(57)【要約】  本発明は、体重の増加、乳汁生産、及び／又は飼料転換率（ＦＣＲ）を向上さるためのウシ亜科の反芻動物の飼料における、チモール、オイゲノール、メタ−クレゾール、バニリン、及びグアヤコールからなる群から選択される少なくとも２つの精油化合物の混合物と組み合わせられる少なくとも１つの細菌アミラーゼの使用に関する。ウシ亜科動物の例としては、肉牛及び乳牛が挙げられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ亜科動物の体重の増加、乳汁生産、及び／又は飼料転換率を向上させる方法であって、チモール、オイゲノール、メタ−クレゾール、バニリン、及びグアヤコールからなる群から選択される少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つの精油化合物の混合物と組み合わせて少なくとも１つのカルボヒドラーゼを前記動物に与えることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記精油が、５０〜１５０ｍｇ／体重１ｋｇ１日当たり、好ましくは７０ｍｇ〜１２０ｍｇ／体重１ｋｇ１日当たり、の量（精油の総用量範囲）で与えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記動物が、家畜種、特に肉牛である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記動物が乳牛である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つのカルボヒドラーゼがアミラーゼである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
体重増加、乳汁生産、及び／又は飼料転換率を向上させるためのウシ亜科動物の飼料における、チモール、オイゲノール、メタ−クレゾール、バニリン、及びグアヤコールからなる群から選択される少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つの精油化合物の混合物と組み合わせられる少なくとも１つのカルボヒドラーゼの使用。
【請求項７】
前記精油が、５０〜１５０ｍｇ／体重１ｋｇ１日当たり、好ましくは７０ｍｇ〜１２０ｍｇ／体重１ｋｇ１日当たり、の量（精油の総用量範囲）で与えられる、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記動物が、家畜種、特に肉牛である、請求項６又は７に記載の使用。
【請求項９】
前記動物が乳牛である、請求項６又は６に記載の使用。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのカルボヒドラーゼがアミラーゼである、請求項７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
現代農業システムにおける高生産性の雌ウシは、非常に高い乳汁産生（乳牛）又は成長速度（肉牛）によって特徴付けられ、同様に高エネルギーが必要となる条件下で飼育される。試料の利用率は、摂取が維持レベルを超えて増加される場合は著しく低下する。これをある程度考慮して、より一層分解しやすい飼料が、反芻動物飼料、例えば、デンプン含有原料、例えば、穀物ベースの濃厚飼料及び全シリアルサイレージに含められる。デンプン材料は、糞便中で回収される場合が多く、このような飼料成分の利用率が更に改善できることを示唆している。
【０００２】
ウシ亜科動物の飼料のエネルギー含有量は、１９７９年にＰｒｏｆ．Ｍｅｎｋｅ及び同僚らによってＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｈｅｎｈｅｉｍで開発されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ発酵技術を用いて測定することができる。Ｈｏｈｅｎｈｅｉｍ飼料価値試験（ＨＦＴ）は、第一胃液中での動物飼料の２４時間の定温放置中に産生されるガスの量の測定を伴う。定温放置中に産生されるガスの量は、飼料の消化率、従ってエネルギー含有量に直接相関する。この方法の最初の公表以来、Ｓｔｅｉｎｇａｓｓ  ａｎｄ  Ｍｅｎｋｅ，１９８６によって説明されているように多数の改善及び適応がされている。
【０００３】
ＨＦＴの変更により、観察されるガス産生率を変更することができる。試験の特定の態様、例えば、基材の種類、基材の調製、及び／又は定温放置時間の変更は、第一胃液混合物に対して利用可能な基材（飼料）のエネルギーに変化をもたらす。特定の物質のＨＦＴ発酵への添加は、この基材の消化率を増減させ得る。従って、処置の一貫性、例えば、使用される機器及び溶液の一貫性、測定の実施、及び基材の調製が必要である。
【０００４】
動物飼料において、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）／トウモロコシ（ｃｏｒｎ）又はトウモロコシ（ｍａｉｚｅ）／トウモロコシ（ｃｏｒｎ）サイラージは、その効率的な成長及びそのエネルギー密度特性により、特に反芻動物の飼料でより一般的に重要になってきている。
【０００５】
この結果として、反芻動物飼料におけるトウモロコシ及び／又はデンプンの消化率の改善は、エネルギー潜在力及び全ての利用可能な栄養素の完全な利用を可能にするために必要である。
【０００６】
それ以外に、高成長速度（肉牛）によって特徴付けられる高生産性の雌ウシは、高濃縮レベルのトウモロコシを含む食餌を摂取する。このような食餌は、動物の肥育成績、枝肉特性を向上させ、結果として採算性を高めることができるため、フィードロット牛に広く使用されている。このような食餌は、典型的には、Ｍｏｎｅｎｓｉｎ、当初は家禽コクシジウム抑制薬として開発されたカルボン酸イオノフォアが添加される。Ｍｏｎｅｎｓｉｎは、飼料効率を向上させ、群れの寄生虫感染を防止し、抑制するため、ウシに与えられた場合に有利な成長促進特性を有することが知られている。
【０００７】
Ｍｏｎｅｎｓｉｎの不都合な点は、合成抗生物質であるということである。従って、動物育種及び農業における抗生物質の使用を削減することができ、かつ抗生物質不使用の肉製品の世界的な需要の高まりに対応することができる肉牛用の持続可能な代替の解決策を見出すという継続的な要望が存在する。
【０００８】
［関連技術の説明］
国際公開第０３／０６８２５６  Ａ１号パンフレットに、反芻動物の栄養の向上のためのアミラーゼ飼料補助剤が記載されている。使用されるアミラーゼは、ショウユコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）によって産生される真菌アミラーゼである。Ｔｒｉｃａｒｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ，ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５，８１：３６５−３７４に、第一胃内発酵及び泌乳ホルスタイン乳牛での乳汁産生に対するα−アミラーゼ活性を含むショウユコウジカビ抽出物の効果が記載されている。
【０００９】
Ｒｏｊｏ  ｅｔ  ａｌ（Ａｎｉｍａｌ  Ｆｅｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２３−１２４（２００５），６５５−６６５）は、第一胃デンプン消化及び子羊の肥育成績に対するリケニホルミス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）及び黒色アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来の外来性アミラーゼの効果を研究した。
【００１０】
［発明の概要］
本発明の目的は、フィードロット動物の飼料利用率を向上させることによって、即ち、飼料転換率及び／又は体重増加を向上させることによって、並びに乳牛の乳量を向上させることによって上記の問題を緩和することができる、好ましくは向上した代替の概念を提供することにある。
【００１１】
本発明の別の目的は、動物の食餌中の全て又は一部の抗生物質を置き換えることによって動物の肉製品を生産するための持続可能な方法に対応するフィードロット動物の代替の給餌概念を提供することにある。
【００１２】
驚くべきことに、ここで、ウシ亜科のフィードロット動物に必要な飼料中のチモール、オイゲノール、メタ−クレゾール、バニリン、及びグアヤコールからなる群から選択される少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つの精油化合物の混合物とカルボヒドラーゼの併用が、トウモロコシ飼料の消化率を著しく向上できるという利点を有することが見出された。
【００１３】
特に、本発明の発明者らは、チモール、オイゲノール、メタ−クレゾール、バニリン、及びグアヤコールからなる群から選択される精油化合物の混合物に加えて、例えば、アミラーゼとしてのカルボヒドラーゼの添加が、フィードロットの群れにおける日々の体重増加及び飼料効率を改善することを見出した。
【００１４】
フィードロット又は飼育場は、屠殺前の家畜、特に肉牛であるが、ブタ、ウマ、ヒツジ、シチメンチョウ、ニワトリ、又はカモの仕上げ用の集約動物農場に使用される動物飼養業のタイプである。
【００１５】
本文脈において、ウシ亜科の動物（ウシ又はウシ亜科動物とも呼ばれる）とは、動物界の動物、脊索動物の門、哺乳類の綱、偶蹄目、及びウシ科のファミリーのことである。本目的では、家畜種が最も好ましい種である。本目的では、この用語は、全ての品種の家畜種、及び全ての生産種のウシ、特に肉牛及び乳牛を含む。
【００１６】
ウシ亜科の動物に必要な飼料中のチモール、オイゲノール、メタ−クレゾール、バニリン、及びグアヤコールからなる群から選択される少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つの精油化合物の混合物を、フィードロット動物の飼料に現在使用されている抗生物質の重要な利点を維持したまま、前記抗生物質の量を軽減する、又は前記抗生物質の代わりに使用することができる代替の食餌成分として使用することができることが更に見出された。
【００１７】
従って、一実施形態では、本発明は、フィードロット動物に使用される食餌の消化率を向上させる方法に関する。より詳細には、本発明は、フィードロット動物の群れにおける肉牛の体重増加及び／又は飼料転換率（ＦＣＲ）を改善する方法に関し、この方法は、チモール、オイゲノール、メタ−クレゾール、バニリン、及びグアヤコールからなる群から選択される少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つの精油化合物の混合物と組み合わせて、有効量の少なくとも１つのカルボヒドラーゼを動物に与えることを含む。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、ウシ亜科の動物の肉製品を持続可能に生産する方法に関し、前記方法は、フィードロットで使用される予定の飼料組成物を、この組成物中の抗生物質の全て又は一部をチモール、オイゲノール、メタ−クレゾール、バニリン、及びグアヤコールからなる群から選択される少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つの精油化合物の混合物で置き換えることによって配合する工程を含む。
【００１９】
飼料又は飼料組成物という語は、動物が摂取するのに適した、又は動物が摂取する予定のあらゆる化合物、調製物、混合物、又は組成物を指す。
【００２０】
本発明はまた、フィードロット動物、特に肉牛用の新規な飼料添加組成物に関し、この組成物は、上記定義された少なくとも２つの精油化合物と組み合わせられる少なくとも１つのカルボヒドラーゼを活性成分として含む。
【００２１】
［発明の詳細な説明］
本発明による精油化合物は、市販の物である、又は先行技術で周知のプロセス及び方法を用いて当業者が調製することができる。
【００２２】
精油化合物は、混合物中の高度に精製された形態で、又は天然に入手可能な植物の抽出物若しくは抽出混合物の形態で使用することができる。
【００２３】
本明細書で使用される「抽出物」という語は、溶媒抽出（「抽出油」としても知られる）、蒸気蒸留（「精油」としても知られる）、又は当業者に公知の他の方法によって得られる組成物を含む。適切な抽出溶媒としては、アルコール、例えば、エタノールが挙げられる。
【００２４】
「天然の」という表現は、本文脈においては、自然に発生する化合物及び天然産物又は合成によって得られる化合物からなる物質であることを理解されたい。天然物質は、好ましくは、主成分として上記定義された化合物の少なくとも２つと、例えば、カプサイシン、タンニン、又はカルバクロールのような追加の他の精油化合物とを含み得る。
【００２５】
肉牛に関しては、現在は、精油は、５０〜１５０ｍｇ／体重１ｋｇ１日当たり、好ましくは７０ｍｇ〜１２０ｍｇ／体重１ｋｇ１日当たり、の量（精油の総投与量範囲）で与えられることが企図される。
【００２６】
本発明の別の好ましい実施形態では、精油は、単一飼料添加組成物として飼料に添加される。
【００２７】
本発明による精油を含む試料添加組成物は、任意選択により少量の他の化合物、例えば、植物中に見られ、以下の群から選択される少なくとも１つの化合物を含み得る（飼料１ｋｇ当たり）：
最大約１ｍｇのプロピリデン、ブチリデン、フタライド、ジンゲロール、ラベンダー油；
最大約２ｍｇのデカラクトン、ウンデカラクトン、ドデカラクトン、イオノン、イロン、ユーカリプトール、メントール、ペパーミント油、α−ピネン；
最大約３ｍｇのリモネン、アネトール、リナロール、ジヒドロジャスモン酸メチル；
最大約４ｍｇのカルバクロール、プロピオン酸、酢酸又は酪酸、ローズマリー油、クローブ油、ゲラニオール、テルピネオール、シトロネロール；
最大約５ｍｇのサリチル酸アミル及び／又はサリチル酸ベンジル、シンナムアルデヒド、植物ポリフェノール（タンニン）；及び
最大約５ｍｇのターメリックの粉末又はクルクマの抽出物。
【００２８】
全ての精油及び追加の化合物は、乳化界面活性剤と組み合わせて使用することができる。
【００２９】
乳化剤は、やや親水性の乳化剤、例えば、脂肪酸、例えば、エステル化リシノール酸のポリグリセロールエステル、又は脂肪酸のプロピレングリコールエステル、糖エステル又は糖グリセリド、ポリエチレングリコール、レシチンなどの中から有利に選択することができる。
【００３０】
本発明による最終飼料添加組成物中の精油化合物の特に好ましい用量の例は、以下の範囲で互いに独立している：
チモール、８０〜１２０ｇ／ｋｇ、好ましくは１０１ｇ／ｋｇ；
オイゲノール、２０〜６０ｇ／ｋｇ、好ましくは３０ｇ／ｋｇ；
メタ−クレゾール、８０〜１１０ｇ／ｋｇ、好ましくは９０ｇ／ｋｇ；
バニリン、３０〜７０ｇ／ｋｇ、好ましくは５０ｇ／ｋｇ；
グアヤコール、２０〜５０ｇ／ｋｇ、３５ｇ／ｋｇ；
サリチル酸塩、１０〜３０ｇ／ｋｇ、２５ｇ／ｋｇ；
レゾルシン、５〜２０ｇ／ｋｇ、１５ｇ／ｋｇ。
【００３１】
肉牛の給餌概念の好ましい一実施形態では、最終飼料は、チモール、メタ−クレゾール、及びバニリンの混合物を含み、これらの３つの化合物は、これらの化合物が与えられるべき対象の体重１ｋｇ当たり５０ｍｇ〜１５０ｍｇの総精油の日用量を提供するのに十分な量で使用される。
【００３２】
本発明のために、請求される精油の組み合わせを含む好ましい飼料添加組成物は、Ｃｒｉｎａ（登録商標）Ｒｕｍｉｎａｎｔｓ（ＤＳＭ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＡＧ，Ｋａｉｓｅｒａｕｇｓｔ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手可能）という名称の市販品として入手可能である。Ｃｒｉｎａ（登録商標）Ｒｕｍｉｎａｎｔｓは、動物の栄養用の風味化合物の配合物であり、かつ３８０ｇ／ｋｇの総精油の含有量を有する。
【００３３】
本文脈において、カルボヒドラーゼは、炭水化物の単糖への分解を触媒する酵素である。
【００３４】
本文脈において有用なカルボヒドラーゼの例としては、グルカナーゼ、特に、β−グルカナーゼ及びキシログルカナーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、及びペクチナーゼ、及びこれらの混合物が挙げられる。本発明の好ましい一実施形態では、カルボヒドラーゼはアミラーゼである。
【００３５】
本発明に従って使用されるカルボヒドラーゼは、プロテアーゼの存在下で安定である。プロテアーゼ安定性は、プロテアーゼ（例えば、ペプシン、７０ｍｇ／ｌ）の存在下、所望の時間（例えば、３０分、４５分、６０分、９０分、又は１２０分）、所望のｐＨ（例えば、ｐＨ３、ｐＨ４、又はｐＨ５）で、緩衝液中で０．５ｍｇの精製カルボヒドラーゼ酵素タンパク質／ｍｌをインキュベートし、そしてｐＨを所望のｐＨ（例えば、ｐＨ４、ｐＨ５、ｐＨ６、又はｐＨ７）まで上げて残留活性を測定することによって決定することができる。残留カルボヒドラーゼ活性は、対照（非プロテアーゼ処置サンプル）に対して、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は少なくとも９０％である。
【００３６】
特定の一実施形態では、少なくとも１つのカルボヒドラーゼは、アミラーゼ、又はβ−グルカナーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、及びペクチナーゼからなる群から選択される少なくとも２つの酵素を含む酵素混合物である。
【００３７】
本発明のために、好ましいカルボヒドラーゼは、以下の市販品に含まれるカルボヒドラーゼである：Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＲｕｍｉＳｔａｒ（登録商標）、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＶＰ、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＷＸ、及びＲｏｘａｚｙｍｅ（登録商標）（ＤＳＭ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＡＧ，Ｋａｉｓｅｒａｕｇｓｔ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手可能）。
【００３８】
本文脈において、アミラーゼは、デンプン並びに他の直鎖及び分岐オリゴ糖及び多糖の内部加水分解を触媒する酵素である。特定の一実施形態では、本発明に従って使用されるアミラーゼは、α−アミラーゼ活性を有する、即ち、オリゴ糖及び多糖における１，４−α−グルコシド結合の内部加水分解を触媒する。α−アミラーゼは、例えば、デンプン、グリコーゲン、並びに関連する多糖及びオリゴ糖に無作為に作用し、還元基を遊離させてα−配置にする。
【００３９】
好ましい一実施形態では、本発明のアミラーゼは、α−アミラーゼ（系統名：１，４−α−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼ）、好ましくは細菌アミラーゼである。更なる実施形態では、本発明のアミラーゼは、アミラーゼのＥＣ  ３．２．１群、例えば、ＥＣ  ３．２．１．１（α−アミラーゼ）、ＥＣ  ３．２．１．２（β−アミラーゼ）、ＥＣ  ３．２．１．３（グルカン１、４−α−グルコシダーゼ、アミログルコシダーゼ、又はグルコアミラーゼ）、ＥＣ  ３．２．１．２０（α−グルコシダーゼ）、ＥＣ  ３．２．１．６０（グルカン１、４−α−マルトテトラオヒドロラーゼ）、ＥＣ  ３．２．１．６８（イソアミラーゼ）、ＥＣ  ３．２．１．９８（グルカン１、４−α−マルトヘキソシダーゼ）、又はＥＣ  ３．２．１．１３３（グルカン１、４−α−マルトヒドロラーゼ）に属する。
【００４０】
好ましい一実施形態では、本発明に従って使用されるアミラーゼは、ＥＣ  ３．２．１．１群に属するとして分類され得る、又は分類される。ＥＣ番号は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４，２２３，１−５で公表された付録１〜５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９５，２３２，１−６；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９６，２３７，１−５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７，２５０，１−６；及びＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９，２６４，６１０−６５０のそれぞれを含め、ＮＣ−ＩＵＢＭＢ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａからの酵素命名法１９９２を参考にしている。この命名法は、定期的に追加され、更新される；例えば、ワールドワイドウェブ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｗ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌを参照されたい。
【００４１】
アミラーゼ活性は、任意の適切なアッセイによって決定することができる。一般に、アッセイ−ｐＨ及びアッセイ−温度を、当該酵素に適応させることができる。アッセイ−ｐＨ値の例としては、ｐＨ２、ｐＨ３、ｐＨ４、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８、ｐＨ９、ｐＨ１０、ｐＨ１１、又はｐＨ１２が挙げられる。アッセイ−温度の例としては、３０度、３５℃、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、８０℃、９０℃、又は９５℃が挙げられる。好ましいｐＨ値及び温度は、生理学的範囲では、例えば、３、４、５、６、７、又は８のｐＨ値及び３０℃、３５℃、３７℃、又は４０℃の温度である。以下のアミラーゼアッセイを使用することができる：基質：Ｐｈａｄｅｂａｓタブレット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；架橋結合不溶性青色デンプンポリマーであって、ウシ血清アルブミン及び緩衝物質と混合され、タブレットに製造されたもの）。アッセイ温度：３７℃。アッセイｐＨ：４．３（又は、所望に応じて７．０）。反応時間：２０分。水に懸濁後、デンプンをα−アミラーゼによって加水分解し、可溶性青色断片を得る。得られた青色溶液の６２０ｎｍで測定された吸光度は、α−アミラーゼ活性の関数である。１真菌α−アミラーゼ単位（１ＦＡＵ）は、標準的なアッセイ条件で１時間に５．２６ｇのデンプンを分解する酵素の量である。好ましいデンプンは、Ｍｅｒｃｋ、Ａｍｙｌｕｍ可溶性Ｅｒｇ．Ｂ．６、Ｂａｔｃｈ  ９９４７２７５である。より詳細なアッセイの記述、ＡＰＴＳＭＹＱＩ−３２０７は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ，Ｋｒｏｇｓｈｏｅｊｖｅｊ  ３６，ＤＫ−２８８０  Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋの請求に応じて入手可能である。
【００４２】
細菌の分類学的分類及び同定では、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９８６），ｖｏｌ  ２，ＩＳＢＮ０−６８３−０７８３を参照する。別の方法では、周知の１６ＳｒＲＮＡ配列分析を使用することができる（例えば、Ｊｏｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９９，４９，１２３１−１２４０、特に１２３３ページの第２段の方法のセクションを参照されたい）；又は分類学の専門家、例えば、ＤＳＭＺ又は他の承認されている受託機関に尋ねることができる。
【００４３】
本明細書で利用される、細菌性という語は、細菌に由来するアミラーゼを指す。「〜に由来する」という語は、野生型細菌の菌株から得ることができる又は得られる酵素及びその変異体を含む。この変異体は、少なくとも１つのアミノ酸残基の少なくとも１つの置換、挿入、及び／又は欠失を有し得る。変異体という語はまた、シャッフル体（ｓｈｕｆｆｌａｎｔ）、ハイブリッド、キメラ酵素、及びコンセンサス酵素（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｅｎｚｙｍｅ）も含む。変異体は、当分野で公知の任意の方法、例えば、部位特異的突然変異誘発法、ランダム変異導入法、コンセンサス誘導プロセス（欧州特許第８９７９８５号明細書）、及び遺伝子シャフリング（国際公開第９５／２２６２５号パンフレット、国際公開第９６／００３４３号パンフレット）などによって作製することができる。本目的では、アミラーゼ変異体は、少なくとも１つの細菌アミラーゼが、その設計、誘導体化、又は調製に使用されたときに細菌性と見なす。細菌性という語は、潜在的な組換え体作製宿主を指すのではなく、この組換え体作製宿主が有する遺伝子をコードするアミラーゼの起源のみを指す。
【００４４】
本発明に従って使用されるアミラーゼは、好ましくは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌株、例えば、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ハルマパルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｍａｐａｌｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、及びバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の菌株；好ましくは、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ハルマパルス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス属、バチルス・サブチリス、及びバチルス・ステアロサーモフィルスの菌株に由来する。
【００４５】
本発明に従って使用される野生型アミラーゼの非限定の例としては、リケニホルミス菌に由来する野生型アミラーゼ、例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔエントリー名ＡＭＹ＿ＢＡＣＬＩ、プライマリーアクセッション番号Ｐ０６２７８；バチルス・アミロリケファシエンス、例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔエントリー名ＡＭＹ＿ＢＡＣＡＭ、プライマリーアクセッション番号Ｐ００６９２；バチルス・メガテリウム、例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔエントリー名ＡＭＹ＿ＢＡＣＭＥ、プライマリーアクセッション番号Ｐ２０８４５；バチルス・サーキュランス、例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔエントリー名ＡＭＹ＿ＢＡＣＣＩ、プライマリーアクセッション番号Ｐ０８１３７；バチルス・ステアロサーモフィルス、例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔエントリー名ＡＭＹ＿ＢＡＣＳＴ、プライマリーアクセッション番号Ｐ０６２７９が挙げられる。別の例は、バチルス・サブチリス由来であり、例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔエントリー名ＡＭＹ＿ＢＡＣＳＵ、プライマリーアクセッション番号Ｐ００６９１である。
【００４６】
本発明のために、好ましいアミラーゼは、以下の市販品：ＢＡＮ、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ、Ｔｅｒｍａｍｙｌ  ＳＣ、Ｎａｔａｌａｓｅ、及びＤｕｒａｍｙｌ（全てＮｏｖｏｚｙｍｅｓから入手）、並びにＶａｌｉｄａｓｅ  ＢＡＡ及びＶａｌｉｄａｓｅ  ＨＴ製品（Ｖａｌｌｅｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手）に含まれるアミラーゼである。本発明に従って使用されるアミラーゼの更なる特定の例は、以下の市販品：Ｃｌａｒａｓｅ、ＤｅｘＬｏ、ＧＣ  ２６２  ＳＰ、Ｇ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９０、Ｇ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９５、Ｇ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９７、Ｇ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９８、ＨＴＡＡ、Ｏｐｔｉｍａｘ  ７５２５、Ｐｕｒａｓｔａｒ  ＯｘＡｍ、Ｐｕｒａｓｔａｒ  ＳＴ、Ｓｐｅｚｙｍｅ  ＡＡ、Ｓｐｅｚｙｍｅ  Ａｌｐｈａ、Ｓｐｅｚｙｍｅ  ＢＢＡ、Ｓｐｅｚｙｍｅ  Ｄｅｌｔａ  ＡＡ、Ｓｐｅｚｙｍｅ  ＤＢＡ、Ｓｐｅｚｙｍｅ  Ｅｔｈｙｌ、Ｓｐｅｚｙｍｅ  Ｆｒｅｄ（ＧＣ５２１）、Ｓｐｅｚｙｍｅ  ＨＰＡ、及びＵｌｔｒａｐｈｌｏｗ（全てＧｅｎｅｎｃｏｒから入手）；Ｖａｌｉｄａｓｅ  ＨＴ３４０Ｌ、Ｖａｌｌｅｙ  Ｔｈｉｎ  ３４０Ｌ（全てＶａｌｌｅｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手）；Ａｖｉｚｙｍｅ  １５００、Ｄｅｘｔｒｏ  ３００  Ｌ、Ｋｌｅｉｓｔａｓｅ、Ｍａｌｔａｚｙｍｅ、Ｍａｘａｍｙｌ、Ｔｈｅｒｍｏｚｙｍｅ、Ｔｈｅｒｍａｔｅｘ、Ｓｔａｒｚｙｍｅ  ＨＴ  １２０  Ｌ、Ｓｔａｒｚｙｍｅ  Ｓｕｐｅｒ  Ｃｏｎｃ、及びＵｌｔｒａｐｈｌｏに含まれるアミラーゼである。
【００４７】
特定の一実施形態では、本発明に従って使用されるアミラーゼは、ペレット化しても安定であり、かつ／又は熱安定性である。酵素の溶融温度（Ｔｍ）は、その熱安定性の指標である。本発明のアミラーゼは、示差走査熱量計（ＤＳＣ）で測定すると、少なくとも７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、又は少なくとも９５℃のＴｍを有し得る。ＤＳＣは、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、５０ｍＭ  塩化ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で行われる。走査速度は、一定、例えば、１．５℃／分である。走査される区間は、２０〜１００℃であり得る。別の緩衝液、例えば、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、又はｐＨ６．５の緩衝液が、走査のために選択され得る。更なる代替の実施形態では、より高い又はより低い走査速度、例えば、１．４℃／分、１．３℃／分、１．２℃／分、１．１℃／分、１．０℃／分、又は０．９℃／分の１つの低い走査速度を使用することができる。
【００４８】
別の好ましい実施形態では、本発明に従って使用されるアミラーゼは、最適なｐＨ及び３７℃での活性と比較して、ｐＨ７．０及び３７℃で少なくとも３５％の活性を有する。より好ましくは、ｐＨ７．０及び３７℃での活性は、最適なｐＨ及び３７℃での活性の少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、又は少なくとも７５％である。
【００４９】
別の好ましい実施形態では、本発明のアミラーゼは、胆汁塩の非存在下、最適ｐＨ及び３７℃での活性と比較して、５ｍＭ  胆汁塩の存在下、ｐＨ７．０及び３７℃で少なくとも２５％の活性を有する。より好ましくは、５ｍＭ  胆汁塩の存在下、ｐＨ７．０及び３７℃での活性は、胆汁塩の非存在下、最適ｐＨ及び３７℃での活性の少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、又は少なくとも６５％である。
【００５０】
本発明に従って使用される細菌アミラーゼは、市販品Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＲｕｍｉＳｔａｒ（登録商標）の活性酵素である。
【００５１】
特定の一実施形態では、飼料に添加される形態のアミラーゼ、又は飼料添加物に含められる場合のアミラーゼは、明確に定義される。明確に定義されるは、酵素調製物が、タンパク質ベースで少なくとも５０％の純度であることを意味する。他の特定の実施形態では、酵素調製物は、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９４％、又は少なくとも９５％の純度である。純度は、当分野で公知の任意の方法によって、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、又はサイズ排除クロマトグラフィーによって決定することができる（例えば、国際公開第０１／５８２７５号パンフレットの実施例１２を参照されたい）。
【００５２】
明確に定義された酵素調製物は有利である。例えば、他の酵素を本質的に妨害しない又は汚染しないように酵素を飼料に正確に添加することが遥かに容易である。正確に添加するという語は、特に、一貫した一定の結果を得る目的、及び所望の効果に基づいて用量を最適化する能力に対して用いられる。
【００５３】
この桁の純度の酵素調製物は、特に、組換え生産方法を用いて得ることが可能であり、このような酵素調製物は、従来の発酵法によって生産される場合は、容易に得られないし、遥かに大きいバッチごとの変動も生じる。
【００５４】
本発明に従って使用される細菌アミラーゼは、ウシの食餌又はウシ飼料添加物に有効量含められる。現在、有効量は、乾物食餌１ｋｇ当たり２００ｍｇ未満の酵素タンパク質、好ましくは乾物食餌１ｋｇ当たり１５０ｍｇ未満、１００ｍｇ未満、９０ｍｇ未満、８０ｍｇ未満、７０ｍｇ未満、６０ｍｇ未満、５０ｍｇ未満、４０ｍｇ未満、３０ｍｇ未満、２０ｍｇ未満、１５ｍｇ未満、１０ｍｇ未満、９ｍｇ未満、８ｍｇ未満、又は７ｍｇ（ｐｐｍ）未満の酵素タンパク質であることが企図される。他方、有効量は、乾物食餌１ｋｇ当たり０．０１ｍｇを超える酵素タンパク質、好ましくは乾物食餌１ｋｇ当たり０．０５ｍｇ、０．１０ｍｇ、０．１５ｍｇ、０．２０ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．３０ｍｇ、０．３５ｍｇ、０．４０ｍｇ、０．４５ｍｇ、０．５０ｍｇ、０．７５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、又は４ｍｇ（ｐｐｍ）を超える酵素タンパク質であり得る。従って、好ましい用量範囲の非限定の例は：０．１０〜５０ｍｇ酵素タンパク質／ｋｇ、好ましくは、０．５０〜１０酵素タンパク質／ｋｇ、１〜９酵素タンパク質／ｋｇ、２〜８酵素タンパク質／ｋｇ、３〜８、酵素タンパク質／ｋｇ又は４〜７ｍｇ酵素タンパク質／ｋｇである。
【００５５】
本発明に従った使用では、精油とアミラーゼとの混合物は、動物の食餌の前、後、又は同時に動物に与えることができる。後者が好ましい。
【００５６】
飼料転換率（ＦＣＲ）は、いかに効率的に飼料が利用されているかの指標である。ＦＣＲは、動物成長試験に基づいて決定することができ、この試験は、アミラーゼと併用される本発明に従った少なくとも２つの化合物の混合物が、飼料１ｋｇ当たりの適切な濃度で動物飼料に添加される第１の処置、及び動物飼料に化合物が添加されない第２の処置（対照）を含む。
【００５７】
一般に知られているように、改善されたＦＣＲは、対照ＦＣＲよりも低い。特定の実施形態では、ＦＣＲは、対照と比較して、少なくとも１．０％、好ましくは少なくとも１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、又は少なくとも２．５％向上（即ち、低下）する。
【００５８】
改善された体重の増加とは、アミラーゼ及び精油が添加されてない対照と比較した、毎日の体重増加の向上、毎週の体重増加の向上、隔週の体重増加の向上、又は毎月の体重増加（関連期間当たりのグラム又はキログラム単位での増加）の向上のことである。
【００５９】
ウシ、例えば、肉牛の飼料組成物については、ウシの食餌は、通常は、容易に分解可能な画分（濃厚飼料と呼ばれる）、及び本発明に従って大部分をトウモロコシとして含む繊維の多いやや分解されにくい画分から構成される。サイラージは、サイロに貯蔵された繊維の多い画分であり、水分量の多い材料は、（天然発酵又は添加物処理される）制御された嫌気的発酵プロセスで処理される。
【００６０】
本発明の飼料添加組成物は、本明細書で上記されたアミラーゼ及び精油に加えて、ビタミン及びミネラルの中から選択される少なくとも１つの更なる成分を含む。例えば、本発明の飼料添加物は、（ｉ）少なくとも１つのビタミン、（ｉｉ）少なくとも１つのミネラル、又は（ｉｉｉ）少なくとも１つのビタミンと少なくとも１つのミネラルを含み得る。
【００６１】
少なくとも１つのビタミンは、脂溶性又は水溶性であり得る。脂溶性ビタミンの例としては、ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、及びビタミンＫ、例えば、ビタミンＫ３が挙げられる。水溶性ビタミンの例としては、ビタミンＢ１２、ビオチン及びコリン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ナイアシン、葉酸、及びパントテン酸、例えば、Ｃａ−Ｄ−パントテン酸が挙げられる。
【００６２】
少なくとも１つのミネラルは、多量ミネラル及び／又は微量ミネラルであり得る。微量ミネラルの例としては、マンガン、亜鉛、鉄、銅、ヨウ素、セレン、及びコバルトが挙げられる。多量ミネラルの例としては、カルシウム、リン、及びナトリウムが挙げられる。
【００６３】
本明細書で上記例示された飼料添加物の組成物の動物飼料への混入は、実際、濃厚飼料又はプレミックスを用いて行われる。プレミックスは、好ましくは、１つ以上の微量成分と希釈剤及び／又は担体との均質な混合物を指す。プレミックスを用いて、より大きい混合物中での微量成分の均質な分散を促進する。本発明によるプレミックスは、固体（例えば、水溶性粉末）又は液体として飼料成分又は飲料水に添加することができる。
【００６４】
プレミックスは、０．５〜１０重量％の本発明による活性成分及び１０〜９５重量％の他の従来の添加物、例えば、香味料、ビタミン、無機塩、及び任意の従来の吸収補助剤を含み得る。このプレミックスは、最終的に飼料に添加される。
【００６５】
本発明は、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない以下の実施例によって更に説明される。
【００６６】
［実施例：フィードロットのＮｅｌｏｒｅ牛の仕上げ用のＣｒｉｎａ（登録商標）Ｒｕｍｉｎａｎｔｓ及びＲｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）Ｒｕｍｉｓｔａｒ（登録商標）の効果］
［プロトコル及び設計］
ＥＳＡＬＱ／ＵＳＰ  （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓａｏ  Ｐａｕｌｏ），Ｐｉｒａｃｉｃａｂａ−ＳＰ，ＢｒａｚｉｌのＡｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔの施設で研究を行った。
【００６７】
処置を５０の囲いに割り当て、各囲いに６匹の動物とした。水は自由に飲めるようにし、給餌は１日１回とした。実験の開始時及び終了時の体重（ＢＷ）測定の前の１６時間、ウシには飼料と水を与えなかった。２８日後及び５６日後に、部分的な平均の１日の体重増加を監視するために体重（ＢＷ）を測定した。
【００６８】
【表１】
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【００６９】
【表２】
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【００７０】
［結果］
結果は表１及び表２に示されている。
【００７１】
【表３】
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【００７２】
要約：ＣＲＩＮＡ  ＲＵＭＩＮＡＮＴＳは、ＭＯＮＥＮＳＩＮと比較すると、平均の１日の体重増加が１４．５％、飼料効率が７．３４％増加した。ＣＲＩＮＡ  ＲＵＭＩＮＡＮＴＳ＋ＲＯＮＯＺＹＭＥ  ＲＵＭＩＳＴＡＲ（アミラーゼ）は、ＭＯＮＥＮＳＩＮと比較すると、平均の１日の体重増加が２３．３％、飼料効率が１２．４％増加した。
【００７３】
【表４】
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【００７４】
要約：ＣＲＩＮＡ  ＲＵＭＩＮＡＮＴＳは、ＭＯＮＥＮＳＩＮと比較すると、平均の１日の体重増加が１４．７％、飼料効率が７．７５％増加した。ＣＲＩＮＡ  ＲＵＭＩＮＡＮＴＳ＋ＲＯＮＯＺＹＭＥ  ＲＵＭＩＳＴＡＲ（アミラーゼ）は、ＭＯＮＥＮＳＩＮと比較すると、平均の１日の体重増加が２０．８％、飼料効率が１０．９％増加した。
【国際調査報告】
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