(57)【要約】リステリア宿主細胞中のＰｒｆＡ介在型発現構築物の発現を査定する方法が提供される。本方法の態様は、ＰｒｆＡ介在型発現構築物を含むリステリア宿主細胞を、還元剤含有限定培地中に維持すること、及び発現構築物からの産物の発現を評価して、ＰｒｆＡ介在型発現構築物の発現を査定することを有する。また、リステリアワクチンの製造方法及び使用方法、ならびにそのような方法で使用するための限定培地も提供される。
2018530317.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰｒｆＡ介在型発現構築物の発現の査定方法であって、
ＰｒｆＡ介在型発現構築物を含むリステリア宿主細胞を、ＰｒｆＡ活性化量の還元剤を含有する限定培地中に維持すること、及び
発現構築物からの産物の発現を評価して、前記ＰｒｆＡ介在型発現構築物の発現を査定すること
を有する、方法。
【請求項２】
前記ＰｒｆＡ介在型発現構築物は、改変病原因子発現構築物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記改変病原因子発現構築物は、ＡｃｔＡ発現構築物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＡｃｔＡ発現構築物は、ＡｃｔＡプロモーターを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＡｃｔＡ発現構築物は、融合タンパク質をコードする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記融合タンパク質は、Ｎ末端のＡｃｔＡドメインを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰｒｆＡ介在型発現構築物は、異種抗原をコードする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記査定することは、観測された発現レベルを閾値と比較することを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記リステリア宿主細胞は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ワクチンの製造方法であって、
異種抗原をコードするＰｒｆＡ介在型発現構築物を含むリステリア宿主細胞を、ＰｒｆＡ活性化量の還元剤を含む限定成長培地中、ワクチンを製造するために十分な様式で、培養することを有する、方法。
【請求項１１】
前記リステリア宿主細胞は、請求項１から９のいずれか１項に記載されるとおりである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記リステリア宿主を殺傷することをさらに有する、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法により製造されるリステリア細菌を含む、ワクチン。
【請求項１４】
対象における抗原に対する細胞性免疫応答の誘発または強化方法であって、
前記対象に、請求項１３記載のワクチンを有効量で投与することを有する、方法。
【請求項１５】
ＰｒｆＡ活性化量の還元剤を含む、細菌培養限定培地。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ワクチンの使用は、細菌、ウイルス、寄生虫、及び真菌によるものをはじめとする感染症を管理するために費用効率が良い医療手段である。感染症予防を実現することだけでなく、宿主の免疫系を刺激して腫瘍成長に介入するワクチンの開発にも労力が費やされている。
【０００２】
宿主免疫応答には、抗体産生が関与する液性免疫応答及び細胞性免疫応答の両方が含まれる。ワクチンによる防御免疫化は、通常、感染病原体、腫瘍細胞、または毒素の作用に対して指向した液性抗体の形成を誘導するように設計されてきた。しかしながら、腫瘍細胞が存在することまたは細胞が感染病原体に慢性感染していることを特徴とするある特定の疾患の制御には、抗体の産生の代わりに、またはそれに加えてのいずれかで、細胞性免疫応答が必要になることが多い。液性免疫応答は、生感染病原体及び不活化された病原体を使用して誘導することが可能である一方で、細胞性免疫応答は、ワクチンの使用を通じて誘導することが最も効果的である。
【０００３】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、免疫低下した個体及び妊婦に重篤な感染症をもたらす原因となる、グラム陽性、食品媒介性の、ヒト及び動物病原体である。ヒトにおける重度のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ感染症は、髄膜炎、髄膜脳炎、敗血症、及び胎児死亡を特徴とする。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、自然に偏在している上に、さらに広範囲の温血動物から単離され得る。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、動物に接種した場合、主に細胞性免疫応答を誘発する。
【０００４】
標的病原体または悪性病変として選択されたものに関連する指定された抗原（複数可）をコードするように操作された組換え改変Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）ワクチンプラットホームが、複数のヒト臨床試験の基礎となってきた。リステリアは、特に免疫低下宿主において病原性生物となり得るため、投与工程は、関心対象の抗原の発現可能な免疫学的活性部分をコードする弱毒リステリアを投与することを含むことが好ましい。「弱毒」は、細菌を改変して、その細菌の病原性を低下させまたは排除するが、その細菌が持つ、関心対象の疾患に対する予防薬または治療薬として作用する能力は保持させるプロセスを示す。例として、遺伝学的に定義された生弱毒Ｌｍ  ΔａｃｔＡΔｉｎＩＢは、２つの病原遺伝子が欠失されており、マウスリステリア症モデルで＞３ｌｏｇ弱毒化されているが、その免疫効力を保持しており、ヒト疾患のマウスモデルならびにヒトの両方で、確固たるＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞免疫を誘導することを示してきており、さらに様々な固形腫瘍悪性病変の患者の臨床状況で安全であること及び忍容性が良いことが示されてきている。
【０００５】
Ｌｍワクチンの作用機構に関して、対象への投与後、宿主細胞の細胞質基質に進入する際、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、Ｃｒｐ−Ｆｎｒファミリー転写調節因子、ＰｒｆＡの活性化を通じて、複数の必須病原因子を協調して発現させる。ＰｒｆＡ及びそれが調節する病原遺伝子についての知見は多いものの、ＰｒｆＡの最初の活性化を招く宿主由来の刺激は、不明のままである。
【発明の概要】
【０００６】
リステリア宿主細胞でのＰｒｆＡ介在型発現構築物の発現を査定する方法が提供される。本方法の態様は、ＰｒｆＡ介在型発現構築物を含むリステリア宿主細胞を、還元剤含有限定培地中に維持すること、及び発現構築物からの産物の発現を評価して、ＰｒｆＡ介在型発現構築物の発現を査定することを有する。また、リアワクチンの製造方法及び使用方法、ならびにそれらの方法で使用するための限定培地も提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ａｃｔＡプロモーターが駆動する蛍光レポーターコード配列を有するＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株３種を、化学合成培地中、記載される還元剤の添加ありまたはなしで成長させた。野生型株の他に、ｐｒｆＡ欠失株、ならびに構成的活性型ｐｒｆＡ株（ｐｒｆＡ＊と表記）を、対照として、平行して試験した。
【図２−１】この実験では、細菌を、富栄養培地（ＢＨＩ）またはリステリア合成培地（ＬＳＭ）中で、還元剤（ＴＣＥＰ）ありまたはなしで増殖させ、マウスにＩＶ注射した。データは、肝臓及び脾臓中の４８でのＣＦＵである。ＷＴ細菌及び構成的活性型ＰｒｆＡを有するＰｒｆＡ＊株を使用した。データは、ＬＳＭ＋ＴＣＥＰ中で成長した細菌が、５０倍前後多い細菌を臓器中に存在することを示し、このことは、この方法が細菌の病原性を高めることを示す。
【図２−２】この実験では、細菌を、富栄養培地（ＢＨＩ）またはリステリア合成培地（ＬＳＭ）中で、還元剤（ＴＣＥＰ）ありまたはなしで増殖させ、マウスにＩＶ注射した。データは、肝臓及び脾臓中の４８でのＣＦＵである。ＷＴ細菌及び構成的活性型ＰｒｆＡを有するＰｒｆＡ＊株を使用した。データは、ＬＳＭ＋ＴＣＥＰ中で成長した細菌が、５０倍前後多い細菌を臓器中に存在することを示し、このことは、この方法が細菌の病原性を高めることを示す。
【図２−３】この実験では、細菌を、富栄養培地（ＢＨＩ）またはリステリア合成培地（ＬＳＭ）中で、還元剤（ＴＣＥＰ）ありまたはなしで増殖させ、マウスにＩＶ注射した。データは、肝臓及び脾臓中の４８でのＣＦＵである。ＷＴ細菌及び構成的活性型ＰｒｆＡを有するＰｒｆＡ＊株を使用した。データは、ＬＳＭ＋ＴＣＥＰ中で成長した細菌が、５０倍前後多い細菌を臓器中に存在することを示し、このことは、この方法が細菌の病原性を高めることを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
リステリア宿主細胞でのＰｒｆＡ介在型発現構築物の発現を査定する方法が提供される。本方法の態様は、ＰｒｆＡ介在型発現構築物を含むリステリア宿主細胞を、還元剤含有限定培地中に維持すること、及び発現構築物からの産物の発現を評価して、ＰｒｆＡ介在型発現構築物の発現を査定することを有する。また、リステリアワクチンの製造方法及び使用方法、ならびにそれらの方法で使用するための限定培地も提供される。
【０００９】
本発明をより詳細に説明する前に、当然のことながら、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、そのため、もちろん変更の可能性がある。同じく当然のことながら、本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を記載することのみを目的とし、制限をかけることを意図しない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されることになるからである。
【００１０】
ある範囲の値が提示される場合、当然ながら、その範囲の上限と下限及びその指定範囲中のあらゆる記載されたまたは間に存在する値の間に存在する各値は、文脈で特に明白に指示されない限り下限値の単位の１０分の１まで、本発明に包含される。これらのより狭い範囲の上限値及び下限値は、独立してこのより狭い範囲に含まれる場合があり、同じく本発明に包含され、記載される範囲において具体的な排他的限度値をどれでも取る。記載される範囲が、限度値の一方または両方を含める場合、そのように含まれる限度値のいずれかまたは両方を含めない範囲も、同じく本発明に含まれる。
【００１１】
ある特定の範囲は、本明細書中、「約」という用語に先行される数値で提示される。「約」という用語は、本明細書中、その用語に続くまさにその数、ならびにその用語に続く数に近いまたは近似する数に対する文字での支持を提供するために使用される。ある数が、具体的に引用された数に近いまたは近似するのかどうかを決める際、引用された数に近いまたは近似する数は、その数が提示される文脈において、具体的に引用された数と実質的に等価であるものを提供する数である場合がある。
【００１２】
特に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中記載されるものと同様または等価な方法及び材料はどれでも本発明の実施または試験において同じく使用可能であるものの、代表的な例示の方法及び材料をここで説明する。
【００１３】
本明細書中で引用される刊行物及び特許は全て、個々の刊行物または特許がそれぞれ、具体的に及び個別に、参照として援用されると示されたかのように、本明細書中に参照として援用され、方法及び／または材料を、刊行物が引用される箇所と関連して開示及び説明するために本明細書中に参照として援用される。刊行物の引用はどれも、出願日前にその開示があったということについてであり、本発明より前であるという理由でそのような刊行物に対して本発明が先行するものとしての権利を与えられないことを承認すると見なされるべきではない。さらに、提示される刊行物の日付は、実際の公開日とは異なる可能性があり、個々に確認しなければならない可能性がある。
【００１４】
なお、本明細書中及び添付の特許請求の範囲中で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈で特に明白に指定されない限り、複数の指示対象を含む。さらに、特許請求の範囲は、任意選択要素のいずれかを排除するように作成される場合がある。そのため、本記載は、請求項の要素の復唱に関連して「だけ」、「のみ」などのような排他的用語の使用、あるいは「否定的」制限の使用のための先行詞として機能することを意図する。
【００１５】
当業者には本開示を読むことで当然であるだろうが、本明細書中で記載及び例示される個々の実施形態はそれぞれ、個別の構成要素及び特長を有しており、それらは、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、その他の複数の実施形態のいずれの特長とも、容易に切り離すまたは組み合わせることができる。記載される方法はどれでも、記載される事象の順序で、または論理的に可能な任意の他の順序で行うことができる。
【００１６】
本発明の様々な態様をさらに記載するにあたり、ＰｒｆＡ介在型発現を評価する方法を、最初により詳細に説明し、続いてワクチンの総説、そして本発明の実施形態によるその使用方法を説明する。
【００１７】
ＰｒｆＡ介在型発現を評価する方法
上記で要約したとおり、本発明の態様は、リステリア宿主細胞におけるＰｒｆＡ介在型発現構築物の発現を査定する方法を含む。本明細書中で使用される場合、「査定する」という用語は、ある様式での特性決定、例えば、特性決定が定性的（例えば、発現の発生を検出すること、相対的発現レベルを同定することなど）である場合または定量的（例えば、コピー数で発現を測定することなど）である場合のものを意味する。
【００１８】
ＰｒｆＡ介在型発現構築物とは、構築物のコード配列の発現が、ＰｒｆＡ転写アクチベーターの存在により介在される、例えば活性化される、核酸発現構築物である。そのため、ＰｒｆＡ介在型発現構築物は、ＰｒｆＡ応答配列、例えば、７つの不変ヌクレオチド（大文字で記載）及び２塩基ミスマッチ耐性を有するｔＴＡＡＣａｎｎｔＧＴｔＡａ（配列番号０１）を含む。
【００１９】
発現構築物は、ＰｒｆＡ応答配列の他に、コード配列をさらに含む。場合によっては、コード配列は、異種抗原をコードする。異種抗原は、ある特定の実施形態では、異種抗原の起源となった感染病原体による曝露に対する動物において防御を提供することができ、または宿主生体にとって有益である様式で腫瘍の成長及び転移に影響を及ぼすことができるものである。すなわち、発現構築物によりコードすることができる異種抗原として、リステリアにより発現した場合に、細胞性免疫応答を誘発する働きがあり、その応答が誘導される宿主にとって、その応答が有益である任意の抗原が挙げられる。したがって、異種抗原として、感染病原体により特異性があるものが挙げられ、その抗原に対して生じる免疫応答は、病原体により引き起こされる疾患を予防または治療する働きがある。そのような異種抗原として、ウイルス、細菌、真菌、もしくは寄生虫の表面タンパク質、及び任意の他のタンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質などが挙げられるが、これらに限定されない。異種抗原として、また、その異種抗原（複数可）を発現する腫瘍を生じるリスクがある、またはそのような腫瘍を有すると診断された宿主生体に便益をもたらすものが挙げられる。宿主生体は、哺乳類、例えば、ヒトの場合がある。
【００２０】
「異種抗原」という用語は、本明細書中で使用される場合、感染病原体、腫瘍細胞、または腫瘍関連タンパク質の同一抗原に実質的に相当する、タンパク質もしくはペプチド、糖タンパク質もしくは糖ペプチド、リポタンパク質もしくはリポペプチド、またはリステリアで通常発現しない任意の他の巨大分子を意味する。異種抗原は、哺乳類細胞が細胞株に感染した際、発現構築物により発現し、プロセシングを受けて、細胞傷害性Ｔ細胞に提示される。リステリア菌により発現した異種抗原は、哺乳類で自然に発現する未変性抗原またはタンパク質を認識するＴ細胞応答をもたらす限り、腫瘍細胞または感染病原体中の相当する未変性抗原またはタンパク質と正確に一致する必要はない。他の例において、腫瘍細胞抗原は、哺乳類で自然に発現するものの変異体型が可能であり、リステリア菌により発現する抗原は、その腫瘍細胞変性抗原に適合することになる。「腫瘍関連抗原」という用語は、本明細書中で使用される場合、宿主生体での腫瘍成長または転移に影響を及ぼす抗原を意味する。腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞により発現する抗原の場合もあるし、非腫瘍細胞により発現するが、そのように発現した場合でも腫瘍細胞の成長または転移を促進する抗原の場合もある。そのような抗原をコードするＤＮＡを組み込むやり方でリステリアに導入することができる腫瘍抗原及び腫瘍関連抗原の型として、任意の既知のまたは現時点では未知の腫瘍抗原が挙げられる。他の例において、「腫瘍関連抗原」は、腫瘍成長または転移に何の影響も及ぼさないが、その抗原が、腫瘍の起源である組織（及び腫瘍）で特異的に発現するという理由で、リステリアワクチンの成分として使用される。さらに他の例において、「腫瘍関連抗原」は、腫瘍成長または転移に何の影響も及ぼさないが、その抗原が、腫瘍細胞で選択的に発現し、その他の正常組織では発現しないという理由で、リステリアワクチンの成分として使用される。
【００２１】
ワクチン開発に有用な異種抗原は、当業者が利用可能な知見を用いて選択することができ、腫瘍細胞により発現する、または腫瘍成長もしくは転移に影響を及ぼす、または感染病原体により発現する抗原タンパク質は、現在多数知られている。例えば、異種抗原として有用であるとみなすことが可能なウイルス抗原として、インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）及びＨＩＶのｇａｇタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。他の異種抗原として、ＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質またはその構成部分であるｇｐ１２０及びｇｐ４１、ＨＩＶ  ｎｅｆタンパク質、ならびにＨＩＶ  ｐｏｌタンパク質、逆転写酵素、ならびにプロテアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。さらに他の異種抗原として、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）と関連したものが可能であり、Ｅ１及びＥ２糖タンパク質、ならびに非構造（ＮＳ）タンパク質、例えば、ＮＳ３が挙げられるが、これらに限定されない。また、他のウイルス抗原、例えばヘルペスウイルスタンパク質などが有用な場合もある。異種抗原は、ウイルス起源のものに必ずしも限定されない。寄生虫抗原、例えば、マラリア抗原なども含まれ、真菌抗原、細菌抗原、及び腫瘍抗原も同様である。
【００２２】
本明細書中で記載されるとおり、腫瘍細胞により発現するタンパク質も複数知られており、本発明のワクチン株に挿入することができる異種抗原として関心対象にある。そのようなものとして、白血病のｂｃｒ／ａｂｌ抗原、子宮頸癌と関連した発癌ウイルスのＨＰＶＥ６及びＥ７抗原、黒色腫のもしくは黒色腫と関連したＭＡＧＥ１及びＭＺ２−Ｅ抗原、ならびに乳癌のもしくは乳癌と関連したＭＶＣ−１及びＨＥＲ−２抗原が挙げられるが、これらに限定されない。他の関心対象のコード配列として、共刺激分子、免疫調節性分子などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
発現構築物によりコードすることができるさらなる異種抗原は、ＷＯ２０１４／１０６１２３に開示されており、この開示は、本明細書中、参照として援用される。
【００２４】
ＰｒｆＡ介在型発現構築物は、ＰｒｆＡ応答要素及び異種抗原コード配列の他に、さらに、リステリア病原因子由来の１つまたはさらなる構成要素を含むことができ、そのようなものとして、プロモーター配列、Ｎ末端コード配列などがあるがこれらに限定されず、このような発現構築物は、病原因子発現構築物と称する場合がある。病原因子発現構築物において、発現構築物の１つまたは複数の領域またはドメインは、リステリア病原因子、例えばＰｒｆＡ介在型病原因子などのために誘導されたものである場合がある。そのような病原因子は様々である可能性があるものの、そのような病原因子の例として、Ｈｌｙ、Ｍｐｌ、ＰｌｃＡ、ＡｃｔＡ、及びＰｌｃＢが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
場合によっては、ＰｒｆＡ介在型発現構築物は、ＡｃｔＡプロモーター及び異種抗原と融合したＡｃｔＡのＮ末端ドメイン、すなわち、異種抗原と融合したＡｃｔＡのＮ末端ドメインを含む融合タンパク質用のコード配列を含むＡｃｔＡ発現構築物である。Ｎ末端ドメイン用コード配列は、様々な長さのＮ末端ドメインをコードすることができ、長さは、場合によっては、２５〜１２５ａａ、例えば、７５〜１００ａａの範囲である。
【００２６】
上記で記載したものなどのＰｒｆＡ介在型発現構築物を含むリステリア宿主細胞は、複数の様々なリステリア菌の中の任意の１種が可能である。関心対象のリステリア菌として、Ｌ．ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎｉｉ、Ｌ．ｇｒａｙｉ、Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌ．ｍａｒｔｈｉｉ、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．ｒｏｃｏｕｒｔｉａｅ、Ｌ．ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌ．ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ、及びＬ．ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉが挙げられるが、これらに限定されない。すなわち、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ以外のリステリア株が宿主細胞である場合がある。ある特定の実施形態において、リステリア株は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。
【００２７】
場合によっては、リステリア宿主細胞は、弱毒化されている。「弱毒」及び「弱毒された」は、宿主に対する毒性を低下させるように改変されたリステリア宿主細胞を包含する。宿主として、ヒトもしくは動物宿主、または臓器、組織、もしくは細胞が可能である。リステリア宿主細胞は、限定ではなく例を挙げると、弱毒化により、宿主細胞との結合を減少させる、１つの宿主細胞から別の宿主細胞への拡散を減少させる、細胞外成長を減少させる、または宿主細胞での細胞内成長を減少させることができる。弱毒は、例えば、毒性の１つまたは複数の明確な指標物質、ＬＤ５０、臓器からのクリアランス速度、または競合指標（例えば、Ａｕｅｒｂｕｃｈ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６９：５９５３−５９５７を参照）などを測定することにより、査定可能である。一般に、弱毒は、少なくとも２５％、より一般的には少なくとも５０％、最も一般的には少なくとも１００％（２倍）、通常は、少なくとも５倍、より通常には少なくとも１０倍、最も通常には少なくとも５０倍、多くの場合、少なくとも１００倍、より多くの場合、少なくとも５００倍、最も多くの場合少なくとも１０００倍、普通は少なくとも５０００倍、より普通には少なくとも１０，０００倍、及び最も普通には少なくとも５０，０００倍、ならびに最も多くの場合少なくとも１００，０００倍のＬＤ５０の上昇及び／またはクリアランス速度の上昇をもたらす。
【００２８】
所定のリステリア宿主細胞は、野生型と比べた場合に１つまたは複数の改変を含む場合があり、そのような改変は、宿主細胞において望ましい特質、例えば、弱毒、向上した免疫原性などをもたらすものであり、ＰｒｆＡ介在型発現構築物の一部分及び／またはリステリア宿主細胞の別の構成要素にある場合がある。本発明の実施形態で査定される具体的なリステリア宿主細胞として、ＰＣＴ出願公開番号：ＷＯ２０１４／１０６１２３、ＷＯ２０１４／０７４６３５、ＷＯ２００９／１４３０８５、ＷＯ２００８／０２７５６０、ＷＯ２００８／０６６７７４、ＷＯ２００７／１１７３７１、ＷＯ２００７／１０３２２５、ＷＯ２００５／０７１０８８、ＷＯ２００３／１０２１６８、ＷＯ２００３／０９２６００、ＷＯ／２０００／００９７３３、及びＷＯ１９９９／０２５３７６に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されず；これら出願の開示は、本明細書中に参照として援用される。
【００２９】
上記で要約したとおり、本方法の態様は、ＰｒｆＡ介在型発現構築物を含むリステリア宿主細胞を、還元剤含有限定培地中に維持することを有する。限定培地とは、正確な化学組成が既知である細菌培養培地を意味する。そのため、本発明の方法で使用可能な限定培地は、複合培地ではない、すなわち、使用可能な限定培地は、培地の正確な化学構成が不明な培地ではない。関心対象の限定培地は、自然には生じない培地の場合がある。
【００３０】
本発明の方法での利用が認められる限定培地として、様々なものが可能である。場合によっては、限定培地は、炭素源、例えば、グルコース、１種または複数のアミノ酸、例えば、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、ＤＬ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、ＤＬ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、ＤＬ−バリンなど、窒素源、例えば、アデニン、１種または複数のビタミン、例えば、ナイアシンアミド／ニコチンアミド、Ｄ−パントテン酸（ヘミカルシウム）、ピリドキサール、チアミンなど、１種または複数の塩、例えば、ＫＨ2 ＰＯ4 、Ｎａ2 ＨＰＯ4 、ＭｇＳＯ4 など、ならびに１種または複数の微量金属、例えば、ＦｅＣｌ2 、ＭｎＳＯ4 、ＺｎＳＯ4 、ＣａＣｌ2 、ＣｕＳＯ4 、ＣｏＣｌ2 、Ｈ3 ＢＯ3 、Ｎａ2 ＭｏＯ4 、ＮａＣｌ、クエン酸ナトリウム（三ナトリウム塩）など、１種または複数の必須栄養素、例えば、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、他の（例えば、ＢＲＰＬ）成分、例えば、ビオチン、リボフラビン、Ｐａｒａ−アミノ安息香酸、リポ酸など、緩衝剤、例えば、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、などを含む。本発明の方法で使用可能な具体的限定培地として、Ｗｈｉｔｅｌｅｙ，Ａ．Ｔ．，Ｐｏｌｌｏｃｋ，Ａ．Ｊ．，＆Ｐｏｒｔｎｏｙ，Ｄ．Ａ．（２０１５）、Ｔｈｅ  ＰＡＭＰ  ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ  Ｉｓ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  Ｒｉｃｈ  ｂｕｔ  Ｎｏｔ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｍｅｄｉａ  ｄｕｅ  ｔｏ  ａ  Ｔｏｘｉｃ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  （ｐ）ｐｐＧｐｐ、Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｅ，１７（６），７８８−７９８、及びＰｈａｎ−Ｔｈａｎｈ，Ｌ，＆Ｇｏｒｍｏｎ，Ｔ．（１９９７）、Ａ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３５（１），９１−９５、ならびに以下の実験の部に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。限定培地の様々な成分の範囲は、所望の場合、変化させることができるが、場合によっては、限定培地は、以下の１種または複数を含む。炭素源、例えば、グルコースを、０．０１〜０．１０Ｍ、例えば０．０２５〜０．０７５Ｍの範囲の量；緩衝剤、例えば、ＭＯＰＳを、０．０５〜０．２Ｍ、例えば０．０７５〜０．１２５Ｍの範囲の量；１種または複数の塩を、任意の所定の塩の量が変更可能な場合に、場合によっては、０．００１〜０．０５Ｍ、例えば０．００１〜０．０２Ｍの範囲；ＢＲＰＬ成分を、任意の所定のＢＲＰＬ成分の量が変更可能な場合に、場合によっては、０．０１〜１０μｍ、例えば０．０２〜７．５μｍの範囲；１種または複数のアミノ酸から構成されるアミノ酸成分を、任意の所定のアミノ酸の量が変更可能な場合に、場合によっては、０．０００１〜０．００２０Ｍ、例えば０．０００４〜０．００１０Ｍの範囲；１種または複数のアミノ酸から構成されるビタミン成分を、任意の所定のアミノ酸の量が変更可能な場合に、場合によっては、１〜１０μｍ、例えば２．５〜９μｍの範囲；窒素源、例えば、アデニンを、１５〜２５μｍ、例えば１７．５〜２０μｍの範囲；１種または複数の微量金属から構成される微量金属成分を、任意の所定の微量金属の量が変更可能な場合に、場合によっては、０．０５〜１５０μｍ、例えば０．１〜１００μｍの範囲；ならびに１種または複数の必須栄養素、例えば、Ｌ−システイン及び／またはＬ−グルタミンから構成される必須栄養素を、任意の所定の必須栄養素の量が変更可能な場合に、場合によっては、５００〜５０００μｍ、例えば５００〜４５００μｍの範囲。
【００３１】
上記で要約したとおり、本発明の方法に使用される限定培地は、さらに還元剤を含む。還元剤は、還元剤そのものとしてまたはその生化学前駆体として培地に添加することができる。成長培地に添加することができる還元剤として、グルタチオン（ＧＳＨ）、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリス（３−ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ）、システイン、システアミン、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。限定成長培地に添加される還元剤の濃度は、宿主細胞中の反応性病原因子の発現のＰｒｆＡによる活性化をもたらすために有効である限りにおいて変更可能であり（すなわち、ＰｒｆＡ活性化量で存在し）、場合によっては、濃度は、１〜２０ｍＭ、例えば１．５〜１５ｍＭ、例えば、１．５〜２０ｍＭ、例えば２〜１０ｍＭなどの範囲である。
【００３２】
本発明の方法を実施する際、リステリア宿主細胞は、標的ＰｒｆＡ介在型発現構築物からのＰｒｆＡ介在型発現が起こるために十分な条件下及び時間で、限定成長培地中に維持される。場合によっては、宿主細胞は、４℃〜４０℃、例えば１５℃〜４０℃、例えば、２５℃〜４０℃、例えば３５℃〜３７℃などの範囲の温度で、限定培地中に維持される。宿主細胞をその条件下に置く時間の長さは変更可能であるものの、場合によっては、時間の長さは、３０分〜７２時間、例えば、６時間〜２４時間をはじめとする１時間〜４８時間の範囲である。
【００３３】
上記で要約したとおり、本方法の態様は、さらに、発現構築物からの産物の発現を評価して、ＰｒｆＡ介在型発現構築物の発現及び／または宿主細胞からの発現産物の分泌を査定することを有する。評価は、任意の従来プロトコルを用いて、例えば、発現産物によりコードされた産物の存在をアッセイすることにより達成することができ、アッセイは、所望の場合、定性的（例えば、存在または不在を判断する）、半定量的（例えば、相対量を求める）、または定量的（例えば、絶対量を求める）とすることができる。そのため、本発明の方法は、宿主細胞を含む培地中の関心対象の発現構築物の発現産物を検出することを含む場合がある。関心対象の発現産物は、任意の従来プロトコル、例えば、核酸検出プロトコル、タンパク質検出プロトコルなどを用いて検出することができる。場合によっては、検出プロトコルは、アッセイ培地、例えば、宿主細胞またはその成分を含むものを、発現産物と特異的に結合する標識化結合メンバーと接触させることを含むことができ、この場合宿主細胞を、検出に適するように改変、例えば、透過処理または溶解することができる。標識化結合メンバーの性質は、結合部分及び検出標識に関して変更可能であり、関心対象の結合部分として、核酸及びペプチド／タンパク質、例えば、抗体及びその結合断片が挙げられ、ならびに、標識部分も変更可能であり、例として、蛍光標識、質量標識、同位体標識などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
場合によっては、本方法は、さらに、評価の結果、例えば、観察された発現レベル、分泌された産物の量などを、閾値と比較することを有する。そのような場合、本方法はさらに、観察された結果が閾値を超えるならば、リステリア宿主細胞を許容されるワクチンとして同定することを有することができる。
【００３５】
ワクチン
上記のとおりの方法により同定された、または上記のとおりの限定培地を用いて製造された細菌は、とりわけ、ワクチンとしての利用が認められる。細菌は、生きている場合もあるし、不活化されているが代謝活性を示す（「ＫＢＭＡ」）場合もある。ＫＢＭＡワクチン株は、ｕｖｒＡ及びｕｖｒＢなどのＤＮＡ修復遺伝子の欠失を通じてヌクレオチド除去修復能力を抑止することにより構築する。遺伝子欠失は、細菌を、ソラレン及びＵＶＡの複合処理を通じた光化学的不活化に対して感受性にする。ＫＢＭＡ細菌株は、形成されたソラレン誘導型ＤＮＡ架橋を修復できないことから、複製不可能、すなわち機能的に非伝染性になる。この特徴は、生弱毒株と比較して改善された安全性プロファイルをもたらす。しかしながら、架橋数が非常に限られていることで、抗原発現をはじめとするそれらの代謝活性、すなわち免疫の潜在能力は保存される。ＫＢＭＡワクチン株は、米国特許第７，８３３，７７５号に記載されており、その開示は、本明細書中で参照として援用される。
【００３６】
そのようなワクチンは、脊椎動物を亜致死性用量の細菌と接触させることにより、脊椎動物に投与することができ、接触として、ワクチンを宿主に投与することが挙げられる。いくつかの実施形態によっては、細菌は、薬学上許容される配合物において提供される。投与は、経口、非経口、鼻腔内、筋肉内、皮内、腹腔内、血管内、皮下、リンパ節への直接ワクチン接種、カテーテルによる投与、あるいは様々な周知の投与経路の任意の１種または複数が可能である。家畜動物では、例えば、ワクチンは、ワクチンを飼料または液体（水など）に組み入れることにより、経口投与することができる。ワクチンは、凍結乾燥粉末として、凍結配合物として、またはカプセル剤の成分として、あるいは任意の他の簡便な薬学上許容される、ワクチンの抗原性を保存する配合物として、供給することができる。複数の周知の薬学上許容される希釈剤または賦形剤のうち任意のものを、本発明のワクチンに使用することができる。適切な希釈剤として、例えば、滅菌蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝液などが挙げられる。希釈剤の量は、当業者が認識できる場合、広く変わる可能性がある。適切な賦形剤も、当業者に周知であり、例えば、Ａ．Ｗａｄｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｊ．Ｗｅｌｌｅｒ，ｅｄｓ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（１９９４）  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ：Ｌｏｎｄｏｎから選択することができる。投与される投薬量は、患者の年齢、健康状態、及び体重、患者の種類、ならびにもしあれば、併用療法の存在に左右される可能性がある。ワクチンは、経口投与用についてはカプセル剤、液状の溶液、懸濁剤、またはエリキシル剤など、あるいは、非経口、鼻腔内、筋肉内、または血管内用途については、溶液もしくは懸濁液などの滅菌液状配合物などの剤形で使用することができる。本発明に従って、ワクチンは、薬学上許容される希釈剤と組み合わせて、選択された生体もしくはウイルスから生じる感染症に対してまたは腫瘍に関してなどで、患者を免疫化するために有用な、ワクチン組成物として、使用することができる。患者を免疫化するとは、患者に、選択された病原、癌性細胞などに対する少なくともある程度の治療的または予防的免疫を提供することを意味する。
【００３７】
対象ワクチンは、脊椎動物において、選択された病原体、例えば、病原性生体、腫瘍などに対する細胞性免疫応答、例えば、ヘルパーＴ細胞もしくは細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発するまたは強化する方法に利用され、そのような方法は、リステリアワクチンを有効量で投与することを含む。対象ワクチンは、脊椎動物において、抗原特異的免疫応答を増強する自然免疫応答を誘発する方法の利用が認められる。そのうえさらに、本発明のワクチンは、曝露後または診断後の治療に使用することができる。一般に、曝露後治療のためのワクチンの使用は、例えば、狂犬病及び破傷風の治療で、当業者に認められるものと思われる。本発明の同一ワクチンを、例えば、免疫化のため及び曝露後の追加免疫のための両方に使用することができる。あるいは、本発明の異なるワクチンを、例えば、曝露のその後の段階で発現する抗原に特異的なものを、曝露後治療に使用することができる。そのため、対象ベクターを用いて調製された対象ワクチンは、様々な疾患病態と関連する抗原に特異的な免疫応答を誘導するための予防ワクチン及び治療ワクチンとしての使用が認められる。
【００３８】
患者は、選択された生体による感染に感受性がある任意のヒト及び非ヒト動物が可能である。対象ワクチンは、哺乳類をはじめとする脊椎動物、例えば、ヒトなどの霊長類、及び家畜動物の用途が認められる。家畜動物として、家禽、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ科動物（ウサギなど）、または飼育可能な他の動物が挙げられる。
【００３９】
対象ワクチンは、ＰＣＴ出願公開番号第：ＷＯ２０１４／１０６１２３、ＷＯ２０１４／０７４６３５、ＷＯ２００９／１４３０８５、ＷＯ２００８０２７５６０、ＷＯ２００８０６６７７４、ＷＯ２００７１１７３７１、ＷＯ２００７１０３２２５、ＷＯ２００５０７１０８８、ＷＯ２００３１０２１６８、ＷＯ  ２００３／０９２６００、ＷＯ／２０００／００９７３３、及びＷＯ１９９９／０２５３７６号に記載されるとおり、ワクチン接種用途の利用が認められ、これら出願の開示は、本明細書中で参照として援用される。
【００４０】
以下の実施例を、制限としてではなく、例として提示する。
【実施例】
【００４１】
Ｉ．還元剤によるＰｒｆＡ活性化
宿主細胞の細胞質基質に進入する際、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、Ｃｒｐ−Ｆｎｒファミリー転写調節因子、ＰｒｆＡの活性化を通じて、複数の必須病原因子を協調して発現させる。ＰｒｆＡ及びそれが調節する病原遺伝子についての知見は多いものの、ＰｒｆＡの最初の活性化を招く宿主由来の刺激は、不明のままである。最近になって、組織培養物及び動物モデルにおいて、宿主及び細菌両方が合成したグルタチオンが、ＰｒｆＡの活性化に必要であることが示された（Ｒｅｎｉｅｒｅ，Ｍ．Ｌ．，Ｗｈｉｔｅｌｅｙ，Ａ．Ｔ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｋ．Ｌ．，Ｊｏｈｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｌａｕｅｒ，Ｐ．，Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｒ．Ｇ．＆Ｐｏｒｔｎｏｙ，Ｄ．Ａ．Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１７，１７０−１７３（２０１５））が、しかしながら外来性グルタチオンは、標準複合ブロス培養物では、ＰｒｆＡ活性化を刺激するには不十分である。
【００４２】
ＰｒｆＡ活性化に必要なさらなる因子が何であるかを特定するために実験を行った。Ｌ．  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを化学合成培地（富栄養（すなわち、複合）培地ではない）で成長させた場合、外部から添加された過剰なグルタチオンは、この場合は、ＰｒｆＡ活性化を刺激するためには不十分であった。さらなる研究から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのこのＰｒｆＡ活性化は、グルタチオンに対して特異的であるのではなく、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む一連の還元剤により再現可能であることが明らかとなった。富栄養（すなわち、複合）成長培地で見られる未知の阻害性化合物（複数可）が存在しない場合、Ｌ．  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓが感受する宿主由来のＰｒｆＡ活性化刺激は、単純に、宿主細胞の細胞質基質自体が非常に還元された酸化還元状態にあることである。この知見は、Ｌ．  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ分野における重要な、未解決の課題に取り組むものであり、細胞内病原がどうやって他の細胞コンパートメントから宿主細胞の細胞質を識別することを可能にするのかについての簡潔な機構を提供する。
【００４３】
この発見は、ＡｃｔＡの発現を刺激するｉｎ  ｖｉｔｒｏの成長条件の同定である。３種の異なる株を、使用した。ＷＴ  １０４０３Ｓ（Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（２００２）１８４：４１７７−４１８６、ΔｐｒｆＡ、これは、対立遺伝子交換により生じたｐｒｆＡのフレーム内欠失型であった、及びＰｒｆＡ＊、これはＧ１４５Ｓ変異を有する。これらの株を、操作して、ａｃｔＡプロモーター由来のＴａｇＲＦＰを発現させた（例えば、Ｗａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．（２０１１）７：ｅ１００１３２６に報告されるとおりにして）。表１に詳細に記載した化学合成培地を調製した。
【００４４】
【表１−１】
2018530317.tif 000003
【００４５】
【表１−２】
2018530317.tif 000004
【００４６】
次に、表２に列挙した複数の還元剤を、培地に加えた。
【００４７】
【表２】
2018530317.tif 000005
【００４８】
３種の株を、化学合成培地中、上記の還元剤の添加ありまたはなしで、成長させた。野生型株の他に、ｐｒｆＡ欠失株及び構成的活性型ｐｒｆＡ株（ｐｒｆＡ＊と表記）を、対照として並行して試験した。図１は、３種の異なる還元剤（Ｌ−システイン、グルタチオン、及びＴＣＥＰ）を用いてＡｃｔＡを誘導した例を示す。
【００４９】
上記の方法により、細胞を感染させることを必要とせずに、ｐｒｆＡ制御型発現構築物を発現及び分泌について簡単に試験できる。場合によっては、この方法は、ワクチンベクターの免疫原性を上昇させる。場合によっては、この方法は、不活化されているが代謝活性を示す（ＫＢＭＡ）リステリアワクチンの免疫原性を上昇させる。
【００５０】
ＩＩ．富栄養培地、限定培地、及びＰｒｆＡ活性化量の還元剤を含む限定培地中で成長した株の免疫原性。
上記実施例の野生型、ΔｐｒｆＡ、及びＰｒｆＡ＊株を改変して、５つの定義されたＨ−２ｂ−限定主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩエピトープをコードするＡｇ発現カセットを含有させる。このエピトープは、既に、生弱毒ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎＩＢ、及びＫＢＭＡワクチンでコードされる場合に、マウスである範囲のＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することが示されている（Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（２００８）７６：３７４２−３７５３）。一連の正確なクラスＩ限定エピトープを使用することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで免疫原性を査定するために最適な方法が提供され、異なる条件下で成長した株の比較を簡単にする。
【００５１】
Ａｇ発現カセット構築物は、４つの直列配置で間隔を置いたワクシニアウイルス（Ａ４２Ｒ、Ｃ４Ｌ、Ｋ３Ｌ、及びＢ８Ｒ）クラスＩエピトープ及びトリＯＶＡ（ＳＬ８）エピトープをコードするもので、合成されたものを、次いでＡｃｔＡのＮ末端の１００アミノ酸と融合した融合タンパク質としてＰｒｆＡ制御型ａｃｔＡプロモーターの制御下でクローン複製した（Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。構築物は、Ｑｕａｄｖａｃとして知られており、これをｐＰＬ２組込みベクターの誘導体にクローン導入し、次いで、野生型、ΔＰｒｆＡ、及びＰｒｆＡ＊リステリア株のｔＲＮＡＡｒｇ部位に組み込む（Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。また、上記実施例の野生型、ΔＰｒｆＡ、及びＰｒｆＡ＊株を、ｐｒｆＡ依存性ａｃｔＡプロモーター、ＡｃｔＡＮ１００、及びヒトメソテリンからなる異なる抗原発現カセットを含有するように改変する。これは、前臨床モデル及びヒト臨床試験で有効であることが既に示されている複数のｂａｌｂ／ｃ制限型Ｔ細胞エピトープの重複ライブラリーを含有する。Ｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１５）３３：１３２５−３３を参照。
【００５２】
これらの改変した株を、先の実施例の条件下で、及びまた富栄養（すなわち、複合）培養培地で成長させる。Ｑｕａｄｖａｃ発現株の相対免疫原性を評価するため、５匹のメスＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウスからなる群を、野生型、ΔＰｒｆＡ、及びＰｒｆＡ＊リステリア株を用いて、５×１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）の用量レベルで、３６日の間隔を開けて２回免疫化する。リステリア株は、それぞれがＱｕａｄｖａｃをコードし、それぞれが富栄養培養培地中で、または上記実施例に記載されるとおりの条件下で成長したものである。２回目の免疫化から６日後、ワクチン接種したマウスから脾臓を抽出し、５つのコードされたエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答の度合いを、既に記載されたとおり、以下のとおりのアミノ酸配列を有するＭＨＣクラスＩエピトープそれぞれに対応するペプチド１μΜで一晩刺激した後に、脾細胞のＥＬＩＳｐｏｔ分析により測定する。Ａ４２Ｒ８８−９６、ＹＡＰＶＳＰＩＶＩ；Ｃ４Ｌ１２５−１３２、ＬＮＦＲＦＥＮＶ；Ｋ３Ｌ６−１５、ＹＳＬＰＮＡＧＤＶＩ；Ｂ８Ｒ２０−２７、ＴＳＹＫＦＥＳＶ；及び、ＳＬ８２５７−２６４、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｍｏｕｔａｆｔｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００６）２４：８１７−８１９）。メソテリン発現株の相対免疫原性を評価するため、５匹のメスｂａｌｂ／ｃマウスからなる群を、５×１０６ｃｆｕで１回または２回免疫化する。初回刺激から７日後または追加免疫から６日後、重複メソテリンペプチドプールを用いて脾細胞のＥＬＩＳｐｏｔ分析を行う。これは、ＰｒｆＡ活性化量の還元剤を含有する限定培地中で成長した野生型及びＰｒｆＡ＊株の免疫原性を実証する。
【００５３】
ＩＩＩ．富栄養培地、限定培地、及びＰｒｆＡ活性化量の還元剤を含有する限定培地中で成長した株の病原性
感染の前に、細菌株を、リステリア合成培地（ＬＳＭ）中、３７℃で一晩、定常期まで成長させ、次いで還元剤（２ｍＭのＴＣＥＰ）ありまたはなしで、ＢＨＩまたはＬＳＭいずれかに希釈し、ＯＤ６００が約０．５になるまで振盪させながら３７℃で成長させた。培養物を、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁させ、これを用いて、６週〜８週齢のメスＣＤ−１マウスに１０5 細菌の最終接種量で静脈内感染させた。感染から４８時間後、マウスを屠殺し、臓器を収集した。臓器ホモジネートをＬＢプレートに播種し、一晩インキュベートすることにより、細菌負荷量を数え上げた。
【００５４】
結果を図２に示す。ＷＴ細菌及び構成的活性型ＰｒｆＡを有するＰｒｆＡ＊株を使用した。具体的には、２枚の主パネルに示すデータは、限定培地及びＴＣＥＰの存在下では、リステリアがＰｒｆＡ構成的活性変異体のものと等価なＰｒｆＡ依存性発現の活性化を表し、この活性化は病原性により測定されることを実証する。小さい方の図は、観測された効果が、最初の細菌投与量によるものではないことを示す。データは、ＬＳＭ＋ＴＣＥＰ中で成長した細菌の方が、臓器中に５０倍前後多い細菌を存在させることを示し、このことは、この方法が、細菌の病原性を上昇させることを示す。
【００５５】
添付の請求項にもかかわらず、本明細書に記載される開示は、以下の付記によっても定義される。
１．ＰｒｆＡ介在型発現構築物の発現の査定方法であって、
ＰｒｆＡ介在型発現構築物を含むリステリア宿主細胞を、ＰｒｆＡ活性化量の還元剤を含有する限定培地中に維持すること、及び
発現構築物からの産物の発現を評価して、ＰｒｆＡ介在型発現構築物の発現を査定すること
を有する、方法。
２．ＰｒｆＡ介在型発現構築物は、改変病原因子発現構築物である、付記１に記載の方法。
３．改変病原因子発現構築物は、ＡｃｔＡ発現構築物である、付記１または２に記載の方法。
４．ＡｃｔＡ発現構築物は、ＡｃｔＡプロモーターを含む、付記３に記載の方法。
５．ＡｃｔＡ発現構築物は、融合タンパク質をコードする、付記４に記載の方法。
【００５６】
６．融合タンパク質は、Ｎ末端のＡｃｔＡドメインを含む、付記５に記載の方法。
７．ＰｒｆＡ介在型発現構築物は、異種抗原をコードする、付記１〜６のいずれか一つに記載の方法。
８．還元剤は、グルタチオン（ＧＳＨ）、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、システイン、及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、付記１〜７のいずれか一つに記載の方法。
９．限定培地は、炭素源、１種または複数のアミノ酸、窒素源、１種または複数のビタミン、１種または複数の塩、及び１種または複数の微量金属を含む、付記１〜８のいずれか一つに記載の方法。
１０．炭素源は、グルコースを含み、かつ窒素源は、アデニンを含む、付記９に記載の方法。
【００５７】
１１．査定することは、観測された発現レベルを閾値と比較することを含む、付記１〜１０のいずれか一つに記載の方法。
１２．観測された発現レベルが閾値を超える場合に、リステリア宿主細胞を、許容されるワクチンとして同定することをさらに有する、付記１１に記載の方法。
１３．リステリア宿主細胞は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである、付記１〜１２のいずれか一つに記載の方法。
１４．ワクチンの製造方法であって、
異種抗原をコードするＰｒｆＡ介在型発現構築物を含むリステリア宿主細胞を、ＰｒｆＡ活性化量の還元剤を含む限定成長培地中、ワクチンを製造するために十分な様式で、培養することを有する、方法。
１５．ＰｒｆＡ介在型発現構築物は、改変病原因子発現構築物である、付記１４に記載の方法。
【００５８】
１６．改変病原因子発現構築物は、ＡｃｔＡ発現構築物である、付記１５に記載の方法。
１７．ＡｃｔＡ発現構築物は、ＡｃｔＡプロモーターを含む、付記１６に記載の方法。
１８．ＡｃｔＡ発現構築物は、融合タンパク質をコードする、付記１７に記載の方法。
１９．融合タンパク質は、Ｎ末端のＡｃｔＡドメインを含む、付記１８に記載の方法。
２０．還元剤は、グルタチオン（ＧＳＨ）、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、システイン、及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、付記１４〜１９のいずれか一つに記載の方法。
【００５９】
２１．限定培地は、炭素源、１種または複数のアミノ酸、窒素源、１種または複数のビタミン、１種または複数の塩、及び１種または複数の微量金属を含む、付記１４〜２０のいずれか一つに記載の方法。
２２．炭素源は、グルコースを含み、かつ窒素源は、アデニンを含む、付記２１に記載の方法。
２３．リステリア宿主細胞は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである、付記１４〜２２のいずれか一つに記載の方法。
２４．リステリア宿主を殺傷することをさらに有する、付記１４〜２２のいずれか一つに記載の方法。
２５．付記１２の方法に従って同定される、または付記１４〜２４のいずれか一つに記載の方法により製造される、リステリア細菌を含む、ワクチン。
【００６０】
２６．リステリア細菌は弱毒化されている、付記２５に記載のワクチン。
２７．リステリア細菌は、ＫＢＭＡである、付記２５に記載のワクチン。
２８．対象における抗原に対する細胞性免疫応答の誘発または強化方法であって、
対象に、付記２５〜２７のいずれか一つに記載のワクチンを有効量で投与することを有する、方法。
２９．ＰｒｆＡ活性化量の還元剤を含む、細菌培養限定培地。
３０．還元剤は、グルタチオン（ＧＳＨ）、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、システイン、及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、付記２９に記載の細菌培養限定培地。
【００６１】
３１．限定培地は、炭素源、１種または複数のアミノ酸、窒素源、１種または複数のビタミン、１種または複数の塩、及び１種または複数の微量金属を含む、付記２９または３０に記載の細菌培養限定培地。
３２．炭素源は、グルコースを含み、かつ窒素源は、アデニンを含む、付記３１に記載の細菌培養限定培地。
【００６２】
本明細書中で引用される刊行物及び特許出願は全て、個々の刊行物または特許出願がそれぞれ、具体的かつ個別に参照として援用されると示されたかのように、本明細書中に参照として援用される。刊行物の引用はどれも、出願日前にその開示があったということについてであり、本発明より前であるという理由でそのような刊行物に対して本発明が先行するものとしての権利を与えられないことを承認すると見なされるべきではない。
【００６３】
上記の発明は、理解を明確にする目的で、例示及び実例によりある程度詳細に記載されてきたものの、当業者にはすぐわかることだが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、ある特定の変更及び修飾を行うことが可能である。
【００６４】
国からの支援への謝辞
本発明は、国立衛生研究所から授与された委託書第ＲＯ１  ＡＩ６３３０２号及び第ＲＯ１  ＡＩ２７６５５号の下、国からの支援によりなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【００６５】
関連出願の相互参照
米国特許法第１１９条（ｅ）項に準じて、本出願は、２０１５年９月２日出願の米国仮特許出願番号第６２／２１３，５７９号の出願日の優先権を主張する。その出願の開示は、本明細書中、参照として援用される。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【国際調査報告】
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