(57)【要約】  本発明はテルペンの微生物利用製造に関する。テルペンの微生物利用製造の公知方法のほとんどは糖の直接変換に基づく。したがって、テルペンの微生物利用製造に使用される代替物質、特に代替炭素源を得ることが望ましかった。本発明は、メチロトローフ細菌における異種発現のための酵素活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする組換えDNAを含有するメチロトローフ細菌であり、酵素活性を有する前記の少なくとも1つのポリペプチドは、異種メバロン酸経路の酵素、異種テルペンシンターゼ、および所望により、プレニル二リン酸前駆体の異種シンターゼからなる群から選択される。本発明はまた、特に、メタノールおよび／またはエタノールからのセスキテルペンまたはジテルペンのデノボ微生物利用合成のための方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種テルペンシンターゼと、メチロトローフ細菌における発現のための酵素活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする組換えDNAとを含有する該メチロトローフ細菌であって、前記酵素活性を有する少なくとも1つのポリペプチドが、
ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMG-CoAシンターゼ）、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ（HMG-CoAレダクターゼ）、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ピロホスホメバロン酸デカルボキシラーゼおよびイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼからなる群から選択される異種メバロン酸経路の酵素の少なくとも1つ、ならびに
プレニル二リン酸前駆体のシンターゼ
からなる群から選択されることを特徴とする、メチロトローフ細菌。
【請求項２】
異種メバロン酸経路の酵素としての異種ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMG-CoAシンターゼ）およびヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ（HMG-CoAレダクターゼ）と、メチロトローフ細菌における発現のための酵素活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする組換えDNAとを含有する該メチロトローフ細菌であって、前記酵素活性を有する少なくとも1つのポリペプチドが、
メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ピロホスホメバロン酸デカルボキシラーゼおよびイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼからなる群から選択される異種メバロン酸経路の別の酵素の少なくとも1つ、
異種テルペンシンターゼ、ならびに
プレニル二リン酸前駆体のシンターゼ
からなる群から選択される、メチロトローフ細菌。
【請求項３】
異種メバロン酸経路の酵素の少なくとも1つが、それぞれ対応して、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号6のペプチド配列に対して、少なくとも60%の同一性を有するペプチド配列を含有することを特徴とする、請求項１または２記載の細菌。
【請求項４】
異種テルペンシンターゼが、セスキテルペンシンターゼおよびジテルペンシンターゼからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか1項に記載の細菌。
【請求項５】
異種テルペンシンターゼがセスキテルペンシンターゼであり、ここで、セスキテルペンシンターゼが環状セスキテルペンの合成のための酵素であり、該セスキテルペンが、特に、α-フムレンおよびサンタレンのエピマー、例えばα-サンタレン、β-サンタレン、エピ-β-サンタレンまたはα-エキソ-ベルガモテン、およびビサボレン、例えばb-ビサボレンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項４記載の細菌。
【請求項６】
異種テルペンシンターゼがジテルペンシンターゼ、特に、ジテルペンの合成のための酵素であり、該ジテルペンが、特に、スクラレオール、シス-アビエノール、アビタジエン、イソピマラジエン、マヌールおよびラリクソールからなる群から選択されることを特徴とする、請求項４記載の細菌。
【請求項７】
プレニル二リン酸前駆体のシンターゼが、ファルネシル二リン酸シンターゼ（FPPシンターゼ）およびゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（GGPPシンターゼ）からなる群から選択される酵素であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか1項に記載の細菌。
【請求項８】
プレニル二リン酸前駆体のシンターゼが異種FPPシンターゼであり、ここで、異種FPPシンターゼが真核生物または原核生物異種FPPシンターゼであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか1項に記載の細菌。
【請求項９】
プレニル二リン酸前駆体のシンターゼが異種GGPPシンターゼであり、ここで、異種GGPPシンターゼが、細菌、植物または真菌からなる群から選択される生物に由来する酵素であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか1項に記載の細菌。
【請求項１０】
該酵素の異種発現のための組換えDNAに、共通の誘導性プロモーターまたは幾つかの相互非依存的誘導性プロモーターが付与されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか1項に記載の細菌。
【請求項１１】
組換えDNAが、各場合において、プラスミド上または染色体において相互非依存的に発現可能であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか1項に記載の細菌。
【請求項１２】
細菌がメチロトローフプロテオバクテリア、特に、Methylobacterium属またはMethylomonas属の細菌、好ましくは、Methylobacterium extorquensであることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか1項に記載の細菌。
【請求項１３】
細菌が、カロテノイド生合成活性を欠く株、特に、ジアポリコペンオキシダーゼ活性を欠く株であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか1項に記載の細菌。
【請求項１４】
以下の工程、すなわち、
メタノールおよび／またはエタノール含有水性培地を準備し、
請求項１〜１３のいずれか1項に記載のメチロトローフ細菌をバイオリアクター内の該培地内で培養し、ここで、メタノールおよび／またはエタノールが該細菌によりテルペンに変換され、
バイオリアクター内で生じたセスキテルペンまたはジテルペンを分離することを含む、
メタノールおよび／またはエタノールからのセスキテルペンまたはジテルペンのデノボ微生物利用合成のための方法。
【請求項１５】
メタノールおよび／またはエタノールが、該細菌を培養するための唯一の炭素源として該培地内に含有されることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
メタノールおよび／またはエタノールからのセスキテルペンまたはジテルペンのデノボ微生物利用合成のために請求項１〜１３のいずれか1項に記載の組換えメチロトローフ細菌を培養するための、メタノールおよび／またはエタノール含有培地の使用。
【請求項１７】
メタノールおよび／またはエタノールからのセスキテルペンまたはジテルペンのデノボ微生物利用合成のための、請求項１〜１３のいずれか1項に記載のメチロトローフ細菌の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチロトローフ細菌、メタノールおよび／またはエタノールからのセスキテルペンまたはジテルペンのデノボ（de novo）微生物利用（microbial）合成のための方法、ならびにメタノールおよび／またはエタノールからのテルペンのデノボ微生物利用合成のためのメチロトローフ細菌の使用に関する。本発明はホワイトバイオテクノロジーの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
芳香物質、香料および化粧品物質ならびにバイオ燃料物質の製造のための、環境に優しい可能性を秘めたテルペンの微生物利用合成は、種々の微生物、例えばEscherichia coli（大腸菌）またはSaccharomyces cerevisiaeに関して既に記載されている（Martinら, 2003, Nature Biotechnology 21, 796-802; Asadollahiら, 2008, Biotechnology and Bioengineering 99, 666-677; Chandranら, 2011, Process Biochemistry 46, 1703-1710）。これらにおける相当な成長の可能性は今後何年かにおける微生物利用テルペン製造によるものであり、これは、とりわけ、環境に優しい化学物質合成の必要性と共に化石資源の不足および世界人口の増加によるものである（Peralta-Yahyaら, 2010, Biotechnol J 5, 147-62; Ajikumarら, 2008, Molecular pharmaceutics 5, 167-90）。
【０００３】
テルペンの微生物利用製造のための公知方法のほとんどは、糖、特にグルコース、または食糧生産と競合する基質、例えばグリセリン、または複合基質、例えばタンパク質加水分解産物の直接変換に基づく（Yoonら, 2009, Journal of Biotechnology, 140, 218-226; Sarriaら, 2014, ACS Synthetic Biology 3 (7), 466-475）。バイオテクノロジーのための基質としてのそのような物質の利用は種々の欠点を伴い、これらは、倫理的な要素だけでなく、とりわけ、将来において変動する、そして恐らくは増加する物価水準、ならびに地域的および季節的要因に関するものである。更に、複合培地または糖含有培地の使用は産物処理および無菌要件におけるコストの増加を常に伴う。したがって、可能な限り多数の前記欠点を補う代替基質、特に代替炭素源がバイオテクノロジーにおける使用に望ましい。
【０００４】
テルペン、特にアモルファ-4,11-ジエン、またはテルペン混合物の微生物利用製造はUS 2008/0274523 A1に記載されている。しかし、これによれば、単糖グルコースが炭素源として使用されている。特に、該発酵のための代替炭素源はそれには記載されていない。更に、US 2008/0274523 A1によれば、アセトアセチル-CoAシンターゼ（アセトアセチル-CoAチオラーゼ）の異種発現が必要である。
【０００５】
US 2003/0148479 A1によれば、大腸菌（E. coli）におけるイソペンテニルピロホスファート（IPP）の微生物利用生合成が提示されており、この場合、培養はLB培地内で行われる。これにおいてはアセトアセチル-CoAシンターゼ（アセトアセチル-CoAチオラーゼ）の異種発現が必要であり、更に、メバロン酸経路の種々の中間体が培地に添加された。該発酵のための代替炭素源は提示されていない。
【０００６】
US 2011/0229958 A1は大腸菌（E. coli）におけるイソプレン化合物の製造のための微生物を示している。アセトアセチル-CoAシンターゼ（アセトアセチル-CoAチオラーゼ）の異種発現がこの場合も必要であり、メバロナートが培地に添加された。該発酵のための安価な代替炭素源は提示されていない。
【０００７】
WO 2014/014339 A2においては、モノテルペン合成のための組換えRhodobacter宿主細胞が記載されている。炭素源としては、それほど詳細には特徴づけられていない糖が提示されている。該発酵のための代替炭素源は記載されていない。
【０００８】
モノテルペンであるゲラン酸の、Pseudomonas putidaにおけるデノボ製造が提示されている（Miら, 2014, Microbial Cell Factories 13:170）。しかし、これによれば、LB含有培地におけるグリセリンのみが炭素源として使用されている。特に、該発酵のための代替炭素源はそれにおいては提示されていない。
【０００９】
複合培地の使用、または組成が適切に特徴づけられていない培地の使用は、所望の産物の簡便かつ安価な後処理を妨げる。
【発明の概要】
【００１０】
したがって、第1の態様による本発明の目的は、テルペンの生合成に関する公知組換え微生物の欠点を克服することにある。本発明のもう1つの態様においては、代替炭素源からのテルペンのデノボ微生物利用合成を可能にする細菌を提供すべきである。この場合、該細菌は、理想的には、唯一の炭素源としての代替炭素源において増殖可能であるべきであり、特に、コスト集約的基質添加剤、例えばアセト-アセタートまたはD,L-メバロナートの添加は不要であるべきである。もう1つの態様においては、得られたテルペン産物の簡便な下流精製を可能にする代替炭素源からのテルペンのデノボ微生物利用合成のための発酵方法を提供すべきである。特に、セスキテルペンおよびジテルペンが高収率で製造可能であるべきである。もう1つの態様においては、振とうフラスコ、そしてまた、バイオテクノロジー用途のための大規模な発酵槽の両方における該方法の変換および収率は非常に有望または適度なものであるべきである。
【００１１】
そのような課題は、特許請求の範囲および以下に記載されている実施形態によって解決される。
【００１２】
本発明の第1実施形態は、メチロトローフ細菌における発現のための酵素活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする組換えDNAを含有するメチロトローフ細菌であって、酵素活性を有する前記の少なくとも1つのポリペプチドが、
・ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMG-CoAシンターゼ）、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ（HMG-CoAレダクターゼ）、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ピロホスホメバロン酸デカルボキシラーゼおよびイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼからなる群から選択される異種メバロン酸経路の酵素の少なくとも1つ、
・異種テルペンシンターゼ、ならびに
・プレニル二リン酸前駆体のシンターゼ
からなる群から選択される、メチロトローフ細菌に関する。
【００１３】
特に、本発明はまた、異種テルペンシンターゼと、メチロトローフ細菌における発現のための酵素活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする組換えDNAとを含有するメチロトローフ細菌であって、酵素活性を有する前記の少なくとも1つのポリペプチドが、
・ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMG-CoAシンターゼ）、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ（HMG-CoAレダクターゼ）、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ピロホスホメバロン酸デカルボキシラーゼおよびイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼからなる群から選択される異種メバロン酸経路の酵素の少なくとも1つ、ならびに
・プレニル二リン酸前駆体のシンターゼ
からなる群から選択されることを特徴とする、メチロトローフ細菌に関する。
【００１４】
同様に、本発明はまた、異種メバロン酸経路の酵素としての異種ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMG-CoAシンターゼ）およびヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ（HMG-CoAレダクターゼ）と、メチロトローフ細菌における発現のための酵素活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする組換えDNAとを含有するメチロトローフ細菌であって、酵素活性を有する前記の少なくとも1つのポリペプチドが、
・メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ピロホスホメバロン酸デカルボキシラーゼおよびイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼからなる群から選択される異種メバロン酸経路の別の酵素の少なくとも1つ、
・異種テルペンシンターゼ、ならびに
・プレニル二リン酸前駆体のシンターゼ
からなる群から選択される、メチロトローフ細菌に関する。
【００１５】
特に好ましくは、本発明の細菌は、少なくとも、以下の酵素、すなわち、
・異種ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMG-CoAシンターゼ）およびヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ（HMG-CoAレダクターゼ）、ならびにメバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ピロホスホメバロン酸デカルボキシラーゼおよびイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼからなる群から選択される少なくとも1つの酵素、そして特に好ましくは、全てのこれらの酵素、ならびに
・異種テルペンシンターゼ
を含有する。
【００１６】
最も好ましくは、該細菌は更に、プレニル二リン酸前駆体のシンターゼをも含有する。
【００１７】
本発明の意図においては、「異種」は、本発明においては生物が含有することになる酵素または酵素群であって、天然では該生物には存在しない酵素または酵素群、例えばメバロン酸経路のものを意味すると理解されるべきである。したがって、異種テルペンシンターゼまたは異種メバロン酸経路の酵素は本発明のメチロトローフ細菌には元来存在せず、むしろ1以上の他の種から誘導されるべきものである。
【００１８】
本発明の細菌は、驚くべきことに、代替炭素源、例えばメタノールおよび／またはエタノールからのテルペンのデノボ微生物利用合成を可能にする。該細菌は、異種発現しなければこの細菌に天然には存在しないメバロン酸経路（MVA経路）酵素の異種発現により、唯一の炭素源としてのメタノールおよび／エタノール上で増殖し、所望のテルペンをデノボで高収率で合成しうる。
【００１９】
使用されるメチロトローフ細菌の顕著な特徴は、一次代謝、本発明においてはエチルマロニル-CoA経路（EMCP）におけるアセトアセチル-CoA分子の存在にある。アセトアセチル-CoAはメバロン酸経路における最初の分子である。本発明の組換えメチロトローフ細菌の生存能は、予想することが全く不可能であった。したがって、一次代謝の代謝産物を除去すると、相当な流動不均衡が推定されうることは確かである。この点において、異種発現しなければこの細菌に天然には存在しないメバロン酸経路の異種発現酵素の少なくとも1つによる本発明の細菌の、メタノールおよび／またはエタノール上での増殖は、驚くべきものである。更に、一次代謝におけるアセトアセチル-CoA分子の存在は、アセトアセチル-CoAシンターゼの異種発現を余分で不必要なものにする。本発明のもう1つの好ましい修飾においては、該メチロトローフ細菌は、アセトアセチル-CoAシンターゼ（アセトアセチル-CoAチオラーゼ）の異種発現をコードする組換えDNAを含有しない。
【００２０】
本発明の意図におけるプレニル二リン酸前駆体のシンターゼは特に、イソペンテニル二リン酸（IPP）およびジメチルアリル二リン酸（DMAPP）をプレニル二リン酸前駆体へと酵素的に変換し、ここで、プレニル二リン酸前駆体は、好ましくは、ファルネシル二リン酸（FPP）（C15）およびゲラニル-ゲラニル二リン酸（GGPP）（C20）からなる群から選択される。
【００２１】
形成される非環状プレニル二リン酸（本明細書においてはイソプレニル二リン酸と同義）（FPPおよびGGPP）は多数のテルペンの前駆体である。異種テルペンシンターゼの基質は、好ましくは、前記プレニル二リン酸前駆体から選択される。
【００２２】
好ましい実施形態においては、本発明のメチロトローフ細菌は、該細菌における異種発現のための酵素活性を有するポリペプチドをコードする組換えDNAを含有し、ここで、酵素活性を有するポリペプチドには、以下の酵素が含まれる：
・異種メバロン酸経路（MVA経路）の酵素、すなわち、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMG-CoAシンターゼ）、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ（HMG-CoAレダクターゼ）、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ピロホスホメバロン酸デカルボキシラーゼおよびイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ、
・異種テルペンシンターゼ、ならびに
・特に、プレニル二リン酸前駆体の異種シンターゼ。
【００２３】
本発明の好ましい細菌は、異種メバロン酸経路の酵素の少なくとも1つ、すなわち、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMG-CoAシンターゼ）、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ（HMG-CoAレダクターゼ）、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ピロホスホメバロン酸デカルボキシラーゼおよびイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼからなる群から選択される酵素が、それぞれ対応して、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号6のペプチド配列に対して、少なくとも60%の同一性を有するペプチド配列を含有すること、あるいは前記の特定のペプチド配列をコードする対応核酸配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしうる核酸配列によりコードされることを特徴とする。
【００２４】
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号6のペプチド配列に対してそれぞれ少なくとも60%の同一性を有するペプチド配列を含有する酵素に関しては、好ましくは、該酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号6の特定のペプチド配列の1つに対して各場合において少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%同一であるペプチド配列を含有すると理解されるべきである。言うまでもなく、特定のペプチド配列を有する酵素のそのような変異体は、好ましくは、特定のペプチド配列を有する前記酵素の生物活性を実質的に有するべきである。これに当てはまるかどうかは、先行技術において公知である又は実施例に記載されている、生物活性に関する活性試験によって容易に確認されうる。これにおいて、配列比較アルゴリズムを使用して、ペプチド配列同一性が典型的に決定される。このためには、2つの配列を、それらの全長にわたって、またはそれらの2つの配列の1つのアミノ酸の少なくとも半分を構成する予め定められた断片の長さにわたって、互いに比較する。比較ウィンドウ、すなわち、比較されるべき2つの配列の領域において、同一または同等位置における同一アミノ酸の数を決定する。このためには、配列内にギャップを導入することが必要かもしれない。本発明の場合には、アミノ酸配列は、特に好ましくは、先行技術において公知のアルゴリズム、特に、NCBIのホームページ上で入手可能な以下のアルゴリズムの1つを使用して行われるべきである：BLASTp、PSI-BLAST、PHI-BLASTまたはDELTA-BLAST（Johnson 2008, Nucleic Acids Res 36 (Web Server issue):W5-9; Boratyn 2012, Biol Direct. 17(7):12; Ye 2012, BMC Bioinformatics 13:134; Ye 2013, Nucleic Acids Res 41: (Web Server issue):W34-40; Marchler-Bauer 2009, Nucleic Acids Res 37 (Database issue):D205-10;およびPapadopoulos 2007, Bioinformatics 23(9):1073-9も参照されたい）。好ましくは、特定されている標準的な設定がこのために使用されるべきである。
【００２５】
また、本発明において使用される酵素の変異体は、好ましくは、前記の特定のペプチド配列をコードする核酸配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしうる核酸配列によりコードされうる。本発明の場合のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件はSouthern 1975, J. Mol. Biol. 98(3): 503-517に記載されている。この場合もまた、言うまでもなく、該酵素のそのような変異体は、特定のペプチド配列を有する前記酵素の生物活性を実質的に有するべきである。
【００２６】
本発明のもう1つの態様においては、メチロトローフ細菌は、該細菌における異種発現のための酵素活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする組換えDNAを含有し、ここで、酵素活性を有するポリペプチドには、以下の酵素が含まれる：
・異種メバロン酸経路（MVA経路）の酵素、すなわち、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMG-CoAシンターゼ）、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ（HMG-CoAレダクターゼ）、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ピロホスホメバロン酸デカルボキシラーゼおよびイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ、ここで、該酵素は、それぞれ対応して、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号6のペプチド配列に対して、少なくとも60%の同一性を有するペプチド配列を含有し、あるいは前記の特定のペプチド配列をコードする対応核酸配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしうる核酸配列によりコードされる；
・異種テルペンシンターゼ、ならびに
・特に、プレニル二リン酸前駆体の異種シンターゼ。
【００２７】
本発明の細菌の有利な実施形態においては、異種メバロン酸経路の酵素、すなわち、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMG-CoAシンターゼ）、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ（HMG-CoAレダクターゼ）、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ピロホスホメバロン酸デカルボキシラーゼおよびイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼは、それぞれ互いに独立して、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号6のペプチド配列に対して少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、所望により少なくとも80%、特に少なくとも85%、より詳細には少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%、特に好ましくは少なくとも99%の同一性を有するペプチド配列を有する。
【００２８】
本発明の細菌の好ましい実施形態においては、異種メバロン酸経路の酵素は、それぞれ（対応して）、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号6のペプチド配列を有する、Myxococcus xanthus由来のヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMG-CoAシンターゼ）、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ（HMG-CoAレダクターゼ）、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ピロホスホメバロン酸デカルボキシラーゼおよびイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼである。
【００２９】
本発明の細菌のもう1つの態様においては、異種メバロン酸経路の前記酵素をコードする組換えDNAは、それぞれ互いに独立して、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11または配列番号12のヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、所望により少なくとも80%、特に少なくとも85%、より詳細には少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%、特に好ましくは少なくとも99%の同一性を有するポリヌクレオチド、あるいは配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11または配列番号12のヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。
【００３０】
これにおいては、配列比較アルゴリズムを使用して、核酸配列同一性が典型的に決定される。このためには、2つの配列を、それらの全長にわたって、またはそれらの2つの配列の1つのヌクレオチドの少なくとも半分を構成する予め定められた断片の長さにわたって、互いに比較する。比較ウィンドウ、すなわち、比較されるべき2つの配列の領域において、同一または同等位置における同一ヌクレオチドの数を決定する。このためには、配列内にギャップを導入することが必要かもしれない。本発明の場合には、アミノ酸配列は、特に好ましくは、先行技術において公知のアルゴリズム、特に、NCBIのホームページ上で入手可能な以下のアルゴリズムの1つを使用して行われるべきである：BLASTn、megablastまたは不連続blast（Johnson 2008, Nucleic Acids Res 1;36 (Web Server issue):W5-9を参照されたい）。好ましくは、特定されている標準的な設定がこのために使用されるべきである。
【００３１】
特に、本発明において使用されるポリヌクレオチドはMyxococcus xanthus由来の遺伝子hmgs（配列番号7）、hmgr（配列番号8）、mvaK1（配列番号9）、mvaK2（配列番号10）、mvaD（配列番号11）およびfni（配列番号12）である。この実施形態による細菌の異種メバロン酸経路の酵素は配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号6のペプチド配列を有する。
【００３２】
原核生物MVA遺伝子、特に、Myxococcus xanthus由来のMVA遺伝子の使用は幾つかの利点を伴う。比較しうるGC含量、例えばMyxococcus xanthusからの約70%のGC含量は、非常に良好なコドン適合度指数（Codon Adaptation Indices, CAI）、例えば、MVA遺伝子の場合には約0.7〜約0.9を与える。
【００３３】
本発明のもう1つの態様においては、異種メバロン酸経路の該酵素をコードする組換えDNAは1つの単一オペロン内に位置する。これは、1つの単一プロモータの補助により、発現の、より良好な共調節を可能にする。必要に応じて、他の異種遺伝子もそのようなオペロン内に組込まれうる。
【００３４】
異種メバロン酸経路の該酵素をコードする組換えDNAは同義的にMVA遺伝子とも称される。
【００３５】
有利な更なる発展においては、該MVA遺伝子のリボソーム結合部位（RBS）の少なくとも1つは該細菌における異種発現の翻訳開始に関して最適化される。
【００３６】
有利な実施においては、異種イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼの遺伝子のRBSは翻訳開始に関して最適化される。該遺伝子の、特にMyxococcus xanthus由来の遺伝子fniのそのようなRBS最適化変異体は、50〜200,000、好ましくは50〜100,000、特に好ましくは50,000〜100,000のTIR（Salis 2011によれば翻訳開始率）を有する。
【００３７】
もう1つの有利な実施形態においては、異種ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMG-CoAシンターゼ）の遺伝子のRBSは翻訳開始に関して最適化される。該遺伝子の、特にMyxococcus xanthus由来の遺伝子hmgsのそのようなRBS最適化変異体は、50〜100,000、好ましくは50〜50,000、特に好ましくは1,000〜50,000のTIRを有する。
【００３８】
本発明のもう1つの好ましい実施形態においては、該細菌の組換えDNAは更に、少なくとも1つの異種テルペンシンターゼをコードし、ここで、該テルペンシンターゼは、セスキテルペンシンターゼおよびジテルペンシンターゼからなる群から選択される。該テルペンシンターゼにより形成されるセスキテルペンおよびジテルペンはバイオテクノロジー的に重要な産物であると認識される。
【００３９】
1つの修飾においては、前記の少なくとも1つの異種テルペンシンターゼはセスキテルペンシンターゼである。セスキテルペンシンターゼは、好ましくは、環状セスキテルペンの合成のための酵素であり、ここで、該セスキテルペンは、特に、α-フムレン、サンタレンの種々のエピマー、例えばα-サンタレン、β-サンタレン、エピ-β-サンタレンまたはα-エキソ-ベルガモテン、およびビサボレン、例えばβ-ビサボレンからなる群から選択される。
【００４０】
セスキテルペンシンターゼは、より好ましくは、α-フムレンシンターゼまたはサンタレンシンターゼである。この場合、特に、サンタレンシンターゼは非常に広範な産物スペクトルを有し、したがって、サンタレン型の非常に多数の異なるセスキテルペンが入手可能であることに注目されるべきである。
【００４１】
セスキテルペンシンターゼは、好ましくは、植物由来のセスキテルペンシンターゼである。好ましくは、セスキテルペンシンターゼは生物由来の酵素であり、ここで、該生物は、Zingiber属およびSantalum属からなる群から選択される。適切な適合性を有する他の生物からのセスキテルペンシンターゼも使用されうる。
【００４２】
もう1つの態様におけるセスキテルペンシンターゼは、配列番号15のペプチド配列のポリペプチド、配列番号45のペプチド配列のポリペプチドおよび配列番号46のペプチド配列のポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも60%の同一性を有するペプチド配列を含む。
【００４３】
本発明の意図におけるセスキテルペンシンターゼはまた、配列番号15、45または46のポリペプチドの1つをコードするヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる適当な活性を有する酵素でありうる。
【００４４】
セスキテルペンシンターゼのペプチド配列は、より好ましくは、配列番号15のペプチド配列のポリペプチド、配列番号45のペプチド配列のポリペプチドおよび配列番号46のペプチド配列のポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、所望により少なくとも80%、特に少なくとも85%、より詳細には少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%、特に好ましくは少なくとも99%の同一性を有する。
【００４５】
好ましくは、セスキテルペンシンターゼは、Zingiber zerumbet、Santalum albumまたはSantalum spicatumからの適当な活性を有するポリペプチドを含有する酵素である。
【００４６】
セスキテルペンシンターゼは、特に、Zingiber zerumbet由来のα-フムレンシンターゼであり、これは配列番号15のペプチド配列のポリペプチドを含有する。もう1つの発展においては、配列番号15のペプチド配列のポリペプチドを含有するα-フムレンシンターゼは、配列番号16の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む組換えDNAによりコードされる。配列番号16の核酸配列はZingiber zerumbet由来の遺伝子zssIであり、これはMethylobacterium extorquens AM1における発現に関してコドン最適化された。
【００４７】
代替的実施においては、セスキテルペンシンターゼは、特に、Santalum album由来のサンタレンシンターゼSsaSSｙであり、これは配列番号45のペプチド配列のポリペプチドを含有する。
【００４８】
もう1つの代替的実施においては、セスキテルペンシンターゼは、好ましくは、Santalum spicatum由来のサンタレンシンターゼSspiSSyであり、これは配列番号46のペプチド配列のポリペプチドを含有する。
【００４９】
代替的修飾においては、前記の少なくとも1つの異種テルペンシンターゼはジテルペンシンターゼである。ジテルペンシンターゼは、好ましくは、ジテルペンの合成のための酵素であり、ここで、該ジテルペンは、スクラレオール、シス-アビエノール、アビタジエン、イソピマラジエン、マヌールおよびラリクソールからなる群から選択される。好ましくは、植物由来のジテルペンシンターゼは、特に、Salvia属またはAbies属由来である。
【００５０】
もう1つの態様においては、ジテルペンシンターゼは、配列番号47のペプチド配列のポリペプチドに対して少なくとも40%の同一性を有するペプチド配列を含む。
【００５１】
本発明の意図におけるジテルペンシンターゼはまた、配列番号47のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる適当な活性を有する酵素でありうる。
【００５２】
ジテルペンシンターゼのペプチド配列は、より好ましくは、配列番号47のペプチド配列のポリペプチドに対して少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、所望により少なくとも80%、特に少なくとも85%、より詳細には少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%、特に好ましくは少なくとも99%の同一性を有する。
【００５３】
ジテルペンシンターゼは、共発現される2つの単官能性I型およびII型ジテルペンシンターゼ、すなわち、SsLPS（Salvia sclarea LPPシンターゼ）およびSsSCS（S. sclareaスクラレオールシンターゼ）（Caniardら, BMC Plant Biol 2012 Jul 26;12:119）、二官能性I型／II型ジテルペンシンターゼである、Abies balsamea由来のシス-アビエノールシンターゼAbCAS（Zerbeら, J Biol Chem 2012 Apr 6;287(15):12121-31）、LPPシンターゼNtCPS2、ならびにNicotiana tabacum由来のシス-アビエノールシンターゼNtABS（Sallaudら, Plant J 2012 Oct;72(1):1-17）からなる群から選択される。
【００５４】
1つの態様においては、ジテルペンシンターゼは、特に、二官能性I型／II型ジテルペンシンターゼである、Abies balsamea由来のシス-アビエノールシンターゼAbCASであり、これは配列番号47のぺプチド配列のポリペプチドを含有する。
【００５５】
特に好ましくは、シス-アビエノールシンターゼは、M. extorquens AM1に関してコドン最適化されたポリヌクレオチドによりコードされ、非常に特に好ましくは、配列番号50の配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。   
既に前記で記載されているとおり、プレニル二リン酸前駆体、例えばFPPまたはGGPPは、テルペンシンターゼのそれぞれの基質を形成する。したがって、あるテルペンシンターゼの選択においては、適当なプレニル二リン酸前駆体を得るための適当なシンターゼを選択する必要がある、と当業者は認識する。
【００５６】
有利なもう1つの発展においては、セスキテルペンシンターゼの遺伝子のRBSは翻訳開始に関して最適化される。該遺伝子のそのようなRBS最適化変異体は少なくとも50,000、特に50,000〜400,000、好ましくは200,000〜300,000、特に好ましくは210,000〜250,000のTIR（翻訳開始率）を有する。
【００５７】
もう1つの実施形態における細菌は、異種メバロン酸経路の酵素の少なくとも1つをコードする組換えDNAに加えて、必要に応じて更に、プレニル二リン酸前駆体のシンターゼの少なくとも1つをコードする組換えDNAを有する。
【００５８】
プレニル二リン酸前駆体のシンターゼは内因性または異種酵素である。プレニル二リン酸前駆体の内因性シンターゼの場合、それをコードする遺伝子は、好ましくは、適当なプロモーターの補助により、過剰発現可能である。
【００５９】
好ましい実施においては、該細菌は、異種メバロン酸経路の酵素の少なくとも1つをコードする組換えDNAに加えて、更に、プレニル二リン酸前駆体の異種シンターゼの少なくとも1つをコードする組換えDNAを含有する。必要に応じて、プレニル二リン酸前駆体の異種シンターゼは、対応内因性酵素に加えて発現可能である。
【００６０】
プレニル二リン酸前駆体のシンターゼは、ファルネシル二リン酸シンターゼ（FPPシンターゼ）およびゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（GGPPシンターゼ）からなる群から選択される酵素である。前記シンターゼから形成されるプレニル二リン酸前駆体であるそれぞれFPPおよびGGPPは、バイオテクノロジー的に重要なセスキテルペンおよびジテルペンの合成のための重要な前駆体分子であると認識されている。
【００６１】
1つの修飾においては、プレニル二リン酸前駆体のシンターゼは異種FPPシンターゼであり、ここで、これは真核生物または原核生物異種FPPシンターゼでありうる。異種FPPシンターゼは例えば細菌由来または真菌由来でありうる。
【００６２】
異種FPPシンターゼは、特に、真菌由来の酵素、好ましくは酵母由来の酵素、例えばSaccharomyces属の酵素である。
【００６３】
もう1つの態様においては、FPPシンターゼは、配列番号13のペプチド配列に対して少なくとも60%の同一性を有するペプチド配列を含む。FPPシンターゼは、特に、真核生物FPPシンターゼである。
【００６４】
本発明の意図におけるFPPシンターゼはまた、配列番号13のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる適当な活性を有する酵素でありうる。
【００６５】
もう1つの実施においては、FPPシンターゼのペプチド配列は、好ましくは、配列番号13に対して少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、所望により少なくとも80%、特に少なくとも85%、より詳細には少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%、特に好ましくは少なくとも99%の同一性を有する。
【００６６】
本発明の細菌のもう1つの態様においては、FPPシンターゼをコードする組換えDNAは、配列番号14のヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、所望により少なくとも80%、特に少なくとも85%、より詳細には少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%、特に好ましくは少なくとも99%の同一性を有するポリヌクレオチドを含む。
【００６７】
FPPシンターゼは、好ましくは、Saccharomyces cerevisiae由来のFPPシンターゼである。他の生物由来のFPPシンターゼも適当な適合性で使用可能である。FPPシンターゼは、特に、配列番号13のポリペプチドを含有するSaccharomyces cerevisiae由来のFPPシンターゼERG20である。
【００６８】
1つの実施においては、配列番号13のポリペプチドを有するSaccharomyces cerevisiae由来のFPPシンターゼERG20は、特に、配列番号14の配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００６９】
もう1つの修飾においては、プレニル二リン酸前駆体のシンターゼは異種ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（GGPPシンターゼ）である。異種GGPPシンターゼは、特に、細菌、植物または真菌由来の適当な酵素である。好ましくは、GGPPシンターゼは、好ましくは、Enterobacteriaceae科の細菌、Taxus属の植物およびSaccharomyces属の真菌からなる群から選択される生物に由来する酵素である。Enterobacteriaceae科の細菌に由来する適当なGGPPシンターゼは、例えば、Pantoea属の細菌に由来する適当な酵素でありうる。
【００７０】
もう1つの態様においては、GGPPシンターゼは、配列番号43のペプチド配列のポリペプチド、配列番号44のペプチド配列のポリペプチドおよび配列番号42のペプチド配列のポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも60%の同一性を有するペプチド配列を含む。
【００７１】
本発明の意図におけるGGPPシンターゼはまた、配列番号43、44または42のポリペプチドの1つをコードするヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる適当な活性を有する酵素でありうる。
【００７２】
GGPPシンターゼのペプチド配列は、より好ましくは、配列番号43のペプチド配列のポリペプチド、配列番号44のペプチド配列のポリペプチドおよび配列番号42のペプチド配列のポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、所望により少なくとも80%、特に少なくとも85%、より詳細には少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%、特に好ましくは少なくとも99%の同一性を有する。
【００７３】
GGPPシンターゼは、好ましくは、Pantoea agglomeransもしくはPantoea ananatis、Taxus canadensisまたはSaccharomyces cerevisiae由来の適当な活性を有するポリペプチドを有する酵素である。
【００７４】
もう1つの態様においては、GGPPシンターゼは、配列番号43のペプチド配列を有するPantoea agglomerans由来のGGPPシンターゼcrtE、配列番号44のペプチド配列を有するTaxus canadensis由来のGGPPシンターゼ、および配列番号42のペプチド配列を有するSaccharomyces cerevisiae由来のGGPPシンターゼBTS1からなる群から選択される酵素である。他の生物由来のGGPPシンターゼも適当な適合性で使用可能である。
【００７５】
有利なもう1つの発展においては、該組換えDNA、すなわち、プレニル二リン酸前駆体の異種シンターゼ（例えば、FPPまたはGGPPシンターゼ）の遺伝子のRBSは翻訳開始に関して最適化される。該遺伝子のそのようなRBS最適化変異体は500〜100,000、好ましくは10,000〜50,000、特に好ましくは20,000〜40,000のTIR（翻訳開始率）を有する。
【００７６】
本発明の有利な実施においては、異種テルペンシンターゼおよびプレニル二リン酸前駆体の異種シンターゼをコードする遺伝子のRBSは、異種テルペンシンターゼのTIR値がプレニル二リン酸前駆体の異種シンターゼTIR値より高くなるように適合化される。したがって、毒性作用を有することがあるプレニル二リン酸前駆体の蓄積が回避されうる。
【００７７】
必要に応じて、該組換えDNAは本発明の細菌における発現に関してコドン最適化される。例えば、異種テルペンシンターゼをコードする遺伝子は本発明の細菌に関して最適化される。このようにして、該メチロトローフ細菌における発現が改善されうる。
【００７８】
該細菌のもう1つの実施形態においては、該組換えDNAは、FPPシンターゼであるSaccharomyces cerevisiae由来のERG20 FPPシンターゼをコードし、該組換えDNAは、セスキテルペンシンターゼであるZingiber zerumbet由来のα-フムレンシンターゼをコードする。
【００７９】
該実施の1つにおける細菌は、好ましくは、該酵素の異種発現のための組換えDNAに、共通のプロモーターまたは幾つかの相互非依存的誘導性プロモーターが付与されるよう、更に発展される。これはそれぞれの遺伝子に応じて様々な形態となりうる。この場合、それらの誘導性プロモーターは、互いに独立して調節可能となるよう、性質において異なりうる。好ましくは、本明細書に記載されている酵素の発現のための全ての遺伝子に、同じ共通の誘導性プロモーターが付与される。
【００８０】
誘導性プロモーター系は原理上は当業者に公知である。好ましくは、非常に「厳密（tight）」なプロモーター系が本発明で使用される。このようにして、該組換え遺伝子の発現は培養における所望の時点で意図的にスイッチが入れられうる。特に、MVA経路遺伝子の発現の調節のためには、特に「厳密」なプロモーター系が有利である。なぜなら、そうでなければ、増殖に影響を及ぼす作用が生じうるからである。特に好ましいのはクマート（cumate）誘導系である。
【００８１】
該細菌の有利な実施形態においては、該組換えDNAは各場合においてプラスミド上または染色体において発現可能である。これもそれぞれの遺伝子に応じて様々な形態となりうる。ゲノム内への安定な組込みのための適当な染色体部位および技術は当業者に公知である。プラスミドにおける発現のためには、該組換えDNAを含有する適当なプラスミドを該細菌内に形質転換により導入する。したがって、本発明の細菌は、好ましくは、関連組換えDNAを含有する1以上のプラスミドでの形質転換により得られる。
【００８２】
好ましい実施形態においては、本発明の細菌は、形質添加により導入された少なくとも1つのプラスミドを含有し、ここで、前記の少なくとも1つのプラスミドは、以下の組換えDNA、すなわち、
・ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMG-CoAシンターゼ）、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ（HMG-CoAレダクターゼ）、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ピロホスホメバロン酸デカルボキシラーゼおよびイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼからなる群から選択される前記の異種メバロン酸経路の酵素の少なくとも1つをコードする組換えDNA、
・所望により、前記のプレニル二リン酸前駆体の異種シンターゼの少なくとも1つをコードする組換えDNA、ならびに
・前記の異種テルペンシンターゼの少なくとも1つをコードする組換えDNA
を含む。
【００８３】
本発明の意図におけるメチロトローフ細菌は、特に、プロテオバクテリアである。好ましいメチロトローフプロテオバクテリアはMethylobacterium属およびMethylomonas属から選択される。より好ましくは、メチロトローフプロテオバクテリアはMethylobacterium属の株、特に、Methylobacterium extorquensの株である。特に好ましいのはMethylobacterium extorquens AM1株またはMethylobacterium extorquens PA1株である。
【００８４】
更に、メチロトローフプロテオバクテリアの株、特にMethylobacterium属およびMethylomonas属の株、好ましくはMethylobacterium extorquens AM1またはPA1の株であって、カロテノイド生合成活性を欠いており、好ましくは遺伝子crtNb（ジアポリコペンオキシダーゼ）の欠損を有するもの（Van Dienら, 2003, Appl Environ Microbiol 69, 7563-6）が好ましい。そのような株はカロテノイド生合成活性を有さず、特に、ジアポリコペンオキシダーゼ活性を欠いている。それにより、テルペン合成速度の更なる改善が可能である。
【００８５】
本発明のもう1つの態様は、以下の工程、すなわち、
・メタノールおよび／またはエタノール含有水性培地を準備し、
・前記実施形態の1つに記載されているメチロトローフ細菌をバイオリアクター内の該培地内で培養し、ここで、メタノールおよび／またはエタノールは該細菌によりテルペンに変換され、
・バイオリアクター内で生じたセスキテルペンまたはジテルペンを分離することを含む、メタノールおよび／またはエタノールからのセスキテルペンまたはジテルペンのデノボ微生物利用合成のための方法に関する。
【００８６】
使用される水性培地はメタノール、エタノールまたはメタノールとエタノールとの混合物を含有しうる。必要に応じて、他の基質がそれに加えられうる。水性培地内には専らメタノールまたはエタノールのみが含有されていること、すなわち、セスキテルペンまたはジテルペンのデノボ微生物利用合成はメタノールまたはエタノールから生じることが有利でありうる。
【００８７】
メタノールの使用は多数の利点をもたらす。メタノールは、石油化学により、そしてまた、再生可能な原料からも、あるいは将来においてはCO2からでさえも製造されうる。季節的（天候および1年における時期）要因も地域的要因も存在せず、これにより、長期的な製造計画が可能となる。これとは別に、糖の場合とは対照的に、メタノールの価格は将来において下落する可能性がある。なぜなら、多数の製造工場が計画されており、または建設中だからである。メタノールは、一般に使用されている糖基質に代わる炭素源である。
【００８８】
メタノールにおいては、そしてまた、エタノールにおいても、その炭素は炭水化物／糖と比較して低い酸化レベルを有する。結果として、メタノールからCO2への酸化においては、糖からCO2への完全酸化の場合より多数の電子が放出されうる。したがって、テルペンのような強く還元された化合物の合成のためには、可能な限り、低い酸化レベルを有する炭素源を使用することが有利である。メタノールおよびエタノールは、糖由来の炭素より良好に、これらの前提条件を満たす。したがって、メタノール／エタノールの使用は、炭水化物から出発するよりも、テルペンの製造に有利である。
【００８９】
エタノールの使用も多数の利点をもたらす。エタノールは例えばバイオマス発酵から「天然基質」（すなわち、バイオエタノール）として入手可能である。
【００９０】
更に、セスキテルペンまたはジテルペンのデノボ微生物利用合成のためのバイオエタノールの使用は、特に、「天然香料物質」として得られたセスキテルペンおよびジテルペン製品の有利な告知を可能にする。エタノールは、一般に使用されている糖基質に代わる代替炭素源である。
【００９１】
本発明の細菌は、必要に応じて、各場合において唯一の炭素源としてのメタノール上でもエタノール上でも増殖する。該方法のもう1つの発展においては、メタノールおよび／またはエタノールは、該細菌を培養するための唯一の炭素源として培地内に含有される。それにより、特に、他の炭素源は培地に意図的には加えられず、あるいは大きな比率では含有されないと理解される。微量の他の炭素源は常に避けられうるわけではなく、本発明の方法の前記の更なる発展の範囲から逸脱することなく含有されうることは明らかである。
【００９２】
該方法の有利な実施形態においては、メタノールおよび／またはエタノール限定フェドバッチ発酵が行われる。
【００９３】
該方法の好ましい実施の意図においては、バイオリアクターからのセスキテルペンまたはジテルペンのin situ（インサイチュ）除去（取り出し）、すなわち、特に、発酵槽におけるin situ産物除去（ISPR）を行う。工業バイオテクノロジーの重要な態様は、実際の産物合成に加えて、その後処理である。insitu産物除去（ISPR）は微生物に対する産物の毒性効果および該方法のコストの両方を低減する。ISPRは、本発明においては、特に、テルペンの除去により行われる。これにおいては、テルペンは、好ましくは、排気流内に移され、ついで有機溶媒に溶解される。メタノールまたはエタノールは還元（reduced）基質であるため、糖で増殖する通常の微生物とは異なり、該メチロトローフ細菌は著しく高い通気速度で培養されること、そして同時に、それにより、生じた揮発性発酵産物、特にセスキテルペンまたはジテルペンが除去されることが著しく好ましい。
【００９４】
該方法のもう1つの発展においては、水性有機2相系において培養を行い、ここで、該有機相は、特に、脂肪族炭化水素化合物、特にアルカン、好ましくはドデカンまたはデカンにより構成される。生じたテルペンは該有機相において良好な溶解度を有する。
【００９５】
該方法の有利な実施形態においては、実質的に一定のpHで培養を行う。特に、> 30%の溶存酸素レベルおよび／または約1g/Lのメタノールもしくはエタノール濃度で該方法を行う。
【００９６】
該方法のもう1つの発展においては、0.75、0.8、0.9g/l以上、好ましくは、1.0g/l以上、より好ましくは1.5g/l以上（それぞれは水相の体積に基づく）のテルペン濃度に達する。
【００９７】
本発明のもう1つの態様は、メタノールおよび／またはエタノールからのテルペンのデノボ微生物利用合成のために前記実施形態の1つに記載されている組換えメチロトローフ細菌を培養するための、メタノールまたはエタノール含有培地の使用に関する。メタノールまたはエタノール最少培地の使用は汚染リスクおよび産物の後処理中のコストの両方を低減する。なぜなら、メタノールおよびエタノールは多数の微生物にとって毒性または増殖抑制性であり、また、複雑な成分を実際の産物から除去する必要がないからである。
【００９８】
多数の事実が、糖と比較した場合のメタノールおよび／またはエタノールの使用の利点を示している。すなわち、i）糖はグルコースだけではなく、収量を保証するためにはその精製が通常必要であり、この場合、評価される精製はコストを伴い、ii）今後何年かにおける糖価格の上昇が予想されており、一方、メタノールおよびエタノールの価格は、製造能力の著しい向上により、おそらく下落すると考えられ、iii）メタノールおよびエタノールは、糖に基づく発酵と比較して、汚染リスクをかなり低減し、これは滅菌コストを低下させ、iv）メタノールおよびエタノール最少培地は、炭素源としてグルコースまたは他の糖源（例えば、コーンスティープリカーまたはリグノセルロース）を含有する培地とは対照的に、複雑な化合物を含有せず、このことは精製方法を単純化する。
【００９９】
適当な発酵培地は例えば以下の組成を有しうる：水、メタノールまたはエタノール、ならびにPIPES、NaH2PO4、K2HPO4、MgCl2、(NH4)2SO4、CaCl2、クエン酸ナトリウム、ZnSO4、MnCl2、FeSO4、(NH4)6Mo7O24、CuSO4およびCoCl2からなる群から選択される他の成分。
【０１００】
使用されるプロテオバクテリウムにおけるカロテノイド合成を遮断することにより、テルペン形成の更なる増加が達成されうる。このためには、カロテノイド生合成活性を欠く、特に、ジアポリコペンオキシダーゼ活性を欠く、Methylobacterium属またはMethylomonas属の株が有利に使用される。これにより、1.5g/lを超える、特に約1.65g/l（それぞれ水相の体積に基づく）の最大テルペン濃度が達成されうる。
【０１０１】
カロテノイド生合成活性を欠く、特に、ジアポリコペンオキシダーゼ活性を欠く、Methylobacterium extorquens AM1の本発明の既に記載されている突然変異体は、テルペン産生の増加を示す。特に、カロテノイド生合成活性を欠くMethylobacterium extorquens AM1の突然変異体により、1.5g/lを超える、特に約1.65g/lの最大α-フムレン濃度が得られた。
【０１０２】
ここで、例えば外的添加を要する高価なアセト酢酸リチウムまたはDL-メバロナート（メバロン酸）を使用することなく、テルペンの前記濃度が既に得られていることに注目すべきである。更に、特に、このためには、株の最適化のための更なる高コスト手段が全く不要である。メチロトローフ細菌の相当な可能性、およびテルペンのバイオテクノロジー製造方法の相当な可能性が既にこれに従っている。更に、安価なメタノールまたはエタノール最少培地の使用により前記濃度に既に達していることも有利である。先行技術とは対照的に、TBまたはLBに基づく発酵培地は不要である。得られたテルペン産物の精製の単純化におけるもう1つの利点がそれから得られる。なぜなら、明確に定められた最少培地が使用可能だからである。副産物の高コスト除去は最低限度に抑えられうる。また、本明細書に記載されている株は増殖のための唯一の炭素源としてのメタノールまたはエタノールの使用を開拓するものである。
【０１０３】
本発明のもう1つの態様は、メタノールおよび／またはエタノールからのテルペンのデノボ微生物利用合成のための前記の実施形態の1つにおける、記載されているメチロトローフ細菌の使用に関する。
【０１０４】
本発明の方法により得られるテルペンは、セスキテルペン（C15）およびジテルペン（C20）からなる群から選択される。
【０１０５】
本発明の方法の意図におけるテルペンは一方においてはセスキテルペンである。したがって、バイオテクノロジーにおいて関心が持たれるセスキテルペンには、例えば、α-フムレン、サンタレンの種々のエピマー、例えばα-サンタレン、β-サンタレン、エピ-β-サンタレンおよびα-エキソ-ベルガモテンからなる群から選択されるセスキテルペンが含まれる。ビサボレン、例えばβ-ビサボレンも、本発明の方法により入手可能なセスキテルペンである。適当なセスキテルペンシンターゼは原理的には当業者に公知である。したがって、所望により、前記メチロトローフ細菌は、適当なセスキテルペンシンターゼをコードする適当な組換え遺伝子を有しうる。特に、このためには、メチロトローフ細菌、およびMVA経路の異種発現遺伝子は、前記の意図において、FPPシンターゼをも含有する。
【０１０６】
本発明の方法の意図におけるテルペンはもう一方においてはジテルペンである。したがって、バイオテクノロジーにおいて関心が持たれるジテルペンには、例えば、スクラレオール、シス-アビエノール、アビタジエン、イソピマラジエン、マノオールおよびラリクソール（larixol）からなる群から選択されるジテルペンが含まれる。適当なジテルペンシンターゼは原理的には当業者に公知である。したがって、所望により、前記メチロトローフ細菌は、適当なジテルペンシンターゼをコードする適当な組換え遺伝子を有しうる。特に、このためには、メチロトローフ細菌、およびMVA経路の異種発現遺伝子は、前記の意図において、GGPPシンターゼをも含有する。
【０１０７】
本発明の方法の特に好ましい実施においては、セスキテルペンである式I
【０１０８】
【化１】
2018507698.tif 000002
のα-フムレンをメタノールおよび／またはエタノールからデノボで合成する。
【０１０９】
本発明の方法の更に好ましい実施においては、式IIのα-サンタレン、式IIIのβ-サンタレン、式IVのエピ-β-サンタレンおよび式Vのα-エキソ-ベルガモテン
【０１１０】
【化２】
2018507698.tif 000003
【０１１１】
からなる群から選択されるサンタレン型のセスキテルペンをメタノールおよび／またはエタノールからデノボで合成する。この場合、サンタレンシンターゼは非常に広範な産物スペクトルを有し、したがって、サンタレン型の非常に多数の異なるセスキテルペンが入手可能であることに注目すべきである。
【０１１２】
本発明の方法の更に好ましい実施形態においては、ジテルペンである式VIのスクラレオールおよび式VIIのシス-アビエノール
【０１１３】
【化３】
2018507698.tif 000004
をメタノールおよび／またはエタノールからデノボで合成する。
【０１１４】
本発明の意図におけるバイオリアクターは、細菌を培養するための任意の適当な容器でありうる。最も単純な場合には、これは振とうフラスコを意味すると理解される。特に、それは発酵槽を意味すると理解される。バイオリアクターは連続的実施、不連続的実施、フェドバッチ実施またはバッチ製造に好適でありうる。
【０１１５】
本発明のもう1つの態様は、示されている実施の1つの方法により入手可能な前記のセスキテルペン（C15）およびジテルペン（C20）に関する。
【０１１６】
以下、本発明の細菌、方法および使用の更に詳細な実施形態を記載する。
【０１１７】
１．メチロトローフ細菌における発現のための酵素活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする組換えDNAを含有するメチロトローフ細菌であって、酵素活性を有する前記の少なくとも1つのポリペプチドが、
・ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMG-CoAシンターゼ）、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ（HMG-CoAレダクターゼ）、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ピロホスホメバロン酸デカルボキシラーゼおよびイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼからなる群から選択される異種メバロン酸経路の酵素の少なくとも1つ、
・異種テルペンシンターゼ、ならびに
・所望により、プレニル二リン酸前駆体のシンターゼ
からなる群から選択されることを特徴とする、メチロトローフ細菌。
【０１１８】
２．異種メバロン酸経路の酵素の少なくとも1つが、それぞれ対応して、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号6のペプチド配列に対して、少なくとも60%の同一性を有するペプチド配列を含有することを特徴とする、実施形態1記載の細菌。
【０１１９】
３．異種テルペンシンターゼが、セスキテルペンシンターゼおよびジテルペンシンターゼからなる群から選択されることを特徴とする、実施形態1または2記載の細菌。
【０１２０】
４．異種テルペンシンターゼがセスキテルペンシンターゼであり、セスキテルペンシンターゼが環状セスキテルペンの合成のための酵素であり、該セスキテルペンが、特に、α-フムレンおよびサンタレンのエピマー、例えばα-サンタレン、β-サンタレン、エピ-β-サンタレンまたはα-エキソ-ベルガモテン、およびビサボレン、例えばb-ビサボレンからなる群から選択されることを特徴とする、実施形態3記載の細菌。
【０１２１】
５．異種テルペンシンターゼがジテルペンシンターゼ、特に、ジテルペンの合成のための酵素であり、該ジテルペンが、特に、スクラレオール、シス-アビエノール、アビタジエン、イソピマラジエン、マヌールおよびラリクソールからなる群から選択されることを特徴とする、実施形態3記載の細菌。
【０１２２】
６．プレニル二リン酸前駆体のシンターゼが、ファルネシル二リン酸シンターゼ（FPPシンターゼ）およびゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（GGPPシンターゼ）からなる群から選択される酵素であることを特徴とする、実施形態1〜5のいずれか1項に記載の細菌。
【０１２３】
７．プレニル二リン酸前駆体のシンターゼが異種FPPシンターゼであり、ここで、異種FPPシンターゼが真核生物または原核生物異種FPPシンターゼであることを特徴とする、実施形態1〜6のいずれか1項に記載の細菌。
【０１２４】
８．プレニル二リン酸前駆体のシンターゼが異種GGPPシンターゼであり、ここで、異種GGPPシンターゼが、細菌、植物または真菌からなる群から選択される生物に由来する酵素であることを特徴とする、実施形態1〜6のいずれか1項に記載の細菌。
【０１２５】
９．該酵素の異種発現のための組換えDNAに、共通の誘導性プロモーターまたは幾つかの相互非依存的誘導性プロモーターが付与されることを特徴とする、実施形態1〜8のいずれか1項に記載の細菌。
【０１２６】
10．組換えDNAが、各場合において、プラスミド上または染色体において相互非依存的に発現可能であることを特徴とする、実施形態1〜9のいずれか1項に記載の細菌。
【０１２７】
11．細菌がメチロトローフプロテオバクテリア、特に、Methylobacterium属およびMethylomonas属の細菌、好ましくは、Methylobacterium extorquensであることを特徴とする、実施形態1〜10のいずれか1項に記載の細菌。
【０１２８】
12．細菌が、カロテノイド生合成活性を欠く株、特に、ジアポリコペンオキシダーゼ活性を欠く株であることを特徴とする、実施形態1〜10のいずれか1項に記載の細菌。
【０１２９】
13．以下の工程、すなわち、
・メタノールおよび／またはエタノール含有水性培地を準備し、
・実施形態1〜12のいずれか1項に記載のメチロトローフ細菌をバイオリアクター内の該培地内で培養し、それにより、メタノールおよび／またはエタノールが該細菌によりテルペンに変換され、
・バイオリアクター内で生じたセスキテルペンまたはジテルペンを分離することを含む、メタノールおよび／またはエタノールからのセスキテルペンまたはジテルペンのデノボ微生物利用合成のための方法。
【０１３０】
14．メタノールおよび／またはエタノールが、該細菌を培養するための唯一の炭素源として該培地内に含有されることを特徴とする、実施形態13記載の方法。
【０１３１】
15．メタノールおよび／またはエタノール限定フェドバッチ発酵を行うことを特徴とする、実施形態13または14記載の方法。
【０１３２】
16．水性有機2相系において培養を行い、ここで、該有機相が、特に、脂肪族炭化水素化合物、好ましくはドデカンまたはデカンにより構成されることを特徴とする、実施形態13〜15のいずれか1項に記載の方法。
【０１３３】
17．バイオリアクターからのセスキテルペンまたはジテルペンのin situ（インサイチュ）除去（取り出し）、すなわち、in situ産物除去（ISPR）を行うことを特徴とする、実施形態13〜16のいずれか1項に記載の方法。
【０１３４】
18．実質的に一定のpH、> 30%の溶存酸素レベルおよび／または約1g/Lのメタノールもしくはエタノール濃度で培養を行うことを特徴とする、実施形態13〜17のいずれか1項に記載の方法。
【０１３５】
19．1.0g/lを超える、好ましくは1.5g/lを超える（それぞれは水相の体積に基づく）のテルペン濃度に達することを特徴とする、実施形態13〜18のいずれか1項に記載の方法。
【０１３６】
20．メタノールおよび／またはエタノールからのセスキテルペンまたはジテルペンのデノボ微生物利用合成のために実施形態1〜12のいずれか1項に記載の組換えメチロトローフ細菌を培養するための、メタノールおよび／またはエタノール含有培地の使用。
【０１３７】
21．メタノールおよび／またはエタノールからのセスキテルペンまたはジテルペンのデノボ微生物利用合成のための、実施形態1〜12のいずれか1項に記載のメチロトローフ細菌の使用。
【０１３８】
本発明は前記実施形態の1つに限定されず、多種多様な様態で修飾可能である。本発明の実施形態、特に、記載されている細菌株および発酵条件は、本発明の範囲から逸脱することなく容易に応用されうる、と当業者は認識する。したがって、メタノールまたはエタノールからの任意のセスキテルペンの製造のための簡便な応用が考えられうる。本発明は、食糧と競合しない炭素源であるメタノールまたはエタノールからのテルペンの生物学的製造を可能にする。本発明の更なる特徴、詳細および利点は特許請求の範囲の記載から、そして図面に基づく実際の具体例（実施例）の以下の記載から理解される。
【０１３９】
本特許出願において引用されている全ての参考文献の内容の全体を、それぞれの具体的な開示内容に関して参照により本明細書に組み入れることとする。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】図1は、デオキシキシルロース-5-リン酸経路（DXP）、異種組込みメバロン酸経路（2つの枠により示されている）、異種α-フムレンシンターゼzsslおよび異種FPPシンターゼERG20を介した内因性テルペン合成を含む、Methylobacterium extorquens AM1の中央代謝の概要図を示す。M. extorquensはIPPイソメラーゼ（fni）を有さない。異種組込みMVA遺伝子はヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（hmgs）、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ（hmgr）、メバロン酸キナーゼ（mvaK）、ホスホメバロン酸キナーゼ（mvaK2）、ピロホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（mvaD）およびイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ（fni）に関連している。他の遺伝子：dxs：1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ、dxr：1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸レダクターゼ、hrd：HMB-PPレダクターゼ、ispA：内因性FPPシンターゼ；分子の略語：2PG：2-ホスホグリセリン酸、3PG：3-ホスホグリセリン酸、1,3-DPG：1,3-ビスホスホグリセリン酸、GA3P：グリセルアルデヒド-3-リン酸、PEP：ホスホエノールピルビン酸、HMG-CoA：ヒドロキシメチルグルタリル-CoA、DXP：1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸、MEP：2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸、HMB-PP：(E)-4-ヒドロキシ-3-メチル-ブタ-2-エニルピロリン、IPP：イソペンテニルピロリン酸、GPP：ゲラニルピロリン酸、FPP：ファルネシルピロリン酸。
【図２−１】図2は、α-フムレン標準（上パネル、黒線）およびpFS33を含有するM. extorquensからのサンプル（pCM80-zssI、上パネル、薄灰色線）のクロマトグラフィー比較を示す。内部標準ゼルンボンは11.5分後に溶出する。pFS33サンプル中のα-フムレンは、クロマトグラムの下に示されている質量スペクトルの比較により同定された。
【図２−２】図２−１の続きである。
【図３】図3は、水相に直接溶解された又は第2有機相としてのドデカン相に溶解されたα-フムレンに対するMethylobacterium extorquens AM1の耐性を示す。α-フムレンの非存在下のそれぞれの培地における最大増殖速度（μmax）が種々のα-フムレン濃度における増殖速度（μ）と比較されている。α-フムレンは、1g/lの濃度においてでさえも、M. extorquensに対して最小の増殖抑制効果を及ぼすに過ぎないことが認められうる。ドデカン相におけるα-フムレンは水相におけるものより若干小さな影響を及ぼす。なぜなら、それは細胞とそれほど接触しないからである。
【図４】図4は、プラスミドpFS33 (pCM80-zssI)、pFS34 (pCM80-zssI-ERG20)、pFS45 (pHC115-zssI)、pFS46 (pHC115-zssI-ERG20)、pFS49 (pQ2148F-zssI) およびpFS50 (pQ2148F-zssI-ERG20) を含有するM. extorquens AM1のα-フムレン産生を示す。黒色棒グラフ部分は、誘導を伴わない産生を示し、灰色棒グラフ部分は、誘導を伴う産生を表す。pCM80は構成プロモーターを含有する。それぞれ培養（pFS33, 34）および誘導（pFS45, 46, 49 50）の48時間後に濃度を比較した。
【図５】図5は、種々の組合せにおけるα-フムレンシンターゼ（zssl）、FPPシンターゼ（ERG20）およびIPPイソメラーゼ（fni）に関する最適化リボソーム結合部位（RBS）を有するプラスミドを含有するM. extorquensのα-フムレン産生を示す。これらの遺伝子の翻訳開始率はy軸上の括弧内に示されている。濃度は3つの3形質転換体からの平均産物濃度であり、ここで、それぞれは2つの別々の培養内で増殖した。黒色棒グラフ：zsslのみを含有するプラスミド（pFS49, pFS57）、斜線付き棒グラフ：zsslおよびERG20を含有するプラスミド（pFS50, pFS58, pFS60a, pFS60b）、灰色棒グラフ：zssl、ERG20およびメバロン酸経路の6つの遺伝子を含有するプラスミド（pFS61b, pFS62a, pFS62b）。
【図６】図6A：M. extorquensカロテノイド生合成欠損株CM502 (A2)からの及びpACCRT-MN (A1)を介してS. aureusからのジアポフィトエンシンターゼおよびジアポフィトエンデサチュラーゼを発現する大腸菌（E．coli）からの非鹸化カロテノイド抽出物のクロマトグラム（n = 502nm）。リコペンの理論的保持時間が矢印で示されている。B：誘導の48時間後の振とうフラスコ内でのプラスミドpFS62b（pQ2148F-zssI225k-ERG2022k-fni65k-MVA)を含有するM. extorquens AM1およびCM502のα-フムレン産生（n = 3）。
【図７】発酵5（表3による）におけるpFS62bを含有する株CM502から生じたα-フムレン濃度および細胞乾燥重量。時点0はクマートでの誘導の時点を示し、垂直の点線で表されている。三重（threefold）分析により同じサンプルからα-フムレン濃度の標準偏差を決定した。黒色正方形：α-フムレン濃度、灰色円形：細胞乾燥重量。
【図８】図8は、ppjo16（pQ2148F-AbCAS-ERG20F96C-MVA、上パネル、標識線）を含有するM. extorquensからのサンプルおよびシス-アビエノール標準（上パネル、標識線）のクロマトグラフィー比較を示す。内部標準であるゼルンボンは11.3分後に溶出する。16s6サンプルにおけるシス-アビエノールは、クロマトグラムの下に示されている質量スペクトルの比較により同定された。
【図９−１】図9は、ppjo03（pQ2148F-SanSyn-ERG20-MVA）を含有するM. extorquensからのサンプル（上パネル（a）、黒色線）およびサンダル油（上パネル、濃灰色線）のクロマトグラフィー比較を示す。ppjo03サンプルにおけるα-サンタレンは、クロマトグラムの下に示されている質量スペクトル（b, c）の比較により同定された。
【図９−２】図９−１の続きである。
【図９−３】図９−２の続きである。
【０１４１】
（実施例）
以下の実施例は、本発明を例示するものである。それらは、保護範囲に関して限定的なものと解釈されてはならない。
【０１４２】
実施例１：組換えα-フムレンの製造
1．材料および方法
1.1  化学物質、培地および細菌株
Methylobacterium extorquens AM1（PeelおよびQuayle, 1961. Biochem J. 81, 465-9）を最少培地内で30℃で培養した。この場合、振とうフラスコ内で培養のために、Kieferら, 2009（PLoS ONE. 4, e7831）の培地を使用した。発酵培地は30 mM PIPES、1.45 mM NaH2PO4、1.88 mM K2HPO4、1.5 mM MgCl2、11.36 mM (NH4)2SO4、20μM CaCl2、45.6μM クエン酸ナトリウム（Na3C6H5O7*2H2O)、8.7μM ZnSO4*7H2O、15.2μM MnCl2*4H2O、36μM FeSO4*7H2O、1μM (NH4)6Mo7O24*4H2O、0.3μM CuSO4*5H2Oおよび12.6μM CoCl2*6H2O（最終濃度）を含有する。
【０１４３】
大腸菌（Escherichia coli）株DH5（Gibco-BRL, Rockville, USA）をLB（lysogeny broth）培地（Bertani, 1951. J. Bacteriol. 62, 293-300）内で37℃で培養した。塩酸テトラサイクリンをE. coliおよびM. extorquensに10μg/mlの濃度で使用した。クマート（4-イソプロピル安息香酸）を、エタノール（振とうフラスコ内の培養）またはメタノール（バイオリアクター内の培養）に溶解された100mM ストック溶液から希釈された100μMの最終濃度で誘導物質として使用した。
【０１４４】
クマート、塩酸テトラサイクリン、α-フムレン、ゼルンボンおよび(RS)-メバロン酸リチウム塩をSigma-Aldrich（Steinheim, DE）から購入した。ドデカンをVWR（Darmstadt, DE）から購入した。
【０１４５】
1.2  遺伝的操作およびプラスミド構築
当業者に公知の方法に従い、標準的なクローニング技術を行った。Toyamaら（Toyamaら, 1998, FEMS Microbiol. Lett. 166, 1-7）に記載されているとおりにM. extorquens AM1またはCM502内へのプラスミドの形質転換を行った。
【０１４６】
リボソーム結合部位（RBS）をリボソーム結合部位カルキュレータ（Salis, 2011, Methods in Enzymology, V. Christopher編, 19-42. Academic Press）の補助により設計した。コドン適合度指数（CAI）をCAIカルキュレータ（Puigboら, 2008, BMC Bioinformatics. 9, 65）で決定した。
【０１４７】
1.3   Myxococcus xanthusからのメバロン酸経路（MVA）遺伝子のクローニング
Myxococcus xanthus DSM16525からのゲノムDNAをDSMZ（Braunschweig, DE）から購入した。HMG-CoAシンターゼをコードするhmgsのEcoRI制限部位を、重複伸長（Overlap extension）PCRにより、サイレント突然変異（gaattcからgagttcへ）の挿入により除去した。このために、該遺伝子の第1の部分を、プライマーHMGS-fwおよびHMGS-over-revを使用して増幅した。一方、第2の部分にはHMGS-over-fwおよびHMGS-revを使用した。EcoRI制限部位を有さないhmgs（配列番号7）の最終増幅のために、HMGS-fwおよびHMGS-revと共に、得られたPCR産物を「メガ（mega）」プライマーとして使用した。
【０１４８】
HMG-CoAレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ピロホスホメバロン酸レダクターゼおよびイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼをそれぞれコードする遺伝子hmgr（配列番号8）、mvaK1（配列番号9）、mvaK2（配列番号10）、mvaD（配列番号11）およびfni（配列番号12）を含有するM. xanthusからのメバロン酸経路オペロンをプラスミドpUC18-mva-op（Miら, 2014, Microbial cell factories. 13, 170）から切り出した。
【０１４９】
1.4  α-フムレンシンターゼを含有するプラスミドのクローニング
プラスミドpQ2148（Kaczmarczykら, 2013, Appl. Environ. Microbiol. 79, 6795-802）のマルチクローニング部位を、クローニングの柔軟性を増大させるために修飾した。このために、プライマーpQF-MCS-fwおよびpQF-MCS-revをアニールした。これは、10μMの各プライマーを含有する100μlのアニーリングバッファー（10 mM TRIS pH7.5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA）を15分間加熱し、ついで室温にゆっくりと3時間冷却することにより行った。アニールしたプライマーを、SpeIおよびXhoIで切断されたpQ2148内に連結して、プラスミドpQ2148Fを得た。
【０１５０】
最初はZingiber zerumbetから誘導されたα-フムレンシンターゼ遺伝子zssl（Yuら, 2008, Planta. 227, 1291-9）（アクセッション番号AB263736.1）をM. extorquens AM1に関してコドン最適化して、配列番号16のDNA配列を得た。プライマーZSSI-fwおよびZSSI-revを使用して、pCM80（MarxおよびLidstrom, 2001, Microbiology. 147, 2065-2075）およびpHC115（ChouおよびMarx, 2012, Cell reports. 1, 133-40）内への挿入のために、配列番号16のコドン最適化遺伝子を増幅した。pQ2148FのRBS最適化変異体（221,625の翻訳開始率（TIR））を、プライマーZSSI-RBS-fwおよびZSSI-revを使用して増幅した。221,625のTIRを有するzssIのRBS最適化変異体は核酸配列AGCTTAAGGATAAAGAAGGAGGTAAAAC（配列番号41）を含有する。Saccharomyces cerevisiaeからのFPPシンターゼERG20の遺伝子を、プライマーERG20-fwおよびERG20-revを使用して、ゲノムDNAから増幅した。ERG20-rev-2と共にERG20-RBS35k-fwまたはERG20-RBS20k-fwを使用してRBS最適化変異体を増幅して、36,800または22,000のTIRを有するRBSをそれぞれが有する2つのERG20 PCR産物を得た。22,000のTIRを有するERG20のRBS最適化変異体は核酸配列ACATCAAACCAAAGGACTTTACAGGTAGTAGAA（配列番号39）を含有する。36,800のTIRを有するERG20のRBS最適化変異体は核酸配列GAGAAGAGCAGACTCGATCATAACAGGGGACTAG（配列番号40）を含有する。
【０１５１】
zssl PCR産物をSphIおよびXbaIで消化し、同一に消化されたプラスミドpCM80内に挿入して、プラスミドpFS33を得た。ついで、ERG20からのClaIおよびSnaB1で消化されたPCR産物をpFS33の同じ制限部位内にクローニングして、pFS34を得た。EcoRI制限部位を有さないhmgs遺伝子（前記を参照されたい）を、制限切断部位XbaIおよびBamH1を用いて、ERG20の後に挿入した。M. xanthusメバロン酸オペロンをBamH1およびEcoRIでpUC18-mva-opから切り出し、同一に消化されたpFS34-hmgs内に再挿入してpFS44を得た。
【０１５２】
AflIIおよびEcoRIを使用してzssIをpFS33から、zssI-ERG20をpFS34から、そしてzssI-ERG20-hmgs-MVAopをpFS44から切り出し、ついで、同一に消化されたpHC115内にそれらを挿入することにより、プラスミドpFS45（pHC115-zssI）、pFS46（pHC115-zssI-ERG20）およびpFS47（pHC115-zssI-ERG20-hmgs-MVAop）を構築した。
【０１５３】
AflIIおよびXbaIを使用してzssIおよびzssI-ERG20をそれぞれpFS33およびpFS34から切り出し、ついで、同一に消化されたpQ2148F内にそれらを挿入することにより、プラスミドpFS49（pQ2148F-zssI）およびpFS50（pQ2148F-zssI-ERG20）を構築した。HmgsおよびMVAopをXba1およびEcoRIによりpFS44から切り出し、ついでpFS50の同じ制限部位内に挿入してpFS52（pQ2148F-zssI-ERG20-hmgs-MVAop）を得た。
【０１５４】
最適化RBSを有するα-フムレンシンターゼ遺伝子zssIのPCR産物をSpeIおよびXbaIで消化し、同一に消化されたpQ2148F内に連結してpFS57を得た。最適化RBSを有するERG20のPCR産物をClaIおよびXbaIでpFS57からのzsslの後にクローニングして、pFS58（pQ2148F-zssIRBSopt-ERG20）を得た。pFS52に関して記載されているとおりにHmgs-MVAopをpFS58内に挿入してpFS59を得た。ERG20のRBS変異体（TIR = 35,000および20,000）をClaIおよびXbaIで消化し、対応するように切断されたpFS57内に挿入して、それぞれpFS60a（zssIRBSopt-ERG2035k）およびpFS60b（zssIRBSopt-ERG2020k）を得た。pFS60aおよびpFS60b内へのhmgs-MVAopの挿入はそれぞれプラスミドpFS61a（zssIRBSopt-ERG2035k-hmgs-MVAop）およびpFS61b（zssIRBSopt-ERG2035k-hmgs-MVAop）を与えた。最初にアニールしたプライマーfni-RBSopt-fwおよびfni-RBSopt-rev（アニーリング法；前記を参照されたい）を制限部位HpaIおよびBamH1内に挿入することにより、IPPイソメラーゼ遺伝子fniのRBSをpFS61aおよびpFS61bに関して最適化した。得られたプラスミドpFS62aおよびpFS62bはfni RBSに関する65,000のTIRを有する。ここで、遺伝子fniの最適化RBSはヌクレオチド配列gttctaggaggaataata（配列番号48）を有する。プラスミドpFS61aおよびpFS61b、そしてまた、pFS62aおよびpFS62bにおける遺伝子hmgsの最適化RBSは、189のTIRを有するヌクレオチド配列配列番号90を有する。
【０１５５】
使用したプライマー、プラスミドおよび株の概要を表1に示す。   
表１: 使用したプライマー、プラスミド及び株。下線付き配列及びイタリック体配列(全て5’ -- > 3’) は制限酵素の認識部位を示す。太字はリボソーム結合部位(RBS)の配列を示す。au: Salis Lab RBSカルキュレータによる翻訳開始率 (TIR); op: オペロン, MVA: メバロン酸経路。
【０１５６】
【表１】
2018507698.tif 000005
2018507698.tif 000006
2018507698.tif 000007
【０１５７】
1.5  水性有機2相振とうフラスコ培養内のα-フムレンの製造
α-フムレン産生プラスミドを含有するMethylobacterium extorquens AM1またはCM502を、塩酸テトラサイクリン（前記を参照されたい）を含有するメタノール最少培地内で培養した。前培養を寒天プレートから、5mlの培地を含有する試験管内に接種し、30℃、180rpmで48〜72時間振とうした。100mlバッフル付き振とうフラスコ内に12mlの培地を含有する主培養に前培養を0.1のOD600まで接種した。30℃、120rpmで16時間の培養の後、該主培養は初期対数増殖期（OD600 0.3〜0.6）に達した。次にクマートを誘導のために加え、3mlのドデカンを有機相として加えた。48時間のインキュベーションの後、全培養体積15mlをデカントし、3220gで10分間遠心分離した。1mlの上部ドデカン層をα-フムレン分析に使用した。細胞内α-フムレン分析のために細胞ペレットを1ml dH2Oに再懸濁させた。
【０１５８】
1.6   M. extorquens AM1のドデカンおよびα-フムレン耐性
M. extorquens AM1前培養を、5mlのメタノール最少培地（MM）を含有する試験管内で48時間培養した。15mlのMMを含有する培養、および12mlのMMと3mlのドデカンとを含有する培養の増殖比較（OD600）により、20% (v/v)ドデカンに対するM. extorquens AM1の耐性を調べた。ドデカンの存在下および非存在下の増殖比較のための培養を1つの前培養から接種した。
【０１５９】
α-フムレン耐性を2つの方法（すなわち、水相に直接加えたα-フムレンに対する耐性、および有機ドデカン層に溶解したα-フムレンに対する耐性）で試験した。第1の実験のために、エタノールに溶解した純粋なα-フムレンを、1000、500、250、100、50、25、10および5 mg/Lのα-フムレン最終濃度で、15mlのMMを含有する100mlのバッフル付き振とうフラスコに加えた。対応量のエタノールを陰性対照としてMMに加えた。種々の濃度のα-フムレンおよび対応陰性対照を含有するフラスコに、α-フムレンを含有しない前培養を0.1のOD600まで接種した。OD600を30時間にわたって記録した。
【０１６０】
前記の第2の実験のために、純粋なα-フムレンをドデカンに溶解し、1000、500、250、100、50および10mg/Lのα-フムレンを含有する溶液を調製した。各α-フムレン濃度に関して12mlのMMおよび3mlのドデカンをそれぞれが含有する2つの培養を、ドデカンを含有しないM. extorquens AM1の前培養から0.1のOD600まで接種した。ドデカンを含有しα-フムレンを含有しない培養を陰性対照として使用した。OD600を30時間にわたって記録した。
【０１６１】
1.7  α-フムレン分析
1mlのドデカンサンプルをNaSO4で乾燥させた。内部標準として、ドデカンに溶解した1mM ゼルンボンの25μlを225μlのドデカンサンプルに加えた。
【０１６２】
細胞内α-フムレンを以下のとおりに抽出した。再懸濁した細胞ペレットを約300mgの0.2mmガラス玉と共に4ml GC容器内に配置した。該細胞を集中的に3×30秒間ボルテックスし、その合間に氷で冷却した。細胞溶解細胞を1mlのヘキサンで3回抽出し、ついで窒素流により体積を1mlに減少させた。内部標準として、ヘキサンに溶解した25μlの1mM ゼルンボンを225μlのサンプルに加えた。
【０１６３】
Equity 5カラム（Supelco, 30 m×0.25 mm×0.25μM)を備えたGC-MS（GC17AおよびQ5050 Mass Spectrometer, Shimadzu, Kyoto, Japan）によりα-フムレンを分析し、定量した。測定は以下のとおりに2回行った。キャリヤーガス：ヘリウム、250℃で分割注入（8：1）；流速：2.2 ml/分；界面温度：250℃；プログラム：80℃で3分間維持、240℃まで16℃/分、2分間維持。保持時間はα-フムレンに関しては9.3分、そしてゼルンボンに関しては11.5分であった。質量スペクトルの3つの主フラグメンテーションを、商業的に入手したα-フムレン標準と比較することにより、サンプル中のα-フムレンを同定した（括弧内に相対強度）：93（15.5）、41（11.4）、80（6.7）。定量のために、4500、2250、900、675、450、225、90、67.5、22.5、9および4.5μMの濃度のα-フムレンをそれぞれ100μMのゼルンボンと共に含む検量線を使用した。
【０１６４】
1.8  カロテノイド抽出および分析
カロテノイド抽出のために、M. extorquens AM1またはE. coliの細胞を遠心分離によりペレット化し、ddH2Oで洗浄し、暗所で凍結乾燥した。
【０１６５】
非鹸化抽出物に関しては、2mlのメタノールを50mgの分解凍結乾燥細胞に加え、ついでそれを65℃で30分間インキュベートした。遠心分離（10分間、4000g、4℃）後、上清を窒素で乾燥させ、0.5mlの石油エーテル（40〜60℃）：ジエチルエーテル：アセトン：メタノール（40:10:15:5）混合物に再懸濁させた。沈殿したタンパク質を遠心分離（5分間、16,000g、4℃）により除去し、窒素での乾燥の後、HPLC分析のために上清を100μlのテトラヒドロフラン（THF）中に取った。鹸化抽出物に関しては、10% KOH溶液（メタノール中に溶解）でのタンパク質除去の後、上清を室温で2時間インキュベートした。ついで上部有機相を窒素で乾燥させ、HPLC分析のために100μlのTHF中に取った。
【０１６６】
HPLC分析をShimadzu SCL10 系（SPD10A UV/VIS検出器, SPD-M10Aダイオードアレイ検出器, SIL10Aオートサンプラー, CTO-10ACカラムオーブン; それぞれShimadzu, Kyoto, Japan）で行った。溶媒Aとしてのアセトニトリル：メタノール：2-プロパノール（85:10:5）および溶媒（Solv.）Bとしての100% 2-プロパノールの勾配プログラムを使用して、逆相C18カラム（250 mm×4.5 mm×5μ; Alltech, Deerfield, USA）上でカロテノイドを分離した。32℃で1ml/分の流速で、以下の溶出プログラムを実施した：100% Solv. A, 0% Solv. B 0〜31分, 0% Solv. A, 100% Solv. B 31〜36分, 100% Solv. Aおよび0% Solv. B 36〜45分。ダイオードアレイ検出器により190〜600nmの波長範囲をモニターした。リコペンの保持時間は25.38分であった。pACCRT-MNによりStaphylococcus aureusからのジアポフィトエンデサチュラーゼおよびジアポフィトエンシンターゼを発現する大腸菌（E．coli）からのカロテノイド抽出物との比較によりジアポリコペンを同定した（表1を参照されたい）。
【０１６７】
1.9  発酵
Mettler-Toledo（Greifensee, Switzerland）のpHおよびpO2電極、2つの6パドルタービン攪拌装置ならびに下向きパドル撹拌装置を有する2.4 lのKLF 2000発酵槽（Bioengineering AG, Wald, Switzerland）においてフェドバッチ培養を行った。濾過滅菌した空気または酸素を50 l/時の流速で供給した。全ての実験は、NH4OH（30%）の自動導入により調節される6.75のpHおよび30℃で行った。溶存酸素（DO）の濃度を、700rpmから開始する撹拌速度の調節により自動的に調節した。BINOS 1001ガス分析装置（Rosemount Analytical, Hanau, DE）を使用して、排気において酸素および二酸化炭素を測定した。透析プローブを備えたProcessTRACE 1.21系（Trace Analytics, Braunschweig, DE）でメタノール濃度をオンラインでモニターし、半時間ごとに調節した。メタノール供給を以下のとおりに設計した：1 g/l, 0.79 g（1 ml）未満および0.5 g/l, 1.42 g（1.8 ml）未満の濃度では、Watson-Marlow 505Du蠕動ポンプ（Cornwall, England）によりメタノールを導入した。機械的消泡装置として液相上に直接取り付けられた6パドルタービン攪拌装置に加えて、発泡を抑制するために、消泡Bエマルション（Sigma-Aldrich）を手動で加えた。
【０１６８】
900mlの発酵培地（前記を参照されたい）のin situ滅菌の後、0.5〜1のOD600の発酵槽に、振とうフラスコ内で72時間増殖させた前培養を接種した。5〜10のOD600が得られた後、15% ドデカンおよびメタノール中の新たに調製されたストック溶液からの100μM クマートを加えた。誘導後、メタノール供給速度を倍加させた。誘導された培養を更に120時間培養し、サンプルを手動で抜き取り、その細胞乾燥質量およびOD600を水相から決定し、有機ドデカン相中のα-フムレンを測定した（前記のとおりに行った）。
【０１６９】
2．結果
2.1  構成プロモーターを含有するプラスミドを使用するα-フムレンの製造（比較例）
Methylobacterium extorquens AM1はファルネシルピロリン酸（FPP）プールを内因的に産生するが、これはメナキノン、ホパンおよびカロテノイドに変換される（図1を参照されたい）。原理上は、この細菌は異種α-フムレンシンターゼの組換えによりα-フムレンを合成しうるであろう。プラスミドpCM80は強力なpmxaFプロモーターを含有し、α-フムレンシンターゼ遺伝子zssIの発現のためのベクターとして、これを選択した。Zingiber zerumbetからの遺伝子のコドン最適化変異体をpCM80内に導入してpFS33を得た。α-フムレン産生を更に増加させるために、Saccharomyces cerevisiaeからのFPPシンターゼ（ERG20）をzssI遺伝子の後のpFS33内にクローニングしてpFS34（pCM80-zssI-ERG20）を得た。
【０１７０】
ドデカンを有機相として使用する水性有機2相培養として、前記の条件下で培養を行った。細胞内α-フムレンは検出可能でなかったため、α-フムレンの強力な疎水性はドデカン相内の完全な蓄積を引き起こす。
【０１７１】
このことから特に2つの利点が導き出される。すなわち、α-フムレン濃度はドデカン相において直接的に測定可能であり、ドデカンの高い沸点によりα-フムレンの蒸発が低下する。更に、M. extorquens AM1は20% ドデカンに対する耐性を示し、毒性効果または増殖に対する影響は認められない。
【０１７２】
図2におけるα-フムレン標準と比較した場合の類似した保持時間のピークおよび質量スペクトルにより示されるとおり、プラスミドpFS33を含有するM. extorquens AM1（以下においてはAM1とも略記される）はα-フムレンを産生することが可能であった。これとは対照的に、空ベクター対照を含有するM. extorquens AM1ではα-フムレンは検出可能でなかった。
【０１７３】
M1 pFS33およびAM1 pFS34のどちらにおいても、2.3 mg/Lのα-フムレンが測定された。pFS34からのFPPシンターゼERG20はα-フムレン濃度を増加させないらしい。このより詳細な理由は不明である。
【０１７４】
2.2  異種メバロン酸経路（MVA）の組込み
しかし、驚くべきことに、ここで、特にMVA経路の酵素の異種発現がα-フムレンの形成の改善を招くことを見出すことができた。
【０１７５】
MVA前駆体アセトアセチル-CoAはM. extorquensの一次代謝の成分であるため（図1を参照されたい）、これは尚更驚くべきことである。異種導入MVA経路におけるアセトアセチル-CoAの除去により、M. extorquensの一次代謝における相当な不均衡が当然予想された。
【０１７６】
この懸念は最初は以下の予備実験により実証された。zssI、ERG20ならびにM. xanthus MVA遺伝子hmgs、fni、hmgr、mvaK、mvaK2およびmvaDを含有するpFS44の、エレクトロコンピテント（electrocompetent）M. extorquens AM1内への形質転換は、メタノール最少培地においてもコハク酸最少培地においても、認識可能な増殖をもたらさなかった。MVA経路の構成的発現はM. extorquensにとって十分には耐えられないものであるらしい。
【０１７７】
2.3  α-フムレンの毒性
M. extorquensがテルペンの産生株として少しでも適しているのかどうかを確認するために、まず、該細菌がより高い濃度のテルペンによって増殖抑制されるのかどうかを調べた。
【０１７８】
テルペンは、しばしば、細菌に対する毒性効果を有する。M. extorquensに対するα-フムレンの毒性を種々の濃度のα-フムレンの存在下の増殖分析により調べた。α-フムレンを含有するドデカン層を第2相としてM. extorquens培養に加えた。もう1つのアプローチにおいては、α-フムレンを水相に直接加えた。図3に示されている結果は、テルペン、特にα-フムレンの産生プラットフォームとしてM. extorquensが適していることを示している。
【０１７９】
2.4  クマート誘導性プロモーターを使用するα-フムレンの製造
MVA遺伝子の誘導性発現のために、以下のとおり、誘導性プロモーターを含有する適当なプラスミド系を使用した。このためには、α-フムレンシンターゼの遺伝子を、単独で、またはFPPシンターゼERG20と組合せて、ならびにERG20およびMVA経路遺伝子と組合せて、クマート誘導性プロモーターを含有するプラスミドpHC115（ChouおよびMarx, 2012）内にクローニングして、それぞれプラスミドpFS45、pFS46およびpFS47を得た。
【０１８０】
形質転換後、pFS45およびpFS46に関してはコロニーが得られたが、pFS47に関してはほとんど検出できなかった。それに束縛されるものではないが、pFS45およびpFS46に関して図4に示されているデータは、これを説明しうるものであろう。すなわち、50%以上のα-フムレンが誘導無しで既に産生されていた。pHC115の遺伝子発現は厳密ではなく、MVA遺伝子の残存発現はM. extorquensの増殖に悪影響を及ぼす。
【０１８１】
プラスミドpQ2148は非常に厳密なクマート誘導性2148プロモーターを含有する。zssIを、単独で、そしてこの場合もERG20と、また、MVA遺伝子と組合せて、pQ2148F内に導入して、pFS49（zssI）、pFS50（zssI-ERG20）およびpFS52（zssI-ERG20-MVA）を得た。pFS49、pFS50、そしてpFS52に関しても、M. extorquens内への形質転換の後、コロニーが得られた。ただし、pFS52のコロニーは、30℃で8日間の増殖の後でさえも、非常に小さかった。α-フムレン濃度はAM1 pFS49においては11 mg/L、そしてAM1 pFS50においては17 mg/Lに達したが（図4を参照されたい）、これは、pFS34およびpFS46と比較して、zssI-ERG20構築物における6倍または1.6倍の増加である。pHC115構築物と比較して、バックグラウンド産生、すなわち、誘導無しの産生は、僅か5%であった。
【０１８２】
代謝における流動不均衡の補償は多種多様な手段により達成されうる。例えば、プロモーターの強度、誘導物質の濃度、プラスミドのコピー数またはそれらの組合せが決定的に重要でありうる。ここでは、驚くべきことに、種々のリボソーム結合部位（RBS）の翻訳開始率（TIR）がテルペン合成の改善に重要であることが判明した。
【０１８３】
まず第1に、プラスミドpFS57（zssI225k）、pFS58（zssI225k-ERG20）およびpFS59（zssI225k-ERG20-MVA）におけるα-フムレンシンターゼRBSのTIRが146倍増加した（表2を参照されたい）。
【０１８４】
表２: 種々のプラスミドの異種メバロン酸経路遺伝子hmgs(ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ)及びfni(IPPイソメラーゼ)(Myxococcus xanthus由来)、FPPシンターゼERG20及びα-フムレンシンターゼzssIの天然及び最適化リボソーム結合部位(RBS)の翻訳開始率(TIR)。増殖: 形質転換後のメタノール寒天上のAM1のコロニー形成: ++++: 空ベクターと同様(3〜4日), +++: 4〜5日, ++: 5〜6日, +: 6〜7日, -: 8日後にコロニーは認識不可能; wt: 未知RBSを有するM. extorquens AM1由来の天然FPPシンターゼ; 中間体: AAc-CoA: アセトアセチル-CoA, HMG-CoA: ヒドロキシメチルグルタリル-CoA, IPP: イソペンテニルピロリン酸, DMAPP: ジメチルアリルピロリン酸, FPP: ファルネシルピロリン酸:
【０１８５】
【表２】
2018507698.tif 000008
【０１８６】
図5において認められうるとおり、zssI単独のRBSの最適化は、MVA経路の前駆体の追加的供給を行わない場合、α-フムレン産生の増加をもたらさない（pFS57およびpFS58）。pFS59（zssI225k-ERG20-MVA）での形質転換体は、zssI RBS最適化を伴わないpFS52含有株と同等に、ゆっくりと増殖した（表2を参照されたい）。
【０１８７】
ERG20 RBSのTIRはzssI RBSのTIRに対して約1:10の比で増加した（表2を参照されたい）。zssI RBS最適化と組合されたERG20のRBS最適化はMVAの非存在下でα-フムレン形成を増加をもたらさなかった（pFS60aおよびpFS60b；図5を参照されたい）。
【０１８８】
RBS最適化α-フムレンシンターゼ、RBS最適化FPPシンターゼおよび存在するMVA酵素の組合せはプラスミドpFS61bを与え、これは良好な増殖を可能にする（ERG20のTIRは22,000である）。α-フムレン濃度は、大きなばらつきが認められたものの、pFS61bでの幾つかのAM1形質転換体によって60mg/Lまでに達した（平均産生は35mg/Lであった）。
【０１８９】
IPPイソメラーゼのRBSの最適化は平均α-フムレン産生の更なる増加、および形質転換体間のα-フムレン産生における大きなばらつきの減少をもたらした。プラスミドpFS62aおよびpFS62bにおいてはfni RBSのTIRは65,000に増加した（表2を参照されたい）。株AM1 pFS62bおよびAM1 pFS62aはAM1 pFS61bと比較して更に改善した増殖を示している。
【０１９０】
株AM1 pFS62bにおいては、58mg/Lの濃度のα-フムレンが形成し、形質転換間のばらつきはAM1 pFS61bと比較して有意に減少した（図5を参照されたい）。48時間の誘導後に光学濃度は約3であり、これは1g/lの細胞乾燥重量に相当する。
【０１９１】
α-フムレンシンターゼ、FPPシンターゼおよびIPPイソメラーゼのRBSの適合化による最後に記載されている実施形態に従い、M. extorquensにおけるMVA経路の異種発現を行った。pFS62b（zssI220k-ERG2020k-fni65k-MVA）を含有するM. extorquensにより、58mg/Lの濃度のα-フムレンが得られた。これは、異種MVA経路の非存在下で過剰発現α-フムレンシンターゼおよび過剰発現FPPシンターゼを含有する株と比較して少なくとも3倍の増加である。
【０１９２】
2.5  カロテノイド生合成欠損M. extorquens株におけるα-フムレンの製造
M. extorquensにおけるカロテノイド生合成は前駆体FPPに関してα-フムレンシンターゼと競合する（図1を参照されたい）。もう1つの実施例においては、カロテノイド合成欠損突然変異体の使用がα-フムレン産生を更に増加させうる可能性があるであろう。このためには、無色M. extorquens AM1突然変異体株CM502（Van Dienら, 2003）はであった。株CM502からのカロテノイドの抽出および分析（前記を参照されたい）は、それがジアポリコペンを産生するが、リコペン（これは同じUVスペクトルを有するが、異なる保持時間を有する）を産生しないことを示した（図6Aを参照されたい）。データは、株CM502がジアポリコペンオキシダーゼ突然変異体（crtNb）であることを示している。なぜなら、それはジアポリコペンを尚も産生しているが、エステル化／グリコシル化誘導体を産生していないからである。
【０１９３】
プラスミドpFS62bを含有する株ΔcrtNbのα-フムレン産生は、再び、プラスミドpFS62bを含有するM. extorquens AM1野生型に対して約30%、有意に増加した（図6Bを参照されたい）。したがって、振とうフラスコにおいて少なくとも75mg/lのα-フムレンの産生力価が達成可能であった。
【０１９４】
ここで、α-フムレンの前記濃度（例えば、58mg/Lまたは75mg/L）は、例えば、外的に添加する必要のある高価なリチウムアセトアセタートまたはDL-メバロナートを使用することなく、既に達成されていることに注目すべきである。更に、安価なメタノール最少培地の使用により前記濃度が達成されたことは有利である。先行技術とは対照的に、TBまたはLBベース発酵培地は不要である。これは、得られたテルペン産物の精製の単純化における更なる利点をもたらす。なぜなら、明確に定められた最少培地が使用可能だからである。副産物の面倒な除去が最小限にされうる。また、本明細書に記載されている株は増殖のための唯一の炭素源としてのメタノールの使用を開拓するものである。
【０１９５】
2.6  フェドバッチ培養におけるα-フムレンの製造
本発明によるM. extorquensに基づくα-フムレン産生の生産性を試験するために、メタノール限定フェドバッチ発酵を行った。前記の水性有機2相培養を用いた。
【０１９６】
プラスミドpFS62bを含有するM. extorquens AM1またはΔcrtNbを5〜10のOD600まで増殖させた後、α-フムレン合成経路の発現をクマートで誘導し、ドデカン相を加えた。一定のpH、> 30%の溶存酸素レベルおよび約1g/Lのメタノール濃度で更なる培養を行った。発酵当たり80〜90の平均OD600値が達成され（表3を参照されたい）、これは約30g/lの細胞密度に相当する。図7に示されているとおり、α-フムレン産生は増殖依存的であった。プラスミドpFS62bを含有するM. extorquens AM1により0.73 g/l〜1.02 g/lの高濃度のα-フムレンが産生された。1.65 g/lの最大濃度のα-フムレンが、プラスミドpFS62bを含有する株M. extorquens ΔcrtNbにより産生された。これは、プラスミドpFS62bを含有する株AM1による最高濃度1.02 g/lと比較して57%の増加である（表3を参照されたい）。1.65 g/lの最大産物濃度は、振とうフラスコにおける培養により得られた最高濃度（この場合、α-フムレン/OD600比は約20mg*l-1/OD600で一定である）と比較して22倍の増加を意味する。
【０１９７】
デノボ合成可能なα-フムレンの最大理論可能収量（メタノール当たり）は0.26 g/gである。発酵5（表3を参照されたい）において得られた0.031 gα-フムレン/gMeOHの最大収量は最大理論収量の12%に相当する。
【０１９８】
表３: 株AM1及びΔcrtNb含有プラスミドpFS62bを使用して行ったメタノール限定フェドバッチ発酵の方法特性。初期対数増殖期(OD600 約10)に達した後でクマート誘導を行った。示されている値は誘導後の時点における測定値を表す。n.d.: 決定されず, cdw: 細胞乾燥重量, STY: 空時収量:
【０１９９】
【表３】
2018507698.tif 000009
【０２００】
実施例２：組換えシス-アビエノールの製造
1．材料および方法
1.1  化学物質、培地および細菌株
Methylobacterium extorquens AM1（PeelおよびQuayle, 1961. Biochem J. 81, 465-9）を、Kieferら（Kieferら, 2009）に従い、123 mMメタノールを使用して最少培地内で30℃で培養した。大腸菌（Escherichia coli）株DH5（Gibco-BRL, Rockville, USA）をLB（lysogeny broth）培地（Bertani, 1951. J. Bacteriol. 62, 293）内で37℃で培養した。塩酸テトラサイクリンをE. coliおよびM. extorquensに10μg/mlの濃度で使用した。クマート（4-イソプロピル安息香酸）を誘導物質として使用し、エタノールに溶解された100mM ストック溶液から開始する100μMの最終濃度で使用した。クマート、塩酸テトラサイクリンおよびゼルンボンをSigma-Aldrich（Steinheim, DE）から購入した。シス-アビエノールをToronto Research Chemicals（Toronto, CA）から購入した。ドデカンをVWR（Darmstadt, DE）から購入した。
【０２０１】
1.2  遺伝的操作およびプラスミド構築
当業者に公知の方法に従い、標準的なクローニング技術を行った。Toyamaら（Toyama, AnthonyおよびLidstrom 1998）に記載されているとおりにプラスミドでのM. extorquens AM1の形質転換を行った。リボソーム結合部位（RBS）をリボソーム結合部位カルキュレータ（Salis, 2011）の補助により設計した。
【０２０２】
1.3  シス-アビエノールの製造のためのプラスミドのクローニング
シス-アビエノールの合成のためのプラスミドをプラスミドpfs62bから構築した。ppjo16（pQ2148F-AbCAS-ERG20F96C-MVA）の構築のために、元々はAbies balsameaから誘導されたシス-アビエノールシンターゼ遺伝子AbCAS（Zerbeら, 2012, J Biol Chem, 287, 12121-31）（アクセッション番号JN254808.1）をM. extorquens AM1に関してコドン最適化して配列番号50のDNA配列を得た。配列番号50のコドン最適化遺伝子を、プライマーpj05およびpj25を使用して、pfs62b内への挿入のために増幅した。AbCAS遺伝子のRBSは核酸配列TATTAATATTAAGAGGAGGTAATAA（配列番号51）を有し、233,000の翻訳開始率（TIR）を有する。Saccharomyces cerevisiaeからのGGPPシンターゼERG20F96Cの遺伝子（配列番号52）（Igneaら, 2015, Metabolic Engineering, 27, 65-75）を、プライマーpj26、pj16、pj17およびpj10を使用する突然変異誘発PCRにより、ERG20から得た。ERG20F96CのRBSのTIRは10,000に設定され、それは核酸配列CTTAAACTAACCGAGATAGGAACGAATTTTACAA（配列番号53）を有する。SpeIおよびXbaIで切断されたベクターpfs62b. 2内へのGibsonクローニングによるAbCASおよびERG20F96CからのPCR産物の挿入により、プラスミドppjo16を構築した。
【０２０３】
プラスミドppjo17（pQ2148F-NtLPPS-NtABS-ERG20F96C-MVA）の構築のために、Nicotiana tabacumからのLPPシンターゼ遺伝子NtLPPS（Sallaudら, 2012, Plant J, 72, 1-17）（アクセッション番号HE588139.1）およびNicotiana tabacumからのシス-アビエノールシンターゼ遺伝子NtABS（Sallaudら, 2012, Plant J, 72, 1-17）（アクセッション番号HE588140.1）をM. extorquens AM1に関してコドン最適化して、それぞれ配列番号54および配列番号55のDNA配列を得た。対応RBSは遺伝子NtLPPSに関しては145,000のTIRおよびDNA配列CAACGGCCCTTACAAAAGGAGGTTAATTATT（配列番号56）を有し、遺伝子NtABSに関しては130,000のTIRおよびDNA配列GATAGAAACCCTTAATTAAGAAGGAGGTCCTTA（配列番号57）を有する。配列番号54のコドン最適化NtLPPS遺伝子をプライマーpj05およびpj27で増幅し、コドン最適化NtABS（配列番号55）の増幅にはプライマーpj28およびpj29を使用した。プラスミドppjo17に関しては、プライマーpj30、pj16、pj17およびpj10での突然変異誘発PCRにより遺伝子ERG20F96C（配列番号52）を得た。ppjo17におけるERG20F96CのRBSのTIRを9,500に設定し、それは核酸配列AACCACTAAGAACACAGACTTATACACAGGAGGAT（配列番号58）を有する。SpeIおよびXbaIで切断されたベクターpfs62b内へのGibsonクローニングによるNtLPPS、NtABSおよびERG20F96CからのPCR産物の挿入により、プラスミドppjo17を構築した。
使用したプライマー、プラスミドおよび株の概要を表4に示す。
【０２０４】
【表４】
2018507698.tif 000010
2018507698.tif 000011
【０２０５】
1.4  水性有機2相振とうフラスコ培養内のシス-アビエノールの製造
シス-アビエノール産生プラスミドを含有するMethylobacterium extorquens AM1を、テトラサイクリン-5塩酸塩（前記を参照されたい）を含有するメタノール最少培地内で培養した。前培養を寒天プレートから、5mlの培地を含有する試験管内に接種し、30℃、180rpmで48時間振とうした。100mlバッフル付き振とうフラスコ内に12mlの培地を含有する主培養に前培養を0.1のOD600まで接種した。30℃で16時間の培養の後、該主培養は初期対数増殖期（OD600 0.3〜0.6）に達した。次にクマートを誘導のために加え、3mlのドデカンを有機相として加えた。48時間のインキュベーションの後、全培養体積15mlをデカントし、3220gで10分間遠心分離した。1mlの上部ドデカン層をシス-アビエノール分析に使用した。
【０２０６】
1.5  シス-アビエノール分析
1mlのドデカンサンプルをNaSO4で乾燥させた。内部標準として、1mM ゼルンボンを含有するドデカン溶液25μlを225μlのドデカンサンプルに加えた。Equity 5カラム（Supelco, 30 m×0.25 mm×0.25μM)を備えたGC-MS（GC17AおよびQ5050 Mass Spectrometer, Shimadzu, Kyoto, Japan）によりシス-アビエノールを分析し、定量した。測定は以下のとおりに行った。キャリヤーガス：ヘリウム、250℃で分割注入（2：1）；流速：2.2 ml/分；界面温度：250°5C；プログラム：80℃で3分間維持、240℃まで16℃/分、2分間維持。保持時間はシス-アビエノールに関しては14.1分、そしてゼルンボンに関しては11.3分であった。質量スペクトルの3つの主フラグメンテーションを、商業的に入手したシス-アビエノール標準と比較することにより、サンプル中のシス-アビエノールを同定した（括弧内に相対強度）：119 (15.9)、134 (30.3)、191 (6.0)。定量のために、100、50、20、10、5、2、1 mg/Lの濃度のシス-アビエノールをそれぞれ100μMのゼルンボンと共に含む検量線を使用した。
【０２０７】
2  結果
2.1  構成プロモーターを含有するプラスミドを使用するシス-アビエノールの製造（比較例）
Myxococcus xanthusからのメバロン酸オペロンおよびMethylobacterium extorquens AM1でのシス-アビエノールの製造のために、GGPPシンターゼERG20F96C（Saccharomyces cerevisiaeからのFPPシンターゼERG20）および他の遺伝子を発現させた。GGPPは、Nicotiana tabacumからの二官能性シス-アビエノールシンターゼAbCASにより直接的に、またはNicotiana tabacumからのLPPシンターゼNtPPSによるGGPPからのLPPの形成を介して逐次的に（ここで、LPPは次いで、同様にNicotiana tabacum由来であるシス-アビエノールシンターゼNtABSによりシス-アビエノールへと変換されるはずである）、シス-アビエノールへと変換されるはずである。総合すると、シス-アビエノール合成のための2つのプラスミド変異体（ppjo16およびppjo17）を構築した。
【０２０８】
プラスミドppjo16またはppjo17でのMethylobacterium extorquens AM1の形質転換の後、30℃で6日間のインキュベーションの後に最初のコロニーが出現した。それぞれppjo16およびppjo17を含有するAM1の場合、各場合において、この時点でクローンが視認可能であった。これと比較して、空ベクターpQ2148Fでは3,000個より遥かに多数の形質転換体が認識可能であった。30℃で合計8日間インキュベートした後ではじめて、シス-アビエノール産生プラスミドを含有する形質転換体において、更に多くの、しかし顕著に、より小さなコロニーも出現した。これらの観察が示すところによると、該シス-アビエノール産生プラスミドは、おそらくMethylobacterium extorquensに対して毒性であるプレニルリン酸中間体の蓄積ゆえに、該生物の増殖を顕著に妨げ、結果として、サプレッサーの形成が生じる。
【０２０９】
6日後に視認可能であった、それぞれppjo16およびppjo17を含有するAM1の2つの形質転換体、ならびに各場合において、小さなコロニーの6個を、新鮮寒天プレート上にプレーティングし、30℃で6日間インキュベートした。それまでは小さかった形質転換体の場合でさえも、再プレーティング後に大きなコロニー（すなわち、サプレッサー）が形成された。したがって、サプレッサー形成を伴わないプラスミドppjo16またはppjo17を含有する形質転換体の選択的培養は可能でなかったため、サプレッサーのみを産物形成に関して試験することが可能であった。このためには、十分な細胞量を得るために、新たに出現したサプレッサーを別の新鮮寒天プレート上にプレーティングし、30℃で7日間インキュベートした。水性有機2相培養として前記で記載されている条件下で培養を行い、この場合、有機相としてドデカンを使用した。
【０２１０】
図1におけるシス-アビエノール標準と比較して同じ保持時間および質量スペクトルのピークにより示されるとおり、プラスミドppjo16を含有するM. extorquens AM1のサプレッサー突然変異体（16s6と称される）はシス-アビエノールを産生することが可能であった。これとは対照的に、空ベクター対照（pQ2148F）を含有するM. extorquens AM1ではシス-アビエノールは検出可能でなかった。ppjo16を含有するM. extorquens AM1のサプレッサー突然変異体16s6の場合、ドデカン相内に21.1 mg/Lのシス-アビエノールが測定され、これは培養ブロス内の5.3 mg/Lのシス-アビエノールの産物濃度に相当する。サプレッサー突然変異体16s6からのppjo16のプラスミド単離およびそれに続く該プラスミドの配列決定の後、該サプレッサーを与える突然変異が同定可能であった。該プラスミドのプロモーター領域において、AbCAS遺伝子の開始コドンのちょうど115ヌクレオチド前の合計28ヌクレオチドの配列が欠失していた。配列番号59はプラスミドppjo16におけるプロモーター領域の配列を表し、一方、サプレッサー突然変異体16s6からのプラスミドppjo16における突然変異プロモーター配列は配列番号60として示されている。
【０２１１】
実施例３：サンタレンの組換え製造
1．材料および方法
1.1  化学物質、培地および細菌株
Methylobacterium extorquens AM1（PeelおよびQuayle, 1961. Biochem J. 81, 465-9）を、Kieferら（Kieferら, PLoS One, e7831）に従い、123 mMメタノールを使用して最少培地内で30℃で培養した。大腸菌（Escherichia coli）株DH5（Gibco-BRL, Rockville, USA）をLB（lysogeny broth）培地（Bertani, 1951. J. Bacteriol. 62, 293）内で37℃で培養した。塩酸テトラサイクリンをE. coliおよびM. extorquensに10μg/mlの濃度で使用した。クマート（4-イソプロピル安息香酸）を誘導物質として使用し、100mM ストック溶液から開始する100μMの最終濃度で使用した。クマート、塩酸テトラサイクリン、ゼルンボンおよびサンダル油をSigma-Aldrich（Steinheim, DE）から購入した。ドデカンをVWR（Darmstadt, DE）から購入した。
【０２１２】
1.2  遺伝的操作およびプラスミド構築
当業者に公知の方法に従い、標準的なクローニング技術を行った。Toyamaら（Toyamaら, FEMS Microbiology Letters, 166, 1-7）に記載されているとおりにプラスミドでのM. extorquens AM1の形質転換を行った。リボソーム結合部位（RBS）をリボソーム結合部位カルキュレータ（Salis 2011, Methods in Enzymology, V. Christopher編, 19-42. Academic Press）の補助により設計した。
【０２１３】
1.3  サンタレンの製造のためのプラスミドのクローニング
サンタレンの合成のためのプラスミドをプラスミドpQ2418F、pfs60bおよびpfs62bから構築した。
【０２１４】
ppjo01 woMVA（pQ2148F-SSpiSSY-ERG20）およびppjo01（pQ2148F-SSpiSSY-ERG20-MVA）の構築のために、元々はSantalum spicatumから誘導されたサンタレン遺伝子SSpiSSY（Jonesら, 2011, Journal of Biological Chemistry, 286, 17445-17454）（アクセッション番号HQ343278.1）をM. extorquens AM1に関してコドン最適化して配列番号61のDNA配列を得た。配列番号61のコドン最適化遺伝子を、プライマーSSpiSSY RBSopt fwおよびSSpiSSY revを使用して、pfs60b（Sonntagら, 2015）内への挿入のために増幅した。SSpiSSY PCR産物をSpeIおよびClaIで消化し、同一に消化されたプラスミドpfs60b内に挿入してプラスミドppjo01 woMVAを得た。遺伝子SSpiSSYおよびERG20をppjo01 woMVAからXbaIおよびEcoRIで切り出し、ついで、同一に消化されたpfs62b内に挿入することにより、プラスミドppjo01を構築した。ppjo01およびppjo01 woMVAのどちらのプラスミドにおいても、SSpiSSYは核酸配列TGTTACACCCACAGAACAAACCCGAGGTAACT（配列番号62）および44,000のTIRを有し、ERG20のRBSのTIRは核酸配列ACATCAAACCAAAGGACTTTACAGGTAGTAGAA（配列番号63）および20,000のTIRを有していた。
【０２１５】
ppjo03（pQ2148F-SanSyn-ERG20）の構築のために、元々はClausena lansiumから誘導されたサンタレンシンターゼ遺伝子SanSyn（Scalcinatiら, 2012, Metabolic Engineering, 14, 91-103; Scalcinatiら, 2012, Microb Cell Fact, 11, 117）（アクセッション番号HQ452480.1）をM. extorquens AM1に関してコドン最適化して配列番号64のDNA配列を得た。配列番号64のコドン最適化遺伝子を、プライマーpj05およびpj06を使用して、pfs62b内への挿入のために増幅した。SanSyn遺伝子のRBSは核酸配列GAAGAAGGAGGTAGTCATAAAGAAGGAGGTAACTA（配列番号65）および233,000のTIRを有する。SpeIおよびBsu36Iで切断されたベクターpfs62b内へのGibsonクローニングによるSanSynからのPCR産物の挿入により、プラスミドppjo03を構築した。ERG20のRBSのTIRは22,000に設定され、それは核酸配列TCCCCAGCGCGCCCCCCAATTCAGGATAACATAG（配列番号66）を有していた。
【０２１６】
ppjo04 woMVA（pQ2148F-ERG20fusSSpiSSY）およびppjo04（pQ2148F-ERG20fusSSpiSSY-MVA）の構築のために、C末端(GGGGS)×2リンカーを含有するFPPシンターゼ遺伝子ERG20を、プライマーERG20-fus fwおよびERG20-fus revを使用して、pQ2418F（Sonntagら, Metab Eng, 32, 82-94）内への挿入のために増幅した。遺伝子SSpiSSY（配列番号61）をSSpiSSY RBSopt fwおよびSSpiSSY revで増幅し、BamHIおよびEcoRIで消化し、同一に消化されたプラスミドpQ2418F-ERG20fus内に挿入してプラスミドppjo04 woMVAを得た。遺伝子ERG20fusをppjo04 woMVAからAseIおよびEcoRIで切り出し、ついで、同一に消化されたpfs62b内に挿入することにより、プラスミドppjo04を構築した。ppjo04およびppjo04 woMVAのどちらのプラスミドにおいても、ERG20は核酸配列AAACATAGCATATTAGCAGATTAAGGACATACGT（配列番号67）および53,000のTIRを有していた。
【０２１７】
ppjo05（pQ2148F-SSpiSSYfusERG20-MVA）の構築のために、コドン最適化サンタレンシンターゼ遺伝子SspiSSY（配列番号61）をプライマーpj01およびpj08で増幅した。N末端(GGGGS)×2リンカーを含有するFPPシンターゼERG20の遺伝子を、プライマーpj09およびpj10を使用して増幅した。融合タンパク質のTIRを402,000に設定し、それは核酸配列CCCCTTCCCTTATTTAAACCAGAGGAGGTAACAAA（配列番号68）を有していた。SpeIおよびXbaIで切断されたベクターpfs62b内へのGibsonクローニングによるSSpiSSYおよびfusERG20からのPCR産物の挿入により、プラスミドppjo05を構築した。
【０２１８】
ppjo06（pQ2148F-SSpiSSY-ERG20 RBSmax）の構築のために、コドン最適化サンタレンシンターゼ遺伝子SspiSSY（配列番号61）をプライマーpj01およびpj77で増幅した。SSpiSSY遺伝子の最適化RBSは配列番号68の核酸配列を有し、402,000のTIRを有していた。FPPシンターゼERG20の遺伝子を、プライマーpj10およびpj78を使用して増幅した。ERG20のTIRを1,344,000に設定し、それは核酸配列AACCAAATAGGATTAGCACAGAAGGGGGTAATA（配列番号69）を有していた。SpeIおよびXbaIで切断されたベクターpfs62b内へのGibsonクローニングによるSSpiSSYおよびERG20からのPCR産物の挿入により、プラスミドppjo06を構築した。
【０２１９】
hmgs遺伝子のRBSのTIRを、フムレン合成プラスミドpfs62bと同様に、プラスミドppjo01、ppjo03およびppjo04における189に維持した。プラスミドppjo05およびppjo06に関しては、hmgsのRBSのTIR値を6345に設定した。
【０２２０】
使用したプライマー、プラスミドおよび株の概要を表5に示す。
【０２２１】
【表５】
2018507698.tif 000012
2018507698.tif 000013
【０２２２】
1.4  水性有機2相振とうフラスコ培養内のサンタレンの製造
サンタレン産生プラスミドを含有するMethylobacterium extorquens AM1を、テトラサイクリン-5塩酸塩（前記を参照されたい）を含有するメタノール最少培地内で培養した。前培養を寒天プレートから、5mlの培地を含有する試験管内に接種し、30℃、180rpmで48時間振とうした。100mlバッフル付き振とうフラスコ内に12mlの培地を含有する主培養に前培養を0.1のOD600まで接種した。30℃で16時間の培養の後、該主培養は初期対数増殖期（OD600 0.3〜0.6）に達した。次にクマートを誘導のために加え、3mlのドデカンを有機相として加えた。48時間のインキュベーションの後、全培養体積15mlをデカントし、3220gで10分間遠心分離した。1mlの上部ドデカン層をサンタレン分析に使用した。
【０２２３】
1.5  サンタレン分析
1mlのドデカンサンプルをNaSO4で乾燥させた。内部標準として、1mM ゼルンボンを含有するドデカン溶液25μlを225μlのドデカンサンプルに加えた。
【０２２４】
Equity 5カラム（Supelco, 30 m×0.25 mm×0.25μM)を備えたGC-MS（GC17AおよびQ5050 Mass Spectrometer, Shimadzu, Kyoto, Japan）によりサンタレンを分析した。測定は以下のとおりに行った。キャリヤーガス：ヘリウム、250℃で分割注入（8：1）；流速：2.2 ml/分；界面温度：250℃；プログラム：80℃で3分間維持、240℃まで16℃/分、2分間維持。サンタレン標準は商業的に入手可能でないため、これの代わりに、サンダル油をサンプル中のサンタレン産物の分析のために使用した。測定前に、サンダル油をドデカン中で1:500希釈した。サンダル油中に含有されている種々の物質は11〜12.4分に溶出した。
【０２２５】
2  結果
2.1  構成プロモーターを含有するプラスミドを使用するサンタレンの製造（比較例）
Myxococcus xanthusからのメバロン酸オペロンおよびMethylobacterium extorquens AM1でのサンタレンの製造のために、Saccharomyces cerevisiaeからのFPPシンターゼERG20および他の遺伝子を発現させた。FPPはSantalum spicatum（SSpiSSY）またはClausena lansium（SanSyn）からのサンタレンシンターゼによりサンタレンへと変換されるはずである。また、サンタレンシンターゼSSpiSSYとFPPシンターゼERG20とからの融合タンパク質をサンタレン産生に関して試験した。合計7個のプラスミド変異体（ppjo01, ppjo01 woMVA, ppjo03, ppjo04, ppjo04 woMVA, ppjo05, ppjo06）をサンタレン合成のために構築した。
【０２２６】
該サンタレン産生プラスミドでのMethylobacterium extorquens AM1の形質転換の後、30℃で5日間のインキュベーションの後にコロニーが出現した。メバロン酸経路を含有しないプラスミド（pQ2418F, ppjo01 woMVA, ppjo04 woMVA）およびRBS hmgsのTIRが189に設定されたプラスミドに関しては、3,000個より遥かに多数の形質転換体が認識可能であった。これと比べて、約100個の視認可能なコロニーを示した、6345のhmgsのRBSのTIRを有するプラスミド（ppjo05, ppjo06）では、顕著に少数の形質転換体が出現した。30℃で合計8日間インキュベートした後、それぞれppjo05およびppjo06を含有する形質転換体において、更に多くの、しかし顕著に、より小さなコロニーが出現した。これらの観察が示すところによると、hmgsのRBSの高設定TIRを有するサンタレン産生プラスミドは、おそらくMethylobacterium extorquensに対して毒性であるプレニルリン酸中間体の蓄積ゆえに、該生物の増殖を顕著に妨げ、結果として、サプレッサーの形成が生じた。
【０２２７】
5日後に視認可能であった、それぞれppjo05およびppjo06を含有するAM1の形質転換体、ならびに各場合において、より小さなコロニーの6個を、新鮮寒天プレート上にプレーティングし、30℃で6日間インキュベートした。それまでは小さかった形質転換体の場合でさえも、再プレーティング後に大きなコロニー（すなわち、サプレッサー）が形成された。したがって、サプレッサー形成を伴わないプラスミドppjo05またはppjo06を含有する形質転換体の選択的培養は可能でなかったため、サプレッサーのみを産物形成に関して試験することが可能であった。このためには、十分な細胞量を得るために、新たに出現したサプレッサーを別の新鮮寒天プレート上にプレーティングし、30℃で7日間インキュベートした。サプレッサー形成が生じなかったM. extorquensのその他の株に関しては、同様に、各場合において3つの異なるクローンを新たな寒天プレート上にプレーティングし、30℃で7日間インキュベートした。
【０２２８】
水性有機2相培養として前記で記載されている条件下で培養を行い、この場合、有機相としてドデカンを使用した。
【０２２９】
図1におけるサンド油中の物質と比較して同じ保持時間および質量スペクトルを有するα-サンタレンのピークにより示されるとおり、プラスミドppjo01 woMVA、ppjo03, ppjo04、ppjo04 woMVAまたはppjo05を含有するM. extorquens AM1はサンタレンを産生することが可能であった。例示として、プラスミドppjo03を含有するM. extorquens AM1からのサンプルのクロマトグラムおよび質量スペクトルが示されている。これとは対照的に、空ベクター対照（pQ2148F）を含有するM. extorquens AM1ではサンタレンは検出可能でなかった。
【０２３０】
実施例において本明細書に記載されている細菌株および発酵条件は、本発明の範囲から逸脱することなく、容易に適合可能である、と当業者は認識する。したがって、メタノールまたはエタノールからの他のセスキテルペン、例えば潜在的なバイオ燃料、例えばビサボレン、または芳香物質、例えばサンタレン、またはジテルペン、例えばスクラレオールの製造のための単純な適合化（応用）が認識可能である。本発明は、食糧と競合しない炭素源であるメタノールまたはエタノールからのテルペンの生物学的製造を可能にする。
【０２３１】
特許請求の範囲、明細書および図面に従う構成の詳細、空間的配置および方法の工程を含む全ての特徴および利点は、それ自体で、そしてまた、多種多様な組合せで、本発明に必須でありうる。
【０２３２】
引用された非特許文献
Ajikumar, P. K., Tyo, K., Carlsen, S., Mucha, O., Phon, T.H. Stephanopoulos, G., 2008. terpenoids: opportunities for biosynthesis of natural product drugs using engineered microorganisms. Molecular pharmaceutics. 5, 167-90
Asadollahi, M. A., Maury, J., Moller, K., Nielsen, K. F., Schalk, M., Clark, A., Nielsen, J., 2008. Production of plant sesquiterpenes in Saccharomyces cerevisiae: Effect of ERG9 repression on sesquiterpene biosynthesis. Biotechnology and Bioengineering. 99, 666-677; 
Bertani, G. (1951) STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1. J Bacteriol, 62, 293. 
Caniard, Anne, et al. "Discovery and functional characterization of two diterpene synthases for sclareol biosynthesis in Salvia sclarea (L.) and their relevance for perfume manufacture." BMC plant biology 12.1 (2012): 119.
Chandran, S., Kealey, J., Reeves, C., 2011. Microbial production of isoprenoids. Process Biochemistry. 46, 1703-1710
Chou, H. H., Marx, C. J., 2012. Optimization of gene expression through divergent mutational paths. Cell reports. 1, 133-40.
Entian, K.-D., Koetter, P., 1998. Yeast mutant and plasmid collections. In: Brown, A. J. P., Tuite, M. F., Eds.). Academic Press Ltd., San Diego, pp. 431-449.
Ignea, C., F. A. Trikka, K. Nikolaidis, P. Georgantea, E. Ioannou, S. Loupassaki, P. Kefals, A. K. Kanellis, V. Roussis, A. M. Makris & S. C. Kampranis (2015) Efficient 10 diterpene production in yeast by engineering Erg20p into a geranylgeranyl diphosphate synthase. Metabolic Engineering, 27, 65-75. 
Jones, C. G., J. Moniodis, K. G. Zulak, A. Scaffidi, J. A. Plummer, E. L. Ghisalberti, E. L. Barbour & J. Bohlmann (2011) Sandalwood Fragrance Biosynthesis Involves Sesquiterpene Synthases of Both the Terpene Synthase (TPS)-a and TPS-b Subfamilies, including Santalene Synthases. Journal of Biological Chemistry, 286, 17445-17454.
Kaczmarczyk, A., Vorholt, J. A., Francez-Charlot, A., 2013. Cumate-inducible gene expression system for sphingomonads and other Alphaproteobacteria. Appl. Environ. Microbiol. 79, 6795-802.
Kiefer, P., Buchhaupt, M., Christen, P., Kaup, B., Schrader, J., Vorholt, J. A., 2009. Metabolite Profiling Uncovers Plasmid-Induced Cobalt Limitation under Methylotrophic Growth Conditions. PLoS ONE. 4, e7831.
Martin, V. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D., 2003. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids. Nature biotechnology. 21, 796-802; 
Marx, C. J., Lidstrom, M. E., 2001. Development of improved versatile broad-host-range vectors for use in methylotrophs and other Gram-negative bacteria. Microbiology. 147, 2065-2075.
Mi, J., Becher, D., Lubuta, P., Dany, S., Tusch, K., Schewe, H., Buchhaupt, M., Schrader, J., 2014. De novo production of the monoterpenoid geranic acid by metabolically engineered Pseudomonas putida. Microbial cell factories. 13, 170.
Peel, D. & J. R. Quayle (1961) Microbial growth on C1 compounds. I. Isolation and characterization of Pseudomonas AM 1. Biochem J, 81, 465-9. 
Peralta-Yahya, P. P., Keasling, J.D., 2010. Advanced biofuel production in microbes. Biotechnol J. 5, 147-62; 
Puigbo, P., Bravo, I., Garcia-Vallve, S., 2008. E-CAI: a novel server to estimate an expected value of Codon Adaptation Index (eCAI). BMC Bioinformatics. 9, 65. 
Salis, H. M. 2011. Chapter two - The Ribosome Binding Site Calculator. In Methods in Enzymology, ed. V. Christopher, 19-42. Academic Press. 
Sallaud, C., C. Giacalone, R. Topfer, S. Goepfert, N. Bakaher, S. Rosti & A. Tissier (2012) Characterization of two genes for the biosynthesis of the labdane diterpene Z-abienol in tobacco (Nicotiana tabacum) glandular trichomes. Plant J, 72, 1-17. 
Sarria, S., Wong, B., Martin, H., Keasling, J.D., Peralta-Yahya, P., 2014. Microbial synthesis of Pinene. ACS Synthetic Biology 3 (7), 466-475
Scalcinati, G., C. Knuf, S. Partow, Y. Chen, J. Maury, M. Schalk, L. Daviet, J. Nielsen & V. Siewers (2012) Dynamic control of gene expression in Saccharomyces cerevisiae engineered for the production of plant sesquiterpene α-santalene in a fed batch mode. Metabolic Engineering, 14, 91-103.
Scalcinati, G., S. Partow, V. Siewers, M. Schalk, L. Daviet & J. Nielsen (2012) Combined metabolic engineering of precursor and co-factor supply to increase alpha-santalene production by Saccharomyces cerevisiae. Microb Cell Fact, 11, 117.
Sonntag, F., C. Kroner, P. Lubuta, R. Peyraud, A. Horst, M. Buchhaupt & J. Schrader (2015) Engineering Methylobacterium extorquens for de novo synthesis of the sesquiterpenoid alpha-humulene from methanol. Metab Eng, 32, 82-94.
Toyama, H., Anthony, C., Lidstrom, M. E., 1998. Construction of insertion and deletion mxa mutants of Methylobacterium extorquens AM1 by electroporation. FEMS Microbiol. Lett. 166, 1-7.
Van Dien, S. J., Marx, C. J., O'Brien, B. N., Lidstrom, M. E., 2003. Genetic characterization of the carotenoid biosynthetic pathway in Methylobacterium extorquens AM1 and isolation of a colorless mutant. Appl. Environ. Microbiol. 69, 7563-6.
Yoon, S.-H., Lee, S.-H., Das, A., Ryu, H.-K., Jang, H.-J., Kim, J.-Y., Oh, D.-K., Keasling, J. D., Kim, S.-W., 2009. Combinatorial expression of bacterial whole mevalonate pathway for the production of β-carotene in E. coli. Journal of Biotechnology. 140, 218-226; 
Yu, F., Okamto, S., Nakasone, K., Adachi, K., Matsuda, S., Harada, H., Misawa, N., Utsumi, R., 2008. Molecular cloning and functional characterization of alpha-humulene synthase, a possible key enzyme of zerumbone biosynthesis in shampoo ginger (Zingiber zerumbet Smith). Planta. 227, 1291-9.
Zerbe, P., A. Chiang, M. Yuen, B. Hamberger, B. Hamberger, J. A. Draper, R. Britton & J. Bohlmann (2012) Bifunctional cis-abienol synthase from Abies balsamea discovered by transcriptome sequencing and its implications for diterpenoid fragrance production. J Biol Chem, 287, 12121-31.
【０２３３】
配列プロトコルフリーテキスト
配列番号1:  ヒドロキシメチルグルタリル-CoA シンターゼ, Myxococcus Xanthus
配列番号2:  ヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ, Myxococcus Xanthus
配列番号3:  メバロン酸キナーゼ, Myxococcus Xanthus
配列番号4:  ホスホメバロン酸キナーゼ, Myxococcus Xanthus
配列番号5:  ピロホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ, Myxococcus Xanthus
配列番号6:  イソペンテニルピロリン酸 イソメラーゼ, Myxococcus Xanthus
配列番号7:  EcoRI制限部位が除去されサイレント突然変異(gaattcからgagttcへ)が挿入されたMyxococcus xanthus由来のhmgs遺伝子
配列番号8:  Myxococcus xanthus由来のhmgr遺伝子
配列番号9:  Myxococcus xanthus由来のmvaK1遺伝子
配列番号10:  Myxococcus xanthus由来のmvaK2遺伝子
配列番号11:  Myxococcus xanthus由来のmvaD遺伝子
配列番号12:  Myxococcus xanthus由来のfni遺伝子
配列番号13:  Saccharomyces cerevisiae由来のFPPシンターゼERG20, PRT
配列番号14:  Saccharomyces cerevisiae由来のFPPシンターゼERG20, DNA
配列番号15:  Zingiber zerumbet由来のセスキテルペンシンターゼ
配列番号16:  Methylobacterium extorquens AM1に関してコドン最適化されたZingiber zerumbet由来のアルファ-フムレンシンターゼzssIのDNA配列
配列番号17  プライマーHMGS-fw
配列番号18  プライマーHMGS-rev
配列番号19  プライマーHMGS-over-fw
配列番号20  プライマーHMGS-over-rev
配列番号21  プライマーMVA1_fw
配列番号22  プライマーMVA-SacIA-rev
配列番号23  プライマーMVA-SacIA-fw
配列番号24  プライマーMVA-SacIB-rev
配列番号25  プライマーMVA-SacIB_fw
配列番号26  プライマーMVA2_rev
配列番号27  プライマーpQF_MCS-fw
配列番号28  プライマーpQF_MCS-rev
配列番号29  プライマーZSSI-fw
配列番号30  プライマーZSSI-RBS-fw
配列番号31  プライマーZSSI-rev
配列番号32  プライマーERG20_fw
配列番号33  プライマーERG20-RB S(35k)-fw
配列番号34  プライマーERG20-RB S(20k)-fw
配列番号35  プライマーERG20_rev
配列番号36  プライマーERG20_rev-2
配列番号37  プライマーfni-RBSopt-fw
配列番号38  プライマーfni-RBSopt-rev
配列番号39  22,000のTIRを有するERG20の最適化RBS
配列番号40  36,800のTIRを有するERG20の最適化RBS
配列番号41  221,625のTIRを有するzssIの最適化RBS
配列番号42:  S. cerevisiae由来のGGPPシンターゼ
配列番号43:  Pantoea agglomerans由来のGGPPシンターゼ
配列番号44:  Taxus canadensis由来のGGPPシンターゼ
配列番号45:  Santalum album由来のセスキテルペンシンターゼ
配列番号46:  セスキテルペンシンターゼSantalum spicatum
配列番号47:  Abies balsamea由来のジテルペンシンターゼ
配列番号48  65,000のTIRを有するfniの最適化RBS
配列番号49  6,345のTIRを有するhmgsの最適化RBS
配列番号50  Methylobacterium extorquens AM1に関してコドン最適化されたAbies balsamea由来のシス-アビエノールシンターゼAbCASのDNA配列
配列番号51  233,000のTIRを有するAbCASの最適化RBS
配列番号52  Saccharomyces cerevisiae由来のGGPPシンターゼERG20F96CのDNA配列
配列番号53  プラスミドppjo16における10,000のTIRを有するERG20F96Cの最適化RBS
配列番号54  Methylobacterium extorquens AM1に関してコドン最適化されたAbies balsamea由来のLPPシンターゼNtLPPS遺伝子のDNA配列
配列番号55  Methylobacterium extorquens AM1に関してコドン最適化されたAbies balsamea由来のシス-アビエノールシンターゼNtABS遺伝子のDNA配列
配列番号56  プラスミドppjo16における145,000のTIRを有するNtLPPSの最適化RBS
配列番号57  プラスミドppjo16における130,000のTIRを有するNtABSの最適化RBS
配列番号58  プラスミドppjo17における9,500のTIRを有するERG20F96Cの最適化RBS
配列番号59:  CymR*の直後から始まるRBS AbCASを含むプラスミドppjo16のプロモーター領域
配列番号60:  CymR*の直後から始まるRBS AbCASを含むクローン16s6からのプラスミドppjo16のプロモーター領域
配列番号61:  Methylobacterium extorquens AM1に関してコドン最適化されたSantalum spicatum由来のサンタレンシンターゼSspiSSYのDNA配列
配列番号62:  プラスミドppjo01及びppjo01_woMVAにおける44,000のTIRを有するSSpiSSYの最適化RBS
配列番号63:  プラスミドppjo01及びppjo01_woMVAにおける20,000のTIRを有するERG20最適化RBS
配列番号64:  Methylobacterium extorquens AM1に関してコドン最適化されたClausena lansium由来のサンタレンシンターゼSanSynのDNA配列
配列番号65:  プラスミドppjo03における233,000のTIRを有するSanSynの最適化RBS
配列番号66:  プラスミドppjo03における22,000のTIRを有するERG20の最適化RBS
配列番号67:  プラスミドppjo04及びppjo04_woMVAにおける53,000のTIRを有するERG20の最適化RBS
配列番号68:  プラスミドppjo05及びppjo06における402,000のTIRを有するSSpiSSYの最適化RBS
配列番号69:  プラスミドppjo06における1,344,000のTIRを有するERG20の最適化RBS
配列番号70  プライマーpj05
配列番号71  プライマーpj10
配列番号72  プライマーpj16
配列番号73  プライマーpj17
配列番号74  プライマーpj25 
配列番号75  プライマーpj26
配列番号76  プライマーpj27
配列番号77  プライマーpj28
配列番号78  プライマーpj29
配列番号79  プライマーpj30 
配列番号80  プライマーSspiSSY_RBSopt_fw
配列番号81  プライマーSspiSSY_rev
配列番号82  プライマーpj01
配列番号83  プライマーpj06
配列番号84  プライマーERG20-fus_fw
配列番号85  プライマーERG20-fus_rev 
配列番号86  プライマーpj08
配列番号87  プライマーpj09
配列番号88  プライマーpj77
配列番号89  プライマーpj78
配列番号90  189のTIRを有するhmgsの最適化RBS
【図１】
2018507698.tif 000014
【図２−１】
2018507698.tif 000015
【図２−２】
2018507698.tif 000016
【図３】
2018507698.tif 000017
【図４】
2018507698.tif 000018
【図５】
2018507698.tif 000019
【図６】
2018507698.tif 000020
【図７】
2018507698.tif 000021
【図８】
2018507698.tif 000022
【図９−１】
2018507698.tif 000023
【図９−２】
2018507698.tif 000024
【図９−３】
2018507698.tif 000025
【配列表】
2018507698000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年12月16日(2016.12.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種テルペンシンターゼと、メチロトローフ細菌における発現のための酵素活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする組換えDNAとを含有する該メチロトローフ細菌であって、前記酵素活性を有する少なくとも1つのポリペプチドが、
ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMG-CoAシンターゼ）、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ（HMG-CoAレダクターゼ）、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ピロホスホメバロン酸デカルボキシラーゼおよびイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼからなる群から選択される異種メバロン酸経路の酵素の少なくとも1つ、ならびに
プレニル二リン酸前駆体のシンターゼ
からなる群から選択され、
前記異種メバロン酸経路の酵素の少なくとも1つが、それぞれ対応して、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号6のペプチド配列に対して、少なくとも60%の同一性を有するペプチド配列を含有することを特徴とする、メチロトローフ細菌。
【請求項２】
異種メバロン酸経路の酵素としての異種ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMG-CoAシンターゼ）およびヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ（HMG-CoAレダクターゼ）と、メチロトローフ細菌における発現のための酵素活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする組換えDNAとを含有する該メチロトローフ細菌であって、前記酵素活性を有する少なくとも1つのポリペプチドが、
メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ピロホスホメバロン酸デカルボキシラーゼおよびイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼからなる群から選択される異種メバロン酸経路の別の酵素の少なくとも1つ、
異種テルペンシンターゼ、ならびに
プレニル二リン酸前駆体のシンターゼ
からなる群から選択され、
前記異種メバロン酸経路の酵素の少なくとも1つが、それぞれ対応して、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号6のペプチド配列に対して、少なくとも60%の同一性を有するペプチド配列を含有することを特徴とする、メチロトローフ細菌。
【請求項３】
異種テルペンシンターゼが、セスキテルペンシンターゼおよびジテルペンシンターゼからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１又は２のいずれか1項に記載の細菌。
【請求項４】
異種テルペンシンターゼがセスキテルペンシンターゼであり、ここで、セスキテルペンシンターゼが環状セスキテルペンの合成のための酵素であり、該セスキテルペンが、特に、α-フムレンおよびサンタレンのエピマー、例えばα-サンタレン、β-サンタレン、エピ-β-サンタレンまたはα-エキソ-ベルガモテン、およびビサボレン、例えばb-ビサボレンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項３記載の細菌。
【請求項５】
異種テルペンシンターゼがジテルペンシンターゼ、特に、ジテルペンの合成のための酵素であり、該ジテルペンが、特に、スクラレオール、シス-アビエノール、アビタジエン、イソピマラジエン、マヌールおよびラリクソールからなる群から選択されることを特徴とする、請求項３記載の細菌。
【請求項６】
プレニル二リン酸前駆体のシンターゼが、ファルネシル二リン酸シンターゼ（FPPシンターゼ）およびゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（GGPPシンターゼ）からなる群から選択される酵素であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか1項に記載の細菌。
【請求項７】
プレニル二リン酸前駆体のシンターゼが異種FPPシンターゼであり、ここで、異種FPPシンターゼが真核生物または原核生物異種FPPシンターゼであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか1項に記載の細菌。
【請求項８】
プレニル二リン酸前駆体のシンターゼが異種GGPPシンターゼであり、ここで、異種GGPPシンターゼが、細菌、植物または真菌からなる群から選択される生物に由来する酵素であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか1項に記載の細菌。
【請求項９】
該酵素の異種発現のための組換えDNAに、共通の誘導性プロモーターまたは幾つかの相互非依存的誘導性プロモーターが付与されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか1項に記載の細菌。
【請求項１０】
組換えDNAが、各場合において、プラスミド上または染色体において相互非依存的に発現可能であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか1項に記載の細菌。
【請求項１１】
細菌がメチロトローフプロテオバクテリア、特に、Methylobacterium属またはMethylomonas属の細菌、好ましくは、Methylobacterium extorquensであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか1項に記載の細菌。
【請求項１２】
細菌が、カロテノイド生合成活性を欠く株、特に、ジアポリコペンオキシダーゼ活性を欠く株であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか1項に記載の細菌。
【請求項１３】
以下の工程、すなわち、
メタノールおよび／またはエタノール含有水性培地を準備し、
請求項１〜１２のいずれか1項に記載のメチロトローフ細菌をバイオリアクター内の該培地内で培養し、ここで、メタノールおよび／またはエタノールが該細菌によりテルペンに変換され、
バイオリアクター内で生じたセスキテルペンまたはジテルペンを分離することを含む、
メタノールおよび／またはエタノールからのセスキテルペンまたはジテルペンのデノボ微生物利用合成のための方法。
【請求項１４】
メタノールおよび／またはエタノールが、該細菌の培養のための唯一の炭素源として該培地内に含有されることを特徴とする、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
メタノールおよび／またはエタノールからのセスキテルペンまたはジテルペンのデノボ微生物利用合成のために請求項１〜１２のいずれか1項に記載の組換えメチロトローフ細菌を培養するための、メタノールおよび／またはエタノール含有培地の使用。
【請求項１６】
メタノールおよび／またはエタノールからのセスキテルペンまたはジテルペンのデノボ微生物利用合成のための、請求項１〜１２のいずれか1項に記載のメチロトローフ細菌の使用。
【国際調査報告】
2018507698.tif 000026
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