(57)【要約】本発明は、イデベノンおよびその類似体、化合物10、11、12、およびDF-1176-178を使用した、糖尿病および関連状態の処置の方法を提供する。2018508534.tif 000005
2018508534.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物10、化合物11、化合物12、化合物DF1176-78、もしくはイデベノン、またはそれらの薬学的に許容される塩の有効な投与計画を、インスリン感受性障害、耐糖能障害、または肥満を有する対象に施行する段階であって、それによって、インスリン感受性障害、耐糖能障害、または肥満を処置するかまたはその予防を達成する、前記段階
を含む、インスリン感受性障害、耐糖能障害、または肥満を処置するかまたはその予防を達成する方法。
【請求項２】
前記対象が2型糖尿病を有する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記対象が少なくとも30のボディ・マス・インデックスを有する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
化合物10、化合物11、化合物12、化合物DF1176-78、もしくはイデベノン、またはそれらの薬学的に許容される塩の有効な投与計画を、代謝症候群を有するかまたはそのリスクを有する対象に施行する段階であって、それによって、該症候群を処置するかまたはその予防を達成する、前記段階
を含む、代謝症候群を処置するかまたはその予防を達成する方法。
【請求項５】
前記対象が2型糖尿病を有する、請求項4記載の方法。
【請求項６】
前記対象が肥満である、請求項4記載の方法。
【請求項７】
前記対象がインスリン感受性障害および耐糖能障害を有する、請求項4記載の方法。
【請求項８】
前記対象が高血糖症を有する、請求項4記載の方法。
【請求項９】
前記対象が脂質異常症を有する、請求項4記載の方法。
【請求項１０】
前記対象がミクロアルブミン尿症を有する、請求項4記載の方法。
【請求項１１】
化合物10、化合物11、化合物12、化合物DF1176-78、もしくはイデベノン、またはそれらの薬学的に許容される塩の有効な投与計画を対象に施行する段階であって、それによって老化を抑える、前記段階
を含む、老化を抑える方法。
【請求項１２】
イデベノン、化合物10、化合物11、化合物12、もしくは化合物DF1176-78、またはそれらの薬学的に許容される塩の有効な投与計画を施行する段階であって、それによって2型糖尿病または代謝症候群の発症を抑える、前記段階
を含む、副腎皮質ステロイド処置を受けている対象において2型糖尿病または代謝症候群の発症を抑える方法。
【請求項１３】
前記対象が、免疫障害、癌、またはデュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置のため、副腎皮質ステロイドを投与されている、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
免疫障害が、自己免疫障害、移植片対宿主病、または宿主対移植片病である、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
イデベノン、化合物10、化合物11、化合物12、もしくは化合物DF1176-78、またはそれらの薬学的に許容される塩の有効な投与計画を対象に施行する段階を含む、非アルコール性脂肪性肝炎を有する対象を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、事実上その全体が参照により組み入れられる、2015年3月6日に出願されたUS 62/129,723の恩典を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
背景
肥満および2型糖尿病は、併発することが多い一般的な代謝疾患である。2型糖尿病を有する大部分の患者が、肥満であるかまたは肥満であった。肥満は、2型糖尿病を発症するリスクを約10倍増加させる（Field et al., Arch Intern Med, 161:1581-6(2001)（非特許文献1））。代謝症候群という用語は、肥満、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血圧、および脂質異常症を含む、相互に関連した一般的な臨床的障害のクラスタを記載するために造り出された（Reaven, (1988) Diabetes 37;1595-1607（非特許文献2））。代謝症候群、その構成疾患および続発症は、重大な増加中の世界的健康問題である（Zimmet et al., Obesity, 14:1-3, 2006（非特許文献3））。2012年8月31日に出願されたUS 61/696,112（特許文献1）の恩典を主張する、2013年8月30日に出願されたPCT/US2013/057729（特許文献2）の国内段階である、2015年2月26日に出願されたUS No. 14/424,422（特許文献3）は、関連した主題を開示している。それらは、各々、事実上その全体が参照によって組み入れられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】US 61/696,112
【特許文献２】PCT/US2013/057729
【特許文献３】US No. 14/424,422
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Field et al., Arch Intern Med, 161:1581-6(2001)
【非特許文献２】Reaven, (1988) Diabetes 37;1595-1607
【非特許文献３】Zimmet et al., Obesity, 14:1-3, 2006
【発明の概要】
【０００５】
請求される発明の概要
本発明は、イデベノン、化合物10、化合物11、化合物12、もしくは化合物DF-1176-178、またはそれらの薬学的に許容される塩の有効な投与計画を、インスリン感受性障害、耐糖能障害、または肥満を有する対象に施行する段階であって、それによって、インスリン感受性障害、耐糖能障害、または肥満を処置するかまたはその予防を達成する前記段階を含む、インスリン感受性障害、耐糖能障害、または肥満を処置するかまたはその予防を達成する方法を提供する。任意で、対象は2型糖尿病を有する。任意で、対象は少なくとも30のボディ・マス・インデックスを有する。
【０００６】
本発明は、イデベノン、化合物10、化合物11、化合物12、もしくは化合物DF-1176-178の有効な投与計画を、代謝症候群を有するかまたはそのリスクを有する対象に施行する段階を含む、代謝症候群を処置するかまたはその予防を達成する方法をさらに提供する。任意で、対象は2型糖尿病を有する。任意で、対象は肥満である。任意で、対象はインスリン感受性障害および耐糖能障害を有する。任意で、対象は高血糖症を有する。任意で、対象は脂質異常症を有する。任意で、対象はミクロアルブミン尿症を有する。
【０００７】
本発明は、イデベノン、化合物10、化合物11、化合物12、もしくは化合物DF-1176-178、またはそれらの薬学的に許容される塩の有効な投与計画を対象に施行する段階であって、それによって老化を抑える前記段階を含む、老化を抑える方法をさらに提供する。
【０００８】
本発明は、イデベノン、化合物10、化合物11、化合物12、もしくは化合物DF1176-78、またはそれらの薬学的に許容される塩の有効な投与計画を施行する段階であって、それによって、2型糖尿病または代謝症候群の発症を抑える前記段階を含む、副腎皮質ステロイド処置を受けている対象において2型糖尿病または代謝症候群の発症を抑える方法をさらに提供する。いくつかの態様において、対象は、免疫障害、癌、またはデュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置のため、副腎皮質ステロイドを投与されている。いくつかの態様において、免疫障害は、自己免疫障害、移植片対宿主病、または宿主対移植片病である。
【０００９】
本発明は、イデベノン、化合物10、化合物11、化合物12、もしくは化合物DF1176-78、またはそれらの薬学的に許容される塩の有効な投与計画を対象に施行する段階を含む、非アルコール性脂肪性肝炎を有する対象を処置する方法をさらに提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
定義
「個体」、「患者」、「対象」という用語は、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、飼育された哺乳動物（例えば、イヌもしくはネコ）、農業用の哺乳動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ）、または実験用の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター）を交換可能にさす。
【００１１】
「処置すること」および「処置」という用語は、その用語が適用される疾患もしくは障害またはそのような疾患もしくは障害の一つもしくは複数の症状のいずれかの発生の遅延、進行の減速もしくは逆転、重症度の低下、または軽減もしくは防止をさす。
【００１２】
「有効量」または「治療的に有効な量」という用語は、所望の生物学的結果を誘導するのに十分な活性作用物質の量をさす。その結果は、疾患の兆候、症状、もしくは原因の軽減、または生物系のその他の所望の改変であり得る。「治療的に有効な量」という用語は、ある期間にわたり患部に繰り返し適用された時に、疾患または障害の兆候または症状の実質的な改善を引き起こす製剤の量を意味するため、本明細書において使用される。その量は、処置されている疾患または障害、疾患または障害の進行の段階、ならびに適用される製剤の型および濃度によって変動する。
【００１３】
「治療効果」には、前記の治療的利益および/または予防的利益が包含される。予防効果には、疾患もしくは障害の出現の遅延もしくは排除、疾患もしくは障害の症状の発生の遅延もしくは排除、疾患もしくは障害の進行の減速、停止、もしくは逆転、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【００１４】
「投与」とは、例えば、経口投与または非経口投与を含む、局所投与または全身投与をさす。本発明において有用な活性作用物質の投与経路には、例えば、対象への、経口（「po」）投与、坐薬としての投与、局所接触、静脈内（「iv」）投与、腹腔内（「ip」）投与、筋肉内（「im」）投与、病巣内投与、鼻腔内投与、もしくは皮下（「sc」）投与、または徐放装置、例えば、ミニ浸透圧ポンプ、デポ製剤の植え込み等が含まれる。投与は、非経口および経粘膜（例えば、口腔、鼻、膣、直腸、または経皮）を含む任意の経路によってもよい。非経口投与には、例えば、静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、イオン泳動、および頭蓋内が含まれる。その他の送達様式には、リポソーム製剤、静脈内注入、経皮パッチ等の使用が含まれる。
【００１５】
「同時投与する」および「同時投与すること」およびそれらの変化形は、相互に時間的に近い（例えば、同日内もしくは同一週内もしくは30日以内、または両方の薬物が血中に同時に検出され得るよう十分に近い、または、それ以外では、併用投与から相乗効果が生じるよう十分に近い）2種類の活性作用物質の投与をさす。併用作用物質の用量と同一の用量の個々の各作用物質の投与より望ましい応答および/または少ない副作用が、2種類の（またはそれ以上の）作用物質の同時投与から得られる場合、その効果は相乗的であると見なされる（用量は、モル、モル/kg、mg、またはmg/kgとして測定され得る）。例えば、0.5×モルのAおよび0.5×モルのBの同時投与が、1.0×モルのAの別々の投与および1.0×モルのBの別々の投与より良好な効力および/または低下した副作用を与える場合、活性作用物質AおよびBの同時投与は相乗的であると見なされる。同時投与される場合、2種類以上の活性作用物質は、同一組成物の一部として共製剤化されてもよいし、または別々の製剤として投与されてもよい。
【００１６】
「候補物質」とは、例えば、未処置の細胞、組織、または対象と比較して、処置された細胞、組織、または対象において、測定されるパラメーターを阻害することができると推測される、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、炭水化物、有機分子、無機分子、および/または分子の組み合わせを含む任意の組成物の任意の分子をさす。同様に、そのような活性を有することがスクリーニングアッセイにおいて決定されたかまたは他の方法で公知である任意の物質は、治療活性を示すかまたは確認するためにさらなる前臨床試験または臨床試験が必要とされ得るにも関わらず、「活性作用物質」と呼ばれる。活性作用物質は、単に作用物質または化合物と呼ばれることもある。
【００１７】
「代謝症候群」とは、2型糖尿病、耐糖能、インスリン感受性障害、高血圧、肥満、腹囲の増加、高トリグリセリド血症、低HDL、高尿酸血症、凝固性亢進、および/またはミクロアルブミン尿の組み合わせを含む障害を記載するために使用される専門用語である。International Diabetes Federationによる代謝症候群の国際的コンセンサス定義（consensus worldwide definition of the metabolic syndrome）(2006)は、以下の通りである：中心性肥満および以下のうちの2つ：トリグリセリド上昇：＞150mg/dL（1.7mmol/L）またはこの脂質異常のための特別な処置；HDLコレステロール低下：男性で＜40mg/dL（1.03mmol/L）、女性で＜50mg/dL（1.29mmol/L）またはこの脂質異常のための特別な処置；血圧（BP）上昇：収縮期BP＞130または拡張期BP＞85mmHgまたは以前に診断された高血圧の処置；空腹時血漿ブドウ糖（FPG）上昇：＞100mg/dL（5.6mmol/L）または以前に診断された2型糖尿病。
【００１８】
「インスリン感受性障害」とは、インスリンに対する身体の正常な生理学的応答のうちの一つまたは複数が損なわれるかまたは失われる障害である。対象におけるインスリン感受性障害は、内在性または外来性のインスリンに対する生物学的応答の低下を特徴とする。インスリン感受性障害は、2型糖尿病を発症するリスクの増加を含む、ヒトにおける多数の疾患または障害に関連している。インスリン感受性障害は、最も一般的な内科的な疾患または障害の多くのリスクを作出する異常のクラスタである代謝症候群の特色でもある。インスリン感受性障害は、経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）、IVブドウ糖負荷試験（FSIVGTT）、インスリン負荷試験（ITT）、インスリン感受性試験（1ST）、およびモデル査定しながらのブドウ糖の連続注入（continuous infusion of glucose with model assessment）（CIGMA）、またはグルコースクランプのような方法によって決定され得る。例えば、Krentz, Insulin Resistance(Wiley-Blackwell, 2002);de Paula Martins et al., Eur.J.Obst.Gynecol.Reprod.Biol., 133(2):203-207. Obesity, Body Mass Index(BMI) and Visceral Adiposityを参照されたい。
【００１９】
「糖尿病」とは、体内の適切な血糖レベルを維持することができなくなる、ブドウ糖の生成および利用における代謝的欠陥を一般に特徴とする障害である。これらの欠陥の結果は、「高血糖」と呼ばれる血中ブドウ糖の上昇である。糖尿病は、126mg/dl（6.9mmol/1）以上の空腹時血漿ブドウ糖濃度、または75gの経口ブドウ糖負荷の摂取の2時間後の200mg/dl（11.1mmol/1）以上の血漿ブドウ糖濃度に相当する障害と定義され得る。糖尿病の2つの主要な型は、1型糖尿病および2型糖尿病である。1型糖尿病は、一般に、ブドウ糖利用を制御するホルモンであるインスリンの絶対的な欠損の結果である。2型糖尿病は、しばしば、インスリンのレベルが正常であるかまたはさらには上昇しているにも関わらず起こり、組織がインスリンに適切に応答することができないことに起因し得る。大部分の2型糖尿病患者が、インスリン抵抗性であり（即ち、インスリン感受性障害を有し）、インスリン分泌が末梢組織のインスリン応答への抵抗性を補うことができないという点で、インスリンの相対的な欠損を有する。さらに、多くの2型糖尿病患者が肥満である。1.5型糖尿病（成人における遅発性の自己免疫の発生）は、1型糖尿病および2型糖尿病のいくつかの特徴を示す。
【００２０】
「肥満の」および「肥満」とは、World Health Organizationによって、男性で27.8kg/m、女性で27.3kg/m2を越えるボディ・マス・インデックス（「BMI」）と定義されている（BMIは、体重（kg）/身長（m2）に等しい）。肥満は、II型糖尿病および高脂血症を含む多様な内科的な疾患または障害に関係している。（例えば、Barrett-Conner E,Epidemol.Rev.(1989)11:172-181；およびKnowler, et al., Am.J.Clin.Nutr.(1991)53:1543-1551参照）。
【００２１】
「腹部肥満」とは、the third report of the national cholesterol education program expert panel on detection,evaluation,and treatment of high blood cholesterol in adults（NCEP/ATP Panel III）によって推奨されるように、胴囲のカットオフ点が男性で＞102cm、女性で＞80cmである。
【００２２】
「耐糖能」とは、血清ブドウ糖濃度の上昇に応答してインスリンが分泌されるホメオスタシス機序が適切に機能している状態をさす。この系における障害は、島β細胞からのインスリンの不十分な分泌のため、または循環血中のインスリンに対する標的組織の非感受性のため、生物がブドウ糖負荷（例えば、炭水化物を含有している食事）の後に正常血糖を維持することができないため、一過性の高血糖をもたらす。「耐糖能障害」とは、75gの経口ブドウ糖負荷の摂取の2時間後の140mg/dl（7.8mmol/1）以上の血漿ブドウ糖濃度と定義され得る。
【００２３】
「ボディ・マス・インデックス」（BMI）とは、体脂肪の尺度である。個体のBMIは、2段階の数式で導出される。まず、個体の体重（ポンド）に703をかける。次いで、第1段階の積を、個体の身長（インチ）の平方で割る。メートルバージョンにおいては、BMIは、個体の体重（キログラム）を身長（メートル）の平方で割ったものとして計算される。BMIは、過体重および肥満を評価するために頻繁に使用されている医学的基準である。
【００２４】
「高血糖」とは、血中ブドウ糖の正常レベルを超えていることをさし、正常レベルは、約65mg/dL〜約140mg/dLの範囲である。一般に、高血糖とは、約140mg/dLを越えた血中ブドウ糖レベルをさす。
【００２５】
「脂質異常症」とは、リポタンパク質の過剰産生または欠損を含むリポタンパク質代謝の障害をさす。脂質異常症は、血中の総コレステロール、「悪玉」低密度リポタンパク質（LDL）コレステロール、およびトリグリセリド濃度の上昇、ならびに「善玉」高密度リポタンパク質（HDL）コレステロール濃度の減少によって顕在化する。成人の対象において、脂質異常症/高脂血症は、LDLコレステロールレベルが100mg/dL（2.60mmol/L）を超えており、HDLコレステロール値が40mg/dL（1.02mmol/L）以下であり、トリグリセリドレベルが150mg/dL（1.7mmol/L）を超えている時に示される。
【００２６】
「ミクロアルブミン尿」とは、ヒトにおいて約20〜200μg/分の速度でまたは約30〜300mg/Lのレベルで排泄される尿中のアルブミンの存在をさす（例えば、Abbott, K.C, et al., Arch.Internal Med.154:146-153,1994参照）。尿ACRによって定義される場合、「ミクロアルブミン尿」とは、約30mg/gを超える尿ACR、または女性で約3.5mg/mmol以上、男性で約2.5mg/mmol以上の尿ACRをさす。ミクロアルブミン尿を検出し診断する方法には、ラジオイムノアッセイ、ラテックスボディによるイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、凝集阻害、免疫比濁法（immunoturbidimetry）、免疫比濁分析（immunonephelometry）、および放射状免疫拡散アッセイが含まれる。（Keen, H. et al., Lancet 2:913-916,1968；Silver, A. et al., Clin.Chem 32:1303-1306,1986；Close, C. et al., Diabet.Med.4:491-492,1987；Harmoinen, A. et al., Clin.Chim.Acta 166:85-89,1987；Marre, M. et al., Clin..Chem.33:209-213,1987；McCormik, C.P. et al., Ann.Clin.Lab Sci.19:944-951,1989；Cambiaso, C.L. et al., Clin.Chem.34:416-418,1988；Niwa, T. et al., Clin.Chim.Acta 186:391-396,1990）。
【００２７】
「老化」とは、生物のホメオスタシスの低減および脆弱性の増加に至る、成熟後過程をさす（Troen B.R.,Mount Sinai J Med 70:3-22,2003参照）。暦年齢は、時間の経過からのみ決定された出生からの年齢である。生物学的年齢は、身体的健康および精神的健康の尺度である。個体は、当該の個体と類似した身体的健康および精神的健康の全体プロファイルを示す個体の集団の暦年齢に等しい生物学的年齢を割り当てられる。個体の生物学的年齢は、個体の暦年齢より高いかまたは低い場合もある。より低い生物学的年齢は、個体が通常より低速で老化していることの指標であり、より高い生物学的年齢は、個体が通常より急速に老化していることの指標である。生物学的年齢は、ボディ・マス・インデックス、全身健康（例えば、消化、心血管、および免疫系）、人生観、精神的健康、食事、喫煙、アルコール、および生活環境に基づく毒性負荷、ならびに関係、運動、および性的習慣を含む生活習慣に関する質問を問う質問票によって査定され得る。インスリンに対する抵抗性および肥満は、両方とも、早期老化に寄与する因子である。
【００２８】
「アンタゴニスト」とは、（Shcのような）標的タンパク質に結合した時に、標的タンパク質の量（発現）または生物学的活性もしくは免疫学的活性の効果の持続時間を減少させる分子である。アンタゴニストは、試料中に存在する標的タンパク質の量（発現）または効果を減少させる低分子、タンパク質、核酸、炭水化物、または抗体であり得る。
【００２９】
疾患または障害のリスクを有する対象とは、遺伝子マーカー、バイオマーカー、または家族歴のような既知の特徴のため、そのような遺伝子マーカー、バイオマーカー、または家族歴等を有しないことが既知である個体の対照集団よりも疾患または障害を発症するリスクが有意に高い（p≦0.05）対象を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図1は、ShcKOマウスが高脂肪食（HFD）摂取の際に増加した寿命を有することを図示する。
【図２】図2A〜Gは、Shc枯渇がインスリン/IGF-1受容体経路のAktアームを敏感にすることを図示する。
【図３】図3A〜Eは、ShcKOマウスが複数の脂肪パッドにおいて減少した白色脂肪を有し、ShcKOマウスが高脂肪食摂取の際に減少した体重を有し、ShcKOマウスが増加した褐色脂肪を有することを図示する。
【図４】図4A〜Cは、Erkキナーゼの活性化を伴わない、インスリン依存性のAktキナーゼの活性化に基づく、インスリン増感剤についてのハイスループットスクリーニングを図示する。
【図５】図5Aは、ホスホAkt対ホスホErk経路を刺激する能力（即ち、抗Shc活性）、およびミトコンドリアの生体エネルギー論を変化させる能力について候補薬物をさらにスクリーニングし、客観的な式によってスコア化した結果を図示する。図5Bは、Shcとミトコンドリアとインスリンシグナリングとの相互作用を図示する。多数のインスリン増感剤がミトコンドリアの生体エネルギー論の何らかの局面を変化させることが観察される。図5Cにおいて、20種類のインスリン増感剤のうちの16種類が、ミトコンドリアAMPKキナーゼを刺激し、残りの4種は、ミトコンドリアO2消費速度アッセイまたはミトコンドリアATP合成速度アッセイのいずれかにおいて陽性であった。
【図６】図6A〜Eは、SrcI-1が、インビトロおよびインビボで、Shc活性化を阻害し、インスリン感受性を刺激したことを図示する。
【図７】図7A〜Eは、イデベノンが、インビトロおよびインビボで、Shc活性化を阻害し、インスリン感受性を刺激したことを図示する。
【図８】図8A〜Fは、イデベノンが、インビトロおよびインビボで、Shcタンパク質PTBドメインに結合し、インスリン感受性を増加させることを図示する。図8Aは、イデベノンがp52Shcタンパク質に対して滴定されたことを示す。図8Bは、FL83Bマウス肝細胞へ適用されたイデベノンを示す。図8Cは、図8Bに記載されたインスリン依存性のAkt活性化についてのウエスタンブロットの例示画像を示す。図8Dは、「プラセボ」、「イデベノン、20mg/kg」、「イデベノン、50mg/kg」によって処理された、ピーナッツバターを自由に消費するよう訓練されたマウスを示す。図8Eは、イデベノンについての原子電荷、距離、および結合角が計算されたことを示す。図8Fは、イデベノンの化学構造を示す。
【図９】図9A〜Eは、SrcI-1がShcタンパク質のPTBドメインに結合することを図示する。図9Aは、p52Shcタンパク質に対して滴定されたSrcI-1を示す。図9Bは、log濃度に対してプロットされた、Shc-PTBに対して試験されたSrcI-1の各濃度についての応答［nm］を示す。図9Cは、SrcI-1が、記載されたようなiGEMDOCKによってShc-PTBに対して試験されたことを示す。図9Dは、Shcタンパク質のPTBポケットへのSrcI-1の仮想ドッキングの画像を示す。図9Eは、SrcI-1の構造を示す。
【図１０】図10は、数種類のイデベノン類似体のShc-PTBとの結合を示す。
【図１１】図11A〜Fは、イデベノン類似体、イデベノン、およびSrcI-1のShcタンパク質との相互作用の詳細を図示する。図11Aは、イデベノン類似体がiGEMDOCKによってShc-PTBに対して試験されたことを示す。図11B〜Eは、示された化合物が、24点滴定系列で10pM〜100uMの濃度範囲で滴定され、p52Shcに対して試験されたことを示す。図11Fは、シグモイド可変勾配フィッティング分析がGraphPad Prism Softwareを使用して実施されたことを示す；EC50、hill勾配、および最大応答を同定し、表に示した。
【図１２】図12A〜Dは、副腎皮質ステロイド処理を受けている対象における2型糖尿病の発生の抑制を示す。図12Aは、実験の流れを示す。図12Bおよび12Cは、副腎皮質ステロイド処理による体重および血中ブドウ糖の変動を示す。図12Dは、インスリン注射後の時間と共に血中ブドウ糖を示す。
【００３１】
詳細な説明
1．序論
本発明は、一部、数種類の既存の作用物質の新規な使用、即ち、インスリン感受性障害、耐糖能障害、肥満、糖尿病、老化、代謝症候群、またはその他の代謝症候群構成疾患を処置するための使用を提供する。新規な使用は、マウスにおけるホスホAkt経路の刺激およびホスホErk経路の抑制が、耐糖能およびインスリン感受性の増加、グルカゴンの増加、ならびにグルカゴン依存性ホルモン感受性リパーゼ活性化の増加、複数の脂肪パッドにおける脂肪の減少、高脂肪食摂取の際の健康特徴の改善、体重の改善、高脂肪食摂取の際の正常血糖、ならびに高脂肪食摂取時の生存率の増加をもたらすという発見に一部基づく。
【００３２】
使用するために有効な既存の作用物質には、イデベノンが含まれる。本願は、イデベノンと比べて改善された特性を有する、イデベノンとの何らかの構造的関係を示す数種類の化合物、例えば、図10に示される、化合物10、化合物11、化合物12、および化合物DF-1176-178も提供する。これらの作用物質のうちの数種類は、Shcタンパク質の活性または発現のアンタゴニストである。本発明は、副腎皮質ステロイドステロイド処置を受けている対象における2型糖尿病および/または代謝症候群の発症を抑えるためのイデベノンおよび前述の類似体の両方の新規な使用をさらに提供する。
【００３３】
本発明は、インスリン感受性障害、耐糖能障害、肥満、糖尿病、老化、代謝症候群、またはその他の代謝症候群構成疾患の一つまたは複数の症状を処置するかまたはその予防を達成するのに有用な作用物質についてスクリーニングするためのアッセイをさらに提供する。
【００３４】
2．処置を適用可能な対象
処置を適用可能な患者には、疾患のリスクを有するが症状を示していない個体だけでなく、インスリン感受性障害、耐糖能障害、肥満、糖尿病、老化、代謝症候群、またはその他の代謝症候群構成疾患の症状を現在示している患者も含まれる。例えば、対象は、インスリン感受性障害、耐糖能障害、肥満、糖尿病、老化、代謝症候群、またはその他の代謝症候群構成疾患の症状を現在示していてよい。例えば、対象は、少なくとも30のボディ・マス・インデックスを有していてもよいし、または正常と見なされるものより30％以上高い体重を有していてもよい。
【００３５】
本発明の方法は、無症候であるか、疾患の症状を示しているかに関わらず、インスリン感受性障害、耐糖能障害、肥満、糖尿病、老化、代謝症候群、またはその他の代謝症候群構成疾患の既知の遺伝学的リスクを有する個体のために有用である。例えば、対象は、無症候であるが、インスリン感受性障害、耐糖能障害、肥満、糖尿病、老化、代謝症候群、またはその他の代謝症候群構成疾患の発症の家族性のおよび/または遺伝学的なリスクファクターを有する者であってよい。そのような個体には、この疾患を経験した親類（例えば、親、祖父、兄弟）を有する者、ならびに遺伝学的および/または生化学的マーカーの分析によって決定されたリスクを有する者が含まれる。例えば、そのような個体には、正常なインスリン感受性および血中ブドウ糖を有するが、糖尿病の家族歴または肥満の遺伝学的素因を有する者が含まれる。
【００３６】
インスリン感受性障害、耐糖能障害、肥満、糖尿病、老化、代謝症候群、またはその他の代謝症候群構成疾患のリスクの遺伝子マーカーは、周知である。例えば、肥満の素因に関連付けられている遺伝子には、UCP1およびUCP2（これらの遺伝子産物は体温を制御する）、LEP（この遺伝子産物レプチンは食欲を低下させ身体の代謝を増加させるよう視床下部に作用する）、LEPR（レプチン受容体）、PCSK1（この遺伝子産物プロタンパク質転換酵素スブチリシン/ケキシン1型はPOMCのようなホルモン前駆物質をプロセシングする）、POMC（この遺伝子産物は数ある機能の中でもとりわけ副腎を刺激する）、MC4R（この遺伝子産物はメラノコルチン4受容体である）、ならびにInsig2（この遺伝子産物は脂肪酸およびコレステロールの合成を制御する）が含まれる。
【００３７】
ヒト肥満表現型に関連または関係しているその他の遺伝子は、現在、200を越える。肥満遺伝子マップデータベースはワールドワイドウェブ上で入手可能であり、遺伝子および遺伝子マップは科学文献に記載されている（例えば、Perusse et al., Obesity Res.13:381-490,2005参照）。対象の肥満のリスクを決定する時には、これらの因子のいずれかを考慮に入れることができる。
【００３８】
2型糖尿病の発症に関連付けられている数種類の遺伝子は、スルホニル尿素受容体（ABCC8）、カルパイン10酵素（CAPN10）、グルカゴン受容体（GCGR）、酵素グルコキナーゼ（GCK）、ブドウ糖トランスポーター（GLUT2）、転写因子HNF4A、インスリンホルモン（INS）、インスリン受容体（INSR）、カリウムチャンネルKCNJ11、酵素リポタンパク質リパーゼ（LPL）、転写因子PPARγ、リン酸化酵素の制御サブユニット（PIK3R1）等をコードする。本発明の方法から利益を得ることができる対象を同定する時には、これらの遺伝子を評価することができる。ゲノムの約18の領域が、1型糖尿病リスクと関係付けられている（例えば、Dean et al., "The Genetic Landscape of Diabetes, "National Center for Biotechnology Information(NCBI)参照）。各々が数種類の遺伝子を含有している場合があるこれらの領域は、IDDM1〜IDDM18と名付けられている。最もよく研究されているのが、免疫応答タンパク質をコードするHLA遺伝子を含有しているIDDM1である。これまでに、2種類の他の非HLA遺伝子が同定されている。一方のIDDM2は、インスリン遺伝子であり、他方は、免疫応答において制御的な役割を有するCTLA4の近くにマッピングされている。
【００３９】
本発明の方法は、インスリン感受性障害、耐糖能障害、肥満、糖尿病、老化、代謝症候群、またはその他の代謝症候群構成疾患に関連した良くない続発症の抑制においても有用である。従って、処置を適用可能な患者には、アテローム性動脈硬化症、狭心症、跛行、心臓発作、脳卒中、うっ血性心不全、心筋梗塞、睡眠時無呼吸、ならびに関節炎、血管変性、マクロファージの増殖および活性亢進、プラーク形成、高血糖症、高脂肪酸血症、腫瘍壊死因子およびレジスチンのレベルの増加、低アディポネクチン血症、高インスリン血症または低インスリン血症、チオール酸化還元状態の障害（低グルタチオンおよびシステイン血症）、PPARγ不活性、ならびにH2O2、OHOOの上昇を伴うミトコンドリアエネルギー脱共役、細胞質シトクロムc、高血圧、高血中コレステロール、脂質異常症、高脂血症、脂質異常症、脳卒中、冠動脈疾患、または心筋梗塞を含むアテローム性動脈硬化性疾患、高インスリン血症および/または高プロインスリン血症、ミクロアルブミン尿症、インスリン放出の遅延、冠性心疾患を含む糖尿病合併症、狭心症、うっ血性心不全、脳卒中、認知症における認知機能、網膜症、末梢神経障害、腎症、糸球体腎炎、糸球体硬化症、ネフローゼ症候群、高血圧性腎硬化症、（子宮内膜、乳房、前立腺、および結腸のような）いくつかの型の癌、妊娠の合併症、（生理不順、不妊、不規則排卵、多嚢胞性卵巣症候群（PCOS）のような）女性の生殖に関する健康不良、リポジストロフィー、胆石、胆嚢炎、および胆石症のようなコレステロール関連障害、痛風、閉塞性睡眠時無呼吸および呼吸器問題、骨関節炎、ならびに骨減少、例えば、骨粗鬆症の防止および処置を含むこれらの良くない続発症のうちの一つまたは複数を有する個体が含まれる。
【００４０】
処置を適用可能な患者には、老化過程の減速を目的として、早期老化を起こしている個体（例えば、暦年齢を超えている生物学的年齢）、またはさらには正常な老化を起こしている個体（暦年齢に等しい生物学的年齢）も含まれる。
【００４１】
一部の対象は、本明細書に開示された疾患または障害（例えば、糖尿病、肥満、代謝症候群およびその構成要素、早期老化、非アルコール性脂肪性肝炎、または副腎皮質ステロイドの服用の結果としての2型糖尿病もしくは代謝症候群に対する感受性）以外に、活性作用物質によって処置可能な疾患または障害を有しない。
【００４２】
処置を適用可能な対象のさらなるクラスは、対象において2型糖尿病、代謝症候群、および関連状態の発症のリスクを高める副腎皮質ステロイド処置を受けている患者である。対象は、自己免疫疾患、移植片対宿主病、もしくは宿主対移植片病のような免疫障害、癌、またはデュシェンヌ型筋ジストロフィーを含む多様な障害のため、副腎皮質ステロイド処置を受けている場合がある。副腎皮質ステロイドを長期に（例えば、少なくとも6ヶ月、または少なくとも1年、または無限に）投与されている対象は、特に適当である。本明細書に開示されたイデベノンまたは類似体のいずれかのそのような患者への投与は、そのような対象における2型糖尿病、代謝症候群、および関連状態の発症を抑える。そのような抑制は、そのような状態の発生を遅延させるか、またはその重症度を低下させることができる。イデベノンの投与は、副腎皮質ステロイドの投与計画が施行されるのと同時に、そのような投与計画の開始の前に、またはそのような投与計画の施行の間の任意の時点で、開始され得る。
【００４３】
対象のさらなるクラスは、非アルコール性脂肪性肝炎としても公知の脂肪肝脂肪性肝炎を有するものである。処置の非存在下では、肝臓が脂肪性になるほど、対象はよりインスリン抵抗性になる。Shc阻害剤は、ミトコンドリア脂質酸化を刺激することによって、そのような患者におけるインスリン抵抗性の発症を抑えることができる。
【００４４】
活性作用物質
本発明の方法において有用な活性作用物質は、インスリン感受性障害、耐糖能障害、肥満、糖尿病、老化、代謝症候群、またはその他の代謝症候群構成疾患の一つまたは複数の症状の防止、低下、遅延、または抑制において有効である。例えば、作用物質は、インスリン感受性障害、耐糖能障害、肥満、糖尿病、老化、代謝症候群、またはその他の代謝症候群構成疾患を有する対象の細胞において、ホスホAkt-1対ホスホERKのレベルの比を対照比と比べて増加させ；細胞の酸素消費速度およびプロトン生成速度を対照と比べて増加させ；ミトコンドリアO2取り込みおよびミトコンドリア脂質酸化を増加させ；AMPキナーゼリン酸化を活性化する。好ましくは、作用物質は、細胞の細胞骨格または微小管を破壊しない。
【００４５】
好ましい作用物質には、イデベノン、化合物10、化合物11、化合物12、もしくは化合物DF-1176-178、またはそれらの薬学的に許容される塩、または治療的もしくは予防的な効果を発揮するための類似した活性を有するエステル、アミド、プロドラッグ、もしくはその他の誘導体が含まれる。前後関係からそうでないことが明白でない限り、化合物への言及は、化合物、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、またはその他の誘導体のいずれかへの言及として理解されるべきである。
【００４６】
処置および予防の方法
対象は、既に疾患の症状を示していてもよいし、またはインスリン感受性障害、耐糖能障害、肥満、糖尿病、老化、代謝症候群、もしくはその他の代謝症候群構成疾患を有すると診断されていてもよい。そのような対象において、本明細書に記載された1種類または複数種類の活性作用物質および/またはその類似体および/または薬学的に許容される塩の投与は、疾患症状の進行を逆転させるかもしくは遅延させ、かつまたはその重症度を低下させることができる。
【００４７】
処置の有効性は、本明細書に記載された1種類または複数種類の活性作用物質および/またはその類似体および/または薬学的に許容される塩の投与が開始される前の疾患のパラメーターのベースライン測定値を、本明細書に記載された1種類または複数種類の活性作用物質および/またはその類似体および/または薬学的に許容される塩が投与された後の一つまたは複数の時点での同一のパラメーターと比較することによって決定され得る。疾患のパラメーターは、本明細書に記載されたインスリン感受性障害、耐糖能障害、肥満、糖尿病、老化、代謝症候群、またはその他の代謝症候群構成疾患の兆候または症状のうちの一つまたは複数であり得る。処置に対する応答における本明細書に記載された様々なバイオマーカーのレベルの測定は、処置が有効であることを示すことができる。
【００４８】
予防目的の場合、対象は、無症候であるが、本明細書に記載された1個または複数個のリスクファクター（遺伝性または非遺伝性）を有する者であってよい。例えば、対象は、無症候であるが、遺伝子検査またはその他の予測試験に基づき、高いリスクを有すると判断された者であってよい。あるいは、対象は、疾患の初期の症状を示していてもよい。そのような対象において、本明細書に記載された1種類または複数種類の活性作用物質および/またはその類似体および/または薬学的に許容される塩の投与は、疾患の発生もしくは疾患の後期への進行を防止するかもしくは遅延させることができ、かつ/または存在した後は疾患の重症度を低下させることができる。
【００４９】
防止計画の有効性を評価するための測定可能なパラメーターは、治療およびモニタリングについて本明細書に記述されたものと同様である。
【００５０】
3．活性作用物質の製剤および投与
a．製剤
本明細書に記載された1種類または複数種類の活性作用物質および/またはその類似体および/または薬学的に許容される塩は、経口、非経口（静脈内（IV）、筋肉内（IM）、デポIM、皮下（SQ）、およびデポSQ）、舌下、鼻腔内（例えば、吸入、鼻噴霧、もしくは点鼻）、くも膜下腔内、局所、経粘膜、頬側、舌下、イオントフォレーシス、または直腸で投与され得る。
【００５１】
治療的に有効な量の1種類または複数種類の活性作用物質を含有する組成物が提供される。化合物は、好ましくは、経口投与用の錠剤、カプセル、もしくはエリキシル、または非経口投与用の無菌の溶液もしくは懸濁液のような適当な薬学的調製物へ製剤化される。
【００５２】
本明細書に記載された1種類または複数種類の活性作用物質および/またはその類似体および/または薬学的に許容される塩は、「本来の」形態で投与されてもよいし、または、望ましければ、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、または誘導体が薬理学的に適当である、即ち、本発明の方法において有効であるという条件で、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、誘導体等の形態で投与されてもよい。活性作用物質の塩、エステル、アミド、プロドラッグ、およびその他の誘導体は、例えば、March(1992)Advanced Organic Chemistry;Reactions,Mechanisms and Structure,4th Ed.N.Y.Wiley-Interscienceによって記載された標準的な手法を使用して調製され得る。作用物質のプロドラッグは、生理学的条件の下で容易に化学的変化を受け、本発明の作用物質を提供する。変換は、一般的には、患者への投与の後に起こる。
【００５３】
そのような誘導体は、従来の方法によって製剤化され得る。例えば、多数の送達作用物質のジスルフィド塩が、参照によって本明細書に組み入れられるWO 2000/059863に記載されている。同様に、作用物質の酸性塩は、典型的には、適当な酸との反応を含む従来の方法論を使用して、遊離の塩基から調製され得る。一般に、薬物の塩基型をメタノールまたはエタノールのような極性有機溶媒に溶解させ、それに酸を添加する。得られた塩は、沈殿するか、またはより極性の低い溶媒の添加によって溶液から取り出されてもよい。酸付加塩の調製に適した酸には、有機酸、例えば、酢酸、カルボン酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、スベリン酸、乳酸、ベンゼンスルホン酸、p-トリルスルホン酸、アルギニン、グルクロン酸、ガラクツロン酸、フタル酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、イソ酪酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、サリチル酸等、および無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の両方が含まれる（例えば、Berge et al., J.Pharm.Sci. 66,1-19(1977)参照）。
【００５４】
一部の作用物質は、一般的に、HCl塩の形態で供給されるが、非経口投与のためには、より弱い酸（例えば、pKa 1-6-9、または、好ましくは、pKa 4〜6.5）による酸性塩が好ましい。酸付加塩は、適当な塩基による処理によって遊離の塩基へ再変換され得る。好ましい酸付加塩には、塩酸または臭化水素酸を使用して調製され得るようなハロゲン化物塩が含まれる。本発明の活性作用物質の塩基性塩は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、トリメチルアミン等のような薬学的に許容される塩基を使用して、同様に調製され得る。例えば、塩基性塩には、アルカリ金属塩、例えば、ナトリウム塩および銅塩が含まれ得る。
【００５５】
塩基性薬物の塩形態の調製のため、対イオンのpKaは、好ましくは、薬物のpKaより少なくとも約2pH低い。同様に、酸性薬物の塩形態の調製のため、対イオンのpKaは、好ましくは、薬物のpKaより少なくとも約2pH高い。これは、塩の可溶性が遊離の酸または塩基の可溶性に勝る塩プラトーに到達するため、対イオンが、溶液のpHをpHmaxより低いレベルにすることを可能にする。活性薬学的成分（API）および酸または塩基におけるイオン化可能基のpKa単位の違いの一般化された規則は、プロトン移動をエネルギー的に有利にするためのものである。APIおよび対イオンのpKaが有意に異ならない時には、固体の複合体が形成され得るが、水性環境において急速に不均化を起こし得る（即ち、薬物および対イオンの個々のエンティティへ分解され得る）。
【００５６】
好ましくは、対イオンは薬学的に許容される対イオンである。適当な陰イオン性の塩形態には、酢酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、ベンジレート（benzylate）、酒石酸水素塩、臭化物、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート（estolate）、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化物、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチルブロミド、メチル硫酸塩、ムチン酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩）、リン酸塩および二リン酸塩、サリチル酸塩およびジサリチレート（disalicylate）、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル化物、トリエチオダイド（triethiodide）、吉草酸塩等が含まれる。適当な陽イオン性の塩形態には、アルミニウム、ベンザチン、カルシウム、エチレンジアミン、リジン、マグネシウム、メグルミン、カリウム、プロカイン、ナトリウム、トロメタミン、亜鉛等が含まれる。
【００５７】
エステルの調製は、典型的には、活性作用物質の分子構造内に存在するヒドロキシル基および/またはカルボキシル基の官能化を含み得る。例えば、エステルは、典型的には、遊離のアルコール基のアシル置換誘導体、即ち、式RCOOH（Rは、アルキル基であり、好ましくは、低級アルキルである）のカルボン酸に由来物の一部である。エステルは、従来の水素化分解または加水分解の手法を使用することによって、所望により、遊離の酸へ再変換され得る。
【００５８】
アミドも関連文献に記載された技術を使用して調製され得る。例えば、アミドは、適当なアミン反応物を使用して、エステルから調製されてもよいし、またはアンモニアもしくは低級アルキルアミンとの反応によって無水物もしくは酸塩化物から調製されてもよい。
【００５９】
約1〜1000mgの1種類または複数種類の活性作用物質または生理学的に許容される塩もしくはエステルの化合物または混合物が、認められている薬学的実務によって、生理学的に許容される媒体、担体、賦形剤、結合剤、保存剤、安定剤、風味剤等と共に、必要とされる単位剤形へと調合される。それらの組成物または調製物の中の活性物質の量は、示された範囲内の適当な投薬量が得られるようなものである。組成物は、好ましくは、単位剤形へ製剤化され、各投薬量は、約1〜1000mg、2〜800mg、5〜500mg、10〜400mg、50〜200mg、例えば、約5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、または1000mgの活性成分を含有している。「単位剤形」という用語は、ヒト対象およびその他の哺乳動物のための単位の（即ち、単一の）投薬量として適当な物理的に不連続の単位をさし、各単位は、適当な薬学的賦形剤と共に、所望の治療効果を生ずるよう計算された予定された量の活性材料を含有している。
【００６０】
組成物を調製するためには、1種類または複数種類の活性作用物質を、適当な薬学的に許容される担体と混合する。化合物の混合または添加によって、得られる混合物は、溶液、懸濁物、乳濁液等であり得る。リポソーム懸濁物も、薬学的に許容される担体として適当であり得る。得られる混合物の形態は、意図された投与様式、および選択された担体または媒体における化合物の可溶性を含む多数の因子に依る。有効な濃度は、疾患または障害の少なくとも一つの症状を少なくするかまたは寛解させるのに十分なものであり、経験的に決定され得る。
【００６１】
本明細書に提供される化合物の投与に適した薬学的な担体または媒体には、具体的な投与様式に適当であることが既知である任意のそのような担体が含まれる。さらに、活性材料は、所望の作用を損なわない他の活性材料、または所望の作用を補足するかもしくはもう一つの作用を有する材料と混合されてもよい。化合物は、組成物中の唯一の薬学的活性成分として製剤化されてもよいし、または他の活性成分と組み合わせられてもよい。
【００６２】
化合物が不十分な可溶性を示す場合には、可溶化のための方法が使用されてもよい。そのような方法には、ジメチルスルホキシド（DMSO）のような共溶媒の使用、ツイーン（商標）のような界面活性剤の使用、および水性炭酸水素ナトリウムへの溶解が含まれる。塩またはプロドラッグのような化合物の誘導体も、有効な薬学的組成物の製剤化において使用され得る。
【００６３】
1種類または複数種類の活性作用物質の濃度は、投与された時に、化合物が投与されかつ/または予防的な情況において有効である障害の少なくとも一つの症状を少なくするかまたは寛解させる量を送達するために有効なものである。典型的には、組成物は単一投薬量（例えば、毎日）投与のために製剤化される。
【００６４】
活性化合物は、処置された患者に対する望ましくない副作用なしに、治療的に有用な効果を発揮するのに十分な量で、薬学的に許容される担体に含まれる。治療的に有効な濃度は、処置される障害の公知のインビトロおよびインビボのモデル系において化合物を試験することによって経験的に決定され得る。治療的にまたは予防的に有効な用量は、まず低用量を投与し、次いで、望ましくない副作用が最小であるかまたは存在せずに、所望の効果が達成される用量に到達するまで、漸増させることによって、決定され得る。
【００６５】
本明細書に記載された1種類または複数種類の活性作用物質および/またはその類似体および/または薬学的に許容される塩は、多用量容器または単一用量容器に封入され得る。封入された化合物および組成物は、例えば、使用するために組み立てられ得る構成部分を含むキットで提供され得る。例えば、凍結乾燥形態の作用物質および適当な希釈剤が、使用前に混合するための分離された成分として提供され得る。キットは、同時投与のための作用物質および第2の治療用作用物質を含んでいてもよい。作用物質および第2の治療用作用物質は、別々の構成部分として提供されてもよい。キットは、1種類または複数種類の活性作用物質の一つまたは複数の単位用量を各々保持している複数の容器を含んでいてもよい。容器は、好ましくは、経口投与のための錠剤、ゲルカプセル、持続放出型カプセル等；非経口投与のためのデポ剤、プレフィルドシリンジ、アンプル、バイアル等；および局所投与または経皮投与のためのパッチ、メディパッド（medipad）、クリーム等を含む、所望の投与様式に適したものである。
【００６６】
薬物組成物中の活性化合物の濃度および/または量は、活性化合物の吸収、不活化、および排泄速度、投薬量スケジュール、ならびに投与される量、ならびにその他の因子に依る。
【００６７】
活性成分は、一度に投与されてもよいし、または間隔を空けて投与される多数のより小さい用量へ分割されてもよい。処置の正確な投薬量および持続時間は、処置される疾患の関数であり、公知の試験プロトコルを使用して経験的に決定されてもよいし、またはインビボもしくはインビトロの試験データからの外挿によって決定されてもよい。濃度および投薬量の値は、軽減すべき疾患または障害の重症度によっても変動し得る。特定の対象のための具体的な投薬計画は、個々の必要性、および組成物を投与するかもしくはその投与を管理する者の専門的な判断によって経時的に調整されてよく、本明細書に示された濃度範囲は例示的なものに過ぎず、特許請求の範囲に記載された組成物の範囲または実施を限定するためのものではない。
【００６８】
経口投与が望まれる場合、化合物は、胃の酸性環境からそれを保護する製剤で提供され得る。例えば、組成物は、胃においてはその完全性を維持し、腸において活性化合物を放出する腸溶コーティングでコーティングして製剤化され得る。組成物は、制酸剤またはその他のそのような成分と組み合わせて製剤化されてもよい。
【００６９】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含み、錠剤へと圧縮されてもよいし、またはゼラチンカプセルに封入されてもよい。経口の治療的投与の目的の場合、活性化合物は、賦形剤に組み入れられ、錠剤、カプセル、またはトローチの形態で使用され得る。薬学的に適合性の結合剤および補助材料が、組成物の一部として含まれてもよい。
【００７０】
錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は、以下の成分または類似した性質の化合物のいずれかを含有していてよい：トラガントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、またはゼラチンのような結合剤；結晶セルロース、デンプン、または乳糖のような賦形剤；アルギン酸およびコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような流動性改善剤；ショ糖またはサッカリンのような甘味剤；ならびにペパーミント、サリチル酸メチル、または果実風味剤のような風味剤。
【００７１】
投薬単位形態がカプセルである場合、それは、前記の種類の材料に加えて、脂肪油のような液体担体を含有していてよい。さらに、投薬単位形態は、投薬単位の物理的形態を変化させる様々な他の材料、例えば、糖およびその他の腸溶剤のコーティングを含有していてよい。化合物は、エリキシル、懸濁物、シロップ、ウエハー、薬用チューインガム等の成分として投与されてもよい。シロップは、活性化合物に加え、甘味剤としてのショ糖、ならびにある特定の保存剤、色素および着色剤、ならびに風味剤を含有していてもよい。
【００７２】
活性材料は、所望の作用を損なわない他の活性材料、または所望の作用を補足する材料と混合されていてもよい。
【００７３】
非経口適用、皮内適用、皮下適用、または局所適用のために使用される溶液または懸濁物は、以下の成分のいずれかを含むことができる：注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ゴマ油、ヤシ油、ピーナッツ油、綿実油等のような天然に存在する植物油、またはオレイン酸エチル等のような合成脂肪媒体、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、またはその他の合成溶媒のような無菌の希釈剤；ベンジルアルコールおよびメチルパラベンのような抗微生物剤；アスコルビン酸および亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（EDTA）のようなキレート剤；酢酸、クエン酸、およびリン酸のような緩衝剤；ならびに塩化ナトリウムおよびデキストロースのような浸透圧の調整のための薬剤。非経口調製物は、ガラス、プラスチック、またはその他の適当な材料で作製された、アンプル、使い捨ての注射器、または多用量バイアルに封入され得る。緩衝剤、保存剤、抗酸化剤等が、必要に応じて、組み入れられてもよい。
【００７４】
静脈内投与のための適当な担体には、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、ならびにブドウ糖、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびそれらの混合物のような濃化剤および可溶化剤を含有している溶液が含まれる。組織標的型リポソームを含むリポソーム懸濁物も、薬学的に許容される担体として適当であり得る。これらは、例えば、米国特許第4,522,811号に記載されているような公知の方法に従って調製され得る。
【００７５】
本明細書に記載された1種類または複数種類の活性作用物質および/またはその類似体および/または薬学的に許容される塩は、放出時間調節型（time-release）製剤またはコーティングのような、身体からの急速な排除からそれらを保護する担体によって調製されてもよい。放出制御は、延長された時間にわたり薬物を放出するための製剤の機序である。放出制御型製剤の使用は、投与の頻度を低下させ、血中濃度の変動を低下させ、胃腸管を副作用から保護することができる。活性化合物は、放出時間調節型製剤またはコーティングのような、身体からの急速な排除から化合物を保護する担体によって調製されてもよい。そのような担体には、放出制御型製剤（例えば、多くの薬物の毎日投薬のために十分な、胃において膨張し約8時間滞留するポリマーに作用物質が封入されるDepomed GR（商標）系などの、放出調節型、遅延放出型、長期放出型、または持続放出型、または胃内滞留型の剤形としても公知）が含まれる。放出制御系には、マイクロカプセル化送達系、インプラント、およびコラーゲンのような生分解性、生体適合性のポリマー、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、マトリックス放出制御装置、浸透圧放出制御装置、マルチパーティクル放出制御装置、イオン交換樹脂、腸溶コーティング、多層コーティング、マイクロスフェア、リポソーム、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。活性成分の放出速度は、活性成分の粒子サイズを変動させることによっても変更され得る。放出調節の例には、例えば、米国特許第3,845,770号；第3,916,899号；第3,536,809号；第3,598,123号；第4,008,719号；第5,674,533号；第5,059,595号；第5,591,767号；第5,120,548号；第5,073,543号；第5,639,476号；第5,354,556号；第5,639,480号；第5,733,566号；第5,739,108号；第5,891,474号；第5,922,356号；第5,972,891号；第5,980,945号；第5,993,855号；第6,045,830号；第6,087,324号；第6,113,943号；第6,197,350号；第6,248,363号；第6,264,970号；第6,267,981号；第6,376,461号；第6,419,961号；第6,589,548号；第6,613,358号；および第6,699,500号に記載されたものが含まれる。
【００７６】
b．投与および投薬の経路
本明細書に記載された1種類または複数種類の活性作用物質および/またはその類似体および/または薬学的に許容される塩は、経口投与、非経口投与（IV、IM、デポIM、SQ、およびデポSQ）、舌下投与、鼻腔内（吸入）投与、脊髄内投与、くも膜下腔内投与、局所投与、または直腸投与され得る。インスリン感受性障害、耐糖能障害、肥満、糖尿病、老化、代謝症候群、またはその他の代謝症候群構成疾患以外の疾患または障害を処置するかまたは防止するための過去の使用について既知である作用物質の投薬量が、インスリン感受性障害、耐糖能障害、肥満、糖尿病、老化、代謝症候群、またはその他の代謝症候群構成疾患の症状を寛解させる目的での出発点を提供することができる。
【００７７】
本明細書に記載された1種類または複数種類の活性作用物質および/またはその類似体および/または薬学的に許容される塩は、経腸投与されてもよいしまたは非経口投与されてもよい。経口製剤には、錠剤およびカプセル、ならびに溶液、懸濁物、およびエリキシルのような液体剤形が含まれる。固体剤形が使用される時には、1種類または複数種類の活性作用物質が1日1回または2回（またはより少ない頻度）のみ投与される必要があるよう、それらは持続放出型であることが好ましい。
【００７８】
経口剤形は、1日1回、2回、3回、または4回、またはそれより少ない頻度で、例えば、隔日、3日毎、週2回、または週1回、患者へ投与されてよい。1日3回以下、より好ましくは、1日1回または2回、1種類または複数種類の活性作用物質が投与されることが好ましい。経口剤形は、好ましくは、腸溶コーティングによって、または酸性の胃から保護するために各々がコーティングされた小さいスフィアが充填されたカプセルの使用によって、胃の酸性環境から1種類または複数種類の活性作用物質を保護するために設計される。
【００７９】
経口投与される場合、インスリン感受性障害、耐糖能障害、肥満、糖尿病、老化、代謝症候群、またはその他の代謝症候群構成疾患を防止するか、緩和するか、または処置するため、治療的に有効な投与される量は、約0.1mg/日〜約200mg/日、例えば、約1mg/日〜約100mg/日、例えば、約5mg/日〜約50mg/日である。対象は、約0.05〜約0.50mg/kgまたは0.1mg/kg〜10mg/kgまたは0.5mg/kg〜5mg/kg、例えば、約0.05mg/kg、0.10mg/kg、0.20mg/kg、0.33mg/kg、0.50mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、または10mg/kgの用量で、1種類または複数種類の活性作用物質を投与され得る。患者は、ある用量で開始されてもよいが、その用量は、患者の状態が変化するにつれ、経時的に変動（適宜、増加または減少）させてもよい。転帰の評価に依って、より高い用量が使用されてもよい。例えば、ある特定の対象において、1000mg/日まで、例えば、200mg/日、300mg/日、400mg/日、500mg/日、600mg/日、700mg/日、800mg/日、900mg/日、または1000mg/日が投与され得る。
【００８０】
本明細書に記載された1種類または複数種類の活性作用物質および/またはその類似体および/または薬学的に許容される塩は、ナノ結晶分散製剤で有利に送達されてもよい（米国特許第5,145,684号または米国特許第6,045,829号参照）。ナノ結晶製剤は、典型的には、薬物化合物のより大きい生物学的利用能を与える。
【００８１】
1種類または複数種類の活性作用物質および/またはその類似体は、例えば、IV、IM、デポIM、SC、またはデポSCによって、非経口投与され得る。非経口投与される場合、約0.5〜約1000mg/日、好ましくは、1日約5〜約500または50〜200mgの治療的に有効な量が送達されるべきである。非経口剤形は、デポ製剤であってよく、その場合、より多量の薬物が、低下した頻度で投与され得る。
【００８２】
1種類または複数種類の活性作用物質および/またはその類似体は、舌下投与されてもよい。舌下で与えられる場合、1種類または複数種類の活性作用物質および/またはその類似体は、IM投与のための前記の量で1日1〜4回与えられ得る。
【００８３】
1種類または複数種類の活性作用物質および/またはその類似体は、鼻腔内投与されてもよい。適切な製剤には、鼻スプレーまたは乾燥粉末が含まれる。鼻腔内投与のための1種類または複数種類の活性作用物質および/またはその類似体の投薬量は、IM投与のための前記の量である。
【００８４】
1種類または複数種類の活性作用物質および/またはその類似体は、非経口製剤で、くも膜下腔内投与されてもよい。くも膜下腔内投与のための1種類または複数種類の活性作用物質および/またはその類似体の投薬量は、IM投与のための前記の量である。
【００８５】
1種類または複数種類の活性作用物質および/またはその類似体は、局所投与または経皮投与されてもよい。この経路によって与えられる場合、適切な剤形は、クリーム、軟膏、またはパッチである。局所投与される場合、投薬量は、約0.5mg/日〜約200mg/日であり得る。パッチによって送達され得る量は限定されているため、2個以上のパッチが使用されてもよい。パッチの数およびサイズは重要ではなく、重要なことは、治療的に有効な量の1種類または複数種類の活性作用物質および/またはその類似体が送達されることである。1種類または複数種類の活性作用物質および/またはその類似体は、坐薬によって直腸投与されてもよい。坐薬によって投与される場合、治療的に有効な量は、約0.5mg〜約500mgであり得る。
【００８６】
1種類または複数種類の活性作用物質および/またはその類似体は、インプラントによって投与されてもよい。インプラントによって1種類または複数種類の活性作用物質を投与する場合、治療的に有効な量は、デポ投与のための前記の量である。
【００８７】
投与の正確な投薬量および頻度は、処置される特定の疾患または障害、処置される疾患または障害の重症度、特定の患者の年齢、体重、全身的な身体状態、および個体が受けている可能性のある他の薬物治療に依る。
【００８８】
4．併用療法
本明細書に記載された1種類または複数種類の活性作用物質および/またはその類似体は、互いに組み合わせて使用されてもよいし、またはインスリン感受性障害、耐糖能障害、肥満、糖尿病、老化、代謝症候群、もしくはその他の代謝症候群構成疾患を処置するか、緩和するか、もしくは防止するために使用される他の治療剤もしくはアプローチと組み合わせて使用されてもよい。例えば、本明細書に記載された1種類または複数種類の活性作用物質および/またはその類似体は、インスリンと同時投与されてもよい。インスリンは、長期にわたる糖尿病を有する患者において必要とされる場合が多く、本明細書に記載された1種類または複数種類の活性作用物質は、インスリンの必要性を低くすることができる。高用量のインスリンは、アテローム生成促進効果を有する場合がある。従って、併用薬物は、インスリン単独と比較して、複数の利益を有するであろう。
【００８９】
本明細書に記載された1種類または複数種類の活性作用物質および/またはその類似体は、他の糖尿病薬および肥満薬と同時投与されてもよい。併用療法に適した糖尿病薬には、グリピジド、グリブリド（グリベンクラミド）、クロルプロパミド、トルブタミド、トラザミド、およびグリメピリド、またはそれらの薬学的に許容される塩形態のようなスルホニル尿素剤（例えば、US 2003/008869参照）；メトホルミンおよびその薬学的に許容される塩形態のようなビグアナイド剤（例えば、米国特許公開番号2003/0018028参照）；チアゾリジンジオン剤ピオグリタゾンもしくはロシグリタゾンまたはそれらの薬学的に許容される塩形態（例えば、US 2002/0198203参照）；ミグリトールもしくはアカルボースまたはそれらの薬学的に許容される塩形態のようなαグルコシダーゼ阻害薬（例えば、US 2003/0013709参照）；胆汁酸捕捉剤、フィブリン酸誘導体、HMG-CoA還元酵素阻害剤、およびニコチン酸化合物のような（抗高脂血症剤としても公知の）抗脂肪血症剤（例えば、米国特許出願第2002/0198202号参照）；キナプリル、ラミプリル、ベラパミル、カプトプリル、ジルチアゼム、クロニジン、ヒドロクロロチアジド、ベナゼプリル、プラゾシン、ホシノプリル、リシノプリル、アテノロール、エナラプリル、ペリンドプリル、ペリンドプリルtert-ブチルアミン、トランドラプリル、およびモエキシプリル、またはそれらの薬学的に許容される塩形態のようなアンジオテンシン変換酵素（ACE）阻害剤（例えば、米国特許出願第2003/0055058号参照）；ミナルレスタット（minalrestat）、トルレスタット、ソルビニル、メトソルビニル（Methosorbinil）、ゾポルレスタット、エパルレスタット、ゼナレスタット、イミレスタット（Imirestat）、およびポナルレスタット（Ponalrestat）、またはそれらの薬学的に許容される塩形態のような（糖尿病を有する人々における眼および神経の傷害を防止する）アルドース還元酵素阻害薬（例えば、米国特許出願第2002/0198201号参照）が含まれる。併用療法に適した肥満薬には、フェンテルミン（例えば、商標Ionamin（登録商標）およびAdipex-P（登録商標）で市販されているもの）のような中枢神経系（CNS）刺激薬（例えば、米国特許第5,019,594号参照）が含まれる。フェンテルミンは、中枢神経系の刺激を模倣する能力のために交感神経模倣薬として公知である以下の薬物のクラスのメンバーである；5HT-2C阻害剤（例えば、Meridia（登録商標）（シブトラミン）、ロルカセリン（APD-356））のような再取り込み阻害剤（例えば、米国特許第4,929,629号参照）；リモナバン（Acomplia（登録商標））およびCP-945598のようなCB-1アンタゴニスト（例えば、米国特許第5,624,941号参照）；ならびにエキセナチド（Byetta（登録商標））（例えば、米国特許第5,424,286号参照）のようなGLP-1アゴニストまたは模倣薬。
【００９０】
5．インスリンシグナリング経路
インスリン作用は、インスリン受容体によるシグナル伝達によって媒介される。インスリン受容体は、受容体チロシンキナーゼのスーパーファミリーに属しており、2個の細胞外αサブユニットおよび2個の細胞内βサブユニットからなる。インスリンのαサブユニットとの結合は、コンフォメーション変化をもたらし、それが、細胞内ドメインのチロシンキナーゼの活性化、アデノシン三リン酸の結合、および最終的な受容体自己リン酸化に至る（White,Science,302:1710-1711,2003）。
【００９１】
インスリン受容体自己リン酸化の後、インスリン受容体基質（IRS）のリン酸化が起こる。IRSは、配列類似性ではなく機能的特性によって関連している。4種類の基質は、IRSのファミリー、IRS-1、IRS-2、IRS-3、およびIRS-4に属している。他の基質には、増殖因子受容体結合タンパク質2（GRB2）関連結合タンパク質1（Gab-1）、p60dok、c-Cbl癌原遺伝子（Cbl）、プレクストリン相同（PH）ドメインおよびSrc相同2ドメイン（APS）を含むアダプタータンパク質、ならびにSrc相同2（SH2）ドメイン含有α2コラーゲン関連タンパク質（Shc）の3種類のアイソフォームが含まれる（Virkamaki et al., J Clin Invest. 103:931-943,1999）。IRSは、NH2末端のPHドメインおよび/またはホスホチロシン結合ドメイン、SH2タンパク質結合部位を作出するCOOH末端のチロシン残基、Src相同3（SH3）ドメインまたはWWドメイン（プロリンリッチリガンドに結合するタンパク質モジュール）と会合するプロリンリッチ領域、ならびに他のタンパク質に結合するセリントレオニンリッチ領域を含有している。Shc以外の全ての基質が、基質をインスリン受容体へターゲティングするSH2ドメインを含有している（White, Science, 302:1710-1711,2003）。インスリン受容体を通して生成されたシグナルを増幅する3種類の主要な経路が存在する：IRS/ホスファチジルイノシトール3（PI3）キナーゼ経路；レトロウイルス関連DNA配列（RAS）/マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）経路；およびCbl関連タンパク質（CAP）/Cbl経路（図2A）。
【００９２】
ShcはRAS/MAPK/ERK経路のメンバーである（図4C）。Shcは、SH2ドメインおよびPTBドメインの両方を含有しているアダプター型細胞内シグナリングタンパク質である（Blaikie, J.Biol.Chem. 269:32031-32034,1994；van der Geer, Curr.Biol. 5:404-412,1995；Pelicci, Oncogene 13:633-641,1996）。Shcは、（PTBドメインまたはSH2ドメインによって）インスリン受容体の細胞質ドメインのリン酸化されたチロシン残基に結合することができ、他の細胞内シグナリング分子にも結合することができ、従って、インスリン受容体に由来するシグナルの細胞内伝達において役割を果たすことができる。
【００９３】
細胞レベルでは、Shcの低下は、Ras依存性のリン酸化および細胞増殖の減少、Akt依存性のリン酸化および代謝の増加、ならびにインスリン感受性に至る（図2、4C）。インビトロのShcノックダウンは、ホスホAktを刺激し、ミトコンドリアPDHの阻害性のリン酸化を除去する（図2E）。生物レベルでは、Shcの欠損は、Shc低下マウスの褐色脂肪、筋肉、および肝臓におけるインスリン依存性のブドウ糖取り込みを増加させたことが、PETスキャニングによって示されている（示されない）。Shc低下マウス組織においては、ホスホAktおよびホスホIRS1のようなインスリン経路酵素が活性化される（図2D）。Shc低下マウスは、褐色脂肪の活性（図3D）および分化（図3E）の増加、脱共役タンパク質（UCP-1）の発現、ミトコンドリアの脱共役および活性の増加（図3D）、ならびに脂質酸化遺伝子発現の増加（示されない）を有する。マウスにおいて、Shc低下は、耐糖能およびインスリン感受性の増加をもたらす（図2C、2G）。Shc低下マウスは、複数の脂肪パッドにおける減少した脂肪（図3A）、高脂肪食摂取の際の改善された健康特徴、改善された体重（図3B）を有し、かつ、高脂肪食摂取の際に正常血糖である（図2G）。マウスにおけるShcの低下は、高脂肪食摂取の際の生存率の増加をもたらす（図1）。
【００９４】
6．効力のモニタリング
臨床的効力は、血圧、血中インスリン、遊離脂肪酸、体重、トリグリセリドレベル、血中ブドウ糖レベル、高ボディ・マス・インデックスを含む、インスリン感受性障害、耐糖能障害、肥満、糖尿病、老化、代謝症候群、またはその他の代謝症候群構成疾患の疾患パラメーターまたは身体症状のうちの一つまたは複数を測定することによってモニタリングされ得る。一つまたは複数の症状の安定化、改善、および/または逆転の観察は、処置または防止の計画が有効であることを示す。一つまたは複数の症状の進行、増加、または悪化の観察は、処置または防止の計画が有効でないことを示す。
【００９５】
バイオマーカーを使用して臨床的効力をモニタリングすることもできる。処置を査定するためのバイオマーカーは、好ましくは、タンパク質レベルで査定されるが、バイオマーカーをコードするmRNAの測定も、バイオマーカー発現の代理測定として使用され得る。そのようなレベルは、血液試料において（例えば、PBMCにおいて）測定され得る。いくつかのバイオマーカーのレベルは、疾患を有しない個体の対照集団と比べて、インスリン感受性障害、耐糖能障害、肥満、糖尿病、老化、代謝症候群、またはその他の代謝症候群構成疾患を有する対象において低下する。そのようなマーカーのレベルの増加は、有利な処置応答の指標を提供し、レベルの不変または減少は、不利なまたは少なくとも最適でない処置応答の指標を提供する。他のバイオマーカーのレベルは、疾患を有しない個体の対照集団と比べて、インスリン感受性障害、耐糖能障害、肥満、糖尿病、老化、代謝症候群、またはその他の代謝症候群構成疾患を有する対象において増加する。そのようなバイオマーカーのレベルの減少は、有利な処置応答の指標を提供し、レベルの不変または増加は、不利なまたは少なくとも最適でない処置応答の指標を提供する。
【００９６】
モニタリング方法は、本明細書に記載された投薬量の1種類または複数種類の活性作用物質を投与する前に、対象における測定可能なバイオマーカーまたは疾患パラメーターのベースライン値を決定し、これを処置の経過の後の同一の測定可能なバイオマーカーまたはパラメーターの値と比較することを含む。
【００９７】
他の方法において、対照集団についての測定可能なバイオマーカーまたはパラメーターの対照値（即ち、平均値および標準偏差）が決定される。適当な対照集団は、過去に処置を受けたことがなく、標的疾患を有しておらず、標的疾患を発症する既知のリスクを有しない対象の集団である。そのような方法において、測定可能なバイオマーカーまたは臨床的パラメーターの値が対照値に近づく場合、その処置は有効であると見なされる。他の方法において、対照集団内の個体は、過去に処置を受けたことがなく、標的疾患を有すると診断されている。そのような方法において、測定可能なバイオマーカーまたは臨床的パラメーターの値が対照値に近づく場合、その処置は有効でないと見なされる。
【００９８】
他の方法において、処置の再開が必要とされるか否かを決定するため、現在処置を受けていないが、以前に処置の経過を受けたことがある対象が、バイオマーカーまたは臨床的パラメーターのうちの1種類または複数種類についてモニタリングされる。対象におけるバイオマーカーまたは臨床的パラメーターのうちの1種類または複数種類の測定値を、以前の処置の経過の後に対象において以前に達成された値と比較することができる。あるいは、対象において測定された値を、処置の経過を受けた後に対象の集団において決定された対照値（平均値＋標準偏差または好ましくは2標準偏差）と比較することができる。あるいは、対象における測定値を、疾患の症状がないままである予防的に処置された対象の集団、または疾患特徴の寛解を示す治療的に処置された対象の集団における対照値と比較することができる。そのようなケースにおいて、測定可能なバイオマーカーまたは臨床的パラメーターの値が対照値に近づく場合、その処置は有効であると見なされ、再開される必要はない。他方で、対照レベルと比べた有意な差（即ち、1標準偏差超または好ましくは2標準偏差）は、対象において処置が再開されるべきことの指標である。
【００９９】
7．作用物質のスクリーニング
インスリン感受性障害、耐糖能異常、または肥満の症状を防止するか、低下させるか、遅延させるか、または抑制するために有用な化合物を同定するアッセイは、インビトロで実施され得る。候補作用物質を、インスリン（例えば、1nM、5nM、10nM、100nM、またはそれ以上）の存在下で試験細胞の集団と接触させることができる。インスリン感受性障害、耐糖能異常、または肥満の一つまたは複数の症状を防止するか、低下させるか、遅延させるか、または抑制する作用物質は、対照比と比べて、ホスホAkt-1対ホスホErkのレベルの比を増加させる。ホスホAkt-1対ホスホErkのレベルの比の増加は、インスリンと接触させられていないか、もしくは低濃度（例えば、0.1nM未満）のインスリンと接触させられた細胞の対照集団、または試験化合物なしでインスリンと接触させられた細胞の集団と比較して決定され得る。ホスホAkt-1対ホスホErkのレベルの比は、数ある方法の中でもとりわけウエスタンブロットを使用して決定され得る。Shc活性の阻害は、ホスホShc特異的抗体を使用して、刺激性のShcリン酸化の低下をアッセイすることによって定量的に測定され得る。Shc発現の阻害は、ウエスタンブロットを使用して測定され得る。
【０１００】
関心対象の作用物質は、ミトコンドリア生理学、例えば、細胞の酸素消費速度およびプロトン生成速度に対して薬物依存性の効果を生ずる能力について、さらに選択され得る。細胞の酸素消費速度およびプロトン生成速度は、Seahorse機（Seahorse Bioscience,Billerica,MA）を使用して決定され得る。関心対象の作用物質は、ミトコンドリアO2取り込みに対する薬物依存性の効果を生ずる能力についてさらに選択されてもよい。ミトコンドリアO2取り込みは、バイオセンサープレート（例えば、BD（商標）Oxygen Biosensor systems；BD Biosciences,San Jose,CA）を使用して決定され得る。関心対象の作用物質は、ホスホAMPキナーゼに対する薬物依存性の効果を生ずる能力についてさらに選択されてもよい。ホスホAMPキナーゼは、数ある方法の中でもとりわけ、HITHUNTER（商標）Kinase Toolbox（DiscoveRx,Fremont,Calif.）を使用して、またはWO 02/09726に記載されたように、アッセイされ得る。関心対象の作用物質は、ミトコンドリアATP合成を阻害する能力に基づきさらに選択されてもよい。関心対象の作用物質は、作用物質の細胞傷害性に基づきさらに選択されてもよい。細胞傷害性は、任意の公知の方法、例えば、チューブリン重合アッセイを使用して決定され得る（S.Kuo et al., J.Med.Chem. 36,1146,1993；L.Li et al., J.Med.Chem. 37,3400,1994；L.Li et al., J.Med.Chem. 37,1126,1994；Y.Xia et al., J.Med.Chem. 41,1155,1998）。
【０１０１】
関心対象の作用物質は、対照比と比べて、例えば、少なくとも約1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、5.0倍、10.0倍、またはそれ以上、ホスホAkt-1対ホスホErkのレベルの比を増加させる能力に基づき選択されてもよい。いくつかの作用物質は、X〜Y倍の範囲内で比を増加させる。関心対象の作用物質は、低いEC50濃度、例えば、約5μM未満、例えば、約4μM未満、3μM、2μM、1μM、0.5μM、またはそれ以下のEC50濃度で、対照比と比べて、ホスホAkt-1対ホスホErkのレベルの比を増加させる能力に基づき選択されてもよい。関心対象の活性作用物質は、用量依存的に、対照比と比べて、ホスホAkt-1対ホスホErkのレベルの比を増加させる能力を試験することによってさらに確認されてもよい。
【０１０２】
薬物依存性の効果および/または細胞傷害は、細胞モデルまたは動物モデルにおいて決定され得る（例えば、Srinivasa et al., (2007)Indian J.Med.Res. 127:451-472、T.S.Frode et al(2008), Journal of Ethnopharmacology 115:173-183、およびRees et al. (2005)Diabet Med.22:359-370参照）。これらには、例えば、ストレプトゾトシンまたはアロキサンのような作用物質によって糖尿病が薬理学的に誘導されたモデルが含まれる。アロキサンおよびストレプトゾトシンは、いずれも、GLUT2ブドウ糖トランスポーターを介して膵β細胞に蓄積され、インスリン分泌の阻害をもたらし、高血糖を誘導する、毒性ブドウ糖類似体である。糖尿病が外科的に誘導された動物モデルも、利用可能である。例えば、動物から膵臓を外科的に除去することによって、糖尿病を誘導することができる。
【０１０３】
肥満、インスリン抵抗性、および/または糖尿病の遺伝学的動物モデルも、入手可能である。そのようなモデルは、肥満、インスリン抵抗性、および/もしくは糖尿病を自然に発症する動物の系統、または肥満、インスリン抵抗性、および/もしくは糖尿病を遺伝学的に発症しやすいか、もしくは発症するよう遺伝学的に改変された齧歯類のいずれかに基づく。肥満、インスリン抵抗性、および/または糖尿病を自然に発症する動物の例には、ズッカー糖尿病肥満ラット、SHR/N-cpラット、JCR/LA-cpラット、Toniラット、アグーチマウス、db/dbマウス、ob/obマウス、およびKKAγマウスが含まれる。
【０１０４】
栄養的に誘導された糖尿病および/またはインスリン抵抗性の動物モデルも、使用され得る。例には、高脂肪高ショ糖ラット（Tremblay et al. (2001)Diabetes 50:1901-1910）、10％ブドウ糖ラット（El Midaoui A. et al., (2002)Hypertension 39:303-307）、デザート齧歯類モデル（Shafrir et al. (2006)ILAR J.47:212-224）、および高脂肪食摂取マウスが含まれる。
【０１０５】
候補作用物質は、低分子有機化合物、ポリペプチド、抗体もしくはその断片、アミノ酸もしくはその類似体、炭水化物、糖類もしくは二糖類、またはポリヌクレオチドであり得る。
【０１０６】
本発明は、作用物質がShcタンパク質に対してアンタゴニスト効果を有するか否かを決定するため一次スクリーニングされるスクリーニング法をさらに提供する。次いで、そのような効果を有する作用物質は、インスリン感受性障害、耐糖能障害、肥満、糖尿病、老化、代謝症候群、またはその他の代謝症候群構成疾患の細胞モデルまたは動物モデルにおいて、作用物質がこれらの疾患の処置における有用性の指標を提供する活性を有するか否かを決定するため、スクリーニングされ得る。
【０１０７】
本発明のスクリーニング法は、ハイスループットフォーマットで実施され得る。そのようなハイスループットスクリーニング法は、多数の可能性のある治療用化合物（可能性のあるモジュレーターまたはリガンド化合物）を含有しているコンビナトリアルケミカルライブラリーまたはペプチドライブラリーを提供することを含んでいてよい。次いで、そのような「コンビナトリアルケミカルライブラリー」または「リガンドライブラリー」は、所望の特徴的活性を示すライブラリーメンバー（具体的な化学種またはサブクラス）を同定するため、本明細書に記載される1種類または複数種類のアッセイにおいてスクリーニングされる。このようにして同定された化合物は、従来の「リード化合物」として用いられてもよいし、または可能性のあるもしくは実際の治療薬としてそれ自体使用されてもよい。
【０１０８】
コンビナトリアルケミカルライブラリーとは、試薬のような多数のケミカル「ビルディングブロック」を組み合わせることによって、化学合成または生物学的合成のいずれかによって生成された多様な化合物のコレクションである。例えば、ポリペプチドライブラリーのような直鎖状コンビナトリアルケミカルライブラリーは、所定の化合物長（即ち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）のためのあらゆる可能な方式でケミカルビルディングブロック（アミノ酸）のセットを組み合わせることによって形成される。数百万の化合物が、ケミカルビルディングブロックのそのようなコンビナトリアルな混合を通して合成され得る。
【０１０９】
コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニングは周知である。そのようなコンビナトリアルケミカルライブラリーには、ペプチドライブラリーが含まれる（例えば、米国特許第5,010,175号、Furka, Int J Pept Prot Res 37:487-493(1991)、およびHoughton, et al., Nature 354:84-88(1991)参照）。ケミカルダイバーシティライブラリーを生成するための他の化学も使用され得る。そのような化学には、ペプトイド（例えば、WO 91/19735）、コードされたペプチド（例えば、WO 93/20242）、ランダムバイオオリゴマー（例えば、WO 92/00091）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第5,288,514号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドのようなダイバーソマー（diversomers）（Hobbs, et al, Proc Nat Acad Sci USA 90:6909-6913(1993)）、ビニロガス（vinylogous）ポリペプチド（Hagihara,et al.,J Amer Chem Soc 114:6568(1992)）、ブドウ糖足場を有する非ペプチド性ペプチド模倣体（Hirschmann, et al., J Amer Chem Soc 114:9217-9218(1992)）、低分子化合物ライブラリーの類似有機合成（Chen, et al., J Amer Chem Soc 116:2661(1994)）、オリゴカルバメート（Cho, et al., Science 261:1303(1993)）、ならびに/またはペプチジルホスホネート（Campbell, et al., J Org Chem 59:658 (1994)）、核酸ライブラリー、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第5,539,083号参照）、抗体ライブラリー（例えば、Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14(3):309-314(1996)およびPCT/US96/10287参照）、炭水化物ライブラリー（例えば、Liang, et al., Science 274:1520-1522(1996)および米国特許第5,593,853号参照）、低分子有機分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Baum, C&EN, Jan 18, page 33(1993)、イソプレノイド、米国特許第5,569,588号参照）、チアゾリジノン（thiazolidinones）およびメタチアザノン（metathiazanones）、米国特許第5,549,974号、ピロリジン、米国特許第5,525,735号および第5,519,134号、モルホリノ化合物、米国特許第5,506,337号、ベンゾジアゼピン、第5,288,514号等が含まれる。
【０１１０】
コンビナトリアルライブラリーの調製のための装置は、市販されている（例えば、357 MPS、390 MPS、Advanced Chem Tech.Louisville KY；Symphony,Rainin,Woburn,MA；433A Applied Biosystems,Foster City,CA；9050 Plus,Millepore,Bedford.MA参照）。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリーが、それ自体、市販されている（例えば、ComGenex,Princeton,N.J.；Tripos,Inc,St Louis,MO；3D Pharmaceuticals,Eaton,PA；Martek Biosciences,Columbia,MD参照）。FDAによって認可された化合物のライブラリーは、市販されており、有用である（例えば、Enzo Life Sciences（enzolifesciences.com）；およびMicrosource Discovery Systems（msdiscovery.com））。生物学的利用能および脳血液関門通過のために選択された候補作用物質を含むケミカルライブラリーも、有用であり、例えば、ChemBridge（chembridge.com）およびPrestwick Chemical（prestwickchemical.fr）から市販されている。有用な化学的作用物質のさらなるライブラリーは、例えば、Evotec（evotec.com）；Magellan Bioscience Group（magellanbioscience.com）；およびCellumen（cellumen.com）から入手可能である。
【０１１１】
本発明のハイスループットアッセイは、1日に数千もの異なる候補作用物質をスクリーニングする。具体的には、マイクロタイタープレートの各ウェルを、選択された可能性のある候補作用物質に対する別々のアッセイを実行するために使用してもよいし、または濃度もしくはインキュベーション時間の効果を観察すべき場合には、5〜10ウェル毎に1種類のモジュレーターを試験することができる。従って、1枚の標準的なマイクロタイタープレートは、約100種類（例えば、96種類）の候補作用物質をアッセイすることができる。より多数のウェル、例えば、192個、384個、768個、または1536個のウェルを有するマルチウェルプレートが、有用である。1536穴プレートが使用される場合には、1枚のプレートが、約100〜約1500種類の異なる化合物を容易にアッセイすることができる。1日に数枚の異なるプレートをアッセイすることが可能である。本発明の集積システムを使用すれば、約6,000〜20,000種類もの異なる化合物のアッセイスクリーニングが可能である。
【実施例】
【０１１２】
実施例1．ShcKOマウスは高脂肪食（HFD）摂取の際に増加した寿命を有する
同様のマウス数および日齢での、高脂肪食摂取の際の平均生存率および最大生存率は、ShcKOマウスにおいて対照よりも高い（図1）。
【０１１３】
寿命測定プロトコル：同齢マウスの群に、2ヶ月齢の時に、示された飼料を与え始めた。体重、摂食量、および死亡日を記録した。
【０１１４】
実施例2．Shc枯渇はインスリン/IGF-1受容体経路のAKTアームを敏感にする
Shc活性の減少は、Ras癌遺伝子経路の活性を減少させるが（図2A、黒星印）、Akt生存促進/代謝経路の活性を増加させる（図2A、白星印）。ShcKOマウスにおいては、p66Shcが欠失しており、さらに、筋肉、肝臓、心臓、膵臓、褐色脂肪のようないくつかの組織において、p52Shcおよびp46Shcの発現が有意に減少している（図2B）。ShcKOマウスは、増加したインスリン感受性（図2C、上）および改善された耐糖能（図2C、下）を有する。ShcKOマウス（図2D）およびShc枯渇細胞（図2E）は、増加したインスリン依存性のAkt活性化（Aktリン酸化）およびIRS1を有するが、Erk活性化の増加は有しない。低下したShc発現の結果として、高脂肪食を摂取した肥満マウスですら、Aktの活性化のため、より高い代謝インスリン感受性を維持し（図2F）、従って、HFDによって誘導される高血糖症の発症を克服する（図2G）。
【０１１５】
図2Bについてのウエスタンブロットプロトコル：20mMトリスHCl（pH7.5）、150mM NaCl、1mM Na2EDTA、1mM EGTA、1％トリトン、2.5mMピロリン酸ナトリウム、1mM βグリセロホスフェート、1mM Na3VO4、100mM DTT、1μg/mlロイペプチン、1mMフェニルメタンスルホニルフロリドを含有しており、Complete Mini Protease Inhibitor CocktailおよびPhosStop Phosphatase Inhibitor Cocktail（Roche）が補足されているCell Lysis緩衝液を使用して、マウス組織から全タンパク質を単離した。ブラッドフォードアッセイ（Bio-Rad Laboratories）によって決定された1ライン当たり40マイクログラムのタンパク質をSDS-PAGEによって分離し、ニトロセルロース膜に移し、Odyssey Blocking Buffer（Li-Cor Biosciences）でブロッキングし、ウサギポリクローナル抗Shc抗体（BD Bioscience）およびマウスモノクローナル抗チューブリン抗体（Sigma）とハイブリダイズさせた後、IR色素700CWで標識されたヤギ抗ウサギモノクローナル抗体およびIR色素800CWで標識されたヤギ抗マウスモノクローナル抗体（Li-Cor Biosciences）によって発色させた。ブロットをLicor Odyssey赤外イメージング装置でスキャンし、Odyssey 2.1ソフトウェアを使用して定量化した。異なるIR色素によって標識された二次抗体の使用は、同一の膜において関心対象のタンパク質（Shcアイソフォーム）と同時にハウスキーピングタンパク質（この具体例においては、チューブリン）のレベルを測定することを可能にし、これは定量化および標準化の精度を改善する。
【０１１６】
図2Cについてのインスリン負荷試験（ITT）およびブドウ糖負荷試験（GTT）のプロトコル：対照遺伝子型およびShcKO遺伝子型の同齢/同性マウスの群において、4時間、飼料を除去し、インスリンの腹腔内注射によってチャレンジし、正確に示された時点で血中のブドウ糖濃度を決定した。血中ブドウ糖の減少および回復を、基底レベル（インスリン注射前の時点）に対する％として計算した。ブドウ糖の基底レベルは、各マウスについて3回反復で測定した。GTTについては、同マウス群を14時間絶食させ、腹腔内ブドウ糖注射によってチャレンジし、同様に、血中ブドウ糖濃度を測定した。
【０１１７】
図2Dについての急性組織インスリン感受性試験（ATIST）プロトコル：マウスを6時間絶食させ、体重1kg当たり100mgのペントバルビタールの腹腔内注射によって麻酔を開始した。腹腔を開き、所望の組織の小さい生検材料を採取し液体窒素で凍結させた。下大静脈を通してインスリンを注射し、インスリン処理後の異なる正確な時点で生検材料を再び採取した。20mMトリスHCl（pH7.5）、150mM NaCl、1mM Na2EDTA、1mM EGTA、1％トリトン、2.5mMピロリン酸ナトリウム、1mM βグリセロホスフェート、1mM Na3V04、100mM DTT、1μg/mlロイペプチン、1mMフェニルメタンスルホニルフロリドを含有しており、Complete Mini Protease Inhibitor CocktailおよびPhosStop Phosphatase Inhibitor Cocktail（Roshe）がさらに補足されているCell Lysis緩衝液（Cell Signaling Technologies）を使用して、全タンパク質を単離した。上記のように、Bradfordアッセイ（Bio-Rad Laboratories）によって決定された1ライン当たり40マイクログラムのタンパク質をSDS-PAGEによって分離し、ニトロセルロース膜に移し、Odyssey Blocking Buffer（Li-Cor Biosciences）でブロッキングし、示された一次抗体とハイブリダイズさせた後、赤外IR色素700CWおよび/または800CWで標識された二次抗体（Li-Cor）によって発色させた。図2Dに、筋肉組織を試験した結果が提示され、インスリン注射前の時点（インスリン「-」）およびインスリン注射の300秒後（インスリン「+」）が提示される。
【０１１８】
図2FについてのATISTプロトコル：高脂肪食は、AIN-93G飼料（Teklad TD.94045）に基づいており、60％脂肪由来カロリー、7.3％炭水化物由来カロリー、および17.7％タンパク質由来カロリーを有するよう調整された。主な脂質源は大豆油であり、主なタンパク質源はカゼインであり、主な炭水化物源はコーンスターチであった。MFD（中脂肪食）は、通常の脂肪含量を有する対照AIN-93G飼料（Teklad TD.94045）である。HFDおよびMFDにおいて、タンパク質由来カロリーは同一であった。マウスに、3ヶ月齢の時に、示された飼料を与え始め、4ヶ月間維持した。ATISTを前記のように実施した。図2Fに、インスリン注射後「0」秒（インスリン「-」）および90秒（インスリン「+」）の肝臓についてのATISTの結果が提示される。
【０１１９】
図2EについてのShcサイレンシングを有する細胞におけるインビトロのインスリンシグナリング測定：HeLa細胞を、示されたsiRNAによってトランスフェクトした。トランスフェクションは、6穴プレート（Nunc）で実施された。1ウェル当たり20万個の細胞を、抗生物質不含DMEM10％FBSで播種し、定着後、PBSで洗浄した。製造業者のプロトコルに従って、Shcに特異的な10nM siRNAまたは非特異的なAllStar siRNA（Qiagen）、OPTIMEM培地（Invitrogen）、およびLipofectamine 2000（Invitrogen）を使用して、トランスフェクション混合物を調製した。600μlのトランスフェクション混合物における6時間のトランスフェクションの後、新鮮なDMEMを細胞に供給した。細胞を、DMEM 10％FBS、25mMブドウ糖で、48時間維持した。全タンパク質を抽出し、前記の示された抗体によってウエスタン分析した。Akt（活性化型のリン酸化）およびPDH（抑制型のリン酸化）のリン酸化レベル、ならびにShcアイソフォーム、全PDH、全Akt、およびPDK 4の発現レベルを測定した。さらに、インスリンシグナリング経路の複数の他のメンバーの発現のホスホ/全レベルを測定したところ、データは、Shcサイレンシングを有する細胞における代謝的インスリンシグナル流の増加と一致していた。
【０１２０】
図2Gについての空腹時血中ブドウ糖測定：示された時間、HFDで維持されたマウスから、4時間、飼料を除去し、血中ブドウ糖を測定した。
【０１２１】
実施例3．ShcKOマウスは、複数の脂肪パッドにおける減少した白色脂肪、高脂肪食摂取の際の減少した体重、および増加した褐色脂肪を有する
ShcKOマウスは、複数の白色脂肪パッドの減少した重量を有する（図3A）。ShcKOマウスは、高脂肪食摂取の際の減少した体重増加を有する（図3B）。ShcKOマウスにおけるやせの増加の可能性の高い理由は、褐色脂肪のサイズ（図3C）および代謝活性（図3D）の増加、ならびに褐色脂肪分化の増加（図3E）である。
【０１２２】
図3Aについての体組成プロトコル：各遺伝子型：対照およびShcKOの6匹のマウスの群を頸椎脱臼によって屠殺し、示された組織を計量し、重量を各マウスの全体重に対して正規化した。体組成は、野生型に対するShcKOの重量変化倍率として表された。5％未満のαの下で統計的に有意であり、1.2より大きい変化倍率を有するデータを、生物学的に有意であると見なした。
【０１２３】
図3BについてのHFDでの体重増加試験（WGT）：各遺伝子型の14匹のマウスの群に、3ヶ月齢の時にHFDを与え始め、体重を毎週測定した。
【０１２４】
図3Cについての褐色脂肪の形態学的研究：各遺伝子型の5匹のマウスの群を、18ヶ月齢で屠殺し、褐色脂肪パッドを抽出し、ヘマトキシリン・エオシン染色で染色し、100umに切片化し、400倍の倍率で写真を撮影した。明らかに、ShcKOマウスはより大きい褐色脂肪細胞を有していた。各マウスの5個のランダムな切片において、ImageJソフトウェアを使用して、二重盲検プロトコルで、細胞サイズを測定し、サイズ分布を分析したところ（各遺伝子型について全部で25個の切片）、ShcKoマウスは、より大きいBAT細胞の数の統計的に有意な増加、および、より小さい細胞の数の低下を有していた。
【０１２５】
図3Dについてのウエスタンブロットプロトコル：6時間絶食させた対照マウスおよびShcKOマウス（各群5匹のマウス）から、BAT脂肪パッドを抽出し、前記のように、タンパク質を抽出した。ウエスタンブロットを上記のような示された抗体によって実施した。図3Dには、Shcアイソフォーム発現、VDAC、UCP1、MnSOD、Cyt-c、およびUCP3が提示されるが、ACAA1、ACAA2、GCK、GCKR、HK、PK、PCX、CPT2、VLCAD、MCAD、ETF、PDH/P-PDH、ME1、ACLY、CPS、GS、GSK、P-AMPK、HSL、P-HSL、PDK1、PDK4、PFK、PKM、FOXO/P-FOXO等のような、大部分の代謝酵素の発現レベルも測定された（示されない）。一貫して、代謝酵素の大部分の発現が、ShcKOマウスのBAT脂肪において、有意に増加していた。
【０１２６】
図3EについてのQ-RT-PCRプロトコル：褐色脂肪分化の程度を、分化マーカーprdm16、elovl3、およびBMP7のQRTPCRによって測定したところ、ShcKOマウスにおいてより分化していることが見出された。TriZol試薬によって、対照マウスおよびShcKOマウスのBAT組織から全RNAを抽出した後、製造業者の説明に従って、Qiagen RNA-easyミニキットによって精製した。等しいRNA量を、オリゴ（dT）プライマーと共に、Superscript III First Strand逆転写酵素反応混合物（Invitrogen）へ添加した。得られた鋳型を、以下の表にリストされた特異的なプライマーおよびPlatinum-Taq DNAポリメラーゼ（Invitrogen）を使用したSyber Greenに基づく定量的PCRに供した。単一の融解ピークを有する実験のみを分析のために考慮した。βアクチンの増幅を、内在性cDNA量標準化対照として使用した。各遺伝子型の5匹のマウスを分析した。反応の質をゲル電気泳動によって確認した。PCRを、LightCycler480 Real time PCR装置およびLightCycler480分析ソフトウェア（Roche）を使用して実施した。まず、各試料についてβアクチンの発現レベルに対してデータを標準化し、次いで、対照の平均値に対する比として表した。BATマーカー：Prdm16、Elovl3、およびBMP7についての結果が提示される。データは、ウエスタンブロットの結果と一致しており、総合すると、ShcKOマウスにおけるBAT分化の増加の概念を支持した。プライマーは以下の通りであった。
2018508534.tif 000003
【０１２７】
実施例4．インスリン依存性のAKT活性化に基づくインスリン増感剤のハイスループットスクリーニング
微量インスリンまたは10nMインスリンの存在下で、ホスホAkt活性化を刺激する能力について、インセルウエスタンブロット（ICWB）によって、薬物をスクリーニングした（図4A）。ウェル内の細胞を薬物によって処理し、Aktの活性（リン酸化）をホスホAkt特異的抗体によって決定した。図4Aにおいては、低インスリンが与えられ、薬物a、b、cがAkt活性化を刺激した。図4Bにおいては、10nMインスリンが与えられ、a、b、およびcはバックグラウンドを超えてシグナリングを刺激し、dおよびeは阻害した。図4Cは、Aktのホスホ活性化を通して、Shc阻害剤について薬物をスクリーニングする戦略を示す。薬物を、インスリン依存性の（ホスホ）Akt刺激を促進する能力について一次スクリーニングし、次いで、（ホスホ）Erkを刺激する活性の欠如または高いAkt/Erk比について二次スクリーニングした。そのような薬物は、インスリン感受性、肥満に対する抵抗性、および長寿を引き起こすと予想される。これらの所望の特徴を有するいくつかの薬物は、Shc阻害剤である。
【０１２８】
一次ICWBは以下のように実施された：FL83B細胞を、10％FBSおよび25mMブドウ糖が補足されたF-12培地で、1ウェル当たり10,000細胞で、384穴プレートに播種した；48時間後、培地を、FBSを含まないF-12、25mMブドウ糖に16時間交換した；2回反復で、1時間、所望の濃度で、割り当てられた薬物を細胞に補足し、次いで、Akt活性化測定のため10分間、ERK活性化測定のため15分間、所望の濃度のインスリンによって細胞を刺激した。その後、培地を除去し、PBS中5％ホルムアルデヒド（pH＝7.4）の固定液に交換し、30分後、固定液を、透過処理緩衝液、PBS中0.1％トリトンX100の溶液に40分間交換した。Li-Cor Odysseyブロッキング緩衝液（Li-Cor Biosciences,Inc.,Lincoln,NE）によってブロッキングを実施し、一次抗体を、室温で1時間ハイブリダイズさせた後、PBS中0.1％ツイーン20の溶液で3回洗浄した。ウサギモノクローナル抗ホスホ（Ser437）Akt抗体およびウサギモノクローナル抗ホスホ（Thr202/Tyr204）ERK抗体は、Cell Signaling Technology（Danvers,MA）から、マウスモノクローナル抗チューブリン抗体は、Sigma（St.Louis,MO）からであった。二次抗体は、Li-Cor Biosciencesからであり、ヤギ抗ウサギについてはIR色素700、ヤギ抗マウスについては800で標識されていた。室温での1時間の二次抗体とのインキュベーションの後、ウェルをPBS中0.1％ツイーン20の溶液で再び2回洗浄し、Li-Cor Odyssey赤外スキャナーでスキャンした；画像をLi-Cor Odysseyソフトウェアで分析した。一次抗体なしのウェルを、バックグラウンドを差し引くために使用した。PI3K阻害剤ワートマニンを、Akt活性化に対するインスリンの効果を消失させるために使用し、陰性対照として用いた。次いで、各ウェルにおいて、ホスホAkt、ホスホERKのシグナルをチューブリンシグナルによって標準化し、細胞分裂促進性のERK活性化を誘導することなく、代謝的インスリン感受性を改善する薬物を同定するため、濃度測定結果を分析した。
【０１２９】
図4A〜Cについての二次薬物スクリーニングプロトコル：前記と同様にICWBが実施されたが、薬物は、0.01μM、0.1μM、1μM、2.5μM、5μM、7.5μM、および10μMという7つの濃度で2回反復で使用され、インスリンは、1nMおよび10nMという2つの濃度で使用された。インスリン依存性のAktおよびERKの活性化のレベルを、適切な抗体によって測定し、各ウェルにおけるチューブリン発現に対して標準化した。薬物をメガテーブル（megatable）に配置し、P-ERKに対するP-Atkシグナルの有意な改善の変化倍率依存スコアによって選別した。
【０１３０】
実施例5．付加的なスクリーニングアッセイ
ハイスループットスクリーニングの後、インスリン増感剤を、以下のようにさらに試験し、精査した。Shcとミトコンドリアとインスリン感受性との相互作用は、図5Bに記載される。インスリン増感剤のうちどれがShc阻害剤であるかを精査するため、（本発明者らは、Shcがインスリンシグナリングのリプレッサーとして機能することを以前に示したため（図4A〜C、図5B）、Shc阻害剤に期待される）ホスホAkt対ホスホErk経路を刺激する能力について、薬物をさらに試験した。さらに、リン酸化状態のウエスタンブロット（Akt、Erk、AMPK、AS160）を実施した。さらに、本発明者らは、数種類のミトコンドリアに基づくアッセイを実施し、それは、インスリン増感剤の大部分がミトコンドリア機能に影響を与え、非インスリン増感剤においてはミトコンドリア効果がはるかに低頻度であることを証明した（ここでは示されない）。図5Aのブランクは、効果がないことを意味する。IRS1活性の阻害に加え、Shcはミトコンドリア機能も刺激する（図5B）。従って、Shc阻害はミトコンドリア機能を改変し、AMPKを刺激する。AMPKの刺激は、mTORを阻害することが公知であり、活性mTORは、IRSおよびAktを阻害することによってブドウ糖代謝を阻害する。従って、Shc阻害剤は、IRS1を直接刺激し、ミトコンドリア機能の抑制を通して間接的にもIRS1およびAktを刺激し、それが、mTORを抑制するAMPKを刺激し、従って、IRS1およびAktに対するmTORの抑制効果を逆転させる。
【０１３１】
スクリーニングアッセイの妥当性の証拠として、公知の抗糖尿病分子（メトホルミンおよびアカルボース）が、1689種類の分子のうちの上位35に入り、公知のSrc阻害剤SrcI-1も同様であった。
【０１３２】
従って、図5A〜Cに記載されるように、以下のものを含む数種類の付加的なアッセイによって、薬物をさらに検証した：（1）ウエスタンに基づくホスホAktアッセイ（カラム2〜4）；（2）ウエスタンに基づくホスホErkアッセイ（カラム5〜7）；ミトコンドリアO2消費アッセイ（カラム8〜9）、ATP合成アッセイ（カラム10）、ジアミドに基づくミトコンドリア酸化アッセイ（カラム11）；ハイスループットホスホAMPキナーゼアッセイ（カラム12）；ウエスタンに基づくホスホAMPキナーゼアッセイ（カラム13〜14）；およびウエスタンに基づくAS160アッセイ（カラム15〜16）。2時間および24時間のミトコンドリアO2消費、ミトコンドリアATP合成、ミトコンドリア酸化感受性、低血清におけるHTS AMPK活性、ならびに高血清におけるウエスタンAMPK活性を含む、ミトコンドリア機能の7種類のアッセイのうちの1種類または複数種類について、全ての単一のインスリン増感剤が有意に改変されたことは注目すべきである。従って、データは、Shc阻害→IRS1刺激、およびShc阻害→ミトコンドリア機能の改変→AMPKの増加→mTORの抑制→インスリン感受性の増加というインスリン増感機序を支持した。
【０１３３】
ホスホAkt（カラム2〜4）およびホスホErk（カラム5〜7）のウエスタンブロットプロトコル：前記および実施例4において説明されたように、ホスホAktおよびホスホErkのウエスタンブロットは、ICWB測定値より正確で、的確で、定量的なAktリン酸化の尺度である。インスリン依存性ホスホAktは、インスリン感受性の直接の尺度であり、本発明者らは、Shc阻害剤がホスホErkよりホスホAktを刺激するであろうと予想する。図5Aにリストされた薬物は、全て、何らかの濃度でインスリン依存性ホスホAktを刺激した。方法：マウス肝細胞FL83Bを、6穴プレートの各ウェルに400.000細胞の密度で播種し、48時間培養し、培地を25mMブドウ糖で血清を含まないDMEMに交換し、16時間後、示された濃度の薬物によって1時間、細胞を処理した。対照ウェルは媒体（DMSO）によって処理され、ある特定の対照ウェルにおいては、代謝的（Akt）インスリンシグナリングがワートマニンによって遮断された。示された濃度のインスリンによって、10分間、細胞を誘導し、全タンパク質を抽出し、ウエスタンブロットを前記の示された抗体によって実施した。
【０１３４】
ミトコンドリアO2消費プロトコル（カラム8〜9）：前記のように、ミトコンドリアO2消費の阻害剤または刺激剤は、それらがATP合成を減少させ、従って、AMPK活性を刺激する場合、mTORを抑制し、従って、インスリンに対して敏感にするであろう。また、Shcはミトコンドリア機能を刺激し、従って、Shc阻害剤はミトコンドリア機能を阻害するはずである。方法：アッセイを開始する前に、細胞密度をVi-Cellカウンター（Beckman Coulter）を使用して決定し、1ウェル当たり70,000個のRGC5細胞を、90μLのフェノールレッド不含増殖培地（10％ウシ胎仔血清が補足されたDMEM）において、384穴酸素バイオセンサープレート（Becton Dickinson Probe）へ等分し、細胞を20〜30分間付着させた。10μLの試験化合物（DMSO中の10mMストック）または媒体を、0.1％の最終DMSO濃度を与えるPBSでの中間希釈の後、ウェルへ分配した。試験化合物は、全て、3μMおよび10μMの最終アッセイ濃度で試験された。各プレートに、6個の陰性対照ウェル（DMSO媒体のみ）および6個の陽性対照ウェル（5μM FCCP）が存在した。プレートを、2時間または24時間、5％CO2の下で37℃でインキュベートし、次いで、蛍光を測定した（485nm励起；630nm放射）（BMG Labtech,Germany）。データの統計的有意性を、両側スチューデントt試験（p値＜0.05）によって決定した。
【０１３５】
ミトコンドリアATP合成プロトコル（カラム10）：前記の説明のように、ATP合成の減少は、AMPKを刺激し、それが、mTORを阻害し、従って、インスリン増感をもたらすことが公知である。ATPレベルを、製造業者のプロトコルに従って光測定アッセイによって測定した。方法：簡単に説明すると、細胞をジギトニンによって透過処理し、0.25Mショ糖、20mM MOPS、1mM EDTA、5mM無機リン酸、脂肪酸を含まない0.1％BSA、および1mM ADP（pH7.4）を含有している緩衝液においてインキュベートした。0.1マイクロモルのロテノンの濃度で、複合体I〜Vの活性を測定するため、5mMピルビン酸（グルタミン酸）および1mMリンゴ酸を、透過処理された細胞へ添加し、各試料中の非ミトコンドリアATP産生の量を決定するため、10μg/mlオリゴマイシンも添加した。ATP産生を光測定アッセイ（Roche）によって動力学的に測定し、非ミトコンドリアATP産生を全産生から差し引いた。標準化マーカーとして、タンパク質レベルを、Bradfordタンパク質アッセイ（Bio-Rad）を使用して測定した。
【０１３６】
ミトコンドリア酸化（カラム11）ジアミドスクリーニングアッセイ：本発明者らは、ジアミド感受性がミトコンドリア酸化剤感受性の尺度であることを以前に示した。他のものは、ミトコンドリア抗酸化剤保護がミトコンドリア生体エネルギー論機能に関係していることを示した。従って、ミトコンドリアを脱分極する薬物は、ミトコンドリア酸化剤ジアミドに対する増感を引き起こす。ミトコンドリアを脱分極する薬物は、AMPKを増加させ、mTORを抑制し、インスリン感受性を増加させる。方法：繊維芽細胞を、t225組織培養フラスコにおいて15％ウシ胎仔血清が補足されたMEM培地（Gibco）において増殖させ、70％未満のコンフルエンシーで維持した。細胞をトリプシン処理し、密度をVi-Cellカウンター（Beckman Coulter）を使用して決定した。次いで、5,000個の繊維芽細胞を、180マイクロリットルの容量の抗生物質を含まない増殖培地で、96穴ポリ-d-リジンによってコーティングされた黒/透明培養プレート（Becton Dickinson）へ等分した。細胞を、37℃で3〜4時間付着させた。薬物（DMSO中の10mMストック）を、0.1％の最終DMSO濃度を与えるPBSでの中間希釈の後、電子マルチチャンネルピペッター（BioHit）を使用してアッセイプレートウェルへ分配した。Pharmakon薬物ライブラリーは、DMSO中10mMのストック濃度における96穴プレート内の1600種類の化合物（Microsource）からなっていた。試験化合物は、全て、一次スクリーニングにおいて10マイクロモルの最終アッセイ濃度で試験された。300マイクロモルのジチオスレイトール（Sigma）または0.1％DMSOの各8ウェルを、それぞれ、陽性対照または陰性対照として使用した。次いで、細胞を、5％CO2で37℃で一晩インキュベートした。24時間後、ジアミド（Sigma）を、dmsoで調製された100ミリモルのストック溶液から125マイクロモルの最終濃度で全てのウェルに添加し、5％CO2で37℃で一晩（14〜18時間）インキュベートした。次いで、プレートをPBSで洗浄し、1uMカルセインAM（Molecular Probes）を補足し、RTで45分間インキュベートした。残存色素を除去するため、細胞をPBSで再び洗浄し、485の励起波長および520の放射波長でBMG PolarStar Optima（BMG LabTech）で読み取った。
【０１３７】
ホスホAMPK活性化インセルウエスタンブロットハイスループットスクリーニングアッセイ（カラム12）
前記の説明のように、ミトコンドリア脱分極は、ミトコンドリアのATP産生の減少、AMPの増加、およびAMPキナーゼの活性化を招き、それが、mTORを抑制し、インスリン感受性を増加させる（図5B）。方法：ホスホAktおよびホスホErkについて実施例4に記載されたインセルウエスタンブロットと同様に、細胞をホスホAMPKの活性化についてスクリーニングした。ホスホAMPKを活性化するため、細胞を、16時間、ブドウ糖飢餓培養またはブドウ糖飢餓かつ血清飢餓培養した。ホスホAMPK抗体によるインセルウエスタンブロット（ICWB）を、正確に実施例4に記載された通りに実施した。0.1〜10マイクロモルの7つの薬物濃度を使用した。
【０１３８】
標準的なウエスタンプロトコルによるホスホAMPK活性化（カラム13〜14）およびホスホAS160活性化（カラム15〜16）の測定：前記の実施例5、カラム2〜7と同様に、ウエスタンプロトコルを実施したが、ホスホAMPキナーゼまたはホスホAS160に対する抗体を使用した。
【０１３９】
考察：インスリン依存性ホスホAkt活性化に関する1689種類の薬物のスクリーニングにおいて35種類のインスリン増感剤が見出されたことに加えて、本発明者らは、ミトコンドリア機能に対する効果に関してもさらに薬物を精査した。図5Cに示されるように、インスリン増感剤の大部分が、AMPキナーゼを刺激し、そのことから、ミトコンドリア機能に対する効果が示された。O2消費、ATP合成、ミトコンドリア酸化からの防御、およびAS160活性化を含む、ミトコンドリア機能の他の数種類の試験によってこれを追跡したところ、全ての単一の薬物が、これらのミトコンドリアパラメーターのうちの少なくとも一つに対して効果を有する。これは、図5Bに提示されたインスリン増感のShcおよびミトコンドリアの機序、即ち、Shc→ミトコンドリア→AMPK→mTOR阻害→インスリン感受性を支持する。
【０１４０】
実施例6．SrcI-1はインビボで基底血中ブドウ糖を有意に減少させ、インスリン感受性を増加させ、Shc活性化を減少させる
Src阻害剤SrcI-1は、図5A〜Cにおけるスクリーニングによって同定された。SrcI-1はインスリン依存性P-Aktシグナリングを刺激するが（図6A）、同時に、Erk活性化を減少させ、従って、P-Akt/P-Erk比を増加させる（図6B）。SrcI-1は用量依存的にホスホShc活性化を阻害した（図6D）。マウスへ4日間腹腔内投与された低用量のSrcI-1（2.5mg/kg）は、有意に、基底血中ブドウ糖を減少させ（図6E）、インビボのインスリン感受性を増加させた（図6E）。
【０１４１】
図6A、B、Cについてのウエスタンブロットプロトコル：マウス肝細胞FL83Bを6穴プレートの各ウェルに400.000細胞の密度で播種し、48時間培養し、培地を25mMブドウ糖で血清を含まないDMEMに交換し、16時間後、示された濃度の薬物によって1時間、細胞を処理した。対照ウェルは、媒体（DMSO）によって処理され、ある特定の対照ウェルにおいては、代謝的（Akt）インスリンシグナリングがワートマニンによって遮断された。示された濃度のインスリンによって、10分間、細胞を誘導し、全タンパク質を抽出し、前記の示された抗体によってウエスタンブロットを実施した。図は、薬物が、代謝的インスリンシグナリングを改善し、同時に、細胞分裂促進シグナルの流れを抑制し、Shc阻害性薬物機序を表したことを示す。
【０１４２】
図6D、Eについての末梢のインスリン感受性を改善するためのインビボ薬物試験：実験的薬物処理については10匹、プラセボ処理については14匹のマウスの群を、4日間、毎日、薬物溶液またはプラセボ溶液の腹腔内投与に供した。血中ブドウ糖濃度を減少させる公知の薬物アカルボースを、対照として使用した。インスリン負荷試験ITTを、前記の実施例2と同様に、マウスに対して実施した。
【０１４３】
実施例7.イデベノンはインビトロおよびインビボでインスリン感受性を有意に増加させ、Shc活性化を減少させる
イデベノンも、実施例4に記載されるP-Akt/P-Erk比の増加、および用量依存的なインスリン依存性ホスホAkt活性化の増加によって、一次スクリーニングにおいて同定された（図7AB）。さらに、イデベノンは用量依存的にホスホShcを減少させた（図7CD）。20mg/kgおよび50mg/kgの用量でマウスへ経口（PO）投与した場合、イデベノンはインビボのインスリン感受性を増加させた（図7E）。方法：ウエスタンブロットは、正確に実施例6に記載された通り、インスリン負荷試験は、正確に実施例6に記載された通りであった。
【０１４４】
実施例8：Schタンパク質PTBドメインとの結合
図8A〜Fは、イデベノンが、Shcタンパク質PTBドメインに結合し、インビトロおよびインビボでインスリン感受性を増加させることを図示する；インシリコドッキングは、イデベノンがPTB活性ポケットに結合することを明らかにしている。図8Aは、48点滴定系列で10pM〜100uMの濃度範囲でイデベノンが滴定され、Octet RED 384装置を使用して、p52Shcタンパク質に対して試験されたことを示す；PTBドメインを欠くp52Shcが、参照として使用された。センサーグラムを入手し、各濃度についての応答［nm］をイデベノンのlog濃度に対してプロットした。シグモイド可変勾配フィッティング分析を、GraphPad Prism Software（GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA）を使用して実施した。EC50、hill勾配、および最大応答を同定し、示した。p値は、N＝48についての有意性についてR2を試験することによって計算された；スチューデント係数は、t＝(SQRT(R2*(N-2))/SQRT(1-R2)として計算された。イデベノンは1.2nMのEC50でShc-PTBドメインに結合した。図8Bは、FL83Bマウス肝細胞（American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA）を、1ウェル当たり200,000細胞で、24穴組織培養プレート（Corning Inc., One Riverfront Plaza Corning, NY）に播種し、標準DMEM培地でコンフルエントになるまで増殖させ、血清飢餓培養し、調整のために細胞を16時間放置したことを示す。65の実験点で、10pM〜10uMの一連の濃度で、1時間、イデベノンをコンフルエントの細胞へ適用した；DMSOを媒体対照として使用した。細胞を10分間0.2nMインスリンによって刺激し、AktおよびERKの誘導についてウエスタン分析した。Aktのインスリン依存性の活性化が、媒体対照に対する変化倍率として提示され、イデベノンのlog濃度に対してプロットされる；チューブリンシグナルを生物学的試料の間の標準化のために使用した。シグモイド用量応答（可変勾配）フィッティング分析を実施し、前記のように、EC50、hill勾配、および最大応答を同定し、グラフに示した。p値はN＝65についての有意性についてR2を試験することによって計算された。イデベノンは、3.3nMのEC50でインスリンに対して細胞を増感した。図8Cは、図8Bに記載されたインスリン依存性のAkt活性化についてのウエスタンブロットの例示画像を示す；イデベノンの濃度が示される。図8Dは、10ヶ月齢/同性マウスを、200mg/日の量のピーナッツバターを自由に消費するよう訓練し、次いで、15匹の3つの群へランダム化し、「プラセボ」、「イデベノン、20mg/kg」、「イデベノン、50mg/kg」に割り当てたことを示す。示された用量のイデベノンを、5日間、暗期の30分前に動物へ与えた。インスリン負荷試験（ITT）の当日、付加的な用量のイデベノンを、インスリン注射の2時間前に動物へ与えた。ITTのため、午前7時（明期の始め）に飼料を除去し、午前11時に基底ブドウ糖を測定し、インスリンを0.8U/kg回で投与し；血中ブドウ糖を記録し、ベースラインに対する％として表し、時間に対してプロットした。イデベノンは、インビボで有意にインスリン感受性を改善し、一元配置のANOVA、その後のシェッフェの事後法によって決定されたp値は、20mg/kgのイデベノンについて、45分、60分、90分、および120分の時点について、それぞれ、2.3E-03、1.1E-03、1.4E-03、6.0E-04、50mg/kgのイデベノンについて、15分、30分、45分、60分、90分、120分について、5.4E-02、5.5E-03、7.8E-04、6.7E-03、3.7E-03、9.5E-04であった。図8Eは、ChemBio3D Pro.Software（CambridgeSoft Corporation,Waltham,Massachusetts）を使用して、イデベノンについての原子電荷、距離、および結合角が計算され、iGEMDOCKソフトウェア（BioXGEM Lab,National Chiao-Tung University Hsinchu,Taiwan,R.O.C）を使用して、Shc-PTBへの仮想ドッキングがなされ、MOLファイルが生成されたことを示す。ShcのPTBドメインの三次元構造は、Protein Data Bank（http://www.rcsb.org/）から入手された。参照されるように、イデベノンはShcタンパク質のPTBポケットにドッキングした；アミノ酸および結合エネルギーおよび相互作用の型が、表に提示される。図8Fは、イデベノンの化学構造を示す。
【０１４５】
図9A〜Eは、SrcI-1がShcタンパク質のPTBドメインに結合することを図示する。図9Aは、24点滴定系列で10pM〜100uMの濃度範囲でSrcI-1が滴定され、Octet RED 384装置を使用して、p52Shcタンパク質に対して試験されたことを示す；PTBドメインを欠くp52Shcが、参照として使用された。センサーグラムを入手し、示した。示されるように、SrcI-1は用量依存的にShc-PTBに結合した。図9Bは、log濃度に対してプロットされた、Shc-PTBに対して試験された各濃度のSrcI-1についての応答［nm］を示す。シグモイド可変勾配フィッティング分析が実施され；EC50、hill勾配、および最大応答が同定され、示された。p値は、N＝24についての有意性についてR2を試験することによって計算された；SrcI-1は3μMのEC50でShc-PTBドメインに結合した。図9Cは、SrcI-1が、記載されたようなiGEMDOCKによってShc-PTBに対して試験されたことを示し；アミノ酸および結合エネルギーおよび相互作用の型が提示される。示されるように、SrcI-1はShcタンパク質のPTBポケットにドッキングした。図9Dは、Shcタンパク質のPTBポケットへのSrcI-1の仮想ドッキングの画像を示す。図9Eは、SrcI-1の構造を示す。
【０１４６】
図10は、Shc-PTBに特異的に結合するいくつかのイデベノン類似体、およびShc-PTBに結合しない他のものを例示する。イデベノン類似体「10」、「11」、「12」、イデベノン、DF-1176-178、DF-1176-155、デシルユビキノン、「31」、「29」、「28」、DF-1176-83、DF-1291-25、DF-1291-97、および化合物SrcI-1を、記載されたようなOctet 384 RED系によってShcタンパク質に対して試験した。「Shc-PTB結合剤」および「非Shc-PTB結合剤」の分子構造が提示される。
【０１４７】
図11A〜Fは、イデベノン類似体、イデベノン、およびSrcI-1のShcタンパク質との相互作用の詳細を図示する。図11Aは、イデベノン類似体が、記載されたようなiGEMDOCKによってShc-PTBに対して試験されたことを示し、各Shc-PTB特異的結合剤についてのアミノ酸、エネルギー、および相互作用の型が、表に提示される。図11B〜Eは、示された化合物が24点滴定系列で10pM〜100uMの濃度範囲で滴定され、Octet RED 384装置を使用してp52Shcタンパク質に対して試験され；PTBドメインを欠くp52Shcが、参照として使用されたことを示す。センサーグラムが入手され、各濃度についての応答［nm］が化合物のlog濃度に対してプロットされた。示された化合物の仮想ドッキングの画像も示される。図11Fは、シグモイド可変勾配フィッティング分析がGraphPad Prism Softwareを使用して実施されたことを示し；EC50、hill勾配、および最大応答が同定され、表に示された。
【０１４８】
実施例9：イデベノンは副腎皮質ステロイドによって処置された対象において2型糖尿病および代謝症候群の発症を抑える
マウスは、研究の間中、病原体除去条件で維持された。全ての実験手法が、Institutional Animal Care and Use Committee（IACUC）によって承認され、地域、州、および連邦政府の規定を遵守して実施された。飼料は、栄養組成：タンパク質＝19.9％、炭水化物＝53.7％、脂肪＝5.7％を有するLM-485（Teklad 7012）であった。脂質源は大豆油、タンパク質源は大豆粕、エネルギー源は挽き割りオート麦であった。36匹の13ヶ月齢の雄マウスおよび雌マウスの群をITTによって試験した後、研究を開始し、100mg/Lの飲料水中のコルチコステロンを与え始めた。体重および血中ブドウ糖をモニタリングした。図12Aは実験の流れを図示する。1日目にマウスにコルチコステロンを与え始め、研究の間中、継続した。13日目、群をランダムに1:1に分割し、さらに5日間、半分にはピーナッツバターとの混合物としてのイデベノンを毎日与え、半分にはプラセボを毎日与えた。これらの5日間、全てのマウスが、飲料水中のコルチコステロンを受容し続け、次いで、ITTが実施された。インスリン負荷試験のため、マウスを、6時間絶食させ、インスリン（0.2U/kg）の腹腔内注射を与え；次いで、示された時間的経過で、血中ブドウ糖を測定した（図12D）。図12Bのバーは体重（グラム）である。（図12B〜C）10日目以降、代謝症候群の中心的な特色（体重および血中ブドウ糖の有意な増加）が確立される。血中ブドウ糖は、コルチコステロンによって処理された動物において有意に上昇する（即ち、4→10→13→18日）、p＜0.05、N＝36。イデベノンが投与されたコルチコステロンによって処理された動物の血液においては、18日目に、プラセボ群と比較して、血中ブドウ糖レベルの有意な減少が存在する。（図12D）対照群、CS＋プラセボ群、およびCS＋イデベノン群のITT。コルチコステロン＋イデベノンによって処理された動物は、40分、60分、および90分において、コルチコステロン＋プラセボより、インスリンに対して有意に高感受性である。エラーバーは標準偏差である。*＝p＜0.05。18匹のイデベノンによって処理されたマウスおよび18匹のプラセボによって処理されたマウスが使用された。
【０１４９】
本明細書に記載された例および態様は、例示を目的とするものに過ぎず、それを考慮した様々な変更または変化が、本願の本旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。前後関係がそうでないことを必要としない限り、態様、局面、要素、特色、段階等は、各々、任意の他のものと組み合わせて使用され得る。本明細書に引用された全ての刊行物（アクセッション番号、ウェブサイト等を含む）、特許、および特許出願は、個々にそのように明示されたかのごとく、参照によって事実上その全体が本明細書に組み入れられる。アクセッション番号またはカタログ番号のような参照が、異なる時点において異なる内容に関連している場合には、本願の有効出願日において有効であったバージョンを意味する。有効出願日とは、実際の出願日またはそのような参照が引用された先の出願日を意味する。
【０１５０】
配列表
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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