(57)【要約】酵母によって産生されたステビオール配糖体を放出または濃縮する方法が開示される。開示される方法は、ステビオール配糖体の放出または濃縮を向上または改善する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステビオール配糖体を産生するように操作された宿主細胞を含む発酵培地を、５０℃〜９５℃の範囲の温度に５分〜４８時間加熱して、前記操作された宿主細胞から１種以上のステビオール配糖体を前記発酵培地中に放出させることを含む、ステビオール配糖体を宿主細胞から放出させる方法。
【請求項２】
ｃ）１種以上のステビオール配糖体を産生するように操作された宿主細胞を含む発酵培地を提供する工程と、
ｄ）前記発酵培地を５０℃〜９５℃の範囲の温度に５分〜４８時間加熱することによって、前記操作された宿主細胞から前記１種以上のステビオール配糖体を放出させる工程とを含み、前記１種以上のステビオール配糖体は、前記宿主細胞の細胞内部分から前記発酵培地の細胞外部分に放出される、ステビオール配糖体を宿主細胞から放出させる方法。
【請求項３】
前記加熱が、７０℃〜９５℃で５分〜２時間から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記加熱が、７０℃〜９５℃で５分間から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記加熱が、約５０℃で２４時間である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記加熱が、約７５℃で５分〜２時間である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記加熱が、約９５℃で５分〜１時間である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
放出された前記ステビオール配糖体が、産生され、細胞内及び細胞外の両方で認められる総配糖体と比較して、選択された配糖体の９０％を超える、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記加熱が、細胞外窒素含量を、前記組成物の総窒素構成成分の４５％を超えて増加させない、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記加熱が、細胞外リン含量を、前記組成物の総リン構成成分の７０％を超えて増加させない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物中に放出された前記ステビオール配糖体が、前記操作された宿主細胞から更に分離または精製される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステビオール配糖体を合成するように操作された宿主細胞を含む組成物を、７０℃〜９５℃の範囲の温度に５分〜２時間加熱して、前記組成物中の前記宿主細胞から前記ステビオール配糖体を放出させることを含み、前記組成物中の細胞外窒素含量は、前記組成物の総窒素含量の４５％を超えて増加しない、ステビオール配糖体を組成物から回収する方法。
【請求項１３】
ステビオール配糖体を合成するように操作された宿主細胞を含む組成物を、７０℃〜９５℃の範囲の温度に５分〜２時間加熱して、前記組成物中の前記宿主細胞から前記ステビオール配糖体を放出させることを含み、前記組成物中の細胞外リン含量は、前記組成物の総リン構成成分の７０％を超えて増加しない、ステビオール配糖体を組成物から回収する方法。
【請求項１４】
ステビオール配糖体産生工程を含み、前記発酵培地が、前記ステビオール配糖体産生工程中、４０℃未満の温度に維持される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記操作された宿主細胞が酵母である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記操作された酵母が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｐｉｃｈｉａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの属からなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記操作された酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅ属またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に由来する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記操作された酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１８に記載の方法。
【請求項１９】
前記ステビオール配糖体が、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢまたはこれらの組み合わせから選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
放出された前記レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢまたはこれらの組み合わせが、産生され、細胞内及び細胞外の両方で認められる総配糖体と比較して、前記レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢまたは組み合わせの９０％を超える、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
放出された前記レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤまたはこれらの組み合わせが、産生され、細胞内及び細胞外の両方で認められる総配糖体と比較して、前記レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤまたはこれらの組み合わせの９０％を超える、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記発酵培地または組成物中に存在する総Ｒｅｂ  Ｄ及び／またはＲｅｂ  Ｍ（すなわち、細胞内及び細胞外の両方）のうち、細胞外に産生された前記Ｒｅｂ  Ｄ及び／またはＲｅｂ  Ｍが３３％を超える、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
放出されたＲｅｂ  Ｄが、前記発酵培地または組成物に存在するＲｅｂ  Ｄの総量のうち約３０％〜約１００％の範囲で細胞外に存在し得る、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
放出された前記Ｒｅｂ  Ｍが、前記発酵培地または組成物に存在するＲｅｂ  Ｍの総量のうち約３０％〜約１００％の範囲で細胞外に存在し得る、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｒｅｂ  Ａ量が、前記発酵中に産生されたＲｅｂ  Ａの総量のうち約３０％〜約１００％、約５０％〜約１００％、約８０％〜約９０％の範囲で細胞外に放出され得る、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｒｅｂ  Ｂ量が、前記発酵中に産生されたＲｅｂ  Ｂの総量のうち約２５％〜約１００％、約３０％〜約９５％、約４０％〜約８０％の範囲で細胞外に放出され得る、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記加熱が、前記組成物または発酵培地中の細胞外窒素含量を、前記組成物または発酵培地の総窒素含量の４０％を超えて、４５％を超えて、または５０％を超えて増加させない、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記加熱が、前記組成物または発酵培地中の細胞外リン含量を、前記組成物または発酵培地の総リン含量の６５％を超えて、７０％を超えて、または７５％を超えて増加させない、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
先行請求項のいずれか一項に記載の方法に従って得られたステビオール配糖体を含む組成物。
【請求項３０】
組成物であって、１種以上のステビオール配糖体を産生するように操作された宿主細胞と、１種以上のステビオール配糖体とを含み、前記１種以上のステビオール配糖体は、前記組成物を５０℃〜９５℃の範囲の温度に５分〜４８時間加熱することによって、前記操作された宿主細胞から放出される、前記組成物。
【請求項３１】
前記ステビオール配糖体が、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢまたはこれらの組み合わせから選択される、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
放出された前記レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢまたはこれらの組み合わせが、産生され、細胞内及び細胞外の両方で認められる総配糖体と比較して、前記レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢまたは組み合わせの９０％を超える、請求項３０または３１に記載の組成物。
【請求項３３】
放出された前記レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤまたはこれらの組み合わせが、産生され、細胞内及び細胞外の両方で認められる総配糖体と比較して、前記レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤまたはこれらの組み合わせの９０％を超える、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記発酵培地または組成物中に存在する総Ｒｅｂ  Ｄ及び／またはＲｅｂ  Ｍ（すなわち、細胞内及び細胞外の両方）のうち、細胞外に産生された前記Ｒｅｂ  Ｄ及び／またはＲｅｂ  Ｍが３３％を超える、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
放出されたＲｅｂ  Ｄが、前記発酵培地または組成物に存在するＲｅｂ  Ｄの総量のうち約３０％〜約１００％の範囲で細胞外に存在し得る、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
放出された前記Ｒｅｂ  Ｍが、前記発酵培地または組成物に存在するＲｅｂ  Ｍの総量のうち約３０％〜約１００％の範囲で細胞外に存在し得る、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記Ｒｅｂ  Ａ量が、前記発酵中に産生されたＲｅｂ  Ａの総量のうち約３０％〜約１００％、約５０％〜約１００％、約８０％〜約９０％の範囲で細胞外に放出され得る、請求項３０〜３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記Ｒｅｂ  Ｂ量が、前記発酵中に産生されたＲｅｂ  Ｂの総量のうち約２５％〜約１００％、約３０％〜約１００％、約８０％〜約９０％の範囲で細胞外に放出され得る、請求項３０〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記加熱が、細胞外窒素含量を前記組成物の総窒素含量の４５％を超えて増加させない、請求項３０〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記加熱が、細胞外リン含量を前記組成物の総リン含量の７０％を超えて増加させない、請求項３０〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本出願は、２０１６年５月２７日に作成され、９２キロバイトのサイズを有する「ＣＡＲ０２１１ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と題されたＡＳＣＩＩテキストファイルとして本出願とともに提出されたアミノ酸配列及び／または核酸配列への参照を含む。当該配列表は、米国特許法施行規則１．５２（ｅ）（５）に従い、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年５月２９日に出願された米国特許仮出願第６２／１６８，１４２号の優先権を主張するものであり、当該出願の全体を参照により本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００３】
スクロース、フルクトース及びグルコースなどの糖は、飲料、食品、医薬品、口腔衛生品及び美容製品に好ましい味を提供するために利用されている。スクロースは、特に、大部分の消費者に好まれる味を付与する。スクロースは、優れた甘味特性を提供するが、カロリーがある。消費者の需要を満たすために、ノンカロリーまたは低カロリーの甘味料が導入されている。消費者はまた、これらの甘味料が好ましい味特性を有することも望んでいる。
【０００４】
ステビアは、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）の約２４０種のハーブ及び低木の属であり、亜熱帯・熱帯地域及び北米西部から南米に生息している。Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ種は、甘葉（ｓｗｅｅｔｌｅａｆ、ｓｗｅｅｔ  ｌｅａｆ）、糖葉（ｓｕｇａｒｌｅａｆ）または単にステビアとして一般に知られ、その甘い葉のために広く栽培されている。ステビア系甘味料は、その葉から１種以上の甘味化合物を抽出することによって得ることができる。これらの化合物の多くは、ジテルペン化合物であるステビオールの配糖体である。これらのジテルペン配糖体は、砂糖よりも約１５０〜４５０倍甘い。ステビオール配糖体は、甘さの強さだけでなく、苦味、長引く後味などの味の質に寄与する他の官能特性が互いに異なる。Ｋｉｎｇｈｏｒｎ，Ａ．Ｄ．，Ｓｔｅｖｉａ：Ｔｈｅ  ｇｅｎｕｓ  Ｓｔｅｖｉａ，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（２００２）を参照されたい。
【０００５】
ステビオール配糖体の例は、ＰＣＴ国際特許出願第ＷＯ２０１３／０９６４２０号（例えば、図１の一覧を参照）；及び  Ｏｈｔａ  ｅｔ．ａｌ．，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔｅｖｉｏｌ  Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｌｅａｖｅｓ  ｏｆ  Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  Ｍｏｒｉｔａ，”  Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｉ．，５７，１９９−２０９（２０１０）（例えば、２０４頁の表４参照）に記載されている。構造上、ジテルペン配糖体は、単一の基部であるステビオールを特徴とし、ＷＯ２００１３／０９６４２０の図２ａ〜２ｋに示されているように、Ｃ１３位及びＣ１９位の炭水化物残基の存在が異なる。
【０００６】
典型的に、ステビアの葉中に認められる主要なステビオール配糖体は、乾燥重量基準で、ズルコシドＡ（０．３％）、レバウジオシドＣ（０．６〜１．０％）、レバウジオシドＡ（３．８％）及びステビオシド（９．１％）である。ステビア抽出物中で同定される他の配糖体には、レバウジオシドＢ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、ステビオールビオシド及びルブソシドのうちの１つ以上が挙げられる。
【０００７】
主なステビオール配糖体であるレバウジオシドＡが飲料用途の甘味料として一般に使用されているが、望ましくない味の問題がある。ごく最近では、より優れた味特性を有する、特定の少数のステビオール配糖に注目が集まっている。例えば、レバウジオシドＭは、他のステビオール配糖体よりも甘味度が高く、より強力である（例えば、Ｐｒａｋａｓｈ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．，８：１５２３−１５２６、及びＷＯ２０１３／０９６４２０参照）。レバウジオシドＤは、スクロースよりも約２００〜２２０倍甘味があり、官能試験では、甘味の立ち上がりが遅く、極めてすっきりしており、すなわち、スクロースよりも全体的に甘く、スクロースと比較して長引く甘味の後味が少なかった。
【０００８】
（例えば、Ｐｒａｋａｓｈ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．，１３：１５１２６−１５１３６参照）
【０００９】
組換えＤＮＡ技術により、酵母などの多種多様な宿主細胞を使用して所望のステビオール配糖体を産生することが可能となっており、また商業的に実用可能となっている。しかしながら、宿主細胞内から細胞内発現産物を回収することは、堅固な酵母細胞壁を破壊または加水分解する必要があるため、困難を伴う。また、細胞壁破壊の選択は、回収産物の下流プロセス及びその後の酵母細胞または発酵ブロスからの精製に影響を及ぼす場合があり、これにより、プロセスの効率及び費用効果に影響が出ることがある。
【発明の概要】
【００１０】
組換え酵母技術によって産生された所望のステビオール配糖体を費用効果の高い方法で効率的に回収するための方法が開示される。
【００１１】
本発明の一態様において、ステビオール配糖体を産生するように操作された宿主細胞を含む発酵培地を、５０℃〜９５℃の範囲の温度に５分〜４８時間加熱して、操作された宿主細胞から１種以上のステビオール配糖体を発酵培地中に放出させることを含む、ステビオール配糖体を宿主細胞から放出させる方法が開示される。
【００１２】
本発明の別の態様において、
ａ）１種以上のステビオール配糖体を産生するように操作された宿主細胞を含む発酵培地を提供する工程と、
ｂ）この組成物を５０℃〜９５℃の範囲の温度に５分〜４８時間加熱することによって、操作された宿主細胞から１種以上のステビオール配糖体を放出させる工程とを含み、
１種以上のステビオール配糖体は、宿主細胞の細胞内部分から発酵培地の細胞外部分に放出される、ステビオール配糖体を宿主細胞から放出させる方法が開示される。
【００１３】
本発明の更に別の態様において、ステビオール配糖体を組成物から放出させる方法が開示され、この方法は、組成物を５０℃〜９５℃の範囲の温度に５分〜４８時間加熱して、組成物中の操作された宿主細胞からステビオール配糖体を放出させる工程を含む。
【００１４】
本発明の別の態様において、ステビオール配糖体を放出させる方法が開示され、この方法は、
ａ）１種以上のステビオール配糖体を産生するように操作された宿主細胞を含む組成物を提供する工程と、
ｂ）この組成物を５０℃〜９５℃の範囲の温度に５分〜４８時間加熱することによって、操作された宿主細胞から１種以上のステビオール配糖体を放出させる工程とを含む。
【００１５】
本発明の別の態様において、組成物であって、１種以上のステビオール配糖体を産生するように操作された宿主細胞と、１種以上のステビオール配糖体とを含み、当該１種以上のステビオール配糖体は、当該組成物を５０℃〜９５℃の範囲の温度に５分〜４８時間加熱することによって、操作された宿主細胞から放出される、組成物が開示される。
【００１６】
このような方法により、細胞溶解を最小限に抑えつつ、配糖体を組成物中に放出させる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】代表的なメバロン酸経路を示す。
【００１８】
【図２】代表的な非メバロン酸経路を示す。
【００１９】
【図３】ステビオール産生に関する代表的な経路を示す。
【００２０】
【図４】ステビオールからのステビオール配糖体の生合成に関する代表的な経路を示す。
【００２１】
【図５Ａ】熱処理前の明視野顕微鏡画像のデジタル画像である。
【００２２】
【図５Ｂ】熱処理後の明視野顕微鏡画像のデジタル画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書に記載される本開示の実施形態は、網羅的であることも、以下の詳細な説明に開示される厳密な形態に本発明を限定することも意図していない。むしろ、選択され、説明される実施形態の目的は、本発明の原則及び実施に対する当業者の理解及び解釈を容易にすることを可能にすることである。本明細書で言及される全ての公開物及び特許は、その全体が参照により本明細書に援用される。本明細書に開示される公開物及び特許は、それらの開示のためにのみ提供される。
【００２４】
ステビオール配糖体の合成のために、酵母及び真菌などの宿主細胞を操作することができる。発酵中に宿主細胞によって産生された配糖体は、その一部のみが細胞内から発酵培地中に放出され得る。酵母などの宿主細胞から放出される配糖体の量を増やすために、物理的及び化学的破壊法を使用することができる。物理的破壊は、すなわち、細胞を壊して、細胞内の成分を周囲の培地中に放出させる。この結果として得られるものは、所望の組換え産物だけでなく、タンパク質、核酸、細胞代謝産物、細胞断片などの他の産物からなる複雑な混合物であり、所望の産物の回収を困難にする。化学的方法は、細胞内からの産物の拡散を可能にするように、細胞膜及び／もしくは細胞壁の構造を化学的に変更し、またはそれらを化学的に透過性にすることを伴う。しかしながら、化学的処理は、その生物及び所望の産物の放出に適合していなければならない。
【００２５】
開示されるのは、熱処理を使用した、発酵後のステビオール配糖体の効率的な回収方法である。熱は、宿主細胞（例えば、酵母及び真菌）を含む発酵ブロスまたは発酵培地に、所与の時間及び温度で供給される。宿主細胞は、所望のステビオール配糖体を産生することができる。宿主細胞を含有する発酵培地が加熱されると、その宿主細胞から最小限の細胞溶解で所望の配糖体が放出され得、これにより、所望の配糖体の発酵培地または組成物を濃縮することができる。
【００２６】
いくつかの実施形態において、開示される方法は、ステビオール配糖体を産生することが可能な操作された酵母を使用する。ステビオール配糖体を産生することが可能な操作された酵母は、細胞内での１種以上のステビオール配糖体の形成を促進する酵素（複数可）をコードする、１つ以上の外因性核酸を含み得る。
【００２７】
本明細書で使用されるとき、「ステビオール配糖体（複数可）」という用語は、ステビオールの配糖体を指す。例示的なステビオール配糖体には、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＧ、レバウジオシドＨ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＬ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ、ステビオシド、ステビオールビオシド、ズルコシドＡ及び／またはルブソシドが挙げられるが、これらに限定されない。操作された酵母は、天然に存在する（「天然」）ステビオール配糖体または天然に存在しない（非天然）ステビオール配糖体を産生することができる。本明細書で使用されるとき、「総ステビオール配糖体」（ＴＳＧ）という用語は、組成物中の全てのステビオール配糖体の乾燥（無水）基準での含量の合計として計算される。
【００２８】
構造上、ステビオール配糖体は、単一のステビオール基部である中心分子部分と、そのステビオール基部のＣ１３原子及びＣ１９原子（以下に示される基部上の原子付番に従う）に結合したグルコピラノシル残基または他の糖残基とを有する。すなわち、グルコピラノシル残基は、次式中の基Ｒ１及びＲ２で表される。
【化１】
2018516081.tif 000003
【００２９】
以下の表Ａは、いくつかのステビオール配糖体と、その対応するＲ１基及びＲ２基を示す。
表Ａ
2018516081.tif 000004
Ｇｌｕ：グルコース
Ｒｈａ：ラムノース
【００３０】
開示されるステビオール配糖体は、発酵プロセスで産生され得る。発酵プロセスは、レバウジオシドＡ（Ｒｅｂ  Ａ）、レバウジオシドＭ（Ｒｅｂ  Ｍ）及び／またはレバウジオシドＤ（Ｒｅｂ  Ｄ）などの１種以上のステビオール配糖体の産生のために操作された、遺伝子改変生物を使用することができる。ステビオール配糖体の産生は、ステビオール配糖体の合成経路を提供する一連の酵素を有する、操作された微生物菌株を使用して実施することができる。
【００３１】
種々の酵母または真菌宿主細胞を操作して、１種以上のステビオール配糖体への経路をもたらすことができる。かかる細胞は、ステビオール配糖体合成のための酵素をコードする１つ以上のＤＮＡ構築物により形質転換することができる。ステビオール配糖体経路の酵素をコードする外因性ＤＮＡ構築物の宿主に使用することができる例示的な酵母及び真菌には、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｐｉｃｈｉａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの属が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な種には、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅが含まれる。更に、宿主細胞は、発酵中の性能に改善をもたらし得る、ステビオール配糖体経路以外の遺伝子改変も含み得る。
【００３２】
「操作された宿主細胞」は、細胞のゲノム中に組み込まれるか、または細菌中のプラスミドもしくはエピソームなどの染色体外構築物上に存在するかのいずれかで、細胞中に導入された少なくとも１つの外因性ＤＮＡ配列を有する酵母及び真菌細胞を指す。本明細書は、酵母細胞について詳細に記載することがあるが、本開示は真菌細胞にも適用できることを理解されたい。
【００３３】
「外因性」という用語は、核酸などの分子または酵素活性などの活性に関係する。外因性分子は、宿主酵母または真菌中に導入される。外因性核酸は、既知の技術によって宿主生物に導入することができ、宿主の染色体物質の外部に維持され得（例えば、非組込みベクター上で維持される）、または組換え事象などによって宿主の染色体中に組み込まれ得る。一般に、操作された酵母または真菌のゲノムは、１つ以上の組換え遺伝子の安定した導入により増大する。外因性核酸は、宿主生物と同種または異種のいずれかである、酵素またはその一部をコードすることができる。外因性核酸は、分子技術によって１つ以上の点で操作され、天然に存在しない形態である核酸を指す、「組換え遺伝子またはＤＮＡ構築物」の形態であってよい。「非天然」という用語は、自然界に天然に存在しない核酸もしくはタンパク質などの分子または生物を特徴付けるために使用され得る。
【００３４】
「異種」（例えば、「外来種」）という用語は、言及されている分子または生物とは異なる由来源の分子または活性に関係する。したがって、言及されている生物に対して異種である遺伝子またはタンパク質は、その生物中に認められない遺伝子またはタンパク質である。本開示の文脈上、「異種グリコシルトランスフェラーゼ」は、宿主生物に生来存在し得る任意のグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドとは異なるグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドを指す。例えば、第１の種に認められる特定のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子であって、当該第１の種とは異なる宿主酵母または真菌生物中に外因性に導入されたグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、宿主酵母または真菌生物に対して「異種」である。
【００３５】
操作された酵母または真菌は、形質転換体の選択に好適な栄養要求性マーカーを使用することができる。宿主細胞は、ＬＹＳ２、ＬＥＵ２、ＨＩＳ３、ＵＲＡ３、ＵＲＡ５及びＴＲＰ１などの栄養要求性を制御する１つ以上の遺伝子上に改変（例えば、欠失）を含み得る。１つ以上の遺伝子構築物（複数可）は、１つ以上の外因性遺伝子の導入に望ましい遺伝的背景を有する宿主細胞を使用することで、細胞中に導入され、ゲノム中に組み込まれ、または安定的に維持されて、発現される。遺伝子構築物を宿主細胞中に導入するための方法には、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクション、エレクトロポレーションが含まれる。特に、酵母形質転換は、酢酸リチウム法、プロトプラスト法などを使用して実施することができる。導入される遺伝子構築物は、プラスミドの形態で染色体中に組み込んでもよいし、宿主の遺伝子中への挿入により、または宿主の遺伝子との相同組換えを介して組み込んでもよい。遺伝子構築物が導入された形質転換酵母は、選択マーカー（例えば、上記の栄養要求性マーカー）により選択することができる。更なる確認は、発現されたタンパク質の活性を測定することによって行うことができる。
【００３６】
ステビオール経路遺伝子を含む外因性核酸配列の形質転換は、当該技術分野においてよく知られている方法を使用して確認することができる。かかる方法には、例えば、ノーザンブロットもしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などの核酸解析、または遺伝子産物の発現に関する免疫ブロット法、または導入核酸配列もしくはその対応する遺伝子産物の発現を試験するのに適した他の分析方法が含まれる。当業者であれば、外因性核酸が所望の産物を産生するのに十分な量で発現されることを理解し、当該技術分野においてよく知られている、本明細書に開示されるような方法を使用して、十分な発現を得るように発現レベルを最適化できることも更に理解するであろう。
【００３７】
テルペノイド化合物のイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）は、操作された宿主細胞（例えば、酵母）において、ステビオール配糖体への化学前駆体として機能し得る。植物、昆虫及び一部の微生物種を含むいくつかの生物は、一連の化学中間体を介してアセチル−ＣｏＡをＩＰＰ及びＤＭＡＰＰに変換するメバロン酸（ＭＶＡ）経路を有する。いくつかの生物は、グリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）及びピルビン酸（ＰＹＲ）から開始する非メバロン酸経路（メチルＤ−エリスリトール４−リン酸またはＭＥＰ経路としても知られる）を介してＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを産生する。
【００３８】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母は、メバロン酸経路の遺伝子を自然に発現する。メバロン酸経路遺伝子には、（ａ１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）、（ｂ１）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）シンターゼ（ＥＣ４．１．３．５）、（ｃ１）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３４）、（ｄ１）メバロン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１．３６）、（ｅ１）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．４．２）及び（ｆ１）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．３３）が含まれる。メバロン酸経路酵素は、次のようにアセチル−ＣｏＡをＩＰＰに変換する。アセチル−ＣｏＡ→アセトアセチル−ＣｏＡ→３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ→メバロン酸→メバロン酸−５−リン酸→メバロン酸−５−ピロリン酸→ＩＰＰ。図１も参照されたい。
【００３９】
いくつかの実施形態において、操作された酵母は、アセチル−ＣｏＡからＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰへの流量を増やすための１つ以上の改変を含み得、これにより、ステビオールへの経路に使用されるＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰの増加したプールが得られる。この改変には、例えば、酵母細胞と同種もしくは異種である酵素をコードする核酸を、発現増加をもたらすプロモーターの制御下に置くこと、複数の核酸コピーを使用すること、及び／または天然酵素と比較してより高い酵素活性レベルを与える異種酵素、バリアント酵素（例えば、１つ以上のアミノ酸置換を含む）もしくはバリアント異種酵素を使用することなどによって、１つ以上のメバロン酸経路酵素（ａ１）〜（ｆ１）の発現または活性を増大させることが含まれ得る。
【００４０】
あるいは、ステビオール配糖体産生の前駆体であるＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを提供するには、非メバロン酸（ＭＥＰ）経路を使用することができる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母は、ＭＥＰ経路の遺伝子を自然に発現しないが、ＭＥＰ経路遺伝子を与えるように任意に操作することができる。理論上、ＭＥＰ経路は、一般にＭＶＡ経路と比較してＣＯ２としての炭素の損失が少ないので（ＭＥＰ経路：１ＣＯ２／ＩＰＰ；ＭＶＡ経路：４ＣＯ２／ＩＰＰ；炭素源としての糖）、エネルギー的により効率的である。
【００４１】
特に、非メバロン酸（ＭＥＰ）経路化合物のイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）は、グリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）及びピルビン酸（ＰＹＲ）から導かれる一連の中間体を介して生成され、多くの酵素がこの変換に関与している。Ｇ３Ｐ及びＰＹＲからＩＰＰ及びＤＭＡＰＰへの生合成経路に関与する酵素には、（ａ２）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）、（ｂ２）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ｉｓｐＣ）、（ｃ２）４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（ＩｓｐＤ）、（ｄ２）４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＩｓｐＥ）、（ｅ２）２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（ＩｓｐＦ）、（ｆ２）１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸シンターゼ（ＩｓｐＧ）、（ｇ２）４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸レダクターゼ（ＩｓｐＨ）及び（ｈ２）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）が含まれる。図２を参照されたい。
【００４２】
発酵によるステビオール配糖体の産生に使用される操作された酵母は、Ｇ３Ｐ及びＰＹＲからＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰへの流量を増やすための１つ以上の遺伝子改変を含み得、これにより、ステビオールへの経路に使用されるＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰの増加したプールが得られる。この改変には、例えば、酵母細胞に対して異種である酵素をコードする核酸を、発現増加をもたらすプロモーターの制御下に置くこと、複数の核酸コピーを使用すること、及び／または高い酵素活性レベルを与える異種酵素、バリアント酵素（例えば、１つ以上のアミノ酸置換を含むもの）もしくはバリアント異種酵素を使用することなどによって、１つ以上の酵素（ａ２）〜（ｈ２）の発現もしくは活性を増大させることが含まれ得る。
【００４３】
発酵によるステビオール配糖体の産生に使用される操作された酵母はまた、ＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰをステビオールに変換する経路を含み得る。例えば、いくつかの態様において、操作された酵母は、次の酵素：（ａ３）ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）、（ｂ３）コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＰＳ）、（ｃ３）カウレンシンターゼ（ＫＳ）、（ｄ３）カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）及び（ｅ３）カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）を発現する外因性核酸を含み得る。メバロン酸経路の酵素は、次のようにＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰをステビオールに変換する。ＩＰＰ／ＤＭＡＰＰ→ゲラニルゲラニル二リン酸→コパリル二リン酸→カウレン→カウレン酸→ステビオール。（図３を参照されたい。）酵母細胞に対して異種である酵素（ａ３）〜（ｅ３）をコードする外因性核酸は、発現増加をもたらすプロモーターの制御下に置くことができ、複数の核酸コピーを使用し、かつ／または高い酵素活性レベルを与えるバリアント酵素（例えば、１つ以上のアミノ酸置換を含むもの）もしくはバリアント異種酵素を使用することができる。
【００４４】
発酵によってステビオール配糖体（複数可）を産生させるための本開示の方法は、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、コパリル二リン酸シンターゼ、カウレンシンターゼ、カウレンオキシダーゼ、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）、ステビオールシンターゼ、デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）、Ｄ−１−デオキシキシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（ＣＭＳ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＣＭＫ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（ＭＣＳ）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸シンターゼ（ＨＤＳ）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸レダクターゼ（ＨＤＲ）、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、切断型ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼなどからなる群から選択される１つ以上のステビオール生合成酵素を含む、操作された酵母を使用することができる。
【００４５】
発酵によるステビオール配糖体の産生に使用される操作された酵母は、ステビオールをステビオール配糖体に変換する任意の経路を有し得る。操作された酵母中に２つ以上のステビオール配糖体経路の酵素が存在する場合、酵母は、異なるステビオール配糖体を産生することが可能であり得る。例えば、酵母は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種または１０種を超える異なるステビオール配糖体種を産生することが可能であり得る。いくつかの実施形態において、Ｒｅｂ  Ａ、Ｒｅｂ  Ｄ及び／またはＲｅｂ  Ｍが、操作された酵母細胞によって産生される。
【００４６】
ステビオール配糖体経路は、活性化した糖ヌクレオチドから受容体分子へのグリコシル残基の転移を媒介する、１つ以上のウリジン二リン酸（ＵＤＰ）グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）を含み得る。ステビオール配糖体経路の場合、単糖単位は、ステビオール分子もしくはステビオール配糖体分子上のヒドロキシル部分もしくはカルボキシル部分、またはステビオール基部に結合しているグルコース基上のヒドロキシル基に転移され得る。図４を参照されたい。ＵＧＴは、配列相同性に基づいて、ファミリー及びサブファミリーに分類されている。Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４３３８−４３４３を参照されたい。それぞれ４２アミノ酸のコンセンサス配列を含有する、ＵＧＴをコードする１００以上の遺伝子のスーパーファミリーが、モデル植物であるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａで同定されており、ＵＧＴをコードする遺伝子は、他のいくつかの高等植物種でも同定されている。
【００４７】
例示的なＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオール及び／またはステビオール配糖体の基質に少なくとも１つのグルコース単位を付与して所望のステビオール配糖体を与えることができる、任意のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼであってよい。一実施形態において、操作された酵母は、ＵＧＴ７４Ｇ１（配列番号１）、ＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号２）、ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号３）、ＵＧＴ９１Ｄ２（配列番号４）及びこれらのポリペプチドと実質的な同一性（例えば、＞８５％、＞７５％、＞６５％、＞５５％、＞４５％及び＞３５％）を有するＵＧＴの群から選択される、１つ以上のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼを含み得る。操作された酵母は、これらのＵＧＴをコードする１つ以上の外因性核酸分子（複数可）を含み得る。
【００４８】
操作された酵母はまた、１つ以上のＵＧＴ及びＵＤＰ−グルコース再利用酵素（複数可）を含み得る。ルブソシドに少なくとも１つのグルコース単位を付加してステビオシドを形成することができる例示的なＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ９１Ｄ２（配列番号４）である。ステビオシドに少なくとも１つのグルコース単位を付加してレバウジオシドＡを形成することができる例示的なＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号３）である。レバウジオシドＡに少なくとも１つのグルコース単位を付加してレバウジオシドＤを形成することができる例示的なＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ９１Ｄ２（配列番号４）である。レバウジオシドＤに少なくとも１つのグルコース単位を付加してレバウジオシドＭを形成することができる例示的なＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号３）である。
【００４９】
ステビオール配糖体の産生のために操作された微生物を記載する例示的な公開物には、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０３５７５８８号、国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／１９３９３４号、同第ＷＯ２０１４／１９３８８８号及び同第ＷＯ２０１４／１２２２２７号が含まれ、当該出願の全体を参照により本明細書に援用する。
【００５０】
一実施形態において、ステビオール配糖体の産生に有用な操作された酵母は、次の酵素：ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）、ｅｎｔ−コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）、カウレンシンターゼ（ＫＳ）、ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ）、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ９１Ｄ２、ＵＧＴ８５Ｃ２及びＥＵＧＴ１１を発現する。ＷＯ２０１４／１２２２２７は、これらの酵素を発現する、操作された酵母菌株について記載している。ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ポリペプチド、例えば、ＵＧＴ７４Ｇ１（配列番号１）、ＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号２）、ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号３）、ＵＧＴ９１Ｄ２（配列番号４）及びＥＵＧＴ１１（配列番号１３）をコードする遺伝子であってよく、これらの遺伝子は、多数の反応を実施することができるポリペプチドをコードし、例えば、ａ）ステビオール配糖体の１９−ＯグルコースのＣ２’をβ１，２グルコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、（ｂ）ステビオール配糖体の１３−Ｏ−グルコースのＣ２’をβ１，２グルコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、（ｃ）ステビオール配糖体の１９−Ｏ−グルコースのＣ３’をβ１，３グルコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、（ｄ）ステビオール配糖体の１３−Ｏ−グルコースのＣ３’をβ１，３グルコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、（ｉ）ステビオールまたはステビオール配糖体の１３−ＯＨをグルコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、（ｊ）ステビオールまたはステビオール配糖体のＣ−１９カルボキシルをグルコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子である。例えば、ＵＧＴ８５Ｃ２は反応（ｉ）を行い、ＵＧＴ７４Ｇ１は反応（ｊ）を行い、ＵＧＴ９１Ｄ２は反応（ａ；弱め）、（ｂ）を行い、ＵＧＴ７６Ｇ１は反応（ｃ）及び（ｄ）を行い、ＥＵＧＴ１１は反応（ａ）、（ｂ；あまり十分ではない）を行う。
【００５１】
一実施形態において、操作された宿主細胞は、宿主細胞に対して異種である次のタンパク質：ＧＧＰＰＳポリペプチド、ｅｎｆ−コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）ポリペプチド、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）ポリペプチド、カウレンシンターゼ（ＫＳ）ポリペプチド、ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ）ポリペプチド、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチド、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド、ＵＧＴ９１ｄ２ポリペプチド及びＥＵＧＴ１１ポリペプチドのうちの１つ以上をコードする１つ以上の外因性核酸（複数可）を発現する。
【００５２】
別の実施形態において、操作された酵母は、宿主細胞に対して異種である次のタンパク質：ＧＧＰＰＳポリペプチド、切断型Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ＣＤＰＳポリペプチド、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＫＳポリペプチド  Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＫＯポリペプチド、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＲ２ポリペプチド、Ｏｒｙｚｙａ  ｓａｔｉｖａ  ＥＵＧＴ  １１ポリペプチド、ＳｒＫＡＨｅ１ポリペプチド、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＣＰＲ８ポリペプチド、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ９１Ｄ２  バリアントまたは機能性ホモログ及びＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂポリペプチドのうちの１つ以上をコードする１つ以上の外因性核酸（複数可）を発現する。
【００５３】
ステビオール配糖体を産生するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株は、ＷＯ２０１１／１５３３７８、ＷＯ２０１３／０２２９８９、ＷＯ２０１４／１２２２２７及びＷＯ２０１４／１２２３２８（これらの各出願の全体を参照により本明細書に援用する）に記載されているような方法を使用して構築された。親株（株Ａ）の構築には、次の配列：Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ種ＧＧＰＰＳポリペプチド（配列番号６）をコードする組換え遺伝子、切断型Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ＣＤＰＳポリペプチド（配列番号７）をコードする組換え遺伝子、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＫＳポリペプチド（配列番号８）をコードする組換え遺伝子、組換えＳｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＫＯポリペプチド（配列番号９、配列番号１０）をコードする組換え遺伝子、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＲ２ポリペプチド（配列番号１１、配列番号１２）をコードする組換え遺伝子、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ＥＵＧＴ  １１ポリペプチド（配列番号１３）をコードする組換え遺伝子、ＳｒＫＡＨｅ１ポリペプチド（配列番号１４、配列番号１５）をコードする組換え遺伝子、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＣＰＲ８ポリペプチド（配列番号１６、配列番号１７）をコードする組換え遺伝子、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド（配列番号２）をコードする組換え遺伝子、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド（配列番号１）をコードする組換え遺伝子、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド（配列番号３）をコードする組換え遺伝子、及びＳｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ９１Ｄ２バリアント（または機能性ホモログ）である、ステビオール配糖体を産生するＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ（配列番号４）ポリペプチドをコードする組換え遺伝子が使用された。
【００５４】
ＵＧＴ９１Ｄ２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１の配列番号５）のＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂバリアントは、位置２１１におけるロイシンのメチオニンへの置換及び位置２８６におけるバリンのアラニンへの置換を含む。（その全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１の表１２及び実施例１１に記載されている更なるバリアントを、Ｔ１４４Ｓ、Ｍ１５２Ｌ、Ｌ２１３Ｆ、Ｓ３６４Ｐ及びＧ３８４Ｃバリアントを除き、使用することができる。）アミノ酸改変Ｌ２１１Ｍ及びＶ２８６Ａを有するＳｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂをコードするＧｅｎｅＡｒｔコドン最適化配列（アミノ酸配列については配列番号４；コドン最適化ヌクレオチド配列は配列番号５に示す）。
【００５５】
株Ｂは、上記の親株に由来し、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａに由来するコドン最適化ＣＰＲ１（アミノ酸配列番号１９に対応する配列番号１８）を更に含む。
【００５６】
一実施形態において、操作された酵母は、酵母に対して異種である次のタンパク質：ＧＧＰＰＳポリペプチド、ｅｎｔ−コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）ポリペプチド、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）ポリペプチド、カウレンシンターゼ（ＫＳ）ポリペプチド、ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ）ポリペプチド、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチド、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド、ＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチド及びＥＵＧＴ１１ポリペプチドのうちの１つ以上をコードする１つ以上の外因性核酸（複数可）を発現する。
【００５７】
別の実施形態において、操作された酵母は、酵母に対して異種である次のタンパク質：ＧＧＰＰＳポリペプチド、切断型Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ＣＤＰＳポリペプチド、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＫＳポリペプチド  Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＫＯポリペプチド、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＲ２ポリペプチド、Ｏ．ｓａｔｉｖａ  ＥＵＧＴ  １１ポリペプチド、ＳｒＫＡＨｅ１ポリペプチド、Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＣＰＲ８ポリペプチド、Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド、Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド、Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド、Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ９１Ｄ２バリアントまたは機能性ホモログ及びＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂポリペプチドのうちの１つ以上をコードする１つ以上の外因性核酸（複数可）を発現する。
【００５８】
操作された宿主細胞（例えば、酵母細胞）を使用して、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＡなどの所望のステビオール配糖体を発酵によって産生することができる。本発明で使用される「発酵」は、好気性発酵によって、炭水化物などの培地が所望のステビオール配糖体を産生するように同化することを指す。「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」という用語または「培地（ｍｅｄｉａ）」などの文法上の同義語は、操作された酵母または真菌が維持され、増殖し、もしくは発酵し、またはこれらの組み合わせを行うことができる液体組成物を指す。「培地」はまた、「ブロス」または「細胞培養物」と称することもでき、「培地」という用語を形容する「発酵」などの用語及びその同義語は、培地中で生じる細胞活性の種類をより具体的に定義するために使用され得る。
【００５９】
培地は、培地中に存在する構成成分及びその量、例えば、限定するものではないが、（ａ）グルコース及びマルトデキストリンなどのデンプン産物などの炭水化物を含む、炭素源；（ｂ）酵母ニトロゲンベース、水酸化アンモニウム、尿素、硫酸アンモニウム、酵母抽出物またはこれらの任意の組み合わせなどの窒素源；（ｃ）リン酸カリウム（一塩基性、二塩基性）、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム及び塩化カルシウムなどの塩；（ｄ）ビオチン、パントテン酸カルシウム、葉酸、（ｍｙｏ）−イノシトール、ニコチン酸、ｐ−アミノ安息香酸、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン及びクエン酸などのビタミン；ならびに／または（ｅ）ホウ酸、硫酸銅、塩化コバルト、塩化カルシウム、ヨウ化カリウム、塩化第二鉄、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、モリブデン酸ナトリウム及び硫酸亜鉛などの微量金属に関して定義することができる。培地はまた、そのｐＨ、ならびに培地のｐＨを調整するために使用される生体適合性の酸、塩基及び緩衝液に関して定義することもできる。
【００６０】
操作された酵母の発酵は、任意の植物及び植物の一部（塊茎、根、茎、葉及び種など）から得られる、デンプン及び／または糖を含有する植物性材料を使用して実施することができる。デンプン及び／または糖を含む植物性材料は、穀物、例えば、大麦、小麦、トウモロコシ、ライ麦、サトウモロコシ、キビ、大麦、ジャガイモ、キャッサバまたは米及びこれらの任意の組み合わせなどから得ることができる。デンプン及び／または糖を含む植物性材料は、粉砕、麦芽処理または部分的麦芽処理などの方法などによって加工することができる。いくつかの実施形態において、発酵培地は、処理デンプンを含む。例えば、発酵培地は、部分的に加水分解したデンプンを含み得る。部分的に加水分解したデンプンは、高分子量のデキストリン及び高分子量のマルトデキストリンを含み得る。所望の範囲内の量のデンプン及びデンプン分解産物を有する、部分的に加水分解したデンプン産物を使用することができる。
【００６１】
発酵は、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＡなどの所望のステビオール配糖体の産生に適した条件下及び培地中で実施することができる。発酵条件は、一般に、酸素（好気性条件）、炭素源及び栄養素（窒素）ベースを使用する。発酵は、流加培養法または連続処理法を使用して実施することができる。発酵最少培地は、グルコース（５ｇ／Ｌ）、硫酸アンモニウム（５ｇ／Ｌ）、リン酸二水素カリウム（３ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム（０．５ｇ／Ｌ）、微量元素及びビタミンを含む（例えば、Ｖｅｒｄｕｙｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｙｅａｓｔ  ８，５０１−５１７参照）。発酵培地のｐＨは、およそｐＨ４〜ｐＨ５であってよく、発酵は、約３０℃の温度で実施することができる。いくつかの実施形態において、発酵は、ベース培地中での第１の増殖期、次いで、グルコース含有合成フィード培地（微量金属、ビタミン及び塩含有）を用いた長期フィード期を使用して実施することができる。
【００６２】
他の実施形態において、発酵は、５．０を超えるｐＨを用いて実施され得る。いくつかの実施形態において、ｐＨは、約５．５〜８または５．８〜７．５の範囲であってよい。いくつかの実施形態において、操作された酵母は、最初は６．０未満などの低いｐＨで増殖し得、発酵は、５．０を超えるｐＨなどの高いｐＨで実施することができる。所望のステビオール配糖体を産生するための他の発酵方法は、「Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｓｔｅｖｉｏｌ  Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｈｉｇｈ  ｐＨ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｏｂｔａｉｎｅｄ  Ｔｈｅｒｅｆｒｏｍ」と題された出願（米国特許出願第６２／１６８，３４５号）及び本出願と同時に出願された「Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｓｔｅｖｉｏｌ  Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ」と題されたＰＣＴ国際出願（代理人整理番号Ｎ００２９１ＷＯ０１（ＣＡＲ０２１０／ＷＯ））に記載されており、各出願の全体を参考として本明細書に援用する。
【００６３】
必要に応じて、発酵は、ステビオール、レバウジオシドＡ、ステビオシド、ルブソシド、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ズルコシドＡ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＥなどの他の中間体を含有する培地中で実施され得る。
【００６４】
発酵工程は、「ステビオール配糖体産生工程」と呼ぶこともできる。いくつかの実施形態において、発酵培地は、発酵工程中、４０℃未満の温度に維持される。いくつかの実施形態において、発酵培地は、発酵工程中、約２５〜３５℃の範囲の温度に維持される。
【００６５】
発酵後であっても、所望のステビオール配糖体を放出または濃縮するための任意の処理（例えば、熱処理）の前には、発酵ブロスは、所望の配糖体の一部のみしか含有し得ず、所望の配糖体の大部分は、操作された宿主細胞中に含まれる。宿主細胞から所望の配糖体を熱処理によって放出または濃縮する方法が開示される。
【００６６】
熱処理は、所望のステビオール配糖体及び所望のステビオール配糖体産物を産生することが可能な操作された酵母を含有する全細胞発酵ブロスに対して実施することができる。他の実施形態において、発酵後であり、任意の処理（例えば、熱処理）を受ける前の操作された酵母を発酵ブロスから分離し、液体培地などの任意の好適な組成物中に移してもよい。
【００６７】
移された酵母細胞を含有する発酵ブロスまたは組成物を５０℃〜９５℃の範囲の温度で加熱することができる。他の実施形態において、加熱は、７０℃〜９５℃の温度で実施される。加熱は、５分〜４８時間実施される。いくつかの実施形態において、加熱は、７０℃〜９５℃で５分〜２時間、９５℃で５分〜１時間、７５℃で５分〜２時間、または５０℃で２４時間である。いくつかの実施形態において、加熱は、７０℃〜９５℃で５分間または７０℃〜９５℃で２時間である。
【００６８】
いくつかの実施形態において、熱処理は、ステビオール配糖体を培地中に放出させ、または培地のステビオール配糖体含量を高め、これにより、発酵ブロスまたは組成物中の総配糖体含量（すなわち、細胞内及び細胞外の両方）のうち細胞外配糖体含量は、９０％超となる。いくつかの実施形態において、熱処理工程は、ステビオール配糖体を発酵培地中に放出させ、これにより、発酵ブロスまたは組成物中の総ステビオール配糖体含量（すなわち、細胞内及び細胞外の両方）のうち細胞外ステビオール配糖体含量は、８０％、８５％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％超となる。いくつかの実施形態において、熱処理工程は、ステビオール配糖体を発酵培地中に放出させ、これにより、発酵ブロスまたは組成物中の総ステビオール配糖体含量（すなわち、細胞内及び細胞外の両方）のうち細胞外ステビオール配糖体含量は、約８０〜１００％、８５〜１００％、９０〜１００％、９０〜９９％、９２〜９８％または９０〜９５％の範囲になる。
【００６９】
いくつかの実施形態において、発酵ブロスまたは組成物の熱処理により、Ｒｅｂ  Ａ、Ｒｅｂ  Ｂ、Ｒｅｂ  Ｍ、Ｒｅｂ  Ｄまたはこれらの組み合わせが放出される。いくつかの実施形態において、熱処理は、Ｒｅｂ  Ａを濃縮し、これにより、発酵ブロスまたは組成物中に存在する総Ｒｅｂ  Ａ（すなわち、細胞内及び細胞外の両方）のうち細胞外Ｒｅｂ  Ａは、５０％超となる。いくつかの実施形態において、発酵ブロスまたは組成物中に存在する総Ｒｅｂ  Ａ（すなわち、細胞内及び細胞外の両方）のうち細胞外Ｒｅｂ  Ａは、４０％、４５％、４８％、５２％、５５％、５７％、６０％、６２％、６５％、６７％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％超である。いくつかの実施形態において、Ｒｅｂ  Ａ量は、発酵中に産生されたＲｅｂ  Ａの総量のうち約３０％〜約１００％、約５０％〜約１００％、約８０％〜約９０％の範囲で細胞外に放出され得る。
【００７０】
いくつかの実施形態において、熱処理は、Ｒｅｂ  Ｄ及び／またはＲｅｂ  Ｍを濃縮し、これにより、発酵ブロスまたは組成物中に存在する総Ｒｅｂ  Ｄ及び／またはＲｅｂ  Ｍ（すなわち、細胞内及び細胞外の両方）のうち、細胞外に放出されたＲｅｂ  Ｄ及び／またはＲｅｂ  Ｍは、３３％超となる。いくつかの実施形態において、発酵ブロスまたは組成物中に存在する総Ｒｅｂ  Ｄ、総Ｒｅｂ  Ｍ（すなわち、細胞内及び細胞外の両方）及び／またはＲｅｂ  ＤとＲｅｂ  Ｍの合計のうち、細胞外のＲｅｂ  Ｄ、Ｒｅｂ  Ｍ及び／またはＲｅｂ  ＤとＲｅｂ  Ｍの合計は、４０％、４５％、４８％、５２％、５５％、５７％、６０％、６２％、６５％、６７％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％超である。いくつかの実施形態において、発酵ブロスまたは組成物中に存在するＲｅｂ  Ｄ及び／またはＲｅｂ  Ｍの合計量のうち、細胞外に放出されたＲｅｂ  ＤとＲｅｂ  Ｍとを合わせた量は、約３０％〜約１００％、約５０％〜約１００％、約８０％〜約９０％の範囲であり得る。
【００７１】
他の実施形態において、放出されたＲｅｂ  Ｄは、発酵ブロスまたは組成物中に存在するＲｅｂ  Ｄの合計量のうち約３０％〜約１００％、約５０％〜約１００％、約８０％〜約９０％の範囲で細胞外に存在し得る。
【００７２】
他の実施形態において、放出されたＲｅｂ  Ｍは、発酵ブロスまたは組成物中に存在するＲｅｂ  Ｍの合計量のうち約３０％〜約１００％、約５０％〜約１００％、約８０％〜約９０％の範囲で細胞外に存在し得る。
【００７３】
いくつかの実施形態において、放出されたＲｅｂ  Ｂは、発酵ブロスまたは組成物中に存在するＲｅｂ  Ｂの合計量のうち約２５％〜約１００％、約３０％〜約９５％、約４０％〜約８０％の範囲で細胞外に存在し得る。いくつかの実施形態において、発酵ブロスまたは組成物中に存在する総Ｒｅｂ  Ｂ（すなわち、細胞内及び細胞外の両方）のうち細胞外Ｒｅｂ  Ｂは、３０％、３３％、３５％、４０％、４５％、４８％、５２％、５５％、５７％、６０％、６２％、６５％、６７％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％超である。いくつかの実施形態において、開示される熱処理は、Ｒｅｂ  ＤＭ及び／またはＲｅｂ  ＡからＲｅｂ  Ｂへの顕著な分解をもたらさない。
【００７４】
いくつかの実施形態において、開示される熱処理は、所望の配糖体の放出をもたらすが、広範な細胞溶解はもたらさない。細胞溶解は、例えば、発酵及び熱処理後に発酵ブロス（例えば、無細胞）または組成物中に放出された窒素もしくはリンまたはその両方の量によって決定することができる。いくつかの実施形態において、発酵ブロスまたは組成物の加熱は、無細胞発酵ブロスまたは組成物中の窒素及び／またはリン含量を増加させない。いくつかの実施形態において、熱処理後の無細胞発酵ブロスまたは組成物中の細胞外窒素含量は、全細胞発酵ブロスまたは組成物中に存在する総窒素（すなわち、細胞外及び細胞内の両方）のうち４５％を超えて増加しない。いくつかの実施形態において、熱処理後の発酵ブロスまたは組成物中の細胞外リン含量は、細胞含有発酵ブロスまたは組成物中に存在する総リン（すなわち、細胞外及び細胞内）のうち７０％を超えて増加しない。
【００７５】
更に他の実施形態において、７０℃〜９５℃で５分〜２時間加熱したとき、細胞外窒素含量は、細胞含有発酵ブロスまたは組成物中に存在する総窒素のうち４５％を超えて増加せず、かつ／あるいは、熱処理後の発酵ブロスまたは組成物中の細胞外リン含量は、細胞含有発酵ブロスまたは組成物中に存在する総リンのうち７０％を超えて増加しない。
【００７６】
いくつかの実施形態において、細胞外窒素含量は、発酵培地または組成物を５０〜９５℃で５分〜４８時間加熱したとき、細胞含有発酵ブロスまたは組成物中に存在する総窒素のうち、３０％、３３％、３５％、３７％、４０％、４２％、４７％または５０％を超えて増加しない。いくつかの実施形態において、細胞外リン含量は、発酵培地または組成物を５０〜９５℃で５分〜４８時間加熱したとき、細胞含有発酵ブロスまたは組成物に存在する総リンのうち、５０％、５５％、６０％、６３％、６５％、６７％、７３％、７５％、７７％または８０％を超えて増加しない。
【００７７】
発酵ブロスまたは組成物の種々の構成成分（例えば、ステビオール配糖体、窒素またはリン）の細胞内及び／または細胞外含量は、実施例１に記載されるように決定することができる。
【００７８】
発酵ブロスまたは組成物の熱処理は、細胞生存率に基づいて評価することもできる。所望の配糖体が酵母細胞から発酵ブロスまたは組成物中に放出され得るが、酵母生存率は、細胞溶解が限定されるとはいえ、減少する。細胞溶解は、例えば、全細胞ブロスをポテトデキストロース抗生物質寒天上に播種することによって、または細胞生存率計測器（例えば、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（商標））によって特定することができる。
【００７９】
加熱は、温水または蒸気に熱を移動させる熱交換器を使用して実施することができる。いくつかの実施形態において、加熱は、保持ループを備える熱交換器、直接蒸気噴射、またはジャケット付き容器に適用される蒸気を利用した材料のバルク加熱を使用して実施することができる。いくつかの実施形態において、酵母は、熱処理前に、例えば、遠心分離または濾過によって濃縮してもよい。他の実施形態において、遠心分離または濾過した酵母は、他の好適な培地または組成物中に移され、次いで、加熱に使用され得る。
【００８０】
所望の組換え産物（例えば、ステビオール配糖体）を宿主細胞から培地中に放出させ、それにより所望の産物を濃縮した後、所望の組換え産物の更なる単離及び生成のために種々の手順を使用することができる。かかる手順には、遠心分離、限外濾過、沈殿及びクロマトグラフィーの手順が含まれる。
【００８１】
ステビオール配糖体の放出または濃縮後、ステビオール配糖体は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００９／１４０３９４号（その全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている分取ＨＰＬＣによって、更に精製されてもよい。
【００８２】
熱処理後の発酵ブロスまたは組成物は、次いで、遠心分離または濾過して、操作された細胞を除去することができる。発酵ブロスは、必要に応じて、膜透析などによって処理して、低分子量構成成分（グルコース、基本栄養素及び塩）を除去してもよい。
【００８３】
Ｒｅｂ  Ａ、Ｒｅｂ  Ｂ、Ｒｅｂ  Ｍ、Ｒｅｂ  Ｄ及びこれらの組み合わせなどのステビオール配糖体を含む組成物を濃縮または精製された形態で提供することが望まれる場合、あるいはＲｅｂ  Ａ、Ｒｅｂ  Ｂ、Ｒｅｂ  Ｍ、Ｒｅｂ  Ｄ及びこれらの組み合わせを他のステビオール配糖体から分離し、または互いに分離するのが望ましい場合、更なる精製が実施され得る。このようなステビオール配糖体構成成分の濃縮または精製は、液体発酵培地で実施することができ、あるいは、次いで、発酵培地を精製前に乾燥させてもよい。例えば、凍結乾燥を使用して発酵培地を乾燥させて、Ｒｅｂ  Ａ、Ｒｅｂ  Ｂ、Ｒｅｂ  Ｍ、Ｒｅｂ  Ｄ及びこれらの組み合わせを含むステビオール配糖体を含む乾燥組成物（例えば、粉末またはフレーク）を形成することができ、これを引き続き処理してもよい。
【００８４】
いくつかの実施形態において、Ｒｅｂ  Ａ、Ｒｅｂ  Ｂ、Ｒｅｂ  Ｍ及び／またはＲｅｂ  Ｄを含むステビオール配糖体（ｇｌｙｏｓｉｄｅｓ）を濃縮した乾燥発酵ブロスまたは組成物は、精製の出発材料として使用することができる。例えば、乾燥発酵ブロスに溶媒または溶媒の組み合わせを加え、ステビオール配糖体を含む材料を溶解または懸濁することができる。ステビオール配糖体を溶解するための例示的な組み合わせは、水とアルコールの混合物（例えば、５０：５０エタノール：水）である。溶解または懸濁を容易にするために、乾燥させたブロス材料は、４０℃〜６０℃の範囲などの室温を超える温度で加熱することができる。乾燥させた発酵ブロス材料の物理的破壊は、超音波処理などによっても実施することができる。溶解または懸濁させた発酵ブロス材料は、分取クロマトグラフィーなどの更なる精製前に、ミクロンまたはサブミクロン濾過システムを使用して濾過され得る。
【００８５】
ステビオール配糖体化合物を濃縮した乾燥させた発酵ブロスまたは組成物は、逆相液体クロマトグラフィーなどの他の精製プロセスに供され得る。好適な樹脂を使用してステビオール配糖体化合物をカラム中に保持することができ、カラムに水などの液体を通して洗浄して親水性化合物を除去する。Ｒｅｂ  Ａ、Ｒｅｂ  Ｂ、Ｒｅｂ  Ｍ、Ｒｅｂ  Ｄ及びこれらの組み合わせを含むステビオール配糖体のカラムの溶出は、アセトニトリルまたはメタノールなどの好適な溶媒または溶媒組み合わせを使用して達成することができる。
【００８６】
いくつかの実施形態において、Ｒｅｂ  Ａ、Ｒｅｂ  Ｂ、Ｒｅｂ  Ｍ、Ｒｅｂ  Ｄ及びこれらの組み合わせなどのステビオール配糖体は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）などの分取液体クロマトグラフィーを使用して精製することができる。Ｒｅｂ  Ａ、Ｒｅｂ  Ｂ、Ｒｅｂ  Ｍ、Ｒｅｂ  Ｄ及びこれらの組み合わせを含むステビオール配糖体組成物は、水と溶媒（例えば、メタノール、エタノール、アセトニトリル）の所望の比（例えば、６０％水、４０％メタノール、ｖ／ｖ）の混合物などの移動相に溶解し得る。組成物はまた、ステビオール配糖体材料の溶解を促進するために、加熱、例えば、約５０℃で加熱してもよい。溶液はまた、０．２μｍフィルターなどを使用して濾過してもよく、その後、カラムに注入され得る。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｋｉｎｅｔｅｘ  ＸＢ−Ｃ１８  ５μｍ、コアシェルシリカ固体担体であり、イソ−ブチル側鎖及びＴＭＳエンドキャッピングを有するＣ１８固定相。カラムの流量は、カラム特性に基づき得（約２０ｍＬ／分など）、最大圧力は４００ｂａｒである。Ｒｅｂ  Ａ、Ｒｅｂ  Ｂ、Ｒｅｂ  Ｍ、Ｒｅｂ  Ｄ及びこれらの組み合わせは、カラムからのそれぞれの溶出時間によって同定することができる。例示的な流量条件下で、Ｒｅｂ  Ａ、Ｒｅｂ  Ｂ、Ｒｅｂ  Ｍ、Ｒｅｂ  Ｄ及びこれらの組み合わせは、６０分以内にカラムから溶出され得る。当業者であれば、Ｒｅｂ  Ａ、Ｒｅｂ  Ｂ、Ｒｅｂ  Ｍ、Ｒｅｂ  Ｄ及びこれらの組み合わせの溶出時間は、溶媒及び／または装置が変わることで変動し得ることは理解するであろう。当業者はまた、以下に記載されるプロセスは、記載される各工程のある特定の順序を想定しているが、この順序は、場合によって変更可能であることを理解するであろう。
【００８７】
いくつかの実施形態において、Ｒｅｂ  Ａ、Ｒｅｂ  Ｍ及び／またはＲｅｂ  Ｄを含むステビオール配糖体を濃縮した発酵ブロスまたは組成物は、乾燥させ、更なる精製のための出発材料として使用することができる。Ｒｅｂ  Ａ、Ｒｅｂ  Ｍ、Ｒｅｂ  Ｄ及びこれらの組み合わせを含むステビオール配糖体組成物は、水中に溶解させ、これを吸着クロマトグラフィーカラムに通して、組成物中の親水性不純物を除去することができる。吸着されたステビオール配糖体は、エタノール／水混合物を用いてカラムから脱着させることができる。エタノールを除去したら、ステビオール配糖体の液体流をイオン交換クロマトグラフィーにより更に精製して、イオン及び着色物を除去することができる。活性炭による更なる処理を実施してもよい。特定のステビオール配糖体を他の配糖体から更に分離するために、結晶化工程を用いてもよい。結晶は、Ｒｅｂ  Ｍ、Ｒｅｂ  Ｄ、Ｒｅｂ  Ａまたは他のステビオール配糖体について濃縮することができる。結晶は、熱及び真空下で乾燥させてもよいし、水で再度スラリー化し、噴霧乾燥させてもよい。
【実施例】
【００８８】
実施例１
主要窒素源として水酸化アンモニウムを用いる流加培養発酵でのＲｅｂ  Ｄ、Ｒｅｂ  Ｍ及びＲｅｂ  Ａの産生
種菌の調製のために、１リットル振盪フラスコ中、１５０ｍＬのフラスコ種培地で、株Ｂと名付けた酵母菌株を２５０ｒｐｍ、３０℃で２０〜２４時間培養した。
【表１】
2018516081.tif 000005
【００８９】
発酵のために、０．７５リットルの開始体積で、７５ｍＬの種培養物を初期発酵培地（表２、３及び４）に移した。温度は、全体を通じて、３０℃に維持した。発酵中、通気流量は、１．７５ＳＬＰＭにし、攪拌速度は、４００ｒｐｍから９００ｒｐｍに段階的に増加するように自動制御した。グルコース濃度は、フィード培地（表５）の流量を制御することによって制限維持した。２段階供給法は、最初の対数期が１０時間からｕ＝０．１２  １／時の速度で開始することを伴い、一方、第２フィード期（またはフィード期ＩＩ）は３３時間から０．１８０ｍｌ／分の一定流量で開始した。１．９５リットルの最終体積が１２０時間で得られるまで、供給を続けた。
【００９０】
発酵全体を通じて、ｐＨは、１２％ＮＨ４ＯＨによりｐＨ５に維持した。消泡剤の添加は、１０重量％の消泡剤溶液（Ｉｖａｎｈｏｅ  １１６３Ｂ）を用い、消泡剤制御プローブの利用によって、制御した。培地は、Ｖｅｒｄｕｙｎら（Ｖｅｒｄｕｙｎ  Ｃ，Ｐｏｓｔｍａ  Ｅ，Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓ  ＷＡ，Ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎ  ＪＰ．Ｙｅａｓｔ．１９９２  Ｊｕｌ；８（７）：５０１−１７）に基づき、表２〜５に記載の修正を加えた。
表２  初期発酵培地
【表２】
2018516081.tif 000006
表３  微量金属ストック液
【表３】
2018516081.tif 000007
表４  ビタミンストック液
【表４】
2018516081.tif 000008
表５  発酵フィード培地
【表５】
2018516081.tif 000009
【００９１】
実施例２
ステビオール配糖体の濃縮または放出及び分析
実施例１に記載の組換え酵母発酵から生成された発酵ブロスを使用した。細胞内及び細胞外に含まれる総ステビオール配糖体濃度ならびに総窒素含量（細胞内及び細胞外）及び総リン含量（細胞内及び細胞外）の測定は、酵母細胞が混合され、バイアルの底に沈殿しないことを確保するために、酵母細胞を含む発酵試料を攪拌することによって実施した。１００μＬの混合発酵ブロスをピペットで２ｍＬ微量遠心管中に入れた。９００μＬの６１％メタノール（抽出溶媒）を２ｍｌ微量遠心管中に添加し、試料ローテーター上に１０分間置くことによって攪拌して、ステビオール配糖体を抽出した。次いで、試料を微量遠心機で、１０Ｋ  ｒｐｍで３分間、遠心分離し、清澄な上清をピペットで分析用オートサンプラーバイアル中に入れた。
【００９２】
様々な温度及び様々な時間で発酵ブロス（細胞を含む）を加熱した。温水浴を使用して加熱を実施し、試料を次のように調製した。１ｍｌの発酵ブロス（細胞を含む）を各試験温度及び各試験時点のヘッドスペースバイアルに入れた。バイアルを密封し、水浴中に置き、各試験温度で５分間平衡化させた後、所望の温度で所望の時間量、試料を維持した。指定時間の終了時に、試料を水浴から取り出し、４℃まで冷却した。４ｍｌの滅菌水を各バイアルに添加し、その後、試料を１４ｍｌ滅菌チューブに移した。試料をボルテックス処理し、平板法による細胞生存率の決定のために、１ｍｌを取り出した。残りの試料を室温で３０分間、４７００ｒｐｍで遠心分離して、透明な無細胞上清を得た。無細胞上清を、更なる分析、例えば、発酵培地中のステビオール配糖体、窒素及びリンの細胞外含量（リンはＩＣＰ、窒素はＡｎｔｅｋ、配糖体はＵＨＰＬＣによる）のために取り出した。
【００９３】
熱処理後に発酵ブロス中に放出された配糖体の量を決定した。Ｒｅｂ  Ａ、Ｒｅｂ  Ｄ及びＲｅｂ  Ｍは、超高速高分離液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）によって測定した。無細胞上清は、発酵ブロス中への窒素及びリンの放出を評価するためにも使用した。窒素量は、燃焼法及びＡＮＴＥＫ（商標）窒素分析器を使用して分析した（窒素燃焼及びオゾンとの反応を利用して準安定性二酸化窒素を生じさせ、これを化学発光により検出するＡｎｔｅｋ  ９０００窒素検出器。リン量は、誘導結合プラズマ発光分光分析（ＩＣＰ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｏｐｔｉｍａ  ３２００ＤＶ）を使用して、ＵＶ検出２１３．６１７ｎｍ、０．５％ＨＮＯ３中に溶解した試料で分析した）。酵母生存率は、ポテトデキストロース抗生物質Ｅａｓｙゲルプレート（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｓ試験キット）を使用し、室温で５日間インキュベートして、決定した。
【００９４】
配糖体分離のためのＵＰＬＣ法
ステビオール配糖体は、Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８ガード（カラム３ｍｍ×５ｍｍ×１．８ｕｍ）を備えるＥｃｌｉｐｓｅ  Ｃ１８  Ｐｌｕｓ  ＲＲＨＤカラム（３ｍｍ×１５０ｍｍ×１．８ｕｍ）を使用して分離した。使用した移動相は、チャネルＡ：１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ２．６）及びチャネルＢアセトニトリルであった。流量は０．６ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、検出は紫外線吸収２１０ｎｍで実施した。リン酸緩衝液のアセトニトリルに対する比を変化させたグラジエント溶出プロファイルを以下に示す。
ｉ．      開始：８０％Ａ／２０％Ｂ
ｉｉ．    ７分：７０％Ａ／３０％Ｂ
ｉｉｉ．  １２分：７０％Ａ／３０％Ｂ
ｉｖ．    １５分：４５％Ａ／５５％Ｂ
ｖ．      １８分：４５％Ａ／５５％Ｂ
ｖｉ．    ２０分：２０％Ａ／８０％Ｂ
ｖｉｉ．  ２５分：２０％Ａ／８０％Ｂ
ｖｉｉｉ．２７分：１５％Ａ／８５％Ｂ
ｉｘ．    ３０分：１５％Ａ／８５％Ｂ
ｘ．      ３０．５分：８０％Ａ／２０％Ｂ
ｘｉ．    ３５分：８０％Ａ／２０％Ｂ
【００９５】
熱処理後に酵母細胞から放出された細胞外Ｒｅｂ  Ａ、Ｒｅｂ  Ｄ＆Ｍをパーセンテージ（％）で表したＵＰＬＣの結果を表６に示す。細胞外窒素及びリンのパーセンテージ（％）も示す。
【００９６】
細胞を含む発酵ブロス中の総窒素をＬｅｃｏ窒素分析器（Ｌｅｃｏ  ＴｒｕＭａｃ  Ｎ，Ｓｔ．Ｊｏｓｅｐｈ，ＭＩ）を使用して決定した。細胞を含む均質に混合した発酵ブロス１ｍｌを、窒素燃焼分析用のニッケル被覆セラミック燃焼容器に入れた。
【００９７】
細胞を含む発酵ブロス中の総リンは、セラミックるつぼ中でプロパントーチを用いて、５ｍＬの均質に混合した発酵ブロスを灰にすることによって決定した。結果として得られた灰を５２５℃で一晩維持した後、その灰を１０ｍｌの０．５％ＨＮＯ３で溶解した。硝酸溶液中のリン含量をＩＣＰの使用によって決定した。
【表６−１】
2018516081.tif 000010
【表６−２】
2018516081.tif 000011
【表６−３】
2018516081.tif 000012
【表６−４】
2018516081.tif 000013
【表６−５】
2018516081.tif 000014
【００９８】
表６からわかるように、熱処理後の培地中における窒素及びリンの量によって評価すると、より高い温度、かつより短い時間での熱処理のほうが、熱殺傷の影響はあるが、細胞溶解を最小限に抑えつつ、酵母細胞内部からのＲｅｂ  Ａ、Ｒｅｂ  Ｄ及びＲｅｂ  Ｍの放出の増加をもたらす。表ではまた、より高温（５０℃、７５℃及び９５℃かつより長い時間）のほうが、Ｒｅｂ  ＤＭ及びＲｅｂＡがＲｅｂ  Ｂに分解され得、これによりブロス中のＲｅｂ  ＤＭ含量が低下し、Ｒｅｂ  Ｂ含量が増加することが示されている。
【００９９】
熱処理後の酵母生存数を表７に示す。酵母を殺傷するには５０℃で２〜２４時間かかるが、７５℃または９５℃では５分間以下で酵母は殺傷される。
【表７】
2018516081.tif 000015
【０１００】
実施例３
Ａと名付けられた株由来の発酵ブロスを２段階プロセスで７５℃で１時間処理した。２段階の供給流量を以下に示す。
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【０１０１】
Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ法に基づいて、酵母細胞を蛍光色素によって染色した。熱処理前の生細胞は顕微鏡下で緑色に見え、熱処理後の死細胞は赤色に見えた。明視野顕微鏡画像は、熱処理後にデブリがないことを示しており（図５Ａと図５Ｂの比較）、これは、熱処理後であっても酵母細胞は損傷を受けていない状態であることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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