(57)【要約】本発明は、濾胞性制御性Ｔ（ＴＦＲ）細胞媒介免疫応答を調節する方法、並びに例えばウイルス感染、細菌感染、病原性感染、真菌感染、又はがんなどの疾患又は状態の治療における、その方法の使用を提供する。そのような方法は、ＩＬ−２１を使用して抗体産生のＴＦＲ抑制を克服することにより、抗体産生の増強を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
濾胞性制御性Ｔ（ＴＦＲ）細胞、及びサイトカインを含む、増強された免疫活性を有する組成物。
【請求項２】
前記増強された免疫活性が、天然のＴＦＲ細胞と比較した、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体産生の増強により特徴づけられる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記増強された免疫活性が防御抗体応答である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記サイトカインがＩＬ−２１又はＩＬ−６である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
低減された活性を有するＴＦＲ細胞を含む組成物を調製する方法であって、
ａ）ＴＦＲ細胞、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）前駆細胞、又はその両方を含む最初の細胞集団を得る工程；
ｂ）サイトカインの存在下、ｅｘ  ｖｉｖｏで前記細胞を接触させる工程；及び
ｃ）前記細胞集団からＴＦＲ細胞を単離する工程であって、単離されたＴＦＲ細胞は低減された免疫活性を有する、工程；
を有してなる方法。
【請求項６】
前記サイトカインがＩＬ−２１又はＩＬ−６である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記低減された免疫活性が、抗体産生の増強をもたらす、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記最初の細胞集団が、１又は複数の対象の末梢血、組織又は器官から単離される、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
細胞をサイトカインと接触させる前に、前記細胞集団からＴＦＲ細胞及びＴｒｅｇ前駆細胞をソートする工程をさらに含む、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞集団を拡大する工程をさらに含む、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
必要とする対象において免疫応答を調節する方法であって：
前記対象に、ａ）濾胞性制御性Ｔ（ＴＦＲ）細胞とサイトカインとを含む組成物の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１２】
前記サイトカインがＩＬ−２１又はＩＬ−６である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＴＦＲ細胞が、前記サイトカインと一緒に又は組み合わせて投与される、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象に投与する前に、前記ＴＦＲ細胞を前記サイトカインと接触させる、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＴＦＲ細胞が、対象の末梢血から単離されたものである、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ＴＦＲ細胞の調節が、増強された抗体産生をもたらす、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象にワクチンを投与することをさらに含む、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ＴＦＨ細胞を含む組成物、及びワクチンを共投与することを含む、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が静脈内投与される、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が、ウイルス感染、細菌感染、病原性感染、真菌感染、及びがんからなる群より選択される疾患又は状態を患っている、請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ＴＦＨ細胞の組成物、及びサイトカインを含む、増強された免疫活性を有するアジュバント。
【請求項２２】
前記サイトカインがＩＬ−２１又はＩＬ−６である、請求項２１に記載のアジュバント。
【請求項２３】
前記ＴＦＨ細胞が、対象の末梢血から精製されたものである、請求項２１又は２２に記載のアジュバント。
【請求項２４】
対象の末梢血から精製されたＴＦＨ細胞、増強された刺激能を有するＴＦＨ細胞、又はそれらの任意の組合せをさらに含む、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のアジュバント。
【請求項２５】
対象において免疫応答をアップレギュレートする方法であって、前記対象に、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物又は請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のアジュバントの有効量を投与することを含む、方法。
【請求項２６】
請求項１〜４ののいずれか１項に記載組成物又は請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のアジュバントを含む、ワクチン。
【請求項２７】
必要とする対象において抗体産生を増強する方法であって、前記対象に請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のアジュバントを投与することを含む、方法。
【請求項２８】
必要とする対象において防御抗体応答を高める方法であって、前記対象に、ＴＦＲ細胞抑制を調節できる第１の作用物質を、前記対象においてＴＦＲ細胞媒介抗体抑制を低減させるのに有効な量で投与することを含む、方法。
【請求項２９】
前記対象に、選択的ＴＦＨ受容体を調節できる第２の作用物質を、ＴＦＨ細胞媒介抗体産生を増加させるのに有効な量で投与することをさらに含み、防御抗体応答が、前記第１又は第２の作用物質の不在下での防御抗体応答と比較して高められる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２の作用物質が、前記第１の作用物質と一緒に、組み合わせて、又はその後に投与される、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の作用物質がサイトカインである、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記サイトカインがＩＬ−２１又はＩＬ−６である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第２の作用物質がワクチンである、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記対象が、ウイルス感染、細菌感染、病原性感染、真菌感染、及びがんからなる群より選択される疾患又は状態を患っている、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記防御抗体応答が、疾患の病原又は病因を低減する又は排除する、請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１５年１１月２３日出願の米国仮特許出願第６２／２５８，８７６号、及び２０１６年２月２６日出願の米国仮特許出願第６２／３００，３３９号の優先権の利益を主張する。その内容がそれぞれ、ここに参照することによってその全体が本願に援用される、
【技術分野】
【０００２】
本発明は、免疫応答を調節するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
免疫応答の調節は、炎症性疾患及び自己免疫疾患の予防の主流となっている。免疫抑制療法により免疫系のダウンレギュレーションを達成することができるが、全般的に免疫を抑制する作用物質は、感染症及びがんなどの、他の疾患に罹りやすくする。特異的抗原に対する免疫応答の異常活性化を制御する手段は、特定の標的抗原に対する免疫応答のダウンレギュレーションを可能とするが、侵入病原体及び腫瘍関連抗原に対しては免疫系を機能的なままにするため、自己免疫疾患、移植片対宿主病、及び遺伝子治療の副作用の治療における大きな進歩となる。逆に、それに対する免疫応答が望まれる特異的抗原の免疫原性を特異的に高める方法は、例えばワクチン接種との関連において所望の免疫応答を増進させ、及び腫瘍抗原などの抗原に対する応答性を増進させるのに極めて有益となる。
【０００４】
ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞は、Ｂ細胞の増殖及びＢ細胞応答を調節する機能を有する、ＣＤ４＋細胞のクラスである。Ｔｈ細胞は、体液性免疫及び免疫病理において重要な役割を果たす。濾胞性ヘルパーＴ細胞（ＴＦＨ）は、コグネイトＢ細胞が形成して胚中心（ＧＣ）反応を維持するのを助けるため及び体液性免疫応答の発生のために必要不可欠である、最近特定されたＣＤ４＋細胞のサブクラスである。これらの細胞は、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ５の発現により広く一般的に定義され、ＣＸＣＲ５は、ケモカインＣＸＣＬ１３の濃度勾配を介してＢ細胞濾胞にそれら細胞を方向づける１。ＴＦＨ細胞は、転写因子Ｂｃｌ６（Ｂｌｉｍｐ−１／Ｐｒｄｍ１を抑制する）及び高レベルの共刺激受容体ＩＣＯＳも発現しており、それらはともにＴＦＨ細胞の分化及び維持に重要である１−４。さらに、ＴＦＨ細胞は、大量のＩＬ−２１を分泌し、それは、ＧＣ形成、アイソタイプスイッチ、及び形質細胞形成を助ける５。ヒト及びマウスにおいて、機能的に類似するＴＦＨ細胞が二次リンパ器官で見られる。ＣＸＣＲ５＋ＴＦＨ細胞は末梢血にも存在し、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症及び若年性皮膚筋炎患者などの、自己抗体を有する個体において高いレベルで認められる。しかしながら、これら循環ＴＦＨの機能は不明のままである６−９。
【０００５】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、多様な細胞タイプに対する多能性の抗炎症作用を有する。特に、それらは、自然免疫細胞及び獲得免疫細胞の活性化を制御する。抗原特異的態様で作用するＴｒｅｇは、例えば、エフェクターＴ細胞が侵入病原体に対する攻撃をうまく開始した後に、又は自己抗原に対する反応性を抑制して自己免疫疾患を予防するために、エフェクターＴ細胞の活性化及び機能を低減する。
【０００６】
Ｔｒｅｇの２つのサブセットは、それらが生体内で発生する場所によって分類される。内在性Ｔｒｅｇ（naturally occurring Treg）（ｎＴｒｅｇ）は、胸腺内で発生し、末梢において自己反応性免疫応答を抑制するのに対して、誘導性Ｔｒｅｇ（adaptive Treg）（ａＴｒｅｇ）は、通常のＣＤ４＋Ｔ細胞から末梢において発生し、例えば食物や腸内フローラに由来するもののような、害のない抗原に対する寛容を確保する。
【０００７】
Ｔｒｅｇ細胞の両方のサブセットは、高レベルのＣＤ２５、及び転写因子Ｆｏｘｐ３の発現により特徴づけられる。Ｔｒｅｇは、自己反応性エフェクターＴ細胞の抗原特異的な拡大及び／又は活性化を阻害し、ＴＧＦ又はＩＬ−１０などの抑制性サイトカイン分泌すると考えられている。全身性の免疫抑制を生じることなく抗原特異的免疫調節をもたらすその可能性のため、Ｔｒｅｇは、炎症性疾患又は自己免疫性疾患のための細胞療法での使用が検討されている。
【０００８】
濾胞性制御性Ｔ（ＴＦＲ）細胞は、転写因子ＦｏｘＰ３、Ｂｃｌ６及びＰｒｄｍ１／Ｂｌｉｍｐ１が陽性で、かつ胚中心反応を阻害する働きをする、新たに特徴づけられたＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋細胞のサブセットである２１−２３。本発明者は、ＴＦＲ細胞がどのように抗体産生を抑制するか、及びどのように特定のサイトカインがこの抑制を克服して抗体産生を高めることができるのかを発見した。この発見は、治療で使用するための、免疫応答を調節する新規なアプローチを解明する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、対象の末梢血に由来するＴＦＲ細胞が、ＴＦＨ媒介抗体産生の強力な阻害因子であるが、免疫系の他のアームを阻害しないことを発見した。ＴＦＲ細胞を含む組成物は、対象の末梢血から単離することができる。他のＰＭＢＣからＴＦＲ細胞を精製し、さらに任意選択的に、表面マーカーに基づきＴＦＲ細胞をソートすることにより、末梢血ＴＦＲ細胞に関してその組成物を濃縮することができる。末梢血由来のＴＦＲ細胞の組成物を拡大及び／又は活性化して、その患者の末梢血に由来する元のＴＦＲ細胞集団に基づくＴＦＲ細胞のクローン集団を作製してもよい。
【００１０】
本発明者は、ＴＦＲ抑制によりＢ細胞及びＴＦＨ細胞が変化することを発見した。抑制されたＴＦＨ細胞（抑制ＴＦＨ細胞）は、サイトカイン産生の不全を有するがまだＴＦＨプログラムを発現し、代謝リプログラミングされる。抑制されたＢ細胞（抑制Ｂ細胞）は、明確な抑制された遺伝子シグネチャーを有し、及び代謝リプログラミングされ、一般的代謝経路を阻害する（例えば、プリン／１Ｃ代謝経路を遮断する）ことが、ＴＦＲ抑制に似ている又はそれを再現する。
【００１１】
本発明者はまた、対象による免疫応答の前又は間に、対象におけるＴＦＨ細胞に対するＴＦＲ細胞の比を高めると、抗体産生が阻害されることを発見した。従って、本発明は、免疫応答の抑制が望まれる対象において免疫応答を抑制する方法であって、対象の末梢血由来のＴＦＲ細胞（又は拡大／活性化されたその集団）が濃縮された組成物を投与する、或いは増強された抑制活性を有するＴＦＲ細胞を含む組成物を投与することにより、ＴＦＨ細胞に対するＴＦＲ細胞の比を高めることを含む方法を提供する。
【００１２】
本発明はまた、対象において抗体産生を増強する方法であって、ＴＦＲ又はＴＦＨ細胞を、特定のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２１、ＩＬ−６）と接触させて、抗体産生のＴＦＲ抑制を制限することを含む方法を提供する。
【００１３】
本発明のＴＦＲ細胞及びＴＦＨ細胞の組成物は、ワクチン接種レジメンの一部としてアジュバントとしても有用である。この態様で使用される場合、組成物は、そのようなワクチンの有効性を向上させる。
【００１４】
本発明はさらに、患者において防御抗体応答を増強するための組成物及び方法であって、患者において防御抗体応答を増強する、或いは抗体産生又は応答を増加させるのに有効な量で、作用物質（例えば、ＩＬ−２１又はＩＬ−６などのサイトカイン）を用いてＴＦＨ又はＴＦＲ細胞を選択的に調節することを含む、組成物及び方法を提供する。
【００１５】
本発明の１つの態様は、濾胞性制御性Ｔ（ＴＦＲ）細胞又はＴＦＨ細胞、及びサイトカインを含む組成物であって、増強された免疫活性を有する組成物に関する。
【００１６】
ある実施形態において、増強された免疫活性は、天然のＴＦＲ細胞と比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体産生の増強により特徴づけられる。
【００１７】
ある実施形態において、増強された免疫活性は、防御抗体応答である。
【００１８】
ある実施形態において、サイトカインＩＬ−２１である。ある実施形態において、サイトカインはＩＬ−６である。
【００１９】
本発明の別の態様は、低減された活性を有するＴＦＲ細胞を含む組成物を調製する方法であって、
ａ）ＴＦＲ細胞、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）前駆細胞、又はその両方を含む最初の細胞集団を得る工程；
ｂ）サイトカインの存在下、ｅｘ  ｖｉｖｏで前記細胞を接触させる工程；及び
ｃ）前記細胞集団からＴＦＲ細胞を単離する工程であって、その単離されたＴＦＲ細胞は低減された免疫活性を有する、工程；
を有してなる方法に関する。
【００２０】
ある実施形態において、低減された活性は、抗体産生の増強をもたらす。
【００２１】
ある実施形態において、最初の細胞集団は、１又は複数の対象の末梢血、組織又は器官から単離される。
【００２２】
ある実施形態において、その方法は、細胞をサイトカインと接触させる前に、細胞集団からＴＦＲ細胞及びＴｒｅｇ前駆細胞をソートする工程をさらに含む。
【００２３】
ある実施形態において、その方法は、細胞集団を拡大する工程をさらに含む。
【００２４】
本発明の別の態様は、必要とする対象において、免疫応答を調節する方法であって：
ａ）濾胞性制御性Ｔ（ＴＦＲ）細胞とサイトカインとを含む組成物の有効量を、前記対象に投与することを含む方法に関する。
【００２５】
ある実施形態において、ＴＦＲ細胞は、サイトカインと一緒に又は組み合わせて投与される。
【００２６】
ある実施形態において、対象に投与する前に、ＴＦＲ細胞をサイトカインと接触させる。
【００２７】
ある実施形態において、ＴＦＲ細胞は対象の末梢血から単離される。
【００２８】
ある実施形態において、ＴＦＲ細胞の調節は、増強された抗体産生をもたらす。
【００２９】
ある実施形態において、その方法は、前記対象にワクチンを投与することをさらに含む。
【００３０】
ある実施形態において、その方法は、ＴＦＨ細胞を含む組成物、及びワクチンを共投与 (co-administrating) することをさらに含む。
【００３１】
ある実施形態において、組成物は静脈投与される。
【００３２】
ある実施形態において、対象は、ウイルス感染、細菌感染、病原性感染、真菌感染、及びがんからなる群より選択される疾患又は症状を患っている
本発明の別の態様は、ＴＦＨ細胞の組成物、及びサイトカインを含む、増強された免疫活性を有するアジュバントに関する。
【００３３】
ある実施形態において、ＴＦＨ細胞は、対象の末梢血から精製される。
【００３４】
ある実施形態において、アジュバントは、対象の末梢血から精製されたＴＦＨ細胞、増強された刺激能を有するＴＦＨ細胞、又はそれらの任意の組合せをさらに含む。
【００３５】
本発明の別の態様は、対象において免疫応答をアップレギュレートする方法であって、濾胞性制御性（ＴＦＲ）Ｔ細胞とサイトカインとを含む組成物の有効量を、対象に投与することを含む方法に関する。
【００３６】
本発明の別の態様は、濾胞性制御性（ＴＦＲ）Ｔ細胞とサイトカインとを含む組成物を含有するワクチンに関する。
【００３７】
本発明の別の態様は、必要とする対象において抗体産生を増強する方法であって、ＴＦＲ細胞とサイトカインとを含むアジュバントを対象に投与することを含む方法に関する。
【００３８】
本発明の別の態様は、必要とする対象において防御抗体応答を高める方法であって、
対象においてＴＦＲ細胞依存性抗体抑制を低減するのに有効な量で、ＴＦＲ細胞抑制を調節できる第１の作用物質を対象に投与することを含む方法に関する。
【００３９】
ある実施形態において、その方法は、ＴＦＨ細胞依存性抗体産生を増加させるのに有効な量で、選択的ＴＦＨ受容体を調節できる第２の作用物質を投与することをさらに含み、前記防御抗体応答は、第１又は第２の作用物質の不在下での防御抗体応答と比較して、高められる。
【００４０】
ある実施形態において、第２の作用物質は、第１の作用物質と一緒に、組み合わせて、又はその後に投与される。ある実施形態において、第２の作用物質はワクチンである。
【００４１】
ある実施形態において、第１の作用物質はサイトカインである。
【００４２】
ある実施形態において、対象は、ウイルス感染、細菌感染、病原性感染、真菌感染、及びがんからなる群より選択される疾患又は症状を患っている。
【００４３】
ある実施形態において、防御抗体応答は、前記疾患の原因又は病因を低減する。
【００４４】
本発明の他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の精神及び範囲内の様々な変更及び修飾は、この詳細な説明から当業者に明らかとなるため、詳細な説明及び具体例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、例証としてのみ提供されていることを理解すべきである。
【００４５】
類似の参照文字が異なる図を通して同じ部分を指している添付の図面に示されているように、前記の及び他の本発明の目的、特徴及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態のより詳細な説明から明らかとなるであろう。図面は必ずしも一定の比率に拡大されておらず、本発明の原理を示すことに重きを置いている。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｆは、抑制されたＢ細胞が初期活性化を受けることを示す。図１Ａは、抑制アッセイの概略図である。ＦｏｘＰ３−ＧＦＰレポーターマウスをＮＰ−ＯＶＡで免疫し、７日後に流入領域リンパ節（ｄＬＮ）を回収し、さらにＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ＩＣＯＳ＋ＦｏｘＰ３−ＣＤ１９−ＴＦＨ細胞を、ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ＩＣＯＳ＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ１９−ＴＦＲ細胞あり又はなしで、抗ＣＤ３／ＩｇＭの存在下で培養した。（図１Ｂ）図１Ａに示すように６日間培養した抑制アッセイからの、クラススイッチしたＩｇＧ１＋ＧＬ７＋Ｂ細胞（左）、及び抗体測定（右）。ＣＤ１９＋ＩＡ＋ＣＤ４−に基づきＢ細胞をプリゲート（pregated）した。
【図１−２】図１−１の続き。（図１Ｃ）図１Ａに示すように６日間培養した抑制アッセイからの、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）希釈により測定したＢ細胞の増殖。ＣＤ１９＋ＩＡ＋ＣＤ４−に基づきＢ細胞をプリゲートした。（図１Ｄ）図１Ａに示すような抑制アッセイからのＢ細胞におけるＣＤ６９発現の時間的経緯。ＣＤ１９＋ＩＡ＋ＣＤ４−に基づきＢ細胞をプリゲートした。（図１Ｅ）図１Ａに示すような抑制アッセイにおいて、ｚＶＡＤ染色により測定したＢ細胞の細胞死。ＣＤ１９＋ＩＡ＋ＣＤ４−に基づきＢ細胞をプリゲートした。（図１Ｆ）抑制アッセイにおけるＢ細胞の体細胞超突然変異。６日間の培養後、ＣＤ１９＋ＩＡ＋ＣＤ４−Ｂ細胞をソートし、さらにＩｍｍｕｎｏＳｅｑプラットフォームを用いて体細胞超突然変異をアッセイした。エラーバーは、標準誤差を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図２】図２Ａ〜２Ｈは、抑制されたＴＦＨ及びＢ細胞が、キーエフェクター遺伝子のダウンレギュレーションを除いて、エフェクター集団に類似することを示す。（図２Ａ）実験の概略図。ＮＰ−ＯＶＡで免疫したＦｏｘＰ３−ＧＦＰマウスからソートしたＢ及びＴＦＨ細胞を、ＮＰ−ＯＶＡの存在下で、単独で（「活性化」）、又はＦｏｘＰ３−ＧＦＰ  Ａｃｔｉｎ−ＣＦＰマウスからソートしたＴＦＲ細胞と共に（「抑制」）、培養した。４日後、ＣＤ１９＋Ｉ-Ａ＋ＣＤ４−ＣＦＰ−Ｂ細胞、及びＣＤ４＋ＣＤ１９−Ｉ-Ａ−ＣＦＰ−ＴＦＨ細胞をソートし、ＲＮＡｓｅｑ解析にかけた。（図２Ｂ）活性化及び抑制Ｂ及びＴＦＨ細胞の主成分分析。（図２Ｃ）活性化Ｂ及びＴＦＨ細胞と、抑制Ｂ及びＴＦＨ細胞とを対比した、それら細胞における発現変動（ＦＤＲをｐ＜０．０５に調整）遺伝子のベン図。（図２Ｄ）（左）活性化培養と抑制培養とを対比した、ＴＦＨ細胞での全ての遺伝子又はＴＦＨ遺伝子からのデータを示すボルカノプロット。（右）活性化及び抑制ＴＦＨ細胞におけるＴＦＨ遺伝子を示すヒートマップ。（図２Ｅ）ＩｍｍＳｉｇデータベース（ＧＳＥ１１９２４、ＧＳＥ１６６９７、ＧＳＥ２１３８０、ＧＳＥ２４５７４）に対する、活性化Ｂ細胞、活性化ＴＦＨ細胞、及び抑制ＴＦＨ細胞の相関性を示すＳｉｎｇｌｅ  ｓａｍｐｌｅ  ＧＳＥＡ。（図２Ｆ）活性化又は抑制Ｂ細胞におけるＢ細胞機能遺伝子転写物の発現。（図２Ｇ）活性化Ｂ細胞と抑制Ｂ細胞とを対比した、全ての遺伝子又はＢ細胞機能遺伝子からのデータを示すボルカノプロット。（図２Ｈ）ＩｍｍＳｉｇデータベース（ＧＳＥ１２３６６、ＧＳＥ１２８４５）に対する活性化又は抑制Ｂ細胞の相関性を示すＳｉｎｇｌｅ  ｓａｍｐｌｅ  ＧＳＥＡ。
【図３】抑制ＴＦＨ細胞は、サイトカイン産生の不全を有するがまだＴＦＨプログラムを発現することを示す。
【図４】抑制中に発現変動する遺伝子に基づくＧＳＥＡを示す。
【図５−１】図５Ａ〜５Ｅは、ｃ−ＭＹＣの阻害が、ＴＦＲ細胞に対するのと同様にＢ細胞を阻害することを示す。（図５Ａ）活性化Ｂ細胞と抑制Ｂ細胞とを対比して、全ての遺伝子又はＭｙｃ経路（Ｈａｌｌｍａｒｋ＿ＭＹＣ＿ＴＡＲＧＥＴＳ＿Ｖ１）遺伝子を用いた図２Ａ〜２ＨからのＲＮＡ−ｓｅｑデータを示すボルカノプロット。有意性はカイ二乗検定を用いて評価した。（図５Ｂ）Ｍｙｃ阻害剤１００５８−Ｆ４（Ｆ４）を添加して図１Ａ〜１Ｆに示すように実施した抑制アッセイからのＢ細胞における、ＩｇＧ１＋ＧＬ７＋発現により測定したクラススイッチ組換え。（図５Ｃ）図５Ｂにおける抑制アッセイからの培養上清中のクラススイッチしたＩｇＧ抗体レベル
【図５−２】図５−１の続き。（図５Ｄ）対照（ＷＴ）又はＭｙｃ過剰発現（Ｍｙｃ）Ｂ細胞を、抗ＣＤ３／ＩｇＭの存在下で、ＴＦＨ単独と共に又はＴＦＨ及びＴＦＲ細胞と共に培養した抑制アッセイからのＢ細胞において、ＩｇＧ１＋ＧＬ７＋発現（左）又はＧＬ７発現（右）により測定したクラススイッチ組換え。（図５Ｅ）図５Ｄに示すようなアッセイからの培養上清中のクラススイッチしたＩｇＧ抗体レベル。
【図６−１】図６Ａ〜６Ｇは、ｍＴＯＲ／ＡＫＴ経路の阻害が、ＴＦＲ細胞と同様にＢ細胞を阻害することを示す。（図６Ａ）活性化Ｂ細胞と抑制Ｂ細胞とを対比した、全ての遺伝子又はｍＴＯＲシグナリング（Ｈａｌｌｍａｒｋ＿ＭＴＯＲＣ１＿ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ）遺伝子を用いた、図２Ａ〜図２ＨからのＲＮＡ−ｓｅｑデータを示すボルカノプロット。有意性はカイ二乗検定を用いて評価した。（図６Ｂ）ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシン（Ｒａｐａ）を添加して、図１Ａ〜１Ｆにおけるように実施した抑制アッセイからのＢ細胞におけるＩｇＧ１＋ＧＬ７＋発現により測定したクラススイッチ組換え。（図６Ｃ）図６Ｂにおける抑制アッセイからの培養上清中のクラススイッチしたＩｇＧ抗体レベル。（図６Ｄ）ｍＴＯＲ阻害剤ＰＰ２４２を添加して、図６Ｂでのように実施した抑制アッセイからのＢ細胞における、ＩｇＧ１＋ＧＬ７＋発現により測定したクラススイッチ組換え。（図６Ｅ）図６Ｄにおける抑制アッセイからの培養上清中のクラススイッチしたＩｇＧ抗体レベル。
【図６−２】図６−１の続き。（図６Ｆ）ＡＫＴ阻害剤（Ａｋｔ−ｉ）を添加して、（図６Ｂ）でのように実施した抑制アッセイからのＢ細胞におけるＩｇＧ１＋ＧＬ７＋発現により測定したクラススイッチ組換え。（図６Ｇ）図６Ｂにおける抑制アッセイからの培養上清中のクラススイッチしたＩｇＧ抗体レベル。
【図７−１】図７Ａ〜図７Ｊは、ＴＦＲ細胞が、Ｂ細胞において多様な代謝経路を阻害することを示す。（図７Ａ）代謝経路におけるＲＮＡｓｅｑデータからの遺伝子の平均発現のヒートマップ。（図７Ｂ）活性化Ｂ細胞と比較して抑制Ｂ細胞においてダウンレギュレートされた遺伝子、及び抑制Ｂ細胞においてアップレギュレートされた遺伝子と共に、解糖、ＴＣＡ及び１炭素代謝における鍵酵素の概略図。
【図７−２】図７−１の続き。（図７Ｃ）活性化又は抑制培養からのＢ細胞（左）及びＴＦＨ細胞（右）におけるＧｌｕｔ１発現。（図７Ｄ）図７Ｃにおけるような培養からの培養上清において測定したグルコース取込み。（図７Ｅ）図７Ｃにおけるような培養からの培養上清において測定した乳酸産生。（図７Ｆ）図７Ｃにおけるような培養からの培養上清において測定したグルタミン取込み。
【図７−３】図７−２の続き。（図７Ｇ）グルコースアナログである２−デオキシグルコース（２ＤＧ）、３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰＡ）、又はジクロロ酢酸（ＤＣＡ）を添加した、図７Ｃにおけるような培養からの培養上清中のクラススイッチしたＩｇＧ抗体レベル。（図７Ｈ）全ての遺伝子又は１炭素／セリン／プリン代謝に関連する遺伝子を示す、活性化Ｂ細胞と抑制Ｂ細胞とを対比したボルカノプロット（図７Ｉ）メトトレキサート（ＭＴＸ）を添加した図７Ｃにおけるような共培養の上清中のクラススイッチした抗体レベル。（図７Ｊ）アザチオプリン（ＡＺＡ）を添加した図７Ｃにおけるような共培養の上清中のクラススイッチした抗体レベル。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１
【図８−１】図８Ａ〜８Ｇは、ＴＦＲ抑制が、Ｂ細胞において持続的阻害及びエピジェネティックな変化をもたらすことを示す。（図８Ａ）再刺激アッセイの概略図。ＦｏｘＰ３−ＧＦＰマウスを、ＮＰ−ＯＶＡで免疫し、７日後に、Ｂ細胞及びＴＦＨ細胞をソートし、さらに、抗ＣＤ３／ＩｇＭの存在下で、単独で又はＴＦＲ細胞と共に培養した。３日後、活性化培養（Ａｃｔ  Ｂ）又は抑制培養（Ｓｕｐｐ  Ｂ）からのＢ細胞をソートし、さらに、ＦｏｘＰ３−ＧＦＰ免疫マウスからのＴＦＨ細胞と共に、抗ＣＤ３／ＩｇＭの存在下で６日間培養した。（図８Ｂ）図８Ａでのような培養からのＴＦＨ細胞における細胞内のＢｃｌ６及びＫｉ６７。（図８Ｃ）図８Ａにおけるような培養から、クラススイッチした（ＩｇＧ１＋ＧＬ７＋）Ｂ細胞を解析した。（図８Ｄ）図８Ａにおけるような培養からのＢ細胞におけるＧｌｕｔ１発現。（図８Ｅ）図８Ａにおけるような培養からの上清におけるグルコース取込み。
【図８−２】図８−１の続き。（図８Ｆ）図２Ａ〜２ＨにおけるＲＮＡ−ｓｅｑデータから得られた、抑制によりＢ細胞においてダウンレギュレートされた遺伝子を、ＡＴＡＣ−ｓｅｑにより測定された、抑制によりＢ細胞で非アクセシビリティの証拠を示す遺伝子と共に示すベン図。（図８Ｇ）（左）ＲＮＡ−ｓｅｑにより抑制されたＢ細胞においてダウンレギュレートされ、かつＡＴＡＣ−ｓｅｑによりアクセシビリティが低いと測定された遺伝子に関して、昇順のＡＴＡＣ−ｓｅｑのｐ値によりソートしたＲＮＡ−ｓｅｑデータ。（右）ＡＴＡＣ−ｓｅｑデータからのＡｉｃｄａ及びＰｏｕ２ａｆ１に関する発現トラック、遺伝子トラック及びピークトラック。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図９】ＴＦＲ細胞抑制中におけるＢ細胞のエピジェネティック修飾。
【図１０】ＩＬ−２１は、ＴＦＲ抑制を救済できる：抗体産生及び代謝。
【図１１−１】図１１Ａ〜１１Ｊは、ＩＬ−２１がＢ細胞の代謝及び抗体産生のＴＦＲ媒介抑制を克服できることを示す。（図１１Ａ）（左）ＴＦＨ細胞単独と共に、ＴＦＨ及びＴＦＲ細胞と共に、又はＩＬ−２１を添加してＴＦＨ及びＴＦＲ細胞と共に培養したＢ細胞からのＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）希釈により測定したＢ細胞増殖。（図１１Ｂ）図１１Ａにおけるような培養からのＢ細胞において、ＩｇＧ１＋ＧＬ７＋染色により測定したクラススイッチ組換え。（図１１Ｃ）図１１Ａにおけるような培養からの培養上清において測定した抗体産生。ＩＬ−４／ＩＬ−２１（左）又はＩＬ−６（右）を一部のウェルに添加した。（図１１Ｄ）図１１Ａにおけるような培養からのＢ細胞におけるＧｌｕｔ１発現。（図１１Ｅ）図１１Ａにおけるような培養上清から測定したグルコース取込み。
【図１１−２】図１１−１の続き。（図１１Ｆ）図１１Ａにおけるような培養上清から測定した乳酸産生。（図１１Ｇ）２−デオキシグルコース（２ＤＧ）を添加して図１１Ａにおけるような培養上清において測定した抗体産生。（図１１Ｈ）抑制＋ＩＬ−２１培養と抑制培養とを対比して、ソートされたＢ細胞のＲＮＡ−ｓｅｑ解析からの全ての遺伝子又はＢ細胞機能遺伝子を示すボルカノプロット。（図１１Ｉ）活性化Ｂ細胞（Ａｃｔ  Ｂ）、抑制Ｂ細胞、又は抑制＋ＩＬ−２１Ｂ細胞のＲＮＡ−ｓｅｑデータに関する破綻したｓｓＧＳＥＡ相関プロット。（図１１Ｊ）図１１Ｂにおけるような抑制培養又は抑制＋ＩＬ−２１培養における、（左）Ｋｉ６７発現、又は（右）ＴＦＲ細胞の総数。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１２】ＴＦＲ抑制の間の代謝リプログラミングを示す。
【図１３】抑制Ｂ細胞が変化した代謝シグネチャーを有することを示す。
【図１４】ＩＬ−２１がＴＦＲ抑制を救済できることを示す：Ｐｏｕ２ａｆ１、Ａｉｃｄａ、Ｉｇｈｇ１、Ｉｇｈｇ２ｃ、Ｍｔｈｆｄ２、Ｓｈｍｔ２、Ｐｓｐｈ、Ｉｍｐｄｈ１、Ｐｇａｍ１、及びＭｅｔａｐ２を解析した。
【図１５】図１Ａにおけるような培養、及びＣＤ４＋ＩＣＯＳ−ＣＸＣＲ５−Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を含む培養（下に記載）での、分泌抗体の定量化を示す。
【図１６】図１Ａにおけるような培養、及び抑制培養の上清を含む培養（ＴＦＲ  ｓｕｐ）からのＩｇＧ１＋Ｂ細胞の頻度を示す。
【図１７】４日後における、Ｂ細胞、ＴＦＨ細胞及びＴＦＲ細胞を含む培養の顕微鏡写真を示す。スケールバーは５μｍ。
【図１８】リポ多糖（ＬＰＳ）及びＩＬ−４及びＴＦＲ細胞（キー）と共に、又はそれら無しで４日間培養した、図１Ａにおけるような培養でのＢ細胞の増殖を示す。
【図１９】ＴＦＨ細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−ＣＤ１９−ＩＡ−）によりプリゲートした細胞の図１Ａにおけるような培養のフローサイトメトリーからのデータ。白抜きの領域（左）の近くに記載する数は、Ｂｃｌ６＋Ｋｉ６７＋（細胞周期が回転している）ＴＦＨ細胞のパーセントを示す。
【図２０】活性化培養（Ｂ細胞＋ＴＦＨ細胞）、ＴＦＲ細胞−抑制培養（Ｂ細胞＋ＴＦＨ細胞＋ＴＦＲ細胞）、又はＴｒｅｇ細胞−抑制培養（Ｂ細胞＋ＴＦＨ細胞＋Ｔｒｅｇ細胞）（下に記載）からのＢ細胞中のＧｌｕｔ１＋細胞の頻度を示す。
【図２１】ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ分裂ピーク（横軸）を示すようにゲートをかけた、ＴＦＨ細胞のみと共に、又はＴＦＨ細胞＋ＴＦＲ細胞（キー）と共に培養したＢ細胞中のＧｌｕｔ１＋細胞の頻度を示す。
【図２２】ＴＦＨ細胞又はＴＦＨ細胞＋ＴＦＲ細胞（左の余白部）の培養に３日目に添加し、２２時間後に評価した、Ｂ細胞のフローサイトメトリー（左）、及びそれらＢ細胞中のＧｌｕｔ１＋細胞の頻度（右）を示す。白抜きの領域（左）の数は、Ｇｌｕｔ１＋Ｂ細胞のパーセントを示す。
【図２３】図２０でのような培養におけるＴＦＨ細胞中のＧｌｕｔ１＋細胞の頻度を示す。
【図２４】（＋２ＤＧ）の存在下又は２ＤＧの不在下での図２０におけるような培養のフローサイトメトリーを示す（プロット中の数は、図１Ｂと同様）。
【図２５】細胞を含まない培養（対照）、或いは活性化培養又は抑制培養（キー）に３日目に添加し、２０時間後に評価した、Ｂ細胞におけるＳｈｍｔ１（上側）及びＳｈｍｔ２（下側）の発現を示す。
【図２６】図８Ａにおけるような培養でのＴＦＨ細胞の頻度を示す。
【図２７】Ａｉｃｄａに関する、ＡＴＡＣ−ｓｅｑピーク、及びＢ細胞レギュローム遺伝子トラック注釈付けＣｈＩＡ−ｐｅｔ；囲みは有意なダウンレギュレーション（ｐ＜０．０５）を示す。
【図２８】Ｍｙｃに関する、ＡＴＡＣ−ｓｅｑピーク、及びＢ細胞レギュローム遺伝子トラック注釈付けＣｈＩＡ−ｐｅｔ；囲みは有意なダウンレギュレーション（ｐ＜０．０５）を示す。
【図２９】Ｐｏｕ２ａｆ１に関する、ＡＴＡＣ−ｓｅｑピーク、及びＢ細胞レギュローム遺伝子トラック注釈付けＣｈＩＡ−ｐｅｔ；囲みは有意なダウンレギュレーション（ｐ＜０．０５）を示す。
【図３０】抑制Ｂ細胞における全てのピーク又はアクセシビリティの低いピークに関してＴＳＳからのＡＴＡＣ−ｓｅｑピークの距離を示す。
【図３１】活性化Ｂ細胞と抑制Ｂ細胞とを対比して（左）、又はＩＬ−２１で救済した抑制Ｂ細胞と、抑制Ｂ細胞とを対比して（右）、発現変動する（ＦＤＲをｐ＜０．０５に調整）全ての遺伝子を示す。
【図３２】ＴＦＨ細胞単独と共に、ＴＦＨ及びＴＦＲ細胞と共に、又はＴＦＨ細胞及びＴＦＲ細胞＋ＩＬ−２１と共に培養した（下に記載）、野生型Ｂ細胞（ＷＴ）又はＩｌ２１ｒ−／−Ｂ細胞（２１Ｒ）の（ＣＤ１９＋ＩＡ＋ＣＤ４−としてプレゲートした）培養中のＩｇＧ１＋ＧＬ７＋Ｂ細胞の頻度を示す。
【図３３】図３２におけるような培養からのＢ細胞でのＧＬ７発現を示す。
【図３４】図３２におけるような培養からのＢ細胞中のＧＬ７＋細胞の頻度を示す。
【図３５】図１１Ｊにおけるような培養からのＴＦＲ細胞におけるＧｌｕｔ１発現（左）、及び培養からのＧｌｕｔ＋ＴＦＲ細胞の頻度（右）を示す。
【図３６】図３６Ａ〜３６Ｃは、ＴＦＨ細胞、ＴＦＲ細胞及びＢ細胞に関するソートゲートを示す。図３６Ａは、抑制アッセイの概略図を示す。ＦｏｘＰ３−ＧＦＰレポーターマウスをＮＰ−ＯＶＡで免疫し、７日後にｄＬＮを回収し、さらにＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ＩＣＯＳ＋ＦｏｘＰ３−ＣＤ１９−ＴＦＨ細胞を、抗ＣＤ３／ＩｇＭの存在下で、ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ＩＣＯＳ＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ１９−ＴＦＲ細胞あり又はなしで培養した。図３６Ｂは、ＴＦＨ及びＴＦＲ細胞をソートするためのソート戦略を示す。図３６Ｃは、Ｂ及びＴＦＨ細胞を、抗ＣＤ３／ＩｇＭ又はＮＰ−ＯＶＡのいずれか一方と共に、ＴＦＲ細胞あり又はなしで培養した抑制アッセイにおける、ＩｇＧ１へのクラススイッチを示す。
【図３７】図３７Ａ〜３７Ｅは、ＲＮＡ−ｓｅｑ解析に基づく、活性化及び抑制Ｂ細胞の更なる特徴づけを示す。図３７Ａは、実験の概略図を示す。ＮＰ−ＯＶＡ免疫ＦｏｘＰ３ＧＦＰマウスからソートしたＢ及びＴＦＨ細胞を、ＮＰ−ＯＶＡの存在下で、単独で（「活性化」）、又はＦｏｘＰ３ＧＦＰＡｃｔｉｎＣＦＰマウスからソートしたＴＦＲ細胞と共に（「抑制」）培養した。４日後、ＣＤ１９＋ＩＡ＋ＣＤ４−ＣＦＰ−Ｂ細胞、及びＣＤ４＋ＣＤ１９−ＩＡ−ＣＦＰ−ＴＦＨ細胞をソートし、ＲＮＡ−ｓｅｑ解析に進めた。図３７Ｂは、Ｂ細胞のためのソートゲートを示す。図３７Ｃは、活性化又は抑制培養に関して、Ｂ及びＴＦＨ細胞における遺伝子を示すボルカノプロットを示す。図３７Ｄは、活性化培養と抑制培養とを対比して、それらからのＢ細胞及びＴＦＨ細胞において発現変動する遺伝子（ＦＤＲをｐ＜０．０５に補正）のヒートマップを示す。図３７Ｅは、活性化培養と抑制培養とを対比して、ＴＦＨ及びＢ細胞の両方において発現変動する遺伝子を示す。
【図３８】Ｂ及びＴＦＨ（Ａｃｔ  Ｂ）、又はＢ、ＴＦＨ及びＴＦＲを培養した抑制アッセイからの代謝経路（図７Ａに示す）における個々の遺伝子のヒートマップを示す。
【図３９】図３９Ａ〜３９Ｅは、ＴＦＲ細胞−抑制Ｂ細胞において変化した代謝経路の更なる解析を示す。図３９Ａは、図４ｂに示されている実験に関するＢ細胞におけるＧｌｕｔ１染色を示す。図３９Ｂは、（左）図４ｃに示す実験に関する分裂回数のゲーティング；（右）分裂回数によりゲートされたＢ細胞におけるＩｇＧ１＋染色を示す。図３９Ｃは、図４ｄにおけるように、３日目の培養に加えられかつ２０時間後に回収されたＢ細胞におけるＩｇＧ１＋染色を示す。図３９Ｄは、図４ｂにおけるような培養からの培養上清において測定したグルタミン取込みを示す。一部の条件において、ＣＤ４＋ＩＣＯＳ−ＣＸＣＲ５−ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞を添加した。図３９Ｅは、グルタミノリシス阻害剤ＢＰＴＥＳを添加した、図３９Ａにおけるような培養からの培養上清中のＩｇＧ１＋Ｂ細胞を示す。
【図４０】図４０Ａ〜４０Ｃは、「ＩＬ−２１救済（IL-2 rescue）」の拡大解析を示す。図４０Ａは、ＩＬ２１、ＩＬ６又はＩＬ４を添加した抑制アッセイからのＢ細胞における、細胞カウント（左）、ＩｇＧ１＋染色（中央）、及びＧｌｕｔ１発現（右）を示す。図４０Ｂは、野生型（ＷＴ）又はＩｌ２１ｒ−／−Ｂ細胞を、ＩＬ−２１と共に培養した抑制アッセイからのＢ細胞における、細胞カウント（左）、ＩｇＧ１＋染色（中央）、及びＧｌｕｔ１発現（右）を示す。図４０Ｃは、活性化Ｂ細胞と抑制Ｂ細胞とを対比して、それら細胞においてダウンレギュレートされ、ＩＬ−２１の添加で救済されなかった遺伝子のヒートマップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
２０１３年１１月８日に出願された米国特許出願第１４／７０７，５９６号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６９１９７号、及び２０１２年１１月９日に出願された米国仮特許出願第６１／７２４，４２４号は、参照によりその全てがこの中に組み込まれる。
【００４８】
１．定義
本発明の理解を容易にするために、まず特定の用語を定義する。
【００４９】
この中で用いられている濾胞性制御性Ｔ（ＴＦＲ）細胞は、限定はされないが、以下の細胞表面マーカーを含む：ＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋ＣＸＣＲ５＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ１９−又はＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋ＣＸＣＲ５＋ＧＩＴＲ＋ＣＤ１９−、又はＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋ＣＸＣＲ５＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１９−。一実施形態において、ＴＦＲ細胞は、以下の細胞表面マーカーを有する：ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ＩＣＯＳ＋、並びに、ＧＩＴＲ＋、ＣＤ２５ｈｉ、ＣＤ６、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６２、ＣＤ２７、ＣＤ９５、ＣＤ９、ＣＤ４３、ＣＤ５０、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ１０２、ＣＤ６１、ＣＤ５８、ＣＤ１９６、ＣＤ３８、ＣＤ３１、ＣＤ１５、ＣＤ２５、ＣＤ１３、ＣＤ６６ａ／ｃ／ｅ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６３、ＣＤ３２、ＣＤ９７、ＨＬＡ−ＨＱ、ＣＤ１５０、Ｓｉｇｌｅｃ−９、インテグリンβ７、ＣＤ７１、ＣＤ１８０、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ１９３、ＣＤ２３５ａｂ、ＣＤ３５、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ２１０、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１１９、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１４６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８５、ＣＤ１７２ｂ、ＳＳＥＡ−１、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ１７０、ＣＤ６６ｂ、及びＣＤ８６から選択される少なくとも表面マーカー。一実施形態において、ＴＦＲ細胞は、以下の細胞表面マーカーを有する：ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ＩＣＯＳ＋、並びに、ＣＤ２７、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ１５０、Ｓｉｇｌｅｃ−９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ３３から選択される少なくとも１つの表面マーカー。
【００５０】
この中で用いられている濾胞性ヘルパーＴ（ＴＦＨ）細胞は、限定はされないが、以下の細胞表面マーカーを含む：ＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋ＣＸＣＲ５＋ＦｏｘＰ３−ＣＤ１９−。一実施形態において、ＴＦＨ細胞は、以下の細胞表面マーカーを有する：ＣＤ４、ＣＸＣＲ５、ＩＣＯＳ陽性、並びに、ＣＤ１６３、ＣＤ１２７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８９、ＣＤ１９７、ＣＤ１６１、ＣＤ６、ＣＤ２２９、ＣＤ９６、ＣＤ２７２、ＣＤ１４８、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１００、ＣＤ８２、ＣＤ１２６、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２７９、ＣＤ５、及びＣＤ９９から選択される少なくとも１つのマーカー；さらに任意選択的に、ＴＦＨ細胞は以下の受容体の１つ又は複数に関して陰性である：ＧＩＴＲ、ＣＤ２５、ＣＤ１６２、ＣＤ２７、ＣＤ９５、ＣＤ９、ＣＤ４３、ＣＤ５０、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ１０２、ＣＤ６１、ＣＤ５８、ＣＤ１９６、ＣＤ３８、ＣＤ３１、ＣＤ１５、ＣＤ２５、ＣＤ１３、ＣＤ６６ａ／ｃ／ｅ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６３、ＣＤ３２、ＣＤ９７、ＨＬＡ−ＨＱ、ＣＤ１５０、Ｓｉｇｌｅｃ−９、インテグリンβ７、ＣＤ７１、ＣＤ１８０、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ１９３、ＣＤ２３５ａｂ、ＣＤ３５、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ２１０、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１１９、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１４６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８５、ＣＤ１７２ｂ、ＳＳＥＡ−１、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ１７０、ＣＤ６６ｂ、及びＣＤ８６。一実施形態において、ＴＦＨ細胞は以下の細胞表面マーカーを有する：ＣＤ４、ＣＸＣＲ５、ＩＣＯＳ陽性、並びに、ＣＤ１６３、ＣＤ１２７、ＣＤ１６１、ＣＤ６、ＣＤ２２９、ＣＤ２７２、ＣＤ１００、ＣＤ１２６、ＰＤ−１（ＣＤ２７９）から選択される少なくとも１つのマーカー；さらに、任意選択的に、ＴＦＨ細胞は以下の受容体の１つ又は複数に関して陰性である：ＧＩＴＲ、ＣＤ２５、ＣＤ１６２、ＣＤ２７、ＣＤ９５、ＣＤ９、ＣＤ４３、ＣＤ５０、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ１０２、ＣＤ６１、ＣＤ５８、ＣＤ１９６、ＣＤ３８、ＣＤ３１、ＣＤ１５、ＣＤ２５、ＣＤ１３、ＣＤ６６ａ／ｃ／ｅ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６３、ＣＤ３２、ＣＤ９７、ＨＬＡ−ＨＱ、ＣＤ１５０、Ｓｉｇｌｅｃ−９、インテグリンβ７、ＣＤ７１、ＣＤ１８０、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ１９３、ＣＤ２３５ａｂ、ＣＤ３５、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ２１０、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１１９、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１４６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８５、ＣＤ１７２ｂ、ＳＳＥＡ−１、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ１７０、ＣＤ６６ｂ、及びＣＤ８６。
【００５１】
一実施形態において、ＴＦＨ細胞は、以下の細胞表面マーカーを有する：ＣＤ４、ＣＸＣＲ５、ＩＣＯＳ陽性、並びに、ＣＤ１６３、ＣＤ１２７、ＣＤ１６１、ＣＤ６、ＣＤ２２９、ＣＤ２７２、ＣＤ１００、ＣＤ１２６、ＰＤ−１（ＣＤ２７９）から選択される少なくとも１つのマーカー；さらに、任意選択的に、以下のマーカーは、ＴＦＲ細胞での発現レベルと比較して、ＴＦＨ細胞において発現レベルが低く、そのような受容体は：ＧＩＴＲ、ＣＤ２５、ＣＤ１６２、ＣＤ２７、ＣＤ９５、ＣＤ９、ＣＤ４３、ＣＤ５０、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ１０２、ＣＤ６１、ＣＤ５８、ＣＤ１９６、ＣＤ３８、ＣＤ３１、ＣＤ１５、ＣＤ２５、ＣＤ１３、ＣＤ６６ａ／ｃ／ｅ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６３、ＣＤ３２、ＣＤ９７、ＨＬＡ−ＨＱ、ＣＤ１５０、Ｓｉｇｌｅｃ−９、インテグリンβ７、ＣＤ７１、ＣＤ１８０、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ１９３、ＣＤ２３５ａｂ、ＣＤ３５、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ２１０、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１１９、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１４６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８５、ＣＤ１７２ｂ、ＳＳＥＡ−１、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ１７０、ＣＤ６６ｂ、及びＣＤ８から選択される。
【００５２】
この中で用いられている制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、限定されないが、以下の細胞表面マーカーを含む：ＣＤ４＋ＧＩＴＲ＋ＣＸＣＲ５−、又はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＸＣＲ５−、又はＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＸＣＲ５−。
【００５３】
この中で、血液から「単離された」又は「精製された」と称されるＴＦＨ又はＴＦＲ細胞集団は、対象の末梢血、器官又は組織から採取された試料の一部として体から取り出された細胞を意味する。「単離」及び「精製」細胞組成物は、セルソーティングなどの試料中の他の細胞集団から所望の細胞タイプを分離するための公知の手段により、所望の細胞タイプを濃縮してもよい。この中で用いられている「濃縮（enriched）」の語は、得られる試料が、その試料中の他の細胞タイプよりも所望の細胞タイプをより多く含むことを意味する。
【００５４】
免疫応答に関して、用語「阻害する」、「阻害」、「抑制する」、及び「抑制」には、例えば特定の作用、機能又は相互作用の低減、制限又は遮断（例えば、抗体抑制）が含まれる。
【００５５】
免疫応答に関して、用語「増強する」、「促進する」又は「刺激する」には、免疫応答に関連する特定の作用、機能又は相互作用の増大、亢進又は増殖（例えば、抗体産生の増加）を含む。
【００５６】
この中で使用する用語「調節する」には、例えば、免疫応答を増強する又は阻害するなど、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションが含まれる。用語「調節する」は、受容体の調節に関して用いられる場合、例えばそのリガンドによってその受容体が活性化される、又は例えば遮断抗体で阻害される場合に、その受容体に関連する生物活性のアップレギュレーション及びダウンレギュレーションを含む。
【００５７】
この中で使用する用語「免疫細胞」は、免疫応答で役割を果たす細胞を意味する。免疫細胞は、造血系起源の細胞であり、例えばＢ細胞及びＴ細胞などのリンパ球；ナチュラルキラー細胞；単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球、顆粒球などの骨髄性細胞が挙げられる。
【００５８】
この中で使用する用語「Ｔ細胞」には、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞が含まれる。用語「抗原提示細胞」には、専門的な抗原提示細胞（例えばＢリンパ球、単球、樹状細胞及びランゾルハンス細胞）、ならびに他の抗原提示細胞（例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、星状細胞、線維芽細胞、及び希突起膠細胞）が含まれる。
【００５９】
例えば、ＴＦＲ細胞、ＴＦＨ細胞、又は他の細胞に関連してこの中で使用される用語「天然」細胞又は「野生型」細胞は、例えば、対象の血液、器官又は組織において普通に見られるＴＦＲ細胞のような、天然又は野生型細胞の元の起源で通常みられる同じ細胞タイプの細胞と表現型において及び機能的に実質的に同じである細胞を意味する。
【００６０】
「増強された抑制能」又は「増強された免疫抑制活性」又は「増強された制御能」を有するＴＦＲ細胞は、（例えば、ＰＤ−１遮断中に活性化されるなど）Ｂ細胞応答を阻害するその能力においてより強力であるように調節されているＴＦＲ細胞を意味する。増強された免疫抑制活性は、例えば、当業界で公知でありかつこの中に記載されている抗体抑制アッセイなどの標準的なｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより測定することができる。
【００６１】
「増強された刺激能」、「増強された免疫刺激能」、又は「増強された抗体刺激能」を有するＴＦＨ細胞は、（例えば、ＰＤ−１遮断中に活性化される、又はＩＬ−２１の存在下で活性化されるなど）Ｂ細胞応答を刺激するより強力な能力を有するように調節されているＴＦＨ細胞意味する。増強された刺激能は、例えば、この中に記載されているような本発明の新規なｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗体増殖アッセイにより、測定することができる。
【００６２】
この中で使用する用語「免疫応答」には、Ｔ細胞媒介及び／又はＢ細胞媒介免疫応答が含まれ、ＴＦＲ細胞又はＴＦＨ細胞により媒介されるそれら免疫応答が含まれる。例示の免疫応答として、例えば、サイトカイン産生、及び細胞傷害性などのＴ細胞応答が挙げられる。さらに、免疫応答の語には、例えば、抗体産生（体液性応答）及びサイトカイン応答性細胞（例えば、マクロファージ）の活性化などの、Ｔ細胞活性化により間接的に影響を受ける免疫応答が含まれる。
【００６３】
「対象」は、好ましくはヒト対象であるが、自己免疫応答の調節が望まれる、動物モデルを含む、任意の哺乳動物であってよい。
【００６４】
関心哺乳動物として、限定はされないが、例えばマウス、ラットなどの齧歯動物；例えばブタ、ウマ、ウシなどの家畜；例えばイヌ、ネコなどのペット；及び霊長類などが挙げられる。対象は、この中で「健康なドナー」と称される、自己免疫反応の調節が望ましい対象ではなく、末梢血Ｔ細胞のドナーであってもよい。対象は、この中で「患者」とも称される。
【００６５】
用語「治療」、「治療する」及び「治療している」は、障害、疾患、病気、又は他の状態（この中では集合的に、「状態」と称する）の少なくとも１つの症状又は他の態様の緩和、治癒又は予防、或いは、そのような状態等の重篤性の軽減を包含する。本発明の組成物は、実現可能な治療剤を構成するのに、完全な治癒をもたらす、或いは全ての症状又は疾患の兆候を根絶させる必要はない。関連分野で認められているように、治療剤として用いられる薬剤は、所定の疾患状態の重篤性を軽減しうるが、有用な治療剤としてみなされるのに疾患の全ての兆候を取り除く必要はない。有益な又は所望の臨床結果には、限定はされないが、症状の緩和、疾患の程度の低減、疾患の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患の進行の遅延又は減速、疾患状態の緩和又は苦痛緩和、疾患の寛解（部分的又は完全、検出可能又は検出不可）及び疾患のぶり返し又は再発の予防などが含まれる。同様に、予防的に投与される治療は、実現可能な予防剤を構成するために、状態の発現を予防するのに完全に効果的である必要はない。単に疾患の影響を低減する（例えば、その症状の数又は重篤性を低減することにより、又は別の治療の有効性を高めることにより、又は別の薬効を生じさせることにより）、或いは、対象において疾患が発症される又は悪化する可能性を低減することで十分である。
【００６６】
「治療」はまた、治療を受けない場合に予測される生存性と比較して、生存性を延長することも意味することができる。一実施形態において、治療有効量の組成物が患者に投与されていることを示す目安は、特定の障害の重篤性を反映する指標のベースラインを超える持続的改善である。
【００６７】
本発明の組成物の「治療有効量」は、任意の薬物療法に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比で、治療対象に対して治療効果をもたらす組成物の量を意味する。治療効果は、その用語がこの中で用いられるように患者を「治療」するのに十分である。
【００６８】
この中で使用する「細胞療法」は、生細胞の投与を含む治療法である
「養子免疫療法」は、対象からの細胞の取り出し、ｅｘ  ｖｉｖｏでの何らかの方法による処理、及び治療としての、処理細胞の同じ対象への注入を含む、治療プロセスである。
【００６９】
この中で使用するワクチンは、ウイルス感染、がん、又は他の障害に対する防御、或いはウイルス感染、がん、又は他の障害の治療を提供する組成物である。ウイルス感染、がん、又は他の障害に対する防御は、感染又は腫瘍又は他の障害を完全に予防するか、或いは、後でその障害に感染又は罹患した場合に、感染、腫瘍又は他の障害の重篤性又は罹患期間を低減する。治療は、１つ又は複数の症状の改善、或いは重篤性又は罹患期間の低減を生じさせる。ここでの目的のために、ワクチンは、抗原と、この中に記載の方法により作製される組成物との共注入（co-infusion）（続いて又は同時に）により行われる。この中で使用する、特定の組成物の投与による特定障害の症状の改善は、永久的又は一時的、永続性又は一過性にかかわらず、組成物の投与による又はそれに関連しうる任意の低減を意味する。
【００７０】
この中で用いられる「ワクチン接種レジメン」は、抗原及び／又はアジュバントを含むワクチンが、例えばＴＦＲ細胞及び／又はＴＦＨ細胞を含む本発明の組成物と組み合わせて、別箇の又は組み合わせた処方で同時に、或いは、分単位、時間単位又は日単位で隔てられた異なる時間に順次に、対象に投与されるが、何らかの態様で一緒に作用して、本発明に従い、ＴＦＲ及び／又はＴＦＨ組成物の不在での対象の免疫応答と比較して、対象においてそのワクチンに対する所望の増強された免疫応答を提供するような、治療計画を意味する。
【００７１】
用語「アジュバント」は、抗原に対する免疫応答を増強する、高める、上方に調節する又は亢進させる任意の物質として、そのもっとも広い意味で用いられる。免疫応答は、抗体力価又は細胞媒介応答レベルのような、任意の都合の良い手段により測定することができる。
【００７２】
「免疫関連疾患」は、その疾患の病因に免疫系が関連する疾患を意味する。免疫関連疾患のサブセットが自己免疫疾患である。自己免疫疾患として、限定はされないが、関節リウマチ、重症筋無力症、多発性硬化症、乾癬、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、グレーブス病（バセドウ病）、炎症性腸疾患、自己免疫性ぶどう膜網膜炎、多発性筋炎、及び特定のタイプの糖尿病などが挙げられる。他の免疫関連疾患は下記に記載する。本開示を鑑みて、当業者は、本発明の組成物及び方法により治療可能である他の自己免疫疾患を容易に理解することができる。
【００７３】
ＴＦＲ細胞及び／又はＴＦＨ細胞の調節、及び好ましくは選択的調節が治療となる疾患又は状態には、病原性抗体応答の抑制が望ましい疾患、及び防御抗体応答の増強が望ましい疾患が含まれる。ある場合には、例えば、病原性抗体応答の抑制が治療となる疾患において、その疾患はＴＦＲ細胞媒介抗体抑制を選択的にアップレギュレートするが、同時に、ＴＦＨ細胞媒介免疫応答を選択的にダウンレギュレートすることにより治療することができると考えられる。
【００７４】
病原性抗体応答の抑制が望ましい疾患又は状態の例には、抗体が病原に寄与する又は主にその原因となる疾患が含まれる。そのような抗体が病原に寄与する及び／又は主にその原因となる疾患には、限定はされないが、糖尿病（１型）、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、アレルギー、喘息、多発性硬化症、重症筋無力症、紅斑性狼瘡、自己免疫性溶血性貧血、強皮症及び全身性硬化症、シェーグレン症候群、未分化結合組織症候群、リン脂質抗体症候群、血管炎（結節性多発性動脈炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、ヴェグナー肉芽腫症、過敏性血管炎、多発性筋炎全身性エリテマトーデス、膠原病、自己免疫性肝炎、原発性（自己免疫性）硬化性胆管炎又は他の肝疾患、甲状腺炎、糸球体腎炎、デビック病、自己免疫性血小板減少性紫斑病、尋常性天疱瘡、ＡＮＣＡ関連血管炎、グッドパスチャー症候群、リウマチ熱、バセドウ病（甲状腺機能亢進症）、インスリン抵抗性糖尿病、悪性貧血、セリアック病、新生児溶血性疾患、寒冷凝集素症、ＩｇＡ腎症、糸球体腎炎（連鎖球菌感染後糸球体腎炎を含む）、原発性胆汁性肝硬変、及び血清病が含まれる。一実施形態において、病原性抗体が病原に寄与する及び／又は主にその原因となる疾患は、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、アレルギー、重症筋無力症、膠原病、糸球体腎炎、デビック病、ＡＮＣＡ関連血管炎、及びセリアック病から選択される。
【００７５】
防御抗体応答の増強が望ましい疾患又は状態の例には、強力な抗体応答の存在が疾患の病因又は病原を低減する又は排除する疾患が含まれる。防御抗体応答により恩恵を受ける疾患又は状態の例として、限定はされないが、ウイルス感染、病原性感染、細菌感染、又は真菌感染、及びがんが挙げられる。
【００７６】
ウイルス感染症には、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ジカウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）などのレトロウイルス、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）などのヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２、インフルエンザウイルス、Ａ型及びＢ型肝炎、ＦＩＶ、レンチウイルス、ペスチウイルス、西ナイルウイルス、麻疹、天然痘、牛痘、エボラ、コロナウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ポテトウイルスＳ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス、ＡＬＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）、又はラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）などが含まれる。さらに、細菌性、真菌性、及び他の病原性疾患が含まれ、例えば、アスペルギルス属、ブルギア属、カンジダ属、チクングニア、クラミジア属、コクシジウム類、クリプトコッカス属、デング熱ウイルス、イヌ糸状虫属、ゴノコックス、ヒストプラズマ属、リーシュマニア、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、ゾウリムシ属、百日咳菌、プラスモディウム属、肺炎球菌属、ニューモシスティス属、ハマダラカ属の蚊媒介の３日熱マラリア原虫、リケッチア属、サルモネラ属、シゲラ属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、トキソプラズマ属、及びコレラ菌などによるものが挙げられる。例示的な種として、淋菌（Neisseria gonorrhea）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、膣トリコモナス（Trichomonas vaginalis）、ヘモフィルス・バギナリス（Haemophilus vaginalis）、Ｂ群レンサ球菌種（Group B Streptococcus sp.）、マイコプラズマ・ホミニス（Microplasma hominis）、軟性下疳菌（Hemophilus ducreyi）、グラヌローマ・イングイネル（Granuloma inguinale）、リンホパチア・ベネレウム（Lymphopathia venereum）、梅毒トレポネ−マ（Treponema pallidum）、ブルセラ・アボルタス（Brucella abortus）、ブルセラ・メリテンシス（Brucella melitensis）、ブルセラ・スイス（Brucella suis）、ブルセラ・カニス（Brucella canis）、カンピロバクター・フィタス（Campylobacter fetus）、カンピロバクター・フィタス・インテスチナリス（Campylobacter fetus intestinalis)、レプトスピラ・ポモナ（Leptospira pomona）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、ブルセラ・オビス（Brucella ovis）、オウム病クラミジア（Chlamydia psittaci）、トリコモナス・フィータス（Trichomonas foetus）、トキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、アクチノバチルス・エクーリ（Actinobacillus equuli）、ヒツジ流産菌（Salmonella abortus ovis）、ウマ流産菌（Salmonella abortus equi）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、コリネバクテリウム・エクイ（Corynebacterium equｉ）、コリネバクテリウム・ピオゲネス（Corynebacterium pyogenes）、アクチノバチルス・セミニス（Actinobaccilus seminis）、マイコプラズマ・ボビゲニタリウム（Mycoplasma bovigenitalium）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アブシジア・ラモーザ（Absidia ramosa）、トリパノソーマ・エクイペルダム（Trypanosoma equiperdum）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）；或いは、例えばパラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Paracoccidioides brasiliensis）などの菌類；或いは、プラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）などの他の病原菌が挙げられる。また、米国立アレルギー感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）の優先的病原菌も含まれる。これらは、大痘瘡（variola major）（天然痘）、バチルス・アンスラシス（Bacillus anthracis）（炭疽菌）、エルシニア・ペスティス（Yersinia pestis）（ペスト）、ボツリヌス菌毒素（ボツリヌス中毒）、フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis）（野兎病）、フィロウイルス（filovirus）（エボラ出血熱、マールブルグ出血熱）、アレナウイルス（arenavirus）（ラッサ（Lassa）（ラッサ熱）、フニン（Junin）（アルゼンチン出血熱）及び関連ウイルス）などのカテゴリーＡ物質；コクシエラ・バーネッティイ（Coxiella burnetii）（Ｑ熱）、ブルセラ（Brucella）種（ブルセラ症）、バークホルデリア・マレイ（Burkholderia mallei）（鼻疽）、アルファウイルス（ベネズエラ脳脊髄炎、東部及び西部ウマ脳脊髄炎）、リシナス・コミュニス（Ricinus communis）（トウゴマ）由来のリシン毒素、ウェルチ菌（Clostridium perfringens）のイプシロン毒素；ブドウ球菌（Staphylococcus）エンテロトキシンＢ、サルモネラ（Salmonella）種、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、大腸菌株（Escherichia coli strain）Ｏ１５７：Ｈ７、コレラ菌（Vibrio cholerae）、クリプトスポリジウム・パルブム（Cryptosporidium parvum）などのカテゴリーＢ物質；ニパ（nipaｈ）ウイルス、ハンタウイルス（hantavirus）、ネッタイシマカ（Aedes mosquitoes）媒介性黄熱病、及び多剤耐性結核などのカテゴリーＣ物質；例えば住血吸虫及び条虫類などの蠕虫；並びに原虫、例えばサシチョウバエ媒介のリーシュマニア（Leishmania）（例えば、メキシコリーシュマニア（L. mexicana））、プラスモジウム（Plasmodium）、及びサシガメ媒介のシャーガス病を含む。
【００７７】
細菌性病原体には、限定はされないが、細菌性病原性グラム陽性菌が含まれ、それには、限定はされないが、肺炎球菌、ブドウ球菌、及び連鎖球菌が含まれる。病原性グラム陽性球菌には、髄膜炎菌、及び淋菌が含まれる。病原性腸内グラム陽性桿菌には、腸内細菌科；シュードモナス、アシネトバクテリア、及びエイケネラ；類鼻疽；サルモネラ菌；細菌性赤痢；ヘモフィルス；軟性下疳；ブルセラ症；野兎病；エルシニア（パスツレラ）；ストレプトバチルス・モルチリホルミス（Streptobacillus moniliformis）、及び螺旋菌；リステリア・モノサイトゲネス（listeria monocytogenes）；ブタ丹毒菌；ジフテリア、コレラ、炭疽；及びドノヴァン症（鼠径部肉芽腫）が含まれる。病原性嫌気性細菌には、破傷風；ボツリヌス；他のクロストリジウム菌；結核菌、癩菌、及び他のマイコバクテリアが含まれる。病原性スピロヘータ症には、梅毒；トレポネーマ症；イチゴ腫及び地方病性梅毒；ならびにレプトスピラ症が含まれる。高等な病原性細菌及び病原性真菌により引き起こされる他の感染症には、放線菌症；ノカルジア症；クリプトコッカス症、ブラストミセス症、ヒストプラズマ症、及びコクシジオイデス症；カンジダ症、アスペルギルス症、及びムコール菌症；スポロトリクム症；パラコクシジオイデス症、ペトリエリジオーシス（petriellidiosis）、トルロプシス症、マイセトーマ（mycetoma）、及び黒色真菌症；ならびに皮膚糸状菌症が含まれる。リケッチア感染症には、リケッチア及びリケッチア症が含まれる。マイコプラズマ及びクラルニジア感染症の例には、肺炎マイコプラズマ；鼠径リンパ肉芽腫症；オウム病；及び周産期クラミジア感染症が含まれる。病原性の原生動物及び蠕虫、ならびにそれによる感染症には、アメーバ症；マラリア；リーシュマニア症；トリパノソーマ症；トキソプラズマ症；ニューモシスチス・カリニ；ジアルジア症；旋毛虫症；フィラリア症；住血吸虫症；線虫類；吸虫又は吸虫類；及び条虫類（条虫）感染が含まれる。疾患又は状態ではないが、防御抗体応答の増強は、ワクチンにおいて又はこの中に記載されているようなワクチン接種レジメンの一部としても有益である。
【００７８】
この中で用いられている用語「がん」は、制御されていない態様で増殖する傾向を有し、場合によっては転移する（広がる）傾向を有する細胞の異常増殖をいう。がんのタイプには、限定はされないが、転写の有無にかかわらず、またその疾患の任意のステージの、固形腫瘍（例えば、膀胱、腸管、乳房、子宮内膜、心臓、腎臓、肺、子宮、リンパ組織（リンパ腫）、卵巣、膵臓、又は他の内分泌器官（甲状腺）、前立腺、皮膚（黒色腫又は基底細胞がん）の腫瘍など）、或いは血液腫瘍（例えば、白血病及びリンパ腫など）が含まれる。
【００７９】
がんのさらなる非限定的な例には、急性リンパ芽球性リンパ腫、急性骨髄性白血病、副腎皮質がん、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨のがん（骨肉種及び悪性線維性組織球腫）、脳幹神経膠腫（グリオーマ）、脳腫瘍、脳及び脊椎腫瘍、乳がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、子宮頸がん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、胚芽腫、子宮内膜がん、上衣芽腫、上衣細胞腫、食道がん、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、眼のがん、網膜芽細胞腫、胆嚢がん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、消化管間質細胞腫瘍、胚細胞腫瘍、神経膠腫、有毛細胞白血病、頭頚部がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、島細胞腫（膵内分泌組織）、カポジ肉腫、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、髄芽腫、髄上皮腫、黒色腫、中皮腫、口腔がん、慢性骨髄性白血病、骨髄性白血病、多発性骨髄腫、上咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん、口腔咽頭がん、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、上皮性卵巣がん、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓がん、乳頭腫症、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、中間型松果体実質腫瘍、松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞腫／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、中枢神経系原発リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞（腎臓）がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、肉腫、カポジ、セザリー症候群、皮膚がん、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮がん、胃がん、テント上原始神経外胚葉腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、睾丸がん、咽喉がん、胸腺腫及び胸腺がん、甲状腺がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍が含まれる。
【００８０】
ＴＦＨ細胞又はＴＦＲ細胞上の細胞表面受容体の「アンタゴニスト」である作用物質（agent）は、その細胞表面受容体の生物学的機能をダウンレギュレートする又は遮断する作用物質である。この中で使用する、「アンタゴニスト」である作用物質には、細胞表面受容体のリガンドと結合する又はさもなければそれを妨害し、それによって、リガンドが細胞表面受容体に結合する能力を遮断し、細胞表面受容体の生物学的機能をダウンレギュレートする作用物質が含まれる。
【００８１】
ＴＦＨ細胞又はＴＦＲ細胞上の細胞表面受容体の「アゴニスト」である作用物質は、細胞表面受容体の生物学的機能をアップレギュレートする又は高める作用物質である。
【００８２】
ＩＩ．開始集団細胞
一実施形態において、ＴＦＲ細胞及びＴＦＲ前駆細胞、例えば、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）前駆細胞は、そのような細胞を含有する混合細胞集団に由来する（例えば、末梢血、組織又は器官に由来する）。好ましくは、ＴＦＲ細胞又はＴＦＲ前駆細胞を含有する混合細胞集団は、ＴＦＲ細胞又はＴＦＲ前駆細胞が、その集団中の他の細胞タイプよりもより多くのＴＦＲ細胞を含むように濃縮される。一実施形態において、ＴＦＲ細胞の濃縮組成物（enriched composition）は、ＴＦＲ細胞が、組成物中の細胞集団の約５０％超（例えば、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は９９．９％以上）を構成する組成物である。ある実施形態において、ＴＦＲ細胞は、組成物中の細胞の約９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は９９．９％以上を構成し、そのような組成物はこの中で「高度に精製された」又は「実質的に均質な」ＴＦＲ細胞組成物と称される。
【００８３】
開始ＴＦＲ細胞集団は上記のとおりであるが、開始ＴＦＨ細胞集団を得るために同様の手順を適用できることが理解される。従って、ある実施形態において、ＴＦＨを含有する混合細胞集団は、組成物がその集団中の他の細胞タイプよりも多くのＴＦＨ細胞を含むように濃縮される。一実施形態において、ＴＦＨ細胞の濃縮組成物は、ＴＦＨ細胞が、組成物中の細胞集団の約５０％超（例えば、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は９９．９％以上）を構成する組成物である。ある実施形態において、ＴＦＨ細胞は、組成物中の細胞の約９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は９９．９％以上を構成し、そのような組成物はこの中で「高度に精製された」又は「実質的に均質な」ＴＦＨ細胞組成物と称される。ある実施形態において、ＴＦＲ細胞又はＴＦＨ細胞は、活性化及び／又は拡大工程の前に、細胞集団から濃縮される。ある実施形態において、ＴＦＲ細胞又はＴＦＨ細胞は、活性化及び／又は拡大工程の後に、細胞集団から濃縮される。
【００８４】
そのような高度に精製された又は実質的に均質なＴＦＲ又はＴＦＨ細胞集団は、ＴＦＲ細胞媒介又はＴＦＨ細胞媒介疾患のｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでの診断及び検査に用いることができる。
【００８５】
免疫抑制性ＴＦＲ細胞に特異的な細胞表面マーカーのセレクションを標的にして、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、固相磁気ビーズなどの自動細胞ソーティングを用いて分離することにより、ＴＦＲ細胞を濃縮することができる。濃縮を高めるために、ポジティブセレクションを、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６及びＣＤ５６保有細胞の排除のような、非制御性Ｔ細胞型に特異的な表面マーカーを有する細胞に対するネガティブセレクションと組み合わせてもよい。
【００８６】
一実施形態において、ＴＦＲ細胞は、ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ＩＣＯＳ＋ＧＩＴＲ＋、又はＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ＩＣＯＳ＋ＣＤ２５＋の表面マーカーに基づき、フローサイトメトリーによってソートされる。一実施形態において、ＴＦＲ細胞は、以下の細胞表面マーカーに基づき、フローサイトメトリーによってソートされる：Ｄ４＋ＣＸＣＲ５＋ＩＣＯＳ＋、並びに、以下の１つ又は複数から選択される少なくとも１つの表面マーカー：ＧＩＴＲ＋、ＣＤ２５ｈｉ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ６、ＣＤ１６２、ＣＤ２７、ＣＤ９５、ＣＤ９、ＣＤ４３、ＣＤ２７８、ＣＤ５０、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ１０２、ＣＤ６１、ＣＤ５８、ＣＤ１９６、ＣＤ３８、ＣＤ３１、ＣＤ１５、ＣＤ２５、ＣＤ１３、ＣＤ６６ａ／ｃ／ｅ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６３、ＣＤ３２、ＣＤ９７、ＨＬＡ−ＨＱ、ＣＤ１５０、Ｓｉｇｌｅｃ−９、インテグリンβ７、ＣＤ７１、ＣＤ１８０、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ１９３、ＣＤ２３５ａｂ、ＣＤ３５、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ２１０、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１１９、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１４６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８５、ＣＤ１７２ｂ、ＳＳＥＡ−１、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ１７０、ＣＤ６６ｂ、及びＣＤ８６。
【００８７】
ＴＦＨ細胞は、ＣＤ４、ＣＸＣＲ５、ＩＣＯＳ陽性；ＧＩＴＲ陰性、ＣＤ２５陰性の表面マーカーに基づき、ソートすることができる。一実施形態において、ＴＦＨ細胞は、以下の細胞表面マーカーに基づき、フローサイトメトリーによりソートされる：ＣＤ４、ＣＸＣＲ５、ＩＣＯＳ陽性、並びに、ＣＤ１６３、ＣＤ１２７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８９、ＣＤ１９７、ＣＤ１６１、ＣＤ６、ＣＤ２２９、ＣＤ９６、ＣＤ２７２、ＣＤ１４８、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１００、ＣＤ８２、ＣＤ１２６、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２７９、ＣＤ５、及びＣＤ９９から選択される少なくとも１つのマーカー；さらに、任意選択で、ＴＦＨ細胞は、以下の受容体の１つ又は複数に関して陰性である：ＧＩＴＲ、ＣＤ２５、ＣＤ１６２、ＣＤ２７、ＣＤ９５、ＣＤ９、ＣＤ４３、ＣＤ５０、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ１０２、ＣＤ６１、ＣＤ５８、ＣＤ１９６、ＣＤ３８、ＣＤ３１、ＣＤ１５、ＣＤ２５、ＣＤ１３、ＣＤ６６ａ／ｃ／ｅ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６３、ＣＤ３２、ＣＤ９７、ＨＬＡ−ＨＱ、ＣＤ１５０、Ｓｉｇｌｅｃ−９、インテグリンβ７、ＣＤ７１、ＣＤ１８０、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ１９３、ＣＤ２３５ａｂ、ＣＤ３５、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ２１０、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１１９、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１４６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８５、ＣＤ１７２ｂ、ＳＳＥＡ−１、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ１７０、ＣＤ６６ｂ、及びＣＤ８６。
【００８８】
これらソーティング方法論はまた、単独で、又はサイトカイン又は代謝調節剤のアンタゴニストの存在下でのそれら細胞の活性化と組み合わせて、ＴＦＨ細胞及びＴＦＲ細胞の機能の増強に寄与すると考えられている。
【００８９】
一実施形態において、最初のＴＦＲ細胞集団を、対象の末梢血から単離し、さらにＴＦＲ細胞に関して濃縮してよい。一実施形態において最初のＴＦＨ細胞集団を、対象の末梢血から単離し、さらにＴＦＨ細胞に関して濃縮してもよい。例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ［Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ］といった適当な媒体による差別沈降（differential sedimentation）などの方法、及び／又はセルソーティングの方法を用いて、血液中の他の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からＴＦＲ細胞又はＴＦＨ細胞を生成する方法は、よく知られており、そのような方法の例はこの中に記載されている。
【００９０】
一実施形態において、本発明は、対象の末梢血由来のＴＦＲ細胞（この中で「血液ＴＦＲ細胞」とも称される）の組成物であって、組成物中に約９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．９％以上のその細胞を含む組成物を提供する。
【００９１】
一実施形態において、本発明は、患者の末梢血由来のＴＦＨ細胞（この中で「血液ＴＦＨ細胞」とも称される）の組成物であって、組成物中に約９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．９％以上のその細胞を含む組成物を提供する。そのような血液ＴＦＲ細胞又は血液ＴＦＨ細胞の高純度の組成物は、この中に記載されている免疫系を調節する方法において直接用いてよい。或いは、この中に記載されている免疫系の調節において使用する前に、そのような組成物をさらに活性化及び／又は拡大してもよい。
【００９２】
ＩＩＩ．開始細胞集団の活性化／拡大
一実施形態において、開始細胞集団の活性化は、開始ＴＦＨ細胞又はＴＦＲ細胞集団を、Ｔ細胞刺激組成物と、及び／又は、例えばＩＬ−２１及びＩＬ−６などのサイトカイン又は代謝調節剤の存在下、接触させることにより達成される。活性化工程は拡大工程をさらに含んでいてよく、或いは、活性化工程とは別に、細胞集団を拡大してもよい。拡大工程が望ましい場合、細胞は、好ましくは少なくとも５０倍、さらに好ましくは、少なくとも１００倍、２００倍、３００倍、５００倍及び８００倍に拡大される。
【００９３】
例示の代謝調節剤として、限定はされないが、２−デオキシグルコース、メトホルミン、メトトレキサート、アザチオプリン、ラパマイシン、ジクロロ酢酸塩、ロニダミン、α−トコフェロールコハク酸エステル、ジャスモン酸メチル、ベツリン酸、及びレスベラトロールなどが挙げられる。
【００９４】
好ましい刺激組成物は、細胞上のＴ細胞受容体複合体に結合し、及びそれを活性化することにより、Ｔ細胞を刺激する。一実施形態において、刺激組成物は、この中に記載されている選択的ＴＦＲ及び／又は選択的ＴＦＨ受容体に結合し、及びそれを活性化できる作用物質を含んでいてよい。一実施形態において、刺激組成物は、例えば、ＣＤ１９＋Ｂ細胞（好ましくは、血液由来の自家のもの）などの生理的な抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）；例えばＴＣＲ／ＣＤ３に対する多価抗体又はリガンドなどのＴＣＲ／ＣＤ３活性化物質；ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＣＤ５、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０又はＣＤ４０Ｌに対する多価抗体又はリガンドなどのＴＣＲ共刺激因子活性化物質；及び任意選択で、ＩＬ−２、ＩＬ−２１又はＩＬ−６などのインターロイキンを含む。一実施形態において、ＴＣＲ／ＣＤ３活性化物質は抗ＣＤ３抗体であり、ＴＣＲ共刺激因子活性化物質は抗ＣＤ２８抗体である。抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体は、任意選択で、当業界で知られているようにビーズ上に固定化され、１：１と１：２の間の細胞：ビーズ比で提供される。
【００９５】
ある実施形態において、刺激組成物は、例えば、共刺激物質、第２の制御性Ｔ細胞刺激物質、又はＴ細胞の生存性及び／又は増殖を総じて促進させる物質などの、１つ又は複数の追加の作用物質をさらに含んでいてよい。
【００９６】
ある実施形態において、共刺激物質は、下記に記載するように、例えばＣＤ２８又はＩＣＯＳなどのＴ細胞共刺激因子に特異的な抗体又はリガンドである。ある実施形態において、共刺激物質は、例えばＣＤ２８に結合するアゴニスト抗体などの、アゴニスト抗体である。或いは、刺激組成物は、第２の制御性Ｔ細胞刺激物質を含む。例示の刺激物質には、顆粒球コロニー刺激因子、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１３、及びＩＬ−１５などのインターロイキン、並びに肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が含まれる。
【００９７】
ある実施形態では、刺激組成物の１つ又は複数の構成要素を、例えば細胞又はビーズなどの担体に固定化する。担体として使用するのに適した細胞には、人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣｓ）（Kim, J V et al, Nat Biotechnol. April 2004; 22(4):403-10;及びThomas, A K et al, Clin Immunol. December 2002; 105(3):259-72）が含まれる。ビーズは、プラスチック、ガラス、又は任意の他の適した材料であってよく、通常、１〜２０μｍの範囲である。
【００９８】
ＰＤ−１及びＰＤ−１リガンドのアンタゴニストの例は、参照によりこの中に組み込まれる米国特許第７，７２２，８６８号に記載されている。適切なＰＤ−１及びＰＤ−１リガンドのアンタゴニストとして、ＰＤ−１リガンド抗体、抗ＰＤ−１抗体、その作用物質がＰＤ−１とＰＤ−１リガンドとの間の相互作用を阻害するようなペプチド又は小分子が挙げられる。ＰＤ−１又はＰＤ−１リガンドのアンタゴニストの他の例は、例えば、米国特許第８，１６８，７５７号；米国特許第８，１１４，８４５号；米国特許第８，００８，４４９号；米国特許第７，５９５，０４８号；米国特許第７，４８８，８０２号；及び米国特許第７，０２９，６７４号に開示されている。
【００９９】
刺激組成物の各成分の最適濃度、培養条件及び期間は、ルーチン実験を用いて、経験に基づき特定することができる。
【０１００】
ＰＤ−１又はＰＤ−１リガンドのアンタゴニストの存在下で拡大／活性化されたＴＦＲ細胞集団は、この中に記載されている適切なアッセイにおいて実証されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで、ＴＦＨ媒介抗体産生を阻害するその能力により示される増強された抑制活性を有する。
【０１０１】
ＰＤ−１又はＰＤ−１リガンドのアンタゴニストの存在下で拡大／活性化されたＴＦＨ細胞集団は、この中に記載されている適切なアッセイにおいて実証されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで、ＴＦＨ媒介抗体産生を増強するその能力により示される増強された抗体刺激活性を有する。そのようなＴＦＨ細胞は、この中で、「増強された刺激能を有するＴＦＨ細胞」と称される。
【０１０２】
ＩＶ．免疫系の調節
この中に記載されている拡大及び／又は活性化されたＴＦＲ細胞、及びその組成物を対象に導入して、例えば自己免疫反応を調節することにより、免疫関連疾患を治療することができる。例えば、その対象は、継続中の又は再発性の自己免疫反応を有することにより特徴づけられる疾患又は障害を患っていてよく、そのような疾患／障害には、限定はされないが、紅斑性狼瘡；重症筋無力症；自己免疫性肝炎；関節リウマチ；多発性硬化症；バセドウ病、及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が含まれる。
【０１０３】
一実施形態において、対象において、例えばワクチンに応答する抗体の量又は質を高めるなどの、免疫応答のアップレギュレーションが望ましい場合、開始ＴＦＨ細胞集団を含む、濃縮され、及び任意選択的に拡大及び／又は活性化された組成物を対象に投与してよい。
【０１０４】
一実施形態において、本発明の組成物を投与すると、対象におけるＴＦＨ細胞に対するＴＦＲ細胞の比が、本発明の組成物の投与前の対象におけるＴＦＨ細胞に対するＴＦＲ細胞の比と比較して変化する場合に、免疫系の調節が達成される。本発明の組成物の投与前及び後の対象におけるＴＦＨ細胞に対するＴＦＲ細胞の比は、患者の血中におけるＴＦＲ細胞又はＴＦＨ細胞の存在についてアッセイすることにより測定することができる。患者の血中におけるＴＦＨ細胞に対するＴＦＲ細胞の比を測定するのに適したアッセイはこの中に記載されている。
【０１０５】
一実施形態において、例えば、対象が自己免疫疾患を有し、抗体応答の阻害が望ましい場合など、対象の免疫応答のダウンレギュレーションが望ましい場合、血液由来のＴＦＲ細胞の高度に精製された組成物、又は増強された抑制活性を有するＴＦＲ細胞について濃縮された組成物を患者に投与してよい。組成物の投与後、患者からの血液試料を検査して、ＴＦＨ細胞に対するＴＦＲ細胞の比が高いかを特定することができる。
【０１０６】
一実施形態において、例えばワクチンに応答する抗体産生を増加させるなど、対象における免疫応答のアップレギュレーションが望ましい場合、血液由来のＴＦＨ細胞の高度に精製された組成物を患者に投与してよい。ＴＦＨ組成物の投与後、患者からの血液試料を検査して、ＴＦＲ細胞に対するＴＦＨ細胞の比が高いかを特定することができる。
【０１０７】
従って、本発明は、例えば、有効量のその対象のｅｘ  ｖｉｖｏで拡大／活性化したＴＦＲ細胞を、それを必要とする患者に導入することを含む、養子細胞免疫療法のための方法及び組成物を提供する。これらの適用は、一般的に、同じ患者から取り出し、拡大／活性化したＴＦＲ細胞を再導入することを含むが、その方法は、ドナー組織及び／又は健康な個体由来のＴＦＲを用いた、移植、特に骨髄移植、に関連する移植片対宿主病の治療のための養子細胞免疫療法にも適用可能である。
【０１０８】
例示の養子細胞免疫療法プロトコルにおいて、混合細胞集団を最初に標的ドナーから取り出す。適用によっては、寛解の期間中又は疾患が活動性である間に細胞を取り出してもよい。通常、例えば白血球除去療法によって、全血を引出し、ＰＭＢＣを採取することによりこれを行う。例えば、白血球大量除去療法（large volume leukopherisis）（ＬＶＬ）は、血液白血球収率を最大化することが示されている。回収は、連続流動アフェレーシス装置（Ｓｐｅｃｔｒａ、ＣＯＢＥ  ＢＣＴ）を用いて、２０×１０６細胞／Ｌに達した。白血球除去療法を通して投与されるカルシウムの連続注入により、低カルシウム血症の症状を回避する。通常、約１００〜３００分に及ぶ時間の間に、約４全血液量に相当する１５〜４５リットルの流体を採取する。
【０１０９】
回収したＰＭＢＣは、フローサイトメトリー、或いはＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＸＣＲ５、ＩＣＯＳ、及びＧＩＴＲなどのＴｒｅｇ及び／又はＴＦＲ特異的細胞マーカーに基づく他の細胞分離技術により分離され、さらにこの中に記載されているように拡大／活性化され、その後、養子免疫抑制のため、通常、その細胞のドナー（ドナーとレシピエントとが異なるＧＶＨＤの場合を除いて）に、好ましくは静脈経路により、患者に輸血される。或いは、拡大の前及び／又はその後に、保存及び／又は輸送のため細胞を凍結してもよい。
【０１１０】
拡大及び／又は濃縮され、任意選択で高純度のＴＦＨ又はＴＦＲ細胞を用いる有効かつ最適化された用量及び治療レジメンは、既存のＴ細胞注入療法を用いた以前の臨床経験に基づき当業界で知られており、また経験に基づきさらに特定することができる。
【０１１１】
本発明に従い対象にＴＦＲ及びＴＦＨ細胞組成物を投与する好ましい投与経路は、静脈経路によるものである。しかしながら、適用に応じて、本発明に従う細胞組成物を、限定はされないが、非経口、非経口、又は吸入などを含む、他の経路により投与してもよい。
【０１１２】
Ｖ．ワクチン接種
本発明は、増強された抑制活性を有するＴＦＲ細胞、末梢血由来のＴＦＲ細胞組成物、増強された刺激活性を有するＴＦＨ細胞、又は末梢血由来のＴＦＨ細胞を、ワクチン接種レジメンの一部として対象に投与することを含む、抗原に対する免疫応答を増強する方法も意図している。
【０１１３】
アジュバントは、免疫応答を引き起こす及び維持することに関連する免疫細胞の活性を変更するような多くのやり方で免疫応答を促進させる。さらに、アジュバントは、免疫系への抗原提示を変更する。本発明の組成物は、ワクチン接種レジメンにおいてアジュバントとして使用することができる。
【０１１４】
一実施形態において、本発明に従うＴＦＨ又はＴＦＲ細胞の組成物は、ワクチン接種レジメンにおいて使用してよい。特定の理論に制限されることなく、ＴＦＲ細胞は、肺中心Ｂ（ＧＣ  Ｂ）細胞を阻害し、低減されたクラススイッチ組換え及び抗体産生をもたらし、またＴＦＨ細胞はＧＣ  Ｂ細胞及び抗体産生を刺激すると考えられる。
【０１１５】
一実施形態において、ＴＦＨ細胞の組成物、特に、患者の末梢血由来のＴＦＨ細胞（「血液ＴＦＨ細胞」とも称される）は、ＴＦＨ細胞媒介抗体応答を増強するためにワクチン接種レジメンで使用することができる。いずれの特定の理論に制限されることなく、血液由来のＴＦＨ細胞は、抗原暴露により迅速に、リンパ節に遊走し及びコグネイトＢ細胞と相互作用するが、その際に、ナイーブＴ細胞は、分化し及びＣＸＣＲ５をアップレギュレートするのに少なくとも２〜４日を要すると考えられる。従って、血液由来のＴＦＨ細胞は、より大きな抗体刺激能を有する。
【０１１６】
一実施形態において、ワクチン接種レジメンの一部として、免疫応答をアップレギュレートする又は免疫応答をダウンレギュレートすることが望ましい場合がある。これは、ＴＦＲ細胞に関して濃縮された又は高度に精製された組成物、或いはＴＦＨ細胞に関して濃縮された又は高度に精製された組成物を投与することにより、ワクチンの投与と組み合わせて、対象の血液中のＴＦＨ細胞に対するＴＦＲ細胞の比を変化させることにより、達成することができる。
【０１１７】
ある実施形態において、ワクチンは、ＴＦＨ細胞の組成物、及びサイトカイン（例えば、ＩＬ−２１又はＩＬ−６）又は代謝調節剤を含んでいてよい。
【０１１８】
本発明は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２１又はＩＬ−６）、或いは代謝調節剤を、ワクチン接種レジメンの一部として対象に投与することを含む、抗原に対する免疫応答を増強する方法も意図している。抗原及び／又はアジュバントを、ＩＬ−２１、ＩＬ−６、又は代謝調節剤と組み合わせて対象に投与すると、対象のＴＦＲ細胞の活性を阻害し、ＴＦＨ／ＴＦＲ組成物と類似の効果をもたらすことができる。
【０１１９】
例示の代謝調節剤には、限定はされないが、２−デオキシグルコース、メトホルミン、メトトレキサート、アザチオプリン、ラパマイシン、ジクロロ酢酸塩、ロニダミン、α−トコフェロールコハク酸エステル、ジャスモン酸メチル、ベツリン酸、及びレスベラトロールが含まれる。
【０１２０】
ＶＩ．新規なｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
本発明は、本発明に従うＴＦＲ細胞及びＴＦＨ細胞の組成物の機能を分析するためのｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイも提供する。
【０１２１】
例示の一実施形態において、本発明は、ＴＦＨ細胞などのＣＤ４Ｔ細胞集団の活性化を阻害するＴＦＲ細胞の能力を分析するためのアッセイを提供する。簡単に説明すると、野生型（ＷＴ）マウス及びＰＤ−１−／−マウスをＭＯＧ／ＣＦＡで免疫し、流入領域リンパ節からＴＦＲ細胞をソートし、ＭＯＧ／ＣＦＡ免疫マウス由来のＣＦＳＥ−標識ＣＤ４ナイーブＷＴ（ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ＦｏｘＰ３−）レスポンダー細胞及びＷＴ  ＧＬ７−Ｂ２２０＋Ｂ細胞と、１：１：１で播種し、抗ＣＤ３及び抗ＩｇＭと共に４日間培養する。３日後に、フローサイトメトリーにより試料を分析する。このアッセイのために、任意の適切な抗原／アジュバントの組合せを用いてマウスを免疫してよく、及びその細胞を任意の適切な刺激因子の組合せで刺激してよいことが理解される。
【０１２２】
例示の一実施形態において、本発明は、ナイーブＣＤ４Ｔ細胞の活性化を阻害するＴＦＲ細胞の能力を分析するためのアッセイを提供する。野生型（ＷＴ）マウス及びＰＤ−１−／−マウスをＭＯＧ／ＣＦＡで免疫し、流入領域リンパ節からＴＦＲ細胞をソートし、ＭＯＧ／ＣＦＡ免疫マウス由来のＣＦＳＥ−標識ＣＤ４ナイーブＷＴ（ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ＦｏｘＰ３−）レスポンダー細胞及びＷＴ  ＧＬ７−Ｂ２２０＋Ｂ細胞と、１：１：１で播種し、抗ＣＤ３及び抗ＩｇＭと共に４日間培養する。３日後、フローサイトメトリーにより試料を分析する。ＣＤ６９発現、並びにＣＦＳＥ希釈を測定することにより増殖に関して、Ｔレスポンダーを分析する。
【０１２３】
一実施形態において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩｇＧ抑制のためのアッセイを提供する。簡単に説明すると、ナイーブＣＤ４Ｔ細胞の活性化を阻害するＴＦＲ細胞の能力を分析するためのアッセイにおけるようにＴＦＲ細胞をソートし、抗ＣＤ３及び抗ＩｇＭの存在下、ＭＯＧ／ＣＦＡ免疫マウスの流入領域リンパ節由来のＴＦＲ（ＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋ＣＸＣＲ５＋ＧＩＴＲ＋ＣＤ１９−）細胞、ＴＦＨ（ＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋ＣＸＣＲ５＋ＧＩＴＲ−ＣＤ１９−）細胞、及びＢ（ＧＬ−７−Ｂ２２０＋）細胞の１：１：１比で播種し、６日間培養する。上清を用いてＥＬＩＳＡにより全ＴｇＧを測定した。一実施形態において、抗ＣＤ３の濃度範囲にわたり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抑制アッセイを実施してよい。免疫マウス由来のナイーブ（ＣＤ４＋ＩＣＯＳ−ＣＸＣＲ５−ＣＤ１９−）細胞を、対照として含めてよい。任意の適切な抗原／アジュバントの組合せを用いてマウスを免疫してよく、またこのアッセイのために任意の適切な刺激因子の組合せにより細胞を刺激してよいことが理解される。
【０１２４】
本発明の新規アッセイは、対象のＴＦＲ細胞機能及びＴＦＨ細胞機能を測定するための診断ツールとして有用である。そのようなアッセイは、自己免疫疾患の同定及びタイピングに有用である。
【０１２５】
本発明のアッセイはまた、免疫応答の前又は間、及び／又は本発明の組成物の投与の前及び後に、患者の血中のＴＦＨ細胞に対するＴＦＲ細胞の比を測定するのにも有用である。そのようなアッセイは、対象における免疫応答をアップレギュレートすべきか又はダウンレギュレートすべきか、或いは免疫調節治療レジメンが所望の効果を有しているかを特定するのを支援するための診断として有用である。このアッセイは特定疾患の診断又は経過観察（progression）にも有用となるであろう。
【０１２６】
本発明に従い、例示のアッセイは、以下の工程を含む、患者においてＴＦＲ細胞機能又はＴＦＨ細胞機能、或いはその両方を評価する方法を含む：
ａ）患者から末梢血試料を得る工程；
ｂ）前記血液試料からＴＦＨ細胞及びＴＦＲ細胞の集団を単離する工程；
ｃ）Ｔ細胞受容体刺激因子、並びに抗ＣＤ３及び抗ＩｇＭなどの補助因子の存在下、前記ＴＦＨ細胞及びＴＦＲ細胞を、抗原提示細胞（例えば、Ｂ細胞）を含む刺激組成物と、ＩｇＧなどの抗体産生を可能とするのに十分な期間、接触させる工程；及び
ｄ）標準的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を用いて、産生された全抗体を測定する。
【０１２７】
ＶＩＩ．選択的ＴＦＲ及びＴＦＨ細胞表面受容体を介したＴＦＲ及びＴＦＨ細胞媒介免疫応答の調節
参照によりこの中に組み込まれる国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６９１９７号の図２３のデータは、ＴＦＲ細胞が、Ｔｒｅｇ細胞及びＴＦＨ細胞と比較して、その遺伝子発現において区別されることを示し、ＴＦＲ細胞が独立して免疫応答を調節できることを示唆する。この知識は、疾患又は症状を診断、監視及び治療するのに適用することができ、抗体が病原における鍵となる役割を果たしかつ免疫抑制の増強が治療となるそれら疾患又は症状などにおいて、ＴＦＲ−免疫応答を選択的に調節することができる。そのような疾患の例は、上記のとおりこの中に提供されている。
【０１２８】
例えばこの中に記載されているような１つ又は複数のＴＦＲ細胞表面受容体のアゴニスト又はアンタゴニストなどの作用物質の使用により、ＴＦＲ細胞機能を調節することができる。ＴＦＲ細胞の分化を阻害又は誘導する及び／又はＴＦＲ細胞の生物学的機能を調節するのに有効な量でのそのような作用物質の使用は、ＴＦＲ細胞媒介免疫応答に影響を及ぼすことができる。
【０１２９】
一実施形態において、本発明は、必要とする患者において、病原性抗体応答を抑制する方法であって、前記患者に、ＴＦＨ細胞と比較してＴＦＲ細胞において少なくとも１．１７の倍率変化にて高められた平均蛍光強度（ＭＦＩ）で発現変動する少なくとも１つの受容体を調節する作用物質を投与することを含み、前記受容体は、ＴＦＲ細胞において少なくとも１８６のＭＦＩを有し、前記作用物質は、ＴＦＲ受容体を調節し及びその作用物質の不在下でのＴＦＲ細胞媒介抗体抑制と比較してＴＦＲ細胞媒介抗体抑制を高めるのに有効な量で投与される、方法を提供する。そのような発現変動受容体は、この中で「選択的ＴＦＲ受容体」と称される。一実施形態において、少なくとも１つの選択的ＴＦＲ受容体は：ＣＤ１６２、ＣＤ２７、ＣＤ９５、ＣＤ９、ＣＤ４３、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ５０、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ１０２、ＣＤ６１、ＣＤ５８、ＣＤ１９６、ＣＤ３８、ＣＤ３１、ＣＤ１５、ＣＤ２５、ＣＤ１３、ＣＤ６６ａ／ｃ／ｅ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６３、ＣＤ３２、ＣＤ９７、ＨＬＡ−ＨＱ、ＣＤ１５０、Ｓｉｇｌｅｃ−９、インテグリンβ７、ＣＤ７１、ＣＤ１８０、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ１９３、ＣＤ２３５ａｂ、ＣＤ３５、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ２１０、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１１９、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１４６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８５、ＣＤ１７２ｂ、ＳＳＥＡ−１、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ１７０、ＣＤ６６ｂ、及びＣＤ８６；の１つ又は複数から選択される。一実施形態において、選択的ＴＦＲ受容体は、ＣＤ２７、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ１５０、Ｓｉｇｌｅｃ−９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１５８ｂ、及びＣＤ３３の１つ又は複数から選択される。
【０１３０】
選択的ＴＦＲ受容体の生物学的機能をアンタゴナイズ又はアゴナイズすることを介してＴＦＲ細胞媒介免疫応答を調節する方法は、ＴＦＲ細胞媒介免疫応答の低減又は増強が有用である疾患及び状態の治療に有用である。ＴＦＲ細胞媒介免疫応答を高めることにより治療しうる疾患又は状態の例には、抗体が、この中で既に列挙されている疾患におけるような病原に寄与する及び／又は主にその原因となる疾患及び状態が含まれる。一実施形態において、抗体が病原に寄与する及び／又は主にその原因となる疾患又は状態として：多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、アレルギー、重症筋無力症、膠原病、糸球体腎炎、デビック病、ＡＮＣＡ関連血管炎、及びセリアック病が挙げられる。
【０１３１】
一実施形態において、作用物質は、選択的ＴＦＲ受容体を遮断する／アンタゴナイズすることができる、又はその受容体のリガンドに結合しそれによって対応する受容体に結合するその能力を遮断することができる、遮断抗体である。作用物質は、例えば、受容体の過剰発現を生じさせることにより又は受容体の発現を遮断することにより、受容体の生物学的機能をアンタゴナイズする又はアゴナイズすることができる、小分子、或いはＤＮＡ又はＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ又はアンチセンス分子）であってもよい。
【０１３２】
一般的に知られている様々な選択的ＴＦＲ受容体の公知のアゴニスト及びアンタゴニストに加えて、公知のアッセイ及びスクリーニングを用いて、選択的ＴＦＲ受容体をアンタゴナイズする又はアゴナイズする能力に関して、他の作用物質を試験することができる。
【０１３３】
ＴＦＲ細胞表面受容体をアゴナイズする又はアンタゴナイズする能力に関して様々な作用物質を試験するのに有用な本発明のアッセイ及びスクリーニングは、本発明の作用物質を同定するのに使用される。一実施形態において、本発明は、ＴＦＨ細胞の刺激機能を特異的に及び敏感に特定するアッセイを提供する。ＴＦＲ細胞の阻害能を特定する補完的アッセイ（Complementary assay）も提供する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ実験の両方を含むこれらのアッセイを用いて、ＴＦＨ及びＴＦＲ細胞上の表面受容体を通してアゴニスト及び／又はアンタゴニストシグナルを送ることの機能的結果を特定することができる。
【０１３４】
抗原／アジュバントでマウスを免疫／ワクチン接種することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏマウスＴＦＨ刺激アッセイを実施する。ある場合には、生又は弱毒化ウイルスを用いることができる。７〜１０日後、（ＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋ＣＸＣＲ５＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ１９−）又は（ＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋ＣＸＣＲ５＋ＧＩＴＲ＋ＣＤ１９−）（或いは別のＴＦＨマーカー）として規定されるＴＦＨ細胞を、フローサイトメトリーによりソートする。抗ＣＤ３及び抗ＩｇＭと共に（或いは、特異的抗原と共に）、ＴＦＨ細胞をＢ細胞と一緒にインキュベートする。
【０１３５】
ＴＦＨ表面受容体のアゴニスト及び／又はアンタゴニストも培養に添加してよい。７日後、活性化マーカー（Ｂ７−１、ＧＬ７など）に関して培養からのＢ細胞を染色することにより、或いはＩｇＧアイソタイプに関して細胞内を染色することにより、抗体産生及びクラススイッチ組換えを評価する。ＴＦＨ細胞の活性化状態も特定することができる。
【０１３６】
或いは、ＥＬＩＳＡによりＩｇＧの存在について上清を評価することができる。
【０１３７】
このアッセイの例は、参照によりこの中に組み込まれる国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６９１９７号の図４、２０及び２１に含まれる。血液又は他の組織から単離されたヒト細胞を用いて、同様のアッセイを実施する。
【０１３８】
抗原／アジュバントでマウスを免疫／ワクチン接種することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏマウスＴＦＨ刺激アッセイを実施する。ある場合には、生又は弱毒化ウイルスを用いることができる。
【０１３９】
７〜１０日後、（ＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋ＣＸＣＲ５＋ＦｏｘＰ３−ＣＤ１９−）又は（ＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋ＣＸＣＲ５＋ＧＩＴＲ−ＣＤ１９−）（或いは別のＴＦＨマーカー）として規定されるＴＦＨ細胞を、フローサイトメトリーによりソートする。細胞を直に使用するか、或いは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおけるように、アゴニスト又はアンタゴニストと共にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートする。抗原及び／又はウイルスでワクチン接種された又は同様に攻撃接種されたマウスに、細胞を静脈内に養子移入する。１０日後、マウスから血清を採取し、ＥＬＩＳＡによりＩｇＧを検出する。この１０日内に、ＴＦＨ表面受容体のアゴニスト又はアンタゴニストを投与することができる。
【０１４０】
このアッセイの例は、参照によりこの中に組み込まれる国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６９１９７号の図８及び２１にある。これらのアッセイを用いて、ＴＦＨ細胞がどのように自己免疫疾患の病状を変化させるかを特定することができる。例として、コラーゲンでマウスを免疫し、その後、ＴＦＨ細胞をソートし、コラーゲンで免疫した新しいマウスに移入することができる。結果として生じる抗コラーゲン抗体は関節炎を生じさせ、それを測定して、ＴＦＨ細胞がこの特定疾患内でどのように機能するかを特定することができる。さらに、これらのアッセイを用いて、インフルエンザ感染マウスからのＴＦＨ細胞を用いることにより、ワクチン接種との関連で、Ｂ細胞抗体産生のＴＦＨ刺激を特定し、さらにその後、インフルエンザに感染した新なマウスにそれらを養子移入することができる。ウイルス感染の程度は、抗体媒介のウイルスクリアランスの読み出しとして測定することができる。
【０１４１】
抗原／アジュバントでマウスを免疫／ワクチン接種することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏマウスＴＦＲ抑制アッセイを実施する。ある場合には、生又は弱毒化ウイルスを用いることができる。７〜１０日後、（ＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋ＣＸＣＲ５＋ＦｏｘＰ３−ＣＤ１９−）又は（ＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋ＣＸＣＲ５＋ＧＩＴＲ−ＣＤ１９−）（或いは別のＴＦＨマーカー）として規定されるＴＦＨ細胞、及び（ＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋ＣＸＣＲ５＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ１９−）又は（ＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋ＣＸＣＲ５＋ＧＩＴＲ＋ＣＤ１９−）（或いは別のＴＦＲマーカー）として規定されるＴＦＲ細胞を、フローサイトメトリーによりソートする。抗ＣＤ３及び抗ＩｇＭと共に（或いは、特異的抗原と共に）、ＴＦＨ及び／又はＴＦＲ細胞をＢ細胞と一緒にインキュベートする。ＴＦＲ表面受容のアゴニスト及び／又はアンタゴニストも培養に添加してよい。７日後、活性化マーカー（Ｂ７−１、ＧＬ７など）に関して培養からのＢ細胞を染色することにより、或いはＩｇＧアイソタイプに関して細胞内を染色することにより、抗体産生及びクラススイッチ組換えを評価する。ＴＦＨ細胞の活性化状態も特定することができる。或いは、ＥＬＩＳＡによりＩｇＧの存在について上清を評価することができる。このアッセイの例は、参照によりこの中に組み込まれる国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６９１９７号の図４、２０及び２１に含まれる。血液又は他の組織から単離されたヒト細胞を用いて、同様のアッセイを実施する。
【０１４２】
抗原／アジュバントでマウスを免疫／ワクチン接種することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏマウスＴＦＲ抑制アッセイを実施する。ある場合には、生又は弱毒化ウイルスを用いることができる。７〜１０日後、（ＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋ＣＸＣＲ５＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ１９−）又は（ＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋ＣＸＣＲ５＋ＧＩＴＲ＋ＣＤ１９−）（或いは別のＴＦＨマーカー）として規定されるＴＦＨ細胞、及び（ＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋ＣＸＣＲ５＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ１９−）又は（ＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋ＣＸＣＲ５＋ＧＩＴＲ＋ＣＤ１９−）（或いは別のＴＦＲマーカー）として規定されるＴＦＲ細胞を、フローサイトメトリーによりソートする。細胞を直に使用するか、或いは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおけるように、アゴニスト又はアンタゴニストと共にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートする。抗原及び／又はウイルスでワクチン接種された又は同様に攻撃接種されたマウスに、細胞を静脈内に養子移入する。１０日後、マウスから血清を採取し、ＥＬＩＳＡによりＩｇＧを検出する。この１０日内に、ＴＦＲ表面受容体のアゴニスト又はアンタゴニストを投与してよい。これらのアッセイを用いて、ＴＦＲ細胞がどのように疾患の病状を変化させるかを特定することができる。例として、コラーゲンでマウスを免疫し、その後、ＴＦＨ及びＴＦＲ細胞をソートし、コラーゲンで免疫した新しいマウスに移入することができる。結果として生じる抗コラーゲン抗体は関節炎を生じさせ、それを測定してＴＦＲ細胞がＴＦＨ媒介疾患を抑制するのにどのように機能するかを特定することができる。
【０１４３】
本発明はさらに、この中に記載されているアッセイで同定される作用物質を提供する。そのような作用物質は、選択されたＴＦＲ受容体をアンタゴナイズする又はアゴナイズすることができ、それにより、ＴＦＲ細胞媒介免疫機能を調節し、さらにはこの中に記載されているような疾患を治療することができる。
【０１４４】
本発明の選択された作用物質及び試験物質の、疾患に対する防御又はその治療における有効性をスクリーニングするのに使用できる動物モデル系が利用可能である。感受性マウスにおいて全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を試験する方法は当業界で知られている（Knight et al. (1978) J. Exp. Med., 147: 1653 ; Reinersten et al. (1978) New Eng. J. Med., 299: 515）。重症筋無力症（ＭＧ）は、ＳＪＬ／Ｊ雌マウスにおいて、別の種からの可溶性ＡｃｈＲタンパク質を用いて疾患を誘導することによって試験する（Lindstrom et al. (1988) Adv.  Immunol., 42: 233）。関節炎は、マウスの感受性系統においてＩＩ型コラーゲンを注射することによって誘導する（Stuart et al. (1984) Ann. Rev. Immunol., 42: 233）。感受性ラットにおいてマイコバクテリア熱ショックタンパク質を注射することによってアジュバント関節炎を誘導するモデルが記載されている（Van Eden et al. (1988) Nature, 331: 171）。甲状腺炎は、マウスにおいて記載のようにサイログロブリンを投与することによって誘導する（Maron et al. (1980) J. Exp. Med., 152: 1115）。インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、Kanasawa et al. (1984) Diabetologia, 27: 113に記載されているものなど、特定のマウス系統において自然に発生するか又は誘導することができる。マウス及びラットにおけるＥＡＥは、ヒトにおけるＭＳのモデルとなる。このモデルでは、ミエリン塩基性タンパク質を投与することによって脱髄性疾患が誘導される（Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer et al., eds., Grune and Stratton, New York, pp. 179-213; McFarlin et al. (1973) Science, 179: 478;及びSatoh et al. (1987) J. hnmunol., 138: 179を参照）。
【０１４５】
一般的に、上記のように同定及び試験された適切な作用物質は、薬理学的に適切な担体と一緒に、精製された形態で使用されるであろう。通常、これらの担体には、生理食塩水及び／又は緩衝媒体を含めた、水溶液又はアルコール／水溶液、乳濁液又は懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、及び塩化ナトリウム、並びに乳酸リンゲル液が含まれる。例えば抗体などのポリペプチド複合体を懸濁液中に保つために必要な場合は、適切な生理的に許容されるアジュバントを、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン及びアルギネートなどの増粘剤から選択してよい。静脈内ビヒクルには、リンゲルデキストロースに基づくものなどの、体液及び栄養素補充液、並びに電解質補充液が含まれる。また、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、及び不活性ガスなどの保存料及び他の添加剤も存在し得る（Mack (1982) Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th Edition）。
【０１４６】
本発明の選択された作用物質は、単独で投与される組成物として使用しても、或いは他の作用物質と併せて使用してもよい。これらには、シルコスポリン、メトトレキサート、アドリアマイシン又はシスプラチン、及び免疫毒素などの、様々な免疫治療薬が含まれていてよい。医薬組成物は、本発明の作用物質と共に、様々な細胞毒性物質又は他の作用物質の「カクテル」を含んでいてよい。
【０１４７】
本発明による医薬組成物の投与経路は、当業者に一般的に知られている任意のものであってよい。限定されないが免疫療法を含む治療のために、標準の技法に従って、選択された作用物質を任意の患者に投与することができる。投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、肺の経路を介して、或いは、適切には、カテーテルを用いた直接輸液によるものを含めた、任意の適切な態様によって行うことができる。用量及び投与頻度は、患者の年齢、性別及び状態、他の薬物の併用投与、対抗適応症ならびに臨床家が考慮すべき他のパラメータに依存する。
【０１４８】
ある治療適用において、ＴＦＲ及び／又はＴＦＨ細胞媒介免疫応答の調節を達成するのに適した量は、疾患の重篤性及び患者自身の免疫系の全身状態に依存する。一般に、その作用物質が遮断抗体である場合、例えば、体重１キログラム当たり０．０１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲であり、１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量がより適切であろう。
【０１４９】
１つ又は複数の本発明により選択された作用物質を含む組成物は、ＴＦＲ及び／又はＴＦＨ細胞媒介応答の調節を支援するために、予防的及び治療的な設定で使用してよい。さらに、この中に記載の作用物質は、ＴＦＲ及び／又はＴＦＨ細胞媒介免疫応答を選択的に調節するために、体外で又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用することができる。
【０１５０】
本発明はまた、ＴＦＨ細胞媒介免疫応答を調節するための作用物質及び方法も提供する。ＴＦＨ細胞は、他のタイプのヘルパーＴ細胞から遺伝子的に区別されるヘルパーＴ細胞のサブセットであることが従来技術で知られており、ＴＦＨ細胞が免疫応答に寄与することを示唆する。この知識は、例えば、防御抗体応答の増強が治療となる疾患又は状態を診断し、監視し、及び治療するのに適用することができる。そのような疾患には、限定はされないが、ウイルス感染を治療する及びがんを治療することが含まれる。また、ＴＦＨ細胞媒介免疫応答を増強すること、好ましくは選択的に増強することは、ワクチン接種又はワクチン接種レジメンの一部として特に有用である。
【０１５１】
この中に記載されているような１つ又は複数のＴＦＨ細胞表面受容体のアゴニスト又はアンタゴニストなどの作用物質の使用により、ＴＦＨ細胞機能を調節することができる。ＴＦＨ細胞の分化を阻害又は誘導する及び／又はＴＦＨ細胞の生物学的機能を調節するのに有効な量でのそのような作用物質の使用は、ＴＦＨ細胞媒介免疫応答に影響を及ぼすことができる。
【０１５２】
一実施形態において、本発明は、必要とする患者において、防御抗体応答を高める方法であって、前記患者に、ＴＦＲ細胞と比較してＴＦＨ細胞において少なくとも１．１７の倍率変化で高められた平均蛍光強度（ＭＦＩ）で発現変動する少なくとも１つの受容体を調節する作用物質を投与することを含み、その受容体は、ＴＦＨ細胞において少なくとも２００のＭＦＩを有し、前記作用物質は、前記受容体を調節し及び該作用物質の不在下での抗体応答と比較して前記患者における抗体応答を高めるのに有効である、方法を提供する。そのような発現変動受容体は、この中で「選択的ＴＦＨ受容体」と称される。一実施形態において、少なくとも１つの選択的ＴＦＨ受容体は：ＣＤ１６３、ＣＤ１２７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８９、ＣＤ１９７、ＣＤ１６１、ＣＤ６、ＣＤ２２９、ＣＤ９６、ＣＤ２７２、ＣＤ１４８、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１００、ＣＤ８２、ＣＤ１２６、ＣＤ４５ＲＯ、ＰＤ−１（ＣＤ２７９）、ＣＤ５、及びＣＤ９９の１つ又は複数から選択される。一実施形態において、少なくとも１つの選択的ＴＦＨ受容体は、ＣＤ１６３、ＣＤ１２７、ＣＤ１６１、ＣＤ６、ＣＤ２２９、ＣＤ２７２、ＣＤ１００、ＣＤ１２６、ＰＤ−１（ＣＤ２７９）の１つ又は複数から選択される。
【０１５３】
一実施形態において、作用物質は、選択的ＴＦＨ受容体を遮断することができる、又はその受容体のリガンドに結合しそれによって対応する受容体に結合するその能力を遮断することができる、遮断／アンタゴニスト抗体である。作用物質は、受容体をアンタゴナイズする又はアゴナイズすることができる、小分子、或いはＤＮＡ又はＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ又はアンチセンス分子）であってもよい。
【０１５４】
この中に記載されている様々な選択的ＴＦＨ受容体の公知のアゴニスト及びアンタゴニストに加えて、公知のアッセイ及びスクリーニングを用いて、選択的ＴＦＨ受容体をアンタゴナイズする又はアゴナイズする能力に関して、他の作用物質を試験することができる。ＴＦＨ細胞表面受容体をアゴナイズする又はアンタゴナイズする能力に関して様々な作用物質を試験するためのアッセイ及びスクリーニングは、前述のとおりである。前述のように、動物モデルを用いて選択的ＴＦＨ受容体の調節を試験してもよい。
【０１５５】
本発明はさらに、この中に記載されるアッセイで同定される作用物質を提供し、そのような作用物質は、選択的ＴＦＨ受容体をアンタゴナイズする又はアゴナイズすることができ、それにより、ＴＦＨ細胞媒介免疫機能を調節する。選択的ＴＦＨ受容体を調節する作用物質を処方し、上記のように患者に投与することができる。
【０１５６】
一実施形態において、本発明は、必要とする患者において、病原性抗体応答を低減させる方法であって、前記患者に、該患者においてＴＦＲ細胞媒介抗体抑制を高めるのに有効な量の選択的ＴＦＲ受容体を調節できる第１の作用物質を、単独で、或いはＴＦＨ細胞媒介抗体産生を低減させるのに有効な量の選択的ＴＦＨ受容体を調節することができる第２の作用物質と組み合わせて、投与することを含み、前記第１の作用物質又は第２の作用物質の不在下での病原性抗体応答と比較して、病原性抗体応答が低減される、方法を提供する。
【０１５７】
一実施形態において、本発明は、必要とする患者において、防御抗体応答を高める方法であって、前記患者に、該患者においてＴＦＲ細胞媒介抗体抑制を低減させるに有効な量の選択的ＴＦＲ受容体を調節できる第１の作用物質を、単独で、或いはＴＦＨ細胞媒介抗体産生を増加させるのに有効な量の選択的ＴＦＨ受容体を調節できる第２の作用物質と組み合わせて、投与することを含み、前記第１の作用物質又は第２の作用物質の不在下での防御抗体応答と比較して、防御抗体応答が高められる、方法を提供する。
【０１５８】
ＶＩＩＩ．ＰＤ−１受容体を介したＴＦＲ及びＴＦＨ細胞媒介免疫応答の調節
ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１相互作用が、ＴＦＲ細胞の分化及び機能を制限するという本発明者の発見は、患者においてＴＦＲ細胞媒介及びＴＦＨ細胞媒介免疫応答の両方を調節することへの別の新規なアプローチも解明する。
【０１５９】
従って、一実施形態において、本発明は、必要とする患者において、病原性抗体応答を低減させる方法であって、前記患者に、ＴＦＲ細胞上のＰＤ−１受容体を調節する作用物質を投与することを含む方法を提供する。一実施形態において、その作用物質は、ＴＦＲ細胞上のＰＤ−１受容体のアンタゴニストである。一実施形態において、その作用物質は、ＴＦＲ細胞上のＰＤ−１受容体を遮断できる抗体である。一実施形態において、その作用物質は、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２から選択されるリガンドに結合でき、かつリガンドのＰＤ−１受容体への結合を妨げることができる抗体である。作用物質はまた、その受容体をアンタゴナイズする又はアゴナイズすることができる小分子、或いはＤＮＡ又はＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ又はアンチセンス分子）であってもよい。
【０１６０】
一実施形態において、病原性抗体応答の抑制が治療となる疾患又は状態には、抗体が病原に寄与する又は主にその原因となる、上述したような疾患が含まれる。
【０１６１】
別の実施形態において、本発明は、必要とする患者において、防御抗体応答を高める方法であって、前記患者に、ＴＦＨ細胞上のＰＤ−１受容体を調節する作用物質を投与することを含む方法を提供する。一実施形態において、その作用物質は、ＴＦＨ細胞上のＰＤ−１受容体のアゴニストである。作用物質はまた、ＰＤ−１受容体をアゴナイズできる小分子、或いはＤＮＡ又はＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ又はアンチセンス分子）であってもよい。
【０１６２】
一実施形態において、本発明は、必要とする患者において、病原性抗体応答を低減させる方法であって、前記患者に、該患者においてＴＦＲ細胞媒介抗体抑制を高めるのに有効な量のＴＦＲ細胞上のＰＤ−１受容体を調節できる第１の作用物質を、ＴＦＨ細胞媒介抗体産生を低減させるのに有効な量のＴＦＨ細胞上のＰＤ−１受容体を調節できる第２の作用物質と組み合わせて、投与することを含み、前記第１の作用物質又は第２の作用物質の不在下での病原性抗体応答と比較して、病原性抗体応答が低減される、方法を提供する。
【０１６３】
一実施形態において、本発明は、必要とする患者において、防御抗体応答を高める方法であって、前記患者に、該患者においてＴＦＲ細胞媒介抗体抑制を低減させるのに有効な量のＴＦＲ細胞上のＰＤ−１受容体を調節できる第１の作用物質を、ＴＦＨ細胞媒介抗体産生を増加させるのに有効な量のＴＦＨ細胞上のＰＤ−１受容体を調節できる第２の作用物質と組み合わせて、投与することを含み、前記第１の作用物質又は第２の作用物質の不在下での防御抗体応答と比較して、防御抗体応答が高められる、方法を提供する。
【０１６４】
一般的に知られているＰＤ１受容体のアゴニスト及びアンタゴニストに加えて、公知のアッセイ及びスクリーニングを用いて、ＴＦＨ及びＴＦＲ細胞上のＰＤ−１をアンタゴナイズする又はアゴナイズする能力に関して、他の作用物質を試験することができる。ＰＤ−１受容体をアゴナイズする又はアンタゴナイズする能力に関して様々な作用物質を試験するためのアッセイ及びスクリーニングは、前述のとおりである。前述のように、動物モデルを用いて選択的ＴＦＨ受容体の調節を試験してもよい。
【０１６５】
本発明はさらに、この中に記載されるアッセイで同定される作用物質を提供し、そのような作用物質は、ＰＤ−１受容体をアンタゴナイズする又はアゴナイズすることができ、それにより、ＴＦＲ又はＴＦＨ細胞媒介免疫機能又はその両方を調節する。
【０１６６】
ＴＦＲ又はＴＦＨ細胞上のＰＤ−１受容体を調節する作用物質を処方し、上記のように患者に投与することができる。
【０１６７】
下記の実施例は、本開示のさらなる理解を容易にすることが意図されている。本開示は、図示されている実施形態に関連してこの中で説明されているが、それらに限定されないことが理解されるべきである。この中の教示に接した当業者は、本発明の範囲内の追加の改変及び実施形態を認識するであろう。従って、本開示は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１６８】
１）ＰＤ−１は濾胞性制御性Ｔ細胞を制御する；２）ＰＤ−１欠損ＴＦＲ細胞は胚中心にホーミングできる；３）ＰＤ−１欠損ＴＦＲ細胞はより強力にＴ細胞活性化を阻害する；４）ＰＤ−１は血液濾胞性制御性Ｔ細胞を制御する；５）血液ＴＦＨ及びＴＦＲ細胞はＣＤ２８及びＩＣＯＳシグナルを必要とする；６）ＰＤ−１欠損血液ＴＦＲ細胞はｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体産生をより強力に調節する；７）濾胞性制御性Ｔ細胞（ＴＦＲ）細胞療法戦略；８）循環ＴＦＨ及びＴＦＲ細胞の分化は樹状細胞によるプライミングを必要とする；９）血液ＴＦＨ及びＴＦＲ細胞はＳ１Ｐシグナルを介してリンパ節を出る；１０）循環ＴＦＨ及びＴＦＲ細胞は様々なリンパ節及び組織に遊走する；１１）循環ＴＦＨ及びＴＦＲ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで移送された後により強力に活性化される；１２）循環ＴＦＨ細胞は再刺激のために樹状細胞を必要とし、記憶特性を有する；１３）ＴＦＲ細胞はＴ細胞及びＢ細胞活性化を強力に抑制する；１４）血液ＴＦＲ細胞による弱いＢ細胞抑制；１５）ＴＦＲ及びＴｒｅｇ遺伝子発現シグネチャーの比較；１６）ヒト血液ＴＦＲ細胞により発現変動される表面受容体；１７）ヒト血液ＴＦＨ細胞により発現変動される表面受容体；及び１８）ＰＤ−１経路の遮断はＴＦＨ細胞の抗体刺激能を高めることができることが、２０１３年１１月８日に出願された米国特許出願第１４／７０７，５９６号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６９１９７号、及び２０１２年１１月９日に出願された米国仮特許出願第６１／７２４，４２４号に提供されており、参照によりそれらの全てがこの中に組み込まれる。
【０１６９】
実施例１−ＴＦＲ細胞により抑制されたＢ細胞は初期活性化を受ける
直接ＴＦＲ抑制中にＴＦＨ及びＢ細胞がどのように変化するかについてのメカニズムを特定するために、ＴＦＲ細胞をＴＦＨ及びＢ細胞と共に培養するｉｎ  ｖｉｔｒｏ抑制アッセイを利用した。例えば、Sage et al., J Clin Invest 124, 5191-5204 (2014); Sage et al., Immunity 41, 1026-1039 (2014); Sage et al., Methods Mol Biol 1291, 151-160 (2015)を参照。これらのアッセイのために、ＦｏｘＰ３ＩＲＥＳ−ＧＦＰマウスをＮＰ−ＯＶＡ（ＣＦＡ中に乳化させる）で皮下投与により免疫し、７日後に流入領域リンパ節を単離した。抗ＣＤ３及び抗ＩｇＭと共に、ＴＦＲ（ＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋ＣＸＣＲ５＋ＣＤ１９−ＦｏｘＰ３＋としてソートした）細胞を、Ｂ（ＣＤ１９＋としてソートした）細胞及びＴＦＨ（ＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋ＣＸＣＲ５＋ＣＤ１９−ＦｏｘＰ３としてソートした）細胞の共培養に添加し、２〜６日間培養した（図１Ａ、図３６Ａ、及び図３６Ｂ）。Ｂ及びＴＦＨ細胞の６日間の共培養の後、ＧＣ  Ｂ細胞マーカーＧＬ７の強いアップレギュレーション、並びに、このモデルでの主なクラススイッチアイソタイプであるＩｇＧ１へのクラススイッチ組換えが見られた（図１Ｂ）。さらに、Ｂ細胞をＴＦＨ細胞と共に培養した場合、培養上清中に大量の分泌ＩｇＧが見られたが、Ｂ細胞を単独で培養した場合には見られなかった。しかしながら、ＴＦＲ細胞をＢ及びＴＦＨ細胞の培養に加えた場合、クラススイッチ組換え、ＧＬ７発現及び抗体の分泌は著しく減少し、ＴＦＲ細胞がＢ細胞エフェクター機能を強力に抑制することを実証する。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５−ＩＣＯＳ−Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞は、ＴＦＲ細胞ほどは効果的に抑制することができなかった。ＴＦＲ細胞は、特異的抗原に応答するＢ細胞のクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）も抑制した（図３６Ｃ）。さらには、ＴＦＲ培養からの上清はＢ細胞を抑制しなかった（図１６）ため、ＴＦＲ細胞によるＣＳＲの抑制は細胞接触を必要とした。培養の経時的顕微鏡検査は、ＴＦＲ細胞がＴＦＨ細胞及びＢ細胞の両方と密接に相互作用することを示した（図１７）。これらのデータは、ＴＦＲ細胞が、抑制中にＴＦＨ細胞−及びＢ細胞−認識連関を物理的に破壊しうることを示唆した。従って、この培養系は、ＴＦＨ及びＢ細胞のＴＦＲ抑制を調べる強力なモデルである。
【０１７０】
次に、Ｂ細胞のＴＦＲ抑制がＢ細胞活性化の完全な欠乏をもたらすか、又は抑制が下流のエフェクター機能にさらに標的化されるかを特定した。Ｂ細胞をｃｅｌｌ  ｔｒａｃｅ  ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｄｙｅで標識したことを除いて、同様のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抑制アッセイを実施した。Ｂ細胞増殖（ＣＴＶ希釈を評価することによる）を、ＴＦＲ細胞あり又はなしで共培養した後に解析すると、ＴＦＲ細胞が存在する場合、細胞分裂回数の減少にもかかわらず、Ｂ細胞の圧倒的多数が少なくとも１細胞周期増殖したことが分かった（図１Ｃ）。従って、ＴＦＲ細胞抑制は、ＴＦＲ細胞及びＢ細胞のみ（ＴＦＨ細胞なし）並びにリポ多糖＋ＩＬ−４の共培養において、Ｂ細胞の増殖を完全には妨げない（図１８）。Ｂ細胞の初期活性化がＴＦＲ細胞により影響を受けるかを特定するために、共培養の最初の数日間、Ｂ細胞におけるＣＤ６９発現を解析した。驚いたことに、最初の３日間の培養中に抑制性のＴＦＲ細胞が存在するか否かにかかわらず、ＣＤ６９は、Ｂ細胞においてアップレギュレートされ、ＴＦＲ細胞抑制中にＢ細胞の初期活性化がまだ生じることを示す（図１Ｄ）。従って、ＴＦＲ細胞は、Ｂ細胞の増殖及びエフェクター機能を阻害するが、抑制Ｂ細胞は多少の活性化及び増殖の証拠を示す。
【０１７１】
ＴＦＲ抑制中のＢ細胞のエフェクター機能の不全の１つの可能性のある説明は、ＴＦＲ細胞が、Ｂ細胞において細胞死を誘導しているかもしれないというものである。従って、活性型カスパーゼ試薬ｚＶＡＤを用いてＢ細胞を染色することにより細胞死を評価した。これらの共培養実験において、ＴＦＨ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの親和性成熟中の胚中心内での多量の細胞死と一致するＢ細胞における細胞死を誘導する（図１Ｅ）。しかしながら、ＴＦＲ細胞が存在する場合、細胞死はＢ細胞において劇的に減少し、ＴＦＲ細胞が、アポトーシスを受けるようにＢ細胞を感受性にすることによってＢ細胞応答を変化させるのではないことを示唆する。ＧＣにおけるＢ細胞の親和性成熟は、体細胞超突然変異と細胞死との間のバランスにより生じる。ＴＦＲ細胞が体細胞超突然変異を変化させるかを特定するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抑制アッセイを実施し、突然変異Ｂ細胞受容体の試験を容易にするために特定の抗原（ＮＰ−ＯＶＡ）（抗ＣＤ３及び抗ＩｇＭの代わりに）を培養に添加した。６日間の培養後、Ｂ細胞をソートし、Ｂ細胞受容体の重鎖をシーケンスし、体細胞超突然変異を解析した。ＴＦＨ細胞と一緒のＢ細胞の培養における適度に低いユニークＶＤＪ配列当たりの突然変異頻度が見られた（図１Ｆ）。Ｂｃｌ６及び増殖マーカーＫｉ６７の発現の低下により示唆されるように、ＴＦＲ細胞（Ｔｒｅｇ細胞ではない）は、ＴＦＨ細胞の活性化も抑制した（図１９）。しかしながら、ＴＦＲ細胞を添加したとき、より少ないユニークＶＤＪ配列当たりの突然変異頻度が見られ、それはＴＦＲ細胞がＢ細胞の体細胞超突然変異を抑制できることを裏付ける。総合すれば、これらのデータは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抑制アッセイが、Ｂ細胞のＴＦＲ抑制を確実に測定すること、及びこの抑制は、Ｂ細胞が多少の活性化シグナルを受けることを許容することを示す。
【０１７２】
実施例２−抑制されたＢ及びＴＦＨ細胞は、エフェクター遺伝子の小さなサブセットをダウンレギュレートするが、まだエフェクター細胞に似ている
これらの研究結果は、ＴＦＲ細胞が、Ｂ細胞が一部の活性化シグナルを受けることを許容するが、例えばクラススイッチ組換え、体細胞超突然変異、又は抗体分泌などのエフェクター機能を発揮できない態様でＢ細胞を抑制することを示唆した。ＴＦＲ媒介抑制中にどのようにＢ及びＴＦＨ細胞のエフェクター状態が変化するかを特定するために、アッセイを実施し、その後ＲＮＡ−ｓｅｑトランスクリプトーム解析を実施した。これらの実験において、Ｂ及びＴＦＨ細胞（免疫したＦｏｘＰ３−ＩＲＥＳ−ＧＦＰマウス由来）を、ＴＦＲ細胞（免疫したＡｃｔｉｎＣＦＰ  ＦｏｘＰ３−ＩＲＥＳ−ＧＦＰマウス由来）あり又はなしで、ＮＰ−ＯＶＡ（Ｂ、ＴＦＨ及びＴＦＲ細胞を作製するのに用いたのと同じ抗原）の存在下で６日間培養した。４日間の培養後、Ｂ（ＣＤ１９＋ＩＡ＋ＣＤ４−としてソートした）細胞及びＴＦＨ（ＣＤ４＋ＩＡ−ＣＤ１９−ＣＦＰ−としてソートした）細胞を、「活性化」培養（ＴＦＨ及びＢ細胞のみ）から、又は「抑制」培養（ＴＦＨ、Ｂ及びＴＦＲ細胞）からソートし、さらにＲＮＡｓｅｑトランスクリプトーム解析を実施した（図２Ａ、図３７Ａ及び図３７Ｂ）。
【０１７３】
主成分分析（ＰＣＡ）により、活性化Ｂ細胞及び抑制Ｂ細胞のわずかな分離が見られたが、活性化ＴＦＨ細胞又は抑制ＴＦＨ細胞では見られなかった（図２Ｂ）。ＴＦＨ細胞集団とＢ細胞集団は、別の系統の細胞であるため、予想通り分離した。１１７１の遺伝子が、活性化Ｂ細胞と抑制Ｂ細胞との間で発現変動される（ＦＤＲをｐ値＜０．０５に調整）ことが見られたが、４０７遺伝子のみが、活性化ＴＦＨ細胞と抑制ＴＦＨ細胞との間で発現変動された（図２Ｃ、及び図３７Ｃ〜図３７Ｆ）。従って、ＴＦＲ抑制は、ＴＦＨ細胞よりもＢ細胞においてより多くの転写変化を誘導する。
【０１７４】
次に、ＴＦＲ抑制がＴＦＨ細胞のアイデンティティ及び機能に影響を及ぼすかを特定した。これを行うために、ＴＦＨ細胞の分化／機能を調節するＴＦＨ遺伝子のリストをまとめ、活性化ＴＦＨ細胞と抑制ＴＦＨ細胞との間の違いを解析した。驚いたことに、抑制に関連するＢｃｌ６又はＡｓｃｌ２などのＴＦＨ転写因子のダウンレギュレーションは全く認められなかった（図２Ｅ）。しかしながら、ＩＬ−４及びＩＬ−２１転写物は、ＴＦＲ抑制中にＴＦＨ細胞において強くダウンレギュレートされた。このデータは、ＴＦＲ媒介抑制の後、ＴＦＨ細胞がそのＴＦＨプログラムをまだ保持するが、キーエフェクター分子のダウンレギュレーションを有することを示唆する。抑制ＴＦＨ細胞がＴＦＨ様転写プログラムをまだ保持していたことを確認するために、単一サンプル遺伝子集合濃縮解析（single sample gene set enrichment analysis）（ｓｓＧＳＥＡ）を実施した。活性化ＴＦＨ細胞と抑制ＴＦＨ細胞との間の転写状態を、ＴＦＨ細胞の公開されている転写シグネチャー（Ｂｒｏａｄ  ｉｍｍＳｉｇ  Ｃ７コレクションから）と比較した。抑制ＴＦＨ細胞はそのＴＦＨ様転写シグネチャーを質的にまだ保持していることが見いだされ、それは、抑制中にこれら細胞が異なる細胞タイプに変換されておらず、ＴＦＨ様プログラムをまだ有していることを示唆する。
【０１７５】
次に、Ｂ細胞が、ＴＦＨ細胞と同様に、ＴＦＲ細胞抑制中にそのエフェクタープログラムを保持するかを特定した。活性化又は抑制Ｂ細胞におけるＢ細胞エフェクター遺伝子（厳選されたリストから）を比較したとき、転写物のより低い発現が、Ｉｇｈｇ１（ＩｇＧ１、これらのアッセイにおける主要なＩｇＧアイソタイプ）、Ｉｇｈｇ２ｃ及びＩｇｈａを含む抗体アイソタイプに関して見られた（図２Ｆ〜図２Ｇ）。Ｉｇｈｇ２ｂ転写物は、抑制によりアップレギュレートされたが、ＩｇＧ２ｂは、これらのアッセイにおいてＥＬＩＳＡ測定により増加しなかった。ＴＦＲ抑制によりＢ細胞において最もダウンレギュレートされた転写物のうちの３つは、Ｐｏｕ２ａｆ１（ＧＣ  Ｂ細胞の形成に不可欠である転写因子をコードする）、Ｘｂｐ１（タンパク質フォールディング、及び形質細胞による抗体の分泌に重要であるＥＲストレスの、調節因子をコードする）、及びＡｉｃｄａ（クラススイッチ組換えの開始を担う酵素であるＡＩＤをコードする）であった。ＧＣ／形質細胞機能に重要な遺伝子におけるこれら劇的な変化にもかかわらず、ほとんどの他のＢ細胞エフェクター遺伝子の発現は変化しなかった。
【０１７６】
エフェクター遺伝子の小さなサブセットにおける変化にもかかわらず、抑制Ｂ細胞が活性化されたＧＣ  Ｂ細胞転写シグネチャーをまだ保持しているかを特定するために、ｓｓＧＳＥＡ解析を実施した。活性化Ｂ細胞及と抑制Ｂ細胞（免疫マウスからソートしたＧＣ  Ｂ又はナイーブＢ細胞と一緒に）を比較すると、抑制Ｂ細胞はそのＧＣシグネチャーをまだほとんど保持していることが分かった（図２Ｈ）。従って、抑制ＴＦＨ細胞及び抑制Ｂ細胞はエフェクター分子（ＴＦＨにおいてＩＬ−４及びＩＬ−２１、及びＢ細胞においてＩｇＧ１、Ｘｂｐ１、Ｐｏｕ２ａｆ１及びＡＩＤ）をコードする遺伝子のダウンレギュレーションを示すが、これらの細胞はまだエフェクター細胞に類似する転写シグネチャーを保持する。総合すれば、これらのデータは、ＴＦＲ細胞が、抑制中にＢ細胞及びＴＦＨ細胞が活性化された転写シグネチャーを保持することを許容するが、下流のエフェクター機能に重要であるキーエフェクター分子をダウンレギュレートすることを示し、これはＴＦＲ抑制が特定分子に標的化されることを示唆する。
【０１７７】
抑制中にいずれかの非エフェクターサブセット関連経路がＢ及びＴＦＨ細胞において変化したかを特定するために、ブロード研究所（Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）からの、ホールマーク（Ｈａｌｌ）、遺伝子オントロジー（ＧＯ）、及び転写因子（ＴＦ）の遺伝子セットを利用して、基本的なＧＳＥＡを実施した。活性化Ｂ細胞が、抑制Ｂ細胞と比較して、Ｍｙｃターゲット、ＭＴＯＲｃ１シグナリング、酸化的リン酸化、及び解糖に関する遺伝子セットの強い濃縮（enrichment）を示した（表１）。活性化ＴＦＨ細胞も、抑制ＴＦＨ細胞と比較して、Ｆ２Ｆターゲット、解糖及びＭＴＯＲｃ１シグナリングの濃縮を示したが、この濃縮はＢ細胞におけるほど強くはなかった。インターフェロンα応答及びｃＡＭＰ共役Ｇタンパク質シグナリングを除いて、活性化Ｂ細胞と比較して、抑制Ｂ細胞において濃縮されているいくつかの遺伝子セットが検出された。
【０１７８】
【表１】
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【０１７９】
実施例３−ＴＦＲ抑制は、Ｂ細胞におけるＭｙｃ及びＭＴＯＲ経路を変化させる
Ｍｙｃ経路遺伝子は、抑制Ｂ細胞において最もダウンレギュレートされた遺伝子セットの１つであったため、ＴＦＲ抑制によりＢ細胞においてＭｙｃ経路遺伝子が変化するかを特定した。Ｂ細胞におけるほとんど全てのＭｙｃ標的遺伝子は、ＴＦＲ抑制中に転写レベルでダウンレギュレーションの証拠を示した（図５Ａ）。活性化Ｂ細胞においてＭｙｃを抑制することが、ＴＦＲ抑制を再現できるかを特定するために、Ｂ細胞を、ＴＦＨ細胞；ＴＦＨ及びＴＦＲ細胞；又はＴＦＨ細胞及びＭｙｃ阻害剤１００５８−Ｆ４（Ｆ４ｗ）と共に培養する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抑制アッセイを実施した。これらのアッセイにおいて、ＴＦＨ細胞はＩｇＧ１への強健なクラススイッチ組換えを刺激し、それはＴＦＲ細胞の添加によりほぼ完全に抑制された（図５Ｂ）。活性化培養（Ｂ＋ＴＦＨ）へのＭｙｃ阻害剤の添加は、クラススイッチ組換えのわずかな低減をもたらした。これらの実験からの培養上清を解析すると、Ｍｙｃ阻害剤が、ＴＦＲ細胞よりもさえ多く、分泌抗体の量を大きく低減させたことが分かった（図５Ｃ）。従って、Ｍｙｃ経路の阻害は、クラススイッチ組換え及抗体分泌の抑制をもたらす。
【０１８０】
Ｍｙｃ経路は、ＴＦＲ抑制中に調節されるＢ細胞でのキー経路でありうるため、Ｍｙｃの過剰発現が、Ｂ細胞をＴＦＲ抑制に対して抵抗性とならせることができるかを特定した。ＷＴ又はＩｇｈ−Ｍｙｃ（すなわち、Ｅμ−Ｍｙｃ、Ｍｙｃを過剰発現する）マウスのＢ細胞を、ＴＦＨ及びＴＦＲ細胞と共に培養した。興味深いことに、Ｍｙｃの過剰発現は、クラススイッチ組換え及び分泌抗体のいずれの救済ももたらさなかった（図５Ｄ及び図５Ｅ）。しかしながら、Ｂ細胞でのＧＬ７発現は、Ｍｙｃ過剰発現の状態で部分的に救済され、Ｍｙｃ過剰発現が、マイナーかもしれないが、ＴＦＲ細胞による一部の抑制を防ぐことができることを示唆した。総合すると、これらのデータは、ＴＦＲ細胞が、Ｂ細胞におけるＭｙｃ経路を抑制し、それは抗体産生不全の部分的な原因である可能性がある。
【０１８１】
ｍＴＯＲ経路は、活性化の間にタンパク質合成を増進させ、細胞代謝を増強することに関連している。ＴＦＲ抑制中にＢ細胞及びＴＦＨ細胞の両方において転写レベルでｍＴＯＲｃ１経路がダウンレギュレートされる（図４）ことの証拠が見られたため、ｍＴＯＲ経路を遮断することが、抗体産生の抑制につながるかを特定した。ｍＴＯＲｃ１阻害剤であるラパマイシン、又はＴＦＲ細胞のいずれかと共に、Ｂ及びＴＦＨ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養を実施した。培養へのラパマイシンの添加は、ＴＦＲ細胞を添加した場合と同程度、クラススイッチ組換え、並びに抗体産生を著しく低減させた（図６Ｂ及び図６Ｃ）。ｍＴＯＲｃ１／ｍＴＯＲｃ２阻害剤ＰＰ２４２を用いた場合にも、同様の結果が得られた（図６Ｄ及び図６Ｅ）。従って、ｍＴＯＲ経路を阻害すると、ＴＦＲ細胞と同様に、クラススイッチ組換え及び抗体産生の抑制をもたらす。Ａｋｔは、ｍＴＯＲの上流及び下流の両方に作用し、活性化シグナリングを媒介できる。Ｂ細胞とＴ細胞の共培養において、ＡｋｔをＡｋｔ１／２阻害剤で阻害した場合、ＡＫｔの阻害が、驚いたことに、クラススイッチ組換えの増加を生じさせたことが分かった（図６Ｆ）。しかしながら、Ａｋｔの阻害は、共培養実験で抗体分泌の減少をもたらした。総合すると、これらのデータは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路を抑制すると、ＴＦＲ媒介抑制と同様の大きさ及び特徴をもって、ＴＦＨ媒介Ｂ細胞抗体産生の抑制をもたらすことができることを示す。
【０１８２】
実施例４−ＴＦＲ細胞はＢ細胞代謝を抑制する
ＧＳＥＡ解析は、解糖、酸化的リン酸化、Ｍｙｃ及びｍＴＯＲ経路に関連する遺伝子のダウンレギュレーションを示したため、Ｂ細胞及びＴＦＨ細胞のＴＦＲ抑制が、代謝に変化をもたらすかを特定した。最初に、個々の経路内の鍵酵素をコードする遺伝子の発現値を平均化することにより、（図２Ａ〜２Ｈで作製した）活性化又は抑制Ｂ細胞を比較して、ＲＮＡ−ｓｅｑデータを用いた代謝経路の一般的比較を実施した。セリン生合成、プリン代謝、１炭素代謝、ＴＣＡ回路、電子伝達系（酸化的リン酸化に含まれる）、及び解糖を含む、多くの代謝経路のダウンレギュレーションの証拠が見いだされた（図７Ａ）。抑制によりＢ細胞で高められた何らかの兆候を与えた唯一の経路は、脂肪酸酸化であった。それでもなお、このデータは、多くの代謝経路がＴＦＲ抑制によりＢ細胞でダウンレギュレートされることを示唆する。これら経路のサブセットの複雑な相互作用をより視覚化するために、解糖、セリン代謝、１炭素代謝、プリン代謝及びＴＣＡ回路におけるキー中間体の代謝マップを作製した。多様な経路に影響を及ぼす酵素を含めて、多くの鍵酵素がこれら経路内で見いだされた（図７Ｂ）。従って、ＴＦＲ細胞は１つの単一代謝経路を抑制するのではなく、このデータは、ＴＦＲ細胞が、抑制の一部として多くの異なる代謝経路を弱めることを示唆する。
【０１８３】
解糖経路は抗体産生に不可欠であるため、解糖に対するＴＦＲ細胞による抑制の影響を評価した。まず、ＴＦＲ細胞により抑制されたＢ細胞におけるグルコーストランスポーターＧｌｕｔ１の発現を比較した。ＴＦＲ細胞（Ｔｒｅｇ細胞ではない）は、Ｂ細胞においてＧｌｕｔ１発現を抑制し（図２０）、それはＴＦＲ細胞がＢ細胞の解糖を抑制したことを示唆した。同じ回数の細胞分裂を受けたＢ細胞の比較が、抑制Ｂ細胞でＧｌｕｔ１発現及びＣＳＲが減少したことを示した（図２１、及び図３９Ａ〜図３９Ｅ）ことから、ＴＦＲ細胞によるＢ細胞におけるＧｌｕｔ１発現（及びＣＳＲ）の抑制は、非分裂細胞（Ｇｌｕｔ１の低発現を有する）の存在度の増加によるものではなかった。さらに、ＴＦＲ細胞によるＣＳＲ及び代謝の抑制は、Ｂ細胞増殖の変化より前に生じた；活性化培養又は抑制培養に添加し、２０時間後（最初の細胞分裂前）に回収したＢ細胞を解析したとき、抑制培養におけるＢ細胞は、活性化培養におけるＢ細胞よりも、Ｇｌｕｔ１及びＩｇＧ１の発現が低かった（図２２、及び図３９Ａ〜図３９Ｅ）。これらの試験は、増殖からのＣＳＲ及び代謝の分離を表し、ＴＦＲ細胞によるＢ細胞におけるＣＳＲ及び代謝の抑制が、増殖の変化とは関係なく生じたことを示した。ＴＦＲ細胞（Ｔｒｅｇ細胞ではない）は、ＴＦＨ細胞においてＧｌｕｔ１の発現を低下させた（図２３）。
【０１８４】
解糖などの代謝経路が抑制Ｂ細胞及び抑制ＴＦＨ細胞において変化したかを確認した。Ｇｌｕｔ１は、グルコースの最も重要なトランスポーターの１つであり、解糖細胞のマーカーである。Ｇｌｕｔ１発現を活性化又は抑制培養からのＢ細胞及びＴＦＨ細胞において測定すると、Ｂ細胞及びＴＦＨ細胞の両方において、ＴＦＲ細胞がＧｌｕｔ１発現を抑制したことが分かり、Ｂ細胞及びＴＦＨ細胞の両方において、ＴＦＲ細胞が解糖を抑制することが示唆された（図７Ｃ）。Ｂ細胞及びＴＦＨ細胞が、抑制培養において、より少ないグルコースを利用したかを特定するために、培養上清からのグルコースを解析した。ＴＦＨ細胞とＢ細胞との培養において大量のグルコースが利用され、それはＴＦＲ細胞の添加で大きく減少したことが分かった（図７Ｄ）。乳酸が解糖の副産物として作られる。培養上清中の乳酸産生を測定すると、ＴＦＨ細胞をＢ細胞に添加した場合に大量の乳酸が産生され、この乳酸産生は、さらにＴＦＲ細胞を添加することによって顕著に弱められた（図７Ｅ）。同じリンパ節由来のＩＣＯＳ−ＣＸＣＲ５−Ｔｒｅｇｓは乳酸産生を強く抑制することはできなかったため、乳酸産生の抑制はＴＦＲ細胞に独特であった。グルコースに加えて、グルタミン利用もＴＦＲ細胞により抑制され、それはＲＮＡ−ｓｅｑにより測定されたグルタミノリシス転写シグネチャーの減少と相関した（図７Ｆ）。
【０１８５】
解糖を阻害することが、ＴＦＲ抑制を再現できるかを特定するために、解糖を遮断するグルコースアナログである２−デオキシグルコース（２ＤＧ）を添加して、Ｂ細胞とＴＦＨ細胞の培養を実施した。２ＤＧを活性化培養に添加すると、ＴＦＲ抑制と同様の、抗体産生の頑強な抑制がみられた（図７Ｇ及び図２４）。ＴＣＡ回路を阻害する２−ニトロプロピオン酸（ＮＰＡ）を添加したときに同様の結果が見られた。しかしながら、解糖から酸化的リン酸化へ代謝をシフトさせるジクロロ酢酸塩（ＤＣＡ）の添加は、抗体産生を変化させなかった。このデータは、Ｂ細胞がエネルギー利用の多様な経路を使用でき、１つの経路が強く阻害されると、ＴＦＲ細胞による抑制に類似する抗体産生の弱化がもたらされることを示唆する。
【０１８６】
次に、この経路内の全ての鍵酵素（Ｍｔｈｆｓを除く）が、ＴＦＲ抑制によってＢ細胞においてより少ない転写物存在度を有しているため（図７Ｈ）、ＴＦＲ細胞が、セリン代謝、プリン代謝及び１炭素代謝も強く抑制するかを特定した。Ｓｈｍｔ１及びＳｈｍｔ２（それぞれ１炭素代謝におけるリンパ球活性化のサイトゾル酵素及びミトコンドリア酵素であって、リンパ球活性化の数時間内にアップレギュレートされる３２）の発現は最初の細胞分裂の前に減少したことから（図２５）、ＴＦＲ細胞により抑制されたＢ細胞における１炭素代謝に含まれる産物をコードする遺伝子の発現低下は、増殖の変化によるものではなかった。プリン代謝の阻害剤は、自己免疫の関連で、抗体産生を阻害するために臨床で使用されている。従って、プリン代謝の阻害剤がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴＦＲ抑制を再現できるかを特定した。プリン合成阻害剤であるメトトレキサート（ＭＴＸ）を、Ｂ細胞とＴＦＨ細胞の培養に添加し、ＭＴＸが、ＴＦＲ細胞よりも増して強くｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗体産生を抑制することが分かった（図７Ｉ）。メトトレキサートは、プリン代謝を阻害すること以上の影響を及ぼしうるため、追加のプリン阻害剤アザチオプリン（ＡＺＡ）を用いた。Ｂ細胞とＴＦＨ細胞の培養へのＡＺＡの添加は、ＭＴＸに類似する抗体分泌の強い抑制をもたらし、その抑制はＴＦＲ細胞単独による抑制よりも強かった（図７Ｊ）。ＭＴＸ及びＡＺＡは両方とも、ＴＦＲ細胞と同様に、Ｂ細胞のクラススイッチ組換えも強力に抑制した。総合すると、これらのデータは、ＴＦＲ細胞がＢ細胞における多様な代謝経路を抑制し、これら経路を強く抑制すると、Ｂ細胞による抗体産生の同様の抑制をもたらすことを示す。
【０１８７】
実施例５−Ｂ細胞のＴＦＲ抑制は、持続性の阻害及びエピジェネティックな変化をもたらす
次に、抑制Ｂ細胞が、活性化細胞になることがでるか、或いは、ＴＦＲ抑制が、ＴＦＲ細胞がもはや存在しなくなった後も続く長続きする抑制を誘導するかを特定した。これを試験するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抑制アッセイを適合させた。Ｂ細胞とＴＦＨ細胞の活性化又は抑制培養を設定し、３日後、活性化又は抑制Ｂ細胞をソートした。これらＢ細胞を新たなＴＦＨ細胞と共に第２の培養において培養し、６日後に培養を解析した（図８Ａ）。最初に、ＴＦＨ細胞をこれら培養から測定した。抑制Ｂ細胞と共に培養したＴＦＨ細胞は、Ｋｉ６７及びＢｃｌ６の共染色を有し、これら培養からのＴＦＨ細胞が抑制Ｂ細胞によって活性化されたことを示唆する（図８Ｂ及び図２６）。しかしながら、これら培養からのＢ細胞において、細胞内のＩｇＧ１を分析すると、ＴＦＨ細胞により再刺激された抑制Ｂ細胞がまだ、クラススイッチ組換えを受ける能力を顕著に欠いていたことが分かった（図８Ｃ）。先の例は、ＴＦＲ細胞が、代謝をダウンレギュレートすることを介して、Ｂ細胞のクラススイッチ組換えを抑制することを示唆するため、不完全なクラススイッチ組換えを有する再活性化された抑制Ｂ細胞が、代謝の不全も有することが予測される。この質問に答えるために、ＴＦＨ細胞で再活性化された抑制Ｂ細胞において、Ｇｌｕｔ１発現を解析すると、Ｇｌｕｔ１発現は第１の培養からの抑制Ｂ細胞よりも高かったが、それは活性化Ｂ細胞よりもかなり低かったことが分かった（図８Ｄ）。さらに、培養からのグルコース取込みを測定すると、再活性化培養をうけた抑制Ｂ細胞は、実質的により少ないグルコースを利用したことが分かった（図８Ｅ）。総合すると、これらデータは、ＴＦＲ細胞によって抑制されたＢ細胞が、クラススイッチ組換え及び代謝における不全を有し、それはＴＦＲ細胞が最早存在しなくなった後も持続することを示す。
【０１８８】
抑制Ｂ細胞が、ＴＦＲ細胞の後にもクラススイッチ組換えの不全を維持することの発見は、Ｂ細胞の修飾を暗示する。このデータの１つの可能性のある説明は、ＴＦＲ細胞が、抑制中にＢ細胞にエピジェネティックな修飾を生じさせ、そのようなエピジェネティックな修飾がＴＦＲ細胞の存在より長く持続するということである。従って、任意のキーとなるＢ細胞エフェクター又は代謝遺伝子が、おそらくＴＦＲ細胞により誘導されるエピジェネティックな変化による、アクセシビリティにおける変化の何らかの証拠を示したかについて特定するために、シーケシング（ＡＴＡＣ−ｓｅｑ）を用いたトランスポザーゼ−アクセスクロマチン（transposase-accessible chromatin）のためのアッセイを利用して、クロマチンアクセシビリティを評価した。抗ＣＤ３ではなくＮＰ−ＯＶＡを用い、培養の３日後に活性化及び抑制Ｂ細胞をソートしたことを除き、図８Ａにおけるようにｉｎ  ｖｉｔｒｏ抑制アッセイを実施した。６４６の遺伝子が、活性化Ｂ細胞と比較して、抑制Ｂ細胞において、アクセシビリティに統計的なダウンレギュレーションを示したことが分かった（図８Ｆ）．これらの遺伝子の内、４３の遺伝子がＲＮＡレベルでより低い発現を有していた。転写物がＲＮＡレベルで大いにダウンレギュレートされた２つの不可欠なＢ細胞機能遺伝子Ａｉｃｄａ及びＰｏｕ２ａｆ１は、ＡＴＡＣ−ｓｅｑによりクロマチン非アクセシビリティの証拠を示し、エピジェネティック修飾を示唆した（図８Ｇ）。Ａｉｃｄａ遺伝子座は、Ａｉｃｄａ  ＴＳＳの〜８ｋｂ上流の領域でより低いアクセシビリティを示した。この領域は、ＮＦ−ｋｂ、Ｓｔａｔ６及びＣ／ＥＢＰ転写因子が結合する公知のエンハンサー領域であり、ＡＩＤ発現に重要である２０。Ｐｏｕ２ａｆ１遺伝子座に、非アクセシビリティの証拠を示す２つのピークが見られた；ＴＳＳのすぐ近くに１つ、及びエクソン１とエクソン２の間のイントロン領域に１つ。従って、クラススイッチ及びＧＣ形成に不可欠な２つの遺伝子ＡＩＤ及びＰｏｕ２ａｆ１は、ＴＦＲ抑制により誘導されるエピジェネティック修飾により阻害される可能性があり、それは、ＴＦＲ細胞が最早存在しなくなった後におけるＢ細胞の抑制を説明することができる。
【０１８９】
同定された遺伝子がどのように調節されるかを検討するために、ＡＴＡＣ−ｓｅｑデータに、ＣｈＩＡ−ｐｅｔ技術により規定した「Ｂ細胞レギュローム」（Ｂ細胞におけるプロモーターの長距離エンハンサー（long-range enhancers）との確認された相互作用のコレクション）を重ねた。Ａｉｃｄａ遺伝子座は、２つの領域（Ａｉｃｄａ転写開始部位（ＴＳＳ）の〜８キロベース（ｋｂ）上流と、もう一方は〜２１ｋｂ上流）において、活性化Ｂ細胞よりも抑制Ｂ細胞で、より低いアクセシビリティを示した（図２７）。これらのエンハンサー領域は、ＡＩＤ発現に不可欠である３３、３４。Ｍｙｃ遺伝子座に、活性化Ｂ細胞におけるよりも、ＴＦＲ細胞によって抑制されたＢ細胞においてアクセシビリティが低い７つの推定上のエンハンサー領域が同定された（図２８）。Ｐｏｕ２ａｆ１遺伝子座にアクセシビリティが低い１つのピークが見られ、それはエクソン１とエクソン２との間にあるイントロン領域に位置していた（図２９）。抑制Ｂ細胞においてアクセシビリティが低い領域の多くはＴＳＳではなく、長距離エンハンサーの部位にあった（図２８及び図２９）。全てのＡＴＡＣ−ｓｅｑ領域の分布をＴＳＳの位置に対して定量化したとき、ＴＦＲ細胞により抑制されたＢ細胞でアクセシビリティが低い領域は、ＡＴＡＣ−ｓｅｑにより同定された全ての領域よりも、ＴＳＳからさらに離れている傾向があった（図３０）。これらのデータは、鍵代謝酵素をコードする遺伝子ではなく、Ｂ細胞機能に重要である産物をコードする遺伝子が、ＴＦＲ細胞による抑制中にエピジェネティック調節の証拠を示したことを表した。
【０１９０】
興味深いことに、ＲＮＡｓｅｑによりダウンレギュレートされた鍵代謝酵素（図７Ｂを参照）のいずれも、非アクセシビリティの明確な証拠を全く示さなかった。しかしながら、３つのミトコンドリア／代謝遺伝子は、非アクセシビリティの証拠を示した；Ａｔｐ５ｆ１、Ａｃａｄｍ及びＡｕｈ。Ａｔｐ５ｆ１は、ＲＮＡレベルで全体的に抑制される経路である酸化的リン酸化の間に電子伝達系において機能する。Ａｃａｄｍは、ミトコンドリアの脂肪酸β酸化経路において機能する。Ａｕｈは、ロイシンを分解する働きをする酵素をコードし、ＲＮＡにおけるＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）に結合できる。総合すると、これらのデータは、セレクトＢ細胞機能遺伝子は、ＴＦＲ抑制中にエピジェネティックな調節の証拠を示し、わずかな例外を除いて、代謝遺伝子はクロマチンリモデリングによりエピジェネティックに調節されないことを表す。このデータは、ＴＦＲ抑制が、下流のＢ細胞機能及び代謝を変化させうるＡＩＤ及びＰｏｕ２ａｆのエピジェネティック修飾に主に影響を及ぼすことを示唆する。
【０１９１】
実施例６−ＩＬ−２１はＢ細胞の代謝及び抗体産生のＴＦＲ媒介抑制を克服できる
データは、ＴＦＲ細胞が、Ｂ細胞機能遺伝子の標的化されたダウンレギュレーション及び代謝の変化を介してＢ細胞を抑制することを表す。Ｂ細胞機能遺伝子及び多様な代謝経路は共働してＢ細胞においてクラススイッチ組換え及び抗体産生を誘導することが可能である。Ｂ細胞のＴＦＲ抑制は、いずれの単一の代謝経路を迂回することによっても救済できず（図７Ａ〜図７Ｊ）、多様な代謝経路及び／又はＢ細胞遺伝子のＴＦＲ抑制が、抑制に寄与することを示唆する。従って、治療的に抑制Ｂ細胞を回復させる方法を特定するために、Ｂ細胞遺伝子及び代謝の両方を活発にして抑制を克服することが必要である可能性がある。ＩＬ−２１は、ＴＦＲ細胞により強力に抑制される胚中心反応に不可欠なサイトカインである。ＩＬ−２１は、脂肪組織における代謝プロセスを制御することもでき、エフェクター細胞のＴｒｅｇ抑制を阻害することが示されている。抑制アッセイにＩＬ−２１を添加すると、ＴＦＲ細胞により媒介されるＢ細胞の増殖の低下は救済された（図１１Ａ）。さらに、クラススイッチ組換えは、ＩＬ−２１を添加した抑制状態においてはるかに高かったが、これは活性化培養レベルには全く達しなかった（図１１Ｂ）。抑制培養へのＩＬ−２１の添加は、活性化培養と比較して、分泌抗体の量をほぼ救済し、そのような結果はＩＬ−４を添加した場合には生じなかった（図１１Ｃ）。しかしながら、別のＳｔａｔ３シグナリングサイトカインＩＬ−６も抗体産生の抑制を救済することができた。
【０１９２】
代謝は、Ｂ細胞エフェクター機能を促進するのに不可欠であり、かつＴＦＲ細胞により調節されるため、ＩＬ−２１を添加した抑制培養においてＢ細胞の代謝能を評価した。ＩＬ−２１を抑制培養に添加すると、Ｂ細胞におけるＧｌｕｔ１発現が完全に救済された（図１１Ｄ）。同様に、ＩＬ−２１を抑制培養に添加すると、ＴＦＨ細胞におけるＧｌｕｔ１発現も救済された。ＩＬ−２１を抑制培養に添加すると、培養でのグルコース消費は、ほぼ完全に救済された（図１１Ｅ）。ＩＬ−２１及びＩＬ−６は、抑制培養において乳酸産生も実質的に（完全ではないが）救済することができた（図１１Ｆ）。従って、ＩＬ−２１の添加は、抑制Ｂ細胞の解糖機能を救済することができる。ＩＬ−２１は、主に代謝を増強することにより抗体産生を救済する可能性がある。増強された解糖が抑制培養における抗体産生のＩＬ−２１による救済に要求されるかを特定するために、解糖を遮断して、代謝の増強がない場合にまだ抗体応答が救済されうるかを特定した。解糖を遮断すると、ＩＬ−２１は抑制を救済できなかった（図１１Ｇ）。従って、ＩＬ−２１は、主に代謝を増強することにより、Ｂ細胞をＴＦＲ媒介抑制に対して抵抗性にする。
【０１９３】
どのＢ細胞機能遺伝子が転写レベルで救済されたかを特定するために、活性化培養からのＢ細胞、抑制培養からのＢ細胞、及びＩＬ−２１を捕捉した抑制培養からのＢ細胞において、ＲＮＡ−ｓｅｑ転写解析を実施した。抑制培養と抑制＋ＩＬ−２１培養とを対比して、Ｂ細胞機能遺伝子を評価する（図２Ｇにおけるように）と、個々のＩｇＧアイソタイプ（Ｉｇｈｇ１、Ｉｇｈｇ２ｃ、Ｉｇｈｇ２ｂ、Ｉｇｈａ）の転写物のみが、ＩＬ−２１の添加により有意なアップレギュレーションの証拠を示した（図１１Ｈ）。１２の遺伝子のみが、抑制培養からのＢ細胞と「ＩＬ−２１救済」培養からのＢ細胞との対比において、また抑制培養からのＢ細胞と活性化培養からのＢ細胞との対比においても、発現変動され、それらの遺伝子のうち、Ｉｇｈｇ１及びＩｇｈｇ２ｃのみがＩＬ−２１で「救済された」（図３１）。興味深いことに、ＴＦＲ抑制中に最も抑制された３つのＢ細胞機能遺伝子Ａｉｃｄａ、Ｘｂｐ１及びＰｏｕ２ａｆ１は、ＩＬ−２１による救済のいずれの証拠も示さなかった。Ａｉｃｄａ及びＰｏｕ２ａｆ１の場合、これはＴＦＲ細胞によるそれらの遺伝子座のエピジェネティック修飾のせいである可能性があるが、このことは直性試験しなかった。
【０１９４】
次に、解糖以外の代謝経路が転写において救済されうるかを特定した。我々のＲＮＡ−ｓｅｑ試料においてｓｓＧＳＥＡを実施し、ＩＬ−２１の添加による多くの代謝経路の一部の救済の証拠が見られた（図１１Ｉ）。従って、ＩＬ−２１は、Ｂ細胞、並びに代謝経路を刺激することにより、ＴＦＲ抑制を克服する。
【０１９５】
ＩＬ−２１がＢ細胞に直接作用することにより抗体産生を回復させたかを特定した。ＩＬ−２１の受容体を欠くＢ細胞（Ｉｌ２１ｒ−／−）を用いて、抑制アッセイを実施した。ベースライン抗体応答は、ＴＦＨ細胞とのＩｌ２１ｒ＋／＋Ｂ細胞の培養よりも、ＴＦＨ細胞とのＩｌ２１ｒ−／−Ｂ細胞の培養において低かったが、ＩＬ−２１の添加によって抑制培養での抗体応答が回復した証拠は全く見られなかった（図３２）。ＩＬ−２１Ｒの欠損は、ＩＬ−２１の添加後の抑制培養で観察されるＢ細胞の数の増加を無効にしなかったが、ＣＳＲ及びＧｌｕｔ１発現の回復を妨げた（図４０Ａ〜図４０Ｃ）。ＧＬ７のアップレギュレーションはＢ細胞活性化の頑強な指標であるため、Ｉｌ２１ｒ＋／＋Ｂ細胞又はＩｌ２１ｒ−／−Ｂ細胞のいずれかを含む、ＩＬ−２１を捕捉された抑制培養におけるその発現を比較した。Ｉｌ２１ｒ＋／＋Ｂ細胞が存在する場合、ＩＬ−２１はＧＬ７発現を回復させたが、Ｉｌ２１ｒ−／−Ｂ細胞が存在する場合は回復させず（図３３及び３４）、これは、ＩＬ−２１を介したＢ細胞内へのシグナリングが、Ｂ細胞活性化の回復に不可欠であることを示唆した。
【０１９６】
ＩＬ−２１は、抑制培養において、ＴＦＨ、Ｂ又はＴＦＲ細胞に影響している可能性があるため、抑制された代謝の救済が、Ｂ細胞を刺激する及び（ＴＦＲ細胞に直接作用することにより）ＴＦＲ抑制を阻害することの組合せ効果によるものであるかを特定した。ＩＬ−２１を添加した又は添加しなかった抑制培養からのＴＦＲ細胞を解析すると、ＩＬ−２１を含有する培養でのＴＦＲ細胞がかなり少ない細胞内Ｋｉ６７染色を有していたことが分かり、これは、ＩＬ−２１が添加されたＴＦＲ細胞において細胞周期の回転(cell cycling)が阻害されることを示唆する（図１１Ｊ）。ＩＬ−２の不在下よりも、ＩＬ−２１の存在下でのＴＦＲ細胞において、Ｇｌｕｔ１発現が高く（図３５）、それは、ＩＬ−２１が、ＴＦＲ細胞の代謝、並びにそれらの活性化を変化させることができることを示唆した。従って、Ｂ細胞及びＴＦＨ細胞のＴＦＲ細胞抑制のＩＬ−２１救済は、Ｂ細胞の修飾、並びにＴＦＲ細胞を阻害することの結果である。
【０１９７】
参照による組み込み
この中で言及されている全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各刊行物、特許、又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的に及び個別的に指摘されているかのように、参照によりその全てが組み込まれる。矛盾する場合、この中の任意の定義を含めて、本出願が制御するであろう。
【０１９８】
等価物
当業者は、単にルーチン実験を用いて、この中に記載されている具体的な実施形態の多くの等価物を認識し、又は確認することができる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図されている。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【国際調査報告】
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