(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つのオープンリーディングフレームと、少なくとも１つの３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）及び／又は少なくとも１つの５’−非翻訳領域エレメント（５’−ＵＴＲエレメント）とを含み、高い翻訳効率によって特徴付けられる人工核酸分子に関する。この翻訳効率は、５’−ＵＴＲエレメント又は３’−ＵＴＲエレメント又は５’−ＵＴＲエレメントと３’−ＵＴＲエレメントの両方によって少なくとも一部寄与される。本発明は、更に、遺伝子治療及び／又は遺伝子ワクチン接種における前記人工核酸分子の使用に関する。更に、新規な３’−ＵＴＲエレメント及び５’−ＵＴＲエレメントが提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、
ｂ．少なくとも１つの３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）及び／又は少なくとも１つの５’−非翻訳領域エレメント（５’−ＵＴＲエレメント）とを含み、
高い翻訳効率によって特徴付けられることを特徴とする人工核酸分子。
【請求項２】
前記高い翻訳効率が、前記少なくとも１つの３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）及び／又は前記少なくとも１つの５’−非翻訳領域エレメント（５’−ＵＴＲエレメント）によって提供される請求項１に記載の人工核酸分子。
【請求項３】
前記人工核酸分子の翻訳効率が、レファレンス核酸分子の翻訳効率と比較され、
前記レファレンス核酸分子が、前記人工核酸分子の少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と同一である少なくとも１つのＯＲＦを含み、前記レファレンス核酸分子が、前記人工核酸分子の少なくとも１つの３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）及び／又は前記人工核酸分子の少なくとも１つの５’−非翻訳領域エレメント（５’−ＵＴＲエレメント）を含まず、
前記人工核酸分子の前記翻訳効率及び前記レファレンス核酸分子の前記翻訳効率が、
（ｉ）哺乳類細胞に前記人工核酸分子をトランスフェクトし、トランスフェクション後の特定の時点（例えば、２４時間又は４８時間）において、前記人工核酸分子の前記ＯＲＦによってコードされているタンパク質の発現量を測定する工程、
（ｉｉ）哺乳類細胞に前記レファレンス核酸分子をトランスフェクトし、トランスフェクション後の同時点において、前記レファレンス核酸分子の前記ＯＲＦによってコードされているタンパク質の発現量を測定する工程、
（ｉｉｉ）前記人工核酸分子から発現したタンパク質の量の前記レファレンス核酸分子から発現したタンパク質の量に対する比を計算する工程
を含む方法によって比較され、
（ｉｉｉ）において計算される前記比が、≧１、好ましくは＞１である請求項１から２のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項４】
前記ＯＲＦが、定量可能なタンパク質、好ましくはレポータータンパク質をコードしている請求項３に記載の人工核酸分子。
【請求項５】
前記レファレンス核酸分子が、前記人工核酸分子中には存在しない３’−ＵＴＲエレメントを含むか、又は
前記レファレンス核酸分子が、前記人工核酸分子中には存在しない５’−ＵＴＲエレメントを含む請求項３から４のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項６】
前記レファレンス核酸分子が、アルブミン遺伝子の３’−ＵＴＲ、好ましくは配列番号２０７に係る配列に対応する３’−ＵＴＲに由来する３’−ＵＴＲエレメントを含むか、又は
前記レファレンス核酸分子が、ＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲ、好ましくは５’末端オリゴピリミジン領域が欠損しているヒトリボソームタンパク質ラージ３２の５’−ＵＴＲ、好ましくは配列番号２０８に係る配列に対応する５’−ＵＴＲに由来する５’−ＵＴＲエレメントを含む請求項５に記載の人工核酸分子。
【請求項７】
前記レファレンス核酸分子が任意の３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）を含まないか、又は
前記レファレンス核酸分子が任意の５’−非翻訳領域エレメント（５’−ＵＴＲエレメント）を含まない請求項３から４のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項８】
前記方法が、更に、以下の通り特徴付けられる請求項６に記載の人工核酸分子：
（ａ）前記トランスフェクションの工程において、前記細胞が、ＨＤＦ、Ｌ９２９、ＨＥＰ２Ｇ、及びＨｅＬａ細胞の群から選択される哺乳類細胞であり；
（ｂ）前記測定の時点がトランスフェクションの２４時間後であり；且つ
（ｃ）前記レファレンス核酸分子が、配列番号２０５のｍＲＮＡ（図１Ａ）である。
【請求項９】
前記オープンリーディングフレームが、前記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は前記少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントが由来する遺伝子とは異なる遺伝子に由来する請求項１から４のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１０】
少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントを含む請求項１から９のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのオープンリーディングフレーム、前記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント、及び前記少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントが互いに異種である請求項１０に記載の人工核酸分子。
【請求項１２】
前記人工核酸分子が、リボソームタンパク質Ｓ６、ＲＰＬ３６ＡＬ、ｒｐｓ１６、又はリボソームタンパク質Ｌ９の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲを含まず、前記人工核酸分子の前記オープンリーディングフレームが、ＧＦＰタンパク質をコードしていない請求項１から１１のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１３】
前記人工核酸分子の前記オープンリーディングフレームが、レポータータンパク質をコードしていない請求項１２に記載の人工核酸分子。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は前記少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントが安定なｍＲＮＡに由来する請求項１から１３のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は前記少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントが、真核生物のタンパク質をコードしている遺伝子の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ、好ましくは脊椎動物のタンパク質をコードしている遺伝子の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ、より好ましくは哺乳類のタンパク質をコードしている遺伝子の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ、更により好ましくは霊長類のタンパク質をコードしている遺伝子の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ、特に、ヒト又はマウスのタンパク質をコードしている遺伝子の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる請求項１から１４のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は前記少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントが、それぞれ３’−ＵＴＲ及び／又は前記少なくとも１つの５’−ＵＴＲが欠損しているレファレンス核酸分子からのタンパク質産生と比べて少なくとも１．２倍、好ましくは少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、更により好ましくは少なくとも２．５倍、前記人工核酸分子の翻訳効率を増加させる、及び／又は前記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は前記少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントが、それぞれ３’−ＵＴＲ及び／又は前記少なくとも１つの５’−ＵＴＲが欠損しているレファレンス核酸分子からのタンパク質産生と比べて少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも２．５倍高い翻訳効率を前記人工核酸分子に与える請求項１から１５のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は前記少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントが、ＺＮＦ４６０、ＴＧＭ２、ＩＬ７Ｒ、ＢＧＮ、ＴＫ１、ＲＡＢ３Ｂ、ＣＢＸ６、ＦＺＤ２、ＣＯＬ８Ａ１、ＮＤＵＦＳ７、ＰＨＧＤＨ、ＰＬＫ２、ＴＳＰＯ、ＰＴＧＳ１、ＦＢＸＯ３２、ＮＩＤ２、ＡＴＰ５Ｄ、ＥＸＯＳＣ４、ＮＯＬ９、ＵＢＢ４Ｂ、ＶＰＳ１８、ＯＲＭＤＬ２、ＦＳＣＮ１、ＴＭＥＭ３３、ＴＵＢＡ４Ａ、ＥＭＰ３、ＴＭＥＭ２０１、ＣＲＩＰ２、ＢＲＡＴ１、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＣＤ９、ＤＰＹＳＬ２、ＣＤＫ９、ＴＦＲＣ、ＰＳＭＢ３  ５’−ＵＴＲ、ＦＡＳＮ、ＰＳＭＢ６、ＰＲＳＳ５６、ＫＰＮＡ６、ＳＦＴ２Ｄ２、ＰＡＲＤ６Ｂ、ＬＰＰ、ＳＰＡＲＣ、ＳＣＡＮＤ１、ＶＡＳＮ、ＳＬＣ２６Ａ１、ＬＣＬＡＴ１、ＦＢＸＬ１８、ＳＬＣ３５Ｆ６、ＲＡＢ３Ｄ、ＭＡＰ１Ｂ、ＶＭＡ２１、ＣＹＢＡ、ＳＥＺ６Ｌ２、ＰＣＯＬＣＥ、ＶＴＮ、ＡＬＤＨ１６Ａ１、ＲＡＶＥＲ１、ＫＰＮＡ６、ＳＥＲＩＮＣ５、ＪＵＰ、ＣＰＮ２、ＣＲＩＰ２、ＥＰＴ１、ＰＮＰＯ、ＳＳＳＣＡ１、ＰＯＬＲ２Ｌ、ＬＩＮ７Ｃ、ＵＱＣＲ１０、ＰＹＣＲＬ、ＡＭＮ、ＭＡＰ１Ｓ、ＮＤＵＦＳ７、ＰＨＧＤＨ、ＴＳＰＯ、ＡＴＰ５Ｄ、ＥＸＯＳＣ４、ＴＵＢＢ４Ｂ、ＴＵＢＡ４Ａ、ＥＭＰ３、ＣＲＩＰ２、ＢＲＡＴ１、ＣＤ９、ＣＤＫ９、ＰＳＭＢ３、ＰＳＭＢ６、ＰＲＳＳ５６、ＳＣＡＮＤ１、ＡＭＮ、ＣＹＢＡ、ＰＣＯＬＣＥ、ＭＡＰ１Ｓ、ＶＴＮ、ＡＬＤＨ１６Ａ１（いずれも好ましくはヒト）及びＤｐｙｓｌ２、Ｃｃｎｄ１、Ａｃｏｘ２、Ｃｂｘ６、Ｕｂｃ、Ｌｄｌｒ、Ｎｕｄｔ２２、Ｐｃｙｏｘ１ｌ、Ａｎｋｒｄ１、Ｔｍｅｍ３７、Ｔｓｐｙｌ４、Ｓｌｃ７ａ３、Ｃｓｔ６、Ａａｃｓ、Ｎｏｓｉｐ、Ｉｔｇａ７、Ｃｃｎｄ２、Ｅｂｐ、Ｓｆ３ｂ５、Ｆａｓｎ、Ｈｍｇｃｓ１、Ｏｓｒ１、Ｌｍｎｂ１、Ｖｍａ２１、Ｋｉｆ２０ａ、Ｃｄｃａ８、Ｓｌｃ７ａ１、Ｕｂｑｌｎ２、Ｐｒｐｓ２、Ｓｈｍｔ２、Ａｕｒｋｂ、Ｆｉｇｎｌ１、Ｃａｄ、Ａｎｌｎ、Ｓｌｆｎ９、Ｎｃａｐｈ、Ｐｏｌｅ、Ｕｈｒｆ１、Ｇｊａ１、Ｆａｍ６４ａ、Ｋｉｆ２ｃ、Ｔｓｐａｎ１０、Ｓｃａｎｄ１、Ｇｐｒ８４、Ｆａｄｓ３、Ｃｅｒｓ６、Ｃｘｃｒ４、Ｇｐｒｃ５ｃ、Ｆｅｎ１、Ｃｓｐｇ４、Ｍｒｐｌ３４、Ｃｏｍｔｄ１、Ａｒｍｃ６、Ｅｍｒ４、Ａｔｐ５ｄ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ、Ｃｓｆ２ｒａ、Ａａｒｓｄ１、Ｋｉｆ２２、Ｃｔｈ、Ｔｐｇｓ１、Ｃｃｌ１７、Ａｌｋｂｈ７、Ｍｓ４ａ８ａ、Ａｃｏｘ２、Ｕｂｃ、Ｓｌｐｉ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ、Ｉｇｆ２ｂｐ１、Ｔｍｅｍ３７、Ｓｌｃ７ａ３、Ｃｓｔ６、Ｅｂｐ、Ｓｆ３ｂ５、Ｐｌｋ１、Ｃｄｃａ８、Ｋｉｆ２２、Ｃａｄ、Ｃｔｈ、Ｐｏｌｅ、Ｋｉｆ２ｃ、Ｓｃａｎｄ１、Ｇｐｒ８４、Ｔｐｇｓ１、Ｃｃｌ１７、Ａｌｋｂｈ７、Ｍｓ４ａ８ａ、Ｍｒｐｌ３４、Ｃｏｍｔｄ１、Ａｒｍｃ６、Ａｔｐ５ｄ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ、Ｎｕｄｔ２２、Ａａｒｓｄ１（いずれも好ましくはマウス）からなる群から選択される遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる請求項１から１６のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントが、ＺＮＦ４６０−５’−ＵＴＲ、ＴＧＭ２−５’−ＵＴＲ、ＩＬ７Ｒ−５’−ＵＴＲ、ＢＧＮ−５’−ＵＴＲ、ＴＫ１−５’−ＵＴＲ、ＲＡＢ３Ｂ−５’−ＵＴＲ、ＣＢＸ６−５’−ＵＴＲ、ＦＺＤ２−５’−ＵＴＲ、ＣＯＬ８Ａ１−５’−ＵＴＲ、ＮＤＵＦＳ７−５’−ＵＴＲ、ＰＨＧＤＨ−５’−ＵＴＲ、ＰＬＫ２−５’−ＵＴＲ、ＴＳＰＯ−５’−ＵＴＲ、ＰＴＧＳ１−５’−ＵＴＲ、ＦＢＸＯ３２−５’−ＵＴＲ、ＮＩＤ２−５’−ＵＴＲ、ＡＴＰ５Ｄ−５’−ＵＴＲ、ＥＸＯＳＣ４−５’−ＵＴＲ、ＮＯＬ９−５’−ＵＴＲ、ＵＢＢ４Ｂ−５’−ＵＴＲ、ＶＰＳ１８−５’−ＵＴＲ、ＯＲＭＤＬ２−５’−ＵＴＲ、ＦＳＣＮ１−５’−ＵＴＲ、ＴＭＥＭ３３−５’−ＵＴＲ、ＴＵＢＡ４Ａ−５’−ＵＴＲ、ＥＭＰ３−５’−ＵＴＲ、ＴＭＥＭ２０１−５’−ＵＴＲ、ＣＲＩＰ２−５’−ＵＴＲ、ＢＲＡＴ１−５’−ＵＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＨ１−５’−ＵＴＲ、ＣＤ９−５’−ＵＴＲ、ＤＰＹＳＬ２−５’−ＵＴＲ、ＣＤＫ９−５’−ＵＴＲ、ＴＦＲＣ−５’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ３  ５’−ＵＴＲ、ＦＡＳＮ−５’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ６−５’−ＵＴＲ、ＰＲＳＳ５６−５’−ＵＴＲ、ＫＰＮＡ６−５’−ＵＴＲ、ＳＦＴ２Ｄ２−５’−ＵＴＲ、ＰＡＲＤ６Ｂ−５’−ＵＴＲ、ＬＰＰ−５’−ＵＴＲ、ＳＰＡＲＣ−５’−ＵＴＲ、ＳＣＡＮＤ１−５’−ＵＴＲ、ＶＡＳＮ−５’−ＵＴＲ、ＳＬＣ２６Ａ１−５’−ＵＴＲ、ＬＣＬＡＴ１−５’−ＵＴＲ、ＦＢＸＬ１８−５’−ＵＴＲ、ＳＬＣ３５Ｆ６−５’−ＵＴＲ、ＲＡＢ３Ｄ−５’−ＵＴＲ、ＭＡＰ１Ｂ−５’−ＵＴＲ、ＶＭＡ２１−５’−ＵＴＲ、ＣＹＢＡ−５’−ＵＴＲ、ＳＥＺ６Ｌ２−５’−ＵＴＲ、ＰＣＯＬＣＥ−５’−ＵＴＲ、ＶＴＮ−５’−ＵＴＲ、ＡＬＤＨ１６Ａ１−５’−ＵＴＲ、ＲＡＶＥＲ１−５’−ＵＴＲ、ＫＰＮＡ６−５’−ＵＴＲ、ＳＥＲＩＮＣ５−５’−ＵＴＲ、ＪＵＰ−５’−ＵＴＲ、ＣＰＮ２−５’−ＵＴＲ、ＣＲＩＰ２−５’−ＵＴＲ、ＥＰＴ１−５’−ＵＴＲ、ＰＮＰＯ−５’−ＵＴＲ、ＳＳＳＣＡ１−５’−ＵＴＲ、ＰＯＬＲ２Ｌ−５’−ＵＴＲ、ＬＩＮ７Ｃ−５’−ＵＴＲ、ＵＱＣＲ１０−５’−ＵＴＲ、ＰＹＣＲＬ−５’−ＵＴＲ、ＡＭＮ−５’−ＵＴＲ、ＭＡＰ１Ｓ−５’−ＵＴＲ（いずれも好ましくはヒト）及びＤｐｙｓｌ２−５’−ＵＴＲ、Ｃｃｎｄ１−５’−ＵＴＲ、Ａｃｏｘ２−５’−ＵＴＲ、Ｃｂｘ６−５’−ＵＴＲ、Ｕｂｃ−５’−ＵＴＲ、Ｌｄｌｒ−５’−ＵＴＲ、Ｎｕｄｔ２２−５’−ＵＴＲ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ−５’−ＵＴＲ、Ａｎｋｒｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｔｍｅｍ３７−５’−ＵＴＲ、Ｔｓｐｙｌ４−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ３−５’−ＵＴＲ、Ｃｓｔ６−５’−ＵＴＲ、Ａａｃｓ−５’−ＵＴＲ、Ｎｏｓｉｐ−５’−ＵＴＲ、Ｉｔｇａ７−５’−ＵＴＲ、Ｃｃｎｄ２−５’−ＵＴＲ、Ｅｂｐ−５’−ＵＴＲ、Ｓｆ３ｂ５−５’−ＵＴＲ、Ｆａｓｎ−５’−ＵＴＲ、Ｈｍｇｃｓ１−５’−ＵＴＲ、Ｏｓｒ１−５’−ＵＴＲ、Ｌｍｎｂ１−５’−ＵＴＲ、Ｖｍａ２１−５’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２０ａ−５’−ＵＴＲ、Ｃｄｃａ８−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ１−５’−ＵＴＲ、Ｕｂｑｌｎ２−５’−ＵＴＲ、Ｐｒｐｓ２−５’−ＵＴＲ、Ｓｈｍｔ２−５’−���ＴＲ、Ａｕｒｋｂ−５’−ＵＴＲ、Ｆｉｇｎｌ１−５’−ＵＴＲ、Ｃａｄ−５’−ＵＴＲ、Ａｎｌｎ−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｆｎ９−５’−ＵＴＲ、Ｎｃａｐｈ−５’−ＵＴＲ、Ｐｏｌｅ−５’−ＵＴＲ、Ｕｈｒｆ１−５’−ＵＴＲ、Ｇｊａ１−５’−ＵＴＲ、Ｆａｍ６４ａ−５’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２ｃ−５’−ＵＴＲ、Ｔｓｐａｎ１０−５’−ＵＴＲ、Ｓｃａｎｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｇｐｒ８４−５’−ＵＴＲ、Ｆａｄｓ３−５’−ＵＴＲ、Ｃｅｒｓ６−５’−ＵＴＲ、Ｃｘｃｒ４−５’−ＵＴＲ、Ｇｐｒｃ５ｃ−５’−ＵＴＲ、Ｆｅｎ１−５’−ＵＴＲ、Ｃｓｐｇ４−５’−ＵＴＲ、Ｍｒｐｌ３４−５’−ＵＴＲ、Ｃｏｍｔｄ１−５’−ＵＴＲ、Ａｒｍｃ６−５’−ＵＴＲ、Ｅｍｒ４−５’−ＵＴＲ、Ａｔｐ５ｄ−５’−ＵＴＲ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ−５’−ＵＴＲ、Ｃｓｆ２ｒａ−５’−ＵＴＲ、Ａａｒｓｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２２−５’−ＵＴＲ、Ｃｔｈ−５’−ＵＴＲ、Ｔｐｇｓ１−５’−ＵＴＲ、Ｃｃｌ１７−５’−ＵＴＲ、Ａｌｋｂｈ７−５’−ＵＴＲ、Ｍｓ４ａ８ａ−５’−ＵＴＲ（いずれも好ましくはマウス）からなる群から選択される遺伝子の転写物の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含む請求項１７に記載の人工核酸分子。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントが、ＮＤＵＦＳ７−３’−ＵＴＲ、ＰＨＧＤＨ−３’−ＵＴＲ、ＴＳＰＯ−３’−ＵＴＲ、ＡＴＰ５Ｄ−３’−ＵＴＲ、ＥＸＯＳＣ４−３’−ＵＴＲ、ＴＵＢＢ４Ｂ−３’−ＵＴＲ、ＴＵＢＡ４Ａ−３’−ＵＴＲ、ＥＭＰ３−３’−ＵＴＲ、ＣＲＩＰ２−３’−ＵＴＲ、ＢＲＡＴ１−３’−ＵＴＲ、ＣＤ９−３’−ＵＴＲ、ＣＤＫ９−３’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ３−３’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ６−３’−ＵＴＲ、ＰＲＳＳ５６−３’−ＵＴＲ、ＳＣＡＮＤ１−３’−ＵＴＲ、ＡＭＮ−３’−ＵＴＲ、ＣＹＢＡ−３’−ＵＴＲ、ＰＣＯＬＣＥ−３’−ＵＴＲ、ＭＡＰ１Ｓ−３’−ＵＴＲ、ＶＴＮ−３’−ＵＴＲ、ＡＬＤＨ１６Ａ１−３’−ＵＴＲ（いずれも好ましくはヒト）及びＡｃｏｘ２−３’−ＵＴＲ、Ｕｂｃ−３’−ＵＴＲ、Ｓｌｐｉ−３’−ＵＴＲ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ−３’−ＵＴＲ、Ｉｇｆ２ｂｐ１−３’−ＵＴＲ、Ｔｍｅｍ３７−３’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ３−３’−ＵＴＲ、Ｃｓｔ６−３’−ＵＴＲ、Ｅｂｐ−３’−ＵＴＲ、Ｓｆ３ｂ５−３’−ＵＴＲ、Ｐｌｋ１−３’−ＵＴＲ、Ｃｄｃａ８−３’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２２−３’−ＵＴＲ、Ｃａｄ−３’−ＵＴＲ、Ｃｔｈ−３’−ＵＴＲ、Ｐｏｌｅ−３’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２ｃ−３’−ＵＴＲ、Ｓｃａｎｄ１−３’−ＵＴＲ、Ｇｐｒ８４−３’−ＵＴＲ、Ｔｐｇｓ１−３’−ＵＴＲ、Ｃｃｌ１７−３’−ＵＴＲ、Ａｌｋｂｈ７−３’−ＵＴＲ、Ｍｓ４ａ８ａ−３’−ＵＴＲ、Ｍｒｐｌ３４−３’−ＵＴＲ、Ｃｏｍｔｄ１−３’−ＵＴＲ、Ａｒｍｃ６−３’−ＵＴＲ、Ａｔｐ５ｄ−３’−ＵＴＲ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ−３’−ＵＴＲ、Ｎｕｄｔ２２−３’−ＵＴＲ、Ａａｒｓｄ１−３’−ＵＴＲ（いずれも好ましくはマウス）からなる群から選択される遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含む請求項１７に記載の人工核酸分子。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントが、ＺＮＦ４６０−５’−ＵＴＲ、ＴＧＭ２−５’−ＵＴＲ、ＩＬ７Ｒ−５’−ＵＴＲ、ＣＯＬ８Ａ１−５’−ＵＴＲ、ＮＤＵＦＳ７−５’−ＵＴＲ、ＰＬＫ２−５’−ＵＴＲ、ＦＢＸＯ３２−５’−ＵＴＲ、ＡＴＰ５Ｄ−５’−ＵＴＲ、ＴＵＢＢ４Ｂ−５’−ＵＴＲ、ＯＲＭＤＬ２−５’−ＵＴＲ、ＦＳＣＮ１−５’−ＵＴＲ、ＣＤ９−５’−ＵＴＲ、ＰＹＳＬ２−５’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ３−５’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ６−５’−ＵＴＲ、ＫＰＮＡ６−５’−ＵＴＲ、ＳＦＴ２Ｄ２−５’−ＵＴＲ、ＬＣＬＡＴ１−５’−ＵＴＲ、ＦＢＸＬ１８−５’−ＵＴＲ、ＳＬＣ３５Ｆ６−５’−ＵＴＲ、ＶＭＡ２１−５’−ＵＴＲ、ＳＥＺ６Ｌ２−５’−ＵＴＲ、ＰＣＯＬＣＥ−５’−ＵＴＲ、ＶＴＮ−５’−ＵＴＲ、ＡＬＤＨ１６Ａ１−５’−ＵＴＲ、ＫＰＮＡ６−５’−ＵＴＲ、ＪＵＰ−５’−ＵＴＲ、ＣＰＮ２−５’−ＵＴＲ、ＰＮＰＯ−５’−ＵＴＲ、ＳＳＳＣＡ１−５’−ＵＴＲ、ＰＯＬＲ２Ｌ−５’−ＵＴＲ、ＬＩＮ７Ｃ−５’−ＵＴＲ、ＵＱＣＲ１０−５’−ＵＴＲ、ＰＹＣＲＬ−５’−ＵＴＲ、ＡＭＮ−５’−ＵＴＲ、ＭＡＰ１Ｓ−５’−ＵＴＲからなる群から選択されるヒト遺伝子の転写物の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列；又はＤｐｙｓｌ２−５’−ＵＴＲ、Ａｃｏｘ２−５’−ＵＴＲ、Ｕｂｃ−５’−ＵＴＲ、Ｎｕｄｔ２２−５’−ＵＴＲ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ−５’−ＵＴＲ、Ａｎｋｒｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｔｓｐｙｌ４−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ３−５’−ＵＴＲ、Ａａｃｓ−５’−ＵＴＲ、Ｎｏｓｉｐ−５’−ＵＴＲ、Ｉｔｇａ７−５’−ＵＴＲ、Ｃｃｎｄ２−５’−ＵＴＲ、Ｅｂｐ−５’−ＵＴＲ、Ｓｆ３ｂ５−５’−ＵＴＲ、Ｆａｓｎ−５’−ＵＴＲ、Ｈｍｇｃｓ１−５’−ＵＴＲ、Ｏｓｒ１−５’−ＵＴＲ、Ｌｍｎｂ１−５’−ＵＴＲ、Ｖｍａ２１−５’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２０ａ−５’−ＵＴＲ、Ｃｄｃａ８−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ１−５’−ＵＴＲ、Ｕｂｑｌｎ２−５’−ＵＴＲ、Ｐｒｐｓ２−５’−ＵＴＲ、Ｓｈｍｔ２−５’−ＵＴＲ、Ｆｉｇｎｌ１−５’−ＵＴＲ、Ｃａｄ−５’−ＵＴＲ、Ａｎｌｎ−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｆｎ９−５’−ＵＴＲ、Ｎｃａｐｈ−５’−ＵＴＲ、Ｐｏｌｅ−５’−ＵＴＲ、Ｕｈｒｆ１−５’−ＵＴＲ、Ｇｊａ１−５’−ＵＴＲ、Ｆａｍ６４ａ−５’−ＵＴＲ、Ｔｓｐａｎ１０−５’−ＵＴＲ、Ｓｃａｎｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｇｐｒ８４−５’−ＵＴＲ、Ｃｅｒｓ６−５’−ＵＴＲ、Ｃｘｃｒ４−５’−ＵＴＲ、Ｇｐｒｃ５ｃ−５’−ＵＴＲ、Ｆｅｎ１−５’−ＵＴＲ、Ｃｓｐｇ４−５’−ＵＴＲ、Ｍｒｐｌ３４−５’−ＵＴＲ、Ｃｏｍｔｄ１−５’−ＵＴＲ、Ａｒｍｃ６−５’−ＵＴＲ、Ｅｍｒ４−５’−ＵＴＲ、Ａｔｐ５ｄ−５’−ＵＴＲ、Ｃｓｆ２ｒａ−５’−ＵＴＲ、Ａａｒｓｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｃｔｈ−５’−ＵＴＲ、Ｔｐｇｓ１−５’−ＵＴＲ、Ｃｃｌ１７−５’−ＵＴＲ、Ａｌｋｂｈ７−５’−ＵＴＲ、Ｍｓ４ａ８ａ−５’−ＵＴＲからなる群から選択されるマウス遺伝子の転写物の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含む請求項１７から１９のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントが、ＮＤＵＦＳ７−３’−ＵＴＲ、ＰＨＧＤＨ−３’−ＵＴＲ、ＴＳＰＯ−３’−ＵＴＲ、ＡＴＰ５Ｄ−３’−ＵＴＲ、ＥＸＯＳＣ４−３’−ＵＴＲ、ＴＵＢＢ４Ｂ−３’−ＵＴＲ、ＴＵＢＡ４Ａ−３’−ＵＴＲ、ＥＭＰ３−３’−ＵＴＲ、ＣＲＩＰ２−３’−ＵＴＲ、ＢＲＡＴ１−３’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ３−３’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ６−３’−ＵＴＲ、ＳＣＡＮＤ１−３’−ＵＴＲ、ＡＭＮ−３’−ＵＴＲ、ＣＹＢＡ−３’−ＵＴＲ、ＰＣＯＬＣＥ−３’−ＵＴＲ、ＭＡＰ１Ｓ−３’−ＵＴＲ、ＶＴＮ−３’−ＵＴＲ、ＡＬＤＨ１６Ａ１−３’−ＵＴＲからなる群から選択されるヒト遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲに由来する核酸配列；又はＡｃｏｘ２−３’−ＵＴＲ、Ｕｂｃ−３’−ＵＴＲ、Ｓｌｐｉ−３’−ＵＴＲ、Ｉｇｆ２ｂｐ１−３’−ＵＴＲ、Ｔｍｅｍ３７−３’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ３−３’−ＵＴＲ、Ｃｓｔ６−３’−ＵＴＲ、Ｅｂｐ−３’−ＵＴＲ、Ｓｆ３ｂ５−３’−ＵＴＲ、Ｃｄｃａ８−３’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２２−３’−ＵＴＲ、Ｃａｄ−３’−ＵＴＲ、Ｐｏｌｅ−３’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２ｃ−３’−ＵＴＲ、Ｓｃａｎｄ１−３’−ＵＴＲ、Ｇｐｒ８４−３’−ＵＴＲ、Ｔｐｇｓ１−３’−ＵＴＲ、Ｃｃｌ１７−３’−ＵＴＲ、Ａｌｋｂｈ７−３’−ＵＴＲ、Ｍｓ４ａ８ａ−３’−ＵＴＲ、Ｍｒｐｌ３４−３’−ＵＴＲ、Ｃｏｍｔｄ１−３’−ＵＴＲ、Ａｒｍｃ６−３’−ＵＴＲ、Ａｔｐ５ｄ−３’−ＵＴＲ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ−３’−ＵＴＲ、Ｎｕｄｔ２２−３’−ＵＴＲからなる群から選択されるマウス遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含む請求項１７から１９のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントが、配列番号１５２〜配列番号２０４からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる、或いは、前記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントが、配列番号１５２〜配列番号２０４からなる群から選択される核酸配列の断片に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなる請求項１から２１のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントが、配列番号１〜配列番号１５１からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる、或いは、前記少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントが、配列番号１〜配列番号１５１からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなる請求項１から２２のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項２４】
前記断片が、３ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド、好ましくは５ヌクレオチド〜約１５０ヌクレオチド、より好ましくは１０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチド、更により好ましくは１５ヌクレオチド〜９０ヌクレオチド、最も好ましくは２０ヌクレオチド〜７０ヌクレオチドの長さを有する請求項２２から２３のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は前記少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントが、３ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド、好ましくは５ヌクレオチド〜約１５０ヌクレオチド、より好ましくは１０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチド、更により好ましくは１５ヌクレオチド〜９０ヌクレオチド、最も好ましくは２０ヌクレオチド〜７０ヌクレオチドの長さを有する請求項１から２４のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項２６】
ｃ．ポリ（Ａ）配列及び／又はポリアデニル化シグナル
を更に含む請求項１から２５のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項２７】
前記ポリ（Ａ）配列又は前記ポリアデニル化シグナルが、前記３’−ＵＴＲエレメントの３’に位置する請求項２６に記載の人工核酸分子。
【請求項２８】
前記ポリアデニル化シグナルが、コンセンサス配列ＮＮ（Ｕ／Ｔ）ＡＮＡ（Ｎ＝Ａ又はＵ）、好ましくは、ＡＡ（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡ又はＡ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡを含む請求項２６から２７のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項２９】
前記ポリアデニル化シグナル、好ましくはコンセンサス配列ＮＮＵＡＮＡが、前記３’−ＵＴＲエレメントの３’末端の約５０ヌクレオチド未満下流に位置する請求項２６から２８のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項３０】
前記ポリ（Ａ）配列が、約２０アデニンヌクレオチド〜約３００アデニンヌクレオチド、好ましくは約４０アデニンヌクレオチド〜約２００アデニンヌクレオチド、より好ましくは約５０アデニンヌクレオチド〜約１００アデニンヌクレオチド、更により好ましくは約６０アデニンヌクレオチド〜約７０アデニンヌクレオチドの長さを有する請求項２６から２８のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項３１】
５’−キャップ構造、ポリ（Ｃ）配列、ヒストンステムループ、及び／又はＩＲＥＳモチーフを更に含む請求項１から３０のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項３２】
前記ヒストンステムループが、配列番号２０９に係る配列を含む請求項３１に記載の人工核酸分子。
【請求項３３】
前記核酸が、プロモータを含む請求項１から３２のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項３４】
前記核酸が、５’−ＴＯＰ  ＵＴＲを含む請求項１から３３のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項３５】
前記核酸が、アルブミン遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる３’−ＵＴＲを含む請求項１から３４のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項３６】
前記人工核酸分子、好ましくは前記オープンリーディングフレームが、少なくとも部分的にＧ／Ｃ改変されており、好ましくは、前記オープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量が、野生型オープンリーディングフレームに比べて増加している請求項１から３５のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項３７】
前記オープンリーディングフレームが、コドンが最適化されている領域を含み、好ましくは、前記オープンリーディングフレームのコドンが最適化されている請求項１から３６のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項３８】
ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ分子である請求項１から３７のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項３９】
請求項１から３８のいずれかに記載の人工核酸分子を含むことを特徴とするベクター。
【請求項４０】
ＤＮＡベクターである請求項３９に記載のベクター。
【請求項４１】
プラスミドベクター又はウイルスベクター、好ましくは、プラスミドベクターである請求項３９から４０のいずれかに記載のベクター。
【請求項４２】
環状分子である請求項３９から４１のいずれかに記載のベクター。
【請求項４３】
５’→３’方向において、コード鎖の前記ポリ（Ａ）配列、前記ポリ（Ｃ）配列、前記ヒストンステムループ、又は前記３’−ＵＴＲエレメントに続いて、環状ベクター分子を線形化するための制限酵素部位が配置されている請求項４２に記載のベクター。
【請求項４４】
請求項１から３８のいずれかに記載の人工核酸分子又は請求項３９から４３のいずれかに記載のベクターを含むことを特徴とする細胞。
【請求項４５】
哺乳類細胞である請求項４４に記載の細胞。
【請求項４６】
哺乳類の被験体の細胞、好ましくは、哺乳類の被験体（好ましくは、ヒトの被験体）の単離細胞である請求項４４から４５のいずれかに記載の細胞。
【請求項４７】
請求項１から３８のいずれかに記載の人工核酸分子、請求項３９から４３のいずれかに記載のベクター、又は請求項４４から４６のいずれかに記載の細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項４８】
１以上の薬学的に許容できるビヒクル、希釈剤、及び／又は賦形剤、及び／又は１以上のアジュバントを更に含む請求項４７に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
医薬として使用するための請求項１から３８のいずれかに記載の人工核酸分子、請求項３９から４３のいずれかに記載のベクター、請求項４４から４６のいずれかに記載の細胞、又は請求項４７から４８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５０】
ワクチンとして使用するための又は遺伝子治療において使用するための請求項１から３８のいずれかに記載の人工核酸分子、請求項３９から４３のいずれかに記載のベクター、請求項４４から４６のいずれかに記載の細胞、又は請求項４７から４８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５１】
請求項１から３８のいずれかに記載の人工核酸分子、請求項３９から４３のいずれかに記載のベクター、請求項４４から４６のいずれかに記載の細胞、又は請求項４７から４８のいずれかに記載の医薬組成物を、それを必要としている被験体に投与することを含むことを特徴とする疾患を治療又は予防する方法。
【請求項５２】
請求項１から３８のいずれかに記載の人工核酸分子又は請求項３９から４３のいずれかに記載のベクターで細胞をトランスフェクトすることを含むことを特徴とする疾患を治療又は予防する方法。
【請求項５３】
細胞のトランスフェクトが、インビトロ／エクスビボで実施され、トランスフェクトされた細胞が、それを必要としている被験体（好ましくは、ヒト患者）に投与される請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
インビトロでトランスフェクトされる細胞が、被験体（好ましくは、ヒト患者）の単離細胞である請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
ワクチン接種方法又は遺伝子治療方法である請求項５１から５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
人工核酸分子の、好ましくはｍＲＮＡ分子又はベクターの翻訳効率を上昇させる方法であって、オープンリーディングフレームを３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメント（前記３’−ＵＴＲエレメント及び／又は前記５’−ＵＴＲエレメントは、得られる人工核酸分子からの翻訳効率を上昇させる）と連結させて、請求項１から３８のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはｍＲＮＡ分子、又は請求項３９から４３のいずれかに記載のベクターを得る工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項５７】
請求項５２に記載の、人工核酸分子の、好ましくはｍＲＮＡ分子又はベクターからの翻訳効率を上昇させる方法であって、前記３’−ＵＴＲエレメント及び／又は前記５’−ＵＴＲエレメントが、ＺＮＦ４６０、ＴＧＭ２、ＩＬ７Ｒ、ＢＧＮ、ＴＫ１、ＲＡＢ３Ｂ、ＣＢＸ６、ＦＺＤ２、ＣＯＬ８Ａ１、ＮＤＵＦＳ７、ＰＨＧＤＨ、ＰＬＫ２、ＴＳＰＯ、ＰＴＧＳ１、ＦＢＸＯ３２、ＮＩＤ２、ＡＴＰ５Ｄ、ＥＸＯＳＣ４、ＮＯＬ９、ＵＢＢ４Ｂ、ＶＰＳ１８、ＯＲＭＤＬ２、ＦＳＣＮ１、ＴＭＥＭ３３、ＴＵＢＡ４Ａ、ＥＭＰ３、ＴＭＥＭ２０１、ＣＲＩＰ２、ＢＲＡＴ１、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＣＤ９、ＤＰＹＳＬ２、ＣＤＫ９、ＴＦＲＣ、ＰＳＭＢ３  ５’−ＵＴＲ、ＦＡＳＮ、ＰＳＭＢ６、ＰＲＳＳ５６、ＫＰＮＡ６、ＳＦＴ２Ｄ２、ＰＡＲＤ６Ｂ、ＬＰＰ、ＳＰＡＲＣ、ＳＣＡＮＤ１、ＶＡＳＮ、ＳＬＣ２６Ａ１、ＬＣＬＡＴ１、ＦＢＸＬ１８、ＳＬＣ３５Ｆ６、ＲＡＢ３Ｄ、ＭＡＰ１Ｂ、ＶＭＡ２１、ＣＹＢＡ、ＳＥＺ６Ｌ２、ＰＣＯＬＣＥ、ＶＴＮ、ＡＬＤＨ１６Ａ１、ＲＡＶＥＲ１、ＫＰＮＡ６、ＳＥＲＩＮＣ５、ＪＵＰ、ＣＰＮ２、ＣＲＩＰ２、ＥＰＴ１、ＰＮＰＯ、ＳＳＳＣＡ１、ＰＯＬＲ２Ｌ、ＬＩＮ７Ｃ、ＵＱＣＲ１０、ＰＹＣＲＬ、ＡＭＮ、ＭＡＰ１Ｓ、ＮＤＵＦＳ７、ＰＨＧＤＨ、ＴＳＰＯ、ＡＴＰ５Ｄ、ＥＸＯＳＣ４、ＴＵＢＢ４Ｂ、ＴＵＢＡ４Ａ、ＥＭＰ３、ＣＲＩＰ２、ＢＲＡＴ１、ＣＤ９、ＣＤＫ９、ＰＳＭＢ３、ＰＳＭＢ６、ＰＲＳＳ５６、ＳＣＡＮＤ１、ＡＭＮ、ＣＹＢＡ、ＰＣＯＬＣＥ、ＭＡＰ１Ｓ、ＶＴＮ、ＡＬＤＨ１６Ａ１（いずれも好ましくはヒト）及びＤｐｙｓｌ２、Ｃｃｎｄ１、Ａｃｏｘ２、Ｃｂｘ６、Ｕｂｃ、Ｌｄｌｒ、Ｎｕｄｔ２２、Ｐｃｙｏｘ１ｌ、Ａｎｋｒｄ１、Ｔｍｅｍ３７、Ｔｓｐｙｌ４、Ｓｌｃ７ａ３、Ｃｓｔ６、Ａａｃｓ、Ｎｏｓｉｐ、Ｉｔｇａ７、Ｃｃｎｄ２、Ｅｂｐ、Ｓｆ３ｂ５、Ｆａｓｎ、Ｈｍｇｃｓ１、Ｏｓｒ１、Ｌｍｎｂ１、Ｖｍａ２１、Ｋｉｆ２０ａ、Ｃｄｃａ８、Ｓｌｃ７ａ１、Ｕｂｑｌｎ２、Ｐｒｐｓ２、Ｓｈｍｔ２、Ａｕｒｋｂ、Ｆｉｇｎｌ１、Ｃａｄ、Ａｎｌｎ、Ｓｌｆｎ９、Ｎｃａｐｈ、Ｐｏｌｅ、Ｕｈｒｆ１、Ｇｊａ１、Ｆａｍ６４ａ、Ｋｉｆ２ｃ、Ｔｓｐａｎ１０、Ｓｃａｎｄ１、Ｇｐｒ８４、Ｆａｄｓ３、Ｃｅｒｓ６、Ｃｘｃｒ４、Ｇｐｒｃ５ｃ、Ｆｅｎ１、Ｃｓｐｇ４、Ｍｒｐｌ３４、Ｃｏｍｔｄ１、Ａｒｍｃ６、Ｅｍｒ４、Ａｔｐ５ｄ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ、Ｃｓｆ２ｒａ、Ａａｒｓｄ１、Ｋｉｆ２２、Ｃｔｈ、Ｔｐｇｓ１、Ｃｃｌ１７、Ａｌｋｂｈ７、Ｍｓ４ａ８ａ、Ａｃｏｘ２、Ｕｂｃ、Ｓｌｐｉ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ、Ｉｇｆ２ｂｐ１、Ｔｍｅｍ３７、Ｓｌｃ７ａ３、Ｃｓｔ６、Ｅｂｐ、Ｓｆ３ｂ５、Ｐｌｋ１、Ｃｄｃａ８、Ｋｉｆ２２、Ｃａｄ、Ｃｔｈ、Ｐｏｌｅ、Ｋｉｆ２ｃ、Ｓｃａｎｄ１、Ｇｐｒ８４、Ｔｐｇｓ１、Ｃｃｌ１７、Ａｌｋｂｈ７、Ｍｓ４ａ８ａ、Ｍｒｐｌ３４、Ｃｏｍｔｄ１、Ａｒｍｃ６、Ａｔｐ５ｄ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ、Ｎｕｄｔ２２、Ａａｒｓｄ１（いずれも好ましくはマウス）からなる群から選択される遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなることを特徴とする方法。
【請求項５８】
人工核酸分子の、好ましくはｍＲＮＡ分子又はベクターからの翻訳効率を上昇させるための、３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントの使用であって、前記３’−ＵＴＲエレメント及び／又は前記５’−ＵＴＲエレメントが、ＺＮＦ４６０、ＴＧＭ２、ＩＬ７Ｒ、ＢＧＮ、ＴＫ１、ＲＡＢ３Ｂ、ＣＢＸ６、ＦＺＤ２、ＣＯＬ８Ａ１、ＮＤＵＦＳ７、ＰＨＧＤＨ、ＰＬＫ２、ＴＳＰＯ、ＰＴＧＳ１、ＦＢＸＯ３２、ＮＩＤ２、ＡＴＰ５Ｄ、ＥＸＯＳＣ４、ＮＯＬ９、ＵＢＢ４Ｂ、ＶＰＳ１８、ＯＲＭＤＬ２、ＦＳＣＮ１、ＴＭＥＭ３３、ＴＵＢＡ４Ａ、ＥＭＰ３、ＴＭＥＭ２０１、ＣＲＩＰ２、ＢＲＡＴ１、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＣＤ９、ＤＰＹＳＬ２、ＣＤＫ９、ＴＦＲＣ、ＰＳＭＢ３  ５’−ＵＴＲ、ＦＡＳＮ、ＰＳＭＢ６、ＰＲＳＳ５６、ＫＰＮＡ６、ＳＦＴ２Ｄ２、ＰＡＲＤ６Ｂ、ＬＰＰ、ＳＰＡＲＣ、ＳＣＡＮＤ１、ＶＡＳＮ、ＳＬＣ２６Ａ１、ＬＣＬＡＴ１、ＦＢＸＬ１８、ＳＬＣ３５Ｆ６、ＲＡＢ３Ｄ、ＭＡＰ１Ｂ、ＶＭＡ２１、ＣＹＢＡ、ＳＥＺ６Ｌ２、ＰＣＯＬＣＥ、ＶＴＮ、ＡＬＤＨ１６Ａ１、ＲＡＶＥＲ１、ＫＰＮＡ６、ＳＥＲＩＮＣ５、ＪＵＰ、ＣＰＮ２、ＣＲＩＰ２、ＥＰＴ１、ＰＮＰＯ、ＳＳＳＣＡ１、ＰＯＬＲ２Ｌ、ＬＩＮ７Ｃ、ＵＱＣＲ１０、ＰＹＣＲＬ、ＡＭＮ、ＭＡＰ１Ｓ、ＮＤＵＦＳ７、ＰＨＧＤＨ、ＴＳＰＯ、ＡＴＰ５Ｄ、ＥＸＯＳＣ４、ＴＵＢＢ４Ｂ、ＴＵＢＡ４Ａ、ＥＭＰ３、ＣＲＩＰ２、ＢＲＡＴ１、ＣＤ９、ＣＤＫ９、ＰＳＭＢ３、ＰＳＭＢ６、ＰＲＳＳ５６、ＳＣＡＮＤ１、ＡＭＮ、ＣＹＢＡ、ＰＣＯＬＣＥ、ＭＡＰ１Ｓ、ＶＴＮ、ＡＬＤＨ１６Ａ１（いずれも好ましくはヒト）及びＤｐｙｓｌ２、Ｃｃｎｄ１、Ａｃｏｘ２、Ｃｂｘ６、Ｕｂｃ、Ｌｄｌｒ、Ｎｕｄｔ２２、Ｐｃｙｏｘ１ｌ、Ａｎｋｒｄ１、Ｔｍｅｍ３７、Ｔｓｐｙｌ４、Ｓｌｃ７ａ３、Ｃｓｔ６、Ａａｃｓ、Ｎｏｓｉｐ、Ｉｔｇａ７、Ｃｃｎｄ２、Ｅｂｐ、Ｓｆ３ｂ５、Ｆａｓｎ、Ｈｍｇｃｓ１、Ｏｓｒ１、Ｌｍｎｂ１、Ｖｍａ２１、Ｋｉｆ２０ａ、Ｃｄｃａ８、Ｓｌｃ７ａ１、Ｕｂｑｌｎ２、Ｐｒｐｓ２、Ｓｈｍｔ２、Ａｕｒｋｂ、Ｆｉｇｎｌ１、Ｃａｄ、Ａｎｌｎ、Ｓｌｆｎ９、Ｎｃａｐｈ、Ｐｏｌｅ、Ｕｈｒｆ１、Ｇｊａ１、Ｆａｍ６４ａ、Ｋｉｆ２ｃ、Ｔｓｐａｎ１０、Ｓｃａｎｄ１、Ｇｐｒ８４、Ｆａｄｓ３、Ｃｅｒｓ６、Ｃｘｃｒ４、Ｇｐｒｃ５ｃ、Ｆｅｎ１、Ｃｓｐｇ４、Ｍｒｐｌ３４、Ｃｏｍｔｄ１、Ａｒｍｃ６、Ｅｍｒ４、Ａｔｐ５ｄ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ、Ｃｓｆ２ｒａ、Ａａｒｓｄ１、Ｋｉｆ２２、Ｃｔｈ、Ｔｐｇｓ１、Ｃｃｌ１７、Ａｌｋｂｈ７、Ｍｓ４ａ８ａ、Ａｃｏｘ２、Ｕｂｃ、Ｓｌｐｉ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ、Ｉｇｆ２ｂｐ１、Ｔｍｅｍ３７、Ｓｌｃ７ａ３、Ｃｓｔ６、Ｅｂｐ、Ｓｆ３ｂ５、Ｐｌｋ１、Ｃｄｃａ８、Ｋｉｆ２２、Ｃａｄ、Ｃｔｈ、Ｐｏｌｅ、Ｋｉｆ２ｃ、Ｓｃａｎｄ１、Ｇｐｒ８４、Ｔｐｇｓ１、Ｃｃｌ１７、Ａｌｋｂｈ７、Ｍｓ４ａ８ａ、Ｍｒｐｌ３４、Ｃｏｍｔｄ１、Ａｒｍｃ６、Ａｔｐ５ｄ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ、Ｎｕｄｔ２２、Ａａｒｓｄ１（いずれも好ましくはマウス）からなる群から選択される遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなることを特徴とする使用。
【請求項５９】
前記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は前記少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントが、ＺＮＦ４６０、ＴＧＭ２、ＩＬ７Ｒ、ＢＧＮ、ＴＫ１、ＲＡＢ３Ｂ、ＣＢＸ６、ＦＺＤ２、ＣＯＬ８Ａ１、ＮＤＵＦＳ７、ＰＨＧＤＨ、ＰＬＫ２、ＴＳＰＯ、ＰＴＧＳ１、ＦＢＸＯ３２、ＮＩＤ２、ＡＴＰ５Ｄ、ＥＸＯＳＣ４、ＮＯＬ９、ＵＢＢ４Ｂ、ＶＰＳ１８、ＯＲＭＤＬ２、ＦＳＣＮ１、ＴＭＥＭ３３、ＴＵＢＡ４Ａ、ＥＭＰ３、ＴＭＥＭ２０１、ＣＲＩＰ２、ＢＲＡＴ１、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＣＤ９、ＤＰＹＳＬ２、ＣＤＫ９、ＴＦＲＣ、ＰＳＭＢ３  ５’−ＵＴＲ、ＦＡＳＮ、ＰＳＭＢ６、ＰＲＳＳ５６、ＫＰＮＡ６、ＳＦＴ２Ｄ２、ＰＡＲＤ６Ｂ、ＬＰＰ、ＳＰＡＲＣ、ＳＣＡＮＤ１、ＶＡＳＮ、ＳＬＣ２６Ａ１、ＬＣＬＡＴ１、ＦＢＸＬ１８、ＳＬＣ３５Ｆ６、ＲＡＢ３Ｄ、ＭＡＰ１Ｂ、ＶＭＡ２１、ＣＹＢＡ、ＳＥＺ６Ｌ２、ＰＣＯＬＣＥ、ＶＴＮ、ＡＬＤＨ１６Ａ１、ＲＡＶＥＲ１、ＫＰＮＡ６、ＳＥＲＩＮＣ５、ＪＵＰ、ＣＰＮ２、ＣＲＩＰ２、ＥＰＴ１、ＰＮＰＯ、ＳＳＳＣＡ１、ＰＯＬＲ２Ｌ、ＬＩＮ７Ｃ、ＵＱＣＲ１０、ＰＹＣＲＬ、ＡＭＮ、ＭＡＰ１Ｓ、ＮＤＵＦＳ７、ＰＨＧＤＨ、ＴＳＰＯ、ＡＴＰ５Ｄ、ＥＸＯＳＣ４、ＴＵＢＢ４Ｂ、ＴＵＢＡ４Ａ、ＥＭＰ３、ＣＲＩＰ２、ＢＲＡＴ１、ＣＤ９、ＣＤＫ９、ＰＳＭＢ３、ＰＳＭＢ６、ＰＲＳＳ５６、ＳＣＡＮＤ１、ＡＭＮ、ＣＹＢＡ、ＰＣＯＬＣＥ、ＭＡＰ１Ｓ、ＶＴＮ、ＡＬＤＨ１６Ａ１からなる群から選択されるヒト遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含む請求項５７に記載の方法又は請求項５８に記載の使用。
【請求項６０】
前記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は前記少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントが、Ｄｐｙｓｌ２、Ｃｃｎｄ１、Ａｃｏｘ２、Ｃｂｘ６、Ｕｂｃ、Ｌｄｌｒ、Ｎｕｄｔ２２、Ｐｃｙｏｘ１ｌ、Ａｎｋｒｄ１、Ｔｍｅｍ３７、Ｔｓｐｙｌ４、Ｓｌｃ７ａ３、Ｃｓｔ６、Ａａｃｓ、Ｎｏｓｉｐ、Ｉｔｇａ７、Ｃｃｎｄ２、Ｅｂｐ、Ｓｆ３ｂ５、Ｆａｓｎ、Ｈｍｇｃｓ１、Ｏｓｒ１、Ｌｍｎｂ１、Ｖｍａ２１、Ｋｉｆ２０ａ、Ｃｄｃａ８、Ｓｌｃ７ａ１、Ｕｂｑｌｎ２、Ｐｒｐｓ２、Ｓｈｍｔ２、Ａｕｒｋｂ、Ｆｉｇｎｌ１、Ｃａｄ、Ａｎｌｎ、Ｓｌｆｎ９、Ｎｃａｐｈ、Ｐｏｌｅ、Ｕｈｒｆ１、Ｇｊａ１、Ｆａｍ６４ａ、Ｋｉｆ２ｃ、Ｔｓｐａｎ１０、Ｓｃａｎｄ１、Ｇｐｒ８４、Ｆａｄｓ３、Ｃｅｒｓ６、Ｃｘｃｒ４、Ｇｐｒｃ５ｃ、Ｆｅｎ１、Ｃｓｐｇ４、Ｍｒｐｌ３４、Ｃｏｍｔｄ１、Ａｒｍｃ６、Ｅｍｒ４、Ａｔｐ５ｄ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ、Ｃｓｆ２ｒａ、Ａａｒｓｄ１、Ｋｉｆ２２、Ｃｔｈ、Ｔｐｇｓ１、Ｃｃｌ１７、Ａｌｋｂｈ７、Ｍｓ４ａ８ａ、Ａｃｏｘ２、Ｕｂｃ、Ｓｌｐｉ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ、Ｉｇｆ２ｂｐ１、Ｔｍｅｍ３７、Ｓｌｃ７ａ３、Ｃｓｔ６、Ｅｂｐ、Ｓｆ３ｂ５、Ｐｌｋ１、Ｃｄｃａ８、Ｋｉｆ２２、Ｃａｄ、Ｃｔｈ、Ｐｏｌｅ、Ｋｉｆ２ｃ、Ｓｃａｎｄ１、Ｇｐｒ８４、Ｔｐｇｓ１、Ｃｃｌ１７、Ａｌｋｂｈ７、Ｍｓ４ａ８ａ、Ｍｒｐｌ３４、Ｃｏｍｔｄ１、Ａｒｍｃ６、Ａｔｐ５ｄ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ、Ｎｕｄｔ２２、Ａａｒｓｄ１からなる群から選択されるマウス遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含む請求項５７に記載の方法又は請求項５８に記載の使用。
【請求項６１】
前記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントが、ＮＤＵＦＳ７−３’−ＵＴＲ、ＰＨＧＤＨ−３’−ＵＴＲ、ＴＳＰＯ−３’−ＵＴＲ、ＡＴＰ５Ｄ−３’−ＵＴＲ、ＥＸＯＳＣ４−３’−ＵＴＲ、ＴＵＢＢ４Ｂ−３’−ＵＴＲ、ＴＵＢＡ４Ａ−３’−ＵＴＲ、ＥＭＰ３−３’−ＵＴＲ、ＣＲＩＰ２−３’−ＵＴＲ、ＢＲＡＴ１−３’−ＵＴＲ、ＣＤ９−３’−ＵＴＲ、ＣＤＫ９−３’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ３−３’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ６−３’−ＵＴＲ、ＰＲＳＳ５６−３’−ＵＴＲ、ＳＣＡＮＤ１−３’−ＵＴＲ、ＡＭＮ−３’−ＵＴＲ、ＣＹＢＡ−３’−ＵＴＲ、ＰＣＯＬＣＥ−３’−ＵＴＲ、ＭＡＰ１Ｓ−３’−ＵＴＲ、ＶＴＮ−３’−ＵＴＲ、ＡＬＤＨ１６Ａ１−３’−ＵＴＲ（いずれも好ましくはヒト）及びＡｃｏｘ２−３’−ＵＴＲ、Ｕｂｃ−３’−ＵＴＲ、Ｓｌｐｉ−３’−ＵＴＲ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ−３’−ＵＴＲ、Ｉｇｆ２ｂｐ１−３’−ＵＴＲ、Ｔｍｅｍ３７−３’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ３−３’−ＵＴＲ、Ｃｓｔ６−３’−ＵＴＲ、Ｅｂｐ−３’−ＵＴＲ、Ｓｆ３ｂ５−３’−ＵＴＲ、Ｐｌｋ１−３’−ＵＴＲ、Ｃｄｃａ８−３’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２２−３’−ＵＴＲ、Ｃａｄ−３’−ＵＴＲ、Ｃｔｈ−３’−ＵＴＲ、Ｐｏｌｅ−３’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２ｃ−３’−ＵＴＲ、Ｓｃａｎｄ１−３’−ＵＴＲ、Ｇｐｒ８４−３’−ＵＴＲ、Ｔｐｇｓ１−３’−ＵＴＲ、Ｃｃｌ１７−３’−ＵＴＲ、Ａｌｋｂｈ７−３’−ＵＴＲ、Ｍｓ４ａ８ａ−３’−ＵＴＲ、Ｍｒｐｌ３４−３’−ＵＴＲ、Ｃｏｍｔｄ１−３’−ＵＴＲ、Ａｒｍｃ６−３’−ＵＴＲ、Ａｔｐ５ｄ−３’−ＵＴＲ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ−３’−ＵＴＲ、Ｎｕｄｔ２２−３’−ＵＴＲ、Ａａｒｓｄ１−３’−ＵＴＲ（いずれも好ましくはマウス）からなる群から選択される遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含む；好ましくは、前記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントが、ＮＤＵＦＳ７−３’−ＵＴＲ、ＰＨＧＤＨ−３’−ＵＴＲ、ＴＳＰＯ−３’−ＵＴＲ、ＡＴＰ５Ｄ−３’−ＵＴＲ、ＥＸＯＳＣ４−３’−ＵＴＲ、ＴＵＢＢ４Ｂ−３’−ＵＴＲ、ＴＵＢＡ４Ａ−３’−ＵＴＲ、ＥＭＰ３−３’−ＵＴＲ、ＣＲＩＰ２−３’−ＵＴＲ、ＢＲＡＴ１−３’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ３−３’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ６−３’−ＵＴＲ、ＳＣＡＮＤ１−３’−ＵＴＲ、ＡＭＮ−３’−ＵＴＲ、ＣＹＢＡ−３’−ＵＴＲ、ＰＣＯＬＣＥ−３’−ＵＴＲ、ＭＡＰ１Ｓ−３’−ＵＴＲ、ＶＴＮ−３’−ＵＴＲ、ＡＬＤＨ１６Ａ１−３’−ＵＴＲ（いずれもヒト）、Ａｃｏｘ２−３’−ＵＴＲ、Ｕｂｃ−３’−ＵＴＲ、Ｓｌｐｉ−３’−ＵＴＲ、Ｉｇｆ２ｂｐ１−３’−ＵＴＲ、Ｔｍｅｍ３７−３’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ３−３’−ＵＴＲ、Ｃｓｔ６−３’−ＵＴＲ、Ｅｂｐ−３’−ＵＴＲ、Ｓｆ３ｂ５−３’−ＵＴＲ、Ｃｄｃａ８−３’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２２−３’−ＵＴＲ、Ｃａｄ−３’−ＵＴＲ、Ｐｏｌｅ−３’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２ｃ−３’−ＵＴＲ、Ｓｃａｎｄ１−３’−ＵＴＲ、Ｇｐｒ８４−３’−ＵＴＲ、Ｔｐｇｓ１−３’−ＵＴＲ、Ｃｃｌ１７−３’−ＵＴＲ、Ａｌｋｂｈ７−３’−ＵＴＲ、Ｍｓ４ａ８ａ−３’−ＵＴＲ、Ｍｒｐｌ３４−３’−ＵＴＲ、Ｃｏｍｔｄ１−３’−ＵＴＲ、Ａｒｍｃ６−３’−ＵＴＲ、Ａｔｐ５ｄ−３’−ＵＴＲ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ−３’−ＵＴＲ、Ｎｕｄｔ２２−３’−ＵＴＲ（いずれもマウス）からなる群から選択される遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる請求項５７から５９のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項６２】
前記少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントが、ＺＮＦ４６０−５’−ＵＴＲ、ＴＧＭ２−５’−ＵＴＲ、ＩＬ７Ｒ−５’−ＵＴＲ、ＢＧＮ−５’−ＵＴＲ、ＴＫ１−５’−ＵＴＲ、ＲＡＢ３Ｂ−５’−ＵＴＲ、ＣＢＸ６−５’−ＵＴＲ、ＦＺＤ２−５’−ＵＴＲ、ＣＯＬ８Ａ１−５’−ＵＴＲ、ＮＤＵＦＳ７−５’−ＵＴＲ、ＰＨＧＤＨ−５’−ＵＴＲ、ＰＬＫ２−５’−ＵＴＲ、ＴＳＰＯ−５’−ＵＴＲ、ＰＴＧＳ１−５’−ＵＴＲ、ＦＢＸＯ３２−５’−ＵＴＲ、ＮＩＤ２−５’−ＵＴＲ、ＡＴＰ５Ｄ−５’−ＵＴＲ、ＥＸＯＳＣ４−５’−ＵＴＲ、ＮＯＬ９−５’−ＵＴＲ、ＵＢＢ４Ｂ−５’−ＵＴＲ、ＶＰＳ１８−５’−ＵＴＲ、ＯＲＭＤＬ２−５’−ＵＴＲ、ＦＳＣＮ１−５’−ＵＴＲ、ＴＭＥＭ３３−５’−ＵＴＲ、ＴＵＢＡ４Ａ−５’−ＵＴＲ、ＥＭＰ３−５’−ＵＴＲ、ＴＭＥＭ２０１−５’−ＵＴＲ、ＣＲＩＰ２−５’−ＵＴＲ、ＢＲＡＴ１−５’−ＵＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＨ１−５’−ＵＴＲ、ＣＤ９−５’−ＵＴＲ、ＤＰＹＳＬ２−５’−ＵＴＲ、ＣＤＫ９−５’−ＵＴＲ、ＴＦＲＣ−５’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ３  ５’−ＵＴＲ、ＦＡＳＮ−５’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ６−５’−ＵＴＲ、ＰＲＳＳ５６−５’−ＵＴＲ、ＫＰＮＡ６−５’−ＵＴＲ、ＳＦＴ２Ｄ２−５’−ＵＴＲ、ＰＡＲＤ６Ｂ−５’−ＵＴＲ、ＬＰＰ−５’−ＵＴＲ、ＳＰＡＲＣ−５’−ＵＴＲ、ＳＣＡＮＤ１−５’−ＵＴＲ、ＶＡＳＮ−５’−ＵＴＲ、ＳＬＣ２６Ａ１−５’−ＵＴＲ、ＬＣＬＡＴ１−５’−ＵＴＲ、ＦＢＸＬ１８−５’−ＵＴＲ、ＳＬＣ３５Ｆ６−５’−ＵＴＲ、ＲＡＢ３Ｄ−５’−ＵＴＲ、ＭＡＰ１Ｂ−５’−ＵＴＲ、ＶＭＡ２１−５’−ＵＴＲ、ＣＹＢＡ−５’−ＵＴＲ、ＳＥＺ６Ｌ２−５’−ＵＴＲ、ＰＣＯＬＣＥ−５’−ＵＴＲ、ＶＴＮ−５’−ＵＴＲ、ＡＬＤＨ１６Ａ１−５’−ＵＴＲ、ＲＡＶＥＲ１−５’−ＵＴＲ、ＫＰＮＡ６−５’−ＵＴＲ、ＳＥＲＩＮＣ５−５’−ＵＴＲ、ＪＵＰ−５’−ＵＴＲ、ＣＰＮ２−５’−ＵＴＲ、ＣＲＩＰ２−５’−ＵＴＲ、ＥＰＴ１−５’−ＵＴＲ、ＰＮＰＯ−５’−ＵＴＲ、ＳＳＳＣＡ１−５’−ＵＴＲ、ＰＯＬＲ２Ｌ−５’−ＵＴＲ、ＬＩＮ７Ｃ−５’−ＵＴＲ、ＵＱＣＲ１０−５’−ＵＴＲ、ＰＹＣＲＬ−５’−ＵＴＲ、ＡＭＮ−５’−ＵＴＲ、ＭＡＰ１Ｓ−５’−ＵＴＲ（いずれも好ましくはヒト）及びＤｐｙｓｌ２−５’−ＵＴＲ、Ｃｃｎｄ１−５’−ＵＴＲ、Ａｃｏｘ２−５’−ＵＴＲ、Ｃｂｘ６−５’−ＵＴＲ、Ｕｂｃ−５’−ＵＴＲ、Ｌｄｌｒ−５’−ＵＴＲ、Ｎｕｄｔ２２−５’−ＵＴＲ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ−５’−ＵＴＲ、Ａｎｋｒｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｔｍｅｍ３７−５’−ＵＴＲ、Ｔｓｐｙｌ４−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ３−５’−ＵＴＲ、Ｃｓｔ６−５’−ＵＴＲ、Ａａｃｓ−５’−ＵＴＲ、Ｎｏｓｉｐ−５’−ＵＴＲ、Ｉｔｇａ７−５’−ＵＴＲ、Ｃｃｎｄ２−５’−ＵＴＲ、Ｅｂｐ−５’−ＵＴＲ、Ｓｆ３ｂ５−５’−ＵＴＲ、Ｆａｓｎ−５’−ＵＴＲ、Ｈｍｇｃｓ１−５’−ＵＴＲ、Ｏｓｒ１−５’−ＵＴＲ、Ｌｍｎｂ１−５’−ＵＴＲ、Ｖｍａ２１−５’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２０ａ−５’−ＵＴＲ、Ｃｄｃａ８−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ１−５’−ＵＴＲ、Ｕｂｑｌｎ２−５’−ＵＴＲ、Ｐｒｐｓ２−５’−ＵＴＲ、Ｓｈｍｔ２−５’−���ＴＲ、Ａｕｒｋｂ−５’−ＵＴＲ、Ｆｉｇｎｌ１−５’−ＵＴＲ、Ｃａｄ−５’−ＵＴＲ、Ａｎｌｎ−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｆｎ９−５’−ＵＴＲ、Ｎｃａｐｈ−５’−ＵＴＲ、Ｐｏｌｅ−５’−ＵＴＲ、Ｕｈｒｆ１−５’−ＵＴＲ、Ｇｊａ１−５’−ＵＴＲ、Ｆａｍ６４ａ−５’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２ｃ−５’−ＵＴＲ、Ｔｓｐａｎ１０−５’−ＵＴＲ、Ｓｃａｎｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｇｐｒ８４−５’−ＵＴＲ、Ｆａｄｓ３−５’−ＵＴＲ、Ｃｅｒｓ６−５’−ＵＴＲ、Ｃｘｃｒ４−５’−ＵＴＲ、Ｇｐｒｃ５ｃ−５’−ＵＴＲ、Ｆｅｎ１−５’−ＵＴＲ、Ｃｓｐｇ４−５’−ＵＴＲ、Ｍｒｐｌ３４−５’−ＵＴＲ、Ｃｏｍｔｄ１−５’−ＵＴＲ、Ａｒｍｃ６−５’−ＵＴＲ、Ｅｍｒ４−５’−ＵＴＲ、Ａｔｐ５ｄ−５’−ＵＴＲ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ−５’−ＵＴＲ、Ｃｓｆ２ｒａ−５’−ＵＴＲ、Ａａｒｓｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２２−５’−ＵＴＲ、Ｃｔｈ−５’−ＵＴＲ、Ｔｐｇｓ１−５’−ＵＴＲ、Ｃｃｌ１７−５’−ＵＴＲ、Ａｌｋｂｈ７−５’−ＵＴＲ、Ｍｓ４ａ８ａ−５’−ＵＴＲ（いずれも好ましくはマウス）からなる群から選択される遺伝子の転写物の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含む；好ましくは、前記少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントが、ＺＮＦ４６０−５’−ＵＴＲ、ＴＧＭ２−５’−ＵＴＲ、ＩＬ７Ｒ−５’−ＵＴＲ、ＣＯＬ８Ａ１−５’−ＵＴＲ、ＮＤＵＦＳ７−５’−ＵＴＲ、ＰＬＫ２−５’−ＵＴＲ、ＦＢＸＯ３２−５’−ＵＴＲ、ＡＴＰ５Ｄ−５’−ＵＴＲ、ＴＵＢＢ４Ｂ−５’−ＵＴＲ、ＯＲＭＤＬ２−５’−ＵＴＲ、ＦＳＣＮ１−５’−ＵＴＲ、ＣＤ９−５’−ＵＴＲ、ＰＹＳＬ２−５’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ３−５’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ６−５’−ＵＴＲ、ＫＰＮＡ６−５’−ＵＴＲ、ＳＦＴ２Ｄ２−５’−ＵＴＲ、ＬＣＬＡＴ１−５’−ＵＴＲ、ＦＢＸＬ１８−５’−ＵＴＲ、ＳＬＣ３５Ｆ６−５’−ＵＴＲ、ＶＭＡ２１−５’−ＵＴＲ、ＳＥＺ６Ｌ２−５’−ＵＴＲ、ＰＣＯＬＣＥ−５’−ＵＴＲ、ＶＴＮ−５’−ＵＴＲ、ＡＬＤＨ１６Ａ１−５’−ＵＴＲ、ＫＰＮＡ６−５’−ＵＴＲ、ＪＵＰ−５’−ＵＴＲ、ＣＰＮ２−５’−ＵＴＲ、ＰＮＰＯ−５’−ＵＴＲ、ＳＳＳＣＡ１−５’−ＵＴＲ、ＰＯＬＲ２Ｌ−５’−ＵＴＲ、ＬＩＮ７Ｃ−５’−ＵＴＲ、ＵＱＣＲ１０−５’−ＵＴＲ、ＰＹＣＲＬ−５’−ＵＴＲ、ＡＭＮ−５’−ＵＴＲ、ＭＡＰ１Ｓ−５’−ＵＴＲ（いずれもヒト）、Ｄｐｙｓｌ２−５’−ＵＴＲ、Ａｃｏｘ２−５’−ＵＴＲ、Ｕｂｃ−５’−ＵＴＲ、Ｎｕｄｔ２２−５’−ＵＴＲ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ−５’−ＵＴＲ、Ａｎｋｒｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｔｓｐｙｌ４−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ３−５’−ＵＴＲ、Ａａｃｓ−５’−ＵＴＲ、Ｎｏｓｉｐ−５’−ＵＴＲ、Ｉｔｇａ７−５’−ＵＴＲ、Ｃｃｎｄ２−５’−ＵＴＲ、Ｅｂｐ−５’−ＵＴＲ、Ｓｆ３ｂ５−５’−ＵＴＲ、Ｆａｓｎ−５’−ＵＴＲ、Ｈｍｇｃｓ１−５’−ＵＴＲ、Ｏｓｒ１−５’−ＵＴＲ、Ｌｍｎｂ１−５’−ＵＴＲ、Ｖｍａ２１−５’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２０ａ−５’−ＵＴＲ、Ｃｄｃａ８−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ１−５’−ＵＴＲ、Ｕｂｑｌｎ２−５’−ＵＴＲ、Ｐｒｐｓ２−５’−ＵＴＲ、Ｓｈｍｔ２−５’−ＵＴＲ、Ｆｉｇｎｌ１−５’−ＵＴＲ、Ｃａ���−５’−ＵＴＲ、Ａｎｌｎ−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｆｎ９−５’−ＵＴＲ、Ｎｃａｐｈ−５’−ＵＴＲ、Ｐｏｌｅ−５’−ＵＴＲ、Ｕｈｒｆ１−５’−ＵＴＲ、Ｇｊａ１−５’−ＵＴＲ、Ｆａｍ６４ａ−５’−ＵＴＲ、Ｔｓｐａｎ１０−５’−ＵＴＲ、Ｓｃａｎｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｇｐｒ８４−５’−ＵＴＲ、Ｃｅｒｓ６−５’−ＵＴＲ、Ｃｘｃｒ４−５’−ＵＴＲ、Ｇｐｒｃ５ｃ−５’−ＵＴＲ、Ｆｅｎ１−５’−ＵＴＲ、Ｃｓｐｇ４−５’−ＵＴＲ、Ｍｒｐｌ３４−５’−ＵＴＲ、Ｃｏｍｔｄ１−５’−ＵＴＲ、Ａｒｍｃ６−５’−ＵＴＲ、Ｅｍｒ４−５’−ＵＴＲ、Ａｔｐ５ｄ−５’−ＵＴＲ、Ｃｓｆ２ｒａ−５’−ＵＴＲ、Ａａｒｓｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｃｔｈ−５’−ＵＴＲ、Ｔｐｇｓ１−５’−ＵＴＲ、Ｃｃｌ１７−５’−ＵＴＲ、Ａｌｋｂｈ７−５’−ＵＴＲ、Ｍｓ４ａ８ａ−５’−ＵＴＲ（いずれもマウス）の転写物の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる請求項５７から６０のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項６３】
前記３’−ＵＴＲエレメントが、配列番号１５２〜配列番号２０４からなる群から選択される配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる、或いは、前記３’−ＵＴＲエレメントが、配列番号１５２〜配列番号２０４からなる群から選択される配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなる請求項５７から６１のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項６４】
前記５’−ＵＴＲエレメントが、配列番号１〜１５１からなる群から選択される配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる、或いは、前記５’−ＵＴＲエレメントが、配列番号１〜１５１からなる群から選択される配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなる請求項５７から６０及び６２のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項６５】
前記断片が、３ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド、好ましくは５ヌクレオチド〜約１５０ヌクレオチド、より好ましくは１０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチド、更により好ましくは１５ヌクレオチド〜９０ヌクレオチド、最も好ましくは２０ヌクレオチド〜７０ヌクレオチドの長さを有する請求項６３から６４のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項６６】
前記３’−ＵＴＲエレメント及び／又は前記５’−ＵＴＲエレメントが、３ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド、好ましくは５ヌクレオチド〜約１５０ヌクレオチド、より好ましくは１０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチド、更により好ましくは１５ヌクレオチド〜９０ヌクレオチド、最も好ましくは２０ヌクレオチド〜７０ヌクレオチドの長さを有する請求項５７から６５のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項６７】
請求項１から３８のいずれかに記載の人工核酸分子、請求項３９から４３のいずれかに記載のベクター、請求項４４から４６のいずれかに記載の細胞、及び／又は請求項４７から４８のいずれかに記載の医薬組成物を含むことを特徴とするキット又はキットオブパーツ。
【請求項６８】
使用説明書と、トランスフェクション用の細胞と、アジュバントと、前記医薬組成物の投与手段と、前記人工核酸分子、前記ベクター、前記細胞、又は前記医薬組成物を溶解又は希釈するための薬学的に許容できる担体及び／又は薬学的に許容できる溶液とを更に含む請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
人工核酸分子を作製する方法であって、少なくとも１つのオープンリーディングフレームと、請求項１から３８のいずれかに定義された少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントとを含む人工核酸分子が合成されることを特徴とする方法。
【請求項７０】
前記人工核酸分子を合成するために請求項３９から４３のいずれかに記載のベクターを用いる請求項６９に記載の人工核酸分子を作製する方法。
【請求項７１】
請求項６９から７０のいずれかに記載の人工核酸分子を作製する方法によって得ることができることを特徴とする人工核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オープンリーディングフレームと、３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）及び／又は５’−非翻訳領域エレメント（５’−ＵＴＲエレメント）と、任意で、ポリ（Ａ）配列及び／又はポリアデニル化シグナルとを含む人工核酸分子に関する。本発明は、更に、好ましくは遺伝子治療及び／又は遺伝子ワクチン接種の分野で使用するための、３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントを含むベクター、前記人工核酸分子又は前記ベクターを含む細胞、前記人工核酸分子又は前記ベクターを含む医薬組成物、並びに前記人工核酸分子、前記ベクター、及び／又は前記医薬組成物を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療及び遺伝子ワクチン接種は、現代医学の最も有望且つ急速に発展している方法に属する。これらは、非常に広範囲に亘る疾患を治療するための非常に特異的且つ個人的な選択肢を提供することができる。具体的には、遺伝性の遺伝子疾患だけでなく、自己免疫疾患、癌性又は腫瘍関連疾患に加えて、炎症性疾患も、かかる治療アプローチの対象となり得る。また、これらアプローチによってかかる疾患の発症を早期に予防することも考えられる。
【０００３】
遺伝子治療の背後にある主な概念的理論は、特定の疾患の病態に関連している遺伝子発現の欠陥を適切に調節することである。遺伝子発現の病理学的変化は、重要な遺伝子産物、例えば、ホルモン等のシグナル伝達因子、ハウスキーピング因子、代謝酵素、構造タンパク質等の欠失又は過剰産生を引き起こす場合がある。遺伝子発現の変化は、転写及び／又は翻訳の誤制御によるだけではなく、特定のタンパク質をコードしているＯＲＦ内部の突然変異による場合もある。病理学的突然変異は、例えば、染色体の異常によって、又は点突然変異若しくはフレームシフト突然変異等のより特異的な突然変異によって引き起こされる場合があり、これらは全て、遺伝子産物の機能を限定したり、場合によっては、機能全てを失わせたりする。しかし、細胞の転写又は翻訳機構に関与しているタンパク質をコードしている遺伝子が突然変異によって影響を受ける場合、転写又は翻訳の誤制御が生じる場合もある。かかる突然変異は、機能的な遺伝子の病理学的なアップレギュレーション又はダウンレギュレーションにつながる場合がある。かかる制御機能を発揮する遺伝子産物をコードしている遺伝子は、例えば、転写因子、シグナル受容体、メッセンジャータンパク質等であり得る。しかし、かかる制御タンパク質をコードしている遺伝子の機能が失われても、特定の状況下では、欠陥のある遺伝子産物の更に下流で作用する他の因子を人工的に導入することによって復帰させることができる。また、異常のある遺伝子自体を置換することを介して、遺伝子治療によってかかる遺伝子の欠陥を補償することもできる。
【０００４】
遺伝子ワクチン接種は、選択された抗原（例えば、細菌表面、ウイルス粒子、腫瘍抗原等の特徴的な成分）に対する所望の免疫応答を誘起する。一般的に、ワクチン接種は、現代医学の重要な偉業のうちの１つである。しかし、現在有効なワクチンを利用できる疾患は限定的な数でしかない。したがって、未だ毎年数百万の人々が、ワクチン接種によって予防することができない感染症に冒されている。
【０００５】
一般的に、ワクチンは、「第１」世代、「第２」世代、及び「第３」世代のワクチンに更に分類することができる。「第１世代」のワクチンは、典型的に、全生物ワクチンである。これは、ウイルス、細菌等の生病原体及び弱毒化病原体又は死病原体に基づく。生ワクチン及び弱毒化ワクチンの主な問題点は、生命に危険を及ぼすような変異体に戻ってしまうリスクがあることである。したがって、かかる病原体は、たとえ弱毒化されていても、依然として本質的に予測不可能なリスクを有している場合がある。死病原体は、特異的免疫応答を発生させるのに望ましいほど有効ではない場合がある。これらリスクを最小限に抑えるために、「第２世代」のワクチンが開発された。これは、典型的に、病原体に由来する所定の抗原又は組み換えタンパク質成分からなるサブユニットワクチンである。
【０００６】
遺伝子ワクチン、即ち、遺伝子ワクチン接種用ワクチンは、通常、「第３世代」のワクチンであると理解される。これは、典型的に、インビボで病原体又は腫瘍抗原に特徴的なペプチド又はタンパク質（抗原）の断片を発現させる遺伝的に改変された核酸分子で構成される。遺伝子ワクチンは、患者に投与され、標的細胞によって取り込まれた後に発現する。投与された核酸が発現することにより、コードされているタンパク質が産生される。これらタンパク質が患者の免疫系によって外来タンパク質であると認識された場合、免疫応答が誘発される。
【０００７】
上記から分かる通り、遺伝子治療及び遺伝子ワクチン接種の両方法は、本質的に、核酸分子を患者に投与し、次いで、コードされている遺伝情報を転写及び／又は翻訳させることに基づいている。或いは、遺伝子ワクチン接種又は遺伝子治療は、治療を受ける患者から特定の身体細胞を単離し、次いで、かかる細胞をエクスビボでトランスフェクトし、処理された細胞を前記患者に再投与することを含む方法を含んでいてもよい。
【０００８】
ＤＮＡ及びＲＮＡは、遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種を行う際に、投与するための核酸分子として用いることができる。ＤＮＡは、比較的安定で取り扱いが容易であることが知られている。しかし、ＤＮＡの使用には、投与されたＤＮＡ断片が患者のゲノムに不所望に挿入されて、欠陥の生じた遺伝子の機能が失われてしまう等の突然変異誘発事象の可能性があるというリスクがある。更なるリスクとして、抗ＤＮＡ抗体の不所望な産生が生じたことがある。別の問題点は、ＤＮＡを投与して得ることができる、コードされているペプチド又はタンパク質の発現レベルが限定的である点である。これは、転写された後で、生じたｍＲＮＡが翻訳され得るためには、当該ＤＮＡが核に入らなければならないからである。数ある理由の中でも、投与されるＤＮＡの発現レベルは、ＤＮＡ転写を制御する特定の転写因子の存在に依存する。かかる因子が存在しない場合、ＤＮＡ転写によって満足のいく量のＲＮＡが得られない。その結果、得られる翻訳されたペプチド又はタンパク質のレベルが限定される。
【０００９】
遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種のためにＤＮＡの代わりにＲＮＡを用いることによって、不所望のゲノムへの組み込み及び抗ＤＮＡ抗体の産生のリスクが最小限に抑えられるか又は回避される。しかし、ＲＮＡは、遍在するＲＮＡｓｅによって容易に分解され得る比較的不安定な分子種であると考えられている。
【００１０】
典型的には、ＲＮＡの分解は、ＲＮＡの半減期の制御に寄与している。この効果により真核生物の遺伝子発現の制御が微調整されていると考えられ、立証されている（非特許文献１）。したがって、各自然界に存在するｍＲＮＡは、前記ｍＲＮＡが由来する遺伝子及び前記ｍＲＮＡが発現する細胞型に依存する個々の半減期を有している。このことは、前記遺伝子の発現レベルの制御に寄与している。不安定なＲＮＡは、異なる時点で一過的に遺伝子を発現させるために重要である。しかし、寿命の長いＲＮＡは、別のタンパク質の蓄積又は遺伝子の連続的発現に関連している場合がある。インビボでは、ｍＲＮＡの半減期は、例えば、インスリン様成長因子Ｉ、アクチン、及びアルブミンのｍＲＮＡについて示されている通り、ホルモン処理等の環境要因にも依存している場合がある（非特許文献２）。
【００１１】
遺伝子治療及び遺伝子ワクチン接種の場合、通常、安定なＲＮＡが望ましい。これは、一方では、通常ＲＮＡ配列によってコードされている産物がインビボで蓄積することが望ましいという事実によるものである。他方、ＲＮＡは、好適な剤形に調製されたとき、保存の過程で、及び投与したときに、構造的且つ機能的に一体性を維持しなければならない。したがって、早期に分解又は崩壊するのを防ぐために、遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種用の安定なＲＮＡ分子を提供する努力がなされてきた。
【００１２】
核酸分子のＧ／Ｃ含量がその安定性に影響を及ぼす場合があることが報告されている。したがって、多量のグアニン（Ｇ）及び／又はシトシン（Ｃ）残基を含む核酸は、多量のアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含有する核酸よりも機能的に安定であり得る。これに関連して、特許文献１は、コード領域の配列を改変することによって安定化されたｍＲＮＡを含有する医薬組成物を提供している。かかる配列改変は、遺伝子コードの縮重を利用する。したがって、あまり好ましくない（ＲＮＡの安定性の観点であまり好ましくない）組合せのヌクレオチドを含有するコドンを、コードされているアミノ酸配列を変化させることなしに別のコドンに置換してよい。このＲＮＡの安定化方法は、所望のアミノ酸配列の余地を残してはならない各単一のＲＮＡ分子の特定のヌクレオチド配列の提供によって限定される。また、このアプローチは、ＲＮＡのコード領域に制限される。
【００１３】
ｍＲＮＡを安定化するための別の選択肢として、自然界に存在する真核生物のｍＲＮＡ分子は、特徴的な安定化エレメントを含有することが見出されている。例えば、真核生物のｍＲＮＡ分子は、５’末端（５’−ＵＴＲ）及び／又は３’末端（３’−ＵＴＲ）に所謂非翻訳領域（ＵＴＲ）、更に５’−キャップ構造又は３’−ポリ（Ａ）テール等の他の構造的特徴を含み得る。５’−ＵＴＲ及び３’−ＵＴＲは、典型的に、ゲノムＤＮＡから転写されるので、未成熟ｍＲＮＡのエレメントである。５’−キャップ及び３’−ポリ（Ａ）テール（ポリ（Ａ）テール又はポリ（Ａ）配列とも呼ばれる）等の成熟ｍＲＮＡの特徴的な構造的特徴は、通常、ｍＲＮＡのプロセシング中に転写（未成熟）ｍＲＮＡに付加される。
【００１４】
３’−ポリ（Ａ）テールは、典型的に、転写ｍＲＮＡの３’末端に付加されるアデノシンヌクレオチドの単調な一続きの配列である。これは、最高約４００個のアデノシンヌクレオチドを含み得る。かかる３’−ポリ（Ａ）テールの長さは、個々のｍＲＮＡの安定性にとって重要な要素である可能性があることが見出されている。
【００１５】
また、α−グロビンｍＲＮＡの３’−ＵＴＲは、α−グロビンｍＲＮＡの周知の安定性にとって重要な因子であり得ることが示されている（非特許文献３）。α−グロビンｍＲＮＡの３’−ＵＴＲは、その存在がインビトロにおけるｍＲＮＡの安定性と相関している特定のリボ核タンパク質複合体（α−複合体）の形成に関与していることが明らかである（非特許文献４）。
【００１６】
更に、リボソームタンパク質のｍＲＮＡにおけるＵＴＲについて興味深い調節機能が実証されている：リボソームタンパク質のｍＲＮＡの５’−ＵＴＲは、ｍＲＮＡの成長関連翻訳を制御するが、その調節のストリンジェンシーは、リボソームタンパク質のｍＲＮＡにおけるそれぞれの３’−ＵＴＲによって付与される（非特許文献５）。この機序は、リボソームタンパク質の特異的発現パターンに寄与し、前記リボソームタンパク質は、典型的に、リボソームタンパク質Ｓ９又はリボソームタンパク質Ｌ３２等の幾つかのリボソームタンパク質のｍＲＮＡがハウスキーピング遺伝子と称されるように、一定レベルで転写される（非特許文献６）。したがって、リボソームタンパク質の成長関連発現パターンは、主に、翻訳レベルの調節に起因するものである。
【００１７】
特許文献２は、５’−ＵＴＲ及び／又は３’−ＵＴＲを有する幾つかの具体的な核酸分子を記載しているが、かかる分子の翻訳効率については、詳述していない。
【００１８】
ｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼす因子にかかわらず、投与された核酸分子が標的細胞又は組織によって有効に翻訳されることは、遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種用の核酸分子を用いる任意のアプローチにとって非常に重要である。上に引用した例から分かる通り、安定性の調節とともに、大部分のｍＲＮＡの翻訳も、ＵＴＲ、５’−キャップ、及び３’−ポリ（Ａ）テール等の構造的特徴によって調節されている。これに関連して、ポリ（Ａ）テールの長さも同様に翻訳効率にとって重要な役割を果たしている可能性があることが報告されている。しかし、３’−エレメントの安定化は、翻訳を減少させる効果を有している可能性もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】国際公開第０２／０９８４４３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１４／１６４２５３Ａ１号パンフレット
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｆｒｉｅｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９．Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ＲＮＡ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３７（１７）：１−１２
【非特許文献２】Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ＲＮＡ：Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｉｎｔａｃｔ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｒａｔｅｓ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔ又はＩ，ａｃｔｉｎ，ａｎｄ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｉｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．８８，ｐｐ．５２８７−５２９１，１９９１
【非特許文献３】Ｒｏｄｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  α−ｇｌｏｂｉｎ  ｍＲＮＡ  ｄｅｃａｙ  ｉｓ  ａ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｅｖｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ３’−ｔｏ−５’  ｅｘｏｓｏｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｅｃａｐｐｉｎｇ，ＲＮＡ，８，ｐｐ．１５２６−１５３７，２００２
【非特許文献４】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎ  ｍＲＮＡ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙ（Ａ）−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  １９，Ｎｏ．７，Ｊｕｌｙ  １９９９，ｐ．４５５２−４５６０
【非特許文献５】Ｌｅｄｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３’−ＵＴＲ  ｌｅｎｇｔｈ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ５’−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｏｌｉｇｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｍＲＮＡｓ，Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．３４４，２００５，ｐ．２１３−２２０
【非特許文献６】Ｊａｎｏｖｉｃｋ−Ｇｕｒｅｔｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｌｉｖｅｒ  ｉｓ  Ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｂｙ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｔｅ，Ｆｅｅｄ  Ｉｎｔａｋｅ，ａｎｄ  Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．９０，２００７，ｐ．２２４６−２２５２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明の目的は、遺伝子治療及び／又は遺伝子ワクチン接種に応用するのに好適であり得る核酸分子を提供することにある。具体的には、本発明の目的は、翻訳効率において著しい機能喪失を示すことなしに、早期の分解又は崩壊に対して安定化されているｍＲＮＡ種を提供することにある。また、本発明の目的は、高い翻訳効率によって特徴付けられる人工核酸分子、好ましくはｍＲＮＡを提供することにある。本発明の１つの具体的な目的は、翻訳効率（それぞれのコードされているタンパク質のリボゾームによる産生）が、例えば、レファレンス核酸分子（レファレンスｍＲＮＡ）に対して増強されるｍＲＮＡを提供することにある。本発明の別の目的は、遺伝子治療及び／又は遺伝子ワクチン接種において使用することができる優れたｍＲＮＡ種をコードする核酸分子を提供することにある。本発明の更なる目的は、遺伝子治療及び／又は遺伝子ワクチン接種において使用するための医薬組成物を提供することにある。要約すると、本発明の目的は、コスト効率が高く且つ簡単なアプローチによって関連技術の上記問題点を克服する改善された核酸種を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明の根底にある目的は、請求する発明主題によって解決される。具体的には、本発明者らは、高い翻訳効率を与えるＵＴＲエレメント（５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメント）を同定した。本発明の好ましい核酸分子はいずれも、これまでに知られている核酸分子の翻訳効率よりも高い翻訳効率によって特徴付けられることが共通点である。レファレンス核酸分子に対して高い翻訳効率を測定するためのアッセイも提供される。
【００２３】
本発明は、ＤＡＲＰＡにより与えられたＡｇｒｅｅｍｅｎｔ  Ｎｏ．ＨＲ００１１−１１−３−０００１の下で、米国政府による支援を受けてなされた。米国政府は、本発明における一定の権利を有している。
【００２４】
以下の図、配列、及び実施例は、本発明を更に説明することを意図する。これらは、本発明の発明主題を限定することを意図するものではない。
【００２５】
図１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって得ることができるｍＲＮＡ（即ち、人工核酸分子）をコードする配列を示す。
以下の略記を用いる：
・  ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）：キタアメリカホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼをコードしているＧＣリッチｍＲＮＡ配列。ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）ＯＲＦは、イタリックで示される。
・  Ａ６４：６４アデニラートを含むポリ（Ａ）配列。
・  Ｃ３０：３０シチジラートを含むポリ（Ｃ）配列。
・  ｈＳＬ：（Ｃａｋｍａｋｃｉ，Ｌｅｒｎｅｒ，Ｗａｇｎｅｒ，Ｚｈｅｎｇ，＆  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｆ  Ｍａｒｚｌｕｆｆ，２００８．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２８（３）：１１８２−９４）から得たヒストンステムループ配列
・  ３２Ｌ４：５’末端オリゴピリミジン領域が欠損しているヒトリボソームタンパク質ラージ３２の５’非翻訳領域５’−ＵＴＲの人工変異体。５’−ＵＴＲは、５’末端オリゴピリミジン領域が欠損しているヒトリボソームタンパク質ラージ３２ｍＲＮＡに由来する。
・  ａｌｂｕｍｉｎ７：Ｔ７終結シグナル並びにＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ制限酵素部位を除去するために導入された３つの単一点突然変異を有するヒトアルブミンの３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）の人工変異体
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】図１Ａは、レファレンスコンストラクト、配列番号２０５、即ち、３２Ｌ４−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｌｂｕｍｉｎ７−Ａ６４−Ｃ３０−ｈＳＬのｍＲＮＡ配列（Ｒ３１１１）を示す。実験的試験に付したヒト起源のＵＴＲエレメントについては、表３を参照。実験的試験に付したマウス起源のＵＴＲエレメントについては、表４を参照。
【図１Ｂ】図１Ｂは、配列番号１に対応する試験した５’−ＵＴＲを含む人工核酸（配列番号２１０）（一重下線付）。この図に示す配列の全てのエレメントは、一重下線付エレメントを除いて配列番号２０５と同一である。したがって、配列番号２１０は、５’−ＵＴＲエレメントが異なる点で配列番号２０５と異なる。［配列番号１に対応する５’−ＵＴＲ］−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｌｂｕｍｉｎ７−Ａ６４−Ｃ３０−ｈＳＬ
【図１Ｃ】図１Ｃは、配列番号１５２に対応する試験した３’−ＵＴＲを含む人工核酸（配列番号２１１）（二重下線付）。この図に示す配列の全てのエレメントは、二重下線付エレメントを除いて配列番号２０５と同一である。したがって、配列番号２１１は、３’−ＵＴＲエレメントが異なる点で配列番号２０５と異なる。３２Ｌ４−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−［配列番号１５２に対応する３’−ＵＴＲ］−Ａ６４−Ｃ３０−ｈＳＬ
【図２】図２は、トリプリケートで分析したｍＲＮＡの平均ルシフェラーゼ発現及びＳＥＭ；即ち、ＲｒＬｕｃに対して正規化された相対的ＰｐＬｕｃ発現を示す（３回の独立した実験の平均値及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す）。図１に示すｍＲＮＡ（レファレンスコンストラクト）からのルシフェラーゼ発現と比較した、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対するヒト起源の５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメント（表３）並びにマウス起源の５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメント（表４）の効果について調べた。表３及び４の試験した５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメントを含むコンストラクトの詳細については、実施例３、特にセクション３．３及び３．４を参照。この目的のために、リポフェクションによって図中に示す細胞株に様々なｍＲＮＡをトランスフェクトした。図２は、表３に示すヒト起源の５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメントを有するｍＲＮＡをトランスフェクトしたＨＤＦ細胞である。詳細については、実施例３、特にセクション３．５を参照。図２は、実施例３のアッセイの９６個のウェルに対応する９６本のバーを示す。図２中、９６本のバーは、番号順、即ち、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、［．．．］、Ｆ１２、Ｇ１２、Ｈ１２で示される。ＲＬＵ＝相対光単位（ルシフェラーゼ活性測定値）。
【図３】図３は、トリプリケートで分析したｍＲＮＡの平均ルシフェラーゼ発現及びＳＥＭ；即ち、ＲｒＬｕｃに対して正規化された相対的ＰｐＬｕｃ発現を示す（３回の独立した実験の平均値及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す）。図１に示すｍＲＮＡ（レファレンスコンストラクト）からのルシフェラーゼ発現と比較した、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対するヒト起源の５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメント（表３）並びにマウス起源の５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメント（表４）の効果について調べた。表３及び４の試験した５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメントを含むコンストラクトの詳細については、実施例３、特にセクション３．３及び３．４を参照。この目的のために、リポフェクションによって図中に示す細胞株に様々なｍＲＮＡをトランスフェクトした。図３は、表４に示すマウス起源の５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメントを有するｍＲＮＡをトランスフェクトしたＨＤＦ細胞である。詳細については、実施例３、特にセクション３．５を参照。図３は、実施例３のアッセイの９６個のウェルに対応する９６本のバーを示す。図３中、９６本のバーは、番号順、即ち、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、［．．．］、Ｆ１２、Ｇ１２、Ｈ１２で示される。ＲＬＵ＝相対光単位（ルシフェラーゼ活性測定値）。
【図４】図４は、トリプリケートで分析したｍＲＮＡの平均ルシフェラーゼ発現及びＳＥＭ；即ち、ＲｒＬｕｃに対して正規化された相対的ＰｐＬｕｃ発現を示す（３回の独立した実験の平均値及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す）。図１に示すｍＲＮＡ（レファレンスコンストラクト）からのルシフェラーゼ発現と比較した、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対するヒト起源の５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメント（表３）並びにマウス起源の５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメント（表４）の効果について調べた。表３及び４の試験した５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメントを含むコンストラクトの詳細については、実施例３、特にセクション３．３及び３．４を参照。この目的のために、リポフェクションによって図中に示す細胞株に様々なｍＲＮＡをトランスフェクトした。図４は、表３に示すヒト起源の５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメントを有するｍＲＮＡをトランスフェクトしたＬ９２９細胞である。詳細については、実施例３、特にセクション３．５を参照。図４は、実施例３のアッセイの９６個のウェルに対応する９６本のバーを示す。図４中、９６本のバーは、番号順、即ち、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、［．．．］、Ｆ１２、Ｇ１２、Ｈ１２で示される。ＲＬＵ＝相対光単位（ルシフェラーゼ活性測定値）。
【図５】図５は、トリプリケートで分析したｍＲＮＡの平均ルシフェラーゼ発現及びＳＥＭ；即ち、ＲｒＬｕｃに対して正規化された相対的ＰｐＬｕｃ発現を示す（３回の独立した実験の平均値及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す）。図１に示すｍＲＮＡ（レファレンスコンストラクト）からのルシフェラーゼ発現と比較した、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対するヒト起源の５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメント（表３）並びにマウス起源の５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメント（表４）の効果について調べた。表３及び４の試験した５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメントを含むコンストラクトの詳細については、実施例３、特にセクション３．３及び３．４を参照。この目的のために、リポフェクションによって図中に示す細胞株に様々なｍＲＮＡをトランスフェクトした。図５は、表４に示すマウス起源の５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメントを有するｍＲＮＡをトランスフェクトしたＬ９２９細胞である。詳細については、実施例３、特にセクション３．５を参照。図５は、実施例３のアッセイの９６個のウェルに対応する９６本のバーを示す。図５中、９６本のバーは、番号順、即ち、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、［．．．］、Ｆ１２、Ｇ１２、Ｈ１２で示される。ＲＬＵ＝相対光単位（ルシフェラーゼ活性測定値）。
【図６】図６は、トリプリケートで分析したｍＲＮＡの平均ルシフェラーゼ発現及びＳＥＭ；即ち、ＲｒＬｕｃに対して正規化された相対的ＰｐＬｕｃ発現を示す（３回の独立した実験の平均値及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す）。図１に示すｍＲＮＡ（レファレンスコンストラクト）からのルシフェラーゼ発現と比較した、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対するヒト起源の５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメント（表３）並びにマウス起源の５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメント（表４）の効果について調べた。表３及び４の試験した５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメントを含むコンストラクトの詳細については、実施例３、特にセクション３．３及び３．４を参照。この目的のために、リポフェクションによって図中に示す細胞株に様々なｍＲＮＡをトランスフェクトした。図６は、表３に示すヒト起源の５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメントを有するｍＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＰＧ２細胞である。詳細については、実施例３、特にセクション３．５を参照。図６は、実施例３のアッセイの９６個のウェルに対応する９６本のバーを示す。図６中、９６本のバーは、番号順、即ち、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、［．．．］、Ｆ１２、Ｇ１２、Ｈ１２で示される。ＲＬＵ＝相対光単位（ルシフェラーゼ活性測定値）。
【図７】図７は、トリプリケートで分析したｍＲＮＡの平均ルシフェラーゼ発現及びＳＥＭ；即ち、ＲｒＬｕｃに対して正規化された相対的ＰｐＬｕｃ発現を示す（３回の独立した実験の平均値及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す）。図１に示すｍＲＮＡ（レファレンスコンストラクト）からのルシフェラーゼ発現と比較した、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対するヒト起源の５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメント（表３）並びにマウス起源の５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメント（表４）の効果について調べた。表３及び４の試験した５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメントを含むコンストラクトの詳細については、実施例３、特にセクション３．３及び３．４を参照。この目的のために、リポフェクションによって図中に示す細胞株に様々なｍＲＮＡをトランスフェクトした。図７は、表４に示すマウス起源の５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメントを有するｍＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＰＧ２細胞である。詳細については、実施例３、特にセクション３．５を参照。図７は、実施例３のアッセイの９６個のウェルに対応する９６本のバーを示す。図７中、９６本のバーは、番号順、即ち、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、［．．．］、Ｆ１２、Ｇ１２、Ｈ１２で示される。ＲＬＵ＝相対光単位（ルシフェラーゼ活性測定値）。
【図８】図８は、トリプリケートで分析したｍＲＮＡの平均ルシフェラーゼ発現及びＳＥＭ；即ち、ＲｒＬｕｃに対して正規化された相対的ＰｐＬｕｃ発現を示す（３回の独立した実験の平均値及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す）。図１に示すｍＲＮＡ（レファレンスコンストラクト）からのルシフェラーゼ発現と比較した、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対するヒト起源の５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメント（表３）並びにマウス起源の５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメント（表４）の効果について調べた。表３及び４の試験した５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメントを含むコンストラクトの詳細については、実施例３、特にセクション３．３及び３．４を参照。この目的のために、リポフェクションによって図中に示す細胞株に様々なｍＲＮＡをトランスフェクトした。図８は、表３に示すヒト起源の５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメントを有するｍＲＮＡをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞である。詳細については、実施例３、特にセクション３．５を参照。図８は、実施例３のアッセイの９６個のウェルに対応する９６本のバーを示す。図８中、９６本のバーは、番号順、即ち、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、［．．．］、Ｆ１２、Ｇ１２、Ｈ１２で示される。ＲＬＵ＝相対光単位（ルシフェラーゼ活性測定値）。
【図９】図９は、トリプリケートで分析したｍＲＮＡの平均ルシフェラーゼ発現及びＳＥＭ；即ち、ＲｒＬｕｃに対して正規化された相対的ＰｐＬｕｃ発現を示す（３回の独立した実験の平均値及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す）。図１に示すｍＲＮＡ（レファレンスコンストラクト）からのルシフェラーゼ発現と比較した、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対するヒト起源の５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメント（表３）並びにマウス起源の５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメント（表４）の効果について調べた。表３及び４の試験した５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメントを含むコンストラクトの詳細については、実施例３、特にセクション３．３及び３．４を参照。この目的のために、リポフェクションによって図中に示す細胞株に様々なｍＲＮＡをトランスフェクトした。図９は、表４に示すマウス起源の５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメントを有するｍＲＮＡをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞である。詳細については、実施例３、特にセクション３．５を参照。図９は、実施例３のアッセイの９６個のウェルに対応する９６本のバーを示す。図９中、９６本のバーは、番号順、即ち、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、［．．．］、Ｆ１２、Ｇ１２、Ｈ１２で示される。ＲＬＵ＝相対光単位（ルシフェラーゼ活性測定値）。
【００２７】
明確に且つ読みやすくするために、以下の定義を提供する。これら定義について言及される任意の技術的特徴は、本発明の各実施形態及び全実施形態において読み取ることができる。これら実施形態に関連して更なる定義及び説明を具体的に提供する場合がある。
【００２８】
適応免疫応答：適応免疫応答は、典型的に、免疫系の抗原特異的応答であると理解される。抗原特異性により、特定の病原体又は病原体に感染している細胞に合わせた応答を生じさせることができる。これら病原体又は細胞に合わせた応答を開始させる能力は、通常、「記憶細胞」によって体内に維持されている。身体がある病原体に１回超感染した場合、これら特異的記憶細胞を用いて、前記病原体を速やかに排除する。これに関連して、適応免疫応答の第１の工程は、抗原提示細胞による抗原特異的免疫応答を誘導することができる抗原特異的なナイーブＴ細胞又は様々な免疫細胞の活性化である。これは、ナイーブＴ細胞が常に通過しているリンパ組織及び器官で生じる。抗原提示細胞として機能し得る３種の細胞は、樹状細胞、マクロファージ、及びＢ細胞である。これら細胞は、それぞれ、免疫応答の誘発において異なる機能を有する。樹状細胞は、食作用及びマクロピノサイトーシスによって抗原を取り込むことができ、また、例えば外来抗原と接触することによって刺激されて、樹状細胞が成熟樹状細胞に分化する局所リンパ組織に遊走することができる。マクロファージは、細菌等の特定の抗原を摂取し、感染因子又は他の適切な刺激によって誘導されてＭＨＣ分子を発現させる。また、受容体を介して可溶性タンパク質抗原に結合し、内部に取り込むＢ細胞の独自の能力は、Ｔ細胞の誘導にとって重要であり得る。ＭＨＣ分子は、典型的に、抗原のＴ細胞への提示を担当する。ＭＨＣ分子における抗原の提示により、Ｔ細胞が活性化されて、前記Ｔ細胞の増殖及びアームドエフェクターＴ細胞への分化が誘導される。エフェクターＴ細胞の最も重要な機能は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞によって感染細胞を殺傷し、共に細胞媒介免疫を構成するＴｈ１細胞によってマクロファージを活性化させ、Ｔｈ２細胞及びＴｈ１細胞の両方によってＢ細胞を活性化させて様々な分類の抗体を産生させ、それによって体液性免疫応答を駆動することである。Ｔ細胞は、抗原を直接認識したり結合したりはしないが、その代わり、例えば、他の細胞の表面上のＭＨＣ分子に結合している病原体由来のタンパク質抗原の短いペプチド断片（例えば、所謂エピトープ）を認識するＴ細胞受容体によって抗原を認識する。
【００２９】
適応免疫系：適応免疫系は、本質的に、病原体の成長を停止させるか又は妨げることに専念している。適応免疫系は、典型的に、特定の病原体を認識及び記憶し（免疫を生じさせ）、前記病原体に遭遇したときにより強い攻撃を開始する能力を脊椎動物の免疫系に付与することによって適応免疫応答を制御する。前記系は、体細胞超変異（体細胞の突然変異が加速されるプロセス）及びＶ（Ｄ）Ｊ組み換え（抗原受容体遺伝子セグメントの不可逆的な遺伝子組み替え）により、高度に適応可能である。この機序により、少数の遺伝子が膨大な数の異なる抗原受容体を産生することができ、前記抗原受容体は、後に、個々のリンパ球で一意的に発現する。遺伝子の再配置により各細胞のＤＮＡが不可逆的に変化するので、かかる細胞の後代（子孫）は全て、長命特異的免疫にとって重要であるメモリーＢ細胞及びメモリーＴ細胞を含む、同じ受容体特異性をコードしている遺伝子を受け継ぐ。
【００３０】
アジュバント／アジュバント成分：アジュバント又はアジュバント成分は、最も広い意味では、典型的に、薬物又はワクチン等の他の剤の効果を変化させ得る、例えば、増強し得る薬理学的及び／又は免疫学的剤である。アジュバント又はアジュバント成分は、広義で解釈すべきであり、広範囲に亘る物質を指す。典型的に、これら物質は、抗原の免疫原性を高めることができる。例えば、アジュバントは、自然免疫系によって認識され得、例えば、自然免疫応答を誘発することができる。「アジュバント」は、典型的に、適応免疫応答を誘発しない。したがって、「アジュバント」は、抗原として適切ではない。アジュバントの作用機序は、適応免疫応答を生じさせる抗原によって誘発される効果とは異なる。
【００３１】
抗原：本発明において、「抗原」は、典型的に、免疫系によって、好ましくは適応免疫系によって認識され得る物質を指し、例えば、適応免疫応答の一部として抗体及び／又は抗原特異的Ｔ細胞を形成することによって抗原特異的免疫応答を誘発することができる。典型的に、抗原は、ＭＨＣによってＴ細胞に提示され得るペプチド又はタンパク質であってもよく、前記ペプチド又はタンパク質を含んでいてもよい。本発明の意味では、抗原は、提供される核酸分子、好ましくは本明細書に定義するｍＲＮＡの翻訳産物であってよい。この状況では、少なくとも１つのエピトープを含むペプチド及びタンパク質の断片、変異体、及び誘導体も抗原として理解される。本発明の状況では、本明細書に定義する腫瘍抗原及び病原性抗原が特に好ましい。
【００３２】
言い換えれば、人工核酸分子は、非天然核酸分子として理解してよい。かかる核酸分子は、その個々の配列（自然界には存在しない）及び／又は他の修飾（例えば、自然界には存在しないヌクレオチドの構造的修飾）から非天然であり得る。人工核酸分子は、ＤＮＡ分子であってもよく、ＲＮＡ分子であってもよく、ＤＮＡ部分とＲＮＡ部分とを含むハイブリッド分子であってもよい。典型的に、人工核酸分子は、所望の人工ヌクレオチド配列（異種配列）に相当するように遺伝子改変方法によって設計及び／又は作製することができる。これに関連して、人工配列は、通常、自然界には存在し得ない配列である、即ち、少なくとも１つのヌクレオチドが野生型配列とは異なる。用語「野生型」とは、自然界に存在する配列であると理解してよい。本明細書において、任意の特定の「人工核酸分子」が任意の特定の野生型核酸分子に「基づく」と記載されるとき、前記人工核酸分子は、前記野生型核酸分子と少なくとも１つのヌクレオチドが異なっている。更に、用語「人工核酸分子」の意味は、「１つの単一分子」には限定されず、典型的に、同一分子の集合体を含むと理解される。したがって、人工核酸分子とは、アリコートに含有されている複数の同一分子に関する場合もある。
【００３３】
２シストロン性ＲＮＡ、多シストロン性ＲＮＡ：２シストロン性又は多シストロン性のＲＮＡは、典型的に２つ（２シストロン性）又はそれ以上（多シストロン性）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有し得る、典型的にはＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡである。これに関連して、オープンリーディングフレームは、ペプチド又はタンパク質に翻訳可能なコドンの配列である。
【００３４】
担体／高分子担体：本発明の状況における担体は、典型的に、別の化合物（カーゴ）の輸送及び／又は複合体化を促進する化合物であってよい。高分子担体は、典型的に、高分子で形成される担体である。担体は、共有結合性相互作用又は非共有結合性相互作用によってそのカーゴに結合し得る。担体は、核酸（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）を標的細胞に輸送することができる。担体は、幾つかの実施形態では、カチオン性成分であってよい。
【００３５】
カチオン性成分：用語「カチオン性成分」は、典型的に、典型的に１〜９のｐＨ値、好ましくは９以下（例えば、５〜９）、８以下（例えば、５〜８）、７以下（例えば、５〜７）のｐＨ値、最も好ましくは生理学的ｐＨ（例えば、７．３〜７．４）を有する正に帯電している帯電分子（カチオン）を指す。したがって、カチオン性成分は、任意の正に帯電している化合物又はポリマーであってよく、好ましくは、生理学的条件下で、特にインビボにおける生理学的条件下で正に帯電しているカチオン性のペプチド又はタンパク質であってよい。「カチオン性のペプチド又はタンパク質」は、例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＯｒｎから選択される、少なくとも１つの正に帯電しているアミノ酸、又は１超の正に帯電しているアミノ酸を含有していてよい。したがって、所与の条件下で１超の正電荷を有する「ポリカチオン性」成分も、カチオン性成分の範囲内である。
【００３６】
５’−キャップ：５’−キャップは、一般的に成熟ｍＲＮＡの５’末端を「キャップ」する実体、典型的に修飾ヌクレオチド実体である。５’−キャップは、典型的に、修飾ヌクレオチド、特に、グアニンヌクレオチドの誘導体によって形成され得る。好ましくは、５’−キャップは、５’−５’−三リン酸結合を介して５’末端に結合する。５’−キャップは、メチル化されていてもよく、例えば、ｍ７ＧｐｐｐＮ（式中、Ｎは、５’−キャップを有する核酸の５’末端のヌクレオチド、典型的に、ＲＮＡの５’末端である）である。５’−キャップ構造の更なる例としては、グリセリル、逆転デオキシ非塩基残基（部分）、４’，５’メチレンヌクレオチド、１−（ベータ−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、アルファ−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’−セコヌクレオチド、非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式３，５ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−逆転ヌクレオチド部分、３’−３’−逆転非塩基部分、３’−２’−逆転ヌクレオチド部分、３’−２’−逆転非塩基部分、１，４−ブタンジオールホスファート、３’−ホスホロアミダート、ヘキシルホスファート、アミノヘキシルホスファート、３’−ホスファート、３’ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、又は架橋若しくは非架橋メチルホスホナート部分が挙げられる。
【００３７】
細胞免疫／細胞免疫応答：細胞免疫は、典型的に、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の活性化、及び抗原に応答する様々なサイトカインの放出を指す。より一般的な用語では、細胞免疫は、抗体に基づくのではなく、免疫系の細胞の活性化に基づく。典型的に、細胞免疫応答は、細胞（例えば、樹状細胞又は他の細胞等の特定の免疫細胞）においてアポトーシスを誘導することができる抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化し、その表面上に外来抗原のエピトープを提示することを特徴とし得る。かかる細胞は、ウイルスに感染していてもよく、細胞内細菌に感染していてもよく、腫瘍抗原を提示する癌細胞であってもよい。更なる特徴は、マクロファージ及びナチュラルキラー細胞を活性化して病原体を破壊させたり、細胞を刺激して適応免疫応答及び自然免疫応答に関与している他の細胞の機能に影響を及ぼす様々なサイトカインを分泌させたりすることであり得る。
【００３８】
ＤＮＡ：ＤＮＡは、デオキシリボ核酸の一般的な略称である。ＤＮＡは、核酸分子、即ち、ヌクレオチドからなるポリマーである。これらヌクレオチドは、通常、デオキシアデノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、及びデオキシシチジン一リン酸のモノマーであり、これらは、単独で、糖部分（デオキシリボース）、塩基部分、及びリン酸部分で構成され、特徴的な骨格構造によって重合する。前記骨格構造は、典型的に、第１のヌクレオチドの糖部分（即ち、デオキシリボース）と、隣接する第２のモノマーのリン酸部分との間のホスホジエステル結合によって形成される。モノマーの特定の順序、即ち、糖／リン酸骨格に結合している塩基の順序が、ＤＮＡ配列と呼ばれる。ＤＮＡは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖形態では、第１の鎖のヌクレオチドは、典型的に、例えばＡ／Ｔ塩基対合及びＧ／Ｃ塩基対合によって第２の鎖のヌクレオチドとハイブリダイズする。
【００３９】
エピトープ：（「抗原決定基」とも呼ばれる）は、Ｔ細胞エピトープとＢ細胞エピトープとに分けることができる。本発明におけるＴ細胞エピトープ又はタンパク質の一部は、好ましくは約６アミノ酸長〜約２０アミノ酸長又はそれ以上のアミノ酸長を有する断片、例えば、好ましくは約８アミノ酸長〜約１０アミノ酸長、例えば、８アミノ酸長、９アミノ酸長、又は１０アミノ酸長（又は更には１１アミノ酸長又は１２アミノ酸長）を有するＭＨＣクラスＩ分子によって処理及び提示される断片、或いは、好ましくは約１３アミノ酸長以上、例えば、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長、１５アミノ酸長、１６アミノ酸長、１７アミノ酸長、１８アミノ酸長、１９アミノ酸長、２０アミノ酸長、又はそれ以上のアミノ酸長を有するＭＨＣクラスＩＩ分子によって処理及び提示される断片を含んでよく、これら断片は、アミノ酸配列の任意の部分から選択してよい。これら断片は、典型的に、ペプチド断片及びＭＨＣ分子からなる複合体の形態でＴ細胞によって認識される。即ち、前記断片は、典型的に、そのネイティブな形態では認識されない。Ｂ細胞エピトープは、典型的に、好ましくは５アミノ酸〜１５アミノ酸、より好ましくは５アミノ酸〜１２アミノ酸、更により好ましくは６アミノ酸〜９アミノ酸を有する、本明細書に定義する（ネイティブな）タンパク質又はペプチド抗原の外表面上に位置する断片であり、これは、即ちそのネイティブな形態で抗体によって認識され得る。
【００４０】
更に、タンパク質又はペプチドのかかるエピトープは、かかるタンパク質又はペプチドの本明細書に記載する変異体のいずれかから選択してよい。これに関連して、抗原決定基は、本明細書に定義するタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列においては不連続であるが、三次元構造では結合する本明細書に定義するタンパク質又はペプチドのセグメントで構成される高次構造エピトープ又は不連続エピトープであってもよく、単一ポリペプチド鎖で構成される連続エピトープ又は線状エピトープであってもよい。
【００４１】
配列の断片：配列の断片は、典型的に、例えば、核酸分子又はアミノ酸の配列の完全長配列のより短い部分であってよい。したがって、断片は、典型的に、完全長配列内の相当する一続きと同一である配列からなる。本発明における好ましい配列の断片は、前記断片が由来する分子における連続する一続きの実体に相当するヌクレオチド又はアミノ酸等の連続する一続きの実体からなり、これは、前記断片が由来する分子全体（即ち、完全長分子）の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％を表す。
【００４２】
Ｇ／Ｃ改変：Ｇ／Ｃ改変核酸は、典型的に、好ましくは野生型配列よりも多数のグアノシン／シトシンヌクレオチドを含む改変野生型配列に基づく核酸、好ましくは本明細書に定義する人工核酸分子であってよい。アデノシン又はチミジンヌクレオチドを含有するコドンをグアノシン又はシトシンヌクレオチドを含有するコドンで置換することによって、このように数を増加させることができる。ＤＮＡ又はＲＮＡのコード領域におけるＧ／Ｃ含量を増加させる場合、遺伝コードの縮重を利用する。したがって、コドン置換は、コードされているアミノ酸残基は変化させず、核酸分子のＧ／Ｃ含量のみを増加させることが好ましい。
【００４３】
遺伝子治療：遺伝子治療は、典型的に、ペプチド又はタンパク質をコードしている核酸による患者の身体又は患者の身体の単離要素（例えば、単離組織／細胞）の治療を意味すると理解してよい。遺伝子治療は、典型的に、ａ）核酸、好ましくは本明細書に定義する人工核酸分子を任意の投与経路によって患者に直接投与するか、又はインビトロで前記患者の単離細胞／組織に投与して、インビボ／エクスビボ又はインビトロで前記患者の細胞をトランスフェクトする工程；ｂ）導入された前記核酸分子を転写及び／又は翻訳させる工程；及び任意でｃ）前記核酸を前記患者に直接投与しなかった場合、トランスフェクトされた単離細胞を前記患者に再投与する工程のうちの少なくとも１つを含んでよい。
【００４４】
遺伝子ワクチン接種：遺伝子ワクチン接種は、典型的に、抗原若しくは免疫原をコードしている核酸分子又はその断片を投与することによるワクチン接種であると理解してよい。前記核酸分子は、被験体の身体又は被験体の単離細胞に投与してよい。身体の特定の細胞をトランスフェクトした際又は単離細胞をトランスフェクトした際、これら細胞は、前記抗原又は免疫原を発現し、次いで、免疫系に提示して、適応免疫応答、即ち、抗原特異的免疫応答を誘発し得る。したがって、遺伝子ワクチン接種は、典型的に、ａ）核酸、好ましくは本明細書に定義する人工核酸分子を被験体、好ましくは患者、又は被験体、好ましくは患者の単離細胞に投与して、通常、インビボ又はインビトロで前記被験体の細胞をトランスフェクトする工程；ｂ）導入された前記核酸分子を転写及び／又は翻訳させる工程；及び任意で、ｃ）前記核酸を前記患者に直接投与しなかった場合、トランスフェクトされた単離細胞を被験体、好ましくは患者に再投与する工程のうちの少なくとも１つを含む。
【００４５】
異種配列：２つの配列は、典型的に、同一の遺伝子に由来していない場合、「異種」であると理解される。即ち、異種配列は、同一の生物に由来し得たとしても、天然で（自然界で）同一の核酸分子（例えば、同一のｍＲＮＡ）中に存在することはない。
【００４６】
体液性免疫／体液性免疫応答：体液性免疫は、典型的に、抗体産生と、任意で抗体産生に付随する付属プロセスとを指す。体液性免疫応答は、典型的に、例えば、Ｔｈ２活性化及びサイトカイン産生、胚中心の形成及びアイソタイプの切り換え、親和性成熟及び記憶細胞の産生を特徴とし得る。また、体液性免疫は、典型的に、病原体及び毒素の中和、古典的補体活性化、並びに食作用及び病原体排除のオプソニンによる促進を含む抗体のエフェクター機能を指す場合もある。
【００４７】
免疫原：本発明において、免疫原は、典型的に、免疫応答を刺激することができる化合物であると理解してよい。好ましくは、免疫原は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質である。特に好ましい実施形態では、本発明の意味における免疫原は、提供される核酸分子、好ましくは本明細書に定義する人工核酸分子の翻訳産物である。典型的に、免疫原は、少なくとも適応免疫応答を誘発する。
【００４８】
免疫賦活組成物：本発明において、免疫賦活組成物は、典型的に、免疫応答を誘導することができるか、又は免疫応答を誘導することができる成分が由来する少なくとも１つの成分を含有する組成物であると理解してよい。かかる免疫応答は、好ましくは、自然免疫応答又は適応免疫応答と自然免疫応答との組合せであってよい。本発明における免疫賦活組成物は、好ましくは、少なくとも１つの人工核酸分子、より好ましくはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）分子を含有する。ｍＲＮＡ等の免疫賦活成分は、好適な担体と複合体化し得る。したがって、免疫賦活組成物は、ｍＲＮＡ／担体複合体を含んでいてよい。更に、免疫賦活組成物は、ｍＲＮＡ等の免疫賦活成分用のアジュバント及び／又は好適なビヒクルを含んでいてよい。
【００４９】
免疫応答：免疫応答は、典型的に、特定の抗原に対する適応免疫系の特異的反応（所謂、特異的又は適応免疫応答）、又は自然免疫系の非特異的反応（所謂、非特異的又は自然免疫応答）、又はこれらの組合せであってよい。
【００５０】
免疫系：免疫系は、生物を感染から保護することができる。病原体が、生物の物理的障壁の通過に成功し、この生物に侵入した場合、自然免疫系が、即座にではあるが非特異的に応答する。病原体がこの自然応答から逃れた場合、脊椎動物は、第２の保護層である適応免疫系を有している。ここで、免疫系は、感染中の応答に適応してその病原体認識を向上させる。その後、この向上した応答は、病原体が排除された後も免疫記憶の形態で保持され、この病原体に遭遇したときにはいつも適応免疫系がより速やかに且つより強力な攻撃を行うことが可能になる。これによれば、免疫系は、自然免疫系及び適応免疫系を含む。これら２つの部分はそれぞれ、典型的に、所謂体液性成分及び細胞性成分を含有する。
【００５１】
免疫賦活ＲＮＡ：本発明における免疫賦活ＲＮＡ（ｉｓＲＮＡ）は、典型的に、自然免疫応答を誘導することができるＲＮＡであってよい。これは、通常、オープンリーディングフレームを有しないので、ペプチド抗原又は免疫原を提供しないが、例えば、特定の種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）又は他の好適な受容体に結合することによって免疫応答を誘発する。しかし、無論、オープンリーディングフレームを有し且つペプチド／タンパク質をコードしているｍＲＮＡも自然免疫応答を誘導し得るので、免疫賦活ＲＮＡであり得る。
【００５２】
自然免疫系：非特異的免疫系としても知られている自然免疫系は、典型的に、非特異的に他の生物による感染からホストを守る細胞及び機構を含む。これは、自然免疫系の細胞が、包括的に病原体を認識し、応答することはできるが、適応免疫系とは異なり、ホストに対して長期間免疫を付与することも、防御免疫を付与することもないことを意味する。自然免疫系は、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のリガンド、又はリポ多糖類等の他の補助物質、ＴＮＦ−アルファ、ＣＤ４０リガンド、又はサイトカイン、モノカイン、リンホカイン、インターロイキン、又はケモカイン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＬＴ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、成長因子及びｈＧＨ、ヒトＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０のリガンド、マウスＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２、又はＴＬＲ１３のリガンド、ＮＯＤ様受容体のリガンド、ＲＩＧ−Ｉ様受容体のリガンド、免疫賦活核酸、免疫賦活ＲＮＡ（ｉｓＲＮＡ）、ＣｐＧ−ＤＮＡ、抗菌剤、又は抗ウイルス剤によって活性化され得る。本発明に係る医薬組成物は、１以上のかかる物質を含んでいてよい。典型的に、自然免疫系の応答は、サイトカインと呼ばれる特殊な化学メディエーターを含む化学因子の産生を介して感染部位に免疫細胞を動員し、補体カスケードを活性化し、特殊な白血球によって器官、組織、血液、及びリンパ中に存在する外来物質を同定及び除去し、適応免疫系を活性化し、及び／又は感染因子に対する物理的及び化学的な障壁として作用することを含む。
【００５３】
クローニングサイト：クローニングサイトは、典型的に、核酸配列、例えば、オープンリーディングフレームを含む核酸配列の挿入に好適である核酸分子のセグメントであると理解される。挿入は、例えば、制限酵素処理及びライゲーションによって当業者に公知の任意の分子生物学的方法によって実施してよい。クローニングサイトは、典型的に、１以上の制限酵素認識部位（制限酵素部位）を含む。これら１以上の制限酵素部位は、これら部位においてＤＮＡを切断する制限酵素によって認識され得る。１超の制限酵素部位を含むクローニングサイトは、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）又はポリリンカーと呼ばれる場合もある。
【００５４】
核酸分子：核酸分子は、核酸成分を含む、好ましくは核酸成分からなる分子である。核酸分子という用語は、好ましくは、ＤＮＡ又はＲＮＡの分子を指す。好ましくは、用語「ポリヌクレオチド」と同義的に用いられる。好ましくは、核酸分子は、糖／リン酸骨格のホスホジエステル結合によって互いに共有結合しているヌクレオチドモノマーを含むか又はからなるポリマーである。また、用語「核酸分子」は、例えば、塩基が修飾されている、糖が修飾されている、又は骨格が修飾されているＤＮＡ又はＲＮＡの分子等の修飾核酸分子も含む。
【００５５】
オープンリーディングフレーム：本発明におけるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、典型的に、ペプチド又はタンパク質に翻訳され得る幾つかのヌクレオチドトリプレットの配列であってよい。オープンリーディングフレームは、好ましくは、その５’末端における開始コドン、即ち、通常アミノ酸メチオニンをコードしている３つの連続するヌクレオチドの組合せ（ＡＴＧ）と、その後に、通常３の倍数である長さのヌクレオチドを有する領域とを含む。典型的に、これは、オープンリーディングフレームの唯一の終止コドンである。したがって、本発明におけるオープンリーディングフレームは、好ましくは、開始コドン（例えば、ＡＴＧ）で始まり、好ましくは、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＧＡ、又はＴＡＧ）で終結する、３で割り切れる多数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列である。オープンリーディングフレームは、単離することができたり、例えば、ベクター又はｍＲＮＡにおけるより長い核酸配列に組み込むことができたりする。また、オープンリーディングフレームは、「タンパク質コード領域」と呼ばれる場合もある。
【００５６】
ペプチド：ペプチド又はポリペプチドは、典型的に、ペプチド結合によって連結されているアミノ酸モノマーのポリマーである。典型的に、５０個未満のモノマーユニットを含む。しかし、ペプチドという用語は、５０個超のモノマーユニットを有する分子を除外するものではない。また、典型的に５０個〜６００個のモノマーユニットを有する長いペプチドは、ポリペプチドとも呼ばれる。
【００５７】
薬学的に有効な量：本発明において薬学的に有効な量は、典型的に、免疫応答等の薬学的効果を誘導して、ペプチド又はタンパク質の病的レベルの発現を変化させるか又は例えば、病理学的状況の場合、欠損している遺伝子産物を置換するのに十分な量であると理解される。
【００５８】
タンパク質：タンパク質は、典型的に、１以上のペプチド又はタンパク質を含む。タンパク質は、典型的に、３次元形態に折り畳まれており、このことは、タンパク質がその生物学的機能を発揮するのに必要である場合がある。
【００５９】
ポリ（Ａ）配列：ポリ（Ａ）テール又は３’−ポリ（Ａ）テールとも呼ばれるポリ（Ａ）配列は、典型的に、アデノシンヌクレオチドの配列、例えば、約４００個以下のアデノシンヌクレオチドの配列、約２０個〜約４００個のアデノシンヌクレオチドの配列、好ましくは約５０個〜約４００個のアデノシンヌクレオチドの配列、より好ましくは約５０個〜約３００個のアデノシンヌクレオチドの配列、更により好ましくは約５０個〜約２５０個のアデノシンヌクレオチドの配列、最も好ましくは約６０個〜約２５０個のアデノシンヌクレオチドの配列であると理解される。ポリ（Ａ）配列は、典型的に、ｍＲＮＡの３’末端に位置する。本発明において、ポリ（Ａ）配列は、ｍＲＮＡ内に位置していてもよく、又は例えば、ベクターの転写によってＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）を作製するためのテンプレートとして機能するベクター等のベクターにおける任意の他の核酸分子内に位置していてもよい。
【００６０】
ポリアデニル化：ポリアデニル化は、典型的に、ＲＮＡ分子等の核酸分子、例えば、未成熟ｍＲＮＡにポリ（Ａ）配列を付加することであると理解される。ポリアデニル化は、所謂ポリアデニル化シグナルによって誘導され得る。このシグナルは、好ましくは、ポリアデニル化される核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子）の３’末端における一続きのヌクレオチド内に位置している。ポリアデニル化シグナルは、典型的に、アデニン及びウラシル／チミンヌクレオチドからなるヘキサマー、好ましくは、ヘキサマー配列ＡＡＵＡＡＡを含む。他の配列、好ましくはヘキサマー配列も考えられる。ポリアデニル化は、典型的に、プレｍＲＮＡ（未成熟ｍＲＮＡとも呼ばれる）のプロセシング中に生じる。典型的に、ＲＮＡの成熟（プレｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへ）は、ポリアデニル化工程を含む。
【００６１】
制限酵素部位：「制限酵素認識部位」とも呼ばれる制限酵素部位は、制限酵素によって認識されるヌクレオチド配列である。制限酵素部位は、典型的に短く、好ましくは、回文構造のヌクレオチド配列、例えば、４個〜８個のヌクレオチドを含む配列である。制限酵素部位は、好ましくは、制限酵素によって特異的に認識される。制限酵素は、典型的に、この部位において制限酵素部位を含むヌクレオチド配列を切断する。二本鎖ＤＮＡ配列等の二本鎖ヌクレオチド配列では、制限酵素は、典型的に、ヌクレオチド配列の両方の鎖を切断する。
【００６２】
ＲＮＡ、ｍＲＮＡ：ＲＮＡは、リボ核酸の一般的な略称である。ＲＮＡは、核酸分子、即ち、ヌクレオチドからなるポリマーである。これらヌクレオチドは、通常、所謂骨格に沿って互いに結合しているアデノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、グアノシン一リン酸、及びシチジン一リン酸のモノマーである。骨格は、第１のモノマーの糖（即ち、リボース）と第２の隣接するモノマーのリン酸部分との間のホスホジエステル結合によって形成される。特定の連続するモノマーをＲＮＡ配列と呼ぶ。通常、ＲＮＡは、例えば、細胞内部のＤＮＡ配列の転写によって得ることができる。真核細胞では、転写は、通常、核又はミトコンドリア内部で実施される。典型的には、ＤＮＡの転写により、通常、所謂未成熟ＲＮＡが得られ、これは、所謂メッセンジャーＲＮＡ（通常、ｍＲＮＡと略される）にプロセシングされなければならない。例えば、真核生物における未成熟ＲＮＡのプロセシングは、スプライシング、５’−キャッピング、ポリアデニル化、核又はミトコンドリアからのエクスポート等の様々な異なる転写後修飾を含む。これらプロセス全体をＲＮＡの成熟とも呼ぶ。成熟メッセンジャーＲＮＡは、通常、特定のペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列に翻訳され得るヌクレオチド配列を提供する。典型的に、成熟ｍＲＮＡは、５’−キャップ、５’−ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、３’−ＵＴＲ、及びポリ（Ａ）配列を含む。メッセンジャーＲＮＡは別として、転写及び／又は翻訳の制御に関与し得る幾つかの非コード型のＲＮＡが存在する。
【００６３】
核酸分子の配列：核酸分子の配列は、典型的に、そのヌクレオチドの特定の及び個々の順序、即ち、連続物であると理解される。タンパク質又はペプチドの配列は、典型的に、そのアミノ酸の順序、即ち、連続物であると理解される。
【００６４】
配列同一性：同じ長さ及び順序のヌクレオチド又はアミノ酸を有する場合、２以上の配列は同一である。同一性の割合は、典型的に、２つの配列が同一である程度について説明する。即ち、典型的に、その配列位置においてレファレンス配列の同一ヌクレオチドと一致するヌクレオチドの割合について説明するものである。同一性の程度を決定する場合、比較する配列は、同じ長さ、即ち、比較する配列のうちの最長の配列の長さを有するとみなされる。これは、８ヌクレオチドからなる第１の配列が、前記第１の配列を含む１０ヌクレオチドからなる第２の配列と８０％同一であることを意味する。言い換えれば、本発明において、配列同一性は、好ましくは、同じ長さを有する２以上の配列において配列のうちの同一位置を有するヌクレオチドの割合に関する。ギャップは、アラインメントにおけるその実際の位置にかかわらず、通常、非同一位置であるとみなされる。
【００６５】
安定化核酸分子：安定化核酸分子は、例えば、環境因子又はエキソヌクレアーゼ若しくはエンドヌクレアーゼによる分解等の酵素分解によって、修飾されていない核酸分子よりも崩壊又は分解に対して安定であるように修飾されている核酸分子、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡの分子である。好ましくは、本発明における安定化核酸分子は、細胞（例えば、原核細胞又は真核細胞）、好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）において安定化される。また、安定化効果は、例えば、安定化核酸分子を含む医薬組成物の製造過程において、細胞外、例えば、バッファ溶液中等でも発揮され得る。
【００６６】
トランスフェクション：用語「トランスフェクション」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の分子等の核酸分子を細胞、好ましくは真核細胞に導入することを指す。本発明において、用語「トランスフェクション」は、核酸分子を細胞、好ましくは真核細胞、例えば哺乳類細胞に導入するための当業者に公知の任意の方法を含む。かかる方法は、例えば、エレクトロポレーション、（例えば、カチオン性脂質及び／又はリポソームに基づく）リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ナノ粒子に基づくトランスフェクション、ウイルスに基づくトランスフェクション、又はカチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン又はポリエチレンイミン等）に基づくトランスフェクションを含む。好ましくは、非ウイルス的に導入される。
【００６７】
翻訳効率（又は翻訳の効率）：この用語は、本明細書で使用するとき、典型的には、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）の性質に関する。翻訳効率は、実験的に定量可能である。翻訳効率は、典型的には、ＯＲＦから翻訳されるタンパク質の量を求めることによって測定される。翻訳効率を実験的に定量する場合、ＯＲＦは、好ましくは、レポータータンパク質又は定量可能な任意の他のタンパク質をコードしている。しかし、特定の理論に束縛されるものではないが、高い翻訳効率は、典型的には、特定のＵＴＲエレメント（特定の５’−ＵＴＲエレメント又は特定の３’−ＵＴＲエレメント）によって与えられると理解される。したがって、本発明の状況において翻訳効率という用語は、特に、ＯＲＦに加えて（好ましくは本明細書に定義される）少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントを含む核酸分子に関連して使用される。翻訳効率を実験的に定量する目的のためには、ＯＲＦは、好適には、レポータータンパク質又は定量可能な任意の他のタンパク質をコードしているが、本発明は、かかる目的に限定されるものではない。したがって、（高翻訳効率を与える）本発明の少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、レポータータンパク質をコードしていないＯＲＦを含む核酸分子に含まれていてもよい。
【００６８】
翻訳効率は、相対的な用語である。したがって、例えばＯＲＦによってコードされているタンパク質を実験的に定量することによって、様々な、例えば２以上の核酸分子の翻訳効率を測定し、比較することができる。これは、標準化された条件下で、例えば、本明細書に記載される標準化されたアッセイにおいて行うことができる。したがって、標準化された条件下で測定された翻訳効率は、客観的な特徴である。好ましくは、２つの核酸分子の翻訳効率を測定し、比較する。前記２つの核酸分子のうちの第１の核酸分子を「サブジェクト核酸分子」又は「サブジェクトコンストラクト」と称することがあり、前記２つの核酸分子のうちの第２の核酸分子を「レファレンス核酸分子」又は「レファレンスコンストラクト」と称することがある。サブジェクト核酸分子は、本発明に係る人工核酸分子であってよい。この目的のために、レファレンス核酸分子及びサブジェクト核酸分子は、同じＯＲＦ（同一の核酸配列）を共有しており；好ましくは、サブジェクト核酸分子の核酸配列は、試験されるＵＴＲエレメント、即ち、５’−ＵＴＲエレメント又は３’−ＵＴＲエレメントのいずれかを除いてレファレンス核酸分子の核酸配列と同一である。言い換えれば、サブジェクト核酸分子及びレファレンス核酸分子は、好ましくは、５’−ＵＴＲエレメント又は３’−ＵＴＲエレメントのいずれかが異なる核酸配列を有するという点においてのみ互いに異なっており；その結果、５’−ＵＴＲエレメント又は３’−ＵＴＲエレメントは、サブジェクト核酸分子をレファレンス核酸分子と識別する唯一の構造的特徴となる。
【００６９】
本明細書に記載されるアッセイでは、サブジェクト核酸分子及びレファレンス核酸分子を哺乳類細胞にトランスフェクトし、翻訳効率を測定する。サブジェクト核酸分子の翻訳効率がレファレンス核酸分子の翻訳効率よりも高いとき、サブジェクト核酸分子は、高い翻訳効率によって特徴付けられるといわれる。この場合、サブジェクト核酸分子をレファレンス核酸分子と識別する５’−ＵＴＲエレメント又は３’−ＵＴＲエレメントは、（サブジェクト核酸分子に）高い翻訳効率を与えるといわれる。言い換えれば、高い翻訳効率は、サブジェクト核酸分子には存在しているが、レファレンス核酸分子には存在していない特定の５’−ＵＴＲエレメント又は３’−ＵＴＲエレメントによって「与えられる」といわれ；かかる５’−ＵＴＲ又は３’−ＵＴＲと少なくとも１つのＯＲＦとを含むサブジェクト核酸分子（又は人工核酸分子）は、高い翻訳効率「によって特徴付けられる」といわれる。
【００７０】
ワクチン：ワクチンは、典型的に、少なくとも１つの抗原、好ましくは免疫原を提供する予防的又は治療的材料であると理解される。抗原又は免疫原は、ワクチン接種に好適な任意の材料に由来してよい。例えば、抗原又は免疫原は、病原体（例えば、細菌又はウイルス粒子等）又は腫瘍若しくは癌性組織に由来してよい。抗原又は免疫原は、身体の適応免疫系を刺激して、適応免疫応答を提供する。
【００７１】
ベクター：用語「ベクター」は、核酸分子、好ましくは人工核酸分子を指す。本発明におけるベクターは、オープンリーディングフレームを含む核酸配列等の所望の核酸配列を組み込むか又は有するのに好適である。かかるベクターは、ストレージベクター、発現ベクター、クローニングベクター、トランスファーベクター等であってよい。ストレージベクターは、核酸分子、例えば、ｍＲＮＡ分子を便利に保管することができるベクターである。したがって、このベクターは、例えば、所望のｍＲＮＡ配列又はその一部に相当する配列（例えば、ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム並びに３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲに相当する配列）を含んでいてよい。発現ベクターは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、又はペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質等の発現産物を産生するために用いることができる。例えば、発現ベクターは、プロモータ配列（例えば、ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列）等のベクターの一続きの配列の転写に必要な配列を含んでいてよい。クローニングベクターは、典型的に、核酸配列をベクターに組み込むために用いることができるクローニングサイトを含むベクターである。クローニングベクターは、例えば、プラスミドベクター又はバクテリオファージベクターであってよい。トランスファーベクターは、細胞又は生物に核酸分子を移入するのに好適なベクター、例えば、ウイルスベクターであってよい。本発明におけるベクターは、例えば、ＲＮＡベクターであってもＤＮＡベクターであってもよい。好ましくは、ベクターは、ＤＮＡ分子である。好ましくは、本願の意味におけるベクターは、クローニングサイト、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性因子）、及びベクターの増殖に好適な配列（例えば、複製起点）を含む。好ましくは、本願におけるベクターは、プラスミドベクターである。
【００７２】
ビヒクル：ビヒクルは、典型的に、化合物（例えば、薬学的に活性のある化合物）を保管、輸送、及び／又は投与するのに好適な材料であると理解される。例えば、薬学的に活性のある化合物を保管、輸送、及び／又は投与するのに好適な生理学的に許容できる液体であってよい。
【００７３】
３’−非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）：一般的に、用語「３’−ＵＴＲ」は、オープンリーディングフレームの３’側（即ち、「下流」）に位置し、タンパク質には翻訳されない、人工核酸分子の部分を指す。典型的に、３’−ＵＴＲは、ｍＲＮＡのタンパク質コード領域（オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又はコード配列（ＣＤＳ））とポリ（Ａ）配列との間に位置するｍＲＮＡの部分である。本発明の状況では、用語３’−ＵＴＲは、それからＲＮＡが転写されるテンプレートにコードされているのではなく、転写後成熟中に付加されるエレメント、例えば、ポリ（Ａ）配列を含んでいてもよい。ｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、アミノ酸配列には翻訳されない。３’ＵＴＲ配列は、一般的に、遺伝子発現プロセス中にそれぞれのｍＲＮＡに転写される遺伝子によってコードされている。ゲノム配列は、先ず、任意のイントロンを含む未成熟ｍＲＮＡに転写される。次いで、前記未成熟ｍＲＮＡは、成熟プロセスにおいて成熟ｍＲＮＡに更にプロセシングされる。この成熟プロセスは、５’キャッピング工程、未成熟ｍＲＮＡをスプライシングして、任意のイントロンを除去する工程、及び３’末端を修飾する工程（例えば、未成熟ｍＲＮＡの３’末端のポリアデニル化）、及び任意のエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼによる切断工程等を含む。本発明において、３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡのタンパク質コード領域の終止コドン、好ましくはタンパク質コード領域の終止コドンの直ぐ３’側とポリ（Ａ）配列との間に位置する成熟ｍＲＮＡの配列に相当する。用語「相当する」とは、３’ＵＴＲ配列が、３’ＵＴＲ配列を定義するために用いられるｍＲＮＡ配列等のＲＮＡ配列であってもよく、かかるＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列であってもよいことを意味する。本発明の状況において、用語「遺伝子の３’ＵＴＲ」は、この遺伝子に由来する成熟ｍＲＮＡ、即ち、遺伝子の転写及び未成熟ｍＲＮＡの成熟によって得られるｍＲＮＡの３’ＵＴＲに相当する配列である。用語「遺伝子の３’ＵＴＲ」は、３’ＵＴＲのＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列（センス鎖及びアンチセンス鎖の両方、並びに成熟及び未成熟の両方）を含む。好ましくは、３’ＵＴＲは、２０ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、又は５０ヌクレオチド長を超える長さを有する。
【００７４】
５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）：一般的に、用語「５’−ＵＴＲ」とは、オープンリーディングフレームの５’側（即ち、「上流」）に位置し、タンパク質には翻訳されない、人工核酸分子の一部を指す。５’−ＵＴＲは、典型的に、ｍＲＮＡのオープンリーディングフレームの５’側に位置する、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の特定のセクションであると理解される。典型的に、５’−ＵＴＲは、転写開始点から始まり、オープンリーディングフレームの開始コドンの１ヌクレオチド前で終わる。好ましくは、５’ＵＴＲは、２０ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、又は５０ヌクレオチド長を超える長さを有する。５’−ＵＴＲは、制御エレメントとも呼ばれる、遺伝子発現を制御するためのエレメントを含んでいてよい。かかる制御エレメントは、例えば、リボソーム結合部位であってよい。５’−ＵＴＲは、例えば、５’−キャップの付加によって、転写後翻訳され得る。ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲは、アミノ酸配列には翻訳されない。５’−ＵＴＲ配列は、一般的に、遺伝子発現プロセス中にそれぞれのｍＲＮＡに転写される遺伝子によってコードされている。ゲノム配列は、先ず、任意のイントロンを含む未成熟ｍＲＮＡに転写される。次いで、前記未成熟ｍＲＮＡは、成熟プロセスにおいて成熟ｍＲＮＡに更にプロセシングされる。この成熟プロセスは、５’キャッピング工程、未成熟ｍＲＮＡをスプライシングして、任意のイントロンを除去する工程、及び３’末端を修飾する工程（例えば、未成熟ｍＲＮＡの３’末端のポリアデニル化）、及び任意のエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼによる切断工程等を含む。本発明の状況では、５’−ＵＴＲは、開始コドンと、例えば、５’−キャップとの間に位置する成熟ｍＲＮＡの配列に相当する。好ましくは、５’−ＵＴＲは、５’−キャップの３’側に位置するヌクレオチドから、より好ましくは、５’−キャップの直ぐ３’側に位置するヌクレオチドから、タンパク質コード領域の開始コドンの５’側に位置するヌクレオチドまで、好ましくは、タンパク質コード領域の開始コドンの直ぐ５’側に位置するヌクレオチドまで延在する配列に相当する。成熟ｍＲＮＡの５’−キャップの直ぐ３’側に位置するヌクレオチドは、典型的に、翻訳開始点に相当する。用語「相当する」とは、５’−ＵＴＲ配列が、５’−ＵＴＲ配列を定義するために用いられるｍＲＮＡ配列等のＲＮＡ配列であってもよく、かかるＲＮＡ配列に相当するＤＮＡ配列であってもよいことを意味する。本発明の状況では、用語「遺伝子の５’−ＵＴＲ」は、この遺伝子に由来する成熟ｍＲＮＡ、即ち、遺伝子の転写及び未成熟ｍＲＮＡの成熟によって得られるｍＲＮＡの５’−ＵＴＲに相当する配列である。用語「遺伝子の５’−ＵＴＲ」は、５’−ＵＴＲのＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列（センス鎖及びアンチセンス鎖の両方、並びに成熟及び未成熟の両方）を含む。
【００７５】
５’末端オリゴピリミジン領域（ＴＯＰ）：５’末端オリゴピリミジン領域（ＴＯＰ）は、典型的に、特定の遺伝子の核酸分子の５’末端領域（例えば、特定のｍＲＮＡ分子の５’末端領域又は機能的実体、例えば、転写領域の５’末端領域）に位置する一続きのピリミジンヌクレオチドである。この配列は、シチジン（通常、転写開始点に相当する）で始まり、その後に、通常約３個〜約３０個の一続きのピリミジンヌクレオチドが続く。例えば、ＴＯＰは、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２９ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、又は更に多くのヌクレオチドを含み得る。一続きのピリミジン、延いては５’ＴＯＰは、ＴＯＰの下流に位置する最初のプリンヌクレオチドの１ヌクレオチド５’側で終わる。５’末端オリゴピリミジン領域を含有するメッセンジャーＲＮＡは、多くの場合、ＴＯＰ  ｍＲＮＡと呼ばれる。したがって、かかるメッセンジャーＲＮＡを提供する遺伝子は、ＴＯＰ遺伝子と呼ばれる。ＴＯＰ配列は、例えば、ペプチド伸長因子及びリボソームタンパク質をコードしている遺伝子及びｍＲＮＡにおいて見出されている。
【００７６】
ＴＯＰモチーフ：本発明の状況では、ＴＯＰモチーフは、上に定義した５’ＴＯＰに相当する核酸配列である。したがって、本発明の状況におけるＴＯＰモチーフは、好ましくは、３ヌクレオチド長〜３０ヌクレオチド長を有する一続きのピリミジンヌクレオチドである。好ましくは、ＴＯＰモチーフは、少なくとも３ピリミジンヌクレオチド、好ましくは、少なくとも４ピリミジンヌクレオチド、好ましくは、少なくとも５ピリミジンヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも６ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも７ヌクレオチド、最も好ましくは、少なくとも８ピリミジンヌクレオチドからなり、この一続きのピリミジンヌクレオチドは、好ましくは、その５’末端におけるシトシンヌクレオチドで始まる。ＴＯＰ遺伝子及びＴＯＰ  ｍＲＮＡでは、ＴＯＰモチーフは、好ましくは、その５’末端における転写開始点で始まり、前記遺伝子又はｍＲＮＡにおける最初のプリン残基の１ヌクレオチド５’側で終わる。本発明の意味におけるＴＯＰモチーフは、好ましくは、５’−ＵＴＲを表す配列の５’末端、又は５’−ＵＴＲをコードしている配列の５’末端に位置する。したがって、好ましくは、３以上の一続きのピリミジンヌクレオチドは、この一続きが、人工核酸分子、人工核酸分子の５’−ＵＴＲエレメント、又は本明細書に記載するＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列等、それぞれの配列の５’末端に位置している場合、本発明の意味において「ＴＯＰモチーフ」と呼ばれる。言い換えれば、５’−ＵＴＲ又は５’−ＵＴＲエレメントの５’末端ではなく、５’−ＵＴＲ又は５’−ＵＴＲエレメント内のどこかに位置する、３以上の一続きのピリミジンヌクレオチドは、好ましくは、「ＴＯＰモチーフ」とは呼ばれない。
【００７７】
ＴＯＰ遺伝子：ＴＯＰ遺伝子は、典型的に、５’末端オリゴピリミジン領域の存在を特徴とする。更に、殆どのＴＯＰ遺伝子は、成長に関連する翻訳制御を特徴とする。しかし、組織特異的に翻訳制御するＴＯＰ遺伝子も知られている。上に定義した通り、ＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲは、ＴＯＰ遺伝子に由来する成熟ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲの配列に相当し、これは、好ましくは、５’−キャップの３’側に位置するヌクレオチドから開始コドンの５’側に位置するヌクレオチドまで延在する。ＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲは、典型的に、開始コドンを全く含まず、好ましくは、上流ＡＵＧ（ｕＡＵＧ）も上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）も含まない。本明細書では、上流ＡＵＧ及び上流オープンリーディングフレームは、典型的に、翻訳されるべきオープンリーディングフレームの開始コドン（ＡＵＧ）の５’側に存在するＡＵＧ及びオープンリーディングフレームであると理解される。ＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲは、一般的に、短めである。ＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲの長さは、２０ヌクレオチド〜５００ヌクレオチドで変動し得るが、典型的には、約２００ヌクレオチド未満、好ましくは、約１５０ヌクレオチド未満、より好ましくは、約１００ヌクレオチド未満である。本発明の意味における例示的なＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲは、国際公開第２０１３／１４３７００号（この開示は、参照により本明細書に援用される）の配列番号１〜１３６３に係る配列における５位のヌクレオチドから開始コドン（例えば、ＡＴＧ）の直ぐ５’側に位置するヌクレオチドまで延在する核酸配列である。この状況では、ＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲの特に好ましい断片は、５’ＴＯＰモチーフの欠損しているＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲである。用語「ＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲ」又は「５’−ＴＯＰ  ＵＴＲ」は、好ましくは、自然界に存在するＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲを指す。好ましい例は、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１３６８に対応する配列番号２０８（５’末端オリゴピリミジン領域が欠損しているヒトリボソームタンパク質ラージ３２の５’−ＵＴＲ）によって表される。
【００７８】
野生型、例えば野生型核酸分子：用語「野生型」は、自然界に存在する配列として理解することができる。野生型核酸分子は、典型的には、自然界に存在する核酸分子、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであると理解することができる。言い換えれば、人工核酸分子は、天然核酸分子であると理解することができる。かかる核酸分子は、（自然界に存在する）その個々の配列及び／又は自然界に存在するヌクレオチドの他の修飾、例えば構造的修飾により天然であり得る。野生型核酸分子は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、又はＤＮＡ部分とＲＮＡ部分とを含むハイブリッド分子であり得る。本明細書では、用語「野生型」は、自然界に存在している限り任意の配列を指し、ＧｅｎＢａｎｋ等の公的にアクセス可能な配列コレクションへの反映は必要ない。米国国立保健研究所（ＮＩＨ）は、公的に利用可能な野生型配列を含む公的に利用可能なヌクレオチド配列の、公的にアクセス可能なアノテーション付けされたコレクションを提供している（「ＧｅｎＢａｎｋ」、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ情報検索システム：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を通してアクセス可能）、（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１３；４１（Ｄ１）：Ｄ３６−４２）。各ＧｅｎＢａｎｋレコードには、アクセッション番号と呼ばれる独自の不変の識別名が割り当てられ、ＧｅｎＢａｎｋレコードのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ欄に表示される。配列データの変更は、ＧｅｎＢａｎｋレコードのＶＥＲＳＩＯＮ欄に表示されるアクセッション番号の整数の継ぎ足しによって追跡される。更に、用語「野生型核酸分子」は、「１つの分子」の意味には限定されず、典型的には、同一分子の集合体を含むと理解される。したがって、それは、アリコートに含有される複数の同一分子に関連し得る。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
本発明は、少なくとも１つのオープンリーディングフレームと少なくとも１つの３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）及び／又は少なくとも１つの５’−非翻訳領域エレメント（５’−ＵＴＲエレメント）とを含む人工核酸分子であって、高い翻訳効率によって特徴付けられる人工核酸分子に関する。翻訳効率には、５’−ＵＴＲエレメント若しくは３’−ＵＴＲエレメント、又は５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメントの両方が少なくとも部分的に寄与する。本発明は、更に、遺伝子療法及び／又は遺伝子ワクチン接種におけるかかる人工核酸分子の使用に関する。更に、新規３’−ＵＴＲエレメント及び５’−ＵＴＲエレメントが提供される。
【００８０】
第１の態様では、本発明は、
ａ．少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、
ｂ．少なくとも１つの３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）及び／又は少なくとも１つの５’−非翻訳領域エレメント（５’−ＵＴＲエレメント）とを含み、高い翻訳効率によって特徴付けられる人工核酸分子に関する。
【００８１】
例えば、本発明の人工核酸分子は、少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント（好ましくは、１つの３’−ＵＴＲエレメント）が少なくとも１つの非同一の３’−ＵＴＲエレメント（好ましくは、１つの３’−ＵＴＲエレメント）に置換されているか、又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメント（好ましくは、１つの５’−ＵＴＲエレメント）が少なくとも１つの非同一の５’−ＵＴＲエレメント（好ましくは、１つの５’−ＵＴＲエレメント）に置換されている点で他の（例えば、野生型又は人工）核酸分子とは異なり得る。
【００８２】
一般的に、（出発核酸分子又はレファレンス核酸分子における）１つの（又は少なくとも１つの）３’−ＵＴＲエレメントの置換又は１つの（又は少なくとも１つの）５’−ＵＴＲエレメントの置換は、一般的に、前記３’−ＵＴＲエレメント又は前記５’−ＵＴＲエレメントの少なくとも幾つかのヌクレオチドの配列が、非同一の核酸配列によって置換されることを意味する。好ましくは、５’−ＵＴＲエレメントが置換されるとき、５’−ＵＴＲエレメントのヌクレオチドの連続配列が、非同一のヌクレオチドの連続配列（エレメント）によって置換され；３’−ＵＴＲエレメントが置換されるとき、３’−ＵＴＲエレメントのヌクレオチドの連続配列が、非同一のヌクレオチドの連続配列（エレメント）によって置換される。元の（置換される）エレメントのヌクレオチドの連続配列及び置換するエレメントのヌクレオチドの連続配列は、それぞれ独立して任意の長さ、例えば、１ヌクレオチド以上５００ヌクレオチド超、２０ヌクレオチド〜５００ヌクレオチド、４０ヌクレオチド〜４００ヌクレオチド、６０ヌクレオチド〜３００ヌクレオチド、８０ヌクレオチド〜２００ヌクレオチド、又は１００ヌクレオチド〜１５０ヌクレオチドであってよい。（５’−又は３’−）ＵＴＲエレメントが置換されるとき、これは、必ずしも、開始コドンの５’に位置する全てのヌクレオチド又は終止コドンの３’に位置する全てのヌクレオチドが置換されることを意味するものではない。好ましい実施形態では、それぞれ開始コドンの５’に位置する全てのヌクレオチドのサブセット又は終止コドンの３’に位置する全てのヌクレオチドのサブセットである連続配列が置換される。その例を図１Ｂ（５’）及び図１Ｃ（３’）に示す。出発配列又はレファレンス配列に存在する公知の５’−ＵＴＲエレメント又は公知の３’−ＵＴＲエレメントを正確に置換することが可能である。例えば、（例えば、レファレンス）核酸が配列番号２０８に係る配列に対応する５’−ＵＴＲエレメントを含むとき、本発明の人工核酸分子は、配列番号２０８に係る連続配列全体を、非同一の本発明に係る連続５’−ＵＴＲエレメント、即ち、高い翻訳効率を与える５’−ＵＴＲエレメントによって正確に置換することにより作製することができる。或いは、公知のＵＴＲエレメントを正確には置換しない、例えば、追加のヌクレオチド（即ち、公知のＵＴＲエレメントに加えて）を含む連続核酸配列を置換するか、又は例えば、公知のＵＴＲエレメントの一部のみ（通常、大部分、即ち、長さの９０％以上）を置換することも可能である。本明細書では５’−ＵＴＲエレメントの場合についてこれら可能性を説明してきたが、３’−ＵＴＲエレメントについても同じ可能性が存在する。言い換えれば、置換されるＵＴＲエレメントは、必ずしも公知のＵＴＲエレメントの正確な境界によって限定される必要はない。これら可能性については、一例として、それぞれ図１Ｂ及び図１Ｃを図１Ａと比較することにより更に説明する。同様に、置換するＵＴＲエレメントは、必ずしも、公知のＵＴＲエレメントの正確な境界によって限定される必要はない。
【００８３】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子は、リボソームタンパク質Ｓ６、ＲＰＬ３６ＡＬ、ｒｐｓ１６、又はリボソームタンパク質Ｌ９の３’−ＵＴＲ（エレメント）及び／又は５’−ＵＴＲ（エレメント）を含まない。より好ましくは、本発明に係る人工核酸分子は、リボソームタンパク質Ｓ６、ＲＰＬ３６ＡＬ、ｒｐｓ１６、又はリボソームタンパク質Ｌ９の３’−ＵＴＲ（エレメント）及び／又は５’−ＵＴＲ（エレメント）を含まず、本発明に係る人工核酸分子のオープンリーディングフレームは、ＧＦＰタンパク質をコードしていない。更により好ましくは、本発明に係る人工核酸分子は、リボソームタンパク質Ｓ６、ＲＰＬ３６ＡＬ、ｒｐｓ１６、又はリボソームタンパク質Ｌ９の３’−ＵＴＲ（エレメント）及び／又は５’−ＵＴＲ（エレメント）を含まず、本発明に係る人工核酸分子のオープンリーディングフレームは、例えば、グロビンタンパク質（特に、ベータ−グロビン）、ルシフェラーゼタンパク質、ＧＦＰタンパク質、グルクロニダーゼタンパク質（特に、ベータ−グルクロニダーゼ）、又はこれらの変異体、例えば、グロビンタンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、ＧＦＰタンパク質、又はグルクロニダーゼタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を示す変異体からなる群から選択されるレポータータンパク質をコードしていない。
【００８４】
用語「３’−ＵＴＲエレメント」は、３’−ＵＴＲ又は３’−ＵＴＲの変異体若しくは断片に由来する核酸配列を含むか又はからなる核酸配列を指す。「３’−ＵＴＲエレメント」は、好ましくは、人工核酸配列（例えば、人工ｍＲＮＡ）の３’−ＵＴＲによって含まれる核酸配列を指す。したがって、本発明の意味において、好ましくは、３’−ＵＴＲエレメントは、ｍＲＮＡ（好ましくは、人工ｍＲＮＡ）の３’−ＵＴＲによって含まれていてもよく、３’−ＵＴＲエレメントは、それぞれの転写テンプレートの３’−ＵＴＲによって含まれていてもよい。好ましくは、３’−ＵＴＲエレメントは、ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ、好ましくは人工ｍＲＮＡ（例えば、遺伝的に改変されているベクターコンストラクトの転写によって得られるｍＲＮＡ）の３’−ＵＴＲに相当する核酸配列である。好ましくは、本発明の意味における３’−ＵＴＲエレメントは、３’−ＵＴＲとして機能するか、又は３’−ＵＴＲの機能を発揮するヌクレオチド配列をコードしている。
【００８５】
したがって、用語「５’−ＵＴＲエレメント」は、５’−ＵＴＲ又は５’−ＵＴＲの変異体若しくは断片に由来する核酸配列を含むか又はからなる核酸配列を指す。「５’−ＵＴＲエレメント」は、好ましくは、人工核酸配列（例えば、人工ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲによって含まれる核酸配列を指す。したがって、本発明の意味において、好ましくは、５’−ＵＴＲエレメントは、ｍＲＮＡ（好ましくは人工ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲによって含まれていてもよく、５’−ＵＴＲエレメントは、それぞれの転写テンプレートの５’−ＵＴＲによって含まれていてもよい。好ましくは、５’−ＵＴＲエレメントは、ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ、好ましくは人工ｍＲＮＡ（例えば、遺伝的に改変されているベクターコンストラクトの転写によって得られるｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲに相当する核酸配列である。好ましくは、本発明の意味における５’−ＵＴＲエレメントは、５’−ＵＴＲとして機能するか、又は５’−ＵＴＲの機能を発揮するヌクレオチド配列をコードしている。
【００８６】
本発明に係る人工核酸分子における３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントは、前記人工核酸分子に高い翻訳効率を与える。したがって、本発明に係る人工核酸分子は、特に、以下を含んでいてよい：
−  前記人工核酸分子に高い翻訳効率を与える３’−ＵＴＲエレメント、
−  前記人工核酸分子に高い翻訳効率を与える５’−ＵＴＲエレメント、
−  前記人工核酸分子に高い翻訳効率を与える３’−ＵＴＲエレメント及び前記人工核酸分子に高い翻訳効率を与える５’−ＵＴＲエレメント。
【００８７】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子は、前記人工核酸分子に高い翻訳効率を与える３’−ＵＴＲエレメント及び前記人工核酸分子に高い翻訳効率を与える５’−ＵＴＲエレメントを含む。
【００８８】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子は、少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメント、即ち、前記人工核酸分子に高い翻訳効率を与える少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び前記人工核酸分子に高い翻訳効率を与える少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントを含む。
【００８９】
以下に詳細に記載する通り、前記人工核酸分子に高い翻訳効率を与える前記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント又は前記人工核酸分子に高い翻訳効率を与える前記少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、自然界に存在する（好ましくは、異種の）３’−ＵＴＲエレメント及び５’−ＵＴＲエレメント（共に自然界に存在するＵＴＲエレメント又は野生型ＵＴＲエレメント）、並びに人工３’−ＵＴＲエレメント及び人工５’−ＵＴＲエレメント（共に人工ＵＴＲエレメント）から選択することができる。野生型ＵＴＲエレメントは、文献及び公的にアクセス可能なデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）に公開されている野生型ＵＴＲエレメント、並びにこれまでに公開されていない野生型ＵＴＲエレメントを含む群から選択することができる。後者は、細胞、好ましくは哺乳類細胞にみられるｍＲＮａの配列を決定することによって同定することができる。本発明者らは、このアプローチを使用してこれまでに公開されていない幾つかの野生型ＵＴＲエレメントを同定し、この種のＵＴＲエレメントを本発明に提供する。人工ＵＴＲエレメントという用語は特に限定されず、自然界ではみられない、即ち、野生型ＵＴＲエレメントと非同一である任意の核酸配列を指すことができる。しかし、好ましい実施形態では、本発明で使用される人工ＵＴＲエレメントは、野生型ＵＴＲエレメントに対して特定の配列同一度、例えば、１０％〜９９．９％、２０％〜９９％、３０％〜９８％、４０％〜９７％、５０％〜９６％、６０％〜９５％、７０％〜９０％を示す核酸配列である。好ましい実施形態では、本発明で使用される人工ＵＴＲは、１つ、又は２つ、又は３つ、又は４つ、又は５つ、又は５超のヌクレオチドが同数のヌクレオチドによって置換されている（例えば、１つのヌクレオチドが１つのヌクレオチドによって置換されている）ことを除いて、野生型ＵＴＲと同一である。好ましくは、１つのヌクレオチドの置換は、それぞれの相補的ヌクレオチドによる置換である。好ましい人工ＵＴＲエレメントは、（ｉ）野生型５’−ＵＴＲエレメント（存在する場合）におけるＡＴＧトリプレットの一部又は全てがトリプレットＴＡＧに変換されている；及び／又は（ｉｉ）野生型５’−ＵＴＲエレメント若しくは野生型３’−ＵＴＲエレメント（存在する場合）における選択された特定の制限酵素の切断部位が、前記特定の制限酵素の切断部位内の１つのヌクレオチドを相補的ヌクレオチドで置換することによって除去され、それによって、前記特定の制限酵素の切断部位が除去されていることを除いて、野生型ＵＴＲエレメントに対応する。後者は、通常、（例えば、野生型）ＵＴＲエレメントが前記特定の制限酵素の切断部位を含むとき及び前記特定の制限酵素が後続のクローニング工程で使用される（ことが計画されている）ときに望ましい。５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメントのかかる内部切断は望ましくないので、前記特定の制限酵素の制限酵素切断部位が除去されている人工ＵＴＲエレメントを作製してよい。かかる置換は、当業者に公知の任意の公的な方法によって、例えば、ＰＣＲにより改変プライマーを使用することによって行うことができる。
【００９０】
任意で、本発明に係る人工核酸分子は、少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメント、即ち、前記人工核酸分子からのタンパク質産生を延長及び／又は増加させる少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント並びに前記人工核酸分子からのタンパク質産生を延長及び／又は増加させる少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントを含む。
【００９１】
タンパク質産生；タンパク質産生が延長及び／又は増加しているかどうかを判定するためのアッセイ
「前記人工核酸分子からのタンパク質産生を延長及び／又は増加させる」とは、一般的に、３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損している又はレファレンス３’−ＵＴＲ及び／又はレファレンス５’−ＵＴＲ（例えば、自然界においてＯＲＦと併存する３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ）を含むそれぞれのレファレンス核酸から産生されるタンパク質の量と比較した、それぞれの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントを有する本発明に係る人工核酸分子から産生されるタンパク質の量に言及する。
【００９２】
特に、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントは、３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損しているか又はレファレンス３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ（例えば、自然界においてＯＲＦと併存する３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ）を含むそれぞれの核酸と比較して、本発明に係る人工核酸分子（例えば、本発明に係るｍＲＮＡ）からのタンパク質産生を延長する。
【００９３】
特に、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントは、３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損しているか又はレファレンス３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ（例えば、自然界においてＯＲＦと併存する３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ）を含むそれぞれの核酸と比較して、本発明に係る人工核酸分子（例えば、本発明に係るｍＲＮＡ）からのタンパク質産生、特に、タンパク質発現及び／又は総タンパク質産生を増加させる。
【００９４】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損しているか又はレファレンス３’−ＵＴＲ及び／又はレファレンス５’−ＵＴＲ（例えば、自然界においてＯＲＦと併存する３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ）を含むそれぞれの核酸の翻訳効率と比較して、核酸の翻訳効率に負の影響を与えない。或いは、翻訳効率は、自然界の状況においてそれぞれのＯＲＦによってコードされているタンパク質の翻訳効率と比較して、前記３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲによって増強される。
【００９５】
用語「それぞれの核酸分子」又は「レファレンス核酸分子」とは、本明細書で使用するとき、様々な３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲは別にして、レファレンス核酸分子が、３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントを含む本発明の人工核酸分子と同等、好ましくは同一であることを意味する。
【００９６】
インビボ又は本明細書に定義されるインビトロ（即ち、インビトロとは、（「生」）細胞及び／又は組織（生体の組織を含む）を指し；細胞は、特に、細胞株、初代細胞、組織又は被験体における細胞を含み、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞及びマウス細胞）が好ましく、ヒト細胞株ＨｅＬａ、ＨＥＰＧ２、及びＵ−９３７並びにマウス細胞株ＮＩＨ３Ｔ３、ＪＡＷＳＩＩ、及びＬ９２９が特に好ましく、更に、初代細胞が特に好ましく、特に好ましい実施形態では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）である）における本発明の人工核酸分子によるタンパク質産生を評価するために、本発明の人工核酸分子の標的細胞／組織への注入／トランスフェクション後に、コードされているタンパク質の発現を測定し、レファレンス核酸によって誘導されるタンパク質発現と比較する。タンパク質発現を測定する定量的な方法は、当技術分野において公知である（例えば、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、質量分析）。この状況において特に有用なのは、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、又は分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）等のレポータータンパク質の発現の測定である。したがって、好ましくは哺乳類の発現系（例えば、ＨＤＦ、Ｌ９２９、ＨｅｐＧ２、及び／又はＨｅＬａ細胞等の哺乳類細胞）において、例えば、トランスフェクション又は注入を介して、本発明に係る人工核酸分子又はレファレンス核酸を標的組織又は細胞に導入する。核酸分子の発現開始又は導入の数時間又は数日間（例えば、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、又は７２時間）後に、標的細胞サンプルを回収し、ＦＡＣＳを介して測定する及び／又は溶解させる。その後、溶解物を用いて、例えば、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、質量分析等の幾つかの方法を用いて、又は蛍光若しくは発光測定によって、発現したタンパク質を検出することができる（延いては、タンパク質発現の効率を求めることができる）。
【００９７】
したがって、特定の時点（例えば、核酸分子の発現開始又は導入の６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、又は７２時間後）において、本発明に係る人工核酸分子からのタンパク質発現をレファレンス核酸分子からのタンパク質発現と比較する場合、両核酸分子を別々に標的組織／細胞に導入し、特定の時点後に前記組織／細胞からサンプルを回収し、特定の検出方法（例えば、当技術分野において公知であるウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、蛍光若しくは発光測定等）に合わせた特定のプロトコールに従ってタンパク質溶解物を調製し、選択した検出方法によってタンパク質を検出する。細胞溶解物中の発現タンパク質量を測定する代わりに、又は回収した細胞を溶解させる前に若しくは並行してアリコートを用いて細胞溶解物中のタンパク質量を測定することに加えて、ＦＡＣＳ分析を用いることによってタンパク質量を求めてもよい。
【００９８】
人工核酸分子（例えば、人工ｍＲＮＡ）からの「タンパク質産生を延長する」という用語は、好ましくは、哺乳類発現系（例えば、ＨＤＦ、Ｌ９２９、ＨＥＰ２Ｇ、又はＨｅＬａ細胞）において（例えば、レファレンス３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲを含むか又は３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損している）レファレンス核酸分子（例えば、レファレンスｍＲＮＡ）からのタンパク質産生と比べて、人工核酸分子（例えば、人工ｍＲＮＡ）からのタンパク質産生が延長されることを意味する。したがって、人工核酸分子（例えば、人工ｍＲＮＡ）から産生されるタンパク質は、レファレンス核酸分子から産生されるタンパク質についてみられ得る期間よりも長い期間観察可能である。言い換えれば、後続時点、例えば、トランスフェクションの４８時間後又は７２時間後に測定される人工核酸分子（例えば、人工ｍＲＮＡ）から産生されるタンパク質の量は、対応する後続時点におけるレファレンス核酸分子（例えば、レファレンスｍＲＮＡ）から産生されるタンパク質の量よりも多い。かかる「後続時点」は、発現の開始後、例えば、核酸分子のトランスフェクション後２４時間を超える任意の時点、例えば、発現の開始、即ち、トランスフェクションの３６時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後、９６時間後であってよい。更に、同じ核酸については、後続時点で産生されたタンパク質の量を、より早い（レファレンス）時点で産生された量に対して正規化してもよく、例えば、後続時点におけるタンパク質の量を、トランスフェクションの２４時間後におけるタンパク質の量の百分率として表してよい。
【００９９】
好ましくは、このタンパク質産生を延長する効果は、（ｉ）好ましくは哺乳類発現系（例えば、ＨＤＦ、Ｌ９２９、ＨＥＰ２Ｇ、又はＨｅＬａ細胞）において、コードされているレポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）の発現によって得られるタンパク質量を経時的に測定し、（ｉｉ）「レファレンス」時点ｔ１（例えば、ｔ１＝トランスフェクションの２４時間後）において観察されるタンパク質の量を測定し、このタンパク質量を１００％に設定し、（ｉｉｉ）１以上の後続時点ｔ２、ｔ３等（例えば、ｔ２＝トランスフェクションの４８時間後及びｔ３＝トランスフェクションの７２時間後）において観察されるタンパク質の量を測定し、後続時点において観察される相対タンパク質量を時点ｔ１におけるタンパク質量の百分率として計算することによって求められる。例えば、ｔ１における量が「８０」であり、ｔ２における量が「２０」であり、ｔ３における量が「１０」であると表されるタンパク質では、ｔ２におけるタンパク質の相対量は２５％であり、ｔ３では１２．５％である。次いで、工程（ｉｖ）において、後続時点におけるこれら相対量を、それぞれ３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損しているか又はそれぞれレファレンス３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲを含む核酸分子の対応する時点における相対タンパク質と比較してよい。本発明に係る人工核酸分子から産生される相対タンパク質量を、レファレンス核酸分子、即ち、それぞれ３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損しているか又はそれぞれレファレンス３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲを含む核酸分子から産生される相対タンパク質量と比較することによって、本発明に係る人工核酸分子からのタンパク質産生がレファレンス核酸分子からのタンパク質産生と比べて何倍延長されるかを決定することができる。
【０１００】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子における少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントは、それぞれ３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損しているか又はそれぞれレファレンス３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲを含むレファレンス核酸分子からのタンパク質産生と比べて、前記人工核酸分子からのタンパク質産生を少なくとも１．２倍、好ましくは少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、更により好ましくは少なくとも２．５倍延長する。言い換えれば、上記特定の後続時点において本発明に係る人工核酸分子から産生されるタンパク質の（相対）量は、同じ後続時点においてレファレンス核酸分子（例えば、それぞれ３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損しているか又はそれぞれレファレンス３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲを含む）から産生されるタンパク質の（相対）量と比べて少なくとも１．２倍、好ましくは少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、更により好ましくは少なくとも２．５倍増加する。
【０１０１】
或いは、このタンパク質産生を延長する効果は、（ｉ）好ましくは哺乳類発現系（例えば、ＨＤＦ、Ｌ９２９、ＨＥＰ２Ｇ、又はＨｅＬａ細胞）において、コードされているレポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）の発現によって得られるタンパク質量を経時的に測定し、（ｉｉ）タンパク質量が、人工核酸分子の発現開始の１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、又は６時間後（例えば、トランスフェクションの１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、又は６時間後）等に観察されるタンパク質量を下回る時点を求め、（ｉｉｉ）前記タンパク質量が発現開始の１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、又は６時間後に観察されたタンパク質量を下回る時点を、それぞれ３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損しているか又はそれぞれレファレンス３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲを含む核酸分子について求めた前記時点と比較することによって求めることもできる。
【０１０２】
例えば、人工核酸分子（例えば、人工ｍＲＮＡ）からのタンパク質産生は、哺乳類の発現系（例えば、ＨＤＦ、Ｌ９２９、ＨＥＰ２Ｇ、又はＨｅＬａ細胞等の哺乳類細胞）において、レファレンス核酸分子（例えば、レファレンスｍＲＮＡ）からのタンパク質産生と比べて、少なくとも核酸分子の発現開始（例えば、トランスフェクション）の１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、又は６時間後等の発現の初期相において観察される量である量において、少なくとも約５時間、好ましくは少なくとも約１０時間、より好ましくは少なくとも約２４時間延長される。したがって、本発明に係る人工核酸分子は、好ましくは、それぞれ３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損しているか又はそれぞれレファレンス３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲを含むレファレンス核酸分子と比べて、少なくとも発現開始（例えば、トランスフェクション）の１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、又は６時間後等、発現の初期相において観察される量である量において、タンパク質産生を少なくとも約５時間、好ましくは少なくとも約１０時間、より好ましくは少なくとも約２４時間延長することができる。
【０１０３】
好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子からのタンパク質産生期間は、それぞれ３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損しているか又はそれぞれレファレンス３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲを含むレファレンス核酸分子からのタンパク質産生と比べて、少なくとも１．２倍、好ましくは少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、更により好ましくは少なくとも２．５倍延びる。
【０１０４】
好ましくは、このタンパク質産生を延長する効果が得られると同時に、例えば、４８時間又は７２時間の期間内に本発明に係る人工核酸分子から産生されるタンパク質の合計量は、それぞれ３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損しているか又はそれぞれレファレンス３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ（例えば、自然界において前記人工核酸分子のＯＲＦと併存している３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ）を含むレファレンス核酸分子から産生されるタンパク質の量に少なくとも対応する。したがって、本発明は、上に指定した哺乳類の発現系（例えば、ＨＤＦ、Ｌ９２９、ＨＥＰ２Ｇ、又はＨｅＬａ細胞等の哺乳類細胞）においてタンパク質産生を延長することができる人工核酸分子であって、例えば、４８時間又は７２時間の期間内に前記人工核酸分子から産生されるタンパク質の合計量が、少なくとも、例えば、前記期間内にそれぞれ３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損しているか又はそれぞれレファレンス３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ（例えば、自然界において前記人工核酸分子のＯＲＦと併存している３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ）を含むレファレンス核酸分子から産生されるタンパク質の合計量である人工核酸分子を提供する。
【０１０５】
更に、用語「タンパク質発現の延長」は、「タンパク質発現の安定化」も含み、「タンパク質発現の安定化」とは、好ましくは、それぞれレファレンス３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲを含むか又はそれぞれ３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損しているレファレンス核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）と比べたとき、所定の期間、例えば、２４時間、より好ましくは４８時間、更により好ましくは７２時間に亘って本発明に係る人工核酸分子からより均一にタンパク質が産生されることを意味する。
【０１０６】
したがって、本発明に係る３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントを含む人工核酸分子（例えば、本発明に係るｍＲＮＡ）からの（例えば、哺乳類系における）タンパク質産生のレベルは、好ましくは、レファレンス核酸分子（例えば、上記レファレンスｍＲＮＡ）について観察される程度まで低下することはない。特定の核酸分子からのタンパク質産生が低下する程度を評価するために、例えば、発現開始の２４時間後、例えば、本発明に係る人工核酸分子を細胞（例えば、哺乳類細胞）にトランスフェクトした２４時間後に観察される（それぞれのＯＲＦによってコードされている）タンパク質の量を、発現開始の４８時間後、例えば、トランスフェクションの４８時間後に観察されるタンパク質の量と比較してよい。後続時点、例えば、発現開始（例えば、トランスフェクション）の４８時間後に観察される、本発明に係る人工核酸分子のＯＲＦによってコードされているタンパク質の量、例えば、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）の量の、より早い時点、例えば、発現開始（例えば、トランスフェクション）の２４時間後に観察されるタンパク質の量に対する比は、好ましくは、したがって、それぞれレファレンス３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲを含むか又はそれぞれ３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損しているレファレンス核酸分子についての対応する比（同時点を含む）よりも高い。
【０１０７】
好ましくは、後続時点、例えば、発現開始（例えば、トランスフェクション）の４８時間後に観察される、本発明に係る人工核酸分子のＯＲＦによってコードされているタンパク質、例えば、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）の量の、より早い時点、例えば、発現開始（例えば、トランスフェクション）の２４時間後に観察されるタンパク質の量に対する比は、好ましくは少なくとも０．２、より好ましくは少なくとも約０．３、より好ましくは少なくとも約０．４、更により好ましくは少なくとも約０．５、特に好ましくは少なくとも約０．７である。それぞれレファレンス３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲを含むか又はそれぞれ３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損しているそれぞれのレファレンス核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）の場合、前記比は、例えば、約０．０５〜約０．３５であってよい。
【０１０８】
したがって、本発明は、ＯＲＦと上記３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントとを含む人工核酸分子であって、好ましくは、哺乳類の発現系（例えば、ＨＤＦ細胞又はＨｅＬａ細胞等の哺乳類細胞）における、発現開始の４８時間後に観察されるタンパク質の量（例えば、ルシフェラーゼの量）の、発現開始の２４時間後に観察されるタンパク質の量に対する比が、好ましくは少なくとも０．２、より好ましくは少なくとも約０．３、より好ましくは少なくとも約０．４、更により好ましくは少なくとも約０．５、更により好ましくは少なくとも約０．６、特に好ましくは少なくとも約０．７である人工核酸分子を提供する。それによって、好ましくは、例えば、４８時間の期間内に前記人工核酸分子から産生されるタンパク質の合計量は、少なくとも、それぞれ３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損しているか又はそれぞれレファレンス３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ（例えば、自然界において人工核酸分子のＯＲＦと併存している３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ）を含むレファレンス核酸分子から、例えば、前記期間内に産生されるタンパク質の合計量に対応する。
【０１０９】
好ましくは、本発明は、ＯＲＦと上記３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントとを含む人工核酸分子であって、好ましくは、哺乳類の発現系（例えば、ＨｅＬａ細胞又はＨＤＦ細胞等の哺乳類細胞）における、発現開始の７２時間後に観察されるタンパク質の量（例えば、ルシフェラーゼの量）の、発現開始の２４時間後に観察されるタンパク質の量に対する比が、好ましくは約０．０５超、より好ましくは約０．１超、更により好ましくは約０．２超、更により好ましくは約０．３超であり、好ましくは、例えば、７２時間の期間内に前記人工核酸分子から産生されるタンパク質の合計量が、少なくとも、それぞれ３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損しているか又はそれぞれレファレンス３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ（例えば、自然界において人工核酸分子のＯＲＦと併存している３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ）を含むレファレンス核酸分子から、例えば、前記期間内に産生されるタンパク質の合計量である人工核酸分子を提供する。
【０１１０】
本発明において、「タンパク質発現の増加」又は「タンパク質発現の増強」とは、好ましくは、レファレンス核酸分子によって誘導される発現と比べて発現開始後のある時点におけるタンパク質発現が増加／増強すること又は発現するタンパク質の合計量が増加／増強することを意味する。したがって、本発明に係る人工核酸分子の発現開始後（例えば、トランスフェクション後）、例えば、本発明に係るｍＲＮＡのトランスフェクション後の特定の時点、例えば、トランスフェクションの６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、又は７２時間後において観察されるタンパク質レベルは、好ましくは、レファレンス核酸分子（例えば、それぞれレファレンス３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲを含むか又はそれぞれ３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損しているレファレンスｍＲＮＡ）の発現開始後（例えば、トランスフェクション後）の同時点で観察されるタンパク質レベルよりも高い。好ましい実施形態では、人工核酸分子から発現するタンパク質の最大量（例えば、タンパク質の活性又は質量によって決定）は、それぞれレファレンス３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲを含むか又はそれぞれ３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損しているレファレンス核酸から発現するタンパク質量に比べて増加する。例えば、トランスフェクション後好ましくは４８時間以内、より好ましくは２４時間以内、更により好ましくは１２時間以内にピーク発現レベルに達する。
【０１１１】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子からの「合計タンパク質産生量の増加」又は「合計タンパク質産生量の増強」という用語は、それぞれ３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損しているか又はそれぞれレファレンス３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲを含むレファレンス核酸分子と比べて、好ましくは哺乳類の発現系（例えば、ＨＤＦ、Ｌ９２９、ＨＥＰ２Ｇ、又はＨｅＬａ細胞等の哺乳類細胞）において、人工核酸分子からタンパク質が産生される期間、例えば、４８時間又は７２時間に亘って、タンパク質産生量が増加／増強することを指す。好ましい実施形態によれば、経時的に発現するタンパク質の累積量は、本発明に係る人工核酸分子を用いたときに増加する。
【０１１２】
特定の期間における合計タンパク質量は、（ｉ）人工核酸分子の導入後の幾つかの時点で（例えば、人工核酸分子の発現開始又は導入の６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後）組織又は細胞を回収することによって求めることができ、上で説明した通り、時点当たりのタンパク質量を求めることができる。累積タンパク質量を計算するために、合計タンパク質量を求める数学的方法を用いてよく、例えば、以下の式に従って曲線下面積（ＡＵＣ）を求めてよい。
【数１】
2018529329.tif 000002
【０１１３】
合計タンパク質量についての曲線下面積を計算するために、各エンドポイント（ａ及びｂ）からの発現曲線の積分式を計算する。
【０１１４】
したがって、「合計タンパク質産生量」は、好ましくは、経時的なタンパク質産生量を表す曲線下面積（ＡＵＣ）を指す。
【０１１５】
好ましくは、本発明に係る少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント又は５’−ＵＴＲエレメントは、それぞれ３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損しているレファレンス核酸分子から産生されるタンパク質と比べて、前記人工核酸分子からのタンパク質産生を少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも２．５倍増加させる。言い換えれば、特定の時点、例えば、発現の開始（例えば、トランスフェクション）の４８時間後又は７２時間後における本発明に係る人工核酸分子から産生されるタンパク質の合計量は、対応する後続時点におけるレファレンス核酸分子（例えば、それぞれ３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損しているか又はそれぞれレファレンス３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲを含む）から産生されるタンパク質の（相対）量と比べて少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも２．５倍増加する。
【０１１６】
本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントのｍＲＮＡ及び／又はタンパク質産生の延長効果及び効率、及び／又はタンパク質産生の増加効果及び効率に加えて、３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲの変異体、断片、及び／又は変異体断片のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質産生の延長効果及び効率、及び／又はタンパク質産生の増加効果及び効率は、当業者に公知である、この目的に適した任意の方法によって求めることができる。
【０１１７】
例えば、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）のコード配列／オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及び本発明に係る３’−ＵＴＲエレメントを含む、即ち、人工ｍＲＮＡ分子からのタンパク質産生を延長及び／又は増加させる人工ｍＲＮＡ分子を作製することができる。更に、かかる本発明のｍＲＮＡ分子は、更に、本発明に係る、即ち、前記人工ｍＲＮＡ分子からのタンパク質産生を延長及び／又は増加させる５’−ＵＴＲエレメントを含んでいてもよく、５’−ＵＴＲエレメントを含んでいなくてもよく、本発明に係らない５’−ＵＴＲエレメント、例えば、レファレンス５’−ＵＴＲを含んでいてもよい。したがって、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）のコード配列／オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、本発明に係る、即ち、前記人工ｍＲＮＡ分子からのタンパク質産生を延長及び／又は増加させる５’−ＵＴＲエレメントとを含む人工ｍＲＮＡ分子を作製することができる。更に、かかる本発明のｍＲＮＡ分子は、更に、本発明に係る、即ち、前記人工ｍＲＮＡ分子からのタンパク質産生を延長及び／又は増加させる３’−ＵＴＲエレメントを含んでいてもよく、３’−ＵＴＲエレメントを含んでいなくてもよく、本発明に係らない３’−ＵＴＲエレメント、例えば、レファレンス３’−ＵＴＲを含んでいてもよい。
【０１１８】
本発明によれば、ｍＲＮＡは、例えば、Ｔ７プロモータとそれぞれのｍＲＮＡ配列をコードしている配列とを含むそれぞれのベクター（例えば、プラスミドベクター）のインビトロ転写によって作製することができる。作製されたｍＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡをトランスフェクトするのに適した任意のトランスフェクション法によって細胞にトランスフェクトしてよい。哺乳類細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞又はＨＤＦ細胞）にリポフェクトしてよく、トランスフェクション後の特定の時点、例えば、トランスフェクションの６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にサンプルを分析してよい。前記サンプルは、当業者に周知の方法によってｍＲＮＡ量及び／又はタンパク質量について分析してよい。例えば、サンプリング時点で細胞中に存在するレポーターｍＲＮＡの量は、定量ＰＣＲ法によって求めることができる。それぞれのｍＲＮＡによってコードされているレポータータンパク質の量は、例えば、用いられるレポータータンパク質に依存して、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＦＡＣＳ分析、又はレポーターアッセイ（例えば、ルシフェラーゼアッセイ）によって求めることができる。タンパク質発現の安定化及び／又はタンパク質発現の延長の効果は、例えば、トランスフェクションの４８時間後に観察されるタンパク質レベルの、トランスフェクションの２４時間後に観察されるタンパク質レベルに対する比を求めることによって分析することができる。前記値が１に近いほど、この期間内におけるタンパク質発現がより安定である。かかる測定は、無論、７２時間以上の時点で実施してもよく、タンパク質発現の安定性を求めるために、トランスフェクションの７２時間後に観察されるタンパク質レベルとトランスフェクションの２４時間後に観察されるタンパク質レベルとの比を求めてもよい。
【０１１９】
翻訳効率；翻訳効率を測定するためのアッセイ
上に詳細に記載した通り、翻訳効率は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）の性質であり、典型的には、前記核酸分子に含まれる特定のＵＴＲエレメント（特定の５’−ＵＴＲエレメント又は特定の３’−ＵＴＲエレメント）によって与えられる。翻訳効率は、典型的には、ＯＲＦから翻訳されるタンパク質の量を用いて測定される。これに関して、本発明は、一般的な方法及び具体的なアッセイを提供する。様々な、例えば２以上の核酸分子の翻訳効率は、例えば、ＯＲＦによってコードされているタンパク質の実験的定量によって比較することができる。
【０１２０】
一般的に、翻訳効率を評価するために、細胞ベースの方法が使用される。翻訳効率は、本発明の人工核酸分子により、本明細書に定義される通りインビボ又はインビトロにおいて実験的に試験され（即ち、インビトロとは、（「生存」）細胞及び／又は組織（生存被験体の組織を含む）を指し；細胞は、特に、細胞株、初代細胞、組織又は被験体中の細胞を含み、哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞及びマウス細胞が好ましく、ヒト細胞株ＨｅＬａ、ＨＥＰＧ２、及びＵ−９３７並びにマウス細胞株ＮＩＨ３Ｔ３、ＪＡＷＳＩＩ、及びＬ９２９が特に好ましく、更に初代細胞が特に好ましく、特定の好ましい実施形態では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ））、コードされているタンパク質の発現は、本発明の人工核酸分子を標的細胞／組織に注入／トランスフェクションした後に測定され、レファレンス核酸分子によって誘導されるタンパク質発現と比較される。タンパク質発現を測定する定量的な方法は、当該技術分野において公知である（例えば、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、質量分析）。この状況において特に有用なのは、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、又は分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）等のレポータータンパク質の発現の測定である。したがって、好ましくは哺乳類発現系、例えば哺乳類細胞、例えばＨＤＦ、Ｌ９２９、ＨｅｐＧ２及び／又はＨｅＬａ細胞において、例えばトランスフェクション又は注入を介して、本発明に係る人工核酸又はレファレンス核酸を標的組織又は細胞に導入する。核酸分子の発現開始又は導入の数時間又は数日間（例えば、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、又は７２時間）後に、標的細胞サンプルを回収し、ＦＡＣＳを介して測定する及び／又は溶解させる。その後、幾つかの方法、例えば、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、質量分析を使用して、又は蛍光若しくは発光を測定することによって、発現したタンパク質を検出する（ひいては、翻訳効率を測定する）ために溶解物を使用することができる。
【０１２１】
したがって、特定の時点（例えば、核酸分子の発現開始又は導入の６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、又は７２時間後）において、本発明に係る人工核酸分子からのタンパク質発現をレファレンス核酸分子からのタンパク質発現と比較する場合、両核酸分子を別々に標的組織／細胞に導入し、特定の時点後に前記組織／細胞からサンプルを回収し、特定の検出方法（例えば、当該技術分野において公知であるウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、蛍光又は発光測定等）に合わせた特定のプロトコールに従ってタンパク質溶解物を調製し、選択した検出方法によってタンパク質を検出する。細胞溶解物中の発現タンパク質量を測定する代わりに、又は回収した細胞を溶解させる前に細胞溶解物中のタンパク質量を測定すること若しくは並行してアリコートを使用することに加えて、ＦＡＣＳ分析を用いることによってタンパク質量を測定してもよい。
【０１２２】
特に記載しない限り、他の一般的な態様は、タンパク質産生に関連して上に記載した態様に対応する。
【０１２３】
好ましくは、高い翻訳効率は、少なくとも１つの３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）及び／又は少なくとも１つの５’−非翻訳領域エレメント（５’−ＵＴＲエレメント）によって本発明の人工核酸分子に与えられる。「によって与えられる」とは、少なくとも１つの３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）及び／又は少なくとも１つの５’−非翻訳領域エレメント（５’−ＵＴＲエレメント）の非存在下では、翻訳効率が本明細書に定義されるほど高くないことを意味する。
【０１２４】
用語「高い翻訳効率」は、本発明の人工核酸分子の翻訳効率をレファレンス核酸分子と比較するために使用することができる。用語「レファレンス核酸分子」とは、本明細書で使用するとき、レファレンス核酸分子が、異なる３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲを除いて、３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントを含む本発明の人工核酸分子と同等、好ましくは同一であることを意味する。したがって、人工核酸分子の翻訳効率をレファレンス核酸分子の翻訳効率と比較することができる。翻訳効率を比較するそれぞれの方法を本明細書に提供する。
【０１２５】
特に記載しない限り、タンパク質産生の測定に関連する上記全ての態様は、翻訳効率を比較する方法にも同様に当てはまる。翻訳効率を比較する方法は２つの核酸分子の比較を含むので、核酸分子の性質のみが異なる２つの並行実験を実施する。言い換えれば、他の全ての条件、例えば、成長培地、温度、ｐＨは実験間で同一である。当業者は、共通一般知識及び本明細書に記載される指針に基づいて適切な条件を日常的に選択するが、但し両並行実験について同一の条件を選択する。典型的には、並行実験のうちの一方は、レファレンス核酸分子（野生型であっても人工であってもよい）に関し、他方は、人工核酸分子（サブジェクト核酸分子とも呼ばれる）に関する。この方法によって、サブジェクト核酸分子が高い翻訳効率によって特徴付けられるかどうか、即ち、本発明に係る人工核酸分子であるかどうかを比較することができるようになる。翻訳効率を比較する方法の具体的な態様は、以下の通りである。
【０１２６】
この方法では、レファレンス核酸分子は、人工核酸分子の少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と同一の少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み；レファレンス核酸分子は、人工核酸分子の少なくとも１つの３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）及び／又は人工核酸分子の少なくとも１つの５’−非翻訳領域エレメント（５’−ＵＴＲエレメント）を含まない。人工核酸分子の翻訳効率及びレファレンス核酸分子の翻訳効率は、以下の工程を含む方法によって比較される：
（ｉ）哺乳類細胞に人工核酸分子をトランスフェクトし、トランスフェクション後の特定の時点（例えば、２４時間又は４８時間）において、人工核酸分子のＯＲＦによってコードされているタンパク質の発現量を測定する工程、
（ｉｉ）哺乳類細胞にレファレンス核酸分子をトランスフェクトし、トランスフェクション後の同時点において、レファレンス核酸分子のＯＲＦによってコードされているタンパク質の発現量を測定する工程、
（ｉｉｉ）前記人工核酸分子から発現したタンパク質の量の前記レファレンス核酸分子から発現したタンパク質の量に対する比を計算する工程。
（ｉｉｉ）において計算される比は、≧１、好ましくは＞１である。
【０１２７】
したがって、本発明に係るサブジェクト核酸分子から産生された相対タンパク質量をレファレンス核酸分子から産生された相対タンパク質量と比較することによって、本発明に係る人工核酸分子の翻訳効率をレファレンス核酸分子の翻訳効率と比べて増加せしめる要因を決定することができる。
【０１２８】
「トランスフェクション後」は、細胞にサブジェクト核酸分子及びレファレンス核酸分子をトランスフェクトした時点を指すために使用される。
【０１２９】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子における少なくとも１つの３’−及び／又は５’−ＵＴＲエレメントは、それぞれレファレンス３’−及び／又は５’−ＵＴＲを含むレファレンス核酸分子からのタンパク質産生と比べて、前記人工核酸分子の翻訳効率を少なくとも１．２倍、好ましくは少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、更により好ましくは少なくとも２．５倍増加させる（即ち、（ｉｉｉ）において計算される比は、少なくとも１．２、好ましくは少なくとも１．５、より好ましくは少なくとも２、更により好ましくは少なくとも２．５である）。言い換えれば、翻訳効率は、同じ時点について、レファレンス核酸分子の翻訳効率と比べて少なくとも１．２倍、好ましくは少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、更により好ましくは少なくとも２．５倍増加する。
【０１３０】
高い翻訳効率は、サブジェクト核酸分子をレファレンス核酸分子と異ならしめる５’−ＵＴＲ又は３’−ＵＴＲによって付与される。
【０１３１】
本発明に係る翻訳効率を比較する方法の好ましい実施形態では、（ｉ）レファレンス核酸分子は、人工核酸分子には存在しない３’−ＵＴＲエレメントを含むか、又は（ｉｉ）レファレンス核酸分子は、人工核酸分子には存在しない５’−ＵＴＲエレメントを含む。より好ましい実施形態では、（ｉ）レファレンス核酸分子は、アルブミン遺伝子の３’−ＵＴＲ、好ましくは、配列番号２０７に係る配列に対応する３’−ＵＴＲに由来する３’−ＵＴＲエレメントを含むか、又は（ｉｉ）レファレンス核酸分子は、ＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲ、好ましくは５’末端オリゴピリミジン領域が欠損しているヒトリボソームタンパク質ラージ３２の５’−ＵＴＲ、好ましくは配列番号２０８に係る配列に対応する５’−ＵＴＲに由来する５’−ＵＴＲエレメントを含む。
【０１３２】
別の好ましい実施形態では、（ｉ）レファレンス核酸分子は、任意の３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）を含まないか、又は（ｉｉ）レファレンス核酸分子は、任意の５’−非翻訳領域エレメント（５’−ＵＴＲエレメント）を含まない。
【０１３３】
好ましい実施形態では、人工核酸分子及びレファレンス核酸分子のトランスフェクション工程で使用される細胞は、好ましくはＨＤＦ、Ｌ９２９、ＨＥＰ２Ｇ、及びＨｅＬａ細胞の群から選択される哺乳類細胞である。前記方法は、更に、１種超の哺乳類細胞において並行して、例えば、上記細胞株のうちの任意の２つ、好ましくは任意の３つ、より好ましくは４つ全ての組合せにおいて並行して実施することが好ましい場合がある。前記方法が１種超の哺乳類細胞において並行して実施されるとき、サブジェクト核酸分子は、使用される少なくとも１種の哺乳類細胞において、工程（ｉｉｉ）で計算される比が≧１、好ましくは＞１であるとき、高い翻訳効率によって特徴付けられるとみなすことができる。しかし、サブジェクト核酸分子は、使用される哺乳類細胞の少なくとも２種、例えば少なくとも３種、例えば４種において、工程（ｉｉｉ）で計算される比が≧１、好ましくは＞１であるとき、高い翻訳効率によって特徴付けられるとみなされることが好ましい。
【０１３４】
人工核酸分子及びレファレンス核酸分子のＯＲＦによってコードされているタンパク質の発現量は、トランスフェクション後の特定の時点（例えば、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、又は７２時間）で測定される。好ましくは、ＯＲＦによってコードされているタンパク質の発現量は、トランスフェクションの２４時間後に測定される。
【０１３５】
また、本発明は、本発明の方法において使用することができる特定の好ましいレファレンスコンストラクトを提供する。レファレンス核酸分子は配列番号２０５のｍＲＮＡ（図１Ａ）であることが特に好ましい。この場合、少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントが少なくとも１つの他の３’−ＵＴＲエレメント（好ましくは１つの３’−ＵＴＲエレメント）によって置換されている点、又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントが少なくとも１つの他の５’−ＵＴＲエレメント（好ましくは１つの５’−ＵＴＲエレメント）によって置換されている点においてのみ、レファレンス核酸分子が人工核酸分子と異なることが更に好ましい。いずれの場合も、これによって前記他の３’−ＵＴＲエレメント又は他の５’−ＵＴＲエレメントがそれぞれ高い翻訳効率を与えるかどうかを直接試験することができるようになる。
【０１３６】
翻訳効率を測定する方法が更に以下の通り特徴付けられることが特に好ましい：
（ａ）トランスフェクション工程において、前記細胞が、ＨＤＦ、Ｌ９２９、ＨＥＰ２Ｇ、及びＨｅＬａ細胞の群から選択される哺乳類細胞であり；且つ
（ｂ）測定時点がトランスフェクションの２４時間後であり；且つ
（ｃ）レファレンス核酸分子が、配列番号２０５のｍＲＮＡ（図１Ａ）であり；且つ
好ましくは、（ｄ）（ｉ）少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント（好ましくは１つの３’−ＵＴＲエレメント）が少なくとも１つの他の３’−ＵＴＲエレメント（好ましくは１つの３’−ＵＴＲエレメント）によって置換されている点、又は（ｉｉ）少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメント（好ましくは１つの５’−ＵＴＲエレメント）が少なくとも１つの他の５’−ＵＴＲエレメント（好ましくは１つの５’−ＵＴＲエレメント）によって置換されている点においてのみ、レファレンス核酸分子が人工核酸分子と異なる；言い換えれば、少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントが図１Ａに示す５’−ＵＴＲと異なるか、又は少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントが図１Ａに示す３’−ＵＴＲとは異なることを除いて、サブジェクト核酸分子がレファレンス核酸分子と同一である。５’−ＵＴＲエレメント置換の例を図１Ｂに示し；３’−ＵＴＲエレメント置換の例を図１Ｃに示す。
【０１３７】
（ａ）〜（ｄ）の全てを満たすとき、前記方法は、「翻訳効率を測定するための標準化されたアッセイ」又は単に「翻訳効率を測定するためのアッセイ」とも称される。本発明の人工核酸分子は、この翻訳効率を測定するための標準アッセイによって測定可能な高い翻訳効率によって特徴付けられることが特に好ましい。この標準アッセイによって、特に有利な人工核酸分子を簡単に同定することができるようになる。
【０１３８】
標準アッセイを本発明の実施例３で使用した。それによって、本発明者らは、新規人工核酸の群が、翻訳効率が高い、即ち、図１Ａのレファレンス核酸分子の翻訳効率よりも翻訳効率が高いという有利な特徴を共有していることを見出した。実施例３．５を参照。これは、特に前記レファレンス核酸分子がアルブミン遺伝子の３’−ＵＴＲ（配列番号２０７に係るＤＮＡ配列に対応する３’−ＵＴＲ）に由来する３’−ＵＴＲエレメント及びＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲ、特に５’末端オリゴピリミジン領域が欠損しているヒトリボソームタンパク質ラージ３２の５’−ＵＴＲ（配列番号２０８に係るＤＮＡ配列に対応する５’−ＵＴＲ）に由来する５’−ＵＴＲエレメントを含むという背景から、非常に驚くべき且つ有利な知見である。かかる３’−ＵＴＲエレメント及び５’−ＵＴＲエレメントは、細胞におけるタンパク質翻訳の状況において有利であることが知られている（アルブミン遺伝子に由来する３’−ＵＴＲについては、国際公開第２０１３／１４３７００号を参照；５’−ＴＯＰ−ＵＴＲについては、国際公開第２０１３／１４３７００号を参照）。本発明は、更なる改善を提供する。
【０１３９】
幾つかの実施形態では、人工核酸分子のＯＲＦは、定量可能なタンパク質、好ましくはレポータータンパク質をコードしている。これら実施形態は、本発明に係る翻訳効率を比較する方法において非常に好適である。他の実施形態では、人工核酸分子のＯＲＦは、定量可能なタンパク質、好ましくはレポータータンパク質をコードしていない。例えば、定量可能なタンパク質をコードしている人工核酸分子のＯＲＦを使用して特定の５’−ＵＴＲ又は３’−ＵＴＲが高い翻訳効率を与えると本発明の方法によって判定されているとき、前記５’−ＵＴＲ又は３’−ＵＴＲを任意のＯＲＦと再結合させてよい。例えば、翻訳効率を測定するための標準化されたアッセイでは、ＯＲＦはレポータータンパク質をコードしているが、本発明の人工核酸分子は、標準化されたアッセイにおいて使用されるＯＲＦには限定されない。
【０１４０】
また、これら方法は、繰り返し使用してもよく；即ち、高い翻訳効率によって特徴付けられると本明細書における方法によって判定されている人工核酸分子は、それ自体、本明細書における方法の後続ラウンドにおいて「レファレンスコンストラクト」として使用することができる。これによって、更なる人工核酸分子が更に高い翻訳効率によって特徴付けられるかどうか（又は更なる人工核酸分子に含まれるＵＴＲが更に高い翻訳効率を与えるかどうか）を試験することが可能になる。これによって、更に改善された人工核酸分子及びＵＴＲを同定することができるようになる。
【０１４１】
安定なｍＲＮＡ
幾つかの実施形態においては、更に、本発明に係る人工核酸分子における少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、安定なｍＲＮＡに由来する。それに関して、安定なｍＲＮＡに「由来する」とは、少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントが、安定なｍＲＮＡの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントと少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、安定なｍＲＮＡは、自然界に存在するｍＲＮＡであり、したがって、安定なｍＲＮＡの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントとは、自然界に存在するｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ、又はこれらの断片若しくは変異体を指す。更に、安定なｍＲＮＡに由来する３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントとは、好ましくは、例えば、ＲＮＡの安定性を更に増大させる及び／又はタンパク質産生を延長及び／又は増加させるために、自然界に存在する３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントと比べて改変されている３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントも指す。言うまでもなく、かかる改変は、例えば、自然界に存在する（改変されていない）３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントと比べてＲＮＡの安定性を損なわないことが好ましい。特に、本明細書で使用するとき、ｍＲＮＡという用語は、ｍＲＮＡ分子を指すが、本明細書で定義するｍＲＮＡ種を指す場合もある。
【０１４２】
好ましくは、ｍＲＮＡの安定性、即ち、ｍＲＮＡの分解及び／又は半減期は、標準的な条件下、例えば、用いられる特定の細胞株についての標準的な条件（標準的な培地、インキュベーション等）下で評価される。
【０１４３】
用語「安定なｍＲＮＡ」とは、本明細書で使用するとき、一般的に、ｍＲＮＡの分解が緩徐なｍＲＮＡを指す。したがって、「安定なｍＲＮＡ」は、典型的には、長い半減期を有する。ｍＲＮＡの半減期は、インビボ又はインビトロにおける既存のｍＲＮＡ分子の５０％を分解するのに必要な時間である。したがって、ｍＲＮＡの安定性は、通常、インビボ又はインビトロにおいて評価される。それに関して、インビトロとは、特に、（「生」）細胞及び／又は組織（生体の組織を含む）を指す。細胞は、特に、細胞株、初代細胞、組織又は被験体における細胞を含む。特定の実施形態では、細胞培養可能な細胞型が本発明に好適であり得る。哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞及びマウス細胞が特に好ましい。特に好ましい実施形態では、ヒト細胞株ＨｅＬａ、ＨＥＰＧ２、及びＵ−９３７、並びにマウス細胞株ＮＩＨ３Ｔ３、ＪＡＷＳＩＩ、及びＬ９２９が用いられる。更に、初代細胞が特に好ましく、特に好ましい実施形態では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）を用いてよい。或いは、被験体の組織を用いてもよい。
【０１４４】
好ましくは、「安定なｍＲＮＡ」の半減期は、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、及び／又は少なくとも１５時間である。対象となるｍＲＮＡの半減期は、当業者に公知の様々な方法によって求めることができる。典型的には、対象となるｍＲＮＡの半減期は、分解定数を求めることによって求められ、ここでは、通常、対象となるｍＲＮＡの転写を完全に（又は少なくとも検出不可能なレベルまで）「オフにする」ことができる理想のインビボ（又は上に定義したインビトロ）状況であると仮定される。かかる理想の状況では、通常、ｍＲＮＡの分解が一次速度論に従うと仮定する。したがって、ｍＲＮＡの分解は、通常、以下の等式によって記載することができる：
【数２】
2018529329.tif 000003
（式中、Ａ０は、０時点、即ち、分解開始前における対象となるｍＲＮＡの量（又は濃度）であり、Ａ（ｔ）は、分解中の時点ｔにおける対象となるｍＲＮＡの量（又は濃度）であり、λは、分解定数である）。したがって、０時点における対象となるｍＲＮＡの量（又は濃度）（Ａ０）及び分解プロセス中の特定の時点ｔにおける対象となるｍＲＮＡの量（又は濃度）（Ａ（ｔ）及びｔ）が公知である場合、分解定数λを計算することができる。定義に従えば、ｔ１／２ではＡ（ｔ）／Ａ０＝１／２であるので、分解定数λに基づいて、以下の等式によって半減期ｔ１／２を計算することができる。
【数３】
2018529329.tif 000004
したがって、対象となるｍＲＮＡの半減期を評価するために、通常、インビボ（又は上に定義したインビトロ）におけるＲＮＡ分解プロセス中のｍＲＮＡの量又は濃度が求められる。
【０１４５】
インビボ（又は上に定義したインビトロ）におけるＲＮＡ分解プロセス中のｍＲＮＡの量又は濃度を求めるために、当業者に公知の様々な方法を用いてよい。かかる方法の非限定的な例としては、例えばアクチノマイシンＤ等の転写阻害剤を用いる転写の全体的な阻害、例えばｃ−ｆｏｓ血清誘導性プロモータ系及びＴｅｔ−ｏｆｆ制御性プロモータ系等の一時的転写を特異的に促進するための誘導性プロモータの使用、並びに例えば４−チオウリジン（４ｓＵ）、５−エチニルウリジン（ＥＵ）、又は５’−ブロモ−ウリジン（ＢｒＵ）による動的標識技術（例えば、パルス標識）が挙げられる。ＲＮＡ分解中のｍＲＮＡの量又は濃度を求める方法に関する更なる詳細及び好ましい実施形態については、本発明に係る３’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントを同定する方法に関連して以下に概説する。ＲＮＡ分解中のｍＲＮＡの量又は濃度を求める方法のそれぞれの記載及び好ましい実施形態は、同様に本明細書にも当てはまる。
【０１４６】
好ましくは、本発明の意味における「安定なｍＲＮＡ」は、好ましくはインビボ（又は上に定義したインビトロ）において評価される平均ｍＲＮＡに比べて緩徐なｍＲＮＡ分解を有する。例えば、「平均ｍＲＮＡ分解」は、複数のｍＲＮＡ種、好ましくは１００、少なくとも３００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも２，０００、少なくとも３，０００、少なくとも４，０００、少なくとも５，０００、少なくとも６，０００、少なくとも７，０００、少なくとも８，０００、少なくとも９，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１１，０００、少なくとも１２，０００、少なくとも１３，０００、少なくとも１４，０００、少なくとも１５，０００、少なくとも１６，０００、少なくとも１７，０００、少なくとも１８，０００、少なくとも１９，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも２１，０００、少なくとも２２，０００、少なくとも２３，０００、少なくとも２４，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも２６，０００、少なくとも２７，０００、少なくとも２８，０００、少なくとも２９，０００、少なくとも３０，０００のｍＲＮＡ種のｍＲＮＡ分解を調べることによって評価し得る。トランスクリプトーム全体を評価するか、又はトランスクリプトームのできる限り多くのｍＲＮＡ種を評価することが特に好ましい。これは、例えば、トランスクリプトーム全体を網羅するマイクロアレイを用いることによって行うことができる。
【０１４７】
「ｍＲＮＡ種」は、本明細書で使用するとき、ゲノム転写単位、即ち、通常遺伝子に対応する。したがって、例えば、ｍＲＮＡのプロセシングに起因して、１つの「ｍＲＮＡ種」内で異なる転写物が生じる場合がある。例えば、ｍＲＮＡ種は、マイクロアレイ上のスポットによって表すことができる。したがって、マイクロアレイは、例えば、ｍＲＮＡ分解中の特定の時点における複数のｍＲＮＡ種の量を求めるための便利なツールを提供する。しかし、当業者に公知の他の技術、例えば、ＲＮＡ−ｓｅｑ、定量ＰＣＲ等を用いてもよい。
【０１４８】
本発明では、安定なｍＲＮＡは、第１の時点における前記ｍＲＮＡの量に対する第２の時点における前記ｍＲＮＡの量の比が少なくとも０．５（５０％）、少なくとも０．６（６０％）、少なくとも０．７（７０％）、少なくとも０．７５（７５％）、少なくとも０．８（８０％）、少なくとも０．８５（８５％）、少なくとも０．９（９０％）、又は少なくとも０．９５（９５％）であるｍＲＮＡ分解を特徴とすることが特に好ましい。それに関して、第２の時点は、分解プロセスにおいて第１の時点よりも後である。
【０１４９】
好ましくは、第１の時点は、ｍＲＮＡが分解プロセスのみを受けていると考えられる、即ち、例えば、進行中の転写において、ｍＲＮＡの出現が回避されるように選択される。例えば、動的標識技術（例えば、パルス標識）を用いる場合、第１の時点は、好ましくは、ｍＲＮＡへの標識の取り込みが完了している、即ち、ｍＲＮＡへの標識の進行中の取り込みが生じていないように選択される。したがって、動的標識を用いる場合、第１の時点は、実験的標識手順の終了、例えば、細胞と標識とのインキュベーション終了の少なくとも１０分間後、少なくとも２０分間後、少なくとも３０分間後、少なくとも４０分間後、少なくとも５０分間後、少なくとも６０分間後、少なくとも７０分間後、少なくとも８０分間後、又は少なくとも９０分間後であってよい。
【０１５０】
例えば、第１の時点は、好ましくは、（例えば、転写阻害剤による）転写の停止、誘導性プロモータの場合はプロモータ誘導の停止、又はパルス若しくは標識の供給の停止、例えば、標識の終了の０時間後〜６時間後であってよい。より好ましくは、第１の時点は、（例えば、転写阻害剤による）転写の停止、誘導性プロモータの場合はプロモータ誘導の停止、又はパルス若しくは標識の供給の停止、例えば、標識の終了の３０分間後〜５時間後、更により好ましくは１時間後〜４時間後、特に好ましくは約３時間後であってよい。
【０１５１】
好ましくは、第２の時点は、ｍＲＮＡ分解プロセス中のできる限り遅い時点になるように選択される。しかし、複数のｍＲＮＡ種を考慮する場合、第２の時点は、好ましくは、相当量の複数のｍＲＮＡ種、好ましくは、ｍＲＮＡ種の少なくとも１０％が依然として検出可能な量、即ち、０よりも多い量で存在するように選択される。好ましくは、第２の時点は、転写の終了又は実験的標識手順の終了の少なくとも５時間後、少なくとも６時間後、少なくとも７時間後、少なくとも８時間後、少なくとも９時間後、少なくとも１０時間後、少なくとも１１時間後、少なくとも１２時間後、少なくとも１３時間後、少なくとも１４時間後、又は少なくとも１５時間後である。
【０１５２】
したがって、第１の時点と第２の時点との時間間隔は、上記限度内でできる限り長いことが好ましい。したがって、第１の時点と第２の時点との時間間隔は、好ましくは、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、又は少なくとも１２時間である。
【０１５３】
更に、本発明に係る人工核酸分子における少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、本明細書に記載の通り、本発明に係る３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントを同定する方法によって同定されることができる。本発明に係る人工核酸分子における少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、本明細書に記載の通り、人工核酸分子に高い翻訳効率を与える３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントを同定する方法によって同定されることが特に好ましい。
【０１５４】
本発明の人工核酸分子の好ましい実施形態
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子における少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、真核生物のタンパク質をコードしている遺伝子の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ、好ましくは、脊椎動物のタンパク質をコードしている遺伝子の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ、より好ましくは、哺乳類のタンパク質（例えば、マウス及びヒトのタンパク質）をコードしている遺伝子の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ、更により好ましくは、霊長類又はげっ歯類のタンパク質をコードしている遺伝子の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ、特に、ヒト又はマウスのタンパク質をコードしている遺伝子の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる。
【０１５５】
一般的に、本発明に係る人工核酸分子における少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、好ましくは自然界（天然）に存在する３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなり、一方、本発明に係る人工核酸分子における少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、好ましくは自然界（天然）に存在する５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなることが理解される。
【０１５６】
好ましくは、少なくとも１つのオープンリーディングフレームと少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントとは、異種である。これに関連して、用語「異種」とは、オープンリーディングフレームと３’−ＵＴＲエレメント及び／又はオープンリーディングフレームと５’−ＵＴＲエレメント等、人工核酸分子によって含まれる２つの配列エレメントが、自然界（天然）ではこの組合せで存在しないことを意味する。これらは、典型的には、組み換え体である。好ましくは、３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントは、オープンリーディングフレームとは異なる遺伝子に由来する。例えば、ＯＲＦは、例えば、異なるタンパク質をコードしているか又は同じタンパク質であるが異なる種のタンパク質をコードしている、３’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントとは異なる遺伝子に由来していてよい。即ち、オープンリーディングフレームは、３’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントが由来する遺伝子とは異なる遺伝子に由来する。好ましい実施形態では、ＯＲＦは、ヒト又は植物（特に、アラビドプシス）のリボソームタンパク質、好ましくは、ヒトリボソームタンパク質Ｓ６（ＲＰＳ６）、ヒトリボソームタンパク質Ｌ３６ａ様（ＲＰＬ３６ＡＬ）、又はアラビドプシスリボソームタンパク質Ｓ１６（ＲＰＳ１６）をコードしていない。更に好ましい実施形態では、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、リボソームタンパク質Ｓ６（ＲＰＳ６）、リボソームタンパク質Ｌ３６ａ様（ＲＰＬ３６ＡＬ）、又はリボソームタンパク質Ｓ１６（ＲＰＳ１６）をコードしていない。
【０１５７】
具体的な実施形態では、オープンリーディングフレームは、例えば、グロビンタンパク質（特に、ベータ−グロビン）、ルシフェラーゼタンパク質、ＧＦＰタンパク質、又はこれらの変異体（例えば、グロビンタンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、又はＧＦＰタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を示す変異体）からなる群から選択されるレポータータンパク質をコードしていないことが好ましい。したがって、オープンリーディングフレームは、ＧＦＰタンパク質をコードしていないことが特に好ましい。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、レポーター遺伝子をコードしてもおらず、レポーター遺伝子に由来してもおらず、前記レポーター遺伝子が、好ましくは、グロビンタンパク質（特にベータ−グロビン）、ルシフェラーゼタンパク質、ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、及びＧＦＰタンパク質若しくはその変異体（好ましくはＥＧＦＰ）、又は典型的に、これらレポーター遺伝子のいずれか、好ましくはグロビンタンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、若しくはＧＦＰタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を示す上記遺伝子のいずれかの変異体からなる群からは選択されないことが特に好ましい。
【０１５８】
更により好ましくは、３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントは、本明細書に定義する人工核酸に含まれる任意の他のエレメントと異種である。例えば、本発明に係る人工核酸分子が所与の遺伝子由来の３’−ＵＴＲエレメントを含む場合、それは、その遺伝子のＯＲＦの５’末端及び３’末端における調節配列を含む、同じ遺伝子由来の任意の他の核酸配列、特に、機能的核酸配列（例えば、コード配列エレメント又は調節配列エレメント）を含まないことが好ましい。したがって、本発明に係る人工核酸分子が所与の遺伝子由来の５’−ＵＴＲエレメントを含む場合、それは、その遺伝子のＯＲＦの５’末端及び３’末端における調節配列を含む、同じ遺伝子由来の任意の他の核酸配列、特に、機能的核酸配列（例えば、コード配列エレメント又は調節配列エレメント）を含まないことが好ましい。
【０１５９】
更に、本発明に係る人工核酸は、少なくとも１つのオープンリーディングフレームと、少なくとも１つの３’−ＵＴＲ（エレメント）と、少なくとも１つの５’−ＵＴＲ（エレメント）とを含み、前記少なくとも１つの３’−ＵＴＲ（エレメント）が本発明に係る３’−ＵＴＲエレメントである、及び／又は前記少なくとも１つの５’−ＵＴＲ（エレメント）が本発明に係る５’−ＵＴＲエレメントであることが好ましい。少なくとも１つのオープンリーディングフレームと、少なくとも１つの３’−ＵＴＲ（エレメント）と、少なくとも１つの５’−ＵＴＲ（エレメント）とを含む本発明に係る好ましい人工核酸では、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム、少なくとも１つの３’−ＵＴＲ（エレメント）、及び少なくとも１つの５’−ＵＴＲ（エレメント）がそれぞれ異種である、即ち、前記少なくとも１つの３’−ＵＴＲ（エレメント）と前記少なくとも１つの５’−ＵＴＲ（エレメント）との組合せも、前記オープンリーディングフレームと前記３’−ＵＴＲ（エレメント）又は前記５’−ＵＴＲ（エレメント）との組合せも、自然界（天然）ではこの組合せで存在しないことが特に好ましい。これは、人工核酸分子が、ＯＲＦと、３’−ＵＴＲ（エレメント）と、５’−ＵＴＲ（エレメント）とを含み、これらが全て互いに異種である、例えば、それぞれが異なる遺伝子（並びにその５’−ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ）に由来する組み換え体であることを意味する。別の好ましい実施形態では、３’−ＵＴＲ（エレメント）は、ウイルス遺伝子の３’−ＵＴＲ（エレメント）に由来しないか、又はウイルス起源ではない。
【０１６０】
好ましくは、少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、ＯＲＦに機能的に連結している。これは、好ましくは、例えば、コードされているペプチド若しくはタンパク質の発現に対する増強若しくは安定化機能又は人工核酸分子に対する安定化機能等の機能を発揮することができるように、３’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントがＯＲＦに連結していることを意味する。好ましくは、ＯＲＦ及び３’−ＵＴＲエレメントは、５’→３’方向に連結される、及び／又は５’−ＵＴＲエレメント及びＯＲＦは、５’→３’方向に連結される。したがって、好ましくは、人工核酸分子は、一般的に、以下の構造：５’−［５’−ＵＴＲエレメント］−（任意の）−リンカー−ＯＲＦ−（任意の）−リンカー−［３’−ＵＴＲエレメント］−３’を含み、前記人工核酸分子は、５’−ＵＴＲエレメントのみを含んで３’−ＵＴＲエレメントを含んでいなくてもよく、３’−ＵＴＲエレメントのみを含んで５’−ＵＴＲエレメントを含んでいなくてもよく、又は３’−ＵＴＲエレメント及び５’−ＵＴＲエレメントの両方を含んでいてもよい。更に、リンカーは、存在していても存在していなくてもよい。例えば、リンカーは、１以上の制限酵素認識部位（制限酵素部位）を含むか又はからなる一続きの１ヌクレオチド〜５０ヌクレオチド又は１ヌクレオチド〜２０ヌクレオチド等、１以上のヌクレオチドであってよい。
【０１６１】
好ましくは、少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、ＺＮＦ４６０、ＴＧＭ２、ＩＬ７Ｒ、ＢＧＮ、ＴＫ１、ＲＡＢ３Ｂ、ＣＢＸ６、ＦＺＤ２、ＣＯＬ８Ａ１、ＮＤＵＦＳ７、ＰＨＧＤＨ、ＰＬＫ２、ＴＳＰＯ、ＰＴＧＳ１、ＦＢＸＯ３２、ＮＩＤ２、ＡＴＰ５Ｄ、ＥＸＯＳＣ４、ＮＯＬ９、ＵＢＢ４Ｂ、ＶＰＳ１８、ＯＲＭＤＬ２、ＦＳＣＮ１、ＴＭＥＭ３３、ＴＵＢＡ４Ａ、ＥＭＰ３、ＴＭＥＭ２０１、ＣＲＩＰ２、ＢＲＡＴ１、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＣＤ９、ＤＰＹＳＬ２、ＣＤＫ９、ＴＦＲＣ、ＰＳＭＢ３  ５’−ＵＴＲ、ＦＡＳＮ、ＰＳＭＢ６、ＰＲＳＳ５６、ＫＰＮＡ６、ＳＦＴ２Ｄ２、ＰＡＲＤ６Ｂ、ＬＰＰ、ＳＰＡＲＣ、ＳＣＡＮＤ１、ＶＡＳＮ、ＳＬＣ２６Ａ１、ＬＣＬＡＴ１、ＦＢＸＬ１８、ＳＬＣ３５Ｆ６、ＲＡＢ３Ｄ、ＭＡＰ１Ｂ、ＶＭＡ２１、ＣＹＢＡ、ＳＥＺ６Ｌ２、ＰＣＯＬＣＥ、ＶＴＮ、ＡＬＤＨ１６Ａ１、ＲＡＶＥＲ１、ＫＰＮＡ６、ＳＥＲＩＮＣ５、ＪＵＰ、ＣＰＮ２、ＣＲＩＰ２、ＥＰＴ１、ＰＮＰＯ、ＳＳＳＣＡ１、ＰＯＬＲ２Ｌ、ＬＩＮ７Ｃ、ＵＱＣＲ１０、ＰＹＣＲＬ、ＡＭＮ、ＭＡＰ１Ｓ、ＮＤＵＦＳ７、ＰＨＧＤＨ、ＴＳＰＯ、ＡＴＰ５Ｄ、ＥＸＯＳＣ４、ＴＵＢＢ４Ｂ、ＴＵＢＡ４Ａ、ＥＭＰ３、ＣＲＩＰ２、ＢＲＡＴ１、ＣＤ９、ＣＤＫ９、ＰＳＭＢ３、ＰＳＭＢ６、ＰＲＳＳ５６、ＳＣＡＮＤ１、ＡＭＮ、ＣＹＢＡ、ＰＣＯＬＣＥ、ＭＡＰ１Ｓ、ＶＴＮ、ＡＬＤＨ１６Ａ１（いずれも好ましくはヒト）、及びＤｐｙｓｌ２、Ｃｃｎｄ１、Ａｃｏｘ２、Ｃｂｘ６、Ｕｂｃ、Ｌｄｌｒ、Ｎｕｄｔ２２、Ｐｃｙｏｘ１ｌ、Ａｎｋｒｄ１、Ｔｍｅｍ３７、Ｔｓｐｙｌ４、Ｓｌｃ７ａ３、Ｃｓｔ６、Ａａｃｓ、Ｎｏｓｉｐ、Ｉｔｇａ７、Ｃｃｎｄ２、Ｅｂｐ、Ｓｆ３ｂ５、Ｆａｓｎ、Ｈｍｇｃｓ１、Ｏｓｒ１、Ｌｍｎｂ１、Ｖｍａ２１、Ｋｉｆ２０ａ、Ｃｄｃａ８、Ｓｌｃ７ａ１、Ｕｂｑｌｎ２、Ｐｒｐｓ２、Ｓｈｍｔ２、Ａｕｒｋｂ、Ｆｉｇｎｌ１、Ｃａｄ、Ａｎｌｎ、Ｓｌｆｎ９、Ｎｃａｐｈ、Ｐｏｌｅ、Ｕｈｒｆ１、Ｇｊａ１、Ｆａｍ６４ａ、Ｋｉｆ２ｃ、Ｔｓｐａｎ１０、Ｓｃａｎｄ１、Ｇｐｒ８４、Ｆａｄｓ３、Ｃｅｒｓ６、Ｃｘｃｒ４、Ｇｐｒｃ５ｃ、Ｆｅｎ１、Ｃｓｐｇ４、Ｍｒｐｌ３４、Ｃｏｍｔｄ１、Ａｒｍｃ６、Ｅｍｒ４、Ａｔｐ５ｄ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ、Ｃｓｆ２ｒａ、Ａａｒｓｄ１、Ｋｉｆ２２、Ｃｔｈ、Ｔｐｇｓ１、Ｃｃｌ１７、Ａｌｋｂｈ７、Ｍｓ４ａ８ａ、Ａｃｏｘ２、Ｕｂｃ、Ｓｌｐｉ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ、Ｉｇｆ２ｂｐ１、Ｔｍｅｍ３７、Ｓｌｃ７ａ３、Ｃｓｔ６、Ｅｂｐ、Ｓｆ３ｂ５、Ｐｌｋ１、Ｃｄｃａ８、Ｋｉｆ２２、Ｃａｄ、Ｃｔｈ、Ｐｏｌｅ、Ｋｉｆ２ｃ、Ｓｃａｎｄ１、Ｇｐｒ８４、Ｔｐｇｓ１、Ｃｃｌ１７、Ａｌｋｂｈ７、Ｍｓ４ａ８ａ、Ｍｒｐｌ３４、Ｃｏｍｔｄ１、Ａｒｍｃ６、Ａｔｐ５ｄ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ、Ｎｕｄｔ２２、Ａａｒｓｄ１（いずれも好ましくはマウス）からなる群から選択される遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる。
【０１６２】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲの「機能的断片」、「機能的変異体」、又は「変異体の機能的断片」を含むか又はからなる。
【０１６３】
好ましくは、少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、ＺＮＦ４６０−５’−ＵＴＲ、ＴＧＭ２−５’−ＵＴＲ、ＩＬ７Ｒ−５’−ＵＴＲ、ＢＧＮ−５’−ＵＴＲ、ＴＫ１−５’−ＵＴＲ、ＲＡＢ３Ｂ−５’−ＵＴＲ、ＣＢＸ６−５’−ＵＴＲ、ＦＺＤ２−５’−ＵＴＲ、ＣＯＬ８Ａ１−５’−ＵＴＲ、ＮＤＵＦＳ７−５’−ＵＴＲ、ＰＨＧＤＨ−５’−ＵＴＲ、ＰＬＫ２−５’−ＵＴＲ、ＴＳＰＯ−５’−ＵＴＲ、ＰＴＧＳ１−５’−ＵＴＲ、ＦＢＸＯ３２−５’−ＵＴＲ、ＮＩＤ２−５’−ＵＴＲ、ＡＴＰ５Ｄ−５’−ＵＴＲ、ＥＸＯＳＣ４−５’−ＵＴＲ、ＮＯＬ９−５’−ＵＴＲ、ＵＢＢ４Ｂ−５’−ＵＴＲ、ＶＰＳ１８−５’−ＵＴＲ、ＯＲＭＤＬ２−５’−ＵＴＲ、ＦＳＣＮ１−５’−ＵＴＲ、ＴＭＥＭ３３−５’−ＵＴＲ、ＴＵＢＡ４Ａ−５’−ＵＴＲ、ＥＭＰ３−５’−ＵＴＲ、ＴＭＥＭ２０１−５’−ＵＴＲ、ＣＲＩＰ２−５’−ＵＴＲ、ＢＲＡＴ１−５’−ＵＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＨ１−５’−ＵＴＲ、ＣＤ９−５’−ＵＴＲ、ＤＰＹＳＬ２−５’−ＵＴＲ、ＣＤＫ９−５’−ＵＴＲ、ＴＦＲＣ−５’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ３  ５’−ＵＴＲ、ＦＡＳＮ−５’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ６−５’−ＵＴＲ、ＰＲＳＳ５６−５’−ＵＴＲ、ＫＰＮＡ６−５’−ＵＴＲ、ＳＦＴ２Ｄ２−５’−ＵＴＲ、ＰＡＲＤ６Ｂ−５’−ＵＴＲ、ＬＰＰ−５’−ＵＴＲ、ＳＰＡＲＣ−５’−ＵＴＲ、ＳＣＡＮＤ１−５’−ＵＴＲ、ＶＡＳＮ−５’−ＵＴＲ、ＳＬＣ２６Ａ１−５’−ＵＴＲ、ＬＣＬＡＴ１−５’−ＵＴＲ、ＦＢＸＬ１８−５’−ＵＴＲ、ＳＬＣ３５Ｆ６−５’−ＵＴＲ、ＲＡＢ３Ｄ−５’−ＵＴＲ、ＭＡＰ１Ｂ−５’−ＵＴＲ、ＶＭＡ２１−５’−ＵＴＲ、ＣＹＢＡ−５’−ＵＴＲ、ＳＥＺ６Ｌ２−５’−ＵＴＲ、ＰＣＯＬＣＥ−５’−ＵＴＲ、ＶＴＮ−５’−ＵＴＲ、ＡＬＤＨ１６Ａ１−５’−ＵＴＲ、ＲＡＶＥＲ１−５’−ＵＴＲ、ＫＰＮＡ６−５’−ＵＴＲ、ＳＥＲＩＮＣ５−５’−ＵＴＲ、ＪＵＰ−５’−ＵＴＲ、ＣＰＮ２−５’−ＵＴＲ、ＣＲＩＰ２−５’−ＵＴＲ、ＥＰＴ１−５’−ＵＴＲ、ＰＮＰＯ−５’−ＵＴＲ、ＳＳＳＣＡ１−５’−ＵＴＲ、ＰＯＬＲ２Ｌ−５’−ＵＴＲ、ＬＩＮ７Ｃ−５’−ＵＴＲ、ＵＱＣＲ１０−５’−ＵＴＲ、ＰＹＣＲＬ−５’−ＵＴＲ、ＡＭＮ−５’−ＵＴＲ、ＭＡＰ１Ｓ−５’−ＵＴＲ（いずれも好ましくはヒト）及びＤｐｙｓｌ２−５’−ＵＴＲ、Ｃｃｎｄ１−５’−ＵＴＲ、Ａｃｏｘ２−５’−ＵＴＲ、Ｃｂｘ６−５’−ＵＴＲ、Ｕｂｃ−５’−ＵＴＲ、Ｌｄｌｒ−５’−ＵＴＲ、Ｎｕｄｔ２２−５’−ＵＴＲ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ−５’−ＵＴＲ、Ａｎｋｒｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｔｍｅｍ３７−５’−ＵＴＲ、Ｔｓｐｙｌ４−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ３−５’−ＵＴＲ、Ｃｓｔ６−５’−ＵＴＲ、Ａａｃｓ−５’−ＵＴＲ、Ｎｏｓｉｐ−５’−ＵＴＲ、Ｉｔｇａ７−５’−ＵＴＲ、Ｃｃｎｄ２−５’−ＵＴＲ、Ｅｂｐ−５’−ＵＴＲ、Ｓｆ３ｂ５−５’−ＵＴＲ、Ｆａｓｎ−５’−ＵＴＲ、Ｈｍｇｃｓ１−５’−ＵＴＲ、Ｏｓｒ１−５’−ＵＴＲ、Ｌｍｎｂ１−５’−ＵＴＲ、Ｖｍａ２１−５’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２０ａ−５’−ＵＴＲ、Ｃｄｃａ８−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ１−５’−ＵＴＲ、Ｕｂｑｌｎ２−５’−ＵＴＲ、Ｐｒｐｓ２−５’−ＵＴＲ、Ｓｈｍｔ２���５’−ＵＴＲ、Ａｕｒｋｂ−５’−ＵＴＲ、Ｆｉｇｎｌ１−５’−ＵＴＲ、Ｃａｄ−５’−ＵＴＲ、Ａｎｌｎ−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｆｎ９−５’−ＵＴＲ、Ｎｃａｐｈ−５’−ＵＴＲ、Ｐｏｌｅ−５’−ＵＴＲ、Ｕｈｒｆ１−５’−ＵＴＲ、Ｇｊａ１−５’−ＵＴＲ、Ｆａｍ６４ａ−５’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２ｃ−５’−ＵＴＲ、Ｔｓｐａｎ１０−５’−ＵＴＲ、Ｓｃａｎｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｇｐｒ８４−５’−ＵＴＲ、Ｆａｄｓ３−５’−ＵＴＲ、Ｃｅｒｓ６−５’−ＵＴＲ、Ｃｘｃｒ４−５’−ＵＴＲ、Ｇｐｒｃ５ｃ−５’−ＵＴＲ、Ｆｅｎ１−５’−ＵＴＲ、Ｃｓｐｇ４−５’−ＵＴＲ、Ｍｒｐｌ３４−５’−ＵＴＲ、Ｃｏｍｔｄ１−５’−ＵＴＲ、Ａｒｍｃ６−５’−ＵＴＲ、Ｅｍｒ４−５’−ＵＴＲ、Ａｔｐ５ｄ−５’−ＵＴＲ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ−５’−ＵＴＲ、Ｃｓｆ２ｒａ−５’−ＵＴＲ、Ａａｒｓｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２２−５’−ＵＴＲ、Ｃｔｈ−５’−ＵＴＲ、Ｔｐｇｓ１−５’−ＵＴＲ、Ｃｃｌ１７−５’−ＵＴＲ、Ａｌｋｂｈ７−５’−ＵＴＲ、Ｍｓ４ａ８ａ−５’−ＵＴＲ（いずれも好ましくはマウス）からなる群から選択される遺伝子の転写物の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含む。
【０１６４】
好ましくは、少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、ＮＤＵＦＳ７−３’−ＵＴＲ、ＰＨＧＤＨ−３’−ＵＴＲ、ＴＳＰＯ−３’−ＵＴＲ、ＡＴＰ５Ｄ−３’−ＵＴＲ、ＥＸＯＳＣ４−３’−ＵＴＲ、ＴＵＢＢ４Ｂ−３’−ＵＴＲ、ＴＵＢＡ４Ａ−３’−ＵＴＲ、ＥＭＰ３−３’−ＵＴＲ、ＣＲＩＰ２−３’−ＵＴＲ、ＢＲＡＴ１−３’−ＵＴＲ、ＣＤ９−３’−ＵＴＲ、ＣＤＫ９−３’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ３−３’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ６−３’−ＵＴＲ、ＰＲＳＳ５６−３’−ＵＴＲ、ＳＣＡＮＤ１−３’−ＵＴＲ、ＡＭＮ−３’−ＵＴＲ、ＣＹＢＡ−３’−ＵＴＲ、ＰＣＯＬＣＥ−３’−ＵＴＲ、ＭＡＰ１Ｓ−３’−ＵＴＲ、ＶＴＮ−３’−ＵＴＲ、ＡＬＤＨ１６Ａ１−３’−ＵＴＲ（いずれも好ましくはヒト）及びＡｃｏｘ２−３’−ＵＴＲ、Ｕｂｃ−３’−ＵＴＲ、Ｓｌｐｉ−３’−ＵＴＲ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ−３’−ＵＴＲ、Ｉｇｆ２ｂｐ１−３’−ＵＴＲ、Ｔｍｅｍ３７−３’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ３−３’−ＵＴＲ、Ｃｓｔ６−３’−ＵＴＲ、Ｅｂｐ−３’−ＵＴＲ、Ｓｆ３ｂ５−３’−ＵＴＲ、Ｐｌｋ１−３’−ＵＴＲ、Ｃｄｃａ８−３’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２２−３’−ＵＴＲ、Ｃａｄ−３’−ＵＴＲ、Ｃｔｈ−３’−ＵＴＲ、Ｐｏｌｅ−３’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２ｃ−３’−ＵＴＲ、Ｓｃａｎｄ１−３’−ＵＴＲ、Ｇｐｒ８４−３’−ＵＴＲ、Ｔｐｇｓ１−３’−ＵＴＲ、Ｃｃｌ１７−３’−ＵＴＲ、Ａｌｋｂｈ７−３’−ＵＴＲ、Ｍｓ４ａ８ａ−３’−ＵＴＲ、Ｍｒｐｌ３４−３’−ＵＴＲ、Ｃｏｍｔｄ１−３’−ＵＴＲ、Ａｒｍｃ６−３’−ＵＴＲ、Ａｔｐ５ｄ−３’−ＵＴＲ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ−３’−ＵＴＲ、Ｎｕｄｔ２２−３’−ＵＴＲ、Ａａｒｓｄ１−３’−ＵＴＲ（いずれも好ましくはマウス）からなる群から選択される遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる。
【０１６５】
また、本発明の人工核酸分子は、（ｉ）少なくとも１つの好ましい５’−ＵＴＲと（ｉ）少なくとも１つの好ましい３’−ＵＴＲの両方を含むことが好ましい。
【０１６６】
特に好ましい実施形態においては、少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、ＺＮＦ４６０−５’−ＵＴＲ、ＴＧＭ２−５’−ＵＴＲ、ＩＬ７Ｒ−５’−ＵＴＲ、ＣＯＬ８Ａ１−５’−ＵＴＲ、ＮＤＵＦＳ７−５’−ＵＴＲ、ＰＬＫ２−５’−ＵＴＲ、ＦＢＸＯ３２−５’−ＵＴＲ、ＡＴＰ５Ｄ−５’−ＵＴＲ、ＴＵＢＢ４Ｂ−５’−ＵＴＲ、ＯＲＭＤＬ２−５’−ＵＴＲ、ＦＳＣＮ１−５’−ＵＴＲ、ＣＤ９−５’−ＵＴＲ、ＰＹＳＬ２−５’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ３−５’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ６−５’−ＵＴＲ、ＫＰＮＡ６−５’−ＵＴＲ、ＳＦＴ２Ｄ２−５’−ＵＴＲ、ＬＣＬＡＴ１−５’−ＵＴＲ、ＦＢＸＬ１８−５’−ＵＴＲ、ＳＬＣ３５Ｆ６−５’−ＵＴＲ、ＶＭＡ２１−５’−ＵＴＲ、ＳＥＺ６Ｌ２−５’−ＵＴＲ、ＰＣＯＬＣＥ−５’−ＵＴＲ、ＶＴＮ−５’−ＵＴＲ、ＡＬＤＨ１６Ａ１−５’−ＵＴＲ、ＫＰＮＡ６−５’−ＵＴＲ、ＪＵＰ−５’−ＵＴＲ、ＣＰＮ２−５’−ＵＴＲ、ＰＮＰＯ−５’−ＵＴＲ、ＳＳＳＣＡ１−５’−ＵＴＲ、ＰＯＬＲ２Ｌ−５’−ＵＴＲ、ＬＩＮ７Ｃ−５’−ＵＴＲ、ＵＱＣＲ１０−５’−ＵＴＲ、ＰＹＣＲＬ−５’−ＵＴＲ、ＡＭＮ−５’−ＵＴＲ、ＭＡＰ１Ｓ−５’−ＵＴＲ（いずれもヒト）、Ｄｐｙｓｌ２−５’−ＵＴＲ、Ａｃｏｘ２−５’−ＵＴＲ、Ｕｂｃ−５’−ＵＴＲ、Ｎｕｄｔ２２−５’−ＵＴＲ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ−５’−ＵＴＲ、Ａｎｋｒｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｔｓｐｙｌ４−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ３−５’−ＵＴＲ、Ａａｃｓ−５’−ＵＴＲ、Ｎｏｓｉｐ−５’−ＵＴＲ、Ｉｔｇａ７−５’−ＵＴＲ、Ｃｃｎｄ２−５’−ＵＴＲ、Ｅｂｐ−５’−ＵＴＲ、Ｓｆ３ｂ５−５’−ＵＴＲ、Ｆａｓｎ−５’−ＵＴＲ、Ｈｍｇｃｓ１−５’−ＵＴＲ、Ｏｓｒ１−５’−ＵＴＲ、Ｌｍｎｂ１−５’−ＵＴＲ、Ｖｍａ２１−５’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２０ａ−５’−ＵＴＲ、Ｃｄｃａ８−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ１−５’−ＵＴＲ、Ｕｂｑｌｎ２−５’−ＵＴＲ、Ｐｒｐｓ２−５’−ＵＴＲ、Ｓｈｍｔ２−５’−ＵＴＲ、Ｆｉｇｎｌ１−５’−ＵＴＲ、Ｃａｄ−５’−ＵＴＲ、Ａｎｌｎ−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｆｎ９−５’−ＵＴＲ、Ｎｃａｐｈ−５’−ＵＴＲ、Ｐｏｌｅ−５’−ＵＴＲ、Ｕｈｒｆ１−５’−ＵＴＲ、Ｇｊａ１−５’−ＵＴＲ、Ｆａｍ６４ａ−５’−ＵＴＲ、Ｔｓｐａｎ１０−５’−ＵＴＲ、Ｓｃａｎｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｇｐｒ８４−５’−ＵＴＲ、Ｃｅｒｓ６−５’−ＵＴＲ、Ｃｘｃｒ４−５’−ＵＴＲ、Ｇｐｒｃ５ｃ−５’−ＵＴＲ、Ｆｅｎ１−５’−ＵＴＲ、Ｃｓｐｇ４−５’−ＵＴＲ、Ｍｒｐｌ３４−５’−ＵＴＲ、Ｃｏｍｔｄ１−５’−ＵＴＲ、Ａｒｍｃ６−５’−ＵＴＲ、Ｅｍｒ４−５’−ＵＴＲ、Ａｔｐ５ｄ−５’−ＵＴＲ、Ｃｓｆ２ｒａ−５’−ＵＴＲ、Ａａｒｓｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｃｔｈ−５’−ＵＴＲ、Ｔｐｇｓ１−５’−ＵＴＲ、Ｃｃｌ１７−５’−ＵＴＲ、Ａｌｋｂｈ７−５’−ＵＴＲ、Ｍｓ４ａ８ａ−５’−ＵＴＲ（いずれもマウス）からなる群から選択される遺伝子の転写物の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含む。係るＵＴＲエレメントは、高い翻訳効率に寄与することが示された。
【０１６７】
特に好ましい実施形態においては、少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、ＮＤＵＦＳ７−３’−ＵＴＲ、ＰＨＧＤＨ−３’−ＵＴＲ、ＴＳＰＯ−３’−ＵＴＲ、ＡＴＰ５Ｄ−３’−ＵＴＲ、ＥＸＯＳＣ４−３’−ＵＴＲ、ＴＵＢＢ４Ｂ−３’−ＵＴＲ、ＴＵＢＡ４Ａ−３’−ＵＴＲ、ＥＭＰ３−３’−ＵＴＲ、ＣＲＩＰ２−３’−ＵＴＲ、ＢＲＡＴ１−３’−ＵＴＲ、ＣＤ９−３’−ＵＴＲ、ＣＤＫ９−３’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ３−３’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ６−３’−ＵＴＲ、ＰＲＳＳ５６−３’−ＵＴＲ、ＳＣＡＮＤ１−３’−ＵＴＲ、ＡＭＮ−３’−ＵＴＲ、ＣＹＢＡ−３’−ＵＴＲ、ＰＣＯＬＣＥ−３’−ＵＴＲ、ＭＡＰ１Ｓ−３’−ＵＴＲ、ＶＴＮ−３’−ＵＴＲ、ＡＬＤＨ１６Ａ１−３’−ＵＴＲ（いずれも好ましくはヒト）及びＡｃｏｘ２−３’−ＵＴＲ、Ｕｂｃ−３’−ＵＴＲ、Ｓｌｐｉ−３’−ＵＴＲ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ−３’−ＵＴＲ、Ｉｇｆ２ｂｐ１−３’−ＵＴＲ、Ｔｍｅｍ３７−３’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ３−３’−ＵＴＲ、Ｃｓｔ６−３’−ＵＴＲ、Ｅｂｐ−３’−ＵＴＲ、Ｓｆ３ｂ５−３’−ＵＴＲ、Ｐｌｋ１−３’−ＵＴＲ、Ｃｄｃａ８−３’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２２−３’−ＵＴＲ、Ｃａｄ−３’−ＵＴＲ、Ｃｔｈ−３’−ＵＴＲ、Ｐｏｌｅ−３’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２ｃ−３’−ＵＴＲ、Ｓｃａｎｄ１−３’−ＵＴＲ、Ｇｐｒ８４−３’−ＵＴＲ、Ｔｐｇｓ１−３’−ＵＴＲ、Ｃｃｌ１７−３’−ＵＴＲ、Ａｌｋｂｈ７−３’−ＵＴＲ、Ｍｓ４ａ８ａ−３’−ＵＴＲ、Ｍｒｐｌ３４−３’−ＵＴＲ、Ｃｏｍｔｄ１−３’−ＵＴＲ、Ａｒｍｃ６−３’−ＵＴＲ、Ａｔｐ５ｄ−３’−ＵＴＲ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ−３’−ＵＴＲ、Ｎｕｄｔ２２−３’−ＵＴＲ、Ａａｒｓｄ１−３’−ＵＴＲ（いずれも好ましくはマウス）からなる群から選択される遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含む。係るＵＴＲエレメントは、高い翻訳効率に寄与することが示された。
【０１６８】
これらの特に好ましい実施形態は、本発明の人工核酸分子が、（ｉ）少なくとも１つの特に好ましい５’−ＵＴＲと（ｉ）少なくとも１つの特に好ましい３’−ＵＴＲの両方を含むように組み合わせることが可能である。
【０１６９】
語句「遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲに由来する核酸配列」は、好ましくは、遺伝子又はその断片若しくは一部、好ましくは、自然界に存在する遺伝子又はその断片若しくは一部の転写物の３’−ＵＴＲ配列及び／又は５’−ＵＴＲ配列に基づく核酸配列を指す。この状況において、自然界に存在するという用語は、野生型という用語と同義的に用いられる。この語句は、遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ配列全体及び／又は５’−ＵＴＲ配列全体、即ち、完全長３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ配列に対応する配列、並びに遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ配列及び／又は５’−ＵＴＲ配列の断片に対応する配列を含む。好ましくは、遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲの断片は、遺伝子の転写物の完全長３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を表す、遺伝子の転写物の完全長３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲにおける連続する一続きのヌクレオチドに対応する連続する一続きのヌクレオチドからなる。かかる断片は、本発明の意味において、好ましくは本明細書に記載する機能的断片である。好ましくは、前記断片は、３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ又はこれらの断片に連結されているＯＲＦを翻訳するための調節機能を保持している。
【０１７０】
用語「遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲの変異体及び／又は５’−ＵＴＲの変異体」及び「これらの変異体」は、遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲに関連して、自然界に存在する遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲの変異体、好ましくは、脊椎動物の遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲの変異体、より好ましくは、哺乳類の遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲの変異体、更により好ましくは、霊長類の遺伝子（具体的には、上記ヒト遺伝子）の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲの変異体を指す。かかる変異体は、遺伝子の転写物の改変された３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲであってもよい。例えば、変異体３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲの変異体は、その変異体が由来する自然界に存在する３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲに比べて、１以上のヌクレオチドの欠失、挿入、付加、及び／又は置換を示してよい。好ましくは、遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲの変異体及び／又は５’−ＵＴＲの変異体は、その変異体が由来する自然界に存在する３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲと少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一である。好ましくは、変異体は、本明細書に記載する機能的変異体である。
【０１７１】
語句「遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲの変異体及び／又は５’−ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列」は、好ましくは、遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ配列及び／又は５’−ＵＴＲの変異体、又は上記これらの断片若しくは一部に基づく核酸配列を指す。この語句は、遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲの変異体の配列全体、即ち、遺伝子の転写物の完全長変異体３’−ＵＴＲ配列及び／又は完全長変異体５’−ＵＴＲ配列に対応する配列、並びに遺伝子の転写物の変異体３’−ＵＴＲ配列の断片及び／又は変異体５’−ＵＴＲ配列の断片に対応する配列を含む。好ましくは、遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲの変異体の断片は、遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲの完全長変異体の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を表す、遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲの完全長変異体における連続する一続きのヌクレオチドに対応する連続する一続きのヌクレオチドからなる。かかる変異体の断片は、本発明の意味において、好ましくは本明細書に記載する変異体の機能的断片である。
【０１７２】
本発明の状況において、用語「機能的変異体」、「機能的断片」、及び「変異体の機能的断片」（「機能的変異体断片」とも呼ばれる）は、遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲの断片、３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲの変異体、又は３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲの変異体の断片が、前記変異体、前記断片、又は前記変異体の断片が由来する遺伝子の転写物の自然界に存在する３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲの少なくとも１つの機能、好ましくは１超の機能を発揮することを意味する。かかる機能は、例えば、好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）における、ｍＲＮＡの安定化、及び／又はｍＲＮＡからのタンパク質産生の増強、安定化及び／又は延長、及び／又はｍＲＮＡからのタンパク質発現若しくは全タンパク質産生の増加であってよい。好ましくは、３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲの機能は、ＯＲＦによってコードされているタンパク質の翻訳に関する。より好ましくは、前記機能は、３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ又はこれらの断片若しくは変異体に連結されているＯＲＦの翻訳効率を増強することを含む。本発明の状況における変異体、断片、及び変異体の断片は、以下の機能を発揮することが特に好ましい：好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）において、レファレンス３’−ＵＴＲ及び／又はレファレンス５’−ＵＴＲを含むか又は３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損しているｍＲＮＡに比べてｍＲＮＡを安定化させる機能、及び／又は好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）において、レファレンス３’−ＵＴＲ及び／又はレファレンス５’−ＵＴＲを含むか又は３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損しているｍＲＮＡに比べてｍＲＮＡからのタンパク質産生を増強、安定化及び／又は延長する機能、及び／又は好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）において、レファレンス３’−ＵＴＲ及び／又はレファレンス５’−ＵＴＲを含むか又は３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲが欠損しているｍＲＮＡに比べてｍＲＮＡからのタンパク質産生を増加させる機能。レファレンス３’−ＵＴＲ及び／又はレファレンス５’−ＵＴＲは、例えば、自然界においてＯＲＦと併存している３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲであってよい。更に、遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲの機能的変異体、機能的断片、又は機能的変異体断片は、これら変異体、断片、又は変異体断片が由来する野生型の３’−ＵＴＲ及び／又は野生型の５’−ＵＴＲに比べて、かかる３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲの変異体、断片、又は変異体断片を含むｍＲＮＡの翻訳効率を実質的に減じる効果を有しないことが好ましい。本発明の状況において、遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲの「機能的断片」、「機能的変異体」又は「変異体の機能的断片」の特に好ましい機能は、上記機能的断片、機能的変異体、又は変異体の機能的断片を有するｍＲＮＡの発現によるタンパク質産生の増強、安定化及び／又は延長である。
【０１７３】
好ましくは、機能的変異体、機能的断片、又は機能的変異体断片によって発揮される１以上の機能の効率、例えば、翻訳効率の提供は、前記変異体、前記断片、又は前記変異体断片が由来する遺伝子の転写物の自然界に存在する３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲによって発揮される翻訳効率に関して少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％増加する。
【０１７４】
本発明に関連して、遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲの断片、又は遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲの変異体の断片は、好ましくは、少なくとも約３ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約５ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長、少なくとも約１５ヌクレオチド長、少なくとも約２０ヌクレオチド長、少なくとも約２５ヌクレオチド長、又は少なくとも約３０ヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも約７０ヌクレオチド長を有する。好ましくは、遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲの断片、又は遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲの変異体の断片は、上記機能的断片である。好ましい実施形態では、遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ又はこれらの断片若しくは変異体は、３ヌクレオチド長〜約５００ヌクレオチド長、好ましくは５ヌクレオチド長〜約１５０ヌクレオチド長、より好ましくは１０ヌクレオチド長〜１００ヌクレオチド長、更により好ましくは１５ヌクレオチド長〜９０ヌクレオチド長、最も好ましくは２０ヌクレオチド長〜７０ヌクレオチド長を有する。典型的には、５’−ＵＴＲエレメント及び／又は３’−ＵＴＲエレメントは、５００ヌクレオチド未満、４００ヌクレオチド未満、３００ヌクレオチド未満、２００ヌクレオチド未満、１５０ヌクレオチド未満、又は１００ヌクレオチド未満であることを特徴とする。
【０１７５】
５’−ＵＴＲエレメント
好ましくは、少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、それぞれ、配列番号１〜１５１からなる群から選択される核酸配列、又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる、或いは少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、それぞれ、配列番号１〜１５１からなる群から選択される核酸配列、又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなる。
【０１７６】
以下に詳述される配列のうち、配列番号１〜１３６は、野生型５’−ＵＴＲ配列であると考えることができ、配列番号１３６〜１５１は、人工５’−ＵＴＲ配列であると考えることができる。
【化１−１】
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【化１−２】
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【化１−３】
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【化１−４】
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【化１−５】
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【化１−６】
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【化１−７】
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【化１−８】
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【化１−９】
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【化１−１０】
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【化１−１１】
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【化１−１２】
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【化１−１３】
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【化１−１４】
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【化１−１５】
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【化１−１６】
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【化１−１７】
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【化１−１８】
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【化１−１９】
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【化１−２０】
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【化１−２１】
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【化１−２２】
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【化１−２３】
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【化１−２４】
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【０１７７】
これら野生型５’−ＵＴＲエレメントの一部は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋによって識別されている公的に利用可能な５’−ＵＴＲ配列とは異なる。表１（実施例１）を参照。この表には、本発明者らによる配列決定結果が反映されている。
【０１７８】
したがって、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８４、配列番号８５、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０６、配列番号１０９、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１３１、配列番号１３５からなる群から選択される５’−ＵＴＲエレメントは、本発明によって与えられ、本発明の任意の態様において使用することができる。
【０１７９】
本発明において有用な人工５’−ＵＴＲエレメントの例
幾つかの実施形態では、本発明に係る５’−ＵＴＲエレメントは、野生型５’−ＵＴＲエレメントとは異なる。かかる５’−ＵＴＲエレメントは、「人工５’−ＵＴＲエレメント」と称される。
【０１８０】
人工５’−ＵＴＲエレメントは、（ａ）１００％未満であると同時に（Ｂ）１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超である、野生型５’−ＵＴＲエレメントに対する配列同一度を示し、かかる野生型５’−ＵＴＲエレメントは、配列番号１〜１３６からなる群から選択されることが好ましい。典型的には、人工５’−ＵＴＲエレメントは、野生型５’−ＵＴＲエレメントとは異なり、それは、少なくとも１個のヌクレオチド、例えば、２個のヌクレオチド、３個のヌクレオチド、４個のヌクレオチド、５個のヌクレオチド、６個のヌクレオチド、７個のヌクレオチド、８個のヌクレオチド、９個のヌクレオチド、１０個のヌクレオチド、又は１０個超のヌクレオチドが交換されている点に基づいている。例えば、野生型５’−ＵＴＲエレメントが不利であるとみなされるヌクレオチドエレメントを含む場合、かかるヌクレオチド交換を推奨することができる。例えば、幾つかの実施形態では、不利であるとみなされるヌクレオチドエレメントは、（ｉ）内部ＡＴＧトリプレット（即ち、本発明の核酸のオープンリーディングフレームの開始コドン以外のＡＴＧトリプレット）又は（ｉｉ）制限酵素認識部位（切断部位）、特に、本発明の人工核酸を作製（クローニング）するプロセスにおいて使用される制限酵素によって認識される（切断可能な）制限酵素認識部位（切断部位）から選択される。したがって、（それぞれの野生型塩基の交換、好ましくは置換において）特定の塩基を特異的に導入することが可能であり、その結果、人工５’−ＵＴＲエレメントは、不利であるとみなされるヌクレオチドエレメントを含有しなくなる。特定の実施形態では、人工５’−ＵＴＲエレメントは、配列番号１３７〜１５１からなる群から選択される。
【化２−１】
2018529329.tif 000029
【化２−２】
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【化２−３】
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【化２−４】
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【０１８１】
３’−ＵＴＲエレメント
好ましくは、少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、それぞれ配列番号１５２〜２０４又は対応するＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列からなる群から選択される核酸配列と少なくとも約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、又は約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなるか、或いは少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、それぞれ配列番号１５２〜２０４又は対応するＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列からなる群から選択される核酸配列と少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなる。
【０１８２】
以下に詳述する配列の中でも、配列番号１５２〜２０３は野生型３’−ＵＴＲ配列とみなすことができ、配列番号２０４は人工５’−ＵＴＲ配列とみなすことができる。
【化３−１】
2018529329.tif 000033
【化３−２】
2018529329.tif 000034
【化３−３】
2018529329.tif 000035
【化３−４】
2018529329.tif 000036
【化３−５】
2018529329.tif 000037
【化３−６】
2018529329.tif 000038
【化３−７】
2018529329.tif 000039
【化３−８】
2018529329.tif 000040
【化３−９】
2018529329.tif 000041
【化３−１０】
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【化３−１１】
2018529329.tif 000043
【０１８３】
これら野生型３’−ＵＴＲエレメントの一部は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋによって識別されている公的に利用可能な３’−ＵＴＲ配列とは異なる。表２（実施例１）を参照。この表には、本発明者らによる配列決定結果が反映されている。
【０１８４】
したがって、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１９７、配列番号２００からなる群から選択される３’−ＵＴＲエレメントは、本発明によって与えられ、本発明の任意の態様において使用することができる。
【０１８５】
本発明において有用な人工３’−ＵＴＲエレメントの例
幾つかの実施形態では、本発明に係る３’−ＵＴＲエレメントは、野生型３’−ＵＴＲエレメントとは異なる。かかる３’−ＵＴＲエレメントは、「人工３’−ＵＴＲエレメント」と称される。
【０１８６】
人工３’−ＵＴＲエレメントは、（ａ）１００％未満であると同時に（Ｂ）１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超である、野生型３’−ＵＴＲエレメントに対する配列同一度を示し、かかる野生型３’−ＵＴＲエレメントは、配列番号１５２〜２０３からなる群から選択されることが好ましい。典型的には、人工３’−ＵＴＲエレメントは、野生型３’−ＵＴＲエレメントとは異なり、それは、少なくとも１個のヌクレオチド、例えば、２個のヌクレオチド、３個のヌクレオチド、４個のヌクレオチド、５個のヌクレオチド、６個のヌクレオチド、７個のヌクレオチド、８個のヌクレオチド、９個のヌクレオチド、１０個のヌクレオチド、又は１０個超のヌクレオチドが交換されている点に基づいている。例えば、野生型３’−ＵＴＲエレメントが不利であるとみなされるヌクレオチドエレメントを含む場合、かかるヌクレオチド交換を推奨することができる。例えば、幾つかの実施形態では、不利であるとみなされるヌクレオチドエレメントは、制限酵素認識部位（切断部位）、特に、本発明の人工核酸を作製（クローニング）するプロセスにおいて使用される制限酵素によって認識される（切断可能な）制限酵素認識部位（切断部位）である。したがって、（それぞれの野生型塩基の交換、好ましくは置換において）特定の塩基を特異的に導入することが可能であり、その結果、人工３’−ＵＴＲエレメントは、不利であるとみなされるヌクレオチドエレメントを含有しなくなる。特定の実施形態では、人工３’−ＵＴＲエレメントは、配列番号２０４である。
【化４】
2018529329.tif 000044
【０１８７】
新規５’−ＵＴＲエレメント及び新規３’−ＵＴＲエレメント
また、本発明は、新規５’−ＵＴＲエレメント及び新規３’−ＵＴＲエレメント、即ち、それぞれヒト細胞及びマウス細胞で発現することが本発明者らによって見出されたが、公的なデータベースからは知られていない５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメントを提供する（実施例１を参照）。配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９からなる群から選択される任意の５’−ＵＴＲが、本発明の幾つかの実施形態において好ましい場合がある。配列番号７７、配列番号７９、配列番号８４、配列番号８５、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０６、配列番号１０９、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１３１、配列番号１３５からなる群から選択される任意の５’−ＵＴＲが、本発明の幾つかの実施形態において好ましい場合がある。配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１９７、配列番号２００からなる群から選択される任意の３’−ＵＴＲが、本発明の幾つかの実施形態において好ましい場合がある。
【０１８８】
５’−ＵＴＲエレメント及び好ましい３’−ＵＴＲエレメントの説明
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、ＮＤＵＦＳ７−３’−ＵＴＲ、ＰＨＧＤＨ−３’−ＵＴＲ、ＴＳＰＯ−３’−ＵＴＲ、ＡＴＰ５Ｄ−３’−ＵＴＲ、ＥＸＯＳＣ４−３’−ＵＴＲ、ＴＵＢＢ４Ｂ−３’−ＵＴＲ、ＴＵＢＡ４Ａ−３’−ＵＴＲ、ＥＭＰ３−３’−ＵＴＲ、ＣＲＩＰ２−３’−ＵＴＲ、ＢＲＡＴ１−３’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ３−３’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ６−３’−ＵＴＲ、ＳＣＡＮＤ１−３’−ＵＴＲ、ＡＭＮ−３’−ＵＴＲ、ＣＹＢＡ−３’−ＵＴＲ、ＰＣＯＬＣＥ−３’−ＵＴＲ、ＭＡＰ１Ｓ−３’−ＵＴＲ、ＶＴＮ−３’−ＵＴＲ、ＡＬＤＨ１６Ａ１−３’−ＵＴＲ（いずれもヒト）、Ａｃｏｘ２−３’−ＵＴＲ、Ｕｂｃ−３’−ＵＴＲ、Ｓｌｐｉ−３’−ＵＴＲ、Ｉｇｆ２ｂｐ１−３’−ＵＴＲ、Ｔｍｅｍ３７−３’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ３−３’−ＵＴＲ、Ｃｓｔ６−３’−ＵＴＲ、Ｅｂｐ−３’−ＵＴＲ、Ｓｆ３ｂ５−３’−ＵＴＲ、Ｃｄｃａ８−３’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２２−３’−ＵＴＲ、Ｃａｄ−３’−ＵＴＲ、Ｐｏｌｅ−３’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２ｃ−３’−ＵＴＲ、Ｓｃａｎｄ１−３’−ＵＴＲ、Ｇｐｒ８４−３’−ＵＴＲ、Ｔｐｇｓ１−３’−ＵＴＲ、Ｃｃｌ１７−３’−ＵＴＲ、Ａｌｋｂｈ７−３’−ＵＴＲ、Ｍｓ４ａ８ａ−３’−ＵＴＲ、Ｍｒｐｌ３４−３’−ＵＴＲ、Ｃｏｍｔｄ１−３’−ＵＴＲ、Ａｒｍｃ６−３’−ＵＴＲ、Ａｔｐ５ｄ−３’−ＵＴＲ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ−３’−ＵＴＲ、Ｎｕｄｔ２２−３’−ＵＴＲ（いずれもマウス）からなる群から選択される遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは１００％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる。最も好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、それぞれ、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号２０４（又は配列番号１９２）、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号１７７からなる群から選択される配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは１００％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる。
【０１８９】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、ＺＮＦ４６０−５’−ＵＴＲ、ＴＧＭ２−５’−ＵＴＲ、ＩＬ７Ｒ−５’−ＵＴＲ、ＣＯＬ８Ａ１−５’−ＵＴＲ、ＮＤＵＦＳ７−５’−ＵＴＲ、ＰＬＫ２−５’−ＵＴＲ、ＦＢＸＯ３２−５’−ＵＴＲ、ＡＴＰ５Ｄ−５’−ＵＴＲ、ＴＵＢＢ４Ｂ−５’−ＵＴＲ、ＯＲＭＤＬ２−５’−ＵＴＲ、ＦＳＣＮ１−５’−ＵＴＲ、ＣＤ９−５’−ＵＴＲ、ＰＹＳＬ２−５’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ３−５’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ６−５’−ＵＴＲ、ＫＰＮＡ６−５’−ＵＴＲ、ＳＦＴ２Ｄ２−５’−ＵＴＲ、ＬＣＬＡＴ１−５’−ＵＴＲ、ＦＢＸＬ１８−５’−ＵＴＲ、ＳＬＣ３５Ｆ６−５’−ＵＴＲ、ＶＭＡ２１−５’−ＵＴＲ、ＳＥＺ６Ｌ２−５’−ＵＴＲ、ＰＣＯＬＣＥ−５’−ＵＴＲ、ＶＴＮ−５’−ＵＴＲ、ＡＬＤＨ１６Ａ１−５’−ＵＴＲ、ＫＰＮＡ６−５’−ＵＴＲ、ＪＵＰ−５’−ＵＴＲ、ＣＰＮ２−５’−ＵＴＲ、ＰＮＰＯ−５’−ＵＴＲ、ＳＳＳＣＡ１−５’−ＵＴＲ、ＰＯＬＲ２Ｌ−５’−ＵＴＲ、ＬＩＮ７Ｃ−５’−ＵＴＲ、ＵＱＣＲ１０−５’−ＵＴＲ、ＰＹＣＲＬ−５’−ＵＴＲ、ＡＭＮ−５’−ＵＴＲ、ＭＡＰ１Ｓ−５’−ＵＴＲ（いずれもヒト）、Ｄｐｙｓｌ２−５’−ＵＴＲ、Ａｃｏｘ２−５’−ＵＴＲ、Ｕｂｃ−５’−ＵＴＲ、Ｎｕｄｔ２２−５’−ＵＴＲ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ−５’−ＵＴＲ、Ａｎｋｒｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｔｓｐｙｌ４−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ３−５’−ＵＴＲ、Ａａｃｓ−５’−ＵＴＲ、Ｎｏｓｉｐ−５’−ＵＴＲ、Ｉｔｇａ７−５’−ＵＴＲ、Ｃｃｎｄ２−５’−ＵＴＲ、Ｅｂｐ−５’−ＵＴＲ、Ｓｆ３ｂ５−５’−ＵＴＲ、Ｆａｓｎ−５’−ＵＴＲ、Ｈｍｇｃｓ１−５’−ＵＴＲ、Ｏｓｒ１−５’−ＵＴＲ、Ｌｍｎｂ１−５’−ＵＴＲ、Ｖｍａ２１−５’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２０ａ−５’−ＵＴＲ、Ｃｄｃａ８−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ１−５’−ＵＴＲ、Ｕｂｑｌｎ２−５’−ＵＴＲ、Ｐｒｐｓ２−５’−ＵＴＲ、Ｓｈｍｔ２−５’−ＵＴＲ、Ｆｉｇｎｌ１−５’−ＵＴＲ、Ｃａｄ−５’−ＵＴＲ、Ａｎｌｎ−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｆｎ９−５’−ＵＴＲ、Ｎｃａｐｈ−５’−ＵＴＲ、Ｐｏｌｅ−５’−ＵＴＲ、Ｕｈｒｆ１−５’−ＵＴＲ、Ｇｊａ１−５’−ＵＴＲ、Ｆａｍ６４ａ−５’−ＵＴＲ、Ｔｓｐａｎ１０−５’−ＵＴＲ、Ｓｃａｎｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｇｐｒ８４−５’−ＵＴＲ、Ｃｅｒｓ６−５’−ＵＴＲ、Ｃｘｃｒ４−５’−ＵＴＲ、Ｇｐｒｃ５ｃ−５’−ＵＴＲ、Ｆｅｎ１−５’−ＵＴＲ、Ｃｓｐｇ４−５’−ＵＴＲ、Ｍｒｐｌ３４−５’−ＵＴＲ、Ｃｏｍｔｄ１−５’−ＵＴＲ、Ａｒｍｃ６−５’−ＵＴＲ、Ｅｍｒ４−５’−ＵＴＲ、Ａｔｐ５ｄ−５’−ＵＴＲ、Ｃｓｆ２ｒａ−５’−ＵＴＲ、Ａａｒｓｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｃｔｈ−５’−ＵＴＲ、Ｔｐｇｓ１−５’−ＵＴＲ、Ｃｃｌ１７−５’−ＵＴＲ、Ａｌｋｂｈ７−５’−ＵＴＲ、Ｍｓ４ａ８ａ−５’−ＵＴＲ（いずれもマウス）の転写物の５’−ＵＴＲ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは１００％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる。最も好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号１３７（又は配列番号３）、配列番号１３８（又は配列番号９）、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１４０（又は配列番号１７）、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号１４３（又は配列番号３１）、配列番号３２、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４４、配列番号４５、配列番号１４６（又は配列番号５２）、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５７、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号１４４（又は配列番号４２）、配列番号５８、配列番号６２、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１４７（又は配列番号１０９）、配列番号１４８（又は配列番号１１０）、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１４９（又は配列番号１１９）、配列番号１２３、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１５１（又は配列番号１３６）、配列番号９６、配列番号１１１、配列番号１５０（配列番号１２０に基づく）、配列番号１２１、配列番号１２４、配列番号１２５に係る配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは１００％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる。
【０１９０】
また、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲの核酸配列、例えば、配列番号１５２〜２０４に係る配列の３’−ＵＴＲに対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは１００％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなっていてよく、前記断片は、好ましくは、上記機能的断片又は機能的変異体断片である。かかる断片は、好ましくは、少なくとも約３ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約５ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長、少なくとも約１５ヌクレオチド長、少なくとも約２０ヌクレオチド長、少なくとも約２５ヌクレオチド長、又は少なくとも約３０ヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも約７０ヌクレオチド長を有する。好ましい実施形態では、これらの断片又は変異体は、３ヌクレオチド長〜約５００ヌクレオチド長、好ましくは５ヌクレオチド長〜約１５０ヌクレオチド長、より好ましくは１０ヌクレオチド長〜１００ヌクレオチド長、更により好ましくは１５ヌクレオチド長〜９０ヌクレオチド長、最も好ましくは２０ヌクレオチド長〜７０ヌクレオチド長を有する。好ましくは、前記変異体、断片、又は変異体断片は、３’−ＵＴＲの機能的変異体、機能的断片、又は機能的変異体断片であり、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号２０４（又は配列番号１９２）、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号１７７からなる群から選択される核酸配列を含む人工核酸分子が示すタンパク質産生延長効率の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の効率で本発明に係る人工核酸分子からのタンパク質産生を延長する。
【０１９１】
また、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、遺伝子の転写物の５’−ＵＴＲの核酸配列、例えば、配列番号１〜１５１に係る配列の５’−ＵＴＲに対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは１００％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなっていてよく、前記断片は、好ましくは、上記機能的断片又は機能的変異体断片である。かかる断片は、好ましくは、少なくとも約３ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約５ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長、少なくとも約１５ヌクレオチド長、少なくとも約２０ヌクレオチド長、少なくとも約２５ヌクレオチド長、又は少なくとも約３０ヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも約７０ヌクレオチド長を有する。好ましい実施形態では、これらの断片又は変異体は、３ヌクレオチド長〜約５００ヌクレオチド長、好ましくは５ヌクレオチド長〜約１５０ヌクレオチド長、より好ましくは１０ヌクレオチド長〜１００ヌクレオチド長、更により好ましくは１５ヌクレオチド長〜９０ヌクレオチド長、最も好ましくは２０ヌクレオチド長〜７０ヌクレオチド長を有する。好ましくは、前記変異体、断片、又は変異体断片は、５’−ＵＴＲの機能的変異体、機能的断片、又は機能的変異体断片であり、配列番号１、配列番号２、配列番号１３７（又は配列番号３）、配列番号１３８（又は配列番号９）、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１４０（又は配列番号１７）、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号１４３（又は配列番号３１）、配列番号３２、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４４、配列番号４５、配列番号１４６（又は配列番号５２）、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５７、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号１４４（又は配列番号４２）、配列番号５８、配列番号６２、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１４７（又は配列番号１０９）、配列番号１４８（又は配列番号１１０）、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１４９（又は配列番号１１９）、配列番号１２３、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１５１（又は配列番号１３６）、配列番号９６、配列番号１１１、配列番号１５０（配列番号１２０に基づく）、配列番号１２１、配列番号１２４、配列番号１２５からなる群から選択される核酸配列を含む人工核酸分子が示すタンパク質産生増加効率の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の効率で本発明に係る人工核酸分子からのタンパク質産生を増加させる。
【０１９２】
更なる好ましい実施形態
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、少なくとも約３ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約５ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長、少なくとも約１５ヌクレオチド長、少なくとも約２０ヌクレオチド長、少なくとも約２５ヌクレオチド長、又は少なくとも約３０ヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも約７０ヌクレオチド長を有する。少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントの長さの上限は、５００ヌクレオチド長以下、例えば、４００ヌクレオチド長、３００ヌクレオチド長、２００ヌクレオチド長、１５０ヌクレオチド長、又は１００ヌクレオチド長であってよい。他の実施形態では、上限は、５０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドの範囲内で選択してよい。例えば、これらの断片又は変異体は、３ヌクレオチド長〜約５００ヌクレオチド長、好ましくは５ヌクレオチド長〜１５０ヌクレオチド長、より好ましくは１０ヌクレオチド長〜１００ヌクレオチド長、更により好ましくは１５ヌクレオチド長〜９０ヌクレオチド長、最も好ましくは２０ヌクレオチド長〜７０ヌクレオチド長を有し得る。
【０１９３】
また、人工核酸分子に含まれるＵＴＲエレメントは、本明細書に提供される配列番号１〜２０４から選択される任意の配列よりも短いが、それでも配列番号１〜２０４から選択されるそれぞれの配列任意の配列と７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上の同一度を共有している連続配列を含む（又はからなる）ことが好ましい場合もある。かかる場合、好ましくは、置換するＵＴＲエレメントは、配列番号１〜２０４から選択される任意の配列と全長に亘って同一である連続配列を含むが、置換するＵＴＲエレメントは、より短い、例えば、それ以外は同一であり、配列番号１〜２０４から選択される配列の全長に対して７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上の長さを有する。
【０１９４】
更に、本発明に係る人工核酸分子は、上記の通り、１超の３’−ＵＴＲエレメント及び／又は１超の５’−ＵＴＲエレメントを含んでいてよい。例えば、本発明に係る人工核酸分子は、１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上の３’−ＵＴＲエレメント、及び／又は１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上の５’−ＵＴＲエレメントを含んでいてよく、個々の３’−ＵＴＲエレメントは、同じであっても異なっていてもよく、同様に、個々の５’−ＵＴＲエレメントは、同じであっても異なっていてもよい。例えば、本発明に係る人工核酸分子は、上記の通り２つの本質的に同一の３’−ＵＴＲエレメントを含んでいてよく、例えば、２つの３’−ＵＴＲエレメントは、上記の通り、遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ、例えば、配列番号１５２〜２０４に係る配列に由来する核酸配列、又は遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲの断片若しくは変異体、これらの機能的変異体、これらの機能的断片、若しくはこれらの機能的変異体断片に由来する核酸配列を含むか又はからなる。したがって、例えば、本発明に係る人工核酸分子は、上記の通り２つの本質的に同一の５’−ＵＴＲエレメントを含んでいてよく、例えば、２つの５’−ＵＴＲエレメントは、上記の通り、遺伝子の転写物の５’−ＵＴＲ、例えば、配列番号１〜１５１に係る配列に由来する核酸配列、又は遺伝子の転写物の５’−ＵＴＲの断片若しくは変異体、これらの機能的変異体、これらの機能的断片、若しくはこれらの機能的変異体断片に由来する核酸配列を含むか又はからなる。
【０１９５】
驚くべきことに、本発明者らは、上記３’−ＵＴＲエレメント及び／又は上記５’−ＵＴＲエレメントを含む人工核酸分子は、高い翻訳効率を示すｍＲＮＡ分子を表し得るか又は提供し得ることを見出した。したがって、本明細書に記載の３’−ＵＴＲエレメント及び／又は本明細書に記載の５’−ＵＴＲエレメントは、ｍＲＮＡ分子の翻訳効率を改善し得る。
【０１９６】
特に、本発明に係る人工核酸分子は、（ｉ）高い翻訳効率を示す少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントを含んでいてよい；（ｉｉ）高い翻訳効率を示す少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントを含んでいてよいが、高い翻訳効率を示す５’−ＵＴＲエレメントは含まない；或いは（ｉｉｉ）高い翻訳効率を示す少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントを含んでいてよいが、高い翻訳効率を示す３’−ＵＴＲエレメントは含まない。
【０１９７】
しかし、特に（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の場合（（ｉ）の場合もあり得る）、本発明に係る人工核酸分子は、１以上の「更なる３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメント」、即ち、上記の要件を満たさない３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントを更に含んでいてもよい。例えば、本発明に係る３’−ＵＴＲエレメント、即ち、前記人工核酸分子に高い翻訳効率を与える３’−ＵＴＲエレメントを含む本発明に係る人工核酸分子は、任意の更なる３’−ＵＴＲ及び／又は任意の更なる５’−ＵＴＲ、特に、更なる５’−ＵＴＲ（例えば、５’−ＴＯＰ  ＵＴＲ）又は任意の他の５’−ＵＴＲ若しくは５’−ＵＴＲエレメントを更に含んでいてよい。同様に、例えば、本発明に係る５’−ＵＴＲエレメント、即ち、前記人工核酸分子に高い翻訳効率を与える５’−ＵＴＲエレメントを含む本発明に係る人工核酸分子は、任意の更なる３’−ＵＴＲ及び／又は任意の更なる５’−ＵＴＲ、特に、更なる３’−ＵＴＲ（例えば、アルブミン遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する３’−ＵＴＲ）、特に好ましくは、配列番号２０６若しくは２０７、特に配列番号２０７に係る配列を含む３’−ＵＴＲ、又は任意の他の３’−ＵＴＲ若しくは３’−ＵＴＲエレメントを更に含んでいてよい。
【０１９８】
高い翻訳効率を与える本発明の少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメント及び／又は本発明の少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントに加えて、本発明に係る人工核酸分子中に更なる３’−ＵＴＲ（エレメント）及び／又は更なる５’−ＵＴＲ（エレメント）が存在する場合、更なる５’−ＵＴＲ（エレメント）及び／又は更なる３’−ＵＴＲ（エレメント）は、本発明の３’−ＵＴＲエレメント及び／又は本発明の５’−ＵＴＲエレメントと相互作用し得るので、それぞれ、本発明の３’−ＵＴＲエレメント及び／又は本発明の５’−ＵＴＲエレメントの翻訳効率効果を支援する。かかる更なる３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ（エレメント）は、安定性及び翻訳効率を更に支援し得る。更に、本発明の３’−ＵＴＲエレメント及び本発明の５’−ＵＴＲエレメントの両方が本発明に係る人工核酸分子中に存在する場合、本発明の５’−ＵＴＲエレメント及び本発明の３’−ＵＴＲエレメントの翻訳効率効果によって、好ましくは、相乗的に高い翻訳効率がもたらされる。
【０１９９】
好ましくは、更なる３’−ＵＴＲは、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、及びコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、コラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）からなる群から選択される遺伝子の３’−ＵＴＲ、又はその開示が参照によって本明細書に援用される国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１３６９〜１３９０に係るアルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、及びコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、コラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）からなる群から選択される遺伝子の３’−ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる。特に好ましい実施形態では、更なる３’−ＵＴＲは、アルブミン遺伝子、好ましくは脊椎動物のアルブミン遺伝子、より好ましくは哺乳類のアルブミン遺伝子、最も好ましくは配列番号２０６に係るヒトアルブミン遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる：
【化５】
2018529329.tif 000045
【０２００】
別の特に好ましい実施形態では、更なる３’−ＵＴＲは、α−グロビン遺伝子、好ましくは、脊椎動物のα−又はβ−グロビン遺伝子、より好ましくは哺乳類のα−又はβ−グロビン遺伝子、最も好ましくは国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１３７０（ヒトヘモグロビンアルファ１（ＨＢＡ１）の３’−ＵＴＲ）に係る、又は国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１３７１（ヒトヘモグロビンアルファ２（ＨＢＡ２）の３’−ＵＴＲ）に係る、及び／又は国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１３７２（ヒトヘモグロビンベータ（ＨＢＢ）の３’−ＵＴＲ）に係るヒトのα−又はβ−グロビン遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる。
【０２０１】
例えば、更なる３’−ＵＴＲは、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１３９３に係るα−グロビン遺伝子の３’−ＵＴＲの中心α−複合体結合部分を含み得るか又はなり得る。
【０２０２】
この状況では、本発明の核酸分子は、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１３６９〜１３９０に係る核酸に由来する更なる３’−ＵＴＲ、又はその断片、ホモログ、若しくは変異体を含むことが特に好ましい。
【０２０３】
最も好ましくは、更なる３’−ＵＴＲは、配列番号２０７に係るヒトアルブミン遺伝子の断片に由来する核酸配列を含む：
【化６】
2018529329.tif 000046
【０２０４】
この状況では、本発明の人工核酸分子の更なる３’−ＵＴＲは、配列番号２０７に係る核酸配列又は対応するＲＮＡ配列を含む又はからなることが特に好ましい。
【０２０５】
幾つかの実施形態では、更なる３’−ＵＴＲは、好ましくは国際公開第２０１５／１０１４１４号又は国際公開第２０１５／１０１４１５号（これらの開示は参照によって本明細書に援用される）に記載されているリボソームタンパク質をコードしている遺伝子に由来する核酸配列を含むか又はからなる。
【０２０６】
また、更なる３’−ＵＴＲは、リボソームタンパク質をコードしている遺伝子に由来する核酸配列を含んでいてもよく、からなっていてもよく、したがって、更なる３’−ＵＴＲが由来し得るリボソームタンパク質をコードしている遺伝子としては、リボソームタンパク質Ｌ９（ＲＰＬ９）、リボソームタンパク質Ｌ３（ＲＰＬ３）、リボソームタンパク質Ｌ４（ＲＰＬ４）、リボソームタンパク質Ｌ５（ＲＰＬ５）、リボソームタンパク質Ｌ６（ＲＰＬ６）、リボソームタンパク質Ｌ７（ＲＰＬ７）、リボソームタンパク質Ｌ７ａ（ＲＰＬ７Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ１１（ＲＰＬ１１）、リボソームタンパク質Ｌ１２（ＲＰＬ１２）、リボソームタンパク質Ｌ１３（ＲＰＬ１３）、リボソームタンパク質Ｌ２３（ＲＰＬ２３）、リボソームタンパク質Ｌ１８（ＲＰＬ１８）、リボソームタンパク質Ｌ１８ａ（ＲＰＬ１８Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ１９（ＲＰＬ１９）、リボソームタンパク質Ｌ２１（ＲＰＬ２１）、リボソームタンパク質Ｌ２２（ＲＰＬ２２）、リボソームタンパク質Ｌ２３ａ（ＲＰＬ２３Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ１７（ＲＰＬ１７）、リボソームタンパク質Ｌ２４（ＲＰＬ２４）、リボソームタンパク質Ｌ２６（ＲＰＬ２６）、リボソームタンパク質Ｌ２７（ＲＰＬ２７）、リボソームタンパク質Ｌ３０（ＲＰＬ３０）、リボソームタンパク質Ｌ２７ａ（ＲＰＬ２７Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ２８（ＲＰＬ２８）、リボソームタンパク質Ｌ２９（ＲＰＬ２９）、リボソームタンパク質Ｌ３１（ＲＰＬ３１）、リボソームタンパク質Ｌ３２（ＲＰＬ３２）、リボソームタンパク質Ｌ３５ａ（ＲＰＬ３５Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ３７（ＲＰＬ３７）、リボソームタンパク質Ｌ３７ａ（ＲＰＬ３７Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ３８（ＲＰＬ３８）、リボソームタンパク質Ｌ３９（ＲＰＬ３９）、リボソームタンパク質、ラージ、Ｐ０（ＲＰＬＰ０）、リボソームタンパク質、ラージ、Ｐ１（ＲＰＬＰ１）、リボソームタンパク質、ラージ、Ｐ２（ＲＰＬＰ２）、リボソームタンパク質Ｓ３（ＲＰＳ３）、リボソームタンパク質Ｓ３Ａ（ＲＰＳ３Ａ）、リボソームタンパク質Ｓ４、Ｘ連鎖（ＲＰＳ４Ｘ）、リボソームタンパク質Ｓ４、Ｙ連鎖１（ＲＰＳ４Ｙ１）、リボソームタンパク質Ｓ５（ＲＰＳ５）、リボソームタンパク質Ｓ６（ＲＰＳ６）、リボソームタンパク質Ｓ７（ＲＰＳ７）、リボソームタンパク質Ｓ８（ＲＰＳ８）、リボソームタンパク質Ｓ９（ＲＰＳ９）、リボソームタンパク質Ｓ１０（ＲＰＳ１０）、リボソームタンパク質Ｓ１１（ＲＰＳ１１）、リボソームタンパク質Ｓ１２（ＲＰＳ１２）、リボソームタンパク質Ｓ１３（ＲＰＳ１３）、リボソームタンパク質Ｓ１５（ＲＰＳ１５）、リボソームタンパク質Ｓ１５ａ（ＲＰＳ１５Ａ）、リボソームタンパク質Ｓ１６（ＲＰＳ１６）、リボソームタンパク質Ｓ１９（ＲＰＳ１９）、リボソームタンパク質Ｓ２０（ＲＰＳ２０）、リボソームタンパク質Ｓ２１（ＲＰＳ２１）、リボソームタンパク質Ｓ２３（ＲＰＳ２３）、リボソームタンパク質Ｓ２５（ＲＰＳ２５）、リボソームタンパク質Ｓ２６（ＲＰＳ２６）、リボソームタンパク質Ｓ２７（ＲＰＳ２７）、リボソームタンパク質Ｓ２７ａ（ＲＰＳ２７ａ）、リボソームタンパク質Ｓ２８（ＲＰＳ２８）、リボソームタンパク質Ｓ２９（ＲＰＳ２９）、リボソームタンパク質Ｌ１５（ＲＰＬ１５）、リボソームタンパク質Ｓ２（ＲＰＳ２）、リボソームタンパク質Ｌ１４（ＲＰＬ１４）、リボソームタンパク質Ｓ１４（ＲＰＳ１４）、リボソームタンパク質Ｌ１０（ＲＰＬ１０）、リボソームタンパク質Ｌ１０ａ（ＲＰＬ１０Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ３５（ＲＰＬ３５）、リボソームタンパク質Ｌ１３ａ（ＲＰＬ１３Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ３６（ＲＰＬ３６）、リボソームタンパク質Ｌ３６ａ（ＲＰＬ３６Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ４１（ＲＰＬ４１）、リボソームタンパク質Ｓ１８（ＲＰＳ１８）、リボソームタンパク質Ｓ２４（ＲＰＳ２４）、リボソームタンパク質Ｌ８（ＲＰＬ８）、リボソームタンパク質Ｌ３４（ＲＰＬ３４）、リボソームタンパク質Ｓ１７（ＲＰＳ１７）、リボソームタンパク質ＳＡ（ＲＰＳＡ）、ユビキチンＡ−５２残基リボソームタンパク質融合生成物１（ＵＢＡ５２）、遍在的に発現するＦｉｎｋｅｌ−Ｂｉｓｋｉｓ−Ｒｅｉｌｌｙマウス肉腫ウイルス（ＦＢＲ−ＭｕＳＶ）（ＦＡＵ）、リボソームタンパク質Ｌ２２様１（ＲＰＬ２２Ｌ１）、リボソームタンパク質Ｓ１７（ＲＰＳ１７）、リボソームタンパク質Ｌ３９様（ＲＰＬ３９Ｌ）、リボソームタンパク質Ｌ１０様（ＲＰＬ１０Ｌ）、リボソームタンパク質Ｌ３６ａ様（ＲＰＬ３６ＡＬ）、リボソームタンパク質Ｌ３様（ＲＰＬ３Ｌ）、リボソームタンパク質Ｓ２７様（ＲＰＳ２７Ｌ）、リボソームタンパク質Ｌ２６様１（ＲＰＬ２６Ｌ１）、リボソームタンパク質Ｌ７様１（ＲＰＬ７Ｌ１）、リボソームタンパク質Ｌ１３ａシュードジーン（ＲＰＬ１３ＡＰ）、リボソームタンパク質Ｌ３７ａシュードジーン８（ＲＰＬ３７ＡＰ８）、リボソームタンパク質Ｓ１０シュードジーン５（ＲＰＳ１０Ｐ５）、リボソームタンパク質Ｓ２６シュードジーン１１（ＲＰＳ２６Ｐ１１）、リボソームタンパク質Ｌ３９シュードジーン５（ＲＰＬ３９Ｐ５）、リボソームタンパク質、ラージ、Ｐ０シュードジーン６（ＲＰＬＰ０Ｐ６）、及びリボソームタンパク質Ｌ３６シュードジーン１４（ＲＰＬ３６Ｐ１４）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０７】
好ましくは、更なる５’−ＵＴＲが、ＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来するか、又はＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲの断片、ホモログ、若しくは変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる。
【０２０８】
５’−ＵＴＲエレメントは、上に定義した通りＴＯＰモチーフも５’ＴＯＰも含まないことが特に好ましい。特に、ＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲは、ＴＯＰモチーフが欠損しているＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲであることが好ましい。
【０２０９】
ＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列は、真核生物のＴＯＰ遺伝子、好ましくは、植物又は動物のＴＯＰ遺伝子、より好ましくは、脊索動物のＴＯＰ遺伝子、更により好ましくは、脊椎動物のＴＯＰ遺伝子、最も好ましくは、哺乳類のＴＯＰ遺伝子（例えば、ヒトのＴＯＰ遺伝子）に由来する。
【０２１０】
例えば、更なる５’−ＵＴＲエレメントは、好ましくは、その開示が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、及び配列番号１４２２からなる群から選択される核酸配列；国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、及び配列番号１４２２のホモログ；これらの変異体；又は好ましくは、対応するＲＮＡ配列に由来する核酸配列を含むか又はからなる５’−ＵＴＲエレメントから選択される。「国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、及び配列番号１４２２のホモログ」という用語は、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、及び配列番号１４２２に係る配列に対して相同である、ヒト以外の種の配列を指す。
【０２１１】
好ましい実施形態では、更なる５’−ＵＴＲは、５位ヌクレオチド（即ち、配列において５位に位置するヌクレオチド）から（配列の３’末端に位置する）開始コドンの直ぐ５’側のヌクレオチド位置（例えば、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、及び配列番号１４２２；国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、及び配列番号１４２２のホモログ；これらの変異体；又は対応するＲＮＡ配列から選択される核酸配列のＡＴＧ配列の直ぐ５’側のヌクレオチド位置）まで延在する核酸配列に由来する核酸配列を含むか又はからなる。更なる５’−ＵＴＲは、５’ＴＯＰの直ぐ３’側のヌクレオチド位置から（配列の３’末端に位置する）開始コドンの直ぐ５’側のヌクレオチド位置（例えば、（例えば、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、及び配列番号１４２２から選択される核酸配列；国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、及び配列番号１４２２のホモログ；これらの変異体；又は対応するＲＮＡ配列のＡＴＧ配列の直ぐ５’側のヌクレオチド位置）まで延在する核酸配列に由来することが特に好ましい。
【０２１２】
特に好ましい実施形態では、更なる５’−ＵＴＲは、リボソームタンパク質をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲ又はリボソームタンパク質をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる。例えば、５’−ＵＴＲエレメントは、好ましくは５’ＴＯＰモチーフが欠損している、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１７０、２３２、２４４、２５９、１２８４、１２８５、１２８６、１２８７、１２８８、１２８９、１２９０、１２９１、１２９２、１２９３、１２９４、１２９５、１２９６、１２９７、１２９８、１２９９、１３００、１３０１、１３０２、１３０３、１３０４、１３０５、１３０６、１３０７、１３０８、１３０９、１３１０、１３１１、１３１２、１３１３、１３１４、１３１５、１３１６、１３１７、１３１８、１３１９、１３２０、１３２１、１３２２、１３２３、１３２４、１３２５、１３２６、１３２７、１３２８、１３２９、１３３０、１３３１、１３３２、１３３３、１３３４、１３３５、１３３６、１３３７、１３３８、１３３９、１３４０、１３４１、１３４２、１３４３、１３４４、１３４６、１３４７、１３４８、１３４９、１３５０、１３５１、１３５２、１３５３、１３５４、１３５５、１３５６、１３５７、１３５８、１３５９、又は１３６０のいずれかに係る核酸配列の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列、対応するＲＮＡ配列、これらのホモログ、又は本明細書に記載のこれらの変異体を含むか又はからなる。上記の通り、５位から（配列の３’末端に位置する）ＡＴＧの直ぐ５’側のヌクレオチドまで延在する配列は、前記配列の５’−ＵＴＲに相当する。
【０２１３】
好ましくは、更なる５’−ＵＴＲは、リボソームラージタンパク質（ＲＰＬ）をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲ又はリボソームラージタンパク質（ＲＰＬ）をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲのホモログ若しくは変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる。例えば、５’−ＵＴＲエレメントは、好ましくは５’ＴＯＰモチーフが欠損している、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号６７、２５９、１２８４〜１３１８、１３４４、１３４６、１３４８〜１３５４、１３５７、１３５８、１４２１、及び１４２２のいずれかに係る核酸配列、対応するＲＮＡ配列、これらのホモログ、又は本明細書に記載するこれらの変異体の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる。
【０２１４】
特に好ましい実施形態では、５’−ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質ラージ３２遺伝子、好ましくは、脊椎動物リボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子、より好ましくは、哺乳類リボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子、最も好ましくは、ヒトリボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子の５’−ＵＴＲ、又はリボソームタンパク質ラージ３２遺伝子、好ましくは、脊椎動物リボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子、より好ましくは、哺乳類リボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子、最も好ましくは、ヒトリボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子の５’−ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなり、好ましくは、更なる５’−ＵＴＲは、前記遺伝子の５’ＴＯＰを含まない。
【０２１５】
したがって、特に好ましい実施形態では、更なる５’−ＵＴＲは、配列番号２０８に係る核酸配列（５’末端オリゴピリミジン領域が欠損しているヒトリボソームタンパク質ラージ３２の５’−ＵＴＲ：ＧＧＣＧＣＴＧＣＣＴＡＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＣＧＧＣＡＴＣ（配列番号２０８）；国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１３６８に対応）、又は好ましくは、対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる、或いは、更なる５’−ＵＴＲは、配列番号２０８に係る核酸配列、又はより好ましくは対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなり、好ましくは、前記断片は、上記の通りである、即ち、完全長５’−ＵＴＲの少なくとも２０％等を表す連続する一続きのヌクレオチドである。好ましくは、前記断片は、少なくとも約２０ヌクレオチド長以上、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド長以上、より好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチド長以上を有する。好ましくは、前記断片は、本明細書に記載する機能的断片である。
【０２１６】
幾つかの実施形態では、人工核酸分子は、ＲＰＳＡ、ＲＰＳ２、ＲＰＳ３、ＲＰＳ３Ａ、ＲＰＳ４、ＲＰＳ５、ＲＰＳ６、ＲＰＳ７、ＲＰＳ８、ＲＰＳ９、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１１、ＲＰＳ１２、ＲＰＳ１３、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１５、ＲＰＳ１５Ａ、ＲＰＳ１６、ＲＰＳ１７、ＲＰＳ１８、ＲＰＳ１９、ＲＰＳ２０、ＲＰＳ２１、ＲＰＳ２３、ＲＰＳ２４、ＲＰＳ２５、ＲＰＳ２６、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ２７Ａ、ＲＰＳ２８、ＲＰＳ２９、ＲＰＳ３０、ＲＰＬ３、ＲＰＬ４、ＲＰＬ５、ＲＰＬ６、ＲＰＬ７、ＲＰＬ７Ａ、ＲＰＬ８、ＲＰＬ９、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ１０Ａ、ＲＰＬ１１、ＲＰＬ１２、ＲＰＬ１３、ＲＰＬ１３Ａ、ＲＰＬ１４、ＲＰＬ１５、ＲＰＬ１７、ＲＰＬ１８、ＲＰＬ１８Ａ、ＲＰＬ１９、ＲＰＬ２１、ＲＰＬ２２、ＲＰＬ２３、ＲＰＬ２３Ａ、ＲＰＬ２４、ＲＰＬ２６、ＲＰＬ２７、ＲＰＬ２７Ａ、ＲＰＬ２８、ＲＰＬ２９、ＲＰＬ３０、ＲＰＬ３１、ＲＰＬ３２、ＲＰＬ３４、ＲＰＬ３５、ＲＰＬ３５Ａ、ＲＰＬ３６、ＲＰＬ３６Ａ、ＲＰＬ３７、ＲＰＬ３７Ａ、ＲＰＬ３８、ＲＰＬ３９、ＲＰＬ４０、ＲＰＬ４１、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＬＰ２、ＲＰＬＰ３、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＬＰ２、ＥＥＦ１Ａ１、ＥＥＦ１Ｂ２、ＥＥＦ１Ｄ、ＥＥＦ１Ｇ、ＥＥＦ２、ＥＩＦ３Ｅ、ＥＩＦ３Ｆ、ＥＩＦ３Ｈ、ＥＩＦ２Ｓ３、ＥＩＦ３Ｃ、ＥＩＦ３Ｋ、ＥＩＦ３ＥＩＰ、ＥＩＦ４Ａ２、ＰＡＢＰＣ１、ＨＮＲＮＰＡ１、ＴＰＴ１、ＴＵＢＢ１、ＵＢＡ５２、ＮＰＭ１、ＡＴＰ５Ｇ２、ＧＮＢ２Ｌ１、ＮＭＥ２、ＵＱＣＲＢ又はこれらのホモログ若しくは変異体から選択される脊椎動物のＴＯＰ遺伝子（例えば、ヒト等の哺乳類のＴＯＰ遺伝子）の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる更なる５’−ＵＴＲを含み、好ましくは、前記更なる５’−ＵＴＲは、前記遺伝子のＴＯＰモチーフも５’ＴＯＰも含まず、任意で、前記更なる５’−ＵＴＲは、その５’末端において、５’末端オリゴピリミジン領域（ＴＯＰ）の下流の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０に位置するヌクレオチドで始まり、更に、任意で、ＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する前記更なる５’−ＵＴＲは、その３’末端において、それが由来する遺伝子の開始コドン（Ａ（Ｕ／Ｔ）Ｇ）の上流の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０に位置するヌクレオチドで終結する。
【０２１７】
特定の実施形態では、更なる５’−ＵＴＲは、その開示が参照によって本明細書に援用される国際公開第２０１６／１０７８７７に記載されている５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる。
【０２１８】
本発明に係る人工核酸分子は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ又はウイルスＲＮＡ又はレプリコン）、ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡプラスミド又はウイルスＤＮＡ）であってもよく、改変されたＲＮＡ又はＤＮＡ分子であってもよい。それは、例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖を有する二本鎖分子として、例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖を有するＤＮＡ分子として提供され得る。
【０２１９】
本発明に係る人工核酸分子は、更に、任意で５’−キャップを含んでいてよい。任意の５’−キャップは、好ましくは、本発明に係る人工核酸分子内のＯＲＦの５’側、より好ましくは、少なくとも１つの５’−ＵＴＲ又は任意の更なる５’−ＵＴＲの５’側に位置する。
【０２２０】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子は、ポリ（Ａ）配列及び／又はポリアデニル化シグナルを更に含む。好ましくは、任意のポリ（Ａ）配列は、少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント又は任意の更なる３’−ＵＴＲの３’側に位置し、より好ましくは、任意のポリ（Ａ）配列が、３’−ＵＴＲエレメントの３’末端に連結されている。直接連結されていてもよく、又は（例えば、１以上の制限酵素部位を含むか又はからなる１ヌクレオチド〜５０ヌクレオチド、好ましくは１ヌクレオチド〜２０ヌクレオチドのリンカーを介する等、一続きの２ヌクレオチド、４ヌクレオチド、６ヌクレオチド、８ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド等を介して）間接的に連結されていてもよい。しかし、本発明に係る人工核酸分子が３’−ＵＴＲを含まない場合、例えば、少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントしか含まない場合でさえも、好ましくは、依然としてポリ（Ａ）配列及び／又はポリアデニル化シグナルを含む。
【０２２１】
１つの実施形態では、任意のポリアデニル化シグナルは、３’−ＵＴＲエレメントの３’の下流に位置する。好ましくは、ポリアデニル化シグナルは、コンセンサス配列ＮＮ（Ｕ／Ｔ）ＡＮＡ（Ｎ＝Ａ又はＵ）、好ましくはＡＡ（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡ又はＡ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡを含む。かかるコンセンサス配列は、大部分の動物及び細菌の細胞系によって、例えば、ＣｓｔＦ、ＰＡＰ、ＰＡＢ２、ＣＦＩ及び／又はＣＦＩＩと協働する切断／ポリアデニル化特異性因子（ＣＰＳＦ）等のポリアデニル化因子によって認識され得る。好ましくは、ポリアデニル化シグナル、好ましくは、コンセンサス配列ＮＮＵＡＮＡは、３’−ＵＴＲエレメント、又は３’−ＵＴＲエレメントが存在しない場合はＯＲＦの３’末端の約５０ヌクレオチド未満下流、より好ましくは約３０塩基未満下流、最も好ましくは約２５塩基未満下流、例えば、２１塩基下流に位置する。
【０２２２】
３’−ＵＴＲエレメント（又はＯＲＦ）の下流にポリアデニル化シグナルを含む本発明に係る人工核酸分子（例えば、人工ＤＮＡ分子）の転写により、その３’−ＵＴＲエレメント（又はＯＲＦ）の下流にポリアデニル化シグナルを含有する未成熟ＲＮＡが得られる。
【０２２３】
次いで、適切な転写系を用いることにより、ポリ（Ａ）配列を未成熟ＲＮＡに結合させる。例えば、本発明の人工核酸分子は、上記３’−ＵＴＲエレメントとポリアデニル化シグナルとを含むＤＮＡ分子であってよく、このことにより、このＤＮＡ分子の転写時にＲＮＡがポリアデニル化され得る。したがって、得られるＲＮＡは、本発明の３’−ＵＴＲエレメントとそれに続くポリ（Ａ）配列との組合せを含んでいてよい。
【０２２４】
潜在的な転写系は、インビトロ転写系又は細胞転写系等である。したがって、本発明に係る人工核酸分子の転写、例えば、オープンリーディングフレームと、３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントと、任意でポリアデニル化シグナルとを含む人工核酸分子の転写により、オープンリーディングフレームと、３’−ＵＴＲエレメントと、任意でポリ（Ａ）配列とを含むｍＲＮＡ分子を得ることができる。
【０２２５】
したがって、本発明は、また、オープンリーディングフレームと、上記３’−ＵＴＲエレメント及び／又は上記５’−ＵＴＲエレメントと、任意でポリ（Ａ）配列とを含むｍＲＮＡ分子である人工核酸分子を提供する。
【０２２６】
別の実施形態では、本発明に係る人工核酸分子の３’−ＵＴＲは、ポリアデニル化シグナルもポリ（Ａ）配列も含まない。更に好ましくは、本発明に係る人工核酸分子は、ポリアデニル化シグナルもポリ（Ａ）配列も含まない。より好ましくは、人工核酸分子又は本発明の人工核酸分子の３’−ＵＴＲは、ポリアデニル化シグナルを含まず、特に、ポリアデニル化シグナルＡＡＵ／ＴＡＡＡを含まない。
【０２２７】
好ましい実施形態では、本発明は、オープンリーディングフレームと、上記配列番号１、配列番号２、配列番号１３７（又は配列番号３）、配列番号１３８（又は配列番号９）、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１４０（又は配列番号１７）、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号１４３（又は配列番号３１）、配列番号３２、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４４、配列番号４５、配列番号１４６（又は配列番号５２）、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５７、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号１４４（又は配列番号４２）、配列番号５８、配列番号６２、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１４７（又は配列番号１０９）、配列番号１４８（又は配列番号１１０）、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１４９（又は配列番号１１９）、配列番号１２３、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１５１（又は配列番号１３６）、配列番号９６、配列番号１１１、配列番号１５０（配列番号１２０に基づく）、配列番号１２１、配列番号１２４、配列番号１２５又はこれらの断片からなる群から選択されるＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列とを含む人工ＲＮＡ分子である人工核酸分子を提供する。更に、対応する人工ＤＮＡ分子も提供される。
【０２２８】
別の好ましい実施形態では、本発明は、オープンリーディングフレームと、配列番号１、配列番号２、配列番号１３７（又は配列番号３）、配列番号１３８（又は配列番号９）、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１４０（又は配列番号１７）、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号１４３（又は配列番号３１）、配列番号３２、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４４、配列番号４５、配列番号１４６（又は配列番号５２）、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５７、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号１４４（又は配列番号４２）、配列番号５８、配列番号６２、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１４７（又は配列番号１０９）、配列番号１４８（又は配列番号１１０）、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１４９（又は配列番号１１９）、配列番号１２３、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１５１（又は配列番号１３６）、配列番号９６、配列番号１１１、配列番号１５０（配列番号１２０に基づく）、配列番号１２１、配列番号１２４、配列番号１２５に係る配列からなる群から選択される配列とを含む人工ＤＮＡ分子である人工核酸分子を提供する。
【０２２９】
したがって、本発明は、高い翻訳効率によって特徴付けられるＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡ分子のテンプレートとして機能し得る人工核酸分子を提供する。言い換えれば、人工核酸分子は、ｍＲＮＡを産生するためのテンプレートとして用いることができるＤＮＡであってよい。得ることができるｍＲＮＡは、次いで、オープンリーディングフレームによってコードされている所望のペプチド又はタンパク質を産生するために翻訳され得る。人工核酸分子がＤＮＡである場合、例えば、インビトロ又はインビボでｍＲＮＡを継続して繰り返し産生するための二本鎖保管形態として用いてよい。したがって、インビトロとは、特に、（「生」）細胞及び／又は組織（生体の組織を含む）を指す。細胞は、特に、細胞株、初代細胞、組織又は被験体における細胞を含む。特定の実施形態では、細胞培養可能な細胞型が本発明に好適であり得る。哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞及びマウス細胞が特に好ましい。特に好ましい実施形態では、ヒト細胞株ＨｅＬａ、ＨＥＰＧ２、及びＵ−９３７、並びにマウス細胞株ＮＩＨ３Ｔ３、ＪＡＷＳＩＩ、及びＬ９２９が用いられる。更に、初代細胞が特に好ましく、特に好ましい実施形態では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）を用いてよい。細胞株の好ましいグループは、含む。
【０２３０】
或いは、被験体の組織を用いてもよい。
【０２３１】
１つの実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、ポリ（Ａ）配列を更に含む。例えば、ＯＲＦに続いて任意で３’ＵＴＲを含むＤＮＡ分子は、得られるｍＲＮＡにおいてポリ（Ａ）配列に転写され得る一続きのチミジンヌクレオチドを含有し得る。ポリ（Ａ）配列の長さは、変動してよい。例えば、ポリ（Ａ）配列は、約２０アデニンヌクレオチド〜約３００アデニンヌクレオチド、好ましくは約４０アデニンヌクレオチド〜約２００アデニンヌクレオチド、より好ましくは約５０アデニンヌクレオチド〜約１００アデニンヌクレオチド、例えば、約６０アデニンヌクレオチド、約７０アデニンヌクレオチド、約８０アデニンヌクレオチド、約９０アデニンヌクレオチド、又は約１００アデニンヌクレオチドの長さを有していてよい。最も好ましくは、本発明の核酸分子は、約６０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、最も好ましくは６４アデニンヌクレオチドのポリ（Ａ）配列を含む。
【０２３２】
人工ＲＮＡ分子は、必ずしもＤＮＡ前駆体から転写されることなしに一般的な化学合成法によってインビトロで得ることもできる。
【０２３３】
特に好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、５’から３’方向に、オープンリーディングフレームと、上記３’−ＵＴＲエレメントと、ポリ（Ａ）配列とを含むか、又は５’から３’方向に、上記５’−ＵＴＲエレメントと、オープンリーディングフレームと、ポリ（Ａ）配列とを含むＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡ分子である。
【０２３４】
好ましい実施形態では、オープンリーディングフレームは、本発明の人工核酸の３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントが由来する遺伝子とは異なる遺伝子に由来する。幾つかの更なる好ましい実施形態では、オープンリーディングフレームは、ＺＮＦ４６０、ＴＧＭ２、ＩＬ７Ｒ、ＢＧＮ、ＴＫ１、ＲＡＢ３Ｂ、ＣＢＸ６、ＦＺＤ２、ＣＯＬ８Ａ１、ＮＤＵＦＳ７、ＰＨＧＤＨ、ＰＬＫ２、ＴＳＰＯ、ＰＴＧＳ１、ＦＢＸＯ３２、ＮＩＤ２、ＡＴＰ５Ｄ、ＥＸＯＳＣ４、ＮＯＬ９、ＵＢＢ４Ｂ、ＶＰＳ１８、ＯＲＭＤＬ２、ＦＳＣＮ１、ＴＭＥＭ３３、ＴＵＢＡ４Ａ、ＥＭＰ３、ＴＭＥＭ２０１、ＣＲＩＰ２、ＢＲＡＴ１、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＣＤ９、ＤＰＹＳＬ２、ＣＤＫ９、ＴＦＲＣ、ＰＳＭＢ３、ＦＡＳＮ、ＰＳＭＢ６、ＰＲＳＳ５６、ＫＰＮＡ６、ＳＦＴ２Ｄ２、ＰＡＲＤ６Ｂ、ＬＰＰ、ＳＰＡＲＣ、ＳＣＡＮＤ１、ＶＡＳＮ、ＳＬＣ２６Ａ１、ＬＣＬＡＴ１、ＦＢＸＬ１８、ＳＬＣ３５Ｆ６、ＲＡＢ３Ｄ、ＭＡＰ１Ｂ、ＶＭＡ２１、ＣＹＢＡ、ＳＥＺ６Ｌ２、ＰＣＯＬＣＥ、ＶＴＮ、ＡＬＤＨ１６Ａ１、ＲＡＶＥＲ１、ＫＰＮＡ６、ＳＥＲＩＮＣ５、ＪＵＰ、ＣＰＮ２、ＣＲＩＰ２、ＥＰＴ１、ＰＮＰＯ、ＳＳＳＣＡ１、ＰＯＬＲ２Ｌ、ＬＩＮ７Ｃ、ＵＱＣＲ１０、ＰＹＣＲＬ、ＡＭＮ、ＭＡＰ１Ｓ、ＮＤＵＦＳ７、ＰＨＧＤＨ、ＴＳＰＯ、ＡＴＰ５Ｄ、ＥＸＯＳＣ４、ＴＵＢＢ４Ｂ、ＴＵＢＡ４Ａ、ＥＭＰ３、ＣＲＩＰ２、ＢＲＡＴ１、ＣＤ９、ＣＤＫ９、ＰＳＭＢ３、ＰＳＭＢ６、ＰＲＳＳ５６、ＳＣＡＮＤ１、ＡＭＮ、ＣＹＢＡ、ＰＣＯＬＣＥ、ＭＡＰ１Ｓ、ＶＴＮ、ＡＬＤＨ１６Ａ１（いずれも好ましくはヒト）及びＤｐｙｓｌ２、Ｃｃｎｄ１、Ａｃｏｘ２、Ｃｂｘ６、Ｕｂｃ、Ｌｄｌｒ、Ｎｕｄｔ２２、Ｐｃｙｏｘ１ｌ、Ａｎｋｒｄ１、Ｔｍｅｍ３７、Ｔｓｐｙｌ４、Ｓｌｃ７ａ３、Ｃｓｔ６、Ａａｃｓ、Ｎｏｓｉｐ、Ｉｔｇａ７、Ｃｃｎｄ２、Ｅｂｐ、Ｓｆ３ｂ５、Ｆａｓｎ、Ｈｍｇｃｓ１、Ｏｓｒ１、Ｌｍｎｂ１、Ｖｍａ２１、Ｋｉｆ２０ａ、Ｃｄｃａ８、Ｓｌｃ７ａ１、Ｕｂｑｌｎ２、Ｐｒｐｓ２、Ｓｈｍｔ２、Ａｕｒｋｂ、Ｆｉｇｎｌ１、Ｃａｄ、Ａｎｌｎ、Ｓｌｆｎ９、Ｎｃａｐｈ、Ｐｏｌｅ、Ｕｈｒｆ１、Ｇｊａ１、Ｆａｍ６４ａ、Ｋｉｆ２ｃ、Ｔｓｐａｎ１０、Ｓｃａｎｄ１、Ｇｐｒ８４、Ｆａｄｓ３、Ｃｅｒｓ６、Ｃｘｃｒ４、Ｇｐｒｃ５ｃ、Ｆｅｎ１、Ｃｓｐｇ４、Ｍｒｐｌ３４、Ｃｏｍｔｄ１、Ａｒｍｃ６、Ｅｍｒ４、Ａｔｐ５ｄ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ、Ｃｓｆ２ｒａ、Ａａｒｓｄ１、Ｋｉｆ２２、Ｃｔｈ、Ｔｐｇｓ１、Ｃｃｌ１７、Ａｌｋｂｈ７、Ｍｓ４ａ８ａ、Ａｃｏｘ２、Ｕｂｃ、Ｓｌｐｉ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ、Ｉｇｆ２ｂｐ１、Ｔｍｅｍ３７、Ｓｌｃ７ａ３、Ｃｓｔ６、Ｅｂｐ、Ｓｆ３ｂ５、Ｐｌｋ１、Ｃｄｃａ８、Ｋｉｆ２２、Ｃａｄ、Ｃｔｈ、Ｐｏｌｅ、Ｋｉｆ２ｃ、Ｓｃａｎｄ１、Ｇｐｒ８４、Ｔｐｇｓ１、Ｃｃｌ１７、Ａｌｋｂｈ７、Ｍｓ４ａ８ａ、Ｍｒｐｌ３４、Ｃｏｍｔｄ１、Ａｒｍｃ６、Ａｔｐ５ｄ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ、Ｎｕｄｔ２２、Ａａｒｓｄ１（いずれも好ましくはマウス）又はこれらの変異体からなる群から選択される遺伝子をコードしないが、但し、３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントは、配列番号１〜配列番号２０４に係る配列からなる群から選択される配列である。
【０２３５】
好ましい実施形態では、ＯＲＦは、ヒト又は植物、特にアラビドプシスのリボソームタンパク質をコードしておらず、特に、ヒトリボソームタンパク質Ｓ６（ＲＰＳ６）、ヒトリボソームタンパク質Ｌ３６ａ様（ＲＰＬ３６ＡＬ）、又はアラビドプシスリボソームタンパク質Ｓ１６（ＲＰＳ１６）をコードしていない。更に好ましい実施形態では、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、どんな起源であろうと、リボソームタンパク質Ｓ６（ＲＰＳ６）、リボソームタンパク質Ｌ３６ａ様（ＲＰＬ３６ＡＬ）、又はリボソームタンパク質Ｓ１６（ＲＰＳ１６）をコードしていない。
【０２３６】
１つの実施形態では、本発明は、オープンリーディングフレーム、好ましくは、３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントが由来する遺伝子とは異なる遺伝子に由来するオープンリーディングフレームと；配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号２０４（又は配列番号１９２）、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号１７７に係る配列からなる群から選択されるＤＮＡ配列に対して少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも９９％、更により好ましくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか又はからなる３’−ＵＴＲエレメント、及び／又は配列番号１、配列番号２、配列番号１３７（又は配列番号３）、配列番号１３８（又は配列番号９）、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１４０（又は配列番号１７）、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号１４３（又は配列番号３１）、配列番号３２、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４４、配列番号４５、配列番号１４６（又は配列番号５２）、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５７、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号１４４（又は配列番号４２）、配列番号５８、配列番号６２、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１４７（又は配列番号１０９）、配列番号１４８（又は配列番号１１０）、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１４９（又は配列番号１１９）、配列番号１２３、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１５１（又は配列番号１３６）、配列番号９６、配列番号１１１、配列番号１５０（配列番号１２０に基づく）、配列番号１２１、配列番号１２４、配列番号１２５に係る配列からなる群から選択されるＤＮＡ配列に対して少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも９９％、更により好ましくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか又はからなる５’−ＵＴＲエレメントと；ポリアデニル化シグナル及び／又はポリ（Ａ）配列とを含む人工ＤＮＡ分子を提供する。
【０２３７】
更に、本発明は、オープンリーディングフレーム、好ましくは、３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントが由来する遺伝子とは異なる遺伝子に由来するオープンリーディングフレームと；配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号２０４（又は配列番号１９２）、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号１７７に係る配列からなる群から選択されるＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも９９％、更により好ましくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか又はからなる３’−ＵＴＲエレメント、及び／又は配列番号１、配列番号２、配列番号１３７（又は配列番号３）、配列番号１３８（又は配列番号９）、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１４０（又は配列番号１７）、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号１４３（又は配列番号３１）、配列番号３２、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４４、配列番号４５、配列番号１４６（又は配列番号５２）、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５７、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号１４４（又は配列番号４２）、配列番号５８、配列番号６２、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１４７（又は配列番号１０９）、配列番号１４８（又は配列番号１１０）、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１４９（又は配列番号１１９）、配列番号１２３、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１５１（又は配列番号１３６）、配列番号９６、配列番号１１１、配列番号１５０（配列番号１２０に基づく）、配列番号１２１、配列番号１２４、配列番号１２５に係る配列からなる群から選択されるＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも９９％、更により好ましくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか又はからなる５’−ＵＴＲエレメントと；ポリアデニル化シグナル及び／又はポリ（Ａ）配列とを含む人工ＲＮＡ分子、好ましくは人工ｍＲＮＡ分子又は人工ウイルスＲＮＡ分子を提供する。
【０２３８】
本発明は、高い翻訳効率を特徴とし得る人工核酸分子（好ましくは、人工ｍＲＮＡ）を提供する。いかなる理論にも束縛されるものではないが、高い翻訳効率は、人工核酸分子（例えば、本発明に係る人工ｍＲＮＡ分子）の分解減少に起因している可能性がある。したがって、本発明の３’−ＵＴＲエレメント及び／又は本発明の５’−ＵＴＲエレメントは、人工核酸が分解及び崩壊するのを防ぐことができる。
【０２３９】
好ましくは、人工核酸分子は、更に、ヒストンステムループを含んでいてよい。したがって、本発明に係る人工核酸分子は、例えば、５’から３’方向に、ＯＲＦと、３’−ＵＴＲエレメントと、任意のヒストンステムループ配列と、任意のポリ（Ａ）配列若しくはポリアデニル化シグナルと、任意のポリ（Ｃ）配列とを含んでいてもよく、又は５’から３’方向に、５’−ＵＴＲエレメントと、ＯＲＦと、任意のヒストンステムループ配列と、任意のポリ（Ａ）配列若しくはポリアデニル化シグナルと、任意のポリ（Ｃ）配列とを含んでいてもよく、又は５’から３’方向に、５’−ＵＴＲエレメントと、ＯＲＦと、３’−ＵＴＲエレメントと、任意のヒストンステムループ配列と、任意のポリ（Ａ）配列若しくはポリアデニル化シグナルと、任意のポリ（Ｃ）配列とを含んでいてもよい。また、５’から３’方向に、ＯＲＦと、３’−ＵＴＲエレメントと、任意のポリ（Ａ）配列と、任意のポリ（Ｃ）配列と、任意のヒストンステムループ配列とを含んでいてもよく、又は５’から３’方向に、５’−ＵＴＲエレメントと、ＯＲＦと、任意のポリ（Ａ）配列と、任意のポリ（Ｃ）配列と、任意のヒストンステムループ配列とを含んでいてもよく、又は５’から３’方向に、５’−ＵＴＲエレメントと、ＯＲＦと、３’−ＵＴＲエレメントと、任意のポリ（Ａ）配列と、任意のポリ（Ｃ）配列と、任意のヒストンステムループ配列とを含んでいてもよい。
【０２４０】
好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、少なくとも１つのヒストンステムループを更に含む。
【０２４１】
かかるヒストンステムループ配列は、その開示が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１２／０１９７８０号に開示されているヒストンステムループ配列から選択することが好ましい。
【０２４２】
本発明において用いるのに好適なヒストンステムループ配列は、以下の式（Ｉ）又は（ＩＩ）のうちの少なくとも１つから選択することが好ましい：
式（Ｉ）（ステム境界エレメントを含まないステムループ配列）：
【化７】
2018529329.tif 000047
式（ＩＩ）（ステム境界エレメントを含むステムループ配列）：
【化８】
2018529329.tif 000048
（式中、
ステム１又はステム２の境界エレメントＮ１−６は、１個〜６個、好ましくは２個〜６個、より好ましくは２個〜５個、更により好ましくは３個〜５個、最も好ましくは４個〜５個、又は５個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、
ステム１［Ｎ０−２ＧＮ３−５］は、エレメントステム２に対して逆相補的であるか又は部分的に逆相補的であり、且つ５個〜７個のヌクレオチドの連続配列であり、
Ｎ０−２は、０個〜２個、好ましくは０個〜１個、より好ましくは１個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｎ３−５は、３個〜５個、好ましくは４個〜５個、より好ましくは４個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｇは、グアノシン又はそのアナログであり、任意でシチジン又はそのアナログによって置換されてもよいが、但し、その場合、ステム２におけるその相補的ヌクレオチドであるシチジンも、グアノシンによって置換され、
ループ配列［Ｎ０−４（Ｕ／Ｔ）Ｎ０−４］は、エレメントステム１とステム２との間に位置し、且つ３個〜５個のヌクレオチド、より好ましくは４個のヌクレオチドの連続配列であり、
各Ｎ０−４は、互いに独立して、０個〜４個、好ましくは１個〜３個、より好ましくは１個〜２個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｕ／Ｔは、ウリジン又は任意でチミジンを表し、
ステム２［Ｎ３−５ＣＮ０−２］は、エレメントステム１に対して逆相補的であるか又は部分的に逆相補的であり、且つ５個〜７個のヌクレオチドの連続配列であり、
Ｎ３−５は、３個〜５個、好ましくは４個〜５個、より好ましくは４個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｎ０−２は、０個〜２個、好ましくは０個〜１個、より好ましくは１個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、若しくはＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｃは、シチジン又はそのアナログであり、任意でグアノシン又はそのアナログによって置換されてもよいが、但し、その場合、ステム１におけるその相補的ヌクレオチドであるグアノシンも、シチジンによって置換され、
ステム１及びステム２は、互いに塩基対合して逆相補的配列を形成することができる（前記塩基対合は、例えば、ヌクレオチドＡとＵ／Ｔ若しくはＧとＣとのワトソン−クリック塩基対合、又は非ワトソン−クリック塩基対合（例えば、ゆらぎ塩基対合、逆ワトソン−クリック塩基対合、フーグスティーン塩基対合、逆フーグスティーン塩基対合）によってステム１とステム２との間で生じ得る）か、或いは、互いに塩基対合して部分的に逆相補的な配列を形成することができる（一方のステムにおける１以上の塩基が、他方のステムの逆相補的な配列において相補的塩基を有しないことに基づいて、ステム１とステム２との間で不完全な塩基対合が生じ得る）。
【０２４３】
更に好ましい実施形態によれば、ヒストンステムループ配列は、以下の特定の式（Ｉａ）又は（ＩＩａ）のうちの少なくとも１つに従って選択してよい：
式（Ｉａ）（ステム境界エレメントを含まないステムループ配列）：
【化９】
2018529329.tif 000049
式（ＩＩａ）（ステム境界エレメントを含むステムループ配列）：
【化１０】
2018529329.tif 000050
（式中、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、及びＵは、上に定義した通りである）。
【０２４４】
第１の態様の更により特に好ましい実施形態によれば、人工核酸分子配列は、以下の特定の式（Ｉｂ）又は（ＩＩｂ）のうちの少なくともに係る少なくとも１つのヒストンステムループ配列を含んでよい：
式（Ｉｂ）（ステム境界エレメントを含まないステムループ配列）：
【化１１】
2018529329.tif 000051
式（ＩＩｂ）（ステム境界エレメントを含むステムループ配列）：
【化１２】
2018529329.tif 000052
（式中、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、及びＵは、上に定義した通りである）。
【０２４５】
特に好ましいヒストンステムループ配列は、配列番号２０９：ＣＡＡＡＧＧＣＴＣＴＴＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡに係る配列、又はより好ましくは、配列番号２０９に係る核酸配列に対応するＲＮＡ配列である。
【０２４６】
一例として、単一エレメントは、以下の順に人工核酸分子中に存在してよい：
５’−キャップ−５’−ＵＴＲ（エレメント）−ＯＲＦ−３’−ＵＴＲ（エレメント）−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列；
５’−キャップ−５’−ＵＴＲ（エレメント）−ＯＲＦ−３’−ＵＴＲ（エレメント）−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ヒストンステムループ；
５’−キャップ−５’−ＵＴＲ（エレメント）−ＯＲＦ−ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’−ＵＴＲ（エレメント）−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列；
５’−キャップ−５’−ＵＴＲ（エレメント）−ＯＲＦ−ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’−ＵＴＲ（エレメント）−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列；
５’−キャップ−５’−ＵＴＲ（エレメント）−ＯＲＦ−ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’−ＵＴＲ（エレメント）−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ヒストンステムループ；
５’−キャップ−５’−ＵＴＲ（エレメント）−ＯＲＦ−ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’−ＵＴＲ（エレメント）−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ヒストンステムループ；
５’−キャップ−５’−ＵＴＲ（エレメント）−ＯＲＦ−３’−ＵＴＲ（エレメント）−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列；
５’−キャップ−５’−ＵＴＲ（エレメント）−ＯＲＦ−３’−ＵＴＲ（エレメント）−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ヒストンステムループ等。
【０２４７】
幾つかの実施形態では、人工核酸分子は、更なるエレメント（例えば、５’−キャップ、ポリ（Ｃ）配列、及び／又はＩＲＥＳモチーフ）を含む。５’−キャップは、転写中又は転写後にＲＮＡの５’末端に付加してよい。更に、本発明の人工核酸分子は、特に核酸がｍＲＮＡの形態であるか又はｍＲＮＡをコードしている場合、少なくとも１０個のシチジン、好ましくは少なくとも２０個のシチジン、より好ましくは少なくとも３０個のシチジンの配列（所謂「ポリ（Ｃ）配列」）によって修飾されてよい。具体的には、本発明の人工核酸分子は、特に核酸が（ｍ）ＲＮＡの形態であるか又はｍＲＮＡをコードしている場合、典型的に約１０シチジンヌクレオチド〜約２００シチジンヌクレオチド、好ましくは約１０シチジンヌクレオチド〜約１００シチジンヌクレオチド、より好ましくは約１０シチジンヌクレオチド〜約７０シチジンヌクレオチド、又は更により好ましくは約２０シチジンヌクレオチド〜約５０シチジンヌクレオチド、又は更には２０シチジンヌクレオチド〜３０シチジンヌクレオチドのポリ（Ｃ）配列を含有していてよい。最も好ましくは、本発明の核酸は、３０シチジン残基のポリ（Ｃ）配列を含む。したがって、好ましくは、本発明に係る人工核酸分子は、好ましくは５’から３’方向に、上記少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントと、ＯＲＦと、上記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントと、ポリ（Ａ）配列又はポリアデニル化シグナルと、ポリ（Ｃ）配列とを含むか、又は５’から３’方向に、任意で更なる５’−ＵＴＲと、ＯＲＦと、上記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントと、ポリ（Ａ）配列又はポリアデニル化シグナルと、ポリ（Ｃ）配列とを含むか、又は５’から３’方向に、上記少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントと、ＯＲＦと、任意で更なる３’−ＵＴＲと、ポリ（Ａ）配列又はポリアデニル化シグナルと、ポリ（Ｃ）配列とを含む。
【０２４８】
配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列又はＩＲＥＳモチーフは、例えば、人工核酸分子が２以上のペプチド又はタンパク質をコードしている場合、幾つかのオープンリーディングフレームを分離することができる。ＩＲＥＳ配列は、人工核酸分子が２シストロン性又は多シストロン性の核酸分子である場合、特に有用であり得る。
【０２４９】
更に、人工核酸分子は、更なる５’−エレメント、好ましくは、プロモータ又はプロモータ含有配列を含んでいてよい。プロモータは、本発明に係る人工核酸分子、例えば、本発明に係る人工ＤＮＡ分子の転写を駆動及び／又は制御することができる。
【０２５０】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子、好ましくはオープンリーディングフレームは、少なくとも部分的にＧ／Ｃ改変されている。したがって、本発明の人工核酸分子は、前記分子のＧ（グアノシン）／Ｃ（シチジン）含量を改変することによって熱力学的に安定化させることができる。好ましくは遺伝コードの縮重を用いることによって、相当する野生型配列のオープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量と比べて本発明に係る人工核酸分子のオープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量を増加させてよい。したがって、人工核酸分子のコードされているアミノ酸配列は、特定の野生型配列のコードされているアミノ酸配列と比べて、Ｇ／Ｃ改変によって改変されないことが好ましい。したがって、翻訳されるアミノ酸配列を維持しながら含まれるＧ／Ｃヌクレオチドの量が増えるように、野生型コード配列と比べてコード配列又は人工核酸分子全体（例えば、ｍＲＮＡ）のコドンを変化させてよい。幾つかのコドンが１つの同じアミノ酸をコードしている（所謂、遺伝コードの縮重）という事実に起因して、コードされているペプチド／タンパク質配列を変化させることなくコドンを変化させることが実行可能である（所謂、代替コドンの利用）。したがって、（同じアミノ酸をコードしているそれぞれの野生型コドンへの交換において）特異的に特定のコドンを導入することが可能であり、これは、被験体におけるＲＮＡの安定性及び／又はコドン利用に関してより好ましい（所謂、コドンの最適化）。
【０２５１】
本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のコード領域によってコードされているアミノ酸によっては、その野生型コード領域に対して、核酸配列、例えばオープンリーディングフレームを様々に改変できる可能性がある。Ｇ又はＣヌクレオチドのみを含有するコドンによってコードされているアミノ酸の場合、コドンを改変する必要はない。したがって、Ｐｒｏ（ＣＣＣ又はＣＣＧ）、Ａｒｇ（ＣＧＣ又はＣＧＧ）、Ａｌａ（ＧＣＣ又はＧＣＧ）、及びＧｌｙ（ＧＧＣ又はＧＧＧ）のコドンは、ＡもＵ／Ｔも存在しないので、改変する必要がない。
【０２５２】
対照的に、Ａ及び／又はＵ／Ｔヌクレオチドを含有するコドンは、同じアミノ酸をコードしているがＡ及び／又はＵ／Ｔを含有していない他のコドンで置換することによって改変してよい。例えば、
Ｐｒｏのコドンは、ＣＣ（Ｕ／Ｔ）又はＣＣＡからＣＣＣ又はＣＣＧに改変してよい；
Ａｒｇのコドンは、ＣＧ（Ｕ／Ｔ）又はＣＧＡ又はＡＧＡ又はＡＧＧからＣＧＣ又はＣＧＧに改変してよい；
Ａｌａのコドンは、ＧＣ（Ｕ／Ｔ）又はＧＣＡからＧＣＣ又はＧＣＧに改変してよい；
Ｇｌｙのコドンは、ＧＧ（Ｕ／Ｔ）又はＧＧＡからＧＧＣ又はＧＧＧに改変してよい。
【０２５３】
他の場合、Ａ又は（Ｕ／Ｔ）ヌクレオチドをコドンからなくすことはできないが、Ａ及び／又は（Ｕ／Ｔ）ヌクレオチドの含量が低いコドンを使用することによってＡ及び（Ｕ／Ｔ）含量を減少させることができる。その例は、以下の通りである：
Ｐｈｅのコドンは、（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）から（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）Ｃに改変してよい；
Ｌｅｕのコドンは、（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）Ａ、（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）Ｇ、Ｃ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）又はＣ（Ｕ／Ｔ）ＡからＣ（Ｕ／Ｔ）Ｃ又はＣ（Ｕ／Ｔ）Ｇに改変してよい；
Ｓｅｒのコドンは、（Ｕ／Ｔ）Ｃ（Ｕ／Ｔ）又は（Ｕ／Ｔ）ＣＡ又はＡＧ（Ｕ／Ｔ）から（Ｕ／Ｔ）ＣＣ、（Ｕ／Ｔ）ＣＧ又はＡＧＣに改変してよい；
Ｔｙｒのコドンは、（Ｕ／Ｔ）Ａ（Ｕ／Ｔ）から（Ｕ／Ｔ）ＡＣに改変してよい；
Ｃｙｓのコドンは、（Ｕ／Ｔ）Ｇ（Ｕ／Ｔ）から（Ｕ／Ｔ）ＧＣに改変してよい；
Ｈｉｓのコドンは、ＣＡ（Ｕ／Ｔ）からＣＡＣに改変してよい；
Ｇｌｎのコドンは、ＣＡＡからＣＡＧに改変してよい；
Ｉｌｅのコドンは、Ａ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）又はＡ（Ｕ／Ｔ）ＡからＡ（Ｕ／Ｔ）Ｃに改変してよい；
Ｔｈｒのコドンは、ＡＣ（Ｕ／Ｔ）又はＡＣＡからＡＣＣ又はＡＣＧに改変してよい；
Ａｓｎのコドンは、ＡＡ（Ｕ／Ｔ）からＡＡＣに改変してよい；
Ｌｙｓのコドンは、ＡＡＡからＡＡＧに改変してよい；
Ｖａｌのコドンは、Ｇ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）又はＧ（Ｕ／Ｔ）ＡからＧ（Ｕ／Ｔ）Ｃ又はＧ（Ｕ／Ｔ）Ｇに改変してよい；
Ａｓｐのコドンは、ＧＡ（Ｕ／Ｔ）からＧＡＣに改変してよい；
Ｇｌｕのコドンは、ＧＡＡからＧＡＧに改変してよい；
終止コドン（Ｕ／Ｔ）ＡＡは、（Ｕ／Ｔ）ＡＧ又は（Ｕ／Ｔ）ＧＡに改変してよい。
【０２５４】
他方、Ｍｅｔ（Ａ（Ｕ／Ｔ）Ｇ）及びＴｒｐ（（Ｕ／Ｔ）ＧＧ）のコドンの場合、コードされているアミノ酸配列を変化させることなしに配列を改変することはできない。
【０２５５】
上記置換は、その特定の野生型オープンリーディングフレーム（即ち、オリジナル配列）と比べて、本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のオープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量を増加させるために個々に又は全ての可能な組合せで用いることができる。したがって、例えば、野生型配列に存在するＴｈｒの全てのコドンをＡＣＣ（又はＡＣＧ）に改変してもよい。
【０２５６】
好ましくは、本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のオープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量は、コードされているアミノ酸配列を変化させることなしに、即ち、遺伝子コードの縮重を用いて、野生型コード領域のＧ／Ｃ含量と比べて、少なくとも７％、より好ましくは少なくとも１５％、特に好ましくは少なくとも２０％増加させる。特定の実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、又はその断片、変異体、若しくは誘導体のオープンリーディングフレームにおける置換可能なコドンのうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は更には１００％を置換して、前記オープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量を増加させる。
【０２５７】
これに関連して、本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のオープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量を、コードされているアミノ酸配列を変化させることなしに、野生型オープンリーディングフレームと比べて最大限（即ち、置換可能なコドンの１００％）増加させることが特に好ましい。
【０２５８】
更に、オープンリーディングフレームは、好ましくは、少なくとも部分的にコドンが最適化されている。コドンの最適化は、細胞内のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の発生頻度が異なることによって翻訳効率が決定され得るという知見に基づいている。したがって、本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のコード領域に所謂「レアコドン」が存在している場合、前記レアコドンに対応する改変核酸配列は、比較的「高頻度の」ｔＲＮＡをコードしているコドンが存在する場合よりも翻訳効率が低くなる確率が高い。
【０２５９】
したがって、本発明の人工核酸分子のオープンリーディングフレームは、好ましくは、細胞内で比較的レアなｔＲＮＡをコードしている野生型配列のうちの少なくとも１つのコドンが、細胞内で比較的高頻度で存在するｔＲＮＡをコードしており且つ前記比較的レアなｔＲＮＡと同じアミノ酸を運搬するコドンと交換されるように、対応する野生型コード領域に対して改変される。この改変により、本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のオープンリーディングフレームは、高頻度で存在するｔＲＮＡを利用可能なコドンが、レアなｔＲＮＡに対応するコドンに置き換わることができるように改変される。言い換えれば、本発明によれば、この改変により、レアなｔＲＮＡをコードしている野生型オープンリーディングフレームの全てのコドンを、細胞内においてより高頻度で存在し且つ前記レアなｔＲＮＡと同じアミノ酸を運搬するｔＲＮＡをコードしているコドンと交換してよい。どのｔＲＮＡが細胞内で比較的高頻度で存在するか、及び対照的にどのｔＲＮＡが比較的低頻度で存在するかは、当業者に公知である。例えば、Ａｋａｓｈｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．２００１，１１（６）：６６０−６６６を参照されたい。したがって、好ましくは、オープンリーディングフレームは、好ましくは本発明に係る人工核酸分子が発現する系に関して、好ましくは本発明に係る人工核酸分子が翻訳される系に関して、コドンが最適化されている。好ましくは、オープンリーディングフレームのコドン使用頻度は、哺乳類のコドン使用頻度、より好ましくはヒトのコドン使用頻度に従ってコドンが最適化されている。好ましくは、オープンリーディングフレームは、コドンが最適化されており且つＧ／Ｃ含量が改変されている。
【０２６０】
分解耐性、例えば、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼによるインビボ（又は上に定義したインビトロ）における分解に対する耐性を更に改善するために、及び／又は本発明に係る人工核酸分子からのタンパク質発現の安定性を更に改善するために、人工核酸分子は、骨格修飾、糖修飾、及び／又は塩基修飾、例えば、脂質修飾等の修飾を更に含んでいてよい。好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の転写及び／又は翻訳は、前記修飾によって殆ど損なわれない。
【０２６１】
一般的に、本発明の人工核酸分子は、任意のネイティブ（＝天然）ヌクレオチド、例えば、グアノシン、ウラシル、アデノシン、及び／又はシトシン、又はこれらのアナログを含んでいてよい。これに関して、ヌクレオチドアナログは、天然ヌクレオチドであるアデノシン、シトシン、チミジン、グアノシン、及びウリジンのネイティブ及び非ネイティブの変異体として定義される。したがって、アナログは、例えば、非ネイティブの官能基で化学的に誘導体化されたヌクレオチドであり、好ましくは、前記非ネイティブの官能基を天然ヌクレオチドに付加するか若しくは天然ヌクレオチドから欠失させる、又は前記非ネイティブの官能基でヌクレオチドの天然官能基を置換する。したがって、天然ヌクレオチドの各構成成分、即ち、ＲＮＡ配列の骨格（上記を参照）を形成する塩基成分、糖（リボース）成分、及び／又はリン酸成分を修飾することができる。グアノシン、ウリジン、アデノシン、チミジン、及びシトシンのアナログとしては、限定するものではないが、（例えば、アセチル化、メチル化、ヒドロキシ化等によって、化学的に）改変されている、任意のネイティブ又は非ネイティブのグアノシン、ウリジン、アデノシン、チミジン、又はシトシンが挙げられ、例えば、１−メチル−アデノシン、１−メチル−グアノシン、１−メチル−イノシン、２，２−ジメチル−グアノシン、２，６−ジアミノプリン、２’−アミノ−２’−デオキシアデノシン、２’−アミノ−２’−デオキシシチジン、２’−アミノ−２’−デオキシグアノシン、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド、２−アミノプリン−リボシド、２’−アラアデノシン、２’−アラシチジン、２’−アラウリジン、２’−アジド−２’−デオキシアデノシン、２’−アジド−２’−デオキシシチジン、２’−アジド−２’−デオキシグアノシン、２’−アジド−２’−デオキシウリジン、２−クロロアデノシン、２’−フルオロ−２’−デオキシアデノシン、２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン、２’−フルオロ−２’−デオキシグアノシン、２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン、２’−フルオロチミジン、２−メチル−アデノシン、２−メチル−グアノシン、２−メチル−チオ−Ｎ６−イソペネニル−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−２−アミノアデノシン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシアデノシン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシシチジン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシグアノシン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシウリジン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルイノシン、２’−Ｏ−メチルシュードウリジン、２−チオシチジン、２−チオ−シトシン、３−メチル−シトシン、４−アセチル−シトシン、４−チオウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−ウラシル、５，６−ジヒドロウリジン、５−アミノアリルシチジン、５−アミノアリル−デオキシ−ウリジン、５−ブロモウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル、５−クロロ−アラ−シトシン、５−フルオロ−ウリジン、５−ヨードウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン、５−メトキシ−ウリジン、５−メチル−２−チオ−ウリジン、６−アザシチジン、６−アザウリジン、６−クロロ−７−デアザ−グアノシン、６−クロロプリンリボシド、６−メルカプト−グアノシン、６−メチル−メルカプトプリン−リボシド、７−デアザ−２’−デオキシ−グアノシン、７−デアザアデノシン、７−メチル−グアノシン、８−アザアデノシン、８−ブロモ−アデノシン、８−ブロモ−グアノシン、８−メルカプト−グアノシン、８−オキソグアノシン、ベンズイミダゾール−リボシド、ベータ−Ｄ−マンノシル−クエオシン、ジヒドロ−ウラシル、イノシン、Ｎ１−メチルアデノシン、Ｎ６−（［６−アミノヘキシル］カルバモイルメチル）−アデノシン、Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン、Ｎ６−メチル−アデノシン、Ｎ７−メチル−キサントシン、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ピューロマイシン、クエオシン、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ワイブトシン（Ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、キサントシン、及びキシロアデノシンを含む。このようなアナログの調製は、例えば、米国特許第４，３７３，０７１号、米国特許第４，４０１，７９６号、米国特許第４，４１５，７３２号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，５００，７０７号、米国特許第４，６６８，７７７号、米国特許第４，９７３，６７９号、米国特許第５，０４７，５２４号、米国特許第５，１３２，４１８号、米国特許第５，１５３，３１９号、米国特許第５，２６２，５３０号、及び米国特許第５，７００，６４２号から当業者に公知である。上記アナログの場合、本発明の特定の実施形態に従って、コードされているペプチド若しくはタンパク質のタンパク質発現を増加させる、又は本発明の人工核酸分子の免疫原性を増大させる及び／又は導入されている人工核酸分子の更なる修飾に干渉しないアナログが特に好ましい場合がある。
【０２６２】
特定の実施形態によれば、本発明の人工核酸分子は、脂質修飾を含有してよい。
【０２６３】
好ましい実施形態では、人工核酸分子は、好ましくは、５’から３’方向に、以下のエレメントを含む：
前記人工核酸分子、好ましくは、配列番号１〜１５１のいずれかに係る核酸配列に高い翻訳効率を与える５’−ＵＴＲエレメント；又は更なる５’−ＵＴＲ、好ましくは５’−ＴＯＰ  ＵＴＲの５’−ＵＴＲエレメント；
少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、好ましくは、野生型配列に対して少なくとも１つの修飾を含むＯＲＦ；
前記人工核酸分子、好ましくは、配列番号１５２〜２０４のいずれかに係る核酸配列のいずれかに係る核酸配列に高い翻訳効率を与える３’−ＵＴＲエレメント；又は更なる３’−ＵＴＲ、好ましくはａｌｂｕｍｉｎ７  ３’−ＵＴＲの３’−ＵＴＲエレメント；
好ましくは６４アデニラートを含むポリ（Ａ）配列；
好ましくは３０シチジラートを含むポリ（Ｃ）配列；
ヒストンステムループ配列。
【０２６４】
特に好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、以下に記載する修飾のうちの１以上を更に含んでよい。
【０２６５】
化学修飾：
人工核酸分子に関して本明細書で使用するとき、用語「修飾」とは、骨格修飾に加えて、糖修飾又は塩基修飾を含む化学修飾を指し得る。
【０２６６】
この状況では、本明細書に定義する人工核酸分子、好ましくは、ＲＮＡ分子は、ヌクレオチドアナログ／修飾、例えば、骨格修飾、糖修飾、又は塩基修飾を含有し得る。本発明に関連する骨格修飾は、本明細書に定義する核酸分子に含有されているヌクレオチドの骨格のリン酸が化学的に修飾されている修飾である。本発明に関連する糖修飾は、本明細書に定義する核酸分子のヌクレオチドの糖の化学修飾である。更に、本発明に関連する塩基修飾は、核酸分子の核酸分子のヌクレオチドの塩基部分の化学修飾である。この状況では、ヌクレオチドアナログ又は修飾は、好ましくは、転写及び／又は翻訳に適用可能なヌクレオチドアナログから選択される。
【０２６７】
糖修飾：
修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチド（本明細書に記載する通り、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡに組み込まれ得る）は、糖部分が修飾されていてよい。「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシ又はアリールオキシ（−ＯＲ、例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、又は糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ；２’ヒドロキシルが、例えば、メチレン架橋によって、同じリボース糖の４’炭素に結合している「ロック」核酸（ＬＮＡ）；及びアミノ基（−Ｏ−アミノ）、式中、アミノ基、例えば、ＮＲＲは、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノであり得る）又はアミノアルコキシが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６８】
「デオキシ」修飾としては、水素、アミノ（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、又はアミノ酸）が挙げられ；又はアミノ基は、リンカーを介して糖に結合してもよく、前記リンカーは、原子Ｃ、Ｎ、及びＯのうちの１以上を含む。
【０２６９】
また、糖基は、リボースにおける対応する炭素とは逆の立体化学的配置を有する１以上の炭素を含有し得る。したがって、修飾された核酸分子は、例えば、糖としてアラビノースを含有するヌクレオチドを含み得る。
【０２７０】
骨格修飾：
修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチド（本明細書に記載する通り、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡに組み込まれ得る）は、リン酸骨格が更に修飾されていてもよい。骨格のリン酸基は、酸素原子のうちの１以上を異なる置換基で置換することによって修飾することができる。更に、修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチドは、本明細書に記載する通り、非修飾リン酸部分を修飾リン酸で完全に置換することを含み得る。修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオアート、ホスホロセレナート、ボラノホスファート、ボラノホスファートエステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミダート、アルキル又はアリールホスホナート、及びホスホトリエステルが挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロジチオアートは、非結合酸素が両方とも硫黄によって置換されている。また、リン酸リンカーは、窒素（架橋ホスホロアミダート）、硫黄（架橋ホスホロチオアート）、及び炭素（架橋メチレン−ホスホナート）で結合酸素を置換することによって修飾してもよい。
【０２７１】
塩基修飾：
修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチド（本明細書に記載する通り、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ分子に組み込まれ得る）は、ヌクレオ塩基部分が更に修飾されていてもよい。ＲＮＡにみられるヌクレオ塩基の例としては、アデニン、グアニン、シトシン、及びウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本明細書に記載するヌクレオシド及びヌクレオチドは、主溝面において化学修飾され得る。幾つかの実施形態では、主溝化学修飾は、アミノ基、チオール基、アルキル基、又はハロ基を含み得る。
【０２７２】
本発明の特に好ましい実施形態では、ヌクレオチドアナログ／修飾は、塩基修飾から選択され、これは、好ましくは、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド−５’−トリホスファート、２−アミノプリン−リボシド−５’−トリホスファート；２−アミノアデノシン−５’−トリホスファート、２’−アミノ−２’−デオキシシチジン−トリホスファート、２−チオシチジン−５’−トリホスファート、２−チオウリジン−５’−トリホスファート、２’−フルオロチミジン−５’−トリホスファート、２’−Ｏ−メチルイノシン−５’−トリホスファート４−チオウリジン−５’−トリホスファート、５−アミノアリルシチジン−５’−トリホスファート、５−アミノアリルウリジン−５’−トリホスファート、５−ブロモシチジン−５’−トリホスファート、５−ブロモウリジン−５’−トリホスファート、５−ブロモ−２’−デオキシシチジン−５’−トリホスファート、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン−５’−トリホスファート、５−ヨードシチジン−５’−トリホスファート、５−ヨード−２’−デオキシシチジン−５’−トリホスファート、５−ヨードウリジン−５’−トリホスファート、５−ヨード−２’−デオキシウリジン−５’−トリホスファート、５−メチルシチジン−５’−トリホスファート、５−メチルウリジン−５’−トリホスファート、５−プロピニル−２’−デオキシシチジン−５’−トリホスファート、５−プロピニル−２’−デオキシウリジン−５’−トリホスファート、６−アザシチジン−５’−トリホスファート、６−アザウリジン−５’−トリホスファート、６−クロロプリンリボシド−５’−トリホスファート、７−デアザアデノシン−５’−トリホスファート、７−デアザグアノシン−５’−トリホスファート、８−アザアデノシン−５’−トリホスファート、８−アジドアデノシン−５’−トリホスファート、ベンズイミダゾール−リボシド−５’−トリホスファート、Ｎ１−メチルアデノシン−５’−トリホスファート、Ｎ１−メチルグアノシン−５’−トリホスファート、Ｎ６−メチルアデノシン−５’−トリホスファート、Ｏ６−メチルグアノシン−５’−トリホスファート、シュードウリジン−５’−トリホスファート、又はピューロマイシン−５’−トリホスファート、キサントシン−５’−トリホスファートから選択される。５−メチルシチジン−５’−トリホスファート、７−デアザグアノシン−５’−トリホスファート、５−ブロモシチジン−５’−トリホスファート、及びシュードウリジン−５’−トリホスファートからなる塩基修飾されたヌクレオチドの群から選択される塩基修飾のためのヌクレオチドが特に好ましい。
【０２７３】
幾つかの実施形態では、修飾されたヌクレオシドとしては、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン、４−チオ−シュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチル−ウリジン、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、５−メチル−ウリジン、１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、及び４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジンが挙げられる。
【０２７４】
幾つかの実施形態では、修飾されたヌクレオシドとしては、５−アザ−シチジン、シュードイソシチジン、３−メチル−シチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュードイソシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−シュードイソシチジン、及び４−メトキシ−ｌ−メチル−シュードイソシチジンが挙げられる。
【０２７５】
他の実施形態では、修飾されたヌクレオシドとしては、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、及び２−メトキシ−アデニンが挙げられる。
【０２７６】
他の実施形態では、修飾されたヌクレオシドとしては、イノシン、１−メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、及びＮ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシンが挙げられる。
【０２７７】
幾つかの実施形態では、ヌクレオチドは、主溝面で修飾されてよく、ウラシルのＣ−５における水素をメチル基又はハロ基で置換することを含んでよい。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオシドは、５’−Ｏ−（１−チオホスファート）−アデノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスファート）−シチジン、５’−Ｏ−（１−チオホスファート）−グアノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスファート）−ウリジン、又は５’−Ｏ−（１−チオホスファート）−シュードウリジンである。
【０２７８】
更に特定の実施形態では、人工核酸分子、好ましくは、ＲＮＡ分子は、６−アザ−シチジン、２−チオ−シチジン、α−チオ−シチジン、シュード−イソ−シチジン、５−アミノアリル−ウリジン、５−ヨード−ウリジン、Ｎ１−メチル−シュードウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、α−チオ−ウリジン、４−チオ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン、デオキシ−チミジン、５−メチル−ウリジン、ピロロ−シチジン、イノシン、α−チオ−グアノシン、６−メチル−グアノシン、５−メチル−シチジン、８−オキソ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、Ｎ１−メチル−アデノシン、２−アミノ−６−クロロ−プリン、Ｎ６−メチル−２−アミノ−プリン、シュード−イソ−シチジン、６−クロロ−プリン，Ｎ６−メチル−アデノシン、α−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデノシンから選択されるヌクレオシド修飾を含んでいてよい。
【０２７９】
脂質修飾：
更なる実施形態によれば、本明細書に定義する人工核酸分子、好ましくはＲＮＡは、脂質修飾を含有してよい。かかる脂質修飾されたＲＮＡは、典型的に、本明細書に定義するＲＮＡを含む。かかる脂質修飾された本明細書に定義するＲＮＡ分子は、典型的に、そのＲＮＡ分子と共有結合する少なくとも１つのリンカーと、それぞれのリンカーと共有結合する少なくとも１つの脂質とを更に含む。或いは、脂質修飾されたＲＮＡ分子は、本明細書に定義する少なくとも１つのＲＮＡ分子と、そのＲＮＡ分子と（リンカー無しで）共有結合する少なくとも１つの（二官能性）脂質とを含む。第３の代替例によれば、脂質修飾されたＲＮＡ分子は、本明細書に定義する人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ分子と、そのＲＮＡ分子と共有結合する少なくとも１つのリンカーと、それぞれのリンカーと共有結合する少なくとも１つの脂質とを含み、また、そのＲＮＡ分子と（リンカー無しで）共有結合する少なくとも１つの（二官能性）脂質も含む。この状況では、脂質修飾は、直鎖状ＲＮＡ配列の末端に存在することが特に好ましい。
【０２８０】
修飾されたＲＮＡの５’末端の修飾：
本発明の別の好ましい実施形態によれば、本明細書に定義する人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ分子は、所謂「５’キャップ」構造の付加によって修飾してよい。
【０２８１】
５’−キャップは、一般的に、成熟ｍＲＮＡの５’−末端に「蓋をする」実体、典型的には、修飾されたヌクレオチド実体である。５’−キャップは、典型的に、修飾されたヌクレオチド、特に、グアニンヌクレオチドの誘導体によって形成され得る。好ましくは、５’−キャップは、５’−５’−三リン酸結合を介して５’−末端に結合する。５’−キャップは、メチル化されていてもよく、例えば、ｍ７ＧｐｐｐＮ（式中、Ｎは、５’−キャップを有する核酸の５’末端のヌクレオチド、典型的に、ＲＮＡの５’末端である）である。ｍ７ＧｐｐｐＮは、ポリメラーゼＩＩによって転写されたｍＲＮＡ中に天然に存在する５’−キャップ構造であり、したがって、本発明に係る修飾ＲＮＡに含まれる修飾とはみなされない。これは、本発明に係る人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ分子は、５’−キャップとしてｍ７ＧｐｐｐＮを含んでよいが、更に、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ分子は、本明細書に定義する少なくとも１つの更なる修飾を含む。
【０２８２】
５’−キャップ構造の更なる例としては、グリセリル、逆転デオキシ非塩基残基（部分）、４’，５’メチレンヌクレオチド、１−（ベータ−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、アルファ−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’−セコヌクレオチド、非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式３，５ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−逆転ヌクレオチド部分、３’−３’−逆転非塩基部分、３’−２’−逆転ヌクレオチド部分、３’−２’−逆転非塩基部分、１，４−ブタンジオールホスファート、３’−ホスホロアミダート、ヘキシルホスファート、アミノヘキシルホスファート、３’−ホスファート、３’ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、又は架橋若しくは非架橋メチルホスホナート部分が挙げられる。これら修飾５’−キャップ構造は、本発明に係る人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ分子に含まれる少なくとも１つの修飾としてみなされる。
【０２８３】
特に好ましい修飾５’−キャップ構造は、ＣＡＰ１（ｍ７Ｇに隣接するヌクレオチドのリボースのメチル化）、ＣＡＰ２（ｍ７Ｇの下流の２番目のヌクレオチドのリボースのメチル化）、ＣＡＰ３（ｍ７Ｇの下流の３番目のヌクレオチドのリボースのメチル化）、ＣＡＰ４（ｍ７Ｇの下流の４番目のヌクレオチドのリボースのメチル化）、ＡＲＣＡ（抗リバースＣＡＰアナログ、修飾ＡＲＣＡ（例えば、ホスホチオアート修飾ＡＲＣＡ）、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’−フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、及び２−アジド−グアノシンである。
【０２８４】
好ましい実施形態では、少なくとも１つのオープンリーディングフレームは、治療用タンパク質又はペプチドをコードしている。別の実施形態では、抗原は、病原性抗原、腫瘍抗原、アレルギー抗原、又は自己免疫抗原等、少なくとも１つのオープンリーディングフレームによってコードされている。ここでは、抗原が関与する疾患に対する遺伝子ワクチン接種アプローチにおいて、前記抗原をコードする人工核酸分子の投与を用いる。
【０２８５】
別の実施形態では、抗体若しくは抗原特異的Ｔ細胞受容体、又はこれらの断片は、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つのオープンリーディングフレームによってコードされている。
【０２８６】
抗原：
病原性抗原：
本発明に係る人工核酸分子は、病原性抗原又はその断片、変異体、若しくは誘導体を含むタンパク質又はペプチドをコードしていてよい。かかる病原性抗原は、病原性生物、特に、細菌、ウイルス、又は原生動物（多細胞）の病原性生物に由来し、これらは、被験体、具体的には、哺乳類被験体、より具体的には、ヒトにおいて免疫反応を誘発する。より具体的には、病原性抗原は、好ましくは、ウイルス又は細菌又は原生動物の表面に位置する表面抗原、例えば、タンパク質（又はタンパク質の断片、例えば、表面抗原の外側部分）である。
【０２８７】
病原性抗原は、好ましくは感染性疾患に関連する病原体に由来するペプチド又はタンパク質抗原であり、好ましくは、以下の病原体に由来する抗原から選択される：アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、アナプラズマ（Ａｎａｐｌａｓｍａ）属、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、ブラジル鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｅ）、ズビニ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）、溶血性アルカノバクテリア（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ）、回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、アストロウイルス（Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）科、バベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）属、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、ヘンセラ菌（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）、ＢＫウイルス、ブラストシスチス・ホミニス（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、ブラストマイセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ライム病ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属の種、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ  ｍａｌａｙｉ）、ブニヤウイルス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）科、セパシア菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）及び他のバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属の種、鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）、類鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、カリシウイルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）科、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属の種、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、ＣＪＤプリオン、肝臓ジストマ（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属の種、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属の種、コロナウイルス、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、Ｑ熱コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３、及びＤＥＮ−４）、二核アメーバ（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）、エキノコックス（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、エーリキア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、エーリキア・エウィンギイ（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｅｗｉｎｇｉｉ）、エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）属、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）属、エンテロウイルス、主にコクサッキーＡウイルス及びエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、エピデルモフィトン（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）属の種、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ１１１、及びＯ１０４：Ｈ４、肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ）及び巨大肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｇｉｇａｎｔｉｃａ）、ＦＦＩプリオン、フィラリア（Ｆｉｌａｒｉｏｉｄｅａ）上科、フラビウイルス、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、フゾバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ゲオトリクム・カンジドゥム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、顎口虫（Ｇｎａｔｈｏｓｔｏｍａ）属の種、ＧＳＳプリオン、グアナリトウイルス、デュクレー菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、ヘニパウイルス（ヘンドラウイルス、ニパーウイルス）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１及び２（ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２））、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ホルタエ・ウェルネッキー（Ｈｏｒｔａｅａ  ｗｅｒｎｅｃｋｉｉ）、ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）及びヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ−７）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、フニンウイルス、キンゲラ・キンゲ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、クレブシエラ・グラヌロマチス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）、クーループリオン、ラッサウイルス、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）属、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、マチュポウイルス、マラセジア（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）属の種、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、横川吸虫（Ｍｅｔａｇｏ���ｉｍｕｓ  ｙｏｋａｇａｗａｉ）、微胞子虫（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）門、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ）、流行性耳下腺炎ウイルス、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）及びマイコバクテリウム・レプロマトシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ）、肺炎マイコプラスマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ネグレリア・フォーレリ（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ  ｆｏｗｌｅｒｉ）、アメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔ又はａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ノカルジア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属の種、回旋糸状虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ）、オリエンティア・ツツガムシ（Ｏｒｉｅｎｔｉａ  ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）、オルソミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）科（インフルエンザ）、ブラジルパラコクシジオイデス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、肺吸虫（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ）属の種、ヴェステルマン肺吸虫（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ  ｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ）、パルボウイルスＢ１９、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、プラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属、ニューモシスチス肺炎菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、鼻炎ウイルス、ライノウイルス、痘瘡リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ａｋａｒｉ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）属、発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、斑点熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、発疹熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｙｐｈｉ）、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、サビアウイルス（Ｓａｂｉａ  ｖｉｒｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、ヒゼンダニ（Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ  ｓｃａｂｉｅｉ）、ＳＡＲＳコロナウイルス、住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）属、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、シンノンブルウイルス、ハンタウイルス、スポロトリックス・シェンキィ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、糞線虫（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）、テニア（Ｔａｅｎｉａ）属、有鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｓｏｌｉｕｍ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、イヌ回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ  ｃａｎｉｓ）又はネコ回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ  ｃａｔｉ）、トキソプラズマ・ゴンヂ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）、膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）属の種、ヒト鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｔｒｉｃｈｉｕｒａ）、トリパノソーマ・ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、大痘瘡又は小痘瘡、ｖＣＪＤプリオン、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、西ナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、バンクロフト糸状虫（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）、黄熱病ウイルス、腸炎エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、及び偽結核エルジニア菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）。
【０２８８】
この状況では、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、プラスモディウム、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、デングウイルス、トラコーマクラミジア、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、結核菌、狂犬病ウイルス、及び黄熱病ウイルスから選択される病原体由来の抗原が特に好ましい。
【０２８９】
腫瘍抗原：
更なる実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、タンパク質又はペプチドをコードしてよく、前記タンパク質又はペプチドは、腫瘍抗原、前記腫瘍抗原の断片、変異体、又は誘導体を含むペプチド又はタンパク質を含み、好ましくは、前記腫瘍抗原は、メラニン形成細胞特異的抗原、癌−精巣抗原、又は腫瘍特異的抗原、好ましくは、ＣＴ−Ｘ抗原、非Ｘ  ＣＴ抗原、ＣＴ−Ｘ抗原の結合パートナー、若しくは非Ｘ  ＣＴ抗原の結合パートナー、又は腫瘍特異的抗原、より好ましくは、ＣＴ−Ｘ抗原、非Ｘ  ＣＴ抗原の結合パートナー、又は腫瘍特異的抗原、又は前記腫瘍抗原の断片、変異体、若しくは誘導体であり；前記核酸配列は、それぞれ、異なるペプチド又はタンパク質をコードし；前記核酸配列の少なくとも１つは、以下をコードしている：５Ｔ４、７０７−ＡＰ、９Ｄ７、ＡＦＰ、ＡｌｂＺＩＰ  ＨＰＧ１、アルファ−５−ベータ−１−インテグリン、アルファ−５−ベータ−６−インテグリン、アルファ−アクチニン−４／ｍ、アルファ−メチルアシル補酵素Ａラセマーゼ、ＡＲＴ−４、ＡＲＴＣ１／ｍ、Ｂ７Ｈ４、ＢＡＧＥ−１、ＢＣＬ−２、ｂｃｒ／ａｂｌ、ベータ−カテニン／ｍ、ＢＩＮＧ−４、ＢＲＣＡ１／ｍ、ＢＲＣＡ２／ｍ、ＣＡ１５−３／ＣＡ２７−２９、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡ１２５、カルレチクリン、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＳＰ−８／ｍ、カテプシンＢ、カテプシンＬ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤＥ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ／ｍ、ＣＥＡ、ＣＬＣＡ２、ＣＭＬ２８、ＣＭＬ６６、ＣＯＡ−１／ｍ、コアクトシン様タンパク質、ｃｏｌｌａｇｅ  ＸＸＩＩＩ、ＣＯＸ−２、ＣＴ−９／ＢＲＤ６、Ｃｔｅｎ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、ｃｙｐ−Ｂ、ＣＹＰＢ１、ＤＡＭ−１０、ＤＡＭ−６、ＤＥＫ−ＣＡＮ、ＥＦＴＵＤ２／ｍ、ＥＧＦＲ、ＥＬＦ２／ｍ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥｐＣａｍ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｒｂＢ３、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、ＥＺＨ２、ＦＧＦ−５、ＦＮ、Ｆｒａｕ−１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ７ｂ、ＧＡＧＥ−８、ＧＤＥＰ、ＧｎＴ−Ｖ、ｇｐ１００、ＧＰＣ３、ＧＰＮＭＢ／ｍ、ＨＡＧＥ、ＨＡＳＴ−２、ヘプシン、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７Ｉ、ＨＬＡ−Ａ１１／ｍ、ＨＬＡ−Ａ２／ｍ、ＨＮＥ、ホメオボックスＮＫＸ３．１、ＨＯＭ−ＴＥＳ−１４／ＳＣＰ−１、ＨＯＭ−ＴＥＳ−８５、ＨＰＶ−Ｅ６、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ｈＴＥＲＴ、ｉＣＥ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−１３Ｒａ２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−５、未成熟ラミニン受容体、カリクレイン−２、カリクレイン−４、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、ＫＩＡＡ０２０５／ｍ、ＫＫ−ＬＣ−１、Ｋ−Ｒａｓ／ｍ、ＬＡＧＥ−Ａ１、ＬＤＬＲ−ＦＵＴ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｂ１、ＭＡＧＥ−Ｂ２、ＭＡＧＥ−Ｂ３、ＭＡＧＥ−Ｂ４、ＭＡＧＥ−Ｂ５、ＭＡＧＥ−Ｂ６、ＭＡＧＥ−Ｂ１��、ＭＡＧＥ−Ｂ１６、ＭＡＧＥ−Ｂ１７、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｄ１、ＭＡＧＥ−Ｄ２、ＭＡＧＥ−Ｄ４、ＭＡＧＥ−Ｅ１、ＭＡＧＥ−Ｅ２、ＭＡＧＥ−Ｆ１、ＭＡＧＥ−Ｈ１、ＭＡＧＥＬ２、マンマグロビンＡ、ＭＡＲＴ−１／ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＡＲＴ−２、ＭＡＲＴ−２／ｍ、基質タンパク質２２、ＭＣ１Ｒ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＥ１／ｍ、メソテリン、ＭＧ５０／ＰＸＤＮ、ＭＭＰ１１、ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ−抗原、ＭＲＰ−３、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＭ−１／ｍ、ＭＵＭ−２／ｍ、ＭＵＭ−３／ｍ、ミオシンクラスＩ／ｍ、ＮＡ８８−Ａ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ、Ｎｅｏ−ＰＡＰ、Ｎｅｏ−ＰＡＰ／ｍ、ＮＦＹＣ／ｍ、ＮＧＥＰ、ＮＭＰ２２、ＮＰＭ／ＡＬＫ、Ｎ−Ｒａｓ／ｍ、ＮＳＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−Ｂ、ＯＡ１、ＯＦＡ−ｉＬＲＰ、ＯＧＴ、ＯＧＴ／ｍ、ＯＳ−９、ＯＳ−９／ｍ、オステオカルシン、オステオポンチン、ｐ１５、ｐ１９０マイナー  ｂｃｒ−ａｂｌ、ｐ５３、ｐ５３／ｍ、ＰＡＧＥ−４、ＰＡＩ−１、ＰＡＩ−２、ＰＡＰ、ＰＡＲＴ−１、ＰＡＴＥ、ＰＤＥＦ、Ｐｉｍ−１−キナーゼ、Ｐｉｎ−１、Ｐｍｌ／Ｐａｒアルファ、ＰＯＴＥ、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＤＸ５／ｍ、プロステイン、プロテイナーゼ−３、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＧＲ、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ、ＰＴＰＲＫ／ｍ、ＲＡＧＥ−１、ＲＢＡＦ６００／ｍ、ＲＨＡＭＭ／ＣＤ１６８、ＲＵ１、ＲＵ２、Ｓ−１００、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３、ＳＣＣ、ＳＩＲＴ２／ｍ、Ｓｐ１７、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２／ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０、ＳＳＸ−４、ＳＴＡＭＰ−１、ＳＴＥＡＰ−１、サバイビン、サバイビン−２Ｂ、ＳＹＴ−ＳＳＸ−１、ＳＹＴ−ＳＳＸ−２、ＴＡ−９０、ＴＡＧ−７２、ＴＡＲＰ、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、ＴＧＦベータ、ＴＧＦベータＲＩＩ、ＴＧＭ−４、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＡＧ−３、ＴＲＧ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２／６ｂ、ＴＲＰ／ＩＮＴ２、ＴＲＰ−ｐ８、チロシナーゼ、ＵＰＡ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ−２／ＦＬＫ−１、ＷＴ１、及びリンパ血球の免疫グロブリンイディオタイプ又はリンパ血球のＴ細胞受容体イディオタイプ、又は前記腫瘍抗原の断片、変異体、若しくは誘導体；好ましくは、サバイビン若しくはそのホモログ、ＭＡＧＥファミリー若しくはその結合パートナー由来の抗原、又は前記腫瘍抗原の断片、変異体、若しくは誘導体。この状況では、腫瘍抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１、５Ｔ４、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、サバイビン、Ｍｕｃ−１、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＳＴＥＡＰ、及びＰＡＰが特に好ましい。
【０２９０】
好ましい実施形態では、人工核酸分子は、タンパク質又はペプチドをコードし、前記タンパク質又はペプチドは、治療用タンパク質、又はその断片、変異体、若しくは誘導体を含む。
【０２９１】
本明細書に定義する治療用タンパク質は、任意の遺伝性疾患若しくは後天性疾患の治療に有益であるか、又は個体の症状を改善するペプチド又はタンパク質である。特に、治療用タンパク質は、数ある機能の中でも、遺伝子エラーを修正及び修復し、癌細胞又は病原体感染細胞を破壊し、免疫系疾患を治療し、代謝性疾患又は内分泌疾患を治療することができる治療剤の作製において重要な役割を果たす。例えば、タンパク質ホルモンであるエリスロポイエチン（ＥＰＯ）は、腎臓合併症の一般的な原因である赤血球欠乏の患者の治療において利用することができる。更に、アジュバントタンパク質、治療用抗体も治療用タンパク質に含まれ、また、例えば閉経期の女性の治療において用いられるホルモン補充療法も含まれる。より最近のアプローチでは、患者の体細胞を用いて、前記体細胞の多能性幹細胞へのリプログラムが行われている。これは、論争になっている幹細胞療法に取って代わるものである。また、体細胞のリプログラム又は幹細胞の分化に用いられるこれらタンパク質も、本明細書では治療用タンパク質として定義される。更に、治療用タンパク質は、例えば、創傷治癒、組織再生、血管形成等の他の目的のために用いることもできる。更に、抗原特異的Ｂ細胞受容体、並びにこれらの断片及び変異体も、本明細書において治療用タンパク質として定義される。
【０２９２】
したがって、治療用タンパク質は、遺伝性疾患であるか後天性疾患であるかにかかわらず、例えば、感染性疾患、新生物（例えば、癌又は腫瘍疾患）、血液及び造血器官の疾患、内分泌疾患、栄養疾患、代謝性疾患、神経系の疾患、循環系の疾患、呼吸器系の疾患、消化器系の疾患、皮膚及び皮下組織の疾患、筋骨格系及び結合組織の疾患、並びに尿生殖器系の疾患等の様々な疾患の治療を含む様々な目的のために使用することができる。
【０２９３】
この状況では、特に代謝性疾患又は内分泌疾患の治療において用いることができる特に好ましい治療用タンパク質は、以下から選択される（括弧内は、治療用タンパク質が治療で用いられる具体的な疾患である）：酸性スフィンゴミエリナーゼ（ニーマン−ピック病）、アジポタイド（肥満）、アガルシダーゼ−ベータ（ヒトガラクトシダーゼＡ）（ファブリー病；腎臓及び心血管系合併症を引き起こす可能性のある脂質の蓄積を防ぐ）、アルグルコシダーゼ（ポンペ病（ＩＩ型糖原病））、アルファ−ガラクトシダーゼＡ（アルファ−ＧＡＬ  Ａ、アガルシダーゼアルファ）（ファブリー病）、アルファ−グルコシダーゼ（糖原病（ＧＳＤ）、ポンぺ病）、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ（ムコ多糖症（ＭＰＳ）、ハーラー症候群、シャイエ症候群）、アルファ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（サンフィリポ症候群）、アンフィレグリン（癌、代謝性疾患）、アンジオポエチン（（Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３、Ａｎｇ４、ＡＮＧＰＴＬ２、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ５、ＡＮＧＰＴＬ６、ＡＮＧＰＴＬ７）（血管新生、脈管を安定化させる）、ベータセルリン（代謝性疾患）、ベータ−グルクロニダーゼ（スライ症候群）、骨形成タンパク質ＢＭＰ（ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１５）（再生効果、骨関連症状、慢性腎疾患（ＣＫＤ））、ＣＬＮ６タンパク質（ＣＬＮ６疾患−不定型遅発性小児型、遅発性異型、早発性若年型、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ））、上皮成長因子（ＥＧＦ）（創傷治癒、細胞の成長、増殖、及び分化の制御）、エピゲン（代謝性疾患）、エピレギュリン（代謝性疾患）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２２、ＦＧＦ−２３）（創傷治癒、血管新生、内分泌疾患、組織再生）、ガルスルファーゼ（ムコ多糖症ＶＩ）、グレリン（過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、肥満、プラダー−ウィリー症候群、ＩＩ型糖尿病）、グルコセレブロシダーゼ（ゴーシェ病）、ＧＭ−ＣＳＦ（再生効果、白血球の産生、癌）、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）（創傷治癒、心臓肥大、並びに心臓の発生及び機能）、肝細胞成長因子ＨＧＦ（再生効果、創傷治癒）、ヘプシジン（鉄代謝障害、ベータ−サラセミア）、ヒトアルブミン（アルブミン産生の減少（低タンパク血症）、アルブミン喪失の増加（ネフローゼ症候群）、血液量減少、高ビリルビン血症）、イズルスルファーゼ（イズロン酸−２−スルファターゼ）（ムコ多糖症ＩＩ（ハンター症候群））、インテグリンαＶβ３、αＶβ５、及びα５β１（マトリクス高分子及びプロテイナーゼに結合、血管新生）、イズロン酸スルファターゼ（ハンター症候群）、ラロニダーゼ（ハーラー型及びハーラー−シャイエ型のムコ多糖症Ｉ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ｒｈＡＳＢ；ガルス���ファーゼ、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ））（アリールスルファターゼＢ欠乏症、マロトー−ラミー症候群、ムコ多糖症ＶＩ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ（サンフィリポ症候群）、神経成長因子（ＮＧＦ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、及びニューロトロフィン４／５（ＮＴ−４／５）（再生効果、心血管疾患、冠状動脈アテローム性硬化症、肥満、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、急性冠状動脈症候群、痴呆、鬱病、統合失調症、自閉症、レット症候群、神経性食欲不振症、神経性過食症、創傷治癒、皮膚潰瘍、角膜潰瘍、アルツハイマー病）、ニューレグリン（ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、ＮＲＧ４）（代謝性疾患、統合失調症）、ニューロピリン（ＮＲＰ−１、ＮＲＰ−２）（血管新生、軸索ガイダンス、細胞生存、遊走）、オベスタチン（過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、肥満、プラダー−ウィリー症候群、ＩＩ型糖尿病）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ（ＰＤＦＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ）（再生効果、創傷治癒、血管新生の障害、動脈硬化症、線維症、癌）、ＴＧＦベータ受容体（エンドグリン、ＴＧＦ−ベータ１受容体、ＴＧＦ−ベータ２受容体、ＴＧＦ−ベータ３受容体）（腎線維症、腎疾患、糖尿病、最後には末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、血管新生）、トロンボポイエチン（ＴＨＰＯ）（巨核球増殖発達因子（ＭＧＤＦ））（血小板疾患、輸血用血小板、骨髄抑制療法後の血小板数の回復）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ（ＴＧＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ（ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、及びＴＧＦベータ３）））（再生効果、創傷治癒、免疫、癌、心疾患、糖尿病、マルファン症候群、ロイス−ディーズ症候群）、ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ−Ｆ、及びＰＩＧＦ）（再生効果、血管新生、創傷治癒、癌、透過性）、ネシリチド（急性非代償性鬱血性心不全）、トリプシン（褥創、静脈瘤性潰瘍、焼痂デブリードマン、裂創、日焼け、胎便性イレウス）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）（「アディソン病、小細胞癌、副腎白質ジストロフィー、先天性副腎過形成、クッシング症候群、ネルソン症候群、点頭てんかん）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）（内分泌疾患）、コレシストキニン（多様）、ガストリン（高ガストリン血症）、レプチン（糖尿病、高トリグリセリド血症、肥満）、オキシトシン（母乳栄養を刺激、分娩の非進行）、ソマトスタチン（カルチノイド症候群の対症療法、急性静脈瘤出血、及び先端巨大症、肝臓及び腎臓の多嚢胞性疾患、先端巨大症、及び神経内分泌腫瘍によって引き起こされる症状）、バソプレシン（抗利尿ホルモン）（尿崩症）、カルシトニン（閉経後骨粗鬆症、高カルシウム血症、パジェット病、骨転移、幻肢痛、脊椎管狭窄症）、エクセナチド（メトホルミン及びスルホニルウレアによる治療に対して抵抗性である２型糖尿病）、成長ホルモン（ＧＨ）、ソマトトロピン（ＧＨ欠乏又は慢性腎不全による成長不全、プラダー−ウィリー症候群、ターナー症候群、抗ウイルス療法によるＡＩＤＳ消耗又は悪液質���、インスリン（糖尿病、糖尿病性ケトアシドーシス、高カリウム血症）、インスリン様成長因子１  ＩＧＦ−１（ＧＨ遺伝子欠損又は重症原発性ＩＧＦ１欠乏の小児における成長不全、神経変性疾患、心血管疾患、心不全）、メカセルミンリンファベート、ＩＧＦ−１アナログ（ＧＨ遺伝子欠損又は重症原発性ＩＧＦ１欠乏の小児における成長不全、神経変性疾患、心血管疾患、心不全）、メカセルミン、ＩＧＦ−１アナログ（ＧＨ遺伝子欠損又は重症原発性ＩＧＦ１欠乏の小児における成長不全、神経変性疾患、心血管疾患、心不全）、ペグビソマント（先端巨大症）、プラムリンタイド（糖尿病、インスリンと組み合わせる）、テリパラチド（ヒト副甲状腺ホルモン残基１−３４）（重症骨粗鬆症）、ベカプレルミン（糖尿病性潰瘍のデブリードマン補助）、ジボテルミン−アルファ（骨形成タンパク質２）（脊椎固定術、骨損傷修復）、酢酸ヒストレリン（性腺刺激ホルモン放出ホルモン；ＧｎＲＨ）（早発思春期）、オクトレオチド（先端巨大症、ＶＩＰ分泌線腫及び転移カルチノイド腫瘍の症状緩和）、及びパリフェルミン（ケラチノサイト成長因子；ＫＧＦ）（化学療法を受けている患者における重症口腔粘膜炎、創傷治癒）。
【０２９４】
これら及び他のタンパク質は、内因的に産生される欠陥のある機能的タンパク質を十分な量置き換えることによって被験体を治療することを意味するので、治療用であると理解される。したがって、かかる治療用タンパク質は、典型的に、哺乳類、特にヒトのタンパク質である。
【０２９５】
血液疾患、循環系の疾患、呼吸器系の疾患、癌若しくは腫瘍疾患、感染性疾患、又は免疫不全の治療のために、以下の治療用タンパク質を用いてよい：アルテプラーゼ（組織プラスミノーゲン活性化因子；ｔＰＡ）（肺塞栓症、心筋梗塞、急性虚血発作、中心静脈アクセス装置の閉塞）、アニストレプラーゼ（血栓溶解）、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）（遺伝性ＡＴ−ＩＩＩ欠乏、血栓塞栓症）、ビバリルジン（冠状動脈形成術における血液凝固リスクの低減及びヘパリン誘発性血小板減少症）、ダルベポエチン−アルファ（慢性腎機能不全及び慢性腎不全の患者における貧血の治療（＋／−透析））、ドロトレコギン−アルファ（活性化プロテインＣ）（死亡のリスクが高い重症敗血症）、エリスロポイエチン、エポエチン−アルファ、エリスロポエチン、エリスロポイエチン（慢性疾患の貧血、脊髄形成異常症、腎不全又は化学療法による貧血、術前調製）、第ＩＸ因子（血友病Ｂ）、第ＶＩＩａ因子（血友病Ａ又はＢの患者における出血、及び第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子の阻害剤）、第ＶＩＩＩ因子（血友病Ａ）、レピルジン（ヘパリン誘発性血小板減少症）、プロテインＣ濃縮物（静脈血栓、電撃性紫斑病）、レテプラーゼ（ｔＰＡの欠損変異体）（急性心筋梗塞の管理、心室機能の改善）、ストレプトキナーゼ（急性貫壁性心筋梗塞、肺塞栓症、深部静脈血栓、動脈血栓又は塞栓症、動静脈カニューレの閉塞）、テネクテプラーゼ（急性心筋梗塞）、ウロキナーゼ（肺塞栓症）、アンギオスタチン（癌）、抗ＣＤ２２免疫毒素（再発性ＣＤ３３＋急性骨髄性白血病）、デニロイキンジフチトクス（皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ））、イムノシアニン（膀胱及び前立腺癌）、ＭＰＳ（メタロパンスチムリン）（癌）、アフリバーセプト（非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、転移性結直腸癌（ｍＣＲＣ）、ホルモン抵抗性転移性前立腺癌、滲出型黄斑変性症）、エンドスタチン（癌、関節リウマチ等の炎症性疾患に加えてクローン病、糖尿病性網膜症、乾癬、及び子宮内膜症）、コラゲナーゼ（慢性皮膚潰瘍及び重篤な焼損領域のデブリードマン、デュピュイトラン拘縮、ペイロニー病）、ヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ、ドルナーゼ（嚢胞性線維症；ＦＶＣが４０％超と予測される選択された患者における気道感染症の減少）、ヒアルロニダーゼ（注入された薬物、特に眼科手術における麻酔薬及び特定のイメージング剤の吸収及び分散を増加させる補助剤として使用される）、パパイン（壊死組織のデブリードマン、又は褥瘡、静脈瘤性潰瘍及び糖尿病性潰瘍、火傷、術後創、毛巣嚢胞創傷、癰、及び他の創傷等の急性及び慢性病変における瘡蓋の液化）、Ｌ−アスパラギナーゼ（急性リンパ性白血病、増殖に内因性アスパラギンを必要とする）、Ｐｅｇ−アスパラギナーゼ（急性リンパ性白血病、増殖に内因性アスパラギンを必要とする）、ラスブリカーゼ（腫瘍崩壊症候群を引き起こす可能性のある抗癌療法を受けている白血病、リンパ腫、及び固形腫瘍の小児患者）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）（生殖補助）、ヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）（生殖補助）、ルトロピン−アルファ（黄体形成ホルモン欠乏による不妊）、プロラクチン（低プロラクチン血症、血清プロラクチン欠乏、女性の卵巣機能不全、不安症、動脈性勃起不全、精液早漏、乏精子症、精子無力症、精嚢の機能低下、男性の低アンドロゲン症）、アルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤（先天性抗トリプシン欠乏症）、ラクターゼ（ラクトースを消化できないことによるガス、膨満感、痙攣、及び下痢）、膵臓酵素（リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ）（嚢胞性線維症、慢性膵炎、膵不全、ビルロートＩＩ法胃バイパス手術後、膵管閉塞、脂肪便、消化不良、ガス、膨満感）、アデノシンデアミナーゼ（ウシペガデマーゼ、ＰＥＧ−ＡＤＡ）（アデノシンデアミナーゼ欠乏による重症複合免疫不全症）、アバタセプト（関節リウマチ（特に、ＴＮＦアルファ阻害に対して不応である場合））、アレファセプト（尋常性乾癬）、アナキンラ（関節リウマチ）、エタネルセプト（関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、尋常性乾癬、強直性脊椎炎）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体アンタゴニスト、アナキンラ（関節リウマチに関連する炎症及び軟骨分解）、チムリン（神経変性疾患、リウマチ、神経性食欲不振症）、ＴＮＦ−アルファアンタゴニスト（関節リウマチ、強直性脊椎炎、クローン病、乾癬、化膿性汗腺炎、難治性喘息等の自己免疫疾患）、エンフビルチド（ＨＩＶ−１感染症）、及びチモシンα１（Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎）。（括弧内は、治療用タンパク質が治療で用いられる具体的な疾患である）。
【０２９６】
更なる態様では、本発明は、
ａ．オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及び／又は例えば、オープンリーディングフレーム若しくはオープンリーディングフレームを含む配列を挿入するためのクローニングサイトと、
ｂ．少なくとも１つの３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）及び／又は少なくとも１つの５’−非翻訳領域エレメント（５’−ＵＴＲエレメント）とを含み、前記人工核酸分子が高い翻訳効率によって特徴付けられるベクターを提供する。
【０２９７】
一般的に、本発明に係るベクターは、上記本発明に係る人工核酸分子を含んでいてよい。特に、本発明に係る人工核酸分子について上に記載した好ましい実施形態は、本発明に係るベクターに含まれる本発明に係る人工核酸分子にも当てはまる。例えば、本発明のベクターでは、少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントとＯＲＦとは、好ましい実施形態を含む、本発明に係る人工核酸分子について上に記載した通りである。例えば、本発明に係るベクターでは、少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントが由来する安定なｍＲＮＡは、好ましくは、第１の時点における前記ｍＲＮＡの量に対する第２の時点における前記ｍＲＮＡの量の比が少なくとも０．５（５０％）、少なくとも０．６（６０％）、少なくとも０．７（７０％）、少なくとも０．７５（７５％）、少なくとも０．８（８０％）、少なくとも０．８５（８５％）、少なくとも０．９（９０％）、又は少なくとも０．９５（９５％）であるｍＲＮＡ分解を特徴とし得る。
【０２９８】
クローニングサイトは、オープンリーディングフレームを導入するのに好適な任意の配列又はオープンリーディングフレームを含む配列、例えば、１以上の制限酵素部位等であってよい。したがって、クローニングサイトを含むベクターは、好ましくは、オープンリーディングフレームをベクターに挿入するのに好適である。好ましくは、オープンリーディングフレームを５’−ＵＴＲエレメントの３’側に及び／又は３’−ＵＴＲエレメントの５’側に挿入するのに好適である。好ましくは、クローニングサイト又はＯＲＦは、５’−ＵＴＲエレメントの３’側に及び／又は３’−ＵＴＲエレメントの５’側に、好ましくは５’−ＵＴＲエレメントの３’末端に及び／又は３’−ＵＴＲエレメントの５’末端に近接して位置する。例えば、クローニングサイト又はＯＲＦは、５’−ＵＴＲエレメントの３’末端に及び／又は３’−ＵＴＲエレメントの５’末端に直接連結していてもよく、本発明に係る人工核酸分子について上記した通り一続きのヌクレオチド（例えば、一続きの２ヌクレオチド、４ヌクレオチド、６ヌクレオチド、８ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド等）を介して連結していてもよい。
【０２９９】
好ましくは、本発明に係るベクターは、例えば、任意でオープンリーディングフレーム又はオープンリーディングフレームを含む配列をベクターに挿入し、前記ベクターを転写することによって、本発明に係る人工核酸分子を作製するのに、好ましくは、本発明に係る人工ｍＲＮＡを作製するのに好適である。したがって、好ましくは、ベクターは、プロモータ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼプロモータ）等の転写に必要なエレメントを含む。好ましくは、ベクターは、真核生物、原核生物、ウイルス若しくはファージの転写系（例えば、真核細胞、原核細胞等）、又は真核生物、原核生物、ウイルス、若しくはファージのインビトロ転写系を用いる転写に好適である。したがって、例えば、ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ（例えば、真核生物、原核生物、ウイルス、又はファージのＲＮＡポリメラーゼ）によって認識されるプロモータ配列を含んでいてよい。好ましい実施形態では、ベクターは、ＳＰ６、Ｔ３、又はＴ７等のファージＲＮＡポリメラーゼプロモータ、好ましくはＴ７プロモータを含む。好ましくは、ベクターは、ファージに基づくインビトロ転写系（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに基づくインビトロ転写系等）を用いるインビトロ転写に好適である。別の好ましい実施形態では、ベクターは、コードされているペプチド又はタンパク質を細胞又は組織で発現させるために直接用いてよい。この目的のために、ベクターは、例えば、ＣＭＶプロモータ等の特定のプロモータ配列等、その細胞／組織における発現に必須の特定のエレメントを含む。
【０３００】
ベクターは、本発明に係る人工核酸分子について上記した通りポリ（Ａ）配列及び／又はポリアデニル化シグナルを更に含んでいてよい。
【０３０１】
ベクターは、ＲＮＡベクターであってもよく、ＤＮＡベクターであってもよい。好ましくは、ベクターは、ＤＮＡベクターである。ベクターは、ウイルスベクター又はプラスミドベクター等の当業者に公知の任意のベクターであってよい。好ましくは、ベクターは、プラスミドベクター、好ましくはＤＮＡプラスミドベクターである。
【０３０２】
好ましい実施形態では、本発明に係るベクターは、本発明に係る人工核酸分子を含む。
【０３０３】
好ましくは、本発明に係るＤＮＡベクターは、配列番号１５２〜２０４に係る核酸配列等、遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲの核酸配列に対して少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは１００％の同一性を有する核酸配列を含む。
【０３０４】
好ましくは、本発明に係るＤＮＡベクターは、配列番号１〜１５１に係る核酸配列等、遺伝子の転写物の５’−ＵＴＲエレメントの核酸配列に対して少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは１００％の同一性を有する核酸配列を含む。
【０３０５】
好ましくは、本発明に係るＤＮＡベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号１３７（又は配列番号３）、配列番号１３８（又は配列番号９）、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１４０（又は配列番号１７）、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号１４３（又は配列番号３１）、配列番号３２、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４４、配列番号４５、配列番号１４６（又は配列番号５２）、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５７、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号１４４（又は配列番号４２）、配列番号５８、配列番号６２、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１４７（又は配列番号１０９）、配列番号１４８（又は配列番号１１０）、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１４９（又は配列番号１１９）、配列番号１２３、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１５１（又は配列番号１３６）、配列番号９６、配列番号１１１、配列番号１５０（配列番号１２０に基づく）、配列番号１２１、配列番号１２４、配列番号１２５で表される５’−ＵＴＲエレメント、及び配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号２０４（又は配列番号１９２）、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号１７７で表される３’−ＵＴＲエレメントに係るＤＮＡ配列からなる群から選択される配列、又は前記配列のいずれかに係るＤＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、又は上記これらの断片、好ましくはこれらの機能的断片を含む。
【０３０６】
好ましくは、本発明に係るＲＮＡベクターは、本発明に係るＤＮＡベクターに関連して上に記載したＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列に係る配列からなる群から選択される配列を含む。
【０３０７】
好ましくは、ベクターは、環状分子である。好ましくは、ベクターは、二本鎖ＤＮＡ分子等の二本鎖分子である。かかる環状の、好ましくは二本鎖のＤＮＡ分子は、本発明の人工核酸分子の保管形態として便利に用いることができる。更に、細胞、例えば培養細胞のトランスフェクションに用いることができる。また、本発明に係る人工ＲＮＡ分子を得るためのインビトロ転写に用いることができる。
【０３０８】
好ましくは、ベクター、好ましくは環状ベクターは、例えば、制限酵素で切断することによって線形にすることができる。好ましい実施形態では、ベクターは、ＯＲＦの直ぐ３’側、又は（存在する場合）、３’−ＵＴＲエレメントの直ぐ３’側、又は（存在する場合）ポリ（Ａ）配列若しくはポリアデニル化シグナルの３’側、又は（存在する場合）ポリ（Ｃ）配列の３’側、又は（存在する場合）ヒストンステムループの３’側に位置する制限酵素部位等の切断部位、好ましくは唯一の切断部位を含む。したがって、好ましくは、ベクターの線形化によって得られる生成物は、３’末端において、ＯＲＦの３’末端、又は（存在する場合）３’−ＵＴＲエレメントの３’末端、又は（存在する場合）ポリ（Ａ）配列若しくはポリアデニル化シグナルの３’末端、又は（存在する場合）ポリ（Ｃ）配列の３’末端で終結する。本発明に係るベクターが、本発明に係る人工核酸分子を含む実施形態では、制限酵素部位、好ましくは唯一の制限酵素部位が、人工核酸分子の３’末端の直ぐ３’側に位置することが好ましい。
【０３０９】
更なる態様では、本発明は、本発明に係る人工核酸分子又は本発明に係るベクターを含む細胞に関する。前記細胞は、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、脊椎動物細胞（例えば、哺乳類細胞）等の任意の細胞であってよい。かかる細胞は、例えば、細菌細胞において本発明のベクターを複製するために用いることができる。更に、前記細胞は、本発明に係る人工核酸分子若しくはベクターを転写するため、及び／又は本発明に係る人工核酸分子若しくはベクターのオープンリーディングフレームを翻訳するために用いることができる。例えば、前記細胞は、組み換えタンパク質を産生するために用いることができる。
【０３１０】
本発明に係る細胞は、例えば、標準的なトランスフェクション、形質移入、又は形質転換の方法等の標準的な核酸移入法によって得ることができる。例えば、本発明に係る人工核酸分子又はベクターは、エレクトロポレーション、（例えば、カチオン性脂質及び／又はリポソームに基づく）リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ナノ粒子に基づくトランスフェクション、ウイルスに基づくトランスフェクション、又はカチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン又はポリエチレンイミン等）に基づくトランスフェクション等によって細胞に移入してよい。
【０３１１】
好ましくは、前記細胞は、哺乳類細胞、例えば、ヒト被験体、家畜、実験動物（例えば、マウス又はラット）の細胞等である。好ましくは、前記細胞は、ヒトの細胞である。前記細胞は、確立されている細胞株の細胞、例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３Ｔ、ＣＯＳ−７、ＨｅＬａ、ＨＥＰＧ２、ＨＥＫ等であってもよく、初代細胞、例えば、ヒト皮膚線維芽（ＨＤＦ）細胞等であってもよい。好ましくは、生物から単離された細胞である。好ましい実施形態では、前記細胞は、哺乳類の被験体、好ましくはヒトの被験体の単離細胞である。例えば、前記細胞は、好ましくは哺乳類の被験体、好ましくはヒトの被験体の免疫細胞（例えば、樹状細胞）、癌細胞若しくは腫瘍細胞、又は任意の体細胞等であってよい。
【０３１２】
更なる態様では、本発明は、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、又は本発明に係る細胞を含む医薬組成物を提供する。本発明に係る医薬組成物は、例えば、遺伝子ワクチン接種用のワクチンとして用いてよい。したがって、ＯＲＦは、ワクチン接種のために患者に投与される抗原をコードしていてよい。したがって、好ましい実施形態では、本発明に係る医薬組成物は、ワクチンである。更に、本発明に係る医薬組成物は、例えば、遺伝子治療に用いることができる。
【０３１３】
好ましくは、医薬組成物は、更に、１以上の薬学的に許容できるビヒクル、希釈剤、及び／又は賦形剤、及び／又は１以上の補助剤を含んでいてよい。本発明では、薬学的に許容できるビヒクルは、典型的に、本発明の医薬組成物用の液体又は非液体の基剤を含む。１つの実施形態では、医薬組成物は、液体形態で提供される。これに関連して、前記ビヒクルは、好ましくは、パイロジェンフリー水、等張生理食塩水又は緩衝（水）溶液、例えば、リン酸、クエン酸等のバッファ溶液等の水に基づく。バッファは、特定のレファレンス媒体に対して高張、等張、又は低張であってよい。即ち、前記バッファは、特定のレファレンス媒体に対してより高い、同一の、又はより低い塩含量を有してよく、好ましくは、浸透圧又は他の濃度効果により哺乳類細胞を損傷させない濃度の前述の塩を用いてよい。レファレンス媒体は、例えば、血液、リンパ液、サイトゾル液、若しくは他の体液等の「インビボ」法で用いられる液体であるか、又は一般的なバッファ若しくは液体等の「インビトロ」法でレファレンス媒体として用いることができる液体である。かかる一般的なバッファ又は液体は、当業者に公知である。乳酸リンゲル液が、液体基剤として特に好ましい。
【０３１４】
本発明の医薬組成物のために、患者に投与するのに適している１以上の相溶性の固体又は液体の充填剤又は希釈剤、或いは封入化合物を同様に用いてもよい。用語「相溶性」とは、本明細書で使用するとき、好ましくは、典型的な使用条件下で本発明の医薬組成物の薬学的有効性を実質的に低減させる相互作用が生じないように、本発明の医薬組成物のこれら成分と本明細書に定義する本発明の人工核酸、ベクター、又は細胞とを混合できることを意味する。
【０３１５】
本発明に係る医薬組成物は、任意で、１以上の更なる医薬活性成分を更に含んでいてよい。これに関連して医薬活性成分とは、特定の適応症又は疾患を治癒させる、寛解させる、又は予防する治療効果を示す化合物である。前記化合物としては、限定するものではないが、ペプチド又はタンパク質、核酸、（治療的に活性のある）低分子量の有機化合物又は無機化合物（分子量：５，０００未満、好ましくは１，０００未満）、糖類、抗原又は抗体、関連技術において既に知られている治療剤、抗原細胞、抗原細胞断片、細胞画分、細胞壁成分（例えば、多糖類）、（例えば、化学的に又は放射線照射により）改変、弱毒化、又は不活化された病原体（ウイルス、細菌等）等が挙げられる。
【０３１６】
更に、本発明の医薬組成物は、人工核酸分子又はベクター用の担体を含んでいてよい。かかる担体は、医薬的に活性のある人工核酸分子又はベクターの生理学的に許容できる液体への溶解、輸送、及び細胞内取り込みを媒介するのに好適であり得る。したがって、かかる担体は、本発明に係る人工核酸分子又はベクターのデポー製剤及び送達に好適であり得る成分であってよい。かかる成分は、例えば、トランスフェクション剤又は複合体化剤として機能し得るカチオン性又はポリカチオン性の担体又は化合物であってよい。
【０３１７】
本発明に係る好ましい実施形態では、人工核酸分子又はベクターは、１以上のカチオン性又はポリカチオン性化合物、好ましくはカチオン性若しくはポリカチオン性ポリマー、カチオン性若しくはポリカチオン性ペプチド若しくはタンパク質、例えば、プロタミン、カチオン性若しくはポリカチオン性多糖類、及び／又はカチオン性若しくはポリカチオン性脂質と複合体化される。
【０３１８】
好ましい実施形態によれば、人工核酸分子又はベクターは、１以上のリポソーム、リポプレックス、又は脂質ナノ粒子を形成するために脂質と複合体化され得る。したがって、一実施形態では、本発明の医薬組成物は、人工核酸分子又はベクター、好ましくはＲＮＡ、より好ましくはｍＲＮＡを含むリポソーム、リポプレックス、及び／又は脂質ナノ粒子を含む。
【０３１９】
脂質ベースの製剤は、その生体適合性及び大規模生産の容易さから、核酸、特にＲＮＡの最も有望な送達系の１つとして次第に認識されてきている。カチオン性脂質は、ＲＮＡを送達するための合成物質として広く研究されている。互いに混合した後、核酸をカチオン性脂質によって縮合させて、リポプレックスとして知られている脂質／核酸を形成する。これら脂質複合体は、ヌクレアーゼの作用から遺伝物質を保護し、負に帯電している細胞膜と相互作用することによって前記遺伝物質を細胞に送達することができる。リポプレックスは、生理学的ｐＨにおいて正に帯電している脂質を負に帯電している核酸と直接混合することによって調製することができる。
【０３２０】
従来のリポソームは、カチオン性、アニオン性、又は中性の（リン）脂質及びコレステロールで構成され得る脂質二重層からなり、これが水性コアを封入する。脂質二重層及び水性空間はいずれも、それぞれ、疎水性又は親水性の化合物を組み込むことができる。リポソーム表面に親水性ポリマーコーティング、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を付加することによって、インビボにおけるリポソームの特徴及び挙動を改変して、立体安定性を付与することができる。更に、リガンド（例えば、抗体、ペプチド、及び炭水化物）をリポソームの表面又は結合するＰＥＧ鎖の末端に結合させることによって、特異的ターゲティングのためにリポソームを使用することもできる（Ｆｒｏｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１５  Ｄｅｃ  １；６：２８６）。
【０３２１】
リポソームは、典型的には、水性コンパートメントを取り囲むリン脂質二重層で構成されるコロイド脂質ベース及び界面活性剤ベースの送達系である。リポソームは、球形ベシクルとして存在し得、２０ｎｍから数マイクロメートルのサイズ範囲であり得る。カチオン性脂質ベースのリポソームは、静電相互作用を介して負に帯電している核酸と複合体化することができ、その結果、生体適合性、低毒性、及びインビボ臨床応用に必要な大規模生産の可能性を与える複合体が得られる。リポソームは、取り込みのために原形質膜と融合し得；一旦細胞の内部に入ると、リポソームはエンドサイトーシス経路を介して処理され、次いで、エンドソーム／キャリアから遺伝物質が原形質に放出される。リポソームは、その優れた生体適合性により長年に亘って薬物送達ビヒクルとして認知されており、リポソームが基本的に生体膜のアナログであると仮定すると、天然及び合成リン脂質から調製することができる（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１４；９：１８３３−１８４３）。
【０３２２】
カチオン性リポソームは、従来より、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴ、及びｓｉＲＮＡ／低分子ヘアピン型ＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ）を含むオリゴヌクレオチドに最も一般的に使用されている非ウイルス送達系である。カチオン性脂質、例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン）及びＤＯＴＭＡ（（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルサルファート）は、負に帯電している核酸と複合体又はリポプレックスを形成し、静電相互作用によってナノ粒子を形成することができるので、高いインビトロトランスフェクション効率を与える。更に、例えば中性１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）ベースのナノリポソームとして、ＲＮＡ送達用の中性脂質ベースのナノリポソームが開発された（Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２０１４  Ｆｅｂ；６６：１１０−１１６．）。
【０３２３】
したがって、一実施形態では、本発明に係る医薬組成物の人工核酸分子又はベクター、好ましくはＲＮＡは、カチオン性脂質及び／又は中性脂質と複合体化され、それによって、リポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックス、又は中性脂質ベースのナノリポソームを形成する。
【０３２４】
更なる実施形態においては、特に好ましいトランスフェクション剤又は複合体化剤は、カチオン性又はポリカチオン性の化合物であり、例えば、プロタミン、ヌクレオリン、スペルミン若しくはスペルミジン、又は他のカチオン性のペプチド又はタンパク質（例えば、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン、塩基性ポリペプチド、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）（ＨＩＶ結合ペプチド、ＨＩＶ−１  Ｔａｔ（ＨＩＶ）、Ｔａｔ由来ペプチド、ペネトラチン、ＶＰ２２由来ペプチド又はアナログペプチドを含む）、ＨＳＶ  ＶＰ２２（単純ヘルペス）、ＭＡＰ、ＫＡＬＡ、又はタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、ＰｐＴ６２０、プロリンリッチペプチド、アルギニンリッチペプチド、リシンリッチペプチド、ＭＰＧ−ペプチド、Ｐｅｐ−１、Ｌ−オリゴマー、カルシトニンペプチド、アンテナペディア由来ペプチド（特に、ショウジョウバエのアンテナペディア由来）、ｐＡｎｔｐ、ｐＩｓｌ、ＦＧＦ、ラクトフェリン、トランスポータン、ブフォリン−２、Ｂａｃ７１５−２４、ＳｙｎＢ、ＳｙｎＢ（１）、ｐＶＥＣ、ｈＣＴ由来ペプチド、ＳＡＰ、又はヒストン）が挙げられる。
【０３２５】
更に、かかるカチオン性又はポリカチオン性の化合物又は担体は、好ましくは少なくとも１つの−ＳＨ部分を含むか又は含むように更に改変されているカチオン性又はポリカチオン性のペプチド又はタンパク質であってよい。好ましくは、カチオン性又はポリカチオン性の担体は、以下の合計式（Ｉ）を有するカチオン性ペプチドから選択される：
｛（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ｝；式（Ｉ）
（式中、ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｘは、３〜１００であり、ｌ、ｍ、ｎ、又はｏは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９０、及び９１〜１００から選択される任意の数であるが、但し、Ａｒｇ（アルギニン）、Ｌｙｓ（リジン）、Ｈｉｓ（ヒスチジン）及びＯｒｎ（オルニチン）の総含量は、オリゴペプチドの全アミノ酸の少なくとも１０％であり；Ｘａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＯｒｎを除くネイティブ（即ち、天然）又は非ネイティブなアミノ酸から選択される任意のアミノ酸であり；ｘは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９０から選択される任意の数であるが、但し、Ｘａａの総含量は、オリゴペプチドの全アミノ酸の９０％を超えない）。アミノ酸Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ、及びＸａａはいずれも、ペプチドの任意の位置に位置してよい。これに関連して、７アミノ酸〜３０アミノ酸のカチオン性ペプチド又はタンパク質が特に好ましい。好ましいカチオン性ペプチド及びタンパク質は、その開示内容を参照により本明細書に援用する国際特許出願ＷＯ２００９／０３０４８１号にも記載されている。
【０３２６】
更に、カチオン性又はポリカチオン性のペプチド又はタンパク質は、上に示す通り、式｛（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ｝（式（Ｉ））に従って定義され、少なくとも１つの−ＳＨ部分を含むか又は含むように更に改変されているとき、限定されるものではないが、部分式（Ｉａ）から選択してよい：
｛（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ’）ｘ（Ｃｙｓ）ｙ｝  部分式（Ｉａ）
（式中、（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；及びｘは、本明細書に定義する通りであり、Ｘａａ’は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ、又はＣｙｓを除くネイティブ（即ち、天然）又は非ネイティブなアミノ酸から選択される任意のアミノ酸であり、ｙは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９０から選択される任意の数であるが、但し、Ａｒｇ（アルギニン）、Ｌｙｓ（リジン）、Ｈｉｓ（ヒスチジン）及びＯｒｎ（オルニチン）の総含量は、オリゴペプチドの全アミノ酸の少なくとも１０％である）。この状況において、国際公開第２０１２／０１３３２６号の開示内容を、参照により本明細書に援用する。更に、カチオン性又はポリカチオン性のペプチドは、部分式（Ｉｂ）から選択してよい：
Ｃｙｓ１｛（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ｝Ｃｙｓ２  部分式（Ｉｂ）
（式中、経験式｛（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ｝（式（ＩＩＩ））は、本明細書に定義する通りであり、（半経験）式（ＩＩＩ）に係るアミノ酸配列のコアを形成し、Ｃｙｓ１及びＣｙｓ２は、（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘに近接するか又は末端に存在するシステインである）。この状況において、国際公開第２０１１／０２６６４１号の開示内容を、参照により本明細書に援用する。
【０３２７】
トランスフェクション剤又は複合体化剤として用いることができる更に好ましいカチオン性又はポリカチオン性の化合物は、カチオン性多糖類（例えば、キトサン）、ポリブレン、カチオン性ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ））、カチオン性脂質（例えば、ＤＯＴＭＡ：［１−（２，３−シオレイルオキシ）プロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、ＤＭＲＩＥ、ジ−Ｃ１４−アミジン、ＤＯＴＩＭ、ＳＡＩＮＴ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＢＧＴＣ、ＣＴＡＰ、ＤＯＰＣ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ：ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＤＡＢ、ＤＯＩＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＯＧＳ：ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、ＤＩＭＲＩ：ジミリスト−オキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ＤＯＴＡＰ：ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン、ＤＣ−６−１４：Ｏ，Ｏ−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド、ＣＬＩＰ１：ｒａｃ−［（２，３−ジオクタデシルオキシプロピル）（２−ヒドロキシエチル）］−ジメチルアンモニウムクロリド、ＣＬＩＰ６：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシメチルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム、ＣＬＩＰ９：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシスクシニルオキシ）エチル］−トリメチルアンモニウム、オリゴフェクタミン、又はカチオン性若しくはポリカチオン性のポリマー（例えば、β−アミノ酸ポリマー又は逆ポリアミド等の修飾ポリアミノ酸；ＰＶＰ（ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムブロミド））等の修飾ポリエチレン；ｐＤＭＡＥＭＡ（ポリ（ジメチルアミノエチルメチルメタクリラート））等の修飾アクリラート；ｐＡＭＡＭ（ポリ（アミドアミン））等の修飾アミドアミン；ジアミン末端修飾１，４ブタンジオールジアクリラート−ｃｏ−５−アミノ−１−ペンタノールポリマー等の修飾ポリベータアミノエステル（ＰＢＡＥ）；ポリプロピルアミンデンドリマー又はｐＡＭＡＭ系デンドリマー等のデンドリマー；ＰＥＩ：ポリ（エチレンイミン）、ポリ（プロピレンイミン）等のポリイミン；ポリアリルアミン；シクロデキストリン系ポリマー、デキストラン系ポリマー、キトサン等の糖骨格系ポリマー；ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳコポリマー等のシラン骨格系ポリマー）、１以上のカチオン性ブロック（例えば、上述のカチオン性ポリマーから選択される）と１以上の親水性又は疎水性のブロックとの組合せからなるブロックポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）等を含んでいてよい。
【０３２８】
別の実施形態によれば、本発明に係る医薬組成物は、医薬組成物の免疫賦活性を増強するために、アジュバントを含んでよい。この状況では、アジュバントは、本発明に係る医薬組成物に含まれる人工核酸分子又はベクター等の成分の投与及び送達を支援するのに好適な任意の化合物として理解してよい。更に、かかるアジュバントは、理論に束縛されるものではないが、自然免疫系の免疫応答、即ち、非特異的免疫応答を開始又は増大させることができる。言い換えれば、投与したとき、本発明に係る医薬組成物は、典型的に、人工核酸分子によってコードされている抗原に対する適応免疫応答を開始させる。更に、本発明に係る医薬組成物は、本発明に定義するアジュバントを本発明に係る医薬組成物に添加することにより、（支持的）自然免疫応答を発生させることができる。
【０３２９】
かかるアジュバントは、当業者に公知であり且つ本発明の場合に好適な、即ち、哺乳類における免疫応答の誘導を支援する任意のアジュバントから選択してよい。好ましくは、アジュバントは、ＴＤＭ、ＭＤＰ、ムラミルジペプチド、プルロニック、アルム溶液、水酸化アルミニウム、ＡＤＪＵＭＥＲ（登録商標）（ポリホスファゼン）、リン酸アルミニウムゲル、藻類由来のグルカン、アルガミュリン（ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ）、水酸化アルミニウムゲル（アルム）、高タンパク質吸着性水酸化アルミニウムゲル、低粘度水酸化アルミニウムゲル、ＡＦ又はＳＰＴ（スクアレン（５％）、Ｔｗｅｅｎ８０（０．２％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１（１．２５％）、リン酸緩衝生理食塩水のエマルジョン、ｐＨ７．４）、ＡＶＲＩＤＩＮＥ（商標）（プロパンジアミン）、ＢＡＹ  Ｒ１００５（登録商標）（（Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−ｂ−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシル−ドデカノイル−アミドヒドロアセタート）、ＣＡＬＣＩＴＲＩＯＬ（商標）（１−アルファ，２５−ジヒドロキシ−ビタミンＤ３）、リン酸カルシウムゲル、ＣＡＰ（商標）（リン酸カルシウムナノ粒子）、コレラホロトキシン、コレラ毒素Ａ１−プロテインＡ−Ｄ断片融合タンパク質、コレラ毒素のＢサブユニット、ＣＲＬ１００５（ブロックコポリマーＰ１２０５）、サイトカイン含有リポソーム、ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン）、ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）、ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）、ＤＯＣ／アルム複合体（デオキシコール酸ナトリウム塩）、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ガンマイヌリン、Ｇｅｒｂｕアジュバント（以下の混合物：ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミニル−（Ｐ１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄグルタミン（ＧＭＤＰ）、ｉｉ）ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド（ＤＤＡ）、ｉｉｉ）亜鉛Ｌ−プロリン塩複合体（ＺｎＰｒｏ−８））、ＧＭ−ＣＳＦ）、ＧＭＤＰ（Ｎ−アセチルグルコサミニル−（ｂ１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌアラニル−Ｄ−イソグルタミン）、イミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（１−（２−メチプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン）、ＩｍｍＴｈｅｒ（商標）（Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−イソＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−グリセロールジパルミタート）、ＤＲＶ類（脱水−再水和小胞から調製した免疫リポソーム）、インターフェロン−ガンマ、インターロイキン−１ベータ、インターロイキン−２、インターロイキン−７、インターロイキン−１２、ＩＳＣＯＭＳ（商標）、ＩＳＣＯＰＲＥＰ７．０．３．（商標）、リポソーム、ＬＯＸＯＲＩＢＩＮＥ（商標）（７−アリル−８−オキソグアノシン）、ＬＴ経口アジュバント（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性内毒素プロトキシン）、任意の組成物のミクロスフェア及びミクロ粒子、ＭＦ５９（商標）、（スクアレン水エマルジョン）、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ５１（商標）（精製不完全フロイントアジュバント）、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ７���０（商標）（代謝可能油アジュバント）、ＭＰＬ（商標）（３−Ｑ−デスアシル−４’−モノホスホリル脂質Ａ）、ＭＴＰ−ＰＥ及びＭＴＰ−ＰＥリポソーム（（Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−（ヒドロキシホスホリルオキシ））−エチルアミド、一ナトリウム塩）、ＭＵＲＡＭＥＴＩＤＥ（商標）（Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｎ−ＯＣＨ３）、ＭＵＲＡＰＡＬＭＩＴＩＮＥ（商標）及びＤＭＵＲＡＰＡＬＭＩＴＩＮＥ（商標）（Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｄ−イソＧｌｎ−ｓｎ−グリセロールジパルミトイル）、ＮＡＧＯ（ノイラミニダーゼ−ガラクトースオキシダーゼ）、任意の組成物のナノスフェア又はナノ粒子、ＮＩＳＶ類（非イオン性界面活性剤小胞）、ＰＬＥＵＲＡＮ（商標）（−グルカン）、ＰＬＧＡ、ＰＧＡ及びＰＬＡ（乳酸及びグリコール酸のホモポリマー及びコポリマー、ミクロスフェア／ナノスフェア）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｌ１２１（商標）、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリラート）、ＰＯＤＤＳ（商標）（プロテイノイドミクロスフェア）、ポリエチレンカルバマート誘導体、ポリ−ｒＡ：ポリ−ｒＵ（ポリアデニル酸−ポリウリジル酸複合体）、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、渦巻き型タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｃｈｌｅａｔｅｓ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ））、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）（ＱＳ−２１）、Ｑｕｉｌ−Ａ（Ｑｕｉｌ−Ａサポニン）、Ｓ−２８４６３（４−アミノ−オテック−ジメチル−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール）、ＳＡＦ−１（商標）（「Ｓｙｎｔｅｘアジュバント配合物」）、センダイプロテオリポソーム及びセンダイ含有脂質マトリックス、Ｓｐａｎ−８５（トリオレイン酸ソルビタン）、Ｓｐｅｃｏｌ（Ｍａｒｃｏｌ５２、Ｓｐａｎ８５、及びＴｗｅｅｎ８５のエマルジョン）、スクアレン又はＲｏｂａｎｅ（登録商標）（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチルテトラコサン及び２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサン）、ステアリルチロシン（オクタデシルチロシンヒドロクロリド）、Ｔｈｅｒａｍｉｄ（登録商標）（Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−イソＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド）、スレオニル−ＭＤＰ（Ｔｅｒｍｕｒｔｉｄｅ（商標）又は［ｔｈｒ１］−ＭＤＰ、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン）、Ｔｙ粒子（Ｔｙ−ＶＬＰ又はウイルス様粒子）；Ｗａｌｔｅｒ−Ｒｅｅｄリポソーム（水酸化アルミニウムに吸着させた脂質Ａを含有するリポソーム）及びリポペプチド（Ｐａｍ３Ｃｙｓを含む）、特に、Ａｄｊｕ−ｐｈｏｓ、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ及びＲｅｈｙｄｒａｇｅｌ等のアルミニウム塩；ＣＦＡ、ＳＡＦ、ＩＦＡ、ＭＦ５９、Ｐｒｏｖａｘ、ＴｉｔｅｒＭａｘ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎを含むエマルジョン；Ｏｐｔｉｖａｘ（ＣＲＬ１００５）、Ｌ１２１、及びＰｏｌｏａｘｍｅｒ４０１０を含むコポリマー；Ｓｔｅａ��ｔｈを含むリポソーム、ＢＩＯＲＡＬを含む渦巻き型のもの；ＱＳ２１、Ｑｕｉｌ  Ａ、Ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘ、ＩＳＣＯＭを含む植物由来のアジュバント；トマチンを含む同時刺激に好適なアジュバント、ＰＬＧ、ＰＭＭ、及びイヌリンを含むバイオポリマー；Ｒｏｍｕｒｔｉｄｅを含む微生物由来のペプチド、ＤＥＴＯＸ、ＭＰＬ、ＣＷＳ、マンノース、ＣｐＧ核酸配列、ＣｐＧ７９０９、ヒトＴＬＲ１−１０のリガンド、マウスＴＬＲ１−１３のリガンド、ＩＳＳ−１０１８、ＩＣ３１、イミダゾキノリン類、Ａｍｐｌｉｇｅｎ、Ｒｉｂｉ５２９、ＩＭＯｘｉｎｅ、ＩＲＩＶ類、ＶＬＰ類、コレラ毒素、易熱性毒素、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、フラジェリン、ＧＰＩアンカー、ＬＮＦＰＩＩＩ／Ｌｅｗｉｓ  Ｘ、抗菌ペプチド、ＵＣ−１Ｖ１５０、ＲＳＶ融合タンパク質、ｃｄｉＧＭＰ、並びにＣＧＲＰ神経ペプチドを含むアンタゴニストとして好適なアジュバントからなる群から選択してよいが、これらに限定されない。
【０３３０】
また、好適なアジュバントは、カチオン性又はポリカチオン性の化合物から選択してもよく、前記アジュバントは、好ましくは、医薬組成物の人工核酸分子又はベクターとカチオン性又はポリカチオン性の化合物とを複合体化させる際に調製される。医薬組成物の人工核酸分子又はベクターと本明細書に定義するカチオン性又はポリカチオン性の化合物とを会合又は複合体化させることにより、好ましくは、医薬組成物の人工核酸分子又はベクターにアジュバント特性が提供され、また、安定化効果が付与される。このように特に好ましいカチオン性又はポリカチオン性の化合物は、カチオン性又はポリカチオン性のペプチド又はタンパク質から選択され、例えば、以下が挙げられる：プロタミン、ヌクレオリン（ｎｕｃｌｅｏｌｉｎｅ）、スペルミン又はスペルミジン、或いは他のカチオン性のペプチド又はタンパク質、例えば、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン、塩基性ポリペプチド、ＨＩＶ結合ペプチドを含む細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、Ｔａｔ、ＨＩＶ−１  Ｔａｔ（ＨＩＶ）、Ｔａｔ由来ペプチド、ペネトラチン、ＶＰ２２由来又は類似のペプチド、ＨＳＶ、ＶＰ２２（単純ヘルペス）、ＭＡＰ、ＫＡＬＡ、又はタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ、ＰｐＴ６２０、プロリンリッチペプチド、アルギニンリッチペプチド、リジンリッチペプチド、ＭＰＧペプチド、Ｐｅｐ−１、Ｌ−オリゴマー、カルシトニンペプチド、アンテナペディア由来ペプチド（特に、ショウジョウバエアンテナペディア由来）、ｐＡｎｔｐ、ｐＩｓｌ、ＦＧＦ、ラクトフェリン、トランスポータン、ブフォリン−２、Ｂａｃ７１５−２４、ＳｙｎＢ、ＳｙｎＢ（１）、ｐＶＥＣ、ｈＣＴ由来ペプチド、ＳＡＰ、プロタミン、スペルミン、スペルミジン、又はヒストン。更に好ましいカチオン性又はポリカチオン性の化合物は、例えば、キトサン等のカチオン性多糖類、ポリブレン、例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）等のカチオン性ポリマー、例えば、ＤＯＴＭＡ：１−（２，３−シオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド等のカチオン性脂質、ＤＭＲＩＥ、ジ−Ｃ１４−アミジン、ＤＯＴＩＭ、ＳＡＩＮＴ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＢＧＴＣ、ＣＴＡＰ、ＤＯＰＣ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ：ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＤＡＢ、ＤＯＩＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＯＧＳ：ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、ＤＩＭＲＩ：ジミリスト−オキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ＤＯＴＡＰ：ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン、ＤＣ−６−１４：Ｏ，Ｏ−ジテトラデカノイル−Ｎ−（  −トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド、ＣＬＩＰ１：ｒａｃ−［（２，３−ジオクタデシルオキシプロピル）（２−ヒドロキシエチル）］−ジメチルアンモニウムクロリド、ＣＬＩＰ６：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシメチルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム、ＣＬＩＰ９：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシスクシニルオキシ）エチル］−トリメチルアンモニウム、オリゴフェクタミン、或いは、カチオン性又はポリカ��オン性のポリマー、例えば、−アミノ酸ポリマー又は逆向きポリアミド等の修飾ポリアミノ酸、ＰＶＰ（ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムブロミド））等の修飾ポリエチレン、ｐＤＭＡＥＭＡ（ポリ（ジメチルアミノエチルメチルアクリラート））等の修飾アクリラート、ｐＡＭＡＭ（ポリ（アミドアミン））等の修飾アミドアミン、ジアミン末端修飾１，４ブタンジオールジアクリラート−コ−５−アミノ−１−ペンタノールポリマー等の修飾ポリベータ−アミノエステル（ＰＢＡＥ）、ポリプロピルアミンデンドリマー又はｐＡＭＡＭ系デンドリマー等のデンドリマー、ＰＥＩ：ポリ（エチレンイミン）、ポリ（プロピレンイミン）等のポリイミン、ポリアリルアミン、シクロデキストリン系ポリマー、デキストラン系ポリマー及びキトサン等の糖骨格系ポリマー、ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳコポリマー等のシラン骨格系ポリマー、１以上のカチオン性ブロック（例えば、上述のカチオン性ポリマーから選択される）及び１以上の親水性ブロック又は疎水性ブロック（例えば、ポリエチレングリコール）の組合せからなるブロックポリマー。
【０３３１】
更に、組成物の人工核酸分子又はベクター、好ましくはＲＮＡを複合体化することによってアジュバントとして用いることができる好ましいカチオン性又はポリカチオン性のタンパク質又はペプチドは、以下の合計式（Ｉ）：（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ（式中、ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｘ＝８〜１５であり、ｌ、ｍ、ｎ又はｏは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される任意の数であるが、但し、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ及びＯｒｎの全体含量がオリゴペプチドの全アミノ酸の少なくとも５０％であり；Ｘａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＯｒｎを除くネイティブの（＝天然）又は非ネイティブのアミノ酸から選択される任意のアミノ酸であってよく；ｘは、０、１、２、３又は４から選択される任意の数であってよいが、但し、Ｘａａの全体含量がオリゴペプチドの全アミノ酸の５０％を超えない）を有する以下のタンパク質又はペプチドから選択してよい。この状況において特に好ましいオリゴアルギニンは、例えば、Ａｒｇ７、Ａｒｇ８、Ａｒｇ９、Ａｒｇ７、Ｈ３Ｒ９、Ｒ９Ｈ３、Ｈ３Ｒ９Ｈ３、ＹＳＳＲ９ＳＳＹ、（ＲＫＨ）４、及びＹ（ＲＫＨ）２Ｒ等である。
【０３３２】
人工核酸又はベクターのカチオン性又はポリカチオン性の化合物に対する比は、核酸複合体全体の窒素／リン酸比（Ｎ／Ｐ比）に基づいて計算することができる。例えば、１μｇのＲＮＡは、ＲＮＡが塩基の統計的分布を示す限り、典型的に、約３ｎｍｏｌのリン酸残基を含有する。更に、１μｇのペプチドは、塩基性アミノ酸の分子量及び数に依存して、典型的に、約ｘｎｍｏｌの窒素残基を含有する。例示として（Ａｒｇ）９（分子量：１，４２４ｇ／ｍｏｌ、９窒素原子）について計算する場合、１μｇの（Ａｒｇ）９は、約７００ｐｍｏｌの（Ａｒｇ）９を含有するので、７００×９＝６，３００ｐｍｏｌ塩基性アミノ酸＝６．３ｎｍｏｌ窒素原子である。質量比約１：１のＲＮＡ／（Ａｒｇ）９については、Ｎ／Ｐ比約２と計算することができる。例示として、２μｇのＲＮＡとの質量比が約２：１であるプロタミン（分子量：約４，２５０ｇ／ｍｏｌ、２１窒素原子、サケ由来のプロタミンを用いる場合）について計算する場合、ＲＮＡについて６ｎｍｏｌのリン酸を計算すべきであり、１μｇのプロタミンは、約２３５ｐｍｏｌのプロタミン分子を含有するので、２３５×２１＝４，９３５ｐｍｏｌ塩基性アミノ酸＝４．９ｎｍｏｌ窒素原子である。ＲＮＡ／プロタミンの質量比が約２：１の場合、Ｎ／Ｐ比は約０．８１と計算することができる。ＲＮＡ／プロタミンの質量比が約８：１の場合、Ｎ／Ｐ比は約０．２と計算することができる。本発明の状況では、Ｎ／Ｐ比は、好ましくは、約０．１〜約１０の範囲、好ましくは、約０．３〜約４の範囲、最も好ましくは約０．５〜約２の範囲であるか、又は複合体中の核酸：ペプチドの比に関しては０．７〜２の範囲、最も好ましくは、約０．７〜約１．５の範囲である。
【０３３３】
参照により本明細書に援用される国際公開第２０１０／０３７５３９号には、免疫賦活組成物及び免疫賦活組成物を調製する方法が記載されている。したがって、本発明の好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子の効率的な免疫賦活効果及び効率的な翻訳の両方を得るために、組成物を２つの別々の工程で得る。ここでは、所謂「アジュバント成分」は、第１の工程で、アジュバント成分の人工核酸分子又はベクター、好ましくはＲＮＡとカチオン性又はポリカチオン性の化合物とを特定の比で複合体化させて、安定な複合体を形成することによって調製される。この状況では、核酸の複合体化後に、アジュバント成分中に遊離カチオン性又はポリカチオン性の化合物が存在しないか、又は無視できる程度に少ない量しか残っていないことが重要である。したがって、アジュバント成分中の核酸及びカチオン性又はポリカチオン性の化合物の比は、典型的に、核酸全部が複合体化され、且つ組成物中に遊離カチオン性又はポリカチオン性の化合物が存在しないか、又は無視できる程度に少ない量しか残らない範囲で選択される。好ましくは、アジュバント成分の比、即ち、核酸のカチオン性又はポリカチオン性の化合物に対する比は、約６：１（ｗ／ｗ）〜約０，２５：１（ｗ／ｗ）、より好ましくは、約５：１（ｗ／ｗ）〜約０，５：１（ｗ／ｗ）、更により好ましくは、約４：１（ｗ／ｗ）〜約１：１（ｗ／ｗ）、又は約３：１（ｗ／ｗ）〜約１：１（ｗ／ｗ）、最も好ましくは約３：１（ｗ／ｗ）〜約２：１（ｗ／ｗ）の範囲から選択される。
【０３３４】
好ましい実施形態によれば、本発明の（免疫賦活）組成物を形成するために、本発明に係る人工核酸分子又はベクター、好ましくはＲＮＡ分子を、第２の工程で、アジュバント成分の複合体化核酸分子、好ましくはＲＮＡに添加する。ここでは、本発明の人工核酸分子又はベクター、好ましくはＲＮＡは、遊離核酸、即ち、他の化合物と複合体化していない核酸として添加される。添加前、遊離人工核酸分子又はベクターは複合体化されておらず、アジュバント成分を添加した際、任意の検出可能な又は著しい複合体化反応を受けないことが好ましい。
【０３３５】
好適なアジュバントは、更に、式（ＩＩ）：ＧｌＸｍＧｎ（式中、Ｇは、グアノシン（グアニン）、ウリジン（ウラシル）、又はグアノシン（グアニン）若しくはウリジン（ウラシル）のアナログであり；Ｘは、グアノシン（グアニン）、ウリジン（ウラシル）、アデノシン（アデニン）、チミジン（チミン）、シチジン（シトシン）、又は上記ヌクレオチド（ヌクレオシド）のアナログであり；ｌは、１〜４０の整数であり、ｌ＝１であるとき、Ｇは、グアノシン（グアニン）又はそのアナログであり、ｌ＞１であるとき、ヌクレオチド（ヌクレオシド）の少なくとも５０％が、グアノシン（グアニン）又はそのアナログであり；ｍは、整数であり且つ少なくとも３であり、ｍ＝３であるとき、Ｘは、ウリジン（ウラシル）又はそのアナログであり、ｍ＞３であるとき、少なくとも３つの連続するウリジン（ウラシル）又はウリジンのアナログが存在し；ｎは、１〜４０の整数であり、ｎ＝１であるとき、Ｇは、グアノシン（グアニン）又はそのアナログであり、ｎ＞１であるとき、ヌクレオチド（ヌクレオシド）の少なくとも５０％が、グアノシン（グアニン）又はそのアナログである）を有する核酸から選択してよい。
【０３３６】
他の好適なアジュバントは、更に、式（ＩＩＩ）：ＣｌＸｍＣｎ（式中、Ｃは、シチジン（シトシン）、ウリジン（ウラシル）、又はシチジン（シトシン）若しくはウリジン（ウラシル）のアナログであり；Ｘは、グアノシン（グアニン）、ウリジン（ウラシル）、アデノシン（アデニン）、チミジン（チミン）、シチジン（シトシン）、又は上記ヌクレオチド（ヌクレオシド）のアナログであり；ｌは、１〜４０の整数であり、ｌ＝１であるとき、Ｃは、シチジン（シトシン）又はそのアナログであり、ｌ＞１であるとき、ヌクレオチド（ヌクレオシド）の少なくとも５０％が、シチジン（シトシン）又はそのアナログであり；ｍは、整数であり且つ少なくとも３であり、ｍ＝３であるとき、Ｘは、ウリジン（ウラシル）又はそのアナログであり、ｍ＞３であるとき、少なくとも３つの連続するウリジン（ウラシル）又はウリジン（ウラシル）のアナログが存在し；ｎは、１〜４０の整数であり、ｎ＝１であるとき、Ｃは、シチジン（シトシン）又はそのアナログであり、ｎ＞１であるとき、ヌクレオチド（ヌクレオシド）の少なくとも５０％が、シチジン（シトシン）又はそのアナログである）を有する核酸から選択してよい。
【０３３７】
本発明に係る医薬組成物は、好ましくは、「安全且つ有効な量」の医薬組成物の成分、特に、本明細書に定義する本発明の人工核酸分子、ベクター、及び／又は細胞を含む。本明細書で使用するとき、「安全且つ有効な量」とは、本明細書に定義する疾患又は疾病の好ましい変化を著しく誘導するのに十分な量を意味する。しかし、同時に、「安全且つ有効な量」は、好ましくは、重篤な副作用を避け、且つ利益とリスクとの間の道理に適った関係を可能にする。これらの限度は、典型的に、道理に適った医学的判断の範囲内で決定される。
【０３３８】
更なる態様では、本発明は、医薬として、例えば（遺伝子ワクチン接種における）ワクチンとして、又は遺伝子治療において用いるための本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を提供する。
【０３３９】
本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、ペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質の治療作用又は効果を利用するか、又は特定のペプチド若しくはタンパク質の追加が必要である任意の医学的用途に特に好適である。したがって、本発明は、ペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質の治療作用若しくは効果によって治療することができるか、又は特定のペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質の追加によって治療することができる疾患又は疾病の治療又は予防において用いるための本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を提供する。例えば、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、例えば、遺伝子ワクチン接種又は遺伝子治療によって、遺伝性疾患、自己免疫疾患、癌性又は腫瘍関連疾患、感染性疾患、慢性疾患等を治療又は予防するために用いることができる。
【０３４０】
特に、本発明の３’−ＵＴＲエレメントは、本発明の人工核酸分子又はベクターにコードされているペプチド又はタンパク質を安定的に長期に亘って発現させる及び／又は本発明の５’−ＵＴＲエレメントは、本発明の人工核酸分子又はベクターにコードされているペプチド又はタンパク質の発現を増加させるので、治療を受ける被験体において治療用のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質が増加し且つ長期に亘って存在することから利益を得るかかる治療的処置は、本発明に関連する医学的用途として特に好適である。したがって、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物に特に好適な医学的用途は、ワクチン接種である。したがって、本発明は、被験体、好ましくは哺乳類の被験体、より好ましくはヒトの被験体のワクチン接種のための本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を提供する。好ましいワクチン接種処理は、細菌、原生動物、又はウイルスによる感染症等の感染性疾患に対するワクチン接種、及び抗腫瘍ワクチン接種である。かかるワクチン接種処理は、予防的であってもよく、治療的であってもよい。
【０３４１】
治療又は予防される疾患に応じてＯＲＦを選択してよい。例えば、オープンリーディングフレームは、遺伝性疾患に罹患している患者等、タンパク質が完全に欠失しているか又は機能が少なくとも部分的に喪失している患者に供給しなければならないタンパク質をコードしていてよい。更に、オープンリーディングフレームは、被験体の疾患又は症状に有益な影響を与えるペプチド又はタンパク質をコードしているＯＲＦから選択してよい。更に、オープンリーディングフレームは、天然のペプチド若しくはタンパク質の病的過剰産生をダウンレギュレートするか又は病的にタンパク質若しくはペプチドを発現する細胞を排除するペプチド又はタンパク質をコードしていてもよい。かかる欠失、機能喪失、又は過剰産生は、例えば、腫瘍及び新生物、自己免疫疾患、アレルギー、感染症、慢性疾患等に関連して生じる場合がある。更に、オープンリーディングフレームは、抗原又は免疫原（例えば、病原体又は腫瘍抗原のエピトープ）をコードしていてよい。したがって、好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子又はベクターは、抗原又は免疫原（例えば、病原体又は腫瘍関連抗原のエピトープ）と、上記３’−ＵＴＲエレメント及び／又は上記５’−ＵＴＲエレメントと、ポリ（Ａ）配列等の任意の更なる成分とを含むか又はからなるアミノ酸配列をコードしているＯＲＦを含む。
【０３４２】
医学的用途に関連して、特に、ワクチン接種に関連して、ＤＮＡは、抗ＤＮＡ免疫応答を誘発するリスクを有し且つゲノムＤＮＡに挿入される傾向を有するので、本発明に係る人工核酸分子は、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡであることが好ましい。しかし、幾つかの実施形態では、例えば、アデノウイルス送達ビヒクル等のウイルス送達ビヒクルを、例えば、遺伝子治療的処置において本発明に係る人工核酸分子又はベクターを送達するために用いる場合、人工核酸分子又はベクターがＤＮＡ分子であることが望ましい場合もある。
【０３４３】
本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、直腸内に、経鼻的に、口腔内に、膣内に、埋め込まれたレザーバを介して、又はジェット注射を介して投与してよい。本明細書で使用するとき、非経口という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、基質内、鞘内、肝臓内、病変内、頭蓋内、経皮、皮内、肺内、腹腔内、手根内、動脈内、及び舌下への注射又は注入技術を含む。好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、無針注射（例えば、ジェット注射）を介して投与される。
【０３４４】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、非経口的に、例えば非経口注射によって投与され、より好ましくは、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、基質内、鞘内、肝臓内、病変内、頭蓋内、経皮、皮内、肺内、腹腔内、手根内、動脈内、及び舌下への注射又は注入技術によって投与される。皮内及び筋肉内への注射が特に好ましい。本発明の医薬組成物の滅菌注射用形態は、水性又は油性の懸濁液であってよい。これら懸濁液は、好適な分散剤又は湿潤剤と懸濁化剤とを用いて当技術分野において公知の技術に従って製剤され得る。好ましくは、溶液又は懸濁液は、無針注射（例えば、ジェット注射）を介して投与される。
【０３４５】
また、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤、又は液剤が挙げられるがこれらに限定されない任意の経口的に許容できる剤形で経口投与してよい。
【０３４６】
また、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、例えば、皮膚又は任意の他のアクセス可能な上皮組織の疾患を含む、局所塗布によって容易にアクセス可能な領域又は器官が治療標的に含まれる場合は特に、局所投与してもよい。これら領域又は器官のそれぞれについて、好適な局所製剤は容易に調製される。局所塗布については、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を、１以上の担体に懸濁又は溶解している好適な軟膏に製剤してよい。
【０３４７】
１つの実施形態では、医薬としての使用は、哺乳類細胞のトランスフェクション、好ましくは哺乳類細胞のインビトロ又はエクスビボトランスフェクション、より好ましくは前記医薬により治療される被験体の単離細胞のインビトロトランスフェクションの工程を含む。前記使用が単離細胞のインビトロトランスフェクションを含む場合、医薬としての使用は、トランスフェクトされた細胞を患者に再投与することを更に含んでいてよい。医薬としての本発明の人工核酸分子又はベクターの使用は、トランスフェクションに成功した単離細胞を選択する工程を更に含んでいてよい。したがって、ベクターが選択マーカーを更に含むことが有益である場合がある。また、前記医薬としての使用は、単離細胞のインビトロトランスフェクションと、前記細胞からの発現産物（即ち、コードされているペプチド又はタンパク質）の精製とを含んでいてよい。この精製されたペプチド又はタンパク質は、後に、それを必要としている被験体に投与してよい。
【０３４８】
また、本発明は、上記疾患又は疾病を治療又は予防する方法であって、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物をそれを必要としている被験体に投与することを含む方法を提供する。
【０３４９】
更に、本発明は、疾患又は疾病を治療又は予防する方法であって、本発明に係る人工核酸分子又は本発明に係るベクターで細胞をトランスフェクトすることを含む方法を提供する。トランスフェクションは、インビトロで実施してもよく、エクスビボで実施してもよく、インビボで実施してもよい。好ましい実施形態では、細胞のトランスフェクションは、インビトロで実施され、トランスフェクトされた細胞は、それを必要としている被験体、好ましくはヒト患者に投与される。好ましくは、インビトロでトランスフェクトされる細胞は、被験体、好ましくはヒト患者の単離細胞である。したがって、本発明は、被験体、好ましくはヒト患者から細胞を単離する工程と、本発明に係る人工核酸又は本発明に係るベクターを前記単離細胞にトランスフェクトする工程と、前記トランスフェクトされた細胞を前記被験体、好ましくは前記ヒト患者に投与する工程とを含む治療方法を提供する。
【０３５０】
本発明に係る疾患を治療又は予防する方法は、好ましくは、上記ワクチン接種方法又は遺伝子治療方法である。
【０３５１】
上記の通り、本発明の３’−ＵＴＲエレメント及び／又は本発明の５’−ＵＴＲエレメントは、ｍＲＮＡからのタンパク質産生を延長及び／又は増加させることができる。したがって、更なる態様では、本発明は、人工核酸分子、好ましくはｍＲＮＡ分子又はベクターからのタンパク質産生を増加及び／又は延長させる方法であって、オープンリーディングフレームを３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメント（前記３’−ＵＴＲエレメント及び／又は前記５’−ＵＴＲエレメントは、得られる人工核酸分子に高い翻訳効率を与える）に結合させて、上記の通り本発明に係る人工核酸分子、好ましくはｍＲＮＡ分子、又は上記の通り本発明に係るベクターを得る工程を含む方法に関する。
【０３５２】
好ましくは、本発明に係る、人工核酸分子からの、好ましくはｍＲＮＡ分子又はベクターからのタンパク質産生を増加及び／又は延長させるための方法において、３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントは、ＺＮＦ４６０、ＴＧＭ２、ＩＬ７Ｒ、ＢＧＮ、ＴＫ１、ＲＡＢ３Ｂ、ＣＢＸ６、ＦＺＤ２、ＣＯＬ８Ａ１、ＮＤＵＦＳ７、ＰＨＧＤＨ、ＰＬＫ２、ＴＳＰＯ、ＰＴＧＳ１、ＦＢＸＯ３２、ＮＩＤ２、ＡＴＰ５Ｄ、ＥＸＯＳＣ４、ＮＯＬ９、ＵＢＢ４Ｂ、ＶＰＳ１８、ＯＲＭＤＬ２、ＦＳＣＮ１、ＴＭＥＭ３３、ＴＵＢＡ４Ａ、ＥＭＰ３、ＴＭＥＭ２０１、ＣＲＩＰ２、ＢＲＡＴ１、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＣＤ９、ＤＰＹＳＬ２、ＣＤＫ９、ＴＦＲＣ、ＰＳＭＢ３、ＦＡＳＮ、ＰＳＭＢ６、ＰＲＳＳ５６、ＫＰＮＡ６、ＳＦＴ２Ｄ２、ＰＡＲＤ６Ｂ、ＬＰＰ、ＳＰＡＲＣ、ＳＣＡＮＤ１、ＶＡＳＮ、ＳＬＣ２６Ａ１、ＬＣＬＡＴ１、ＦＢＸＬ１８、ＳＬＣ３５Ｆ６、ＲＡＢ３Ｄ、ＭＡＰ１Ｂ、ＶＭＡ２１、ＣＹＢＡ、ＳＥＺ６Ｌ２、ＰＣＯＬＣＥ、ＶＴＮ、ＡＬＤＨ１６Ａ１、ＲＡＶＥＲ１、ＫＰＮＡ６、ＳＥＲＩＮＣ５、ＪＵＰ、ＣＰＮ２、ＣＲＩＰ２、ＥＰＴ１、ＰＮＰＯ、ＳＳＳＣＡ１、ＰＯＬＲ２Ｌ、ＬＩＮ７Ｃ、ＵＱＣＲ１０、ＰＹＣＲＬ、ＡＭＮ、ＭＡＰ１Ｓ、ＮＤＵＦＳ７、ＰＨＧＤＨ、ＴＳＰＯ、ＡＴＰ５Ｄ、ＥＸＯＳＣ４、ＴＵＢＢ４Ｂ、ＴＵＢＡ４Ａ、ＥＭＰ３、ＣＲＩＰ２、ＢＲＡＴ１、ＣＤ９、ＣＤＫ９、ＰＳＭＢ３、ＰＳＭＢ６、ＰＲＳＳ５６、ＳＣＡＮＤ１、ＡＭＮ、ＣＹＢＡ、ＰＣＯＬＣＥ、ＭＡＰ１Ｓ、ＶＴＮ、ＡＬＤＨ１６Ａ１（いずれも好ましくはヒト）及びＤｐｙｓｌ２、Ｃｃｎｄ１、Ａｃｏｘ２、Ｃｂｘ６、Ｕｂｃ、Ｌｄｌｒ、Ｎｕｄｔ２２、Ｐｃｙｏｘ１ｌ、Ａｎｋｒｄ１、Ｔｍｅｍ３７、Ｔｓｐｙｌ４、Ｓｌｃ７ａ３、Ｃｓｔ６、Ａａｃｓ、Ｎｏｓｉｐ、Ｉｔｇａ７、Ｃｃｎｄ２、Ｅｂｐ、Ｓｆ３ｂ５、Ｆａｓｎ、Ｈｍｇｃｓ１、Ｏｓｒ１、Ｌｍｎｂ１、Ｖｍａ２１、Ｋｉｆ２０ａ、Ｃｄｃａ８、Ｓｌｃ７ａ１、Ｕｂｑｌｎ２、Ｐｒｐｓ２、Ｓｈｍｔ２、Ａｕｒｋｂ、Ｆｉｇｎｌ１、Ｃａｄ、Ａｎｌｎ、Ｓｌｆｎ９、Ｎｃａｐｈ、Ｐｏｌｅ、Ｕｈｒｆ１、Ｇｊａ１、Ｆａｍ６４ａ、Ｋｉｆ２ｃ、Ｔｓｐａｎ１０、Ｓｃａｎｄ１、Ｇｐｒ８４、Ｆａｄｓ３、Ｃｅｒｓ６、Ｃｘｃｒ４、Ｇｐｒｃ５ｃ、Ｆｅｎ１、Ｃｓｐｇ４、Ｍｒｐｌ３４、Ｃｏｍｔｄ１、Ａｒｍｃ６、Ｅｍｒ４、Ａｔｐ５ｄ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ、Ｃｓｆ２ｒａ、Ａａｒｓｄ１、Ｋｉｆ２２、Ｃｔｈ、Ｔｐｇｓ１、Ｃｃｌ１７、Ａｌｋｂｈ７、Ｍｓ４ａ８ａ、Ａｃｏｘ２、Ｕｂｃ、Ｓｌｐｉ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ、Ｉｇｆ２ｂｐ１、Ｔｍｅｍ３７、Ｓｌｃ７ａ３、Ｃｓｔ６、Ｅｂｐ、Ｓｆ３ｂ５、Ｐｌｋ１、Ｃｄｃａ８、Ｋｉｆ２２、Ｃａｄ、Ｃｔｈ、Ｐｏｌｅ、Ｋｉｆ２ｃ、Ｓｃａｎｄ１、Ｇｐｒ８４、Ｔｐｇｓ１、Ｃｃｌ１７、Ａｌｋｂｈ７、Ｍｓ４ａ８ａ、Ｍｒｐｌ３４、Ｃｏｍｔｄ１、Ａｒｍｃ６、Ａｔｐ５ｄ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ、Ｎｕｄｔ２２、Ａａｒｓｄ１（いずれも好ましくはマウス）からなる群；好ましくは、ＺＮＦ４６０−５’−ＵＴＲ、ＴＧＭ２−５’−ＵＴＲ、ＩＬ７Ｒ−５’−ＵＴＲ、ＢＧＮ−５’−ＵＴＲ、ＴＫ１−５’−ＵＴＲ、ＲＡＢ３Ｂ−５’−ＵＴＲ、ＣＢＸ６−５’−ＵＴＲ、ＦＺＤ２−５’−ＵＴＲ、ＣＯＬ８Ａ１−５’−ＵＴＲ、ＮＤＵＦＳ７−５’−ＵＴＲ、ＰＨＧＤＨ−５’−ＵＴＲ、ＰＬＫ２−５’−ＵＴＲ、ＴＳＰＯ−５’−ＵＴＲ、ＰＴＧＳ１−５’−ＵＴＲ、ＦＢＸＯ３２−５’−ＵＴＲ、ＮＩＤ２−５’−ＵＴＲ、ＡＴＰ５Ｄ−５’−ＵＴＲ、ＥＸＯＳＣ４−５’−ＵＴＲ、ＮＯＬ９−５’−ＵＴＲ、ＵＢＢ４Ｂ−５’−ＵＴＲ、ＶＰＳ１８−５’−ＵＴＲ、ＯＲＭＤＬ２−５’−ＵＴＲ、ＦＳＣＮ１−５’−ＵＴＲ、ＴＭＥＭ３３−５’−ＵＴＲ、ＴＵＢＡ４Ａ−５’−ＵＴＲ、ＥＭＰ３−５’−ＵＴＲ、ＴＭＥＭ２０１−５’−ＵＴＲ、ＣＲＩＰ２−５’−ＵＴＲ、ＢＲＡＴ１−５’−ＵＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＨ１−５’−ＵＴＲ、ＣＤ９−５’−ＵＴＲ、ＤＰＹＳＬ２−５’−ＵＴＲ、ＣＤＫ９−５’−ＵＴＲ、ＴＦＲＣ−５’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ３  ５’−ＵＴＲ、ＦＡＳＮ−５’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ６−５’−ＵＴＲ、ＰＲＳＳ５６−５’−ＵＴＲ、ＫＰＮＡ６−５’−ＵＴＲ、ＳＦＴ２Ｄ２−５’−ＵＴＲ、ＰＡＲＤ６Ｂ−５’−ＵＴＲ、ＬＰＰ−５’−ＵＴＲ、ＳＰＡＲＣ−５’−ＵＴＲ、ＳＣＡＮＤ１−５’−ＵＴＲ、ＶＡＳＮ−５’−ＵＴＲ、ＳＬＣ２６Ａ１−５’−ＵＴＲ、ＬＣＬＡＴ１−５’−ＵＴＲ、ＦＢＸＬ１８−５’−ＵＴＲ、ＳＬＣ３５Ｆ６−５’−ＵＴＲ、ＲＡＢ３Ｄ−５’−ＵＴＲ、ＭＡＰ１Ｂ−５’−ＵＴＲ、ＶＭＡ２１−５’−ＵＴＲ、ＣＹＢＡ−５’−ＵＴＲ、ＳＥＺ６Ｌ２−５’−ＵＴＲ、ＰＣＯＬＣＥ−５’−ＵＴＲ、ＶＴＮ−５’−ＵＴＲ、ＡＬＤＨ１６Ａ１−５’−ＵＴＲ、ＲＡＶＥＲ１−５’−ＵＴＲ、ＫＰＮＡ６−５’−ＵＴＲ、ＳＥＲＩＮＣ５−５’−ＵＴＲ、ＪＵＰ−５’−ＵＴＲ、ＣＰＮ２−５’−ＵＴＲ、ＣＲＩＰ２−５’−ＵＴＲ、ＥＰＴ１−５’−ＵＴＲ、ＰＮＰＯ−５’−ＵＴＲ、ＳＳＳＣＡ１−５’−ＵＴＲ、ＰＯＬＲ２Ｌ−５’−ＵＴＲ、ＬＩＮ７Ｃ−５’−ＵＴＲ、ＵＱＣＲ１０−５’−ＵＴＲ、ＰＹＣＲＬ−５’−ＵＴＲ、ＡＭＮ−５’−ＵＴＲ、ＭＡＰ１Ｓ−５’−ＵＴＲ（いずれも好ましくはヒト）及びＤｐｙｓｌ２−５’−ＵＴＲ、Ｃｃｎｄ１−５’−ＵＴＲ、Ａｃｏｘ２−５’−ＵＴＲ、Ｃｂｘ６−５’−ＵＴＲ、Ｕｂｃ−５’−ＵＴＲ、Ｌｄｌｒ−５’−ＵＴＲ、Ｎｕｄｔ２２−５’−ＵＴＲ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ−５’−ＵＴＲ、Ａｎｋｒｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｔｍｅｍ３７−５’−ＵＴＲ、Ｔｓｐｙｌ４−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ３−５’−ＵＴＲ、Ｃｓｔ６−５’−ＵＴＲ、Ａａｃｓ−５’−ＵＴＲ、Ｎｏｓｉｐ−５’−ＵＴＲ、Ｉｔｇａ７−５’−ＵＴＲ、Ｃｃｎｄ２−５’−ＵＴＲ、Ｅｂｐ−５’−ＵＴＲ、Ｓｆ３ｂ５−５’−ＵＴＲ、Ｆａｓｎ−５’−ＵＴＲ、Ｈｍｇｃｓ１−５’−ＵＴＲ、Ｏｓｒ１−５’−ＵＴＲ、Ｌｍｎｂ１−５’−ＵＴＲ、Ｖｍａ２１−５’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２０ａ−５’−ＵＴＲ、Ｃｄｃａ８−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ１−５’−ＵＴＲ、Ｕｂｑｌｎ２−５’−ＵＴＲ、Ｐｒｐｓ２−５’−ＵＴＲ、Ｓｈｍｔ２−５’−ＵＴＲ、Ａｕｒｋｂ−５’−ＵＴＲ、Ｆｉｇｎｌ１−５’−ＵＴＲ、Ｃａｄ−５’−ＵＴＲ、Ａｎｌｎ−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｆｎ９−５’−ＵＴＲ、Ｎｃａｐｈ−５’−ＵＴＲ、Ｐｏｌｅ−５’−ＵＴＲ、Ｕ���ｒｆ１−５’−ＵＴＲ、Ｇｊａ１−５’−ＵＴＲ、Ｆａｍ６４ａ−５’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２ｃ−５’−ＵＴＲ、Ｔｓｐａｎ１０−５’−ＵＴＲ、Ｓｃａｎｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｇｐｒ８４−５’−ＵＴＲ、Ｆａｄｓ３−５’−ＵＴＲ、Ｃｅｒｓ６−５’−ＵＴＲ、Ｃｘｃｒ４−５’−ＵＴＲ、Ｇｐｒｃ５ｃ−５’−ＵＴＲ、Ｆｅｎ１−５’−ＵＴＲ、Ｃｓｐｇ４−５’−ＵＴＲ、Ｍｒｐｌ３４−５’−ＵＴＲ、Ｃｏｍｔｄ１−５’−ＵＴＲ、Ａｒｍｃ６−５’−ＵＴＲ、Ｅｍｒ４−５’−ＵＴＲ、Ａｔｐ５ｄ−５’−ＵＴＲ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ−５’−ＵＴＲ、Ｃｓｆ２ｒａ−５’−ＵＴＲ、Ａａｒｓｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２２−５’−ＵＴＲ、Ｃｔｈ−５’−ＵＴＲ、Ｔｐｇｓ１−５’−ＵＴＲ、Ｃｃｌ１７−５’−ＵＴＲ、Ａｌｋｂｈ７−５’−ＵＴＲ、Ｍｓ４ａ８ａ−５’−ＵＴＲ（いずれも好ましくはマウス）；及びＮＤＵＦＳ７−３’−ＵＴＲ、ＰＨＧＤＨ−３’−ＵＴＲ、ＴＳＰＯ−３’−ＵＴＲ、ＡＴＰ５Ｄ−３’−ＵＴＲ、ＥＸＯＳＣ４−３’−ＵＴＲ、ＴＵＢＢ４Ｂ−３’−ＵＴＲ、ＴＵＢＡ４Ａ−３’−ＵＴＲ、ＥＭＰ３−３’−ＵＴＲ、ＣＲＩＰ２−３’−ＵＴＲ、ＢＲＡＴ１−３’−ＵＴＲ、ＣＤ９−３’−ＵＴＲ、ＣＤＫ９−３’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ３−３’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ６−３’−ＵＴＲ、ＰＲＳＳ５６−３’−ＵＴＲ、ＳＣＡＮＤ１−３’−ＵＴＲ、ＡＭＮ−３’−ＵＴＲ、ＣＹＢＡ−３’−ＵＴＲ、ＰＣＯＬＣＥ−３’−ＵＴＲ、ＭＡＰ１Ｓ−３’−ＵＴＲ、ＶＴＮ−３’−ＵＴＲ、ＡＬＤＨ１６Ａ１−３’−ＵＴＲ（いずれも好ましくはヒト）及びＡｃｏｘ２−３’−ＵＴＲ、Ｕｂｃ−３’−ＵＴＲ、Ｓｌｐｉ−３’−ＵＴＲ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ−３’−ＵＴＲ、Ｉｇｆ２ｂｐ１−３’−ＵＴＲ、Ｔｍｅｍ３７−３’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ３−３’−ＵＴＲ、Ｃｓｔ６−３’−ＵＴＲ、Ｅｂｐ−３’−ＵＴＲ、Ｓｆ３ｂ５−３’−ＵＴＲ、Ｐｌｋ１−３’−ＵＴＲ、Ｃｄｃａ８−３’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２２−３’−ＵＴＲ、Ｃａｄ−３’−ＵＴＲ、Ｃｔｈ−３’−ＵＴＲ、Ｐｏｌｅ−３’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２ｃ−３’−ＵＴＲ、Ｓｃａｎｄ１−３’−ＵＴＲ、Ｇｐｒ８４−３’−ＵＴＲ、Ｔｐｇｓ１−３’−ＵＴＲ、Ｃｃｌ１７−３’−ＵＴＲ、Ａｌｋｂｈ７−３’−ＵＴＲ、Ｍｓ４ａ８ａ−３’−ＵＴＲ、Ｍｒｐｌ３４−３’−ＵＴＲ、Ｃｏｍｔｄ１−３’−ＵＴＲ、Ａｒｍｃ６−３’−ＵＴＲ、Ａｔｐ５ｄ−３’−ＵＴＲ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ−３’−ＵＴＲ、Ｎｕｄｔ２２−３’−ＵＴＲ、Ａａｒｓｄ１−３’−ＵＴＲ、（いずれも好ましくはマウス）からなる群から選択される遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる。
【０３５３】
本発明の状況において、用語「人工核酸分子又はベクターを３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントと結合させる」とは、好ましくは、人工核酸分子又はベクターを３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントと機能的に結合させるか又は機能的に組み合わせることを意味する。これは、人工核酸分子又はベクターと３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメント、好ましくは、上記３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントとを、３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントの機能（例えば、ＲＮＡ及び／又はタンパク質の産生を延長及び／又は増加させる機能）が発揮されるように結合又はカップリングさせることを意味する。典型的に、これは、３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントが、人工核酸分子又はベクター（好ましくは、ｍＲＮＡ分子）の、オープンリーディングフレームのそれぞれ３’側及び／又は５’側、好ましくはオープンリーディングフレームの直ぐ３’側及び／又はオープンリーディングフレームの直ぐ５’側に組み込まれ、３’−ＵＴＲエレメントは、好ましくはオープンリーディングフレームとポリ（Ａ）配列又はポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれることを意味する。好ましくは、３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントは、人工核酸分子又はベクター（好ましくは、ｍＲＮＡ）に、任意で短いリンカー（例えば、１以上の制限酵素部位を含むか又はからなる配列）を介して連結されている、それぞれ３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲとして、即ち、前記３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントが、前記人工核酸分子又はベクター（好ましくは、ｍＲＮＡ）のそれぞれ３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲになるように、即ち、５’−ＵＴＲがＯＲＦの５’末端の直前で終わり、３’−ＵＴＲがオープンリーディングフレームの３’側からポリ（Ａ）配列又はポリアデニル化シグナルの５’側まで延在するように組み込まれる。したがって、好ましくは、用語「人工核酸分子又はベクターと３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントとを結合させる」とは、人工核酸分子又はベクター（好ましくは、ｍＲＮＡ分子）内に位置するオープンリーディングフレームと３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントとを機能的に結合させることを意味する。３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲ並びにＯＲＦは、本発明に係る人工核酸分子について上記した通りであり、例えば、好ましくは、それぞれＯＲＦと３’−ＵＴＲとは異種である及び／又はＯＲＦと５’−ＵＴＲとは異種であり、例えば、上記の通り異なる遺伝子に由来する。３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントとの結合は、個々のエレメントのデノボ結合によって、又は既存の核酸（テンプレート）を改変することによって行うことができる。後者の場合、例えば、例示目的のために、（ｉ）テンプレートとして図１Ａに示す配列に対応する核酸を使用し、（ｉｉ）（ａ）下線付５’−ＵＴＲエレメント（図１Ａ中一重下線付）又は（ｂ）３’−ＵＴＲエレメント（図１Ａ中二重下線付）のうちの少なくとも１つを（ａ）異なる５’−ＵＴＲエレメント又は（ｂ）異なる３’−ＵＴＲエレメントで置換することによって前記テンプレートを改変し、それによって、人工核酸分子を前記５’−ＵＴＲエレメント又は３’−ＵＴＲエレメントと結合させることにより、本発明に係る核酸分子を得ることができる。
【０３５４】
更なる態様においては、本発明は、３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメント、好ましくは、上記３’−ＵＴＲエレメント及び／又は上記５’−ＵＴＲエレメントの、人工核酸分子からの、好ましくはｍＲＮＡ分子又はベクターからのタンパク質産生を増加及び／又は延長させるための使用を提供し、３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントは、ＺＮＦ４６０、ＴＧＭ２、ＩＬ７Ｒ、ＢＧＮ、ＴＫ１、ＲＡＢ３Ｂ、ＣＢＸ６、ＦＺＤ２、ＣＯＬ８Ａ１、ＮＤＵＦＳ７、ＰＨＧＤＨ、ＰＬＫ２、ＴＳＰＯ、ＰＴＧＳ１、ＦＢＸＯ３２、ＮＩＤ２、ＡＴＰ５Ｄ、ＥＸＯＳＣ４、ＮＯＬ９、ＵＢＢ４Ｂ、ＶＰＳ１８、ＯＲＭＤＬ２、ＦＳＣＮ１、ＴＭＥＭ３３、ＴＵＢＡ４Ａ、ＥＭＰ３、ＴＭＥＭ２０１、ＣＲＩＰ２、ＢＲＡＴ１、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＣＤ９、ＤＰＹＳＬ２、ＣＤＫ９、ＴＦＲＣ、ＰＳＭＢ３  ５’−ＵＴＲ、ＦＡＳＮ、ＰＳＭＢ６、ＰＲＳＳ５６、ＫＰＮＡ６、ＳＦＴ２Ｄ２、ＰＡＲＤ６Ｂ、ＬＰＰ、ＳＰＡＲＣ、ＳＣＡＮＤ１、ＶＡＳＮ、ＳＬＣ２６Ａ１、ＬＣＬＡＴ１、ＦＢＸＬ１８、ＳＬＣ３５Ｆ６、ＲＡＢ３Ｄ、ＭＡＰ１Ｂ、ＶＭＡ２１、ＣＹＢＡ、ＳＥＺ６Ｌ２、ＰＣＯＬＣＥ、ＶＴＮ、ＡＬＤＨ１６Ａ１、ＲＡＶＥＲ１、ＫＰＮＡ６、ＳＥＲＩＮＣ５、ＪＵＰ、ＣＰＮ２、ＣＲＩＰ２、ＥＰＴ１、ＰＮＰＯ、ＳＳＳＣＡ１、ＰＯＬＲ２Ｌ、ＬＩＮ７Ｃ、ＵＱＣＲ１０、ＰＹＣＲＬ、ＡＭＮ、ＭＡＰ１Ｓ、ＮＤＵＦＳ７、ＰＨＧＤＨ、ＴＳＰＯ、ＡＴＰ５Ｄ、ＥＸＯＳＣ４、ＴＵＢＢ４Ｂ、ＴＵＢＡ４Ａ、ＥＭＰ３、ＣＲＩＰ２、ＢＲＡＴ１、ＣＤ９、ＣＤＫ９、ＰＳＭＢ３、ＰＳＭＢ６、ＰＲＳＳ５６、ＳＣＡＮＤ１、ＡＭＮ、ＣＹＢＡ、ＰＣＯＬＣＥ、ＭＡＰ１Ｓ、ＶＴＮ、ＡＬＤＨ１６Ａ１（いずれも好ましくはヒト）及びＤｐｙｓｌ２、Ｃｃｎｄ１、Ａｃｏｘ２、Ｃｂｘ６、Ｕｂｃ、Ｌｄｌｒ、Ｎｕｄｔ２２、Ｐｃｙｏｘ１ｌ、Ａｎｋｒｄ１、Ｔｍｅｍ３７、Ｔｓｐｙｌ４、Ｓｌｃ７ａ３、Ｃｓｔ６、Ａａｃｓ、Ｎｏｓｉｐ、Ｉｔｇａ７、Ｃｃｎｄ２、Ｅｂｐ、Ｓｆ３ｂ５、Ｆａｓｎ、Ｈｍｇｃｓ１、Ｏｓｒ１、Ｌｍｎｂ１、Ｖｍａ２１、Ｋｉｆ２０ａ、Ｃｄｃａ８、Ｓｌｃ７ａ１、Ｕｂｑｌｎ２、Ｐｒｐｓ２、Ｓｈｍｔ２、Ａｕｒｋｂ、Ｆｉｇｎｌ１、Ｃａｄ、Ａｎｌｎ、Ｓｌｆｎ９、Ｎｃａｐｈ、Ｐｏｌｅ、Ｕｈｒｆ１、Ｇｊａ１、Ｆａｍ６４ａ、Ｋｉｆ２ｃ、Ｔｓｐａｎ１０、Ｓｃａｎｄ１、Ｇｐｒ８４、Ｆａｄｓ３、Ｃｅｒｓ６、Ｃｘｃｒ４、Ｇｐｒｃ５ｃ、Ｆｅｎ１、Ｃｓｐｇ４、Ｍｒｐｌ３４、Ｃｏｍｔｄ１、Ａｒｍｃ６、Ｅｍｒ４、Ａｔｐ５ｄ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ、Ｃｓｆ２ｒａ、Ａａｒｓｄ１、Ｋｉｆ２２、Ｃｔｈ、Ｔｐｇｓ１、Ｃｃｌ１７、Ａｌｋｂｈ７、Ｍｓ４ａ８ａ、Ａｃｏｘ２、Ｕｂｃ、Ｓｌｐｉ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ、Ｉｇｆ２ｂｐ１、Ｔｍｅｍ３７、Ｓｌｃ７ａ３、Ｃｓｔ６、Ｅｂｐ、Ｓｆ３ｂ５、Ｐｌｋ１、Ｃｄｃａ８、Ｋｉｆ２２、Ｃａｄ、Ｃｔｈ、Ｐｏｌｅ、Ｋｉｆ２ｃ、Ｓｃａｎｄ１、Ｇｐｒ８４、Ｔｐｇｓ１、Ｃｃｌ１７、Ａｌｋｂｈ７、Ｍｓ４ａ８ａ、Ｍｒｐｌ３４、Ｃｏｍｔｄ１、Ａｒｍｃ６、Ａｔｐ５ｄ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ、Ｎｕｄｔ２２、Ａａｒｓｄ１（いずれも好ましくはマウス）からなる群���好ましくは、ＺＮＦ４６０−５’−ＵＴＲ、ＴＧＭ２−５’−ＵＴＲ、ＩＬ７Ｒ−５’−ＵＴＲ、ＢＧＮ−５’−ＵＴＲ、ＴＫ１−５’−ＵＴＲ、ＲＡＢ３Ｂ−５’−ＵＴＲ、ＣＢＸ６−５’−ＵＴＲ、ＦＺＤ２−５’−ＵＴＲ、ＣＯＬ８Ａ１−５’−ＵＴＲ、ＮＤＵＦＳ７−５’−ＵＴＲ、ＰＨＧＤＨ−５’−ＵＴＲ、ＰＬＫ２−５’−ＵＴＲ、ＴＳＰＯ−５’−ＵＴＲ、ＰＴＧＳ１−５’−ＵＴＲ、ＦＢＸＯ３２−５’−ＵＴＲ、ＮＩＤ２−５’−ＵＴＲ、ＡＴＰ５Ｄ−５’−ＵＴＲ、ＥＸＯＳＣ４−５’−ＵＴＲ、ＮＯＬ９−５’−ＵＴＲ、ＵＢＢ４Ｂ−５’−ＵＴＲ、ＶＰＳ１８−５’−ＵＴＲ、ＯＲＭＤＬ２−５’−ＵＴＲ、ＦＳＣＮ１−５’−ＵＴＲ、ＴＭＥＭ３３−５’−ＵＴＲ、ＴＵＢＡ４Ａ−５’−ＵＴＲ、ＥＭＰ３−５’−ＵＴＲ、ＴＭＥＭ２０１−５’−ＵＴＲ、ＣＲＩＰ２−５’−ＵＴＲ、ＢＲＡＴ１−５’−ＵＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＨ１−５’−ＵＴＲ、ＣＤ９−５’−ＵＴＲ、ＤＰＹＳＬ２−５’−ＵＴＲ、ＣＤＫ９−５’−ＵＴＲ、ＴＦＲＣ−５’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ３  ５’−ＵＴＲ、ＦＡＳＮ−５’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ６−５’−ＵＴＲ、ＰＲＳＳ５６−５’−ＵＴＲ、ＫＰＮＡ６−５’−ＵＴＲ、ＳＦＴ２Ｄ２−５’−ＵＴＲ、ＰＡＲＤ６Ｂ−５’−ＵＴＲ、ＬＰＰ−５’−ＵＴＲ、ＳＰＡＲＣ−５’−ＵＴＲ、ＳＣＡＮＤ１−５’−ＵＴＲ、ＶＡＳＮ−５’−ＵＴＲ、ＳＬＣ２６Ａ１−５’−ＵＴＲ、ＬＣＬＡＴ１−５’−ＵＴＲ、ＦＢＸＬ１８−５’−ＵＴＲ、ＳＬＣ３５Ｆ６−５’−ＵＴＲ、ＲＡＢ３Ｄ−５’−ＵＴＲ、ＭＡＰ１Ｂ−５’−ＵＴＲ、ＶＭＡ２１−５’−ＵＴＲ、ＣＹＢＡ−５’−ＵＴＲ、ＳＥＺ６Ｌ２−５’−ＵＴＲ、ＰＣＯＬＣＥ−５’−ＵＴＲ、ＶＴＮ−５’−ＵＴＲ、ＡＬＤＨ１６Ａ１−５’−ＵＴＲ、ＲＡＶＥＲ１−５’−ＵＴＲ、ＫＰＮＡ６−５’−ＵＴＲ、ＳＥＲＩＮＣ５−５’−ＵＴＲ、ＪＵＰ−５’−ＵＴＲ、ＣＰＮ２−５’−ＵＴＲ、ＣＲＩＰ２−５’−ＵＴＲ、ＥＰＴ１−５’−ＵＴＲ、ＰＮＰＯ−５’−ＵＴＲ、ＳＳＳＣＡ１−５’−ＵＴＲ、ＰＯＬＲ２Ｌ−５’−ＵＴＲ、ＬＩＮ７Ｃ−５’−ＵＴＲ、ＵＱＣＲ１０−５’−ＵＴＲ、ＰＹＣＲＬ−５’−ＵＴＲ、ＡＭＮ−５’−ＵＴＲ、ＭＡＰ１Ｓ−５’−ＵＴＲ（いずれも好ましくはヒト）及びＤｐｙｓｌ２−５’−ＵＴＲ、Ｃｃｎｄ１−５’−ＵＴＲ、Ａｃｏｘ２−５’−ＵＴＲ、Ｃｂｘ６−５’−ＵＴＲ、Ｕｂｃ−５’−ＵＴＲ、Ｌｄｌｒ−５’−ＵＴＲ、Ｎｕｄｔ２２−５’−ＵＴＲ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ−５’−ＵＴＲ、Ａｎｋｒｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｔｍｅｍ３７−５’−ＵＴＲ、Ｔｓｐｙｌ４−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ３−５’−ＵＴＲ、Ｃｓｔ６−５’−ＵＴＲ、Ａａｃｓ−５’−ＵＴＲ、Ｎｏｓｉｐ−５’−ＵＴＲ、Ｉｔｇａ７−５’−ＵＴＲ、Ｃｃｎｄ２−５’−ＵＴＲ、Ｅｂｐ−５’−ＵＴＲ、Ｓｆ３ｂ５−５’−ＵＴＲ、Ｆａｓｎ−５’−ＵＴＲ、Ｈｍｇｃｓ１−５’−ＵＴＲ、Ｏｓｒ１−５’−ＵＴＲ、Ｌｍｎｂ１−５’−ＵＴＲ、Ｖｍａ２１−５’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２０ａ−５’−ＵＴＲ、Ｃｄｃａ８−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ１−５’−ＵＴＲ、Ｕｂｑｌｎ２−５’−ＵＴＲ、Ｐｒｐｓ２−５’−ＵＴＲ、Ｓｈｍｔ２−５’−ＵＴＲ、Ａｕｒｋｂ−５’−ＵＴＲ��Ｆｉｇｎｌ１−５’−ＵＴＲ、Ｃａｄ−５’−ＵＴＲ、Ａｎｌｎ−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｆｎ９−５’−ＵＴＲ、Ｎｃａｐｈ−５’−ＵＴＲ、Ｐｏｌｅ−５’−ＵＴＲ、Ｕｈｒｆ１−５’−ＵＴＲ、Ｇｊａ１−５’−ＵＴＲ、Ｆａｍ６４ａ−５’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２ｃ−５’−ＵＴＲ、Ｔｓｐａｎ１０−５’−ＵＴＲ、Ｓｃａｎｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｇｐｒ８４−５’−ＵＴＲ、Ｆａｄｓ３−５’−ＵＴＲ、Ｃｅｒｓ６−５’−ＵＴＲ、Ｃｘｃｒ４−５’−ＵＴＲ、Ｇｐｒｃ５ｃ−５’−ＵＴＲ、Ｆｅｎ１−５’−ＵＴＲ、Ｃｓｐｇ４−５’−ＵＴＲ、Ｍｒｐｌ３４−５’−ＵＴＲ、Ｃｏｍｔｄ１−５’−ＵＴＲ、Ａｒｍｃ６−５’−ＵＴＲ、Ｅｍｒ４−５’−ＵＴＲ、Ａｔｐ５ｄ−５’−ＵＴＲ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ−５’−ＵＴＲ、Ｃｓｆ２ｒａ−５’−ＵＴＲ、Ａａｒｓｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２２−５’−ＵＴＲ、Ｃｔｈ−５’−ＵＴＲ、Ｔｐｇｓ１−５’−ＵＴＲ、Ｃｃｌ１７−５’−ＵＴＲ、Ａｌｋｂｈ７−５’−ＵＴＲ、Ｍｓ４ａ８ａ−５’−ＵＴＲ（いずれも好ましくはマウス）；及びＮＤＵＦＳ７−３’−ＵＴＲ、ＰＨＧＤＨ−３’−ＵＴＲ、ＴＳＰＯ−３’−ＵＴＲ、ＡＴＰ５Ｄ−３’−ＵＴＲ、ＥＸＯＳＣ４−３’−ＵＴＲ、ＴＵＢＢ４Ｂ−３’−ＵＴＲ、ＴＵＢＡ４Ａ−３’−ＵＴＲ、ＥＭＰ３−３’−ＵＴＲ、ＣＲＩＰ２−３’−ＵＴＲ、ＢＲＡＴ１−３’−ＵＴＲ、ＣＤ９−３’−ＵＴＲ、ＣＤＫ９−３’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ３−３’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ６−３’−ＵＴＲ、ＰＲＳＳ５６−３’−ＵＴＲ、ＳＣＡＮＤ１−３’−ＵＴＲ、ＡＭＮ−３’−ＵＴＲ、ＣＹＢＡ−３’−ＵＴＲ、ＰＣＯＬＣＥ−３’−ＵＴＲ、ＭＡＰ１Ｓ−３’−ＵＴＲ、ＶＴＮ−３’−ＵＴＲ、ＡＬＤＨ１６Ａ１−３’−ＵＴＲ（いずれも好ましくはヒト）及びＡｃｏｘ２−３’−ＵＴＲ、Ｕｂｃ−３’−ＵＴＲ、Ｓｌｐｉ−３’−ＵＴＲ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ−３’−ＵＴＲ、Ｉｇｆ２ｂｐ１−３’−ＵＴＲ、Ｔｍｅｍ３７−３’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ３−３’−ＵＴＲ、Ｃｓｔ６−３’−ＵＴＲ、Ｅｂｐ−３’−ＵＴＲ、Ｓｆ３ｂ５−３’−ＵＴＲ、Ｐｌｋ１−３’−ＵＴＲ、Ｃｄｃａ８−３’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２２−３’−ＵＴＲ、Ｃａｄ−３’−ＵＴＲ、Ｃｔｈ−３’−ＵＴＲ、Ｐｏｌｅ−３’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２ｃ−３’−ＵＴＲ、Ｓｃａｎｄ１−３’−ＵＴＲ、Ｇｐｒ８４−３’−ＵＴＲ、Ｔｐｇｓ１−３’−ＵＴＲ、Ｃｃｌ１７−３’−ＵＴＲ、Ａｌｋｂｈ７−３’−ＵＴＲ、Ｍｓ４ａ８ａ−３’−ＵＴＲ、Ｍｒｐｌ３４−３’−ＵＴＲ、Ｃｏｍｔｄ１−３’−ＵＴＲ、Ａｒｍｃ６−３’−ＵＴＲ、Ａｔｐ５ｄ−３’−ＵＴＲ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ−３’−ＵＴＲ、Ｎｕｄｔ２２−３’−ＵＴＲ、Ａａｒｓｄ１−３’−ＵＴＲ（いずれも好ましくはマウス）からなる群から選択される遺伝子の転写物の３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる。
【０３５５】
本発明に係る使用は、好ましくは、人工核酸分子、ベクター、又はＲＮＡと上記３’−ＵＴＲエレメント及び／又は上記５’−ＵＴＲエレメントとを結合させることを含む。
【０３５６】
本発明の医薬組成物の化合物及び成分は、互いに独立して製造及び取引されていてもよい。したがって、本発明は、更に、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、及び／又は本発明に係る医薬組成物を含むキット又はキットオブパーツに関する。好ましくは、かかるキット又はキットオブパーツは、更に、使用説明書と、トランスフェクション用の細胞と、アジュバントと、医薬組成物の投与手段と、人工核酸分子、ベクター、細胞、又は医薬組成物を溶解又は希釈するための薬学的に許容できる担体及び／又は薬学的に許容できる溶液とを含んでいてよい。
【０３５７】
３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）及び／又は５’−非翻訳領域エレメント（５’−ＵＴＲエレメント）を同定する方法
更なる態様では、本発明は、３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）及び／又は５’−非翻訳領域エレメント（５’−ＵＴＲエレメント）を同定する方法であって、
ａ）ｍＲＮＡの安定性を分析する工程であって、以下のサブ工程：
ｉ．  前記ｍＲＮＡの分解プロセス中の第１の時点における前記ｍＲＮＡの量を測定する工程、
ｉｉ．  前記ｍＲＮＡの分解プロセス中の第２の時点における前記ｍＲＮＡの量を測定する工程、及び
ｉｉｉ．  工程（ｉ）において測定された前記ｍＲＮＡの量の工程（ｉｉ）において測定された前記ｍＲＮＡの量に対する比を計算する工程
を含む工程と、
ｂ）サブ工程（ｉｉｉ）において計算された比が、少なくとも０．５（５０％）、少なくとも０．６（６０％）、少なくとも０．７（７０％）、少なくとも０．７５（７５％）、少なくとも０．８（８０％）、少なくとも０．８５（８５％）、少なくとも０．９（９０％）、又は少なくとも０．９５（９５％）である安定なｍＲＮＡを選択する工程と、
ｃ）前記安定なｍＲＮＡの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントのヌクレオチド配列を決定する工程と
を含む方法を提供する。
【０３５８】
したがって、ｍＲＮＡの安定性は、好ましくは、標準的な条件下、例えば、用いられる特定の細胞株又は細胞型について標準的な条件（標準的な培地、インキュベーション等）下で評価される。
【０３５９】
ｍＲＮＡの安定性を分析するために、前記ｍＲＮＡの分解プロセス中の第１及び第２の時点における前記ｍＲＮＡの量又は濃度を求めることによってこのｍＲＮＡの分解プロセスを評価する（工程ａ）ｉ．及びａ）ｉｉ．を参照）。
【０３６０】
インビボ又は上に定義したインビトロ（即ち、インビトロとは、特に、（「生」）細胞及び／又は組織（生体の組織を含む）を指し、細胞としては、特に、細胞株、初代細胞、組織又は被験体における細胞が挙げられ、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞及びマウス細胞）が好ましく、ヒト細胞株ＨｅＬａ、ＨＥＰＧ２、及びＵ−９３７並びにマウス細胞株ＮＩＨ３Ｔ３、ＪＡＷＳＩＩ、及びＬ９２９が特に好ましく用いられ、更に、初代細胞が特に好ましく、特に好ましい実施形態では、ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）である）におけるＲＮＡ分解プロセス中のｍＲＮＡの量又は濃度を求めるために、当業者に公知の様々な方法を用いてよい。かかる方法の非限定的な例としては、例えば、アクチノマイシンＤ等の転写阻害剤を用いる転写の全体的な阻害、一時的転写を特異的に促進するための誘導性プロモータ（例えば、ｃ−ｆｏｓ血清誘導性プロモータ系及びＴｅｔ−ｏｆｆ制御性プロモータ系）の使用、及び動的標識技術（例えば、パルス標識）が挙げられる。
【０３６１】
例えば、インビボ又は上に定義したインビトロにおいてＲＮＡ分解プロセス中のｍＲＮＡの量又は濃度を測定するために工程ａ）で転写阻害剤媒介転写停止を用いる場合、アクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ）、５，６−ジクロロ−１−Ｄ−リボフラノシル−ベンズイミダゾール（ＤＲＢ）、又は−アマニチン（α−Ａｍ）等の転写阻害剤を用いてよい。その結果、ｍＲＮＡの分解を評価するために、通常、転写阻害剤を細胞に添加し、それによって、転写が全体的に阻害され、進行中の転写に干渉することなしにＲＮＡ分解を観察することができる。
【０３６２】
或いは、工程ａ）において一時的転写を特異的に促進するための誘導性プロモータを用いてもよく、この理論的根拠は、転写を活性化し且つｍＲＮＡ合成の突発的増加を導く刺激を提供し、次いで、前記刺激を除去して転写を停止させ、ｍＲＮＡの分解をモニタリングすることである。したがって、誘導性プロモータによってストリンジェントな制御が可能になり、その結果、狭い時間枠内で転写の誘導及びサイレンシングが達成される。哺乳類細胞では、ｃｆｏｓプロモータがこの目的のために有益であることが知られているが、その理由は、急速に且つ一時的に血清添加に応答して誘導され得るので、転写の一時的な突発的増加を達成する信頼できる簡単な方法が得られるためである。Ｔｅｔ−ｏｆｆプロモータ系は、哺乳類細胞においてｍＲＮＡのターンオーバーについて調べるために転写パルシングアプローチの用途を更に広げる別の選択肢を提供する。
【０３６３】
しかし、本発明では、インビボ又は上に定義したインビトロにおけるＲＮＡ分解プロセス中のｍＲＮＡの量を測定するために、工程ａ）において動的標識技術が好ましい。動的標識では、ＲＮＡは通常標識され、標識としては、特に、標識されたヌクレオチド及び標識されたヌクレオシド及び標識されたウリジン及び標識されたウラシルが特に好ましい。好ましい標識の例としては、４−チオウリジン（４ｓＵ）、２−チオウリジン、６−チオグアノシン、５−エチニルウリジン（ＥＵ）、５−ブロモ−ウリジン（ＢｒＵ）、ビオチン−１６−アミノアリルウリジン、５−アミノアリルウリジン、５−アミノアリルシチジン等が挙げられ、４−チオウリジン（４ｓＵ）、５−エチニルウリジン（ＥＵ）、又は５’−ブロモ−ウリジン（ＢｒＵ）がより好ましい。４−チオウリジン（４ｓＵ）が特に好ましい。４−チオウリジン（４ｓＵ）は、好ましくは、１００μＭ〜５００μＭの濃度で用いられる。更に、例えば、ウリジン−３Ｈを用いる放射活性標識ヌクレオチドを用いてもよい。また、上述の標識されたヌクレオチドの組合せを用いてもよく、４−チオウリジンと６−チオグアノシンとの組合せが特に好ましい。
【０３６４】
動的標識では、通常、例えば標識されたウリジン又はウラシルを転写中に取り込むことによって、生成されるＲＮＡを標識する。少し間を置いて、標識の供給を停止し、次いで、特異的に標識されたＲＮＡを評価することによって転写を全体的に阻害することなしにＲＮＡ分解を観察することができる。
【０３６５】
工程ａ）においてＲＮＡ分解プロセス中にｍＲＮＡの量を測定するためには、パルス標識が好ましく、パルスチェイス法が特に好ましい。本明細書で使用するとき、用語「パルス標識」とは、生細胞内の化合物の合成及び／又は分解の速度を測定するために標識（例えば、上記標識）を用いる技術を指す。典型的には、短時間少量の標識に細胞を曝露するので、「パルス」という用語が用いられる。パルスチェイス法では、パルス標識後、通常、「パルス」に対応する遥かに多量の標識されていない化合物（例えば、標識されたウリジンをパルスとして用いる場合、標識されていないウリジン）を、必要な標識への曝露時間後に添加する。標識された化合物と標識されていない化合物との間の競合の効果によって、標識された化合物の更なる取り込みが無視できるレベルまで低下するので、「チェイス」という用語が用いられる。
【０３６６】
ｍＲＮＡの量又は濃度を測定するためには、通常、ｍＲＮＡを単離しなければならない。ＲＮＡを単離するための様々な技術が当業者に知られており、例えば、チオシアン酸グアニジン−フェノール−クロロホルム抽出又はシリカカラムベースの抽出による。また、Ｑｉａｇｅｎ製のＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔ等の市販されているキットを用いてもよい。
【０３６７】
更に、（転写が全体的に阻害されるので、全ＲＮＡが「分解されている」ＲＮＡとなる転写阻害剤とは対照的に）特に動的標識を用いる場合、抽出工程が必要になる場合がある。抽出工程では、全単離ＲＮＡから標識ＲＮＡ（即ち、「分解されている」ＲＮＡを表す）を抽出する。したがって、抽出の手段は、用いられる標識に依存して選択してよい。例えば、標識に対する抗体を用いる免疫精製を用いてよい。
【０３６８】
更に、例えば、チオ標識（例えば、４−チオウリジン（４ｓＵ）標識）されたＲＮＡを抽出する場合、ＨＰＤＰ−ビオチン（切断可能な（可逆的）ジスルフィド結合を介してコンジュゲートするピリジルジチオール活性化スルフヒドリル反応性ビオチン化試薬）を単離された「全ＲＮＡ」と共にインキュベートしてよい。この試薬は、４−チオウリジン（４ｓＵ）標識されたＲＮＡにおける還元チオール（−ＳＨ）と特異的に反応して、可逆的ジスルフィド結合を形成する。ビオチン化によって、チオ標識（例えば、４−チオウリジン（４ｓＵ）標識）されたＲＮＡがストレプトアビジンに結合できるようになり、したがって、ジチオスレイトール又はベータ−メルカプトエタノール（又は任意の他の還元剤）でジスルフィド結合を還元することによって全ＲＮＡから抽出することができる。
【０３６９】
ビオチン標識されたヌクレオチド（例えば、ビオチン−１６−アミノアリルウリジン）の場合、ストレプトアビジンを直接用いて全ＲＮＡから標識ＲＮＡを抽出することができる。
【０３７０】
例えば、新たに転写される５−エチニルウリジン（ＥＵ）標識された細胞ＲＮＡを全ＲＮＡから抽出するために、銅触媒環付加反応におけるＥＵのビオチン化（クリックケミストリーと称されることが多い）を使用してよく、この後、ストレプトアビジン親和性によって精製する。この方法は、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ  Ｎａｓｃｅｎｔ  ＲＮＡ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（カタログ番号Ｃ１０３６５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）として市販されている。このキットの製造業者による説明書では、ＥＵ用量０．５ｍＭの場合は３０分間〜６０分間、又はＥＵ用量０．１ｍＭ若しくは０．２ｍＭの場合は１時間〜２４時間のパルス標識時間が推奨されている。
【０３７１】
例えば、ＢｒＵ標識されたＲＮＡ分子は、抗ブロモデオキシウリジン抗体（例えば、Ｃｌｏｎｅ．２Ｂ１、カタログ番号ＭＩ−１１−３、ＭＢＬ）及びプロテインＧセファロースを用いる免疫精製によって抽出してよい。
【０３７２】
次いで、当業者に公知の様々な方法によって、ｍＲＮＡの量又は濃度、即ち、転写レベルを測定してよい。かかる方法の非限定的な例としては、マイクロアレイ解析、ノーザンブロット解析、定量ＰＣＲ、又は次世代シーケンシング（ハイスループットシーケンシング）が挙げられる。マイクロアレイ解析及び次世代シーケンシングが特に好ましい。更に、全ゲノムアプローチ／全トランスクリプトームアプローチ、例えば、マイクロアレイ解析では、全ゲノムマイクロアレイ解析（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  １．０ＳＴ若しくは２．０ＳＴ又はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｅ  １．０ＳＴ若しくは２．０ＳＴ）又は次世代シーケンシングによる全トランスクリプトーム解析が特に好ましい。
【０３７３】
工程ａ）のサブ工程ｉ．及びｉｉ．では、ｍＲＮＡの分解プロセス中の第１及び第２の時点におけるｍＲＮＡの量を測定する。典型的には、これは、特にｍＲＮＡの分解プロセス中の第１及び第２の時点においてｍＲＮＡを単離して、それぞれの量を測定することを意味する。したがって、「第１の時点」及び「第２の時点」は、特に、ＲＮＡを単離してＲＮＡ量を測定する、ＲＮＡ分解プロセス中の時点である。一般的に、「第２の時点」は、ＲＮＡ分解プロセスにおいて「第１の時点」よりも後である。
【０３７４】
好ましくは、第１の時点は、ｍＲＮＡが分解プロセスのみを受けていると考えられる、即ち、例えば、進行中の転写において、ｍＲＮＡの出現が回避されるように選択される。例えば、動的標識技術（例えば、パルス標識）を用いる場合、第１の時点は、好ましくは、標識のｍＲＮＡへの取り込みが完了している、即ち、標識のｍＲＮＡへの取り込みが進行中ではないように選択される。したがって、動的標識を用いる場合、第１の時点は、実験的標識手順の終了、例えば、細胞と標識とのインキュベーションの終了の少なくとも１０分間後、少なくとも２０分間後、少なくとも３０分間後、少なくとも４０分間後、少なくとも５０分間後、少なくとも６０分間後、少なくとも７０分間後、少なくとも８０分間後、又は少なくとも９０分間後であってよい。
【０３７５】
例えば、第１の時点は、好ましくは、（例えば、転写阻害剤による）転写の停止、誘導性プロモータの場合はプロモータ誘導の停止、又はパルス若しくは標識の供給の停止（例えば、標識の終了）の０時間後〜６時間後であってよい。より好ましくは、第１の時点は、（例えば、転写阻害剤による）転写の停止、誘導性プロモータの場合はプロモータ誘導の停止、又はパルス若しくは標識の供給の停止（例えば、標識の終了）の３０分間後〜５時間後、更により好ましくは１時間後〜４時間後、特に好ましくは３時間後であってよい。
【０３７６】
好ましくは、第２の時点は、ｍＲＮＡ分解プロセス中においてできる限り遅くなるように選択される。しかし、複数のｍＲＮＡ種を考慮する場合、第２の時点は、好ましくは、相当量の複数のｍＲＮＡ種、好ましくは、ｍＲＮＡ種の少なくとも１０％が依然として検出可能な量、即ち、０よりも多い量で存在するように選択される。好ましくは、第２の時点は、（例えば、転写阻害剤による）転写の停止、誘導性プロモータの場合はプロモータ誘導の停止、又はパルス若しくは標識の供給の停止（例えば、標識の終了）の少なくとも５時間後、少なくとも６時間後、少なくとも７時間後、少なくとも８時間後、少なくとも９時間後、少なくとも１０時間後、少なくとも１１時間後、少なくとも１２時間後、少なくとも１３時間後、少なくとも１４時間後、又は少なくとも１５時間後である。
【０３７７】
例えば、第２の時点は、好ましくは、（例えば、転写阻害剤による）転写の停止、誘導性プロモータの場合はプロモータ誘導の停止、又はパルス若しくは標識の供給の停止（例えば、標識の終了）の３時間後〜４８時間後であってよい。より好ましくは、第２の時点は、（例えば、転写阻害剤による）転写の停止、誘導性プロモータの場合はプロモータ誘導の停止、又はパルス若しくは標識の供給の停止（例えば、標識の終了）の６分間後〜３６時間後、更により好ましくは１０時間後〜２４時間後、特に好ましくは約１５時間後であってよい。
【０３７８】
したがって、第１の時点と第２の時点との時間間隔は、上記限度内でできる限り大きいことが好ましい。したがって、第１の時点と第２の時点との時間間隔は、好ましくは、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、又は少なくとも１２時間であり、約１２時間の時間間隔が特に好ましい。一般的に、第２の時点は、第１の時点よりも少なくとも１０分間遅い。
【０３７９】
工程ａ）のサブ工程ｉｉｉ．では、工程（ｉ）において測定されたｍＲＮＡの量の工程（ｉｉ）において測定されたｍＲＮＡの量に対する比を計算する。この目的のために、第２の時点において上記の通り測定したｍＲＮＡの量（転写物レベル）を第１の時点において上記の通り測定したｍＲＮＡの量（転写物レベル）で除する。この比は、第１の時点では非常に少量でしか存在してしない安定なｍＲＮＡが、大量に存在するｍＲＮＡに対して無視されることを防ぐ。
【０３８０】
工程ｂ）では、工程（ａ）のサブ工程（ｉｉｉ）において計算された比が少なくとも０．５（５０％）、少なくとも０．６（６０％）、少なくとも０．７（７０％）、少なくとも０．７５（７５％）、少なくとも０．８（８０％）、少なくとも０．８５（８５％）、少なくとも０．９（９０％）、又は少なくとも０．９５（９５％）である安定なｍＲＮＡを選択する。かかるｍＲＮＡは、本発明において、特定の安定なｍＲＮＡであると考えられる。
【０３８１】
工程ｃ）では、前記ｍＲＮＡ、即ち、工程ｂ）で選択されたｍＲＮＡの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントのヌクレオチド配列を決定する。この目的のために、例えば、シーケンシング又は例えばＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター）等の公的に利用可能なデータベースからの選択等の当業者に公知の様々な方法を適用してよい。例えば、工程ｂ）で選択されたｍＲＮＡのｍＲＮＡ配列をデータベースでサーチし、次いで、データベース中に存在するｍＲＮＡ配列から３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲを抽出してよい。
【０３８２】
特に、３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）及び／又は５’−非翻訳領域エレメント（５’−ＵＴＲエレメント）を同定する上記方法では、用語「ｍＲＮＡ」及び／又は「安定なｍＲＮＡ」とは、それぞれ、本明細書に定義するｍＲＮＡ種及び／又は安定なｍＲＮＡ種を指し得る。
【０３８３】
更に、本明細書では、「安定なｍＲＮＡ」は、好ましくはインビボ又は上に定義したインビトロにおいて評価した平均ｍＲＮＡ分解と比べてｍＲＮＡ分解が緩徐であり得ることが好ましい。したがって、「平均ｍＲＮＡ分解」は、複数のｍＲＮＡ種のｍＲＮＡ分解を調べることによって評価し得る。
【０３８４】
したがって、本明細書において、更なる態様では、３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）及び／又は５’−非翻訳領域エレメント（５’−ＵＴＲエレメント）を同定する方法であって、
ａ）複数のｍＲＮＡ種の安定性を分析する工程であって、以下のサブ工程：
ｉ．  前記ｍＲＮＡ種の分解プロセス中の第１の時点における前記複数のｍＲＮＡ種の各ｍＲＮＡ種の量を測定する工程、
ｉｉ．  前記ｍＲＮＡ種の分解プロセス中の第２の時点における前記複数のｍＲＮＡ種の各ｍＲＮＡ種の量を測定する工程、及び
ｉｉｉ．  前記複数のｍＲＮＡ種の各ｍＲＮＡ種について、工程（ｉ）において測定された前記ｍＲＮＡ種の量の工程（ｉｉ）において測定された前記ｍＲＮＡ種の量に対する比を計算する工程
を含む工程と、
ｂ）各ｍＲＮＡ種について、サブ工程（ｉｉｉ）において計算された比に従って前記複数のｍＲＮＡ種のｍＲＮＡ種を順位付けする工程と、
ｃ）サブ工程（ｉｉｉ）において計算された１つ又は複数の最高比を有する１以上のｍＲＮＡを選択する工程と、
ｄ）前記ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントのヌクレオチド配列を決定する工程と
を含む方法を提供する。
【０３８５】
「ｍＲＮＡ種」とは、本明細書で使用するとき、ゲノム転写単位、即ち、通常遺伝子に対応する。したがって、例えば、ｍＲＮＡのプロセシングに起因して、１つの「ｍＲＮＡ種」内に異なる転写物が生じる場合がある。例えば、ｍＲＮＡ種は、マイクロアレイ上のスポットによって表すことができる。したがって、マイクロアレイは、例えば、ｍＲＮＡ分解中の特定の時点において複数のｍＲＮＡ種の量を測定するのに好都合なツールを提供する。しかし、当業者に公知の他の技術、例えば、ＲＮＡ−ｓｅｑ（全トランスクリプトームショットガンシーケンシングとも呼ばれる、所与の瞬間におけるゲノムからＲＮＡの存在及び量のスナップショットを明らかにするために次世代シーケンシングの能力を使用する技術）、定量ＰＣＲ等を用いてもよい。
【０３８６】
好ましくは、「複数のｍＲＮＡ種」とは、少なくとも１００、少なくとも３００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも２，０００、少なくとも３，０００、少なくとも４，０００、少なくとも５，０００、少なくとも６，０００、少なくとも７，０００、少なくとも８，０００、少なくとも９，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１１，０００、少なくとも１２，０００、少なくとも１３，０００、少なくとも１４，０００、少なくとも１５，０００、少なくとも１６，０００、少なくとも１７，０００、少なくとも１８，０００、少なくとも１９，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも２１，０００、少なくとも２２，０００、少なくとも２３，０００、少なくとも２４，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも２６，０００、少なくとも２７，０００、少なくとも２８，０００、少なくとも２９，０００、少なくとも３０，０００のｍＲＮＡ種を指す。トランスクリプトーム全体を評価するか、又はトランスクリプトームのうちのできる限り多くのｍＲＮＡ種を評価することが特に好ましい。これは、例えば、トランスクリプトーム全体を網羅するマイクロアレイを用いることによって行うことができる。
【０３８７】
サブ工程ｉ．〜ｉｉｉ．を含むこの方法の工程ａ）は、第１及び第２の時点において複数のｍＲＮＡ種の各ｍＲＮＡ種の量を測定し、各ｍＲＮＡ種についての比を計算することのみを除いて、既に記載した本発明の方法のサブ工程ｉ．〜ｉｉｉ．を含む工程ａ）と本質的に一致する。したがって、上に概説した詳細な方法及び好ましい実施形態がここでも適用され、更に、単一のｍＲＮＡ種（及びそれぞれ、各単一のｍＲＮＡ種）についての比は、「ｍＲＮＡ」について上に概説した通り決定してよい。
【０３８８】
しかし、上記方法とは対照的に、ｍＲＮＡの安定性は、比の絶対値ではなく、各ｍＲＮＡ種について工程ａ）のサブ工程（ｉｉｉ）で計算された比による複数のｍＲＮＡ種のうちのｍＲＮＡ種の順位によって評価される。サブ工程ｃ）では、次いで、工程ａ）のサブ工程（ｉｉｉ）で計算された１つ又は複数の最高比を有する１以上のｍＲＮＡ種を選択する。
【０３８９】
この状況では、工程ｃ）において０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％の最も安定なｍＲＮＡを選択することが特に好ましい。それに代えて又はそれに加えて、工程ｃ）では、分析した全てのｍＲＮＡ種から計算された平均比の少なくとも１００％に対応する、工程ａ）のサブ工程ｉｉｉ．で計算された比を示すｍＲＮＡ種を選択してよい。より好ましくは、分析した全てのｍＲＮＡ種から計算された平均比の少なくとも１５０％、更により好ましくは少なくとも２００％、最も好ましくは少なくとも３００％の比を示すｍＲＮＡ種を選択する。
【０３９０】
工程ｄ）では、工程ｃ）において選択されたｍＲＮＡの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントのヌクレオチド配列を、既に記載した本発明の方法の工程ｃ）について上に記載した通り決定する。
【０３９１】
好ましくは、本発明に係る３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントを同定する上記方法の両方において、第１の時点と第２の時点との間の時間間隔は、少なくとも５時間、好ましくは少なくとも６時間、好ましくは少なくとも７時間、より好ましくは少なくとも８時間、より好ましくは少なくとも９時間、更により好ましくは少なくとも１０時間、更により好ましくは少なくとも１１時間、特に好ましくは少なくとも１２時間である。
【０３９２】
好ましくは、本発明に係る３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントを同定する上記方法の両方において、ｍＲＮＡの安定性は、パルス標識によって、好ましくは、パルスチェイス法を用いて分析される。
【０３９３】
３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）及び／又は５’−非翻訳領域エレメント（５’−ＵＴＲエレメント）を同定する方法
更なる態様では、本発明は、また、人工核酸分子に高い翻訳効率を与える３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）及び／又は５’−非翻訳領域エレメント（５’−ＵＴＲエレメント）を同定する方法であって、
ａ）  上記方法のいずれかに従って３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントを同定する方法によって、安定なｍＲＮＡに由来する３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントを同定する工程と、
ｂ）  少なくとも１つのオープンリーディングフレームと、工程ａ）において同定された前記３’−ＵＴＲエレメント及び／又は前記５’−ＵＴＲエレメントに対応するか又は含まれる少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントとを含む人工核酸分子を合成する工程と、
ｃ）  工程ｂ）において合成された前記人工核酸分子の前記少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされているタンパク質の発現を解析する工程と、
ｄ）  ３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントが欠損しているレファレンス人工核酸分子の少なくとも１つのオープンリーディングフレームによってコードされているタンパク質の発現を解析する工程と、
ｅ）  工程ｃ）において解析した前記人工核酸分子からのタンパク質発現を工程ｄ）において解析した前記レファレンス人工核酸分子からのタンパク質発現と比較する工程と、
ｆ）  工程ｄ）において解析した前記レファレンス人工核酸分子からのタンパク質発現と比較して工程ｃ）において解析した前記人工核酸分子からのタンパク質発現が延長及び／又は増加している場合、前記３’−ＵＴＲエレメント及び／又は前記５’−ＵＴＲエレメントを選択する工程と
を含む方法を提供する。
【０３９４】
この方法では、上記の通り本発明に係る方法によって、まず、３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントを同定する。これによって、当業者に公知の方法、例えば、ＰＣＲ増幅によって３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントを合成することができるようになる。かかるＰＣＲに用いられるプライマーは、好ましくは、クローニングのための制限酵素部位を含んでいてよい。或いは、例えば、化学合成又はオリゴアニーリングによって３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントを合成してもよい。したがって、工程ｂ）において、少なくとも１つのオープンリーディングフレームと、工程ａ）で同定された３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントに対応するか又は含まれている少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントとを含む人工核酸分子が合成される。特に、少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、通常、オープンリーディングフレームと組み合わせられ、その結果、３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントがそれぞれの要件を満たす場合、即ち、タンパク質発現を延長及び／又は増加させる場合、本発明に係る３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントを含む人工核酸分子が得られる。これを試験するために、それぞれのＯＲＦからのタンパク質発現を評価するために、工程ａ）で同定される３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメント、又はそれぞれのＰＣＲ断片若しくは合成配列を特定のベクター、好ましくは、発現ベクターにクローニングしてよい。
【０３９５】
次いで、少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントを含む人工核酸分子からのタンパク質発現を、本明細書に記載の通り工程ｃ）において評価し、工程ｅ）において本明細書に記載した通り３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントが欠損しているそれぞれのレファレンス人工核酸分子からの工程ｄ）で評価したタンパク質発現と比較する。
【０３９６】
その後、工程ｆ）において、工程ｄ）で分析したレファレンス人工核酸分子からのタンパク質発現と比べて工程ｃ）で分析した人工核酸分子からのタンパク質産生を増加させる３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントを選択する。本発明の核酸分子のタンパク質発現のレファレンス人工核酸分子との比較は、本明細書に記載の通り、特に、本発明の人工核酸分子の状況において実施される。
【０３９７】
更に、本発明は、人工核酸分子に高い翻訳効率を与える３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）及び／又は５’−非翻訳領域エレメント（５’−ＵＴＲエレメント）を同定する特に好ましい方法であって、
ａ）  新たに転写されるＲＮＡ分子に取り込ませるために、標識されたヌクレオチドを細胞に供給／細胞と共にインキュベートする（パルスチェイス標識）工程と、
ｂ）  第１の時点及び少なくとも１つの第２の時点において前記細胞の全ＲＮＡを単離する工程と、
ｃ）  工程ｂ）で単離された前記全ＲＮＡから、標識されたＲＮＡ分子を抽出する工程と、
ｄ）  前記標識されたＲＮＡに含まれている様々なｍＲＮＡ種の量／転写物レベルを測定する工程と、
ｅ）  前記第１の時点において存在するｍＲＮＡ種の量／転写物レベルに対する前記少なくとも１つの第２の後続時点において存在するｍＲＮＡ種の量／転写物レベルの比を計算する工程と、
ｆ）  工程ｅ）で求められた前記比に従って前記ｍＲＮＡ種を順位付けする工程と、
ｇ）  最も安定なｍＲＮＡを選択する工程と、
ｈ）  工程ｇ）において選択した前記最も安定なｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲのヌクレオチド配列を決定する工程と、
ｉ）工程ｈ）において決定した前記３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲに含まれている３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントを合成する工程と、
ｊ）  工程ｉ）で合成した前記３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントをオープンリーディングフレームと組み合わせて、本明細書に記載する本発明に係る核酸を得る工程と、
ｋ）  任意で、本発明の核酸中に存在する前記オープンリーディングフレームの発現を、本明細書に記載する３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントを有しないレファレンス核酸中に存在するオープンリーディングフレームの発現と比較する工程と
を含む方法を提供する。
【０３９８】
したがって、上記本発明の方法について記載した詳細及び好ましい実施形態も、工程ａ）〜ｋ）において概説したそれぞれの範囲内で、本明細書に適用される。
【０３９９】
特に、本発明の方法の工程ａ）において細胞を供給するためには、以下の標識されたヌクレオチドが好ましい：４−チオウリジン（４ｓＵ）、２−チオウリジン、６−チオグアノシン、５−エチニルウリジン（ＥＵ）、５−ブロモ−ウリジン（ＢｒＵ）、ビオチン−１６−アミノアリルウリジン、５−アミノアリルウリジン、５−アミノアリルシチジン等。４−チオウリジン（４ｓＵ）が特に好ましい。４−チオウリジンは、好ましくは、１００μＭ〜５００μＭの濃度で用いられる。或いは、例えばウリジン−３Ｈ等の放射活性標識ヌクレオチドを用いてもよい。上述の標識されたヌクレオチドの組合せを用いてもよい。４−チオウリジンと６−チオグアノシンとの組合せが特に好ましい。
【０４００】
工程ａ）における細胞と標識されたヌクレオチドとのインキュベーションは、変動し得る。１０分間〜２４時間のインキュベーション（供給時間）が特に好ましい。２時間〜６時間が特に好ましく、２時間〜３時間がより好ましい。
【０４０１】
本発明の方法のために用いることができる細胞としては、特に、細胞株、初代細胞、組織又は被験体における細胞が挙げられる。特定の実施形態では、細胞培養可能な細胞型が本発明の方法に好適であり得る。哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞及びマウス細胞が特に好ましい。特に好ましい実施形態では、ヒト細胞株ＨｅＬａ、ＨＥＰＧ２、及びＵ−９３７、並びにマウス細胞株ＮＩＨ３Ｔ３、ＪＡＷＳＩＩ、及びＬ９２９が用いられる。更に、初代細胞が特に好ましく、特に好ましい実施形態では、特にヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）を用いてよい。或いは、標識されたヌクレオチドを被験体の組織に適用してもよく、インキュベーション時間後、前記組織のＲＮＡを工程ｃ）に従って単離する。
【０４０２】
細胞（型）の最も安定なｍＲＮＡを決定するために、上記第１の時点、例えば、標識の０時間後〜６時間後、好ましくは標識の３時間後、及び上記第２の後続時点、例えば、標識の３時間後〜４８時間後、好ましくは１０時間後〜２４時間後、最も好ましくは１５時間後に全ＲＮＡを抽出する。第２の後続時点は、第１の時点よりも少なくとも１０分間遅い。
【０４０３】
工程ｆ）では、工程ｅ）で計算した比に従ってｍＲＮＡ種を順位付けする。この状況では、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％の最も安定なｍＲＮＡ種を選択することが特に好ましい。
【０４０４】
この状況では、第１の時点と比べて、第２の後続時点において少なくとも５０％（０，５倍）、少なくとも６０％（０，６倍）、少なくとも７０％（０，７倍）、少なくとも９０％（０，９倍）、又は少なくとも９５％（０，９５倍）のｍＲＮＡ種の転写物レベル／量を示すｍＲＮＡ種を選択することが更に好ましい。この実施形態は、標識の３時間後（第１の時点）及び１５時間後（第２の時点）にＲＮＡを単離する場合が特に好ましい。
【０４０５】
それに代えて又はそれに加えて、分析された全てのｍＲＮＡ種から計算された平均比の少なくとも１００％に対応する、工程ｅ）で計算された比を示すｍＲＮＡ種を選択する。より好ましくは、分析された全てのｍＲＮＡ種から計算された平均比の少なくとも１５０％、より好ましくは少なくとも２００％、最も好ましくは少なくとも３００％の比を示すｍＲＮＡ種を選択する。
【０４０６】
本発明の方法の更なる工程では、工程ｇ）において選択された最も安定なｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲのヌクレオチド配列を決定し、工程ｉ）において、例えばＰＣＲ増幅によって３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントを合成する。ＰＣＲに用いられるプライマーは、好ましくは、クローニングのための制限酵素部位を含んでいてよい。或いは、（例えば、化学合成又はオリゴアニーリングによって）３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントを合成してもよい。
【０４０７】
本発明の方法の工程ｊ）では、得られたＰＣＲ断片又は合成された配列をオープンリーディングフレームと組み合わせて、本発明に係る３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントを含む人工核酸を得る。好ましくは、ＰＣＲ断片又は配列をベクターにクローニングしてよい。
【０４０８】
特に好ましい実施形態では、本発明は、３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）及び／又は５’−非翻訳領域エレメント（５’−ＵＴＲエレメント）を同定するための工程ａ）〜ｋ）を含む方法であって、前記３’−ＵＴＲエレメント及び／又は前記５’−ＵＴＲエレメントが、前記３’−ＵＴＲエレメントのうちの少なくとも１つ及び／又は前記５’−ＵＴＲエレメントのうちの少なくとも１つを含む人工核酸分子からのタンパク質産生を延長する方法を提供する。
【０４０９】
更なる態様では、本発明は、また、人工核酸分子を作製する方法であって、少なくとも１つのオープンリーディングフレームと、上記の通り本発明に係る３’−ＵＴＲエレメント及び／又は５’−ＵＴＲエレメントを同定する方法によって同定された少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントとを含む前記人工核酸分子を合成する方法を提供する。かかる人工核酸分子の合成は、典型的には、当業者に公知の方法、例えば、一般的に知られているか又は本明細書に記載されているクローニング方法によって実施される。
【０４１０】
好ましくは、本明細書に記載する本発明に係るベクターが、人工核酸分子を作製する本発明の方法において用いられる。
【０４１１】
好ましくは、かかる人工核酸分子を作製する方法によって作製される人工核酸分子は、本明細書に記載する本発明に係る核酸分子である。
【０４１２】
更に、本発明は、また、本明細書に記載する本発明に係る人工核酸分子を作製する方法によって得ることができる人工核酸分子を提供する。
【実施例】
【０４１３】
実施例１：候補ＵＴＲエレメント
ヒト及びマウスの細胞におけるｍＲＮＡ発現を実験的に評価した。これによって、それぞれの細胞において発現するｍＲＮＡが同定された。ｍＲＮＡ種の５’−及び／又は３’−ＵＴＲのヌクレオチド配列をデータベースサーチによって決定し、細胞のトランスクリプトームのハイスループットシークエンシングデータによって確認し、前記データに従って調整し、ＲＣＰによって増幅させるか又はオリゴアニーリングによって合成した。
【０４１４】
同定されたｍＲＮＡはそのネイティブな細胞環境に由来しているので、これらｍＲＮＡは野生型ｍＲＮＡであると理解される：
配列番号１〜７２は、野生型ヒト５’−ＵＴＲエレメントを表す。
配列番号７３〜１３６は、野生型マウス５’−ＵＴＲエレメントを表す。
配列番号１５２〜１７３は、野生型ヒト３’−ＵＴＲエレメントを表す。
配列番号１７４〜２０３は、野生型マウス３’−ＵＴＲエレメントを表す。
【０４１５】
これらＵＴＲエレメントのうちの幾つかは公知である（例えば、その野生型環境において）が、このアプローチによって、新規５’−ＵＴＲエレメント及び新規３’−ＵＴＲエレメント、即ち、それぞれヒト細胞及びマウス細胞において発現することが本発明者によって見出されたが、公的データベース（ＮＣＢＩ）からは知られていない５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメントも同定された。
【０４１６】
具体的には、配列番号１〜７２のヒト５’−ＵＴＲエレメントからなる群の中でも、以下の野生型５’−ＵＴＲエレメントは、公的データベース（ＮＣＢＩ）から知られている５’−ＵＴＲエレメントとは異なっている：配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９。
【０４１７】
配列番号７３〜１３６のマウス５’−ＵＴＲエレメントからなる群の中でも、以下の野生型５’−ＵＴＲエレメントは、公的データベース（ＮＣＢＩ）から知られている５’−ＵＴＲエレメントとは異なっている：配列番号７７、配列番号７９、配列番号８４、配列番号８５、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０６、配列番号１０９、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１３１、配列番号１３５。
【０４１８】
配列番号１７４〜２０３のマウス３’−ＵＴＲエレメントからなる群の中でも、以下の野生型３’−ＵＴＲエレメントは、公的データベース（ＮＣＢＩ）から知られている３’−ＵＴＲエレメントとは異なっている：配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１９７、配列番号２００。
【０４１９】
新たに同定された５’−ＵＴＲエレメント及び新たに同定された３’−ＵＴＲエレメントと公知の５’−ＵＴＲエレメント及び公知の３’−ＵＴＲエレメントとの差を、それぞれ、表１及び２に示す。具体的には、これら新たに同定されたエレメントは、これまで、それぞれ３’−ＵＴＲエレメント又は５’−ＵＴＲエレメントであると報告されたことがなかった。
【表１】
2018529329.tif 000053
【表２】
2018529329.tif 000054
【０４２０】
人工５’−ＵＴＲエレメント及び人工３’−ＵＴＲエレメント
一部の場合、人工５’−ＵＴＲエレメント及び人工３’−ＵＴＲエレメントを調製した。これは、以下の通り、改変されたプライマーを用いるＰＣＲをベースとしたアプローチにおいて、野生型５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメントを改変することによって行った。
（ｉ）５’−ＵＴＲ配列における幾つかのＡＴＧトリプレット（存在する場合）をトリプレットＴＡＧに変換した。（ｉ）更に、特定の制限酵素の特定の切断部位（存在する場合）が後続のクローニング実験に干渉するとみなされた場合、前記特定の切断部位の存在は望ましくなかった。後続のクローニング実験（例えば、実施例２及び３に記載）において使用される制限酵素が野生型３’−ＵＴＲエレメント又は５’−ＵＴＲエレメントを認識し、切断する場合、野生型配列に存在する切断部位が後続のクローニング実験に干渉するとみなした。５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメントのかかる内部切断は望ましくなかったので、前記特定の制限酵素の切断部位内の１つのヌクレオチドを相補的ヌクレオチドによって置換して前記特定の制限酵素の切断部位を除去することによって、前記特定の制限酵素の切断部位を除去した。
【０４２１】
配列番号１３７（配列番号３に基づく）、配列番号１３８（配列番号９に基づく）、配列番号１３９（配列番号１４に基づく）、配列番号１４０−（配列番号１７に基づく）、配列番号１４１（配列番号１８に基づく）、配列番号１４２（配列番号２９に基づく）、配列番号１４３（配列番号３１に基づく）、配列番号１４４（配列番号４２に基づく）、配列番号１４５（配列番号４３に基づく）、配列番号１４６（配列番号５２に基づく）、配列番号１４７（配列番号１０９に基づく）、配列番号１４８（配列番号１１０に基づく）、配列番号１４９（配列番号１１９に基づく）、配列番号１５０（配列番号１２０に基づく）、及び配列番号１５１（配列番号１３６に基づく）は、人工５’−ＵＴＲエレメントを表す。配列番号２０４（配列番号１９２に基づく）は、人工３’−ＵＴＲエレメントを表す。それぞれの野生型配列に対する正確な差を上に示す。
【０４２２】
要約すると、配列番号１〜１３６は、野生型５’−ＵＴＲ配列とみなすことができ、配列番号１３７〜１５１は、人工５’−ＵＴＲ配列とみなすことができ、配列番号１５２〜２０３は、野生型３’−ＵＴＲ配列とみなすことができ、配列番号２０４は、人工３’−ＵＴＲ配列とみなすことができる。
【０４２３】
要約すると、この実施例は、（実施例２及び３において以下に記載する）レファレンスＵＴＲエレメントを参照して、翻訳効率に対する相対的な影響についてそれぞれ試験することができる幾つかの５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメント（野生型及び人工）を提供する。
【０４２４】
実施例２：レファレンスＵＴＲエレメント及びそれを含むレファレンスコンストラクト
図１Ａは、本発明において用いられるレファレンスコンストラクトのＲＮＡ配列を示す。図１ＡのＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列を含むインビトロ転写用ベクターも構築した。前記ベクターは、Ｔ７プロモータ、３２Ｌ４（リボソームタンパク質ラージ３２）の５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）の人工変異体である、北米ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼをコードしているＧＣリッチ配列（オープンリーディングフレーム、ＯＲＦ）（ＰｐＬｕｃ（ＧＣ））、ヒトアルブミン（ＡＬＢ）の３’−非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）の人工変異体である、ａｌｂｕｍｉｎ７を含有している。Ａ６４ポリ（Ａ）配列、それに続いて、Ｃ３０及びヒストンステムループ配列が、ａｌｂｕｍｉｎ７の３’に存在していた。ヒストンステムループ配列の後には、インビトロ転写前にベクターを線状にするための制限酵素部位が続いていた。
【０４２５】
実施例１に示す配列に対応するＰＣＲ断片を、図１のＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列を含有するベクターに個別にクローニングした。実施例１の野生型配列が５’−ＵＴＲにＡＴＧトリプレットを含有していた及び／又は５’−ＵＴＲ若しくは３’−ＵＴＲに望ましくない制限酵素部位を含有していた場合、実施例１で同定したそれぞれの人工配列を使用した（例えば、配列番号３の代わりに配列番号１３７を使用した）。
【０４２６】
詳細には、候補５’−ＵＴＲエレメントを試験するためのコンストラクトを作製するために、図１Ａ中の一重下線付５’−ＵＴＲエレメントを、試験する候補（野生型又は人工）５’−ＵＴＲエレメント（実施例１）によって置換し（その例を図１Ｂに示す）；候補３’−ＵＴＲエレメントを試験するためのコンストラクトを作製するために、図１Ａ中の二重下線付３’−ＵＴＲエレメントを、試験する候補（野生型又は人工）３’−ＵＴＲエレメント（実施例１）によって置換した（その例を図１Ｃに示す）。得られたベクター又はプラスミド（例えば、ＲＮＡ配列、例えば、図１Ａ〜Ｃに示すＲＮＡに対応するＤＮＡを含有）をＤＮＡテンプレートと呼ぶこともある。
【０４２７】
ＤＮＡテンプレートを線状化し、Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼ（国際公開第２０１５１０１４１６号）を使用してインビトロで転写させた。次いで、ＤＮａｓａ処理によってＤＮＡテンプレートを分解した。ｍＲＮＡ転写物は、過剰のＮ７−メチル−グアノシン−５’−トリホスファート−５’−グアノシンを転写反応に添加することによって得られた５’−キャップ構造を含有していた。このようにして得られたｍＲＮＡを精製し、水に再懸濁させた。このようにして得られた、ＵＴＲエレメントを試験するためのｍＲＮＡは、レファレンスコンストラクトの５’−ＵＴＲエレメント又は３’−ＵＴＲエレメントが、試験するそれぞれのＵＴＲエレメントによって置換されていることを除いて、図１Ａに示すｍＲＮＡ（レファレンスコンストラクト）に対応する。
【０４２８】
実施例３：レファレンスコンストラクトを参照する候補ＵＴＲエレメントの翻訳効率
ヒト起源若しくはマウス起源の５’−ＵＴＲエレメント又はヒト起源若しくはマウス起源の３’−ＵＴＲエレメントを実験的に試験した。実施例の状況において、「ヒト起源」とは、ヒト野生型配列（例えば、配列番号１）又は１以上の塩基の置換によるヒト野生型配列に基づく人工配列（例えば、配列番号１３７）のいずれかを意味し得；用語「マウス起源」は、それに応じて使用される。表３及び４の人工配列がどのように野生型配列に基づいているかについての詳細は、実施例１に記載されている。
【０４２９】
任意の試験した（５’−又は３’−）ＵＴＲ（以下の表３及び４）が翻訳効率に対して有益な効果を有するかどうかを実験的に試験した。これは、
（ｉ）哺乳類細胞に人工核酸分子をトランスフェクトし、トランスフェクション後の１つ又は２つの特定の時点（２４時間及び４８時間）において、人工核酸分子のＯＲＦによってコードされているタンパク質の発現量を測定する工程、
（ｉｉ）哺乳類細胞にレファレンス核酸分子（図１Ａ）をトランスフェクトし、トランスフェクション後の同じ１つ又は２つの特定の時点（２４時間及び４８時間）において、レファレンス核酸分子のＯＲＦによってコードされているタンパク質の発現量を測定する工程、
（ｉｉｉ）人工核酸分子から発現したタンパク質の量のレファレンス核酸分子から発現したタンパク質の量に対する比を計算する工程
を含む方法によって行い、
（ｉｉｉ）において計算される比は≧１である。
【０４３０】
この比は、高い翻訳効率に関連している。
【０４３１】
この実施例で実験的試験に付された全てのＵＴＲ配列は、「実験的に試験されたＵＴＲエレメント」又は「試験されたＵＴＲエレメント」又は「実験的に試験されたＵＴＲ」又は「試験されたＵＴＲ」とも称される。
【０４３２】
（ｉ）の人工核酸分子は、試験されたＵＴＲエレメントを含んでいた。具体的には、人工核酸分子（ｍＲＮＡ）は、レファレンス核酸分子の５’−ＵＴＲエレメント又は３’−ＵＴＲエレメントのいずれかが、試験されたＵＴＲエレメントによって置換されていることを除いて（例示的な例については、図１Ｂ及び１Ｃを参照）、レファレンス核酸分子（図１Ａ）と構造的に異なっていなかった。
【０４３３】
３．１  ヒト起源のＵＴＲエレメント
実験的試験に付されたヒト起源のＵＴＲエレメントの詳細を以下の表３に示す。実験的試験は、上記及び「コンストラクトの詳細」の項に詳細に記載した通り、レファレンスコンストラクトを参照して実施した。
【表３−１】
2018529329.tif 000055
【表３−２】
2018529329.tif 000056
【表３−３】
2018529329.tif 000057
【表３−４】
2018529329.tif 000058
【０４３４】
３．２  マウス起源のＵＴＲエレメント
実験的試験に付されたマウス起源のＵＴＲエレメントの詳細を以下の表４に示す。実験的試験は、上記及び「コンストラクトの詳細」の項に詳細に記載した通り、レファレンスコンストラクトを参照して実施した。
【表４−１】
2018529329.tif 000059
【表４−２】
2018529329.tif 000060
【表４−３】
2018529329.tif 000061
【表４−４】
2018529329.tif 000062
【０４３５】
３．３  コンストラクトの詳細
５’−ＵＴＲを試験したとき、これは、レファレンスコンストラクト（即ち、３２Ｌ４−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｌｂｕｍｉｎ７−Ａ６４−Ｃ３０−ｈＳＬ；図１）の５’−ＵＴＲを、「試験された」５’−ＵＴＲ、即ち、野生型５’−ＵＴＲ配列（表３又は４の最初の列に記載したＤＮＡ配列に対応するｍＲＮＡ配列）又はそれに基づく人工５’−ＵＴＲ配列（表３又は４の２番目の列に記載したＤＮＡ配列に対応するｍＲＮＡ配列）によって置換することにより行った。レファレンスコンストラクトの他の配列エレメントは、変化していなかった。
【０４３６】
次に、３’−ＵＴＲを試験したとき、これは、レファレンスコンストラクト（即ち、３２Ｌ４−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｌｂｕｍｉｎ７−Ａ６４−Ｃ３０−ｈＳＬ；図１）の３’−ＵＴＲを、「試験された」３’−ＵＴＲ、即ち、野生型３’−ＵＴＲ配列（表３又は４の３番目の列に記載したＤＮＡ配列に対応するｍＲＮＡ配列）又はそれに基づく人工３’−ＵＴＲ配列（表３又は４の４番目の列に記載したＤＮＡ配列に対応するｍＲＮＡ配列）によって置換することにより行った。レファレンスコンストラクトの他の配列エレメントは、変化していなかった。
【０４３７】
３．４．  翻訳効率を決定するためのルシフェラーゼアッセイ
様々な哺乳類（ヒト、マウス）細胞株、即ち、ＨＤＦ、Ｌ９２９、ＨｅｐＧ２、及びＨｅｌａを使用する細胞トランスフェクションアッセイにおいて翻訳効率を実験的に試験した（図２〜９を参照）。
【０４３８】
ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）、Ｌ９２９細胞、ＨＥＰＧ２細胞、及びＨｅＬａ細胞を、１×１０４細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。次の日、細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭで洗浄し、次いで、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中にて、２５ｎｇ／ウェルのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００と複合体化したＰｐＬｕｃをコードしているｍＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクトしていない細胞は、対照として機能した。トランスフェクション効率についての対照としてウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼ（ＲｒＬｕｃ）をコードしているｍＲＮＡをＰｐＬｕｃ  ｍＲＮＡと共にトランスフェクトした（１ウェル当たりのＲｒＬｕｃ  ｍＲＮＡ  １ｎｇ）。トランスフェクション開始の９０分間後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭを培地に交換した。トランスフェクションの２４時間後及び４８時間後、培地を吸引し、細胞をＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓバッファ（Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μＬに溶解させた。ルシフェラーゼ活性を測定するまで溶解物を−８０℃で保管した。
【０４３９】
Ｈｉｄｅｘ  Ｃｈａｍｅｌｅｏｎプレートリーダーにおいて、ルシフェラーゼ活性を相対光単位（ＲＬＵ）として測定した。デュアルルシフェラーゼアッセイにおいて単一のサンプルからＰｐｌｕｃ及びＲｒｌｕｃの活性を逐次測定する。先ず、溶解物２０μＬ及びＢｅｅｔｌｅジュース（ｐｊｋ  ＧｍｂＨ）５０μＬを用いて、２秒間の測定時間でＰｐＬｕｃ活性を測定した。１，５００ｍｓの遅延後、Ｒｅｎｉｌｌａジュース（ｐｊｋ  ＧｍｂＨ）５０μＬを用いてＲｒＬｕｃ活性を測定する。
【０４４０】
これは９６ウェルプレートにおいて実施し、全ての試験されたＵＴＲエレメント（それが含有されているコンストラクトのフレームワークにおける、３．３を参照）を９６ウェルプレートの位置に割り当てた。１枚はヒト起源のＵＴＲエレメントを試験するため、そして、１枚はマウス起源のＵＴＲエレメントを試験するために２枚の９６ウェルプレートを使用した。各プレートにおいて、Ｇ１２及びＨ１２の位置は、レファレンスコンストラクト（図１Ａに示すｍＲＮＡ配列に対応する）であった。試験されたＵＴＲエレメントは、それぞれ、表３及び４の最後の列に示す位置であった。例示すると、マウスＡａｒｓｄ１の３’−ＵＴＲ（配列番号１８６）を含むコンストラクトは、Ｆ１２の位置に存在していた（表４を参照）。
【０４４１】
細胞のトランスフェクションの２４時間後（１ｄ、２４ｈ）にルシフェラーゼ活性を測定し、細胞トランスフェクションの４８時間後（２ｄ、４８ｈ）に再度測定した。
【０４４２】
このアッセイの結果を以下の３．５に記載する。
【０４４３】
３．５  結果−高い翻訳効率に関連するＵＴＲエレメントの決定
様々な哺乳類細胞株（ＨＤＦ、Ｌ９２９、ＨｅｐＧ２、及びＨｅｌａ）にトランスフェクトした２４時間後（１ｄ、２４ｈ）及び４８時間後（２ｄ、４８ｈ）に再度測定したアッセイ（上記３．４を参照）の実験結果を図２〜９に示す。２セットの９６ウェルプレートが存在し、１セットはヒト起源のＵＴＲエレメントに関連し、１セットはマウス起源のＵＴＲエレメントに関連することに留意すべきである。
【０４４４】
図２〜９は９６ウェルプレートにおける特定の位置（例えば、Ａ１）に言及するが、表３及び４は、特定の試験された（５’−又は３’−）ＵＴＲエレメントを９６ウェルプレートの特定の位置に割り当てる。例えば、試験したヒトＵＴＲエレメントの９６ウェルプレートの位置Ａ１では、ＺＮＦ４６０−５’−ＵＴＲエレメント（配列番号１）を試験したこと等が表３から分かる。
【０４４５】
特に好ましいＵＴＲエレメントの群（「最終選択物」とも呼ばれる）を決定した。この群は、１日（２４ｈ）間後に測定した、試験された細胞株のうちの少なくとも１つにおける翻訳効率が、レファレンスコンストラクト（図１Ａ）以上である、好ましくはより優れていることを特徴とする５’−ＵＴＲエレメント及び３’−ＵＴＲエレメントを含む。この群は、４つの下位群に分類される：（ｉ）ヒト起源の５’−ＵＴＲエレメント（表５を参照）、（ｉｉ）ヒト起源の３’−ＵＴＲエレメント（表６を参照）、（ｉｉｉ）マウス起源の５’−ＵＴＲエレメント（表７を参照）、（ｉｉ）マウス起源の３’−ＵＴＲエレメント（表８を参照）。
【表５】
2018529329.tif 000063
【０４４６】
したがって、ＺＮＦ４６０−５’−ＵＴＲ、ＴＧＭ２−５’−ＵＴＲ、ＩＬ７Ｒ−５’−ＵＴＲ、ＣＯＬ８Ａ１−５’−ＵＴＲ、ＮＤＵＦＳ７−５’−ＵＴＲ、ＰＬＫ２−５’−ＵＴＲ、ＦＢＸＯ３２−５’−ＵＴＲ、ＡＴＰ５Ｄ−５’−ＵＴＲ、ＴＵＢＢ４Ｂ−５’−ＵＴＲ、ＯＲＭＤＬ２−５’−ＵＴＲ、ＦＳＣＮ１−５’−ＵＴＲ、ＣＤ９−５’−ＵＴＲ、ＰＹＳＬ２−５’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ３−５’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ６−５’−ＵＴＲ、ＫＰＮＡ６−５’−ＵＴＲ、ＳＦＴ２Ｄ２−５’−ＵＴＲ、ＬＣＬＡＴ１−５’−ＵＴＲ、ＦＢＸＬ１８−５’−ＵＴＲ、ＳＬＣ３５Ｆ６−５’−ＵＴＲ、ＶＭＡ２１−５’−ＵＴＲ、ＳＥＺ６Ｌ２−５’−ＵＴＲ、ＰＣＯＬＣＥ−５’−ＵＴＲ、ＶＴＮ−５’−ＵＴＲ、ＡＬＤＨ１６Ａ１−５’−ＵＴＲ、ＫＰＮＡ６−５’−ＵＴＲ、ＪＵＰ−５’−ＵＴＲ、ＣＰＮ２−５’−ＵＴＲ、ＰＮＰＯ−５’−ＵＴＲ、ＳＳＳＣＡ１−５’−ＵＴＲ、ＰＯＬＲ２Ｌ−５’−ＵＴＲ、ＬＩＮ７Ｃ−５’−ＵＴＲ、ＵＱＣＲ１０−５’−ＵＴＲ、ＰＹＣＲＬ−５’−ＵＴＲ、ＡＭＮ−５’−ＵＴＲ、ＭＡＰ１Ｓ−５’−ＵＴＲからなる群由来のヒト遺伝子の５’−ＵＴＲは、高い翻訳効率に寄与すると考えられる。
【０４４７】
また、配列番号１、配列番号２、配列番号１３７（又はその野生型等価物である配列番号３）、配列番号１３８（又はその野生型等価物である配列番号９）、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１４０（又はその野生型等価物である配列番号１７）、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号１４３（又はその野生型等価物である配列番号３１）、配列番号３２、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４４、配列番号４５、配列番号１４６−（又はその野生型等価物である配列番号５２）、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５７、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号１４４（又はその野生型等価物である配列番号４２）、配列番号５８、配列番号６２によって表される５’−ＵＴＲは、高い翻訳効率に寄与すると考えられる。
【表６】
2018529329.tif 000064
【０４４８】
したがって、ＮＤＵＦＳ７−３’−ＵＴＲ、ＰＨＧＤＨ−３’−ＵＴＲ、ＴＳＰＯ−３’−ＵＴＲ、ＡＴＰ５Ｄ−３’−ＵＴＲ、ＥＸＯＳＣ４−３’−ＵＴＲ、ＴＵＢＢ４Ｂ−３’−ＵＴＲ、ＴＵＢＡ４Ａ−３’−ＵＴＲ、ＥＭＰ３−３’−ＵＴＲ、ＣＲＩＰ２−３’−ＵＴＲ、ＢＲＡＴ１−３’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ３−３’−ＵＴＲ、ＰＳＭＢ６−３’−ＵＴＲ、ＳＣＡＮＤ１−３’−ＵＴＲ、ＡＭＮ−３’−ＵＴＲ、ＣＹＢＡ−３’−ＵＴＲ、ＰＣＯＬＣＥ−３’−ＵＴＲ、ＭＡＰ１Ｓ−３’−ＵＴＲ、ＶＴＮ−３’−ＵＴＲ、ＡＬＤＨ１６Ａ１−３’−ＵＴＲからなる群由来のヒト遺伝子の３’−ＵＴＲは、高い翻訳効率に寄与すると考えられる。
【０４４９】
また、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３によって表される３’−ＵＴＲは、高い翻訳効率に寄与すると考えられる。
【表７−１】
2018529329.tif 000065
【表７−２】
2018529329.tif 000066
【表７−３】
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【０４５０】
したがって、Ｄｐｙｓｌ２−５’−ＵＴＲ、Ａｃｏｘ２−５’−ＵＴＲ、Ｕｂｃ−５’−ＵＴＲ、Ｎｕｄｔ２２−５’−ＵＴＲ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ−５’−ＵＴＲ、Ａｎｋｒｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｔｓｐｙｌ４−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ３−５’−ＵＴＲ、Ａａｃｓ−５’−ＵＴＲ、Ｎｏｓｉｐ−５’−ＵＴＲ、Ｉｔｇａ７−５’−ＵＴＲ、Ｃｃｎｄ２−５’−ＵＴＲ、Ｅｂｐ−５’−ＵＴＲ、Ｓｆ３ｂ５−５’−ＵＴＲ、Ｆａｓｎ−５’−ＵＴＲ、Ｈｍｇｃｓ１−５’−ＵＴＲ、Ｏｓｒ１−５’−ＵＴＲ、Ｌｍｎｂ１−５’−ＵＴＲ、Ｖｍａ２１−５’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２０ａ−５’−ＵＴＲ、Ｃｄｃａ８−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ１−５’−ＵＴＲ、Ｕｂｑｌｎ２−５’−ＵＴＲ、Ｐｒｐｓ２−５’−ＵＴＲ、Ｓｈｍｔ２−５’−ＵＴＲ、Ｆｉｇｎｌ１−５’−ＵＴＲ、Ｃａｄ−５’−ＵＴＲ、Ａｎｌｎ−５’−ＵＴＲ、Ｓｌｆｎ９−５’−ＵＴＲ、Ｎｃａｐｈ−５’−ＵＴＲ、Ｐｏｌｅ−５’−ＵＴＲ、Ｕｈｒｆ１−５’−ＵＴＲ、Ｇｊａ１−５’−ＵＴＲ、Ｆａｍ６４ａ−５’−ＵＴＲ、Ｔｓｐａｎ１０−５’−ＵＴＲ、Ｓｃａｎｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｇｐｒ８４−５’−ＵＴＲ、Ｃｅｒｓ６−５’−ＵＴＲ、Ｃｘｃｒ４−５’−ＵＴＲ、Ｇｐｒｃ５ｃ−５’−ＵＴＲ、Ｆｅｎ１−５’−ＵＴＲ、Ｃｓｐｇ４−５’−ＵＴＲ、Ｍｒｐｌ３４−５’−ＵＴＲ、Ｃｏｍｔｄ１−５’−ＵＴＲ、Ａｒｍｃ６−５’−ＵＴＲ、Ｅｍｒ４−５’−ＵＴＲ、Ａｔｐ５ｄ−５’−ＵＴＲ、Ｃｓｆ２ｒａ−５’−ＵＴＲ、Ａａｒｓｄ１−５’−ＵＴＲ、Ｃｔｈ−５’−ＵＴＲ、Ｔｐｇｓ１−５’−ＵＴＲ、Ｃｃｌ１７−５’−ＵＴＲ、Ａｌｋｂｈ７−５’−ＵＴＲ、Ｍｓ４ａ８ａ−５’−ＵＴＲからなる群由来のマウス遺伝子の５’−ＵＴＲは、高い翻訳効率に寄与すると考えられる。
【０４５１】
また、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１４７（又はその野生型等価物である配列番号１０９）、配列番号１４８（又はその野生型等価物である配列番号１１０）、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１４９（又はその野生型等価物である配列番号１１９）、配列番号１２３、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１５１（又はその野生型等価物である配列番号１３６）、配列番号９６、配列番号１１１、配列番号１５０（配列番号１２０に基づく）、配列番号１２１、配列番号１２４、配列番号１２５によって表される５’−ＵＴＲは、高い翻訳効率に寄与すると考えられる。
【表８】
2018529329.tif 000068
【０４５２】
したがって、Ａｃｏｘ２−３’−ＵＴＲ、Ｕｂｃ−３’−ＵＴＲ、Ｓｌｐｉ−３’−ＵＴＲ、Ｉｇｆ２ｂｐ１−３’−ＵＴＲ、Ｔｍｅｍ３７−３’−ＵＴＲ、Ｓｌｃ７ａ３−３’−ＵＴＲ、Ｃｓｔ６−３’−ＵＴＲ、Ｅｂｐ−３’−ＵＴＲ、Ｓｆ３ｂ５−３’−ＵＴＲ、Ｃｄｃａ８−３’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２２−３’−ＵＴＲ、Ｃａｄ−３’−ＵＴＲ、Ｐｏｌｅ−３’−ＵＴＲ、Ｋｉｆ２ｃ−３’−ＵＴＲ、Ｓｃａｎｄ１−３’−ＵＴＲ、Ｇｐｒ８４−３’−ＵＴＲ、Ｔｐｇｓ１−３’−ＵＴＲ、Ｃｃｌ１７−３’−ＵＴＲ、Ａｌｋｂｈ７−３’−ＵＴＲ、Ｍｓ４ａ８ａ−３’−ＵＴＲ、Ｍｒｐｌ３４−３’−ＵＴＲ、Ｃｏｍｔｄ１−３’−ＵＴＲ、Ａｒｍｃ６−３’−ＵＴＲ、Ａｔｐ５ｄ−３’−ＵＴＲ、１１１０００１Ｊ０３Ｒｉｋ−３’−ＵＴＲ、Ｎｕｄｔ２２−３’−ＵＴＲからなる群由来のマウス遺伝子の３’−ＵＴＲは、高い翻訳効率に寄与すると考えられる。
【０４５３】
また、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号２０４（又はその野生型等価物である配列番号１９２）、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号１７７によって表される３’−ＵＴＲは、高い翻訳効率に寄与すると考えられる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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