(57)【要約】ヒト多能性幹細胞（hPSC）には、微小生理学実験モデルおよび再生治療薬として、二重の価値がある。hPSCは上皮細胞であるが、hPSCおよび子孫上皮が系譜特異的機能をどの程度まで再構成することができるかは、依然としてほとんどわかっていない。本明細書において、本発明者らは、三次元培養中のhPSCおよびそれらの分化子孫が、組織特異的な上皮の形態形成、生理機能、および疾患を、機能的に再現できることを示す。2018526010.tif 000009
2018526010.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある量のヒト多能性幹細胞（hPSC）を用意する工程、
胚盤葉上層スフェロイドを形成させるために培養培地中でhPSCを培養する工程、および
胚盤葉上層スフェロイドをオルガノイドに分化させる能力を有する1つまたは複数の作用物質を含む分化培地中で、胚盤葉上層スフェロイドを分化させる工程
を含む、ヒトオルガノイドを生成させる方法。
【請求項２】
胚盤葉上層スフェロイドを形成させる前に、hPSCが、白血病抑制因子（LIF）およびドキシサイクリンの非存在下で培養される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
胚盤葉上層スフェロイドを形成させる前に、hPSCが、Y27632の存在下で培養される、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
培養培地がマトリゲルを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
培養培地がコラーゲンIを含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
hPSCを培養する工程が、ある表面に培養培地の第1層を堆積させることと、堆積させた培養培地上にhPSCを置くことと、hPSCの上に培養培地の第2層を加えることとを含む、請求項4に記載の方法。
【請求項７】
培養培地中でhPSCを培養する工程が約1日、2日、またはそれ以上の日数を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
1つまたは複数の作用物質がCHIR99021を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
1つまたは複数の作用物質がB27を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
胚盤葉上層スフェロイドを分化させる工程が、約7日、8日、9日、10日、11日、12日、もしくは13日、またはそれ以上の日数を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
胚盤葉上層スフェロイドが、ポドカリキシン（PODXL）、閉鎖帯（ZO-1）、およびβ-カテニンのうちの1つまたは複数を発現する、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
胚盤葉上層スフェロイドに空洞が形成される、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
オルガノイドが細管状である、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
オルガノイドが腎臓オルガノイドである、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
オルガノイドが、ポドカリキシン（PODXL）、閉鎖帯（ZO-1）、およびシカクマメ（lotus tetragonolobus）レクチン（LTL）のうちの1つまたは複数を発現する、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
請求項1に記載の方法によって作られる、ある量のオルガノイド。
【請求項１７】
ある量の胚盤葉上層スフェロイドを用意する工程、および
胚盤葉上層スフェロイドをオルガノイドに分化させる能力を有する1つまたは複数の作用物質を含む分化培地中で、胚盤葉上層スフェロイドを分化させる工程
を含む、細管オルガノイドを生成させる方法。
【請求項１８】
1つまたは複数の作用物質がCHIR99021を含む、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
1つまたは複数の作用物質がB27を含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】
細管オルガノイドが腎臓オルガノイドである、請求項17に記載の方法。
【請求項２１】
腎臓オルガノイドが、ポドカリキシン（PODXL）、閉鎖帯（ZO-1）、およびシカクマメレクチン（LTL）のうちの1つまたは複数を発現する、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
胚盤葉上層スフェロイドを腎臓オルガノイドに分化させる工程が、RPMIおよびB27を含む第2分化培地中でさらに培養することを含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２３】
胚盤葉上層スフェロイドを腎臓オルガノイドに分化させる工程が、
CHIR99021、RPMIおよびB27を含む第2分化培地中で約24時間にわたってさらに培養することと、
CHIR99021、RPMI、B27およびインスリンを含む第3分化培地で第2分化培地を置き換え、かつ約48時間にわたってさらに培養することと、
IWP2を加え、かつ約48時間にわたって培養を継続することと、
第3分化培地を第2分化培地でさらに置き換えることと
を含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２４】
ある量の細管オルガノイドを用意する工程、
1つまたは複数の化合物を細管オルガノイドに加える工程、
細管オルガノイドの表現型または活性の変化を判定する工程、および
前記変化を細管オルガノイドに対する前記化合物の効果と相関させる工程であって、それによって、細管オルガノイドに対する効果に関して前記1つまたは複数の化合物をスクリーニングする、工程
を含む、細管オルガノイドに対する効果に関して化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２５】
表現型または活性の変化を判定する工程が、細管オルガノイドにおいて1つまたは複数のマーカーを検出することを含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
1つまたは複数のマーカーが腎臓傷害分子（KIM-1）を含む、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
KIM-1発現の増加が前記化合物の毒性効果と相関する、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
細管オルガノイドが腎臓オルガノイドである、請求項24に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
ヒト幹細胞は三次元培養で培養することができ、組織特異的上皮の形態形成、生理機能、および疾患を再現することができる。
【背景技術】
【０００２】
背景
未分化幹細胞および最終分化体細胞はどちらも上皮を形成する。これらは、胚において分化の軸を確立するように機能すること、または腎臓などの成体器官において障壁および輸送の役割を果たすように機能することができる。インビトロでの3D細胞培養は上皮の形態形成、生理機能、および疾患を調べるための強力なツールであり、顕微鏡検査、化学的処理、および実験操作に容易に利用することができる。例えば、メイディン・ダービー（Madin-Darby）イヌ腎臓（MOCK）細胞などの上皮細胞株の研究により、管腔形成に機構的に寄与する極性およびアポトーシス経路が明らかになっている。しかし、従来の上皮細胞株は系譜拘束的であり、遺伝的多様性を欠く。その結果、生じる3D構造は比較的単純になり、同じ遺伝的背景を持つ異なる上皮または異なる遺伝的背景を持つ同じ上皮の対照比較を行うことは困難であった。これらの制約にも関わらず、細胞微小環境および3D培養系への関心は、特に幹細胞応用のために、着実に増加し続けてきた。組織特異的上皮機能、特に、種特異的な毒性学および疾患病態生理学が生物医学的に重要な、ヒトにおける組織特異的上皮機能を正確に再構成する、遺伝的に多様な細胞培養プラットフォームが、大いに必要とされている。
【０００３】
ヒト多能性幹細胞（hPSC）は高い自己複製能を有し、あらゆる体細胞タイプに分化することができる。それゆえにこれらは、基礎研究および再生のための、多様なヒト上皮の再現性ある供給源に相当する。胚由来の胚性幹細胞（ESC）と患者由来の誘導多能性幹細胞（iPSC）との両方を含むhPSCは、遺伝的に多様であり、生産されている何千もの株は、特異的患者集団または遺伝子標的ノックアウト変異体に相当する。未分化hPSCは極性化された上皮細胞であり、典型的には、接着単層培養において平坦なコロニーとして培養されるか、または3D懸濁液において密な凝集体として培養される。着床期胚盤葉上層上皮をモデル化するために、これらの上皮培養が提案されている。対照的に、マウス（m）ESCは、培養中では、発生上、胚盤葉上層に先立つ構造である内部細胞塊（ICM）と類似する、コンパクトなクラスター化した形態をとる。
【０００４】
最近、マトリゲル細胞外マトリックス（ECM）で取り囲まれたmESCは、小さな空洞を持つ極性化されたロゼットを形成することが示され、羊膜腔形成をインビトロでモデル化できることが示唆された。しかし、これらの実験は多能性を持続させない条件下で培養されたmESCで行われたので、観察されたロゼットが、ICMに相当するのか、胚盤葉上層に相当するのか、スフェロイドを形成することもできる分化中のサブタイプを表すのかは不明なままである。この疑問に取り組み、胚盤葉上層空洞形成のヒトモデルを確立するには、胚盤葉上層期のhPSCを使った多能性持続培地における実験が必要である。
【０００５】
三次元培養中のhPSCおよびそれらの分化子孫は、組織特異的な上皮の形態形成、生理機能、および疾患を、機能的に再現することができるという発見を、本明細書に記載する。未分化hPSCは、胚の胚盤葉上層をモデル化する、中空の羊膜腔様空洞を取り囲むスフェロイドコロニーを形成する。スフェロイドは、二工程プロトコールにより、近位尿細管、ポドサイトおよび内皮細胞を含む腎臓ネフロンの発生的および構造的特徴を持つ曲細管オルガノイドに分化する。腎臓細管と胚盤葉上層の空洞は、差異的に、蛍光カーゴを蓄積し、腎毒性化学傷害に応答する。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書には、ある量のヒト多能性幹細胞（hPSC）を用意する工程、胚盤葉上層スフェロイドを形成させるために培養培地中でhPSCを培養する工程、および胚盤葉上層スフェロイドをオルガノイドに分化させる能力を有する1つまたは複数の作用物質を含む分化培地中で、胚盤葉上層スフェロイドを分化させる工程を含む、ヒトオルガノイドを生成させる方法が記載される。さまざまな態様において、hPSCは、胚盤葉上層スフェロイドを形成させる前に、白血病抑制因子（LIF）およびドキシサイクリンの非存在下で培養される。さまざまな態様において、hPSCは、胚盤葉上層スフェロイドを形成させる前に、Y27632の存在下で培養される。さまざまな態様において、培養培地はマトリゲルを含む。さまざまな態様において、培養培地はコラーゲンIを含む。さまざまな態様において、hPSCを培養する工程は、ある表面に培養培地の第1層を堆積させることと、堆積させた培養培地上にhPSCを置くことと、hPSCの上に培養培地の第2層を加えることとを含む。さまざまな態様において、培養培地中でhPSCを培養する工程は、約1日、約2日、またはそれ以上の日数を含む。さまざまな態様において、前記1つまたは複数の作用物質はCHIR99021を含む。さまざまな態様において、前記1つまたは複数の作用物質はB27を含む。さまざまな態様において、胚盤葉上層スフェロイドを分化させる工程は、約7日、約8日、約9日、約10日、約11日、約12日、もしくは約13日、またはそれ以上の日数を含む。さまざまな態様において、胚盤葉上層スフェロイドは、ポドカリキシン（PODXL）、閉鎖帯（ZO-1）、およびβ-カテニンのうちの1つまたは複数を発現する。さまざまな態様において、胚盤葉上層スフェロイドには空洞が形成される。さまざまな態様において、オルガノイドは細管状である。さまざまな態様において、オルガノイドは腎臓オルガノイドである。さまざまな態様において、オルガノイドは、ポドカリキシン（PODXL）、閉鎖帯（ZO-1）、およびシカクマメ（lotus tetragonolobus）レクチン（LTL）のうちの1つまたは複数を発現する。例えばhPSCは、約3％成長因子低減（Reduced Growth Factor）GeiTrex上で、少なくとも1代は、mTeSR1や、hLR5 iPSCの場合であればhESC条件培地（CM）＋白血病抑制因子（LIF）＋doxなどの培地において、フィーダーフリーで維持することができる。さまざまな態様において、hPSCは、LIFおよびドキシサイクリンを除去することによって、プライミングされる。さまざまな態様において、LIFおよびドキシサイクリンの除去は、FGF2による置換を含む。さまざまな態様において、細胞は培養表面および培地体積に対して特別な密度でプレーティングされる。
【０００７】
本明細書には、ある量のヒト多能性幹細胞（hPSC）を用意する工程、胚盤葉上層スフェロイドを形成させるために培養培地中でhPSCを培養する工程、および胚盤葉上層スフェロイドをオルガノイドに分化させる能力を有する1つまたは複数の作用物質を含む分化培地中で、胚盤葉上層スフェロイドを分化させる工程を含むヒトオルガノイドを生成させる方法によって作られる、ある量のオルガノイドも記載される。さまざまな態様において、hPSCは、胚盤葉上層スフェロイドを形成させる前に、白血病抑制因子（LIF）およびドキシサイクリンの非存在下で培養される。さまざまな態様において、hPSCは、胚盤葉上層スフェロイドを形成させる前に、Y27632の存在下で培養される。さまざまな態様において、培養培地はマトリゲルを含む。さまざまな態様において、培養培地はコラーゲンIを含む。さまざまな態様において、hPSCを培養する工程は、ある表面に培養培地の第1層を堆積させることと、堆積させた培養培地上にhPSCを置くことと、hPSCの上に培養培地の第2層を加えることとを含む。さまざまな態様において、培養培地中でhPSCを培養する工程は、約1日、約2日、またはそれ以上の日数を含む。さまざまな態様において、前記1つまたは複数の作用物質はCHIR99021を含む。さまざまな態様において、前記1つまたは複数の作用物質はB27を含む。さまざまな態様において、胚盤葉上層スフェロイドを分化させる工程は、約7日、約8日、約9日、約10日、約11日、約12日、もしくは約13日、またはそれ以上の日数を含む。さまざまな態様において、胚盤葉上層スフェロイドは、ポドカリキシン（PODXL）、閉鎖帯（ZO-1）、およびβ-カテニンのうちの1つまたは複数を発現する。さまざまな態様において、胚盤葉上層スフェロイドには空洞が形成される。さまざまな態様において、オルガノイドは細管状である。さまざまな態様において、オルガノイドは腎臓オルガノイドである。さまざまな態様において、オルガノイドは、ポドカリキシン（PODXL）、閉鎖帯（ZO-1）、およびシカクマメレクチン（LTL）のうちの1つまたは複数を発現する。さまざまな態様において、hPSCはCRISPRなどのゲノム編集を使って遺伝子修飾される。
【０００８】
本明細書には、ある量の胚盤葉上層スフェロイドを用意する工程、および胚盤葉上層スフェロイドをオルガノイドに分化させる能力を有する1つまたは複数の作用物質を含む分化培地中で、胚盤葉上層スフェロイドを分化させる工程を含む、細管オルガノイドを生成させる方法が、さらに記載される。さまざまな態様において、前記1つまたは複数の作用物質はCHIR99021を含む。さまざまな態様において、前記1つまたは複数の作用物質はB27を含む。さまざまな態様において、胚盤葉上層スフェロイドを分化させる工程は、約7日、約8日、約9日、約10日、約11日、約12日、もしくは約13日、またはそれ以上の日数を含む。さまざまな態様において、細管オルガノイドは腎臓オルガノイドである。さまざまな態様において、腎臓オルガノイドは、ポドカリキシン（PODXL）、閉鎖帯（ZO-1）、およびシカクマメレクチン（LTL）のうちの1つまたは複数を発現する。さまざまな態様において、胚盤葉上層スフェロイドを腎臓オルガノイドに分化させる工程は、RPMIおよびB27を含む第2分化培地中でさらに培養することを含む。さまざまな態様において、胚盤葉上層スフェロイドを腎臓オルガノイドに分化させる工程は、CHIR99021、RPMIおよびB27を含む第2分化培地中で約24時間にわたってさらに培養することと、CHIR99021、RPMI、B27およびインスリンを含む第3分化培地で第2分化培地を置き換え、かつ約48時間にわたってさらに培養することと、IWP2を加え、かつ約48時間にわたって培養を継続することと、第3分化培地を第2分化培地でさらに置き換えることとを含む。
【０００９】
本明細書には、ある量の細管オルガノイドを用意する工程、1つまたは複数の化合物を細管オルガノイドに加える工程、細管オルガノイドの表現型または活性の変化を判定する工程、および前記変化を細管オルガノイドに対する前記化合物の効果と相関させる工程であって、それによって、細管オルガノイドに対する効果に関して前記1つまたは複数の化合物をスクリーニングする、工程を含む、細管オルガノイドに対する効果に関して化合物をスクリーニングする方法も記載される。
【００１０】
さまざまな態様において、表現型または活性の変化を判定する工程は、細管オルガノイドにおいて1つまたは複数のマーカーを検出することを含む。さまざまな態様において、前記1つまたは複数のマーカーは腎臓傷害分子（KIM-1）を含む。さまざまな態様において、KIM-1発現の増加は、当該化合物の毒性効果と相関する。さまざまな態様において、細管オルガノイドは腎臓オルガノイドである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】連続3D培養におけるhPSCおよび子孫細胞の上皮形態形成。スフェロイドからオルガノイドへの培養のプロトコールの（a）概略図および（b）位相差タイムラプス像。赤い矢じりは上皮を強調している。破線の黒い矢印は概略図を図面と関連付けている。（c）代表的なサンドイッチ培養2細胞hPSC凝集体、（d）小スフェロイド、（e）空洞を持つ大スフェロイド、および（f）単層コロニーでの、ポドカリキシン（PODXL）、ZO-1、およびβ-カテニン（βCAT）免疫蛍光を示す、共焦点光学切片。最上部から最下部までの垂直距離を左側に示す。拡大図を図13に示す。細管オルガノイドにおける上皮極性マーカーの免疫蛍光およびLTL対比染色を示す、（g）低倍率広視野像および（h〜i）高倍率共焦点光学切片。スケールバーは100μm（a〜b、g〜i）または20μm（c〜f）。
【図２】空洞形成スフェロイドは胚盤葉上層に相当する。（a）連続継代実験の概略図。（b）解離し（色付き枠）、継代培養（同色の矢印）した、3D培養中のhPSCの代表的明視野像。破線の矢印は3D条件における連続継代培養を表す。下段は、各代から解離されたスフェロイドから2D培養にプレーティングされた細胞を示す。（c）色素上皮（外胚葉）、軟骨（中胚葉）、および腺上皮（内胚葉）を示す、hPSC連続3D継代培養p3、p6およびp9から生成した奇形腫のヘマトキシリンおよびエオシン染色切片。（d）プレーティング72時間後の2D培養および3D培養における細胞数（各時点に関する二重計数の細胞数の平均、またはすべての時点のAVG）。（e）OCT4およびSOX2を示す代表的免疫蛍光像、ならびに（f）p3およびp7連続サンドイッチ培養hPSCにおけるTRA-1-60およびNANOGの局在。（g）3D培養における、ナイーブ型およびプライム型hLR5の形態と、対応するZO-1およびポドカリキシン免疫蛍光。mTeSR1のみでの対照と比較した、mTeSR1＋CHIR中で培養したhPSCコロニーの、（h）形態および（i）定量（n＝3）。mTeSR1において一連の濃度のCHIRで処理した3D培養におけるOCT4およびBRYのDAPI正規化免疫蛍光の（j）代表的な像および（k）ドットプロット。各ドットは単一hESCまたはhiPSC（プール、1条件あたりn＞6,000細胞）に相当する。スケールバー、50μm。エラーバー、s.e.m.。
【図３】細管オルガノイドは腎臓の発生およびアーキテクチャーを再現する。（a）2D培養および3D培養に適用された心筋細胞プロトコールの定量（n＝3）。（b）細管分化19日目の24ウェル全体と枠内の拡大図。（c〜d）細管オルガノイドにおけるネフロン前駆体マーカー（SIX2、LHX1、PAX2）および近位尿細管マーカー（LTL、LRP2/メガリン、CUBN）に関する共焦点免疫蛍光。拡大図は白く囲んだ領域を示す。（e）2つの代表的細管の電子顕微鏡像と、頂端部の微絨毛（矢じり）およびタイトジャンクション（矢印）とを強調している色付き枠内の漸進的拡大図。（f）LTL＋およびPODXLと、E-カドヘリン（ECAD、上段、高倍率）およびCD31（下段、低倍率）との局在を示す広視野像。（g）細管オルガノイド（矢じり）内でのSYNPOクラスターおよびCD31クラスターの共局在を示す共焦点光学切片。細管オルガノイドにおける（h）核WT1とSYNPOおよび（i）CD31とvWFの共局在を示す広視野免疫蛍光。スケールバー、10μm（e）または100μmエラーバー、s.e.m.。
【図４】細管オルガノイドは長期間生き残り、腎臓の生理機能をモデル化する。（a）hiPSC由来の腎臓様パターニングを持つ大きな腎臓オルガノイド。（b）細管コンパートメント、ポドサイト様コンパートメント、および内皮コンパートメント間の相互作用（白い矢じり）を示す、hESCまたは3人の異なる患者からリプログラムされたhiPSCに由来するオルガノイド。白い破線の輪郭は代表的管端を強調している。（c）位相差時間経過および培養120日後（d120）の細管におけるLTL免疫蛍光。（d）解離および連続継代（矢印）後に生じる一次（1°）細管および娘細管（2°および3°）の位相差像。（e）2°細管におけるSIX2およびLTL免疫蛍光。KIM-1と（f）LTLまたは（g）第2KIM-1抗体（KIM1 ab2）との共局在。（h）腎毒性化学薬品による処理後にKIM-1を発現するオルガノイドの定量（n＝3）。（i）腎臓オルガノイドを示す96ウェルプレートのウェル全体。発生中のマウス腎臓における3週間の成長後の（j）LTLを発現するオルガノイド由来成長物（HNN）または（k）SIX2前駆体（矢じり）の共焦点像。スケールバー、100μmまたは50μm（d〜e、g）。エラーバー、s.e.m.。
【図５】胚盤葉上層スフェロイドと腎臓細管における蛍光カーゴの差異的蓄積。（a）実験概略図ならびにLYおよびRDと共にインキュベートされたhPSCスフェロイドを示す共焦点タイムラプス像。（b）実験概略図およびRDのマイクロインジェクション後のhPSCスフェロイド空洞の広視野時間経過。自己蛍光は検出されない（GFPチャンネル）。（c）分子状色素と共に4時間にわたってインキュベートした後、培地を変えた（洗い流し）、hPSCの時間経過。（d）洗い流しの直後に撮像した空洞裏打ち細胞。下側のパネルは枠内の拡大図を示している。（e）RDおよびLYと共にインキュベートした後、洗い流し（パルス）、インキュベーション（チェイス）、固定およびLTLとの局在を行った、細管オルガノイドの代表的時間経過。（f〜g）2μM LatBありまたはなしでRDを蓄積した細管オルガノイドの定量（n＝3）。（h）洗い流しの1時間後および18時間後の2つの代表的生オルガノイドまたは（i）洗い流し直後のhPSCスフェロイドにおける、フルオレセイン-MTXおよびRDの分布。スケールバー、50μm（a〜d）または100μm（e〜i）。エラーバー、s.e.m.。
【図６】ポドカリキシンは胚盤葉上層スフェロイドにおける管腔形成を促進する。（a）pCas9-GFPおよびPODXL gRNAプラスミドをトランスフェクトしたH9 ESCの代表的FACSプロット。紫色のイベントを含む枠内をクローン拡大のためにプレーティングした。（b）フローソーティングの1日後の蛍光顕微鏡像。（c）野生型（wt）として配列決定されたCRISPR/Cas9クローンおよび2つの相異なるポドカリキシン変異体（m1およびm2）のクロマトグラムを整列させたもの。ピンク色のアスタリスクはgRNA配列の始まりの印である。（d）野生型配列に対して整列させた、分離されたアレル（A1およびA2）を示す、変異体m1に関するクロマトグラムの解釈。（e）CRISPR/Cas9非変異体クローン（wt）またはスクランブル（scr）もしくはポドカリキシン（pod）siRNAノックダウンに付した細胞と比較した、代表的PODXL-/- hPSC変異体（m1およびm2）における、ポドカリキシンタンパク質に関するイムノブロット。（f）外胚葉の色素上皮（p）、中胚葉の軟骨（c）、および内胚葉の腸様上皮（g）を示す、野生型hPSCまたはPODXL-/- hPSCからの奇形腫。（g）胚盤葉上層スフェロイドコロニーあたりの総面積（≧7回の実験/SOコロニーからプールしたAVG）。（h）2D培養のエスケイピー（escapee）0/VT）およびPODXL-/- hPSCにおける約7日間の成長後の解離細胞数（≧14回の実験からプールしたAVG）。各実験を野生型に対して正規化した。（i）変異体またはWT CRISPR/Cas9クローンと比較したサンドイッチ培養親ESCの明視野像。（j）総コロニー数のパーセンテージとしての空洞形成スフェロイド。群平均（AVG、n≧9）およびp値を決定するためにWTまたは変異体細胞株からのデータをプールした。（k）空洞を持つコロニーにおける総面積のパーセンテージとしての管腔面積（≧9回の実験/40コロニーからプールしたAVG）。（I）無修飾 0/VT）コロニーまたはPODXL-/-コロニーにおけるZO-1およびP-カテニンの局在を示す、未分化hPSCの共焦点z切片。（m）2つの未分化WTまたはPODXL-/-クローンにおけるアクチンおよびオクルディン（OCLN）免疫蛍光。（n）WT単層またはPODXL-/-単層における平均TEER測定値（n≧3）。スケールバー、50μmまたは（l〜m）20μmエラーバー、s.e.m.。
【図７】hPSC由来PODXL-/-ポドサイトでは接着装置複合体が破壊される。（a）PODXL-/- hPSCまたは同質遺伝子型無修飾対照に由来する細管オルガノイドにおけるタイトジャンクション（ZO-1）、近位尿細管（LTL）、およびポドサイト（PODXL、SYNPO）に関する免疫蛍光。対照において、ポドカリキシンはポドサイト（矢印）において強く発現し、細管（矢じり）ではかすかに発現する。（b）野生型hPSCおよびPODXL-/- hPSCにおける細管径（≧4回の実験/25細管からプールしたAVG）。（c）代表的PODXL-/-腎臓細管における正常（敷石状（cobblestone））ZO-1免疫蛍光。（d）成体ヒト腎臓の共焦点光学切片。ポドカリキシンはポドサイトおよび尿細管周囲毛細血管において発現するが、細管（矢じり）には存在しない。（e）hPSC由来ポドサイトクラスターにおけるZO-1とポドカリキシンまたはSYNPOとWT1の分布を示す共焦点光学切片。矢じりはポドサイト間の接着装置複合体の軌道を強調している。（f）細管オルガノイドにおける野生型またはPODXL-/- hPSCポドサイトクラスターの共焦点切片。（g）これらの細胞における隣接ポドサイト核間の軌道の間隙幅（2回の実験からプールしたn≧100個のギャップ）。スケールバー、50μmまたは（c）20μm。エラーバー、s.e.m.。
【図８】PKD-/-およびPKD-/-は多能性および胚盤葉上層スフェロイド形態形成にとって必要でない。（ab）対照およびPKD hPSCのクロマトグラム。網掛けはgRNAの3'端の印である。矢印はコーディング配列中の塩基対番号を示す。比較のためにPKD2ノックダウンが示されている。（c〜d）同質遺伝子型対照と比較してPKD hPSCにおける完全長PC1またはPC2の減少を示すイムノブロット。（e）WTおよびPKD hPSCの継代培養における細胞数。（f）外胚葉の色素上皮（p）、中胚葉の軟骨（c）、および内胚葉の腸様上皮（g）を示す奇形腫。（g）胚盤葉上層スフェロイドの形態およびスフェロイド全体に対する相対的管腔面積の定量（n≧90個のスフェロイド、≧5回の実験からプール）、および（h）WTおよびPKD hPSCにおけるオルガノイド分化効率。p＜0.01。
【図９】PKD hPSCは系譜特異的嚢胞形成をモデル化する。（a）培養58日目の代表的PKD嚢胞。（b）PKDノックアウトオルガノイドおよび同質遺伝子型WT対照における、平均としての24ウェルあたりの嚢胞数の定量（n＞10回の実験）または散布図。嚢胞におけるLTL反応性を示す（c）広視野落射蛍光像および（d）共焦点光学切片。代表的z切片は嚢胞の中空中心部および関連細管オルガノイド（矢印）を示している。赤枠内の拡大図が示されている。（e）WT株およびPKD株におけるRDおよびMTXの蓄積。破線はPKD嚢胞の輪郭である。スケールバー、100μm。エラー、s.e.m.。*、p＜0.01。
【図１０】hPSC由来上皮のモデル.（a）hPSC管腔形成のモデル。ICM期のhPSCは極性化されたタイトジャンクションを欠き、ランダムな凝集体形成をもたらす。胚盤葉上層期のhPSCは極性化されて、連続したタイトジャンクションを伴うので、単細胞上皮へと組織化する。3D成長では、頂端膜におけるポドカリキシンの極性化された蓄積が電荷斥力（負電荷）をもたらし、それが、細胞の分離による管腔の形成を促進する。タイトジャンクションは頂端膜を環境コンポーネントから隔離して、小さな（緑色）分子の進入は許すが、高分子（赤色）は排除し、それが細胞間隙に蓄積する。（b）腎臓様オルガノイド内の近位尿細管のアーキテクチャー。細長い近位尿細管は単層円柱上皮を形成し、それは頂端面においてLTL（緑色）に結合する。周囲のポドサイト様細胞は高レベルのポドカリキシンを発現し、組織化の程度が低い凝集構造を管端に形成する。ZO-1は、ポドカリキシンによって制限されて、亜頂端位に発現する。内皮細胞は細管コンパートメントともポドサイト様コンパートメントとも密接に相互作用する。薄く描いた背景の構造は、インビトロで形成された上皮構造を、それらの提案されたインビボ状況に置く。
【図１１】hPSCは3D培養においてスフェロイドを形成する。（a）代表的概略図および（b）サンドイッチ（3D）培養または単層（2D）培養で成長するhESCまたはiPSCの高コントラストおよび低コントラスト明視野像。連日が示されており、d0はサンドイッチ化直前の時点を示している。（c）平坦なコロニーと空洞形成したコロニーのパーセンテージおよび（d）サンドイッチ化後、2日目および4日目の20培養および3D培養における、線維状アクチンおよびOCT4の共局在。（e）サンドイッチ化の0時間後、24時間後、および48時間後のhESCコロニー全体を示す明視野時間経過。（f）サンドイッチ化の24時間後および48時間後のhESCおよびMOCK細胞。スケールバー、50μm。エラーバー、s.e.m.。
【図１２】hPSCスフェロイド空洞形成の3D培養要件。（a）1:1マトリゲル:コラーゲンの厚層ゲルにおけるhPSCスフェロイド形成の概略時間経過。（b）厚層ゲルにおける7日後のhPSCまたはMOCK細胞の代表的明視野像。（c）厚層ゲルにおけるhPSC成長の代表的時間経過。（d）1:1マトリゲル:コラーゲンにおいて6日間培養したhESCおよびiPSCに関する、空洞形成スフェロイド/96ウェルプレートのウェルの定量。（e）懸濁培養における嚢胞形成の概略図。（f）hESCまたは2人の患者からのiPSCからの代表的な懸濁培養嚢胞。スケールバー、20μm。エラーバー、標準誤差。
【図１３】hPSCおよび細管オルガノイドにおける上皮マーカー発現。（a）代表的hPSC単層コロニーでのポドカリキシン、ZO-1、およびβ-カテニン免疫蛍光を示す共焦点zスタック。頂端側から基底側へと、単一コロニーでの3つの光学切片が示されている。ポドカリキシンは、最頂端側の光学切片に示されるとおり、最頂端マーカーであり、最頂端側の光学切片では、ZO-1が明白でないコロニーの領域でも見ることができる。真ん中の光学切片では、ZO-1が細胞間接触点に敷石状に表れる。最も基底外側の切片では、β-カテニンだけが見える。これらの切片は、ZO-1が細胞間接触の領域に強く濃縮されていることを示す、全zスタックの垂直3D再構築を伴う。最上部から最下部までの垂直距離は左側に示されている。（b）胚盤葉上層スフェロイド（Epi）および腎臓オルガノイド（Kid）共培養におけるOCT4とLTLとの共局在を示す共焦点光学切片。腎臓オルガノイドを拾い、同じiPSC株からのスフェロイドの培養に移し、一晩接着させてから、固定し、免疫蛍光用に加工した。（c）3つの異なるhPSCクローンにおけるNa,K-ATPaseイムノブロットとβ-アクチンローディング対照。未分化hPSCの2D培養および3D培養を同様にプレーティングした。腎臓オルガノイドを手作業で単離し、溶解した。スケールバー、50μm。
【図１４】空洞形成は胚盤葉上層期のPSCに制限される。（a）ナイーブ型hLR5 iPSCからプライム型LD-hLR5への移行を示す時間経過。20培養および3D培養における（b）ナイーブ型およびプライム型hLR5の形態と、対応する（c）ZO-1およびポドカリキシン免疫蛍光。（d）サンドイッチ化48時間後の薄層ゲルにおけるmESCまたはEpiSCの明視野形態。赤い矢印は管腔形成を始めている構造を示す。時点（24、48など）は、サンドイッチ化後の時間数を表し、異なるコロニーを示す。（e）マトリゲル、緩衝コラーゲン、またはそれら二つの1:1混合物（1:1）のいずれかの厚層ゲル中で単一細胞から成長したmESCコロニー。3つの別々のmESC株から同様の結果が得られた。（f）プレーティング120時間後の厚層ゲル中のマウスEpiSC。（g）同じ縮尺のmESCおよびEpiSCにおけるZO-1およびPODXL免疫蛍光。（h）ナイーブ型およびプライム型hLR5 iPSCにおけるOCT4およびSOX2 免疫蛍光。スケールバー、50μm。
【図１５】胚盤葉上層期のhPSCは極性化された管腔形成を起こす。96ウェル（上）または24ウェル単層（下）にプレーティングしてμMのCDC42阻害剤ML141またはビヒクル対照で処理したhPSCにおける（a）明視野像および（b）空洞形成の定量。50μMのカスパーゼ阻害剤ZVAD（-フルオロメチルケトン）またはビヒクル対照で処理したhPSCスフェロイドにおける（c）代表的免疫蛍光、（d）切断型カスパーゼ3（ccasp3）を発現する細胞のパーセンテージ、および（e）空洞数。スケールバー、50μm。エラーバー、s.e.m.。
【図１６】3D培養における腎臓様細管オルガノイドの生成。（a）RNA-Seq実験の概略図および結果としての2D単層および3DスフェロイドにおけるhPSCの階層的クラスタリング。2つの異なる日（-1および-2）の2つの株が示されている（AおよびB）。プロット中の試料は、右側のデンドログラムによってさらに明示されるとおり、最も高い相関に従って配置されている。ヒートマップグリッドは相関の程度を明示し、対応するRA2値で構成される。（b）確率的分化プロトコールの概略図および21日後の2つのhPSC株からの代表的な像。ZO-1＋細胞の定量を右側に示す。（c）元の2D心筋細胞分化プロトコールおよび3Dスフェロイドへの応用の概略図。（d）記載の心筋細胞分化プロトコール（対照）で処理するか、以下の変法（左から）:インスリンを含む827サプリメントの使用、IWP2処理なし、サンドイッチ化なし、CHIR処理後にサンドイッチ化、IWP2処理後にサンドイッチ化で処理した、同様にプレーティングされたhPSCスフェロイドを表す22日目の構造。（e）表示の変更を加えて、RPMI中のCHIRで処理した、同様にプレーティングされた培養を表す22日目の構造。（f）同様にプレーティングし、異なる用量のCHIRで処理した、3D培養において得られる24ウェルあたりの拍動クラスター。エラーバー、s.e.m.（n≧3回の別々の実験）。スケールバー、20μm（b）または100μm（d〜e）。
【図１７】腎臓オルガノイド分化の定量。（a）代表的オルガノイドにおけるネフロン前駆体マーカー発現。（b）集団のパーセンテージとしての腎臓オルガノイド細胞におけるLTL結合のフローサイトメトリー分析。同様にプレーティングされた腎臓オルガノイドのウェルを、LTLと共に、または補償対照（comp）としてLTLなしで、インキュベートした。次に細胞を解離し、フローサイトメトリーに付した。（c）FACSでLTL＋であった全細胞のパーセンテージ。（d）検出可能な管CUBNを伴うLTL＋オルガノイドのパーセンテージ。（e）CUBNを共発現したLTL＋管長の分率。エラーバー、s.e.m.（n≧回の別々の実験および各実験につき約90個のオルガノイドを検査）。
【図１８】腎臓オルガノイド分化の定量。（a）hPSC由来腎臓オルガノイド（左）およびヒト腎臓組織（右）におけるCrumbs3発現。（b）CD31＋およびPODXL＋細胞タイプと関連するLTL＋オルガノイドのパーセンテージ。（c）腸マーカーCDX2と同時染色するLTLが存在しないことを示す、オルガノイド培養における時間経過（各段に培養日数を示す）。（d）これらの培養における腎臓（LTL＋）オルガノイドに対する神経（TUJ1＋）クラスターの平均比。（e）神経系クラスターを低倍率で示す広視野低解像度像。エラーバー、s.e.m.（n≧3回の別々の実験および各実験につき約30個のオルガノイドを検査）。
【図１９】hPSCの腎臓細管オルガノイドへの分化の時間経過。多能性（OCT4）、原条（BRY）、中間中胚葉（PAX2）、ネフロン前駆体（PAX2、SIX2、LHX1、WT1）、およびポドサイト（WT1）に関するステージ特異的発生マーカーの逐次的発現の（a〜b）免疫蛍光または（b）定量RT-PCRの時間経過。d2は、サンドイッチ化後2日目で、CHIR処理直前の、胚盤葉上層スフェロイドを表す。（c）SIX2およびZO-1または（d）PODXLおよびWT1と同時染色するLTLを示す、オルガノイド培養における時間経過（各段に培養日数を示す）。（e）腎臓分化のための公表された20プロトコールを使って得た細管オルガノイドにおけるマーカー発現を、本明細書記載のプロトコールを使って3Dで生産された細管オルガノイドと比較したもの。細胞を同様にプレーティングし、分化上の同じ日に、免疫蛍光のために同時に加工した。（f）ESCと比較したiPSCにおける細管オルガノイド形成。スケールバー、50μm（a）または100μm（c〜e）。エラーバー、s.e.m.（n＝3）。
【図２０】胚盤葉上層スフェロイドはKIM-1を発現しない。（a）シスプラチンおよびゲンタマイシンのタイトレーションで処理した胚盤葉上層スフェロイドにおける、生細胞の位相差、またはKIM-1およびNANOG免疫蛍光。腎臓オルガノイドにおいてKIM-1を誘導するのに十分な濃度である約5mMのゲンタマイシン用量において、KIM-1発現は観察されない。スケールバー、50μm。
【図２１】インビボでの腎臓系譜の生成。（a）新生児期に細管オルガノイドからの細胞を移植して4週間成長させた腎臓の共焦点切片。ヒトPODXL抗体はマウスポドカリキシンとは反応しない。スケールバー、50μm。
【図２２】RDはLRP2を発現しない細管セグメントに蓄積する。（a）RD蓄積後（0時間）、EDTA処理後、およびRD再蓄積後の細管を示す時間経過。洗浄直後は気泡が見える。（b）左:固定してLRP2免疫蛍光用に加工した同じオルガノイド。蛍光強度を定量するために、RDを含有する細管セグメントに垂直（緑色の点線）またはRDを含有しない細管セグメントに垂直（オレンジ色の点線）に、ライン走査を行った。右:RDを含有する細管領域（上）またはRDを含有しない細管領域（下）を通るライン走査におけるRDおよびLRP2の平均蛍光強度と黒色のエラーバー（1条件あたりn＝14個の細管）。スケールバー、100JJm。エラーバー、s.e.m.。
【図２３】未分化hPSCにおけるポドカリキシンおよびTRA-1-60/81の特徴づけ。（a）hPSC単層（2D）およびhPSCスフェロイド（3D）におけるポドカリキシンイムノブロット。（b）TRA-1-60およびTRA-1-81（複数バンド＞250kDa）とβ-アクチンローディング対照とを示すイムノブロット。（c）野生型hPSCまたはPODXL-/- hPSCの3〜4個のクローンから平均した、β-アクチンに対して正規化されたバンド強度の定量。（d〜e）代表的な野生型クローンおよびノックアウトクローンにおけるマーカー免疫蛍光。スケールバー、50μm。エラーバー、s.e.m.。
【図２４】ポドカリキシンはhPSCタイトジャンクション組織化にとって必要でない。（a）2D培養および3D培養におけるCRISPR!Cas9クローンのZO-1、ポドカリキシン、およびNANOG免疫蛍光像。PODXL-/- hPSC 3D凝集体中に小さな管腔様構造が観察される（白い破線）。（b）RDおよびLYと共に4時間にわたってインキュベートした後の野生型またはPODXL-/-スフェロイドの代表的画像（左）および対応する定量（右）。2つ前後のhESC株からプールされた25の野生型またはPODXL-/-スフェロイドを表す外側から内側へのライン走査（画像中の縁取りされた白い長方形）を平均し、プロットした。（c）PODXL（pod）、OCT4（oct）、またはスクランブル対照配列（scr）に対するsiRNAをトランスフェクトしたhPSCからのタンパク質溶解物中のPODXL、OCT4、およびローディング対照（~ACT）に関するイムノブロット（左）および対応するバンド定量（右）。hPSC溶解物からのイムノブロット強度を個々のローディング対照に対して正規化し、平均した（n＝2）。これらのsiRNAをトランスフェクトして単層（2D）条件下またはサンドイッチ（3D）条件下で培養したhPSCの（d）免疫蛍光像および（e）ZO-1を発現するコロニー表面積。（f）明視野管腔を持つ空洞を形成するコロニーのパーセンテージ。（g）siRNAに付したhPSCにおけるZO-1とβ-アクチンローディング対照に関するイムノブロット。（h）これらの培養における代表的NANOG免疫蛍光。画像は同じ縮尺である。（i）サンドイッチ化の時点から8μg/ml硫酸プロタミン（PS）で処理したhPSC、サンドイッチ化の翌日（PS d2）、または未処理対照の明視野像（左）および定量（右）。（j）PSで処理したhPSCにおけるPODXL局在。スケールバー、50μm。
【図２５】hPSCは3D培養において空洞形成スフェロイドを形成する。（a）スフェロイドからオルガノイドへの培養のプロトコールの概略図。（b）サンドイッチ（3D）培養または単層（2D）培養におけるESCの位相差像。連日が示されており、d0はサンドイッチ化直前の時点を示している。（c）空洞を持つ代表的スフェロイドでのPODXL、ZO-1およびβCAT免疫蛍光を示す共焦点光学切片。最上部から最下部までの垂直距離を左側に示す。（d）解離（色付き枠）し、継代培養（同じ色の矢印）した、3D培養におけるhPSCの代表的明視野像。破線の矢印は3D条件における連続継代培養を表す。下段は、各代からの解離されたスフェロイドから、2D培養にプレーティングした細胞を示す。（e）色素上皮（外胚葉）、軟骨（中胚葉）および腺上皮（内胚葉）を示す、hPSC連続3D継代培養p3、p6およびp9から生成した奇形腫のヘマトキシリンおよびエオシン染色切片。（f）プレーティング72時間後の2D培養および3D培養における細胞数（各時点での二重計数の平均、または最後のカラムに示す5時点すべてのAVG）。（g）p3およびp7の連続サンドイッチ培養hPSCにおけるOCT4および性決定領域Yボックス2（SOX2）または腫瘍拒絶抗原1-60（TRA-1-60）およびNANOGの局在を示す代表的免疫蛍光像。スケールバー、100μm。エラーバー、s.e.m.。
【図２６】細管オルガノイドは腎臓の発生およびアーキテクチャーを再現する。（a）細管オルガノイドへのスフェロイド分化の位相差像。赤い矢じりは上皮を強調している。細管オルガノイドにおけるLTLと（b）ネフロン前駆体マーカーSine oculisホメオボックスホモログ2（SIX2）、Lin11-Isl1-Mec3（LIM）ホメオボックス1（LHX1）、ペアードボックス遺伝子2（PAX2）、ならびに（c）近位尿細管マーカーである低密度リポタンパク質関連タンパク質2/メガリンおよびキュビリンを示す共焦点光学切片。（d）代表的細管の電子顕微鏡像。色付き枠内を順次拡大したもので、頂端微絨毛（矢じり）およびタイトジャンクション（矢印）が強調されている。（e）E-カドヘリン（ECAD）＋からLTL＋を経てPODXL＋オルガノイドセグメントへの細管の解剖学的進行を示す広視野像。（f）交錯した細管と周辺部のPODXL＋凝集体を持つオルガノイドの低倍率像（左）およびオルガノイドポドサイト様細胞におけるシナプトポジン（SYNPO）とウィルムス腫瘍タンパク質（WT1）の共局在を示す高倍率共焦点光学切片（右）。（g）hESCおよびiPSCに由来する細管オルガノイドにおけるCD31とヴォン・ヴィレブランド因子（vWF、左）またはネフロンマーカー（右）との共局在を示す広視野免疫蛍光。白い矢じりは、細管コンパートメント、ポドサイト様コンパートメントおよび内皮コンパートメント間の相互作用を示す。白い破線の輪郭は代表的管端を強調している。画像は、1つのhESC株および異なる患者からの3つのiPSC株の代表である。（h）hESCおよびiPSCの培養における単位表面積あたりの形成された細管オルガノイドの数（左）ならびにオルガノイド内のCD31＋およびPODXL＋細胞タイプに関連するこれらLTL＋オルガノイドのパーセント（右）。（i）発生中のマウス腎臓皮質（m）内部での3週間の成長後のLTL反応性を持つオルガノイド由来ヒト細管（H）の共焦点像。スケールバー、100μm。エラーバー、s.e.m（n≧3回の実験）。
【図２７】細管オルガノイドは腎臓の腎毒性研究のための微小生理学モデルを創出する。KIM-1抗体AKG7と（a）LTLまたは（b）第2のKIM-1抗体（KIM1ab2）との共局在。（c）ビヒクル処理対照と比較した、50μMシスプラチンまたは5mMゲンタマイシンによる処理後にKIM-1を発現するオルガノイドの定量（n=3/条件、＞50オルガノイド/実験）（d）シスプラチンおよびゲンタマイシンのタイトレーションで処理した胚盤葉上層スフェロイドにおける生細胞の位相差またはKIM-1およびNANOG免疫蛍光。腎臓オルガノイドにおけるKIM-1アップレギュレーションを誘導するのに十分な濃度である5mMゲンタマイシンを含むどの用量でも、KIM-1発現は観察されない。シスプラチンは＞1μMの濃度でスフェロイドに対して毒性であった。（e）培養中の細管の位相差時間経過。120日の培養後（d120）に、細管を固定し、LTLに関して染色した。（f）腎臓オルガノイドを示す96ウェルプレートのウェル全体。スケールバー、50μm。エラーバー、s.e.m.。
【図２８】胚盤葉上層スフェロイドと腎臓オルガノイド細管とにおける蛍光カーゴの差異的蓄積。（a）実験概略図ならびにルシファーイエロー（LY）およびローダミンコンジュゲートデキストラン（RD）と共にインキュベートしたhPSCスフェロイドを示す共焦点タイムラプス像。（b）実験概略図およびRDのマイクロインジェクション後のhPSCスフェロイド空洞の広視野時間経過。自己蛍光は検出されない（緑色蛍光タンパク質チャンネル）。（c）洗い流し直後の、4時間にわたってフルオレセインメトトレキサートで処理したhPSCスフェロイド。（d）4時間にわたってLYまたはRD分子状色素と共にインキュベートした後、色素なしで培地を置き換えた（洗い流し）、hPSCスフェロイドの時間経過。（e）4時間にわたってRDおよびLYと共にインキュベートし（パルス）、次に、色素を含まない新鮮培地中でのインキュベーション（チェイス）、固定およびLTLとの共局在を行った、細管オルガノイドの代表的時間経過。（f、g）2μMラトランクリンBありまたはなしでの、RDを蓄積した細管オルガノイドの定量（n=3）。（h）洗い流しの1時間後および18時間後の、2つの代表的生オルガノイドにおける、フルオレセインメトトレキサートおよびRDの分布。スケールバー、50μm（a〜d）または100μm（e〜h）。エラーバー、s.e.m.。
【図２９】ポドカリキシンは胚盤葉上層スフェロイドにおける管腔形成を促進する。（a）CRISPR/Cas9非変異体野生型クローン（WT）またはスクランブル（scr）もしくはポドカリキシン（pod）siRNAノックダウンに付した細胞と比較した、2つの代表的PODXL-/- hPSC変異体クローン（m1およびm2）におけるポドカリキシンタンパク質に関するイムノブロット。（b）サンドイッチ培養親ESCの明視野像を2つの変異体または2つのWT CRISPR/Cas9クローンと比較した。（c）総コロニー数のパーセンテージとしての、空洞形成スフェロイド。WT細胞株または変異体細胞株のプールからのデータを平均することで、群平均（AVG、n≧9）およびP値を決定した。（d）ナイーブ型およびプライム型hLR5 hPSCまたは（e）mESCおよびEpiSCにおける、ポドカリキシンおよびZO-1免疫蛍光。（f）無修飾（WT）コロニーまたはPODXL-/-コロニーにおけるZO-1およびβCATの局在を示す未分化hPSCの共焦点z切片。（g）未分化WTまたはPODXL-/-クローンにおける線維状アクチン（f-アクチン）およびオクルディン（OCLN）免疫蛍光。（h）WTまたはPODXL-/-単層における平均TEER測定値（n≧3）。スケールバー、50μmまたは（f、g）20μm。エラーバー、s.e.m.。
【図３０】hPSC由来PODXL-/-ポドサイト様細胞では接着装置複合体が破壊される。（a）成体ヒト腎臓の共焦点光学切片。ポドカリキシンは、ポドサイトおよび尿細管周囲毛細血管では発現するが、細管には存在しない（白い点線）。Auto、自己蛍光。（b）hPSC由来腎臓オルガノイド（共焦点赤色チャンネル）およびヒト腎臓組織（右端の図、免疫組織化学）におけるCrumbs3発現。hPSC由来ポドサイト様細胞クラスターにおける、ZO-1と（c）ポドカリキシンまたは（d）βCATとの分布を示す共焦点光学切片。矢じりはポドサイト様細胞間の接着装置複合体の軌道を強調している。（e）細管オルガノイドにおける野生型またはPODXL-/-ポドサイト様細胞クラスターの共焦点切片。（f）これらの細胞における隣接ポドサイト様細胞核間の間隙幅（2回の実験からプールされたn≧100個の間隙）。スケールバー、50μm。エラーバー、s.e.m.。
【図３１】PKD hPSCは系譜特異的嚢胞形成をモデル化する。同質遺伝子型対照と比較した、（a）CRISPR生成PKD1-/- hPSCにおける完全長ポリシスチン-1（PC1）または（b）PKD2-/- hPSCにおけるポリシスチン-2（PC2）の低減を示すイムノブロット。比較のためにPKD2ノックダウンが示されている。（c）代表的PKDノックアウトhPSCおよび対照における胚盤葉上層スフェロイドの形態。（d）PKD2腎臓オルガノイドにおける培養58日目の代表的嚢胞。（e）全実験（n＞10）の平均としての、PKDノックアウトオルガノイドおよび同質遺伝子型WT対照における嚢胞形成率の定量、または個々の実験の散布図。嚢胞におけるLTL反応性を示す（f）広視野落射蛍光像および（g）共焦点光学切片。代表的z切片は嚢胞の中空中心部および関連細管オルガノイド（矢印）を示している。赤枠内の拡大図が示されている。スケールバー、100μm。エラーバー、s.e.m.。*P＜0.01。
【図３２】スフェロイドは単層hPSCに似ている。（a）代表的hPSC単層コロニーでのポドカリキシン、ZO-1、およびβ-カテニン免疫蛍光を示す共焦点zスタック。頂端側から基底側へと、単一コロニーでの3つの光学切片が示されている。ポドカリキシンは、最頂端側の光学切片に示されるとおり、最頂端マーカーであり、最頂端側の光学切片では、ZO-1が明白でないコロニーの領域でも見ることができる。真ん中の光学切片では、ZO-1が細胞間接触点に敷石状に表れる。最も基底外側の切片では、β-カテニンだけが見える。これらの切片は、ZO-1が細胞間接触の領域に強く濃縮されていることを示す、全zスタックの垂直3D再構築を伴う。最上部から最下部までの垂直距離を左側に示す。（b）RNA-Seq実験の概略図および結果としての2D単層および3DスフェロイドにおけるhPSCの階層的クラスタリング。2つの異なる日（-1および-2）の2つの株が示されている（AおよびB）。プロット中の試料は、右側のデンドログラムによってさらに明示されるとおり、最も高い相関に従って配置されている。ヒートマップグリッドは相関の程度を明示し、対応するRA2値で構成される。デンドログラム中の色付き枠は概略図中の分類と一致しているスケールバー、50μm。
【図３３】空洞形成は胚盤葉上層期に制限される。（a）ナイーブ型hLR5 iPSCからプライム型LO-hLR5への移行を示す時間経過。（b）2D培養および3D培養におけるナイーブ型およびプライム型hLR5の形態。（c）ナイーブ型およびプライム型hLR5 iPSCにおけるOCT4およびSOX2免疫蛍光。（d）サンドイッチ化48時間後の薄層ゲルにおけるmESC（株J1、R1、およびv6）またはEpiSCの明視野形態。赤い矢印は管腔形成を始めている構造を示す。時点（24、48など）は、サンドイッチ化後の時間数を表し、異なるコロニーを示す。（e）100％マトリゲル、100％緩衝コラーゲン、またはそれら二つの1:1混合物（1:1）のいずれかの厚層ゲル中で単一細胞から成長したmESCコロニー。3つの別々のmESC株から同様の結果が得られた。（f）プレーティングの120時間後の厚層ゲルにおけるマウスEpiSC。スケールバー、50μm。
【図３４】3D培養における腎臓様細管オルガノイドの生成。（a）元の2D心筋細胞分化プロトコールおよび3Dスフェロイドへの応用の概略図。（b）2D培養および3D培養において生産された拍動心筋細胞および細管オルガノイドの定量。（c）記載の心筋細胞分化プロトコールに以下の変更（左から）:元のプロトコール（対照）、インスリンを含む827サプリメントの使用、IWP2処理なし、サンドイッチ化なし、CHIR処理後にサンドイッチ化、IWP2処理後にサンドイッチ化を加えて処理した、同様にプレーティングされたhPSCスフェロイドを表す22日目の構造。（d）表示の変更を加えて、RPMI中のCHIRで処理した、同様にプレーティングされた培養を表す22日目の構造。（e）胚盤葉上層スフェロイド（Epi）と腎臓オルガノイド（Kid）との共培養における、OCT4およびLTLの共局在を示す共焦点光学切片。腎臓オルガノイドを拾い、同じiPSC株からのスフェロイドの培養に移し、一晩接着させてから、固定し、免疫蛍光用に加工した。エラーバー、s.e.m.（n≧3回の別々の実験）。スケールバー、100μm。
【図３５】腎臓オルガノイド分化。（a）集団のパーセンテージとしての、腎臓オルガノイド細胞におけるLTL結合のフローサイトメトリー分析。同様にプレーティングされた腎臓オルガノイドのウェルを、LTLと共に、または補償対照（camp）としてLTLなしで、インキュベートした。次に細胞を解離し、フローサイトメトリーに付した。FACSでLTL＋であった全細胞のパーセンテージ（3回の別々の実験からの平均）を示す。（b）腸マーカーCDX2と共染色するLTLが存在しないことを示すオルガノイド培養の時間経過（各段に培養日数を示す）。（c）これらの培養における神経系（TUJ1＋）クラスターおよび腎臓（LTL＋）オルガノイドを示す広視野低解像度像。（d）神経系クラスターと腎臓オルガノイドの比。（e）多能性（OCT4）、原条（BRY）、中間中胚葉（PAX2）、ネフロン前駆体（PAX2、SIX2、LHX1、WT1）、およびポドサイト（WT1）に関するステージ特異的発生マーカーの逐次的発現の免疫蛍光および定量RT-PCR時間経過。d2は、サンドイッチ化後2日目で、CHIR処理直前の、胚盤葉上層スフェロイドを表す。エラーバー、s.e.m.（n≧3回の別々の実験および各実験につき約30オルガノイドを検査）。
【図３６】PODxcl- hPSCの生成および特徴づけ。（a）代表的CRISPR/Cas9ポドカリキシン変異体クローンのクロマトグラム。ピンク色のアスタリスクはgRNA配列の始まりの印である。解釈は、野生型配列に対して整列させた、分離されたアレル（A1およびA2）を示している。（b）TRA-1-60およびTRA-1-81（＞250kDaの複数のバンド）とβ-アクチンローディング対照とを示すイムノブロット。右、3〜4クローンの野生型またはPODXL-1- hPSCから平均した、β-アクチンに対して正規化したバンド強度の定量。（c）外胚葉の色素上皮（p）、中胚葉の軟骨（c）、および内胚葉の腸様上皮（g）を示す、野生型またはPODXL-1- hPSCからの奇形腫。（d）胚盤葉上層スフェロイドコロニーあたりの総面積（≧7回の実験/SOコロニーからプールしたAVG）。（e）2D培養のエスケイピー（WT）およびPODXL-/- hPSCにおける約7日間の成長後の解離細胞数（≧14回の実験からプールしたAVG）。各実験を野生型に対して正規化した。スケールバー、50μm。エラーバー、s.e.m.。
【図３７】ポドカリキシンはhPSCタイトジャンクション組織化にとって必要でない。（a）2D培養および3D培養におけるCRISPR/Cas9クローンのZO-1、ポドカリキシン、およびNANOG免疫蛍光像。PODXL-/- hPSC 3D凝集体中に小さな管腔様構造が観察される（白い破線）。（b）RDおよびLYと共に4時間にわたってインキュベートした後の野生型またはPODXL-/-スフェロイドの代表的画像（左）および対応する定量（右）。≧2つのhESC株からプールした25の野生型またはPODXL-/-スフェロイドを表す外側から内側へのライン走査（画像中の縁取りされた白い長方形）を平均し、プロットした。（c）サンドイッチ化の時点から8μg/ml硫酸プロタミン（PS）で処理したhPSC、サンドイッチ化の翌日（PSd2）、または未処理対照の、明視野像（左）および定量（右）。（d）PSで処理したhPSCにおけるPODXL局在。スケールバー、50μm。
【図３８】PKD1-/-およびPKD2-/- hPSCの生成および特徴づけ。対照および（a）PKD1-/- hPSCまたは（b）PKD2-- hPSCのクロマトグラム（左）および完全長イムノブロット（右）。網掛けはgRNAの3'端の印である。矢印はコーディング配列中の塩基対番号を示す。アレル1（A1）およびアレル2（A2）の解釈を野生型コンセンサス配列（WT）と比較している。多量体型PC2をPC2mt-と略記する。（c）外胚葉の色素上皮（p）、中胚葉の軟骨（c）、および内胚葉の腸様上皮（g）を示す奇形腫。スケールバー、100μm。（d）スフェロイド全体に対する相対的管腔面積の定量ならびに（e）WTおよび PKD hPSCにおけるオルガノイド分化効率（n、およそ5回の実験）。p＜0.01。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
本明細書において言及する参考文献はすべて、参照によりその全体が、あたかも完全に記載されたかのように、本明細書に組み入れられる。別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。Allen et al., Remington: The Science and Practice of Pharmacy 22nd ed., Pharmaceutical Press（September 15, 2012）、Hornyak et al., Introduction to Nanoscience and Nanotechnology, CRC Press（2008）、Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed., revised ed., J. Wiley & Sons（New York, NY 2006）、Smith, March's Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 7th ed., J. Wiley & Sons（New York, NY 2013）、Singleton, Dictionary of DNA and Genome Technology 3rd ed., Wiley-Blackwell（November 28, 2012）、ならびにGreen and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press（Cold Spring Harbor, NY 2012）は、本願において使用する用語の多くについて、一般的な指針を当業者に与える。抗体を調製する方法については、Greenfield, Antibodies A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press（Cold Spring Harbor NY, 2013）、Koehler and Milstein, Derivation of specific Antibodies-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion, Eur. J. Immunol. 1976 Jul, 6（7）:511-9、Queen and Selick, Humanized immunoglobulins、米国特許第5,585,089号（1996 Dec）、ならびにRiechmann et al., Reshaping human antibodies for therapy, Nature 1988 Mar 24, 332（6162）:323-7を参照されたい。
【００１３】
当業者には、本発明の実施に使用することのできる本明細書記載の方法および材料と類似するまたは等価な、多くの方法および材料がわかるであろう。事実、本発明は、決して、記載の方法および材料に限定されない。本発明の目的のために、次の用語を以下に定義する。
【００１４】
本明細書の記載において使用される場合、また下記特許請求の範囲を通じて使用される場合、「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」の意味は、文脈上そうでないことが明らかである場合を除き、複数への言及を包含する。また、本明細書の記載において使用される場合、「中に（in）」の意味は、文脈上そうでないことが明らかである場合を除き、「中に（in）」および「上に（on）」を包含する。
【００１５】
記載のとおり、ヒト多能性幹細胞（hPSC）には、微小生理学実験モデルおよび再生治療薬として、二重の価値がある。hPSCは上皮細胞であるが、hPSCおよび子孫上皮が系譜特異的機能をどの程度まで再構成することができるかは、依然としてほとんどわかっていない。本明細書において、本発明者らは、三次元培養中のhPSCおよびそれらの分化子孫が、組織特異的な上皮の形態形成、生理機能、および疾患を、機能的に再現できることを示す。
【００１６】
未分化hPSCは、胚の胚盤葉上層をモデル化する、中空の羊膜腔様空洞を取り囲むスフェロイドコロニーを形成する。スフェロイドは、二工程プロトコールにより、近位尿細管、ポドサイトおよび内皮細胞を含む腎臓ネフロンの発生的および構造的特徴を持つ曲細管オルガノイドに分化する。腎臓細管と胚盤葉上層の空洞は、差異的に、蛍光カーゴを蓄積し、腎毒性化学傷害に応答する。
【００１７】
ポドカリキシンまたは多発性嚢胞腎遺伝子のCRISPR/Cas9ノックアウトは、胚盤葉上層スフェロイドにおける効果とは異なる、腎臓オルガノイドの疾患関連組織特異的表現型を生じる。本発明者らの発見は、ヒト微小生理学、疾患モデリング、および再生医学への応用のための再現性のある多用途な三次元フレームワークを確立する。
【００１８】
腎臓は再生医学の分野にとって大変興味深い臓器である。腎臓上皮は高度に専門化しており、特定細胞タイプの機能障害はさまざまな臨床障害をもたらしうる。例えば多発性嚢胞腎（PKD）は細管上皮細胞からの嚢状拡張を特徴とし、一方、糸球体症は、血漿が細管へと濾過されるポドサイト上皮の傷害を伴う。hPSCを使って腎臓疾患をモデル化するための原理証明において、本発明者らは、PKD患者からの未分化iPSCおよび子孫上皮細胞における線毛表現型を記載した。最近、hPSCは、腎臓前駆細胞、近位尿細管およびポドサイトに典型的なマーカーを発現する細管上皮に、インビトロで分化するように方向付けされている。
【００１９】
しかし、これらの研究において使用されるマーカーは、腎臓に限定されるものではなく、hPSC由来腎臓細胞における疾患関連表現型を証明した研究は今のところまだない。それゆえに、これらの上皮をより決定的に同定し、それらの橋渡し的応用を進めるために、hPSC由来腎臓細胞における腎臓特異的な形態形成、微小生理学、および傷害/疾患状態の再構成が重要である。
【００２０】
ここで本発明者らは、2つの異なる上皮構造、すなわちhPSCの単一の連続培養において逐次的に生じる胚盤葉上層スフェロイドおよび腎臓細管オルガノイドを再構成するための、接着、3D成長条件を確立する。本発明者らは、小分子処理とゲノム編集したhPSCとを使って、これらの構造が組織特異的上皮の輸送、毒性応答、および疾患表現型を再構成する能力を有することを証明する。本発明者らの結果は、ヒト微小生理学、病態生理学、および再生医学の機能研究に関連するhPSCおよび子孫上皮の一般的特徴と組織特異的特徴との両方を明らかにする。
【００２１】
本明細書には、ある量のヒト多能性幹細胞（hPSC）を用意する工程、胚盤葉上層スフェロイドを形成させるために培養培地中でhPSCを培養する工程、および胚盤葉上層スフェロイドをオルガノイドに分化させる能力を有する1つまたは複数の作用物質を含む分化培地中で、胚盤葉上層スフェロイドを分化させる工程を含む、ヒトオルガノイドを生成させる方法が記載される。さまざまな態様において、hPSCは、胚盤葉上層スフェロイドを形成させる前に、白血病抑制因子（LIF）およびドキシサイクリンの非存在下で培養される。さまざまな態様において、hPSCは、胚盤葉上層スフェロイドを形成させる前に、Y27632の存在下で培養される。さまざまな態様において、培養培地はマトリゲルを含む。さまざまな態様において、培養培地はコラーゲンIを含む。さまざまな態様において、hPSCを培養する工程は、ある表面に培養培地の第1層を堆積させることと、堆積させた培養培地上にhPSCを置くことと、hPSCの上に培養培地の第2層を加えることとを含む。さまざまな態様において、培養培地中でhPSCを培養する工程は、約1日、約2日、またはそれ以上の日数を含む。さまざまな態様において、前記1つまたは複数の作用物質はCHIR99021を含む。さまざまな態様において、前記1つまたは複数の作用物質はB27を含む。さまざまな態様において、胚盤葉上層スフェロイドを分化させる工程は、約7日、約8日、約9日、約10日、約11日、約12日、もしくは約13日、またはそれ以上の日数を含む。さまざまな態様において、胚盤葉上層スフェロイドは、ポドカリキシン（PODXL）、閉鎖帯（ZO-1）、およびβ-カテニンのうちの1つまたは複数を発現する。さまざまな態様において、胚盤葉上層スフェロイドには空洞が形成される。さまざまな態様において、オルガノイドは細管状である。さまざまな態様において、オルガノイドは腎臓オルガノイドである。さまざまな態様において、オルガノイドは、ポドカリキシン（PODXL）、閉鎖帯（ZO-1）、およびシカクマメレクチン（LTL）のうちの1つまたは複数を発現する。
【００２２】
例えばhPSCは、約3％成長因子低減（Reduced Growth Factor）GeiTrex上で、少なくとも1代は、mTeSR1や、hLR5 iPSCの場合であればhESC条件培地（CM）＋白血病抑制因子（LIF）＋doxなどの培地において、フィーダーフリーで維持することができる。さまざまな態様において、hPSCは、LIFおよびドキシサイクリンを除去することによって、プライミングされる。さまざまな態様において、LIFおよびドキシサイクリンの除去は、FGF2による置換を含む。さまざまな態様において、細胞は培養表面および培地体積に対して特別な密度でプレーティングされる。例えば、10μM Rhoキナーゼ阻害剤Y27632を補足した培地中、GeiTrexがプレコートされた24ウェルプレートまたは4ウェルチャンバースライドのウェル1つにつき、約30〜60,000個の細胞。別の一例では、96ウェルプレートの約5〜20,000を、75ulの緩衝コラーゲンI（10mM HEPESおよび1×DMEMを含有するもの）、成長因子低減マトリゲル（BD Biosciences）、またはそれら2つの1:1混合物のいずれかに再懸濁し、37度で45分にわたってインキュベートしてから、100ulの培地＋Y27632を重層した。
【００２３】
例えば、培養培地の「サンドイッチ」層における3D培養の48時間後に、hPSC胚盤葉上層スフェロイドを、CHIR990021を約12μM CHIRの濃度で含む分化培地において、例えば約36時間にわたって分化させる。腎臓細胞分化の別の一例では、分化培地をRB（Advanced RPMI＋Glutamax＋B27サプリメント）に変え、その後は3日ごとに置き換える。別の一態様では、胚盤葉上層スフェロイドの分化を、例えば濃度が約12μM CHIRであるCHIR990021およびインスリンを除いたRB（RBNI）である培地を含む分化培地で約24時間、RBNIで48時間、5μM IWP2を加えて48時間、RBNIで48時間、その後は3日ごとにRBで行う。
【００２４】
本明細書には、ある量のヒト多能性幹細胞（hPSC）を用意する工程、胚盤葉上層スフェロイドを形成させるために培養培地中でhPSCを培養する工程、および胚盤葉上層スフェロイドをオルガノイドに分化させる能力を有する1つまたは複数の作用物質を含む分化培地中で、胚盤葉上層スフェロイドを分化させる工程を含むヒトオルガノイドを生成させる方法によって作られる、ある量のオルガノイドも記載される。さまざまな態様において、hPSCは、胚盤葉上層スフェロイドを形成させる前に、白血病抑制因子（LIF）およびドキシサイクリンの非存在下で培養される。さまざまな態様において、hPSCは、胚盤葉上層スフェロイドを形成させる前に、Y27632の存在下で培養される。さまざまな態様において、培養培地はマトリゲルを含む。さまざまな態様において、培養培地はコラーゲンIを含む。さまざまな態様において、hPSCを培養する工程は、ある表面に培養培地の第1層を堆積させることと、堆積させた培養培地上にhPSCを置くことと、hPSCの上に培養培地の第2層を加えることとを含む。さまざまな態様において、培養培地中でhPSCを培養する工程は、約1日、約2日、またはそれ以上の日数を含む。さまざまな態様において、前記1つまたは複数の作用物質はCHIR99021を含む。さまざまな態様において、前記1つまたは複数の作用物質はB27を含む。さまざまな態様において、胚盤葉上層スフェロイドを分化させる工程は、約7日、約8日、約9日、約10日、約11日、約12日、もしくは約13日、またはそれ以上の日数を含む。さまざまな態様において、胚盤葉上層スフェロイドは、ポドカリキシン（PODXL）、閉鎖帯（ZO-1）、およびβ-カテニンのうちの1つまたは複数を発現する。さまざまな態様において、胚盤葉上層スフェロイドには空洞が形成される。さまざまな態様において、オルガノイドは細管状である。さまざまな態様において、オルガノイドは腎臓オルガノイドである。さまざまな態様において、オルガノイドは、ポドカリキシン（PODXL）、閉鎖帯（ZO-1）、およびシカクマメレクチン（LTL）のうちの1つまたは複数を発現する。さまざまな態様において、hPSCはCRISPRなどのゲノム編集を使って遺伝子修飾される。
【００２５】
また、本明細書には、ある量の胚盤葉上層スフェロイドを用意する工程、および胚盤葉上層スフェロイドをオルガノイドに分化させる能力を有する1つまたは複数の作用物質を含む分化培地中で、胚盤葉上層スフェロイドを分化させる工程を含む、細管オルガノイドを生成させる方法も記載される。さまざまな態様において、前記1つまたは複数の作用物質はCHIR99021を含む。さまざまな態様において、前記1つまたは複数の作用物質はB27を含む。さまざまな態様において、胚盤葉上層スフェロイドを分化させる工程は、約7日、約8日、約9日、約10日、約11日、約12日、もしくは約13日、またはそれ以上の日数を含む。さまざまな態様において、細管オルガノイドは腎臓オルガノイドである。さまざまな態様において、腎臓オルガノイドは、ポドカリキシン（PODXL）、閉鎖帯（ZO-1）、およびシカクマメレクチン（LTL）のうちの1つまたは複数を発現する。さまざまな態様において、胚盤葉上層スフェロイドを腎臓オルガノイドに分化させる工程は、RPMIおよびB27を含む第2分化培地中でさらに培養することを含む。さまざまな態様において、胚盤葉上層スフェロイドを腎臓オルガノイドに分化させる工程は、CHIR99021、RPMIおよびB27を含む第2分化培地中で約24時間にわたってさらに培養することと、CHIR99021、RPMI、B27およびインスリンを含む第3分化培地で第2分化培地を置き換え、かつ約48時間にわたってさらに培養することと、IWP2を加え、かつ約48時間にわたって培養を継続することと、第3分化培地を第2分化培地でさらに置き換えることとを含む。
【００２６】
本明細書には、ある量の細管オルガノイドを用意する工程、1つまたは複数の化合物を細管オルガノイドに加える工程、細管オルガノイドの表現型または活性の変化を判定する工程、および前記変化を細管オルガノイドに対する前記化合物の効果と相関させる工程であって、それによって、細管オルガノイドに対する効果に関して前記1つまたは複数の化合物をスクリーニングする、工程を含む、細管オルガノイドに対する効果に関して化合物をスクリーニングする方法も記載される。
【００２７】
さまざまな態様において、表現型または活性の変化を判定する工程は、細管オルガノイドにおいて1つまたは複数のマーカーを検出することを含む。さまざまな態様において、前記1つまたは複数のマーカーは腎臓傷害分子（KIM-1）を含む。さまざまな態様において、KIM-1発現の増加は、当該化合物の毒性効果と相関する。さまざまな態様において、細管オルガノイドは腎臓オルガノイドである。
【実施例】
【００２８】
実施例1
3D培養
細胞株には、H9（WA09）、BJ、HDFn、hLR5、hfib2-iPS4、およびhfib2-iPS5（ヒト）、ならびにJ1、R1、およびv6（マウス）を含めた。細胞は、3％成長因子低減GeiTrex（Life Technologies）上で、少なくとも1代は、培地（hPSCにはmTeSR1、mESCにはN2/827サプリメント＋2i in、hLR5 iPSCにはhESC条件培地（CM）＋白血病抑制因子（LIF）＋dox）において、フィーダーフリーで維持し、AccutaseまたはTrypLEを使って解離した。LD-iPSCは、ネイティブ型（native）hLR5 iPSCから、LIFおよびドキシサイクリンを除去し、FGF2で置換することによって誘導した。薄層ゲルサンドイッチコロニーの場合は、10μM Rhoキナーゼ阻害剤Y27632（StemGent）を補足した培地中、GeiTrexがプレコートされた24ウェルプレートまたは4ウェルチャンバースライドのウェル1つにつき、60,000個（プライム型）または30,000個（ネイティブ（native）型）の細胞を、プレーティングした。翌日、培地を、mTeSR1中の1.5％GeiTrex 500μLで置き換えた。24時間後に培地を変えた。厚層ゲル培養の場合は、96ウェルプレートのウェル1つにつき、20,000個（胚盤葉上層期）または6,000個（ナイーブ（narve）型）の細胞を、75ulの緩衝コラーゲンI（10mM HEPESおよび1×DMEMを含有するもの）、成長因子低減マトリゲル（BD Biosciences）、またはそれら2つの1:1混合物のいずれかに再懸濁し、37度で45分にわたってインキュベートしてから、100ulの培地＋Y27632を重層した。薄層ゲルにおける連続継代の場合は、3D培養中の管腔を持つコロニーをプレーティングの72時間後に解離し、6ウェルプレートのウェル1つあたり300,000細胞の密度で再プレーティングし、2D条件または3D条件のいずれかで72時間培養した後、解離、細胞数の計数、および再プレーティングを行った。懸濁培養の場合は、低接着性6ウェルプレートの1つのウェルでmTeSR1培地に20,000個の解離hPSCをプレーティングした。どの細胞についても培地は毎日変えた。
【００２９】
実施例2
細管オルガノイド分化
散在した孤立スフェロイドコロニーを生産するのに十分な60,000〜120,000個のH9 hPSCをプレーティングした。サンドイッチ化の48時間後に、hPSCスフェロイドを12μM CHIRで36時間にわたって処理してから、RB（Advanced RPMI＋Glutamax＋B27サプリメント）に変え、その後は3日ごとに置き換えた。あるいは、2D心筋細胞分化について記載されているように、スフェロイドを、インスリンを除いたRB（RBNI）中、12μM CHIRで24時間、RBNIで48時間、5μM IWP2で48時間、RBNIで48時間、その後は3日ごとにRBで処理した。2D腎臓分化の場合は、細胞を一晩プレーティングしてから、APEL培地（StemCell Technologies）中の8μM CHIRで48〜72時間、APEL培地中の30ng/ml FGF2＋1μg/mlヘパリンで96時間にわたって処理し、次にAPEL培地中で10〜15日にわたって培養した。確率的分化の場合、2D培養中または3D培養中のhPSCを、DMEM＋P/S中の10％ウシ胎児血清（FBS）で処理し、19日にわたって観察した。
【００３０】
免疫蛍光および電子顕微鏡法
3Dアーキテクチャーを保存しつつ固定するために、室温で15分間、等体積の8％パラホルムアルデヒドを培養培地に加えた（最終濃度4％）。固定後に、試料をPBS中で洗浄し、5％ロバ血清（Millipore）/0.3％Triton-X-100/PBS中でブロッキングし、一次抗体と共に3％ウシ血清アルブミン/PBS中で一晩インキュベートし、洗浄し、Alexa-Fiuor二次抗体（Invitrogen）と共にインキュベートし、洗浄し、DAPIで染色するか、Vectashield H-1000にマウントした。一次抗体には、OCT4（sc-5279、Santa Cruz）、NANOG（RCAB0004PF、Cosmobio）、ブラキュリ（sc-17745、Santa Cruz）、TRA-1-60（MAB4360、Millipore）、TRA-1-81（MAB4381、Millipore）、アセチル化o-チューブリン（051M4770、Sigma）、ZO-1（339100、Invitrogen）、ポドカリキシン（AF1658およびAF1556、R&D）、CDX2（-88、Biogenex）、AQP1（AB2219、Millipore）、WT-1（sc-192、Santa Cruz）、LHX1（Developmental Studies Hybridoma Bank）、mPODXL（AF1556、R&D）、hPODXL（AF1658、R&D）、HNA（MAB1281、Millipore）、LTL（FL-1321、Vector Labs）、SYNPO（sc-21537、Santa Cruz）、CD31（555444、BD）、crumbs 3（HPA013835、Sigma）、Na,K-ATPase（ab7671、Abeam）、および切断型カスパーゼ3（MAB835、R&D）を含めた。蛍光像は、ニコン落射蛍光90-1（正立）、Eclipse Ti（倒立）、または共焦点C1顕微鏡を使ってキャプチャした。電子顕微鏡法の場合は、5分間の固定後に構造物をプレートから擦過し、300gで4分間ペレット化し、4％ホルムアルデヒドおよび2％グルタルアルデヒドを含有するカコジル酸緩衝液中にピペッティングすることによって、そのペレットを静かに剥がし、四酸化オスミウムで後固定し、エタノール系列で脱水し、エポキシ樹脂に包埋した。準超薄切片を1mmで切断し、光学顕微鏡検査によって明白な管腔を持つ細管構造を同定するために、トルイジンブルーで染色した。超薄切片（75nm）を切断し、200メッシュ銅グリッドにマウントし、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で対比染色し、JEOL JEM-1010透過型電子顕微鏡で調べた。
【００３１】
実施例3
透過性アッセイ
透過性を試験するために、培地に20mM HEPES＋ルシファーイエローカルボヒドラジドカリウム塩（Invitrogen、38μM）およびローダミン-8イソチオシアネートデキストラン（Sigma、0.5μM）を補足し、共焦点顕微鏡法によって撮像した。マイクロインジェクションの場合は、可視化のために、mTeSR1中の5μMローダミンコンジュゲートデキストラン溶液をフェノールレッド溶液（0.5％、Sigma）で1:1希釈した。Nanoject-2マイクロマニピュレーターでプルドガラスキャピラリーマイクロニードルから2nlをマイクロインジェクションし、広視野落射蛍光により、リアルタイムでモニタリングした。TEERの場合は、希釈マトリゲルがプレコートされた24ウェルトランスウェルプレート（Corning）に、50,000個のhPSCをプレーティングした。細胞が完全にコンフルエントになるまで培地は10日にわたって静かに交換した。TEERはEVOM2デバイス（World Precision Instruments）を使って測定した。
【００３２】
実施例4
KIM-1誘導
24ウェルプレートの、同様にプレーティングされたウェル中のオルガノイドを、一連の濃度のゲンタマイシンおよびシスプラチンで、36〜48時間にわたって処理し、固定し、KIM-1抗体AKG7.9（Bonventre laboratory）または1400（Biogen）による免疫蛍光のために加工した。KIM-1に関する免疫蛍光は、大規模な細管崩壊を誘発しない中等度の準毒性用量で観察された。
【００３３】
実施例5
RNA干渉
プレーティングの16時間後に、抗生物質を含まないmTeSR1中で、PODXL、OCT4、またはスクランブル対照に対するDharmacon Smartpool siRNAを、hPSCにトランスフェクトした。10時間後に、培地を変えて、細胞を2Dで培養するか、3D培養のためにサンドイッチ化した。
【００３４】
実施例6
Cas9/CRISPR変異導入
緑色蛍光タンパク質（GFP）タグ付きCas9（Addgene 44719）およびPODXLの第2エクソン
2018526010.tif 000003
、PKD2の第1エクソン
2018526010.tif 000004
、またはPKD1の第36エクソン
2018526010.tif 000005
を標的とするガイドRNA（Addgene 64711）をコードするコンストラクトをH9 hESCに一過性にトランスフェクトし、GFP発現細胞をフローサイトメトリーソーティングによって単離し、クローン拡大し、両アレル機能喪失型インデルを持つクローンをスクリーニングした。6ウェルプレートのウェル1つにつき約200,000個のソートされたhESCを、hESC条件付けmTeSR1＋Y27632に入れてプレーティングした。翌朝、Y27632なしで培地を置き換え、細胞をクローン拡大し、PODXL gRNA領域をPCRで増幅した。クロマトグラム配列を手作業で分析し、イムノブロットおよび免疫蛍光によって変異を確認した。
【００３５】
実施例7
トランスクリプトームプロファイリング
2Dまたは3DでプレーティングされたhPSCを、RNEasy Mini Kit（Qiagen）を使って、並べて調製した。試料をAgilent BioanalyzerでQCすることで、高品質試料のチェックを行った。次に、TruSeq stranded mRNAライブラリーキット（Illumina）を使って、適格試料を調製した。シーケンシングはIllumina NextSeq500 75×75ペアエンドハイアウトプットランで行った。Tophat2を使って試料をhg19リファレンス配列に整列し、Cuffdiffを使って差異的発現を算出した。
【００３６】
実施例8
RT-PCR
分化時間経過中は、RNeasy Mini Kit（Qiagen）を使って、プレーティング後の2日目、10日目、14日目、および21日目に、RNAを調製した。M-MLV Reverse Transcription System（Promega）を使って、すべての時点からのRNAを並べて逆転写した。定量RT-PCR反応は、eDNA（希釈1:10）、300nMプライマー、およびiQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad）とiQ5 Multi-Color Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad）とを使用し、P-アクチンをハウスキーピング遺伝子として、二連で行った。
【００３７】
実施例9
定量および統計的解析
蛍光強度定量では、1回のイメージングセクションにおいて同じ露出で画像を撮影し、同様に加工した。固定試料より容易に管腔が見分けられる生細胞の位相差像において、空洞形成したコロニー（管腔を持つ楕円体）と平坦なコロニー（非楕円体または管腔を持たないもの）とを手作業でスコア化した。アポトーシスについては、切断型カスパーゼ3発現を手作業でスコア化し、核凝縮によって確認し、広視野落射蛍光像あたりの核の総数によって割った。ZO-1面積については、ZO-1を発現している個々のコロニーまたは小領域を手作業でトレースし、NIS Elements（ニコン）を使って表面積を算出した。各コロニーについて、合計したZO-1発現面積を総表面積のパーセンテージとして表してから、それらを平均した。強度を定量するために、NIS Elementsソフトウェア（ニコン）において、生蛍光値を得るために同じ露出で撮像した無作為に選択した構造物を通って、同じ長さのライン走査を行った。平均したライン走査値をエラーバーと共にプロットした。CHIR誘導分化については、Cell Profiler 2.0を使って低倍率免疫蛍光像中に約6000個の個々の細胞を同定し、蛍光強度を自動的に測定した。統計比較には、不当分散（異分散）である2つの試料について両側I検定を利用した。イムノブロットはImageJ Gel Analyzerを使って定量した。
【００３８】
実施例10
hPSCの連続3D培養における空洞および細管形態形成
未分化hPSCおよびそれらの体細胞子孫からヒト上皮を再構成するために、本発明者らは、まず中空スフェロイドを生産し、次に細管を生産するhPSCのための接着3D培養系を開発した（図1a〜b）。2層の希釈マトリゲル（0.2mg/mL）の間にサンドイッチされた解離未分化hPSCはコンパクトなボール様コロニーを形成し、48時間までに、これらは内部空洞を形成した（図1bおよび図11a〜b）。スフェロイド空洞形成は、コロニー融合事象および回転運動を特徴とする著しく動的なプロセスであり、インキュベーション時間およびコロニーサイズに鋭敏であった（図11a〜e）。類似の希釈ゲル条件下でMOCKスフェロイドには空洞が観察されなかった（図11f）。hPSCは、空洞形成スフェロイドを、無希釈のマトリゲル、マトリゲル:コラーゲン混合物、および懸濁培養でも形成したが、コラーゲン単独では形成しなかった（図12a〜f）。成熟スフェロイドは中空の管腔を取り囲む単層円柱上皮からなり、ポドカリキシンは管腔表面に、閉鎖帯（ZO）-1は頂端細胞間ジャンクションに、そしてβ-カテニンは主に基底外側膜に、極性化されて局在している（図1c〜e）。類似する頂底極性化パターンが未分化hPSCの単層コロニーに観察された（図1fおよび図13a）。同じhPSCから子孫上皮を生成させるために、空洞形成したスフェロイドをグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β阻害剤CHIR99021（CHIR）で36時間にわたって処理した後、既知組成成長培地中でインキュベートした（図1a〜b）。CHIR処理に続いて、スフェロイド細胞は上皮間葉移行（EMT）を起こしてコンフルエントな単層を形成し、それが集まって10日目までにひだ状になり、曲半透明細管オルガノイドへの間葉上皮移行（MET）を開始した（図1a〜b）。細管はシカクマメレクチン（LTL）と強く反応した。これは腎臓近位尿細管などの一定の成体上皮の性質である。一方、並べて調べた胚盤葉上層スフェロイドはLTLに対してごくわずかなアフィニティーしか有しなかった（図1gおよび図13b）。広く発現する上皮マーカーであるNa,KATPaseは、胚盤葉上層スフェロイドにも細管オルガノイドにも発現した（図13c）。共焦点顕微鏡法により、LTL＋細管は管腔ZO-1および基底外側β-カテニンを敷石状に発現し、かすかな頂端ポドカリキシンを伴うことが明らかになった（図1g〜h）。細管に隣接して、第2のZO-1＋上皮細胞集団がクラスター化した凝集体を形成し、それはポドカリキシンを強く発現したが、LTLには結合しなかった（図1g）。これらLTL陰性凝集体の共焦点分析により、明白な管腔形成を伴わない、丸い細胞形態および細胞層間のジッパー様構造におけるZO-1とβ-カテニンの強い共局在が明らかになった（図1i）。このように、この方法は、分化中のhPSCの単一接着培養内での、相異なる上皮細胞集団および組織化された構造の生成を可能にした。
【００３９】
実施例11
空洞形成スフェロイドは未分化胚盤葉上層に相当する
本発明者らは、hPSCスフェロイドを、未分化hPSCの重要な機能的特徴である多能性および自己複製能について試験した。空洞形成スフェロイドを繰り返し解離し、再プレーティングし、サンドイッチ培養した（図2a）。9回の連続継代において、解離した空洞裏打ち細胞は、サンドイッチ培養後に新しい空洞形成スフェロイドを生成するか、あるいは単層条件への最終形態時に平坦なコロニーを生成した（図2b）。3D培養への/からの長い連続継代後でさえ、免疫不全マウスに移植された空洞裏打ち細胞は、3つすべての胚性胚葉に由来する奇形腫組織を効率よく生産した（図2c）。2D培養および3D培養は類似する成長速度を呈し、多能性マーカーは、オクタマー結合転写因子4（OCT4）、性決定領域Yボックス2（SOX2）、NANOG、およびTRA-1-60を含めて、連続サンドイッチ培養細胞において、同一のパターンで発現し続けた（図2d〜f）。このように、スフェロイドは分化したサブタイプではなく未分化の自己複製多能性細胞に相当した。
【００４０】
本発明者らは、hPSCスフェロイドが、ヒトおよび霊長類の着床期胚において初期羊膜腔を形成する胚盤葉上層上皮塊をモデル化するという仮説を立てた。逆に、より原始的なICMに似るhPSCは空洞を形成しないと予測した。事実、マウス（m）ESCと同様にコンパクトなICM様コロニーを形成するナイーブ型hLR5 iPSCは、3D培養において5日間の成長後でも管腔を形成せず、低いポドカリキシン発現量および不連続なZO-1局在と相関した（図2gおよび図14a〜c）。対照的に、胚盤葉上層期hPSCに似るプライム型hLR5由来（LO-）iPSCは、サンドイッチ培養において効率よく空洞を形成し、ポドカリキシンおよびZO-1を極性化された連続的局在パターンで強く発現した（図2gおよび図14a〜c）。同様に、ICMに似るナイーブ型mESCは、さまざまな3D培養条件下で空洞を形成しなかったが、胚盤葉上層期mEpiSCは、ZO-1＋PODXL＋管腔を取り囲むロゼットを形成した（図14d〜g）。ナイーブ型hPSCおよびプライム型hPSCはどちらも、2D培養でも3D培養でも、核OCT4およびSOX2を発現し続けた（図14h）。細胞分裂制御タンパク質42ホモログ（CDC42）の化学的阻害はhPSCにおける空洞形成を有意に低減したが、カスパーゼ阻害は効果がなく、胚盤葉上層の公知の性質と合致した（図15a〜e）。スフェロイド形成に対する分化の効果を調べるために、hPSCを、ブラキュリ（BRY）発現および中内胚葉分化の強力で迅速な誘導因子であるCHIRで処理した。
【００４１】
サンドイッチ化時に添加したCHIRはスフェロイド形成を用量依存的に阻害し、分化中の細胞はEMTを起こし、それらの起源であるコロニーから外向きに放射状に離れた（図2h〜j）。これらの実験により、胚盤葉上層期は、hPSCスフェロイド管腔形成にとってのクリティカルウィンドウであると同定され、一方、ナイーブ型（narve）（ICM期）hPSCまたはCHIR分化hPSCは管腔を形成することができなかった。
【００４２】
実施例12
CHIR処理はスフェロイドを細管オルガノイドに分化させる
先の実験において本発明者らは5~M CHIRが、3D培養では並べてプレーティングした2D培養よりも高レベルのBRY発現を誘導することを観察した（図2j〜k）。多能性持続（mTeSR1）培地における2Dコロニーおよび3Dスフェロイドは、CHIR処理前はほぼ同じ網羅的遺伝子発現プロファイルを有し、3D培養だけが自発的分化を引き起こすわけではないことを示唆した（図16a）。3D培養に対するCHIRの効果をさらに調べるために、本発明者らは、元々は2D培養からの心筋細胞生成のために設計された定方向分化レジメンを応用した。注目すべきことに、3D培養では、結果として得られる間葉が、収縮性心筋細胞ではなく曲細管オルガノイドへと上皮化した（図3a〜b、図1a〜b参照）。これらの効果がCHIR処理に特異的であるかどうかを調べるために、本発明者らは2D培養および3D培養を血清で確率的に分化させた。そのような培養は、ZO-1＋LTL-上皮細胞のコンフルエントな単層を生産したが、細管も心筋細胞も生産しなかったことから、CHIR処理はこれらの細胞運命にとって必要であることが示唆された（図16b）。続いてこのプロトコールを最適化することにより、スフェロイド系性、CHIR処理、およびそれに続く827補足培地におけるインキュベーションは、細管分化を誘導するのに十分であることが明らかになり、一方、インスリンおよびWnt阻害工程は、必要でなかった（図16c〜e;最適化されたプロトコールを図1aに示す）。逆に、低CHIR濃度による胚盤葉上層スフェロイドの処理は、より高いCHIR濃度で2D培養において観察されたものと同様に、収縮性心筋細胞の分化をもたらした（図16l）。これらの結果から、3D培養ではCHIR用量応答性が異なり、心筋細胞から細管オルガノイドへのシフトをもたらすことが示唆された。
【００４３】
実施例13
細管オルガノイドは腎臓の発生およびアーキテクチャーを再現する
新しいプロトコールによる本発明者らの収量は、H9（WA09）hESCから出発して、24ウェルプレートのウェル1つにつきおよそ90の細管凝集体であった（図3a〜b）。腎臓近位尿細管のマーカーであるLTLは、細管構造と強く反応し、細管管腔中に濃縮されて現れた（図3c〜d）。LTLは腎臓細管と強く反応するが、他の上皮とも反応するので、本発明者らは、腎臓および他の器官のマーカーを使って、これらのオルガノイドの、より徹底的な特徴づけを行った。細管または隣接する間葉は、sine oculisホメオボックスホモログ2（SIX2）、LIMホメオボックス1（LHX1）、神経系細胞接着分子1（NCAM）、およびペアードボックス遺伝子2（PAX2）を含む、ネフロン前駆体および後腎胞マーカーを発現する（図3cおよび図17a）。エンドサイトーシス受容体である低密度リポタンパク質関連タンパク質2（LRP2/メガリン）およびキュビリンは、細管セグメントでは頂端に共発現し、LTLと共局在した（図3d）。フローサイトメトリーによる定量および共局在は、LTL＋細胞が全培養の約25％に相当し、キュビリンは細管長の約60％に沿ってLTL＋細管の約70％において発現していることを示した（図17b〜e）。さらにまた、電子顕微鏡法により、細管には、頂端微絨毛およびタイトジャンクションが観察された（図3e）。さらにまた、本発明者らは、遠位尿細管ネフロンセグメントのマーカーであるE-カドヘリン（EGAD）の発現について、これらの構造を検査した。
【００４４】
本発明者らは、ネフロンセグメント形成と合致する、EGAD＋遠位尿細管からLTL＋近位尿細管を経てPODXL＋細胞（予定ポドサイト）を含有する被膜様構造への進行を観察した（図3f）。ポドカリキシンはポドサイトに限定されるわけではないので、本発明者らはさらにポドサイトおよび内皮の追加マーカーについてこれらのオルガノイドを検査した。PODXL＋細胞は球状のタイトにクラスター化した形態を呈し、LTLと反応せず、ウィルムス腫瘍タンパク質（WT1）およびシナプトポジンを含む腎臓ポドサイトの追加マーカー、ならびに腎臓糸球体では高く発現し細管では低レベルに発現するジャンクションコンポーネントであるCrumbs3を共発現した（図3g〜hおよび図18a〜b;図1dも参照されたい）。CD31およびヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）を発現する内皮コードもオルガノイド内に生じ、細管およびポドサイト集団の両方と接触していた（図3f〜i）。LTL＋オルガノイドの約80％は、内皮細胞集団およびポドサイト細胞集団を含んでいた（図18b）。神経外胚葉のマーカー（TUJ1）や腸のマーカー（CDX2）はオルガノイド内には存在しなかったことから、細管はこれらの系譜に相当しないことが示されたが（図18c〜e）、独立したTUJ1＋細胞のクラスターが腎臓オルガノイドに対して約1:2の比で培養中に観察され、細管に向かって軸索様の突起を突き出していた（図18c〜e）。そのようなニューロンは、尿管芽の非存在下での腎臓細管分化にとっての誘導シグナルの供給源に相当するのかもしれない。分化の時間経過中のRNA分析およびタンパク質分析により、中内胚葉、ネフロン前駆体、そして最後に近位尿細管およびポドサイトに特有であるマーカーの逐次的誘導が明らかになった（図19a〜d）。腎臓分化のための2Dプロトコールを使って類似する系譜が得られたが、LTL＋構造は、より広く、より散在していた（図19e）。本発明者らは、細管オルガノイドはおそらく腎臓系譜に相当すると結論した。
【００４５】
実施例14
細管オルガノイドは長期間生き残り、腎臓生理機能をモデル化する
このプロトコールを使うと、H9 hESCおよび3つの異なるhiPSC株は、近位尿細管、内皮細胞、およびポドサイトを腎臓様の配置で組み込んだオルガノイドを生産し、hESCが最も高い分化効率を示した（図4a〜bおよび図19f）。LTL＋細管は、少なくとも120日にわたる長期培養中、安定なままであった（図4c）。生オルガノイドを蛍光性のLTLおよび抗CD31で標識することにより、細管コンパートメントおよび内皮コンパートメントの動態をリアルタイムで視覚化することができた。オルガノイドを解離してサンドイッチ条件で再プレーティングしたところ、1週間後に、SIX2＋ネフロン前駆細胞のパッチに近接して、元の細管より小さな新しいLTL＋上皮が生じた（図4d〜e）。制限されたネフロン前駆細胞の自己複製能と合致して、継代培養はおよそ3代に限られた。腎毒性薬シス-ジアミンジクロロ白金（II）（シスプラチン）またはゲンタマイシンで処理すると、細管は、近位尿細管傷害の臨床バイオマーカーである頂端腎臓傷害分子1（KIM-1）を発現した（図4f〜g）。KIM-1免疫蛍光は、処理後のオルガノイドの約80％に検出され、2つの異なる抗体を使って確認された（図4g〜h）。対照的に、胚盤葉上層スフェロイドは、シスプラチンに対しても、ゲンタマイシンに対しても、用量依存的な感受性を呈したものの、処理後にKIM-1をアップレギュレートしなかったことから、この特徴は腎臓オルガノイドに特異的であることが示された（図11Oa）。オルガノイド培養はハイスループット実験に馴染む96ウェルフォーマットに小型化することもできた（図4i）。細管オルガノイド培養をさらに解離し、新生児免疫不全マウスの腎臓に移植した。3週間後に、本発明者らは、マウス腎臓皮質内にヒト核抗原陽性（HNA＋）上皮構造を同定し、LTL強度は隣接するマウス細管と同等であった（図4j）。ヒトPODXL＋、vwF、およびSIX2＋細胞も観察されたが、本発明者らは、脈管化された糸球体の形成を認めなかった（図4kおよび図21a）。総合すると、これらの結果により、細管オルガノイドは腎臓細管の微小生理学および移植に関連するインビボおよびインビトロ研究に利用できることが証明された。
【００４６】
実施例15
腎臓細管と胚盤葉上層空洞における相異なる透過性
多能性上皮および子孫上皮の障壁機能を試験するために、本発明者らは、サイズが異なる蛍光化合物を使って管腔内外への分子拡散動態を視覚化するためのリアルタイムアッセイを開発した。胚盤葉上層スフェロイドでは、2〜4時間にわたって培地に添加されたルシファーイエロー（LY、521Da）が空洞内に徐々に蓄積したのに対し、ローダミンコンジュゲートデキストラン（RD、10,000Da）は管腔から排除され、その代わりに頂端細胞間領域に蓄積して、管腔の周囲に明るいハローを形成した（図5a）。逆に、空洞にマイクロインジェクションされたRDは数時間にわたって検出可能なままであった（図5b）。蛍光化合物をスフェロイドと共に数時間にわたってインキュベートしてから洗い流すと、それらの化合物は最初はそれぞれの分布を保つが、時間と共に強度が衰えたことから、それらは動的な状態を保っており、その場に固定されているわけではないことが示された（図5c〜d）。これらの知見により、胚盤葉上層スフェロイド上皮の頂端細胞間ジャンクションにある、機能的でサイズ選択的な高分子透過性障壁が明らかになった。本発明者らは、分化した細管オルガノイドにおける蛍光高分子の輸送を評価する並行実験を行った。胚盤葉上層スフェロイドとは対照的に、RDは、2〜4時間のインキュベーション後に、オルガノイドの約80％において細管管腔に局在し、24時間の洗い流しチェイス中も会合したままであり、対応するLYの濃縮を伴わなかった（図5e〜f）。アクチン重合およびエンドサイトーシスの阻害剤であるラトランクリン（Lat）Bとの同時インキュベーションはRDの蓄積を著しく低減した（図5g）。輸送カーゴ・フルオレセインメトトレキサート（MTX、979Da）も、RDと同様に、腎臓細管に明るく蓄積したが、洗い流し後はRDより動的に見えた（図5h）。MTXがhPSCスフェロイド空洞に同様に濃縮されることはなかった（図5i）。RDが負荷されたオルガノイドを、タイトジャンクションを破壊するために1時間にわたって0.5mM EDTAで処理したところ、管腔ROシグナル強度が減少したことから、ROは可動性を保っていることが示唆された（図22a）。48時間後、新たに添加したROは同じ細管に元の分布パターンで局在した（図22a）。固定および共局在により、ROはLRP2/メガリンを欠く細管セグメントには濃縮されるが、隣接するLRP2/メガリン＋セグメントには濃縮されないことが明らかになったことから、局在化したLRP2/メガリン媒介再吸収が示唆された（図22b）。このように細管オルガノイドは、胚盤葉上層スフェロイドとは異なる、近位尿細管に典型的な輸送特徴を呈した。
【００４７】
実施例16
ポドカリキシンは胚盤葉上層およびポドサイト形態形成を調節する
本発明者らは、胚盤葉上層および腎臓の両方において上皮細胞分化、極性および管腔形態形成を調節すると提唱されている頂端シアロムチン・ポドカリキシンの役割を明確にするために、この系をさらに応用した。クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（CRISPR）/Cas9ゲノム編集系を使って、ポドカリキシンノックアウト（PODXL-/-.）hPSCを生成させ、クロマトグラム分析によってクローンを選択した（図6a〜d）。ポドカリキシンに関するイムノブロットでは、約220および80kOaに、PODXL-/-.hPSCには全く存在しない2つの主要バンドが明らかになった（図6eおよび図23a）。ポドカリキシンに関連する2つの多能性マーカーTRA-1-60およびTRA-1-81はノックアウト細胞では約40%低減した（図23b〜e）。PODXL-/-. hPSCは、他の点では同質遺伝子型の無修飾hPSCと識別不可能な奇形腫形成、成長速度、およびコロニーサイズを呈したことから、多能性および自己複製性を保っていることが示された（図6f〜h）。際立ったことに、他の点では同一の遺伝的背景を持つ無修飾対照と比較して、3Dサンドイッチ培養中のPODXL-/-. hPSCは、中空管腔を生産する能力の激しい（約85％）減少を呈し、位相差顕微鏡法ではむしろ中実スフェロイドのように見えた（図6i〜j）。PODXL-/-.スフェロイドが目に見える管腔を形成する稀な例では、その直径が約70％低減した（図6k）。これらの結果は、ポドカリキシンは多能性の維持にとっては必要でないが、胚盤葉上層スフェロイド管腔形成には必要であることを明らかにした。
【００４８】
RNA干渉（RNAi）によるポドカリキシンノックダウンはタイトジャンクションの組織を破壊することが以前に示されている。しかしPODXL-/-- hESCにおいて、ジャンクションコンポーネントZO-1、オクルディン、および線維状アクチンは、適正に局在し、経上皮電気抵抗（TEER）は野生型対照と識別不可能であった（図6l〜n）。さらに、免疫蛍光によって、PODXL-/-. hESCスフェロイドでは、頂端に極性化されたZO-1で裏打ちされた、小さい圧縮された管腔が明らかになった（図24a）。培地に添加したLYはこれら小さな管腔内に蓄積し、一方、RDは、管腔から排除され、野生型細胞と同様に細胞間部位に蓄積した（図24b）。
【００４９】
PODXL-/--hESCにおけるこれらの知見とは反対に、RNAサイレンシングによるポドカリキシンの約90％ノックダウン（siPODXL）は、残存ポドカリキシンの小さなパッチへのZO-1の誤った局在をもたらして、ZO-1をその正常表面積の約50％に閉じ込めた（図24c〜e）。siPODXL hPSCでは空洞形成が約50％阻害され、一方、ZO-1、OCT4、およびNANOGの総発現レベルは影響を受けなかった（図24f〜h）。ポドカリキシンが分子間電荷斥力による管腔拡大に直接寄与するかどうかを調べるために、hPSCを、ポドカリキシンの負荷電シアリル化細胞外ドメインを中和する低濃度（8μg/ml）の硫酸プロタミン（PS）で処理した。PSは3D空洞形成を強く阻害し、分散したパッチへのポドカリキシンの誤った局在を引き起こした（図24i〜j）。総合すると、これらの結果は、ポドカリキシンが、タイトジャンクションとのその会合とは無関係に、おそらく直接的な電荷媒介機序によって、胚盤葉上層管腔形成を促進することを明らかにした。
【００５０】
本発明者らは、次に、ヒト腎臓細胞タイプにおけるポドカリキシンの機能を調べた。PODXL-/--hPSCは、これらの細胞タイプからのポドカリキシン発現の完全な喪失にもかかわらず、細管（ZO-1＋LTL＋）とポドサイト（ZO-1.SYNPO＋）の両方を特徴とする腎臓オルガノイドへと、効率よく分化した（図7a）。PODXL-/--オルガノイドは野生型hPSCに似た細管の形態と直径を呈したことから、総合的な細管オルガノイド形態形成にとってポドカリキシンは必要でないことが証明された（図7a〜b）。ZO-1発現も、PODXL-/--hESCから分化して敷石状の外観をとっているLTL＋細管において、同様に変化がなかった（図7c）。注目すべきことに、成体ヒト腎臓からの組織切片では、ポドカリキシンが糸球体中で高度に発現するが、細管では検出されなかった（図7d）。そこで本発明者らは、共焦点顕微鏡法により、hPSC由来ポドサイトをさらに詳しく調べた。無修飾ポドサイトでは、ポドカリキシンがポドサイト凝集体の外側の形質膜を明るく被覆したのに対し、ZO-1、SYNPO、およびβ-カテニンはポドカリキシンとは逆のパターンで共局在して、凝集体内で隣接細胞間に相異なる内部軌道を形成した（図7e;図1i参照）。対照的に、PODXL-/-オルガノイドでは、そのような線形軌道の出現が著しく低減し、ジャンクションマーカーは、より散在性の発現パターンをとった（図7f）。PODXL-/-オルガノイドにおけるこれらの軌道の消失は、同質遺伝子型対照と比較して、隣接ポドサイト間の間隙幅の減少と相関した（図7g）。本発明者らは、ポドカリキシンは、細管でも胚盤葉上層細胞でもなく、腎臓ポドサイトにおいて、ジャンクションの組織化を調節すると結論した。
【００５１】
実施例17
ゲノム修飾腎臓オルガノイドはPKD特異的嚢胞を形成する
最後に本発明者らは、腎臓細管の拡大による嚢胞の形成を特徴とする多発性嚢胞腎（PKD）を機能的にモデル化する腎臓オルガノイドの潜在能力を調べた。PKD1またはPKD2における両アレル機能喪失型変異は、PKD嚢胞形成に強く寄与すると提唱されている。そこで本発明者らは、CRISPR/Cas9ゲノム編集系を応用することで、hPSC中のPKD1またはPKD2に両アレル短縮型変異を導入した（図8a〜b）。クロマトグラム分析およびイムノブロット法により、ターゲット部位におけるフレームシフト変異が確認され、対応する完全長タンパク質は存在しないことが証明された（図8e〜d）。PKD hPSCは同質遺伝子型対照と同等の自己複製および奇形腫形成を示した（図8e〜f）。PKD hPSCは、対照と類似する形態および管腔直径を持つ空洞形成胚盤葉上層スフェロイドを形成した（図8g）。さらにまた、これらのスフェロイドは同等な効率で細管オルガノイドに分化した（図8h）。これらの実験により、PKD1およびPKD2は多能性の維持にとって必要でなく、胚盤葉上層スフェロイドの空洞形成または形態形成に検出可能な影響を及ぼさないことが明らかになった。
【００５２】
これらの株が腎臓系譜においてPKDに関連する表現型を生じうるかどうかを試験するために、本発明者らは、PKD hPSC由来のオルガノイドを同質遺伝子型無修飾対照と並べて培養した。注目すべきことに、本発明者らは、PKD hPSC培養において、細管オルガノイドに沿った大きな半透明の嚢胞様構造の形成を観察した（図9a）。これらの構造は、基礎をなすマトリックスに係留されたままであったが、ディッシュの表面に近い位置に固定されたままの隣接する細管オルガノイドとは対照的に、振動を受けると自由に動いた。これらの嚢胞は、腎臓オルガノイドの約5％に、低い率で検出された（図9b）。重要なことに、並べてプレーティングし分化させた同質遺伝子型対照hPSCは、これらの条件下で嚢胞を形成しなかった（図9b）。PKD嚢胞は、最初のプレーティングの約35日後に初めて目に見えるようになり、培養の継続期間中は拡大し続けた。嚢胞は、LTLに対して、隣接する細管と同等の強いアフィニティーを呈し（図9c）、タイムラプス動画では細管構造から生じることが観察された。共焦点顕微鏡法は、細胞を欠く中空の内部コンパートメントを嚢胞裏打ち上皮が取り囲んでいることを示した（図9d）。嚢胞は、隣接する細管構造とは対照的に、蛍光カーゴを検出可能なほど蓄積しなかった（図9e）。これらの知見により、PKD変異は、胚盤葉上層スフェロイドとは異なり、細管オルガノイドからの異常な嚢胞形成をもたらすことが示唆された。
【００５３】
実施例18
考察
hPSCおよび派生する体細胞系譜の上皮特徴はほとんどわかっていない。未分化hPSCとそれらの分化子孫との両方における上皮の生理機能および形態形成の再構成は、ヒト実験モデルおよび再生治療薬としてのそれらの潜在的可能性を推進する上で重要である。本明細書に記載する培養系およびアッセイは、三次元で未分化hPSCおよび子孫上皮を生成させ、それらを機能的にプロファイリングするための枠組みを確立する。hPSCは、患者特異的な免疫適合性iPSCを含む、よく特徴づけられた、均一で、遺伝的に多様な細胞タイプである。それゆえに、正しく機能する上皮は再生医学への利用可能性を有しうる。
【００５４】
本発明者らは、未分化胚盤葉上層期hPSCが、3D培養において、最近mESCから得られたロゼットに似ているが拡大された管腔を持つ空洞形成スフェロイドを形成することを、初めて証明する。重要なことに、スフェロイドは非分化条件下で形成され、完全な多能性を保っていることから、スフェロイドが分化系譜に相当する可能性は排除される。14。さらにまた、スフェロイド形成は胚盤葉上層期に限定され、ICM期hPSCまたはmESCの特徴ではない。インビボの霊長類胚盤葉上層は、極めて動的な初期羊膜腔を取り囲む拡大する円盤状の上皮塊である。
【００５５】
この段階にあるヒト胚の研究および培養は、倫理的および法的な障壁によって制限されているので、hPSCスフェロイドは、胚盤葉上層空洞形成とその後の分化に関する倫理的に許容されかつ実験的に利用できる3Dモデルになる。機構的に、胚盤葉上層スフェロイドにおける管腔形態形成は、MOCK細胞と同様に、頂底極性化を介して起こる。hPSCの広範な系譜フレキシビリティおよび遺伝的多様性は、既存の上皮細胞モデルと比べて大きな利点であり、多様な組織および遺伝的背景からのヒト上皮の直接比較を可能にする。遺伝子修飾されたhPSCを使用することで、本発明者らは、ポドカリキシンが、この細胞タイプにおけるタイトジャンクションとは無関係に機能する胚盤葉上層スフェロイド管腔形成の重要な媒介因子であることを確認した。
【００５６】
本発明者らの結果から、頂底極性化、タイトジャンクション組織化、およびポドカリキシン発現の組合せが、胚盤葉上層期のhPSCとICM期の前駆体とを区別し、初期羊膜腔の形成を促進するという分子モデルが示唆される（図10a）。同様に、プライム型hPSCは、インビトロで管腔を形成する能力によって、それらのナイーブ型対応物と区別される。本発明者らの研究は、2D培養と3D培養を直接比較することにより、胚盤葉上層期におけるスフェロイド形成が、以後の細胞運命決定に著しい影響を及ぼし、心筋細胞ではなく細管オルガノイドを生産しうることを明らかにする。これらのオルガノイドは、腎臓の発生および生理機能の重要な特徴を、インビトロで再現する。これは、初代成体腎臓細胞または初代胚性腎臓細胞を使ったモデル化にとっては難題であった。hPSCからの腎臓指向的分化のための以前のプロトコールとは対照的に、スフェロイド形成とそれに続く成長因子低減マトリゲルにおけるCHIR処理という本発明者らの簡単な2工程手法では、線維芽細胞成長因子2（FGF2）、アクチビン、または骨形成タンパク質を外から補足する必要がない。細管構造は、実験的に利用しやすく、スケーラブルで、潜在的にハイスループットな接着マイクロプレートフォーマットにおいて、希釈ECMによって取り囲まれる。これらの構造は、従来の腎臓細胞株および腎臓オルガノイドとは異なる系譜複雑性を呈する。発生中の近位ネフロンの主要コンポーネント-細管細胞、内皮細胞、ネフロン前駆体、およびポドサイト-はすべて、個々のオルガノイド内に、腎臓様アーキテクチャーで表現される（図10b）。近位尿細管は、それらが派生する元となった多能性スフェロイド上皮とは相異なる特徴的な方法で蛍光カーゴを輸送する。傷害を受けると、細管は臨床バイオマーカーKIM-1を発現する。これは、インビボの近位尿細管に著しく特有であり、脱分化した初代培養では失われる応答である。これは、創薬において失敗の原因になることが多い近位尿細管腎毒性を予測するための定量可能なヒト標準になりうる。PKDは、最も一般的な単一遺伝子疾患の一つであり、臨床家にとっても細胞生物学者にとっても大きな関心対象である。既存の細胞系は、単純スフェロイドの形成またはPKD遺伝子発現の欠陥に起因する「嚢胞」の形成に、量的な相違を報告している。
【００５７】
しかし、これらの系では野生型細胞でもしばしば嚢胞を形成する。それゆえに、細管からのPKD特異的嚢胞形成のための再現性のある系は、種特異的な病態生理学および治療法が臨床的関心対象である分野にとって、特にヒトにおいて、重要な目標である。本発明者らは、機能喪失型PKD変異が、同質遺伝子型対照には観察されないhPSC由来細管細胞からの嚢胞形成をもたらすことを見いだした。この知見は、細管からのPKD特異的嚢胞形成が、インビトロの最小系でモデル化することのできる細胞固有の現象であることを示唆している。嚢胞形成はPKD1変異体でもPKD2変異体でも観察され、腎臓オルガノイドに特異的であって、胚盤葉上層スフェロイドにはなかったので、この表現型は、この系において遺伝子特異的かつ系譜特異的である。PKD患者およびマウスモデルの腎臓全体での嚢胞の限局的出現と合致して、嚢胞は比較的低頻度に生じた。この系における嚢胞形成の細胞的基礎を決定し、ヘテロ接合型変異とさまざまな遺伝的背景とを有するPKD患者からのiPSCも嚢胞を生じるかどうかを決定するには、さらなる研究が必要である。嚢胞は比較的稀な現象なので、そのような実験を行うには、iPSC分化効率の改良が必要になりうる。hPSC系は、細管細胞に加えて、形態的にも機能的にも腎臓細管とは相異なるポドサイトも生産する。hPSC由来ポドサイトは、インビボでのポドサイトの生化学的分析および顕微鏡分析と合致して、CRB3およびZO-1などのジャンクションコンポーネントを隔離する極性化されたドメインを形成する。これらのタンパク質とポドカリキシン、シナプトポジン、およびWT1との組合せは、腎臓ポドサイトを除けばどの集団でも共発現することが知られておらず、そのような細胞が他の器官においてLTL＋細管細胞に沿って現れると予想されることもないだろう。本発明者らは、CRISPRノックアウト株を使って、ポドカリキシンが、齧歯類腎発生中およびPodxrlマウスにおける知見と類似して、これらの細胞において、接着装置複合体を基底外側に隔離するように機能することを証明する。
【００５８】
ポドカリキシン発現の変化はヒト糸球体疾患状態に特有であるから、PODXL-/-ポドサイトのさらなる研究は細胞病態生理学および処置への洞察をもたらしうる。hPSC系には制約がある。例えば本発明者らは、hPSCポドサイトおよび隣接する内皮からの脈管化された糸球体の形成をまだ観察していない。さらに進歩した疾患モデル化および治療的応用のためにこの系を完全に機能的なネフロンへとさらに発生させるには、インビボでの流体の流れおよび組織微小環境を伴う熱心な研究が必要である。結論として、本発明者らは、胚盤葉上層、腎臓細管細胞、およびポドサイトに相当する、機能的で明確な構造を持つ上皮を再構成する3D培養系を開発した。これらの多能性上皮および子孫上皮は、一定の重要な構造的特徴を共有しているが、それでもそれらはステージ特異的な輸送特徴および形態形成機構を再現することができる。これは、相異なる発生ステージでのヒト微小生理学、傷害、および疾患をモデル化するための正確で再現性のあるプラットフォームになる。ゲノム修飾細管オルガノイドが腎臓疾患表現型を機能的に再現することは、腎臓であるというこれらの構造の同定を補強し、ヒトの腎生理機能および腎病態生理学をインビトロで研究するための画期的な細胞系を確立する。本明細書に記載する方法論は、多様な組織および遺伝的に多様な背景に広く応用および適応することができ、ヒト上皮疾患に関連する分子経路を実験的に調べるために、すぐに利用することができる。長期的には、この系は、再生移植片の投与に先だって、患者由来の上皮の機能性をインビトロで最適化し試験するための有用な環境になりうる。
【００５９】
実施例19
3D培養
細胞株には、H9（WA09）、BJ、HDF、hLR5、hfib2-iPS4、およびhfib2-iPS5（ヒト）、ならびにJ1、R1、およびv6（マウス）を含めた。細胞は、3％成長因子低減GelTrex（Life Technologies）上で、少なくとも1代は、培地（hPSCにはmTeSR1、mESCにはN2/B27サプリメント＋2i in、hLR5 iPSCにはhESC条件培地（CM）＋白血病抑制因子（LIF）＋dox）において、フィーダーフリーで維持し、AccutaseまたはTrypLEを使って解離した。LD-iPSCは、ナイーブ型hLR5 iPSCから、LIFおよびドキシサイクリンを除去し、FGF2で置換することによって誘導した。薄層ゲルサンドイッチコロニーの場合は、10μM Rhoキナーゼ阻害剤Y27632（StemGent）を補足した培地中、GelTrexがプレコートされた24ウェルプレートまたは4ウェルチャンバースライドのウェル1つにつき、60,000個（プライム型）または30,000個（ナイーブ型）の細胞を、プレーティングした。翌日、培地を、mTeSR1中の1.5％GelTrex 500μLで置き換えた。24時間後に培地を変えた。厚層ゲル培養の場合は、96ウェルプレートのウェル1つにつき、20,000個（胚盤葉上層期）または6,000個（ナイーブ型）の細胞を、75ulの緩衝コラーゲンI（10mM HEPESおよび1×DMEMを含有するもの）、成長因子低減マトリゲル（BD Biosciences）、またはそれら2つの1:1混合物のいずれかに再懸濁し、37度で45分にわたってインキュベートしてから、100ulの培地＋Y27632を重層した。薄層ゲルにおける連続継代の場合は、3D培養中の管腔を持つコロニーをプレーティングの72時間後に解離し、6ウェルプレートのウェル1つあたり300,000細胞の密度で再プレーティングし、2D条件または3D条件のいずれかで72時間培養した後、解離、細胞数の計数、および再プレーティングを行った。懸濁培養の場合は、低接着性6ウェルプレートの1つのウェルでmTeSR1培地に20,000個の解離hPSCをプレーティングした。どの細胞についても培地は毎日変えた。
【００６０】
実施例20
細管オルガノイド分化
散在した孤立スフェロイドコロニーを生産するのに十分な60,000〜120,000個のH9 hPSCをプレーティングした。サンドイッチ化の48時間後に、hPSCスフェロイドを12μM CHIRで36時間にわたって処理してから、RB（Advanced RPMI＋Glutamax＋B27サプリメント）に変え、その後は3日ごとに置き換えた。あるいは、2D心筋細胞分化について記載されているように、スフェロイドを、インスリンを除いたRB（RBNI）中、12μM CHIRで24時間、RBNIで48時間、5μM IWP2で48時間、RBNIで48時間、その後は3日ごとにRBで処理した。2D腎臓分化の場合は、細胞を一晩プレーティングしてから、APEL培地（StemCell Technologies）中の8μM CHIRで48〜72時間、APEL培地中の30ng/ml FGF2＋1μg/mlヘパリンで96時間にわたって処理し、次にAPEL培地中で10〜15日にわたって培養した。確率的分化の場合、2D培養中または3D培養中のhPSCを、DMEM＋P/S中の10％ウシ胎児血清（FBS）で処理し、19日にわたって観察した。
【００６１】
実施例21
免疫蛍光および電子顕微鏡法
3Dアーキテクチャーを保存しつつ固定するために、室温で15分間、等体積の8％パラホルムアルデヒドを培養培地に加えた（最終濃度4％）。固定後に、試料をPBS中で洗浄し、5％ロバ血清（Millipore）/0.3％Triton-X-100/PBS中でブロッキングし、一次抗体と共に3％ウシ血清アルブミン/PBS中で一晩インキュベートし、洗浄し、Alexa-Fluor二次抗体（Invitrogen）と共にインキュベートし、洗浄し、DAPIで染色するか、Vectashield H-1000にマウントした。一次抗体には、OCT4（sc-5279、Santa Cruz）、NANOG（RCAB0004PF、Cosmobio）、ブラキュリ（sc-17745、Santa Cruz）、TRA-1-60（MAB4360、Millipore）、TRA-1-81（MAB4381、Millipore）、アセチル化□-チューブリン（051M4770、Sigma）、ZO-1（339100、Invitrogen）、ポドカリキシン（AF1658およびAF1556、R&D）、CDX2（-88、Biogenex）、AQP1（AB2219、Millipore）、WT-1（sc-192、Santa Cruz）、LHX1（Developmental Studies Hybridoma Bank）、mPODXL（AF1556、R&D）、hPODXL（AF1658、R&D）、HNA（MAB1281、Millipore）、LTL（FL-1321、Vector Labs）、SYNPO（sc-21537、Santa Cruz）、CD31（555444、BD）、crumbs 3（HPA013835、Sigma）、Na,K-ATPase（ab7671、Abcam）、および切断型カスパーゼ3（MAB835、R&D）を含めた。蛍光像は、ニコン落射蛍光90-I（正立）、Eclipse Ti（倒立）、または共焦点C1顕微鏡を使ってキャプチャした。電子顕微鏡法の場合は、5分間の固定後に構造物をプレートから擦過し、300gで4分間ペレット化し、4％ホルムアルデヒドおよび2％グルタルアルデヒドを含有するカコジル酸緩衝液中にピペッティングすることによって、そのペレットを静かに剥がし、四酸化オスミウムで後固定し、エタノール系列で脱水し、エポキシ樹脂に包埋した。準超薄切片を1mmで切断し、光学顕微鏡検査によって明白な管腔を持つ細管構造を同定するために、トルイジンブルーで染色した。超薄切片（75nm）を切断し、200メッシュ銅グリッドにマウントし、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で対比染色し、JEOL JEM-1010透過型電子顕微鏡で調べた。
【００６２】
実施例22
透過性アッセイ
透過性を試験するために、培地に20mM HEPES＋ルシファーイエローカルボヒドラジドカリウム塩（Invitrogen、38μM）およびローダミン-Bイソチオシアネートデキストラン（Sigma、0.5μM）を補足し、共焦点顕微鏡法によって撮像した。マイクロインジェクションの場合は、可視化のために、mTeSR1中の5μMローダミンコンジュゲートデキストラン溶液をフェノールレッド溶液（0.5％、Sigma）で1:1希釈した。Nanoject-2マイクロマニピュレーターでプルドガラスキャピラリーマイクロニードルから2nlをマイクロインジェクションし、広視野落射蛍光により、リアルタイムでモニタリングした。TEERの場合は、希釈マトリゲルがプレコートされた24ウェルトランスウェルプレート（Corning）に、50,000個のhPSCをプレーティングした。細胞が完全にコンフルエントになるまで培地は10日にわたって静かに交換した。TEERはEVOM2デバイス（World Precision Instruments）を使って測定した。
【００６３】
実施例23
KIM-1誘導
24ウェルプレートの、同様にプレーティングされたウェル中のオルガノイドを、一連の濃度のゲンタマイシンおよびシスプラチンで、36〜48時間にわたって処理し、固定し、KIM-1抗体AKG7.9（Bonventre laboratory）または1400（Biogen）による免疫蛍光のために加工した。KIM-1に関する免疫蛍光は、大規模な細管崩壊を誘発しない中等度の準毒性用量で観察された。
【００６４】
実施例24
RNA干渉
プレーティングの16時間後に、抗生物質を含まないmTeSR1中で、PODXL、OCT4、またはスクランブル対照に対するDharmacon Smartpool siRNAを、hPSCにトランスフェクトした。10時間後に、培地を変えて、細胞を2Dで培養するか、3D培養のためにサンドイッチ化した。
【００６５】
実施例25
Cas9/CRISPR変異導入
緑色蛍光タンパク質（GFP）タグ付きCas9（Addgene 44719）およびPODXLの第2エクソン
2018526010.tif 000006
、PKD2の第1エクソン
2018526010.tif 000007
、またはPKD1の第36エクソン
2018526010.tif 000008
を標的とするガイドRNA（Addgene 64711）をコードするコンストラクトをH9 hESCに一過性にトランスフェクトし、GFP発現細胞をフローサイトメトリーソーティングによって単離し、クローン拡大し、両アレル機能喪失型インデルを持つクローンをスクリーニングした。6ウェルプレートのウェル1つにつき約200,000個のソートされたhESCを、hESC条件付けmTeSR1＋Y27632に入れてプレーティングした。翌朝、Y27632なしで培地を置き換え、細胞をクローン拡大し、PODXL gRNA領域をPCRで増幅した。クロマトグラム配列を手作業で分析し、イムノブロットおよび免疫蛍光によって変異を確認した。
【００６６】
実施例26
トランスクリプトームプロファイリング
2Dまたは3DでプレーティングされたhPSCを、RNEasy Mini Kit（Qiagen）を使って、並べて調製した。試料をAgilent BioanalyzerでQCすることで、高品質試料のチェックを行った。次に、TruSeq stranded mRNAライブラリーキット（Illumina）を使って、適格試料を調製した。シーケンシングはIllumina NextSeq500 75×75ペアエンドハイアウトプットランで行った。Tophat2を使って試料をhg19リファレンス配列に整列し、Cuffdiffを使って差異的発現を算出した。
【００６７】
実施例27
RT-PCR
分化時間経過中は、RNeasy Mini Kit（Qiagen）を使って、プレーティング後の2日目、10日目、14日目、および21日目に、RNAを調製した。M-MLV Reverse Transcription System（Promega）を使って、すべての時点からのRNAを並べて逆転写した。定量RT-PCR反応は、cDNA（希釈1:10）、300nMプライマー、およびiQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad）とiQ5 Multi-Color Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad）とを使用し、β-アクチンをハウスキーピング遺伝子として、二連で行った。
【００６８】
実施例28
定量および統計的解析
蛍光強度定量では、1回のイメージングセクションにおいて同じ露出で画像を撮影し、同様に加工した。固定試料より容易に管腔が見分けられる生細胞の位相差像において、空洞形成したコロニー（管腔を持つ楕円体）と平坦なコロニー（非楕円体または管腔を持たないもの）とを手作業でスコア化した。アポトーシスについては、切断型カスパーゼ3発現を手作業でスコア化し、核凝縮によって確認し、広視野落射蛍光像あたりの核の総数によって割った。ZO-1面積については、ZO-1を発現している個々のコロニーまたは小領域を手作業でトレースし、NIS Elements（ニコン）を使って表面積を算出した。各コロニーについて、合計したZO-1発現面積を総表面積のパーセンテージとして表してから、それらを平均した。強度を定量するために、NIS Elementsソフトウェア（ニコン）において、生蛍光値を得るために同じ露出で撮像した無作為に選択した構造物を通って、同じ長さのライン走査を行った。平均したライン走査値をエラーバーと共にプロットした。CHIR誘導分化については、Cell Profiler 2.0を使って低倍率免疫蛍光像中に約6000個の個々の細胞を同定し、蛍光強度を自動的に測定した。統計比較には、不当分散（異分散）である2つの試料について両側t検定を利用した。イムノブロットはImageJ Gel Analyzerを使って定量した。
【００６９】
実施例29
hPSCは3D培養において空洞形成スフェロイドを形成する
未分化hPSCおよび子孫hPSC-KCの組織特異的機能を評価するために、本発明者らは、まず胚盤葉上層スフェロイドを生産し、次に腎臓細管を生産する、hPSCのための接着3D培養系を開発した（図25a）。2層の希釈マトリゲル（0.2mg/mL）の間にサンドイッチされた解離未分化hPSCはコンパクトなボール様コロニーを形成し、48時間までに、これらは内部空洞を形成した（図25b）。成熟スフェロイドは中空の管腔を取り囲む単層円柱上皮からなった（図25b〜c）。スフェロイド細胞では、ポドカリキシン（PODXL）が管腔表面に、閉鎖帯-1（ZO-1）が頂端細胞間ジャンクションに、そしてβ-カテニンが主に基底外側膜に、極性化されて局在した（図25c）。類似する頂底極性化パターンが単層hPSCに観察された（図32a）。
【００７０】
本発明者らは、hPSCスフェロイドを、未分化hPSCの重要な機能的特徴である多能性および自己複製能について、さらに試験した。9回の連続継代において、解離した空洞裏打ちスフェロイド細胞は、サンドイッチ培養後に新しい空洞形成スフェロイドを生成するか、あるいは単層条件への最終形態時に平坦なコロニーを生成した（図25d）。3D培養への/からの長い連続継代後でさえ、免疫不全マウスに移植された空洞裏打ち細胞は、3つすべての胚性胚葉に由来する奇形腫組織を効率よく生産した（図25e）。2D培養および3D培養は類似する成長速度を呈し、多能性マーカーは、オクタマー結合転写因子4（OCT4）、性決定領域Yボックス2（SOX2）、NANOG、およびTRA-1-60を含めて、連続サンドイッチ培養細胞において、同一のパターンで発現し続けた（図25f〜g）。多能性持続（mTeSR1）培地における2Dコロニーおよび3Dスフェロイドもほぼ同じ網羅的遺伝子発現プロファイルを有した（図32b）。このように、スフェロイドは分化したサブタイプではなく未分化の自己複製多能性幹細胞に相当した。
【００７１】
ヒトおよび他の多くの哺乳動物の発生中は、初期胚のICMが胚盤葉上層に分化し、そこからすべての体細胞が派生する。本発明者らは、hPSCスフェロイドが、ヒトおよび霊長類の着床期胚において初期羊膜腔を取り囲む円柱上皮を形成する胚盤葉上層上皮塊をモデル化するという仮説を立てた。逆に、より原始的なICMに似るhPSCは空洞を形成しないと予測した。事実、マウス（m）ESCと同様にコンパクトなICM様コロニーを形成する「ナイーブ型」hLR5 iPSCは、3D培養において5日間の成長後でも管腔を形成しないが、胚盤葉上層期hPSCに似る「プライム型」hLR5由来（LD-）iPSCは、サンドイッチ培養において効率よく空洞を形成した（図33a〜b）。ナイーブ型hPSCおよびプライム型hPSCはどちらも、2D培養でも3D培養でも、核OCT4およびSOX2を発現し続けた（図33c）。同様に、ICMに似るナイーブ型mESCは、さまざまな3D培養条件下で空洞を形成しなかったが、胚盤葉上層期mEpiSCは、小さな管腔を取り囲むロゼットを形成した（図33d〜f）。これらの実験により、胚盤葉上層期は、hPSCスフェロイド管腔形成にとってのクリティカルウィンドウであると同定され、一方、ナイーブ型（ICM期）hPSCは管腔を形成することができなかった。
【００７２】
実施例30
GSK3β阻害はスフェロイドを細管オルガノイドに分化させる
胚盤葉上層スフェロイドを子孫上皮に分化させるために、本発明者らは、元々は2D培養からの心筋細胞生成のために設計された、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β（GSK3β）およびWingless関連組込み部位（WNT）シグナリングの逐次的阻害を伴う定方向分化レジメンを応用した。注目すべきことに、スフェロイド細胞は、心筋細胞を形成するのではなく、上皮間葉移行（EMT）を起こしてコンフルエントな単層を形成し、それが集まって10日目までにひだ状になり、曲半透明細管オルガノイドへの間葉上皮移行（MET）を開始した（図26a、図34a〜b）。この新しいプロトコールを最適化することにより、スフェロイド形成、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β阻害剤CHIR99021による処理、およびそれに続くB27補足培地におけるインキュベーションは、細管分化を誘導するのに十分であることが明らかになり、一方、インスリンおよびWNT阻害工程は、必要でなかった（図34c〜d;最適化されたプロトコールを図265aに示す）。
【００７３】
本発明者らはこれらの細管オルガノイドを腎臓マーカーの発現について調べた。腎臓近位尿細管のマーカーであるシカクマメレクチン（LTL）は、細管構造と強く反応し、細管管腔中に濃縮されて現れた（図26b〜c）。比較すると、細管と並べて調べた胚盤葉上層スフェロイドは、LTLに対してごくわずかなアフィニティーしか有しなかった（図34e）。LTLは腎臓細管と強く反応するが、他の一定の上皮とも反応するので、本発明者らは、腎臓および他の器官のマーカーを使って、これらのオルガノイドの、より徹底的な特徴づけを行った。細管はネフロン前駆体/後腎胞マーカーLIMホメオボックス1（LHX1）およびペアードボックス遺伝子2（PAX2）を発現した（図26b）。Sine oculisホメオボックスホモログ2（SIX2）は、細管に隣接する間葉において発現したが、細管自体には発現せず、このマーカーの後腎間葉への発生的拘束と合致した（図26b）。エンドサイトーシス受容体である低密度リポタンパク質関連タンパク質2（LRP2/メガリン）およびキュビリンは、細管セグメントでは頂端に共発現し、LTLと共局在した（図26c）。電子顕微鏡法により、細管には、頂端微絨毛およびタイトジャンクションが、観察された（図26d）。さらにまた、本発明者らは、遠位尿細管マーカーであるE-カドヘリン（ECAD）を発現するセグメントから、LTL＋セグメント（近位尿細管）を経て、PODXL＋ポドサイト様細胞を含有する被膜様構造への、細管の解剖学的進行を観察した（図26e）。これらのPODXL＋細胞は、オルガノイドの周辺部で、細管の端部に凝集した（図26f）。それらは、球状のタイトにクラスター化した形態を呈し、LTL反応性を欠き、ウィルムス腫瘍タンパク質（WT1）およびシナプトポジンを含む腎臓ポドサイトの追加マーカーを共発現した（図26f〜g）。CD31およびヴォン・ヴィレブランド因子（vWF）を発現する内皮コードもオルガノイド内に生じ、細管およびポドサイトの両方と接触していた（図26g）。これらの結果から、細管オルガノイドは、ネフロン様セグメント形成および脈管構造が可能な自己組織化hPSC-KC亜集団を含有することが示唆された。
【００７４】
このプロトコールを使うと、H9 hESCおよび3つの異なるhiPSC株は、近位尿細管、内皮細胞、およびポドサイトの特徴を持つ細胞および構造を腎臓様のセグメント配置で組み込んだオルガノイドを生産した（図26g）。hESCが最も高い分化効率を示して約90オルガノイド/1.9cm2を与え、LTL＋細胞は全培養の約25％に相当した（図26hおよび図35a）。LTL＋オルガノイドの約80％は内皮（CD31＋）細胞集団およびポドサイト様（PODXL＋）細胞集団を含んだ（図26h）。神経外胚葉のマーカー（TUJ1）や腸のマーカー（CDX2）はオルガノイド内には存在しなかったが、独立したTUJ1＋細胞のクラスターが腎臓オルガノイドに対して約1:2の比で培養中に観察され、細管に向かって軸索様の突起を突き出していた（図35b〜d）。分化の時間経過中のRNA分析およびタンパク質分析により、中内胚葉、ネフロン前駆体、そして最後に近位尿細管および-様細胞に特有であるマーカーの逐次的誘導が明らかになった（図35e）。細管オルガノイド培養のインビボ生着能を評価するために、細管オルガノイド培養を解離し、新生児免疫不全マウスの腎臓に移植した。3週間後に、本発明者らは、マウス腎臓皮質内にヒト核抗原陽性（HNA＋）上皮構造を同定し、LTL強度は隣接するマウス細管と同等であった（図26i）。本発明者らは、細管オルガノイドはおそらく腎臓系譜に相当すると結論した。
【００７５】
実施例31
腎臓オルガノイドは組織特異的な傷害および輸送を再現する
hPSC-KCでは組織特異的な機能または疾患表現型がまだ実証されていない。そこで本発明者らは、近位尿細管傷害の臨床バイオマーカーである腎臓傷害分子1（KIM-1）をアップレギュレートする腎臓オルガノイドの潜在能力を調べた。腎毒性薬シスジアミンジクロロ白金（II）（シスプラチン）またはゲンタマイシンで処理すると、KIM-1免疫蛍光が、オルガノイドの約80％において細管の管腔表面に検出され、それを2つの異なる抗体を使って確認した（図27a〜c）。対照的に、胚盤葉上層スフェロイドは、シスプラチンに対しても、ゲンタマイシンに対しても、用量依存的な感受性を呈したものの、処理後にKIM-1をアップレギュレートしなかったことから、この応答は腎臓オルガノイドに特異的であることが示された（図27d）。注目すべきことに、LTL＋細管は、少なくとも120日にわたる長期培養中、安定なままであり、培養を96ウェルフォーマットに小型化することもできた（図27e〜f）。それゆえに、腎臓オルガノイドは、ヒト腎毒性を評価するための長期ハイスループットモデル系になりうる。
【００７６】
胚盤葉上層スフェロイドおよび腎臓細管が組織特異的障壁機能を呈するかどうかを試験するために、本発明者らは、サイズが異なる蛍光化合物を使って管腔内外への分子拡散動態を視覚化するためのリアルタイムアッセイを開発した。胚盤葉上層スフェロイドでは、2〜4時間にわたって培地に添加されたルシファーイエロー（LY、521Da）が空洞内に徐々に蓄積したのに対し、ローダミンコンジュゲートデキストラン（RD、10,000Da）は管腔から排除され、その代わりに頂端細胞間領域に蓄積して、管腔の周囲に明るいハローを形成した（図28a）。逆に、空洞にマイクロインジェクションされたRDは数時間にわたって検出可能なままであった（図28b）。もう一つの小分子フルオレセインメトトレキサート（MTX、979Da）はhPSC管腔に蓄積しなかった（図28c）。蛍光化合物をスフェロイドと共に数時間にわたってインキュベートしてから洗い流すと、それらの化合物は最初はそれぞれの分布を保つが、時間と共に強度が衰えたことから、それらは動的な状態を保っており、その場に固定されているわけではないことが示された（図28d）。本発明者らは、分化した細管オルガノイドにおける蛍光高分子の輸送を評価する並行実験を行った。胚盤葉上層スフェロイドとは対照的に、RDは、2〜4時間のインキュベーション後に、オルガノイドの約80％において細管管腔に局在し、24時間の洗い流しチェイス中も会合したままであり、対応するLYの濃縮を伴わなかった（図28e〜f）。アクチン重合およびエンドサイトーシスの阻害剤であるラトランクリン（Lat）Bとの同時インキュベーションはRDの蓄積を著しく低減した（図28g）。MTXもRDと同様に腎臓細管に蓄積したが、洗い流し後はRDより動的に見えた（図28h）。このように細管オルガノイドは、胚盤葉上層スフェロイドとは異なる、近位尿細管に典型的な輸送特徴を呈した。
【００７７】
実施例32
ポドカリキシンはタイトジャンクションとは無関係に胚盤葉上層空洞形成を促進する
ポドカリキシンは胚盤葉上層でも腎臓ポドサイトでも高度に発現する頂端シアロムチンである。これらの細胞タイプにおけるポドカリキシンの機能的役割を調べるために、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（CRISPR）/Cas9ゲノム編集系を使って、ポドカリキシンノックアウト（PODXL-/-）hPSCを生成させた（図36a）。ポドカリキシンに関するイムノブロットでは、約220kDaおよび80kDaに、PODXL-/- hPSCには全く存在しない2つの主要バンドが明らかになった（図29a）。ポドカリキシンに関連する2つの多能性マーカーTRA-1-60およびTRA-1-81はノックアウト細胞では約40%低減した（図36b）。PODXL-/- hPSCは、他の点では同質遺伝子型の無修飾hPSCと識別不可能な奇形腫形成、成長速度、および3Dコロニーサイズを呈したことから、多能性および自己複製性を保っていることが示された（図36c〜e）。際立ったことに、他の点では同一の遺伝的背景を持つ無修飾対照と比較して、3Dサンドイッチ培養中のPODXL-/- hPSCは、中空管腔を生産する能力の激しい（約85％）減少を呈し、位相差顕微鏡法ではむしろ中実スフェロイドのように見えた（図29b〜c）。さらにまた、ポドカリキシン発現は、ポドカリキシン裏打ち空洞を形成する胚盤葉上層期のhPSCおよびmEpiSCでは、空洞を形成しないICM期の細胞よりはるかに高かった（図29d〜e）。これらの結果は、ポドカリキシンは多能性の維持にとっては必要でないが、胚盤葉上層スフェロイド管腔形成には必要であることを明らかにした。
【００７８】
ポドカリキシンは、タイトジャンクション組織化による管腔形成を調節すると提唱されている。しかしPODXL-/- hESCにおいて、ジャンクションコンポーネントZO-1、オクルディン、および線維状アクチンは、適正に局在し、経上皮電気抵抗（TEER）は野生型対照と識別不可能であった（図29f〜h）。管腔は生細胞における位相差顕微鏡法では極めてまれにしか観察されなかったが、固定培養における免疫蛍光により、PODXL-/- hESCスフェロイドにおいて、頂端に極性化されたZO-1で裏打ちされた、小さな圧縮された管腔が明らかになった（図37a）。培地に添加したLYはこれら小さな管腔内に蓄積し、一方、RDは、管腔から排除され、野生型細胞と同様に細胞間部位に蓄積した（図37b）。これらの実験により、hPSCにおいて極性化された機能的タイトジャンクションを確立するために、ポドカリキシンは必要でないことが証明された。ポドカリキシンが分子間電荷斥力による管腔拡大に直接寄与するかどうかを調べるために、hPSCを、ポドカリキシンの負荷電シアリル化細胞外ドメインを中和する低濃度（8μg/ml）の硫酸プロタミン（PS）で処理した。PSは3D空洞形成を強く阻害し、分散したパッチへのポドカリキシンの誤った局在を引き起こした（図37c〜d）。総合すると、これらの結果は、ポドカリキシンが、タイトジャンクションとのその会合とは無関係に、おそらく直接的な電荷媒介機序によって、胚盤葉上層管腔形成を促進できることを明らかにした。
【００７９】
実施例33
ポドカリキシンはポドサイト様細胞におけるジャンクションを調節する
本発明者らは、次に、ヒト腎臓細胞タイプにおけるポドカリキシンの機能を調べた。成体ヒト腎臓からの組織切片では、ポドカリキシンが糸球体中で高度に発現するが、細管では検出されなかった（図30a）。同様に、hPSC由来の腎臓オルガノイドでは、ポドサイト様細胞だけが高レベルのポドカリキシンを発現した（図30b）。本発明者らは、これらの細胞におけるポドカリキシンおよびジャンクションマーカーの局在パターンを共焦点顕微鏡法によって決定した。ポドカリキシンともう一つのポドサイトマーカーCrumbs3がどちらもポドサイト様凝集体の外側の形質膜を明るく被覆したのに対し、ZO-1、SYNPO、およびβ-カテニンは逆のパターンで共局在して、隣接細胞間に内部ジッパー様軌道を形成した（図30c〜d）。PODXL、Crumbs3、ZO-1、SYNPO、β-カテニン、およびWT1の複合的発現（図26f参照）は、腎臓ポドサイトを除けばどの集団でも起こることが知られておらず、そのような細胞が他の器官においてLTL＋細管細胞に沿って現れると予想されることもないだろう。これらの結果はさらに、hPSC-KCポドサイト様細胞が、インビボでのポドサイトの生化学的分析および顕微鏡分析と合致して、Crumbs3などのジャンクションコンポーネントをZO-1から隔離する極性化されたドメインを形成することを明らかにしている。
【００８０】
ヒトポドサイト様細胞におけるポドカリキシンの機能を調べるために、本発明者らは、PODXL-/- hPSCから腎臓オルガノイドを生産した。野生型オルガノイドとは対照的に、PODXL-/-オルガノイドでは、線形ZO1＋SYNPO＋軌道の出現が著しく低減し、ジャンクションマーカーは、より散在性の発現パターンをとった（図30e）。PODXL-/-オルガノイドにおけるこれらの軌道の消失は、同質遺伝子型対照と比較して、隣接ポドサイト様細胞間の間隙幅の減少と相関した（図30f）。ポドカリキシンが存在しなくても、細管（ZO-1＋LTL＋）またはポドサイト（ZO-1＋SYNPO＋）へのhPSC-KCの分化の効率には影響がなかった（図38a）。検出可能なポドカリキシンを殆ど乃至全く発現しない細管は、それらの形態、直径、およびPODXL-/-オルガノイドにおけるLTLまたはZO-1の発現パターンに欠陥を呈さなかった（図38a〜c）。本発明者らは、ポドカリキシンは腎臓オルガノイド分化にとっては必要でないが、適正なジャンクション組織化のためにポドサイト様細胞において特異的に必要になると結論した。
【００８１】
実施例34
ゲノム修飾腎臓オルガノイドはPKD特異的嚢胞を形成する
最後に本発明者らは、腎臓細管の拡大による嚢胞の形成を特徴とする多発性嚢胞腎（PKD）を機能的にモデル化する腎臓オルガノイドの潜在能力を調べた。PKD1またはPKD2における両アレル機能喪失型変異は、PKD嚢胞形成に強く寄与すると提唱されている。そこで本発明者らは、CRISPR/Cas9ゲノム編集系を応用することで、hPSC中のPKD1またはPKD2に両アレル短縮型変異を導入した（「PKD hPSC」）。クロマトグラム分析およびイムノブロット法により、ターゲット部位におけるフレームシフト変異が確認され、対応する完全長タンパク質は存在しないことが証明された（図31a〜b）。PKD hPSCは同質遺伝子型対照と同様の奇形腫に分化し、類似するサイズの管腔を持つ胚盤葉上層スフェロイドを形成した（図31c）。これらの実験により、PKD1およびPKD2は多能性の維持にとって必要でなく、胚盤葉上層スフェロイドの空洞形成または形態形成に検出しうる影響を及ぼさないことが明らかになった。
【００８２】
これらの株が腎臓系譜においてPKDに関連する表現型を生じうるかどうかを試験するために、本発明者らは、PKD hPSC由来の腎オルガノイドを同質遺伝子型無修飾対照と並べて培養した。注目すべきことに、本発明者らは、PKD hPSC培養において、細管オルガノイドに沿った大きな半透明の嚢胞様構造の形成を観察した（図31d）。これらの構造は、基礎をなすマトリックスに係留されたままであったが、ディッシュの表面に近い位置に固定されたままの隣接する細管オルガノイドとは対照的に、振動を受けると自由に動いた。これらの嚢胞は、腎臓オルガノイドの約6％に、低い率で検出された（図31e）。重要なことに、並べてプレーティングし分化させた同質遺伝子型対照hPSCは、これらの条件下で嚢胞を形成しなかった（図31e）。PKD hPSCと対照との間でオルガノイド分化の総合的効率に相違は観察されなかった。PKD嚢胞は、最初のプレーティングの約35日後に初めて目に見えるようになり、培養の継続期間中は拡大し続けた。嚢胞は、LTLに対して、隣接する細管と同等の強いアフィニティーを呈し（図31f）、タイムラプス動画では細管構造から生じることが観察された。共焦点顕微鏡法は、細胞を欠く中空の内部コンパートメントを嚢胞裏打ち上皮が取り囲んでいることを示した（図31g）。これらの知見により、PKD変異は、胚盤葉上層スフェロイドとは異なり、細管オルガノイドからの異常な嚢胞形成をもたらすことが示唆された。
【００８３】
実施例35
考察
hPSCおよび派生する腎臓細胞の上皮特徴はほとんどわかっていない。これらの細胞タイプにおける上皮の生理機能および形態形成の再構成は、ヒト実験モデルおよび再生治療薬としてのそれらの潜在的可能性を推進する上で重要である。本明細書に記載する培養系およびアッセイは、三次元で未分化hPSCおよび子孫hPSC-KCを生成させ、それらを機能的にプロファイリングするための枠組みを確立する。hPSCは、患者特異的な免疫適合性iPSCを含む、よく特徴づけられた、均一で、遺伝的に多様な細胞タイプである。それゆえに、正しく機能するhPSC由来上皮は、再生医学への利用可能性を有しうる。
【００８４】
本発明者らは、未分化胚盤葉上層期hPSCが、3D培養において、最近mESCから得られたロゼットに似ているが拡大された管腔を持つ空洞形成スフェロイドを形成することを、初めて証明する。本発明者らの研究は、2D培養と3D培養を直接比較することにより、胚盤葉上層期におけるスフェロイド形成が、以後の細胞運命決定に著しい影響を及ぼし、心筋細胞ではなく細管オルガノイドを生産しうることを明らかにする。これらのオルガノイドは、腎臓の発生および生理機能の重要な特徴を、インビトロで再現する。これは、初代成体腎臓細胞または初代胚性腎臓細胞を使ったモデル化にとっては難題であった。hPSCからの腎臓指向的分化のための以前のプロトコールとは対照的に、スフェロイド形成とそれに続く成長因子低減マトリゲルにおけるGSK3β阻害という本発明者らの簡単な2工程手法では、線維芽細胞成長因子2（FGF2）、アクチビン、または骨形成タンパク質を外から補足する必要がない。細管構造は、実験的に利用しやすく、スケーラブルで、潜在的にハイスループットな接着マイクロプレートフォーマットにおいて、希釈ECMによって取り囲まれる。これらの構造は、従来の腎臓細胞株および腎臓オルガノイドとは異なる系譜複雑性を呈する。発生中の近位ネフロンの主要コンポーネント-細管細胞、内皮細胞、ネフロン前駆体、およびポドサイト様細胞-はすべて、個々のオルガノイド内に、腎臓様アーキテクチャーで表現される。近位尿細管は、それらが派生する元となった多能性スフェロイド上皮とは相異なる特徴的な方法で蛍光カーゴを輸送する。傷害を受けると、細管は臨床バイオマーカーKIM-1を発現する。これは、インビボの近位尿細管に著しく特有であり、脱分化した初代培養では失われる応答である。これは、創薬において失敗の原因になることが多い近位尿細管腎毒性を予測するための定量可能なヒト標準になりうる。
【００８５】
本発明者らによるPODXL-/- hPSCの研究が例証するように、この先進の分化系は、異なるヒト細胞タイプにおける特定遺伝子の機能を、同質遺伝子型遺伝的背景において決定するために、CRISPR/Cas9ゲノム編集と組み合わせることができる。本発明者らの結果から、頂底極性化、タイトジャンクション組織化、およびポドカリキシン発現の組合せが、胚盤葉上層期のhPSCとICM期の前駆体とを区別し、初期羊膜腔の形成を促進するという分子モデルが示唆される（図8a）。ポドカリキシンのアップレギュレーションとタイトジャンクションの組織化は同時に起こるが、hPSCにおいてタイトジャンクションはポドカリキシンとは無関係に組織化し、機能することができる。対照的に、ポドサイト様細胞では、齧歯類糸球体発生中およびMDCK細胞におけるタイトジャンクション表現型の報告と合致して、ポドカリキシンが、ジャンクションの組織化および隣接細胞のスペーシングに主要な役割を果たす。このようにポドカリキシンは胚盤葉上層でもポドサイトでも抗接着的役割を果たすが、細胞極性およびタイトジャンクションに対するその効果はポドサイトに限られる。ある細胞タイプ中には存在するが他の細胞タイプには存在しない共調節因子の存在を示唆するこれらの細胞タイプ特異的な相違の基礎にある正確な分子機構を決定するには、さらなる研究が必要である。ポドカリキシン発現およびポドサイト細胞骨格の変化はヒト糸球体疾患状態の詳しく記述された特徴であるから、そのような研究は病態生理学および処置への新しい洞察をもたらしうる。
【００８６】
PKDは、最も一般的な単一遺伝子疾患の一つであり、臨床家にとっても細胞生物学者にとっても大きな関心対象である。既存の細胞系は、単純スフェロイドの形成またはPKD遺伝子発現の欠陥に起因する「嚢胞」の形成に、量的な相違を報告している。しかし、これらの系では野生型細胞でもしばしば嚢胞を形成する。それゆえに、細管からのPKD特異的嚢胞形成のための再現性のある系は、種特異的な病態生理学および治療法が臨床的関心対象である分野にとって、特にヒトにおいて、重要な目標である。本発明者らは、機能喪失型PKD変異が、同質遺伝子型対照には観察されないhPSC由来細管細胞からの嚢胞形成をもたらすことを見いだした。この知見は、細管からのPKD特異的嚢胞形成が、インビトロの最小系でモデル化することのできる細胞固有の現象であることを示唆している。嚢胞形成はPKD1変異体でもPKD2変異体でも観察され、腎臓オルガノイドに特異的であって、胚盤葉上層スフェロイドにはなかったので、この表現型は、この系において遺伝子特異的かつ系譜特異的である。この系における嚢胞形成の細胞的基礎を決定し、ヘテロ接合型変異とさまざまな遺伝的背景とを有するPKD患者からのiPSCも嚢胞を生じるかどうかを決定するには、さらなる研究が必要である。嚢胞は比較的稀な現象なので、そのような実験を行うには、iPSC分化効率の改良が必要になりうる。
【００８７】
本明細書に記載するhPSC系には制約がある。例えば本発明者らは、hPSCポドサイト様細胞および隣接する内皮からの脈管化された糸球体の形成をまだ観察していない。これらの細管は完全な刷子縁も含有しない。SIX2＋間葉は再幹細胞に隣接して観察されたが、本発明者らが、これらの細管中に尿管芽マーカーの証拠を観察することはなかった。むしろ細管は、非発生的経路によって分化するように誘発されたSIX2＋間葉由来の近位尿細管の特徴を有する。これらの培養ではニューロンが豊富であり、ニューロンは、おそらく、胚性脊髄に似た、尿管芽非存在下での腎臓細管分化のための誘発シグナルの供給源に相当するのであろう。このhPSCベースの系のさらにもう一つの制約は、系譜追跡実験を行うための広く利用可能な蛍光レポーター株がないことである。この課題に対して考えうる解決策の一つは、表現型がhPSCに似ているマウスEpiSCに、このプロトコールを適応させることであろう。例えばSIX2-TdTomatoレポーターマウスからのEpiSCは、このマウスからの発生中の腎臓を陽性対照として使用することで、本発明者らの系におけるすべての細管細胞がSIX2＋間葉に由来するかどうかを、より確実に決定するために使用することができるだろう。全体として、本発明者らの知見は、実際に腎臓分化はhPSCから起こっているが、このインビトロプロセスは発生期の腎臓における腎形成を完全に再現しているわけではないことを示唆している。さらに進歩した疾患モデル化および治療的応用のためにこの系を完全に機能的なネフロンへとさらに発生させるには、インビボでの流体の流れおよび組織微小環境を伴う熱心な研究が必要である。
【００８８】
結論として、本発明者らは、胚盤葉上層、腎臓細管細胞、およびポドサイト様細胞をモデル化する、機能的で明確な構造を持つ上皮を再構成する3D培養系を開発した。これらの多能性上皮および子孫上皮は、一定の重要な構造的特徴を共有しているが、それでもそれらはステージ特異的な輸送特徴および形態形成機構を再現することができる。これは、相異なる発生ステージでのヒト微小生理学、傷害、および疾患をモデル化するための正確で再現性のあるプラットフォームになる。ゲノム修飾細管オルガノイドが腎臓疾患表現型を機能的に再現することは、腎臓であるというこれらの構造の同定を補強し、ヒトの腎生理機能および腎病態生理学をインビトロで研究するための画期的な細胞系を確立する。本明細書に記載する方法論は、多様な組織および遺伝的に多様な背景に広く応用および適応することができ、ヒト上皮疾患に関連する分子経路を実験的に調べるために、すぐに利用することができる。長期的には、この系は、再生移植片の投与に先だって、患者由来の上皮の機能性をインビトロで最適化し試験するための有用な環境になりうる。
【００８９】
上述のさまざまな方法および技法は、本発明を実行するための方法をいくつか提供している。当然ながら、必ずしもすべての目的または利点が、本明細書に記載したどの特定態様でも達成されうるとは限らないと理解すべきである。したがって例えば、本方法が、本明細書において教示または示唆されうる他の目的または利点を必ずしも達成することなく、本明細書において教示される一つの利点または一群の利点を達成しまたは最適化するような方法で行われうることは、当業者にはわかるであろう。本明細書では種々の有利な選択肢および不利な選択肢に言及する。一部の好ましい態様は特に一つの、別の、またはいくつかの有利な特徴を含み、一方、別の好ましい態様は特に一つの、別の、またはいくつかの不利な特徴を排除し、一方、また別の好ましい態様は特に、一つの、別の、またはいくつかの有利な特徴の包含によって現存の欠点を軽減すると理解すべきである。
【００９０】
さらにまた、当業者には、異なる態様からのさまざまな特徴の利用可能性がわかるであろう。同様に、当業者は、本明細書に記載の原理による方法を行うために、上で議論したさまざまな要素、特徴および工程、ならびに上記要素、特徴または工程のそれぞれについての他の公知の等価物を取り混ぜて、それらを調和させることができる。多様な態様において、さまざまな要素、特徴、および工程のうちの一部は特に包含され、他の一部は特に排除されるであろう。
【００９１】
本発明を一定の態様および実施例に関連して開示したが、本発明の態様が、具体的に開示した態様を超えて、他の代替的態様および/または使用、ならびにその変更態様および等価物にも及ぶことは、当業者には理解されるであろう。
【００９２】
本発明の態様では多くの変形および代替的要素を開示した。さらなる変形および代替要素は当業者には明白であるだろう。これらの変形には、スフェロイド、オルガノイドの供給源、そのような細胞産物を生成させ、特徴づけ、生産する方法、および本明細書の教示によって創出される産物の特定用途などがあるが、それらに限定されるわけではない。本発明のさまざまな態様はこれらの変形または要素のいずれかを特に包含または排除することができる。
【００９３】
いくつかの態様において、本発明の一定の態様を記述しクレームするために使用される、成分の量、濃度などの特性、反応条件などを表す数字は、場合により、「約」という用語で修飾されていると理解されるべきである。したがって、いくつかの態様において、本明細書および本願特許請求の範囲に記載する数値パラメータは、特定態様が得ようとする所望の性質に依存して変動しうる近似値である。いくつかの態様において、数値パラメータは、報告された有効数字の数に照らして、通常の丸め技法を適用することによって解釈されるべきである。本発明のいくつかの態様の広い範囲を説明する数値範囲および数値パラメータは近似値であるが、具体的実施例に示す数値は、実施可能である程度には正確に報告されている。本発明のいくつかの態様において提示される数値は、それぞれの試験測定値に見いだされる標準偏差に必然的に起因する一定の誤差を含みうる。
【００９４】
いくつかの態様において、本発明の特定態様を説明する場合に（とりわけ下記のクレームのうちのいくつかに関して）使用される用語「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」ならびに同様の指示は、単数と複数の両方をカバーすると解釈することができる。本明細書における値の範囲の記載は、その範囲内に含まれる独立した値のそれぞれに個別に言及することを簡略化した方法として機能することを意図しているに過ぎない。本明細書において別段の表示がある場合を除き、個々の値は、あたかも本明細書に個別に具陳されているかのように、本明細書に組み入れられる。本明細書に記載するすべての方法は、本明細書において別段の表示がある場合を除き、または文脈上明らかに矛盾する場合を除き、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書において一定の態様に関連して提供されるありとあらゆる実施例または例示表現（例えば「など」）の使用には、本発明をより良く解明しようとする意図しかなく、他の形でクレームされた本発明の範囲に制約を課すものではない。明細書における表現に、本発明の実施に不可欠であってクレームされていない何らかの要素を示していると解釈すべきものはない。
【００９５】
本明細書において開示する本発明の代替的要素または態様のグループわけは、制約と見なしてはならない。各グループの構成要素は、個別に、またはそのグループの他の構成要素もしくは本明細書に見いだされる他の要素との任意の組合せで、言及し、クレームすることができる。あるグループの1つまたは複数の構成要素は、利便性および/または特許可能性を理由として、あるグループに含めること、またはあるグループから除外することができる。何らかのそのような包含または除外が行われる場合、本明細書は、変更が加えられたグループを包含し、よって本願特許請求の範囲において使用されるすべてのマーカッシュグループの書面による明細を満たすと見なされる。
【００９６】
本発明の好ましい態様を、発明の実施するための本発明者らが知る最善の様式を含めて、本明細書に記載する。それら好ましい態様の変形も、上述の説明を読めば、当業者には明らかになるであろう。当業者はそのような変形を適宜使用することができ、本発明は本明細書に具体的に記載した方法以外の方法で実施することができると考えられる。したがって、本発明の数多くの態様は、準拠法が許すとおり、本願に添付する特許請求の範囲に具陳する対象のあらゆる変更態様および等価物を包含する。さらに、上述の要素の任意の組合せは、そのすべての可能な変形において、本明細書に別段の表示がある場合、または文脈上明らかに矛盾する場合を除き、本発明に包含される。
【００９７】
さらにまた、本明細書の全体を通して、数多くの特許および刊行物に言及した。上で言及した参考文献および刊行物のそれぞれは、参照によりその全体が、個別に本明細書に組み入れられる。
【００９８】
最後に、本明細書に開示する本発明の態様は、本発明の原理を例示するものであると理解されるべきである。本発明の範囲には、使用することができる他の変更態様が含まれうる。したがって、限定するわけではないが例えば、本発明の代替的構成を本明細書の教示に従って利用することができる。したがって本発明の態様は、本明細書に示し説明した態様そのものに限定されない。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２ａ】
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【図２２ｂ】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５−１】
2018526010.tif 000062
【図２５−２】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３２ａ】
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【図３２ｂ】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３８−１】
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【図３８−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018526010.tif 000090
2018526010.tif 000091