(57)【要約】  本発明は、鳥類壊死性腸炎を検出するための、微小胞に基づく方法、ならびにウェルシュ菌（クロストリジウム・パーフリンジェンス）（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）による鳥類壊死性腸炎および／または鳥感染症の検出にとって好適であるとして特定された新規のマーカーに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥類壊死性腸炎、特に無症候性の壊死性腸炎を検出する方法であって、鳥類試料から微小胞を単離するステップと、それに続いて、壊死性腸炎を示す少なくとも１種のマーカーの存在および／またはレベルを特定するステップとを含み、非感染の対照との比較における該少なくとも１種のマーカーの存在および／またはレベルの増加が壊死性腸炎を示す、方法。
【請求項２】
前記マーカーが、以下の配列：
ａ）配列番号１に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号３に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号４に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号５に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｅ）配列番号７に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｆ）配列番号８に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｇ）配列番号９に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｈ）配列番号１６に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｉ）配列番号１０に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、６０個、または８０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｊ）配列番号１１に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、または６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｋ）配列番号１２に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、または６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｌ）配列番号１３に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、または６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｍ）（ａ）から（ｌ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｎ）（ｍ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｏ）（ａ）から（ｎ）に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
壊死性腸炎の検出が、以下の配列：
ａ）配列番号１の位置１から６３０、特に４２０から６３０のヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号３の位置６００から１０００、特に６７０から７６０のヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号４の位置６０から２４０、特に８０から２２０のヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号５の位置１３００から１８００、特に１４００から１７００の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｅ）配列番号７の位置１から５９１、特に１００から２８０のヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｆ）配列番号８の位置２４０から５４０、特に３００から５４０のヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｇ）配列番号９の位置１２から４１８、特に２４０から４００のヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｈ）配列番号１６の位置６７３から５６２８のヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｉ）配列番号１０の位置１４から２５のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｊ）配列番号１１の位置４４から６５のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、または２０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｋ）配列番号１２の位置３から２４のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、または２０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｌ）配列番号１３の位置４５から６６のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、または２０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、
ｍ）（ａ）から（ｌ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｎ）（ｍ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｏ）（ａ）から（ｎ）に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
のうちの少なくとも１種を検出することによって実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
鳥類壊死性腸炎、特に無症候性の鳥類壊死性腸炎を検出する方法であって、壊死性腸炎の検出が、鳥類試料における以下の配列：
ａ）配列番号１に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号３に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号４に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号７に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｅ）配列番号９に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｆ）配列番号１０に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、６０個、または８０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｇ）配列番号１１に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、または６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｈ）配列番号１２に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、または６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｉ）配列番号１３に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、または６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｊ）（ａ）から（ｉ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｋ）（ｊ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｌ）（ａ）から（ｋ）に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
のうちの少なくとも１種の存在および／または量を検出することによって実施される、方法。
【請求項５】
鳥類細菌感染症、好ましくは鳥類壊死性腸炎、特に無症候性の壊死性腸炎を検出する方法であって、鳥類試料から微小胞を単離するステップと、それに続いて、該感染症を示す少なくとも１種の鳥類マーカーの存在および／またはレベルを特定するステップとを含み、非感染の対照との比較における該少なくとも１種の鳥類マーカーの存在および／またはレベル増加が該感染症を示し、該少なくとも１種の鳥類マーカーが、鳥類のｍｉＲＮＡであり、好ましくは、
ａ）配列番号１０に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、６０個、または８０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号１１に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、または６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号１２に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、または６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号１３に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、または６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｅ）（ａ）から（ｄ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｆ）（ｅ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｇ）（ａ）から（ｆ）に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
からなる群より選択される、方法。
【請求項６】
前記鳥類試料は、体液、好ましくは血液、特に血漿もしくは血清、あるいは身体からの排泄物、好ましくは糞便または盲腸排泄物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
鳥類壊死性腸炎、特に無症候性の鳥類壊死性腸炎を検出するための方法であって、鳥類の糞便排泄物、好ましくは鳥類の糞便排泄物から単離された微小胞における壊死性腸炎を示す少なくとも１種のマーカーの存在および／またはレベルを特定するステップを含み、非感染の対照との比較における該少なくとも１種のマーカーの存在および／またはレベルの増加が壊死性腸炎を示し、ならびに該マーカーが、好ましくは、
ａ）配列番号１に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号３に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号４に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号５に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｅ）配列番号７に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｆ）配列番号８に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｇ）配列番号９に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｈ）（ａ）から（ｇ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｉ）（ｈ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｊ）（ａ）から（ｉ）に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
から選択される、方法。
【請求項８】
鳥類壊死性腸炎、特に無症候性の鳥類壊死性腸炎を検出するための方法であって、
鳥類の盲腸排泄物、特に鳥類の盲腸排泄物から単離された微小胞における壊死性腸炎を示す少なくとも１種のマーカーの存在および／またはレベルを特定するステップを含み、非感染の対照との比較における該少なくとも１種のマーカーの存在および／またはレベルの増加が壊死性腸炎を示し、ならびに該マーカーが、好ましくは、
ａ）配列番号１に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号３に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号４に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号５に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｅ）配列番号７に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｆ）配列番号８に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｇ）配列番号９に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｈ）配列番号１３に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、または６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｉ）（ａ）から（ｈ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｊ）（ｉ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｋ）（ａ）から（ｊ）に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
から選択される、方法。
【請求項９】
鳥類壊死性腸炎、特に無症候性の壊死性腸炎を検出する方法であって、鳥類の血液、特に鳥類の血液から単離された微小胞における壊死性腸炎を示す少なくとも１種のマーカーの存在および／またはレベルを特定するステップを含み、非感染の対照との比較における該少なくとも１種のマーカーの存在および／またはレベルの増加が壊死性腸炎を示し、ならびに該少なくとも１種のマーカーが、好ましくは、
ａ）配列番号１０に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、６０個、または８０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号１１に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、または６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号１２に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、または６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｄ）（ａ）から（ｃ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｅ）（ｄ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｆ）（ａ）から（ｅ）に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
から選択される、方法。
【請求項１０】
鳥類感染症、特に無症候性の鳥類感染症、好ましくは鳥類細菌感染症、特に無症候性の鳥類細菌感染症、より好ましくは壊死性腸炎、特に無症候性の壊死性腸炎を検出する方法であって、鳥類の排泄物、特に糞便または盲腸排泄物から単離された微小胞における該疾患を示す少なくとも１種のマーカーの存在および／または量を特定するステップを含み、非感染の対照との比較における該少なくとも１種のマーカーの存在および／またはレベル増加が該疾患を示す、方法。
【請求項１１】
前記鳥類試料は、家禽の試料、好ましくは鶏、七面鳥、アヒル、ガチョウ、クジャク、キジ、ヤマウズラ、ホロホロチョウ、ウズラ、オオライチョウ、ライチョウ、ハト、白鳥、ダチョウ、およびオウム、最も好ましくは鶏の試料である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法を実施するステップと、壊死性腸炎感染症の処置のために治療薬を投与するステップとを含む、処置方法。
【請求項１３】
ａ）配列番号１に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも１００個、好ましくは少なくとも１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号１に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、９８％、または９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号３に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも１００個、好ましくは少なくとも１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号３に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、９８％、または９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｅ）配列番号７に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも１００個、好ましくは少なくとも１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｆ）配列番号７に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、９８％、または９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｇ）（ａ）から（ｆ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｈ）（ａ）から（ｇ）に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
からなる群より選択されるポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１５】
ａ）配列番号２に表されるアミノ酸配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の、特に全ての、連続するアミノ酸を含むポリペプチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｂ）配列番号１４に表されるアミノ酸配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、または７０個の、特に全ての、連続するアミノ酸を含むポリペプチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｃ）配列番号１５に表されるアミノ酸配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または１９０個の、特に全ての、連続するアミノ酸を含むポリペプチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｄ）（ａ）から（ｃ）に記載のポリペプチドを含むポリペプチド、
からなる群より選択されるポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鳥類壊死性腸炎を検出するための、微小胞に基づく方法、ならびにウェルシュ菌（クロストリジウム・パーフリンジェンス）（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の関与する鳥類壊死性腸炎および／または鳥感染症の検出にとって好適であるとして特定された新規のマーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
ウェルシュ菌は、１９６１年に最初に報告された家禽類の腸疾患である鳥類の壊死性腸炎（ＮＥ）の主な病原体である。鶏におけるＮＥは、急性または慢性の腸管毒血症として現れる。当該急性疾患は、結果として、腸壁における壊死病斑の発症に起因したかなりのレベルの死亡率を生じるが、その一方で、当該慢性疾患は、生産性および家畜福祉の著しい損失を生じる。当該疾患による損害は、養鶏産業において年間数十億米ドルと見積もられている。
【０００３】
ウェルシュ菌は、一般的に、家禽の胃腸管において見出されるが、ただし、壊死性腸炎の発症は散在的である。ウェルシュ菌は、グラム陽性で、桿菌様の、胞子形成性の酸素耐性嫌気性菌である。ウェルシュ菌種は、４種の疑わしい主要毒素（α、β、ε、およびι）の産生に基づいて、５つの毒素タイプ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ）に分類される。タイプＡは、常に、鶏の腸から回収されるが、他のタイプは、それほど一般的ではない。
【０００４】
ＮＥに関する初期の研究は、当該疾患に関与する主な病原性因子が細菌によって分泌されることを示唆しており、これは、α毒素と呼ばれるホスホリパーゼＣ酵素が、病因に関与する主要な毒素であるという提案につながった。しかし、最近の研究では、α毒素変異体菌株がＮＥを生じることが可能であることからα−毒素は本質的な病原性因子ではないように思われることを示しており、これは、概して、当該疾患におけるα毒素の役割に疑問を投げかけるものである。より最近の研究では、新規の小孔形成毒素ＮｅｔＢが、この疾患の発症における主要で重要な役割を果たすことが示唆されている。
【０００５】
ＮＥの発症に対する当該病原性因子自体の単純な関係性とは別に、鳥または家禽における当該疾患の確立に対してこれらの因子の機序を示すのは、依然として容易ではない。その上、鳥を屠殺することなくその検査を保証するような証拠がないため、これらの病原性因子のいずれかに対して無症候性ＮＥ感染症を関連付けるのは、達成するのが極めて困難である。したがって、ＮＥおよび最も重要なことにはＮＥの無症候性の形態を早期に検出する方法が、依然として必要とされている。
【０００６】
従来、疾患に対するバイオマーカーの発見および検証は、新鮮で凍結された組織、または、より一般的にはホルマリンで固定されパラフィン包埋された組織の使用を必要とする。これは、とりわけｍＲＮＡベースのバイオマーカーに当てはまるが、というのも、単離されたＲＮＡにおけるＲＮａｓｅの劣化は、組織ベースのバイオマーカーを血液などの生体液または糞便／盲腸試料に関連付けることを非常に困難にするためである。しかし、結果として、農場動物の場合などのように試料の数が多い場合、組織バイオマーカーのモニタリングは、その侵襲的性質から、時間がかかり、実用的ではない。
【０００７】
鳥における疾患の検出を目的とした、血液パラメータの測定などの非侵襲的方法が報告されている（Ｃｈｕｋｕら，２０１２；Ａａｄｅら，２０１２；Ｓａｌｅｅｍ，２０１２）。Ｇｕｌｂｅｅｎａ  Ｓａｌｅｅｍ（２０１２）は、無症候性ＮＥの検出のための代替的アプローチとして、鶏の血清中における、ウェルシュ菌のチャレンジに応答したセルロプラスミン、ＰＩＴ５４、およびオボトランスフェリンなどの急性期タンパク質のレベルの測定を提案している。これにより、セルロプラスミンのみが、無症候性ＮＥの発症に関連する好適な急性期タンパク質であると思われるということが明かとなった。にもかかわらず、これには問題があると考えられる。セルロプラスミンは、ＮＥに対する特異的マーカーではなく、他の細菌性病原体によって引き起こされる疾患のマーカーでもあるためである（ｃｏｌｌｉｂａｃｉｌｌｏｓｉｓ  ｉｎ  ｃｈｉｃｋｅｎ，Ｐｉｅｒｃｙ，１９７９；ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｌａｙｅｒｓ，Ｇａｒｃｉａら，２００９）。
【０００８】
しかしながら、バイオマテリアル中に見出されるエキソソームおよび他の膜小胞が、疾患状態に対する高い特異性を伴って、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および他の非コーディングＲＮＡなどの、ヒトドナー細胞由来の安定なＲＮＡを含むことが、最近発見された（Ｓｋｏｇら，２００８；Ｎｉｌｓｓｏｎら，２００９；Ｌｉら，２００９；Ｓｈａｏら，２０１２）。
【０００９】
したがって、本出願の発明者らは、無症候性壊死性腸炎を示す家禽を特定するために、家禽の体液または排泄物から単離された膜小胞を使用することができないだろうかと考えた。これは、疾患に対して相関を示す特異的ホストｍｉＲＮＡの蓄積によるものとして特に当てはまり得る。
【００１０】
驚くべきことに、鳥類の体液または鳥類の排泄物から単離された微小胞が、壊死性腸炎の存在に応じた、検出可能なＲＮＡの含有量の変化を示すことが見出された。ウェルシュ菌による感染に起因した特異的ホスト−ｍｉＲＮＡの増加に加えて、驚くべきことに、ウェルシュ菌のｍＲＮＡ配列も、微小胞画分において検出することができ、したがって、これらは、疾患特異的病原性因子として分類され、したがって、壊死性腸炎を示す好適なバイオマーカーとして分類される。
【００１１】
微小胞画分におけるウェルシュ菌のｍＲＮＡの出現は、適用された単離手順が、家禽の微小胞の濃縮だけでなく、感染性細菌の微小胞の濃縮も生じるという事実によって説明され得る。驚くべきことに、ｎｅｔＢのような既知の推定毒性因子に加えて、以前は疑われていなかったＲＮＡ配列も、壊死性腸炎に相関があるとして特定することができた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明の第１の目的は、好ましくは家禽における、より好ましくは鶏における鳥類壊死性腸炎、特に、無症候性の鳥類壊死性腸炎を特定するための、迅速で信頼性の高い、好ましくは非侵襲的な方法を提供すること、および／または壊死性腸炎に罹患した鳥類対象を識別することであった。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、そのような方法において用いることができる、好適なマーカー、好ましくは疾患特異的マーカーを識別することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、本発明の第１の主題は、鳥類壊死性腸炎、特に無症候性の鳥類壊死性腸炎を検出するための方法であって、鳥類試料、特に鳥類の体液または鳥類の排泄物から微小胞を単離するステップと、それに続いて、これらの微小胞中において壊死性腸炎を示す少なくとも１種のマーカーの存在および／またはレベルを特定するステップとを含み、非感染の対照との比較における、この少なくとも１種のマーカーの当該存在および／またはレベルの増加が壊死性腸炎を示す、方法である。
【００１５】
本発明による壊死性腸炎を示すマーカーは、好ましくは以下のウェルシュ菌の配列および相同物およびそれらの断片：ＳＡＭ領域（配列番号１）、ｓｗｉｍ亜鉛フィンガー領域（配列番号−３）、ｓｃＲＮＡ（配列番号４）、ｃｏｌＡ領域（配列番号５）、ＣＰＥ０９５６領域（配列番号７）、ｎｅｔＢ領域（配列番号８）、ｖｉｒＸ領域（配列番号９）、およびＴｐｅＬ領域（配列番号１６）；ならびに以下の鳥類の配列および相同物およびそれらの断片：ｍｉｒ−１６（配列番号１０）、ｍｉｒ−２４（配列番号１１）、ｍｉｒ−１５５（配列番号１２）、ｍｉｒ−２０６（配列番号１３）、から選択される。
【００１６】
したがって、本発明の好ましい主題は、鳥類壊死性腸炎、特に無症候性の鳥類壊死性腸炎を検出するための方法であって、鳥類試料、特に鳥類の体液または鳥類の排泄物から微小胞を単離するステップと、それに続いて、これらの微小胞中において壊死性腸炎を示す少なくとも１種のマーカーの存在および／またはレベルを特定するステップとを含み、非感染の対照との比較における、この少なくとも１種のマーカーの当該存在および／またはレベルの増加が壊死性腸炎を示し、ならびに当該マーカーが、以下の群（「リストＩ」）：
ａ）配列番号１に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号３に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号４に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号５に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｅ）配列番号７に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｆ）配列番号８に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｇ）配列番号９に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｈ）配列番号１６に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｉ）配列番号１０に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、６０個、または８０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｊ）配列番号１１に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、または６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｋ）配列番号１２に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、または６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｌ）配列番号１３に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、または６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｍ）（ａ）から（ｌ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｎ）（ｍ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｏ）（ａ）から（ｎ）に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
から選択される、方法である。
【００１７】
この方法において、当該配列は、好ましくは、以下の群（「リストＩＩ」）：
ａ）配列番号１の位置１から６３０、特に４２０から６３０、好ましくは４６０から５６０のヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号３の位置６００から１０００、特に６７０から７６０のヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号４の位置６０から２４０、特に８０から２２０のヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号５（に表される配列）の位置１３００から１８００、特に１４００から１７００の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｅ）配列番号７の位置１から５９１、特に１００から２８０のヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｆ）配列番号８の位置２４０から５４０、特に３００から５４０のヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｇ）配列番号９の位置１２から４１８、特に２４０から４００のヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｈ）配列番号１６の位置６７３から５６２８のヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｉ）配列番号１０の位置１４から２５のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｊ）配列番号１１の位置４４から６５のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、または２０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｋ）配列番号１２の位置３から２４のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、または２０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｌ）配列番号１３の位置４５から６６のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、または２０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｍ）（ａ）から（ｌ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｎ）（ｍ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｏ）（ａ）から（ｎ）に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
から選択される。
【００１８】
より好ましくは、当該配列は、好ましくは、以下の群（「リストＩＩＩ」）：
ａ）配列番号１の位置４６０から５６０のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個または４０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号３の位置６７０から７６０のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個または４０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号４の位置８０から２２０のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個または４０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号５の位置１４００から１７００のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個または４０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｅ）配列番号７の位置１００から２８０のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個または４０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｆ）配列番号８の位置３００から５４０のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個または４０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｇ）配列番号９の位置２４０から４００のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個または４０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｈ）配列番号１６の位置６７３から５６２８のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個または４０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｉ）配列番号１０の位置１４から２５のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｊ）配列番号１１の位置４４から６５のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、または２０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｋ）配列番号１２の位置３から２４のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、または２０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｌ）配列番号１３の位置４５から６６のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、または２０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、
ｍ）（ａ）から（ｌ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｎ）（ｍ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｏ）（ａ）から（ｎ）に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
から選択される。
【００１９】
当該ポリヌクレオチド／マーカーの本発明の組み合わせの好ましい実施形態において、好ましくは、当該マーカーの少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、または７個の組み合わせが、壊死性腸炎を検出するために使用される。
【００２０】
本発明の別の主題は、感染症、特に壊死性腸炎に関連するウェルチ菌を検出するための方法であって、鳥類試料から微小胞を単離するステップと、それに続いて、これらの微小胞中における、感染症、特に壊死性腸炎に関連するウェルチ菌の存在を示す少なくとも１種のマーカーの存在および／またはレベルを特定するステップとを含み、非感染の対照との比較における、この少なくとも１種のマーカーの当該存在および／またはレベルの増加が、当該疾患、特に壊死性腸炎を示す、方法である。この方法において、当該少なくとも１種のマーカーは、好ましくは、リストＩの（ａ）から（ｈ）のポリヌクレオチドならびにこれらの配列に相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）から選択される。より好ましくは、当該マーカーは、リストＩＩの（ａ）から（ｈ）のポリヌクレオチドならびにこれらの配列に相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）から選択される。さらにより好ましくは、当該マーカーは、リストＩＩＩの（ａ）から（ｈ）のポリヌクレオチドならびにこれらの配列に相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）から選択される。
【００２１】
本発明の別の主題は、感染症、特に壊死性腸炎に関連する鳥類ｍｉＲＮＡを検出するための方法であって、鳥類試料から微小胞を単離するステップと、それに続いて、これらの微小胞中における、感染症、特に壊死性腸炎に関連するｍｉＲＮＡの存在および／またはレベルを特定するステップとを含み、非感染の対照との比較における、この少なくとも１種のマーカーの当該存在および／またはレベルの増加が、当該疾患、特に壊死性腸炎を示す、方法である。この方法において、当該少なくとも１種のマーカーは、好ましくは、リストＩの（ｉ）から（ｌ）のポリヌクレオチドならびにこれらの配列に相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）から選択される。より好ましくは、当該マーカーは、リストＩＩの（ｉ）から（ｌ）のポリヌクレオチドならびにこれらの配列に相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）から選択される。さらにより好ましくは、当該マーカーは、リストＩＩＩの（ｉ）から（ｌ）のポリヌクレオチドならびにこれらの配列に相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）から選択される。
【００２２】
驚くべきことに、鳥類壊死性腸炎を検出するためのマーカーとして、ＳＡＭ領域（配列番号１）、ｓｗｉｍ亜鉛フィンガー領域（配列番号３）、ｓｃＲＮＡ（配列番号４）、ＣＰＥ０９５６領域（配列番号７）、ｖｉｒＸ領域（配列番号９）、ならびにｍｉｒ−１６（配列番号１０）、ｍｉｒ−２４（配列番号１１）、ｍｉｒ−１５５（配列番号１２）、およびｍｉｒ−２０６（配列番号１３）を使用することができるので、本発明のさらなる主題は、鳥類壊死性腸炎、特に無症候性の鳥類壊死性腸炎を検出する方法であって、壊死性腸炎の検出が、鳥類試料、好ましくは鳥類試料中の微小胞における以下の配列（「リストＩＶ」）：
ａ）配列番号１に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号３に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号４に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号７に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｅ）配列番号９に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｆ）配列番号１０に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、６０個、または８０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｇ）配列番号１１に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、または６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｈ）配列番号１２に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、または６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｉ）配列番号１３に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、または６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｊ）（ａ）から（ｉ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｋ）（ｊ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｌ）（ａ）から（ｋ）に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
のうちの少なくとも１種の存在および／または量を、非感染鳥類の対照試料との比較において検出することによって行われ、非感染の対照との比較におけるこれらの配列のうちの少なくとも１つの存在および／またはレベルの増加が、壊死性腸炎を示す、方法である。
【００２３】
この方法において、当該配列は、好ましくは、以下の群（「リストＶ」）：
ａ）配列番号１の位置１から６３０、特に４２０から６３０、好ましくは４６０から５６０のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号３の位置６００から１０００、特に６７０から７６０のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号４の位置６０から２４０、特に８０から２２０のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号７の位置１から５９１、特に１００から２８０のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｅ）配列番号９の位置１２から４１８、特に２４０から４００のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｆ）配列番号１０の位置１４から２５のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｇ）配列番号１１の位置４４から６５のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、または２０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｈ）配列番号１２の位置３から２４のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、または２０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｉ）配列番号１３の位置４５から６６のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、または２０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｊ）（ａ）から（ｉ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｋ）（ｊ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｌ）（ａ）から（ｋ）に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
から選択される。
【００２４】
より好ましくは、当該配列は、好ましくは、以下の群（「リストＶＩ」）：
ａ）配列番号１の位置４６０から５６０のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個または４０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、９８％、または９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号３の位置６７０から７６０のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個または４０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、９８％、または９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号４の位置８０から２２０のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個または４０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、９８％、または９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号７の位置１００から２８０のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個または４０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、９８％、または９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｅ）配列番号９の位置２４０から４００のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個または４０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、９８％、または９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｆ）配列番号１０の位置１４から２５のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、９８％、または９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｇ）配列番号１１の位置４４から６５のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、または２０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、９８％、または９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｈ）配列番号１２の位置３から２４のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、または２０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、９８％、または９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｉ）配列番号１３の位置４５から６６のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、または２０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、９８％、または９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｊ）（ａ）から（ｉ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｋ）（ｊ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｌ）（ａ）から（ｋ）に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
から選択される。
【００２５】
当該ポリヌクレオチドの本発明の組み合わせの好ましい実施形態において、好ましくは、当該ポリヌクレオチドの少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、または７個の組み合わせが、壊死性腸炎を検出するために使用される。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明による鳥類試料は、組織試料、好ましくは腸管試料、特に十二指腸または空腸試料であり得る。
【００２７】
好ましくは、当該鳥類試料は、鳥類の体液および鳥類の排泄物ならびにそれらの溶液および懸濁液から選択される。
【００２８】
本発明による鳥類の体液は、好ましくは血液、血清、または血漿である。
【００２９】
本発明による鳥類の排泄物は、好ましくは、糞便および盲腸排泄物から選択される。
【００３０】
好適な試料の体積は、例えば、０．１から２０ｍｌ、特に０．２から１０ｍｌ、好ましくは０．５から５ｍｌである。好適な試料の質量は、例えば、０．１から２０ｇ、特に０．２から１０ｇ、好ましくは０．５から５ｇである。
【００３１】
本発明による鳥類対象は、好ましくは家禽である。
【００３２】
本発明による好ましい家禽は、鶏、七面鳥、アヒル、およびガチョウである。当該家禽は、若いストックを生産するために最適化することができる。このタイプの家禽は、親動物とも呼ばれる。
【００３３】
したがって、好ましい親動物は、親ブロイラー、親アヒル、親七面鳥、および親ガチョウである。
【００３４】
本発明による家禽は、観賞用家禽および野鳥から選択することもできる。
【００３５】
好ましい観賞用家禽または野鳥は、クジャク、キジ、ヤマウズラ、ホロホロチョウ、ウズラ、オオライチョウ、ライチョウ、ハト、または白鳥である。
【００３６】
本発明によるさらなる好ましい家禽は、ダチョウおよびオウムである。
【００３７】
本発明による最も好ましい家禽は鶏である。
【００３８】
本明細書において使用される場合、「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡを意味する。当該ポリヌクレオチドおよび核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。
【００３９】
鳥類の排泄物からの微小胞の単離と、その後の、鳥類感染症、特に鳥類の細菌感染症、より具体的には壊死性腸炎を特定するためのそれらの使用は、以前に開示されたことがない。
【００４０】
したがって、本発明のさらなる主題は、鳥類感染症、特に無症候性の鳥類感染症、好ましくは鳥類の細菌感染症、特に無症候性の鳥類の細菌感染症、より好ましくは壊死性腸炎、特に無症候性の壊死性腸炎を検出する方法であって、鳥類の排泄物、特に糞便または盲腸排泄物から単離された微小胞における当該疾患を示す少なくとも１種のマーカーの存在および／または量を特定するステップを含み、非感染の対照との比較におけるこの少なくとも１種のマーカーの存在および／またはレベル増加が当該疾患を示す、方法である。この方法において、好ましくは、当該少なくとも１種のマーカーは、リストＩにおいて開示されるような、好ましくはリストＩＩにおいて開示されるような、より好ましくはリストＩＩＩにおいて開示されるようなポリヌクレオチドのいずれかから選択される。
【００４１】
壊死性腸炎を示すマーカーの出現は試料特異的であること、すなわち、異なるマーカーの検出可能な量は、当該試料のタイプに依存することが判明した。
【００４２】
そのため、糞便排泄物において、最も良好なマーカーは、ＳＡＭ領域であり、それに続いて、ｓｃＲＮＡ、ｎｅｔＢ領域、ｖｉｒＸ領域、ｃｏｌＡ領域、ｓｗｉｍ亜鉛フィンガー領域、およびＣＰＥ０９５６領域であることが見出された。
【００４３】
対照的に、盲腸排泄物でも、最も良好なマーカーはＳＡＭ領域であるが、それに続くのは、ｓｗｉｍ亜鉛フィンガー領域、ｓｃＲＮＡ、ｍｉｒ２０６、ｖｉｒＸ領域、ｎｅｔＢ領域、ＣＰＥ０９５６領域、およびｃｏｌＡ領域である。
【００４４】
さらに、血液試料では、最も良好なマーカーはｍｉｒ１６であり、それに続いてｍｉｒ１５５およびｍｉｒ２４である。
【００４５】
したがって、本出願の好ましい実施形態は、鳥類壊死性腸炎、特に無症候性の鳥類壊死性腸炎を検出する方法であって、鳥類の糞便排泄物、好ましくは鳥類の糞便排泄物から単離された微小胞における壊死性腸炎を示す少なくとも１種のマーカーの存在および／またはレベルを特定するステップを含み、非感染の対照と比較した場合のこの少なくとも１種のマーカーの存在および／またはレベル増加が壊死性腸炎を示し、当該マーカーが、好ましくは、
ａ）配列番号１に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、
ｂ）配列番号３に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、
ｃ）配列番号４に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号５に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｅ）配列番号７に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｆ）配列番号８に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｇ）配列番号９に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｈ）（ａ）から（ｇ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｉ）（ｈ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｊ）（ａ）から（ｉ）に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
から選択される、方法である。
【００４６】
この方法において、当該配列は、好ましくは、以下の群：
ａ）配列番号１の位置１から６３０、特に４２０から６３０、好ましくは４６０から５６０のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、または１００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号３の位置６００から１０００、特に６７０から７６０のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、または９０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号４の位置６０から２４０、特に８０から２２０のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、または１４０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号５の位置１３００から１８００、特に１４００から１７００の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｅ）配列番号７の位置１から５９１、特に１００から２８０のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、または１８０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｆ）配列番号８の位置２４０から５４０、特に３００から５４０のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｇ）配列番号９の位置１２から４１８、特に２４０から４００のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、または１６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｈ）（ａ）から（ｇ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｉ）（ｈ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｊ）（ａ）から（ｉ）に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
から選択される。
【００４７】
したがって、本出願の別の好ましい実施形態は、鳥類壊死性腸炎、特に無症候性の鳥類壊死性腸炎を検出する方法であって、鳥類の盲腸排泄物、特に鳥類の盲腸排泄物から単離された微小胞における壊死性腸炎を示す少なくとも１種のマーカーの存在および／またはレベルを特定するステップを含み、非感染の対照との比較における、この少なくとも１種のマーカーの当該存在および／またはレベルの増加が壊死性腸炎を示し、ならびに当該マーカーが、好ましくは、
ａ）配列番号１に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、
ｂ）配列番号３に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、
ｃ）配列番号４に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号５に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｅ）配列番号７に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｆ）配列番号８に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｇ）配列番号９に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｈ）配列番号１３に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、または６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｉ）（ａ）から（ｈ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｊ）（ｉ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｋ）（ａ）から（ｊ）に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
から選択される、方法である。
【００４８】
この方法において、当該配列は、好ましくは、以下の群：
ａ）配列番号１の位置１から６３０、特に４２０から６３０、好ましくは４６０から５６０のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、または１００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、
ｂ）配列番号３の位置６００から１０００、特に６７０から７６０のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、または９０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、
ｃ）配列番号４の位置６０から２４０、特に８０から２２０のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、または１４０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号５の位置１３００から１８００、特に１４００から１７００の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｅ）配列番号７の位置１から５９１、特に１００から２８０のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、または１８０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｆ）配列番号８の位置２４０から５４０、特に３００から５４０のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｇ）配列番号９の位置１２から４１８、特に２４０から４００のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、または１６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｈ）配列番号１３の位置４５から６６のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、または２０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｉ）（ａ）から（ｈ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｊ）（ｉ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｋ）（ａ）から（ｊ）に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
から選択される。
【００４９】
したがって、本出願の別の好ましい実施形態は、鳥類壊死性腸炎、特に無症候性の壊死性腸炎を検出する方法であって、鳥類の血液、特に鳥類の血液から単離された微小胞における壊死性腸炎を示す少なくとも１種のマーカーの存在および／またはレベルを特定するステップを含み、非感染の対照との比較における、この少なくとも１種のマーカーの当該存在および／またはレベルの増加が壊死性腸炎を示し、ならびに当該少なくとも１種のマーカーが、好ましくは、
ａ）配列番号１０に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、６０個、または８０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号１１に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、または６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号１２に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、または６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｄ）（ａ）から（ｃ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｅ）（ｄ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｆ）（ａ）から（ｅ）に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
から選択される、方法である。
【００５０】
この方法において、当該配列は、好ましくは、以下の群：
ａ）配列番号１０の位置１４から２５のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号１１の位置４４から６５のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、または２０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号１２の位置３から２４のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、または２０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｄ）（ａ）から（ｃ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｅ）（ｄ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｆ）（ａ）から（ｅ）に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
から選択される。
【００５１】
本発明のさらなる主題は、上記において説明されるような壊死性腸炎を検出する方法を実施するステップと、それに続いて壊死性腸炎の処置のために治療薬を投与するステップとを含む、壊死性腸炎の処置方法である。
【００５２】
本発明のさらなる主題は、鳥類壊死性腸炎を検出するためのヌクレオチドアレイであって、リストＩＶに示されるような、好ましくはリストＶに表されるような、より好ましくはリストＶＩに表されるようなポリヌクレオチドから選択される、少なくとも１種のマーカー、好ましくは少なくとも２種、３種、４種、または５種のマーカーを含む、ヌクレオチドアレイでもある。
【００５３】
本発明のさらなる主題は、壊死性腸炎に関連する少なくとも１種のポリヌクレオチドを増幅するためのオリゴヌクレオチドのセットを含むキットであって、当該少なくとも１種のポリヌクレオチドが、リストＩＶに表されるような、好ましくはリストＶに表されるような、より好ましくはリストＶＩに表されるようなポリヌクレオチドから選択される、キットでもある。
ＮｅｔＢおよびＴｐｅＬについて、既に、壊死性腸炎の病因に関与する主要毒素であることが議論されている（Ｋｅｙｂｕｒｎら，２０１０；国際公開第２００８／１４８１６６号；Ｓｈｏｊａｄｏｏｓｔら，２０１２）。
【００５４】
ＣｏｌＡは、ウェルシュ菌のコラゲナーゼＡを表し、この遺伝子は、この病原菌における想定される主要毒素の１つである、いわゆるκ毒素に対する類似性から、ＮＥの病因に関連しているかもしれない（Ｏｂａｎａら，２０１３）。
【００５５】
それにもかかわらず、微小胞におけるこれらの遺伝子の出現ならびに脱調節は、予想されなかった。
【００５６】
ｖｉｒＸ遺伝子は、ウェルシュ菌におけるｐｌｘ、ｃｏｌＡ、およびｐｆｏＡを調節することが知られているが（Ｏｈｔａｎｉら，２００２）、ＮＥの病因への関与は、今まで報告されていない。
【００５７】
ウェルシュ菌の胞子形成機構に関与する、進化的に保存されたシグナル識別粒子様ＲＮＡファミリーのメンバーである低分子量細胞質ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）（Ｎａｋａｍｕｒａら，１９９５）も、鶏のＮＥに直接関連していることは今まで報告されていない。
【００５８】
さらに、壊死性腸炎の病因におけるＳＡＭドメイン、ｓｗｉｍ亜鉛フィンガードメイン、およびＣＰＥ０９５６領域の関与は、これらの配列が今までに知られていない機能を有する配列であるため、今までに開示されておらず、予想され得なかったであろう。
【００５９】
したがって、本発明のさらなる主題は、
ａ）配列番号１に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも１００個、好ましくは少なくとも１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号１に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、９８％、または９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号３に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも１００個、好ましくは少なくとも１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号３に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、９８％、または９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｅ）配列番号７に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも１００個、好ましくは少なくとも１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｆ）配列番号７に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、９８％、または９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｇ）（ａ）から（ｆ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｈ）（ａ）から（ｇ）に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
からなる群より選択される、好ましくは壊死性腸炎に関与する毒素活性および／または病原性因子を有するポリペプチドをコード化する、ポリヌクレオチドである。
【００６０】
特に好ましいのは、
ａ）配列番号１の位置１から６３０、特に４２０から６３０、好ましくは４６０から５６０のヌクレオチド配列の、少なくとも１００個、好ましくは少なくとも１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号１の位置１から６３０、特に４２０から６３０、好ましくは４６０から５６０のヌクレオチド配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、９８％、または９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号３の位置６００から１０００、特に６７０から７６０のヌクレオチド配列の、少なくとも１００個、好ましくは少なくとも１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号３の位置６００から１０００、特に６７０から７６０のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、９８％、または９９％、最も好ましくは−１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｅ）配列番号７の位置１から５９１、特に１００から２８０のヌクレオチド配列の、少なくとも１００個、好ましくは少なくとも１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｆ）配列番号７の位置１から５９１、特に１００から２８０のヌクレオチド配列の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、９８％、または９９％、最も好ましくは−１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｇ）（ａ）から（ｆ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｈ）（ａ）から（ｇ）に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
からなる群より選択されるポリヌクレオチドである。
【００６１】
したがって、本発明のさらなる主題は、
ａ）配列番号２に表されるアミノ酸配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の、特に全ての、連続するアミノ酸を含むポリペプチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｂ）配列番号１４に表されるアミノ酸配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、または７０個の、特に全ての、連続するアミノ酸を含むポリペプチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｃ）配列番号１５に表されるアミノ酸配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または１９０個の、特に全ての、連続するアミノ酸を含むポリペプチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｄ）（ａ）から（ｃ）に記載のポリペプチドを含むポリペプチド、
からなる群より選択される、好ましくは壊死性腸炎に関与する毒素および／または病原性因子であるポリペプチドでもある。
【００６２】
特に好ましいのは、
ａ）配列番号２に表されるアミノ酸配列の、少なくとも１００個、好ましくは少なくとも１５０個、１８０個、または２００個の、特に全ての、連続するアミノ酸を含むポリペプチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｂ）配列番号１４に表されるアミノ酸配列の、少なくとも４０個、好ましくは少なくとも６０個または７０個の、特に全ての、連続するアミノ酸を含むポリペプチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｃ）配列番号１５に表されるアミノ酸配列の、少なくとも１００個、好ましくは少なくとも１５０個、１８０個、または１９０個の、特に全ての、連続するアミノ酸を含むポリペプチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｄ）（ａ）から（ｃ）に記載のポリペプチドを含むポリペプチド、
からなる群より選択されるポリペプチドである。
【００６３】
したがって、本発明のさらなる主題は、動物において免疫反応を高める方法であって、上記において言及されるような、特に、
ａ）配列番号２に表されるアミノ酸配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または２００個の、特に全ての、連続するアミノ酸を含むポリペプチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｂ）配列番号１４に表されるアミノ酸配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、または７０個の、特に全ての、連続するアミノ酸を含むポリペプチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｃ）配列番号１５に表されるアミノ酸配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、２０個、２５個、４０個、６０個、１００個、１５０個、１８０個、または１９０個の、特に全ての、連続するアミノ酸を含むポリペプチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｄ）（ａ）から（ｃ）に記載のポリペプチドを含むポリペプチド、
からなる群より選択される、ポリペプチドを当該動物に投与するステップを含む方法でもある。
【００６４】
本発明によるポリペプチドは、好ましくは、毒素活性を示し、ならびに好ましくは、ウェルチ菌から入手可能である。より好ましくは、本発明によるポリペプチドは、ＮＥ関連病原性因子である。
【００６５】
本発明のさらなる主題は、本発明によるポリヌクレオチドを含む、ベクター、特に、クローニングベクターおよび発現ベクターならびにウイルスベクターおよびプラスミドベクターである。
【００６６】
本発明のさらなる主題は、本発明によるポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／またはベクターを含む、細胞、特に細菌細胞、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞でもある。
【００６７】
本発明のさらなる主題は、本発明による毒素活性を有するポリペプチドに特異的に結合する、特に本発明によるＮＥ関連病原性因子に特異的に結合する、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体あるいはそれらの断片である。
【００６８】
本発明のさらなる主題は、本発明によるポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、細胞、または抗体を含む、組成物である。
【００６９】
本発明のさらなる主題は、本発明によるポリヌクレオチドまたは抗体を含む診断キットである。当該キットはさらに、下記においてより詳細に説明されるように、不要粒子、破片、および小分子から、生物試料由来の微小胞を分離するのに好適な捕捉表面機器を含み得る。当該キットは、さらに、その使用のための、特に、微小胞の任意選択の単離および溶解ならびにその後の本発明によるマーカーのうちの少なくとも１種の存在の定性的または定量的測定において当該コンポーネントを使用するための、取扱説明書を備え得る。
【００７０】
本発明のさらなる主題は、本発明によるポリペプチドと補助剤および／または薬学的に許容される担体とを含む免疫原性組成物である。
【００７１】
本発明のさらなる主題は、本発明によるポリペプチドと、好ましくは補助剤および／または薬学的に許容される担体とを含むワクチンでもある。
【００７２】
本発明による微小胞は、細菌由来の、特にウェルチ菌由来の、ならびに宿主由来の、特に鶏由来の膜小胞を含む。
【００７３】
真核生物の膜小胞は、エキソソームとも呼ばれる。エキソソームは、典型的には、３０〜２００ｎｍの直径を有する。それらは、全ての体液中を流れ、それらによって、多くの無傷のタンパク質およびオリゴヌクレオチドを運ぶが、これは、それらがＲＮＡｓｅによる劣化から保護されるためである（Ｋｏｇａら，２０１１）。
【００７４】
エキソソームは、特に癌および免疫細胞において研究されてきた。
【００７５】
細菌由来の微小胞は、細胞外膜小胞（ＭＶ）または外膜小胞（ＯＭＶ）とも呼ばれる。それらは、典型的には２０〜５００ｎｍの平均直径を有する球状の二層構造である。細菌性微小胞は、最初、グラム陰性菌について報告されたが、後に、いくつかのグラム陽性菌も報告されている。最近の研究では、微小胞はウェルシュ菌のタイプＡ菌種によっても産生および放出され、先天的および順応性の免疫反応を引き起こすことが報告された。さらに、これらの研究の過程において、α毒素およびＮｅｔＢのような重要な病原性因子が、当該膜小胞に存在しないことが分かり、その一方で、β２毒素が膜小胞において見出された（Ｊｉａｎｇら，（２０１４））。
【００７６】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、通常は１８〜２３個のヌクレオチドのサイズの低分子非コーディングＲＮＡであり、遺伝子発現の調節において重要な役割を果たすことが示唆されていた。特に、免疫反応に関連する遺伝子は、ｍｉＲＮＡによって非常に標的化されることが報告されている。鶏において、ｍｉＲＮＡ発現は、胎児の発育過程、生殖細胞発達、免疫器官、および疾患において研究されている。
【００７７】
最近の研究において、ウェルシュ菌に感染した、２種の異なる非常に近交系のホワイトレグホーン鶏菌種のｍｉＲＮＡプロファイルについて調査された（Ｄｉｎｈら，２０１４；Ｈｏｎｇら，２０１４）。脾臓および腸管粘膜の組織によってＲＮＡ分析が実施された。その結果は、いくつかのｍｉＲＮＡは、壊死性腸炎に対応して差次的に変化し、それらの標的遺伝子の発現を調節するということを示唆するものである。微小胞は、これらの研究では調査されていない。
【００７８】
本発明による壊死性腸炎に関連することが見出されるｍｉＲＮＡは、以前に、Ｗａｎｇらによって鳥インフルエンザウイルスに感染したブロイラーに関して調査された（Ｗａｎｇら，２０１２）。Ｗａｎｇらは、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１６−１、およびｍｉＲ−２４のｍｉＲＮＡが、非感染のブロイラーよりも感染したブロイラーの肺においてより強く発現されることを見出したが、彼らはさらに、対照的に、ｍｉＲ−２０６は、感染したブロイラーよりも非感染のブロイラーにおいてより強く発現されることも見出した。したがって、細菌感染症のためのマーカーとしてのｍｉＲ−２０６の使用は、本出願において初めて開示されるものである。さらに、Ｗａｎｇらとは対照的に、本発明により、全てのｍｉＲＮＡは、組織においてではなく、微小胞において検出された。
【００７９】
したがって、本発明のさらなる主題は、鳥類細菌感染症、特に鳥類壊死性腸炎を検出するための方法であって、鳥類試料から微小胞を単離するステップと、それに続いて、感染症を示す少なくとも１種の鳥類マーカーのレベルを特定するステップとを含み、非感染の対照との比較におけるこの少なくとも１種の鳥類マーカーのレベル増加が、当該感染症を示し、当該少なくとも１種の鳥類マーカーが、鳥類のｍｉＲＮＡであり、好ましくは、
ａ）配列番号１０に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、６０個、または８０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号１１に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、または６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号１２に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、または６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号１３に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、または６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｅ）（ａ）から（ｄ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｆ）（ｅ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｇ）（ａ）から（ｆ）に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
からなる群より選択される、方法である。
【００８０】
この方法において、当該配列は、好ましくは、以下の群：
ａ）配列番号１０の位置１４から２５のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号１１の位置４４から６５のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、または２０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号１２の位置３から２４のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、または２０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号１３の位置４５から６６のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、または２０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｅ）（ａ）から（ｄ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｆ）（ｅ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｇ）（ａ）から（ｆ）に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
から選択される。
【００８１】
初めて、ｍｉｒ−２０６を鳥類感染症に対するマーカーとして特定することができたので、本発明のさらなる主題は、鳥類感染症、好ましくは鳥類細菌感染症、より好ましくは鳥類壊死性腸炎を検出する方法であって、非感染の対照との比較における少なくとも１種の鳥類マーカーのレベル増加が、当該感染症を示し、当該少なくとも１種の鳥類マーカーが、
ａ）配列番号１３に表されるヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、４０個、または６０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｂ）（ａ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｃ）（ａ）から（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
からなる群より選択される、方法である。
【００８２】
この方法において、当該配列は、好ましくは、以下の群：
ａ）配列番号１３の位置４５から６６のヌクレオチド配列の、少なくとも８個または１０個、好ましくは少なくとも１２個、１４個、１６個、１８個、または２０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
ｂ）（ａ）に記載の配列に対して相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；
ｃ）（ａ）から（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
から選択される。
【００８３】
本発明による方法の用途は、例えば、（ｉ）鳥類壊死性腸炎の診断および／または予後に役立てること、（ｉｉ）鳥類壊死性腸炎の進行または再発の監視、または（ｉｉｉ）壊死性腸炎の処置を受けるかまたは処置を想到する鳥類対象に対する治効の評価に役立てること、であり、この場合、当該方法から得られる核酸抽出物において前に言及したバイオマーカーの１種または複数種の存在または不在が特定され、当該１種または複数種のバイオマーカーは、それぞれ、壊死性腸炎の診断、進行もしくは再発、または治効に関連付けられる。
【００８４】
本発明の用途は、体重増加および飼料要求率のような鳥類の性能における損失を避けることに役立つ。
【００８５】
微小胞の単離
核酸の抽出の前に生物試料からの微小胞を単離することは有利であり、というのも、最初に微小胞を単離することなく体液試料または排泄物から直接的に核酸を抽出することによって得られる収率／無欠陥性と比較して、核酸含有微小胞は、より高い無欠陥性において、非常に高い収率で核酸種を産生するためである。さらに、低レベルにおいて発現される核酸を検出することも可能である。微小胞の単離により、タンパク質、脂質、細胞破片、細胞、ならびに生物試料内に天然において見出される他の潜在的混在物およびＰＣＲ阻害物の排除も可能となる。
【００８６】
生物試料からの膜小胞の単離、およびそれに続く核酸の抽出は、例えば、超遠心分離によって、例えば、１０，０００ｇを超える速度で１〜３時間にわたって回転させ、その後に上澄みを除去し、ペレットを洗浄し、当該ペレットを溶解させ、カラムにおいて核酸を精製することによって実施することができる。代替法は、例えば１００ｋＤフィルターを使用した限外ろ過、ポリマー沈殿技術、および／またはサイズに基づくろ過である。
【００８７】
さらなる代替法は、Ｒａｐｏｓｏら（１９９６）、Ｓｋｏｇら（２００８）、およびＮｉｌｓｓｏｎら（２００９）によって報告されるような分画遠心法；米国特許第６，８９９，８６３号および同第６，８１２，０２３号に記載されるイオン交換法および／またはゲル透過クロマトグラフィ；米国特許第７，１９８，９２３号に記載されるショ糖密度勾配またはオルガネラ電気泳動法；ＴａｙｌｏｒおよびＧｅｒｃｅｌ−Ｔａｙｌｏｒ（２００８）によって報告される磁気細胞分離法（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＭＡＣＳ）；Ｃｈｅｒｕｖａｎｋｙら（２００７）によって報告されるナノ膜限外ろ過濃縮法（ｎａｎｏｍｅｍｂｒａｎｅ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）；Ｍｉｒａｎｄａら（２０１０）によって報告されるＰｅｒｃｏｌｌ勾配単離法；およびＣｈｅｎら（２０１０）によって報告されるマイクロ流体素子による単離である。
【００８８】
国際公開第２０１４／１０７５７１号による捕捉表面に基づく微小胞の単離
好ましい実施形態において、当該微小胞画分は、捕捉表面、特に、国際公開第２０１４／１０７５７１号に記載されるような、膜、フィルター、または表面改質ビーズに結合される。
【００８９】
当該生物試料は、好ましくは、好ましくは４〜８、より好ましくは５〜７のｐＨを有するローディングバッファーに溶解される。したがって、捕捉表面への結合は、好ましくは、４〜８、より好ましくは５〜７のｐＨにおいて生じる。好ましくは、生物試料を捕捉表面に接触させた後、１回または複数回の洗浄ステップが実施される。
【００９０】
本発明に従って使用することができるローディングバッファーおよび洗浄バッファーは、高イオン強度または低イオン強度であり得る。したがって、塩濃度、例えば、ＮａＣｌ濃度は、０から２．４Ｍであり得る。好ましくは、当該バッファーは、以下の成分：Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−プロパン、イミダゾール、シトレート、メチルマロン酸、酢酸、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）、およびリン酸ナトリウムのうちの１種または複数種を含む。
【００９１】
洗浄ステップは、好ましくは、２５０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ−プロパンを含みかつ６．５〜７．０のｐＨを示す洗浄バッファーを使用することによって実施される。
【００９２】
洗浄バッファーに洗浄剤を加えることによって、非特異的結合が抑制される。使用に好適な洗浄剤としては、これらに限定されるわけではないが、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０）、Ｂｒｉｊ−３５、Ｂｒｉｊ−５８、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ＣＨＡＰＳ、またはＣＨＡＰＳＯが挙げられる。
【００９３】
捕捉表面を洗浄した後、当該核酸は、固定された微小胞を溶解させることによって放出させることができる。当該固定された微小胞を溶解させるため、好ましくは、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）溶解試薬（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）のようなフェノールベースの溶解バッファーが使用される。次いで、ＰＬＧ管を使用したクロロホルム抽出と、その後のエタノールコンディショニングによって、当該核酸の精製を実施することができる。次いで、当該核酸をシリカカラムに結合させた後、洗浄および溶出することができる。
【００９４】
微小胞の溶解および核酸の抽出は、市販のＱｉａｇｅｎ  Ｒ  ｅａｓｙ  Ｐｌｕｓキット、市販のＱｉａｇｅｎ  ｍｉＲ  ｅａｓｙキットを使用することによって、または当技術分野において既知の標準的手法および技術に従ってフェノールクロロホルムを使用することによって達成することもできる。そのような方法では、微小胞内に含まれる核酸を捕捉するために、核酸結合性カラムを使用することもできる。核酸は、カラムに結合させた後、当該核酸と結合カラムとの間の相互作用を分断するのに好適なバッファーまたは溶液を使用して溶出させることができる。
【００９５】
当該核酸抽出法は、ＲＮａｓｅ阻害剤、例えば、Ｓｕｐｅｒａｓｅ−Ｉｎ（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．から市販）またはＲＮａｓｅｌＮｐｌｕｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．から市販）など；プロテアーゼ（ＲＮａｓｅ阻害剤としても機能し得る）；ＤＮａｓｅ；還元剤；偽基質、例えば、合成ＲＮＡおよび／またはキャリアＲＮＡ；ＲＮａｓｅに結合することができる可溶性レセプター；低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；ＲＮＡ結合性分子、例えば、抗−ＲＮＡ抗体、塩基性タンパク質、またはシャペロンタンパク質など；ＲＮａｓｅ変性物質、例えば、高浸透圧溶液、洗浄剤、またはそれらの組み合わせなどのようなさらなる薬剤の使用も含み得る。
【００９６】
核酸の抽出前に、当該ＲＮＡｓｅ阻害剤ならびにさらなる薬剤が、生物試料および／または単離された微小胞画分に加えられ得る。
【００９７】
これらのさらなる薬剤は、様々な方法、例えば、ＲＮａｓｅ活性を阻害することにより（例えば、ＲＮａｓｅ阻害剤）、タンパク質の遍在的分解により（例えば、プロテアーゼ）、あるいはＲＮＡに結合し保護するシャペロンタンパク質により（例えば、ＲＮＡ結合性タンパク質）、それらの機能を発揮し得る。いかなる場合においても、そのような抽出増進剤は、生物試料中の有害因子またはそのままでは単離された粒子からの核酸の高品質な抽出を阻むかまたは邪魔するであろう単離された粒子に関連する有害因子のうちのいくつかまたは全てを除去するかまたは少なくとも緩和する。
【００９８】
抽出された１８Ｓ  ｒＲＮＡおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡの定量測定を使用することにより、核酸抽出の品質を特定することができる。
【００９９】
補足表面は、中性であっても、負に帯電していても、または正に帯電していてもよい。
それは、原則として、任意の種類の補足表面を使用することができるということを意味する。膜材料に応じて、当該膜の孔径は、２０ｎｍから５μｍの範囲であり得る。
【０１００】
特に、当該補足表面は、ＰＡＬＬ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）  Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ；Ｖｉｖａｐｕｒｅ（登録商標）  Ｑ、Ｖｉｖａｐｕｒｅ（登録商標）  Ｑ  Ｍａｘｉ  Ｈ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ製のＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）  Ｄ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（Ｓ），Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）  Ｑ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）  ＩＤＡ、またはＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）  Ａｌｄｅｈｙｄｅ；Ｓｉｇｍａ製のＷｈａｔｍａｎ（登録商標）  ＤＥ８１；ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のＦａｓｔ  Ｔｒａｐ  Ｖｉｒｕｓ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎ；またはＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＊  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎのような市販の膜であってもよい。
【０１０１】
核酸を固定するために膜が使用される場合、当該膜は、様々な好適な材料から作製することができ、例えば、それは、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製またはＰＡＬＬ  Ｃｏｒｐ．製）または再生セルロース（ＲＣ）（例えば、ＳａｒｔｏｒｉｕｓまたはＰｉｅｒｃｅ製）であり得る。
【０１０２】
負帯電膜が使用される場合、捕捉表面は、好ましくは、Ｓ膜であり、これは、負に帯電した膜であって、スルホン酸基を有するカチオン交換体である。好ましくは、当該Ｓ膜は、スルホン酸であるＲ−ＣＨ２−ＳＯ３”で官能化される。あるいは、当該負に帯電した捕捉表面は、Ｄ膜であり、これは、ジエチルアミン基であるＲ−ＣＨ２−ＮＦＴ（Ｃ２Ｈ５）２を有する弱塩基性のアニオン交換体である。あるいは、当該捕捉表面は、金属キレート膜である。例えば、当該膜は、イミノ二酢酸である−Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＨ”）２で官能化されたＩＤＡ膜である。いくつかの実施形態において、当該捕捉表面は、アルデヒド基である−ＣＨＯで官能化された微細孔膜である。他の実施形態において、当該膜は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロースを有する弱塩基性のアニオン交換体である。
【０１０３】
中性捕捉表面が使用される場合、当該捕捉表面は、好ましくは、２０ｎｍ中性ＰＥＳシリンジろ過（ＴｉｓｃｈおよびＥｘｏｍｉｒ）、３０ｎｍ中性ＰＥＳシリンジろ過（Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ）、５０ｎｍ中性ＰＥＳシリンジろ過（Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ）、０．２μｍ中性ＰＥＳホームメイドスピンカラムろ過（Ｐａｌｌ）、０．８μｍ中性ＰＥＳホームメイドスピンカラムろ過（Ｐａｌｌ）、および０．８μｍ中性ＰＥＳシリンジろ過（Ｐａｌｌ）からなる群より選択されるフィルターである。捕捉表面が中性である実施形態において、好ましくは、当該中性捕捉表面は、シリンジフィルターに収容されていない。
【０１０４】
当該帯電表面は、好ましくは、０．６５μｍ正帯電Ｑ  ＰＥＳ吸引ろ過、３〜５μｍ正帯電Ｑ  ＲＣスピンカラムろ過、０．８μｍ正帯電Ｑ  ＰＥＳホームメイドスピンカラムろ過、０．８μｍ正帯電Ｑ  ＰＥＳシリンジろ過、０．８μｍ負帯電Ｓ  ＰＥＳホームメイドスピンカラムろ過、０．８μｍ負帯電Ｓ  ＰＥＳシリンジろ過、および５０ｎｍ負帯電ナイロンシリンジろ過からなる群より選択される。
【０１０５】
好ましい実施形態において、当該表面が正帯電膜である場合、Ｑ膜を使用することができ、これは、正帯電膜であり、第四級アミンを有するアニオン交換体である。好ましい実施形態において、当該Ｑ膜は、第四級アンモニウムであるＲ−ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３で官能化される。
【０１０６】
非常に好ましい実施形態において、当該正帯電膜は、再生セルロースの強塩基性アニオン交換体（「ＲＣ／ＳＢＡＥ」）膜であり、これは第四級アミンを有するアニオン交換体である。好ましい実施形態において、当該ＲＣ／ＳＢＡＥ膜は、第四級アンモニウムであるＲ−ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３で官能化される。当該膜の孔径は、好ましくは、少なくとも３μｍである。
【０１０７】
当該捕捉表面、例えば、膜は、遠心分離に使用される装置、例えば、スピンカラム、または真空用途のための装置、例えば、真空フィルターホルダー、または加圧ろ過のための装置、例えば、シリンジフィルター、などの中に収容することができる。
【０１０８】
スピンカラムベースの精製プロセスにおいて、好ましくは２つ以上の膜、好ましくは２枚から５枚の膜が、管中において平行に使用され、この場合、当該膜は、好ましくは全て、当該カラムの片端において直接的にお互いに隣接している。当該収集管は、５０ｍｌのファルコン管など、市販され得る。当該カラムは、好ましくは、スピンにとって好適であり、すなわち、そのサイズは、標準的遠心分離機およびマイクロ遠心分離機に適合する。
【０１０９】
当該核酸を捕捉するために、膜の代わりに、同じ表面改質を有するビーズを使用することもできる。ビーズが使用される場合、それらは、磁性であってもまたは非磁性であってもよい。
【０１１０】
試料として血液が使用される場合、血液は、例えば、Ｋ２  ＥＤＴＡ管に収集され得て、完全反転によってよく混合され得る。次いで、当該管は、１３００ｘｇにおいて１０分間遠心分離され、血液細胞と血漿とが分離される。次いで、血漿が除去され、０．８μｍフィルターでろ過することにより、細胞破片および血小板が除去される。全ての血漿試料が、１ｍｌのクライオバイアル中へと分注され、使用まで−８０℃で保存される。
【０１１１】
ＲＮＡ単離の前に、当該膜は、好ましくは、平衡バッファーを通すことによってコンディショニングされる。解凍された血漿試料は、ローディングバッファーで希釈される。当該希釈された血漿試料は、微小胞を吸収する膜をゆっくりと通過させられる。次いで、当該膜は、洗浄バッファーによって洗浄され、全ての弱く結合した血漿成分が除去される。次いで、溶解試薬が当該膜を通されて、当該微小胞が溶解される。ｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＲＮＡが単離される。
【０１１２】
ＲＮＡは、ＲＮＡ  ６０００  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｉｐを使用して、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって、品質および濃度について評価することができる。抽出されたＲＮＡの相対量は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製の選択されたヒト遺伝子発現アッセイ（Ｔａｑｍａｎ  Ａｓｓａｙ）を使用して、ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定される。
【０１１３】
好ましい実施形態において、特に、溶かされた糞便または盲腸試料が使用される場合、微小胞の単離、精製、または濃縮の前に、大きい不要粒子、細胞、および／または細胞破片、ならびに生物試料中に存在する他の混在物を除去するために、前処理が実施される。当該前処理ステップは、１つまたは複数の遠心分離ステップ（例えば、分画遠心分離法）あるいは１つまたは複数のろ過ステップ（例えば、限外ろ過）、あるいはそれらの組み合わせによって達成され得る。複数の遠心分離前処理ステップが実際される場合、生物試料は、最初に低速において、次いで高速において遠心分離され得る。所望の場合、さらなる好適な遠心分離前処理ステップを実施してもよい。当該１つまたは複数の遠心分離前処理ステップと二者択一的に、あるいはそれらに加えて、当該生物試料をろ過してもよい。例えば、生物試料は、最初に約１００〜５００ｇ、好ましくは２５０〜３００ｇの低速において、その後に、約２，０００から約２００，０００ｇ、好ましくは約２０，０００ｇの高速において１０分から約１時間にわたって、好ましくは０〜１０℃において遠心分離することによって、大きな不要粒子を除去してもよく；次いで、当該試料を、例えば、０．１から１．０μｍの排除サイズのフィルターを使用することによって、ろ過することができる。
【０１１４】
高速での遠心分離によって得られるペレット中の微小胞は、当該プロセスの後続のステップのために、より少量の好適なバッファーによって再構成され得る。当該濃縮ステップは、限外ろ過によって実施してもよい。実際に、この両方の限外ろ過は、生物試料を濃縮し、微小胞画分のさらなる精製を実施する。別の実施形態において、当該ろ過は、限外ろ過であり、好ましくは接線限外ろ過である。接線限外ろ過は、決められたカットオフ閾値の膜によって分離された、２つのコンパートメント（ろ液および未透過物）の間での溶液の濃縮および分画からなる。当該分離は、未透過コンパートメントへの流れと、このコンパートメントとろ液コンパートメントとの間の膜貫通圧力を適用することによって実施される。限外ろ過を実施するために、様々なシステム、例えば、スパイラル型膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ａｍｉｃｏｎ）、平膜、または中空糸（Ａｍｉｃｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｐａｌｌ、ＧＦ、Ｓｅｐｒａｃｏｒ）などを使用することができる。本発明の範囲内において、１０００ｋＤａ未満、好ましくは１００ｋＤａと１０００ｋＤａの間、さらにより好ましくは１００ｋＤａと６００ｋＤａの間のカットオフ閾値を有する膜の使用が有利である。
【０１１５】
追加または代替の予備処理ステップとして、生物試料を捕捉表面に接触させる前または後に、サイズ排除クロマトグラフィ、ゲル透過クロマトグラフィ、または親和クロマトグラフィを実施してもよい。
【０１１６】
ゲル透過クロマトグラフィステップを実施するために、シリカ、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、エチレングリコール−メタクリレートコポリマー、またはそれらの混合物、例えば、アガロース−デキストラン混合物など、から選択される支持体が好ましく使用される。例えば、そのような支持体としては、これらに限定されるわけではないが、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（登録商標）  ２００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ＴＳＫ  Ｇ６０００（ＴｏｓｏＨａａｓ）、またはＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（登録商標）  Ｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられる。
【０１１７】
親和クロマトグラフィは、例えば、様々な支持体、樹脂、ビーズ、抗体、アプタマー、アプタマー類似物、分子インプリントポリマー、または微小胞上の所望の表面分子を特異的に標的とする当技術分野において既知の他の分子を使用することよって実施することができる。
【０１１８】
任意選択により、微小胞精製および／または核酸抽出の効率または品質を評価するための内部対照として役立てるために、微小胞単離または核酸抽出の前に当該試料に対照粒子を加えてもよい。これらの対照粒子としては、Ｑ−βバクテリオファージ、ウイルス粒子、または、天然に存在し得るかもしくは遺伝子組み換え技術によって設計され得る対照核酸（例えば、少なくとも１つの対照標的遺伝子）を含有する任意の他の粒子が挙げられる。当該対照標的遺伝子は、リアルタイムＰＣＲ分析を使用して定量化することができる。
【０１１９】
好ましくは、当該対照粒子は、Ｑ−βバクテリオファージであり、本明細書では「Ｑ−β粒子」と呼ぶ。当該Ｑ−β粒子は、天然に存在するウイルス粒子であってもよく、または遺伝子組み換えウイルスまたは改変されたウイルスであってもよく、その場合、当該ウイルス粒子の少なくとも１つの構成要素（例えば、ゲノムまたは外被タンパク質の一部）は、当技術分野において既知の遺伝子組み換え技術または分子生物学的技術によって合成される。Ｑ−βは、レヴィウイルス科であり、４つのウイルスタンパク質：外被タンパク質、成熟タンパク質、溶解タンパク質、およびＲＮＡレプリカーゼをコード化する３つの遺伝子からなる直鎖状の一本鎖ＲＮＡゲノムによって特徴付けられる。Ｑ−βは、そのサイズが平均的微小胞のサイズとほぼ同じであるために、本明細書において説明されるように、微小胞を単離するために使用されるのと同じ精製方法を使用して、生物試料から容易に精製することができる。さらに、Ｑ−βウイルスの一本鎖遺伝子構造の低複雑性は、増幅ベースの核酸アッセイにおける対照としての使用に有利である。当該Ｑ−β粒子は、試料中におけるＱ−β粒子の量の定量化のために検出または測定される対照標的遺伝子または対照標的配列を含有する。例えば、当該標的遺伝子は、Ｑ−β外被タンパク質遺伝子である。生物試料にＱ−β粒子を加えた後、当該Ｑ−β粒子由来の核酸が、本明細書において説明される抽出方法および／またはキットを使用して、当該生物試料から核酸と共に抽出される。Ｑ−β対照標的遺伝子の検出は、関心対象のバイオマーカー（すなわち、ＢＲＡＦ）と同時に、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって特定することができる。対照標的遺伝子の１０倍希釈における少なくとも２つ、３つ、または４つの既知の濃度の標準曲線を使用して、コピー数を特定することができる。検出されたコピー数および加えられたＱ−β粒子の量を比較することにより、単離および／または抽出プロセスの品質を特定することができる。
【０１２０】
したがって、Ｑ−β粒子の５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、１，０００、または５，０００のコピーを、体液試料に加えた。好ましい実施形態では、Ｑ−β粒子の１００のコピーを体液試料に加える。Ｑ−β粒子のコピー数は、標的細胞に感染するＱ−β粒子バクテリオファージの能力に基づいて算出することができる。したがって、Ｑ−β粒子のコピー数は、Ｑ−β粒子バクテリオファージのコロニー形成単位と相関がある。
【０１２１】
核酸バイオマーカーの検出
ＲＮＡの検出のため、当該ＲＮＡは、好ましくは、さらなる増幅の前に、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へと逆転写される。そのような逆転写は、単独においてまたは増幅ステップとの組み合わせにおいて実施することができる。逆転写と増幅ステップとを組み合わせる方法の一例は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＴ）であり、これは、例えば、米国特許第５，６３９，６０６号に記載されるような定量的ＲＴ−ＰＣＴなど、定量的となるようにさらに変更することができる。当該方法の別の例は、２つの分離ステップ：ＲＮＡをｃＤＮＡへと変換する逆転写の第１ステップおよび定量的ＰＣＲを使用してｃＤＮＡの量を定量する第２ステップを含む。
【０１２２】
ＲＴ−ＰＣＲ分析は、各反応に対するＣｔ値（サイクル閾値）を特定する。ＲＴ−ＰＣＲにおいて、陽性反応は、蛍光信号の蓄積によって検出される。Ｃｔ値は、蛍光信号が当該閾値を超える（すなわち、バックグラウンドレベルを超える）ために必要なサイクルの数として定義される。Ｃｔレベルは、試料中における標的核酸の量、または対照核酸の量に反比例する（すなわち、Ｃｔレベルが低いほど、試料中の対照核酸の量が多い）。あるいは、対照核酸のコピー数は、当技術分野において認識される別の技術を使用して測定することもできる。
【０１２３】
単離された粒子中に存在する核酸の分析は、定量的および／または定性的である。定量的分析の場合、単離された粒子内の関心対象の特定の核酸の相対的または絶対的な量（発現レベル）は、当技術分野において既知の方法によって測定される。定性的分析の場合、単離された微小胞内の関心対象の特定の核酸の種が、当技術分野において既知の方法によって識別される。
【０１２４】
作業例
接種準備
ｎｅｔＢおよびｔｐｅＬに対して陽性であるウェルシュ菌の分離株を、−８０℃の貯蔵庫から取り出して、５％のヒツジの血液を含有するトリプチケースソイ寒天プレートに無菌においてストリーキングした。プレートを、嫌気性条件下において３７℃で一晩インキュベートした。接種菌培養を開始する１５時間前に、当該一晩おいたプレートから単離したコロニーを、前還元した５０ｍｌのＢＨＩブロスに再植菌し、嫌気性条件下において３７℃で約１５時間インキュベートした。次いで、５０μｌの当該培養物を、２×１００ｍｌの前還元したＢＨＩブロスに加えた。結果として得られるブロス−培養物を、高投与量および低投与量が同時にそれらの最終濃度（それぞれ、１０９ｃｆｕ／ｍｌおよび１０６ｃｆｕ／ｍｌ）に達するように揺動させた。培養期間の終了時に各培養物の一定分量を採取し、細菌濃度を確かめるため、５％のヒツジの血液を加えたＴＳＡ  ＩＩ寒天に、順次、植菌した。
動物実験
【０１２５】
７２０匹の雄のブロイラーを、３６のバタリーケージにおいて３０日間飼育した。４つの処理群（陰性対照、偽、低投与量強制飼養、および高投与量強制飼養）のうちの１つに、鳥を均等かつランダムに割り当てた（それぞれ９ペン）。当該鳥は、抗菌抗生物質を含まない標準的トウモロコシ／大豆飼料を与えた。飼育の１３日目に、体重超過または体重不足の鳥を全てのケージから除去して実験から排除した。次いで、正常な体重範囲の鳥に対して、１ｍｌのｎｅｔＢプラスミドを有するウェルシュ菌種によって経口によりチャレンジを行い、その後、１４、１５、および１６日目にＴｐｅｌ遺伝子に対して陽性であった。偽群に対して、１ｍｌのＰＢＳによりチャレンジを行い、その一方で、陰性対照グループは、ストレスまたは病原体チャレンジを行わなかった。最初の接種（１４日目）の前に、各ケージから３羽の鳥を無作為に選択し、血液および消化物飼料の採取のために屠殺した。１５日目の２回目のチャレンジの１２時間後に、血液および消化物の試料のために各ケージから３羽の鳥を再び屠殺した。以前に報告されているように（Ｈｅｉｋｉｎｈｅｉｍｏら，２００４）、栄養細胞に対する胞子形成ウェルシュ菌の比率を特定するために、全ての屠殺した鳥の消化管内容物を一晩培養した。チャレンジが成功であるかどうかを評価するために、消化管内容物のＮｅｔＢおよびＴｐｅＬ遺伝子のＰＣＲを実施した。試験の終了まで、それぞれのケージにおいて少なくとも１０羽の鳥を残した。全ての鳥を屠殺して各群から３種のプールされた血液試料が得られる２０日目において研究が終了するまで、周期的に排泄物試料を採取した。ＮＥに典型的な徴候／病巣に対して鳥のＧＩＴを試験し、組織病理学的分析のために十二指腸および空腸から胃腸管の部検を採取した。死亡率、飼料消費量、および群病理学などのブロイラーの性能指標を特定した（表３）。
試料採取
１．１．糞便および盲腸の排泄物試料の採取
【０１２６】
最初のチャレンジから２回目の接種（１５日目）の１２時間後まで、２時間毎に、プールされた糞便およびプールされた盲腸試料を採取するために紙のシートをケージに置いた。その後は、１７日目まで４時間毎に試料を採取した。２０日目の試験の終了時にも、糞便および盲腸試料を採取した。いずれの採取イベントにおいても、各ケージから糞便および盲腸の少なくとも１グラムを得て、試料を−８０℃で貯蔵した。
【０１２７】
２．血液採取
血液は、１８ゲージ針を使用して心臓から直接採取した。合計約５〜６ｍｌの血液を、各ケージ毎に無作為に選択した３羽の鳥から採取し、ＥＤＴＡを含有する採取管に移した。冷却遠心機を使用して、１，０００〜２，０００ｘｇにおける１０分間の遠心分離によって血漿から細胞を取り除いた。遠心分離の後で、液体成分（血漿）を直ちに清浄なポリプロピレン管に移して、−２０℃で貯蔵した。
【０１２８】
３．消化管内容物の採取
消化管内容物を、およそ２０ｃｍの長さの腸から採取した。消化管内容物を排出させ、ＰＢＳ＋２０％グリセロール中へと切除し、すぐに−２０℃で冷凍した。胞子形成ウェルシュ菌に対する増殖期ウェルシュ菌の定量化ならびにｎｅｔＢおよびｔｐｅＬのＰＣＲ検出に試料を使用した。
【０１２９】
鶏の腸の組織構造
１．組織採取および処理
十二指腸ループに続く５ｃｍの部分を各鳥から取り出し、１０％ホルマリンに入れ、容器を穏やかに揺動させて、餌料を除去し、ホルマリンを腸内に導入した。固定化の後、組織をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で数回にわたって十分に洗浄し、７０％エタノールに入れて貯蔵した。５μＭの切片を作製する前にパラフィンによる組織の処理および組織の浸透のために、組織を、７０％および９５％のエタノール溶液による２分間の洗浄を順次行うことによって脱水し、次いで、１００％のエタノール溶液による２分間の洗浄を２回行った。最後に、組織をキシレンで１分間濯ぐことを２回繰り返し、その後、パラフィン中に埋め込んだ。次いで、処理した組織を型に揃えて、パラフィンブロック内に埋め込み、５μＭの切片を作製するためにミクロトームで切断した。組織スライスを、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）改質スライドの上に浮かべる。当該スライドを乾燥させ、オーブンに入れて当該パラフィンを「ベーク処理」する。
【０１３０】
２．ハリスヘマトキシリンおよびエオシンによる組織切片の染色
簡潔には、組織切片を、順次、濃度を減少させたエタノール：１００％エタノールによって３分間を２回、９５％エタノールによって３分間を２回、および７０％エタノールによって３分間を１回によって再水和させた。次いで、スライドを蒸留水で５分間濯ぎ、次いで、ヘマトキシリン溶液（ハリスヘマトキシリン、Ｓｉｇｍａ、ＨＨＳ−３２）で６分間染色した。スライドを、水道からの流水で約２０分間濯ぎ、酸アルコール（９５％のエタノール  ２５７８ｍｌ、ｄＨ２Ｏ  ９５０ｍｌ、ＨＣＬ  ９ｍｌ）中において１〜３秒間脱色した。スライドを再び、水道からの流水で５分間濯ぎ、炭酸リチウムに３秒間浸し、次いで水道水で５分間濯いだ。組織を、エオシン希釈標準溶液（１００ｍｌのストックエオシン（１％のエオシン−Ｙ水溶液および１％のフロキシンＢ）、１０ｍｌのストックフロキシンＢ、７８０ｍｌの９５％エタノール、４ｍｌの氷酢酸酸）１５秒間で対比染色し、順次、エタノール溶液（９５％エタノール溶液により３分を２回および１００％エタノール溶液により３分を２回）においてインキュベートすることによって再水和させた。最後に、組織をキシレン溶液中で５分間インキュベートし、次いで、分析のためにサイトシール（ｃｙｔｏｓｅａｌ）で固定した。
【０１３１】
ＰＣＲによるウェルシュ菌のｎｅｔＢおよびｔｐｅＬ遺伝子の検出
【０１３２】
【表１】
2018508204.tif 000002
【０１３３】
１．ＤＮＡ抽出およびＤＮＡ濃度の定量化
腸内容物から単離されたウェルシュ菌種からのＤＮＡの抽出は、Ｑｉａｇｅｎ（ヒルデン、ドイツ）製の市販のＤＮＡ抽出キットにより、メーカーの取扱説明書に従って実施した。
【０１３４】
２．ＤＮＡの増幅
１ｎｇのＤＮＡテンプレートと、増幅される遺伝子または検出される遺伝子に対する各プライマーの０．２μＭと、１．２単位／２５μＬのＴａｑＤＮＡポリメラーゼからなる１×ＰＣＲマスターミックスの１２μｌとを含有する２５μｌの最終体積において、ＰＣＲ増幅を実施した。当該増幅は、遺伝子増幅ＰＣＲシステムである９６００  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｍａｓｔｅｒ  ｃｙｃｌｅｒ  ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ドイツ）において実施した。初期変性は、９５℃で５分間であり、それに続いて、９５℃で３０秒を４０サイクル、５５℃で３０秒のアニール処理および７２℃で３０秒間の延長、ならびに７２℃で７分間の最終延長の後、４０℃で保持した。
【０１３５】
試料の処理
合計で３６個の血漿試料、９６個の糞便試料、および８７個の盲腸試料を、微小胞全ＲＮＡの単離および抽出のために処理した。血漿量は、異なる動物において０．５ｍｌから３ｍｌの間で変わった。
【０１３６】
血漿の準備
簡潔には、血液をＫ２  ＥＤＴＡ管に採取し、完全反転によってよく混合した。次いで、当該管を、１３００ｘｇで１０分間遠心分離することにより、血液細胞と血漿を分離した。次いで、血漿を除去し、０．８μｍのフィルターに通してろ過して細胞破片および血小板を除去した。次いで、全ての血漿試料を、１ｍｌのクライオバイアルに分注し、使用まで−８０℃で貯蔵した。
【０１３７】
微小胞の単離およびＲＮＡ抽出
バイオマテリアル、例えば、血液、脳脊髄液、組織、および細胞培養物など、からの微小胞の抽出および微小胞（ＭＶ）の内容物のさらなる精製における現状技術水準の方法は、以前に、米国特許第６８９９８６３号（Ｄｈｅｌｌｉｎら、２００５）、欧州特許出願公開第２４９５０２５（Ａ１）号、国際公開第２０１４１０７５７１（Ａ）号、および同第２０１４０１７８８８５（Ａ１）号に記載されている。この方法は、高速超遠心分離の使用、または細胞破片を分離するための低速遠心分離の使用とその後のサイズ排除または特定の膜に対する親和結合またはろ過を含む（Ｗｉｔｗｅｒ  ＆  Ｃｏｌｌｅａｇｕｅｓ（２０１３）によるレビューを参照されたい）。微小胞を精製するためのいくつかの免疫学的方法も記載されている（Ｔｈｅｒｙら、２０１６；Ｃｌａｙｔｏｎら，２００１；Ｗｕｂｂｏｌｔｓら，２００３）。微小胞は、所望の集団を明確に選択するために微小胞の表面タンパク質に結合する抗体により、または他の細胞成分の喪失に対してそれらの細胞の表面タンパク質に結合する抗体により官能化されたマトリックス、ビーズ、磁性粒子の使用によって精製することができる（Ｋｉｍら、２０１２およびＭａｔｈｉｖａｎａｎら、２０１０）。研究に利用することができる微小胞の単離の迅速な方法としては、マイクロ流体素子（２０１０，Ｃｈｅｎら２０１０；欧州特許出願公開第２７４０５３６（Ａ２）号）および市販のキット（例えば、ＳｅｒａＭｉｒ（商標）  （Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＥｘｏＳｐｉｎ（商標）（Ｃｅｌｌ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ）、ＥｘｏＭｉｒ（商標）（Ｂｉｏｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓ）、ｍｉＲＣＵＲＹ（商標）（Ｅｘｉｑｏｎ））が挙げられ、これらは専門的な研究所設備をほとんどまたは全く必要としない。
【０１３８】
本明細書において、血漿、糞便および盲腸試料からの微小胞の抽出は、国際公開第２０１４／１０７５７１（Ａ１）号（Ｅｎｄｅｒｌｅら，２０１４）に記載の方法によって実施した。当該方法は、Ｑ官能化膜フィルター（Ｅｘｏ５０、Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の表面に微小胞を捕捉することによる、生物体液からの微小胞の単離を伴った。捕捉された微小胞のＲＮＡ内容物を、Ｑｉａｚｏｌによる溶解によって放出させ、次いで、当該ＲＮＡを、クロロホルム抽出によって、または市販のＱｉａｇｅｎ製のＲＮＡｅｓａｙキットによって精製した。簡潔には、血漿試料を氷上においてゆっくりと解凍し、ＰＢＳまたは０．９％のＮａＯＨで１：１希釈して、当該血漿溶液を、３００ｇで１０分間遠心分離して細胞および破片を除去した。上澄みを０．８μｍのフィルターを通し、次いでフロースルーを４℃において２０，０００ｇで３０分間遠心分離することにより、全ての残留細胞破片を除去した。微小胞に結合する親和性膜を備えるＥｘｏ５０カラムを、５ｍｌのローディングバッファー（２回）、１００ｍＭのリン酸緩衝液、３７０ｍＭのＮａＣｌを流すことによって事前コンディショニングを行った。次いで、第２遠心分離ステップから得られる微小胞を含有する上澄みを、Ｑ−β粒子の１０００コピーまでスパイクして、当該事前コンディショニングを行ったスピンカラムへのロードにおける抽出および回収効率を調べた。当該カラムを手短にスピンし、フロースルーを破棄した。当該カラムを２ｍｌの洗浄バッファー（２５０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ−プロパン、ｐＨ６．５〜７、および（ＩＸ）５０ｍＭのリン酸緩衝液、１８５ｍＭのＮａＣｌ）で２回洗浄し、二度目の洗浄の後、当該カラムを手短にスピンしてフロースルーを破棄した。当該膜に結合した微小胞に５ｍｌ（２．２５ｍｌ）の溶解バッファー（Ｑｉａｚｏｌ）を加えることにより、溶解させて内容物を放出させ、スピンさせて溶解物を収集した。ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）により、メーカーの取扱説明書に従って、当該溶解物からＲＮＡを抽出した。試料あたり４６μｌの総量を得るために、ＲＮａｓｅ不含水で溶出させたＲＮＡを、複製試料のためにプールした。１μＬのＲＮＡをＡｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ｋｉｔに適用して、当該ＲＮＡの品質および濃度を評価し、その一方で、残りのＲＮＡは、さらなる下流での使用（ＱＰＣＲまたは順序付け）のために、−８０℃で貯蔵した。抽出したＲＮＡにおけるＱ−β対照標的遺伝子（Ｑ−β外被タンパク質遺伝子）発現を、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって関心対象の標的遺伝子と比較することにより、ＲＮＡ抽出の抽出効率および品質を評価した。対照標的遺伝子の１０倍希釈における少なくとも２つ、３つ、または４つの既知の濃度の標準曲線を使用して、コピー数を特定した。検出されたコピー数および加えられたＱ−β粒子の量を比較することにより、単離および／または抽出プロセスの品質を特定した。
【０１３９】
糞便および盲腸試料
血漿および盲腸試料は、大きい粗材料を含有しているため、血漿試料に対して、上記において説明したようなＥｘｏ５０キットおよび関連する方法を使用して微小胞単離およびＲＮＡ抽出を実施する前に、追加の前処理ステップが適用される。例えば、２００ｍｇの糞便試料をゆっくりと解凍し、次いで、１ｍｌの冷ＰＢＳまたは０．９％の無菌ＮａＯＨを加えて、当該糞便／盲腸試料を均一化し、その後に約１分間ボルテックスした。結果として得られる懸濁液を、ＰＢＳで１：１希釈し、次いで、４℃において２０，０００ｇで３０分間遠心分離し、嵩高の不要粒子を除去した。上澄みを、０．８μｍの混合セルロースエステルフィルター（例えば、ミリポアフィルター）を通してろ過し、上記において血漿試料に対して説明したようなさらなる使用または処理まで当該ろ液を４℃で貯蔵した。
【０１４０】
表２：標的の発現レベルを定量化するためにｑＰＣＲに使用したプライマーおよびプローブのリスト。ｍｉＲＮＡはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、社内設計したプライマーおよびプローブは、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）によって合成した。
【０１４１】
【表２】
2018508204.tif 000003
【０１４２】
糞便／盲腸由来のＲＮＡのＱＲＴ−ＰＣＲ
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔにより、メーカーの取扱説明書に従って、ならびに以下の変更：１１μｌ（５×ＶＩＬＯ反応ミックス）、５．５μｌ（１０×ＳＳ酵素ミックス）、５．５μｌ（ヌクレアーゼ不含Ｈ２０）、および３３μｌ（ＲＮＡ）からなるＲＴ反応において、糞便および盲腸ＲＮＡの逆転写を実施した。
この場合、当該ＲＴサイクルプロファイルは、４つの連続するインキュベートサイクル／２５℃で１０分間、４２℃で６０分間、８５℃で５分間の保持ステップ、および４℃での最終保持ステップからなった。
【０１４３】
血漿および糞便／盲腸由来のｍｉＲＮＡに対するｑＲＴ−ＰＣＲ：
ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用してＲＮＡの逆転写を用いることにより、以下のＲＴマスターミックスレシピおよびサイクルプロファイル：６μｌ（ＲＴプライマープール）、０．３μｌ（１００ｍＭのｄＮＴＰ）、１．５μｌ（１０×ＲＴバッファー）、０．２μｌのＲＮａｓｅ阻害剤、３．０μｌのＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ  ＲＴ、および４μｌ（糞便および盲腸試料の場合には４μｌのＲＮＡ、血漿試料の場合には２μｌのＲＮＡ＋２μｌのＴＥ緩衝液）からなるＲＴ反応において、各試料に対してｍｉＲＮＡの逆転写を三重に実施した。この場合、当該ＲＴサイクルプロファイルは、４つの連続するインキュベートサイクル／１６℃で３０分間、４２℃で３０分間、８５℃で５分間の保持ステップ、および４℃での最終保持ステップからなった。当該ＲＴプライマープールは、それぞれのＲＴプライマーの１０マイクロリットルをプールし、ＴＥバッファーで１ｍｌに希釈することにより得て、これにより、各プライマーの最終濃度を０．０５倍にした。５種（５×）のカスタマイズしたｍｉＲＮＡアッセイ（ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−１５５、およびｍｉＲ−２０６）を、それぞれのＲＴプライマープールに加えた。
【０１４４】
糞便／盲腸ＲＮＡのｑＰＣＲ
ＲＮＡ遺伝子に対するプローブベースのアッセイのために、Ｑｉａｇｅｎ  Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑを使用して、メーカーの取扱説明書に従って、ｑＰＣＲを実施した。ｖｉｒＸ、ｃｏｌＡ、およびｎｅｔＢアッセイのアニール温度は５７℃であり、その一方で、ウェルシュ菌の１６ｓ  ｒＲＮＡの分析のためのアニール温度は６０℃であった。当該アッセイのためのマスターミックス反応は、５．５μｌ（ヌクレアーゼ不含水）、１０μｌ（ＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧを含まないＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）、０．５μｌのフォワードプライマー（２０μＭ）、１．５μｌのリバースプライマー（２０μＭ）、０．２５μｌのプローブ（２０μＭ）、０．２５μｌのＵＮＧ（ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ）、および２μｌのｃＤＮＡからなった。１６ｓ  ＲＮＡの増幅のために、フォワードおよびリバースのそれぞれ１μｌを使用した。
【０１４５】
低分子非コーディングＲＮＡであるＶＲ−ＲＮＡ、ｅ４５ｎｔ、およびｓｃＲＮＡに対して、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｋｉｔを実施した。当該アッセイのためのマスターミックス反応は、５．７５μｌ（ヌクレアーゼ不含水）、１０μｌ（Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  ＳＹＢＲ  ２×  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）、０．５μｌのフォワードプライマー（２０μＭ）、１．５μｌのリバースプライマー（２０μＭ）、０．２５μｌのプローブ（２０μＭ）、０．２５μｌのＵＮＧ（ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ）、および２μｌのｃＤＮＡからなった。以下の条件：５０℃で２分間の第１保持ステップ、続く９５℃で１０分間のさらなる保持、次いで、９５℃で２秒間、６０℃で１５秒間、７２℃で２０秒間からなる４０サイクルに従って増幅を実施した。
【０１４６】
統計解析
全ての統計的計算は、統計ソフトウェアＲを使用して行った。アッセイの化学量論および分析プロトコルの全体的効率の結果として、正規化の前に欠測値（信号なし）を４０で補完したが、これは、４０増幅サイクルのｑＰＣＲにおける最も可能性の高いＣＴ値である。処理群の一対比較のための適度な統計を、パッケージｌｉｍｍａ（ｌｉｍｍａ：マイクロアレイデータのための線形モデル、Ｓｍｙｔｈ  Ｇ．Ｋ．Ｉｎ：Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｒ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ  ３９７−４２０、Ｒパッケージ  バージョン２．１６．５）におけるＩｍＦｉｔ関数を用いて計算し、結果として得られるｐ値を、ＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｃｈｂｅｒｇ（１９９５）の方法に従って調節することにより、ｑ値（偽発見率：ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）を得た。
【０１４７】
多変量解析（ＡＮＯＶＡ）
時間、処理、および試料タイプの間の依存性を定性的に調べた。可能な関連性の正式な定量的評価は、２ｗａｙ−ＡＮＯＶＡおよびノンパラメトリックＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定を行うことによって実施した。両方の方法を、ｍｉＲＮＡおよび細菌性ＲＮＡデータに対して独立して適用した。２ｗａｙ−ＡＮＯＶＡは、２つの主要効果および相互作用について検定するために使用した。第１の主要効果は、処理後の時間（単位：時間）であり、第２の主要効果は、処理のタイプ（対照、偽、高投与量、低投与量）であった。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定は、時間および処理に対して別々に適用して、遺伝子発現とこれらの因子との関係性について検定した。この方法では、多変数相互関係は評価しなかった。３つの試料タイプ（盲腸、排泄物、および血漿）を、４つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−１５５、およびｍｉＲ−２０６）について分析し、合計で２１６の重複データが利用可能であった。さらに６つの細菌性標的を、２つの試料タイプ（盲腸および排泄物）において分析し、合計で１０８の重複データが利用可能であった。重複データの平均（各試料の平均Ｃｔ値）を、さらなる統計解析に使用した。解析は、生データおよび正規化データの両方において実施した。マイクロＲＮＡ解析に対し、ノーマライザーとしてＭｉＲ−１９１を使用し、その一方で、細菌性標的に対しては、ノーマライザーとしてウェルシュ菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＣｔ値を使用した。ＡＮＯＶＡ線形モデル（ＡＮＯＶＡ（（ｌｍ（式〜時間＋処理＋時間＊処理））は、正規化データおよび生データについて３つの因子（時間の効果、処理の効果、相互作用）に対するｐ値を生成し、その一方で、２つのｐ値（時間の効果および処理の効果）は、正規化データおよび生データに対するＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定による解析から生成した。
【０１４８】
結果：
表３：ウェルシュ菌チャレンジ後の群あたりの死んだ鳥の数。以下の群：低投与量強制飼養群、偽群、および陰性対照群のそれぞれにおいて１羽の鳥が死んだ。ウェルシュ菌の高投与量によるチャレンジの鳥の群では４羽の鳥が死んだ。
【０１４９】
【表３】
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【０１５０】
＊ＡＦＣＲ（adjusted feed conversion ratio）：死亡率およびチャレンジ前での鳥の体重に起因して除外された鳥の数により修正した、消費された餌料の量を鳥の体重で割ることによって特定したＡＦＣＲ（調節された飼料要求率）
【０１５１】
表４：盲腸排泄物の膜小胞における出現の増加が有意なマーカー
【０１５２】
【表４】
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【０１５３】
表５：糞便排泄物の膜小胞における出現の増加が有意なマーカー
【０１５４】
【表５】
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【０１５５】
表６：血液試料の膜小胞における出現の増加が有意なマーカー
【０１５６】
【表６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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