(57)【要約】  新規の抗ＤＬＬ３抗体および抗体薬物コンジュゲートならびに抗ＤＬＬ３抗体および抗体薬物コンジュゲートを使用してがんを治療する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
３００ポイントスケール上の少なくとも９０のＤＬＬ３  Ｈスコアおよび／または≧１０％陽性染色ＤＬＬ３細胞を示す腫瘍を有する対象を治療する方法であって、ＤＬＬ３  ＡＤＣを投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
ＤＬＬ３  ＡＤＣが、ＰＢＤ、カリケアマイシン、オーリスタチン、メイタンシノイドおよびデュオカルマイシンからなる群から選択される細胞毒を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞毒がＰＢＤを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＰＢＤがＰＢＤ１を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＤＬＬ３を発現する腫瘍開始細胞に結合するＤＬＬ３  ＡＤＣを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＤＬＬ３  ＡＤＣが、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒト抗体もしくはヒト化抗体またはそれらの断片である抗体を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
抗体が内在化抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
腫瘍が３００ポイントスケール上の少なくとも１２０のＤＬＬ３  Ｈスコアを示す、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
腫瘍が、３００ポイントスケール上の少なくとも１８０のＤＬＬ３  Ｈスコアを示す、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
腫瘍が、神経内分泌腫瘍を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
腫瘍が、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）腫瘍を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍が、大細胞神経内分泌がん（ＬＣＮＥＣ）腫瘍を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍が、甲状腺髄様がん腫瘍を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
対象が、０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗｘ３投与レジメンを含むＤＬＬ３  ＡＤＣレジメンにより治療される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
対象が、０．３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ６Ｗｘ２投与レジメンを含むＤＬＬ３  ＡＤＣレジメンにより治療される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ＤＬＬ３  ＡＤＣレジメンの後、対象が進行時に治療される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＤＬＬ３  ＡＤＣレジメンの後、対象がＤＬＬ３  ＡＤＣ維持療法に移行する、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１８】
対象が、フロントライン患者である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
対象が、セカンドライン患者である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
対象が、サードライン患者である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ＤＬＬ３  ＡＤＣがＳＣ１６ＬＤ．５を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ＤＬＬ３  ＡＤＣが、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１ＤＬ６を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
腫瘍を有する対象を治療する方法であって、
腫瘍の試料を得る工程、
腫瘍試料を調査して、ＤＬＬ３  Ｈスコアを計算するおよび／または陽性染色ＤＬＬ３細胞のパーセンテージを決定する工程、
計算されたＤＬＬ３  Ｈスコアが、３００ポイントスケール上の少なくとも９０である、および／または陽性染色ＤＬＬ３細胞が、腫瘍細胞の≧１０％を含む場合に、患者をＤＬＬ３  ＡＤＣにより治療する工程
を含む、方法。
【請求項２４】
調査する工程が、免疫組織化学を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
式：Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎの抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）またはそれらの医薬として許容される塩を含む凍結乾燥組成物であって、
Ａｂが抗ＤＬＬ３抗体を含み、
Ｌが任意選択のリンカーを含み、
Ｄが薬物を含み、
ｎが１〜２０の整数である、
凍結乾燥組成物。
【請求項２６】
ＤがＰＢＤを含む、請求項２５に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項２７】
医薬として許容される糖をさらに含む、請求項２５に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項２８】
ＡＤＣが、ＳＣ１６ＬＤ６．５を含む、請求項２６に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項２９】
ＡＤＣが、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１ＤＬ６を含む、請求項２６に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項３０】
請求項２５に記載の組成物を含む、ＤＬＬ３関連障害を診断または治療するために有用な製品。
【請求項３１】
がんを治療する方法であって、
請求項２５に記載の凍結乾燥組成物を再構成して、液体医薬組成物を得る工程、および
液体医薬組成物を、がんの治療を必要とする対象に投与する工程
を含む、方法。
【請求項３２】
がんが神経内分泌の特徴を示す腫瘍を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
がんが神経内分泌腫瘍を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
がんが小細胞肺がんを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
がんが大細胞神経内分泌がんを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
凍結乾燥ＤＬＬ３  ＡＤＣを含むレセプタクルを含み、ＤＬＬ３関連障害を治療または診断するのに製品を使用するための取扱説明資料を伴う、ＤＬＬ３関連障害を治療または治療するのに有用な製品。
【請求項３７】
ＤＬＬ３  ＡＤＣがＰＢＤを含む、請求項３６に記載の製品。
【請求項３８】
腫瘍を有する対象を治療する方法であって、約６日を超える終末相半減期を有するＤＬＬ３  ＡＤＣを投与する工程を含む、方法。
【請求項３９】
ＤＬＬ３  ＡＤＣが約７日を超える終末相半減期を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＤＬＬ３  ＡＤＣが約８日を超える終末相半減期を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
ＤＬＬ３  ＡＤＣが約９日を超える終末相半減期を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
ＤＬＬ３  ＡＤＣが約１０日を超える終末相半減期を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
ＤＬＬ３  ＡＤＣがＰＢＤ、カリケアマイシン、オーリスタチン、メイタンシノイドおよびデュオカルマイシンからなる群から選択される細胞毒を含む、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
細胞毒がＰＢＤを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ＰＢＤがＰＢＤ１を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ＤＬＬ３  ＡＤＣが、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒト抗体もしくはヒト化抗体またはそれらの断片である抗体を含む、請求項３８〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
抗体が内在化抗体である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
腫瘍が、神経内分泌の特徴を示す腫瘍を含む、請求項３８〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
腫瘍が、神経内分泌腫瘍を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
腫瘍が、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）腫瘍を含む、請求項３８〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
腫瘍が、大細胞神経内分泌がん（ＬＣＮＥＣ）腫瘍を含む、請求項３８〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
対象が０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗ投与レジメンを含むＤＬＬ３  ＡＤＣレジメンにより治療される、請求項３８〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
対象が、０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗｘ３投与レジメンを含むＤＬＬ３  ＡＤＣレジメンにより治療される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
対象が０．３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ６Ｗ投与レジメンを含むＤＬＬ３  ＡＤＣレジメンにより治療される、請求項３８〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
対象が０．３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ６Ｗｘ２投与レジメンを含むＤＬＬ３  ＡＤＣレジメンにより治療される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ＤＬＬ３  ＡＤＣレジメンの後、対象が進行時に治療される、請求項５２〜５５に記載の方法。
【請求項５７】
ＤＬＬ３  ＡＤＣレジメンの後、対象がＤＬＬ３  ＡＤＣ維持療法に移行する、請求項５２〜５５に記載の方法。
【請求項５８】
対象が、フロントライン患者である、請求項３８〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
対象が、セカンドライン患者である、請求項３８〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
対象が、サードライン患者である、請求項３８〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
ＤＬＬ３  ＡＤＣが、ＳＣ１６ＬＤ．５を含む、請求項３８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
ＤＬＬ３  ＡＤＣが、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１ＤＬ６を含む、請求項３８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
約６日を超える終末相半減期を有するＤＬＬ３  ＡＤＣを投与する工程を含む、がん幹細胞の頻度の減少を必要とする対象におけるがん幹細胞の頻度を減少させる方法。
【請求項６４】
以下の式
【化１】
2018529656.tif 000039
（式中、Ａｂは、抗ＤＬＬ３抗体またはその免疫反応性断片を含む）
を含むＤＬＬ３  ＡＤＣ。
【請求項６５】
抗ＤＬＬ３抗体が、部位特異的抗体を含む、請求項６４に記載のＤＬＬ３  ＡＤＣ。
【請求項６６】
抗ＤＬＬ３抗体が、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１である、請求項６４に記載のＤＬＬ３  ＡＤＣ。
【請求項６７】
ＤＬＬ３  ＡＤＣおよび抗ＰＤ−１抗体を投与する工程を含む、がん幹細胞の頻度の減少を必要とする対象におけるがん幹細胞の頻度を減少させる方法。
【請求項６８】
ＤＬＬ３  ＡＤＣがＳＣ１６ＬＤ５を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
ＤＬＬ３  ＡＤＣが、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１ＤＬ６を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
ＤＬＬ３  ＡＤＣおよび抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与する工程を含む、がん幹細胞の頻度の減少を必要とする対象におけるがん幹細胞の頻度を減少させる方法。
【請求項７１】
ＤＬＬ３  ＡＤＣがＳＣ１６ＬＤ５を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
ＤＬＬ３  ＡＤＣがｈＳＣ１６．５６ｓｓ１ＤＬ６を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
ＤＬＬ３  ＡＤＣおよび抗ＰＤ−１抗体を投与する工程を含む、がんの治療を必要とする対象におけるがんを治療する方法。
【請求項７４】
ＤＬＬ３  ＡＤＣが、ＳＣ１６ＬＤ５を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
ＤＬＬ３  ＡＤＣが、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１ＤＬ６を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
ＤＬＬ３  ＡＤＣおよび抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与する工程を含む、がんの治療を必要とする対象におけるがんを治療する方法。
【請求項７７】
ＤＬＬ３  ＡＤＣがＳＣ１６ＬＤ５を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
ＤＬＬ３  ＡＤＣがｈＳＣ１６．５６ｓｓ１ＤＬ６を含む、請求項７６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１５年８月２０日に出願された米国仮出願第６２／２０７，８３０号、２０１６年４月１８日に出願された米国仮出願第６２／３２３，９９８号および２０１６年８月１１日に出願された米国仮出願第６２／３７３，９０６号の利益を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩの写しは、２０１６年８月８日に作成され、ｓｃ１６０７＿ｐ３＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿０８０８２０１６と名付けられ、大きさが５９１ＫＢ（６０５，５２１バイト）である。
【０００３】
発明の分野
本出願は、一般に、がんおよびがんの再発または転移の治療、診断または予防のための、新規の化合物および組成物、ならびに抗ＤＬＬ３抗体またはこの免疫反応性断片、例えばそれを含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を、投与する方法に関する。本発明の選択された実施形態は、腫瘍形成性細胞の出現頻度の減少を含むがんの治療のための、このような抗ＤＬＬ３抗体または抗体薬物コンジュゲートの投与を提供する。
【背景技術】
【０００４】
幹細胞および始原細胞の分化および増殖は、器官形成、細胞修復および細胞置換の間の組織成長を支援するために協調して働く通常の進行プロセスである。この機構は、生物の必要性に基づいて適切なシグナルのみが生成されることが確実となるように厳しく制御されている。細胞増殖および分化は、通常、損傷のある細胞もしくは瀕死の細胞の交替のためまたは成長のために必要なときにのみ生じる。しかしながら、これらのプロセスの破壊は、様々なシグナル伝達化学物質の過小な量もしくは過剰な量、微小環境の変化の存在、遺伝子変異またはそれらの組合せなどの、多くの要因によって引き起こされ得る。正常な細胞の増殖および／または分化の撹乱は、様々な障害、例えばがんのような増殖性疾患をもたらし得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
がんに対する従来の治療療法としては、化学療法、放射線療法および免疫療法が含まれる。これらの治療は効果を奏しないことも多く、外科的切除は有効な臨床的代替手段を提供しない場合がある。現行の標準治療の限界は、第１選択治療を行った後に再発した患者の場合に特に明白である。このような場合に、不応性腫瘍は、侵襲性で不治であることが多く、頻繁に発生する。多くの固形腫瘍の全体的な生存率は、長年にわたり大きく変化しておらず、少なくともこの原因の１部は、既存の治療法が、再発（ｒｅｌａｐｓｅ）、腫瘍の再発（ｔｕｍｏｒ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）および転移を防ぎそこなっていることによる。したがって、増殖性障害に対するより標的化された効能の高い治療法を開発することが依然として強く必要とされている。本発明は、この必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
広い態様において、本発明は、ヒトＤＬＬ３決定因子に特異的に結合する、単離抗体および／または対応する抗体薬物コンジュゲートを含む新規の化合物および組成物を提供する。特定の実施形態において、ＤＬＬ３決定因子は、腫瘍細胞上に発現するＤＬＬ３タンパク質であるが、他の実施形態において、ＤＬＬ３決定因子は、腫瘍開始細胞上に発現する。選択された態様において、ＤＬＬ３  ＡＤＣ組成物は、凍結乾燥組成物を含む。他の態様において、本発明は、とりわけ有効な投与レジメンおよび本明細書で示すように同定された特定の患者部分集団の投与を含む、開示する化合物または組成物を投与する新規の方法を提供する。下記にさらに詳細に記載するように、患者選択および患者投与に関して開示する方法論がとりわけ効果的であることを、少なくとも一部は、得られる好ましい治療指数および治療感受性集団に基づいて、証明することができる。さらに他の実施形態において、本発明は、ＤＬＬ３  ＡＤＣと、とりわけ効果的であると思われる、チェックポイント阻害剤を含む免疫療法化合物との組合せを含む、特定の治療レジメンを提供する。
【０００７】
選択された態様において、本発明の抗体は、ＤＬＬ３タンパク質に結合し、ヒトＤＬＬ３タンパク質上のエピトープに結合する参照抗体と結合について競合する。特定の実施形態において、本発明は、ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣを含み、抗体またはＡＤＣ結合ドメインは、ヒトＤＬＬ３（ｈＤＬＬ３）に特異的に結合し、以下のものを含むかまたは以下のものを含む抗体と結合について競合する：配列番号２１の軽鎖可変領域（ＶＬ）および配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）；または配列番号２５のＶＬおよび配列番号２７のＶＨ；または配列番号２９のＶＬおよび配列番号３１のＶＨ；または配列番号３３のＶＬおよび配列番号３５のＶＨ；または配列番号３７のＶＬおよび配列番号３９のＶＨ；または配列番号４１のＶＬおよび配列番号４３のＶＨ；または配列番号４５のＶＬおよび配列番号４７のＶＨ；または配列番号４９のＶＬおよび配列番号５１のＶＨ；または配列番号５３のＶＬおよび配列番号５５のＶＨ；または配列番号５７のＶＬおよび配列番号５９のＶＨ；または配列番号６１のＶＬおよび配列番号６３のＶＨ；または配列番号６５のＶＬおよび配列番号６７のＶＨ；または配列番号６９のＶＬおよび配列番号７１のＶＨ；または配列番号７３のＶＬおよび配列番号７５のＶＨ；または配列番号７７のＶＬおよび配列番号７９のＶＨ；または配列番号８１のＶＬおよび配列番号８３のＶＨ；または配列番号８５のＶＬおよび配列番号８７のＶＨ；または配列番号８９のＶＬおよび配列番号９１のＶＨ；または配列番号９３のＶＬおよび配列番号９５のＶＨ；または配列番号９７のＶＬおよび配列番号９９のＶＨ；または配列番号１０１のＶＬおよび配列番号１０３のＶＨ；または番号１０５のＶＬ配列および配列番号１０７のＶＨ；または配列番号１０９のＶＬおよび配列番号１１１のＶＨ；または配列番号１１３のＶＬおよび配列番号１１５のＶＨ；または配列番号１１７のＶＬおよび配列番号１１９のＶＨ；または配列番号１２１のＶＬおよび配列番号１２３のＶＨ；または配列番号１２５のＶＬおよび配列番号１２７のＶＨ；または配列番号１２９のＶＬおよび配列番号１３１のＶＨ；または配列番号１３３のＶＬおよび配列番号１３５のＶＨ；または配列番号１３７のＶＬおよび配列番号１３９のＶＨ；または配列番号１４１のＶＬおよび配列番号１４３のＶＨ；または配列番号１４５のＶＬおよび配列番号１４７のＶＨ；または配列番号１４９のＶＬおよび配列番号１５１のＶＨ；  または配列番号１５３のＶＬおよび配列番号１５５のＶＨ；または配列番号１５７のＶＬおよび配列番号１５９のＶＨ；または配列番号１６１のＶＬおよび配列番号１６３のＶＨ；または配列番号１６５のＶＬおよび配列番号１６７のＶＨ；または配列番号１６９のＶＬおよび配列番号１７１のＶＨ；または配列番号１７３のＶＬおよび配列番号１７５のＶＨ；または配列番号１７７のＶＬおよび配列番号１７９のＶＨ；または配列番号１８１のＶＬおよび配列番号１８３のＶＨ；または配列番号１８５のＶＬおよび配列番号１８７のＶＨ；または配列番号１８９のＶＬおよび配列番号１９１のＶＨ；または配列番号１９３のＶＬおよび配列番号１９５のＶＨ；または配列番号１９７のＶＬおよび配列番号１９９のＶ���；または配列番号２０１のＶＬおよび配列番号２０３のＶＨ；または配列番号２０５のＶＬおよび配列番号２０７のＶＨ；または配列番号２０９のＶＬおよび配列番号２１１のＶＨ；または配列番号２１３のＶＬおよび配列番号２１５のＶＨ；または配列番号２１７のＶＬおよび配列番号２１９のＶＨ；または配列番号２２１のＶＬおよび配列番号２２３のＶＨ；または配列番号２２５のＶＬおよび配列番号２２７のＶＨ；または配列番号２２９のＶＬおよび配列番号２３１のＶＨ；または配列番号２３３のＶＬおよび配列番号２３５のＶＨ；または配列番号２３７のＶＬおよび配列番号２３９のＶＨ；または配列番号２４１のＶＬおよび配列番号２４３のＶＨ；または配列番号２４５のＶＬおよび配列番号２４７のＶＨ；または配列番号２４９のＶＬおよび配列番号２５１のＶＨ；または配列番号２５３のＶＬおよび配列番号２５５のＶＨ；または配列番号２５７のＶＬおよび配列番号２５９のＶＨ；または配列番号２６１のＶＬおよび配列番号２６３のＶＨ；または配列番号２６５のＶＬおよび配列番号２６７のＶＨ；または配列番号２６９のＶＬおよび配列番号２７１のＶＨ；または配列番号２７３のＶＬおよび配列番号２７５のＶＨ；または配列番号２７７のＶＬおよび配列番号２７９のＶＨ；または配列番号２８１のＶＬおよび配列番号２８３のＶＨ；または配列番号２８５のＶＬおよび配列番号２８７のＶＨ；または配列番号２８９のＶＬおよび配列番号２９１のＶＨ；または配列番号２９３のＶＬおよび配列番号２９５のＶＨ；または配列番号２９７のＶＬおよび配列番号２９９のＶＨ；または配列番号３０１のＶＬおよび配列番号３０３のＶＨ；または配列番号３０５のＶＬおよび配列番号３０７のＶＨ；または配列番号３０９のＶＬおよび配列番号３１１のＶＨ；または配列番号３１３のＶＬおよび配列番号３１５のＶＨ；または配列番号３１７のＶＬおよび配列番号３１９のＶＨ；または配列番号３２１のＶＬおよび配列番号３２３のＶＨ；または配列番号３２５のＶＬおよび配列番号３２７のＶＨ；または配列番号３２９のＶＬおよび配列番号３３１のＶＨ；または配列番号３３３のＶＬおよび配列番号３３５のＶＨ；または配列番号３３７のＶＬおよび配列番号３３９のＶＨ；または配列番号３４１のＶＬおよび配列番号３４３のＶＨ；または配列番号３４５のＶＬおよび配列番号３４７のＶＨ；または配列番号３４９のＶＬおよび配列番号３５１のＶＨ；または配列番号３５３のＶＬおよび配列番号３５５のＶＨ；または配列番号３５７のＶＬおよび配列番号３５９のＶＨ；または配列番号３６１のＶＬおよび配列番号３６３のＶＨ；または配列番号３６５のＶＬおよび配列番号３６７のＶＨ；または配列番号３６９のＶＬおよび配列番号３７１のＶＨ；または配列番号３７３のＶＬおよび配列番号３７５のＶＨ；または配列番号３７７のＶＬおよび配列番号３７９のＶＨ；または配列番号３８１のＶＬおよび配列番号３８３のＶＨ；または配列番号３８５のＶＬおよび配列番号３８７のＶＨ；または配列番号３８９のＶＬおよび配列番号３９１のＶＨ；または配列番号３９３のＶＬおよび配列番号３９５のＶＨ；または配列番号３９７のＶＬおよび配列番号３９９のＶＨ；または配列番号４０１のＶＬ���よび配列番号４０３のＶＨ；または配列番号４０５のＶＬおよび配列番号４０７のＶＨ。一態様において、本発明は、本発明の抗ＤＬＬ３抗体またはその免疫反応性断片をコードする核酸を含む。他の実施形態において、本発明は、上記核酸の１つ以上を含むベクターおよび／または前記ベクターを含む宿主細胞を含む。
【０００８】
本発明のいくつかの態様において、抗体は、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体もしくはヒト抗体またはそれらの免疫反応性断片を含む。本発明の他の態様において、好ましくは前述の配列の全てまたは一部を含む、抗体は、内在化抗体である。さらに他の実施形態において、抗体は、部位特異的抗体を含む。他の選択された実施形態において、本発明は、前述の抗体のいずれかを組み込んだ抗体薬物コンジュゲートを含む。
【０００９】
特定の実施形態において、本発明は、式：Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎ（式中、Ａｂは、抗ＤＬＬ３抗体を含み、Ｌは、任意選択のリンカーを含み、Ｄは、薬物を含み、ｎは、１から２０の整数である）の抗体薬物コンジュゲートまたはそれらの医薬として許容される塩を含む。一態様において、本発明のＡＤＣは、上記の抗ＤＬＬ３抗体のような抗ＤＬＬ３抗体またはこの免疫反応性断片を含む。他の実施形態において、本発明のＡＤＣは、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、オーリスタチン、デュオカルマイシン、メイタンシノイドまたは本明細書に記載の適合治療成分のいずれか１つから選択される細胞毒性化合物を含む。特定の実施形態において、本発明は、上記のＡＤＣを含む医薬組成物を含む。
【００１０】
さらに他の選択された実施形態において、本発明のＡＤＣは、治療指数の増加をもたらし、投与レジメンの最適化を可能にする改善された薬物動態特性および薬力学的特性を有する。この点に関して、本開示のＡＤＣは、本明細書で示すように測定する場合、６日を超える終末相半減期、７日より長い終末相半減期または８日より長い終末相半減期を有する。本発明のさらに他の態様は、９日より長い終末相半減期、１０日より長い終末相半減期、１１日より長い終末相半減期、１２日より長い終末相半減期（それぞれヒト対象において測定された場合）を有するＡＤＣを含む。さらに他の実施形態において、本開示のＡＤＣは、ヒト対象において１３日より長い終末相半減期、約１４日より長い終末相半減期、１５日より長い終末相半減期、約１６日より長い終末相半減期、約１７日より長い終末相半減期、１８日より長い終末相半減期、約１９日より長い終末相半減期、約２０日より長い終末相半減期または３週間より長い終末相半減期を有する。さらに他の実施形態において、本発明のＡＤＣは、約６日の終末相半減期、約７日の終末相半減期、約８日の終末相半減期、約９日の終末相半減期、約１０日の終末相半減期、約１１日の終末相半減期、約１２日の終末相半減期、約１３日の終末相半減期、約１４日の終末相半減期、約１５日の終末相半減期、約１６日の終末相半減期、約１７日の終末相半減期、約１８日の終末相半減期、約１９日の終末相半減期、約２０日の終末相半減期または約３週間の終末相半減期を示す。当業者は、このような長い半減期が、本開示のＡＤＣのより低い頻度の投与を可能にし、これにより、同様のまたは低い毒性を示しながら所望の有効性をもたらすことを十分理解する。
【００１１】
この目的を達成するために、本発明の他の態様は、本明細書に記載されたような医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、がんの治療方法を対象とする。選択された実施形態において、該方法は、約６日より長い終末相半減期、約７日より長い終末相半減期、約８日より長い終末相半減期、約９日より長い終末相半減期、約１０日より長い終末相半減期、約１１日より長い終末相半減期、約１２日より長い終末相半減期、約１３日より長い終末相半減期、約１４日より長い終末相半減期、約１５日より長い終末相半減期、約１６日より長い終末相半減期、約１７日より長い終末相半減期、約１８日より長い終末相半減期、約１９日より長い終末相半減期、約２０日より長い終末相半減期または約３週間より長い終末相半減期を有するＡＤＣを投与することを含む。
【００１２】
他の特定の実施形態において、がんは、固形腫瘍、例えば、限定されないが、副腎、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、子宮頚部、子宮、食道、結腸直腸、前立腺、膵臓、肺（小細胞および非小細胞の両方を含む）、甲状腺、癌腫、肉腫、神経膠芽腫および様々な頭頚部の腫瘍を含む。他の選択された態様において、がんは、肺がん（小細胞がんまたは大細胞神経内分泌癌）、前立腺がん、結腸直腸がんおよびメラノーマのような皮膚がん（例えば、野生型または変異型ＢＲＡＦを発現する皮膚がん）を含む群から選択される。いくつかの実施形態において、上述のがんを治療する方法は、本開示の医薬組成物に加えて少なくとも１つの追加の治療成分を対象に投与することを含む。好ましい態様において、追加の治療成分は、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む。
【００１３】
上述の方法に関して、特定の実施形態において、本発明は、がんの治療に用いる抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートを提供するものであって、治療は、抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲート（ＤＬＬ３  ＡＤＣ）の有効量を１週間毎（ＱＷ）に少なくとも１回、２週間毎（Ｑ２Ｗ）に少なくとも１回、３週間毎（Ｑ３Ｗ）に少なくとも１回、４週間毎（Ｑ４Ｗ）に少なくとも１回、５週間毎（Ｑ５Ｗ）に少なくとも１回、６週間毎（Ｑ６Ｗ）に少なくとも１回、７週間毎（Ｑ７Ｗ）に少なくとも１回、８週間毎（Ｑ８Ｗ）に少なくとも１回、９週間毎（Ｑ９Ｗ）に少なくとも１回、１０週間毎（Ｑ１０Ｗ）に少なくとも１回、１１週間毎（Ｑ１１Ｗ）に少なくとも１回または１２週間毎（Ｑ１２Ｗ）に少なくとも１回投与することを含み得る。選択された実施形態において、ＤＬＬ３  ＡＤＣは３週間毎（Ｑ３Ｗ）に少なくとも１回、４週間毎（Ｑ４Ｗ）に少なくとも１回、５週間毎（Ｑ５Ｗ）に少なくとも１回または６週間毎（Ｑ６Ｗ）に少なくとも１回投与される。他の選択された実施形態において、ＤＬＬ３  ＡＤＣは約０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０７５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇまたは１．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。選択された実施形態は、ＤＬＬ３  ＡＤＣの単回投与により患者を治療することを含む。特定の他の実施形態は、規定の間隔（すなわち、Ｑ２Ｗ、Ｑ３Ｗ、Ｑ４Ｗ、Ｑ５Ｗ、Ｑ６Ｗなど）で２サイクル（ｘ２）、３サイクル（ｘ３）、４サイクル（ｘ４）、５サイクル（ｘ５）、６サイクル（ｘ６）、７サイクル（ｘ７）、８サイクル（ｘ８）、９サイクル（ｘ９）または１０サイクル（ｘ１０）患者を治療することを含む。他の実施形態において、初期ＤＬＬ３  ＡＤＣ治療（ｘサイクル数の治療）を完了させることができ、がんが進行の徴候を示すまでさらなるＤＬＬ３  ＡＤＣ治療は、行われない（進行時治療）。さらに他の実施形態において、初期ＤＬＬ３  ＡＤＣ治療（ｘサイクル数の治療）を完了させることができ、次いで患者を維持療法（例えば、無期限に０．１ｍｇ／ｋｇ  ＤＬＬ３  ＡＤＣ  Ｑ６Ｗ）のもとにおく。このような維持の状況において、ＤＬＬ３  ＡＤＣは、蠕動ポンプを介して持続または定期（例えば、１時間毎）注入として比較的低いレベルで投与することができる。さらに他の実施形態において、患者は、初期ＤＬＬ３  ＡＤＣ治療（ｘサイクル数の治療）を受け、進行するまで同じがんまたは関連するがんについての（本開示のＡＤＣによるまたは他剤による）治療をされない（すなわち、進行時治療）。このような場合、第２の治療サイクル（例えば、ＤＬＬ３  ＡＤＣによる）は、最初の治療サイクルの終了の４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６週後またはそれ以上の週数の後まで実施されない。
【００１４】
一実施形態において、本発明は、腫瘍細胞集団中の腫瘍開始細胞を減少させる方法であって、腫瘍開始細胞集団を本明細書に記載のＡＤＣと（例えば、インビトロまたはインビボで）接触させることを含み、それによって腫瘍開始細胞の出現頻度を減少させる、方法を含む。
【００１５】
一態様において、本発明は、細胞毒を細胞に送達する方法であって、細胞を上記ＡＤＣのいずれかと接触させることを含む、方法を含む。
【００１６】
他の態様において、本発明は、対象におけるがん（例えば、肺がん、前立腺がんまたはメラノーマ）を検出、診断またはモニタリングする方法であって、腫瘍細胞をＤＬＬ３検出剤と（例えば、インビトロまたはインビボで）接触させることおよび腫瘍細胞と会合したＤＬＬ３検出剤を検出することを含む、方法を含む。選択された実施形態において、検出剤は、抗ＤＬＬ３抗体またはＤＬＬ３遺伝子型決定因子と関連する核酸プローブを含む。関連実施形態において、診断方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）またはインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を含む。
【００１７】
この目的を達成するために、本発明の特定の態様が、免疫組織化学のためのＤＬＬ３抗体の使用を含むことが理解される。より詳細には、ＤＬＬ３  ＩＨＣは、様々な増殖性障害の診断の助けとなり、ＤＬＬ３抗体療法を含む治療に対する潜在的な反応をモニタリングするための診断ツールとして用いることができる。これに関して、また下記の実施例で示すように、免疫組織化学手法は、当該技術分野で公知のようにＨスコアを得るために用いることができる。このようなＨスコア（すなわち、３００ポイントスケール上の９０およびそれ以上）は、どの患者が本発明の組成物による治療に適し得るかを示すために用いることができ、さらに治療の決定に対する道筋を立て、投与レジメンおよびタイミングを決定するために使用され得る。他の実施形態において、腫瘍における陽性染色ＤＬＬ３細胞のパーセンテージは、どの患者が本開示のＤＬＬ３  ＡＤＣによる治療に対して感受性であり得るかを示すために用いることができる。
【００１８】
同様に、本発明は、がんのようなＤＬＬ３関連障害の診断、モニタリングまたは治療に有用であるキットまたは装置および関連する方法も提供する。この目的を達成するために、本発明は、好ましくは、ＤＬＬ３  ＡＤＣを含むレセプタクルおよびＤＬＬ３関連障害を治療、モニタリング、または診断するのに前記ＤＬＬ３  ＡＤＣを使用するための取扱説明資料を含む、ＤＬＬ３関連障害を検出、診断または治療するのに有用な製品を提供する。選択された実施形態において、装置および関連する方法は、少なくとも１つの循環する腫瘍細胞を接触させることを含む。他の実施形態において、本開示のキットは、キットまたは装置がＤＬＬ３に関連するがんの診断、モニタリングまたは治療のために用いられることを示す取扱説明書、ラベル、添付文書、読本などを含む。
【００１９】
上記は概要であり、したがって、必要により、単純化、一般化および詳細の省略を含む。結果として、当業者は、概要が例示にすぎず、決して限定を意図していないことを理解する。本明細書に記載の方法、組成物および／または装置および／または他の主題の他の態様、特徴および利点は、本明細書に記載の教示から明らかになる。概要は、以下で詳細な説明においてさらに説明される単純化された形態の概念の選択を紹介するために提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ−１】本明細書における実施例に記載されるように単離され、クローニングされ、遺伝子操作された、本開示のＤＬＬ３  ＡＤＣと適合する多数の例示的マウスおよびヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域の表形式の連続したアミノ酸配列（配列番号：２１−４０５；奇数）を示す図である。
【図１Ａ−２】本明細書における実施例に記載されるように単離され、クローニングされ、遺伝子操作された、本開示のＤＬＬ３  ＡＤＣと適合する多数の例示的マウスおよびヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域の表形式の連続したアミノ酸配列（配列番号：２１−４０５；奇数）を示す図である。
【図１Ａ−３】本明細書における実施例に記載されるように単離され、クローニングされ、遺伝子操作された、本開示のＤＬＬ３  ＡＤＣと適合する多数の例示的マウスおよびヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域の表形式の連続したアミノ酸配列（配列番号：２１−４０５；奇数）を示す図である。
【図１Ａ−４】本明細書における実施例に記載されるように単離され、クローニングされ、遺伝子操作された、本開示のＤＬＬ３  ＡＤＣと適合する多数の例示的マウスおよびヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域の表形式の連続したアミノ酸配列（配列番号：２１−４０５；奇数）を示す図である。
【図１Ａ−５】本明細書における実施例に記載されるように単離され、クローニングされ、遺伝子操作された、本開示のＤＬＬ３  ＡＤＣと適合する多数の例示的マウスおよびヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域の表形式の連続したアミノ酸配列（配列番号：２１−４０５；奇数）を示す図である。
【図１Ａ−６】本明細書における実施例に記載されるように単離され、クローニングされ、遺伝子操作された、本開示のＤＬＬ３  ＡＤＣと適合する多数の例示的マウスおよびヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域の表形式の連続したアミノ酸配列（配列番号：２１−４０５；奇数）を示す図である。
【図１Ｂ−１】本明細書における実施例に記載されるように単離され、クローニングされ、遺伝子操作された、本開示のＤＬＬ３  ＡＤＣと適合する多数の例示的マウスおよびヒト化ＤＬＬ３抗体の重鎖可変領域の表形式の連続したアミノ酸配列（配列番号：２３−４０７；奇数）を示す図である。
【図１Ｂ−２】本明細書における実施例に記載されるように単離され、クローニングされ、遺伝子操作された、本開示のＤＬＬ３  ＡＤＣと適合する多数の例示的マウスおよびヒト化ＤＬＬ３抗体の重鎖可変領域の表形式の連続したアミノ酸配列（配列番号：２３−４０７；奇数）を示す図である。
【図１Ｂ−３】本明細書における実施例に記載されるように単離され、クローニングされ、遺伝子操作された、本開示のＤＬＬ３  ＡＤＣと適合する多数の例示的マウスおよびヒト化ＤＬＬ３抗体の重鎖可変領域の表形式の連続したアミノ酸配列（配列番号：２３−４０７；奇数）を示す図である。
【図１Ｂ−４】本明細書における実施例に記載されるように単離され、クローニングされ、遺伝子操作された、本開示のＤＬＬ３  ＡＤＣと適合する多数の例示的マウスおよびヒト化ＤＬＬ３抗体の重鎖可変領域の表形式の連続したアミノ酸配列（配列番号：２３−４０７；奇数）を示す図である。
【図１Ｂ−５】本明細書における実施例に記載されるように単離され、クローニングされ、遺伝子操作された、本開示のＤＬＬ３  ＡＤＣと適合する多数の例示的マウスおよびヒト化ＤＬＬ３抗体の重鎖可変領域の表形式の連続したアミノ酸配列（配列番号：２３−４０７；奇数）を示す図である。
【図１Ｂ−６】本明細書における実施例に記載されるように単離され、クローニングされ、遺伝子操作された、本開示のＤＬＬ３  ＡＤＣと適合する多数の例示的マウスおよびヒト化ＤＬＬ３抗体の重鎖可変領域の表形式の連続したアミノ酸配列（配列番号：２３−４０７；奇数）を示す図である。
【図２】本明細書における実施例に記載されるように単離され、クローニングされ、遺伝子操作された例示的ＤＬＬ３抗体のドメインレベルマッピング解析の結果を略図の形式で示す図である。
【図３Ａ】ＤＬＬ３発現が標準的治療による療法の臨床転帰と相関しないことを示す免疫組織化学データを示すグラフである。
【図３Ｂ】ＤＬＬ３発現がナイーブおよび化学療法抵抗性ＳＣＬＣ患者の両方において上昇していることを示す免疫組織化学データを示すグラフである。
【図４Ａ】試験設計および結果を要約する、第Ｉ相試験に関するデータを示す図である。
【図４Ｂ】ＤＬＬ３  ＡＤＣの臨床薬物動態を示す、第Ｉ相試験に関するデータを示すグラフである。
【図４Ｃ】ＤＬＬ３  ＡＤＣによってもたらされた反応の持続時間を示す、第Ｉ相試験に関するデータを示す図である。
【図４Ｄ】全ての治療患者の反応を示す、第Ｉ相試験に関するデータを示す図である。
【図４Ｅ】ＤＬＬ３＋陽性患者の反応を示す、第Ｉ相試験に関するデータを示す図である。
【図４Ｆ】報告された有害事象の表形式の要約を示す、第Ｉ相試験に関するデータを示す図である。
【図５Ａ】本開示のＤＬＬ３  ＡＤＣの凍結乾燥実施形態が５℃で安定であることを示す表形式のデータを示す。
【図５Ｂ】本開示のＤＬＬ３  ＡＤＣの凍結乾燥実施形態が２５℃で安定であることを示す表形式のデータを示す。
【図５Ｃ】本開示のＤＬＬ３  ＡＤＣの凍結乾燥実施形態が４０℃で安定であることを示す表形式のデータを示す。
【図６Ａ】併用して投与した場合、ＤＬＬ３  ＡＤＣおよび抗ＰＤ−１抗体が免疫能の正常なマウスにおける腫瘍成長を抑制するように作用することを示すグラフである。
【図６Ｂ】併用して投与した場合、ＤＬＬ３  ＡＤＣおよび抗ＰＤ−１抗体が免疫能の正常なマウスにおける腫瘍成長を抑制するように作用することを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、多くの様々な形態で実施され得る。本明細書には、本発明の原理を例示する本発明の非限定的な説明的実施形態が開示されている。本明細書で使用されるいずれの項目の見出しも、まとめることを目的とするだけのものであり、記載されている主題を限定するものと解釈されるべきでない。本開示の目的に関して、全ての特定されている配列受託番号は、別途記載がない限り、ＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）データベースおよび／またはＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アーカイブ配列データベースで見出され得る。
【００２２】
ＤＬＬ３発現は、驚くべきことに、いくつかの腫瘍型と相関することが見出され、このような腫瘍の治療に、決定因子として利用され得る。さらに、ＤＬＬ３発現が腫瘍形成性細胞に関連していること、したがってこのような細胞の阻害または除去に効果的に利用し得ることが、予想外に見出された。腫瘍形成性細胞は、下記にさらに詳細に記載されるが、従来の多くの治療に耐性を示すことが知られている。先行技術の教唆とは対照的に、本開示の化合物および方法は、この固有の耐性を効果的に克服する。
【００２３】
本発明は、抗ＤＬＬ３抗体（抗体薬物コンジュゲートを含む）を提供し、ならびに、特定の作用機構または特異的に標的化された細胞もしくは分子成分にかかわらず、様々なＤＬＬ３関連がんの予後診断、診断、診断治療、治療および／または予防における、抗ＤＬＬ３抗体の使用を提供する。驚くべきことに、本開示の特定のＤＬＬ３  ＡＤＣが、予想外に強固な治療指数をもたらす新規の投与レジメンを可能にする、インビボでの比較的長い半減期を有することが見出された。さらに、特定のレベルのＤＬＬ３を発現する腫瘍に罹患している患者は、本明細書に添付の臨床試験データにより明らかなように、本抗体およびＡＤＣによる治療に対し、特に感受性が高い。さらに他の実施形態は、腫瘍成長を抑制するのに驚くほど有効であると思われるＰＤ−１に対する抗体を含む、特定の免疫療法化合物と組み合わせた本開示のＤＬＬ３  ＡＤＣの使用を含む。さらに他の実施形態において、本開示のＡＤＣは、凍結乾燥形態において並はずれた安定性を示すことが見出された。このような利点は、一般的に、本開示の組成物のより有効な投与を可能にし、最終的に、標準的治療による療法によってもたらされるよりも良好な患者転帰をもたらすことが理解される。
【００２４】
Ｉ．  ＤＬＬ３生理学
ＤＬＬ３の表現型決定因子が、神経内分泌特性を示す新形成を含む様々な増殖性障害と臨床的に関連すること、ならびにＤＬＬ３タンパク質およびその変異体またはアイソフォームが関連する疾患の治療に利用することができる有用な腫瘍マーカーを提供することが、見出された。これに関して、本発明は、抗ＤＬＬ３抗体標的化剤およびペイロード（例えば、ＰＢＤワーヘッド（ｗａｒｈｅａｄ）を含むペイロード）を含む多数の抗体薬物コンジュゲートを、提供する。下記でより詳細に議論されるようにおよび添付の実施例において示されるように、本開示の抗ＤＬＬ３  ＡＤＣは、腫瘍形成性細胞を除去するのにとりわけ有効であり、したがって、特定の増殖性障害またはその進行もしくは再発の治療および予防に有用である。さらに、特定の本開示のＡＤＣ組成物（例えば、部位特異的構築物）は、同じ成分を含む従来のＡＤＣ組成物と比較した場合に改善された治療指数をもたらし得る比較的高いＤＡＲ＝２パーセンテージおよび予期しない安定性を示し得る。さらに、本開示のＡＤＣは、治療指数をさらに増加させ得る新規投与レジメンの使用を可能にする長い終末相半減期を示し得る。
【００２５】
さらに、細胞表面ＤＬＬ３タンパク質のようなＤＬＬ３マーカーまたは決定因子が、がん幹細胞（腫瘍永続細胞としても公知）と治療上関連していること、およびがん幹細胞を除去するかまたは無症状にするために効果的に利用することができることが見出された。本明細書で開示するような、使用によってがん幹細胞を選択的に減少させるまたは除去する抗ＤＬＬ３コンジュゲートの能力は、このような細胞が一般的に多くの従来の治療に抵抗性であることが公知であることから、驚くべきことである。すなわち、伝統的治療方法および近年の標的治療方法の有効性は、これらの多様な治療方法を受けても腫瘍成長を永続させることができる抵抗性がん幹細胞の存在および／または発生によって、しばしば制限される。さらに、がん幹細胞と会合している決定因子は、低い発現もしくは一貫性のない発現ゆえにしばしば不十分な治療標的であり、腫瘍形成性細胞と会合した状態に留まることができないかまたは細胞表面上に存在することができない。従来技術の教示と極めて対照的に、本明細書に本開示のＡＤＣおよび方法は、この固有の抵抗性を効果的に克服し、このようながん幹細胞を特異的に除去させ、減少させ、消失させまたはその分化促進し、これにより、潜在する腫瘍成長を持続させるまたは再誘発するそれらの能力を無効にする。さらに、本明細書で示したように、本開示のＡＤＣによってもたらされた予期しない安定性および比較的均質なＤＡＲ調製物は、とりわけ効果的であり得る新規な投与レジメンを可能にする。
【００２６】
したがって、本明細書で開示するようなＤＬＬ３コンジュゲートは、選択された増殖性（例えば、新生物）障害またはその進行もしくは再発の治療および／または予防に有利に用いることができる。本発明の好ましい実施形態は、とりわけ特定のドメイン、領域もしくはエピトープに関して、または神経内分泌特性を含むがん幹細胞もしくは腫瘍および本開示の抗体薬物コンジュゲートとのそれらの相互作用に関連して、下記に詳細に議論するが、本発明の範囲がこのような例示的実施形態によって限定されないことを、当業者は理解する。むしろ、本発明の最も広範囲の実施形態および添付の特許請求の範囲は、特定の作用機序または特に標的とされる腫瘍、細胞もしくは分子成分にかかわらず、本開示の抗ＤＬＬ３コンジュゲートならびに新生物障害または細胞増殖性障害を含む様々なＤＬＬ３関連または媒介障害の治療および／または予防におけるそれらの使用を、広くおよび明示的に対象とする。
【００２７】
ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）において、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、１つのＮｏｔｃｈ受容体遺伝子、ならびにＳｅｒｒａｔｅおよびＤｅｌｔａとして公知の２つのリガンド遺伝子により、主として媒介される（Ｗｈａｒｔｏｎら、１９８５年；Ｒｅｂａｙら、１９９１年）。ヒトにおいて、４つの公知のＮｏｔｃｈ受容体ならびに５つのＤＳＬ（Ｄｅｌｔａ−Ｓｅｒｒａｔｅ  ＬＡＧ２）リガンド（Ｊａｇｇｅｄ１およびＪａｇｇｅｄ２として公知の、Ｓｅｒｒａｔｅの２つのホモログ、ならびにデルタ様リガンドまたはＤＬＬ１、ＤＬＬ３およびＤＬＬ４と称される、Ｄｅｌｔａの３つのホモログ）が存在する。一般に、シグナル受信細胞の表面上のＮｏｔｃｈ受容体は、対向するシグナル送信細胞の表面上に発現するリガンドとの相互作用（トランス相互作用と称される）により活性化される。これらのトランス相互作用は、Ｎｏｔｃｈ受容体のプロテアーゼ媒介性分解の結果をもたらす。その結果、Ｎｏｔｃｈ受容体細胞内ドメインは、膜から核に自由に位置を移動し、転写因子のＣＳＬファミリー（ヒトにおけるＲＢＰＪ）とパートナーになり、これらを転写リプレッサーからＮｏｔｃｈ応答性遺伝子のアクチベーターに転換する。
【００２８】
ヒトＮｏｔｃｈリガンドのうち、ＤＬＬ３は、トランス相互作用によりＮｏｔｃｈ受容体を活性化することが不可能であると思われる点が、他とは異なっている（Ｌａｄｉら、２００５年）。シス（同じ細胞上での）阻害の正確な機構は、依然として不明であり、リガンドによって異なり得る（例えば、Ｋｌｅｉｎら、１９９７年；Ｌａｄｉら、２００５年；Ｇｌｉｔｔｅｎｂｅｒｇら、２００６年参照）が、Ｎｏｔｃｈリガンドは、シスでもＮｏｔｃｈ受容体と相互作用し得る。２つの想定された阻害機構は、トランス相互作用を妨げることにより、または受容体のプロセシングを擾乱することもしくは小胞体もしくはゴルジ体における受容体の保持を物理的にもたらすことを介して細胞の表面上のＮｏｔｃｈ受容体の量を減少させること（Ｓａｋａｍｏｔｏら、２００２年；Ｄｕｎｗｏｏｄｉｅ、２００９年）により、細胞表面におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達を調節することを含む。しかし、隣接細胞上のＮｏｔｃｈ受容体およびリガンドの発現の確率論的差は、転写過程および非転写過程の両方によって増幅され得るものであり、シスおよびトランス相互作用の微妙なバランスが、隣接組織における互いに異なる細胞運命のＮｏｔｃｈ媒介による線引きを微調整し得ることは、明らかである（Ｓｐｒｉｎｚａｋら、２０１０年）。
【００２９】
ＤＬＬ３は、Ｎｏｔｃｈ  ＤＳＬリガンドのＤｅｌｔａ様ファミリーのメンバーである。代表的なＤＬＬ３タンパク質オルソログは、ヒト（受託番号ＮＰ＿０５８６３７およびＮＰ＿９８２３５３）、チンパンジー（受託番号ＸＰ＿００３３１６３９５）、マウス（受託番号ＮＰ＿０３１８９２）およびラット（受託番号ＮＰ＿４４６１１８）を含むが、これらに限定されない。ヒトにおいて、ＤＬＬ３遺伝子は、染色体１９ｑ１３上に位置する９．５ｋＢｐに及ぶ８つのエクソンからなる。最後のエクソン内の選択的スプライシングにより、２つのプロセシングされた転写物が生じる。これは、一方が２３８９塩基（受託番号ＮＭ＿０１６９４１）であり、他方が２０５２塩基（受託番号ＮＭ＿２０３４８６）である。前者の転写物は、６１８アミノ酸タンパク質（受託番号ＮＰ＿０５８６３７；配列番号１）をコードするのに対して、後者は、５８７アミノ酸タンパク質（受託番号ＮＰ＿９８２３５３；配列番号２）をコードする。ＤＬＬ３のこれらの２つのタンパク質アイソフォームは、それらの細胞外ドメインおよびそれらの膜貫通ドメインにわたって全体的な１００％の同一性を共有し、長い方のアイソフォームが、タンパク質のカルボキシ末端において３２個のさらなる残基を含む延長した細胞質尾部を有する点のみにおいて、異なっている。両アイソフォームを腫瘍細胞において検出することができるが、アイソフォームの生物学的関連性は不明である。
【００３０】
ＤＬＬ３タンパク質の細胞外領域は、６つのＥＧＦ様ドメイン、単一のＤＳＬドメインおよびＮ末端ドメインを含む。一般的に、ＥＧＦドメインは、アミノ酸残基２１６−２４９（ドメイン１）、２７４−３１０（ドメイン２）、３１２−３５１（ドメイン３）、３５３−３８９（ドメイン４）、３９１−４２７（ドメイン５）および４２９−４６５ドメイン６）あたりに、ＤＳＬドメインは、アミノ酸残基１７６−２１５あたりに、Ｎ末端ドメインは、ｈＤＬＬ３（配列番号１および２）のアミノ酸残基２７−１７５あたりに存在すると認識される。本明細書でより詳細に議論されるようにおよび下記実施例において示されるように、ＥＧＦ様ドメイン、ＤＳＬドメインおよびＮ末端ドメインのそれぞれは、異なるアミノ酸配列により定義されるＤＬＬ３タンパク質の一部を含む。本開示の目的のために、それぞれのＥＧＦ様ドメインは、ＥＧＦ１からＥＧＦ６と称すことができ、ＥＧＦ１がタンパク質のＮ末端部に最も近いことに留意されたい。タンパク質の構造組成に関して、本発明の１つの重要な態様は、本開示のＤＬＬ３モジュレーターを、選択されたドメイン、モチーフまたはエピトープと反応するように、生成するか、作製するか、遺伝子操作するかまたは選択することができることである。特定の場合において、このような抗体またはＡＤＣは、主要な作用機序によって反応性および／または有効性の増強をもたらし得る。とりわけ好ましい実施形態において、抗ＤＬＬ３  ＡＤＣは、ＤＳＬドメインに結合し、より好ましい実施形態において、ＤＳＬドメイン内のＧ２０３、Ｒ２０５、Ｐ２０６を含むエピトープ（配列番号４）に結合する。
【００３１】
ＩＩ．がん幹細胞
現在のモデルによれば、腫瘍は、非腫瘍形成性細胞および腫瘍形成性細胞を含む。非腫瘍形成性細胞は、自己再生能力を有さず、免疫無防備状態マウスに過剰な細胞数で移植された場合でも腫瘍を再現的に形成することができない。腫瘍形成性細胞は、本明細書で「腫瘍開始細胞」（ｔｕｍｏｒ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ、ＴＩＣ）とも称され、腫瘍の細胞集団の０．１〜４０％（より典型的には０．１〜１０％または０．０１〜１．０％）を構成し、腫瘍を形成する能力を有する。腫瘍形成性細胞は、がん幹細胞（ＣＳＣ）と交換可能に参照される腫瘍永続化細胞（ｔｕｍｏｒ  ｐｅｒｐｅｔｕａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ、ＴＰＣ）と、腫瘍始原細胞（ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ、ＴＰｒｏｇ）との両方を包含している。
【００３２】
正常組織の細胞ヒエラルキーを支持する正常幹細胞と同様に、ＣＳＣは、多系列分化の能力を維持しながら、無限に自己複製することができる。これに関して、ＣＳＣは、腫瘍形成性子孫細胞と非腫瘍形成性子孫細胞の両方を生成することができ、連続的な単離および免疫無防備状態マウスへの少数の単離ＣＳＣの移植によって実証されるように、親腫瘍の異種性細胞組成物を完全に再現することができる。これらの「種細胞」が除去されない限り、腫瘍が転位しまたは再発して、疾患の再発および最終的な進行をもたらす可能性がずっと高いことが、証拠により示されている。
【００３３】
ＴＰｒｏｇは、ＣＳＣと同様に、一次移植片において腫瘍成長を促進する能力を有する。しかしながら、ＣＳＣと異なり、ＴＰｒｏｇは、親腫瘍の細胞異種性を再現することができず、後続の移植片において腫瘍形成性を再開するには効率性が低い。なぜなら、ＴＰｒｏｇは、免疫無防備状態マウスへの少数の高精製ＴＰｒｏｇの連続移植により実証されるように、一般に、限定された数の細胞分裂しかできないからである。ＴＰｒｏｇはさらに、初期ＴＰｒｏｇと後期ＴＰｒｏｇとに分けることができ、これらは、表現型（例えば、細胞表面マーカー）および腫瘍細胞構造を再現する能力の差異によって区別され得る。いずれもＣＳＣと同程度に腫瘍を再現することはできないが、初期ＴＰｒｏｇの方が、後期ＴＰｒｏｇよりも、親腫瘍の特徴を再現する能力が高い。前述の区別にかかわらず、一部のＴＰｒｏｇ集団は稀に、ＣＳＣに通常属する性質である自己再生能力を獲得し、それ自体がＣＳＣになることができる。
【００３４】
ＣＳＣは、（ｉ）ＴＰｒｏｇ（初期および後期ＴＰｒｏｇの両方）ならびに（ｉｉ）腫瘍浸潤性細胞などの非腫瘍形成性細胞（例えば、ＣＳＣから誘導されかつ通常はバルクの腫瘍を含む、線維芽細胞／間質、内皮および造血性細胞）よりも高い腫瘍形成性を示し、比較的より静止状態に近い。従来の治療およびレジメンが、大部分は、腫瘍を減量させ、急速に増殖する細胞を攻撃するように設計されていることを考慮すると、ＣＳＣは、より急速に増殖するＴＰｒｏｇおよび他のバルクな腫瘍細胞集団、例えば非腫瘍形成性細胞よりも、従来の治療およびレジメンに対して耐性が強い。ＣＳＣを従来の治療に対して相対的に化学療法耐性にし得る他の特徴は、多剤耐性トランスポーターの発現増加、ＤＮＡ修復メカニズムおよび抗アポトーシス遺伝子発現の向上である。このようなＣＳＣの特性は、進行した病期の新生物を有する患者に持続的な応答をもたらすための標準治療レジメンの失敗を示唆している。なぜなら、標準的化学療法では、継続的な腫瘍成長および再発を実際に促進しているＣＳＣが、有効に標的とされていないためである。本開示の化合物および組成物は、これらの種細胞が腫瘍の成長および拡散を伝播する能力を抑制または除去する。
【００３５】
驚くべきことに、ＤＬＬ３発現が、本明細書に記載される治療に対して様々な腫瘍形成性細胞小集団を感受性にする形でこれらの細胞小集団と関連していることがわかった。本発明は、特に腫瘍形成性細胞を標的化するために有用であり、腫瘍形成性細胞を、機能鎮静化させる、敏感にする、中和する、出現頻度を減少させる、ブロックする、抑止する、干渉する、減少させる、妨害する、抑制する、制御する、枯渇させる、和らげる、媒介する、縮小させる、再プログラムする、排除する、殺傷するまたは他の方法で阻害する（集約して、「阻害する」）ために使用することができ、したがって増殖性障害（例えば、がん）の治療、管理および／または予防を容易にする抗ＤＬＬ３抗体を提供する。好都合には、本発明の新規の抗ＤＬＬ３抗体は、対象に投与した際に、ＤＬＬ３の決定因子の型（例えば、表現型または遺伝子型）にかかわらず、腫瘍形成性細胞の出現頻度または腫瘍形成性を好ましくは減少させるように選択し得る。腫瘍形成性細胞の出現頻度の減少は、（ｉ）腫瘍形成性細胞の阻害もしくは根絶、（ｉｉ）腫瘍形成性細胞の成長、拡大もしくは再発の制御、（ｉｉｉ）腫瘍形成性細胞の開始、伝播、維持または増殖の中断または（ｉｖ）これら以外の腫瘍形成性細胞の生存、再生および／もしくは転移を妨げることの、結果として生じ得る。いくつかの実施形態において、腫瘍形成性細胞の阻害は、１つ以上の生理学的経路の変化の結果として生じ得る。経路の変化は、腫瘍形成性細胞の阻害、腫瘍形成性細胞の能力の改変（例えば、分化もしくはニッチ破壊の誘導による）または腫瘍形成性細胞が腫瘍環境もしくは他の細胞に影響する能力に対する他の方法での干渉のいずれによるものであっても、腫瘍形成性、腫瘍の維持および／または転移ならびに再発の阻害により、より有効にＤＬＬ３関連障害を治療することを可能にする。本開示の抗体の同特徴は、標準治療レジメンに耐性または不応性であることが立証された再発性腫瘍の治療で、抗体を特に有効にすることがさらに認識される。
【００３６】
腫瘍形成性細胞の出現頻度の減少を評価するために使用され得る方法としては、限定されないが、細胞数測定分析または免疫組織化学的分析、好ましくはインビトロまたはインビボ限界希釈分析（Ｄｙｌｌａら、２００８、ＰＭＩＤ：ＰＭＣ２４１３４０２およびＨｏｅｙら、２００９、ＰＭＩＤ：１９６６４９９１）が挙げられる。
【００３７】
インビトロ限界希釈分析は、断片化または非断片化腫瘍細胞（例えば、それぞれ治療腫瘍由来または未治療腫瘍由来）を固体培地で培養してコロニーを形成させ、成長したコロニーを計数し、性質決定することにより行ってもよい。または腫瘍細胞を、液体培地を含有するウェルを有するプレート上に段階希釈し、各ウェルを、接種後、好ましくは接種から１０日より後の任意の時点において、コロニー形成について陽性であるか陰性であるかでスコア化してもよい。
【００３８】
インビボ限界希釈分析は、未治療対照または選択した治療剤に曝露した腫瘍のいずれかに由来する腫瘍細胞を、免疫無防備状態マウスに段階希釈で移植し、この後、各マウスの腫瘍形成について陽性であるか陰性であるかをスコア化することによって実施される。スコア化は、移植した腫瘍が検出可能となった後の任意の時点で行ってよいが、好ましくは移植から６０日以上経過した後で行う。腫瘍形成性細胞の出現頻度を決定するための限界希釈実験の結果の解析は、好ましくは、ポアソン分布統計を使用してまたは予め定義された確定事象（腫瘍がインビボで生成されるか否かの能力など）の出現頻度を評価することにより（Ｆａｚｅｋａｓら、１９８２、ＰＭＩＤ：７０４０５４８）、行われる。
【００３９】
フローサイトメトリおよび免疫組織化学も、腫瘍形成性細胞の出現頻度を決定するために使用され得る。両方の技術が、当該技術分野で認識されている細胞表面タンパク質またはマーカーに結合する１つ以上の抗体または試薬を利用し、これらは、腫瘍形成性細胞を富化することが知られている（ＷＯ２０１２／０３１２８０参照）。当該技術分野で公知であるように、フローサイトメトリ（例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ））は、腫瘍形成性細胞を含む様々な細胞集団を性質決定、単離、精製、富化または分類するためにも使用され得る。フローサイトメトリは、細胞の混合集団が懸濁されている流体の流れを、最大毎秒で何千もの粒子の物理的および／または化学的特徴を測定できる電子的検出装置を通して通過させることによって、腫瘍形成性細胞のレベルを測定する。免疫組織化学は、腫瘍形成性細胞マーカーに結合する標識化抗体または試薬で組織試料を染色することにより、インサイチュ（例えば、組織切片内）で腫瘍形成性細胞の視覚化を可能にするという点で、さらなる情報を提供する。
【００４０】
したがって、本発明の抗体は、例えば、フローサイトメトリ、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、レーザー媒介の薄片化またはＦＡＣＳなどの方法による、腫瘍形成性細胞の同定、性質決定、モニタリング、単離、薄片化または集団もしくは小集団の富化に有用であり得る。ＦＡＣＳは、特異的な細胞表面マーカーに基づいて９９．５％を超える純度で細胞小集団を単離するために使用される信頼性のある方法である。ＣＳＣを含む腫瘍形成性細胞の性質決定および遺伝子操作のための他の適合技術は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．１２／６８６，３５９、１２／６６９，１３６および１２／７５７，６４９において見ることができる。
【００４１】
下記に列挙するのは、ＣＳＣ集団に関連し、ＣＳＣを単離または性質決定するために使用されてきたマーカーである：ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ３、ＡＢＣＧ２、ＡＤＡＭ９、ＡＤＣＹ９、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＡＦＰ、ＡＸＩＮ１、Ｂ７Ｈ３、ＢＣＬ９、Ｂｍｉ−１、ＢＭＰ−４、Ｃ２０ｏｒｆ５２、Ｃ４．４Ａ、カルボキシペプチダーゼＭ、ＣＡＶ１、ＣＡＶ２、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１６６、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２９、ＣＤ３、ＣＤ３１、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７４、ＣＤ９、ＣＤ９０、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＬＳＲ１、ＣＰＤ、ＣＲＩＭ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＲ４、ＤＡＦ、デコリン、ｅａｓｙｈ１、ｅａｓｙｈ２、ＥＤＧ３、ｅｅｄ、ＥＧＦＲ、ＥＮＰＰ１、ＥＰＣＡＭ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＦＬＪ１００５２、ＦＬＶＣＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ１０、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＧＤ２、ＧＪＡ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＧＰＮＭＢ、ＧＰＲ５４、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＪＡＭ３、Ｌｇｒ５、Ｌｇｒ６、ＬＲＰ３、ＬＹ６Ｅ、ＭＣＰ、ｍｆ２、ｍｌｌｔ３、ＭＰＺＬ１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＹＣ、Ｎ３３、Ｎａｎｏｇ、ＮＢ８４、ネスチン、ＮＩＤ２、ＮＭＡ、ＮＰＣ１、オンコスタチンＭ、ＯＣＴ４、ＯＰＮ３、ＰＣＤＨ７、ＰＣＤＨＡ１０、ＰＣＤＨＢ２、ＰＰＡＰ２Ｃ、ＰＴＰＮ３、ＰＡＴＩＥＮＴＳ、ＲＡＲＲＥＳ１、ＳＥＭＡ４Ｂ、ＳＬＣ１９Ａ２、ＳＬＣ１Ａ１、ＳＬＣ３９Ａ１、ＳＬＣ４Ａ１１、ＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ７Ａ８、ｓｍａｒｃＡ３、ｓｍａｒｃＤ３、ｓｍａｒｃＥ１、ｓｍａｒｃＡ５、Ｓｏｘ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＥＡＰ、ＴＣＦ４、ＴＥＭ８、ＴＧＦＢＲ３、ＴＭＥＰＡＩ、ＴＭＰＲＳＳ４、トランスフェリン受容体、ＴｒｋＡ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１６、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ５Ａ、ＹＹ１およびβ−カテニン。例えば、Ｓｃｈｕｌｅｎｂｕｒｇら、２０１０、ＰＭＩＤ：２０１８５３２９、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，６３２，６７８ならびにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４１４、２００８／０１７５８７０、２０１０／０２７５２８０、２０１０／０１６２４１６および２０１１／００２０２２１参照。
【００４２】
同様に、特定の腫瘍型のＣＳＣに関連する細胞表面表現型の非限定的な例としては、ＣＤ４４ｈｉＣＤ２４ｌｏｗ、ＡＬＤＨ＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ１２３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋ＣＤ２４−、ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋ＣＤ６６ｃ−、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋ＣＤ１０−ＣＤ１９−、ＣＤ１３８−ＣＤ３４−ＣＤ１９＋、ＣＤ１３３＋ＲＣ２＋、ＣＤ４４＋α２β１ｈｉＣＤ１３３＋、ＣＤ４４＋ＣＤ２４＋ＥＳＡ＋、ＣＤ２７１＋、ＡＢＣＢ５＋ならびに当該技術分野で公知の他のＣＳＣ表面表現型が挙げられる。例えば、Ｓｃｈｕｌｅｎｂｕｒｇら、２０１０、前掲、Ｖｉｓｖａｄｅｒら、２００８、ＰＭＩＤ：１８７８４６５８およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００８／０１３８３１３参照。本発明に関して特に関心がもたれるのは、ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋表現型を含むＣＳＣ調製物である。
【００４３】
「正」、「低」および「負」の発現レベルがマーカーまたはマーカー表現型に適用されるとき、以下のように定義される。負（つまり、「−」）の発現を有する細胞は、本明細書において、蛍光チャネル中のアイソタイプ対照抗体を、別の蛍光チャネルの目的の他のタンパク質を標識する完全抗体染色カクテルの存在下で観察した発現の９５パーセンタイル以下で発現する細胞として定義される。当業者は、この負の事象を定義するための手法が、「１を引いた蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ）」または「ＦＭＯ」染色として参照されることを認識する。上記で述べたＦＭＯ染色手法を用いてアイソタイプ対照抗体で観察された発現の９５パーセンタイルを上回る発現を有する細胞は、「正」（つまり「＋」）と定義される。本明細書で定義するとき、様々な細胞集団が広範に「正」と定義される。抗原の平均発現観測値が、上記のようにアイソタイプ対照抗体でＦＭＯ染色を用いて決定された９５パーセンタイルを上回る場合、細胞は正として定義される。正の細胞が、平均発現観測値がＦＭＯ染色によって決定された９５パーセンタイルを上回るが、９５パーセンタイルの１標準偏差以内である場合、「低発現」（つまり、「ｌｏ」）の細胞と称され得る。あるいは、正の細胞が、平均発現観測値がＦＭＯ染色によって決定された９５パーセンタイルを上回り、９５パーセンタイルを上回る１標準偏差より大きい場合、「高発現」（つまり、「ｈｉ」）の細胞と称され得る。他の実施形態において、９９パーセンタイルは、好ましくは、負と正のＦＭＯ染色の間の分界点として使用することができ、いくつかの実施形態において、パーセンタイルは９９％より大きくなり得る。
【００４４】
ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋マーカー表現型およびすぐ上に例示された表現型は、標準的フローサイトメトリ解析ならびに細胞選別技術と組み合わせて、さらなる解析のためにＴＩＣおよび／またはＴＰＣ細胞または細胞集団を、性質決定、単離、精製または富化するために使用され得る。
【００４５】
したがって、腫瘍形成性細胞の出現頻度を減少させる本発明の抗体の能力は、上記に記載の技術およびマーカーを使用して決定され得る。いくつかの場合には、抗ＤＬＬ３抗体は、腫瘍形成性細胞の出現頻度を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％またはさらには３５％減少させ得る。他の実施形態において、腫瘍形成性細胞の出現頻度の減少は、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％または６５％程度であり得る。ある特定の実施形態において、本開示の化合物は、腫瘍形成性細胞の出現頻度を７０％、７５％、８０％、８５％、９０％またはさらには９５％減少させ得る。腫瘍形成性細胞の出現頻度の何らかの減少は、腫瘍形成能、残留性、再発性および新生物の悪性度における減少をもたらし得ることが理解される。
【００４６】
ＩＩＩ．抗体
Ａ．抗体の構造
抗体ならびにそのバリアントおよび誘導体は、承認されている命名法および番号付けシステムを含め、例えば、Ａｂｂａｓら（２０１０）、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第６版）、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ；またはＭｕｒｐｈｅｙら（２０１１）、Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（第８版）、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅに詳細に記載されている。
【００４７】
「抗体」または「無傷（ｉｎｔａｃｔ）な抗体」は、通常、ジスルフィド共有結合および非共有結合性相互作用により一緒に保持された２つの重鎖（Ｈ）ポリペプチド鎖と２つの軽鎖（Ｌ）ポリペプチド鎖とを含むＹ字型４量体タンパク質を指す。各軽鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＬ）と１つの定常ドメイン（ＣＬ）とで構成される。各重鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）と、ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体およびＩｇＤ抗体の場合にはＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３と称される３つのドメインを含む（ＩｇＭおよびＩｇＥは第４のドメインＣＨ４を含む）定常領域とを、含む。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤクラスにおいて、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインは、可変長（様々なＩｇＧサブクラスにおいて約１０から約６０のアミノ酸長）のプロリンおよびシステインリッチなセグメントであるフレキシブルなヒンジ領域によって分離されている。軽鎖および重鎖の両方の可変ドメインは、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって定常ドメインに連結されており、重鎖はまた、約１０の付加的アミノ酸の「Ｄ」領域をも有する。抗体の各クラスは、対のシステイン残基によって形成される鎖間および鎖内のジスルフィド結合をさらに含む。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、マルチクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化および霊長類化抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒト抗体（組換え産生ヒト抗体を含む）、組換え産生抗体、細胞内抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、一価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、ならびにこれらのムテインおよびバリアントを含む合成抗体、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）断片および単鎖断片（例えば、ＳｃＦｖおよびＳｃＦｖＦｃ）などの免疫特異的抗体断片を含み、そして決定因子との優先的会合または結合を示す限り、Ｆｃ融合および他の修飾を含むそれらの誘導体ならびにあらゆる他の免疫反応分子を、含む。さらに、文脈上の制約によって他に指示されない限り、用語はさらに全ての抗体のクラス（つまり、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）ならびに全てのサブクラス（つまり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）を含む。様々な抗体のクラスに対応する重鎖定常領域は、通常、対応するギリシャ語の小文字α、δ、ε、γおよびμでそれぞれ示される。いずれかの脊椎動物種からの抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なる種類の１つに割り当てることができる。
【００４９】
抗体の可変ドメインは、抗体毎にアミノ酸組成にかなりの違いを示し、主に抗原認識および結合の役割を担っている。各軽鎖／重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成しており、したがって無傷なＩｇＧ抗体は２つの結合部位を有する（すなわち、これは２価である）。ＶＨおよびＶＬドメインは、非常に可変性のある３つの領域を含み、これらの領域は超可変領域、またはより一般的には相補性決定領域（ＣＤＲ）と称され、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られる４つの可変性の少ない領域によって囲まれ分離されている。ＶＨ領域とＶＬ領域との間の非共有結合性の会合は、抗体の２つの抗原結合部位の１つを含有するＦｖ断片（「可変部断片」を表す）を形成している。ＳｃＦｖ断片（一本鎖可変部断片の場合）は、遺伝子操作によって得ることができ、単一のポリペプチド鎖中でペプチドリンカーによって分離された抗体のＶＨおよびＶＬ領域と会合している。
【００５０】
本明細書で使用される場合、アミノ酸の各ドメイン、フレームワーク領域およびＣＤＲに対する割り付けは、他に記載がない限り、Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版）、米国保健福祉省、ＰＨＳ、ＮＩＨ、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８７、ＰＭＩＤ：３６８１９８１；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、ＰＭＩＤ：２６８７６９８；ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６、ＰＭＩＤ：８８７６６５０；またはＤｕｂｅｌ編（２００７）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第３版、Ｗｉｌｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ａｎｄ  ＣｏまたはＡｂＭ  （Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ／ＭＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉａ）によって提供されるスキームの１つに従い得る。当該技術分野で周知のように、可変領域残基の番号付けは、典型的にはＣｈｏｔｈｉａまたはＫａｂａｔに示されている通りである。Ａｂｙｓｉｓウェブサイトデータベース（下記）から取得されるＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｃｏｎｔａｃｔとしても知られる）およびＡｂＭによって定義される、ＣＤＲを含むアミノ酸残基を下の表１に示す。ＭａｃＣａｌｌｕｍは、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムを用いていることに留意されたい。
【００５１】
【表１】
2018529656.tif 000002
【００５２】
抗体配列における可変領域およびＣＤＲは、当該技術分野で展開されている一般的法則（上記に示したもの、例えば、Ｋａｂａｔ命名システム）に従って、または既知の可変領域のデータベースに対して配列を整列させることにより同定され得る。これらの領域を同定するための方法は、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２００１およびＤｉｎａｒｅｌｌｏら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ、２０００に記載されている。抗体配列の例示的なデータベースは、ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓの「Ａｂｙｓｉｓ」ウェブサイト（英国、ロンドン、ロンドン大学の生化学・分子生物学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）部門のＡ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎによって保持）およびｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇのＶＢＡＳＥ２ウェブサイト（Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３３（データベース号）：Ｄ６７１−Ｄ６７４（２００５）に記載されている）に記載されているか、またはこれらを通じてアクセスされ得る。好ましくは、配列は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴおよびタンパク質データバンク（ＰＤＢ）からの配列データを、ＰＤＢからの構造データと統合したＡｂｙｓｉｓデータベースを使用して解析される。Ｄｒ．Ａｎｄｒｅｗ  Ｃ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ’ｓ  ｂｏｏｋ  ｃｈａｐｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ（編集：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ＩＳＢＮ−１３：９７８−３５４０４１３５４７、ウェブサイトのｂｉｏｉｎｆｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓでも利用可能）参照。Ａｂｙｓｉｓデータベースウェブサイトは、本明細書の教示に従って使用され得る、ＣＤＲを同定するために展開された一般的な規則をさらに含む。他に示さない限り、本明細書に示す全てのＣＤＲは、Ｋａｂａｔらに従ってＡｂｙｓｉｓデータベースウェブサイトにより導き出されたものである。
【００５３】
本発明で議論される重鎖定常領域アミノ酸位置について、番号付けは、Ｅｕインデックスに従う。このインデックスは、最初にＥｄｅｌｍａｎら、１９６９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６３（１）：７８−８５において記載された。この文献は骨髄腫タンパク質Ｅｕのアミノ酸配列を記載しており、この配列は最初に配列決定されたヒトＩｇＧ１であると報告されている。ＥｄｅｌｍａｎのＥｕインデックスは、Ｋａｂａｔら、１９９１（前掲）にも示されている。したがって、重鎖の文脈における用語「Ｋａｂａｔに記載のＥｕインデックス」または「ＫａｂａｔのＥｕインデックス」または「Ｅｕインデックス」または「Ｅｕ番号付け」は、Ｋａｂａｔら、１９９１（前掲）に示されたＥｄｅｌｍａｎらのヒトＩｇＧ１  Ｅｕ抗体に基づく残基番号付けシステムを指す。軽鎖定常領域アミノ酸配列で使用される番号付けシステムは、同様に、Ｋａｂａｔら（前掲）に示されている。本発明に適合する例示的なカッパ軽鎖定常領域アミノ酸配列を直下に示す：
【００５４】
【化１】
2018529656.tif 000003
【００５５】
同様に、本発明に適合する例示的なＩｇＧ１重鎖定常領域アミノ酸配列を直下に示す：
【００５６】
【化２】
2018529656.tif 000004
【００５７】
本開示の定常領域配列またはそれらの当該技術分野で公知の変形もしくは誘導体は、本開示の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と、標準的な分子生物学技術を使用して作動可能に会合されて、本発明の抗ＤＬＬ３  ＡＤＣでそのまま使用され得るかまたはそれに組み込まれ得る全長抗体を提供し得る。これに関して、また例示の目的のために、例示的抗体ｈＳＣ１６．５６の全長重鎖アミノ酸配列（配列番号７）および軽鎖アミノ酸配列（配列番号８）を直下に示す。
【００５８】
【化３】
2018529656.tif 000005
【００５９】
【化４】
2018529656.tif 000006
【００６０】
本発明の抗体または免疫グロブリン（およびＡＤＣ）は、任意のＤＬＬ３決定因子を特異的に認識するまたはこれと会合する抗体から生成され得ることが理解される。本明細書で使用される場合「決定因子」または「標的」は、特定の細胞、細胞集団または組織においてもしくはこれらの上で、同定可能的に会合するかまたは特異的に見出される、任意の検出可能な形質、特性、マーカーまたは因子を意味する。決定因子または標的は、形態学的性質、機能的性質または生化学的性質であってもよく、好ましくは表現型である。いくつかの実施形態において、決定因子は、特定の細胞型またはある特定の条件下の細胞（例えば、細胞周期の特定の点におけるまたは特定の微小環境における細胞）によって異なって発現（過剰発現または過小発現）されるタンパク質である。本発明の目的のために、決定因子は、好ましくは、異常ながん細胞上で異なって発現され、ＤＬＬ３タンパク質またはそのスプライスバリアント、アイソフォーム、ホモログもしくはファミリーメンバーまたはこれらの特異的ドメイン、領域もしくはエピトープのいずれかを含み得る。「抗原」、「免疫原性決定因子」、「抗原性決定因子」または「免疫原」は、免疫適格性の動物に導入されたときに免疫応答を刺激できかつ免疫応答により生じる抗体によって認識される、任意のタンパク質または任意の断片、領域もしくはドメインを意味する。本明細書で検討されるＤＬＬ３決定因子の存在または不在は、細胞、細胞小集団または組織（例えば、腫瘍、腫瘍形成性細胞またはＣＳＣ）を同定するために使用され得る。
【００６１】
免疫グロブリン分子内には、２種類のジスルフィド架橋すなわち結合、つまり鎖間および鎖内のジスルフィド結合がある。当該分野で周知のように、鎖間ジスルフィド結合の位置および数は、免疫グロブリンのクラスおよび種類によって変化する。本発明は、抗体の任意のクラスまたは特定のサブクラスに限定されるものではないが、ＩｇＧ１免疫グロブリンが、例示のために、本開示を通して使用される。野生型ＩｇＧ１分子には、１２の鎖内ジスルフィド結合（それぞれ重鎖に４つとそれぞれ軽鎖に２つ）と、４つの鎖間ジスルフィド結合がある。鎖内ジスルフィド結合は、一般にやや保護されており、鎖間結合よりも相対的に還元されにくい。逆に、鎖間ジスルフィド結合は、免疫グロブリンの表面に位置しており、溶媒に接触可能で、通常は比較的還元されやすい。２つの鎖間ジスルフィド結合が重鎖間に存在し、さらに各重鎖からそれぞれの軽鎖に対しても１つずつ鎖間ジスルフィド結合が存在する。鎖間ジスルフィド結合は、鎖の会合に必須ではないことが実証された。ＩｇＧ１ヒンジ領域は、重鎖に鎖間ジスルフィド結合を形成するシステインを含有しており、これらのシステインが、構造的な支えとともにＦａｂの動きを容易にする柔軟性をもたらす。重／重ＩｇＧ１鎖間ジスルフィド結合は、残基Ｃ２２６およびＣ２２９（Ｅｕナンバリング）に位置し、一方でＩｇＧ１の軽鎖と重鎖との間（重／軽）のＩｇＧ１鎖間ジスルフィド結合は、カッパまたはラムダ軽鎖のＣ２１４と、重鎖の上流ヒンジ領域のＣ２２０との間に形成される。
【００６２】
Ｂ．抗体生成および産生
本発明の抗体は、当該技術分野で公知の様々な方法を使用して産生され得る。
【００６３】
１．宿主動物におけるポリクローナル抗体の生成
様々な宿主動物におけるポリクローナル抗体の産生は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（編集）（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ；およびＨａｒｌｏｗら（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＮＹ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ参照）。ポリクローナル抗体を生成するために、免疫適格性の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、非ヒト霊長類など）は抗原性タンパク質または抗原性タンパク質を含む細胞もしくは調製物によって免疫化される。一定時間後に、ポリクローナル抗体含有血清を、動物を出血させるかまたは屠殺することにより得る。血清は動物から得た形態で使用されてもよく、または抗体を部分的もしくは完全に精製して免疫グロブリン画分もしくは単離された抗体調製物を得てもよい。
【００６４】
任意の形態の抗原または抗原を含有する細胞もしくは調製物を、決定因子に特異的な抗体を生成するために使用することができる。用語「抗原」は、広義で使用され、任意の免疫原性断片または選択された標的の決定因子、例えば、単一のエピトープ、複数のエピトープ、単一もしくは複数のドメインまたは全細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み得る。抗原は、単離された完全長タンパク質、細胞表面タンパク質（例えば、抗原の少なくとも一部をその表面上で発現している細胞による免疫化）または可溶性タンパク質（例えば、タンパク質のＥＣＤ部分のみによる免疫化）であってもよい。抗原は、遺伝子修飾された細胞において産生されてもよい。前述の抗原のいずれかが単独で使用されてもよく、当該技術分野で公知の１つ以上の免疫原性増強アジュバントと組み合わせて使用されてもよい。抗原をコードしているＤＮＡは、ゲノムＤＮＡであっても非ゲノムＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）であってもよく、免疫原性応答を誘発するのに十分なＥＣＤの少なくとも一部をコードしていてもよい。任意のベクターを使用して、抗原が発現される細胞を形質転換してもよく、例えばベクターとして、これらに限定されないが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、プラスミドおよびカチオン性脂質などの非ウイルス性ベクターが挙げられる。
【００６５】
２．モノクローナル抗体
選択された実施形態において、本発明では、モノクローナル抗体の使用を検討する。当該技術分野で公知であるように、用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、微量に存在し得る可能性のある変異（例えば、天然に生じる変異）を除いて同一である集団を構成する個別の抗体から取得される抗体を指す。
【００６６】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、トランスジェニック動物（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標））またはこれらの何らかの組合せを含む、当該技術分野で公知の様々な技術を使用して調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、例えば、Ａｎ，Ｚｈｉｇｉａｎｇ（編集）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂｅｎｃｈ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、第１版  ２００９；Ｓｈｉｒｅら、（編集）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ  ＬＬＣ、第１版  ２０１０；Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓ、第２版  １９８８；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１）により詳細に記載されているハイブリドーマおよび生化学的遺伝子操作技術を使用して産生され得る。決定因子に特異的に結合する複数のモノクローナル抗体の産生後、特に有効な抗体を、様々なスクリーニングプロセスを通じて、例えば、決定因子に対するそれらの親和性または内在化速度に基づいて、選択してもよい。本明細書に記載されるように産生される抗体を、「ソース（ｓｏｕｒｃｅ）」抗体として使用することができ、さらに、例えば、標的への親和性を改善するため、細胞培養における産生性を向上させるため、インビボでの免疫原性を減少させるため、多重特異性構築物を生成するために改変してもよい。モノクローナル抗体の産生およびスクリーニングのより詳細な説明は、下記および添付の実施例に示される。
【００６７】
３．ヒト抗体
別の実施形態において、抗体は、完全ヒト抗体を含み得る。語「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体および／または下記に記載のヒト抗体を作製する技術のいずれかを使用して作製された抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を指す。
【００６８】
ヒト抗体は、当該技術分野で既知の様々な技術を使用して産生され得る。一実施形態において、組換えヒト抗体は、ファージディスプレイを使用して調製された組換えコンビナトリアル抗体ライブラリをスクリーニングすることによって単離され得る。一実施形態において、ライブラリは、Ｂ細胞から単離されたｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬおよびＶＨ  ｃＤＮＡを使用して生成されたｓｃＦｖファージまたは酵母ディスプレイライブラリである。このような技術は、多数の候補抗体のスクリーニングを有利にも可能にし、候補配列の比較的簡単な操作を提供する（例えば、親和性成熟または組換えシャッフリングによる）。
【００６９】
ヒト抗体は、トランスジェニック動物、例えば、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化され、ヒト免疫グロブリン遺伝子が導入されているマウスに、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することにより作製することもできる。チャレンジすると、ヒト抗体産生が観察され、この産生は、遺伝子再配列、アセンブリおよび完全ヒト抗体レパートリーを含む全ての点において、ヒトで見られるものと緊密に類似している。このアプローチは、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，５４５，８０７；５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，６６１，０１６ならびにＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術に関するＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，０７５，１８１および６，１５０，５８４；ならびにＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ、１９９５、ＰＭＩＤ：７４９４１０９）に記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対する抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化を介して調製され得る（このようなＢリンパ球は、新生物障害に罹患している個体から回収し得るかまたはインビトロで免疫化され得る）。例えば、Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、１９９１、ＰＭＩＤ：２０５１０３０；およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，７５０，３７３を参照。他のモノクローナル抗体と同様に、このようなヒト抗体は、ソース抗体として使用され得る。
【００７０】
さらに、このような抗体は、選択された宿主細胞を所望のヒト重鎖および軽鎖をコードする（すぐ上で述べた任意の供給源からの）遺伝物質を用いて形質転換またはトランスフェクトした後に、組換えにより産生させることができる。このような非天然型の組換えにより製造された完全ヒト抗体組成物は、明確に本発明の範囲内にあり、開示の抗ＤＬＬ３  ＡＤＣを得るために用いることができる。
【００７１】
４．誘導された抗体
ソース抗体は、上記のように生成され、選択され、単離された後、改善された医薬的特徴を有する抗ＤＬＬ３抗体となるようにさらに改変されてもよい。好ましくは、ソース抗体は、所望の治療学的特性を有する誘導抗体をもたらすように既知の分子遺伝子操作技術を使用して修飾または改変されてもよい。
【００７２】
４．１．キメラおよびヒト化抗体
本発明の選択された実施形態は、免疫特異的にＤＬＬ３に結合するマウスモノクローナル抗体を含み、この抗体は、「ソース」抗体と考えることができる。ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、このような「ソース」抗体から、ソース抗体の定常領域および／またはエピトープ結合アミノ酸配列の任意選択の修飾を通じて誘導され得る。様々な実施形態では、抗体は、ソース抗体の選択されたアミノ酸が、欠失、変異、置換、統合または組合せを通じて変化する場合、ソース抗体から「誘導される」。別の実施形態において、「誘導された」抗体は、ソース抗体の断片（例えば、１つ以上のＣＤＲまたは全重鎖および軽鎖可変領域）がアクセプター抗体配列と組み合わされるまたはアクセプター抗体配列に組み込まれて、誘導抗体（例えば、キメラまたはヒト化抗体）を提供する抗体である。これらの「誘導された」抗体は、標準的な分子生物学的技術を使用して、下記に記載されるように、例えば、決定因子に対する親和性を改善するために、抗体安定性を向上させるために、細胞培養における産生および収率を向上させるために、インビボにおける免疫原性を下げるために、毒性を下げるために、活性部分のコンジュゲーションを容易にするためにまたは多重特異的抗体を作製するために生成され得る。このような抗体は、ソース抗体から、化学的手段または翻訳後修飾による成熟分子の修飾（例えば、グリコシル化パターンまたはペグ化）を通じて、誘導されてもよい。
【００７３】
一実施形態において、本発明の抗体は、少なくとも２つの異なる抗体の種またはクラス由来の共有結合したタンパク質セグメントから誘導された、キメラ抗体を含み得る。用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるが、鎖の残りは、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体ならびにこのような抗体の断片の対応する配列と同一または相同である構築物を指す（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，８１６，５６７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、ＰＭＩＤ：６４３６８２２）。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のキメラ抗体は、ヒト軽鎖および重鎖定常領域に作動可能に連結されている選択されたマウス重鎖および軽鎖可変領域の全てまたはほとんどを含んでもよい。他の選択された実施形態において、キメラ抗ＤＬＬ３抗体は、本明細書に開示のマウス抗体から「誘導された」ものであり得る。
【００７４】
他の実施形態において、本発明のキメラ抗体は、「ＣＤＲグラフト化」抗体であり、この場合に、ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭｃＣａｌｌｕｍなどを使用して定義される）は、特定の種から誘導されるかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属しており、抗体の残りは、主に別の種から誘導されるかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属している。ヒトで使用するために、１つ以上の選択されたげっ歯類ＣＤＲ（例えば、マウスＣＤＲ）は、ヒトアクセプター抗体にグラフト化され、天然に存在するヒト抗体のＣＤＲの１つ以上と置き換えられ得る。これらの構築物は、一般的に、対象による抗体に対する望ましくない免疫応答を低減しながら、十分な強度のヒト抗体機能、例えば、補体依存細胞傷害性（ＣＤＣ）および抗体依存細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）をもたらすという利点を有する。一実施形態において、ＣＤＲグラフト化抗体は、ヒトフレームワーク配列に組み込まれたマウスから取得される１つ以上のＣＤＲを含む。
【００７５】
ＣＤＲグラフト化抗体に類似しているのが「ヒト化」抗体である。本明細書で使用するとき、「ヒト化」抗体は、１つ以上の非ヒト抗体（ドナーまたはソース抗体）から誘導された１つ以上のアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ配列）を含むヒト抗体（アクセプター抗体）である。ある特定の実施形態では、「逆変異（ｂａｃｋ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）」が、ヒト化抗体に導入されていてもよい。この逆変異では、レシピエントのヒト抗体の可変領域の１つ以上のフレームワークドメイン（ＦＲ）が、非ヒト種ドナー抗体の対応する残基によって置換されている。このような逆変異は、グラフト化ＣＤＲの適切な三次元立体配置の維持を補助し、それにより親和性および抗体安定性を改善し得る。様々なドナー種由来の抗体を使用することができ、例えば、限定されないが、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類が挙げられる。さらに、ヒト化抗体は、例えば、抗体の性能をさらに向上させるために、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない新たな残基を含んでもよい。ソース抗体由来のマウス成分およびアクセプター抗体由来のヒト成分を含む、本発明に適合するＣＤＲグラフト化およびヒト化抗体は、下記実施例に示すように提示される。
【００７６】
当該技術分野で認識されている様々な技術を使用して、どのヒト配列をアクセプター抗体として使用するかを決定し、本発明に従ってヒト化構築物を提供することができる。適合するヒト生殖系列配列の編纂およびそれらのアクセプター配列としての適性を決定するための方法は、例えば、Ｄｕｂｅｌ  ａｎｄ  Ｒｅｉｃｈｅｒｔ（編）（２０１４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ＧｍｂＨ；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ、Ｉ．Ａ．ら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；Ｃｏｏｋ、Ｇ．Ｐ．ら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １６：２３７−２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｄ．ら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９−８１７；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：４６２８−４６３８）に開示されている。Ｖ−ＢＡＳＥディレクトリ（ＶＢＡＳＥ２−Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３３；６７１−６７４、２００５）は、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の網羅的なディレクトリを提供しており（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫにより編集）、これを使用して適合するアクセプター配列を同定してもよい。さらに、例えばＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，３００，０６４に記載されているコンセンサスヒトフレームワーク配列もまた、適合するアクセプター配列であり得、本教示に従って使用し得る。一般に、ヒトフレームワークアクセプター配列は、マウス由来フレームワーク配列との相同性と、ソース抗体およびアクセプター抗体のＣＤＲ古典的構造の解析とに基づいて選択される。次いで、誘導された抗体の重鎖および軽鎖可変領域の誘導された配列が、当該技術分野で認識されている技術を使用して合成され得る。
【００７７】
例として、ＣＤＲグラフト化抗体およびヒト化抗体ならびに関連する方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，１８０，３７０および５，６９３，７６２に記載されている。さらなる詳細は、例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、（ＰＭＩＤ：３７１３８３１）；ならびにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，９８２，３２１および７，０８７，４０９を参照されたい。
【００７８】
ＣＤＲグラフト化またはヒト化抗体の可変領域のヒトアクセプター可変領域の配列同一性またはホモロジーは、本明細書で議論したように決定され、本明細書で議論したように測定されるとき、好ましくは少なくとも６０％または６５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％または９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９３％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）の側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されている置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、配列同一性パーセントまたは類似度を上方調節させて置換の保存的性質を正しくしてもよい。
【００７９】
添付の図１Ａおよび１Ｂに示される注釈の付されたＣＤＲおよびフレームワーク配列は、著作権のあるＡｂｙｓｉｓデータベースを使用して、Ｋａｂａｔらに従って定義されていることが理解される。しかしながら、本明細書で説明されるように、当業者は、Ｃｈｏｔｈｉａら、ＡＢＭまたはＭａｃＣａｌｌｕｍらによって提供される定義に従って、ＣＤＲを、Ｋａｂａｔらと同様に容易に同定し得る。このように、前述のシステムのいずれかに従って誘導された１つ以上のＣＤＲを含む抗ＤＬＬ３ヒト化抗体は、本発明の範囲内に明確に保持される。
【００８０】
４．２．部位特異的抗体
本発明の抗体は、細胞毒または他の抗がん剤へのコンジュゲーションを容易にするために（下記でより詳細に議論されるように）遺伝子操作されてもよい。抗体薬物コンジュゲート調製にとって、抗体上の細胞毒の位置および薬物抗体比（ＤＡＲ）の観点から、均質なＡＤＣ分子集団を含むことが有利である。本発明に基づいて、当業者は本明細書に記載されるような部位特異的遺伝子操作構築物を容易に作製することができる。本明細書で使用するとき、「部位特異的抗体」または「部位特異的構築物」は、重鎖または軽鎖のいずれかの少なくとも１つのアミノ酸が、欠失、改変または（好ましくは別のアミノ酸で）置換されて少なくとも１つの遊離システインを与えている抗体またはその免疫反応性断片を意味する。同様に、「部位特異的コンジュゲート」は、部位特異的抗体と、不対システインまたは遊離システインにコンジュゲートした少なくとも１つの細胞毒または他の化合物とを含むＡＤＣを意味する。ある特定の実施形態において、不対システイン残基は、不対鎖内システイン残基を含む。他の実施形態において、遊離システイン残基は、不対鎖間システイン残基を含む。さらに他の実施形態において、遊離システインは、抗体のアミノ酸配列内（例えば、ＣＨ３ドメイン内）へと改変されてもよい。いずれにしても、部位特異的抗体は、様々なアイソタイプの抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＤであることができ；これらのクラス内で、抗体は、様々なサブクラスの抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４であることができる。ＩｇＧ構築物に関して、抗体の軽鎖は、Ｃ２１４がそれぞれ組み込まれたカッパまたはラムダのいずれかのアイソタイプを含んでもよく、選択された実施形態において、Ｃ２１４は、ＩｇＧ１重鎖のＣ２２０残基がないことにより、不対であってもよい。
【００８１】
したがって、本明細書で使用されるとき、用語「遊離システイン」または「不対システイン」は、他に文脈で指示されていない限り、相互に交換可能に使用することができ、天然に存在しているかまたは分子遺伝子操作技術を使用して選択された残基位置に特別に組み込まれたかにかかわらず、抗体の任意のシステイン（またはチオール含有）成分を意味し得る。ある特定の選択された実施形態において、遊離システインは、天然の鎖内または鎖間ジスルフィド架橋パートナーが置換され、除去されまたは他の方法で変化することにより生理学的条件下で天然に存在しているジスルフィド架橋が破壊され、それによって部位特異的コンジュゲーションに適切な不対システインとなっている、天然のシステインを含み得る。他の好ましい実施形態において、遊離または不対システインは、抗体の重鎖または軽鎖アミノ酸配列内の所定の部位に選択的に配置されているシステイン残基を含む。コンジュゲーションの前に、遊離または不対システインが、チオール（還元されたシステイン）として、キャッピングされたシステイン（酸化されている）としてまたは系の酸化状態に依存した同じ抗体上の別の遊離システインとの非天然分子内ジスルフィド結合（酸化されている）として、存在してもよいことが認識される。下記でより詳細に説明するように、この抗体構築物の穏やかな還元は、部位特異的コンジュゲーションに利用可能なチオールを提供する。特に好ましい実施形態において、遊離または不対システインは（天然に存在するものかまたは組み込まれたものかにかかわらず）、選択的還元とこの後のコンジュゲーションを受けて、均一なＤＡＲの組成物を提供する。
【００８２】
本開示の改変コンジュゲート調製物により示される好ましい特性は、コンジュゲーションの位置および組成物の絶対的ＤＡＲの観点からコンジュゲーションを詳細に指定し、作製されたコンジュゲートを大きく限定する能力に基づき、少なくとも部分的に、予測されるものであることが理解される。従来の多くのＡＤＣ調製物と異なり、本発明は、ランダムコンジュゲーション部位および比較的制御されていないＤＡＲ種を生成する抗体の部分的または完全な還元に完全に依拠する必要はない。むしろ、特定の態様において、本発明は、好ましくは、標的化抗体を改変して天然に存在する（つまり「未処理の（ｎａｔｉｖｅ）」）鎖内または鎖間ジスルフィド架橋の１つ以上を破壊することによりまたは任意の位置にシステイン残基を導入することにより、１つ以上の所定の不対（または遊離の）システイン部位を用意する。この目的のために、選択された実施形態において、システイン残基は、標準的分子遺伝子操作技術を使用して、抗体（またはそれらの免疫反応性断片）の重鎖もしくは軽鎖のいずれの場所に組み込まれてもよくまたは付加されてもよいことが理解される。他の好ましい実施形態において、天然ジスルフィド結合の破壊は、後にコンジュゲーション部位として使用され得る非天然システインの導入（後に遊離システインを含む）との組み合わせで行われ得る。
【００８３】
一実施形態において、遺伝子操作された抗体は、鎖内または鎖間システイン残基に少なくとも１つのアミノ酸欠失または置換を含む。本明細書で使用するとき、「鎖間システイン残基」は、抗体の軽鎖と重鎖との間または抗体の２つの重鎖間のいずれかの天然のジスルフィド結合に含まれるシステイン残基を意味し、一方で、「鎖内システイン残基」は、同じ重鎖または軽鎖内の別のシステインと天然に対をなしているシステイン残基である。一実施形態において、鎖間システイン残基の欠失または置換は、軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合の形成に関与している。別の実施形態において、システイン残基の置換または欠失は、２つの重鎖間のジスルフィド結合に関与している。典型的な実施形態において、軽鎖が重鎖のＶＨおよびＣＨ１ドメインと対形成しており、１つの重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインが相補的重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインと対形成している抗体の相補的な構造により、いずれかの軽鎖または重鎖の単一のシステインの変異または欠失によって、遺伝子操作された抗体における２つの不対システイン残基が生じる。
【００８４】
いくつかの実施形態において、鎖間システイン残基は欠失している。他の実施形態において、鎖間システインは、別のアミノ酸（例えば、天然アミノ酸）で置換されている。例えば、アミノ酸置換は、鎖間システインの、中性残基（例えば、セリン、スレオニンもしくはグリシン）または親水性残基（例えば、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンもしくはイソロイシン）での置き換えを生じ得る。一実施形態において、鎖間システインは、セリンと置き換えられている。
【００８５】
本発明で意図されるいくつかの実施形態において、欠失または置換システイン残基は、軽鎖（カッパまたはラムダのいずれか）上にあり、したがって重鎖上に遊離システインが残る。他の実施形態において、欠失または置換システイン残基は重鎖上にあり、軽鎖定常領域上に遊離のシステインを残す。アセンブリにおける無傷な抗体の軽鎖または重鎖のいずれかの単一システインの欠失または置換は、２つの不対システイン残基を有する部位特異的抗体をもたらすことが理解される。
【００８６】
一実施形態において、ＩｇＧ軽鎖（カッパまたはラムダ）の２１４位のシステイン（Ｃ２１４）が欠失または置換されている。別の実施形態において、ＩｇＧ重鎖の２２０位のシステイン（Ｃ２２０）が欠失または置換されている。さらなる実施形態において、重鎖の２２６位または２２９位のシステインが欠失または置換されている。一実施形態において、重鎖のＣ２２０がセリンに置換されて（Ｃ２２０Ｓ）、軽鎖に好ましい遊離システインをもたらす。別の実施形態において、軽鎖のＣ２１４がセリンに置換されて（Ｃ２１４Ｓ）、重鎖に好ましい遊離システインをもたらす。実施例１５においてこのような部位特異的構築物を示す。これらの構築物の概要を直下の表２に示す。ここで、ナンバリングは一般的にＫａｂａｔに示されるＥＵインデックスに従い、ＷＴは、「野生型」または天然の改変のない定常領域配列を表し、デルタ（Δ）はアミノ酸残基の欠失を指す（例えば、Ｃ２１４Δは、２１４位のシステインが欠失していることを示す）。
【００８７】
【表２】
2018529656.tif 000007
【００８８】
これに関して、また例示の目的のために、例示的抗体ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１の全長重鎖（配列番号９）および軽鎖（配列番号８）アミノ酸配列を直下に示す。カッパ軽鎖は、ｈＳＣ１６．５６抗体に見出される軽鎖と同一であるが、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１重鎖（配列番号９）は、以下の配列において下線および太字で示されるＣ２２０Ｓ突然変異を含む点がｈＳＣ１６．５６抗体における重鎖（配列番号７）と異なる。
【００８９】
【化５】
2018529656.tif 000008
【００９０】
【化６】
2018529656.tif 000009
【００９１】
システイン残基または遊離システインを提供するための残基を導入または付加する（天然のジスルフィド結合を破壊することとは対照的に）ことに関して、抗体または抗体断片上の適合する位置は、当業者によって容易に判別され得る。したがって、選択された実施形態において、システインは、所望のＤＡＲ、抗体構築物、選択されたペイロードおよび抗体標的に応じて、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメインまたはそれらの任意の組合せに導入され得る。他の好ましい実施形態において、システインは、カッパまたはラムダＣＬドメイン内に導入されてもよく、特に好ましい実施形態において、ＣＬドメインのｃ末端領域に導入されてもよい。それぞれの場合において、システインの挿入部位に近位の他のアミノ酸残基を変更、除去または置換して、分子の安定性、コンジュゲーションの効率性を促進させてもよくまたは一度付加されたペイロードに保護的環境を与えてもよい。特定の実施形態において、置換される残基は、抗体の任意の接触可能部位にある。このような表面残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基は、抗体が容易に接触可能な部位に配置され、本明細書でさらに記載されているように選択的に還元され得る。ある特定の実施形態において、置換される残基は、抗体の接触可能部位にある。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基は、抗体が接触可能な部位に配置され、抗体と選択的にコンジュゲートするために使用され得る。ある特定の実施形態において、以下の残基の任意の１つ以上が、システインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（Ｅｕ番号付け）；および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（Ｅｕ番号付け）。さらなる置換位置および適合する部位特異的抗体の作製方法は、その全体が本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，５２１，５４１に記載されている。
【００９２】
本明細書に記載されるような、定義された部位で抗体薬物コンジュゲートを生成するためのストラテジーと薬物負荷の化学量論は、抗体の保存された定常領域の遺伝子操作に主に関わるので、全ての抗ＤＬＬ３抗体に広く適用可能である。抗体の各クラスおよびサブクラスのアミノ酸配列および天然のジスルフィド結合は十分に文献に記載されているので、当業者は、様々なＤＬＬ３抗体の遺伝子操作された構築物を、過度の実験を必要とせずに容易に作製することができ、したがってこのような構築物は、本発明の範囲内にあるとして明確に意図されている。これは、本開示において示す重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む部位特異的構築物について特に当てはまる。
【００９３】
４．３．定常領域の修飾または改変された糖鎖結合
本発明の選択された実施形態は、定常領域（つまりＦｃ領域）の置換または修飾、例えば、限定されないが、アミノ酸残基の置換、変異および／または修飾を含んでもよく、この置換または修飾により、化合物に特徴、例えば、限定されないが、薬物動態の変化、血清半減期の延長、結合親和性の増加、免疫原性の減少、生産増加、ＦｃリガンドのＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合の変化、ＡＤＣＣまたはＣＤＣの増強または減少、糖鎖結合および／またはジスルフィド結合の変化ならびに結合特異性の変更がもたらされる。
【００９４】
改善されたＦｃエフェクター機能を有する化合物は、例えば、ＦｃドメインとＦｃ受容体との間の相互作用（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＢ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎ）に関与するアミノ酸残基の変化を通じて生成することができ、これにより、細胞毒性の増加および／または薬物動態の変化（血清半減期の延長など）が導かれ得る（例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；およびｄｅ  Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）を参照されたい。
【００９５】
選択された実施形態において、インビボ半減期が延長された抗体は、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与することが同定されたアミノ酸残基を修飾（例えば、置換、欠失または付加）することにより生成することができる（例えば、ＷＯ９７／３４６３１；ＷＯ０４／０２９２０７；Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，７３７，０５６およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００３／０１９０３１１を参照）。このような実施形態に関して、Ｆｃバリアントは、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、５日より長い、１０日より長い、１５日より長い、好ましくは２０日より長い、２５日より長い、３０日より長い、３５日より長い、４０日より長い、４５日より長い、２カ月より長い、３カ月より長い、４カ月より長いまたは５カ月より長い、半減期を与え得る。延長された半減期により血清力価が高くなり、従って、抗体の投与頻度を減少させるおよび／または投与される抗体の濃度を減少させる。インビボにおけるヒトＦｃＲｎへの結合およびヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現しているトランスジェニックマウスもしくはトランスフェクトされたヒト細胞株またはバリアントＦｃ領域を有するポリペプチドが投与された霊長類でアッセイされ得る。ＷＯ２０００／４２０７２は、ＦｃＲｎへの結合が向上したまたは減少した抗体バリアントを記載している。さらに、例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓら  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照。驚くべきことに、本発明の特定のＡＤＣは、任意選択の部位特異的コンジュゲートを得るために用いたもの以外の抗体定常領域の修飾なしに長い終末相半減期（例えば、２週間程度）を示す。
【００９６】
他の実施形態において、Ｆｃ改変により、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性の増強または低下が導かれ得る。当該分野で既知のように、ＣＤＣは、補体の存在下での標的細胞の溶解を指し、ＡＤＣＣは、細胞毒性の１形態を指し、ある特定の細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞、好中球およびマクロファージ）に存在するＦｃＲへ分泌Ｉｇが結合すると、これらの細胞毒性エフェクター細胞が抗原保有標的細胞に特異的に結合可能となり、この後、細胞毒により標的細胞が殺傷される。本発明の文脈において、抗体バリアントは、「改変された」ＦｃＲ結合親和性を有し、親もしくは非修飾抗体または天然のＦｃＲ配列を含む抗体と比較して、結合が増強または減少している。低下した結合を示すこのようなバリアントは、明らかな結合をほとんどまたは全く有さず、例えば、ＦｃＲに対する結合は、例えば当該技術分野で周知の技術で決定するとき、天然配列と比較して０〜２０％であり得る。他の実施形態において、バリアントは、天然の免疫グロブリンＦｃドメインと比較して増強された結合を示す。これらの種類のＦｃバリアントは、本開示の抗体の有効な抗新生物特性を増強するために有利に使用し得ることが理解される。さらに他の実施形態において、このような改変は、結合親和性の増加、免疫原性の減少、生産増加、糖鎖結合および／もしくはジスルフィド結合の変化（例えば、コンジュゲーション部位に対して）、結合特異性の変更、ファゴサイトーシスの増加および／または細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などを導く。
【００９７】
さらに他の実施形態は、１つ以上の遺伝子操作されたグリコフォーム、例えば、タンパク質（例えばＦｃドメイン中の）に共有結合されている改変された糖鎖結合パターンまたは改変された炭化水素組成を含む部位特異的抗体を含む。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ、Ｒ．Ｌ．ら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０を参照。遺伝子操作されたグリコフォームは、様々な目的、例えば、これらに限定されないが、エフェクター機能の増強または減少、標的に対する抗体の親和性の増加または抗体の産生促進のために有用であり得る。ある特定の実施形態において、エフェクター機能の減少が所望される場合、分子を遺伝子操作してアグリコシル化された形態を発現させ得る。１つ以上の可変領域フレームワーク糖鎖結合部位の消去に至り得る置換、したがってこの部位での糖鎖結合を消去し得る置換は、周知である（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，７１４，３５０および６，３５０，８６１参照）。逆に、増強されたエフェクター機能または改善された結合が、１つ以上のさらなる糖鎖結合部位の遺伝子操作によって、Ｆｃ含有分子に付与されてもよい。
【００９８】
他の実施形態としては、改変された糖鎖組成を有するＦｃバリアント、例えば、フコシル残基の量が減少している低フコシル化抗体または二分化ＧｌｃＮＡｃ構造が増加している抗体が挙げられる。このような改変された糖鎖結合パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を向上させることが実証されている。遺伝子操作されたグリコフォームは、当業者に公知の任意の方法により、例えば、遺伝子操作されたまたはバリアント発現系統を使用することにより、１つ以上の酵素（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））の共発現により、様々な生物または様々な生物由来の細胞株にＦｃ領域を含む分子を発現させることにより、またはＦｃ領域を含む分子を発現させた後で炭水化物を修飾することにより（例えば、ＷＯ２０１２／１１７００２参照）、生成され得る。
【００９９】
４．４．断片
本発明の実施のためにどの形態の抗体（例えば、キメラ、ヒト化など）を選択したかにかかわらず、免疫反応断片を、それ自体でまたは抗体薬物コンジュゲートの一部として、本明細書の教示に従って使用し得ることが理解される。「抗体断片」は、無傷な抗体の少なくとも１部を含む。本明細書で使用するとき、抗体分子の「断片」という用語は、抗体の抗原結合断片を含んでおり、用語「抗原結合断片」は、選択された抗原またはこの免疫原性断片に免疫特異的に結合または反応し、この断片が由来する無傷抗体と特異的な抗原結合について競合する免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチド断片を指す。
【０１００】
例示的な部位特異的断片としては、可変軽鎖断片（ＶＬ）、可変重鎖断片（ＶＨ）、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単一ドメイン抗体断片、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子および抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。さらに、活性部位特異的断片は、抗原／基質または受容体と相互作用する能力を維持し、無傷抗体と同様の様式でそれらを修飾する（ただしおそらくはやや効率が劣る）、抗体の部分を含む。このような抗体断片は、本明細書に記載されるような１つ以上の遊離システインを含むようにさらに遺伝子操作されてもよい。
【０１０１】
他の実施形態において、抗体断片は、Ｆｃ領域を含む断片であって、Ｆｃ領域が無傷抗体に存在しているときに通常伴われる少なくとも１つの生物学的機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能および補体結合を維持している断片である。一実施形態において、抗体断片は、無傷抗体と実質的に同様のインビボ半減期を有する一価抗体である。例えば、このような抗体断片は、断片にインビボ安定性を付与することが可能な少なくとも１つの遊離システインを含むＦｃ配列に連結された抗原結合アームを含んでもよい。
【０１０２】
当業者であれば十分に認識されるように、断片は、分子遺伝子操作技術によりまたは無傷のもしくは完全な抗体または抗体鎖の、化学的処理もしくは酵素的処理（例えばパパインもしくはペプシン）を介して、あるいは組み換え手段により、取得することができる。抗体断片のより詳細な説明は、例えばＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９９）を参照。
【０１０３】
４．５．多価構築物
他の実施形態において、本発明の抗体およびコンジュゲートは、一価または多価（例えば、二価、三価など）であり得る。本明細書で使用するとき、用語「価数」は、抗体に関連した可能な標的結合部位の数を指す。各標的結合部位は、標的分子上の１つの標的分子または特異的位置もしくは座位（ｌｏｃｕｓ）に特異的に結合する。抗体が一価であるとき、分子の各結合部位は、単一抗原位置またはエピトープで特異的に結合する。抗体が２つ以上の標的結合部位（多価）を含むとき、各標的結合部位は同じまたは異なる分子に特異的に結合してもよい（例えば、異なるリガンドもしくは異なる抗原または同じ抗原上の異なるエピトープもしくは位置に結合してもよい）。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００９／０１３０１０５を参照。
【０１０４】
一実施形態において、抗体は、二重特異的抗体であり、２つの鎖が、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：５３７−５３９に記載されるように、異なる特異性を有している。他の実施形態には、さらなる特異性を有する抗体、例えば三重特異的抗体が含まれる。他のより精巧な適合する多重特異的構築物およびそれらの作製方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００９／０１５５２５５ならびにＷＯ９４／０４６９０；Ｓｕｒｅｓｈら、１９８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１：２１０およびＷＯ９６／２７０１１に記載されている。
【０１０５】
多価抗体は、所望の標的分子の異なるエピトープに免疫特異的に結合することができるか、または異種性ポリペプチドもしくは固形支持材料のような標的分子と異種性エピトープとの両方に免疫特異的に結合することができる。選択された実施形態は２つの抗原にのみ結合することができる（つまり、二重特異的抗体である）が、さらなる特異性を有する抗体、例えば三重特異的抗体も本発明に包含される。二重特異的抗体には、架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体も含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の１つはアビジンに結合することができ、他方はビオチンに結合することができる。このような抗体は、例えば、不要な細胞に対して免疫系細胞を標的化させるために（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，６７６，９８０）およびＨＩＶ感染の治療のために（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３およびＥＰ０３０８９）提唱されてきた。ヘテロコンジュゲート抗体は、いずれかの都合のよい架橋方法を使用して作製することができる。適切な架橋剤は当該技術分野で周知であり、いくつかの架橋技術と共にＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，６７６，９８０に開示されている。
【０１０６】
５．抗体の組換え産生
抗体およびそれらの断片は、抗体産生細胞および組換え技術から得られた遺伝子材料を使用して作製または修飾されてもよい（例えば、Ｄｕｂｅｌ  ａｎｄ  Ｒｅｉｃｈｅｒｔ（編）（２０１４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ＧｍｂＨ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（編）（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、ＮＹ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００２）Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７０９，６１１を参照）。
【０１０７】
本発明の別の態様は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞、細胞溶解物または部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、他の細胞成分または他の混入物、例えば、他の細胞核酸もしくはタンパク質から、標準技術、例えば、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当該技術分野で周知の他のものを使用して分離されるとき、「単離される」または実質的に純粋にされる。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）、ＲＮＡおよびこの人為的バリアント（例えば、ペプチド核酸）であり得、一本鎖もしくは二本鎖またはＲＮＡ、ＲＮＡであってもよく、イントロンを含んでも含まなくてもよい。選択された実施形態において、核酸はｃＤＮＡ分子である。
【０１０８】
本発明の核酸は、標準的な分子生物学的技術を使用して得られ得る。ハイブリドーマ（例えば、下記実施例に記載された調製されるハイブリドーマ）により発現される抗体については、抗体の軽鎖および重鎖をコードしているｃＤＮＡは、標準的ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術によって得られ得る。免疫グロブリン遺伝子ライブラリから（例えば、ファージディスプレイ技術を使用して）得られる抗体については、抗体をコードしている核酸が、ライブラリから収集され得る。
【０１０９】
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードしているＤＮＡ断片は、標準的組換えＤＮＡ技術によりさらに操作され、例えば、可変領域遺伝子を、完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換することができる。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨをコードしているＤＮＡ断片は、別のタンパク質またはタンパク質断片、例えば、抗体定常領域またはフレキシブルリンカーをコードしている別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。用語「作動可能に連結される」は、この文脈で使用される場合、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように２つのＤＮＡ断片が連結されていることを意味する。
【０１１０】
ＶＨ領域をコードしている単離されたＤＮＡは、重鎖定常領域（ＩｇＧ１の場合は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子にＶＨコードＤＮＡを作動可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔら、（１９９１）（前掲））、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲ増幅により取得され得る。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であり得るが、最も好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。例示的ＩｇＧ１定常領域は、配列番号２に示される。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子に関して、ＶＨコードＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードしている別のＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。
【０１１１】
ＶＬ領域をコードしている単離されたＤＮＡは、軽鎖定常領域ＣＬをコードしている別のＤＮＡ分子にＶＬコードＤＮＡを作動可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔら、（１９９１）（前掲））、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲ増幅によって取得され得る。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域であり得るが、最も好ましくはカッパ定常領域である。例示的な適合するカッパ軽鎖定常領域は、配列番号５に示されている。
【０１１２】
本明細書において、本発明のポリペプチドに対する「配列同一性」、「配列類似性」または「配列相同性」を示すある特定のポリペプチド（例えば、抗原または抗体）が検討される。例えば、誘導されたヒト化抗体ＶＨまたはＶＬドメインは、ソース（例えば、マウス）またはアクセプター（例えば、ヒト）ＶＨまたはＶＬドメインと配列類似性を示し得る。「相同」ポリペプチドは、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％の配列同一性を示し得る。他の実施形態において、「相同」ポリペプチドは、９３％、９５％または９８％の配列同一性を示し得る。他の実施形態において、「相同」ポリペプチドは、９３％、９５％または９８％の配列同一性を示し得る。本明細書で使用するとき、２つのアミノ酸配列間の相同性パーセントは、２つの配列間の同一性パーセントと同等である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一の位置の数の関数であり（つまり、％相同性＝同一位置の数／位置の合計数×１００）、２つの配列の最適な整列のために導入することが必要なギャップの数と各ギャップの長さが考慮に入れられる。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、下記の非限定的実施例に記載されるように、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。
【０１１３】
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８））を使用し、ＰＡＭ１２０ウェイト残基テーブル（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ・レングス・ペナルティ、４のギャップペナルティを使用して決定され得る。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））を使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスならびに１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ・ウェイトおよび１、２、３、４、５または６のレングス・ウェイトを使用して決定され得る。
【０１１４】
さらに、またはあるいは、本発明のタンパク質配列を、例えば関連する配列を同定するために、「クエリー配列」として使用して、公的データベースに対して検索を行ってもよい。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施され得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明の抗体分子に相同なアミノ酸配列を取得するために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３を用いて実施されてもよい。比較のためのギャップありアラインメントを取得するために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されているように利用されてもよい。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用するときは、対応するプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用されてもよい。
【０１１５】
同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換また非保存的アミノ酸置換によって異なり得る。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）の側鎖を有する別のアミノ酸残基によって置換されている置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、置換の保存的性質について訂正するために、配列同一性パーセントまたは類似度を上昇するように調整してもよい。ポリペプチドが配列同一性を示す実施形態において、非保存的アミノ酸による置換が存在する場合、これは、本発明のポリペプチド（例えば、抗体）の所望の機能または活性を保持する。
【０１１６】
本発明の核酸に対して「配列同一性」、「配列類似性」または「配列相同性」を示す核酸も、本明細書で検討される。「相同配列」は、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％の配列同一性を示す核酸分子の配列を意味する。他の実施形態において、核酸の「相同配列」は、参照核酸に対して、９３％、９５％または９８％の配列同一性を示し得る。
【０１１７】
本発明は、プロモーターに作動可能に連結されていてもよい上記に記載されたこのような核酸（例えば、ＷＯ８６／０５８０７；ＷＯ８９／０１０３６；およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，１２２，４６４参照）と、真核生物分泌経路の他の転写調節およびプロセシング制御エレメントとを含むベクターも提供する。本発明は、これらのベクターを包含する宿主細胞および宿主発現系も提供する。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、用語「宿主発現系」は、本発明の核酸、またはポリペプチドおよび抗体のいずれかを生成するように遺伝子操作することができる任意のタイプの細胞系を含む。このような宿主発現系としては、これらに限定されないが、組換えバクテリオファージＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトされた微生物（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））；組換え酵母発現ベクターでトランスフェクトされた酵母（例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ））または哺乳動物細胞もしくはウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター）のゲノムに由来するプロモーターを含有する組換え発現構築物を包含する哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ−Ｓ、ＨＥＫ−２９３Ｔ、３Ｔ３細胞）が挙げられる。宿主細胞は、２つの発現ベクター、例えば、重鎖由来ポリペプチドをコードしている第１のベクターおよび軽鎖由来ポリペプチドをコードしている第２のベクターでコトランスフェクトされていてもよい。本発明のとりわけ好ましい態様において、本開示の抗体は、遺伝子操作されたＣＨＯ細胞を用いて産生される。
【０１１９】
哺乳動物細胞を形質転換する方法は当該技術分野で周知である。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，３９９，２１６、４，９１２，０４０、４，７４０，４６１および４，９５９，４５５参照。宿主細胞は、様々な特徴を有する抗原結合分子の産生を可能にするように遺伝子操作されていてもよい（例えば、修飾グリコフォームまたはＧｎＴＩＩＩ活性を有するタンパク質）。
【０１２０】
組換えタンパク質の長期的な高収率生産のために、安定な発現が好ましい。したがって、選択された抗体を安定に発現する細胞株は、当該技術分野で認識されている標準技術を使用して遺伝子操作されてもよく、本発明の一部を形成する。ウイルス複製起源を含有する発現ベクターを使用せずに、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位など）および選択可能マーカーにより制御されたＤＮＡで形質転換されてもよい。当該技術分野で周知の選択系のいずれも使用することができ、例えば、選択された条件下で発現を増強する効率的なアプローチを提供するグルタミン合成酵素遺伝子発現系（ＧＳ系）を使用してもよい。ＧＳ系は、全体的または部分的に、ＥＰ０２１６８４６、ＥＰ０２５６０５５、ＥＰ０３２３９９７およびＥＰ０３３８８４１ならびにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，５９１，６３９および５，８７９，９３６に関連して述べられている。安定な細胞株の開発のための別の適合する発現系は、Ｆｒｅｅｄｏｍ（商標）ＣＨＯ−Ｓキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。
【０１２１】
本発明の抗体が、組換え発現または任意の他の本開示の技術で産生されたら、当該技術分野で公知の方法で精製または単離してもよく、これにより抗体は、同定され、それらの天然環境から分離および／もしくは回収され、抗体または関連ＡＤＣの診断的または治療的用途に干渉する混入物から分離される。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイチュの抗体が含まれる。
【０１２２】
これらの単離された調製物は、当該技術分野で認識されている様々な技術、例えば、イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィー、透析、ダイアフィルトレーションおよび親和性クロマトグラフィー、特にタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ親和性クロマトグラフィーを使用して精製されてもよい。下記の実施例において、適合する方法をより詳細に説明する。
【０１２３】
６．産生後選択
得られる方法にかかわらず、抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマ、酵母コロニーなど）は選択され、クローン化され、所望の特徴、例えば、堅固な成長、抗体高産生および目的の抗原に対する高い親和性などの望ましい抗体特徴のためにさらにスクリーニングされてもよい。ハイブリドーマは、細胞培養においてインビトロでまたは同系遺伝子免疫無防備状態動物においてインビボで拡大増殖させることができる。ハイブリドーマおよび／またはコロニーを選択、クローニングおよび拡大増殖する方法は、当業者に周知である。所望の抗体が同定されたら、当該技術分野で認識されている一般的な分子生物学および生化学的技術を使用して、関連する遺伝子材料を単離、操作および発現させてもよい。
【０１２４】
ナイーブなライブラリ（天然または合成のいずれか）で産生された抗体は、中程度の親和性（約１０６から１０７Ｍ−１のＫａ）を有する抗体であり得る。親和性を増加させるために、親和性成熟が、抗体ライブラリの構築（例えば、エラープローンポリメラーゼを使用したインビトロでのランダム変異の導入による）および抗原に対して高親和性を有する抗体の第２ライブラリからの再選択（例えば、ファージまたは酵母ディスプレイの使用による）により、インビトロで模倣されてもよい。ＷＯ９６０７７５４は、軽鎖遺伝子のライブラリを作成するために、免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲに変異誘発を誘導する方法を記載している。
【０１２５】
様々な技術が、抗体を選択するために使用され得、例えば、これらに限定されないが、ヒトコンビナトリアル抗体またはｓｃＦｖ断片のライブラリがファージまたは酵母で合成されるファージまたは酵母ディスプレイを使用でき、このライブラリを、目的の抗原またはその抗体結合部分でスクリーニングし、この抗原に結合するファージまたは酵母を単離して、これらから抗体または免疫反応性断片を得てもよい（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６、ＰＭＩＤ：９６３０８９１；Ｓｈｅｅｔｓら、１９９８、ＰＭＩＤ：９６００９３４；Ｂｏｄｅｒら、１９９７、ＰＭＩＤ：９１８１５７８；Ｐｅｐｐｅｒら、２００８、ＰＭＩＤ：１８３３６２０６）。ファージまたは酵母ディスプレイライブラリを生成するためのキットは市販されている。抗体ディスプレイライブラリの生成およびスクリーニングに使用され得る他の方法および試薬もある（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，２２３，４０９；ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／０９６９０；およびＢａｒｂａｓら、１９９１、ＰＭＩＤ：１８９６４４５参照）。このような技術は、好都合にも、多数の候補抗体のスクリーニングを可能にし、配列の比較的簡単な操作を提供する（例えば、組換えシャッフリングによる）。
【０１２６】
ＩＶ．抗体の特徴
ある特定の実施形態において、抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマ、酵母コロニーなど）は、選択され、クローン化され、ならびに好ましい特性、例えば、堅固な成長、抗体高産生および下記に詳細に記載されるような望ましい部位特異的抗体特徴のために、さらにスクリーニングされてもよい。他の場合において、抗体の特徴は、動物への接種のために、特定の抗原（例えば、特異的ＤＬＬ３アイソフォーム）または標的抗原の免疫応答性断片を選択することによって付与されてもよい。さらに他の実施形態において、選択された抗体を、上記のように遺伝子操作して、免疫化学的特徴、例えば親和性または薬物動態を増強または向上させてもよい。
【０１２７】
Ａ．中和抗体
特定の実施形態において、コンジュゲートは、「中和」抗体またはそれらの誘導体もしくは断片を含む。すなわち、本発明は、特異的ドメイン、モチーフまたはエピトープに結合し、ＤＬＬ３の生物学的活性をブロックするか、低下させるかまたは阻害することができる抗体分子を含み得る。より一般的には、「中和抗体」という用語は、標的分子またはリガンドに結合するかまたは相互作用し、受容体または基質のような結合パートナーへの標的分子の結合または会合を妨げ、これにより、中和抗体がなければ分子の相互作用から生じるはずの生物学的反応を中断する抗体を意味する。
【０１２８】
当該技術分野で公知の競合結合アッセイを用いて、抗体またはこの免疫学的に機能的な断片もしくは誘導体の結合および特異性を評価することができることが理解される。本発明に関して、過剰量の抗体が、ＤＬＬ３に結合する結合パートナーの量を、（例えばＮｏｔｃｈ受容体活性によりまたはインビトロ競合結合アッセイにより測定した場合に）少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはより多く減少させる場合、この抗体または断片は、ＤＬＬ３が結合パートナーまたは基質に結合することを阻害し続けるかまたは減少させ続ける。例えば、ＤＬＬ３に対する抗体の場合、中和抗体またはアンタゴニストは、好ましくはＮｏｔｃｈ受容体活性を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはそれ以上変化させる。この修飾された活性は、当該技術分野で認識されている技術を使用して直接的に測定され得るか、または変化した活性が下流で有する影響（例えば、腫瘍形成、細胞生存またはＮｏｔｃｈ応答性遺伝子の活性化もしくは抑制）により測定され得ることが、理解される。好ましくは、ＤＬＬ３活性を中和する抗体の能力は、Ｎｏｔｃｈ受容体へのＤＬＬ３の結合の阻害によりまたはＮｏｔｃｈシグナル伝達のＤＬＬ３媒介抑制を解除する抗体の能力を評価することにより評価される。
【０１２９】
Ｂ．内在化抗体
ある特定の実施形態において、抗体は、抗体が決定因子と結合し、腫瘍形成性細胞のような選択された標的細胞に内在化される（任意のコンジュゲートされた医薬活性成分を伴う）ような、内在化抗体を含み得る。内在化する抗体分子の数は、抗原発現細胞、特に、抗原発現腫瘍形成性細胞を殺傷するのに十分であり得る。抗体または一部の場合には抗体薬物コンジュゲートの効力に応じて、単一抗体分子の細胞への取込みが、抗体が結合する標的細胞を殺傷するために十分であり得る。本発明に関連して、発現されたＤＬＬ３タンパク質の実質的な部分が腫瘍形成性細胞表面に会合して残り、それにより本開示の抗体またはＡＤＣの局在化および内在化を可能にしているという証拠がある。選択された実施形態において、このような抗体は、内在化に際して細胞を殺傷する１つ以上の薬物と会合するかまたはコンジュゲートする。いくつかの実施形態において、本発明のＡＤＣは、内在化部位特異的ＡＤＣを含む。
【０１３０】
本明細書で使用されるとき、「内在化する」抗体は、関連する決定因子に結合する際に、標的細胞によって（任意のコンジュゲートされた細胞毒と共に）取り込まれる抗体を指す。このような内在化するＡＤＣの数は、決定因子発現細胞、特に、決定因子発現がん幹細胞を殺傷するのに十分であることが好ましい。細胞毒またはＡＤＣの全体としての効力に応じて、一部の場合に、抗体の数分子の細胞内への取込みが、抗体が結合する標的細胞を殺傷するために十分である。例えば、ＰＢＤまたはカリケアマイシンのようなある特定の薬物は強力であるため、抗体にコンジュゲートされた毒素の数分子の内在化が、腫瘍細胞を殺傷するために十分である。抗体が哺乳類細胞に結合して内在化するかどうかは、当該技術分野で認識されている様々なアッセイ（例えば、Ｍａｂ−ＺａｐおよびＦａｂ−Ｚａｐのようなサポリンアッセイ；アドバンストターゲティングシステム）により決定され得る。抗体が細胞に内在化するかどうかを検出する方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，６１９，０６８にも記載されている。
【０１３１】
Ｃ．枯渇抗体
他の実施形態において、本発明の抗体は枯渇抗体である。用語「枯渇」抗体は、好ましくは細胞表面上または細胞表面近傍で抗原に結合し、（例えば、ＣＤＣ、ＡＤＣＣまたは細胞毒性剤の導入により）細胞の死を誘導するか、促進するかまたは生じさせる抗体を指す。実施形態において、選択された枯渇抗体は、細胞毒にコンジュゲートされている。
【０１３２】
好ましくは、枯渇抗体は、定義された細胞集団におけるＤＬＬ３発現細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％を殺傷することができる。いくつかの実施形態において、細胞集団は、富化されたか、区分されたか、精製されたかまたは単離された腫瘍形成性細胞、例えば、がん幹細胞を含み得る。他の実施形態において、細胞集団は、全腫瘍試料またはがん幹細胞を含む異種性腫瘍抽出物を含み得る。標準的な生化学的技術が使用され、腫瘍形成性細胞の枯渇が、本明細書に記載の技術に従ってモニタリングおよび定量されてもよい。
【０１３３】
Ｄ．結合親和性
本明細書において、特定の決定因子、例えば、ＤＬＬ３に対して高い結合親和性を有する抗体が開示される。用語「ＫＤ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数または見かけの親和性を指す。本発明の抗体は、解離定数ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が≦１０−７Ｍであるとき、その標的抗原に免疫特異的に結合することができる。抗体は、ＫＤが≦５×１０−９Ｍであるとき、高親和性で抗原に特異的に結合し、ＫＤが≦５×１０−１０Ｍであるとき、非常に高い親和性で抗原に特異的に結合する。本発明の一実施形態において、抗体は、≦１０−９ＭのＫＤと、約１×１０−４／秒の解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を有する。本発明の一実施形態において、解離速度は、＜１×１０−５／秒である。本発明の他の実施形態において、抗体は、約１０−７Ｍから１０−１０ＭのＫＤで決定因子に結合し、さらに別の実施形態において、ＫＤ≦２×１０−１０Ｍで決定因子に結合する。本発明のさらに他の選択された実施形態は、１０−６Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１５Ｍ未満または５×１０−１５Ｍ未満のＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を有する抗体を含む。
【０１３４】
ある特定の実施形態において、決定因子、例えば、ＤＬＬ３に免疫特異的に結合する本発明の抗体は、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも２×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１または少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１の会合速度定数またはｋｏｎ（またはｋａ）速度（抗体＋抗原（Ａｇ）ｋｏｎ←抗体−Ａｇ）を有し得る。
【０１３５】
別の実施形態において、決定因子、例えば、ＤＬＬ３に免疫特異的に結合する本発明の抗体は、１０−１ｓ−１未満、５×１０−１ｓ−１未満、１０−２ｓ−１未満、５×１０−２ｓ−１未満、１０−３ｓ−１未満、５×１０−３ｓ−１未満、１０−４ｓ−１未満、５×１０４ｓ−１未満、１０−５ｓ−１未満、５×１０−５ｓ−１未満、１０−６ｓ−１未満、５×１０−６ｓ−１未満、１０−７ｓ−１未満、５×１０−７ｓ−１未満、１０−８ｓ−１未満、５×１０−８ｓ−１未満、１０−９ｓ−１未満、５×１０−９ｓ−１未満または１０−１０ｓ−１未満の解離速度定数またはｋｏｆｆ（またはｋｄ）速度（抗体＋抗原（Ａｇ）ｋｏｆｆ←抗体−Ａｇ）を有し得る。
【０１３６】
結合親和性は、当該技術分野で公知の様々な技術、例えば、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、二面偏波式干渉法、静的光散乱法、動的光散乱法、等温滴定型カロリメトリー、ＥＬＩＳＡ、超遠心分析法およびフローサイトメトリを使用して決定され得る。
【０１３７】
Ｅ．ビニング（Ｂｉｎｎｉｎｇ）およびエピトープマッピング
本明細書に本開示の抗体は、それらが会合する個別のエピトープの観点で性質決定することができる。「エピトープ」は、抗体または免疫反応性断片が特異的に結合する決定因子の部分である。免疫特異的結合は、上記の結合親和性に基づいてまたはタンパク質および／もしくは巨大分子の複雑な混合物における（例えば、競合アッセイにおける）その標的抗原の抗体による優先的な認識により、確認し、定義することができる。「線形エピトープ」は、抗体の免疫特異的結合を可能にする、抗原における連続的アミノ酸により形成される。線形エピトープに優先的に結合する能力は、一般に、抗原が変性されたときでも維持される。逆に、「立体エピトープ」は、通常、抗原のアミノ酸配列における非連続的アミノ酸であるが、抗原の二次的、三次的または四次的構造の概念において、単一の抗体に同時に結合されるために十分に近接している非連続的アミノ酸を含む。立体エピトープを有する抗原が変性されたとき、抗体は通常、もはや抗原を認識しない。エピトープ（連続的または非連続的）は、特有の空間的立体配置に、通常少なくとも３個、より一般的には少なくとも５個または８〜１０個または１２〜２０個のアミノ酸を含む。
【０１３８】
本発明の抗体は、それらが属する群または「ビン（ｂｉｎ）」の観点で性質決定することもできる。「ビニング」は、免疫原性決定因子に同時に結合することができない抗体の対を同定し、それによって結合について「競合する」抗体を同定する、競合的抗体結合アッセイの使用を指す。抗体の競合は、試験される抗体または免疫学的に機能的な断片が、共通の抗原に対する参照抗体の特異的結合を予防または阻害するアッセイによって決定され得る。そのようなアッセイは典型的には、固体表面または細胞、非標識試験抗体および標識参照抗体に結合した精製抗原（例えば、ＤＬＬ３またはこのドメインもしくは断片）の使用が含まれる。競合阻害は、試験抗体の存在下に固体表面または細胞に結合したラベルの量を決定することにより測定される。競合的結合を決定するための方法に関するさらなる詳細は、本明細書に記載の実施例で提供される。通常、競合抗体が過剰に存在するとき、競合抗体は、参照抗体の共通抗原に対する特異的な結合を、少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％阻害する。いくつかの例において、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９７％以上阻害される。逆に、参照抗体が結合しているとき、参照抗体は、後で添加する試験抗体（つまり、ＤＬＬ３抗体）の結合を、好ましくは、少なくとも、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％阻害する。いくつかの例において、試験抗体の結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９７％以上阻害される。
【０１３９】
一般に、ビニングまたは競合結合は、当該技術分野で認識されている様々な技術、例えば、イムノアッセイ、例えば、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定アッセイ、蛍光イムノアッセイおよびタンパク質Ａイムノアッセイを使用して決定され得る。このようなイムノアッセイは慣用されており、当該技術分野で周知である（Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。さらに、交差ブロックアッセイを使用することができる（例えば、ＷＯ２００３／４８７３１；およびＨａｒｌｏｗら（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ参照）。
【０１４０】
競合的阻害（したがって「ビン」）を決定するために使用される他の技術としては、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した表面プラズモン共鳴；例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用したバイオレイヤー干渉法；または、例えば、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）もしくはマルチプレックスＬＵＭＩＮＥＸ（商標）検出アッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用したフローサイトメトリビーズアレイが挙げられる。
【０１４１】
Ｌｕｍｉｎｅｘは、大規模マルチプレックス抗体対合を可能にするビーズベースのイムノアッセイプラットフォームである。アッセイは、抗体の対の標的抗原への同時結合パターンを比較する。抗体の対の１つ（捕捉ｍＡｂ）がＬｕｍｉｎｅｘビーズに結合し、一方でそれぞれの捕捉ｍＡｂは異なる色のビーズに結合する。他の抗体（検出因子ｍＡｂ）は、蛍光シグナル（例えば、フィコエリトリン（ＰＥ））に結合する。アッセイは、抗原に対する抗体の同時結合（対合）を解析し、同様の対合プロファイルを有する抗体とともに群分けする。検出因子ｍＡｂと捕捉ｍＡｂの同様のプロファイルは、２つの抗体が同じまたは密接に関連したエピトープに結合することを示す。一実施形態において、対合プロファイルは、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数を使用して決定され、試験される一連の抗体の任意の特定の抗体に最も密接に相関する抗体を同定することができる。実施形態において、抗体の対のＰｅａｒｓｏｎ相関係数が少なくとも０．９である場合、試験／検出因子ｍＡｂは、参照／捕捉ｍＡｂと同じビンにあると決定される。他の実施形態において、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数は、少なくとも０．８、０．８５、０．８７または０．８９である。さらなる実施形態において、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数は、少なくとも０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９または１である。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイから得られたデータを解析する他の方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．８，５６８，９９２に記載されている。同時に１００種類（またはそれ以上）の異なるビーズを解析するＬｕｍｉｎｅｘの能力により、ほぼ無制限の抗原および／または抗体表面が用意され、バイオセンサーアッセイ上の抗体エピトーププロファイリングにおいて改善された処理能力および解像度がもたらされる（Ｍｉｌｌｅｒら、２０１１、ＰＭＩＤ：２１２２３９７０）。
【０１４２】
同様に、表面プラズモン共鳴を含むビニング技術は、本発明に適合する。本明細書で使用されるとき、「表面プラズモン共鳴」は、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することにより、特異的相互作用のリアルタイム解析を可能にする光学的現象を指す。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００システムのような市販の機器を使用して、選択された抗体が、定義された抗原に対する結合に関して互いに競合するかを容易に決定することができる。
【０１４３】
他の実施形態において、試験抗体が結合に関して参照抗体と「競合する」かを決定するために使用し得る技術は「バイオレイヤー干渉法」である。この干渉法は、２つの表面、つまりバイオセンサーチップ上に固定化されたタンパク質の層および内部参照層から反射される白色光の干渉パターンを解析する光学的解析技術である。バイオセンサーチップに結合した分子の数の任意の変化は、リアルタイムで測定され得る干渉パターンのシフトを引き起こす。このようなバイオレイヤー干渉法アッセイは、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ機器を使用して以下のように実施され得る。参照抗体（Ａｂ１）を、抗マウス捕捉チップ上に捕捉させ、次いで、高濃度の非結合抗体を使用して、チップをブロックし、ベースラインを収集する。単量体の組換え標的タンパク質を、次いで特異的抗体（Ａｂ１）に捕捉させ、チップを対照と同じ抗体（Ａｂ１）を含むウェル中または異なる試験抗体（Ａｂ２）を含むウェル中に浸漬させる。結合レベルを対照Ａｂ１と比較して決定して、さらなる結合が生じない場合、Ａｂ１およびＡｂ２は「競合する」抗体と決定される。Ａｂ２でさらなる結合が観察された場合、Ａｂ１およびＡｂ２は互いに競合しないと決定される。このプロセスは、固有のビンを示す９６ウェルのプレート中の抗体の完全な列を使用して、固有の抗体の大きなライブラリをスクリーニングするために拡大され得る。実施形態において、参照抗体が共通の抗原に対する試験抗体の特異的結合を少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％阻害する場合、試験抗体は参照抗体と競合する。他の実施形態において、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９７％以上阻害される。
【０１４４】
競合抗体の群を包含するビンが定義されたら、この抗体の群が結合する抗原上の特異的ドメインまたはエピトープを決定するために、さらなる性質決定を実施してもよい。ドメイン−レベルエピトープマッピングは、Ｃｏｃｈｒａｎら、２００４、ＰＭＩＤ：１５０９９７６３に記載されているプロトコールを改変して使用することにより実施され得る。ファインエピトープマッピングは、抗体が結合する決定因子のエピトープを含む抗原上の特異的アミノ酸を決定するプロセスである。
【０１４５】
ある特定の実施形態において、ファインエピトープマッピングは、ファージまたは酵母ディスプレイを使用して実施することができる。他の適合エピトープマッピング技術としては、アラニンスキャニング変異体、ペプチドブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ、２００４、ＰＭＩＤ：１４９７０５１３）またはペプチド切断解析が挙げられる。さらに、エピトープ除去、エピトープ抽出および抗原の化学的修飾のような方法（Ｔｏｍｅｒ、２０００、ＰＭＩＤ：１０７５２６１０）も、タンパク分解酵素のような酵素（例えば、トリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、キモトリプシンなど）；スクシンイミジルエステルおよびそれらの誘導体、一級アミン含有化合物、ヒドラジンおよびカルボヒドラジン、遊離アミノ酸のような化学物質を使用して利用することができる。別の実施形態において、抗原構造ベースの抗体プロファイリング（Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ、ＡＳＡＰ）としても公知の修飾補助プロファイリング（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）を使用して、化学的または酵素的に修飾された抗原表面に対する各抗体の結合プロファイルの類似性に従って、同じ抗原に向かう多数のモノクローナル抗体を分類することができる（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００４／０１０１９２０）。
【０１４６】
抗原上の所望のエピトープが決定されたら、このエピトープに対するさらなる抗体を、例えば、本明細書に記載の技術を使用して、選択されたエピトープを含むペプチドで免疫化することにより、生成することができる。
【０１４７】
Ｖ．抗体コンジュゲート
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、医薬として活性なまたは診断的成分とコンジュゲートして、「抗体薬物コンジュゲート」（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）または「抗体コンジュゲート」を形成し得る。用語「コンジュゲート」は広義に使用され、会合の方法に関わらず、任意の医薬として活性なまたは診断的成分と本発明の抗体との共有結合的または非共有結合的会合を意味する。ある特定の実施形態において、この会合は、抗体のリシンまたはシステイン残基を通じて達成される。いくつかの実施形態において、医薬として活性なまたは診断的成分は、１つ以上の部位特異的な遊離システインを介して抗体にコンジュゲーションされ得る。本開示のＡＤＣは、治療および診断目的のために使用され得る。
【０１４８】
本発明のＡＤＣを使用して、細胞毒または他のペイロードを、標的位置（例えば、腫瘍形成性細胞および／またはＤＬＬ３を発現している細胞）に送達し得る。本明細書で使用される場合、用語「薬物」または「ワーヘッド（ｗａｒｈｅａｄ）」は相互に交換可能に使用でき、生物学的に活性なまたは検出可能な分子もしくは薬物、例えば、下記に記載された抗がん剤および細胞毒を意味する。「ペイロード」は、任意選択のリンカー化合物と組み合わせた薬物または「ワーヘッド」を含み得る。コンジュゲート上の「ワーヘッド」は、ペプチド、タンパク質またはインビボで代謝されて活性薬剤となるプロドラッグ、ポリマー、核酸分子、小分子、結合剤、模倣剤、合成薬物、無機分子、有機分子および放射性同位体を含み得る。有利な実施形態において、本開示のＡＤＣは、結合したペイロードを、ワーヘッドの放出および活性化の前に、比較的非反応性の非毒性の状態で標的部位に向かわせる。ワーヘッドのこの標的化放出は、好ましくは、ペイロードの安定なコンジュゲーション（例えば、抗体上の１つ以上のシステインを介して）および過剰にコンジュゲートされた毒性ＡＤＣ種を最小にするＡＤＣ調製物の比較的均質な組成物を通じて達成される。ワーヘッドを大量に放出するように設計された薬物リンカーと結合されて腫瘍部位に送達されると、本発明のコンジュゲートは、望ましくない非特異的な毒性を実質的に低減し得る。これにより、腫瘍部位で比較的高レベルの活性な細胞毒が、非標的化細胞および組織への曝露を最小にしつつ有利に提供され、これにより増強した治療指数が提供される。
【０１４９】
本発明のいくつかの実施形態は、治療成分（例えば、細胞毒）が組み込まれたペイロードを含むが、診断剤および生体適合性修飾剤が組み込まれた他のペイロードも、本開示のコンジュゲートにより、提供される標的化放出から利益を得る場合があることが理解される。したがって、例示的な治療的ペイロードに関する任意の開示は、文脈による他の指示がない限り、本明細書に述べられている診断剤または生体適合性修飾剤を含むペイロードにも適用可能である。選択されたペイロードは、共有結合的にまたは非共有結合的に抗体に連結することができ、少なくとも部分的にコンジュゲーションを達成するために使用される方法に依存して、様々な化学量論的モル比率を示し得る。本発明のコンジュゲートは一般的に、式：
Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎ
（式中、
ａ）Ａｂは、抗ＤＬＬ３抗体を含み、
ｂ）Ｌは、任意選択のリンカーを含み、
ｃ）Ｄは、薬物を含み、
ｄ）ｎは、約１から約２０の整数である）
またはその医薬として許容される塩によって表され得る。
【０１５０】
当業者は、前述の式によるコンジュゲートは、いくつかの異なるリンカーおよび薬物を使用して作製することができ、コンジュゲーション方法は、成分の選択により様々であることを理解する。このように、本開示の抗体の反応性残基（例えば、システインまたはリシン）と会合する任意の薬物または薬物リンカー化合物は、本明細書における教示と適合する。同様に、選択される薬物の抗体に対するコンジュゲーション（部位特異的コンジュゲーションを含む）を可能にする任意の反応条件は、本発明の範囲内である。前記にかかわらず、本発明のいくつかの実施形態は、薬物または薬物リンカーの遊離システインとの、本明細書に記載の穏やかな還元剤と組み合わせた安定化剤を使用した選択的なコンジュゲーションを含む。このような反応条件は、非特異的コンジュゲーションおよび混入物がより少なく、対応して毒性が少ない、より均質な調製物を提供する傾向がある。
【０１５１】
Ａ．  ペイロードおよびワーヘッド
１．治療剤
本発明の抗体は、治療成分または抗がん剤のような薬物である、医薬として活性な成分、例えば、これらに限定されないが、細胞毒性剤（または細胞毒）、細胞分裂停止剤、抗血管新生剤、減量剤、化学治療剤、放射性治療剤、標的化抗がん剤、生物学的応答修飾剤、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、抗転移剤および免疫療法剤と、コンジュゲート、連結、融合または他の方法で会合されてもよい。
【０１５２】
例示的な抗がん剤または細胞毒（それらのホモログおよび誘導体を含む）としては、１−デヒドロテストステロン、アントラマイシン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、カリケアマイシン（ｎ−アセチルカリケアマイシンを含む）、コルヒチン、シクロホスファミド、サイトカラシンＢ、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ジヒドロキシアントラシン、ジオン、デュオカルマイシン、エメチン、エピルビシン、臭化エチジウム、エトポシド、グルココルチコイド、グラミシジンＤ、リドカイン、ＤＭ−１およびＤＭ−４（免疫原）のようなマイタンシノイド、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、パクリタキセル、プロカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、テトラカインならびに上記のいずれかの医薬として許容される塩もしくは溶媒和物、酸、もしくは誘導体が挙げられる。
【０１５３】
さらなる適合細胞毒は、ドラスタチンおよびオーリスタチン類、例えば、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、アマニチン類、例えば、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチンまたはε−アマニチン（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｐｈａｒｍａ）、ＤＮＡ副溝結合剤、例えば、デュオカルマイシン誘導体（Ｓｙｎｔａｒｇａ）、アルキル化剤、例えば、修飾もしくは二量体ピロロベンゾジアゼピン類（ＰＢＤ）、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン、スプライシング阻害剤、例えば、メアヤマイシン類似体または誘導体（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，８２５，２６７に示されるＦＲ９０１４６４）、チューブ（ｔｕｂｕｌａｒ）結合剤、例えば、エポチロン類似体およびチューブリシン、パクリタキセルおよびＤＮＡ損傷剤、例えば、カリケアマイシンおよびエスペラミシン、抗代謝物質、例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビンおよび５−フルオロウラシル  デカルバジン、抗有糸分裂剤、例えば、ビンブラスチンおよびビンクリスチンおよびアントラサイクリン類、例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシンならびに上記のいずれかの医薬として許容される塩または溶媒和物、酸または誘導体を含む。
【０１５４】
選択された実施形態において、本発明の抗体は、細胞傷害性Ｔ細胞を動員し、腫瘍形成性細胞に標的化させるために、抗ＣＤ３結合分子と会合され得る（ＢｉＴＥ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；例えば、Ｆｕｈｒｍａｎｎら、（２０１０）Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＡＡＣＲ要約番号５６２５を参照）。
【０１５５】
さらなる実施形態において、本発明のＡＤＣは、適切なリンカーを使用してコンジュゲートされる治療用放射性同位体を含む細胞毒を含んでもよい。このような実施形態に適合し得る例示的な放射性同位体としては、これらに限定されないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、銅（６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ）、硫黄（３５Ｓ）、ラジウム（２２３Ｒ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ビスマス（２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒおよび２１１Ａｔが挙げられる。他の放射性核種も診断剤および治療剤として利用可能であり、特にエネルギー範囲６０から４，０００ｋｅＶのものを利用し得る。
【０１５６】
他の選択された実施形態において、本発明のＡＤＣは、細胞毒性ベンゾジアゼピン誘導体ワーヘッドにコンジュゲートされる。本開示の抗体にコンジュゲートされ得る適合ベンゾジアゼピン誘導体（および任意選択のリンカー）は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．８，４２６，４０２ならびにＰＣＴ出願ＷＯ２０１２／１２８８６８およびＷＯ２０１４／０３１５６６に記載されている。下記で議論されるＰＢＤと同様に、適合ベンゾジアゼピン誘導体は、ＤＮＡの副溝に結合し、核酸合成を阻害すると考えられる。このような化合物は、強力な抗腫瘍特性を有することが報告され、したがって、本発明のＡＤＣに用いるのにとりわけ適している。
【０１５７】
ある特定の実施形態において、本発明のＡＤＣは、ＰＢＤおよびその医薬として許容される塩または溶媒和物、酸または誘導体を、ワーヘッドとして含み得る。ＰＢＤは、ＤＮＡの副溝に共有結合することにより抗腫瘍活性を発揮し、核酸合成を阻害するアルキル化剤である。ＰＢＤは、強力な抗腫瘍特性を有する一方で、最小の骨髄抑制を示すことが示されてきた。本発明に適合するＰＢＤは、いくつかの種類のリンカー（例えば、遊離のスルフヒドリルを有するマレイミド部分を含むペプチジルリンカー）を使用して抗体に連結されてもよく、ある特定の実施形態では二量体の形態である（すなわち、ＰＢＤ二量体）。本開示の抗体にコンジュゲートさせ得る適合ＰＢＤ（および任意選択のリンカー）は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，３６２，３３１、７，０４９，３１１、７，１８９，７１０、７，４２９，６５８、７，４０７，９５１、７，７４１，３１９、７，５５７，０９９、８，０３４，８０８、８，１６３，７３６、２０１１／０２５６１５７およびＰＣＴ出願ＷＯ２０１１／１３０６１３、ＷＯ２０１１／１２８６５０、ＷＯ２０１１／１３０６１６、ＷＯ２０１４／０５７０７３およびＷＯ２０１４／０５７０７４に記載されている。以下に本発明に適合するＰＢＤ化合物の例を示す。
【０１５８】
これに関して、ＰＢＤは、強力な抗腫瘍特性を有する一方で、最小の骨髄抑制を示すことが示されてきた。本発明に適合するＰＢＤは、いくつかの種類のリンカーのうちのいずれか１つ（例えば、遊離のスルフヒドリルを有するマレイミド部分を含むペプチジルリンカー）を用いてＤＬＬ３モジュレーターに連結されてもよく、特定の実施形態において、二量体の形態である（すなわち、ＰＢＤ二量体）。ＰＢＤは、以下の一般構造のものである。
【０１５９】
【化７】
2018529656.tif 000010
【０１６０】
これらは、芳香族Ａ環およびピロロＣ環の両方における置換基の数、種類および位置ならびにＣ環の飽和の程度が異なる。Ｂ環において、ＤＮＡのアルキル化に関与する求電子中心であるＮ１０−Ｃ１１位にイミン（Ｎ＝Ｃ）、カルビノールアミン（ＮＨ−ＣＨ（ＯＨ））またはカルビノールアミンメチルエーテル（ＮＨ−ＣＨ（ＯＭｅ））のいずれかが存在する。全ての公知の天然産物は、Ｃ環からＡ環の方を見るときに右回りのねじれをもたらすキラルＣ１１ａ位における（Ｓ）−立体配置を有する。これは、Ｂ型ＤＮＡの副溝に対してイソらせん性となるための適切な三次元形状を天然産物に付与して、結合部位におけるぴったりとした結合をもたらす（Ｋｏｈｎ、Ｉｎ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ＩＩＩ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、３−１１頁（１９７５）；ＨｕｒｌｅｙおよびＮｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ、Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．、１９巻、２３０−２３７頁（１９８６））。副溝における付加体を形成する天然産物の能力は、ＤＮＡプロセシングを妨害することであり、したがって細胞毒性剤としてのこれらの使用を可能にする。上で言及したように、これらの効力を増大させるために、ＰＢＤは、本明細書で述べたように抗ＤＬＬ３抗体にコンジュゲートされ得る二量体の形態でしばしば用いられる。
【０１６１】
とりわけ好ましい実施形態において、本開示のモジュレーターにコンジュゲートされ得る適合ＰＢＤは、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１１／０２５６１５７に記載されている。この開示において、ＰＢＤ二量体、すなわち、２つのＰＢＤ部分を含むものが好ましいことがあり得る。したがって、本発明の好ましいコンジュゲートは、式（ＡＢ）または（ＡＣ）を有するものである。
【０１６２】
【化８】
2018529656.tif 000011
（式中、
点線は、Ｃ１とＣ２との間またはＣ２とＣ３との間の二重結合の任意選択の存在を示し、
Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２ＲおよびＣＯＲから独立に選択され、ハロまたはジハロから任意選択的にさらに選択され、
ＲＤは、Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈおよびハロから独立に選択され、
Ｒ６およびＲ９は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎおよびハロから独立に選択され、
Ｒ７は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎおよびハロから独立に選択され、
Ｒ１０は、本明細書で述べたように、ＤＬＬ３抗体またはこの断片もしくは誘導体に結合されたリンカーであり、
Ｑは、Ｏ、ＳおよびＮＨから独立に選択され、
Ｒ１１は、Ｈであり、もしくはＲであり、またはＱがＯである場合、Ｒ１１は、ＳＯ３Ｍであってもよく、Ｍは、金属陽イオンであり、
Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮ（Ｈ）から選択され、選択された実施形態において、Ｏを含み、
Ｒ”は、鎖が、１個以上のヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅ）および／または環が任意選択的に置換されていてもよい芳香環（例えば、ベンゼンもしくはピリジン）により中断されていてもよい、Ｃ３−１２アルキル基であり、
ＲおよびＲ’は、任意選択的に置換されたＣ１−１２アルキル基、Ｃ３−２０ヘテロシクリル基およびＣ５−２０アリール基から独立に選択され、そして任意選択的に、ＮＲＲ’基に関連して、ＲおよびＲ’は、これらが結合している窒素原子と一緒になって任意選択的に置換された４、５、６または７員ヘテロ環を形成し、
Ｒ２”、Ｒ６”、Ｒ７”、Ｒ９”、Ｘ”、Ｑ”およびＲ１１”（存在する場合）は、それぞれＲ２、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、Ｘ、ＱおよびＲ１１に従って定義され、ＲＣは、キャッピング基である）。
【０１６３】
前述の構造を含む選択された実施形態を直下により詳細に記載する。
【０１６４】
二重結合
一実施形態において、Ｃ１とＣ２との間およびＣ２とＣ３との間に二重結合は存在しない。
【０１６５】
一実施形態において、点線は、以下に示すように、Ｃ２とＣ３との間の二重結合の任意選択的な存在を示す。
【０１６６】
【化９】
2018529656.tif 000012
【０１６７】
一実施形態において、二重結合は、Ｒ２がＣ５−２０アリールまたはＣ１−１２アルキルである場合に、Ｃ２とＣ３との間に存在する。
【０１６８】
一実施形態において、点線は、以下に示すように、Ｃ１とＣ２との間の二重結合の任意選択の存在を示す。
【０１６９】
【化１０】
2018529656.tif 000013
【０１７０】
一実施形態において、二重結合は、Ｒ２がＣ５−２０アリールまたはＣ１−１２アルキルである場合に、Ｃ１とＣ２との間に存在する。
【０１７１】
Ｒ２
一実施形態において、Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２ＲおよびＣＯＲから独立に選択され、ハロまたはジハロから任意選択的にさらに選択される。
【０１７２】
一実施形態において、Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２ＲおよびＣＯＲから独立に選択される。
【０１７３】
一実施形態において、Ｒ２は、Ｈ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、Ｒ、＝ＣＨ−ＲＤおよび＝Ｃ（ＲＤ）２から独立に選択される。
【０１７４】
一実施形態において、Ｒ２は、独立にＨである。
【０１７５】
一実施形態において、Ｒ２は、独立にＲであり、Ｒは、ＣＨ３を含む。
【０１７６】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に＝Ｏである。
【０１７７】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に＝ＣＨ２である。
【０１７８】
一実施形態において、Ｒ２は、独立にＣＨ−ＲＤである。ＰＢＤ化合物内において、＝ＣＨ−ＲＤ基は、下に示すいずれかの立体配置を有し得る。
【０１７９】
【化１１】
2018529656.tif 000014
【０１８０】
一実施形態において、立体配置は、立体配置（Ｉ）である。
【０１８１】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に＝Ｃ（ＲＤ）２である。
【０１８２】
一実施形態において、Ｒ２は、独立にＣＦ２である。
【０１８３】
一実施形態において、Ｒ２は、独立にＲである。
【０１８４】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいＣ５−２０アリールである。
【０１８５】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいＣ１−１２アリールである。
【０１８６】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいＣ５−２０アリールである。
【０１８７】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいＣ５−７アリールである。
【０１８８】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいＣ８−１０アリールである。
【０１８９】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいフェニルである。
【０１９０】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいナフチルである。
【０１９１】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいピリジルである。
【０１９２】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいキノリニルまたはイソキノリニルである。
【０１９３】
一実施形態において、Ｒ２は、１つから３つの置換基を有し、１つおよび２つがより好ましく、一置換基が最も好ましい。置換基は、いずれの位置にあってもよい。
【０１９４】
Ｒ２がＣ５−７アリール基である場合、単一置換基は、好ましくは化合物の残余部分に対する結合に隣接しない環原子上にある。すなわち、単一置換基は、好ましくは化合物の残余部分に対する結合に対してβまたはγである。したがって、Ｃ５−７アリール基がフェニルである場合、置換基は、好ましくはメタ位またはパラ位にある、より好ましくはパラ位にある。
【０１９５】
一実施形態において、Ｒ２は、
【０１９６】
【化１２】
2018529656.tif 000015
（式中、アスタリスクは、結合点を示す）から選択される。
【０１９７】
Ｒ２がＣ８−１０アリール基、例えば、キノリニルまたはイソキノリニルである場合、Ｒ２は、キノリニル環またはイソキノリニル環のいかなる位置におけるいかなる数の置換基も有し得る。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、１つ、２つまたは３つの置換基を有し、これらは、近位および遠位の環のいずれかまたは両方（２つ以上の置換基の場合）に存在し得る。
【０１９８】
一実施形態において、Ｒ２が置換されていてもよい場合、置換基は、下の置換基の項に示す置換基から選択される。
【０１９９】
Ｒが置換されていてもよい場合、置換基は、好ましくは以下から選択される：
ハロ、ヒドロキシル、エーテル、ホルミル、アシル、カルボキシ、エステル、アシルオキシ、アミノ、アミド、アシルアミド、アミノカルボニルオキシ、ウレイド、ニトロ、シアノおよびチオエーテル。
【０２００】
一実施形態において、ＲまたはＲ２が置換されていてもよい場合、置換基は、Ｒ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、ハロ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲおよびＣＯＮＲＲ’からなる群から選択される。
【０２０１】
Ｒ２がＣ１−１２アルキルである場合、任意選択の置換基は、Ｃ３−２０ヘテロシクリル基およびＣ５−２０アリール基をさらに含み得る。
【０２０２】
Ｒ２がＣ３−２０ヘテロシクリルである場合、任意選択の置換基は、Ｃ１−１２アルキル基およびＣ５−２０アリール基をさらに含み得る。
【０２０３】
Ｒ２がＣ５−２０アリール基である場合、任意選択の置換基は、Ｃ３−２０ヘテロシクリル基およびＣ１−１２アルキル基をさらに含み得る。
【０２０４】
「アルキル」という用語がアルケニルサブクラスおよびアルキニルサブクラスならびにシクロアルキルを含むことが理解される。したがって、Ｒ２が置換されていてもよいＣ１−１２アルキルである場合、アルキル基が、コンジュゲートした系の一部をなし得る、１つ以上の炭素−炭素二重または三重結合を任意選択的に含むことが理解される。一実施形態において、置換されていてもよいＣ１−１２アルキル基は、少なくとも１つの炭素−炭素二重または三重結合を含み、この結合は、Ｃ１とＣ２との間またはＣ２とＣ３との間に存在する二重結合とコンジュゲートしている。一実施形態において、Ｃ１−１２アルキル基は、飽和Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、Ｃ２−１２アルキニルおよびＣ３−１２シクロアルキルから選択される基である。
【０２０５】
Ｒ２上の置換基がハロである場合、置換基は、好ましくはＦまたはＣｌ、より好ましくはＣｌである。
【０２０６】
Ｒ２上の置換基がエーテルである場合、置換基は、いくつかの実施形態において、アルコキシ基、例えば、Ｃ１−７アルコキシ基（例えば、メトキシ、エトキシ）であり得るかまたは、いくつかの実施形態において、Ｃ５−７アリールオキシ基（例えば、フェノキシ、ピリジルオキシ、フラニルオキシ）であり得る。
【０２０７】
Ｒ２上の置換基がＣ１−７アルキルである場合、置換基は、好ましくはＣ１−４アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル）であり得る。
【０２０８】
Ｒ２上の置換基がＣ３−７ヘテロシクリルである場合、置換基は、いくつかの実施形態において、Ｃ６窒素含有ヘテロシクリル基、例えば、モルホリノ、チオモルホリノ、ピペリジニル、ピペラジニルであり得る。これらの基は、窒素原子を介してＰＢＤ部分の残余部分に結合することができる。これらの基は、例えば、Ｃ１−４アルキル基によりさらに置換することができる。
【０２０９】
Ｒ２上の置換基がビス−オキシ−Ｃ１−３アルキレンである場合、これは、好ましくはビス−オキシ−メチレンまたはビス−オキシ−エチレンである。
【０２１０】
Ｒ２のとりわけ好ましい置換基は、メトキシ、エトキシ、フルオロ、クロロ、シアノ、ビス−オキシ−メチレン、メチル−ピペラジニル、モルホリノおよびメチルチエニルを含む。
【０２１１】
とりわけ好ましい置換Ｒ２基は、４−メトキシ−フェニル、３−メトキシ−フェニル、４−エトキシ−フェニル、３−エトキシ−フェニル、４−フルオロ−フェニル、４−クロロ−フェニル、３，４−ビスオキシメチレン−フェニル、４−メチルチエニル、４−シアノフェニル、４−フェノキシフェニル、キノリン−３−イルおよびキノリン−６−イル、イソキノリン−３−イルおよびイソキノリン−６−イル、２−チエニル、２−フラニル、メトキシナフチルおよびナフチルを含むが、これらに限定されない。
【０２１２】
一実施形態において、Ｒ２は、ハロまたはジハロである。一実施形態において、Ｒ２は、置換基がそれぞれ（ＩＩＩ）および（ＩＶ）として下に例示されている、−Ｆまたは−Ｆ２である。
【０２１３】
【化１３】
2018529656.tif 000016
【０２１４】
ＲＤ
一実施形態において、ＲＤは、Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈおよびハロから独立に選択される。
【０２１５】
一実施形態において、ＲＤは、独立にＲである。
【０２１６】
一実施形態において、ＲＤは、独立にハロである。
【０２１７】
Ｒ６
一実施形態において、Ｒ６は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ−およびハロから独立に選択される。
【０２１８】
一実施形態において、Ｒ６は、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＯ２およびハロから独立に選択される。
【０２１９】
一実施形態において、Ｒ６は、Ｈおよびハロから独立に選択される。
【０２２０】
一実施形態において、Ｒ６は、独立にＨである。
【０２２１】
一実施形態において、Ｒ６およびＲ７は、一緒になって−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−Ｏ−基を形成しており、ｐは、１または２である。
【０２２２】
Ｒ７
Ｒ７は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、  Ｍｅ３Ｓｎおよびハロから独立に選択される。
【０２２３】
一実施形態において、Ｒ７は、独立にＯＲである。
【０２２４】
一実施形態において、Ｒ７は、独立にＯＲ７Ａであり、Ｒ７Ａは、独立に、置換されていてもよいＣ１−６アルキルである。
【０２２５】
一実施形態において、Ｒ７Ａは、独立に、置換されていてもよい飽和Ｃ１−６アルキルである。
【０２２６】
一実施形態において、Ｒ７Ａは、独立にＣＨ３である。
【０２２７】
一実施形態において、Ｒ７Ａは、独立に、置換されていてもよいＣ２−４アルケニルである。
【０２２８】
一実施形態において、Ｒ７Ａは、独立にＭｅである。
【０２２９】
一実施形態において、Ｒ７Ａは、独立にＣＨ２Ｐｈである。
【０２３０】
一実施形態において、Ｒ７Ａは、独立にアリルである。
【０２３１】
一実施形態において、化合物は、二量体であって、各単量体のＲ７基が一緒になって、単量体を連結する式Ｘ−Ｒ’’−Ｘを有する二量体架橋を形成している。
【０２３２】
Ｒ９
一実施形態において、Ｒ９は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、  Ｍｅ３Ｓｎ−およびハロから独立に選択される。
【０２３３】
一実施形態において、Ｒ９は、独立にＨである。
【０２３４】
一実施形態において、Ｒ９は、独立にＲまたはＯＲである。
【０２３５】
Ｒ１０
好ましくは、本明細書に記載されるような適合リンカーは、Ｒ１０位（すなわち、Ｎ１０）における共有結合によりＤＬＬ３抗体をＰＢＤ薬物部分に結合させる。
【０２３６】
Ｑ
特定の実施形態において、Ｑは、Ｏ、ＳおよびＮＨから独立に選択される。
【０２３７】
一実施形態において、Ｑは、独立にＯである。
【０２３８】
一実施形態において、Ｑは、独立にＳである。
【０２３９】
一実施形態において、Ｑは、独立にＮＨである。
【０２４０】
Ｒ１１
選択された実施形態において、Ｒ１１は、ＨもしくはＲであり、またはＱがＯである場合、Ｒ１１は、ＳＯ３Ｍであり得、Ｍは、金属陽イオンである。陽イオンは、Ｎａ＋であり得る。
【０２４１】
特定の実施形態において、Ｒ１１は、Ｈである。
【０２４２】
特定の実施形態において、Ｒ１１は、Ｒである。
【０２４３】
特定の実施形態において、ＱがＯである場合、Ｒ１１は、ＳＯ３Ｍであり、Ｍは、金属陽イオンである。陽イオンは、Ｎａ＋であり得る。
【０２４４】
特定の実施形態において、ＱがＯである場合、Ｒ１１は、Ｈである。
【０２４５】
特定の実施形態において、ＱがＯである場合、Ｒ１１は、Ｒである。
【０２４６】
Ｘ
一実施形態において、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮ（Ｈ）から選択される。
【０２４７】
好ましくは、Ｘは、Ｏである。
【０２４８】
Ｒ’’
Ｒ’’は、鎖が１つ以上のヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅおよび／または環が置換されていてもよい、芳香環、例えば、ベンゼンもしくはピリジンによって中断されていてよい、Ｃ３−１２アルキレン基である。
【０２４９】
一実施形態において、Ｒ’’は、鎖が１つ以上のヘテロ原子および／または芳香環、例えば、ベンゼンまたはピリジンによって中断されていてよい、Ｃ３−１２アルキレン基である。
【０２５０】
一実施形態において、該アルキレン基は、Ｏ、ＳおよびＮＭｅから選択される１つ以上のヘテロ原子ならびに／または環が置換されていてもよい、芳香環によって任意選択的に中断されている。
【０２５１】
一実施形態において、芳香環は、Ｃ５−２０アリレン基であり、アリレンは、芳香族化合物の２個の芳香環原子から２個の水素原子を除去することにより得られた二価部分に関し、この部分は、５から２０個の環原子を有する。
【０２５２】
一実施形態において、Ｒ’’は、鎖が１つ以上のヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅおよび／または環がＮＨ２により置換されていてもよい、芳香環、例えば、ベンゼンもしくはピリジンによって中断されていてよい、Ｃ３−１２アルキレン基である。
【０２５３】
一実施形態において、Ｒ’’は、Ｃ３−１２アルキレン基である。
【０２５４】
一実施形態において、Ｒ’’は、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ９およびＣ１１アルキレン基から選択される。
【０２５５】
一実施形態において、Ｒ’’は、Ｃ３、Ｃ５およびＣ７アルキレン基から選択される。
【０２５６】
一実施形態において、Ｒ’’は、Ｃ３およびＣ５アルキレン基から選択される。
【０２５７】
一実施形態において、Ｒ’’は、Ｃ３アルキレン基である。
【０２５８】
一実施形態において、Ｒ’’は、Ｃ５アルキレン基である。
【０２５９】
上に示したアルキレン基は、１つ以上のヘテロ原子および／または環が置換されていてもよい、芳香環、例えば、ベンゼンもしくはピリジンによって任意選択的に中断されていてよい。
【０２６０】
上に示したアルキレン基は、１つ以上のヘテロ原子および／または芳香環、例えば、ベンゼンもしくはピリジンによって任意選択的に中断されていてよい。
【０２６１】
上に示したアルキレン基は、非置換直鎖脂肪族アルキレン基であり得る。
【０２６２】
ＲおよびＲ’
一実施形態において、Ｒは、置換されていてもよいＣ１−１２アルキル基、Ｃ３−２０ヘテロシクリル基およびＣ５−２０アリール基から独立に選択される。これらの基は、下の置換基の項においてそれぞれが定義されている。
【０２６３】
一実施形態において、Ｒは、独立に、置換されていてもよいＣ１−１２アルキルである。
【０２６４】
一実施形態において、Ｒは、独立に、置換されていてもよいＣ３−２０ヘテロシクリルである。
【０２６５】
一実施形態において、Ｒは、独立に、置換されていてもよいＣ５−２０アリールである。
【０２６６】
一実施形態において、Ｒは、独立に、置換されていてもよいＣ１−１２アルキルである。
【０２６７】
好ましいアルキル基およびアリール基ならびに任意選択の置換基の同一性および数に関する様々な実施形態をＲ２に関して上で述べた。Ｒ２について示した選択は、それがＲに適用されるとき、適切な場合、例えば、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８またはＲ９がＲである場合、全ての他の基Ｒに適用できる。
【０２６８】
Ｒについての選択は、Ｒ’にも適用される。
【０２６９】
本発明のいくつかの実施形態において、−ＮＲＲ’置換基を有する化合物を提供する。いくつかの実施形態において、ＲおよびＲ’は、これらが結合している窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい４、５、６または７員ヘテロ環を形成している。環は、さらなるヘテロ原子、例えば、Ｎ、ＯまたはＳを含み得る。
【０２７０】
一実施形態において、ヘテロ環は、それ自体Ｒ基で置換されている。さらなるＮヘテロ原子が存在する場合、置換基は、Ｎヘテロ原子上に存在し得る。
【０２７１】
前述のＰＢＤに加えて、特定の二量体ＰＢＤは、とりわけ活性であることが示され、本発明と共に用いることができる。この目的を達成するために、本発明の抗体薬物コンジュゲート（すなわち、本明細書で開示するＡＤＣ１−６）は、ＰＢＤ１−５として直下に示すようなＰＢＤ化合物を含み得る。薬物−リンカー化合物の成分としてのＰＢＤ１−５のそれぞれの合成は、このような合成について参照により組み込むＷＯ２０１４／１３０８７９に極めて詳細に示されている。ＷＯ２０１４／１３０８７９を考慮すると、本発明のＡＤＣの選択されたワーヘッドを含み得る細胞毒性化合物を、容易に作製して、本明細書で示すように用いることができる。したがって、リンカーの切断により本開示のＡＤＣから放出させることができる選択されたＰＢＤ化合物を直下に示す。
【０２７２】
【化１４】
2018529656.tif 000017
【０２７３】
前記二量体ＰＢＤワーヘッドのそれぞれが、好ましくは、標的細胞による内在化およびリンカーの破壊に際して放出されることが理解される。下記でさらに詳細に記載されているように、好ましいリンカーには、リンカーのいかなる部分も保持することなく活性なＰＢＤワーヘッドの放出を可能にする自己崩壊部分を組み込んだ切断可能リンカーが含まれる。放出に際し、ＰＢＤワーヘッドは、標的細胞のＤＮＡに結合および架橋する。このような結合は、標的がん細胞の分裂をそのＤＮＡヘリックスを歪ませることなく、明らかに阻止することから、一般的な突発的な薬物耐性現象を潜在的に防ぐ。
【０２７４】
腫瘍部位におけるこのような化合物の送達および放出は、本開示により増殖性障害を治療または管理するのに臨床的に有効であることが証明され得る。該化合物に関して、本開示のＰＢＤのそれぞれが、各Ｃ環における１つのｓｐ２中心のみを有する化合物と比較して、ＤＮＡの副溝におけるより強い結合（したがってより大きい毒性）を可能にし得る、各Ｃ環における２つのｓｐ２中心を有することが理解される。したがって、本明細書に示すＤＬＬ３  ＡＤＣに用いる場合、本開示のＰＢＤは、増殖性障害の治療にとりわけ有効であることが証明され得る。
【０２７５】
前述のことは、本発明に適合する例示的ＰＢＤ化合物をもたらし、このことは、本明細書における教示に従って抗ＤＬＬ３コンジュゲートに首尾よく組み込まれ得る他のＰＢＤを限定することを、決して意味しない。むしろ、本明細書で議論されるようにおよび下記実施例において示されるように、抗体にコンジュゲートされ得る任意のＰＢＤは、本開示のコンジュゲートと適合し、明確に本発明の範囲内にある。
【０２７６】
前述の作用剤に加えて、本発明の抗体は、生物学的応答修飾剤にコンジュゲートされてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するポリペプチドであり得る。このようなタンパク質としては、例えば、アブリン、リシンＡ、オンコナーゼ（Ｏｎｃｏｎａｓｅ）（または別の細胞傷害性ＲＮアーゼ）、シュードモナス菌体外毒素、コレラ毒素、ジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦαまたはＴＮＦβ）などのアポトーシス剤、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、ＡＩＭ  Ｉ（ＷＯ９７／３３８９９）、ＡＩＭ  ＩＩ（ＷＯ９７／３４９１１）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９４、ＰＭＩＤ：７８２６９４７）およびＶＥＧＩ（ＷＯ９９／２３１０５）、血栓性物質（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、抗血管新生剤（例えば、アンジオスタチンまたはエンドスタチン）、リンホカイン（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６））、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または成長因子（例えば、成長ホルモン（ＧＨ））が挙げられ得る。
【０２７７】
２．診断剤または検出剤
他の実施形態において、本発明の抗体またはその断片もしくは誘導体は、例えば、生物学的分子（例えば、ペプチドまたはヌクレオチド）、小分子、フルオロフォアまたは放射性同位体であり得る診断剤もしくは検出剤、マーカーまたはレポーターにコンジュゲートされる。標識化抗体は、過剰増殖障害の発生もしくは進行をモニタリングするために、または開示する抗体（すなわち診断治療薬）を含む特定の治療の有効性を決定するための臨床的試験手法もしくは治療の今後の方針を決定するための臨床的試験手法の一部として、有用であり得る。このようなマーカーまたはレポーターは、抗体分析（例えば、エピトープ結合または抗体ビニング）に使用するための選択された抗体を精製するために、腫瘍形成性細胞を分離もしくは単離するためにまたは前臨床的手法もしくは毒性研究においても、有用であり得る。
【０２７８】
このような診断、解析および／または検出は、抗体を検出可能な物質にカップリングすることによって行われ得、これらの物質は、これらに限定されないが、様々な酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼ；補欠分子族、例えば、これらに限定されないがストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン；蛍光材料、例えば、これらに限定されないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン  フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリン；発光材料、例えば、これらに限定されないが、ルミノール；生物発光材料、例えば、これらに限定されないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリン；放射活性材料、例えば、これらに限定されないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）およびテクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、８９Ｚｒ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎおよび１１７Ｔｉｎ；様々なポジトロン放出トモグラフィを使用したポジトロン放出金属、非放射活性常磁性金属イオンおよび特定の放射性同位体に放射標識またはコンジュゲートした分子なのである。このような実施形態において、適切な検出方法は、当該技術分野で周知であり、多数の市販供給源から容易に利用可能である。
【０２７９】
他の実施形態において、抗体またはその断片は、マーカー配列または化合物、例えば、ペプチドまたはフルオロフォアに融合またはコンジュゲートされて、精製手法または診断手法または分析手法、例えば、免疫組織化学、バイオレイヤー干渉法、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリ、競合的ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣｓなどを容易にすることができる。いくつかの実施形態において、マーカーは、ヒスチジンタグ、例えば、多くの市販品の中でもとりわけｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）によって提供されるヒスチジンタグを含む。精製のために有用な他のペプチドタグとしては、これらに限定されないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応するヘマグルチニン「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８４、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７）および「フラッグ」タグ（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，７０３，００４）が挙げられる。
【０２８０】
３．生体適合性修飾因子
選択された実施形態において、本発明の抗体は、所望の通りに抗体特徴を調整するか、改変するか、改善するかまたは和らげるために使用され得る生体適合性修飾因子とコンジュゲートしてもよい。例えば、インビボ半減期が増加した抗体または融合構築物は、比較的分子量の大きいポリマー分子、例えば、市販のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または同様の生体適合性ポリマーを結合することによって生成され得る。当業者は、ＰＥＧが、多くの様々な分子量および分子構造で得られ得、これらを選択して抗体に特定の特性を付与することができる（例えば半減期を調節し得る）ことを理解する。ＰＥＧは、ＰＥＧの前記抗体もしくは抗体断片のＮもしくはＣ末端へのコンジュゲーションを通じてまたはリシン残基上に存在するεアミノ基を介して、多機能リンカーありまたはなしで、抗体もしくは抗体断片または誘導体に結合し得る。生物学的活性の損失を最小にする直鎖状または分枝鎖状のポリマー誘導体が使用され得る。コンジュゲーションの度合いは、ＰＥＧ分子の抗体分子への最適なコンジュゲーションを確実にするために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析により密接にモニタリングされ得る。未反応のＰＥＧは、抗体−ＰＥＧコンジュゲートから、例えば、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーにより分離され得る。同様の方法において、本開示の抗体は、抗体もしくは抗体断片をインビボでより安定にするためにまたはインビボでより長い半減期を有するためにアルブミンにコンジュゲートされ得る。この技術は、当該技術分野で周知である。例えば、ＷＯ９３／１５１９９、ＷＯ９３／１５２００およびＷＯ０１／７７１３７；およびＥＰ０４１３，６２２を参照。他の生体適合性コンジュゲートは当業者にとって明らかであり、本明細書に記載の教示に従って容易に同定され得る。
【０２８１】
Ｂ．リンカー化合物
多数のリンカー化合物が、関連するワーヘッドに本発明の抗体をコンジュゲートするために使用され得る。リンカーは、抗体上の反応性残基（好ましくはシステインまたはリシン）と選択された薬物化合物とを共有結合することのみを必要とする。したがって、選択された抗体残基と反応し、本発明の比較的安定なコンジュゲート（部位特異的またはそれ以外のコンジュゲート）を提供するために使用され得る任意のリンカーは、本明細書の教示に適合する。
【０２８２】
適合リンカーは、求核性である還元されたシステインおよびリシンに有利に結合し得る。還元されたシステインおよびリシンに関与するコンジュゲーション反応としては、これらに限定されないが、チオール−マレイミド、チオールハロゲノ（アシルハライド）、チオール−エン、チオール−イン、チオール−ビニルスルホン、チオール−ビスルホン、チオール−チオスルホネート、チオール−ピリジルジスルフィドおよびチオールパラフルオロ反応が挙げられる。本明細書でさらに議論されるように、チオール−マレイミド生体コンジュゲーションは、その速い反応速度と穏やかなコンジュゲーション条件により、最も広く使用されているアプローチの１つである。このアプローチの１つの問題点は、レトロミカエル反応の可能性、および抗体からのマレイミド連結ペイロードの損失すなわちその血漿中の他のタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）への移行である。しかしながら、いくつかの実施形態において、コンジュゲートを安定化し、この望ましくない移行を減少させるために、本明細書で示される選択的還元および部位特異的抗体の使用が使用され得る。チオール−アシルハライド反応は、レトロミカエル反応が起こり得ない生体コンジュゲートを提供し、それゆえさらに安定である。しかしながら、チオール−ハライド反応は、一般にマレイミドに基づくコンジュゲーションと比較して反応速度が遅いことから効率的でなく、所望しない薬物抗体比をもたらす。チオール−ピリジルジスルフィド反応は、よく使用される別の生体コンジュゲーション経路である。ピリジルジスルフィドは、遊離チオールとの速い交換が進行し、それにより混成のジスルフィドおよびピリジン−２−チオンの放出がもたらされる。混成のジスルフィドは還元的な細胞環境で切断され、ペイロードが放出され得る。生体コンジュゲーションにおいてさらに注目を集める他のアプローチは、チオール−ビニルスルホンおよびチオールビスルホン反応であり、これらのそれぞれが本明細書の教示に適合し、明確に本発明の範囲内に含まれる。
【０２８３】
いくつかの実施形態において適合リンカーは、細胞外環境においてＡＤＣに安定性を付与し、ＡＤＣ分子の凝集を予防し、ＡＤＣの水性媒体および単量体状態における自由な可溶性を保持する。細胞への移動または送達の前において、ＡＤＣは、好ましくは安定でありかつ無傷（ｉｎｔａｃｔ）のままであり、つまり、抗体は薬物部分に連結したままである。リンカーは、標的細胞外で安定であるが、細胞内でいくぶん効果的な速度で切断または分解されるように設計されている。したがって、効果的なリンカーは、：（ｉ）抗体の特異的結合特性を維持し、（ｉｉ）コンジュゲートまたは薬物部分の細胞内送達を可能にし、（ｉｉｉ）コンジュゲートがその標的部位に送達または輸送されるまで、安定および無傷のままである、すなわち切断も分解もされない；および（ｉｖ）薬物部分の細胞傷害性、細胞殺傷効果または細胞分裂停止効果（いくつかの場合には任意のバイスタンダー効果を含む）を維持する。ＡＤＣの安定性は、標準的な解析技術、例えば、ＨＰＬＣ／ＵＰＬＣ、質量分析、ＨＰＬＣならびに分離／解析技術ＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定され得る。前述のように、抗体および薬物部分の共有結合は、リンカーに、２つの反応性官能基、すなわち反応性という意味において２価を有することを要求する。２つ以上の機能的または生物学的に活性な部分を結合するために有用である２価のリンカー試薬、例えば、ＭＭＡＥおよび抗体は公知であり、それらの結果として生じるコンジュゲートを得るための方法が記載されてきた。
【０２８４】
本発明に適合するリンカーは、広義において、切断可能リンカーおよび切断不能リンカーとして分類され得る。切断可能リンカーは、酸不安定性リンカー（例えば、オキシムおよびヒドロゾン）プロテアーゼ切断可能リンカーおよびジスルフィドリンカーを含み得、標的細胞に内在化され、細胞内のエンドソーマル−リソソーマル経路において切断される。細胞毒の放出および活性化は、酸不安定性化学的連結、例えば、ヒドラゾンまたはオキシムの切断を容易にするエンドソーム／リソソーム酸性区画に依存する。リソソーマル特異的なプロテアーゼ切断部位がリンカー内へと遺伝子操作される場合、細胞毒がそれらの細胞内標的の近傍で放出される。あるいは、混合ジスルフィドを含有するリンカーは、細胞傷害性ペイロードが、血流中の酸素リッチ環境ではなく細胞の還元環境内で選択的に切断されるときに細胞内に放出されるアプローチを提供する。対照的に、アミド連結ポリエチレングリコールまたはアルキルスペーサーを含有する適合性切断不能リンカーは、標的細胞内でＡＤＣがリソソーマル分解される間に毒性ペイロードを解放する。いくつかの観点で、リンカーの選択は、コンジュゲートで使用される特定の薬物、特定の指標および抗体標的に依存する。
【０２８５】
したがって、本発明のある特定の実施形態は、細胞内環境（例えば、リソソーム内またはエンドソーム内またはカベオラ内）に存在する切断剤により切断可能であるリンカーを含む。リンカーは、例えば、細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素、例えば、これらに限定されないが、リソソーマルまたはエンドソーマルプロテアーゼによって切断されるペプチジルリンカーであり得る。いくつかの実施形態において、ペプチジルリンカーは、少なくとも２アミノ酸長または少なくとも３アミノ酸長である。切断剤は、カテプシンＢおよびＤならびにプラスミンを含むことができ、これらのそれぞれは、ジペプチド薬物誘導体を加水分解して標的細胞内に活性な薬物を放出することが知られている。カテプシン−Ｂは、がん性組織で高発現することが見出されているので、チオール−依存性プロテアーゼカテプシン−Ｂによって切断可能な例示的なペプチジルリンカーは、Ｐｈｅ−Ｌｅｕを含むペプチドである。このようなリンカーの他の例は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，２１４，３４５に記載されている。特定の実施形態において、細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチジルリンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカー、Ｖａｌ−ＡｌａリンカーまたはＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである。治療剤の細胞内タンパク分解性放出を利用する１つの利点は、薬剤がコンジュゲートされている場合に通常は減弱化（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）されること、およびコンジュゲートの血清安定性が比較的高いことである。
【０２８６】
他の実施形態において、切断可能なリンカーは、ｐＨ感受性である。通常、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解性である。例えば、リソソーム中で加水分解性である酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、オキシム、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ−アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）を使用することができる（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，１２２，３６８；５，８２４，８０５；５，６２２，９２９を参照）。このようなリンカーは、中性ｐＨ条件、例えば、血液のｐＨ条件下で比較的安定であるが、ほぼリソソームのｐＨであるｐＨ５．５または５．０未満で不安定（例えば、切断可能）である。
【０２８７】
さらに他の実施形態において、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。様々なジスルフィドリンカーが当該技術分野で公知であり、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）およびＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）を使用して形成可能なものが挙げられる。さらに他の特定の実施形態において、リンカーは、マロネートリンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９５、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：１３８７−９３）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕら、１９９５、Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１２９９−１３０４）または３’−Ｎ−アミドアナログ（Ｌａｕら、１９９５、Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１３０５−１２）である。
【０２８８】
選択された態様において、選択されたリンカーは、式
【０２８９】
【化１５】
2018529656.tif 000018
（式中、アスタリスクは薬物への結合点を示し、ＣＢＡ（ｃｅｌｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ、つまり細胞結合剤）は、抗ＤＬＬ３抗体を含み、Ｌ１は、リンカーおよび任意選択的に切断可能リンカーを含み、Ａは、Ｌ１を抗体上の反応性残基に連結する（任意選択的にスペーサーを含む）連結基であり、Ｌ２は、好ましくは共有結合であり、Ｕは、存在していてもしていなくてもよく、腫瘍部位におけるワーヘッドからのリンカーの完全な分離を促進する自己崩壊性単位の全てまたは一部を含み得る）の化合物を含む。
【０２９０】
いくつかの実施形態（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１１／０２５６１５７に示される形態など）において、適合リンカーは、
【０２９１】
【化１６】
2018529656.tif 000019
（式中、アスタリスクは薬物への結合点を示し、ＣＢＡ（ｃｅｌｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ、つまり細胞結合剤）は、抗ＤＬＬ３抗体を含み、Ｌ１は、リンカーおよび任意選択的に切断可能リンカーを含み、Ａは、Ｌ１を抗体上の反応性残基に連結する（任意選択的にスペーサーを含む）連結基であり、Ｌ２は、共有結合であるまたは−ＯＣ（＝Ｏ）−と一緒になって自己崩壊部分を形成する）を含み得る。
【０２９２】
Ｌ１およびＬ２の性質は、存在する場合、広く変動し得ることが理解される。これらの基は、これらの切断特徴に基づき選択され、コンジュゲートが送達される部位の条件によって指示され得る。酵素の作用により切断されるリンカーが好ましいが、ｐＨの変化（例えば、酸もしくは塩基不安定性）、温度の変化または放射線照射（例えば、感光性）によって切断可能なリンカーも使用され得る。還元または酸化条件下で切断可能であるリンカーも本発明で使用され得る。
【０２９３】
ある特定の実施形態において、Ｌ１は、アミノ酸の連続配列を含んでもよい。アミノ酸配列は酵素切断の標的基質となり得、それにより薬物を放出し得る。
【０２９４】
一実施形態において、Ｌ１は、酵素の作用により切断可能である。一実施形態において、酵素は、エステラーゼまたはペプチダーゼである。
【０２９５】
別の実施形態において、Ｌ１は、カテプシン不安定性リンカーである。
【０２９６】
一実施形態において、Ｌ１は、ジペプチドを含む。ジペプチドは、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−として表される場合があり、ここで−ＮＨ−および−ＣＯ−は、それぞれアミノ酸基Ｘ１およびＸ２のＮ末端およびＣ末端を表す。ジペプチドのアミノ酸は、天然アミノ酸の任意の組合せであり得る。リンカーがカテプシン不安定性リンカーである場合、ジペプチドは、カテプシン媒介切断の作用部位となり得る。
【０２９７】
さらに、カルボキシルまたはアミノ側鎖官能基を有するアミノ酸基、例えば、それぞれＧｌｕおよびＬｙｓに対して、ＣＯおよびＮＨが、この側鎖官能基であり得る。
【０２９８】
一実施形態において、ジペプチドである−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における基−Ｘ１−Ｘ２−は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−、−Ｌｅｕ−Ｃｉｔ−、−Ｉｌｅ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−および−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−から選択され、ここでＣｉｔはシトルリンである。
【０２９９】
好ましくは、ジペプチドである−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における基−Ｘ１−Ｘ２−は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−および−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−から選択される。
【０３００】
最も好ましくは、ジペプチドである−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における基−Ｘ１−Ｘ２−は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−または−Ｖａｌ−Ａｌａ−またはＶａｌ−Ｃｉｔである。特定の選択された実施形態において、このジペプチドは、−Ｖａｌ−Ａｌａ−を含む。
【０３０１】
一実施形態において、Ｌ２は存在し、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−と一緒になって自己崩壊性リンカーを形成する。
【０３０２】
一実施形態において、Ｌ２は、酵素活性の基質であり、これによりワーヘッドの放出を可能にする。
【０３０３】
一実施形態において、Ｌ１が酵素の作用により切断可能であり、Ｌ２が存在する場合、酵素は、Ｌ１とＬ２との間の結合を切断する。
【０３０４】
Ｌ１およびＬ２は、存在する場合、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−および−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−から選択される結合によって連結されていてもよい。
【０３０５】
Ｌ２に連結されているＬ１のアミノ基は、アミノ酸のＮ末端であってもよく、またはアミノ酸側鎖、例えば、リシンアミノ酸側鎖のアミノ基から誘導されてもよい。
【０３０６】
Ｌ２に連結されているＬ１のカルボキシル基は、アミノ酸のＣ末端であってもよく、またはアミノ酸側鎖、例えば、グルタミン酸アミノ酸側鎖のカルボキシル基から誘導されてもよい。
【０３０７】
Ｌ２に連結されているＬ１のヒドロキシル基は、アミノ酸側鎖、例えば、セリンアミノ酸側鎖のヒドロキシル基から誘導され得る。
【０３０８】
用語「アミノ酸側鎖」は、（ｉ）天然に存在するアミノ酸、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン；（ｉｉ）マイナーなアミノ酸、例えば、オルニチンおよびシトルリン；（ｉｉｉ）非天然アミノ酸、ベータ−アミノ酸、合成類似体および天然に存在するアミノ酸の誘導体；ならびに（ｉｖ）全てのエナンチオマー、ジアステレオマー、異性体的に濃縮された形態、同位体で標識された形態（例えば、２Ｈ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ）、保護された形態およびそれらのラセミ体混合物で見出されるそれらの基を含む。
【０３０９】
一実施形態において、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−およびＬ２は一緒になって基：
【０３１０】
【化１７】
2018529656.tif 000020
（式中、アスタリスクは、薬物または細胞毒性剤に対する結合点の位置を示し、波線は、リンカーＬ１への結合点を示し、Ｙは、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）−または−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−であり、ｎは０から３である）を形成する。フェニレン環は、１、２または３つの置換基で置換されていてもよい。一実施形態において、フェニレン基は、ハロ、ＮＯ２、アルキルまたはヒドロキシアルキルで置換されていてもよい。
【０３１１】
一実施形態において、Ｙは、ＮＨである。
【０３１２】
一実施形態において、ｎは０または１である。好ましくは、ｎは０である。
【０３１３】
ＹがＮＨであり、ｎが０である場合、自己崩壊性リンカーは、ｐ−アミノベンジルカルボニルリンカー（ＰＡＢＣ）と称され得る。
【０３１４】
他の実施形態において、リンカーは、自己崩壊性リンカーおよびジペプチドを含み、一緒になって、基−ＮＨ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ−を形成してもよい。他の選択された実施形態において、リンカーは、下記に示すＮＨ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ基を含んでもよい：
【０３１５】
【化１８】
2018529656.tif 000021
（式中、アスタリスクは、選択された細胞毒性部分に対する結合点を示し、波線は、抗体にコンジュゲートされ得るリンカーの残余部分（例えば、スペーサー−抗体結合セグメント）への結合点を示す）。ジペプチドの酵素切断に際し、自己崩壊性リンカーは遠位部位が活性化されるとき、以下に示す流れに沿って進み、保護された化合物（つまり、細胞毒）の明確な放出を可能にする：
【０３１６】
【化１９】
2018529656.tif 000022
（式中、アスタリスクは、選択された細胞毒性部分への結合点を示し、Ｌ＊は、切断されるペプチジル単位を含むリンカーの残余部分の活性化形態である）。ワーヘッドの明確な放出は、所望の毒性活性の維持を確実にする。
【０３１７】
一実施形態において、Ａは、共有結合である。したがって、Ｌ１と抗体とは直接的に連結される。例えば、Ｌ１が、連続するアミノ酸配列を含む場合、配列のＮ末端は、抗体残基に直接連結し得る。
【０３１８】
別の実施形態において、Ａは、スペーサー基である。したがって、Ｌ１と抗体は、間接的に連結する。
【０３１９】
ある特定の実施形態において、Ｌ１およびＡは、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−および−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−から選択される結合によって連結され得る。
【０３２０】
下記にさらに詳細に述べられるように、本発明の薬物リンカーは、好ましくは、システイン、例えば、遊離システイン上の反応性チオール求核基に連結する。この目的のために、抗体のシステインは、様々な還元剤、例えば、ＤＴＴまたはＴＣＥＰまたは本明細書に記載の穏やかな還元剤での治療によってリンカー試薬とコンジュゲーションするために反応し得る。他の実施形態において、本発明の薬物リンカーは、好ましくはリシンに連結される。
【０３２１】
好ましくは、リンカーは、抗体上の求核性官能基と反応する求電子性官能基を含む。抗体上の求核性基としては、これらに限定されないが：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えば、リシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えば、システインおよび（ｉｖ）抗体がグリコシル化されている、糖のヒドロキシルまたはアミノ基が挙げられる。アミン、チオールおよびヒドロキシル基は、求核性であり、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子性基と反応して共有結合を形成することができる。リンカー試薬としては、（ｉ）マレイミド基、（ｉｉ）活性化ジスルフィド、（ｉｉｉ）活性エステル、例えば、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステル、ＨＯＢｔ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）エステル、ハロホルメートおよび酸ハロゲン化物；（ｉｖ）アルキルおよびベンジルハロゲン化物、例えば、ハロアセトアミド；および（ｖ）アルデヒド、ケトン、およびカルボキシル基が挙げられる。
【０３２２】
本発明と適合する例示的な官能基を、直下に示す：
【０３２３】
【化２０】
2018529656.tif 000023
【０３２４】
いくつかの実施形態において、システイン（部位特異的抗体の遊離システインを含む）と薬物−リンカー部分との間の結合は、リンカーに存在しているチオール残基および末端マレイミド基を通じたものである。このような実施形態において、抗体と薬物−リンカーとの連結は、
【０３２５】
【化２１】
2018529656.tif 000024
（式中、アスタリスクは、薬物−リンカーの残余部分との結合点を示し、波線は、抗体の残余部分との結合点を示す）であることができる。この実施形態において、Ｓ原子は、好ましくは、部位特異的遊離システインから誘導される。
【０３２６】
他の適合リンカーに関して、結合部分は、抗体上の活性化残基と反応して所望のコンジュゲートを提供し得る末端ヨードアセトアミドを含んでもよい。いずれにしても、当業者は、本開示の薬物−リンカー化合物のそれぞれと、適合する抗ＤＬＬ３抗体（例えば、部位特異的抗体）とを、本開示に鑑みて、容易にコンジュゲートすることができる。
【０３２７】
本開示によれば、本発明は、適合する抗体薬物コンジュゲートを作製する方法であって、抗ＤＬＬ３抗体を下記からなる群から選択される薬物−リンカー化合物にコンジュゲートすることを含む方法を提供する：
【０３２８】
【化２２】
2018529656.tif 000025
2018529656.tif 000026
2018529656.tif 000027
【０３２９】
本出願の目的に関し、ＤＬは、「薬物−リンカー」の略称として使用され、上記に示す薬物リンカー１〜６（つまり、ＤＬ１、ＤＬ２、ＤＬ３、ＤＬ４、ＤＬ５およびＤＬ６）を含む。ＤＬ１およびＤＬ６は、同じワーヘッドおよび同じジペプチドサブユニットを含むが、連結基スペーサーが異なることに注意されたい。したがって、リンカーの切断によりＤＬ１およびＤＬ６の両方がＰＢＤ１を放出する。
【０３３０】
末端マレイミド部分（ＤＬ１〜ＤＬ４およびＤＬ６）またはヨードアセトアミド部分（ＤＬ５）が付されたリンカーは、当該分野で認識されている技術を使用して、選択されたＤＬＬ３抗体の遊離スルフヒドリルにコンジュゲートしてもよいことが理解される。前記化合物の合成経路は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１３０８７９に示されており、このようなＰＢＤをコンジュゲートする詳細な方法は、下記の実施例に示されている。
【０３３１】
したがって、選択された態様において、本発明は、本開示のピロロベンゾジアゼピンにコンジュゲートされたＤＬＬ３抗体に関し、下記のＡＤＣ１−６で実質的に示されるＤＬＬ３免疫コンジュゲートを提供する。したがって、ある特定の態様において、本発明は、
【０３３２】
【化２３】
2018529656.tif 000028
2018529656.tif 000029
（式中、Ａｂは、抗ＤＬＬ３抗体またはそれらの免疫反応性断片を含む）からなる群から選択される抗体薬物コンジュゲートを対象とする。ＡＤＣ１は、ｈＳＣ１６．５６抗体（配列番号７および８）を含む場合、本開示の目的のためにＳＣ１６ＬＤ６．５もしくはｈＳＣ１６．５６ＰＢＤ１（これはＤＬ１もしくはＤＬ６を含み得る）またはｈＳＣ１６．５６ＤＬ１もしくはロバルピツズマブ  テシリン（Ｒｏｖａ−Ｔ）と称され得ることに注意されたい。同様に、ＡＤＣ６は、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１抗体（配列番号８および９）を含む場合、本開示の目的のためにｈＳＣ１６．５６ｓｓ１ＰＢＤ１（これはＤＬ１もしくはＤＬ６を含み得る）またはｈＳＣ１６．５６ｓｓ１ＤＬ６と称され得る。
【０３３３】
Ｃ．コンジュゲーション
いくつかの周知の様々な反応を使用して、薬物部分および／またはリンカーが選択された抗体に結合してもよいことが理解される。例えば、システインのスルフヒドリル基を活用する様々な反応が、所望の部分をコンジュゲートするために利用されてもよい。いくつかの実施形態は、下記に詳細に述べられた１つ以上の遊離システインを含む抗体のコンジュゲーションを含む。他の実施形態において、本発明のＡＤＣは、選択された抗体に存在するリシン残基の溶媒露出されたアミノ基への薬物のコンジュゲーションを通じて生成され得る。さらに他の実施形態は、Ｎ末端スレオニンおよびセリン残基の活性化を含み、この活性化が利用されて本開示のペイロードが抗体に連結され得る。選択されるコンジュゲーション方法は、好ましくは、抗体に結合する薬物の数を最適化し、比較的高い治療指数を得るために仕立てられる。
【０３３４】
治療化合物をシステイン残基にコンジュゲートさせるための様々な方法は、当該技術分野において公知であり、当業者に明らかである。塩基性条件下で、システイン残基を脱プロトン化すると、マレイミドおよびヨードアセトアミドなどのソフトな求電子剤と反応し得るチオレート求核剤が生成される。一般にこのようなコンジュゲーションのための試薬は、システインチオールと直接反応してコンジュゲート化タンパク質を形成してもよくまたはリンカー−薬物と直接反応してリンカー−薬物中間体を形成してもよい。リンカーの場合、有機化学反応、条件および試薬を用いる複数の経路が当業者に公知であり、例えば、（１）本発明のタンパク質のシステイン基をリンカー試薬と反応させて、共有結合を介してタンパク質−リンカー中間体を形成し、次いで、活性化化合物と反応させる経路；および（２）化合物の求核性基をリンカー試薬と反応させて、共有結合を介した薬物−リンカー中間体を形成し、次いで本発明のタンパク質のシステイン基と反応させる経路がある。前述の記載から当業者に明らかなように、二官能性（または二価）リンカーが本発明において有用である。例えば、二官能性リンカーは、システイン残基と共有結合するためのチオール修飾基、および化合物と共有または非共有結合するための少なくとも１つの結合部分（例えば、第２チオール修飾部分）を含み得る。
【０３３５】
コンジュゲーションの前に、抗体を、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）または（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いた治療により、リンカー試薬とのコンジュゲーションに対して反応性にしてもよい。他の実施形態において、抗体にさらなる求核性基を、リシンと試薬との反応により導入してもよく、試薬としては、これらに限定されないが、アミンをチオールに変換する２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）、ＳＡＴＡ、ＳＡＴＰまたはＳＡＴ（ＰＥＧ）４が挙げられる。
【０３３６】
このようなコンジュゲーションに関して、システインチオールまたはリシンアミノ基は求核性であり、リンカー試薬または化合物−リンカー中間体または薬物、例えば、（ｉ）活性エステル、例えば、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメートおよび酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキルおよびベンジルハロゲン化物、例えば、ハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド基；ならびに（ｉｖ）ジスルフィド、例えば、ピリジルジスルフィド、の求電子性基と、スルフィド交換を介して反応して共有結合を形成することができる。化合物またはリンカー上の求核性基としては、これらに限定されないが、リンカー部分またはリンカー試薬の求電子性基と反応して共有結合を形成することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレートおよびアリールヒドラジド基が挙げられる。
【０３３７】
コンジュゲーション試薬としては、マレイミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、２，６−ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステルおよびホスホラミダイトが、一般に挙げられるが、他の官能基も使用され得る。ある特定の実施形態において、方法は、例えば、マレイミド類、ヨードアセトアミド類またはハロアセチル／アルキルハライド、アジリジン、アクリロイル誘導体を使用して、システインのチオールと反応させて、化合物と反応するチオエーテルを製造することを含む。遊離チオールと活性化されたピリジルジスルフィドとのジスルフィド交換は、コンジュゲートの製造（例えば、５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）の使用）のためにも有用である。好ましくは、マレイミドが使用される。
【０３３８】
上述のように、リシンは、本明細書に示されるコンジュゲーションを達成する反応性残基としても使用することができる。求核性リシン残基は、一般に、アミン反応性スクシンイミジルエステルを通して標的化される。最適な数の脱プロトン化リシン残基を得るために、水溶液のｐＨは、リシンアンモニウム基のｐＫａである約１０．５より低くすべきであり、したがって、反応の典型的なｐＨは約８および９である。カップリング反応のための一般的試薬は、リシンアシル化機構を介して求核性リシンと反応するＮＨＳ−エステルである。同様の反応を行う他の適合試薬は、イソシアネートおよびイソチオシアネートを含むが、本明細書の教示と共に使用してＡＤＣを提供することもできる。リシンが活性化されたら、前述の連結基の多くが、ワーヘッドを抗体に共有結合させるために使用され得る。
【０３３９】
化合物をスレオニンまたはセリン残基（好ましくはＮ末端残基）にコンジュゲートさせるための方法も当該技術分野で公知である。例えば、カルボニル前駆体を、セリンまたはスレオニンの１，２−アミノアルコールから誘導し、過ヨウ素酸酸化により選択的におよび迅速にアルデヒド形態に変換させることができる方法が記載されている。アルデヒドを、本発明のタンパク質に結合する化合物におけるシステインの１，２−アミノチオールと反応させることにより、安定なチアゾリジン生成物が形成される。この方法は、Ｎ末端セリンまたはスレオニン残基でタンパク質を標識するために特に有用である。
【０３４０】
いくつかの実施形態において、反応性チオール基が、選択された抗体（またはその断片）に、１、２、３、４またはより多くの遊離システイン残基を導入することにより（例えば、１つ以上の遊離非天然システインアミノ酸残基を含む抗体を調製することにより）、導入され得る。本明細書に示す改変された遊離システイン部位および／または新規コンジュゲーション手法が提供されることに少なくとも部分的に起因して、このような部位特異的抗体または改変抗体は、コンジュゲート調製物が、向上した安定性および実質的な均一性を示すことを可能にする。鎖内または鎖間抗体ジスルフィド結合のそれぞれを完全または部分的に還元してコンジュゲーション部位を提供する従来のコンジュゲーション方法（本発明に完全に適合する）と異なり、本発明はある特定の調製された遊離システイン部位の選択的還元およびそれに対する薬物リンカーの方向をさらに提供する。
【０３４１】
これに関して、部位の改変および選択的還元により特異的に促進されたコンジュゲーションにより、所望の位置での部位特異的コンジュゲーションの割合が高くなるのを可能にすることが理解される。重大なことに、これらのコンジュゲーション部位の一部、例えば、軽鎖定常領域の末端領域に存在するコンジュゲーション部位は、他の遊離システインと交差反応しやすいために、一般に有効にコンジュゲートすることが困難である。しかしながら、得られた遊離システインの分子的遺伝子操作および選択的還元により、望ましくない高ＤＡＲ混入物および非特異的毒性を大きく減少させる効率的なコンジュゲーション率が得られ得る。より一般的には、選択的還元を含む改変された構築物および本開示の新規コンジュゲーション方法は、改善された薬物動態および／または薬力学ならびに潜在的な改善された治療指数を有するＡＤＣ調製物を提供する。
【０３４２】
ある特定の実施形態において、部位特異的構築物は、遊離システインを提示しており、還元されると、上記で開示するようなリンカー部分の求電子性基と反応して共有結合を形成することができる求核性チオール基を含む。上記のように、本発明の抗体は、還元可能な不対の鎖間もしくは鎖内システインまたは導入された非天然システイン、つまりこのような求核性基を提供するシステインを有してもよい。したがって、ある特定の実施形態において、還元された遊離システインの遊離スルフヒドリル基と、本開示の薬物リンカーの末端マレイミドまたはハロアセトアミド基との反応により、所望のコンジュゲーションが提供される。このような場合に、抗体の遊離システインは、還元剤、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）または（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）での治療により、リンカー試薬とのコンジュゲーションに反応性にしてもよい。各遊離システインは、したがって論理的に、反応性チオール求核剤を提供する。このような試薬が適合する一方、部位位特異的抗体のコンジュゲーションは、一般的に当業者に公知の様々な反応、条件および試薬を使用して達成され得ることが理解される。
【０３４３】
さらに、遺伝子操作された抗体の遊離システインは、選択的に還元されて、部位特異的コンジュゲーションの向上および望ましくない潜在的な毒性混入物の減少をもたらし得ることが見出された。より詳細には、アルギニンなどの「安定化剤」は、タンパク質中の分子内または分子間相互作用を調節することが見出され、選択された還元剤（好ましくは比較的穏やか）と組み合わせて使用され、遊離システインを選択的に還元し、本明細書に示される部位特異的コンジュゲーションを容易にし得る。本明細書で使用される場合、用語「選択的還元」または「選択的に還元される」は、相互に交換可能に使用され得、改変抗体に存在する天然ジスルフィド結合を実質的に破壊することのない遊離システインの還元を意味する。選択された実施形態において、この還元は、特定の還元剤によってのみ行うことができる。他の実施形態において、改変構築物の選択的還元は、還元剤（穏やかな還元剤を含む）と組み合わせた安定化剤の使用を含む。用語「選択的コンジュゲーション」は、本明細書に記載の細胞毒で選択的に還元された遺伝子操作された抗体のコンジュゲーションを意味することが理解される。この点に関して、選択された還元剤と組み合わせたこのような安定化剤の使用は、抗体重鎖および／または軽鎖の選択された部位におけるコンジュゲーションの程度ならびに調製物のＤＡＲ分布により決定される部位特異的コンジュゲーションの効率を顕著に改善し得る。適合する抗体構築物ならびに選択的コンジュゲーション技術および試薬は、その全体を本明細書に組み込むＷＯ２０１５／０３１６９８においてこのような方法論および構築物に関して詳細に開示されている。
【０３４４】
特定の理論に制限されることは望まないが、このような安定化剤は、所望のコンジュゲーション部位で静電気的微小環境を調節し、および／または立体配座変化を調節するように作用し得、それにより比較的穏やかな還元剤（無傷の天然のジスルフィド結合を実質的に還元しない）に、所望の遊離システイン部位でのコンジュゲーションを促進させる。このような物質（例えば、ある特定のアミノ酸）は、塩橋を（水素結合および静電相互作用を介して）形成することが知られており、好ましい構造変化を生じさせ得るおよび／または好ましくないタンパク質−タンパク質相互作用を減少させる安定化効果を付与するようにタンパク質−タンパク質相互作用を調節し得る。さらに、このような物質は、還元後の望ましくない分子内（および分子間）システイン−システイン結合の形成を阻害するように作用し得、したがって、改変された部位特異的システインが、薬物に（好ましくはリンカーを介して）結合する所望のコンジュゲーション反応が促進される。選択的還元条件は、無傷の天然のジスルフィド結合を顕著に還元しないので、後のコンジュゲーション反応は自然に、遊離システイン上の比較的反応性の少ないチオール（例えば、好ましくは抗体あたり２つの遊離チオール）に向かう。先に言及したように、このような技術は、本開示に従って作製されるコンジュゲート調製物における非特異的コンジュゲーションおよび対応する不純物のレベルを相当に減少させるために使用され得る。結果として、これらの部位特異的ＡＤＣ組成物は、低い毒性を示し得る。
【０３４５】
選択された実施形態において、本発明に適合する安定化剤は、一般的に、塩基性ｐＫａを有する少なくとも１つの成分を有する化合物を含む。ある特定の実施形態において、この成分は、一級アミンを含むが、他の実施形態において、アミン部分は、二級アミンを含む。さらに他の実施形態において、アミン部分は、三級アミンまたはグアニジニウム基を含む。他の選択された実施形態において、アミン部分は、アミノ酸を含み、他の適合する実施形態において、アミン部分は、アミノ酸側鎖を含む。さらに他の実施形態において、アミン部分は、タンパク質性アミノ酸を含む。さらに他の実施形態において、アミン部分は、非タンパク質性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、適合する安定化剤は、アルギニン、リシン、プロリンおよびシステインを含み得る。さらに適合安定化剤は、グアニジンおよび塩基性ｐＫａを有する窒素含有複素環を含み得る。
【０３４６】
ある特定の実施形態において、適合安定化剤は、約７．５より大きいｐＫａを有する少なくとも１つのアミン部分を有する化合物を含む。他の実施形態において、対象アミン部分は、約８．０より大きいｐＫａを有し、さらに他の実施形態において、アミン部分は、約８．５より大きいｐＫａを有し、さらに他の実施形態において、安定化剤は、約９．０より大きいｐＫａを有するアミン部分を含む。他の実施形態は、アミン部分が約９．５より大きいｐＫａを有する安定化剤を含み、一方で、ある特定の他の実施形態は、約１０．０より大きいｐＫａを有する少なくとも１つのアミン部分を示す安定化剤を含む。さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１０．５より大きいｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含み、他の実施形態において、安定化剤は、約１１．０より大きいｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含み、さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１１．５より大きいｐＫａを有するアミン部分を含む。さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１２．０より大きいｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含み、さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１２．５より大きいｐＫａを有するアミン部分を含む。当業者は、関連するｐＫａが、標準的技術を使用して容易に計算または決定され得、安定化剤としての選択された化合物の使用の適応性を決定するために使用され得ることを理解する。
【０３４７】
本開示の安定化剤は、ある特定の還元剤と組み合わされるときに、遊離の部位特異的システインに対するコンジュゲーションの標的化において特に有効であることが示される。本発明の目的に関して、適合する還元剤は、改変抗体の天然ジスルフィド結合を顕著に破壊することなく、コンジュゲーションについて部位特異的な還元された遊離のシステインを生じさせる、任意の化合物を含み得る。好ましくは、このような選択された安定化剤と還元剤との組合せによりもたらされる条件下において、活性化薬物リンカーは、所望の遊離の部位特異的システイン部位に結合するよう大きく制限されることになる。比較的低濃度で使用され、穏やかな条件を与える比較的穏やかな還元剤または還元剤が、特に好ましい。本明細書で使用される場合、用語「穏やかな還元剤」または「穏やかな還元条件」は、改変抗体に存在する天然ジスルフィド結合を実質的に破壊することなく、遊離システイン部位でチオールを提供する還元剤により（任意選択的に安定化剤の存在下で）もたらされる任意の物質または条件を意味することが支持される。つまり、穏やかな還元剤または条件（好ましくは安定化剤との組合せ）は、タンパク質の天然ジスルフィド結合を顕著に破壊することなく、遊離システインを効果的に還元する（チオールを提供する）ことができる。所望の還元条件は、選択的コンジュゲーションのための適切な環境を確立するいくつかのスルフヒドリル系化合物により提供され得る。実施形態において、穏やかな還元剤は、１つ以上の遊離チオールを有する化合物を含み得、いくつかの実施形態において、穏やかな還元剤は、単一の遊離チオールを有する化合物を含む。本発明の選択的還元技術に適合する還元剤の非限定的な例としては、グルタチオン、ｎ−アセチルシステイン、システイン、２−アミノエタン−１−チオールおよび２−ヒドロキシエタン−１−チオールが挙げられる。
【０３４８】
上記に示される選択的還元プロセスは、遊離のシステインに対する標的化コンジュゲーションで特に効果的であることが理解される。この点に関して、部位特異的抗体における、所望の標的部位に対するコンジュゲーションの程度（ここでは「コンジュゲーション効率」として定義する）は、当該技術分野で受け入れられている様々な技術により決定され得る。抗体に対する薬物の部位特異的コンジュゲーション効率は、全ての他のコンジュゲーション部位に対する標的コンジュゲーション部位（例えば、各軽鎖のｃ末端の遊離システイン）のコンジュゲーションのパーセンテージを評価することによって決定され得る。ある特定の実施形態において、本明細書における方法は、遊離システインを含む抗体に薬物を効率的にコンジュゲートすることを提供する。いくつかの実施形態において、コンジュゲーション効率は、全ての他のコンジュゲーション部位に対する標的コンジュゲーションのパーセンテージにより測定して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％またはそれ以上である。
【０３４９】
コンジュゲーション可能な改変抗体は、抗体が産生または保存されるときに、阻止またはキャップされるスルフヒドリル基を含む遊離システイン残基を含有し得ることがさらに理解される。このようなキャップとしては、小分子、タンパク質、ペプチド、イオンおよびスルフヒドリル基と相互作用し、コンジュゲート形成を予防または阻害する他の物質が挙げられる。いくつかの場合において、コンジュゲートしていない改変抗体は、同じまたは異なる抗体上の他の遊離システインに結合する遊離システインを含んでもよい。本明細書で述べられているように、このような交差反応性は、作製手順の間に様々な混入物を導き得る。いくつかの実施形態において、改変抗体は、コンジュゲーション反応の前にキャップ除去（ｕｎｃａｐ）されることを必要とし得る。特定の実施形態において、本明細書の抗体は、キャップ除去されており、コンジュゲーション可能な遊離スルフヒドリル基を提示する。特定の実施形態において、本明細書の抗体は、天然に存在するジスルフィド結合を破壊も再配列もしない、キャップ除去反応にかけられる。ほとんどの場合において、キャップ除去反応は通常の還元反応（還元または選択的還元）中に生じることが理解される。
【０３５０】
Ｄ．ＤＡＲ分布および精製
選択された実施形態において、本発明に適合するコンジュゲーションおよび精製方法は、狭いＤＡＲ分布を含む比較的均質なＡＤＣ調製物を生成する能力を有利にもたらす。この点に関して、本開示の構築物（例えば、部位特異的構築物）および／または選択的コンジュゲーションは、薬物と改変抗体との間の化学量論比の観点および毒素の位置に関して、試料内のＡＤＣ種の均質性を提供する。上記で簡単に述べたように、用語「薬物対抗体比」または「ＤＡＲ」は、抗体に対する薬物のモル比を指す。ある特定の実施形態において、コンジュゲート調製物は、そのＤＡＲ分布に関して実質的に均質であり得、このことは、ＡＤＣ調製物の内で、特定のＤＡＲ（例えば、２または４のＤＡＲ）を有する部位特異的ＡＤＣが主要な種であり、この種はまた、ローディングの部位（すなわち、遊離システイン上）に関しても均一であることを意味する。本発明の他のある特定の実施形態において、部位特異的抗体および／または選択的還元ならびにコンジュゲーションの使用を通じて、所望の均質性を達成することができる。他の実施形態において、所望の均質性は、選択的還元と組み合わせた部位特異的構築物の使用を通じて達成し得る。さらに他の実施形態において、適合する調製物は、所望の均質性を得るために分析的または分取クロマトグラフィー技術を使用してさらに精製され得る。これらの実施形態のそれぞれにおいて、ＡＤＣ試料の均質性は、当該技術分野で公知の様々な技術、例えば、これらに限定されないが、質量分析、ＨＰＬＣ（例えば、サイズ排除ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＨＩＣ−ＨＰＬＣなど）またはキャピラリー電気泳動を使用して解析され得る。
【０３５１】
ＡＤＣ調製物の精製に関して、所望の純度を得るために、標準的医薬調製方法が使用され得ることが理解される。本明細書において述べられているように、液体クロマトグラフィー方法、例えば、逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、薬物負荷値により混合物中の化合物を分離することができる。一部の場合に、イオン交換（ＩＥＣ）または混合モードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）を使用して、特異的薬物負荷を有する種を単離してもよい。
【０３５２】
本開示のＡＤＣおよびその調製物は、抗体の構成および少なくとも部分的にコンジュゲーションを達成するために使用される方法に依存して、様々な化学量論モル比の薬物部分および抗体成分を含むことができる。ある特定の実施形態において、ＡＤＣあたりの薬物負荷は、１から２０のワーヘッドを含み得る（すなわち、ｎは１〜２０である）。他の選択された実施形態は、１から１５のワーヘッドの薬物負荷を有するＡＤＣを含む。さらに他の実施形態において、ＡＤＣは、１から１２のワーヘッド、またはより好ましくは１から１０のワーヘッドを含み得る。いくつかの実施形態において、ＡＤＣは、１から８のワーヘッドを含む。
【０３５３】
理論的薬物負荷は比較的高くてもよいが、遊離システイン交差反応性およびワーヘッド疎水性などの実際上の限定により、このようなＤＡＲを含む均質な調製物の生成は、凝集物および他の混入物により限定される傾向がある。つまり、高い薬物負荷、例えば、＞６または８は、ペイロードによって、凝集、不溶性、毒性またはある特定の抗体薬物コンジュゲートの細胞透過性の消失を引き起こし得る。このような懸念の観点から、本発明により提供される実際の薬物負荷は、好ましくは、コンジュゲートあたり１から８個の薬物の範囲であり、すなわち各抗体に１、２、３、４、５、６、７または８個の薬物が共有結合している（例えば、ＩｇＧ１の場合には、他の抗体が、ジスルフィド結合の数に応じて異なる負荷許容量を有し得る）。好ましくは、本発明の組成物のＤＡＲは、およそ２、４または６であり、いくつかの実施形態において、ＤＡＲはおよそ２である。
【０３５４】
本発明により提供される比較的高いレベルの均質性にかかわらず、本開示の組成物は、ある範囲の（例えば、ＩｇＧ１の場合は１から８の範囲の）薬物化合物を有するコンジュゲートの混合物を実際に含む。このように、本開示のＡＤＣ組成物は、コンジュゲートの混合物を含み、ここで構成要素の抗体のほとんどは、１つ以上の薬物部分に共有結合的に連結されており、（改変された構築物および選択的還元によりもたらされる相対的なコンジュゲート特異性にもかかわらず）、薬物部分は様々なチオール基により抗体に結合されていてもよい。つまり、以下の本発明のコンジュゲートＡＤＣ組成物は、様々な濃度の異なる薬物負荷（例えば、ＩｇＧ１抗体あたり１から８の薬物）を有するコンジュゲートの混合物を含む（遊離システインの交差反応性によって主に引き起こされる一定の反応混入物を含む）。しかしながら選択的還元および作製後の精製を使用して、コンジュゲート組成物は、単一の主要な所望のＡＤＣ種（例えば、２の薬物負荷を有する）を大量に含み、他のＡＤＣ種（例えば、１、４、６などの薬物負荷を有する）は比較的低レベルとなる点に導かれ得る。平均ＤＡＲ値は、組成物全体（すなわち、全てのＡＤＣ種をまとめたもの）に対する薬物負荷の加重平均を表す。用いられる定量法の固有の不確定性と商業的状況において非優勢ＡＤＣ種を完全に除去することの困難性とにより、許容可能なＤＡＲ値または特異度、平均値、範囲または分布として表されることが多い（すなわち、平均ＤＡＲが２＋／−０．５）。好ましくは、範囲内（すなわち、１．５から２．５）に測定された平均ＤＡＲを含む組成物が、医薬的状況において使用される。
【０３５５】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、１、２、３、４、５、６、７または８でそれぞれ＋／−０．５の平均ＤＡＲを有する組成物を含む。他の実施形態において、本発明は、２、４、６または８＋／−０．５の平均ＤＡＲを含む。最終的に、選択された実施形態において、本発明は、２＋／−０．５または４＋／−０．５の平均ＤＡＲを含む。この範囲または偏差は、いくつかの実施形態において、０．４未満であり得ることが理解される。したがって、他の実施形態において、組成物は、１、２、３、４、５、６、７もしくは８でそれぞれ＋／−０．３の平均ＤＡＲ、２、４、６もしくは８＋／−０．３の平均ＤＡＲ、さらにより好ましくは２もしくは４＋／−０．３の平均ＤＡＲ、またはさらには２＋／−０．３の平均ＤＡＲを含む。他の実施形態において、ＩｇＧ１コンジュゲート組成物は、好ましくは、平均ＤＡＲが１、２、３、４、５、６、７または８でそれぞれ＋／−０．４で、非優勢ＡＤＣ種が比較的低いレベル（すなわち、３０％未満）である組成物を含む。他の実施形態において、ＡＤＣ組成物は、２、４、６または８でそれぞれ＋／−０．４の平均ＤＡＲを含み、非優勢ＡＤＣ種を比較的低レベル（＜３０％）で含む。いくつかの実施形態において、ＡＤＣ組成物は、２＋／−０．４の平均ＤＡＲを含み、非優勢ＡＤＣ種を比較的低いレベル（＜３０％）で含む。さらに他の実施形態において、優勢ＡＤＣ種（例えば、ＤＡＲが２またはＤＡＲが４）は、他のＤＡＲ種に対して測定するとき、６５％超の濃度、７０％超の濃度、７５％超の濃度、８０％超の濃度、８５％超の濃度、９０％超の濃度、９３％超の濃度、９５％超の濃度またはさらに９７％超の濃度で存在する。
【０３５６】
当業者は、コンジュゲーション反応由来のＡＤＣの調製物における抗体あたりの薬物の分布は、従来手段、例えば、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度法、逆相ＨＰＬＣ、ＨＩＣ、質量分析、ＥＬＩＳＡおよび電気泳動法により性質決定され得ることを理解する。例として、抗体あたりの薬物の観点でＡＤＣの定量的分布も、ＨＩＣおよびＲＰクロマトグラフィーの組合せを使用して決定され得る。同様に、ＡＤＣの特定の調製物における抗体あたりの薬物の平均値がＥＬＩＳＡを使用して決定され得るが、抗体あたりの薬物の分布の値は、抗体−抗原結合および検出限界のため、容易には識別できない。さらに、ＥＬＩＳＡアッセイは、薬物部分が抗体上に結合する場所に関する情報を提供しない。しかし、上で言及したように、このようなデータは、当該技術分野で周知の様々なクロマトグラフィーおよび電気泳動技術を用いて容易に得ることができる。
【０３５７】
ＶＩ．診断およびスクリーニング
Ａ．診断
本発明は、増殖性障害を検出、診断またはモニタリングするためのインビトロおよびインビボの方法ならびに患者からの細胞をスクリーニングして、腫瘍形成性細胞を含む腫瘍細胞を同定するための方法を提供する。このような方法は、がんを有する個体を治療のために特定することまたはがんの進行をモニタリングする方法であって、ＤＬＬ３決定因子を特異的に認識し、会合することができる検出剤（例えば、抗体または核酸プローブ）と、患者または患者から得られた試料とを、（インビボまたはインビトロのいずれかで）接触させることおよび試料における検出剤の存在もしくは不在または会合のレベルを検出することを含む、方法を含む。選択された実施形態において、検出剤は、本明細書に記載の検出可能な標識またはレポーター分子と会合した抗体を含む。特定の他の実施形態において、ＤＬＬ３抗体は、投与され、二次標識抗体（例えば、抗マウス抗体）を用いて検出される。さらに他の実施形態（例えば、インサイチュハイブリダイゼーションまたはＩＳＨ）において、ゲノムＤＬＬ３決定因子と反応する核酸プローブは、増殖性障害の検出、診断またはモニタリングに使用される。
【０３５８】
より一般的に、ＤＬＬ３決定因子の存在および／またはレベルは、タンパク質または核酸解析のために当業者に利用可能ないくつかの任意の技術、例えば、直接的物理学的測定（例えば、質量分析）、結合アッセイ（例えば、イムノアッセイ、凝集アッセイおよびイムノクロマトグラフィーアッセイ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ；ＲＴ−ｑＰＣＲ）技術、分枝鎖オリゴヌクレオチド技術、ノザンブロット技術、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション技術ならびにインサイチュハイブリダイゼーション技術を使用して測定されてもよい。方法には、化学反応、例えば、光学的吸光度の変化、蛍光の変化、化学発光もしくは電気化学発光の生成、反射率、屈折率もしくは光散乱の変化、検出可能標識の蓄積もしくは表面からの放出、酸化もしくは還元もしくは酸化還元種、電流もしくは電位、磁場の変化などから生じるシグナルの測定を含んでもよい。適切な検出技術は、光発光（例えば、蛍光、時間分解蛍光、エバネッセント波蛍光、アップコンバート性リン、多光子蛍光の測定を介して）、化学発光、電気化学発光、光散乱、光吸収、放射能、磁場、酵素活性（例えば、光吸収もしくは蛍光の変化を生じさせるまたは化学発光の放射を生じさせる酵素反応を通じた酵素活性の測定による）を介した標識の測定を通じて、標識された結合試薬の参加を測定することにより、結合事象を検出してもよい。代替的に、標識の使用を必要としない検出技術、例えば、質量（例えば、表面弾性波測定）、屈折率（例えば、表面プラズモン共鳴測定）または分析物の固有の発光の測定に基づく技術を使用してもよい。
【０３５９】
いくつかの実施形態において、検出剤と試料中の特定の細胞または細胞成分との会合は、試料が腫瘍形成性細胞を含む可能性があることを示しており、したがって、がんを有する個体を本明細書に記載の抗体またはＡＤＣを用いて効果的に治療し得ることを示している。
【０３６０】
ある特定の好ましい実施形態において、アッセイには、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイもしくはこの変形（例えば、蛍光、色素生産性、標準ＡＢＣ、標準ＬＳＡＢなど）、免疫細胞化学もしくはこの変形（例えば、直接、間接、蛍光、色素生産性など）またはインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）もしくはこの変形（例えば、色素生産性インサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）もしくは蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＤＮＡ−ＦＩＳＨまたはＲＮＡ−ＦＩＳＨ］））が含まれてもよい。
【０３６１】
この点に関して、本発明のある特定の態様は、免疫組織化学（ＩＨＣ）のための標識されたＤＬＬ３抗体の使用を含む。他の実施形態において、ＤＬＬ３抗体は、二次標識抗体を用いて検出される。より詳細にはＤＬＬ３  ＩＨＣは、様々な増殖性障害の診断を補助するためおよびＤＬＬ３抗体療法を含む治療に対する潜在的な応答をモニタリングするための診断ツールとして使用され得る。本明細書で議論するようにおよび下記実施例において示されるように、適合する診断アッセイは、化学的に固定された（適合技術としては、これらに限定されないが、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、四酸化オスミウム、重クロム酸カリウム、酢酸、アルコール、亜鉛塩、塩化第二水銀、四酸化クロムおよびピクリン酸が挙げられる）ならびに包埋された（適合技術としては、これらに限定されないが、グリコールメタクリレート、パラフィンおよび樹脂が挙げられる）または凍結を介して保存された組織に対して実施され得る。このようなアッセイは、治療の決定に対する道筋を立て、投与レジメンおよびタイミングを決定するために使用され得る。
【０３６２】
下記実施例において示されるように、免疫組織化学技術を用いて、当該技術分野で公知のＨスコアを得ることができる。このようなＨスコアは、どの患者が本発明の組成物による治療に適し得るかを示すために用いることができる。下記実施例に基づいて、３００ポイントスケール上の約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０もしくは約２００またはそれ以上のＨスコアを、どの患者が本発明の治療方法に好ましく反応し得るかを示すために、選択された実施形態において、用いることができる。したがって、一実施形態において、本発明のＤＬＬ３  ＡＤＣにより治療される患者は、３００ポイントスケール上の少なくとも９０のＨスコア（すなわち、腫瘍がＤＬＬ３＋）を有する。他の実施形態において、本発明のＤＬＬ３  ＡＤＣにより治療される患者は、少なくとも１２０のＨスコアを有する。さらに他の実施形態において、本発明のＤＬＬ３  ＡＤＣにより治療される患者は、少なくとも１８０のＨスコアを有する。本開示の目的のために３００ポイントスケール上の９０またはそれ以上のＨスコアを示す任意の腫瘍は、ＤＬＬ３＋腫瘍とみなされ、本開示の抗体またはＡＤＣによる治療の対象となる。
【０３６３】
他の実施形態において、患者の選択は、腫瘍試料中の陽性染色ＤＬＬ３細胞のパーセンテージのより単純な測定に基づき得る。この点に関して、抗ＤＬＬ３抗体を用いて調査した場合にＩＨＣ試料中の特定のパーセンテージの陽性染色細胞を示す患者は、ＤＬＬ３＋とみなされ、本明細書における教示に従って治療に選択される。このような実施形態において、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超または５０％超の陽性細胞染色を示す腫瘍試料は、ＤＬＬ３＋と分類することができる。他の実施形態において、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超または９５％超の陽性細胞染色を示す腫瘍試料は、ＤＬＬ３＋と分類することができる。特定の好ましい態様において、ＤＬＬ３＋腫瘍は、構成細胞の≧５０％においてＤＬＬ３を発現する。前述の実施形態のそれぞれにおいて、ＤＬＬ３＋陽性腫瘍に罹患している患者は、本明細書で示す本開示の組成物により治療され得る。
【０３６４】
他の特に適合する本発明の態様は、ＤＬＬ３決定因子を検出またはモニタリングするためのインサイチュハイブリダイゼーションの使用を含む。インサイチュハイブリダイゼーション技術またはＩＳＨは、当業者にとって周知である。簡潔には、細胞を固定し、特定のヌクレオチド配列を含有する検出可能なプローブを固定した細胞に加える。細胞が相補的ヌクレオチド配列を含有する場合には、検出され得るプローブは、それらの配列にハイブリダイズする。本明細書に示す配列情報を使用して、遺伝子型ＤＬＬ３決定因子を発現する細胞を特定するようにプローブを設計することができる。プローブは、好ましくは、そのような決定因子に対応するヌクレオチド配列にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件は、不完全な相補的ハイブリダイゼーションによるバックグラウンドシグナルを最小化するように慣用的に最適化することができるが、好ましくは、プローブは、選択されたＤＬＬ３決定因子に完全に相補的であることが好ましい。選択された実施形態において、プローブは、プローブに付された蛍光色素で標識されており、つまり標準的蛍光方法により容易に検出可能である。
【０３６５】
インビボの診断治療または診断に適合するアッセイには、当業者に公知の磁気共鳴画像、コンピュータ断層撮影（例えば、ＣＡＴスキャン）、陽電子放射断層撮影（例えば、ＰＥＴスキャン）、Ｘ線撮影、超音波のような当該分野で認識されている画像化またはモニタリング技術を含めてもよい。
【０３６６】
ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、患者試料（例えば、血漿または血液）中の特定の決定因子（例えば、ＤＬＬ３タンパク質）のレベルを検出および定量するために使用することができ、同様に、関連する決定因子が関与する増殖性障害を検出、診断またはモニタリングするために使用することができる。関連する実施形態において、本発明の抗体は、循環腫瘍細胞をインビボまたはインビトロのいずれかで検出、モニタリングおよび／または定量するために使用され得る（ＷＯ２０１２／０１２８８０１）。さらに他の実施形態において、循環腫瘍細胞は、腫瘍形成性細胞を含み得る。
【０３６７】
本発明のある特定の実施形態において、対象または対象由来の試料における腫瘍形成性細胞は、治療またはレジメンのベースラインが確立される前に、本開示の抗体を使用して評価または性質決定され得る。他の例において、腫瘍形成性細胞は、治療された対象から誘導される試料から評価され得る。
【０３６８】
別の実施形態において、本発明は、がんの進行および／または病因をインビボで分析する方法を提供する。別の実施形態において、がんの進行および／または病因のインビボでの解析は、腫瘍の進行の程度を決定することを含む。別の実施形態において、解析は、腫瘍の同定を含む。別の実施形態において、腫瘍の進行の解析が、原発性腫瘍に対して行われる。別の実施形態において、解析は、当業者にとって公知のように、がんの種類に応じて経時的に行われる。別の実施形態において、原発性腫瘍の転移性細胞に起因する二次性腫瘍の解析が、さらにインビボで行われる。別の実施形態において、二次性腫瘍の大きさと形状が解析される。いくつかの実施形態において、さらにエクスビボの解析が行われる。
【０３６９】
別の実施形態において、本発明は、がんの進行および／または病因をインビボで解析する方法であって、細胞の転移を決定することまたは循環腫瘍細胞のレベルを検出することおよび定量することを含む方法を提供する。さらに別の実施形態において、細胞転移の解析は原発性腫瘍から不連続の部位において、細胞の進行性成長を測定することを含む。いくつかの実施形態において、手法は、血管、リンパ、体腔内またはそれらの組合せを通じて分散する腫瘍細胞をモニタリングするために行うことができる。別の実施形態において、細胞転移解析は、細胞遊走、播種、血管外漏出、増殖またはそれらの組合せの結果として行われる。
【０３７０】
ある特定の例において、対象または対象由来の試料における腫瘍形成性細胞は、治療の前にベースラインを確立するために、本開示の抗体を使用して評価または性質決定されてもよい。他の例において、試料は、治療された対象から誘導される。いくつかの例において、試料は、対象が治療を開始または終了してから少なくとも約１、２、４、６、７、８、１０、１２、１４、１５、１６、１８、２０、３０、６０、９０日、６カ月、９カ月、１２カ月または１２カ月よりも後の対象から得られる。ある特定の実施例において、腫瘍形成性細胞は、一定数の投与の後（例えば、治療の２、５、１０、２０、３０回以上の投与の後）に、評価または性質決定される。他の例において、腫瘍形成性細胞は、１回以上の治療を受けてから１週、２週、１カ月、２カ月、１年、２年、３年、４年以上後に、性質決定または評価される。
【０３７１】
Ｂ．スクリーニング
ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、決定因子との相互作用により腫瘍細胞の機能または活性を変化させる化合物または作用因子（例えば、抗体またはＡＤＣ）を同定するために、試料のスクリーニングに使用することができる。一実施形態において、腫瘍細胞は、抗体またはＡＤＣと接触させられ、この抗体またはＡＤＣは、ある特定の標的（例えばＤＬＬ３）を発現する細胞について腫瘍をスクリーニングするために使用され、このような細胞を例えば限定されないが診断目的などの目的のために同定すること、このような細胞をモニタリングして治療の有効性を決定することまたはこのような標的発現細胞のための細胞集団を濃縮することができる。
【０３７２】
さらに別の実施形態において、方法は、腫瘍細胞を試験薬剤または化合物に直接的または間接的に接触させることと、試験薬剤または化合物が、決定因子会合腫瘍細胞の活性または機能を調節するかどうか、例えば、細胞の形態または生存性の変化、マーカーの発現、分化または脱分化、細胞の呼吸作用、ミトコンドリア活性、膜完全性、成熟性、増殖性、生存性、アポトーシスまたは細胞死を調節するかどうかを決定することとを含む。直接的相互作用の一例は物理的相互作用であり、一方で、間接的相互作用としては、例えば、参照実体（例えば、細胞または細胞培養物）に順に作用する中間的分子に対する組成物の作用が挙げられる。
【０３７３】
スクリーニング方法は、ハイスループットスクリーニングを含み、この方法は、例えば、培養皿、チューブ、フラスコ、ローラボトルまたはプレート上に、任意選択的に所定の位置において、配置されたまたは置かれた細胞のアレイ（例えば、マイクロアレイ）を含み得る。ハイスループットのロボットまたは手作業による方法は、化学的相互作用を調べ、短期間に多くの遺伝子の発現レベルを決定することができる。分子シグナルを利用する、例えば、フルオロフォアまたはマイクロアレイを介する技術（Ｍｏｃｅｌｌｉｎ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ、２００７、ＰＭＩＤ：１７２６５７１３）が開発され、さらに情報を非常に迅速に処理する解析（例えば、Ｐｉｎｈａｓｏｖら、２００４、ＰＭＩＤ：１５０３２６６０参照）が自動化されてきた。スクリーニングされ得るライブラリは、例えば、小分子ライブラリ、ファージディスプレイライブラリ、全ヒト抗体酵母ディスプレイライブラリ（Ａｄｉｍａｂ）、ｓｉＲＮＡライブラリおよびアデノウイルストランスフェクションベクターを含む。
【０３７４】
ＶＩＩ．医薬調製物および治療的使用
Ａ．製剤および投与経路
本発明の抗体またはＡＤＣは、当該技術分野で認識されている技術を使用して様々な方法で製剤化され得る。いくつかの実施形態において、本発明の治療組成物は、そのまままたは最小量の付加的成分と共に投与することができ、他方で任意選択的に適切な医薬として許容される担体を含有するように製剤化してもよい。本明細書で使用される場合、「医薬として許容される担体」は、当該技術分野で周知であり、医薬調製物で使用するために商業的供給源から入手可能である、賦形剤、ビヒクル、アジュバントおよび希釈剤を含む（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（２００３）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ｗｉｔｈ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ：Ｄｒｕｇｆａｃｔｓ  Ｐｌｕ、第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；Ａｎｓｅｌら（２００４）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第７版、Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｋｉｂｂｅら（２０００）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第３版、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓを参照）。
【０３７５】
適切な医薬として許容される担体は、比較的不活性である物質を含み、抗体またはＡＤＣの投与を容易にすることができるかまたは活性化合を作用部位に送達するために医薬として最適化された調製物に処理することを補助し得る。
【０３７６】
このような医薬として許容される担体は、製剤の形態、一貫性、粘度、ｐＨ、張度、安定性、浸透圧、薬物動態、タンパク質凝集または溶解度を変えることができる薬剤を含み、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、希釈剤、カプセル剤および皮膚浸透促進剤を含む。担体のある特定の非限定的例は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、アルギニン、ショ糖、水、グリセロール、エタノール、ソルビトール、デキストラン、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびこれらの組合せを含む。全身投与のための抗体は、経腸的、非経口的または局所的投与のために製剤化され得る。特定の実施形態において、本開示の組成物は、静脈内投与用に製剤化され、好ましくはＩＶ容器（例えば、ＩＶ点滴バッグ）を用いて注入される。実際、３種類の製剤全てが、活性成分の全身投与を達成するために同時に使用され得る。非経口的および経口的薬物送達のための賦形剤および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇに示されている。
【０３７７】
経腸投与のために適切な製剤は、硬または軟ゼラチンカプセル剤、丸剤、錠剤、例えば、被覆錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップまたは吸入剤およびこれらの制御放出形態を含む。
【０３７８】
非経口投与（例えば、注射または注入による）に適切な製剤としては、活性成分が、溶解、懸濁化または他の方法で（例えば、リポソームまたは他の微小粒子系で）提供される水性または非水性、等張性、発熱物質不含、滅菌液（例えば、溶液、懸濁液）が挙げられる。このような液体は、他の医薬として許容される抗体、例えば、抗酸化剤、緩衝剤、保存剤、安定化剤、静菌剤、懸濁化剤、増粘剤および製剤を対象とするレシピエントの血液（または他の関連する体液）と等張にする溶質をさらに含んでもよい。賦形剤の例としては、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油などが挙げられる。  このような製剤に使用するための適切な等張の医薬として許容される担体の例は、塩化ナトリウム注射剤、リンゲル液または乳酸リンゲル注射剤を含む。
【０３７９】
特に好ましい実施形態において、本発明の製剤化された組成物は、凍結乾燥して、投与前に再構成することができる粉末形態の抗体またはＡＤＣを提供することができる。注射用溶液の調製のための滅菌粉末は、有効成分を任意選択の共可溶化生体適合性成分と共に含む粉末を生成するために本開示の抗体またはＡＤＣを含む溶液を凍結乾燥することによって得ることができる。一般的に、分散体または溶液は、塩基性分散媒または溶媒（例えば、希釈剤）および任意選択的に他の生体適合性成分を含む滅菌媒体に活性化合物を混入することによって調製される。適合する希釈剤は、医薬として許容されるもの（ヒトへの投与のために安全で、非毒性である）であり、凍結乾燥後に再構成される製剤のような、液体製剤の調製に有用である。例示的希釈剤は、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩液、リンゲル液またはデキストロース溶液を含む。代替的な実施形態において、希釈剤は、塩および／または緩衝剤の水溶液を含み得る。
【０３８０】
特定の好ましい実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣは、医薬として許容される糖と組み合わせて凍結乾燥される。「医薬として許容される糖」は、目的のタンパク質と組み合わせた場合、保存時のタンパク質の化学的および／または物理的不安定性を著しく予防するまたは減少させる分子である。このような糖は、製剤が凍結乾燥され、次いで再構成されることが意図される場合、とりわけ適合する。本明細書で使用される場合、医薬として許容される糖は、「乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）」と称すこともできる。例示的糖およびそれらの対応する糖アルコールは、グルタミン酸一ナトリウムまたはヒスチジンのようなアミノ酸；ベタインのようなメチルアミン；硫酸マグネシウムのようなリオトロピック塩；三価またはより高い分子量の糖アルコール、例えば、グリセリン、デキストラン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールのようなポリオール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）；ならびにそれらの組合せを含む。さらなる例示的乾燥保護剤は、グリセリンおよびゼラチンならびに糖メリビオース、メレジトース、ラフィノース、マンノトリオースおよびスタキオースを含む。還元糖の例は、グルコース、マルトース、ラクトース、マルツロース、イソマルツロースおよびラクツロースを含む。非還元糖の例は、糖アルコールおよび他の直鎖ポリアルコールから選択されるポリヒドロキシ化合物の非還元グリコシドを含む。好ましい糖アルコールは、モノグリコシド、とりわけ、ラクトース、マルトース、ラクツロースおよびマルツロースのような二糖の還元により得られる化合物である。グリコシド側基は、グルコシド側基またはガラクトシド側基であり得る。糖アルコールのさらなる例は、グルシトール、マルチトール、ラクチトールおよびイソマルツロースである。好ましい医薬として許容される糖は、非還元糖トレハロースまたはショ糖である。医薬として許容される糖は、タンパク質が保存中の物理的および化学的安定性および完全性を本質的に保持する（例えば、再構成および保存後）ことを意味する「保護量」（例えば、凍結乾燥前）で製剤に添加される。
【０３８１】
当業者は、適合乾燥保護剤は、約１ｍＭから約１０００ｍＭ、約２５ｍＭから約７５０ｍＭ、約５０ｍＭから約５００ｍＭ、約１００ｍＭから約３００ｍＭ、約１２５ｍＭから約２５０ｍＭ、約１５０ｍＭから約２００ｍＭまたは約１６５ｍＭから約１８５ｍＭの範囲の濃度で液体または凍結乾燥製剤に添加することができることを理解する。特定の実施形態において、乾燥保護剤は、約１０ｍＭ、約２５ｍＭ、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、１６５ｍＭ、約１７０ｍＭ、１７５ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１８５ｍＭ、約１９０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約４００ｍＭ、約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、約７００ｍＭ、約８００ｍＭ、約９００ｍＭまたは約１０００ｍＭの濃度となるように添加することができる。特定の好ましい実施形態において、乾燥保護剤は、医薬として許容される糖を含み得る。とりわけ好ましい態様において、医薬として許容される糖は、トレハロースまたはショ糖を含む。
【０３８２】
他の選択された実施形態において、本発明の液体および凍結乾燥製剤は、安定化剤または緩衝剤として作用する、アミノ酸またはそれらの医薬として許容される塩を含む、特定の化合物を含み得る。このような化合物は、約１ｍＭから約１００ｍＭ、約５ｍＭから約７５ｍＭ、約５ｍＭから約５０ｍＭ、約１０ｍＭから約３０ｍＭまたは約１５ｍＭから約２５ｍＭの範囲の濃度で添加することができる。特定の実施形態において、緩衝剤は、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭまたは約１００ｍＭの濃度となるように添加することができる。他の選択された実施形態において、緩衝剤は、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭまたは約１００ｍＭの濃度となるように添加することができる。特定の好ましい実施形態において、緩衝剤は、ヒスチジン塩酸塩（例えば、Ｌ−ヒスチジンＨＣＬ）を含む。
【０３８３】
さらに他の選択された実施形態において、本発明の液体および凍結乾燥製剤は、安定化剤としてのポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０またはポリソルベート８０のような非イオン性界面活性剤を含み得る。このような化合物は、約０．１ｍｇ／ｍｌから約２．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌから約１．０ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌから約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌから約０．６ｍｇ／ｍｌｍまたは約０．３ｍｇ／ｍｌから約０．５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で添加することができる。特定の実施形態において、界面活性剤は、約０．１ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌまたは約１．０ｍｇ／ｍｌの濃度となるように添加することができる。他の選択された実施形態において、界面活性剤は、約１．１ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ、約１．９ｍｇ／ｍｌまたは約２．０ｍｇ／ｍｌの濃度となるように添加することができる。特定の好ましい実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベート２０またはポリソルベート４０を含む。とりわけ好ましい態様において、界面活性剤は、ポリソルベート２０を含む。
【０３８４】
凍結乾燥粉末から再構成されたか未処理の溶液かにかかわらず、非経口投与（例えば、静脈内注射）用の本開示の抗体またはＡＤＣの適合する製剤は、約１０μｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬのＡＤＣまたは抗体濃度を含み得る。特定の選択された実施形態において、抗体またはＡＤＣ濃度は、２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、６００μｇ／ｍＬ、７００μｇ／ｍＬ、８００μｇ／ｍＬ、９００μｇ／ｍＬまたは１ｍｇ／ｍＬを含む。他の実施形態において、ＡＤＣ濃度は、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬまたは１００ｍｇ／ｍＬを含む。
【０３８５】
特定の好ましい態様において、本発明の組成物は、１０ｍｇ／ｍｌのＤＬＬ３  ＡＤＣ（例えば、ｈＳＣ１６．５６ＤＬ１、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１ＤＬ６など）、２０ｍＭのヒスチジン塩酸塩、０．１７５Ｍのショ糖、ｐＨ６．０の０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０を含む液体製剤を含む。一態様において、本発明の組成物は、１０ｍｇ／ｍｌのｈＳＣ１６．５６ＤＬ１（すなわち、Ｒｏｖａ−Ｔ）、２０ｍＭのヒスチジン塩酸塩、０．１７５Ｍのショ糖、ｐＨ６．０の０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０を含む。別の態様において、本発明の組成物は、１０ｍｇ／ｍｌのｈＳＣ１６．５６ｓｓ１ＤＬ６、２０ｍＭのヒスチジン塩酸塩、０．１７５Ｍのショ糖、ｐＨ６．０の０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０を含む。本明細書で議論されるようにおよび下記実施例において示されるように、このような液体製剤は、凍結乾燥して、使用前に医薬として適合の（例えば、水性）担体を用いて再構成することができる粉末状組成物を提供することができる。液体溶液である場合、このような組成物は、好ましくは−７０℃で、遮光して保存すべきである。凍結乾燥した場合、ＤＬＬ３  ＡＤＣ粉末状製剤は、好ましくは２−８℃で、遮光して保存すべきである。前述の溶液または粉末のそれぞれは、好ましくは滅菌ガラスバイアル（例えば、ＵＳＰ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  １０ｍｌ）に入れられ、規定の容積（例えば、３または５ｍＬ）の１０ｍｇ／ｍＬのＤＬＬ３  ＡＤＣ（未処理または再構成溶液）を一貫して供給するように構成することができる。
【０３８６】
凍結乾燥粉末から再構成したか否かにかかわらず、液体ＤＬＬ３  ＡＤＣ製剤（例えば、直上に示した）は、投与前にさらに希釈する（好ましくは水性担体中）ことができる。例えば、前述の液体製剤は、投与のための所望の用量レベルを達成するために、０．９％塩化ナトリウム注射剤、ＵＳＰまたは同等物（必要な変更を加えた）を含む注入バッグ中にさらに希釈することができる。特定の態様において、十分に希釈されたＤＬＬ３  ＡＤＣ溶液は、ＩＶ装置を用いて静脈内注入により投与される。好ましくは、投与されるＤＬＬ３  ＡＤＣ薬物溶液（静脈内（ＩＶ）注入または注射にかかわらず）は、透明、無色および可視粒子状物質不含有である。
【０３８７】
より一般的には、本発明の化合物および組成物は、インビボで、それを必要とする対象に、様々な経路、例えば、これらに限定されないが、経口、静脈内、動脈内、皮下、非経口的、鼻腔内、筋肉内、心臓内、脳室内、気管内、バッカル、直腸、腹腔内、皮内、局所、経皮およびくも膜下内、またはそれ以外に移植もしくは吸入により投与され得る。本組成物は、固体、半固体、液体または気体形態の調製物に製剤化することができ、例えば、これらに限定されないが、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、溶液、坐剤、浣腸剤、注射剤、吸入剤およびエアロゾルが挙げられる。適切な製剤および投与経路は、意図する適用および治療レジメンにより選択され得る。
【０３８８】
Ｂ．投与量および投与レジメン
特定の投与レジメン、すなわち、用量、タイミングおよび反復は、個々の対象ならびに実験的検討事項、例えば、薬物動態（例えば、半減期、クリアランス速度など）に依存する。投与の頻度の決定は、当業者、例えば、担当医により、状態および治療される状態の重症度、治療される対象の年齢および全体的健康状態などの検討事項に基づいて行われ得る。投与の頻度は、選択した組成物の効能および投与レジメンの評価に基づいて治療の過程を通じて調整され得る。このような評価は、特異的な疾患、障害もしくは状態のマーカーまたは個体のウェルビーイング（生活の質評価、日常生活の活動などを用いて測定される）の評価に基づいて行われ得る。個体ががんを有する実施形態において、評価は、触診または視覚的観察を介した腫瘍サイズの直接的測定、Ｘ線または他の画像化技術による腫瘍サイズの間接的測定、直接的な腫瘍生検によって評価される改善および腫瘍試料の顕微鏡検査、間接的な腫瘍マーカー（例えば、前立腺がんに対するＰＳＡ）または本明細書に記載の方法により特定された抗原、増殖性または腫瘍形成性細胞の数の減少、このような新生細胞の減少の維持、新生細胞の増殖の減少または転移の発生の遅延の測定を含む。
【０３８９】
本発明のＤＬＬ３  ＡＤＣは、様々な範囲で投与され得る。これらの範囲としては、１用量あたり約５μｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重、１用量あたり約５０μｇ／ｋｇ体重から約５ｍｇ／ｋｇ体重、１用量あたり約１００μｇ／ｋｇ体重から約１０ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。他の範囲としては、１用量あたり約１００μｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重および１用量あたり約０．５ｍｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。特定の実施形態において、投与量は、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０３９０】
選択された実施形態において、ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣは、１用量あたりおよそ５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００μｇ／ｋｇ体重で（好ましくは静脈内に）投与される。他の実施形態は、１用量あたり約２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００または２０００μｇ／ｋｇ体重での抗体またはＡＤＣの投与を含む。他の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、９または１０ｍｇ／ｋｇで投与される。さらに他の実施形態において、コンジュゲートは、１用量あたり１２、１４、１６、１８または２０ｍｇ／ｋｇ体重で投与され得る。さらに他の実施形態において、コンジュゲートは、１用量あたり２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０または１００ｍｇ／ｋｇ体重で投与され得る。本明細書の教示を用い、当業者は、前臨床動物研究、臨床観察ならびに標準的な医学および生化学的技術および測定に基づいて、様々なＤＬＬ３抗体またはＡＤＣのための適切な投与量を容易に決定することができる。
【０３９１】
他の投与レジメンは、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７４４，８７７に開示されているような体表面積（ＢＳＡ）計算に基づき、予測され得る。周知のように、ＢＳＡは、患者の身長および体重を使用して計算され、彼または彼女の身体の表面積によって表される対象の大きさの尺度を提供する。ある特定の実施形態において、コンジュゲートは、１ｍｇ／ｍ２から８００ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２から５００ｍｇ／ｍ２の投与量および１００ｍｇ／ｍ２、１５０ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、２５０ｍｇ／ｍ２、３００ｍｇ／ｍ２、３５０ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２または４５０ｍｇ／ｍ２の投与量で投与され得る。当該分野で認識されているまたは実験技術が適切な投与量を決定するために使用され得ることも理解される。
【０３９２】
他の実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣは、特別なスケジュールで投与されてもよい。一般に、ＤＬＬ３コンジュゲートの有効量は、対象に１回以上投与される。より詳細には、抗体またはＡＤＣの有効量は、対象に、１週間に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、１カ月に１回または１カ月に１回未満投与される。ある特定の実施形態において、ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣの有効量は、複数回、例えば少なくとも１カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１年、少なくとも２年または数年間投与され得る。さらに他の実施形態において、数日（２、３、４、５、６もしくは７日）、数週間（１、２、３、４、５、６、７もしくは８週間）または数カ月間（１、２、３、４、５、６、７もしくは８カ月間）またさらには１もしくは数年間が、本開示の抗体またはＡＤＣの投与間に経過し得る。
【０３９３】
いくつかの実施形態において、コンジュゲート抗体を含む治療の過程は、数週間または数カ月の期間にわたり、選択された薬物製品を複数回投与すること（サイクル）を含む。より詳細には、本発明の抗体またはＡＤＣは、１日毎に１回、２日毎に１回、４日毎に１回、１週間毎に１回、１０日毎に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、５週間毎に１回、６週間毎に１回、８週間毎に１回、１０週間毎に１回または１２週間毎に１回投与され得る。これに関して、患者の応答および診療に基づき、投与量を変化させてもよく、投与間隔を調整してもよいことが理解される。本発明には、不連続投与または数回の部分投与に分割された１日用量も包含される。本発明の組成物および抗がん剤は、交互に、隔日または隔週で投与されてもよくまたは一連の抗体治療を行って、この後に１つ以上の抗がん剤治療による治療を行ってもよい。いずれにしても、当業者であれば理解するように、化学療法剤の適切な用量は、一般に、化学療法剤が単独でまたは他の化学療法剤との併用で投与される臨床治療において既に採用されている用量程度である。
【０３９４】
特定の実施形態において、本発明は、がんの治療に用いる抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートを提供するものであって、治療は、抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲート（ＤＬＬ３  ＡＤＣ）の有効量を１週間毎（ＱＷ）に少なくとも１回、２週間毎（Ｑ２Ｗ）に少なくとも１回、３週間毎（Ｑ３Ｗ）に少なくとも１回、４週間毎（Ｑ４Ｗ）に少なくとも１回、５週間毎（Ｑ５Ｗ）に少なくとも１回、６週間毎（Ｑ６Ｗ）に少なくとも１回、７週間毎（Ｑ７Ｗ）に少なくとも１回、８週間毎（Ｑ８Ｗ）に少なくとも１回、９週間毎（Ｑ９Ｗ）に少なくとも１回または１０週間毎（Ｑ１０Ｗ）に少なくとも１回投与することを含み得る。選択された実施形態において、ＤＬＬ３  ＡＤＣは、３週間毎（Ｑ３Ｗ）に少なくとも１回、４週間毎（Ｑ４Ｗ）に少なくとも１回、５週間毎（Ｑ５Ｗ）に少なくとも１回または６週間毎（Ｑ６Ｗ）に少なくとも１回投与される。特定の他の実施形態において、ＤＬＬ３  ＡＤＣは、７週間毎（Ｑ７Ｗ）に少なくとも１回、８週間毎（Ｑ８Ｗ）に少なくとも１回、９週間毎（Ｑ９Ｗ）に少なくとも１回または１０週間毎（Ｑ１０Ｗ）に少なくとも１回投与される。他の選択された実施形態において、ＤＬＬ３  ＡＤＣは、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇまたは０．８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。特定の実施形態は、ＤＬＬ３  ＡＤＣの単回投与により患者を治療することを含む。さらに他の実施形態は、規定の間隔（すなわち、Ｑ２Ｗ、Ｑ３Ｗ、Ｑ４Ｗ、Ｑ５Ｗ、Ｑ６Ｗなど）で２サイクル（ｘ２）、３サイクル（ｘ３）、４サイクル（ｘ４）、５サイクル（ｘ５）、６サイクル（ｘ６）、７サイクル（ｘ７）、８サイクル（ｘ８）、９サイクル（ｘ９）または１０サイクル（ｘ１０）患者を治療することを含む。本発明の他の態様は、患者の反応および任意の毒性によって限定されないサイクル数でＤＬＬ３  ＡＤＣを投与することを含む。他の実施形態において、初期ＤＬＬ３  ＡＤＣ治療（ｘサイクルの）を完了させることができ、がんが進行の徴候を示すまでさらなるＤＬＬ３  ＡＤＣ治療は、行われない（進行時治療）。さらに他の実施形態において、初期ＤＬＬ３  ＡＤＣ治療（ｘサイクルの）を完了させることができ、次いで患者を維持療法（例えば、無期限に０．１ｍｇ／ｋｇ  ＤＬＬ３  ＡＤＣ  Ｑ６Ｗ）のもとにおく。
【０３９５】
本発明に適合する例示的投与レジメンを以下の表３に示す。以下でより詳細に議論するように、本開示の例示的投与レジメンは、単剤としてまたは他の治療剤もしくはがん治療（例えば、手術もしくはビーム照射）と併用してＤＬＬ３  ＡＤＣを用いることと適合することに注意されたい。
【０３９６】
【表３】
2018529656.tif 000030
2018529656.tif 000031
2018529656.tif 000032
【０３９７】
本発明のいくつかの態様において、ＤＬＬ３  ＡＤＣは、ＰＢＤを含む。他の態様において、ＤＬＬ３は、ＳＣ１６ＬＤ６．５（例えば、ｈＳＣ１６．５６ＤＬ１またはＡＤＣ１）を含む。他の態様において、ＤＬＬ３  ＡＤＣは、部位特異的ＡＤＣを含み、特定の好ましい態様において、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１ＰＢＤ１（例えば、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１ＤＬ６またはＡＤＣ６）を含む。さらに他の態様において、ＤＬＬ３  ＡＤＣは、静脈内投与される。特定の他の態様において、治療されるがんは、神経内分泌腫瘍を含む。他の態様において、治療されるがんは、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）または大細胞神経内分泌がん（ＬＣＮＥＣ）を含む。特定の実施形態は、フロントライン（ｆｒｏｎｔｌｉｎｅ）患者（すなわち、特定のがんについて治療されたことがない患者）を治療するために本開示の組成物を使用することを含む。選択された実施形態において、フロントライン患者は、広範囲の病期のＳＣＬＣまたは限定された病期のＳＣＬＣを示す。他の選択された態様において、治療されるがん患者は、セカンドライン（ｓｅｃｏｎｄ  ｌｉｎｅ）患者（すなわち、以前に治療された患者）を含む。さらに他の実施形態において、治療されるがん患者は、サードライン（ｔｈｉｒｄ  ｌｉｎｅ）患者（すなわち、以前に２回治療された患者）を含む。さらに他の実施形態において、がん患者は、フォースライン（ｆｏｕｒｔｈ  ｌｉｎｅ）患者（すなわち、以前に３回治療された患者）を含む。
【０３９８】
本発明の特定の好ましい実施形態は、３サイクルにわたり３週間毎に０．２ｍｇ／ｋｇのＤＬＬ３  ＡＤＣ（０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗｘ３）により患者を治療することを含む。選択された実施形態において、０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗｘ３で治療される患者は、ＳＣＬＣに罹患している。他の実施形態において、０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗｘ３で治療される患者は、ＬＣＮＥＣに罹患している。いくつかの態様において、患者は、がんについて治療されたことがない。特定の態様において、患者は、セカンドライン患者を含む。さらに他の実施形態において、患者は、サードライン患者を含む。他の態様において、患者は、０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗｘ３治療サイクルの後、進行時に治療される。さらに他の態様において、患者は、０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗｘ３治療サイクルの後、ＤＬＬ３  ＡＤＣ維持療法に移行する。さらに他の実施形態において、ＤＬＬ３  ＡＤＣは、ＳＣ１６ＬＤ６．５（例えば、ＡＤＣ１）を含むが、さらに他の実施形態において、ＤＬＬ３  ＡＤＣは、ｈ１６．５６ｓｓ１ＤＬ６を含む。
【０３９９】
このような治療において（および下記でより詳細に議論されるように）、ＤＬＬ３  ＡＤＣは、患者の反応を改善するために選択された抗がん剤と組み合わせることができる。特定の対象について、ＤＬＬ３  ＡＤＣは、１つ以上の抗がん剤の投与の前または後に２サイクル以上にわたり３週間毎に投与され得る（例えば、０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗｘ２または０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗｘ３など）。選択された実施形態において、対象は、ＳＣＬＣに罹患しており、抗がん剤は、シスプラチン、カルボプラチンおよび／またはエトポシドである。したがって、１つの例示的投与レジメンは、０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗｘ２または０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗｘ３のＤＬＬ３  ＡＤＣとそれに続く、例えば、Ｑ３Ｗｘ４でそれぞれを投与することができる、シスプラチン（例えば、８０ｍｇ／ｍ２）およびエトポシド（例えば、１００ｍｇ／ｍ２）を含み得る。したがって、このような例において、１つのレジメンは、０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗｘ２または０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗｘ３のＤＬＬ３  ＡＤＣ；Ｑ３Ｗｘ４のＣＤＤＰおよびＥＴＰを含むこととなり、ＣＤＤＰ／ＥＴＰレジメンは、ＤＬＬ３  ＡＤＣサイクルの終了の１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後またはより遅く開始され得る。他の適合する実施形態において、ＣＤＤＰ／ＥＴＰは、ＤＬＬ３  ＡＤＣによる治療の前に投与され得る（すなわち、Ｑ３Ｗｘ４のＣＤＤＰ／ＥＴＰ；０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗｘ２または０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗｘ３のＤＬＬ３  ＡＤＣであって、ＤＬＬ３  ＡＤＣレジメンは、ＣＤＤＰ／ＥＴＰサイクルの終了の１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後またはより遅く開始され得る）。さらに他の実施形態において、ＣＤＤＰ／ＥＴＰレジメンおよびＤＬＬ３  ＡＤＣレジメン（実質的に上述の通りであるが、０．１ｍｇ／ｋｇのＤＬＬ３  ＡＤＣ投与量を任意選択的に用いる）は、同時に実施することができる（すなわち、これらの両方が１週目に始まる）。特定の実施形態において、前述のレジメンに従って治療される対象は、フロントライン患者である。他の好ましい実施形態において、フロントライン患者は、ＳＣＬＣまたはＬＣＮＥＣに罹患している。さらに他の実施形態において、シスプラチンは、６０ｍｇ／ｍ２で投与され、一方、さらに他の実施形態において、シスプラチン／エトポシド組合せは、３週間毎に投与され得る（白金Ｄ１、エトポシドＤ１、２、３、３週間毎ｘ４またはｘ６）。さらに他の実施形態において、カルボプラチン（５ＡＵＣ）／エトポシドは、ＣＤＤＰ／Ｅ  Ｑ２１ｄｘ４−６サイクルと同様の頻度で投与され得る。さらに他の実施形態において、ＤＬＬ３  ＡＤＣは、感作薬として作用し、治療上の組合せの効果を増強させるための任意の化学療法剤（カルボプラチン、シスプラチンおよび／またはエトポシドを含む）の前に患者に投与され得る。
【０４００】
上記で議論したように、本発明の選択された実施形態は、治療指数の増大をもたらし、投与レジメンの最適化を可能にする改善された薬物動態および薬力学的特性を有するＡＤＣを含む。この点に関して、本開示のＡＤＣは、本明細書で示したように測定した場会、６日を超える終末相半減期、７日を超える終末相半減期または８日を超える終末相半減期を有する。本発明のさらに他の態様は、９日を超える終末相半減期、１０日を超える終末相半減期、１１日を超える終末相半減期、１２日を超える終末相半減期（それぞれがヒト対象において測定された）を有するＡＤＣを含む。さらに他の実施形態において、本開示のＡＤＣは、ヒト対象において、１３日を超える終末相半減期、約１４日を超える終末相半減期、１５日を超える終末相半減期、約１６日を超える終末相半減期、約１７日を超える終末相半減期、１８日を超える終末相半減期、約１９日を超える終末相半減期、約２０日を超える終末相半減期または３週間超える終末相半減期を有する。さらに他の実施形態において、本発明のＡＤＣは、約６日の終末相半減期、約７日の終末相半減期、約８日の終末相半減期、約９日の終末相半減期、約１０日の終末相半減期、約１１日の終末相半減期、約１２日の終末相半減期、約１３日の終末相半減期、約１４日の終末相半減期、約１５日の終末相半減期、約１６日の終末相半減期、約１７日の終末相半減期、約１８日の終末相半減期、約１９日の終末相半減期、約２０日の終末相半減期または約３週間の終末相半減期を示す。当業者は、このような長い半減期は、本開示のＡＤＣのより低い頻度の投与を可能にし、これにより、同様または低い毒性を示しながら所望の有効性をもたらすことを理解する。
【０４０１】
したがって、本発明の特定の他の好ましい実施形態は、２サイクル以上にわたり６週間毎に０．３ｍｇ／ｋｇのＤＬＬ３  ＡＤＣ（例えば、０．３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ６Ｗｘ２）により患者を治療することを含む。下記実施例において示されるように、このようなレジメンは、本発明のＤＬＬ３  ＡＤＣの半減期が比較的長いため、とりわけ有効である（効果的な治療指数を示す）。選択された実施形態において、０．３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ６Ｗｘ２で治療される患者は、ＳＣＬＣに罹患している。他の実施形態において、０．３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ６Ｗｘ２で治療される患者は、ＬＣＮＥＣに罹患している。さらに他の実施形態は、３サイクル（ｘ３）にわたり、４サイクル（ｘ４）にわたり、５サイクル（ｘ５）にわたり、６サイクル（ｘ６）にわたりまたはそれ以上にわたり０．３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ６ＷのＤＬＬ３  ＡＤＣを投与することを含む。このような実施形態において、サイクルは、連続的（６週間毎）または間欠的（第３のサイクル毎に抜かし、次いで再開する）であり得る。いくつかの態様において、患者は、がんについて治療されたことがない（フロントライン）。特定の態様において、患者は、セカンドライン患者を含む。さらに他の実施形態において、患者は、サードライン患者を含む。他の態様において、患者は、０．３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ６Ｗｘ２治療サイクルの後、進行時に治療される。さらに他の態様において、患者は、０．３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ６Ｗｘ２治療サイクルの後、ＤＬＬ３  ＡＤＣ維持療法に移行する。特定の実施形態において、ＤＬＬ３  ＡＤＣは、ＳＣ１６ＬＤ６．５（例えば、ＡＤＣ１）を含み、一方、他の好ましい態様において、ＤＬＬ３  ＡＤＣは、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１ＤＬ６（例えば、ＡＤＣ６）を含む。
【０４０２】
下記でより詳細に議論するように、ＤＬＬ３  ＡＤＣは、患者の反応を改善するために選択された抗がん剤と組み合わせることができる。特定の患者について、ＤＬＬ３  ＡＤＣは、１つ以上の抗がん剤の投与の前または後に２サイクルにわたり６週間毎に投与され得る（例えば、０．３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ６Ｗｘ２）。選択された実施形態において、対象は、ＳＣＬＣに罹患しており、抗がん剤は、シスプラチン、カルボプラチンおよび／またはエトポシドである。したがって、１つの例示的投与レジメンは、０．３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ６Ｗｘ２のＤＬＬ３  ＡＤＣとそれに続く、それぞれが例えば、Ｑ３Ｗｘ４で投与される、シスプラチン（例えば、８０ｍｇ／ｍ２）およびエトポシド（例えば、１００ｍｇ／ｍ２）を含み得る。したがって、このような例において、１つのサイクルは、０．３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ６Ｗｘ２のＤＬＬ３  ＡＤＣ；Ｑ３Ｗｘ４のＣＤＤＰおよびＥＴＰを含むこととなり、ＣＤＤＰ／ＥＴＰレジメンは、ＤＬＬ３  ＡＤＣサイクルの終了の１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後またはより遅く開始され得る。他の適合する実施形態において、ＣＤＤＰ／ＥＴＰは、ＤＬＬ３  ＡＤＣによる治療の前に投与され得る（すなわち、Ｑ３Ｗｘ４のＣＤＤＰ／ＥＴＰ；０．３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ６Ｗｘ２のＤＬＬ３  ＡＤＣであって、ＤＬＬ３  ＡＤＣレジメンは、ＣＤＤＰ／ＥＴＰサイクルの終了の１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後またはより遅く開始され得る）。さらに他の実施形態において、ＣＤＤＰ／ＥＴＰレジメンおよびＤＬＬ３  ＡＤＣレジメン（実質的に上述の通りであるが、０．１ｍｇ／ｋｇのＤＬＬ３  ＡＤＣ投与量を任意選択的に用いる）は、同時に実施することができる（すなわち、これらの両方が１週目に始まる）。特定の実施形態において、前述のレジメンに従って治療される対象は、フロントライン患者である。他の好ましい実施形態において、フロントライン患者は、ＳＣＬＣまたはＬＣＮＥＣに罹患している。さらに他の実施形態において、シスプラチンは、６０ｍｇ／ｍ２で投与され、一方、さらに他の実施形態において、シスプラチン／エトポシド組合せは、３週間毎に投与され得る（白金Ｄ１、エトポシドＤ１、２、３、３週間毎ｘ４またはｘ６）。さらに他の実施形態において、カルボプラチン（５ＡＵＣ）／エトポシドは、ＣＤＤＰ／Ｅ  Ｑ２１ｄｘ４−６サイクルと同様の頻度で投与され得る。さらに他の実施形態において、ＤＬＬ３  ＡＤＣは、感作薬として作用し、治療上の組合せの効果を増強させるための任意の化学療法剤（カルボプラチン、シスプラチンおよび／またはエトポシドを含む）の前に患者に投与され得る。
【０４０３】
さらなる実施形態において、本発明のＤＬＬ３  ＡＤＣは、いずれか１つのサイクルにおいて異なる投与量で投与され得る。例えば、薬物を比較的高い用量（例えば、０．５ｍｇ／ｋｇ）で投与し（すなわち、負荷または薬物負荷）、その後、同じサイクルの一部として４週後（Ｑ４Ｗ）により低い用量のＤＬＬ３  ＡＤＣ（例えば、０．２ｍｇ／ｋｇ）を投与することができる。さらに、このようなサイクルを、反復する（２ｘ、３ｘなど）かまたは進行まで遅延させる（進行時に治療する）またはＤＬＬ３  ＡＤＣ維持（例えば、無期限に０．１ｍｇ／ｋｇ  Ｑ４Ｗもしくは無期限に０．１ｍｇ／ｋｇ  Ｑ６Ｗ）によりフォローアップすることができる。この点に関して、本発明のＤＬＬ３抗体またはＡＤＣは、疾患の初期症状後の腫瘍再発の確率を減少または無くすための維持療法の状況に使用されてもよい。最初の治療がＤＬＬ３  ＡＤＣによるものか別の抗新生物薬もしくは治療（例えば、放射線、手術、化学療法など）によるものかにかかわらず、このような維持療法を使用することができる。好ましくは、障害は、治療されたことがあり、最初の腫瘍塊は除去、減少または他の方法で緩和されており、患者は無症状であるかまたは寛解状態にある。このような場合、標準的診断手法を使用して疾患の徴候がほとんどまたは全くない場合でも、対象は、医薬として有効な量の本開示の抗体を１回以上投与されてもよい。好ましい実施形態において、ＤＬＬ３  ＡＤＣは、ＰＢＤを含み、選択された実施形態において、ＳＣ１６ＬＤ６．５またはＳＣ１６．５６ｓｓ１ＤＬ６を含む。
【０４０４】
特定の実施形態において、維持療法は、標準治療（ＳＯＣ）化学療法治療を含む化学療法治療の後のＤＬＬ３  ＡＤＣの投与を含む。選択された態様において、この維持療法は、最初にシスプラチン／エトポシドのようなＳＯＣ化学療法剤による治療を受け、その後、ＤＬＬ３  ＡＤＣ維持レジメンによる治療を受けるフロントライン患者を含む。例として、患者は、１サイクル以上のフロントライン化学療法（例えば、４サイクルの白金ベースの化学療法）とそれに続く１サイクル以上のＤＬＬ３  ＡＤＣの投与により治療され得る。特定の実施形態において、ＤＬＬ３  ＡＤＣは、第３のサイクル毎に省略して０．３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ６Ｗで投与することができる。このような維持レジメンは、患者が反応しており、疾患の進行または有害事象を示さない限り、継続され得ることが理解される。
【０４０５】
別の好ましい実施形態において、本発明の抗体またはＡＤＣは、予防的にまたは減量手法後の腫瘍転移の可能性を予防または減少させるためのアジュバント療法として使用され得る。本開示で使用するとき、「減量手法」は、腫瘍塊を減少させるまたは腫瘍負荷もしくは腫瘍増殖を緩和させる任意の手法、技術または方法を意味する。例示的減量手法としては、限定されないが、外科手術、放射線治療（つまり、ビーム照射）、化学療法、免疫療法またはアブレーションが挙げられる。本開示に鑑みて当業者により容易に決定される適切な時間に、本開示のＡＤＣは、臨床的、診断的または治療診断的手法により示唆されるように腫瘍転移および腫瘍再発の可能性を低減させるために投与されてもよい。
【０４０６】
本発明のさらに他の実施形態は、本開示の抗体またはＡＤＣを、無症状であるががんを発症するリスクのある対象に投与することを含む。つまり、本発明の抗体またはＡＤＣは、真に予防的な意味において使用することができ、検査もしくは試験を受けて１つ以上の認められた危険因子（例えば、ゲノム指標、家族歴、インビボまたはインビトロ試験結果など）を有するが新生物を発症していない患者に投与されてもよい。
【０４０７】
投与量およびレジメンも、本開示の組成物を個体に１回以上投与して実験的に決定され得る。例えば、個体に、本明細書に記載されるように製造された治療組成物を漸増する投与量で与えてもよい。選択された実施形態において、投与量は、実験的に決定されたかまたは観察された副作用または毒性にそれぞれ基づいて、徐々に増加または減少または縮小（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）されてもよい。選択された組成物の有効性を評価するために、特定の疾患、障害または状態のマーカーを前述のように伴ってもよい。がんに関して、これらには、触診または視覚的観察を介した腫瘍サイズの直接的測定、Ｘ線または他の画像化技術による腫瘍サイズの間接的測定、直接的な腫瘍生検によって評価される改善および腫瘍試料の顕微鏡検査；間接的な腫瘍マーカー（例えば、前立腺がんに対するＰＳＡ）または本明細書に記載の方法により特定された腫瘍形成性抗原、疼痛または麻痺の減少、会話、視力、呼吸もしくは他の腫瘍に関連する障害の改善、食欲の増加または容認された試験もしくは生存の延長によって測定される生活の質の向上の測定が挙げられる。当業者は、投与量が、個体、新生物状態の種類、新生物状態の病期、新生物状態の個体の他の位置への転移ならびに過去および現在に使用している治療に依存して変わることを認識する。
【０４０８】
Ｃ．併用療法
上記において言及したように、併用療法は、望まない新生物細胞増殖を減少させるかもしくは抑制するか、がんの発生を減少させるか、がんの再発を低減させるかもしくは予防するか、またはがんの広がりもしくは転移を低減させるかもしくは予防するのに、とりわけ有用であり得る。このような場合、本発明の抗体またはＡＤＣは、除去しなければ腫瘍塊を出現させ存続させるであろうＣＳＣを除去することにより感作剤または化学感作剤として機能し、これにより、現在の標準治療である減量剤または抗がん剤のより有効な使用を可能にする。すなわち、本開示の抗体またはＡＤＣは、特定の実施形態において、別の投与された治療剤の作用機序を強力にする効果の（例えば、事実上、相加的または相乗的な）増強をもたらし得る。本発明の文脈において、「併用療法」は、広く解釈するものとし、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣと１つ以上の抗がん剤との投与を意味するものでしかなく、このような抗がん剤は、細胞毒性剤、細胞分裂停止剤、抗血管新生剤、減量剤、化学療法剤、放射線療法および放射線治療剤、標的化抗がん剤（モノクローナル抗体および小分子体の両方を含む）、ＢＲＭ、治療抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、放射線治療および抗転移剤ならびに特異的および非特異的アプローチを含む免疫療法剤を含むが、これらに限定されない。
【０４０９】
併用の結果が、各治療（例えば、ＤＬＬ３  ＡＤＣおよび抗がん剤）が別個に行われる場合に認められる効果の相加的なものでなければならないわけではない。少なくとも相加効果が一般的に望ましいが、１つの単独療法を上回る抗腫瘍効果の増大は有益である。さらに、本発明は、相乗効果を示すことを併用治療に要求しない。しかし、当業者は、好ましい実施形態を含む特定の選択された組合せにより、相乗効果が認められる可能性があることを理解する。
【０４１０】
したがって、特定の態様において、併用療法は、がんの治療において、（ｉ）抗ＤＬＬ３抗体もしくはＡＤＣの単独使用、（ｉｉ）治療成分の単独使用または（ｉｉｉ）抗ＤＬＬ３抗体もＡＤＣも含まない別の治療成分と組み合わせた治療成分の使用を上回る、治療的相乗効果を有するか、または測定可能な治療効果を改善する。用語「治療的相乗作用」は、本明細書で使用される場合、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣと１つ以上の治療成分との組合せの、相加的効果よりも大きい治療効果を有する、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣと１つ以上の治療成分との組合せを意味する。
【０４１１】
本開示の組合せの所望の転帰は、対照またはベースラインの測定に対する比較によって定量される。本明細書で使用される場合、相対的な用語、例えば、「改善する」、「増加する」または「減少させる」は、対照、例えば、本明細書に記載の治療の開始前の同じ個体の測定値または本明細書に記載の抗ＤＬＬ３抗体もＡＤＣも不在であるが、標準治療などの他の治療成分の存在下における対照個体（もしくは複数の対照個体）の測定値に対する値を示す。代表的な対照個体は、治療されている個体と同じ形態のがんに罹患しており、治療されている個体とほぼ同じ年齢の個体である（治療される個体および対照個体の疾患の病期が同等であることを確実にするため）。
【０４１２】
治療に応答した変化または改善（相加的か相乗的かにかかわらず）は、統計学的に有意であることが判明し得る。本明細書で使用される場合、用語「有意性」または「有意」は、２つ以上の測定された反応の間に非ランダムな関係がある確率についての統計学的解析に関する。関係が「有意」であるかまたは「有意性」を有するかどうかを決定するために「ｐ値」が計算され得る。ユーザー定義のカットオフ点を下回るｐ値は、有意とみなされる。本発明の目的のために、０．１以下、０．０５未満、０．０１未満、０．００５未満または０．００１未満のｐ値は、有意とみなされ得る。
【０４１３】
相乗的治療効果は、一種類の治療成分または抗ＤＬＬ３抗体もしくはＡＤＣにより誘発される治療効果、または所与の組合せの抗ＤＬＬ３抗体もしくはＡＤＣまたは一種類の治療成分により誘発される治療効果の合計よりも、少なくとも約２倍大きいかまたは少なくとも約５倍大きいかまたは少なくとも約１０倍大きいかまたは少なくとも約２０倍大きいかまたは少なくとも約５０倍大きいかまたは少なくとも約１００倍大きい効果であり得る。また相乗的治療効果は、一種類の治療成分または抗ＤＬＬ３抗体もしくはＡＤＣにより誘発される治療効果、または所与の組合せの抗ＤＬＬ３抗体もしくはＡＤＣまたは一種類の治療成分により誘発される治療効果の合計と比較して、少なくとも１０％または少なくとも２０％または少なくとも３０％または少なくとも４０％または少なくとも５０％または少なくとも６０％または少なくとも７０％または少なくとも８０％または少なくとも９０％または少なくとも１００％以上の治療効果の増加として観察され得る。相乗的効果は、組合せで使用したときに、治療剤の投与量の減少を可能にする効果であってもよい。
【０４１４】
併用療法の実施において、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣおよび治療成分は、単一の組成物または同じもしくは異なる投与経路を使用する２つ以上の別個の組成物において、対象に同時に投与することができる。代替的に、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣでの治療は、例えば、数分から数週間の間隔で、治療成分による治療に先行または追随してもよい。一実施形態において、治療成分と、抗体またはＡＤＣとの両方が互いに約５分から約２週間以内に投与される。さらに他の実施形態において、数日（２、３、４、５、６もしくは７）、数週間（１、２、３、４、５、６、７もしくは８）または数カ月間（１、２、３、４、５、６、７もしくは８）が、抗体と治療成分の投与の間に経過してもよい。
【０４１５】
併用療法は、状態が治療されるまで、緩和されるまで、または治癒されるまで、様々なスケジュールで、例えば、１日に１回、２回もしくは３回、２日毎に１回、３日毎に１回、１週間毎に１回、２週間毎に１回、１カ月毎に１回、２カ月毎に１回、３カ月毎に１回、６カ月毎に１回投与されてもよく、または連続的に投与されてもよい。抗体および治療成分は、１日おきにもしくは１週間おきに投与されてもよく、または一連の抗ＤＬＬ３抗体もしくはＡＤＣ治療を行い、後にさらなる治療成分で１回以上治療してもよい。一実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣは、１つ以上の治療成分と組み合わせて短期治療サイクルで投与される。他の実施形態において、組合せ治療は、長期治療サイクルでまたは維持療法型の状況で投与される。
【０４１６】
選択された実施形態において、本発明の化合物および組成物は、ＰＤ−１阻害剤またはＰＤ−Ｌ１阻害剤のようなチェックポイント阻害剤と組み合わせて使用されてもよい。ＰＤ−１は、そのリガンドＰＤ−Ｌ１と共に、抗腫瘍Ｔリンパ球応答の負の制御因子である。一実施形態において、併用療法は、抗ＰＤ−１抗体（例えば、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ）および任意選択的に１つ以上の他の治療成分と共に抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣの投与を含んでもよい。別の実施形態において、併用療法は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ）および任意選択的に１つ以上の他の治療成分と共に抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣの投与を含んでもよい。さらに別の実施形態において、併用療法は、チェックポイント阻害剤および／または標的化ＢＲＡＦ併用療法（例えば、ベムラフェニブまたはダブラフェニブ）での治療後に進行が続く患者に投与される抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体と共に抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣの投与を含んでもよい。本明細書でより詳細に議論するようにおよび下記実施例において示されるように、このような療法の併用は、腫瘍の成長および増殖の抑制に驚くほど効果的であることが証明され得る。
【０４１７】
特定の理論に制限されることは望まないが、本明細書に示す結果は、ＤＬＬ３  ＡＤＣが、Ｔリンパ球を含む免疫適格性の細胞を、活性化しおよび／または腫瘍部位に誘引するようにＤＬＬ３発現腫瘍細胞に結合し、殺傷し得ることを示唆する。さらに、ＤＬＬ３  ＡＤＣの投与によりＤＬＬ３＋がん幹細胞を除去または破壊すること（例えば、細胞破壊により）は、対象の免疫応答を腫瘍の胚性「種細胞」に集中させるＣＳＣ特異抗原を放出させ得る。がん幹細胞に対するこの患者媒介集中免疫攻撃は、腫瘍形成性細胞の除去の増大の機構およびそれに対応する腫瘍の成長または維持の阻害をもたらし得ることが理解される。ＰＤ−１抗体の存在は、新たに活性化されたＴリンパ球が表面上のＰＤ−１受容体を介して抑制性シグナルを（例えば、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２リガンドを作動させることにより）受信することを妨げるようにおよび集中免疫反応を維持または増大させるように作用し得る。このように、ＤＬＬ３  ＡＤＣによる治療は、腫瘍部位においてがん幹細胞を除去するように新たに活性化されるＴ細胞を発生させるかまたは誘引することによって、投与されたＰＤ−１抗体の抗腫瘍形成作用を増強させ得るものであり、それと同時にまたはその後に、ＰＤ−１抗体は、ＣＳＣ活性化Ｔ細胞の抗腫瘍作用を増強させることにより、当該治療を行わない場合にチェックポイント阻害剤の非存在下において可能であるよりも、多くの腫瘍細胞を除去し得る。
【０４１８】
このようなＤＬＬ３  ＡＤＣ／チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体）の併用は、特に有益な治療プロファイルをもたらすように、投与量および対応する投与レジメンを縮小させることを可能にすることが理解される。より詳細には、このような併用は、単剤としてのこれらの使用と比較した場合、いずれかまたは両方の薬物のより低い（またはより低頻度での）用量で、腫瘍形成性細胞の効果的な抑制または除去を可能にし得る。したがって、本発明の特定の態様において、本開示のＤＬＬ３  ＡＤＣと抗ＰＤ−１抗体の（単剤としての使用と比較して）比較的より低い用量を使用することおよび毒性がより低い治療反応を得ることが可能であり得る。例えば、上記で議論した０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗｘ３または０．３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ６Ｗｘ２の本開示のＤＬＬ３  ＡＤＣ投与レジメンを用いるのでなく、ＰＤ−１抗体と併用してより低いＤＬＬ３  ＡＤＣ投与量（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇなど）を用いて、同等の治療結果を得ることが可能であり得る。同様に、より少ないＤＬＬ３  ＡＤＣサイクル数（例えば、０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗｘ２）またはＤＬＬ３  ＡＤＣ投与の間隔の延長（例えば、０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ４Ｗｘ２）のような，削減されたかまたは縮小されたレジメンでＤＬＬ３  ＡＤＣ／抗ＰＤ−１の併用を用いて、有効な治療結果を得ることができる。それぞれのこのようなシナリオ（すなわち、より低い用量または投薬間隔延長）において、本開示の療法の併用によってもたらされた予期されない利益は、比較的低い毒性で患者の有効な治療を可能にするものであることが理解される。これは、ひいては、必要な治療により十分に耐えることができ、そして／または治療レジメンをより十分に延長することができて、肯定的な反応（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の可能性を上げる、より健全な患者をもたらす。
【０４１９】
他の実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣは、がんの様々な承認済みの第一選択治療との組合せで使用されてもよい。選択された実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣならびにイホスファミド、マイトマイシン（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ）Ｃ、ビンデシン、ビンブラスチン、エトポシド、イリノテカン（ｉｒｏｎｉｔｅｃａｎ）、ゲムシタビン、タキサン、ビノレルビン、メトトレキセートおよびペメトレキセドのような細胞毒性剤ならびに任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。
【０４２０】
別の実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣおよび白金系薬剤（例えば、カルボプラチンまたはシスプラチン）および任意選択的に１つ以上の他の治療成分（例えば、ビノレルビン；ゲムシタビン；例えばドセタキセルもしくはパクリタキセルのようなタキサン；イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｉｃａｎ）；またはペメトレキセド）の使用を含む。
【０４２１】
ある特定の実施形態において、例えば、ＢＲ−ＥＲＰＲ、ＢＲ−ＥＲまたはＢＲ−ＰＲがんの治療において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣおよび「ホルモン療法」として記載されている１つ以上の他の治療成分の使用を含む。「ホルモン療法」は、本明細書で使用されるとき、例えば、タモキシフェン；性腺刺激ホルモンまたは黄体形成ホルモン放出ホルモン（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）（ＧｎＲＨまたはＬＨＲＨ）；エベロリムスおよびエキセメスタン；トレミフェン；またはアロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタンまたはフルベストラント）を指す。
【０４２２】
別の実施形態において、例えばＢＲ−ＨＥＲ２の治療において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣおよびトラスツズマブまたはトラスツズマブエムタンシン（ａｄｏ−ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｅｍｔａｎｓｉｎｅ  Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標））および任意選択的に１つ以上の他の治療成分（例えば、ペルツズマブおよび／またはドセタキセル）の使用を含む。
【０４２３】
いくつかの実施形態において、例えば転移性乳がんの治療において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣならびにタキサン（例えば、ドセタキセルまたはパクリタキセル）ならびに任意選択的に１つ以上の他の治療成分、例えば、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシンもしくはエピルビシン）および／またはエリブリンの使用を含む。
【０４２４】
別の実施形態において、例えば転移性または再発性乳がんまたはＢＲＣＡ−変異乳がんの治療において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣおよびメゲストロールおよび任意選択的にさらなる治療成分の使用を含む。
【０４２５】
さらなる実施形態において、例えばＢＲ−ＴＮＢＣの治療において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣならびにポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤（例えば、ＢＭＮ−６７３、オラパリブ、ルカパリブおよびベリパリブ）ならびに任意選択的にさらなる治療成分の使用を含む。
【０４２６】
別の実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣおよびＰＡＲＰ阻害剤および任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。
【０４２７】
別の実施形態において、例えば乳がんの治療において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣならびにシクロホスファミドならびに任意選択的に１つ以上の他の治療成分（例えば、ドキソルビシン、タキサン、エピルビシン、５−ＦＵおよび／またはメトトレキサート）の使用を含む。
【０４２８】
別の実施形態において、ＥＧＦＲ陽性ＮＳＣＬＣの治療のための併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣならびにアファチニブならびに任意選択的に１つ以上の他の治療成分（例えば、エルロチニブおよび／またはベバシズマブ）の使用を含む。
【０４２９】
別の実施形態において、ＥＧＦＲ陽性ＮＳＣＬＣの治療のための併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣおよびエルロチニブおよび任意選択的に１つ以上の他の治療成分（例えば、ベバシズマブ）の使用を含む。
【０４３０】
別の実施形態において、ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣの治療のための併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣおよびセリチニブ（Ｚｙｋａｄｉａ）および任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。
【０４３１】
別の実施形態において、ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣの治療のための併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣおよびクリゾチニブ（Ｘａｌｃｏｒｉ）および任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。
【０４３２】
別の実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣならびにベバシズマブならびに任意選択的に１つ以上の他の治療成分（例えば、ドセタキセルもしくはパクリタキセルのようなゲムシタビンまたはタキサン；および／または白金アナログ）の使用を含む。
【０４３３】
別の実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣおよびベバシズマブおよび任意選択的にシクロホスファミドの使用を含む。
【０４３４】
特定の実施形態において、白金製剤耐性腫瘍の治療のための併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣならびにドキソルビシンおよび／またはエトポシドおよび／またはゲムシタビンおよび／またはビノレルビンおよび／またはイホスファミドおよび／またはロイコボリン変調（ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ−ｍｏｄｕｌａｔｅｄ）５−フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｃｉｌ）および／またはベバシズマブおよび／またはタモキシフェンならびに任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。
【０４３５】
選択された実施形態において、本開示の抗体およびＡＤＣは、治療の過程を潜在的により有効にし、炎症、悪心および過敏性のような副作用を低減させるために特定のステロイドと併用して用いることができる。本発明のＡＤＣと併用して用いることができる例示的ステロイドは、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロンおよびプレドニゾロンを含むが、これらに限定されない。とりわけ好ましい態様において、ステロイドは、デキサメタゾンを含む。他の好ましい態様において、ステロイドは、プレドニゾンを含む。
【０４３６】
併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣと、変異したかまたは異常発現した遺伝子またはタンパク質（例えば、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ）を含む腫瘍（例えば、メラノーマ）に有効な化学療法成分とを、含んでもよい。
【０４３７】
Ｔリンパ球（例えば、細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ））は、悪性腫瘍に対する宿主防御に重要な役割を果たす。ＣＴＬは、抗原提示細胞上の腫瘍関連抗原の提示によって活性化される。活性特異的免疫療法は、既知のがん関連抗原に由来するペプチドを患者にワクチン接種することによって、がんに対するＴリンパ球応答を増強するために使用することができる方法である。一実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣとがん関連抗原（例えば、メラノサイト系譜特異的抗原チロシナーゼ、ｇｐ１００、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１またはｇｐ７５）に対するワクチンとを含んでもよい。他の実施形態において、併用療法は、自己ＣＴＬまたはナチュラルキラー細胞のインビトロ拡大増殖、活性化および養子性再導入を含んでもよい。ＣＴＬ活性化は、抗原提示細胞による腫瘍抗原提示を増強する戦略によっても促進され得る。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、樹状細胞の動員および樹状細胞交差プライミングの活性化を促進する。一実施形態において併用療法は、抗原提示細胞の単離、このような細胞の刺激性サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）による活性化、腫瘍関連抗原を用いたプライミング、ならびにこその後の、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣおよび任意選択的に１つ以上の異なる治療成分の使用と組み合わせた、患者への抗原提示細胞の養子性再導入を含んでもよい。
【０４３８】
いくつかの実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣは、メラノーマの様々な第一選択治療との組合せで使用されてもよい。一実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣおよびダカルバジンならびに任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。さらなる実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣおよびテモゾロミドならびに任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。別の実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣおよび白金系治療成分（例えば、カルボプラチンまたはシスプラチン）ならびに任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。いくつかの実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣおよびビンカアルカロイド治療成分（例えば、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンクリスチンまたはビンデシン）ならびに任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。一実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣおよびインターロイキン２ならびに任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。別の実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣおよびインターフェロンαならびに任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。
【０４３９】
他の実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣは、メラノーマのアジュバント治療および／または外科的手法（例えば、腫瘍切除）との組合せで使用されてもよい。一実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣおよびインターフェロンαならびに任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。
【０４４０】
本発明は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣと放射線療法との組合せも提供する。用語「放射線療法」は、本明細書で使用される場合、腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡ損傷を誘導する任意の機構、例えば、ガンマ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出などを意味する。放射性同位体の腫瘍細胞へ方向付けられた送達を使用する併用療法も検討され、本明細書に開示の抗ＤＬＬ３抗体と組み合わせてまたは抗ＤＬＬ３抗体のコンジュゲートとして使用され得る。典型的には、放射線療法は、約１から約２週間の期間にわたりパルスで投与される。任意選択的に、放射線療法は、単独用量としてまたは複数回の連続用量として投与されてもよい。
【０４４１】
他の実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣは、下記の抗がん剤の１つ以上と組み合わせて使用され得る。
【０４４２】
Ｄ．抗がん剤
用語「抗がん剤」は、本明細書で使用される場合、「治療成分」の１つのサブセット、つまり、「医薬として活性な成分」として記載される薬剤のサブセットである。より詳細には、「抗がん剤」は、細胞増殖性障害、例えば、がんを治療するために使用することができる任意の薬剤（またはその医薬として許容される塩）を意味し、これらに限定されないが、細胞毒性剤、細胞分裂停止剤、抗血管新生剤、減量剤、化学療法剤、放射線治療剤、標的化抗がん剤、生物学的応答修飾剤、治療抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、抗転移剤および免疫療法剤が挙げられる。抗がん剤の前述の分類は、互いに排他的なものではなく、選択された薬剤は、１つ以上のカテゴリーに分類され得ることに注意されたい。例えば、ある適合する抗がん剤が、細胞毒性剤かつ化学療法剤として分類することができる。したがって、前述の用語のそれぞれは、本開示を考慮し、次に医療分野におけるそれらの使用に応じて解釈すべきである。
【０４４３】
好ましい実施形態において、抗がん剤は、がん性細胞またはがん性になる可能性があるかもしくは腫瘍形成性子孫細胞（例えば、腫瘍形成性細胞）を生じる可能性がある細胞を抑制するかもしくは除去する化学剤（例えば、化学療法剤）、または抑制するかもしくは除去するように設計されている化学剤を含み得る。これに関して、選択された化学剤（細胞周期依存性薬剤）は、細胞の成長または分裂に必要な細胞内プロセスをしばしば対象とし、したがって、一般的に急速に成長し、分裂する、がん性細胞対して特に有効である。例えば、ビンクリスチンは、微小管を解重合し、したがって、急速に分裂しつつある細胞が有糸分裂に入ることを阻害する。他の場合において、選択された化学剤は、細胞のライフサイクルのあらゆる点における細胞生存を妨げる細胞周期非依存性薬剤であり、指向性療法（例えば、ＡＤＣ）に有効であり得る。例として、特定のピロロベンゾジアゼピンは、細胞ＤＮＡの副溝に結合し、核への送達により転写を阻害する。併用療法またはＡＤＣ成分の選択に関して、当業者は、本開示を考慮して適合する細胞周期依存性薬剤および細胞周期非依存性薬剤を容易に同定できることが理解される。
【０４４４】
いずれにしてもまた上記で言及したように、選択された抗がん剤は、本明細書で開示した抗ＤＬＬ３抗体およびＡＤＣと互いに組み合わせて（例えば、ＣＨＯＰ療法）投与することができることが理解される。さらに、特定の実施形態において、このような抗がん剤は、コンジュゲートを含むことができ、投与前に抗体と会合していてもよいことがさらに理解される。いくつかの態様において、本開示の抗がん剤は、抗ＤＬＬ３抗体と連結されて、本明細書に開示のＡＤＣを提供する。
【０４４５】
本明細書で使用される場合、用語「細胞毒性剤」（または細胞毒）は、一般的に、細胞に毒性がある物質、すなわち、細胞の機能を減少もしくは阻害しそして／または腫瘍細胞の破壊を引き起こす物質を意味する。特定の実施形態において、物質は、生存生物に由来する天然に存在する分子または（天然源から精製されたもしくは合成により調製された）その類似体である。細胞毒性剤の例としては、これらに限定されないが、小分子毒素または酵素的に活性な細菌毒素（例えば、カリケアマイシン、ジフテリア（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）毒素、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌体内毒素および菌体外毒素、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシンＡ）、菌類（例えば、αサルシン、レストリクトシン）、植物（例えば、アブリン、リシン、モルデクシン、ビスクミン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｉｄｉｎ）、トリコサンチン、オオムギ毒素、アレウリテス・フォルジ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジランチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラッカ・メリカナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質［ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ］、モモルディカ・カランティア（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィキナリス（Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシンおよびトリコテセン）または動物（例えば、細胞傷害性ＲＮアーゼ、例えば、細胞外膵ＲＮアーゼ；ＤＮアーゼＩ、これらの断片および／またはバリアントを含む）が挙げられる。放射性同位体、メイタンシノイド、オーリスタチン、ドラスタチン、デュオカルマイトマイシン、アマニチンおよびピロロベンゾジアゼピンを含むさらなる適合する細胞毒性剤を本明細書に示す。
【０４４６】
より一般に本発明の抗体と組み合わせて（またはコンジュゲートして）使用し得る細胞毒性剤または抗がん剤の例は、限定されないが、アルキル化剤、アルキルスルホネート、アナストロゾール、アマニチン、アジリジン、エチレンイミンおよびメチルメラミン、アセトゲニン、カンプトテシン、ＢＥＺ−２３５、ボルテゾミブ、ブリオスタチン、カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）、ＣＣ−１０６５、セリチニブ、クリゾチニブ、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エリュテロビン、エルロチニブ、パンクラチスタチン、サルコジクチイン、スポンジスタチン、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、エンジイン  ダイネマイシン、ビスホスホネート、エスペラミシン、色素タンパク質のエンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、アクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カンフォスファミド、カルビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、トルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン，ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、エキセメスタン、フルオロウラシル、フルベストラント、ゲフィチニブ、イダルビシン、ラパチニブ、レトロゾール、ロナファーニブ、マルセロマイシン、酢酸メゲストロール、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリゴマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎ）、パゾパニブ、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン、ラパマイン、ロドルビシン、ゾラフェニブ、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、クエン酸タモキシフェン、テモゾロミド、テパディナ（ｔｅｐｏｄｉｎａ）、チピファルニブ、ツベルシジン、ウベニメクス、バンデタニブ、ボロゾール、ＸＬ−１４７、ジノスタチン、ゾルビシン；抗代謝物質、葉酸アナログ、プリンアナログ、アンドロゲン、抗副腎物質、フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）のような葉酸補充薬、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトレキサート、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルチン、ジアジクオン、エフロルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）、マイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、多糖錯体、ラゾキサン；リゾキシン；ＳＦ−１１２６、シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロエチルアミン；トリコテシン類（Ｔ−２毒素、ベラキュリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロ��ジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ、ビンブラスチン；白金；エトポシド；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；レチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン；オキサリプラチン；ＸＬ５１８、細胞増殖を減少させるＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲおよびＶＥＧＦ−Ａの阻害剤、ならびに上記のいずれかの医薬的に許容される塩または溶媒和物、酸もしくは誘導体を含む。腫瘍に対するホルモンの作用を調節するかまたは阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン剤および選択的エストロゲン受容体抗体、副腎におけるエストロゲンの生成を調節する酵素であるアロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤ならびに抗アンドロゲン剤ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＶＥＧＦ発現阻害剤およびＨＥＲ２発現阻害剤などのリボザイム、ワクチン、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ、ビノレルビンおよびエスペラミシンならびに上記のうちのいずれかの医薬として許容される塩または溶媒和物、酸または誘導体なども本定義に含まれる。
【０４４７】
適合する細胞毒性剤または抗がん剤は、商業的または臨床的に利用可能な化合物、例えば、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍ．）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、５−ＦＵ（フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、ＣＡＳ番号５１−２１−８）、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）、Ｌｉｌｌｙ）、ＰＤ−０３２５９０１（ＣＡＳ番号３９１２１０−１０−９、Ｐｆｉｚｅｒ）、シスプラチン（ｃｉｓ−ジアミン、ジクロロ白金（ＩＩ）、ＣＡＳ番号１５６６３−２７−１）、カルボプラチン（ＣＡＳ番号４１５７５−９４−４）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、テモゾロミド（４−メチル−５−オキソ−２，３，４，６，８−ペンタアザビシクロ［４．３．０］ノナ−２，７，９−トリエン−９−カルボキサミド、ＣＡＳ番号８５６２２−９３−１、ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標）、ＴＥＭＯＤＡＬ（登録商標）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、タモキシフェン（（Ｚ）−２−［４−（１，２−ジフェニルブタ−１−エニル）フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）、ＩＳＴＵＢＡＬ（登録商標）、ＶＡＬＯＤＥＸ（登録商標））およびドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））を含む。さらなる商業的または臨床的に利用可能な抗がん剤は、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．）、スーテント（ＳＵＮＩＴＩＮＩＢ（登録商標）、ＳＵ１１２４８、Ｐｆｉｚｅｒ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−５１８（Ｍｅｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ、ＷＯ２００７／０４４５１５）、ＡＲＲＹ−８８６（Ｍｅｋ阻害剤、ＡＺＤ６２４４、Ａｒｒａｙ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ、Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）、ＳＦ−１１２６（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｓｅｍａｆｏｒｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＥＺ−２３５（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−１４７（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ  ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、リューコボリン（フォリン酸）、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＧＳＫ５７２０１６、Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ）、ロナファーニブ（ＳＡＲＡＳＡＲ（商標）、ＳＣＨ  ６６３３６、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標）、ＢＡＹ４３−９００６、Ｂａｙｅｒ  Ｌａｂｓ）、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）、ＣＰＴ−１１、Ｐｆｉｚｅｒ）、ティピフ��ニブ（ＺＡＲＮＥＳＴＲＡ（商標）、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ−ｆｒｅｅ）、パクリタキセルのアルブミン改変ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌ）、バンデタニブ（ｒＩＮＮ、ＺＤ６４７４、ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、クロラムブシル、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ  ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、テムシロリムス（ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、パゾパニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、カンフォスファミド（ＴＥＬＣＹＴＡ（登録商標）、Ｔｅｌｉｋ）、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標））、ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）、タモキシフェン（例えば、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）、クエン酸タモキシフェン、ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）（クエン酸トレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｉｎｅ））、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）（酢酸メゲストロール）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）（エキセメスタン；Ｐｆｉｚｅｒ）、フォルメスタン（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）（ボロゾール）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）およびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）を含み得る。
【０４４８】
用語「医薬として許容される塩」または「塩」は、分子または巨大分子の有機または無機塩を意味する。酸付加塩は、アミノ基と共に形成され得る。例示的な塩としては、これらに限定されないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酸性酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチジン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびパモ酸塩（すなわち、１，１’メチレンビス−（２−ヒドロキシ３−ナフトエート））が挙げられる。医薬として許容される塩は、例えば、酢酸イオン、コハク酸イオンまたは他の対イオンなどの別の分子が包含されたものを含み得る。対イオンは、親化合物の電荷を安定化させる任意の有機または無機部分であり得る。さらに、医薬として許容される塩は、その構造内に２つ以上の荷電原子を有し得る。複数の荷電原子が医薬として許容される塩の一部である場合、この塩は複数の対イオンを有し得る。したがって、医薬として許容される塩は、１つ以上の荷電原子および／または１つ以上の対イオンを有し得る。
【０４４９】
同様に「医薬として許容される溶媒和物」または「溶媒和物」は、１つ以上の溶媒分子と分子または巨大分子との会合物を指す。医薬として許容される溶媒和物を形成する溶媒の例としては、これらに限定されないが、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸およびエタノールアミンが挙げられる。
【０４５０】
他の実施形態において、本発明の抗体またはＡＤＣは、現在臨床試験にあるまたは市販のいくつかの抗体（または免疫療法剤）のいずれか１つと組み合わせて使用し得る。開示されている抗体は、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アルシツモマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ、シクスツムマブ、クリバツズマブ、コナツムマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、ダラツムマブ、デツモマブ、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、ドゥルバルマブ、デュシギツマブ、エクロメキシマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フツキシマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、イムガツズマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、ラムブロリズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モキセツモマブ、ナルナツマブ、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブ（ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂｎ）、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オラパリブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、パーサツズマブ、パトリツマブ、ペンブロリズマブ、ペムツモマブ、パーツズマブ、ピジリズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブ、セルメチニブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、ソリトマブ、タカツズマブ、タプリツモマブ、テナツモマブ、テプロツムマブ、チガツズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ、ボルセツズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ＣＣ４９、３Ｆ８、ＭＥＤＩ０６８０、ＭＤＸ−１１０５およびこれらの組合せからなる群から選択される抗体と組み合わせて使用され得る。
【０４５１】
他の実施形態は、がん治療のために承認された抗体、例えば、これらに限定されないが、リツキシマブ、ゲムツズマブ  オゾガマイシン、アレムツズマブ、イブリツモマブ  チウキセタン、トシツモマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ（ｐａｔｉｔｕｍｕｍａｂ）、オファツムマブ、イピリムマブおよびブレンツキシマブベドチンの使用を含む。当業者は、本明細書の教示に適合するさらなる抗がん剤を容易に特定することができる。
【０４５２】
Ｅ．放射線療法
上記で簡潔に説明したように、本発明は、抗体またはＡＤＣと、放射線療法（つまり、腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡ損傷を誘導する任意の機構、例えば、ガンマ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出など）との組み合わせも提供する。腫瘍細胞への放射性同位体の方向付けられた送達を使用する併用療法も検討され、本開示の抗体またはＡＤＣは、標的抗がん剤または他の標的化手段と結び付けて使用することができる。典型的には、放射線療法は、約１−約２週間の期間にわたりパルスで投与される。放射線療法は、頭頚部がんを有する対象に約６−７週間投与されてもよい。任意選択的に、放射線療法は、単回用量としてまたは複数回の連続用量として投与されてもよい。
【０４５３】
ＶＩＩＩ．適応症
本発明は、本発明の抗体およびＡＤＣの、様々な障害、例えば、増殖性障害、新生物、炎症性、血管新生および免疫学的障害ならびに毒素によって引き起こされる障害の診断、診断治療、治療および／または予防のための使用を提供する。特定の実施形態において、治療される疾患は、新生物状態を含み、特定の他の態様において固形腫瘍を含む。他の実施形態において、治療される疾患は、血液悪性疾患を含む。さらに他の実施形態において、本発明の抗体またはＡＤＣは、ＤＬＬ３決定因子を発現する腫瘍または腫瘍形成性細胞を治療するために使用される。好ましくは、治療される「対象」または「患者」はヒトであるが、本明細書で使用するとき、それらの用語は、あらゆる哺乳動物種を含むものとして表される。
【０４５４】
本発明の化合物および組成物は、疾患の様々な病期にあり、治療サイクルにおける種々の時点にある対象を治療するために用いることができることが理解される。したがって、特定の実施形態において、本発明の抗体およびＡＤＣは、フロントライン治療として使用され、がん性状態に関して以前に治療されたことがない対象に投与される。他の実施形態において、本発明の抗体およびＡＤＣは、セカンドライン患者およびサードライン患者（すなわち、同じ状態について以前にそれぞれ１および２回治療を受けた対象）を治療するために用いられる。さらに他の実施形態は、本開示のＤＬＬ３  ＡＤＣによりまたは異なる治療剤により３回以上同じまたは関連する状態について治療されたフォースライン患者またはこれより高次の患者（例えば、ＳＣＬＣ患者）の治療を含む。他の実施形態において、本発明の化合物および組成物は、以前に（本発明の抗体またはＡＤＣを用いてまたは他の抗がん剤を用いて）治療され、再燃した対象または以前の治療に対して不応性と判断された対象を治療するために使用される。選択された実施形態において、本発明の化合物および組成物は、再発性腫瘍を有する対象を治療するために使用され得る。
【０４５５】
上記で議論したようにおよび添付の実施例に示すように、本発明の化合物および組成物は、好ましくは本明細書に示したように得られるＩＨＣおよび／またはＨスコアを用いて判定されたＤＬＬ３＋腫瘍（例えば、９０以上のＤＬＬ３  Ｈスコアを有する腫瘍および／または細胞の≧２０％においてＤＬＬ３を発現する腫瘍）に罹患している対象を治療するために用いことができる。この点に関して、本発明の一実施形態は、本開示のＤＬＬ３  ＡＤＣによる少なくとも９０のＨスコアを有する患者の治療を含む。他の実施形態において、本発明のＤＬＬ３  ＡＤＣにより治療される患者は、少なくとも１２０のＤＬＬ３  Ｈスコアを有する。さらに他の実施形態において、本発明のＤＬＬ３  ＡＤＣにより治療される患者は、少なくとも１５０のＤＬＬ３  Ｈスコアを有し、より好ましくは少なくとも１８０のＤＬＬ３  Ｈスコアを有する。さらに他の実施形態は、ＤＬＬ３＋腫瘍を含むものであって、腫瘍は、染色により測定された構成細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％または少なくとも５０％においてＤＬＬ３を発現する。特定の好ましい実施形態において、Ｈスコアまたは染色された細胞のパーセンテージは、ＳＣＬＣ腫瘍から得られた試料を用いて測定される。他の実施形態において、Ｈスコアまたは染色された細胞のパーセンテージは、大細胞神経内分泌癌、神経膠芽腫、メラノーマまたは甲状腺髄様腫瘍から得られた試料を用いて測定される。さらに他の実施形態において、Ｈスコアまたは染色された細胞のパーセンテージは、神経内分泌の特徴を示す腫瘍から得られた試料を用いて測定される。
【０４５６】
特定の態様において、増殖性障害は、固形腫瘍、例えば、限定されないが、副腎、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、子宮頚部、子宮、食道、結腸直腸、前立腺（例えば、前立腺腺がん）、膵臓、肺（小細胞および非小細胞の両方を含む）、甲状腺、癌腫、肉腫、神経膠芽腫および様々な頭頚部の腫瘍を含む。他の好ましい実施形態において、および下記実施例において示されるように、本開示のＡＤＣは、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）（例えば、扁平上皮非小細胞肺がんおよび扁平上皮小細胞肺がん）を治療するのにとりわけ有効である。特定の実施形態において、肺がんは、白金ベースの薬剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、トポテカン）および／またはタキサン（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセルもしくはカルバジタキセル）に対して不応性、再発性または抵抗性である。さらに他の実施形態において、治療される対象は、大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）に罹患している。本発明のさらに他の態様において、本開示の抗体およびＡＤＣは、甲状腺髄様がん、神経膠芽腫、神経内分泌前立腺がん（ＮＥＰＣ）、高悪性度胃腸膵がん（ＧＥＰ）および悪性黒色腫の治療に用いることができる。
【０４５７】
より一般的には、本発明に従った例示的な新生物状態の治療対象は、良性または悪性であっても、固形腫瘍および血液悪性疾患であってもよく、限定されないが、以下の群から選択され得る；副腎腫瘍、ＡＩＤＳ−関連がん、胞巣状軟部肉腫、星細胞系腫瘍、自律神経節腫瘍、膀胱がん（扁平上皮がんおよび移行上皮がん）、胞胚腔障害、骨がん（アダマンチノーマ、動脈瘤様骨のう腫（ａｎｅｕｒｉｓｍａｌ  ｂｏｎｅ  ｃｙｓｔ）、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳および脊髄がん、転移性脳腫瘍、乳がん、頸動脈球腫瘍、子宮頚部がん、軟骨肉腫、脊索腫、嫌色素性腎細胞癌、腎明細胞癌、結腸がん、結腸直腸がん、深在性良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣腫、上皮障害、ユーイング腫瘍、骨格性粘液様軟骨肉腫、骨性線維形成不全症（ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔａ  ｏｓｓｉｕｍ）、線維性骨異形成症、胆嚢および胆管がん、胃がん、胃腸、妊娠性絨毛性疾患、胚細胞腫瘍、腺障害、頭頚部がん、視床下部、腸がん、島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん（腎芽腫、乳頭状腎細胞がん）、白血病、脂肪腫／良性脂肪腫様腫瘍、脂肪肉腫／悪性脂肪腫様腫瘍、肝臓がん（肝芽腫、肝細胞がん）、リンパ腫、肺がん（小細胞がん、腺がん、扁平上皮がん、大細胞がんなど）、マクロファージ障害（ｍａｃｒｏｐｈａｇａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、髄芽腫、メラノーマ、髄膜腫、甲状腺髄様がん、多発性内分泌腺腫瘍症、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、甲状腺乳頭がん、副甲状腺腫瘍、小児科がん、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体膿瘍腫瘍、前立腺がん、後ブドウ膜黒色腫、希少血液障害（ｒａｒｅ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、腎性転移性がん、ラブドイド腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚がん、軟組織肉腫、扁平上皮がん、胃がん、間質性障害、滑膜肉腫、精巣がん、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺転移性がんおよび子宮がん（子宮頸部癌、子宮内膜癌および平滑筋腫）。
【０４５８】
さらに他の好ましい実施形態において、化合物または組成物は、メラノーマに罹患している対象に投与される。より一般的に、本明細書に本開示の組成物および方法は、メラノーマを診断、モニタリング、治療または予防するために使用され得る。用語「メラノーマ」は、本明細書で使用されるとき、全ての種類のメラノーマ、例えば、限定されないが、原発性メラノーマ、悪性メラノーマ、皮膚メラノーマ、真皮外メラノーマ、表在拡大型メラノーマ、ポリープ状メラノーマ、黒色癌、黒色上皮腫、黒色肉腫、上皮内メラノーマ（ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）、結節型悪性メラノーマ、悪性黒子型メラノーマ、黒子型メラノーマ、黒子型悪性メラノーマ、粘膜部黒子型メラノーマ、粘膜部メラノーマ、末端黒子型メラノーマ、軟組織メラノーマ、眼内メラノーマ、浸潤性メラノーマ、家族性異型母斑メラノーマ（ＦＡＭ−Ｍ）症候群、線維形成性悪性メラノーマまたはぶどう膜メラノーマを含む。
【０４５９】
転移性メラノーマは、メラノサイト、メラノサイト性母斑または異形成母斑に由来する可能性があり、腫瘍進行の様々な段階（例えば、肥大成長段階または垂直成長段階）を通じて発展し得る。メラノーマは、染色体異常、変性成長および／または発達障害、分裂促進剤、紫外線照射、ウイルス感染、発癌物質、様々な遺伝子変異または遺伝子の異常発現によって生じる可能性がある。
【０４６０】
上記で言及したように、本開示の抗体およびＡＤＣは、肺がん、例えば、以下のサブタイプ：小細胞肺がんおよび非小細胞肺がん（例えば、扁平上皮非小細胞肺がんまたは扁平上皮小細胞肺がん）ならびに大細胞神経内分泌癌の治療に特に有効である。選択された実施形態において、抗体およびＡＤＣは、限定された病期の疾患または広範囲の病期の疾患を示す患者に投与され得る。他の実施形態において、本開示のコンジュゲート抗体は、不応性患者（つまり、初期治療の全工程中または直後に疾患を再発する患者）、感受性のある患者（つまり、再発が一次治療から２〜３カ月後より長い患者）；または白金系薬剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン）および／もしくはタキサン（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセルもしくはカバジタキセル）に耐性を示す患者に投与される。特定の好ましい実施形態において、本発明のＤＬＬ３  ＡＤＣを、フロントライン患者（すなわち、肺がんについて治療されたことがない患者）に投与することができる。他の実施形態において、本発明のＤＬＬ３  ＡＤＣを、セカンドライン肺がん患者に投与することができる。さらに他の実施形態において、本発明のＤＬＬ３  ＡＤＣを、サードラインまたはフォースライン肺がん患者に投与することができる。
【０４６１】
とりわけ好ましい実施形態において、本開示のＡＤＣは、小細胞肺がんを治療するために用いることができる。このような実施形態に関して、コンジュゲート抗体は、限定された病期の疾患を示す患者に投与することができる。他の実施形態において、本開示のＡＤＣは、広範囲の病期の疾患を示す患者に投与することができる。他の好ましい実施形態において、本開示のＡＤＣは、不応性患者（すなわち、最初の療法の過程中もしくはその完了の直後に再発した患者）または再発小細胞肺がん患者に投与される。さらに他の実施形態は、感受性患者（すなわち、再発がＳＣＬＣに対する一次療法の後２−３カ月より長い患者）への本開示のＡＤＣの投与を含む。それぞれの場合において、適合ＡＤＣは、選択された投与レジメンおよび臨床診断によって他の抗がん剤（例えば、白金ベースの薬剤またはタキサンまたはＰＤ−１もしくはＰＤ−Ｌ１に対する抗体）と組み合わせて用いることができることが理解される。
【０４６２】
本明細書に示したように、本開示のＡＤＣは、神経内分泌腫瘍を含む神経内分泌特性または神経内分泌表現型を有する腫瘍を予防、治療または診断するためにさらに用いることができる。分散内分泌系から生じる真性または基準神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）は、比較的まれであり、１００，０００人あたり２−５人の発症率を有するが、非常に悪性が高い。神経内分泌腫瘍は、腎臓、尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頚部および子宮内膜）、消化管（結腸、胃）、甲状腺（甲状腺髄様がん）および肺（小細胞肺癌および大細胞神経内分泌癌）において発生する。これらの腫瘍は、セロトニンおよび／またはカルチノイド症候群として公知の衰弱症状をもたらし得るクロモグラニンＡを含むいくつかのホルモンを分泌し得る。このような腫瘍は、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ、ガンマエノラーゼとしても公知、遺伝子記号＝ＥＮＯ２）、ＣＤ５６（またはＮＣＡＭ１）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）およびシナプトフィシン（ＳＹＰ）のような陽性粘液組織化学的マーカーによってまたはＡＳＣＬ１のような発現の上昇を示すことを、公知の遺伝子によって表すことができる。残念ながら、伝統的な化学療法は、ＮＥＴの治療に特に有効ではなく、肝臓転移が一般的な転帰である。
【０４６３】
本開示のＡＤＣは、神経内分泌腫瘍を治療するために有利に用いることができるが、これらは、古典的な神経内分泌腫瘍を、遺伝子型または表現型の面で模倣するか、またはそれらと共通の形質を示す、偽性神経内分泌腫瘍（ｐＮＥＴ）を治療し、予防しまたは診断するためにも、用いることができる。偽性神経内分泌腫瘍または神経内分泌の特徴を示す腫瘍は、散在性神経内分泌系の細胞から生じるか、または神経内分泌分化カスケードが腫瘍形成過程中に異常に再活性化された細胞から生じる腫瘍である。このようなｐＮＥＴは、一般的に、伝統的に定義された神経内分泌腫瘍（すなわち、これらは神経内分泌の特徴を示す）と、生物学的に活性なアミン、神経伝達物質およびペプチドホルモンのサブセットを産生する能力を含む、特定の表現型特徴または生化学的特徴を共有する。組織学的には、このような腫瘍（ＮＥＴおよびｐＮＥＴ）は、多くの場合、無刺激性の（ｂｌａｎｄ）細胞病理の最小限の細胞質と円形から楕円形の点状の核とを有する、高密度に結合した小細胞を示す、共通の外観を有する。本発明の目的のために、神経内分泌および偽性神経内分泌腫瘍を定義するために用いることができる、一般的に発現する組織学的マーカーまたは遺伝マーカーは、クロモグラニンＡ、ＣＤ５６、シナプトフィシン、ＰＧＰ９．５、ＡＳＣＬ１およびニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）を含むが、これらに限定されない。
【０４６４】
したがって、本発明のＡＤＣは、偽性神経内分泌腫瘍および基準の神経内分泌腫瘍の両方を治療するために、有益に用いることができる。この点に関して、ＡＤＣは、本明細書で述べたように、腎臓、尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頚部および子宮内膜）、消化管（結腸、胃）、甲状腺（甲状腺髄様がん）および肺（小細胞肺癌および大細胞神経内分泌癌）に生じる神経内分泌腫瘍（ＮＥＴおよびｐＮＥＴの両方）を治療するために用いることができる。さらに、本発明のＡＤＣは、ＮＳＥ、ＣＤ５６、シナプトフィシン、クロモグラニンＡ、ＡＳＣＬ１およびＰＧＰ９．５（ＵＣＨＬ１）から選択される１つ以上のマーカーを発現する腫瘍を治療するために用いることができる。すなわち、本発明は、ＮＳＥ＋またはＣＤ５６＋またはＰＧＰ９．５＋またはＡＳＣＬ１＋またはＳＹＰ＋またはＣＨＧＡ＋またはそれらのいくつかの組合せである腫瘍に罹患している対象を治療するために、用いることができる。
【０４６５】
先に言及したように、本発明のＤＬＬ３  ＡＤＣは、特に患者が前述のマーカーを示す場合、１回または２回の治療の後に進行性疾患を有するＳＣＬＣ患者（すなわち、セカンドラインＳＣＬＣ患者またはサードラインＳＣＬＣ患者）を治療するために用いることができる。
【０４６６】
血液悪性疾患に関して、本発明の化合物および方法は、様々な種類のＢ細胞性リンパ腫、例えば、低悪性度／ＮＨＬ濾胞細胞リンパ腫（ＦＣＣ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小非分割細胞ＮＨＬ、巨大腫瘤病変ＮＨＬ、ワルデンストレームマクログロブリン血症、リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、単球Ｂ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症（ａｎｇｉｏｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｙｍｐｈｏａｄｅｎｏｐａｔｈｙ）、小リンパ球性、濾胞性、びまん性大細胞、びまん性小分割細胞型、大細胞免疫芽球性リンパ芽球腫、小非分割バーキットおよび非バーキット濾胞性優性大細胞；濾胞性優性小分割細胞；ならびに濾胞性混合小分割および大細胞リンパ腫を治療するために特に有効であり得ることがさらに認識される。Ｇａｉｄｏｎｏら、「Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ」、ＩＮ  ＣＡＮＣＥＲ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＆  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＯＮＣＯＬＯＧＹ、第２巻：２１３１−２１４５（ＤｅＶｉｔａら編、第５版、１９９７）を参照。これらのリンパ腫が分類体系の変更によってしばしば異なる名称を有し、異なる名称で分類されたリンパ腫を有する患者も本発明の組み合わされた治療レジメンによって利益を得る場合があることは、当業者にとって明らかである。
【０４６７】
ＩＸ．製品
本発明は、１つ以上の容器またはレセプタクルを含む医薬パックまたはキットを含み、ここで、容器は、１用量以上の本発明の抗体またはＡＤＣを含み得る。このようなキットまたはパックは、本質的に診断用または治療用である。特定の実施形態において、パックまたはキットは、単位用量を含み、これは、例えば、本発明の抗体またはＡＤＣを、１つ以上の追加の薬剤および任意選択的に１つ以上の抗がん剤と共に、またはこれらなしで含む、所定の量の組成物を意味する。特定の他の実施形態において、パックまたはキットは、検出可能な量の抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣを、がん性細胞の検出、定量化、染色および／または視覚化のための結合レポーター分子および任意選択的に１つ以上の追加の薬剤と共に、またはこれらなしで、含む。
【０４６８】
いずれにしても本発明のキットは、一般的に、医薬として許容される製剤を含む適切な容器またはレセプタクル内に、本発明の抗体またはＡＤＣを含み、任意選択に、同じまたは異なる容器に１つ以上の抗がん剤を含む。キットは、診断または併用療法用のいずれかのために、他の医薬として許容される製剤または装置を含んでもよい。診断装置または機器の例としては、細胞または増殖性障害に伴うマーカーの検出、調査、モニタリング、定量化またはプロファイルに使用し得るものを含む（このような例示的マーカーの列挙について、上記参照）。いくつかの実施形態において、装置は、インビボまたはインビトロのいずれかで、循環する腫瘍細胞を検出、モニタリング、および／または定量化するために使用することができる（例えば、ＷＯ２０１２／０１２８８０１を参照）。さらに他の実施形態において、循環する腫瘍細胞は、腫瘍形成性細胞を含んでもよい。本発明で検討されるキットは、本発明の抗体またはＡＤＣを抗がん剤または診断剤と組み合わせるための適切な試薬を含んでもよい。
【０４６９】
キットの成分が１つ以上の溶液で提供される場合、溶液は非水性であり得るが、典型的には水溶液が好ましく、滅菌水溶液が特に好ましい。キット内の製剤は、乾燥粉末として、または適切な液体の添加により再構成され得る凍結乾燥形態で提供されてもよい。再構成に使用される液体は、別個の容器に含有され得る。このような液体は、滅菌の医薬として許容されるバッファーまたは他の希釈剤、例えば、注射用静菌水、注射用滅菌水、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液またはデキストロース溶液を含み得る。キットが、本発明の抗体またはＡＤＣをさらなる治療薬または薬剤との組合せで含む場合、溶液はモル当量の組合せで、または一方の成分を他方より過剰にして、予め混合されていてもよい。代替的に、本発明の抗体またはＡＤＣおよびいずれかの任意選択の抗がん剤または他の薬剤は、患者への投与前は別個の容器内で別個に維持されていてもよい。
【０４７０】
特定の好ましい実施形態において、本発明のキットは、凍結乾燥ＤＬＬ３  ＡＤＣを含むバイアルまたはボトルを含む。好ましくは、凍結乾燥ＡＤＣは、ＡＤＣ１、ＡＤＣ２、ＡＤＣ３、ＡＤＣ４、ＡＤＣ５およびＡＤＣ６からなる群から選択されるＤＬＬ３  ＡＤＣを含み、より好ましくは凍結乾燥ＤＬＬ３  ＡＤＣは、ｈＳＣ１６．５６ＤＬ１またはｈＳＣ１６．５６ｓｓ１ＤＬ６を含む。特定の実施形態において、凍結乾燥ＤＬＬ３  ＡＤＣは、乾燥保護剤をさらに含む。他の態様において、他の態様において、キットは、凍結乾燥ＤＬＬ３  ＡＤＣを再構成するために用いることができる水溶液を含む容器を任意選択的に含む。さらに他の実施形態において、キットは、凍結乾燥ＤＬＬ３が２−８℃（例えば、４℃）で３カ月間、６カ月間、１年間、１８カ月間、２年間、３０カ月間または３年間安定のままであることを示す添付文書または使用説明書を含み得る。選択された好ましい実施形態において、添付文書または使用説明書は、凍結乾燥ＡＤＣが２−８℃（例えば、４℃）で２年間安定のままであることを示す。特定の好ましい実施形態において、凍結乾燥ＤＬＬ３  ＡＤＣを含む前述のキットは、キットの内容物をがんの治療、予防および／または診断のために用いることができることを示す標識、マーカー、添付文書、バーコードおよび／または読本を含む。とりわけ好ましい態様において、標識、マーカー、添付文書、バーコードおよび／または読本は、キットの内容物を小細胞肺がんの治療、予防および／または診断のために用いることができることを示す。他のとりわけ好ましい態様において、標識、マーカー、添付文書、バーコードおよび／または読本は、キットの内容物を大細胞神経内分泌癌、メラノーマ、甲状腺がんまたは神経膠芽腫の治療、予防および／または診断のために用いることができることを示す。
【０４７１】
より一般的には、キットは、１つまたは複数の容器またはレセプタクルおよび封入される組成物が選択される疾患状態（例えば、がん）の診断または治療に使用されることを示す標識または添付文書を、容器内に、容器上にまたは容器に付随して含んでもよい。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、注入バッグ（ＩＶバッグ）などが含まれる。容器は、様々な材料、例えば、ガラスまたは医薬として適合するプラスチックなどで形成することができる。特定の実施形態において、容器は、滅菌アクセスポートを含んでもよく、例えば、皮下注射針で穴を開けることができるストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってもよい。
【０４７２】
いくつかの実施形態において、キットは、抗体およびいずれかの任意選択の成分を患者に投与するための手段、例えば、中に含む製剤を対象に注射することもしくは導入すること、または身体の疾患領域に適用することができる、１つ以上の針またはシリンジ（充填済または空）、点眼器、ピペットまたは他の同様の装置を含んでもよい。本発明のキットは、典型的に、バイアルまたはそれと同様のもの、および市販のために厳重に密封された状態の他の要素、例えば、所望のバイアルおよび他の装置を配置および保持できる中空プラスチック容器を含有するための手段も含む。
【０４７３】
Ｘ．その他
本明細書において別段に定義されない限り、本発明に関連して使用される科学的用語および技術的用語は、当業者に一般に理解される意味を有する。さらに、文脈によって別途要求されない限り、単数形は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲において提供される範囲は、両終点および両終点間の全ての点を含む。したがって、２．０から３．０の範囲は、２．０、３．０および２．０と３．０との間の全ての点を含む。
【０４７４】
一般的に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学および化学に関する技術は、当該技術分野において周知であり、一般に使用されているものである。本明細書で使用される命名法は、このような技術に関連して、当該技術分野でも一般に使用されている。他に指示されていない限り、本発明の方法および技術は、一般的に、当該技術分野で周知のおよび本明細書を通じて引用されている様々な参照文献に記載された通常の方法に従って実施される。
【０４７５】
ＸＩ．参照文献
本明細書で引用されている全ての特許、特許出願および出版物ならびに電子工学的に利用可能な資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおけるヌクレオチド配列提出物、ならびに例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＢＤにおけるアミノ酸配列提出物ならびにＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおける注釈の付されたコード領域からの翻訳物を含む）の完全な開示は、「参照により組み込む」という文言が特定の参照文献に関連して使用されているか否かに関わらず、参照により組み込まれる。前述の詳細な説明および以下の実施例は、理解を明確にするためにのみ提供される。それによって不必要に限定されないことが理解されるものとする。本発明は、示され、記載されている正確な詳細に限定されない。当業者にとって明らかな変形は、特許請求の範囲によって定義された本発明に含まれる。本明細書で使用されるあらゆる標題は、まとめることを目的とするものにすぎず、記載の主題を限定するものとして解釈されるべきでない。
【０４７６】
ＸＩＩ．配列
本出願には、いくつかの核酸配列およびアミノ酸配を含む図および配列表を添付している。以下の表４は、含まれる配列の概要を提供する。
【０４７７】
【表４】
2018529656.tif 000033
【０４７８】
下記実施例２において議論するように、上の表４は、図１Ａおよび図１Ｂに示す例示的Ｋａｂａｔ  ＣＤＲの配列番号を指定するためにさらに用いることができる。より詳細には図１Ａおよび１Ｂに各重（ＣＤＲＨ）および軽（ＣＤＲＬ）鎖可変領域配列の３つのＫａｂａｔ  ＣＤＲを示し、上の表４に軽鎖の各ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３ならびに重鎖の各ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３に適用することができる配列番号の指定を挙示したものを示す。この方法を用いて、図１Ａおよび１Ｂに示す各固有のＣＤＲに配列番号を割り当てることができ、本発明の得られる抗体を提供するために用いることができる。
【０４７９】
ＸＩＩＩ．腫瘍一覧表
ＰＤＸ腫瘍細胞のタイプは、特定の腫瘍細胞株を表す略称とそれに続く番号で示されている。試験した試料の継代数は、試料の命名に付属したｐ０〜ｐ＃で表され、ここでｐ０は患者腫瘍から直接取得された非継代の試料を示し、ｐ＃は試験前のマウスから腫瘍が継代された回数を示す。本明細書で使用される場合、腫瘍のタイプおよびサブタイプの略称が以下の通り表５に示される：
【０４８０】
【表５】
2018529656.tif 000034
2018529656.tif 000035
【実施例】
【０４８１】
このように上記で全体的に説明した本発明は、以下の実施例を参照することにより、さらに容易に理解される。以下の実施例は、例証として提供され、本発明を限定することを意図していない。実施例は、以下の実験が、実施される全てまたは唯一の実験であると表すことを意図していない。別途指示しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧または大気圧近傍である。
【０４８２】
［実施例１］
マウス抗ＤＬＬ３抗体の生成
抗ＤＬＬ３マウス抗体を以下のように作製した。第１の免疫付与キャンペーンにおいて、３匹のマウス（次の系統のそれぞれから１匹：Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１、ＦＶＢ）に等量のＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）またはミョウバンアジュバントにより乳化したヒトＤＬＬ３−ｆｃタンパク質（ｈＤＬＬ３−Ｆｃ）を接種した。ｈＤＬＬ３−Ｆｃ融合構築物を、Ａｄｉｐｏｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（カタログ番号ＡＧ−４０Ａ−０１１３）から購入した。最初の免疫付与を、ＴｉｔｅｒＭａｘ中マウスあたり１０μｇのｈＤＬＬ３−Ｆｃの乳剤を用いて実施した。次いでマウスに、１匹あたりミョウバンアジュバント中５μｇのｈＤＬＬ３−Ｆｃを週２回ブーストした。融合の前の最終注射は、ＰＢＳ中マウスあたり５μｇのｈＤＬＬ３−Ｆｃを用いた。
【０４８３】
第２の免疫付与キャンペーンにおいて、６匹のマウス（次の系統のそれぞれ２匹：Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１、ＦＶＢ）に等量のＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）またはミョウバンアジュバントにより乳化したヒトＤＬＬ３−Ｈｉｓタンパク質（ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ）を接種した。組換えｈＤＬＬ３−Ｈｉｓタンパク質を、ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓを過剰発現するように遺伝子操作されたＣＨＯ−Ｓ細胞の上清から精製した。最初の免疫付与を、ＴｉｔｅｒＭａｘ中マウスあたり１０μｇのｈＤＬＬ３−Ｈｉｓの乳剤を用いて実施した。次いでマウスに、１匹あたりミョウバンアジュバント中５μｇのｈＤＬＬ３−Ｈｉｓを週２回ブーストした。最終注射は、ｈＤＬＬ３を過剰発現するように遺伝子操作された２ｘ１０５個のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を用いた。
【０４８４】
固相ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ヒトＤＬＬ３に対して特異的なマウスＩｇＧ抗体についてマウス血清をスクリーニングした。バックグラウンド以上の陽性シグナルは、ＤＬＬ３に対して特異的な抗体を示した。簡潔には、９６ウェルプレート（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カタログ番号６１０７４４）を、ＥＬＩＳＡ被覆バッファー中０．５μｇ／ｍｌの組換えＤＬＬ３−Ｈｉｓで一晩被覆した。０．０２％（容積／容積）のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで洗浄した後、ウェルをＰＢＳ中３％（重量／容積）のＢＳＡ、２００μＬ／ウェルで室温で１時間ブロックした。マウス血清を滴定し（１：１００、１：２００、１：４００および１：８００）、ＤＬＬ３被覆プレートに５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次いでＰＢＳ中３％のＢＳＡ−ＰＢＳまたは２％のＦＣＳで１：１０，０００に希釈した５０μＬ／ウェルＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧと共に、室温で１時間インキュベートした。再びプレートを洗浄し、４０μＬ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ３４０２８）を室温で１５分間にわたり加えた。顕色後、等量の２ＮのＨ２ＳＯ４を加えて、基質の顕色を停止し、プレートを分光光度計によりＯＤ４５０で解析した。
【０４８５】
血清陽性免疫付与マウスを屠殺し、流入リンパ節（膝窩、鼠径および内側腸骨）を切除し、抗体産生細胞源として使用した。Ｂ細胞（ｈＤＬＬ３−Ｆｃ免疫付与マウスからの約２２９ｘ１０６細胞およびｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ免疫付与マウスからの５１０ｘ１０６細胞）の細胞懸濁液を非分泌Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞と、１：１の比率で、エレクトロセルフュージョンにより、モデルＢＴＸ  Ｈｙｂｒｉｍｍｕｎｅシステム（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）モデルを使用して融合した。細胞を、アザセリン、１５％の胎性クローンＩ血清、１０％のＢＭ  Ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのＨＥＰＥ、１００ＩＵのペニシリン−ストレプトマイシンおよび５０μＭの２−メルカプトエタノールを補足したＤＭＥＭ培地からなるハイブリドーマ選択培地に再懸濁し、フラスコあたり１００ｍＬの選択培地を含む４つのＴ２２５フラスコで培養した。フラスコを、５％ＣＯ２および９５％空気を含有する加湿３７℃インキュベータ内に６−７日間配設置した。
【０４８６】
融合後６または７日目にハイブリドーマライブラリ細胞を、フラスコから回収し、２００μＬの補足ハイブリドーマ選択培地（上記の通り）中のウェルあたり１個の細胞（ＦＡＣＳＡｒｉａ  Ｉ細胞ソーターを使用）で、６４Ｆａｌｃｏｎ  ９６ウェルのプレートおよびｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ免疫付与キャンペーン用の４８Ｆａｌｃｏｎ  ９６ウェルのプレートに蒔いた。残余のライブラリを、液体窒素中で保存した。
【０４８７】
ハイブリドーマを１０日間培養し、以下の通りに実施したフローサイトメトリを使用してｈＤＬＬ３に特異的な抗体について上清をスクリーニングした。ヒトＤＬＬ３、マウスＤＬＬ３（染料で前染色した）またはカニクイザルＤＬＬ３（Ｄｙｌｉｇｈｔ８００で前染色した）を過剰発現するように遺伝子操作されたウェルあたり１ｘ１０５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２５μＬのハイブリドーマ上清と共に３０分間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ／２％  ＦＣＳで洗浄し、次いで試料あたり２５μＬの、ＰＢＳ／２％  ＦＣＳで１：３００に希釈したＦｃ断片二次特異的、ＤｙｅＬｉｇｈｔ６４９標識化ヤギ−抗マウスＩｇＧとインキュベートした。１５分間インキュベートした後、細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳで２回洗浄し、ＤＡＰＩのＰＢＳ／２％ＦＣＳ中で再懸濁し、アイソタイプ対照抗体で染色した細胞の蛍光を超える蛍光についてフローサイトメトリにより分析した。未使用ハイブリドーマライブラリ細胞の残りを、今後のライブラリ試験およびスクリーニングのために、液体窒素中で凍結した。
【０４８８】
ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ免疫付与キャンペーンにより、約５０個のマウス抗ｈＤＬＬ３抗体が得られ、ｈＤＬＬ３−Ｆｃ免疫付与キャンペーンにより、約９０個のマウス抗ｈＤＬＬ３抗体が得られた。
【０４８９】
［実施例２］
抗ＤＬＬ３抗体の配列決定
上記に基づいて、固定化ヒトＤＬＬ３またはｈ２９３−ｈＤＬＬ３細胞に明らかに高い親和性で結合する多数の異なる例示的モノクローナル抗体を、配列決定およびさらなる解析のために選択した。実施例１において得られた選択されたモノクローナル抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の配列の解析により、多くが新規の相補性決定領域を有し、しばしば新規のＶＤＪ配置を示したことが確認された。
【０４９０】
最初に所望の抗体を発現する選択されたハイブリドーマ細胞をＴｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で溶解して、抗体をコードするＲＮＡを調製した。１０４−１０５個の細胞を１ｍＬのＴｒｉｚｏｌに再懸濁し、２００μＬのクロロホルムを加えた後に激しく振盪した。次いで試料を４℃で１０分間遠心分離し、水性相を新たな小遠心管に移し、等容積の７０％のエタノールを加えた。試料をＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  スピンカラムに加え、２ｍＬの採取管に入れ、製造業者の指示に従って処理した。１００μＬのＲＮアーゼ不含有水を用いて全ＲＮＡを溶出によりスピンカラム膜に直接抽出した。３μＬを１％アガロースゲルで分画することによってＲＮＡ調製物の量を測定した後、使用するまで−８０℃で保存した。
【０４９１】
各ハイブリドーマのＩｇ重鎖の可変領域を、完全マウスＶＨレパートリーを標的とするように設計した３２のマウス特異的リーダー配列プライマーを含む５’プライマーミックスと、全てのマウスＩｇアイソタイプに特異的な３’マウスＣγプライマーとを組合せて使用して増幅させた。同様に、Ｖκマウスファミリーのそれぞれを増幅するように設計した３２の５’Ｖκリーダー配列を含むプライマーミックスを、マウスカッパ定常領域に特異的な単一リバースプライマーと組み合わせて使用し、カッパ軽鎖を増幅させ配列決定した。ラムダ軽鎖を含む抗体については、増幅は、３つの５’ＶＬリーダー配列をマウスラムダ定常領域に特異的な１つのリバースプライマーと組み合わせて使用して実施した。ＶＨおよびＶＬ転写産物は、１００ｎｇの全ＲＮＡから、Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｎｅ工程ＲＴ−ＰＣＲキットを以下のように使用して増幅した。全部で８つのＲＴ−ＰＣＲ反応を各ハイブリドーマについて実施し、４つはＶκ軽鎖について、４つはＶγ重鎖に対して行った。ＰＣＲ反応混合物は、３μＬのＲＮＡ、０．５μＬの１００μＭの重鎖またはカッパ軽鎖いずれかのプライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄａｔａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによりカスタム合成）、５μＬの５×ＲＴ−ＰＣＲバッファー、１μＬのｄＮＴＰ、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含有する１μＬの酵素ミックスならびに０．４μＬのリボヌクレアーゼ阻害剤ＲＮａｓｉｎ（１単位）を含んでいた。サーマルサイクラープログラムは、５０℃で３０分、９５℃で１５分、続いて３０サイクル×（９５℃で３０秒、４８℃で３０秒、７２℃で１分間）のＲＴ工程であった。次いで最終インキュベーションを７２℃で１０分間実施した。
【０４９２】
抽出されたＰＣＲ産物は、可変領域の増幅について上述したものと同じ特異的可変領域プライマーを使用して配列決定した。直接ＤＮＡ配列決定用のＰＣＲ産物を用意するために、ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造業者のプロトコールに従って精製した。ＤＮＡは、５０μＬの滅菌水を用いてスピンカラムから溶出し、次いで両鎖から直接配列決定した（ＭＣＬＡＢ）。
【０４９３】
選択されたヌクレオチド配列を、ＩＭＧＴ配列解析ツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｍｅｄｉｃａｌ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ａｎａｌｙｓｉｓ．ｈｔｍｌ）を使用して分析し、最も高い配列相同性を有する生殖系列Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子メンバーを同定した。これらの誘導した配列は、著作権のある抗体配列データベースを使用してＶＨおよびＶＬ遺伝子をマウス生殖系列データベースにアラインメントすることにより、ＩｇのＶ−およびＪ−領域の既知の生殖系列ＤＮＡ配列と比較した。
【０４９４】
図１Ａは、抗ＤＬＬ３抗体由来の多数の新規マウス軽鎖可変領域および代表的なマウス抗ＤＬＬ３抗体の可変軽鎖から誘導される例示的ヒト化軽鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（下記の実施例３による）を示す。図１Ｂは同じ抗ＤＬＬ３抗体由来の新規マウス重鎖可変領域およびヒト化軽鎖を提供する同じマウス抗体由来のヒト化重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（下記の実施例３による）を示す。マウス軽および重鎖可変領域アミノ酸配列を、配列番号２１〜３８７、奇数、に示し、一方で、ヒト化軽鎖および重鎖可変領域アミノ酸配列を、配列番号３８９〜４０７、奇数に示す。
【０４９５】
したがって、図１Ａおよび１Ｂは共に、ＳＣ１６．３、ＳＣ１６．４、ＳＣ１６．５、ＳＣ１６．７、ＳＣ１６．８、ＳＣ１６．１０、ＳＣ１６．１１、ＳＣ１６．１３、ＳＣ１６．１５、ＳＣ１６．１８、ＳＣ１６．１９、ＳＣ１６．２０、ＳＣ１６．２１、ＳＣ１６．２２、ＳＣ１６．２３、ＳＣ１６．２５、ＳＣ１６．２６、ＳＣ１６．２９、ＳＣ１６．３０、ＳＣ１６．３１、ＳＣ１６．３４、ＳＣ１６．３５、ＳＣ１６．３６、ＳＣ１６．３８、ＳＣ１６．４１、ＳＣ１６．４２、ＳＣ１６．４５、ＳＣ１６．４７、ＳＣ１６．４９、ＳＣ１６．５０、ＳＣ１６．５２、ＳＣ１６．５５、ＳＣ１６．５６、ＳＣ１６．５７、ＳＣ１６．５８、ＳＣ１６．６１、ＳＣ１６．６２、ＳＣ１６．６３、ＳＣ１６．６５、ＳＣ１６．６７、ＳＣ１６．６８、ＳＣ１６．７２、ＳＣ１６．７３、ＳＣ１６．７８、ＳＣ１６．７９、ＳＣ１６．８０、ＳＣ１６．８１、ＳＣ１６．８４、ＳＣ１６．８８、ＳＣ１６．１０１、ＳＣ１６．１０３、ＳＣ１６．１０４、ＳＣ１６．１０５、ＳＣ１６．１０６、ＳＣ１６．１０７、ＳＣ１６．１０８、ＳＣ１６．１０９、ＳＣ１６．１１０、ＳＣ１６．１１１、ＳＣ１６．１１３、ＳＣ１６．１１４、ＳＣ１６．１１５、ＳＣ１６．１１６、ＳＣ１６．１１７、ＳＣ１６．１１８、ＳＣ１６．１２０、ＳＣ１６．１２１、ＳＣ１６．１２２、ＳＣ１６．１２３、ＳＣ１６．１２４、ＳＣ１６．１２５、ＳＣ１６．１２６、ＳＣ１６．１２９、ＳＣ１６．１３０、ＳＣ１６．１３１、ＳＣ１６．１３２、ＳＣ１６．１３３、ＳＣ１６．１３４、ＳＣ１６．１３５、ＳＣ１６．１３６、ＳＣ１６．１３７、ＳＣ１６．１３８、ＳＣ１６．１３９、ＳＣ１６．１４０、ＳＣ１６．１４１、ＳＣ１６．１４２、ＳＣ１６．１４３、ＳＣ１６．１４４、ＳＣ１６．１４７、ＳＣ１６．１４８、ＳＣ１６．１４９およびＳＣ１６．１５０と称される、多数のマウス抗ＤＬＬ３結合または標的ドメインの注釈のついた配列、ならびにｈＳＣ１６．１３、ｈＳＣ１６．１５、ｈＳＣ１６．２５、ｈＳＣ１６．３４  およびｈＳＣ１６．５６と称される、ヒト化抗体を示す。
【０４９６】
本発明の特定の態様において、ＡＤＣ結合ドメインは、ｈＤＬＬ３に特異的に結合し、以下のものを含むかまたは以下のものを含む抗体と結合について競合する：配列番号２１の軽鎖可変領域（ＶＬ）および配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）；または配列番号２５のＶＬおよび配列番号２７のＶＨ；または配列番号２９のＶＬおよび配列番号３１のＶＨ；または配列番号３３のＶＬおよび配列番号３５のＶＨ；または配列番号３７のＶＬおよび配列番号３９のＶＨ；または配列番号４１のＶＬおよび配列番号４３のＶＨ；または配列番号４５のＶＬおよび配列番号４７のＶＨ；または配列番号４９のＶＬおよび配列番号５１のＶＨ；または配列番号５３のＶＬおよび配列番号５５のＶＨ；または配列番号５７のＶＬおよび配列番号５９のＶＨ；または配列番号６１のＶＬおよび配列番号６３のＶＨ；または配列番号６５のＶＬおよび配列番号６７のＶＨ；または配列番号６９のＶＬおよび配列番号７１のＶＨ；または配列番号７３のＶＬおよび配列番号７５のＶＨ；または配列番号７７のＶＬおよび配列番号７９のＶＨ；または配列番号８１のＶＬおよび配列番号８３のＶＨ；または配列番号８５のＶＬおよび配列番号８７のＶＨ；または配列番号８９のＶＬおよび配列番号９１のＶＨ；または配列番号９３のＶＬおよび配列番号９５のＶＨ；または配列番号９７のＶＬおよび配列番号９９のＶＨ；または配列番号１０１のＶＬおよび配列番号１０３のＶＨ；または番号１０５のＶＬ配列および配列番号１０７のＶＨ；または配列番号１０９のＶＬおよび配列番号１１１のＶＨ；または配列番号１１３のＶＬおよび配列番号１１５のＶＨ；または配列番号１１７のＶＬおよび配列番号１１９のＶＨ；または配列番号１２１のＶＬおよび配列番号１２３のＶＨ；または配列番号１２５のＶＬおよび配列番号１２７のＶＨ；または配列番号１２９のＶＬおよび配列番号１３１のＶＨ；または配列番号１３３のＶＬおよび配列番号１３５のＶＨ；または配列番号１３７のＶＬおよび配列番号１３９のＶＨ；または配列番号１４１のＶＬおよび配列番号１４３のＶＨ；または配列番号１４５のＶＬおよび配列番号１４７のＶＨ；または配列番号１４９のＶＬおよび配列番号１５１のＶＨ；または配列番号１５３のＶＬおよび配列番号１５５のＶＨ；または配列番号１５７のＶＬおよび配列番号１５９のＶＨ；または配列番号１６１のＶＬおよび配列番号１６３のＶＨ；または配列番号１６５のＶＬおよび配列番号１６７のＶＨ；または配列番号１６９のＶＬおよび配列番号１７１のＶＨ；または配列番号１７３のＶＬおよび配列番号１７５のＶＨ；または配列番号１７７のＶＬおよび配列番号１７９のＶＨ；または配列番号１８１のＶＬおよび配列番号１８３のＶＨ；または配列番号１８５のＶＬおよび配列番号１８７のＶＨ；または配列番号１８９のＶＬおよび配列番号１９１のＶＨ；または配列番号１９３のＶＬおよび配列番号１９５のＶＨ；または配列番号１９７のＶＬおよび配列番号１９９のＶＨ；または配列番号２０１のＶＬおよび配列番号２０３のＶＨ；または配列番号２０５のＶＬおよび配列番号２０７のＶＨ；または配列番号２０９のＶＬおよび配列番号２１１のＶＨ；または配列番号２１３のＶＬおよび配列番号２１５のＶＨ；または配列番号２１７のＶＬおよび配列番号２１９のＶＨ；または配列番号２２１のＶＬおよび配列番号２２３のＶＨ；または配列番号２２５のＶＬおよび配列番号２２７のＶＨ；または配列番号２２９のＶＬおよび配列番号２３１のＶＨ；または配列番号２３３のＶＬおよび配列番号２３５のＶＨ；または配列番号２３７のＶＬおよび配列番号２３９のＶＨ；または配列番号２４１のＶＬおよび配列番号２４３のＶＨ；または配列番号２４５のＶＬおよび配列番号２４７のＶＨ；または配列番号２４９のＶＬおよび配列番号２５１のＶＨ；または配列番号２５３のＶＬおよび配列番号２５５のＶＨ；または配列番号２５７のＶＬおよび配列番号２５９のＶＨ；または配列番号２６１のＶＬおよび配列番号２６３のＶＨ；または配列番号２６５のＶＬおよび配列番号２６７のＶＨ；または配列番号２６９のＶＬおよび配列番号２７１のＶＨ；または配列番号２７３のＶＬおよび配列番号２７５のＶＨ；または配列番号２７７のＶＬおよび配列番号２７９のＶＨ；または配列番号２８１のＶＬおよび配列番号２８３のＶＨ；または配列番号２８５のＶＬおよび配列番号２８７のＶＨ；または配列番号２８９のＶＬおよび配列番号２９１のＶＨ；または配列番号２９３のＶＬおよび配列番号２９５のＶＨ；または配列番号２９７のＶＬおよび配列番号２９９のＶＨ；または配列番号３０１のＶＬおよび配列番号３０３のＶＨ；または配列番号３０５のＶＬおよび配列番号３０７のＶＨ；または配列番号３０９のＶＬおよび配列番号３１１のＶＨ；または配列番号３１３のＶＬおよび配列番号３１５のＶＨ；または配列番号３１７のＶＬおよび配列番号３１９のＶＨ；または配列番号３２１のＶＬおよび配列番号３２３のＶＨ；または配列番号３２５のＶＬおよび配列番号３２７のＶＨ；または配列番号３２９のＶＬおよび配列番号３３１のＶＨ；または配列番号３３３のＶＬおよび配列番号３３５のＶＨ；または配列番号３３７のＶＬおよび配列番号３３９のＶＨ；または配列番号３４１のＶＬおよび配列番号３４３のＶＨ；または配列番号３４５のＶＬおよび配列番号３４７のＶＨ；または配列番号３４９のＶＬおよび配列番号３５１のＶＨ；または配列番号３５３のＶＬおよび配列番号３５５のＶＨ；または配列番号３５７のＶＬおよび配列番号３５９のＶＨ；または配列番号３６１のＶＬおよび配列番号３６３のＶＨ；または配列番号３６５のＶＬおよび配列番号３６７のＶＨ；または配列番号３６９のＶＬおよび配列番号３７１のＶＨ；または配列番号３７３のＶＬおよび配列番号３７５のＶＨ；または配列番号３７７のＶＬおよび配列番号３７９のＶＨ；または配列番号３８１のＶＬおよび配列番号３８３のＶＨ；または配列番号３８５のＶＬおよび配列番号３８７のＶＨ；または配列番号３８９のＶＬおよび配列番号３９１のＶＨ；または配列番号３９３のＶＬおよび配列番号３９５のＶＨ；または配列番号３９７のＶＬおよび配列番号３９９のＶＨ；または配列番号４０１のＶＬおよび配列番号４０３のＶＨ；または配列番号４０５のＶＬおよび配列番号４０７のＶＨ。
【０４９７】
本出願の目的のために、それぞれの特定の抗体の配列番号は、一連の奇数である。したがって、モノクローナル抗ＤＬＬ３抗体ＳＣ１６．３は、それぞれ軽鎖および重鎖可変領域のアミノ酸配列番号２１および２３を含み、ＳＣ１６．４は、配列番号２５および２７を含み、ＳＣ１６．５は、配列番号２９および３１を含み、他も同様である。各抗体のアミノ酸配列についての対応する核酸配列は、添付の配列表に含まれており、対応するアミノ酸の配列番号の直前の配列番号を有する。したがって、例えば、ＳＣ１６．３抗体のＶＬおよびＶＨの配列番号は、それぞれ２１および２３であり、ＳＣ１６．３抗体のＶＬおよびＶＨをコードする核酸配列の配列番号は、それぞれ配列番号２０および２２である。図１Ａおよび１ＢにおけるＣＤＲは、Ａｂｙｓｉｓデータベースの著作権のあるバージョンを用いてＫａｂａｔら（前掲）に従って定義されている。
【０４９８】
［実施例３］
キメラおよびヒト化抗ＤＬＬ３抗体の生成
本発明に適合するヒト化結合ドメインの基準を得るために、キメラ抗ＤＬＬ３抗体を、当技術分野で認識されている技術を用いて以下のように生成した。実施例１で述べたように全ＲＮＡをハイブリドーマから抽出し、増幅した。マウス抗体のＶＨおよびＶＬ鎖のＶ、ＤおよびＪ遺伝子に関するデータを、誘導された核酸配列から取得した。抗体のＶＨおよびＶＬ鎖のリーダー配列に特異的なプライマーセットを、次の制限部位を使用して設計した：ＶＨ断片に対してＡｇｅＩおよびＸｈｏＩならびにＶＬ断片に対してＸｍａＩおよびＤｒａＩＩＩ。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、次いでＶＨ断片に対して制限酵素ＡｇｅＩおよびＸｈｏＩならびにＶＬ断片に対してＸｍａＩおよびＤｒａＩＩＩを用いて消化した。ＶＬおよびＶＨ消化ＰＣＲ産物を精製し、それぞれカッパＣＬ（配列番号５）ヒト軽鎖定常領域発現ベクターまたはＩｇＧ１（配列番号６）ヒト重鎖定常領域発現ベクターにライゲーションした。
【０４９９】
ライゲーション反応を、全体積１０μＬの２００ＵのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、７．５μＬの消化および精製した遺伝子特異的ＰＣＲ産物ならびに２５ｎｇの直鎖状ベクターＤＮＡ中で実施した。形質転換受容性のある大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ細菌（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、３μＬのライゲーション産物を用いて４２℃での熱ショックを介して形質転換し、濃度１００μｇ／ｍＬでアンピシリンを含むプレート上に蒔いた。増幅ライゲーション産物の精製および消化後、ＶＨ断片を、ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）のＡｇｅＩ−ＸｈｏＩ制限部位にクローニングし、ＶＬ断片を、ｐＥＥ１２．４Ｈｕ−カッパ発現ベクター（Ｌｏｎｚａ  Ｌｔｄ．）のＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ制限部位にクローニングした。
【０５００】
キメラ抗体を、ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１およびｐＥＥ１２．４Ｈｕ−カッパ発現ベクターを用いてＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクションすることにより発現させた。トランスフェクションの前に、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、１５０ｍｍプレートにおいて、１０％熱不活性化ＦＣＳ、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシおよび１００Ｕ／ｍＬのペニシリンＧを補足したダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、標準的条件下で培養した。一過性トランスフェクションのために細胞を８０％の集密度まで増殖させた。各１２．５μｇのｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１およびｐＥＥ１２．４Ｈｕ−カッパベクターＤＮＡを、１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中５０μＬのＨＥＫ−２９３Ｔトランスフェクション試薬に加えた。混合物を室温で３０分間インキュベートし、蒔いた。上清を、トランスフェクションから３から６日後に採取した。組換えキメラ抗体を含有する培養上清を、８００×ｇで１０分間遠心分離することにより細胞デブリから清澄化し、４℃で保存した。組換えキメラ抗体を、タンパク質Ａアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。
【０５０１】
同じマウス抗ＤＬＬ３抗体（例えば、ＳＣ１６．１３、ＳＣ１６．１５、ＳＣ１６．２５、ＳＣ１６．３４およびＳＣ１６．５６）を用いて、ＣＤＲグラフト化またはヒト化結合ドメインも得た。マウス抗体を、著作権のあるコンピュータ支援ＣＤＲグラフト化方法（Ａｂｙｓｉｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ、ＵＣＬ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ）と標準的な分子遺伝子操作技術を使用して、以下のようにヒト化した。可変領域のヒトフレームワーク領域を、ヒト生殖系列抗体配列のフレームワーク配列およびＣＤＲ古典的構造と、関連マウス抗体のフレームワーク配列およびＣＤＲとの間の最も高い相同性に基づき設計した。解析のために、アミノ酸のＣＤＲドメインのそれぞれに対する帰属をＫａｂａｔらに従って行った。可変領域が選択されたら、それらを合成遺伝子セグメントから生成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ヒト化抗体をクローニングし、キメラ抗体について上述した分子的方法を使用して発現させた。
【０５０２】
選択されたヒトアクセプター可変領域の遺伝子構成をヒト化抗体のそれぞれについて直下の表６に示す。表６に示す配列は、配列番号３８９および３９１（ｈＳＣ１６．１３）、配列番号３９３および３９５（ｈＳＣ１６．１５）、配列番号３９７および３９９（ｈＳＣ１６．２５）、配列番号４０１および４０３（ｈＳＣ１６．３４）ならびに配列番号４０５および４０７（ｈＳＣ１６．５６）に示す連続した可変領域配列に対応する。表６は、選択された抗体の好ましい結合特性を維持するためにフレームワークの変化または復帰変異が必要でないことを示す。
【０５０３】
【表６】
2018529656.tif 000036
【０５０４】
フレームワーク領域における残基は変化しなかったが、ヒト化クローンの１つ（ｈＳＣ１６．１３）において、安定性の問題に対処するために変異を重鎖ＣＤＲ２に導入した。結合親和性が対応するキメラ抗体またはマウス抗体のいずれかと同等であることを保証するために、改変されたＣＤＲを有する抗体の結合親和性を確認した。
【０５０５】
ヒト化の後、得られたＶＬおよびＶＨ鎖アミノ酸配列を解析して、マウスドナーおよびヒトアクセプター軽鎖および重鎖可変領域に関するそれらの相同性を判定した。直下の表７に示す結果は、ヒト化構築物が、マウスドナー配列に対するよりもヒトアクセプター配列に対して一貫して高い相同性を示したことを明らかにしている。マウス重鎖および軽鎖可変領域は、ヒト化抗体およびドナーハイブリドーマタンパク質配列の相同性（７４％−８３％）と比較して、ヒト生殖系遺伝子との最良の一致と類似した全体的なパーセンテージの相同性（８５％−９３％）を示す。
【０５０６】
【表７】
2018529656.tif 000037
【０５０７】
キメラ抗体と同様に、ヒト化ＶＬおよびＶＨ消化ＰＣＲ産物を精製し、カッパＣＬ（配列番号５）ヒト軽鎖定常領域発現ベクターまたはＩｇＧ１（配列番号６）ヒト重鎖定常領域発現ベクター内にそれぞれライゲーションした。発現後、誘導されたヒト化構築物を、表面プラズモン共鳴を用いて解析して、ＣＤＲグラフト化過程により、ＤＬＬ３タンパク質に対するそれらの外観上の親和性が、感知できるほどに変化したかどうかを判定した。ヒト化構築物を、マウス親（またはドナー）重鎖および軽鎖可変ドメインならびにヒト化構築物に用いたものと実質的に同等のヒト定常領域を含むキメラ抗体と、比較した。ヒト化抗ＤＬＬ３抗体は、キメラ親抗体により示されたものとほぼ同等の結合特性を示した（データ示さず）。
【０５０８】
［実施例４］
部位特異的抗体の生成
天然の軽鎖（ＬＣ）定常領域および重鎖（ＨＣ）定常領域を含む遺伝子操作されたヒトＩｇＧ１／カッパ抗ＤＬＬ３部位特異的抗体を構築した。この抗体において、ＬＣのシステイン２１４（Ｃ２１４）と鎖間ジスルフィド結合を形成するＨＣの上方ヒンジ領域のシステイン２２０（Ｃ２２０）がセリンと置換されている（Ｃ２２０Ｓ）。構築されたとき、ＨＣおよびＬＣは、治療剤とのコンジュゲーションに適切である２つの遊離システインを含む抗体を形成する。他に記載しない限り、定常領域残基の全ての番号付けは、Ｋａｂａｔらに示されるＥＵ番号付けスキームに従っている。
【０５０９】
改変抗体を、以下のように生成した。全長ヒト化抗ＤＬＬ３抗体ｈＳＣ１６．５６をコードする発現ベクターを、ＰＣＲ増殖および部位特異的変異誘発の鋳型として使用した。部位特異的変異誘発を、製造業者の指示書に従ってＱｕｉｃｋ−ｃｈａｎｇｅ（登録商標）システム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。
【０５１０】
ｈＳＣ１６．５６の変異Ｃ２２０Ｓ重鎖をコードするベクターを、ＣＨＯ−Ｓ細胞中で、天然全長カッパ軽鎖と同時トランスフェクションし、哺乳類一過性発現システムを使用して発現させた。Ｃ２２０Ｓ変異体を含む改変された抗ＤＬＬ３部位特異的抗体を、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１（配列番号８および９）と名付けた。過剰発現させた後、改変抗ＤＬＬ３抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより性質決定、正確な変異体が生成されていることを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのプレキャスト１０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅミニゲル上で、還元剤、例えば、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）の存在および不在下で実施した。電気泳動後、ゲルをクーマシーコロイド溶液で染色した。還元条件下、遊離ＬＣおよび遊離ＨＣに対応する２つのバンドを観察した（データ示さず）。このパターンは、還元条件のＩｇＧ分子に典型的である。非還元条件下では、バンドパターンは、ＨＣとＬＣとの間のジスルフィド結合の不在を示す天然ＩｇＧ分子とは異なる。ＨＣ−ＨＣダイマーに対応する約９８ｋＤのバンドが観察された。さらに、遊離ＬＣに対応するかすかなバンドと、ＬＣ−ＬＣダイマーに対応する約４８ｋＤの顕著なバンドが観察された。若干量のＬＣ−ＬＣ種の形成は、各ＬＣ上のＣ末端における遊離システインにより予測される。
【０５１１】
［実施例５］
抗ＤＬＬ３抗体のドメインおよびエピトープマッピング
本開示の抗ＤＬＬ３抗体が結合するエピトープを特徴づけ、位置づけるために、ドメインレベルエピトープマッピングを、Ｃｏｃｈｒａｎら、２００４（前掲）に記載されているプロトコールの修正版を使用して実施した。特定のアミノ酸配列を含むＤＬＬ３の個々のドメインを酵母の表面上で発現させ、各抗ＤＬＬ３抗体による結合をフローサイトメトリにより測定した。
【０５１２】
酵母ディスプレイプラスミド構築物を、以下の構築物の発現のために作製した：ＤＬＬ３細胞外ドメイン（アミノ酸２７−４６６）；Ｎ末端領域およびＤＬＬ３のＥＧＦ様ドメイン１−６（アミノ酸２２０−４６６）に融合したＤＬＬ１のＤＳＬドメイン（アミノ酸２２−２２５）からなる、ＤＬＬ１−ＤＬＬ３キメラ；Ｎ末端領域およびＤＬＬ１のＥＧＦ様ドメイン１−８（アミノ酸２２２−５１８）に融合したＤＬＬ３のＤＳＬドメイン（アミノ酸２７−２１４）からなる、ＤＬＬ３−ＤＬＬ１キメラ；ＥＧＦ１（アミノ酸２１５−２４９）；ＥＧＦ２（アミノ酸２７４−３１０）；ＥＧＦ１およびＥＧＦ２（アミノ酸２１５−３１０）；ＥＧＦ３（アミノ酸３１２−３５１）；ＥＧＦ４（アミノ酸３５３−３８９）；ＥＧＦ５（アミノ酸３９１−４２７）；ならびにＥＧＦ６（アミノ酸４２９−４６５）。ドメイン情報について、一般的には、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＮＹＪ７を参照。アミノ酸番号付けは、配列番号１に示されている配列に含まれるリーダー配列を有する非処理ＤＬＬ３タンパク質を参照することに注意されたい。全体としてのＮ末端領域またはＥＧＦドメインの解析のために、ファミリーメンバーＤＬＬ１を有するキメラ（ＤＬＬ１−ＤＬＬ３およびＤＬＬ３−ＤＬＬ１）を、タンパク質フォールディングに関する潜在的問題を最小限にするために断片に対立するものとして用いた。ドメインマップ抗体がＤＬＬ１と交差反応しないことが以前に示されたことから、これらの構築物への任意の結合が構築物のＤＬＬ３部分との会合により起こったことがわかる。これらのプラスミドを、酵母に形質転換し、次いで増殖させ、Ｃｏｃｈｒａｎらによって記載された通りに誘導した。
【０５１３】
特定の構築物に対する結合を試験するために、所望の構築物を発現する２００，０００個の誘導された酵母細胞を、ＰＢＳ＋１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ＰＢＳＡ）で２回洗浄し、５０μＬのＰＢＳＡ中で、０．１μｇ／ｍＬのビオチニル化抗ＨＡクローン３Ｆ１０（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）および５０ｎＭの精製抗体または７日間培養したハイブリドーマからの未精製上清の１：２希釈物のいずれかと共にインキュベートした。細胞を氷上で９０分間インキュベートした後、ＰＢＳＡで２回洗浄した。次いで細胞を５０μＬのＰＢＳＡ中で以下の適切な二次抗体と共にインキュベートした：マウス抗体については、Ａｌｅｘａ  ４８８コンジュゲートストレプトアビジンおよびＡｌｅｘａ  ６４７コンジュゲートヤギ抗マウス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をそれぞれ１μｇ／ｍＬで加え；ヒト化またはキメラ抗体については、Ａｌｅｘａ  ６４７コンジュゲートストレプトアビジン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＲ−フィコエリスリンコンジュゲートヤギ抗ヒト（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）をそれぞれ１μｇ／ｍＬで加えた。氷上で２０分間インキュベートした後、細胞をＰＢＳＡで２回洗浄し、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩで解析した。ＤＬＬ３−ＤＬＬ１キメラに結合した抗体を、Ｎ末端領域＋ＤＳＬに結合している抗体と呼んだ。特定のＥＧＦ様ドメインに存在するエピトープに特異的に結合する抗体を、この各ドメインに結合する抗体と呼んだ（図２）。
【０５１４】
エピトープを立体配座（例えば、不連続）または線形で分類するために、ＤＬＬ３  ＥＣＤをディスプレイしている酵母を、８０℃で３０分間加熱処理して、ＤＬＬ３  ＥＣＤを変性し、次いで氷冷ＰＢＳＡで２回洗浄した。変性酵母に結合する抗ＤＬＬ３抗体の能力は、上記と同じ染色プロトコールを用いてＦＡＣＳにより試験した。変性および天然酵母の両方に結合する抗体を線形エピトープに結合するものとして分類し、一方で、天然酵母に結合するが変性酵母に結合しない抗体を立体配座的特異的として分類した。
【０５１５】
試験した抗体のドメインレベルエピトープマッピングデータの図式要約を図２に示し、線形エピトープに結合した抗体を下線付きで、決定された場合、対応するビンを括弧内に示す。図２を参照すると、抗ＤＬＬ３抗体の大部分がＤＬＬ３またはＥＧＦ２のいずれかのＮ末端／ＤＳＬ領域に見出されるエピトープにマップされる傾向があったことがわかる。図２に様々な抗ＤＬＬ３抗体についてのビンの決定およびドメインマッピングに関する同様のデータを表形式で示す。
【０５１６】
ファインエピトープマッピングを、２つの方法のうちの１つを用いて、選択された抗体にさらに実施した。第１の方法では、製造業者の指示に従って用いたＰｈ．Ｄ．−１２ファージディスプレイペプチドライブラリキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた。エピトープマッピング用抗体を３ｍＬの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液、ｐＨ８中５０μｇ／ｍＬでＮｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ管（Ｎｕｎｃ）上に一晩被覆した。管を重炭酸ナトリウム溶液中３％のＢＳＡ溶液でブロックした。次いで、ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ−２０中１０１１個のインプットファージを結合させた後、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０で１０回連続洗浄して、非結合ファージを洗い流した。残存ファージを緩やかに撹拌しながら１ｍＬの０．２Ｍグリシンで室温で１０分間溶出した後、１５０μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９で中和した。溶出ファージを増幅し、選択厳密性を増大させるために洗浄中０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を用いて１０１１個のインプットファージを用いて再び洗浄した。第２ラウンドの溶出ファージの２４個のプラークからのＤＮＡをＱｉａｐｒｅｐ  Ｍ１３  Ｓｐｉｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、配列決定した。クローンファージの結合は、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて確認した。ここで、マッピングされた抗体または対照抗体をＥＬＩＳＡプレート上に被覆し、ブロックし、各ファージクローンに曝露した。ファージの結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗Ｍ１３抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および１−Ｓｔｅｐ  Ｔｕｒｂｏ  ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて検出した。Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、特異的に結合したファージのファージペプチド配列を抗原ＥＣＤペプチド配列に対してアラインメントして、結合するエピトープを決定した。
【０５１７】
代替的に、酵母ディスプレイ方法（Ｃｈａｏら、２００７、ＰＭＩＤ：１７４０６３０５）を用いて、選択された抗体のエピトープをマッピングした。ＤＬＬ３  ＥＣＤ変異体のライブラリを、ヌクレオチドアナログ８−オキソ−２’−デオキシグアノシン−５’−トリホスフェートおよび２’−デオキシ−ｐ−ヌクレオシド−５’トリホスフェート（ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏ）を使用して、クローンあたり１アミノ酸変異の標的変異誘発割合で、エラープローンＰＣＲを用いて生成した。これらを酵母ディスプレイ形式に変換した。ドメインレベルのマッピングについて上記の技術を使用して、ライブラリを、ＨＡおよび抗体結合に対して５０ｎＭで染色した。ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ＢＤ）を使用して、野生型ＤＬＬ３  ＥＣＤと比較して結合の喪失を示したクローンを選別した。これらのクローンを再増殖させ、標的抗体に対する結合の喪失について別ラウンドのＦＡＣＳ選別にかけた。Ｚｙｍｏｐｒｅｐ  Ｙｅａｓｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、個々のＥＣＤクローンを単離し、配列決定した。必要であれば、変異を、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して単一変異体ＥＣＤクローンに再編成した。
【０５１８】
次に、個々のＥＣＤクローンをスクリーニングし、結合の喪失がエピトープ中の変異によるものかまたはミスフォーディングを生じた変異によるものかを決定した。システイン、プロリンおよびストップコドンが関与する変異は、ミスフォーディング変異の可能性が高いために自動的に廃棄した。次いで残りのＥＣＤクローンを、非競合性の立体配座特異的抗体への結合についてスクリーニングした。非競合性の立体配座特異的抗体への結合が喪失したＥＣＤクローンは、ミスフォーディング突然変異を含むと結論され、一方で、野生型ＤＬＬ３  ＥＣＤと等価な結合を保持したＥＣＤクローンは、適切にフォールディングされていると結論された。後者のグループのＥＣＤクローン中の変異は、エピトープ中にあると結論された。
【０５１９】
抗体結合に関与するアミノ酸残基を含む誘導されたエピトープを有する選択された抗体のまとめを以下の表８に示す。抗体ＳＣ１６．３４およびＳＣ１６．５６は、図２に示すビニング情報およびドメインマッピング結果と一致する共通アミノ酸残基と相互作用する。さらに、ＳＣ１６．２３は、異なる隣接エピトープと相互作用することが見出され、ＳＣ１６．３４またはＳＣ１６．５６のファミリーに属さないことが見出された。添付の配列表の目的のために配列番号４は、２０４位におけるプレースホルダアミノ酸を含むことに注意されたい。
【０５２０】
【表８】
2018529656.tif 000038
【０５２１】
［実施例６］
ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）への抗ＤＬＬ３抗体のコンジュゲーション
ヒト化抗ＤＬＬ３抗体（ｈＳＣ１６．５６）およびヒト化部位特異的抗ＤＬＬ３抗体（ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１）を、遊離スルフヒドリル基を有する末端マレイミド部分を介してピロロベンゾジアゼピン薬物リンカー（それぞれＤＬ１およびＤＬ６、それぞれがＰＢＤ１を含む）にコンジュゲートさせ、ｈＳＣ１６．５６ＤＬ１およびｈＳＣ１６．５６ｓｓ１ＤＬ６と称するＡＤＣを作製した。ｈＳＣ１６．５６ＤＬ１（すなわち、ＳＣ１６ＬＤ６．５）およびｈＳＣ１６．５６ｓｓ１ＤＬ６は、臨床試験における使用が意図されていたので、ＧＭＰ条件下で製造された。
【０５２２】
ヒト化ＤＬＬ３（ｈＳＣ１６．５６）抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を、還元工程およびＰＢＤ１（ＤＬ１）をｈＳＣ１６．５６にコンジュゲートするためのコンジュゲーション工程の２つの異なる段階で調製した。次いでＡＤＣは、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーとそれに続く、原薬を製造するためのダイアフィルトレーションおよび製剤化工程により処理された。このプロセスを下記に詳細に説明する。
【０５２３】
抗体を、２００ｍＭのトリス塩基、３２ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ８．５を添加してｐＨ７．５に調整した。次いで、ｐＨ調整したＤＬＬ３抗体のシステイン結合を、抗体１ｍｏｌあたりトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の所定のモル数の添加により２０℃で９０分間部分的に還元させた。次いで、得られた部分還元調製物を、（上で示したように）２０℃で最低３０分間、マレイミドリンカーを介してＰＢＤ１とコンジュゲートした。次いで、水中で調製した１０ｍＭの原液を使用して、リンカー薬物と比較して過剰のＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を添加することにより、反応をクエンチした。最低２０分間クエンチした後、０．５Ｍの酢酸を添加してｐＨを５．５に調整した。次いで、ＡＤＣの調製物を、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーに供し、コンジュゲーション工程中に形成された凝集体を除去するための溶出工程を含む結合および溶出モードで処理した。次いで、ＣＥＸ精製ＡＤＣを、３０ｋＤａ膜を使用してダイアフィルトレーションによりダイアフィルトレーションバッファーにバッファー交換した。次いでダイアフィルトレーションした抗ＤＬＬ３  ＡＤＣを、ショ糖およびポリソルベート２０を用いて製剤化し、目的の最終濃度にして、原薬を製造した。
【０５２４】
部位特異的ヒト化抗ＤＬＬ３（ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１）ＡＤＣを、改変された部分還元プロセスを使用してＤＬ６とコンジュゲートした。これに関して、所望の生成物は、各ＬＣ定常領域上の不対システイン（Ｃ２１４）に最大限にコンジュゲートし、２より大きい（ＤＡＲ＞２）薬物対抗体比（ＤＡＲ）を有するＡＤＣを最小化する一方で、ＤＡＲが２の（ＤＡＲ＝２）ＡＤＣを最大化する、ＡＤＣである。コンジュゲーションの特異性をさらに改善するために、安定化剤（例えば、Ｌ−アルギニン）および穏やかな還元剤（例えば、グルタチオン）を含むプロセスを使用して抗体を選択的に還元し、この後、リンカー薬物を用いたコンジュゲーションを行った。次いでＡＤＣを分取疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、続いて、原薬を製造するためのダイアフィルトレーションおよび製剤化工程により処理した。このプロセスを下記で詳細に説明する。
【０５２５】
部位特異的抗体構築物を、１ＭのＬ−アルギニン／５ｍＭのＥＤＴＡを所定濃度の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）と共に含有するｐＨ８．０の緩衝液中で最低２時間、室温で部分的に還元させた。次いで全ての調製物を、３０ｋＤａ膜を用いて２０ｍＭのＴｒｉｓ／３．２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０バッファーへとバッファー交換し、還元バッファーを除去した。次いで、得られた部分還元調製物を、２０℃で最低３０分間、マレイミドリンカーを介してＰＢＤ１（上記で示したＤＬ６）とコンジュゲートした。次いで水中で調製した１０ｍＭの原液を使用して、リンカー薬物と比較して過剰のＮＡＣを添加することにより、反応をクエンチした。最低２０分間クエンチした後、０．５Ｍの酢酸を添加してｐＨを６．０に調整した。次いでｐＨ調整したＡＤＣを、分取疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）（ブチルセファロースＦＦ）によりＤＡＲ２種をさらに精製するための溶出工程を含む結合および溶出モードで処理した。次いで精製したＡＤＣを、３０ｋＤａ膜を用いてダイアフィルトレーションによりダイアフィルトレーションバッファーにバッファー交換した。次いでダイアフィルトレーションした抗ＤＬＬ３  ＡＤＣを、ショ糖およびポリソルベート２０を用いて製剤化し、目的の最終濃度にして、部位特異的原薬を製造した。
【０５２６】
［実施例７］
免疫組織化学
免疫組織化学（ＩＨＣ）を、原発性ヒト腫瘍組織切片に実施し、腫瘍細胞におけるＤＬＬ３の発現および位置を評価した。
【０５２７】
ＩＨＣ適合抗ＤＬＬ３抗体を同定するために、本発明の多数の抗ＤＬＬ３抗体を使用して、ＩＨＣをＨＥＫ２９３Ｔ親細胞ペレットまたはＤＬＬ３発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ペレットに実施した。いくつかのマウス抗ＤＬＬ３抗体（ＳＣ１６．６５）は、試験した本発明の他の抗ＤＬＬ３抗体よりも効果的にＤＬＬ３過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ペレットを特異的に検出することができた（データ示さず）。これらの抗体がＤＬＬ３を特異的に検出する能力を、関連抗ＤＬＬ３抗体を５ｘモル比の過剰のｈＤＬＬ３−Ｈｉｓタンパク質と混合し、次いでＤＬＬ３発現ＨＥＫ２９３Ｔホルマリン固定およびパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片と共にインキュベートする競合実験により確認した。陽性染色が存在しないことにより、ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓタンパク質が、ＤＬＬ３過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する抗ＤＬＬ３抗体の結合に干渉していることが実証された（データ示さず）。
【０５２８】
ＩＨＣを、下記に記載するように、当技術分野の標準であるホルマリン固定およびパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織に実施した。組織の平らな部分を切断し、顕微鏡スライドガラス上に載せた。キシレン脱パラフィン後、５μｍの切片を、抗原回収溶液（Ｄａｋｏ）を用いて９９℃で２０分間前処理し、７５℃に冷却し、次いで、０．３％過酸化水素を含むＰＢＳ、次いで、アビジン／ビオチンブロッキング溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処理した。この後、ＦＦＰＥスライドを、３％ＢＳＡを含むＰＢＳバッファー中１０％ウマ血清でブロッキンクし、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で１０μｇ／ｍｌに希釈した本発明の一次抗ＤＬＬ３抗体と共に室温で３０分間インキュベートした。ＦＦＰＥスライドを、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で２．５μｇ／ｍｌに希釈したビオチンコンジュゲート化ウマ抗マウス抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に室温で３０分間インキュベートした後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ  Ｋｉｔ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中でインキュベートした。次いで、原発性ヒト腫瘍のＦＦＰＥスライドを、ＴＳＡ増幅キット（ＴＳＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の製造業者の指示書に従って、ビオチニルトリアミド中、次いでストレプトアビジン−ＨＲＰ中でインキュベートした。発色性検出を、３，３’−ジアミノベンジジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて５分間、室温で展開させ、組織をＭｅｙｅｒヘマトキシリン（ＩＨＣ  Ｗｏｒｌｄ）で対比染色し、アルコールで洗浄し、キシレン中に浸漬した。ＰＤＸ腫瘍は、ＴＳＡ増幅を受けなかった。この後、切片を明視野観察法により観察し、腫瘍上皮上のＤＬＬ３膜発現をＨスコアにより記した。Ｈスコアは、式：３ｘ強く染色している膜状表面のパーセンテージ＋２ｘ中程度に染色している膜状表面のパーセンテージ＋弱く染色している膜状表面のパーセンテージにより得られ、０から３００の範囲となる。試験の結果を図３Ａおよび３Ｂに示す。
【０５２９】
図３Ａおよび３ＢにＤＬＬ３タンパク質の発現対全生存（ＯＳ）ならびに限定対広範ＳＣＬＣ腫瘍における（図３Ａ）または未処理腫瘍および化学療法不応性ＳＣＬＣ腫瘍におけるＤＬＬ３タンパク質の発現をグラフによって示す。図３Ａの実験により、ＤＬＬ３発現が全生存（従来技術の標準治療薬で治療した患者における）を示さず、限定ＳＣＬＣ腫瘍および広範ＳＣＬＣ腫瘍の両方がＤＬＬ３のレベルの変化を示すことがわかる。ＤＬＬ３発現が患者生存と逆相関したメラノーマと異なり、神経内分泌の特徴を示す腫瘍におけるＤＬＬ３発現が、標準治療療法に関して死亡を示すものでないと思われる。同様に図３Ｂは、ＤＬＬ３発現レベルが未処理腫瘍および標準治療腫瘍の両方でほぼ同じであることを示している。さらに図３Ｂは、３００ポイントスケール上の約９０（点線）および１８０（実線）の経験的に得られたＤＬＬ３  Ｈスコアを示す。９０と１８０との間の他のＤＬＬ３  Ｈスコア（例えば、１２０）も得られた（図示せず）。これらのＨスコアを実施例８に記載される第Ｉ相試験に従って検討したところ、本発明のＤＬＬ３  ＡＤＣによる治療に良好な反応を示し得る患者を示すことが見出された。したがって、一実施形態において、本発明のＤＬＬ３  ＡＤＣにより治療される患者は、少なくとも９０のＤＬＬ３  Ｈスコアを有する。他の実施形態において、本発明のＤＬＬ３  ＡＤＣにより治療される患者は、少なくとも１２０のＤＬＬ３  Ｈスコアを有する。さらに他の実施形態において、本発明のＤＬＬ３  ＡＤＣにより治療される患者は、少なくとも１５０のＤＬＬ３  Ｈスコアを有し、より好ましくは少なくとも１８０のＤＬＬ３  Ｈスコアを有する。本開示の目的のために、９０またはそれ以上のＤＬＬ３  Ｈスコアを示す任意の腫瘍（または、上記で議論したように、構成細胞の≧１０％がＤＬＬ３を発現する場合）は、ＤＬＬ３＋であり、本開示の化合物および組成物により潜在的に治療可能であるとみなされる。
【０５３０】
他の試験において２００ポイントスケールを有するＨスコアも開発されたことに注意されたい。このような２００Ｈスコアスケールにおいて、１２０のＨスコアは、３００Ｈスコアスケール上の１８０のＨスコアとほぼ同等である。両方の場合（例えば、１２０／２００または１８０／３００）において、このようなＨスコアを、バイオマーカー陽性（ＢＭ＋）またはＤＬＬ３＋（すなわち、これらの両方が３００ポイントスケール上の９０のＨスコアを上回り、および／または構成細胞の≧１０％がＤＬＬ３を発現する）と分類することができ、本発明の治療方法に良好な反応を示し得る患者を示唆する。
【０５３１】
［実施例８］
ＳＣ１６．５６ＰＢＤ１（ＳＣ１６ＬＤ６．５）試験の概要および結果
再発性小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）および大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）を有する患者を治療するための、本開示のＤＬＬ３標的化ＡＤＣを用いる可能性を探究するために第Ｉ相臨床試験を実施した。該臨床試験の概要を図４Ａに示す。
【０５３２】
背景：ロバルピツズマブ  テシリン（Ｒｏｖａｌｐｉｔｕｚｕｍａｂ  ｔｅｓｉｒｉｎｅ）（すなわち、Ｒｏｖａ−Ｔ、本明細書に記載されるＳＣ１６ＬＤ６．５、ｈＳＣ１６．５６ＰＢＤ１またはｈＳＣ１６．５６ＤＬ１）は、２の薬物対抗体比を有する、ヒト化モノクローナル抗体、ジペプチドリンカーおよびピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体毒素からなるデルタ様タンパク質３（ＤＬＬ３）標的化抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。ＳＣ１６ＬＤ６．５を、ＧＭＰ条件下で実施例６で示した通りに実質的に調製することができる。ＤＬＬ３は、ＳＣＬＣおよびＬＣＮＥＣ腫瘍の約３分の２を含む、ヒト神経内分泌腫瘍およびこれらの腫瘍開始細胞において、高度に発現する。ＤＬＬ３タンパク質は、正常組織において検出可能なレベルで発現しない。ロバルピツズマブ  テシリンは、腫瘍の退縮をもたらし、ＤＬＬ３発現ＳＣＬＣおよびＬＣＮＥＣ患者に由来する異種移植片（ＰＤＸ）腫瘍モデルにおける進行までの時間をシスプラチン／エトポシドより著しく延長する。この有望な活性に基づいて、再発性ＳＣＬＣを有する患者におけるヒトにおける最初の第Ｉ相試験（ＮＣＴ０１９０１６５３）を開始し、予備的結果を下記に報告する。
【０５３３】
方法：１回または２回の以前のラインの治療の後の進行性疾患を有する患者（すなわち、セカンドライン患者またはサードライン患者）が、用量制限毒性（ＤＬＴ）が認められるまで１−３例の患者コホートにおいて３週間毎（Ｑ３Ｗ）に１回の漸増用量の単剤としてのロバルピツズマブ  テシリンの投与を受けた。用量は、０．０５、０．１、０．２、０．４および０．８ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗであった。途中に得られた薬物動態データ（図４Ｂおよび下記実施例９により詳細に記載する）から、Ｑ６Ｗスケジュールの評価を促進する、約１１日という予想より長いＡＤＣの半減期が明らかにされた。先の実施例で述べたように、保管腫瘍試料における抗原の発現を評価するために、ＤＬＬ３抗体を開発し、利用した。本試験の目的のために、バイオマーカー陽性（ＢＭ＋）腫瘍を、ＩＨＣ膜関連Ｈスコア≧１２０（２００Ｈスコアスケール上）により定義した。
【０５３４】
結果：７９例の患者を治療した：３４  Ｑ３Ｗおよび４５  Ｑ６Ｗ；３３Ｆ／４６Ｍ；年齢中央値、６１歳（４４−８１）。血小板減少症の急性および慢性ＤＬＴならびに漿液性滲出液（毛細血管漏出症候群「ＣＬＳ」と第Ｉ相試験における研究者らによって誤って注釈がつけらけた専門家からなるデータモニタリング委員会による）がそれぞれ０．８および０．４ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗで認められた。０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗｘ３サイクルおよび０．３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ６Ｗｘ２サイクルの最大耐容量（ＭＴＤ）を拡大コホートにおいてさらに評価した。全ての患者におけるあらゆるグレードの最も一般的な（≧２０％）治療で発生したＡＥは、疲労（４７％）、呼吸困難（２４％）、悪心（２４％）および食欲不振（２２％）であった。最も一般的な関連性のある治療で発生したＳＡＥは、それぞれ１１例（１４％）および３例（３％）の患者において報告された、漿液性滲出液および血小板減少症であった（図４Ｆ）。
【０５３５】
登録患者から受け取った４９個の保管腫瘍試料のうち、３４個（６９％）がＤＬＬ３  ＢＭ＋であった。ＭＴＤで治療された２７例の確認されたＤＬＬ３  ＢＭ＋患者のうち、１１例の患者（４１％）が部分奏効（ＰＲ）を有し、１２例の患者（４４％）が８５％の複合臨床的有用率（ＣＢＲ）の安定疾患（ＳＤ）を達成した（図４Ｅ）。ＤＬＬ３バイオマーカー状態を考慮せずにＭＴＤで治療された全ての評価可能な患者（ｎ＝５９）において、ＯＲＲは２０％（ｎ＝１２ＰＲ）および８０％のＣＢＲで、ＳＤ５９％（ｎ＝３５）であった（図４Ｄ）。注目すべきことに、ＭＴＤで治療されたＰＲを有する全ての患者、および最も持続性の臨床ベネフィットを有する患者（最大５６９日ＯＳ）は、ＢＭ＋であった。第一選択療法に対して感受性および不応性で、標準治療が現在存在しない第三選択の状況にある患者において類似の反応率が認められた。
【０５３６】
興味深いことに、ＡＤＣへの同様の全曝露にもかかわらず、０．３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ６Ｗｘ２は、０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗｘ３コホートと比較した場合に優れた反応持続時間を示し（図４Ｃ）、それぞれ平均で＞１７５日対８８日であった。図４Ｃは、同じ０．３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ６Ｗｘ２コホートは、０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗｘ３コホートより良好な平均ＯＳを有していたことをさらに示す。
【０５３７】
結論：ファーストインクラスのＤＬＬ３標的化ＡＳＣであるロバルピツズマブ  テシリン（Ｒｏｖａ−Ｔ）は、管理可能な毒性を有し、再発性ＤＬＬ３  ＢＭ＋  ＳＣＬＣを有するセカンドライン患者およびサードライン患者において単剤として有意な抗腫瘍活性（４１％ＯＲＲおよび８０％ＣＢＲ）を有することを実証した。
【０５３８】
［実施例９］
ＳＣ１６．５６ＰＢＤ１（ＳＣ１６ＬＤ６．５）の薬物動態
先の実施例で言及したように、ＳＣ１６ＬＤ６．５の薬物動態（ＰＫ）を上述の第１ａ／１ｂ相臨床試験において評価した。ヒト血清中のＳＣ１６ＬＤ６．５の濃度を、ＳＣＬＣまたはＬＣＮＥＣを有する患者への予め規定された用量のＳＣ１６ＬＤ６．５の投与後に評価した。血清レベル用の血液試料は、試験に参加した全ての対象からＳＣ１６ＬＤ６．５の対象への最初の投与の直前および１日目の複数の時点（１日目は注入の当日である）に採取した。血清測定用の追加の血液をサイクル１の２、３、５、８および１５日目にそれぞれ１回採取した。サイクル２および３において、１日目における注入の直前（トラフ）および後（ピーク）に血液を採取した。推定された定常状態時またはこの近くにおいて（サイクル４）、追加の試料を１、８および１５日目に採取した。血液の採取後に、試料を血清まで処理し、凍結した。
【０５３９】
ＳＣ１６ＬＤ６．５の血清濃度を、ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォーム上の化学発光検出による酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で測定した。このアッセイでは、１つ以上のコンジュゲート毒素を有するＳＣ１６ＬＤ６．５を特異的に捕捉し、検出する抗イディオパシック抗体の対を用いた。このアッセイは、ＳＣ１６ＬＤ６．５上の毒素コンジュゲートの数を識別することはできない。これらの測定濃度に基づいて濃度−時間プロファイルを作成した（図４Ｂ）。
【０５４０】
ＳＣ１６ＬＤ６．５の血清濃度に基づいて、ソフトウェアパッケージＰｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎを用いて非コンパートメント分析によりＳＣ１６ＬＤ６．５のＰＫを推定した。ＰＫは、曝露の用量比例的増加に対して線形であった。終末相半減期は、終末速度係数（ラムダ）を決定するための濃度−時間プロファイルの終末相の対数線形回帰により推定した。２の自然対数とラムダとの比率を計算して、終末相半減期を推定した。ＳＣ１６ＬＤ６．５の終末相半減期は、３週間ごとの０．２ｍｇ／ｋｇのＳＣ１６ＬＤ６．５の投与後に約１０．１日、６週間ごとの０．３ｍｇ／ｋｇのＳＣ１６ＬＤ６．５の投与後に約１２．１日と推定された。この推定半減期は、ブレンツキシマブベドチンおよびトラスツズマブエムタンシン（ａｄｏ−ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）のような他の抗体薬物コンジュゲートの推定半減期を超えている。このような予期しないほど長い半減期は、新規の投与レジメン（例えば、０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗｘ３および０．３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ６Ｗｘ２）を用いて着実な治療指数を達成することを可能にする。
【０５４１】
［実施例１０］
抗ＤＬＬ３  ＡＤＣの凍結乾燥
長期保存およびその後の商業活動の選択肢を用意するために、本発明の例示的ＤＬＬ３−ＡＤＣを凍結乾燥した。次いで、医薬として適合するバイアル中で保存された凍結乾燥試料を用いて安定性試験を行って、ＰＢＤを含むＡＤＣへの技術の適用可能性を判定した。ＰＢＤ薬物リンカーコンジュゲートは、大きく、比較的疎水性であるので、長期安定性を示すこのような凍結乾燥組成物を提供し得るかどうかは、不明であった。
【０５４２】
本試験のために、ＳＣ１６ＬＤ６．５抗体薬物コンジュゲート調製物（上記の実施例６で示した通りに実質的に調製した）を１０ｍｇ／ｍＬのＳＣ１６ＬＤ６．５、１７５ｍＭのショ糖、２０ｍＭのＬ−ヒスチジン塩酸塩（ｐＨ６．０）および０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０で製剤化した。この例示的製剤は、第Ｉ／ＩＩ相臨床試験の意図される条件である−７０℃の凍結液体として長期保存に適し、適切な条件下で凍結乾燥形態で潜在的に安定であるので選択した。同じ製剤を用いた冷蔵条件（２−８℃）下での保存を目的とした凍結乾燥剤形（３０ｍｇ／バイアル、１０ｍＬガラスバイアル中約３ｍＬ）を後の臨床試験および潜在的な商業的使用のために開発した。
【０５４３】
凍結乾燥プロセスおよび条件は、開発規模凍結乾燥機を用いて得られた。プロセスは、次の工程：凍結ランプ、凍結ホールド、一次乾燥および二次乾燥を含む。このプロセスを用いて、臨床材料の製造を目的とした装置において凍結乾燥バイアルのバッチを製造した。凍結乾燥後に、粉末状ＤＬＬ３−ＡＤＣを含む栓付きバイアルを種々の温度（５℃、２５℃および４０℃）で長期間保存した。所定の時点に選択されたバイアルを再構成し、得られた製剤を出発製剤からの何らかの材料の逸脱について分析した。６カ月までの時点の分析の結果を図５Ａ−５Ｃに示す。
【０５４４】
データを参照すると、凍結乾燥ＡＤＣが選択された温度のいずれにおいても劣化をほとんど示さなかったことが実証されている。したがって、開発規模で製造された凍結乾燥バイアルは、実時間、ストレスおよび加速保存条件下で安定であることが実証された。
【０５４５】
［実施例１１］
インビボでの小細胞肺がんの腫瘍成長を抑制する抗ＤＬＬ３  ＡＤＣおよび抗ＰＤ−１抗体の併用
上記で議論したように、本発明のＤＬＬ３  ＡＤＣを、様々なＤＬＬ３発現腫瘍を効果的に治療するために抗ＰＤ−１抗体と併用することができる。本発明の治療能力を実証するために、ｈＳＣ１６．５６ＤＬ１（Ｒｏｖａ−Ｔ）を、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）の同系インビボモデルにおいてＰＤ−１とこのリガンドＰＤＬ１との間の相互作用を阻害する抗ＰＤ−１抗体と併用して試験した。
【０５４６】
Ｒｏｖａ−Ｔは、本出願において実証されたように、臨床状況においてＳＣＬＣに対する活性を示したＤＬＬ３特異的抗体薬物コンジュゲートである。活性化Ｔ細胞上に主として発現するＰＤ−１とこのリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２との間の相互作用を阻害する、ＰＤ−１に対する抗体は、多くのがん適応における臨床的有用性を示した。現在、抗ＰＤ−１抗体薬物Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）（ニボルマブ）およびＫｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）（ペンブロリズマブ）は、メラノーマ、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮がんおよびホジキンリンパ腫を有する特定の患者における使用について承認されているが、ＳＣＬＣを有する患者のサブセットにおいてもある程度の活性が実証された。併用して用いた場合にＲｏｖａ−Ｔおよび抗ＰＤ−１抗体が抑制、中性、相加または相乗効果を有するかどうかを判定するために、単剤としてのおよび併用したこれらの活性をＳＣＬＣの動物モデルにおいて試験した。
【０５４７】
抗ＰＤ−１抗体の作用機序が免疫適格性の宿主を必要とするので、ＤＬＬ３発現マウス細胞株ＫＰ１を免疫適合性同系マウスと共に用いた。ＫＰ１細胞株は、ＲＢ１およびＴＰ５３遺伝子を欠くマウスの肺に見出された自発小細胞肺がんから得られた（ＰＭＩＤ：２１９８３８５７）。Ｒｏｖａ−Ｔは、ヒトおよびマウスＤＬＬ３タンパク質に同等の親和性で結合することができ、インビトロでＤＬＬ３発現細胞に対して細胞毒性活性を有するため、薬物をマウスモデルにおいて用いることができる。しかし、ニボルマブもペンブロリズマブもマウスＰＤ−１と十分に相互作用しないので、抗マウスＰＤ−１代用抗体クローンを選択した。これに関して、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）からの抗マウスＰＤ−１抗体クローンＥＨ１２．２Ｈ７は、臨床状況で使用される抗ヒト抗体と同様に、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を阻害し、これらのＴ細胞増強および抗がん活性を模倣することが示された。
【０５４８】
ＫＰ１細胞を、Ｂ６１２９ＳＦ１／Ｊマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＃１０１０４３、ＵＳＡ）の側腹部における皮下腫瘍として成長させた。腫瘍体積は、キャリパーで週２回測定した。平均腫瘍体積が約２００ｍｍ３であった場合、マウスを各５匹のマウスのコホートに無作為化した。腹腔内注射により、マウスをＳＣ１６ＬＤ６．５（「Ｒｏｖａ−Ｔ」、０．１ｍｇ／ｋｇ、１日目の治療のみ）またはＨｕＩｇＧ１．ＤＬ１（「ＨｕＩｇＧ１．ＰＢＤ」、０．５ｍｇ／ｋｇ、１日目の治療のみ）のいずれかにより治療し、同じマウスを抗マウスＰＤ−１抗体（「抗ＰＤ−１」２００μｇ／マウス、１、３、７日目に治療；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ）またはラットＩｇＧ２ａ抗体（「Ｒａｔ  ＩｇＧ２ａ」、２００μｇ／マウス、１、３、７日目に治療；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ）のいずれかによっても治療した。腫瘍体積を週２回測定し続け、腫瘍体積が１５００ｍｍ３を超えたとき、マウスを安楽死させた。試験の結果を本明細書に添付した図６Ａおよび６Ｂに示す。
【０５４９】
図６Ａに示すように、抗ＰＤ−１抗体およびＨｕＩｇＧ１．ＰＢＤ対照の併用は、ＫＰ１腫瘍成長を有意に抑制しなかった。同様に、Ｒａｔ  ＩｇＧ２ａ（抗ＰＤ−１のアイソタイプ対照）とＨｕＩｇＧ１．ＰＢＤ対照またはＲｏｖａ−Ｔの併用は、かなりの時間にわたりインビボでＫＰ１腫瘍の成長を実質的に抑制しない（図６Ａ）。遅延は広範でなかったが、これらの投与量ではＲｏｖａ−Ｔが本質的に単剤として作用し、腫瘍成長のある程度の抑制を明らかに示したことが理解される。
【０５５０】
同様に、図６Ｂに示すように、対照治療ＨｕＩｇＧ１．ＰＢＤ＋Ｒａｔ  ＩｇＧ２ａおよびＨｕＩｇＧ１．ＰＢＤ＋抗ＰＤ−１併用は、ＫＰ１腫瘍体積が３００ｍｍ３を超えて成長するまでの時間を実質的に延長しなかった。さらに、図６Ｂに示す用量では、Ｒｏｖａ−Ｔ＋アイソタイプ対照（Ｒａｔ  ＩｇＧ２ａ）併用は、ＨｕＩｇＧ１．ＰＢＤによる治療と比較してＫＰ１腫瘍成長を有意に抑制しない。Ｒｏｖａ−Ｔ（ｈＳＣ１６．５６ＤＬ１）は、唯一の活性剤として本質的に作用して、０．５ｍｇ／ｋｇの用量でＫＰ１腫瘍を完全に除去する（データ示さず）が、０．１ｍｇ／ｋｇの比較的低い用量は、この腫瘍細胞株に対してほとんど効果を示さない。
【０５５１】
対照併用と極めて対照的に、併用したＲｏｖａ−Ｔおよび抗ＰＤ−１抗体による治療は、２つの活性剤いずれかの単独による治療と比較して、インビボでのＫＰ１腫瘍成長の有意な抑制をもたらした（図６Ａおよび６Ｂ）。図６Ａおよび６Ｂの両方に示すように、平均腫瘍成長は、高度に遅延した。併用対照治療群の全てのマウスが１７日後に３００ｍｍ３より大きい腫瘍を有していたが、５匹のうちの２匹のみ（４０％）の併用群マウスが３００ｍｍ３より大きい腫瘍を有していた（図６Ｂ）。同様に、図６Ａは、Ｒｏｖａ−Ｔおよび抗ＰＤ−１抗体により治療したマウスにおける平均腫瘍体積は、Ｒｏｖａ−Ｔ＋アイソタイプ対照治療マウスの２倍を超える期間にわたり１０００ｍｍ３未満に留まっていたことを示している。さらに、Ｒｏｖａ−Ｔ＋抗ＰＤ−１により治療した群の腫瘍成長抑制パーセンテージの中央値（最小測定治療後腫瘍体積が開始腫瘍体積より小さかったパーセンテージ）は、６９％であったのに対して「ＨｕＩｇＧ１．ＰＢＤ＋Ｒａｔ  ＩｇＧ２ａ」治療群で０％、「ＨｕＩｇＧ１．ＰＢＤ＋抗ＰＤ−１」治療群で０％、「Ｒｏｖａ−Ｔ＋Ｒａｔ  ＩｇＧ２ａ」治療群で０％であった。この腫瘍成長抑制データは、ＤＬＬ３  ＡＤＣおよび抗ＰＤ−１抗体の併用は、実際に相乗的であり得ることを強く示唆する。
【０５５２】
いずれにしてもこの実施例に示すデータは、ＤＬＬ３  ＡＤＣと抗ＰＤ−１抗体との併用が腫瘍体積を減少させ、腫瘍保有マウスの長く持続する生存を促進することによってＳＣＬＣに対する、相乗的効果でないとしても、少なくとも相加的効果を実証することを明確に示す。抗ＰＤ−１抗体と併用したアイソタイプＰＢＤ  ＡＤＣによる治療がビヒクル対照に対して有効性の改善を示さないことから、観察された効果は、特異的であり、Ｒｏｖａ−ＴによるＤＬＬ３の認識に依存する。Ｒｏｖａ−Ｔと併用したアイソタイプ対照Ａｂが同じ結果を示さないことから、測定された効果は、少なくとも一部は、ＰＤ−１結合および阻害にも起因する。
【０５５３】
まとめると、提示したデータは、Ｒｏｖａ−ＴによるＤＬＬ３発現がんの標的化細胞の殺傷が、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１抗体の使用を含む免疫療法を含む、免疫療法の効果をさらに増大させ得ることを示している。
【０５５４】
本明細書で引用されている全ての特許、特許出願、および出版物、ならびに電子工学的に利用可能な資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおけるヌクレオチド配列提出物、ならびに例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＢＤにおけるアミノ酸配列提出物ならびにＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおける注釈の付されたコード領域からの翻訳物を含む）の完全な開示は、参照により組み込まれる。前述の詳細な説明および実施例は、理解を明確にするためにのみ提供される。それによって不必要に限定されないことが理解されるものとする。当業者に明らかな変形が特許請求の範囲によって定義された本発明に含まれることから、本発明は、示され、記載されている正確な詳細に限定されない。
【図１Ａ−１】
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【図１Ａ−２】
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【図１Ａ−３】
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【図１Ａ−４】
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【図１Ａ−５】
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【図１Ａ−６】
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【図１Ｂ−１】
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【図１Ｂ−２】
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【図１Ｂ−３】
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【図１Ｂ−４】
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【図１Ｂ−５】
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【図１Ｂ−６】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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