(57)【要約】本開示は、ミニ遺伝子発現構築体を含むリステリア送達ベクターを含む組成物と、抗原発現腫瘍に対する免疫応答を誘発するためおよびこれを処置するため、ならびに腫瘍を持つ被験者に対してワクチン接種するためにこれを使用する方法と、を提供する。本発明は、例えば、ミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリア株であって、前記構築体はキメラタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、前記キメラタンパク質は、ａ．細菌分泌シグナル配列と、ｂ．ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質と、ｃ．ペプチドとを含み、ａ〜ｃの前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記ペプチドが、アミノ末端からカルボキシ末端へとそれぞれ直列に配列される、組み換え型リステリアを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリア株であって、前記構築体はキメラタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、前記キメラタンパク質は、
ａ．細菌分泌シグナル配列と、
ｂ．ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質と、
ｃ．ペプチドとを含み、
ａ〜ｃの前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記ペプチドが、アミノ末端からカルボキシ末端へとそれぞれ直列に配列される、組み換え型リステリア。
【請求項２】
前記リステリアが、シャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によってリンクした２つ以上のオープンリーディングフレームをさらに含む、請求項１に記載の組み換え型リステリア。
【請求項３】
前記リステリアが、各々のオープンリーディングフレームの間に、シャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によってリンクした１つ〜４つのオープンリーディングフレームをさらに含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
【請求項４】
前記ペプチドが１つ以上のネオエピトープを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
【請求項５】
各々のオープンリーディングフレームが異なるペプチドを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
【請求項６】
前記ミニ遺伝子構築体が、前記核酸構築体の５’細菌プロモーター駆動発現をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
【請求項７】
前記プロモーターが、ＡｃｔＡプロモーター、ｈｌｙプロモーター、またはｐ６０プロモーターである、請求項６に記載の組み換え型リステリア。
【請求項８】
前記細菌分泌シグナル配列が、前記ＡｃｔＡタンパク質シグナル配列の最初の１００アミノ酸を含むＡｃｔＡ１００シグナル配列をコードする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
【請求項９】
前記細菌分泌シグナル配列が、配列番号：４を含むリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質からの分泌シグナル配列である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
【請求項１０】
前記組み換え型リステリアが、Ｄ−アラニン・ラセマーゼ（ｄａｌ）遺伝子およびＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ（ｄａｔ）遺伝子内にゲノム突然変異、または欠失を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
【請求項１１】
リステリアが、代謝酵素をコードする第一のオープンリーディングフレームを含む核酸分子をさらに含み、前記代謝酵素が前記ｄａｌ／ｄａｔゲノム突然変異または欠失を相補する、請求項１０に記載の組み換え型リステリア。
【請求項１２】
前記核酸分子が前記リステリアゲノムに組み込まれる、請求項１１に記載の組み換え型リステリア。
【請求項１３】
前記核酸分子が前記組み換え型リステリア株の中のプラスミドの中にあり、かつ抗生物質選択が無いときに、前記プラスミドが前記組み換え型リステリア株の中に安定して維持される、請求項１１に記載の組み換え型リステリア。
【請求項１４】
前記代謝酵素が、アラニン・ラセマーゼ酵素、またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
【請求項１５】
前記ミニ遺伝子構築体が、前記リステリアゲノムに組み込まれる、または前記リステリア内の染色体外プラスミド内にある、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
【請求項１６】
前記組み換え型リステリアが、ａｃｔＡ遺伝子内のゲノム突然変異、または欠失を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
【請求項１７】
前記組み換え型リステリアが、ｉｎｌＢ遺伝子内に、ゲノム突然変異、または欠失を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
【請求項１８】
前記組み換え型リステリアが、ｐｒｆＡ遺伝子内に、ゲノム突然変異、または欠失を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
【請求項１９】
前記組み換え型弱毒化リステリアがリステリア・モノサイトゲネスである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組み換え型リステリアと、医薬的に許容される担体と、を含む医薬組成物。
【請求項２１】
腫瘍またはガンを有する被験者の中に抗腫瘍または抗ガン応答を引き出す方法であって、前記方法が前記被験者にミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリアを投与する工程を含み、前記構築体がキメラタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、前記キメラタンパク質が、
ａ．細菌分泌シグナル配列と、
ｂ．ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質と、
ｃ．ペプチドとを含み、
ａ〜ｃの前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記ペプチドが、アミノ末端からカルボキシ末端へとそれぞれ直列に配列され、これによって前記被験者の中の抗腫瘍応答を強化する、方法。
【請求項２２】
前記リステリアが、シャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によってリンクした２つ以上のオープンリーディングフレームをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記リステリアが、各々のオープンリーディングフレームの間をシャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によってリンクした１つ〜４つのオープンリーディングフレームをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ペプチドが、１つ以上のネオエピトープを含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
各々のオープンリーディングフレームが異なるペプチドを含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ミニ遺伝子構築体が、前記核酸構築体の５’細菌プロモーター駆動発現をさらに含む、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記プロモーターが、ａｃｔＡプロモーター、ｈｌｙプロモーター、またはｐ６０プロモーターである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細菌分泌シグナル配列が、前記ＡｃｔＡタンパク質シグナル配列の最初の１００アミノ酸を含むＡｃｔＡ１００シグナル配列をコードする、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記細菌分泌シグナル配列が、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質からの分泌シグナル配列である、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記組み換え型リステリアが、Ｄ−アラニン・ラセマーゼ（ｄａｌ）遺伝子およびＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ（ｄａｔ）遺伝子内にゲノム突然変異を含む、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記リステリアが代謝酵素をコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸分子をさらに含み、前記代謝酵素が前記組み換え型リステリア株の染色体内の突然変異または欠失している内因性遺伝子を相補する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記核酸分子が前記リステリアゲノムに組み込まれる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３３】
前記核酸分子が前記組み換え型リステリア株の中のプラスミドの中にあり、かつ抗生物質選択が無いとき、前記プラスミドは前記組み換え型リステリア株の中に安定して維持される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３４】
前記代謝酵素がアラニン・ラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ミニ遺伝子構築体が、前記リステリアゲノムに組み込まれる、または前記リステリア内の染色体外プラスミド内にある、請求項２１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記組み換え型リステリアが前記ａｃｔＡ遺伝子内にゲノム突然変異または欠失を含む、請求項２１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記組み換え型リステリアが、ｉｎｌＢ遺伝子内にゲノム突然変異または欠失を含む、請求項２１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記組み換え型リステリアが、ｐｒｆＡ遺伝子内にゲノム突然変異または欠失を含む、請求項２１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記組み換え型弱毒化リステリアがリステリア・モノサイトゲネスである、請求項２１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
独立したアジュバントを投与することをさらに含む、請求項２１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記アジュバントが、顆粒球性／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、またはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ガンが、リンパ腫、白血病、乳ガン、大腸ガン、頭頸部扁平上皮ガン腫、腎臓の細胞ガン腫、膵管腺ガン、骨肉腫、胃ガン、非小細胞肺ガン、または骨ガンを含む、請求項２１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ガンが難治性ガンである、請求項２１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記リンパ腫がホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記リンパ腫が多発性骨髄腫である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
被験者の中の腫瘍またはガンを処置する方法であって、前記方法が前記被験者にミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリアを投与する工程を含み、前記構築体がキメラタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、前記キメラタンパク質が、
ａ．細菌分泌シグナル配列と、
ｂ．ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質と、
ｃ．ペプチドとを含み、
ａ〜ｃの前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記ペプチドが、アミノ末端からカルボキシ末端へとそれぞれ直列に配列され、これによって前記被験者の中の抗腫瘍応答を強化する、方法。
【請求項４７】
前記リステリアが、シャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によってリンクした２つ以上のオープンリーディングフレームをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記リステリアが、各々のオープンリーディングフレームの間をシャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によってリンクした１つ〜４つのオープンリーディングフレームをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記ペプチドが、１つ以上のネオエピトープを含む、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
各々のオープンリーディングフレームが異なるペプチドを含む、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ミニ遺伝子発現核酸構築体が、前記核酸構築体の５’細菌プロモーター駆動発現をさらに含む、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記プロモーターが、ａｃｔＡプロモーター、ｈｌｙプロモーター、またはｐ６０プロモーターである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記細菌分泌シグナル配列が、前記ＡｃｔＡタンパク質シグナル配列の最初の１００アミノ酸を含むＡｃｔＡ１００シグナル配列をコードする、請求項４６〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記細菌分泌シグナル配列が、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質からの分泌シグナル配列である、請求項４６〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記組み換え型リステリアが、Ｄ−アラニン・ラセマーゼ（ｄａｌ）遺伝子およびＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ（ｄａｔ）遺伝子内にゲノム突然変異を含む、請求項４６〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
リステリアが代謝酵素をコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸分子をさらに含み、前記代謝酵素が前記組み換え型リステリア株の染色体内の突然変異または欠失している内因性遺伝子を相補する、請求項４６〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記核酸分子が前記リステリアゲノムに組み込まれる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記核酸分子が前記組み換え型リステリア株の中のプラスミドの中にあり、かつ抗生物質選択が無いとき、前記プラスミドは前記組み換え型リステリア株の中に安定して維持される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記代謝酵素がアラニン・ラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、請求項５６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ミニ遺伝子発現構築体が、前記リステリアゲノムに組み込まれる、または前記リステリア内の染色体外プラスミド内にある、請求項４６〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記組み換え型リステリアが前記ａｃｔＡ遺伝子内にゲノム突然変異を含む、請求項４６〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記組み換え型リステリアが前記ｉｎｌＢ遺伝子内にゲノム突然変異を含む、請求項４６〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記組み換え型リステリアが前記ｐｒｆＡ遺伝子内にゲノム突然変異を含む、請求項４６〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記組み換え型弱毒化リステリアがリステリア・モノサイトゲネスである、請求項４６〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
独立したアジュバントを投与することをさらに含む、請求項４６〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記アジュバントが、顆粒球性／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、またはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ガンが、リンパ腫、白血病、乳ガン、大腸ガン、頭頸部扁平上皮ガン腫、腎臓の細胞ガン腫、膵管腺ガン、骨肉腫、胃ガン、非小細胞肺ガン、または骨ガンを含む、請求項４６〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記ガンが難治性ガンである、請求項４６〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記リンパ腫がホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記リンパ腫が多発性骨髄腫である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記投与が前記組み換え型弱毒化リステリアの少なくとも２つの投与を含む、請求項２１〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記ガンの前記被験者内での再発または転移に続いて前記組み換え型弱毒化リステリアを投与する工程をさらに含む、請求項２１〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
ブースター注射を投与することをさらに含む、請求項２１〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記免疫応答がＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答である、請求項２１〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記処置が転移性疾患を遅延させる、請求項４６〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記処置がリンパ節サイズを減少する、請求項４６〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記処置が結果として無進行生存率をもたらす、請求項４６〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記処置が、結果的に疾患が進行する時間の増加をもたらす、請求項４６〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
被験者内の腫瘍またはガンの形成を抑制または遅延する方法であって、前記方法が請求項１〜１９の前記組み換え型リステリアまたは請求項２０の前記医薬組成物を投与する前記工程を含む、方法。
【請求項８０】
自己抗原に対する耐性を破壊する方法であって、前記方法が請求項１〜１９の前記組み換え型リステリアまたは請求項２０の前記医薬組成物を投与する前記工程を含む、方法。
【請求項８１】
被験者内のガンの退行を誘発する方法であって、前記方法が請求項１〜１９の前記組み換え型リステリアまたは請求項２０の前記医薬組成物を投与する前記工程を含む、方法。
【請求項８２】
被験者の生存を延長する方法であって、前記方法が請求項１〜１９の前記組み換え型リステリアまたは請求項２０の前記医薬組成物を投与する前記工程を含む、方法。
【請求項８３】
腫瘍またはガンを有する被験者内の抗腫瘍または抗ガン応答を引き出すための組み換え型リステリアの使用であって、前記使用が、前記腫瘍またはガンを有する前記被験者に前記リステリアを投与する前記工程を含み、前記組み換え型リステリアがミニ遺伝子核酸構築体を含み、前記核酸構築体がキメラタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、前記キメラタンパク質が、
ａ．細菌分泌シグナル配列と、
ｂ．ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質と、
ｃ．ペプチドとを含み、
ａ〜ｃの前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記ペプチドが、アミノ末端からカルボキシ末端へとそれぞれ直列に配列される、使用。
【請求項８４】
前記リステリアが、シャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によってリンクした２つ以上のオープンリーディングフレームをさらに含む、請求項８３に記載の使用。
【請求項８５】
前記リステリアが、各々のオープンリーディングフレームの間をシャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によってリンクした１つ〜４つのオープンリーディングフレームをさらに含む、請求項８３に記載の使用。
【請求項８６】
前記ペプチドが、１つ以上のネオエピトープを含む、請求項８３〜８５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８７】
各々のオープンリーディングフレームが異なるペプチドを含む、請求項８３〜８６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８８】
前記ミニ遺伝子構築体が、前記核酸構築体の５’細菌プロモーター駆動発現をさらに含む、請求項８３〜８７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８９】
前記プロモーターが、ａｃｔＡプロモーター、ｈｌｙプロモーター、またはｐ６０プロモーターである、請求項８８に記載の使用。
【請求項９０】
前記細菌分泌シグナル配列が、前記ＡｃｔＡタンパク質シグナル配列の最初の１００アミノ酸を含むＡｃｔＡ１００シグナル配列をコードする、請求項８３〜８９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９１】
前記細菌分泌シグナル配列が、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質からの分泌シグナル配列である、請求項８３〜９０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９２】
前記組み換え型リステリアが、Ｄ−アラニン・ラセマーゼ（ｄａｌ）遺伝子およびＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ（ｄａｔ）遺伝子内にゲノム突然変異を含む、請求項８３〜９１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９３】
リステリアが代謝酵素をコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸分子をさらに含み、前記代謝酵素が前記組み換え型リステリア株の染色体内の欠失または突然変異している内因性遺伝子を相補する、請求項８８に記載の使用。
【請求項９４】
前記核酸分子が前記リステリアゲノムに組み込まれる、請求項９３に記載の使用。
【請求項９５】
前記核酸分子が前記組み換え型リステリア株の中のプラスミドの中にあり、かつ抗生物質選択が無いとき、前記プラスミドは前記組み換え型リステリア株の中に安定して維持される、請求項９３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９６】
前記代謝酵素がアラニン・ラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、請求項９３〜９５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９７】
前記ミニ遺伝子構築体が、前記リステリアゲノムに組み込まれる、または前記リステリア内の染色体外プラスミド内にある、請求項８３〜９６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９８】
前記組み換え型リステリアが前記ａｃｔＡ遺伝子内にゲノム突然変異を含む、請求項８３〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記組み換え型リステリアが、前記内因性ｉｎｌＢ遺伝子でのゲノム突然変異を含む、請求項８３〜９８に記載の使用。
【請求項１００】
前記組み換え型リステリアが、前記内因性ｐｒｆＡ遺伝子でのゲノム突然変異を含む、請求項８３〜９９に記載の使用。
【請求項１０１】
前記組み換え型弱毒化リステリアがリステリア・モノサイトゲネスである、請求項８３〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
独立したアジュバントを投与することをさらに含む、請求項８３〜１０１に記載の使用。
【請求項１０３】
前記アジュバントが、顆粒球性／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、またはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、請求項１０２に記載の使用。
【請求項１０４】
前記免疫応答がＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答である、請求項８３〜１０３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０５】
被験者内の腫瘍またはガンを処置するための、請求項８３〜１０４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０６】
前記ガンが、リンパ腫、白血病、乳ガン、大腸ガン、頭頸部扁平上皮ガン腫、腎臓の細胞ガン腫、膵管腺ガン、骨肉腫、胃ガン、非小細胞肺ガン、または骨ガンを含む、請求項８３〜１０５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０７】
前記ガンが難治性ガンである、請求項８３〜１０６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０８】
前記リンパ腫がホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫である、請求項１０６に記載の使用。
【請求項１０９】
前記ガンの前記被験者内での再発または転移に続いて前記組み換え型弱毒化リステリアを投与する工程をさらに含む、請求項１０５〜１０８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１０】
ブースター注射を投与することをさらに含む、請求項１０４〜１０９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１１】
前記処置が転移性疾患を遅延させる、請求項１０４〜１１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１２】
前記処置がリンパ節サイズを減少する、請求項１０４〜１１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１３】
前記処置が結果として無進行生存率をもたらす、請求項１０４〜１１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１４】
前記処置が、結果的に疾患が進行する時間の増加をもたらす、請求項１０４〜１１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１５】
被験者内の腫瘍またはガンの形成を抑制または遅延するための、請求項１〜１９の前記組み換え型リステリアまたは請求項２０の前記医薬組成物の使用であって、前記使用が、前記組み換え型リステリアまたは前記医薬組成物を前記被験者に投与する前記工程を含む、使用。
【請求項１１６】
自己抗原に対する耐性を破壊するための請求項１〜１９の前記組み換え型リステリアまたは請求項２０の前記医薬組成物の使用であって、前記使用が、前記組み換え型リステリアまたは前記医薬組成物を前記被験者に投与する前記工程を含む、使用。
【請求項１１７】
被験者内のガンの退行を誘発するための、請求項１〜１９の前記組み換え型リステリアまたは請求項２０の前記医薬組成物の使用であって、前記使用が、前記組み換え型リステリアまたは前記医薬組成物を前記被験者に投与する前記工程を含む、使用。
【請求項１１８】
被験者の生存を延長するための、請求項１〜１９の前記組み換え型リステリアまたは請求項２０の前記医薬組成物の使用であって、前記使用が、前記組み換え型リステリアまたは前記医薬組成物を前記被験者に投与する前記工程を含む、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ミニ遺伝子発現構築体を含むリステリア送達ベクターを含む組成物と、抗原発現腫瘍またはガンに対する免疫応答を誘発するためおよびこれを処置するためにこの組成物を使用する方法、ならびに腫瘍またはガンを持つ被験者に対してこの組成物をワクチン接種することと、が開示される。
【背景技術】
【０００２】
リステリア・モノサイトゲネスは、主として抗原提示細胞に感染し、またこれらの細胞の細胞質内に死ぬまで適合する細胞内病原体である。マクロファージなどの宿主細胞は、Ｌ．モノサイトゲネスを活発に貪食し、その大半の細菌がファゴリソソーム内で分解される。一部の細菌は、溶血素、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）の活動を通してファゴソーム膜に穿孔することによって宿主サイトゾルの中へとエスケープする。一旦サイトゾル内に入ると、Ｌ．モノサイトゲネスは宿主アクチンを重合して、細胞間を直接通り抜けて、宿主の免疫系をさらに逃れることができ、結果としてＬ．モノサイトゲネスに対する抗体応答がごくわずかになる。
【０００３】
リステリアからの組み換え型タンパク質発現は、全長のタンパク質をコードするＤＮＡ配列または対象となる抗原性配列（複数可）を含有する大きいポリペプチドの導入に関与するが、異種供給源からの複数のペプチド決定基の発現が望ましい事例ではこれは可能ではなかった。この事例では、ペプチドは、様々な長さのアミノ酸リンカーによって分離された対象となるペプチドを含有する単一のポリペプチド構築体として発現されており、またこれらはＭＨＣクラスＩ結合ペプチド決定基の産生のためのプロテアソーム活性を必要とされている。これは抗原提示の損失をもたらす場合がある。
【０００４】
よって、免疫応答を増強するためにプロテアソーム活性を避けることおよび抗原提示を強化することに対する必要性がある。本開示は、ＭＨＣクラスＩ分子による提示のために最小限のペプチド決定基をコードする核酸配列の「ミニ遺伝子」発現系を含むリステリアベースの組成物を提供することによってこの必要性に対処する。これらのミニ遺伝子は、ユビキチン部分（Ｕｂ−ペプチド）にすぐ続くペプチドを用いて発現させることができ、そうすることによって、この系は抗原を抗原プロセシング経路に入れる必要性を避け、これによって組み換え型リステリアによって感染した細胞のサイトゾルの中へとペプチド抗原を直接発現することができるようにする。さらに、また本明細書で詳細な説明に記述されるように、本開示のミニ遺伝子系は、単一のリステリア送達ベクターを使用して複数のペプチドを細胞の中へと装填することができるようにする利点を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様では、本開示はミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリア株を提供し、前記構築体はキメラタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、前記キメラタンパク質は、
ａ．細菌分泌シグナル配列と、
ｂ．ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質と、
ｃ．ペプチドとを含み、
ａ〜ｃの前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記ペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端へとそれぞれ直列に配列される。
【０００６】
別の態様では、本開示は腫瘍またはガンを有する被験者の中に抗腫瘍または抗ガン応答を引き出す方法を提供し、前記方法は前記被験者にミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリアを投与する工程を含み、前記構築体はキメラタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、前記キメラタンパク質は、
ａ．細菌分泌シグナル配列と、
ｂ．ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質と、
ｃ．ペプチドとを含み、
ａ〜ｃの前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記ペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端へとそれぞれ直列に配列され、それによって前記被験者での抗腫瘍応答が強化される。
【０００７】
一態様では、本開示は被験者の中の腫瘍またはガンを処置する方法を提供し、前記方法は前記被験者にミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリアを投与する工程を含み、前記構築体はキメラタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、前記キメラタンパク質は、
ａ．細菌分泌シグナル配列と、
ｂ．ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質と、
ｃ．ペプチドとを含み、
ａ〜ｃの前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記ペプチドが、アミノ末端からカルボキシ末端へとそれぞれ直列に配列され、それによって前記被験者での抗腫瘍応答が強化される。
【０００８】
特許または出願の書類は、色付きで描かれた少なくとも一つの図面を含有する。本特許または本特許出願のカラー図面（複数可）付きの出版物の複製物は、要求に応じ、かつ必要な料金の支払いに応じて米国特許商標局から提供される。本開示に関する主題は、本明細書の結論部分に特定的に指摘され、かつ明瞭に主張されている。しかしながら、本発明の構成および運用方法の両方については、その目的、特徴、および利点とともに、添付図面とともに読んだとき、以下の発明を実施するための形態を参照することによって最も良好に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１Ａ〜図１Ｂは、Ｅ７を発現および分泌するために異なる発現系を使用するＬｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を示す。Ｌｍ−Ｅ７は、Ｌ．モノサイトゲネスゲノムのｏｒｆＺドメインの中へと遺伝子カセットを導入することによって生成された（図１Ａ）。ｈｌｙプロモーターは、ＨＰＶ−１６  Ｅ７が後に続くＬＬＯのｈｌｙシグナル配列および最初の５つのアミノ酸（ＡＡ）の発現を駆動する（図１Ｂ）。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を、ｐｒｆＡ−株ＸＦＬ−７をプラスミドｐＧＧ−５５で形質転換することによって生成した。ｐＧＧ−５５は、ＬＬＯ−Ｅ７の融合非溶血性の融合の発現を駆動するｈｌｙプロモーターを有する。ｐＧＧ−５５は、ｐｒｆＡ遺伝子も含有し、インビボでＸＦＬ−７によってプラスミドの保持を選択する。
【図２】図２は、Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７のＥ７分泌を示す。Ｌｍ−Ｇａｇ（レーン１）、Ｌｍ−Ｅ７（レーン２）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（レーン３）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（レーン４）、ＸＦＬ−７（レーン５）、および１０４０３Ｓ（レーン６）を、ルリア−ベルターニ培地中、３７℃で一晩増殖させた。６００ｎｍの吸光度においてＯＤによって決定された同等数の細菌をペレット化し、そして各々の上清１８ｍＬをＴＣＡ沈殿させた。Ｅ７発現をウエスタンブロットによって解析した。ブロットを抗Ｅ７  ｍＡｂでプローブし、それに続いてＨＲＰ共役抗マウス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でプローブし、次いでをＥＣＬ検出試薬を使用して発色させた。
【図３】図３は、ＬＬＯ−Ｅ７融合の腫瘍免疫療法的な有効性を示す。腫瘍接種の７、１４、２１、２８、および５６日後におけるマウス内の腫瘍サイズがミリメートルで示される。無処置マウス：白丸、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７：黒丸、Ｌｍ−Ｅ７：正方形、Ｌｍ−Ｇａｇ：白ひし形、そしてＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰ：黒三角。
【図４】図４は、ＴＣ−１細胞に曝露されたとき増殖するＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７−免疫化マウスからの脾細胞を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、または対照ｒＬｍ株を用いて免疫を与え、かつブーストした。脾細胞を、ブーストの６日後に採取し、そして示される比で照射したＴＣ−１細胞と共に培養皿に蒔いた。細胞を３Ｈチミジンでパルスラベルし、採取した。ｃｐｍは、（実験的ｃｐｍ）−（非ＴＣ−１対照）と定義された。
【図５Ａ】図５Ａは、（Ａ）Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７がＥ７を分泌することを実証するウエスタンブロットを示す。レーン１：Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、レーン２：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７．００１、レーン３：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７−２．５．３、レーン４：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７−２．５．４。
【図５Ｂ】図５Ｂは、Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（長方形）、Ｌｍ−Ｅ７（楕円）、およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（×）を投与したマウス、ならびに無処置マウス（非ワクチン接種、黒三角形）内の腫瘍サイズを示す。
【図６Ａ】図６Ａは、４つのＬＭワクチンを作り出すために使用されるプラスミドインサートの概略表示を示す。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７インサートは、使用されるすべてのリステリア遺伝子を含有する。これは、ｈｌｙプロモーター、ｈｌｙ遺伝子の最初の１．３ｋｂ（タンパク質ＬＬＯをコードする）、およびＨＰＶ−１６  Ｅ７遺伝子を含有する。ｈｌｙの最初の１．３ｋｂは、シグナル配列（ｓｓ）およびＰＥＳＴ領域を含む。Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、ｈｌｙプロモーター、シグナル配列、ならびにＰＥＳＴおよびＥ７配列を含むが、残りの切断ＬＬＯ遺伝子は除外する。Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７はＰＥＳＴ領域を除外するが、ｈｌｙプロモーター、シグナル配列、Ｅ７、および切断ＬＬＯの残りを含有する。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、ｈｌｙプロモーター、シグナル配列、およびＥ７のみを有する。
【図６Ｂ】上のパネル：リステリア構築体は、腫瘍退行を誘発するＰＥＳＴ領域を含有する。下のパネル：２つの別個の実験での腫瘍チャレンジ後２８日目における平均腫瘍サイズ。
【図６Ｃ】図６Ｃは、脾臓内にＥ７特異的なリンパ球のより高いパーセンテージを誘発するＰＥＳＴ領域を含有するリステリア構築体を示す。３つの実験からのデータの平均およびＳＥが図示される。
【図７Ａ】図７Ａは、ＴＣ−１腫瘍細胞を投与し、これに続いてＬｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、もしくはＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７を投与した、またはワクチンを投与しなかった（無処置）マウスでの、脾臓内でのＥ７特異的なＩＦＮ−ガンマ−分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導、および腫瘍に浸透する数を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、（Ａ）に記述したマウスの脾臓および腫瘍でのＥ７特異的なＣＤ８＋細胞の誘導および浸透を示す。
【図８】図８Ａ〜図８Ｂは、腫瘍の中のＥ７特異的なリンパ球のより高いパーセンテージを誘発するＰＥＳＴ領域を含有するリステリア構築体を示す。（図８Ａ）１つの実験からの代表的データ。（図８Ｂ）３つのすべての実験からのデータの平均およびＳＥ。
【図９Ａ】図９Ａは、大腸菌−リステリアシャトルプラスミドｐＧＧ５５の概略的なマップを示す。ＣＡＴ（−）：大腸菌クロラムフェニコールトランスフェラーゼ、ＣＡＴ（＋）：リステリアクロラムフェニコールトランスフェラーゼ、Ｏｒｉ  Ｌｍ：リステリアの複製起点、Ｏｒｉ  Ｅｃ：大腸菌のｐ１５複製の起点、ｐｒｆＡ：リステリア病原性調節因子Ａ、ＬＬＯ：Ｃ末端切断リステリオリシンＯ、そのプロモーターを含む、Ｅ７：ＨＰＶ  Ｅ７。選択された制限部位も図示される。
【図９Ｂ】図９Ｂは、大腸菌−リステリアシャトルプラスミドｐＴＶ３（下記）の概略的なマップを示す。ＣＡＴ（−）：大腸菌クロラムフェニコールトランスフェラーゼ、ＣＡＴ（＋）：リステリアクロラムフェニコールトランスフェラーゼ、Ｏｒｉ  Ｌｍ：リステリアの複製起点、Ｏｒｉ  Ｅｃ：大腸菌のｐ１５複製の起点、ｐｒｆＡ：リステリア病原性調節因子Ａ、ＬＬＯ：Ｃ末端切断リステリオリシンＯ、そのプロモーターを含む、Ｅ７：ＨＰＶ  Ｅ７、ｐ６０−ｄａｌ、ｐ６０プロモーターおよびリステリアｄａｌ遺伝子の発現カセット。選択された制限部位も図示される。
【図１０】図１０はＤＮＡ配列（配列番号：７４）を示し、これは、リステリア株ＥＧＤのゲノム上のｉｎｌＣ領域の上流および下流を提示する。ＤＮＡ−ｕｐ（赤色）、ｉｎｌＣ遺伝子（青色）、およびＤＮＡ−ｄｏｗｎ（黒色）。
【図１１】図１１はＤＮＡの配列（配列番号：７５）を示し、これは、温度感受性プラスミド、ｐＫＳＶ７中でクローニングされ、ｉｎｌ  Ｃ欠失突然変異体を作り出す。これらの領域のクローニングのために使用される制限酵素部位は、大文字および下線付きで示される。ＧＡＡＴＴＣ−ＥｃｏＲＩ、ＧＧＡＴＣＣ−ＢａｍＨＩ、およびＣＴＧＣＡｇ−ＰｓｔＩである。ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩインサートは、ベクター、ｐＫＳＶ７内でクローニングされる。
【図１２】図１２は、Ｌｍ−ｄｄおよびＬｍ−ｄｄＤ  ａｃｔＡ株の概略的な表示を示す。株、Ｌｍ−ｄｄおよびＬｍ−ｄｄΔａｃｔＡのｅ染色体のＤＮＡをテンプレートとして使用して、オリゴの１／２およびオリゴの３／４を使用するＰＣＲ産物のサイズを示すゲルが得られた。
【図１３】図１３はＤＮＡ配列（配列番号：５７）を示し、これは、リステリア染色体内のｉｎｌＣ領域ａｃｔＡ遺伝子の上流および下流を提示する。斜字体の領域は、ＬｍｄｄΔａｃｔＡ株内に存在する残りのａｃｔＡ配列要素を含有する。下線付きの配列ｇｔｃｇａｃは、ａｃｔＡのＮ−Ｔ領域とＣ−Ｔ領域との間の結合である、ＸｈｏＩの制限部位を表す。
【図１４】図１４は、ＬＭワクチン株（Ａ）の投与に応答する腫瘍退行を図示する。丸は無処置マウスを表し、逆三角形はＬｍｄｄ−ＴＶ３を投与されたマウスを表し、十文字はＬｍ−ＬＬＯＥ７を投与されたマウスを表す。
【図１５】図１５Ａは、ｐＡｄｖ１６４のプラスミドマップを示し、これは、構造性のリステリアｐ６０プロモーターの制御下で、ＬｍｄｄＡ株内の染色体のｄａｌ−ｄａｔ欠失の相補のために、バシラスサチリスｄａｌ遺伝子を持つ。これは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの３つの断片：ＥＣ１（ａａ  ４０−１７０）、ＥＣ２（ａａ  ３５９−５１８）およびＩＣＩ（ａａ  ６７９−８０８）の直接融合によって構造化された、切断ＬＬＯ（１−４４１）のキメラ型ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子への融合も含有する。図１５Ｂでは、抗ＬＬＯ抗体でブロットしたＴＣＡ沈殿した細胞培養上清のウエスタンブロット解析によって、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８）およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（ＡＤＸＳ３１−１６４）内でｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌が検出された。〜１０４  ＫＤの差を示す帯はｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２に対応する。内因性のＬＬＯは、５８  ＫＤ帯として検出される。リステリア対照はＣｈＨｅｒ２発現を欠いている。
【図１６】図１６Ａでは、ＮＴ−２細胞を刺激細胞として使用し、かつ３Ｔ３／ｎｅｕ細胞を標的として使用して、免疫化マウスからの脾細胞内でＨｅｒ２／ｎｅｕリステリアベースのワクチンによって引き出された細胞毒性Ｔ細胞応答が試験された。Ｌｍ−対照は、すべてのやり方で同一であるが、無関連の抗原（ＨＰＶ１６−Ｅ７）が発現される、ＬｍｄｄＡバックグラウンドに基づく。図１６Ｂでは、脾細胞によって免疫化ＦＶＢ／Ｎマウスから細胞培地の中へと分泌されたＩＦＮ−γが、ＮＴ−２細胞によって処置されたマイトマイシンＣを用いたインビトロの刺激の２４時間後、ＥＬＩＳＡによって測定された。図１６Ｃは、インビトロでのタンパク質の異なる領域からのペプチドを用いたインキュベーションに応答する、キメラワクチンを用いて免疫化したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスからの脾細胞によるＩＦＮ−γ分泌である。図の凡例にリスト表示したように、組み換え型ＣｈＨｅｒ２タンパク質が正の対照として使用され、無関連ペプチドまたはペプチドを含まない群が負の対照を構成要素とした。コインキュベーションの７２時間後に採取した細胞培養上清を使用するＥＬＩＳＡアッセイによって、ＩＦＮ−γ分泌が検出された。各々のデータ点は、３倍のデータ＋／−標準誤差の平均であった。＊Ｐ値＜０．００１。
【図１７】図１７は、各々の組み換え型リステリア−ＣｈＨｅｒ２ワクチン、または対照リステリアワクチンを６回注射したＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスからの結果を表す。生後６週で免疫化を開始し、２１週目まで３週ごとに継続した。腫瘍の外観を毎週観察して、腫瘍を有しないマウスのパーセンテージで表現した。＊ｐ＜０．０５、グループ当たりＮ＝９。
【図１８】図１８は、ＦＶＢ／Ｎマウスに１×１０６ＮＴ−２細胞を用いて皮下接種し、各々のワクチンを用いて一週間間隔で３回免疫化したことを示す。第２の免疫化の７日後、脾臓を採取した。免疫細胞の分離後、Ｔｒｅｇの検出のためにこれらを抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦｏｘＰ３抗体によって染色した。代表的な実験からのＴｒｅｇのドットプロットは、異なる治療群の間での全ＣＤ３＋またはＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するパーセンテージとして表されるＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度を示す。
【図１９】図１９Ａ〜図１９Ｂは、ＦＶＢ／Ｎマウスが１×１０６ＮＴ−２細胞を用いて皮下接種され、各々のワクチンを用いて一週間間隔で３回免疫化されたことを示す。第２の免疫化の７日後に腫瘍を採取した。免疫細胞の分離後、Ｔｒｅｇの検出のために、抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦｏｘＰ３抗体によってこれらを染色した。図１９Ａは、代表的な実験からのＴｒｅｇのドットプロットである。図１９Ｂは、異なる投与群にわたって全ＣＤ３＋またはＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（左のパネル）、および腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比（右のパネル）に対するパーセンテージとして表される、ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度である。データは、２つの独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示される。
【図２０】図２０Ａ〜図２０Ｃは、組み換え型リステリアタンパク質ミニ遺伝子構築体の概略的なマップを表す。図２０Ａは、オボアルブミン派生ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを産生する構築体を表す。図２０Ｂは、ＰＣＲクローニングによってＳＩＩＮＦＥＫＬの代わりにＧＢＭ派生ペプチドが導入された同等の組み換え型タンパク質を表す。図２０Ｃは、リステリアの株から４つの別個のペプチド抗原を発現するように設計された構築体を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
図示の単純化および明瞭化のために図に示される要素は必ずしも実寸に比例していないことを理解されたい。例えば、一部の要素の寸法は、明瞭化のために他の要素に対して相対的に誇張されている場合がある。さらに、適切と考えられる場合には、参照番号は対応するかまたは類似する要素を示す図の間で繰り返される場合がある。
【００１１】
以下の発明を実施するための形態では、本発明の完全な理解を提供するために多数の具体的な詳細が示される。しかしながら、本開示はこれらの具体的な詳細を含まずに実施されてもよいことが当業者には理解されるであろう。他の事例では、本発明を不明瞭にしないために周知の方法、手順、および構成成分は詳細には記述されていない。
【００１２】
一実施形態では、抗腫瘍または抗ガン応答を誘発するための組成物および方法が本明細書に開示される。
【００１３】
一態様では、本開示は、キメラタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリア株を提供し、前記構築体は、前記キメラタンパク質は、
ａ．細菌分泌シグナル配列と、
ｂ．ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質と、
ｃ．ペプチドとを含み、
ａ〜ｃの前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記ペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端へとそれぞれ直列に配列される。
【００１４】
一実施形態では、リステリアは、シャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によってリンクした２つ以上のオープンリーディングフレームをさらに含む。
【００１５】
別の実施形態では、組み換え型リステリアは、各々のオープンリーディングフレームの間をシャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によってリンクした１つ〜４つのオープンリーディングフレームをさらに含む。別の実施形態では、各々のオープンリーディングフレームは異なるペプチドを含む。
【００１６】
別の態様では、本開示は腫瘍またはガンを有する被験者の中に抗腫瘍または抗ガン応答を誘発する方法を提供し、前記方法は前記被験者にキメラタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリアを投与する工程を含み、前記キメラタンパク質は、
ａ．細菌分泌シグナル配列と、
ｂ．ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質と、
ｃ．ペプチドとを含み、
ａ〜ｃの前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記ペプチドが、アミノ末端からカルボキシ末端へとそれぞれ直列に配列され、これによって前記被験者の中の抗腫瘍応答を強化する。
【００１７】
一態様では、本開示は被験者の中の腫瘍またはガンを処置する方法を提供し、前記方法は前記被験者にキメラタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリアを投与する工程を含み、前記キメラタンパク質は、
ａ．細菌分泌シグナル配列と、
ｂ．ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質と、
ｃ．ペプチドとを含み、
ａ〜ｃの前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記ペプチドが、アミノ末端からカルボキシ末端へとそれぞれ直列に配列され、これによって前記被験者の中の抗腫瘍応答を強化する。
【００１８】
一実施形態では、「核酸分子」、「核酸構築体」、および「ミニ遺伝子核酸構築体」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。
【００１９】
「核酸」という用語およびその文法的な同等物は、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも含む場合があるがこれに限定されない分子を指す場合があることを当業者は理解するであろう。この用語は既知のＤＮＡおよびＲＮＡの塩基類似体のいずれかを含む配列も指す。
【００２０】
別の実施形態では、本明細書に開示された方法を使用して生成された融合ペプチドは、ＨＩＳタグまたはＳＩＩＮＦＥＣＫＬタグにさらにリンクしている。これらのタグが発現される場合があり、そして提示される抗原性エピトープは、これらの「タグ」配列ペプチドに対する免疫応答を追いかけることによって、臨床医が分泌されたペプチド免疫原性を追いかけることができるようにする。かかる免疫応答は、これらのタグに対して特異的なモノクローナル抗体およびＤＮＡまたはＲＮＡプローブを含むがこれに限定されない数多くの試薬を使用して監視することができる。タグに対する配列は、融合ペプチド配列をコードする核酸配列の中へと組み込まれる場合があることが当業者によって理解されるであろう。別の実施形態では、プラスミドまたはファージベクターなどの本明細書に開示されたベクターは、本明細書に開示された融合ペプチドまたはキメラタンパク質をコードする核酸配列を含む。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「ガン」および「腫瘍」という用語は、すべて同一の意味と質を有する場合があることを当業者は理解するであろう。
【００２２】
別の実施形態では、腫瘍抗原に対する免疫応答を誘発するための組成物および方法が本明細書に開示される。別の実施形態では、腫瘍抗原は異種抗原である。別の実施形態では、腫瘍抗原は自己抗原である。別の実施形態では、感染性疾患抗原に対する免疫応答を誘発するための組成物および方法が本明細書に開示される。別の実施形態では、感染性疾患抗原は異種抗原である。別の実施形態では、本開示の組成物および方法は腫瘍またはガンに対してワクチン接種するために使用される。
【００２３】
また別の実施形態では、本開示の組成物および方法は、処置に続くエスケープ変異の発生を防止する。別の実施形態では、腫瘍またはガンを患う被験者に無進行生存率を提供するための組成物および方法が本明細書に開示される。別の実施形態では、被験者にガンまたは腫瘍に対して免疫付与するための組成物および方法が本明細書に開示される。別の実施形態では、被験者にガンまたは腫瘍に対して免疫付与するための組成物および方法が本明細書に開示される。別の実施形態では、このガンは転移である。
【００２４】
組み換え型リステリア株
一実施形態では、キメラタンパク質をコードする核酸構築体を含む組み換え型弱毒化リステリア株が本明細書に開示される。別の実施形態では、核酸構築体は組み換え型核酸構築体である。別の実施形態では、細菌分泌シグナル配列（ＳＳ）、ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、およびペプチド配列をコードするオープンリーディングフレームを含む組み換え型核酸構築体を含む組み換え型弱毒化リステリア株が本明細書に開示される。別の実施形態では、核酸構築体は、細菌分泌シグナル配列、ユビキチンタンパク質、およびペプチド配列を含むキメラタンパク質をコードする。一実施形態では、キメラタンパク質は以下の様式（ＳＳ−Ｕｂ−ペプチド）で配列される。
【００２５】
一実施形態では、核酸構築体は、ペプチド部分のカルボキシ末端に対応するコドンを含み、タンパク質合成の終了を確認するために２つの終止コドンが続く。
【００２６】
一実施形態では、本明細書に開示される組み換え型ポリペプチドをコードする核酸は、シグナルペプチドまたは配列も含む。一実施形態では、本明細書に開示される核酸構築体によってコードされる細菌分泌シグナル配列は、リステリア分泌シグナル配列である。別の実施形態では、本開示の方法および組成物の融合タンパク質はリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）からのＬＬＯシグナル配列を含む。一実施形態では、異種抗原は、リステリアシグナル配列（例えば、溶血素（ｈｌｙ）シグナル配列またはａｃｔＡシグナル配列）などのシグナル配列の使用を通して発現される場合がある。代替的には、例えば、融合タンパク質を作り出すことなく外来遺伝子をＬ．モノサイトゲネスプロモーターから下流で発現することができる。別の実施形態では、シグナルペプチドは、細菌性（リステリア性または非リステリア性）である。一実施形態では、シグナルペプチドは、細菌に対してネイティブである。別の実施形態では、シグナルペプチドは、細菌に対して外来である。別の実施形態では、シグナルペプチドは、ｓｅｃＡ１シグナルペプチドなどのリステリア・モノサイトゲネスからのシグナルペプチドである。別の実施形態では、シグナルペプチドは、ラクトコッカス・ラクティスからのＵｓｐ４５シグナルペプチド、またはバチルス・アントラシスからの保護抗原シグナルペプチドである。別の実施形態では、シグナルペプチドは、ｐ６０シグナルペプチドなどの、リステリア・モノサイトゲネスからのｓｅｃＡ２シグナルペプチドである。さらに、組み換え型核酸分子は、任意選択的にｐ６０またはその断片をコードする第３のポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、シグナルペプチドは、バシラスサチリスＴａｔシグナルペプチドなどのＴａｔシグナルペプチド（例えば、ＰｈｏＤ）である。一実施形態では、シグナルペプチドは、組み換え型ポリペプチドをコードする同一の翻訳リーディングフレームである。
【００２７】
本明細書のすべての目的に対して、「組み換え型ポリペプチド」、「融合タンパク質」、「組み換え型タンパク質」、および「キメラタンパク質」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。
【００２８】
別の実施形態では、分泌シグナル配列はリステリアタンパク質由来である。別の実施形態では、分泌シグナルは、ＡｃｔＡ３００分泌シグナルである。別の実施形態では、分泌シグナルは、ＡｃｔＡ１００分泌シグナルである。
【００２９】
一実施形態では、核酸構築体はユビキチンタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。一実施形態では、ユビキチンは全長のタンパク質である。本明細書に開示された発現された構築体内のユビキチン（本明細書に開示された核酸構築体から発現される）は、カルボキシ末端において、宿主細胞サイトゾルへ入る際に加水分解酵素の活性を通して核酸構築体から発現される組み換え型キメラタンパク質の残りから分割されることを当業者は理解するであろう。これはペプチド部分のアミノ末端を遊離させ、ペプチド（長さは特異的ペプチドに依存する）を宿主細胞サイトゾルの中に産生する。
【００３０】
一実施形態では、本明細書に開示される核酸構築体によってコードされるペプチドは、長さが８〜１０アミノ酸（ＡＡ）である。別の実施形態では、ペプチドは１０〜２０ＡＡ長である。別の実施形態では、ペプチドは２１〜３０ＡＡ長である。別の実施形態では、ペプチドは３１〜５０ＡＡ長である。別の実施形態では、ペプチドは５１〜１００ＡＡ長である。
【００３１】
一実施形態では、ペプチドは抗原性ペプチドである。別の実施形態では、ペプチドは腫瘍抗原に由来する。別の実施形態では、ペプチドは感染性疾患抗原に由来する。別の実施形態では、ペプチドは自己抗原に由来する。別の実施形態では、ペプチドは血管形成抗原に由来する。
【００３２】
一実施形態では、本明細書に開示されたペプチドが由来する抗原は、真菌病原体、細菌、寄生生物、蠕虫、またはウイルスに由来する。別の実施形態では、本明細書のペプチドが由来する抗原は、破傷風トキソイド、インフルエンザウイルスからの血球凝集素分子、ジフテリアトキソイド、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質、ＩｇＡプロテアーゼ、インシュリンペプチドＢ、粉状そうか病菌抗原、ビブリオ症菌抗原、サルモネラ抗原、肺炎球菌抗原、呼吸器合胞体ウイルス抗原、インフルエンザ菌外膜タンパク質、ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ、髄膜炎菌ピリン、淋菌ピリン、メラノーマ−関連抗原（ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ）、タイプＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−３３、−３５、または−４５からのヒトパピローマウイルス抗原Ｅ１およびＥ２、腫瘍抗原ＣＥＡ、突然変異したまたはしていないｒａｓタンパク質、突然変異したまたはしていないｐ５３タンパク質、Ｍｕｃ１、メソテリン、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、またはｐＳＡから選択される。
【００３３】
他の実施形態では、ペプチドは以下の疾患のうちの１つと関連付けられる抗原から由来する。コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、麻疹、髄膜炎、おたふく風邪、百日咳、天然痘、肺炎球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、結核、腸チフス、水痘帯状疱疹、百日咳、黄熱病、アジソン病由来のイムノゲンおよび抗原、アレルギー、アナフィラキシー、ブルートン症候群、固形および血液由来の腫瘍を含むガン、湿疹、橋本甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、後天性免疫不全症候群、腎臓、心臓、すい臓、肺、骨、および肝臓などの移植拒否反応、グレーブス病、多内分泌自己免疫疾患、肝炎、顕微鏡的多発性動脈炎、結節性多発動脈炎、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変症、悪性貧血、セリアック病、抗体媒介性腎炎、糸球体腎炎、リウマチ性疾患、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、血清反応陰性脊椎関節症、鼻炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、硬化性胆管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、疱疹状皮膚炎、乾癬、白斑、多発性硬化症、脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、ランバート・イートン筋無力症候群、強膜、上強膜、ブドウ膜炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、じんましん、乳児一過性低ガンマグロブリン血症、骨髄腫、Ｘ連鎖高Ｉｇｍ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、アミロイド症、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、マラリアのスポロゾイト周囲タンパク、微生物抗原、ウイルス抗原、自己抗原、およびリステリア症。
【００３４】
別の実施形態では、本明細書に開示されたペプチドが由来する抗原は腫瘍関連抗原であり、これは、一実施形態では、ＭＡＧＥ（メラノーマ関連抗原Ｅ）タンパク質、例えば、ＭＡＧＥ  １、ＭＡＧＥ  ２、ＭＡＧＥ  ３、ＭＡＧＥ  ４、チロシナーゼ；突然変異ｒａｓタンパク質；突然変異ｐ５３タンパク質；進行ガンと関連付けられたｐ９７メラノーマ抗原、ｒａｓペプチドもしくはｐ５３ペプチド；子宮頸ガンと関連付けられたＨＰＶ１６／１８抗原、乳ガンと関連付けられたＫＬＨ抗原、大腸ガンと関連付けられたＣＥＡ（ガン胎児抗原）、ｇｐ１００、メラノーマと関連付けられたＭＡＲＴ１抗原、または前立腺ガンと関連付けられたＰＳＡ抗原といった腫瘍抗原のうちの１つである。別の実施形態では、本明細書に開示された組成物および方法のための抗原はメラノーマ−関連抗原であり、これは、一実施形態では、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ、またはこれらの組み合わせである。当該技術分野で既知の他の腫瘍関連抗原は本発明でも企図される。
【００３５】
一実施形態では、ペプチドは、米国特許出願シリアル番号第１２／９４５，３８６号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記述されているキメラ型Ｈｅｒ２抗原に由来する。
【００３６】
別の実施形態では、ペプチドは、ＨＰＶ−Ｅ７（ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８株のいずれかから）、ＨＰＶ−Ｅ６（ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８株のいずれかから）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ、ＳＣＣＥ、ＣＥＡ、ＬＭＰ−１、ｐ５３、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＰＳＭＡ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＷＴ−１、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２、ＰＳＡ（前立腺に特異的な抗原）、ＥＧＦＲ−ＩＩＩ、サバイビン、アポトーシスのバキュロウイルス阻害剤繰返し含有５（ＢＩＲＣ５）、ＬＭＰ−１、ｐ５３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、Ｍｕｃ１、ＰＳＡ（前立腺に特異的な抗原）、またはこれらの組み合せから選択される抗原に由来する。
【００３７】
一実施形態では、本開示のリステリアによって発現されるポリペプチドは神経ペプチド成長因子拮抗薬でもよく、一実施形態では、これは［Ｄ−Ａｒｇ１、Ｄ−Ｐｈｅ５、Ｄ−Ｔｒｐ７，９、Ｌｅｕ１１］サブスタンスＰ、［Ａｒｇ６、Ｄ−Ｔｒｐ７，９、ＮｍｅＰｈｅ８］サブスタンスＰ（６−１１）である。これらの実施形態および関連する実施形態は当業者に理解される。
【００３８】
別の実施形態では、異種抗原は感染性疾患抗原である。一実施形態では、抗原は自己抗原（ａｕｔｏ  ａｎｔｉｇｅｎ）または自己抗原（ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｇｅｎ）である。
【００３９】
一実施形態では、ペプチドはＭＨＣクラスＩ分子上に負荷される能力を有する。別の実施形態では、ペプチドはＭＨＣクラスＩＩ分子上に負荷される能力を有する。別の実施形態では、ペプチドはＭＨＣクラスＩペプチドである。別の実施形態では、ペプチドはＭＨＣクラスＩＩペプチドである。別の実施形態では、宿主細胞の表面上でＭＨＣクラスＩ分子と結合した場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞上でＴ細胞受容体によってペプチドを識別することができる。別の実施形態では、宿主細胞の表面上でＭＨＣクラスＩ分子と結合した場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞上でＴ細胞受容体によってペプチドを識別することができる。別の実施形態では、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子に宿主細胞の表面上で結合したとき、ペプチドの結合に対して特異的なエフェクターＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞の表面上に存在する抗体または小分子によってペプチドを識別することができる。
【００４０】
一実施形態では、本明細書に開示された発現系は、本明細書に開示されたキメラタンパク質をコードする核酸構築体の使用を含む。別の実施形態では、この発現系は、カルボキシ末端において独特のペプチド部分を含有する組み換え型タンパク質のパネルを促進するように設計される。一実施形態では、これはテンプレートとして細菌分泌シグナル配列−ユビキチン−ペプチド（ＳＳ−Ｕｂ−ペプチド）構築体上でコードする配列を利用するＰＣＲ反応によって達成される。一実施形態では、Ｕｂ配列のカルボキシ末端領域の中へと延在するプライマーを使用し、また所望のペプチド配列に対してプライマーの３’端においてコドンを導入して、単一のＰＣＲ反応で新しいＳＳ−Ｕｂ−ペプチド配列を生成することができる（本明細書の実施例を参照のこと）。細菌プロモーターおよび細菌分泌シグナル配列の最初のいくつかのヌクレオチドをコードする５’プライマーは、すべての構築体に対して同一であってもよい。この構築体の概略表示が本明細書の図１に提供される。
【００４１】
一実施形態では、組み換え型リステリアは、第２の核酸分子または代謝酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む構築体を含み、代謝酵素はリステリアの内因性遺伝子で突然変異、欠失、または不活性化を相補する。別の実施形態では、代謝酵素は、組み換え型リステリア株の染色体を欠いている内因性遺伝子を相補する。別の実施形態では、第２の核酸分子は、リステリアの内因性遺伝子内の突然変異を相補する第２の代謝酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む。別の実施形態では、第２の核酸分子は、組み換え型リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補する第２の代謝酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む。
【００４２】
完全長のタンパク質またはポリペプチドについて、「断片」という用語は、完全長のタンパク質またはポリペプチドよりも短いかまたは少ないアミノ酸を含むタンパク質またはポリペプチドを意味する。
【００４３】
一実施形態では、断片は１０〜２０の核酸またはアミノ酸を有し、また別の実施形態では、断片は５つの核酸またはアミノ酸を有し、また別の実施形態では、断片は１００〜２００の核酸またはアミノ酸を有し、また別の実施形態では、断片は１００〜５００の核酸またはアミノ酸を有し、また別の実施形態では、断片は５０〜２００の核酸またはアミノ酸を有し、また別の実施形態では、断片は１０〜２５０の核酸またはアミノ酸を有する。
【００４４】
別の実施形態では、核構築体または核酸分子は少なくとも１つのエピソーム性またはプラスミドベクターから発現される。別の実施形態では、抗生物質選択が無い状態で、プラスミドベクターは組み換え型リステリア株内で安定して維持される。別の実施形態では、プラスミドは組み換え型リステリア上に抗生物質抵抗性を与えない。一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は、抗生物質耐性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は抗生物質耐性遺伝子をコードする核酸を含むプラスミドを含む。
【００４５】
一実施形態では、組み換え型リステリアは本明細書に開示される核酸構築体を担持するエピソーム性ベクターを含む。別の実施形態では、エピソーム性ベクターは染色体外であり、その中でリステリアのゲノムに組み込まれない。別の実施形態では、組み換え型リステリアは本明細書に開示される核酸構築体を担持するプラスミドベクターを含む。別の実施形態では、プラスミドベクターは、リステリア染色体に組み込むための組み込み配列を含有する。別の実施形態では、「ゲノム」および「染色体」という用語は本明細書で交換可能に使用される。
【００４６】
別の実施形態では、本明細書で開示される組成物および方法で使用するためのＬＬＯタンパク質が本明細書で開示される。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質断片は、本明細書に開示される組成物および方法で利用される。別の実施形態では、断片は機能的断片である。別の実施形態では、断片は免疫原性断片である。
【００４７】
本開示のワクチンを構築するために利用されるＬＬＯタンパク質は、別の実施形態では、以下の配列を有する：
【００４８】
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＰＥＧＮＥＩＶＱＨＫＮＷＳＥＮＮＫＳＫＬＡＨＦＴＳＳＩＹＬＰＧＮＡＲＮＩＮＶＹＡＫＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲＴＶＩＤＤＲＮＬＰＬＶＫＮＲＮＩＳＩＷＧＴＴＬＹＰＫＹＳＮＫＶＤＮＰＩＥ  （ＧｅｎＢａｎｋ受入番号  Ｐ１３１２８；配列番号：１；核酸配列はＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ１５１２７で示される）。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ０５４５８９．１で示される配列を有し、これは、リステリア１０４０３Ｓからのｈｌｙ遺伝子を指す。この配列に対応するプロタンパク質の最初の２５個のＡＡはシグナル配列であり、細菌によって分泌されるときにＬＬＯから分割される。したがって、この実施形態では、全長の活性ＬＬＯタンパク質は５０４残基長である。別の実施形態では、上記のＬＬＯ断片は本発明のワクチンに組み込まれるＬＬＯ断片の供給源として使用される。
【００４９】
別の実施形態では、本開示の組成物および方法で利用されるＬＬＯタンパク質のＮ末端断片は、以下の配列を有する：
【００５０】
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤ  （配列番号：２）。
【００５１】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は本明細書で利用されるＡＡ２０〜４４２のＬＬＯタンパク質にほぼ対応する。
【００５２】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、以下の配列を有する：
【００５３】
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤ  配列番号：３。
【００５４】
一実施形態では、ＬＬＯシグナルペプチドまたはシグナル配列は以下のアミノ酸を含む：ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫ（配列番号：４）。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「切断ＬＬＯ」、「ｔＬＬＯ」、または「ΔＬＬＯ」はＰＥＳＴ様ドメインを含むＬＬＯの断片を指す。別の実施形態では、これらの用語はＰＥＳＴ配列を含むＬＬＯ断片を指す。別の実施形態では、上で定義したように「ΔＬＬＯ」は４１６ＡＡ  ＬＬＯ断片を指す。
【００５６】
別の実施形態では、切断ＬＬＯ、ｔＬＬＯ、またはΔＬＬＯという用語はアミノ末端において活性化ドメインを含有せず、システイン４８４を含まないＬＬＯ断片を指す。別の実施形態では、これらの用語は溶血性でないＬＬＯ断片を指す。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、活性化ドメインの欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、システイン４８４の欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、別の場所における欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態では、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，７７１，７０２号に詳細に述べられるように、ＬＬＯは、コレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）の欠失または突然変異によって非溶血性にされる。
【００５７】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質のおよそ最初の４４１  ＡＡから構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯのおよそ最初の４２０  ＡＡから構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質の非溶血性の形態である。
【００５８】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜４００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜４２５から構成される。
【００５９】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は上記のＡＡ範囲のうちの１つに対応する相同ＬＬＯタンパク質の残基を含有する。別の実施形態では、残基番号は上記に列挙した残基番号と必ずしも正確に対応する必要はなく、例えば、相同ＬＬＯタンパク質が本明細書で利用されるＬＬＯタンパク質に対して挿入または欠失を有する場合、残基番号を適宜調節することができる。他のＬＬＯ断片が当該技術分野で既知である。
【００６０】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質のおよそ最初の４４１  ＡＡから構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯのおよそ最初の４２０  ＡＡから構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質の非溶血性の形態である。
【００６１】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜４００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜４２５から構成される。
【００６２】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は上記のＡＡ範囲のうちの１つに対応する相同ＬＬＯタンパク質の残基を含有する。別の実施形態では、残基番号は上記に列挙した残基番号と必ずしも正確に対応する必要はなく、例えば、相同ＬＬＯタンパク質が本明細書で利用されるＬＬＯタンパク質に対して挿入または欠失を有する場合、残基番号を適宜調節することができる。他のＬＬＯ断片が当該技術分野で既知である。
【００６３】
別の実施形態では、相同ＬＬＯは、ＬＬＯ配列（例えば、配列番号：１〜３のうちの１つ）に対する同一性が７０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同ＬＬＯは、配列番号：１〜３から選択された配列との同一性が７２％より大きいことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１〜３のうちの１つに対する同一性が７５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１〜３のうちの１つに対する同一性が７８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１〜３のうちの１つに対する同一性が８０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１〜３４のうちの１つに対する同一性が８２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１〜３のうちの１つに対する同一性が８３％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１〜３のうちの１つに対する同一性が８５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１〜３のうちの１つに対する同一性が８７％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１〜３のうちの１つに対する同一性が８８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１〜３のうちの１つに対する同一性が９０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１〜３のうちの１つに対する同一性が９２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１〜３のうちの１つに対する同一性が９３％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１〜３のうちの１つに対する同一性が９５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１〜３のうちの１つに対する同一性が９６％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１〜３のうちの１つに対する同一性が９７％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１〜３のうちの１つに対する同一性が９８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１〜３のうちの１つに対する同一性が９９％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１〜３のうちの１つに対する同一性が１００％であることを指す。
【００６４】
一実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号：５で示される配列によってコードされる
ＭＧＬＮＲＦＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧＰＮＩＮＮＮＮＳＥＱＴＥＮＡＡＩＮＥＥＡＳＧＡＤＲＰＡＩＱＶＥＲＲＨＰＧＬＰＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＶＮＫＫＫＶＡＫＥＳＶＡＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＳＰＱＰＬＫＡＮＱＱＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＩＲＥＴＡＳＳＬＤＳＳＦＴＲＧＤＬＡＳＬＲＮＡＩＮＲＨＳＱＮＦＳＤＦＰＰＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲＬＡＤＬＲＤＲＧＴＧＫＨＳＲＮＡＧＦＬＰＬＮＰＦＡＳＳＰＶＰＳＬＳＰＫＶＳＫＩＳＤＲＡＬＩＳＤＩＴＫＫＴＰＦＫＮＰＳＱＰＬＮＶＦＮＫＫＴＴＴＫＴＶＴＫＫＰＴＰＶＫＴＡＰＫＬＡＥＬＰＡＴＫＰＱＥＴＶＬＲＥＮＫＴＰＦＩＥＫＱＡＥＴＮＫＱＳＩＮＭＰＳＬＰＶＩＱＫＥＡＴＥＳＤＫＥＥＭＫＰＱＴＥＥＫＭＶＥＥＳＥＳＡＮＮＡＮＧＫＮＲＳＡＧＩＥＥＧＫＬＩＡＫＳＡＥＤＥＫＡＫＥＥＰＧＮＨＴＴＬＩＬＡＭＬＡＩＧＶＦＳＬＧＡＦＩＫＩＩＱＬＲＫＮＮ（配列番号：５）。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：５から成る。この配列に対応するプロタンパク質の最初の２９個のＡＡはシグナル配列であり、細菌によって分泌されるときにＡｃｔＡタンパク質から分割される。一実施形態では、ＡｃｔＡポリペプチドまたはペプチドは、シグナル配列、上記の配列番号：５のＡＡ１〜２９を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡポリペプチドまたはペプチドは、シグナル配列、上記の配列番号：５のＡＡ１〜２９を含まない。
【００６５】
別の実施形態では、本明細書に開示される切断ＡｃｔＡタンパク質をコードする組み換え型ヌクレオチドは、配列番号：６に示される配列を含む
Ａｔｇｃｇｔｇｃｇａｔｇａｔｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃａｔｔａｃｔｇｃｃａａｔｔｇｃａｔｔａｃｇａｔｔａａｃｃｃｃｇａｃａｔａａｔａｔｔｔｇｃａｇｃｇａｃａｇａｔａｇｃｇａａｇａｔｔｃｔａｇｔｃｔａａａｃａｃａｇａｔｇａａｔｇｇｇａａｇａａｇａａａａａａｃａｇａａｇａｇｃａａｃｃａａｇｃｇａｇｇｔａａａｔａｃｇｇｇａｃｃａａｇａｔａｃｇａａａｃｔｇｃａｃｇｔｇａａｇｔａａｇｔｔｃａｃｇｔｇａｔａｔｔａａａｇａａｃｔａｇａａａａａｔｃｇａａｔａａａｇｔｇａｇａａａｔａｃｇａａｃａａａｇｃａｇａｃｃｔａａｔａｇｃａａｔｇｔｔｇａａａｇａａａａａｇｃａｇａａａａａｇｇｔｃｃａａａｔａｔｃａａｔａａｔａａｃａａｃａｇｔｇａａｃａａａｃｔｇａｇａａｔｇｃｇｇｃｔａｔａａａｔｇａａｇａｇｇｃｔｔｃａｇｇａｇｃｃｇａｃｃｇａｃｃａｇｃｔａｔａｃａａｇｔｇｇａｇｃｇｔｃｇｔｃａｔｃｃａｇｇａｔｔｇｃｃａｔｃｇｇａｔａｇｃｇｃａｇｃｇｇａａａｔｔａａａａａａａｇａａｇｇａａａｇｃｃａｔａｇｃａｔｃａｔｃｇｇａｔａｇｔｇａｇｃｔｔｇａａａｇｃｃｔｔａｃｔｔａｔｃｃｇｇａｔａａａｃｃａａｃａａａａｇｔａａａｔａａｇａａａａａａｇｔｇｇｃｇａａａｇａｇｔｃａｇｔｔｇｃｇｇａｔｇｃｔｔｃｔｇａａａｇｔｇａｃｔｔａｇａｔｔｃｔａｇｃａｔｇｃａｇｔｃａｇｃａｇａｔｇａｇｔｃｔｔｃａｃｃａｃａａｃｃｔｔｔａａａａｇｃａａａｃｃａａｃａａｃｃａｔｔｔｔｔｃｃｃｔａａａｇｔａｔｔｔａａａａａａａｔａａａａｇａｔｇｃｇｇｇｇａａａｔｇｇｇｔａｃｇｔｇａｔａａａａｔｃｇａｃｇａａａａｔｃｃｔｇａａｇｔａａａｇａａａｇｃｇａｔｔｇｔｔｇａｔａａａａｇｔｇｃａｇｇｇｔｔａａｔｔｇａｃｃａａｔｔａｔｔａａｃｃａａａａａｇａａａａｇｔｇａａｇａｇｇｔａａａｔｇｃｔｔｃｇｇａｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃａｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃａｇａａｃｃｇａｇｃｔｃａｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃｇｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃｇｇａａｃｃｇａｇｃｔｃｇｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃｇｃｃｔｃｃａａｃａｇａａｇａｔｇａａｃｔａｇａａａｔｃａｔｃｃｇｇｇａａａｃａｇｃａｔｃｃｔｃｇｃｔａｇａｔｔｃｔａｇｔｔｔｔａｃａａｇａｇｇｇｇａｔｔｔａｇｃｔａｇｔｔｔｇａｇａａａｔｇｃｔａｔｔａａｔｃｇｃｃａｔａｇｔｃａａａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｔｔｔｃｃｃａｃｃａａｔｃｃｃａａｃａｇａａｇａａｇａｇｔｔｇａａｃｇｇｇａｇａｇｇｃｇｇｔａｇａｃｃａ（配列番号：６）。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは配列番号：６に示される配列を有する。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする任意の他の配列を含む。
【００６６】
別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：７に示される配列を含む
【００６７】
Ｍ  Ｇ  Ｌ  Ｎ  Ｒ  Ｆ  Ｍ    Ｒ    Ａ    Ｍ    Ｍ    Ｖ    Ｖ    Ｆ    Ｉ    Ｔ    Ａ    Ｎ    Ｃ    Ｉ    Ｔ    Ｉ    Ｎ    Ｐ    Ｄ    Ｉ    Ｉ    Ｆ    Ａ    Ａ    Ｔ    Ｄ    Ｓ    Ｅ    Ｄ    Ｓ    Ｓ    Ｌ    Ｎ    Ｔ    Ｄ    Ｅ    Ｗ    Ｅ    Ｅ    Ｅ    Ｋ    Ｔ    Ｅ    Ｅ    Ｑ    Ｐ    Ｓ    Ｅ    Ｖ    Ｎ    Ｔ    Ｇ    Ｐ    Ｒ    Ｙ    Ｅ    Ｔ    Ａ    Ｒ    Ｅ    Ｖ    Ｓ    Ｓ    Ｒ    Ｄ    Ｉ    Ｅ    Ｅ    Ｌ    Ｅ    Ｋ    Ｓ    Ｎ    Ｋ    Ｖ    Ｋ    Ｎ    Ｔ    Ｎ    Ｋ    Ａ    Ｄ    Ｌ    Ｉ    Ａ    Ｍ    Ｌ    Ｋ    Ａ    Ｋ    Ａ    Ｅ    Ｋ    Ｇ    Ｐ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｇ    Ｅ    Ｑ    Ｔ    Ｇ    Ｎ    Ｖ    Ａ    Ｉ    Ｎ    Ｅ    Ｅ    Ａ    Ｓ    Ｇ    Ｖ    Ｄ    Ｒ    Ｐ    Ｔ    Ｌ    Ｑ    Ｖ    Ｅ    Ｒ    Ｒ    Ｈ    Ｐ    Ｇ    Ｌ    Ｓ    Ｓ    Ｄ    Ｓ    Ａ    Ａ    Ｅ    Ｉ    Ｋ    Ｋ    Ｒ    Ｒ    Ｋ    Ａ    Ｉ    Ａ    Ｓ    Ｓ    Ｄ    Ｓ    Ｅ    Ｌ    Ｅ    Ｓ    Ｌ    Ｔ    Ｙ    Ｐ    Ｄ    Ｋ    Ｐ    Ｔ    Ｋ    Ａ    Ｎ    Ｋ    Ｒ    Ｋ    Ｖ    Ａ    Ｋ    Ｅ    Ｓ    Ｖ    Ｖ    Ｄ    Ａ    Ｓ    Ｅ    Ｓ    Ｄ    Ｌ    Ｄ    Ｓ    Ｓ    Ｍ    Ｑ    Ｓ    Ａ    Ｄ    Ｅ    Ｓ    Ｔ    Ｐ    Ｑ    Ｐ    Ｌ    Ｋ    Ａ    Ｎ    Ｑ    Ｋ    Ｐ    Ｆ    Ｆ    Ｐ    Ｋ    Ｖ    Ｆ    Ｋ    Ｋ    Ｉ    Ｋ    Ｄ    Ａ    Ｇ    Ｋ    Ｗ    Ｖ    Ｒ    Ｄ    Ｋ    Ｉ    Ｄ    Ｅ    Ｎ    Ｐ    Ｅ    Ｖ    Ｋ    Ｋ    Ａ    Ｉ    Ｖ    Ｄ    Ｋ    Ｓ    Ａ    Ｇ    Ｌ    Ｉ    Ｄ    Ｑ    Ｌ    Ｌ    Ｔ    Ｋ    Ｋ    Ｋ    Ｓ    Ｅ    Ｅ    Ｖ    Ｎ    Ａ    Ｓ    Ｄ    Ｆ    Ｐ    Ｐ    Ｐ    Ｐ    Ｔ    Ｄ    Ｅ    Ｅ    Ｌ    Ｒ    Ｌ    Ａ    Ｌ    Ｐ    Ｅ    Ｔ    Ｐ    Ｍ    Ｌ    Ｌ    Ｇ    Ｆ    Ｎ    Ａ    Ｐ    Ｔ    Ｐ    Ｓ    Ｅ    Ｐ    Ｓ    Ｓ    Ｆ    Ｅ    Ｆ    Ｐ    Ｐ    Ｐ    Ｐ    Ｔ    Ｄ    Ｅ    Ｅ    Ｌ    Ｒ    Ｌ    Ａ    Ｌ    Ｐ    Ｅ    Ｔ    Ｐ    Ｍ    Ｌ    Ｌ    Ｇ    Ｆ    Ｎ    Ａ    Ｐ    Ａ    Ｔ    Ｓ    Ｅ    Ｐ    Ｓ    Ｓ    Ｆ    Ｅ    Ｆ    Ｐ    Ｐ    Ｐ    Ｐ    Ｔ    Ｅ    Ｄ    Ｅ    Ｌ    Ｅ    Ｉ    Ｍ    Ｒ    Ｅ    Ｔ    Ａ    Ｐ    Ｓ    Ｌ    Ｄ    Ｓ    Ｓ    Ｆ    Ｔ    Ｓ    Ｇ    Ｄ    Ｌ    Ａ    Ｓ    Ｌ    Ｒ    Ｓ    Ａ    Ｉ    Ｎ    Ｒ    Ｈ    Ｓ    Ｅ    Ｎ    Ｆ    Ｓ    Ｄ    Ｆ    Ｐ    Ｐ    Ｉ    Ｐ    Ｔ    Ｅ    Ｅ    Ｅ    Ｌ    Ｎ    Ｇ    Ｒ    Ｇ    Ｇ    Ｒ    Ｐ    Ｔ    Ｓ    Ｅ    Ｅ    Ｆ    Ｓ    Ｓ    Ｌ    Ｎ    Ｓ    Ｇ    Ｄ    Ｆ    Ｔ    Ｄ    Ｄ    Ｅ    Ｎ    Ｓ    Ｅ    Ｔ    Ｔ    Ｅ    Ｅ    Ｅ    Ｉ    Ｄ    Ｒ    Ｌ    Ａ    Ｄ    Ｌ    Ｒ    Ｄ    Ｒ    Ｇ    Ｔ    Ｇ    Ｋ    Ｈ    Ｓ    Ｒ    Ｎ    Ａ    Ｇ    Ｆ    Ｌ    Ｐ    Ｌ    Ｎ    Ｐ    Ｆ    Ｉ    Ｓ    Ｓ    Ｐ    Ｖ    Ｐ    Ｓ    Ｌ    Ｔ    Ｐ    Ｋ    Ｖ    Ｐ    Ｋ    Ｉ    Ｓ    Ａ    Ｐ    Ａ    Ｌ    Ｉ    Ｓ    Ｄ    Ｉ    Ｔ    Ｋ    Ｋ    Ａ    Ｐ    Ｆ    Ｋ    Ｎ    Ｐ    Ｓ    Ｑ    Ｐ    Ｌ    Ｎ    Ｖ    Ｆ    Ｎ    Ｋ    Ｋ    Ｔ    Ｔ    Ｔ    Ｋ    Ｔ    Ｖ    Ｔ    Ｋ    Ｋ    Ｐ    Ｔ    Ｐ    Ｖ    Ｋ    Ｔ    Ａ    Ｐ    Ｋ    Ｌ    Ａ    Ｅ    Ｌ    Ｐ    Ａ    Ｔ    Ｋ    Ｐ    Ｑ    Ｅ    Ｔ    Ｖ    Ｌ    Ｒ    Ｅ    Ｎ    Ｋ    Ｔ    Ｐ    Ｆ    Ｉ    Ｅ    Ｋ    Ｑ    Ａ    Ｅ    Ｔ    Ｎ    Ｋ    Ｑ    Ｓ    Ｉ    Ｎ    Ｍ    Ｐ    Ｓ    Ｌ    Ｐ    Ｖ    Ｉ    Ｑ    Ｋ    Ｅ    Ａ    Ｔ    Ｅ    Ｓ    Ｄ    Ｋ    Ｅ    Ｅ    Ｍ    Ｋ    Ｐ    Ｑ    Ｔ    Ｅ    Ｅ    Ｋ    Ｍ    Ｖ    Ｅ    Ｅ    Ｓ    Ｅ    Ｓ    Ａ    Ｎ    Ｎ    Ａ    Ｎ    Ｇ    Ｋ    Ｎ    Ｒ    Ｓ    Ａ    Ｇ    Ｉ    Ｅ    Ｅ    Ｇ    Ｋ    Ｌ    Ｉ    Ａ    Ｋ    Ｓ    Ａ    Ｅ    Ｄ    Ｅ    Ｋ    Ａ    Ｋ    Ｅ    Ｅ    Ｐ    Ｇ    Ｎ    Ｈ    Ｔ    Ｔ    Ｌ    Ｉ    Ｌ    Ａ    Ｍ    Ｌ    Ａ    Ｉ    Ｇ    Ｖ    Ｆ    Ｓ    Ｌ    Ｇ    Ａ    Ｆ    Ｉ    Ｋ    Ｉ    Ｉ    Ｑ    Ｌ    Ｒ    Ｋ    Ｎ    Ｎ    （配列番号：７）。この配列に対応するプロタンパク質の最初の２９個のＡＡはシグナル配列であり、細菌によって分泌されるときにＡｃｔＡタンパク質から分割される。
【００６８】
一実施形態では、ＡｃｔＡポリペプチドまたはペプチドは、シグナル配列、配列番号：７のＡＡ１〜２９を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡポリペプチドまたはペプチドは、シグナル配列、配列番号：７のＡＡ１〜２９を含まない。一実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質はＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片を含む。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質はＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片である。
【００６９】
一実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：８に示される配列を含む
ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧＰＮＩＮＮＮＮＳＥＱＴＥＮＡＡＩＮＥＥＡＳＧＡＤＲＰＡＩＱＶＥＲＲＨＰＧＬＰＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＶＮＫＫＫＶＡＫＥＳＶＡＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＳＰＱＰＬＫＡＮＱＱＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＩＲＥＴＡＳＳＬＤＳＳＦＴＲＧＤＬＡＳＬＲＮＡＩＮＲＨＳＱＮＦＳＤＦＰＰＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰ（配列番号：８）。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は配列番号：８に示される配列を含む。
【００７０】
別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：９に示される配列を含む  ＭＧＬＮＲＦＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧ（配列番号：９）。
【００７１】
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は当該技術分野で既知の任意の他のＡｃｔＡ断片である。
【００７２】
一実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１０に示される配列を含む
ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧＰＮＩＮＮＮＮＳＥＱＴＥＮＡＡＩＮＥＥＡＳＧＡＤＲＰＡＩＱＶＥＲＲＨＰＧＬＰＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＶＮＫＫＫＶＡＫＥＳＶＡＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＳＰＱＰＬＫＡＮＱＱＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＩＲＥＴＡＳＳＬＤＳＳＦＴＲＧＤＬＡＳＬＲＮＡＩＮＲＨＳＱＮＦＳＤＦＰＰＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰ  （配列番号：１０）。
【００７３】
別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１１に示される配列を含む
ＭＧＬＮＲＦＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥ
ＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧ（配列番号：１１）。
【００７４】
別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１２に示される配列を含む
Ａ    Ｔ    Ｄ    Ｓ    Ｅ    Ｄ    Ｓ    Ｓ    Ｌ    Ｎ    Ｔ    Ｄ    Ｅ    Ｗ    Ｅ    Ｅ    Ｅ    Ｋ    Ｔ    Ｅ    Ｅ    Ｑ    Ｐ    Ｓ    Ｅ    Ｖ    Ｎ    Ｔ    Ｇ    Ｐ    Ｒ    Ｙ    Ｅ    Ｔ    Ａ    Ｒ    Ｅ    Ｖ    Ｓ    Ｓ    Ｒ    Ｄ    Ｉ    Ｅ    Ｅ    Ｌ    Ｅ    Ｋ    Ｓ    Ｎ    Ｋ    Ｖ    Ｋ    Ｎ    Ｔ    Ｎ    Ｋ    Ａ    Ｄ    Ｌ    Ｉ    Ａ    Ｍ    Ｌ    Ｋ    Ａ    Ｋ    Ａ    Ｅ    Ｋ    Ｇ    Ｐ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｇ    Ｅ    Ｑ    Ｔ    Ｇ    Ｎ    Ｖ    Ａ    Ｉ    Ｎ    Ｅ    Ｅ    Ａ    Ｓ    Ｇ  （配列番号：１２）。別の実施形態では、配列番号：１２に示される切断ＡｃｔＡはＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ１と呼ばれる。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡは、最初の３０個から完全長のＡｃｔＡ配列のアミノ酸１２２までを含む。別の実施形態では、配列番号：１２は、最初の３０個から完全長のＡｃｔＡ配列のアミノ酸１２２までを含む。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡは、最初の３０個から配列番号：７のアミノ酸１２２までを含む。別の実施形態では、配列番号：１２は、最初の３０個から配列番号：７のアミノ酸１２２までを含む。
【００７５】
別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１３に示される配列を含む
Ｍ  Ｒ  Ａ  Ｍ  Ｍ  Ｖ  Ｖ  Ｆ  Ｉ  Ｔ  Ａ  Ｎ  Ｃ  Ｉ  Ｔ  Ｉ  Ｎ  Ｐ  Ｄ  Ｉ  Ｉ  Ｆ  Ａ  Ａ    Ｔ    Ｄ    Ｓ    Ｅ    Ｄ    Ｓ    Ｓ    Ｌ    Ｎ    Ｔ    Ｄ    Ｅ    Ｗ    Ｅ    Ｅ    Ｅ    Ｋ    Ｔ    Ｅ    Ｅ    Ｑ    Ｐ    Ｓ    Ｅ    Ｖ    Ｎ    Ｔ    Ｇ    Ｐ    Ｒ    Ｙ    Ｅ    Ｔ    Ａ    Ｒ    Ｅ    Ｖ    Ｓ    Ｓ    Ｒ    Ｄ    Ｉ    Ｅ    Ｅ    Ｌ    Ｅ    Ｋ    Ｓ    Ｎ    Ｋ    Ｖ    Ｋ    Ｎ    Ｔ    Ｎ    Ｋ    Ａ    Ｄ    Ｌ    Ｉ    Ａ    Ｍ    Ｌ    Ｋ    Ａ    Ｋ    Ａ    Ｅ    Ｋ    Ｇ    Ｐ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｇ    Ｅ    Ｑ    Ｔ    Ｇ    Ｎ    Ｖ    Ａ    Ｉ    Ｎ    Ｅ    Ｅ    Ａ    Ｓ    Ｇ  Ｖ  Ｄ  Ｒ  Ｐ  Ｔ  Ｌ  Ｑ  Ｖ  （配列番号：１３）。別の実施形態では、配列番号：１２に示される切断ＡｃｔＡはＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ１と呼ばれる。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡは、最初の１個から完全長のＡｃｔＡ配列のアミノ酸１３０までを含む。別の実施形態では、配列番号：１３は、最初の１個から完全長のＡｃｔＡ配列のアミノ酸１３０までを含む。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡは、最初の１個から配列番号：７のアミノ酸１３０までを含む。別の実施形態では、配列番号：１３は、最初の３０個から配列番号：７のアミノ酸１２２までを含む。
【００７６】
別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１４に示される配列を含む
Ａ    Ｔ    Ｄ    Ｓ    Ｅ    Ｄ    Ｓ    Ｓ    Ｌ    Ｎ    Ｔ    Ｄ    Ｅ    Ｗ    Ｅ    Ｅ    Ｅ    Ｋ    Ｔ    Ｅ    Ｅ    Ｑ    Ｐ    Ｓ    Ｅ    Ｖ    Ｎ    Ｔ    Ｇ    Ｐ    Ｒ    Ｙ    Ｅ    Ｔ    Ａ    Ｒ    Ｅ    Ｖ    Ｓ    Ｓ    Ｒ    Ｄ    Ｉ    Ｅ    Ｅ    Ｌ    Ｅ    Ｋ    Ｓ    Ｎ    Ｋ    Ｖ    Ｋ    Ｎ    Ｔ    Ｎ    Ｋ    Ａ    Ｄ    Ｌ    Ｉ    Ａ    Ｍ    Ｌ    Ｋ    Ａ    Ｋ    Ａ    Ｅ    Ｋ    Ｇ    Ｐ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｇ    Ｅ    Ｑ    Ｔ    Ｇ    Ｎ    Ｖ    Ａ    Ｉ    Ｎ    Ｅ    Ｅ    Ａ    Ｓ    Ｇ    Ｖ  Ｄ  Ｒ  Ｐ  Ｔ  Ｌ  Ｑ  Ｖ  （配列番号：１４）。別の実施形態では、配列番号：１４に示される切断ＡｃｔＡはＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ１と呼ばれる。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡは、最初の３０個から完全長のＡｃｔＡ配列のアミノ酸１２２までを含む。別の実施形態では、配列番号：１４は、最初の３０個から完全長のＡｃｔＡ配列のアミノ酸１２２までを含む。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡは、最初の３０個から配列番号：７のアミノ酸１２２までを含む。別の実施形態では、配列番号：１４は、最初の３０個から配列番号：７のアミノ酸１２２までを含む。
【００７７】
別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１５に示される配列を含む
Ａ    Ｔ    Ｄ    Ｓ    Ｅ    Ｄ    Ｓ    Ｓ    Ｌ    Ｎ    Ｔ    Ｄ    Ｅ    Ｗ    Ｅ    Ｅ    Ｅ    Ｋ    Ｔ    Ｅ    Ｅ    Ｑ    Ｐ    Ｓ    Ｅ    Ｖ    Ｎ    Ｔ    Ｇ    Ｐ    Ｒ    Ｙ    Ｅ    Ｔ    Ａ    Ｒ    Ｅ    Ｖ    Ｓ    Ｓ    Ｒ    Ｄ    Ｉ    Ｅ    Ｅ    Ｌ    Ｅ    Ｋ    Ｓ    Ｎ    Ｋ    Ｖ    Ｋ    Ｎ    Ｔ    Ｎ    Ｋ    Ａ    Ｄ    Ｌ    Ｉ    Ａ    Ｍ    Ｌ    Ｋ    Ａ    Ｋ    Ａ    Ｅ    Ｋ    Ｇ    Ｐ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｇ    Ｅ    Ｑ    Ｔ    Ｇ    Ｎ    Ｖ    Ａ    Ｉ    Ｎ    Ｅ    Ｅ    Ａ    Ｓ    Ｇ    Ｖ    Ｄ    Ｒ    Ｐ    Ｔ    Ｌ    Ｑ    Ｖ    Ｅ    Ｒ    Ｒ    Ｈ    Ｐ    Ｇ    Ｌ    Ｓ    Ｓ    Ｄ    Ｓ    Ａ    Ａ    Ｅ    Ｉ    Ｋ    Ｋ    Ｒ    Ｒ    Ｋ    Ａ    Ｉ    Ａ    Ｓ    Ｓ    Ｄ    Ｓ    Ｅ    Ｌ    Ｅ    Ｓ    Ｌ    Ｔ    Ｙ    Ｐ    Ｄ    Ｋ    Ｐ    Ｔ    Ｋ    Ａ    Ｎ    Ｋ    Ｒ    Ｋ    Ｖ    Ａ    Ｋ    Ｅ    Ｓ    Ｖ    Ｖ    Ｄ    Ａ    Ｓ    Ｅ    Ｓ    Ｄ    Ｌ    Ｄ    Ｓ    Ｓ    Ｍ    Ｑ    Ｓ    Ａ    Ｄ    Ｅ    Ｓ    Ｔ    Ｐ    Ｑ    Ｐ    Ｌ    Ｋ    Ａ    Ｎ    Ｑ    Ｋ    Ｐ    Ｆ    Ｆ    Ｐ    Ｋ    Ｖ    Ｆ    Ｋ    Ｋ    Ｉ    Ｋ    Ｄ    Ａ    Ｇ    Ｋ    Ｗ    Ｖ    Ｒ    Ｄ    Ｋ  （配列番号：１５）。別の実施形態では、配列番号：１５に示される切断ＡｃｔＡはＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２と呼ばれる。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡは、完全長のＡｃｔＡ配列のアミノ酸３０からアミノ酸２２９までを含む。別の実施形態では、配列番号：１５は、完全長のＡｃｔＡ配列のおよそアミノ酸３０からおよそアミノ酸２２９までを含む。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡは、配列番号：７のおよそアミノ酸３０からおよそアミノ酸２２９までを含む。別の実施形態では、配列番号：１５は、配列番号：７のアミノ酸３０からアミノ酸２２９までを含む。
【００７８】
別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１６に示される配列を含む
Ａ    Ｔ    Ｄ    Ｓ    Ｅ    Ｄ    Ｓ    Ｓ    Ｌ    Ｎ    Ｔ    Ｄ    Ｅ    Ｗ    Ｅ    Ｅ    Ｅ    Ｋ    Ｔ    Ｅ    Ｅ    Ｑ    Ｐ    Ｓ    Ｅ    Ｖ    Ｎ    Ｔ    Ｇ    Ｐ    Ｒ    Ｙ    Ｅ    Ｔ    Ａ    Ｒ    Ｅ    Ｖ    Ｓ    Ｓ    Ｒ    Ｄ    Ｉ    Ｅ    Ｅ    Ｌ    Ｅ    Ｋ    Ｓ    Ｎ    Ｋ    Ｖ    Ｋ    Ｎ    Ｔ    Ｎ    Ｋ    Ａ    Ｄ    Ｌ    Ｉ    Ａ    Ｍ    Ｌ    Ｋ    Ａ    Ｋ    Ａ    Ｅ    Ｋ    Ｇ    Ｐ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｇ    Ｅ    Ｑ    Ｔ    Ｇ    Ｎ    Ｖ    Ａ    Ｉ    Ｎ    Ｅ    Ｅ    Ａ    Ｓ    Ｇ    Ｖ    Ｄ    Ｒ    Ｐ    Ｔ    Ｌ    Ｑ    Ｖ    Ｅ    Ｒ    Ｒ    Ｈ    Ｐ    Ｇ    Ｌ    Ｓ    Ｓ    Ｄ    Ｓ    Ａ    Ａ    Ｅ    Ｉ    Ｋ    Ｋ    Ｒ    Ｒ    Ｋ    Ａ    Ｉ    Ａ    Ｓ    Ｓ    Ｄ    Ｓ    Ｅ    Ｌ    Ｅ    Ｓ    Ｌ    Ｔ    Ｙ    Ｐ    Ｄ    Ｋ    Ｐ    Ｔ    Ｋ    Ａ    Ｎ    Ｋ    Ｒ    Ｋ    Ｖ    Ａ    Ｋ    Ｅ    Ｓ    Ｖ    Ｖ    Ｄ    Ａ    Ｓ    Ｅ    Ｓ    Ｄ    Ｌ    Ｄ    Ｓ    Ｓ    Ｍ    Ｑ    Ｓ    Ａ    Ｄ    Ｅ    Ｓ    Ｔ    Ｐ    Ｑ    Ｐ    Ｌ    Ｋ    Ａ    Ｎ    Ｑ    Ｋ    Ｐ    Ｆ    Ｆ    Ｐ    Ｋ    Ｖ    Ｆ    Ｋ    Ｋ    Ｉ    Ｋ    Ｄ    Ａ    Ｇ    Ｋ    Ｗ    Ｖ    Ｒ    Ｄ    Ｋ    Ｉ    Ｄ    Ｅ    Ｎ    Ｐ    Ｅ    Ｖ    Ｋ    Ｋ    Ａ    Ｉ    Ｖ    Ｄ    Ｋ    Ｓ    Ａ    Ｇ    Ｌ    Ｉ    Ｄ    Ｑ    Ｌ    Ｌ    Ｔ    Ｋ    Ｋ    Ｋ    Ｓ    Ｅ    Ｅ    Ｖ    Ｎ    Ａ    Ｓ    Ｄ    Ｆ    Ｐ    Ｐ    Ｐ    Ｐ    Ｔ    Ｄ    Ｅ    Ｅ    Ｌ    Ｒ    Ｌ    Ａ    Ｌ    Ｐ    Ｅ    Ｔ    Ｐ    Ｍ    Ｌ    Ｌ    Ｇ    Ｆ    Ｎ    Ａ    Ｐ    Ｔ    Ｐ    Ｓ    Ｅ    Ｐ    Ｓ    Ｓ    Ｆ    Ｅ    Ｆ    Ｐ    Ｐ    Ｐ    Ｐ    Ｔ    Ｄ    Ｅ    Ｅ    Ｌ    Ｒ    Ｌ    Ａ    Ｌ    Ｐ    Ｅ    Ｔ    Ｐ    Ｍ    Ｌ    Ｌ    Ｇ    Ｆ    Ｎ    Ａ    Ｐ    Ａ    Ｔ    Ｓ    Ｅ    Ｐ    Ｓ    Ｓ  （配列番号：１６）。別の実施形態では、配列番号：１６に示される切断ＡｃｔＡはＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ３と呼ばれる。別の実施形態では、この切断ＡｃｔＡは、最初の３０個から完全長のＡｃｔＡ配列のアミノ酸３３２までを含む。別の実施形態では、配列番号：１６は、最初の３０個から完全長のＡｃｔＡ配列のアミノ酸３３２までを含む。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡは、およそ最初の３０個から配列番号：７のアミノ酸３３２までを含む。別の実施形態では、配列番号：１６は、最初の３０個から配列番号：７のアミノ酸３３２までを含む。
【００７９】
別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１７に示される配列を含む
Ａ    Ｔ    Ｄ    Ｓ    Ｅ    Ｄ    Ｓ    Ｓ    Ｌ    Ｎ    Ｔ    Ｄ    Ｅ    Ｗ    Ｅ    Ｅ    Ｅ    Ｋ    Ｔ    Ｅ    Ｅ    Ｑ    Ｐ    Ｓ    Ｅ    Ｖ    Ｎ    Ｔ    Ｇ    Ｐ    Ｒ    Ｙ    Ｅ    Ｔ    Ａ    Ｒ    Ｅ    Ｖ    Ｓ    Ｓ    Ｒ    Ｄ    Ｉ    Ｅ    Ｅ    Ｌ    Ｅ    Ｋ    Ｓ    Ｎ    Ｋ    Ｖ    Ｋ    Ｎ    Ｔ    Ｎ    Ｋ    Ａ    Ｄ    Ｌ    Ｉ    Ａ    Ｍ    Ｌ    Ｋ    Ａ    Ｋ    Ａ    Ｅ    Ｋ    Ｇ    Ｐ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｇ    Ｅ    Ｑ    Ｔ    Ｇ    Ｎ    Ｖ    Ａ    Ｉ    Ｎ    Ｅ    Ｅ    Ａ    Ｓ    Ｇ    Ｖ    Ｄ    Ｒ    Ｐ    Ｔ    Ｌ    Ｑ    Ｖ    Ｅ    Ｒ    Ｒ    Ｈ    Ｐ    Ｇ    Ｌ    Ｓ    Ｓ    Ｄ    Ｓ    Ａ    Ａ    Ｅ    Ｉ    Ｋ    Ｋ    Ｒ    Ｒ    Ｋ    Ａ    Ｉ    Ａ    Ｓ    Ｓ    Ｄ    Ｓ    Ｅ    Ｌ    Ｅ    Ｓ    Ｌ    Ｔ    Ｙ    Ｐ    Ｄ    Ｋ    Ｐ    Ｔ    Ｋ    Ａ    Ｎ    Ｋ    Ｒ    Ｋ    Ｖ    Ａ    Ｋ    Ｅ    Ｓ    Ｖ    Ｖ    Ｄ    Ａ    Ｓ    Ｅ    Ｓ    Ｄ    Ｌ    Ｄ    Ｓ    Ｓ    Ｍ    Ｑ    Ｓ    Ａ    Ｄ    Ｅ    Ｓ    Ｔ    Ｐ    Ｑ    Ｐ    Ｌ    Ｋ    Ａ    Ｎ    Ｑ    Ｋ    Ｐ    Ｆ    Ｆ    Ｐ    Ｋ    Ｖ    Ｆ    Ｋ    Ｋ    Ｉ    Ｋ    Ｄ    Ａ    Ｇ    Ｋ    Ｗ    Ｖ    Ｒ    Ｄ    Ｋ    Ｉ    Ｄ    Ｅ    Ｎ    Ｐ    Ｅ    Ｖ    Ｋ    Ｋ    Ａ    Ｉ    Ｖ    Ｄ    Ｋ    Ｓ    Ａ    Ｇ    Ｌ    Ｉ    Ｄ    Ｑ    Ｌ    Ｌ    Ｔ    Ｋ    Ｋ    Ｋ    Ｓ    Ｅ    Ｅ    Ｖ    Ｎ    Ａ    Ｓ    Ｄ    Ｆ    Ｐ    Ｐ    Ｐ    Ｐ    Ｔ    Ｄ    Ｅ    Ｅ    Ｌ    Ｒ    Ｌ    Ａ    Ｌ    Ｐ    Ｅ    Ｔ    Ｐ    Ｍ    Ｌ    Ｌ    Ｇ    Ｆ    Ｎ    Ａ    Ｐ    Ｔ    Ｐ    Ｓ    Ｅ    Ｐ    Ｓ    Ｓ    Ｆ    Ｅ    Ｆ    Ｐ    Ｐ    Ｐ    Ｐ    Ｔ    Ｄ    Ｅ    Ｅ    Ｌ    Ｒ    Ｌ    Ａ    Ｌ    Ｐ    Ｅ    Ｔ    Ｐ    Ｍ    Ｌ    Ｌ    Ｇ    Ｆ    Ｎ    Ａ    Ｐ    Ａ    Ｔ    Ｓ    Ｅ    Ｐ    Ｓ    Ｓ    Ｆ    Ｅ    Ｆ    Ｐ    Ｐ    Ｐ    Ｐ    Ｔ    Ｅ    Ｄ    Ｅ    Ｌ    Ｅ    Ｉ    Ｍ    Ｒ    Ｅ    Ｔ    Ａ    Ｐ    Ｓ    Ｌ    Ｄ    Ｓ    Ｓ    Ｆ    Ｔ    Ｓ    Ｇ    Ｄ    Ｌ    Ａ    Ｓ    Ｌ    Ｒ    Ｓ    Ａ    Ｉ    Ｎ    Ｒ    Ｈ    Ｓ    Ｅ    Ｎ    Ｆ    Ｓ    Ｄ    Ｆ    Ｐ    Ｌ    Ｉ    Ｐ    Ｔ    Ｅ    Ｅ    Ｅ    Ｌ    Ｎ    Ｇ    Ｒ    Ｇ    Ｇ    Ｒ    Ｐ    Ｔ    Ｓ    Ｅ  （配列番号：１７）。別の実施形態では、配列番号：１７に示される切断ＡｃｔＡはＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ４と呼ばれる。別の実施形態では、この切断ＡｃｔＡは、最初の３０個から完全長のＡｃｔＡ配列のアミノ酸３９９までを含む。別の実施形態では、配列番号：２５は、最初の３０個から完全長のＡｃｔＡ配列のアミノ酸３９９までを含む。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡは、最初の３０個から配列番号：７のアミノ酸３９９までを含む。別の実施形態では、配列番号：１７は、最初の３０個から配列番号：７のアミノ酸３９９までを含む。
【００８０】
別の実施形態では、本明細書に開示された切断ＡｃｔＡ配列はＮ末端においてｈｌｙシグナルペプチドにさらに融合される。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡは配列番号：１８を含むｈｌｙシグナルペプチドに融合される
【００８１】
Ｍ    Ｋ    Ｋ    Ｉ    Ｍ    Ｌ    Ｖ    Ｆ    Ｉ    Ｔ    Ｌ    Ｉ    Ｌ    Ｖ    Ｓ    Ｌ    Ｐ    Ｉ    Ａ    Ｑ    Ｑ    Ｔ    Ｅ    Ａ    Ｓ    Ｒ    Ａ    Ｔ    Ｄ    Ｓ    Ｅ    Ｄ    Ｓ    Ｓ    Ｌ    Ｎ    Ｔ    Ｄ    Ｅ    Ｗ    Ｅ    Ｅ    Ｅ    Ｋ    Ｔ    Ｅ    Ｅ    Ｑ    Ｐ    Ｓ    Ｅ    Ｖ    Ｎ    Ｔ    Ｇ    Ｐ    Ｒ    Ｙ    Ｅ    Ｔ    Ａ    Ｒ    Ｅ    Ｖ    Ｓ    Ｓ    Ｒ    Ｄ    Ｉ    Ｅ    Ｅ    Ｌ    Ｅ    Ｋ    Ｓ    Ｎ    Ｋ    Ｖ    Ｋ    Ｎ    Ｔ    Ｎ    Ｋ    Ａ    Ｄ    Ｌ    Ｉ    Ａ    Ｍ    Ｌ    Ｋ    Ａ    Ｋ    Ａ    Ｅ    Ｋ    Ｇ    Ｐ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｎ    Ｇ    Ｅ    Ｑ    Ｔ    Ｇ    Ｎ    Ｖ    Ａ    Ｉ    Ｎ    Ｅ    Ｅ    Ａ    Ｓ    Ｇ    Ｖ    Ｄ    Ｒ    Ｐ    Ｔ    Ｌ    Ｑ    Ｖ    Ｅ    Ｒ    Ｒ    Ｈ    Ｐ    Ｇ    Ｌ    Ｓ    Ｓ  Ｄ  Ｓ    Ａ    Ａ    Ｅ    Ｉ    Ｋ    Ｋ    Ｒ    Ｒ    Ｋ    Ａ    Ｉ    Ａ    Ｓ    Ｓ    Ｄ    Ｓ    Ｅ    Ｌ    Ｅ    Ｓ    Ｌ    Ｔ  Ｙ    Ｐ    Ｄ    Ｋ    Ｐ    Ｔ    Ｋ    Ａ    Ｎ    Ｋ    Ｒ    Ｋ    Ｖ  Ａ    Ｋ    Ｅ    Ｓ    Ｖ    Ｖ    Ｄ    Ａ    Ｓ    Ｅ    Ｓ    Ｄ    Ｌ    Ｄ    Ｓ    Ｓ    Ｍ    Ｑ    Ｓ    Ａ    Ｄ    Ｅ    Ｓ    Ｔ    Ｐ    Ｑ    Ｐ    Ｌ    Ｋ    Ａ    Ｎ    Ｑ    Ｋ    Ｐ    Ｆ    Ｆ    Ｐ    Ｋ    Ｖ    Ｆ    Ｋ    Ｋ    Ｉ    Ｋ    Ｄ    Ａ    Ｇ    Ｋ    Ｗ    Ｖ    Ｒ    Ｄ    Ｋ．  別の実施形態では、配列番号：１８に示される切断ＡｃｔＡは「ＬＡ２２９」と呼ばれる。
【００８２】
別の実施形態では、ｈｌｙシグナルペプチドに融合された切断ＡｃｔＡは、配列番号：１９を含む配列によってコードされるＡｔｇａａａａａａａｔａａｔｇｃｔａｇｔｔｔｔｔａｔｔａｃａｃｔｔａｔａｔｔａｇｔｔａｇｔｃｔａｃｃａａｔｔｇｃｇｃａａｃａａａｃｔｇａａｇｃａｔｃｔａｇａｇｃｇａｃａｇａｔａｇｃｇａａｇａｔｔｃｃａｇｔｃｔａａａｃａｃａｇａｔｇａａｔｇｇｇａａｇａａｇａａａａａａｃａｇａａｇａｇｃａｇｃｃａａｇｃｇａｇｇｔａａａｔａｃｇｇｇａｃｃａａｇａｔａｃｇａａａｃｔｇｃａｃｇｔｇａａｇｔａａｇｔｔｃａｃｇｔｇａｔａｔｔｇａｇｇａａｃｔａｇａａａａａｔｃｇａａｔａａａｇｔｇａａａａａｔａｃｇａａｃａａａｇｃａｇａｃｃｔａａｔａｇｃａａｔｇｔｔｇａａａｇｃａａａａｇｃａｇａｇａａａｇｇｔｃｃｇａａｔａａｃａａｔａａｔａａｃａａｃｇｇｔｇａｇｃａａａｃａｇｇａａａｔｇｔｇｇｃｔａｔａａａｔｇａａｇａｇｇｃｔｔｃａｇｇａｇｔｃｇａｃｃｇａｃｃａａｃｔｃｔｇｃａａｇｔｇｇａｇｃｇｔｃｇｔｃａｔｃｃａｇｇｔｃｔｇｔｃａｔｃｇｇａｔａｇｃｇｃａｇｃｇｇａａａｔｔａａａａａａａｇａａｇａａａａｇｃｃａｔａｇｃｇｔｃｇｔｃｇｇａｔａｇｔｇａｇｃｔｔｇａａａｇｃｃｔｔａｃｔｔａｔｃｃａｇａｔａａａｃｃａａｃａａａａｇｃａａａｔａａｇａｇａａａａｇｔｇｇｃｇａａａｇａｇｔｃａｇｔｔｇｔｇｇａｔｇｃｔｔｃｔｇａａａｇｔｇａｃｔｔａｇａｔｔｃｔａｇｃａｔｇｃａｇｔｃａｇｃａｇａｃｇａｇｔｃｔａｃａｃｃａｃａａｃｃｔｔｔａａａａｇｃａａａｔｃａａａａａｃｃａｔｔｔｔｔｃｃｃｔａａａｇｔａｔｔｔａａａａａａａｔａａａａｇａｔｇｃｇｇｇｇａａａｔｇｇｇｔａｃｇｔｇａｔａａａ  （配列番号：１９）。別の実施形態では、配列番号：１９は、ＸｂａＩに対して特有の制限酵素部位を作製するために使用されるリンカー領域（太字、斜字体のテキストを参照のこと）をコードする配列を含み、これによりシグナル配列の後に異なるポリペプチド、異種抗原等をクローンすることができる。よって、リンカー領域がシグナルペプチド分割する前にシグナルペプチダーゼが配列上で作用することが当業者によって理解されるであろう。
【００８３】
別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質をコードする組み換え型ヌクレオチドは、配列番号：２０に示される配列を含む
ａｔｇｃｇｔｇｃｇａｔｇａｔｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃａｔｔａｃｔｇｃｃａａｔｔｇｃａｔｔａｃｇａｔｔａａｃｃｃｃｇａｃａｔａａｔａｔｔｔｇｃａｇｃｇａｃａｇａｔａｇｃｇａａｇａｔｔｃｔａｇｔｃｔａａａｃａｃａｇａｔｇａａｔｇｇｇａａｇａａｇａａａａａａｃａｇａａｇａｇｃａａｃｃａａｇｃｇａｇｇｔａａａｔａｃｇｇｇａｃｃａａｇａｔａｃｇａａａｃｔｇｃａｃｇｔｇａａｇｔａａｇｔｔｃａｃｇｔｇａｔａｔｔａａａｇａａｃｔａｇａａａａａｔｃｇａａｔａａａｇｔｇａｇａａａｔａｃｇａａｃａａａｇｃａｇａｃｃｔａａｔａｇｃａａｔｇｔｔｇａａａｇａａａａａｇｃａｇａａａａａｇｇｔｃｃａａａｔａｔｃａａｔａａｔａａｃａａｃａｇｔｇａａｃａａａｃｔｇａｇａａｔｇｃｇｇｃｔａｔａａａｔｇａａｇａｇｇｃｔｔｃａｇｇａｇｃｃｇａｃｃｇａｃｃａｇｃｔａｔａｃａａｇｔｇｇａｇｃｇｔｃｇｔｃａｔｃｃａｇｇａｔｔｇｃｃａｔｃｇｇａｔａｇｃｇｃａｇｃｇｇａａａｔｔａａａａａａａｇａａｇｇａａａｇｃｃａｔａｇｃａｔｃａｔｃｇｇａｔａｇｔｇａｇｃｔｔｇａａａｇｃｃｔｔａｃｔｔａｔｃｃｇｇａｔａａａｃｃａａｃａａａａｇｔａａａｔａａｇａａａａａａｇｔｇｇｃｇａａａｇａｇｔｃａｇｔｔｇｃｇｇａｔｇｃｔｔｃｔｇａａａｇｔｇａｃｔｔａｇａｔｔｃｔａｇｃａｔｇｃａｇｔｃａｇｃａｇａｔｇａｇｔｃｔｔｃａｃｃａｃａａｃｃｔｔｔａａａａｇｃａａａｃｃａａｃａａｃｃａｔｔｔｔｔｃｃｃｔａａａｇｔａｔｔｔａａａａａａａｔａａａａｇａｔｇｃｇｇｇｇａａａｔｇｇｇｔａｃｇｔｇａｔａａａａｔｃｇａｃｇａａａａｔｃｃｔｇａａｇｔａａａｇａａａｇｃｇａｔｔｇｔｔｇａｔａａａａｇｔｇｃａｇｇｇｔｔａａｔｔｇａｃｃａａｔｔａｔｔａａｃｃａａａａａｇａａａａｇｔｇａａｇａｇｇｔａａａｔｇｃｔｔｃｇｇａｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃａｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃａｇａａｃｃｇａｇｃｔｃａｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃｇｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃｇｇａａｃｃｇａｇｃｔｃｇｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃｇｃｃｔｃｃａａｃａｇａａｇａｔｇａａｃｔａｇａａａｔｃａｔｃｃｇｇｇａａａｃａｇｃａｔｃｃｔｃｇｃｔａｇａｔｔｃｔａｇｔｔｔｔａｃａａｇａｇｇｇｇａｔｔｔａｇｃｔａｇｔｔｔｇａｇａａａｔｇｃｔａｔｔａａｔｃｇｃｃａｔａｇｔｃａａａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｔｔｔｃｃｃａｃｃａａｔｃｃｃａａｃａｇａａｇａａｇａｇｔｔｇａａｃｇｇｇａｇａｇｇｃｇｇｔａｇａｃｃａ（配列番号：２０）。
【００８４】
別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは配列番号：１８に示される配列を有する。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする他の配列を含む。
【００８５】
別の実施形態では、「切断ＡｃｔＡ」、「Ｎ末端ＡｃｔＡ」、または「ΔＡｃｔＡ」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、ＰＥＳＴドメインを含むＡｃｔＡの断片を指す。別の実施形態では、これらの用語はＰＥＳＴ配列を含むＡｃｔＡ断片を指す。別の実施形態では、この用語はＡｃｔＡタンパク質の免疫原性断片を指す。別の実施形態では、この用語は、本明細書に開示される配列番号：８〜１８によってコードされる切断ＡｃｔＡ断片を指す。
【００８６】
一実施形態では、本発明の方法および組成物のＮ末端ＡｃｔＡタンパク質断片は配列番号：８〜１８から選択される配列を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はＡｃｔＡシグナルペプチドを含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は配列番号：８〜１８から選択される配列からほぼ構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は配列番号：８〜１８から選択される配列から本質的に構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は配列番号：８〜１８から選択される配列に対応する。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は配列番号：８〜１８から選択される配列と相同である。
【００８７】
別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、原核生物に由来する別のＰＥＳＴ  ＡＡ配列である。ＰＥＳＴ  ＡＡ配列は、当該技術分野で既知の他のＰＥＳＴ配列であってもよい。
【００８８】
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はＡｃｔＡタンパク質のおよそ最初の１００  ＡＡから構成される。
【００８９】
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２９から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜７５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜１００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜１２５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜１５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜１７５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２２５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２７５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜３００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜３２５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜３３８から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜３５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜３７５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜４００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜４５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜５００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜５５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜６００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜６３９から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜１００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜１２５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜１５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜１７５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜２００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜２２５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜２５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜２７５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜３００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜３２５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜３３８から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜３５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜３７５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜４００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜４５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜５００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜５５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜６００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜６０４から構成される。
【００９０】
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は上記のＡＡ範囲のうちの１つに対応する相同ＡｃｔＡタンパク質の残基を含有する。別の実施形態では、残基番号は上記に列挙した残基番号と必ずしも正確に対応する必要はなく、例えば、相同ＡｃｔＡタンパク質が本明細書で利用されるＡｃｔＡタンパク質に対して挿入または欠失を有する場合、残基番号を適宜調節することができる。他のＡｃｔＡ断片が当該技術分野で既知である。
【００９１】
別の実施形態では、相同ＡｃｔＡは、ＡｃｔＡ配列（例えば、配列番号：５、７〜１８のうちの１つ）に対する同一性が７０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同ＡｃｔＡは、配列番号：５、７〜１８のうちの１つに対する同一性が７２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７〜１８のうちの１つに対する同一性が７５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７〜１８のうちの１つに対する同一性が７８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７〜１８のうちの１つに対する同一性が８０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７〜１８のうちの１つに対する同一性が８２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７〜１８のうちの１つに対する同一性が８３％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７〜１８のうちの１つに対する同一性が８５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７〜１８のうちの１つに対する同一性が８７％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７〜１８のうちの１つに対する同一性が８８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７〜１８のうちの１つに対する同一性が９０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７〜１８のうちの１つに対する同一性が９２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７〜１８のうちの１つに対する同一性が９３％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７〜１８のうちの１つに対する同一性が９５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７〜１８のうちの１つに対する同一性が９６％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７〜１８のうちの１つに対する同一性が９７％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７〜１８のうちの１つに対する同一性が９８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７〜１８のうちの１つに対する同一性が９９％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：５、７〜１８のうちの１つに対する同一性が１００％であることを指す。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「相同性」という用語は、本明細書に開示された任意の核酸配列を参照するとき、対応する未変性核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセンテージを指す。
【００９３】
当該技術分野において適切に記述される方法によって、相同性は配列アライメントに対してコンピューターアルゴリズムによって決定されてもよい。例えば、核酸配列相同性のコンピューターアルゴリズム解析は入手可能な任意の数のソフトウェアパッケージの利用を含む場合があり、これらは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＤＯＭＡＩＮ、ＢＥＡＵＴＹ（ＢＬＡＳＴ増強アラインメントユーティリティ）、ＧＥＮＰＥＰＴ、およびＴＲＥＭＢＬパッケージなどである。
【００９４】
別の実施形態では、「相同性」は本明細書に開示された配列から選択された配列との同一性が６８％より大きいことを指す。別の実施形態では、「相同性」は本明細書に開示された配列から選択された配列との同一性が７０％より大きいことを指す。別の実施形態では、「相同性」は本明細書に開示された配列から選択された配列との同一性が７２％より大きいことを指す。別の実施形態では、同一性は７５％より大きい。別の実施形態では、同一性は７８％より大きい。別の実施形態では、同一性は８０％より大きい。別の実施形態では、同一性は８２％より大きい。別の実施形態では、同一性は８３％より大きい。別の実施形態では、同一性は８５％より大きい。別の実施形態では、同一性は８７％より大きい。別の実施形態では、同一性は８８％より大きい。別の実施形態では、同一性は９０％より大きい。別の実施形態では、同一性は９２％より大きい。別の実施形態では、同一性は９３％より大きい。別の実施形態では、同一性は９５％より大きい。別の実施形態では、同一性は９６％より大きい。別の実施形態では、同一性は９７％より大きい。別の実施形態では、同一性は９８％より大きい。別の実施形態では、同一性は９９％より大きい。別の実施形態では、同一性は１００％である。
【００９５】
別の実施形態では、本開示のＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはその断片は、正確に本明細書に示される配列通りに示される必要はないが、本明細書のどこかに示されるＬＬＯまたはＡｃｔＡタンパク質の機能的な特徴を保持する他の改変、修飾、または変更を行うことができる。別の実施形態では、本開示はＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはその断片の類似体を利用する。別の実施形態では、保存ＡＡ配列の差異によって、または配列に影響しない修飾によって、または両方によって、類似体は自然発生したタンパク質またはペプチドとは異なる。
【００９６】
別の実施形態では、相同性は、候補配列ハイブリダイゼーションの決定を介し決定され、その方法は当業者によりよく記述されている（例えば、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”  Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．  Ｊ．，  Ｅｄｓ．（１９８５）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．；  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎ．Ｙを参照）。例えば、ハイブリダイゼーションの方法は、ネイティブカスパーゼペプチドをコードするＤＮＡの補体に対して中程度からストリンジェントな条件下で実行される場合がある。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、１０〜２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍＬの変性断片化サケ精子ＤＮＡを含む溶液中４２℃にて一晩のインキュベーションである。
【００９７】
一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリアは、ファゴリソソームを避ける能力を有する。
【００９８】
一実施形態では、異種抗原またはその抗原性部分をコードする核酸配列は、リステリア染色体内にフレーム内で統合される。別の実施形態では、異種抗原をコードする統合核酸配列は、ＡｃｔＡを持つフレーム内のＡｃｔＡ遺伝子座にて統合される。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードする染色体の核酸は、抗原をコードする配列を含む核酸分子によって置き換えられる。別の実施形態では、抗原は本明細書に開示されており、かつ当該技術分野で既知の任意の抗原である。
【００９９】
一実施形態では、本明細書に開示される第２の核酸分子または構築体は代謝酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む。別の実施形態では、代謝酵素は、組み換え型リステリア株の染色体内で突然変異した内因性遺伝子を相補する。別の実施形態では、代謝酵素は、組み換え型リステリア株の染色体を欠いている内因性遺伝子を相補する。別の実施形態では、オープンリーディングフレームによってコードされる代謝酵素はアラニン・ラセマーゼ酵素（ｄａｌ）である。別の実施形態では、オープンリーディングフレームによってコードされる代謝酵素はＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素（ｄａｔ）である。別の実施形態では、本明細書に開示されたリステリア株は内因性ｄａｌ／ｄａｔ遺伝子内の突然変異を含む。別の実施形態では、リステリアはｄａｌ／ｄａｔ遺伝子を欠いている。
【０１００】
別の実施形態では、本開示の方法および組成物の核酸分子は、プロモーター／調節性配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、本開示の方法および組成物のオープンリーディングフレームは、プロモーター／調節性配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、本明細書に開示されるオープンリーディングフレームの各々はプロモーター／調節性配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、本明細書に開示されるオープンリーディングフレームの各々の発現は単一のプロモーター／調節性配列から駆動される。
【０１０１】
一実施形態では、ｈｌｙプロモーターおよびｈｌｙシグナル配列は、本明細書に開示されるキメラタンパク質の発現を駆動するように動作可能にリンクする。別の実施形態では、ａｃｔＡプロモーターおよびａｃｔＡシグナル配列は本明細書に記述されるキメラタンパク質の発現を駆動するように動作可能にリンクする。
【０１０２】
「代謝酵素」は、宿主細菌によって要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌によって要求される栄養素の合成のために要求される酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌によって利用される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌の増殖の保持のために要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この酵素は栄養素の合成のために要求される。
【０１０３】
別の実施形態では、組み換え型リステリアは、弱毒化栄養要求性株である。
【０１０４】
一実施形態では、弱毒化株は、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）である。別の実施形態では、弱毒化株は、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）ΔａｃｔＡ（ＬｍｄｄＡ）である。ＬｍｄｄＡは、リステリアワクチンベクターに基づき、これは病毒性遺伝子ａｃｔＡの欠失に起因して弱毒化され、かつインビボおよびインビトロで、ｄａｌ遺伝子の相補によってプラスミドの発現を保持する。
【０１０５】
別の実施形態では、弱毒化株はＬｍｄｄＡである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍΔａｃｔＡである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍΔｐｒｆＡである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍΔｐｌｃＢである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍΔｐｌｃＡである。別の実施形態では、株は上述の株のいずれかの二重変異体または三重変異体である。別の実施形態では、この株は、リステリアベースのワクチンの先天的な特性である強いアジュバント効果を発揮する。別の実施形態では、この株はＥＧＤリステリアバックボーンから作られる。別の実施形態では、本開示で使用される株はゲノムの溶血性ＬＬＯを発現するリステリア株である。
【０１０６】
別の実施形態では、リステリア株は、栄養要求性突然変異体である。別の実施形態では、リステリア株はビタミン合成遺伝子をコードする遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はパントテン酸シンターゼをコードする遺伝子が欠損している。
【０１０７】
一実施形態では、リステリア株はアミノ酸（ＡＡ）代謝酵素が欠損している。一実施形態では、Ｄ−アラニンを欠損したリステリアの栄養要求性株の生成は、例えば、欠失突然変異生成、挿入突然変異生成、およびフレームシフト突然変異の発生の結果として生じる突然変異生成、タンパク質の中途終始を生じる突然変異、または遺伝子発現に影響を与える調節性配列の突然変異を含む、当業者には周知の数多くの方法で達成されうる。別の実施形態では、組み換え型ＤＮＡ技法を使用して、または変異原性化学薬品もしくは放射、およびそれに続く突然変異体の選択を使用する従来の突然変異生成技術を使用して突然変異生成を達成することができる。別の実施形態では、栄養要求性表現型の復帰をともなう可能性が低いため、欠失変異体が好ましい。別の実施形態では、本明細書に提示されるプロトコルに従って生成されるＤ−アラニンの変異体は、単純な実験室の培養アッセイでＤ−アラニンの非存在下で成長する能力を試験される場合がある。別の実施形態では、この化合物の非存在下で成長することができない変異体がさらなる研究のために選択される。
【０１０８】
別の実施形態では、本明細書に開示されるとおり、リステリアの突然変異生成のための標的として上述のＤ−アラニンに関連する遺伝子に加えて、代謝酵素の合成に関与する他の遺伝子が使用されてもよい。
【０１０９】
別の実施形態では、代謝酵素は、組み換え型細菌株の染色体の残りのものに欠けている内在性代謝遺伝子を相補する。一実施形態では、内在性代謝遺伝子は、染色体内で突然変異する。別の実施形態では、内在性代謝遺伝子は染色体から欠失される。別の実施形態では、代謝酵素はアミノ酸代謝酵素である。別の実施形態では、代謝酵素は組み換え型リステリア株内で細胞壁合成のために使用されるアミノ酸の形成を触媒する。別の実施形態では、代謝酵素はアラニン・ラセマーゼ酵素である。別の実施形態では、代謝酵素はＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。
【０１１０】
一実施形態では、栄養要求性リステリア株は、栄養要求性リステリア株の栄養要求性を相補する代謝酵素を含むエピソームの発現ベクターを含む。別の実施形態では、構成物はエピソームの様式でリステリア株内に含有される。別の実施形態では、外来抗原またはペプチドは組み換え型リステリア株が抱えるベクターから発現される。別の実施形態では、エピソームの発現ベクターは抗生物質耐性マーカーを欠いている。別の実施形態では、リステリア株はＤグルタミン酸シンターゼ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はｄａｔ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はｄａｌ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はｄｇａ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株は、ジアミノピメリン酸の合成に関与する遺伝子が欠損している。ＣｙｓＫ。別の実施形態では、遺伝子はビタミンＢ１２に依存しないメチオニンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｐＡである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｐＢである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｐＥである。別の実施形態では、遺伝子はａｓｎＢである。別の実施形態では、遺伝子はｇｌｔＤである。別の実施形態では、遺伝子はｇｌｔＢである。別の実施形態では、遺伝子はｌｅｕＡである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｇＧである。別の実施形態では、遺伝子はｔｈｒＣである。別の実施形態では、リステリア株は上述の遺伝子のうちの１つ以上が欠損している。
【０１１１】
別の実施形態では、リステリア株はシンターゼ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、遺伝子は、ＡＡ合成遺伝子である。別の実施形態では、遺伝子は、ｆｏｌＰである。別の実施形態では、遺伝子はジヒドロウリジンシンターゼファミリータンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＤである。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＦである。別の実施形態では、遺伝子はホスホエノールピルビン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｈｉｓＦである。別の実施形態では、遺伝子はｈｉｓＨである。別の実施形態では、遺伝子はｆｌｉＩである。別の実施形態では、遺伝子はリボソームの大型サブユニットシュードウリジンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＤである。別の実施形態では、遺伝子は二機能性ＧＭＰシンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はｃｏｂＳである。別の実施形態では、遺伝子はｃｏｂＢである。別の実施形態では、遺伝子はｃｂｉＤである。別の実施形態では、遺伝子はウロポルフィリン−ＩＩＩＣ−メチルトランスフェラーゼ／ウロポルフィリノゲン−ＩＩＩシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｃｏｂＱである。別の実施形態では、遺伝子はｕｐｐＳである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｕＢである。別の実施形態では、遺伝子はｄｘｓである。別の実施形態では、遺伝子はｍｖａＳである。別の実施形態では、遺伝子はｄａｐＡである。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＧである。別の実施形態では、遺伝子はｆｏｌＣである。別の実施形態では、遺伝子は、クエン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｇＪである。別の実施形態では、遺伝子は３−デオキシ−７−ホスホヘプツロン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はインドール−３−グリセロール−リン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はアントラニル酸シンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼ構成成分である。別の実施形態では、遺伝子はｍｅｎＢである。別の実施形態では、遺伝子はメナキノン特異的イソコリスミ酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼＩまたはＩＩである。別の実施形態では、遺伝子はホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミドシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｃａｒＢである。別の実施形態では、遺伝子はｃａｒＡである。別の実施形態では、遺伝子はｔｈｙＡである。別の実施形態では、遺伝子はｍｇｓＡである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＢである。別の実施形態では、遺伝子はｈｅｐＢである。別の実施形態では、遺伝子はｒｌｕＢである。別の実施形態では、遺伝子はｉｌｖＢである。別の実施形態では、遺伝子はｉｌｖＮである。別の実施形態では、遺伝子はａｌｓＳである。別の実施形態では、遺伝子はｆａｂＦである。別の実施形態では、遺伝子はｆａｂＨである。別の実施形態では、遺伝子はシュードウリジンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｐｙｒＧである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｕＡである。別の実施形態では、遺伝子はｐａｂＢである。別の実施形態では、遺伝子はａｔｐシンターゼ遺伝子（例えば、ａｔｐＣ、ａｔｐＤ−２、ａｐｔＧ、ａｔｐＡ−２、等々）である。
【０１１２】
別の実施形態では、遺伝子はｐｈｏＰである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＡである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＣである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＤである。別の実施形態では、遺伝子はｐｌｃＢである。
【０１１３】
別の実施形態では、リステリア株はペプチド輸送体が欠損している。別の実施形態では、遺伝子はＡＢＣ輸送体／ＡＴＰ結合／パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はオリゴペプチドＡＢＣ輸送体／オリゴペプチド結合タンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はオリゴペプチドＡＢＣ輸送体／パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子は亜鉛ＡＢＣ輸送体／亜鉛結合タンパク質である。別の実施形態では、遺伝子は糖ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はリン酸輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＺＩＰ亜鉛輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＥｍｒＢ／ＱａｃＡファミリーの薬剤耐性輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は硫酸塩輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はプロトン依存性オリゴペプチド輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマグネシウム輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は蟻酸塩／亜硝酸塩輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はスペルミジン／プトレシンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＮａ／Ｐｉ共輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は糖リン酸輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はグルタミンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はメジャーファシリテイターファミリー輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はグリシンベタイン／Ｌ−プロリンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はモリブデンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はテイコ酸ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はコバルトＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はアンモニウム輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はアミノ酸ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は細胞分裂ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマンガンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は鉄化合物ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマルトース／マルトデキストリンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＢｃｒ／ＣｆｌＡファミリーの薬剤耐性輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は上記のタンパク質のうちの１つのサブユニットである。
【０１１４】
一実施形態では、組み換え型リステリアに到達するために、リステリアを形質転換するために使用される核酸分子が本明細書に開示されている。別の実施形態では、リステリアを形質転換するために使用される本明細書に開示される核酸は病毒性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、核酸分子はリステリアゲノムの中へと組み込まれ、非機能性病毒性遺伝子を担持する。別の実施形態では、病毒性遺伝子は組み換え型リステリア内で突然変異する。さらに別の実施形態では、核酸分子はリステリアゲノム内に存在する内因性の遺伝子を不活性化するために使用される。また別の実施形態では、病毒性遺伝子は、ａｃｔＡ遺伝子、ｉｎｌＡ遺伝子、ならびにｉｎｌＢ遺伝子、ｉｎｌＣ遺伝子、ｉｎｌＪ遺伝子、ｐｌｂＣ遺伝子、ｂｓｈ遺伝子、またはｐｒｆＡ遺伝子である。病毒性遺伝子は、組み換え型リステリア内で、病毒性と関連付けられる当該技術分野で既知の任意の遺伝子とすることができることが当業者によって理解されるべきである。
【０１１５】
また別の実施形態では、リステリア株は、ｉｎｌＡ突然変異体、ｉｎｌＢ突然変異体、ｉｎｌＣ突然変異体、ｉｎｌＪ突然変異体、ｐｒｆＡ突然変異体、ａｃｔＡ突然変異体、ｄａｌ／ｄａｔ突然変異体、ｐｌｃＢ欠失突然変異体、またはｐｌｃＡおよびｐｌｃＢの両方を欠いている二重変異体である。別の実施形態では、リステリアはこれらの遺伝子の個別または組合せでの欠失または突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示されたリステリアは、各々遺伝子のうちの１つを欠いている。別の実施形態では、本明細書に開示されたリステリアは、ａｃｔＡ、ｐｒｆＡ、およびｄａｌ／ｄａｔ遺伝子を含む本明細書に開示されたいずれかの遺伝子のうちの少なくとも１個かつ最高１０個を欠いている。別の実施形態では、ｐｒｆＡ突然変異体はＤ１３３Ｖ  ＰｒｆＡ突然変異体である。
【０１１６】
一実施形態では、弱毒化生リステリアは、組み換え型リステリアである。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ゲノムインターナリンＣ（ｉｎｌＣ）遺伝子の突然変異または欠失を含む。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ゲノムａｃｔＡ遺伝子およびゲノムインターナリンＣ遺伝子の突然変異または欠失を含む。一実施形態では、リステリアの隣接するＴ細胞への転座は、プロセス中に関与するａｃｔＡ遺伝子および／またはｉｎｌＣ遺伝子の欠失によって阻害され、これはプロセスに関与するので、それによって、免疫原性の増加およびワクチンバックボーンとしての有用性によって結果として予想外に高いレベルの弱毒化が得られる。
【０１１７】
一実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子などが、リステリア株の染色体で欠けている。別の実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子等は、リステリア株のゲノムを欠いている。一実施形態では、病毒性遺伝子は、染色体内で突然変異する。別の実施形態では、病毒性遺伝子は染色体から欠失される。別の実施形態では、病毒性遺伝子は、染色体内で不活性化される。
【０１１８】
一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は弱毒化されている。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ａｃｔＡ病毒性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ｐｒｆＡ病毒性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、組み換え型リステリアはｉｎｌＢ遺伝子を欠いている。別の実施形態では、組み換え型リステリアはａｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子の両方を欠いている。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ａｃｔＡ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ｉｎｌＢ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ＡｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ＡｃｔＡおよびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ＡｃｔＡ、ｉｎｌＢおよびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ＡｃｔＡ、ｉｎｌＢおよびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ＡｃｔＡ、ｉｎｌＢおよびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は以下の遺伝子：ａｃｔＡ、ｄａｌ、ｄａｔ、ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣ、ｐｒｆＡ、ｐｌｃＡ、ｐｌｃＢのうちの任意の単一遺伝子または遺伝子の組み合わせの不活性化突然変異を含む。一実施形態では、「欠いている」という用語は、ゲノム病毒性遺伝子に関連するとき、病毒性遺伝子が欠失した（部分的もしくは全体的な欠失）、または別の方法で染色体から機能的に発現されていないことを意味する。かかる用語は、染色体内の病毒性遺伝子の部分的な欠失または遺伝子全体の欠失も包含する場合がある。
【０１１９】
「突然変異」という用語およびその文法的な同等物は、配列（核酸またはアミノ酸配列）に対する任意のタイプの突然変異または修飾を含み、これにはアミノ酸欠失突然変異、置換、置き換え、切断、不活性化、妨害、または転座を含むことを当業者は理解するであろう。突然変異のこれらのタイプは当該技術分野でよく知られている。
【０１２０】
一実施形態では、本明細書に開示された代謝酵素または相補する遺伝子をコードするプラスミドを含む栄養要求性細菌を選択するために、形質転換した栄養要求性細菌をアミノ酸代謝遺伝子または相補遺伝子の発現を選択する培地上で成長させる。別の実施形態では、Ｄ−グルタミン酸合成のための栄養要求性の細菌は、Ｄ−グルタミン酸合成のための遺伝子を含むプラスミドを用いて形質転換され、また栄養要求性細菌はＤ−グルタミン酸無しで増殖することになり、一方でＤ−グルタミン酸合成のためにプラスミドを用いて形質転換されていない栄養要求性細菌、またはタンパク質をコードするプラスミドを発現していない栄養要求性細菌は、増殖しないことになる。別の実施形態では、Ｄ−アラニン合成のための栄養要求性の細菌は、プラスミドがＤ−アラニン合成のためのアミノ酸代謝酵素をコードする孤立核酸を含む場合、本開示のプラスミドを形質転換し、かつ発現するときＤ−アラニン無しで増殖することになる。必要な増殖因子、サプリメント、アミノ酸、ビタミン、抗生物質、およびこれに類するものを含んでいる、または欠いている適切な培地を作成するためのかかる方法は当該技術分野で既知であり、また市販されている（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ）。
【０１２１】
別の実施形態では、本開示のプラスミドを含む栄養要求性細菌が一旦選択されると、この細菌は適切な培地上で選択圧の存在下で繁殖する。かかる繁殖は、栄養要求性因子を有しない培地内での細菌の増殖を含む。栄養要求性細菌内でのアミノ酸代謝酵素を発現するプラスミドの存在は、細菌とともにプラスミドの複製を確保し、したがって継続的にプラスミドが規制する細菌を選択する。本開示および本明細書の方法を備えるとき、プラスミドを含む栄養要求性細菌が増殖する培地の体積を調節することによって、当業者は、リステリアワクチンベクターの生産を容易にスケールアップすることができる。
【０１２２】
別の実施形態では、他の栄養要求性株および相補系が本発明の使用に適合されることを当業者は理解するであろう。
【０１２３】
一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は、本明細書に開示されたキメラタンパク質を発現する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株はキメラタンパク質をコードするプラスミドを含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型核酸は、本明細書に開示された組み換え型リステリア株のプラスミド中にある。別の実施形態では、プラスミドは、組み換え型リステリア株の染色体の中へと統合されないエピソーム性プラスミドである。別の実施形態では、プラスミドはマルチコピープラスミドである。別の実施形態では、プラスミドはリステリア株の染色体の中へと組み込まれる組み込みプラスミドである。
【０１２４】
一実施形態では、本明細書に開示される組み換え型リステリア株は、腫瘍関連１ペプチドをコードする核酸分子を含む。
【０１２５】
別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物の組み換え型リステリア株は、リステリアゲノムにオープンリーディングフレームとして内因性ＡｃｔＡ配列とともに動作可能に組み込まれる核酸分子を含む。別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物の組み換え型リステリア株は、アミノ末端上でユビキチンタンパク質に融合されるペプチド抗原を含むキメラタンパク質をコードする核酸分子を含むエピソーム性の発現ベクターを含む。一実施形態では、ペプチド抗原の発現および分泌は、ａｃｔＡプロモーターおよびＡｃｔＡシグナル配列制御下にあり、またこれはＡｃｔＡ（切断ＡｃｔＡまたはｔＡｃｔＡ）の１〜２３３アミノ酸への融合として発現される。別の実施形態では、ペプチド抗原の発現および分泌は、ａｃｔＡプロモーターおよびＡｃｔＡシグナル配列制御下にあり、またこれはＡｃｔＡ（切断ＡｃｔＡまたはｔＡｃｔＡ）の１〜１００アミノ酸への融合として発現される。別の実施形態では、ペプチド抗原の発現および分泌は、ａｃｔＡプロモーターおよびＡｃｔＡシグナル配列制御下にあり、またこれはＡｃｔＡ（切断ＡｃｔＡまたはｔＡｃｔＡ）の１〜３００アミノ酸への融合として発現される。別の実施形態では、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，６５５，２３８号に記述されるように、切断ＡｃｔＡは野生型ＡｃｔＡタンパク質の最初の３９０のアミノ酸から成る。別の実施形態では、米国特許公開第２０１４／０１８６３８７号に記述されるように、切断ＡｃｔＡは、ＡｃｔＡ−Ｎ１００またはその修正版（ＡｃｔＡ−Ｎ１００＊と称される）であり、この中でＰＥＳＴモチーフを欠失しており、非保存的なＱＤＮＫＲ置換を含有する。
【０１２６】
別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物の組み換え型リステリア株は、リステリアゲノムにオープンリーディングフレームとして内因性ＬＬＯ配列とともに動作可能に組み込まれる核酸分子を含む。別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物の組み換え型リステリア株は、アミノ末端上でユビキチンタンパク質に融合されるペプチド抗原を含むキメラタンパク質をコードする核酸分子を含むエピソーム性の発現ベクターを含む。一実施形態では、ペプチド抗原の発現および分泌は、ＬＬＯプロモーターおよびＬＬＯシグナル配列の制御下にあり、またこれはＬＬＯ（切断ＬＬＯまたはｔＬＬＯ）の１〜５０アミノ酸への融合として発現される。別の実施形態では、ペプチド抗原の発現および分泌は、ＬＬＯプロモーターおよびＬＬＯシグナル配列の制御下にあり、またこれはＬＬＯ（切断ＬＬＯまたはｔＬＬＯ）の１〜１００アミノ酸への融合として発現される。別の実施形態では、ペプチド抗原の発現および分泌は、ＬＬＯプロモーターおよびＬＬＯシグナル配列の制御下にあり、またこれはＬＬＯ（切断ＬＬＯまたはｔＬＬＯ）の１〜３００アミノ酸への融合として発現される。別の実施形態では、切断ＬＬＯは、野生型ＬＬＯの最初の４２０アミノ酸から成る。
【０１２７】
一実施形態では、無処置の動物、または無関連のリステリアワクチンを注射したマウスではＣＴＬ活性は検出されなかった。一方で、別の実施形態では、本明細書に開示されるキメラタンパク質を発現する弱毒化栄養要求性株は、ＩＦＮ−γの分泌を刺激することができ、かつ抗腫瘍免疫応答を引き出すことができる。
【０１２８】
別の実施形態では、リステリア株は、ペプチド抗原に対する耐性を破壊する能力を有する強くかつ抗原特異的な抗腫瘍応答を行使する。
【０１２９】
一実施形態では、免疫化したマウスの脾臓からより迅速に除去されるので、ｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ株は高度に弱毒化され、以前のリステリアワクチン世代より良好な安全性プロファイルを有する。別の実施形態では、リステリア株は、腫瘍内の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の著しい減少を生じる。別の実施形態では、ＬｍｄｄＡワクチンで処理した腫瘍内のＴｒｅｇのより低い頻度は、腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の増加をもたらし、ＬｍｄｄＡワクチンを用いた免疫化後により好ましい腫瘍の微小環境を得ることができることを示唆する。
【０１３０】
一実施形態では、「ペプチド抗原」という用語は、以下の用語、すなわち「抗原」、「抗原断片」、「抗原性ペプチド」、または「抗原ペプチド」と交換可能に使用される。「ペプチド抗原」という用語が、主要な組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子の状況で抗原提示細胞（ＡＰＣ）に提示される場合、免疫応答を引き出す能力を有する異種抗原またはその断片を包含することを当業者は理解するであろう。
【０１３１】
本明細書に列挙された任意のアミノ酸配列に対するタンパク質および／またはペプチド相同性は、一実施形態では、免疫ブロット解析を含む当該技術分野において適切に記述される方法によって、または確立された方法を介して利用可能な任意の数のソフトウェアパッケージを利用したアミノ酸配列のコンピューターアルゴリズム解析を介して決定される。これらのパッケージのうちのいくつかはＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＭＰｓｒｃｈ、またはＳｃａｎｐｓパッケージを含んでもよく、また例えば、スミス−ウォーターマンアルゴリズムの使用、および／または解析のための広範囲／局所的もしくはＢＬＯＣＫＳアラインメントを採用してもよい。
【０１３２】
別の実施形態では、本明細書に開示された構築体または核酸分子は相同的組み換えを使用してリステリア染色体の中へと組み込まれる。相同的組み換えのための技法は当該技術分野で周知であり、また例えば以下の文献に記述されている。Ｂａｌｏｇｌｕ  Ｓ、Ｂｏｙｌｅ  ＳＭ、ｅｔ  ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｔｏ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｅｉｔｈｅｒ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｐａｒｔｉａｌ  ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ  ｏｒ  Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｌ７／Ｌ１２  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００５，  １０９（１−２）：１１−７）；およびＪｉａｎｇ  ＬＬ，  Ｓｏｎｇ  ＨＨ，  ｅｔ  ａｌ．，  （Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｔｒａｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｓｉｎ  （Ｓｈａｎｇｈａｉ）  ２００５，  ３７（１）：１９−２４）。別の実施形態では、相同的組み換えを米国特許第６，８５５，３２０号に記述されるように実施した。この場合、Ｅ７を発現する組み換え型Ｌｍ株は、ｈｌｙプロモーターの制御下で、また遺伝子産物の分泌を確保するためにｈｌｙシグナル配列を含めることによって、Ｅ７遺伝子の染色体組み込みによって作成され、Ｌｍ−ＡＺ／Ｅ７と称される組み換え型を得る。別の実施形態では、温度感受性プラスミドは、組み換え型を選択するために使用される。
【０１３３】
別の実施形態では、構築体または核酸分子はトランスポゾン挿入を使用してリステリア染色体の中へと組み込まれる。トランスポゾン挿入の技法は当該技術分野で周知であり、とりわけ以下のＳｕｎらの文献  ＤＰ−Ｌ９６７の構造における（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９０，  ５８：  ３７７０−３７７８）に記載されている。トランスポゾン突然変異生成は、別の実施形態では、安定したゲノム挿入変異体を形成することができるという有利点を有するが、外来性遺伝子が挿入されるゲノム内の位置が未知であるという不利点を有する。
【０１３４】
別の実施形態では、構築体または核酸分子は、ファージ組み込み部位を使用してリステリアの染色体の中へと組み込まれる（Ｌａｕｅｒ  Ｐ，Ｃｈｏｗ  ＭＹ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈａｇｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２００２；１８４（１５）：４１７７−８６）。この方法のある特定の実施形態では、異種遺伝子を、ゲノム内の任意の適切な部位であってもよい、対応する付着部位（例えば、ｃｏｍＫまたはａｒｇ  ｔＲＮＡ遺伝子の３‘端）の中へとインサートするために、バクテリオファージ（例えば、Ｕ１５３またはＰＳＡリステリオファージ）のインテグラーゼ遺伝子および付着部位が使用される。別の実施形態では、内因性のプロファージは構築体または異種遺伝子組込の前に利用された付着部位から回復した。別の実施形態では、この方法は結果として単一コピー組み込み体をもたらす。別の実施形態では、本開示は、臨床用途のためのファージベースの染色体組み込み系をさらに含み、ここでｄ−アラニン・ラセマーゼを含むがこれに限定されない必須酵素のための栄養要求性である宿主株を使用することができ、例えば、Ｌｍｄａｌ（−）ｄａｔ（−）である。別の実施形態では、「ファージキュアリング工程」を避けるためにＰＳＡに基づくファージ組み込み系を使用する。別の実施形態では、これは組み込まれた遺伝子を維持するために抗生物質による継続的な選択を必要とする。したがって、別の実施形態では、本開示は、抗生物質を用いた選択を必要としないファージベースの染色体組み込み系の確立を可能にする。代わりに、栄養要求性宿主株を相補することができる。
【０１３５】
本明細書で開示される方法および組成物の一実施形態では、「組み換え部位」または「部位特異的な組み換え部位」という用語は、組み換え部位に隣接する核酸区分の交換または切除を媒介するリコンビナーゼによって（いくつかの事例では、関連するタンパク質とともに）識別される核酸分子内の塩基の配列を指す。リコンビナーゼおよび関連するタンパク質は「組み換え型タンパク質」と総称される（例えば、Ｌａｎｄｙ，Ａ．，（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）３：６９９−７０７；１９９３）を参照のこと）。
【０１３６】
「ベクター」という用語はプラスミドを包含しうることを当業者は理解するであろう。別の実施形態では、この用語は、リステリア宿主へと形質転換され、かつリステリアの染色体内に前記ベクターから成る遺伝子の発現を可能にするようにする様式で組み込まれる能力を有する組込み型ベクターを指す。別の実施形態では、この用語は、リステリアの染色体内に統合されないが、その代わりに前記リステリアの細胞質内に存在する非組込み型ベクターを指す。別の実施形態では、該用語は組込み型ベクターを含むプラスミドを指す。別の実施形態では、組込み型ベクターは部位特異的な組込み型ベクターである。
【０１３７】
本開示および本明細書に開示される方法が装備されたとき、異なる転写プロモーター、停止剤、キャリアベクター、または特異的な遺伝子配列（例えば、市販のクローニングベクター内のもの）を本発明の方法および組成物内で順調に使用することができることを当業者は容易に理解するであろう。本発明で意図されるように、これらの機能性は、例えば、ｐＵＣシリーズとして知られる市販のベクターで提供される。別の実施形態では、非必須ＤＮＡ配列（例えば、抗生物質抵抗性遺伝子）は除去される。別の実施形態では、本発明で市販のプラスミドが使用される。かかるプラスミドは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）などの様々な供給元から入手可能であり、または当該技術分野で周知の方法を使用して構築することができる。
【０１３８】
別の実施形態は、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）などのプラスミドであり、これは原核生物の複製起点および原核生物内での発現を容易にするプロモーター／調節要素を有する原核生物発現ベクターである。別の実施形態では、外来ヌクレオチド配列は、プラスミドのサイズを減少しかつその中に定置することができるカセットのサイズを増加するために除去される。
【０１３９】
かかる方法は当該技術分野で周知であり、また例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびＡｕｓｕｂｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記述されている。
【０１４０】
抗生物質抵抗性遺伝子は、分子生物学およびワクチン調製で一般的に採用される従来の選択およびクローニングプロセスで使用される。本開示で企図される抗生物質抵抗性遺伝子としては、アンピシリン、ペニシリン、メチシリン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール（ＣＡＴ）、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ゲンタマイシンおよび当該技術分野で周知の他のものに抵抗を与える遺伝子産物が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４１】
本開示で有用なプラスミドおよび他の発現ベクターは、本明細書のどこかに記述され、プロモーター／調節配列、グラム陰性およびグラム陽性細菌に対する複製の起点、融合タンパク質をコードする孤立核酸、および分離されたアミノ酸代謝遺伝子をコードする核酸などの特徴を含むことができる。さらに、融合タンパク質およびアミノ酸代謝遺伝子をコードする孤立核酸は、かかる孤立核酸の発現を駆動するのに好適なプロモーターを有する。細菌系で発現を駆動するために有用であるプロモーターは当該技術分野で周知であり、またバクテリオファージλ、ｐＢＲ３２２のβラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーター、およびｐＢＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターを含む。原核生物プロモーターのさらなる例として、５  バクテリオファージλの主要な右および左のプロモーター（ＰＬおよびＰＲ）、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｄ、および［２］Ｅ．  ｃｏｌｉ［３］のｇａｌプロモーター、αアミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９８５．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １６２：１７６−１８２）およびＢ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓのＳ２８特異的プロモーター（Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９８４  Ｇｅｎｅ  ３２：１１−  ２０）、Ｂａｃｉｌｌｕｓのバクテリオファージのプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，  １９８２，  Ｉｎ：  Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｉ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびストレプトミセスプロモーター（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，  １９８６，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２０３：４６８−４７８）が挙げられる。本開示において企図される追加的な原核生物プロモーターは、例えば、Ｇｌｉｃｋ（１９８７，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７７−２８２）、Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ，（１９８６，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，６８：５０５−５１６）、およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ，（１９８４，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−４４２）で概説されている。本開示で企図されるプロモーター／調節要素のさらなる実施例としては、リステリアのｐｒｆＡプロモーター、リステリアのｈｌｙプロモーター、リステリアのｐ６０プロモーター、およびリステリアのＡｃｔＡプロモーター（遺伝子銀行受入番号ＮＣ＿００３２１０）またはその断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
別の実施形態では、含む部分配列の方法および組成物のプラスミドは分割され、ならびに適切な部分配列は適切な制限酵素を使用してクローニングされる。別の実施形態では、次いで断片は連結され、望ましいＤＮＡ配列が生産される。別の実施形態では、抗原をコードするＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を使用して生産され、その技法は当該技術分野で周知である。
【０１４３】
「ファージ発現ベクター」または「ファージミド」とは、本明細書で開示されるような方法および組成物の核酸配列をインビトロまたはインビボで、任意の細胞（原核生物細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳類の細胞を含む）内で構造的にまたは誘導的に発現する目的の任意のファージベースの組み換え型発現系を指す。ファージ発現ベクターは、典型的には、細菌細胞内で再生すること、および適切な条件下でファージ粒子を生成することの両方を可能にすることができる。この用語は線形または円形の発現系を含み、またエピソームのまま、または宿主細胞ゲノムの中へと組込まれた両方のファージベースの発現ベクターを包含する。
【０１４４】
別の実施形態では、本開示は臨床用途のためのファージベースの染色体組込系をさらに含む。ｄ−アラニン・ラセマーゼ（しかしこれに限定されない）を含む必須酵素のための栄養要求性宿主株は、例えばＬｍｄａｌ（−）ｄａｔ（−）を使用されることになる。別の実施形態では、「ファージ治癒工程」を避けるためにＰＳＡベースのファージ組込系を使用した（Ｌａｕｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８４：４１７７−４１８６）。別の実施形態では、これは組み込まれた遺伝子を維持するために抗生物質による継続的な選択を必要とする。したがって、別の実施形態では、本開示は、抗生物質を用いた選択を必要としないファージベースの染色体組み込み系の確立を可能にする。別の方法で、栄養要求性宿主株を相補することになる。
【０１４５】
別の実施形態では、本開示のキメラタンパク質は、組み換え型ＤＮＡ法を使用して合成される。一実施形態では、これは、キメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列を作り出すことと、特定のプロモーター／調節要素の制御下で本発明のプラスミドなどの発現カセット内にＤＮＡを定置することと、タンパク質を発現することと、に関与する。別の実施形態では、本開示のキメラタンパク質（例えば、ＳＳ−Ｕｂ−ペプチド）をコードするＤＮＡは、任意の好適な方法によって調製され、この方法としては、例えば、適切な配列のクローニングおよび制限、またはＮａｒａｎｇらのホスホトリエステル法（１９７９，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ６８：  ９０−９９）、Ｂｒｏｗｎらのホスホジエステル法（１９７９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ  ６８：１０９−１５１）、Ｂｅａｕｃａｇｅらのジエチルホスホラミダイト法（１９８１，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１５  １８５９−１８６２）、および米国特許第４，４５８，０６６号の固定支持法などの方法による直接化学合成が挙げられる。
【０１４６】
別の実施形態では、本開示のキメラタンパク質または組み換え型タンパク質をコードするＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を使用してクローニングされる。別の実施形態では、一本鎖のオリゴヌクレオチドを生産するために化学合成が使用される。様々な実施形態では、一本鎖をテンプレートとして使用して、相補的な配列を用いたハイブリダイゼーションによって、またはＤＮＡポリメラーゼを用いた重合によって、この一本鎖のオリゴヌクレオチドを二本鎖のＤＮＡへと変換する。ＤＮＡの化学合成が約１００個の塩基の配列に限られ一方で、より短い配列の連結によってより長い配列を得ることができることを当業者は認識するであろう。別の実施形態では、部分配列はクローニングされ、また適切な部分配列は適切な制限酵素を使用して分割される。次いで断片は連結され、望ましいＤＮＡ配列が生産される。
【０１４７】
一実施形態では、本明細書に開示されるキメラタンパク質をコードする核酸配列は、大腸菌、リステリアなどの他の細菌宿主、酵母、および様々なより高度な真核生物細胞（ＣＯＳ、ＣＨＯおよびＨｅＬａ細胞株、ならびに骨髄腫細胞株などの）を含む様々な宿主細胞へと形質転換される。本明細書に開示されたキメラタンパク質をコードする核酸配列は、各々の宿主に対して適切な発現制御配列に動作可能にリンクされる。プロモーター／調節配列は、本明細書のいずれかに詳細に記述される。別の実施形態では、本明細書に開示されるキメラタンパク質をコードするプラスミドは、追加的なプロモーター調節要素、ならびにリボソーム結合部位および転写終結シグナルをさらに含む。真核生物細胞については、対照配列は、例えば、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルス、等々に由来するプロモーターおよびエンハンサー、およびポリアデニレーション配列を含む。別の実施形態では、配列はスプライスドナーおよびアクセプター配列を含む。
【０１４８】
一実施形態では、本明細書に開示されたプラスミドは、本明細書に開示されたように各々が異なるペプチド抗原を含む、少なくとも１つのキメラタンパク質をコードすることができるようにする、少なくとも１つのリボソーム結合部位および少なくとも１つの転写終止シグナルを含む。一実施形態では、本明細書に開示されたプラスミドは、本明細書に開示されたように各々が異なるペプチド抗原を含む、１つ〜４つのキメラタンパク質をコードすることができるようにする、１つ〜４つのリボソーム結合リボソーム結合部位および１つ〜４つの転写終止シグナルを含む。一実施形態では、本明細書に開示されたプラスミドは、本明細書に開示されたように各々が異なるペプチド抗原を含む、５〜１０個のキメラタンパク質をコードすることができるようにする、５〜１０個のリボソーム結合リボソーム結合部位および５〜１０個の転写終止シグナルを含む。一実施形態では、本明細書に開示されたプラスミドは、本明細書に開示されたように各々が異なるペプチド抗原を含む、１１〜２０個のキメラタンパク質をコードすることができるようにする、１１〜２０個のリボソーム結合リボソーム結合部位および１１〜２０個の転写終止シグナルを含む。一実施形態では、本明細書に開示されたプラスミドは、本明細書に開示されたように各々が異なるペプチド抗原を含む、２１〜３０個のキメラタンパク質をコードすることができるようにする、２１〜３０個のリボソーム結合リボソーム結合部位および２１〜３０個の転写終止シグナルを含む。別の実施形態では、リボソーム結合部位はシャイン・ダルガノリボソーム結合部位である。
【０１４９】
一実施形態では、「動作可能にリンクした」という用語は、転写および翻訳調節性核酸が、任意のコード配列に対して転写が開始されるような様式で位置することを意味する。一般的にこれは、プロモーターおよび転写開始配列または始動配列がコ−ド化領域に５’に位置されることを意味することになる。別の実施形態では「動作可能にリンクする」という用語は並置を指し、そのように記述される構成成分はそれらの意図される様式で機能することができるような関係にある。コード配列に「動作可能にリンクする」対照配列は、コード配列の発現が対照配列に対応する条件の下で達成されるようなやり方で連結される。別の実施形態では、「動作可能にリンクした」という用語は、各々がタンパク質またはペプチドをコードする転写ユニット内でのいくつかのオープンリーディングフレームの結合を指し、これにより結果的に意図されるように機能するキメラタンパク質またはポリペプチドの発現をもたらす。
【０１５０】
一実施形態では、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、潜在的にタンパク質をコードする可能性がある塩基の配列を含有する生命体のゲノムの部分である。別の実施形態では、ＯＲＦの開始端および停止端はｍＲＮＡの端部と同等でないが、通常のｍＲＮＡ中に含まれる。一実施形態では、ＯＲＦは、遺伝子の開始コード配列（開始コドン）と停止コドン配列（終止コドン）との間に位置する。したがって、一実施例として、内因性のポリペプチドとともにオープンリーディングフレームとして動作可能にゲノムの中へと組込まれる核酸分子は、内因性のポリペプチドと同一のオープンリーディングフレーム内でゲノムの中へと組込まれた核酸分子である。
【０１５１】
一実施形態では、本開示はリンカー配列を含む融合ポリペプチドを提供する。「リンカー配列」は２つの異種ポリペプチド、またはその断片もしくはドメインを結合するアミノ酸配列を包含する場合があることを当業者は理解するであろう。一般的に、リンカーは融合ポリペプチドを形成するためにポリペプチドを共有的にリンクするアミノ酸配列である。リンカーは、典型的には、オープンリーディングフレームおよび表示タンパク質によってコードされたアミノ酸配列を含む融合タンパク質を作り出すために、表示ベクターからのレポーター遺伝子の除去後の残りの組み換え型信号から翻訳されたアミノ酸を含む。当業者によって理解されるように、リンカーはグリシンおよび他の小さい中性アミノ酸などの追加的なアミノ酸を含むことができる。
【０１５２】
一実施形態では、「内因性」という用語は、参照生命体内で発生もしくは創出された、または参照生命体の中生じたものから発生してきた物品を記述する。例えば、内因性は天然を指す。
【０１５３】
本明細書に開示される組み換え型またはキメラタンパク質は、例えば、クローニングおよび適切な配列の制限、または以下に考察する方法による直接的化学合成を含む任意の好適な方法によって調製されてもよい。あるいは、部分配列をクローニングし、適切な部分配列を適切な制限酵素を使用して分割してもよい。次いで断片を連結し、望ましいＤＮＡ配列を生産してもよい。一実施形態では、抗原をコードするＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を使用して生産することができる。まず、未変性のＤＮＡのいずれかの側の新しい末端の区分を別個に増幅する。１つの増幅した配列の５’端はペプチドリンカーをコードし、一方でもう１つの増幅した配列の３’端もペプチドリンカーをコードする。第一の断片の５’端は第二の断片の３’端の相補なので、２つの断片を（例えば、ＬＭＰアガロース上での部分的な精製後）第三のＰＣＲ反応での重複テンプレートとして使用することができる。増幅した配列は、コドン、開放部位のカルボキシ側上の区分（ここではアミノ配列を形成している）、リンカー、および開放部位のアミノ側上の配列（ここではカルボキシル配列を形成している）を含有することになる。抗原はプラスミドへと連結される。
【０１５４】
「安定して維持される」とは、選択（例えば、抗生物質選択）無しで検出可能な損失を伴わずに、核酸分子またはプラスミドを１０世代の間、維持することを指す。別の実施形態では、期間は１５世代である。別の実施形態では、期間は２０世代である。別の実施形態では、期間は２５世代である。別の実施形態では、期間は３０世代である。別の実施形態では、期間は４０世代である。別の実施形態では、期間は５０世代である。別の実施形態では、期間は６０世代である。別の実施形態では、期間は８０世代である。別の実施形態では、期間は１００世代である。別の実施形態では、期間は１５０世代である。別の実施形態では、期間は２００世代である。別の実施形態では、期間は３００世代である。別の実施形態では、期間は５００世代である。別の実施形態では、期間は世代を超えるものである。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロで（例えば、培養液内で）安定して維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビボで安定して維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロおよびインビトロの両方で安定して維持される。
【０１５５】
「機能的断片」は免疫原性断片であり、単独でまたは本明細書に開示された治療的な組成物内で被験者に投与されるとき、免疫応答を引き出す。例えば、当業者は理解するであろうように、また本明細書にさらに開示されるように、機能的断片は生物活性を有する。本明細書で使用される場合、「機能的断片」という用語は、「免疫原性断片」という用語と交換可能に使用される。
【０１５６】
「免疫原性」もしくは「免疫原性の」という用語またはその文法的な均等物は、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体が動物に投与されたとき、ヒトまたは非ヒト動物内に免疫応答を引き出すタンパク質、ペプチド、核酸、抗原、または生物体の先天的な能力を指す場合があることを当業者は理解するであろう。したがって、「免疫原性の促進」は、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体が動物に投与された時に、動物において免疫応答を誘発するタンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体の固有の能力を増大することを指す場合がある。免疫応答を誘発するタンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体の能力の増大は、一実施形態では、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体に対する抗体数の増加、抗原または生物体に対する抗体の多様性の増大、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体に特異的なＴ細胞数の増加、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体に対する細胞毒性またはヘルパーＴ細胞の応答の増大、およびこれに類するものによって測定されうる。
【０１５７】
別の実施形態では、本開示の方法および組成物の組み換え型リステリア株は組み換え型リステリア・モノサイトゲネス株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・シーリゲリ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・グレイ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・イバノビ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・ムライ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・ウェルシメリ株である。別の実施形態では、リステリア株は、別のリステリア種の組み換え型株である。
【０１５８】
一実施形態では、本発明では、ＬＭ  ｄｅｌｔａ−ａｃｔＡ  ｍｕｔａｎｔ（Ｂｒｕｎｄａｇｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９０：１１８９０−１１８９４）、Ｌ．モノサイトゲネスｄｅｌｔａ−ｐｌｃＡ（Ｃａｍｉｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ、１９９１、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７３：７５１−７５４）、またはｄｅｌｔａ−ＡｃｔＡ、ｄｅｌｔａ  ＩＮＬ−ｂ（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ５  ａｌ、２００４、ＰＮＡＳ、１０１：１３８３２−１３８３７）などの弱毒化リステリア株が使用される。別の実施形態では、弱毒化リステリア株は、本明細書の開示を装備するとき当業者であれば理解するとおり、１つ以上の弱毒化突然変異を導入することによって構築される。かかる株の例としては、芳香族アミノ酸に対する栄養要求性のリステリア株（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９３，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０  ６１：２２４５−２２４８）およびリポタイコ酸の形成のための突然変異体（Ａｂａｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ、２００２、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１−１４）、および病毒性遺伝子を欠くことによって弱毒化されるもの（本明細書に含まれる実施例を参照）が挙げられるが、これに限定されない。
【０１５９】
別の実施形態では、本開示の組み換え型リステリア株は、動物宿主を通して継代されている。別の実施形態では、継代は株のワクチンベクターとしての有効性を最大化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の病毒性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を増加する。別の実施形態では、継代はリステリア株の病毒性を増加する。別の実施形態では、継代はリステリア株の不安定な亜系を除去する。別の実施形態では、継代はリステリア株の不安定な亜系の有病率を減少する。別の実施形態では、継代は本明細書に記述されるように実施される。別の実施形態では、当該技術分野で既知の他の方法によって継代を実施する。
【０１６０】
一実施形態では、リステリア株は本明細書に開示されるミニ遺伝子核酸構築体のゲノムの挿入を含有する。別の実施形態では、リステリア株は本明細書に開示されるミニ遺伝子核酸構築体を含むプラスミドを担持する。
【０１６１】
別の実施形態では、本開示の組み換え型核酸は、リステリア株内のコードしたペプチドの発現を駆動するプロモーター／調節配列に動作可能にリンクしている。遺伝子の構造性の発現を駆動するために有用なプロモーター／調節性配列が当該技術分野で周知であり、これらとしては、例えば、リステリアのＰｈｌｙＡプロモーター、ＰＡｃｔＡプロモーター、およびｐ６０プロモーター、ストレプトコッカスｂａｃプロモーター、ストレプトマイセス・グリセウスｓｇｉＡプロモーター、およびバシルス・チューリンゲンシスｐｈａＺプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６２】
別の実施形態では、本開示のペプチドをコードする核酸の誘発性でかつ組織に特異的な発現は、ペプチドをコードする核酸を誘発性または組織特異的プロモーター／調節性配列の制御下に置くことによって遂行される。この目的のために有用な組織特異的または誘発性プロモーター／調節性配列の実施例としては、ＭＭＴＶ  ＬＴＲ誘発性プロモーター、およびＳＶ４０後期エンハンサー／プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、金属、グルココルチコイド、およびこれに類するものなどの誘発剤に応答して誘発されたプロモーターが利用される。こうして、本開示は、既知または未知のいずれかで、かつこれらに動作可能にリンクする所望のタンパク質の発現を駆動する能力を有する、任意のプロモーター／調節性配列の使用を含むことが理解されるであろう。
【０１６３】
「異種」という用語が、参照種とは異なる種に由来する核酸、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド、またはタンパク質を包含することが当業者によって理解されるであろう。したがって、例えば、異種ポリペプチドを発現するリステリア株は、一実施形態では、天然ではないかもしくはリステリア株に対して内因性のリペプチドを発現することになり、または別の実施形態では、リステリア株によって通常発現されるポリペプチドを発現することになり、または別の実施形態では、リステリア株以外の供給源からのポリペプチドを発現することになる。別の実施形態では、異種という用語は同一の種の中の異なる生命体に由来するものを記述するために使用される。
【０１６４】
「エピソーム性の発現ベクター」という用語が、直線状または円形状であってもよく、また通常二本鎖の形態であり、その中に細菌のゲノムまたは細胞のゲノムに組み込まれるのと反対に宿主細菌の細胞質または細胞内に存在する染色体外である核酸ベクターを包含することを当業者は理解するであろう。一実施形態では、エピソーム性の発現ベクターは対象となる遺伝子を含む。別の実施形態では、エピソーム性ベクターは細菌性細胞質内の複数のコピーの中で持続し、結果的に対象となる遺伝子の増幅をもたらし、これは一実施形態では本明細書に開示される核酸分子または構築体である。別の実施形態では、ウイルス性トランス作用因子は必要に応じて供給される。本明細書ではエピソーム性の発現ベクターはプラスミドと呼ばれる場合がある。「組み込みプラスミド」はその挿入または宿主ゲノムの中に担持される対象となる遺伝子の挿入を標的化する配列を含む。別の実施形態では、挿入された対象となる遺伝子は中断されない、または細胞ＤＮＡへの組み込みからしばしば生じる調節性の制約を受けない。別の実施形態では、挿入された異種遺伝子の存在は細胞自身の重要な領域の再配列または中断につながらない。別の実施形態では、安定したトランスフェクション手順で、エピソーム性ベクターの使用は、染色体を組み込むプラスミドの使用より高いトランスフェクション効率をしばしばもたらす（Ｂｅｌｔ，Ｐ．Ｂ．Ｇ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（ＨＰＲＴ２）ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，４８６１−４８６６；Ｍａｚｄａ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｌｙｍｐｈｏ−ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０４，１４３−１５１）。一実施形態では、本明細書で開示される方法および組成物のエピソーム性の発現ベクターは、ＤＮＡ分子を細胞に送達するために採用される様々な方法のいずれかによってインビボ、エクスビボ、またはインビトロで細胞に送達される場合がある。ベクターも単独でまたは被験者の細胞への送達を強化する医薬組成物の形態で送達される場合がある。
【０１６５】
「融合された」という用語が共有結合による動作可能な連鎖を包含する場合があることは当業者によって理解されるであろう。一実施形態では、この用語は組み換え型融合（その核酸配列またはオープンリーディングフレームの）を包含する。別の実施形態では、この用語は化学的結合を包含する。
【０１６６】
「形質転換」という用語は、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子を取り上げるために細菌細胞を改変すること包含する場合があることを理解するべきである。「形質転換」は、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子の遺伝子を発現するために細菌細胞を改変することも指す場合がある。
【０１６７】
細菌を形質転換する方法は当該技術分野で周知であり、塩化カルシウムコンピテント細胞に基づく方法、エレクトロポレーション法、バクテリオファージ媒介形質導入、化学的、および物理的な形質転換技術（ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９８９，Ｃｅｌｌ  ５６：６４１−６４９；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，９：１９０−１９９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２，Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。別の実施形態では、本開示のリステリアワクチン株はエレクトロポレーションにより形質転換される。
【０１６８】
別の実施形態では、遺伝物質および／またはプラスミドを細菌の中へと導入するために結合が使用される。結合の方法は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｎｉｋｏｄｉｎｏｖｉｃ  Ｊ．ら（Ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｎｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ  ｂｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｐｌａｓｍｉｄ．２００６  Ｎｏｖ；５６（３）：２２３−７）およびＡｕｃｈｔｕｎｇ  ＪＭら（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｍｏｂｉｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００５  Ａｕｇ  ３０；１０２（３５）：１２５５４−９）に記述されている。
【０１６９】
「弱毒化」という用語が細菌の動物内に疾患を発生する能力の減少を包含する場合があることが当業者によって理解されるであろう。つまり、弱毒化されたリステリア株の病原性特徴は野生型リステリアと比較すると低下しているが、弱毒化されたリステリアは培養物中で成長および維持する能力を有する。実施例として弱毒化されたリステリアを用いたＢａｌｂ／ｃマウスの静脈内接種を使用すると、接種した動物の５０％が生存する致死量（ＬＤ５０）は、野生型リステリアのＬＤ５０より少なくとも約１０倍増加するのが好ましく、少なくとも約１００倍増加するのがより好ましく、少なくとも約１，０００倍増加するのがより好ましく、少なくとも約１０，０００倍増加するのがなおより好ましく、および少なくとも約１００，０００倍増加するのが最も好ましい。したがってリステリアの弱毒化された株は、投与された動物を殺さないものであるか、または投与された細菌の数が同じ動物を殺すのに必要な野生型の弱毒化されていない細菌の数より非常に多いときのみ動物を殺すものである。弱毒化された細菌は、その成長のために必要な栄養素がその中に存在しないために一般的な環境内では複製する能力を有しないものを意味するとも解釈されるべきである。したがって、細菌は必要な栄養素がその中で提供される制御された環境に複製が限定される。したがって、本開示の弱毒化された株は制御されていない複製の能力がないという点で、環境的に安全である。
【０１７０】
組成物
別の実施形態では、本明細書に開示されるキメラタンパク質をコードするミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリアを含む医薬組成物が本明細書に開示され、ガンを含む疾患を有する被験者に医薬組成物を投与することは、前記疾患または前記ガンを処置、軽快する。別の実施形態では、本明細書は、本明細書に開示されるキメラタンパク質をコードするミニ遺伝子核酸構築体を含む医薬組成物を開示する。別の実施形態では、医薬組成物はアジュバントとともに投与される。
【０１７１】
一実施形態では、本開示の組成物は免疫原性組成物である。一実施形態では、本開示の組成物はインターフェロンガンマの強い先天的な刺激を誘発し、一実施形態では、これは抗血管形成特性を有する。一実施形態では、本開示のリステリアはインターフェロンガンマの強い先天的な刺激を誘発し、一実施形態では、これは抗血管形成特性を有する（Ｄｏｍｉｎｉｅｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００５  Ｍａｙ；５４（５）：４７７−８８．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｏｃｔ  ６、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｅａｔｔｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  Ｆｅｂ  １５；１６６（４）：２２７６−８２、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。一実施形態では、リステリアの抗血管形成特性は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって媒介される（Ｂｅａｔｔｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，  ２００１）。別の実施形態では、リステリアの抗血管形成特性は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介される。別の実施形態では、リステリアワクチン接種の結果としてのＩＦＮ−γ分泌は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔｈ１  ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＣ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはこれらの組み合せによって媒介される。
【０１７２】
別の実施形態では、本開示の組成物の投与は１つ以上の抗血管形成タンパク質または因子の生産を誘発する。一実施形態では、抗血管形成タンパク質はＩＦＮ−γである。別の実施形態では、抗血管形成タンパク質は、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、アンジオスタチン、エンドスタチン、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ（ｓＦｌｔ）−１、または可溶性エンドグリン（ｓＥｎｇ）である。一実施形態では、本開示のリステリアは、抗血管形成因子の放出に関与し、したがって一実施形態では、抗原を被験者に導入するためのベクターとしての役割に加えて、治療的な役割を有する。一実施形態では、本開示の組成物の投与は、宿主の中のインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）経路を刺激する。
【０１７３】
本明細書に開示された方法および組成物によって誘発される免疫応答は、別の実施形態ではＴ細胞応答である。別の実施形態では、免疫応答はＴ細胞応答を含む。別の実施形態では、応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む。
【０１７４】
別の実施形態では、本開示の方法および組成物によって引き出される免疫応答はＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性応答を含む。別の実施形態では、免疫応答は主としてＣＤ８＋  Ｔ細胞媒介性応答から構成される。別の実施形態では、免疫応答の唯一検出可能な構成成分は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞媒介性応答である。
【０１７５】
別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物によって引き出される免疫応答はＣＤ４＋  Ｔ細胞媒介性応答を含む。別の実施形態では、免疫応答は主としてＣＤ４＋  Ｔ細胞媒介性応答から構成される。別の実施形態では、免疫応答の唯一検出可能な構成成分は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞媒介性応答である。別の実施形態では、ＣＤ４＋  Ｔ細胞媒介性応答は抗原に対する測定可能な抗体応答に付随して起こる。別の実施形態では、ＣＤ４＋  Ｔ細胞媒介性応答は抗原に対する測定可能な抗体応答に付随しない。
【０１７６】
別の実施形態では、本開示は、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫応答を抗原の準優占ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対して被験者の中に誘発する方法を提供する。
【０１７７】
一実施形態では、腫瘍内のＣＤ８＋／調節性Ｔ細胞の比を増加する方法が本明細書に開示され、また別の実施形態では、この方法は本発明のキメラタンパク質、組み換え型リステリア、または組み換え型ベクターを含む組成物を被験者に投与する工程を含む。
【０１７８】
別の実施形態では、腫瘍内のＣＤ８＋／調節性Ｔ細胞の比を増加する方法が本明細書に開示され、また別の実施形態では、この方法は本発明のキメラタンパク質、組み換え型リステリア、または組み換え型ベクターを含む組成物を被験者に投与する工程を含む。
【０１７９】
別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物によって引き出された免疫応答は少なくとも１つの抗原の準優占エピトープへの免疫応答を含む。別の実施形態では、免疫応答は準優占エピトープへの免疫応答を含まない。別の実施形態では、免疫応答は少なくとも１つの準優占エピトープへの免疫応答から構成される。別の実施形態では、ただ１つの測定可能な免疫応答の構成成分は少なくとも１つの準優占エピトープへの免疫応答である。
【０１８０】
別の実施形態では、本開示の組成物の投与は、抗原特異的Ｔ細胞の数を増加させる。別の実施形態では、組成物の投与はＴ細胞上の共刺激受容体を活性化する。別の実施形態では、組成物の投与は記憶Ｔ細胞および／またはエフェクターＴ細胞の増殖を誘発する。別の実施形態では、組成物の投与はＴ細胞の増殖を増加させる。
【０１８１】
被験者内に強化した抗腫瘍Ｔ細胞応答を引き出すため、被験者内で腫瘍を薬物治療した免疫抑制を阻害するため、もしくは被験者の脾臓および腫瘍のＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加するため、またはこれらの任意の組み合せの目的で、本開示の組成物を本開示の方法で使用してもよい。
【０１８２】
別の実施形態では、本発明のリステリア株を含む組成物はアジュバントをさらに含む。一実施形態では、本開示の組成物はアジュバントをさらに含む。別の実施形態では、本開示の方法および組成物で使用されるアジュバントは顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質である。別の実施形態では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦタンパク質を含む。別の実施形態では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、アジュバントはサポニンＱＳ２１である。別の実施形態では、アジュバントはサポニンＱＳ２１を含む。別の実施形態では、アジュバントは、モノホスホリルリピドＡである。別の実施形態では、アジュバントはモノホスホリルリピドＡを含む。別の実施形態では、アジュバントはＳＢＡＳ２である。別の実施形態では、アジュバントはＳＢＡＳ２を含む。別の実施形態では、アジュバントはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、アジュバントはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインである。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインを含む。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、アジュバントはクイルグリコシドであるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは細菌マイトジェンであるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは細菌毒素であるか、またはこれを含む。他のアジュバントが当該技術分野で既知である。
【０１８３】
一実施形態では、本開示はペプチド抗原を発現する組み換え型リステリア株を提供する。別の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される組み換え型リステリアを含むワクチンおよび免疫原性組成物を提供する。別の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される組み換え型リステリアを含む医薬組成物を提供する。
【０１８４】
一実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、本明細書に開示されるキメラタンパク質をコードする核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む。
【０１８５】
一部の実施形態では、追加的なポリペプチドまたは追加的なアジュバントポリペプチドは、ＬＬＯと類似の様式で抗原提示および免疫性を増強する。
【０１８６】
一実施形態では、本明細書に開示された医薬組成物は、追加的な療法と同時投与される。別の実施形態では、追加的な療法は外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、またはこれらの組み合せである。別の実施形態では、組み換え型リステリアを含む医薬組成物の投与より追加的療法を先に行う。別の実施形態では、組み換え型リステリアを含む医薬組成物の投与の後に追加的療法を行う。別の実施形態では、追加的療法は抗体療法である。別の実施形態では、抗体療法は、抗ＰＤ１、抗ＣＴＬＡ４である。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞に対する調節性Ｔ細胞の比を増加し、より強力な抗腫瘍免疫応答を生成するために、組み換え型リステリアを含む医薬組成物は漸増用量で投与される。細胞の免疫応答を強化するために、腫瘍を有する被験者にＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、および当該技術分野で既知の他のサイトカインを含むがこれに限定されないサイトカインを提供することによって、抗腫瘍免疫応答をさらに強化することができることが当業者によって理解されるであろう。これらのうちのいくつかは米国特許第６，９９１，７８５号に記載されており、この特許は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８７】
一実施形態では、本発明の組み換え型リステリアを含むワクチンを本明細書に開示する。別の実施形態では、本発明のミニ遺伝子構築体を発現する組み換え型弱毒化リステリアを含むワクチンを本明細書に開示する。
【０１８８】
別の実施形態では、本発明の組み換え型リステリアを含む医薬組成物を本明細書に開示する。別の実施形態では、本発明のミニ遺伝子構築体を発現する組み換え型弱毒化リステリアを含む医薬組成物を本明細書に開示する。
【０１８９】
別の実施形態では、本発明の組み換え型ポリペプチド、またはこれをコードする核酸構築体、または核酸構築体をコードする組み換え型リステリアを含む免疫原性組成物を本明細書に開示する。
【０１９０】
別の実施形態では、本発明のヌクレオチド分子または組み換え型ポリペプチドを含む医薬組成物を本明細書に開示する。
【０１９１】
別の実施形態では、本発明のヌクレオチド分子または組み換え型ポリペプチドを含むベクターを本明細書に開示する。
【０１９２】
別の実施形態では、本発明のヌクレオチド分子またはリステリアの組み換え型形態を本明細書に開示する。
【０１９３】
別の実施形態では、本発明のリステリアの組み換え型形態を含むワクチンを本明細書に開示する。別の実施形態では、本発明のリステリアの組み換え型形態を含む医薬組成物を本明細書に開示する。
【０１９４】
別の実施形態では、本発明のリステリアの組み換え型形態のカルチャーを本明細書に開示する。
【０１９５】
別の実施形態では、本開示の方法および組成物のリステリアはリステリア・モノサイトゲネスである。別の実施形態では、リステリアはリステリア・イバノビである。別の実施形態では、リステリアはリステリア・ウェルシメリである。別の実施形態では、リステリアはリステリア・シーリゲリである。
【０１９６】
抗原
「抗原」、「抗原性ポリペプチド」、「抗原断片」という用語は本明細書で交換可能に使用され、また宿主の細胞の表面上でＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子上に負荷および提示され、かつ宿主の免疫細胞によって識別または検出することができるポリペプチドまたはペプチド（組み換え型ペプチドを含む）を包含する場合があり、これによってポリペプチド、ペプチドまたはこれを提示する細胞に対する免疫応答の搭載をもたらすことを当業者は理解するであろう。同様に、免疫応答は、宿主の中の同一のポリペプチドまたはペプチドを発現する腫瘍またはガン細胞などの病的な細胞を含む他の細胞にも延長される場合がある。
【０１９７】
「その抗原性部分」、「その断片」、「その免疫原性部分」という用語は、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドに関して本明細書で交換可能に使用され、また本明細書に記述されるように単独で、または融合タンパク質の状況でのいずれかで、宿主によって検出されるものの中にまたは一部の実施形態の中に存在する場合、免疫応答の搭載をもたらすドメインまたは区分を含むその組み換え型形態を含むタンパク質、ポリペプチド、ペプチドを包含する場合があることを当業者は理解するであろう。
【０１９８】
「異種」という用語が、参照種とは異なる種に由来する核酸、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を包含することが当業者によって理解されるであろう。したがって、例えば、異種ポリペプチドを発現するリステリア株は、一実施形態では、天然ではないかもしくはリステリア株に対して内因性のリペプチドを発現することになり、または別の実施形態では、リステリア株によって通常発現されるポリペプチドを発現することになり、または別の実施形態では、リステリア株以外の供給源からのポリペプチドを発現することになる。別の実施形態では、異種という用語は同一の種の中の異なる生命体に由来するものを記述するために使用される。別の実施形態では、異種抗原はリステリアの組み換え型株によって発現され、かつ哺乳類細胞の感染に際して組み換え型株によって細胞毒性Ｔ細胞に加工および提示される。別の実施形態では、リステリア種によって発現される異種抗原は、結果として哺乳類内に自然に発現される修飾されていない抗原またはタンパク質を識別するＴ細胞応答をもたらす限り、腫瘍細胞または感染性薬剤の中で対応する修飾されていない抗原またはタンパク質に厳密に適合する必要はない。一実施形態では、「抗原性ポリペプチド」および「タンパク質抗原」、「抗原」という用語は、本明細書で交換可能に使用される。
【０１９９】
一実施形態では、抗原は外来であってもよく、すなわち、宿主に対して異種であってもよく、本明細書では「異種抗原」と称される。別の実施形態では、抗原は、自己抗原であり、これは宿主内に存在するが、免疫寛容のために宿主はこれに対する免疫応答を引き出さない。当業者にとっては当然のことながら、異種抗原ならびに自己抗原は、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、または血管形成抗原を包含しうる。さらに、異種抗原は、感染性疾患抗原を包含する場合がある。別の実施形態では、抗原は血管形成抗原である。
【０２００】
一実施形態では、本明細書に開示されるペプチドは、腫瘍関連抗原に由来する。一実施形態では、腫瘍関連抗原は、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＰＶ−Ｅ６、Ｈｅｒ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、高分子量メラノーマ−関連（ＨＭＷ−ＭＡＡ）抗原またはその断片、ヘプシン、サバイビン、ＰＳＧ４、ＶＥＧＦＲ−２断片、サバイビン、Ｂ−細胞受容体抗原、チロシナーゼ関連タンパク質２、またはＰＳＡ（前立腺−特異的抗原）またはこれらの組み合せから選択される。別の実施形態では、抗原は、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、ＭＡＧＥ（メラノーマ−関連抗原Ｅ）タンパク質（例えば、ＭＡＧＥ  １、ＭＡＧＥ  ２、ＭＡＧＥ  ３、ＭＡＧＥ  ４、チロシナーゼ）；突然変異ｒａｓタンパク質；突然変異ｐ５３タンパク質；進行ガン関連ｐ９７メラノーマ抗原、ｒａｓペプチド、またはｐ５３ペプチド；子宮頸ガン関連ＨＰＶ１６／１８抗原、乳ガン関連ＫＬＨ抗原、ガン胎児抗原（ＣＥＡ）、ｇｐ１００、メラノーマ関連ＭＡＲＴ１抗原、インターロイキン−１３受容体α（ＩＲ１３−Ｒ  α）、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ）、角質層キモトリプシン様酵素（ＳＣＣＥ）抗原、ＣＥＡ、ＬＭＰ−１、ｐ５３、プロテイナーゼ３、滑膜肉腫、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、サバイビン、ＧＰ１００、テスチシンペプチド、ＰＳＭＡ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、またはウィルムス腫瘍（ＷＴ−１）抗原などの感染性疾患抗原である。本明細書に開示されるまたは当該技術分野において開示される任意の抗原の断片は本発明にも包含されることが理解されるべきである。
【０２０１】
一実施形態では、本明細書に開示される疾患は感染性疾患である。一実施形態では、感染性疾患は、以下の病原体のいずれか１つによって発生するものであるが、これに限定されない。リーシュマニア、赤痢アメーバ（アメーバ症を発生する）、鞭虫属、ＢＣＧ／結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、Ｂ型肝炎、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ）、汎発性インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌Ａ＋Ｃ、経口ポリオワクチン、一価、二価、および三価、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス（炭疽菌）、クロストリジウム・ボツリヌス毒素（ボツリヌス中毒症）、エルシニア・ペスチス（ペスト）、大痘瘡（天然痘）、および他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス（野兎病）、ウイルス性出血熱、アレナウイルス（ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱）、ブニヤウイルス（ハンタウイルス、リフトバレー熱）、フラビウイルス（デング）、フィロウイルス（エボラ、マールブルグ）、バークホルデリア・シェードマレイ、コクシエラ・バーネティー（Ｑ熱）、ブルセラ種（ブルセラ症）、バークホルデリア・マレイ（鼻疽）、クラミジア・シタッシ（オウム病）、リシン毒素（リシナス・コンムニス由来）、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンＢ、発疹チフス（リケッチア・プロワゼキ）、他のリケッチア食品由来および水由来の病原体、細菌（下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ種、サルモネラＢＣＧ／、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ）、ウイルス（カルシウイルス、Ａ型肝炎、西ナイルウイルス、ラクロス、カリフォルニア脳炎、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、原虫（クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ）、真菌類（微胞子虫）、黄熱病、薬剤耐性ＴＢを含む結核、狂犬病、プリオン、コロナウイルスに関連付けられた重症急性呼吸器症候（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性腟症、トラコーマクラミジア、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、腟トリコモナス、または本明細書に列挙されていない当該技術分野で既知の任意の他の感染性疾患。
【０２０２】
一実施形態では、病原性原虫および蠕虫感染としては：アメーバ症；マラリア；リーシュマニア；トリパノソーマ症；トキソプラズマ症；ニューモシスティス・カリニ；バベシア症；ランブル鞭毛虫症；旋毛虫病；フィラリア症；住血吸虫症；線虫；吸虫（ｔｒｅｍａｔｏｄｅｓまたはｆｌｕｋｅｓ）；および条虫（ｃｅｓｔｏｄｅまたはｔａｐｅｗｏｒｍ）感染が挙げられる。
【０２０３】
一実施形態では、本明細書に開示されるＥ６またはＥ７抗原などのＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ  ６株、およびＨＰＶ  １１株、ＨＰＶ  １６株、ＨＰＶ−１８株、ＨＰＶ−３１株、ＨＰＶ−３５株、ＨＰＶ−３９株、ＨＰＶ−４５株、ＨＰＶ−５１株ＨＰＶ−５２株、ＨＰＶ−５８株、またはＨＰＶ−５９株から選択される。別の実施形態では、ＨＰＶ抗原は高リスクＨＰＶ株から選択される。別の実施形態では、ＨＰＶ株は粘膜ＨＰＶタイプである。別の実施形態では、ＨＰＶ抗原は、いぼおよび異形成を生じるタイプ６、タイプ１１等などの非発ガン性ＨＰＶを含むすべてのＨＰＶ株から選択される可能性がある。
【０２０４】
一実施形態では、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７は、ＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７の代わりにまたはこれと組み合せて利用される。かかる実施形態では、組み換え型リステリアはＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７を染色体から、ならびにＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７をプラスミドから発現してもよく、またはその反対であってもよい。別の実施形態では、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７抗原ならびにＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７抗原は、本明細書に開示された組み換え型リステリア内に存在するプラスミドから発現される。別の実施形態では、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７抗原ならびにＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７抗原は、本明細書に開示された組み換え型リステリアの染色体から発現される。別の実施形態では、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７抗原ならびにＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７抗原は上記の実施形態の任意の組み合せで発現され、これには各々のＨＰＶ株由来の各々のＥ６およびＥ７抗原がプラスミドまたは染色体のいずれかから発現されるものを含む。
【０２０５】
一実施形態では、抗原は、米国特許出願シリアル番号第１２／９４５，３８６号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記述されるキメラＨｅｒ２抗原である。
【０２０６】
他の実施形態では、抗原は以下の疾患のうちの１つと関連付けられる。コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、麻疹、髄膜炎、おたふく風邪、百日咳、天然痘、肺炎球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、結核、腸チフス、水痘帯状疱疹、百日咳、黄熱病、アジソン病由来のイムノゲンおよび抗原、アレルギー、アナフィラキシー、ブルートン症候群、固形および血液由来の腫瘍を含むガン、湿疹、橋本甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、後天性免疫不全症候群、腎臓、心臓、すい臓、肺、骨、および肝臓などの移植拒否反応、グレーブス病、多内分泌自己免疫疾患、肝炎、顕微鏡的多発性動脈炎、結節性多発動脈炎、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変症、悪性貧血、セリアック病、抗体媒介性腎炎、糸球体腎炎、リウマチ性疾患、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、血清反応陰性脊椎関節症、鼻炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、硬化性胆管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、疱疹状皮膚炎、乾癬、白斑、多発性硬化症、脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、ランバート・イートン筋無力症候群、強膜、上強膜、ブドウ膜炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、じんましん、乳児一過性低ガンマグロブリン血症、骨髄腫、Ｘ連鎖高Ｉｇｍ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、アミロイド症、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、マラリアのスポロゾイト周囲タンパク、微生物抗原、ウイルス抗原、自己抗原、およびリステリア症。
【０２０７】
別の実施形態では、本明細書に開示された症状は異形成である。別の実施形態では、疾患は新生物である。別の実施形態では、疾患は肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）である。別の実施形態では、疾患は膣上皮内腫瘍（ＶＩＮ）である。別の実施形態では、疾患は子宮頸部上皮内腫瘍形成（ＣＩＮ）である。
【０２０８】
別の実施形態では本明細書に開示される症状は前ガン状態、または処置されずに放置された場合に疾患（慢性もしくは急性）を発症するように進行する状態である。
【０２０９】
別の実施形態では、本明細書に開示される腫瘍関連抗原は、活性化した周皮細胞と腫瘍血管形成血管系内の周皮細胞との両方の上で発現される血管形成抗原であり、これインビボでの新血管形成と関連付けられる。血管形成抗原は、当該技術分野で既知であり、例えば国際特許公開広報第ＷＯ２０１０／１０２１４０号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。例えば、血管形成因子は、アンジオポイエチン−１（Ａｎｇ１）、アンジオポイエチン３、アンジオポイエチン４、アンジオポイエチン６；Ｄｅｌ−１；線維芽細胞成長因子：酸性（ａＦＧＦ）および塩基性（ｂＦＧＦ）；ホリスタチン；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／散乱因子（ＳＦ）；インターロイキン−８（ＩＬ−８）；レプチン；ミッドカイン；胎盤成長因子；血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）；血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）；プレイオトロフィン（ＰＴＮ）；プログラニュリン；プロリフェリン；スルビビン；形質転換成長因子−アルファ（ＴＧＦ−アルファ）；形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦ−ベータ）；腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ）；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）／血管透過性因子（ＶＰＦ）から選択されてもよい。別の実施形態では、血管形成因子は血管形成タンパク質である。一実施形態では、成長因子は血管形成タンパク質である。一実施形態では、本発明の組成物および方法で使用する血管形成タンパク質は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＲおよびニューロピリン１（ＮＲＰ−１）；Ｔｉｅ２；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ；ＢＢホモ二量体）およびＰＤＧＦＲ；形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦ−β）、エンドグリンおよびＴＧＦ−β受容体；単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）；インテグリンαＶβ３、αＶβ５およびα５β１；ＶＥ−カドヘリンおよびＣＤ３１；エフリン；プラスミノーゲン活性化因子；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１；一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）およびＣＯＸ−２；ＡＣ１３３；またはＩｄ１／Ｉｄ３、ＴＧＦベータ共受容体またはエンドグリン（これはＣＤ１０５；ＥＤＧ；ＨＨＴ１；ＯＲＷ；またはＯＲＷ１としても既知である）である。
【０２１０】
一実施形態では、ネオエピトープは以下の米国特許出願のうちのいずれか１つに開示されるように生成されかつ得られる（米国特許出願シリアル番号第６２／１６６，５９１号、同第６２／１７４，６９２号、同第６２／２１８，９３６号、同第６２／１８４，１２５号、これらはすべてその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２１１】
一実施形態では、リステリアベースの免疫療法レジメンの投与に続く被験者の中の組織上のリステリア株の持続性を防止する方法が本明細書に開示され、方法は、前記組み換え型リステリアベースの免疫療法の投与に続いて、有効量の抗生物質のレジメンを投与する工程を含み、これによって前記被験者の中の前記リステリア株の前記持続性を防止する。
【０２１２】
別の実施形態では、リステリア株は、１つ以上のネオエピトープをコードする１つ以上のペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を含み、前記１つ以上のペプチドは免疫原性タンパク質またはペプチドに融合される。別の実施形態では、免疫原性タンパク質またはペプチドは、切断ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）、切断ＡｃｔＡ（ｔＡｃｔＡ）、またはＰＥＳＴアミノ酸配列ペプチドを含む。
【０２１３】
一実施形態では、組み換え型弱毒化リステリア株が本明細書に開示され、リステリア株は１つ以上の個人用のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のオープンリーディングフレームを含む核酸配列を含み、ネオエピトープ（複数可）は、疾患または症状を有する被験者の疾患または症状を持つ組織または細胞の中に存在する免疫原性エピトープを含む。別の実施形態では、１つ以上のネオエピトープは、疾患または症状を有する被験者の疾患または症状を持つ組織または細胞の中に存在する。
【０２１４】
別の実施形態では、リステリア株を前記疾患または症状を有する被験者に投与すると、被験者の疾患または症状を標的とする免疫応答を生成する。
【０２１５】
別の実施形態では、株は前記被験者の疾患または症状を標的とする前記被験者のための個人用の免疫療法ベクターである。
【０２１６】
別の実施形態では、ペプチドは少なくとも２つの異なるネオエピトープアミノ酸配列を含む。
【０２１７】
別の実施形態では、ペプチドは同じアミノ酸配列の１つ以上のネオエピトープの繰り返しを含む。
【０２１８】
別の実施形態では、リステリア株は１つのネオエピトープを含む。別の実施形態では、リステリア株は約１〜１００の範囲のネオエピトープを含む。あるいは、リステリア株は、約１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、５〜１５、５〜２０、５〜２５、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜３５、２０〜２５、２０〜３５、２０〜４５、３０〜４５、３０〜５５、４０〜５５、４０〜６５、５０〜６５、５０〜７５、６０〜７５、６０〜８５、７０〜８５、７０〜９５、８０〜９５、８０〜１０５、または９５〜１０５の範囲のネオエピトープを含む。あるいは、リステリア株は約５０〜１００の範囲のネオエピトープを含む。あるいは、リステリア株は最高約１００のネオエピトープを含む。
【０２１９】
別の実施形態では、リステリア株は約１００を超えるネオエピトープを含む。別の実施形態では、リステリア株は最高約１０のネオエピトープを含む。別の実施形態では、リステリア株は最高約２０のネオエピトープを含む。別の実施形態では、リステリア株は最高約５０のネオエピトープを含む。あるいは、リステリア株は約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００のネオエピトープを含む。
【０２２０】
本明細書に記述される一実施形態では、検出された突然変異の各々の側に隣接する約５〜３０の範囲のアミノ酸の組み込みが生成される。追加的にまたは代替的に、様々なサイズのネオエピトープインサートが約８〜２７の範囲のアミノ酸配列長さで挿入される。追加的にまたは代替的に、様々なサイズのネオエピトープインサートが約５〜５０の範囲のアミノ酸配列長さで挿入される。
【０２２１】
別の実施形態では、ネオエピトープ配列は腫瘍特異的、転移特異的、細菌感染特異的、ウイルス感染特異的、およびこれらの任意の組み合せである。追加的にまたは代替的に、ネオエピトープ配列は、炎症特異的、免疫調整分子エピトープ特異的、Ｔ−細胞特異的、自己免疫疾患特異的、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）特異的、およびこれらの任意の組み合わせである。
【０２２２】
別の実施形態では、１つ以上のネオエピトープは線形ネオエピトープを含む。追加的にまたは代替的に、１つ以上のネオエピトープは溶媒曝露エピトープを含む。
【０２２３】
別の実施形態では、１つ以上のネオエピトープはＴ細胞エピトープを含む。
【０２２４】
治療的な方法およびその使用の組成
別の実施形態では、本開示は上述のように、腫瘍またはガンを含む疾患または症状を処置するために免疫原性組成物を提供する。例えば、本開示の方法で使用される免疫原性組成物は、本明細書に記載するようにミニ遺伝子核酸構築体を発現するリステリア株を含む。
【０２２５】
一実施形態では、本明細書に開示された症状は異形成である。別の実施形態では、疾患は新生物である。別の実施形態では、疾患は肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）である。別の実施形態では、疾患は膣上皮内腫瘍（ＶＩＮ）である。別の実施形態では、疾患は子宮頸部上皮内腫瘍形成（ＣＩＮ）である。
【０２２６】
別の実施形態では本明細書に開示される症状は前ガン状態、または処置されずに放置された場合に疾患、慢性、もしくは急性を発症するように進行する状態である。
【０２２７】
一実施形態では、本明細書に開示されたガンは、乳ガン、中枢神経系（ＣＮＳ）ガン、頭頸部ガン、骨肉腫（ＯＳＡ）、イヌの骨肉腫（ＯＳＡ）、大腸ガン、腎臓の細胞ガン、膵管腺ガン、ユーイング肉腫（ＥＳ）、膵臓ガン、卵巣ガン、胃ガン、膵臓のガンの病巣、肺腺ガン、結腸直腸腺ガン、肺の扁平上皮腺ガン、胃腺ガン、卵巣表面上皮性新生物（例えば、その良性、増殖性、または悪性変種）、口腔扁平細胞ガン、非小細胞肺ガン、ＣＮＳガン腫、子宮内膜ガン、膀胱ガン、中皮腫、悪性中皮腫（ＭＭ、前立腺ガン、メラノーマ、または当該技術分野で既知の任意の他のガンである。別の実施形態では、ガンはリンパ腫、白血病、または骨髄腫である。別の実施形態では、リンパ腫はホジキンリンパ腫である。別の実施形態では、リンパ腫は非ホジキンリンパ腫である。別の実施形態では、ガンは多発性メラノーマである。
【０２２８】
また別の実施形態では、ガンは急性リンパ球白血病（ＡＬＬ）である。別の実施形態では、ガンは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。また別の実施形態では、ガンは慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である。別の実施形態では、ガンは有毛細胞白血病（ＨＣＬ）である。別の実施形態では、ガンはＴ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）である。別の実施形態では、ガンは大顆粒リンパ球性白血病である。別の実施形態では、ガンは成人Ｔ細胞白血病である。別の実施形態では、ガンは慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。別の実施形態では、ガンは慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）である。別の実施形態では、ガンはリンパ腫である。別の実施形態では、ガンは皮膚リンパ腫である。別の実施形態では、ガンはホジキン病である。別の実施形態では、ガンは非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。別の実施形態では、ガンは低悪性度のＮＨＬである。別の実施形態では、ガンはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。別の実施形態では、ガンは低悪性度のＮＨＬである。別の実施形態では、ガンは前駆Ｔ細胞リンパ腫である。別の実施形態では、ガンは末梢Ｔ細胞リンパ腫である。別の実施形態では、ガンは末梢マントル細胞リンパ腫である。別の実施形態では、ガンは多発性骨髄腫である。別の実施形態では、ガンは濾胞性リンパ腫である。別の実施形態では、ガンは免疫増殖性疾患である。また別の実施形態では、ガンはＢ細胞慢性リンパ性白血病である。別の実施形態では、このガンはバーキットリンパ腫である。別の実施形態では、ガンはＭＡＬＴリンパ腫である。別の実施形態では、ガンは菌状息肉症である。別の実施形態では、ガンは結節性硬化症である。別の実施形態では、ガンは低悪性度のリンパ腫である。別の実施形態では、ガンは上記のタイプのリンパ腫または白血病のうちの１つからの残りの疾患である。別の実施形態では、ガンは、当該技術分野で既知の任意の他のタイプのリンパ腫または白血病である。別の実施形態では、ガンはサバイビンを発現する任意の他の既知のタイプのリンパ腫である。別の実施形態では、ガンは骨髄異形成症候群である。別の実施形態では、ガンは任意のサバイビンを発現する血液ガンである。別の実施形態では、前記ガンまたは固形腫瘍は、再燃または転移性疾患の結果である。別の実施形態では、ガンは不応性である。別の実施形態では、ガンは進行性である。別の実施形態では、ガンは転移性である。
【０２２９】
別の実施形態では、腫瘍は骨肉腫腫瘍、乳房腫瘍、頭頸部腫瘍、または本明細書に開示されるいずれかのガンに進行する可能性があり、かつ当該技術分野で既知の任意の他の腫瘍である。
【０２３０】
別の実施形態では、本開示の方法および組成物によって標的とされる腫瘍の細胞は、本明細書に開示される組み換え型リステリア株によって発現されるペプチドと関連付けられた抗原を発現する。別の実施形態では、ペプチド抗原は血管形成性腫瘍抗原（例えば、ＨＭＷ−ＭＡＡ）と関連付けられる。本明細書に開示された免疫原性組成物の投与に続いて、本明細書に開示された方法は末梢リンパ器官内でのＴエフェクター細胞の増殖を誘発し、腫瘍部位におけるＴエフェクター細胞の存在の強化をもたらす。別の実施形態では、本明細書に開示された方法は末梢リンパ器官におけるＴエフェクター細胞の増殖を誘発し、Ｔエフェクター細胞の末梢における存在の強化をもたらす。Ｔエフェクター細胞のかかる増殖は、Ｔｒｅｇの数に影響を与えずに、末梢内および腫瘍部位におけるＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞に対する比の増加をもたらす。末梢リンパ器官としては、脾臓、パイエル板、リンパ節、アデノイド等が挙げられるが、これに限定されないことを当業者は理解するであろう。一実施形態では、Ｔｒｅｇの数に影響を与えずに、Ｔエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞に対する比の増加が末梢で生じる。別の実施形態では、末梢、リンパ器官、および腫瘍部位で、これらの部位でのＴｒｅｇの数に影響を与えずに、Ｔエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞に対する比の増加が生じる。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞の比の増加はＴｒｅｇの頻度を減少するが、この部位におけるＴｒｅｇの総数は減少しない。
【０２３１】
別の実施形態では、被験者の中のガンを防止する方法が本明細書に開示され、方法はキメラタンパク質をコードするミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリアを投与する工程を含み、前記キメラタンパク質は腫瘍抗原関連ペプチドを含む。別の実施形態では、被験者の中の腫瘍の成長を防止する方法が本明細書に開示され、方法はキメラタンパク質をコードするミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリアを含む組成物を投与する工程を含み、前記キメラタンパク質は腫瘍抗原関連ペプチドを含む。
【０２３２】
一実施形態では、被験者の中のガンを処置する方法が本明細書に開示され、方法はキメラタンパク質をコードするミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリアを含む組成物を投与する工程を含み、前記キメラタンパク質は腫瘍抗原関連ペプチドを含む。一実施形態では、被験者の中の腫瘍の成長を処置する方法が本明細書に開示され、方法はキメラタンパク質をコードするミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリアを投与する工程を含み、前記キメラタンパク質は腫瘍抗原関連ペプチドを含む。
【０２３３】
一実施形態では、ガンを持つ被験者の生存を延長する方法が本明細書に開示され、方法はキメラタンパク質をコードするミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリアを含む組成物を投与する工程を含み、前記キメラタンパク質は腫瘍抗原関連ペプチドを含む。一実施形態では、腫瘍の成長を有する被験者の生存を延長する方法が本明細書に開示され、方法はキメラタンパク質をコードするミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリアを含む組成物を投与する工程を含み、前記キメラタンパク質は腫瘍抗原関連ペプチドを含む。
【０２３４】
一実施形態では、疾患を有する被験者の中の転移性疾患を阻害する、妨げる、または遅延する方法が本明細書に開示され、方法はキメラタンパク質をコードするミニ遺伝子核酸構築体を含む組み換え型リステリアを含む組成物を投与する工程を含み、前記キメラタンパク質は前記疾患と関連付けられる関連ペプチドを含む。一実施形態では、本開示は被験者の中に抗腫瘍または抗ガン免疫応答を誘発する方法を提供し、方法は被験者に本発明の組成物を投与することを含む。
【０２３５】
別の実施形態では、被験者内の腫瘍またはガンの退行を誘発する方法を本明細書に開示し、方法は本明細書に開示される組み換え型リステリア株を含む組成物を被験者に投与する工程を含む。
【０２３６】
一実施形態では、腫瘍内の調節性Ｔ細胞の頻度を減少する方法を本明細書に開示し、方法は本明細書に開示される組み換え型リステリア株を含む組成物を被験者に投与する工程を含む。
【０２３７】
一実施形態では、腫瘍内の骨髄系由来サプレッサー細胞の頻度を減少する方法を本明細書に開示し、方法は本明細書に開示される組み換え型リステリア株を含む組成物を被験者に投与する工程を含む。
【０２３８】
別の実施形態では、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の頻度を減少する方法を本明細書に開示し、方法は本明細書に開示される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験者に投与する工程を含む。
【０２３９】
別の実施形態では、被験者内の転移性腫瘍またはガンを処置する方法を本明細書に開示し、方法は本明細書に開示される組み換え型リステリア株を含む組成物を被験者に投与する工程を含む。
【０２４０】
一実施形態では、本開示の方法は被験者内の腫瘍またはガンに対する前記被験者内の耐性を破壊し、方法は本明細書に開示される組み換え型リステリア株を含む組成物を被験者に投与する工程を含む。
【０２４１】
別の実施形態では、本開示は被験者内の腫瘍またはガンの成長を妨げる方法を提供し、方法は被験者に本明細書に開示される組み換え型リステリア株を含む組成物を投与することを含み、これによって被験者内の腫瘍またはガンの成長を妨げる。
【０２４２】
別の実施形態では、本開示は、ガンの発生率を減少する方法を提供し、方法は本発明の組み換え型リステリアを含む組成物を投与する工程を含む。別の実施形態では、本開示は、ガンを軽快する方法を提供し、方法は本発明の組み換え型リステリアを含む組成物を投与する工程を含む。
【０２４３】
一実施形態では、本明細書に記述されるリステリア株を含む本明細書に開示する任意の組成物を、本発明の方法で使用してもよい。
【０２４４】
一実施形態では、本発明の組成物を投与する方法が本明細書に開示される。別の実施形態では、本発明の組み換え型リステリアを含むワクチンを投与する方法が本明細書に開示される。別の実施形態では、本発明の組み換え型ポリペプチドを投与する方法が本明細書に開示される。別の実施形態では、本発明の組み換え型ポリペプチドをコードする核酸構築体を投与する方法が本明細書に開示される。別の実施形態では、異なる弱毒化細菌ベクターを用いて投与を遂行する。別の実施形態では、異なる弱毒化リステリア・モノサイトゲネスベクターを用いて投与を遂行する。別の実施形態では、ＤＮＡワクチン（例えば、ネイキッドＤＮＡワクチン）を用いて投与を遂行する。別の実施形態では、本開示の組み換え型ポリペプチドの投与は、タンパク質を遺伝子組み換えによって生産し、次いで組み換え型タンパク質を被験者に投与することによって遂行される。
【０２４５】
一実施形態では、本開示は腫瘍の「エピトープ拡大」のための方法を提供する。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用する免疫付与は、本発明のワクチン内で搬送される抗原以外の抗原を持つ他の腫瘍の上へのエピトープ拡大を誘発する。これは結果的に他の腫瘍上への抗腫瘍応答の延長をもたらす。
【０２４６】
別の実施形態では、優占エピトープまたは準優占エピトープは、治療される被験者内でそれぞれ優占または準優占である。別の実施形態では、優占エピトープまたは準優占エピトープは、治療される母集団内でそれぞれ優占または準優占である。
【０２４７】
一実施形態では、エピトープ拡大によって被験者内のガンまたは腫瘍増殖を治療する、抑制する、または阻害する方法が本明細書に開示され、また別の実施形態では、前記ガンは本発明の組成物内に含まれる抗原またはその断片の発現と関連付けられる。別の実施形態では、方法は前記被験者に本発明の組み換え型ポリペプチド、組み換え型リステリア、または組み換え型ベクターを含む組成物を投与することを含む。さらに別の実施形態では、被験者は抗原を発現するガンまたは抗原を発現する腫瘍に対する免疫応答を搭載し、これによって被験者内のガンまたは腫瘍増殖を治療、抑制、または阻害する。
【０２４８】
一実施形態では、「優占ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ」または「優占エピトープ」という用語は、ワクチン接種、タンパク質もしくは病原体による感染または悪性増殖、またはタンパク質を含有するガン細胞によって引き出される、３０％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、これによって引き出される３５％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、４０％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、４５％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、５０％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、５５％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、６０％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、６５％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、７０％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、７５％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、８０％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、８５％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、９０％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、９５％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、９６％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、９７％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、９８％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。
【０２４９】
一実施形態では、「準優占ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ」または「準優占エピトープ」という用語は、ワクチン接種、タンパク質もしくは病原体による感染または悪性増殖、またはタンパク質を含有するガン細胞によって引き出される、３０％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、２８％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、２６％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、２４％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、２２％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、２０％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、１８％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、１６％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、１４％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、１２％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、１０％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、８％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、６％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、５％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、４％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、３％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、２％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、１％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、０．５％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。
【０２５０】
一実施形態では、本開示の方法および組成物でのペプチドを含む抗原は被験者の非腫瘍細胞上で検出可能なレベルで発現される。別の実施形態では、抗原は被験者の非腫瘍細胞の少なくともある特定のパーセンテージ（例えば、０．０１％、０．０３％、０．１％、０．３％、１％、２％、３％、または５％）の検出可能なレベルで発現される。一実施形態では、「非腫瘍細胞」は腫瘍の本体の外側の細胞を指す。別の実施形態では、「非腫瘍細胞」は非悪性細胞を指す。別の実施形態では、「非腫瘍細胞」は形質転換されていない細胞を指す。別の実施形態では、非腫瘍細胞は体細胞である。別の実施形態では、非腫瘍細胞は生殖細胞である。
【０２５１】
「検出可能なレベル」は、標準的なアッセイ使用するときに検出可能なレベルを指す。一実施形態では、アッセイは免疫学的アッセイである。一実施形態では、アッセイは酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）である。別の実施形態では、アッセイはウエスタンブロットである。別の実施形態では、アッセイはＦＡＣＳである。別の実施形態では、アッセイは遺伝子発現アッセイである。当該技術分野において利用可能である他のアッセイを本明細書に開示される方法において使用することができることが当業者によって理解されるべきである。別の実施形態では、検出可能なレベルは特定のアッセイのバックグラウンドレベルに対して決定される。これらの技法の各々を遂行するための方法は当業者には周知である。
【０２５２】
一実施形態では、組み換え型の抗原を発現するＬＭを用いたワクチン接種はエピトープ拡大を誘発する。
【０２５３】
一実施形態では、本開示は抗腫瘍応答の「エピトープ拡大」のための方法を提供する。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用する免疫付与は、他の腫瘍の上へのエピトープ拡大を誘発する。
【０２５４】
別の実施形態では、優占エピトープまたは準優占エピトープは、治療される被験者内でそれぞれ優占または準優占である。別の実施形態では、優占エピトープまたは準優占エピトープは、治療される母集団内でそれぞれ優占または準優占である。
【０２５５】
一実施形態では、エピトープ拡大によって被験者内のガンまたは腫瘍増殖を治療する、抑制する、または阻害する方法が本明細書に開示され、また別の実施形態では、前記ガンは本発明の組成物内に含まれる抗原またはその断片の発現と関連付けられる。別の実施形態では、方法は前記被験者に本発明の組み換え型ポリペプチド、組み換え型リステリア、または組み換え型ベクターを含む組成物を投与することを含む。さらに別の実施形態では、被験者は抗原を発現するガンまたは抗原を発現する腫瘍に対する免疫応答を搭載し、これによって被験者内のガンまたは腫瘍増殖を治療、抑制、または阻害する。
【０２５６】
別の実施形態では、本開示はガンを有する宿主内に細胞毒性Ｔ細胞の形成を誘発するための方法を提供し、この方法は宿主に本発明の組成物を投与することを含み、これによってガンを有する宿主内の細胞毒性Ｔ細胞の形成を誘発する。
【０２５７】
一実施形態では、組成物を被験者の細胞にエクスビボで投与し、別の実施形態では、組成物をドナーの細胞にエクスビボで投与し、別の実施形態では、組成物をドナーの細胞にインビボで投与し、次いで被験者に移入した。
【０２５８】
本発明の方法の別の実施形態では、被験者は抗原を発現する腫瘍または標的抗原に対して免疫応答を搭載し、これによって抗腫瘍効果を媒介する。
【０２５９】
一実施形態では、腫瘍退行を達成するために、第１の処置の過程にすぐ引き続いて、または数日、数週間、または数か月の間隔の後、本開示の組成物の繰返し投与（ブースター投与量）を行ってもよい。別の実施形態では、腫瘍増殖の抑制を達成するために、第１の処置の過程にすぐ引き続いて、または数日、数週間、または数か月の間隔の後、繰返し投与を行ってもよい。撮像技法、血清腫瘍マーカーの解析、生検、または腫瘍に伴う症状の存在、不在、または寛解などの診断方法を含む当該技術分野で既知の任意の技法によって評価を決定してもよい。
【０２６０】
一実施形態では、被験者の脾臓および腫瘍微小環境内で、Ｔエフェクター細胞の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加する方法が本明細書に提供され、方法は本明細書に開示された免疫原性組成物を投与することを含む。別の実施形態では、被験者内の脾臓および腫瘍微小環境内のＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加することは、被験者内のより著明な抗腫瘍応答を可能にする。別の実施形態では、制御性Ｔ細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞である。
【０２６１】
別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞を含む。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞である。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０２６２】
一実施形態では、本開示は、腫瘍またはガンを治療する、腫瘍またはガンから保護する、および腫瘍またはガンに対する免疫応答を誘発する方法を提供し、これには本明細書に提供される免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。
【０２６３】
一実施形態では、本開示はヒトの被験者内の腫瘍またはガンを防止または処置する方法を提供し、これは本明細書に開示される免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、免疫応答はＴ細胞応答である。別の実施形態では、Ｔ細胞応答はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、Ｔ細胞応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、Ｔ細胞応答はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。
【０２６４】
別の実施形態では、本開示は腫瘍またはガンから被験者を保護する方法を提供し、これは本明細書に開示される免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本開示は被験者内の腫瘍の退行を誘発する方法を提供し、これは本明細書に開示される免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本開示は腫瘍またはガンの発生または再発を減少させる方法を提供し、これは本明細書に開示される免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本開示は被験者内の腫瘍の形成を抑制する方法を提供し、これは本明細書に開示される免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本開示は被験者内のガンの寛解を誘発する方法を提供し、これは本明細書に開示される免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。
【０２６５】
一実施形態では、本明細書に開示されるキメラ型ペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むミニ遺伝子核酸構築体がリステリアゲノムに組み込まれる。別の実施形態では、ミニ遺伝子構築体は組み換え型リステリアワクチン株内のプラスミドの中にある。別の実施形態では、ミニ遺伝子構築体は前記リステリア内の染色体外プラスミドの中にある。別の実施形態では、構築体は前記リステリア内の染色体外プラスミドから発現される。
【０２６６】
別の実施形態では、処置する方法はリンパ節サイズを減少する。リンパ節サイズの減少は部分的または１００％である場合がある。別の実施形態では、本開示の方法はリンパ節サイズを９０％ほど減少する。別の実施形態では、本開示の方法はリンパ節サイズを８０％ほど減少する。別の実施形態では、方法はリンパ節サイズを７０％ほど減少する。別の実施形態では、方法はリンパ節サイズを６０％ほど減少する。別の実施形態では、方法はリンパ節サイズを５０％ほど減少する。
【０２６７】
別の実施形態では、処置する方法は疾患が進行する時間を増加する。一実施形態では、疾患が進行する時間は、処置されていない被験者と比較して少なくとも２カ月ほど増加する。一実施形態では、疾患が進行する時間は、処置されていない被験者と比較して少なくとも４カ月ほど増加する。一実施形態では、疾患が進行する時間は、処置されていない被験者と比較して少なくとも６カ月ほど増加する。一実施形態では、疾患が進行する時間は、処置されていない被験者と比較して少なくとも１年ほど増加する。一実施形態では、疾患が進行する時間は、処置されていない被験者と比較して少なくとも２年ほど増加する。一実施形態では、疾患が進行する時間は、処置されていない被験者と比較して少なくとも３年ほど増加する。一実施形態では、疾患が進行する時間は、処置されていない被験者と比較して少なくとも４年ほど増加する。一実施形態では、疾患が進行する時間は、処置されていない被験者と比較して少なくとも５年ほど増加する。
【０２６８】
一実施形態では、方法は組み換え型リステリアを追加的な療法とともに同時投与する工程を含む。別の実施形態では、追加的な療法は外科手術、化学療法、免疫療法、放射線療法、抗体ベースの免疫療法、またはこれらの組み合わせである。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与より追加的療法を先に行う。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与に続いて追加的療法を行う。別の実施形態では、追加的療法は抗体療法である。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞に対する調節性Ｔ細胞の比を増加し、より強力な抗腫瘍免疫応答を生成するために、組み換え型リステリアは漸増用量で投与される。細胞の免疫応答を強化するために、腫瘍を有する被験者にＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、および当該技術分野で既知の他のサイトカインを含むがこれに限定されないサイトカインを提供することによって、抗腫瘍免疫応答をさらに強化することができることが当業者によって理解されるであろう。これらのうちのいくつかは米国特許第６，９９１，７８５号に記載されており、この特許は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２６９】
一実施形態では、本明細書に開示された方法は、本明細書に提供される免疫原性組成物を前記被験者内で抗腫瘍免疫応答を強化する抗体またはその機能的断片と同時投与する工程をさらに含む。
【０２７０】
別の実施形態では、ガンを患う被験者または腫瘍を有する被験者の生存を増加する方法が本明細書に開示され、方法は本明細書に開示される組み換え型リステリアワクチン株を含む免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。
【０２７１】
別の実施形態では、ガンを患う被験者または腫瘍を有する被験者内の抗原特異的なＴ細胞を増加する方法が本明細書に開示され、方法は本明細書に開示される組み換え型リステリアワクチンを含む免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。
【０２７２】
一実施形態では、本開示の治療プロトコルは治療的である。別の実施形態では、プロトコルは予防的である。別の実施形態では、当業者であれば理解するであろうように、本開示の組成物は、家族性遺伝のためまたはこれらのタイプの病気にかかりやすくなる他の状況のために、乳ガンまたは他のタイプの腫瘍などのガンのリスクがある人々を保護するために使用される。別の実施形態では、組成物は、外科手術による腫瘍成長の減量術、従来の化学療法、または放射線治療の後のガン免疫療法として使用される。かかる治療に続いて、本開示の組成物を投与し、これによってワクチンの腫瘍抗原に対する細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答が残りの転移を破壊し、ガンからの寛解を長持ちさせる。別の実施形態では、組成物は、外科手術、従来の化学療法、または放射線治療と組み合わせてガン免疫療法として使用される。別の実施形態では、本開示の組成物は、以前に定着した腫瘍の成長に作用し、既存の腫瘍細胞を死滅させるために使用される。
【０２７３】
本発明によって投与範囲の様々な実施形態が企図される。一実施形態では、ワクチンベクターの場合は、投与量は０．４ＬＤ５０／回の範囲である。別の実施形態では、投与量は約０．４〜４．９ＬＤ５０／回である。別の実施形態では、投与量は約０．５〜０．５９ＬＤ５０／回である。別の実施形態では、投与量は約０．６〜０．６９ＬＤ５０／回である。別の実施形態では、投与量は約０．７〜０．７９ＬＤ５０／回である。別の実施形態では、投与量は約０．８ＬＤ５０／回である。別の実施形態では、投与量は０．４ＬＤ５０／回〜０．８のＬＤ５０／回である。
【０２７４】
別の実施形態では、投与量は細菌数１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１．５×１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数２×１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数３×１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数４×１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数６×１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１．５×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数２×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数３×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数４×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数６×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１．５×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数２×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数３×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数５×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数６×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１．５×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数２×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数３×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数５×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数６×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１．５×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数２×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数３×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数５×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数６×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０１１個／回である。
【０２７５】
本発明によって様々な投与レジメンも企図される。一実施形態では、本開示に記述されるような細菌を含む医薬組成物は１回投与される。別の実施形態では、組成物は２回以上投与される。別の実施形態では、組成物は２回投与され、投与の間の間隔は１週間である。別の実施形態では、組成物は２回投与され、投与の間の間隔は２週間である。別の実施形態では、組成物は２回投与され、投与の間の間隔は３週間である。別の実施形態では、組成物は３回投与され、投与の間の間隔は１週間である。別の実施形態では、組成物は３回投与され、投与の間の間隔は２週間である。別の実施形態では、組成物は３回投与され、投与の間の間隔は３週間である。別の実施形態では、上記のレジメンのうちのいずれかには、さらなる投与が追加される。一部の実施形態では、さらなる投与は予防的である。別の実施形態では、被験者がガンの再発を経験する場合、さらにブースター投与が行われる。別の実施形態では、被験者がガンの寛解を経験する場合、さらにブースター投与が行われる。一部の実施形態では、ブースターレジメンは、組成物の月次の投与を含む。別の実施形態では、ブースターレジメンは、組成物の２カ月に一度の投与を含む。また別の実施形態では、ブースターレジメンは、組成物の２カ月以上の間隔での投与を含む。他の実施形態では、ブースターレジメンは、追加的な投与を１回含む。他の実施形態では、ブースターレジメンは、追加的な投与を２回以上含む。また別の実施形態では、ブースターレジメンは追加的な投与を２回含む。また別の実施形態では、ブースターレジメンは追加的な投与を３回含む。別の実施形態では、追加する投与レジメンは、４回以上の追加的な投与を含む。
【０２７６】
別の実施形態では、本開示の方法は、本明細書に開示された弱毒化リステリア株を含む免疫原性組成物を用いて被験者をブーストすることをさらに含む。別の実施形態では、本開示の方法は本明細書に開示された弱毒化リステリア株を含む免疫原性組成物のブースター用量を投与する工程を含む。別の実施形態では、本開示の方法は被験者にブースター免疫原性組成物を投与する工程をさらに含む。一実施形態では、ブースター用量は前記免疫原性組成物の単一のプライミング用量の後に続く。別の実施形態では、プライミング用量の後に単一のブースター用量を投与する。別の実施形態では、プライミング用量の後に２回のブースター用量を投与する。別の実施形態では、プライミング用量の後に３回のブースター投与量を投与する。一実施形態では、本明細書に開示された弱毒化リステリアを含む免疫原性組成物のプライム用量とブースト用量との間の期間は当業者によって実験的に決定される。
【０２７７】
別の実施形態では、ブースター用量は、本明細書に開示されるリステリアを含む免疫原性組成物の代替形態である。別の実施形態では、ブースター用量は、本明細書に開示される免疫原性組成物およびアジュバントを含む。異種「プライムブースト」戦略は免疫応答および多数の病原体に対する保護を強化するために効果的であった。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１７０：２９−３８（１９９９）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２３９−５０（２００２）；Ｇｏｎｚａｌｏ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒａｉｎ  ２０：１２２６−３１（２００２）；Ｔａｎｇｈｅ，Ａ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：３０４１−７（２００１）。プライム注射とブースト注射において異なる形態で抗原を提供すると、抗原に対する免疫応答を最大化するように思われる。ＤＮＡ株プライミングの後にアジュバント中のタンパク質を用いたブースティング、または抗原をコードするＤＮＡのウイルスベクター送達が続くのが、抗原特異的抗体およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答のそれぞれの改善の最も効果的なやり方であるように思われる。Ｓｈｉｖｅｒ  Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：３３１−５（２００２）；Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒａｉｎ  ２０：１０３９−４５（２００２）；Ｂｉｌｌａｕｔ−Ｍｕｌｏｔ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒａｉｎ  １９：９５−１０２（２０００）；Ｓｉｎ，Ｊ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１８：７７１−９（１９９９）。サルのワクチン接種の研究からの最近のデータは、サルにＨＩＶ  ｇａｇ  ＤＮＡをプライムでワクチン接種し、ＨＩＶ  ｇａｇを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ５−ｇａｇ）を用いたブーストを後に続けた場合、ＣＲＬ１００５ポロクサマー（１２ｋＤａ、５％  ＰＯＥ）をＨＩＶ  ｇａｇ抗原をコードするＤＮＡに加えることがＴ細胞応答を強化することを示唆している。ＤＮＡ／ポロクサマーのプライムの後にＡｄ５−ｇａｇブーストを続けることに対する細胞免疫応答は、ＤＮＡ（ポロクサマーを用いない）プライムの後に続くＡｄ５−ｇａｇブーストで、またはＡｄ５−ｇａｇのみで誘発される応答より大きい。Ｓｈｉｖｅｒ、Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：３３１−５（２００２）。米国特許出願  公開第ＵＳ２００２／０１６５１７２Ａ１号は、免疫応答が生成されるような、抗原の免疫原性の部分をコードするベクター構築体と抗原の免疫原性の部分を含むタンパク質との同時投与を記述している。このドキュメントは、Ｂ型肝炎抗原およびＨＩＶ抗原に限られる。さらに、米国特許  第６，５００，４３２号は対象となるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同時投与によって核酸ワクチン接種の免疫応答を強化する方法を対象としている。この特許によると、同時投与は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同一の免疫応答の間の投与を意味し、相互の間が０〜１０日間または３〜７日間であるのが好ましい。意図される抗原としては、数ある中でも、肝炎（すべての形態）、ＨＳＶ、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＲＳＶ、ＶＺＶ、ＨＰＶ、ポリオ、インフルエンザ、寄生虫（例えば、��ラスモジウム属からの）、および病原性細菌（結核菌、ライ菌、クラミジア、シゲラ、ライム病ボレリア、腸内毒素原性大腸菌、サルモネラ・ティフォサ、ピロリ菌、コレラ菌、百日咳菌等々が挙げられるがこれに限定されない）が挙げられる。すべての上記の参考文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２７８】
一実施形態では、本開示のワクチンまたは免疫原性組成物を被験者に単独で投与する。別の実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、放射線療法、化学療法、または抗−ＰＤ−１抗体、ＩＤＯ経路阻害剤等などのチェックポイント阻害剤、またはこれらの任意の組み合せなどの、しかしこれに限定されない、別のガン療法と一緒に投与される。
【０２７９】
一実施形態では、本開示の治療プロトコルは治療的である。別の実施形態では、プロトコルは予防的である。別の実施形態では、当業者であれば理解するであろうように、本開示の組成物は、家族性遺伝のためまたはこれらのタイプの病気にかかりやすくなる他の状況のために、乳ガンまたは他のタイプの腫瘍などのガンのリスクがある人々を保護するために使用される。別の実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、外科手術による腫瘍増殖の減量術、従来の化学療法、または放射線治療の後のガン免疫療法として使用される。かかる治療に続いて、本開示のワクチンを投与し、これによってワクチンの腫瘍抗原に対するＣＴＬ応答が残りの転移を破壊し、ガンからの寛解を長持ちさせる。別の実施形態では、本開示のワクチンは、以前に定着した腫瘍の成長に作用し、既存の腫瘍細胞を死滅させるために使用される。
【０２８０】
本明細書で使用される時、単数形（「１つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」）は複数形の参照を含むが、その文脈によってそうでないことが明らかに示される場合はその限りではない。例えば、「１つの化合物」または「少なくとも１つの化合物」は、これらの混合物を含む複数の化合物を含む場合がある。
【０２８１】
本出願全体を通して、本開示の様々な実施形態が範囲の形式で提示される場合がある。範囲の形式の記述は、単に利便性および簡潔性の目的に過ぎず、本発明の範囲の一定不動の制限として解釈するべきではないことを理解するべきである。したがって、範囲の記述はすべての可能性のある部分的範囲ならびにその範囲内の個別の数値を具体的に開示したものと考えるべきである。例えば、１〜６などのような範囲の記述は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６、等々などの具体的に開示された部分的範囲、ならびにこの範囲内の個別の数、例えば、１、２、３、４、５、および６を有すると考えるべきである。これは、範囲の幅広さに関わらず適用される。
【０２８２】
本明細書に数値的範囲が示されるときはいつも、示される範囲内のあらゆる引用された数値（分数または整数）を含むことを意味する。第１に示す数と第２に示す数と「の間の範囲」という句、および第１に示す数「から」第２に示す数「までの範囲」という句は、本明細書で互換的に使用され、第１に示す数および第２に示す数ならびにそれらの間のすべての分数および整数を含むことを意味する。
【０２８３】
「方法」という用語は、化学技術、薬学技術、生物学技術、生化学技術、および医術の実践者に既知であるか、または既知の様式、手段、技法、および手順からこれらの施術者によって容易に開発される様式、手段、技法、および手順を含むがこれに限定されない、所与の課題を遂行するための様式、手段、技法、および手順を包含することが当業者には理解されるであろう。
【０２８４】
以下の実施例では、本発明の完全な理解を提供するために多数の具体的な詳細が示される。しかしながら、本開示はこれらの具体的な詳細を含まずに実施されうることが当業者には理解されるであろう。他の事例では、本発明を不明瞭にしないために周知の方法、手順、および構成成分は詳細には記述されていない。
【０２８５】
医薬的剤形および投与
別の実施形態では、非経口的に、ガン近傍に、経粘膜的に、経皮的に、筋肉内に、静脈内に、皮内に、皮下に、経口で、腹腔内に、脳室内に、頭蓋内に、腟内に、または腫瘍内になどの当業者に既知の任意の方法によって、本開示のワクチン、免疫原性組成物、または組み換え型リステリアを含有する医薬組成物を被験者に投与する。
【０２８６】
一実施形態では、被験者内の少なくとも１つのガンを治療、抑制、または阻害する方法が本明細書に開示され、これは組み換え型リステリア株を前記被験者に投与する工程を含む。
【０２８７】
一実施形態では、特定のガンまたは腫瘍に感受性があることが知られている特異的な母集団で、本明細書に開示された免疫原性組成物を投与することによってガンまたは腫瘍が防止される場合がある。一実施形態では、こうした感受性は、一実施形態で、喫煙によってある母集団が肺ガンになりやすくなる場合があるなど、環境的因子による場合があり、一方で別の実施形態では、こうした感受性は遺伝的因子による場合があり、例えば、ＢＲＣＡ１／２突然変異を持つ母集団は、一実施形態では乳ガンに、また別の実施形態では卵巣ガンに対する影響を受けやすい場合がある。別の実施形態では、染色体８ｑ２４、染色体１７ｑ１２、および染色体１７ｑ２４．３での１つ以上の突然変異は、当該技術で既知のとおり、前立腺ガンに対する感受性を高めうる。ガン感受性に寄与するその他の遺伝的因子および環境的因子は当該技術分野で既知である。
【０２８８】
本明細書に開示される方法および組成物の別の実施形態では、ワクチンまたは組成物は経口で投与され、したがってこれは経口投与に好適な形態、すなわち固形調製物または液状調製物で処方される。好適な固形の経口剤形としては、錠剤、カプセル、丸薬、顆粒、ペレット、およびこれに類するものが挙げられる。好適な液状の経口剤形としては、溶液、懸濁液、分散剤、エマルション、オイル、およびこれに類するものが挙げられる。本発明の別の実施形態では、活性成分はカプセルで処方される。この実施形態によると、本開示の組成物は活性化合物および不活性担体または希釈剤に加えて、硬いゼラチンカプセルを含む。
【０２８９】
別の実施形態では、ワクチンまたは組成物は、液状調製物の静脈内、動脈内、または筋肉内注射によって投与される。好適な液体剤形としては、溶液、懸濁液、分散剤、エマルション、オイルおよびこれに類するものが挙げられる。一実施形態では、医薬組成物は静脈内に投与され、したがって静脈内投与に好適な形態で処方される。別の実施形態では、医薬組成物は動脈内に投与され、したがって動脈内投与に好適な形態で処方される。別の実施形態では、医薬組成物は筋肉内に投与され、したがって筋肉内投与に好適な形態で処方される。
【０２９０】
「免疫原性組成物」、「組成物」、および「医薬組成物」という用語は交換可能に使用される場合がある。例えば、一実施形態では、本開示の組成物は、本明細書に記述される組み換え型リステリア、およびアジュバントを包含する場合がある。別の実施形態では、免疫原性組成物は本明細書に開示された組み換え型リステリアを含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は当該技術分野で既知のまたは本明細書に開示されたアジュバントを含む。本明細書にさらに開示されているとおり、かかる組成物の投与が免疫応答を強化する、またはＴエフェクター細胞に対する制御性Ｔ細胞の比を増加するもしくは抗腫瘍免疫応答を引き出すことも理解されるべきである。
【０２９１】
「医薬組成物」という用語は、リステリア株を医薬的に許容される担体または希釈剤とともに含む治療的に有効な量の活性成分（複数可）を包含する。
【０２９２】
「投与する」という用語は被験者に本発明の組成物との接触をもたらすことを包含することを当業者は理解するであろう。一実施形態では、投与はインビトロで、すなわち、試験管内で、またはインビボで、すなわち、生命体、例えば、ヒトの細胞または組織の中で遂行することができる。一実施形態では、本開示は、本開示のリステリア株およびその組成物を被験者に投与することを包含する。
【０２９３】
一実施形態では、「治療する」という用語は疾患を治癒することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患を防止することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患の発生率を減少することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患の症状を軽快することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは患者のパフォーマンスのない生存率または全体的な生存率が増加することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患の進行を安定させることを指す。別の実施形態では、「治療する」とは寛解を誘発することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患の進行を減速することを指す。別の実施形態では、腫瘍またはガンに関する場合、「処置する」は腫瘍またはガンの退行を誘発することを指す。「減少する」、「抑制する」、および「阻害する」という用語は、より少なくすることまたは減らすことを指す。
【０２９４】
一実施形態では、「治療する」という用語は、療法的な治療および予防または防止手段の両方を意味するが、目的は本明細書に記述されるように、標的化された病理学状態または障害を予防または少なくすることである。したがって、一実施形態では、治療することは、疾患、障害、もしくは病状、またはこれらの組合せに直接的に影響するもしくはそれを治癒すること、抑制すること、阻害すること、防止すること、その重症度を減少すること、その発症を遅延すること、それに関連する症状を減少することを含む場合がある。したがって、一実施形態では、「治療する」ことは、とりわけ、進行を遅延すること、寛解を早めること、寛解を誘発すること、寛解を増強すること、回復を加速すること、代替治療に対する有効性を増加することもしくは耐性を減少すること、またはこれらの組合せを意味する。一実施形態では、「防止する」または「妨げる」ことは、とりわけ、症状の発症を遅延すること、疾患の再発を防止すること、再発の発症の数または頻度を減少すること、症候性の症状の発現の間の潜伏を増加すること、またはこれらの組合せを意味する。一実施形態では、「抑制する」または「阻害する」ことは、とりわけ、症状の重症度を減少すること、急性症状の発現の重症度を減少すること、症状の数を減少すること、疾患に関係した症状の発生率を減少すること、症状の潜伏を減少すること、症状を軽快すること、二次性症状を減少すること、二次感染を減少すること、患者の生存を延長すること、またはこれらの組合せを意味する。
【０２９５】
一実施形態では、症状は一次性であるが、一方で別の実施形態では、症状は続発性である。一実施形態では、「一次」は特定の疾患または障害の直接的な結果である症状を指すが、一方で一実施形態では、「続発性」は主因に由来する、その結果としての症状を指す。一実施形態では、本開示で使用するための化合物は、一次症状、または続発性症状、または二次合併症を治療する。別の実施形態では、「症状」は疾患または病的状態の何らかの兆候である場合がある。
【０２９６】
本明細書で使用される時、「約」という用語は定量的な用語プラスもしくはマイナス５％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス１０％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス１５％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス２０％を意味する。
【０２９７】
「被験者」という用語は、症状もしくはその後遺症に対するまたはその症状になりやすいことに対する療法を必要とする、成人のヒト、またはヒトの子ども、ティーンエージャー、もしくは青年を含むことができ、これはイヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびマウスなどのヒト以外の哺乳類を包含してもよいことを当業者は理解するべきである。この用語が家畜を包含してもよいことも理解されるであろう。「被験者」という用語はあらゆる点で正常な個体を除外しない。
【０２９８】
治療の目的については、［哺乳類」という用語は哺乳類と分類されたあらゆる動物を指し、ヒト、飼育動物および家畜物、ならびに動物園の動物、スポーツ用の動物、または愛玩用動物（犬を含むイヌ科の動物、およびウマ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ等々など）を含むがこれに限定されないことを当業者は理解するであろう。
【０２９９】
腫瘍の治療に関して「治療的に有効な量」とは、以下の効果のうちの１つ以上を引き起こす能力を有する量を指す。（１）増殖の減速および完全な増殖停止を含むある程度の腫瘍増殖の阻害、（２）腫瘍細胞の数の減少、（３）腫瘍サイズの減少、（４）周辺器官への腫瘍細胞の浸潤の阻害（すなわち、減少、減速、または完全な停止）、（５）転移の阻害（すなわち、減少、減速、または完全な停止）、（６）腫瘍の退行もしくは拒絶をもたらす場合があるが、必ずしもそうでなくてもよい、抗腫瘍免疫応答の強化、および／または（７）障害に関連した１つ以上の症状のある程度の軽減。腫瘍の治療の目的については、本明細書に開示されるワクチンの「治療的に有効な量」は、経験的におよび習慣的な様式で決定される場合がある。
【０３００】
以下の実施例では、本発明の完全な理解を提供するために多数の具体的な詳細が示される。しかしながら、本開示はこれらの具体的な詳細を含まずに実施されてもよいことが当業者には理解されるであろう。他の事例では、本発明を不明瞭にしないために周知の方法、手順、および構成成分は詳細には記述されていない。したがって、これらの実施例は本発明の幅広い範囲を制限するものとはけっして理解するべきでない。
【実施例】
【０３０１】
材料および実験方法（実施例１〜２）
（実施例１）  ＬＬＯ−抗原融合が抗腫瘍免疫性を誘発
【０３０２】
細胞株
Ｃ５７ＢＬ／６同系ＴＣ−１腫瘍をＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７で不死化し、ｃ−Ｈａ−ｒａｓガン遺伝子で形質転換した。Ｔ．Ｃ．Ｗｕ（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、米国メリーランド州Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）によって提供されたＴＣ−１は、ＨＰＶ−１６  Ｅ６  および  Ｅ７で低いレベルを発現する腫瘍形成性の高い肺上皮細胞であり、またｃ−Ｈａ−ｒａｓガン遺伝子で形質転換される。ＴＣ−１を、ＲＰＭＩ  １６４０、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００μＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０マイクロモル（ｍｃＭ）の２−ＭＥ、４００マイクログラム（ｍｃｇ）／ｍＬのＧ４１８、および１０％のナショナルコレクションタイプ培養液−１０９培地中、３７°で、１０％のＣＯ２を用いて成長させた。Ｃ３は、ＨＰＶ  １６の完全ゲノムで不死化し、ｐＥＪ−ｒａｓで形質転換されたＣ５７ＢＬ／６マウスからのマウスの胎芽細胞である。ＥＬ−４／Ｅ７は、Ｅ７を用いてレトロウイルスによって形質導入した胸腺腫ＥＬ−４である。
【０３０３】
Ｌ．モノサイトゲネス株および増殖
使用されたリステリア株は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（エピソームの発現系内のｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子、図１Ａ）、Ｌｍ−Ｅ７（リステリアゲノムへと組込まれる単一コピーＥ７遺伝子カセット）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（「ＤＰ−Ｌ２０２８」、エピソーム発現系内のｈｌｙ−ＮＰ融合遺伝子）、およびＬｍ−Ｇａｇ（「ＺＹ−１８」、染色体へと組込まれる単一コピーＨＩＶ−１Ｇａｇ遺伝子カセット）である。Ｅ７を、プライマー５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣ−３’（配列番号：２１、ＸｈｏＩ部位は下線付き）および５’−ＧＧＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡ−３’（配列番号：２１、ＳｐｅＩ部位は下線付き）を使用してＰＣＲによって増幅し、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）へと連結させた。ｐＣＲ２．１をＸｈｏＩ／ＳｐｅＩによって消化してＥ７を切り離してｐＧＧ−５５へと連結した。このｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子および多能性の転写因子ｐｒｆＡをマルチコピーシャトルプラスミド（Ｗｉｒｔｈ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６５：８３１，１９８６）であるｐＡＭ４０１へとクローニングし、ｐＧＧ−５５を生成した。ｈｌｙプロモーターはｈｌｙ遺伝子産物（以下に「ΔＬＬＯ」と称される溶血性のＣ末端を欠いている）の最初の４４１  ＡＡの発現を駆動し、これはＸｈｏＩ部位によってＥ７遺伝子に連結され、ｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子を生じ、これは転写されてＬＬＯ−Ｅ７として分泌される。リステリアのｐｒｆＡ陰性株、ＸＦＬ−７（ペンシルバニア大学のＤｒ．Ｈａｏ  Ｓｈｅｎによって提供された）のｐＧＧ−５５を用いた形質転換が、インビボでのプラスミドの保持に対して選択された（図１Ａ〜図１Ｂ）。ｈｌｙプロモーターおよび遺伝子断片は、プライマー５’−ＧＧＧＧＧＣＴＡＧＣＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＣ−３’（配列番号：２３、ＮｈｅＩ部位は下線付き）、および５’−ＣＴＣＣＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡＴＡＡＴＴＴＡＣＴＴＣＡＴＣ−３’（配列番号：２４、ＸｈｏＩ部位は下線付き）を用いて作成した。ｐｒｆＡ遺伝子は、プライマー５’−ＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧＴＧＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＣＧＴＴＴ−３’（配列番号：２５、ＸｂａＩ部位は下線付き）、および５’−ＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧ−３’（配列番号：２６、ＳａｌＩ部位は下線付き）を用いてＰＣＲ増幅した。Ｌｍ−Ｅ７は、ｈｌｙプロモーターと、Ｅ７の発現および分泌を駆動するシグナル配列とを含有する発現カセットを、ＬＭゲノムのｏｒｆＺドメインへと導入することによって生成した。Ｅ７をプライマー５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣ−３’（配列番号：２７、ＢａｍＨＩ部位は下線付き）および５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧ−３’（配列番号：２８、ＸｂａＩ部位は下線付き）を使用してＰＣＲ増幅した。次いでＥ７をｐＺＹ−２１シャトルベクターへと連結させた。ＬＭ株１０４０３Ｓを、結果として得られるプラスミドｐＺＹ−２１−Ｅ７を用いて形質転換したが、このプラスミドはＬＭゲノムのｏｒｆ��、Ｙ、Ｚドメインに対応する１．６ｋｂ配列の中央に挿入された発現カセットを含む。相同性ドメインは、相同的組み換えによるＥ７遺伝子カセットのｏｒｆＺドメインへの挿入を可能にする。クローンを、Ｅ７遺伝子カセットのｏｒｆＺドメインへの組込みについてスクリーニングした。細菌をブレインハートインフュージョン培地中で、クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）を用いて（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰ）、または用いないで（Ｌｍ−Ｅ７およびＺＹ−１８）、成長させた。細菌は、アリコートで−８０℃にて凍結させた。ウエスタンブロット法によって発現を検証した（図２）。
【０３０４】
ウエスタンブロット法
リステリア株をルリア−ベルターニ培地内で３７℃にて増殖させ、６００ｎｍで測定された同一の光学濃度にて採取した。上清をＴＣＡ沈殿させ、０．１ＮのＮａＯＨを補充した１×サンプルバッファー中で再懸濁した。同一量の各々の細胞ペレットまたは各々のＴＣＡ沈殿させた上清を、４〜２０％のトリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮＯＶＥＸ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）上に負荷した。ゲルを二フッ化ポリビニリデンに移し、抗Ｅ７モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）でプローブし、次いでＨＲＰ−結合抗マウス二次Ａｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、英国Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ）でインキュベートし、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ検出試薬で顕色し、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に露光させた。
【０３０５】
腫瘍増殖の測定
１日おきに表面の最短径及び最長径にキャリパーをわたして腫瘍を測定した。これら２つの測定値の平均を平均腫瘍径としてミリメートルの単位で様々な時点に対してプロットした。腫瘍径が２０ｍｍに達したとき、マウスを犠牲にした。各々の時点に対する腫瘍の測定値は、生きているマウスに対してのみ示されている。
【０３０６】
定着した腫瘍増殖に対するリステリア組み換え型の効果
生後６〜８週目のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）が２×１０５ＴＣ−１細胞を左脇腹の皮下に投与された。腫瘍接種の一週間後、腫瘍は直径４〜５ｍｍの触知可能なサイズに達した。次いで８匹のマウスの群が、７日目および１４日目に、０．１ＬＤ５０腹腔内で、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１０７ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１０６ＣＦＵ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（１０７ＣＦＵ）、またはＬｍ−Ｇａｇ（５×１０５ＣＦＵ）で処置された。
【０３０７】
５１Ｃｒリリースアッセイ
生後６〜８週間のＣ５７ＢＬ／６マウスが、０．１ＬＤ５０Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ、またはＬｍ−Ｇａｇで腹腔内免疫化された。免疫化の１０日後、脾臓を採取した。フィーダー細胞として照射されたＴＣ−１細胞（１００：１、脾細胞：ＴＣ−１）を用いて、脾細胞を培養液内に定着させ、インビトロで５日間刺激し、次いで以下の標的を使用して標準的５１Ｃｒリリースアッセイに使用した。ＥＬ−４、ＥＬ−４／Ｅ７、またはＥＬ−４でパルスしたＥ７  Ｈ−２ｂペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）（配列番号：２９）。各３回実施したＥ：Ｔ細胞比は、８０：１、４０：１、２０：１、１０：１、５：１、および２．５：１であった。３７℃で４時間のインキュベーション後、細胞をペレット化し、５０μｌの上清を各々のウェルから取り出した。Ｗａｌｌａｃ  １４５０シンチレーションカウンター（米国メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を用いてサンプルをアッセイした。パーセント特異的溶解は、［（一分当たりの実験計数（ｃｐｍ）−自然発生ｃｐｍ）／（合計ｃｐｍ−自然発生ｃｐｍ）］×１００として決定された。
【０３０８】
ＴＣ−１特異的増殖
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを０．１ＬＤ５０を用いて免疫化し、２０日後に１ＬＤ５０のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ、またはＬｍ−Ｇａｇを用いて腹腔内注射によってブーストした。ブースティングの６日後、免疫化マウスおよび無処置マウスから脾臓を採取した。脾細胞を５×１０５／ウェルで、平底９６−ウェルプレート内に、２．５×１０４、１．２５×１０４、６×１０３、または３×１０３の照射ＴＣ−１細胞／ウェルをＥ７  Ａｇ源として用いて、またはＴＣ−１細胞なし、もしくは１０μｇ／ｍＬのＣｏｎ  Ａありで、培養液内に定着させた。４５時間後に０．５μＣｉ［３Ｈ］チミジン／ウェルを用いて細胞をパルスした。プレートはＴｏｍｔｅｃハーベスター９６（米国コネチカット州Ｏｒａｎｇｅ）を使用して１８時間後に採取され、Ｗａｌｌａｃ  １４５０シンチレーションカウンターを用いて増殖が評価された。ｃｐｍの変化は、実験的ｃｐｍ−Ａｇを含まないｃｐｍとして計算された。
【０３０９】
フローサイトメトリー解析
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、０．１  ＬＤ５０  Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＬｍ−Ｅ７を用いて静脈内（ｉ．ｖ．）免疫化し、３０日後にブーストした。ＣＤ８（５３−６．７、ＰＥ結合）、ＣＤ６２リガンド（ＣＤ６２Ｌ、ＭＥＬ−１４、ＡＰＣ結合）、およびＥ７  Ｈ−２Ｄｂ四量体に対する３色フローサイトメトリーを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメーターとＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国カリフォルニア州Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、）を使用して実施した。ブーストの５日後に採取した脾細胞を、Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）（配列番号：２９）または対照（ＨＩＶ−Ｇａｇ）ペプチドを負荷したＨ−２Ｄｂ四量体を用いて、室温（ｒｔ）にて染色した。四量体は１／２００に希釈して使用され、これらの四量体は、Ｄｒ．Ｌａｒｒｙ  Ｒ．Ｐｅａｓｅ（Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ、米国ミネソタ州Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）およびＮＩＡＩＤ  Ｔｅｔｒａｍｅｒ  Ｃｏｒｅ  ＦａｃｉｌｉｔｙおよびＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈならびに標準試薬プログラムによって提供された。Ｔｅｔｒａｍｅｒ＋、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞が解析された。
【０３１０】
Ｂ１６Ｆ０−Ｏｖａ実験
２４匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに５×１０５のＢ１６Ｆ０−Ｏｖａ細胞を接種した。３日目、１０日目、および１７日目に、０．１ＬＤ５０Ｌｍ−ＯＶＡ（１０６ｃｆｕ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＯＶＡ（１０８ｃｆｕ）を用いて８匹のマウスの群を免疫化し、８匹のマウスは処置しないままにした。
【０３１１】
統計
腫瘍径の比較のために、各々の群に対する腫瘍サイズの平均およびＳＤが決定され、スチューデントのｔ−検定によって統計的有意性が決定された。ｐ≦０．０５が有意と見なされた。
【０３１２】
結果
Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７がＴＣ−１増殖に影響を与える能力に関して比較された。皮下腫瘍がＣ５７ＢＬ／６マウスの左の脇腹に定着した。７日後、腫瘍は触診可能なサイズ（４〜５ｍｍ）に達した。７日目および１４日目に、０．１ＬＤ５０ｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、または対照としてのＬｍ−ＧａｇおよびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰをマウスにワクチン接種した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、定着したＴＣ−１腫瘍の７５％の完全な退行を誘発し、一方でこの群の中の他の２匹のマウスでは腫瘍増殖が制御された（図３）。対照的に、Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−Ｇａｇを用いた免疫化は、腫瘍退行を誘発しなかった。この実験は複数回繰返され、常に非常に類似した結果であった。加えて、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７に対しては異なる免疫化プロトコル下でも類似の結果が達成された。別の実験では、単一の免疫化で、マウスの定着した５ｍｍのＴＣ−１腫瘍を治癒することができた。
【０３１３】
他の実験では、２つの他のＥ７を発現する腫瘍細胞株：Ｃ３およびＥＬ−４／Ｅ７で類似の結果が得られた。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を用いたワクチン接種の有効性を確認するために、腫瘍を除去した動物にＴＣ−１またはＥＬ−４／Ｅ７腫瘍細胞をそれぞれ６０日目または４０日目に再負荷した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を用いて免疫化した動物は実験終了まで腫瘍がないままであった（ＴＣ−１の場合１２４日目、ＥＬ−４／Ｅ７に対しては５４日目）。
【０３１４】
したがってΔＬＬＯとの融合タンパク質としての抗原の発現は抗原の免疫原性を強化する。
（実施例２）  ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７治療がＴＣ−１特異的脾細胞増殖を引き出す
【０３１５】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を有するＬｍ−Ｅ７によるＴ細胞の誘導を測定するために、Ｅ７特異的な増殖性の応答、抗原特異的な免疫能の測定が免疫化したマウスで測定された。脾細胞においてＥ７の供給源として照射したＴＣ−１細胞に曝露したとき、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で免疫化したマウスからの脾細胞を増殖した。ＴＣ−１比は２０：１、４０：１、８０：１、および１６０：１である（図４）。反対に、Ｌｍ−Ｅ７およびｒＬｍ対照免疫化マウスからの脾細胞はバックグラウンドレベルの増殖しか示さなかった。
（実施例３）ＡｃｔＡ−Ｅ７およびＰＥＳＴ−Ｅ７融合が抗腫瘍免疫性を与える
【０３１６】
材料および実験方法
【０３１７】
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７の構築
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７は、ａｃｔＡタンパク質の切断版に融合されるＥ７タンパク質を発現するプラスミドを含むＬＭの組み換え型株である。Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７は、ｐＤＰ−２０２８を修飾することにより構成されるプラスミドベクターｐＤＤ−１をリステリアに導入することにより生成された。ｐＤＤ−１は、ＡｃｔＡ−Ｅ７の発現および分泌を駆動する３１０ｂｐのｈｌｙプロモーターおよびｈｌｙシグナル配列（ｓｓ）のコピーを発現する発現カセットと、４つのＰＥＳＴ配列を含む１１７０ｂｐのＡｃｔＡ遺伝子（切断ＡｃｔＡポリペプチドは分子の最初の３９０のＡＡから成る）と、３００ｂｐのＨＰＶ  Ｅ７遺伝子と、１０１９ｂｐのｐｒｆＡ遺伝子（病毒性遺伝子の発現を制御）と、形質転換細菌クローンの選択のためのＣＡＴ遺伝子（クロラムフェニコール耐性遺伝子）とを含む（Ｓｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）、Ａｒｃｈ．Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ．、１３０：９２−９７）。
【０３１８】
ｈｌｙプロモーター（ｐＨｌｙ）および遺伝子断片は、ｐＧＧ５５（実施例１）から、プライマー５’−ＧＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＣ−３’（Ｘｂａ  Ｉ部位は下線付き；配列番号：３０）およびプライマー５’−ＡＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＣＴＧＴＣＧＣＣＧＣＧＧＣＧＣＧＴＧＣＴＴＣＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣＧＣ−’３（Ｎｏｔ  Ｉ部位は下線付き。最初の１８ヌクレオチドはＡｃｔＡ遺伝子と重複；配列番号：３１）を使用してＰＣＲ増幅された。ＡｃｔＡ遺伝子は、Ｌｍ  １０４０３Ｓ野生型ゲノムからプライマー５’−ＧＣＧＣＡＡＣＡＡＡＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＧＡＣＡＧＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＴ−３’（ＮｏｔＩ部位は下線付き；配列番号：３２）およびプライマー５’−ＴＧＴＡＧＧＴＧＴＡＴＣＴＣＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴＡＧＧＣＧＡＴＣＡＡＴＴＴＣ−３’（ＸｈｏＩ部位は下線付き；配列番号：３３）を使用してＰＣＲ増幅された。Ｅ７遺伝子は、ｐＧＧ５５（ｐＬＬＯ−Ｅ７）から、プライマー５’−ＧＧＡＡＴＴＧＡＴＣＧＣＣＴＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡ−３’（ＸｈｏＩ部位は下線付き；配列番号：３４）およびプライマー５’−ＡＡＡＣＧＧＡＴＴＴＡＴＴＴＡＧＡＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡ−３’（ＸｍａＩ部位は下線付き；配列番号：３５）を使用してＰＣＲ増幅された。ｐｒｆＡ遺伝子は、Ｌｍ  １０４０３Ｓ野生型ゲノムから、プライマー５’−ＴＧＴＴＣＴＣＡＧＡＡＡＣＣＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＣＧＴＴＴ−３’（ＸｍａＩ部位は下線付き；配列番号：３６）およびプライマー５’−ＧＧＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧ−３’（ＳａｌＩ部位は下線付き；配列番号：３７）を使用してＰＣＲ増幅された。ｈｌｙプロモーター−ＡｃｔＡ遺伝子融合（ｐＨｌｙ−ａｃｔＡ）は、精製したｐＨｌｙ  ＤＮＡおよび精製したＡｃｔＡ  ＤＮＡから、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号：３０）および下流ＡｃｔＡプライマー（配列番号：３３）を使用してＰＣＲ生成および増幅された。
【０３１９】
ｐｒｆＡ遺伝子（Ｅ７−ｐｒｆＡ）に融合されたＥ７遺伝子は、精製したＥ７  ＤＮＡおよび精製したｐｒｆＡ  ＤＮＡから、上流Ｅ７プライマー（配列番号：３４）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号：３７）を使用してＰＣＲ生成および増幅された。
【０３２０】
Ｅ７−ｐｒｆＡ融合生成物に融合されたｐＨｌｙ−ａｃｔＡ融合生成物は、精製した融合ｐＨｌｙ−ａｃｔＡ  ＤＮＡ生成物および精製した融合Ｅ７−ｐｒｆＡ  ＤＮＡ生成物から、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号：３０）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号：３７）を使用してＰＣＲ生成および増幅され、ｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）に連結された。コンピテント大腸菌（ＴＯＰ１０’Ｆ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）は、ｐＣＲＩＩ−ＡｃｔＡＥ７で形質転換された。溶解および分離の後、プラスミドは、ＢａｍＨＩ（期待される断片サイズ７７０ｂｐおよび６４００ｂｐ（またはインサートがベクター：２５００ｂｐおよび４１００ｂｐに反転された時））およびＢｓｔＸＩ（期待される断片サイズ２８００ｂｐおよび３９００ｂｐ）を使用した制限分析によってスクリーニングされ、また上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号：３０）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号：３７）を使用したＰＣＲ分析を用いてスクリーニングされた。
【０３２１】
ｐＨｌｙ−ＡｃｔＡ−Ｅ７−ｐｒｆＡ  ＤＮＡインサートはＸｂａ  ＩおよびＳａｌ  Ｉを用いた二重消化によってｐＣＲＩＩから切り離され、またこれもＸｂａ  Ｉ  および  Ｓａｌ  Ｉを用いて消化されたｐＤＰ−２０２８へと連結された。ＴＯＰ１０’Ｆ構成要素大腸菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）を発現系ｐＡｃｔＡＥ７で形質転換した後、クロラムフェニコール耐性クローンが、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号：３０）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号：３７）を使用してＰＣＲ分析によってスクリーニングされた。。ｐＡｃｔＡＥ７を含むクローンがブレインハートインフュージョン培地（クロラムフェニコール（２０ｍｃｇ（マイクログラム）／ｍｌ（ミリリットル）、Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈ．を使用）内で培養され、ｐＡｃｔＡＥ７がミディプレップＤＮＡ精製システムキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）を使用して細菌細胞から分離された。ペニシリン処置したリステリア（株ＸＦＬ−７）のｐｒｆＡ陰性株は、Ｉｋｏｎｏｍｉｄｉｓら（１９９４、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２２０９−２２１８）が記述しているように発現系ｐＡｃｔＡＥ７を用いて形質転換され、クローンはプラスミドの保持のためにインビボで選択された。クローンをクロラムフェニコール（２０ｍｃｇ／ｍＬ）入りのブレインハートインフュージョン中で３７℃にて増殖させた。細菌をアリコートで−８０℃にて凍結した。
【０３２２】
抗原発現のイムノブロット検証
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７がＡｃｔＡ−Ｅ７を分泌する（約６４ｋＤ）ことを検証するために、リステリア株をルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地中で３７℃にて増殖させた。トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いて培養上清からタンパク質を沈殿させ、０．１Ｎの水酸化ナトリウムを用いて１×サンプルバッファー中に再懸濁した。同一の量の各々のＴＣＡ沈殿した上清を４％〜２０％のトリスグリシンドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（ＮＯＶＥＸ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）に負荷した。ゲルを二フッ化ポリビニリデン膜に導入し、１：２５００抗Ｅ７モノクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）でプローブし、次いで１：５０００西洋ワサビペルオキシダーゼ共役抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、英国、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ）でプローブした。ブロットはＡｍｅｒｓｈａｍ強化化学発光検出試薬を用いて発色させ、オートラジオグラフィーフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に曝露した（図５Ａ）。
【０３２３】
Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−Ｅ７ｅｐｉの構築（図６Ａ）
Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、それがプロモーターおよびｈｌｙ遺伝子のＰＥＳＴ配列のみ、特にＬＬＯの最初の５０個のＡＡを含有すること以外はＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と同一である。Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７を構築するために、ＳＯＥ（重複延長による遺伝子スプライシング）ＰＣＲ技法を使用して、ｈｌｙプロモーターおよびＰＥＳＴ領域を全長のＥ７遺伝子に融合した。Ｅ７遺伝子およびｈｌｙ−ＰＥＳＴ遺伝子断片をＬＬＯの最初の４４１個のＡＡを含有するプラスミドｐＧＧ−５５から増幅し、従来のＰＣＲ技法によって一緒にスプライシングした。最終的なプラスミドｐＶＳ１６．５を作り出すために、ｈｌｙ−ＰＥＳＴ−Ｅ７断片およびｐｒｆＡ遺伝子を、インビトロでの選択のためのクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むプラスミドｐＡＭ４０１へとサブクローンし、得られたプラスミドを使用してＸＦＬ−７を形質転換した。
【０３２４】
Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７は、それがＰＥＳＴ配列を欠いていること以外は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と同一である組み換え型リステリア株である。これは、ＰＥＳＴ含有領域（ｂｐ３３３−３８７）をｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子から除去するために設計されたプライマーを使用してエピソーム発現系を構築した以外は、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７について本質的に記載されたように作成された。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、ＰＥＳＴ領域またはＬＬＯなしでＥ７を分泌する組み換え型株である。この株を形質転換するのに用いるプラスミドは、ｈｌｙプロモーターの遺伝子断片、およびＥ７遺伝子に融合したシグナル配列を含有する。この構築体は、染色体の中へと組み込まれたＥ７遺伝子の単一コピーを発現する本来のＬｍ−Ｅ７とは異なる。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、発現されたＥ７抗原の形態を除いて、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７と完全に同系である。
【０３２５】
結果
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７対Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７によって誘発した抗腫瘍免疫性を比較するために、２×１０５ＴＣ−１腫瘍細胞をマウス内に皮下移植し、触知可能サイズ（おおよそ５ミリメートル［ｍｍ］）まで増殖させた。７日目および１４日目に、マウスをＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（５×１０８ＣＦＵ）（十字）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１０８ＣＦＵ）（四角）、またはＬｍ−Ｅ７（１０６ＣＦＵ）（丸）いずれかの１つのＬＤ５０でマウスを腹腔内で免疫化した。２６日目までに、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７でのすべての動物は腫瘍がなく、そのままであったが、一方ですべての無処置の動物（三角）およびＬｍ−Ｅ７で免疫化した動物は大きい腫瘍を成長させた（図５Ｂ）。したがって、ＡｃｔＡ−Ｅ７融合でのワクチン接種は腫瘍退行を生じさせる。
【０３２６】
加えて、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−Ｅ７ｅｐｉを、Ｅ７発現腫瘍の退行を生じさせるそれらの能力について比較した。皮下  ＴＣ−１腫瘍は４０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの左脇腹に定着した。腫瘍が４〜５ｍｍに達した後、マウスを８匹のマウスの５つの群に分けた。各々の群を４つの組み換え型ＬＭワクチンのうちの１つで処置し、１つの群は未処置のまま放置した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、それぞれ５／８および３／８の事例では定着した腫瘍の退行を誘発した。いずれの時点においても、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７またはＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で処置したマウスの平均腫瘍サイズの間に統計的な差はなかった。しかしながら、ＰＥＳＴ配列、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−Ｅ７ｅｐｉを含まないＥ７を発現したワクチンは、１つを除いて全てのマウスで腫瘍退行を生じなかった（図６Ｂ、上のパネル）。これは２つの実験の代表であり、２８日目における平均腫瘍サイズの統計的に有意な差がＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７で処置した腫瘍とＬｍ−Ｅ７ｅｐｉまたはＬｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７で処置した腫瘍との間で観察された（Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定；図６Ｂ、下のパネル）。加えて、四量体陽性脾細胞のパーセンテージの増大は、ＰＥＳＴ含有ワクチンをワクチン接種したマウスの脾臓における３つの実験にわたって再現性が見られた（図６Ｃ）。したがって、ＰＥＳＴ−Ｅ７融合を用いたワクチン接種は腫瘍退行を生じさせる。
（実施例４）ＬＬＯ、ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ様配列へのＥ７の融合はＥ７特異的な免疫性を強化し、腫瘍浸潤Ｅ７特異的ＣＤ８＋細胞を発生させる
【０３２７】
材料および実験方法
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１００ｍｃｌ（マイクロリットル）の２×１０５ＴＣ−１腫瘍細胞に加えて４００ｍｃｌのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ）を含む５００ｍｃｌのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）を１２匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの左脇腹に皮下移植した（ｎ＝３）。マウスを７日目、１４日目、および２１日目に腹腔内免疫し、脾臓および腫瘍を２８日目に採取した。腫瘍ＭＡＴＲＩＧＥＬをマウスから取り出し、氷上で、２ミリリットル（ｍＬ）のＲＰ  １０培地を含有する試験管内で４℃にて一晩インキュベートした。腫瘍を鉗子を用いて細かく切り刻み、２ｍｍのブロックに切断し、３ｍＬの酵素混合物（ＰＢＳ中の０．２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＰ、１ｍｇ／ｍＬのＤＮＡｓｅ−１）とともに３７℃で１時間インキュベートした。組織懸濁液を、ナイロンメッシュを通して濾過し、四量体およびＩＦＮ−γ染色のために、ＰＢＳ中の５％胎児ウシ血清＋０．０５％のＮａＮ３で洗浄した。
【０３２８】
脾細胞および腫瘍細胞を１０７細胞／ｍＬのブレフェルジンＡの存在下で、１マイクロモル（ｍｃｍ）のＥ７ペプチドと共に５時間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、５０ｍｃｌの抗マウスＦｃ受容体上清（２．４  Ｇ２）中、４℃で１時間または一晩インキュベートした。細胞を表面分子ＣＤ８およびＣＤ６２Ｌについて染色し、浸透させ、浸透キットＧｏｌｇｉ−ｓｔｏｐ（登録商標）またはＧｏｌｇｉ−Ｐｌｕｇ（登録商標）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を使用して固定し、ＩＦＮ−γに対して染色した。５００，０００事象を２レーザーフローサイトメーター、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを使用して獲得し、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ）を使用して分析した。活性化（ＣＤ６２Ｌｌｏｗ）ＣＤ８＋Ｔ細胞内のＩＦＮ−γ分泌細胞のパーセンテージを計算した。
【０３２９】
四量体染色のために、Ｈ−２Ｄｂ四量体にフィコエリスリン（ＰＥ）結合Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、配列番号：２７）を負荷し、室温で１時間染色し、抗アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合ＭＥＬ−１４（ＣＤ６２Ｌ）およびＦＩＴＣ−結合ＣＤ８＋で４℃にて３０分間染色した。脾臓および腫瘍内の四量体＋ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞を比較して細胞を解析した。
【０３３０】
結果
抗原特異的免疫性を強化するＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７の能力を解析するために、マウスにＴＣ−１腫瘍細胞を移植し、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０７ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１×１０６ＣＦＵ）、またはＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（２×１０８ＣＦＵ）のいずれかで免疫化するか、あるいは未処置とした（無処置）。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７群からのマウスの腫瘍は、Ｌｍ−Ｅ７または無処置マウスにおけるよりも、より高いパーセンテージのＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞（図７Ａ）および四量体特異的なＣＤ８＋細胞（図７Ｂ）を含有した。
【０３３１】
別の実験では、腫瘍を持つマウスにＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、またはＬｍ−Ｅ７ｅｐｉを投与し、腫瘍の中のＥ７特異的リンパ球のレベルを測定した。０．１ＬＤ５０の４つのワクチンを用いて、７日目および１４日目にマウスを処置した。腫瘍を２１日目に採取し、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８に対する抗体を用いて、およびＥ７／Ｄｂ四量体を用いて染色した。腫瘍内の四量体陽性リンパ球のパーセンテージの増大が、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７を用いてワクチン接種したマウスで見られた（図８Ａ）。この結果は３つの実験にわたって再現性があった（図８Ｂ）。
【０３３２】
したがって、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７、およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導および腫瘍退行において各々有効である。
材料および実験方法（実施例５〜１０）
【０３３３】
細菌株、形質転換、および選択
大腸菌株ＭＢ２１５９が、標準的なプロトコルを使用して、形質転換のために使用された。細菌細胞は、Ｈ２Ｏを用いた洗浄によって電気穿孔法のために準備された。
【０３３４】
大腸菌株ＭＢ２１５９（Ｓｔｒｙｃｈ  Ｕ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２００１  Ｍａｒ  １５；１９６（２）：９３−８）は、Ｄ−アラニン・ラセマーゼを合成することができないａｌｒ（−）／ｄａｄＸ（−）欠損突然変異体である。同様に、リステリア株Ｌｍ  ｄａｌ（−）／ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）は、ｄａｌ遺伝子およびｄａｔ遺伝子の部分的な欠失に起因してＤ−アラニン・ラセマーゼを合成することができない。
【０３３５】
プラスミド構築
公開されているｐｌｃＡ遺伝子の配列（Ｍｅｎｇａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．１９８９  ５７、３６９５−３７０１）を使用して、染色体ＤＮＡから遺伝子を増幅するためにＰＣＲが使用された。次いで、増幅された製品はＳａｌＩを生成したおよびＸｂａＩを生成したＤＮＡ端部を使用してｐＡＭ４０１へと連結され、ｐＤＰ１４６２を生成する。
【０３３６】
ｐｒｆＡを単独で含有するプラスミドｐＤＰ１５００は、ｐＤＰ１４６２から、ｐｌｃＡ遺伝子、塩基４２９〜１３４９（Ｍｅｎｇａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．、同上）を除去することによって、ＸｂａＩおよびＰｓｔＩを用いた制限、それらを鈍らせるためのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用したＤＮＡ端部の処置、および細胞内連結の後、構造化される。
【０３３７】
ｐｌｃＡプロモーターおよびｐｌｃＡの３’端部の一部を含有するプラスミドｐＤＰ１４９９は、ｐｌｃＡ内部断片、塩基４２８〜８８２（Ｍｅｎｇａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９８９  ５７，３６９５−３７０１）を除去することによって、ｐＤＰ１３３９から、ＰｓｔＩおよびＮｓｉＩを用いた制限、および細胞内連結の後、構造化された。      
【０３３８】
ｐＤＰ１５２６（ｐＫＳＶ７：：ΔｐｌｃＡ）は、ＢＡＭＨＩおよびＸｂａＩ、４６８ｂｐのｐｌｃＡの５’端部を含有するｐＡＭ４０１：：ｐｌｃＡからのＸｂａＩおよびＮｓｉＩで生成した断片（塩基８８２〜１３５１、Ｍｅｎｇａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．、同上）、および５０１ｂｐのｐｌｃＡの３’端部を含有するｐＡＭ４０１：：ｐｌｃＡ  ｐｒｆＡからのＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで生成した断片（塩基７７〜４２９、Ｍｅｎｇａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．、同上）で制限されたｐＫＳＶ７の単一の３部分からなる連結によって構造化された。
【０３３９】
ｐｒｆＡプロモーター、塩基１〜４２９（Ｍｅｎｇａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．、同上）は、ｐＤＰ１４６２のＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ二重消化によって分離され、またこれに続いて断片はＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで制限されたｐＫＳＶ７へと連結され、ｐＤＰ１４９８を生成した。２つのランダムにＨｉｎｄＩＩＩで生成した長さがおよそ３ｋｂである１０４０３Ｓ染色体ＤＮＡ断片は、ＨｉｎｄＩＩＩで制限されたｐＫＳＶ７へと連結され、ランダム組み込み対照プラスミドｐＤＰ１５１９およびｐＤＰ１５２１を生成した。
【０３４０】
Ｌ．モノサイトゲネス突然変異体株の構築
Ｌ．モノサイトゲネス株ＤＰ−Ｌ１３８７は、構造化されたＳＬＣＣ  ５７６４のＴｎ９１７−ＬＴＶ３バンクから、減少したレシチナーゼ（ＰＣ−ＰＬＣ）を用いて突然変異体として分離された（前述されているように（Ｃａｍｉｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９０，１７２，３７３８−３７４４）。Ｔｎ９１７−ＬＴＶ３挿入の部位はトランスポゾン染色体ＤＮＡ結合をシークエンシングすることによって決定される（前述されているように（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９９０  ５８，３７７０−３７７８）。Ｌ．モノサイトゲネスはプラスミドＤＮＡを用いて形質転換される（前述されているように（Ｃａｍｉｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、同上））。Ｌ．モノサイトゲネス内のｐＡＭ４０１、ｐＫＳＶ７、およびこれらの誘導体の維持のための選択的な圧力が、培地１ｍＬ当たり１０μｇのクロラムフェニコールの存在下でかけられた。加えて、ｐＫＳＶ７誘導体の維持は、３０℃（グラム陽性細菌内でのプラスミド複製のために許容できる温度）における増殖を必要とした。    
【０３４１】
Ｌ．モノサイトゲネス染色体の中へのｐＫＳＶ７誘導体の組み込みは、プラスミド上のＬ．モノサイトゲネスＤＮＡ配列とこれらの対応する染色体の対立遺伝子との間の相同的組み換えによってによって生じた。組込突然変異体は、培地１ｍＬあたり１０μｇのクロラムフェニコールを含有するブレインハートインフージョン（ＢＨＩ）培地中で４０℃（ｐＫＳＶ７の複製を許容しない温度）にておよそ３０世代の間増殖することによって富化された。これに続いて各々の組込み株を、培地１ｍＬあたり１０μｇのクロラムフェニコールを含有するＢＨＩ寒天培養基上でコロニー精製し、４０℃にてインキュベートした。各々の組込み株から分離された染色体ＤＮＡのサザンブロット解析は組込まれたプラスミドの存在を確認した。
【０３４２】
ＤＰ−Ｌ１５５２の構築は、上述のように、部分二倍体中間体を生成するためのｐＫＳＶ７誘導体ｐＤＰ１５２６の組込みによって達成された。組込まれたプラスミドの細胞内の相同的組み換えを通した自然発生的な切り離しが低い頻度で生じる。プラスミドが染色体から切り離された細菌を、ＢＨＩ培地中で３０℃におけるおよそ５０世代の間の増殖によって濃縮した。この工程の間の選択圧の特性は、未知であるが、組込まれている温度感応性プラスミドを含有する株のわずかな増殖欠陥に起因しているかもしれない。切り離し事象、すなわち３’の欠失の配列の間の相同的組み換えから結果として得られもののおよそ５０％は、結果として染色体上の野生型対立遺伝子に対するΔｐｌｃＡの対立遺伝子の交換を生じる。
【０３４３】
切り離されたプラスミドは細菌をＢＨＩ中で４０℃にておよそ３０世代増殖することによって回復される。染色体上にΔｐｌｃＡ対立遺伝子を保持するプラスミドから回復した細菌は、ＢＨＩ寒天培養基／２．５％の卵黄／２．５％のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＢＨＩ／卵黄寒天培養基）の５ｍＬの覆いを含有するＢＨＩ寒天培養基プレート上で増殖した後、コロニーを包囲する濁ったゾーンを生成できないことによって識別される。濁りゾーンは、卵黄中のＰＩのＰＩ−ＰＬＣ加水分解の結果から生じ、不溶性のジアシルグリセロールの沈殿が得られる。Ｌ．モノサイトゲネス染色体上の正しいｐｌｃＡ欠失は、ＰＣＲおよび欠失にわたる配列決定を使用して欠失した対立遺伝子を増幅することによって確認される。
【０３４４】
したがって、ＰＩ−ＰＬＣ陰性突然変異体（ｐｌｃＡ欠失突然変異体）は、本開示により弱毒化Ｌ．モノサイトゲネスワクチンを生成するために使用される場合がある。他の突然変異体、すなわち、ａｃｔＡ欠失突然変異体、ｐｌｃＢ欠失突然変異体、およびｐｌｃＡとｐｌｃＢとの両方を欠いている二重変異体が同じ方法を使用して作成され、これらのすべては、弱毒化Ｌ．モノサイトゲネスワクチンを生成するためにも本開示により使用されてもよい。本開示が与えられると、当業者は上述のものに加えて他の弱毒化突然変異体を作り出すことができることになる。
【０３４５】
Ｌｍｄｄの構築
ｄａｌ遺伝子は、本来の８５０−ｂｐｄａｌ遺伝子ＰＣＲ産物の５’端部からの４５０−ｂｐ断片とｄａｌ遺伝子ＰＣＲ産物の３’端部からの４５０−ｂｐ断片との間に、染色体遺伝子とエリスロマイシン耐性遺伝子を担持する温度感受性シャトルプラスミドｐＫＳＶ７（Ｓｍｉｔｈ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．１９９２  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；７４（７−８）：７０５−１１）との間の二重の対立遺伝子交換によって、当初不活性化されていた。これに続いて、遺伝子の８２％をカバーするｄａｌ欠失突然変異体は、相同性領域を望ましい欠失を包囲する無傷の遺伝子（遺伝子の上流および下流の配列を含む）の５’および３’端部から搬送するｐＫＳＶ７を用いた類似の交換反応によって構造化された。ＰＣＲ解析は、この染色体の欠失の構造を確認するために使用される。
【０３４６】
染色体のｄａｔ遺伝子は、類似の対立遺伝子交換反応によって不活性化される。ｐＫＳＶ７は、無傷のｄａｔ遺伝子の５’および３’の両方の端部からＰＣＲに由来する４５０ｂｐの断片を搬送するように修正される（配列の上流および下流の遺伝子を含む）。これらの２つの断片は適切なＰＣＲによって連結される。この構築体の染色体の中への交換は、結果としてＰＣＲ解析によって確認されたｄａｔ遺伝子の中心塩基の３０％の欠失をもたらす。
【０３４７】
細菌培養およびリステリアのインビボ継代
大腸菌は以下の標準的な方法で培養された。リステリアをＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ、米国ミシガン州Ｄｅｔｒｏｉｔ）＋５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンの中で２５０ｒｐｍのシェーキングで３７℃にて増殖させ、対数増殖フェーズの間に採取した。Ｌｍ−ＬＬＯＥ７については、３７μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールが培地に追加された。増殖速度論の決定のために、細菌を１０ｍＬのＬＢ＋抗生剤中で１６時間の間増殖させた。ＯＤ６００ｎｍが測定され、培養液密度が株の間で標準化された。培養液はＬＢ＋の好適な抗生物質および適用可能な場合はＤ−アラニン中へ１：５０に希釈された。
【０３４８】
マウス中でのＬＭの継代
１×１０８ＣＦＵをＣ５７ＢＬ／６マウスの中に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。３日目に脾臓を分離し、ＰＢＳ中で均質化した。脾臓懸濁液のアリコートをＬＢプレート上に適用可能な抗生物質と共にプレーティングした。いくつかのコロニーが拡張し、混合して注射ストックを定着した。
【０３４９】
抗生物質抵抗性因子を有しないプラスミドｐＴＶ３の構築
ｐ６０−ｄａｌカセットの構築。抗生物質抵抗性遺伝子を有しないベクターの構築での第１の工程は、切断ｐ６０プロモーターの融合のｄａｌ遺伝子への構築である。ＬＭアラニン・ラセマーゼ（ｄａｌ）遺伝子（フォワードプライマー：５’−ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＡＴＣ−３’；配列番号：３８）（リバースプライマー：５’−ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＣＴＡ  ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＧＴＡ  ＴＴＴ  ＴＣＴ  ＡＧＧ−３’；配列番号：３９）および最小限のｐ６０プロモーター配列（フォワードプライマー：５’−ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＡＡＣ  ＡＡＡタグＴＴＧ  ＧＴＡタグＴＣＣ−３’；配列番号：４０）（リバースプライマー：５’−ＧＡＣ  ＧＡＴ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＡＣＴ  ＣＣＴ  ＣＴＣ−３’；配列番号：４１）は、ＰＣＲ増幅によってＬＭ株１０４０３Ｓのゲノムから分離される。プライマーは、重なった延長部の接合（ＳＯＥ）−ＰＣＲによるｐ６０およびｄａｌのこれに続く融合のために、ｐ６０配列の上流ＰａｃＩ部位と、ｄａｌ配列の下流のＮｈｅＩ部位（制限部位を太字で示す）と、ｐ６０プロモーターの下流の重なっているｄａｌ配列（最初の１８ｂｐ）とを導入した。切断ｐ６０プロモーターの配列は以下のとおりである。    ＣＡＡＡＴＡＧＴＴＧＧＴＡＴＡＧＴＣＣＴＣＴＴＴＡＧＣＣＴＴＴＧＧＡＧＴＡＴＴＡＴＣＴＣＡＴＣＡＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＴＧＧＧＴＡＡＡＣＴＴＡＧＴＡＴＴＡＴＣＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＴＡＣＴＴＡＡＴＴＡＣＧＴＡＣＴＧＧＧＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＣＣ（配列番号：４２）（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７３：４６６８−７４、１９９１）。ＳＯＥ−ＰＣＲを使用して、ｐ６０およびｄａｌ  ＰＣＲ産物はクローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）へと融合およびクローニングされる。
【０３５０】
抗生物質抵抗性遺伝子のｐＧＧ５５からの除去。これに続くｐＧＧ５５からクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を除去するためおよびｐ６０−ｄａｌカセットを導入するためのクローニング戦略は、グラム陽性複製領域（ｏｒｉＲｅｐ；  Ｂｒａｎｔｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １８：４７８３−４７９０，１９９０）の除去も間欠的にもたらす。グラム陽性ｏｒｉＲｅｐを再導入するために、配列（ＧＧＣＧＣＣＡＣＴＡＡＣＴＣＡＡＣＧＣＴＡＧＴＡＧ、配列番号：４３）の上流にＮａｒＩ／ＥｈｅＩ部位を追加する５’プライマー、および配列（ＧＣＴＡＧＣＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣＡＡＡＣＡＣＧ、配列番号：４４）の下流にＮｈｅＩ部位を追加する３’プライマーを使用して、ｐＧＧ５５からｏｒｉＲｅｐをＰＣＲ増幅する。ＰＣＲ産物はクローニングベクターｐＣＲ２．１の中へとクローニングされ、配列が検証された。
【０３５１】
ｐ６０−ｄａｌ配列をｐＧＧ５５ベクターの中へと組込むために、ｐ６０−ｄａｌ発現カセットはＰａｃＩ／ＮｈｅＩ二重消化によってｐＣＲ−ｐ６０ｄａｌから切り離された。ｐＧＧ５５内のグラム陽性細菌に対する複製領域は、追加的な制限部位をＥｈｅＩおよびＮｈｅＩ対して導入するために、ｐＣＲ−ｏｒｉＲｅｐからＰＣＲによって増幅される（プライマー１、５’−ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＣＡＣ  ＣＧＧ  ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＴＡＡ  ＣＴＣ  ＡＡＣ  ＧＣＴ  ＡＧＴ  ＡＧ−３’；配列番号：４５）；（プライマー２、５’−ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＡＡＧ  ＣＴＡ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＡＡＡ  ＣＡＡ  ＡＣＡ  ＣＧ−３’；配列番号：４６）。ＰＣＲ産物はｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）へと連結され、配列は検証された。複製領域はＥｈｅＩ／ＮｈｅＩ消化によって切り離され、ベクターｐＧＧ５５はＥｈｅＩおよびＮｈｅＩで二重消化され、両方のＣＡＴ遺伝子をプラスミドから同時に除去する。２つのインサート、ｐ６０−ｄａｌおよびｏｒｉＲｅｐ、ならびにｐＧＧ５５断片は一緒に連結され、ｐＴＶ３を産する（図９）。ｐＴＶ３はｐｒｆＡ（病原性調節因子Ａ）遺伝子も含有する。この遺伝子はｐＴＶ３の機能のためには必要ないが、追加的な選択されたマーカーが必要かまたは望ましい状況では使用することができる。
【０３５２】
リアルタイムＰＣＲのためのＤＮＡの準備
総リステリアＤＮＡはＭａｓｔｅｒｐｕｒｅ（登録商標）Ｔｏｔａｌ  ＤＮＡ  ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、米国ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を使用して準備された。リステリアは２４時間の間３７℃にて培養されてから、２５ｍＬのルリア−ベルターニ培地（ＬＢ）中で２５０ｒｐｍで振盪された。細菌細胞は遠心分離によってペレット化され、５ｍｇ／ｍＬのリゾチームで補足されたＰＢＳ中で再懸濁されてから、３７℃にて２０分の間インキュベートされ、その後ＤＮＡが分離された。
【０３５３】
リアルタイムＰＣＲのための標準的な標的ＤＮＡを得るために、ＬＬＯ−Ｅ７遺伝子をｐＧＧ５５（５’−ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＧＣＴＡＧＴＴＴＴＴＡＴＴＡＣ−３’（配列番号：４７）；５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧ  ＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧ−３’（配列番号：４８））からＰＣＲ増幅し、そしてベクターｐＥＴｂｌｕｅ１（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）へとクローニングした。同様に、ｐｌｃＡアンプリコンはｐＣＲ２．１へとクローニングされる。大腸菌はｐＥＴ−ＬＬＯＥ７およびｐＣＲ−ｐｌｃＡでそれぞれ形質転換されてから、精製されたプラスミドＤＮＡはリアルタイムＰＣＲで使用するために準備された。
【０３５４】
リアルタイムＰＣＲ
Ｔａｑｍａｎプライマープローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）は、プラスミド標的としてＥ７を用いてＡＢＩ  ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するように設計され、以下のプライマー、５’−ＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧ−３’（配列番号：４９）；５’−ＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＡ−３’（配列番号：５０）；５’−ＦＡＭ−ＴＧＣＧＴＡ  ＣＡＡＡＧＣＡＣＡＣＡＣＧＴＡＧＡＣＡＴＴＣＧＴＡＣ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号：５１）、およびワンコピー遺伝子ｐｌｃＡ（ＴＧＡＣＡＴＣＧＴＴＴＧＴＧＴＴＴＧＡＧＣＴＡＧ−３’（配列番号：５２）、５’−ＧＣＡＧＣＧＣＴＣＴＣＴＡＴＡＣＣＡＧＧＴＡＣ−３’（配列番号：５３）；５’−ＴＥＴ−ＴＴＡＡＴＧＴＣＣＡＴＧＴＴＡ  ＴＧＴＣＴＣＣＧＴＴＡＴＡＧＣＴＣＡＴＣＧＴＡ−ＴＡＭＲＡ−３’；配列番号：５４）をリステリアゲノム標的として使用する。
【０３５５】
０．４μＭのプライマーおよび０．０５ｍＭのプローブを、製造業者による推奨に従ってＰｕＲＥ  Ｔａｑ  ＲＴＧ  ＰＣＲビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、米国ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）と混合した。各々の標的に対して精製したプラスミドＤＮＡ、ｐＥＴ−ＬＬＯＥ７、およびｐＣＲ−ｐｌｃＡ（内部標準）を用いて標準曲線が準備され、既知のサンプルにおいて遺伝子コピー番号を計算するために使用された。Ｅ７コピー／ｐｌｃＡコピーの平均比は、標準曲線に基づいて計算され、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３およびＬｍ−ＬＬＯＥ７に対する結果をＬｍ−Ｅ７（ゲノムの中へと組込まれたＥ７遺伝子のシングルコピーを有するリステリア株）からの結果で割ることによって較正された。すべてのサンプルを各々のｑＰＣＲアッセイ中で３回実行し、これは３回繰り返された。サンプル間の変化を、ＫｙＰｌｏｔソフトウェアを使用するＴｗｏ−Ｗａｙ  ＡＮＯＶＡによって解析した。ｐ＜０．０５の場合、結果は統計的に有意であると見なされた。
【０３５６】
増殖の測定
細菌を３７℃にて、２５０ｒｐｍのシェーキングで、ルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地＋／−１００マイクログラム（μｇ）／ｍＬのＤ−アラニンおよび／または３７μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール中で増殖させた。開始種材料はＯＤ６００ｎｍの測定値に基づいて、すべての株に対して同じとなるように調節された。
【０３５７】
溶血性溶解アッセイ
４×１０９ＣＦＵのリステリアが解凍され、遠心分離（１分間、１４０００ｒｐｍ）によってペレット化され、１Ｍのシステインを有する１００μＬのＰＢＳ（ｐＨ５．５）中で再懸濁された。細菌は、１：２で段階希釈され、分泌されたＬＬＯを活性化するために３７℃にて４５分間インキュベートされた。線維素を取り除いたヒツジ全血（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、Ｈｏｒｎｂｙ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を５倍量のＰＢＳで２回洗浄し、上清が透明のままになるまで６倍量のＰＢＳ−システインで３〜４回洗浄し、洗浄工程の間に３０００×ｇで８分間細胞をペレット化し、次いで１０％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにＰＢＳ−システイン中で再懸濁した。１００μｌの１０％洗浄血液細胞を１００μｌのリステリア懸濁液と混合し、さらに３７℃にて４５分間インキュベートした。次いで溶解していない血液細胞を遠心分離（１０分間、１０００×ｇ）によってペレット化した。１００μｌの上清を新しいプレートの中へと移し、ＯＤ５３０ｎｍが決定され、サンプル希釈に対してプロットされた。
【０３５８】
Ｌｍｄｄ−Ｔｖ３の治療的有効性  
１０５ＴＣ−１（ＡＴＣＣ、米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）をＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝８）の皮下に移植し、約７日間増殖させ、その後腫瘍は触知可能になった。ＴＣ−１は、ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７で不死化したＣ５７ＢＬ／６上皮細胞株であり、また皮下移植すると腫瘍を形成する活性化したｒａｓを用いて形質転換されている。マウスは、腫瘍細胞の移植後７日目および１４日目に０．１ＬＤ５０の適切なリステリア株で免疫化されている。非免疫化対照群（無処置）も含まれた。腫瘍増殖は電子カリパスを用いて測定された。
【０３５９】
ＡｃｔＡ欠失突然変異体の発生
Ｌｍｄａｌ  ｄａｔ（Ｌｍｄｄ）株は、病毒性因子、ＡｃｔＡの不可逆的な欠失によって弱毒化された。ａｃｔＡのＬｍｄａｌｄａｔ（Ｌｍｄｄ）バックグラウンド内でのインフレーム欠失は、下流遺伝子発現上のあらゆる極性効果を避けるように構造化された。Ｌｍｄａｌ  ｄａｔΔａｃｔＡは、ＡｃｔＡの５９１アミノ酸の欠失によるＮ末端における最初の１９アミノ酸およびＣ末端の２８アミノ酸残基を含有する。染色体スポットの中への遺伝子の欠失が、ａｃｔＡ欠失領域の外部をアニーリングするプライマーを使用して検証された。これらは、図１２に示すように、プライマー３（Ａｄｖ３０５−ｔｇｇｇａｔｇｇｃｃａａｇａａａｔｔｃ）（配列番号：５５）および４（Ａｄｖ３０４−ｃｔａｃｃａｔｇｔｃｔｔｃｃｇｔｔｇｃｔｔｇ）（配列番号：５６）である。ＰＣＲ解析をＬｍｄｄおよびＬｍ−ｄｄΔＡｃｔＡから分離された染色体ＤＮＡ上で実施した。Ｌｍ−ｄｄ染色体のＤＮＡ内のプライマー対１、２および３、４の２つの異なるセットで増幅した後のＤＮＡ断片のサイズは、３．０Ｋｂおよび３．４Ｋｂとなると予想された。しかしながら、Ｌｍ−ｄｄΔａｃｔＡについては、プライマーの対１、２および３、４を使用するＰＣＲの予想されるサイズは、１．２Ｋｂおよび１．６Ｋｂである。したがって、図１２のＰＣＲ解析はａｃｔＡの１．８ｋｂ領域は株、Ｌｍ−ｄｄΔａｃｔＡ内では除去されていることを確認する。ＤＮＡ配列決定を、株、Ｌｍ−ｄｄΔａｃｔＡ（図１３、配列番号：５７）内の領域を含有するａｃｔＡの欠失を確認するためにＰＣＲ産物上でも実施した。
【０３６０】
ｇｃｇｃｃａａａｔｃａｔｔｇｇｔｔｇａｔｔｇｇｔｇａｇｇａｔｇｔｃｔｇｔｇｔｇｃｇｔｇｇｇｔｃｇｃｇａｇａｔｇｇｇｃｇａａｔａａｇａａｇｃａｔｔａａａｇａｔｃｃｔｇａｃａａａｔａｔａａｔｃａａｇｃｇｇｃｔｃａｔａｔｇａａａｇａｔｔａｃｇａａｔｃｇｃｔｔｃｃａｃｔｃａｃａｇａｇｇａａｇｇｃｇａｃｔｇｇｇｇｃｇｇａｇｔｔｃａｔｔａｔａａｔａｇｔｇｇｔａｔｃｃｃｇａａｔａａａｇｃａｇｃｃｔａｔａａｔａｃｔａｔｃａｃｔａａａｃｔｔｇｇａａａａｇａａａａａａｃａｇａａｃａｇｃｔｔｔａｔｔｔｔｃｇｃｇｃｃｔｔａａａｇｔａｃｔａｔｔｔａａｃｇａａａａａａｔｃｃｃａｇｔｔｔａｃｃｇａｔｇｃｇａａａａａａｇｃｇｃｔｔｃａａｃａａｇｃａｇｃｇａａａｇａｔｔｔａｔａｔｇｇｔｇａａｇａｔｇｃｔｔｃｔａａａａａａｇｔｔｇｃｔｇａａｇｃｔｔｇｇｇａａｇｃａｇｔｔｇｇｇｇｔｔａａｃｔｇａｔｔａａｃａａａｔｇｔｔａｇａｇａａａａａｔｔａａｔｔｃｔｃｃａａｇｔｇａｔａｔｔｃｔｔａａａａｔａａｔｔｃａｔｇａａｔａｔｔｔｔｔｔｃｔｔａｔａｔｔａｇｃｔａａｔｔａａｇａａｇａｔａａｃｔａａｃｔｇｃｔａａｔｃｃａａｔｔｔｔｔａａｃｇｇａａｃａａａｔｔａｇｔｇａａａａｔｇａａｇｇｃｃｇａａｔｔｔｔｃｃｔｔｇｔｔｃｔａａａａａｇｇｔｔｇｔａｔｔａｇｃｇｔａｔｃａｃｇａｇｇａｇｇｇａｇｔａｔａａｇｔｇｇｇａｔｔａａａｃａｇａｔｔｔａｔｇｃｇｔｇｃｇａｔｇａｔｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃａｔｔａｃｔｇｃｃａａｔｔｇｃａｔｔａｃｇａｔｔａａｃｃｃｃｇａｃｇｔｃｇａｃｃｃａｔａｃｇａｃｇｔｔａａｔｔｃｔｔｇｃａａｔｇｔｔａｇｃｔａｔｔｇｇｃｇｔｇｔｔｃｔｃｔｔｔａｇｇｇｇｃｇｔｔｔａｔｃａａａａｔｔａｔｔｃａａｔｔａａｇａａａａａａｔａａｔｔａａａａａｃａｃａｇａａｃｇａａａｇａａａａａｇｔｇａｇｇｔｇａａｔｇａｔａｔｇａａａｔｔｃａａａａａｇｇｔｇｇｔｔｃｔａｇｇｔａｔｇｔｇｃｔｔｇａｔｃｇｃａａｇｔｇｔｔｃｔａｇｔｃｔｔｔｃｃｇｇｔａａｃｇａｔａａａａｇｃａａａｔｇｃｃｔｇｔｔｇｔｇａｔｇａａｔａｃｔｔａｃａａａｃａｃｃｃｇｃａｇｃｔｃｃｇｃａｔｇａｔａｔｔｇａｃａｇｃａａａｔｔａｃｃａｃａｔａａａｃｔｔａｇｔｔｇｇｔｃｃｇｃｇｇａｔａａｃｃｃｇａｃａａａｔａｃｔｇａｃｇｔａａａｔａｃｇｃａｃｔａｔｔｇｇｃｔｔｔｔｔａａａｃａａｇｃｇｇａａａａａａｔａｃｔａｇｃｔａａａｇａｔｇｔａａａｔｃａｔａｔｇｃｇａｇｃｔａａｔｔｔａａｔｇａａｔｇａａｃｔｔａａａａａａｔｔｃｇａｔａａａｃａａａｔａｇｃｔｃａａｇｇａａｔａｔａｔｇａｔｇｃｇｇａｔｃａｔａａａａａｔｃｃａｔａｔｔａｔｇａｔａｃｔａｇｔａｃａｔｔｔｔｔａｔｃｔｃａｔｔｔｔｔａｔａａｔｃｃｔｇａｔａｇａｇａｔａａｔａｃｔｔａｔｔｔｇｃｃｇｇｇｔｔｔｔｇｃｔａａｔｇｃｇａａａａｔａａｃａｇｇａｇｃａａａｇｔａｔｔｔｃａａｔｃａａｔｃｇｇｔｇａｃｔｇａｔｔａｃｃｇａｇａａｇｇｇａａ  （配列番号：５７）。
【０３６１】
炎症性サイトカインの生産：
ＲＡＷ  ２６４．７などのマクロファージは、ＬｍｐｒｆＡ−（ｐＧＧ５５）、Ｌｍｄａｌ  ｄａｔ、Ｌｍｄａｌ  ｄａｔ  ａｃｔＡ、Ｌｍｄａｌ  ｄａｔ  ａｃｔＡΔｉｎｌＣ、およびＬｍｄａｌ  ｄａｔΔｉｎｌＣなどの異なるリステリアバックボーンに感染し、様々なサイトカインのレベルを定量するために異なるＥＬＩＳＡベースのキットを使用して上清を異なる時点で採取した。定量化されたサイトカインとしてはＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−６が挙げられる。
【０３６２】
インビボでのサイトカインの生産：
インビボでのサイトカイン生産および好中球の採用を測定するために、異なる１０８ＣＦＵのＬｍｐｒｆＡ−（ｐＧＧ５５）、Ｌｍｄａｌ  ｄａｔ、Ｌｍｄａｌ  ｄａｔ  ａｃｔＡ、Ｌｍｄａｌ  ｄａｔ  ａｃｔＡΔｉｎｌＣ、およびＬｍｄａｌ  ｄａｔ  ΔｉｎｌＣ、リステリア対照、または等価な体積の生理食塩水をＣ５７ＢＬ／６マウスに腹腔内に注射した。１２時間後、マウスを屠殺し、２ｍＬのＰＢＳで腹膜腔を洗浄した。プレーティングした後増殖培地上で腹膜洗浄を細菌の負荷について調べ、ＭＩＰ−１α、ＫＣ、ＭＣＰ等々などの炎症誘発性のサイトカインの解析を行った。フローサイトメトリーを使用して、Ｇｒ−１、ＣＤ１１ｂ、およびＦ４／８０などのマーカーを用いて染色した後に好中球およびマクロファージの数を決定し、さらにＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用してこれらの集団を定量化した。
【０３６３】
トランスウェル遊走アッセイ：
ｉｎｌＣ欠失株を用いたマクロファージまたは樹状細胞に由来する骨髄の感染に続く好中球の遊走の増加があるかどうかを決定するためにこのアッセイを行った。骨髄に由来するマクロファージまたは樹状細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６などのマウスから分離され、これらはｉｎｌＣ欠失突然変異体または対照リステリアに感染した。Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒトランスウェルプレートを使用して、感染した細胞を使用してトランスウェルアッセイを設定した。アッセイは、当初３、５、または８マイクロメートルポアトランスウェルプレートを使用して標準化された。好中球の遊走を試験するためには、プレートの底部に感染したＡＰＣをプレーティングし、チャンバー内のウェルの上部に好中球をプレーティングした。異なる時点で、底部に遊走した好中球の数を決定するために細胞を計数した。
【０３６４】
Ｌｍｄａｌ  ｄａｔ  ａｃｔＡΔｉｎｌＣ突然変異体の治療的有効性：
概念の証拠として、ｉｎｌＣ突然変異体の治療的な有効性を決定するために、ヒトの前立腺特異的な抗原（ＰＳＡ）を腫瘍抗原として使用した。バックボーンＬｍｄａｌ  ｄａｔ  ａｃｔＡ  ｉｎｌＣは、プラスミド、ｐＡｄｖ１４２を用いて形質転換され、これはヒトＰＳＡに対する発現カセットを含有し、結果としてＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２が得られる。株ＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２は、融合タンパク質、ｔＬＬＯ−ＰＳＡの発現および分泌のために特徴付けられる。さらに、株ＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２はマウスの中でインビボで２回継代されたが、インビボで２回の継代の後に得られたコロニーを融合タンパク質、ｔＬＬＯ−ＰＳＡの発現および分泌について調べた。ワクチンの通常在庫は第２のインビボ継代の後で得られたコロニーから準備され、これは治療的な効果および免疫原性の評価のために使用された。
【０３６５】
腫瘍微小環境への影響：
ＬｍｄｄＡ、ＬｍｄｄＡΔａｃｔＡ、ＬｍｄｄＡΔＰｌｃＡ、ＬｍｄｄＡΔＰｌｃＢ、ＬｍｄｄＡΔｐｒｆＡ、ＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２、ＬｍｄｄＡ１４２、および他の対照株が腫瘍微小環境内で免疫細胞の浸潤を生じる能力が決定された。この研究では、マウスに１×１０６ＴＰＳＡ２３腫瘍細胞を０日目に接種し、７日目、１４日目、および２１日目に１０８ＣＦＵのＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２、ＬｍｄｄＡ１４２、および他の対照株をワクチン接種した。２８日目に腫瘍を採取して、Ｇｒ−１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、ＮＫ１．１、およびＣＤ６２Ｌなどの異なる細胞表面マーカーを用いてさらに染色のために処理した。これらのマーカーを使用して、調べられる異なる細胞集団としては、マクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋）、ＮＫ細胞（ＮＫ１．１＋）、好中球（Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋）、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）（Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋）、調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  Ｆｏｘｐ３＋）およびエフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋  ＣＤ３＋  ＣＤ６２Ｌｌｏｗ）が挙げられる。さらにエフェクターＴ細胞は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２などのエフェクターサイトカインを生産するそれらの機能的な能力のために特徴付けられる。腫瘍内の調節性Ｔ細胞およびＭＤＳＣは、Ｔ細胞増殖の抑制を生じるそれらの能力を試験された。
【０３６６】
結果
（実施例５）  アミノ酸代謝酵素を含有するプラスミドは、抗生物質耐性遺伝子の代わりに、大腸菌およびＬＭ内に、インビトロおよびインビボの両方で保持される
【０３６７】
Ｄ−アラニン・ラセマーゼに基づく栄養要求性相補系が、抗生物質耐性遺伝子を使用せずにＬＭ中へのプラスミド保持を媒介するために利用された。大腸菌株ＭＢ２１５９は、Ｄ−アラニン・ラセマーゼを合成することができないａｌｒ（−）／ｄａｄＸ（−）欠損突然変異体である。同様に、リステリア株Ｌｍ  ｄａｌ（−）／ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）は、ｄａｌ遺伝子およびｄａｔ遺伝子の部分的な欠失に起因してＤ−アラニン・ラセマーゼを合成することができない。大腸菌−リステリアシャトルベクターｐＡＭ４０１に基づくプラスミドｐＧＧ５５を、ｐＴＶ３を生成するためのリステリアｐ６０プロモーターの制御下で、両方のＣＡＴ遺伝子を除去し、かつこれらをｐ６０−ｄａｌ発現カセットで置き換えることによって修正した（図９）。いくつかのコロニーからＤＮＡを精製した。
（実施例６）  代謝酵素を含有するプラスミドは細菌の病毒性を増加しない
【０３６８】
病毒性はＬＬＯ機能に関連しているので、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３とＬｍ−ＬＬＯＥ７との間の溶血性溶解活性が比較される。このアッセイは赤血球の溶解によってＬＬＯ機能を試験したが、これは培養上清、精製したＬＬＯ、または細菌細胞を用いて実施することができる。Ｌｍｄｄ−ＴＶ３は、Ｌｍ−ＬＬＯＥ７より高い溶血性溶解活性を示した。
【０３６９】
インビボでの病毒性はＬＤ５０値を決定することによっても測定され、これはより直接的で、したがってより正確な病毒性の測定手段である。Ｌｍｄｄ−ＴＶ３のＬＤ５０（０．７５×１０９）は、Ｌｍ−ＬＬＯＥ７のもの（１×１０９）に大変近く、これは代謝酵素を含有するプラスミドが細菌の病毒性を増加しないことを示す。
（実施例７）代謝酵素を含有するプラスミドによる抗腫瘍免疫性の誘導
【０３７０】
代謝酵素含有プラスミドのガンワクチンとしての有効性は腫瘍退行モデルで決定された。ＴＣ−１細胞株モデルが使用され、これはＨＰＶワクチン発生のために良好に特徴付けられ、かつこれはＬｍｄｄ−ＴＶ３またはＬｍ−ＬＬＯＥ７で免疫化した後の類似サイズの定着した腫瘍退行の制御された比較を可能にする。２つの別個の実験では、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３およびＬｍ−ＬＬＯＥ７を用いたマウスの免疫化は、結果として類似の腫瘍退行（図１４）をもたらし、ワクチン接種した群の間には統計的に有意な差異はない（ｐ＜０．０５）。すべての免疫化マウスは、６３日後でも生きていたが、非免疫化マウスはその腫瘍の直径が２０ｍｍに達したときに犠牲にしなければならなかった。回復したマウスは実験終了時まで腫瘍を有しないままであった。
【０３７１】
したがって、代謝酵素含有プラスミドは治療的なガンワクチンとして有効である。治療的なガンワクチンに対して要求される免疫応答は、予防的なガンワクチンに対して要求される免疫応答より強いので、これらの結果は予防的なガンワクチンに対する有用性も実証する。
（実施例８）ｉｎｌＣ欠失突然変異体はケモカインおよびサイトカインの著しく高いレベルを生成する。
【０３７２】
ｉｎｌＣ欠失突然変異体は、著しく高いレベルのケモカイン（ＭＩＰ−１α、ＫＣ（ＩＬ−８のマウスホモログ）、ＭＣＰなどの）を生成し、結果として感染部位に対する好中球および白血球の浸潤が得られる。したがって、異なるリステリア株が腹腔内に投与されたとき、ｉｎｌＣ突然変異体はこれらのサイトカインおよびケモカインの産生の増加を実証し、これは、注射の１２時間後に得られた腹水中の好中球およびマクロファージを引き付ける。さらに、ｉｎｌＣ欠失突然変異体は対照株と比較したときに著しく高いレベルの炎症性サイトカインを生成した。
（実施例９）ｉｎｌＣ欠失突然変異体は好中球の遊走を誘発する
【０３７３】
ｉｎｌＣ欠失突然変異体に感染したマクロファージは、他の対照株と比較したとき、異なる時点で好中球の遊走の著しい増加を示す。この実験の結果は、感染の間にこの株の好中球などの免疫細胞を引き付ける能力を強く支持する。
（実施例１０）ｉｎｌＣ欠失突然変異体は治療的な抗腫瘍応答に影響を与える
【０３７４】
ＬｍｄｄＡ１４２とＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２との両方を使用した抗腫瘍研究の結果は、相互に大変同等であり、また腫瘍の治療的な退行が観察された。さらに、それの先天的な応答および炎症誘発性のサイトカインの分泌の増加を生成する能力のレベルが高いので、ＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２の２回の投与量は株ＬｍｄｄＡ１４２の３回の投与と同等である。
【０３７５】
材料および方法（実施例１１〜１６）
オリゴヌクレオチドはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）によって合成され、またＤＮＡ配列決定はＧｅｎｅｗｉｚ  Ｉｎｃ（米国ニュージャージー州Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ）によって行われた。フローサイトメトリー試薬はＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＢＤ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）から購入した。細胞培養培地、補助剤および他のすべての試薬は、示されない限りＳｉｇｍａ（米国ミズーリ州Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓｅ）から入手した。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＨＬＡ−Ａ２ペプチドはＥＺｂｉｏｌａｂｓ（米国インディアナ州Ｗｅｓｔｆｉｅｌｄ）によって合成された。完全なＲＰＭＩ  １６４０（Ｃ−ＲＰＭＩ）培地は、２ｍＭグルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、および１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｈｅｐｅｓ（２５ｍＭ）を含有した。多クローン性の抗ＬＬＯ抗体が前述されており、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体はＳｉｇｍａから購入した。
【０３７６】
マウスおよび細胞株
すべての動物実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａまたはＲｕｔｇｅｒｓ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおいてＩＡＣＵＣによって認可されたプロトコルに従って実施した。ＦＶＢ／ＮマウスはＪａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国メーン州Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ）から購入した。ラットＨｅｒ２／ｎｅｕ腫瘍性タンパク質を過剰発現するＦＶＢ／Ｎ  Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａの実験動物コア施設で収容および飼育された。ＮＴ−２腫瘍細胞株は高いレベルのラットＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質を発現し、これはこれらのマウスの自然発生的な乳腺腫瘍に由来し、前述したように増殖した。ＤＨＦＲ−Ｇ８（３Ｔ３／ｎｅｕ）細胞はＡＴＣＣから得られ、ＡＴＣＣの推奨に従って増殖した。ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞株は、Ｊｏｈｎ  Ｏｈｌｆｅｓｔ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、米国ミネソタ州）からの寛大な供与物であり、また完全なＣ−ＲＰＭＩ培地中で増殖した。生物発光の作業は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（米国ペンシルバニア州Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）のＳｍａｌｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＳＡＩＦ）によるガイダンスに従って実行された。
【０３７７】
リステリア構築体および抗原発現
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ−ｐＧＥＭ７Ｚは、親切にもＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのＭａｒｋ  Ｇｒｅｅｎｅ博士によって供与され、これはｐＧＥＭ７Ｚプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）へとクローニングされた全長のヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ（ｈＨｅｒ２）遺伝子を含んでいた。このプラスミドは、ＰＣＲによってｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および表１に示されるオリゴを使用して、ｈＨｅｒ−２／ｎｅｕの３つの区分、すなわちＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１を増幅するためのテンプレートとして使用された。
【表１】
2018508212.tif 000002
【０３７８】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕキメラ構築体はＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲ法およびテンプレートとしての各々の別個のｈＨｅｒ−２／ｎｅｕ区分による直接融合によって生成された。プライマーを表２に示す。
【表２】
2018508212.tif 000003
【０３７９】
異なる区分のヒトＨｅｒ２領域の増幅のためのプライマーの配列。
【０３８０】
異なる区分のヒトＨｅｒ２領域の増幅のためのプライマーの配列。
【０３８１】
ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ制限酵素を使用してｐＡｄｖ１３８から切り離され、Ｌｍｄｄシャトルベクター、ｐＡｄｖ１３４で、ＬＬＯの切断非溶血性断片を用いてインフレームでクローニングされた。インサート、ＬＬＯ、およびｈｌｙプロモーターの配列はＤＮＡシークエンシング解析によって確認された。このプラスミドは電子コンピテントＡｃｔＡ、ｄａｌ、ｄａｔ突然変異体リステリア・モノサイトゲネス株、ＬｍｄｄＡへと電気穿孔され、ストレプトマイシン（２５０μｇ／ｍＬ）を含有するブレインハートインフージョン（ＢＨＩ）寒天培養基プレート上で陽性クローンが選択された。いくつかの実験では、ｈＨｅｒ２／ｎｅｕ（Ｌｍ−ｈＨｅｒ２）断片を発現する類似のリステリア株が比較の目的で使用された。これらは以前に記述した。すべての研究で、無関連リステリア構築体（Ｌｍ対照）が、免疫系でリステリアの抗原と無関係な効果を説明するために含まれる。Ｌｍ対照は、ＡＤＸＳ３１−１６４と同一のリステリアプラットフォームに基づくが、ＨＰＶ１６−Ｅ７またはＮＹ−ＥＳＯ−１などの異なる抗原を発現した。融合タンパク質のリステリアからの発現および分泌が試験された。各々の構築体はインビボで２回継代された。
【０３８２】
細胞毒性アッセイ
３〜５匹のＦＶＢ／Ｎマウスの群が、１×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２、ＡＤＸＳ３１−１６４、Ｌｍ−ｈＨｅｒ２  ＩＣＩ、またはＬｍ対照（無関連抗原を発現する）を用いて一週間間隔で３回免疫化されるか、または無処置のままとされた。ＮＴ−２細胞をインビトロで増殖させ、トリプシンで取り出し、マイトマイシンＣ（血清を含まないＣ−ＲＰＭＩ媒体中２５０μｇ／ｍＬ）で３７℃にて４５分間処置した。５回洗浄した後、これらを免疫化した動物または無処置の動物から採取した脾細胞を用いて１：５の比（刺激薬：レスポンダー）で５日間、３７℃および５％ＣＯ２で共インキュベートした。標的として３Ｔ３／ｎｅｕ（ＤＨＦＲ−Ｇ８）細胞のラベルが付いているユーロピウムを使用して、前述した方法により、標準的な細胞毒性アッセイを実施した。４時間のインキュベーションの後、分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｖｉｃｔｏｒ２）を５９０ｎｍにて使用して、死滅した標的細胞から放出されたユーロピウムを測定した。特異的な溶解のパーセントが（実験群での溶解−自然発生的溶解）／（最大溶解−自然発生的溶解）として定義された。
【０３８３】
免疫化マウスからの脾細胞によるインターフェロン−γ分泌
３〜５匹のＦＶＢ／ＮまたはＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスの群が、１×１０８ＣＦＵのＡＤＸＳ３１−１６４、陰性リステリア対照（無関連抗原を発現する）を用いて一週間間隔で３回免疫化されるか、または無処置のままとされた。最後の免疫化の一週間後、ＦＶＢ／Ｎマウスからの脾細胞が分離され、５×１０６細胞／ウェルにて２４ウェルプレートでマイトマイシンＣで処置したＮＴ−２細胞の存在下でＣ−ＲＰＭＩ培地中で共培養された。ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスからの脾細胞は、１μＭのＨＬＡ−Ａ２特異的なペプチドまたは１μｇ／ｍＬの組み換え型Ｈｉｓタグ付きＣｈＨｅｒ２タンパク質（大腸菌内で生産され、ニッケルベースのアフィニティークロマトグラフィーシステムによって精製された）の存在下でインキュベートされた。上清からのサンプルが２４時間または７２時間後に得られ、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の存在について、製造業者の推奨に従ってマウスＩＦＮ−γ酵素にリンクした免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを使用して試験した。
【０３８４】
Ｈｅｒ２トランスジェニック動物での腫瘍研究
生後６週間のＦＶＢ／ＮラットＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウス（９〜１４／群）に５×１０８ＣＦＵのＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２、ＡＤＸＳ３１−１６４、またはＬｍ対照を６回免疫化した。これらを、自然発生的な乳腺腫瘍の出現について週に２回観察し、これらは最高５２週間まで電子カリパスを使用して測定された。平均直径が１ｃｍ２のサイズに達したとき、エスケープした腫瘍を切り離し、ＲＮＡｌａｔｅｒ内で−２０℃にて保存した。これらの腫瘍のエスケープ上のＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質内の突然変異の効果を決定するために、ゲノムＤＮＡ分離キットを使用してゲノムＤＮＡを抽出し、配列決定した。
【０３８５】
脾臓および腫瘍内の調節性Ｔ細胞へのＡＤＸＳ３１−１６４の効果
マウスに１×１０６ＮＴ−２細胞を皮下（ｓ．ｃ．）で移植した。７日目、１４日目、および２１日目に、これらに１×１０８ＣＦＵのＡＤＸＳ３１−１６４、ＬｍｄｄＡ対照で免疫化、または無処置のままにした。２８日目に腫瘍および脾臓を抽出し、ＦＡＣＳ解析によってＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの存在について試験した。簡潔に述べると、Ｃ−ＲＰＭＩ培地中で２枚のガラススライドの間で脾臓を均質化することによって脾細胞を分離した。滅菌したカミソリの刃を使用して腫瘍を細かく刻み、ＰＢＳ中にＤＮａｓｅ（１２Ｕ／ｍＬ）およびコラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍＬ）を含有するバッファーを用いて消化した。室温にて撹拌しながら６０分間インキュベーションした後で、細胞を激しいピペッティングによって分離した。赤血球をＲＢＣ溶解バッファーによって溶解し、続いて１０％ＦＢＳを含有する完全なＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて数回洗浄した。ナイロンメッシュを通した濾過の後、腫瘍細胞および脾細胞をＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳ／ＰＢＳ）中で再懸濁し、抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ２５−ＡＰＣ抗体を用いて染色し、続いて抗Ｆｏｘｐ３−ＰＥを用いて透過処理および染色した。４色ＦＡＣＳキャリバー（ＢＤ）を使用してフローサイトメトリー解析を実施し、ｃｅｌｌ  ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ）を使用してデータを解析した。
【０３８６】
統計的解析
生存データに対して対数順位χ二乗検定を使用し、ＣＴＬおよびＥＬＩＳＡアッセイに対してスチューデントのｔ検定を使用し、これらを３回行った。これらの解析では、０．０５未満（＊印をつけた）のｐ値は統計的に有意であると考えられる。Ｐｒｉｓｍソフトウェア、Ｖ．４．０ａ（２００６）またはＳＰＳＳソフトウェア、Ｖ．１５．０（２００６）のいずれかを用いてすべての統計的な解析が行われた。別段の記載がない限り、すべてのＦＶＢ／ＮラットＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック研究のために、群あたり８〜１４匹のマウスを使用し、すべての野生型ＦＶＢ／Ｎ研究のために、群あたり少なくとも８匹のマウスを使用した。Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスモデルの長期腫瘍研究を除いて、すべての研究を少なくとも１回は繰り返した。
【０３８７】
結果
（実施例１１）  Ｈｅｒ−２断片に融合されたＬＬＯ断片を分泌するＬ．モノサイトゲネス株の発生：ＡＤＸＳ３１−１６４の構築。
【０３８８】
キメラＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子（ＣｈＨｅｒ２）の構築については前述した。簡潔に述べると、ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、ＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲ法によって、Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の２つの細胞外断片（ａａ４０〜１７０およびａａ３５９〜４３３）と１つの細胞内断片（ａａ６７８〜８０８）との直接融合によって生成された。キメラタンパク質は、タンパク質の既知のヒトＭＨＣクラスＩエピトープのほとんどを有する。ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、プラスミド、ｐＡｄｖ１３８（これは構築体Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２に使用される）から切り離され、ＬｍｄｄＡシャトルプラスミドへとクローニングされ、結果としてプラスミドｐＡｄｖ１６４が得られる（図１５Ａ）。これらの２つのプラスミドバックボーンの間には２つの大きい違いがある。１）組み換え型細菌のインビトロでの選択のためにｐＡｄｖ１３８はクロラムフェニコール耐性マーカー（ｃａｔ）を使用しているが、ｐＡｄｖ１６４はバシラスサチリスからのＤ−アラニン・ラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）を寄生し、これはｄａｌ−ｄａｔ遺伝子を欠いているＬｍｄｄＡ株内でインビトロでの選択のためおよびインビボでのプラスミド保持のために代謝相補経路を使用する。このワクチンプラットフォームは、ＦＤＡによる改変リステリアワクチン株の抗生物質抵抗性についての憂慮に対処するために設計および開発された。２）ｐＡｄｖ１３８とは異なり、これはインビボでのＬｍｄｄ株の相補に必要ないので、プラスミド（以下の配列および図１５Ａを参照）中でｐＡｄｖ１６４はｐｒｆＡ遺伝子のコピーを有しない。ＬｍｄｄＡワクチン株も、ａｃｔＡ遺伝子（リステリア細胞内移動、および細胞から細胞への拡散を担当する）を欠いているので、このバックボーンに由来する組み換え型ワクチン株は、その親株であるＬｍｄｄに由来するものより病毒性が１００倍少ない。ＬｍｄｄＡベースのワクチンは、免疫化マウスの脾臓からのＬｍｄｄベースのワクチンよりもずっと速く（４８時間未満の間に）除去される。この株からの融合タンパク質ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌は、インビトロで８時間増殖したＴＣＡ沈殿した細胞培養上清の中のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２のもの（図１５Ｂ）と同等であり、ウエスタンブロット解析を使用して〜１０４ＫＤの帯域として抗ＬＬＯ抗体によって検出される。負の対照としてｔＬＬＯのみを発現するリステリアバックボーン株が使用される。
【０３８９】
ｐＡｄｖ１６４配列（７０７５塩基対）（図１５参照）：
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（実施例１２）  ＡＤＸＳ３１−１６４は、ＬＭ−ＬＬＯ−ＣｈＨＥＲ２と同じく免疫原性である。
【０３９０】
抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的な細胞毒性Ｔ細胞を発生するうえでのＡＤＸＳ３１−１６４の免疫原性の特性が、標準的なＣＴＬアッセイでＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２ワクチンのものと比較された。両方のワクチンは、３Ｔ３／ｎｅｕ標的細胞によって発現されるＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原に対して強いが同等の細胞毒性Ｔ細胞応答を引き出す。したがって、ＬＬＯに対してＨｅｒ２に融合された細胞内断片のみを発現するリステリアを用いて免疫化されたマウスは、より多くのＭＨＣクラスＩエピトープを含有するキメラより低い溶解活性を示す。無処置の動物、または無関連リステリアワクチンを注射したマウス（図１６Ａ）ではＣＴＬ活性は検出されなかった。ＡＤＸＳ３１−１６４は、野生型ＦＶＢ／Ｎマウスからの脾細胞によってＩＦＮ−γの分泌を刺激することもできる（図１６Ｂ）。これはマイトマイシンＣで処理されたＮＴ−２細胞と共培養されたこれらの細胞の培養上清の中で検出され、これらは高いレベルのＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原（図１９Ｃ）を発現する。
【０３９１】
ヒトＭＨＣクラスＩエピトープのＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化後の適切な処置および提示は、ＨＬＡ−Ａ２マウスで試験された。免疫化したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックからの脾細胞は、マッピングしたＨＬＡ−Ａ２で制限されたエピトープに対応するペプチドと７２時間の間共インキュベートされ、このペプチドはＨＥＲ２／ｎｅｕ分子の細胞外（ＨＬＹＱＧＣＱＶＶ配列番号：７１もしくはＫＩＦＧＳＬＡＦＬ配列番号：７２）、または細胞内（ＲＬＬＱＥＴＥＬＶ配列番号：７３）領域に位置する（図１６Ｃ）。組み換え型ＣｈＨｅｒ２タンパク質は、正の対照、および無関連ペプチド、または負の対照としてペプチドなしで使用された。この実験からのデータは、ＡＤＸＳ３１−１６４が抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的な免疫応答を標的化した抗原の異なるドメインに位置するヒトエピトープへと引き出すことができることを示す。
（実施例１３）  ＡＤＸＳ３１−１６４は、自然発生的な乳腺腫瘍の発症の防止には、ＬＭ−ＬＬＯ−ＣｈＨＥＲ２より有効である。
【０３９２】
ＡＤＸＳ３１−１６４の抗腫瘍効果が、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２とＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック動物において比較され、この動物は生後２０〜２５週間で繁殖の遅い自然発生的な乳腺腫瘍を発生した。無関連リステリア対照ワクチンを用いて免疫化されたすべての動物は、２１〜２５週の間に乳房の腫瘍を発生し、３３週の前に犠牲にされた。対照的に、リステリア−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ組み換え型ワクチンは、乳腺腫瘍の形成の著しい遅延を生じた。４５週には、５０％を超えるＡＤＸＳ３１−１６４をワクチン接種したマウス（９匹のうち５匹）は、まだ腫瘍がなく、これはＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２を用いて免疫化したマウスの２５％と比較される。５２週には、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いて免疫化した８匹のうち２匹のマウスは、まだ腫瘍を有しないままであったが、一方で他の実験的な群からのマウスはすべて、すでにこれらの疾患に屈服していた（図１７）。これらの結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４はより弱毒化しているにもかかわらず、Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック動物の自然発生的な乳腺腫瘍の発症の防止ではＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２より有効であることを示す。
（実施例１４）  ＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化の際のＨＥＲ２／ＮＥＵ遺伝子での突然変異。
【０３９３】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕのＭＨＣクラスＩエピトープ内の突然変異は、小さい分量のワクチンまたはトラスツズマブ（ハーセプチン）（Ｈｅｒ２／ｎｅｕの細胞外ドメインでエピトープを標的化するモノクローナル抗体）を用いた免疫化の際にエスケープした腫瘍を担当すると考えられてきた。これを評価するために、トランスジェニック動物内のエスケープした腫瘍からゲノム材料が抽出され、キメラワクチンまたは対照ワクチンを用いて免疫化した腫瘍内のｎｅｕ遺伝子の対応する断片を配列決定した。いかなるワクチン接種した腫瘍サンプルのＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子の中にも突然変異が観察されなかったことは、代替的なエスケープ機構を示唆するの（データ示さず）。
（実施例１５）ＡＤＸＳ３１−１６４は、腫瘍内の調節性Ｔ細胞の著しい減少を生じる。
【０３９４】
脾臓および腫瘍内での調節性Ｔ細胞の頻度に対するＡＤＸＳ３１−１６４の効果を解明するために、マウスにＮＴ−２腫瘍細胞を移植した。３回の免疫化の後、脾細胞および腫瘍内のリンパ球が分離され、Ｔｒｅｇのために染色した。これらは、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋細胞と定義されたが、別個に解析したとき、ＦｏｘＰ３マーカーまたはＣＤ２５マーカーのいずれかを用いて同等の結果が得られた。この結果は、無関連リステリアワクチンまたは無処置の動物と比較して、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化は、脾臓内のＴｒｅｇの頻度については効果を有しないことを示した（図１８参照）。対照的に、リステリアワクチンを用いた免疫化は、腫瘍内のＴｒｅｇの存在は少なからぬ影響を生じた（図１９Ａ）。処置されていない腫瘍ではすべてのＣＤ３＋  Ｔ細胞の平均で１９．０％がＴｒｅｇであったが、この頻度は無関連ワクチンについては４．２％に減少し、ＡＤＸＳ３１−１６４ついては３．４％と腫瘍内のＴｒｅｇの頻度が５分の１に減少した（図１９Ｂ）。いずれかのＬｍｄｄＡワクチンで処置したマウスでの腫瘍内のＴｒｅｇの頻度の減少は、腫瘍のサイズの差異には貢献しなかった。代表的実験では、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いて免疫化したマウスからの腫瘍（平均直径（ｍｍ）±ＳＤ：６．７１±０．４３、ｎ＝５）は、未処置マウス（８．６９±０．９８、ｎ＝５、ｐ＜０．０１）、または無関連ワクチン（８．４１±１．４７、ｎ＝５、ｐ＝０．０４）で処置されたマウスからの腫瘍より著しくより小さかったが、一方で後者のこれら２つの群の比較は腫瘍サイズでは統計的な有意さを示さなかった（ｐ＝０．７３）。ＬｍｄｄＡワクチンで処置した腫瘍内のＴｒｅｇのより低い頻度は、腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の増加をもたらし、ＬｍｄｄＡワクチンを用いた免疫化後により好ましい腫瘍の微小環境を得ることができることを示唆する。しかしながら、標的抗原ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＡＤＸＳ３１−１６４）を発現するワクチンのみが腫瘍増殖を減少することができ、Ｔｒｅｇの減少は腫瘍内で抗原特異的な応答が存在するときのみ効果を有することを示す。
（実施例１６）ペプチド「ミニ遺伝子」発現系
【０３９５】
材料および方法
この発現系は、カルボキシ末端において独特のペプチド部分を含有する組み換え型タンパク質のパネルのクローニングを促進するように設計される。これは、テンプレートとしてＳＳ−Ｕｂ−ペプチド構築体のうちの１つをコードする配列を利用する単純なＰＣＲ反応によって達成される。Ｕｂ配列のカルボキシ末端領域の中へと延在するプライマーを使用し、また所望のペプチド配列に対してプライマーの３’端においてコドンを導入することによって、単一のＰＣＲ反応で新しいＳＳ−Ｕｂ−ペプチド配列を生成することができる。細菌プロモーターおよびＡｃｔＡシグナル配列の最初のいくつかのヌクレオチドをコードする５’プライマーは、すべての構築体に対して同一である。この戦略を使用して生成された構築体を図１に概略的に表す。この実施例では、２つの構築体が記述される。一方は、マウスＭＨＣクラスＩ上に提示されるモデルペプチド抗原を含有し、第２の構築体は、ヒト膠芽腫（ＧＢＭ）ＴＡＡに由来するものなどの治療的に関連のあるペプチドが置換されることになる場所を示す。明確のため、図１で図表化した構築体をＡｃｔＡ１〜１００分泌シグナルを含有するものとして指定した。しかしながら、ＬＬＯベースの分泌シグナルは均等な効果を置換される可能性がある。
【０３９６】
提案されている系の利点のうちの１つは、単一のリステリアベクター構築体を使用して細胞にマルチプルペプチドを負荷することができることになる点である。マルチプルペプチドは、上述の単一のペプチド発現系の修正を使用して組み換え型弱毒化リステリア（例えば、ＰｒｆＡ突然変異リステリアまたはｄａｌ／ｄａｔ／ＡｃｔＡ突然変異リステリア）の中へと導入されることになる。連続的なＳＳ−Ｕｂ−ペプチド配列から独特のマルチプルペプチドをコードするキメラタンパク質が１つのインサートの中にコードした。シャイン・ダルガノリボソーム結合部位は、各々のＳＳ−Ｕｂ−ペプチドコード配列がペプチド構築体の各々の分離翻訳が有効になる前に導入される。図１Ｃは、組み換え型リステリアの１つの株から４つの別個のペプチド抗原を発現するように設計された構築体の概略表示を実証する。これは厳密に一般的な発現戦略の表示であるので、既知のマウスまたはヒト腫瘍に関連する抗原または感染性疾患の抗原に由来する４つの独特のＭＨＣクラスＩ結合ペプチドを含めた。
【０３９７】
本開示のある特定の特徴が本明細書に例示され記述されてきたが、今では当業者には数多くの修正、置換、変更、および均等物が生じるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の趣旨に含まれるかかるすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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