(57)【要約】本開示は、その必要がある対象におけるT細胞媒介免疫応答を調節するための組成物および方法に関する。本方法は、本開示のCD112Rタンパク質、融合ポリペプチド、CD112Rと第2のタンパク質とを含む複合体、または抗CD112R抗体の有効量を対象に投与する段階を含む。2018529667.tif 000106
2018529667.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CD112Rタンパク質と第2のタンパク質とを含む、融合ポリペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列
2018529667.tif 000100
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する、請求項1に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
第2のタンパク質が、抗体もしくはその断片、結合タンパク質もしくはその断片、または検出可能なタンパク質もしくはその断片である、請求項1に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記抗体断片が前記抗体のFc領域である、請求項3に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記Fc領域が、SEQ ID NO: 46〜50からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項3に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記結合タンパク質またはその断片が、それぞれCD112またはその断片である、請求項3に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
前記検出可能なタンパク質が、リン酸化タンパク質、蛍光マーカーを有するタンパク質、放射性物質を有するタンパク質、グリコシル化タンパク質、ポリヒスチジン(ポリ(His))でタグ付けされたタンパク質、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、FLAGタグ付きタンパク質、AviTagを有するタンパク質、カルモジュリンタグを有するタンパク質、ポリグルタミン酸タグを有するタンパク質、Eタグを有するタンパク質、 HAタグを有するタンパク質、Mycタグを有するタンパク質、Sタグを有するタンパク質、SBPタグを有するタンパク質、Softtag 1を有するタンパク質、Softtag 3を有するタンパク質、Strepタグを有するタンパク質、TCタグを有するタンパク質、V5タグを有するタンパク質、VSVタグを有するタンパク質、Xpressタグを有するタンパク質、Isopeptagを有するタンパク質、SpyTagを有するタンパク質、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質(BCCP)タグを有するタンパク質、Haloタグを有するタンパク質、チオレドキシンタグを有するタンパク質、またはFcタグを有するタンパク質である、請求項3に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
CD112Rに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、アミノ酸配列
2018529667.tif 000101
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する、前記単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
CD112Rに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、SEQ ID NO: 6を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 7を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 8を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 9を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 10を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 11を含む軽鎖CDR3を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
SEQ ID NO: 5を含む重鎖およびSEQ ID NO: 3を含む軽鎖を含む、請求項9に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
CD112Rに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 37を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 38を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 39を含む軽鎖CDR3を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 33を含む軽鎖を含む、請求項11に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
CD112Rに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 41を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 42を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 43を含む軽鎖CDR3を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 40を含む軽鎖を含む、請求項13に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
アミノ酸配列
2018529667.tif 000102
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片とヒトCD112Rへの結合について交差競合する、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１６】
SEQ ID NO: 6を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 7を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 8を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 9を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 10を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 11を含む軽鎖CDR3を含む単離された抗体またはその抗原結合断片とヒトCD112Rへの結合について交差競合する、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１７】
(i) SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 37を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 38を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 39を含む軽鎖CDR3; または
(ii) SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 41を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 42を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 43を含む軽鎖CDR3
を含む単離された抗体またはその抗原結合断片とヒトCD112Rへの結合について交差競合する、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１８】
CD112Rと第2の標的とに結合する単離された二重特異性抗体またはその抗原結合断片であって、アミノ酸配列
2018529667.tif 000103
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する、前記単離された二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１９】
SEQ ID NO: 6を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 7を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 8を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 9を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 10を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 11を含む軽鎖CDR3を含む、請求項18に記載の単離された二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２０】
SEQ ID NO: 5を含む重鎖およびSEQ ID NO: 3を含む軽鎖を含む、請求項19に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２１】
SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 37を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 38を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 39を含む軽鎖CDR3を含む、請求項18に記載の単離された二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２２】
SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 33を含む軽鎖を含む、請求項21に記載の単離された二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２３】
SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 41を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 42を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 43を含む軽鎖CDR3を含む、請求項18に記載の単離された二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２４】
SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 40を含む軽鎖を含む、請求項23に記載の単離された二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２５】
第2の標的が免疫受容体上の標的である、請求項18に記載の単離された二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２６】
第2の標的がTIGITである、請求項25に記載の単離された二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２７】
抗体、検出可能な部分、治療用部分、固体支持体、またはそれらの任意の組み合わせに結合しているCD112Rタンパク質を含む、複合体。
【請求項２８】
前記固体支持体がビーズまたはナノ粒子である、請求項27に記載の複合体。
【請求項２９】
前記抗体がSEQ ID NO: 3およびSEQ ID NO: 5の1つまたは複数を含む、請求項27に記載の複合体。
【請求項３０】
前記検出可能な部分が、ポリヒスチジン(ポリ(His))、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、FLAGタグ、AviTag、カルモジュリンタグ、ポリグルタミン酸タグ、Eタグ、HAタグ、Mycタグ、Sタグ、SBPタグ、Softtag 1、Softtag 3、Strepタグ、TCタグ、V5タグ、VSVタグ、Xpressタグ、Isopeptag、SpyTag、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質(BCCP)タグ、Haloタグ、チオレドキシンタグ、もしくはFcタグ、高電子密度試薬、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、常磁性分子、常磁性ナノ粒子、造影剤、磁気共鳴造影剤、X線造影剤、ガドリニウム、放射性同位体、放射性核種、フルオロデオキシグルコース、γ線放出核種、陽電子放出核種、生体コロイド、マイクロバブル、ヨウ素化造影剤、硫酸バリウム、二酸化トリウム、金、金ナノ粒子、金ナノ粒子凝集体、フルオロフォア、二光子フルオロフォア、ハプテン、タンパク質、または蛍光部分である、請求項27に記載の複合体。
【請求項３１】
前記治療用部分が抗がん剤である、請求項27に記載の複合体。
【請求項３２】
CD112に結合する単離された一本鎖可変断片(scFv)であって、アミノ酸配列
2018529667.tif 000104
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する、前記単離されたscFv。
【請求項３３】
CD112に結合する単離された一本鎖可変断片(scFv)であって、
(i) SEQ ID NO: 6を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 7を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 8を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 9を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 10を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 11を含む軽鎖CDR3;
(ii) SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 37を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 38を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 39を含む軽鎖CDR3; または
(iii) SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 41を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 42を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 43を含む軽鎖CDR3
を含む、前記単離されたscFv。
【請求項３４】
(i) SEQ ID NO: 3を含む重鎖およびSEQ ID NO: 5を含む軽鎖;
(ii) SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 33を含む軽鎖; または
(iii) SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 40を含む軽鎖
を含む、請求項33に記載の単離されたscFv。
【請求項３５】
CD112Rタンパク質に特異的に結合するドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、およびエンドドメインを含む、キメラ抗原受容体(CAR)構築物。
【請求項３６】
前記CD112R結合ドメインが一本鎖可変断片(scFv)である、請求項35に記載のCAR構築物。
【請求項３７】
scFvが、アミノ酸配列
2018529667.tif 000105
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する、請求項35に記載のCAR構築物。
【請求項３８】
前記scFvが
(i) SEQ ID NO: 6を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 7を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 8を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 9を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 10を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 11を含む軽鎖CDR3;
(ii) SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 37を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 38を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 39を含む軽鎖CDR3; または
(iii) SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 41を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 42を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 43を含む軽鎖CDR3
を含む、請求項37に記載のCAR構築物。
【請求項３９】
前記ヒンジ領域がCD8ヒンジ領域を含む、請求項35に記載のCAR構築物。
【請求項４０】
前記エンドドメインがCD28共刺激ドメインおよびCD3-ζドメインを含む、請求項35に記載のCAR構築物。
【請求項４１】
前記CD112R結合ドメインが一本鎖可変断片(scFv)であり、前記ヒンジ領域がCD8ヒンジ領域を含み、かつ前記エンドドメインがCD28共刺激ドメインおよびCD3-ζドメインを含む、請求項35に記載のCAR構築物。
【請求項４２】
N末端からC末端へと、CD112R scFv - CD8aヒンジ + TM + CD28共刺激ドメイン + CD3-ζドメインの構造配置を有する、請求項41に記載のCAR構築物。
【請求項４３】
SEQ ID NO: 51の配列を含む、請求項41に記載のCAR構築物。
【請求項４４】
その必要がある対象における免疫応答の調節方法であって、CD112Rタンパク質、請求項1〜7のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、請求項8〜17のいずれか一項に記載の単離された抗体、請求項18〜26のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体、請求項27〜31のいずれか一項に記載の複合体、請求項32〜34のいずれか一項に記載の単離された一本鎖可変断片(scFv)、または請求項35〜43のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体(CAR)を前記対象に投与する段階を含む、前記方法。
【請求項４５】
前記免疫応答の調節が、前記対象における腫瘍抑制または退縮を誘導する、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
前記免疫応答の調節が、前記対象におけるT細胞応答を調節する、請求項44に記載の方法。
【請求項４７】
前記免疫応答の調節が、免疫関連疾患および炎症性疾患を調節する、請求項44に記載の方法。
【請求項４８】
前記免疫応答の調節が、自己免疫疾患、移植関連疾患もしくは障害、または感染性疾患の調節を含む、請求項44に記載の方法。
【請求項４９】
第2の薬剤を前記対象に投与する段階をさらに含む、請求項44に記載の方法。
【請求項５０】
第2の薬剤が、インドールアミン-ピロール2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)、機構的ラパマイシン標的(mTOR)、TIGIT、PD-1、PD-L1、TIM-3、LAG-3、BTLA、CD226、CD160、CD137、CD96、CD70、CD47、CD40、NKG2D、VISTA、ICOS、B7-HE、GITR、OX40、KIR、SLAM7、CTLA-4、またはそれらの組み合わせを標的とする薬剤である、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
第2の薬剤が、分子標的療法、ワクチン、化学療法剤、放射線、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項49に記載の方法。
【請求項５２】
第2の薬剤が、ニボルマブ、イピリムマブ、IL-2、アテゾリズマブ、エロツズマブ、ダラツムマブ、タリモジーン・ラハーパレプベック、ペンブロリズマブ、イピリムマブ、ブリナツモマブ、ラムシルマブ、ブレンツキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、ペグインターフェロンα-2bj、シプロイセル-T、オファツムマブ、デノスマブ、トレメリムマブ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項49に記載の方法。
【請求項５４】
外科手術をさらに含む、請求項44に記載の方法。
【請求項５５】
その必要がある対象におけるがんを処置する方法であって、毒素と、請求項8〜17のいずれか一項に記載の単離された抗CD112R抗体、請求項18〜26のいずれか一項に記載の単離された抗CD112R二重特異性抗体、または請求項32〜34のいずれか一項に記載の抗CD112R scFvとを含む組成物の有効量を、前記対象に投与する段階を含む、前記方法。
【請求項５６】
前記毒素がDNAトポイソメラーゼIまたはトポイソメラーゼIIの阻害剤である、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
前記毒素が、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン(CPT)、ラメラリンD、エトポシド(VP-16)、テニポシド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、エリプチシン、アウリントリカルボン酸、HU-331、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
前記組成物が薬物送達媒体を含む、請求項55に記載の方法。
【請求項５９】
前記薬物送達媒体がナノ粒子である、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
前記ナノ粒子がポリ(ラクチド-コ-グリコリド)粒子である、請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
前記抗CD112R抗体、抗CD112R二重特異性抗体、または抗CD112R scFvが、前記ナノ粒子の周囲層にコンジュゲートされている、請求項59に記載の方法。
【請求項６２】
前記抗CD112R抗体、抗CD112R二重特異性抗体、または抗CD112R scFvが、前記ナノ粒子に共有結合的にコンジュゲートされている、請求項61に記載の方法。
【請求項６３】
前記抗CD112R抗体または抗CD112R scFvとコンジュゲートした前記ナノ粒子が、前記対象のがん性細胞に前記毒素を送達する、請求項61に記載の方法。
【請求項６４】
前記がん性細胞がT細胞性急性リンパ芽球性白血病(T-ALL)細胞である、請求項63に記載の方法。
【請求項６５】
前記がんが非ホジキンリンパ腫、白血病、または膵臓がんである、請求項55に記載の方法。
【請求項６６】
第2の薬剤を前記対象に投与する段階をさらに含む、請求項55に記載の方法。
【請求項６７】
第2の薬剤が、インドールアミン-ピロール2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)、機構的ラパマイシン標的(mTOR)、TIGIT、PD-1、PD-L1、TIM-3、LAG-3、BTLA、CD226、CD160、CD137、CD96、CD70、CD47、CD40、NKG2D、VISTA、ICOS、B7-HE、GITR、OX40、KIR、SLAM7、CTLA-4、またはそれらの組み合わせを標的とする薬剤である、請求項66に記載の方法。
【請求項６８】
第2の薬剤が、分子標的療法、ワクチン、化学療法剤、放射線、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項66に記載の方法。
【請求項６９】
第2の薬剤が、ニボルマブ、イピリムマブ、IL-2、アテゾリズマブ、エロツズマブ、ダラツムマブ、タリモジーン・ラハーパレプベック、ペンブロリズマブ、イピリムマブ、ブリナツモマブ、ラムシルマブ、ブレンツキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、ペグインターフェロンα-2bj、シプロイセル-T、オファツムマブ、デノスマブ、トレメリムマブ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項66に記載の方法。
【請求項７０】
外科手術をさらに含む、請求項55に記載の方法。
【請求項７１】
毒素と、請求項8〜17のいずれか一項に記載の単離された抗CD112R抗体、請求項18〜26のいずれか一項に記載の単離された抗CD112R二重特異性抗体、または請求項32〜34のいずれか一項に記載の抗CD112R scFvとを含む、薬物送達媒体。
【請求項７２】
前記毒素がDNAトポイソメラーゼIまたはトポイソメラーゼIIの阻害剤である、請求項71に記載の薬物送達デバイス。
【請求項７３】
前記毒素が、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン(CPT)、ラメラリンD、エトポシド(VP-16)、テニポシド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、エリプチシン、アウリントリカルボン酸、HU-331、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項72に記載の薬物送達デバイス。
【請求項７４】
薬物送達媒体がナノ粒子である、請求項73に記載の薬物送達デバイス。
【請求項７５】
前記ナノ粒子がポリ(ラクチド-コ-グリコリド)粒子である、請求項74に記載の薬物送達デバイス。
【請求項７６】
抗CD112抗体、請求項18〜26のいずれか一項に記載の単離された抗CD112R二重特異性抗体、または請求項32〜34のいずれか一項に記載の抗CD112R scFvが、前記ナノ粒子の周囲層にコンジュゲートされている、請求項76に記載の薬物送達デバイス。
【請求項７７】
前記抗CD112R抗体、請求項18〜26のいずれか一項に記載の単離された抗CD112R二重特異性抗体、または請求項32〜34のいずれか一項に記載の抗CD112R scFvが、前記ナノ粒子の周囲層に共有結合的にコンジュゲートされている、請求項76に記載の薬物送達デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2015年9月2日付で出願された米国仮特許出願第62/213,305号および2016年8月3日付で出願された米国仮特許出願第62/370,512号の恩典を主張するものであり、これらの各々の内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表の組み入れ
2016年9月2日に作成され、サイズが55.1 KBである「UNCO002001WO_SeqList.txt」という名前のテキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００３】
開示の分野
本開示は、その必要がある対象におけるT細胞媒介免疫応答を調節するための組成物および方法に関する。本方法は、本開示のCD112Rタンパク質、融合ポリペプチド、CD112Rと第2のタンパク質とを含む複合体、または抗CD112R抗体の有効量を対象に投与する段階を含む。
【背景技術】
【０００４】
開示の背景
T細胞活性化は、T細胞応答の全ての段階に関与する、共シグナル伝達ネットワークによって調整される。免疫グロブリンスーパーファミリー(IGSF)のB7/CD28ファミリーおよび腫瘍壊死因子受容体(TNFR)スーパーファミリーのいくつかのメンバーは、T細胞共シグナル伝達分子の主要な群である。これらの共シグナル伝達経路の重要性は、移植片対宿主病(GVHD)、自己免疫、感染およびがんを含む、種々のヒト疾患において強調されている。ポリオウイルス受容体(PVR)様タンパク質は、T細胞共刺激機能を有するIGSFの新興群である。この分子群は、最初の免疫グロブリン可変様(IgV)ドメインにおいてPVR-シグナチャーモチーフを共有し、元々は、上皮細胞−細胞接触を媒介することが知られている。CD155 (PVR/Necl-5)およびCD112 (PVRL2/ネクチン-2)の2つのリガンドは、CD226 (DNAM1)と相互作用してT細胞を共刺激し、それらはまた、別の共阻害性受容体であるT細胞免疫グロブリンおよび免疫受容体チロシンに基づく阻害モチーフ[ITIM]ドメイン(TIGIT)を通じてT細胞応答を阻害する。CD112とTIGITとの間の相互作用は非常に弱いので、CD155はこのリガンド/受容体ネットワークにおける主たるリガンドであると思われる。このネットワークの複雑さに加えて、CD112ではなく、CD155は、T細胞上およびナチュラルキラー(NK)細胞上に存在する別のPVR様タンパク質であるCD96と相互作用するが、この相互作用の機能はいまだに不明である。さらに、TIGITはその固有の阻害機能に対して、樹状細胞(DC)上のCD155に結合してIL-10分泌を増加させることを通じそのT細胞阻害効果を発揮するか、またはリガンド相互作用のための共刺激受容体CD226と競合する。
【０００５】
CD226とTIGITとの間の分子的および機能的関係はいまだに不明であるが、この新規な共シグナル伝達経路は、T細胞応答の重要な免疫調節因子であり、将来の免疫療法のための貴重な標的でもある。例えば、CD8+ 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)上の高いTIGIT発現がヒト腫瘍サンプルにおいて観察され、リガンドCD155およびCD122は、腫瘍微小環境における大部分のAPCおよびがん細胞によって上方制御された。TIGIT遮断は、PD-1遮断と相乗作用を示してマウスおよびヒトの両方でCD8+ TIL活性を増強し、それゆえ、移植マウス腫瘍モデルにおいて腫瘍を拒絶した。同様に、TIGITおよびPD-L1の遮断は、抗ウイルスCD8+T細胞応答を相乗的に促進し、それゆえ、可溶性TIGIT融合タンパク質の接種におけるウイルスクリアランスを増強し、遅延型過敏反応(DTH)、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)およびコラーゲン誘導関節炎(CIA)を含む一連の自己免疫マウスモデルにおいてT細胞媒介応答を弱めた。
【０００６】
本開示は、ヒトT細胞のための新しい共阻害性受容体としてのCD112Rに関する。本開示は、CD112RのリガンドとしてCD112を同定する。
【発明の概要】
【０００７】
開示の概要
本開示は、とりわけ、その必要がある対象におけるT細胞媒介免疫応答を調節するための組成物および方法を提供する。本方法は、本開示のCD112Rタンパク質、融合ポリペプチド、CD112Rと第2のタンパク質とを含む複合体、または抗CD112R抗体(本明細書において集合的に「CD112Rターゲティング分子」または「抗CD112R結合分子」といわれる)の有効量を対象に投与する段階を含む。
【０００８】
1つの局面において、本開示は、CD112Rタンパク質と第2のタンパク質とを含む融合ポリペプチドを提供する。態様において、CD112Rは、CD112に結合することができ、かつSEQ ID NO: 1に対する少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドである。態様において、CD112Rは、CD112に結合することができ、かつSEQ ID NO: 1の少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドである。
【０００９】
態様において、融合ポリペプチドは、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000003
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、融合ポリペプチドは、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000004
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、融合ポリペプチドは、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000005
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、融合ポリペプチドは、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000006
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、融合ポリペプチドは、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000007
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。
【００１０】
いくつかの態様において、CD112Rは、SEQ ID NO: 44のアミノ酸配列を含むCD112Rの細胞外ドメインの最小機能領域である。いくつかの態様において、CD112Rは、SEQ ID NO: 45のアミノ酸配列を含むCD112Rの細胞外ドメインである。
【００１１】
態様において、第2のタンパク質はFcタンパク質であり、得られる融合タンパク質は本明細書においてCD112R-Fc融合タンパク質といわれる。いくつかの態様において、CD112R-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO: 44のアミノ酸配列を含むCD112Rの細胞外ドメインの最小機能領域を含む。いくつかの態様において、CD112R-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO: 45のアミノ酸配列を含むCD112Rの細胞外ドメインを含む。態様において、CD112R-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO: 46〜50からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むFcポリペプチド配列を含む。
【００１２】
態様において、CD112R-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO: 44のアミノ酸配列を含むCD112Rの細胞外ドメインの最小機能領域およびSEQ ID NO: 46〜50からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むFcポリペプチド配列を含む。
【００１３】
態様において、CD112R-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO: 45のアミノ酸配列を含むCD112Rの細胞外ドメインおよびSEQ ID NO: 46〜50からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むFcポリペプチド配列を含む。
【００１４】
態様において、CD112R-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO: 44のアミノ酸配列を含むCD112Rの細胞外ドメインの最小機能領域およびSEQ ID NO: 46のアミノ酸配列を含むFcポリペプチド配列を含む。
【００１５】
態様において、CD112R-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO: 45のアミノ酸配列を含むCD112Rの細胞外ドメインおよびSEQ ID NO: 46のアミノ酸配列を含むFcポリペプチド配列を含む。
【００１６】
CD112R融合タンパク質の個別化された要素は、例えば、直接的付着、中間体もしくはスペーサーペプチドの使用、ヒンジ領域の使用、非限定的な例として、1つもしくは複数のリンカーペプチドのような、リンカー領域の使用、またはそれらの任意の組み合わせを含む、種々の方法のいずれかにおいて連結することができる。例えば、リンカーペプチドは、概して0〜40個のアミノ酸、例えば0〜35個のアミノ酸、0〜30個のアミノ酸、0〜25個のアミノ酸、0〜20個のアミノ酸、0〜10個のアミノ酸、または0〜5個のアミノ酸を含む。態様において、リンカーは、例えば、グリシン-セリンリンカーまたはグリシン-セリンに基づくリンカーのような、可動性リンカーである。
【００１７】
本開示のCD112R-Fc融合タンパク質は、部分的にまたは完全にCD112Rの少なくとも1つの生物学的活性を調節し、遮断し、阻害し、低減し、CD112Rの少なくとも1つの生物学的活性に拮抗し、CD112Rの少なくとも1つの生物学的活性を中和し、またはそうでなければ妨害するのに有用である。例えば、本開示のCD112R-Fc融合タンパク質は、部分的にまたは完全にCD112RとCD112との間の相互作用を調節し、遮断し、阻害し、低減し、CD112RとCD112との間の相互作用に拮抗し、CD112RとCD112との間の相互作用を中和し、またはそうでなければ妨害するのに有用である。例えば、本開示の融合タンパク質はまた、部分的にまたは完全にCD112とCD226との間の相互作用を調節し、遮断し、阻害し、低減し、CD112とCD226との間の相互作用に拮抗し、CD112とCD226との間の相互作用を中和し、またはそうでなければ妨害するのに有用である。例えば、本開示のCD112R-Fc融合タンパク質は本開示のCD112R-Fc融合タンパク質の投与時に、部分的にまたは完全にTT特異的T細胞応答を調節し、遮断し、阻害し、低減し、TT特異的T細胞応答に拮抗し、TT特異的T細胞応答を中和し、またはそうでなければ妨害するのに有用である。
【００１８】
CD112R-Fc融合タンパク質は、CD112R-Fc融合タンパク質の存在下でのCD112R機能的活性のレベルが本明細書において記述されるCD112R-Fc融合タンパク質との結合の非存在下でのCD112R機能的活性のレベルと比較して少なくとも95%、例えば、96%、97%、98%、99%または100%低下する場合に完全に、CD112R機能的活性を調節し、遮断し、阻害し、低減し、CD112R機能的活性に拮抗し、CD112R機能的活性を中和し、またはそうでなければ妨害するものと考えられる。CD112R-Fc融合タンパク質は、CD112R-Fc融合タンパク質の存在下でのCD112R活性のレベルが本明細書において記述されるCD112R-Fc融合タンパク質との結合の非存在下でのCD112R活性のレベルと比較して95%未満、例えば、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、85%または90%低下する場合に部分的に、CD112R機能的活性を調節し、遮断し、阻害し、低減し、CD112R機能的活性に拮抗し、CD112R機能的活性を中和し、またはそうでなければ妨害するものと考えられる。
【００１９】
態様において、本明細書において記述されるCD112R結合融合ポリペプチドは、1つもしくは複数のさらなる薬剤またはさらなる薬剤の組み合わせと併用される。適当なさらなる薬剤には、例えば、がん、自己免疫疾患、炎症性障害、および/または感染性疾患のような、意図した用途のための任意の適当な既知の薬学的および/または外科的治療が含まれる。例えば、CD112R結合融合ポリペプチドを、さらなる化学療法剤または抗新生物剤と併用することができる。
【００２０】
態様において、少なくとも1つのさらなる薬剤は、例えば、T細胞上の免疫受容体、ナチュラルキラー(NK)細胞上の免疫受容体、またはそれらの組み合わせのような免疫受容体上の標的と相互作用する分子である。態様において、少なくとも1つのさらなる薬剤は、免疫応答を調節する化学物質または分子、例えば、インドールアミン-ピロール2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)または機構的ラパマイシン標的(mTOR)を標的とする薬剤であってもよい。態様において、少なくとも1つのさらなる薬剤は、TIGIT、PD-1、PD-L1、TIM-3、LAG-3、BTLA、CD226、CD160、CD137、CD96、CD70、CD47、CD40、NKG2D、VISTA、ICOS、B7-HE、GITR、OX40、KIR、SLAM7、CTLA-4、およびそれらの組み合わせを標的とする分子である。
【００２１】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つまたは複数の分子標的療法と組み合わせて用いられる。態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つまたは複数のワクチンと組み合わせて用いられる。態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つまたは複数の化学療法剤および/またはレジメンと組み合わせて用いられる。態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、放射線または他の放射線に基づく治療と組み合わせて用いられる。態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、非限定的な例として、外科的切除のような、外科手術と組み合わせて用いられる。
【００２２】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つもしくは複数の二重特異性T細胞エンゲージャ、1つもしくは複数のがんワクチン、フロイントアジュバント、1つもしくは複数のCAR-T細胞療法、1つもしくは複数の幹細胞療法、および/または1つもしくは複数のscFv療法と組み合わせて用いられる。
【００２３】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つまたは複数の市販の抗がん剤と組み合わせて用いられる。適当な市販の抗がん剤には、非限定的な例として、ニボルマブ、イピリムマブ、IL-2、アテゾリズマブ、エロツズマブ、ダラツムマブ、タリモジーン・ラハーパレプベック、ペンブロリズマブ、イピリムマブ、ブリナツモマブ、ラムシルマブ、ブレンツキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、ペグインターフェロンα-2bj、シプロイセル-T、オファツムマブ、デノスマブ、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【００２４】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、臨床試験中のおよび/または規制審査を受けている1つまたは複数の抗がん剤との組み合わせで用いられる。そのような抗がん剤の例としては、非限定的な例として、トレメリムマブが挙げられる。
【００２５】
態様において、CD112R結合融合ポリペプチドおよびさらなる薬剤は、単一の治療用組成物に処方され、CD112R結合融合ポリペプチドおよびさらなる薬剤は同時に投与される。態様において、CD112R結合融合ポリペプチドおよびさらなる薬剤は、互いに分離され、例えば、各々が別個の治療用組成物に処方され、CD112R結合融合ポリペプチドおよびさらなる薬剤は同時に投与されるか、またはCD112R結合融合ポリペプチドおよびさらなる薬剤は、処置レジメン中の異なる時間に投与される。例えば、CD112R結合融合ポリペプチドは、さらなる薬剤の投与の前に投与されるか、CD112R結合融合ポリペプチドは、さらなる薬剤の投与の後に投与されるか、またはCD112R結合融合ポリペプチドおよびさらなる薬剤は交互に投与される。本明細書において記述されるように、CD112R結合融合ポリペプチドおよびさらなる薬剤は、単回用量または複数回用量で投与される。
【００２６】
別の局面において、本開示は、抗体、検出可能な部分、治療用部分、固体支持体、またはそれらの任意の組み合わせに結合したCD112Rタンパク質を含む複合体を提供する。態様において、固体支持体は、ビーズまたはナノ粒子である。態様において、複合体は、CD112Rと、SEQ ID NO: 3および/またはSEQ ID NO: 5の配列を含む抗体とを含む。
【００２７】
別の局面において、本開示は、CD112タンパク質に結合したCD112Rタンパク質のインビトロ複合体を提供する。態様において、インビトロ複合体は、抗体、検出可能な部分、治療用部分、または固体支持体に結合したCD112Rタンパク質またはCD112タンパク質を含む。態様において、インビトロ複合体は、CD112Rに結合した固体支持体を含み、固体支持体は、例えば、ビーズまたはナノ粒子である。態様において、インビトロ複合体は、CD112Rと、SEQ ID NO: 3および/またはSEQ ID NO: 5の配列を含む抗体とを含む。
【００２８】
別の局面において、本開示は、CD112Rタンパク質に特異的に結合する精製された抗体を提供する。態様において、精製された抗体は、SEQ ID NO: 1のタンパク質であるCD112Rに結合する。態様において、抗体は、CD112に結合することができかつSEQ ID NO: 1に対する少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドであるCD112Rに結合する。態様において、抗体は、CD112に結合することができかつSEQ ID NO: 1の少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドであるCD112Rに結合する。態様において、精製された抗体は、CD112に結合することができかつSEQ ID NO: 1の少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドであるCD112Rに結合する、ヒト化抗体である。
【００２９】
態様において、抗体またはその抗原結合断片は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000008
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、抗体またはその抗原結合断片は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000009
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、抗体またはその抗原結合断片は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000010
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、抗体またはその抗原結合断片は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000011
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、抗体またはその抗原結合断片は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000012
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。
【００３０】
態様において、CD112Rに結合する抗体は、SEQ ID NO: 6を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 7を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 8を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 9を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 10を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 11を含む軽鎖CDR3を有する。
【００３１】
態様において、CD112Rに結合する抗体は、SEQ ID NO: 5を含む重鎖およびSEQ ID NO: 3を含む軽鎖を有する。この抗体は、本明細書において2H6 CD112Rモノクローナル抗体といわれる。
【００３２】
態様において、CD112Rに結合する抗体は、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 37を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 38を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 39を含む軽鎖CDR3を有する。
【００３３】
態様において、CD112Rに結合する抗体は、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 33を含む軽鎖を有する。この抗体は、本明細書においてCD112Rモノクローナル抗体mAb 4-4といわれる。
【００３４】
態様において、CD112Rに結合する抗体は、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 41を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 42を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 43を含む軽鎖CDR3を有する。
【００３５】
態様において、CD112Rに結合する抗体は、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 40を含む軽鎖を有する。この抗体は、本明細書においてCD112Rモノクローナル抗体mAb 4-5といわれる。
【００３６】
本開示の適当な抗体はまた、SEQ ID NO: 6を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 7を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 8を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 9を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 10を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 11を含む軽鎖CDR3を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００３７】
本開示の適当な抗体はまた、SEQ ID NO: 5を含む重鎖およびSEQ ID NO: 3を含む軽鎖を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００３８】
本開示の適当な抗体はまた、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 37を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 38を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 39を含む軽鎖CDR3を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００３９】
本開示の適当な抗体はまた、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 33を含む軽鎖を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００４０】
本開示の適当な抗体はまた、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 41を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 42を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 43を含む軽鎖CDR3を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００４１】
本開示の適当な抗体はまた、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 40を含む軽鎖を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００４２】
態様において、抗CD112R抗体または抗原結合断片はまた、抗体または抗原結合断片にコンジュゲートされた薬剤を含む。態様において、薬剤は治療剤である。態様において、薬剤は検出可能な部分である。態様において、検出可能な部分は診断剤である。態様において、薬剤は、リンカーを介して抗体または抗原結合断片にコンジュゲートされる。態様において、リンカーは切断可能なリンカーである。態様において、リンカーは切断不可能なリンカーである。
【００４３】
態様において、本明細書において記述される抗CD112R抗体または抗原結合断片は、1つもしくは複数のさらなる薬剤またはさらなる薬剤の組み合わせと併用される。適当なさらなる薬剤には、例えば、がん、自己免疫疾患、炎症性障害、および/または感染性疾患のような、意図した用途のための任意の適当な既知の薬学的および/または外科的治療が含まれる。例えば、抗CD112R抗体または抗原結合断片を、さらなる化学療法剤または抗新生物剤と併用することができる。
【００４４】
態様において、少なくとも1つのさらなる薬剤は、例えば、T細胞上の免疫受容体、ナチュラルキラー(NK)細胞上の免疫受容体、またはそれらの組み合わせのような免疫受容体上の標的と相互作用する分子である。態様において、少なくとも1つのさらなる薬剤は、免疫応答を調節する化学物質または分子、例えば、インドールアミン-ピロール2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)または機構的ラパマイシン標的(mTOR)を標的とする薬剤であってもよい。態様において、少なくとも1つのさらなる薬剤は、TIGIT、PD-1、PD-L1、TIM-3、LAG-3、BTLA、CD226、CD160、CD137、CD96、CD70、CD47、CD40、NKG2D、VISTA、ICOS、B7-HE、GITR、OX40、KIR、SLAM7、CTLA-4、およびそれらの組み合わせを標的とする分子である。
【００４５】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つまたは複数の分子標的療法と組み合わせて用いられる。態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つまたは複数のワクチンと組み合わせて用いられる。態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つまたは複数の化学療法剤および/またはレジメンと組み合わせて用いられる。態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、放射線または他の放射線に基づく治療と組み合わせて用いられる。態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、非限定的な例として、外科的切除のような、外科手術と組み合わせて用いられる。
【００４６】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つもしくは複数の二重特異性T細胞エンゲージャ、1つもしくは複数のがんワクチン、フロイントアジュバント、1つもしくは複数のCAR-T細胞療法、1つもしくは複数の幹細胞療法、および/または1つもしくは複数のscFv療法と組み合わせて用いられる。
【００４７】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つまたは複数の市販の抗がん剤と組み合わせて用いられる。適当な市販の抗がん剤には、非限定的な例として、ニボルマブ、イピリムマブ、IL-2、アテゾリズマブ、エロツズマブ、ダラツムマブ、タリモジーン・ラハーパレプベック、ペンブロリズマブ、イピリムマブ、ブリナツモマブ、ラムシルマブ、ブレンツキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、ペグインターフェロンα-2bj、シプロイセル-T、オファツムマブ、デノスマブ、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【００４８】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、臨床試験中のおよび/または規制審査を受けている1つまたは複数の抗がん剤との組み合わせで用いられる。そのような抗がん剤の例としては、非限定的な例として、トレメリムマブが挙げられる。
【００４９】
態様において、抗CD112R抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は、単一の治療用組成物に処方され、抗CD112R抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は同時に投与される。態様において、抗CD112R抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は、互いに分離され、例えば、各々が別個の治療用組成物に処方され、抗CD112R抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は同時に投与されるか、または抗CD112R抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は、処置レジメン中の異なる時間に投与される。例えば、抗CD112R抗体または抗原結合断片は、さらなる薬剤の投与の前に投与されるか、抗CD112R抗体または抗原結合断片は、さらなる薬剤の投与の後に投与されるか、または抗CD112R抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は交互に投与される。本明細書において記述されるように、抗CD112R抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は、単回用量または複数回用量で投与される。
【００５０】
別の局面において、本開示は、CD112Rと少なくとも第2の標的とに結合する多重特異性抗体およびその抗原結合断片を提供する。態様において、多重特異性抗体は、SEQ ID NO: 1のタンパク質であるCD112Rと、少なくとも第2の標的とに結合する。態様において、抗体は、CD112に結合することができかつSEQ ID NO: 1に対する少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドであるCD112Rと、少なくとも第2の標的とに結合する。態様において、多重特異性抗体は、CD112に結合することができかつSEQ ID NO: 1の少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドであるCD112Rと、少なくとも第2の標的とに結合する。態様において、多重特異性抗体は、CD112に結合することができかつSEQ ID NO: 1の少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドであるCD112Rと、少なくとも第2の標的とに結合するヒト化抗体である。
【００５１】
態様において、多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000013
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合し、かつ少なくとも第2の標的に結合する。態様において、多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000014
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合し、かつ少なくとも第2の標的に結合する。態様において、多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000015
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合し、かつ少なくとも第2の標的に結合する。態様において、多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000016
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合し、かつ少なくとも第2の標的に結合する。態様において、多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000017
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合し、かつ少なくとも第2の標的に結合する。
【００５２】
態様において、CD112Rと少なくとも第2の標的とに結合する多重特異性抗体は、SEQ ID NO: 6を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 7を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 8を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 9を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 10を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 11を含む軽鎖CDR3を有する。
【００５３】
態様において、CD112Rと少なくとも第2の標的とに結合する多重特異性抗体は、SEQ ID NO: 5を含む重鎖およびSEQ ID NO: 3を含む軽鎖を有する。この抗体は、本明細書において2H6 CD112Rモノクローナル抗体といわれる。
【００５４】
態様において、CD112Rと少なくとも第2の標的とに結合する多重特異性抗体は、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 37を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 38を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 39を含む軽鎖CDR3を有する。
【００５５】
態様において、CD112Rと少なくとも第2の標的とに結合する多重特異性抗体は、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 33を含む軽鎖を有する。この抗体は、本明細書においてCD112Rモノクローナル抗体mAb 4-4といわれる。
【００５６】
態様において、CD112Rと少なくとも第2の標的とに結合する多重特異性抗体は、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 41を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 42を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 43を含む軽鎖CDR3を有する。
【００５７】
態様において、CD112Rと少なくとも第2の標的とに結合する多重特異性抗体は、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 40を含む軽鎖を有する。この抗体は、本明細書においてCD112Rモノクローナル抗体mAb 4-5といわれる。
【００５８】
本開示の適当な多重特異性抗体はまた、SEQ ID NO: 6を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 7を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 8を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 9を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 10を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 11を含む軽鎖CDR3を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する多重特異性抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００５９】
本開示の適当な多重特異性抗体はまた、SEQ ID NO: 5を含む重鎖およびSEQ ID NO: 3を含む軽鎖を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する多重特異性抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００６０】
本開示の適当な多重特異性抗体はまた、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 37を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 38を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 39を含む軽鎖CDR3を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する多重特異性抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００６１】
本開示の適当な多重特異性抗体はまた、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 33を含む軽鎖を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する多重特異性抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００６２】
本開示の適当な多重特異性抗体はまた、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 41を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 42を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 43を含む軽鎖CDR3を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する多重特異性抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００６３】
本開示の適当な多重特異性抗体はまた、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 40を含む軽鎖を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する多重特異性抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００６４】
態様において、少なくとも1つのさらなる標的は、例えば、T細胞上の免疫受容体、ナチュラルキラー(NK)細胞上の免疫受容体、またはそれらの組み合わせのような免疫受容体上の標的である。態様において、少なくとも1つのさらなる薬剤は、免疫応答を調節する化学物質または分子、例えば、インドールアミン-ピロール2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)または機構的ラパマイシン標的(mTOR)を標的とする薬剤であってもよい。態様において、少なくとも1つのさらなる標的は、TIGIT、PD-1、PD-L1、TIM-3、LAG-3、BTLA、CD226、CD160、CD137、CD96、CD70、CD47、CD40、NKG2D、VISTA、ICOS、B7-HE、GITR、OX40、KIR、SLAM7、CTLA-4、およびそれらの組み合わせである。
【００６５】
態様において、本明細書において記述される多重特異性抗CD112R抗体または抗原結合断片は、1つもしくは複数のさらなる薬剤またはさらなる薬剤の組み合わせと併用される。適当なさらなる薬剤には、例えば、がん、自己免疫疾患、炎症性障害、および/または感染性疾患のような、意図した用途のための任意の適当な既知の薬学的および/または外科的治療が含まれる。例えば、多重特異性抗CD112R抗体または抗原結合断片を、さらなる化学療法剤または抗新生物剤と併用することができる。
【００６６】
態様において、少なくとも1つのさらなる薬剤は、例えば、T細胞上の免疫受容体、ナチュラルキラー(NK)細胞上の免疫受容体、またはそれらの組み合わせのような免疫受容体上の標的と相互作用する分子である。態様において、少なくとも1つのさらなる薬剤は、免疫応答を調節する化学物質または分子、例えば、インドールアミン-ピロール2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)または機構的ラパマイシン標的(mTOR)を標的とする薬剤であってもよい。態様において、少なくとも1つのさらなる薬剤は、TIGIT、PD-1、PD-L1、TIM-3、LAG-3、BTLA、CD226、CD160、CD137、CD96、CD70、CD47、CD40、NKG2D、VISTA、ICOS、B7-HE、GITR、OX40、KIR、SLAM7、CTLA-4、およびそれらの組み合わせを標的とする分子である。
【００６７】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つまたは複数の分子標的療法と組み合わせて用いられる。態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つまたは複数のワクチンと組み合わせて用いられる。態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つまたは複数の化学療法剤および/またはレジメンと組み合わせて用いられる。態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、放射線または他の放射線に基づく治療と組み合わせて用いられる。態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、非限定的な例として、外科的切除のような、外科手術と組み合わせて用いられる。
【００６８】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つもしくは複数の二重特異性T細胞エンゲージャ、1つもしくは複数のがんワクチン、フロイントアジュバント、1つもしくは複数のCAR-T細胞療法、1つもしくは複数の幹細胞療法、および/または1つもしくは複数のscFv療法と組み合わせて用いられる。
【００６９】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つまたは複数の市販の抗がん剤と組み合わせて用いられる。適当な市販の抗がん剤には、非限定的な例として、ニボルマブ、イピリムマブ、IL-2、アテゾリズマブ、エロツズマブ、ダラツムマブ、タリモジーン・ラハーパレプベック、ペンブロリズマブ、イピリムマブ、ブリナツモマブ、ラムシルマブ、ブレンツキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、ペグインターフェロンα-2bj、シプロイセル-T、オファツムマブ、デノスマブ、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【００７０】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、臨床試験中のおよび/または規制審査を受けている1つまたは複数の抗がん剤との組み合わせで用いられる。そのような抗がん剤の例としては、非限定的な例として、トレメリムマブが挙げられる。
【００７１】
態様において、多重特異性抗CD112R抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は、単一の治療用組成物に処方され、多重特異性抗CD112R抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は同時に投与される。態様において、多重特異性抗CD112R抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は、互いに分離され、例えば、各々が別個の治療用組成物に処方され、多重特異性抗CD112R抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は同時に投与されるか、または多重特異性抗CD112R抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は、処置レジメン中の異なる時間に投与される。例えば、多重特異性抗CD112R抗体もしくは抗原結合断片は、さらなる薬剤の投与の前に投与されるか、多重特異性抗CD112R抗体もしくは抗原結合断片は、さらなる薬剤の投与の後に投与されるか、または多重特異性抗CD112R抗体もしくは抗原結合断片およびさらなる薬剤は交互に投与される。本明細書において記述されるように、多重特異性抗CD112R抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は、単回用量または複数回用量で投与される。
【００７２】
別の局面において、本開示は、CD112Rと第2の標的とに結合する二重特異性抗体およびその抗原結合断片を提供する。態様において、二重特異性抗体は、SEQ ID NO: 1のタンパク質であるCD112Rと、第2の標的とに結合する。態様において、抗体は、CD112に結合することができかつSEQ ID NO: 1に対する少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドであるCD112Rと、第2の標的とに結合する。態様において、二重特異性抗体は、CD112に結合することができかつSEQ ID NO: 1の少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドであるCD112Rと、第2の標的とに結合する。態様において、二重特異性抗体は、CD112に結合することができかつSEQ ID NO: 1の少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドであるCD112Rと、第2の標的とに結合するヒト化抗体である。
【００７３】
態様において、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000018
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合し、かつ第2の標的に結合する。態様において、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000019
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合し、かつ第2の標的に結合する。態様において、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000020
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合し、かつ第2の標的に結合する。態様において、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000021
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合し、かつ第2の標的に結合する。態様において、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000022
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合し、かつ第2の標的に結合する。
【００７４】
態様において、CD112Rと第2の標的とに結合する二重特異性抗体は、SEQ ID NO: 6を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 7を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 8を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 9を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 10を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 11を含む軽鎖CDR3を有する。
【００７５】
態様において、CD112Rと第2の標的とに結合する二重特異性抗体は、SEQ ID NO: 5を含む重鎖およびSEQ ID NO: 3を含む軽鎖を有する。この抗体は、本明細書において2H6 CD112Rモノクローナル抗体といわれる。
【００７６】
態様において、CD112Rと第2の標的とに結合する二重特異性抗体は、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 37を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 38を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 39を含む軽鎖CDR3を有する。
【００７７】
態様において、CD112Rと第2の標的とに結合する二重特異性抗体は、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 33を含む軽鎖を有する。この抗体は、本明細書においてCD112Rモノクローナル抗体mAb 4-4といわれる。
【００７８】
態様において、CD112Rと第2の標的とに結合する二重特異性抗体は、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 41を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 42を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 43を含む軽鎖CDR3を有する。
【００７９】
態様において、CD112Rと第2の標的とに結合する二重特異性抗体は、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 40を含む軽鎖を有する。この抗体は、本明細書においてCD112Rモノクローナル抗体mAb 4-5といわれる。
【００８０】
本開示の適当な二重特異性抗体はまた、SEQ ID NO: 6を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 7を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 8を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 9を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 10を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 11を含む軽鎖CDR3を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する二重特異性抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００８１】
本開示の適当な二重特異性抗体はまた、SEQ ID NO: 5を含む重鎖およびSEQ ID NO: 3を含む軽鎖を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する二重特異性抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００８２】
本開示の適当な二重特異性抗体はまた、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 37を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 38を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 39を含む軽鎖CDR3を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する二重特異性抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００８３】
本開示の適当な二重特異性抗体はまた、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 33を含む軽鎖を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する二重特異性抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００８４】
本開示の適当な二重特異性抗体はまた、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 41を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 42を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 43を含む軽鎖CDR3を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する二重特異性抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００８５】
本開示の適当な二重特異性抗体はまた、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 40を含む軽鎖を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する二重特異性抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００８６】
態様において、第2の標的は、例えば、T細胞上の免疫受容体、ナチュラルキラー(NK)細胞上の免疫受容体、またはそれらの組み合わせのような免疫受容体上の標的である。態様において、少なくとも1つのさらなる薬剤は、免疫応答を調節する化学物質または分子、例えば、インドールアミン-ピロール2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)または機構的ラパマイシン標的(mTOR)を標的とする薬剤であってもよい。態様において、第2の標的は、TIGIT、PD-1、PD-L1、TIM-3、LAG-3、BTLA、CD226、CD160、CD137、CD96、CD70、CD47、CD40、NKG2D、VISTA、ICOS、B7-HE、GITR、OX40、KIR、SLAM7、CTLA-4、およびそれらの組み合わせである。
【００８７】
態様において、本明細書において記述される二重特異性抗CD112R抗体または抗原結合断片は、1つもしくは複数のさらなる薬剤またはさらなる薬剤の組み合わせと併用される。適当なさらなる薬剤には、例えば、がん、自己免疫疾患、炎症性障害、および/または感染性疾患のような、意図した用途のための任意の適当な既知の薬学的および/または外科的治療が含まれる。例えば、二重特異性抗CD112R抗体または抗原結合断片を、さらなる化学療法剤または抗新生物剤と併用することができる。
【００８８】
態様において、少なくとも1つのさらなる薬剤は、例えば、T細胞上の免疫受容体、ナチュラルキラー(NK)細胞上の免疫受容体、またはそれらの組み合わせのような免疫受容体上の標的と相互作用する分子である。態様において、少なくとも1つのさらなる薬剤は、免疫応答を調節する化学物質または分子、例えば、インドールアミン-ピロール2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)または機構的ラパマイシン標的(mTOR)を標的とする薬剤であってもよい。態様において、少なくとも1つのさらなる薬剤は、TIGIT、PD-1、PD-L1、TIM-3、LAG-3、BTLA、CD226、CD160、CD137、CD96、CD70、CD47、CD40、NKG2D、VISTA、ICOS、B7-HE、GITR、OX40、KIR、SLAM7、CTLA-4、およびそれらの組み合わせを標的とする分子である。
【００８９】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つまたは複数の分子標的療法と組み合わせて用いられる。態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つまたは複数のワクチンと組み合わせて用いられる。態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つまたは複数の化学療法剤および/またはレジメンと組み合わせて用いられる。態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、放射線または他の放射線に基づく治療と組み合わせて用いられる。態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、非限定的な例として、外科的切除のような、外科手術と組み合わせて用いられる。
【００９０】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つもしくは複数の二重特異性T細胞エンゲージャ、1つもしくは複数のがんワクチン、フロイントアジュバント、1つもしくは複数のCAR-T細胞療法、1つもしくは複数の幹細胞療法、および/または1つもしくは複数のscFv療法と組み合わせて用いられる。
【００９１】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つまたは複数の市販の抗がん剤と組み合わせて用いられる。適当な市販の抗がん剤には、非限定的な例として、ニボルマブ、イピリムマブ、IL-2、アテゾリズマブ、エロツズマブ、ダラツムマブ、タリモジーン・ラハーパレプベック、ペンブロリズマブ、イピリムマブ、ブリナツモマブ、ラムシルマブ、ブレンツキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、ペグインターフェロンα-2bj、シプロイセル-T、オファツムマブ、デノスマブ、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【００９２】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、臨床試験中のおよび/または規制審査を受けている1つまたは複数の抗がん剤との組み合わせで用いられる。そのような抗がん剤の例としては、非限定的な例として、トレメリムマブが挙げられる。
【００９３】
態様において、二重特異性抗CD112R抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は、単一の治療用組成物に処方され、二重特異性抗CD112R抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は同時に投与される。態様において、二重特異性抗CD112R抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は、互いに分離され、例えば、各々が別個の治療用組成物に処方され、二重特異性抗CD112R抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は同時に投与されるか、または二重特異性抗CD112R抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は、処置レジメン中の異なる時間に投与される。例えば、二重特異性抗CD112R抗体または抗原結合断片は、さらなる薬剤の投与の前に投与されるか、二重特異性抗CD112R抗体または抗原結合断片は、さらなる薬剤の投与の後に投与されるか、または二重特異性抗CD112R抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は交互に投与される。本明細書において記述されるように、二重特異性抗CD112R抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は、単回用量または複数回用量で投与される。
【００９４】
別の局面において、本開示は、CD112Rタンパク質に特異的に結合する精製された一本鎖抗体を提供する。態様において、本明細書において「抗CD112R一本鎖抗体」といわれるCD112Rの結合に特異的な一本鎖抗体は、Fcポリペプチドに融合される。態様において、Fcポリペプチドは、IgG1アイソタイプ、IgG2アイソタイプ、IgG3アイソタイプ、IgG4アイソタイプ、およびIgMアイソタイプからなる群より選択されるIgG免疫グロブリンのような、IgG免疫グロブリンのFc領域である。態様において、Fcポリペプチドは、SEQ ID NO: 46〜50からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００９５】
態様において、一本鎖抗体は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000023
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、一本鎖抗体は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000024
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、一本鎖抗体は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000025
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、一本鎖抗体は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000026
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、一本鎖抗体は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000027
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。
【００９６】
態様において、抗CD112R一本鎖抗体は、Fcポリペプチドのカルボキシ末端に融合される。態様において、抗CD112R一本鎖抗体は、Fcポリペプチドのアミノ末端に融合される。融合物は、単一の遺伝子構築物として構築され、培養細胞中で発現される。
【００９７】
態様において、抗CD112R一本鎖抗体は、CD112に結合することができかつSEQ ID NO: 1に対する少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドであるCD112Rに結合する。態様において、抗CD112R一本鎖抗体は、CD112に結合することができかつSEQ ID NO: 1の少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドであるCD112Rに結合する。態様において、抗CD112R一本鎖抗体は、CD112に結合することができかつSEQ ID NO: 1の少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドであるCD112Rに結合する。
【００９８】
態様において、CD112Rに結合する抗CD112R一本鎖抗体は、SEQ ID NO: 6を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 7を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 8を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 9を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 10を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 11を含む軽鎖CDR3を有する。
【００９９】
態様において、CD112Rに結合する抗CD112R一本鎖抗体は、SEQ ID NO: 5を含む重鎖およびSEQ ID NO: 3を含む軽鎖を有する。
【０１００】
態様において、CD112Rに結合する抗CD112R一本鎖抗体は、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 37を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 38を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 39を含む軽鎖CDR3を有する。
【０１０１】
態様において、CD112Rに結合する抗CD112R一本鎖抗体は、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 33を含む軽鎖を有する。
【０１０２】
態様において、CD112Rに結合する抗CD112R一本鎖抗体は、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 41を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 42を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 43を含む軽鎖CDR3を有する。
【０１０３】
態様において、CD112Rに結合する抗CD112R一本鎖抗体は、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 40を含む軽鎖を有する。
【０１０４】
態様において、抗CD112R一本鎖抗体は、SEQ ID NO: 6を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 7を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 8を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 9を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 10を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 11を含む軽鎖CDR3を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片である。
【０１０５】
態様において、抗CD112R一本鎖抗体は、SEQ ID NO: 5を含む重鎖およびSEQ ID NO: 3を含む軽鎖を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片である。
【０１０６】
態様において、抗CD112R一本鎖抗体は、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 37を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 38を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 39を含む軽鎖CDR3を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片である。
【０１０７】
態様において、抗CD112R一本鎖抗体は、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 33を含む軽鎖を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片である。
【０１０８】
態様において、抗CD112R一本鎖抗体は、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 41を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 42を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 43を含む軽鎖CDR3を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片である。
【０１０９】
態様において、抗CD112R一本鎖抗体は、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 40を含む軽鎖を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片である。
【０１１０】
抗CD112R一本鎖抗体またはその抗原結合断片は、治療適応症において有用である。態様において、抗CD112R一本鎖抗体またはその抗原結合断片は、その必要がある対象において抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を引き起こすのに十分なレベルで投与される。例えば、抗CD112R一本鎖抗体またはその抗原結合断片は、がんに罹患しているか、またはがんを発症する危険性がある対象において、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を引き起こすために用いられる。
【０１１１】
態様において、抗CD112R一本鎖抗体はまた、一本鎖抗体または抗原結合断片にコンジュゲートされた薬剤を含む。態様において、薬剤は治療剤である。態様において、薬剤は検出可能な部分である。態様において、検出可能な部分は診断剤である。態様において、薬剤は、リンカーを介して一本鎖抗体または抗原結合断片にコンジュゲートされる。態様において、リンカーは切断可能なリンカーである。態様において、リンカーは切断不可能なリンカーである。
【０１１２】
態様において、本明細書において記述される抗CD112R一本鎖抗体は、1つもしくは複数のさらなる薬剤またはさらなる薬剤の組み合わせと併用される。適当なさらなる薬剤には、例えば、がん、自己免疫疾患、炎症性障害、および/または感染性疾患のような、意図した用途のための任意の適当な既知の薬学的および/または外科的治療が含まれる。例えば、抗CD112R一本鎖抗体を、さらなる化学療法剤または抗新生物剤と併用することができる。
【０１１３】
態様において、少なくとも1つのさらなる薬剤は、例えば、T細胞上の免疫受容体、ナチュラルキラー(NK)細胞上の免疫受容体、またはそれらの組み合わせのような免疫受容体上の標的と相互作用する分子である。態様において、少なくとも1つのさらなる薬剤は、免疫応答を調節する化学物質または分子、例えば、インドールアミン-ピロール2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)または機構的ラパマイシン標的(mTOR)を標的とする薬剤であってもよい。態様において、少なくとも1つのさらなる薬剤は、TIGIT、PD-1、PD-L1、TIM-3、LAG-3、BTLA、CD226、CD160、CD137、CD96、CD70、CD47、CD40、NKG2D、VISTA、ICOS、B7-HE、GITR、OX40、KIR、SLAM7、CTLA-4、およびそれらの組み合わせを標的とする分子である。
【０１１４】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つまたは複数の分子標的療法と組み合わせて用いられる。態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つまたは複数のワクチンと組み合わせて用いられる。態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つまたは複数の化学療法剤および/またはレジメンと組み合わせて用いられる。態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、放射線または他の放射線に基づく治療と組み合わせて用いられる。態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、非限定的な例として、外科的切除のような、外科手術と組み合わせて用いられる。
【０１１５】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つもしくは複数の二重特異性T細胞エンゲージャ、1つもしくは複数のがんワクチン、フロイントアジュバント、1つもしくは複数のCAR-T細胞療法、1つもしくは複数の幹細胞療法、および/または1つもしくは複数のscFv療法と組み合わせて用いられる。
【０１１６】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つまたは複数の市販の抗がん剤と組み合わせて用いられる。適当な市販の抗がん剤には、非限定的な例として、ニボルマブ、イピリムマブ、IL-2、アテゾリズマブ、エロツズマブ、ダラツムマブ、タリモジーン・ラハーパレプベック、ペンブロリズマブ、イピリムマブ、ブリナツモマブ、ラムシルマブ、ブレンツキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、ペグインターフェロンα-2bj、シプロイセル-T、オファツムマブ、デノスマブ、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【０１１７】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、臨床試験中のおよび/または規制審査を受けている1つまたは複数の抗がん剤との組み合わせで用いられる。そのような抗がん剤の例としては、非限定的な例として、トレメリムマブが挙げられる。
【０１１８】
態様において、抗CD112R一本鎖抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は、単一の治療用組成物に処方され、抗CD112R一本鎖抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は同時に投与される。態様において、抗CD112R一本鎖抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は、互いに分離され、例えば、各々が別個の治療用組成物に処方され、抗CD112R一本鎖抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は同時に投与されるか、または抗CD112R一本鎖抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は、処置レジメン中の異なる時間に投与される。例えば、抗CD112R一本鎖抗体または抗原結合断片は、さらなる薬剤の投与の前に投与されるか、抗CD112R一本鎖抗体または抗原結合断片は、さらなる薬剤の投与の後に投与されるか、または抗CD112R一本鎖抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は交互に投与される。本明細書において記述されるように、抗CD112R一本鎖抗体または抗原結合断片およびさらなる薬剤は、単回用量または複数回用量で投与される。
【０１１９】
1つの局面において、本開示は、本明細書においてCAR構築物の抗CD112R結合ドメインといわれる、CD112Rタンパク質に特異的に結合するドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)構築物を提供する。本明細書において提示される態様において、CAR構築物は、T細胞に抗CD112結合ドメインを移植するために用いられる。態様において、本明細書において提供されるCAR構築物は、CD3-ζ膜貫通およびエンドドメインに融合された、抗CD112R一本鎖抗体、例えば、本開示の抗CD112モノクローナル抗体に由来する抗CD112R一本鎖可変断片(scFv)の融合物である。
【０１２０】
態様において、本明細書において提供されるCAR構築物は、シグナルペプチド、scFvを含む抗体認識領域、および抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに連結するスペーサー領域からなるエクトドメインを含む。
【０１２１】
態様において、抗原認識領域は抗CD112R結合ドメインである。態様において、抗CD112R結合ドメインはscFvである。態様において、CAR構築物の抗CD112R scFvは、CD112に結合することができかつSEQ ID NO: 1に対する少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドであるCD112Rに結合する。態様において、CAR構築物の抗CD112R scFvは、CD112に結合することができかつSEQ ID NO: 1の少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドであるCD112Rに結合する。態様において、抗CD112R一本鎖抗体は、CD112に結合することができかつSEQ ID NO: 1の少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドであるCD112Rに結合する。
【０１２２】
態様において、CAR構築物の抗CD112R scFvは、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000028
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、CAR構築物の抗CD112R scFvは、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000029
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、CAR構築物の抗CD112R scFvは、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000030
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、CAR構築物の抗CD112R scFvは、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000031
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、CAR構築物の抗CD112R scFvは、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000032
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。
【０１２３】
態様において、CD112Rに結合するCAR構築物の抗CD112R scFvは、SEQ ID NO: 6を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 7を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 8を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 9を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 10を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 11を含む軽鎖CDR3を有する。
【０１２４】
態様において、CD112Rに結合するCAR構築物の抗CD112R scFvは、SEQ ID NO: 5を含む重鎖およびSEQ ID NO: 3を含む軽鎖を有する。
【０１２５】
態様において、CD112Rに結合する抗CD112R一本鎖抗体は、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 37を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 38を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 39を含む軽鎖CDR3を有する。
【０１２６】
態様において、CD112Rに結合するCAR構築物の抗CD112R scFvは、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 33を含む軽鎖を有する。
【０１２７】
態様において、CD112Rに結合するCAR構築物の抗CD112R scFvは、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 41を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 42を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 43を含む軽鎖CDR3を有する。
【０１２８】
態様において、CD112Rに結合するCAR構築物の抗CD112R scFvは、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 40を含む軽鎖を有する。
【０１２９】
態様において、CAR構築物の抗CD112R scFvは、SEQ ID NO: 6を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 7を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 8を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 9を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 10を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 11を含む軽鎖CDR3を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片である。
【０１３０】
態様において、CAR構築物の抗CD112R scFvは、SEQ ID NO: 5を含む重鎖およびSEQ ID NO: 3を含む軽鎖を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片である。
【０１３１】
態様において、CAR構築物の抗CD112R scFvは、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 37を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 38を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 39を含む軽鎖CDR3を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片である。
【０１３２】
態様において、CAR構築物の抗CD112R scFvは、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 33を含む軽鎖を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片である。
【０１３３】
態様において、CAR構築物の抗CD112R scFvは、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 41を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 42を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 43を含む軽鎖CDR3を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片である。
【０１３４】
態様において、CAR構築物の抗CD112R scFvは、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 40を含む軽鎖を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片である。
【０１３５】
態様において、スペーサー領域は、抗CD112R結合ドメインを種々の方向に配向させて、抗原認識を容易にするのに十分なほど可動性である。態様において、スペーサーは、IgG1由来のヒンジ領域である。態様において、スペーサーは、免疫グロブリンのCH2CH3領域およびCD3の部分を含む。
【０１３６】
膜貫通ドメインは、膜にまたがる疎水性αヘリックスである。態様において、エンドドメインの最も膜近位の成分からの膜貫通ドメインが用いられる。
【０１３７】
態様において、エンドドメイン成分は、CD112Rが結合した後に活性化シグナルをT細胞に伝達する免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ITAM)を含むCD3-ζを含む。
【０１３８】
態様において、CAR構築物は、N末端からC末端への以下の構造配置を有する: 抗CD112R結合ドメイン + ヒンジ + 膜貫通領域(TM) + エンドドメイン。態様において、CAR構築物は、N末端からC末端への以下の構造配置を有する: 抗CD112R結合ドメイン + ヒンジ領域 + TM + 共刺激ドメイン + CD3-ζドメイン。態様において、CAR構築物は、N末端からC末端への以下の構造配置を有する: 抗CD112R結合ドメイン + CD8aヒンジ領域 + TM + CD28a (アミノ酸180〜219)共刺激 + CD3-ζドメイン。態様において、CAR構築物は、N末端からC末端への以下の構造配置を有する: (VH-リンカー-VL) - CD8aヒンジ + TM + CD28 (180〜219aa)共刺激ドメイン + CD3-ζ(細胞質内ドメイン)。態様において、CAR構築物は、図15に示される構造配置を有する。
【０１３９】
態様において、CAR構築物は、SEQ ID NO: 51の配列を含む。
【０１４０】
本明細書において記述される態様のいずれかにおいて、抗CD112結合分子は、抗CD112結合分子の1つまたは複数の特性を変化させるように改変されうる。態様において、エフェクター機能に関して本開示の抗CD112結合分子を改変し、そのような機能を増強または低減させて、疾患および障害を処置する際の抗CD112結合分子の有効性を改善することが望ましい場合がある。態様において、抗CD112結合分子は、所望の治療効力を達成するために、例えば、グリコシル化のような、1つまたは複数の翻訳後修飾を含むように改変することができる。抗CD112結合分子がFc領域を含む態様において、システイン残基をFc領域に導入し、それによってこの領域内の鎖間ジスルフィド結合形成を可能にすることができる。このようにして作出されたホモ二量体抗体は、改善された内部移行能力ならびに/または増大された補体媒介細胞殺傷および抗体依存性細胞傷害(ADCC)を有することができる。(Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992)およびShopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)を参照のこと)。あるいは、二重Fc領域を有し、それにより増強された補体溶解およびADCC能力を持ちうる本開示の抗体の抗CD112を設計することができる。(例えば、Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)を参照のこと)。いくつかの態様において、Fc変異を行ってグリコシル化部位を除去し、それによりFc機能を低減させる。態様において、抗CD112結合分子は、FcRn結合部位におけるFc変異の使用によってさらに改変される(Petkova, S. B. et al., Intl. Immunol. 18, 1759-1769 (2006)); Deng, R. et al., mAbs 4, 101-109 (2012)); Olafson, T Methods Mol. Biol. 907, 537-556 (2012))。抗CD112R結合分子がFcドメインを含む態様において、抗CD112結合分子は、的外れの毒性を低減するためにIgGエフェクター機能(ADCCおよびCDC)を低減するN297A変異(Lund, J. et al., Mol. Immunol. 29, 53-39 (1992))のような、Fcドメインにおける変異を含むことができる。
【０１４１】
別の局面において、本開示は、CD112Rタンパク質、本開示の融合ポリペプチド、複合体、または抗体を対象にそれぞれ投与する段階を含む、その必要がある対象における免疫応答の調節方法を含む。本開示の免疫応答の調節方法は、対象における腫瘍抑制または退縮を誘導する。本開示の免疫応答の調節方法は、対象におけるT細胞応答を調節する。
【０１４２】
別の局面において、本開示は、本開示のCD112Rタンパク質、融合ポリペプチド、CD112Rと第2のタンパク質とを含む複合体、または抗CD112R抗体(本明細書において集合的に「抗CD112R結合分子」といわれる)を、そのような処置または予防が望まれる対象に投与する段階により、1つもしくは複数の病態の症状を処置するか、予防するか、1つもしくは複数の病態の症状の進行を遅延させるか、またはさもなければ1つもしくは複数の病態の症状を改善するか、あるいはそのような病態に関連する症状を緩和する方法を含む。処置される対象は、例えば、ヒトまたは他の哺乳動物である。態様において、対象は、非ヒト霊長類、伴侶動物(例えば、ネコ、イヌ、ウマ)、家畜、使役動物、または動物園の動物のような、非ヒト哺乳動物である。態様において、対象はげっ歯類である。
【０１４３】
これらの方法および使用の態様のいずれかにおいて用いられる本開示の抗CD112R結合分子は単独で、あるいは小分子阻害剤、他の抗体に基づく治療、ポリペプチドもしくはペプチドに基づく治療、核酸に基づく治療および/または他の生物製剤を含む、1つまたは複数のさらなる薬剤と組み合わせて投与することができる。態様において、抗CD112R結合分子は、非限定的な例として、化学療法剤、例えばアルキル化剤、代謝拮抗物質、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、細胞傷害性抗生物質、および任意の他の核酸損傷剤のような、1つまたは複数のさらなる薬剤と組み合わせて投与される。態様において、さらなる薬剤は、別の抗体、例えばモノクローナル抗体(例えば、ベバシズマブ)、二重特異性抗体、または多重特異性抗体のような、標的指向薬剤である。態様において、さらなる薬剤は、ボルテゾミブまたはカルフィルゾミブのような、プロテオソーム阻害剤である。態様において、さらなる薬剤は、レノリドミンド(lenolidominde)またはIL-2のような、免疫調節剤である。態様において、さらなる薬剤は、放射線である。態様において、さらなる薬剤は、当業者によって標準治療と考えられる薬剤である。態様において、さらなる薬剤は、当業者に周知の化学療法剤である。態様において、さらなる薬剤は、チェックポイント阻害剤、キナーゼ阻害剤、腫瘍微小環境における作用物質ターゲティング阻害剤、および/またはT細胞もしくはNKアゴニストである。
【０１４４】
態様において、抗CD112R結合分子は、例えば、化学療法剤、抗炎症剤および/または免疫抑制剤のような1つまたは複数のさらなる薬剤と組み合わせて処置中および/または処置後に投与される。態様において、抗CD112R結合分子およびさらなる薬剤は、単一の治療用組成物に処方され、抗CD112R結合分子およびさらなる薬剤は同時に投与される。あるいは、抗CD112R結合分子およびさらなる薬剤は、互いに分離され、例えば、各々が別個の治療用組成物に処方され、抗CD112R結合分子およびさらなる薬剤は同時に投与されるか、または抗CD112R結合分子およびさらなる薬剤は、処置レジメン中の異なる時間に投与される。例えば、抗CD112R結合分子は、さらなる薬剤の投与の前に投与されるか、抗CD112R結合分子は、さらなる薬剤の投与の後に投与されるか、または抗CD112R結合分子およびさらなる薬剤は交互に投与される。本明細書において記述されるように、抗CD112R結合分子およびさらなる薬剤は、単回用量または複数回用量で投与される。
【０１４５】
態様において、CD112Rタンパク質、融合ポリペプチド、CD112Rと第2のタンパク質とを含む複合体、または抗CD112R結合分子、およびさらなる薬剤は、同時に投与される。例えば、抗CD112R結合分子およびさらなる薬剤は、単一の組成物に処方されることができ、または2つもしくはそれ以上の別個の組成物として投与されることができる。態様において、抗CD112R結合分子およびさらなる薬剤は連続的に投与されるか、または抗CD112R結合分子およびさらなる薬剤は処置レジメン中の異なる時間に投与される。
【０１４６】
1つの局面において、毒素および抗CD112R抗体を含む組成物の有効量を、その必要がある対象に投与する段階によりがんを処置する方法が提供される。
【０１４７】
1つの局面において、毒素および抗CD112R抗体を含む薬物送達媒体が提供される。薬物送達デバイスは毒素を含む。態様において、毒素は、DNAトポイソメラーゼIまたはトポイソメラーゼIIの阻害剤である。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１Ａ】ヒトCD112R遺伝子によってコードされる配列である。予測される細胞外IgV様ドメインおよび膜貫通ドメインは、それぞれ青色および赤色で強調表示されている。細胞質ドメイン中の2つのチロシンには下線が引かれ、1つは、下線が引かれている可能なITIMモチーフ内にある。
【図１Ｂ】他の既知のPVRファミリーメンバーに対するCD112Rのアミノ酸配列を示す複数の配列アライメントであり、CD112RのIgVドメインがPVRファミリー間で保存された残基を含むことを示している。同様の残基および同一の残基は赤で網掛けされ、PVR-シグネチャーモチーフは緑色の枠で囲まれている。配列識別子はアライメント中の各配列に、次のように割り当てられている: CD112R (SEQ ID NO: 61)、CD112 (SEQ ID NO: 62)、CD155 (SEQ ID NO: 63)、TIGIT (SEQ ID NO: 64)、CD96 (SEQ ID NO: 65)、PVRL1 (SEQ ID NO: 66)、PVRL3 (SEQ ID NO: 67)、PVRL4 (SEQ ID NO: 68)、およびCD226 (SEQ ID NO: 69)。
【図１Ｃ】MacVector 6.5におけるClustal WプログラムによるヒトCD112Rおよび既知のPVR様タンパク質の分析を示す系統樹ガイドである。
【図１Ｄ】ヒトPVRL4 (タンパク質データバンクアクセッション番号4JJH)を鋳型として用いた、ヒトCD112R IgVドメイン(55〜150 aa)の予測されるタンパク質構造モデルである。
【図１Ｅ】ヒト免疫細胞におけるヒトCD112R転写産物のPCR分析を示すブロットである。
【図１Ｆ】健常ドナーのPBMC由来のナイーブまたは活性化ヒトT細胞上の表面CD112R発現のFACS分析を示すグラフを描く。T (CD3+)およびNK (CD56+)細胞の有意な集団は、低いが検出可能な表面CD112Rを発現したが、CD112R発現T細胞の割合は異なるドナーにおいて変化した。
【図１Ｇ】過バナジン酸処理によるCD112Rタンパク質のチロシンリン酸化を示すブロットを描く。対照またはCD112RプラスミドをHEK293T細胞に一過性にトランスフェクトした。チロシンリン酸化の分析の前に、細胞を過バナジン酸有りまたは無しで10分間インキュベートした。
【図１Ｈ】ルシフェラーゼアッセイ法におけるNFAT活性に及ぼすキメラ受容体刺激の効果を示すグラフを描く。異なるキメラをトランスフェクトされたJurkat-NFAT-Luc細胞を、マウスCD28アゴニストmAbの存在下または非存在下において、OKT3で刺激した。
【図２Ａ】PBMC中のヒト免疫細胞をCD112Rタンパク質結合について染色したことを示すグラフを描く。
【図２Ｂ】培養ヒト腫瘍細胞株をCD112Rタンパク質結合について染色したことを示す棒グラフを描く。示したデータは、対照タンパク質結合に対するCD112R結合の蛍光強度中央値(MFI)比である。
【図２Ｃ】トリプシン処理(10分)有りまたは無しの腫瘍細胞株をCD112Rタンパク質結合について染色したことを示すグラフを描く。
【図２Ｄ】CD112R mAbによるCD112R結合の遮断を示すグラフを描く。HEK293T細胞を、CD112R mAb (クローン2H6)の存在有りまたは無しで、CD112R結合について染色した。
【図３Ａ】表示のように異なるPVR様遺伝子をHEK293T細胞に一過性にトランスフェクトし、該細胞をCD112R融合タンパク質結合について染色したことを示すグラフを描く。
【図３Ｂ】CD112R (青色)または対照プラスミド(赤色)をHEK293T細胞にトランスフェクトし、該細胞をCD112R mAb (左)またはCD112-Fc融合タンパク質(右)で染色したことを示すグラフを描く。
【図３Ｃ】CD112 (右)または対照タンパク質(左)でコーティングされたビーズをCD112 mAb (青色)またはアイソタイプ対照(赤色)で染色して、ビーズ上のCD112の存在を確認したことを示すグラフを描く。ビーズをまた、CD112R融合タンパク質(青色)または対照(赤色)とともに直接相互作用のためにインキュベートした。
【図３Ｄ】CD112へのCD112R結合のBIAcore3000分析を示すグラフを描く。CD112Rタンパク質の一連の濃度を用いて、固定化CD112での結合反応速度を測定した。
【図３Ｅ】マウスにおいてCD112R/CD112相互作用が保存されたことを示すグラフを描く。mCD112を安定に発現するマウスリンパ腫細胞株であるRMA-S/mCD112細胞(青色)、または対照RMA-S細胞(赤色)を、それぞれマウスCD112R-Fc、マウスCD226-FcまたはマウスTIGIT-Fcで染色した。
【図３Ｆ】CD112R、CD226、およびTIGITの間でのCD112に対する競合結合アッセイ法を示すグラフを描く。コーティングされたCD112は、異なる濃度のTIGITまたはCD226タンパク質の存在下においてCD112Rタンパク質により染色された; その一方で、コーティングされたCD112は、異なる濃度のCD112Rタンパク質の存在下において、CD226タンパク質により染色された。
【図４Ａ】ヒト単球由来DCをTLRアゴニストで終夜刺激し、CD112発現について染色した(左)ことを示すグラフを描く。それらを対照またはCD112 mAb (クローンTX31)とともにプレインキュベートした後に、CD112R融合タンパク質結合について染色した(右)。
【図４Ｂ】ヒト膵臓細胞株PANC198をCD112発現について染色したことを示すグラフを描き、それらを対照またはCD112 mAb (クローンTX31)とともにプレインキュベートした後に、CD112R融合タンパク質結合について染色した。
【図４Ｃ】精製されたヒトT細胞をCFSE標識し、コーティングされたCD112または対照タンパク質とともにOKT3で刺激したことを示すグラフを描く。対照またはCD112R mAbを細胞培養中に添加した。示されたCFSE希釈細胞を、分裂T細胞としてカウントした。
【図４Ｄ】精製されたヒトT細胞をCFSEで標識し、TTの存在下において自己樹状細胞とともに同時培養したことを示すグラフを描く。対照、CD112R mAbまたはTIGIT (チロシンに基づく阻害モチーフ[ITIM]ドメイン) mAbを培養開始時に含めた。TT特異的CD4+ T細胞の増殖を、ヒトCD3およびCD4二重陽性細胞のCFSE希釈によって決定した。
【図４Ｅ】CD112R-Fc融合タンパク質の添加がT細胞増殖を中程度に阻害したことを示すグラフを描く。
【図４Ｆ】CD112R-Fc融合タンパク質を用いたTT特異的T細胞応答の減少を描くグラフである。
【図４Ｇ】新しいCD112/CD155分子ネットワークのモデルを示す略画である。リガンドCD112およびCD155は、抗原提示細胞および腫瘍細胞上に豊富に発現される。それらはともに、T細胞およびNK細胞上の共刺激受容体CD226と相互作用し、その活性を増加させ、TIGITを通してT細胞およびNK細胞媒介応答を抑制する。さらに、リンパ球に及ぼす効果は不明であるが、CD155はCD96に結合することができ、CD112はCD112Rと相互作用して免疫応答を阻害する。
【図５Ａ】BioGPSからのmRNA発現データに基づき、Tリンパ球およびNK細胞を含むリンパ球においてCD112R遺伝子が選択的に転写されることを示すグラフである。
【図５Ｂ】遺伝子濃縮プロファイル(Gene Enrichment Profile)からのmRNA発現データに基づく; CD112R遺伝子がT細胞サブセットおよびNK細胞において高度に濃縮された遺伝子の1つであることを示すグラフである。
【図６Ａ】CD112R mAbの特異性をフローサイトメトリーによりCD112Rトランスフェクタントへのその結合を検証することによって示すグラフを描く。対照またはCD112R遺伝子をHEK293Tウナギ(eel)にトランスフェクトし、生細胞をフローサイトメトリーにより対照(赤色)またはCD112R mAb (クローン2H6) (青色)で染色した。
【図６Ｂ】クローン2H6によるCD112RまたはGAPDHタンパク質を示すウエスタンブロットを描く。CD112Rトランスフェクタントまたは対照HEK293T細胞由来の細胞溶解物を用いた。
【図７】Jurkat-Luc-NFAT細胞にマウスCD28キメラ遺伝子を形質導入したことを示すグラフを描く。mCD28/hCD28またはmCD28/hCD112Rキメラ遺伝子をJurkat-Luc-NFAT細胞にトランスフェクトした。細胞をゼオシンで選択し、マウスCD28 mAbで染色した。マウスCD28+細胞のフローサイトメトリー選別により細胞をさらに濃縮した。
【図８】CD112 mAbであるクローンTX31がCD112/CD226相互作用を遮断することを示すグラフを描く。CD112コーティングビーズを対照Ig (左)またはCD112 mAb (右)とともにプレインキュベートし、次に結合についてCD226-Fcで染色した。
【図９】ヒトT細胞、B細胞、またはNK細胞は検出可能なCD112タンパク質を全く発現しなかったが、単球は有意なレベルの表面CD112を発現したことを示すグラフを描く。細胞サブセットを表面マーカーによってヒトPBMCから同定し、個々のサブセット上のCD112発現をフローサイトメトリーによって明らかにした。
【図１０】CD112以外の既知のPVR様タンパク質がCD112Rタンパク質と相互作用しないことを示すグラフを描く。個々のPVR様融合タンパク質(マウスIgG2aのFc断片)でコーティングされたビーズを、結合について対照(赤色)またはCD112R融合タンパク質(ヒトIgG1 Fc) (オープンブラック色)で染色した。コーティングされたタンパク質の存在を、マウスIgG2a Fc断片に特異的な抗体(青色)を染色することによって確認した。
【図１１Ａ】アミノ酸配列に基づくヒトCD112Rの予測されるタンパク質構造の略図を示す。
【図１１Ｂ】異なる細胞型および組織におけるCD112R遺伝子のCD112R発現プロファイルを表す棒グラフである。
【図１１Ｃ】異なる組織起源の腫瘍細胞株におけるCD112R転写産物を表す散布図を示す。
【図１１Ｄ】リンパ腫/白血病細胞株の異なるサブタイプにおけるCD112R転写産物を表す線グラフである。
【図１２Ａ】CD112R mAb (クローン2H6) (緑線)またはアイソタイプ対照抗体(赤線)で染色された対照またはCD112Rタンパク質コーティングビーズのFACSを示す。
【図１２Ｂ】CD112R mAbにより表面CD112Rについて染色された、新たに単離され活性化されたヒトT細胞のFACSを示す。
【図１２Ｃ】T-ALLの細胞株の表面CD112R発現のFACSを示す。
【図１２Ｄ】NHLの細胞株の表面CD112R発現のFACSを示す。
【図１２Ｅ】リンパ腫/白血病の細胞株の表面CD112R発現のFACSを示す。
【図１３Ａ】カンプトテシンを負荷したポリ(ラクチド-コ-グリコリド)ナノ粒子(NP)に共有結合した、CD112Rを標的とする周囲の抗体の層を含むナノ粒子の概略図を示す。
【図１３Ｂ】対照として用いられる非特異的アイソタイプ抗体と結合させたナノ粒子の概略図を示す。蛍光可視化を用いて、Molt4のようなT-ALL細胞株へのナノ構築物の内部移行を研究することができる。
【図１４−１】本開示の3つの抗CD112R抗体mAb 2H6、mAb 4-4、およびmAb 4-5がヒトCD112Rに結合する能力を描く一連のグラフである。
【図１４−２】本開示の3つの抗CD112R抗体mAb 2H6、mAb 4-4、およびmAb 4-5がヒトCD112Rに結合する能力を描く一連のグラフである。
【図１５】CD112R scFvを含む、本開示のCAR構築物の3つの態様の概略図である。
【図１６Ａ】ヒトがんにおけるCD112R経路の発現を描く一連のグラフである。複数のヒトがん検体におけるCD112転写産物の発現。100超を陽性とみなした。
【図１６Ｂ】ヒトがんにおけるCD112R経路の発現を描く一連のグラフである。ヒト黒色腫およびPDAC組織におけるCD112のIHC染色の代表例。
【図１６Ｃ】ヒトがんにおけるCD112R経路の発現を描く一連のグラフである。PDAC患者由来のPBMCおよびTILのCD8+ T細胞におけるCD112R発現の代表例。細胞をCD3、CD8およびaCD112Rで染色した。示されたデータは、CD8+CD3+細胞でゲーティングされている。
【図１７Ａ】活性化時にCD112Rがマウスリンパ球上で上方制御されることを描く一連のグラフである。mCD112Rプラスミド(青色)または対照ベクター(赤色)をトランスフェクトされたHEK293T細胞を、ラット抗mCD112R mAb (クローン6H11)で染色した。
【図１７Ｂ】活性化時にCD112Rがマウスリンパ球上で上方制御されることを描く一連のグラフである。RMA-S/mCD112安定細胞株(青色)またはRMA-S対照細胞(赤色)を、amCD112R mAb (クローン6H11)の存在有り(右)または無し(左)で、CD112R-Fc相互作用について染色した。
【図１７Ｃ】活性化時にCD112Rがマウスリンパ球上で上方制御されることを描く一連のグラフである。ナイーブマウス脾臓における免疫細胞サブセットを表面マーカーによって検出し、CD112R発現について染色した: B細胞(CD19+CD3-)、T細胞(CD3+CD19-)、単球(CD11b+Ly6C+)、およびDC (CD11c+IAb+)。
【図１７Ｄ】活性化時にCD112Rがマウスリンパ球上で上方制御されることを描く一連のグラフである。PBSまたは100 μgポリICを終夜注入したマウスからの脾臓NK細胞を、表面CD112R発現について染色した。
【図１７Ｅ】活性化時にCD112Rがマウスリンパ球上で上方制御されることを描く一連のグラフである。CD3/CD28 mAbsビーズによって活性化されたマウスT細胞上のCD112Rの発現。
【図１７Ｆ】活性化時にCD112Rがマウスリンパ球上で上方制御されることを描く一連のグラフである。CD112Rは、ペプチド刺激に応答してOT-1トランスジェニックT細胞上で上方制御される。
【図１８Ａ】マウス腫瘍モデルにおいてCD112R/CD112経路が上方制御されることを描く一連のグラフである。マウス腫瘍細胞株でのCD112発現。
【図１８Ｂ】マウス腫瘍モデルにおいてCD112R/CD112経路が上方制御されることを描く一連のグラフである。移植されたB16F10腫瘍由来のTIL中のNK細胞を、表面CD112Rについて染色した。
【図１８Ｃ】マウス腫瘍モデルにおいてCD112R/CD112経路が上方制御されることを描く一連のグラフである。dLNおよびTIL由来のT細胞をCD112R発現について調べた。
【図１９−１】CD112RがTIL上の他の既知の免疫チェックポイントと同時発現されることを描く一連のグラフである。マウス腫瘍組織由来のTILをCD3、CD4およびCD8について染色した。異なるT細胞サブセット上のCD112Rと他の免疫チェックポイント(表示の通り)との同時発現が示された。各集団におけるCD112R発現細胞の割合を表示した。
【図１９−２】CD112RがTIL上の他の既知の免疫チェックポイントと同時発現されることを描く一連のグラフである。マウス腫瘍組織由来のTILをCD3、CD4およびCD8について染色した。異なるT細胞サブセット上のCD112Rと他の免疫チェックポイント(表示の通り)との同時発現が示された。各集団におけるCD112R発現細胞の割合を表示した。
【図２０】CD112R遮断が肺転移マウスモデルにおける抗がん免疫を改善することを描く図解およびグラフである。B6マウスにB16F10黒色腫細胞を静脈内(iv)注射して肺転移を誘導した。マウスを対照またはmCD112R遮断mAbで計3回(1日目、4日目、7日目)処理した。腫瘍攻撃の20日後に肺を採取し、結節をカウントした。
【図２１Ａ】単独でまたはTIGIT遮断と共にCD112R遮断がヒトNK細胞によるハーセプチン媒介ADCCを増加させることを描く一連のグラフである。ヒト乳がん細胞株でのCD112およびCD155の発現。
【図２１Ｂ】単独でまたはTIGIT遮断と共にCD112R遮断がヒトNK細胞によるハーセプチン媒介ADCCを増加させることを描く一連のグラフである。ヒトNK細胞を、表示の通り異なるmAbの存在下において、ハーセプチンコーティングSK-BR3細胞とともに15時間インキュベートした; NK細胞上の細胞内IFN-γの発現をフローサイトメトリーによって検出した。
【図２１Ｃ】単独でまたはTIGIT遮断と共にCD112R遮断がヒトNK細胞によるハーセプチン媒介ADCCを増加させることを描く一連のグラフである。ヒトNK細胞を、表示の通り異なるmAbの存在下において、ハーセプチンコーティングSK-BR3細胞とともに15時間インキュベートした; NK細胞上のCD107aの発現をフローサイトメトリーによって検出した。
【図２２】水素重水素交換質量分析法(HDX-MS)を用いた、ヒトCD112Rと本明細書において2H6といわれる抗CD112R抗体との間の相互作用領域のエピトープマッピングを描く図解である。HXMSデータ分析は、ペプチドリストの同定のためのPLGSならびに同位体割り当ておよび取り込みエクスポートのためのDynamX 3.0 (手作業による検証)によって実施された。CD112R-mFcタンパク質(SEQ ID NO: 52)の一部としてCD112Rタンパク質の配列全体の71%をカバーする53種の特有のCD112Rペプチド配列を、図22に示されるように同定した。
【図２３】D2Oインキュベーション10分後のHXMS取り込みのまとめを描くグラフである。左から右に列挙されるペプチドは、それぞれ、SEQ ID NO: 70〜122によって識別される。
【図２４】D2Oインキュベーション60分後のHXMS取り込みのまとめを描くグラフである。左から右に列挙されるペプチドは、それぞれ、SEQ ID NO: 70〜122によって識別される。
【発明を実施するための形態】
【０１４９】
開示の詳細な説明
本明細書において、とりわけ、その必要がある対象におけるT細胞媒介免疫応答を調節するための組成物および方法が提供される。本方法は、有効量の本開示のCD112Rタンパク質、融合ポリペプチド、CD112Rと第2のタンパク質とを含む複合体、または抗CD112R抗体を対象に投与する段階を含む。
【０１５０】
定義
以下の定義は、本発明の主題を理解する目的でおよび添付の特許請求の範囲を構成する目的で含まれる。本明細書において用いられる略語は、化学的および生物学的技術内でのその従来の意味を有する。
【０１５１】
他に定義されない限り、本明細書において用いられる技術的および科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989)を参照されたい。本明細書において記述されたものと類似または同等の任意の方法、デバイスおよび材料を本開示の実践において用いることができる。以下の定義は、本明細書において頻繁に用いられる特定の用語の理解を容易にするために提供されており、本開示の範囲を限定するようには意図されない。
【０１５２】
「CD112Rポリペプチド」、「CD112Rタンパク質」および「CD112R」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、CD112ポリペプチドに結合することができる、相同体およびその態様を含むポリペプチド配列をいう。本明細書において記述されるCD112Rは、ヒト由来もしくは非ヒト生物由来のような、種々の供給源から単離され、または組換えもしくは合成方法によって調製されうる。CD112Rは、CD112に結合することができ、かつSEQ ID NO: 1に対する少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドである。態様において、CD112Rは、CD112に結合することができ、かつSEQ ID NO: 1の少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドである。「CD112R」に言及する本明細書における全ての開示は、ポリペプチドの各々を個別におよび一緒にいう。例えば、本開示の各ポリペプチドの調製、本開示の各ポリペプチドの精製、本開示の各ポリペプチドの誘導、本開示の各ポリペプチドに対する抗体の形成、本開示の各ポリペプチドの投与、本開示の各ポリペプチドを含有する組成物、本開示の各ポリペプチドによる疾患の処置などの記述は、本開示の各ポリペプチドに個別に関連する。「CD112Rポリペプチド」、「CD112Rタンパク質」または「CD112R」という用語はまた、本明細書において開示の、または当技術分野において公知のCD112Rの変異体を含む。
【０１５３】
CD112R「細胞外ドメイン」または「ECD」は、膜貫通および細胞質ドメインを本質的に含まないCD112Rの形態をいう。通常、CD112R ECDは、そのような膜貫通および/または細胞質ドメインの1%未満を有する。態様において、CD112R ECDは、そのようなドメインの0.5%未満を有する。本開示のCD112R ECDについて同定された任意の膜貫通ドメインが、そのタイプの疎水性ドメインを同定するために当技術分野において日常的に利用される基準にしたがって同定されることが理解されよう。膜貫通ドメインの正確な境界は、本明細書において同定されるように、ドメインのいずれかの末端で約5アミノ酸以下だけ変化する可能性が最も高い。それゆえ、任意で、CD112Rの細胞外ドメインは、膜貫通ドメイン/細胞外ドメイン境界のいずれかの側に約5個またはそれ以下のアミノ酸を含んでいてもよく、そのようなポリペプチドは、関連するシグナルペプチドの有無にかかわらず、およびそれらをコードする核酸は、本開示によって企図される。
【０１５４】
「CD112R変異体」は、本明細書において開示される全長天然配列CD112Rペプチド配列、本明細書において開示されるCD112Rの細胞外ドメインまたは全長CD112R配列の任意の他の断片と少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性を有する上記または下記で定義されるCD112Rを意味する。そのようなCD112R変異体は、例えば、全長天然アミノ酸配列のN末端またはC末端の位置で、1つまたは複数のアミノ酸残基が付加され、または欠失されているCD112Rを含む。通常、CD112R変異体は、本明細書において開示される全長天然配列CD112R配列、本明細書において開示されるCD112Rの細胞外ドメインまたは全長CD112R配列の任意の他の具体的に定義された断片と少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約81%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約82%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約83%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約84%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約86%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約87%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約88%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約89%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約91%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約92%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約93%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約94%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約96%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約97%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約98%のアミノ酸配列同一性およびあるいは少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１５５】
ヒトCD112R遺伝子は、単一の細胞外IgVドメイン、1つの膜貫通ドメイン、および長い細胞内ドメインから構成される推定上の単一膜貫通タンパク質をコードする。CD112Rの細胞内ドメインは2つのチロシン残基を含有しており、1つは、ホスファターゼの潜在的なドッキング部位であるITIM様モチーフ内にある。CD112Rのアミノ酸配列の他の既知PVRファミリーメンバーとのアライメントにより、CD112RのIgVドメインがPVRファミリー間で保存された残基を含有することが示唆される。これらの残基は、PVRファミリー間で共有される少なくとも3つの主要なモチーフ: CD112Rの72〜74aa位のValもしくはIle-SerまたはThr-Gln; Ala89-X6-Gly96; およびTyr139またはPhe139-Pro140-X-Gly142を構成する。PVRファミリーの最初のIgVの系統樹分析によってさらに、CD112Rが全てのPVR様タンパク質に近いことが明らかにされている。CD112Rの構造モデルから、このタンパク質が一連のβシートからなるVセット免疫グロブリン折り畳みをとることが示唆される。
【０１５６】
本明細書において用いられる「CD112」は、CD226 (DNAM1)と相互作用してT細胞を共刺激するPVRL2/ネクチン-2としても知られているタンパク質である。CD112はまた、別の共阻害性受容体であるT細胞免疫グロブリンおよび免疫受容体チロシンに基づく阻害モチーフ[ITIM]ドメイン(TIGIT)を通じてT細胞応答を阻害する。
【０１５７】
本明細書において用いられる「第2のタンパク質」は、生物学的活性(例えば、結合活性)を有するタンパク質をいう。態様において、第2のタンパク質は、抗体もしくは抗体断片、生物学的活性もしくは結合活性を有する任意のタンパク質もしくはポリペプチド、または検出可能なタンパク質でありうる。検出可能なタンパク質は、ペプチドタグ、共有ペプチドタグ、またはタンパク質タグを有するタンパク質でありうる。
【０１５８】
態様において、ペプチドタグは、酵素BirAによるビオチン化を可能にし、したがってストレプトアビジンによりそのタンパク質を単離することができるペプチドであるAviTag
2018529667.tif 000033
、タンパク質カルモジュリンによって結合されるペプチドであるカルモジュリンタグ
2018529667.tif 000034
、Mono-Qのような陰イオン交換樹脂に効率的に結合するペプチドであるポリグルタミン酸タグ(EEEEEE (SEQ ID NO: 14))、抗体によって認識されるペプチドであるEタグ
2018529667.tif 000035
、抗体によって認識されるペプチドであるFLAGタグ
2018529667.tif 000036
、抗体によって認識されるペプチドであるHAタグ
2018529667.tif 000037
、ニッケルまたはコバルトキレートによって結合される5〜10個のヒスチジンであるHisタグ(HHHHHH (SEQ ID NO: 18))、抗体によって認識される短いペプチドであるMycタグ
2018529667.tif 000038
、Sタグ
2018529667.tif 000039
、ストレプトアビジンに結合するペプチドであるSBPタグ
2018529667.tif 000040
、哺乳動物発現用の、Softag 1
2018529667.tif 000041
、原核生物発現用の、Softag 3
2018529667.tif 000042
、ストレプトアビジンまたはストレプタクチンと呼ばれる修飾ストレプトアビジンに結合するペプチドであるStrepタグ(StrepタグII:
2018529667.tif 000043
、FlAsHおよびReAsH二ヒ素化合物によって認識されるテトラシステインタグであるTCタグ(CCPGCC (SEQ ID NO: 25))、抗体によって認識されるペプチドであるV5タグ
2018529667.tif 000044
、抗体によって認識されるペプチドであるVSVタグ
2018529667.tif 000045
、Xpressタグ
2018529667.tif 000046
である。
【０１５９】
態様において、共有結合ペプチドタグは、ピリン-Cタンパク質に共有結合するペプチドであるIsopeptag
2018529667.tif 000047
、SpyCatcherタンパク質に共有結合するペプチドであるSpyTag
2018529667.tif 000048
である。
【０１６０】
態様において、タンパク質タグは、ストレプトアビジンによる認識を可能にするBirAによってビオチン化されたタンパク質ドメインであるBCCP (ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質)、固定化されたグルタチオンに結合するタンパク質であるグルタチオン-S-トランスフェラーゼタグ、自然発生的に蛍光を発し、ナノボディによって結合されうるタンパク質である緑色蛍光タンパク質タグ、HaloLink(商標) Resin (Promega)に共有結合する変異ヒドロラーゼであるHaloタグ、アミロースアガロースに結合するタンパク質であるマルトース結合タンパク質タグ、Nusタグ、チオレドキシンタグ、二量体化および可溶化を可能にする、免疫グロブリンFcドメインに由来する、Fcタグである。
【０１６１】
本明細書において用いられる「検出可能な部分」は、ポリヒスチジン(ポリ(His))、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、FLAGタグ、AviTag、カルモジュリンタグ、ポリグルタミン酸タグ、Eタグ、HAタグ、Mycタグ、Sタグ、SBPタグ、Softtag 1、Softtag 3、Strepタグ、TCタグ、V5タグ、VSVタグ、Xpressタグ、Isopeptag、SpyTag、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質(BCCP)タグ、Haloタグ、チオレドキシンタグ、もしくはFcタグ、高電子密度試薬、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、常磁性分子、常磁性ナノ粒子、造影剤、磁気共鳴造影剤、X線造影剤、ガドリニウム、放射性同位体、放射性核種、フルオロデオキシグルコース、γ線放出核種、陽電子放出核種、生体コロイド、マイクロバブル、ヨウ素化造影剤、硫酸バリウム、二酸化トリウム、金、金ナノ粒子、金ナノ粒子凝集体、フルオロフォア、二光子フルオロフォア、ハプテン、タンパク質、または蛍光部分を意味する。
【０１６２】
本明細書において用いられる「治療用部分」は、抗がん剤、例えば、化学療法剤、成長阻害剤; 細胞傷害剤; 免疫原性剤; 免疫調節剤; T細胞活性を調節する薬剤; ケモカイン; アプタマー、低分子干渉RNA (siRNA); または短鎖活性化RNA (saRNA)を意味する。
【０１６３】
本明細書において用いられる「細胞傷害剤」という用語は、細胞の機能を阻害または抑止し、および/または細胞の破壊を引き起こす物質をいう。この用語は、放射性同位体(例えば、I131、I125、Y90およびRe186)、化学療法剤、および細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素活性毒素、またはその断片のような毒素を含むことが意図される。
【０１６４】
態様において、毒素はトポイソメラーゼ阻害剤でありうる。トポイソメラーゼ阻害剤は、それが阻害する酵素のタイプによって分類されることが多い。トポイソメラーゼI阻害剤: イリノテカン、トポテカン、カンプトテシンおよびラメラリンDは全て、IB型トポイソメラーゼを標的とする。トポイソメラーゼII阻害剤: エトポシド(VP-16)、テニポシド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、エリプチシン、アウリントリカルボン酸、およびカンナビジオールから合成されたキノロンHU-331。
【０１６５】
ヒトDNAトポイソメラーゼI (Top1)は、複製および転写中にDNAスーパーコイル形成を緩める必須酵素である。Top1は、切断された鎖を二重らせん軸の周りで回転させるDNA一本鎖切断を生成する。Top1はまた、切断された鎖を再ライゲーションしてインタクトな二本鎖DNAを再確立する。切断複合体として知られているTop1-DNA中間体は、通常の状況下で一過性かつ低レベルで存在する。しかしながら、カンプトテシンのような、Top1阻害剤による処理は、切断可能な複合体を安定化させ、DNA再ライゲーションを抑止し、致命的なDNA鎖切断を誘導する。がん細胞は、これらのDNA損傷の発生に対して選択的に感受性である。
【０１６６】
「化学療法剤」は、がんの処置において有用な化学化合物である。化学療法剤の例としては、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、5-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド(「Ara-C」)、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソイド、例えばパクリタキセル(タキソール, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、およびドセタキセル(タキソテール, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)、トキソテール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン(米国特許第4,675,187号参照)、メルファランならびに他の関連するナイトロジェンマスタードが挙げられる。この定義には、タモキシフェンおよびオナプリストンのような、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用するホルモン剤も含まれる。
【０１６７】
「成長阻害剤」は、本明細書において用いられる場合、インビトロまたはインビボのいずれかで、本明細書において同定される遺伝子のいずれかを過剰発現する細胞、特にがん細胞の成長を阻害する化合物または組成物をいう。したがって、成長阻害剤は、S期におけるそのような遺伝子を過剰発現する細胞の割合を有意に低減させるものである。成長阻害剤の例としては、01停止およびM期停止を誘導する薬剤のような、細胞周期の進行を(S期以外の場所で)遮断する薬剤が挙げられる。古典的なM期遮断薬には、ビンカ(ビンクリスチンおよびビンブラスチン)、タキソール、ならびにドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシドおよびブレオマイシンのようなトポII阻害剤が含まれる。G1停止させるそれらの薬剤は、S期停止にも波及し、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、5-フルオロウラシル、およびara-CのようなDNAアルキル化剤である。さらなる情報は、例えば、Murakamiら(WB Saunders: Philadelphia, 1995)による「Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs」と題されたThe Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1のなかで見出すことができる。
【０１６８】
「サイトカイン」という用語は、ある細胞集団により放出され、別の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するタンパク質の総称である。そのようなサイトカインの特定の例は、リンホカイン、モノカイン、および伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインのなかに含まれるものは、例えば、ヒト成長ホルモン、N-メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンのような成長ホルモン; 副甲状腺ホルモン; サイロキシン; インスリン; プロインスリン; リラキシン; プロレラキシン; 卵胞刺激ホルモン(FSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、および黄体形成ホルモン(LH)のような糖タンパク質ホルモン; 肝成長因子; 線維芽細胞成長因子; プロラクチン; 胎盤性ラクトゲン; 腫瘍壊死因子αおよびβ; ミュラー管抑制物質; マウスゴナドトロピン関連ペプチド; インヒビン; アクチビン; 血管内皮成長因子; インテグリン; トロンボポエチン(TPO); NGF-βのような神経成長因子; 血小板成長因子; TGF-αおよびTGF-βのような形質転換成長因子(TGF); インスリン様成長因子-Iおよび-II; エリスロポエチン(EPO); 骨誘導因子; インターフェロンα、β、およびγのようなインターフェロン; マクロファージ-CSF (M-CSF)のようなコロニー刺激因子(CSF); 顆粒球マクロファージ-CSF (GM-CSF); および顆粒球-CSF (G-CSF); IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12のようなインターロイキン(IL); TNF-αまたはTNF-βのような腫瘍壊死因子; ならびにLIPおよびキットリガンド(KL)を含む他のポリペプチド因子である。本明細書において用いられる場合、サイトカインという用語は、天然供給源由来または組換え細胞培養由来のタンパク質および天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価体を含む。
【０１６９】
「アプタマー」という用語は、ポリペプチドのような、標的分子に結合することができうる核酸分子をいう。例えば、本開示のアプタマーは、CD112Rに特異的に結合することができ、またはCD112Rの発現を調節するシグナル伝達経路中の分子に特異的に結合することができる。アプタマーの作出および治療的使用は、当技術分野において十分に確立されている。例えば、米国特許第5,475,096号を参照されたい。
【０１７０】
「免疫原性剤」または「免疫原」は、任意でアジュバントと併せて、哺乳動物への投与時にそれ自体に対する免疫応答を誘導することができうる。免疫原の例は、本明細書において提供されるCD112Rまたはその断片を含む融合ポリペプチド、コンジュゲートである。免疫原性剤は、化学的架橋によって担体に連結することができる。免疫原を担体に連結させるための技法には、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジル-チオ)プロピオネート(SPDP)およびスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)を用いたジスルフィド結合の形成が含まれる(ペプチドがスルフヒドリル基を欠く場合、システイン残基の付加によってこれを提供することができる)。これらの試薬は、それら自体とあるタンパク質上のペプチドシステイン残基との間のジスルフィド結合およびリシン上のイプシロン-アミノまたは他のアミノ酸における他の遊離アミノ基を通じたアミド結合をもたらす。種々のそのようなジスルフィド/アミド形成剤は、Immun. Rev. 62, 185 (1982)によって記述されている。他の二官能性カップリング剤は、ジスルフィド結合ではなくチオエーテルを形成する。これらのチオエーテル形成剤の多くは、市販されており、6-マレイミドカプロン酸、2-ブロモ酢酸、および2-ヨード酢酸、4-(N-マレイミド-メチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸の反応性エステルを含む。カルボキシル基は、それらをスクシンイミドまたは1-ヒドロキシル-2-ニトロ-4-スルホン酸, ナトリウム塩と組み合わせることによって活性化することができる。
【０１７１】
本明細書において開示されるさまざまなポリペプチドを記述するために用いられる場合に、「単離された」とは、同定され、その天然環境の成分から分離および/または回収されたポリペプチドを意味する。その天然環境の夾雑成分は、ポリペプチドの診断的または治療的使用を典型的に妨害する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含みうる。態様において、ポリペプチドは、(1) スピニングカップ配列決定装置の使用により少なくとも15残基のN末端もしくは内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度にまで、または(2) 非還元もしくは還元条件下でのSDS-PAGEによりクマシーブルー染色もしくは、好ましくは、銀染色を用いて均質になるまで精製されうる。単離されたポリペプチドは、ポリペプチド天然環境の少なくとも1つの成分が存在しないので、組換え細胞内のインサイチューのポリペプチドを含む。態様において、単離されたポリペプチドは、少なくとも1つの精製段階によって調製されうる。
【０１７２】
「抗体」という用語は、当技術分野において一般的に知られているその意味にしたがって用いられる。抗体は、例えば、インタクトな免疫グロブリンとして、またはさまざまなペプチダーゼでの消化により産生されたいくつかの十分に特徴付けられた断片として存在する。このように、例えば、ペプシンは抗体を、ヒンジ領域中のジスルフィド結合より下部で消化して、それ自体がジスルフィド結合によってVHCH1に連結された軽鎖であるFabの二量体F(ab)'2を産生する。F(ab)'2は、温和な条件下で還元されてヒンジ領域中のジスルフィド結合を破壊し、それによってF(ab)'2二量体をFab'単量体に変換しうる。Fab'単量体は本質的に、ヒンジ領域の一部を有するFabである(Fundamental Immunology (Paul ed., 3d ed. 1993)参照。さまざまな抗体断片はインタクトな抗体の消化に関して定義されるが、当業者は、そのような断片が化学的にまたは組換えDNA方法論を用いることにより新規に合成されうることを理解するであろう。したがって、抗体という用語は、本明細書において用いられる場合、全抗体の改変によって産生される抗体断片、または組換えDNA方法論を用いて新規に合成されるもの(例えば一本鎖Fv)もしくはファージディスプレイライブラリを用いて同定されるものも含む(例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)を参照のこと)。
【０１７３】
「アゴニスト(agonistic)抗体またはアゴニスト(agonist)抗体」という用語は、内因性リガンドの活性を模倣し、それによって標的分子の下流のシグナル伝達経路を活性化するようにデザインされた抗体のクラスを表す。CD40およびDR5のような多くの腫瘍壊死因子受容体(TNFR)スーパーファミリーメンバーは、免疫応答および抗腫瘍応答に関与する重要なシグナル伝達経路を制御し、これらの分子を標的とするアゴニスト抗体は抗腫瘍活性を有する。
【０１７４】
抗体は、複雑な内部構造を有する大きな、複雑な分子(約150,000の分子量または約1320アミノ酸)である。天然抗体分子は、2つの同一の対のポリペプチド鎖を含み、各対は1つの軽鎖および1つの重鎖を有する。各軽鎖および重鎖が、今度は、2つの領域: 標的抗原の結合に関与する可変(「V」)領域、および免疫系の他の成分と相互作用する定常(「C」)領域からなる。軽鎖および重鎖の可変領域は、3次元空間で一体となって、抗原(例えば、細胞の表面上の受容体)に結合する可変領域を形成する。各軽鎖または重鎖可変領域内には、相補性決定領域(「CDR」)と呼ばれる3つの短いセグメント(長さが平均10アミノ酸)が存在する。抗体可変ドメイン中の6つのCDR (軽鎖由来の3つおよび重鎖由来の3つ)は、3次元空間で一緒に折り畳まれて、標的抗原上にドッキングする実際の抗体結合部位を形成する。CDRの位置および長さは、Kabat, E. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1983, 1987によって正確に定義されている。CDRに含有されていない可変領域の部分はフレームワーク(「FR」)と呼ばれ、これはCDRの環境を形成する。
【０１７５】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体の調製の場合、当技術分野において公知の任意の技法を用いることができる(例えば、Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); Cole et al., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)を参照のこと)。「モノクローナル」抗体(mAb)は、単一のクローンに由来する抗体をいう。一本鎖抗体の産生のための技法(米国特許第4,946,778号)を適合させて、本開示のポリペプチドに対する抗体を産生することができる。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳動物のような他の生物を用いて、ヒト化抗体を発現させることもできる。あるいは、ファージディスプレイ技術を用いて、選択された抗原に特異的に結合する抗体および異種Fab断片を同定することができる(例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)を参照のこと)。
【０１７６】
mAbのエピトープは、mAbが結合するその抗原の領域である。2つの抗体は、それぞれが抗原への他方の結合を競合的に阻害する(遮断する)場合、同じまたは重複するエピトープに結合する。すなわち、1倍、5倍、10倍、20倍または100倍過剰の一方の抗体は、競合結合アッセイ法において測定された場合に少なくとも30%、しかし好ましくは50%、75%、90%またはさらには99%他方の結合を阻害する(例えば、Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990を参照のこと)。あるいは、2つの抗体は、一方の抗体の結合を低減させまたは排除する抗原における本質的に全てのアミノ酸変異が、他方の結合を低減させまたは排除する場合、同じエピトープを有する。2つの抗体は、一方の抗体の結合を低減させまたは排除するいくつかのアミノ酸変異が、他方の結合を低減させまたは排除する場合、重複するエピトープを有する。
【０１７７】
例示的な免疫グロブリン(抗体)構造単位には、四量体が含まれる。各四量体は、2つの同一の対のポリペプチド鎖から構成され、各対は1つの「軽」鎖(約25 kD)および1つの「重」鎖(約50〜70 kD)を有する。各鎖のN末端は、抗原認識に主に関与する約100〜110またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)という用語は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖をいう。Fc (すなわち、断片の結晶化可能領域)は、免疫グロブリンの「基部」または「尾部」であり、典型的には、抗体のクラスに応じて2つまたは3つの定常ドメインに寄与する2つの重鎖から構成される。特定のタンパク質に結合することにより、Fc領域は、各抗体が所与の抗原に対して適切な免疫応答をもたらすことを確実にする。Fc領域はまた、Fc受容体のような、さまざまな細胞受容体、および補体タンパク質のような、他の免疫分子に結合する。
【０１７８】
抗体は、例えば、インタクトな免疫グロブリンとして、またはさまざまなペプチダーゼでの消化により産生されたいくつかの十分に特徴付けられた断片として存在する。このように、例えば、ペプシンは抗体を、ヒンジ領域中のジスルフィド結合より下部で消化して、それ自体がジスルフィド結合によってVH-CH1に連結された軽鎖であるFabの二量体F(ab)'2を産生する。F(ab)'2は、温和な条件下で還元されてヒンジ領域中のジスルフィド結合を破壊し、それによってF(ab)'2二量体をFab'単量体に変換しうる。Fab'単量体は本質的に、ヒンジ領域の一部を有する抗原結合部分である(Fundamental Immunology (Paul ed., 3d ed. 1993)参照。さまざまな抗体断片はインタクトな抗体の消化に関して定義されるが、当業者は、そのような断片が化学的にまたは組換えDNA方法論を用いることにより新規に合成されうることを理解するであろう。したがって、抗体という用語は、本明細書において用いられる場合、全抗体の改変によって産生される抗体断片、または組換えDNA方法論を用いて新規に合成されるもの(例えば一本鎖Fv)もしくはファージディスプレイライブラリを用いて同定されるものも含む(例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)を参照のこと)。
【０１７９】
一本鎖可変断片(scFv)は、典型的には、10〜約25アミノ酸の短いリンカーペプチドで連結された、免疫グロブリンの重鎖(VH)および軽鎖(VL)の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常、柔軟性のためにはグリシンが豊富であり、および溶解性のためにはセリンまたはスレオニンが豊富でありうる。リンカーは、VHのN末端をVLのC末端に、またはその逆に結び付けることができる。
【０１８０】
mAbのエピトープは、mAbが結合するその抗原の領域である。2つの抗体は、それぞれが抗原への他方の結合を競合的に阻害する(遮断する)場合、同じまたは重複するエピトープに結合する。すなわち、1倍、5倍、10倍、20倍または100倍過剰の一方の抗体は、競合結合アッセイ法において測定された場合に少なくとも30%、しかし好ましくは50%、75%、90%またはさらには99%他方の結合を阻害する(例えば、Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990を参照のこと)。あるいは、2つの抗体は、一方の抗体の結合を低減させまたは排除する抗原における本質的に全てのアミノ酸変異が、他方の結合を低減させまたは排除する場合、同じエピトープを有する。2つの抗体は、一方の抗体の結合を低減させまたは排除するいくつかのアミノ酸変異が、他方の結合を低減させまたは排除する場合、重複するエピトープを有する。
【０１８１】
本開示の適当な抗体の調製の場合、および本開示による使用、例えば、組換え抗体、モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の場合、当技術分野において公知の多くの技法を用いることができる(例えば、Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985); Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988); およびGoding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed. 1986)を参照のこと)。関心対象の抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を細胞からクローニングすることができ、例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマからクローニングすることができ、組換えモノクローナル抗体を産生するために用いることができる。モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子ライブラリも、ハイブリドーマまたは形質細胞から作製することができる。重鎖および軽鎖遺伝子産物のランダムな組み合わせにより、異なる抗原特異性を有する大きな抗体プールが得られる(例えば、Kuby, Immunology (3rd ed. 1997)を参照のこと)。本開示のポリペプチドに対する抗体を産生するために、一本鎖抗体または組換え抗体の産生のための技法(米国特許第4,946,778号、米国特許第4,816,567号)を適合させることができる。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳動物のような生物を用いて、ヒト化抗体またはヒト抗体を発現させることもできる(例えば、米国特許第5,545,807号; 同第5,545,806号; 同第5,569,825号; 同第5,625,126号; 同第5,633,425号; 同第5,661,016号、Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); およびLonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)を参照のこと)。あるいは、ファージディスプレイ技術を用いて、選択された抗原に特異的に結合する抗体および異種Fab断片を同定することができる(例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)を参照のこと)。抗体はまた、二重特異性にすることもでき、すなわち、2つの異なる抗原を認識することもできる(例えば、WO 93/08829, Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991); およびSuresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)を参照のこと)。抗体はまた、ヘテロコンジュゲート、例えば、2つの共有結合した抗体、または免疫毒素であることもできる(例えば、米国特許第4,676,980号、WO 91/00360; WO 92/200373; およびEP 03089を参照のこと)。
【０１８２】
非ヒト抗体をヒト化または霊長類化するための方法は、当技術分野において周知である(例えば、米国特許第4,816,567号; 同第5,530,101号; 同第5,859,205号; 同第5,585,089号; 同第5,693,761号; 同第5,693,762号; 同第5,777,085号; 同第6,180,370号; 同第6,210,671号; および同第6,329,511号; WO 87/02671; EP Patent Application 0173494; Jones et al. (1986) Nature 321:522; ならびにVerhoyen et al. (1988) Science 239:1534)。ヒト化抗体は、例えば、Winter and Milstein (1991) Nature 349:293にさらに記述されている。一般に、ヒト化抗体は、1つまたは複数のアミノ酸残基がヒト以外の供給源から導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、インポート残基といわれることが多く、これは、典型的には、インポート可変ドメインから取られる。ヒト化は本質的に、げっ歯類CDRまたはCDR配列を対応するヒト抗体配列の代わりに用いることにより、Winterおよび共同研究者の方法(例えば、Morrison et al., PNAS USA, 81:6851-6855 (1984), Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988), Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992), Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)を参照のこと)にしたがって行うことができる。したがって、そのようなヒト化抗体は、インタクトなヒト可変ドメインに実質的に満たないものが非ヒト種由来の対応する配列によって置換されているキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのCDR残基および場合によってはいくつかのFR残基が、げっ歯類抗体における類似部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。例えば、ヒト化免疫グロブリンフレームワーク領域をコードする第1の配列および所望の免疫グロブリン相補性決定領域をコードする第2の配列セットを含むポリヌクレオチドは合成的に、または適切なcDNAおよびゲノムDNAセグメントを組み合わせることにより作出することができる。ヒト定常領域DNA配列は、種々のヒト細胞から周知の手順にしたがって単離することができる。
【０１８３】
特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに「特異的に結合する」または「特異的」である抗体は、任意の他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープに実質的に結合することなくその特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに結合する抗体である。
【０１８４】
タンパク質またはペプチドに言及する場合、抗体に「特異的に(もしくは選択的に)結合する」または「特異的に(もしくは選択的に)免疫反応性である」という語句は、多くの場合にはタンパク質および他の生物学的物質(biologics)の異種集団における、タンパク質の存在を決定する結合反応をいう。したがって、指定された免疫アッセイ条件下で、特定の抗体は、バックグラウンドの少なくとも2倍、より典型的には、バックグラウンドの10〜100倍超、特定のタンパク質に結合する。そのような条件下での抗体への特異的結合は、典型的には、特定のタンパク質に対するその特異性のために選択される抗体を必要とする。例えば、ポリクローナル抗体は、選択された抗原と特異的に免疫反応性であり、他のタンパク質とはそうでない抗体のサブセットのみを得るように選択することができる。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を差し引くことによって達成されうる。特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために、種々の免疫アッセイ形式が用いられうる。例えば、固相ELISA免疫アッセイ法は、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために日常的に使われている(例えば、特定の免疫反応性を決定するために用いることができる免疫アッセイ形式および条件の記述については、Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)を参照されたい)。
【０１８５】
「キメラ抗体」は、(a) 抗原結合部位(可変領域)が異なるもしくは改変されたクラス、エフェクター機能および/もしくは種の定常領域、またはキメラ抗体に新しい特性を付与する完全に異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などに連結されるように、定常領域またはその一部分が改変され、置換されもしくは交換されている; または(b) 可変領域またはその一部分が、異なるもしくは改変された抗原特異性を有する可変領域により改変され、置換されもしくは交換されている、抗体分子である。本開示の好ましい抗体、および本開示による使用のために好ましい抗体は、ヒト化および/またはキメラモノクローナル抗体を含む。
【０１８６】
本明細書において提供される「治療用抗体」は、がん、自己免疫疾患、移植拒絶、心血管疾患、または本明細書において記述されるものなどの他の疾患もしくは状態を処置するために用いられる任意の抗体またはその機能的断片をいう。治療用抗体の非限定的な例としては、エルビタックス(セツキシマブ)、レオプロ(アブシキシマブ)、シムレクト(バシリキシマブ)、レミケード(インフリキシマブ); オルトクローンOKT3 (ムロモナブ-CD3); リツキサン(リツキシマブ)、ベクサール(トシツモマブ)、ヒューミラ(アダリムマブ)、キャンパス(アレムツズマブ)、シムレクト(バシリキシマブ)、アバスチン(ベバシズマブ)、シムジア(セルトリズマブペゴル)、ゼナパックス(ダクリズマブ)、ソリリス(エクリズマブ)、ラプティバ(エファリズマブ)、マイロターグ(ゲムツズマブ)、ゼバリン(イブリツモマブチウキセタン)、チサブリ(ナタリズマブ)、ゾレア(オマリズマブ)、シナジス(パリビズマブ)、ベクティビックス(パニツムマブ)、ルセンティス(ラニビズマブ)、およびハーセプチン(トラスツズマブ)を含むが、これらに限定されない、マウス抗体、マウス化もしくはヒト化キメラ抗体またはヒト抗体が挙げられる。
【０１８７】
治療剤を抗体にコンジュゲートさせるための技法は、周知である(例えば、Amon et al., 「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., 「Antibodies For Drug Delivery」 in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」 in Monoclonal Antibodies ‘84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); およびThorpe et al., 「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」, Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)を参照のこと)。本明細書において用いられる場合、「抗体-薬物コンジュゲート」または「ADC」という用語は、抗体とコンジュゲートしたまたは別の方法で共有結合した治療剤をいう。本明細書において言及される「治療剤」は、がんのような疾患を処置または予防するのに有用な組成物である。
【０１８８】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部分、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Fab、Fab'、F(ab')2およびFv断片; ダイアボディ; 直鎖状抗体(Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); 一本鎖抗体分子; ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【０１８９】
抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位を有する、「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗原結合断片、および容易に結晶化する能力を反映した名称である、残りの「Fc」断片を産生する。ペプシン処理は、2つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋することができるF(ab')2断片を生じる。
【０１９０】
「Fv」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含んだ最小限の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合している1つの重鎖可変ドメインおよび1つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この構成において、各可変ドメインの3つのCDRが相互作用して、VH-VL二量体の表面上の抗原結合部位を規定する。集合的に、6つのCDRは抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(または抗原に特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分)でさえ、結合部位全体よりも低い親和性であるが、抗原を認識して結合する能力を有する。
【０１９１】
Fab断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)を含む。Fab断片は、抗体ヒンジ領域由来の1つまたは複数のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端の位置での数個の残基の付加によりFab'断片と異なる。Fab'-SHは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するFab'のための本明細書における名称である。F(ab)'2抗体断片はもともと、それらの間にヒンジシステインを有するFab'断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
【０１９２】
任意の脊椎動物種由来の抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κおよびλと呼ばれる、2つの明確に異なるタイプのうちの1つに割り当てることができる。
【０１９３】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMの5つの主要なクラスの免疫グロブリンがあり、これらのいくつかはサブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAおよびIgA2にさらに分けられうる。
【０１９４】
「一本鎖Fv」または「sFv」抗体断片は、抗体のVHドメインおよびVLドメインを含み、これらのドメインが単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Fvポリペプチドは、sFvが抗原結合に望ましい構造を形成することを可能にするVHドメインとVLドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。sFvの概説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照されたい。
【０１９５】
「ダイアボディ」という用語は、同じポリペプチド鎖(VW-VL)中の軽鎖可変ドメイン(VL)に連結された重鎖可変ドメイン(VH)を含む2つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片をいう。同じ鎖上の2つのドメイン間での対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることにより、これらのドメインは別の鎖の相補的ドメインと対形成するほかなく、2つの抗原結合部位を形成するようになる。ダイアボディは、例えば、EP 404,097; WO 93111161; およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)にさらに十分に記述されている。
【０１９６】
「単離された」抗体とは、同定され、その天然環境の成分から分離および/または回収されたものである。その天然環境の夾雑成分は、抗体の診断的または治療的使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含みうる。特定の態様において、抗体は、(1) Lowry法により決定された場合に抗体の95重量%超、最も好ましくは99重量%超にまで、(2) スピニングカップ配列決定装置の使用により少なくとも15残基のN末端もしくは内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度にまで、または(3) 還元もしくは非還元条件下でのSDS-PAGEにより色素もしくは染色、例えば、限定されるものではないが、クマシーブルー染色もしくは銀染色などを用いて均質になるまで精製される。単離された抗体は、抗体の天然環境の少なくとも1つの成分が存在しないので、組換え細胞内のインサイチューの抗体を含む。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも1つの精製段階によって調製される。
【０１９７】
「超可変領域」、「HVR」または「HV」という用語は、本明細書において用いられる場合、配列が超可変性でありおよび/または構造的に規定されたループを形成する抗体可変ドメインの領域をいう。一般に、抗体は6つのHVR: VH中の3つ(H1、H2、H3)、およびVL中の3つ(L1、L2、L3)を含む。天然の抗体では、H3およびL3は6つのHVRのうちで最大の多様性を示し、特にH3は抗体に細かい特異性を付与するうえで独特の役割を果たすと考えられている。例えば、Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003)を参照されたい。実際、重鎖のみを有する天然に存在するラクダ抗体は、軽鎖の非存在下において機能的かつ安定である。例えば、Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)を参照されたい。
【０１９８】
いくつかのHVR描写が用いられており、本明細書において包含される。Kabat相補性決定領域(CDR)は、配列可変性に基づいており、最も一般的に用いられている(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。Chothiaは、その代わりに、構造ループの位置をいう(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。AbM HVRは、Kabat HVRとChothia構造ループとの折衷案を表し、Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェアによって用いられる。「コンタクト」HVRは、利用可能な複雑な結晶構造の分析に基づいている。これらのHVRの各々からの残基を下記に示す。
【０１９９】
「フレームワーク」または「FR」残基は、本明細書において定義されるHVR残基以外の可変ドメイン残基である。
【０２００】
用語「Kabatにあるような可変ドメイン残基付番」または「Kabatにあるようなアミノ酸位置付番」およびその変化形は、Kabat et al., 前記における抗体編集の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに用いられる付番システムをいう。この付番システムを用いて、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのFRもしくはHVRの短縮または可変ドメインのFRもしくはHVRへの挿入に対応する、より少ないまたは追加のアミノ酸を含むことができる。
【０２０１】
Kabat付番システムは、一般に、可変ドメインにおける残基(軽鎖のおよそ残基1〜111および重鎖の残基1〜114)をいう場合に用いられる(例えば、Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。「EU付番システム」または「EU指数」は、免疫グロブリン重鎖定常領域における残基に言及する場合に一般に用いられる(例えば、Kabat et al., 前記において報告されたEU指数)。「KabatにあるようなEU指数」は、ヒトIgG1 EU抗体の残基付番をいう。本明細書において特に明記されない限り、抗体の可変ドメインにおける残基番号への言及は、Kabat付番システムによる残基付番を意味する。本明細書において特に明記されない限り、抗体の定常ドメインにおける残基番号への言及は、EU付番システムによる残基付番を意味する。
【０２０２】
「親和性成熟」抗体は、改変を保有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらすその1つまたは複数のHVRにおける1つまたは複数の改変を有するものである。1つの態様において、親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモルまたはピコモルもの親和性を有する。親和性成熟抗体は、当技術分野において公知の特定の手順を用いて産生されうる。例えば、Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)には、VHおよびVLドメインシャッフリングによる親和性成熟が記述されている。例えば、HVRおよび/またはフレームワーク残基のランダム変異誘発は、Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gen e169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); およびHawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)により記述されている。
【０２０３】
「遮断」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害または低減するものである。特定の遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的にまたは完全に阻害する。本明細書において用いられる「アゴニスト抗体」は、関心対象のポリペプチドの機能的活性の少なくとも1つを部分的にまたは完全に模倣する抗体である。
【０２０４】
「リガンド」は、受容体に結合することができる薬剤、例えばポリペプチドまたは他の分子をいう。
【０２０５】
「保存的に改変された変異体」は、アミノ酸配列にも核酸配列にも当てはまる。特定の核酸配列に関して、「保存的に改変された変異体」とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいう。遺伝暗号の縮重により、いくつかの核酸配列が任意の所与のタンパク質をコードするものと考えられる。例えば、コドンGCA、GCC、GCGおよびGCUは全て、アミノ酸のアラニンをコードする。このため、コドンによってアラニンが指定されるあらゆる位置で、コードされるポリペプチドを変化させずに、そのコドンを対応する上記のコドンのいずれかに変化させることができる。そのような核酸の変化は「サイレント変化」であり、これは保存的に改変された変種の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書のあらゆる核酸配列は、核酸のあらゆる可能なサイレント変化も表す。当業者は、核酸内の各コドン(通常メチオニンに対する唯一のコドンであるAUGおよび通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるTGGを除く)を改変して、機能的に同一の分子を産生できることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変化が、記述されている各配列において暗に意味されている。
【０２０６】
アミノ酸配列に関して、コードされる配列内の単一アミノ酸またはほんの小数のアミノ酸を変化、付加または欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失または付加が、その変化によって化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換を生じる場合に「保存的に改変された変異体」であることを、当業者は認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸をもたらす保存的置換の表は、当技術分野において周知である。そのような保存的に改変された変異体は、本開示の多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子に追加されるものであり、これらを排除するものではない。
【０２０７】
以下の8群は各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む:
1) アラニン(A)、グリシン(G);
2) アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3) アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4) アルギニン(R)、リジン(K);
5) イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6) フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7) セリン(S)、スレオニン(T); および
8) システイン(C)、メチオニン(M)
(例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照のこと)。
【０２０８】
「遺伝子」という用語は、タンパク質の産生に関与するDNAのセグメントを意味する; それは、個々のコードセグメント(エクソン)間の介在配列(イントロン)と同様に、コード領域の前後の領域(リーダーおよびトレイラー)を含む。リーダー、トレイラーおよびイントロンは、遺伝子の転写および翻訳の間に必要な調節エレメントを含む。さらに、「タンパク質遺伝子産物」は、特定の遺伝子から発現されるタンパク質である。
【０２０９】
DNA核酸配列(例えば、遺伝子)に関して本明細書において用いられる「発現」または「発現され」という単語は、その配列の転写産物および/または翻訳産物を意味する。細胞内のDNA分子の発現レベルは、細胞内に存在する対応するmRNAの量または細胞によって産生されるそのDNAによってコードされるタンパク質の量のいずれかに基づいて決定されうる(Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 18.1-18.88)。ポリペプチドに関して用いられる場合、発現には、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与する任意の段階が含まれる。発現は、タンパク質を検出するための従来の技法(例えば、ELISA、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光、免疫組織化学など)を用いて検出することができる。
【０２１０】
「配列同一性の割合」は、比較ウインドウ上の2つの最適に整列された配列を比較することにより決定され、ここで比較ウインドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、2つの配列の最適なアライメントのために参照配列(付加または欠失を含まない)と比較して付加または欠失(すなわちギャップ)を含みうる。割合は、両方の配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定し一致した位置の数を得て、一致した位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数で割り、その結果に100を掛けて配列同一性の割合を得ることによって計算される。
【０２１１】
2つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列についての文脈で「同一の」または%「同一性」という用語は、同じものである、または比較ウインドウ、すなわち以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いてもしくは手作業によるアライメントおよび目視検査によって測定される指定領域にわたり、最大の対応関係が得られるように比較および整列を行ったときに、同じものである特定の割合(すなわち、例えば本開示のポリペプチド配列全体または本開示のポリペプチドの個々のドメインの、特定領域にわたり60%の同一性、任意で65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、または99%の同一性)のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する2つまたはそれ以上の配列または部分配列をいう。そのような配列は「実質的に同一」であると言われる。この定義はまた、試験配列の相補体をいう。任意で、同一性は、少なくとも約50ヌクレオチド長である領域にわたって、あるいはより好ましくは、100〜500または1000もしくはそれ以上のヌクレオチド長である領域にわたって存在する。
【０２１２】
配列比較の場合、典型的には、ある配列が参照配列となり、これと試験配列とを比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて、部分配列の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを用いることができ、または別のパラメータが指定されてもよい。次に、プログラムのパラメータに基づき、参照配列に対する試験配列の配列同一性の比率を配列比較アルゴリズムで計算する。
【０２１３】
本明細書において用いられる「比較ウインドウ」は、2つの配列を最適に整列させた後に、ある配列が同数の連続位置の参照配列と比較されうるような、例えば、全長配列または20〜600個、約50〜約200個もしくは約100〜約150個のアミノ酸もしくはヌクレオチドからなる群より選択される連続位置数のいずれか1つのセグメントに対する言及を含む。比較のための配列のアライメントの方法は、当技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局所相同性アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443の相同性アライメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるGAP、BESTFIT、PASTA、およびTFASTA)により、または手作業によるアライメントならびに目視検査(例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)を参照のこと)により行うことができる。
【０２１４】
配列同一性および配列類似性の比率を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402、およびAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記述されている。BLAST解析を行うためのソフトウエアは国立生物工学情報センター(http_www_ncbi_nlm_nih_gov/)を通じて公的に利用可能である。このアルゴリズムでは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列を行った場合に何らかの正値の閾値スコアTと一致するまたはそれを満たす、長さWの短いワードを問い合わせ配列中で特定することにより、高スコア配列ペア(HSP)をまず初めに特定することを伴う。Tは隣接ワードスコア閾値といわれる(Altschul et al., 前記)。これらの初期の隣接ワードでのヒットは、それらを含む長いHSPを見いだすための検索を開始する源となる。ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加されうる限り、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメータM (一致する残基の対についての報酬スコア; 常に>0)およびN (不一致残基についてのペナルティースコア; 常に<0)を用いて計算される。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。各方向でのワードヒットの拡張は、以下の場合に停止される: 累積整列スコアが、その最大達成値から量X低下した場合; 1つもしくは複数の負のスコアリング残基アライメントの蓄積に起因して、累積スコアがゼロ以下になる場合; またはいずれかの配列の末端に達した場合。BLASTアルゴリズムのパラメータW、TおよびXは、アライメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列の場合)は、11のワード長(W)、10の期待値(E)、M=5、N=-4および両方の鎖の比較をデフォルトとして用いる。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムは、3のワード長、および10の期待値(E)、ならびにBLOSUM62スコアリングマトリックス(Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915を参照のこと)のアライメント(B) 50、10の期待値(E)、M=5、N=-4、および両方の鎖の比較をデフォルトとして用いる。
【０２１５】
BLASTアルゴリズムは、2つの配列の間の類似性に関する統計分析も行う(例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787を参照のこと)。BLASTアルゴリズムによって得られる類似性の指標の一つは最小合計確率(P(N))であり、これは2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間での一致が偶然に起こる確率の指標となる。例えば、ある核酸は、被験核酸と参照核酸との比較による最小合計確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満の場合に、参照配列と類似していると見なされる。
【０２１６】
2つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという指標は、第1の核酸によってコードされるポリペプチドが、以下に記述されるように、第2の核酸によってコードされるポリペプチドに対して作製された抗体と免疫学的に交差反応することである。したがって、ポリペプチドは、典型的には、例えば2つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる第2のポリペプチドと実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、以下に記述されるように、2つの分子またはそれらの相補体がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。2つの核酸配列が実質的に同一であるというさらに別の指標は、同じプライマーを用いて配列を増幅できることである。
【０２１７】
抗体におけるアミノ酸残基は、所与の残基と抗体内の同じ必須の構造的位置を占める場合、所与の残基に「対応する」。例えば、比較抗体における選択された残基は、選択された残基が、当技術分野において適用可能な方法を用いて評価されたときにKabat位置番号97と同じ必須の空間的または構造的関係を占める場合、本明細書において提供される抗体における位置番号97 (本明細書において記述されるKabat付番システムによる)に対応する。例えば、本明細書において提供される抗体と最大の配列相同性を得るように比較抗体を整列させることができ、Kabat位置97と整列する、整列された比較抗体における位置を、それに対応するものと決定することができる。あるいは、上記のような一次配列アライメントの代わりに(またはそれに加えて)、三次元構造アライメントを用いることもでき、例えば、この場合には本明細書において提供される抗体と最大の対応関係が得られるように比較抗体の構造を整列させ、全体の構造を比較する。この場合、構造モデルにおいてKabat位置番号97と同じ必須位置を占めるアミノ酸は、対応すると言われうる。
【０２１８】
本明細書において用いられる場合、「エピトープタグ付けされた」という用語は、「タグポリペプチド」に融合された関心対象のポリペプチド(1つの非限定的な例として、CD112R)を含むキメラポリペプチドをいう。タグポリペプチドは、抗体を作製できるエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、それが融合されるポリペプチドの活性を妨害しないように十分に短い。タグポリペプチドはまた、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないように、かなり独特であることが好ましい。適当なタグポリペプチドは一般に、少なくとも6アミノ酸残基、通常、約8〜50アミノ酸残基(好ましくは、約10〜20アミノ酸残基)を有する。
【０２１９】
本明細書において用いられる場合、「イムノアドヘシン」という用語は、異種タンパク質の結合特異性(「接着」)と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを組み合わせた抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識部位および結合部位以外の(すなわち「異種」である)所望の結合特異性を有するアミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドヘシン部分は、典型的には、少なくとも受容体またはリガンドの結合部位を含む連続したアミノ酸配列である。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、IgG-1、IgG-2、IgG-3またはIgG-4サブタイプ、IgA (IgA-1およびIgA-2を含む)、IgE、IgD またはIgMのような、いずれかの免疫グロブリンから得られうる。
【０２２０】
「長期」投与とは、最初の治療効果(活性)を長期間維持するために、急性モードとは対照的に、連続モードでの薬剤の投与をいう。「間欠」投与は、中断することなく連続的に行われるのではなく、本質的に周期的である処置である。
【０２２１】
処置の目的で「哺乳動物」とは、ヒト、家畜および飼育動物、ならびに動物園の動物、スポーツ動物、またはペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む、哺乳動物として分類される任意の動物をいう。態様において、哺乳動物はヒトである。
【０２２２】
1つまたは複数のさらなる治療剤「と組み合わせて」投与することは、同時(simultaneous)(同時(concurrent))投与および任意の順での連続投与を含む。
【０２２３】
本明細書において用いられる「担体」には、利用される投与量および濃度でそれに曝露される細胞または哺乳動物に対して無毒性の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤が含まれる。多くの場合、生理学的に許容される担体は、pH緩衝水溶液である。生理学的に許容される担体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝液; アスコルビン酸を含む抗酸化物質; 低分子量(約10残基未満)のポリペプチド; 血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンのようなタンパク質; ポリビニルピロリドンのような親水性重合体; グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリジンのようなアミノ酸; 単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む他の炭水化物; EDTAのようなキレート剤; マンニトールもしくはソルビトールのような糖アルコール; ナトリウムのような塩形成対イオン; ならびに/またはTWEEN(商標)、ポリエチレングリコール(PEG)、およびPLURONICS(商標)のような非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０２２４】
本明細書における目的で「活性な」または「活性」は、そのポリペプチドの天然型または天然存在型の生物学的および/または免疫学的活性(前の例では、CD112R活性)を保持するポリペプチド(非限定的な例として、CD112R)の型をいい、ここで「生物学的」活性とは、天然または天然存在のポリペプチドが保有する抗原エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力以外の、天然または天然存在のポリペプチドによって引き起こされる生物学的機能(阻害性または刺激性のいずれか)をいい、「免疫学的」活性とは、天然または天然存在のポリペプチドが保有する抗原エピトープ(前の例では、CD112R抗原エピトープ)に対する抗体の産生を誘導する能力をいう。
【０２２５】
「アンタゴニスト」という用語は、最も広い意味で用いられ、本明細書において開示される天然ポリペプチドの生物学的活性を部分的にまたは完全に遮断する、阻害する、または中和する任意の分子を含む。同様に、「アゴニスト」という用語は、最も広い意味で用いられ、本明細書において開示される天然ポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を含む。適当なアゴニストまたはアンタゴニスト分子には、具体的には、アゴニストまたはアンタゴニスト抗体または抗体断片、天然ポリペプチド、ペプチドの断片またはアミノ酸配列変異体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、有機低分子などが含まれる。ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを同定するための方法は、ポリペプチドを候補アゴニストまたはアンタゴニスト分子と接触させ、ポリペプチドに通常付随する1つまたは複数の生物学的活性の検出可能な変化を測定することを含みうる。
【０２２６】
「CD112Rアンタゴニスト」および「CD112R活性またはCD112R発現のアンタゴニスト」という用語は互換的に用いられ、CD112Rをコードする核酸の転写もしくは翻訳を減少させることによって、またはCD112R活性を阻害もしくは遮断することによって、またはその両方によってCD112Rの正常機能を妨害する化合物または生物学的薬剤をいう。CD112Rアンタゴニストの例としては、CD112RのCD112結合断片、アンチセンスポリヌクレオチド、干渉RNA、触媒RNA、RNA-DNAキメラ、CD112R特異的アプタマー、抗CD112R抗体、抗CD112R抗体のCD112R結合断片、CD112R結合小分子、CD112R結合ペプチド、およびCD112Rに特異的に結合する他のポリペプチド(1つまたは複数のさらなるドメインに任意で融合されてもよい、1つまたは複数のCD112RリガンドのCD112R結合断片を含むが、これに限定されない)が挙げられるが、これらに限定されることはない。CD112Rアンタゴニストは、CD112Rの活性または発現を低減または阻害する。いくつかの例では、CD112Rアンタゴニストは、別のCD112R活性に影響を及ぼすことなく1つのCD112R活性に拮抗しうることが、当業者によって理解されるであろう。例えば、本明細書における特定の方法で用いるのに望ましいCD112Rアンタゴニストは、ポリオウイルス受容体(PVR)相互作用の1つに応答して、例えば他のCD112R相互作用のいずれにも影響を及ぼすことなく、またはわずかにしか影響を及ぼさずに、CD112R活性に拮抗するCD112Rアンタゴニストである。
【０２２７】
「標識」または「検出可能な部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的または他の物理的手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な標識には、32P、蛍光色素、電子密度の高い試薬、酵素(例えば、ELISAにおいて一般的に用いられる)、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、ならびに例えば標的ペプチドと特異的に反応するペプチドまたは抗体の中に放射性同位体を組み入れることにより、検出可能にすることができるタンパク質または他の実体が含まれる。例えば、Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diegoに記述されている方法を用いて、標識にペプチドまたは抗体をコンジュゲートするための当技術分野において公知の任意の適切な方法が利用されうる。標識は、それ自体で検出可能でありうる(例えば、放射性同位体標識もしくは蛍光標識)か、または酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒しうる。
【０２２８】
「標識されたタンパク質またはポリペプチド」は、標識されたタンパク質またはポリペプチドの存在が標識されたタンパク質またはポリペプチドに結合している標識の存在を検出することにより検出されうるように、リンカーもしくは化学結合を通じて共有結合的に、またはイオン性、ファンデルワールス、静電気的もしくは水素結合を通じて非共有結合的に標識に結合しているものである。あるいは、高親和性相互作用を用いる方法では同じ結果を達成することができ、この場合には結合パートナーの対のうちの一方が他方、例えば、ビオチン、ストレプトアビジンに結合する。
【０２２９】
「固相」とは、本開示の抗体が接着できる非水性マトリックスを意味する。本明細書において包含される固相の例としては、ガラス(例えば、制御された細孔ガラス)、多糖類(例えば、アガロース)、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコールおよびシリコーンで一部または全部が形成されたものが挙げられるが、これらに限定されることはない。態様において、文脈に応じ、固相はアッセイプレートのウェルを含むことができる; 他の態様において固相は精製カラム(例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム)である。
【０２３０】
「リポソーム」は、哺乳動物への薬物(本明細書において記述されるポリペプチドまたはそれに対する抗体のような)の送達に有用な、脂質、リン脂質および/または界面活性剤から構成される小胞である。リポソームの成分は、一般に、生物学的膜の脂質配置と同様に、二重層形成で配置される。
【０２３１】
「小分子」は、約500ダルトン未満の分子量を有すると本明細書において定義される。
【０２３２】
本明細書において提供される「siRNA」、「低分子干渉RNA」、「低分子RNA」または「RNAi」は、二本鎖RNAを形成する核酸をいい、この二本鎖RNAは、遺伝子または標的遺伝子と同じ細胞内で発現される場合に遺伝子または標的遺伝子の発現を低減または阻害する能力を有する。ハイブリダイズして二本鎖分子を形成する核酸の相補的部分は、典型的には、実質的または完全な同一性を有する。態様において、siRNAまたはRNAiは、標的遺伝子との実質的または完全な同一性を有し、二本鎖siRNAを形成する核酸をいう。態様において、siRNAは、相補的な細胞mRNAと相互作用し、それによって相補的mRNAの発現を妨げることによって遺伝子発現を阻害する。典型的には、核酸は少なくとも約15〜50ヌクレオチド長である(例えば、二本鎖siRNAの各相補的配列は長さが15〜50ヌクレオチドであり、二本鎖siRNAは長さが約15〜50塩基対である)。他の態様において、長さは20〜30塩基ヌクレオチド長、好ましくは約20〜25ヌクレオチド長または約24〜29ヌクレオチド長、例えば、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチド長である。siRNAの非限定的な例としては、リボザイム、RNAデコイ、ショートヘアピンRNA (shRNA)、マイクロRNA (miRNA)および核小体低分子RNA (snoRNA)が挙げられる。「組換え」という用語は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、もしくはベクターに関して用いられる場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが異種核酸もしくはタンパク質の導入または天然核酸もしくはタンパク質の改変によって修飾されていること、あるいは細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、細胞の天然の(非組換え)形態内には見出されない遺伝子を発現するか、またはさもなければ異常に発現される、過小発現される、もしくは全く発現されない天然遺伝子を発現する。トランスジェニック細胞および植物は、典型的には組換え方法の結果として、異種遺伝子またはコード配列を発現するものである。
【０２３３】
「外因性」という用語は、所与の細胞または生物の外部が起源である分子または物質(例えば、化合物、核酸またはタンパク質)をいう。例えば、本明細書において言及される「外因性プロモーター」は、それが発現される植物が起源ではないプロモーターである。逆に、「内因性」または「内因性プロモーター」という用語は、所与の細胞または生物に固有であるか、またはその中に起源を有する分子または物質をいう。
【０２３４】
「単離された」という用語は、核酸またはタンパク質に適用される場合、核酸またはタンパク質が、その自然状態で結び付いている他の細胞成分を本質的に含まないことを示す。それは、例えば、均質な状態であってもよく、乾燥または水溶液のいずれかであってもよい。純度および均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高性能液体クロマトグラフィーのような分析化学技法を用いて決定される。調製物中に存在する優勢な種であるタンパク質は、実質的に精製される。
【０２３５】
「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸重合体または2つもしくはそれ以上の相互作用アミノ酸重合体もしくは結合アミノ酸重合体のセットを示すために互換的に用いられる。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸重合体および天然に存在しないアミノ酸重合体にだけでなく、1つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工化学模倣体であるアミノ酸重合体にも適用される。
【０２３６】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様の仕方で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体をいう。天然アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるもの、ならびに後で修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸およびO-ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基に結合した炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムをいう。そのような類似体は、修飾されたR基(例えば、ノルロイシン)または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なるが、天然アミノ酸と同様に機能する構造を有する化学化合物をいう。「天然に存在しないアミノ酸」および「非天然アミノ酸」という用語は、天然には見出されないアミノ酸類似体、合成アミノ酸およびアミノ酸模倣体をいう。
【０２３７】
アミノ酸は、一般的に知られているその3文字の記号またはIUPAC-IUB生化学命名委員会によって推奨される1文字の記号のいずれかにより本明細書において言及されうる。同様に、ヌクレオチドは、一般に認められているその1文字記号によって言及されうる。
【０２３８】
「免疫関連疾患」という用語は、哺乳動物の免疫系の成分が、哺乳動物において病的状態を引き起こし、媒介し、またはそうでなければ病的状態に寄与する疾患を意味する。また、免疫応答の刺激または介入が疾患の進行に及ぼす改善効果を有する疾患も含まれる。この用語には、免疫媒介炎症性疾患、非免疫媒介炎症性疾患、感染性疾患、免疫不全疾患、腫瘍形成などが含まれる。
【０２３９】
「T細胞媒介疾患」という用語は、T細胞が哺乳動物において病的状態を直接的または間接的に媒介し、またはそうでなければ病的状態に寄与する免疫関連疾患を意味する。T細胞媒介疾患は、細胞媒介作用、リンホカイン媒介作用などに関連し、さらには、例えばT細胞によって分泌されるリンホカインによりB細胞が刺激される場合にはB細胞に関連する作用に関連しうる。
【０２４０】
本開示によって処置できる、一部のものは免疫媒介性またはT細胞媒介性である、免疫関連疾患および炎症性疾患の例としては、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症(強皮症)、突発性炎症性筋疾患(皮膚筋炎、筋炎)、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血(免疫汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症)、自己免疫性血小板減少症(特発性血小板減少性紫斑病、免疫介在性血小板減少症)、甲状腺炎(バセドウ病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎)、糖尿病、免疫介在性腎疾患(糸球体腎炎、慢性尿細管間質性腎炎)、中枢神経系および末梢神経系の脱髄疾患、例えば多発性硬化症、突発性脱髄性多発性神経障害またはギラン・バレー症候群、ならびに慢性炎症性脱髄性多発神経炎、肝胆道疾患、例えば感染性肝炎(A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、E型肝炎および他の非肝臓指向性ウイルス)、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、ならびに硬化性胆管炎、炎症性腸疾患(IBD) (潰瘍性結腸炎: クローン病)、グルテン過敏性腸疾患、ならびにウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑および接触皮膚炎を含む自己免疫または免疫媒介皮膚疾患、乾癬、アレルギー性疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症およびじんましん、肺の免疫疾患、例えば好酸性肺炎、特発性肺線維症および過敏性肺炎、移植片拒絶および移植片対宿主病を含む移植関連疾患が挙げられる。AIDS (HIV感染)、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、およびE型肝炎、ヘルペスなどのようなウイルス性疾患、細菌感染症、真菌感染症、原生動物感染症ならびに寄生虫感染症を含む感染性疾患はまた、免疫および/もしくは炎症性成分ならびに/または病因を有しうる。
【０２４１】
「対照」または「対照実験」は、その平凡な普通の意味にしたがって用いられ、実験の手順、試薬または変数の脱落を除いて平行実験と同様に実験の対象または試薬が処理される実験をいう。いくつかの例では、対照は、実験効果の評価における比較標準として用いられる。いくつかの態様において、対照は、本明細書(態様および実施例を含む)において記述される化合物の非存在下でのタンパク質の活性の測定である。
【０２４２】
「患者」、「対象」、「その必要がある患者」および「その必要がある対象」は、本明細書において互換的に用いられ、本明細書において提供される方法および組成物を用いた投与によって処置できる疾患または状態に罹患している、またはかかる傾向のある生物をいう。非限定的な例としては、ヒト、他の哺乳動物、ウシ、ラット、マウス、イヌ、サル、ヤギ、ヒツジ、ウシ、シカ、および他の非哺乳類動物が挙げられる。いくつかの態様において、患者はヒトである。インビトロで得られまたはインビトロで培養された生物学的実体の組織、細胞およびそれらの子孫も企図される。
【０２４３】
「疾患」または「状態」は、本明細書において提供される化合物または方法で処置することができる患者または対象の状態または健康状態をいう。場合によっては、「疾患」または「状態」は「がん」をいう。
【０２４４】
本明細書において用いられる場合、「がん」という用語は、白血病、がん腫および肉腫を含めて、哺乳動物に見出されるあらゆるタイプのがん、新生物、悪性腫瘍または良性腫瘍をいう。例示的ながんとしては、乳がん、卵巣がん、結腸がん、肝臓がん、腎臓がんおよび膵臓がんが挙げられる。さらなる例としては、白血病(例えば、急性骨髄性白血病(「AML」)または慢性骨髄性白血病(「CML」)）、脳のがん、肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、肉腫、および前立腺がん、子宮頸がん、胃がん、頭頸部がん、子宮がん、中皮腫、転移性骨がん、髄芽腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、悪性膵臓インスリノーマ(insulanoma)、悪性カルチノイド、膀胱がん、前悪性皮膚病変、精巣がん、リンパ腫、甲状腺がん、神経芽細胞腫、食道がん、尿生殖器がん、悪性高カルシウム血症、子宮内膜がん、副腎皮質がん、内分泌および外分泌膵臓の新生物が挙げられる。
【０２４５】
本明細書において用いられる場合、「T-ALL」または「T-ALLs」という用語は、T細胞の前駆細胞の悪性形質転換から生じる浸潤性の血液学的腫瘍であるT細胞性急性リンパ芽球性白血病をいう。T-ALLは小児症例の10%〜15%および成人ALL症例の25%を占める。臨床的に、T-ALL患者は、未熟T細胞リンパ芽球による骨髄のびまん性浸潤、高い白血球数、胸水を伴う縦隔腫瘤、および頻繁な中枢神経系浸潤を診断時に示す。
【０２４６】
本明細書において用いられる場合、「感染性疾患」という用語は、細菌、ウイルス、寄生虫または真菌のような、病原微生物によって引き起こされるあらゆるタイプの疾患をいう; この疾患は人から人に、直接的または間接的に、伝染しうる。人獣共通感染症は、ヒトに伝染すると疾患を引き起こしうる動物の感染性疾患である。疾患は、疾患を有する患者において健常対照におけるよりも頻繁に感染性病原体が見出される場合にその病原体と関連または関係しているといわれる。
【０２４７】
「有効量」という用語は、記載された特定の目的の達成をもたらすポリペプチドおよび/またはアゴニスト/アンタゴニストの濃度または量である。ポリペプチドまたはそのアゴニストもしくはアンタゴニストの「有効量」は、実験的に決定されうる。さらに、「治療的有効量」は、記載された治療効果を達成するのに有効なポリペプチドおよび/またはアゴニスト/アンタゴニストの濃度または量である。この量はまた、実験的に決定されうる。
【０２４８】
本明細書において用いられる場合、「炎症細胞」という用語は、単核細胞、好酸球、マクロファージ、および多形核好中球(PMN)のような炎症応答を増強する細胞を指す。
【０２４９】
本明細書において用いられる「表現型」および「表現型の」という用語は、疾患症状の発症もしくは進行、生化学的特性、または生理学的特性のような生物の観察可能な特徴をいう。
【０２５０】
本明細書において用いられる用語「処置する」、「処置すること」または「処置」および他の文法上の同義語は、疾患、状態もしくは症状を緩和すること、寛解すること、改善することもしくは予防すること、さらなる症状を予防すること、症状の根底にある代謝の原因を改善することもしくは予防すること、疾患もしくは状態を抑止すること、例えば、疾患もしくは状態の発現を停止させること、疾患もしくは状態を緩和すること、疾患もしくは状態の退行を引き起こすこと、疾患もしくは状態によって引き起こされる状態を緩和すること、または疾患もしくは状態の症状を阻止することを含み、予防を含むことが意図される。これらの用語は、治療的利益および/または予防的利益を達成することをさらに含む。治療的利益とは、処置される基礎障害の根絶または改善を意味する。また、患者が基礎障害にまだ罹患しているにもかかわらず、患者において改善が観察されるような、基礎障害に関連する生理学的症状の1つまたは複数の根絶または改善によって治療的利益が達成される。
【０２５１】
本明細書において用いられる用語「予防する」、「予防すること」または「予防」および他の文法上の同義語は、疾患または状態の症状を発現、発生させないようにすること、妨げることまたは回避すること、および症状の発生を減少させることを含む。予防は、処置なしで起こる可能性が高い症状よりも少ない症状が観察されるように、完全(すなわち、検出可能な症状なし)または部分的でありうる。これらの用語は、予防的利益をさらに含む。疾患または状態が予防されるために、組成物は、特定の疾患を発現するリスクのある患者に投与されうるか、またはこの疾患の診断がなされていなくても、疾患の生理学的症状の1つもしくは複数を訴えている患者に投与されうる。
【０２５２】
「阻害すること」という用語はまた、本開示の化合物または組成物の非存在下での状態と比べて作用(疾患状態または遺伝子/タンパク質/mRNAの発現レベル)を低減させることを意味する。
【０２５３】
本明細書において用いられる「調節する」、「調節すること」という用語は、ある程度まで調節することまたは調整することを意味する。
【０２５４】
本明細書において用いられる場合、「投与すること」という用語は、経口投与、坐剤としての投与、局所的接触、静脈内、非経口、腹腔内、筋肉内、病巣内、髄腔内、鼻腔内もしくは皮下投与、または徐放デバイス、例えばミニ浸透圧ポンプの対象への移植を意味する。投与は、非経口および経粘膜(例えば、頬側、舌下、口蓋、歯肉、鼻、膣、直腸または経皮)を含む、任意の経路によるものである。非経口投与は、例えば、静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内および頭蓋内を含む。他の送達様式は、リポソーム製剤、静脈内注入、経皮パッチなどの使用を含むが、これらに限定されることはない。
【０２５５】
本開示の薬剤は、活性治療剤、すなわち、および種々の他の薬学的に許容される成分を含む薬学的組成物として投与されることが多い。Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1980)を参照されたい。好ましい形態は、意図される投与様式および治療的適用に依る。組成物はまた、望まれる処方物に依って、動物またはヒト投与用の薬学的組成物を処方するために一般的に用いられる媒体として定義される、薬学的に許容される無毒の担体または希釈剤を含むことができる。希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響を与えないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理学的リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。さらに、薬学的組成物または処方物はまた、他の担体、アジュバント、または無毒性、非治療性、非免疫原性の安定剤などを含みうる。
【０２５６】
組成物は、治療的または予防的処置のために投与することができる。治療用途において、組成物は、「治療的に有効な用量」で疾患(例えば、百日咳)を患っている患者に投与される。この使用に有効な量は、疾患の重篤度および患者の全身健康状態に依る。組成物の単回投与または複数回投与は、患者によって必要とされかつ許容される投与量および頻度に依って投与されうる。本開示の目的のための「患者」または「対象」は、ヒトおよび他の動物、特に哺乳動物の両方を含む。したがって、本方法は、ヒト治療および獣医学的用途の両方に適用可能である。好ましい態様において、患者は哺乳動物、好ましくは霊長類であり、最も好ましい態様において、患者はヒトである。
【０２５７】
経口投与に適した処方物は、(a) 水、生理食塩水またはPEG 400のような、希釈剤に懸濁されたパッケージ核酸の有効量のような、液体溶液; (b) 液体、固体、顆粒またはゼラチンとして、所定量の活性成分を各々が含有するカプセル、サッシェ剤または錠剤; (c) 適切な液体中の懸濁液; および(d) 適当な乳濁液からなることができる。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ(com starch)、ポテトスターチ、微結晶性セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、増量剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、着香剤、染料、崩壊剤、ならびに薬学的に適合する担体の1つまたは複数を含むことができる。トローチ剤形態は、香味料中、例えばスクロース中の活性成分、ならびに活性成分に加えて、当技術分野において公知の担体を含有するゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシア乳濁液、ゲルなどのような、不活性基剤中に活性成分を含む芳香錠を含むことができる。
【０２５８】
薬学的組成物はまた、タンパク質、キトサンのような多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸および共重合体(ラテックス官能化sepharose(商標)、アガロース、セルロースなどのような)、重合体アミノ酸、アミノ酸共重合体、ならびに脂質凝集体(例えば、油滴またはリポソームのような)のような、大きくて、ゆっくり代謝される高分子を含むことができる。さらに、これらの担体は、免疫刺激剤(すなわち、アジュバント)として機能することができる。
【０２５９】
本明細書において用いられる場合、「デンドリマー」という用語は、その一般的な使用などで用いられる。デンドリマーは、中心コアから放射状に出現する複数の高度に分枝した単量体から構成されるナノメートル寸法の合成高分子である。それらの構造は、単分散および制御可能なサイズ、改変可能な表面、官能性、多価性、水溶性、ならびに薬物送達のために利用可能な内部腔のような、さまざまな利点を提供する。得られた球状高分子構造は、アルブミンおよびヘモグロビンに似たサイズを有するが、IgM抗体複合体のような多量体よりも小さい。デンドリマーの特徴的な構造およびその構造の改変の柔軟性は、標的指向薬物送達のための生体適合性デンドリマーの適用においてより大きな進歩を可能にした。これに関して、シスプラチンおよびドキソルビシンのような化学療法薬を送達するためのがん処置に向けた生体適合性デンドリマーの使用に関する研究がある。
【０２６０】
本明細書において提供される組成物は、単独でまたは他の適当な成分との組み合わせで、吸入により投与されるエアロゾル処方物にすることができる(すなわち、それらは「霧状にする」ことができる)。エアロゾル処方物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などのような、加圧された許容される噴霧剤の中に入れることができる。
【０２６１】
直腸投与に適した処方物は、例えば、坐剤基剤でパッケージされた核酸からなる坐剤を含む。適当な坐剤基剤は、天然または合成トリグリセリドまたはパラフィン炭化水素を含む。さらに、例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコールおよびパラフィン炭化水素を含む、基剤との選択の化合物の組み合わせからなるゼラチン直腸カプセルを用いることも可能である。
【０２６２】
例えば、関節内(関節中)、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮内、腹腔内、および皮下経路によるような、非経口投与に適した処方物は、抗酸化物質、緩衝液、静菌薬、および意図されたレシピエントの血液と処方物を等張にする溶質を含有しうる水性および非水性の等張滅菌注射溶液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含みうる水性および非水性の滅菌懸濁液を含む。本開示の実践において、組成物は、例えば、静脈内注入により、経口的に、局所的に、腹腔内に、膀胱内にまたは髄腔内に投与することができる。非経口投与、経口投与および静脈内投与は、好ましい投与方法である。化合物の処方物は、アンプルおよびバイアルのような、単位用量または複数用量の密封容器中で提示することができる。
【０２６３】
注射溶液および懸濁液は、前述の種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。エクスビボ治療のために核酸が形質導入された細胞は、上記のように静脈内にまたは非経口的に投与することもできる。
【０２６４】
薬学的調製物は、好ましくは、単位投与量形態にある。そのような形態において、調製物は、適切な量の活性成分を含有する単位用量に細分される。単位投与量形態は、パッケージされた調製物であってもよく、パッケージは、パッケージされた錠剤、カプセル、およびバイアルまたはアンプル中の粉末のような、別個の量の調製物を含有する。また、単位投与量形態は、カプセル、錠剤、カシェ剤もしくはトローチ剤自体であってもよく、またはパッケージされた形態のこれらのいずれかの適切な数のものであってもよい。組成物は、必要に応じて、他の適合する治療剤も含有することができる。
【０２６５】
併用投与は、別個の処方物または単一の薬学的処方物を用いた同時投与、およびいずれかの順での連続投与を企図し、好ましくは両方の(または全ての)活性剤がその生物学的活性を同時に発揮する期間がある。
【０２６６】
本明細書において提供される組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬物療法、および処置が予防的であるか治療的であるかを含む多くの異なる因子に依って変化する。しかしながら、当業者は、指針として百日咳を処置および予防するために承認された組成物の投与量を調べて適切なおよび/または等価な用量を直ちに認識するであろう。
【０２６７】
本明細書の記述および特許請求の範囲を通して、「含む(comprise)」という単語ならびに「含む(comprising)」および「含む(comprises)」のような、他の形態の単語は、例えば他の成分を、含むがそれに限定されるものではないことを意味し、排除するよう意図されるものではない。
【０２６８】
融合ポリペプチド
本開示は、CD112Rタンパク質と第2のタンパク質とを含む融合ポリペプチドを提供する。態様において、CD112Rは、CD112に結合することができ、かつSEQ ID NO: 1に対する少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドである。態様において、CD112Rは、CD112に結合することができ、かつSEQ ID NO: 1の少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドである。
2018529667.tif 000049
【０２６９】
態様において、CD112Rは、SEQ ID NO: 44のアミノ酸配列を含むCD112Rの細胞外ドメインの最小機能領域を含む。態様において、CD112Rは、CD112に結合することができ、かつSEQ ID NO: 44の少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドである。
2018529667.tif 000050
【０２７０】
態様において、CD112Rは、SEQ ID NO: 45のアミノ酸配列を含むCD112Rの細胞外ドメインを含む。態様において、CD112Rは、CD112に結合することができ、かつSEQ ID NO: 45の少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドである。
2018529667.tif 000051
【０２７１】
態様において、融合ポリペプチドは、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000052
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、融合ポリペプチドは、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000053
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、融合ポリペプチドは、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000054
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、融合ポリペプチドは、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000055
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、融合ポリペプチドは、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000056
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。
【０２７２】
態様において、第2のタンパク質は、抗体もしくはその断片、結合タンパク質もしくはその断片、または検出可能なタンパク質もしくはその断片である。態様において、抗体断片は抗体のFc領域である。態様において、結合タンパク質またはその断片は、それぞれCD112Rまたはその断片である。
【０２７３】
態様において、第2のタンパク質は、IgG1アイソタイプ、IgG2アイソタイプ、IgG3アイソタイプ、IgG4アイソタイプ、およびIgMアイソタイプからなる群より選択されるIgG免疫グロブリンのような、IgG免疫グロブリンのFc領域である。
【０２７４】
態様において、融合タンパク質は、SEQ ID NO: 46のアミノ酸配列
2018529667.tif 000057
を有するヒトIgG1 Fcポリペプチド配列を含む。
【０２７５】
態様において、融合タンパク質は、SEQ ID NO: 46のアミノ酸配列と少なくとも50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるヒトIgG1 Fcポリペプチド配列を含む。
【０２７６】
態様において、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列
2018529667.tif 000058
を有するヒトIgG2 Fcポリペプチド配列を含む。
【０２７７】
態様において、融合タンパク質は、SEQ ID NO: 47のアミノ酸配列と少なくとも50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるヒトIgG2 Fcポリペプチド配列を含む。
【０２７８】
態様において、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列
2018529667.tif 000059
を有するヒトIgG3 Fcポリペプチド配列を含む。
【０２７９】
態様において、融合タンパク質は、SEQ ID NO: 48のアミノ酸配列と少なくとも50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるヒトIgG3 Fcポリペプチド配列を含む。
【０２８０】
態様において、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列
2018529667.tif 000060
を有するヒトIgG4 Fcポリペプチド配列を含む。
【０２８１】
態様において、融合タンパク質は、SEQ ID NO: 49のアミノ酸配列と少なくとも50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるヒトIgG4 Fcポリペプチド配列を含む。
【０２８２】
態様において、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列
2018529667.tif 000061
を有するヒトIgM Fcポリペプチド配列を含む。
【０２８３】
態様において、融合タンパク質は、SEQ ID NO: 50のアミノ酸配列と少なくとも50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるヒトIgM Fcポリペプチド配列を含む。
【０２８４】
態様において、融合タンパク質は、リン酸化タンパク質、蛍光マーカーを有するタンパク質、放射性物質を有するタンパク質、グリコシル化タンパク質、ポリヒスチジン(ポリ(His))でタグ付けされたタンパク質、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、FLAGタグ付きタンパク質、AviTagを有するタンパク質、カルモジュリンタグを有するタンパク質、ポリグルタミン酸タグを有するタンパク質、Eタグを有するタンパク質、 HAタグを有するタンパク質、Mycタグを有するタンパク質、Sタグを有するタンパク質、SBPタグを有するタンパク質、Softtag 1を有するタンパク質、Softtag 3を有するタンパク質、Strepタグを有するタンパク質、TCタグを有するタンパク質、V5タグを有するタンパク質、VSVタグを有するタンパク質、Xpressタグを有するタンパク質、Isopeptagを有するタンパク質、SpyTagを有するタンパク質、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質(BCCP)タグを有するタンパク質、Haloタグを有するタンパク質、チオレドキシンタグを有するタンパク質、またはFcタグを有するタンパク質のような、検出可能なタンパク質を含む。
【０２８５】
複合体
本開示は、抗体、検出可能な部分、治療的部分、固体支持体、またはそれらの任意の組み合わせに結合したCD112Rタンパク質を含む複合体を提供する。態様において、固体支持体は、ビーズまたはナノ粒子である。態様において、複合体は、CD112Rと、SEQ ID NO: 3および/またはSEQ ID NO: 5の配列を含む抗体とを含む。態様において、CD112RならびにSEQ ID NO: 3および/またはSEQ ID NO: 5の抗体配列は、インビトロ複合体中に存在する。
【０２８６】
態様において、複合体は、CD112Rに結合した検出可能な部分を含む。態様において、検出可能な部分は、ポリヒスチジン(ポリ(His))、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、FLAGタグ、AviTag、カルモジュリンタグ、ポリグルタミン酸タグ、Eタグ、HAタグ、Mycタグ、Sタグ、SBPタグ、Softtag 1、Softtag 3、Strepタグ、TCタグ、V5タグ、VSVタグ、Xpressタグ、Isopeptag、SpyTag、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質(BCCP)タグ、Haloタグ、チオレドキシンタグ、もしくはFcタグ、高電子密度試薬、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、常磁性分子、常磁性ナノ粒子、造影剤、磁気共鳴造影剤、X線造影剤、ガドリニウム、放射性同位体、放射性核種、フルオロデオキシグルコース、γ線放出核種、陽電子放出核種、生体コロイド、マイクロバブル、ヨウ素化造影剤、硫酸バリウム、二酸化トリウム、金、金ナノ粒子、金ナノ粒子凝集体、フルオロフォア、二光子フルオロフォア、ハプテン、タンパク質、または蛍光部分である。
【０２８７】
態様において、複合体はCD112Rに結合した治療用部分を含む。態様において、治療剤は、抗がん剤、例えば、化学療法剤、成長阻害剤; 細胞傷害剤; 免疫原性剤; 免疫調節剤; T細胞活性を調節する薬剤; ケモカイン; アプタマー、低分子干渉RNA (siRNA); または短鎖活性化RNA (saRNA)でありうる。
【０２８８】
インビトロ複合体
本開示は、CD112タンパク質に結合したCD112Rタンパク質のインビトロ複合体を提供する。態様において、インビトロ複合体は、抗体、検出可能な部分、治療用部分、または固体支持体に結合したCD112Rタンパク質またはCD112タンパク質を含む。態様において、インビトロ複合体は、CD112Rに結合した固体支持体を含み、固体支持体は、例えば、ビーズまたはナノ粒子である。態様において、インビトロ複合体は、CD112Rと、SEQ ID NO: 3および/またはSEQ ID NO: 5の配列を含む抗体とを含む。
【０２８９】
態様において、インビトロ複合体は、CD112Rに結合した検出可能な部分を含む。態様において、検出可能な部分は、ポリヒスチジン(ポリ(His))、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、FLAGタグ、AviTag、カルモジュリンタグ、ポリグルタミン酸タグ、Eタグ、HAタグ、Mycタグ、Sタグ、SBPタグ、Softtag 1、Softtag 3、Strepタグ、TCタグ、V5タグ、VSVタグ、Xpressタグ、Isopeptag、SpyTag、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質(BCCP)タグ、Haloタグ、チオレドキシンタグ、もしくはFcタグ、高電子密度試薬、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、常磁性分子、常磁性ナノ粒子、造影剤、磁気共鳴造影剤、X線造影剤、ガドリニウム、放射性同位体、放射性核種、フルオロデオキシグルコース、γ線放出核種、陽電子放出核種、生体コロイド、マイクロバブル、ヨウ素化造影剤、硫酸バリウム、二酸化トリウム、金、金ナノ粒子、金ナノ粒子凝集体、フルオロフォア、二光子フルオロフォア、ハプテン、タンパク質、または蛍光部分である。
【０２９０】
態様において、インビトロ複合体はCD112Rに結合した治療用部分を含む。態様において、治療剤は、抗がん剤、例えば、化学療法剤、成長阻害剤; 細胞傷害剤; 免疫原性剤; 免疫調節剤; T細胞活性を調節する薬剤; ケモカイン; アプタマー、低分子干渉RNA (siRNA); または短鎖活性化RNA (saRNA)でありうる。
【０２９１】
抗体
本開示は、CD112Rタンパク質に特異的に結合する精製された抗体を提供する。
【０２９２】
態様において、精製された抗体は、SEQ ID NO: 1のタンパク質であるCD112Rに結合する。態様において、抗体は、CD112に結合することができかつSEQ ID NO: 1に対する少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドであるCD112Rに結合する。態様において、抗体は、CD112に結合することができかつSEQ ID NO: 1の少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドであるCD112Rに結合する。態様において、精製された抗体は、CD112に結合することができかつSEQ ID NO: 1の少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドであるCD112Rに結合する、ヒト化抗体である。
【０２９３】
態様において、抗体またはその抗原結合断片は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000062
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、抗体またはその抗原結合断片は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000063
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、抗体またはその抗原結合断片は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000064
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、抗体またはその抗原結合断片は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000065
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、抗体またはその抗原結合断片は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000066
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。
【０２９４】
態様において、CD112Rに結合する抗体は、SEQ ID NO: 6を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 7を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 8を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 9を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 10を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 11を含む軽鎖CDR3を有する。
【０２９５】
態様において、CD112Rに結合する抗体は、SEQ ID NO: 5を含む重鎖およびSEQ ID NO: 3を含む軽鎖を有する。この抗体は、本明細書において2H6 CD112Rモノクローナル抗体といわれる。
【０２９６】
2H6 CD112Rモノクローナル抗体のκ鎖のペプチド配列:
2018529667.tif 000067
【０２９７】
2H6 CD112Rモノクローナル抗体の重鎖のペプチド配列:
2018529667.tif 000068
【０２９８】
（表１Ａ）抗CD112Rモノクローナル抗体のCDR配列
2018529667.tif 000069
【０２９９】
態様において、CD112Rに結合する抗体は、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 37を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 38を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 39を含む軽鎖CDR3を有する。
【０３００】
態様において、CD112Rに結合する抗体は、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 33を含む軽鎖を有する。この抗体は、本明細書においてCD112Rモノクローナル抗体mAb 4-4といわれる。
【０３０１】
CD112Rモノクローナル抗体mAb 4-4の重鎖のペプチド配列:
2018529667.tif 000070
【０３０２】
CD112Rモノクローナル抗体mAb 4-4のκ鎖のペプチド配列:
2018529667.tif 000071
【０３０３】
（表１Ｂ）抗CD112Rモノクローナル抗体mAb 4-4のCDR配列
2018529667.tif 000072
【０３０４】
態様において、CD112Rに結合する抗体は、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 41を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 42を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 43を含む軽鎖CDR3を有する。
【０３０５】
態様において、CD112Rに結合する抗体は、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 40を含む軽鎖を有する。この抗体は、本明細書においてCD112Rモノクローナル抗体mAb 4-5といわれる。
【０３０６】
CD112Rモノクローナル抗体mAb 4-5の重鎖のペプチド配列:
2018529667.tif 000073
【０３０７】
CD112Rモノクローナル抗体mAb 4-5のκ鎖のペプチド配列:
2018529667.tif 000074
【０３０８】
（表１Ｃ）抗CD112Rモノクローナル抗体mAb 4-5のCDR配列
2018529667.tif 000075
【０３０９】
本開示の適当な抗体はまた、SEQ ID NO: 6を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 7を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 8を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 9を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 10を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 11を含む軽鎖CDR3を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【０３１０】
本開示の適当な抗体はまた、SEQ ID NO: 5を含む重鎖およびSEQ ID NO: 3を含む軽鎖を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【０３１１】
本開示の適当な抗体はまた、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 37を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 38を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 39を含む軽鎖CDR3を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【０３１２】
本開示の適当な抗体はまた、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 33を含む軽鎖を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【０３１３】
本開示の適当な抗体はまた、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 41を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 42を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 43を含む軽鎖CDR3を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【０３１４】
本開示の適当な抗体はまた、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 40を含む軽鎖を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【０３１５】
態様において、本開示の精製された抗体は、CD112Rのアゴニスト抗体である。態様において、本開示の精製された抗体は、CD112RとCD112との間の相互作用を遮断する。アゴニスト抗体は、抗原提示細胞(APC)を活性化し、T細胞応答を促進し、T細胞免疫の非存在下で免疫応答を調節する可能性のある細胞傷害性骨髄細胞を育成しうる。
【０３１６】
態様において、抗体またはその抗原結合断片は、CD112Rの機能的活性を調節し、遮断し、阻害し、低減し、CD112Rの機能的活性に拮抗し、CD112Rの機能的活性を中和しまたはそうでなければ妨害する。これらの抗体またはその抗原結合断片は、本明細書において「中和抗CD112R抗体」または「遮断抗CD112R抗体」といわれる。CD112Rの機能的活性には、非限定的な例として、CD112との相互作用が含まれる。例えば、抗CD112R抗体は、部分的にまたは完全にCD112へのCD112Rの結合を調節し、遮断し、阻害し、低減し、CD112へのCD112Rの結合に拮抗し、CD112へのCD112Rの結合を中和し、またはそうでなければ妨害することによりCD112R活性を完全にまたは部分的に阻害する。抗CD112R抗体は、抗CD112R抗体の存在下でのCD112R機能的活性のレベルが本明細書において記述される抗CD112R抗体との結合の非存在下でのCD112R機能的活性のレベルと比較して少なくとも95%、例えば、96%、97%、98%、99%または100%低下する場合に完全に、CD112R機能的活性を調節し、遮断し、阻害し、低減し、CD112R機能的活性に拮抗し、CD112R機能的活性を中和し、またはそうでなければ妨害するものと考えられる。抗CD112R抗体は、抗CD112R抗体の存在下でのCD112R機能的活性のレベルが本明細書において記述される抗CD112R抗体との結合の非存在下でのCD112R活性のレベルと比較して95%未満、例えば、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、85%または90%低下する場合に部分的に、CD112R機能的活性を調節し、遮断し、阻害し、低減し、CD112R機能的活性に拮抗し、CD112R機能的活性を中和し、またはそうでなければ妨害するものと考えられる。
【０３１７】
態様において、中和抗CD112R抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO: 6を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 7を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 8を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 9を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 10を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 11を含む軽鎖CDR3を含む。
【０３１８】
態様において、中和抗CD112R抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO: 5を含む重鎖およびSEQ ID NO: 3を含む軽鎖を含む。
【０３１９】
態様において、中和抗CD112R抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO: 6を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 7を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 8を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 9を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 10を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 11を含む軽鎖CDR3を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【０３２０】
態様において、中和抗CD112R抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO: 5を含む重鎖およびSEQ ID NO: 3を含む軽鎖を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【０３２１】
一本鎖抗体
本開示は、CD112Rタンパク質に特異的に結合する精製された一本鎖抗体を提供する。
【０３２２】
態様において、本明細書において「抗CD112R一本鎖抗体」といわれるCD112Rの結合に特異的な一本鎖抗体は、Fcポリペプチドに融合される。態様において、Fcポリペプチドは、IgG1アイソタイプ、IgG2アイソタイプ、IgG3アイソタイプ、IgG4アイソタイプ、およびIgMアイソタイプからなる群より選択されるIgG免疫グロブリンのような、IgG免疫グロブリンのFc領域である。態様において、Fcポリペプチドは、SEQ ID NO: 46〜50からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【０３２３】
態様において、抗CD112R一本鎖抗体は、Fcポリペプチドのカルボキシ末端に融合される。態様において、抗CD112R一本鎖抗体は、Fcポリペプチドのアミノ末端に融合される。融合物は、単一の遺伝子構築物として構築され、培養細胞中で発現される。
【０３２４】
態様において、抗CD112R一本鎖抗体は、CD112に結合することができかつSEQ ID NO: 1に対する少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドであるCD112Rに結合する。態様において、抗CD112R一本鎖抗体は、CD112に結合することができかつSEQ ID NO: 1の少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドであるCD112Rに結合する。態様において、抗CD112R一本鎖抗体は、CD112に結合することができかつSEQ ID NO: 1の少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドであるCD112Rに結合する。
【０３２５】
態様において、一本鎖抗体は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000076
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、一本鎖抗体は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000077
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、一本鎖抗体は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000078
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、一本鎖抗体は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000079
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、一本鎖抗体は、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000080
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。
【０３２６】
態様において、CD112Rに結合する抗CD112R一本鎖抗体は、SEQ ID NO: 6を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 7を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 8を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 9を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 10を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 11を含む軽鎖CDR3を有する。
【０３２７】
態様において、CD112Rに結合する抗CD112R一本鎖抗体は、SEQ ID NO: 5を含む重鎖およびSEQ ID NO: 3を含む軽鎖を有する。
【０３２８】
態様において、CD112Rに結合する抗CD112R一本鎖抗体は、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 37を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 38を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 39を含む軽鎖CDR3を有する。
【０３２９】
態様において、CD112Rに結合する抗CD112R一本鎖抗体は、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 33を含む軽鎖を有する。
【０３３０】
態様において、CD112Rに結合する抗CD112R一本鎖抗体は、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 41を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 42を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 43を含む軽鎖CDR3を有する。
【０３３１】
態様において、CD112Rに結合する抗CD112R一本鎖抗体は、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 40を含む軽鎖を有する。
【０３３２】
態様において、抗CD112R一本鎖抗体は、SEQ ID NO: 6を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 7を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 8を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 9を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 10を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 11を含む軽鎖CDR3を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片である。
【０３３３】
態様において、抗CD112R一本鎖抗体は、SEQ ID NO: 5を含む重鎖およびSEQ ID NO: 3を含む軽鎖を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片である。
【０３３４】
態様において、抗CD112R一本鎖抗体は、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 37を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 38を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 39を含む軽鎖CDR3を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片である。
【０３３５】
態様において、抗CD112R一本鎖抗体は、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 33を含む軽鎖を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片である。
【０３３６】
態様において、抗CD112R一本鎖抗体は、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 41を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 42を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 43を含む軽鎖CDR3を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片である。
【０３３７】
態様において、抗CD112R一本鎖抗体は、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 40を含む軽鎖を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片である。
【０３３８】
抗CD112R一本鎖抗体またはその抗原結合断片は、治療適応症において有用である。態様において、抗CD112R一本鎖抗体またはその抗原結合断片は、その必要がある対象において抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を引き起こすのに十分なレベルで投与される。例えば、抗CD112R一本鎖抗体またはその抗原結合断片は、がんに罹患しているか、またはがんを発症する危険性がある対象において、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を引き起こすために用いられる。
【０３３９】
キメラ抗原受容体(CAR)構築物
本開示は、本明細書においてCAR構築物の抗CD112R結合ドメインといわれる、CD112Rタンパク質に特異的に結合するドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)構築物を提供する。
【０３４０】
キメラT細胞受容体、キメラ免疫受容体および/またはキメラ抗原受容体(CAR)としても知られている人工T細胞受容体は、免疫エフェクター細胞に任意の特異性を移植する改変受容体である。典型的には、これらの受容体は、T細胞にモノクローナル抗体の特異性を、レトロウイルスベクターによって容易にされるそのコード配列の移入によって移植するために用いられる。本明細書において提示される態様において、CAR構築物は、T細胞に抗CD112結合ドメインを移植するために用いられる。
【０３４１】
人工T細胞受容体は、養子細胞移入と呼ばれる技法を用い、がんの治療として研究中である。(例えば、Pule, M; Finney H; Lawson A (2003). 「Artificial T-cell receptors」. Cytotherapy 5 (3): 211-26を参照のこと)。簡潔には、T細胞を患者から取り出し、それらが患者の特定のがんに特異的な受容体を発現するように改変する。がん細胞を認識し殺傷しうるT細胞が、患者に再導入される。
【０３４２】
態様において、本明細書において提供されるCAR構築物は、CD3-ζ膜貫通およびエンドドメインに融合された、抗CD112R一本鎖抗体、例えば、本開示の抗CD112モノクローナル抗体に由来する抗CD112R一本鎖可変断片(scFv)の融合物である。
【０３４３】
態様において、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変部分は、可動性リンカーにより融合されてscFvを形成する。このscFvの前に、新生タンパク質を小胞体およびその後の表面発現(切断)に向けるシグナルペプチドがある。可動性スペーサーはscFvを種々の方向に配向させて、抗原結合を可能にする。膜貫通ドメインは、細胞内に突出し、所望のシグナルを伝達するシグナル伝達エンドドメインの元の分子に由来する典型的な疎水性αヘリックスである。
【０３４４】
タイプIタンパク質は、実際、膜貫通αへリックスによって連結された2つのタンパク質ドメインである。膜貫通ドメインが通過する細胞膜脂質二重層は、内側部分(エンドドメイン)を外側ドメイン(エクトドメイン)から隔離する。1つのタンパク質由来のエクトドメインをもう1つのタンパク質のエンドドメインに付着させることにより、前者の認識を後者のシグナルと組み合わせた分子が作出される。
【０３４５】
ScFv/CD3-ζハイブリッドは、scFvによるCD112Rの認識に応答してζシグナルの伝達をもたらす。T細胞が、例えば、オンコレトロウイルスベクター形質導入の使用により、この分子を発現する場合、T細胞は、CD112Rを発現する標的細胞を認識し殺傷する。
【０３４６】
本明細書において提供されるCAR構築物は、シグナルペプチド、scFvを含む抗体認識領域、および抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに連結するスペーサー領域からなる、エクトドメインを含む。
【０３４７】
シグナルペプチドは新生タンパク質を小胞体に向ける。任意の真核生物シグナルペプチド配列を、本明細書において提供されるCAR構築物において用いることができる。態様において、アミノ末端成分に自然に付着されているシグナルペプチドは、例えば、軽鎖 - リンカー - 重鎖の方向でscFvにおいて用いられ、軽鎖の天然シグナルが用いられる。
【０３４８】
態様において、抗原認識領域は抗CD112R結合ドメインである。態様において、抗CD112R結合ドメインはscFvである。態様において、CAR構築物の抗CD112R scFvは、CD112に結合することができかつSEQ ID NO: 1に対する少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドであるCD112Rに結合する。態様において、CAR構築物の抗CD112R scFvは、CD112に結合することができかつSEQ ID NO: 1の少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドであるCD112Rに結合する。態様において、抗CD112R一本鎖抗体は、CD112に結合することができかつSEQ ID NO: 1の少なくとも10アミノ酸の連続配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリペプチドであるCD112Rに結合する。
【０３４９】
態様において、CAR構築物の抗CD112R scFvは、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000081
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、CAR構築物の抗CD112R scFvは、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000082
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、CAR構築物の抗CD112R scFvは、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000083
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、CAR構築物の抗CD112R scFvは、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000084
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。態様において、CAR構築物の抗CD112R scFvは、少なくともアミノ酸配列
2018529667.tif 000085
を含むヒトCD112R上のエピトープに結合する。
【０３５０】
態様において、CD112Rに結合するCAR構築物の抗CD112R scFvは、SEQ ID NO: 6を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 7を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 8を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 9を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 10を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 11を含む軽鎖CDR3を有する。
【０３５１】
態様において、CD112Rに結合するCAR構築物の抗CD112R scFvは、SEQ ID NO: 5を含む重鎖およびSEQ ID NO: 3を含む軽鎖を有する。
【０３５２】
態様において、CD112Rに結合する抗CD112R一本鎖抗体は、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 37を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 38を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 39を含む軽鎖CDR3を有する。
【０３５３】
態様において、CD112Rに結合するCAR構築物の抗CD112R scFvは、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 33を含む軽鎖を有する。
【０３５４】
態様において、CD112Rに結合するCAR構築物の抗CD112R scFvは、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 41を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 42を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 43を含む軽鎖CDR3を有する。
【０３５５】
態様において、CD112Rに結合するCAR構築物の抗CD112R scFvは、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 40を含む軽鎖を有する。
【０３５６】
態様において、CAR構築物の抗CD112R scFvは、SEQ ID NO: 6を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 7を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 8を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 9を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 10を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 11を含む軽鎖CDR3を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片である。
【０３５７】
態様において、CAR構築物の抗CD112R scFvは、SEQ ID NO: 5を含む重鎖およびSEQ ID NO: 3を含む軽鎖を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片である。
【０３５８】
態様において、CAR構築物の抗CD112R scFvは、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 37を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 38を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 39を含む軽鎖CDR3を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片である。
【０３５９】
態様において、CAR構築物の抗CD112R scFvは、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 33を含む軽鎖を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片である。
【０３６０】
態様において、CAR構築物の抗CD112R scFvは、SEQ ID NO: 34を含む重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35を含む重鎖CDR2、SEQ ID NO: 36を含む重鎖CDR3、SEQ ID NO: 41を含む軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 42を含む軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO: 43を含む軽鎖CDR3を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片である。
【０３６１】
態様において、CAR構築物の抗CD112R scFvは、SEQ ID NO: 32を含む重鎖およびSEQ ID NO: 40を含む軽鎖を含む抗CD112R抗体とヒトCD112Rへの結合について交差競合する抗体またはその抗原結合断片である。
【０３６２】
態様において、スペーサー領域は、抗CD112R結合ドメインを種々の方向に配向させて、抗原認識を容易にするのに十分なほど可動性である。態様において、スペーサーは、IgG1由来のヒンジ領域である。態様において、スペーサーは、免疫グロブリンのCH2CH3領域およびCD3の部分を含む。
【０３６３】
膜貫通ドメインは、膜にまたがる疎水性αヘリックスである。態様において、エンドドメインの最も膜近位の成分からの膜貫通ドメインが用いられる。
【０３６４】
エンドドメインは、CAR構築物の機能的末端である。CD112R認識の後、受容体がクラスタ化し、シグナルが細胞に伝達される。態様において、エンドドメイン成分は、CD112Rが結合した後に活性化シグナルをT細胞に伝達する免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ITAM)を含むCD3-ζである。態様において、十分にコンピテントな活性化シグナルを提供するために共刺激シグナル伝達が用いられる。態様において、キメラCD28およびOX40をCD3-ζとともに用いて、増殖/生存シグナルを伝達することができる。態様において、CD28、OX40、およびCD3-ζが一緒に用いられる。
【０３６５】
態様において、CAR構築物は、N末端からC末端への以下の構造配置を有する: 抗CD112R結合ドメイン + ヒンジ + 膜貫通領域(TM) + エンドドメイン。態様において、CAR構築物は、N末端からC末端への以下の構造配置を有する: 抗CD112R結合ドメイン + ヒンジ領域 + TM + 共刺激ドメイン + CD3-ζドメイン。態様において、CAR構築物は、N末端からC末端への以下の構造配置を有する: 抗CD112R結合ドメイン + CD8aヒンジ領域 + TM + CD28a (アミノ酸180〜219)共刺激 + CD3-ζドメイン。態様において、CAR構築物は、N末端からC末端への以下の構造配置を有する: (VH-リンカー-VL) - CD8aヒンジ + TM + CD28 (180〜219aa)共刺激ドメイン + CD3-ζ(細胞質内ドメイン)。態様において、CAR構築物は、図15に示される構造配置を有する。
【０３６６】
態様において、CAR構築物は、SEQ ID NO: 51の配列を含む:
2018529667.tif 000086
【０３６７】
CAR構築物は、NHLおよびT-ALLを含むCD112R発現腫瘍および悪性腫瘍を標的とするのに有用である。態様において、CAR構築物は、ヒトT細胞に形質導入し、形質導入されたヒトT細胞の抗腫瘍効果をNHLおよびT-ALLに向けるのに有用である。
【０３６８】
核酸、ポリペプチド
CD112Rに結合することができるヒト化抗体をコードする単離された核酸が提供される。抗体は、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖を含む。単離された核酸によってコードされるヒト化抗体は、本出願(上記のおよび実施例の項の記述を含む)を通じて詳細に記述される。したがって、単離された核酸によってコードされるヒト化抗体には、本明細書において記述される態様の全てが含まれる。例えば、核酸は、少なくとも1つのCDR; 相同体もしくは保存された変異を含むエピトープの結合に関与する残基、およびその態様; または相同体もしくは保存された変異を含む結合フレームワーク残基、およびその態様をコードしうる。
【０３６９】
2H6 CD112Rモノクローナル抗体のκ鎖のヌクレオチド配列:
2018529667.tif 000087
【０３７０】
2H6 CD112Rモノクローナル抗体のκ鎖のペプチド配列:
2018529667.tif 000088
【０３７１】
2H6 CD112Rモノクローナル抗体の重鎖のヌクレオチド配列:
2018529667.tif 000089
【０３７２】
2H6 CD112Rモノクローナル抗体の重鎖のペプチド配列:
2018529667.tif 000090
【０３７３】
ヒト化抗体
ヒト化抗体は、マウス抗体(ラット、ハムスターまたは他の非ヒト種であることもできる「ドナー抗体」)由来の少なくとも1つのCDR (またはその機能的断片)がヒト抗体(「アクセプター抗体」)に移植されている遺伝子操作された抗体である。態様において、2つ以上のマウスCDRが移植される(例えば、6つ全てのマウスCDRが移植される)。アクセプター抗体の配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列(もしくはその断片)、ヒト抗体配列のコンセンサス配列(もしくはその断片)、または生殖系列領域配列(もしくはその断片)であることができる。したがって、ヒト化抗体は、ドナー抗体由来の1つまたは複数のCDRおよび可変領域フレームワーク(FR)を有する抗体でありうる。FRは、ヒト抗体内の定常領域の一部を形成しうる。さらに、高い結合親和性を保持するために、ヒトアクセプター配列中のアミノ酸は、例えば: (1) アミノ酸がCDR内にある; (2) アミノ酸がヒトフレームワーク領域にある(例えば、アミノ酸がCDRの1つのすぐ近くにある)場合に、ドナー配列由来の対応するアミノ酸によって置き換えられうる。参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,530,101号および同第5,585,089号を参照されたく、これはヒト化抗体の構築のための詳細な説明を提供している。ヒト化抗体は、多くの場合、マウス抗体由来の6つ全てのCDR (例えば、Kabatによって定義される通り、しかし多くの場合、Chothiaによって定義される超可変ループH1も含む)を組み入れるが、それらを、より少ないマウスCDRおよび/または完全未満のマウスCDR配列(例えば、CDRの機能的断片)で作出することもできる(例えば、Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999; Tamura et al, Journal of Immunology, 164:1432-1441, 2000)。
【０３７４】
したがって、態様において、ドナーCDRの一部、すなわちSDRと呼ばれる結合に必要なCDR残基のサブセットのみをヒト化抗体に組み入れることが必要でありうる。抗原に接触せず、SDRには存在しないドナーCDR残基は、分子モデリングによりおよび/もしくは経験的に、またはGonzales et al., Mol. Immunol. 41: 863, 2004に記述されているように、Chothia超可変ループ外に存在するKabat CDRの領域から(Chothia, J. Mol. Biol. 196:901, 1987)、以前の研究に基づき同定することができる(例えばマウスCDR H2中の残基H60〜H65 (Kabat付番システム)は必要とされないことが多い)。そのようなヒト化抗体において、1つまたは複数のドナーCDR残基が存在しない位置で、その位置を占めるアミノ酸は、アクセプター抗体配列での(Kabat付番による)対応する位置を占めるアミノ酸であることができる。ドナーCDR中のドナーアミノ酸に対するアクセプターアミノ酸のそのような置換の数は、矛盾する考慮事項のバランスを反映しうる。
【０３７５】
典型的には、本明細書において提供されるヒト化抗体は、(i) マウス抗体由来の少なくとも1つのCDR (多くの場合3つのCDR) (本明細書においてマウスCDRといわれることもある)およびヒト可変領域フレームワークを含む軽鎖; ならびに(ii) マウス抗体由来の少なくとも1つのCDR (多くの場合3つのCDR)およびヒト可変領域フレームワーク(FR)を含む重鎖を含みうる。軽鎖および重鎖可変領域フレームワーク(FR)はそれぞれ、成熟ヒト抗体可変領域フレームワーク配列(もしくはその断片)、生殖系列可変領域フレームワーク配列(J領域配列と組み合わせたもの) (もしくはその断片)、またはヒト抗体可変領域フレームワーク配列のコンセンサス配列(もしくはその断片)でありうる。態様において、ヒト化抗体は、軽鎖ヒト定常領域および重鎖定常領域とともに、(i)に記述されている軽鎖、(ii)に記述されている重鎖を含む。
【０３７６】
キメラ抗体は、マウス(または他のげっ歯類)抗体の可変領域がヒト抗体の定常領域と組み合わされた抗体であり; 遺伝子工学によるそれらの構築は周知である。そのような抗体は、ヒトのものが約3分の2であるが、マウス抗体の結合特異性を保持する。マウス抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体に存在する非ヒト配列の比率は、キメラ抗体の免疫原性がマウス抗体とヒト化抗体の中間であることを示唆している。マウス抗体と比べて低減された免疫原性を有しうる他のタイプの遺伝子改変抗体には、ファージディスプレイ法を用いて(Dower et al., W091/17271; McCafferty et al., W092/001047; Winter, W092/20791; およびWinter, FEBS Lett. 23:92, 1998, これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる)またはトランスジェニック動物を用いて(Lonberg et al., W093/12227; Kucherlapati W091/10741, これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる)作製されたヒト抗体が含まれる。
【０３７７】
ヒト化抗体をデザインするための他のアプローチを用いて、上記の米国特許第5,530,101号および同第5,585,089号における方法、例えば「超ヒト化」(Tan et al. J. Immunol. 169: 1119, 2002、および米国特許第6,881,557号)またはStudnicak et al., Protein Eng. 7:805, 1994の方法と同じ結果を達成することもできる。さらに、遺伝子操作された、免疫原性の低減したmAbを産生するための他のアプローチには、例えば、Vaswami et al., Annals of Allergy, Asthma and Immunology 81:105, 1998; Roguska et al. Protein Eng. 9:895, 1996; ならびに米国特許第6,072,035号および同第5,639,641号に記述されている、「再形成(reshaping)」、「超キメラ化(hyperchimerization)」およびベニヤリング(veneering)/表面再構成(resurfacing)が含まれる。
【０３７８】
1つの局面において、CD112Rに結合することができるヒト化抗体が提供される。ヒト化抗体は、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖を含む。上記のように、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域は、相補性決定領域(CDR)を含む。CDRは、抗原結合に直接関与する抗体内の領域と定義される。アミノ末端から進んで、これらの領域は、重鎖についてはCDR H1、CDR H2およびCDR H3、ならびに軽鎖についてはCDR L1、CDR L2およびCDR L3とそれぞれ指定される。CDRは、より保存されたフレームワーク領域(FR)によって適所に保持される。アミノ末端から進んで、これらの領域は、重鎖についてはFR H1、FR H2、FR H3、およびFR H4、ならびに軽鎖についてはFR L1、FR L2、FR L3、およびFR L4とそれぞれ指定される。ヒト化抗体の場合、CDRの1つまたは複数は、ドナー抗体(本明細書においてドナーCDR、例えばマウスCDRともいわれる)由来であるが、FRはヒト由来である。CDR領域およびFR領域の位置ならびに付番システムは、例えば、Kabatら(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991))によって定義されている。
【０３７９】
本明細書において提供されるヒト化抗体は、少なくとも1つのマウスCDRまたはその機能的断片を含む。CDRの機能的断片は、抗原に結合することができうる完全なCDRアミノ酸配列の一部分である。したがって、CDRの機能的断片は、典型的には、抗原へのCDR結合に必要とされるアミノ酸残基を含む。「マウスCDR」は、CD112Rまたはその断片に結合することができうるマウス抗体に由来する完全CDRアミノ酸配列またはその機能的断片である。したがって、マウスCDRの機能的断片は、典型的には、CD112Rまたはその断片へのCDR結合に必要なアミノ酸残基を含む。ヒト化抗体が少なくとも1つのマウスCDRを含む場合、少なくとも1つのマウスCDRまたはその機能的断片は、ドナー抗体に由来する。当業者は、少なくとも1つのマウスCDRを含むヒト化抗体が、ドナー抗体に由来する少なくとも1つのマウスCDRおよびアクセプター抗体に由来するさらなるCDRを有するヒト化抗体であることを直ちに認識するであろう(例えば、軽鎖が計3つのCDRを含み、かつ重鎖が計3つのCDRを含む場合)。
【０３８０】
態様において、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖は、組み合わされた1つのマウスCDRまたはマウスCDRの機能的断片を含みうる。したがって、態様において、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖は、6つのCDRのうちの少なくとも1つがマウスCDRである組み合わされた6つのCDRを含む。ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖が、組み合わされた1つのマウスCDRを含む場合、ヒト化重鎖またはヒト化軽鎖は1つのマウスCDRを含む。例えば、ヒト化抗体は、ドナー抗体に由来するCDR H3 (例えば、マウスのもの、本明細書においてマウスCDR H3ともいわれる)ならびにアクセプター抗体に由来するCDR H1、CDR H2、CDR L1、CDR L2およびCDR L3 (すなわち、ヒトのもの)を含みうる。
【０３８１】
態様において、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖は、組み合わされた2つのマウスCDRを含みうる。ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖が、組み合わされた2つのマウスCDRを含む場合、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖が各々、1つのマウスCDRを含む(i)か、ヒト化重鎖が2つのマウスCDRを含む(ii)か、またはヒト化軽鎖が2つのマウスCDRを含む(iii)。例えば、ヒト化抗体は、マウスCDRのような、ドナー抗体に由来するCDR H3およびCDR L3 (本明細書においてそれぞれマウスCDR H3、マウスCDR L3およびマウスCDR H2ともいわれる)ならびにアクセプター抗体に由来するCDR H1、CDR H2、CDR L1、およびCDR L2 (すなわち、ヒトのもの)を含みうる。
【０３８２】
態様において、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖は、組み合わされた3つのマウスCDRを含みうる。ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖が、組み合わされた3つのマウスCDRを含む場合、ヒト化重鎖が1つのマウスCDRを含み得、かつヒト化軽鎖が2つのマウスCDRを含み得る(i)か、ヒト化重鎖が2つのマウスCDRを含み、かつヒト化軽鎖が1つのマウスCDRを含む(ii)か、ヒト化重鎖が3つのマウスCDRを含む(iii)か、またはヒト化軽鎖が3つのマウスCDRを含む(vi)。例えば、ヒト化抗体は、ドナー抗体に由来するCDR H3、CDR L3およびCDR H2 (例えば、マウスのもの、本明細書においてそれぞれCDR H3、マウスCDR L3およびマウスCDR H2ともいわれる)ならびにアクセプター抗体に由来するCDR H1、CDR L1、およびCDR L2 (すなわち、ヒトのもの)を含みうる。
【０３８３】
態様において、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖は、組み合わされた4つのマウスCDRを含みうる。ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖が、組み合わされた4つのマウスCDRを含む場合、ヒト化重鎖が1つのマウスCDRを含み、かつヒト化軽鎖が3つのマウスCDRを含む(i)か、ヒト化重鎖が3つのマウスCDRを含み、かつヒト化軽鎖が1つのマウスCDRを含む(ii)か、またはヒト化重鎖が2つのマウスCDRを含み、かつヒト化軽鎖が2つのマウスCDRを含む(iii)。例えば、ヒト化抗体は、ドナー抗体に由来するCDR H3、CDR L3、CDR H2およびCDR H1 (例えば、マウスのもの、本明細書においてそれぞれマウスCDR H3、マウスCDR L3、マウスCDR H2およびマウスCDR H1ともいわれる)ならびにアクセプター抗体に由来するCDR L1およびCDR L2 (すなわち、ヒトのもの)を含みうる。
【０３８４】
態様において、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖は各々、少なくとも1つのマウスCDRを含みうる。ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖が各々、少なくとも1つのマウスCDRを含む場合、ヒト化重鎖は少なくとも1つのマウスCDRを含み、かつヒト化軽鎖は少なくとも1つのマウスCDRを含む。したがって、態様において、ヒト化重鎖はマウスCDR H1を含み、かつヒト化軽鎖はマウスCDR L1を含む。
【０３８５】
態様において、マウスCDR H3およびマウスCDR L3の存在は、CD112Rへのヒト化抗体の結合に十分でありうる。したがって、態様において、ヒト化抗体は、マウスCDR H1、マウスCDR H2、CDR L1またはマウスCDR L2を含まなくてもよい。ヒト化抗体がマウスCDR H1、マウスCDR H2、マウスCDR L1またはマウスCDR L2を含まない場合、ヒト化抗体は、アクセプター抗体に由来するCDR H1、CDR H2、CDR L1またはCDR L2 (すなわち、ヒトのもの)を含む。したがって、マウスCDR H1、マウスCDR H2、マウスCDR L1またはマウスCDR L2を含まないヒト化抗体は、ドナー抗体由来のCDR H1、CDR H2、CDR L1またはCDR L2 (例えば、マウス、ラット、ウサギのもの)を含まないが、しかしアクセプター抗体由来のCDR H1、CDR H2、CDR L1またはCDR L2 (すなわち、ヒトのもの)を含む。したがって、態様において、ヒト化重鎖はマウスCDR H1またはマウスCDR H2を含まなくてもよく、ヒト化軽鎖はマウスCDR L1またはマウスCDR L2を含まない。態様において、ヒト化重鎖はマウスCDR H1およびマウスCDR H2を含まなくてもよく、ヒト化軽鎖はマウスCDR L1およびマウスCDR L2を含まない。
【０３８６】
態様において、ヒト化重鎖はマウスCDR H2およびマウスCDR H3を含むことができ、ヒト化軽鎖はマウスCDR L2およびマウスCDR L3を含むことができる。態様において、ヒト化重鎖はマウスCDR H1、マウスCDR H2およびマウスCDR H3を含むことができ、ヒト化軽鎖はマウスCDR L1、マウスCDR L2およびマウスCDR L3を含むことができる。
【０３８７】
上記のように、CDRの機能的断片のみをヒト化抗体に組み入れることが必要でありうる。CDRの機能的断片は、CDRの一部または結合に必要とされる1つもしくは複数のCDR残基上のサブセットでありうる。したがって、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖は、ドナー抗体CDR (例えば、マウスCDR)の特定の残基のみを含みうる。ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖がドナー抗体CDRの特定の残基のみを含む場合、これらのドナー抗体CDR残基は、対応するアクセプター抗体CDRの一部である。例えば、ヒト化抗体のCDR H3は、アクセプター抗体CDR H3内に存在するドナー抗体CDR H3 (例えば、マウスのもの)に由来する1つまたは複数の残基を含みうる。それゆえ、このヒト化抗体のCDR H3は、アクセプター抗体CDR H3内に存在する1つまたは複数のマウスCDR H3残基を含む。ヒト化抗体の結合に必要とされる1つまたは複数のマウスCDR残基は、ヒト化抗体内の単一CDR (例えば、CDR H3、CDR H2、CDR H1、CDR L3、CDR L2、CDR L1)の一部でありうる。例えば、ヒト化抗体の結合に必要とされる1つまたは複数のマウスCDR残基は、ヒト化抗体内のCDR H3の一部でありうる。あるいは、ヒト化抗体の結合に必要とされる1つまたは複数のマウスCDR残基は、ヒト化抗体内の複数のCDRの一部でありうる。例えば、1つまたは複数のマウスCDR残基は、ヒト化抗体内のCDR H3およびCDR L3内に存在しうる。
【０３８８】
CDRおよびFRの位置は、Kabat付番システムによって定義されうる(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991))。同様に、抗体の重鎖または軽鎖内の個々の残基によって占められる位置は、Kabat付番システムによって定義されうる。それゆえ、ヒト化抗体のヒト化重鎖およびヒト化軽鎖内での結合に必要とされる残基の位置は、当技術分野において周知のKabat付番システムによる残基の位置によって定義されうる。
【０３８９】
上記のように、ヒト化抗体は、ヒト抗体由来のCDR (例えば、マウスのもの)およびヒト抗体由来の可変領域フレームワーク(FR)を有する抗体でありうる。フレームワーク領域(FR)は、ヒト化抗体における適所にCDRを保持すると言われている。アミノ末端から進んで、これらの領域は、重鎖についてはFR H1、FR H2、FR H3、およびFR H4ならびに軽鎖についてはFR L1、FR L2、FR L3、およびFR L4とそれぞれ指定される。驚くべきことに、本開示は、ヒト化抗体のエピトープ結合に重要なフレームワーク領域内に1つまたは複数の残基を含むヒト化抗体を提供する。エピトープ結合に関与する(または重要である)フレームワーク領域残基(例えば、CD112Rまたはその結合断片(fragment thereof binding))は、本明細書において結合フレームワーク領域残基といわれる。結合フレームワーク領域残基は、ヒト化重鎖のフレームワーク領域(すなわち、FR H1、FR H2、FR H3、FR H4)に存在しうるか、またはそれらはヒト化軽鎖のフレームワーク(すなわち、FR L1、FR L2、FR L3、FR L4)に存在しうる。ヒト化軽鎖のFR L3領域に存在する結合フレームワーク残基は、本明細書においてFR L3結合フレームワーク領域残基といわれる。したがって、ヒト化重鎖のFR H3領域に存在する結合フレームワーク領域残基は、本明細書においてFR H3結合フレームワーク領域残基といわれる。
【０３９０】
態様において、ヒト化抗体は、少なくとも1つの結合フレームワーク領域残基を含みうる。態様において、ヒト化重鎖は、少なくとも1つの結合フレームワーク領域残基を含みうる。態様において、ヒト化重鎖は、1つまたは複数のFR H3結合フレームワーク領域残基を含みうる。態様において、ヒト化重鎖は、1つまたは複数のFR H2結合フレームワーク領域残基を含みうる。態様において、ヒト化軽鎖は、少なくとも1つの結合フレームワーク領域残基を含みうる。態様において、ヒト化軽鎖は、1つまたは複数のFR L3結合フレームワーク領域残基を含みうる。態様において、ヒト化軽鎖は、1つまたは複数のFR L1結合フレームワーク領域残基を含みうる。
【０３９１】
態様において、ヒト化重鎖は、少なくとも1つの結合フレームワーク領域残基を含み、ヒト化軽鎖は、少なくとも1つの結合フレームワーク領域残基を含みうる。態様において、ヒト化軽鎖は、少なくとも1つのFR H3結合フレームワーク領域残基を含み、ヒト化軽鎖は、少なくとも1つのFR L3結合フレームワーク領域残基を含みうる。態様において、ヒト化軽鎖は、少なくとも1つのFR H3結合フレームワーク領域残基および少なくとも1つのFR H2結合フレームワーク領域残基を含み、ヒト化軽鎖は、少なくとも1つのFR L3結合フレームワーク領域残基および少なくとも1つのFR L1結合フレームワーク領域残基を含みうる。ヒト化抗体内の結合フレームワーク領域残基の位置は、CDR残基の位置と同様のKabat付番システムによって定義されうる。
【０３９２】
本明細書において提供されるヒト化抗体は、Fab'断片でありうる。ヒト化抗体がFab'断片である場合、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖(例えば、定常領域および可変領域を含む)ならびにヒト化軽鎖(例えば、定常領域および可変領域を含む)を含む。態様において、ヒト化抗体はFab'断片である。他の態様において、ヒト化抗体は、ヒト定常領域を含む。他の態様において、ヒト化抗体はIgGである。他の態様において、ヒト化抗体はIgAである。他の態様において、ヒト化抗体はIgMである。態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO: 1のアミノ酸配列を含む。
【０３９３】
態様において、ヒト化抗体は、一本鎖抗体でありうる。一本鎖抗体は、可変軽鎖および可変重鎖を含む。当業者は、各対が1本の軽鎖および1本の重鎖を有する、2本の同一のポリペプチド鎖の対を含む免疫グロブリン抗体とは対照的に、一本鎖抗体が単一の軽鎖および単一の重鎖を含むことを直ちに認識するであろう。各軽鎖および重鎖が、今度は、2つの領域: 標的抗原の結合に関与する可変(「V」)領域(すなわち、可変軽鎖および可変重鎖)、ならびに免疫系の他の成分と相互作用する定常(「C」)領域からなる。一本鎖抗体中の可変軽鎖および可変重鎖は、リンカーペプチドを通じて連結されうる。一本鎖抗体のリンカーペプチドの例は、Bird, R. E., Hardman, K. D., Jacobson, J. W., Johnson, S., Kaufman, B. M., Lee, S.M., Lee, T., Pope, S. H., Riordan, G. S. and Whitlow, M. (1988)に記述されている。scFv抗体を作製する方法が記述されている。Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); Ward et al., Nature 341:544-546 (1989); およびVaughan et al., Nature Biotech. 14:309-314 (1996)を参照されたい。簡潔には、免疫動物由来B細胞からのmRNAを単離し、cDNAを調製する。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域に特異的なプライマーを用いてcDNAを増幅する。PCR産物を精製し、核酸配列を連結させる。リンカーペプチドが望まれる場合、ペプチドをコードする核酸配列は、重鎖および軽鎖の核酸配列の間に挿入される。scFvをコードする核酸はベクターに挿入され、適切な宿主細胞中で発現される。
【０３９４】
特定のエピトープに結合する抗体の能力は、平衡解離定数(KD)によって記述することができる。本明細書において定義される平衡解離定数(KD)は、ヒト化抗体のCD112Rに対する解離速度(K-オフ)および会合速度(K-オン)の比である。以下の式で記述される: KD = K-オフ/K-オン。態様において、ヒト化抗体は、約100 nMの平衡解離定数(KD)でCD112Rに結合することができうる。態様において、ヒト化抗体は、約90 nMの平衡解離定数(KD)でCD112Rに結合することができうる。態様において、ヒト化抗体は、約80 nMの平衡解離定数(KD)でCD112Rに結合することができうる。態様において、ヒト化抗体は、約70 nMの平衡解離定数(KD)でCD112Rに結合することができうる。態様において、ヒト化抗体は、約60 nMの平衡解離定数(KD)でCD112Rに結合することができうる。態様において、ヒト化抗体は、約50 nMの平衡解離定数(KD)でCD112Rに結合することができうる。態様において、ヒト化抗体は、約30 nMの平衡解離定数(KD)でCD112Rに結合することができうる。態様において、ヒト化抗体は、約20 nMの平衡解離定数(KD)でCD112Rに結合することができうる。態様において、ヒト化抗体は、約10 nMの平衡解離定数(KD)でCD112Rに結合することができうる。態様において、ヒト化抗体は、約9.5 nMの平衡解離定数(KD)でCD112Rに結合することができうる。態様において、ヒト化抗体は、約9 nMの平衡解離定数(KD)でCD112Rに結合することができうる。態様において、ヒト化抗体は、約8.5 nMの平衡解離定数(KD)でCD112Rに結合することができうる。態様において、ヒト化抗体は、約8 nMの平衡解離定数(KD)でCD112Rに結合することができうる。態様において、ヒト化抗体は、約7.5 nMの平衡解離定数(KD)でCD112Rに結合することができうる。態様において、ヒト化抗体は、約7 nMの平衡解離定数(KD)でCD112Rに結合することができうる。態様において、ヒト化抗体は、約6.5 nMの平衡解離定数(KD)でCD112Rに結合することができうる。態様において、ヒト化抗体は、約6 nMの平衡解離定数(KD)でCD112Rに結合することができうる。態様において、ヒト化抗体は、約5.5 nMの平衡解離定数(KD)でCD112Rに結合することができうる。態様において、ヒト化抗体は、約5 nMの平衡解離定数(KD)でCD112Rに結合することができうる。態様において、ヒト化抗体は、約4.5 nMの平衡解離定数(KD)でCD112Rに結合することができうる。態様において、ヒト化抗体は、約4 nMの平衡解離定数(KD)でCD112Rに結合することができうる。態様において、ヒト化抗体は、約3.5 nMの平衡解離定数(KD)でCD112Rに結合することができうる。態様において、ヒト化抗体は、約3 nMの平衡解離定数(KD)でCD112Rに結合することができうる。態様において、ヒト化抗体は、約2.5 nMの平衡解離定数(KD)でCD112Rに結合することができうる。態様において、ヒト化抗体は、約2 nMの平衡解離定数(KD)でCD112Rに結合することができうる。
【０３９５】
態様において、ヒト化抗体は、10 nM未満の平衡解離定数(KD)でCD112Rに結合することができうる。態様において、平衡解離定数(KD)は8 nM未満かつ1 nM超である。態様において、平衡解離定数(KD)は6 nM未満かつ1.25 nM超である。態様において、平衡解離定数(KD)は4 nM未満かつ1.5 nM超である。
【０３９６】
態様において、本明細書において提供されるヒト化抗体は、CD112Rの細胞外ドメインまたは断片に結合する。態様において、ヒト化抗体は、10 nM未満の平衡解離定数(KD)でCD112Rコンジュゲートに結合することができうる。態様において、平衡解離定数(KD)は8 nM未満かつ1 nM超である。態様において、平衡解離定数(KD)は6 nM未満かつ1.25 nM超である。態様において、平衡解離定数(KD)は4 nM未満かつ1 nM超である。態様において、平衡解離定数(KD)は約1.5 nMである。
【０３９７】
特定の抗体が別の抗体と同じエピトープを認識する能力は、1つの抗体が抗原への、例えば、CD112Rまたはその断片へのもう1つの抗体の結合を競合的に阻害する能力によって決定することができる。いくつかの競合結合アッセイ法のいずれかを用いて、同じ抗原に対する2つの抗体間の競合を測定することができる。例示的なアッセイ法はBiacore(登録商標)アッセイ法である。簡潔には、これらのアッセイ法において、相互作用物質、例えば異なる抗体が別の抗体の結合を阻害する能力を試験することにより、結合部位を構造的にマッピングすることができる。連続して2つの抗体サンプルを十分な濃度で注入することにより、同じ結合エピトープに対する競合抗体の対を同定することができる。
【０３９８】
当技術分野において公知の他の従来の免疫アッセイ法を、本開示において用いることができる。例えば、抗体はサンドイッチELISAアッセイ法を用いて、それらが結合するエピトープにより区別することができる。これは、捕捉抗体(例えば、マウス1B7抗体)を用いてウェルの表面をコーティングすることにより行われる。次いで、飽和濃度以下のタグ付き抗原を捕捉表面に添加する。このタンパク質は、特異的抗体とエピトープとの間の相互作用を通じて抗体に結合される。洗浄後、ELISAに、検出可能な部分(例えば、HRP、標識された抗体は検出抗体として定義される)に共有結合されている第2の抗体(例えば、CD112Rに結合することができるヒト化抗体)を添加する。この抗体が捕捉抗体と同じエピトープを認識する場合、その特定のエピトープはもはや結合に利用できなくなるため、標的タンパク質に結合することができない。しかし、この第2の抗体が標的タンパク質上の異なるエピトープを認識する場合、それは結合することが可能であり、この結合は、関連する基質を用いて活性のレベル(したがって、結合した抗体)を定量することにより検出することができる。バックグラウンドは、単一の抗体を捕捉抗体および検出抗体の両方として用いることによって定義されるが、最大シグナルは、抗原特異的抗体で捕捉し、抗原上のタグに対する抗体で検出することによって確立することができる。バックグラウンドシグナルおよび最大シグナルを参照として用いることにより、エピトープ特異性を決定するために抗体を対にして評価することができる。
【０３９９】
態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO: 1のアミノ酸残基1〜326に対応するアミノ酸配列を含むCD112Rに結合することができうる抗体と競合する抗体である。
【０４００】
免疫応答の調節方法
態様において、本開示は、本開示のCD112Rタンパク質、融合ポリペプチド、複合体、または抗体を対象にそれぞれ投与する段階を含む、その必要がある対象における免疫応答の調節方法を含む。本開示の免疫応答の調節方法は、対象における腫瘍抑制または退縮を誘導する。本開示の免疫応答の調節方法は、対象におけるT細胞応答を調節する。
【０４０１】
態様において、本開示の免疫応答の調節方法は、免疫関連疾患および炎症性疾患を調節する。態様において、本開示の免疫応答の調節方法は、自己免疫疾患、移植関連疾患もしくは障害、または感染性疾患を調節する。
【０４０２】
自己免疫疾患の非限定的な例としては、関節リウマチ、1型糖尿病(インスリン依存性糖尿病としても知られる)、多発性硬化症、血管炎、円形脱毛症、狼瘡、リウマチ性多発筋痛、強直性脊椎炎、セリアック病、シェーグレン病、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、後天性免疫不全症候群(AIDS、これは自己免疫性成分を伴うウイルス性疾患である)、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患(AIED)、自己免疫性リンパ球増殖性症候群(ALPS)、自己免疫性血小板減少性紫斑病(ATP)、ベーチェット病、心筋症、セリアック病-疱疹状皮膚炎; 慢性疲労免疫機能障害症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発神経炎(CIPD)、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、デゴス病、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgA腎症、若年性慢性関節炎(スティル病)、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合性結合組織病、重症筋無力症、悪性貧血(pernacious anemia)、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症(全身性硬化症(SS)としても知られている進行性全身性硬化症(PSS))、スティッフ・マン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑ならびにヴェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０４０３】
非限定的な炎症性障害には、慢性および急性炎症性障害が含まれる。炎症性障害の例としては、アルツハイマー病、喘息、アトピー性アレルギー、アレルギー、アテローム性動脈硬化症、気管支ぜんそく、湿疹、糸球体腎炎、移植片対宿主病、溶血性貧血、変形性関節症、敗血症、脳卒中、組織および臓器の移植、血管炎、糖尿病性網膜症ならびに人工呼吸器誘発肺損傷が挙げられる。
【０４０４】
非限定的な移植関連疾患または障害には、移植後リンパ球増殖性障害(PTLD)、腎臓移植に関連した血液障害、移植に関連する血栓性微小血管症、血球貪食症候群、および移植片対宿主病が含まれる。移植後リンパ球増殖性障害(PTLD)は、臓器移植後の治療的免疫抑制に起因したB細胞増殖に与えられる名称である。これらの患者は、感染性単核球症様病変または多クローン性多型性B細胞過形成を発症しうる。
【０４０５】
感染性疾患の非限定的な例としては、HIV感染症、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、またはE型肝炎感染症、ヘルペスウイルス1型(HSV-1)または2型(HSV-2)感染症、エプスタイン・バー・ウイルス、BKウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、西ナイルウイルス、エボラウイルスなどのようなウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、原生動物感染症、ならびに寄生虫感染症が挙げられる。
【０４０６】
態様において、本開示は、本開示のCD112Rタンパク質、融合ポリペプチド、複合体または抗体を静脈内、非経口、皮下、筋肉内、経皮、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル、経口または局所投与により対象に投与することを含む。態様において、処置は、用量依存性の本開示のCD112Rタンパク質、融合ポリペプチド、複合体、または抗体である。態様において、約0.001 mg/kg〜約100 mg/kgの本開示のCD112Rタンパク質、融合ポリペプチド、複合体または抗体が対象に投与される。この範囲内の全ての数字およびさまざまな範囲も暗示される。
【０４０７】
本開示は、本開示のCD112Rタンパク質、融合ポリペプチド、複合体、または抗体の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要がある対象における免疫応答を刺激する方法を含む。態様において、免疫応答の刺激には、T細胞の成熟、分化、または増殖が含まれる。態様において、免疫応答の刺激には、TH1型免疫応答の増加が含まれる。態様において、免疫応答の刺激は、樹状細胞およびCD8+ T細胞を対象の臓器に動員しうる。態様において、免疫応答の刺激は、対象における抗原提示細胞の集団を拡大する。態様において、免疫応答の刺激は、対象におけるがん細胞の増殖を抑制する。態様において、本開示のCD112Rタンパク質、融合ポリペプチド、複合体、または抗体は、免疫応答を刺激するために、静脈内、非経口、皮下、筋肉内、経皮、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル、経口または局所投与により対象に投与される。
【０４０８】
本開示は、本開示のCD112Rタンパク質、融合ポリペプチド、複合体、または抗CD112R抗体の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要がある対象における免疫応答を抑制する方法を含む。
【０４０９】
がんを処置する方法
1つの局面において、毒素および抗CD112R抗体を含む組成物の有効量を、その必要がある対象に投与する段階によりがんを処置する方法が提供される。態様において、組成物は薬物送達媒体を含む。態様において、薬物送達媒体は毒素および抗CD112R抗体を含む。態様において、本開示のがんを処置する方法は、細胞傷害剤、例えば、DNAトポイソメラーゼIまたはトポイソメラーゼIIの阻害剤でありうる毒素と、抗CD112R抗体とを含む薬物送達媒体を対象に投与する段階を伴う。態様において、細胞傷害剤は、ベンダムスチン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ダカルバジン、イフォスファミド、メルファラン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、テモゾロミド、アスパラギナーゼ、カペシタビン、シタラビン、5-フルオロウラシル、フルダラビン、ゲムシタビン、メトトレキセート、ペメトレキセド、ラルチトレキセドでありうる。態様において、毒素はイリノテカン、トポテカン、カンプトテシン(CPT)、ラメラリンD、エトポシド(VP-16)、テニポシド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、エリプチシン、アウリントリカルボン酸、HU-331、またはそれらの組み合わせである/ありうる。態様において、薬物送達媒体はまた、第2の抗がん剤または抗腫瘍剤、例えばアクチノマイシンD/ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ドキソルビシン(ペグ化リポソーム(pegylated liposomal))、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン、またはミトキサントロンを含みうる。態様において、薬物送達媒体はまた、植物性アルカロイドまたは微小管阻害剤、例えば、エトポシド、ドセタキセル、イリノテカン、パクリタキセル、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはビノレルビンを含みうる。態様において、薬物送達媒体は、DNA連結剤、例えば、カルボプラチン、シスプラチン、またはオキサリプラチンを含みうる。態様において、薬物送達媒体はまた、第2の抗がんまたは抗腫瘍生物剤、例えば、アレムツズマブ、BCG、ベバシズマブ、セツキシマブ、デノスマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、インターフェロン、イピリムマブ、ラパチニブ、パニツムマブ、リツキシマブ、スニチニブ、ソラフェニブ、テムシロリムス、またはトラスツズマブを含みうる。
【０４１０】
態様において、薬物送達媒体はナノ粒子である。態様において、ナノ粒子はポリ(ラクチド-コ-グリコリド)粒子である。態様において、ナノ粒子は抗CD112R抗体の周囲層を含む。態様において、抗CD112R抗体はナノ粒子に共有結合的にコンジュゲートされる。
【０４１１】
態様において、本開示のがんを処置する方法は、毒素および抗CD112R抗体を含む薬物送達媒体を、その必要がある対象のがん性細胞に送達する。態様において、がん性細胞はT細胞性急性リンパ芽球性白血病(T-ALL)細胞である。態様において、本方法は、非ホジキンリンパ腫、白血病、または膵臓がんを処置するために提供される。
【０４１２】
低分子干渉RNA
1つの局面において、本開示は、抗CD112R siRNAの1つまたは複数の組成物を含む。CD112R siRNAの非限定的な例を表2に記載する。
【０４１３】
（表２）
2018529667.tif 000091
【０４１４】
薬物送達媒体
1つの局面において、毒素および抗CD112R抗体を含む薬物送達媒体が提供される。薬物送達デバイスは毒素を含む。毒素は細胞傷害剤、例えば、DNAトポイソメラーゼIまたはトポイソメラーゼIIの阻害剤でありうる。態様において、細胞傷害剤はベンダムスチン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ダカルバジン、イフォスファミド、メルファラン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、テモゾロミド、アスパラギナーゼ、カペシタビン、シタラビン、5-フルオロウラシル、フルダラビン、ゲムシタビン、メトトレキセート、ペメトレキセド、ラルチトレキセドでありうる。態様において、毒素はイリノテカン、トポテカン、カンプトテシン(CPT)、ラメラリンD、エトポシド(VP-16)、テニポシド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、エリプチシン、アウリントリカルボン酸、HU-331、またはそれらの組み合わせである/でありうる。態様において、薬物送達媒体はまた、第2の抗がん剤または抗腫瘍剤、例えばアクチノマイシンD/ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ドキソルビシン(ペグ化リポソーム)を含み、薬物送達媒体はまた、植物性アルカロイドまたは微小管阻害剤、例えば、エトポシド、ドセタキセル、イリノテカン、パクリタキセル、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはビノレルビンを含みうる。態様において、薬物送達媒体は、DNA連結剤、例えば、カルボプラチン、シスプラチン、またはオキサリプラチンを含みうる。態様において、薬物送達媒体はまた、第2の抗がんまたは抗腫瘍生物剤、例えば、アレムツズマブ、BCG、ベバシズマブ、セツキシマブ、デノスマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、インターフェロン、イピリムマブ、ラパチニブ、パニツムマブ、リツキシマブ、スニチニブ、ソラフェニブ、テムシロリムス、またはトラスツズマブを含みうる。
【０４１５】
態様において、薬物送達媒体はナノ粒子である。態様において、ナノ粒子はポリ(ラクチド-コ-グリコリド)粒子である。態様において、ナノ粒子は抗CD112R抗体の周囲層を含む。態様において、抗CD112R抗体はナノ粒子に共有結合的にコンジュゲートされる。
【０４１６】
態様において、ナノ粒子は、本明細書において記述される重合体(例えば、共重合体)を含む。N-(2-ヒドロキシプロピル)-メタクリルアミド, 共重合体(HPMA)、ポリ(エチレングリコール) (PEG)、ポリ(乳酸-グリコール酸) (PLGA)およびポリ(乳酸) PLAのようなナノ粒子のための天然重合体および合成重合体が本開示の態様において用いられうる。
【０４１７】
態様において、本開示のナノ粒子は重合体ミセルでありうる。ミセルは、難溶性薬物をカプセル化できる、50から200 nmまでのサイズが異なる生体適合性ナノ粒子である。重合体は、薬物送達から生体イメージングまで幅広い用途を提供するため、コア-シェルナノ粒子に用いられる。重合体コア-シェルナノ構造は、重合体コアおよび/または重合体シェルを含み、特性が改変または増強される任意の材料クラスのマトリックス中に分散されうる。薬物送達において、親水性重合体によって取り囲まれた疎水性コアを含む重合体に基づくミセル系は、疎水性薬物のための担体として用いられる。
【０４１８】
態様において、本開示のナノ粒子は、生分解性重合体またはデンドリマーでありうる。
【０４１９】
態様において、ナノ粒子は、約1〜約1000 nmの最長寸法(例えば、直径)を有する。態様において、ナノ粒子は、約5〜約100 nmの最長寸法(例えば、直径)を有する。態様において、ナノ粒子は、約10〜約50 nmの最長寸法(例えば、直径)を有する。態様において、ナノ粒子は、1〜1000 nmの最長寸法(例えば、直径)を有する。態様において、ナノ粒子は、5〜100 nmの最長寸法(例えば、直径)を有する。態様において、ナノ粒子は、10〜50 nmの最長寸法(例えば、直径)を有する。
【０４２０】
態様において、ナノ粒子は、
2018529667.tif 000092
2018529667.tif 000093
の最長寸法(例えば、直径)を有する。
【０４２１】
態様において、ナノ粒子は、
2018529667.tif 000094
2018529667.tif 000095
の最長寸法(例えば、直径)を有する。
【０４２２】
態様において、ナノ粒子最長寸法(例えば、直径)は、流体力学的最長寸法(例えば、直径)である。態様において、最長寸法(例えば、直径)は、サンプルの平均最長寸法(例えば、直径)である。
【０４２３】
併用療法
本開示はまた、本開示のCD112Rタンパク質、融合ポリペプチド、CD112Rと第2のタンパク質とを含む複合体、または抗CD112R抗体(本明細書において集合的に「抗CD112R結合分子」といわれる)を、そのような処置または予防が望まれる対象に投与する段階により、1つもしくは複数の病態の症状を処置するか、予防するか、1つもしくは複数の病態の症状の進行を遅延させるか、またはさもなければ1つもしくは複数の病態の症状を改善するか、あるいはそのような病態に関連する症状を緩和する方法を提供する。処置される対象は、例えば、ヒトまたは他の哺乳動物である。態様において、対象は、非ヒト霊長類、伴侶動物(例えば、ネコ、イヌ、ウマ)、家畜、使役動物、または動物園の動物のような、非ヒト哺乳動物である。態様において、対象はげっ歯類である。
【０４２４】
これらの方法および使用の態様のいずれかにおいて用いられる抗CD112R結合分子は、疾患の任意の段階で投与することができる。例えば、抗CD112R結合分子は、早期から転移までの、任意の段階のがんに罹患している患者に投与することができる。対象および患者という用語は、本明細書において互換的に用いられる。
【０４２５】
これらの方法および使用の態様のいずれかにおいて用いられる抗CD112R結合分子は、ネオアジュバント療法を含む処置レジメンにおいて用いることができる。
【０４２６】
これらの方法および使用の態様のいずれかにおいて用いられる抗CD112R結合分子は単独で、あるいは小分子阻害剤、他の抗体に基づく治療、ポリペプチドもしくはペプチドに基づく治療、核酸に基づく治療および/または他の生物製剤を含む、1つまたは複数のさらなる薬剤と組み合わせて投与することができる。
【０４２７】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つまたは複数の免疫療法と組み合わせて用いられる。使用に適した免疫療法には、非限定的な例として、TIGIT、PD-1、PD-L1、TIM-3、LAG-3、BTLA、CD226、CD160、CD137、CD96、CD70、CD47、CD40、NKG2D、VISTA、ICOS、B7-HE、GITR、OX40、KIR、SLAM7、CTLA-4、およびそれらの組み合わせを標的とする免疫療法が含まれる。
【０４２８】
態様において、少なくとも1つのさらなる薬剤はまた、免疫応答を調節する化学物質または分子、例えば、インドールアミン-ピロール2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)または機構的ラパマイシン標的(mTOR)を標的とする薬剤であることができる。
【０４２９】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つまたは複数の分子標的療法と組み合わせて用いられる。
【０４３０】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つまたは複数のワクチンと組み合わせて用いられる。
【０４３１】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つまたは複数の化学療法剤および/またはレジメンと組み合わせて用いられる。
【０４３２】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、放射線または他の放射線に基づく治療と組み合わせて用いられる。
【０４３３】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、非限定的な例として、外科的切除のような、外科手術と組み合わせて用いられる。
【０４３４】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つもしくは複数の二重特異性T細胞エンゲージャ、1つもしくは複数のがんワクチン、フロイントアジュバント、1つもしくは複数のCAR-T細胞療法、1つもしくは複数の幹細胞療法、および/または1つもしくは複数のscFv療法と組み合わせて用いられる。
【０４３５】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、1つまたは複数の市販の抗がん剤と組み合わせて用いられる。適当な市販の抗がん剤には、非限定的な例として、ニボルマブ、イピリムマブ、IL-2、アテゾリズマブ、エロツズマブ、ダラツムマブ、タリモジーン・ラハーパレプベック、ペンブロリズマブ、イピリムマブ、ブリナツモマブ、ラムシルマブ、ブレンツキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、ペグインターフェロンα-2bj、シプロイセル-T、オファツムマブ、デノスマブ、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【０４３６】
態様において、本開示の1つまたは複数の抗CD112R結合分子は、臨床試験中のおよび/または規制審査を受けている1つまたは複数の抗がん剤との組み合わせで用いられる。そのような抗がん剤の例としては、非限定的な例として、トレメリムマブが挙げられる。
【０４３７】
態様において、抗CD112R結合分子は、非限定的な例として、化学療法剤、例えばアルキル化剤、代謝拮抗物質、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、細胞傷害性抗生物質、および任意の他の核酸損傷剤のような、1つまたは複数のさらなる薬剤と組み合わせて投与される。態様において、さらなる薬剤はパクリタキセル(例えば、Abraxane(登録商標))のような、タキサンである。態様において、さらなる薬剤はゲムシタビンのような、代謝拮抗物質である。態様において、さらなる薬剤はアルキル化剤、例えば白金に基づく化学療法、例えばカルボプラチンまたはシスプラチンである。態様において、さらなる薬剤はキナーゼ阻害剤、例えば、ソラフェニブまたはエルロチニブのような、標的指向薬剤である。態様において、さらなる薬剤は、別の抗体、例えばモノクローナル抗体(例えば、ベバシズマブ)、二重特異性抗体、または多重特異性抗体のような、標的指向薬剤である。態様において、さらなる薬剤は、ボルテゾミブまたはカルフィルゾミブのような、プロテオソーム阻害剤である。態様において、さらなる薬剤は、レノリドミンド(lenolidominde)またはIL-2のような、免疫調節剤である。態様において、さらなる薬剤は、放射線である。態様において、さらなる薬剤は、当業者によって標準治療と考えられる薬剤である。態様において、さらなる薬剤は、当業者に周知の化学療法剤である。態様において、抗CD112R結合分子およびさらなる薬剤は、単一の組成物中に処方される。態様において、抗CD112R結合分子およびさらなる薬剤は、2つまたはそれ以上の別個の組成物として投与される。態様において、抗CD112R結合分子およびさらなる薬剤は、同時に投与される。態様において、抗CD112R結合分子およびさらなる薬剤は、連続的に投与される。
【０４３８】
態様において、さらなる薬剤は、ドセタキセル、パクリタキセル、アブラキサン(abraxane)(すなわち、アルブミン結合パクリタキセル)、ドキソルビシン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、イリノテカン、およびゲムシタビンからなる群より選択される化学療法剤のような、化学療法剤である。
【０４３９】
態様において、さらなる薬剤は、チェックポイント阻害剤、キナーゼ阻害剤、腫瘍微小環境における作用物質ターゲティング阻害剤、および/またはT細胞もしくはNKアゴニストである。態様において、さらなる薬剤は、単独でのまたは化学療法剤もしくは抗新生物剤のような別のさらなる薬剤との組み合わせでの、放射線療法である。態様において、さらなる薬剤は、ワクチン、腫瘍ウイルス、および/またはDC活性化剤、例えば、非限定的な例として、トール様受容体(TLR)アゴニストおよび/またはα-CD40である。態様において、さらなる薬剤は、ADCCを介して、または毒素への直接コンジュゲーション(例えば、抗体薬物コンジュゲート(ADC)を介して腫瘍を殺傷するようにデザインされた腫瘍標的指向抗体である。
【０４４０】
態様において、チェックポイント阻害剤は、CTLA-4、LAG-3、PD-1、PDL1、TIGIT、TIM-3、B7H4およびVistaからなる群より選択される標的の阻害剤である。態様において、キナーゼ阻害剤は、B-RAFi、MEKi、およびBtk阻害剤、例えばイブルチニブからなる群より選択される。態様において、キナーゼ阻害剤は、クリゾチニブである。態様において、腫瘍微小環境阻害剤は、IDO阻害剤、α-CSF1R阻害剤、α-CCR4阻害剤、TGF-β、骨髄由来抑制細胞、またはT調節細胞からなる群より選択される。態様において、アゴニストは、Ox40、GITR、CD137、ICOS、CD27、およびHVEMからなる群より選択される。態様において、チェックポイント阻害剤は、CTLA-4、PD-1および/またはPD-L1から選択される標的に結合する抗体である。態様において、チェックポイント阻害剤は、抗CTLA4抗体、抗PD-1抗体、および抗PD-L1抗体、ならびに/またはそれらの組み合わせである。態様において、チェックポイント阻害剤は、例えば、Yervoy(商標)のような抗CTLA4抗体である。態様において、チェックポイント阻害剤は、例えば、Opdivo(商標)および/またはKeytruda(商標)のような抗PD-1抗体である。
【０４４１】
態様において、阻害剤はCTLA-4阻害剤である。態様において、阻害剤はLAG-3阻害剤である。態様において、阻害剤はPD-1阻害剤である。態様において、阻害剤はPDL1阻害剤である。態様において、阻害剤はTIGIT阻害剤である。態様において、阻害剤はTIM-3阻害剤である。態様において、阻害剤はB7H4阻害剤である。態様において、阻害剤はVista阻害剤である。態様において、阻害剤はB-RAFi阻害剤である。態様において、阻害剤はMEKi阻害剤である。態様において、阻害剤はBtk阻害剤である。態様において、阻害剤はイブルチニブである。態様において、阻害剤はクリゾチニブである。態様において、阻害剤はIDO阻害剤である。態様において、阻害剤はα-CSF1R阻害剤である。態様において、阻害剤はα-CCR4阻害剤である。態様において、阻害剤はTGF-βである。態様において、阻害剤は骨髄由来抑制細胞である。態様において、阻害剤はT調節細胞である。
【０４４２】
態様において、アゴニストはOx40である。態様において、アゴニストはGITRである。態様において、アゴニストはCD137である。態様において、アゴニストはICOSである。態様において、アゴニストはCD27である。態様において、アゴニストはHVEMである。
【０４４３】
態様において、さらなる薬剤は、抗体もしくはその抗原結合断片またはコンジュゲートされた抗体もしくはその抗原結合断片である。態様において、さらなる薬剤は、CD122Rに結合する抗体もしくはその抗原結合断片またはコンジュゲートされた抗体もしくはその抗原結合断片である。態様において、さらなる薬剤は、CD112R以外の標的に対する抗体もしくはその抗原結合断片またはコンジュゲートされた抗体もしくはその抗原結合断片である。
【０４４４】
態様において、抗CD112R結合分子は、例えば、化学療法剤、抗炎症剤、および/または免疫抑制剤のような1つまたは複数のさらなる薬剤と組み合わせて処置中および/または処置後に投与される。態様において、抗CD112R結合分子およびさらなる薬剤は、単一の治療用組成物に処方され、抗CD112R結合分子およびさらなる薬剤は同時に投与される。あるいは、抗CD112R結合分子およびさらなる薬剤は、互いに分離され、例えば、各々が別個の治療用組成物に処方され、抗CD112R結合分子およびさらなる薬剤は同時に投与されるか、または抗CD112R結合分子およびさらなる薬剤は、処置レジメン中の異なる時間に投与される。例えば、抗CD112R結合分子は、さらなる薬剤の投与の前に投与されるか、抗CD112R結合分子は、さらなる薬剤の投与の後に投与されるか、または抗CD112R結合分子およびさらなる薬剤は交互に投与される。本明細書において記述されるように、抗CD112R結合分子およびさらなる薬剤は、単回用量または複数回用量で投与される。
【０４４５】
態様において、CD112Rタンパク質、融合ポリペプチド、CD112Rと第2のタンパク質とを含む複合体、または抗CD112R結合分子、およびさらなる薬剤は、同時に投与される。例えば、抗CD112R結合分子およびさらなる薬剤は、単一の組成物に処方されることができ、または2つもしくはそれ以上の別個の組成物として投与されることができる。態様において、抗CD112R結合分子およびさらなる薬剤は連続的に投与されるか、または抗CD112R結合分子およびさらなる薬剤は処置レジメン中の異なる時間に投与される。
【実施例】
【０４４６】
実施例1：PVRファミリーの新規受容体としてのCD112Rの特徴づけ
ヒトT細胞上で優先的に発現され、かつ単一のIgV細胞外ドメインを有する膜貫通タンパク質をコードする遺伝子を同定するために、大規模なゲノムワイド探索を行った。この探索を通じて、ポリオウイルス受容体関連免疫グロブリンドメイン含有 (PVRIG)（遺伝子ID 79037）と以前に命名された候補ヒト遺伝子が発見された。本明細書において記載されるCD112とのその強力な相互作用を反映させるために、これをCD112の受容体 (CD112R) と新たに命名した。
【０４４７】
CD112R遺伝子は、推定上の単一膜貫通タンパク質（単一の細胞外IgVドメイン、1つの膜貫通ドメイン、および長い細胞内ドメインから構成される）をコードする（図1A）。注目すべきことに、CD112Rの細胞内ドメインは2つのチロシン残基を含み、そのうちの1つは、ホスファターゼの潜在的ドッキング部位であるITIM様モチーフ内にある (Billadeau and Leibson, 2002)。CD112Rのアミノ酸配列と他の公知のPVRファミリーメンバーとのアラインメントにより、CD112RのIgVドメインが、PVRファミリー間で保存される残基を含むことが示された(図1B)。これらの残基は、PVRファミリー間で共有される少なくとも3つの主要なモチーフ：CD112Rの72〜74aa位におけるValまたはIle-SerまたはThr-Gln；Ala89-X6-Gly96；およびTyr139またはPhe139-Pro140-X-Gly142 (Yu et al., 2009) を構成する。PVRファミリーの第1 IgVの系統樹解析から、CD112RがすべてのPVR様タンパク質に近いことがさらに明らかになった（図1C）。PVRL4の第1 IgVドメインを鋳型として用いて、CD112Rの構造モデルを構築した。CD112Rは、一連のβシートからなるVセット免疫グロブリン折りたたみを適応させた（図1D）。
【０４４８】
BioGPS (www_biogps_org) からのmRNA発現データを用いたところ、CD112R遺伝子は、Tリンパ球およびNK細胞を含むリンパ球において優先的に転写された（図5A）。一貫して、CD112R遺伝子は、遺伝子濃縮プロファイルに基づいて、T細胞サブセットおよびNK細胞において重度に濃縮される遺伝子の1つであった（図5B）。ヒト免疫細胞におけるCD112R発現を、逆転写PCRにより確認した（図1E）。単球由来のヒト樹状細胞 (DC) がCD112Rを発現しなかったのに対して、NK細胞およびT細胞はいずれも、相当量のCD112R転写物を含んでいた。CD112Rの発現は、T細胞において活性化時にさらに上方制御された。CD112Rタンパク質の発現をさらに調べるために、精製CD112R-Ig組換えタンパク質をマウスに免疫することにより、ヒトCD112Rに対するモノクローナル抗体 (mAb)（クローン2H6）を作製した。CD112R mAbの特異性は、フローサイトメトリーおよびウエスタンブロットにより、CD112Rトランスフェクタントに対するその結合によって検証した（図6Aおよび6B）。正常ヒト末梢血単核細胞 (PBMC) から新たに単離されたT細胞は、検出可能な表面CD112Rを発現しなかった。刺激すると、CD112Rは活性化T細胞上で上方制御された（図1F）。同様に、CD112Rは、健常ドナーのPBMCから新たに単離されたナチュラルキラー細胞上に存在しなかったが、刺激に応答して誘導された（図1F）。CD112R転写物はまた、ヒト白血病細胞株およびリンパ腫細胞株においても検出された（図12B）。
【０４４９】
細胞起源に基づいた、ヒトがん細胞株におけるCD112R遺伝子発現を調べた。CD112Rは、白血病／リンパ腫起源のがん細胞において独占的に転写されることが見出された（図12C）。白血病／リンパ腫起源由来の細胞株のさらなる解析から、T-ALLおよび非ホジキンリンパ腫 (NHL) 細胞株が、大量のCD112R mRNAを優位に発現することが示される（図12D）。したがって、CD112R遺伝子は、ヒトT-ALLおよびNHLにおいて高度に転写される。
【０４５０】
実施例2：CD112Rを介したシグナルは、TCR媒介性シグナルを阻害した
プラスミドおよび融合タンパク質
PCRにより、ヒトCD112R cDNAをヒト胸腺組織cDNA (Clontech) からクローニングした。制限酵素消化により、全長コード領域をさらにpcDNA3.1(-)発現ベクターに挿入した。マウスCD112R cDNAは、Genescriptによって合成され、そこから購入した。CD112Rおよび他のPVR様分子の細胞外ドメインをクローニングし、マウスIgG2aの定常領域を含むpMigV発現ベクター中に融合させた。ポリエチレンイミン (PEI) トランスフェクション法を用いてfreestyle 293-F細胞に一過性にトランスフェクトすることによって融合タンパク質を発現させ、製造業者の説明書 (GE Healthcare) に従ってプロテインA Sepharoseカラムを用いて融合タンパク質を精製した。
【０４５１】
抗体
SP2ミエローマと、ヒトCD112R-Fcを免疫したマウス由来のB細胞との融合に由来するハイブリドーマから、マウス抗ヒトCD112R（クローン2H6）を作製した。ハイブリドーマをLife Technologies製のHybridoma-SFM培地中で適応させ、培養した。上清中の抗体を、HitrapプロテインGアフィニティーカラム (GE Healthcare) によって精製した。機能的等級のヒトCD112 mAbクローンTX31は、Biolegendから購入した。対照ハムスターIgG（ハムスター抗マウスTNP）およびヒトTIGIT mAbは、eBioscienceから購入した。フローサイトメトリーに使用した他のすべての抗体は、BD Bioscience (San Jose, CA)、eBioscience、RnDSystems、またはBiolegendから購入した。
【０４５２】
Jurkat-Luc-NFAT活性化アッセイ
PCRによってmCD28/hCD28キメラおよびmCD28/hCD112Rキメラを作製し、pcDNA3.1(-)発現ベクター中にクローニングした。キメラ遺伝子を、NFAT応答エレメントの制御下でルシフェラーゼレポーターを安定して発現するJurkat細胞 (Promega) に形質導入した。トランスフェクタントをゼオシンで選択し、フローサイトメトリー選別によってさらに濃縮した。トランスフェクトされたJurkat細胞を、マウスCD28 mAb（クローン3751）を伴うかまたは伴わずに、コーティングされたヒトCD3 mAb (OKT3) で4時間刺激した。ONE-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム (Promega) を用いて細胞を溶解し、発光シグナル強度について測定した。
【０４５３】
T細胞増殖アッセイ
健常ドナー由来のPBMCを、Denver, COのBonfils Blood Centerから購入した。OKT mAb（抗ヒトCD3）を、96ウェルプレート中に表示濃度で予めコーティングした。5μg/mLのCD112-Fcまたは対照Igもまた、ウェル中に固定化した。ヒト末梢血T細胞を陰性選択し、ヒトpan-T細胞選択キットまたはナイーブヒトCD4 T細胞選択キット（Miltenyi Biotec、Auburn, CA）により精製した。T細胞をCFSE標識し、各ウェルにウェル当たり2.5〜3 x 105個で添加し、3日間培養した。細胞を回収し、表面マーカーで染色してから、フローサイトメトリー解析した。
【０４５４】
研究から、CD112RとTIGITが、タンパク質構造および発現プロファイルを含む多くの類似点を共有することが示された (Yu et al., 2009)。したがって、CD112Rを、T細胞共受容体を提供してT細胞応答を調節するその能力について試験した。TIGITと同様に、ヒトCD112Rの細胞内ドメインは2つのチロシンを含み、そのうちの1つはITIM様モチーフ内にある (Billadeau and Leibson, 2002)（図1A）。最初に、CD112Rの細胞内ドメイン内のこれら2つのチロシンが、リン酸化されてシグナルを伝達し得るかどうかを調べた。HEK293T細胞にCD112R遺伝子をトランスフェクトし、次いで過バナジン酸で処理した。過バナジン酸で処理しなくても、CD112Rタンパク質の相当量のp-Tyrシグナルが認められた（図1G）。これは、HEK293T細胞上にCD112Rリガンドが存在するという知見によって解釈され（図3A）、これがCD112Rタンパク質のチロシンリン酸化を誘発した可能性がある。過バナジン酸処理によりCD112Rタンパク質のチロシンリン酸化がさらに増加し（図1G）、これにより、CD112R細胞内ドメイン内のチロシンがリン酸化され得、したがってシグナル伝達を媒介し得たことが示される。
【０４５５】
第二に、CD112Rを介したT細胞受容体 (TCR) 媒介性シグナルの調節を調査した。T細胞活性化時に強く誘導され、共刺激シグナルによって調節される活性化T細胞核内因子 (NFAT) 経路を調べた（Chen and Flies, 2013；Smith-Garvin et al., 2009）。NFAT応答エレメント (Huang et al., 2008) の制御下のルシフェラーゼレポーターが安定にトランスフェクトされたJurkat細胞株 (Jurkat-NFAT-Luc)を樹立した。アゴニストマウスCD28 mAb（クローン37.51）の周知の特徴を利用して (Grosset al., 1992)、2種類のキメラ分子を構築した：マウスCD28の細胞外ドメイン、ヒトCD28の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインから構成されるmCD28/hCD28キメラ；ならびにマウスCD28細胞外ドメイン、ヒトCD112Rの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むmCD28/hCD112Rキメラ（図7）。Jurkat-NFAT-Luc細胞に、これら2種類のキメラ分子をトランスフェクトした。次に、表面マウスCD28を安定して発現するJurkat細胞をフローサイトメトリー選別によって選択した。これらの細胞株を、対照抗体またはマウスCD28アゴニストmAbと共にヒトCD3 mAb (OKT3) で刺激した。マウスCD28 mAbの添加によってキメラが架橋され、細胞内シグナルの増幅が生じた。mCD28 mAbをmCD28/hCD28トランスフェクタントに添加すると、TCR刺激に際してヒトCD28シグナルが増幅され、NFAT活性が増加した。しかしながら、mCD28/hCD112R発現細胞にmCD28 mAbを含めると、ルシフェラーゼ活性化が有意に阻害され、これにより、CD112Rを介したシグナル伝達がTCR媒介性NFAT活性化を阻害することが示された（図1H）。したがって、結果から、CD112Rが、TCRシグナルを抑制する新規な共阻害性受容体であり得ることが示された。
【０４５６】
実施例3：ヒトがん細胞株の大多数は、CD112Rの推定リガンドを発現した
CD112Rの相互作用パートナーを同定するため、ヒト細胞上の潜在的リガンドを探索した。ヒト末梢血単核細胞 (PBMC) を、フローサイトメトリーによって、結合に関してCD112R融合タンパク質で染色した。CD112Rタンパク質は、T細胞、B細胞、およびナチュラルキラー (NK) 細胞と相互作用しなかった。しかしながら、CD112Rタンパク質はヒト単球とわずかな結合を示し、これにより、ヒト単球上にCD112Rの推定リガンドが存在することが示された（図2A）。この相互作用は、ヒト単球由来樹状細胞がCD112Rタンパク質によって染色された場合に、より明白となった（図2A）。ヒト腫瘍細胞株もまた、予想されるCD112Rリガンドについて、CD112R融合タンパク質で染色した。興味深いことに、実質的にすべての接着性腫瘍細胞株が、CD112Rタンパク質に対する強力な結合シグナルを有し、これによって、CD112Rに対するがん細胞上のリガンドの可能性が示された（図2B）。対照的に、造血起源の大部分の腫瘍はCD112Rと相互作用しなかった。このデータから、腫瘍細胞上のCD112Rの推定リガンドが、細胞接着を媒介する表面分子であり得ることが示唆された。
【０４５７】
がん細胞をトリプシンで長時間（>10分間）処理した場合に、腫瘍細胞はCD112R結合能を完全に失ったため（図2C）、この潜在的リガンドはトリプシン切断に感受性があった。CD112Rタンパク質は、トランスフェクトされていないHEK293T細胞に結合し、CD112R mAb（クローン2H6）を含めることによってこの相互作用は除去され、これにより、CD112Rタンパク質とのこの相互作用の特異性がさらに確認された（図2D）。これらの結果から、CD112Rの推定上の表面リガンドが、大多数の腫瘍細胞およびDC上に存在することが示された。
【０４５８】
実施例4： CD112はCD112Rのリガンドである
Biacoreアッセイ
バイオセンサー実験はすべて、Biacore 3000装置（GE Healthcare、Piscataway, NJ, USA）で行った。0.005% P20を含むPBS緩衝液 (Gibco) を、固定化実験および動態実験の両方のランニング緩衝液として使用した。アミンカップリング化学を用いて、タンパク質FLAG、CD112、およびCD155をCM5センサーチップ表面に2SOCで固定化した。動態実験は、3つの異なる濃度系列：4、12、36、111、333nMのCD112R；9000、3000、1000、333、111 nM TGIT；9000、3000、1000、333、111nM PVR L3を用いて、3つの異なるリガンドについて行った。試料はすべてPBS緩衝液で希釈し、流速20flL／分で表面を横切って3分間かけて注入し、表面結合リガンドからの分析物の解離を5分間モニターした。分析物濃度はすべて2つ組で行い、未修飾の参照フローセルを用いて、装置のドリフトおよび／またはノイズを補正した。緩衝液ブランクを用いて、得られた動態データを二重参照した。Scrubberソフトウェアパッケージ（Version 2.0b、BioLogic Software、Campbell, Australia；http_www_biologic_com_au）を用いて、生センサーグラムデータを処理し、適合させた。
【０４５９】
がん細胞におけるCD112Rの推定リガンドの存在およびT細胞上でのその調節機能が、この特異的リガンドの同定をもたらした。フローサイトメトリーによってCD112Rタンパク質に強く結合したHBL100（図2B）からの細胞溶解物の免疫沈降アッセイを、CD112R融合タンパク質を用いて行った。この試料の質量分析は成功しなかった。その一方で、予想されるCD112Rリガンドの数種の候補遺伝子を試験した。CD112Rは免疫グロブリン含有タンパク質であるため、CD112Rの結合パートナーもまた、免疫グロブリンスーパーファミリー (IGSF) のメンバーであることが推測された。B7ファミリー、ブチロフィリン様分子、T細胞免疫グロブリンムチン (TIM) ファミリー、およびPVR様分子 (Zhu et al., 2011) を含むIGSF遺伝子のいくつかの群を、公知のT細胞調節機能を用いて試験した。遺伝子をHEK293T細胞に個々にトランスフェクトし、フローサイトメトリーによってCD112Rタンパク質結合について染色した。CD112RはトランスフェクトされていないHEK293T細胞に結合し、これにより、これらの細胞上のCD112Rの推定リガンドが示された。CD112Rタンパク質に結合した、B7、ブチロフィリン様、およびTIMファミリーからのメンバーは同定されなかった。しかしながら、PVRメンバーをHEK293T細胞に個々に形質導入した場合には、CD112（PVRL2、ネクチン2とも称される）をHEK293T細胞にトランスフェクトした場合に、さらにより強い結合ピークが検出された（図3A）。このことから、CD112がCD112Rの結合パートナーであり得ることが示された。CD112R発現細胞を染色するためのCD112-Ig融合タンパク質の産生を通じて、この相互作用をさらに検証した。CD112RをHEK293T細胞に形質導入した場合に、CD112Rの表面発現は、CD112R mAb染色によって検証された（図3B左側）。CD112融合タンパク質はCD112Rトランスフェクタントには結合したが、対照HEK293T細胞には結合しなかった（図3B）。
【０４６０】
CD112RとCD112の相互作用の結合親和性
CD112RとCD112の直接的相互作用を決定するために、ビーズをCD112または対照タンパク質でコーティングした。コーティングビーズ上のCD112タンパク質の存在は、CD112 mAb染色によって確認した。CD112Rタンパク質は、CD112コーティングビーズに結合したが対照ビーズには結合せず、これにより、CD112RがCD112と直接相互作用したことが示される（図3C）。この相互作用のBiacore測定から、CD112-CD112R相互作用のKDが0.088flMであり（図3D）、これは同様の測定法でのCD112とCD226との間の相互作用（KD=8.97μMまたはKD=0.31μM）（Liu et al., 2012；Tahara-Hanaoka et al., 2004）よりも高いことが明らかになった。TIGITとCD112との間の相互作用は弱すぎて、Biacore実験によって親和性を決定することはできなかった。したがって、結果から、CD112Rは、CD226よりも高い親和性を有するCD112の新規受容体であることが示された。
【０４６１】
CD112R/CD112相互作用は、マウスにおいて保存された。CD112R/CD112相互作用は、マウスにおいても保存された。マウスリンパ腫細胞株RMA-SはCD112を発現せず、この細胞株にマウスCD112遺伝子を形質導入して、表面マウスCD112を発現する安定した細胞株 (RMA-S/mCD112) を作製した（図3E、左側）。これらの細胞を、結合に関して、いくつかのマウスPVR様受容体融合タンパク質で染色した。図3Eに示されるように、マウスCD112R融合タンパク質はRMA-S/mCD112細胞に強く結合したが、偽RMA-Sトランスフェクタントには結合しなかった。マウスCD226融合タンパク質がRMA-S/mCD112トランスフェクタントと弱く結合した一方で、RMA-S/mCD112細胞に対するTIGITタンパク質の相互作用は無視できるほどであった（図3E）。まとめると、研究から、CD112Rが、ヒトおよびマウスの両方において、最も高い親和性を有するCD112の受容体であることが示される。
【０４６２】
実施例5：CD112R相互作用と他のPVRメンバー相互作用との間の競合解析
CD112は、CD226およびTIGITの両方と相互作用することが知られているが、後者の相互作用は比較的弱い（Bottino et al., 2003；Stanietsky et al., 2009；Yu et al., 2009）。これら2種類の対抗受容体が、CD112相互作用に関してCD112Rと競合するかどうかを調査した。CD112タンパク質をビーズ上にコーティングし、異なる濃度のTIGITまたはCD226タンパク質の存在下において、CD112Rタンパク質で染色した。TIGITを含めてもこの相互作用の破壊にほとんど影響を及ぼさなかったが、CD226はCD112-CD112R結合の優れた阻害剤であった（図3F）。この結果は、CD112-TIGIT相互作用よりも比較的高いCD112-CD226対間の親和性と一致した（Martinet and Smyth, 2015；Yu et al., 2009）。逆に、CD112Rを競合物として使用した場合、比較的低濃度においてさえ、CD112-CD226相互作用は有意に阻害された。CD112とTIGITとの間の弱い相互作用、およびビーズ上にコーティングされたCD112タンパク質の限定のために、フローサイトメトリーによるこれら2つの分子間の結合は観察されなかった。したがって、競合研究から、CD112RとCD226が、CD112上の共通の結合部位を共有することが示された。この結論は、CD112 mAb、クローンTX31が、CD112RおよびCD226の両方に対するCD112の結合を阻止した研究によってさらに支持された（図4Bおよび図8）。
【０４６３】
実施例6：CD112は、DCおよび腫瘍細胞へのCD112R結合を媒介した。
研究により、CD112はCD112Rのリガンドとして立証された。最初の研究により、CD112Rタンパク質が、DCおよびヒトがん細胞を含む多くの細胞型に結合することが明らかにされたため、CD112がCD112R相互作用を担う表面分子であるかどうかをさらに調査した。単球が顕著なレベルの表面CD112を発現したのに対して、ヒトT細胞、B細胞、およびNK細胞は、検出可能なCD112タンパク質を発現しなかった（図9）。これは、CD112Rがこれらの細胞と結合しなかったことを示す以前の結果と一致する（図2A）。ヒト単球由来DCは高レベルのCD112を発現し、この発現はTLRアゴニストによってさらに上方制御された。DCをCD112遮断mAb（クローンTX31）と共にプレインキュベートした場合、DCとのCD112R相互作用は完全に阻止され、これにより、DC上のCD112がCD112R相互作用を媒介したことが示唆される（図4A）。接着性腫瘍細胞株の大多数が高レベルのCD112を構成的に発現したのに対し、造血起源をもつ腫瘍細胞の大部分はCD112陰性であった（表3）。したがって、腫瘍細胞におけるCD112の発現プロファイルは、腫瘍細胞に対するCD112Rタンパク質結合のものと一致した。
【０４６４】
（表３）腫瘍細胞上のCD112発現はCD112R結合と相関する
2018529667.tif 000096
【０４６５】
腫瘍細胞をCD112遮断mAbと共にプレインキュベートし、CD112Rで染色して、CD112が、相互作用を媒介するリガンドであることを確認した。図4Bに示される代表的な結果のように、CD112 mAbを含めることで、ヒト膵がん細胞株、PANC198に対するCD112R結合は完全に除去された。試験したすべての腫瘍細胞株において、腫瘍細胞をCD112遮断mAbと共にプレインキュベートすると、CD112R融合タンパクは結合が完全に妨げられた。
【０４６６】
最後に、PVR様タンパク質は、メンバー間の異種相互作用を媒介することが公知である（Martinet and Smyth, 2015；Takai et al., 2008）。大多数の細胞型における高親和性リガンドCD112の存在が、CD112Rと他のPVRメンバーとの間に起こり得る弱い結合を隠した可能性がある。個々のPVR様タンパク質でコーティングし、CD112Rタンパク質結合について染色したビーズを調製した。図10に示されるように、CD112を除くPVR様タンパク質は、CD112Rタンパク質と相互作用することができなかった。まとめると、研究から、CD112が、DCおよび腫瘍細胞に対するCD112Rの相互作用を媒介する主要なリガンドであることが示される。
【０４６７】
実施例7：CD112はCD112Rと相互作用して、T細胞応答を抑制する
破傷風トキソイド (TT) 特異的なヒトT細胞応答
インビトロTT刺激のために、自己樹状細胞を、50 ng/mL TT (List Biological Laboratories) の存在下で、異なる比率のCFSE標識精製ヒトT細胞と10〜14日間、共培養した。培養の開始時から、抗体または融合タンパク質を添加した。ヒトCD4+ T細胞の細胞分裂を、記載される通りに(Zhu et al., 2013)、CFSE希釈について蛍光活性化細胞選別によって調べた。
【０４６８】
研究から、TIGITよりもむしろCD112Rが、CD112の優位な阻害性受容体であることが示された。T細胞応答におけるCD112/CD112R相互作用の潜在的機能を試験するため、精製ヒトT細胞をCFSEで標識し、ヒトCD3 mAbの存在下で、プレートコーティングされたCD112-Igで刺激した（図4C）。固定化されたCD112-Igは、CFSE色素の希釈によって明らかなように、ヒトT細胞分裂を中程度に増加させた。T細胞応答におけるCD112のこの共刺激効果は、CD112の公知のT細胞共刺激受容体であるCD226を介して媒介された（Shibuya et al., 2003；Tahara-Hanaoka et al., 2004）。CD112R中和mAb（クローン2H6、図2D）を含めることで、CD112の共刺激効果はさらに増強され（図4C）、これにより、CD112がCD112Rと相互作用してT細胞増殖を阻害したことが示される。
【０４６９】
T細胞応答における内因性のCD112/CD112R相互作用の機能をさらに評価するため、抗原特異的T細胞応答におけるこの経路の影響を調べた。精製ヒトT細胞をCFSEで標識し、破傷風トキソイド (TT) の存在下で自己単球由来樹状細胞と共に培養した。CD112RまたはTIGIT遮断mAbの単独での包含は、TT特異的T細胞増殖にわずかな影響しか及ぼさなかった。しかしながら、CD112R mAbとTIGIT mAbの組み合わせは、T細胞増殖を有意に増大させることができ（図4D）、これにより、T細胞応答に及ぼすこれら2つの阻害性受容体の相乗効果が実証された。その一方で、CD112R-Fc融合タンパク質を添加すると、同じモデルにおいてT細胞増殖は中程度に阻害された（図4E）。CD112の3つの受容体はすべて、CD112上の類似の結合部位を共有するため、CD112R-Fc融合タンパク質を含めると、その受容体によるすべてのCD112相互作用が除去された。これらのデータは、T細胞に及ぼすCD112の全体的なプラス効果と一致する（図4C）（Tahara-Hanaoka et al., 2006；Tahara-Hanaoka et al., 2004）。
【０４７０】
新規なT細胞共抑制分子であるCD112Rは、高親和性を有するCD112の受容体である。CD112はTIGITおよびCD226と弱く結合し、CD155と比較して、TIGIT/CD226ネットワークにおいてわずかな役割を果たすと考えられた（Guillerey et al., 2015；Lozano et al., 2012；Yu et al., 2009）。結果から、同様にPVR様分子であるCD112Rが、CD112の主要な共阻害性受容体であることが示される。
【０４７１】
TIGITは、がん免疫療法に関してT細胞チェックポイントに関与する（Chauvin et al., 2015；Pauken and Wherry, 2014）。TIGITおよびそのリガンドは高度に発現され、がんの抑制性微小環境に寄与しており、PD-1遮断と共にこの経路を破壊すると、抗腫瘍免疫応答が改善される。一貫して、本実施例により、CD112ががん細胞株（図2B）およびがん組織の大多数において高度に発現されることが示された。TIGITとCD112RはCD112で同じリガンドを共有し、いずれもリガンド相互作用に関して共刺激受容体CD226と競合し得る。一貫して、TIGIT遮断と合わせたCD112Rの遮断は、優れた相乗作用を示して、インビトロにおいてT細胞応答を増強した。
【０４７２】
実施例8：がん免疫療法
皮下マウス腫瘍モデルのために、50万個のCT26細胞を野生型 (WT) Balb/cマウスの右側腹部に移植する。腫瘍接種後の1日目および5日目に、腫瘍保有マウスを、マウス当たり200μgの対照ラットIgG、mCD112R mAbで処理する。ノギスを用いて、腫瘍サイズを2次元で測定する。いくつかの実験では、マウスを屠殺して、その数、IL-2、IFN-γ、およびTNF-αなどのサイトカイン分泌を含め、TILを調べる。CD112RがCD112の阻害性受容体であるという本明細書における発見を前提とすると、CD112R/CD112相互作用の妨害は抗腫瘍応答を促進すると予測される。結果として、CD112R遮断mAbの接種は腫瘍の成長を阻害する。CD112RおよびTIGITの同時遮断は、がんならびに腫瘍のサイズおよび成長の有意な抑制をもたらし、CD112RまたはTIGITの単独での遮断で見られたものを上回る。
【０４７３】
B16メラノーマ肺転移モデルにおいて、生理食塩水100μl中に懸濁された1 x 105個メラノーマ細胞をWT C57BL/6マウスの尾静脈に注射する。マウスを2群に分け、それぞれ対照ラットIgG、mCD112R mAbで処理する。腫瘍接種の10日後から、マウスの生存を毎日モニターする。いくつかの実験では、腫瘍接種後の14日目にマウスを屠殺して、肺における腫瘍を調べる。CD112RがCD112の阻害性受容体であるという本明細書における発見を前提とすると、CD112R/CD112相互作用の妨害は抗腫瘍応答を促進すると予測される。結果として、CD112R遮断mAbの接種は、腫瘍進行を阻害して、腫瘍保有マウスの生存期間を延長する。CD112RおよびTIGITの同時遮断は、がん転移の有意な抑制をもたらし、腫瘍負荷マウスの生存を促進し、これはCD112RまたはTIGITの単独での遮断で見られたものを上回る。
【０４７４】
実施例9：実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE)
WT C57BL/6マウスに完全フロイントアジュバント (CFA) 中のMOG35-55の乳濁液を免疫した後、免疫の第1日目および次いで再度翌日に、PBS中の百日咳毒素 (PTX) を投与する。免疫後の1、4、および7日目に、免疫化マウスを300μgの対照マウスIgG1またはmCD112R-mFcで処理する。疾患の発症についてマウスを毎日モニターし、該発症は以下の尺度に従ってスコア化する：0、臨床兆候なし；1、尾部緊張の消失；2、後肢の脱力；3、後肢の麻痺；4、前肢の麻痺；および5、瀕死または死亡。EAE症状は一般に、T細胞応答を阻害する薬剤によって弱まる。CD112RはCD112結合に関してCD226と競合するため、CD112R-Fcの投与は、EAE症状を軽減するか、または疾患マーカーを低下させる。T細胞の新規チェックポイントとしてのCD112Rを考慮すると、CD112Rシグナルを増幅するためのアゴニスト抗体のような薬剤もまた、病理学的T細胞応答を抑制するのに役立ち、したがってEAE症状を軽減するか、または疾患マーカーを低下させる。
【０４７５】
実施例10：移植片対宿主病
移植片対宿主病 (GVHD) は通常、幹細胞または骨髄移植後に起こり、この場合ドナーの免疫細胞が患者の正常細胞を誤って攻撃する。非照射の親 対 F1 GVHDモデルにおいて、野生型 (WT) B6マウスから単離された脾臓細胞5 x 107個を、0日目にBDF1レシピエントの静脈内に移植する。いくつかの実験では、移植前に、ドナーの脾臓細胞を5μMカルボキシフルオセイン二酢酸スクシンイミジルエステル (CFSE) で標識する。細胞移植後の0、3、および6日目に、300μgのmCD112R-mFcまたは対照FLAG-mFcを腹腔内投与する。7日目にレシピエントマウスを屠殺し、脾臓細胞をフローサイトメトリーおよびクロム51 (51Cr) 放出アッセイによって解析する。2C T細胞を用いるモデルでは、2C TCRトランスジェニックマウス由来の脾臓細胞1 x 107個をB6脾臓細胞3 x 107個と混合し、次いで0日目にBDF1宿主の静脈内に移植する。その後、0日目および4日目に、レシピエントマウスに300μgのmCD112R-mFcまたは対照FLAG-mFcを腹腔内投与する。7日目に、レシピエント脾臓細胞を回収し、1B2クローン形質mAbおよび抗CD8 mAbを用いて、フローサイトメトリー解析により2C T細胞の存在について評価する。mCD112RはCD112結合に関してCD226と競合するため、本発明者らは、CD112Rタンパク質の投与がGVHD応答を阻害することがわかると予測する。
【０４７６】
加えて、同種骨髄移植によって誘導されたGVHDの2つの生存モデルを用いる。最初に、致死線量照射 (12 Gy) により前条件づけされたBDF1レシピエントマウスに、WT B6 T細胞（2〜3 x 106個細胞）を伴うかまたは伴わずに、T細胞枯渇B6 BM細胞（5 x 106個細胞）を静脈内注射する。BM細胞からのT細胞枯渇および脾臓細胞からのT細胞単離は、それぞれ抗Thy1.2 mAb結合マイクロビーズおよびpan-T細胞単離キットを用いて、MACS systemによって行う。0、3、および6日目に、マウスに300μgのmCD112R-mFcまたは対照FLAG-mFcを腹腔内投与する。レシピエントマウスの生存を毎日モニターする。第2のモデルでは、BALB/cマウスを致死線量照射 (10 Gy) に曝露し、その後WT B6 T細胞（1 x 106個細胞）を伴うかまたは伴わずに、T細胞枯渇B6 BM細胞（5 x 106個細胞）を静脈内に移植する。0、3、および6日目に、マウスに300μgのmCD112R-mFcまたは対照FLAG-mFcを腹腔内投与する。この主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) 完全ミスマッチGVHDモデルにおいて、レシピエントマウスの生存および体重変化を定期的にモニターする。mCD112RはCD112結合に関してCD226と競合するため、本発明者らは、CD112Rタンパク質の投与がGVHD応答を阻害し、GVHDマウスの生存を促進することがわかると予測する。同様に、T細胞のチェックポイントとしてのCD112Rを考慮すると、CD112Rシグナルを増幅するための抗体のような薬剤は、GVHD応答を抑制するのに役立ち、したがってGVHDマウスの生存期間を延長する。
【０４７７】
実施例11：オボアルブミン (OVA) 誘発性アレルギー性喘息
0日目および5日目に、8〜10週齢の雄のWT C57BL/6を、4 mg水酸化アルミニウムゲル (Sigma-Aldrich) に吸着させた20μg OVAタンパク質 (Sigma-Aldrich) のi.p.注射によって感作させる。0、3、および6日目に、マウスに300μgのmCD112R-mFcまたは対照FLAG-mFcを腹腔内投与する。次いで、12〜14日目に、ネブライザー (Proneb Ultra II) を用いて、マウスにPBS中のエアロゾル化1% OVAを60分間負荷する。翌日、解析のためにマウスを屠殺する。血液を回収し、OVA特異的IgE決定のために血清を分離する。気管支肺胞洗浄液 (BALF) からの上清を回収して、サイトカインIL-5およびIL-13レベルを決定する。細胞ペレットを計数し、顕微鏡スライド上で遠心し、Hema3で染色して異なる細胞型を決定する。肺炎症の病理組織学解析のために、気管支周囲および血管周囲の炎症を、0〜4の尺度、炎症なし (0)、炎症細胞はほとんど存在しない (1)、少数の炎症部位 (2)、複数の炎症部位 (3)、肺全体にわたる炎症細胞 (4) で評価する。スコアは平均値±SEMとして表す。気道における粘液分泌細胞に関しては、0〜3の粘液スコア：陽性細胞の存在なし (0)、少数の陽性細胞 (1)、多くの陽性細胞 (2)、および粘液分泌細胞の広範な染色 (3) を評価する。同様に、喘息症状は一般に、T細胞応答を阻害する薬剤によって軽減されるため、CD112R-Fcの投与は、喘息症状を軽減するか、または疾患マーカーを低下させる。
【０４７８】
実施例12：コラーゲン誘発関節炎 (CIA)
ニワトリコラーゲンII（CII、Sigma-Aldrich）を4 mg/mlで10 mM酢酸中に溶解し、等量のCPA (Difco) で乳化する。8〜10週齢のWT雄DBA/1Jマウスの両側腹部に100μlの乳濁液をs.c.免疫し、一次免疫の16日後または18日後に、同濃度のCIIを追加免疫する。免疫後の1、4、および7日目に、免疫化マウスを300μgの対照マウスIgG1またはmCD112R-mFcで処理する。
【０４７９】
関節炎の発生について目視検査により動物を評価する；重症度は0〜4尺度で個々にスコア化した。4つの足すべてのスコアを加算して、各動物の合計を得る。関節炎症状は一般に、T細胞応答を阻害する薬剤によって軽減され、したがって、CD112R-Fcの投与は、CIA症状を軽減するか、または疾患マーカーを低下させる。同様に、T細胞のチェックポイントとしてのCD112Rを考慮すると、CD112Rシグナルを増幅するための抗体のような薬剤は、CIA症状を軽減するのに役立つ。
【０４８０】
実施例13：CD112R表面タンパク質は、T-ALLにおいて構成的に発現される
CD112R遺伝子のタンパク質発現を調べるため、ヒトCD112Rタンパク質に対するmAbを作製した。CD112R mAbの特異性は、CD112Rトランスフェクタントに結合するが、対照HEK293Tトランスフェクタントには結合しないことによって検証した（図12A）。健常ヒトドナーの末梢血単核細胞 (PBMC) におけるCD112R発現を、フローサイトメトリーを用いて解析した。複数名の健常ドナーから新たに単離されたヒトT細胞上に、検出可能な表面CD112Rは見出されなかった。しかしながら、CD3 mAbおよびCD28 mAbによって刺激すると、健常ドナーのPBMC由来のCD3+ T細胞の大部分は表面CD112Rを発現した（図12B）。
【０４８１】
フローサイトメトリーにより、血液悪性腫瘍由来のヒト細胞株におけるCD112R発現をさらに評価した。結果から、試験したすべてのT-ALL細胞株 (10110) が、程度は異なるものの、CD112Rを構成的に発現することが示された。RajiおよびDaudiなどのNHLは、表面CD112Rタンパク質を構成的に発現した（図2D）。プレ-BALLまたは急性骨髄性白血病 (AML) などの、ヒトリンパ腫／白血病の他のサブタイプでは、CD112Rタンパク質は検出されなかった（図2E）。
【０４８２】
実施例14：T-ALLおよびNHLを有するヒト患者におけるCD112R発現
本明細書において示された研究から、CD112Rタンパク質が、T-ALLを含むある特定の型のリンパ腫／白血病において構成的に発現されるが、正常ヒトPBMCでは発現されないことが実証された。したがって、CD112RはヒトT-ALLの治療のために標的とされる。最初に、T-ALL患者に直接由来する原発がん細胞上のCD112Rタンパク質発現を確認する。第二に、ヒトT-ALLの処置のためにCD112Rを標的とする抗体を開発する。
【０４８３】
血液悪性腫瘍を有する患者のhPBMCからのCD112Rタンパク質発現を調べた。5名のT-ALL患者、7名のプレ-BALL患者、および4名のAML患者からのhPBMCを解析した。プレ-B ALL患者およびAML患者のPBMCからは、表面CD112Rは検出されなかった。しかしながら、6名のT-ALL患者のうち5名において、腫瘍細胞上にCD112Rが構成的に発現された（表4）。
【０４８４】
（表４）ヒト白血病患者における表面CD112R発現
2018529667.tif 000097
【０４８５】
Children's Hospitalに設立された組織バンクからの、T-ALL患者およびNHL患者におけるCD112Rタンパク質発現を解析する。CD112Rは過剰発現され、T-ALL疾患の優れた診断マーカーとして役立つ。加えて、CD1a、CD4、CDS、およびCD3などの、ヒトT-ALLを規定する明確に定義された他の分子シグネチャーを、フローサイトメトリーにより、CD112Rの発現に準じて比較する。NOTCHシグナル伝達ネットワーク、PTEN、FBXW7、およびLEF1のような、ヒトT-ALLにおける一般的な遺伝子変化を調べて、これらの経路のうちのいずれかがT-ALLにおけるCD112R発現に寄与するのかどうかを確かめる。
【０４８６】
実施例15：ヒトT-ALLおよびNHLを処置するための標的としてのCD112Rの使用
T-ALL処置のためのナノ粒子を用いたCD112Rのターゲティング：高親和性を有するヒトCD112Rに対するmAb（クローン2H6）（図12A）を作製した。カンプトテシン (CPT) を負荷したナノ粒子をT-ALLに送達するための媒体として、この抗体を使用する（図13A）。元々カンレンボク (Camptotheca acuminata)（カンレンボク属、キジュ）の樹皮および幹から単離されたCPTは、DNA酵素トポイソメラーゼIを阻害する細胞毒性キノリンアルカロイドである。カンプトテシンが負荷されたポリ(ラクチド-コ-グリコリド)ナノ粒子 (NP) に共有結合した、CD112Rを標的とする周囲の抗体の層を含むナノ粒子を作製した（図13A）。非特異的アイソタイプ抗体と結合させたナノ粒子を対照として使用する。蛍光可視化を用いて、Molt4のようなT-ALL細胞株へのナノ構築物の内部移行を研究する（図13B）。
【０４８７】
実施例16：CD112R mAbがコーティングされたナノ粒子によるT-ALLのターゲティングの戦略
一例としてのMolt4に対する細胞毒性研究を、ナノ粒子とのインビトロ培養で実施する。これを行うことによって、ヒトT-ALLに対する治療効果が改善された新規な免疫ナノ粒子が開発される。
【０４８８】
実施例17：抗体依存性細胞傷害 (ADCC) を誘発するためにCD112R mAbを使用するT-ALLのターゲティング
最初に、2H6 mAb由来の結合配列、およびADCCを誘導して標的細胞を殺傷することが公知であるヒトIgG1由来のFc断片を含むキメラ抗体、2H6-hFc1の構築物をPCRによって作製する。293FECTIN（商標）を用いて293F細胞に2H6-hFc1プラスミドを一過性に形質導入することによって、2H6-hFc1タンパク質を産生させる。2H6-hFc1の結合をフローサイトメトリーにより確認する。このキメラmAbがADCCを誘発するかどうかを試験するため、Lymphocyte Separation Medium（MP BioMedicals、Solon, OH）を用いて、健常ドナーから得られたヒト全血から末梢血単核球 (PBMC) を単離する。100:1、50:1、または25:1のエフェクター 対 標的比で、単離されたPBMCをMolt4細胞と共に、2H6-hFc1を伴うかまたは伴わずに37℃で4時間インキュベートする。4時間のインキュベーション期間後、細胞上清を96ウェルプレートに移し、比色アッセイ（Promega、Madison, WI）を用いて、放出された乳酸脱水素酵素 (LDH) の量を決定する。以下のようにパーセント細胞傷害性を算出する：パーセント細胞傷害性＝（実験−エフェクター自発−標的自発）／（標的最大−標的自発）x 100、式中、「実験」は処理された試料で測定されたシグナルに相当し、「エフェクター自発」はPBMCの単独での存在下で測定されたシグナルに相当し、「標的自発」は腫瘍細胞の単独での存在下で測定されたシグナルに相当し、および「標的最大」は界面活性剤で溶解された腫瘍細胞の存在下で測定されたシグナルに相当する。LDH放出アッセイにおいて、精製NK細胞を用いる付加的な研究を試行する。
【０４８９】
2H6-hFc1の抗腫瘍効果をインビボで試験するため、精製された新鮮なhPBMCを免疫欠損マウスNOD scid γ (NSG) マウスに移植する。マウスに、蛍光を発するヒトT-ALL細胞株Molt4を静脈内注射し、次いでCD112R mAbまたは対照抗体で処理する。2日ごとに画像法により腫瘍量を明らかにし、マウス生存の結果を記録する。
【０４９０】
実施例18：抗CD112R抗体のエピトープ解析
本明細書において示される研究において、本開示の3つの抗CD112R抗体、mAb 2H6、mAb 4-4、およびmAb 4-5がヒトCD112Rと結合する能力を解析した。これらの研究の結果を図14に示す。
【０４９１】
mAb 2H6は遮断抗体であるのに対して、抗体mAb 4-4およびmAb 4-5は遮断抗体ではないと判定された。試験した3つの抗体、mAb 2H6、mAb 4-4、およびmAb 4-5はすべて、ヒトCD112Rへの結合に関して互いに競合することが見出され、このことから、これらの抗体の各々が結合するCD112Rのエピトープの各々は、少なくとも部分的に重複することが示唆される。
【０４９２】
実施例19：腫瘍研究におけるCD112R経路の役割
ヒトがんにおけるCD112R/CD112経路の発現
CD112は、ヒトがんにおいて高度に発現されることが公知である。以前の研究によって、接着性ヒトがん細胞株の大多数がCD112を発現することが見出された。ヒトがんからのアレイデータにより、CD112が複数のヒトがん型において高度に転写されることが示された（図16A）。免疫組織化学的検査からもまた、メラノーマおよびヒト膵臓腺がん (PDAC) の大多数が高レベルの表面CD112を発現することが実証された（図16B）。さらに、PDAC患者由来のPBMCよりもTILにおいて有意により多くのCD112R+ T細胞が存在した（図16C）。
【０４９３】
マウスにおけるCD112R発現の特徴づけ
マウスにおけるCD112R発現を調べるため、マウスCD112Rに対するラットモノクローナル抗体（クローン6H11）を作製した。このmAbの特異性は、mCD112R/HEK293Tトランスフェクタントに特異的に結合するが、HEK293T対照細胞には結合しないことによって検証した（図17A）。クローン6H11 mAbは、mCD112R-Fcタンパク質のmCD112トランスフェクタントへの結合を完全に除去し、これによって、それがマウスにおけるCD112R/CD112相互作用に関する遮断mAbであることが示された（図17B）。ナイーブマウス脾臓からの免疫細胞における表面CD112R発現は、NK細胞のわずかな割合による以外は検出されなかった（図17Cおよび17D）。ポリIC注射によってインビボで活性化すると、多くのNK細胞 (53.3%) がCD112Rの表面発現を上方制御した（図17C）。ナイーブOT-1 T細胞はCD112Rを発現しない；しかしながら、インビトロでOVAペプチドによって活性化すると、OT-1は表面CD112Rを実質的に上方制御した（図17E）。同様に、野生型 (WT) B6マウスからのCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞はいずれも、CD3 mAb＋CD28 mAbによる刺激に応答してCD112Rを上方制御した（図17F）。したがって、マウスにおけるCD112Rの発現は、ヒトにおける知見と同様に、活性化T細胞およびNK細胞において濃縮された。
【０４９４】
CD112R/CD112経路は、マウス腫瘍部位において高度に発現される
いくつかの一般的に使用されるマウス腫瘍細胞株において、CD112発現を評価した。がんにおけるヒトCD112発現と同様に、接着性細胞株B16F10およびCT26がCD112を一貫して発現したのに対して、リンパ腫細胞株EG7 (EL4-OVA) はCD112陰性であった（図18A）。マウスTILにおけるCD112R発現もまた調べた。がん部位におけるNK細胞のかなりの部分 (>50%) は、CD112R陽性であった（図18B）。流入領域リンパ節 (dLN) においてCD112Rを発現するT細胞はほとんどなかったが (<2%)、CD4+ T細胞サブセット（約20%）およびCD8+ T細胞サブセット（約50%）の両方を含むT細胞の大きな割合が、CD112Rを上方制御した（図18C）。理論によって縛られることは意図しないが、これらのデータのすべてから、がん部位において果たし得るCD112R経路の役割が示唆される。
【０４９５】
CD112Rは、マウスTILにおいて他の免疫チェックポイントと共発現される
がん部位におけるこれらのCD112R+ T細胞をさらに特徴づけるため、TILを、PD-1、TIM-3、およびLAG3を含む他の公知の免疫チェックポイントと共にCD112Rの発現について調べた。CD8+ TILおよびCD4+ TILの両方において、CD112RはPD-1、TIM-3、およびLAG3と共発現された（図19）。理論によって縛られることは意図しないが、CD112Rと他の免疫チェックポイントとの共発現によって、TIL枯渇において果たし得るCD112Rの役割が示唆され、他の免疫チェックポイントと共にCD112Rを標的とすることによるがん免疫療法の組み合わせアプローチが正当化される。
【０４９６】
メラノーマ肺転移マウスモデルにおいて、CD112Rシグナル伝達の遮断により抗がん免疫が改善される
TILにおいてCD112Rが上方制御されたため、インビボでCD112Rを標的とすると抗原免疫が促進されるかどうかを調べるために研究を行った。B16F10が：a) NK細胞感受性；およびb) CD112R陽性であるという事実に基づいて（図18A）、CD112R遮断の抗がん効果の可能性を評価するためにB16F10メラノーマ細胞を選択した。B16F10メラノーマをB6マウスに静脈内 (iv) 注射して肺転移を誘導した場合、mCD112R遮断mAbを投与すると、B16F10腫瘍転移は阻害された（図20）。理論によって縛られることは意図しないが、これらの結果から、腫瘍免疫におけるCD112R/CD112相互作用の不可欠な役割が示唆される。
【０４９７】
実施例20：ヒトNK細胞によるトラスツズマブ誘発性ADCCに及ぼすCD112R遮断の効果
ヒト乳がんにおいて、CD112R遮断は、Herceptinによって誘発される抗がん効果を改善する
CD112RはNK細胞において発現され、NK細胞活性の機能的阻害剤であり得る。トラスツズマブは、乳がんを有する女性の約4分の1において過剰発現される膜貫通受容体チロシンキナーゼであるヒト上皮増殖因子受容体2（HER2；HER-2/neuとしても知られる）を標的とするヒト化mAbである。NK細胞によって媒介される抗体依存性細胞傷害 (ADCC) は、トラスツズマブの抗腫瘍活性に寄与する主要な機構の1つである。
【０４９８】
ヒト乳がん細胞は、高レベルのPVR様リガンドCD112およびCD155を発現した（図21A）。したがって、CD112R遮断がNK細胞媒介性の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害 (ADCC) を促進し得るかどうかを調べるために、研究を行った。ヒトNK細胞を、HER2を発現するヒト乳がん細胞株であるSK-BR3細胞；トラスツズマブ (0.01ug/ml)、およびCD112Rに対する遮断mAbまたは対照マウスIgGと共に培養した。単独でのCD112R遮断は、対照におけるNK細胞のものと比較して、IFN-γ陽性NK細胞の割合の有意な増加をもたらした（図21B）。同様に、CD107a陽性NK細胞の割合も、CD112R遮断時に有意に増加した（図21C）。TIGIT遮断mAbを含めると、NK細胞活性はさらに増強された（図21B、1C）。したがって、理論によって縛られることは意図しないが、これらの結果から、CD112R遮断が、トラスツズマブコーティングされた乳がんに対するNK細胞活性を促進し得ることが示唆される。
【０４９９】
実施例21：水素重水素交換質量分析によるヒト抗CD112R 2H6抗体のエピトープマッピング
ヒトCD112Rと抗CD112R mAb 2H6との間の相互作用領域を、水素重水素交換質量分析 (HDX-MS) により決定した。HDX-MSは、重水素の水素との交換による、タンパク質のアミド骨格中への取り込みを調べる。交換速度は、溶媒への水素の曝露によって影響を受ける。抗体が結合している場合の抗原における交換レベルの比較により、抗体が結合するタンパク質の領域を同定することができる。
【０５００】
本明細書において示される研究では、図22に示される、以下のアミノ酸配列を有するCD112R-mFcタンパク質を使用した：
2018529667.tif 000098
【０５０１】
およそ2.4対1（抗体 対 タンパク質）比となるように、CD112R-mFcタンパク質 (約5.45μM) を2H6 mAb (約13μM) と共に10度で1時間プレインキュベートして、2H6 mAbに結合するCD112Rタンパク質の量を最大化した。タンパク質とmAbの混合物10μLを40uLのD20と共に10度で10分間および60分間インキュベートし、50μLの氷冷クエンチ緩衝液（100 mM第二リン酸カリウムHCl、pH 2.4）でクエンチした。対照として、単独の10μl CD112Rタンパク質（すなわち、SEQ ID NO: 45）を同条件で処理した。インキュベーションはいずれも、標識段階中に80% のD20を提供する。HXMSデータ解析は、ペプチドリスト同定に関してはPLGSにより、ならびに同位体割り当ておよび取り込み排出に関してはDynamX 3.0により行った（手作業により検証した）。CD112Rタンパク質の配列全体の71%をカバーする53種の特有のCD112Rペプチド配列（図22）が同定された。図23および図24に図示されるように、配列
2018529667.tif 000099
をカバーするペプチド領域の周囲に、CD112R+ Abデータセットにおいて保護の異なる領域が存在する。このパターンは、この領域内に同定されるいくつかのペプチドにおいて反復される。このデータから、アミノ酸のこの狭い領域内に、2H6 mAbが結合する潜在的エピトープが存在することが示される。
【０５０２】
他の態様
本開示をその詳細な説明と共に記載してきたが、前述の説明は例示を意図するものであって、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲の範囲によって定義されることが理解されるべきである。他の局面、利点、および変更は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１Ａ】
2018529667.tif 000107
【図１Ｂ】
2018529667.tif 000108
【図１Ｃ】
2018529667.tif 000109
【図１Ｄ】
2018529667.tif 000110
【図１Ｅ】
2018529667.tif 000111
【図１Ｆ】
2018529667.tif 000112
【図１Ｇ】
2018529667.tif 000113
【図１Ｈ】
2018529667.tif 000114
【図２Ａ】
2018529667.tif 000115
【図２Ｂ】
2018529667.tif 000116
【図２Ｃ】
2018529667.tif 000117
【図２Ｄ】
2018529667.tif 000118
【図３Ａ】
2018529667.tif 000119
【図３Ｂ】
2018529667.tif 000120
【図３Ｃ】
2018529667.tif 000121
【図３Ｄ】
2018529667.tif 000122
【図３Ｅ】
2018529667.tif 000123
【図３Ｆ】
2018529667.tif 000124
【図４Ａ】
2018529667.tif 000125
【図４Ｂ】
2018529667.tif 000126
【図４Ｃ】
2018529667.tif 000127
【図４Ｄ】
2018529667.tif 000128
【図４Ｅ】
2018529667.tif 000129
【図４Ｆ】
2018529667.tif 000130
【図４Ｇ】
2018529667.tif 000131
【図５Ａ】
2018529667.tif 000132
【図５Ｂ】
2018529667.tif 000133
【図６Ａ】
2018529667.tif 000134
【図６Ｂ】
2018529667.tif 000135
【図６Ｃ】
2018529667.tif 000136
【図７】
2018529667.tif 000137
【図８】
2018529667.tif 000138
【図９】
2018529667.tif 000139
【図１０】
2018529667.tif 000140
【図１１Ａ】
2018529667.tif 000141
【図１１Ｂ】
2018529667.tif 000142
【図１１Ｃ】
2018529667.tif 000143
【図１１Ｄ】
2018529667.tif 000144
【図１２Ａ】
2018529667.tif 000145
【図１２Ｂ】
2018529667.tif 000146
【図１２Ｃ】
2018529667.tif 000147
【図１２Ｄ】
2018529667.tif 000148
【図１２Ｅ】
2018529667.tif 000149
【図１３Ａ】
2018529667.tif 000150
【図１３Ｂ】
2018529667.tif 000151
【図１４−１】
2018529667.tif 000152
【図１４−２】
2018529667.tif 000153
【図１５】
2018529667.tif 000154
【図１６Ａ】
2018529667.tif 000155
【図１６Ｂ】
2018529667.tif 000156
【図１６Ｃ】
2018529667.tif 000157
【図１７Ａ】
2018529667.tif 000158
【図１７Ｂ】
2018529667.tif 000159
【図１７Ｃ】
2018529667.tif 000160
【図１７Ｄ】
2018529667.tif 000161
【図１７Ｅ】
2018529667.tif 000162
【図１７Ｆ】
2018529667.tif 000163
【図１８Ａ】
2018529667.tif 000164
【図１８Ｂ】
2018529667.tif 000165
【図１８Ｃ】
2018529667.tif 000166
【図１９−１】
2018529667.tif 000167
【図１９−２】
2018529667.tif 000168
【図２０】
2018529667.tif 000169
【図２１Ａ】
2018529667.tif 000170
【図２１Ｂ】
2018529667.tif 000171
【図２１Ｃ】
2018529667.tif 000172
【図２２】
2018529667.tif 000173
【図２３】
2018529667.tif 000174
【図２４】
2018529667.tif 000175
【配列表】
2018529667000001.app
【国際調査報告】
2018529667.tif 000176
2018529667.tif 000177
2018529667.tif 000178