(57)【要約】  本発明は、新規ハンチンチン標的に関連する。ハンチントン病の処置のための新規オリゴヌクレオチドも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’ＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡ  ３’(配列番号１)に実質的に相補性である相補性領域を含む、１５〜３５塩基長であるＲＮＡ分子。
【請求項２】
該ＲＮＡ分子が一本鎖(ｓｓ)ＲＮＡまたは二本鎖(ｄｓ)ＲＮＡである、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
【請求項３】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖が５’ＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡ  ３’(配列番号１)と実質的に相補性である相補性領域を含む、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４】
該ｄｓＲＮＡが３０〜３５塩基対長である、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項５】
該相補性領域が配列番号１の少なくとも１０、１１、１２または１３連続ヌクレオチドに相補的である、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項６】
該相補性領域が配列番号１と３未満のミスマッチを含む、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項７】
該相補性領域が配列番号１と完全相補性である、請求項３に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項８】
該ｄｓＲＮＡが平滑末端である、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項９】
該ｄｓＲＮＡが少なくとも一つの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１０】
該ｄｓＲＮＡが天然に存在するヌクレオチドを含む、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１１】
該ｄｓＲＮＡが少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１２】
該修飾ヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’ホスホロチオエート基を含むヌクレオチドおよびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合した末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１３】
該修飾ヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデートおよび非天然塩基含有ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１４】
該ｄｓＲＮＡが少なくとも一つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドおよび少なくとも一つの５’ホスホロチオエート基を含むヌクレオチドを含む、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１５】
請求項２に記載のｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む、生物におけるハンチンチン(ＨＴＴ)遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
【請求項１６】
コレステロール部分を含む、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１７】
５’末端、３’末端を含み、標的に対する相補性を有し、ここで、
(１)ＲＮＡ分子は交互の２’−メトキシ−リボヌクレオチドおよび２’−フルオロ−リボヌクレオチドを含み；
(２)５’末端から２位および１４位のヌクレオチドは２’−メトキシ−リボヌクレオチドではなく；
(３)ヌクレオチドはホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合により結合し；そして
(４)３’末端から１〜６位または３’末端から１〜７位のヌクレオチドはホスホロチオエート結合により隣接ヌクレオチドと結合する、
請求項１に記載のＲＮＡ分子。
【請求項１８】
５’末端、３’末端および標的に対する相補性を有し、第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドを含み、ここで、
(１)第一オリゴヌクレオチドは配列番号１に示す配列を含み；
(２)第一オリゴヌクレオチドの一部は第二オリゴヌクレオチドの一部と相補的であり；
(３)第二オリゴヌクレオチドは交互の２’−メトキシ−リボヌクレオチド２’−フルオロ−リボヌクレオチドを含み；
(４)第二オリゴヌクレオチドの３’末端から２位および１４位のヌクレオチドは２’−メトキシ−リボヌクレオチドであり、そして
(５)第二オリゴヌクレオチドのヌクレオチドはホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合により結合する、
請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１９】
第二オリゴヌクレオチドが第二オリゴヌクレオチドの３’末端で疎水性分子と結合する、請求項１８に記載の核酸。
【請求項２０】
第二オリゴヌクレオチドと疎水性分子の結合がポリエチレングリコールまたはトリエチレングリコールを含む、請求項１９に記載の核酸。
【請求項２１】
第二オリゴヌクレオチドの３’末端から１位および２位のヌクレオチドが隣接ヌクレオチドにホスホロチオエート結合により結合する、請求項１８に記載の核酸。
【請求項２２】
第二オリゴヌクレオチドの３’末端から１位および２位のヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドの５’末端から１位および２位のヌクレオチドが隣接リボヌクレオチドにホスホロチオエート結合により結合する、請求項１８に記載の核酸。
【請求項２３】
(ａ)細胞に請求項２に記載の二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)を導入し；
(ｂ)工程(ａ)で産生した細胞を、ＨＴＴ遺伝子のｍＲＮＡトランスクリプトを分解させるのに十分な時間維持し、それにより、細胞におけるＨＴＴ遺伝子の発現を阻害する
ことを含む、細胞におけるＨＴＴ遺伝子の発現を阻害する方法。
【請求項２４】
ハンチントン病を処置または管理する方法であって、このような処置または管理を必要とする患者に治療有効量の請求項２に記載のｄｓＲＮＡを投与することを含む、方法。
【請求項２５】
該ｄｓＲＮＡが患者の脳に投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
該ｄｓＲＮＡが線条体内注入により投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２に記載のｄｓＲＮＡの脳への投与が、線条体におけるＨＴＴ遺伝子ｍＲＮＡの減少を引き起こす、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２に記載のｄｓＲＮＡの脳への投与が、皮質におけるＨＴＴ遺伝子ｍＲＮＡの減少を引き起こす、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
細胞におけるＨＴＴ遺伝子の発現を阻害するためのベクターであって、５’ＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡ  ３’(配列番号１)に実質的に相補性であるＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合した制御配列を含み、ここで、該ＲＮＡ分子が１０〜３５塩基長であり、該ＲＮＡ分子が、該ＨＴＴ遺伝子を発現する細胞と接触したとき、該ＨＴＴ遺伝子の発現を少なくとも２０％阻害する、ベクター。
【請求項３０】
ＲＮＡ分子がｓｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡである、請求項２９に記載のベクター。
【請求項３１】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖が５’ＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡ  ３’(配列番号１)と実質的に相補性である相補性領域を含む、請求項３０に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３２】
請求項３０に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項３３】
５’ＡＵＡＵＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡ  ３’(配列番号２)または５’ＣＵＣＡＧＧＡＵＵＵＡＡＡＡＵ  ３’(配列番号３)に実質的に相補性である相補性領域を含む、１５〜３５塩基対長であるＲＮＡ分子。
【請求項３４】
該ＲＮＡ分子がｓｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡである、請求項３３に記載のＲＮＡ分子。
【請求項３５】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖が５’ＡＵＡＵＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡ  ３’(配列番号２)または５’ＣＵＣＡＧＧＡＵＵＵＡＡＡＡＵ  ３’(配列番号３)に実質的に相補性である相補性領域を含む、請求項３４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３６】
該ＲＮＡ分子が３０〜３５塩基対長である、請求項３４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３７】
該相補性領域が配列番号２または３の少なくとも１０、１１、１２または１３連続ヌクレオチドに相補的である、請求項３４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３８】
該相補性領域が配列番号２または３と３未満のミスマッチを含む、請求項３４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３９】
該相補性領域が配列番号２または３と完全相補性である、請求項３５に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４０】
該ｄｓＲＮＡが平滑末端である、請求項３４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４１】
該ｄｓＲＮＡが少なくとも一つの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項３４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４２】
該ｄｓＲＮＡが天然に存在するヌクレオチドを含む、請求項３４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４３】
該ｄｓＲＮＡが少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項３４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４４】
該修飾ヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’ホスホロチオエート基を含むヌクレオチドおよびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合した末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項４３に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４５】
該修飾ヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデートおよび非天然塩基含有ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項４３に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４６】
該ｄｓＲＮＡが少なくとも一つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドおよび少なくとも一つの５’ホスホロチオエート基を含むヌクレオチドを含む、請求項３４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４７】
請求項３４に記載のｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む、生物におけるＨＴＴ遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
【請求項４８】
該ｄｓＲＮＡがコレステロール部分を含む、請求項３４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４９】
５’末端、３’末端を含み、標的に対する相補性を有し、ここで、
(１)ＲＮＡ分子は交互の２’−メトキシ−リボヌクレオチドおよび２’−フルオロ−リボヌクレオチドを含み；
(２)５’末端から２位および１４位のヌクレオチドは２’−メトキシ−リボヌクレオチドではなく；
(３)ヌクレオチドはホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合により結合し；そして
(４)３’末端から１〜６位または３’末端から１〜７位のヌクレオチドはホスホロチオエート結合により隣接ヌクレオチドと結合する、
請求項３３に記載のＲＮＡ分子。
【請求項５０】
５’末端、３’末端および標的に対する相補性を有し、第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドを含み、ここで、
(１)第一オリゴヌクレオチドは配列番号２または配列番号３に示す配列を含み；
(２)第一オリゴヌクレオチドの一部は第二オリゴヌクレオチドの一部と相補的であり；
(３)第二オリゴヌクレオチドは交互の２’−メトキシ−リボヌクレオチド２’−フルオロ−リボヌクレオチドを含み；
(４)第二オリゴヌクレオチドの３’末端から２位および１４位のヌクレオチドは２’−メトキシ−リボヌクレオチドであり、そして
(５)第二オリゴヌクレオチドのヌクレオチドはホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合により結合する、
請求項３４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項５１】
第二オリゴヌクレオチドが第二オリゴヌクレオチドの３’末端で疎水性分子と結合する、請求項５０に記載の核酸。
【請求項５２】
第二オリゴヌクレオチドと疎水性分子の結合がアルキル鎖、ポリエチレングリコールまたはトリエチレングリコールを含む、請求項５０に記載の核酸。
【請求項５３】
第二オリゴヌクレオチドの３’末端から１位および２位のヌクレオチドが隣接ヌクレオチドにホスホロチオエート結合により結合する、請求項５１に記載の核酸。
【請求項５４】
第二オリゴヌクレオチドの３’末端から１位および２位のヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドの５’末端から１位および２位のヌクレオチドが、隣接リボヌクレオチドにホスホロチオエート結合により結合する、請求項５０に記載の核酸。
【請求項５５】
(ａ)細胞に請求項３４に記載のｄｓＲＮＡを導入し；そして
(ｂ)工程(ａ)で産生した細胞を、ＨＴＴ遺伝子のｍＲＮＡトランスクリプトを分解させるのに十分な時間維持し、それにより、細胞におけるＨＴＴ遺伝子の発現を阻害する
ことを含む、細胞におけるＨＴＴ遺伝子の発現を阻害する方法。
【請求項５６】
ハンチントン病を処置または管理する方法であって、このような処置または管理を必要とする患者に治療有効量の請求項３４に記載のｄｓＲＮＡを投与することを含む、方法。
【請求項５７】
該ｄｓＲＮＡが患者の脳に投与される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
該ｄｓＲＮＡが線条体内注入により投与される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
請求項３０に記載のｄｓＲＮＡの脳への投与が、線条体におけるＨＴＴ遺伝子ｍＲＮＡの減少を引き起こす、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
請求項３０に記載のｄｓＲＮＡの脳への投与が、皮質におけるＨＴＴ遺伝子ｍＲＮＡの減少を引き起こす、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
細胞におけるＨＴＴ遺伝子の発現を阻害するためのベクターであって、５’ＡＵＡＵＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡ  ３’(配列番号２)または５’ＣＵＣＡＧＧＡＵＵＵＡＡＡＡＵ  ３’(配列番号３)に実質的に相補性であるＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合した制御配列を含み、ここで、該ＲＮＡ分子は１５〜３５塩基長であり、該ＲＮＡ分子は、該ＨＴＴ遺伝子を発現する細胞と接触したとき、該ＨＴＴ遺伝子の発現を少なくとも２０％阻害する、ベクター。
【請求項６２】
該ＲＮＡ分子がｓｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡである、請求項６１に記載のベクター。
【請求項６３】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖が５’ＡＵＡＵＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡ  ３’(配列番号２)または５’ＣＵＣＡＧＧＡＵＵＵＡＡＡＡＵ  ３’(配列番号３)に実質的に相補性である相補性領域を含む、請求項６２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項６４】
該ｄｓＲＮＡが３０〜３５塩基対長である、請求項６２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項６５】
請求項６２に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項６６】
５’ＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡ  ３’(配列番号１)、５’ＡＵＡＵＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡ  ３’(配列番号２)または５’ＣＵＣＡＧＧＡＵＵＵＡＡＡＡＵ  ３’(配列番号３)に実質的に相補性である相補性領域を含み、ＨＴＴ遺伝子短ｍＲＮＡの３’非翻訳領域(ＵＴＲ)を標的とする、１５〜３５塩基長であるＲＮＡ分子。
【請求項６７】
該ＲＮＡ分子がｓｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡである、請求項６６に記載のＲＮＡ分子。
【請求項６８】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖が５’ＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡ  ３’(配列番号１)、５’ＡＵＡＵＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡ  ３’(配列番号２)または５’ＣＵＣＡＧＧＡＵＵＵＡＡＡＡＵ  ３’(配列番号３)と実質的に相補性である相補性領域を含む、請求項６７に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項６９】
５’ＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡ  ３’(配列番号１)、５’ＡＵＡＵＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡ  ３’(配列番号２)または５’ＣＵＣＡＧＧＡＵＵＵＡＡＡＡＵ  ３’(配列番号３)に実質的に相補性である相補性領域を含む、１５〜３５塩基長であるｄｓＲＮＡ分子であって、ＨＴＴ  ｍＲＮＡを標的とし、少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡ分子。
【請求項７０】
該修飾ヌクレオチドがホスファチジルコリン誘導体に結合した末端ヌクレオチドである、請求項６９に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項７１】
５’ＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡ  ３’(配列番号１)、５’ＡＵＡＵＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡ  ３’(配列番号２)または５’ＣＵＣＡＧＧＡＵＵＵＡＡＡＡＵ  ３’(配列番号３)に実質的に相補性である相補性領域を含む、１５〜３５塩基長である２ＲＮＡ分子を含む二分岐ＲＮＡ化合物であって、２ＲＮＡ分子がリンカー、スペーサーおよび分岐点から独立して選択される１以上の部分により、互いに結合する、二分岐ＲＮＡ化合物。
【請求項７２】
該ＲＮＡ分子がアンチセンス分子またはＧＡＰＭＥＲ分子である、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
【請求項７３】
該アンチセンス分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項７２に記載のＲＮＡ分子。
【請求項７４】
該アンチセンス分子が相補性領域の分解を増強する、請求項７３に記載のＲＮＡ分子。
【請求項７５】
該分解がヌクレアーゼ分解である、請求項７４に記載のＲＮＡ分子。
【請求項７６】
該ヌクレアーゼ分解がＲＮａｓｅ  Ｈが介在する、請求項７５に記載のＲＮＡ分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年１月３１日出願の米国仮特許出願番号６２／２８９,２７４号および２０１５年４月３日出願の米国仮特許出願番号６２／１４２,７３１号に基づく優先権を主張し、これらの出願の全内容を、引用によりここに包含させる。
【０００２】
連邦援助研究または開発に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所(ＮＩＨ)により与えられる認可番号ＮＳ０３８１９４およびＴＲ０００８８８のもとに政府援助を受けて実施された。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、ハンチントン病の処置のための新規ハンチンチン標的および新規オリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
ハンチントン病、パーキンソン病およびアルツハイマー病を含む神経障害は、主要なまだ満たされていない医療上の必要性を代表する。一部の症例では、これらの疾患は一遺伝子性であり、オリゴヌクレオチド治療介入、例えば、ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)の理想的な標的となる。ＲＮＡｉは、細胞機序を再プログラムし、標的ｍＲＮＡをオン・デマンドで発現停止および分解させるのに使用できる、短二本鎖ＲＮＡ断片を含む基本メカニズムである。このテクノロジーは臨床的に進歩しており、ヒトの機能遺伝学の分野に大改革をもたらしている。
【０００５】
低分子ヘアピン型ＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)およびネイキッドまたはわずかに修飾したｓｉＲＮＡのウイルスベースの送達を含む、多くのテクノロジーが、治療剤および機能研究用ツールとして、ｍＲＮＡノックダウンのために探索されている(Sah, D. W. Y. & Aronin, N. Oligonucleotide therapeutic approaches for Huntington disease. J. Clin. Invest. 121, 500-507 (2011); DiFiglia, M. et al. Therapeutic silencing of mutant huntingtin with siRNA attenuates striatal and cortical neuropathology and behavioral deficits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 17204-17209 (2007))。
【０００６】
ＡＳＯはまた将来有望な手法であることも示されている。このテクノロジーは、送達媒体を用いずに細胞への効率的送達を行い、齧歯類および非ヒト霊長類の脳において、ハンチントン病の処置用の有効なノックダウンのために、脳に投与されている(Mantha, N., Das, S. K. & Das, N. G. RNAi-based therapies for Huntington's disease: delivery challenges and opportunities. Therapeutic delivery 3, 1061-1076 (2012); Kordasiewicz, H. B. et al. Sustained Therapeutic Reversal of Huntington’s Disease by Transient Repression of Huntingtin Synthesis. NEURON 74, 1031-1044 (2012))。残念ながら、現在の研究は、わずか５０％のサイレンシングを見るために７００μgの蓄積用量を２週間で投与することが必要であることを示すのみである(Kordasiewicz, Supra)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非修飾ｓｉＲＮＡ(“ネイキッドｓｉＲＮＡ”)は、これまで、より感受性の細胞株やインビボで組織に送達することが困難であった。リポフェクタミンのようなトランスフェクション試薬を使用できるが、有効かつ非毒性である範囲内のウィンドウは極めて狭く、比較可能なレベルのサイレンシングに必要なｓｉＲＮＡ対脂質比を決定するためには、ニューロンのバッチ毎に独立して最適化しなければならない(Bell, H., Kimber, W. L., Li, M. & Whittle, I. R. Liposomal transfection efficiency and toxicity on glioma cell lines: in vitro and in vivo studies. NeuroReport 9, 793-798 (1998); Dass, C. R. Cytotoxicity issues pertinent to lipoplex-mediated gene therapy in-vivo. Journal of Pharmacy and Pharmacology 1-9 (2010); Masotti, A. et al. Comparison of different commercially available cationic liposome-DNA lipoplexes: Parameters influencing toxicity and transfection efficiency. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 68, 136-144 (2009); Zou, L. L. et al. Liposome-mediated NGF gene transfection following neuronal injury: potential therapeutic applications. Gene Ther 6, 994-1005 (1999))。疎水性に修飾されたｓｉＲＮＡも、細胞および脳への送達の代替手段として使用されており(Sah, Supra; Soutschek, J. et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature 432, 173-178 (2004); Cheng, K., Ye, Z., Guntaka, R. V. & Mahato, R. I. Enhanced hepatic uptake and bioactivity of type alpha1(I) collagen gene promoter-specific triplex-forming oligonucleotides after conjugation with cholesterol. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 317, 797-805 (2006); Byrne, M. et al. Novel Hydrophobically Modified Asymmetric RNAi Compounds (sd-rxRNA) Demonstrate Robust Efficacy in the Eye. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics 29, 855-864 (2013))、これらの化合物のいくつかは臨床にまで進んでいるが、送達を最大にしながら、化学的安定性および最小毒性の両者を確実にするのは、困難な課題のままである。ＲＮＡｉテクノロジーにおける現在のハードルは、機能ゲノム研究および治療剤の両方に使用される能力を制限し、インビトロおよびインビボ両方での神経科学領域に適用されるようにそれらの設計を改善する機会を提供している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
要約
従って、ここに提供するのは、新規ハンチンチン標的配列である。新規ハンチンチン標的配列を標的とする新規ＲＮＡ分子(例えば、ｓｉＲＮＡ)も提供される。該新規ＲＮＡ分子(例えば、ｓｉＲＮＡ)は、効能および効力を、インビトロでの一次ニューロンおよびインビボでの単回低用量注射後のマウス脳の両方で示す。
【０００９】
ある側面において、５’ＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡ  ３’(配列番号１)に実質的に相補性である相補性領域を含む、１５〜３０塩基長または１５〜３５塩基長であるＲＮＡ分子が提供される。
【００１０】
ある態様において、ＲＮＡ分子は、一本鎖(ｓｓ)ＲＮＡまたは二本鎖(ｄｓ)ＲＮＡである。ある態様において、ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は、５’ＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡ  ３’(配列番号１)と実質的に相補性である相補性領域を含む。
【００１１】
ある態様において、ｄｓＲＮＡは、３０〜３５塩基対長である。ある態様において、相補性領域は、配列番号１の少なくとも１０、１１、１２または１３連続ヌクレオチドと相補性である。ある態様において、相補性領域は、配列番号１と３未満のミスマッチを含む。ある態様において、相補性領域は、配列番号１と完全相補性である。
【００１２】
ある態様において、ｄｓＲＮＡは平滑末端である。ある態様において、ｄｓＲＮＡは、少なくとも一つの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む。ある態様において、ｄｓＲＮＡは、天然に存在するヌクレオチドを含む。
【００１３】
ある態様において、ｄｓＲＮＡは、少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含む。ある態様において、修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’ホスホロチオエート基を含むヌクレオチドおよびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合した末端ヌクレオチドからなる群から選択される。ある態様において、修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデートおよび非天然塩基含有ヌクレオチドからなる群から選択される。ある態様において、ｄｓＲＮＡは、少なくとも一つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドおよび少なくとも一つの５’ホスホロチオエート基を含むヌクレオチドを含む。
【００１４】
ある態様において、ＲＮＡ分子は５’末端、３’末端を含み、標的に対する相補性を有し、ここで、(１)ＲＮＡ分子は交互の２’−メトキシ−リボヌクレオチドおよび２’−フルオロ−リボヌクレオチドを含み；(２)５’末端から２位および１４位のヌクレオチドは２’−メトキシ−リボヌクレオチドではなく；(３)ヌクレオチドはホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合により結合し；そして(４)３’末端から１〜６位または３’末端から１〜７位のヌクレオチドはホスホロチオエート結合により隣接ヌクレオチドと結合する。
【００１５】
ある態様において、ｄｓＲＮＡは、５’末端、３’末端および標的に対する相補性を有し、第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドを含み、ここで、(１)第一オリゴヌクレオチドは配列番号１に示す配列を含み；(２)第一オリゴヌクレオチドの一部は第二オリゴヌクレオチドの一部と相補的であり；(３)第二オリゴヌクレオチドは交互の２’−メトキシ−リボヌクレオチド２’−フルオロ−リボヌクレオチドを含み；(４)第二オリゴヌクレオチドの３’末端から２位および１４位のヌクレオチドは２’−メトキシ−リボヌクレオチドであり；そして(５)第二オリゴヌクレオチドのヌクレオチドはホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合により結合する。
【００１６】
ある態様において、第二オリゴヌクレオチドは、第二オリゴヌクレオチドの３’末端で疎水性分子に結合する。ある態様において、第二オリゴヌクレオチドと疎水性分子の結合は、ポリエチレングリコールまたはトリエチレングリコールを含む。ある態様において、第二オリゴヌクレオチドの３’末端から１位および２位のヌクレオチドは、隣接ヌクレオチドにホスホロチオエート結合により結合する。ある態様において、第二オリゴヌクレオチドの３’末端から１位および２位のヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドの５’末端から１位および２位のヌクレオチドは、隣接リボヌクレオチドにホスホロチオエート結合により結合する。
【００１７】
ある側面において、ｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む、生物におけるＨＴＴ遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物が提供される。ｄｓＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。ｄｓＲＮＡは１５〜３５塩基対長であり、アンチセンス鎖は、５’ＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡ  ３’(配列番号１)に実質的に相補性である相補性領域を含む。
【００１８】
ある態様において、ｄｓＲＮＡはコレステロール部分を含む。
【００１９】
ある側面において、細胞におけるＨＴＴ遺伝子の発現を阻害する方法が提供される。方法は、細胞にセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)(ｄｓＲＮＡは１５〜３５塩基対長であり、アンチセンス鎖は５’ＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡ  ３’(配列番号１)に実質的に相補性である相補性領域を含む)を導入し、工程(ａ)で産生した細胞を、ＨＴＴ遺伝子のｍＲＮＡトランスクリプトを分解させるのに十分な時間維持し、それにより、細胞におけるＨＴＴ遺伝子の発現を阻害する、工程を含む。
【００２０】
ある側面において、ハンチントン病を処置または管理する方法であって、このような処置または管理を必要とする患者に、治療有効量のｄｓＲＮＡを投与することを含む、方法が提供される。ｄｓＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、１５〜３５塩基対長であり、アンチセンス鎖は５’ＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡ  ３’(配列番号１)に実質的に相補性である相補性領域を含む。
【００２１】
ある態様において、ｄｓＲＮＡは、患者の脳に投与される。ある態様において、ｄｓＲＮＡは、線条体内、脳室内および／または髄腔内注入および／またはポンプのいずれかにより投与される。ある態様において、ｄｓＲＮＡの脳への投与は、線条体におけるＨＴＴ遺伝子ｍＲＮＡの減少を引き起こす。ある態様において、ｄｓＲＮＡの脳への投与は、皮質におけるＨＴＴ遺伝子ｍＲＮＡの減少を引き起こす。
【００２２】
ある側面において、細胞におけるＨＴＴ遺伝子の発現を阻害するためのベクターが提供される。ベクターは、５’ＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡ  ３’(配列番号１)に実質的に相補性であるＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合した制御配列を含み、ここで、該ＲＮＡ分子は１５〜３５塩基長であり、該ＲＮＡ分子は、該ＨＴＴ遺伝子を発現する細胞と接触したとき、該ＨＴＴ遺伝子の発現を少なくとも２０％阻害する。
【００２３】
ある態様において、ＲＮＡ分子はｓｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡである。ある態様において、ｄｓＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は５’ＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡ  ３’(配列番号１)と実質的に相補性である相補性領域を含む。
【００２４】
ある側面において、細胞におけるＨＴＴ遺伝子の発現を阻害するためのベクターを含む細胞が提供される。ベクターは、５’ＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡ  ３’(配列番号１)に実質的に相補性であるＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合した制御配列を含み、ここで、該ＲＮＡ分子は１５〜３５塩基長であり、該ＲＮＡ分子は、該ＨＴＴ遺伝子を発現する細胞と接触したとき、該ＨＴＴ遺伝子の発現を少なくとも２０％阻害する。
【００２５】
ある態様において、ＲＮＡ分子はｓｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡである。ある態様において、ｄｓＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は５’ＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡ  ３’(配列番号１)と実質的に相補性である相補性領域を含む。
【００２６】
ある側面において、５’ＡＵＡＵＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡ  ３’(配列番号２)または５’ＣＵＣＡＧＧＡＵＵＵＡＡＡＡＵ  ３’(配列番号３)に実質的に相補性である相補性領域を含む、１５〜３５塩基長であるＲＮＡ分子が提供される。
【００２７】
ある態様において、ＲＮＡ分子は一本鎖(ｓｓ)ＲＮＡまたは二本鎖(ｄｓ)ＲＮＡである。ある態様において、ｄｓＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は５’ＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡ  ３’(配列番号１)と実質的に相補性である相補性領域を含む。
【００２８】
ある態様において、ｄｓＲＮＡは３０〜３５塩基対長である。ある態様において、相補性領域は、配列番号２または３の少なくとも１０、１１、１２または１３連続ヌクレオチドと相補性である。ある態様において、相補性領域は、配列番号１と３個以下のミスマッチを含む。ある態様において、相補性領域は、配列番号２または３と完全相補性である。
【００２９】
ある態様において、ｄｓＲＮＡは平滑末端である。ある態様において、ｄｓＲＮＡは少なくとも一つの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む。ある態様において、ｄｓＲＮＡは天然に存在するヌクレオチドを含む。
【００３０】
ある態様において、ｄｓＲＮＡは少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含む。ある態様において、修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’ホスホロチオエート基を含むヌクレオチドおよびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合した末端ヌクレオチドからなる群から選択される。ある態様において、修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデートおよび非天然塩基含有ヌクレオチドからなる群から選択される。ある態様において、ｄｓＲＮＡは少なくとも一つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドおよび少なくとも一つの５’ホスホロチオエート基を含むヌクレオチドを含む。
【００３１】
ある態様において、ＲＮＡ分子は５’末端、３’末端を含み、標的に対する相補性を有し、ここで、(１)ＲＮＡ分子は交互の２’−メトキシ−リボヌクレオチドおよび２’−フルオロ−リボヌクレオチドを含み；(２)５’末端から２位および１４位のヌクレオチドは２’−メトキシ−リボヌクレオチドではなく；(３)ヌクレオチドはホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合により結合し；そして(４)３’末端から１〜６位または３’末端から１〜７位のヌクレオチドはホスホロチオエート結合により隣接ヌクレオチドと結合する。
【００３２】
ある態様において、ｄｓＲＮＡは５’末端、３’末端および標的に対する相補性を有し、第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドを含み、ここで、(１)第一オリゴヌクレオチドは配列番号１に示す配列を含み；(２)第一オリゴヌクレオチドの一部は第二オリゴヌクレオチドの一部と相補的であり；(３)第二オリゴヌクレオチドは交互の２’−メトキシ−リボヌクレオチド２’−フルオロ−リボヌクレオチドを含み；(４)第二オリゴヌクレオチドの３’末端から２位および１４位のヌクレオチドは２’−メトキシ−リボヌクレオチドであり；および(５)第二オリゴヌクレオチドのヌクレオチドはホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合により結合する。
【００３３】
ある態様において、第二オリゴヌクレオチドは、第二オリゴヌクレオチドの３’末端で疎水性分子と結合する。ある態様において、第二オリゴヌクレオチドと疎水性分子の結合はポリエチレングリコールまたはトリエチレングリコールを含む。ある態様において、第二オリゴヌクレオチドの３’末端から１位および２位のヌクレオチドは、隣接ヌクレオチドにホスホロチオエート結合により結合する。ある態様において、第二オリゴヌクレオチドの３’末端から１位および２位のヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドの５’末端から１位および２位のヌクレオチドは、隣接リボヌクレオチドにホスホロチオエート結合により結合する。
【００３４】
ある側面において、ｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む、生物におけるＨＴＴ遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物が提供される。ｄｓＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。ｄｓＲＮＡは１５〜３５塩基対長であり、アンチセンス鎖は５’ＡＵＡＵＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡ  ３’(配列番号２)または５’ＣＵＣＡＧＧＡＵＵＵＡＡＡＡＵ  ３’(配列番号３)に実質的に相補性である相補性領域を含む。
【００３５】
ある態様において、ｄｓＲＮＡはコレステロール部分を含む。
【００３６】
ある側面において、細胞におけるＨＴＴ遺伝子の発現を阻害する方法が提供される。該方法は、細胞にセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)(ｄｓＲＮＡは１５〜３５塩基対長であり、アンチセンス鎖は５’ＡＵＡＵＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡ  ３’(配列番号２)または５’ＣＵＣＡＧＧＡＵＵＵＡＡＡＡＵ  ３’(配列番号３)に実質的に相補性である相補性領域を含む)を導入し、工程(ａ)で産生した細胞を、ＨＴＴ遺伝子のｍＲＮＡトランスクリプトを分解させるのに十分な時間維持し、それにより、細胞におけるＨＴＴ遺伝子の発現を阻害する。
【００３７】
ある側面において、ハンチントン病を処置または管理する方法であって、このような処置または管理を必要とする患者に治療有効量のｄｓＲＮＡを投与する、方法が提供される。ｄｓＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、１５〜３５塩基対長であり、アンチセンス鎖は５’ＡＵＡＵＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡ  ３’(配列番号２)または５’ＣＵＣＡＧＧＡＵＵＵＡＡＡＡＵ  ３’(配列番号３)に実質的に相補性である相補性領域を含む。
【００３８】
ある態様において、ｄｓＲＮＡは患者の脳に投与される。ある態様において、ｄｓＲＮＡは、線条体内注入により投与される。ある態様において、ｄｓＲＮＡの脳への投与は、線条体におけるＨＴＴ遺伝子ｍＲＮＡの減少を引き起こす。ある態様において、ｄｓＲＮＡの脳への投与は、皮質におけるＨＴＴ遺伝子ｍＲＮＡの減少を引き起こす。
【００３９】
ある側面において、細胞におけるＨＴＴ遺伝子の発現を阻害するためのベクターが提供される。ベクターは、５’ＡＵＡＵＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡ  ３’(配列番号２)または５’ＣＵＣＡＧＧＡＵＵＵＡＡＡＡＵ  ３’(配列番号３)に実質的に相補性であるＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合した制御配列を含み、ここで、該ＲＮＡ分子は１５〜３５塩基長であり、該ＲＮＡ分子は、該ＨＴＴ遺伝子を発現する細胞と接触したとき、該ＨＴＴ遺伝子の発現を少なくとも２０％阻害する。
【００４０】
ある態様において、ＲＮＡ分子はｓｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡである。ある態様において、ｄｓＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は５’ＡＵＡＵＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡ  ３’(配列番号２)または５’ＣＵＣＡＧＧＡＵＵＵＡＡＡＡＵ  ３’(配列番号３)に実質的に相補性である相補性領域を含む。
【００４１】
ある側面において、細胞におけるＨＴＴ遺伝子の発現を阻害するためのベクターを含む細胞が提供される。ベクターは５’ＡＵＡＵＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡ  ３’(配列番号２)または５’ＣＵＣＡＧＧＡＵＵＵＡＡＡＡＵ  ３’(配列番号３)に実質的に相補性であるＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合した制御配列を含み、ここで、該ＲＮＡ分子は１５〜３５塩基長であり、該ＲＮＡ分子は、該ＨＴＴ遺伝子を発現する細胞と接触したとき、該ＨＴＴ遺伝子の発現を少なくとも２０％阻害する。
【００４２】
ある態様において、ＲＮＡ分子はｓｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡである。ある態様において、ｄｓＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は５’ＡＵＡＵＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡ  ３’(配列番号２)または５’ＣＵＣＡＧＧＡＵＵＵＡＡＡＡＵ  ３’(配列番号３)に実質的に相補性である相補性領域を含む。
【００４３】
ある側面において、１５〜３５塩基長であるＲＮＡ分子が提供される。ＲＮＡ分子は、５’ＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡ  ３’(配列番号１)、５’ＡＵＡＵＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡ  ３’(配列番号２)または５’ＣＵＣＡＧＧＡＵＵＵＡＡＡＡＵ  ３’(配列番号３)に実質的に相補性である相補性領域を含み、ＲＮＡ分子は、ＨＴＴ遺伝子短ｍＲＮＡの３’非翻訳領域(ＵＴＲ)を標的とする。
【００４４】
ＨＴＴ遺伝子短ｍＲＮＡの３’ＵＴＲは次のとおりである。
【化１】
2018516091.tif 000002
(配列番号４)
【００４５】
ある態様において、ＲＮＡ分子はｓｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡである。ある態様において、ｄｓＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は５’ＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡ  ３’(配列番号１)、５’ＡＵＡＵＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡ  ３’(配列番号２)または５’ＣＵＣＡＧＧＡＵＵＵＡＡＡＡＵ  ３’(配列番号３)と実質的に相補性である相補性領域を含む。
【００４６】
ある側面において、５’ＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡ  ３’(配列番号１)、５’ＡＵＡＵＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡ  ３’(配列番号２)または５’ＣＵＣＡＧＧＡＵＵＵＡＡＡＡＵ  ３’(配列番号３)に実質的に相補性である相補性領域を含むｄｓ１５〜３５塩基長であるＲＮＡ分子が提供され、ここで、ＲＮＡ分子はＨＴＴ  ｍＲＮＡを標的とし、少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含む。ある態様において、修飾ヌクレオチドは、ホスファチジルコリン誘導体に結合した末端ヌクレオチドである。
【００４７】
ある側面において、５’ＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡ  ３’(配列番号１)、５’ＡＵＡＵＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡ  ３’(配列番号２)または５’ＣＵＣＡＧＧＡＵＵＵＡＡＡＡＵ  ３’(配列番号３)に実質的に相補性である相補性領域を含む、１５〜３５塩基長である２ＲＮＡ分子を含む二分岐ＲＮＡ化合物が提供され、ここで、２ＲＮＡ分子は、リンカー、スペーサーおよび分岐点から独立して選択される１以上の部分により、互いに結合する。
【００４８】
ここに記載する側面のいずれかにおいて、ＲＮＡ分子はアンチセンス分子(例えば、ＡＳＯ)またはＧＡＰＭＥＲ分子である。ある態様において、アンチセンス分子は、相補性領域の分解を増強する。ある態様において、分解は、ヌクレアーゼ分解(例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ)である。
【００４９】
図面の簡単な説明
本発明の前記のおよび他の特性および利点は、添付する図面と組み合わせて解説する、下記の説明的態様の詳細な説明からより完全に理解される。特許または出願書類は、カラーで提出した少なくとも一枚の図を含む。カラー図面を含むこの特許または特許出願公報は、請求と必要な費用の支払いにより、役所から提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１Ａ−Ｂ】疎水性ｓｉＲＮＡ構造および化学的組成および一次皮質ニューロンにおける効率的内部移行を記載する。Ａ)疎水性修飾および安定化されたｓｉＲＮＡ(ｈｓｉＲＮＡ)の模式図；Ｂ)Ｃｙ３−ＨＴＴ１０１５０  ｈｓｉＲＮＡ(赤色)(０.５μM)を一次皮質ニューロンに添加した。ツァイス共焦点顕微鏡、６３Ｘ、ヘキスト色素(青色)で各染色して造影。
【００５１】
【図２Ａ−Ｃ】線グラフ(Ａ)または棒グラフ(Ｂ)および(Ｃ)としてプロットしたハンチンチンｍＲＮＡをターゲティングする非公式化ｈｓｉＲＮＡの系統的スクリーニングを示す。９４個のｈｓｉＲＮＡの一団を、ＨｅＬａ細胞に１.５μMで添加した。ハンチンチンｍＲＮＡのレベルを７２時間目にハウスキーピング遺伝子、ＰＰＩＢ(シクロフィリンＢ)に対して正規化したQUANTIGENE(Affymetrix)を使用して測定し、未処理対照に対するパーセントとして示した(ｎ＝３、平均±ＳＤ)。ＵＮＴ  −  未処理細胞、ＮＴＣ  −  非ターゲティング対照。活性化合物(赤色)を、さらなる分析のために選択した。
【００５２】
【図３Ａ−Ｃ】受動的(Ａ)および脂質介在送達(Ｂ)両方での、ＨＴＴ１０１５０によるハンチンチンｍＲＮＡの濃度依存的サイレンシングを示す。化学的修飾は、ｓｉＲＮＡ  ＲＩＳＣ(ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体)エントリーに負に影響することなく、受動的取り込みを可能にする。ＨｅＬａ細胞を、示す濃度の修飾(疎水性および塩基化学的修飾の両方を含む)または非修飾ＨＴＴ１０１５０と、ＲＮＡＩＭＡＸ非存在下(Ａ)および存在下(Ｂ)インキュベートした。ハンチンチンｍＲＮＡのレベルを７２時間目にハウスキーピング遺伝子、ＰＰＩＢ(シクロフィリンＢ)に対して正規化したQUANTIGENE(Affymetrix)を使用して測定し、未処理対照に対するパーセントとして示した(ｎ＝３、平均±ＳＤ)。ＵＮＴ  −  未処理細胞。ＩＣ５０値はここに記載するとおり計算した。(Ｃ)はこれらの結果を要約する表である。
【００５３】
【図４Ａ−Ｂ】一次ニューロンにおけるＨＴＴ１０１５０によるハンチンチンｍＲＮＡおよびタンパク質の濃度依存的サイレンシングをグラフ的に示す(受動的取り込み)。一次ニューロンを、示す濃度のＨＴＴ１０１５０とインキュベートした。ハンチンチンｍＲＮＡのレベルを、ハウスキーピング遺伝子、ＰＰＩＢ(シクロフィリンＢ)に対して正規化したQUANTIGENE(Affymetrix)を使用して測定し、未処理対照に対するパーセントとして示した(ｎ＝３、平均±ＳＤ)。ＵＮＴ  −  未処理細胞。Ａ)一次皮質および線条体ニューロンにおける、１週間。Ｂ)ＨＴＴ１０１５０と１週間インキュベーション後のハンチンチンタンパク質レベルをウェスタンブロットにより検出し、β−チューブリンに対して正規化した。
【００５４】
【図５Ａ−Ｈ】ＨＴＴ１０１５０の単回線条体内注射は、２４時間後、注射部位に同側性のニューロンおよび神経索に局在化することを示す。１nmol  ＣＹ３−ＨＴＴ１０１５０(赤色)を、ＷＴ(ＦＶＢＮｊ)マウスの線条体に一側性に注射した。脳を２４時間後採取し、パラフィン包埋および切片化した。(Ａ)冠状脳切片のタイル画像(１６Ｘ)。ＨＴＴ１０１５０の大部分は、鋭い勾配の拡散を伴い、注射部位に局在化した。(Ｂ)矢状脳切片のタイル画像(１６Ｘ)、注射部位。(Ｃ)冠状脳切片の画像(４０Ｘ)、非注射部位。(Ｄ)冠状脳切片の画像(４０Ｘ)、注射部位。(Ｅ、Ｇ)非注射部位からのＮｕｅＮ染色ニューロン(６０Ｘ)。(Ｆ、Ｈ)注射部位からのＮｕｅＮ染色ニューロン(６０Ｘ)。
【００５５】
【図６】インビボでのＨＴＴ１０１５０有効性評価をグラフ的に示す。ＨＴＴ１０１５０を、ＷＴ(ＦＶＢ)マウスの線条体に一側性に注射した(２μl)。１２０時間目にマウスを屠殺した。脳を３００μm切片にスライスし、線条体の６個の２mmパンチ生検を、同側の側および対側の側の両方から採取した。ハンチンチンｍＲＮＡのレベルを、ハウスキーピング遺伝子、ＰＰＩＢ(シクロフィリンＢ)に対して正規化したQUANTIGENE(Affymetrix)を使用して測定し、未処理対照に対するパーセントとして示した(ｎ＝２４、平均±ＳＥＭ、８動物、領域あたり３生検)。
【００５６】
【図７Ａ−Ｅ】ＨＴＴ１０１５０が、注射部位付近にＤＡＲＰＰ−３２陽性ニューロンにおいて毒性を示さないことを示す。ＨＴＴ１０１５０を、ＷＴ(ＦＶＢ)マウスの線条体に一側性に注射した。脳を５日後に採取し、固定し、切片化し、ＤＡＲＰＰ−３２に対する抗体で染色した(Ａ〜Ｄ)。ＡＣＳＦ[完全脳スキャンおよび６０Ｘ拡大率(Ａ、Ｂ)]または１２.５μg  ＨＴＴ１０１５０[完全脳スキャンおよび６０Ｘ拡大率(Ｃ、Ｄ)]の注射後の線条体の代表的画像。ＤＡＲＰＰ−３２陽性ニューロンの定量化(Ｅ)(ｎ＝３動物、平均±ＳＤ)。
【００５７】
【図８】ある態様による、標的配列、修飾オリゴヌクレオチドおよびそれらの有効性を示す。
【００５８】
【図９】一次皮質ニューロンにおけるｈｓｉＲＮＡの経時的な効率的取り込みおよび内部移行を示す。Ｃｙ３−ＨＴＴ１０１５０  ｈｓｉＲＮＡ(赤色)、０.５μMを一次皮質ニューロンに添加した。ツァイス共焦点顕微鏡、６３Ｘ、ヘキスト色素(青色)で各染色して造影。
【００５９】
【図１０Ａ−Ｂ】ＨｅＬａ細胞におけるＨＴＴ１０１５０によるハンチンチンｍＲＮＡの濃度依存的サイレンシングをグラフ的に示す。ハンチンチンｍＲＮＡのレベルを７２時間目にハウスキーピング遺伝子、ＰＰＩＢ(シクロフィリンＢ)に対して正規化したQUANTIGENE(Affymetrix)を使用して測定し、未処理対照に対するパーセントとして示した(ｎ＝３、平均±ＳＤ)。ＵＮＴ  −  未処理細胞、ＮＴＣ  −  非ターゲティング対照。Ａ)受動的取り込みにおける１６活性配列の用量応答(製剤せず)。Ｂ)脂質介在取り込みにおける、８選択配列の用量応答(Invitrogen LIPOFECTAMINE RNAIMAX Transfection Reagentを使用)。用量応答データを、GraphPad Prism 6.03を使用して適合させた。
【００６０】
【図１１Ａ−Ｂ】ハンチンチンｍＲＮＡレベルをグラフ的に示す。Ａ)ＨＴＴ１０１５０およびＮＴＣと一次皮質ニューロンを７２時間および１週間インキュベーション後、細胞生存能をALAMAR BLUE(Life Technologies)を使用して試験した。Ｂ)一次皮質ニューロンを、示す濃度の３ＨＴＴ  ｈｓｉＲＮＡ配列ＨＴＴ１０１５０、ＨＴＴ１０１４６およびＨＴＴ１２１５とインキュベートした。ハンチンチンｍＲＮＡのレベルを、ハウスキーピング遺伝子、ＰＰＩＢ(シクロフィリンＢ)に対して正規化したQUANTIGENE(Affymetrix)を使用して測定し、未処理対照に対するパーセントとして示した(ｎ＝３、平均±ＳＤ)。ＵＮＴ  −  未処理細胞。
【００６１】
【図１２Ａ−Ｂ】一次ニューロンにおけるＨＴＴ１０１５０によるハンチンチンｍＲＮＡの濃度依存的サイレンシングをグラフ的に示す(受動的取り込み)。一次ニューロンを、示す濃度のＨＴＴ１０１５０とインキュベートした。ハンチンチンｍＲＮＡのレベルを、ハウスキーピング遺伝子、ＰＰＩＢ(シクロフィリンＢ)に対して正規化したQUANTIGENE(Affymetrix)を使用して測定し、未処理対照に対するパーセントとして示した(ｎ＝３、平均±ＳＤ)。ＵＮＴ  −  未処理細胞。Ａ)７２時間および１週間について。Ｂ)１週間、２週間および３週間について。
【００６２】
【図１３】一次皮質ニューロンにおけるシクロフィリンＢ(ＰＰＩＢ)に対するｈｓｉＲＮＡの有効性をグラフ的に示す。一次ニューロンを、示す濃度のＰＰＩＢをターゲティングするｈｓｉＲＮＡとインキュベートした。ＰＰＩＢ  ｍＲＮＡのレベルを、ハウスキーピング遺伝子、ＨＴＴに対して正規化したQUANTIGENE(Affymetrix)を使用して測定し、未処理対照に対するパーセントとして示した(ｎ＝３、平均±ＳＤ)。ＵＮＴ  −  １週間の未処理細胞。
【００６３】
【図１４】一次皮質ニューロンにおけるＨｔｔ減少の代表的ウェスタンブロットを示す。一次皮質ニューロンを、５つの個々の子(＃１〜５)から培養し、示す濃度のＨＴＴ１０１５０と１週間インキュベートした。ハンチンチンタンパク質レベルを、抗体ＡＢ１を使用するウェスタンブロットにより検出した。
【００６４】
【図１５Ａ−Ｂ】インビボでのＨＴＴ１０１５０有効性の評価をグラフ的に示す。Ａ)ＨＴＴ１０１５０を、ＷＴ(ＦＶＢ)マウスの線条体に一側性に注射した(２μl)。１２０時間目にマウスを屠殺した。脳を３００μm切片にスライスし、線条体の６個の２mmパンチ生検を、同側の側および対側の側の両方から採取した。ハンチンチンｍＲＮＡのレベルを、ハウスキーピング遺伝子、ＰＰＩＢ(シクロフィリンＢ)に対して正規化したQUANTIGENE(Affymetrix)を使用して測定し、未処理対照に対するパーセントとして示した(ｎ＝８動物、平均±ＳＤ)。Ｂ)ウェスタンブロットによるハンチンチンタンパク質サイレンシングの定量化。
【００６５】
【図１６】インビボでのＨＴＴ１０１５０細胞毒性の評価をグラフ的に示す。ＤＡＲＰＰ３２神経細胞マーカーはＨＴＴ１０１５０注射により受ける影響は最小限であり、神経細胞の健康に大きな影響がないことを示した。ＨＴＴ１０１５０を、示す用量で野生型(ＦＶＢ)マウスの線条体に一側性に注射した。１２０時間目にマウスを屠殺した。脳を３００μm切片にスライスし、線条体の６個のパンチ生検(２mm)を、同側の側および対側の側の両方から採取した。ＤＡＲＰＰ３２  ｍＲＮＡ発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子、ＰＰＩＢ(シクロフィリンＢ)に対して正規化したQUANTIGENE(Affymetrix)を使用して測定し、未処理対照に対するパーセントとして示した(ｎ＝２４、平均±ＳＤ)。
【００６６】
【図１７Ａ−Ｃ】ＨＴＴ１０１５０が、注射部位でミクログリア活性化の２倍増加を示したことを示す。ＨＴＴ１０１５０を、ＷＴ(ＦＶＢ)マウスの線条体に一側性に注射した。脳を、６時間後(ｂ)および５日後(ａおよびｃ)に採取し、固定し、切片化し、ＩＢＡ−１に対する抗体で染色した。(Ａ)注射後５日の１nmol  ＨＴＴ１０１５０およびＡＣＳＦの注射後の活性化ミクログロリア(黒色矢頭)および静止ミクログロリア(白色矢頭)の代表的画像。４０Ｘ拡大率。(Ｂ)ＡＣＳＦ(ｎ＝６)および１nmol  ＨＴＴ１０１５０(ｎ＝３)注射６時間後の活性化および静止ミクログリアの定量化。(ｃ)ＡＣＳＦ(ｎ＝４)および１nmol  ＨＴＴ１０１５０(ｎ＝３)注射５日後の活性化および静止ミクログリア。
【００６７】
【図１８Ａ−Ｃ】ＨＴＴ１０１５０が、２５μg用量で注射部位に限定的な毒性を示したことを示す。ＨＴＴ１０１５０を、ＷＴ(ＦＶＢ)マウスの線条体に一側性に注射した。脳を５日後に採取し、固定し、切片化し、ＤＡＲＰＰ−３２に対する抗体で染色した。２５μg注射後の線条体の代表的画像、完全脳スキャン(Ａ)、注射部位１０Ｘ拡大率(Ｂ)、注射部位２０Ｘ拡大率(Ｃ)および６０Ｘ拡大率。
【００６８】
【図１９】ＨＴＴ１０１５０は、低濃度でＤａｒｐｐ３２陽性ニューロンに対して毒性を示さなかったことを示す。ＨＴＴ１０１５０を、ＷＴ(ＦＶＢ)マウスの線条体に一側性に注射した。脳を５日後に採取し、固定し、切片化し、ＤＡＲＰＰ−３２に対する抗体で染色した。注射部位に同側性および対側性の２５μg、１２.５μgおよびＡＣＳＦ(２０Ｘ拡大率)注射後の線条体の代表的画像。
【００６９】
【図２０Ａ−Ｂ】ＨＴＴ１０１５０が注射５日後総静止ミクログリアのわずかな増加を引き起こしたことを示す。ＨＴＴ１０１５０を、ＷＴ(ＦＶＢ)マウスの線条体に一側性に注射した。脳を６時間および５日後に採取し、固定し、切片化し、ＩＢＡ−１に対する抗体で染色した。ＡＣＳＦ(ｎ＝６、Ａ)(ｎ＝４、Ｂ)および１２.５μg  ＨＴＴ１０１５０(ｎ＝３、Ａ、Ｂ)注射６時間(Ａ)および５日(Ｂ)後の総ミクログリアの定量化。
【００７０】
【図２１】本発明のある態様による化学的修飾および構造的足場と併せたさらなる標的配列を示す。
【００７１】
【図２２】QUANTIGENEおよびALAMAR BLUEを使用する、１週間後の一次皮質ニューロン(細胞生存能)におけるｈｓｉＲＮＡＨＴＴ有効性を示す。ＮＴＣ＝非ターゲティング対照。
【００７２】
【図２３】QUANTIGENEを使用する、１週間後の野生型一次線条体ニューロンおよび一次皮質ニューロンにおけるＨＴＴ  ｈｓｉＲＮＡ有効性を示す。ＮＴＣ＝非ターゲティング対照。
【００７３】
【図２４】受動的取り込みにおける処理１〜３週間後の一次ニューロン(効果持続期間)におけるＨＴＴ  ｈｓｉＲＮＡ有効性を示す。ＨＴＴ発現を、ＰＰＩＢに対して正規化した。データを、非ターゲティング対照のおよそのパーセンテージとして示す。ＵＮＴ＝未処理。
【００７４】
【図２５】ＬＮＡ−ＧＡＰＭＥＲではなく、ｈｓｉＲＮＡＨＴＴが、QUANTIGENEを使用して、７２時間後の皮質ニューロンにおけるサイレンシングプラトーを示すことを示す。Ｎ＝３。
【００７５】
【図２６】ＲＮＡ−ＳＣＯＰＥを使用する、一次皮質ニューロンにおけるｈｔｔおよびｐｐｉｂの細胞内局在化を示す。Ｈｔｔ  ｍＲＮＡ、赤色；ｐｐｉｂ  ｍＲＮＡ、緑色；核(ＤＡＰＩ)、青色。
【００７６】
【図２７】ニューロンにおけるｈｔｔ検出プローブセットを検証し、特異性を確認する。
【００７７】
【図２８】ニューロンにおけるｈｔｔ検出プローブセットを検証し、シグナルがイントロン特異的ではないことを示す(イントロン６０〜６１について検証)。
【００７８】
【図２９】ｈｔｔ  ｍＲＮＡ核局在化がニューロンのみに特異的であることを示す。左パネルは一次ニューロンを示す；ｐｐｉｂ  ｍＲＮＡ、緑色；ｈｔｔ  ｍＲＮＡ、赤色；核、青色。
【００７９】
【図３０】皮質ニューロンのｈｓｉＲＮＡＨＴＴ処理が、優先的に細胞質ｈｔｔ  ｍＲＮＡを排除することを示す。Ｐｐｉｂ  ｍＲＮＡ、緑色；ｈｔｔ  ｍＲＮＡ、赤色；核、青色。上部パネル：非処理。下部パネル、３日間１.５μM  ｈｓｉＲＮＡＨＴＴで処理。
【００８０】
【図３１】皮質ニューロンのｈｓｉＲＮＡＨＴＴ処理が優先的に細胞質ｈｔｔ  ｍＲＮＡを排除することを示す。
【００８１】
【図３２】野生型一次皮質ニューロンにおけるＨＴＴタンパク質サイレンシングを示すウェスタンブロットを示す。ｈｓｉＲＮＡ  ｈｔｔ−１０１５０；ＮＴＣ＝非ターゲティング対照、１週間。
【００８２】
【図３３】ＨＴＴ１０１５０直接注射の結果をグラフ的に示す。神経細胞生存能に対する影響は観察されなかった。
【００８３】
【図３４】コレステロール−ｈｓｉＲＮＡ投与後の注射部位近辺の毒性を示す。
【００８４】
【図３５Ａ−Ｃ】部分的修飾ｈｓｉＲＮＡが短効果持続期間を示し、全身曝露がないことを示す。
【００８５】
【図３６Ａ−Ｃ】ｈｓｉＲＮＡの完全代謝安定化を示す。
【００８６】
【図３７Ａ−Ｃ】完全代謝安定化がｈｓｉＲＮＡのＲＩＳＣエントリーを妨害しないことを示す。
【００８７】
【図３８Ａ−３８Ｅ】局所送達および分布の完全代謝安定化ｈｓｉＲＮＡ(ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡ)増強を示す。
【００８８】
【図３９Ａ−Ｂ】ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡが介在する効力および効果持続期間の増強を示す。
【００８９】
【図４０】ｈｓｉＲＮＡバイオコンジュゲートとしての向神経活性の天然に存在する脂質を特徴付けする。
【００９０】
【図４１】ｈｓｉＲＮＡ疎水性が脳分布および保持と直接相関することを示す。線条体内注射、１２.５μg(０.５mg／kg)、ｔ＝２４時間、ＦＶＢ／ＮＪマウス(ｎ＝２)。
【００９１】
【図４２】ドコサヘキサエン酸(ＤＨＡ)ｈｓｉＲＮＡ合成を示す。
【００９２】
【図４３】ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡおよびｃｈｏｌ−ｈｓｉＲＮＡの一次皮質ニューロンへの内部移行を示す。取り込み：０.５μM  Ｃｙ３−ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡ(赤色)、ＤＡＰＩ(青色)。
【００９３】
【図４４】ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡとニューロンおよび星状膠細胞の共局在化を示す。線条体内注射、１２.５μg(０.５mg／kg)、ｔ＝２４時間、ＦＶＢ／ＮＪマウス(ｎ＝２)。
【００９４】
【図４５】ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡの線条体ニューロンにおける核周囲領域への局在化を示し、一方ｃｈｏｌ−ｈｓｉＲＮＡは検出不能である。線条体内注射、１２.５μg(０.５mg／kg)、ｔ＝２４時間、ＦＶＢ／ＮＪマウス(ｎ＝２)。
【００９５】
【図４６】単回線条体内注射後の皮質におけるＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡとニューロンおよび星状膠細胞の共局在化を示す。線条体内注射、１２.５μg(０.５mg／kg)、ｔ＝２４時間、ＦＶＢ／ＮＪマウス(ｎ＝２)。
【００９６】
【図４７】ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡの皮質ニューロンにおける核周囲領域への局在化を示し、一方ｃｈｏｌ−ｈｓｉＲＮＡは検出不能である。
【００９７】
【図４８】線条体および皮質におけるＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡの確固たるサイレンシング効率を示す。線条体内注射、６〜２５μg(０.２５〜１mg／kg)、ｔ＝５日、ＦＶＢ／ＮＪマウス(ｎ＝８)。
【００９８】
【図４９】ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡの単回線条体内投与後の線条体における効果持続期間および回復を示す。
【００９９】
【図５０】有効用量の２０倍より多くて、ＤＨＡ−ｓｉＲＮＡ投与が線条体ニューロン完全性に影響しないことを示す、パイロット安全性試験を示す。
【０１００】
【図５１】有効用量の２０倍より多くて、ＤＨＡ−ｓｉＲＮＡが最小限の線条体ミクログリア活性化しか引き起こさないことを示す、パイロット安全性試験を示す。
【０１０１】
【図５２】オリゴヌクレオチド化学により引き起こされる、核周囲局在化を示す。
【０１０２】
【図５３】オリゴヌクレオチド化学により引き起こされる、核内フォーカス分布を示す。
【０１０３】
【図５４】ｈｔｔ  ｍＲＮＡ線条体サイレンシングの程度は、オリゴヌクレオチド細胞局在化により影響されることを示す。
【０１０４】
【図５５】標的膠細胞送達を示す。
【０１０５】
【図５６】標的神経細胞送達を示す。
【０１０６】
【図５７】ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡが効率的に脳全体に分布し、線条体および皮質の両方における遺伝子をサイレンスさせることを示す。線条体内注射、１２.５μg(０.５mg／kg)、ｔ＝２４時間、ＦＶＢ／ＮＪマウス(ｎ＝２)。
【０１０７】
【図５８】野生型一次海馬ニューロンおよびＱ１４０一次海馬ニューロンにおけるｈｓｉＲＮＡ有効性を示す。１６％ゲル。
【０１０８】
【図５９】野生型一次海馬ニューロンおよびＱ１４０一次海馬ニューロンにおけるｈｓｉＲＮＡ有効性をグラフ的に示す。
【０１０９】
【図６０】野生型一次海馬ニューロンおよびＱ１４０一次海馬ニューロンにおけるｈｓｉＲＮＡ有効性を示す。７.５％ゲル。
【０１１０】
【図６１】ＰＣ−ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡおよびｃｈｏｌ−ｈｓｉＲＮＡの各々が、変異体および野生型ｈｔｔ  ｍＲＮＡをサイレンスさせることを示す。
【０１１１】
【図６２】三群のｈｓｉＲＮＡ化学：ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡ、ＰＣ−ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡおよびｃｈｏｌ−ｈｓｉＲＮＡを示す。
【０１１２】
【図６３Ａ−Ｂ】皮質一次ニューロンにおけるＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡに対するＰＣ−ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡの効力増強をグラフ的に示す。１週間、QUANTIGENEにより分析、ＰＰＩＢに対してデータ正規化。
【０１１３】
【図６４】ｃｈｏｌ−ｈｓｉＲＮＡが、ＰＣ−ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡおよびＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡと比較して、一次皮質ニューロンにおける遺伝子調節についてより有効な化学を有することを説明する。１週間、QUANTIGENEにより分析、ＰＰＩＢに対してデータ正規化。
【０１１４】
【図６５】ＰＣ−ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡが、ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡよりも良好な脳保持および広い分布を示すことを示す。２nmolまたは１０nmol線条体内注射、Ｎ＝２、脳を４８時間目に採取。
【０１１５】
【図６６】マウス線条体におけるＰＣ−ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡ単回ＩＳ注射後の約８０％サイレンシングを示す。
【０１１６】
【図６７】マウス皮質におけるＰＣ−ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡ単回ＩＳ注射後の約６０％サイレンシングを示す。
【０１１７】
【図６８】ＣＳＦボーラス注射(２５０μg)後のジ−ｈｓｉＲＮＡ脳分布を示す、４８時間。
【０１１８】
【図６９】単回ＩＳ注射後のジ−ｈｓｉＲＮＡの分布を示す。
【０１１９】
【図７０】脳分布における分岐の効果を示す。
【０１２０】
【図７１】ジ−ｈｓｉＲＮＡの単回ＩＳ注射後のインビボ遺伝子サイレンシングのアッセイのための試験設計を示す。
【０１２１】
【図７２】ジ−ｈｓｉＲＮＡの神経細胞送達を示す。
【０１２２】
【図７３】線条体および皮質におけるジ−ｈｓｉＲＮＡの有効性を示す。ＩＳ注射、２nmol  ジ−ｈｓｉＲＮＡ、１週間、QUANTIGENE 2.0。
【０１２３】
【図７４】ジ−ｈｓｉＲＮＡの均一脊髄分布を示す。
【０１２４】
【図７５】ジ−ｈｓｉＲＮＡＨＴＴボーラス投与後の脊髄におけるｈｔｔ  ｍＲＮＡサイレンシングを示す。ＩＴ、３nmol、１週間、QUANTIGENE。
【０１２５】
【図７６】ＨｅＬａ細胞および一次皮質ニューロンにおけるジ−ｈｓｉＲＮＡ介在インビトロサイレンシングを示す。
【０１２６】
【図７７】ジ−ｈｓｉＲＮＡの体内分布を示す。２nmolのジ−ｓｉＲＮＡオリゴ(４nmolの対応するアンチセンス鎖)の線条体内注射。Ｎ＝２マウス／コンジュゲート。脳を４８時間に採取し、ＤＡＰＩ(核、青色)およびＮｅｕＮ(神経細胞マーカー、緑色)で染色した。画像は代表図である。赤色−オリゴ。
【０１２７】
【図７８】ジ−ｈｓｉＲＮＡの体内分布を示す。２nmolのジ−ｓｉＲＮＡオリゴ(４nmolの対応するアンチセンス鎖)の線条体内注射。Ｎ＝２マウス／コンジュゲート。脳を４８時間に採取し、ＤＡＰＩ(核、青色)およびＮｅｕＮ(神経細胞マーカー、緑色)で染色した。画像は代表図である。赤色−オリゴ。
【０１２８】
【図７９】４８時間後のジ−ｈｓｉＲＮＡ、ＴＥＧ−アジド、ＴＥＧおよびビタミンＤの脳分布を示す。２nmoleをＩＳに注射、Ｎ＝２マウス／コンジュゲート、脳を４８時間後に採取した。
【０１２９】
【図８０】ｈｔｔ  ｍＲＮＡ発現に対するビタミンＤ合成の有効性を示す。
【０１３０】
【図８１】ここに提供する化合物の化学式を示す。
【０１３１】
【図８２】Ｒ３のヌクレオチド間結合の例を示す。
【０１３２】
【図８３】図８１の化学式のある態様を示す。
【０１３３】
【図８４】ここに提供する化合物の化学式を示す。
【０１３４】
【図８５】ここに提供する化合物の化学式を示す。
【０１３５】
【図８６】図８４または図８５のＹ部分のある態様を示す。
【０１３６】
【図８７】ここに提供する化合物の化学式を示す。
【０１３７】
【図８８】図８７の化学式のある態様を示す。
【０１３８】
【図８９】ここに提供する化合物の化学式を示す。
【０１３９】
【図９０】図８９の化学式のある態様を示す。
【０１４０】
【図９１Ａ−Ｄ】完全代謝安定化ｈｓｉＲＮＡ(ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡ)の発展を示す。(Ａ)部分的におよび完全に修飾されたｈｓｉＲＮＡの模式図。(Ｂ)ｈｓｉＲＮＡおよびＦＭ−ｈｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣに進入する同等な能力を有する(ＨｅＬａ、７２時間)。(Ｃ)代謝的に安定な５’−Ｅ−ＶＰは、５’−Ｐと同程度活性である。(Ｄ)５’−Ｅ−ＶＰは、遠位組織への持続性送達を可能とする(注射７日後、ＰＮＡアッセイ)。
【０１４１】
【図９２】化学の進化がボーラスＣＳＦ(ＩＣＶ)注入後のマウス脳におけるｈｓｉＲＮＡの広範な分布を可能としたことを示す。矢状断(左パネル)の図はＩＣＶ注射４８時間後であり、２５０μg  Ｃｙ３標識ｈｓｉＲＮＡバリアントを伴う(右パネル)。画像はライカタイリングアレイ顕微鏡で１０×および同一レーザー強度で得た。核(青色)；Ｃｙ３−ｈｓｉＲＮＡ(赤色)。Ｃｈｏｌ−ｈｓｉＲＮＡは、主に注射した脳室周囲に留まり、脳の遠位側への最低限度の分布を伴う。ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡは良好な分布を示す。ＰＣ−ＤＨＡおよびジ−ｈｓｉＲＮＡは、最も広汎性の分布と、皮質、線条体および小脳までの明らかな送達を示す。スケールバー＝９００μm。
【０１４２】
【図９３】ＰＣ−ＤＨＡ官能化固体支持体の合成プロトコールを示す。
【０１４３】
【図９４】二官能化固体支持体の合成プロトコールを示す。
【０１４４】
【図９５Ａ−Ｃ】ジ−ｈｓｉＲＮＡ発見を示す。(Ａ)カルシフェロール−ｈｓｉＲＮＡ合成からの４個のビ生成物の化学的組成(粗製合成物の分析的ＨＰＬＣ)。(Ｂ)ＨｅＬａ細胞におけるビ生成物の有効性、７２時間、QUANTIGENE(登録商標)。全化合物は等しく活性であった。(Ｃ)各Ｃｙ３−ｈｓｉＲＮＡビ生成物の単回一側性線条体内注射(２５μg)、４８時間。ジ−ｈｓｉＲＮＡのみが、広範な分布と優先的神経細胞取り込みを示した。
【０１４５】
【図９６】ｈｓｉＲＮＡアンチセンス鎖シード領域に完全相補性であるように設計された高親和性修飾(ＬＮＡ)を担持するｈｓｉ解毒薬アンチセンスオリゴヌクレオチドを示す。
【０１４６】
【図９７】コレステロールおよびエンドサイトーシスペプチド(プロトンスポンジ)コンジュゲートｈｓｉＲＮＡを示す。
【０１４７】
【図９８】ＧＭ１コンジュゲートｈｓｉＲＮＡの液相合成プロトコールを示す。
【０１４８】
【図９９】ＤＨＡコンジュゲート(ｇ１ＤＨＡ)およびＰＣ−ＤＨＡ  ｈｓｉＲＮＡコンジュゲート(ｇ２ＤＨＡ)の化学構造を示す。
【０１４９】
【図１００】ＰＣ−ＤＨＡ  ｈｓｉＲＮＡコンジュゲートの固相合成プロトコールを示す。
【０１５０】
【図１０１】ＰＣ−ＤＨＡ  ｈｓｉＲＮＡコンジュゲートの液相合成プロトコールを示す。
【０１５１】
【図１０２Ａ−Ｄ】完全代謝安定化が、インビボでのコンジュゲート介在ｓｉＲＮＡ送達および効果持続期間に必須であったことを示す。(Ａ、Ｂ)ｈｓｉＲＮＡ(Ａ)、ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡ(Ｂ)との比較は、静脈内(IV)およびＣＳＦ(ＩＣＶ)投与後の組織における顕著に増強された分布および保持を示す。野生型妊娠マウス(Ｅ１５)に１０mg／kg(IV)または６０μg(ＩＣＶ)を注射した。組織を、ライカタイリング蛍光顕微鏡で、同一レーザー強度で１０×で撮像した。ＨｓｉＲＮＡ(赤色)；核(青色)。スケールバー＝９００μm。(Ｃ)組織中のインタクトガイド鎖をIV注射５日後定量化した(ｎ＝３、平均±ＳＥＭ)。(Ｄ)ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡは、注射１ヶ月後マウス線条体におけるＨｔｔ  ｍＲＮＡをサイレンスさせる(１２μg、線条体内)。部分的修飾ｈｓｉＲＮＡは、２週間未満サイレンスさせる。
【０１５２】
【図１０３Ａ−Ｃ】インビボでのマウス脳におけるＰＣ−ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡ有効性および安全性を示す。(Ａ)２５μgまたは５０μg  ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡ注射１週間後の線条体および皮質におけるＨｔｔ  ｍＲＮＡレベル。＊＊＊ａＣＳＦおよびＮＴＣ両者に対してＰ＜０.０００１。(Ｂ)有効用量の２０倍の用量レベルで検出可能な天然免疫活性化は生じなかった(データは、ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡに対する総ミクログリアについて示す)。(Ｃ)ＤＡＲＰ３２レベルに基づく正常神経細胞生存能。ｃｈｏｌ−ｈｓｉＲＮＡに対する毒性用量(赤色棒)に注意。
【０１５３】
【図１０４Ａ−Ｃ】ジ−ｈｓｉＲＮＡが、マウス脳における広範な分布および有効性を示したことを示す。(Ａ)ＩＣＶ注射４８時間の目視および組織学による脳全体へのＣｙ３−ジ−ｈｓｉＲＮＡの確固たるおよび均一な分布と、明らかな神経細胞取り込み(２５０μg、ＣＳＦ、両側)、スケールバー＝１００μm。(Ｂ)単回線条体内注射７日後の皮質および線条体におけるＨｔｔ  ｍＲＮＡサイレンシング(２５μg)。(Ｃ)注射７日後の組織におけるｈｓｉＲＮＡ蓄積(ＰＮＡアッセイ)。
【０１５４】
【図１０５Ａ−Ｂ】ジ−ｈｓｉＲＮＡが、ボーラス腰部髄腔内注射後マウス脊髄において広範な分布および有効性を示したことを示す。(Ａ)Ｃｈｏｌ−ｈｓｉＲＮＡは、脊髄の外側から内側への急勾配の拡散を示すが、ジ−ｈｓｉＲＮＡは脊髄全体に広く分布する。動物に、７５μg  Ｃｙ３−Ｃｈｏｌ−ｈｓｉＲＮＡまたはＣｙ３−ジ−ｈｓｉＲＮＡを髄腔内注射した。スケールバー＝１００μm。(Ｂ)確固たるＨｔｔ  ｍＲＮＡサイレンシングが脊髄の全領域で観察された(注射７日後、ｎ＝６)。
【０１５５】
【図１０６】マウス組織におけるｈｓｉＲＮＡガイド鎖検出のためのＰＮＡ(ペプチド核酸)ベースのアッセイを示す。組織を溶解し、残骸を沈殿により分離し、ＰＮＡガイド鎖二本鎖をＨＰＬＣにより精製した(ＤＮＡＰａｃ  Ｐ１００、５０％水５０％アセトニトリル、塩勾配０〜１Ｍ  ＮａＣｌＯ４)。
【０１５６】
【図１０７】ＰＣ−ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡによる腎臓のターゲティングを示す。
【０１５７】
【図１０８】ＧＭ１−ｈｓｉＲＮＡ内部移行およびＧＭ１−ｈｓｉＲＮＡ介在ｈｔｔ  ｍＲＮＡサイレンシングを示す。
【０１５８】
【図１０９】ＧＭ１−ｈｓｉＲＮＡ脳分布を示す。
【０１５９】
【図１１０Ａ−Ｇ】全身性に投与された完全修飾(ＦＭ)ｈｓｉＲＮＡが、インビボで劇的に増強された組織分布および有効性を示すことを示す。(ａ)Ｃｙ３−ｈｓｉＲＮＡおよびＣｙ３−ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡＦＬＴ１(赤色)の組織分布１０mg／kg  IV注射。ＤＡＰＩで核染色(青色)。全画像を同一設定で得た。(ｂ−ｅ)ＰＮＡハイブリダイゼーションベースのアッセイによるガイド鎖定量化(ｂ)１０mg／kg、IV、２４時間  (ｃ)１０mg／kg、ＳＣ、２４時間  (ｄ)２×２０mg／kg、IV、１２０時間、(ｎ＝７)  (ｅ)２×１５mg／kg、IV、１２０時間、(ｎ＝１２)。(ｆ、ｇ)  (ｆ)２×２０mg／kg、Ｃ５７Ｂ６マウス(ｎ＝３、ＰＢＳ；ｎ＝７、ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡＦＬＴ)、(ｇ)２×１５mg／kg、ＣＤ１マウス(ｎ＝１２、ＰＢＳ；ｎ＝６、ＮＴＣ；ｎ＝１２、ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡＦＬＴ１)後のｓＦＬＴ１  ｍＲＮＡサイレンシングの定量化。ｍＲＮＡレベルを、注射１２０時間後QUANTIGENE(登録商標)(Affymetrix)アッセイで測定し、ハウスキーピング遺伝子ＦＬＴ１に対して正規化し、ＰＢＳ処置対照のパーセントとして示した。全エラーバーは平均±ＳＤを示す。＊＊＊、Ｐ＜０.００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０.０００１。
【０１６０】
【図１１１Ａ−Ｇ】局所投与により、完全修飾ｈｓｉＲＮＡが脳全体に広く分布し、サイレンシングの高い効力および長い作用時間を示すことを示す。ｈｓｉＲＮＡＨＴＴ(ａ)およびＦＭ−ｈｓｉＲＮＡＨＴＴ(ｂ、ｃ、ｄ、ｅ)をＩＣＶに注射し、４８時間後の脳の矢状切片にわたる分布を示す。核をＤＡＰＩで染色した(青色)。Ｃｙ３−ｈｓｉＲＮＡ(赤色)。(ｆ、ｇ)ｈｓｉＲＮＡＨＴＴおよびＦＭ−ｈｓｉＲＮＡＨＴＴを線条体に一側性に注射し、ＨＴＴ  ｍＲＮＡレベルを、(ｆ)５日または(ｇ)７日、１４日および２８日後にQUANTIGENE(登録商標)(Affymetrix)を使用して測定し、ハウスキーピング遺伝子、ＰＰＩＢに対して正規化し、未処理対照に対するパーセントとして示した(ｎ＝８マウス、平均±ＳＤ)。ＮＴＣ＝非ターゲティング対照；ＣＳＦ＝人工脳脊髄液。全エラーバーは平均±ＳＤ。＊＊Ｐ＜０.０１；＊＊＊Ｐ＜０.００１；＊＊＊＊Ｐ＜０.０００１。
【発明を実施するための形態】
【０１６１】
ある例示的態様の詳細な記載
新規ハンチンチン標的配列が提供される。本発明の新規ハンチンチン標的配列を標的とする新規ｓｉＲＮＡも提供される。
【０１６２】
一般に、ここに記載する細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションと関連して使用する命名法は、当分野で周知であり、一般に使用されるものである。ここに提供する方法および技術は、特に断らない限り、一般に、当分野で周知であり、ここに引用する種々の包括的なおよびより具体的な引用文献に記載され、本明細書全体に記載するとおり、慣用法に従い実施される。酵素反応および精製技術は、製造業者の明細に従い、当分野で一般になされているとおりまたはここに記載のとおり実施する。ここに記載する分析化学、合成有機化学ならびに医薬品化学および薬化学と関連して使用する、およびこれらの実験室法および技術の命名法は、当分野で周知であり、一般的に使用されるものである。標準的技術を、化学的合成、化学的分析、医薬調製、製剤および送達および患者の処置に使用する。
【０１６３】
特に断らない限り、ここに使用する科学的および技術的用語は、当業者により一般的に理解されている意味を有する。何らかの曖昧さが潜在している場合、ここに提供する定義が、あらゆる辞書または外的定義に優先する。文脈から他の解釈が必要でない限り、単数表現は複数を含み、複数表現は単数を含む。“または”の使用は、特に断らない限り“および／または”を意味する。用語“含む”ならびに“含み”および“含まれる”のような他の形態は限定的ではない。
【０１６４】
本発明がより容易に理解され得るように、いくつかの用語をまず定義する。
【０１６５】
用語“ヌクレオシド”は、リボースまたはデオキシリボース糖に共有結合したプリンまたはピリミジン塩基を有する分子をいう。ヌクレオシドの例は、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジンおよびチミジンを含む。さらなるヌクレオシドの例は、イノシン、１−メチルイノシン、シュードウリジン、５,６−ジヒドロウリジン、リボチミジン、２Ｎ−メチルグアノシンおよび２,２Ｎ,Ｎ−ジメチルグアノシン(“希”ヌクレオシドとも称される)を含む。用語“ヌクレオチド”は、糖部分にエステル結合により結合した１以上のリン酸基を有するヌクレオシをいう。ヌクレオチドの例は、ヌクレオシド一リン酸類、二リン酸類および三リン酸類を含む。用語“ポリヌクレオチド”および“核酸分子”は、ここでは、相互交換可能に使用し、５’および３’炭素原子間のホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合により互いに結合したヌクレオチドのポリマーをいう。
【０１６６】
用語“ＲＮＡ”または“ＲＮＡ分子”または“リボ核酸分子”は、リボヌクレオチドのポリマーをいう(例えば、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０またはそれを超えるリボヌクレオチド)。用語“ＤＮＡ”または“ＤＮＡ分子”またはデオキシリボ核酸分子”は、デオキシリボヌクレオチドのポリマーをいう。ＤＮＡおよびＲＮＡは、天然界で合成され得る(例えば、それぞれＤＮＡ複製またはＤＮＡ転写による)。ＲＮＡは、転写後修飾され得る。ＤＮＡおよびＲＮＡはまた化学合成もできる。ＤＮＡおよびＲＮＡは、一本鎖(すなわち、それぞれｓｓＲＮＡおよびｓｓＤＮＡ)または多重鎖(例えば、二本鎖、すなわち、それぞれｄｓＲＮＡおよびｄｓＤＮＡ)であり得る。“ｍＲＮＡ”または“メッセンジャーＲＮＡ”は、１以上のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を特定する一本鎖ＲＮＡである。この情報が、リボソームがｍＲＮＡに結合したとき、タンパク質合成中に翻訳される。
【０１６７】
ここで使用する用語“低分子干渉ＲＮＡ”(“ｓｉＲＮＡ”)(当分野では“短干渉ＲＮＡ”とも称する)は、ＲＮＡ干渉を指示または伝達できる、約１０〜５０ヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)を含むＲＮＡ(またはＲＮＡアナログ)をいう。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、約１５〜３０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、より好ましくは約１６〜２５ヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)、よりさらに好ましくは約１８〜２３ヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)、よりさらに好ましくは約１９〜２２ヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)(例えば、１９、２０、２１または２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ)を含む。用語“短”ｓｉＲＮＡは、約２１ヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)、例えば、１９、２０、２１または２２ヌクレオチド含むｓｉＲＮＡをいう。用語“長”ｓｉＲＮＡは、約２４〜２５ヌクレオチド、例えば、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド含むｓｉＲＮＡをいう。短ｓｉＲＮＡは、ある場合、１９より少ないヌクレオチド、例えば、１６、１７または１８ヌクレオチドを含むかもしれないが、但しこのより短いｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉに介在する能力を保持する。同様に、長ｓｉＲＮＡは、ある場合、２６をこえるヌクレオチドを含むかもしれないが、但しこのより長いｓｉＲＮＡは、短ｓｉＲＮＡへのさらなるプロセシング、例えば、酵素プロセシングなしで、ＲＮＡｉに介在する能力を保持する。
【０１６８】
用語“ヌクレオチドアナログ”または“変改ヌクレオチド”または“修飾ヌクレオチド”は、天然に存在しないリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む、非標準ヌクレオチドをいう。ヌクレオチドアナログの例は、ヌクレオチドのある化学的性質を変えるために任意の位置が修飾されているが、ヌクレオチドアナログがその意図する機能を発揮する能力はなお保持する。誘導体化し得るヌクレオチドの位置は、５位、例えば、５−(２−アミノ)プロピルウリジン、５−ブロモウリジン、５−プロピンウリジン、５−プロペニルウリジンなど；６位、例えば、６−(２−アミノ)プロピルウリジン；アデノシンおよび／またはグアノシンについては８位、例えば、８−ブロモグアノシン、８−クロログアノシン、８−フルオログアノシンなどを含む。ヌクレオチドアナログはデアザヌクレオチド、例えば、７−デアザ−アデノシン；Ｏ−およびＮ修飾(例えば、アルキル化、例えば、Ｎ６−メチルアデノシンまたは他に当分野で知られるように)ヌクレオチド；およびHerdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2000 Aug. 10(4):297-310に記載のもののような他のヘテロ環修飾ヌクレオチドアナログも含む。
【０１６９】
ヌクレオチドアナログはまたヌクレオチドの糖部分にも修飾を含み得る。例えば、２’  ＯＨ基をＨ、ＯＲ、Ｒ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＣＯＯＲまたはＯＲ(ここで、Ｒは置換または非置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールなどである)に置き換えてよい。他の可能な修飾は、米国特許５,８５８,９８８号および６,２９１,４３８号に記載のものを含む。
【０１７０】
ヌクレオチドのリン酸基も、例えば、リン酸基の酸素の１以上を硫黄に置き換えることにより(例えば、ホスホロチオエート)または、例えば、Eckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Apr. 10(2):117-21, Rusckowski et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Oct. 10(5):333-45, Stein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Oct. 11(5): 317-25, Vorobjev et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Apr. 11(2):77-85および米国特許５,６８４,１４３号に記載のように、ヌクレオチドがその意図する機能を発揮することを可能にする他の置換をすることにより、修飾してよい。上記修飾のいくつか(例えば、リン酸基修飾)は、好ましくはインビボまたはインビトロで、例えば、該アナログを含むポリヌクレオチドの加水分解の速度を低減する。
【０１７１】
用語“オリゴヌクレオチド”は、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログの短ポリマーをいう。用語“ＲＮＡアナログ”は、対応する非変改または非修飾ＲＮＡと比較して、少なくとも一つの変改または修飾ヌクレオチドを有するが、対応する非変改または非修飾ＲＮＡと同じまたは類似する性質または機能を保持する、ポリヌクレオチド(例えば、化学合成ポリヌクレオチド)をいう。上記のとおり、オリゴヌクレオチドを、ホスホジエステル結合を有するＲＮＡ分子と比較して、ＲＮＡアナログの低加水分解速度をもたらす結合で結合してよい。例えば、アナログのヌクレオチドは、メチレンジオール、エチレンジオール、オキシメチルチオ、オキシエチルチオ、オキシカルボニルオキシ、ホスホロジアミデート、ホスホロアミデートおよび／またはホスホロチオエート結合を含み得る。好ましいＲＮＡアナログは、糖および／または主鎖修飾リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含む。このような変改または修飾は、さらに、非ヌクレオチド物質の、例えば、ＲＮＡの末端または内部への付加を含み得る(ＲＮＡの１以上のヌクレオチドで)。ＲＮＡアナログに必要とされるのは、天然ＲＮＡに十分類似するＲＮＡ干渉に介在する能力を有することのみである。
【０１７２】
ここで使用する用語“ＲＮＡ干渉”(“ＲＮＡｉ”)は、ＲＮＡの選択的細胞内分解をいう。ＲＮＡｉは、外来ＲＮＡ(例えば、ウイルスＲＮＡ)を除去するために天然に細胞で起こる。天然のＲＮＡｉは、他の類似ＲＮＡ配列への分解機序を指示する、遊離ｄｓＲＮＡから開裂された断片を経て進行する。あるいは、ＲＮＡｉは、例えば、標的遺伝子の発現をサイレンスさせるために、人の手により開始され得る。
【０１７３】
“標的特異的ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)を指示するために標的ｍＲＮＡ配列と十分に相補性である配列”である鎖を有するＲＮＡｉ剤、例えば、ＲＮＡサイレンシング剤は、鎖が、ＲＮＡｉ機序または過程により標的ｍＲＮＡの破壊を誘発するのに十分な配列を有することを意味する。
【０１７４】
ここで使用する用語“単離ＲＮＡ”(例えば、“単離ｓｉＲＮＡ”または“単離ｓｉＲＮＡ前駆体”)は、組み換え技術により産生されたとき他の細胞物質もしくは培養媒体を実質的に含まないまたは化学合成されたとき化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない、ＲＮＡ分子をいう。
【０１７５】
ここで使用する用語“ＲＮＡサイレンシング”は、対応するタンパク質コード化遺伝子の発現の阻害または“サイレンシング”をもたらす、ＲＮＡ分子が介在する一群の配列特異的制御機序(例えばＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)、転写型遺伝子サイレンシング(ＴＧＳ)、転写後型遺伝子サイレンシング(ＰＴＧＳ)、鎮圧、共抑制および翻訳抑制)をいう。ＲＮＡサイレンシングは、植物、動物および真菌を含む多くのタイプの生物で観察されている。
【０１７６】
用語“識別ＲＮＡサイレンシング”は、ＲＮＡ分子が、例えば、両ポリヌクレオチド配列が同じ細胞に存在するとき、“第一”または“標的”ポリヌクレオチド配列の発現を実質的に阻害するが、“第二”または“非標的”ポリヌクレオチド配列”の発現を実質的に阻害しない能力をいう。ある態様において、標的ポリヌクレオチド配列は標的遺伝子に対応し、一方非標的ポリヌクレオチド配列は非標的遺伝子に対応する。他の態様において、標的ポリヌクレオチド配列は標的アレルに対応し、一方非標的ポリヌクレオチド配列は非標的アレルに対応する。ある態様において、標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子の制御領域をコードするＤＮＡ配列(例えばプロモーターまたはエンハンサーエレメント)である。他の態様において、標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子によりコードされる標的ｍＲＮＡである。
【０１７７】
用語“インビトロ”は、例えば、精製された反応物または抽出物、例えば、細胞抽出物が関与する、当分野で認識されているその意味を有する。用語“インビボ”も、例えば、生存細胞、例えば、不死化細胞、一次細胞、細胞株および／または生物中の細胞が関与する、当分野で認識されているその意味を有する。
【０１７８】
ここで使用する用語“トランスジーン”は、細工により細胞へ挿入され、該細胞から発達した生物のゲノムの一部となる、あらゆる核酸分子をいう。このようなトランスジーンは、トランスジェニック生物に一部または完全に異種性(すなわち、外来)である遺伝子を含んでよく、または生物の内在性遺伝子と相同である遺伝子を表し得る。用語“トランスジーン”はまた、トランスジェニック生物、例えば、動物において発現する、１以上の改変ＲＮＡ前駆体をコードする１以上の選択核酸配列、例えば、ＤＮＡを含む核酸分子をいい、これは、トランスジェニック動物に一部または完全に異種性、すなわち、外来であるか、またはトランスジェニック動物の内在性遺伝子と相同であるが、天然遺伝子と異なる位置で動物ゲノムに挿入するよう設計されている。トランスジーンは、選択核酸配列の発現に必要な１以上のプロモーターおよびイントロンのような何らかの他のＤＮＡ(全て選択配列に操作可能に結合している)を含み、そしてエンハンサー配列を含み得る。
【０１７９】
疾患または障害に“関与する”遺伝子は、正常または異常発現または機能が疾患または障害または該疾患または障害の少なくとも一つの症状に影響するまたは原因となる遺伝子である。
【０１８０】
ここで使用する用語“機能獲得型変異”は、遺伝子における何らかの変異をいい、これにより、該遺伝子によりコードされるタンパク質(すなわち、変異体タンパク質)が、疾患または障害の原因となるかまたは寄与し、通常該タンパク質(すなわち、野生型タンパク質)と関係しない機能を獲得する。機能獲得型変異は、コード化タンパク質における機能を変化させる、遺伝子におけるヌクレオチドまたはヌクレオチドの欠失、付加または置換であり得る。ある態様において、機能獲得型変異は、変異体タンパク質の機能を変化させるかまたは他のタンパク質との相互作用を引き起こす。他の態様において、機能獲得型変異は、正常野生型タンパク質の、例えば、変改、変異体タンパク質と、該正常、野生型タンパク質との相互作用による低減または除去を引き起こす。
【０１８１】
ここで使用する用語“標的遺伝子”は、発現が実質的に阻害または“サイレンシング”される遺伝子である。このサイレンシングは、ＲＮＡサイレンシングにより、例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡの開裂または標的遺伝子の翻訳抑制により達成される。用語“非標的遺伝子”は、発現が実質的にサイレンシングされない遺伝子である。ある態様において、標的および非標的遺伝子のポリヌクレオチド配列(例えば標的および非標的遺伝子によりコードされるｍＲＮＡ)は、１以上のヌクレオチドで異なり得る。他の態様において、標的および非標的遺伝子は、１以上の多型(例えば、一塩基多型またはＳＮＰ)で異なり得る。他の態様において、標的および非標的遺伝子は、１００％未満の配列同一性を有してよい。他の態様において、非標的遺伝子は、標的遺伝子のホモログ(例えばオルソログまたはパラログ)であり得る。
【０１８２】
“標的アレル”は、発現が選択的に阻害または“サイレンス”されるアレル(例えば、ＳＮＰアレル)である。このサイレンシングは、ＲＮＡサイレンシングにより、例えば、ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子または標的アレルのｍＲＮＡの開裂により達成できる。用語“非標的アレル”は、発現が実質的にサイレンスされないアレルである。ある態様において、標的および非標的アレルは、同じ標的遺伝子に対応し得る。他の態様において、標的アレルは標的遺伝子に対応または結合し、非標的アレルは非標的遺伝子に対応または結合する。ある態様において、標的および非標的アレルのポリヌクレオチド配列は、１以上のヌクレオチドで異なり得る。他の態様において、標的および非標的アレルは、１以上のアレル多型(例えば、１以上のＳＮＰ)で異なり得る。他の態様において、標的および非標的アレルは、１００％未満の配列同一性を有し得る。
【０１８３】
ここで使用する用語“多型”は、異なる起源または対象(しかし同じ生物)からの同じ遺伝子配列を比較したときに同定または検出される、遺伝子配列における多様性(例えば、１以上の欠失、挿入または置換)をいう。例えば、多型は、異なる対象からの同じ遺伝子配列を比較したとき、同定できる。このような多型の同定は当分野で常套的であり、方法論は、例えば、乳癌点変異検出に使用されるものに類似する。同定は、例えば、対象のリンパ球から抽出されたＤＮＡから、続く該多型領域に対する特異的プライマーを使用する多型領域の増幅により行い得る。あるいは、多型は、同じ遺伝子の２アレルを比較したとき、同定できる。特定の態様において、多型は一塩基多型(ＳＮＰ)である。
【０１８４】
生物内の同じ遺伝子の２アレル間の配列の多様性を、ここでは“アレル多型”と称する。ある態様において、アレル多型はＳＮＰアレルに対応する。例えば、アレル多型は、ＳＮＰの２アレル間の単一ヌクレオチド多様性を含み得る。多型は、コーディング領域内のヌクレオチドであってよいが、遺伝コードの縮重により、アミノ酸配列の変化はコードされない。あるいは、多型配列は、特定の位置の異なるアミノ酸をコードできるが、アミノ酸の変化はタンパク質機能に影響しない。多型領域はまた遺伝子の非コード化領域にも見ることができる。例示的態様において、多型は遺伝子のコーディング領域または遺伝子の非翻訳領域(例えば、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ)に見られる。
【０１８５】
ここで使用する用語“アレル頻度”は、個体集団における単一座位でのアレル(例えば、ＳＮＰアレル)の関連頻度の指標(例えば、比率またはパーセンテージ)である。例えば、個体集団が、体細胞の各々に特定の染色体座位(および座位を占拠する遺伝子)のｎ座位を担持するならば、あるアレルのアレル頻度は、該アレルが集団内で占める座位の分数またはパーセンテージである。特定の態様において、アレル(例えば、ＳＮＰアレル)のアレル頻度は、サンプル集団の少なくとも１０％(例えば、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％またはそれ以上)である。
【０１８６】
ここで使用する用語“サンプル集団”は、統計学的に有意な数の個体を含む、個体集団をいう。例えば、サンプル集団は、５０、７５、１００、２００、５００、１０００またはそれ以上の個体を含み得る。特定の態様において、サンプル集団は、少なくとも一つの共通疾患表現型(例えば、機能獲得型障害)または変異(例えば、機能獲得型変異)を共有する個体を含み得る。
【０１８７】
ここで使用する用語“ヘテロ接合性”は、特定の座位(例えば、ＳＮＰ)でヘテロ接合である(例えば、２以上の異なるアレルを含む)、集団内の個体の分数をいう。ヘテロ接合性は、当業者に周知の方法を使用してサンプル集団について計算できる。
【０１８８】
ここで使用する用語“ポリグルタミンドメイン”は、ペプチド結合により結合された連続的グルタミン残基からなるタンパク質のセグメントまたはドメインをいう。ある態様において、連続的領域は少なくとも５グルタミン残基を含む。
【０１８９】
ここで使用する用語“拡張ポリグルタミンドメイン”または“拡張ポリグルタミンセグメント”は、ペプチド結合により結合された少なくとも３５連続的グルタミン残基を含むタンパク質のセグメントまたはドメインをいう。このような拡張セグメントは、ここに記載するとおり、ポリグルタミン障害に罹患した対象に、対象が顕在化した症状を有するか否かに関わらず、見られる。
【０１９０】
ここで使用する用語“トリヌクレオチド反復”または“トリヌクレオチド反復領域”は、特定のトリヌクレオチド配列の連続的反復からなる、例えば、核酸配列のセグメントをいう。ある態様において、トリヌクレオチド反復は、少なくとも５連続的トリヌクレオチド配列を含む。トリヌクレオチド配列の例は、ＣＡＧ、ＣＧＧ、ＧＣＣ、ＧＡＡ、ＣＴＧおよび／またはＣＧＧを含むが、これらに限定されない。
【０１９１】
ここで使用する用語“トリヌクレオチド反復疾患”は、遺伝子内に位置する拡張トリヌクレオチド反復領域により特徴付けられる何らかの疾患または障害をいい、拡張トリヌクレオチド反復領域は該疾患または障害の原因である。トリヌクレオチド反復疾患の例は、脊髄小脳失調症１２型、脊髄小脳失調症８型、脆弱Ｘ症候群、脆弱ＸＥ精神遅滞、フリードライヒ失調症および筋強直性ジストロフィーを含むが、これらに限定されない。本発明による処置のためのトリヌクレオチド反復疾患の例は、遺伝子のコーディング領域の５’末端での拡張トリヌクレオチド反復領域により特徴付けられるまたは引き起こされるものであり、遺伝子は、該疾患または障害を引き起こすまたは原因である変異体タンパク質をコードする。あるトリヌクレオチド疾患、例えば、脆弱Ｘ症候群は、変異がコーディング領域と関係しないとき、ＲＮＡｉにより標的とすべき適当なｍＲＮＡがないため、本発明の方法での処置に不適であり得る。対照的に、フリードライヒ失調症のような疾患は、原因変異がコーディング領域内ではないが(すなわち、イントロンにある)、変異が、例えば、ｍＲＮＡ前駆体(例えば、プレスプライスｍＲＮＡ前駆体)内にあり得るため、本発明の方法での処置に適し得る。
【０１９２】
ここで使用する用語“ポリグルタミン障害”は、コーディング領域(すなわち、コード化タンパク質における拡張ポリグルタミン領域をコード化する)の５’末端での(ＣＡＧ)ｎ反復の拡張により特徴付けられるあらゆる疾患または障害をいう。ある態様において、ポリグルタミン障害は、神経細胞の進行性変性により特徴付けられる。ポリグルタミン障害の例は、次のものを含むが、これらに限定されない：ハンチントン病、脊髄小脳失調症１型、脊髄小脳失調症２型、脊髄小脳失調症３型(マシャド・ジョセフ病としても知られる)および脊髄小脳失調症６型、脊髄小脳失調症７型および歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症。
【０１９３】
用語“細胞または生物における遺伝子の機能を試験”は、それに起因する発現、活性、機能または表現型の試験または研究をいう。
【０１９４】
ここで使用する用語“ＲＮＡサイレンシング剤”は、標的遺伝子の発現を阻害または“サイレンシング”できるＲＮＡをいう。ある態様において、ＲＮＡサイレンシング剤は、転写後サイレンシング機序を介してｍＲＮＡ分子の完全プロセシング(例えば、完全翻訳および／または発現)を阻止できる。ＲＮＡサイレンシング剤は、小(＜５０ｂ.ｐ.)、非コーディングＲＮＡ分子、例えば対鎖を含むＲＮＡ二本鎖、ならびにこのような小非コーディングＲＮＡが産生され得る前駆体ＲＮＡを含む。ＲＮＡサイレンシング剤の例は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ様二本鎖、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＧＡＰＭＥＲ分子および二機能性オリゴヌクレオチドならびにその前駆体を含む。ある態様において、ＲＮＡサイレンシング剤はＲＮＡ干渉を誘発できる。他の態様において、ＲＮＡサイレンシング剤は翻訳抑制に介在できる。
【０１９５】
ここで使用する用語“希ヌクレオチド”は、稀に生じる天然に存在するデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、例えば、グアノシン、アデノシン、シトシンまたはウリジンではない天然に存在するリボヌクレオチドを含む、稀に生じる天然に存在するヌクレオチドをいう。希ヌクレオチドの例は、イノシン、１−メチルイノシン、シュードウリジン、５,６−ジヒドロウリジン、リボチミジン、２Ｎ−メチルグアノシンおよび２,２Ｎ,Ｎ−ジメチルグアノシンを含むが、これらに限定されない。
【０１９６】
改変ＲＮＡ前駆体または改変核酸分子におけるような用語“改変”は、前駆体または分子の核酸配列の全てまたは一部がヒトにより作製または選択される点で、該前駆体または分子が天然に見られないことを示す。作製または選択されたら、配列は、複製、翻訳、転写または細胞内での機序により他に処理される。それ故に、改変核酸分子を含むトランスジーンから細胞内で製造されたＲＮＡ前駆体は改変ＲＮＡ前駆体である。
【０１９７】
ここで使用する用語“マイクロＲＮＡ”(“ｍｉＲＮＡ”)は、当分野では“小一過性ＲＮＡ”(“ｓｔＲＮＡ”)とも称され、遺伝的にコード化され(例えば、ウイルス、哺乳動物または植物ゲノムによる)、ＲＮＡサイレンシングの指示または介在が可能である、小(１０〜５０ヌクレオチド)ＲＮＡをいう。“ｍｉＲＮＡ障害”は、ｍｉＲＮＡの異常発現または活性により特徴付けられる疾患または障害をいう。
【０１９８】
ここで使用する用語“二機能性オリゴヌクレオチド”は、式Ｔ−Ｌ−μ(式中、ＴはｍＲＮＡターゲティング部分であり、Ｌは連結部分であり、μはｍｉＲＮＡ動員部分である)を有するＲＮＡサイレンシング剤をいう。ここで使用する用語“ｍＲＮＡターゲティング部分”、“ターゲティング部分”、“ｍＲＮＡターゲティング部分”または“ターゲティング部分”は、十分なサイズを有し、かつサイレンシングのために選択したまたは標的化したｍＲＮＡの部分または領域に十分な相補性を有する、二機能性オリゴヌクレオチドのドメイン、部分または領域をいう(すなわち、該部分は、標的ｍＲＮＡを捕捉するのに十分な配列を有する)。ここで使用する用語“連結部分”または“連結部分”は、ｍＲＮＡと共有結合的に連結または架橋するＲＮＡサイレンシング剤のドメイン、部分または領域をいう。
【０１９９】
ここで使用するＲＮＡサイレンシング剤、例えば、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡサイレンシング剤の“アンチセンス鎖”なる用語は、サイレンシングの標的である遺伝子のｍＲＮＡの約１０〜５０ヌクレオチド、例えば、約１５〜３０、１６〜２５、１８〜２３または１９〜２２ヌクレオチドの切片に実質的に相補性である鎖をいう。アンチセンス鎖または第一鎖は、標的特異的サイレンシングを指示するために所望の標的ｍＲＮＡ配列に十分に相補性である、例えば、ＲＮＡｉ機序または過程(ＲＮＡｉ干渉)による所望の標的ｍＲＮＡの破壊の誘発に十分な相補性または所望の標的ｍＲＮＡの翻訳抑制の誘発に十分な相補性の配列をいう。
【０２００】
ＲＮＡサイレンシング剤、例えば、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡサイレンシング剤の“センス鎖”または“第二鎖”なる用語は、アンチセンス鎖または第一鎖と相補的な鎖をいう。アンチセンス鎖およびセンス鎖は、第一鎖または第二鎖とも称することができ、第一鎖または第二鎖は標的配列に相補性を有し、各第二鎖または第一鎖は、該第一鎖または第二鎖に相補性を有する。ｍｉＲＮＡ二本鎖は、サイレンシングの標的である遺伝子のｍＲＮＡの約１０〜５０ヌクレオチドの切片に十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ鎖およびｍｉＲＮＡ鎖と二本鎖を形成するための十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ＊鎖に介在するか、またはｓｉＲＮＡ様二本鎖はそれを含む。
【０２０１】
ここで使用する用語“ガイド鎖”は、ＲＩＳＣ複合体の中に進入し、標的ｍＲＮＡの切断を支持する、ＲＮＡサイレンシング剤、例えば、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖またはｓｉＲＮＡ配列の鎖をいう。
【０２０２】
ＲＮＡサイレンシング剤の二本鎖領域(例えば、ｓｈＲＮＡのステム)の非対称におけるような、ここで使用する用語“非対称”は、二本鎖の一方の鎖の５’末端が相補的鎖の５’末端よりも高頻度で一過性不対、例えば、一本鎖状態であるように、ＲＮＡサイレンシング剤の終端間(例えば、第一鎖の末端ヌクレオチドまたはステム部分と、反対の第二鎖の末端ヌクレオチドまたはステム部分の間)の結合強度または塩基対形成強度の不均衡をいう。この構造差は、二本鎖の一方の鎖が、ＲＩＳＣ複合体に優先的に取り込まれることを決定する。５’末端が相補的鎖にあまり堅く対合していない鎖が、ＲＩＳＣに優先的に取り込まれ、ＲＮＡｉに介在する。
【０２０３】
ここで使用する用語“結合強度”または“塩基対強度”は、主にヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)間のＨ結合形成、ファンデルワールス相互作用などによる、オリゴヌクレオチド二本鎖(例えば、ｓｉＲＮＡ二本鎖)の反対の鎖上のヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)の対間の相互作用の強度をいう。
【０２０４】
アンチセンス鎖の５’末端におけるような、ここで使用する“５’末端”は、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチド、例えば、５’末端の１〜約５ヌクレオチドをいう。センス鎖の３’末端におけるようなここで使用する“３’末端”は、相補的アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドに相補的である領域、例えば、１〜約５ヌクレオチドの領域をいう。
【０２０５】
ここで使用する用語“不安定化ヌクレオチド”は、塩基対が慣用の塩基対(すなわち、ワトソン・クリック塩基対)より低結合強度であるように、第二ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログと塩基対を形成する第一ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログをいう。ある態様において、不安定化ヌクレオチドは、第二ヌクレオチドとミスマッチ塩基対を形成できる。他の態様において、不安定化ヌクレオチドは、第二ヌクレオチドと揺らぎ塩基対を形成できる。さらに他の態様において、不安定化ヌクレオチドは、第二ヌクレオチドと多義性塩基対を形成できる。
【０２０６】
ここで使用する用語“塩基対”は、主にヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)間のＨ結合形成、ファンデルワールス相互作用などによる、オリゴヌクレオチド二本鎖(例えば、ＲＮＡサイレンシング剤の一鎖と標的ｍＲＮＡ配列により形成される二本鎖)の反対の鎖のヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)間の相互作用をいう。ここで使用する用語“結合強度”または“塩基対強度”は、塩基対の強度をいう。
【０２０７】
ここで使用する用語“不適正塩基対”は、非相補的または非ワトソン・クリック塩基対からなる塩基対、例えば、通常の相補的Ｇ：Ｃ、Ａ：ＴまたはＡ：Ｕ塩基対以外をいう。ここで使用する用語“多義性塩基対”(非識別塩基対としても既知)は、普遍的ヌクレオチドにより形成される塩基対をいう。
【０２０８】
ここで使用する用語“普遍的ヌクレオチド”(“中立ヌクレオチド”としても既知)は、塩基対を形成するとき、相補的ポリヌクレオチド上の塩基間を顕著に識別しない塩基(“普遍的塩基”または“中立塩基”)を有するヌクレオチド(例えばある不安定化ヌクレオチド)を含む。普遍的ヌクレオチドは、主にスタッキング相互作用により逆平行二本鎖核酸(例えば、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ)に効率的に包装され得る疎水性分子である。普遍的ヌクレオチドの塩基部分は、一般に窒素含有芳香族ヘテロ環式部分を含む。
【０２０９】
ここで使用する用語“十分な相補性”または“十分な程度の相補性”は、ＲＮＡサイレンシング剤が、それぞれ所望の標的ＲＮＡに結合し、標的ｍＲＮＡのＲＮＡサイレンシングを誘発するのに十分な配列(例えばアンチセンス鎖において、ｍＲＮＡターゲティング部分またはｍｉＲＮＡ動員部分)を有することを意味する。
【０２１０】
ここで使用する用語“翻訳抑制”は、ｍＲＮＡ翻訳の選択的阻害をいう。天然の翻訳抑制は、ｓｈＲＮＡ前駆体から開裂されたｍｉＲＮＡを経て進行する。ＲＮＡｉおよび翻訳抑制の両方は、ＲＩＳＣが介在する。ＲＮＡｉおよび翻訳抑制の両方は、自然に生じ、または、例えば、標的遺伝子の発現をサイレンスさせるために人の手により開始され得る。
【０２１１】
本発明の種々の方法論は、“適当な対照”(ここでは、“適切な対照”と相互交換可能に使用する)との値、レベル、特色、特徴、性質などの比較を含む工程を含む。“適当な対照”または“適切な対照”は、比較目的に有用な、当業者に周知の何らかの対照または標品である。ある態様において、“適当な対照”または“適切な対照”は、ここに記載するＲＮＡｉ方法論の実施前に決定した値、レベル、特色、特徴、性質などである。例えば、転写速度、ｍＲＮＡレベル、翻訳速度、タンパク質レベル、生物学的活性、細胞の特徴または性質、遺伝子型、表現型などを、本発明のＲＮＡサイレンシング剤を細胞または生物に導入する前に決定できる。他の態様において、“適当な対照”または“適切な対照”は、例えば、正常形質を示す細胞または生物、例えば、対照または正常細胞または生物で決定した値、レベル、特色、特徴、性質などである。さらに他の態様において、“適当な対照”または“適切な対照”は、定義済み値、レベル、特色、特徴、性質などである。
【０２１２】
他に定義しない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。ここに記載するものに類似するまたは等価な方法および物質を、本発明の実施または試験に際して使用できるが、適当な方法および物質を下に記載する。ここに記載する全ての刊行物、特許出願、特許および他の引用文献は、その全体を引用により本明細書に包含させる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が支配する。さらに、物質、方法および例は説明のみであり、限定的であることは意図しない。
【０２１３】
本発明の種々の側面を、次のセクションでさらに詳細に記載する。
【０２１４】
Ｉ. ポリグルタミン障害
ポリグルタミン障害は、一般的遺伝子突然変により特徴付けられる疾患または障害の一群である。特に、本疾患または障害は、コード化タンパク質における、拡張した一続きのグルタミン残基を生じさせる、トリヌクレオチドＣＡＧの拡張反復により特徴付けられる。ポリグルタミン障害は、疾患が神経細胞の進行性変性により特徴付けられる点で類似する。それらの類似性にも関わらず、ポリグルタミン障害は種々の染色体で生じ、故に、ＤＮＡの全く異なるセグメントで生じる。ポリグルタミン障害の例は、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症１型、脊髄小脳失調症２型、脊髄小脳失調症３型、脊髄小脳失調症６型および脊髄小脳失調症７型を含む。
【０２１５】
本発明でいうポリグルタミン障害は、例えば、約３０〜３５グルタミン残基、約３５〜４０グルタミン残基、約４０〜４５グルタミン残基を有するまたは約４５以上のグルタミン残基を有するドメインにより特徴付けられる。ポリグルタミンドメインは、一般に連続的グルタミン残基を含む(Ｑ  ｎ＞３６)。
【０２１６】
II. ハンチントン病
ある態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ハンチントン病の処置のための変異体ヒトハンチンチンタンパク質(ｈｔｔ)における多型(例えば一塩基多型)を標的とするよう設計される。
【０２１７】
常染色体優性疾患として遺伝するハンチントン病は、認知障害および運動疾患を引き起こす。患者は、飢餓または感染で早死にする前に、重度に衰弱しながら１０年以上生存することができる。疾患は、大部分で４０代または５０代で始まるが、一部の患者では、１０代で疾患が顕在化する。ハンチントン病の遺伝子突然変異は、ハンチンチン遺伝子におけるＣＡＧ反復延長である。ＣＡＧ反復は、正常個体で８〜３５の間で数が変わる(Kremer et al., 1994)。遺伝子突然変異、例えば、ＣＡＧ反復の長さの延長(ハンチンチン遺伝子における３６未満から、疾患における３６超)は、３６を超えるポリグルタミン酸を有する変異体ハンチンチンタンパク質の合成と関係する(Aronin et al., 1995)。一般に、３６以上のＣＡＧ反復を有する個体はハンチントン病を発症する。根底にある変異として延長したＣＡＧを伴う２０もの多くの他の疾患のプロトタイプとして、ハンチントン病はなお有効な治療がない。アポトーシス経路の妨害、ミトコンドリア効率を増強する薬剤の追加およびＮＭＤＡ受容体の遮断のような多種多様な介入は、細胞培養およびハンチントン病のマウスモデルで有望であることが示されている。しかしながら、これらの研究は、せいぜい細胞または動物の生存の短期延命を示すのみである。
【０２１８】
ハンチントン病は、変異体遺伝子が、変異体ｍＲＮＡの産生の鋳型として働き、次いで変異体ｍＲＮＡが変異体タンパク質の合成を指示するという遺伝学の中心的ドグマに従う(Aronin et al., 1995; DiFiglia et al., 1997)。科学的理論に縛られることを意図しないが、変異体ハンチンチンタンパク質は、線条体および皮質の選択的ニューロンに蓄積し、これまでに知られている細胞の活動を妨害し、神経細胞の機能不全および死を引き起こすと考えられる(Aronin et al., 1999; Laforet et al., 2001)。変異体遺伝子の単一コピーがハンチントン病を引き起こすのに十分であるため、最も廉価な処置が、変異体遺伝子を無効とする。理論によるアプローチは、変異体ハンチンチンの遺伝子転写停止、変異体ｍＲＮＡ破壊および翻訳遮断を含む。各々が変異体ハンチンチンの喪失という同じ結果に到る。
【０２１９】
III. ハンチンチン遺伝子
ハンチントン病と関連する疾患遺伝子は、ハンチンチンまたは(ｈｔｔ)と呼ばれる。ハンチンチン座位は大きく、１８０kbに及び、６７エクソンからなる。ハンチンチン遺伝子は広範に発現され、正常発達に必要である。種々の胎児および成体組織において種々の相対的豊富さを示す、２つの選択的ポリアデニル化形態として発現される。大きなトランスクリプトは約１３.７kbであり、主に成体および胎児脳で発現され、約１０.３kbの小トランスクリプトはより広範に発現される。２つのトランスクリプトは、その３’非翻訳領域が異なる(Lin et al., 1993)。両メッセージは、３１４４アミノ酸を含む３４８キロダルトンタンパク質をコードすると予測される。ハンチントン病に至る遺伝的欠陥は、ｍＲＮＡに新規性質を付与するかまたはタンパク質の機能を変えると考えられる。
【０２２０】
本発明は、ＲＮＡ干渉を利用してハンチンチン(例えば、野生型および／または変異体ハンチンチン)を標的とする(Hutvagner et al., 2002)。二本鎖ＲＮＡの一鎖(ｓｉＲＮＡ)は、ハンチンチンｍＲＮＡ内の標的配列を補完する。ｓｉＲＮＡをニューロンに挿入後、ｓｉＲＮＡは部分的に巻き戻され、部位特異的方式でハンチンチンｍＲＮＡ内の多型領域に結合し、ｍＲＮＡヌクレアーゼを活性化させる。このヌクレアーゼはハンチンチンｍＲＮＡを開裂し、それによりハンチンチン(例えば、野生型および／または変異体ハンチンチン)の翻訳を停止させる。細胞は部分的に消化されたｍＲＮＡを排除し、そうして翻訳を妨げるか、または細胞は部分的に翻訳されたタンパク質を消化する。ある態様において、ニューロンは、その産生を排除することにより変異体ハンチンチンの被害を阻止し、正常アレルからの野生型ハンチンチンで生き残る。
【０２２１】
本発明の態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、図８に挙げる標的配列の１以上のターゲティングができる。ある例示的態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ヒトｈｔｔ遺伝子の１２１４、１２１８、１２１９、１２５７、１８９４、１９０７、２８６６、４０４１、４０４９、５３０１、６０１６、６５７９、８６０３、１０１２５、１０１４６、１０１５０、４２４、４５６、５２２、５２７、８７８、８７９、９０８、１０２４、１１６５、１２０７、１２１２、１２１７、１２２０、１２２３、１２２７、１２２９、１２６０、１４０３、１４７０、１９０１、１９０３、２４１１、２４１２、２８６５、３８０１、４０４０、４０４８、４０５２、４０５５、４０８３、４２７５、４３７２、４３７４、４３７６、４４２５、４５６２、４６９２、４７２１、５２００、５４４３、５５１５、８６０９、１０１３０、１０１３４、１０１４２、１０１６９、１０１８２、１０１８６、１０８０９、１１１１６、１１１２９、１１１３４、１１１４７、１１４１２、１１４２６、１１４４３、１１６５９、１１６６６、１１６７７、１１８６３、１１８９０、１１９２７、１１９４７、１２１６３、１２２１８、１２２２３、１２２３５、１２２７９、１２２８２、１２２９７、１２３０９、１２３１３、１２３３１、１３１３６、１３３９８、１３４０３、１３４２３、１３４２８からなる群から選択される遺伝子位置で、挙げられた１以上の標的配列の標的配列の１以上をターゲティングできる(図８に示す)。ある例示的態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ヒトｈｔｔ遺伝子の５３０１、１０１２５、１０１４６、１０１５０、４２４、８７８、８７９、４０８３、４２７５、４５６２、４７２１、５２００、１０１３０、１０１３４、１０１４２、１１１１６、１１１２９、１１１３４、１１１４７、１１４１２、１１４２６、１１４４３、１１６５９、１１６６６、１１６７７、１１８６３、１１８９０、１１９２７、１１９４７、１２１６３、１２２１８、１２２２３、１２２３５、１２２７９、１２２８２、１２２９７、１２３３１、１３１３６、１３４２３および１３４２８からなる群から選択される遺伝子位置で、挙げられた１以上の標的配列の標的配列の１以上をターゲティングできる(図８に示す)。特にヒトｈｔｔ遺伝子の例示的標的配列は、１０１５０(５’ＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡ  ３’(配列番号１))、１０１４６(５’ＡＵＡＵＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡ  ３’(配列番号２))および１０１２５(５’ＣＵＣＡＧＧＡＵＵＵＡＡＡＡＵ  ３’(配列番号３))の位置で見ることができる。各標的配列のゲノム配列は、例えば、ＮＣＢＩにより維持されている公的に利用可能なデータベースに見ることができる。
【０２２２】
ある例示的態様において、１以上の標的配列で標的配列の１以上をターゲティングできる本発明のＲＮＡサイレンシング剤を、下記表１および図２１に示す(これはまた例示的修飾も含む)。
【０２２３】
【表１】
2018516091.tif 000003
【表２】
2018516091.tif 000004
表１. 本発明のある態様によるさらなる標的配列
【０２２４】
IV. ｓｉＲＮＡ設計
ある態様において、ｓｉＲＮＡは、次のように設計される。まず、標的遺伝子(例えば、ｈｔｔ遺伝子)、例えば、図８に示す標的配列の１以上の部分、例えば、標的遺伝子の５’非翻訳領域から１０１５０、１０１４６および／または１０１２５を選択する。これらの部位でのｍＲＮＡの開裂は、対応する変異体タンパク質の翻訳を排除するはずである。センス鎖を、標的配列に基づき設計した(図８参照)。好ましくは、該部分(および対応するセンス鎖)は、約１９〜２５ヌクレオチド、例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド含む。より好ましくは、該部分(および対応するセンス鎖)は、２１、２２または２３ヌクレオチド含む。しかしながら、当業者は、１９未満のヌクレオチドまたは２５を超えるヌクレオチドの長さを有するｓｉＲＮＡも、ＲＮＡｉの介在に機能できることを認識する。従って、このような長さのｓｉＲＮＡも、ＲＮＡｉに介在する能力を保持する限り、本発明の範囲内である。長いＲＮＡｉ剤は、ある哺乳動物細胞においてインターフェロンまたはＰＫＲ応答を惹起することが示されており、これは望ましくない可能性がある。好ましくは、本発明のＲＮＡｉ剤はＰＫＲ応答を惹起しない(すなわち、十分に短い長さである)。しかしながら、長いＲＮＡｉ剤は、例えば、ＰＲＫ応答を産生できない細胞型またはＰＫＲ応答が代替的に手段により下方制御または減弱されている状況では有用であり得る。
【０２２５】
センス鎖配列を、標的配列が原則的に鎖の中心になるように設計する。標的配列の中心を外れた位置への移動は、ある場合、ｓｉＲＮＡによる開裂の効率を下げ得る。野生型ｍＲＮＡのオフサイレンシングが検出されるならば、このような組成物、すなわち、低効率組成物の使用が望ましいことがある。
【０２２６】
アンチセンス鎖は、通常センス鎖と同じ長さであり、相補的ヌクレオチドを含む。ある態様において、これらの鎖は完全に相補的であり、すなわち、これらの鎖は、整列またはアニールしたとき、平滑末端である。他の態様において、これらの鎖は、１、２、３、４、５、６または７ヌクレオチドオーバーハングが産生されるように、アラインまたはアニールすることを含み、すなわち、センス鎖の３’末端が、アンチセンス鎖の５’末端より１、２、３、４、５、６または７ヌクレオチド伸びおよび／またはアンチセンス鎖の３’末端がセンス鎖の５’末端より１、２、３、４、５、６または７ヌクレオチド延びる。オーバーハングは、標的遺伝子配列(またはその相補体)に対応するヌクレオチドを含む(またはこれからなる)。あるいは、オーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド、例えばｄＴｓまたはヌクレオチドアナログまたは他の適当な非ヌクレオチド物質を含む(またはこれからなる)。
【０２２７】
アンチセンス鎖のＲＩＳＣへのエントリーを促進する(およびそれにより標的開裂およびサイレンシングの効率を増加または改善する)ために、引用によりその内容を全体に本明細書に包含させる、“ＲＮＡサイレンシングの有効性を制御するための方法および組成物”なる表題の米国特許７,４５９,５４７号、７,７７２,２０３号および７,７３２,５９３号(２００３年６月２日出願)および“ＲＮＡｉの有効性および特異性を増強するための方法および組成物”なる表題の米国特許８,３０９,７０４号、７,７５０,１４４号、８,３０４,５３０号、８,３２９,８９２号および８,３０９,７０５号(２００３年６月２日出願)に詳述されるように、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の３’末端の間の塩基対強度を改変、例えば、低下または減少させ得る。本発明のこれらの側面のある態様において、塩基対強度は、第一鎖またはアンチセンス鎖の５’末端と第二鎖またはセンス鎖の３’末端の間のＧ：Ｃ塩基対が、第一鎖またはアンチセンス鎖の３’末端と第二鎖またはセンス鎖の５’末端の間より少ないため、低い。他の態様において、塩基対強度は、第一鎖またはアンチセンス鎖の５’末端と第二鎖またはセンス鎖の３’末端の間の少なくとも一つの不適正塩基対により低い。ある例示的態様において、不適正塩基対は、Ｇ：Ａ、Ｃ：Ａ、Ｃ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ｃ：ＣおよびＵ：Ｕからなる群から選択される。他の態様において、塩基対強度は、第一鎖またはアンチセンス鎖の５’末端と第二鎖またはセンス鎖の３’末端の間の少なくとも一つの揺らぎ塩基対、例えば、Ｇ：Ｕにより低い。他の態様において、塩基対強度は、希ヌクレオチド、例えば、イノシン(Ｉ)を含む少なくとも一つの塩基対により低い。ある例示的態様において、塩基対は、Ｉ：Ａ、Ｉ：ＵおよびＩ：Ｃからなる群から選択される。さらに他の態様において、塩基対強度は、修飾ヌクレオチドを含む少なくとも一つの塩基対により低い。ある例示的態様において、修飾ヌクレオチドは、２−アミノ−Ｇ、２−アミノ−Ａ、２,６−ジアミノ−Ｇおよび２,６−ジアミノ−Ａからなる群から選択される。
【０２２８】
図８に示すｈｔｔ標的配列のターゲティングに適当なｓｉＲＮＡの設計を、下に詳細に記載する。ｓｉＲＮＡは、ｈｔｔ遺伝子に見られるあらゆる他の標的配列に対して、上記例示的教示に従い設計され得る。さらに、本テクノロジーは、あらゆる他の標的配列、例えば、非病因標的配列のターゲティングに適用可能である。
【０２２９】
ｓｉＲＮＡがｍＲＮＡ(例えば、ハンチンチンｍＲＮＡ)を破壊する有効性を評価するために、ショウジョウバエベースのインビトロｍＲＮＡ発現系でｓｉＲＮＡをｃＤＮＡ(例えば、ハンチンチンｃＤＮＡ)とインキュベートさせ得る。３２Ｐで放射標識された新たに合成されたｍＲＮＡ(例えば、ハンチンチンｍＲＮＡ)を、アガロースゲル上でオートラジオグラフィーにより検出する。開裂ｍＲＮＡの存在が、ｍＲＮＡヌクレアーゼ活性を示す。適当な対照は、ｓｉＲＮＡの省略を含む。あるいは、選択ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を有するが、適切な標的遺伝子に顕著な配列相補性がない対照ｓｉＲＮＡを選択する。このような陰性対照を、選択ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を無作為に混合することにより設計できる；相同性サーチを、陰性対照が適切なゲノムにおける何らかの他の遺伝子との相同性を欠くことを確実にするために実施できる。さらに、陰性対照ｓｉＲＮＡを、配列に１以上の塩基ミスマッチを導入することにより設計できる。
【０２３０】
最適ｍＲＮＡ特異性および最大ｍＲＮＡ開裂を生じるｓｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ相補性の部位を選択する。
【０２３１】
本発明は、主に拡張ＣＡＧ領域変異と異なる遺伝子の特異的標的配列(例えば、ｈｔｔにおける)のターゲティングに注目するが、変異体領域のターゲティングがある状況においては治療戦略として適用性を有し得ることを当業者は認識する。変異体領域のターゲティングは、ＣＡＧを直列で補完するｓｉＲＮＡを使用して達成できる。ｓｉＲＮＡｃａｇは、ＣＡＧ相補性でｍＲＮＡに結合するが、拡張されたＣＡＧ系列に結合する機会が多いことが予測される。複数ｓｉＲＮＡｃａｇが、変異体ハンチンチンｍＲＮＡに結合する(野生型ハンチンチンｍＲＮＡに対して少ないのと逆に)；それにより、変異体ハンチンチンｍＲＮＡが開裂される可能性が高い。この方法を使用したｍＲＮＡ不活性化の成功はまた正常または野生型ハンチンチンｍＲＮＡも排除する。また、ＣＡＧ反復を同様に有する他の正常遺伝子(約７０)を、そのｍＲＮＡがｓｉＲＮＡと相互作用するならば、少なくともある程度、不活性化する。この方法は、それ故に、消耗戦略に依存する  −  すなわち、野生型ハンチンチンｍＲＮＡまたはポリグルタミンをコードする他の約６９  ｍＲＮＡよりも多くの変異体ハンチンチンｍＲＮＡが破壊される。
【０２３２】
Ｖ. ＲＮＡｉ剤
本発明は、例えば、上記のとおりに設計された、ｓｉＲＮＡ分子を含む。本発明のｓｉＲＮＡ分子は化学的に合成できまたはインビトロでＤＮＡ鋳型からまたはインビボで例えば、ｓｈＲＮＡからまたはインビトロ転写ｄｓＲＮＡ鋳型を２０、２１または２３bp二本鎖ＲＮＡ介在ＲＮＡｉのプールに開裂するための組み換えヒトダイサー(DICER)酵素の使用により、転写され得る。ｓｉＲＮＡ分子を、当分野で知られる任意の方法を使用して設計できる。
【０２３３】
ある側面において、干渉リボ核酸としてのＲＮＡｉ剤、例えば、上記のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの代わりに、ＲＮＡｉ剤は、干渉リボ核酸、例えば、上記のｓｈＲＮＡをコードすることができる。換言すると、ＲＮＡｉ剤は、干渉リボ核酸の転写鋳型であり得る。それ故に、本発明のＲＮＡｉ剤はまた小ヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)およびｓｈＲＮＡを発現するために改変された発現構築物も含み得る。ｓｈＲＮＡの転写はポリメラーゼIII(ｐｏｌ  III)プロモーターで開始され、４−５−チミン転写終結部位の２位で停止すると考えられる。発現により、ｓｈＲＮＡは、３’ＵＵ−オーバーハングを伴うステムループ構造に折りたたまれると考えられる；その後これらのｓｈＲＮＡの末端が処理され、ｓｈＲＮＡが約２１〜２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ様分子に変換される(Brummelkamp et al., 2002; Lee et al., 2002, Supra; Miyagishi et al., 2002; Paddison et al., 2002, supra; Paul et al., 2002, supra; Sui et al., 2002 supra; Yu et al., 2002, supra)。ｓｈＲＮＡ設計および使用に関するさらなる情報は、インターネットで次のアドレスで見ることができる（katandin.cshl.org:9331/RNAi/docs/BseRI-BamHI_Strategy.pdf and katandin.cshl.org:9331/RNAi/docs/Web_version_of_PCR_strategy1.pdf)。
【０２３４】
本発明の発現構築物は、適切な発現系における使用に適するあらゆる構築物を含み、当分野で知られるように、レトロウイルスベクター、直線状発現カセット、プラスミドおよびウイルスまたはウイルス由来ベクターを含むが、これらに限定されない。このような発現構築物は、誘導性プロモーター、Ｕ６  ｓｎＲＮＡプロモーターまたはＨ１  ＲＮＡポリメラーゼIIIプロモーターのようなＲＮＡ  Ｐｏｌ  IIIプロモーター系または当分野で知られる他のプロモーターの１以上を含み得る。構築物は、ｓｉＲＮＡの一鎖または両鎖を含み得る。両鎖を発言する発現構築物はまた両鎖を連結するループ構造も含んでよくまたは各鎖は、同じ構築物内の別のプロモーターから別々に転写され得る。各鎖はまた別の発現構築物から転写され得る(Tuschl, T., 2002, Supra)。
【０２３５】
合成ｓｉＲＮＡは、カチオン性リポソームトランスフェクションおよびエレクトロポレーションを含む、当分野で知られる方法により細胞に送達できる。標的遺伝子(すなわち、ｈｔｔ遺伝子)の長期抑制を得るためおよびある状況下での送達を促進するために、１以上のｓｉＲＮＡを、組み換えＤＮＡ構築物から細胞内で発現させ得る。細胞における長期標的遺伝子抑制を可能とするために組み換えＤＮＡ構築物から細胞内でｓｉＲＮＡ二本鎖を発現するこのような方法は当分野で知られ、機能的二本鎖ｓｉＲＮＡの発現が可能な哺乳動物Ｐｏｌ  IIIプロモーター系を含む(例えば、Ｈ１またはＵ６／ｓｎＲＮＡプロモーター系(Tuschl, T., 2002, supra)；(Bagella et al., 1998; Lee et al., 2002, supra; Miyagishi et al., 2002, supra; Paul et al., 2002, supra; Yu et al., 2002), supra; Sui et al., 2002, supra)。ＲＮＡ  Ｐｏｌ  IIIによる転写終結は、ＤＮＡ鋳型における４連続的Ｔ残基のランで生じ、ｓｉＲＮＡトランスクリプトが特異的配列で末端する機序を提供する。ｓｉＲＮＡは、５’−３’および３’−５’配向で標的遺伝子の配列に相補的であり、ｓｉＲＮＡの２鎖は同じ構築物にまたは別の構築物に発現させ得る。Ｈ１またはＵ６  ｓｎＲＮＡプロモーターにより駆動され、細胞で発現するヘアピンｓｉＲＮＡは、標的遺伝子発現を阻害できる(Bagella et al., 1998; Lee et al., 2002, supra; Miyagishi et al., 2002, supra; Paul et al., 2002, supra; Yu et al., 2002), supra; Sui et al., 2002, supra)。Ｔ７プロモーター制御下にｓｉＲＮＡ配列を含む構築物も、細胞にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するベクターと共トランスフェクトしたとき、機能的ｓｉＲＮＡを作る(Jacque et al., 2002, supra)。単一構築物は、同じ遺伝子または複数遺伝子をターゲティングする、遺伝子コード化ｈｔｔの複数領域のようなｓｉＲＮＡのための複数配列コーディングを含んでよく、例えば、別のＰｏｌIIIプロモーター部位により駆動され得る。
【０２３６】
動物細胞は、動物発育中に転写後または翻訳後レベルで遺伝子発現を制御できる、マイクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ)と呼ばれる約２２ヌクレオチドの様々な非コーディングＲＮＡを発現する。ｍｉＲＮＡの一つの共通する特色は、恐らく、ダイサー、ＲＮａｓｅ  III型酵素またはそのホモログにより、全て、約７０ヌクレオチド前駆体ＲＮＡステムループから切り取られることである。ｍｉＲＮＡ前駆体のステム配列を、標的ｍＲＮＡに相補的な配列に変えることにより、改変前駆体を発現するベクター構築物を、哺乳動物細胞における特異的ｍＲＮＡ標的に対するＲＮＡｉを開始するためのｓｉＲＮＡの産生に使用できる(Zeng et al., 2002, supra)。ポリメラーゼIIIプロモーターを含むＤＮＡベクターから発現されたとき、マイクロＲＮＡ設計ヘアピンは、遺伝子発現をサイレンスできる(McManus et al., 2002, supra)。多型をターゲティングするマイクロＲＮＡも、ｓｉＲＮＡ介在遺伝子−サイレンシング非存在下で、変異体タンパク質の翻訳の遮断に有用であり得る。このような適用は、例えば、設計ｓｉＲＮＡが、野生型タンパク質の標的外サイレンシングを引き起こす状況で有用であり得る。
【０２３７】
ウイルス介在送達機序はまた、例えば、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  IIプロモーター転写下にｓｉＲＮＡを担持する組み換えアデノウイルスの産生により、ｓｉＲＮＡの発現を介する標的遺伝子の特異的サイレンシングの誘発にも使用できる(Xia et al., 2002, supra)。これらの組み換えアデノウイルスによるＨｅＬａ細胞の感染は、内在性標的遺伝子発現低減を可能にする。組み換えアデノウイルスベクターの、ｓｉＲＮＡの標的遺伝子を発現するトランスジェニックマウスへの注射は、インビボでの標的遺伝子発現の減少をもたらす。Ｉｄ。動物モデルにおいて、全胚エレクトロポレーションは、着床後マウス胚へ合成ｓｉＲＮＡを効率的に送達できる(Calegari et al., 2002)。成体マウスにおいて、ｓｉＲＮＡの効率的送達は、動物に尾静脈から大量のｓｉＲＮＡ含有溶液を急速注射(５秒以内)する、“高圧”送達技術により達成できる(Liu et al., 1999, supra; McCaffrey et al., 2002, supra; Lewis et al., 2002)。ナノ粒子およびリポソームも、動物へのｓｉＲＮＡ送達に使用できる。ある例示的態様において、組み換えアデノ随伴ウイルス(ｒＡＡＶ)およびその関連ベクターを、１以上のｓｉＲＮＡの細胞、例えば、神経系細胞(例えば、脳細胞)への送達に使用できる(ＵＳ特許出願２０１４／０２９６４８６号、２０１０／０１８６１０３号、２００８／０２６９１４９号、２００６／００７８５４２号および２００５／０２２０７６６号)。
【０２３８】
本発明の核酸組成物は、非修飾ｓｉＲＮＡおよび架橋ｓｉＲＮＡ誘導体または例えば３’末端または５’末端に結合した非ヌクレオチド部分を有する誘導体のような修飾ｓｉＲＮＡの両方を含む。ｓｉＲＮＡ誘導体のこの方法での修飾は、対応するｓｉＲＮＡと比較して、得られたｓｉＲＮＡ誘導体の細胞の取り込みを改善するかまたは細胞ターゲティング活性を増強でき、細胞におけるｓｉＲＮＡ誘導体のトレーシングに有用でありまたは対応するｓｉＲＮＡと比較してｓｉＲＮＡ誘導体の安定性を改善する。
【０２３９】
ここに記載するとおり細胞または生物全体に導入された改変ＲＮＡ前駆体は、所望のｓｉＲＮＡ分子の産生をもたらす。このようなｓｉＲＮＡ分子は、次いで、ＲＮＡｉ経路の内在性タンパク質成分と結合し、特異的ｍＲＮＡ配列と結合し、開裂および破壊のための標的とする。この方法で、改変ＲＮＡ前駆体から産生されたｓｉＲＮＡにより標的化されるｍＲＮＡは、細胞または生物で枯渇し、細胞または生物におけるそのｍＲＮＡによりコードされるタンパク質濃度の低下に至る。ＲＮＡ前駆体は、一般にｄｓＲＮＡのいずれか一鎖を個々にコードするまたはＲＮＡヘアピンループ構造のヌクレオチド配列全体をコードする核酸分子である。
【０２４０】
本発明の核酸組成物は、コンジュゲートされていなくても、組成物の性質、例えば、吸収、有効性、バイオアベイラビリティおよび／または半減期のような薬物動態パラメータを増強するため、ナノ粒子のような他の部分とコンジュゲートされていてもよい。コンジュゲーションは、当分野で知られる方法により、例えば、Lambert et al., Drug Deliv. Rev.: 47(1), 99-112 (2001)(ポリアルキルシアノアクリレート(ＰＡＣＡ)ナノ粒子に充填された核酸を記載する)；Fattal et al., J. Control Release 53(1-3):137-43 (1998)(ナノ粒子に結合した核酸を記載する)；Schwab et al., Ann. Oncol. 5 Suppl. 4:55-8 (1994)(挿入剤、疎水性基、ポリカチオンまたはＰＡＣＡナノ粒子に連結した核酸を記載する)；およびGodard et al., Eur. J. Biochem. 232(2):404-10 (1995)(ナノ粒子に連結した核酸を記載する)の方法を使用して、達成できる。
【０２４１】
本発明の核酸分子を、当分野で知られる任意の方法を使用して標識もできる。例えば、核酸組成物をフルオロフォア、例えば、Ｃｙ３、フルオレセインまたはローダミンで標識できる。標識はキット、例えば、ＳＩＬＥＮＣＥＲＴＭ  ｓｉＲＮＡ標識キット(Ambion)を使用して実施できる。さらに、ｓｉＲＮＡを、例えば、３Ｈ、３２Ｐまたは他の適切な同位体を使用して、放射標識してよい。
【０２４２】
さらに、ＲＮＡｉが少なくとも一つの一本鎖ＲＮＡ中間物を経て進行すると考えられるため、当業者は、ｓｓ−ｓｉＲＮＡ(例えば、ｄｓ−ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖)も(例えば、化学的合成のために)設計し、ここに記載するように産生(例えば、酵素的に産生)または発現(例えば、ベクターまたはプラスミドから)させ、本願方法論に従い使用できる。さらに、無脊椎動物において、ＲＮＡｉは、ＲＮＡｉのエフェクターとして作用する長ｄｓＲＮＡ(例えば、ｄｓＲＮＡ約１００〜１０００ヌクレオチド長、好ましくは約２００〜５００、例えば、約２５０、３００、３５０、４００または４５０ヌクレオチド長)により効果的に誘発され得る(Brondani et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2001 Dec. 4; 98(25):14428-33. Epub 2001 Nov. 27.)。
【０２４３】
VI. 抗Ｈｔｔ  ＲＮＡサイレンシング剤
本発明は、抗ハンチンチンＲＮＡサイレンシング剤(例えば、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ)、該ＲＮＡサイレンシング剤を製造する方法およびハンチンチンタンパク質(例えば、変異体ハンチンチンタンパク質)のＲＮＡサイレンシングのための該改善されたＲＮＡサイレンシング剤(またはその一部)の使用のための方法(例えば、研究および／または治療方法)に関する。ＲＮＡサイレンシング剤はアンチセンス鎖(またはその一部)を含み、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ介在サイレンシング機序(例えばＲＮＡｉ)に介在するのに十分な相補性をヘテロ接合一塩基多型に対して有する。
【０２４４】
ある態様において、次の性質の一つまたは任意の組み合わせを有するｓｉＲＮＡ化合物が提供される：(１)完全化学的安定化(すなわち、非修飾２’−ＯＨ残基なし)； (２)非対称；(３)１１〜１６塩基対二本鎖；(４)化学修飾ヌクレオチドの交互パターン(例えば、２’−フルオロおよび２’−メトキシ修飾)；および(５)５〜８塩基の一本鎖、完全ホスホロチオエート化テイル。ホスホロチオエート修飾の数は重要である。この数は、種々の態様で計６〜１７で変わり得る。
【０２４５】
ある態様において、ここに記載するｓｉＲＮＡ化合物を、コレステロール、ＤＨＡ、フェニルトロパン、コルチゾール、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ＧａｌＮａｃおよびガングリオジドを含むが、これらに限定されない種々のターゲティング剤にコンジュゲートできる。コレステロール修飾型は、広範な細胞型(例えば、ＨｅＬａ、ニューロン、肝細胞、栄養芽細胞)で、先に使用した化学的安定化パターン(例えば、ピリミジンではなく、全プリンを修飾)に対してインビトロで有効性の５〜１０倍改善を示す。
【０２４６】
本明細書中に記載する構造的性質を有するある本発明の化合物は、“ｈｓｉＲＮＡ−ＡＳＰ”(高度安定化パターンを特徴する、疎水性修飾、低分子干渉ＲＮＡ)と称し得る。さらに、このｈｓｉＲＮＡ−ＡＳＰパターンは、脳、脊髄にわたる分布、肝臓、胎盤、腎臓、脾臓およびいくつかの他の組織への送達の劇的改善を示し、それらを治療介入に利用可能とする。
【０２４７】
肝臓において、ｈｓｉＲＮＡ−ＡＳＰは特異的に内皮およびクッパー細胞に送達されるが、肝細胞にされず、この化学的修飾パターンを、ＧａｌＮａｃコンジュゲートに対する競合的テクノロジーではなく、むしろ補完的とする。
【０２４８】
本発明の化合物は、次の側面および態様において説明され得る。
【０２４９】
第一の側面において、ここに提供されるのは少なくとも１６連続ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドは５’末端、３’末端および標的に対する相補性を有し、ここで、(１)オリゴヌクレオチドは交互の２’−メトキシ−リボヌクレオチドおよび２’−フルオロ−リボヌクレオチドを含み；(２)５’末端から２位および１４位のヌクレオチドは２’−メトキシ−リボヌクレオチドではなく；(３)ヌクレオチドはホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合により結合し；そして(４)３’末端から１〜６位または３’末端から１〜７位のヌクレオチドはホスホロチオエート結合により隣接ヌクレオチドと結合する。
【０２５０】
第二の側面において、ここに提供されるのは第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドを含む二本鎖、化学修飾核酸であり、ここで、(１)第一オリゴヌクレオチドはここに記載するオリゴヌクレオチドである(例えば、配列番号１、２、３または４を含む)；(２)第一オリゴヌクレオチドの一部は第二オリゴヌクレオチドの一部と相補的であり；(３)第二オリゴヌクレオチドは交互の２’−メトキシ−リボヌクレオチド２’−フルオロ−リボヌクレオチドを含み；(４)第二オリゴヌクレオチドの３’末端から２位および１４位のヌクレオチドは２’−メトキシ−リボヌクレオチドであり；および(５)第二オリゴヌクレオチドのヌクレオチドはホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合により結合する。
【０２５１】
第三の側面において、ここに提供されるのは、構造
Ｘ−Ａ(−Ｌ−Ｂ−Ｌ−Ａ)ｊ(−Ｓ−Ｂ−Ｓ−Ａ)ｒ(−Ｓ−Ｂ)ｔ−ＯＲ
〔式中、Ｘは５’リン酸基であり；Ａは、各々独立して２’−メトキシ−リボヌクレオチドであり；Ｂは、各々独立して２’−フルオロ−リボヌクレオチドであり；Ｌは、各々独立してホスホジエステルまたはホスホロチオエートリンカーであり；Ｓはホスホロチオエートリンカーでわり；Ｒは水素およびキャッピング基(例えば、アセチルのようなアシル)から選択され；ｊは４、５、６または７であり；ｒは２または３であり；ｔは０または１である。〕
を有するオリゴヌクレオチドである。
【０２５２】
第四の側面において、ここに提供されるのは第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドを含む二本鎖、化学修飾核酸であり、ここで、(１)第一オリゴヌクレオチドは第三の側面のオリゴヌクレオチドから選択され；(２)第一オリゴヌクレオチドの一部は第二オリゴヌクレオチドの一部と相補的であり；(３)第二オリゴヌクレオチドは構造
Ｃ−Ｌ−Ｂ(−Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｂ)ｍ’(−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｂ)ｎ’(−Ｐ−Ａ−Ｓ−Ｂ)ｑ’(−Ｓ−Ａ)ｒ’(−Ｓ−Ｂ)ｔ’−ＯＲ
〔式中、Ｃは疎水性分子であり；Ａは各々独立して２’−メトキシ−リボヌクレオチドであり；Ｂは、各々独立して２’−フルオロ−リボヌクレオチドであり；Ｌはエチレングリコール、ホスホジエステルおよびホスホロチオエートの０〜４反復単位からなる群から選択される１以上の部分を含むリンカーであり；Ｓはホスホロチオエートリンカーであり；Ｐはホスホジエステルリンカーであり；Ｒは水素およびキャッピング基(例えば、アセチルのようなアシル)から選択され；ｍ’は０または１であり；ｎ’は４、５または６であり；ｑ’は０または１であり；ｒ’は０または１であり；ｔ’は０または１である。〕
を有する。
【０２５３】
ａ)抗Ｈｔｔ  ｓｉＲＮＡ分子の設計
本発明のｓｉＲＮＡ分子は、センス鎖および相補的アンチセンス鎖からなる二本鎖であり、アンチセンス鎖は、ｈｔｔ  ｍＲＮＡに対してＲＮＡｉに介在するのに十分な相補性を有する。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は約１０〜５０以上のヌクレオチドの長さであり、すなわち、各鎖は１０〜５０ヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)を含む。より好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は各鎖で約１６〜３０、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドの長さを有し、ここで、鎖の一方は、標的領域に十分に相補性である。好ましくは、これらの鎖を、これらの鎖をアニールしたとき、二本鎖の一端または両端に１、２または３残基のオーバーハングが生じるように、鎖の末端に整列しない(すなわち、相補的塩基が反対の鎖に存在しない)少なくとも１、２または３塩基があるように、整列させる。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は約１０〜５０以上のヌクレオチドの長さを有し、すなわち、各鎖は１０〜５０ヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)含む。より好ましくは、ｓｉＲＮＡ分は、各鎖約１６〜３０、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドの長さを有し、ここで、鎖の一方は標的配列に実質的に相補性であり、他方の鎖は、第一鎖と同一または実質的に同一である。
【０２５４】
一般に、ｓｉＲＮＡは、当分野で知られる任意の方法、例えば、次のプロトコールを使用して設計され得る。
【０２５５】
１. ｓｉＲＮＡは、標的配列、例えば、図８に示す標的配列に特異的でなければならない。ある態様において、標的配列は変異体ハンチンチン(ｈｔｔ)アレルに見られるが、野生型ハンチンチンアレルには見られない。他の態様において、標的配列は、変異体ハンチンチン(ｈｔｔ)アレルおよび野生型ハンチンチンアレル両者に見られる。他の態様において、標的配列は野生型ハンチンチンアレルに見られる。第一鎖は、標的配列に相補的でなければならず、他方の鎖は第一鎖に実質的に相補性である(センス鎖およびアンチセンス鎖の例について図８参照)。ある態様において、標的配列は、変異体ハンチンチン(ｈｔｔ)アレルの拡張ＣＡＧ反復の外側である。他の態様において、標的配列は、標的遺伝子のコーディング領域の外側である。標的配列例は、標的遺伝子の５’非翻訳領域(５’−ＵＴＲ)から選択される。これらの部位でのｍＲＮＡの開裂は、対応する変異体タンパク質の翻訳を排除すべきである。ｈｔｔ遺伝子の他の領域からの標的配列もターゲティングに適する。センス鎖は、標的配列に基づき設計される。さらに、低Ｇ／Ｃ含量(３５〜５５％)のｓｉＲＮＡは、５５％より高いＧ／Ｃ含量のものより活性であり得る。このようにして、ある態様において、本発明は、３５〜５５％Ｇ／Ｃ含量を有する核酸分子を含む。
【０２５６】
２. ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、選択標的部位の配列に基づき設計される。好ましくは、センス鎖は約１９〜２５ヌクレオチド、例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドを含む。より好ましくは、センス鎖は、２１、２２または２３ヌクレオチドを含む。しかしながら、当業者は、１９未満のヌクレオチドまたは２５を超えるヌクレオチドの長さを有するｓｉＲＮＡも、ＲＮＡｉの介在に機能できることを認識する。従って、このような長さのｓｉＲＮＡも、ＲＮＡｉに介在する能力を保持する限り、本発明の範囲内である。長いＲＮＡｉ剤は、ある哺乳動物細胞においてインターフェロンまたはＰＫＲ応答を惹起することが示されており、これは望ましくない可能性がある。好ましくは、本発明のＲＮＡｉ剤はＰＫＲ応答を惹起しない(すなわち、十分に短い長さである)。しかしながら、長いＲＮＡｉ剤は、例えば、ＰＲＫ応答を産生できない細胞型またはＰＫＲ応答が代替的に手段により下方制御または減弱されている状況では有用であり得る。
【０２５７】
本発明のｓｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡがＲＮＡｉに介在できるように、標的配列と十分な相補性を有する。一般に、標的遺伝子のＲＩＳＣ介在開裂を行うために標的遺伝子の標的配列部分と十分に同一であるヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡが好ましい。従って、好ましい態様において、ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、標的の一部と十分に同一である配列を有するように設計される。例えば、センス鎖は、標的部位と１００％同一性を有し得る。しかしながら、１００％同一性は必要ではない。センス鎖と標的ＲＮＡ配列の間の８０％を超える同一性、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性が好ましい。本発明は、ＲＮＡｉの効率および特異性を増強するために、ある配列多様性に耐容性であるという利点を有する。ある態様において、センス鎖は、野生型と変異体アレルが少なくとも一つの塩基対により異なる標的領域、例えば、機能獲得型変異を含む標的領域のように、標的領域と４、３、２、１または０不適正ヌクレオチドを有し、他方の鎖は、第一鎖と同一または実質的に同一である。さらに、１または２ヌクレオチドの小挿入または欠失を有するｓｉＲＮＡ配列も、ＲＮＡｉ介在に有効であり得る。あるいは、ヌクレオチドアナログ置換または挿入を有するｓｉＲＮＡ配列は、阻害に有効であり得る。
【０２５８】
配列同一性を、当分野で知られる配列比較およびアライメントアルゴリズムにより決定し得る。２核酸配列(または２アミノ酸配列)の同一性パーセントを決定するために、配列を、最適比較目的で整列させる(例えば、最適アライメントのためにギャップを第一配列または第二配列に挿入し得る)。対応するヌクレオチド(またはアミノ酸)位置のヌクレオチド(またはアミノ酸残基)を続いて比較する。第一配列におけるある位置が、第二配列における対応する位置と同じ残基で占拠されているならば、これら分子はその位置で同一である。２配列間の同一性パーセントは、配列により共有される同一位置の数の関数であり(すなわち、相同性％＝同一位置の数／位置の総数×１００)、所望によりスコアを挿入したギャップ数および／または挿入したギャップの長さのペナルティに付す。
【０２５９】
２配列間の配列比較および同一性パーセント決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成できる。ある態様において、アライメントを、十分な同一性を有する整列配列のある部分にわたり作製するが、低同一性度を有する部分にはしない(すなわち、局所アライメント)。配列の比較のために利用する局所アライメントアルゴリズムの好ましい、非限定的例は、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77におけるように修飾された、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、BLASTプログラム(version 2.0)に組み込まれる(Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10)。
【０２６０】
他の態様において、アライメントを適切なギャップの挿入により最適化し、同一性パーセントを整列配列の長さにわたり決定する(すなわち、ギャップ付アライメント)。比較目的のためのギャップ付アライメントを得るには、ギャップ付ＢＬＡＳＴを利用できる（Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402)。他の態様において、アライメントを適切なギャップの挿入により最適化し、同一性パーセントを配列整列の全長にわたり決定する(すなわち、網羅的アライメント)。配列の網羅的比較に利用する数学的アルゴリズムの好ましい、非限定的例は、Myers and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(version 2.0)に組み込まれる。アミノ酸配列比較のためにＡＬＩＧＮプログラムを使用するとき、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用できる。
【０２６１】
３. ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖またはガイド鎖は、日常的にセンス鎖と同じ長さであり、相補的ヌクレオチドを含む。ある態様において、ガイド鎖およびセンス鎖は、完全相補的であり、すなわち、これら鎖は、整列またはアニールしたとき平滑末端である。他の態様において、ｓｉＲＮＡの鎖は、１〜７(例えば、２、３、４、５、６または７)または１〜４、例えば、２、３または４ヌクレオチドの３’オーバーハングを有するような方法で対合できる。オーバーハングは、標的遺伝子配列(またはその相補体)に対応するヌクレオチドを含む(またはこれからなる)ことができる。あるいは、オーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド、例えばｄＴｓまたはヌクレオチドアナログまたは他の適当な非ヌクレオチド物質を含む(またはこれからなる)ことができる。こうして、他の態様において、核酸分子は、ＴＴのような２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有し得る。オーバーハングヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。上記のとおり、変異体：野生型ミスマッチがプリン：プリンミスマッチである、標的領域を選択するのが望ましい。
【０２６２】
４. 当分野で知られる任意の方法を使用して、潜在的標的を適切なゲノムデータベース(ヒト、マウス、ラットなど)と比較し、他のコーディング配列と顕著な相同性を有するあらゆる標的配列を考慮から外す。このような配列相同性サーチのための一つのこのような方法が、ＢＬＡＳＴとして知られ、これは、National Center for Biotechnology Information websiteで利用可能である。
【０２６３】
５.評価基準に合う１以上の配列の選択。
【０２６４】
ｓｉＲＮＡの設計および使用に関するさらなる一般的情報は、The Max-Plank-Institut fur Biophysikalishe Chemie websiteで利用可能な“The siRNA User Guide”に見ることができる。
【０２６５】
あるいは、ｓｉＲＮＡを、標的配列(例えば、４００mM  ＮａＣｌ、４０mM  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６.４、１mM  ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間ハイブリダイゼーションし、続いて洗浄)とハイブリダイズできるヌクレオチド配列(またはオリゴヌクレオチド配列)として機能的に定義してよい。さらなる好ましいハイブリダイゼーション条件は、１×ＳＳＣ中７０℃または１×ＳＳＣ中５０℃、５０％ホルムアミドでのハイブリダイゼーション、続く、０.３×ＳＳＣ中７０℃での洗浄または４×ＳＳＣ中７０℃または４×ＳＳＣ中５０℃、５０％ホルムアミドでのハイブリダイゼーション、続く、１×ＳＳＣ中６７℃での洗浄を含む。５０塩基対長未満であると推定されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融点(Ｔｍ)より５〜１０℃低くなければならず、ここで、Ｔｍは、次の式に従い決定する。１８塩基対長未満のハイブリッドについて、Ｔｍ(℃)＝２(Ａ＋Ｔ塩基数)＋４(Ｇ＋Ｃ塩基数)。１８〜４９塩基対長のハイブリッドについて、Ｔｍ(℃)＝８１.５＋１６.６(ｌｏｇ１０[Ｎａ＋])＋０.４１(％Ｇ＋Ｃ)−(６００／Ｎ)であり、ここで、Ｎはハイブリッドにおける塩基数であり、[Ｎａ＋]はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である(１×ＳＳＣの[Ｎａ＋]＝０.１６５Ｍ)。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件のさらなる例(Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11およびCurrent Protocols in Molecular Biology, 1995, F. M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4)は、引用により本明細書に包含させる。
【０２６６】
陰性対照ｓｉＲＮＡは、選択ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を有するが、適切なゲノムと顕著な配列相補性はないべきである。このような陰性対照を、選択ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を無作為に混合することにより設計できる。相同性サーチを、陰性対照が適切なゲノムにおける何らかの他の遺伝子との相同性を欠くことを確実にするために実施できる。さらに、陰性対照ｓｉＲＮＡを、配列に１以上の塩基ミスマッチを導入することにより設計できる。
【０２６７】
６. ｓｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡ(例えば、野生型または変異体ハンチンチンｍＲＮＡ)を破壊する効果を評価するために、ショウジョウバエベースのインビトロｍＲＮＡ発現系でｓｉＲＮＡをｃＤＮＡ(例えば、ハンチンチンｃＤＮＡ)とインキュベートさせ得る。３２Ｐで放射標識された新たに合成されたｍＲＮＡ(例えば、ハンチンチンｍＲＮＡ)を、アガロースゲル上でオートラジオグラフィーにより検出する。開裂ｍＲＮＡの存在が、ｍＲＮＡヌクレアーゼ活性を示す。適当な対照は、ｓｉＲＮＡの省略および非標的ｃＤＮＡの使用を含む。あるいは、選択ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を有するが、適切な標的遺伝子に顕著な配列相補性がない対照ｓｉＲＮＡを選択する。このような陰性対照を、選択ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を無作為に混合することにより設計できる。相同性サーチを、陰性対照が適切なゲノムにおける何らかの他の遺伝子との相同性を欠くことを確実にするために実施できる。さらに、陰性対照ｓｉＲＮＡを、配列に１以上の塩基ミスマッチを導入することにより設計できる。
【０２６８】
抗ｈｔｔ  ｓｉＲＮＡを、上記標的配列のいずれかを標的とするように設計できる。該ｓｉＲＮＡは、標的配列のサイレンシングに介在するのに標的配列と十分に相補的であるアンチセンス鎖を含む。ある態様において、ＲＮＡサイレンシング剤はｓｉＲＮＡである。
【０２６９】
ある態様において、ｓｉＲＮＡは、図８に示す配列を含むセンス鎖および図８に示す配列を含むアンチセンス鎖を含む。
【０２７０】
最適ｍＲＮＡ特異性および最大ｍＲＮＡ開裂を生じるｓｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ相補性の部位を選択する。
【０２７１】
ｂ)  ｓｉＲＮＡ様分子
本発明のｓｉＲＮＡ様分子は、ＲＮＡｉまたは翻訳抑制により遺伝子サイレンシングを指示するためにｍＲＮＡの標的配列と“十分に相補的”である配列を有する(すなわち、配列を有する鎖を有する)。ｓｉＲＮＡ様分子はｓｉＲＮＡ分子に準じて設計されるが、センス鎖と標的ＲＮＡの間の配列同一性の程度はｍｉＲＮＡとその標的の間で観察されるものに近似する。一般に、ｍｉＲＮＡ配列と対応する標的遺伝子配列の間の配列同一性の程度が下がるに連れて、ＲＮＡｉではなく翻訳抑制により転写後遺伝子サイレンシングに介在する傾向が高まる。それ故に、代替的態様において、標的遺伝子の翻訳抑制による転写後遺伝子サイレンシングが望まれるとき、ｍｉＲＮＡ配列は、標的遺伝子配列と部分的相補性を有する。ある態様において、ｍｉＲＮＡ配列は、標的ｍＲＮＡに分散している１以上の短配列(相補性部位)と部分的相補性を有する(例えば標的ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ内)(Hutvagner and Zamore, Science, 2002; Zeng et al., Mol. Cell, 2002; Zeng et al., RNA, 2003; Doench et al., Genes & Dev., 2003)。翻訳抑制の機序が協調的であるとき、複数相補性部位(例えば、２、３、４、５または６)がある態様において標的とされ得る。
【０２７２】
ｓｉＲＮＡ様二本鎖がＲＮＡｉまたは翻訳抑制に介在する能力は、相補性の部位での標的遺伝子配列とサイレンシング剤のヌクレオチド配列の間の非同一ヌクレオチドの分布により予測され得る。ある態様において、翻訳抑制による遺伝子サイレンシングが望まれるとき、ｍｉＲＮＡガイド鎖と標的ｍＲＮＡにより形成される二本鎖が中央“隆起”を含むように、少なくとも一つの非同一ヌクレオチドが相補性部位の中央部分に存在する(Doench J G et al., Genes & Dev., 2003)。他の態様において、２、３、４、５または６連続的または非連続的非同一ヌクレオチドが導入される。非同一ヌクレオチドを、揺らぎ塩基対(例えば、Ｇ：Ｕ)または不適正塩基対(Ｇ：Ａ、Ｃ：Ａ、Ｃ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ｃ：Ｃ、Ｕ：Ｕ)を形成するように選択し得る。さらに好ましい態様において、“隆起”は、ｍｉＲＮＡ分子の５’末端のヌクレオチド１２位および１３位に集中させる。
【０２７３】
ｃ)  低分子ヘアピン型ＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)分子
ある特徴的態様において、本発明は、増強された選択性でｈｔｔ標的配列のＲＮＡサイレンシングに介在できるｓｈＲＮＡを提供する。ｓｉＲＮＡとは対照的に、ｓｈＲＮＡはマイクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ)の天然前駆体を模倣し、遺伝子サイレンシング経路の最初の部分で介入する。この理由のため、ｓｈＲＮＡは、天然遺伝子サイレンシング経路全体を通して供給されることにより、遺伝子サイレンシングにより効率的に介在すると考えられる。
【０２７４】
ｍｉＲＮＡは、植物および動物発育中に転写後または翻訳後レベルで遺伝子発現を制御できる、約２２ヌクレオチドの非コーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡの一つの共通する特色は、恐らく、ダイサー、ＲＮａｓｅ  III型酵素またはそのホモログにより、全て、約７０ヌクレオチド前駆体ＲＮＡステムループから切り取られることである。天然に存在するｍｉＲＮＡ前駆体(前ｍｉＲＮＡ)は、一般に相補的である２部分を含む二本鎖ステムおよびステムの２部分を連結するループを形成する単一鎖である。典型的前ｍｉＲＮＡにおいて、ステムは、１以上の隆起、例えば、ステムの一部分における単一ヌクレオチド“ループ”を形成する余分なヌクレオチドおよび／または互いにステムの２部分のハイブリダイゼーションにおけるギャップを作る１以上の不対ヌクレオチドを含む。本発明の低分子ヘアピン型ＲＮＡまたは改変ＲＮＡ前駆体は、天然に存在する前ｍｉＲＮＡに基づく人工構築物であるが、所望のＲＮＡサイレンシング剤(例えば、本発明のｓｉＲＮＡ)を送達するように操作されている。前ｍｉＲＮＡのステム配列を標的ｍＲＮＡに相補的な配列で置き換えることにより、ｓｈＲＮＡが形成される。ｓｈＲＮＡは細胞の遺伝子サイレンシング経路全体で処理され、それによりＲＮＡｉに効率的に介在する。
【０２７５】
ｓｈＲＮＡ分子の必須要素は、二本鎖または二本鎖ステム部分を形成するためにアニールまたはハイブリダイズするための十分な相補性を有する第一部分および第二部分である。２部分は、完全にまたは完璧に相補的である必要はない。第一および第二“ステム”部分は、ｓｈＲＮＡの他の部分とアニールまたはハイブリダイズするためには不十分な配列相補性を有する配列を有する部分を含む。この後者の部分は、ｓｈＲＮＡ分子における“ループ”部分と称される。ｓｈＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡを産生するように処理される。ｓｈＲＮＡはまた１以上の隆起、すなわち、ステムの部分に小ヌクレオチド“ループ”を作る余分なヌクレオチド、例えば１、２または３ヌクレオチドループも含み得る。これらステム部分は同じ長さであっても、一部分が例えば、１〜５ヌクレオチドのオーバーハングを含んでもよい。オーバーハングヌクレオチドは、例えば、ウラシル(Ｕ)を含んでよく、例えば、全Ｕである。このようなＵは、とりわけｓｈＲＮＡコード化ＤＮＡにおけるチミジン(Ｔ)によりコードされ、これは転写停止をシグナル伝達する。
【０２７６】
本発明のｓｈＲＮＡ(または改変前駆体ＲＮＡ)において、二本鎖ステムの一部分は、ｈｔｔ標的配列に相補的(またはアンチセンス)である核酸配列である。好ましくは、ｓｈＲＮＡのステム部分の一鎖は、標的ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)配列に、ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)を介して該標的ＲＮＡの分解または開裂に介在するのに、十分に相補的(例えば、アンチセンス)である。それ故に、改変ＲＮＡ前駆体は、２部分および２ステム部分を連結するループを有する二本鎖ステムを含む。アンチセンス部分は、ステムの５’末端または３’末端にあり得る。ｓｈＲＮＡのステム部分は好ましくは約１５〜約５０ヌクレオチド長である。好ましくは２ステム部分は、約１８または１９〜約２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、３７、３８、３９または４０以上のヌクレオチド長である。好ましい態様において、ステム部分の長さは２１ヌクレオチド以上でなければならない。哺乳動物細胞において使用するとき、ステム部分の長さは、インターフェロン経路のような非特異的応答の誘発を避けるために、約３０ヌクレオチド未満でなければならない。非哺乳動物細胞において、ステムは３０ヌクレオチドより長くてよい。事実、ステムは、標的ｍＲＮＡに相補的なはるかに長い切片を含み得る(ｍＲＮＡ全体までおよびそれを含む)。事実、ステム部分は、標的ｍＲＮＡに相補的なはるかに長い切片を含み得る(ｍＲＮＡ全体までおよびそれを含む)。
【０２７７】
二本鎖ステムの２部分は、二本鎖ステムを形成するのにハイブリダイズするために十分に相補的でなければならない。それ故に、２部分は、完全にまたは完璧に相補的であってよいが、その必要はない。さらに、２ステム部分は同じ長さでも、一部分１、２、３または４ヌクレオチドのオーバーハングを含んでもよい。オーバーハングヌクレオチドは、例えば、ウラシル(Ｕ)を含んでよく、例えば、全Ｕであり得る。ｓｈＲＮＡまたは改変ＲＮＡ前駆体におけるループは、対合ヌクレオチドの数を増やすもしくは減らすためのループ配列の修飾またはループ配列の全てもしくは一部のテトラループまたは他のループ配列での置換により天然前ｍｉＲＮＡ配列と異なり得る。それ故に、ｓｈＲＮＡまたは改変ＲＮＡ前駆体におけるループは、２、３、４、５、６、７、８、９以上の、例えば、１５または２０以上のヌクレオチド長であり得る。
【０２７８】
ｓｈＲＮＡまたは改変ＲＮＡ前駆体におけるループは、対合ヌクレオチドの数を増やすもしくは減らすためのループ配列の修飾またはープ配列の全てもしくは一部のテトラループまたは他のループ配列での置換により天然前ｍｉＲＮＡ配列と異なる。それ故に、ｓｈＲＮＡにおけるループ部分は、約２〜約２０ヌクレオチド長、すなわち、約２、３、４、５、６、７、８、９以上の、例えば、１５または２０以上のヌクレオチド長であり得る。好ましいループは“テトラループ”配列からなるまたはこれを含む。テトラループ配列の例は、配列ＧＮＲＡ(ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｒはプリンヌクレオチドである)、ＧＧＧＧおよびＵＵＵＵを含むが、これらに限定されない。
【０２７９】
ある態様において、本発明のｓｈＲＮＡは、上記所望のｓｉＲＮＡ分子の配列を含む。他の態様において、ｓｈＲＮＡのアンチセンス部分の配列は、本質的に上記のとおり、または一般に標的ＲＮＡ(例えば、ｈｔｔ  ｍＲＮＡ)内の１８、１９、２０、２１ヌクレオチドまたはそれより長い配列からの、例えば、翻訳の開始から領域１００〜２００または３００ヌクレオチド上流または下流からの選択により設計できる。一般に、配列は、５’ＵＴＲ(非翻訳領域)、コーディング配列または３’ＵＴＲを含む標的ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)のあらゆる部分から選択できるが、該部分は、機能獲得型変異の部分から遠位でなければならない。この配列は、所望により２隣接ＡＡヌクレオチドを含む標的遺伝子の領域の直ぐ後ろに続いてよい。ヌクレオチド配列の最後の２ヌクレオチドは、ＵＵであるように選択できる。この２１程度のヌクレオチド配列を、ｓｈＲＮＡにおける二本鎖ステムの一部分を作るために使用する。この配列は、野生型前ｍｉＲＮＡ配列のステム部分を、例えば、酵素的に置き換えることができ、または合成された完全配列に含まれる。例えば、ステムループ改変ＲＮＡ前駆体全体をコードするまたは前駆体の二本鎖ステムに挿入する部分のみをコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成し、例えば、野生型前ｍｉＲＮＡから、制限酵素を使用して、改変ＲＮＡ前駆体構築物を構築できる。
【０２８０】
改変ＲＮＡ前駆体は、二本鎖ステムに、インビボでの産生が望まれるｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様二本鎖の２１〜２２程度のヌクレオチド配列を含む。それ故に、改変ＲＮＡ前駆体のステム部分は、発現が低減または阻害されるべき遺伝子のエクソン部分の配列に対応する少なくとも１８または１９ヌクレオチド対を含む。ステムのこの領域に隣接する２個の３’ヌクレオチドが、改変ＲＮＡ前駆体からのｓｉＲＮＡの産生を最大化し、インビボおよびインビトロでＲＮＡｉによる翻訳抑制または破壊のための対応するｍＲＮＡのターゲティングにおいて得られたｓｉＲＮＡの効果を最大化するために、選択される。
【０２８１】
ある態様において、本発明のｓｈＲＮＡは、ＲＩＳＣへのエントリーを増強するために、ｍｉＲＮＡ配列、所望により末端修飾ｍｉＲＮＡ配列を含む。ｍｉＲＮＡ配列は、何れかの天然に存在するｍｉＲＮＡと類似でも同一でもよい(例えばThe miRNA Registry; Griffiths-Jones S, Nuc. Acids Res., 2004参照)。１０００を超える天然ｍｉＲＮＡが現在までに同定されており、合わせてゲノムにおける全予測遺伝子の約１％を構成すると考えられる。多くの天然ｍｉＲＮＡが、前ｍＲＮＡのイントロンで一緒にクラスター化し、イン・シリコで相同性ベースのサーチを使用し(Pasquinelli et al., 2000; Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001; Lee and Ambros, 2001)またはコンピューターアルゴリズム(例えばMiRScan, MiRSeeker)を使用して同定され、これは、候補ｍｉＲＮＡ遺伝子が前ｍＲＮＡのステムループ構造を形成する能力を予測させる(Grad et al., Mol. Cell., 2003; Lim et al., Genes Dev., 2003; Lim et al., Science, 2003; Lai E C et al., Genome Bio., 2003)。オンライン登録は、全公開ｍｉＲＮＡ配列のサーチ可能なデータベースを提供する(The miRNA Registry at the Sanger Institute website; Griffiths-Jones S, Nuc. Acids Res., 2004)。例として、天然ｍｉＲＮＡは、ｌｉｎ−４、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１０、ｍｉｒＲ−１５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１６８、ｍｉＲ−１７５、ｍｉＲ−１９６およびそれらのホモログ、ならびに国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０３／０２９４５９号に記載のようにヒトおよびキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)、線虫(Caenorhabditis elegans)、ゼブラフィッシュ、シロイヌナズナ(Arabidopsis thalania)、マウス(Mus musculus)およびラット(Rattus norvegicus)を含むあるモデル生物からの他の天然ｍｉＲＮＡを含む。
【０２８２】
天然に存在するｍｉＲＮＡは、インビボで内在性遺伝子により発現され、ヘアピンまたはステムループ前駆体(前ｍｉＲＮＡまたは前ｍｉＲＮＡ)から、ダイサーまたは他のＲＮＡｓｅ酵素により処理される(Lagos-Quintana et al., Science, 2001; Lau et al., Science, 2001; Lee and Ambros, Science, 2001; Lagos-Quintana et al., Curr. Biol., 2002; Mourelatos et al., Genes Dev., 2002; Reinhart et al., Science, 2002; Ambros et al., Curr. Biol., 2003; Brennecke et al., 2003; Lagos-Quintana et al., RNA, 2003; Lim et al., Genes Dev., 2003; Lim et al., Science, 2003)。ｍｉＲＮＡは、インビボで一過性に二本鎖となった二重鎖として存在できるが、一鎖のみがＲＩＳＣ複合体に取り込まれ、遺伝子サイレンシングを指示する。あるｍｉＲＮＡ、例えば、植物ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡと完璧またはほぼ完璧な相補性を有し、従って、標的ｍＲＮＡの開裂を指示する。他のｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡと完璧に満たない相補性であり、従って、標的ｍＲＮＡの翻訳抑制を指示する。ｍｉＲＮＡとその標的ｍＲＮＡの間の相補性の程度は、その作用機序を決定すると考えられる。例えば、ｍｉＲＮＡとその標的ｍＲＮＡの間の完璧またはほぼ完璧な相補性は、開裂機序の予測となり(Yekta et al., Science, 2004)、一方完璧に満たない相補性は、翻訳抑制機序の予測となる。特定の態様において、ｍｉＲＮＡ配列は、天然に存在するｍｉＲＮＡ配列のものであり、その異常発現または活性がｍｉＲＮＡ障害と相関する。
【０２８３】
ｄ)  二機能性オリゴヌクレオチドテザー
他の態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ｍｉＲＮＡの細胞間動員に有用な二機能性オリゴヌクレオチドテザーを含む。動物細胞は、転写後または翻訳後レベルで遺伝子発現を制御できる約２２ヌクレオチドの非コーディングＲＮＡである様々なｍｉＲＮＡを発現する。ｍｉＲＮＡをＲＩＳＣに結合させ、それを標的ｍＲＮＡに動員することにより、二機能性オリゴヌクレオチドテザーは、例えば、動脈硬化過程に関与する、遺伝子の発現を抑制できる。オリゴヌクレオチドテザーの使用は、特定の遺伝子の発現抑制のための、既存の技術を超えるいくつかの利点を提供する。第一に、ここに記載する方法は、内在性分子(しばしば豊富に存在する)、ｍｉＲＮＡのＲＮＡサイレンシングへの介在を可能とする。従って、ここに記載する方法は、ＲＮＡサイレンシングの介在に外来分子(例えば、ｓｉＲＮＡ)を導入する必要性をなくす。第二に、ＲＮＡサイレンシング剤、および、特に、連結部分(例えば、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチド)は、安定であり、かつヌクレアーゼ活性に抵抗性であるように製造できる。その結果、本発明のテザーは直接送達のために設計でき、細胞内で所望の薬剤を製造するよう設計された前駆体分子またはプラスミドの間接的送達(例えばウイルス)の必要性を取り除く。第三に、テザーおよびその各部分は、特異的ｍＲＮＡ部位および特異的ｍｉＲＮＡと適合するように設計され得る。設計は細胞および遺伝子産物特異的であり得る。第四に、ここに開示する方法は、ｍＲＮＡをインタクトとし、当業者が細胞それら自体の機序を使用して短パルスでタンパク質合成を遮断することを可能とする。その結果、ＲＮＡサイレンシングのこれらの方法は、高度に制御可能である。
【０２８４】
本発明の二機能性オリゴヌクレオチドテザー(“テザー”)は、目的の遺伝子の調節を誘発するように、それらがｍｉＲＮＡ(例えば、内在性細胞のｍｉＲＮＡ)を標的ｍＲＮＡに動員するように設計される。好ましい態様において、テザーは式Ｔ−Ｌ−μ(式中、ＴはｍＲＮＡターゲティング部分であり、Ｌは連結部分であり、μはｍｉＲＮＡ動員部分である)を有する。任意の１以上の部分は二本鎖でよい。好ましくは、しかしながら、各部分は一本鎖である。
【０２８５】
テザー内の部分は、(５’から３’方向)で式Ｔ−Ｌ−μに描かれるように配置または連結される(すなわち、ターゲティング部分の３’末端が連結部分の５’末端に連結および連結部分の３’末端がｍｉＲＮＡ動員部分の５’末端に連結)。あるいは、これら部分は、テザー内でμ−Ｔ−Ｌように配置または連結され得る(ここで、、ｍｉＲＮＡ動員部分の３’末端が連結部分の５’末端に連結および連結部分の３’末端がターゲティング部分の５’末端に連結)。
【０２８６】
上記のとおりｍＲＮＡターゲティング部分は特異的標的ｍＲＮＡを捕捉できる。本発明においては、標的ｍＲＮＡの発現は望ましくなく、それゆえに、ｍＲＮＡの翻訳抑制が望まれる。ｍＲＮＡターゲティング部分は、標的ｍＲＮＡに効果的に結合するのに十分なサイズでなければならない。ターゲティング部分の長さは、一部、標的ｍＲＮＡの長さおよび標的ｍＲＮＡとターゲティング部分の間の相補性の程度による。種々の態様において、ターゲティング部分は、約２００、１００、５０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６または５ヌクレオチド長未満である。特定の態様において、ターゲティング部分は約１５〜約２５ヌクレオチド長である。
【０２８７】
上記のｍｉＲＮＡ動員部分は、ｍｉＲＮＡと結合できる。本発明において、ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを抑制できるあらゆるｍｉＲＮＡであり得る。哺乳動物は、２５０を超える内在性ｍｉＲＮＡを有すると報告されている(Lagos-Quintana et al. (2002) Current Biol. 12:735-739; Lagos-Quintana et al. (2001) Science 294:858-862;およびLim et al. (2003) Science 299:1540)。種々の態様において、ｍｉＲＮＡは、当分野において認識されているあらゆるｍｉＲＮＡであり得る。
【０２８８】
連結部分は、ターゲティング部分の活性が維持されるように、ターゲティング部分に連結ができるあらゆる薬剤であり得る。連結部分は、好ましくはターゲティング剤がその各標的と十分に相互作用できるように、十分な数のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド部分である。連結部分は、細胞のｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ配列と配列相同性をほとんど有しないかまたは全く有しない。連結部分の例は、１以上の２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、例えば、２’−β−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルチミジン、２’−Ｏ−メチルグアノシンまたは２’−Ｏ−メチルウリジンを含む。
【０２８９】
ｅ)遺伝子サイレンシングオリゴヌクレオチド
ある例示的態様において、遺伝子発現(すなわち、ｈｔｔ遺伝子発現)は、ｈｔｔ遺伝子発現を効果的に阻害または減少させるために２以上の利用可能な３’末端の存在を可能にする、５’末端を経て連結した２以上の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドベースの化合物を使用して調節できる。このような連結オリゴヌクレオチドはまた遺伝子サイレンシングオリゴヌクレオチド(ＧＳＯ)として知られている(例えば、その全体を全ての目的のために本明細書に引用により包含させる、Idera Pharmaceuticals, Incに譲渡されたＵＳ８,４３１,５４４参照)。
【０２９０】
ＧＳＯの５’末端での結合は、他のオリゴヌクレオチド結合と無関係であり、５’、３’または２’ヒドロキシル基を経て直接的でも、ヌクレオシドの２’または３’ヒドロキシル位置を使用する、非ヌクレオチドリンカーまたはヌクレオシドを経て間接的でもよい。結合は５’末端ヌクレオチドの官能化糖または核酸塩基も使用し得る。
【０２９１】
ＧＳＯは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートまたは非ヌクレオシドリンカーにより５’−５’末端でコンジュゲートされた２つの同一または異なる配列を含み得る。このような化合物は、遺伝子産物のアンチセンス下方制御のための目的のｍＲＮＡ標的の特異的部分と相補的である１５〜２７ヌクレオチドを含み得る。同一配列を含むＧＳＯは、ワトソン・クリック水素結合相互作用により特異的ｍＲＮＡと結合し、タンパク質発現を阻害する。異なる配列を含むＧＳＯは、１以上のｍＲＮＡ標的の２以上の異なる領域と結合し、タンパク質発現を阻害できる。このような化合物は標的ｍＲＮＡに相補的なヘテロヌクレオチド配列からなり、ワトソン・クリック水素結合により安定な二本鎖構造を形成する。ある条件下では、２つの遊離３’末端(５’−５’結合アンチセンス)を含むＧＳＯは、単一遊離３’末端を含むかまたは遊離３’末端を含まないものよりも、遺伝子発現の強力な阻害剤であり得る。
【０２９２】
ある態様において、非ヌクレオチドリンカーは、式ＨＯ−(ＣＨ２)ｏ−ＣＨ(ＯＨ)−(ＣＨ２)ｐ−ＯＨ(式中、ｏおよびｐは、独立して１〜約６、１〜約４または１〜約３の整数である)のグリセロールまたはグリセロールホモログである。ある他の態様において、非ヌクレオチドリンカーは、１,３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの誘導体である。このような誘導体のいくつかは、式ＨＯ−(ＣＨ２)ｍ−Ｃ(Ｏ)ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)−ＣＨ２−ＮＨＣ(Ｏ)−(ＣＨ２)ｍ−ＯＨ(式中、ｍは０〜約１０、０〜約６、２〜約６または２〜約４の整数である)を有する。
【０２９３】
いくつかの非ヌクレオチドリンカーは、２を超えるＧＳＯ成分の結合を可能とする。例えば、非ヌクレオチドリンカーグリセロールは、ＧＳＯ成分が共有結合し得る３ヒドロキシル基を有する。あるオリゴヌクレオチドベースの本発明の化合物は、それ故に、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーに連結した２以上のオリゴヌクレオチドを含む。このようなオリゴヌクレオチドは、本発明において“分枝している”と称される。
【０２９４】
ある態様において、ＧＳＯは少なくとも１４ヌクレオチド長である。ある例示的態様において、ＧＳＯは１５〜４０ヌクレオチド長または２０〜３０ヌクレオチド長である。それ故に、ＧＳＯの成分オリゴヌクレオチドは、独立して１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０ヌクレオチド長であり得る。
【０２９５】
これらのオリゴヌクレオチドは、ホスホロアミデートまたはＨ−ホスホネート化学のような当分野において認識されている方法により製造でき、これらは手動でまたは自動化合成装置により実施できる。これらのオリゴヌクレオチドはまたｍＲＮＡとハイブリダイズする能力を損なうことなく、多様な方法で修飾もできる。このような修飾は、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスフェートエステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホロアミデート、カルバメート、カーボネート、ホスフェートヒドロキシル、アセトアミデートまたはカルボキシメチルエステルまたはこれらの組み合わせであるオリゴヌクレオチドの少なくとも一つのヌクレオチド間結合およびあるヌクレオチドの５’末端と、５’ヌクレオチドホスホジエステル結合が任意の数の化学基で置換されている他方のヌクレオチドの３’末端の間の他のヌクレオチド間結合を含み得る。
【０２９６】
VII. 修飾抗Ｈｔｔ  ＲＮＡサイレンシング剤
本発明のある側面において、上記の本発明のＲＮＡサイレンシング剤(またはその任意の部分)は、該薬剤の活性がさらに改善されるように修飾し得る。例えば、上記セクションIIのＲＮＡサイレンシング剤を、下記修飾のいずれかで修飾し得る。修飾は、一部、さらなる標的識別増強、薬剤の安定性増強(例えば、分解阻止)、細胞の取り込み促進、標的効率増強、(例えば、標的への)結合における有効性改善、薬剤に対する患者耐容性改善および／または毒性軽減に役立つ。
【０２９７】
１)標的識別増強のための修飾
ある態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤を、単一ヌクレオチド標的識別を増強するために、不安定化ヌクレオチドで置換し得る(２００７年１月２５日出願の米国出願１１／６９８,６８９号および２００６年１月２５日出願の米国仮出願６０／７６２,２２５号参照、これら両者は引用により本明細書に包含させる)。このような修飾は、標的ｍＲＮＡ(例えば機能獲得型変異体ｍＲＮＡ)に対するＲＮＡサイレンシング剤の特異性に明らかに影響することなく、非標的ｍＲＮＡ(例えば野生型ｍＲＮＡ)に対するＲＮＡサイレンシング剤の特異性を排除するのに十分であり得る。
【０２９８】
好ましい態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤を、そのアンチセンス鎖に少なくとも一つの普遍的ヌクレオチドを導入することにより修飾する。普遍的ヌクレオチドは、４つの慣用のヌクレオチド塩基(例えばＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕ)のいずれかと識別をつけずに塩基対形成できる塩基部分を含む。普遍的ヌクレオチドは、ＲＮＡ二本鎖またはＲＮＡサイレンシング剤のガイド鎖と標的ｍＲＮＡにより形成された二本鎖の安定性に比較的影響が少ないため、好ましい。普遍的ヌクレオチドの例は、イノシン塩基部分またはデオキシイノシン(例えば２’−デオキシイノシン)、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、２’−アザ−２’−デオキシイノシン、ＰＮＡ−イノシン、モルホリノ−イノシン、ＬＮＡ−イノシン、ホスホロアミデート−イノシン、２’−Ｏ−メトキシエチル−イノシンおよび２’−ＯＭｅ−イノシンからなる群から選択されるイノシンアナログ塩基部分を有するものを含む。特に好ましい態様において、普遍的ヌクレオチドはイノシン残基またはその天然に存在するアナログである。
【０２９９】
ある態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、特異性決定ヌクレオチド(すなわち、疾患関連多型を認識するヌクレオチド)から５ヌクレオチド以内の少なくとも一つの不安定化ヌクレオチドの導入により修飾される。例えば、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドから５、４、３、２または１ヌクレオチド内である位置に導入され得る。例示的態様において、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドから３ヌクレオチドである位置に導入される(すなわち、不安定化ヌクレオチドと特異性決定ヌクレオチドの間に２つの安定化ヌクレオチドがあるように)。２鎖または鎖部分を有するＲＮＡサイレンシング剤(例えばｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ)において、不安定化ヌクレオチドを、特異性決定ヌクレオチドを含まない鎖または鎖部分に導入し得る。好ましい態様において、不安定化ヌクレオチドを、特異性決定ヌクレオチドを含むのと同じ鎖または鎖部分に導入する。
【０３００】
２)有効性および特異性増強のための修飾
ある態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤を、非対称設計規則により、介在ＲＮＡｉにおける有効性および特異性の増強を促進するように変改し得る(米国特許８,３０９,７０４号、７,７５０,１４４号、８,３０４,５３０号、８,３２９,８９２号および８,３０９,７０５号参照)。このような変改は、アンチセンス鎖が優先的に標的ｍＲＮＡの開裂または翻訳抑制をガイドし、それにより、標的開裂およびサイレンシングの効率を増加または改善するように、センス鎖のために、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖(例えば、本発明の方法を使用して設計されたｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡから産生されたｓｉＲＮＡ)のＲＩＳＣへのエントリーを促進する。好ましくは、ＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、ＲＮＡサイレンシング剤のアンチセンス鎖５’末端(ＡＳ  ５’)とセンス鎖３’末端(Ｓ  ３’)の間の塩基対強度を、該ＲＮＡサイレンシング剤のアンチセンス鎖３’末端(ＡＳ  ３’)とセンス鎖５’末端(Ｓ  ’５)の間の結合強度または塩基対強度に比して低減させることにより増強される。
【０３０１】
ある態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、第一鎖またはアンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖部分の５’末端の間よりも第一鎖またはアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖部分の３’末端の間でＧ：Ｃ塩基対が少ないように増強し得る。他の態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、第一鎖またはアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖部分の３’末端の間に少なくとも一つの不適正塩基対があるように増強し得る。好ましくは、不適正塩基対は、Ｇ：Ａ、Ｃ：Ａ、Ｃ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ｃ：ＣおよびＵ：Ｕからなる群から選択される。他の態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、第一鎖またはアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖部分の３’末端の間に、少なくとも一つの揺らぎ塩基対、例えば、Ｇ：Ｕがあるように増強し得る。他の態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、希ヌクレオチド、例えば、イノシン(Ｉ)を含む少なくとも一つの塩基対があるように増強し得る。好ましくは、塩基対をＩ：Ａ、Ｉ：ＵおよびＩ：Ｃからなる群から選択する。さらに他の態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性を、修飾ヌクレオチドを含む少なくとも一つの塩基対があるように増強し得る。好ましい態様において、修飾ヌクレオチドは２−アミノ−Ｇ、２−アミノ−Ａ、２,６−ジアミノ−Ｇおよび２,６−ジアミノ−Ａからなる群から選択される。
【０３０２】
３)安定性が増強されたＲＮＡサイレンシング剤
本発明のＲＮＡサイレンシング剤を、血清または細胞培養用増殖培地における安定性を改善するために修飾できる。安定性を増強するために、３’残基を分解に対して安定化でき、例えば、それらをプリンヌクレオチド、特にアデノシンまたはグアノシンヌクレオチドからなるように選択し得る。あるいは、ピリミジンヌクレオチドの修飾アナログによる置換、例えば、ウリジンの２’−デオキシチミジンによる置換は耐容性であり、ＲＮＡ干渉の効率に影響しない。
【０３０３】
好ましい側面において、本発明は、第一鎖および第二鎖を含むＲＮＡサイレンシング剤に関し、ここで、第二鎖および／または第一鎖は、対応する非修飾ＲＮＡサイレンシング剤と比較してインビボ安定性が増強されるように、内部ヌクレオチドの修飾ヌクレオチドでの置換により修飾される。ここで定義する“内部”ヌクレオチドは、核酸分子、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端以外のあらゆる位置にあるものである。内部ヌクレオチドは、一本鎖分子内でも二本鎖または二重鎖分子の一鎖内でもよい。ある態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、少なくとも一つの内部ヌクレオチドの置換により修飾される。他の態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上の内部ヌクレオチドの置換により修飾される。他の態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、内部ヌクレオチドの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の置換により修飾される。さらに他の態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、内部ヌクレオチドの全ての置換により修飾される。
【０３０４】
本発明の好ましい態様において、ＲＮＡサイレンシング剤は少なくとも一つの修飾ヌクレオチドアナログを含み得る。ヌクレオチドアナログは、標的特異的サイレンシング活性、例えば、ＲＮＡｉ介在活性または翻訳抑制活性が実質的に影響されない位置、例えば、ｓｉＲＮＡ分子の５’末端および／または３’末端における領域に位置し得る。特に、末端は、修飾ヌクレオチドアナログの取り込みにより安定化され得る。
【０３０５】
ヌクレオチドアナログの例は、糖および／または主鎖修飾リボヌクレオチド(すなわち、ホスフェート−糖主鎖の修飾を含む)を含む。例えば、天然ＲＮＡのホスホジエステル結合を、窒素または硫黄ヘテロ原子の少なくとも一つを含むように修飾し得る。主鎖修飾リボヌクレオチドの例において、隣接リボヌクレオチドを接続するホスホエステル基を、例えば、ホスホチオエート基の、修飾基に置き換える。糖修飾リボヌクレオチドの例において、２’  ＯＨ基を、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＯＮから選択される基に置き換え、ここで、ＲはＣ１−Ｃ６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。
【０３０６】
特定の態様において、修飾は、２’−フルオロ、２’−アミノおよび／または２’−チオ修飾である。特に好ましい修飾は、２’−フルオロ−シチジン、２’−フルオロ−ウリジン、２’−フルオロ−アデノシン、２’−フルオロ−グアノシン、２’−アミノ−シチジン、２’−アミノ−ウリジン、２’−アミノ−アデノシン、２’−アミノ−グアノシン、２,６−ジアミノプリン、４−チオ−ウリジンおよび／または５−アミノ−アリル−ウリジンを含む。特定の態様において、２’−フルオロリボヌクレオチドは、全てウリジンおよびシチジンである。修飾のさらなる例は、５−ブロモ−ウリジン、５−ヨード−ウリジン、５−メチル−シチジン、リボ−チミジン、２−アミノプリン、２’−アミノ−ブチリル−ピレン−ウリジン、５−フルオロ−シチジンおよび５−フルオロ−ウリジンを含む。２’−デオキシ−ヌクレオチドおよび２’−Ｏｍｅヌクレオチドも、本発明の修飾ＲＮＡサイレンシング剤部分内で使用できる。さらなる修飾残基は、デオキシ−無塩基、イノシン、Ｎ３−メチル−ウリジン、Ｎ６,Ｎ６−ジメチル−アデノシン、シュードウリジン、プリンリボヌクレオシドおよびリバビリンを含む。特に好ましい態様において、２’部分は、連結部分が２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドであるようにメチル基である。
【０３０７】
例示的態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ロックド核酸(ＬＮＡ)を含む。ＬＮＡは、ヌクレアーゼ活性に抵抗する(高度に安定)およびｍＲＮＡに対する単一ヌクレオチド識別を有する糖修飾ヌクレオチドを含む(Elmen et al., Nucleic Acids Res., (2005), 33(1): 439-447; Braasch et al. (2003) Biochemistry 42:7967-7975, Petersen et al. (2003) Trends Biotechnol 21:74-81)。これらの分子は、２’−Ｏ,４’−Ｃ−エチレン架橋核酸を、２’−デオキシ−２’’−フルオロウリジンのような可能な修飾と共に有する。さらに、ＬＮＡは、糖部分を３’−ｅｎｄｏ立体構造に拘束することによりオリゴヌクレオチドの特異性を増加し、それにより塩基対形成のためにヌクレオチドを前組織化し、オリゴヌクレオチドの融点を塩基あたり１０℃程度上昇させる。
【０３０８】
他の例示的態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ペプチド核酸(ＰＮＡ)を含む。ＰＮＡは、糖−ホスフェート部分が、ヌクレオチドがヌクレアーゼ消化に高度に抵抗性であり、分子への結合特異性の改善を与える、ポリアミド主鎖を形成できる中立２−アミノエチルグリシン部分で置換された、修飾ヌクレオチドを含む(Nielsen, et al., Science, (2001), 254: 1497-1500)。
【０３０９】
また好ましいのは、核酸塩基修飾リボヌクレオチド、すなわち、天然に存在する核酸塩基の代わりに少なくとも一つの天然に存在しない核酸塩基を含む、リボヌクレオチドである。塩基は、アデノシンデアミナーゼ活性を遮断するよう修飾される。修飾核酸塩基の例は、５位を修飾されたウリジンおよび／またはシチジン、例えば、５−(２−アミノ)プロピルウリジン、５−ブロモウリジン；８位を修飾されたアデノシンおよび／またはグアノシン、例えば、８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば、７−デアザ−アデノシン；Ｏ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えば、Ｎ６−メチルアデノシンを含むが、これらに限定されない。上記修飾を組み合わせてよいことは注意すべきである。
【０３１０】
他の態様において、ＲＮＡサイレンシング剤の薬物動態を変えるために、例えば、体内の半減期を延長するために、架橋結合を用いることができる。そのために、本発明は、核酸の２つの相補的鎖を有するＲＮＡサイレンシング剤を含み、ここで、２鎖は架橋結合される。本発明はまた、他の部分(例えばペプチドのような非核酸部分)、有機化合物(例えば、色素)など)とコンジュゲートされたまたはコンジュゲートされていない(例えば、３’末端で)ＲＮＡサイレンシング剤も含む。この方法でのｓｉＲＮＡ誘導体の修飾は、対応するｓｉＲＮＡと比較して得られたｓｉＲＮＡ誘導体の細胞の取り込みを改善するかまたは細胞ターゲティング活性を増強でき、細胞におけるｓｉＲＮＡ誘導体の追跡に有用でありまたは対応するｓｉＲＮＡと比較してｓｉＲＮＡ誘導体の安定性を改善する。
【０３１１】
他の修飾の例は、(ａ)２’修飾、例えば、センス鎖またはアンチセンス鎖、特にセンス鎖のＵにおける２’ＯＭｅ部分の提供または、例えば、３’末端での、３’オーバーハングにおける２’ＯＭｅ部分の提供(文脈から示されるとおり、３’末端は分子の３’原子または最も３’部分、例えば、最も３’Ｐまたは２’位を意味する)； (ｂ)例えば、ホスフェート主鎖における、ＯのＳでの置換による、主鎖の修飾、例えば、特にアンチセンス鎖における、ＵまたはＡまたは両者のホスホロチオエート修飾の提供；例えば、ＯのＳでの置換；(ｃ)ＵのＣ５アミノリンカーでの置換；(ｄ)ＡのＧでの置換(配列変化は、アンチセンス鎖ではなくセンス鎖に位置するのが好ましい)；および(ｄ)２’位、６’位、７’位または８’位の修飾。例示的態様は、これらの修飾の１以上がセンス鎖に存在するが、アンチセンス鎖にない、またはアンチセンス鎖が有するこのような修飾が少ない態様である。さらに他の例示的修飾は、例えば、３’末端での３’オーバーハングにおけるメチル化Ｐの使用；２’修飾、例えば、２’ＯＭｅ部分の提供および主鎖の、例えば、ＯのＳでの置換による、修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾の提供または例えば、３’末端でのメチル化Ｐの使用の組み合わせ；３’アルキルでの修飾；例えば、３’末端での、３’オーバーハングにおける脱塩基ピロリドンでの修飾；ナプロキセン、イブプロフェンまたは３’末端での分解を阻害する他の部分での修飾を含む。
【０３１２】
４)細胞の取り込みを増強するための修飾
他の態様において、ＲＮＡサイレンシング剤を、例えば、標的細胞(例えば、神経細胞)による細胞の取り込みを増強するために、化学的部分で修飾し得る。それ故に、本発明は、他の部分(例えばペプチドのような非核酸部分)、有機化合物(例えば、色素)などとコンジュゲートしたまたはコンジュゲートしていない(例えば、３’末端で)ＲＮＡサイレンシング剤を含む。コンジュゲーションは、当分野で知られる方法により、例えば、Lambert et al., Drug Deliv. Rev.: 47(1), 99-112 (2001)(ポリアルキルシアノアクリレート(ＰＡＣＡ)ナノ粒子に充填された核酸を記載する)；Fattal et al., J. Control Release 53(1-3):137-43 (1998)(ナノ粒子に結合した核酸を記載する)；Schwab et al., Ann. Oncol. 5 Suppl. 4:55-8 (1994)(挿入剤、疎水性基、ポリカチオンまたはＰＡＣＡナノ粒子に連結された核酸を記載する)；およびGodard et al., Eur. J. Biochem. 232(2):404-10 (1995)(ナノ粒子に連結された核酸を記載する)の方法を使用して、達成できる。
【０３１３】
特定の態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤を、親油性部分とコンジュゲートする。ある態様において、親油性部分は、カチオン基を含むリガンドである。他の態様において、親油性部分を、ｓｉＲＮＡの一鎖または両鎖に結合する。例示的態様において、親油性部分を、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の一端に結合する。他の例示的態様において、親油性部分をセンス鎖の３’末端に結合する。ある態様において、親油性部分を、コレステロール、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＡ、葉酸またはカチオン性色素(例えば、Ｃｙ３)からなる群から選択する。例示的態様において、親油性部分はコレステロールである。他の親油性部分はコール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１,３−ビス−Ｏ(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１,３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−(オレオイル)リトコール酸、Ｏ３−(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチルまたはフェノキサジンを含む。
【０３１４】
５)テザーリガンド
他の物を、本発明のＲＮＡサイレンシング剤にテザーできる。リガンドを、例えば、安定性、標的核酸とのハイブリダイゼーション熱力学、特定の組織または細胞型へのターゲティングまたは、例えば、エンドサイトーシス依存的または非依存的機序による細胞透過性の改善のためにＲＮＡサイレンシング剤にテザーする。リガンドおよび関連する修飾は、配列特異性を増加し、結果として標的外ターゲティングを減少させ得る。テザーリガンドは、介入物として機能できる１以上の修飾塩基または糖を含み得る。これらは、好ましくは、ＲＮＡサイレンシング剤／標的二本鎖の隆起におけるような、内部領域に位置する。介入物は芳香族、例えば、多環式芳香族またはヘテロ環式芳香族化合物であり得る。多環式介入物は、スタッキング能を有することができ、２、３または４縮合環を有する系を含み得る。ここに記載する普遍的塩基は、リガンド上に挿入され得る。ある態様において、リガンドは、標的核酸の開裂により標的遺伝子阻害に寄与する開裂基を含み得る。開裂基は、例えば、ブレオマイシン(例えば、ブレオマイシン−Ａ５、ブレオマイシン−Ａ２またはブレオマイシン−Ｂ２)、ピレン、フェナントロリン(例えば、Ｏ−フェナントロリン)、ポリアミン、トリペプチド(例えば、ｌｙｓ−ｔｙｒ−ｌｙｓトリペプチド)または金属イオンキレート基であり得る。金属イオンキレート基は、例えば、Ｌｕ(III)またはＥＵ(III)大環状複合体、Ｚｎ(II)２,９−ジメチルフェナントロリン誘導体、Ｃｕ(II)テルピリジンまたはアクリジンを含み得て、これは、Ｌｕ(III)のような遊離金属イオンにより隆起の部位での標的ＲＮＡの選択的開裂を促進できる。ある態様において、ペプチドリガンドを、例えば、隆起領域での、標的ＲＮＡの開裂促進のためにＲＮＡサイレンシング剤にテザーできる。例えば、１,８−ジメチル−１,３,６,８,１０,１３−ヘキサアザシクロテトラデカン(シクラム)を、ペプチドにコンジュゲートさせて(例えば、アミノ酸誘導体により)、標的ＲＮＡ開裂を促進できる。テザーリガンドは、ＲＮＡサイレンシング剤のハイブリダイゼーション性質改善または配列特異性改善をもたらし得る、アミノグリコシドリガンドであり得る。アミノグリコシドの例は、グリコシル化ポリリシン、ガラクトース化ポリリシン、ネオマイシンＢ、トブラマイシン、カナマイシンＡおよびアミノグリコシドのアクリジンコンジュゲート、例えばＮｅｏ−Ｎ−アクリジン、Ｎｅｏ−Ｓ−アクリジン、Ｎｅｏ−Ｃ−アクリジン、Ｔｏｂｒａ−Ｎ−アクリジンおよびＫａｎａＡ−Ｎ−アクリジンを含む。アクリジンアナログの使用は配列特異性を増加させ得る。例えば、ネオマイシンＢは、ＤＮＡと比較してＲＮＡに高親和性を有するが、低配列特異性である。アクリジンアナログ、ｎｅｏ−５−アクリジンは、ＨＩＶ  Ｒｅｖ応答配列(ＲＲＥ)に対して増加した親和性を有する。ある態様において、アミノグリコシドリガンドのグアニジンアナログ(グアニジノグリコシド)を、ＲＮＡサイレンシング剤にテザーする。グアニジノグリコシドにおいて、アミノ酸のアミン基をグアニジン基に交換する。グアニジンアナログの結合は、ＲＮＡサイレンシング剤の細胞透過性を増加させる。テザーリガンドは、ポリアルギニンペプチド、ペプト��ドまたはペプチド模倣体であってよく、これは、オリゴヌクレオチド剤の細胞の取り込みを増強できる。
【０３１５】
リガンドの例は、リガンドコンジュゲート担体に、直接的にまたはテザーを経て間接的に、好ましくは共有結合により、結合する。例示的態様において、リガンドは、担体に介在テザーを経て結合する。例示的態様において、リガンドは、取り込まれるＲＮＡサイレンシング剤の分布、ターゲティングまたは寿命を変える。例示的態様において、リガンドは、例えば、このようなリガンドを欠く種と比較して、選択標的、例えば、分子、細胞または細胞型、区画、例えば、細胞または臓器区画、組織、臓器または体の領域に対する親和性の増強を提供する。
【０３１６】
リガンドの例は、輸送、ハイブリダイゼーションおよび特異性の特性を改善でき、また得られる天然または修飾ＲＮＡサイレンシング剤またはここに記載する単量体の任意の組み合わせを含む重合分子および／または天然または修飾リボヌクレオチドのヌクレアーゼ抵抗性も改善し得る。リガンドは、一般に、例えば、取り込みを増強するための治療修飾因子；例えば、分布をモニタリングするための診断化合物またはレポーター基；架橋結合剤；ヌクレアーゼ−抵抗性付与部分；および天然または異常核酸塩基を含み得る。一般的例は、脂溶性物、脂質、ステロイド(例えば、ウバオール、ヘコゲニン(hecigenin)、ジオスゲニン)、テルペン(例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸)、ビタミン(例えば、葉酸、ビタミンＡ、ビオチン、ピリドキサール)、炭水化物、タンパク質、タンパク質結合剤、インテグリンターゲティング分子、ポリカチオン性物、ペプチド、ポリアミンおよびペプチド模倣物を含む。リガンドは、天然に存在する物質(例えば、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)、低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)またはグロブリン)；炭水化物(例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸)；アミノ酸または脂質を含み得る。リガンドはまた組み換えまたは合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸であり得る。ポリアミノ酸の例は、ポリアミノ酸を含み、ポリリシン(ＰＬＬ)、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ(Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド)コポリマー、ジビニルエーテル−マレイン無水物コポリマー、Ｎ−(２−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドコポリマー(ＨＭＰＡ)、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリウレタン、ポリ(２−エチルアクリル酸)、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファジンである。ポリアミンの例は、ポリエチレンイミン、ポリリシン(ＰＬＬ)、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣体ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩またはアルファ螺旋状ペプチドを含む。
【０３１７】
リガンドはまた、腎細胞のような特定の細胞型に結合する、ターゲティング基、例えば、細胞または組織ターゲティング剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、抗体も含み得る。ターゲティング基は、チロトロピン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチンまたはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。リガンドの他の例は、色素、挿入剤(例えばアクリジンおよび置換アクリジン)、クロスリンカー(例えばソラレン、マイトマイシンＣ)、ポルフィリン(ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン)、多環式芳香族炭化水素(例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン、フェナントロリン、ピレン)、ｌｙｓ−ｔｙｒ−ｌｙｓトリペプチド、アミノグリコシド、グアニジニウムアミノグリコリド、人工エンドヌクレアーゼ(例えばＥＤＴＡ)、親油性分子、例えば、コレステロール(およびそのチオアナログ)、コール酸、コラン酸、リトコール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、グリセロール(例えば、エステル(例えば、モノ、ビスまたはトリス脂肪酸エステル、例えば、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９またはＣ２０脂肪酸)およびそのエーテル、例えば、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９またはＣ２０アルキル；例えば、１,３−ビス−Ｏ(ヘキサデシル)グリセロール、１,３−ビス−Ｏ(オクタデシル)グリセロール)、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１,３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ステアリン酸(例えば、ジステアリン酸グリセリル)、オレイン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−(オレオイル)リトコール酸、Ｏ３−(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチルまたはフェノキサジン)およびペプチドコンジュゲート(例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド)、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ(例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ)、ＭＰＥＧ、[ＭＰＥＧ]２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン(例えばビオチン)、輸送／吸収促進剤(例えば、アスピリン、ナプロキセン、ビタミンＥ、葉酸)、合成リボヌクレアーゼ(例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾールコンジュゲート、テトラアザ大環状環のＥｕ３＋複合体)、ジニトロフェニル、ＨＲＰまたはＡＰを含む。
【０３１８】
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質またはペプチド、例えば、共リガンドに対する特異的親和性を有する分子または抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞または骨細胞のような特定の細胞型に結合する抗体であり得る。リガンドはまたホルモンおよびホルモン受容体も含み得る。それらはまた脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノースまたは多価フコースのような非ペプチド種でもあり得る。リガンドは、例えば、リポサッカライド、ｐ３８ＭＡＰキナーゼのアクティベーターまたはＮＦ−κＢのアクティベーターであり得る。
【０３１９】
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格の破壊、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメントおよび／または中間径フィラメントの破壊により、ＲＮＡサイレンシング剤の細胞への取り込みを増加できる物質、例えば、薬物であり得る。薬物は、例えば、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシンまたはmyoservinであり得る。リガンドは、例えば、炎症性応答の活性化により、ＲＮＡサイレンシング剤の細胞への取り込みを増加できる。このような効果を有するリガンドの例は、腫瘍壊死因子アルファ(ＴＮＦα)、インターロイキン−１ベータまたはガンマインターフェロンを含む。ある側面において、リガンドは、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)に結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、コンジュゲートの、標的組織、例えば、体の非腎臓標的組織への分布を可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。ＨＳＡに結合できる他の分子もリガンドとして使用できる。例えば、neproxinまたはアスピリンを使用できる。脂質または脂質ベースのリガンドは、(ａ)コンジュゲートの分解に対する抵抗性の増加、(ｂ)標的細胞または細胞膜へのターゲティングまたは輸送の増加ができおよび／または(ｃ)血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合の調整に使用できる。脂質ベースのリガンドは、標的組織へのコンジュゲートの結合の調節、例えば、制御に使用できる。例えば、ＨＳＡにより強力に結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓に標的化される可能性が低く、それ故に体内から浄化される可能性が低い。あまり強くなくＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドを使用して、コンジュゲートを腎臓に標的化できる。好ましい態様において、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに結合する。脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが好ましくは非腎臓組織に分布するようにＨＳＡと十分な親和性で結合できる。しかしながら、親和性は、ＨＳＡ−リガンド結合が保持できないほどには強くないのが好ましい。他の好ましい態様において、脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが好ましくは腎臓に分布するように、ＨＳＡに弱く結合するかまたは全く結合しない。腎細胞を標的とする他の部も、脂質ベースのリガンドに代えてまたはそれに加えて使用できる。
【０３２０】
他の側面において、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖細胞により取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、例えば、悪性または非悪性タイプの、望まない細胞増殖、例えば、癌細胞により特徴付けられる障害の処置に特に有用である。ビタミンの例は、ビタミンＡ、ＥおよびＫを含む。ビタミンの他の例は、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールまたは癌細胞により取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素である。ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)も包含される。
【０３２１】
他の側面において、リガンドは、細胞浸透剤、好ましくは螺旋状細胞浸透剤である。好ましくは、薬剤は両親媒性である。薬剤の例は、ｔａｔまたはアンテナペディアのようなペプチドである。薬剤がペプチドであるならば、修飾でき、ペプチジル模倣体、逆転異性体、非ペプチドまたはシュード−ペプチド結合およびＤ−アミノ酸の使用を含む。螺旋状薬剤は、好ましくはアルファ螺旋状剤であり、これは、好ましくは親油性および疎油性相を有する。
【０３２２】
リガンドはペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体(ここではオリゴペプチド模倣体とも称する)は、天然ペプチドに類似する規定の三次元構造に折りたたまれることができる分子である。ペプチドおよびペプチド模倣体のオリゴヌクレオチド剤への結合は、細胞の認識および吸収の増加によるなどのように、ＲＮＡサイレンシング剤の薬物動態分布に影響する。ペプチドまたはペプチド模倣体部分は、約５〜５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸長であり得る。ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞浸透ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチドまたは疎水性ペプチド(例えば、主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる)であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。ペプチド部分はＬ−ペプチドまたはＤ−ペプチドであり得る。他の代替において、ペプチド部分は、疎水性膜転座配列(ＭＴＳ)を含むことができる。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリーまたはone-bead-one-compound(ＯＢＯＣ)コンビナトリアルライブラリーから同定されたペプチドのような、ＤＮＡの無作為配列によりコードされ得る(Lam et al., Nature 354:82-84, 1991)。例示的態様において、組み込まれた単量体単位によりＲＮＡサイレンシング剤にテザーされたペプチドまたはペプチド模倣体は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸(ＲＧＤ)−ペプチドまたはＲＧＤ模倣体のような細胞ターゲティングペプチドである。ペプチド部分は、約５アミノ酸〜約４０アミノ酸長の範囲であり得る。ペプチド部分は、安定性を増加させるためまたは立体構造的性質を指示するための、構造的修飾を有し得る。下記構造的修飾のいずれかを利用できる。
【０３２３】
６)化合物
ある側面において、ここに提供されるのは、図８１に示す式の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、ここで、
Ｒ１は
【化２】
2018516091.tif 000005
から選択され；
Ｒ３は、各々独立して、図８２に示すヌクレオチド間リンカーからなる群から選択され；
Ｌは、２部分を連結するリンカーであり、ここで、リンカーは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、
【化３】
2018516091.tif 000006
またはこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０３２４】
ある態様において、Ｒ１は
【化４】
2018516091.tif 000007
からなる群から選択される。
【０３２５】
他の態様において、Ｒ１は
【化５】
2018516091.tif 000008
である。
【０３２６】
他の態様において、Ｒ３は、各々、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、メチレンホスホネート、ホスホトリエステルおよびボラノホスフェートからなる群から独立して選択されるヌクレオチド間リンカーである。
【０３２７】
他の態様において、Ｒ３は、各々、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートおよびボラノホスフェートからなる群から独立して選択されるヌクレオチド間リンカーである。
【０３２８】
他の態様において、Ｒ３はホスホロチオエートである。
【０３２９】
他の態様において、Ｌは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖およびペプチドからなる群から選択される。
【０３３０】
他の態様において、Ｌは、エチレングリコール鎖またはペプチドから選択される。
【０３３１】
さらに他の態様において、Ｌは
【化６】
2018516091.tif 000009
である。
【０３３２】
さらに他の態様において、Ｌは
【化７】
2018516091.tif 000010
である。
【０３３３】
他の態様において、Ｌは
【化８】
2018516091.tif 000011
である。
【０３３４】
ある態様において、図８１に示す式の化合物は、図８３に示す式の化合物である。
【０３３５】
他の態様において、図８１に示す式の化合物は、図８３に示す式の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、ここで
Ｒ１は
【化９】
2018516091.tif 000012
であり；
Ｌは
【化１０】
2018516091.tif 000013
である。
【０３３６】
他の態様において、図８１に示す式の化合物は、図８３に示す式の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、ここで
Ｒ１は
【化１１】
2018516091.tif 000014
であり；
Ｌは
【化１２】
2018516091.tif 000015
である。
【０３３７】
他の側面において、ここに提供されるのは図８４に示す式の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、ここで
Ｒ１は
【化１３】
2018516091.tif 000016
からなる群から選択され；
Ｒ３は、各々独立して、図８２に示すヌクレオチド間リンカーからなる群から選択され；
Ｌは、２部分を連結するリンカーであり、ここで、リンカーは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、
【化１４】
2018516091.tif 000017
またはこれらの組み合わせからなる群から選択され；
Ｂは２以上のリンカー間の分岐点であり、ここで、分岐点はグリコール、アミノ酸または任意の多価有機種からなる群から選択される。
【０３３８】
ある態様において、Ｒ１は
【化１５】
2018516091.tif 000018
からなる群から選択される。
【０３３９】
他の態様において、Ｒ１は
【化１６】
2018516091.tif 000019
である。
【０３４０】
他の態様において、Ｒ３は、各々、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、メチレンホスホネート、ホスホトリエステルおよびボラノホスフェートからなる群から独立して選択されるヌクレオチド間リンカーである。
【０３４１】
他の態様において、Ｒ３は、各々、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートおよびボラノホスフェートからなる群から独立して選択されるヌクレオチド間リンカーである。
【０３４２】
他の態様において、Ｒ３はホスホロチオエートである。
【０３４３】
他の態様において、Ｌは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖およびペプチドからなる群から選択される。
【０３４４】
他の態様において、Ｌは、エチレングリコール鎖またはペプチドから選択される。
【０３４５】
さらに他の態様において、Ｌは
【化１７】
2018516091.tif 000020
である。
【０３４６】
さらに他の態様において、Ｌは
【化１８】
2018516091.tif 000021
である。
【０３４７】
他の態様において、Ｌは
【化１９】
2018516091.tif 000022
である。
【０３４８】
ある態様において、Ｂは２以上のリンカー間の分岐点であり、ここで、分岐点はグリコールまたはアミノ酸から選択される。他の態様において、分岐点はグリコールである。他の態様において、分岐点はアミノ酸である。
【０３４９】
図８４に示す式の化合物の他の態様において、Ｙは図８６に示すとおり定義される。
【０３５０】
他の側面において、ここに提供されるのは図８５に示す式の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、ここで
【０３５１】
Ｒ１は
【化２０】
2018516091.tif 000023
からなる群から選択され；
Ｒ３は、各々独立して、図８２に示すヌクレオチド間リンカーからなる群から選択され；
Ｌは、２部分を連結するリンカーであり、ここで、リンカーは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、
【化２１】
2018516091.tif 000024
またはこれらの組み合わせからなる群から選択され；
Ｂは２以上のリンカー間の分岐点であり、ここで、分岐点はグリコール、アミノ酸またはあらゆる多価有機種からなる群から選択される。
【０３５２】
ある態様において、Ｒ１は
【化２２】
2018516091.tif 000025
からなる群から選択される。
【０３５３】
他の態様において、Ｒ１は
【化２３】
2018516091.tif 000026
である。
【０３５４】
他の態様において、Ｒ３は、各々、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、メチレンホスホネート、ホスホトリエステルおよびボラノホスフェートからなる群から独立して選択されるヌクレオチド間リンカーである。
【０３５５】
他の態様において、Ｒ３は、各々、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートおよびボラノホスフェートからなる群から独立して選択されるヌクレオチド間リンカーである。
【０３５６】
他の態様において、Ｒ３はホスホロチオエートである。
【０３５７】
他の態様において、Ｌは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖およびペプチドからなる群から選択される。
【０３５８】
他の態様において、Ｌは、エチレングリコール鎖またはペプチドから選択される。
【０３５９】
さらに他の態様において、Ｌは
【化２４】
2018516091.tif 000027
である。
【０３６０】
さらに他の態様において、Ｌは
【化２５】
2018516091.tif 000028
である。
【０３６１】
他の態様において、Ｌは
【化２６】
2018516091.tif 000029
である。
【０３６２】
ある態様において、Ｂは２以上のリンカー間の分岐点であり、ここで、分岐点はグリコールまたはアミノ酸から選択される。他の態様において、分岐点はグリコールである。他の態様において、分岐点はアミノ酸である。
【０３６３】
図８５に示す式の化合物のある態様において、Ｙは図８６に示すとおり定義される。
【０３６４】
他の側面において、ここに提供されるのは図８７に示す式の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、ここで
Ｒ１は
【化２７】
2018516091.tif 000030
からなる群から選択され；
Ｒ３は、各々独立して、図８２に示すヌクレオチド間リンカーからなる群から選択され；
Ｌは、２部分を連結するリンカーであり、ここで、リンカーは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、
【化２８】
2018516091.tif 000031
またはこれらの組み合わせからなる群から選択され；
Ｒ２は、アルキル鎖(例えば、Ｃ１−６、Ｃ１−１０、Ｃ１−２０、Ｃ１−３０またはＣ１−４０)、ビタミン、リガンド、ペプチド、生理活性コンジュゲート(スフィンゴ糖脂質、多不飽和脂肪酸、セコステロイド、ステロイドホルモンまたはステロール脂質を含むが、これらに限定されない)、
【化２９】
2018516091.tif 000032
からなる群から選択される。
【０３６５】
ある態様において、Ｒ１は
【化３０】
2018516091.tif 000033
からなる群から選択される。
【０３６６】
他の態様において、Ｒ１は
【化３１】
2018516091.tif 000034
である。
【０３６７】
他の態様において、Ｒ２は
【化３２】
2018516091.tif 000035
からなる群から選択される。
【０３６８】
他の態様において、Ｒ３は、各々、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、メチレンホスホネート、ホスホトリエステルおよびボラノホスフェートからなる群から独立して選択されるヌクレオチド間リンカーである。
【０３６９】
他の態様において、Ｒ３は、各々、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートおよびボラノホスフェートからなる群から独立して選択されるヌクレオチド間リンカーである。
【０３７０】
他の態様において、Ｒ３はホスホロチオエートである。
【０３７１】
他の態様において、Ｌは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖およびペプチドからなる群から選択される。
【０３７２】
他の態様において、Ｌは、エチレングリコール鎖またはペプチドから選択される。
【０３７３】
さらに他の態様において、Ｌは
【化３３】
2018516091.tif 000036
である。
【０３７４】
さらに他の態様において、Ｌは
【化３４】
2018516091.tif 000037
である。
【０３７５】
他の態様において、Ｌは
【化３５】
2018516091.tif 000038
である。
【０３７６】
ある態様において、図８７に示す式の化合物は、図８８に示す式の化合物である。
【０３７７】
他の態様において、図８７に示す式の化合物は、図８８またはその薬学的に許容される塩であり、ここで
Ｒ１は
【化３６】
2018516091.tif 000039
Ｒ２は
【化３７】
2018516091.tif 000040
である。
【０３７８】
他の側面において、ここに提供されるのは図８９に示す式の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、ここで
Ｒ１は
【化３８】
2018516091.tif 000041
からなる群から選択され；
Ｒ３は、各々独立して、図８２に示すヌクレオチド間リンカーからなる群から選択され；
Ｒ２は、アルキル鎖(例えば、Ｃ１−６、Ｃ１−１０、Ｃ１−２０、Ｃ１−３０またはＣ１−４０)、ビタミン、リガンド、ペプチド、生理活性コンジュゲート(スフィンゴ糖脂質、多不飽和脂肪酸、セコステロイド、ステロイドホルモンまたはステロール脂質を含むが、これらに限定されない)、
【化３９】
2018516091.tif 000042
からなる群から選択される。
【０３７９】
ある態様において、Ｒ１は
【化４０】
2018516091.tif 000043
からなる群から選択される。
【０３８０】
他の態様において、Ｒ１は
【化４１】
2018516091.tif 000044
である。
【０３８１】
他の態様において、Ｒ２は
【化４２】
2018516091.tif 000045
からなる群から選択される。
【０３８２】
他の態様において、Ｒ３は、各々、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、メチレンホスホネート、ホスホトリエステルおよびボラノホスフェートからなる群から独立して選択されるヌクレオチド間リンカーである。
【０３８３】
他の態様において、Ｒ３は、各々、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートおよびボラノホスフェートからなる群から独立して選択されるヌクレオチド間リンカーである。
【０３８４】
他の態様において、Ｒ３はホスホロチオエートである。
【０３８５】
ある態様において、図８９に示す式の化合物は図９０に示す式の化合物である。
【０３８６】
ある態様において、図８９に示す式の化合物は図９０に示す式の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、ここで
Ｒ１は
【化４３】
2018516091.tif 000046
であり、
Ｒ２は
【化４４】
2018516091.tif 000047
である。
【０３８７】
ある態様において、図８９に示す式の化合物は図９０に示す式の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、ここで
Ｒ１は
【化４５】
2018516091.tif 000048
であり、
Ｒ２は
【化４６】
2018516091.tif 000049
である。
【０３８８】
ある態様において、図８９に示す式の化合物は図９０に示す式の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、ここで
Ｒ１は
【化４７】
2018516091.tif 000050
であり、
Ｒ２は
【化４８】
2018516091.tif 000051
である。
【０３８９】
ある態様において、図８９に示す式の化合物、ｉｓ  図９０に示す式の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、ここで
Ｒ１は
【化４９】
2018516091.tif 000052
であり、
Ｒ２は
【化５０】
2018516091.tif 000053
である。
【０３９０】
ある態様において、図８９に示す式の化合物、ｉｓ  図９０に示す式の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、ここで
Ｒ１は
【化５１】
2018516091.tif 000054
であり、
Ｒ２は
【化５２】
2018516091.tif 000055
である。
【０３９１】
ある態様において、図８９に示す式の化合物、ｉｓ  図９０に示す式の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、ここで
Ｒ１は
【化５３】
2018516091.tif 000056
であり、
Ｒ２は
【化５４】
2018516091.tif 000057
である。
【０３９２】
VIII. 核酸、ベクターおよび宿主細胞を導入する方法
本発明のＲＮＡサイレンシング剤を、細胞(例えば、神経系細胞)に直接導入できる(すなわち、細胞内)、または細胞外に、空洞、間質性空間、生物の循環に、経口的に導入しまたは核酸含有溶液に細胞または生物を浸すことにより導入し得る。血管または血管外循環、血液またはリンパ系および脳脊髄液は、核酸を導入し得る部位である。
【０３９３】
本発明のＲＮＡサイレンシング剤を、核酸含有溶液の注入、核酸で覆われた粒子による被曝(bombardment)、細胞または生物の核酸溶液への浸漬または核酸存在下の細胞膜のエレクトロポレーションを含む当分野で知られる核酸送達方法を使用して導入できる。脂質介在担体輸送、化学的介在輸送およびカチオン性リポソームトランスフェクション、たとえばリン酸カルシウムなどのような、核酸を細胞に導入する他の既知方法を使用し得る。核酸は、次の活性(細胞による核酸取り込みの増強および他の手段による標的遺伝子の阻害増強)の１以上を実現する他の成分とともに導入し得る。
【０３９４】
核酸を導入する物理的方法は、ＲＮＡ含有溶液の注入、ＲＮＡで覆われた粒子による被曝、細胞または生物のＲＮＡ溶液への浸漬またはＲＮＡ存在下の細胞膜のエレクトロポレーションを含む。ウイルス粒子に包装されたウイルス構築物は、発現構築物の細胞への効率的導入および発現構築物によりコードされるＲＮＡの転写の両方を達成する。脂質介在担体輸送、化学的介在輸送、例えばリン酸カルシウムなどのような核酸を細胞に導入する他の既知方法を使用し得る。それ故に、ＲＮＡは、次の活性(細胞によるＲＮＡ取り込みの増強、一本鎖アニーリングの阻害、一本鎖安定化または他の方法による標的遺伝子の阻害増強)の１以上を実現する他の成分とともに導入し得る。
【０３９５】
ＲＮＡを、細胞(例えば、神経系細胞)に直接導入できる(すなわち、細胞内に)または細胞外に、空洞、間質性空間、生物の循環に、経口的に導入しまたはＲＮＡ含有溶液に細胞または生物を浸すことにより導入し得る。血管または血管外循環、血液またはリンパ系および脳脊髄液は、ＲＮＡを導入し得る部位である。
【０３９６】
標的遺伝子を有する細胞は、生殖細胞系または体細胞、全能性細胞または多能性細胞、分裂細胞または非分裂細胞、柔組織細胞または上皮細胞、不死化細胞またはトランスフォーム細胞などに由来し得る。細胞は幹細胞または分化細胞であり得る。分化した細胞型は、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮、ニューロン、膠細胞、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、白血球、顆粒球、ケラチン生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞および内分泌または外分泌腺の細胞を含む。
【０３９７】
特定の標的遺伝子および送達する二本鎖ＲＮＡ物質の用量により、この過程は、標的遺伝子の機能の部分的または完全喪失をもたらし得る。標的細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％以上における遺伝子発現の減少または喪失の阻害が例示される。遺伝子発現の阻害は、標的遺伝子からのタンパク質および／またはｍＲＮＡ産物のレベルの不在(または観察可能な減少)をいう。特異性は、細胞の他の遺伝子に明らかな影響を及ぼすことなく、標的遺伝子を阻害する能力をいう。阻害の結果は、細胞または生物の外向き性質の試験(下記実施例に示すとおり)またはＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイでの遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)、ウェスタンブロッティング、放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)、他の免疫アッセイおよび蛍光標示式細胞分取(ＦＡＣＳ)のような生化学的技術により確認できる。
【０３９８】
細胞株または生物全体におけるＲＮＡ介在阻害について、遺伝子発現を、タンパク質産物が容易にアッセイされるレポーターまたは薬物抵抗性遺伝子の使用により便利にアッセイされる。このようなレポーター遺伝子は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ＡＨＡＳ)、アルカリホスファターゼ(ＡＰ)、ベータガラクトシダーゼ(ＬａｃＺ)、ベータグルクロニダーゼ(ＧＵＳ)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)、ルシフェラーゼ(Ｌｕｃ)、ノパリンシンターゼ(ＮＯＳ)、オクトピンシンターゼ(ＯＣＳ)およびそれらの誘導体を含む。複数の選択可能マーカーが利用可能であり、これはアンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシンおよびテトラサイクリンに対する耐性を付与する。遺伝子発現量のアッセイによる定量により、本発明によって処理されない細胞と比較して、１０％、３３％、５０％、９０％、９５％または９９％より大きい程度の阻害の決定を可能にする。注入物質の低用量およびＲＮＡｉ剤投与後のより長い時間経過は、細胞の小さい分画の阻害をもたらし得る(例えば、少なくとも標的細胞の１０％、２０％、５０％、７５％、９０％または９５％)。細胞における遺伝子発現の定量は、標的ｍＲＮＡの蓄積または標的タンパク質の翻訳のレベルでの阻害の類似量を示し得る。一例として、阻害の効率は、細胞における遺伝子産物の評価により決定し得る；ｍＲＮＡは阻害性二本鎖ＲＮＡに使用する領域外のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブで検出できるし、また翻訳ポリペプチドはその領域のポリペプチド配列に対して誘導された抗体で検出できる。
【０３９９】
ＲＮＡを、細胞あたり少なくとも一コピーの送達を可能にする量で導入し得る。高用量(例えば、少なくとも細胞あたり５、１０、１００、５００または１０００コピー)の物質は、より有効な阻害を生じ得る；低用量も特異的適用に対して有用であり得る。
【０４００】
例示的側面において、本発明のＲＮＡｉ剤(例えば、ｈｔｔ標的配列をターゲティングするｓｉＲＮＡ)の有効性を、細胞、特に、ニューロン(例えば、線条体または皮質神経細胞栄養系および／または一次ニューロン)における変異体ｍＲＮＡ(例えば、ｈｔｔ  ｍＲＮＡおよび／またはハンチンチンタンパク質の産生)を特異的に分解する能力について試験する。また細胞ベースの検証アッセイに適当なのは、他の容易にトランスフェクト可能な細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞またはＣＯＳ細胞である。細胞を、ヒト野生型または変異体ｃＤＮＡ(例えば、ヒト野生型または変異体ハンチンチンｃＤＮＡ)でトランスフェクトする。ＵループｍＲＮＡからｓｉＲＮＡを産生できる標準的ｓｉＲＮＡ、修飾ｓｉＲＮＡまたはベクターを共トランスフェクトする。標的ｍＲＮＡ(例えば、ハンチンチンｍＲＮＡ)および／または標的タンパク質(例えば、ハンチンチンタンパク質)の選択的減少を測定する。標的ｍＲＮＡまたはタンパク質の減少を、ＲＮＡｉ剤非存在下またはｈｔｔ  ｍＲＮＡを標的としないＲＮＡｉ剤存在下の標的ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルと比較できる。外因的に導入したｍＲＮＡまたはタンパク質(または内在性ｍＲＮＡまたはタンパク質)を、比較目的でアッセイできる。標準的トランスフェクション技術にいくぶん抵抗性であることが知られる神経細胞を使用するとき、受動的取り込みによりＲＮＡｉ剤(例えば、ｓｉＲＮＡ)を導入することが望ましい。
【０４０１】
組み換えアデノ随伴ウイルスおよびベクター
ある例示的態様において、組み換えアデノ随伴ウイルス(ｒＡＡＶ)およびその関連ベクターを使用して、１以上のｓｉＲＮＡを細胞、例えば、神経系細胞(例えば、脳細胞)に送達できる。ＡＡＶは、多くの細胞型への感染が可能であるが、感染効率は、カプシドタンパク質の配列により決定される血清型により変わる。いくつかの天然ＡＡＶ血清型が同定されており、血清型１〜９が組み換えＡＡＶに最も一般的に使用されている。ＡＡＶ−２が最も広く研究され、公開されている血清型である。ＡＡＶ−ＤＪ系は、血清型ＡＡＶ−ＤＪおよびＡＡＶ−ＤＪ／８を含む。これらの血清型を、インビトロで(ＡＡＶ−ＤＪ)および種々の細胞および組織においてインビボで(ＡＡＶ−ＤＪ／８)、改善された形質導入効率を有するハイブリッドカプシドを備えたＡＡＶを産生するための複数ＡＡＶ血清型のＤＮＡシャッフリングにより作製した。
【０４０２】
特定の態様において、広範な中枢神経系(ＣＮＳ)送達が、組み換えアデノ随伴ウイルス７(ｒＡＡＶ７)、ＲＡＡＶ９およびｒＡＡＶ１０または他の適当なｒＡＡＶの血管内送達により達成できる(Zhang et al. (2011)Mol. Ther. 19(8):1440-8. doi: 10.1038/mt.2011.98. Epub 2011May 24)。ｒＡＡＶおよびその関連ベクターは文献から周知であり、ＵＳ特許出願２０１４／０２９６４８６号、２０１０／０１８６１０３号、２００８／０２６９１４９号、２００６／００７８５４２号および２００５／０２２０７６６号に記載れ、この各々を、引用によりその全体を全ての目的で本明細書に包含させる。
【０４０３】
ｒＡＡＶを、当分野で知られる任意の適切な方法により組成物で対象に送達し得る。ｒＡＡＶを生理学的適合性担体中(すなわち、組成物中)に懸濁し、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、モルモット、ハムスター、ニワトリ、七面鳥、非ヒト霊長類(例えば、マカク)などのような対象、すなわち、宿主動物に投与し得る。ある態様において、宿主動物は非ヒト宿主動物である。
【０４０４】
１以上のｒＡＡＶの哺乳動物対象への送達は、例えば、筋肉内注射または哺乳動物対象の血流への投与により実施できる。血流への投与は、静脈、動脈または任意の他の血液導管への注射によるものであり得る。ある態様において、１以上のｒＡＡＶを、単独肢灌流法で単独肢血流に投与し、これは、外科分野で周知の技術であり、当業者がｒＡＡＶウイルス粒子投与前に、全身循環から単独肢を独立させることを本質的に可能とする方法である。米国特許６,１７７,４０３号に記載の単独肢灌流技術の変法も、筋肉細胞または組織への形質導入を増強する可能性のために、単独肢の脈管構造にウイルス粒子を投与するために当業者により用いられ得る。さらに、ある例において、ウイルス粒子を、対象の中枢神経系(ＣＮＳ)に送達することが望ましいことがある。“ＣＮＳ”は、脊椎動物の脳および脊髄の全細胞および組織を意味する。それ故に、本用語は、神経細胞、膠細胞、星状膠細胞、脳脊髄液(ＣＳＦ)、間質性空間、骨、軟骨などを含むが、これらに限定されない。組み換えＡＡＶは、ＣＮＳまたは脳に、直接、例えば、脳室領域への、ならびに線条体(例えば、線条体の尾状核または被殻)、脊髄および神経筋接合部または小脳葉への、針、カテーテルまたは関連デバイスでの注射により、定位的注射によるような当分野で知られる神経外科的技術により、送達し得る(例えば、Stein et al., J Virol 73:3424-3429, 1999; Davidson et al., PNAS 97:3428-3432, 2000; Davidson et al., Nat. Genet. 3:219-223, 1993;およびAlisky and Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000参照)。
【０４０５】
本発明の組成物は、ｒＡＡＶを単独でまたは１以上の他のウイルス(例えば、１以上の異なるトランスジーンを有する第二ｒＡＡＶ)と組み合わせて含み得る。ある態様において、組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の異なるｒＡＡＶを含み、各々、１以上の異なるトランスジーンを含む。
【０４０６】
ｒＡＡＶの有効量は、動物、標的所望の組織の標的感染に十分な量である。ある態様において、ｒＡＡＶの有効量は、安定な体細胞トランスジェニック動物モデルの提供に十分な量である。有効量は、主に対象の種、年齢、体重、健康および標的する組織のような因子により、従って、動物および組織毎に異なり得る。例えば、１以上のｒＡＡＶの有効量は、一般に約１０９〜１０１６ゲノムコピー含有溶液約１ml〜約１００mlの範囲である。一部の症例では、約１０１１〜１０１２  ｒＡＡＶゲノムコピーの量が適切である。ある態様において、１０１２  ｒＡＡＶゲノムコピーが、心臓、肝臓および膵臓組織の標的に有効である。一部の症例では、安定なトランスジェニック動物が、ｒＡＡＶの複数用量により産生される。
【０４０７】
ある態様において、ｒＡＡＶ組成物は、特に高ｒＡＡＶ濃度が存在するとき(例えば、約１０１３ゲノムコピー／mL以上)、組成物中のＡＡＶ粒子の凝集を低減するように製剤する。ｒＡＡＶの凝集を低減する方法は当分野で周知であり、例えば、界面活性剤添加、ｐＨ調節、塩濃度調節などを含む(例えば、内容を引用により本明細書に包含させるWright et al. (2005) Molecular Therapy 12:171-178参照)。
【０４０８】
“組み換えＡＡＶ(ｒＡＡＶ)ベクター”は、最低限、トランスジーンおよびその制御配列および５’および３’ＡＡＶ末端逆位配列(ＩＴＲ)を含む。カプシドタンパク質に包装され、選択標的細胞に送達されるのは、この組み換えＡＡＶベクターである。ある態様において、トランスジーンは、目的のポリペプチド、タンパク質、機能的ＲＮＡ分子(例えば、ｓｉＲＮＡ)または他の遺伝子産物をコードする、ベクター配列に異種性の核酸配列である。核酸コーディング配列を、標的組織の細胞におけるトランスジーン転写、翻訳および／または発現を可能にする方法で、制御成分と操作可能に連結する。
【０４０９】
ベクターのＡＡＶ配列は、一般にｃｉｓ作動性５’および３’末端逆位(ＩＴＲ)配列を含む(例えば、B. J. Carter, in “Handbook of Parvoviruses”, ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168 (1990)参照)。ＩＴＲ配列は、通常約１４５塩基対長である。ある態様において、実質的にＩＴＲをコードする配列全体が分子において使用されるが、これらの配列のある程度の微細な修飾は許容される。これらのＩＴＲ配列を修飾する能力は、当分野の技術範囲内である(例えば、Sambrook et al, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); and K. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)のような参考書参照)。本発明で用いるこのような分子の例は、選択トランスジーン配列および関連する制御要素が５’および３’ＡＡＶ  ＩＴＲ配列が横にある、トランスジーンを含む“ｃｉｓ作動性”プラスミドである。ＡＡＶ  ＩＴＲ配列は、ここにさらに記載する哺乳動物ＡＡＶタイプを含む、あらゆる既知ＡＡＶから得ることができる。
【０４１０】
IX. 処置方法
本発明は、全体または一部が、機能獲得型変異体タンパク質が原因の、疾患または障害のリスクにある(または疑われる)対象における予防および治療両方の方法を提供する。ある態様において、疾患または障害は、トリヌクレオチド反復疾患または障害である。他の態様において、疾患または障害は、ポリグルタミン障害である。好ましい態様において、疾患または障害は、ハンチンチンの発現と関連する障害であり、ハンチンチンの変改、特にＣＡＧ反復コピー数の増幅が、臨床的顕在化がハンチントン病患者に見られるものを含むように、ハンチンチン遺伝子(構造または機能)またはハンチンチンタンパク質(構造または機能または発現)の欠損をもたらす。
【０４１１】
ここで使用する“処置”または“処置する”は疾患または障害、疾患または障害の症状または疾患の素因を治療、治癒、軽減、軽快、改変、矯正、向上、改善または作用を目的とした、患者への治療剤(例えば、ＲＮＡ剤またはそれをコードするベクターまたはトランスジーン)の適用または投与または疾患または障害、疾患または障害の症状または疾患または障害の素因を有する患者から単離した単離組織または細胞株への治療剤の適用または投与として定義する。
【０４１２】
ある側面において、本発明は、対象に治療剤(例えば、ＲＮＡｉ剤またはそれをコードするベクターまたはトランスジーン)を投与することによる、対象における上記の疾患または障害を予防する方法を提供する。疾患の危険がある対象は、例えば、ここに記載する診断または予後アッセイのいずれかまたは組み合わせにより同定できる。予防剤の投与は、疾患または障害が阻止される、あるいは、その進行が遅延されるように、疾患または障害の特徴症状の顕在化前に行い得る。
【０４１３】
本発明の他の側面は、対象を治療的に処置する、すなわち、疾患または障害の症状の発症を変える方法に関する。例示的態様において、本発明の調節的方法は、機能獲得型変異体を発現する細胞と、遺伝子内の標的配列(例えば、配列番号１、２または３)に特異的な治療剤(例えば、ＲＮＡｉ剤またはそれをコードするベクターまたはトランスジーン)を、遺伝子での配列特異的干渉が達成されるように接触させることを含む。これらの方法は、インビトロで(例えば、細胞を薬剤と培養するにより)、あるいは、インビボで(例えば、対象に薬剤を投与することにより)実施できる。
【０４１４】
処置の予防および治療両方の方法に関して、薬理ゲノミクスの分野から得られた知識に基づき、このような処置は特異的にあつらえても修飾してもよい。ここで使用する“薬理ゲノミクス”は、遺伝子配列決定、統計遺伝学、臨床開発および市場での薬物に対する遺伝子発現解析のようなゲノミクステクノロジーの適用をいう。より具体的に、本用語は、患者の遺伝子が、どのように薬物に対する応答を決定するかの研究をいう(例えば、患者の“薬物応答表現型”または“薬物応答遺伝子型”)。それ故に、本発明の他の側面は、本発明の標的遺伝子分子または標的遺伝子モジュレーターでの個々の予防または治療処置を、個々の薬物応答遺伝子型に応じてあつらえる方法を提供する。薬理ゲノミクスは、臨床医または内科医が、処置により最も利益を受ける患者への標的予防または治療処置を実施するおよび毒性薬物関副作用を経験するであろう患者の処置を避けることを可能にする。
【０４１５】
治療剤を適切な動物モデルで試験できる。例えば、ここに記載するＲＮＡｉ剤(または発現、それをコードするベクターまたはトランスジーン)を動物モデルで使用して、該薬剤での処置の有効性、毒性または副作用を決定できる。あるいは、治療剤を動物モデルで使用して、このような薬剤の作用機序を決定できる。例えば、薬剤を動物モデルに使用して、このような薬剤での処置の有効性、毒性または副作用を決定できる。あるいは、薬剤を動物モデルで使用して、このような薬剤の作用機序を決定できる。
【０４１６】
本発明のＲＮＡサイレンシング剤を含む医薬組成物を、ハンチントン病のような神経障害を有するまたは発症する危険があると診断されたあらゆる患者に投与できる。ある態様において、患者は神経障害と診断され、患者はその他は一般に良好な健康状態である。例えば、患者は、病状末期ではなく、患者は、診断後少なくとも２年、３年、５年以上生存する可能性がある。患者を、診断後すぐに処置してよく、または処置は、患者が、パーキンソン病患者における運動変動およびジスキネジアのような、より衰弱性の症状を経験するまで遅らせてよい。他の態様において、患者は、疾患の最終段階に達していない。
【０４１７】
神経系細胞への取り込み増強のために修飾されたＲＮＡサイレンシング剤を、約１.４mg／体重kgまたは１０mg／体重kg、５mg／体重kg、２mg／体重kg、１mg／体重kg、０.５mg／体重kg、０.１mg／体重kg、０.０５mg／体重kg、０.０１mg／体重kg、０.００５mg／体重kg、０.００１mg／体重kg、０.０００５mg／体重kg、０.０００１mg／体重kg、０.００００５mg／体重kgまたは０.００００１mg／体重kg未満および２００nmoleのＲＮＡ剤(例えば、約４.４×１０１６コピー)／体重kg未満または１５００nmole、７５０nmole、３００nmole、１５０nmole、７５nmole、１５nmole、７.５nmole、１.５nmole、０.７５nmole、０.１５nmole、０.０７５nmole、０.０１５nmole、０.００７５nmole、０.００１５nmole、０.０００７５nmole、０.０００１５nmoleのＲＮＡサイレンシング剤／体重kg未満の単位用量で投与できる。単位用量は、例えば、注射(例えば、静脈内または筋肉内、髄腔内または直接脳に)、吸入用量または局所適用により投与できる。特に好ましい用量は、２、１または０.１mg／体重kg未満である。
【０４１８】
臓器へ直接(例えば、脳へ直接)のＲＮＡサイレンシング剤の送達は、臓器あたり約０.００００１mg〜約３mg程度の用量または好ましくは臓器あたり約０.０００１〜０.００１mg、臓器あたり約０.０３〜３.０mg、眼あたり約０.１〜３.０mgまたは臓器あたり約０.３〜３.０mgの用量であり得る。用量は、神経疾患または障害、例えば、ハンチントン病の処置または予防に有効な用量である。ある態様において、単位用量を、１日１回より少ない、例えば、２日毎、４日毎、８日毎または３０日毎より少ない頻度で投与する。他の態様において、単位用量を一定頻度で投与しない(例えば、規則的頻度ではない)。例えば、単位用量を一度に投与し得る。ある態様において、有効用量を他の伝統的治療モダリティと投与する。
【０４１９】
ある態様において、対象に、初期用量および１以上の維持用量のＲＮＡサイレンシング剤を投与する。１以上の維持用量は、一般に初期用量より低く、例えば、初期用量の半分である。維持レジメンは、対象を、１日あたり０.０１μg〜１.４mg／体重kg、例えば、１日あたり１０、１、０.１、０.０１、０.００１または０.００００１mg／体重kgの１以上の用量で処置することを含み得る。維持用量は、好ましくは５日、１０日または３０日に１回未満で投与する。さらに、処置レジメンは、特定の疾患の性質、その重症度および患者の全体的状態によって変わる一定期間で終了し得る。好ましい態様において、用量は１日１回未満、例えば、２４時間、３６時間、４８時間以上で１回以下、例えば、５日または８日に１回以下で送達し得る。処置後、患者を、状態の変化および疾患状態の症状の軽減についてモニターし得る。化合物の用量は、患者が現在の用量レベルで顕著に応答しないならば増やしてよく、または疾患状態の症状の軽減が観察され、疾患状態が消失し、または望まない副作用が観察されたならば用量を減らしてよい。
【０４２０】
有効用量を、所望によりまたは特定の状況下で適切と考えるならば単一用で量または２以上の用量で投与してよい。反復を容易にするまたは頻繁な注入が望まれるならば、送達デバイス、例えば、ポンプ、半永久的ステント(例えば、静脈内、腹腔内、大槽内または嚢内)またはリザーバーの移植が賢明である。ある態様において、医薬組成物は、複数のＲＮＡサイレンシング剤種を含む。他の態様において、ＲＮＡサイレンシング剤種は、天然に存在する標的配列に関して、他の種と非重複および非隣接である配列を有する。他の態様において、複数のＲＮＡサイレンシング剤種は、異なる天然に存在する標的遺伝子に特異的である。他の態様において、ＲＮＡサイレンシング剤は、アレル特異的である。他の態様において、複数のＲＮＡサイレンシング剤種は、２以上の標的配列(例えば、２、３、４、５、６以上の標的配列)を標的とする。
【０４２１】
処置が成功した後、疾患状態の再発を防止するために患者を維持治療に付すのが望ましい可能性があり、ここで、本発明の化合物を、０.０１μg〜１００ｇ／kg体重範囲の維持用量で投与する(米国特許６,１０７,０９４号参照)。
【０４２２】
ＲＮＡサイレンシング剤組成物の濃度は、障害の処置または予防にまたはヒトにおける生理学的状態の制御に有効であるのに十分な量である。投与するＲＮＡサイレンシング剤の濃度または量は、薬剤および投与方法、例えば経鼻、バッカルまたは肺について決定されるパラメータによる。例えば、経鼻製剤は、経鼻経路の刺激またはヒリヒリ感を避けるために、ある成分の濃度を遥かに下げる必要がある傾向にある。適当な経鼻製剤を提供するために、経口製剤を１０〜１００倍希釈することが望ましいことがある。
【０４２３】
疾患または障害の重症度、先の処置、対象の一般的健康および／または年齢および存在する他の疾患を含むが、これらに限定されないある因子は、対象の効果的処置に必要な用量に影響し得る。さらに、治療有効量のＲＮＡサイレンシング剤での対象の処置は、単回処置を含んでよく、または、好ましくは、連続的処置を含み得る。処置のためのＲＮＡサイレンシング剤の有効用量は、特定の処置中に増加させても減少させてもよいことも認識される。用量の変更は、ここに記載する診断アッセイの結果であり、明らかである。例えば、対象を、ＲＮＡサイレンシング剤組成物投与後にモニターできる。モニタリングの情報に基づき、ＲＮＡサイレンシング剤組成物のさらなる量を投与できる。
【０４２４】
投薬は重症度および処置する疾患状態により、処置の経過は数日〜数ヶ月または治癒するまでまたは疾患状態の軽減が達成されるまで続く。最適投薬スケジュールは患者体内の薬物蓄積の測定から計算できる。当業者は、最適用量、投与方法および反復率を容易に決定できる。最適用量は、個々の化合物の相対的効力により変わり得て、一般にインビトロおよびインビボ動物モデルで有効と判明したＥＣ５０に基づき概算され得る。ある態様において、動物モデルは、標的ＲＮＡ、例えば、神経系細胞で発現されるＲＮＡを産生するヒト遺伝子、例えば、遺伝子を発現するトランスジェニック動物を含む。トランスジェニック動物は、対応する内在性ＲＮＡが欠損していてよい。他の態様において、試験用組成物は、少なくとも内部領域において、動物モデルにおける標的ＲＮＡとヒトにおける標的ＲＮＡの間で保存されている配列に、相補的であるＲＮＡサイレンシング剤を含む。
【０４２５】
Ｘ. 医薬組成物および投与方法
本発明は、下記のとおり予防および／または治療処置のための上記薬剤の使用に関する。従って、本発明のモジュレーター(例えば、ＲＮＡｉ剤)を、投与に適する医薬組成物に組み込み得る。このような組成物は、一般に核酸分子、タンパク質、抗体または調節化合物および薬学的に許容される担体を含む。ここで使用する用語“薬学的に許容される担体”は、医薬投与と適合する任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当分野で周知である。何らかの慣用の媒体または薬剤が活性化合物と非適合性でない限り、組成物におけるその使用が企図される。補助的活性化合物も組成物に組み込み得る。
【０４２６】
本発明の医薬組成物を、意図する投与経路に適合するように製剤する。投与経路の例は、非経腸、例えば、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、筋肉内、経口(例えば、吸入)、経皮(局所)および経粘膜投与を含む。ある例示的態様において、本発明の医薬組成物は、線条体内(ＩＳ)投与、脳室内(ＩＣＶ)投与および髄腔内(ＩＴ)投与(例えば、ポンプ、注入などにより)を含むが、これらに限定されない投与経路により脳脊髄液(ＣＳＦ)に送達される。非経腸、皮内または皮下適用に使用する溶液または懸濁液は、次の成分を含み得る：注射用水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗細菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；アセテート、シトレートまたはホスフェートのような緩衝液および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような張性調節用薬剤。ｐＨを、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調節できる。非経腸製剤は、アンプル、使い捨てシリンジまたはガラスもしくはプラスチック製複数用量バイアルに充填する。
【０４２７】
注射使用に適する医薬組成物は、無菌水溶液(水可溶性であるとき)または分散剤および無菌注射用溶液または即時製剤用無菌粉末を含む。静脈内、ＩＳ、ＩＣＶおよび／またはＩＴ投与について、適当な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ(BASF、Parsippany、N.J.)またはリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)を含む。いずれの場合も、組成物は無菌でなければならず、容易な注射性(syringability)を有する程度に流体でなければならない。製造および保存条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染に対して保護されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)および適当なそれらの混合物を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適正な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散剤の場合必要な粒子径の維持によりおよび界面活性剤の使用により維持できる。微生物の作用の予防は、種々の抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成できる。多くの場合、組成物に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを包含させるのが好ましい。注射用組成物の吸収延長は、組成物に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを添加することによりもたらされる。
【０４２８】
無菌注射用溶液は、必要な量の活性化合物を、必要に応じて、上記成分の一つまたは組み合わせと適切な溶媒に取り込み、続いて滅菌濾過することにより製造できる。一般に、分散剤は、基本分散媒体および上記からの必要な他の成分を含む、無菌媒体に活性化合物を取り込むことにより製造する。無菌注射用溶液の製剤用無菌粉末の場合、製剤の好ましい方法は、先に無菌濾過した溶液から活性成分と何らかの所望の追加成分の粉末を産生する真空乾燥および凍結乾燥である。
【０４２９】
経口組成物は、一般に不活性希釈剤または可食担体を含む。それらはゼラチンカプセルに充填されるかまたは錠剤に圧縮される。経口治療投与のために、活性化合物を錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形で添加物と共に組み込み、使用できる。経口組成物はまた洗口液として使用する流体担体を使用しても製造でき、ここで、流体担体中の化合物を経口的に適用し、クチュクチュし、吐き出し、または嚥下する。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバント物質が組成物の一部として包含され得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、次の成分または類似性質の化合物のいずれかを含み得る：微結晶セルロース、トラガカントガムまたはゼラチンのような結合剤；デンプンまたはラクトースのような添加物、アルギン酸、Primogelまたはコーンデンプンのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはSterotesのような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような流動促進剤；スクロースまたはサッカリンのような甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジフレーバーのような風味剤。
【０４３０】
吸入による投与について、化合物は、適当な噴射剤、例えば、二酸化炭素のようなガスを含む加圧容器またはディスペンサーからエアロゾルスプレーの形でまたはネブライザーで送達される。
【０４３１】
全身投与はまた経粘膜または経皮手段にもよる。経粘膜または経皮投与のために、透過すべき障壁に適切な浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は、一般に当分野で知られ、例えば、経粘膜投与、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、経鼻スプレーまたは坐薬を経て達成できる。経皮投与について、活性化合物を当分野で一般に知られるとおり、軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームに製剤する。
【０４３２】
化合物を、坐薬(例えば、カカオバターおよび他のグリセリドのような慣用の坐薬基剤と)または直腸送達のような保持浣腸の形にも製剤できる。
【０４３３】
ＲＮＡサイレンシング剤を、McCaffrey et al. (2002), Nature, 418(6893), 38-9 (流体力学トランスフェクション); Xia et al. (2002), Nature Biotechnol., 20(10), 1006-10 (ウイルス介在送達);またはPutnam (1996), Am. J. Health Syst. Pharm. 53(2), 151-160, erratum at Am. J. Health Syst. Pharm. 53(3), 325 (1996)に記載の方法を含むが、これらに限定されない当分野で知られる方法を使用して、トランスフェクションまたは感染によっても送達できる。
【０４３４】
ＲＮＡサイレンシング剤をまた、ＤＮＡワクチンのような核酸剤投与に適するあらゆる方法も送達できる。これらの方法は、遺伝子銃、バイオ注射器および皮膚パッチならびに米国特許６,１９４,３８９号に開示のマイクロ粒子ＤＮＡワクチンテクノロジーおよび米国特許６,１６８,５８７号に開示のような粉末形態ワクチンの哺乳動物経皮無針ワクチン接種のような無針方法を含む。さらに、とりわけ、Hamajima et al. (1998), Clin. Immunol. Immunopathol., 88(2), 205-10に開示のような、鼻腔内送達が可能である。リポソーム(例えば、米国特許６,４７２,３７５号に記載)およびマイクロカプセル封入も使用できる。生分解性標的可能微粒子送達系も使用できる(例えば、米国特許６,４７１,９９６号に記載)。
【０４３５】
ある態様において、活性化合物を、インプラントおよびマイクロカプセル封入送達系を含む、制御送達製剤のような、化合物を身体からの急速な排除に対して保護する担体と製造する。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸のような生分解性、生体適合性のポリマーを使用できる。このような製剤の製剤方法は当業者には明らかである。物質をまたAlza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から購入することができる。リポソーム懸濁液(ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞に標的化したリポソームを含む)も薬学的に許容される担体として使用できる。これらは、例えば、米国特許４,５２２,８１１号に記載のような、当業者に知られる方法で製造できる。
【０４３６】
投与の容易さおよび用量の均一性のために、経口または非経腸組成物を用量単位で製剤するのが特に有益である。ここで使用する用量単位形態は、処置する対象のための単位用量として適する物理的に分離された単位をいう。各単位は、必要な医薬担体と共に、所望の治療効果を生じるように予定された量の活性化合物を含む。本発明の用量単位の仕様は、活性化合物および達成すべき特定の治療効果の特異的特徴および個体の処置のための活性化合物の製剤に固有の制約に必要とされ、直接的に依存する。
【０４３７】
このような化合物の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０(集団の５０％に致死の用量)およびＥＤ５０(集団の５０％に治療的に有効な用量)を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的薬学手段により決定できる。毒性と治療効果の用量比は治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現できる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用できるが、非感染細胞への損傷の可能性を最小化するために罹患組織の部位へこのような化合物を標的化し、それにより、副作用を軽減する送達系の設計に留意すべきである。
【０４３８】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータを、ヒトにおける使用のための範囲の用量の決定に使用できる。このような化合物の用量は、好ましくは毒性がわずかであるかまたはなく、ＥＤ５０を含む循環濃度範囲内である。用量は用いる用量形態および利用する投与経路により変わる。本発明の方法において使用するあらゆる化合物について、治療的有効用量は、最初に細胞培養アッセイから計算できる。用量を、細胞培養で決定されるＥＣ５０(すなわち、最大の半分の応答を達成する試験化合物の濃度)を含む、循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルで決定し得る。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより詳細に決定できる。血漿レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定し得る。
【０４３９】
医薬組成物を、必要な投与指示書と共に容器、パックまたはディスペンサーに包装することができる。
【０４４０】
ここで定義する治療有効量のＲＮＡサイレンシング剤(すなわち、有効な用量)は、選択するＲＮＡサイレンシング剤による。例えば、プラスミドコード化ｓｈＲＮＡを選択したならば、約１μg〜１０００mg範囲の量の単回用量を投与し得る；ある態様において、１０μg、３０μg、１００μgまたは１０００μgを投与し得る。ある態様において、１〜５ｇの組成物を投与できる。組成物を１日１回以上から、隔日を含む週に回１以上投与できる。当業者は、疾患または障害の重症度、先行処置、対象の一般的健康および／または年齢および併存する他の疾患を含むが、これらに限定されないある因子が、対象の効果的処置に必要な用量およびタイミングに影響することを認識する。さらに、治療有効量のタンパク質、ポリペプチドまたは抗体での対象の処置は、単回処置を含んでよく、または好ましくは、連続処置を含んでよい。
【０４４１】
本発明の核酸分子を、例えば、Xia et al., (2002), Supra.に記載のものを含むが、これに限定されない当分野で知られる方法を使用して、発現構築物、例えば、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、発現カセットまたはプラスミドウイルスベクターに挿入できる。発現構築物を、対象に、例えば、吸入、経口、静脈内注射、局所投与により(米国特許５,３２８,４７０号参照)または定位的注射により送達できる(例えば、Chen et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3054-3057参照)。送達ベクターの医薬調製は、許容される希釈剤中のベクターを含んでよくまたは送達媒体が包埋された遅延放出マトリクスを含み得る。あるいは、完全送達ベクターが組み換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターからインタクトで製造できるとき、医薬調製は、遺伝子送達系を産生する１以上の細胞を含み得る。
【０４４２】
本発明の核酸分子はまた小ヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)およびｓｈＲＮＡを発現するように改変された発現構築物も含み得る。ｓｈＲＮＡの転写はポリメラーゼIII(ｐｏｌ  III)プロモーターにより開始され、４−５−チミン転写終結部位の２位で停止すると考えられる。発現により、ｓｈＲＮＡは３’ＵＵ−オーバーハングを備えたステムループ構造に折りたたまれ；その後、これらのｓｈＲＮＡの末端が処理され、ｓｈＲＮＡを約２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ様分子に変換すると考えられる。Brummelkamp et al. (2002), Science, 296, 550-553; Lee et al, (2002). supra; Miyagishi and Taira (2002), Nature Biotechnol., 20, 497-500; Paddison et al. (2002), supra; Paul (2002), supra; Sui (2002) supra; Yu et al. (2002), supra.。
【０４４３】
発現構築物は、適切な発現系における使用に適するあらゆる構築物であってよく、当分野で知られるように、レトロウイルスベクター、直線状発現カセット、プラスミドおよびウイルスまたはウイルス由来ベクターを含むが、これらに限定されない。このような発現構築物は、誘導性プロモーター、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  IIIプロモーター系、例えばＵ６  ｓｎＲＮＡプロモーターまたはＨ１  ＲＮＡポリメラーゼIIIプロモーターまたは当分野で知られる他のプロモーターの１以上を含み得る。構築物はｓｉＲＮＡの一鎖または両鎖を含み得る。両鎖を発現する発現構築物はまた両鎖を連結するループ構造も含んでよく、また各鎖は同じ構築物内の個別のプロモーターから個別に転写され得る。各鎖はまた個別の発現構築物から転写され得る、Tuschl (2002), Supra.。
【０４４４】
ある例示的態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤を含む組成物は、多種多様な経路により対象の神経系に送達される。経路の例は、髄腔内、柔組織内(例えば、脳内)、経鼻および眼送達を含む。組成物はまた、例えば、静脈内、皮下または筋肉内注射により全身送達でき、これは、末梢ニューロンへのＲＮＡサイレンシング剤の送達に特に有用である。好ましい送達経路は、脳に直接、例えば、脳室または脳の視床下部にまたは脳の側面または背領域にである。神経系細胞送達用ＲＮＡサイレンシング剤を、投与に適する医薬組成物に混合し得る。
【０４４５】
例えば、組成物はＲＮＡサイレンシング剤の１以上の種および薬学的に許容される担体を含み得る。本発明の医薬組成物を、局所または全身処置が望まれるかおよび処置領域により、多くの方法で投与し得る。投与は、局所(眼、鼻腔内、経皮を含む)、経口または非経腸であり得る。非経腸投与は、静脈内点滴、皮下、腹腔内または筋肉内注射、髄腔内または脳室内(例えば、脳室内)投与を含む。ある例示的態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤を、ここに記載する多種多様な適当な組成物および方法を使用し、血液脳関門(ＢＢＢ)を通して送達する。
【０４４６】
送達経路は、患者の障害に依存する。例えば、ハンチントン病を有すると診断された対象に、脳に直接本発明の抗ｈｔｔ  ＲＮＡサイレンシング剤を投与できる(例えば、大脳基底核細胞の淡蒼球または線条体および線条体の近中型有棘ニューロンに)。本発明のＲＮＡサイレンシング剤に加えて、患者に第二治療、例えば、軽減治療および／または疾患特異的治療を実施できる。第二治療は、例えば、対症的治療(例えば、症状を軽減するため)、神経保護的治療(例えば、疾患進行遅延または停止のため)または回復的治療(例えば、疾患過程の逆転のため)であり得る。ハンチントン病処置のためには、例えば、対症治療は、薬物ハロペリドール、カルバマゼピンまたはバロプロエートを含み得る。他の治療は、精神療法、理学療法、言語療法、伝達および記憶補助、社会的支持サービスおよび食事アドバイスを含み得る。
【０４４７】
ＲＮＡサイレンシング剤を、脳の神経系細胞に送達できる。組成物の血液脳関門を超える通過を必要としない送達方法を利用できる。例えば、ＲＮＡサイレンシング剤含有医薬組成物を、患者に、疾患罹患細胞を含む領域に直接注射することにより送達できる。例えば、医薬組成物を、脳への直接注射により送達できる。注射は、脳の特定の領域への定位的注射により得る(例えば、黒質、皮質、海馬、線条体または淡蒼球)。ＲＮＡサイレンシング剤を、中枢神経系の複数領域に送達できる(例えば、脳および／または脊髄の複数領域)。ＲＮＡサイレンシング剤を、脳の汎発性領域に送達できる(例えば、脳の皮質への汎発性送達)。
【０４４８】
ある態様において、ＲＮＡサイレンシング剤を、一端が組織、例えば、脳、例えば、脳の黒質、皮質、海馬、線条体または淡蒼球にインプラントされた、カニューレまたは他の送達デバイスの方法により送達できる。カニューレをＲＮＡサイレンシング剤のリザーバーに接続できる。流れまたは送達は、ポンプ、例えば、Ａｌｚｅｔポンプ(Durect, Cupertino, CA)のような浸透圧ポンプまたはミニポンプが介在し得る。ある態様において、ポンプおよびリザーバーを、組織から遠位の領域、例えば、腹部にインプラントし、送達をポンプまたはリザーバーから放出部位に至る導管により行う。脳への送達用デバイスは、例えば、米国特許６,０９３,１８０号および５,８１４,０１４号に記載される。
【０４４９】
本発明のＲＮＡサイレンシング剤を、さらに血液脳関門を通過できるように修飾できる。例えば、ＲＮＡサイレンシング剤を、薬剤を関門通過させることができる分子にコンジュゲートできる。このような修飾ＲＮＡサイレンシング剤を、脳室内または筋肉内注射または、例えば肺送達のような任意の所望の方法により投与できる。
【０４５０】
ある態様において、エキソソームを、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の送達に使用する。エキソソームは、全身注射後ＢＢＢを通過し、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、化学療法剤およびタンパク質を、特異的にニューロン送達できる(Alvarez-Erviti L, Seow Y, Yin H, Betts C, Lakhal S, Wood MJ. (2011). Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nat Biotechnol. 2011 Apr;29(4):341-5. doi: 10.1038/nbt.1807; El-Andaloussi S, Lee Y, Lakhal-Littleton S, Li J, Seow Y, Gardiner C, Alvarez-Erviti L, Sargent IL, Wood MJ.(2011). Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nat Protoc. 2012 Dec;7(12):2112-26. doi: 10.1038/nprot.2012.131; EL Andaloussi S, Maeger I, Breakefield XO, Wood MJ. (2013). Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov. 2013 May;12(5):347-57. doi: 10.1038/nrd3978; El Andaloussi S, Lakhal S, Maeger I, Wood MJ. (2013). Exosomes for targeted siRNA delivery across biological barriers. Adv Drug Deliv Rev. 2013 Mar;65(3):391-7. doi: 10.1016/j.addr.2012.08.008参照)。
【０４５１】
ある態様において、１以上の親油性分子を、本発明のＲＮＡサイレンシング剤をＢＢＢを通過して送達させるために使用する(Alvarez-Ervit (2011))。ＲＮＡサイレンシング剤は、その後、薬物をその活性形態で放出するために、親油性偽装の活性化、例えば、酵素分解により活性化される。
【０４５２】
ある態様において、１以上の受容体介在透過性化化合物を使用して、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の送達を可能にするためにＢＢＢの透過性を増加できる。これらの薬物は、内皮細胞間の密接な接合を緩める、血液における浸透圧上昇により、ＢＢＢの透過性を一過性に増加させる((El-Andaloussi (2012))。密接な接合を緩めることにより、ＲＮＡサイレンシング剤の通常の静脈内注射が実施できる。
【０４５３】
ある態様において、ナノ粒子ベースの送達系を使用して、ＢＢＢを通過して本発明のＲＮＡサイレンシング剤を送達する。ここで使用する“ナノ粒子”は、一般に、薬物または遺伝子担体として集中的に探索されている、固体、生分解性、コロイド状系である重合ナノ粒子をいう(S. P. Egusquiaguirre, M. Igartua, R. M. Hernandez, and J. L. Pedraz, “Nanoparticle delivery systems for cancer therapy: advances in clinical and preclinical research,” Clinical and Translational Oncology, vol. 14, no. 2, pp. 83-93, 2012)。重合ナノ粒子は２つの大きなカテゴリー、天然ポリマーおよび合成ポリマーに分類できる。ｓｉＲＮＡ送達用の天然のポリマーは、シクロデキストリン、キトサンおよびアテロコラーゲンを含むが、これらに限定されない(Y. Wang, Z. Li, Y. Han, L. H. Liang, and A. Ji, “Nanoparticle-based delivery system for application of siRNA in vivo,” Current Drug Metabolism, vol. 11, no. 2, pp. 182-196, 2010)。合成ポリマーは、集中的に探索されているポリエチレンイミン(ＰＥＩ)、ポリ(ｄｌ−ラクチド−共グリコリド)(ＰＬＧＡ)およびデンドリマーを含むが、これらに限定されない(X. Yuan, S. Naguib, and Z. Wu, “Recent advances of siRNA delivery by nanoparticles,” Expert Opinion on Drug Delivery, vol. 8, no. 4, pp. 521-536, 2011)。ナノ粒子および他の適当な送達系のレビューについて、Jong-Min Lee, Tae-Jong Yoon, and Young-Seok Cho, “Recent Developments in Nanoparticle-Based siRNA Delivery for Cancer Therapy,” BioMed Research International, vol. 2013, Article ID 782041, 10 pages, 2013. doi:10.1155/2013/782041参照(その全体を引用によりここに包含させる)。
【０４５４】
本発明のＲＮＡサイレンシング剤を、網膜障害、例えば、網膜症処置のためなどに、眼に投与できる。例えば、医薬組成物を、眼の表面または近位組織、例えば、瞼に適用できる。それらは、局所的に、例えば、スプレー、点眼、洗眼剤または軟膏として適用できる。軟膏または滴下可能液体を、アプリケーターまたは点眼剤のような当分野で既知の眼送達系で送達し得る。このような組成物は、ムコミメチック、例えばヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはポリ(ビニルアルコール)、防腐剤、例えばソルビン酸、ＥＤＴＡまたは塩化ベンジルクロニウムおよび通常量の希釈剤および／または担体を含み得る。医薬組成物はまた眼の内部に投与でき、選択領域または構造に導入できる針または他の送達デバイスにより導入できる。ＲＮＡサイレンシング剤含有組成物は、眼パッチによっても適用できる。
【０４５５】
一般に、本発明のＲＮＡサイレンシング剤を、あらゆる適当な方法により投与できる。ここで使用する局所送達は、ＲＮＡサイレンシング剤の眼、粘膜、体空洞表面またはいずれかの内部表面を含む、身体のいずれかの表面への直接適用を指し得る。局所投与用製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、液滴、スプレーおよび液体を含み得る。慣用の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、濃厚剤などが必要であるか望ましいことがあり得る。局所投与はまたＲＮＡサイレンシング剤を対象の表皮または真皮またはその特異的層または裏打ち組織に選択的送達する手段としても使用し得る。
【０４５６】
髄腔内または脳室内(例えば、脳室内)投与用組成物は、緩衝液、希釈剤および他の適当な添加剤も含み得る無菌水溶液を含み得る。髄腔内または脳室内投与用組成物は、好ましくは、例えば、ＲＮＡサイレンシング剤に結合した親油性部分以外、トランスフェクション試薬またはさらなる親油性部分を含まない。
【０４５７】
非経腸投与用製剤は、緩衝液、希釈剤および他の適当な添加剤も含み得る無菌水溶液を含み得る。脳室内注射は、例えば、リザーバーに結合した、脳室内カテーテルにより促進され得る。静脈内使用のために、溶質の総濃度は、製剤を等張とするように制御されなければならない。
【０４５８】
本発明のＲＮＡサイレンシング剤を、肺送達により対象に投与できる。肺送達組成物は、分散剤中の組成物が肺胞領域を通して直接血液循環に容易に吸収され得る場所である肺に到達するように、分散剤の吸入により送達できる。肺送達は、肺疾患処置のために全身送達および局所送達両方のために有効である。ある態様において、肺送達により投与されるＲＮＡサイレンシング剤は、血液脳関門を通過できるように、修飾されている。
【０４５９】
肺送達は、噴霧化、エアロゾル化、ミセルおよび乾燥粉末ベースの製剤の使用を含む、種々のアプローチにより達成できる。送達は、液体ネブライザー、エアロゾルベースの吸入器および乾燥粉末分散デバイスで達成できる。定量デバイスが好ましい。アトマイザーまたは吸入器を使用する一つの利点は、デバイスが自給式であるため、汚染の可能性が最小化されることである。乾燥粉末分散デバイスは、例えば、乾燥粉末として容易に製剤化され得る薬物を送達する。ＲＮＡサイレンシング剤組成物は、それ自体または適当な粉末担体と組み合わせて、凍結乾燥または噴霧乾燥粉末として安定に保存できる。吸入用組成物の送達は、タイマー、用量カウンター、回数測定デバイスまたは回数インディケーターを含み得る投薬回数要素が介在でき、これは、デバイスに取り込まれたとき、エアロゾル医薬の投与中の用量トラッキング、コンプライアンスモニタリングおよび／または投与誘発を可能とする。
【０４６０】
担体として有用な医薬添加物のタイプは、安定化剤、例えばヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)、増量剤、例えば炭水化物、アミノ酸およびポリペプチド；ｐＨ調節剤または緩衝液；塩、例えば塩化ナトリウムなどを含む。これらの担体は結晶形態でも非晶質形態でもよく、または２種の混合物であってもよい。
【０４６１】
特に有益な増量剤は、適合性の炭水化物、ポリペプチド、アミノ酸またはこれらの組み合わせを含む。適当な炭水化物は、単糖、例えばガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボースなど；二糖、例えばラクトース、トレハロースなど；シクロデキストリン、例えば２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン；および多糖、例えばラフィノース、マルトデキストリン、デキストランなど；アルジトール、例えばマンニトール、キシリトールなどを含む。炭水化物の好ましい群は、ラクトース、トレハロース、ラフィノースマルトデキストリンおよびマンニトールを含む。適当なポリペプチドは、アスパルテームを含む。アミノ酸はアラニンおよびグリシンを含み、グリシンが好ましい。
【０４６２】
適当なｐＨ調節剤または緩衝液は、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウムなどのような有機酸および塩基から製造された有機塩を含み、クエン酸ナトリウムが好ましい。
【０４６３】
本発明のＲＮＡサイレンシング剤を、経口および経鼻送達により投与できる。例えば、これらの膜を通して投与した薬物は、効果開始が迅速であり、治療血漿レベルを提供し、肝臓代謝の初回通過効果を避け、薬物に有害な消化器(ＧＩ)環境への暴露を避ける。さらなる利益は、薬物を適用し、局在化し、容易に除去できるように、膜部位への容易な接近を含む。ある態様において、経口または経鼻送達により投与されるＲＮＡサイレンシング剤は、血液脳関門を通過できるように、修飾されている。
【０４６４】
ある態様において、ＲＮＡサイレンシング剤を含む組成物の単位用量または計測用量を、インプラントデバイスにより分配する。デバイスは、対象内のパラメータをモニターするセンサーを含み得る。例えば、デバイスは、浸透圧ポンプのようなポンプ、および所望により、関連する電子機器を含み得る。
【０４６５】
ＲＮＡサイレンシング剤を、ウイルス天然カプシドにまたはそれ由来の化学的または酵素的に産生した人工カプシドまたは構造に含み得る。
【０４６６】
XI. キット
ある他の側面において、本発明は、ＲＮＡサイレンシング剤、例えば、二本鎖ＲＮＡサイレンシング剤またはｓＲＮＡ剤の医薬製剤を含む適当な容器を含むキットを提供する(例えば、ｓＲＮＡ剤に処理され得る前駆体、例えば、大型ＲＮＡサイレンシング剤またはＲＮＡサイレンシング剤、例えば、二本鎖ＲＮＡサイレンシング剤またはｓＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ)。ある態様において、医薬製剤の個々の成分を一容器に提供し得る。あるいは、医薬製剤の成分を２以上の容器、例えば、ＲＮＡサイレンシング剤製剤用の一容器および担体化合物の少なくとも一つの他の容器に別々に提供するのが望ましいことがある。キットを、一つの箱における１以上の容器のような多くの配置で包装し得る。異なる成分を、例えば、キットに備わった指示書に従い組み合わせ得る。成分を、ここに記載する方法で組み合わせて、例えば、医薬組成物を製造し、投与できる。キットはまた送達デバイスも含み得る。
【０４６７】
ここに記載する方法の他の適当な修飾および適合が、ここに開示する態様の範囲から逸脱することなく、適当な等価物を使用して実施し得ることは当業者には容易に明らかである。ある態様がここで詳細に記載されているが、それは説明の目的のために包含させ、限定を意図しない、次の実施例を参照して、より明らかに理解される。
【実施例】
【０４６８】
実施例１. 非製剤化、安定化、疎水性ｓｉＲＮＡでの一次ニューロンおよびマウス脳の両方におけるハンチンチンの減少
インビボで良好な有効性および分布ならびにインビトロで一次ニューロンにおけるノックダウンの両方を提供する可能性を有する疎水性に修飾されたＡＳＯ−ｓｉＲＮＡハイブリッドを探索した。ハンチンチン遺伝子をｍＲＮＡノックダウンの標的として使用した。ハンチントン病は一遺伝子性であり(Mangiarini, L. et al. Exon 1 of the HTT gene with an expanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice. Cell 87, 493-506 (1996))、疾患病理に至る多数の細胞の機序を有し(Zuccato, C., Valenza, M. & Cattaneo, E. Molecular Mechanisms and Potential Therapeutical Targets in Huntington's Disease. Physiological Reviews 90, 905-981 (2010))、将来的オリゴヌクレオチド治療の可能性の優れた候補となる。
【０４６９】
一団の疎水性に修飾されたｓｉＲＮＡターゲティングハンチンチン遺伝子を開発した。効果および効力が、送達用製剤を行うことなく、単回低用量注射でインビトロで一次ニューロンおよびインビボでマウス脳の両方で観察された。これらの化合物は早期のモデルｉＲＮＡおよびｈｓｉＲＮＡ、ならびにＡＳの両者に見られた多数の種々の化学的および構造的修飾を組み合わせる。安定化塩基修飾、コレステロールコンジュゲーションおよび完全ホスホロチオエート化一本鎖テイルを含むこれらの性質は、これらのｈｓｉＲＮＡを、多数の種々の生物学的に適切な系における使用に適合できる、標的困難一次細胞および臓器における遺伝子機能の研究の優れたツールとする。
【０４７０】
１.１  ｈｓｉＲＮＡ  −  疎水性に修飾されたｓｉＲＮＡ／アンチセンスハイブリッドは、一次ニューロンに効率的に内在化された
ｈｓｉＲＮＡは非対称化合物であり、短二本鎖領域(１５塩基対)および一本鎖完全ホスホロチオエート化テイルを有する。これらの化合物における全ピリミジンは２’−フルオロおよび２’−Ｏ−メチル修飾され(安定化する)、パッセンジャー鎖の３’末端はＴＥＧ−コレステロールにコンジュゲートされた(図１Ａ、図８)１３。コレステロールコンジュゲートは迅速な膜結合を可能とし、一方一本鎖ホスホロチオエート化テイルは、慣用のアンチセンスオリゴヌクレオチドにより使用されるものに類似する機序による細胞内部移行に必要であった。Ｃｙ３標識ｈｓｉＲＮＡの一次皮質ニューロンへの添加は、即時の(数分以内)細胞結合をもたらした(図１Ｂ)。興味深いことに、取り込みがまず優先的にデンドライトで観察され、続いて細胞体に再局在化した(図９)。取り込みは、皿の全細胞で均一であり、効率的内部移行が確認された。
【０４７１】
１.２  ハンチンチンをターゲティングするｈｓｉＲＮＡの同定
ハンチンチンｍＲＮＡをターゲティングする一団の９４ｈｓｉＲＮＡ化合物(図８)を設計し、合成した。これらの配列は遺伝子にわたっており、ＧＣ含量、特異性および低シード相補性(compliment)頻度の評価(Anderson, E. M. et al. Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity. RNA 14, 853-861 (2008))、ｍｉＲＮＡシード含有配列の除去および熱力学バイアスの試験(Khvorova, A., Reynolds, A. & Jayasena, S. D. Functional siRNAs and miRNAs Exhibit Strand Bias. Cell 115, 209-216 (2003); Schwarz, D. S. et al. Asymmetry in the Assembly of the RNAi Enzyme Complex. Cell 115, 199-208 (2003))を含み、標準的ｓｉＲＮＡ設計パラメータに適合するように選択した(Birmingham, A. et al. A protocol for designing siRNAs with high functionality and specificity. Nat Protoc 2, 2068-2078 (2007))。５０％を超える塩基が化学修飾され、インビボ安定性および免疫応答の最小化を提供した(Judge, A., Bola, G., Lee, A. & MacLachlan, I. Design of Noninflammatory Synthetic siRNA Mediating Potent Gene Silencing in Vivo. Molecular Therapy 13, 494-505 (2006))。修飾は、さらなる制限を配列空間に付し、ヒット率を低減した。ハンチンチンｍＲＮＡ発現への影響を、QUANTIGENEアッセイによりＨｅＬａ細胞における１.５μM  ｈｓｉＲＮＡ(受動的取り込み、製剤せず)暴露７２時間後に測定し(図２)、７％の配列が７０％を超えるサイレンシングを示した。機能的標的部位は、３’ＵＴＲの遠位部分を例外として遺伝子中に広がり、後にＨｅＬａ細胞における短ｈｔｔアイソフォームの優先的発現により説明された(Li, S. H. et al. Huntington's disease gene (IT15))。ＩＣ５０値が、活性および異種間保存の一次スクリーンに基づき選択された１６活性配列で同定された(図１０)。ＩＣ５０値は、受動的取り込みで９０〜７６６nM(製剤せず)および脂質介在取り込みで４〜９１pMの範囲であった(図８)。完全化学的最適化活性化合物は容易に同定され、はるかに小さいライブラリーが他の遺伝子の将来的スクリーニングに十分であるが、ｈｉｔ率は標的毎に異なる可能性がある。１０１５０位をターゲティングするｈｓｉＲＮＡ(ＨＴＴ１０１５０(すなわち、５’ＣＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡ  ３’(配列番号１)))をさらなる試験に使用した。ｈｓｉＲＮＡ化学的骨格がＨＴＴ１０１５０の有効性および効力に負に影響しないことを確実にするために、修飾および非修飾型の化合物を受動的および脂質介在サイレンシングアッセイの両方で試験した(図３)。予想通り、修飾配列のみが受動的取り込みによる細胞送達およびＨｔｔサイレンシングに成功し(ＩＣ５０＝８２.２nM)、一方修飾および非修飾化合物両者は、脂質介在送達で類似ＩＣ５０値を示し(それぞれ４pMおよび１３pM)、ｈｓｉＲＮＡ骨格修飾がＲＮＡ誘発サイレンシング複合体(ＲＩＳＣ)充填を妨害しないことを示唆した。
【０４７２】
１.３  一次ニューロンにおける非公式化ｈｓｉＲＮＡでの強力および特異的遺伝子サイレンシング
ＨＴＴ１０１５０を、ＦＶＢＮマウスから単離した一次ニューロンにおけるｍＲＮＡサイレンシングについてさらに試験した。有効性を、皮質ニューロンに単純非製剤化化合物添加７２時間および１週間後見られ(図４Ａ)、最大サイレンシング(７０％)は１.２５μM濃度で見られた。ＨＴＴ１０１５０はまた一次線条体ニューロンで類似サイレンシングを示した(図４Ｂ)。タンパク質レベルを１週間後ウェスタンブロットで測定し(図１４)、１.２５μMの化合物で処置後タンパク質が８５％減少するｍＲＮＡデータを確認した(図４Ｃ)。ＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥアッセイで測定したハウスキーピング遺伝子(ＰＰＩＢ、ＧＡＰＤＨ)および全体的細胞生存能(図１１Ｂおよび１４)はこれらの濃度で影響されなかった。他の実験において、細胞生存能へのわずかな影響が３μMで観察された。
【０４７３】
単一ＨＴＴ１０１５０処置での効果持続期間の評価のため、サイレンシングを、１週間、２週間および３週間間隔で測定した(図４Ｄ)。充填ＲＩＳＣ複合体の半減期は数週間であり(Song, E. et al. Sustained Small Interfering RNA-Mediated Human Immunodeficiency Virus Type 1 Inhibition in Primary Macrophages. Journal of Virology 77, 7174-7181 (2003))、サイレンシングは、非分裂細胞で長く続くと予想された。実際、ｈｓｉＲＮＡでの単回処置は、試験した全ての時点でｈｔｔサイレンシング誘発に十分であった。３週間は、最長であり、一次ニューロンは培養で維持できた。他の系を長期実験に使用できる。
【０４７４】
ｈｓｉＲＮＡの神経細胞遺伝子サイレンシングのツールとしての一般的適用性を示し、この化学骨格が神経細胞送達に妥当であることを確認するために、いくつかの他のＨＴＴをターゲティングするｈｓｉＲＮＡおよびハウスキーピング遺伝子ＰＰＩＢ(シクロフィリンＢ)をターゲティング一つでの類似実験を実施した(図１１Ａおよび１３)。７０％および９０％の高いサイレンシングがＨＴＴおよびＰＰＩＢでそれぞれ観察された。
【０４７５】
要約すると、これらのデータは、疎水性に修飾されたｓｉＲＮＡが一次ニューロンにおける遺伝子サイレンシングの単純かつ簡単なアプローチであり、複数遺伝子標的に適合できることを示す。
【０４７６】
１.４  単回注射によるマウス脳におけるインビボｈｓｉＲＮＡ分布
ＲＮＡは、インビトロで種々のタイプのニューロンにより効率的に内在化される。選択ｈｓｉＲＮＡ、ＨＴＴ１０１５０を、さらにインビボで脳における遺伝子発現をサイレンシングする可能性について評価した。インビボ投与によるＨＴＴ１０１５０の分布プロファイルを確認するために、１２.５μgのＣｙ３標識ｈｓｉＲＮＡ(配列について図８参照)を線条体内注射し、２４時間後、脳を潅流し、切片化し、オリゴヌクレオチド分布を蛍光顕微鏡(ライカDM5500 - DFC365FX)で可視化した。同時に処理した人工ＣＳＦ注入サンプルを、背景組織落射蛍光の対照のために設定した顕微鏡的造影設定のために使用した。
【０４７７】
化合物の大部分は、注射部位から離れる拡散の急勾配を示し、同側性線条体の大部分が被覆された(図５Ａ、５Ｂ)。興味深いことに、ｈｓｉＲＮＡは脳(皮質および線条体の両方)の非注射部位(対側)側で検出されたが、相対的濃度ははるかに低いように見えた。高拡大率画像は、疎水性修飾の存在による可能性が高い、ｈｓｉＲＮＡとファイバートラックの有意な関係を示した。ｈｓｉＲＮＡのこの側面は、脳シグナル伝達構造可視化のための標識試薬として有用とし得る(図５Ｃ、５Ｄ)。ファイバートラックおよび神経突起標識に加えて、ｈｓｉＲＮＡは、注射わずか２４時間後のＮｅｕＮ(神経細胞マーカー)染色細胞(図５Ｅ)での共局在化により示されるとおり、ニューロンを含む種々の細胞型の核周囲空間における染色の細点として検出できた。
【０４７８】
ｈｓｉＲＮＡ分布におけるビタミンＤの効果を図７９および８０に示す。
【０４７９】
１.５  単回注射によるマウス脳におけるインビボでのｈｓｉＲＮＡ有効性
ＨＴＴ１０１５０有効性をインビボで決定するために、野生型ＦＶＢＮマウスを、３〜２５μg(０.１〜０.９mg／kg)の化合物の単回注射により線条体内投与し、ｍＲＮＡサイレンシングを注射部位の同側性および対側性の両方で試験した。８動物を処置群あたり投与し、３の個々のパンチをｍＲＮＡおよびタンパク質定量化のために線条体の各側からとった。ハンチンチン発現レベルをQUANTIGENEアッセイで測定し、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化した(オンライン方法に詳述)。
【０４８０】
統計解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して、ＣＳＦまたはＰＢＳ対照に対して一元配置ＡＮＯＶＡ比較で実施し、反復測定はボンフェローニ補正を用いた(詳細はオンライン方法)。サイレンシングを誘発した全群はＣＳＦ、ＰＢＳおよび非ターゲティング対照処置動物に対して有意であった。処置群あたり２４の独立したパンチからの生データ(８動物、動物あたり３パンチ)は図１５に見られる。投与部位(同側性側)で、統計的有意に達する用量依存性サイレンシングが全濃度で見られた。２５μg処置は７７％サイレンシング(ｐ＜０.０００１)を誘発し、１２.５μg処置は、動物２群で異なる日に反復し、統計的に有意な６６％および４２％のサイレンシングを示した(図６)。
【０４８１】
初期分布試験は、注射部位から離れる拡散の急勾配と、対側性部位に移動する最小量の化合物をしめしたが、２５μgおよび１２.５μgの高用量での処置は、非注射部位に統計学的に有意なサイレンシング(ｐ＜０.０００１)をもたらした。しかしながら、サイレンシングレベルは、脳の処置側より有意に低かった(２５μg群でわずか３６％)。
【０４８２】
要約すると、これらのデータは、ｈｓｉＲＮＡの単回線条体内注射が投与部位周囲の強力遺伝子サイレンシング誘発に十分であることを示す。この効果は種々の処置群および独立した実験で再現性があった。
【０４８３】
１.６  マウス脳における単回ｈｓｉＲＮＡ注射後の神経細胞生存能
非修飾、ネイキッドｓｉＲＮＡのコレステロール修飾が、ｓｉＲＮＡ脳分布改善のために先に使用されており、高用量での毒性は可能性限界と同定された。脳に対する非特異的化学関連効果の程度を評価するために、線条体における中型有棘ニューロンのドーパミン受容体発現の確立されたマーカーであり、神経細胞生存能を表すＤＡＲＰＰ３２発現を試験した。さらに、免疫応答を誘発する可能性を、ｈｓｉＲＮＡ注射によるミクログリア活性化の評価により実施した。
【０４８４】
ＤＡＲＰＰ３２発現に対する顕著な影響は１２.５μgまでの用量で観察されず、永続性神経細胞生存能が示された(図７Ａ、７Ｂ、１６)。同様に、修飾ｈｓｉＲＮＡ存在下の限定的な免疫応答の指標である最小ミクログリア活性化が１２.５μg用量で可視化された(図７Ｃ、７Ｄ)。２５μg用量は、毒性の指標である注射部位周囲のみのＤＡＲＰＰ３２のいくぶんかの減少を誘発し、示した投与経路によるこの化学的骨格の最大用量レベルを確立した。ｈｓｉＲＮＡの１０〜１２.５μg単回投与は、３つの、十分に力のある、独立した試験でＨＴＴ  ｍＲＮＡを効率的にサイレンシングし、毒性なしで６２％、４２％および５２％の確実なサイレンシングを示した。これらのデータは、このテクノロジーが他の神経学的に有意な標的の機能的試験に広範に使用できることを示す。
【０４８５】
１.７  ニューロンにおけるさらなる特徴付け
持続性サイレンシングが、２１日間末期分化ニューロンで達成された(図２４)。サイレンシングプラトーがＲＮＡｉ(細胞質)で観察されたが、ＲＮａｓｅＨ(主に核)化合物で観察されなかった(図２５)。観察されたプラトーは、ｈｔｔ遺伝子に特異的であった。ｈｔｔ  ｍＲＮＡの約６０％が核に局在化した(図２６)。
【０４８６】
プローブセットをニューロンで検証した(図２７)。検出シグナルの大部分はｈｔｔ  ｍＲＮＡに特異的であった。黄色(共局在化染色)領域の高フラクションが観察された。科学的理論に縛られることを意図しないが、高程度の赤色シグナルは、２プローブセットの一様でない濃度と関連し得る。
【０４８７】
さらなるプローブセットを、ニューロンにおいてイントロン６０〜６１について検証した(図２８)。イントロン特異的プローブは、転写部位に特異的に核において１〜２黄色ドットを示した。エキソン特異的プローブは高い程度の重複を示した。
【０４８８】
Ｈｔｔ  ｍＲＮＡ核局在化はニューロンに特異的であり、線維芽細胞にはなかった(図２９)。皮質ニューロンのＨｓｉＲＮＡＨＴＴ処置は、細胞質ｈｔｔ  ｍＲＮＡを優先的に排除した(図３０および３１)。
【０４８９】
完全に近いＨＴＴタンパク質サイレンシングが一次皮質ニューロンで観察された(図３２)。
【０４９０】
ＨＴＴ１０１５０の直接注射は、神経細胞数に検出可能な変化をもたらさなかった(図３３)。コレステロール−ｈｓｉＲＮＡは、注射部位に隣接した毒性の小領域を示した(図３４)。
【０４９１】
図５８〜６０は、野生型およびＱ１４０一次海馬ニューロンにおけるｈｓｉＲＮＡ有効性を示す。
【０４９２】
１.８  考察
本研究は、一次細胞への送達のための疎水性に修飾されたｓｉＲＮＡの使用が、神経細胞経路および神経障害の機能試験およびゲノム試験を可能にするための価値あるツールであることを示す。
【０４９３】
毒性製剤を用いずに一次ニューロンにおいて遺伝子サイレンシングを起こす能力は、神経科学研究において相当な影響を与え、一次細胞株の状況における神経障害のより深い研究を促進し、最終的にインビボ機能および病理のより有意な理解を提供する。大部分の神経細胞試験は、送達および細胞維持の容易さのために安定な細胞株で行われているが、人工細胞系使用は、一次細胞使用により避けされる問題であるこれらの細胞株の操作に起因し得るデータのアーチファクトをもたらし得る(Cheung, Y.-T. et al. Effects of all-trans-retinoic acid on human SH-SY5Y neuroblastoma as in vitro model in neurotoxicity research. NeuroToxicology 30, 127-135 (2009); Gilany, K. et al. The proteome of the human neuroblastoma cell line SH-SY5Y: An enlarged proteome. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics 1784, 983-985 (2008); Lopes, F. M. et al. Comparison between proliferative and neuron-like SH-SY5Y cells as an in vitro model for Parkinson disease studies. Brain Research 1337, 85-94 (2010); Zhang, W. et al. Cyclohexane 1,3-diones and their inhibition of mutant SOD1-dependent protein aggregation and toxicity in PC12 cells. BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY 1-17 (2011). doi:10.1016/j.bmc.2011.11.039)。一次ニューロンにｓｉＲＮＡを送達する現在の方法は、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)またはリポフェクタミンＴＭ介在トランスフェクションの使用を含む(Karra, D. & Dahm, R. Transfection Techniques for Neuronal Cells. Journal of Neuroscience 30, 6171-6177 (2010))。ｓｉＲＮＡ自体にコレステロールのような疎水性部分を直接コンジュゲートし、取り込み促進のためにさらなる一本鎖ホスホロチオエート化テイルを用いることにより、ここで、ｓｉＲＮＡが最小毒性で効率的に一次ニューロンにインビトロで送達できるだけでなく、なおｍＲＮＡの強力なサイレンサーのままであることが示された。
【０４９４】
科学的理論に縛られることを意図しないが、アンチセンステクノロジーを超えるＲＮＡｉの大きな利点の一つは、充填ＲＩＳＣが非分裂細胞で長時間活性なままであることが予測されることである(Bartlett, D. W. Insights into the kinetics of siRNA-mediated gene silencing from live-cell and live-animal bioluminescent imaging. Nucleic Acids Research 34, 322-333 (2006))。さらに、限定的な数の充填ＲＩＳＣが、ＲＮＡｉ介在サイレンシングの誘発に十分である(Stalder, L. et al. The rough endoplasmatic reticulum is a central nucleation site of siRNA-mediated RNA silencing. The EMBO Journal 32, 1115-1127 (2013))。ここに示すデータは、インビトロでｈｓｉＲＮＡの単回処置により一次皮質ニューロンの３週間までのサイレンシングを示し、ＲＮＡｉ介在サイレンシングが効率がよく、かつ持続的であるとの見解を支持する。ここに示すデータはまたこれらの化合物が、異なる遺伝子の複数領域を標的とできることを示し、これは、代替的神経経路および疾患の研究のためのｈｓｉＲＮＡの適応性を示す。
【０４９５】
ｈｓｉＲＮＡの単回線条体内注射が、インビボで注射部位近辺で強力な遺伝子サイレンシングをもたらすが、効果は脳全体に均一に拡散しなかった。限定的であるが、脳の他の領域への拡散(インビボ有効性試験により照明)は、多くの機序を介して起こり得た。これらはＣＳＦにおける移動、分布試験におけるＣｙ３標識ｈｓｉＲＮＡの大きな可視密度を有することが示された神経索を経る拡散またはおそらく逆行輸送の可能性を含むが(tewart, G. R. & Sah, D. Retrograde Transport of siRNA and Therapeutic Uses to Treat Neurological Disorders. United States Patent Application Publication US 2008/0039415 A1, 1-18 (2008))、正確な機序の決定にさらなる試験を実施する。
【０４９６】
ここに示すテクノロジーは、特定の脳領域の機能的ゲノムの理解、ならびに複数脳領域間の関係の解明に有用である。さらに、ある神経障害の研究(例えば記憶障害(Samuelson, K. W. Post-traumatic stress disorder and declarative memory functioning: a review. Dialogues in Clinical Neuroscience 13, 346-351 (2011)))は、限定的かつ領域的標的分布およびサイレンシングから利益を受け得る。しかしながら、その分布プロファイルにより、現在存在しているｈｓｉＲＮＡは、ハンチントン病のような一般的神経障害に実行可能な治療ではない。複数注射は小齧歯類で全体的サイレンシングの増加に作用するが、このテクノロジーを大型動物脳およびヒトでの使用に適合させ、均一かつ広範な分布を達成するために、他の化学的修飾および送達の治療方法が利用されるであろう。これに接近するであろう多数の方法がある。まず、ｈｓｉＲＮＡ組成物自体への化学的調節をなし得る。これらは、種々の脂質へのコンジュゲート、主鎖のさらなるホスホロチオエート基での補助または疎水性部分のヌクレオチド自体への添加を含む(Vaught, J. D., Dewey, T. & Eaton, B. E. T7 RNA Polymerase Transcription with 5-Position Modified UTP Derivatives. J. Am. Chem. Soc. 126, 11231-11237 (2004))。これらの修飾の全ては、より遠い距離を経るより改善された分布を可能にする一定範囲の疎水性によって支持される。バイオアベイラビリティの増大もまた線条体内ではなく、脳全体の暴露の可能性を高めるＣＳＦへのような種々の態様による注射により達成される。しかしながら、ＣＳＦを経る送達は、線条体以外の脳領域へのｈｓｉＲＮＡの局在化を支持し、ハンチントン病処置のためのより理想的送達方法とはならない。他の可能性は、これらの疎水性に修飾されたｓｉＲＮＡをエキソソームおよびリポソームに包含させることによる製剤化送達であり(現在のリポフェクタミンＴＭ製剤より低毒性)、これらの天然および合成ナノ担体のより均一に分散された形式での積荷の送達に使用することである(Alvarez-Erviti, L. et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nat Biotechnol 1-7 (2011). doi:10.1038/nbt.1807; Marcus, M. & Leonard, J. FedExosomes: Engineering Therapeutic Biological Nanoparticles that Truly Deliver. Pharmaceuticals 6, 659-680 (2013))。しかしながら、送達ｈｓｉＲＮＡの効力および効果は、これらの方法について検証する必要がある。
【０４９７】
結論として、ＨＴＴ１０１５０はインビトロで一次ニューロンおよびインビボでマウス脳への局所的なハンチンチンｍＲＮＡのターゲティングに効率的であった。この化合物は一次細胞への送達のためになんら製剤を必要とせず、ハンチンチンならびに他の標的のための遺伝子機能的試験を可能とし、神経障害研究のために極めて有用なツールとなった。このテクノロジーの潜在的利点は、将来的にハンチントン病ならびに他の神経疾患のための治療処置としてｈｓｉＲＮＡが機能することを可能とするはずである。
【０４９８】
１.９  方法
細胞培養
ＨｅＬａ細胞を、１０％胎児ウシ血清(Gibco)および１００Ｕ／mLペニシリン／ストレプトマイシン(Invitrogen)添加ＤＭＥＭ(Corning Cellgro)に播種し、３７℃および５％ＣＯ２で増殖させた。細胞は１５継代まで２〜５日に分け、その後廃棄した。
【０４９９】
受動的取り込みのための細胞培養
細胞を、９６ウェル組織培養処置プレートにおいて６％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ中、１０,０００細胞／ウェルで播種した。ｈｓｉＲＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ(Gibco)で２×最終濃度まで希釈し、５０μL希釈ｈｓｉＲＮＡを５０μLの細胞に３％ＦＢＳ最終まで添加した。細胞を、７２時間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０５００】
脂質介在取り込みのための細胞培養
細胞を、９６ウェル組織培養処置プレートにおいて、６％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ中１０,０００細胞／ウェルで播種した。ｈｓｉＲＮＡを、ＯｐｔｉＭＥＭで４×最終濃度に希釈した。LIPOFECTAMINE RNAIMAX Transfection Reagent(Invitrogen #13778150)を４×最終濃度に希釈した(最終＝０.３μL／２５μL／ウェル)。ＲＮＡＩＭＡＸおよびｈｓｉＲＮＡを１：１で混合し、５０μLを、５０μLの細胞に３％ＦＢＳ最終について添加した。細胞を、７２時間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０５０１】
一次ニューロンの製造
一次皮質ニューロンをＷＴ(ＦＶＢＮ)マウスのＥ１５.５マウス胚から得た。妊娠雌をアバチン(２５０mg／体重kg)ＩＰ注射で麻酔し、次いで頚椎脱臼させた。胚を除き、氷冷ＤＭＥＭ／Ｆ１２媒体(Invitrogen)含有ペトリ皿に移した。脳を除き、髄膜を注意深く離した。皮質を単離し、予め温めたパパイン溶液含有１.５mlチューブに２５分、３７℃および５％ＣＯ２で移し、組織を溶解した。パパイン溶液を次のとおり調製した：パパイン(Worthington #54N15251)を２mL  HibernateE(Brainbits)および１mL  ＥＢＳＳ(Worthington)に溶解した。別に、ＤＮａｓｅ(Worthington #54M15168)を０.５mL  HibernateEに再懸濁した。次いで、０.２５mLの再懸濁ＤＮａｓｅを再懸濁パパインに最終溶液のために移した。２５分インキュベーション後、パパイン溶液を除き、２.５％ＦＢＳ添加１mL  NbActiv4(Brainbits)を組織に添加した。次いで皮質を、熱加工、ガラスパスツールピペットを上下することにより解離させた。皮質ニューロンを計数し、１×１０６細胞／mlでプレーティングした。生存細胞造影試験のために、培養プレートをポリＬ−リシン(Sigma #P4707)でプレコートし、２×１０５細胞を、各皿のガラス中心に添加した。サイレンシングアッセイのために、ニューロンを、ポリＬ−リシンプレコート９６ウェルプレート(BD BIOCOAT #356515)に１×１０５細胞／ウェルで播種した。一夜、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーション後、非神経細胞の増殖を阻止するための有糸分裂阻害剤、０.４８４μL／mLの５’ＵｔＰ(Sigma #U6625)および０.２４０２μL／mLの５’ＦｄＵ(Sigma #F3503)添加等体積のNbActiv4(Brainbits)を神経細胞培養に添加した。培地の体積の半分を、ニューロンをｓｉＲＮＡで処置するまで４８時間毎に変えた(有糸分裂阻害剤含有新NbActiv4)。細胞が処置されたら、培地を除かず、添加だけした。全てのこの後の培地添加は有糸分裂阻害剤を含んだ。
【０５０２】
ｍＲＮＡ定量化
ｍＲＮＡをQUANTIGENE 2.0アッセイ(Affymetrix #QS0011)を使用して定量化した。細胞を２５０μL希釈溶解混合物(Affymetrix #13228)、１部溶解混合物、２部Ｈ２Ｏと、０.１６７μg／μLプロテイナーゼＫ(Affymetrix #QS0103)で３０分、５５℃で溶解した。細胞ライセートを徹底的に混合し、４０μL(約８０００細胞)のライセートを、プロテイナーゼＫなしの４０μLのさらなる希釈溶解混合物と共に捕捉プレートに添加した。プローブセットをAffymetrixプロトコールに特定のとおり希釈した。ＨｅＬａ細胞について、２０μLのヒトＨＴＴまたはＰＰＩＢプローブセット(Affymetrix #SA-50339, #SA-10003)を１００μL最終体積まで適切なウェルに添加した。一次ニューロンについて、２０μLのマウスＨＴＴまたはＰＰＩＢプローブセット(Affymetrix #SB-14150, #SB-10002)を使用した。
【０５０３】
組織を、５mg組織パンチについて２μg／μLプロテイナーゼＫを添加した３００μLの均質化緩衝液(Affymetrix #10642)で同様に処置した。次いで組織を９６ウェルプレート形式で、QIAGEN TissueLyser IIで均質化し、４０μLを捕捉プレートに添加した。プローブセットをAffymetrixプロトコールに特定するように希釈し、６０μLのＨＴＴまたはＰＰＩＢプローブセット(Affymetrix #SB-14150, #SB-10002)を、１００μL最終体積まで捕捉プレートの各ウェルに添加した。ＤＡＲＰＰ３２定量化について、１０μLの組織サンプルおよび３０μLの均質化緩衝液のみを、６０μLのマウスＰｐｐ１ｒ１ｂプローブセット(Affymetrix #SB-21622)と共に各ウェルに添加した。シグナルをAffymetrixプロトコールに従い増幅させた。発光をVeritas LuminometeまたはTecan M 1000で検出した。
【０５０４】
生存細胞染色
生存細胞ｈｓｉＲＮＡ取り込みをモニターするために、一次ニューロンの製造について上記のとおり細胞を３５mmガラス底皿あたり２×１０５細胞で播種した。造影前に、細胞核を、製造業者により示されるとおり、NUCBLUE(Life Technologies #R37605によるMolecular Probes)を使用して無フェノールレッドNbActiv4で染色した。造影を無フェノールレッドNbActiv4で実施した。細胞を０.５μMのＣｙ３標識ｈｓｉＲＮＡで処置し、生存細胞造影を経時的に実施した。全生存細胞共焦点画像をツァイス共焦点顕微鏡で獲得し、画像をImageJ(1.47v)ソフトウェアを使用して処理した。
【０５０５】
免疫組織化学／免疫蛍光
分布試験について、脳に１nmol(１２.５μg)のＣｙ３標識ｈｓｉＲＮＡを注射した。２４時間後、マウスを屠殺し、脳を取り出し、DERC Morphology Core at UMASS Medical Schoolに送り、パラフィンに包埋させ、４μm切片にスライスし、ガラススライドにマウントした。切片をキシレン中で２回８分脱パラフィン化した。次いで切片を連続エタノール希釈(１００％、９５％、８０％)で各４分再水和し、次いで２回、２分、ＰＢＳで洗浄した。ＮｕｅＮ染色について、スライドを、５分、抗原回収緩衝液で沸騰させ、次いで室温で２０分静置し、続いてＰＢＳで５分洗浄した。次いでスライドを５％正常ヤギ血清でＰＢＳ＋０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０で１時間遮断し、ＰＢＳ＋０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０で１回、５分洗浄した。一次抗体(ＰＢＳ＋０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０中１：１０００希釈)をスライドに１時間インキュベーションのために添加し、続いて３回ＰＢＳ＋０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０で５分洗浄した。二次抗体(ＰＢＳ＋０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０中１：１０００希釈)をスライドに暗所での３０分インキュベーションのために添加し、続いて３回ＰＢＳ＋０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０で５分洗浄した。次いで、スライドをＤＡＰＩ(Life Technologies #D3571のMolecular Probes)で染色し、２５０ng／mLにＰＢＳで１分希釈し、続いて３回、ＰＢＳで１分洗浄した。マウンティング媒体およびカバーグラスをスライドに適用し、一夜乾燥させて、記載する拡大率でライカDM5500 - DFC365FX顕微鏡で造影した。
【０５０６】
毒性およびミクログリア活性化試験のために、抽出、潅流脳を氷冷ＰＢＳ中、ライカ2000T Vibratomeで４０μm切片にスライスした。免疫組織化学を、ＤＡＲＰＰ３２(Millipore、１：１０,０００希釈)およびＩＢＡ−１(Millipore、１：５００希釈)に対して６切片毎に実施した。切片をマウントし、光学顕微鏡で可視化した。４画像を線条体の各切片の注射および非注射部位の両方で２０倍で撮った。ＤＡＲＰＰ３２陽性ニューロン数をＩｍａｇｅＪを使用して定量化した。活性化ミクログリアをＩＢＡ−１に対する染色細胞の形態により定量化した。
【０５０７】
動物、定位注射
野生型(ＦＶＢＮ)マウスは、定位的配置で右線条体(協調(ブレグマに相対的)は１.０mm前側、２.０mm側面および３.０mm腹側)のマイクロ注射を受けた。動物を、１.２％アバチンで注射前に深く麻酔した。毒性(ＤＡＲＰＰ３２)および有効性の両方の試験について、マウスはＰＢＳまたは人工脳脊髄液(２μL／線条体、Ｎ＝８マウス)、１２.５μgのＮＴＣ  ｈｓｉＲＮＡ(２μLの５００μM原液／線条体、Ｎ＝８マウス)、２５μgのＨＴＴ１０１５０  ｈｓｉＲＮＡ(２μLの１mM原液／線条体、Ｎ＝８マウス)、１２.５μgのＨＴＴ１０１５０  ｈｓｉＲＮＡ(２μLの５００μM原液／線条体、計Ｎ＝１６マウス、２回の異なる日に８マウスの２セット)、６.３μgのＨＴＴ１０１５０  ｈｓｉＲＮＡ(２μLの２５０μM原液／線条体、Ｎ＝８マウス)または３.１μgのＨＴＴ１０１５０  ｈｓｉＲＮＡ(２μLの１２５μM原液／線条体、Ｎ＝８マウス)を注射され、５日後屠殺された。脳を取り出し、３個の３００μm冠状切片を製造した。１個の２mmパンチを各切片の側あたり(注射および非注射)取得し、RNAlater(Ambion #AM7020)で２４時間、４℃に置いた。各パンチを、QUANTIGENEアッセイ解析のための独立したサンプルとして処理した。全動物手順は、the University of Massachusetts Medical School Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC, protocol number A-2411)により承認された。
【０５０８】
統計解析
データ分析を、GraphPad Prism 6 version 6.04ソフトウェア(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)を使用して実施した。濃度依存的曲線ＩＣ５０について、曲線をｌｏｇ(阻害剤)対応答−可変傾斜(４パラメータ)を使用して適合させた。曲線の底を０以上に設定し、曲線上部を１００以下に設定した。各独立したマウス実験について、全データが対照の比率として表されるように、各用量でのノックダウンレベルをＰＢＳまたは人工ＣＳＦ群の非注射部位である対照群の平均に対して正規化した。インビボデータを複数比較についてボンフェローニ補正を伴うクラスカル・ワリス検定(一元配置ＡＮＯＶＡ)を使用して分析した。全比較における差異は、０.０５未満のＰ値で有意とみなした。
【０５０９】
受動的取り込み(一次スクリーニングおよび用量応答)のための細胞培養
細胞を、９６ウェル組織培養処置プレートで６％ＦＢＳ(Gibco)添加ＤＭＥＭ(Gibco)中、１０,０００細胞／ウェルで播種した。ＨｓｉＲＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ(Gibco)で２×最終濃度に希釈し、５０μL希釈ｈｓｉＲＮＡを、５０μLの細胞に３％ＦＢＳ最終について添加した。細胞を、７２時間、３７Ｃおよび５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０５１０】
脂質介在取り込みのための細胞培養
細胞を、９６ウェル組織培養処置プレートで６％ＦＢＳ(Gibco)含有ＤＭＥＭ(Gibco)中、１０,０００細胞／ウェルで播種した。ＨｓｉＲＮＡを、ＯｐｔｉＭＥＭ(Gibco)で４×最終濃度に希釈した。LIPOFECTAMINE RNAIMAX Transfection Reagent(Invitrogen CAT#13778150)を４×最終濃度に希釈した(最終＝０.３μL／２５μL／ウェル)。ＲＮＡＩＭＡＸおよびｈｓｉＲＮＡを１：１で混合し、５０μLを５０μLの細胞に３％ＦＢＳ最終のために添加した。細胞を７２時間、３７Ｃおよび５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０５１１】
ｍＲＮＡ定量化
ｍＲＮＡを、QUANTIGENE 2.0アッセイ(Affymetrix QS0011)を使用して定量化した。細胞を２５０μL希釈溶解混合物、１部溶解混合物、２部Ｈ２Ｏと、０.１６７μg／μLプロテイナーゼＫ(Affymetrix QS0103)で３０分、５５℃で溶解した。細胞ライセートを徹底的に混合し、４０μL(〜８０００細胞)のライセートをプロテイナーゼＫを含まない４０μLのさらなる希釈溶解混合物と共に捕捉プレートに添加した。組織を、５mg組織パンチについて、２μg／μLプロテイナーゼＫ含有３００μLの均質化緩衝液(Affymetrix)を使用して同様に処置した。次いで組織を、９６ウェルプレート形式でQaigen TissueLyzerで均質化し、４０μLを捕捉プレートに添加した。プローブセットをAffymetrixプロトコールに特定されるように希釈し、２０μLのＨＴＴまたはＰＰＩＢプローブ(Affymetrix：SA-50339, SA-10003)を捕捉プレートの各ウェルに最終体積１００μLまで添加した。シグナルを製造プロトコールに従い増幅させた。発光をVeritas LuminometeまたはTecan M 1000で検出した。
【０５１２】
生存細胞染色および脳切片免疫染色
生存細胞取り込みモニタリングについて、細胞を３５mmガラス底皿あたり２×１０５細胞密度で播種し、一夜増殖させた。造影前に、細胞小器官を、特記しない限り、Life Technologiesから購入した染色試薬を使用してＨＢＳＳ(Gibco)において染色した：細胞核、小胞体およびリソソームを、製造業者の指示どおり、NUCBLUE LIVE READYPROBE、ER-TRACKER Green(Bodipy FL Glibenclamide)およびLYSOTRACKER Deep Red試薬を使用して、各々染色した。造影を、フェノールレッドなしの非補足ＤＭＥＭで実施した(Invitrogen)。細胞を０.５μMのＣｙ３標識ｈｓｉＲＮＡで処置し、生存細胞造影を経時的に実施した。
【０５１３】
共焦点造影
全共焦点画像を、60x Plan/APOオイルレンズおよびCoolsnap HQ2カメラ(Roper)を備えたＴＥ−２００Ｅ２倒立顕微鏡(Nikon)にマウントしたCSU10B Spinning Disk Confocal System scan head(Solamere Technology Group)で獲得した。画像をImageJ(1.47v)ソフトウェアを使用して処理した。ｈｓｉＲＮＡを伴わないまたは伴うニューロン数をＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して計数した。脳切片画像を、１μmのｚ軸スペーシングで獲得した。
【０５１４】
実施例２. ｈｓｉＲＮＡ保持および分布は疎水性と直接相関する
ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡは、部分的安定化ｈｓｉＲＮＡより１０倍低用量で脳および脊髄における改善された保持および蓄積ならびに最大サイレンシングを示すが、それらは注射部位近辺に大部分保持された(図１０２；Ｃｈｏｌ−ｈｓｉＲＮＡ)。ｈｓｉＲＮＡの限定的な分布が、コレステロールコンジュゲートの強い疎水性によるものであり、ｈｓｉＲＮＡの脂質に富むミエリンおよび有髄構造への優先的結合に起因し、そしてｈｓｉＲＮＡコンジュゲートの疎水性の微調整が脊髄および脳にわたる分布を改善するとの仮説を立てた。この考えを試験するために、活性神経細胞輸送ができる一団の天然に存在する疎水性分子をスクリーニングし、(ｉ)向神経活性ステロイド、すなわち、ＧＡＢＡ(Lan NC, Gee KW. Neuroactive steroid actions at the GABAA receptor. Hormones and behavior. 1994; 28:537-44. PMID: 7729823)を含む、血液脳関門を通過でき、多様な開口型イオンチャネルおよび神経細胞発現受容体に結合する(Rupprecht R. Neuroactive steroids: mechanisms of action and neuropsychopharmacological properties. Psychoneuroendocrinology. 2003; 28:139-68. PMID: 12510009)内在性ステロイド；(ii)神経細胞可塑性および修復に重要なガングリオシド神経保護糖脂質(Aureli M, Mauri L, Ciampa MG, Prinetti A, Toffano G, Secchieri C, Sonnino S. GM1 Ganglioside: Past Studies and Future Potential. Molecular neurobiology. 2015. PMID: 25762012)；および(iii)食欲、疼痛、気分および記憶に関与する受容体により認識されるエンドカンナビノイド様長鎖多不飽和脂肪酸神経調節性脂質((Dyall SC. Long-chain omega-3 fatty acids and the brain: a review of the independent and shared effects of EPA, DPA and DHA. Frontiers in aging neuroscience. 2015; 7:52. PMID: 25954194; PMCID: PMC4404917; Janssen CI, Kiliaan AJ. Long-chain polyunsaturated fatty acids (LCPUFA) from genesis to senescence: the influence of LCPUFA on neural development, aging, and neurodegeneration. Progress in lipid research. 2014; 53:1-17. PMID: 24334113; Figueroa JD, De Leon M. Neurorestorative targets of dietary long-chain omega-3 fatty acids in neurological injury. Molecular neurobiology. 2014; 50:197-213. PMID: 24740740; PMCID: PMC4183712)を含めた。
【０５１５】
オリゴヌクレオチドコンジュゲート合成のための最も確実なアプローチは、活性化コンジュゲートのアミノ修飾支持体への結合である。リンカーの構造および長さは多様であり(例えば、分枝)、支持体は実行できるならば必ず官能化された。図９３および９４に概説する合成アプローチの変法を使用して、コルチゾール、ドコサヘキサエン酸(ＤＨＡ)、カルシフェロール、コレステロールおよびＧＭ１ガングリオシドにコンジュゲートしたｈｓｉＲＮＡを合成した(図９８および９９)。全ての化合物はＨＰＬＣ精製し、その同一性をマススペクトロメトリーにより確認した。カルシフェロール官能化支持体は不安定であり、インビボで試験した数バリアントの混合物をもたらした(下記)。
【０５１６】
予想通り、化合物は、逆相クロマトグラフィーでの保持時間に基づき、種々の程度の疎水性を示した。野生型マウスの線条体またはＩＣＶへのＣｙ３標識ｈｓｉＲＮＡコンジュゲートの注射(図９２)は、疎水性と強く相関する、種々の程度のｈｓｉＲＮＡ分布および保持を示した。コンジュゲートしていないまたはリンカーのみのｈｓｉＲＮＡは、脳において最小保持を示し(アンチセンスオリゴヌクレオチドに類似)、最も疎水性化合物、コレステロールおよびＧＭ１は、主に注射部位近辺に保持された。最適保持／分布が中間物疎水性プロファイルを有するＤＨＡおよびカルシフェロールコンジュゲート(下記)で達成された。ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡを詳細に試験し、大きな有効性および前例のない安全性を示した(治療指数＞２０倍)(Nikan et al., 2016; Molecular Therapy, in revision, Appendix参照)。要約すると、ここに示すデータは、コンジュゲートの疎水性の微調整が、脳組織における最適保持、分布および安全性を支持するコンジュゲートを同定する価値ある戦略であることを示す。
【０５１７】
ＧＭ１−ｈｓｉＲＮＡは一次皮質ニューロンにおいて効率的に内在化し、ハンチンチンｍＲＮＡサイレンシングを誘発した(図１０８)。ＧＭ１−ｈｓｉＲＮＡは、線条体内注射によるマウス脳における限定的な分布を示した(図１０９)。
【０５１８】
実施例３. ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡ
部分的に修飾されたｈｓｉＲＮＡは短効果持続時間を示し、全身曝露を示さなかった(図３５Ａ〜Ｃ)。代謝安定化をさらに探索した(図３６)。完全代謝安定化は、ｈｓｉＲＮＡのＲＩＳＣエントリーを妨害しなかった(図３７)。完全代謝安定化ｈｓｉＲＮＡ(ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡ)は局所送達および分布を増大し、長時間の効果持続を可能とした(図３８、３９Ａ〜Ｂ、９１、１１０および１１１；用語“ヌクレオシド”)。
【０５１９】
天然に存在する脂質(すなわち、スフィンゴ糖脂質、多不飽和脂肪酸、セコステロイド、ステロイドホルモンおよびステロール脂質)をｈｓｉＲＮＡバイオコンジュゲートとして試験した(図４０)。脂質バイオコンジュゲートは、ｈｓｉＲＮＡＨＴＴセンス鎖疎水性に顕著な効果を有した。
【０５２０】
研究を、ｈｓｉＲＮＡコンジュゲートのインビボ分布探索のために設計した。ＦＶＢＮ  ＷＴマウスのａＣＳＦ中のＰ２安定化ｓｉＲＮＡ  ＣＹ３コンジュゲートでの線条体内片側注射(２nmol／２μl)を実施した。注射４８時間後、動物をＰＢＳおよび１０％ホルマリンで潅流した。それらの脳を取り出し、４８時間後固定した。４μm冠状および矢状切片を調製し、ＤＡＰＩで染色した。造影をライカＤＭ  ５５００蛍光顕微鏡(ＣＹ３およびＤＡＰＩ)で実施した。ｈｓｉＲＮＡ疎水性が脳分布および保持と直接相関することが確認された(図４１)。重要な性質は分布と保持のバランスであった。
【０５２１】
ドコサヘキサエン酸(ＤＨＡ)−ｈｓｉＲＮＡを合成した(図４２)。ＤＨＡは、ヒト脳の主要成分(７０％)であるオメガ−３脂肪酸である。ＤＨＡは血液脳関門(ＢＢＢ)を通過し、ニューロンおよび他の細胞型により能動的に内在化される。これは、ＨＤおよびＡＬＳ患者における認知機能改善が臨床的に示された非毒性サプリメントである。ＤＨＡは、コレステロールよりはるかに低い疎水性である。
【０５２２】
ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡおよびｃｈｏｌ−ｈｓｉＲＮＡは一次皮質ニューロンに内在化されることが示された(図４３)。ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡはニューロンおよび星状膠細胞で共局所し(図４４)、線条体ニューロンの核周囲領域に局在化した(ｃｈｏｌ−ｈｓｉＲＮＡは線条体ニューロンで検出不可能であった)(図４５)。ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡは単回線条体内注射後皮質におけるニューロンおよび星状膠細胞に共局在化した(図４６)。ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡは、皮質ニューロンにおける核周囲領域に局在化したが、ｃｈｏｌ−ｈｓｉＲＮＡは検出不可能であった(図４７)。ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡは、効率的に脳内に分散し、線条体および皮質の両方で遺伝子をサイレンシングした(図５７)。
【０５２３】
ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡは、線条体および皮質で確固たる有効性を示した(図４８および４９)。２００μgまでのＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡはＤＡＲＰＰ−３２レベルに影響せず、化合物安全性を示した(図５０)。対照的に、２５μg(１mg／kg)がｃｈｏｌ−ｈｓｉＲＮＡの最大耐性線条体内用量であった。２００μgまでのＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡは活性化ミクログリアを顕著に増加させず、最小免疫刺激を示した(図５１)。
【０５２４】
ｈｓｉＲＮＡは、インビボで脳における一次ニューロン単純かつ効率的遺伝子サイレンシングを可能にする。オリゴヌクレオチド疎水性が脳組織保持および分布を規定する。オリゴヌクレオチド化学は細胞送達および分布に影響することが示された(図５２〜５６)。ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡコンジュゲートは、広いインビボ有効性および広い治療指数を備えた新規オリゴヌクレオチド群を表す。
【０５２５】
実施例４. ＰＣ−ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡ(ＰＣ−ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡ)
ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡの広い治療指数に鼓舞され、ＤＨＡおよび関連コンジュゲートをより詳細に調べた。循環ＤＨＡは大部分リソホスファチジルコリンエステルとして存在し、これは、特異的輸送体Ｍｆｓｄ２ａにより血液脳関門を通して能動的に輸送される唯一の形態である(Nguyen LN, Ma D, Shui G, Wong P, Cazenave-Gassiot A, Zhang X, Wenk MR, Goh EL, Silver DL. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 2014; 509:503-6. PMID: 24828044)。
【０５２６】
ＤＨＡのリソホスファチジルコリンエステルは不安定であり、従って、ＤＨＡのリソホスファチジルコリン(ＰＣ)アミドを合成した(図９３、９４、１００および１０１)。ＰＣ−ＤＨＡは、固相オリゴヌクレオチド合成に適合性の代謝的に安定なアナログである。その同一性をＮＭＲおよびマススペクトロメトリーで確認した。リソホスファチジルコリンがＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡの輸送を改善するはずであるとの考えを試験するために、ＰＣ−ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡが、ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡよりも脳組織において広い分布および有効性増加を示すことが確認された(図９２および１０３)。重要なことに、一群として、ＤＨＡコンジュゲートは、最小有効用量より２０倍高い濃度で、明白な天然免疫活性化または神経細胞変性なく、広い治療指数を示した(図９２)。対照的に、Ｃｈｏｌ−ｈｓｉＲＮＡは、２５μg注射で顕著な毒性を示した(図９２Ｃ)。最後に、ボーラスＣＳＦ(ＩＣＶ)注入は、脳における広い分布を支持し、線条体、皮質を多い、脳のより後側および腹側の領域にまで達した(図９２)。その例外的特徴により、ＰＣ−ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡを、試験すべきリード化合物として選択した。
【０５２７】
ＰＣ−ＤＨＡは、ＤＨＡの代謝活性アナログである(図６２)。ＰＣ−ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡは、ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡに比して、インビトロで神経細胞サイレンシング増強、脳分布増強およびインビボ効力増強を示す(毒性の徴候なく)。
【０５２８】
ＰＣ−ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡおよびｃｈｏｌ−ｈｓｉＲＮＡは、各々変異体および野生型ｈｔｔ  ｍＲＮＡ両方の効率的サイレンシングを示した(図６１)。Ｃｈｏｌ−ｈｓｉＲＮＡは毒性を示した(６匹中３匹の動物死亡)。生存動物は極めて低い(背景に対して３倍)ヒトｈｔｔ発現を示した。
【０５２９】
ＰＣ−ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡは、一次ニューロンに送達されたとき、ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡに比して富化された効力を示した(図６３)。ｃｈｏｌ−ｈｓｉＲＮＡが一次ニューロンにおけるｈｔｔ遺伝子発現減少により有効であったが(図６４)、ＰＣ−ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡは優れた脳保持および広い分布を示した(図６５)。
【０５３０】
ＰＣ−ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡは、単回間質(ＩＳ)注射後マウス線条体における約８０％サイレンシングを示し(図６６)、単回ＩＳ注射後マウス皮質における約６０％サイレンシングを示した(図６７)。毒性の徴候はなかった。サイレンシングは、脳の注射部位に限定的であった。
【０５３１】
腎臓は、ＰＣ−ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡの主標的である(図１０７)。ＰＣ−ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡは近位曲尿細管に蓄積した。
【０５３２】
実施例５. ジ−ｈｓｉＲＮＡの発見
分枝オリゴヌクレオチドは、新規オリゴヌクレオチド治療剤群を代表する。２〜８オリゴヌクレオチドを、疎水性リンカーを介して一体として結合させ、２〜３オリゴヌクレオチドを一体として結合させるのが好ましかった。実質的化学的安定化が一般に使用された(少なくとも４０％塩基修飾、完全修飾が好ましい。２〜２０の一本鎖ホスホロチオエート化テイルを一般に使用した(８〜１０が好ましい))。
【０５３３】
二分岐ｈｓｉＲＮＡ(ジ−ｈｓｉＲＮＡ)化合物の発見は、純粋に偶然の事件であった。カルシフェロールは容易に酸化され、固体支持体は不安定となり、ＱＣおよび精製が複雑である。４つの主要な副産物のプールを野生型マウスの線条体に注射した。ＣＮＳに今まで注射されたどんな化合物よりも良好な成績であった。生成物は、広い拡散、大きな保持および皮質、線条体および脊髄におけるニューロンへの優先的取り込みを示し、これはほぼ理想的プロファイルである。ＨＰＬＣおよびマススペクトロメトリーによる詳細な特徴付けの結果、粗製混合物に存在する副産物を同定した。所望のカルシフェロール−ｈｓｉＲＮＡコンジュゲート、トリエチレングリコールリンカー(ＴＥＧ)でキャップされたｈｓｉＲＮＡおよびＴＥＧリンカーにより接続された２つのｈｓｉＲＮＡであった。後者の化合物は、支持体に負荷中に開裂されたカルシフェロール由来であり、ｈｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖が増殖する２つの活性基を遊離させた(図９５Ａ)。各副産物精製後、各々がインビトロで効率的にＲＩＳＣに入ることが確認されたが(図９５Ｂ)、ジ−ｈｓｉＲＮＡのみが広い分布および優先的神経細胞取り込みを示した(図９５Ｃ)。マススペクトロメトリーにより確認された、＞７０％収率でのジ−ｈｓｉＲＮＡの合成経路(図９３および９４)が考えられた(図１００および１０１)。
【０５３４】
脳中へのジ−ｈｓｉＲＮＡ支持送達ボーラスＩＣＶ注入で、二分岐ｈｓｉＲＮＡ(ジ−ｈｓｉＲＮＡ)化合物が脳における広い分布を支持することが確認された(図６８、６９および１０４Ａ)。図１０４ＡにおけるＣｙ３−ジ−ｈｓｉＲＮＡでの脳注射が至るところピンク色であることに注意。ジ−ｓｉＲＮＡの単回注射は、注射部位の同側性および対側性の両方で検出され、拡散が注射半球に限定的ではなく、非注射部位へ中線を越えて拡散することも示した。対側性側への、顕著ではあるが、少ない程度のジ−ｓｉＲＮＡ蓄積は、完全脳サイレンシングには両側注射を必要とし得る。脳内−脳室を含む代替的注射方法がまた単回注射での両側分布を促進し得る。
【０５３５】
分岐は、脳分布増強に必須であることが確認された(図７０)。ジ−ｈｓｉＲＮＡは、線条体内注射後、マウス脳の注射半球中に分布した。単一非コンジュゲートｈｓｉＲＮＡは一次ニューロンにおいてｍＲＮＡをサイレンシングできるが、ジ−ｈｓｉＲＮＡ構造は、修飾オリゴヌクレオチドの組織分布および組織保持増強に必須であった。コレステロールのような他のコンジュゲートは、保持されるものの、注射部位からの急勾配での拡散を示した。２つの一本鎖ホスホロチオエート化テイルのわずかな疎水性が組織保持を支持し、同時に注射した脳の同側半球中の広い拡散および均一分布も可能とする。
【０５３６】
ジ−ｈｓｉＲＮＡ単回ＩＳ注射後のインビボ遺伝子サイレンシングを試験した(図７１)。ジ−ｓｉＲＮＡの単回注射は、マウス脳の線条体および皮質の両方に確固たるサイレンシングを誘発した(図７２および７３)。このレベルの有効性は、非コンジュゲートｓｉＲＮＡで今まで示されたことはなかった。ジ−ｈｓｉＲＮＡは、線条体における神経索と関連するように見えるが、観察された有効性は、線条体ニューロンが相当な程度ジ−ｓｉＲＮＡを内在化させたことを明らかに示す。
【０５３７】
ジ−ｈｓｉＲＮＡはまた均一脊髄分布も支持した(図７４)。ジ−ｈｓｉＲＮＡボーラスＩＴ注射は、脊髄におけるｈｔｔサイレンシングを支持した(図７５)。ジ−ｓｉＲＮＡは、髄腔内注射後脊髄中の確実で、均一なサイレンシング示した。脊髄の腰部領域におけるジ−ｈｓｉＲＮＡの単回注射は、頸部、胸部および腰部領域で同程度にｍＲＮＡをサイレンシングさせ、均一かつ長距離の分布を示した。薬物送達のこの認められた方法は、脊髄におけるニューロンを脅かす神経変性疾患の処置を可能とする。
【０５３８】
ジ−ｓｉＲＮＡは、脳への線条体内注射時、極めて独特な細胞分布を示した(図７６)。蛍光標識ジ−ｓｉＲＮＡは、優先的に皮質におけるニューロンに局在化することが明らかとなった。この選択的特色は、これらの化合物に特異的であり、細胞型優先性を示さなかったコレステロールの他のｓｉＲＮＡコンジュゲートには当てはまらなかった。
【０５３９】
ジ−ｓｉＲＮＡは線条体における神経索への局在化を示したが、皮質における神経細胞体内にも存在した(図７７)。科学的理論に縛られることを意図しないが、皮質への移動は拡散または線条体神経索を経る逆行輸送によるものである。逆行輸送が部分的に担うとの理論は、皮質のある領域が完全神経細胞浸透を示すのに対し、隣接領域におけるニューロンはジ−ｈｓｉＲＮＡ結合を示さないとの事実により支持される。
【０５４０】
ジ−ｈｓｉＲＮＡの髄腔内注射は、同様に脊髄について印象的な結果であった(図１０５Ａ)。ｃｈｏｌ−ｈｓｉＲＮＡ(元のコンジュゲートｈｓｉＲＮＡ)は、急勾配の分布を示し、比較的小量が灰白質および運動神経に達するのに対し、ジ−ｈｓｉＲＮＡは、脊髄中に均一に分散し、運動神経で共局在化した(図１０５Ａにおいて拡大)。
【０５４１】
単回注射後のジ−ｈｓｉＲＮＡの広い分布は、線条体における８５％を超えるサイレンシング、皮質における７０％サイレンシング(図１０４Ｂ)および脊髄における約５０％サイレンシング(図１０５Ｂ)と関係する。相当量のジ−ｈｓｉＲＮＡが線条体、皮質、肝臓および腎臓に時間と共に蓄積されるが(図１０４Ｃ)、炎症または神経細胞変性の証拠は、最小有効用量をはるかに超える試験した最高用量で検出されなかった(すなわち、４００μg  ＩＣＶおよび１５０μg  ＩＴ)。これらのレベルで、Ｃｈｏｌ−ｈｓｉＲＮＡは毒性である。これらのデータに基づき、ジ−ｈｓｉＲＮＡを、詳細な特徴付け、最適化および検証のための第二化学物群として選択した。ジ−ｈｓｉＲＮＡの詳細な特徴付けは、用量−応答、最大耐性用量および治療指数の決定のために実施する。細胞、分子および生化学的アッセイを使用して、さらに化合物のインビボ分布および蓄積ならびに標的遺伝子制御程度を測定する。
【０５４２】
実施例６. 軸索輸送が脳におけるジ−ｈｓｉＲＮＡ分布に寄与する証拠
ジ−ｈｓｉＲＮＡのニューロンへの、特に注射部位遠位への優先的送達は励みとなった。Ｃｙ３−ジ−ｈｓｉＲＮＡを線条体内注射したマウスにおいて(図９５Ｃ)、我々は、皮質の全ＮｅｕＮ陽性細胞(ニューロン)でジ−ｈｓｉＲＮＡを検出したが、他の非神経細胞型(例えば、膠細胞)では検出しなかった。この観察の一つの解釈は、ジ−ｈｓｉＲＮＡが遠位ニューロンまで軸索に沿って優先的に輸送されることである。なぜ分枝オリゴヌクレオチドが分布にこのような深い効果を有するのか？ｈｓｉＲＮＡが受容体と弱く結合し、第二の独立した結合事象が内部移行を促進する、協調的結合の役割が仮説立てられた(Alves ID, Ciano KA, Boguslavski V, Varga E, Salamon Z, Yamamura HI, Hruby VJ, Tollin G. Selectivity, cooperativity, and reciprocity in the interactions between the delta-opioid receptor, its ligands, and G-proteins. The Journal of biological chemistry. 2004; 279:44673-82. PMID: 15317820)。ｈｓｉＲＮＡの共有結合による協調的結合は、細胞の取り込み率および結果として組織保持を劇的に増強するはずである。この仮説および他の仮説を試験し、ジ−ｈｓｉＲＮＡの詳細な構造−活性相関試験を実施する。
【０５４３】
実施例７. ＰＣ−ＤＨＡおよびジ−ｈｓｉＲＮＡコンジュゲートの証拠：新規２群のＣＮＳ活性オリゴヌクレオチド
上述のデータで説明するとおり、ＣＳＦ注入後ＣＮＳ組織における広い分布および強力な遺伝子サイレンシングを支持する、２つの新規な、化学的に異なる群の治療ｓｉＲＮＡ、ＰＣ−ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡおよびジ−ｈｓｉＲＮＡが設計されている。ジ−ｈｓｉＲＮＡは有望であるように見えるが、現在安全性および治療指数のデータが足りない。ＰＣ−ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡは、広い治療可能性を有する(図１０３)。ＣＮＳ適応症についての臨床治験におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドが狭い治療指数を有するため、これは重要である。
【０５４４】
可能性のあるリスクを軽減するために、両群の化合物を詳細に評価する。目標は、ＣＳＦでのボーラス注入による、２００μg／注射未満の用量での７０％を超える標的遺伝子サイレンシング、１０倍を超える治療指数および１ヶ月〜３ヶ月効果持続期間である。小動物の脳および脊髄における簡単かつ長期サイレンシングを可能にする単純なテクノロジープラットホームの開発は、神経科学研究分野を顕著に進歩させるであろう。それは、脳生物学および神経変性疾患進行の関与への疑いと同時に様々な新規標的の直接機能的解析を可能にする。ここに記載するデータは、化学がオリゴヌクレオチドの分布、有効性および安全性を規定することを示す。ＰＣ−ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡおよびジ−ｈｓｉＲＮＡの化学的バリアントを評価し、このテクノロジープラットホームのヒト治療に向けた将来的翻訳に必須である特色である、高い有効性および広い治療指数を有する骨格を同定する。最後に、数化合物の性能を、ＨＤにおけるサイレンシングＨＴＴにより、神経変性疾患の確立された動物モデルで検証する。
【０５４５】
実施例８. 脳および脊髄におけるＰＣ−ＤＨＡおよびジ−ｈｓｉＲＮＡ分布、有効性および安全性の特徴付け
オリゴヌクレオチド合成
ＨｓｉＲＮＡおよびジ−ｈｓｉＲＮＡを合成し(０.２ｇ、＋／−Ｃｙ３)、完全代謝的安定ｈｓｉＲＮＡとしてＨＰＬＣ精製し(末端ホスフェートアナログとして５’−Ｅ−ＶＰを含む)、続いてマススペクトロメトリーにより特徴付けする。多種多様なリンカーがスクリーニングされており、ＰＣ−ＤＨＡおよびジ−ｈｓｉＲＮＡコンジュゲーションの最適骨格が同定されている。官能化支持体を図９３および９４に示すとおり合成する。次の化合物を使用する：ＨＴＴ−１０１５０(ＨＤ)およびＰＰＩＢ−４３７(ハウスキーピング対照)。数字は、ガイド鎖の５’ヌクレオチドにより標的されるヒトｍＲＮＡの位置を示す。全化合物は、先に、最適化バイオインフォマティクスパラメータを使用して、同定(Birmingham A, Anderson E, Sullivan K, Reynolds A, Boese Q, Leake D, Karpilow J, Khvorova A. A protocol for designing siRNAs with high functionality and specificity. Nature protocols. 2007; 2:2068-78. PMID: 17853862)および詳細な実験スクリーニングされている。各ｓｉＲＮＡは、対応するヒト、マウスおよびサルｍＲＮＡを標的およびサイレンシングし、これは、将来的臨床開発を単純化する。
【０５４６】
標準的オリゴヌクレオチド合成系、すなわち、Ｍｅｒｍａｉｄ１２およびＥｘｐｅｄｉｔｅに加えて、オリゴパイロット１００分取ＨＰＬＣおよび高分解能ＬＣ−ＭＳを含む中規模ＲＮＡ合成能力(Ｓ１０承諾により出資)が確立されている。下に提案するインビボ試験に必要な新規化合物の大量のバッチが合成される。
【０５４７】
投与経路最適化
数投与経路を比較し、ＣＳＦを経るボーラス注入(ＩＣＶおよびＩＴ注入)が、最良の程度の化合物保持およびＣＮＳ組織における分布を支持することが決定された。これらの経路を経るＣＳＦ送達は、臨床的に許容される投与経路である“脊椎穿刺”に類似する。組織保持および有効性のサイド・バイ・サイドの比較を、等用量がボーラス注射または１週間の期間にわたるＡＬＺＥＴポンプによる送達で実施した。顕著に良好な組織保持および有効性が、ＡＳＯで報告されたデータに一致して、ボーラス注射で観察された(Rigo F, Chun SJ, Norris DA, Hung G, Lee S, Matson J, Fey RA, Gaus H, Hua Y, Grundy JS, Krainer AR, Henry SP, Bennett CF. Pharmacology of a central nervous system delivered 2'-O-methoxyethyl-modified survival of motor neuron splicing oligonucleotide in mice and nonhuman primates. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 2014; 350:46-55. PMID: 24784568; PMCID: PMC4056267)。科学的理論に縛られることを意図しないが、ポンプ投与を超えるボーラス投与の良好な成績は、オリゴヌクレオチド取り込み機序と関係する。例えば、非増殖性オリゴヌクレオチドシンクは、ポンプ注入よりボーラスで速く飽和し、それにより過剰なオリゴヌクレオチドがより容易に輸送されることを可能にする。
【０５４８】
組織におけるインタクトガイド鎖の直接定量のために、我々は、新規な定量的ペプチド核酸(ＰＮＡ)ハイブリダイゼーションアッセイを開発し、実施した(図１０６)。アッセイは高感度であり、検出限度は組織１ｇあたり１０fmole  ｈｓｉＲＮＡであった。完全長、部分的分解、５’−リン酸化および５’−脱リン酸化ガイド鎖を有するｈｓｉＲＮＡ代謝物は、ＨＰＬＣトレースの別のピークまたはショルダーとして容易に定量された。このアッセイを使用して、脊髄および脳中の領域から採った２mmパンチ生検におけるガイド鎖保持の動態を定量する。
【０５４９】
先の経験に基づき、注射１週間後組織１ｇあたり１〜５μgオリゴヌクレオチドの蓄積が、通常増殖性標的サイレンシング支持に十分である(図１０４Ｂ、１０４Ｃ)。蛍光およびＰＮＡアッセイは、送達コンジュゲートｈｓｉＲＮＡの分布のマッピングおよび定量を可能とする。これらの試験は、機能的分析を補完し、サイレンシング有効性試験の基礎を確立する。
【０５５０】
最大耐性用量の同定
パイロット試験において、２００μg  ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡおよびジ−ｈｓｉＲＮＡが線条体内注射の安全用量として確立され(ＤＨＡのデータは図１０３Ｂおよび１０３Ｃに示す)、１５０μgが髄腔内注射の安全用量として確立され、４００μgが脳室内注射の安全用量として確立された。これらのレベルから開始して、用量を動物が何らかの毒性徴候を示すかまたはＰＣ−ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡについて約２０mMおよびジ−ｈｓｉＲＮＡについて約５０mMである薬物溶解度限度に達するまで、２倍増分で増加させる。注射３週間後(オリゴヌクレオチド毒性を見るのに必要な最適時間)、脳組織を採取し、ニューロンの数および生存能を神経細胞マーカーＮｅｕＮおよびＤＡＲＰＰ−３２での染色により評価する(Mullen RJ, Buck CR, Smith AM. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development (Cambridge, England). 1992; 116:201-11. PMID: 1483388; Weyer A, Schilling K. Developmental and cell type-specific expression of the neuronal marker NeuN in the murine cerebellum. Journal of neuroscience research. 2003; 73:400-9. PMID: 12868073; Ouimet CC, Miller PE, Hemmings HC, Jr., Walaas SI, Greengard P. DARPP-32, a dopamine- and adenosine 3':5'-monophosphate-regulated phosphoprotein enriched in dopamine-innervated brain regions. III. Immunocytochemical localization. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 1984; 4:111-24. PMID: 6319625)。ミクログリア活性化(天然免疫活性化)もＩＢＡ１での染色により評価する(Judge AD, Bola G, Lee AC, MacLachlan I. Design of noninflammatory synthetic siRNA mediating potent gene silencing in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 2006; 13:494-505. PMID: 16343994; Marques JT, Williams BR. Activation of the mammalian immune system by siRNAs. Nature biotechnology. 2005; 23:1399-405. PMID: 16273073)。化合物が、可逆性、短期炎症性応答を誘発するかを試験するために、マウスに最大耐性用量を注射し、膠細胞活性化を投与６時間後に試験する。この研究の完成は、ここに記載する新規２群の治療ｈｓｉＲＮＡの最大耐性用量に対するデータを作成する。
【０５５１】
ＰＣ−ＤＨＡおよびジ−ｈｓｉＲＮＡクリアランスプロファイルの推定
ＣＳＦおよび血液におけるＲＮＡ滞在時間を決定する。マウスにおける反復ＣＳＦ採取は実行不可能であり、それ故にＣＳＦクリアランス試験を、用量を適宜調節した、ラットを使用して実施する。１０μlのＣＳＦを、動物の重複群を使用して、ＰＣ−ＤＨＡ−およびジ−ｈｓｉＲＮＡ投与１時間、６時間、１２時間および２４時間および１週間後に採取する。同様に、２０μLの血液を、注射５分および３０分および１時間、４時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間後に採る。短時間の反復採血と関連する懸念を最小化し、厳密なデータを得るために必要な動物数を最小化するために、頸静脈カテーテル法を使用する。
【０５５２】
関連ｓｉＲＮＡ化合物での先の薬物動態試験に基づき、二相性クリアランス動態が観察され、早期相は４〜６時間以内に完了することが予測された。パイロット試験に基づき、完全薬物クリアランスに１ヶ月かかる。しかしながら、１週間のパイロット試験がクリアランスプロファイルの近似に十分である。この試験は、ここに記載する２クラスの新規治療剤ｈｓｉＲＮＡのクリアランスプロファイルに対するパイロットデータを完成する。
【０５５３】
用量応答の確立
用量応答試験を実施し、顕著なオリゴヌクレオチド蓄積を示す脳の領域におけるサイレンシングの最適用量を決定する。実験は、図１０３、１０４および１０５に示すものに準じて実施する。３mmパンチ生検試料をＰＣ−ＤＨＡおよびジ−ｈｓｉＲＮＡの用量を増加させながら注入したマウスの脳および脊柱から採取し、ＨＴＴまたは対照ｍＲＮＡのレベルをQUANTIGENE(登録商標)アッセイを使用して測定する。
【０５５４】
QUANTIGENE(登録商標)は、組織または細胞ライセートにおけるｍＲＮＡを直接検出するためにシグナル増幅を使用する高感度の９６ウェルベースのアッセイである。TissueLyserとQUANTIGENE(登録商標)を直接連結する、自動化、ハイスループット(９６ウェル)型アッセイを記載するプロトコールが最近公開された(Coles AH, Osborn MF, Alterman JF, Turanov AA, Godinho BM, Kennington L, Chase K, Aronin N, Khvorova A. A High-Throughput Method for Direct Detection of Therapeutic Oligonucleotide-Induced Gene Silencing In Vivo. Nucleic acid therapeutics. 2015. PMID: 26595721)。それ故に、ＨＴＴおよびハウスキーピングｍＲＮＡの同時定量化を多くの組織および／または動物で実施できる。パイロット試験において、８マウス／群が、８０％信頼区間(Ｉｄ)で標的遺伝子発現の４０％減少を検出するのに十分であることが決定された。
【０５５５】
ＨＴＴ  ｍＲＮＡレベルを対照ハウスキーピングｍＲＮＡについて正規化する。同じ化学的組成物の人工ＣＳＦおよび非ターゲティング対照(ＮＴＣ)を、非配列特異的事象の制御に使用する。ＮＴＣ  ｈｓｉＲＮＡを、使用動物数を制限するために、最高非毒性濃度でのみ注射する。ＮＴＣは良好な陰性対照であるが、第二ターゲティングｈｓｉＲＮＡ(例えば、ＰＰＩＢ−ターゲティング)は、同じ動物数で２つの異なる標的に対するサイレンシングデータを提供する。タンパク質レベルでのサイレンシングの確認は、疾患の動物モデルに向けた移行の前に必須であり、したがって、ウェスタンブロッティングを、ｃｈｏｌ−ｈｓｉＲＮＡについて先に実施した方法に準じて実施する(Alterman JF, Hall LM, Coles AH, Hassler MR, Didiot MC, Chase K, Abraham J, Sottosanti E, Johnson E, Sapp E, Osborn MF, Difiglia M, Aronin N, Khvorova A. Hydrophobically Modified siRNAs Silence Huntingtin mRNA in Primary Neurons and Mouse Brain. Molecular therapy Nucleic acids. 2015; 4:e266. PMID: 26623938)。この研究の完了は、ここに記載する新規２クラスの治療藥ｈｓｉＲＮＡについて、ＣＮＳの種々の領域における機能的遺伝子サイレンシングを可能にする用量を同定するはずである。
【０５５６】
単回投与によるサイレンシングのＰＣ−ＤＨＡおよびジ−ｈｓｉＲＮＡ期間
大部分の神経変性障害および疾患モデルは、症状の発症遅延を示す(例えば、マウスにおいて３〜９ヶ月)。１回の注入からのサイレンシング期間および何回の注射が６〜９ヶ月のサイレンシング支持に必要であるかを決定しなければならない。一般に、非分裂細胞におけるｓｉＲＮＡ誘発サイレンシングは月単位(１ヶ月または数ヶ月)で続くと予測される。充填ＲＩＳＣ複合体の半減期は数週間であり(Whitehead KA, Langer R, Anderson DG. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature reviews Drug discovery. 2009; 8:129-38. PMID: 19180106)、細胞あたり１,０００未満の充填ＲＩＳＣ分子がサイレンシング誘発に十分である(Stalder L, Heusermann W, Sokol L, Trojer D, Wirz J, Hean J, Fritzsche A, Aeschimann F, Pfanzagl V, Basselet P, Weiler J, Hintersteiner M, Morrissey DV, Meisner-Kober NC. The rough endoplasmatic reticulum is a central nucleation site of siRNA-mediated RNA silencing. The EMBO journal. 2013; 32:1115-27. PMID: 23511973; PMCID: 3630355; Pei Y, Hancock PJ, Zhang H, Bartz R, Cherrin C, Innocent N, Pomerantz CJ, Seitzer J, Koser ML, Abrams MT, Xu Y, Kuklin NA, Burke PA, Sachs AB, Sepp-Lorenzino L, Barnett SF. Quantitative evaluation of siRNA delivery in vivo. Rna. 2010; 16:2553-63. PMID: 20940339; PMCID: 2995415)。
【０５５７】
さらに、ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡは他の利点を提供し得る。細胞は、通常数百万のｈｓｉＲＮＡを取り込むが、大多数はリソソームに捕捉される。リソソームに捕捉された、慣用の、部分的修飾ｈｓｉＲＮＡは分解されるが、ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡはしない。その結果、ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡは、リソソームに一過性に捕捉されたＦＭ−ｈｓｉＲＮＡをゆっくり放出する細胞内“デポー”を形成し、ＲＩＳＣ充填に有用となる。Alnylam  ＧａｌＮＡｃ治験のデータは、肝臓への最適化送達が、単回皮下注射から最大６ヶ月の有効性を提供することを示す。ここに示すデータはこの観察と一致する；単回ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡ注射が少なくとも１ヶ月最大サイレンシングを提供する(図２Ｄ)。
【０５５８】
ｈｓｉＲＮＡの保持およびサイレンシングの期間を測定するために、３マウスに最高耐性用量のＰＣ−ＤＨＡ−またはジ−ｈｓｉＲＮＡを注射し、組織におけるインタクトガイド鎖のレベルを、１週間、２週間および４週間および２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月および６ヶ月にＰＮＡアッセイを使用して測定する(図１０６)。インタクトガイド鎖レベルが組織１ｇあたり１μg  ｈｓｉＲＮＡ未満に落ちたら、試験を終了する。ＨＴＴ  ｍＲＮＡレベルを、別の研究検出力(ｎ＝８)で、ガイド鎖濃度が組織１ｇあたり１μg以上である時点で測定し、サイレンシング効果の検出を容易にする。サイレンシングの期間が少なくとも３ヶ月であることが予測されるが、実験検証が望まれる。
【０５５９】
ジ−ｈｓｉＲＮＡの細胞の取り込みおよび輸送の機序の探索
二分岐ｈｓｉＲＮＡは、等用量のリンカー結合単一ｓｉＲＮＡと比較してＣＮＳ組織における顕著に増強された保持および分布を示しており、共有結合したｓｉＲＮＡの協調的結合または受容体二量体化が細胞の取り込みを駆動することを示す(図９５Ｃ)。示差的取り込みを、ＴＥＳＭ顕微鏡(時間分解落射蛍光構造顕微鏡)およびマススペクトロメトリーの組み合わせにより可視化および特徴付けする。
【０５６０】
ＨＴＴ化合物に対する“解毒薬”開発
遺伝子治療アプローチ(すなわち、永続的遺伝子サイレンシング)は現在神経変性障害の処置について考慮されており、したがって１〜６ヶ月のサイレンシング期間は比較的安全であると考えられる。それにも関わらず、サイレンシングを戻す“解毒薬が安全性に関する懸念である。“解毒薬”はまたインビボでの遺伝子機能の研究の大きなツールであり、関連する表現型を産生するためにどの程度の時間が遺伝子の下方制御に必要があるかの試験を可能とする。
【０５６１】
ＦＤＡの同様の懸念に鑑み、Alnylamは、長期サイレンシングの逆転が可能である、“REVERSIR(登録商標)”と呼ばれるテクノロジーを開発している。概念は、機能的ｈｓｉＲＮＡのシード領域に完全相補的な高親和性アンチセンス(ＬＮＡおよび２’−Ｏ−メチル／デオキシ)MIXMER(登録商標)の開発を含む。ＨＴＴ１０１５０(および最終的に他の化合物)をターゲティングするＷＡパネルのｈｓｉ解毒薬を設計し、合成し、インビトロおよびインビボでサイレンシングを逆転する能力を評価する(図９６)。解毒薬を、ＰＣ−ＤＨＡ−ｈｓｉＲＮＡと類似する分布性質を可能とするために、ＰＣ−ＤＨＡコンジュゲートのように合成する。この研究の完了は、所望によりインビボ活性を逆転可能な、リードｈｓｉＲＮＡ化合物に対する解毒薬の産生を可能にする。
【０５６２】
代替的アプローチ：ＰＣ−ＤＨＡコンジュゲーションおよび二分岐構造が脳におけるアンチセンス介在サイレンシングに介在するか否かの試験
神経変性障害の処置用アンチセンスオリゴヌクレオチドは、臨床的に進んだ開発段階にある(Evers MM, Toonen LJ, van Roon-Mom WM. Antisense oligonucleotides in therapy for neurodegenerative disorders. Advanced drug delivery reviews. 2015. PMID: 25797014; Kordasiewicz HB, Stanek LM, Wancewicz EV, Mazur C, McAlonis MM, Pytel KA, Artates JW, Weiss A, Cheng SH, Shihabuddin LS, Hung G, Bennett CF, Cleveland DW. Sustained therapeutic reversal of Huntington's disease by transient repression of huntingtin synthesis. Neuron. 2012; 74:1031-44. PMID: 22726834; PMCID: PMC3383626)。ＩＯＮＩＳ−ＨＴＴＲｘは、Ｉｏｎｉｓに独占的な２.５世代アンチセンス化学であり、学界で一般に利用可能ではない。
【０５６３】
ＨＴＴをターゲティングする高度に強力なロックド核酸(ＬＮＡ)ＧａｐｍｅＲは、いずれにしても、開発されている。ＰＣ−ＤＨＡコンジュゲーションおよび／またはジ分岐が脳組織におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの分布および保持を改善し、有効用量を低減するかを試験するために、ＨＴＴをターゲティングするＰＣ−ＤＨＡ−およびジ−ＬＮＡ  ＧａｐｍｅＲを合成する。
【０５６４】
本例の完了は、最適送達経路、薬物クリアランスおよび保持、安全性、用量応答および効果持続期間を含む、ＣＮＳ(脳および脊髄)における、ここに記載する２つの新規オリゴヌクレオチドコンジュゲート(すなわち、ＰＣ−ＤＨＡおよびジ−ｈｓｉＲＮＡ)の完全特徴付けをもたらす。ここに記載する実験は、インビボでのＣＮＳにおける遺伝子サイレンシングおよび標的検証試験のためのこれらの化合物の使用を可能とし、またＨＤの新規治療の開発に向けた確実な基礎を提供する。
【０５６５】
実施例９. 分布および治療指数を改善するための、一団のＰＣ−ＤＨＡおよびジ−ｈｓｉＲＮＡ化学的バリアントの合成および特徴付け
ここに示すデータ(図９２、１０３、１０４および１０５)は、ＰＣ−ＤＨＡ−およびジ−ｈｓｉＲＮＡ化合物が、脊髄、線条体および皮質における標的に１ヶ月〜３ヶ月効果持続期間で到達するのに十分であることを示し、これは、インビボ機能的ゲノム研究に十分である。これ単独で、顕著な達成であるが、このテクノロジープラットホームのヒト治療に向けた将来的翻訳は、他のレベルの複雑さを示す。テクノロジー翻訳前に、我々は、(ｉ)最も広い可能な治療指数および(ii)大きな脳への送達を支持する分布の増強のために、この化合物を最適化する。
【０５６６】
コンジュゲートの化学的骨格のわずかな変化が、ホスファチジルコリンでのＤＨＡ官能化により示されたように、組織分布に大きく影響し得る(図９２)。これらの合成プラットホームを利用して、一団のＰＣ−ＤＨＡ−およびジ−ｈｓｉＲＮＡバリアントを合成し、さらに治療指数および広い組織分布を最適化する。
【０５６７】
ＰＣ−ＤＨＡ最適化
ＰＣ−ＤＨＡ構造に２個の必須成分がある。ホスファチジルコリンおよびＤＨＡ(図９２における構造参照)である。ここに記載する合成アプローチ(図９３および９４)は、これらの化合物を独立して変えることを可能とする。オリゴヌクレオチドコンジュゲートの構造機能相関に関する情報は文献にはほとんどまたは全く存在せず、むしろポリマー構造および脂質化合物がどのように脂質−粒子形成に影響するかを記載する多くの情報が存在する４８。試験は、脂質の長さが製剤の全体的有効性に大きく影響することを示す。
【０５６８】
多不飽和結合はＣＮＳ組織における増強されたｈｓｉＲＮＡ分布に必須である。ＤＨＡの完全飽和アナログであるＤＣＡのコンジュゲーションは、ＣＮＳにおける広い分布を促進しない。ＤＨＡより２炭素短いＥＰＡのコンジュゲーションは、興味深い分布プロファイルをもたらすが、有効性はまだ試験していない。脂質テイルが１０から２２炭素まで、多不飽和結合数が０から４までの種々の一団のホスファチジルコリン修飾多不飽和脂肪酸バリアントを合成する。これらの合成反応の前駆体は市販されている。これらの化合物は、脂質テイル長の長さおよび多不飽和結合数がＣＮＳにおけるオリゴヌクレオチド分布にどのように影響するかを確認する。
【０５６９】
第二に、コリンエンティティーの系統的置換を、様々な修飾について、大部分天然に存在する化学的骨格、例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールおよびホスファチジルアミンを用いて行う。これらの合成の大部分を、固定脂質テイル組成物および多様な頭基を有する化合物のライブラリーを作り、並行して実施できる。このライブラリーは、ｈｓｉＲＮＡコンジュゲートのインビボ性能に対する頭基の重要性を定義するために使用されよう。
【０５７０】
送達用の化合物または製剤の性質とは無関係に、大部分の内在化オリゴヌクレオチドが生物学的に利用可能ではないことは周知である。エンドソーム溶解、ペプチド修飾ポリマーが、共投与コレステロール修飾ｓｉＲＮＡ化合物の全身有効性を増強するために、Arrowhead Research Corporationにより使用されている(Wong SC, Klein JJ, Hamilton HL, Chu Q, Frey CL, Trubetskoy VS, Hegge J, Wakefield D, Rozema DB, Lewis DL. Co-injection of a targeted, reversibly masked endosomolytic polymer dramatically improves the efficacy of cholesterol-conjugated small interfering RNAs in vivo. Nucleic acid therapeutics. 2012; 22:380-90. PMID: 23181701)。この概念の構築により、エンドソーム溶解ペプチドの種々の数および組成のリンカーのライブラリーを合成した。大部分のバリアントはｃｈｏｌ−ｈｓｉＲＮＡ有効性に影響しなかったが、最良のリード(図９７Ａ)は、受動的取り込みにより１０倍を超えてサイレンシングを増強した(図９７Ｂ)。科学的理論に縛られることを意図しないが、増強された活性は、修飾リンカーが脂質介在取り込みによる有効性を増加させなかったため(図９７Ｂ)、内在化ｃｈｏｌ−ｈｓｉＲＮＡのバイオアベイラビリティ増加または内在化したオリゴヌクレオチドの全体的量によるものである可能性が高い。このリンカーを、最も適当である脂質長および頭基と組み合わせる。
【０５７１】
ジ−ｈｓｉＲＮＡ最適化
ジ−ｈｓｉＲＮＡ化合物における二つのｈｓｉＲＮＡは、非対称性に結合されている：一方はホスフェート結合および他方はホスホロアミデート結合による(図９３、９４および１０３Ａ)。ホスホロアミデート結合が必要であるか否かを確立するために、ｈｓｉＲＮＡが両方ともホスフェートを経てリンカーに連結した二分岐化合物が現在試験中である(図９３および９４に基づく修飾合成スキーム)。ホスホロアミデート結合が必須でないことを示すことは、多数の前駆体が購入可能であるため、構造活性相関試験を単純化する。それにも関わらず、ホスホアミド結合の必要性は、ホスホアミドが酸性条件ではるかに不安定であり、エンドソームからの化合物遊離を促進すると予測されるため、興味深い。
【０５７２】
一団のバリアントを合成し、次のパラメータについて試験する：ｈｓｉＲＮＡの数(２、３、４または６、Glen Researchから購入できる２および３分岐ディバイダーを使用)ならびにオリゴヌクレオチドを接続するリンカーの化学的性質(ＴＥＧ、飽和および非飽和アルキル鎖、荷電、非荷電、３〜３０炭素の長さおよびプロトンスポンジである。取り込みに必要なホスホロチオエート結合の最小数も決定される。ホスホロチオエート結合がｈｓｉＲＮＡの受動的取り込みおよび有効性に必須であることが既に決定されているため、ホスホロチオエートテイルの協調的結合がジ−ｈｓｉＲＮＡの分布および取り込み増強を駆動することが疑われる。しかしながら、ホスホロチオエート結合はまたアンチセンスオリゴヌクレオチドの毒性も駆動する(Geary RS, Norris D, Yu R, Bennett CF. Pharmacokinetics, biodistribution and cell uptake of antisense oligonucleotides. Advanced drug delivery reviews. 2015;87:46-51)。それ故に、ホスホロチオエート数の最適化および減少は、治療指数増強に向けた合理的方針である。
【０５７３】
ＰＣ−ＤＨＡ−およびジ−ｈｓｉＲＮＡバリアントの有効性評価
組織培養実験を使用して、安全性およびＲＩＳＣ複合体への効率的侵入を確認する。次いで、各化合物を、ここで記載するように確立された最小有効量および最大耐性用量でＩＣＶ注射する。低濃度で有効であるおよび／または高濃度で非毒性である化合物を、詳細な試験のために選択する。最後に、大きな脳(例えば、ヒツジ)中の分布に最も有望な化合物を評価する。ヒツジモデルは、ＡＡＶ−ｈｔｔベクターの分布の評価のために設計されている。ここに記載するＰＮＡアッセイを使用して、ボーラスＩＣＶ注入後のヒツジ脳の種々の領域からの生検サンプルにおける化合物のレベルを測定する。
【０５７４】
本実施例の完了は： (ｉ)ＰＣ−ＤＨＡ−およびジ−ｈｓｉＲＮＡのインビボ有効性を規定する化学構造を知ること；および(ii)増強された分布、有効性および治療指数を有する化合物の型を知ることが予測される。
【０５７５】
実施例１０. ハンチントン病モデルのための候補前臨床化合物の開発
ハンチントン病動物モデルにおけるｈｓｉＲＮＡ  ＨＴＴ１０１５０の新規コンジュゲートの評価
Ｈｔｔのための機能亢進性、ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡであるＨＴＴ−１０１５０をここで記載する。その研究室で現在飼育されている複数ＨＤ動物モデル(Chang R, Liu X, Li S, Li XJ. Transgenic animal models for study of the pathogenesis of Huntington's disease and therapy. Drug design, development and therapy. 2015; 9:2179-88. PMID: 25931812; PMCID: PMC4404937)は、ＹＡＣ１２８(Hodgson JG, Agopyan N, Gutekunst CA, Leavitt BR, LePiane F, Singaraja R, Smith DJ, Bissada N, McCutcheon K, Nasir J, Jamot L, Li XJ, Stevens ME, Rosemond E, Roder JC, Phillips AG, Rubin EM, Hersch SM, Hayden MR. A YAC mouse model for Huntington's disease with full-length mutant huntingtin, cytoplasmic toxicity, and selective striatal neurodegeneration. Neuron. 1999; 23:181-92. PMID: 10402204)、ＢＡＣＨＤ(Hult S, Soylu R, Bjorklund T, Belgardt BF, Mauer J, Bruning JC, Kirik D, Petersen A. Mutant huntingtin causes metabolic imbalance by disruption of hypothalamic neurocircuits. Cell metabolism. 2011;13:428-39. PMID: 21459327; Hult Lundh S, Nilsson N, Soylu R, Kirik D, Petersen A. Hypothalamic expression of mutant huntingtin contributes to the development of depressive-like behavior in the BAC transgenic mouse model of Huntington's disease. Human molecular genetics. 2013; 22:3485-97. PMID: 23697793; Gray M, Shirasaki DI, Cepeda C, Andre VM, Wilburn B, Lu XH, Tao J, Yamazaki I, Li SH, Sun YE, Li XJ, Levine MS, Yang XW. Full-length human mutant huntingtin with a stable polyglutamine repeat can elicit progressive and selective neuropathogenesis in BACHD mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 2008; 28:6182-95. PMID: 18550760; PMCID: PMC2630800)および最近確立されたＱ１４０を含むアレルシリーズ(Ｗｅｂｓｉｔｅ：chdifoundation.org)を含み、使用される。
【０５７６】
ここに記載されたように同定した最適パラメータに基づき、ＨＴＴ−１０１５０のボーラスＩＣＶ注入を、各ハンチントンマウスモデルに実施し、マウスをＨｔｔサイレンシング、ハンチントン行動および／またはハンチントン関連表現型の発症についてアッセイし、組織学的パラメータを検証する。一組の検証アッセイが、ＹＡＣ１２８およびＱ１４０変異体ｍＲＮＡと野生型Ｈｔｔ  ｍＲＮＡの示差的発現の検出のために設計されている。ロータロッド、プラットホーム上昇 およびオープンフィールドアッセイを含む、一団の行動的アッセイが、運動機能評価のために設計されている(Sah DW, Aronin N. Oligonucleotide therapeutic approaches for Huntington disease. The Journal of clinical investigation. 2011; 121:500-7. PMID: 21285523; PMCID: 3026739; Kordasiewicz HB, Stanek LM, Wancewicz EV, Mazur C, McAlonis MM, Pytel KA, Artates JW, Weiss A, Cheng SH, Shihabuddin LS, Hung G, Bennett CF, Cleveland DW. Sustained therapeutic reversal of Huntington's disease by transient repression of huntingtin synthesis. Neuron. 2012; 74:1031-44. PMID: 22726834; PMCID: PMC3383626)。一群のマウスを、３ヶ月齢で処置して疾患予防を評価し、他群のマウスを６ヶ月で処置して疾患回復を評価する。ＨＴＴ凝集体を、市販の抗ポリグルタミン抗体(３Ｂ５Ｈ１０)を使用して免疫組織化学的染色により評価する。ＨＴＴ−１０１５０  ｈｓｉＲＮＡコンジュゲートを、必要に応じて再投与する。対照群は、ＰＢＳおよびＨＴＴ−１０１５０  ｈｓｉＲＮＡコンジュゲートと同一化学を有する非ターゲティング対照化合物を注射されたマウスを含む。最良のリードを、ハンチントン病の数行動的モデルの他の群により、独立して再試験する。
【０５７７】
この例の完了は、有効性、安全性および効果試験期間と共に、最適化ｈｓｉＲＮＡ  ＨＴＴ−１０１５０を前臨床開発に進めるのに十分な一組のデータを作成する。現在、ハンチントン病のオリゴヌクレオチドベースの処置の最良の利用可能なプログラムは２’−Ｏ−メトキシエチルＧａｐｍｅＲ(Ｉｄ.)であり、これを基準として使用する。ＩＯＮＩＳ−ＨＴＴＲｘ化合物は、最近、第１相臨床治験を開始しており、そこで、患者はボーラス脊椎穿刺注入を受け、ＣＳＦにおけるＨＴＴレベル減少が、概念実証のバイオマーカーとして利用される。これは、ハンチントン病処置のためのオリゴヌクレオチド治療の開発に向けた臨床的方針を確立する。最初に、ＩＯＮＩＳアプローチに類似して、変異体および野生型Ｈｔｔの両方のサイレンシングが計画される。ここに記載する骨格を使用して、ＳＮＰ識別により変異体ＨＴＴを選択的にサイレンシングする化合物も産生される。実際、５ＳＮＰアレルが、ハンチントン病患者変異の７５％で毒性ＣＡＧ拡張と結びつく(Pfister EL, Kennington L, Straubhaar J, Wagh S, Liu W, DiFiglia M, Landwehrmeyer B, Vonsattel JP, Zamore PD, Aronin N. Five siRNAs targeting three SNPs may provide therapy for three-quarters of Huntington's disease patients. Current biology : CB. 2009;19:774-8. PMID: 19361997; PMCID: PMC2746439)。
【０５７８】
引用による取り込み
本明細書を通して引用され得る引用文献(文献、特許、特許出願およびウェブサイトを含む)を、引用文献がここに引用される限り、その全体を、あらゆる目的のために、ここに明示的に包含させる。特に断らない限り、本開示は、当分野で周知の免疫学、分子生物学および細胞生物学の慣用の技術を使用する。
【０５７９】
本開示はまた、分子生物学および薬物送達分野で周知の技術を、その全体として引用により包含させる。これらの技術は、次の刊行物に記載される技術を含むが、これらに限定されない。
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【０５８０】
均等物
本開示は、その精神または必須特徴から逸脱することなく、他の特定の形態に具現化され得る。前記態様は、それ故に、全てに関して、開示を限定するのではなく、説明的と見なされる。本開示の範囲は、それゆえに、前の記載ではなく、添付する特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲の均等の意義および範囲内に入る全ての変化は、それ故に、ここに包含されることが意図される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２１−５】
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【図２１−６】
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【図２１−７】
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【図２１−８】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１−１】
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【図９１−２】
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【図９１−３】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５−１】
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【図９５−２】
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【図９５−３】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８−１】
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【図９８−２】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２−１】
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【図１０２−２】
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【図１０３−１】
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【図１０３−２】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０−１】
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【図１１０−２】
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【図１１０−３】
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【図１１１−１】
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【図１１１−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018516091.tif 000200
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