(57)【要約】  本開示は、ポリペプチドタグ付きヌクレオチドに基づく組成物および方法ならびにナノポアデバイスおよび方法におけるこのようなポリペプチドタグ付きヌクレオチドの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式（Ｉ）
Ｎ−Ｐ−Ｌ−Ｔ
（Ｉ）
［式中、
Ｎは、ヌクレオシドであり、
Ｐは、ヌクレオシドの５’−Ｏ基に共有結合によって付けられたオリゴリン酸であり、オリゴリン酸は、３〜１２個のリン酸基からなり、
Ｌは、オリゴリン酸の末端リン酸基に共有結合によって付けられたリンカーであり、
Ｔは、リンカーに共有結合によって付けられたポリペプチドタグであり、ポリペプチドは、全体的な電荷を有し、少なくとも１つのヘリックス構造を含む］
の化合物。
【請求項２】
構造式（ＩＩ）：
【化１】
2018526418.tif 000032
［式中、
塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、
Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、
ｎは、１〜４であり、
リンカーは、２〜１００個の原子の共有結合によって結合した鎖を含むリンカーであり、
ポリペプチドは、全体的な電荷および少なくとも１つのヘリックス構造を含むポリペプチドタグである］
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ポリペプチドタグの長さが、少なくとも１６個のアミノ酸残基であり、任意選択で、ポリペプチドタグの長さが、少なくとも２０個のアミノ酸残基、少なくとも２５個のアミノ酸残基、少なくとも３０個のアミノ酸残基、少なくとも４０個のアミノ酸残基、少なくとも５０個のアミノ酸残基、少なくとも６０個のアミノ酸残基、少なくとも７０個のアミノ酸残基、少なくとも８０個のアミノ酸残基または少なくとも９０個のアミノ酸残基である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
ヘリックス構造が、少なくとも８個のアミノ酸残基を含み、任意選択で、ポリペプチドヘリックス構造が、少なくとも１６個のアミノ酸残基、少なくとも２０個のアミノ酸残基、少なくとも２５個のアミノ酸残基、少なくとも３０個のアミノ酸残基、少なくとも４０個のアミノ酸残基、少なくとも５０個のアミノ酸残基または少なくとも６０個のアミノ酸残基を含む、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項５】
ヘリックス構造が、α−ヘリックスであり、任意選択で、α−ヘリックスの長さが、少なくとも１０個のアミノ酸残基、少なくとも１６個のアミノ酸残基、少なくとも２０個のアミノ酸残基、少なくとも２５個のアミノ酸残基、少なくとも３０個のアミノ酸残基または少なくとも４０個のアミノ酸残基である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項６】
前記α−ヘリックスが、少なくとも３個のアミノ酸残基を含む配列モチーフの少なくとも２つの反復を含み、任意選択で、配列モチーフが、少なくとも４個のアミノ酸残基、少なくとも５個のアミノ酸残基または少なくとも６個のアミノ酸残基を含む、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記反復が、非ヘリックス形成性であるアミノ酸残基によって中断されない、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
アミノ酸配列モチーフが、ＥＡＡＡ、ＡＥＡＡ、ＡＡＥＡ、ＡＡＡＥ、ＤＡＡＡ、ＡＤＡＡ、ＡＡＤＡ、ＡＡＡＤ、ＲＡＡＡ、ＡＲＡＡ、ＡＡＲＡ、ＡＡＡＲ、ＫＡＡＡ、ＡＫＡＡ、ＡＡＫＡおよびＡＡＡＫからなるモチーフの群から選択される、請求項６に記載の化合物。
【請求項９】
ポリペプチドタグの全体的な電荷が負であり、任意選択で、ポリペプチドタグの全体的な電荷が、約−１０から−３０の間である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項１０】
リンカーから遠位のポリペプチドタグの末端に位置するアミノ酸残基の２５％は、リンカーから近位のポリペプチドタグの末端に位置するアミノ酸残基の２５％の正味電荷絶対値よりも大きい正味電荷絶対値を有する、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｐが、３〜９個のリン酸基、任意選択で、４〜６個のリン酸基または任意選択で、６個のリン酸基からなる、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項１２】
リンカーが、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾール、ジヒドロピリダジン、ホスホジエステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびそれらの組合せからなる群から選択される化学基を含む、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項１３】
構造式（ＩＩ）
【化２】
2018526418.tif 000033
［式中、
塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、
Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、
ｎは、１〜４であり、
リンカーは、２〜１００個の原子の共有結合によって結合した鎖を含むリンカーであり、
ポリペプチドは、全体的な電荷および少なくとも１つのヘリックス構造を含むポリペプチドタグである］
のポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物を調製する方法であって、
（ａ）（ｉ）５’位に３〜１２個のリン酸が付けられ、末端リン酸が第１のリンカー形成基と連結されたヌクレオチドおよび（ｉｉ）少なくとも１つのヘリックス構造を含み、全体的な電荷を有し、第１のリンカー形成基と反応してリンカーを形成することが可能である第２のリンカー形成基と連結されたポリペプチドタグを提供するステップであって、
−第１のリンカー形成基が、構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）の化合物から選択され、第２のリンカー形成基が、構造式（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）の対応する反応性化合物であるか、または
−第１のリンカー形成基が、構造式（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）の化合物から選択され、第２のリンカー形成基が、構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）の対応する反応性化合物であるステップと、
（ｂ）第１のリンカー形成基を第２のリンカー形成基と反応させ、それによって、ヌクレオチドとポリペプチドタグ間の共有結合性連結を形成するステップと
を含む、前記方法。
【請求項１４】
（１）第１のリンカー形成基が、アルキンおよびジエンからなる群から選択され、第２のリンカー形成基が、アジドおよびテトラジンからなる群から選択されるか、または（２）第１のリンカー形成基が、アジドおよびテトラジンからなる群から選択され、第２のリンカー形成基が、アルキンおよびジエンからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
各々異なるタグを有するタグ付きヌクレオチドのセットを含む組成物であって、異なるタグは各々、ナノポア中に位置付けられると異なる遮断電流を引き起こし、セットは、請求項１から１５のいずれか一項に記載の少なくとも１種の化合物を含む、組成物。
【請求項１６】
核酸の配列を決定するための方法であって、
（ａ）膜、膜のシス側およびトランス側の電極、細孔が膜を通って伸長するナノポア、両電極と接触する電解質溶液、ナノポアに隣接して位置する活性ポリメラーゼおよびポリメラーゼと複合体を形成しているプライマー鎖を含む、ナノポアシーケンシング組成物を提供するステップと、
（ｂ）ナノポアシーケンシング組成物を、（ｉ）核酸の鎖および（ｉｉ）各々異なるタグを有するタグ付きヌクレオチドのセットと接触させるステップであって、異なるタグが各々、ナノポア中に位置付けられると異なる遮断電流および／もしくは遮断電流を引き起こし、ならびに／または異なる滞留時間を有し、セットが、請求項１から１５のいずれか一項に記載の少なくとも１種の化合物を含むステップと、
（ｃ）タグの異なる遮断電流および／もしくは遮断電圧ならびに／または異なる滞留時間を経時的に検出し、核酸配列に対して相補的である（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）ポリメラーゼによって組み込まれた異なるタグ付きヌクレオチドの各々と相関させ、それによって核酸配列を決定するステップと
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本出願は、タグ付きヌクレオチド組成物であって、タグがポリペプチドを含む組成物、核酸をシーケンシングするために開示されたポリペプチドタグ付きヌクレオチド組成物を調製し、使用する方法、特に、ナノポアに基づくシーケンシング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]核酸シーケンシングは、核酸のヌクレオチド配列を決定するためのプロセスである。このような配列情報は、対象を診断および／または治療するのに役立ち得る。例えば、対象の核酸の配列は、遺伝病を同定、診断するために、および潜在的に遺伝病の治療を開発するために使用できる。別の例として、病原体への研究は、伝染病の治療につながり得る。一部の疾患は、何百万ものヌクレオチド中のわずか１ヌクレオチドの相違を特徴とするので、高度に正確なシーケンシングが必須である。
【０００３】
[0003]ナノポアを使用する単一分子合成時解読（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（ＳＢＳ）技術が開発されている。例えば、米国特許公開第２０１３／０２４４３４０  Ａ１号、同２０１３／０２６４２０７  Ａ１号、同２０１４／０１３４６１６  Ａ１号を参照のこと。ナノポアＳＢＳは、標的配列鋳型と相補的であるＤＮＡ鎖を合成するためにポリメラーゼを使用することおよび各ヌクレオチドモノマーが成長する鎖に加えられるのと同時に、各ヌクレオチドモノマーの同一性を決定し、それによって標的配列を決定することを含む。加えられるヌクレオチドモノマーは各々、鎖が合成される時間にわたって、ポリメラーゼ活性部位に隣接して位置するナノポアを通る電流をモニタリングすることによって検出される。正確なシグナルを得ることは、ポリメラーゼ活性部位をナノポアの付近に適切に位置付けることおよびナノポアに入ることができ、細孔を流れる電流の同定可能な変化を提供することができる、加えられるヌクレオチド各々でのタグの使用を必要とする。正確なナノポアシーケンシングを提供するために、タグがナノポア中入り、十分な時間量の間ナノポア中にあること（すなわち「滞留時間」）が重要であり、ナノポア中にある間に、十分な検出可能な、同定可能な、ナノポアを通る電流の遮断（すなわち「遮断電流」）を提供し、その結果、タグを会合された特定のヌクレオチドを、他のタグ付きヌクレオチドから明白に区別することができる。
【０００４】
[0004]Ｋｕｍａｒら、（２０１２）「ＰＥＧ−Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、２：６８４；ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ００６８４には、ナノポアを使用して、末端５’−ホスホルアミダートを介してｄＧヌクレオチドに付けられた４種の異なる長さのＰＥＧ−クマリンタグを区別することが記載されており、ＤＮＡポリメラーゼによるこれら４種のＰＥＧ−クマリンタグ付きｄＧヌクレオチドの効率的かつ正確な組込みを個々に実証する。２０１３年９月１９日に公開された米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０  Ａ１号、２０１３年１０月１０日に公開された同２０１３／０２６４２０７  Ａ１号および２０１４年５月１４日に公開された同２０１４／０１３４６１６  Ａ１号も参照のこと。
【０００５】
[0005]Ｓｔｅｆｕｒｅａｃら（２００６）には、α−溶血素による膜を通るペプチドの輸送が記載されているが、シーケンシングのためのこの輸送現象の使用は提案しなかった（例えば、Ｓｔｅｆｕｒｅａｃら、「Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｌｐｈａ−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  ａｎｄ  Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ  Ｐｏｒｅｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００６、４５、９１７２；Ｓｔｅｆｕｒｅａｃら、「Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｎａｎｏｐｏｒｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ＡＣ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄ」、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．２０１２、４８、１０２８を参照のこと）。
【０００６】
[0006]ＷＯ２０１３／１５４９９９には、概して、タグがペプチドまたはアミノ酸を含み得るタグ付きヌクレオチドの使用が記載されており、具体的には、タグが、化合物の残部の電荷と符号が逆である電荷を有することを提供する。したがって、ヌクレオチドに付けられたペプチドタグは、リン酸の数のバランスをとるために適当な数のリジンまたはアルギニンを有さなくてはならない。
【０００７】
[0007]ＷＯ２０１３／１９１７９３は、概して、ヌクレオチドタグとしてのペプチドの使用が開示されているが、特定のペプチド配列またはこのようなペプチドタグの特性は提供されていない。
【０００８】
[0008]米国特許第８，６５２，７７９  Ｂ２号には、概して、ナノポアシーケンシングのための「電荷遮断標識」としてのペプチドの可能性ある使用が記載されており、３種の、６〜７個のリジン残基を有する正電荷を有する７マーおよび１１マーのペプチド遮断標識を開示している。しかし、米国特許第８，６５２，７７９  Ｂ２号は、これらの標識が、実際のナノポアが付いたポリメラーゼと結合し、シーケンシングに十分な、必要なナノポア電流遮断レベルおよび滞留時間を提供できることを実証できなかった。
【０００９】
[0009]上記の先行開示は、ナノポアシーケンシングの適用にとって有用であるように、十分な長さの滞留時間および十分に狭く識別可能である遮断電流を提供できる特定のポリペプチドタグ構造を教示できなかった。したがって、ポリペプチドタグ付きヌクレオチド組成物ならびにナノポアおよびその他のシーケンシング技術において使用できる方法が依然として必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
[0010]本開示は、ポリペプチドタグ付きヌクレオチドの組成物およびナノポアシーケンシングにおけるその使用を含む、このようなポリペプチドタグ付きヌクレオチドを調製し、使用するためのプロセスを提供する。これらのタグ付きヌクレオチド化合物のポリペプチドタグは、少なくとも１つのヘリックス構造および全体的な電荷を含む。ポリペプチドタグ付きヌクレオチドは、ナノポア検出システムにおける使用に十分に適しており、限定されるものではないが、より狭い分散を有するより大きな遮断電流低減（開口チャネル電流に対して）、ナノポアにおける長い滞留時間およびより少ない非特異的捕獲事象による低いバックグラウンド電流を含む、ナノポア検出の驚くべき利点を提供する。さらに、本明細書において記載されるように、本開示の種々のポリペプチドタグ付きヌクレオチドは、識別可能なナノポア遮断電流およびその他のナノポア検出の特徴を提供できる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
[0011]一部の実施形態においては、本開示は、構造式（Ｉ）
Ｎ−Ｐ−Ｌ−Ｔ
（Ｉ）
［式中、Ｎは、ヌクレオシドであり、Ｐは、ヌクレオシドの５’−Ｏ基に共有結合によって付けられたオリゴリン酸であり、オリゴリン酸は、３〜１２個のリン酸基からなり、Ｌは、オリゴリン酸の末端リン酸基に共有結合によって付けられたリンカーであり、Ｔは、リンカーに共有結合によって付けられたポリペプチドタグであり、ポリペプチドは、全体的な電荷を有し、少なくとも１つのヘリックス構造を含む］
の化合物を提供する。
【００１２】
[0012]一部の実施形態においては、構造式（Ｉ）の化合物は、構造式（ＩＩ）：
【００１３】
【化１】
2018526418.tif 000002
【００１４】
［式中、塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、１〜４であり、リンカーは、２〜１００個の原子の共有結合によって結合した鎖を含むリンカーであり、ポリペプチドは、全体的な電荷および少なくとも１つのヘリックス構造を含むポリペプチドタグである］
を含む。
【００１５】
[0013]本開示は、本明細書において別の場所に開示されるような、塩基、オリゴリン酸、リンカーおよびポリペプチドタグを含む種々の構造の範囲を含む、構造式（Ｉ）および（ＩＩ）によって包含される種々の部分構造の化合物をさらに提供する。
【００１６】
[0014]例えば、一部の実施形態においては、構造式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物は、ポリペプチドタグを含むことができ、ポリペプチドタグの長さは、本明細書において開示されるような中間の長さ範囲を含む、少なくとも１６個のアミノ酸残基から少なくとも９０個のアミノ酸残基の範囲である。一部の実施形態においては、ポリペプチドタグのヘリックス構造は、少なくとも８個アミノ酸残基から少なくとも６０個のアミノ酸残基を含むことができ、本明細書において開示されるような種々の中間の範囲を含む。一部の実施形態においては、ヘリックス構造は、α−ヘリックスであり、任意選択で、α−ヘリックスの長さは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、少なくとも１６個のアミノ酸残基、少なくとも２０個のアミノ酸残基、少なくとも２５個のアミノ酸残基、少なくとも３０個のアミノ酸残基または少なくとも４０個のアミノ酸残基である。さらに、一部の実施形態においては、α−ヘリックスは、少なくとも３個のアミノ酸残基を含む配列モチーフの少なくとも２つの反復、任意選択で、少なくとも４個のアミノ酸残基、少なくとも５個のアミノ酸残基または少なくとも６個のアミノ酸残基を含む配列モチーフの２つの反復を含む、種々の配列モチーフを含み得る。一部の実施形態においては、配列モチーフは、ホモポリマーであり、任意選択で、ホモポリマー配列モチーフは、配列ＡＡＡを含み得る。一部の実施形態においては、配列モチーフの反復は、非ヘリックス形成性であるアミノ酸残基によって中断され得ない。特定の実施形態においては、配列モチーフは、ＥＡＡＡ、ＡＥＡＡ、ＡＡＥＡ、ＡＡＡＥ、ＤＡＡＡ、ＡＤＡＡ、ＡＡＤＡ、ＡＡＡＤ、ＲＡＡＡ、ＡＲＡＡ、ＡＡＲＡ、ＡＡＡＲ、ＫＡＡＡ、ＡＫＡＡ、ＡＡＫＡおよびＡＡＡＫからなるモチーフの群から選択される。
【００１７】
[0015]ポリペプチドタグの特徴に関連する一部の実施形態においては、ポリペプチドタグの全体的な電荷は、負であり、任意選択で、ポリペプチドタグの全体的な電荷は、約−１０から−３０の間である。負電荷を有するポリペプチドタグの一部の実施形態においては、リンカーから遠位の末端のポリペプチドタグの少なくとも３個のアミノ酸残基は、負電荷を有する残基であり、任意選択で、リンカーから遠位の末端のポリペプチドタグの少なくとも５個のアミノ酸残基は、負電荷を有する残基である。特定の実施形態においては、負電荷を有する残基は、グルタミン酸、アスパラギン酸、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、ホモ−グルタミン酸、システイン酸、ホスホセリン、ホスホトレオニン、ホスホチロシンおよびそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態においては、リンカーから遠位のポリペプチドタグの末端に位置するアミノ酸残基の２５％は、リンカーから近位のポリペプチドタグの末端に位置するアミノ酸残基の２５％の正味電荷絶対値よりも大きい正味電荷絶対値を有する。
【００１８】
[0016]一部の実施形態においては、ポリペプチドタグは、表４から選択されるポリペプチドタグを含む。
[0017]一部の実施形態においては、構造式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物は、構造式（ＩＩＩ）：
【００１９】
【化２】
2018526418.tif 000003
【００２０】
［式中、「塩基」は、天然に存在する、または天然に存在しない核酸塩基であり、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、１〜１０であり、「ポリペプチド」は、全体的な電荷を有し、少なくとも１つのヘリックス構造を含むポリペプチドであり、「−ＬＢ−Ｘ−ＬＡ−」はリンカーであり、ＬＡおよびＬＢは各々、２〜１００個の原子の共有結合によって結合した鎖を含み、Ｘは、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾールおよびジヒドロピリダジンからなる群から選択される化学部分である］
の化合物を含むが、これに限定されない、さまざまな異なるリンカー構造を含む化合物を含み得る。構造式（ＩＩＩ）の化合物の一部の実施形態においては、ＬＡおよびＬＢは各々独立に、構造式（ＸＶＩＩＩａ）から（ＸＶＩＩＩｄ）から選択されるリンカー構造を含む。一部の実施形態においては、ＬＢは、アミノ酸残基を含み、任意選択で、ＬＢは、ポリペプチドタグのＮ末端またはＣ末端のアミノ酸残基を含み得る。
【００２１】
[0018]本開示はまた、本明細書において開示されるような塩基、オリゴリン酸、リンカーおよびポリペプチドタグを含む種々の構造の範囲を含む、構造式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）のいずれか１種または構造式（Ｉ）および（ＩＩ）によって包含される種々の部分構造のいずれかの化合物を調製するための方法を提供する。
【００２２】
[0019]本開示はまた、各々異なるタグを有するタグ付きヌクレオチドのセットを含む組成物を提供し、異なるタグは各々、ナノポア中に位置付けられると異なる遮断電流を引き起こし、セットは、本明細書において開示されるような塩基、オリゴリン酸、リンカーおよびポリペプチドタグを含む種々の構造の範囲を含む、構造式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）のいずれか１種または構造式（Ｉ）および（ＩＩ）によって包含される種々の部分構造のいずれかの少なくとも１種の化合物を含む。
【００２３】
[0020]本開示はまた、本明細書において開示されるような塩基、オリゴリン酸、リンカーおよびポリペプチドタグを含む種々の構造の範囲を含む、構造式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）のいずれか１種または構造式（Ｉ）および（ＩＩ）によって包含される種々の部分構造のいずれかの少なくとも１種の化合物を利用する核酸の配列を決定するための方法も提供する。したがって、一部の実施形態においては、本開示は、（ａ）膜、膜のシス側およびトランス側の電極、細孔が膜を通って伸長するナノポア、両電極と接触する電解質溶液、ナノポアに隣接して位置する活性ポリメラーゼおよびポリメラーゼと複合体を形成しているプライマー鎖を含む、ナノポアシーケンシング組成物を提供するステップと、（ｂ）ナノポアシーケンシング組成物を、（ｉ）核酸の鎖および（ｉｉ）各々異なるタグを有するタグ付きヌクレオチドのセットと接触させるステップであって、異なるタグが各々、ナノポア中に位置付けられると異なる遮断電流を引き起こし、および／または異なる滞留時間を有し、セットが、本明細書において開示されるような塩基、オリゴリン酸、リンカーおよびポリペプチドタグを含む種々の構造の範囲を含む、構造式（ｉ）および（ｉｉ）によって包含される種々の部分構造のいずれかを含む、構造式（ｉ）または（ｉｉ）の少なくとも１種の化合物を含むステップと、（ｃ）タグの異なる遮断電流および／もしくは遮断電圧ならびに／または異なる滞留時間を経時的に検出し、核酸配列に対して相補的である（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）ポリメラーゼによって組み込まれた異なるタグ付きヌクレオチドの各々と相関させ、それによって核酸配列を決定するステップとを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】[0021]アジドアルキンクリック反応によるポリペプチドタグ付きヌクレオシド六リン酸を調製するのに有用な合成反応スキームを表す図である。
【図２】[0022]ＪＡＭ１Ａ  ＤＮＡ鋳型と複合体を形成しており、１００ｍＶ直流電位下で膜中に埋め込まれたα−ＨＬ−Ｐｏｄｌ２ポリメラーゼコンジュゲートを使用する、ポリペプチドタグ付きヌクレオチドｄＴ６Ｐ−リンカー−（ＥＡＡＡ）１６−Ｅ５の「静的捕獲」ナノポア検出データを表す図である。実施例２に記載したように、ｄＴ６Ｐ−リンカー−（ＥＡＡＡ）１６−Ｅ５は、２０％  Ｏ．Ｃ．の強力な遮断電流（低分散を有する）および約９７５ｍｓの長い平均滞留時間を示す。
【図３】[0023]２種の異なるポリペプチドタグ付きヌクレオチド、ｄＴ６Ｐ−リンカー−（ＥＡＡＡ）１６−Ｅ５およびｄＴ６Ｐ−（プロパルギル）Ｋ（ＵＥ）２５−ビオチンの「静的捕獲」ナノポア検出データを表す図である。ナノポア検出は、ＪＡＭ１Ａ  ＤＮＡ鋳型と複合体形成している、２５０ｍＶ（ピークとピークの間）交流電位下で膜中に埋め込まれた、α−ＨＬ−Ｐｏｌ２ポリメラーゼコンジュゲートを用いた場合である。実施例３に記載したように、ｄＴ６Ｐ−リンカー−（ＥＡＡＡ）１６−Ｅ５（ヘリックス構造を有する）およびｄＴ６Ｐ−（プロパルギル）Ｋ（ＵＥ）２５−ビオチン（ランダムコイル構造のみを有する）は、５０％  Ｏ．Ｃ．および８０〜９０％  Ｏ．Ｃ．の容易に識別可能な遮断電流を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
[0024]本明細書における説明および添付の特許請求の範囲について、単数形「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、明確に別に示さない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「１種のタンパク質」への言及は、２種以上のタンパク質を含み、「１種の化合物」への言及は、２種以上の化合物を指す。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、互換可能であり、制限であるように意図されない。種々の実施形態の説明が、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用する場合には、当業者ならば、一部の特別な場合においては、実施形態を、代替として、言語「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を使用して説明することができるということは、さらに理解されるべきである。
【００２６】
[0025]さまざまな値が提供される場合には、明確に別段の定めがない限り、その範囲の上限および下限の間の、値の介在する整数各々および明確に別段の定めがない限り、値の介在する整数各々の１０分の１ならびに任意のその他の示された値またはその示された範囲中の介在する値が、本発明内に包含されるということは理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は独立に、より小さい範囲中に含まれ得、また、本発明内に包含され、示された範囲中の任意の具体的に排除される限界の支配下にある。示された範囲が、限界の一方または両方を含む場合には、それらの含まれる限界の（ｉ）いずれか、または（ｉｉ）両方を排除する範囲も、本発明中に含まれる。例えば、「１〜５０」は、「２〜２５」、「５〜２０」、「２５〜５０」、「１〜１０」などを含む。
【００２７】
[0026]図面を含む前記の一般的な説明および以下の詳細な説明は、単に例示的なものであって、本開示を制限するものではないということは理解されるべきである。
[0027]定義
[0028]本明細書の説明において使用される技術用語および科学用語は、別段の定めがない限り、当業者に一般に理解される意味を有する。したがって、以下の用語は、以下の意味を有するものとする。
【００２８】
[0029]「核酸」とは、本明細書において、核酸塩基、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）のうち１種またはそのバリアントを含む１種または複数の核酸サブユニットの分子を指す。核酸は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとも呼ばれる、ヌクレオチド（例えば、ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ）のポリマーを指すこともあり、一本鎖および二本鎖形態両方のＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらのハイブリッドを含む。
【００２９】
[0030]「ヌクレオチド」とは、本明細書において、核酸ポリメラーゼの基質または阻害剤として作用可能であるヌクレオシド−５’−オリゴリン酸化合物またはヌクレオシド−５’−オリゴリン酸の構造的類似体を指す。例示的ヌクレオチドとして、ヌクレオシド−５’−三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＵＴＰ）、４つ以上のリン酸の長さの５’−オリゴリン酸鎖を有するヌクレオシド（例えば、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴおよびｄＵ）（例えば、５’−テトラホスフェート（ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、５’−ペンタホスフェート（ｐｅｎｔａｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、５’−ヘキサホスフェート（ｈｅｘａｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、５’−ヘプタホスフェート（ｈｅｐｔａｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、５’−オクタホスフェート（ｏｃｔａｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ））ならびに修飾塩基部分（例えば、置換プリンまたはピリミジン塩基）、修飾糖部分（例えば、Ｏ−アルキル化糖）および／または修飾オリゴリン酸部分（例えば、チオリン酸、メチレンおよび／またはリン酸間の他の架橋を含むオリゴリン酸）を有し得るヌクレオシド−５’−三リン酸の構造的類似体が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
[0031]「ヌクレオチド類似体」とは、本明細書において、ヌクレオチドと構造的に類似しており、核酸ポリメラーゼの基質または阻害剤として働くことが可能である化学的化合物を指す。ヌクレオチド類似体は、修飾されたまたは天然に存在しない核酸塩基部分、修飾糖および／または修飾オリゴリン酸部分を有し得る。
【００３１】
[0032]「ヌクレオシド」とは、本明細書において、糖部分（例えば、リボースまたはデオキシリボース）に付けられた天然に存在する、または天然に存在しない核酸塩基を含む分子部分を指す。
【００３２】
[0033]「デオキシヌクレオシド」とは、本明細書において、天然に存在する、または天然に存在しない核酸塩基が付けられた、単一ヒドロキシル基を有する糖部分（例えば、デオキシリボースまたはデオキシヘキソース基）含む分子部分を指す。
【００３３】
[0034]「オリゴリン酸」とは、本明細書において、リン酸基のオリゴマーを含む分子部分を指す。例えば、オリゴリン酸は、２〜２０のリン酸のオリゴマー、３〜１２のリン酸のオリゴマー、３〜９のリン酸のオリゴマーを含み得る。
【００３４】
[0035]「ポリメラーゼ」とは、本明細書において、任意の天然の、または天然に存在しない酵素またはヌクレオチドモノマーの核酸ポリマーを形成する重合などの重合反応を触媒可能である他の触媒を指す。本開示の組成物および方法において使用できる例示的ポリメラーゼとして、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、クラスＥＣ２．７．７．７の酵素）、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、クラスＥＣ２．７．７．６またはＥＣ２．７．７．４８の酵素）、逆転写酵素（例えば、クラスＥＣ２．７．７．４９の酵素）およびＤＮＡリガーゼ（例えば、クラスＥＣ６．５．１．１の酵素）などの核酸ポリメラーゼが挙げられる。
【００３５】
[0036]「ナノポア」とは、本明細書において、約０．１ｎｍ〜約１０００ｎｍの特徴的な幅または直径を有する膜または他のバリア材料中に形成される、または別に提供される細孔、チャネルまたは通路を指す。ナノポアは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のα−溶血素などの天然に存在する細孔形成性タンパク質またはα−ＨＬ−Ｃ４６などの天然に存在しない（すなわち、操作された）または天然に存在するいずれかの、野生型細孔形成性タンパク質の変異体またはバリアントから作製することができる。膜は、脂質二重層などの有機膜であっても、天然に存在しないポリマー材料から作製された合成膜であってもよい。ナノポアは、例えば相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）回路または電界効果トランジスター（ＦＥＴ）回路などのセンサー、検出回路、または検出回路に連結された電極に隣接して、またはその近傍に配置してもよい。
【００３６】
[0037]「細孔形成性タンパク質」とは、本明細書において、脂質二重層または細胞膜などのバリア材料中に細孔またはチャネル構造を形成することが可能である天然のまたは天然に存在しないタンパク質を指す。この用語は、本明細書において、溶液中で細孔形成性のタンパク質および膜もしくはバリア材料中に埋め込まれた、または固体基板もしくは支持体上に固定化されている細孔形成性タンパク質の両方を含むものとする。この用語は、本明細書において、モノマーとしての細孔形成性タンパク質およびまたそれらが構築可能である任意の多量体形態を含むものとする。本開示の組成物および方法において使用できる例示的細孔形成性タンパク質として、α−溶血素（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来の）、β−溶血素、γ−溶血素、アエロリジン、溶血毒（例えば、ニューモリシン）、ロイコシジン、メリチンおよびポリンＡ（例えば、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来のＭｓｐＡ）が挙げられる。
【００３７】
[0038]「タグ」とは、本明細書において、タグと連結された分子または分子複合体を直接または間接的に検出および／または同定する能力を可能にする、または増強する分子を指す。例えば、タグは、立体容積または容量、帯電、電気化学電位および／または分光学的特徴などの検出可能な特性または特徴を提供することができる。
【００３８】
[0039]「タグ付きヌクレオチド」とは、本明細書において、オリゴリン酸部分、塩基部分または糖部分に付けられたタグを有するヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を指す。
【００３９】
[0040]「ナノポアが検出可能なタグ」とは、本明細書において、ナノポア中に入ることができる、ナノポア中に配置するようになることができる、ナノポアによって捕獲され得る、ナノポアを通って転位置することができる、および／またはナノポアを横切ることができ、それによってナノポアを通る電流の検出可能な変化をもたらすタグを指す。例示的なナノポアが検出可能なタグとして、検出可能なナノポア電流の変化をもたらし得る、いずれも任意選択で、色素部分またはフルオロフォアなどの化学基を用いて修飾されてもよく、それらと連結されてもよい、ポリエチレングリコール、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、炭水化物、ペプチド核酸ポリマー、ロックド核酸ポリマーなどの天然または合成ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
[0041]「リンカー」とは、本明細書において、２以上の分子、分子基および／または分子部分の間の幾分かの空間を有する結合取付けを提供する任意の分子部分を指す。
[0042]「ペプチド」とは、本明細書において、アミド結合によって共有結合される少なくとも２個のアミノ酸を指す。
【００４１】
[0043]「アミノ酸」とは、本明細書において、アミンおよびカルボキシ官能基および側鎖を含む化合物を指す。アミノ酸は、標準の２０種の遺伝子によってコードされるα−アミノ酸ならびに別のアミノ酸との縮合反応を起こして、ペプチドを形成することができる、当技術分野で公知の、および／または本明細書において開示される、任意の他の天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸を含み得る。
【００４２】
[0044]「ポリペプチド」とは、本明細書において、２〜約４００個以上のアミノ酸のポリマーを指す。ポリペプチド配列を、１文字または３文字略語（またはそれらの混合物）の列として本明細書において提示する場合には、配列を、一般的な慣例に従ってアミノ（Ｎ）からカルボキシ（Ｃ）方向に提示する。
【００４３】
[0045]「ヘリックス構造」とは、本明細書において、α−ヘリックス構造などの１つまたは複数の３次元らせん状またはループ構造を形成する、アミノ酸のオリゴマーまたはポリマーを指す。
【００４４】
[0046]「全体的な電荷」とは、本明細書において、ポリペプチドタグに関連して、ポリペプチドタグを構成するアミノ酸残基の正電荷を有するおよび負電荷を有する側鎖の合計を指す。例えば、正電荷（＋１）を有する５個のリジン残基を有するポリペプチドを含むポリペプチドタグおよび負電荷（−１）を有する１５個のグルタミン酸残基は、−１０の全体的な電荷を有する。
【００４５】
[0047]「バックグラウンド電流」とは、本明細書において、電位が印加され、ナノポアが開口し、遮断されていない（例えば、ナノポア中にタグがない）ときに、ナノポア中にわたって測定された電流レベルを指す。
【００４６】
[0048]「遮断電流」とは、本明細書において、電位が印加され、タグがナノポアに存在するときにナノポア中にわたって測定された電流レベルを指す。一般に、ナノポア中のタグ分子の存在は、ナノポアを通る帯電分子の流れを制限し、それによって、電流レベルをバックグラウンドから変化させる。
【００４７】
[0049]「遮断電圧」とは、本明細書において、電流がかけられ、タグがナノポア中に存在するときに、ナノポア中にわたって測定された電圧レベルを指す。一般に、ナノポア中のタグ分子の存在は、ナノポアを通る帯電分子の流れを制限し、それによって、電圧レベルをバックグラウンドから変化させる。
【００４８】
[0050]「滞留時間」とは、本明細書において、ナノポアにおけるタグの捕獲に関連して、遮断電流によって検出されるような、タグが、ナノポア中で過ごす時間を指す。
[0051]「天然に存在する」とは、天然に見られる形態を指す。例えば、天然に存在するまたは野生型タンパク質は、天然に見られる供給源から単離することができる生物中に存在する、ヒトの操作によって意図的に改変されていない配列を有するタンパク質である。
【００４９】
[0052]「天然に存在しない」または「組換え」または「操作された」または、例えば、核酸、ポリペプチドもしくは細胞に関して使用される場合には、そうでなければ天然に存在しない方法で改変されている、または同一であるが、合成材料から、および／もしくは組換え技術を使用する操作によって製造される、もしくはそれに由来する材料を指す。限定されない例として、中でも、細胞の天然（非組換え）形態内では見られない遺伝子を発現する、またはそうでなければ異なるレベルで発現される天然遺伝子を発現する組換え細胞が挙げられる。
実施形態の詳細な説明
第１の態様において、本発明は、構造式（Ｉ）
Ｎ−Ｐ−Ｌ−Ｔ
（Ｉ）
［式中、
Ｎは、ヌクレオシドであり、
Ｐは、ヌクレオシドの５’−Ｏ基に共有結合によって付けられたオリゴリン酸であり、オリゴリン酸は、３〜１２個のリン酸基からなり、
Ｌは、オリゴリン酸の末端リン酸基に共有結合によって付けられたリンカーであり、
Ｔは、リンカーに共有結合によって付けられたポリペプチドタグであり、ポリペプチドは、全体的な電荷を有し、少なくとも１つのヘリックス構造を含む］
の化合物を提供する。
【００５０】
好ましくは、化合物は、構造式（ＩＩ）：
【００５１】
【化３】
2018526418.tif 000004
【００５２】
［式中、
塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、
Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、
ｎは、１〜４であり、
リンカーは、２〜１００個の原子の共有結合によって結合した鎖を含むリンカーであり、
ポリペプチドは、全体的な電荷および少なくとも１つのヘリックス構造を含むポリペプチドタグである］
を含む。
【００５３】
ポリペプチドタグの長さは、少なくとも１６個のアミノ酸残基、少なくとも２０個のアミノ酸残基、少なくとも２５個のアミノ酸残、少なくとも３０個のアミノ酸残基、少なくとも４０個のアミノ酸残基、少なくとも５０個のアミノ酸残基、少なくとも６０個のアミノ酸残基、少なくとも７０個のアミノ酸残基、少なくとも８０個のアミノ酸残基または少なくとも９０個のアミノ酸残基であり得る。ヘリックス構造は、少なくとも８個のアミノ酸残基、任意選択で、少なくとも１６個のアミノ酸残基、少なくとも２０個のアミノ酸残基、少なくとも２５個のアミノ酸残基、少なくとも３０個のアミノ酸残基、少なくとも４０個のアミノ酸残基、少なくとも５０個のアミノ酸残基または少なくとも６０個のアミノ酸残基を含み得る。例えば、アミノ酸残基の少なくとも５０％または少なくとも７５％は、Ａ残基である。
【００５４】
ヘリックス構造は、α−ヘリックスであり得、α−ヘリックスの長さは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、少なくとも１６個のアミノ酸残基、少なくとも２０個のアミノ酸残基、少なくとも２５個のアミノ酸残基、少なくとも３０個のアミノ酸残基または少なくとも４０個のアミノ酸残基である。前記α−ヘリックスは、少なくとも３個のアミノ酸残基、少なくとも４個のアミノ酸残基、少なくとも５個のアミノ酸残基または少なくとも６個のアミノ酸残基を含む配列モチーフの少なくとも２つの反復を含み得る。配列モチーフは、配列ＡＡＡを含み得るホモポリマーであり得る。前記反復は、非ヘリックス形成性であるアミノ酸残基によって中断され得ない。一実施形態においては、前記配列モチーフは、少なくとも２個のＡ残基または３個のＡ残基および荷電アミノ酸残基を含み得る４個のアミノ酸からなる。例えば、４個のアミノ酸配列モチーフは、ＥＡＡＡ、ＡＥＡＡ、ＡＡＥＡ、ＡＡＡＥ、ＤＡＡＡ、ＡＤＡＡ、ＡＡＤＡ、ＡＡＡＤ、ＲＡＡＡ、ＡＲＡＡ、ＡＡＲＡ、ＡＡＡＲ、ＫＡＡＡ、ＡＫＡＡ、ＡＡＫＡおよびＡＡＡＫからなるモチーフの群から選択される、または少なくとも２個のＡ残基、荷電アミノ酸残基ならびにＦ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、ＷおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸を含む。前記反復は、非ヘリックス形成性であるアミノ酸残基によって中断され得ない。
【００５５】
ポリペプチドタグの全体的な電荷は、負であり得、例えば、ポリペプチドタグの全体的な電荷は、約−１０から−３０の間である。リンカーから遠位の末端のポリペプチドタグの少なくとも３個、４個または５個のアミノ酸残基は、負電荷を有する残基であり得る。負電荷を有する残基は、グルタミン酸、アスパラギン酸、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、ホモ−グルタミン酸、システイン酸、ホスホセリン、ホスホトレオニン、ホスホチロシンおよびそれらの組合せからなる群から選択される。全体に、リンカーから遠位のポリペプチドタグの末端に位置するアミノ酸残基の２５％は、リンカーから近位のポリペプチドタグの末端に位置するアミノ酸残基の２５％の正味電荷絶対値よりも大きい正味電荷絶対値を有し得る。特定の実施形態においては、ポリペプチドタグは、表４から選択されるポリペプチドタグを含む。
【００５６】
元素「Ｐ」は、３〜９個のリン酸基、任意選択で、４〜６個のリン酸基または任意選択で、６個のリン酸基からなり得る。リンカー「Ｌ」は、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾール、ジヒドロピリダジン、ホスホジエステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびそれらの組合せからなる群から選択される化学基を含み得る。好ましくは、リンカーは、トリアゾール、ジヒドロピリダジン、アミド、チオエーテル、エーテル、エステル、ホスホジエステル、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾンおよびオキシムからなる群から選択される化学基を含む。一実施形態では、リンカーは、アジド基のアルキン基との反応によって生成したトリアゾール基を含む。
【００５７】
本発明の化合物はまた、構造式（ＩＩＩ）：
【００５８】
【化４】
2018526418.tif 000005
【００５９】
［式中、
「塩基」は、天然に存在する、または天然に存在しない核酸塩基であり、
Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎａは、１〜１０であり、
「ポリペプチド」は、全体的な電荷を有し、少なくとも１つのヘリックス構造を含むポリペプチドであり、
「−ＬＢ−Ｘ−ＬＡ−」は、リンカーであり、
ＬＡおよびＬＢは、各々、２〜１００個の原子の共有結合によって結合した鎖を含み、
Ｘは、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾールおよびジヒドロピリダジンからなる群から選択される化学部分である］
を含み得る。
【００６０】
ＬＡおよびＬＢは各々独立に、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルケン、直鎖（Ｃ１−Ｃ１２）アルキン、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾール、ジヒドロピリダジン、ホスホジエステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびそれらの組合せからなる群から選択される化学部分を含み得る。Ｌａは、アミノ酸残基を含み得る。ＬＢは、ポリペプチドタグのＮ末端またはＣ末端にアミノ酸残基を含み得る。
【００６１】
本発明の化合物の例は、以下の通りである：
【００６２】
【化５】
2018526418.tif 000006
【００６３】
第２の態様において、本発明は、構造式（ＩＩ）
【００６４】
【化６】
2018526418.tif 000007
【００６５】
［式中、
塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、
Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、
ｎは、１〜４であり、
リンカーは、２〜１００個の原子の共有結合によって結合した鎖を含むリンカーであり、
ポリペプチドは、全体的な電荷および少なくとも１つのヘリックス構造を含むポリペプチドタグである］
のポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物を調製する方法を提供し、
当該方法は、以下のステップ：
（ａ）（ｉ）５’位に３〜１２個のリン酸が付けられ、末端リン酸が第１のリンカー形成基と連結されたヌクレオチドおよび（ｉｉ）少なくとも１つのヘリックス構造を含み、全体的な電荷を有し、第１のリンカー形成基と反応してリンカーを形成することが可能である第２のリンカー形成基と連結されたポリペプチドタグを提供するステップであって、
（１）第１のリンカー形成基が、構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）の化合物から選択され、第２のリンカー形成基が、構造式（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）の対応する反応性化合物であるか、または
（２）第１のリンカー形成基が、構造式（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）の化合物から選択され、第２のリンカー形成基が、構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）の対応する反応性化合物であるステップと、
（ｂ）第１のリンカー形成基を第２のリンカー形成基と反応させ、それによって、ヌクレオチドとポリペプチドタグ間の共有結合性連結を形成するステップと
を含む。
【００６６】
第１のリンカー形成基は、アルキンおよびジエンからなる群から選択され得、第２のリンカー形成基は、アジドおよびテトラジンからなる群から選択されるか、または（２）第１のリンカー形成基は、アジドおよびテトラジンからなる群から選択され、第２のリンカー形成基は、アルキンおよびジエンからなる群から選択される。一実施形態においては、第１のリンカー形成基は、アジドであり、第２のリンカー形成基は、アルキンである。
【００６７】
第３の態様においては、本発明は、各々異なるタグを有するタグ付きヌクレオチドのセットを含む組成物を提供し、異なるタグは各々、ナノポア中に位置付けられると異なる遮断電流を引き起こし、セットは、上記で開示される少なくとも１種の化合物を含む。
【００６８】
さらなる態様において、本発明は、核酸の配列を決定するための方法であって、
（ａ）膜、膜のシス側およびトランス側の電極、細孔が膜を通って伸長するナノポア、両電極と接触する電解質溶液、ナノポアに隣接して位置する活性ポリメラーゼおよびポリメラーゼと複合体を形成しているプライマー鎖を含む、ナノポアシーケンシング組成物を提供するステップと、
（ｂ）ナノポアシーケンシング組成物を、（ｉ）核酸の鎖および（ｉｉ）各々異なるタグを有するタグ付きヌクレオチドのセットと接触させるステップであって、異なるタグが各々、ナノポア中に位置付けられると異なる遮断電流を引き起こし、および／または異なる滞留時間を有し、セットが、上記で開示されるようないずれかのうち少なくとも１種の化合物を含むステップと、
（ｃ）タグの異なる遮断電流および／または異なる滞留時間を経時的に検出し、核酸配列に対して相補的である（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）ポリメラーゼによって組み込まれた異なるタグ付きヌクレオチドの各々と相関させ、それによって核酸配列を決定するステップと
を含む、方法を提供する。
【００６９】
[0053]
[0054]概要：タグ付きヌクレオチドおよびナノポアシーケンシング
[0055]本開示は、核酸のナノポアシーケンシングにとって有用である、ポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物の組成物および関連方法、デバイスおよびシステムを記載する。ポリペプチドタグ付きヌクレオチドは、鋳型核酸鎖と相補的である成長する鎖への核酸ポリメラーゼによる個々のヌクレオチド組込みを正確に検出するための方法において使用できる。一般に、鎖延長酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、その活性部位で成長する核酸鎖とハイブリダイズされる、鋳型核酸鎖に対して相補的である（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）ポリペプチドタグ付きヌクレオチドと特異的に結合する。鎖延長酵素は、次いで、ポリペプチドタグ付き相補性（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）ヌクレオチドを、成長する核酸鎖の末端に触媒によって連結する（すなわち、組み込む）。触媒的組込み事象の完了は、ポリペプチドタグおよびオリゴリン酸部分（成長する鎖中に組み込まれた１つのリン酸を引いた）の放出をもたらし、これは、次いで隣接するナノポアを通過する。
【００７０】
[0056]タグ付きヌクレオチドのタグは、組み込まれたヌクレオチドからそれを放出する触媒的プロセスを受ける前であっても、タグ付きヌクレオチドのタグは、ナノポアの細孔に入り、それによって、電位の下でナノポアのバックグラウンド電流を変化させ、検出することができる遮断電流を引き起こすことができる。タグの種々の分子特性（例えば、質量、容量、三次元構造、帯電）は、細孔とのその相互作用に大きく影響を及ぼし、それによって、ナノポア検出のために特定の、識別可能な特徴を有する種々のタグ分子を考慮に入れることができる。シーケンシングにおいてタグ付きヌクレオチドを含むタグ付き分子を検出するためにそれらを使用するためのさまざまなナノポアシステムおよび方法が、当技術分野で公知である。例えば、各々、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、２００９年５月１８日に出願された米国特許出願第１２／３０８，０９１号、Ｊｕら；２０１３年６月１４日に出願された米国特許出願第１３／９９４，４３１号、Ｊｕら；２０１３年９月１９日に公開された米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０  Ａ１号；２０１３年１０月１０日に公開された米国特許公開第２０１３／０２６４２０７  Ａ１号および２０１４年５月１４日に公開された米国特許公開第２０１４／０１３４６１６  Ａ１号；２０１３年４月８日に出願されたＰＣＴ国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ１３／３５６３５号、Ｊｕら；および２０１３年４月８日に出願されたＰＣＴ国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ１３／３５６４０号、Ｊｕらを参照のこと。
【００７１】
[0057]ほとんどの実施形態において、ナノポアシーケンシングは、成長する鎖中に酵素によって組み込まれ得る４種のヌクレオチド類似体（例えば、ｄＡ６Ｐ、ｄＣ６Ｐ、ｄＧ６ＰおよびｄＴ６Ｐ）の混合物を使用し、各ヌクレオチド類似体は、ナノポアを用いて検出されるときに同定可能な、識別可能な特徴を提供する、共有結合によって付けられたタグを有する。
【００７２】
[0058]ポリペプチド分子は、アミノ酸のポリマーである。利用可能である広範な天然に存在するおよび天然に存在しないアミノ酸およびそれらを用いて種々のポリペプチド配列に合成できる容易さのために、識別可能なナノポア検出を提供できる極めて広範な分子特性を有するポリペプチドタグの作製が可能となる。
【００７３】
[0059]本開示は、ポリペプチドタグが、アミノ酸鎖の変動する長さ、容量、三次元構造（例えば、α−ヘリックス）および全体的な電荷が含まれるが、これらに限定されない、さまざまな個別の分子特徴を特徴とする、ポリペプチドタグ付きヌクレオチドを提供する。
【００７４】
[0060]ポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物構造
[0061]一部の実施形態においては、本開示は、一般構造（Ｉ）
Ｎ−Ｐ−Ｌ−Ｔ
（Ｉ）
［式中、Ｎは、ヌクレオシドであり、Ｐは、ヌクレオシドの５’−Ｏ基に共有結合によって付けられたオリゴリン酸であり、オリゴリン酸は、３〜１２個のリン酸基を含み、Ｌは、オリゴリン酸の末端リン酸基に共有結合によって付けられたリンカーであり、Ｔは、リンカーに共有結合によって付けられたポリペプチドタグであり、ポリペプチドは、全体的な電荷を有し、少なくとも１つのヘリックス構造を含む］
の化合物であるポリペプチドタグ付きヌクレオチドを提供する。
【００７５】
[0062]ヌクレオシド（Ｎ）は、三リン酸などのオリゴリン酸（Ｐ）とヌクレオシドが共有結合によって連結される場合に、ポリメラーゼなどの鎖延長酵素によって組み込まれることが可能である任意のヌクレオシドであり得る。ヌクレオシドは、天然に存在するまたは天然に存在しない核酸塩基およびリボースまたはデオキシリボース基などの天然に存在するまたは天然に存在しない糖部分を含み得る。一部の実施形態においては、核酸塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンからなる群から選択される。糖部分は、鎖延長酵素によって触媒的に組み込まれる場合に、成長するポリヌクレオチド鎖とリン酸ジエステル結合を形成できる位置に遊離ヒドロキシル基（例えば、３’−ＯＨ基）を提供しなくてはならない。ヌクレオシド糖部分もまた、オリゴリン酸部分の共有結合取付けを可能にする基（例えば、５’−Ｏ基）を提供しなくてはならない。
【００７６】
[0063]一部の実施形態においては、ポリペプチドタグ付きヌクレオチドは、式（ＩＩ）：
【００７７】
【化７】
2018526418.tif 000008
【００７８】
［式中、「塩基」は、天然に存在する、または天然に存在しない核酸塩基であり、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、１〜１０であり、「リンカー」は、２〜１００個の原子の共有結合によって結合した鎖を含むリンカーであり、「ポリペプチド」は、全体的な電荷を有し、少なくとも１つのヘリックス構造を含むポリペプチドである］
の構造を含む化合物を含み得る。
【００７９】
[0064]一部の実施形態においては、核酸塩基（「塩基」）は、ポリメラーゼなどの鎖延長酵素によって組み込まれることが可能である任意の天然に存在する、または天然に存在しない（例えば、化学修飾された）塩基であり得る。一部の実施形態においては、核酸塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンからなる群から選択される。
【００８０】
[0065]一部の実施形態においては、ポリペプチドタグ付きヌクレオチドのオリゴリン酸（Ｐ）は、ヌクレオシドの５’−Ｏ付けられる場合に、得られたヌクレオチドが、依然としてポリメラーゼなどの鎖延長酵素によって組み込まれることが可能であることを可能にする任意のオリゴリン酸部分であり得る。一般に、ポリメラーゼなどの鎖延長酵素は、３〜１２個のリン酸基の鎖を有するオリゴリン酸を含むヌクレオチドを組み込むことが可能である。したがって、本開示のポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物（例えば、構造式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物）においては、オリゴリン酸（Ｐ）基は、３〜１２個のリン酸基を含み得る。構造式（ＩＩ）の化合物に表されるように、３〜１２個のリン酸基のオリゴリン酸は、ｎ＝１〜ｎ＝１０の値によって表される。したがって、本開示の一部の実施形態においては、ポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物は、３〜９個のリン酸基（または式（ＩＩ）のｎ＝１〜７）を含むオリゴリン酸（Ｐ）基を含む。一部の実施形態においては、オリゴリン酸基は、４〜６個のリン酸基（または式（ＩＩ）のｎ＝２〜４）を含む。一部の実施形態においては、オリゴリン酸基は、６個のリン酸基（または式（ＩＩ）のｎ＝４）を含む。
【００８１】
[0066]他の実施形態においては、本開示のポリペプチドタグ付きヌクレオチドは、４〜２０個のリン酸、４〜１２個のリン酸、４〜９個のリン酸、４〜６個のリン酸のオリゴリン酸鎖を含み、鎖は、ヌクレオシドの５’位に付けられる（例えば、５’−四リン酸、５’−五リン酸、５’−六リン酸、５’−七リン酸、５’−八リン酸、５’−九リン酸、５’−十リン酸など）。
【００８２】
[0067]本開示のポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物において、オリゴリン酸は、修飾リン酸基、リン酸類似体または他の非リン酸化学基を含み得ることがさらに考慮される。当然、オリゴリン酸中にこのようなリン酸基を含めることは、オリゴリン酸が、ヌクレオシドの５’−Ｏに付けられる場合に、得られたヌクレオチドが、依然として鎖延長酵素によって組み込まれることが可能であることを可能にしなくてはならない。典型的には、これは、α−位の天然に存在するリン酸基および鎖延長酵素による触媒組込みを受けることができるオリゴリン酸のα−位とβ−位の間のリン酸ジエステル結合を必要とする。したがって、一部の実施形態においては、オリゴリン酸は、三リン酸基を含み得る。さらに、オリゴリン酸は、リン酸またはメチレンなどの１つもしくは複数の非リン酸基を有するリン酸類似体基および／または２つ以上のリン酸基の間の架橋基のオリゴマーを含み得るということが考慮される。
【００８３】
[0068]構造式（Ｉ）および（ＩＩ）のポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物において広範なリンカーを使用できる。一般に、リンカーは、ポリペプチドタグおよびヌクレオチドの間の共有結合性連結および所望の空間または構造を提供可能である任意の分子部分を含み得る。ポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物の特定の使用のために、所望の空間または構造を選択し、最適化することができる。例えば、ナノポア検出の使用においては、ヌクレオチドが隣接するポリメラーゼと三元複合体を形成するときに、ポリペプチドタグがナノポアに入り、ナノポア中にあることを可能にする空間を提供するリンカーを選択することができる。ポリメラーゼがナノポア連結される方法に応じて、ポリペプチドタグが細孔中の場所にあるときに適した遮断電流を提供するために、わずかに短いまたは長い空間を選択してもよい。しかし、一般に、本開示のポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物において有用なリンカー（例えば、式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物）は、２〜１００個の原子の共有結合によって結合した鎖を含む。一部の実施形態においては、２〜１００個の原子のリンカー鎖は、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルケン、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキン、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾール、ジヒドロピリダジン、ホスホジエステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の化学部分を含む。ポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物において有用であるさまざまな化学部分を含むさまざまなリンカーを、本明細書において記載し、例示する。 
【００８４】
[0069]典型的には、リンカーは、ポリペプチドタグをオリゴリン酸部分に共有結合により連結する化学反応における、構造式（Ｉ）または（ＩＩ）のポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物の調製の際に形成される。より詳しくは、この化学反応は、典型的には、反応性リンカー形成基およびオリゴリン酸を含むヌクレオチドを用いて修飾されたポリペプチドタグを含み、オリゴリン酸の末端もまた、反応性リンカー形成基を用いて修飾される。このリンカー形成性化学反応を、スキーム１におけるように表すことができる。
【００８５】
【化８】
2018526418.tif 000009
【００８６】
[0070]スキーム１に表されるように、ＸＡおよびＸＢは、反応性リンカー形成基であり、ＬＡおよびＬＢは、化学部分であり、それらは、構造−ＬＢ−Ｘ−ＬＡ−の最終的に形成されるリンカーへの前駆体リンカーである。したがって、ＸＡおよびＸＢは、ポリペプチドタグとヌクレオチドの間の共有結合性連結をもたらす化学反応を起こすことが可能である化学部分である。リンカー形成基、ＸＡおよびＸＢの間のこの共有結合性連結反応の生成物は、一般構造−ＬＢ−Ｘ−ＬＡ−を含む、ポリペプチドタグとヌクレオチドの間のリンカーである。すなわち、一部の実施形態においては、式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物におけるようなリンカー「Ｌ」または「リンカー」は、スキーム１に表されるような構造式「−ＬＢ−Ｘ−ＬＡ−」のリンカーである。
【００８７】
[0071]新規化学部分、Ｘは、リンカー形成反応において生成される特有の化学部分である。ＬＡおよびＬＢによって提供されるリンカーの他の部分は、リンカーの全体的な構造に実質的に寄与し得るが、特定の化学基Ｘの名称を使用して、リンカーの種類を示すことが多い。例えば、特徴的なリンカー部分Ｘは、トリアゾール基であり得る。トリアゾール基は、アジドリンカー形成基とアルキンリンカー形成基の間の「クリック」反応において形成され得る。
【００８８】
[0072]さらに、全体的なリンカーは、トリアゾール部分の片側または両側にＣ５直鎖アルキルおよびアミド基を含み得る。したがって、一部の実施形態においては、リンカーは、リンカー形成試薬、ＸＡおよびＸＢの間のリンカー形成反応において生成した化学部分、Ｘを含み、Ｘは、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾール、ジヒドロピリダジン、ホスホジエステルおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群から選択される化学部分である。
【００８９】
[0073]化学部分、ＬＡおよびＬＢは、ポリペプチドタグまたはオリゴリン酸とそのリンカー形成基、ＸＡおよびＸＢの間のリンカーまたはスペーサーとして有効に作用できる化学基である。典型的には、ＬＡおよびＬＢは、リンカー形成反応において反応しないが、最終的に形成されるリンカーにさらなる空間または構造を提供する化学部分である。ＬＡおよびＬＢ部分は、同一であっても、異なっていてもよい。一部の実施形態においては、ＬＡまたはＬＢは、もう一方よりもかなり長いまたは短いこともあり、および／または異なる構造的特徴、例えば、多かれ少なかれコンホメーション的可動性をもたらす特徴を提供する。したがって、一部の実施形態においては、本開示のポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物において有用なＬＡおよびＬＢ部分は、２〜１００個の原子の共有結合によって結合した鎖および任意選択で、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルケン、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキン、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾール、ジヒドロピリダジン、ホスホジエステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の化学部分を含む。
【００９０】
[0074]したがって、一部の実施形態においては、本開示は、構造式（ＩＩＩ）
【００９１】
【化９】
2018526418.tif 000010
【００９２】
［式中、「塩基」は天然に存在する、または天然に存在しない核酸塩基であり、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、１〜１０であり、「ポリペプチド」は、全体的な電荷を有し、少なくとも１つのヘリックス構造を含むポリペプチドであり、「−ＬＢ−Ｘ−ＬＡ−」はリンカーであり、ＬＡおよびＬＢは各々、２〜１００個の原子の共有結合によって結合した鎖を含み、Ｘは、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾールおよびジヒドロピリダジンからなる群から選択される化学部分である］
のポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物を提供する。一部の実施形態においては、ＬＡおよびＬＢは各々独立に、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルケン、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキン、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾール、ジヒドロピリダジン、ホスホジエステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびそれらの組合せからなる群から選択される化学部分を含む。
【００９３】
[0075]例示的リンカー形成基、ＸＡおよびＸＢ、リンカー前駆体部分、ＬＡおよびＬＢならびに式−ＬＡ−Ｘ−ＬＢ−の、それらが形成する得られるリンカーを、以下の表１に示す。
【００９４】
【表１−１】
2018526418.tif 000011
【００９５】
【表１−２】
2018526418.tif 000012
【００９６】
【表１−３】
2018526418.tif 000013
【００９７】
[0077]表１は、リンカーおよび共有結合性連結リンカーをもたらす反応を起こす対応する反応性リンカー形成基の範囲を例示する。これらの種々のリンカーおよび反応は、当技術分野で周知である。当業者ならば、これらの反応に必要な試薬を同定し、それらを合成するか、または商業的に入手することができるであろう。例えば、ポリペプチド（またはタンパク質）を、他の生体分子にコンジュゲートまたは架橋するための試薬を、リンカー形成基として使用して、本開示のポリペプチドタグ−リンカー−オリゴリン酸ヌクレオチド化合物構造を調製することができる。（例えば、ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍでＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡから、またはｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍでＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡから入手可能な「ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔｓ」のカタログを参照のこと）。さらに、ポリペプチドの自動固相合成において使用できるアジドまたはアルキン基（または他のリンカー形成基）を用いて修飾された、広範なＦＭＯＣ保護アミノ酸残基が市販されている（例えば、ＡｎａＳｐｅｃ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡを参照のこと）。同様に、末端リン酸修飾ヌクレオシドおよび／またはアジドまたはアルキン基（または他のリンカー形成基）を用いるこのような修飾のための試薬は、市販されている（例えば、Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｇｍｂｈ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙを参照のこと）。
【００９８】
[0078]構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）および（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）のリンカー形成基の対のいずれも、本開示のペプチドタグ付きヌクレオチド化合物（例えば、式（ＩＩＩ）の化合物）中のリンカーを調製することにおいていずれかの配置で使用できるということが考慮される。すなわち、リンカー形成基、ＸＡおよびＸＢのいずれも、リンカー形成基が、リンカー部分Ｘを形成するリンカー反応を提供するために対合される限り、ポリペプチドタグまたはヌクレオチドのいずれでも使用できる。したがって、構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）のリンカー形成基のいずれも、ポリペプチドまたはヌクレオチドのいずれにも付けることができ、構造式（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）のコンジュゲートリンカー形成基を、もう一方に付ける。したがって、表１において形態Ｒ１−ＬＡ−Ｘ−ＬＢ−Ｒ２のリンカーにおいて表されるような基Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、ポリペプチドタグおよびヌクレオチドまたはヌクレオチドおよびポリペプチドタグのいずれかを表すことができる。
【００９９】
[0079]したがって、一部の実施形態においては、本開示は、式（ＩＩＩ）のポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物を提供し、化合物は、式Ｒ１−ＬＡ−Ｘ−ＬＢ−Ｒ２の化合物を含み、ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、ヌクレオチドおよびポリペプチドタグであるか、またはＲ１およびＲ２は、ポリペプチドタグおよびヌクレオチドであり、−ＬＡ−Ｘ−ＬＢ−は、表１における構造式（ＩＶｃ）〜（ＸＶＩＩｃ）の部分から選択される化学部分を含む。
【０１００】
[0080]上記のように、リンカーを構成する化学部分ＬＡおよびＬＢは各々独立に、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、カーボネート、カルバメート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびそれらの組合せを含む化学部分を含み得る。リンカー形成基ＸＡおよびＸＢと同様に、リンカーを構成する化学部分ＬＡおよびＬＢのいずれも、各々独立に、任意のリンカー形成基とともに使用でき、ポリペプチドタグまたはヌクレオチドのいずれかで使用できるということが考慮される。さらに、化学部分ＬＡおよびＬＢは、同一であっても、異なっていてもよいということが考慮される。式（ＩＩＩ）のポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物の一部の実施形態においては、ＬＡおよびＬＢ化学部分は、表２におけるような式（ＸＶＩＩＩａ）〜式（ＸＶＩＩＩｄ）の部分構造からなる群から独立に選択される化学部分を含む。
【０１０１】
【表２】
2018526418.tif 000014
【０１０２】
[0082]化合物（ＩＩＩ）の構造式は、ポリペプチドタグと共有結合によって連結された別個の部分として、「−ＬＢ−Ｘ−ＬＡ−」としてリンカーを表すが、一部の実施形態においては、このリンカーは、次に、標準ペプチド結合によってポリペプチドタグと連結されたアミノ酸残基を含み得るということが考慮される。このような実施形態は、本開示の実施例において例示し、ポリペプチドタグと連結されたアミノ酸は、プロパルギル（またはその他のアルキニル）基を含む。プロパルギル基は、ポリペプチドタグが、アジド−アルキンまたはアジド−シクロオクチン「クリック」反応によって所望のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）と共有結合によって連結することを可能にするアルキン「ハンドル」を提供する。このプロパルギル基は、スキーム２に例示するように、リンカー形成基（すなわち「ＸＢ」）として作用し、ヌクレオチドに付けられたアジドリンカー形成基とのリンカー形成性「クリック」反応を起こす。
【０１０３】
【化１０】
2018526418.tif 000015
【０１０４】
[0083]本明細書において開示される例示的ポリペプチドタグの各々を（例えば、以下の表４および５を参照のこと）、プロパルギル基を用いて修飾できる。特定のあり得る修飾として、Ｎ末端のプロパルギル−グリシン（「Ｐｒａ」）アミノ酸残基またはＣ末端のアミノ酸の側鎖と共有結合によって連結されたプロパルギル基（例えば、Ｃ末端リジンの側鎖イプシロンアミンのプロパルギル基修飾）を挙げることができるが、これらに限定されない。また、プロパルギル基は、アミノ酸残基側鎖の修飾であり得、アミノ酸は、ポリペプチド配列の内部部分にある（すなわち、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかにではない）ということが可能である。したがって、一部の実施形態においては、構造式（ＩＩＩ）のポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物（上記のような）は、構造式（ＸＩＸ）（すなわち、式中、Ｘは、トリアゾール基である）をさらに含むことができる。
【０１０５】
【化１１】
2018526418.tif 000016
【０１０６】
[0084]ポリペプチドタグは、Ｎ末端もしくはＣ末端のプロパルギル基または修飾が可能であるポリペプチド配列中の任意のその他のアミノ酸残基を用いて修飾することができる。一部の実施形態においては、プロパルギル修飾は、プロパルギル修飾されたアミノ酸合成試薬を含めることによってポリペプチドタグの合成の際に導入することができる。固相ポリペプチド合成において使用するためのこのような修飾されたアミノ酸試薬は、周知であり、市販されている。例えば、ポリペプチドタグの合成は、Ｌ−プロパルギルグリシンアミノ酸がそのＮ末端に付加されるステップを含むことができる。Ｎ末端Ｌ−プロパルギルグリシンアミノ酸残基（「Ｐｒａ」アミノ酸とも呼ばれる）は、アジド修飾されたヌクレオチドとの反応を起こし、ポリペプチドタグ付きヌクレオチドを形成することができるα位にプロパルギル（または２−プロピニル）基を有する。したがって、一部の実施形態においては、本開示は、構造式（ＩＩＩ）のポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物を提供し、ポリペプチドタグ（Ｔ）は、ポリペプチドのＮ末端によってリンカーに付けられる。Ｎ末端Ｐｒａアミノ酸残基を使用するこのような例を、スキーム３に例示する。
【０１０７】
【化１２】
2018526418.tif 000017
【０１０８】
[0085]したがって、一部の実施形態においては、構造式（ＩＩＩ）（上記のような）のポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物は、構造式（ＸＸ）（すなわち、式中、ＬＢは、修飾されたグリシンアミノ酸を含み、Ｘは、トリアゾール基である）をさらに含むことができる。
【０１０９】
【化１３】
2018526418.tif 000018
【０１１０】
[0086]ポリペプチドタグはまた、Ｃ末端または他の位置にプロパルギル修飾アミノ酸を用いて合成できる。例えば、試薬Ｎ２−［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］−Ｎ６−［（２−プロピニルオキシ）カルボニル］−Ｌ−リジンを使用して、プロパルギル修飾リジン残基を挿入できる。別の実施形態では、ポリペプチドタグを固相ポリペプチド合成によって合成し、次いで、ポリペプチド上の適したアミノ酸残基側鎖でプロパルギル基を用いて続いて修飾できる。例えば、リジンアミノ酸残基を、標準固相ポリペプチド合成によってポリペプチドタグ配列のＣ末端に付加できる。次いで、ポリペプチド合成に続いて、リジン側鎖のイプシロンアミン基を、プロパルギル基を用い、標準コンジュゲーション化学（例えば、ＮＨＳ−エステル付加）を使用して修飾できる。プロパルギル修飾リジンは、アジド修飾ヌクレオチドとの反応を起こして、ポリペプチドタグ付きヌクレオチドを形成することができる。Ｃ末端プロパルギル修飾リジン（すなわち、「Ｋ（プロパルギル）」）アミノ酸残基を使用するこのような例を、スキーム４に例示する。
【０１１１】
【化１４】
2018526418.tif 000019
【０１１２】
[0087]したがって、一部の実施形態においては、構造式（ＩＩＩ）（上記のような）のポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物は、構造式（ＸＸＩ）（すなわち、式中、ＬＢは、修飾リジンアミノ酸を含み、Ｘは、トリアゾール基である）をさらに含み得る。
【０１１３】
【化１５】
2018526418.tif 000020
【０１１４】
[0088]上記で記載したように、リンカー部分Ｘを形成するリンカー反応を提供するために対合される限り、ポリペプチドタグまたはヌクレオチドのいずれでもリンカー形成基、ＸＡおよびＸＢを使用できるということが考慮される。例えば、ポリペプチドタグの合成は、アジド修飾アミノ酸（例えば、Ｌ−アジドブチル−アラニン、アジド−リジン、アジド−フェニルアラニン）を配列（例えば、そのＮ末端に）に付加し、ヌクレオチドの末端リン酸をアルキン基を用いて修飾するステップを含み得る。したがって、一部の実施形態においては、スキーム５に例示されるように、ポリペプチドタグは、アジド基を含み、ヌクレオチドに付けられたプロパルギル（またはその他のアルキニル）基と「クリック」反応を起こす。
【０１１５】
【化１６】
2018526418.tif 000021
【０１１６】
[0089]したがって、一部の実施形態においては、構造式（ＩＩＩ）（上記のような）のポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物は、構造式（ＸＸＩＩ）をさらに含み得、トリアゾール基は、構造式（ＸＩＸ）の化合物に対して反対の配向である。
【０１１７】
【化１７】
2018526418.tif 000022
【０１１８】
[0090]しかし、本開示のポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物において有用なリンカーは、リンカー形成基によって形成され、構造式（ＩＩＩ）の化合物において表されるような構造−ＬＢ−Ｘ−ＬＡ−を有するリンカーに制限されない。典型的には、２種のリンカー形成基（すなわち、ＸＡおよびＸＢ）は、スキーム１におけるようなリンカー形成反応を実施するように存在することが必要であるが、２種の前駆体リンカー基の存在は必要ではない。例えば、一部の実施形態においては、１種または両方のリンカー形成基を、ポリペプチドタグおよび／またはヌクレオチドに直接付けるリンカー形成反応を実施できることが考慮される。したがって、リンカー形成基、ＸＡおよびＸＢの間の反応によって形成される部分Ｘは、完全なリンカーを提供し得る。このような例をスキーム６において例示する。
【０１１９】
【化１８】
2018526418.tif 000023
【０１２０】
[0091]ポリペプチドタグ
[0092]本開示のポリペプチドタグ付きヌクレオチドにおいてタグとして有用であるポリペプチドは、一般に、全体的な電荷および少なくとも１つのヘリックス構造を有する３０個以上のアミノ酸のポリマー鎖である。本開示のポリペプチドタグのヘリックス構造は、構造がナノポア中に入り、ナノポア中にあるときに、より少ない分散を示すより強い遮断電流を提供し得る。任意の提案される理論または機序によって制限されるような意図はなく、１６個またはより長いアミノ酸（例えば、１６〜８０個のアミノ酸）の、α−ヘリックスループなどのヘリックス構造を有するポリペプチドは、ナノポアの細孔中により良好に適合でき、リンカーまたはランダムコイル構造を有するポリペプチドよりも強い遮断電流およびより長い滞留時間を提供するということが考えられる。したがって、本開示は、さまざまな長さ、ヘリックス構造および全体的な電荷を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドタグを提供する。
【０１２１】
[0093]ポリペプチドタグの一部の実施形態においては、ポリペプチドの長さは、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１６個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも２５個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも６０個のアミノ酸、少なくとも７０個のアミノ酸、少なくとも８０個のアミノ酸またはさらにそれ以上のアミノ酸である。一部の実施形態においては、ポリペプチドの長さは、１０〜１００個のアミノ酸、１６〜９０個のアミノ酸、３０〜９０個のアミノ酸、４０〜８０個のアミノ酸または５０〜７０個のアミノ酸である。
【０１２２】
[0094]本開示のポリペプチドタグは、２０種の遺伝子によってコードされるアミノ酸に制限されない。本明細書において記載されるポリペプチドは、遺伝子によってコードされるアミノ酸に加えて、遺伝子によってコードされるＬ−アミノ酸のＤ−立体異性体（ｓｔｅｒｅｉｓｏｍｅｒｓ）、遺伝子によってコードされるα−アミノ酸のβ−置換アミノ酸異性体（例えば、β−アラニン）、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、ε−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）、δ−アミノ吉草酸（Ａｖａ）、Ｎ−メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙまたはＳａｒ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、ｔ−ブチルアラニン（Ｂｕａ）、ｔ−ブチルグリシン（Ｂｕｇ）、Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ナフチルアラニン（Ｎａｌ）、２−クロロフェニルアラニン（Ｏｃｆ）、３−クロロフェニルアラニン（Ｍｃｆ）、４−クロロフェニルアラニン（Ｐｃｆ）、２−フルオロフェニルアラニン（Ｏｆｆ）、３−フルオロフェニルアラニン（Ｍｆｆ）、４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｆｆ）、２−ブロモフェニルアラニン（Ｏｂｆ）、３−ブロモフェニルアラニン（Ｍｂｆ）、４−ブロモフェニルアラニン（ＰｂＦ）、２−メチルフェニルアラニン（ＯｍＦ）、３−メチルフェニルアラニン（Ｍｍｆ）、４−メチルフェニルアラニン（Ｐｍｆ）、２−ニトロフェニルアラニン（Ｏｎｆ）、３−ニトロフェニルアラニン（Ｍｎｆ）、４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｎｆ）、２−シアノフェニルアラニン（Ｏｃｆ）、３−シアノフェニルアラニン（Ｍｃｆ）、４−シアノフェニルアラニン（Ｐｃｆ）、２−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｏｔｆ）、３−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｍｔｆ）、４−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｐｔｆ）、４−アミノフェニルアラニン（Ｐａｆ）、４−ヨードフェニルアラニン（Ｐｉｆ）、４−アミノメチルフェニルアラニン（Ｐａｍｆ）、２，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｏｐｅｆ）、３，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｍｐｃｆ）、２，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｏｐｆｆ）、３，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｍｐｆｆ）、ピリド−２−イルアラニン（２ｐＡｌａ）、ピリド−３−イルアラニン（３ｐＡｌａ）、ピリド−４−イルアラニン（４ｐＡｌａ）、ナフタ−１−イルアラニン（１ｎＡｌａ）、ナフタ−２−イルアラニン（２ｎＡｌａ）、チアゾリルアラニン（ｔａＡｌａ）、ベンゾチエニルアラニン（ｂＡｌａ）、チエニルアラニン（ｔＡｌａ）、フリルアラニン（ｆＡｌａ）、ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）、ホモチロシン（ｈＴｙｒ）、ホモトリプトファン（ｈＴｒｐ）、ペンタフルオロフェニルアラニン（５ｆｆ）、スチリルアラニン（ｓｔｙｒｙｌｋａｌａｎｉｎｅ）（ｓＡｌａ）、アウスリルアラニン（ａｕｔｈｒｙｌａｌａｎｉｎｅ）（ａＡｌａ）、３，３−ジフェニルアラニン（Ｄｆａ）、３−アミノ−５−フェニルペンタン酸（ｐｈｅｎｙｐｅｎｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）（Ａｆｐ）、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カル���ン酸（Ｔｉｃ）、β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）、メチオニンスルホキシド（Ｍｓｏ）、Ｎ（ｗ）−ニトロアルギニン（ｎＡｒｇ）、ホモリシン（ｈＬｙｓ）、ホスホノメチルフェニルアラニン（ｐｍＰｈｅ）、ホスホセリン（ｐＳｅｒ）、ホスホトレオニン（ｐＴｈｒ）、ホモアスパラギン酸（ｈＡｓｐ）、ホモグルタミン酸（ｇｌｕｔａｎｉｃ  ａｃｉｄ）（ｈＧｌｕ）、１−アミノシクロペンタ−（２または３）−エン−４カルボン酸、ピペコリン酸（ＰＡ）、アゼチジン−３−カルボン酸（ＡＣＡ）、１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸、アリルグリシン（ａＯｌｙ）、プロパルギルグリシン（Ｐｒａ）、ホモアラニン（ｈＡｌａ）、ノルバリン（ｎＶａｌ）、ホモロイシン（ｈＬｅｕ）、ホモバリン（ｈＶａｌ）、ホモイソロイシン（ｈＩｌｅ）、ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）、Ｎ−アセチルリシン（ＡｃＬｙｓ）、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）、２，３−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）、ホモシステイン（ｈＣｙｓ）、ホモセリン（ｈＳｅｒ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）およびホモプロリン（ｈＰｒｏ）を含むが、これらに限定されない、他の合成または天然に存在するコードされないアミノ酸を、全体または部分のいずれかで含み得る。本明細書において記載されるポリペプチドタグにおいて有用なさらなるコードされないアミノ酸は、当業者には明らかであろう（例えば、Ｆａｓｍａｎ、１９８９、ＣＲＣ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、ａｔ  ｐｐ．  ３−７０およびそれに引用される参考文献に提供される種々のアミノ酸を参照のこと）。これらのアミノ酸は、Ｌ−またはＤ−立体配置のいずれかであってもよい。
【０１２３】
[0095]当業者ならば、本開示のポリペプチドタグはまた、側鎖保護基を有するアミノ酸を含み得るということを認識するであろう。側鎖が保護されたこのようなアミノ酸の例として、（括弧中に記載される保護基）：Ａｒｇ（ｔｏｓ）、Ｃｙｓ（メチルベンジル）、Ｃｙｓ（ニトロピリジンスルフェニル）、Ｇｌｕ（δ−ベンジルエステル）、Ｇｌｎ（キサンチル）、Ａｓｎ（Ｎ−δ−キサンチル）、Ｈｉｓ（ｂｏｍ）、Ｈｉｓ（ベンジル）、Ｈｉｓ（ｔｏｓ）、Ｌｙｓ（ｆｍｏｃ）、Ｌｙｓ（ｔｏｓ）、Ｓｅｒ（Ｏ−ベンジル）、Ｔｈｒ（Ｏ−ベンジル）およびＴｙｒ（Ｏ−ベンジル）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２４】
[0096]本開示のポリペプチドタグのポリペプチドヘリックス構造は、ポリペプチドのアミノ酸残基のすべてまたはポリペプチドの一部の従属部分を含み得る。したがって、ポリペプチドタグの一部の実施形態においては、ポリペプチドヘリックス構造は、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１６個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも２５個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸または少なくとも６０個のアミノ酸を含む。
【０１２５】
[0097]アルファヘリックス（α−ヘリックス）は、本開示のポリペプチドタグ付きヌクレオチドにおいて有用な、一般的な十分に特性決定されたヘリックス構造である。α−ヘリックスは、どの骨格Ｎ−Ｈ基も、４残基前のアミノ酸の骨格Ｃ＝Ｏ基に水素結合を提供する右巻のらせん状コンホメーションを有する。ポリペプチド構造の種類の中で、α−ヘリックスは、最もよく見られ、アミノ酸配列に基づいて容易に予測される。α−ヘリックス構造を有するポリペプチドの設計の原則は、当技術分野で十分に研究されており、確立されている（例えば、Ｇａｒｎｅｒ  ＆  Ｈａｒｄｉｎｇ、「Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  α−ｈｅｌｉｃａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ」、Ｏｒｇ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２００７、５、３５７７−３５８５およびＤｏｉｇ、「Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  α−Ｈｅｌｉｃａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．  ８３、ｐｐ．  １−５２、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ２００８を参照のこと）。これらの一般原則を使用して、本開示のポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物において有用であるヘリックス構造を有するポリペプチドタグを設計できる。
【０１２６】
[0098]異なるアミノ酸配列は、α−ヘリックス構造を形成する異なる傾向を有する。メチオニン、アラニン、ロイシン、グルタミン酸およびリジン（アミノ酸１−文字表記で「ＭＡＬＥＫ」）はすべて、特に高いヘリックス形成傾向を有するが、プロリンおよびグリシンは、不十分なヘリックス形成傾向しか有さない。プロリンは、アミノ酸配列がα−ヘリックスなどのヘリックス構造を形成するのを妨害するアミノ酸残基である。しかし、プロリンは、ヘリックスの第１の残基としてふるまうことができる。グリシンもまた、ヘリックス構造を妨害する傾向があり、それは、相対的に制限されたヘリックス構造をとりながらの、その高いコンホメーション的可動性のエントロピー的不都合性のためであると考えられる。
【０１２７】
[0099]例えば、α−ヘリックス構造を形成するアミノ酸の傾向は、任意にゼロとして設定されるアミノ酸アラニンと比較した、アミノ酸がα−ヘリックス中にある場合の残基あたりのｋｃａｌ／ｍｏｌで推定される自由エネルギーの差に基づいて推定することができる。アミノ酸残基のα−ヘリックス形成傾向は、自由エネルギー差に基づいて推定されており（例えば、Ｐａｃｅら  （１９９８）、「Ａ  Ｈｅｌｉｘ  Ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ  Ｓｃａｌｅ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７５：  ４２２−４２７；  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｓ０００６−３４９５（９８）７７５２９−０を参照のこと）。以下の表３に示すように、２０種の遺伝子によってコードされるＬ−アミノ酸について、アミノ酸残基Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＧｌｕは、ヘリックス構造を形成する比較的高い傾向を示す（正の自由エネルギーが多いほど、低いヘリックス形成傾向を有する）。しかし、これらの相対的傾向値は、隣接するアミノ酸残基に応じて変わり得る。
【０１２８】
【表３】
2018526418.tif 000024
【０１２９】
[00101]本開示の一部の実施形態においては、ポリペプチドタグ付きヌクレオチドのポリペプチドタグは、α−ヘリックスを含むヘリックス構造を含む。一部の実施形態においては、α−ヘリックスは、少なくとも３個のアミノ酸を含む配列モチーフの少なくとも２つの反復を含む。任意選択で、少なくとも３個のアミノ酸を含む配列モチーフは、ホモポリマーであり、さらに任意選択で、少なくとも３個のアミノ酸を含むホモポリマー配列モチーフは、配列ＡＡＡを含む。
【０１３０】
[00102]一部の実施形態においては、α−ヘリックスは、４個のアミノ酸からなる配列モチーフの少なくとも２つの反復を含む。任意選択で、４つのアミノ酸配列モチーフは、少なくとも２個のＡ残基を含む。一部の実施形態においては、α−ヘリックスは、８個のアミノ酸からなる配列モチーフの少なくとも２つの反復を含む。一部の実施形態においては、α−ヘリックスは、３個のＡ残基を含む４個のアミノ酸の配列を含む配列モチーフを含む。一部の実施形態においては、４個のアミノ酸の配列モチーフは、３個のアラニン残基および荷電アミノ酸残基を含む。任意選択で、４個のアミノ酸の配列モチーフは、ＥＡＡＡ、ＡＥＡＡ、ＡＡＥＡ、ＡＡＡＥ、ＤＡＡＡ、ＡＤＡＡ、ＡＡＤＡ、ＡＡＡＤ、ＲＡＡＡ、ＡＲＡＡ、ＡＡＲＡ、ＡＡＡＲ、ＫＡＡＡ、ＡＫＡＡ、ＡＡＫＡおよびＡＡＡＫからなるモチーフの群から選択されるモチーフを含む。一部の実施形態においては、α−ヘリックスは、４個のアミノ酸の配列モチーフを含む配列モチーフを含み、モチーフは、少なくとも２個のＡ残基、荷電アミノ酸残基および立体障害を提供する側鎖を有するアミノ酸を含む。任意選択で、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、ＷおよびＹからなる群から選択される、立体障害を提供する側鎖を有するアミノ酸。
【０１３１】
[00103]α−ヘリックスを含むポリペプチドタグの一部の実施形態においては、α−ヘリックスは、配列モチーフの少なくとも２つの反復を含み、反復は、０．５０を超える、または０．６０を超える、または少なくとも１．００の（表３において上記で列挙されるような）ヘリックス傾向を有するアミノ酸残基などのα−ヘリックス形成の低い傾向を有するアミノ酸残基によって中断されない。
【０１３２】
[00104]α−ヘリックスを含むポリペプチドタグの一部の実施形態においては、α−ヘリックスは、配列モチーフの少なくとも２つの反復を含み、反復は、非ヘリックス形成性であるアミノ酸残基（またはヘリックス破壊物質）によって中断されない。このような非ヘリックス形成性残基として、ＰおよびＧが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３３】
[00105]ヘリックスを含むポリペプチドタグの一部の実施形態においては、α−ヘリックスは、配列モチーフの少なくとも２つの反復を含み、反復は、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｔ、ＶおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸残基によって中断されない。一部の実施形態においては、α−ヘリックスは、配列モチーフの少なくとも２つの反復を含み、反復は、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、ＴおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸残基によって中断されない。一部の実施形態においては、α−ヘリックスは、配列モチーフの少なくとも２つの反復を含み、反復は、ＧおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸残基によって中断されない。
【０１３４】
[00106]本開示のポリペプチドタグの一部の実施形態においては、ポリペプチドは、α−ヘリックスを含み、α−ヘリックスの長さは、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１６個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも２５個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸または少なくとも４０個のアミノ酸である。一部の実施形態においては、α−ヘリックスのアミノ酸残基の少なくとも５０％は、Ａ残基である。一部の実施形態においては、α−ヘリックスのアミノ酸残基の少なくとも７５％は、Ａ残基である。したがって、一部の実施形態においては、ポリペプチドタグは、α−ヘリックスを含み、α−ヘリックスの長さは、少なくとも１６個のアミノ酸であり、α−ヘリックスは、少なくとも６個のＡ残基（すなわち、５０％）を含む。一部の実施形態においては、ポリペプチドタグは、α−ヘリックスを含み、α−ヘリックスの長さは、少なくとも４０個のアミノ酸であり、α−ヘリックスは、少なくとも３０個のＡ残基（すなわち、７５％のアラニン残基）を含む。
【０１３５】
[00107]ナノポアによるタグ付きヌクレオチドの捕獲および検出を、タグ分子の電荷によって促進することができる。一般に、ナノポア検出システムが、細孔のシス側（すなわち、ヌクレオチドおよびポリメラーゼを有するリザーバー側）が負電荷を有する電極を有し、トランス側が正電荷を有する電極を有する、交流電流（ＡＣ）または直流電流（ＤＣ）電位下で設定される場合には、タグ付きヌクレオチドのタグが負電荷を有することが好ましい。このような条件下で、負電荷を有するタグの捕獲および検出を、トランス側の正の電極によって提供される起電力によって促進することができる。あるいは、正電荷を有するタグは、一般に、ナノポアシステムのトランス側が負の電極を含む条件下が好ましい。
【０１３６】
[00108]本開示は、ポリペプチドタグ付きヌクレオチドを提供し、ポリペプチドは、３０個以上のアミノ酸および全体的な電荷を有する。全体的な電荷は、ポリペプチドを構成するアミノ酸側鎖の各々の電荷を合計することに基づく全ポリペプチドのその正味電荷である。ポリペプチド配列中に組み込むことができる多種多様な荷電アミノ酸残基が利用可能であるので、広範な可能性あるナノポア検出特徴を見越して、本開示のポリペプチドタグの全体的な電荷を広範囲にわたって容易に調節（または調整）することができる。
【０１３７】
[0109]一部の実施形態においては、本開示は、ポリペプチドタグ付きヌクレオチドを提供し、ポリペプチドの全体的な電荷は負である。一部の実施形態においては、ポリペプチドの全体的な電荷は、約−１０から−３０の間である。ポリペプチドの全体的な電荷が負である実施形態では、ポリペプチド配列は、１個または複数の負電荷を有するアミノ酸残基を含み得、負電荷を有する残基は、同一である場合も異なっている場合もある。例えば、−１０の全体的な電荷を有するポリペプチドタグの場合には、ポリペプチド配列は、少なくとも１０個の負電荷を有する残基を含むことを必要とする。一部の実施形態においては、負電荷を有する残基は、グルタミン酸、アスパラギン酸、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸、ホスホセリン、ホスホトレオニン、ホスホチロシンおよびそれらの組合せからなる群から選択される。
【０１３８】
[0110]あるいは、ポリペプチドタグ付きヌクレオチドの一部の実施形態においては、ポリペプチドの全体的な電荷は、正であり、任意選択で、約＋１０から＋３０の間の全体的な電荷を有する。このような実施形態においては、ポリペプチド配列は、任意選択で、アルギニン、リジンおよびヒスチジンからなる群から選択される、１個または複数の正電荷を有するアミノ酸残基を含み得る。
【０１３９】
[0111]一部の実施形態においては、ポリペプチドタグの全体的な電荷を、ポリペプチドタグの長さにわたって均等に分配できるということが考慮される。しかし、一部の実施形態においては、本開示のポリペプチドタグの全体的な電荷を、ポリペプチド配列の長さにわたって不均等に分配することができる。このような不均等な電荷分布は、例えば、ＡＣまたはＤＣ電位のいずれかのナノポア検出条件下で、さらなる識別特徴を有するタグを提供し得る。したがって、一部の実施形態においては、本開示は、ポリペプチドタグ付きヌクレオチドを提供し、リンカーから遠位の（すなわち、遠い）ポリペプチドタグの末端に位置するアミノ酸残基の２５％は、リンカーに近位の（すなわち、近い）ポリペプチドの末端に位置するアミノ酸残基の２５％の正味電荷絶対値よりも大きい正味電荷絶対値を有する。すなわち、全体的な電荷が負である場合には、リンカーから遠位のアミノ酸残基の２５％は、リンカーに近位のアミノ酸残基の２５％よりも多い負電荷を有する。
【０１４０】
[0112]不均等に分配された全体的な電荷を有するペプチドタグを有するポリペプチドタグ付きヌクレオチドの一部の実施形態においては、リンカーから遠位の末端のポリペプチドの少なくとも３個のアミノ酸残基は、負電荷を有する残基である。一部の実施形態においては、リンカーから遠位の末端のポリペプチドの少なくとも５個のアミノ酸残基は、は、負電荷を有する残基である。一部の実施形態においては、リンカーから遠位の末端に少なくとも６個、７個、８個、９個または１０個またはそれ以上の負電荷を有する残基がある。一部の実施形態においては、末端の少なくとも３個、４個、５個、６個またはそれ以上の負電荷を有するアミノ酸残基は、同一アミノ酸、例えば、ＥＥＥＥＥＥまたはＤＤＤＤＤである。一部の実施形態においては、末端の少なくとも３個、４個、５個、６個またはそれ以上の負電荷を有するアミノ酸残基は、異なる負電荷を有するアミノ酸の混合物、例えば、ＥＥＥＤＤＤまたはＤＥＤＥＤまたはＥＥＤＥＥである。
【０１４１】
[0113]アミノ酸残基、電荷、長さ、容量および質量特徴に関する当技術分野における知識ならびにポリペプチド配列に重合された場合に特定の種類の構造を形成するその公知の傾向（例えば、α−ヘリックス形成傾向）を利用し、ナノポア検出におけるタグ付きヌクレオチドの使用に関する本開示に従って、ナノポア検出に適したさまざまな特徴を提供できるさまざまなポリペプチドタグを設計することが可能である。表４は、本開示のポリペプチドタグ付きヌクレオチドにおいて使用できる例示的ポリペプチドタグを示す。
【０１４２】
[0114]したがって、一部の実施形態においては、本開示は、ポリペプチドタグ（Ｔ）が、表４のポリペプチドタグ配列を含む、ポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物を提供する。一部の実施形態においては、本開示は、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＸＩＸ）、（ＸＸ）、（ＸＸＩ）または（ＸＸＩＩ）のうちいずれか１種のポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物を提供し、ポリペプチドタグは、表４のポリペプチドタグ配列を含む。
【０１４３】
【表４】
2018526418.tif 000025
【０１４４】
[0116]表４に示される例示的ポリペプチドタグは、天然および／または非天然アミノ酸モノマーを含み、標準固相ポリペプチド合成法によって調製できる。さらに、これらのポリペプチドタグ（最大８０個のアミノ酸の実質的に任意の他のポリペプチド配列）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ２．０（Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡ）またはＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）のようなカスタムペプチドベンダーから市販されている。
【０１４５】
[0117]本開示のポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物の調製において標準合成法を使用できる（例えば、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）の化合物）。標準アジドアルキンクリック反応を、上記で（例えば、（ＸＩＸ）、（ＸＸ）、（ＸＸＩ）または（ＸＸＩＩ）の化合物）および実施例において記載している。表１および２は、本開示のペプチドタグ付きヌクレオチドの調製において使用できる、さまざまなリンカーおよびリンカー形成基反応を例示する。表１に示される構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）のリンカー形成基のいずれも、ポリペプチドまたはヌクレオチドの末端リン酸のいずれかに付けることができ、構造式（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）のコンジュゲートリンカー形成基をもう一方に付ける。得られるポリペプチドリンカー−オリゴリン酸ヌクレオチド構造を、構造式（ＩＶｃ）〜（ＸＶＩＩｃ）によって表１に例示し、トランス−シクロオクテン（ＸＶＩＩａ）およびテトラジン（ＸＶＩＩｂ）リンカー形成基のクリック反応に起因するジヒドロピラジジン基構造（ＸＶＩＩｃ）を含む。
【０１４６】
[0118]したがって、本開示は、タグ付きヌクレオチドを調製する方法であって、（ａ）（ｉ）５’位に３〜１２個のリン酸が付けられ、末端リン酸が第１のリンカー形成基（例えば、ＸＡまたはＸＢ）と連結されたヌクレオチドおよび（ｉｉ）少なくとも１つのヘリックス構造を含み、全体的な電荷を有し、第１のリンカー形成基と反応してリンカー（例えば、−Ｘ−）を形成することが可能である第２のリンカー形成基（例えば、ＸＢまたはＸＡ）と連結されたポリペプチドタグを提供するステップと、（ｂ）第１のリンカー形成基を第２のリンカー形成基と反応させて、ヌクレオチドとポリペプチドタグを連結するステップとを含む方法を提供する。反応してリンカーを形成することが可能である、第１のおよび第２のリンカー形成基は、上記の表１に例示されている。したがって、当該方法の一部の実施形態においては、第１のリンカー形成基は、構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）の化合物から選択され、第２のリンカー形成基が、構造式（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）の対応する反応性化合物であるか、あるいは、第１のリンカー形成基が、構造式（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）の化合物から選択され得、第２のリンカー形成基が、構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）の対応する反応性化合物である。
【０１４７】
[0119]一部の実施形態においては、本開示は、構造式（ＩＩ）
【０１４８】
【化１９】
2018526418.tif 000026
【０１４９】
［式中、塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、１〜４であり、リンカーは、２〜１００個の原子の共有結合によって結合した鎖を含むリンカーであり、ポリペプチドは、全体的な電荷および少なくとも１つのヘリックス構造を含むポリペプチドタグである］
のポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物を調製する方法を提供し、当該方法は、（ａ）（ｉ）５’位に３〜１２個のリン酸が付けられ、末端リン酸が第１のリンカー形成基と連結されたヌクレオチドおよび（ｉｉ）少なくとも１つのヘリックス構造を含み、全体的な電荷を有し、第１のリンカー形成基と反応してリンカーを形成することが可能である第２のリンカー形成基と連結されたポリペプチドタグを提供するステップであって、
（１）第１のリンカー形成基が、構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）の化合物から選択され、第２のリンカー形成基が、構造式（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）の対応する反応性化合物であるか、または
（２）第１のリンカー形成基が、構造式（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）の化合物から選択され、第２のリンカー形成基が、構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）の対応する反応性化合物であるステップと、
（ｂ）第１のリンカー形成基を第２のリンカー形成基と反応させ、それによって、ヌクレオチドとポリペプチドタグ間の共有結合性連結を形成するステップと
を含む。
【０１５０】
[0120]ポリペプチドタグ付きヌクレオチドを調製する方法の一部の実施形態においては、末端リン酸に付けられた第１のリンカー形成基は、アジド基であり、ポリペプチドタグに付けられた第２のリンカー形成基は、アルキンである。他の実施形態では、末端リン酸に付けられた第１のリンカー形成基は、アルキン基であり、ポリペプチドタグに付けられた第２のリンカー形成基は、アジドである。
【０１５１】
[0121]ポリペプチドタグ付きヌクレオチドを調製する方法の一部の実施形態においては、末端リン酸に付けられた第１のリンカー形成基は、テトラジンであり、ポリペプチドタグに付けられた第２のリンカー形成基は、トランス−シクロオクテンである。他の実施形態では、末端リン酸に付けられた第１のリンカー形成基は、トランス−シクロオクテンであり、ポリペプチドタグに付けられた第２のリンカー形成基は、テトラジンである。
【０１５２】
[0122]ナノポアシーケンシングにおけるポリペプチドタグ付きヌクレオチドの使用
[0123]本開示のポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物を、公知のナノポアシーケンシング法において使用でき、これでは、ナノポアが、相補的ヌクレオチドに付けられたタグの存在を、ナノポアに近接して位置し、標的核酸配列の相補的なプライマーを延長している鎖延長酵素（例えば、ポリメラーゼ、リガーゼ）によって、それが組み込まれるときに（または組み込まれ、放出された後に）検出する。タグ付きヌクレオチドを使用してナノポアシーケンシングを実施するための一般的な方法、材料、デバイスおよびシステムは、米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０  Ａ１号、同２０１３／０２６４２０７  Ａ１号、同２０１４／０１３４６１６  Ａ１号、同２０１５／０１１９２５９  Ａ１号および２０１５年３月２３日に出願された米国特許出願第１４／６６６，１２４号に記載されており、それらの各々は、本明細書において参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。核酸のナノポアシーケンシングのためにタグ付きヌクレオチドを使用するために、これらの一般的な方法において、本開示のポリペプチドタグ付きヌクレオチドを使用できる。
【０１５３】
[0124]したがって、一実施形態においては、本開示は、核酸の配列を決定するための方法であって、（ａ）膜、膜のシス側およびトランス側の電極、細孔が膜を通って伸長するナノポア、両電極と接触する電解質溶液、ナノポアに隣接して位置する活性ポリメラーゼおよびポリメラーゼと複合体を形成しているプライマー鎖を含む、ナノポアシーケンシング組成物を提供するステップと、（ｂ）ナノポアシーケンシング組成物を、（ｉ）核酸の鎖および（ｉｉ）各々異なるタグを有するタグ付きヌクレオチドのセットと接触させるステップであって、異なるタグが各々、ナノポア中に位置付けられると、電極中にわたって異なる遮断電流レベルを引き起こし、セットが、構造式（Ｉ）
Ｎ−Ｐ−Ｌ−Ｔ
（Ｉ）
［式中、Ｎは、ヌクレオシドであり、Ｐは、ヌクレオシドの５’−Ｏ基に共有結合によって付けられたオリゴリン酸であり、オリゴリン酸は、３〜１２個のリン酸基を含み、Ｌは、オリゴリン酸の末端リン酸基に共有結合によって付けられたリンカーであり、Ｔは、リンカーに共有結合によって付けられたポリペプチドタグであり、ポリペプチドは、全体的な電荷を有し、少なくとも１つのヘリックス構造を含む］
の少なくとも１種の化合物を含むステップと、（ｄ）電極にわたる電流レベルを経時的に検出し、核酸配列に対して相補的である（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）ポリメラーゼによって組み込まれた異なるタグ付きヌクレオチドの各々と相関させ、それによって核酸配列を決定するステップとを含む、方法を提供する。
【０１５４】
[0125]核酸の配列を決定するための方法の一部の実施形態においては、各々異なるタグを有するタグ付きヌクレオチドのセットは、式（ＩＩ）：
【０１５５】
【化２０】
2018526418.tif 000027
【０１５６】
［式中、「塩基」は、天然に存在する、または天然に存在しない核酸塩基であり、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、１〜１０であり、「リンカー」は、２〜１００個の原子の共有結合によって結合した鎖を含むリンカーであり、「ポリペプチド」は、全体的な電荷を有し、少なくとも１つのヘリックス構造を含むポリペプチドタグである］
の構造を含む少なくとも１種の化合物を含む。
【０１５７】
[0126]式（Ｉ）または（ＩＩ）の構造を含むポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物は、核酸の配列を決定するための方法において使用する場合には、本明細書において別の場所で開示される化合物実施形態の範囲のいずれも含み得る。例えば、式（Ｉ）のヌクレオシド（Ｎ）は、ヌクレオシドが、三リン酸などのオリゴリン酸（Ｐ）と共有結合によって連結される場合に、ポリメラーゼなどの鎖延長酵素によって組み込まれることが可能な任意のヌクレオシドであり得、ヌクレオシドは、天然に存在するまたは天然に存在しない核酸塩基およびリボースまたはデオキシリボース基などの天然に存在するまたは天然に存在しない糖部分を含み得る。
【０１５８】
[0127]タグ付きヌクレオチドのセット
[0128]本明細書において別の場所で記載されるように、ナノポア検出を使用して核酸の配列を決定するための方法は、一般に、検出されるように望まれる各々異なるタグがヌクレオチドと会合されたタグ付きヌクレオチドのセットを必要とする。ＤＮＡ鎖をシーケンシングするための標準的な実施形態においては、当該方法は、少なくとも４種の標準的なデオキシヌクレオチドｄＡ、ｄＣ、ｄＧおよびｄＴのセットを必要とし、各ヌクレオチドは、ヌクレオチドが近位の鎖延長酵素によって組み込まれると、ナノポアによって検出されることが可能である付けられたタグを有し、さらに、タグのナノポア検出は、他の３種のタグの各々のナノポア検出から識別可能であり、それによって、ナノポア検出によるタグと会合している特定のヌクレオチドの同定が可能になる。一般に、セット中の異なるタグ付きヌクレオチドの各々は、近位の鎖延長酵素によって触媒される組込み事象の際にナノポア中に位置付けられると、タグが導入する特有のナノポア検出特徴によって識別可能である。タグ付きヌクレオチドを識別するために使用できる、単独または組み合わせたナノポア検出特徴の中でも、ナノポア検出システムの電極にわたる（ＤＣまたはＡＣ電位のいずれかの下での）遮断電流レベルおよび遮断電流の滞留時間が挙げられる。したがって、一部の実施形態においては、本開示は、各々異なるタグを有するタグ付きヌクレオチドのセットを提供し、異なるタグは各々、ナノポア中に位置付けられると、電極にわたる異なる遮断電流レベルおよび／または異なる滞留時間を引き起こし、セットは、構造式（Ｉ）
Ｎ−Ｐ−Ｌ−Ｔ
（Ｉ）
［式中、Ｎは、ヌクレオシドであり、Ｐは、ヌクレオシドの５’−Ｏ基に共有結合によって付けられたオリゴリン酸であり、オリゴリン酸は、３〜１２個のリン酸基を含み、Ｌは、オリゴリン酸の末端リン酸基に共有結合によって付けられたリンカーであり、Ｔは、リンカーに共有結合によって付けられたポリペプチドタグであり、ポリペプチドは、全体的な電荷を有し、少なくとも１つのヘリックス構造を含む］
の少なくとも１種の化合物を含む。
【０１５９】
[0129]各々異なるタグを有するタグ付きヌクレオチドのセットの一部の実施形態においては、セットは、式（ＩＩ）：
【０１６０】
【化２１】
2018526418.tif 000028
【０１６１】
［式中、「塩基」は、天然に存在する、または天然に存在しない核酸塩基であり、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、１〜１０であり、「リンカー」は、２〜１００個の原子の共有結合によって結合した鎖を含むリンカーであり、「ポリペプチド」は、全体的な電荷を有し、少なくとも１つのヘリックス構造を含むポリペプチドタグである］
の構造を含む少なくとも１種の化合物を含む。
【０１６２】
[0130]本開示のポリペプチドタグ付きヌクレオチドを、ポリペプチドではないタグを有するタグ付きヌクレオチドのセットにおいて使用できるということが考慮される。例えば、一部の実施形態においては、タグ付きヌクレオチドのセットは、構造式（Ｉ）または（ＩＩ）のポリペプチドタグ付きヌクレオチドを含み得、セット中の他のタグ付きヌクレオチドは、非ポリペプチドタグを含み得、非ポリペプチドタグは、オリゴヌクレオチド、ポリエチレングリコールポリマー、炭水化物または色素化合物などのナノポアによって検出可能な化合物またはポリマーである。オリゴヌクレオチドタグ付きヌクレオチドのセットなどの他のタグ付きヌクレオチドのセットは、当技術分野で公知である（例えば、米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０  Ａ１号、同２０１３／０２６４２０７  Ａ１号、同２０１４／０１３４６１６  Ａ１号、同２０１５／０１１９２５９  Ａ１号および２０１５年３月２３日に出願された米国特許出願第１４／６６６，１２４号を参照のこと、それらの各々は、本明細書において参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態、タグ付きヌクレオチドのセットにおいては、セットは、構造式（Ｉ）または構造式（ＩＩ）の少なくとも２種、少なくとも３種または少なくとも４種のポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物を含み、セット中のポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物の少なくとも２種、少なくとも３種または少なくとも４種の異なるペプチドタグの各々は、セット中の他のものと識別可能であるナノポア検出特徴を有する。遮断電流および／または滞留時間などのナノポア検出特徴を調べるための方法および技術は、当技術分野で公知であり（例えば、米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０  Ａ１号、同２０１３／０２６４２０７  Ａ１号、同２０１４／０１３４６１６  Ａ１号、同２０１５／０１１９２５９  Ａ１号および２０１５年３月２３日に出願された米国特許出願第１４／６６６，１２４号を参照のこと、それらの各々は、本明細書において参照により本明細書に組み込まれる）、本明細書において実施例に記載したような、ナノポアアレイマイクロチップを使用するＤＣまたはＡＣ電位下でのナノポア静的捕獲実験などの方法が挙げられる。
【０１６３】
[0131]したがって、一部の実施形態においては、本開示は、各々異なるポリペプチドタグを有する、少なくとも２種の異なるポリペプチドタグ付きヌクレオチドを含むタグ付きヌクレオチドのセットを提供し、少なくとも２種の異なるポリペプチドタグは、識別可能な遮断電流レベルおよび／または滞留時間を示す。タグ付きヌクレオチドのセットの一部の実施形態においては、少なくとも２種の異なるポリペプチドタグ付きヌクレオチドは、構造（Ｉ）または構造（ＩＩ）の化合物を含む。一部の実施形態においては、少なくとも２種の異なるポリペプチドタグ付きヌクレオチドは各々、表４から選択される異なるポリペプチドタグを含む。一部の実施形態においては、少なくとも２種の異なるポリペプチドタグは、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％または少なくとも７５％異なる遮断電流レベルを示す。遮断電流レベル間の相違の測定は、任意の適したナノポア検出法を使用して行うことができる。例えば、各々異なるポリペプチドタグを有する少なくとも２種の異なるポリペプチドタグ付きヌクレオチドの各々の遮断電流は、本明細書において実施例において一般的に記載されるようなナノポア静的捕獲実験において測定できる。
【０１６４】
[0132]ナノポアデバイス
[0133]タグ付きヌクレオチドを使用するナノポアシーケンシングなどのナノポア検出適用においてそれらを作製し、使用するためのナノポアデバイスおよび方法は、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第７，００５，２６４  Ｂ２号、同７，８４６，７３８号、同６，６１７，１１３号、同６，７４６，５９４号、同６，６７３，６１５号、同６，６２７，０６７号、同６，４６４，８４２号、同６，３６２，００２号、同６，２６７，８７２号、同６，０１５，７１４号、同５，７９５，７８２号および米国特許出願公開第２０１５／０１１９２５９号、同２０１４／０１３４６１６号、同２０１３／０２６４２０７号、同２０１３／０２４４３４０号、同２００４／０１２１５２５号および同２００３／０１０４４２８号を参照のこと、それらの各々は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる）。ナノポア検出を測定するのに有用なナノポアデバイスもまた、本明細書において開示される実施例において記載する。一般に、ナノポアデバイスはすべて、脂質二重膜中に埋め込まれた細孔形成性タンパク質を含み、膜は、ウェルまたはリザーバーを含む固体基板に固定化される、または付けられる。ナノポアの細孔は、膜を通って伸長し、膜のシスおよびトランス側間の流体連絡を作製する。典型的には、固体基板は、ポリマー、ガラス、シリコンおよびそれらの組合せからなる群から選択される材料を含む。さらに、固体基板は、ナノポアに隣接する、センサー、検出回路または検出回路に連結された電極、任意選択で、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）回路または電界効果トランジスター（ＦＥＴ）回路を含む。典型的には、ＤＣまたはＡＣ電位が、膜にわたって設定されることを可能にする膜のシスおよびトランス側の電極があり、これが、ナノポアの細孔を通るベースライン電流（または開口電流レベル）を生成する。本開示のポリペプチドタグなどのタグの存在は、この電流の遮断をもたらし、それによって、測定できる開口電流に対する遮断電流レベルを生成する。
【０１６５】
[0134]本開示のポリペプチドタグ付きヌクレオチド化合物を、天然に存在する、および天然に存在しない（例えば、操作された、または組換え）細孔形成性タンパク質の両方によって作製されたナノポアを含む広範囲のナノポアデバイスとともに使用できることが考慮される。本開示のポリペプチドタグ付きヌクレオチドのナノポア検出にとって有用なナノポアを作製するために使用できる広範な細孔形成性タンパク質は、当技術分野で公知である。代表的な細孔形成性タンパク質として、α−溶血素、β−溶血素、γ−溶血素、アエロリジン、溶血毒、ロイコシジン、メリチン、ＭｓｐＡポリンおよびポリンＡが挙げられるが、これらに限定されない。細孔形成性タンパク質、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のα−溶血素（本明細書において、「α−ＨＬ」とも呼ばれる）は、細孔形成性タンパク質のクラスの最も研究されたメンバーのうち１種であり、ナノポアデバイスの作製において広範に使用されてきた。（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０１１９２５９号、同２０１４／０１３４６１６号、同２０１３／０２６４２０７号および同２０１３／０２４４３４０号を参照のこと）。α−ＨＬは、配列決定され、クローニングされ、部位特異的突然変異誘発および化学標識を含む広範な技術を使用して構造的および機能的に広く特性決定されている（例えば、Ｖａｌｅｖａら（２００１）およびそれに引用される参考文献を参照のこと）。α−ＨＬモノマーの七量体複合体は、脂質二重膜中に埋め込まれ、脂質二重膜を通って細孔を作製するナノポアを自発的に形成する。６：１天然α−ＨＬ対変異体α−ＨＬの比を含むα−ＨＬの七量体は、ナノポアを形成できることがわかっている（例えば、Ｖａｌｅｖａら（２００１）およびそれに引用される参考文献）。さらに、α−ＨＬは、多数の位置でシステイン残基置換が挿入されて操作されており、マレイミドリンカー化学（同書）によるタンパク質の共有結合修飾が可能となっている。例えば、操作されたα−溶血素−Ｃ４６（「α−ＨＬ−Ｃ４６」）は、一般的なクリック反応化学を使用して、ポリメラーゼなどの鎖延長酵素を共有結合によって付けるために使用できるリンカーを用いる修飾を可能にする、Ｋ４６Ｃアミノ酸残基置換を含む。あるいは、α−ＨＬ七量体を、実施例に記載したように、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇコンジュゲーション法を使用してＤＮＡ−ポリメラーゼを用いて共有結合によって修飾できる。
【０１６６】
[0135]したがって、一部の実施形態においては、本開示のタグ付きヌクレオチド組成物は、ナノポアデバイスとともに使用でき、ナノポアは、６：１天然α−ＨＬ対α−ＨＬの修飾されたまたは操作されたものを有し、修飾されたα−ＨＬが、ＤＮＡポリメラーゼなどの鎖延長酵素に共有結合によってコンジュゲートされる七量体α−ＨＬ複合体を含む。例えば、操作されたα−ＨＬ−Ｃ４６を、ＤＮＡポリメラーゼのＢｓｔ２．０バリアントを、七量体６：１ナノポアに共有結合によって付けるために、テトラジン−トランス−シクロオクテンクリック化学の使用を可能にするリンカーを用いて修飾できる。このような実施形態は、本明細書において参照により本明細書に組み込まれる、２０１５年３月９日に出願された米国特許仮出願第６２／１３０，３２６号に記載されている。
【０１６７】
[0136]本明細書において提供されるポリペプチドタグ付きヌクレオチドおよび関連する方法は、当技術分野で公知であるポリメラーゼおよびリガーゼなどの広範な鎖延長酵素とともに使用できる。本開示の化合物および方法とともに使用できる例示的ポリメラーゼとして、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、クラスＥＣ  ２．７．７．７の酵素）、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、クラスＥＣ  ２．７．７．６またはＥＣ  ２．７．７．４８の酵素）、逆転写酵素（例えば、クラスＥＣ  ２．７．７．４９の酵素）およびＤＮＡリガーゼ（例えば、クラスＥＣ  ６．５．１．１の酵素）などの核酸ポリメラーゼが挙げられる。一部の実施形態においては、ポリペプチドタグ付きヌクレオチドとともに有用であるポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎポリメラーゼ（エキソ−）Ａ４８５Ｌ／Ｙ４０９ＶまたはＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（φ２９ＤＮＡポリメラーゼ）である。一部の実施形態においては、ポリペプチドタグ付きヌクレオチドを組み込む鎖延長酵素は、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼを含む。一部の実施形態においては、Ｂ．ステアロサーモフィルス（ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼの大断片。一実施形態においては、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＢｓｔ  ２．０（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡから市販されている）である。一実施形態においては、ポリメラーゼは、Ｐｏｌ２  ＤＮＡポリメラーゼ−Ｄ４４Ａである。
【実施例】
【０１６８】
[0137]本開示の種々の特徴および実施形態を以下の代表的な例において例示するが、これらは、例示であるよう意図され、制限ではない。当業者ならば、具体例は単に、以下の特許請求の範囲において、より十分に記載するような本発明の例示であることを容易に理解するであろう。本出願に記載されるどの実施形態および特徴も、含有されるどの実施形態とも互換可能であり、結合可能であると理解されなければならない。
【実施例１】
【０１６９】
ポリペプチドタグ付きヌクレオチドの調製
[0138]この実施例は、表４に列挙されるポリペプチドタグのいずれかまたはプロパルギル基もしくは他のアルキン部分を用いて（例えば、Ｎ末端プロパルギル−グリシン（「Ｐｒａ」）アミノ酸残基を用いて）修飾される任意のポリペプチドタグを使用して、構造式（Ｉ）または（ＩＩ）の任意のポリペプチドタグ付きヌクレオチドを調製するための一般的な方法を例示する。この実施例は、具体的には、以下に示される化合物（１）に対応するｄＴ６Ｐ−リンカー−（ＥＡＡＡ）１６−Ｅ５の調製におけるステップを例示する。
【０１７０】
【化２２】
2018526418.tif 000029
【０１７１】
[0139]化合物（１）のポリペプチドタグ付きヌクレオチドを、６９マーのポリペプチドタグ、Ｎ末端プロパルギル−グリシンアミノ酸残基を用いて修飾される（ＥＡＡＡ）−Ｅ５（例えば、構造式（Ｖ）の化合物におけるように）および化合物（２）として示される、アジド−リンカー修飾ヌクレオシド六リン酸、ｄＴ６Ｐ−Ｎ３の間のアジド−アルキンクリック反応において合成した：
【０１７２】
【化２３】
2018526418.tif 000030
【０１７３】
[0140]Ａ．合成ｄＴ６Ｐ−アジド（化合物（２））
[0141]化合物（２）アジド−リンカー修飾ヌクレオシド六リン酸（ｄμＴ６Ｐ−Ｎ３）を、図１に表される以下の一般的な反応スキームに従って調製する。この一般的な反応スキームは、任意のヌクレオシド−六リン酸化合物、ｄＮ６Ｐを、ヘキシルアミンリンカーおよびアジド基を用いて修飾するために使用できる。手短には、６−Ｆｍｏｃ−アミノヘキサノール（１ｇ、２．９４ｍｍｏｌ）（図１中の１）を、無水アセトニトリル（２ｘ２０ｍｌ）と共蒸発させ、次いで、リン酸トリエチル（１０ｍｌ）に溶解する。この冷却された、撹拌溶液に、新鮮な蒸留オキシ塩化リン（５５０μｌ、５．８８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を０℃で２時間撹拌する。ピロリン酸トリブチルアンモニウム（５当量、１５ｍｍｏｌ、無水ＤＭＦ中の０．５Ｍ溶液）およびトリブチルアミン（１５ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を２０分間撹拌する。溶液を、０．１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウムバッファー（ＴＥＡＢ、２００ｍｌ、ｐＨ７．５）を用いてクエンチし、ｐＨ約７に調整する。この溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５カラムに載せ、０．１Ｍ〜１．０Ｍ  ＴＥＡＢバッファー（ｐＨ７．０）勾配を使用して溶出する。適当な画分を収集し、プールし、Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ（商標）ＬＣ−１８−Ｔ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）３μＭ、１５ｃｍ×４．６ｍｍでの逆相ＨＰＬＣでさらに精製する（ＨＰＬＣパラメータ：移動相：Ａ、ｐＨ８．１の水中、８．６ｍＭ  Ｅｔ３Ｎ、１００ｍＭ  ＨＦＩＰ；Ｂ、１００％メタノール。４０分で、１００％  Ａ／０％  Ｂから出発して、０％  Ａ／１００％  Ｂまで）。純粋な三リン酸、３１Ｐ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）は、以下のシフトを示す：δ：−７．６８（ｄ，１Ｐ），−１０．５（ｄ，１Ｐ），−２２．６５（ｔ，１Ｐ）。生じたＦｍｏｃ−アミノヘキシル三リン酸（２００ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）（図１中の２）を、無水アセトニトリル（２Ｘ１０ｍｌ）と共蒸発させ、次いで、無水ＤＭＦ（３ｍｌ）に溶解する。ＣＤＩ（４当量、１．４ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温で４時間撹拌する。メタノール（６当量、８５μｌ）を添加し、さらに３０分間撹拌する。上記の生成物（３）に、ＤＭＦ中の所望の２’−デオキシヌクレオシド−５’−三リン酸（ｄＮＴＰ、トリブチルアンモニウム塩、０．５ｍｍｏｌ）の溶液およびＭｇＣｌ２（１０当量、３．５ｍｍｏｌ）を添加する。この反応混合物を１８時間撹拌し、続いて、水（２５ｍｌ）中の１０％トリエチルアミンを添加して、Ｆｍｏｃ基を加水分解して、所望のリンカー修飾ヌクレオチド六リン酸化合物、ｄＮ６Ｐ−ＮＨ２（図１中の４〜７）を得る。反応混合物をさらに１６時間撹拌し、沈殿した固体を濾過し、溶液をエーテルで抽出する。水層を、逆相ＨＰＬＣ（Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ（商標）ＬＣ−Ｃ１８−Ｔ（Ｓｕｌｐｅｌｃｏ）３．０μｍ粒径、１５ｃｍ×４．６ｍｍ）で、以下のパラメータを使用して濃縮し、精製する：室温で、１ｍｌ／分の流速で、４分の１００％  Ａ／０％  Ｂ、次いで、３０分の７０％  Ａ／３０％  Ｂへの直線勾配変化および最後に、さらに４５分の０％  Ａおよび１００％  Ｂ；移動相：Ａ、０．１Ｍ  ＴＥＡＡ；Ｂ、１００％ＡＣＮ）。ｄＮ６Ｐ−ＮＨ２生成物は、以下のシフト：δ−１０．６３（ｂｓ，１Ｐ）、−１１．６５（ｂｓ，１Ｐ）、−２３．３５（ｂｍ，４Ｐ）に基づいて３１Ｐ−ＮＭＲによって特性決定できる。４種のよく使用されるリンカー修飾ｄＮ６Ｐ化合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：ｄＡ６Ｐ−ＮＨ２：８３２．０２（理論値８２９）；ｄＴ６Ｐ−ＮＨ２：８２５．９７（理論値８２０）；ｄＧ６Ｐ−ＮＨ２：８４８．３３（理論値８４５）；ｄＣ６Ｐ−ＮＨ２：８２６．０８（理論値８２８．０）。
【０１７４】
[0142]０．１Ｍ重炭酸−炭酸バッファー（５００μｌ、ｐＨ８．７）および２００μｌのＤＭＦ中のアジド酪酸−ＮＨＳ（２５μｍｏｌ）に、ｄＮ６Ｐ−ＮＨ２（１０μｍｏｌ）を溶解することによって所望のアジド修飾化合物ｄＮ６Ｐ−Ｎ３（図１中の８〜１１）を調製する。この反応混合物を一晩撹拌し、次いで、ＨＰＬＣによって、ｄＮ６Ｐ−ＮＨ２化合物について上記で記載された同一のＨＰＬＣパラメータおよび条件を使用して精製する。４種のよく使用されるアジド修飾ｄＮ６Ｐ化合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：ｄＡ６Ｐ−Ｎ３：９６３．７５（Ｎａ＋塩としての理論値９６３．３）；ｄＴ６Ｐ−Ｎ３：９３４．５８（理論値９３２．３）；ｄＧ６Ｐ−Ｎ３：９６０．２７（理論値９５７．４）；ｄＣ６Ｐ−Ｎ３：９１９．０９（理論値９１７．４）。
【０１７５】
[0143]Ｂ．プロパルギル修飾ポリペプチドタグ、Ｐｒａ−（ＥＡＡＡ）−Ｅ５の合成
[0144]Ｎ末端プロパルギル−グリシン修飾ポリペプチドタグ、Ｐｒａ−（ＥＡＡＡ）−Ｅ５を、自動化Ｍｕｌｔｉｓｙｎｔｅｃｈマルチプルペプチドシンセサイザーを使用してＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）Ｓ  ＰＨＢ樹脂でのフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相ペプチド合成によって合成した。４．０当量の使用される各アミノ酸誘導体（すなわち、Ｆｍｏｃ−Ｐｒａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ）を、１当量の１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールを含有するＮ−メチルピロリドンに溶解した。反応培地としてのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で、樹脂ローディングに対して４当量のＨＡＴＵおよび８当量のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンとカップリング反応を５分間実施した。ＤＭＦ中、２５％ピペリジンを使用して、各合成ステップ後８分で、Ｆｍｏｃ基を切断した。９．５ｍｌのトリフルオロ酢酸、０．２５ｍｌのトリイソプロピルシランおよび０．２５ｍｌの水を用いて、合成樹脂からのポリペプチドの放出および酸不安定性保護基の切断を室温で３時間で達成した。続いて、反応溶液を、冷却したジイソプロピルエーテルと混合して、ポリペプチドを沈殿させた。沈殿物を濾過し、ジイソプロピルエーテルを用いて再度洗浄し、少量の酢酸またはＮａＯＨ水溶液に溶解し、凍結乾燥した。得られた粗材料を、０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル／水の勾配を使用する分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。精製されたプロパルギル修飾ポリペプチドタグ、Ｐｒａ−（ＥＡＡＡ）−Ｅ５の同一性を、イオンスプレー質量分析法によって確認した：ＥＳＩ−ＭＳｃａｌｃ：Ｍ＋＝６２３７．４；ＥＳＩ−ＭＳｅｘｐ：［Ｍ＋４Ｈ］４＋＝１５５９．７。
【０１７６】
[0145]この実施例の合成法を使用して調製したさまざまなプロパルギル修飾ポリペプチドタグを表５に示す。種々のポリペプチドタグを合成するために使用したアミノ酸誘導体は、Ｆｍｏｃ−Ｐｒａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ  Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｇｌａ（ＯｔＢｕ）２−ＯＨを含んでいた。
【０１７７】
【表５】
2018526418.tif 000031
【０１７８】
[0147]Ｃ．ｄＴ６Ｐ−アジドおよびＰｒａ−（ＥＡＡＡ）−Ｅ５のクリック反応
[0148]ポリペプチドタグ付きヌクレオチド、化合物（１）のｄＴ６Ｐ−リンカー−（ＥＡＡＡ）１６−Ｅ５を形成するためにアジド−アルキンクリック反応を、図１の最終ステップに示される同一の一般的なスキームに従って実施でき、所望のｄＮ６Ｐ−Ｎ３化合物（図１中の８〜１１）に付けられる「タグ」は、ポリペプチドタグである。ポリペプチドタグのＮ末端のプロパルギル−グリシン（「Ｐｒａ」）残基は、アルキン基を提供し、これが、ヌクレオチド上のアジド基とクリック反応を起こして、ヌクレオチドｄＮ６Ｐを修飾ポリペプチドタグ、Ｐｒａ−（ＥＡＡＡ）１６−Ｅ５のＮ末端プロパルギル基と連結する共有結合を形成する（トリアゾール部分の形成によって）。
【０１７９】
[0149]手短には、水溶液（０．７ｍｌ）Ｐｒａ−ポリペプチドタグ、Ｐｒａ−（ＥＡＡＡ）−Ｅ５（４００ｎｍｏｌ）、ｄＴ６Ｐ−アジド（１２００ｎｍｏｌ）、予め混合したＣｕＳＯ４／ＴＨＰＴＡ（６μｍｏｌ／３０μｍｏｌ）およびＮａ−アスコルビン酸塩（８μｍｏｌ）を、４０℃で一晩振盪した。ＥＤＴＡを添加し、混合物を透析によって脱塩した。クリック反応生成物、ｄＴ６Ｐ−リンカー−（ＥＡＡＡ）−Ｅ５を酢酸トリエチルアンモニウム／アセトニトリル勾配を用いる分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。純粋なコンジュゲートを含有する画分をプールし、遠心真空濃縮によってドライダウン（ｄｒｙ  ｄｏｗｎ）して白色固体を得た。イオンスプレー質量分析によって、ポリペプチドタグ付きヌクレオチド、ｄＴ６Ｐ−リンカー−（ＥＡＡＡ）−Ｅ５の形成を確認した：ＥＳＩ−ＭＳｃａｌｃ：ｍ／ｚ＝７１６８．８；ＥＳＩ−ＭＳｅｘｐ：ｍ／ｚ＝７１６９．２。
【０１８０】
[0150]上記の方法に従うポリペプチドタグ付きｄＴ６Ｐを形成するためのクリック反応もまた、以下のプロパルギル修飾ポリペプチドタグ：Ｐｒａ−（ＥＡＡＡ）１３−Ｅ５、ＰＲＡ−（ＥＡＡＡ）１０−Ｅ５およびＰｒａ−（ＥＡＡＡ）８−Ｐ−（ＥＡＡＡ）８−Ｅ５を使用して実施した。これらの反応の各々の式（ＩＩ）の予測されたポリペプチドタグ付きヌクレオチドの形成化合物を、以下に示すようにイオンスプレー質量分析解析によって確認した：
[0151]ｄＴ６Ｐ−アジド＋Ｐｒａ−（ＥＡＡＡ）１３−Ｅ５の反応の結果：ＥＳＩ−ＭＳｃａｌｃ：ｍ／ｚ＝６１４１．７；ＥＳＩ−ＭＳｅｘｐ：ｍ／ｚ＝６１４１．７。
【０１８１】
[0152]ｄＴ６Ｐ−アジド＋Ｐｒａ−（ＥＡＡＡ）１０−Ｅ５の反応の結果：ＥＳＩ−ＭＳｃａｌｃ：ｍ／ｚ＝５１１４．７；ＥＳＩ−ＭＳｅｘｐ：ｍ／ｚ＝５１１５．１。
[0153]ｄＴ６Ｐ−アジド＋Ｐｒａ−（ＥＡＡＡ）８−Ｐ−（ＥＡＡＡ）８−Ｅ５の反応の結果：ＥＳＩ−ＭＳｃａｌｃ：ｍ／ｚ＝７２６５．９；ＥＳＩ−ＭＳｅｘｐ：ｍ／ｚ＝７２６７．１。
【実施例２】
【０１８２】
ポリペプチドタグ付きヌクレオチドのナノポア検出
[0154]この実施例は、ナノポアアレイマイクロチップ検出システムを用いる「静的捕獲」実験を使用する、実施例１において調製したポリペプチドタグ付きヌクレオチド、ｄＴ６Ｐ−リンカー−（ＥＡＡＡ）１６−Ｅ５（化合物（１））の遮断電流および滞留時間特徴の検出および測定を例示する。「静的捕獲」実験では、相補的ポリペプチドタグ付きヌクレオチドは、ナノポアに近接するポリメラーゼがコンジュゲートされた活性部位三元複合体を形成するが、必要な触媒性ＭＧ２＋カチオンがないためにポリメラーゼによって組み込まれない。しかし、ポリペプチドタグは、ナノポアの細孔中に入り、ナノポアの細孔中に存在することができる。ナノポアシステムの電極は、ＤＣまたはＡＣ電位のいずれかの下にあるので、ナノポア中のタグの存在は、検出可能な遮断電流を生じさせる。
【０１８３】
[0155]ナノポア検出システム：ナノポア遮断電流測定を、浅いウェル内に２６４の銀電極（直径５μｍ）のアレイを有する約１ｘ１ｍｍ  ＣＭＯＳマイクロチップを含むナノポアアレイマイクロチップ（Ｇｅｎｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡによって製作されたチップ）を使用して実施する。このようなナノポアアレイマイクロチップを製作し、使用するための方法はまた、米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０  Ａ１号、同２０１３／０２６４２０７  Ａ１号および同２０１４／０１３４６１６  Ａ１号に見出すことができ、それらの各々は、本明細書において参照により本明細書に組み込まれる。アレイ中の各ウェルは、生物学的試薬および伝導性塩との一定の接触を考慮する表面修飾を用いて、標準的なＣＭＯＳプロセスを使用して製造される。各ウェルは、ナノポア−ポリメラーゼコンジュゲートが中に埋め込まれたリン脂質二重膜を支持できる。各ウェルの電極は、コンピュータインターフェースによって個々にアドレス可能である。使用されるすべての試薬は、コンピュータによって制御されたシリンジポンプを使用してアレイマイクロチップの上の簡単なフローセル中に入れられる。チップは、アナログからデジタルへの変換を支持し、１秒あたり１０００点を超える速度ですべての電極からの電気的測定値を独立に報告する。ナノポア遮断電流測定は、ミリ秒（ｍｓｅｃ）毎に少なくとも１回、アレイ中の２６４のアドレス可能なナノポアを含有する膜の各々で非同期的に行い、インターフェースで接続したコンピュータに記録することができる。
【０１８４】
[0156]チップ上での脂質二重層の形成：１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を使用してチップ上にリン脂質二重膜を調製する。脂質粉末を１５ｍＭでデカンに溶解し、次いで、チップ上の２６４ウェルにわたって塗布して層にする。次いで、アレイウェルのシス側を通って空気を送り、こうして多重層脂質膜を単一二重層に減少することによって、薄化プロセスを開始する。０〜１０００ｍＶのランピング電圧を使用して、二重層形成を試験する。典型的な単一二重層は、３００〜５００ｍＶの間の印加電圧で一時的に開口する。
【０１８５】
[0157]ナノポア−ポリメラーゼコンジュゲートの調製：化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）フィブロネクチン結合タンパク質ＦｂａＢのコラーゲン接着ドメイン（ＣｎａＢ２）の２つの断片は、互いに特異的に結合し、一方の断片中のリジンの−アミノ基（すなわち、「ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ」）およびもう一方の断片中のアスパラギン酸のカルボキシル側鎖基（すなわち、「ＳｐｙＴａｇ」）間でペプチド結合を生成できる。本実施例においては、ＳｐｙＴａｇ断片を、短いペプチドリンカーを介して、Ｈ１４４Ａ変異を有するα−ＨＬモノマーのＮ末端と接着し、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ断片を、同様の短いペプチドリンカーを介して、Ｄ４４Ａ変異を有するＰｏｌ２  ＤＮＡポリメラーゼのＮ末端と接着する。ＳｐｙＴａｇを有する、および有さないα−ＨＬモノマーを混合して、七量体ナノポアの構築を可能にし、１つのＳｐｙＴａｇ修飾α−ＨＬモノマーのみを有する七量体ナノポアをクロマトグラフィーによって精製して、所望の６：１  α−ＨＬナノポアを提供した。次いで、６：１  α−ＨＬナノポア溶液を、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ修飾Ｐｏｌ２  ＤＮＡポリメラーゼ−Ｄ４４Ａと組み合わせて、６：１  α−ＨＬ−Ｐｏｌ２コンジュゲートを形成した。
【０１８６】
[0158]膜へのナノポア−ポリメラーゼコンジュゲート挿入：脂質二重層をチップの２５６のウェル上に形成した後、すべて、２０℃の３ｍＭ  ＣａＣｌ２、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓおよび３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（ＤＣモード用）または５００ｍＭ  グルタミン酸カリウム、ｐＨ８（ＡＣモード用）のバッファー溶液中の、３μＭの化合物（１）のポリペプチドタグ付きヌクレオチド、０．１μＭの６：１  α−ＨＬ−Ｐｏｌ２ナノポア−ポリメラーゼコンジュゲート、０．４μＭの所望の「ＪＡＭ１Ａ」ＤＮＡ鋳型を、チップのシス側に添加した。混合物中のナノポア−ポリメラーゼコンジュゲートは、脂質二重層中に自発的に挿入する。Ｃａ２＋金属イオンのみが存在し、Ｍｇ２＋金属イオンは存在しないので、活性部位でＤＮＡポリメラーゼでの三元複合体は形成できたが、ヌクレオチドは組み込まれず、５’−リン酸が連結されたタグは放出されなかった。
【０１８７】
[0159]「ＪＡＭ１Ａ」ＤＮＡ鋳型は、９９マーの自己プライミング一本鎖である。このＤＮＡ鋳型は、相補的ｄＴヌクレオチドとの結合のための、鋳型上の第１の利用可能な位置を有する。
【０１８８】
[0160]ナノポア遮断電流測定：ナノポアコンジュゲートおよびＤＮＡ鋳型を挿入するために使用される同一バッファー溶液（２０℃の、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（ＤＣモード用）または５００ｍＭ  グルタミン酸カリウム、ｐＨ８（ＡＣモード用）、３ｍＭ  ＣａＣｌ２、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ）をまた、ナノポア電流遮断測定のための電解質溶液として使用した。ＤＣモード用には、膜のいずれかの側に位置する２つのＡｇ／ＡｇＣｌ電極の間のチップボードおよび細孔にわたって１００ｍＶ（シス対トランス）電圧を印加した。ＡＣモード用には、Ｐｔ／Ａｇ／ＡｇＣｌ電極設定を使用し、−１０ｍＶ〜２００ｍＶ矩形波形を印加した。
【０１８９】
[0161]図２は、ＤＣモードで実施した静的捕獲実験の結果を示す。細孔にわたって電圧が印加されたポリペプチドタグ付きヌクレオチドについて、多数の電流遮断事象をプロットした。図２は、遮断電流事象の２つの検出可能な特徴に基づいてプロットを示す。：（１）細孔のバックグラウンド電流または「開口電流」（「Ｏ．Ｃ．」）のパーセンテージとしての遮断電流および（２）ミリ秒での平均滞留時間。異なるタグ付きヌクレオチド各々について観察された電流遮断事象滞留時間のヒストグラムを、指数関数ｙ＝Ａ  ｅ−Ｂｘに適合させ、定数Ｂの逆数を算出される平均滞留時間として使用した。１０ｍｓより長い平均滞留時間を有する電流遮断事象および開口電流の６０％未満の遮断電流を、ナノポアにコンジュゲートされたポリメラーゼによるタグ付きヌクレオチドの生産的な捕獲（すなわち、ポリメラーゼ活性部位でのタグ付きヌクレオチドの、相補的鋳型塩基との結合および隣接する細孔中に位置するタグ付きヌクレオチドの「テール」）を示すとみなした。
【０１９０】
[0162]結果：ポリペプチドタグ付きヌクレオチド、化合物（１）のｄＴ６Ｐ−リンカー−（ＥＡＡＡ）１６−Ｅ５は、１．７％の低い分散を伴う開口電流の１７％の一貫して高い遮断電流を示した。平均滞留時間は、９７５ｍｓであり、これは、１５〜３０ｍｓの範囲の平均滞留時間を示す３０マーのオリゴヌクレオチドなどの、ナノポア検出実験において使用した他の種類のタグについて観察された滞留時間よりも有意に長かった。
【実施例３】
【０１９１】
交流電流（ＡＣ）条件下での異なるポリペプチドタグ付きヌクレオチドのナノポア捕獲
[0163]この実施例は、ＡＣ電圧を使用するナノポア検出「静的捕獲」下での４種のポリペプチドタグ付きヌクレオチドの遮断電流特徴の測定および比較を例示し、ヘリックス構造および変動する全体的な電荷を有する３種のポリペプチドタグ付きヌクレオチド、ｄＴ６Ｐ−リンカー−（ＥＡＡＡ）１６−Ｅ５、ｄＴ６Ｐ−リンカー−（ＥＡＡＡ）１３−Ｅ５およびｄＴ６Ｐ−リンカー−（ＥＡＡＡ）８−Ｐ−（ＥＡＡＡ）８−Ｅ５の遮断電流、主にランダムコイル構造を有するポリペプチドタグ付きヌクレオチド、ｄＴ６Ｐ−リンカー−（ＵＥ）２５−ビオチンの遮断電流を比較する。
【０１９２】
[0164]実施例１に記載した方法に従い、ｄＴ６Ｐ−Ｎ３と、対応するプロパルギル修飾ポリペプチドタグ、Ｐｒａ−（ＥＡＡＡ）１６−Ｅ５および（プロパルギル）Ｋ（ＵＥ）２５−ビオチンの間のクリック反応によって２種のポリペプチドタグ付きヌクレオチドを調製する。ナノポア検出システムは、ナノポア−ポリメラーゼコンジュゲートが、実施例２に記載されるようなＪＡＭ１Ａ  ＤＮＡ鋳型と複合体形成された膜に挿入された、２６４ナノポアアレイマイクロチップである。ナノポアウェル溶液は、５００ｍＭ  グルタミン酸カリウム（ＫＧｌｕ）、３ｍＭ  ＣａＣｌ２、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８であり、１００ｍＶ  ＤＣ電圧よりも、２１０ｍＶピークとピークの間のＡＣ電圧を膜電極にわたって走らせる。
【０１９３】
[0165]本明細書において別の場所に記載したように、ＡＣ電流は、ポリペプチドタグが、反復的にナノポア中に向けられ、ナノポアから排出されることを可能にし、それによって、タグを検出するより多くの機会を提供するので、ナノポア検出にとって特定の利点を有し得る。ＡＣ電流はまた、経時的に、より安定な電流シグナルおよび電極のより少ない分解のための、より不変の電位を提供し得る。
【０１９４】
[0166]第１のｄＴ６Ｐ−リンカー−（ＥＡＡＡ）１６−Ｅ５、次いでｄＴ６Ｐ−リンカー−（ＵＥ）２５−ビオチンの３μＭの溶液をチップのシス側に添加し、２種のポリペプチドタグ付きヌクレオチドの捕獲事象の明確に異なる遮断電流を測定し、時間に対してプロットする。得られたプロットを図３に示す。ｄＴ６Ｐ−リンカー−（ＥＡＡＡ）１６−Ｅ５のナノポア捕獲は、約５０％  Ｏ．Ｃ．のかなり高い遮断電流をもたらすのに対し、ｄＴ６Ｐ−リンカー−（ＵＥ）２５−ビオチンのナノポア捕獲は、約８０〜９０％  Ｏ．Ｃ．のより低い遮断電流をもたらす（注記：開口電流のより低いパーセンテージは、開口電流のより高い遮断、したがって、より高い遮断電流を示す）。したがって、２種の異なるポリペプチドタグを有するポリペプチドタグ付きヌクレオチドは、核酸シーケンシングにとって有用なナノポアアレイ検出条件下でのより高い識別可能な遮断電流を提供可能である。
【０１９５】
[0167]さらに、ナノポア静的捕獲測定を、ヘリックス構造を有する２種の他のポリペプチドタグ付きヌクレオチド、ｄＴ６Ｐ−リンカー−（ＥＡＡＡ）１３−Ｅ５およびｄＴ６Ｐ−リンカー−（ＥＡＡＡ）８−Ｐ−（ＥＡＡＡ）８−Ｅ５で実施し、同様の結果が得られる。両方とも、同様のヘリックス構造を有するｄＴ６Ｐ−リンカー−（ＥＡＡＡ）１６−Ｅ５の遮断電流と同様の、５０〜５５％  Ｏ．Ｃ．の高い遮断電流を示す。
【図１】
2018526418.tif 000034
【図２】
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【図３】
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【配列表】
2018526418000001.app
【国際調査報告】
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2018526418.tif 000038
2018526418.tif 000039
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