(57)【要約】  本発明は、抗代替軽鎖抗体及びそれらの使用に関する。具体的には、本発明は、抗ＶｐｒｅＢ１抗体及びそれらの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
代替軽鎖（ＳＬＣ）に特異的に結合する単離抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記抗体が、前記ＳＬＣのＶｐｒｅＢサブユニットに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体、または抗原結合断片。
【請求項３】
前記ＶｐｒｅＢサブユニットが、配列番号１のヒトＶｐｒｅＢ１である、請求項２に記載の抗体、または抗原結合断片。
【請求項４】
前記ＶｐｒｅＢサブユニットが、配列番号２または配列番号３のマウスＶｐｒｅＢ２である、請求項２に記載の抗体、または抗原結合断片。
【請求項５】
前記ＶｐｒｅＢサブユニットが、配列番号４のヒトＶｐｒｅＢ３である、請求項２に記載の抗体、または抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗体が、前記ＳＬＣのλ５サブユニットに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体、または抗原結合断片。
【請求項７】
前記λ５サブユニットが、配列番号７のヒトλ５である、請求項６に記載の抗体、または抗原結合断片。
【請求項８】
前記λ５サブユニットが、配列番号９のヒトλ５ｄＴａｉｌである、請求項６に記載の抗体、または抗原結合断片。
【請求項９】
前記抗体が、配列番号３６〜５１からなる群から選択される軽鎖可変領域配列を含む、請求項３に記載の抗体、または抗原結合断片。
【請求項１０】
前記抗体が、配列番号５２〜６７からなる群から選択される重鎖可変領域配列を含む、請求項３に記載の抗体、または抗原結合断片。
【請求項１１】
前記抗体が、配列番号５２〜６７からなる群から選択される重鎖可変領域配列を含む、請求項９に記載の抗体、または抗原結合断片。
【請求項１２】
前記抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、ｓｃＦｖ、及び（ｓｃＦｖ）２断片からなる群から選択される、請求項２に記載の抗体。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片を含む、組成物。
【請求項１４】
診断用組成物である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
ヒト対象におけるリウマチ性関節炎の診断のための方法であって、前記対象に由来する生物試料を、ヒト代替軽鎖（ＳＬＣ）に特異的に結合する抗体と接触させることと、ＳＬＣの発現レベルを決定することと、を含む、方法。
【請求項１６】
異常なＳＬＣ発現に関連付けられる白血病または自己免疫疾患の診断のための方法であって、対象に由来する生物試料を、ヒト代替軽鎖（ＳＬＣ）に特異的に結合する抗体と接触させることと、ＳＬＣの発現レベルを決定することと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
Ｂリンパ球によって産生される抗体（Ｉｇ）分子は、重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖から作られる。Ｈ鎖及びＬ鎖のアミノ末端ドメインのアミノ酸配列は、特に抗原結合部位を形成する３つの超可変領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）において、可変的である（ＶＨ及びＶＬ）。Ｈ鎖及びＬ鎖の組み立て物は、Ｌ鎖（ＣＬ）の定常領域と重鎖（ＣＨ１）の第１の定常領域との間のジスルフィド結合によって、及びＶＨドメインとＶＬドメインとの間の非共有的な相互作用によって安定される。
【０００２】
ヒト及びマウス等の多くの動物において、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子は、Ｖ領域の一部をコードする遺伝子断片の段階的な体細胞再配列によって組み立てられる。Ｂリンパ球の発達の種々の段階は、Ｉｇ遺伝子座の再配列の状態によって特徴付けられる（例えば、Ｍｅｌｃｈｅｒｓ，Ｆ．＆  Ｒｏｌｉｎｋ，Ａ．，Ｂ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，ｅｄ．，１９９９，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａを参照）。
【０００３】
Ｂ細胞の前駆体（プレＢ細胞）が、完全に成長した軽鎖の代わりにＶｐｒｅＢ（１〜３）及びλ５と呼ばれる一組の遺伝子のそれらの産生、ならびにμ重鎖の共発現によって、骨髄内で確認されている。
【０００４】
ヒトＶｐｒｅＢ１（ＣＡＧ３０４９５）の主要アイソフォームは、１４５ａａ長のポリペプチド（配列番号１）である。それは、ＩｇＶドメイン様構造を有するが、典型的なＶドメインの最後のβ鎖（β７）を欠き、また他のいずれのタンパク質に対しても配列相同性を示さないカルボキシル末端部を有する。ＶｐｒｅＢ２は複数のアイソフォームを有し、１４２−アミノ酸マウスＶｐｒｅＢ２ポリペプチド（Ｐ１３３７３；配列番号２）、及びマウスＶｐｒｅＢ２配列の１７１アミノ酸長スプライスバリアント（ＣＡＡ０１９６４１、配列番号３）が挙げられる。ＶｐｒｅＢ１及びＶｐｒｅＢ２配列は、ＥＰ０  ２６９  １２７及び米国特許第５，１８２，２０５号；Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．５（１０）：Ｒ８４（２００４）；ならびにＨｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６（１４）：５５５２−５５５６（１９８９）に開示されている。ヒトＶｐｒｅＢ３（配列番号４）の主要アイソフォームは、１２３ａａ長のタンパク質（ＣＡＧ３０４９６）であり、Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．５（１０）：Ｒ８４（２００４）に開示されている。
【０００５】
ＶｐｒｅＢ（１〜３）は、別のタンパク質、λ５に非共有的に会合される。ヒトλ５は、抗体軽鎖に対する強い相同性と、そのアミノ末端部に向かって、そのうちの１つがＶλドメインのβ７鎖に対する強い相同性を示す２つの機能的に別個の領域を有するＩｇＣドメイン様構造を持つ２０９−アミノ酸ポリペプチド（ＣＡＡ０１９６２；配列番号７）である。ヒトλ５様タンパク質は、２１３個のアミノ酸（ＮＰ＿０６４４５５；配列番号８）を有し、抗体λ軽鎖定常領域に対して約８４％の配列同一性を示す。
【０００６】
さらなる詳細については、以下のｒｅｖｉｅｗ  ｐａｐｅｒを参照されたい：Ｋａｒａｓｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６３：１−４１（１９９６）；Ｍｅｌｃｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １４：６０−６８（１９９３）；及びＭｅｌｃｈｅｒｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：２５７１−２５７３（１９９９）。
【０００７】
ＶｐｒｅＢ及びλ５ポリペプチドは、非共有的に会合されたＩｇ軽鎖様構造を共に形成し、これは、代替軽鎖または偽軽鎖と呼ばれる。初期のプレＢ細胞の表面上で、代替軽鎖は、シグナル変換器ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂヘテロ二量体と関連して、膜結合Ｉｇμ重鎖にジスルフィド連結されて、Ｂ細胞受容体様構造、いわゆるプレＢ細胞受容体（プレＢＣＲ）を形成する。
【０００８】
Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙは、プレＢ細胞受容体（プレＢＣＲ）に基づき、これは、抗体レパートリーの正常な発達中に産生される。抗体とは異なり、プレＢＣＲは三量体であり、２つの代替軽鎖成分ＶｐｒｅＢ及びλ５と対になった抗体重鎖から構成される。ＶｐｒｅＢ及びλ５はどちらも、遺伝子再配列を受けない遺伝子によってコードされ、Ｖ（Ｄ）Ｊ組み換えが開始する前に初期のプレＢ細胞中で発現される。プレＢＣＲは、それが重鎖と２つの非共有的に会合されたタンパク質：ＶｐｒｅＢ及びλ５とから構成される、すなわち、抗体内に２つとは対照的に３つの成分を有するという点で、成熟免疫グロブリンとは構造的に異なる。さらに、ＶｐｒｅＢは抗体のＶλ  Ｉｇドメインに相同であり、λ５はＣλドメインに相同ではあるが、それらは各々、非標準的なペプチド伸長を有する。ＶｐｒｅＢ１は、追加的な２１個の残基をそのＣ末端に有し、λ５は、５０アミノ酸伸長をそのＮ末端に有する。
【０００９】
κ様Ｂ細胞受容体（κ様ＢＣＲ）は、κ様代替軽鎖（κ様ＳＬＣ）を利用して同定されてきた（Ｆｒａｎｃｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：５９３７−４３（１９９４）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４８：３０５−１  １（１９９８）；Ｒａｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０：１７８０７−１４（２００５））。
【００１０】
Ｒａｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０（１８）：１７８０７−１７８１４（２００５）は、再配列されていないＶκ遺伝子の産生物であるＶκ様タンパク質の同定及び分子的特徴付けを報告しており、それは、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４８：３０５−３１１（１９９８）によって先に報告されたｃＤＮＡ配列と同一であることが分かった。一方、Ｆｒａｎｃｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：５９３７−４３（１９９４）は、Ｂ細胞前駆体の表面においてμ重鎖に会合する能力を有し、それによってＢ細胞の発達のためのλ５経路の代替物を提供する再配列された生殖細胞系ＪＣｋの同定及び特徴付けを報告した。
【００１１】
κ様及びλ様プレＢＣＲは、軽鎖の再配列を促進し、Ｂ細胞の先祖の成熟を確実にするように協働することが提唱されてきた。概要に関しては、ＭｃＫｅｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｖａｌｄｅｚ  Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８：４０４３（２００６）を参照されたい。
【００１２】
Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙの設計及び製造のさらなる詳細は、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００８，１０５（３１）：１０７５６−６１、２００８年１０月２日に公開されたＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／１１８９７０号、２００８年７月１１日に出願された米国仮出願第６１／１３４，９２９号、及びＸｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１０，３９７，３５２−３６０に提供されており、それらの全体の開示は参照により本明細書に明白に援用される。
【００１３】
繊維状ファージに基づく組み合わせ抗体ライブラリの多様性は、重及び軽鎖遺伝子のシャッフリングによって（Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１１１２０−１１１２３，（１９９１））、またはエラープローンポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によるランダム変異のライブラリへの導入によって（Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０，（１９９２））増加され得ることが説明されてきた。抗体ライブラリの生成のための土台としての定義されたフレームワークの使用は、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４４５７−４４６１（１９９２）（ＣＤ３−Ｈ３のランダム化）；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １３７：５７−６２（２００３）（Ｖ．ｓｕｂ．．カッパ．ＣＤＲ３へのランダム化の進展）；及びＨａｙａｎａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：３１０（１９９４）（重複伸長及びＰＣＲによる抗体ＣＤＲ領域の同時変異誘発）によって説明されてきた。他には、単一Ｖ．ｓｕｂ．Ｌ遺伝子とのＣＤＲ−Ｈ３ライブラリの組み合わせ（Ｎｉｓｓｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：６９２−６９８（１９９４））、限られたＶＬ遺伝子の組（Ｄｅ  Ｋｒｕｉｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：９７−１０５（１９９５））、またはＶＬ遺伝子のランダム化レパートリー（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：３２４５−３２６０（１９９４））が報告されている。
【００１４】
同様に、普遍的またはランダム化された免疫グロブリン軽鎖を使用して抗体ライブラリを作り出すための方法を説明している米国特許第５，６６７，９８８号；同第６，０９６，５５１号；同第７，０６７，２８４号も参照されたい。
【００１５】
Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６（２０００）は、ＨｕＣＡＬ（ヒト組み合わせ抗体ライブラリ）と指定されるヒト抗体ライブラリを設計及び構築するための異なる概念を説明している。このアプローチは、免疫応答中に頻繁に使用されるヒトＶ．ｓｕｂ．Ｈ、及びＶ．ｓｕｂ．Ｌサブファミリーの各々は、１つのコンセンサスフレームワークによって表され、重鎖のための７つのＨｕＣＡＬコンセンサス遺伝子及び軽鎖のための７つのＨｕＣＡＬコンセンサス遺伝子をもたらし、これらは４９個の可能な組み合わせを生み出すという発見に基づく。全ての遺伝子は、コドン利用、タンパク質凝集を促進する不要な残基、及び全てのＣＤＲに隣接する固有の一般的な制限部位を考慮して、全合成によって作製される。このアプローチは、必要に応じて、異なる抗体フォーマットに変換され得るＣＤＲを含有するモジュラー抗体遺伝子の生成を導く。ＨｕＣＡＬ抗体ライブラリの設計及び合成は、米国特許第６，３００，０６４号、同第６，６９６，２４８号、同第６，７０６，４８４号、及び同第６，８２８，４２２号に説明されている。
【００１６】
多様性合成抗体ライブラリの構築は、米国特許第８，１３１，４８０号に説明されている。
【発明の概要】
【００１７】
本発明は、抗代替軽鎖（ＳＬＣ）抗体及びそれらの使用に関する。
【００１８】
一態様では、本発明は、代替軽鎖（ＳＬＣ）に特異的に結合することができる単離抗体、またはそれらの抗原結合断片を提供する。一実施形態では、本抗体、または抗原結合断片は、ＳＬＣのＶｐｒｅＢサブユニットに特異的に結合する。別の実施形態では、ＶｐｒｅＢサブユニットは、配列番号１のヒトＶｐｒｅＢ１である。１つの他の実施形態では、ＶｐｒｅＢサブユニットは、配列番号２または配列番号３のマウスＶｐｒｅＢ２である。また別の実施形態では、ＶｐｒｅＢサブユニットは、配列番号４のヒトＶｐｒｅＢ３である。別の実施形態では、本抗体、または抗原結合断片は、ＳＬＣのλ５サブユニットに特異的に結合する。１つの他の実施形態では、λ５サブユニットは、配列番号７のヒトλ５である。また別の実施形態では、λ５サブユニットは、配列番号９のヒトλ５ｄＴａｉｌである。
【００１９】
一実施形態では、本発明は、配列番号３６〜５１からなる群から選択される軽鎖可変領域配列を含む抗体、または抗原結合断片を提供する。別の実施形態では、本抗体または抗原結合断片は、配列番号５２〜６７からなる群から選択される重鎖可変領域配列を含む。また別の実施形態では、配列番号３６〜５１からなる群から選択される軽鎖可変領域配列を含む本抗体、または抗原結合断片は、配列番号５２〜６７からなる群から選択される重鎖可変領域配列をさらに含む。１つの他の実施形態では、本抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、ｓｃＦｖ、及び（ｓｃＦｖ）２断片からなる群から選択される。
【００２０】
別の態様では、本発明は、本明細書に説明される抗体、または抗原結合断片を含有する、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本組成物は、診断用組成物である。
【００２１】
１つの他の態様では、本発明は、自己免疫疾患の診断のための方法を提供する。一実施形態では、本方法は、対象におけるリウマチ性関節炎の診断のために使用される。１つの他の実施形態では、対象は、ヒト患者である。別の実施形態では、本方法は、対象に由来する生物試料を、ヒト代替軽鎖（ＳＬＣ）に特異的に結合する抗体に接触させることと、ＳＬＣの発現レベルを決定することとを含む。
【００２２】
また別の態様では、本発明は、白血病の診断のための方法を提供する。一実施形態では、白血病は、異常なＳＬＣ発現に関連付けられる。別の実施形態では、本方法は、該対象に由来する生物試料を、ヒト代替軽鎖（ＳＬＣ）に特異的に結合する抗体に接触させることと、ＳＬＣの発現レベルを決定することとを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】配列番号１のヒトＶｐｒｅＢ１アミノ酸配列（天然リーダー配列に下線が施されている）、配列番号２及び３のマウスＶｐｒｅＢ２配列、配列番号４のヒトＶｐｒｅＢ３様配列を示し、また「三量体」における短縮されたＶｐｒｅＢ１配列の配列が配列番号５として示され、ならびに配列番号６のヒトＶｐｒｅＢ１アミノ酸配列（マウスＩｇカッパリーダーに下線が施されている）が示される。下線は、ＶｐｒｅＢアミノ酸配列内のリーダー配列を示す。
【図２】配列番号７のヒトλ５配列、配列番号８のヒトλ５様配列、「λ５ｄＴａｉｌ」と指定される「三量体」における短縮されたλ５配列の配列（配列番号９）、及びマウスＩｇκリーダー配列を有する配列番号１０のヒトλ５ｄＴａｉｌ配列を示す。下線は、λ５アミノ酸配列内のリーダー配列を示す。
【図３】配列番号３５としてのヒトＶｐｒｅＢ１〜λ５キメラアミノ酸配列（マウスＩｇκリーダー配列に下線が施されている）を示す。
【図４Ａ】（Ａ）配列番号１１のヒトＶκ様ヌクレオチド配列、及びコードされるタンパク質のアミノ酸配列（ＡＪ００４９５６；配列番号１２）（天然リーダー配列に下線が施されている）を示し、（Ｂ）ＡＪ００４９５６  Ｖκ様プロトタイプ配列（配列番号１２）と整列させた、各々異なる長さの伸長（配列番号１３〜２４）を有する全Ｖκファミリーからの可能なＶκ様タンパク質の予測される成熟アミノ酸配列を示す。
【図４Ｂ】（Ａ）配列番号１１のヒトＶκ様ヌクレオチド配列、及びコードされるタンパク質のアミノ酸配列（ＡＪ００４９５６；配列番号１２）（天然リーダー配列に下線が施されている）を示し、（Ｂ）ＡＪ００４９５６  Ｖκ様プロトタイプ配列（配列番号１２）と整列させた、各々異なる長さの伸長（配列番号１３〜２４）を有する全Ｖκファミリーからの可能なＶκ様タンパク質の予測される成熟アミノ酸配列を示す。
【図５Ａ】（Ａ）配列番号２５のヒトＪＣκヌクレオチド配列、及びコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２６）（予測成熟ＪＣｋタンパク質と比較したユニーク配列には二重下線が施され、潜在的リーダー切断配列には下線が施されている）を示し、（Ｂ）残りのカッパＪ定常領域再配列（Ｊ１〜Ｊ５Ｃκ）（配列番号２７〜３１）からの予測ＪＣκ様アミノ酸配列を示し、（Ｃ）添付の下線が施されたマウスＩｇκリーダー配列を有するＪＣκ（配列番号３２）、添付の下線が施されたマウスＩｇκリーダー配列のみを有する組み換えＪＣκ（配列番号３３）、及び添付の下線が施されたマウスＩｇκリーダー配列を有する予測される処理ＪＣκ（配列番号３４）を含む、ＪＣｋ操作された分泌最適化バリアントを示す。
【図５Ｂ】（Ａ）配列番号２５のヒトＪＣκヌクレオチド配列、及びコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２６）（予測成熟ＪＣｋタンパク質と比較したユニーク配列には二重下線が施され、潜在的リーダー切断配列には下線が施されている）を示し、（Ｂ）残りのカッパＪ定常領域再配列（Ｊ１〜Ｊ５Ｃκ）（配列番号２７〜３１）からの予測ＪＣκ様アミノ酸配列を示し、（Ｃ）添付の下線が施されたマウスＩｇκリーダー配列を有するＪＣκ（配列番号３２）、添付の下線が施されたマウスＩｇκリーダー配列のみを有する組み換えＪＣκ（配列番号３３）、及び添付の下線が施されたマウスＩｇκリーダー配列を有する予測される処理ＪＣκ（配列番号３４）を含む、ＪＣｋ操作された分泌最適化バリアントを示す。
【図５Ｃ】（Ａ）配列番号２５のヒトＪＣκヌクレオチド配列、及びコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２６）（予測成熟ＪＣｋタンパク質と比較したユニーク配列には二重下線が施され、潜在的リーダー切断配列には下線が施されている）を示し、（Ｂ）残りのカッパＪ定常領域再配列（Ｊ１〜Ｊ５Ｃκ）（配列番号２７〜３１）からの予測ＪＣκ様アミノ酸配列を示し、（Ｃ）添付の下線が施されたマウスＩｇκリーダー配列を有するＪＣκ（配列番号３２）、添付の下線が施されたマウスＩｇκリーダー配列のみを有する組み換えＪＣκ（配列番号３３）、及び添付の下線が施されたマウスＩｇκリーダー配列を有する予測される処理ＪＣκ（配列番号３４）を含む、ＪＣｋ操作された分泌最適化バリアントを示す。
【図６−１】抗ヒトＶｐｒｅＢ１  Ｆａｂタンパク質（配列番号３６〜５１）の軽鎖配列を示す。
【図６−２】抗ヒトＶｐｒｅＢ１  Ｆａｂタンパク質（配列番号３６〜５１）の軽鎖配列を示す。
【図７】抗ヒトＶｐｒｅＢ１  Ｆａｂタンパク質（配列番号５２〜６７）の重鎖配列（ＶＨ）を示す。
【図８】抗ヒトＶｐｒｅＢ１  ＩｇＧ１（２４６０Ｂ０４  ＩｇＧ１）に使用される特徴付け法の概要を例証する。
【図９】抗ＶｐｒｅＢ１抗体（２４６０Ｂ０４  ＩｇＧ１）が、５０％血清中でＨＧＦ結合２ピースＳｕｒｒｏｂｏｄｙを検出することを実証する。
【図１０】抗ＶｐｒｅＢ１抗体（２４６０Ｂ０４  ＩｇＧ１）が、５０％血清中でＨＧＦ結合３ピースＳｕｒｒｏｂｏｄｙを検出することを実証する。
【図１１】抗ＶｐｒｅＢ１抗体（２４６０Ｂ０４  ＩｇＧ１）が、５０％血清中で２ピースＳｕｒｒｏｂｏｄｙを捕捉することを実証する。
【図１２】抗ＶｐｒｅＢ１抗体（２４６０Ｂ０４  ＩｇＧ１）が、５０％血清中で３ピースＳｕｒｒｏｂｏｄｙを捕捉することを実証する。
【図１３】検出試薬として使用される抗ＶｐｒｅＢ１  ｍＡｂ（２４６０Ｂ０４  ＩｇＧ１）が、ヒトＶＬ  ＯＲＦを含有するＩｇＧに結合しないことを実証する。
【図１４】抗ＶｐｒｅＢ１  ｍＡｂ  Ｉｓが、ＶＬ含有ＩｇＧ（４４８Ｃ１２−ＨＣ）を捕捉することができないことを実証する。
【図１５】抗ＶｐｒｅＢ１  ｍＡｂ  Ｉｓが、ＶＬ含有ＩｇＧ（２５４７Ｃ０２  ＨＣ）を捕捉することができないことを実証する。
【図１６】抗ＶｐｒｅＢ１  ｍＡｂ  Ｉｓが、ＶＬ含有ＩｇＧ（２２１１Ａ０１＿Ｎ５６Ｈ−ＨＣ）を捕捉することができないことを実証する。
【図１７】免疫前血清試料のＰＫ血清ＥＬＩＳＡ結果を示す。
【図１８】５分間〜９６時間の時点にわたるＳＬ−５４１＿αＨＧＦ  ＳｇＧのＰＫ血清ＥＬＩＳＡ結果を示す。
【図１９】１６８時間〜６７２時間の時点にわたるＳＬ−５４１＿αＨＧＦ  ＳｇＧのＰＫ血清ＥＬＩＳＡ結果を示す。
【図２０】５分間〜９６時間の時点にわたるＳＬ−６５６＿αＨＧＦ  ＳｇＧのＰＫ血清ＥＬＩＳＡ結果を示す。
【図２１】１６８時間〜６７２時間の時点にわたるＳＬ−６５６＿αＨＧＦ  ＳｇＧのＰＫ血清ＥＬＩＳＡ結果を示す。
【図２２】二重特異性ＳｕｒｒｏｂｏｄｙのＰＫ特性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
Ａ．定義
別段に定義されない限り、本明細書で使用される技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４）は、当業者に本出願で使用される用語の多くに関する一般的な手引きを提供する。
【００２５】
当業者は、本発明の実践において使用され得る、本明細書に説明されるものに類似または等価である多数の方法及び材料を認識するであろう。実際、本発明は、説明される方法及び材料にいかようにも限定されない。本発明の目的のために、以下の用語が下記に定義される。
【００２６】
本出願を通して、明白に別段の定めがない限り、単数形の使用は複数形を含む。
【００２７】
本出願において、明白に別段の定めがない限り、「または」の使用は「及び／または」を含む。
【００２８】
さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」は、限定的ではない。
【００２９】
本発明の文脈において、「抗体」（Ａｂ）という用語は、Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝子組み換えに由来する古典的に組み換えられた重鎖及び同様にＶＪ遺伝子組み換えに由来する古典的に組み換えられた軽鎖からの天然抗体、またはそれらの断片を指すために使用される。
【００３０】
「天然抗体」は、２本の同一である軽（Ｌ）鎖及び２本の同一である重（Ｈ）鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、共有ジスルフィド結合（複数可）によって重鎖に連結され、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変動する。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的に配置された鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の端部に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後に多数の定常ドメインが続く。各軽鎖は、一方の端部に可変ドメイン（ＶＬ）を、またもう一方の端部に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列され、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列される。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられる。Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：６５１（１９８５）；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ａｎｄ  Ｈａｂｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４５９２（１９８５）。
【００３１】
抗体鎖に関する「可変」という用語は、抗体間で配列が大きく異なり、各特定の抗体のその特定の抗原に関する結合及び特性に関与する抗体鎖の部分を指すために使用される。かかる可変性は、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方における超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中される。可変ドメインのより高度に保存される部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、各々４つのＦＲ（それぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）を含み、主にβ−シート構成をとり、β−シート構造を接続し、場合によりその一部を形成するループを形成する３つの超可変領域によって接続される。各鎖内の超可変領域は、ＦＲによって近接して共に保持され、他方の鎖の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に貢献する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１），６４７−６６９ページを参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与等の種々のエフェクター機能を示す。
【００３２】
「超可変領域」という用語は、本明細書で使用されるとき、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基３０〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）、及び８６〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の３０〜３５（Ｈ１）、４７〜５８（Ｈ２）、及び９３〜１０１（Ｈ３）；ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ，．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２６２（５）：７３２−４５（１９９６））。
【００３３】
「フレームワーク領域」という用語は、より相違するＣＤＲ領域の間に存在する、当該技術分野において認識される抗体可変領域の部分を指す。かかるフレームワーク領域は、典型的には、フレームワーク１〜４（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）と称され、ＣＤＲが抗原結合表面を形成し得るように、重または軽鎖抗体可変領域内に見出される３つのＣＤＲを三次元空間に保持するための骨格を提供する。
【００３４】
抗体は、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて異なるクラスに割り当てられ得る。抗体の５つの主要なクラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２等のサブクラス（アイソタイプ）、にさらに分類され得る。好ましい実施形態では、本発明のイムノアドヘシンの構築に使用される免疫グロブリン配列は、ＩｇＧ免疫グロブリン重鎖ドメインに由来する。ヒトイムノアドヘシンに関しては、ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３免疫グロブリン配列の使用が好ましい。ＩｇＧ１を使用することの主な利益は、ＩｇＧ１イムノアドヘシンは固定化されたタンパク質Ａ上で効率的に精製され得るということである。しかしながら、特定のイムノアドヘシン構築に関するＩｇ融合パートナーを選択する際には、他の構造的及び機能的特性が考慮されるべきである。例えば、ＩｇＧ３ヒンジは、より長く、より柔軟であり、その結果、それはより大きい「付着因子」ドメインを格納することができ、それはＩｇＧ１に融合されるときに適切に折り畳まれないか、または機能しない場合がある。別の懸念事項は原子価であり得、ＩｇＧイムノアドヘシンは、二価ホモ二量体であり、一方ＩｇＡ及びＩｇＭ等のＩｇサブタイプは、それぞれ基本的なＩｇホモ二量体ユニットの二量体または五量体構造を生じさせ得る。インビボ用途のために設計されるＶＥＧＦ受容体Ｉｇ様ドメイン／免疫グロブリンキメラに関しては、Ｆｃ領域によって特定される薬物動態特性及びエフェクター機能も重要である。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４は全て２１日間のインビボ半減期を有するが、補体系の活性化におけるそれらの相対的な潜在力は異なる。さらに、種々の免疫グロブリンは、様々な数のアロタイプのアイソタイプを有する。
【００３５】
免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００３６】
任意の脊椎動物種からの抗体の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる明確に区別され得る２つのタイプのうちの１つに割り当てられ得る。本明細書における抗体軽鎖への任意の言及は、κ及びλ軽鎖の両方を含む。
【００３７】
「抗体断片」は、全長抗体の一部分、概してその抗原結合または可変ドメインを含む。抗体断片の例としては、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、ｓｃＦｖ、及び（ｓｃＦｖ）２断片が挙げられる。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、「抗体結合領域」という用語は、抗原（複数可）を結合することができる免疫グロブリンまたは抗体可変領域の１つ以上の部分を指す。典型的には、抗体結合領域は、例えば、抗体軽鎖（ＶＬ）（もしくはその可変領域）、抗体重鎖（ＶＨ）（もしくはその可変領域）、重鎖Ｆｄ領域、組み合わされた抗体軽鎖及び重鎖（もしくはその可変領域）、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、単一ドメイン、もしくは一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）等、または全長抗体、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭ抗体等である。
【００３９】
「エピトープ」という用語は、本明細書で使用されるとき、少なくとも約３〜５個、好ましくは少なくとも約５〜１０個、または少なくとも約５〜１５個のアミノ酸、及び典型的には約５００個または約１，０００個以下のアミノ酸の配列を指し、これは、それ自体によってかまたはより大きい配列の一部として、かかる配列に応答して生成される抗体に結合する配列を定義する。エピトープは、それが由来する親タンパク質の部分と同一である配列を有するポリペプチドに限定されない。実際、ウイルスゲノムは、一定の変化の状態にあり、単離物間で比較的高度の変動性を示す。したがって、「エピトープ」という用語は、天然配列と同一の配列、ならびに天然配列に対する欠失、置換、及び／または挿入等の修飾を包含する。概して、かかる修飾は、保存的な性質であるが、非保存的修飾も企図される。本用語は、具体的には「ミモトープ」、すなわち、連続的な線状天然配列を同定しないか、または必ずしも天然タンパク質中に発生するわけではないが、天然タンパク質上のエピトープを機能的に模倣する配列を含む。「エピトープ」という用語は、具体的には線状及び立体配座的エピトープを含む。
【００４０】
「代替軽鎖ポリペプチド」または「ＳＬＣポリペプチド」という用語は、本明細書において、ＶｐｒｅＢポリペプチド、λ５ポリペプチド、Ｖκ様ポリペプチド、ＪＣκポリペプチド、またはそれらのバリアントを指すために使用される。
【００４１】
「非代替軽鎖分子」または「非ＳＬＣ分子」という用語は、本明細書において、ＳＬＣポリペプチドではない分子を指すために使用される。非ＳＬＣ分子は、サイトカインまたは抗体断片等のポリペプチドであってもよい。
【００４２】
「ＶｐｒｅＢ」という用語は、本明細書において広義に使用され、任意の天然配列またはバリアントＶｐｒｅＢポリペプチドを指し、具体的には、限定されるものではないが、配列番号１のヒトＶｐｒｅＢ１、配列番号２及び３のマウスＶｐｒｅＢ２、配列番号４のヒトＶｐｒｅＢ３様配列、配列番号５のヒトＶｐｒｅＢ  ｄＴ、配列番号６のヒトＶｐｒｅＢ１アミノ酸配列、ならびに翻訳後修飾によって形成されるスプライスバリアント及びバリアントを含むアイソフォーム、それらの他の哺乳類相同体、ならびにかかる天然配列ポリペプチドのバリアントを含む。（図１）
【００４３】
「λ５」という用語は、本明細書において広義に使用され、任意の天然配列またはバリアントλ５ポリペプチドを指し、具体的には、限定されるものではないが、配列番号７のヒトλ５、配列番号８のヒトλ５様タンパク質、配列番号９及び１０として示されるヒトλ５ｄＴ、ならびに翻訳後修飾によって形成されるスプライスバリアント及びバリアントを含むそれらのアイソフォーム、それらの他の哺乳類同族体、ならびにかかる天然配列ポリペプチドのバリアントを含む。（図２）
【００４４】
λ様Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙの具体的な例としては、その天然配列の断片またはバリアントを含む、ＶｐｒｅＢ１、ＶｐｒｅＢ２、またはＶｐｒｅＢ３配列等のＶｐｒｅＢ配列が、その天然配列の断片及びバリアントを含むλ５配列に共役されたポリペプチドが挙げられる。この種類の代表的な融合は、その全体の開示が参照により本明細書に明白に援用される２００８年１０月２日に公開されたＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／１１８９７０号に提供される。異種リーダー配列との融合の例は、図３に例証される（配列番号３５）。
【００４５】
「バリアントＶｐｒｅＢポリペプチド」及び「ＶｐｒｅＢポリペプチドのバリアント」という用語は、互換的に使用され、本明細書において、アミノ酸修飾の結果、１つ以上のアミノ酸位置において天然配列ＶｐｒｅＢポリペプチドと異なるポリペプチドと定義される。「バリアントＶｐｒｅＢポリペプチド」は、本明細書で定義されるとき、天然抗体λもしくはκ軽鎖配列、またはそれらの断片とは異なる。「バリアントＶｐｒｅＢポリペプチド」は、好ましくは、天然配列ＶｐｒｅＢポリペプチドと少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の配列同一性を保持する。別の好ましい実施形態では、「バリアントＶｐｒｅＢポリペプチド」は、天然抗体λまたはκ軽鎖配列に対してそのアミノ酸配列が９５％未満、または９０％未満、または８５％未満、または８０％未満、または７５％未満、または７０％未満、または６５％未満、または６０％未満同一である。バリアントＶｐｒｅＢポリペプチドは具体的には、限定されるものではないが、ＶｐｒｅＢ配列のＣ末端の非Ｉｇ様ユニークテールが部分的または完全に除去されるＶｐｒｅＢポリペプチドを含む。
【００４６】
「バリアントλ５ポリペプチド」及び「λ５ポリペプチドのバリアント」という用語は、互換的に使用され、本明細書において、アミノ酸修飾の結果、１つ以上のアミノ酸位置において天然配列λ５ポリペプチドと異なるポリペプチドと定義される。「バリアントλ５ポリペプチド」は、本明細書で定義されるとき、天然抗体λもしくはκ軽鎖配列、またはそれらの断片とは異なる。「バリアントλ５ポリペプチド」は、好ましくは、天然配列λ５ポリペプチドと少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の配列同一性を保持する。別の好ましい実施形態では、「バリアントλ５ポリペプチド」は、天然抗体λまたはκ軽鎖配列に対してそのアミノ酸配列が９５％未満、または９０％未満、または８５％未満、または８０％未満、または７５％未満、または７０％未満、または６５％未満、または６０％同一である。バリアントλ５ポリペプチドは具体的には、限定されるものではないが、λ５配列のＮ末端のユニークテールが部分的または完全に除去されるλ５ポリペプチドを含む。
【００４７】
「バリアントＶκ様ポリペプチド」及び「Ｖκ様ポリペプチドのバリアント」という用語は、互換的に使用され、本明細書において、アミノ酸修飾の結果、１つ以上のアミノ酸位置において天然配列Ｖκ様ポリペプチドと異なるポリペプチドと定義される。「バリアントＶκ様ポリペプチド」は、本明細書で定義されるとき、天然抗体λもしくはκ軽鎖配列、またはそれらの断片とは異なる。（図４）「バリアントＶκ様ポリペプチド」は、好ましくは、天然配列Ｖκ様ポリペプチドと少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の配列同一性を保持する。別の好ましい実施形態では、「バリアントＶκ様ポリペプチド」は、天然抗体λまたはκ軽鎖配列に対してそのアミノ酸配列が９５％未満、または９０％未満、または８５％未満、または８０％未満、または７５％未満、または７０％未満、または６５％未満、または６０％未満同一である。バリアントＶκ様ポリペプチドは具体的には、限定されるものではないが、Ｖκ様配列のＣ末端の非Ｉｇ様ユニークテールが部分的または完全に除去されるＶκ様ポリペプチドを含む。
【００４８】
「バリアントＪＣκポリペプチド」及び「ＪＣκポリペプチドのバリアント」という用語は、互換的に使用され、本明細書において、アミノ酸修飾の結果、１つ以上のアミノ酸位置において天然配列ＪＣκポリペプチドとは異なるポリペプチドと定義される。（図５）「バリアントＪＣκポリペプチド」は、本明細書で定義されるとき、天然抗体λもしくはκ軽鎖配列、またはそれらの断片とは異なる。「バリアントＪＣκポリペプチド」は、好ましくは、天然配列ＪＣκポリペプチドと少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の配列同一性を保持する。別の好ましい実施形態では、「バリアントＪＣκポリペプチド」は、天然抗体λまたはκ軽鎖配列に対してそのアミノ酸配列が９５％未満、または９０％未満、または８５％未満、または８０％未満、または７５％未満、または７０％未満、または６５％未満、または６０％未満同一である。バリアントＪＣκポリペプチドは具体的には、限定されるものではないが、ＪＣκ配列のＮ末端のユニークテールが部分的または完全に除去されるＪＣκポリペプチドを含む。
【００４９】
パーセントアミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２を使用して決定され得る（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードでき、さもなくばＢｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤの国立衛生研究所から入手することができる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は、複数の検索パラメータを使用し、それらの検索パラメータの全ては、例えば、ｕｎｍａｓｋ＝ｙｅｓ、ｓｔｒａｎｄ＝ａｌｌ、ｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｓ＝１０、ｍｉｎｉｍｕｍ  ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｌｅｎｇｔｈ＝１５／５、ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓ  ｅ−ｖａｌｕｅ＝０．０１、ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓ＝２５、ｄｒｏｐｏｆｆ  ｆｏｒ  ｆｉｎａｌ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝２５、及びｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含む、デフォルト値に設定される。
【００５０】
「ＶｐｒｅＢ配列」という用語は、本明細書において、本明細書で上記に定義される通りの「ＶｐｒｅＢ」の配列またはそれらの断片を指すために使用される。
【００５１】
「λ５配列」という用語は、本明細書において、本明細書で上記に定義される通りの「λ５」の配列またはそれらの断片を指すために使用される。
【００５２】
「Ｖκ様配列」という用語は、本明細書において、本明細書で上記に定義される通りの「Ｖκ様」の配列またはそれらの断片を指すために使用される。
【００５３】
「ＪＣκ配列」という用語は、本明細書において、本明細書で上記に定義される通りの「ＪＣκ」の配列またはそれらの断片を指すために使用される。
【００５４】
「λ様代替軽鎖」という用語は、本明細書で使用されるとき、ＶｐｒｅＢ及びλ５タンパク質の非共有会合によって形成される二量体を指す。
【００５５】
「κ様代替軽鎖」という用語は、本明細書で使用されるとき、Ｖκ様及びＪＣκタンパク質の非共有会合によって形成される二量体を指す。
【００５６】
「λ様代替軽鎖配列」という用語は、本明細書で定義されるとき、本明細書で上記に定義される通りの「ＶｐｒｅＢ配列」及び／または「λ５配列」を含む任意のポリペプチド配列を意味する。本明細書で定義されるとき、「λ様代替軽鎖配列」とは具体的には、限定されるものではないが、配列番号１のヒトＶｐｒｅＢ１配列、配列番号２及び３のマウスＶｐｒｅＢ２配列、ならびに配列番号４のヒトＶｐｒｅＢ３配列、配列番号５として示されるヒトＶｐｒｅＢ  ｄＴ、ならびに配列番号６のヒトＶｐｒｅＢ１アミノ酸配列、ならびに翻訳後修飾によって形成されるスプライスバリアント及びバリアントを含むそれらの種々のアイソフォーム、他の哺乳類種におけるそれらの相同体、ならびにそれらの断片及びバリアントを含む。「λ様代替軽鎖配列」という用語はさらに、限定されるものではないが、配列番号７のヒトλ５配列、配列番号８のヒトλ５様配列、配列番号９として示されるヒトλ５ｄＴａｉｌ、配列番号１０のヒトλ５ｄＴａｉｌ配列、ならびに翻訳後修飾によって形成されるスプライスバリアント及びバリアントを含むそれらのアイソフォーム、他の哺乳類種におけるそれらの相同体、ならびにそれらの断片及びバリアントを含む。「λ様代替軽鎖配列」という用語はさらに、本明細書で上記に定義される通りのＶｐｒｅＢ及びλ５配列の両方を含む配列を含む。
【００５７】
「κ様代替軽鎖配列」という用語は、本明細書で定義されるとき、本明細書で上記に定義される通りの「Ｖκ様配列」及び／または「ＪＣκ」を含む任意のポリペプチド配列を意味する。本明細書で定義されるとき、「κ様代替軽鎖配列」という用語は具体的には、限定されるものではないが、配列番号１２〜２４のいずれかのヒトＶκ様配列、ならびに翻訳後修飾によって形成されるスプライスバリアント及びバリアントを含むそれらの種々のアイソフォーム、他の哺乳類種におけるそれらの相同体、ならびにそれらの断片及びバリアントを含む。「κ様代替軽鎖配列」という用語は、限定されるものではないが、配列番号１２〜２４のいずれかのヒトＶκ様配列、配列番号２５〜３５のいずれかのヒトＪＣκ配列、ならびに翻訳後修飾によって形成されるスプライスバリアント及びバリアントそれらのアイソフォーム、他の哺乳類種におけるそれらの相同体、ならびにそれらの断片及びバリアントをさらに含む。「κ様代替軽鎖配列」という用語」は、本明細書で上記に定義される通りのＶκ様及びＪＣκ配列の両方を含む配列をさらに含む。
【００５８】
「代替軽鎖構築物」という用語は、広義に使用され、異種アミノ酸配列、核酸、及び代替軽鎖配列に共役される他の分子を含む、任意の及び全ての追加的な異種成分を含み、「共役」は下記に定義される。
【００５９】
「代替軽鎖構築物」は、本明細書において、「Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ（商標）」、または「Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ」とも呼ばれ、この２つの用語は互換的に使用される。特定のＳｕｒｒｏｂｏｄｙ（商標）λ様代替軽鎖構築物は、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００８，１０５（３１）：１０７５６−６１、及び２００８年１０月２日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ２００８／１１８９７０に開示されている。同様に、それらの全体の開示が参照により本明細書に明白に援用される、米国特許公開第２０１０／００６２９５０号、及びＸｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１０，３９７，３５２−３６０に説明されるκ様代替軽鎖構築物も企図される。
【００６０】
本発明のポリペプチドの文脈において、第１のアミノ酸配列に関する「異種アミノ酸配列」という用語は、第１のアミノ酸配列に自然に会合されず、本明細書における代替軽鎖構築物中に存在する形態では少なくともないアミノ酸配列を指すために使用される。したがって、ＶｐｒｅＢ、λ５、Ｖκ様、またはＪＣκに関する「異種アミノ酸配列」は、その天然環境において天然ＶｐｒｅＢ、λ５、Ｖκ様、またはＪＣκに会合されない任意のアミノ酸配列である。これらとしては、限定されるものではないが、ｉ）ＶｐｒｅＢと共に、発達途中のＢ細胞上に代替軽鎖を形成するλ５配列とは異なるλ５配列、例えば、短縮された及び／または誘導体化されたλ５配列等のアミノ酸配列バリアント、ｉｉ）λ５と共に、発達中のＢ細胞上に代替軽鎖を形成するＶｐｒｅＢ配列とは異なるＶｐｒｅＢ配列、例えば、短縮された及び／または誘導体化されたＶｐｒｅＢ配列等のアミノ酸配列バリアント、ｉｉｉ）ＪＣκと共に、発達途中のＢ細胞上にκ様代替軽鎖を形成するＶκ様配列とは異なるＶκ様配列、例えば、短縮された及び／または誘導体化されたＶκ様配列等のアミノ酸配列バリアント、及びｉｖ）Ｖκ様と共に、発達途中のＢ細胞上にκ様代替軽鎖を形成するＪＣκ配列とは異なるＪＣκ配列、例えば、短縮された及び／または誘導体化されたＪＣκ配列等のアミノ酸配列バリアントが挙げられる。
【００６１】
ＶｐｒｅＢまたはλ５に関する「異種アミノ酸配列」はまた、それらの天然環境においてはＶｐｒｅＢ及びλ５配列は互いに共有的に会合されない、例えば、融合されないため、天然配列ＶｐｒｅＢまたはλ５を含む対応するＶｐｒｅＢまたはλ５に共有的に会合される、例えば、融合される、ＶｐｒｅＢまたはλ５配列も含む。同様に、Ｖκ様またはＪＣκに関する「異種アミノ酸配列」もまた、それらの天然環境においてはＶκ様またはＪＣκ配列は互いに共有的に会合されない、例えば、融合されないため、天然配列Ｖκ様またはＪＣκを含む対応するＶκ様またはＪＣκに共有的に会合される、例えば、融合される、Ｖκ様またはＪＣκ配列を含む。異種アミノ酸配列はまた、限定されるものではないが、例えば、抗体軽及び重可変領域配列ならびに抗体軽及び重鎖定常領域配列等の、抗体及び重鎖配列ならびにそれらの断片を含む抗体配列を含む。
【００６２】
「共役する」、「共役される」、及び「共役」という用語は、共有または非共有結合の任意の及び全ての形態を指し、限定されるものではないが、直接遺伝子融合または化学融合、リンカーまたは架橋剤によるカップリング、及び例えば、ファンデルワールス力を介した、またはロイジンジッパーの使用による非共有会合が挙げられる。
【００６３】
「可撓性リンカー」という用語は、本明細書において、その化学構造に基づいて、その意図される文脈及び環境内で三次元空間内に固定されることが予測されない任意のリンカーを指すために使用される。
【００６４】
「融合」という用語は、本明細書において、１本のポリペプチド鎖内の異なる起源のアミノ酸配列の、それらをコードするヌクレオチド配列をインフレームで組み合わせることによる組み合わせを指すために使用される。「融合」という用語は、内部融合、すなわち、その末端のうちの１つとの融合に加えて、ポリペプチド鎖内の異なる起源の配列の挿入を明白に包含する。
【００６５】
本明細書で使用されるとき、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は全て、共有的な「ペプチド結合」によって連結されるアミノ酸の一次配列を指す。ペプチドは概して、数個のアミノ酸、典型的には約２〜約５０個のアミノ酸からなり、タンパク質よりも短い。「ポリペプチド」という用語は、本明細書で定義されるとき、ペプチド及びタンパク質を包含する。
【００６６】
「アミノ酸」または「アミノ酸残基」という用語は、典型的には、当該技術分野において認識される定義を有するアミノ酸、例えば、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｉｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｈｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｉｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選択されるアミノ酸を指すが、但し、修飾アミノ酸、合成アミノ酸、または希アミノ酸が所望通りに使用されてもよい。したがって、３７  ＣＦＲ  １．８２２（ｂ）（４）に列挙される修飾された及び通常ではないアミノ酸は、本定義に具体的に含まれ、参照により本明細書に明白に援用される。アミノ酸は、種々の亜群に下位分類され得る。したがって、アミノ酸は、非極性側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）、負荷電側鎖（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、正荷電側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）、または非荷電の極性側鎖（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒ）を有するものとして分類され得る。アミノ酸はまた、小アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ）、求核性アミノ酸（Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ）、疎水性アミノ酸（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、アミド（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、及び塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ）としても分けられ得る。
【００６７】
「ポリヌクレオチド（複数可）」という用語は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子等の核酸、ならびにそれらの類似体（例えば、ヌクレオチド類似体を使用して、または核酸化学を使用して生成されるＤＮＡまたはＲＮＡ）を指す。所望通り、ポリヌクレオチドは、合成的に、例えば、当該技術分野において認識される核酸化学を使用して、または酵素的に、例えば、ポリメラーゼを使用して作製されてもよく、また所望により修飾されてもよい。典型的な修飾としては、メチル化、ビオチン化、及び他の当該技術分野において既知である修飾が挙げられる。それに加えて、核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得、また所望により、検出可能な部分に連結され得る。
【００６８】
参照ポリペプチドに関する「バリアント」という用語は、天然ポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸変異または修飾（すなわち、改変）を有するポリペプチドを指す。「アミノ酸修飾」によって生成されるバリアントは、例えば、天然アミノ酸配列内の少なくとも１つのアミノ酸を置換、欠失、挿入、及び／または化学修飾することによって産生され得る。
【００６９】
「アミノ酸修飾」は、所定のアミノ酸配列のアミノ酸配列内の変化を指す。例示的な修飾としては、アミノ酸置換、挿入、及び／または欠失が挙げられる。
【００７０】
特定の位置「におけるアミノ酸修飾」は、その特定の残基の置換もしくは欠失、またはその特定の残基に隣接する少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入を指す。特定の残基に「隣接する」挿入とは、その１〜２つの残基内の挿入を意味する。挿入は、Ｎ末端またはＣ末端から特定の残基までであってもよい。
【００７１】
「アミノ酸置換」は、所定のアミノ酸配列内の少なくとも１つの既存のアミノ酸残基を、別の異なる「置き換え」アミノ酸残基で置き換えることを指す。置き換え残基または残基は、「自然に存在するアミノ酸残基」（すなわち、遺伝コードによってコードされる）であってもよく、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｉｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選択されてもよい。１つ以上の自然に存在しないアミノ酸残基による置換もまた、本明細書におけるアミノ酸置換の定義によって包含される。
【００７２】
「自然に存在しないアミノ酸残基」は、上記に列挙される自然に存在するアミノ酸残基以外の残基を指し、それらは、ポリペプチド鎖内の隣接するアミノ酸残基（複数可）と共有的に結合し得る。自然に存在しないアミノ酸残基の例としては、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、及びＥｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１  ３３６（１９９１）に説明されるもの等の他のアミノ酸残基類似体が挙げられる。かかる自然に存在しないアミノ酸残基を生成するために、Ｎｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２（１９８９）及びＥｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）の手順が使用され得る。手短に述べると、これらの手順は、サプレッサーｔＲＮＡを自然に存在しないアミノ酸残基によって化学的に活性化させた後、ＲＮＡをインビトロで転写及び翻訳することを含む。
【００７３】
「アミノ酸挿入」は、所定のアミノ酸配列内への少なくとも１つのアミノ酸の組み込みを指す。挿入は通常、１または２つのアミノ酸残基の挿入からなるが、本出願は、例えば、約３〜約５個またはさらには最大で約１０個のアミノ酸残基の挿入等の、より大きい「ペプチド挿入」を企図する。挿入される残基（複数可）は、上記に開示される通り、自然に存在してもよく、または自然に存在しなくてもよい。
【００７４】
「アミノ酸欠失」は、所定のアミノ酸配列からの少なくとも１つのアミノ酸残基の除去を指す。
【００７５】
「変異誘発」という用語は、別段に特定されない限り、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を改変するための任意の当該技術分野において認識される技術を指す。好ましい種類の変異誘発としては、エラープローンＰＣＲ変異誘発、飽和変異誘発、または他の部位特異的飽和誘発が挙げられる。
【００７６】
「部位特異的変異誘発」は、当該技術分野における技術標準であり、限定されたミスマッチ以外を除いて変異誘発される一本鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して行われ、所望の変異を表す。手短に述べると、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、一本鎖ファージＤＮＡに相補的な鎖の合成を方向付け、結果として得られる二本鎖ＤＮＡをファージ支持宿主細菌に形質転換する。形質転換された細菌の培養物を上層寒天に塗り、ファージを含む単一細胞からのプラーク形成を可能にする。理論上、新たなプラークの５０％が、一本鎖として変異形態を有するファージを含有し、５０％が元の配列を有する。関心のプラークは、完全にマッチしたハイブリダイゼーションを可能にするが、元の鎖とのミスマッチがハイブリダイゼーションを防止するのに十分である温度で、キナーゼされた合成プライマーとハイブリダイズすることによって選択される。次に、プローブとハイブリダイズするプラークが選択され、配列決定され、培養され、ＤＮＡが回収される。
【００７７】
「ベクター」という用語は、細胞内で自己複製が可能であり、例えば、遺伝子またはポリヌクレオチド等のＤＮＡセグメントが、付着されたセグメントの複製を引き起こすように、作動的に連結され得るｒＤＮＡ分子を指すために使用される。本明細書において、１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を方向付けることができるベクターは「発現ベクター」と称される。「制御配列」という用語は、特定の宿主生物内での作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適な制御配列としては、例えば、プロモーター、任意にオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが知られている。ベクターは、追加的なＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状の二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」であってもよい。ベクターは、追加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得るファージベクターまたはウイルスベクターであってもよい。好適なベクターは、例えば、細菌起源を有する細菌ベクターまたは複製及びエピソーム哺乳類ベクター等、それらが導入される宿主細胞内で自己複製することができる。ベクターは、宿主細胞への導入に際して、例えば、非エピソーム哺乳類ベクター等の宿主細胞ゲノムに統合され、宿主ゲノムと共に複製されてもよい。
【００７８】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれる場合に、「作動可能に連結される」。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、そのポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されており、プロモーターもしくはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、その配列に作動可能に連結されており、またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置付けられる場合、コード配列に作動可能に連結されている。概して、「作動可能に連結された」は、連結されているＤＮＡ配列が隣接していることを意味し、分泌リーダーの場合には、隣接しており、かつ読み取りフェーズにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接していなくてもよい。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションによって達成される。かかる部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の実践に従って使用される。
【００７９】
「ファージディスプレイライブラリ」は、クローン化されたタンパク質配列の収集物をファージコートタンパク質との融合体として発現するタンパク質発現ライブラリである。したがって、「ファージディスプレイライブラリ」という語句は、本明細書において、ファージが外来性（典型的には非相同）のタンパク質を発現するファージ（例えば、繊維状ファージ）の収集物指す。外来性タンパク質は、ファージが接触される他の部分と自由に相互作用（結合）する。外来性タンパク質をディスプレイする各ファージは、ファージディスプレイライブラリの「メンバー」である。
【００８０】
「繊維状ファージ」という用語は、その表面上に異種ポリペプチドをディスプレイすることができるウイルス粒子を指し、限定されるものではないが、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ１、及びＭ１３が挙げられる。繊維状ファージは、テトラサイクリン（例えば、「ｆｄ−ｔｅｔ」）等の選択可能なマーカーを含有してもよい。種々の繊維状ファージディスプレイシステムが、当業者に周知である（例えば、Ｚａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ９：１２７−１４０（１９８０），Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７（１９８５）；及びＰａｒｍｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  ７３：３０５−３１８（１９８８）を参照）。
【００８１】
「パンニング」という用語は、標的に対する高い親和性及び特性を有する、抗体等の化合物を担持するファージの同定及び単離における複数回のスクリーニングプロセスを指すために使用される。
【００８２】
「宿主細胞」は、本明細書に説明される分子をコードする核酸を含有する核酸（複数可）及び／またはベクター（複数可）の形質転換の受容者であり得るか、または受容者となっている、個々の細胞または細胞培養物を含む。本発明の方法において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞等の真核細胞であり得る。他の好適な宿主細胞は、当業者に既知である。
【００８３】
Ｂ．詳細な説明
本発明の方法を実施するための技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  （１９９７）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１；Ｏ′Ｂｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｈｉｃｋｌｅ  ａｎｄ  Ｆｉｔｃｈ，ｅｄｓ．，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１９９０；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ：ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ，Ｔ．Ｒ．Ｇｌａｒｅ  ａｎｄ  Ｍ．Ｏ′Ｃａｌｌａｇｈａｎ，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，２０００；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００１；及びＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｇ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，ｅｄ．，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ，２００４を含む標準的な実験室教本に説明されている。変異誘発は、例えば、部位特異的変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２（１９８５））を使用して実施され得る。ＰＣＲ増幅法は、米国特許第４，６８３，１９２号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、及び同第４，９６５，１８８号に、ならびにＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；及びＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）を含むいくつかの教本に説明されている。
【００８４】
本発明は、代替軽鎖（ＳＬＣ）に対する抗体に関する。抗体は、これらの抗体の各々が代替軽鎖に特異的に結合するように、ＶｐｒｅＢサブユニット、λ５サブユニット、または融合接合体に対するものであり得る。
【００８５】
抗ＳＬＣ抗体は、多様な用途に使用され得る。１つの用途は、薬物動態／薬力学研究、免疫組織学研究における、またはインビトロの診断使用のための複雑な生体液中のＳＬＣ含有タンパク質の検出である。
【００８６】
抗ＳＬＣ抗体の別の用途は、診断目的のためである。ＳＬＣの不在または欠損に関連付けられる、当該技術分野において既知である多数の条件が存在する。例えば、λ５欠損マウスは、Ｂ細胞の発達の劇的な減少を示し（Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｄ，Ｋｕｄｏ  Ａ，Ｓｃｈａａｌ  Ｓ，Ｍｕｌｌｅｒ  Ｗ，Ｍｅｌｃｈｅｒｓ  Ｆ，Ｒａｊｅｗｓｋｙ  Ｋ．Ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｌａｍｂｄａ  ５  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ．１９９２；６９（５）：８２３−８３１）、ヒトλ５遺伝子における変異は、無ガンマグロブリン血症をもたらす（Ｍｉｎｅｇｉｓｈｉ  Ｙ，Ｃｏｕｓｔａｎ−Ｓｍｉｔｈ  Ｅ，Ｗａｎｇ  ＹＨ，Ｃｏｏｐｅｒ  ＭＤ，Ｃａｍｐａｎａ  Ｄ，Ｃｏｎｌｅｙ  ＭＥ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｌａｍｂｄａ５／１４．１  ｇｅｎｅ  ｒｅｓｕｌｔ  ｉｎ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ａｎｄ  ａｇａｍｍａｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９８；１８７（１）：７１−７７）。ヒトにおいて、ＳＬＣを発現する自己反応性Ｂ細胞が同定されており、これらの細胞は、リウマチ性関節炎を罹患する患者の関節内に蓄積することが示されている（Ｍｅｆｆｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １，２０７−２１３）。したがって、ＳＬＣは、多反応性細胞及び異常なプレＢＣＲ機能のマーカーであり得る。したがって、抗ＳＬＣ抗体は、異常なＳＬＣ発現及びＢ細胞機能に関連付けられる特定の白血病及び自己免疫疾患を診断するための有用な試薬であり得る。
【００８７】
それに加えて、融合タンパク質、非共有ヘテロマーとして、または細胞集団としてのＳＬＣ錯体の精製にも、抗ＳＬＣ抗体の使用が考慮され得る。調査試薬として、抗ＳＬＣ抗体は、インビトロでＳＬＣを含有する錯体の生物物理学的及び機能的特徴を評価するために使用され得る。ＳＬＣ−錯体に関する定量化、親和性決定、有効なまたは抑制性の濃度、免疫沈降、及び免疫吸着剤用途は、抗ＳＬＣ  抗体の重要な使用の例である。
【００８８】
本発明の抗体は、例えば、米国特許第８，１３１，４８０号に説明される多様性抗体ライブラリ等の抗体ライブラリをスクリーニングすることによって得ることができ、それは、好ましい実施形態では、ファージベクターを使用して多様性抗体ライブラリを発現する。この方法は概して、クローン化及び発現のための繊維状ファージ（ファージミド）表面発現ベクター系の使用を含む。例えば、Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８：４３６３−４３６６（１９９１）；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８：７９７８−７９８２（１９９１）；Ｚｅｂｅｄｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：３１７５−３１７９（１９９２）；Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８：１１１２０−１１１２３（１９９１）；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：４４５７−４４６１（１９９２）；Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０（１９９２）；Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８７  ９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０（１９９４）；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２３３，４０９号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５７１，６９８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号；同第５，８３７，５００号；同第５，９６９，１０８号；同第６，３２６，１５５号；同第５，８８５，７９３号；同第６，５２１，４０４号；同第６，４９２，１６０，６，４９２，１２３号；同第６，４８９，１２３号；同第６，３４２，５８８号；同第６，２９１，６５０号；同第６，２２５，４４７号；同第６，１８０，３３６号；同第６，１７２，１９７号；同第６，１４０，４７１号；同第５，９９４，５１９号；同第６，９６９，１０８号；同第５，８７１，９０７号；及び同第５，８５８，６５７号を参照されたい。
【００８９】
ベクターは、組み換え宿主細胞を形質転換するために使用され、該組み換え宿主細胞は、導入されたファージ遺伝子及びディスプレイタンパク質遺伝子が発現されること、及びファージ粒子が組み立てられ、宿主細胞から発生されることを可能にするように培養される。発生されたファージ粒子は次に、宿主細胞培地から採取（収集）され、所望の抗体結合特性に関してスクリーニングされる。典型的には、採取された粒子は、予め選択された抗原との結合に関して「パンニング」される。強く結合する粒子が収集され、粒子の個々の種はクローン的に単離され、抗原に対する結合に関してさらにスクリーニングされる。所望の抗原結合特異性の結合部位を産生するファージが選択される。
【００９０】
本発明を、以下の非限定的な実施例においてさらに説明する。
【実施例】
【００９１】
実施例１−抗ＶｐｒｅＢ１  Ｆａｂの同定
Ｓｅａ  Ｌａｎｅの専有Ｆａｂ断片ライブラリを、ヒトＶｐｒｅＢ−１に関して４回パンニングした。典型的には、３〜４回のパンニングの後、富化されたファージプールからの個々のクローンをＥＬＩＳＡによってヒトＶｐｒｅＢ１に対して分析し、陽性クローンを配列決定して、それらの重及び軽鎖配列を決定した。これらの研究から、Ｆａｂクローン分析は、１６個のユニークヒトＶｐｒｅＢ１結合剤を同定した（表１）。表２にさらに特徴付けられる通り、カッパ及びラムダ軽鎖のどちらも、４つの異なる重鎖フレームワークを伴って同定された。
表１−抗ヒトＶｐｒｅＢ１のユニーク陽性クローン
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表２−抗ヒトＶｐｒｅＢ１  Ｆａｂヒット間の軽及び重鎖配列の概要
2018507254.tif 000003
【００９２】
ＦＡＳＴＡプログラムを使用して、特異性抗ヒトＶｐｒｅＢ１  Ｆａｂクローンのアミノ酸配列を決定し、可変領域配列を同定し、分析した。抗ヒトＶｐｒｅＢ１  Ｆａｂクローンの軽鎖配列（ＶＬ）を、図６に描写されるように整列させた。この整列内では、可変軽鎖は残基番号３から開始し、この点において、定常軽鎖（ＣκまたはＣλ）への可変軽鎖配列の転移が矢印で画定される。抗ヒトＶｐｒｅＢ１  Ｆａｂクローンの重鎖配列（ＶＨ）を、図７に描写されるように整列させた。この整列内では、可変重鎖は残基番号１から開始し、この点において、定常重鎖への可変重鎖及びＪ鎖配列の転移が矢印で画定される。
【００９３】
実施例２−選択される抗ＶｐｒｅＢ１  ＩｇＧ  ｍＡｂの特徴付け
ＥＬＩＳＡアッセイを実施して、ヒトＶｐｒｅＢ１に対して親和性を有する個々のパンニングされたファージＦａｂ抗体のＳｇＧ結合親和性、感受性、及び血清バックグラウンドを特徴付けた。図８は、抗ヒトＶｐｒｅＢ１  ＩｇＧ１（２４６０Ｂ０４  ＩｇＧ１）の特徴付けの概要を提供する。ＳｇＧタンパク質は、代替軽鎖（ＳＬＣ）構築物を指し、本明細書においては「Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ」とも称され、この２つの用語は互換的に使用される。概して、２ピースフォーマットは、ＳＬＣ融合及び抗体重鎖を含み、３ピースフォーマットは、２つのＳＬＣポリペプチド及び抗体重鎖を含む。
【００９４】
検出
抗ヒトＶｐｒｅＢ１  ＩｇＧ１（２４６０Ｂ０４  ＩｇＧ１）を検出抗体として評価するために、ＨＧＦ特異性Ｓ２ｇＧ及びＳ３ｇＧを、ＥＬＩＳＡにおいて非標識の、ビオチン標識された、及びＤＩＧ標識された抗ＶｐｒｅＢ１抗体によって検出した。２ピースまたは３ピースＳｕｒｒｏｂｏｄｙのいずれかを検出するためのアッセイでは、ウェルをＨＧＦ（０．１ｍＬの０．００１ｍｇ／ｍＬ）でコーティングし、１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴをブロッキング及び希釈緩衝液として使用し、Ｓ２ｇＧまたはＳ３ｇＧを５０％血清中で段階希釈した。ＨＧＦ結合Ｓ２ｇＧまたはＳ３ｇＧを、ビオチン化抗ＶｐｒｅＢ１  ＩｇＧ及びＨＲＰ共役ストレプトアビジンによって検出した。図９に実証される通り、抗ＶｐｒｅＢ１抗体は、５０％血清中でＨＧＦ結合２ピースＳｕｒｒｏｂｏｄｙを検出する。同様に、抗ＶｐｒｅＢ１抗体はまた、５０％血清中でＨＧＦ結合３ピースＳｕｒｒｏｂｏｄｙも検出する（図１０）。検出アッセイに使用される異なるＳＬＣ構築物のＥＣ５０値は、下記の表３に提供される。
表３−非標識対標識された抗ヒトＶｐｒｅＢ１  ＩｇＧ抗体
2018507254.tif 000004
【００９５】
捕捉
抗ＶｐｒｅＢ１  ＩｇＧ
（２４６０Ｂ０４  ＩｇＧ１）によって捕捉される２ピースまたは３ピースＳｕｒｒｏｂｏｄｙを評価するためのアッセイでは、ウェルを抗ＶｐｒｅＢ１  ＩｇＧ（０．１ｍＬの０．００１ｍｇ／ｍＬ）でコーティングし、１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴをブロッキング及び希釈緩衝液として使用し、Ｓ２ｇＧまたはＳ３ｇＧを５０％血清中で段階希釈した。ＨＧＦ結合Ｓ２ｇＧを、ＨＲＰ共役ヤギ抗ＥタグＡｂによって検出した。図１１に実証される通り、抗ＶｐｒｅＢ１抗体は、５０％血清中で２ピースＳｕｒｒｏｂｏｄｙを捕捉する。抗ＶｐｒｅＢ１抗体はまた、５０％血清中で３ピースＳｕｒｒｏｂｏｄｙも捕捉する（図１２）。
【００９６】
親和性
ＳｇＧに対する抗ヒトＶｐｒｅＢ１  ＩｇＧ  ｍＡｂ（２４６０Ｂ０４  ＩｇＧ１）の結合親和性を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  オクテット上でＢｉｏｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙによって試験した（「オクテット分析」）。動的結合分析を実施し、明らかな親和性を表４に報告する。結果は、２ピースまたは３ピースサログロブリン（ｓｕｒｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）に結合するためのサブナノモル親和性を示す。
表４−オクテットによって測定したＳｇＧに対する抗ヒトＶｐｒｅＢ１  ＩｇＧ  ｍＡｂの結合親和性
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【００９７】
抗ヒトＶｐｒｅＢ１  ＩｇＧ  ｍＡｂ（２４６０Ｂ０４  ＩｇＧ１）は、ヒト、マウス、またはカニクイザルの血清の存在下でクリーンなバックグラウンドを実証した。これは、２４６０Ｂ０４  ＩｇＧ１抗体が薬物動態（ＰＫ）研究において有用であろうことを示唆している。これらの結果によって示唆されるさらなる用途は、ヒト、マウス、及びサル血清（１５ｎｇ／ｍＬ）中で最小の交差反応性を有する検出試薬として、ヒト、マウス、及びサル血清中で最小の交差反応性を有する捕捉試薬として、ならびにＶｐｒｅＢ１含有ライブラリ構築においてライブラリを富化するための親和性抗体としてである。
【００９８】
交差反応性
ヒトＶＬに対する抗ＶｐｒｅＢ１  ｍＡｂ（２４６０Ｂ０４  ＩｇＧ１）の交差反応性を、ＥＬＩＳＡによって調査した。表５は、抗ＶｐｒｅＢ１  ｍＡｂの交差反応性を調査するために使用される方法の概要を提供する。表６は、ヒトＶＬ  ＯＲＦを含有するＩｇＧのタンパク質配列類似性を同定する。
表５−抗ＶｐｒｅＢ１  ｍＡｂの交差反応性の特徴付け
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表６−ヒトＶＬタンパク質配列類似性
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【００９９】
検出試薬として使用されるとき、抗ＶｐｒｅＢ１  ｍＡｂは、ヒトＶＬ  ＯＲＦを含有するＩｇＧに結合しない（図１３Ａ〜Ｄ）。同様に、捕捉試薬として使用されるとき、抗ＶｐｒｅＢ１  ｍＡｂは、ＶＬ含有ＩｇＧ（４４８Ｃ１２−ＨＣ）を捕捉することができない（図１４Ａ〜Ｃ）。抗ＶｐｒｅＢ１  ｍＡｂはまた、２５４７Ｃ０２  ＨＣ（図１５Ａ〜Ｃ）または２２１１Ａ０１＿Ｎ５６Ｈ−ＨＣ（図１６Ａ〜Ｃ）によって表されるＶＬ含有ＩｇＧを捕捉することもできない。したがって、従来的な軽鎖タンパク質に対する交差反応性は存在しないと考えられる。
【０１００】
実施例３−カニクイザルにおけるＳｕｒｒｏｂｏｄｙの薬物動態研究
抗ＶｐｒｅＢ１  ＩｇＧ  ｍＡｂの有用性を、カニクイザルにおけるＳｕｒｒｏｂｏｄｙの薬物動態（ＰＫ）研究においてさらに実証した。カニクイザルにおけるＳｕｒｒｏｂｏｄｙのＰＫプロファイルを、半減期（Ｔ１／２）、最大血漿／血清濃度（Ｃｍａｘ）、排除速度定数、ＡＵＣ０−ｔ（最後に観察されたデータ点に対する血漿濃度−時間曲線下の面積）、及びクリアランスの測定によって評価した。単回注射から得られる抗ＳｇＧ応答も調査した。カニクイザルＰＫ研究に使用されるＳｕｒｒｏｂｏｄｙ試験物品は、表７に特定される。
表７−カニクイザルＰＫ研究に使用されるＳｕｒｒｏｂｏｄｙ試験物品
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【０１０１】
ＰＫカニクイザル血清中の標的特異性Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙの検出
生物学的にナイーブなカニクイザルを使用して、図１７に特定される通り、５つのＳｇＧ試験物品を評定した。試験物品群の各々において３匹のサルが研究された。５つの群の中、合計１５匹のサルが存在し、各々３．３７〜５．６７ｋｇの体重であり、各サルに関して健康に関する報告を維持した。各群の平均体重は、４．３４〜４．８７ｋｇであった。単回の１０ｍｇ／ｍＬ注射を、静脈注射によって付与した。各サルの血清を収集し、最大２８日間で調製した。血清収集の時点は、短間隔（０及び５分間）、中間隔（１、４、８、及び２４時間）、及び長間隔（４８時間（２日間）、７２時間（３日間）、９６時間（４日間）、１６８時間（７日間）、２４０時間（１０日間）、３３６時間（１４日間）、４０８時間（１７日間）、５０４時間（２１日間）、５７６時間（２４日間）、及び６７２時間（２８日間））を含んだ。カニクイザル血清中のＳｇＧを検出するために、ＥＬＩＳＡアッセイを使用した。１つのＰＫ時点をプレート毎にアッセイし、標準／試料の段階希釈を２ｍＬ深ウェルブロック中で実施した。１：３段階希釈液は、８００ｕＬの１％  ＢＳＡ−ＰＢＳＴ＋４００ｕＬの試料を含んだ。１つの希釈液を、ＨＧＦ結合、ＰＩＧＦ結合、及びコンプレックスＥＬＩＳＡの各々のために作製した。
【０１０２】
５つの試験群の各々における全てのサルからの免疫前血清試料は、ＳｇＧタンパク質に関してクリーンであった（図１７）。５分間〜９６時間の時点にわたってＳＬ−５４１＿αＨＧＦＳｇＧに関して収集したＥＬＩＳＡデータの例が、図１８に提供され、１６８時間〜６７２時間の時点にわたるこのＳｇＧ構造のデータが、図１９に提供される。５分間〜９６時間の時点にわたってＳＬ−６５６＿αＨＧＦ  ＩｇＧに関して収集されたＥＬＩＳＡデータの例が、図２０に提供され、１６８時間〜６７２時間の時点にわたるこのＳｇＧ構造のデータが、図２１に提供される。結果は、試験対象の半減期が６〜１０日間の範囲にわたることを示している。これらの結果は、治療用ＳｕｒｒｏｂｏｄｙのＰＫ特性を決定するためのＶｐｒｅＢ１  ＩｇＧ  ｍＡｂ（２４６０Ｂ０４  ＩｇＧ１）の有用性をさらに実証する。ＰＫ研究は、潜在的な治療薬の分配、代謝、及び排除の決定に役立つ。これらのデータは、治験治療用製品と認可された治療薬との間の歴史的比較の基礎を提供し、また製品の最適な投薬計画及び消退期間の決定に役立つであろう。したがって、ＶｐｒｅＢ１  ＩｇＧ  ｍＡｂは、臨床的に有効な量及び臨床的に関連のある用量を達成するためのクリアランス時間の両方を確立することによって、Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙの適切な投薬を決定するために有用である。
【０１０３】
我々はまた、二重特異性ＳｕｒｒｏｂｏｄｙのＰＫ特性にも着目し、それらがカニクイザルにおける親に相当することを見出した。（図２２）カニクイザルのナイーブ群（ｎ＝３）にＳｕｒｒｏｂｏｄｙの単回静脈注射用量（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与し、その血清を２８日間の期間にわたり試験した。二重特異性Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙの全体的なＰＫ特性は、非特異的ＨＧＦ及びＰＩＧＦ  Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙに極めて類似であることが見出された。
【０１０４】
前述の説明において、本発明は特定の実施形態に関して例証されるが、それはそのように限定されるものではない。実際、本明細書に示され、説明されるものに加え本発明の種々の修正は、前述の説明から当業者に明らかになり、また添付の特許請求の範囲の範疇に含まれるであろう。
【０１０５】
本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個々に参照により援用されることが示される場合と同程度に、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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