が挙げられる。実施形態にはまた少なくとも１つのアルキル鎖を含み得る。そのような実施形態において、当該アルキル鎖は、少なくとも５個の炭素を含み得、５０〜３０個の炭素を有し得、または６〜１４個の炭素を有しうる。当該アルキル鎖は、完全にまたは部分的に飽和していてもよい。当該鎖が部分的にのみ飽和された実施形態では、担体分子の実施形態は、シス／トランス異性化分子の混合物または当該分子のシス異性体のみもしくはトランス異性体のみを含んでいてもよいで。
【００４２】
他の担体分子の実施形態は、アミノ酸の様々な組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも３つの疎水性アミノ酸を使用されうる。そのような実施形態では、アミノ酸の少なくとも１つはフェニルアラニンでありうる。他の実施形態において、担体分子は、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）、メチオニン（Ｍ）、トリプトファン（Ｗ）、ロイシン（Ｌ）、およびイソロイシン（Ｉ）、およびそれらの任意の組み合わせ、および任意の他の疎水性アミノ酸からなる群から選択される少なくとも５個のアミノ酸または少なくとも７個のアミノ酸を含み得る。他の実施形態において、担体分子は、システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アルギニン（Ｒ）、およびヒスチジン（Ｈ）、およびそれらの任意の組み合わせ、および他の任意の親水性または極性アミノ酸からなる群から選択される少なくとも５個のアミノ酸または少なくとも７個のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、疎水性および疎水性、親水性、および／または極性アミノ酸の組み合わせを使用することができる。また、列挙されたもの以外の他の非標準アミノ酸も様々な実施において利用され得る。
【００４３】
アミノ酸だけを含む担体分子の実施形態においては、種々の組み合わせが使用され得る。様々な実施形態において、担体分子は、ペプチジル親油性ポリマー骨格、ペプチジル親油性オリゴマー骨格、非ペプチジル親油性ポリマー骨格、および非ペプチジル親油性オリゴマー骨格から選択される骨格を含むことができる。
【００４４】
例として、該担体分子はＦＦＦＩＬＶＦ−ｇｌｙｐ−ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号１）、ＦＬＶＦＦＦ−ｇｌｙｐ−ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号２）、ＫＫＲＰＫＰＧ−ｇｌｙｐ−ＦＬＶＦＦＦ（配列番号３）、ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号４）、またはそれらの任意の組み合わせ（ｐは０〜１０の整数である）から選択されうる。これらの担体分子実施形態と一致する配列表は、本明細書で示される配列表と合わせて、同時に提出したＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ（その開示の全ては参照することによって本明細書に組み込まれる）に含まれうる。様々な他の担体分子の実施形態において、アミノ酸とパルミトイル、オクタノイル、およびオレイル基の様々な組合せが使用されうる。例えば、該担体分子はパルミトイル−ｇｌｙｐ−ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号５）、オクタノイル−ｇｌｙｐ−ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号６）、オレイル−ｇｌｙｐ−ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号７）、またはそれらの任意の組み合わせ（ｐは０〜２０の整数である）の１つであり得る。
【００４５】
特定の実施形態では、担体分子は、少なくとも１つの共有結合したＣＰＰを含む親油性オリゴまたはポリマー骨格を含む。本明細書に開示されている様々な組成物の実施形態、および様々な担体分子および活性分子の実施形態と組み合わせにおいて、多種多様なＣＰＰのいずれかを使用することができる。１つ以上のＣＰＰを使用することができ、１つ以上のＣＰＰは担体分子、活性分子、または担体分子と活性分子の両方上に含まれうる。
【００４６】
例えば、該ＣＰＰはＨＩＶフラグメントまたはＨＩＶ−ＴＡＴまたはＨＩＶ−ＴＡＴフラグメントであり得る。該フラグメントの例として、（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号８）、式（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号９）を有するフラグメント、式（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号１０）を有するフラグメント（下付き文字ｐおよびｑは各々独立して０〜２０の整数である）、および該フラグメントの任意の組合せが挙げられる。特定の実施形態において、該ＨＩＶ−ＴＡＴフラグメントは具体的には配列番号１０バーションであり得る。他の実施形態において、該Ｒ９  ＣＰＰが使用され得、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号１１）としてコードされる。
【００４７】
含まれうる他のＣＰＰはアンテナペディア：ＲＱＩＫＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１２）としてコードされる；形質導入領域１（ＴＤ１）：ＮＰＧＧＹＣＬＴＫＷＭＩＬＡＡＥＬＫＣＦＧＮＴＡＶＡＫＣＮＶＮＨＤＡＥＦＣＤ（配列番号１３）としてコードされる；メリチン：ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（配列番号１４）としてコードされる；およびプリオン：ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１５）としてコードされる；である。使用されうる他のＣＰＰとして、（ｇｌｙ）ｐ−ＫＫＲＰＫＰＧ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号１６）（下付き文字ｐおよびｑは各々独立して０〜２０の整数である）；およびＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号１７）の固定単独が挙げられる。特定の実施形態において、該ＣＰＰはＦＬＶＦＦＦＧＧ（配列番号１８）であり得る。別の実施形態において、該ＣＰＰは−（Ｇｌｙ）ｎ１−（Ａｒｇ）ｎ２（配列番号１９）またはｇｌｙｎ１ａ−ＫＫＲＰＱＰＤ−ｇｌｙｎ１ｂ（配列番号２０）（下付き文字ｎ１は０〜約２０の整数であり、下付き文字ｎ１ａおよびｎ２ａは各々０〜約２０の整数であり、および下付き文字ｎ２は約５〜約２５の奇数の整数である）であり得る。
【００４８】
ヒトまたは動物の細胞壁に浸透することができる任意のウイルス由来の任意の相同配列を含む、ウイルス源由来の多種多様な他のＣＰＰを、様々な実施形態に含めることおよび／または使用することができる。これらは、本明細書に開示される原理に一致して、現在知られているか、または今後発見されるものであってもよい。
【００４９】
加えて、様々な合成または別法の人工ＣＰＰが様々な実施形態で使用されうる。これらは下記の１つ、下記の全て、下記の任意の組合せを含み得る：ＫＫＲＰＫＰＧＧＧＧＦＦＦＩＬＶＦ（配列番号２１）、ＦＦＦＩＬＶＦＧＧＧＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号２２）、ＧＧＧＧＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号２３）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＧＧＧＦＦＦＩＬＶＦ（配列番号２４）、およびＧＧＧＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２５）。特定の実施形態において、ＧＧＧＧＫＫＲＰＫＰＧおよびＧＧＧＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲはパルミトイル基に結合して、該ＣＰＰおよび／または担体分子＋ＣＰＰの完成した構造を形成しうる。本明細書で開示される担体分子およびＣＰＰの様々な実施形態で使用される該特定のパルミトイル基はｎ−パルミトイルであり得る。
【００５０】
ボツリヌス毒素活性物質以外に多種多様な生物学的に活性な分子が、本明細書に開示される組成物の様々な実施形態において使用され得る。これらには、非限定的な例として、ＶＧＶＡＰＧ（配列番号２６）；本明細書に配列番号１０として開示されるＴＡＴ配列に共有結合したパルミトイル；レチノイン酸レチニル；レチノイン酸；ステロイドおよびステロイド化合物；ヒドロキノン；ヒアルロン酸；非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えばナプロキセン、イブプロフェン、およびアセトアミノフェン；皮膚引き締めペプチド；光活性化可能な部分および化合物；紫外線（ＵＶ）光を吸収、ブロック、または反射する化合物；ビタミン；コレステロール；神経伝達物質（アセチルコリンなど）の機能を遮断、影響、または妨害する薬物；およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００５１】
担体分子、ＣＰＰ、および生物学的に活性な分子を含む多種多様な組成物の実施形態は、本明細書に開示される原理を使用して構築され得る。最初のステップとして、担体分子をまず調製する。各担体分子は、それに共有結合するか、さもなければそれに会合する１つ以上のＣＰＰを含み得る。担体分子／ＣＰＰ結合分子の調製後、生物学的に活性な分子は、該担体分子／ＣＰＰ結合分子と非共有的に結合する。これは様々な種々の方法で行うことができ、非限定的な例として、単なる混合、滴定、キレート化、タンパク質の折り畳み、リポソームへの組み込み、ナノエマルションへの組み込み、直接会合、乳化、および生物学的に活性な分子を該担体分子／ＣＰＰ結合分子と非共有的に結合させるための任意の他の技術が挙げられる。
【００５２】
エマルションまたはリポソーム製剤による送達のために、特定の実施形態を調製することができる。エマルション製剤は主として親水性または極性アミノ酸を含有する担体分子および／またはＣＰＰを含み、該担体分子および／またはＣＰＰ（および対応して非共有的に結合した生物学的に活性な分子）を当該エマルション中の複数のミセルに接着／会合にさせることを含む。その後、エマルションは、１つ以上の液体／固相に含まれる追加の成分と混合されて、患者の皮膚に適用されるように調整された最終組成物を形成し得る。
【００５３】
主に疎水性アミノ酸を含有する担体分子および／またはＣＰＰに、リポソーム製剤が使用され得る。担体分子、１つ以上のＣＰＰ、および１つ以上の生物学的に活性な分子の組み合わせが、リポソームにパッケージングされる。様々な実施形態で使用されるリポソームは、Encapsula NanoSciences（Brentwood、TN）；Lippomix, Inc.（Novato、CA）；Azaya Therapeutics Incorporated（San Antonio、TX）；Oakwood Laboratories, L.L.C.（Oakwood Village、OH）；Tergus Pharma（Durham、NC）によって使用されるプロセスおよび技術由来のものであっても、および／またはそれらによって製造されたものであってもよい。上記リポソーム組成物、および各製造業者の製造プロセスおよび技術の開示はそれぞれ、‘８１３仮出願の添付Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ（これらの開示は全て参照により既に本明細書に組み込まれている）に含まている。次いで、複数のリポソームを調製し、１つ以上の液体／固相中さらなる成分と混合して、患者の皮膚に適用するように構成された最終組成物を形成する。
【００５４】
本明細書に開示される組成物の実施形態の最終製剤は、液体、ゲル、クリーム、ローション、または軟膏の形態をとり得る。組成物の実施形態は、室温保存および／または冷蔵保存の際に安定であり得る。組成物は、約４．０〜約８．３のｐＨを有しうる。特定の実施形態では、組成物はｐＨ緩衝系を含み得、ここには様々な成分が含まれ得、非限定的な例として、アスコルビン酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、それらの任意の組み合わせ、および任意の他のｐＨ緩衝化組成物または化合物が挙げられる。特定の組成物の実施形態は、生物学的に活性な分子の制御放出および／または時間遅延放出を提供するように設計され得る。これは種々の方法で行うことができ、非限定的な例として、担体分子および／またはＣＰＰと皮膚成分との間の濃度依存性反応を引き起こして生物学的に活性な分子を放出させること、生物学的に活性な分子と担体分子との間の特定の活性化エネルギーとの解離反応を使用して、生物学的に活性な分子の特定の解離速度を駆動すること、違う反応速度を有する様々な担体分子に結合したＣＰＰと皮膚細胞との組み合わせを利用して生物学的に活性な分子を時間をかけて放出すること、および生物学的に活性な分子を皮膚の所望の組織に徐々に放出するように設計された、他の化学反応駆動、大量輸送、またはエネルギー輸送駆動プロセスが挙げられる。
【００５５】
本明細書に開示されるもののような組成物の実施形態は、生物学的に活性な分子を対象に投与するために設計されたキットに含まれ得る。特定の実施形態においては、キットは、対象へのボツリヌス毒素の投与のために設計されうる。該キットは、その経皮送達に有効な量で存在するボツリヌス毒素、ならびに少なくとも１つの親油性ドメインおよび／または疎水性ドメインおよび少なくとも１つのＣＰＰを有する本明細書に開示されたもののような担体分子の実施形態を含み、ここで当該担体とボツリヌス毒素の間の結合は非共有結合性である。キットの実施形態には、ボツリヌス毒素を皮膚に送達するためのデバイス、ならびに少なくとも１つの親油性ドメインおよび／または疎水性ドメインおよび少なくとも１つのＣＰＰを有する担体を含有する組成物が含まれる。組成物中に含まれる特定の担体分子およびＣＰＰは、本明細書に開示されている任意のものであり得る。
【００５６】
特定のキットは、担体およびボツリヌス毒素を含む組成物を調製または製剤化するために設計されたキット構成要素、ならびに使用に適した製剤を製造するために必要とされる追加のアイテム、またはそのような製剤を製造するために順に使用され得るプレミックスを含み得る。実施形態において、キットは、担体分子およびボツリヌス毒素を含有する予め調製された組成物を含有し；他の実施形態では、キットは、独立して調製されたボツリヌス毒素組成物および独立して調製された担体分子組成物を含む。他のキットの実施形態では、キットは、別個であるが併用して、ボツリヌス毒素および担体分子の実施形態を対象の皮膚に投与するためのマテリアルを含む。キットはまた、種々の実施形態において、担体分子および／またはボツリヌス毒素製剤を対象の皮膚を介して対象に投与するためのデバイスを含み得る。特定の実施形態では、デバイスは皮膚パッチであり得る。
【００５７】
キットの他の構成要素は、対象の皮膚を介して担体分子および生物学的に活性な分子を対象に投与するためのデバイスを含み得る。特定の実施形態では、デバイスは、担体分子組成物および／または生物学的に活性な分子組成物を含む１つ以上のチューブと組み合わせた皮膚パッチであってもよい。特定のキットの実施形態では、生物学的に活性な分子は、ボツリヌス毒素であり得る。他のキットの実施形態では、生物学的に活性な分子は、本明細書に開示されているいずれかのものであってもよい。様々なキット実施形態は、１つ以上のワイプ、１つ以上の消毒用ワイプ、１つ以上の針、１つ以上のポンプ、１つ以上の噴霧器、１つ以上のチューブ、および１つ以上のアプリケータデバイス、これらに限定されないが例えば、ブラシ、マッサージ器、超音波装置、および液体または固体の皮膚適用用の任意の他のデバイスが挙げられる。キットの実施形態は、医療専門家による使用のために設計されてもよく、患者が自己投与するように設計されてもよい。
【００５８】
本明細書に開示されるような担体分子および生物学的に活性な分子を含む組成物は、特定の生物学的に活性な分子を投与する方法の様々な実施形態を用いて対象に投与されることができる。例えば、対象にボツリヌス毒素を投与する方法の実施形態には、有効量の担体分子と共にボツリヌス毒素（当該担体分子は少なくとも１つの親油性ドメインおよび／または疎水性ドメインおよび少なくとも１つのＣＰＰを含み、かつ、ボツリヌス毒素と非共有的に結合している）を対象の皮膚または上皮に局所適用することが挙げられる。担体分子および少なくとも１つのＣＰＰは、本明細書に開示されるもののいずれかであり得る。その他の方法の実施形態は、本明細書に開示されるもののような、担体分子および生物学的に活性な分子を含む組成物の有効量を以下のような処置を必要とする対象又は患者の好ましくは皮膚に局所的に適用することによって、筋肉麻痺などの生物学的効果を生じること、皮膚を柔らかくすること、肌の明るさを増すこと、皮膚外観を引き締めること、分泌過多または発汗を減らすこと、皮膚の色素沈着を変化させること、神経性の痛みまたは片頭痛を治療すること、筋けいれんを軽減すること、ニキビを予防または軽減すること、または免疫応答を低減または増強することを含む。加えて、該方法は、例えば、従来の顔の筋肉への注射に代わって、ボツリヌス毒素を顔へ局所適用することにより、審美的効果または化粧効果を生じることを含み得る。
【実施例】
【００５９】
実施例１：
生物学的に活性な分子と共に担体分子およびＣＰＰを含有する局所製剤の例を調製し、その効果を測定する試験をした。
テーブル１は、実験的アプローチと結果を概説する。
テーブル１
2018507169.tif 000002
【００６０】
アルカリホスファターゼコンジュゲートは、１５０キロダルトンの抗体である。追加の生理食塩水のみコントロールおよびガルデルマラボラトリーズ、ＬＰ（フォートワース、テキサス州）製セタフィル（登録商標）保湿ベース中で生理食塩水を実験の一環として調製し、試験した。セタフィル（登録商標）保湿剤ベースは、水、グリセリン、ワセリン、ジカプリリルエーテル、ジメチコン、ステアリン酸グリセリル、セチルアルコール、prunus amygdalus dulcis（スイートアーモンド）油、ＰＥＧ−３０ステアレート、酢酸トコフェロール、アクリレート／Ｃ１０−３０アルキルアクリレートクロスポリマー、ジメチコノール、ベンジルアルコール、フェノキシエタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、グリセリルアクリレート／アクリル酸共重合体、プロピレングリコール、ＥＤＴＡ二ナトリウム、および水酸化ナトリウムを含有した。活性分子および担体分子を、ミセルを介して当該ベースに加えた。ＳＫ−１担体分子はＦＦＦＩＬＶＦＧＧＧＫＫＲＰＫＰＧのタンパク質配列（配列番号２７）を有し、ＳＫ−２担体分子はパルミトイル−ＧＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（パルミトイル−ＴＡＴ、配列番号２８）のタンパク質配列を有した。
【００６１】
生存可能なブタ皮膚移植片（厚さ０．０４５−０．０５５インチ、これは新たに採取され、凍結されておらず、およびｎ＝５の反復が採用された）を選択することによって実験を行った。職員には皮膚の表面に適用される製剤のアイデンテティーは知らせなかった。皮膚移植片に適用されたレセプター液（０．９％ＮａＣｌ）を各試験された皮膚移植片への製剤の単回適用後１４〜１６時間集めた。レセプター液を、２００マイクロリットルのアリコートで９６ウェルプレートにピペットで移し、Molecular Devices社（サニーベール、カリフォルニア州）製分光光度計で試験した。サリチレートの検出は、光学密度（ＯＤ）に基づいて最初に行った。ついで、ワンステップニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３’−インドリル  ホスフェート（ＮＢＴ−ＢＣＩＰ）基質のウェル当たり２０マイクロリットルのアリコートを各ウェルに添加し、アルカリホスファターゼ活性を可視化した。レセプター液の時限連続的測定（timed serial measurement）を採用し、速度論的測定で標準曲線（連続１：３希釈  ストック１５０キロダルトン抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲート溶液から）から計算された濃度を確認した。
【００６２】
実験の結果をテーブル２にまとめる。
テーブル２
2018507169.tif 000003
【００６３】
標準と比較した場合、これらの吸光度数はＳＫ−１（パルミトイル−ＴＡＴ  ＣＰＰ）を用いたミセルベース中の生物学的に活性な分子および担体分子の計算された１．８％経皮フラックス（flux）に相当する。当該試験に使用した分子量の大きく異なる生物学的に活性な分子にわたってでさえ、該２つの疎水性ドメイン担体分子のフラックス結果は統計的には互いに違いはなかった。実験を２回反復し、結果は担体分子を使用する生物学的に活性な分子のフラックスは、同様に統計学的に有意に増加した。担体分子を用いて観察される、高分子化合物、低分子化合物の両方での統計学的に有意なフラックスの増加は予想外の結果であり、疎水性ドメインとＣＰＰを有する担体分子の使用の有効性を示す。
【００６４】
上記の説明が、担体分子組成物、キット、および関連する方法の実施形態、実施形態のコンポーネント、サブコンポーネント、方法およびサブ方法
の特定の実施形態について言及するとき、その精神から逸脱することなく様々な改変はなされうること、およびこれらの実施形態、実施形態のコンポーネント、サブコンポーネント、方法およびサブ方法は、他の担体分子組成物、キット、および関連する方法の実施形態に適用されうるは容易に明らかである。
【配列表】
2018507169000001.app
【国際調査報告】
2018507169.tif 000004
2018507169.tif 000005
2018507169.tif 000006