(57)【要約】  本発明は、ウサギ-αl抗プロテイナーゼFのフラグメント、DEAQETAVSSHEQDの配列、及びその誘導体DEAQETAVSSHEQとQETACSSHEQDを有するペプチドであって、hADSCとヒト肝細胞における血清媒介HCV複製を顕著に抑制するペプチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象体におけるHCV感染を治療又は予防する、或いは、HCVの複製を抑制するための方法であって、前記方法は、前記対象体に対して、DEAQETAVSSHEQDのアミノ酸配列に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列、若しくは、そのバリアント、誘導体、変異体、又は、フラグメントを含むペプチドの有効量を投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記ペプチドの前記アミノ酸配列は、前記アミノ酸配列DEAQETAVSSHEQDに対して少なくとも75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%、又は、99%、若しくは、それ以上の同一性を有する請求項１に記載の方法。  
【請求項３】
前記ペプチドは、アミノ酸配列DEAQETAVSSHEQD, QETAVSSHEQD、又は、DEAQETAVSSHEQを含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチドの前記配列は、DEAQETAVSSHEQD, QETAVSSHEQD又はDEAQETAVSSHEQから実質的に構成される、又は、構成される請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換を含む請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記アミノ酸の付加、欠失及び／又は置換は、C末端及び／又はN末端で行われる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドは、１〜５、好ましくは１〜３のアミノ酸付加、欠失及び／又は置換を有する請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
更に、別の抗HCV剤を投与する工程を含む請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
HCVは遺伝子型1a、1b、2a、又は、2b、若しくは、遺伝子型3、又は、遺伝子型4のものである請求項１〜８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
アミノ酸配列QETAVSSHEQD又はDEAQETAVSSHEQに対して少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列、若しくは、そのバリアント、誘導体、変異体、又は、フラグメントを含むペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチドの前記配列は、DEAQETAVSSHEQD、 QETAVSSHEQD、又は、DEAQETAVSSHEQから実質的に構成される、又は、構成される請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１２】
以下からなるグループから選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも70%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（a） アミノ酸配列QETAVSSHEQD又はDEAQETAVSSHEQD、又は、そのバリアント、誘導体、変異体、又はフラグメントを含むペプチドをコードするヌクレオチド配列、そして
（b） ヌクレオチド配列（a）に対して相補的なポリヌクレオチド、
ここで、前記ペプチド、バリアント、誘導体、変異体、又は、フラグメントはHCV複製に対する抑制作用を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載のポリヌクレオチド、又は、請求項１３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１０又は１１に記載のペプチド、請求項１２に記載のポリヌクレオチド、請求項１３記載のベクター、若しくは、請求項１４に記載の宿主細胞の有効量と、薬剤的に許容可能なキャリアとを含む医薬組成物。
【請求項１６】
アミノ酸配列DEAQETAVSSHEQDに対して少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド、請求項１２に記載のポリヌクレオチド、請求項１３に記載のベクター、請求項１４に記載の宿主細胞、又は、請求項１５に記載の医薬組成物の、対象体におけるHCV感染の治療又は予防、或いは、HCVの複製の抑制のための薬剤の製造のための使用。
【請求項１７】
前記薬剤は、更に、別の抗HCV剤を含む請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記HCVは、遺伝子型1a、1b、2a、又は、2b、若しくは、遺伝子型3又は遺伝子型4のものである請求項１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、C型肝炎ウイルスの複製を抑制することが可能なペプチドとその誘導体、それをコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、前記ペプチドを含む医薬組成物及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景    
HCVは、フラビウイルス（Flaviviridae）科におけるエンベロープされたプラス鎖RNAウイルスである。それは、9.6 kbのゲノムを含み、これは、非翻訳領域（5’-UTR）から始まり、その後、構造タンパク質（コア、E1とE2）とp7、NS2、NS3、NS4Aと4B、NS5Aと5B（参考文献1（非特許文献１）を参照）とを含む非構造タンパク質（NS）をコードする配列が続く。少なくとも1億7000万の人々がHCVによって慢性感染し、毎年350,000人以上の死亡をもたらしている（参考文献2（非特許文献２）を参照）。PEG−インターフェロンと抗ウイルス薬リバビリンとの組み合わせ等の現在の治療法は、多くの副作用があり、その効果は一部の感染患者においてのみ有効である。新たな抗HCV治療法の開発が活発に試みられているが（参考文献3（非特許文献３）を参照）、そのために、血清媒介性のHCV（HCVser）を成長させるための信頼性が高い生理的細胞培養システムの欠如が未だに障害となっている。例えば、HCVserの直接感染は、初代ヒト及びチンパンジー肝細胞においてのみ示されており、その感染は過渡的で非効率的である（参考文献4（非特許文献４）を参照）。最近考案されたイン・ヴィトロ細胞ベース培養方法は、HCVゲノムの分子クローンを使用するものであって、天然ウイルスを使用するものではない（参考文献5（非特許文献５）を参照）。更に、これらのモデルは、ヘパトーマ細胞ライン（参考文献6（非特許文献６）を参照）又は神経上皮細胞ライン（参考文献７（非特許文献７）を参照）等の非初代ヒト細胞においてHCVを伝播した。従って、知見を臨床ウイルス-宿主相互作用へと推定（extrapolating）することには懸念がある。チンパンジー、ヒト-肝臓キメラマウス（参考文献８（非特許文献８）を参照）、又は、HCV感染にかかりやすい遺伝子改変マウス等の動物モデルは、アクセス又は確立が困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Lindenbach, B.D. & Rice, C.M. Unravelling hepatitis C virus replication from genome to function. Nature 436, 933-938, doi: 10.1038/nature04077 (2005）.
【非特許文献２】Sheets, W.F.  http: //www. who. int/mediacentre/factsheets/fs164/en/. (July 2012）.
【非特許文献３】Scheel, T.K. & Rice, C.M. Understanding the hepatitis C virus life cycle paves the way for highly effective therapies. Nature medicine 19, 837-849, doi: 10.1038/nm.3248 (2013）.
【非特許文献４】Bartenschlager, R. & Lohmann, V. Novel cell culture systems for the hepatitis C virus. Antiviral research 52, 1-17 (2001）.
【非特許文献５】Wilson, G.K. & Stamataki, Z. In vitro systems for the study of hepatitis C virus infection. International journal of hepatology 2012, 292591, doi: 10.1155/2012/292591 (2012）.
【非特許文献６】Sheehy, P. et al. In vitro replication models for the hepatitis C virus. Journal of viral hepatitis 14, 2-10, doi: 10.1111/j. 1365-2893.2006.00807.x (2007）.
【非特許文献７】Fletcher, N.F. et al. Hepatitis C virus infection of neuroepitheliomacell lines. Gastroenterology 139, 1365-1374, doi: 10.1053/j.gastro. 2010.06.008 (2010）.
【非特許文献８】Mercer, D.F. et al. Hepatitis C virus replication in mice with chimeric human livers. Nature medicine 7, 927-933, doi: 10.1038/90968 (2001）.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これを克服するために、同時継続出願（PCT/CN2015/070243）において、我々は、ヒト脂肪由来幹細胞（hADSC）のサブセットが血清由来HCV遺伝子型1a、1b、2a、2b及び混合2a±2bの完全複製をサポートするプラットフォームを成功裏に開発した。更に、新たに作り出されたウイルスは、ネイティブhADSCに対して感染力を有し、ネイティブhADSCへの連続「再感染」がウイルス複製を維持し、総ウイルス価を6サイクルの再感染後に、1×1011コピー以上にエスカレートすることができる。重要なこととして、血清媒介HCV感染hADSCによって作り出されたウイルスは、初代ヒト肝細胞に対して感染性を有していたということである。
【０００５】
副作用が少ない効果的な薬剤と治療法がいまだ求められている。最近、新たな世代の抗HCV治療法としての小分子の考案における進歩がなされているが、これらのHCV特異的酵素インヒビターの製造はコスト高である。更に、その長期的な副作用によって更なるモニタリングを必要とする。従って、より安全なプロファイルをもたらし、より製造コストが低い天然生成物からなる、又は、由来する新たな抗HCV治療法の開発が未だに求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要約
この要約は、本発明の性質と内容とを簡単に示すべく本発明の要約を提示するべく提供されるものである。それは特許請求の範囲の記載及び意味を解釈又は限定するために使用されるものではない。
【０００７】
一態様において、本開示は、対象体におけるHCV感染を治療又は予防する、或いは、HCVの複製を抑制するための方法を提供し、ここで、当該方法は、前記対象体に対して、DEAQETAVSSHEQDのアミノ酸配列に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列、若しくは、そのバリアント、誘導体、変異体、又は、フラグメントを含むペプチドを、有効量、投与する工程を有する。いくつかの実施例において、前記ペプチドの前記アミノ酸配列は、前記アミノ酸配列DEAQETAVSSHEQDに対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%、又は99%、或いはそれ以上の同一性を有する。いくつかの実施例において、前記ペプチドは、アミノ酸配列DEAQETAVSSHEQD, QETAVSSHEQD又はDEAQETAVSSHEQを含む。いくつかの実施例において、前記ペプチドの前記配列は、DEAQETAVSSHEQD, QETAVSSHEQD又はDEAQETAVSSHEQから実質的に構成される、又は、構成される。いくつかの実施例において、前記ペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換を含む。いくつかの実施例において、前記アミノ酸の付加、欠失及び／又は置換は、C末端及び／又はN末端で行われる。いくつかの実施例において、前記ペプチドは、1〜5、好ましくは1〜3のアミノ酸付加、欠失及び／又は置換を含む。いくつかの実施例において、前記方法は、更に、別の抗HCV剤を投与する工程を含む。そのような抗HCV剤は、本発明の前記ペプチドの前または後、或いは同時に、投与することができる。しくつかの実施例において、HCVは遺伝子型1a、1b、2a、又は、2b、或いは、遺伝子型3又は遺伝子型4のものである。
【０００８】
別の態様において、本開示は、アミノ酸配列QETAVSSHEQD又はDEAQETAVSSHEQに対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列、若しくは、そのバリアント、誘導体、変異体、又は、フラグメントを含むペプチドを提供する。いくつかの実施例において、前記ペプチドの前記アミノ酸配列は、前記アミノ酸配列QETAVSSHEQD又はDEAQETAVSSHEQDに対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%、又は、99%、或いは、それ以上の同一性を有する。いくつかの実施例において、前記ペプチドは、QETAVSSHEQD又はDEAQETAVSSHEQを含む、から実質的に構成される、又は、構成される。いくつかの実施例において、前記ペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換を含む。いくつかの実施例において、前記アミノ酸の付加、欠失及び／又は置換は、C末端及び／又はN末端で行われる。いくつかの実施例において、前記ペプチドは、1〜5、好ましくは1〜3のアミノ酸付加、欠失及び／又は置換を有する。いくつかの実施例において、前記ペプチドは、HCV複製に対する抑制作用を有する。いくつかの実施例において、前記ペプチドは、単離されるか、化学的合成によって得られる。
【０００９】
別の態様において、本開示は、本発明の前記ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１０】
別の態様において、本開示は、本発明の前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００１１】
別の態様において、本開示は、本発明の前記ポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１２】
別の態様において、本開示は、本発明の前記ペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター又は宿主細胞の有効量と、薬剤的に許容可能なキャリアとを含む医薬組成物とを提供する。
【００１３】
別の態様において、本開示は、対象体におけるHCV感染の治療又は予防、或いはHCVの複製の抑制のための薬剤の製造における、本発明の前記ペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又は医薬組成物の使用を提供する。いくつかの実施例において、前記薬剤は、更に、別の抗HCV剤を含む。いくつかの実施例において、HCVは、遺伝子型1a、1b、2a、又は、2b、或いは、遺伝子型3又は遺伝子型4のものである。
【００１４】
その他の態様については後述する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
以上の要旨と詳細説明は、限定のためにではなく例示のために含まれる添付の図面を参照することによってより良く理解される。
【図１】DEAQETAVSSHEQDとその誘導体は、hADSCと初代肝細胞（AとB）における血清媒介HCVの複製を効果的に抑制する。濃度1、 10及び100μgmlのDEA、DEA-Q及びQETペプチドをHCV（+）血清（遺伝子型1b）に対する曝露の前に1時間、p5 hADSCの培養物に添加した。HLA-A11拘束Epstein-Barrウイルス特異性ペプチドエピトープCSSCSSCPLSKを対照（無関係）ペプチドとして使用した。感染後21日目に、上清（A）と細胞溶解液（B）中の5’-UTR複製数を、qRT-PCRによって定量化した。データは、3つの実験からの平均±SDとしてあらわす。（C） 濃度1、10及び100μgmlのDEA、DEA-Q及びQETペプチドをHCVser（遺伝子型1b）に対する曝露の前に1時間、初代ヒト肝細胞の培養物に添加した。感染後5日間、5’-UTRのRT-PCRのために細胞RNAを抽出した。データは、3つの実験からの平均±SDとしてあらわす。いくつかの濃度（10及び100μg/ml等）でのDEA、DEA-Q及びQETのHCV複製数は検出限界以下である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
発明の実施例の詳細説明
以下、例示のための利用例を参照して本発明のいくつかの態様について説明する。尚、様々な具体的詳細、関係、及び方法は、本発明の完全な理解を提供するために記載される。しかしながら、当業者は、本発明が、これらの具体的詳細無しでも、或いは、他の方法によっても、実施可能であることを容易に理解するであろう。いくつかの行為は異なる順序及び／又は他の行為又は事象と同時に行うことが可能であるため、本発明は行為又は事象の順序によって限定されるものではない。更に、本発明による方法を実施するために、例示される行為又は事象の全てが必要とされるものではない。
【００１７】
特に別の定義がなされない限り、ここに使用される科学的及び技術的用語及び名称は本発明が関連する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有するものである。一般に、細胞培養、感染、分子生物学的方法等は当該技術における一般的な方法である。そのような標準技術は、例えば、Sambrook et al. （1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories）やAusubel et al. (1994, Current Protocols in Molecular Biology Wiley, New York）等といった参考マニュアルに見出すことができる。
【００１８】
ここでの使用において、単数形“a”、“an”、“the”は、特にはっきりと銘記されない限り、複数も含むものと意図される。
【００１９】
量、持続時間等の測定可能値に言及する際にここで使用される「約」という用語は、そのようなバリエーションは開示される方法を実行するために適切であることから、その規定された値から、±20%又は±10%、より好ましくは、±5%、更に好ましくは±1%、更に好ましくは±0.1%のバリエーションを含むものと意図される。
【００２０】
本開示の前記ペプチドは、組み換え、天然又は合成ペプチドとすることができる。本開示の前記ペプチドは、精製された天然産物、又は、化学的合成産物とすることができる。或いは、それは、細菌、酵母、高等植物、昆虫、及び、哺乳動物細胞等の原核又は真核宿主から、組み換え技術を使用して作り出すことができる。組み換え生産において使用される前記宿主に応じて、前記ペプチドは、グリコシル化又は非グリコシル化することができる。一実施例において、本開示の前記ペプチドは、ウサギα1-抗プロテイナーゼFのフラグメント、及び、その誘導体由来である。
【００２１】
ここでの使用において、用語「誘導体」、「バリアント」、「変異体」及び「フラグメント」は、本ペプチドと同じ生物機能又は活性を実質的に保持するペプチドを意味する。
【００２２】
ここでの使用において、前記用語「誘導体」は、（i）その単数又は複数のアミノ酸残基が置換基を含むもの、（ii）前記ペプチドが、当該ペプチドの半減期を増大するための化合物（たとえば、ポリエチレングリコール）、等の別の化合物と融合されたもの、（iii）例えば、リーダー又はセクレタリー配列或いは、ペプチド又はプロタンパク質を精製するために使用される配列等、付加アミノ酸が前記ペプチドに融合されるもの、或いは、（iv）前記ペプチドがなんらかの改変によって改変されるもの、を含むが、これらに限定されるものではない。そのような誘導体は、ここでの教示内容に基づき当業者に知られている。
【００２３】
ここでの使用において、前記用語「改変」（通常は一次配列を変化させるものではない）は、アセチル化又はカルボキシル化等のペプチドのイン・ヴィヴォ又はイン・ヴィトロな化学的誘導を含む。また、例えば、その合成及び処理、或いは、例えば、ペプチドをグリコシル化酵素（たとえば、哺乳動物グリコシル化又は脱グリコシル化酵素）に対して曝露させること等による更なる処理工程においてペプチドのグリコシレル化パターンを改変することによって作り出されるもの等のグリコシレル化の改変も含まれる。更に、ホスホチロシン、ホスホセリン、ホスホトレオニン等のリン酸化アミノ酸残基を有する配列、更には、タンパク質分解に対する耐性を改善するべく、又は、溶解性を最適化するべく、改変された配列も含まれる。
【００２４】
ここでの使用において、前記用語「バリアント」は、前記ペプチドのC末端、N末端、或いは、そのペプチド内部に、複数のアミノ酸の欠失、挿入及び／又は置換、好ましくは、複数の保存アミノ酸置換（通常1〜7、好ましくは1〜6、より好ましくは1〜5、更に好ましくは1〜4、更に好ましくは1〜3、最も好ましくは1〜2）、及び、単数又は複数のアミノ酸（通常20未満、好ましくは10未満、より好ましくは5未満）の付加を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、一つのアミノ酸残基が、類似又は同等のものによって置換される場合、例えば、保存又は非保存アミノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸残基）によって置換される場合、タンパク質機能は変化しない。更に、C末端及び／又はN末端における単数又は複数のアミノ酸の付加は、通常、タンパク質機能を変化させるものではない。
【００２５】
ここでの使用において、「保存アミノ酸置換」とは、最大で7つ、好ましくは、最大で6つ、より好ましくは5つ、最も好ましくは最大3つのアミノ酸を、もとのアミノ酸配列と比較して、実質的に同じ又は類似の性質を有するアミノ酸によって置換することによって形成されるペプチドを意味する。自然発生アミノ酸は、共通の側鎖特性に基づいて以下のクラスに分類することができる。
【００２６】
1）疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile、
2）中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、
3）酸性：Asp、Glu、 
4）塩基性：His、Lys、Arg、
5）鎖配向に影響する残基：Gly, Pro、及び、
6）芳香性：Trp、Tyr、Phe
【００２７】
保存アミノ酸置換は、これらのクラスの一つのメンバーの同クラスの別のメンバーとの置換を伴いうる。保存アミノ酸置換は、非自然発生アミノ酸残基を含むことができ、これらは、通常、生物系における合成ではなく、化学的なペプチド合成によって組み込まれる。これらには、ペプチド模倣物、及び、他の逆又は反転形状のアミノ酸成分が含まれる。
【００２８】
保存アミノ酸置換の例を表１に示す。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
当業者は、周知の技術をここに提供される情報と組み合わせて使用して、さきに記載のポリペプチドの適当なバリアントを決定することができるであろう。当業者は、その活性のために重要であるとは考えられない領域を標的化することによって、その活性を破壊することなく変更可能な分子の適当な領域を同定することができる。当業者は、又、類似のポリペプチド間において保存されている分子の残基及び部分を同定することができるであろう。更なる実施例においては、生物活性又は構造にとって重要でありうる領域ですら、その生物活性を破壊することなく、或いは、そのペプチド構造に悪影響を与えることなく、保存アミノ酸置換を行うことが可能である。
【００３１】
本発明の前記ポリヌクレオチドは、DNA又はRNAの形態とすることができる。DNAは、一本鎖又は二本鎖形態の、cDNA、ゲノムDNA及び合成DNA等を含む。本発明のポリヌクレオチドは、縮重配列とすることができる。ここでの使用において、前記用語「縮重配列」とは、コドンの縮重によって同じタンパク質をコードする異なる配列が存在するということを意味する。
【００３２】
前記用語「前記ペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、前記ペプチドをコード化する前記ポリヌクレオチドと、付加的、及び／又は、非コード配列を含むポリヌクレオチドを含む。
【００３３】
ここでの前記ペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドは、PCR増幅、組み換え法、及び、合成法によって作り出すことができる。PCR増幅の場合、前記配列を、ここに開示されるヌクレオチド配列、特にORFに基づいてプライマーを設計し、そして、鋳型として市販の、又は、当該技術における標準技術によって作製されるcDNAライブラリーを使用することによって得ることができる。前記配列が得られると、多くの配列を組み換え法によって作り出すことができる。通常、前記配列は、ベクターにクローニングされ、それが、宿主細胞へと形質転換される。前記配列は、従来技術を使用して増幅された宿主細胞から単離される。
【００３４】
本発明は、更に、本開示の前記ポリヌクレオチドを含むベクター、本開示の前記ベクター又は前記ポリヌクレオチドによって形質転換された遺伝子工学的に作製された宿主細胞、及び、前記ペプチドを組み換え技術によって作り出すための方法にも関する。
【００３５】
前記組み換えペプチドは、本発明の前記ポリヌクレオチド配列を利用して、従来の組み換えDNA技術（Science, 1984; 224:1431）によって発現、又は、作り出すことができる。一般に、それは以下の工程を含む。
【００３６】
（１） 適当な宿主細胞を、前記ペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド、又は、当該ポリヌクレオチドを含む前記ベクターによって形質移入、又は、形質転換する;
（２）前記宿主細胞を適当な培地で培養する、;
（３）前記培地又は細胞から前記タンパク質を単離又は精製する。
【００３７】
本発明において、ここでの前記ポリヌクレオチド配列は、組み換え発現ベクターに挿入することができる。前記用語「発現ベクター」は、細菌プラスミド、バクリテオファージ、酵母プラスミド、アデノウイルスやレトロウイルス等の植物ウイルス又は哺乳動物細胞ウイルス、又は、当該技術において公知のその他任意の媒体を意味する。それが宿主中で複製し安定しうる限り、任意のプラスミド又はベクターを前記組み換え発現ベクターを構築するために使用することができる。発現ベクターの一つの重要な特徴は、その発現ベクターは、通常、複製オリジン、プロモーター、マーカ遺伝子、更に、翻訳調節成分を含んでいることである。
【００３８】
前記公知の方法を、ここに記載の前記配列と、適当な転写/翻訳調節成分とを含む発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、イン・ヴィトロ組み換えDNA技術、DNA合成技術、イン・ヴィヴォ組み換え技術等を含む。前記DNA配列は、mRNAの合成を指令するために発現ベクター中の適当なプロモータに効率的に連結される。プロモーターの例は、E. coliのlac又はtrpプロモーター、AファージのPLプロモーター、CMV最初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期SV40プロモーター、レトロウイルスのLTR、及び原核細胞、真核細胞又はウイルス中の発現を制御するその他任意の公知のプロモーターである。前記発現ベクターは、更に、前記翻訳を開始するリボソーム結合部位、転写ターミネーター等を含むことができる。  
【００３９】
ここでの使用において、前記「宿主細胞」は、原核細胞、例えば、細菌、初代真核細胞、例えば、酵母、高度真核生物、例えば、哺乳動物細胞、を含む。代表的な例は、細菌細胞、例えば、E. coli、ストレプトマイセス属、サルモネラ・チフィムリウム、真菌細胞、例えば、酵母、植物細胞、昆虫細胞、例えば、Drosophilia S2又はSf9、動物細胞、例えば、CHO、COS、又は、Bowesメラノーマ等である。
【００４０】
本発明は、更に、対象体におけるHCV感染の治療又は予防、或いはHCVの複製を抑制する方法にも関し、これは、前記対象体に、本発明の前記ペプチドを有効量投与する工程を含む。そのようなペプチドは、DEAQETAVSSHEQDのアミノ酸配列対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列、若しくは、そのバリアント、誘導体、変異体、又は、フラグメントを含むペプチドを含むが、それらに限定されるものではない。一の実施形態において、前記ペプチドは、DEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD、又は、DEAQETAVSSHEQのアミノ酸配列から実質的に構成される、又は、構成される。実施形態において、前記ペプチドは、そのようなバリアント、誘導体、変異体、又は、フラグメントが、前記ペプチドDEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD、又は、DEAQETAVSSHEQのHCVに対する抑制作用を保持する限りにおいて、ペプチドDEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD、又は、DEAQETAVSSHEQのバリアント、誘導体、変異体、又は、フラグメントとすることができる。例えば、前記バリアント、誘導体、変異体、又は、フラグメントのHCVに対する抑制作用は、前記ペプチドDEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD、又は、DEAQETAVSSHEQのHCVに対する抑制作用の少なくとも40%、 50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、又は、それ以上とすることができる。当業者は、そのようなバリアント、誘導体、変異体及びフラグメントをルーチン的に選択し決定することができる。
【００４１】
ここで使用される前記用語「有効量」は、有意な患者の利益、例えば、ウイルス負荷における持続的減少を示すのに十分な量の活性成分をいう。
【００４２】
本発明によるHCVは、hADSC又はヒト肝細胞に感染可能な任意のHCV、又は、HCV感染した個人から分離することが可能な任意のHCVとすることができる。一実施形態において、HCVは、遺伝子型1a、1b、2a、2b、2c、2d、3a、3b、3c、3d、3e、3f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h、4i、4j、5a、及び、6aからなるグループから選択されるHCV遺伝子型の少なくとも1つ、又は、それらの組み合わせである。別の実施例において、HCVは、遺伝子型1a、1b、2a、2b、3、及び、4からなるグループから選択されるHCV遺伝子型の少なくとも1つである。
【００４３】
HCVのレベルは、当該技術において公知の任意の技術によって測定することができる。そのような技術は、HCVタンパク質をテストする抗-HCV ELISAアッセイ（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay）を含むことができる。テストRNAの増幅（たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応、又は、PCR、分岐DNAアッセイ）によるHCV複製をテストすることを使用することができる。HCVのRNAの合成を、実際に、リアルタイムPCR用に設計された装置を使用して単一の工程でのRT-PCRによって、或いは、HCV特異性放射性プローブを使用したフィルター上でのRNAのハイブリダイゼーションによって分析することができる。例えば、HCVゲノムの増幅を可能にする特異性オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、逆転写及びポリヌクレオチド連鎖反応による増幅（RT-PCR）等の、逆転写及び増幅の組み合わせを単離されたRNAに対して行うことができる。その後、前記対象体に感染したHCVの遺伝子型を決定するために直接配列決定法を行うことができる。
【００４４】
ここでの使用において、前記用語「ヒト脂肪由来幹細胞」（hADSC）は、脂肪組織を含む組織源から得られた親細胞である、又は、親細胞を有する、ヒト成人幹細胞である。いくつかのケースにおいて、hADSCは、間質血管フラクション（SVF）とも呼ばれ、これは正に一連のADSCの源である。SVFは、ヒト脂肪組織から単離された初代細胞であり、培地において、それらは自発的に増殖する（細胞数が増加する）。
【００４５】
ここでの使用において、前記用語「患者」、「対象体」、「個人」、等は、相互交換可能に使用されるものであり、ここに記載される方法を受け入れる任意の動物をさし、ヒト、非ヒト哺乳動物（たとえば、ウシ、ヒツジ、ウサギ、犬、マウス、ラット、サル等）及び家禽類を含む。
【００４６】
本発明は、ここに記載の前記ペプチド、そのバリアント、誘導体、変異体、及び／又は、フラグメントの有効量を、薬剤的に許容可能な担体と共に含む医薬組成物も提供する。そのような担体は、生理食塩水、緩衝溶液、グルコース、水、グリセリン、エタノール、又は、それらの組み合わせを含むが、それらに限定されるものではない。前記医薬組成物は、送達方法のために適当なものでなければならない。前記医薬組成物は、生理食塩水、若しくは、その他のグルコース又は補助成分を含むその他の水溶液を使用して、従来法によって作られる注射剤の形態とすることができる。錠剤又はカプセル剤の形態の医薬組成物をルーチン的な方法によって作ることができる。前記医薬組成物、例えば、注射剤、溶液、錠剤及びカプセル剤は、殺菌条件下で製造されなければならない。その活性成分は、例えば、一日当たり約1μg〜50mg/kg体重、又は、それ以上の治療有効量で投与される。
【００４７】
更に、本開示の前記ペプチドは、組み合わせ療法において、併用又は別々に、或いは、それらの化合物を組成物に組み合わせることによって投与することができる。本開示の前記ペプチドと共に投与することが可能な薬剤としては、インターフェロンとリバビリン、ボセプレビル、テラプレビル、又はソホスブヒルを含むが、それらに限定されるものではない。前記インターフェロンは、インターフェロンアルファ2B、ペグ化インターフェロンアルファ、コンセンサスインターフェロン、インターフェロンアルファ2A、インターフェロンラムダ、ペグ化インターフェロンラムダ、及びリンパ芽球系インターフェロンタウ、から選択することができる。
【００４８】
本開示の前記ペプチドは、実験試薬として使用することも可能である。前記ペプチドは、HCV疾患機序の知識を高めるべく、ウイルス複製アッセイの設計、動物アッセイシステムの確認、構造生物学研究、のための研究ツールを提供することにおいても有用でありうる。更に、本開示の前記ペプチドは、例えば、競合阻害による他の抗ウイルス剤の結合部位を確立又は決定することにおいても有用である。
【００４９】
本開示の前記ペプチドは、例えば、血液、組織、外科機器、衣服、実験器具及び実験衣服、及び、血液コレクション又は輸血装置及び輸血マテリアルのようなマテリアルのウイルス汚染を治療又は予防することに使用することもでき、従って、そのようなマテリアルと接触する実験室又は医療スタッフ又は患者のウイルス感染リスクを低減することに使用することもできる。
【００５０】
本開示の前記ペプチド、医薬組成物、使用、及び、方法の実施態様は、例示的であることを意図するものであり、限定的なものではない。上記教示、特に、抗-hCVウイルス作用に関して元の機能近く維持する前記ペプチドの改変に関するものに鑑みて、当業者によって、改変及び変更を行うことが可能である。従って、ここに記載のものの範囲内である開示される特定の実施形態において変更を行うことが可能であると理解される。
【実施例】
【００５１】
以下の例によって本発明を更に例示する。これらの例は、本発明を例示することを意図するものに過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。以下の例における実験方法に関して、特に銘記されない限り、それらは、ルーチン的な条件下、例えば、Sambrook et al., in Molecule Clone: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989、に記載されているもの、又は、製造業者によって指示されているようにして行われた。
【００５２】
実施例１： 
ペプチドの作製
合成の一般的情報
合成のために使用されたアミノ酸: Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH。C18カラム（BIOSIL. 4.6mm×150 mm、5μm）を使用してAgilent 1100シリーズシステム上でHPLC分析を行った。検出は、220nmでのUVによる。流速は0.3 mL/分である。ペプチド−３及び５に関しては、下記のグラジエント溶出（溶媒A: 0.1%TFA/H2O、溶媒B: 0.1%TFA/MeOH）が使用される。0分で100% A、10分で80% A、20%B、15分で50%A、50%B、20分で100%B、更に追加の10分で100%B。HPLC（NUCLEODUR C18 Pyramid、4.6 mm×250 mm、5μm）中のQETの移動相は0.1% TFA/CH3OHである。MALDI-TOF質量分光計（Autoflex III system、Brucker Daltonics）とNuclear Magnetic Resonance分光（Varian Unity Plus 400 MHz）をペプチド同定に使用する。
【００５３】
ペプチドの一般的合成と精製
Solid Phase Peptide Synthesizer（PS3）によって標準Fmoc-ストラテジーを使用してペプチドを合成した。概略すると、D又はQ残基プレロードWang樹脂（0.79 mmol/gロード）を反応容器に計量し、合成の前に一時間、新しいDMF（5mL）で膨張させた。N末端のアミンをフリーにするために、一番目とそれに続くFmoc基を、5分間、２回、5mLのDMF中の20%ピペリジン（“DEP”溶液として）で除去した。その後、3mLのDMF中の0.4M N-メチルモルフォリンをC末端活性化の為に添加し（“ACT”として）、カップリング（AAと称する）のために、前記所望アミノ酸（Fmoc-AA（保護側鎖）-OHとして）とPyBOPとを4倍の過剰で使用した。適切な時間の”AA”処理（表２を参照）後、N末端アミノ酸を導入しAc2O（100μL）で、25分間、ACT溶液中の未反応フリーアミン（CAPと称する）の残りをキャップした。その後、DEP-ACT-AA-CAPサイクルを反復してCからN末端へペプチドを構築する。すべての反応をKaiserテストによってモニタリングした。最後に、氷浴における95% TFA/H2Oでの処理によって固体担体からペプチドを取り除き、1.5時間で室温に戻した。粗精製物を濾過によって収集した。前記粗精製物をC18カラム（MERICK Lobar 310-25 Lichrprep）を使用した中圧液体クロマトグラフィによって精製した。純度を、HPLCシステムによって同定した。合成されたペプチドをMALDI-TOF質量分光計とNuclear Magnetic Resonance分光計とによって特徴付けた。
【００５４】
結果
ペプチド−３ (DEQ-Q）: DEAQETAVSSHEO、収率:29% 保持時間17.7 分（純度>95%）。MS（MALDI-TOF）: Calcd: 1432 Da(M+H+)（観察）。1H-NMR（400MHz、D2O）: 8.54 (s,1H), 7.22(s, 1H), 4.65(m, 1H）, 4.51(q, J=7Hz, 1H), 4.30(m, 8H), 4.09(m, 3H), 3.77(m, 3H), 3.58(m, 2H), 3.23(dd, J=6及び6Hz, 1H), 3.09(dd, J=8及び9Hz, 1H), 2.97(dd, J=5及び5Hz, 1H), 2.87(dd, J=8及び8Hz, 1H), 2.42(m, 6H）, 2.04(m, 15H), 1.30(t, J=7Hz, 6H), 1.16(m, 3H), 0.87(dd, J=4及び4Hz, 6H)。
【００５５】
ペプチド−５（DEA）: DEAQETAVSSHEQD、収率: 28% 保持時間: 16.5分（純度>95%）。MS（MALDI-TOF）: Calcd: 1545 Da(M+H+),知見: 1545 Da（M+H+）。1H-NMR（400MHz, D2O）; ・8.53 (s,1H), 7.20(s, 1H), 4.64(m, 2H), 4.50(t, J=7Hz, 1H), 4.30(m, 8H), 4.08(m, 3H), 3.69(m, 5H), 3.20(dd, J=6及び6Hz, 1H), 3.07(dd, J=8及び8Hz), 2.85(m, 3H), 2.42(m,6H), 2.07(m, 15H), 1.28(m, 6H), 1.15(m, 3H), 0.86(dd, J=3及び3Hz,6H)。
【００５６】
QUET:QETAVSSHEQD、保持時間:3.9、MS（MALDI-TOF）、Calcd: 1230 Da（[M+H]）、知見: 1230. Da（[M+H]）. 
【００５７】
【表２】
2018516272.tif 000003
【００５８】
実施例２： 
抗-HCV活性    
次に我々は、実施例１にて作製された、14のアミノ酸DEAQETAVSSHEQDからなるペプチド（DEAとして示す）とその誘導体QETAVSSHEQD（QETとして示す）及びDEAQETAVSSHEQ（DEA-Qとして示す）のhADSCとヒト初代肝細胞における血清媒介HCVの複製における作用を調べた。各ペプチドの1、10及び100μg/mlの投与量を、HCV(+）血清（遺伝子型1b）に対する曝露の前に1時間、p5 hADSCの培養に添加した。前記hADSCは、HLA-A11拘束、エプスタイン・バール（Epstein-Barr）ウイルス特異性ペプチドエピトープCSSCSSCPLSK10である、100μg/mlの対照ペプチドによっても処理された。感染後21日目に、上清と細胞溶解物中の5’-UTR複製数を、qRT-PCRによって定量化した。その結果は、HCVser-1b感染hADSCのd21上清（図１Ａ）と細胞溶解液 （図１Ｂ）との両方において、ウイルス複製数がDEA、DEA-Q、又は、QETペプチドによる前処理によって大幅に低減されたこと、そして、その抑制作用は、各ペプチドにおいて1μg/mlにおいて既にみられるものであることを示した。これに対して、対照ペプチドによる前処理では効果はなかった。
【００５９】
我々は、更に、これらのペプチドがヒト肝細胞におけるHCVser複製も抑制するか否かを調べた。ヒト肝細胞を、記載11されているようにして、病変の非腫瘍部分から単離された。肝細胞は、プラスチックウェルへの付着を可能にするべく3日間放置され、その後、対照ペプチド、DEA、DEA-Q、又は、QETペプチドによる前処理有り又は無しでHCVser-1bに対して曝露された。感染後5日間で、細胞RNAが、5’-UTRのRT-PCRに対して抽出された。その結果、hADSCのケースと同様、ペプチドDEQ、DEA-Q、及び、QETでの前処理が、1μg/mlもの低い濃度で、ヒト肝細胞におけるHCVser複製を大幅に抑制することが確認された（図１Ｃ）。
【００６０】
要約すると、我々は、DEAQETAVSSHEQD、DEAQETAVSSHEQ及びQETAVSSHEQDの配列を有するペプチドが、hADSCと初代ヒト肝細胞との両方においてHCVser複製に対して抑制作用を有するという証拠を提供するものである。DEAQETAVSSHEQDの配列を有する前記ペプチドは、ウサギα1-抗プロテイナーゼFのフラグメントであり、そのような天然由来生成物は、より安全なプロファイルをもたらし、しかも低い製造コストで提供されるものである。
【００６１】
参照文献
1  Lindenbach, B.D. & Rice, C.M. Unravelling hepatitis C virus replication from genome to function. Nature 436, 933-938, doi: 10.1038/nature04077 (2005）.
2  Sheets, W.F.  http: //www. who. int/mediacentre/factsheets/fs164/en/. (July 2012）.
3  Scheel, T.K. & Rice, C.M. Understanding the hepatitis C virus life cycle paves the way for highly effective therapies. Nature medicine 19, 837-849, doi: 10.1038/nm.3248 (2013）.
4  Bartenschlager, R. & Lohmann, V. Novel cell culture systems for the hepatitis C virus. Antiviral research 52, 1-17 (2001）.
5  Wilson, G.K. & Stamataki, Z. In vitro systems for the study of hepatitis C virus infection. International journal of hepatology 2012, 292591, doi: 10.1155/2012/292591 (2012）.
6  Sheehy, P. et al. In vitro replication models for the hepatitis C virus. Journal of viral hepatitis 14, 2-10, doi: 10.1111/j. 1365-2893.2006.00807.x (2007）.
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10  Lin, C.L. et al. Immunization with Epstein-Barr Virus (EBV） peptide-pulsed dendritic cells induces functional CD8+ T-cell immunity and may lead to tumor regression in patients with EBV-positive nasopharyngeal carcinoma. Cancer research 62, 6952-6958 (2002）.
11  Bhogal, R.H. et al. Isolation of primary human hepatocytes from normal and diseased liver tissue: a one hundred liver experience. PloS one 6, e18222, doi: 10.1371/journal. pone. 0018222 (2011）.
【図１Ａ】
2018516272.tif 000004
【図１Ｂ】
2018516272.tif 000005
【図１Ｃ】
2018516272.tif 000006
【配列表】
2018516272000001.app
【国際調査報告】
2018516272.tif 000007
2018516272.tif 000008
2018516272.tif 000009