(57)【要約】  本願発明は、ｍｉＲＮＡの発現プロフィールの決定に基づく、対象の健康状態の変化の診断のための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において健康状態を診断するための方法であって、工程：
（ａ）対象からの血液サンプル中の１つ以上のｍｉＲＮＡの第１の所定のセットの発現プロフィールを決定すること、ここで、該ｍｉＲＮＡの第１の所定のセットに含まれるｍｉＲＮＡは図１および／または図３に列挙されたｍｉＲＮＡから選択される
（ｂ）該対象からの該血液サンプル中の１つ以上のｍｉＲＮＡの第２の所定のセットの発現プロフィールを決定すること、ここで、該ｍｉＲＮＡの第２の所定のセットに含まれるｍｉＲＮＡは図２および／または図４に列挙されたｍｉＲＮＡから選択される
（ｃ）該ｍｉＲＮＡの第２の所定のセットに対して該ｍｉＲＮＡの第１の所定のセットの発現プロフィールを正規化すること
（ｄ）工程（ｃ）の正規化された発現プロフィールを参照と比較すること
（ｅ）該参照との比較が変更されたとき、該対象において健康状態の変化を診断すること
を含み、
該血液サンプルは赤血球、白血球および血小板を含む血液細胞画分である、方法。
【請求項２】
工程（ｃ）において正規化することが該ｍｉＲＮＡの第１の所定のセットに含まれるｍｉＲＮＡのそれぞれに対して相対発現レベルを生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該参照が、得られた正規化された参照発現プロフィールである、請求項２に記載の方法であって、工程：
（ｉ．）１つ以上の参照対象からの血液サンプル中の１つ以上のｍｉＲＮＡの第１の所定のセットの発現プロフィールを決定すること、ここで、該ｍｉＲＮＡの第１の所定のセットに含まれるｍｉＲＮＡは図１および／または図３に列挙されたｍｉＲＮＡから選択される
（ｉｉ．）１つ以上の参照対象からの該血液サンプル中の１つ以上のｍｉＲＮＡの第２の所定のセットの発現プロフィールを決定すること、ここで、該ｍｉＲＮＡの第２の所定のセットに含まれるｍｉＲＮＡは図２および／または図４に列挙されたｍｉＲＮＡから選択される
（ｉｉｉ．）該１つ以上の参照対象からの該ｍｉＲＮＡの第２の所定のセットに対して該ｍｉＲＮＡの第１の所定のセットの発現プロフィールを正規化すること
を含む、方法。
【請求項４】
工程（ｉｉｉ）において正規化することが該ｍｉＲＮＡの第１の所定のセットに含まれるｍｉＲＮＡのそれぞれに対して相対参照発現レベルを生成する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｄ）において比較することが、該ｍｉＲＮＡの第１の所定のセットに含まれるｍｉＲＮＡのそれぞれに対して、該対象からの相対発現レベルを相対参照発現レベルと比較することによる、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
相対発現レベルが、図１に列挙された（疾患調節）ｍｉＲＮＡおよび図２に列挙された（疾患保存）ｍｉＲＮＡからの比率を計算することにより得られる、請求項２、４または５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
相対発現レベルが図７に列挙された比率の群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｅ）において、相対参照発現レベルに対する該対象からの相対発現レベルの比較が該セットに含まれる該１つ以上の所定のｍｉＲＮＡに対する閾値を超えるとき、健康状態の変化が診断される、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
該閾値が３標準偏差に設定され、好ましくは５標準偏差に設定され、さらに好ましくは７標準偏差に設定される、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
対象において健康状態を診断するための方法であって、工程：
（ａ）対象からの血液サンプル中のｍｉＲＮＡの第１の所定のセットの発現プロフィールを決定すること
（ｂ）該対象からの該血液サンプル中のｍｉＲＮＡの第２の所定のセットの発現プロフィールを決定すること
（ｃ）該工程（ａ）の発現プロフィールおよび該工程（ｂ）の発現プロフィールを参照発現プロフィールと比較すること
（ｄ）該第１の参照発現プロフィールに対する比較が変更され、該第２の参照発現プロフィールに対する比較が変更されなかったとき、該対象において健康状態の変化を診断すること
を含み、
ここで、
（ｉ．）該所定のｍｉＲＮＡの第１のセットに含まれる該ｍｉＲＮＡおよび該第１の参照発現プロフィールに含まれるｍｉＲＮＡは図１および／または図３に列挙されたｍｉＲＮＡから選択され、
（ｉｉ．）該所定のｍｉＲＮＡの第２のセットに含まれる該ｍｉＲＮＡは図２および／または図４に列挙されたｍｉＲＮＡから選択され、
（ｉｉｉ．）該血液サンプルは赤血球、白血球および血小板を含む血液細胞画分である、
方法。
【請求項１１】
該参照発現プロフィールが同じ対象の前の時点によって得られる、請求項３から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
健康状態の変化が健康状態の改善または悪化である、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
（ｉ．）１つ以上の対象間の健康状態を比較すること
（ｉｉ．）対象において健康状態をモニターすること
（ｉｉｉ．）対象において免疫系の状態をモニターすること
（ｉｖ．）対象において治療処置、好ましくは薬物処置に対する応答をモニターすること
のための、請求項１から１２のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項１４】
対象において健康状態をモニターするための方法であって、工程：
（ａ）請求項１から１２のいずれかに記載の方法を実施することにより、最初の時点で対象において健康状態を診断すること
（ｂ）請求項１から１２のいずれかに記載の方法を実施することにより、１つ以上の後の時点で対象において健康状態を診断すること、および
（ｃ）工程（ａ）において診断された健康状態を工程（ｂ）において診断された健康状態と比較し、それにより対象において健康状態をモニターすること
を含む、方法。
【請求項１５】
対象において健康状態が時間とともに改善または悪化する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
モニターされる対象において健康状態が該対象の免疫系の状態を含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
対象が最初の時点から１つ以上の後の時点の間で治療処置を受けている、請求項１４から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
治療処置が薬物の投与を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
治療処置が外科処置、化学療法、放射線療法および／または免疫療法を含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、ｍｉＲＮＡの発現プロフィールの決定に基づく、対象の健康状態の変化の診断のための方法、使用、キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、バイオマーカーは、種々の疾患の診断、リスク層化および治療管理において重要な役割を果たす。ＭｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、バイオマーカーの新しいクラスである。それらは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）標的の翻訳を破壊またはブロックすることによって翻訳後レベルで遺伝子発現を調節する、小さい非コードＲＮＡの群を表す。ｍｉＲＮＡは、高度に組織特異的様式にて発現され、さらにｍｉＲＮＡはまた、血液を含む体液サンプル中に存在することが見出されている。それにもかかわらず、ｍｉＲＮＡが血液中、とりわけ血球中において見いだされるメカニズム、またはこれらの血液分画中のこれらの機能は、まだ理解されていない。とりわけ望ましいものは、外科的介入の必要性を排除し、迅速かつ容易かつ費用効果の高い診断／予後を可能にする非侵襲的バイオマーカーである。特に、対象の健康状態における変化の一般的な診断のための非侵襲的バイオマーカーとしてのｍｉＲＮＡの可能な役割は、まだ系統的に評価されていない。したがって、対象の健康状態における変化の非侵襲的診断のための有効な方法およびキットが依然として必要とされている。
【０００３】
本願発明者らは、初めて、癌（すなわち肺、大腸、腎臓、グリア芽腫、前立腺、黒色腫）、神経変性疾患（すなわち多発性硬化症、パーキンソン病）、心臓血管疾患（急性心筋梗塞、心不全）、自己免疫性疾患（すなわちサルコイドーシス、乾癬）または炎症性疾患（すなわちＣＯＰＤ、ＢＰＨ）を含む複数の疾患（ｎ＝８８３）と診断される健常（ｎ＝１５８）である広範囲の対象において全ゲノムレベルのｍｉＲＮＡの発現を評価した。本願発明者らは、驚くべきことに、赤血球、白血球および／または血小板を含む血液サンプル、好ましくは全血サンプルまたは血液細胞画分中に、特定のｍｉＲＮＡ（疾患調節ｍｉＲＮＡ、図１）が健常対照と疾患対象との間で有意に異常調節されるが、他の特定のｍｉＲＮＡ（疾患保存ｍｉＲＮＡ、図２）が健常対照と疾患対象との間に有意に異常調節されないことを見いだした。したがって、該疾患保存ｍｉＲＮＡと組み合わせての該疾患調節ｍｉＲＮＡは、対象の健康状態における変化の診断のための適切な非侵襲的バイオマーカーである。特に、疾患保存ｍｉＲＮＡは、疾患調節ｍｉＲＮＡに対する内部正規化群として働くことができ、これは、ごく少数のｍｉＲＮＡバイオマーカーのセットを使用するために、試験自体が包括的な正規化方法に頼ることができないとき、信頼できる強力な診断試験を市場にもたらすという目的のときに大きな利点である。したがって、本願発明の試験は、相対発現レベルを参照と比較することに頼り得る。さらに、本願発明者らは、全血サンプルを回収することから得られる、赤血球、白血球および／または血小板を含む血球、それぞれの血液細胞画分からのｍｉＲＮＡの使用を探索した。したがって、末梢免疫系の成分を表す全ての血球のｍｉＲＮＡを分析する。したがって、このアプローチにより評価される診断内容は、疾患臓器または組織に直接関連する、細胞外血液分画（血清、血漿）に由来するｍｉＲＮＡに基づくアプローチと異なる末梢免疫系のｍｉＲＮＡ−バイオマーカー情報の評価を指す。さらに、細胞外血液分画（血清、血漿）に由来するｍｉＲＮＡに頼ることは、回収および／または分析前の後処理時に血球から細胞外マトリックスに漏出するｍｉＲＮＡからの汚染が非常に起こり易く、これは、血球または血液細胞画分からのｍｉＲＮＡバイオマーカーを使用する場合とでは異なる。
【０００４】
したがって、赤血球、白血球および／または血小板を含む血球または血液細胞画分に由来する該疾患保存ｍｉＲＮＡと組み合わせての該疾患調節ｍｉＲＮＡは、末梢免疫系由来の直交診断情報を使用して対象の健康状態における変化の診断のための内部正規化能力を有する分析的に強力かつ信頼できる適切な非侵襲的バイオマーカーである。
【発明の概要】
【０００５】
第１の局面において、本願発明は、対象において健康状態を診断するための方法であって、工程：
（ａ）対象からの血液サンプル中の１つ以上のｍｉＲＮＡの第１の所定のセットの発現プロフィールを決定すること、ここで、該ｍｉＲＮＡの第１の所定のセットに含まれるｍｉＲＮＡは図１および／または図３に列挙されたｍｉＲＮＡから選択される
（ｂ）該対象からの該血液サンプル中の１つ以上のｍｉＲＮＡの第２の所定のセットの発現プロフィールを決定すること、ここで、該ｍｉＲＮＡの第２の所定のセットに含まれるｍｉＲＮＡは図２および／または図４に列挙されたｍｉＲＮＡから選択される
（ｃ）該ｍｉＲＮＡの第２の所定のセットに対して該ｍｉＲＮＡの第１の所定のセットの発現プロフィールを正規化すること
（ｄ）工程（ｃ）の正規化された発現プロフィールを参照と比較すること
（ｅ）該参照との比較が変更されたとき、該対象において健康状態の変化を診断することを含む、方法を提供する。
【０００６】
第２の局面において、本願発明は、対象において健康状態を診断するための方法であって、工程：
（ａ）対象からの血液サンプル中のｍｉＲＮＡの第１の所定のセットの発現プロフィールを決定すること
（ｂ）該対象からの該血液サンプル中のｍｉＲＮＡの第２の所定のセットの発現プロフィールを決定すること
（ｃ）該工程（ａ）の発現プロフィールおよび該工程（ｂ）の発現プロフィールを参照発現プロフィールと比較すること
（ｄ）該第１の参照発現プロフィールに対する比較が変更され、該第２の参照発現プロフィールに対する比較が変更されなかったとき、該対象において健康状態の変化を診断すること
を含む、方法を提供する。
【０００７】
第３の局面において、本願発明は、
（ｉ．）１つ以上の対象間の健康状態を比較すること
（ｉｉ．）対象において健康状態をモニターすること
（ｉｉｉ．）対象において免疫系の状態をモニターすること
（ｉｖ．）対象において治療処置、好ましくは薬物処置に対する応答をモニターすること
のための、本願発明の第１および第２の局面による方法の使用を提供する。
【０００８】
さらなる局面において、本願発明者らは、赤血球、白血球および／または血小板を含む血液サンプル、好ましくは全血サンプルまたは血液細胞画分中に、特定のｍｉＲＮＡ（癌調節ｍｉＲＮＡ、図３）が健常対照と癌対象との間で有意に異常調節されるが、他の特定のｍｉＲＮＡ（癌保存ｍｉＲＮＡ、図４）が健常対照と癌対象との間に有意に異常調節されないことを見いだした。
【０００９】
さらなる局面において、本願発明は、対象において健康状態をモニターするための方法であって、工程：
（ａ）第１および第２の局面による方法を実施することにより、最初の時点で対象において健康状態を診断すること
（ｂ）第１および第２の局面による方法を実施することにより、１つ以上の後の時点で対象において健康状態を診断すること、および
（ｃ）工程（ａ）において診断された健康状態を工程（ｂ）において診断された健康状態と比較し、それにより対象において健康状態をモニターすること
を含む、方法を提供する。
【００１０】
本願発明の概要は、本願発明の全ての特徴を必ずしも記載していない。他の態様は、以下の詳細な説明のレビューから明らかになるであろう。
【００１１】
発明の詳細な説明
定義
本願発明を以下に詳細に説明する前に、本願発明は、変化してもよいとき、本願明細書に記載されている特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されないことを理解されたい。本願明細書において使用される用語は、特定の態様を単に記載する目的であって、特許請求の範囲によってのみ限定される本願発明の範囲を限定することを意図しないことも理解されたい。他に定義されていない限り、本願明細書において使用される全ての専門および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００１２】
以下、本願発明の要素について説明する。これらの要素は特定の態様と共に列挙されているが、追加の態様を作成するために任意の様式で任意の数で組み合わせることができることを理解されたい。様々に記載された例および好ましい態様は、本願発明を明示的に記載された態様のみに限定すると解釈されるべきではない。この記載は、明示的に記載された態様を任意の数の開示された要素および／または好ましい要素と組み合わせる態様をサポートし包含すると理解すべきである。さらに、本願に記載されている全ての要素の任意の置換および組み合わせは、文脈上そうでないことが示されていない限り、本願の記載によって開示されると考えられるべきである。
【００１３】
好ましくは、本願明細書において使用される用語は、“A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)”, H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Koelbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)に記載されているものと定義される
【００１４】
本願発明を実施するために、他に記載のない限り、当分野の文献で説明されている化学、生化学および組換えＤＮＡ技術の慣用の方法を使用する（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989）。
【００１５】
いくつかの文献が本願明細書の本文中に引用されている。本願明細書に引用されている各文献（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、指示書などを含む）は、上記または下記のいずれかにかかわらず、出典明示によりそれら全体において本願明細書に包含させる。本願明細書中のいかなるものも、先行発明によって本願発明が開示に先立つ権利がないと認めるものとして、解釈されるべきではない。
【００１６】
本願明細書および特許請求の範囲を通じて、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（comprise）」という擁護および「含む（comprises）」および「含む（comprising）」などの変形は、記載された整数または工程または整数または工程の群の包含を意味すると理解されるが、他の任意の整数または工程または整数または工程の群の包含を除外しない。
【００１７】
本願明細書および特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明白に他の意味を示さない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「試験化合物（a test compound）」という用語は、「試験化合物（test compounds）」も含む。
【００１８】
「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」なる用語は、共に共有結合した少なくとも１０ヌクレオチドかつ多くて３５ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡ分子を示す。好ましくは、本願発明のポリヌクレオチドは、１０〜３３ヌクレオチド長または１５〜３０ヌクレオチド長の分子、さらに好ましくは１７〜２７ヌクレオチド長または１８〜２６ヌクレオチド長の分子、すなわち１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５ヌクレオチド長の分子である。「ｍｉｃｒｏＲＮＡ＊」または「ｍｉＲＮＡ＊」なる用語は、プロセッシング時にパッセンジャー鎖に由来するｍｉＲＮＡ分子を示す。本願発明の文脈において、「ｍｉＲＮＡ」および「ｍｉＲＮＡ＊」なる用語は、互換的に使用される。ｍｉＲＢａｓｅ（www.mirbase.org）は、公開されているｍｉＲＮＡ配列のよく確立されたリポジトリーおよび検索可能なデータベースおよび注釈である。
【００１９】
本願発明の文脈において使用される「全血サンプル」なる用語は、細胞内（赤血球、白血球、血小板）および細胞外血液分画（血清、血漿）の両方を含む全ての血液分画を含む対象由来の血液サンプルを示す。全血サンプルは、慣用の血液回収技術によって対象から血液を取り出すことによって得ることができるが、以前に単離されたおよび／または保存された血液サンプルを使用することによって提供することもできる。好ましくは、対象（例えばヒトまたは動物）からの全血サンプルは、０．１〜２０ｍｌ、さらに好ましくは０．５〜１５ｍｌ、さらに好ましくは１〜１０ｍｌ、より好ましくは２〜７．５ｍｌ、すなわち０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ｍｌの容量を有する。好ましくは、全血サンプルは血液回収チューブの手段により回収され、好ましくは、それはＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブ、Ｔｅｍｐｕｓ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブ、ＥＤＴＡ−チューブ（例えばＫ２−ＥＤＴＡ  Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅチューブ）、Ｎａ−ｃｉｔｒａｔｅチューブ、Ｈｅｐａｒｉｎ−チューブまたはＡＣＤ−チューブ（クエン酸デキストロース）に回収される。好ましくは、全血サンプルが回収されるとき、ＲＮＡ画分、とりわけｍｉＲＮＡ画分は、分解に対して保護／防護され得る。この目的のために、ＲＮＡ画分および／またはｍｉＲＮＡ画分を安定化させる特別回収チューブ（例えばＰｒｅａｎａｌｙｔｉｘからのＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブ、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＴｅｍｐｕｓ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブ）または添加物（例えばＡｍｂｉｏｎからのＲＮＡｌａｔｅｒ、ＰｒｏｍｅｇａからのＲＮＡｓｉｎ）が使用され得る。
【００２０】
本願発明の文脈において使用される「血球サンプル」なる用語は、血球（赤血球、白血球、血小板）を含むか、または実質的に含む全血サンプルの調製物を示し、さらに好ましくは、血球サンプルは赤血球、白血球および血小板を含む。好ましくは、血球サンプルは全血の細胞外画分（例えば血漿、血清）に由来するｍｉＲＮＡを含まないか、またはそれは本願発明の血球サンプル中の１つ以上のｍｉＲＮＡのセットの発現プロフィールに寄与しないか、または実質的に寄与しないように、細胞外画分（例えば血漿、血清）に由来するｍｉＲＮＡを少量のみ含む。赤血球、白血球および／または血小板を含む血球サンプルまたは赤血球、白血球および血小板を包含する血球サンプルは、全血サンプルの初期細胞分布（血球組成物）を維持するか、または実質的に維持するＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブ、Ｔｅｍｐｕｓ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブ、ＥＤＴＡ−チューブ（例えばＫ２−ＥＤＴＡ  Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅチューブ）、Ｎａ−ｃｉｔｒａｔｅチューブまたはＨｅｐａｒｉｎ−チューブに回収される全血サンプルの処理から得られる。血球サンプルから全ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ画分を含む短いＲＮＡ画分を含む）を単離し、これを該サンプル中の対象の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのｍｉＲＮＡのセットの発現プロフィールを決定するために使用する。
【００２１】
本願明細書において使用される「血液細胞画分」なる用語は、血液サンプルに由来する細胞画分、すなわち血球画分に関する。血球画分は、赤血球(red blood cells)（赤血球(erythrocytes)）、白血球(white blood cells)（白血球(leukocytes)）、血小板(platelets)（血小板(thrombocytes)）またはそれらの前記血球型の亜画分（すなわちＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、好中球、顆粒球、網状赤血球など）または前記エンティティーからの組合せを含む。好ましくは、血液細胞画分は、全血の細胞外画分（例えば血漿、血清）に由来するｍｉＲＮＡを含まないか、または本願発明の血液細胞画分中の１つ以上のｍｉＲＮＡのセットの発現プロフィールに寄与しないか、または実質的に寄与しないように、細胞外画分（例えば血漿、血清）に由来するｍｉＲＮＡを少量のみ含む。本願発明の文脈において、「血球サンプル」および「血液細胞画分のサンプル」なる用語は、互換的に使用される。
【００２２】
本願明細書において使用される「全ＲＮＡ」なる用語は、全血サンプルに由来するそれぞれの血球サンプルに存在するｍｉＲＮＡ画分を含む単離されたＲＮＡに関する。好ましくは、本願発明による全ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ画分を含むか、または該全ＲＮＡのｍｉＲＮＡ富化画分を含む。（ｍｉＲＮＡ画分またはｍｉＲＮＡ富化画分を含む）全ＲＮＡは、血球サンプル中の血球の溶解（例えばＴｒｉｚｏｌ）、次に例えばフェノール／クロロホルム抽出および／または分離に基づく技術（例えばガラス繊維フィルターカラム、シリカ膜カラム）によるＲＮＡ精製によって得られる。ＲＮＡ単離および精製のためのキットの例は、ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｍｉＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）、ｍｉｒＶａｎａ  ＰＡＲＩＳ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰＡＲＩＳ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｔｅｍｐｕｓ  Ｓｐｉｎ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む。
【００２３】
本願明細書において使用される「疾患調節ｍｉＲＮＡ」なる用語は、健常対象および疾患対象間で（調節される）差異があることが知られているセットに含まれる少なくとも１つの固定された定義されたｍｉＲＮＡを示す。好ましい疾患調節ｍｉＲＮＡは、図１に列挙されたｍｉＲＮＡ、すなわち配列番号：１〜２６を有するｍｉＲＮＡの群から選択される。
【００２４】
本願明細書において使用される「疾患保存ｍｉＲＮＡ」なる用語は、健常対象および疾患対象間で（調節されない）差異がないことが知られているセットに含まれる少なくとも１つの固定された定義されたｍｉＲＮＡを示す。好ましい疾患保存ｍｉＲＮＡは、図２に列挙されたｍｉＲＮＡ、すなわち配列番号：２７〜５９を有するｍｉＲＮＡの群から選択される。
【００２５】
本願明細書において使用される「癌調節ｍｉＲＮＡ」なる用語は、健常対象および癌に罹患している対象間で（調節される）差異があることが知られているセットに含まれる少なくとも１つの固定された定義されたｍｉＲＮＡを示す。好ましい癌調節ｍｉＲＮＡは、図３に列挙されたｍｉＲＮＡの群から選択される。
【００２６】
本願明細書において使用される「癌保存ｍｉＲＮＡ」なる用語は、健常対象および癌に罹患している対象間で（調節されない）差異がないことが知られているセットに含まれる少なくとも１つの固定された定義されたｍｉＲＮＡを示す。好ましい癌保存ｍｉＲＮＡは、図４に列挙されたｍｉＲＮＡの群から選択される。
【００２７】
本願発明の文脈において使用される「発現プロフィール」なる用語は、ｍｉＲＮＡ発現プロフィールの決定を示すか、またはサンプル中の（例えば全血サンプルに由来する血球サンプルまたは血液細胞画分中の）ｍｉＲＮＡ発現と相関する測定を示す。ｍｉＲＮＡ発現プロフィールを決定することにより、それぞれのｍｉＲＮＡは数値で表される。個々のｍｉＲＮＡの値が高いほど、該ｍｉＲＮＡの発現レベルが高くなるか、または個々のｍｉＲＮＡの値が低いほど、該ｍｉＲＮＡの発現レベルが低い。発現プロフィールは、対象におけるｍｉＲＮＡ発現プロフィールの分析およびサンプル間の比較を可能にする、任意の便利な手段、例えば核酸ハイブリダイゼーション（例えばマイクロアレイによる）、核酸増幅（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ハイスループットＲＴ−ＰＣＲ）、定量のためのＥＬＩＳＡ、次世代シーケンシング（例えばＡＢＩ  ＳＯＬＩＤ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｒｏｃｈｅ／４５４  ＧＳ  ＦＬＸ）、フローサイトメトリー（例えばＬＵＭＩＮＥＸ、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ  Ｇｕａｖａ）などによって生成され得る。前記手段によって測定されるサンプル材料は、血球サンプルに由来し、全ＲＮＡ、標識された全ＲＮＡ、増幅された全ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、標識されたｃＤＮＡ、増幅されたｃＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、標識されたｍｉＲＮＡ、増幅されたｍｉＲＮＡまたは前記ＲＮＡ／ＤＮＡ種から生成され得る任意の誘導体であり得る。本願明細書において使用される「発現プロフィール」は、１つ以上のｍｉＲＮＡ、好ましくは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５１、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９またはそれ以上のｍｉＲＮＡ、好ましくは配列番号：１〜７７のｍｉＲＮＡから選択されるもの、さらに好ましくは配列番号：１〜５９のｍｉＲＮＡから選択されるものの発現プロフィールの回収に関する。
【００２８】
本願明細書において使用される「血球サンプル中の（からの）発現プロフィールを決定すること」なる用語は、該血球サンプルに存在するｍｉＲＮＡからの発現プロフィールの決定に関する、したがって、それは、該血球サンプルに存在するｍｉＲＮＡと相関する測定である。この点で、当業者に知られている、任意の便利な手段（例えば核酸ハイブリダイゼーション、核酸増幅、ポリメラーゼ伸長、質量分析、フローサイトメトリー、シーケンシング、次世代シーケンシング）による発現プロフィールを記録することを可能にする形態に血球サンプルをもたらすために必要な全ての工程または変形は、例えば細胞溶解、ＲＮＡ単離、ＲＮＡ標識化、ＲＮＡのポリメラーゼ伸長、ｃＤＮＡへのＲＮＡ逆転写のライゲーション、ｃＤＮＡの増幅、ｃＤＮＡの標識などを含む。
【００２９】
本願発明の文脈において使用される「診断」なる用語は、起こり得る疾患または障害を決定またはモニターする処理を示し、したがって、対象の健康状態を定義またはモニターを試みる処理である。疾患調節のリスト（図１；配列番号：１〜２６）から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡおよび１つ以上の疾患保存ｍｉＲＮＡ（図２、配列番号：２７〜５９）の発現プロフィールの決定は、対象の健康状態と相関する。核酸ハイブリダイゼーションは、マイクロアレイ／バイオチップまたはインサイチュハイブリダイゼーションを使用して実施され得る。核酸増幅は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、例えばリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ  ｑＰＣＲ）を使用して実施され得る。上記リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、工程：（ｉ）対象の全血サンプルに由来する血球サンプルから全ＲＮＡを抽出すること、（ｉｉ）ユニバーサルまたはｍｉＲＮＡ特異的ＲＴプライマー（例えばステムループＲＴプライマー）を使用するＲＮＡ逆転写（ＲＴ）反応によってｃＤＮＡサンプルを得ること；（ｉｉｉ）所望により、（例えば特異的標的増幅（ＳＴＡ）のようなＰＣＲにより）得られたｃＤＮＡを増幅すること、（ｉｖ）工程（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のｃＤＮＡの（リアルタイム）定量化の手段によって、例えば、蛍光色素（例えばＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ）または蛍光プローブ（例えばＴａｑｍａｎプローブ）が加えられるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によって、サンプル中のｍｉＲＮＡレベルを検出すること、を含み得る。工程（ｉ）において、ＲＮＡの単離および／または抽出は、ＲＴ−ＰＣＲがｍｉＲＮＡ含有サンプルから直接行われる場合、省略され得る。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってｍｉＲＮＡ発現プロフィールを決定するためのキットは、例えばＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｍｂｉｏｎ、Ｒｏｃｈｅ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅｘｉｑｏｎからのものである。工程（ｉｉ）において、ユニバーサルまたはｍｉＲＮＡ特異的ＲＴプライマーは、ｍｉＲＮＡの３’末端にライゲートされる一本鎖（ｄｎａ）オリゴヌクレオチドであり得、非天然ｍｉＲＮＡ−ｄｎａキメラ分子を引き起こし、これは逆転写酵素によってｄｎａに転写される。
【００３０】
核酸シーケンシングは、慣用のサンガーシーケンシングによって、または、限定はしないが、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、単一の分子シーケンシング、ナノポアシーケンシングなどの技術を含む、いわゆる「次世代シーケンシング（ＮＧＳ）」によって実施され得る。ＮＧＳは、工程：（ｉ）対象の全血サンプルに由来する血球サンプルから全ＲＮＡを抽出すること、（ｉｉ）ユニバーサルまたはｍｉＲＮＡ特異的ＲＴプライマー（例えばステムループＲＴプライマー）を使用するＲＮＡ逆転写（ＲＴ）反応によってｃＤＮＡサンプルを得ること；（ｉｉｉ）所望により、（例えばＰＣＲにより）得られたｃＤＮＡ転写産物を増幅すること、（ｉｖ）ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡ転写産物を前記シーケンシング技術、例えば合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシングに付すこと、を含み得る。工程（ｉｉ）において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ユニバーサルまたはｍｉＲＮＡ特異的逆転写酵素（ＲＴ）プライマーを含む３’末端にライゲートされる。ｃＤＮＡが工程（ｉｉｉ）において増幅されるべきである場合、３’末端にライゲートされるオリゴはまたＰＣＴプライマー配列を含み、一本鎖オリゴヌクレオチドはまた５’末端にライゲートされ、これもまたＰＣＲプライマー配列を含む。工程（ｉｉｉ）において、次に、ｃＤＮＡは、３’および５’末端での工程（ｉｉ）にて導入されたプライマー配列を使用して増幅される。
【００３１】
本願発明の文脈において使用される「健康状態」なる用語は、限定はしないが、該対象の病気または疾患の存在または非存在の評価を含む、対象の健康全般の状態の測定に関する。本願発明において、対象の健康状態は、血液サンプル、好ましくは該対象の血球サンプルまたは血液細胞画分からの、１つ以上の疾患保存ｍｉＲＮＡのセットと組み合わせて１つ以上の疾患調節ｍｉＲＮＡのセットを決定することにより評価され得る。健康状態は、対象の疾患の存在または非存在および／または対象の癌の存在または非存在であり得る。本願発明の方法と共に、健康状態の変化が診断される。該健康状態の変化は、健康状態の改善または悪化、例えば疾患の改善または悪化および／または癌の改善または悪化であり得る。
【００３２】
本願明細書において使用される「疾患」なる用語は、対象の身体に影響を及ぼす異常状態を示す。疾患は、しばしば、特定の症状および兆候と関連する医学的状態として解釈される。疾患は、感染病のような外部要因に最初に起因する要因によって引き起こされ得るか、または自己免疫疾患のような内部機能障害によって引き起こされ得る。ヒトにおいて、「疾患」は、しばしば、患っている対象に、疼痛、機能障害、苦痛、社会的問題または死、または対象と接触したものに同様の問題を引き起こすあらゆる状態を示すようにより広範に使用される。この広範な意味において、それは、ときどき、損傷、身体障害、障害、症候群、感染、単発症状、逸脱行動、および構造および機能の非典型的な変異を含むが、他の文脈においておよび他の目的のために、これらは、区別できるカテゴリーと考えられ得る。多数の疾患の罹患および多数の疾患を有する生活は、人生観および人格を変更させる可能性があるため、疾患は、通常、物理的にだけでなく、感情的にもまた対象に影響を及ぼす。本願明細書において使用される「疾患」なる用語はまた癌を包含する。
【００３３】
本願明細書において使用される「感染病」なる用語は、対象から対象に伝達され得るあらゆる疾患、および微生物因子によって引き起こされるあらゆる疾患（例えば風邪）を示す。感染症は、当分野で知られており、例えば、それぞれウイルス、細菌および寄生生物によって引き起こされるウイルス疾患、細菌疾患または寄生虫疾患を含む。この点において、感染病は、例えば、肝炎、性感染症（例えばクラミジアまたは淋病）、結核、ＨＩＶ／後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ジフテリア、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、コレラ、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、鳥インフルエンザおよびインフルエンザであり得る。
【００３４】
本願明細書において使用される「自己免疫疾患」なる用語は、身体がそれ自身の組織のいくつかの成分に対して免疫原性（すなわち免疫系）応答を生じるあらゆる疾患を示す。言い換えれば、免疫系が、自己として体内のいくつかの組織または系を認識する能力を失い、外来であるかのようにそれを標的とし攻撃する。自己免疫疾患は、主に１つの臓器が影響を及ぼされるもの（例えば溶血性貧血および自己免疫性(anti-immune)甲状腺炎）、および自己免疫疾患プロセスが多くの組織を介して拡散するもの（例えば全身性エリテマトーデス）に分類することができる。例えば、多発性硬化症は、脳および脊髄の神経線維を囲む鞘を攻撃するＴ細胞によって引き起こされると考えられている。これは、協調運動障害、虚弱、および視力障害を引き起こす。自己免疫疾患は、当分野で知られており、例えば、橋本甲状腺炎、グレーブス病、狼瘡、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、セリアック疾患、クローン病、大腸炎、糖尿病、強皮症、乾癬などを含む。
【００３５】
本願明細書において使用される「癌疾患」または「癌」なる用語は、一般的に調節されていない細胞増殖により特徴付けられる対象の生理学的状態を示すか、または表す。癌の例は、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫および白血病を含むが、これらに限定されない。さらに特に、かかる癌の例は、骨癌、血液癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内の黒色腫、子宮癌、卵巣癌、経直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、性器および生殖器の癌腫、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎の癌、軟組織肉腫、膀胱癌、腎臓癌、腎細胞癌腫、腎盂癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、神経外胚葉性癌、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、および下垂体腺腫を含む。本願発明において「癌」なる用語はまた癌転移も含む。
【００３６】
本願発明の文脈において使用される「対象」なる用語は、健康状態が評価される個体を意味し、したがって、対象は、疾患および／または癌を患っているか、または患っていない者であってよく、また疾患および／または癌であると疑われるか、または疑われない者であってよい。本願発明の方法と共に、健康状態の変化が診断される。該健康状態の変化は、健康状態の改善または悪化、例えば疾患の改善または悪化および／または癌の改善または悪化であり得る。
【００３７】
「治療処置」なる用語は、対象の健康状態を改善する、および／または対象の寿命を延長させる（増加させる）あらゆる処置に関する。該処置は、対象において疾患を除去し得る、対象において疾患の発症を停止または遅延させ得る、対象において疾患の発症を阻害または遅延させ得る、対象において症状の頻度または重症度を減少させ得る、および／または疾患を現在有しているか、または疾患を以前に有していた対象において再発を減少させ得る。
【００３８】
本願発明の態様
本願発明をさらに説明する。以下の段落において、本願発明の異なる局面をより詳細に定義する。そのように定義された各局面は、それとは反対に明確に指示されていない限り、他の任意の局面（複数も含む）と組み合わされ得る。特に、好ましい、または有利であると指示されている任意の特徴は、それとは反対に明確に指示されていない限り、好ましい、または有利であると指示されている他の任意の特徴（複数も含む）と組み合わされ得る。
【００３９】
第１の局面において、本願発明は、対象において健康状態を診断するための方法であって、工程：
（ａ）対象からの血液サンプル中の１つ以上の（疾患調節）ｍｉＲＮＡの第１の所定のセットの発現プロフィールを決定すること、ここで、該ｍｉＲＮＡの第１の所定のセットに含まれるｍｉＲＮＡは図１および／または図３に列挙されたｍｉＲＮＡから選択される
（ｂ）該対象からの該血液サンプル中の１つ以上の（疾患保存）ｍｉＲＮＡの第２の所定のセットの発現プロフィールを決定すること、ここで、該ｍｉＲＮＡの第２の所定のセットに含まれるｍｉＲＮＡは図２および／または図４に列挙されたｍｉＲＮＡから選択される
（ｃ）該ｍｉＲＮＡの第２の所定のセットに対して該ｍｉＲＮＡの第１の所定のセットの発現プロフィールを正規化すること
（ｄ）工程（ｃ）の正規化された発現プロフィールを参照と比較すること
（ｅ）該参照との比較が変更されたとき、該対象において健康状態の変化を診断すること
を含む、方法を提供する。
【００４０】
ここに、血液サンプルは、全血、血球、赤血球、白血球および血小板からなる血液細胞画分、赤血球、白血球および血小板を含む血液細胞画分、または、赤血球、白血球または血小板を含む血液細胞画分から選択される。好ましくは、血液サンプルは血球サンプルであり、さらに好ましくは赤血球、白血球および血小板を含む血液細胞画分である。
【００４１】
本願発明において、全血サンプルは、慣用の血液採取技術によって対象から回収される。全血の回収に適切な血液回収チューブは、ＥＤＴＡ−（例えばＫ２−ＥＤＴＡ  Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅチューブ）、Ｎａ−ｃｉｔｒａｔｅ−、ＡＣＤ−、Ｈｅｐａｒｉｎ−、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ−、Ｔｅｍｐｕｓ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ−チューブを含む。本願発明において、使用前に中間的に保存されていてもよい回収された全血サンプルは、全血の血球サンプルをもたらすように処理される。これは、例えば遠心分離技術による、血清／血漿画分（全血の細胞外画分）から血球画分（全血の細胞画分）の分離によってなし遂げられる。全血サンプルに由来する血球サンプルは赤血球、白血球および／または血小板を含むことが好ましく、全血サンプルに由来する血球サンプルは赤血球、白血球および血小板を含むことがより好ましい。
【００４２】
好ましくは、ｍｉＲＮＡ画分を含む全ＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ画分は、該血球サンプル内に存在する該血球から単離される。ｍｉＲＮＡ画分を含む全ＲＮＡの単離のためのキットまたはｍｉＲＮＡ画分の単離のためのキットは、当業者によく知られている、例えば、ｍｉＲＮｅａｓｙ−ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｐａｒｉｓ−ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）である。次に、（配列番号：１〜２６を有する図１に列挙されたｍｉＲＮＡから選択される）１つ以上の疾患調節ｍｉＲＮＡの第１のセットおよび（配列番号：２７〜５９を有する図２に列挙されたｍｉＲＮＡから選択される）１つ以上の疾患保存ｍｉＲＮＡの第２のセットのｍｉＲＮＡ−プロフィールを、全血の血球サンプルに存在する血球に由来する単離されたＲＮＡから決定される。発現プロフィールの決定は、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡプロフィールを決定するための任意の簡便な手段により決定され得る。種々の技術は、当業者によく知られている、例えば核酸ハイブリダイゼーション、核酸増幅、シーケンシング、質量分析、フローサイトメトリーに基づく技術、またはそれらの組合せである。
【００４３】
工程（ｃ）において正規化することは、該ｍｉＲＮＡの第１の所定のセットに含まれるｍｉＲＮＡのそれぞれに対して相対発現レベルを生成することが好ましい。好ましくは、該相対発現レベルは、診断される１つ以上の対象からの、（疾患および／または癌調節）ｍｉＲＮＡの該第１のセットに含まれる１つ以上のｍｉＲＮＡと（疾患および／または癌保存）ｍｉＲＮＡの該第２のセットに含まれる１つ以上のｍｉＲＮＡから得られる比率である。さらに好ましくは、該相対発現レベルは、（疾患および／または癌調節）ｍｉＲＮＡの該第１のセットに含まれる１つ以上のｍｉＲＮＡの発現レベルを（疾患および／または癌保存）ｍｉＲＮＡの該第２のセットに含まれる１つ以上のｍｉＲＮＡのレベルにより割ることによって得られる。したがって、（疾患および／または癌保存）ｍｉＲＮＡの第２のセットは、（疾患および／または癌調節）ｍｉＲＮＡの該第１のセットに対する正規化群として働く。該相対発現レベルの例は、診断される１つ以上の対象からの、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号：２７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ（配列番号：１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ（配列番号：１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ（配列番号：２９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ（配列番号：１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３１）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ（配列番号：１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−４２５（配列番号：３２）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ（配列番号：１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ（配列番号：３７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ（配列番号：１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号：３８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ（配列番号：１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２５（配列番号：３９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ（配列番号：１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号：２７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号：２）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号：２）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ（配列番号：２９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号：２）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３１）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号：２）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−４２５（配列番号：３２）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号：２）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ（配列番号：３７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号：２）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号：３８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号：２）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２５（配列番号：３９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号：２）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号：２７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ（配列番号：３）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ（配列番号：３）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ（配列番号：２９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ（配列番号：３）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３１）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ（配列番号：３）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−４２５（配列番号：３２）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ（配列番号：３）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ（配列番号：３７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ（配列番号：３）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号：３８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ（配列番号：３）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２５（配列番号：３９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ（配列番号：３）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号：２７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−７２０（配列番号：５）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−７２０（配列番号：５）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ（配列番号：２９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−７２０（配列番号：５）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３１）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−７２０（配列番号：５）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−４２５（配列番号：３２）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−７２０（配列番号：５）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ（配列番号：３７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−７２０（配列番号：５）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号：３８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−７２０（配列番号：５）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２５（配列番号：３９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−７２０（配列番号：５）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号：２７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ（配列番号：２９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３１）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−４２５（配列番号：３２）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ（配列番号：３７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号：３８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２５（配列番号：３９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号：２７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊（配列番号：７）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊（配列番号：７）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ（配列番号：２９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊（配列番号：７）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３１）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊（配列番号：７）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−４２５（配列番号：３２）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊（配列番号：７）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ（配列番号：３７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊（配列番号：７）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号：３８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊（配列番号：７）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２５（配列番号：３９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊（配列番号：７）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号：２７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１７（配列番号：８）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１７（配列番号：８）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ（配列番号：２９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１７（配列番号：８）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３１）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１７（配列番号：８）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−４２５（配列番号：３２）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１７（配列番号：８）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ（配列番号：３７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１７（配列番号：８）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号：３８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１７（配列番号：８）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２５（配列番号：３９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１７（配列番号：８）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号：２７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１２６（配列番号：９）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１２６（配列番号：９）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ（配列番号：２９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１２６（配列番号：９）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３１）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１２６（配列番号：９）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−４２５（配列番号：３２）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１２６（配列番号：９）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ（配列番号：３７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１２６（配列番号：９）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号：３８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１２６（配列番号：９）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２５（配列番号：３９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１２６（配列番号：９）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号：２７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号：１０）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号：１０）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ（配列番号：２９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号：１０）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３１）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号：１０）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−４２５（配列番号：３２）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号：１０）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ（配列番号：３７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号：１０）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号：３８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号：１０）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２５（配列番号：３９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号：１０）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号：２７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ（配列番号：１１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ（配列番号：１１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ（配列番号：２９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ（配列番号：１１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３１）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ（配列番号：１１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−４２５（配列番号：３２）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ（配列番号：１１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ（配列番号：３７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ（配列番号：１１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号：３８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ（配列番号：１１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２５（配列番号：３９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ（配列番号：１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊（配列番号：７）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号：２７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊（配列番号：７）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１２６（配列番号：９）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３５）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号：２７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３６３（配列番号：２４）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号：３８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（配列番号：４１）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３６３（配列番号：２４）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（配列番号：４１）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−８７４（配列番号：５９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−７２０（
配列番号：５）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１７（配列番号：８）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３５）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号：１０）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号：１０）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ（配列番号：３７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊（配列番号：７）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ（配列番号：１３）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３５）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１７（配列番号：８）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３５）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊（配列番号：７）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３５）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ（配列番号：１３）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ（配列番号：３４）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−９３＊（配列番号：２１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ（配列番号：２９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊（配列番号：７）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３５）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号：１５）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ（配列番号：２９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号：３８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３６３（配列番号：２４）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３５）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３６３（配列番号：２４）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ（配列番号：５４）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−９３＊（配列番号：２１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ（配列番号：２９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−７２０（配列番号：５）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３６１−３ｐ（配列番号：５５）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−７２０（配列番号：５）のｍｉＲＮＡ発現レベルの比率である。
【００４４】
好ましくは、工程（ｄ）において正規化された発現プロフィールが比較される参照は、参照発現プロフィールである。発現プロフィールが診断される対象から得られたとき、参照発現プロフィールは１つ以上の参照対象から比較できる様式において得られることが好ましい。好ましくは、参照は、工程：
（ｉ．）１つ以上の参照対象からの血液サンプル中の１つ以上のｍｉＲＮＡの第１の所定のセットの発現プロフィールを決定すること、ここで、該ｍｉＲＮＡの第１の所定のセットに含まれるｍｉＲＮＡは図１および／または図３に列挙されたｍｉＲＮＡから選択される
（ｉｉ．）１つ以上の参照対象からの該血液サンプル中の１つ以上のｍｉＲＮＡの第２の所定のセットの発現プロフィールを決定すること、ここで、該ｍｉＲＮＡの第２の所定のセットに含まれるｍｉＲＮＡは図２および／または図４に列挙されたｍｉＲＮＡから選択される
（ｉｉｉ．）該１つ以上の参照対象からの該ｍｉＲＮＡの第２の所定のセットに対して該ｍｉＲＮＡの第１の所定のセットの発現プロフィールを正規化すること
を含む得られた正規化された参照発現プロフィールである。
【００４５】
工程（ｉｉｉ）において正規化することは、該ｍｉＲＮＡの第１の所定のセットに含まれるｍｉＲＮＡのそれぞれに対して相対参照発現レベルを生成することがさらに好ましい。好ましくは、該相対参照発現レベルは、１つ以上の参照対象からの、（疾患および／または癌調節）ｍｉＲＮＡの該第１のセットに含まれる１つ以上のｍｉＲＮＡと（疾患および／または癌保存）ｍｉＲＮＡの該第２のセットに含まれる１つ以上のｍｉＲＮＡから得られる比率である。さらに好ましくは、該相対発現レベルは、１つ以上の参照対象からの、（疾患および／または癌調節）ｍｉＲＮＡの該第１のセットに含まれる１つ以上のｍｉＲＮＡの発現レベルを（疾患および／または癌保存）ｍｉＲＮＡの該第２のセットに含まれる１つ以上のｍｉＲＮＡのレベルにより割ることによって得られる。したがって、（疾患および／または癌保存）ｍｉＲＮＡの第２のセットは、（疾患および／または癌調節）ｍｉＲＮＡの該第１のセットに対する正規化群として働く。該相対参照発現レベルの例は、１つ以上の参照対象からの、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号：２７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ（配列番号：１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ（配列番号：１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ（配列番号：２９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ（配列番号：１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３１）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ（配列番号：１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−４２５（配列番号：３２）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ（配列番号：１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ（配列番号：３７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ（配列番号：１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号：３８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ（配列番号：１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２５（配列番号：３９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ（配列番号：１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号：２７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号：２）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号：２）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ（配列番号：２９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号：２）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３１）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号：２）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−４２５（配列番号：３２）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号：２）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ（配列番号：３７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号：２）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号：３８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号：２）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２５（配列番号：３９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号：２）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号：２７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ（配列番号：３）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ（配列番号：３）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ（配列番号：２９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ（配列番号：３）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３１）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ（配列番号：３）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−４２５（配列番号：３２）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ（配列番号：３）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ（配列番号：３７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ（配列番号：３）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号：３８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ（配列番号：３）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２５（配列番号：３９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ（配列番号：３）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号：２７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−７２０（配列番号：５）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−７２０（配列番号：５）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ（配列番号：２９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−７２０（配列番号：５）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３１）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−７２０（配列番号：５）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−４２５（配列番号：３２）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−７２０（配列番号：５）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ（配列番号：３７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−７２０（配列番号：５）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号：３８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−７２０（配列番号：５）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２５（配列番号：３９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−７２０（配列番号：５）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号：２７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ（配列番号：２９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３１）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−４２５（配列番号：３２）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ（配列番号：３７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号：３８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２５（配列番号：３９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号：２７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊（配列番号：７）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊（配列番号：７）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ（配列番号：２９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊（配列番号：７）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３１）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊（配列番号：７）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−４２５（配列番号：３２）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊（配列番号：７）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ（配列番号：３７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊（配列番号：７）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号：３８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊（配列番号：７）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２５（配列番号：３９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊（配列番号：７）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号：２７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１７（配列番号：８）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１７（配列番号：８）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ（配列番号：２９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１７（配列番号：８）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３１）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１７（配列番号：８）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−４２５（配列番号：３２）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１７（配列番号：８）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ（配列番号：３７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１７（配列番号：８）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号：３８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１７（配列番号：８）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２５（配列番号：３９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１７（配列番号：８）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号：２７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１２６（配列番号：９）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１２６（配列番号：９）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ（配列番号：２９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１２６（配列番号：９）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３１）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１２６（配列番号：９）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−４２５（配列番号：３２）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１２６（配列番号：９）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ（配列番号：３７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１２６（配列番号：９）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号：３８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１２６（配列番号：９）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２５（配列番号：３９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１２６（配列番号：９）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号：２７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号：１０）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号：１０）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ（配列番号：２９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号：１０）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３１）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号：１０）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−４２５（配列番号：３２）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号：１０）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ（配列番号：３７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号：１０）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号：３８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号：１０）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２５（配列番号：３９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号：１０）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号：２７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ（配列番号：１１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ（配列番号：１１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ（配列番号：２９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ（配列番号：１１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３１）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ（配列番号：１１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−４２５（配列番号：３２）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ（配列番号：１１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ（配列番号：３７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ（配列番号：１１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号：３８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ（配列番号：１１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２５（配列番号：３９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ（配列番号：１１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊（配列番号：７）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号：２７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊（配列番号：７）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１２６（配列番号：９）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３５）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号：２７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３６３（配列番号：２４）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号：３８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（配列番号：４１）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３６３（配列番号：２４）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（配列番号：４１）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−８７４（配列番号：５９
）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−７２０（配列番号：５）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１７（配列番号：８）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３５）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号：１０）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号：１０）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ（配列番号：３７）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊（配列番号：７）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号：２８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ（配列番号：１３）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３５）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１７（配列番号：８）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３５）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊（配列番号：７）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３５）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ（配列番号：１３）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ（配列番号：３４）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−９３＊（配列番号：２１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ（配列番号：２９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊（配列番号：７）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３５）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号：１５）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ（配列番号：２９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号：６）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号：３８）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３６３（配列番号：２４）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号：３５）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−３６３（配列番号：２４）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ（配列番号：５４）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−９３＊（配列番号：２１）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ（配列番号：２９）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−７２０（配列番号：５）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３６１−３ｐ（配列番号：５５）によって割られたｈｓａ−ｍｉＲ−７２０（配列番号：５）のｍｉＲＮＡ発現レベルの比率である。
【００４６】
本願発明において、工程（ｄ）における比較は、ｍｉＲＮＡの同じ組合せ、すなわち疾患調節および疾患保存ｍｉＲＮＡの同じ組合せ、さらに好ましくは疾患調節および疾患保存ｍｉＲＮＡの同じ比率を使用することによって得られた、診断される対象からの正規化された発現レベルおよび１つ以上の参照対象に由来する正規化された参照発現プロフィールを使用して行われる。
【００４７】
好ましくは、工程（ｄ）における比較は、該ｍｉＲＮＡの第１の所定のセットに含まれるｍｉＲＮＡのそれぞれに対して、該対象からの相対発現レベルを相対参照発現レベルと比較することによる。
【００４８】
相対発現レベルは、図１に列挙された（疾患調節）ｍｉＲＮＡと図２に列挙された（疾患保存）ｍｉＲＮＡからの比率を計算することにより得られることが好ましい。
【００４９】
相対発現レベルは図７に列挙された比率の群から選択されることがまた好ましい。
【００５０】
工程（ｅ）において、相対参照発現レベルに対する該対象からの相対発現レベルの比較が該セットに含まれる該１つ以上の所定のｍｉＲＮＡに対する閾値を超えるとき、健康状態の変化が診断されることがさらに好ましい。
【００５１】
好ましくは、健康状態の変化を診断するための閾値は、３標準偏差に設定され、好ましくは５標準偏差に設定され、さらに好ましくは７標準偏差に設定される。
【００５２】
第２の局面において、本願発明は、対象において健康状態を診断するための方法に関する。
【００５３】
本願発明の第２の局面による方法は、本願発明の第１の局面による方法における詳細な局面を包含および／または含むことが理解される。
【００５４】
該第２の局面において、本願発明は、対象において健康状態を診断するための方法であって、工程：
（ａ）対象からの血液サンプル中のｍｉＲＮＡの第１の所定のセットの発現プロフィールを決定すること
（ｂ）該対象からの該血液サンプル中のｍｉＲＮＡの第２の所定のセットの発現プロフィールを決定すること
（ｃ）該工程（ａ）の発現プロフィールおよび該工程（ｂ）の発現プロフィールを参照発現プロフィールと比較すること
（ｄ）該第１の参照発現プロフィールに対する比較が変更され、該第２の参照発現プロフィールに対する比較が変更されなかったとき、該対象において健康状態の変化を診断すること
を含む、方法に関する。
【００５５】
ここで、該所定のｍｉＲＮＡの第１のセットに含まれる該ｍｉＲＮＡおよび該第１の参照発現プロフィールに含まれるｍｉＲＮＡは図１および／または図３に列挙されたｍｉＲＮＡから選択され、該所定のｍｉＲＮＡの第２のセットに含まれる該ｍｉＲＮＡは図２および／または図４に列挙されたｍｉＲＮＡから選択される。
【００５６】
該血液サンプルが、全血、血球、赤血球、白血球および血小板からなる血液細胞画分、赤血球、白血球および血小板を含む血液細胞画分、または、赤血球、白血球または血小板を含む血液細胞画分から選択されることが好ましい。さらに好ましくは、血液サンプルは、赤血球、白血球および血小板を含む血液細胞画分である。
【００５７】
本願発明の第１および第２の局面による該参照発現プロフィールが同じ対象の前の時点によって得られることが好ましい。
【００５８】
好ましくは、本願発明の第１および第２の局面による健康状態の変化は健康状態の改善または悪化である。
【００５９】
好ましくは、本願発明の第１または第２の局面による方法において、全血サンプルに由来する血球サンプル中の発現プロフィールを決定するとき、少なくとも２つのｍｉＲＮＡ、すなわち（配列番号：１〜２６を有する図１に列挙されたｍｉＲＮＡから選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの第１の所定のセットの）１つの疾患調節ｍｉＲＮＡおよび（配列番号：２７〜５９を有する図２に列挙されたｍｉＲＮＡから選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの第２の所定のセットの）１つの疾患保存ｍｉＲＮＡの核酸配列は、配列番号：１および配列番号：２７を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：１および配列番号：２８を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：１および配列番号：２９を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：１および配列番号：３０を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：１および配列番号：３１を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：１および配列番号：３２を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：１および配列番号：３３を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：１および配列番号：３４を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：１および配列番号：３５を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：２および配列番号：２７を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：２および配列番号：２８を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：２および配列番号：２９を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：２および配列番号：３０を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：２および配列番号：３１を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：２および配列番号：３２を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：２および配列番号：３３を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：２および配列番号：３４を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：３および配列番号：２７を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：３および配列番号：２８を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：３および配列番号：２９を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：３および配列番号：３０を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：３および配列番号：３１を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：３および配列番号：３２を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：３および配列番号：３３を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：４および配列番号：２７を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：４および配列番号：２８を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：４および配列番号：２９を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：４および配列番号：３０を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：４および配列番号：３１を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：４および配列番号：３２を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：５および配列番号：２７を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：５および配列番号：２８を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：５および配列番号：２９を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：５および配列番号：３０を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：５および配列番号：３１を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：６および配列番号：２７を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：６および配列番号：２８を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：６および配列番号：２９を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：６および配列番号：３０を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：７および配列番号：２７を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：７および配列番号：２８を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：７および配列番号：２９を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：８および配列番号：２７を有し、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：８および配列番号：２９を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：９および配列番号：２７を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：７および配列番号：２８を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：７および配列番号：２７を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：９および配列番号：２８を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：６および配列番号：２８を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：６および配列番号：３５を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：６および配列番号：２７を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：２４および配列番号：２８を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：６および配列番号：３８を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：２４および配列番号：４１を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：６および配列番号：４１を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：５および配列番号：５９を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：８および配列番号：２８を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：１０および配列番号：３５を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：１０および配列番号：２８を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：７および配列番号：３７を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：１３および配列番号：２８を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：８および配列番号：３５を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：７および配列番号：３５を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：１３および配列番号：３５を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：２１および配列番号：３４を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：７および配列番号：２９を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：１５および配列番号：３５を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：６および配列番号：２９を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：２４および配列番号：３８を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：２４および配列番号：３５を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：２１および配列番号：５４を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：５および配列番号：２９を有し、または、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの核酸配列は配列番号：５および配列番号：５５を有する。
【００６０】
発現プロフィールは、工程：
（ａ）健康状態について診断される対象の全血サンプルを提供すること
（ｂ）該全血サンプルから血球サンプルを得ること
（ｃ）該血球サンプルから全ＲＮＡを抽出すること
（ｄ）抽出された全ＲＮＡから（配列番号：１〜２６を有する図１に列挙されたｍｉＲＮＡから選択される）１つ以上の疾患調節ｍｉＲＮＡの第１のセットおよび（配列番号：２７〜５９を有する図２に列挙されたｍｉＲＮＡから選択される）の１つ以上の疾患保存ｍｉＲＮＡの第２のセットの発現プロフィールを決定すること
を含んで決定されることが好ましい。
【００６１】
好ましくは、血球サンプルは、遠心分離によってなし遂げられ得る、全血サンプルの残存部分から血球を分離することによって全血サンプルに由来し、ここで、（赤血球、白血球および血小板を含む）血球は回収することができるペレットを形成する（実施例１参照）。当業者は、全血サンプルの残存部分から血球を分離する代替方法（例えば、サイズ排除、サイズ分布、誘電泳動、陽性または陰性の抗体選択など）を認識している。
【００６２】
発現プロフィールを決定することは、ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）へのセットに含まれる少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、好ましくは少なくとも２つのｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列の逆転写を含むことがさらに好ましい。ここに、ＲＮＡ配列は、該ｍｉＲＮＡの発現プロフィールの決定の前に、（例えば逆転写酵素の使用によって）ＤＮＡに逆転写される。好ましくは、セットに含まれる少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、好ましくは少なくとも２つのｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列は、核酸増幅（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）、シーケンシング（次世代シーケンシング、サンガーシーケンシング）またはハイブリダイゼーションに基づく技術がｍｉＲＮＡ発現プロフィールの決定において使用されるとき、ｃＤＮＡに逆転写される。さらに、全ＲＮＡは、発現プロフィールが決定されるｃＤＮＡに転写されることが好ましい。
【００６３】
本願発明の第１および第２の局面による本願発明のさらなる態様において、疾患調節ｍｉＲＮＡは、図３に列挙されたｍｉＲＮＡから選択される癌調節ｍｉＲＮＡであり、疾患保存ｍｉＲＮＡは、図４に列挙されたｍｉＲＮＡから選択される癌保存ｍｉＲＮＡである。
【００６４】
第３の局面において、本願発明は、本願発明の第１および第２の局面による方法の使用に関する。
【００６５】
本願発明の第３の局面による使用は、本願発明の第１および第２の局面による方法における詳細な局面を包含および／または含むことが理解される。
【００６６】
該本願発明の第３の局面は、
（ｉ．）１つ以上の対象間の健康状態を比較すること
（ｉｉ．）対象において健康状態をモニターすること
（ｉｉｉ．）対象において免疫系の状態をモニターすること
（ｉｖ．）対象において治療処置、好ましくは薬物処置に対する応答をモニターすること
のための、本願発明の第１および第２の局面による方法の使用に関する。
【００６７】
第４の局面において、本願発明は、
（ｉ．）対象の血液サンプルにおいて配列番号：１〜２６からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡおよび配列番号：２７〜５９からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含むセットの発現プロフィールを決定するための手段、および
（ｉｉ．）少なくとも１つの参照
を含む、対象の健康状態を診断するためのキットに関する。
【００６８】
本願発明の第４の局面によるキットは、本願発明の第１および第２の局面による方法における詳細な局面、第３の局面による使用における詳細な局面を包含および／または含むことが理解される。
【００６９】
好ましくは、該発現プロフィールを決定するための手段は、
（ｉ．）対象の血液サンプルにおいて配列番号：１〜２６からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡおよび配列番号：２７〜５９からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含むセットを決定するための少なくとも２つのポリヌクレオチドのセット、および
（ｉｉ．）マイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＴシステム、ＰＣＲシステム、フローサイトメーター、ビーズに基づく多重システムまたは次世代シーケンシングシステム
を含む。
【００７０】
キットは、本願発明の第１の局面において概説される本願発明による少なくとも１つの参照を含む。好ましい態様において、参照はキットのデータキャリアに含まれ得る。さらなる好ましい態様において、参照は、キットに含まれ、例えば発現プロフィールの決定において、キットを行うとき使用される、参照サンプルおよび／または参照標準であり得る。
【００７１】
所望により、キットはデータキャリアを含む。好ましくは、データキャリアは、電子または非電子データキャリアであり、さらに好ましくは、電子データキャリア、例えば記憶媒体である。キットは、所望により、所望により参照および／または健康状態の診断において発現プロフィールおよび参照の適用方法についてのこの指示を含み得る、データキャリアを含む。発現プロフィールおよび参照の適用方法についてのこの指示は、健康状態の診断に関与する医師および／または診断研究のための指示を含み得る。データキャリアは決定された発現プロフィールの分析および評価のためのツールをさらに含むことが好ましい。これらのツールは、健康状態の診断において医師および／または診断研究を支援するあらゆるツールであり得る。含まれる指示はアルゴリズムまたはソフトウェアであることが好ましい。好ましくは、これらのツールは、決定された発現プロフィールの分析において支援する、および／または次の診断において支援するソフトウェアツールである。分析および評価のためのツールは、本願発明による参照を含み得る。
【００７２】
キットは、所望により、好ましくはＥＤＴＡ−、Ｎａ−ｃｉｔｒａｔｅ−、ＡＣＤ−、Ｈｅｐａｒｉｎ−、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ−、Ｔｅｍｐｕｓ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ−チューブからなる群から選択される全血回収チューブを含み、所望により、ＲＮＡ画分を安定化させるための添加物を含む。
【００７３】
キットは、所望により、全血サンプルから血球サンプルを得るための手段を含む。これらの手段は、好ましくは、全血サンプルの残存部分からそれぞれの血球サンプル（例えば、白血球、赤血球または血小板を含む血球サンプル、白血球、赤血球および血小板を含む血球サンプル、血小板調製物）を分離および／または単離するためである。これらの手段は、それぞれの血球画分を単離／分離するための試薬または消耗品および／または適当な器具（例えば遠心機、特別な回収チューブ）を含み得る。
【００７４】
さらなる局面において、本願発明者らは、赤血球、白血球および／または血小板を含む血液サンプル、好ましくは全血サンプルまたは血液細胞画分中に、特定のｍｉＲＮＡ（癌調節ｍｉＲＮＡ、図３）が健常対照と癌対象との間に有意に異常調節されるが、他の特定のｍｉＲＮＡ（癌保存ｍｉＲＮＡ、図４）が健常対照と癌対象との間に有意に異常調節されないことを見いだした。本願発明のさらなる態様において、該癌調節ｍｉＲＮＡ（図３）および該癌保存ｍｉＲＮＡ（図４）は、対象において健康状態を診断するための本願発明の第１、第２、第３および第４の局面による疾患調節ｍｉＲＮＡおよび疾患保存ｍｉＲＮＡにおける詳細と同じように使用され得、健康状態の変化は該対象の癌の非存在または存在に関することが理解される。
【００７５】
さらなる局面において、本願発明は、対象において健康状態をモニターするための方法であって、工程：
（ａ）第１および第２の局面による方法を実施することにより、最初の時点で対象において健康状態を診断すること
（ｂ）第１および第２の局面による方法を実施することにより、１つ以上の後の時点で対象において健康状態を診断すること、および
（ｃ）工程（ａ）において診断された健康状態を工程（ｂ）において診断された健康状態と比較し、それにより対象において健康状態をモニターすること
を含む、方法を提供する。
【００７６】
１つの態様において、対象において健康状態は時間とともに改善または悪化する。
【００７７】
１つの他の態様において、モニターされる対象において健康状態は該対象の免疫系の状態を含む。
【００７８】
１つの他の態様において、対象は、最初の時点から１つ以上の後の時点の間で治療処置を受けている。該処置は薬物処置であり得、すなわち薬物の投与を含み得る。該薬物は、対象において疾患および／または癌を処置するための薬物であり得る。該処置は、あるいは、および／またはさらに、外科処置、化学療法、放射線療法、および／または免疫療法を含み得る。
【００７９】
要約すれば、本願発明は、以下の項目から構成される：
【００８０】
１．対象において健康状態を診断するための方法であって、工程：
（ｆ）対象からの血液サンプル中の１つ以上のｍｉＲＮＡの第１の所定のセットの発現プロフィールを決定すること、ここで、該ｍｉＲＮＡの第１の所定のセットに含まれるｍｉＲＮＡは図１および／または図３に列挙されたｍｉＲＮＡから選択される
（ｇ）該対象からの該血液サンプル中の１つ以上のｍｉＲＮＡの第２の所定のセットの発現プロフィールを決定すること、ここで、該ｍｉＲＮＡの第２の所定のセットに含まれるｍｉＲＮＡは図２および／または図４に列挙されたｍｉＲＮＡから選択される
（ｈ）該ｍｉＲＮＡの第２の所定のセットに対して該ｍｉＲＮＡの第１の所定のセットの発現プロフィールを正規化すること
（ｉ）工程（ｃ）の正規化された発現プロフィールを参照と比較すること
（ｊ）該参照との比較が変更されたとき、該対象において健康状態の変化を診断すること
を含み、
該血液サンプルは、全血、血球、赤血球、白血球および血小板からなる血液細胞画分、赤血球、白血球および血小板を含む血液細胞画分、または、赤血球、白血球または血小板を含む血液細胞画分から選択される、方法。
【００８１】
２．工程（ｃ）において正規化することが該ｍｉＲＮＡの第１の所定のセットに含まれるｍｉＲＮＡのそれぞれに対して相対発現レベルを生成する、項目１に記載の方法。
【００８２】
３．該参照が、得られた正規化された参照発現プロフィールである、項目２に記載の方法であって、工程：
（ｉ．）１つ以上の参照対象からの血液サンプル中の１つ以上のｍｉＲＮＡの第１の所定のセットの発現プロフィールを決定すること、ここで、該ｍｉＲＮＡの第１の所定のセットに含まれるｍｉＲＮＡは図１および／または図３に列挙されたｍｉＲＮＡから選択される
（ｉｉ．）１つ以上の参照対象からの該血液サンプル中の１つ以上のｍｉＲＮＡの第２の所定のセットの発現プロフィールを決定すること、ここで、該ｍｉＲＮＡの第２の所定のセットに含まれるｍｉＲＮＡは図２および／または図４に列挙されたｍｉＲＮＡから選択される
（ｉｉｉ．）該１つ以上の参照対象からの該ｍｉＲＮＡの第２の所定のセットに対して該ｍｉＲＮＡの第１の所定のセットの発現プロフィールを正規化すること
を含む、方法。
【００８３】
４．工程（ｉｉｉ）において正規化することが該ｍｉＲＮＡの第１の所定のセットに含まれるｍｉＲＮＡのそれぞれに対して相対参照発現レベルを生成する、項目３に記載の方法。
【００８４】
５．工程（ｄ）において比較することが、該ｍｉＲＮＡの第１の所定のセットに含まれるｍｉＲＮＡのそれぞれに対して、該対象からの相対発現レベルを相対参照発現レベルと比較することによる、項目１から４のいずれかに記載の方法。
【００８５】
６．相対発現レベルが、図１に列挙された（疾患調節）ｍｉＲＮＡおよび図２に列挙された（疾患保存）ｍｉＲＮＡからの比率を計算することにより得られる、項目２、４または５のいずれかに記載の方法。
【００８６】
７．相対発現レベルが図７に列挙された比率の群から選択される、項目６に記載の方法。
【００８７】
８．工程（ｅ）において、相対参照発現レベルに対する該対象からの相対発現レベルの比較が該セットに含まれる該１つ以上の所定のｍｉＲＮＡに対する閾値を超えるとき、健康状態の変化が診断される、項目１から７のいずれかに記載の方法。
【００８８】
９．該閾値が３標準偏差に設定され、好ましくは５標準偏差に設定され、さらに好ましくは７標準偏差に設定される、項目１から８のいずれかに記載の方法。
【００８９】
１０．対象において健康状態を診断するための方法であって、工程：
（ｅ）対象からの血液サンプル中のｍｉＲＮＡの第１の所定のセットの発現プロフィールを決定すること
（ｆ）該対象からの該血液サンプル中のｍｉＲＮＡの第２の所定のセットの発現プロフィールを決定すること
（ｇ）該工程（ａ）の発現プロフィールおよび該工程（ｂ）の発現プロフィールを参照発現プロフィールと比較すること
（ｈ）該第１の参照発現プロフィールに対する比較が変更され、該第２の参照発現プロフィールに対する比較が変更されなかったとき、該対象において健康状態の変化を診断すること
を含み、
ここで、
（ｉ．）該所定のｍｉＲＮＡの第１のセットに含まれる該ｍｉＲＮＡおよび該第１の参照発現プロフィールに含まれるｍｉＲＮＡは図１および／または図３に列挙されたｍｉＲＮＡから選択され、
（ｉｉ．）該所定のｍｉＲＮＡの第２のセットに含まれる該ｍｉＲＮＡは図２および／または図４に列挙されたｍｉＲＮＡから選択され、
（ｉｉｉ．）該血液サンプルは、全血、血球、赤血球、白血球および血小板からなる血液細胞画分、赤血球、白血球および血小板を含む血液細胞画分、または、赤血球、白血球または血小板を含む血液細胞画分から選択される
方法。
【００９０】
１１．該参照発現プロフィールが同じ対象の前の時点によって得られる、項目３から１０のいずれかに記載の方法。
【００９１】
１２．健康状態の変化が健康状態の改善または悪化である、項目１から１１のいずれかに記載の方法。
【００９２】
１３．（ｉ．）１つ以上の対象間の健康状態を比較すること、
（ｉｉ．）対象において健康状態をモニターすること、
（ｉｉｉ．）対象において免疫系の状態をモニターすること、
（ｉｖ．）対象において治療処置、好ましくは薬物処置に対する応答をモニターすること
のための、項目１から１２のいずれかに記載の方法の使用。
【００９３】
１４．（疾患調節）ｍｉＲＮＡの該第１のセットのさらなるｍｉＲＮＡが図３に列挙されたｍｉＲＮＡから選択され、（疾患保存）ｍｉＲＮＡの該第２のセットのさらなるｍｉＲＮＡが図３に列挙されたｍｉＲＮＡから選択され、健康状態の変化は該対象の癌の非存在または存在に関する、項目１から１３のいずれかに記載の方法、使用またはキット。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】赤血球、白血球および血小板を含むＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブに回収された全血サンプルに由来する血球サンプル中の決定された疾患調節ｍｉＲＮＡ（配列番号：１〜２６）の要約。ここで、血液サンプルをＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブに入れ、血球のｍｉＲＮＡ画分を含む血球の全ＲＮＡをｍｉＲＮｅａｓｙキットの使用によって単離し（http://www.qiagen.com）、ｍｉＲＢａｓｅバージョン１２を代表するｄｎａ−マイクロアレイ（ｆｅｂｉｔ  ｂｉｏｍｅｄ）にて分析した（実験的詳細：配列番号：配列識別番号；ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＢａｓｅバージョン１２によるｍｉＲＮＡ注釈；中央ｇ１（健常対照）＝健常対照患者の中央発現レベル；中央ｇ２（疾患）＝疾患対象の中央発現レベル；ｑ中央＝中央ｇ１（健常対照）および中央ｇ２（疾患）の比率；ｔｔｅｓｔ＿ａｄｊｐ＝ｔｔｅｓｔに従って計算されたＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ−調整ｐ値；ＡＵＣ＝曲線下面積統計値）。
【００９５】
【図２】赤血球、白血球および血小板を含むＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブに回収された全血サンプルに由来する血球サンプル中の決定された疾患保存ｍｉＲＮＡ（配列番号：２７〜５９）の要約。ここで、血液サンプルをＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブに入れ、血球のｍｉＲＮＡ画分を含む血球の全ＲＮＡをｍｉＲＮｅａｓｙキットの使用によって単離し（http://www.qiagen.com）、ｍｉＲＢａｓｅバージョン１２を代表するｄｎａ−マイクロアレイ（ｆｅｂｉｔ  ｂｉｏｍｅｄ）にて分析した（実験的詳細：配列番号：配列識別番号；ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＢａｓｅバージョン１２によるｍｉＲＮＡ注釈；中央ｇ１（健常対照）＝健常対照患者の中央発現レベル；中央ｇ２（疾患）＝疾患対象の中央発現レベル；ｑ中央＝中央ｇ１（健常対照）および中央ｇ２（疾患）の比率；ｔｔｅｓｔ＿ａｄｊｐ＝ｔｔｅｓｔに従って計算されたＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ−調整ｐ値；ＡＵＣ＝曲線下面積統計値）。
【００９６】
【図３】赤血球、白血球および血小板を含むＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブに回収された全血サンプルに由来する血球サンプル中の決定された癌調節ｍｉＲＮＡの要約。ここで、血液サンプルをＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブに入れ、血球のｍｉＲＮＡ画分を含む血球の全ＲＮＡをｍｉＲＮｅａｓｙキットの使用によって単離し（http://www.qiagen.com）、ｍｉＲＢａｓｅバージョン１２を代表するｄｎａ−マイクロアレイ（ｆｅｂｉｔ  ｂｉｏｍｅｄ）にて分析した（実験的詳細：配列番号：配列識別番号；ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＢａｓｅバージョン１２によるｍｉＲＮＡ注釈；中央ｇ１（健常対照）＝健常対照患者の中央発現レベル；中央ｇ２（癌）＝疾患（癌）対象の中央発現レベル；ｑ中央＝中央ｇ１（健常対照）および中央ｇ２（癌）の比率；ｔｔｅｓｔ＿ａｄｊｐ＝ｔｔｅｓｔに従って計算されたＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ−調整ｐ値；ＡＵＣ＝曲線下面積統計値）。
【００９７】
【図４】赤血球、白血球および血小板を含むＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブに回収された全血サンプルに由来する血球サンプル中の決定された癌保存ｍｉＲＮＡの要約。ここで、血液サンプルをＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブに入れ、血球のｍｉＲＮＡ画分を含む血球の全ＲＮＡをｍｉＲＮｅａｓｙキットの使用によって単離し（http://www.qiagen.com）、ｍｉＲＢａｓｅバージョン１２を代表するｄｎａ−マイクロアレイ（ｆｅｂｉｔ  ｂｉｏｍｅｄ）にて分析した（実験的詳細：配列番号：配列識別番号；ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＢａｓｅバージョン１２によるｍｉＲＮＡ注釈；中央ｇ１（健常対照）＝健常対照患者の中央発現レベル；中央ｇ２（癌）＝疾患（癌）対象の中央発現レベル；ｑ中央＝中央ｇ１（健常対照）および中央ｇ２（癌）の比率；ｔｔｅｓｔ＿ａｄｊｐ＝ｔｔｅｓｔに従って計算されたＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ−調整ｐ値；ＡＵＣ＝曲線下面積統計値）。
【００９８】
【図５】（ａ）本願発明の第２の局面および（ｂ）本願発明の第１の局面による方法の概略図。
【００９９】
【図６】本願発明による対象において健康状態をモニターするための方法の使用のためのグラフ図。
【０１００】
【図７】ｍｉＲＮＡの第２の所定のセット（図２から選択される疾患保存ｍｉＲＮＡ）に対して１つ以上のｍｉＲＮＡの第１の所定のセット（図１から選択される疾患調節ｍｉＲＮＡ）の発現プロフィールを正規化することから得られる相対発現レベルを描写するボックスプロット。ここで、左側の灰色のボックスプロットは健常対照対象（ｎ＝６７）内で相対発現レベルを示し、右側の白色のボックスプロットは疾患対象（ｎ＝７１３）内で相対発現レベルを示す；ｐｖａｌ＝ｔｔｅｓｔに従って計算されたＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ−調整ｐ値。ここで、全てのサンプルを回収し、赤血球、白血球および血小板を含む血液細胞画分に由来するｍｉＲＮＡを使用する実施例１−５にしたがって処理した。図７−１：ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊／ｈｓａ−ｍｉＲ−１６；図７−２：ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊／ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ；図７−３：ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６／ｈｓａ−ｍｉＲ−１６；図７−４：ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１６；図７−５：ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ；図７−６：ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ／ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ；図７−７：ｈｓａ−ｍｉＲ−３６３／ｈｓａ−ｍｉＲ−１６；図７−８：ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ／ｈｓａ−ｍｉＲ−２２；図７−９：ｈｓａ−ｍｉＲ−３６３／ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２；図７−１０：ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２；図７−１１：ｈｓａ−ｍｉＲ−７２０／ｈｓａ−ｍｉＲ−８７４；図７−１２：ｈｓａ−ｍｉＲ−１７／ｈｓａ−ｍｉＲ−１６；図７−１３：ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ；図７−１４：ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１６；図７−１５：ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊／ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ；図７−１６：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１６；図７−１７：ｈｓａ−ｍｉＲ−１７／ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ；図７−１８：ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊／ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ；図７−１９：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ；図７−２０：ｈｓａ−ｍｉＲ−９３＊／ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ；図７−２１：ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４＊／ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ；図７−２２：ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２／ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ；図７−２３：ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ；図７−２４：ｈｓａ−ｍｉＲ−３６３／ｈｓａ−ｍｉＲ−２２；図７−２５：ｈｓａ−ｍｉＲ−３６３／ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ；図７−２６：ｈｓａ−ｍｉＲ−９３＊／ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ；図７−２７：ｈｓａ−ｍｉＲ−７２０／ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ；図７−２８：ｈｓａ−ｍｉＲ−７２０／ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１−３ｐ。（グラフ内で、視覚化の制約のために、ｍｉＲＮＡ識別子の注釈を切断する；ここで、相対発現値は上記のとおりである）
【０１０１】
【図８】ｍｉＲＮＡの第２の所定のセット（図２から選択される疾患保存ｍｉＲＮＡ）に対して１つ以上のｍｉＲＮＡの第１の所定のセット（図１から選択される疾患調節ｍｉＲＮＡ）の発現プロフィールを正規化することから得られる相対発現レベルの要約（実験的詳細：ｍｉＲＮＡ＝ｍｉＲＢａｓｅバージョン１２によるｍｉＲＮＡ注釈；中央比率ｒ／ｐ（健常対照）＝健常対照群内で疾患調節ｍｉＲＮＡ（ｒ）および疾患保存ｍｉＲＮＡ（ｐ）の発現レベルの比率から計算された中央を有する健常対照群の中央相対発現レベル；中央比率ｒ／ｐ（疾患）＝疾患群内で疾患調節ｍｉＲＮＡ（ｒ）および疾患保存ｍｉＲＮＡ（ｐ）の発現レベルの比率から計算された中央を有する疾患群の中央相対発現レベル；倍数変化＝健常対照および疾患群間の中央相対発現レベルの中央倍数変化；Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｔｅｓｔ調整ｐ値＝ＷＭＷ−ｔｅｓｔに従って計算された調整ｐ値；ｔ−Ｔｅｓｔ調整ｐ値＝ｔｔｅｓｔに従って計算されたＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ−調整ｐ値；ＡＵＣ＝曲線下面積統計値）。
【０１０２】
【図９】ｍｉＲＮＡの第２の所定のセット（図４から選択される癌保存ｍｉＲＮＡ）に対して１つ以上のｍｉＲＮＡの第１の所定のセット（図３から選択される癌調節ｍｉＲＮＡ）の発現プロフィールを正規化することから得られる相対発現レベルの要約（実験的詳細：ｍｉＲＮＡ＝ｍｉＲＢａｓｅバージョン１２によるｍｉＲＮＡ注釈；中央比率ｒ／ｐ（健常対照）＝健常対照群内で癌調節ｍｉＲＮＡ（ｒ）および癌保存ｍｉＲＮＡ（ｐ）の発現レベルの比率から計算された中央を有する健常対照群の中央相対発現レベル；中央比率ｒ／ｐ（癌）＝癌群内で癌調節ｍｉＲＮＡ（ｒ）および癌保存ｍｉＲＮＡ（ｐ）の発現レベルの比率から計算された中央を有する癌群の中央相対発現レベル；倍数変化＝健常対照および癌群間の中央相対発現レベルの中央倍数変化；Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｔｅｓｔ調整ｐ値＝ＷＭＷ−ｔｅｓｔに従って計算された調整ｐ値；ｔ−Ｔｅｓｔ調整ｐ値＝ｔｔｅｓｔに従って計算されたＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ−調整ｐ値；ＡＵＣ＝曲線下面積統計値）。
【０１０３】
【図１０】対象において健康状態を診断するための５つの疾患調節および５つの疾患保存ｍｉＲＮＡの所定のセットの分類能力。５つの正規化された発現プロフィールからなるセットは、０．７８のＡＵＣで健康状態（健常対照  対  疾患）を分類する。分類は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４／ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２／ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ／ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ／ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４およびｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ／ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂから計算された５つの正規化された発現プロフィールを用いてであった。
【実施例】
【０１０４】
実施例は、本願発明をさらに説明し、より良い理解を提供するために設計されている。それらは、決して本願発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。
【０１０５】
実施例１：全血サンプルから血球サンプルを得ること
健常対照および疾患対象  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ）の血液。各血液ドナーについて、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブ中に２．５ｍｌ。血球調製物は、遠心分離による全血サンプルの処理に由来する／から得られる。ここで、該血液回収チューブに回収された全血からの血球を１０分、５０００ｘｇ遠心分離によって遠心した。血球ペレット（赤血球、白血球および血小板を含む細胞血液分画）をさらなる処理のために回収したが、上清（細胞外血液分画を含む）は捨てた。低分子ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ画分）を含む全ＲＮＡを、ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して回収された血球から抽出した；詳細には実施例２参照。
【０１０６】
実施例２：ｍｉｃｒｏＲＮＡを含む全ＲＮＡの単離
低分子ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ画分）を含む全ＲＮＡの単離を、ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の使用によって行った。ここで、血球ペレット（実施例１において概説されるとおりに得られた）を、上下のピペッティングによって７００μｌのＱＩＡｚｏｌ溶解試薬に完全に再懸濁し、懸濁液を新たな１，５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに即座に移した。次に、１４０μｌのクロロホルムを加え、完全にボルテックスし、室温で２−３分インキュベートし、次に４℃で１５分１２，０００ｇで遠心分離した。その後、上部の水相を、他の２つの相に触れることなく、細心の注意を払って新たな２ｍｌチューブに移した。次に、１．５容量の１００％エタノールを移された水相に加え、完全な混合をピペッティングにより行った。次に、７００μｌのサンプルをカラムに移し、ＲＴで１５秒１３，０００ｒｐｍで遠心し、流出液を捨てた。その後、７００μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＲＷＴを各カラムに加え、ＲＴで１５秒１３，０００ｒｐｍで再び遠心し、流出液を捨てた。次に、５００μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＲＰＥをカラムに加え、ＲＴで１５秒１３，０００ｒｐｍで遠心し、流出液を捨てた。その後、別の５００μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＲＰＥをカラムに加え、ＲＴで２分１３，０００ｒｐｍで遠心し、流出液を捨てた。次に、カラムを新たな２ｍｌ回収チューブに置き、ＲＴで１分１３，０００ｒｐｍで遠心し、それを乾燥した。カラムを新たな１．５ｍｌ回収チューブに移した。ｍｉｃｒｏＲＮＡを含む全ＲＮＡの溶離のため、４０μｌのＲＮａｓｅ非含有水をカラム上にピペッティングし、１分インキュベートし、ＲＴで１分１３．０００ｒｐｍ遠心した。次に、溶出液を同じカラムに戻し、ＲＴで１分インキュベートし、１分再び遠心した。溶出したｍｉｃｒｏＲＮＡを含む全ＲＮＡをＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００を使用して定量し、発現プロファイリング実験の使用前に−２０℃で貯蔵した。全ＲＮＡの品質管理のために、１μｌの全ＲＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐ測定によって決定されるＲＮＡ濃度に依存してＡｇｉｌｅｎｔ’ｓ  ｎａｎｏまたはｐｉｃｏ  ＲＮＡ  Ｃｈｉｐのいずれかを選択してＡｇｉｌｅｎｔ’ｓ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒに付した。
【０１０７】
実施例３：発現プロフィールのマイクロアレイベースの決定
ｍｉＲＮＡ画分を含む全ＲＮＡサンプル（実施例２のプロトコールによって得られた）を、Ｇｅｎｉｏｍ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  ｍｉＲＮＡホモサピエンスを使用するＧｅｎｉｏｍ  Ｒｅａｌｔｉｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ｆｅｂｉｔ  ｂｉｏｍｅｄ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にてマイクロアレイハイブリダイゼーションを使用して分析した。各マイクロ流体マイクロアレイは、Ｓａｎｇｅｒ  ｍｉＲＢａｓｅ  １２．０に注釈されるとおり８６６個のｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊（それぞれ、７つの複製によって表される）の相補的ｄｎａ−ｐｒｏｂｅを含む。ビオチンでのサンプル標識化は、ｆｅｂｉｔのＭＰＥＡアッセイを使用するｍｉＲＮＡの酵素的オンチップ標識化によって行われた。４２℃で１６時間のハイブリダイゼーション後、バイオチップを自動的に洗浄し、シグナル増強のためのプログラムをＧｅｎｉｏｍ  Ｒｅａｌｔｉｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒで処理した。得られた検出画像を、Ｇｅｎｉｏｍ  Ｗｉｚａｒｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して評価した。各アレイについて、それぞれのｍｉＲＮＡについて、アレイ上のｍｉＲＢａｓｅのそれぞれの複製コピーに対応して７つの強度値が計算されるように、中央シグナル強度を生データファイルから抽出した。バックグラウンド補正後、それぞれのｍｉＲＮＡの７つの複製強度値を、それらの中央値によって要約した。異なるアレイ間でデータを正規化するために、分位正規化を適用し、正規化されたバックグラウンド減算強度値を使用して全てのさらなる分析を行った。中央ｇ１および中央ｇ２から、発現の倍数変化（＝ｑ中央）を比率ｇ１／ｇ２として計算した。
【０１０８】
実施例４：統計分析
測定されたデータの正規分布を検証した後、パラメトリックｔ−ｔｅｓｔ（不対、両側）をそれぞれのｍｉＲＮＡごとに別々に実施し、血液ドナーの異なる群において異なる挙動を示すｍｉＲＮＡを検出した。得られた生のｐ値を、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ調整（＝ｔｔｅｓｔ＿ａｄｊ）によって複数の試験のために調整した。さらに、本願発明者らは、それぞれのｍｉＲＮＡごとに別々にｌｉｍｍａ−ｔｅｓｔを適用し、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ（＝ｌｉｍｍａ＿ａｄｊ）にしたがって補正した。さらに、本願発明者らは、受信者動作特性を適用し、「曲線下面積」値（＝ＡＵＣ）を計算した。ｔｔｅｓｔ−、ｌｉｍｍａ−ｔｅｓｔ−およびＡＵＣ−値は、それぞれのｍｉＲＮＡに対する統計的有意性に基づいて、群１（ｇ１対象）および群２（ｇ２対象）間で発現される差異があると判断することを可能にする。
【０１０９】
実施例５：疾患調節および疾患保存ｍｉＲＮＡの決定
この試験の目的は、種々の疾患および健常対照において有意に変更された発現を示すｍｉＲＮＡおよび対照的に疾患および対照において非常に低い発現変動を示すｍｉＲＮＡを同定することであった。ｍｉＲＮＡの２つの群は「疾患調節」または「疾患保存」ｍｉＲＮＡと称される。合計で、ｍｉＲＮＡプロフィールは１，０４９の血液サンプルから得られ、それら全ては同じプロトコールを使用してＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブに回収された。それぞれの場合において、プロフィールは、マイクロアレイ分析によって記録される８４８個のｍｉＲＮＡの発現値から生成した。「疾患調節」または「疾患保存」ｍｉＲＮＡを同定するために、本願発明者らはｔ−ｔｅｓｔおよびＡＵＣ値を使用した。ｐ値またはＡＵＣ値について２０個の異なる閾値を使用して、本願発明者らは「疾患調節」（図１）または「疾患保存」ｍｉＲＮＡ（図２）の異なるセットを得た。
【図１】
2018506997.tif 000002
【図２】
2018506997.tif 000003
【図３】
2018506997.tif 000004
【図４】
2018506997.tif 000005
【図５】
2018506997.tif 000006
【図６】
2018506997.tif 000007
【図７Ａ】
2018506997.tif 000008
【図７Ｂ】
2018506997.tif 000009
【図７Ｃ】
2018506997.tif 000010
【図７Ｄ】
2018506997.tif 000011
【図７Ｅ】
2018506997.tif 000012
【図７Ｆ】
2018506997.tif 000013
【図７Ｇ】
2018506997.tif 000014
【図８Ａ】
2018506997.tif 000015
【図８Ｂ】
2018506997.tif 000016
【図８Ｃ】
2018506997.tif 000017
【図８Ｄ】
2018506997.tif 000018
【図９Ａ】
2018506997.tif 000019
【図９Ｂ】
2018506997.tif 000020
【図９Ｃ】
2018506997.tif 000021
【図９Ｄ】
2018506997.tif 000022
【図９Ｅ】
2018506997.tif 000023
【図１０】
2018506997.tif 000024
【配列表】
2018506997000001.app
【国際調査報告】
2018506997.tif 000025
2018506997.tif 000026
2018506997.tif 000027