(57)【要約】  本発明は、標的生物内の遺伝子の発現を転写後に停止させるために、細胞溶解物中に存在するｄｓＲＮＡの生物活性を実質的に保持するか又は他に保存する方法であって、タンパク質架橋剤又はアミン架橋剤の機能を有する化合物を溶解物に添加する工程を含む方法を提供する。本発明は、ｄｓＲＮＡを含む溶解物と、タンパク質架橋剤とを含む組成物、及び前記架橋剤の本方法における使用も含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的生物内の遺伝子の発現を転写後に停止させるために、細胞溶解物中に存在するｄｓＲＮＡの生物活性を実質的に保持するか又は他に保存する方法であって、タンパク質架橋剤又はアミン架橋剤の機能を有する化合物を前記溶解物に添加する工程を含む方法。
【請求項２】
前記架橋剤が、前記溶解物が形成されるときに前記細胞へ添加されるか、又は前記溶解物が形成された後に前記溶解物へ添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記架橋剤が、前記溶解物が投与される場所へ添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記架橋剤が、前記溶解物の投与前に前記場所へ添加される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記場所が、土壌である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記架橋剤が、ポリアルデヒド、ジアルデヒド、ジエポキシド、ポリエポキシド、ピリジルジスルフィド、多官能性カルボジイミド、多官能性マレイミド、多官能性イミドエステル、多官能性ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及び多官能性ハロアセタールからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記架橋剤が、グルタルアルデヒドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記溶解物が調製される前記細胞が、熱的不活性化によって任意に事前に不活性化された細菌細胞である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細菌細胞が、転写されたときに、二本鎖ＲＮＡであって、その少なくとも一部が、真核生物細胞内の遺伝子のｍＲＮＡの配列と実質的に同一である配列を含む二本鎖ＲＮＡをもたらすＤＮＡ配列を含むように操作されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
真核生物が、ディアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）（ウェスタンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・バルベリ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｒｂｅｒｉ）（ノーザンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・ウンデキムプンクタタ・ホワルディ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｈｏｗａｒｄｉ）（サザンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・ヴィルギフェラ・ゼアエ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｚｅａｅ）（メキシカンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・スペキオサ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｓｐｅｃｉｏｓａ）（ウリムシ）からなる群から選択される昆虫、線虫、ハリガネムシ及び地虫、ならびに細菌及び真菌などの適切な土壌病原体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶解物が、細菌細胞の溶解物であり、前記架橋剤が、グルタルアルデヒドであり、前記グルタルアルデヒドが、前記溶解物の体積に関して０．７〜０．２％の量で土壌に適用され、前記生物活性が、少なくとも１４日間の期間中に実質的に保持される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
細胞溶解物及びタンパク質架橋剤を含む物質の組成物であって、土壌を含み、前記溶解物が、ｄｓＲＮＡを含み、かつ前記架橋剤が、グルタルアルデヒドであることを特徴とする組成物。
【請求項１３】
細胞内で異種的に発現されたｄｓＲＮＡの生物活性を保持する目的で添加されたタンパク質架橋剤を含む細胞溶解物。
【請求項１４】
細胞溶解物中に存在するｄｓＲＮＡの生物活性を実質的に安定化するか又は他に保存するための、タンパク質架橋剤又はアミン架橋剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二本鎖ＲＮＡによる遺伝子発現の制御に関する。特に、本発明は、外因的に（即ち、標的生物の外側に、かつ比較的厳しい環境条件下で）投与された二本鎖ＲＮＡが標的生物おいて遺伝子発現を停止させる能力を増強する方法に関する。本発明は、本方法で使用するための組成物、及び特定の既知の架橋剤の本方法における使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉が潜在的に遺伝子発現を停止させる現象はよく知られている。
【０００３】
ＲＮＡは比較的不安定であり、例えば、細胞の外側に遍在的に存在するリボヌクレアーゼによって急速に分解され得る。ｄｓＲＮＡを直接的に標的生物へ適用するか、又は外因性投与によりこれらが存在する場所へ適用することの問題は、ＲＮＡの安定性の乏しさに関する。外因性適用とは、生物がそれを取り込むことができるような方法、又は標的生物と異なる第１の生物においてｄｓＲＮＡが産生され、かつ標的生物が第１の生物又はｄｓＲＮＡを含むその一部を取り込むような方法で標的生物に適用されることを意味し、その結果、前記ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡにより含まれる配列に対応するヌクレオチド配列を含む遺伝子の転写後サイレンシング(post-transcriptional silencing)をもたらすことができる。外因性適用は、標的遺伝子を転写後に発現停止させることができる二本鎖ＲＮＡが標的生物の細胞内で産生されること（一般的に、適切な異種配列からの発現による）を意味する内因性産生と区別される。
【０００４】
外因的に適用されたｄｓＲＮＡは、一般的に、適用後、短期間内、おそらく最大でも数日間にわたり関連の生物学的効果を発揮することができるが、効果は一般的に急速に低下し、通常、ｄｓＲＮＡは、例えば、土壌中でわずか約１２〜２４時間の半減期を有し、更に、それが投与される正確な環境条件に依存する。ｄｓＲＮＡを、その安定性を増強するポリマーにカプセル化するか又は他に結合させることによってｄｓＲＮＡを安定化し、従って作用の持続時間の増大を提供することなど、この問題に対する種々の解決法が提唱されている。効果の持続時間には２つの態様がある。遺伝子サイレンシング自体は、関連タンパク質の回転率に応じて消滅し得る。周囲条件における土壌とのインキュベーションにおいて、ｄｓＲＮＡは約２日以内に分解される。ｄｓＲＮＡはこれよりも実質的に長い効果を有することが可能であり、本発明の利点は、環境中のｄｓＲＮＡの残留性を増大させることである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従って、本発明は、通常、圃場条件下（一般的に、ｄｓＲＮＡの急速な分解又は不活性化につながる）で生物に外因的に適用されるｄｓＲＮＡの比較的急速な不活性化の問題の解決法に関する。
【０００６】
本発明によると、標的生物内の遺伝子の発現を転写後に停止させるために、細胞溶解物中に存在するｄｓＲＮＡの生物活性を実質的に保持するか又は他に保存する方法であって、タンパク質架橋剤又はアミン架橋剤の機能を有する化合物を溶解物に添加する工程を含む方法が提供される。
【０００７】
「溶解物」とは、単に細胞溶解の生成物を意味する。しかしながら、溶解は、好ましくはあるが必ずしも１００％でなくてもよい。即ち、溶解物は、細胞の全ての溶解の生成物を含まなくてもよい。また、他方で、溶解は、溶解物が比較的ごくわずか（例えば、約１０％未満）の細胞の溶解生成物のみを含むことを意味しない。従って、当業者は、溶解物は、たとえ比較的低い割合で実質的に無傷の細胞を含んでいても、依然として溶解物であることを認識するであろう。
【０００８】
細胞溶解物は、通常、細胞を機械的に分解又はせん断することによって生成され得るが、これらは、通常、例えば低温殺菌又は熱的もしくは化学的不活性化を含むいくつかの他のプロセスによって細菌細胞が不活性化されるときに生じるため、細胞不活性化プロセスの一部として生成させることもできる。
【０００９】
架橋剤は、溶解物が形成されるとき（即ち、溶解物の形成プロセスの一部として）に細胞に添加されてもよく、又は溶解物が形成された後に溶解物に添加されてもよい。あるいは、架橋剤は、溶解物が投与される場所に添加されてもよい。場所とは、任意選択的に架橋剤を含む溶解物が投与されるところを意味し、植物が生育している圃場、又は栽培植物の種子が蒔かれる圃場、又はこのような種子もしくは植物が植えられる予定の土壌、又は更に圃場、土壌、種子、及び／もしくは植物自体が含まれる。架橋剤は、溶解物の投与前に前記場所に添加されることが可能である。
【００１０】
本方法の好ましい実施形態では、場所は土壌であり、組成物は、例えばコーンルートワームなどの昆虫有害生物の必須遺伝子に対してｄｓＲＮＡを標的化することにより保護されることが所望される植物の近くで土壌に適用される。
【００１１】
架橋剤は、ポリアルデヒド、ジアルデヒド、ジエポキシド、ポリエポキシド、ピリジルジスルフィド、カルボジイミド、ジ又はポリイソシアナート、多官能性マレイミド、ジ又はポリイミドエステル、ビス−ジアゾニウム、ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びハロアセタール、ならびに更に少なくとも２つの官能基（同じであっても異なっていてもよい）を含む任意の他の既知の架橋剤からなる群から選択され得る。いくつかの架橋剤は水にやや溶けにくく、この場合、これらは、適切な溶媒中又は水及びこのような溶媒の混合物中の溶液において都合よく使用され得る。より好ましくは、架橋剤は、ポリアルデヒド及びジアルデヒドから、更により好ましくはジアルデヒドからなる群から選択される。最も特に好ましいジアルデヒドはグルタルアルデヒドであり、本発明の方法におけるその特定の使用は以下に例示される。グルタルアルデヒドは、反応が都合よく速いが、取り扱いが困難である程度に速くないような反応性であるために好ましい。グルタルアルデヒドは比較的無毒性であり、都合よく水溶性であり、容易に入手可能でありかつ安価である。
【００１２】
本方法の特定の実施形態では、溶解物が形成される細胞は、細菌細胞であるが、藻類及び更に植物又は他の真核生物細胞を含む他の細胞が溶解物の原料であってもよい。
【００１３】
上記のように、細胞が細菌細胞である場合、溶解物は、（少なくともある程度）その不活性化プロセスの結果として生じ得る。熱による不活性化（かなり幅広い範囲の温度及び持続時間の条件下）、過酢酸、アスコルビン酸第二銅、次亜塩素酸ナトリウム、過酸化水素、チオシアン酸グアニジニウム、ホルムアルデヒド及び他のモノアルデヒドのようなものによる化学的不活性化、ならびに電離放射線への暴露を含む、種々の不活性化プロセスが当該技術分野において知られている。いずれのプロセスが使用されても、上記で示されるようにいくらかの実質的に無傷の細菌を含有し得る溶解物は、生物学的に生存可能な細菌を全く含有しない。従って、溶解物は、細菌細胞の不活性化プロセスの一部として調製されてもよく、又は細胞は、実質的に不活性化されるが実質的に無傷であることがあり、続いてそこから溶解物が生成されてもよい。
【００１４】
溶解物を生成させる細胞は、原核生物であっても真核生物であっても、転写されたときに、二本鎖ＲＮＡであって、その少なくとも一部が、真核生物細胞（特に、例えば昆虫などの植物有害生物の細胞）内の遺伝子のｍＲＮＡの配列と実質的に同一である配列を含む二本鎖ＲＮＡをもたらすＤＮＡ配列を含むように操作される。このような昆虫有害生物の典型的な例としては、ディアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）（ウェスタンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・バルベリ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｒｂｅｒｉ）（ノーザンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・ウンデキムプンクタタ・ホワルディ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｈｏｗａｒｄｉ）（サザンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・ヴィルギフェラ・ゼアエ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｚｅａｅ）（メキシカンコーンルートワーム）及びディアブロティカ・スペキオサ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｓｐｅｃｉｏｓａ）（ウリムシ（ｃｕｃｕｒｂｉｔ  ｂｅｅｔｌｅ））が挙げられる。ｄｓＲＮＡが有効であり得る有害生物には、線虫、ハリガネムシ（wireworm）及び地虫(grub)、ならびに細菌及び真菌などの適切な土壌病原体など、農学者によく知られている種々の有害生物も含まれる。
【００１５】
細胞溶解物中に存在するか、又は細胞溶解物へ添加される架橋剤の濃度は比較的重要である。溶解物中に存在するか、又は溶解物が添加される場所に添加されるかもしくは他に存在する架橋剤が多すぎる又は少なすぎると、転写後遺伝子サイレンシング効果を示すことできるｄｓＲＮＡがそれほど有効ではない。例えば、架橋剤がグルタルアルデヒドであり、発酵ブロスが約４０ｇ／Ｌのバイオマス（遠心ペレットとして捕集される）を含有する場合、架橋剤は、６〜０．１％、より好ましくは２．５〜０．１５％、更により好ましくは０．７〜０．２％の量で溶解物中に／場所に存在する（ここで、％は溶解物の最終体積に関するものである）。グルタルアルデヒドのこれらの量は、発酵ブロスの濃度が異なる栄養培地及び成長条件と共に変化するにつれて、それに比例して調整され得る。
【００１６】
本発明の特に好ましい実施形態では、溶解物は細菌細胞の溶解物であり、架橋剤は、溶解物の最終体積により０．７〜０．２％の量で溶解物中に存在するグルタルアルデヒドである。作用機序の任意の特定の解釈により限定されることなく、過剰な架橋剤は、ｄｓＲＮＡの生物学的利用能を低減することが理解され、一方、少なすぎる架橋剤は、所望される安定性の改善を付与しない。
【００１７】
本発明の方法の使用は、溶解物中に存在するｄｓＲＮＡに関連する生物活性の持続時間をかなり大幅に延長し、通常、架橋剤を使用せずに土壌に投与された溶解物中に存在するｄｓＲＮＡと比べて、１４日間まで及びそれを超える期間、かつ更に１２週間までにわたり、約１２℃よりも高い温度の土壌環境下で活性を保持する。
【００１８】
また、本発明は細胞溶解物及びタンパク質架橋剤を含む物質の組成物も含み、本組成物が土壌を含み、溶解物がｄｓＲＮＡを含み、かつ架橋剤がグルタルアルデヒドであることを特徴とする．
【００１９】
また、本発明は、細胞内で異種的に(heterologously)発現されるｄｓＲＮＡの生物活性を保持する目的で添加されたタンパク質架橋剤を含む細胞溶解物と、細胞溶解物中に存在するｄｓＲＮＡの生物活性を実質的に安定化するか又は他に保存するためのタンパク質架橋剤の使用とを含む。
【００２０】
本発明は、以下の非限定的な実施例から更に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】土壌へ暴露した後の細菌産生ｄｓＲＮＡの定性的評価を示す。
【図２】トリポニン（ｔｒｙｐｏｎｉｎ）Ｉであり、コーンルートワームの潜在的な必須遺伝子として知られている標的Ｄｖｓ００６．５に対して熱的不活性化（白色棒）又は熱的不活性化＋グルタルアルデヒド細菌材料（黒色棒）のいずれかで処理した土壌の寄生の７日後の幼虫の死亡率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
試験サンプルの作製  −  発酵
Ｔ７駆動性ｄｓＲＮＡ発現カセットを含有するプラスミドをＨＴ１１５（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内に形質転換した。
【００２３】
ｄｓＲＮＡの産生のために、単一コロニーから培養物を播種し、適切な抗生物質を含有するＬＢ培地中で一晩成長させた。
【００２４】
次に、適切な抗生物質を含有するＬＢを用いて、一晩培養物をＯＤ600＝１に希釈した。ｄｓＲＮＡの転写を誘導するために、ＩＰＴＧを１．０ｍＭの最終濃度まで添加した。次に、２５０ｒｐｍで振とうさせながら、培養物を３７℃で３．５時間インキュベートした。
【００２５】
誘導後、培養物を遠心分離し、関連のＯＤ600、通常、５０〜１００単位／ｍｌ（ここで、１単位はＯＤ600＝１における１ｍｌの細胞に相当する）で再懸濁させ、上澄みを廃棄した。次に、さらなる実験のためにペレットを不活性化した。
【００２６】
熱的不活性化。熱処理、通常、低温殺菌法についてよく知られているようにフロースルーで細菌ブロスを加熱することからなる「高温短時間」プロセスのＨＴＳＴ処理によって細菌を死滅させた。処理したブロスのアリコートをＬＢプレート上に画線し、３７℃で一晩のインキュベーションにより、細菌の非生存性を確認した。
【００２７】
土壌安定性の増大のための製剤。土壌安定性又は土壌生物活性アッセイを始める直前に必要量のグルタルアルデヒドを液体ブロスへピペットで移し、チューブのボルテックスにより混合することにより、グルタルアルデヒド（Ｈ２Ｏ中７０％、Ｇ７７７６  Ｓｉｇｍａ）をサンプルに添加した。
【００２８】
土壌安定性アッセイにおいて。このアッセイは、土壌中に存在するときのｄｓＲＮＡの安定性を評価するために開発された。この定性的アッセイのために、通常、２ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中で０．５ｇの土壌を１０単位に相当する不活性化細菌材料と混合した。ｄｓＲＮＡ安定性に対する土壌暴露の効果を評価するために、ｄｓＲＮＡを土壌から抽出し、アガロースゲルにおいて分析した。そのために、まず全ＲＮＡ抽出を実施した後、ＬｉＣｌ沈殿を用いて二本鎖ＲＮＡを濃縮した。
【００２９】
ＲＮＡ抽出。土壌及び細菌溶液を含有するチューブに１ｍｌのＴＲＩｒｅａｇｅｎｔ（ＴＲ１１８−２００、Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  Ｃｈｅｍｉｅ）を添加した。混合後、溶液を室温で５分間インキュベートした。２００μｌのクロロホルムを添加し、溶液を再度混合した。室温で３分間のインキュベーション後、遠心分離により相を分離した。上相を新しいチューブに移し、さらなる処理のために使用した。イソプロパノールで沈殿させた後、７０％のＥｔＯＨを用いてペレットを洗浄した。ＥｔＯＨをペレットから除去し、これを放置して乾燥させた後、ＤＥＰＣ水中に溶解させた。
【００３０】
ＬｉＣｌ沈殿。ＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ抽出から得られる全ＲＮＡに対して２回の連続的なＬｉＣｌ沈殿を行った。第１の沈殿工程は、２Ｍの最終濃度のＬｉＣｌにより実施した。次に、４Ｍの最終濃度のＬｉＣｌを用いて上澄みを再度沈殿させた。次に、得られたペレットを７０％のＥｔＯＨで洗浄し、続いてＤＥＰＣ水中に溶解させた。
【００３１】
次に、得られたｄｓＲＮＡを２％のアガロースゲルにおいて定性的に分析した。
【００３２】
土壌生物活性アッセイにおいて。このアッセイは、土壌へ暴露した後の細菌産生ｄｓＲＮＡの生物活性を評価するために最適化される。３００μｌの寒天層と、寒天の上部の２５０ｍｇの土壌とを含有する４８ウェルプレートを作製した。５０μｌの対象のサンプルを土壌の上に局所的に適用した。土壌中のサンプルのインキュベーション後、１ウェル当たり５０匹の幼虫をプレートに寄生させた。２６℃の暗所で土壌プレート上に幼虫を２４時間留めた。その後、さらなる経過観察のために幼虫を人工的なダイエットプレートに移した（１ウェル当たり１匹の幼虫）。寄生の７日後まで毎日生存を評価した。
【００３３】
結果
土壌安定性アッセイにおいて。活性土壌環境中の細菌産生ｄｓＲＮＡの安定性に対するグルタルアルデヒドの添加の効果を評価した。コーンルートワーム標的Ｄｖｓ００６．５に対するｄｓＲＮＡを含有する細菌培養物を生成させた。熱処理したＤｖｓ００６．５サンプルは０時点及び１２時間後では目に見えたが、ｄｓＲＮＡは急速に分解し、２４時間後のゲルでは見えなかった（図１−Ａ）。細菌溶解物の土壌安定性に対するグルタルアルデヒドの効果を評価するために、不活性化細菌ブロスを異なる量のグルタルアルデヒドと混合することにより異なるアリコートを調製した。このアッセイでは、２３％、７％、２．３％、０．７％及び０．２％の最終濃度に達するようにグルタルアルデヒドを添加した（図１−Ｂ）。サンプルを土壌に適用し、２５℃で０、１２、２４、４８、７２、９６、１２０及び１４４時間インキュベートした。次に、ＲＮＡ抽出及びその後のＬｉＣｌ沈殿を用いて、ｄｓＲＮＡを記載されるように抽出した。
【００３４】
ｄｓＲＮＡを２％のアガロースゲルに負荷させた（図１−Ａ及び１−Ｂ）。
【００３５】
高濃度のグルタルアルデヒド（２３％及び７％）は、０時点から土壌からのｄｓＲＮＡの回収を損なうようであったが、２．３％又は０．７％のグルタルアルデヒドの存在下では、ｄｓＲＮＡは１４４時間（６日間）までにわたり土壌と共にインキュベートした細菌溶解物から抽出された。より低濃度のグルタルアルデヒド（０．２％）は、７２時間までにわたり安定性の増大を提供した。
【００３６】
土壌生物活性アッセイにおいて。土壌安定性アッセイ（上記）で試験したものと同じサンプルを用いてアッセイを開始した。簡単に、ＧＦＰ  ｄｓＲＮＡ対照又は活性Ｄｖｓ００６．５  ｄｓＲＮＡのいずれかを発現する不活性化細菌ブロスをグルタルアルデヒドと混合することにより、異なるアリコートの活性成分を調製した。土壌安定性アッセイの結果に基づいて、この実験のために０．７％のグルタルアルデヒドの濃度を選択した。２．５μｇ、２５μｇ又は５０μｇに等しいｄｓＲＮＡの最終濃度に達するまで、異なる量のサンプルを４８ウェルプレート内の土壌へ適用した。プレートを２５℃で０、３、７及び１４日間インキュベートした後、幼虫を寄生させた。
【００３７】
土壌プレートにおける２４時間のインキュベーション後、１処理当たり少なくとも３０匹の幼虫を人工的なダイエットプレートに移した（１ウェル当たり１匹の幼虫）。幼虫の死亡率を７日間毎日評価した。寄生の７日後の幼虫の死亡率のデータが示される（図２）。幼虫寄生の日（０日目）に活性成分を土壌プレートに添加すると、熱的不活性化及び熱的不活性化＋グルタルアルデヒド材料の両方によって著しい死亡率が誘導された。熱処理サンプルからのｄｓＲＮＡが１２時間後に土壌から抽出されなかった土壌安定性アッセイから予想されるように（図２）、土壌中で３、７及び１４日間の活性成分のインキュベーションは、生物活性の明らかな低下をもたらした。対照的に、０．７％のグルタルアルデヒドの存在下では、土壌中で１４日までのインキュベーションにわたり、活性成分の生物活性は変化しないままであった（８０〜１００％）。
【００３８】
データは、０．７％のグルタルアルデヒドが補充された細菌溶解物中のｄｓＲＮＡが土壌中で１４日間安定しており、グルタルアルデヒド処理が土壌中の分解に対して活性成分を保護し、従ってｄｓＲＮＡの残留性を延長する方法を提供したことを示す。
【００３９】
図の凡例
図１：土壌へ暴露した後の細菌産生ｄｓＲＮＡの定性的評価。（Ａ）０、１２、２４、４８又は７２時間の土壌曝露後の熱的不活性化された細菌産生ｄｓＲＮＡ。（Ｂ）０、１２、２４、４８、７２、９６、１２０及び１４４時間の土壌曝露後の、２３％、７％、２．３％、０．７％及び０．２％のグルタルアルデヒドが補充された、熱的不活性化された細菌産生ｄｓＲＮＡ。サンプルをマーカー（Ｍ；１ｋｂラダー）と比較した。白色矢印は、無傷のｄｓＲＮＡに相当するバンドを示す。
【００４０】
図２：標的Ｄｖｓ００６．５に対して熱的不活性化（白色棒）又は熱的不活性化＋グルタルアルデヒド細菌材料（黒色棒）のいずれかで処理した土壌の寄生の７日後の幼虫の死亡率。縞模様の棒は、グルタルアルデヒドの存在下又は非存在下において、負の対照ｄｓＲＮＡで処理した土壌上でインキュベートした幼虫の死亡率を示す。幼虫寄生の０日前、３日前、７日前及び１４日前にサンプルを土壌に適用した。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
2018529386.tif 000004
2018529386.tif 000005
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