(57)【要約】  本開示は、デコイレセプター３タンパク質（ＤｃＲ３）をコードするＴＮＦＲＳＦ６Ｂ遺伝子に、例えば、ＤｃＲ３の発現、分泌、又はリガンド結合活性を低減させる遺伝子改変を有する患者において自己免疫状態を治療する方法に関する。例えば、一部の実施態様において、状態は、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、及びＦａｓＬなどのＤｃＲ３リガンドの活性を阻害する分子、例えば、抗ＬＩＧＨＴ抗体、抗ＴＬ１Ａ抗体、及び抗ＦａｓＬ抗体、又は非カノニカルＮＦ−κＢ経路の阻害剤などで治療され得る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患の治療を必要とする患者においてそれを治療する方法であって、
（ａ）前記患者が、ＤｃＲ３ネットワーク遺伝子に少なくとも１つの遺伝子改変、例えば、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂに、ＤｃＲ３の発現若しくは分泌の低減又はＤｃＲ３リガンド結合活性の低減と関連するものなど、ＤｃＲ３のレベル又は活性の低減と関連する少なくとも１つの遺伝子改変を有するかどうかを決定することと、前記患者がそのような突然変異を有する場合には、
（ｂ）前記患者に、有効量のＤｃＲ３リガンド阻害剤を投与することと
を含む方法。
【請求項２】
部分（ａ）は、前記患者が、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂに、ＤｃＲ３の発現若しくは分泌又はＤｃＲ３リガンド結合活性の低減と関連するものなど、ＤｃＲ３のレベル又は活性の低減と関連する少なくとも１つの遺伝子改変を有するかどうかを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
部分（ａ）は、前記患者が、ＤｃＲ３、ＤＲ３、ＴＬ１Ａ、ＬＩＧＨＴ、ＦａｓＬ、ＨＶＥＭ、ＬＴＡ、ＬＴＢ、ＦａｓＲ（ＣＤ９５）、及びＬＩＧＨＴ受容体をコードする遺伝子のうちの１つ又は複数に、少なくとも１つの遺伝子改変を有するかどうかを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの遺伝子改変が、Ｔ細胞活性の増大及び／又はＩＦＮ−ガンマ産生の増大と関連している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記患者が、小児患者である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記患者が、成人である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記自己免疫疾患が、強直性脊椎炎（ＡＳ）、乾癬（ＰＳ又はＰＳＯＲ）、セリアック病（ＣＥＬ）、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、クローン病（ＣＤ）、円形脱毛症（ＡＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群（ＳＪＯ）、全身性硬化症（ＳＳＣ）、脊椎関節症（ＳＰＡ）、白斑（ＶＩＴ）、喘息、又は甲状腺炎（ＡＩＴＤ、ＴＨＹ、又はＴＨ）のうちの１つ又は複数である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
治療を受ける対象が、ＴＮＦアルファモノクローナル療法に対して低応答性であるか、又はそれに対する耐性を有するか若しくは発症している、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記自己免疫疾患が、ＩＢＤである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者が少なくとも１つの遺伝子改変を有するかどうかを決定することが、少なくとも１つのＤｃＲ３ネットワーク遺伝子若しくは前記遺伝子の転写産物の増幅及び配列決定を含むか、又は少なくとも１つのＤｃＲ３ネットワーク遺伝子への１つ若しくは複数の核酸プローブのハイブリダイゼーションを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子改変が、以下のＤｃＲ３突然変異：Ｇｌｙ６Ａｒｇ、Ｐｒｏ２３Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２９Ａｒｇ、Ａｌａ１０２Ｔｈｒ、Ａｒｇ１０３Ｇｌｎ、Ａｒｇ１１６Ｈｉｓ、Ｇｌｙ１２４Ｖａｌ、Ａｒｇ１７２Ｈｉｓ、Ｇｌｙ１７８Ａｓｐ、Ｇｌｙ１７８Ｇｌｕ、Ｃｙｓ２１１Ｇｌｙ、Ｖａｌ２１５Ｉｌｅ、Ａｌａ２２０Ｖａｌ、Ａｒｇ２５８Ｃｙｓ、Ａｒｇ２８１Ｃｙｓ、及びＶａｌ２８２Ｍｅｔのうちの１つ又は複数を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子改変が、ＤｃＲ３分泌欠損型突然変異を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＤｃＲ３リガンド阻害剤が、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、又はＦａｓＬの阻害剤である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤｃＲ３リガンド阻害剤が、抗体、リガンドトラップ、アンチセンス核酸若しくはｓｉＲＮＡなどの核酸、又はアプタマーである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤｃＲ３リガンド阻害剤が、抗ＬＩＧＨＴ抗体、抗ＴＬ１Ａ抗体、又は抗ＦａｓＬ抗体などの抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が、抗ＬＩＧＨＴ抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗ＬＩＧＨＴ抗体が、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列の以下のセット：
（ａ）配列番号２、３、４、５、６、及び７；
（ｂ）配列番号１０、１１、１２、１３、１４、及び１５；
（ｃ）配列番号１６、１７、１８、１９、２０、及び２１；
（ｄ）配列番号２２、２３、２４、２５、２６、及び２７；
（ｅ）配列番号２８、２９、３０、３１、３２、及び３３；
（ｆ）配列番号３４、３５、３６、３７、３８、及び３９；
（ｇ）配列番号４０、４１、４２、４３、４４、及び４５；
（ｈ）配列番号４６、４７、４８、４９、５０、及び５１；並びに
（ｉ）配列番号５２、５３、５４、５５、５６、及び５７
のうちの１つをともに含む、重鎖及び軽鎖を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗ＬＩＧＨＴ抗体が、配列番号２、３、４、５、６、及び７をともに含む、重鎖及び軽鎖を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗ＬＩＧＨＴ抗体が、配列番号８及び９又は配列番号５８及び５９に対して少なくとも８５％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体が、国際公開第２０１５／１０７３３１号に記載されている１Ｃ０２抗体、１３Ｈ０４抗体、３１Ａ１０抗体、１Ｃ０６抗体、９８Ｃ０７抗体、１８Ｅ０４抗体、４２Ａ０２抗体、２９Ｃ０９抗体、１４Ｂ０９抗体、１１７Ｃ０６抗体、１１４Ｆ０５抗体、又は６２Ｃ０１抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
自己免疫疾患の治療を必要とする患者においてそれを治療する方法であって、前記患者が、ＤｃＲ３ネットワーク遺伝子に少なくとも１つの遺伝子改変、例えば、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂに、ＤｃＲ３の発現若しくは分泌の低減又はＤｃＲ３リガンド結合活性の低減と関連するものなど、ＤｃＲ３のレベル又は活性の低減と関連する少なくとも１つの遺伝子改変を有し、前記患者に、有効量のＤｃＲ３リガンド阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項２２】
前記ＤｃＲ３ネットワーク遺伝子が、ＤｃＲ３、ＤＲ３、ＴＬ１Ａ、ＬＩＧＨＴ、ＦａｓＬ、ＨＶＥＭ、ＬＴＡ、ＬＴＢ、ＦａｓＲ（ＣＤ９５）、及びＬＩＧＨＴ受容体のうちの１つ又は複数である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの遺伝子改変が、Ｔ細胞活性の増大及び／又はＩＦＮ−ガンマ産生の増大と関連している、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記患者が、小児患者である、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記患者が、成人である、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記自己免疫疾患が、強直性脊椎炎（ＡＳ）、乾癬（ＰＳ又はＰＳＯＲ）、セリアック病（ＣＥＬ）、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、クローン病（ＣＤ）、円形脱毛症（ＡＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群（ＳＪＯ）、全身性硬化症（ＳＳＣ）、脊椎関節症（ＳＰＡ）、白斑（ＶＩＴ）、喘息、又は甲状腺炎（ＡＩＴＤ、ＴＨＹ、又はＴＨ）のうちの１つ又は複数である、請求項２１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記自己免疫疾患が、ＩＢＤである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記遺伝子改変が、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂにおけるものであり、Ｇｌｙ６Ａｒｇ、Ｐｒｏ２３Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２９Ａｒｇ、Ａｌａ１０２Ｔｈｒ、Ａｒｇ１０３Ｇｌｎ、Ａｒｇ１１６Ｈｉｓ、Ｇｌｙ１２４Ｖａｌ、Ａｒｇ１７２Ｈｉｓ、Ｇｌｙ１７８Ａｓｐ、Ｇｌｙ１７８Ｇｌｕ、Ｃｙｓ２１１Ｇｌｙ、Ｖａｌ２１５Ｉｌｅ、Ａｌａ２２０Ｖａｌ、Ａｒｇ２５８Ｃｙｓ、Ａｒｇ２８１Ｃｙｓ、及びＶａｌ２８２Ｍｅｔのうちの１つ又は複数を含む、請求項２１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＤｃＲ３リガンド阻害剤が、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、又はＦａｓＬの阻害剤である、請求項２１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＤｃＲ３リガンド阻害剤が、抗体、リガンドトラップ、アンチセンス核酸若しくはｓｉＲＮＡなどの核酸、又はアプタマーである、請求項２１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＤｃＲ３リガンド阻害剤が、抗体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体が、抗ＬＩＧＨＴ抗体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗ＬＩＧＨＴ抗体が、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列の以下のセット：
（ａ）配列番号２、３、４、５、６、及び７；
（ｂ）配列番号１０、１１、１２、１３、１４、及び１５；
（ｃ）配列番号１６、１７、１８、１９、２０、及び２１；
（ｄ）配列番号２２、２３、２４、２５、２６、及び２７；
（ｅ）配列番号２８、２９、３０、３１、３２、及び３３；
（ｆ）配列番号３４、３５、３６、３７、３８、及び３９；
（ｇ）配列番号４０、４１、４２、４３、４４、及び４５；
（ｈ）配列番号４６、４７、４８、４９、５０、及び５１；並びに
（ｉ）配列番号５２、５３、５４、５５、５６、及び５７
のうちの１つをともに含む、重鎖及び軽鎖を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗ＬＩＧＨＴ抗体が、配列番号２、３、４、５、６、及び７をともに含む、重鎖及び軽鎖を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗ＬＩＧＨＴ抗体が、配列番号８及び９又は配列番号５８及び５９に対して少なくとも８５％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体が、国際公開第２０１５／１０７３３１号に記載されている１Ｃ０２抗体、１３Ｈ０４抗体、３１Ａ１０抗体、１Ｃ０６抗体、９８Ｃ０７抗体、１８Ｅ０４抗体、４２Ａ０２抗体、２９Ｃ０９抗体、１４Ｂ０９抗体、１１７Ｃ０６抗体、１１４Ｆ０５抗体、又は６２Ｃ０１抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
自己免疫疾患の治療を必要とする患者においてそれを治療する方法であって、前記患者が、ＤｃＲ３ネットワーク遺伝子に少なくとも１つの遺伝子改変、例えば、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂに、ＤｃＲ３の発現若しくは分泌の低減又はＤｃＲ３リガンド結合活性の低減と関連するものなど、ＤｃＲ３のレベル又は活性の低減と関連する少なくとも１つの遺伝子改変を有し、前記患者に、有効量の非カノニカルＮＦ−κＢ阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項３８】
前記ＤｃＲ３ネットワーク遺伝子が、ＤｃＲ３、ＤＲ３、ＴＬ１Ａ、ＬＩＧＨＴ、ＦａｓＬ、ＨＶＥＭ、ＬＴＡ、ＬＴＢ、ＦａｓＲ（ＣＤ９５）、及びＬＩＧＨＴ受容体のうちの１つ又は複数である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１つの遺伝子改変が、Ｔ細胞活性の増大及び／又はＩＦＮ−ガンマ産生の増大と関連している、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記患者が、小児患者である、請求項３７から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記患者が、成人である、請求項３７から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記自己免疫疾患が、強直性脊椎炎（ＡＳ）、乾癬（ＰＳ又はＰＳＯＲ）、セリアック病（ＣＥＬ）、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、クローン病（ＣＤ）、円形脱毛症（ＡＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群（ＳＪＯ）、全身性硬化症（ＳＳＣ）、脊椎関節症（ＳＰＡ）、白斑（ＶＩＴ）、喘息、又は甲状腺炎（ＡＩＴＤ、ＴＨＹ、又はＴＨ）のうちの１つ又は複数である、請求項３７から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記自己免疫疾患が、ＩＢＤである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記遺伝子改変が、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂにおけるものであり、Ｇｌｙ６Ａｒｇ、Ｐｒｏ２３Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２９Ａｒｇ、Ａｌａ１０２Ｔｈｒ、Ａｒｇ１０３Ｇｌｎ、Ａｒｇ１１６Ｈｉｓ、Ｇｌｙ１２４Ｖａｌ、Ａｒｇ１７２Ｈｉｓ、Ｇｌｙ１７８Ａｓｐ、Ｇｌｙ１７８Ｇｌｕ、Ｃｙｓ２１１Ｇｌｙ、Ｖａｌ２１５Ｉｌｅ、Ａｌａ２２０Ｖａｌ、Ａｒｇ２５８Ｃｙｓ、Ａｒｇ２８１Ｃｙｓ、及びＶａｌ２８２Ｍｅｔのうちの１つ又は複数を含む、請求項３７から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
治療剤を特定するための方法であって、
ａ）ＴＮＦＲＳＦ６Ｂに、ＤｃＲ３の発現若しくは分泌の低減又はＤｃＲ３リガンド結合活性の低減と関連するものなど、ＤｃＲ３のレベル又は活性の低減と関連する少なくとも１つの遺伝子改変を発現する、細胞を提供することと、
ｂ）野生型ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ対立遺伝子を含む細胞を提供することと、
ｃ）ａ）の細胞及びｂ）の細胞を試験薬剤と接触させることと、
ｄ）前記薬剤が、ａ）の細胞の免疫シグナル伝達を、ｂ）の細胞と比べて改変するかどうかを決定することと
を含む方法。
【請求項４６】
前記薬剤が、ＩκＢホメオスタシス、ＦａｓＬによって誘導されるアポトーシス、ＤｃＲ３−ＬＩＧＨＴ結合、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＬＴβＲ、ＴＬ１Ａ、又はＣＤ１６０機能、及び非カノニカルＮＦ−κＢシグナル伝達から選択される少なくとも１つのパラメーターを改変する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
自己免疫疾患の治療を必要とする患者においてそれを治療する方法であって、前記患者が、ＴＮＦａモノクローナル抗体療法に低応答性又は非応答性であり、前記患者に有効量のＤｃＲ３リガンド阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項４８】
前記患者が、ＤｃＲ３ネットワーク遺伝子に少なくとも１つの遺伝子改変、例えば、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂに、ＤｃＲ３の発現若しくは分泌の低減又はＤｃＲ３リガンド結合活性の低減と関連するものなど、ＤｃＲ３レベル又は活性の低減と関連する少なくとも１つの遺伝子改変を有する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＤｃＲ３ネットワーク遺伝子が、ＤｃＲ３、ＤＲ３、ＴＬ１Ａ、ＬＩＧＨＴ、ＦａｓＬ、ＨＶＥＭ、ＬＴＡ、ＬＴＢ、ＦａｓＲ（ＣＤ９５）、及びＬＩＧＨＴ受容体のうちの１つ又は複数である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記少なくとも１つの遺伝子改変が、Ｔ細胞活性の増大及び／又はＩＦＮ−ガンマ産生の増大と関連している、請求項４８又は４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記患者が、小児患者である、請求項４７から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記患者が、成人である、請求項４７から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記自己免疫疾患が、強直性脊椎炎（ＡＳ）、乾癬（ＰＳ又はＰＳＯＲ）、セリアック病（ＣＥＬ）、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、クローン病（ＣＤ）、円形脱毛症（ＡＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群（ＳＪＯ）、全身性硬化症（ＳＳＣ）、脊椎関節症（ＳＰＡ）、白斑（ＶＩＴ）、喘息、又は甲状腺炎（ＡＩＴＤ、ＴＨＹ、又はＴＨ）のうちの１つ又は複数である、請求項４７から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記自己免疫疾患が、ＩＢＤである、請求項４７から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記遺伝子改変が、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂにおけるものであり、Ｇｌｙ６Ａｒｇ、Ｐｒｏ２３Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２９Ａｒｇ、Ａｌａ１０２Ｔｈｒ、Ａｒｇ１０３Ｇｌｎ、Ａｒｇ１１６Ｈｉｓ、Ｇｌｙ１２４Ｖａｌ、Ａｒｇ１７２Ｈｉｓ、Ｇｌｙ１７８Ａｓｐ、Ｇｌｙ１７８Ｇｌｕ、Ｃｙｓ２１１Ｇｌｙ、Ｖａｌ２１５Ｉｌｅ、Ａｌａ２２０Ｖａｌ、Ａｒｇ２５８Ｃｙｓ、Ａｒｇ２８１Ｃｙｓ、及びＶａｌ２８２Ｍｅｔのうちの１つ又は複数を含む、請求項４７から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＤｃＲ３リガンド阻害剤が、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、又はＦａｓＬの阻害剤である、請求項４７から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＤｃＲ３リガンド阻害剤が、抗体、リガンドトラップ、アンチセンス核酸若しくはｓｉＲＮＡなどの核酸、又はアプタマーである、請求項４７から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＤｃＲ３リガンド阻害剤が、抗体である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗体が、抗ＬＩＧＨＴ抗体である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記抗ＬＩＧＨＴ抗体が、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列の以下のセット：
（ａ）配列番号２、３、４、５、６、及び７；
（ｂ）配列番号１０、１１、１２、１３、１４、及び１５；
（ｃ）配列番号１６、１７、１８、１９、２０、及び２１；
（ｄ）配列番号２２、２３、２４、２５、２６、及び２７；
（ｅ）配列番号２８、２９、３０、３１、３２、及び３３；
（ｆ）配列番号３４、３５、３６、３７、３８、及び３９；
（ｇ）配列番号４０、４１、４２、４３、４４、及び４５；
（ｈ）配列番号４６、４７、４８、４９、５０、及び５１；並びに
（ｉ）配列番号５２、５３、５４、５５、５６、及び５７
のうちの１つをともに含む、重鎖及び軽鎖を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記抗ＬＩＧＨＴ抗体が、配列番号２、３、４、５、６、及び７をともに含む、重鎖及び軽鎖を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記抗ＬＩＧＨＴ抗体が、配列番号８及び９又は配列番号５８及び５９に対して少なくとも８５％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記抗体が、国際公開第２０１５／１０７３３１号に記載されている１Ｃ０２抗体、１３Ｈ０４抗体、３１Ａ１０抗体、１Ｃ０６抗体、９８Ｃ０７抗体、１８Ｅ０４抗体、４２Ａ０２抗体、２９Ｃ０９抗体、１４Ｂ０９抗体、１１７Ｃ０６抗体、１１４Ｆ０５抗体、又は６２Ｃ０１抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を含む、請求項６０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願とのクロスリファレンス
本出願は、２０１５年８月２１日に出願された米国仮出願第６２／２０８３８３号及び２０１６年４月８日に出願された同第６２／３２０４００号に対する優先権を主張し、これらは、その全内容が本明細書に参照により援用される。
【０００２】
本開示は、デコイレセプター３タンパク質（ＤｃＲ３）をコードするＴＮＦＲＳＦ６Ｂ遺伝子に、例えば、ＤｃＲ３の発現、分泌、若しくはリガンド結合活性を低減させる遺伝子改変を有する患者、又はＴＮＦＲＳＦ６Ｂ／ＤｃＲ３シグナル伝達ネットワークの遺伝子に遺伝子改変を有する患者において自己免疫状態を治療する方法に関する。例えば、一部の実施態様において、状態は、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、及びＦａｓＬなどのＤｃＲ３リガンドの活性を阻害する分子、例えば、抗ＬＩＧＨＴ抗体、抗ＴＬ１Ａ抗体、及び抗ＦａｓＬ抗体、又は非カノニカルＮＦ−κＢ経路の阻害剤などで治療され得る。
【背景技術】
【０００３】
いくつかの刊行物及び特許文献が、本発明が属する技術分野の状況を説明するために本明細書全体を通じて引用される。これらの引用のそれぞれは、全体が記載されているかのように、本明細書に参照により援用される。
【０００４】
これまでに、小児発症炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を有する１，０１１人の個体、及び４，２５０人の対応するコントロールのコホートにおいて全ゲノム相関解析（ＧＷＡＳ）が行われ、これまでに報告されていなかった有意に関連する２０ｑ１３染色体上の対立遺伝子変異体を有する遺伝子座が特定され、複製されている。この遺伝子座は、デコイレセプター３（ＤｃＲ３）タンパク質をコードするＴＮＦＲＳＦ６Ｂ遺伝子の近傍にある。続いて、５２８人の小児ＩＢＤ罹患者及び５４９人の健常コントロール個体におけるＴＮＦＲＳＦ６Ｂ遺伝子の配列決定により、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ遺伝子座における複数のミスセンス変異体が発見され、これらの変異体は、ＩＢＤ罹患者ではコントロールと比較して多く含まれ、一部のものは、培養細胞においてＤｃＲ３分泌に影響を及ぼし得る。（Cardinaleら、Genes and Immunity 14: 447-452 (2013)）。
【０００５】
本出願は、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ遺伝子座における対立遺伝子の変異が、乾癬及び甲状腺炎を含む他の自己免疫状態と相関することを示すデータをさらに含む。
【０００６】
ＤｃＲ３は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのサイトカイン、すなわち、ＴＬ１Ａ（ＴＮＦＳＦ１５）、ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）、及びＦａｓリガンド（ＦＡＳＬＧ）に結合し、それらの受容体を刺激する能力を遮断する。ＴＬ１Ａは、例えば、デスドメイン受容体３（ＤＲ３）タンパク質のリガンドでもある。ＴＬ１ＡがＤＲ３に結合することにより、Ｔ細胞によるＩＦＮ−ガンマの分泌が誘導され得、ＮＦ−κＢ経路が活性化され得る。ＤｃＲ３は、ＴＬ１Ａへの結合に関してＤＲ３と競合し、それによって、Ｔ細胞に対するその刺激作用を制御し得る。ＤｃＲ３遺伝子ＴＮＦＲＳＦ６Ｂの遺伝子改変、例えば、ＤＣＲ３の分泌又はリガンド結合の低減を引き起こすもの、並びにＤｃＲ３の発現レベルに影響を及ぼす突然変異は、ＤｃＲ３の、そのリガンド、例えば、ＴＬ１Ａ又はＬＩＧＨＴの下方制御における有効性が低くなり得るため、対抗するものがない炎症シグナルを引き起こし得る。同様に、本発明者らは、本明細書において、この経路内の他の遺伝子、例えば、ＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ２５）、ＴＬ１Ａ（ＴＮＦＳＦ１５）、ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）、ＦａｓＬ（ＦＡＳＬＧ）、並びにＦａｓ受容体（ＦＡＳＲ；ＣＤ９５）、ヘルペスウイルス進入媒介因子Ａ（ＨＶＥＭ又はＴＮＦＲＳＦ１４）、並びにリンホトキシンＡ及びＢ（ＬＴＡ及びＬＴＢ）の遺伝子、並びにそれらの受容体の遺伝子改変により、同様に、ＤＲ３／ＤｃＲ３制御系の正常な機能が損なわれ得ることを認識した。
【０００７】
したがって、本発明者らは、ＤｃＲ３リガンド、例えば、ＴＬ１Ａ、ＬＩＧＨＴ、及びＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）の阻害剤、例えば、抗ＴＬ１Ａ抗体、抗ＬＩＧＨＴ抗体、若しくは抗ＦａｓＬ抗体、又は小分子阻害剤が、ＤｃＲ３遺伝子改変を有する（すなわち、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ対立遺伝子変異体を有する）ＩＢＤ対象、又はこの経路内の別の遺伝子に遺伝子改変を有するＩＢＤ対象において、特に有用であり得ることを認識した。本明細書におけるデータは、ＤＲ３／ＤｃＲ３もまた、非カノニカルＮＦ−κＢ経路を制御し得ることも示す。したがって、非カノニカルＮＦ−κＢ経路の阻害剤は、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ又はＴＮＦＲＳＦ６Ｂ／ＤｃＲ３経路の遺伝子に遺伝子改変を有する自己免疫疾患患者のためのさらなる薬物標的である。
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、例えば、それを必要とする成人患者又は小児患者において自己免疫疾患（ＡＩＤ）を治療する方法であって、
（ａ）患者が、少なくとも１つのＤｃＲ３ネットワーク遺伝子に少なくとも１つの遺伝子改変、例えば、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂに、ＤｃＲ３の発現若しくは分泌の低減又はＤｃＲ３リガンド結合活性の低減と関連するものなど、ＤｃＲ３のレベル又は活性の低減と関連する少なくとも１つの遺伝子改変を有するかどうかを決定することと、患者がそのような突然変異を有する場合には、
（ｂ）患者に、有効量のＤｃＲ３リガンド阻害剤を投与することと
を含む方法を含む。
【０００９】
本開示はまた、それを必要とする成人患者又は小児患者において自己免疫疾患を治療する方法であって、患者が、少なくとも１つのＤｃＲ３ネットワーク遺伝子に少なくとも１つの遺伝子改変、例えば、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂに、ＤｃＲ３の発現若しくは分泌の低減又はＤｃＲ３リガンド結合活性の低減と関連するものなど、ＤｃＲ３のレベル又は活性の低減と関連する少なくとも１つの遺伝子改変を有し、患者に、有効量のＤｃＲ３リガンド阻害剤を投与することを含む、方法も含む。上述の実施態様の一部において、ＤｃＲ３ネットワーク遺伝子は、ＤｃＲ３、ＤＲ３、ＴＬ１Ａ、ＬＩＧＨＴ、ＦａｓＬ、ＨＶＥＭ、ＬＴＡ、ＬＴＢ、ＦａｓＲ（ＣＤ９５）、及びＬＩＧＨＴ受容体のうちの１つ又は複数である。一部の実施態様において、ＤｃＲ３ネットワーク遺伝子は、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＣＳＦ２、ＴＮＦ、ＩＮＳ−ＩＧＦ２、ＥＲＢＢ３、ＴＮＦＳＦ１５、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＤＡＸＸ、ＴＲＡＩＰ、ＣＵＬ２、ＧＰＸ１、ＮＯＤ２、ＩＮＳ、ＲＨＯＡ、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＤＤＡＨ２、ＬＴＢ、ＲＴＥＬ１、ＬＴＡ、ＩＬ４、ＣＬＮ３、ＣＡＲＤ９、ＳＭＡＤ３、ＩＧＦ２、ＮＦＫＢＩＬ１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＰＰＩＦ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＮＯＴＣＨ１、ＰＬＡ２Ｇ４Ａ、ＮＵＰＲ１、ＪＡＫ２、ＩＬ１２Ｂ、ＬＲＲＫ２、ＩＬ２、ＤＡＰ３のうちの１つ又は複数である。
【００１０】
一部の実施態様において、少なくとも１つのＤｃＲ３ネットワーク遺伝子における少なくとも１つの遺伝子改変は、Ｔ細胞活性の増大及び／又はＩＦＮ−ガンマ産生の増大と関連している。
【００１１】
一部の実施態様において、治療しようとする自己免疫疾患は、強直性脊椎炎（ＡＳ）、乾癬（ＰＳ又はＰＳＯＲ）、セリアック病（ＣＥＬ）、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、クローン病（ＣＤ）、円形脱毛症（ＡＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群（ＳＪＯ）、全身性硬化症（ＳＳＣ）、脊椎関節症（ＳＰＡ）、白斑（ＶＩＴ）、喘息、又は甲状腺炎（ＡＩＴＤ、ＴＨＹ、又はＴＨ）のうちの１つ又は複数である。一部の実施態様において、治療を受ける対象は、ＴＮＦアルファモノクローナル抗体療法に対して低応答性である。一部の実施態様において、対象は、ＴＮＦアルファモノクローナル抗体療法に対して耐性を既に発症しているか、又は発症途中である。任意のそのような実施態様において、患者が少なくとも１つの遺伝子改変を有するかどうかを決定することは、ＤｃＲ３ネットワーク遺伝子若しくはその遺伝子の転写産物の増幅及び配列決定、又はその遺伝子への１つ又は複数の核酸プローブのハイブリダイゼーションを含み得る。
【００１２】
一部の実施態様において、ＤｃＲ３ネットワークの遺伝子改変は、下記の実施例ＩＩＩの表に示されているもののうちの１つ又は複数を含む。ＴＮＦＲＳＦ６Ｂの遺伝子改変は、本明細書の配列番号１に提供される野生型ＤｃＲ３配列に基づいて、Ｇｌｙ６Ａｒｇ、Ｐｒｏ２３Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２９Ａｒｇ、Ａｌａ１０２Ｔｈｒ、Ａｒｇ１０３Ｇｌｎ、Ａｒｇ１１６Ｈｉｓ、Ｇｌｙ１２４Ｖａｌ、Ａｒｇ１７２Ｈｉｓ、Ｇｌｙ１７８Ａｓｐ、Ｇｌｙ１７８Ｇｌｕ、Ｃｙｓ２１１Ｇｌｙ、Ｖａｌ２１５Ｉｌｅ、Ａｌａ２２０Ｖａｌ、Ａｒｇ２５８Ｃｙｓ、Ａｒｇ２８１Ｃｙｓ、及びＶａｌ２８２Ｍｅｔのうちの１つ又は複数であり得るが、これらに限定されない。一部の事例において、遺伝子改変は、Ｇｌｙ２９Ａｒｇ、Ａｒｇ１１６Ｈｉｓ、Ａｒｇ１７２Ｈｉｓ、Ｇｌｙ１７８Ｇｌｕ若しくはＡｓｐ、Ｃｙｓ２１１Ｇｌｙ、又はＡｒｇ２５８Ｃｙｓなどの分泌欠損型ＤｃＲ３表現型と関連するもの、あるいはＤｃＲ３発現の低減と関連するか又はＤｃＲ３リガンド結合活性の低減と関連するものである。
【００１３】
ＤｃＲ３リガンド阻害剤は、例えば、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、又はＦａｓＬの阻害剤であり得る。ＤｃＲ３リガンド阻害剤は、ＤｃＲ３の抗体、リガンドトラップ（ｌｉｇａｎｄ  ｔｒａｐ）、アンチセンス核酸若しくはｓｉＲＮＡなどの核酸、又はアプタマーであり得る。阻害剤は、抗ＬＩＧＨＴ抗体、抗ＴＬ１Ａ抗体、又は抗ＦａｓＬ抗体であり得る。ＤｃＲ３リガンド阻害剤が抗ＬＩＧＨＴ抗体である場合、これは、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列の以下のセット：
配列番号２、３、４、５、６、及び７；
配列番号１０、１１、１２、１３、１４、及び１５；
配列番号１６、１７、１８、１９、２０、及び２１；
配列番号２２、２３、２４、２５、２６、及び２７；
配列番号２８、２９、３０、３１、３２、及び３３；
配列番号３４、３５、３６、３７、３８、及び３９；
配列番号４０、４１、４２、４３、４４、及び４５；
配列番号４６、４７、４８、４９、５０、及び５１；並びに
配列番号５２、５３、５４、５５、５６、及び５７
のうちの１つをともに含む、重鎖及び軽鎖を含み得る。
【００１４】
一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、配列番号８及び９又は配列番号５８及び５９に対して少なくとも８５％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み得る。他の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、国際公開第２０１５／１０７３３１号に記載されている１Ｃ０２抗体、１３Ｈ０４抗体、３１Ａ１０抗体、１Ｃ０６抗体、９８Ｃ０７抗体、１８Ｅ０４抗体、４２Ａ０２抗体、２９Ｃ０９抗体、１４Ｂ０９抗体、１１７Ｃ０６抗体、１１４Ｆ０５抗体、又は６２Ｃ０１抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を含み得る。例えば、これは、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列の以下のセット：配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５；配列番号６６、６７、６８、６９、７０、及び７１；配列番号７２、７３、７４、７５、７６、及び７７；又は配列番号７８、７９、８０、８１、８２、及び８３のうちの１つを含み得る。さらなる抗ＬＩＧＨＴ抗体は、以下の発明を実施するための形態において記載されている。
【００１５】
上述の治療的処置の実施態様のうちの一部において、ＤｃＲ３リガンド阻害剤は、ＴＬ１Ａ阻害剤ではない。一部の実施態様において、それは、抗ＴＬ１Ａ抗体ではない。一部の実施態様において、それは、ＦａｓＬ阻害剤ではない。一部の実施態様において、それは、抗ＦａｓＬ抗体ではない。
【００１６】
本開示はさらに、それを必要とする成人患者又は小児患者において自己免疫疾患を治療する方法であって、患者が、少なくとも１つのＤｃＲ３ネットワーク遺伝子に少なくとも１つの遺伝子改変、例えば、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂに、ＤｃＲ３の発現若しくは分泌の低減又はＤｃＲ３リガンド結合活性の低減と関連するものなど、ＤｃＲ３のレベル又は活性の低減と関連する少なくとも１つの遺伝子改変を有し、患者に、有効量の非カノニカルＮＦ−κＢ阻害剤を投与することを含む、方法を含む。上述の実施態様の一部において、ＤｃＲ３ネットワーク遺伝子は、ＤｃＲ３、ＤＲ３、ＴＬ１Ａ、ＬＩＧＨＴ、ＦａｓＬ、ＨＶＥＭ、ＬＴＡ、ＬＴＢ、ＦａｓＲ（ＣＤ９５）、及びＬＩＧＨＴ受容体のうちの１つ又は複数である。一部の実施態様において、ＤｃＲ３ネットワーク遺伝子は、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＣＳＦ２、ＴＮＦ、ＩＮＳ−ＩＧＦ２、ＥＲＢＢ３、ＴＮＦＳＦ１５、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＤＡＸＸ、ＴＲＡＩＰ、ＣＵＬ２、ＧＰＸ１、ＮＯＤ２、ＩＮＳ、ＲＨＯＡ、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＤＤＡＨ２、ＬＴＢ、ＲＴＥＬ１、ＬＴＡ、ＩＬ４、ＣＬＮ３、ＣＡＲＤ９、ＳＭＡＤ３、ＩＧＦ２、ＮＦＫＢＩＬ１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＰＰＩＦ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＮＯＴＣＨ１、ＰＬＡ２Ｇ４Ａ、ＮＵＰＲ１、ＪＡＫ２、ＩＬ１２Ｂ、ＬＲＲＫ２、ＩＬ２、ＤＡＰ３のうちの１つ又は複数である。一部の実施態様において、少なくとも１つのＤｃＲ３ネットワーク遺伝子における少なくとも１つの遺伝子改変は、Ｔ細胞活性の増大及び／又はＩＦＮ−ガンマ産生の増大と関連している。
【００１７】
一部の実施態様において、治療しようとする自己免疫疾患は、強直性脊椎炎（ＡＳ）、乾癬（ＰＳ又はＰＳＯＲ）、セリアック病（ＣＥＬ）、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、クローン病（ＣＤ）、円形脱毛症（ＡＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群（ＳＪＯ）、全身性硬化症（ＳＳＣ）、脊椎関節症（ＳＰＡ）、白斑（ＶＩＴ）、喘息、又は甲状腺炎（ＡＩＴＤ、ＴＨＹ、又はＴＨ）のうちの１つ又は複数である。一部の実施態様において、治療を受ける対象は、ＴＮＦアルファモノクローナル抗体療法に対して低応答性である。一部の実施態様において、対象は、ＴＮＦアルファモノクローナル抗体療法に対して耐性を既に発症しているか、又は発症途中である。任意のそのような実施態様において、患者が少なくとも１つの遺伝子改変を有するかどうかを決定することは、遺伝子若しくはその遺伝子の転写産物の増幅及び配列決定、又はその遺伝子への１つ又は複数の核酸プローブのハイブリダイゼーションを含み得る。
【００１８】
一部の実施態様において、ＤｃＲ３ネットワークの遺伝子改変は、下記の実施例ＩＩＩの表に示されているもののうちの１つ又は複数を含む。ＴＮＦＲＳＦ６Ｂの遺伝子改変は、本明細書の配列番号１に提供される野生型ＤｃＲ３配列に基づいて、Ｇｌｙ６Ａｒｇ、Ｐｒｏ２３Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２９Ａｒｇ、Ａｌａ１０２Ｔｈｒ、Ａｒｇ１０３Ｇｌｎ、Ａｒｇ１１６Ｈｉｓ、Ｇｌｙ１２４Ｖａｌ、Ａｒｇ１７２Ｈｉｓ、Ｇｌｙ１７８Ａｓｐ、Ｇｌｙ１７８Ｇｌｕ、Ｃｙｓ２１１Ｇｌｙ、Ｖａｌ２１５Ｉｌｅ、Ａｌａ２２０Ｖａｌ、Ａｒｇ２５８Ｃｙｓ、Ａｒｇ２８１Ｃｙｓ、及びＶａｌ２８２Ｍｅｔのうちの１つ又は複数であり得るが、これらに限定されない。一部の事例において、遺伝子改変は、Ｇｌｙ２９Ａｒｇ、Ａｒｇ１１６Ｈｉｓ、Ａｒｇ１７２Ｈｉｓ、Ｇｌｙ１７８Ｇｌｕ若しくはＡｓｐ、Ｃｙｓ２１１Ｇｌｙ、又はＡｒｇ２５８Ｃｙｓなどの分泌欠損型ＤｃＲ３表現型と関連するもの、あるいはＤｃＲ３発現の低減と関連するか又はＤｃＲ３リガンド結合活性の低減と関連するものである。
【００１９】
上述の治療的処置の実施態様のうちの一部において、ＤｃＲ３リガンド阻害剤は、ＴＬ１Ａ阻害剤ではない。一部の実施態様において、それは、抗ＴＬ１Ａ抗体ではない。一部の実施態様において、それは、ＦａｓＬ阻害剤ではない。一部の実施態様において、それは、抗ＦａｓＬ抗体ではない。
【００２０】
本開示はまた、治療剤を特定するための方法であって、
（ａ）ＴＮＦＲＳＦ６Ｂに、ＤｃＲ３の発現若しくは分泌の低減又はＤｃＲ３リガンド結合活性の低減と関連するものなど、ＤｃＲ３のレベル又は活性の低減と関連する少なくとも１つの遺伝子改変を発現する、細胞を提供することと、
（ｂ）野生型ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ対立遺伝子を含む細胞を提供することと、
（ｃ）ａ）の細胞及びｂ）の細胞を試験薬剤と接触させることと、
（ｄ）薬剤が、ａ）の細胞の免疫シグナル伝達を、ｂ）の細胞と比べて改変するかどうかを決定することと
を含む方法も含む。
【００２１】
一部の実施態様において、薬剤は、ＩκＢホメオスタシス、ＦａｓＬによって誘導されるアポトーシス、ＤｃＲ３−ＬＩＧＨＴ結合、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＬＴＢＲ、ＴＬ１Ａ、又はＤＣ１６０機能、及び非カノニカルＮＦ−κＢシグナル伝達から選択される少なくとも１つのパラメーターを改変する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＤｃＲ３のウェスタンブロット解析。非分泌型、コントロール、及び患者に由来するＥＢＶ細胞の全細胞溶解物を、ＤｃＲ３発現に関して分析した。１はＡ又はＴを指す。２はＧ又はＣを指す。ブロットをストリッピングし、ローディングコントロールとしてβ−アクチンについて再プローブした。各レーンの下の番号は、ローディングコントロールに対して正規化した候補タンパク質の濃度比を表す。
【図２】ＮＦ−κＢの活性化及び動態を、経時変化実験において、ＩκＢαのイムノブロット解析によって監視した。ＴＮＦ−αで活性化した１０６個の細胞の溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、経時変化実験においてＩκＢα分解について評価した。ブロットをストリッピングし、ローディングコントロールとしてα−アクチンについて再プローブした。各レーンの下の番号は、０分時点に対して正規化した候補タンパク質の濃度比を表す。
【図３】デコイレセプター３（ＤｃＲ３）はＮＦ−κＢの活性化を誘導する。ＮＦ−κＢの活性化を、３つの異なる組合せのリスク変異体（１／１、１／２、及び２／２）を有するコントロール細胞及び患者細胞におけるＩκＢαのイムノブロット解析によって監視した。細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＤＭＥＭ）、コントロール上清、及びＤｃＲ３含有上清とともに３０分間インキュベートした。ブロットをストリッピングし、ローディングコントロールとしてβ−アクチンについて再プローブした。各レーンの下の番号は、ローディングコントロールに対して正規化した候補タンパク質の濃度比を表す。
【図４】ＭＴＴ分析。非分泌型細胞（丸）、３つの異なる組合せのリスク変異体（１／１、１／２、及び２／２）を有するコントロール細胞（四角）、及び患者細胞（三角）において、ＭＴＴ（マイクロタイターテトラゾリウム）系アッセイを使用して、細胞増殖を測定した。データは、５回の別個の実験の代表である。
【図５Ａ】カスパーゼ−８、カスパーゼ−３、カスパーゼ−９、及びＢｃｌ−２の検出。非分泌型、３つの異なる組合せのリスク変異体（１／１、１／２、及び２／２）を有するコントロール細胞、及び患者細胞の１０６個の細胞からの溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＴＮＦ−α活性化の経時変化実験において、カスパーゼ−８、カスパーゼ−３、カスパーゼ−９、及びＢｃｌ−２に関して評価した。ブロットをストリッピングし、ローディングコントロールとしてβ−アクチンについて再プローブした。各レーンの下の番号は、０分時点及びローディングコントロールに対して正規化した候補タンパク質の濃度比を表す。
【図５Ｂ】カスパーゼ−８、カスパーゼ−３、カスパーゼ−９、及びＢｃｌ−２の検出。カスパーゼ−８、カスパーゼ−３、カスパーゼ−９、及びＢｃｌ−２の経時的な発現レベル及び倍変化の棒グラフ。
【図６Ａ】特定のＮＦ−κＢメンバーの細胞質発現レベル及び核内発現レベル。特定のＮＦ−κＢメンバーの細胞質レベル及び核内レベルを、イムノブロット解析によって監視した。ブロットをストリッピングし、細胞質抽出物において、ローディングコントロールとしてβ−アクチンについて再プローブした。核抽出物の純度を表すβ−アクチンは核抽出物中には存在しない。各レーンの下の番号は、０分時点及びローディングコントロールに対して正規化した候補タンパク質の濃度比を表す。
【図６Ｂ】特定のＮＦ−κＢメンバーの細胞質発現レベル及び核内発現レベル。棒グラフは、経時変化実験においてイムノブロット解析によって監視した、非分泌型（丸）、３つの異なる組合せのリスク変異体（１／１、１／２、及び２／２）を有するコントロール細胞（四角）、及び患者細胞（三角）における特定のＮＦ−κＢメンバーの細胞質発現レベル及び核内発現レベルの倍変化を表す。
【図７Ａ−Ｂ】ｓｉＲＮＡによるＤｃＲ３発現のノックダウン。Ｐ（１／２）ＥＢＶ細胞へのコントロールｓｉＲＮＡ及びＤｃＲ３  ｓｉＲＮＡのヌクレオフェクション後のＤｃＲ３発現の減少を示す。
【図７Ｃ】ｓｉＲＮＡによるＤｃＲ３発現のノックダウン。３つの異なる組合せのリスク変異体（１／１、１／２、及び２／２）を有する患者細胞においてＭＴＴアッセイによって測定した、細胞増殖に対するＤｃＲ３ノックダウンの効果を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下の定義は、本発明の理解を容易にするために提供されている。これらは、決して本発明を制限することを意図するものではない。
【００２４】
定義
本発明の目的で、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」実体は、その実体の１つ又は複数を指し、例えば、「１つのｃＤＮＡ」は、１つ若しくは複数のｃＤＮＡ、又は少なくとも１つのｃＤＮＡを指す。したがって、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」、「１つ又は複数」、及び「少なくとも１つの」という用語は、本明細書において互換可能に使用することができる。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「有する」という用語が、互換可能に使用され得ることにも留意されたい。さらに、「からなる群から選択される」化合物は、続くリスト内の化合物のうちの１つ又は複数を指し、これには、化合物のうちの２つ以上の混合物（すなわち、組合せ）も含まれる。本発明によると、「単離された」又は「生物学的に純粋な」分子は、その天然の環境から取り出された化合物である。そのため、「単離された」及び「生物学的に純粋な」という用語は、必ずしも、化合物が精製されている程度を反映するわけではない。本発明の単離された化合物は、その天然の供給源から得ることができるか、実験室での合成技法を使用して生成することができるか、又は任意のそのような合成経路によって生成することができる。
【００２５】
本明細書において使用される「自己免疫疾患（ＡＩＤ）」又は「自己免疫状態」には、強直性脊椎炎（ＡＳ）、乾癬（ＰＳ又はＰＳＯＲ）、セリアック病（ＣＥＬ）、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、クローン病（ＣＤ）、円形脱毛症（ＡＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群（ＳＪＯ）、全身性硬化症（ＳＳＣ）、脊椎関節症（ＳＰＡ）、白斑（ＶＩＴ）、喘息、又は甲状腺炎（ＡＩＴＤ、ＴＨＹ、又はＴＨ）のうちの１つ又は複数が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施態様において、治療を受ける対象は、ＴＮＦアルファモノクローナル抗体療法に対して低応答性である。一部の実施態様において、対象は、ＴＮＦアルファモノクローナル抗体療法に対して耐性を既に発症しているか、又は発症途中である。本明細書における自己免疫疾患は、成人並びに小児対象に罹患する疾患、すなわち、小児自己免疫疾患（ｐＡＩＤ）を含み得る。ＡＩＤには、本明細書においてｐＡＩＤが含まれる。
【００２６】
本明細書における「小児」対象とは、１８歳未満のヒトであり、一方で「成人」対象は、１８歳以上である。
【００２７】
「デコイレセプター３（ＤｃＲ３）」は、例えば、ＴＬ１Ａ、ＬＩＧＨＴ、及びＦａｓＬタンパク質に結合し、それらの活性を阻害し得る、分泌型可溶性デコイレセプタータンパク質である。ＤｃＲ３はまた、ＬＩＧＨＴとＨＶＥＭ及びリンホトキシンベータ受容体（ＬＴβＲ）との相互作用、並びにＦａｓＬとＦａｓとの相互作用を直接的又は間接的に阻害するように作用し得る。ＤｃＲ３は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであり、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ遺伝子によってコードされる。
【００２８】
本明細書における「ＴＮＦＲＳＦ６Ｂネットワーク」又は「ＤｃＲ３ネットワーク」という用語は、ＤｃＲ３の２等級以内のタンパク質（又は文脈によってはそれらをコードする遺伝子）の群を互換可能に指す。換言すると、「ネットワーク」は、（ａ）ＤｃＲ３自体、（ｂ）ＤｃＲ３が結合するタンパク質、又はＤｃＲ３を直接的に制御する（例えば、活性化若しくは不活化する）タンパク質若しくはＤｃＲ３によって直接的に制御されるタンパク質、例えば、ＴＬ１Ａ、ＬＩＧＨＴ、及びＦａｓＬ、並びに（ｃ）（ｂ）のタンパク質を直接的に制御するか又はそれらによって直接的に制御されるタンパク質、例えば、ＤＲ３及びＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴ受容体）を含む。本明細書における「ネットワーク」には、例えば、ＤｃＲ３、ＤＲ３、リンホトキシンＡ及びＢ（ＬＴＡ及びＬＴＢ）、ＦａｓＬ、ＴＬ１Ａ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、並びにＦａｓ受容体（ＦａｓＲ又はＣＤ９５）が含まれる。ＤｃＲ３ネットワーク遺伝子はまた、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＣＳＦ２、ＴＮＦ、ＩＮＳ−ＩＧＦ２、ＥＲＢＢ３、ＴＮＦＳＦ１５、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＤＡＸＸ、ＴＲＡＩＰ、ＣＵＬ２、ＧＰＸ１、ＮＯＤ２、ＩＮＳ、ＲＨＯＡ、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＤＤＡＨ２、ＬＴＢ、ＲＴＥＬ１、ＬＴＡ、ＩＬ４、ＣＬＮ３、ＣＡＲＤ９、ＳＭＡＤ３、ＩＧＦ２、ＮＦＫＢＩＬ１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＰＰＩＦ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＮＯＴＣＨ１、ＰＬＡ２Ｇ４Ａ、ＮＵＰＲ１、ＪＡＫ２、ＩＬ１２Ｂ、ＬＲＲＫ２、ＩＬ２、及びＤＡＰ３も含み得、これらの遺伝子における突然変異は、ＤｃＲ３における突然変異とともに、ｐＡＩＤ罹患者において、コントロールと比較して多く含まれることが見出されている。
【００２９】
本明細書における「ＤｃＲ３変異体」には、配列番号１に提供されるヒトＤｃＲ３配列とは異なるような修飾を有するＤｃＲ３タンパク質が含まれる。それらは、少なくとも１つの遺伝子改変、すなわち、「ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ変異体」対立遺伝子を有するＴＮＦＲＳＦ６Ｂ遺伝子配列によってコードされ得る。アポトーシスシグナル伝達もまた、ＤｃＲ３変異体を発現する細胞において改変されている場合がある。ＤｃＲ３変異体はまた、少なくとも１つのＤｃＲ３リガンド又はＤｃＲ３リガンド相互作用タンパク質、例えば、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＬＴＢＲ、ＴＬ１Ａ、及びＣＤ１６０と相互作用する能力の改変も呈し得る。ＤｃＲ３変異体の特性は、そのような変異体を有さない対象におけるリスクと比較して、改変された１つ又は複数のＡＩＤ発症のリスクをもたらし得る。「デコイレセプター３（ＤｃＲ３）の分泌欠損型変異体」又は「分泌欠損型ＤｃＲ３変異体」は、野生型ＤｃＲ３と比較してＤｃＲ３の分泌レベルの低減を示す、ＤｃＲ３タンパク質である。
【００３０】
本明細書において使用される「遺伝子改変」という用語は、野生型から又は１つ若しくは複数の核酸分子の基準配列からの変化を指す。遺伝子改変には、塩基対置換、既知の配列の核酸分子からの少なくとも１つのヌクレオチドの付加及び欠失、並びにコピー数変異が含まれるがこれらに限定されない。「遺伝子改変」という用語はまた、タンパク質にも適用され得、アミノ酸置換、挿入、及び欠失を含むがこれらに限定されない。「対立遺伝子変異」は、野生型又は基準の対立遺伝子とは異なる対立遺伝子、すなわち、野生型又は基準の対立遺伝子と比較して、遺伝子改変を有する対立遺伝子が存在することを指す。例えば、ある人物は、対立遺伝子が、野生型と指定されるＴＮＦＲＳＦ６Ｂ対立遺伝子とは異なるヘテロ接合型又はホモ接合型である場合、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂに対立遺伝子変異を有し得る。一部の実施態様において、対立遺伝子変異体のＴＮＦＲＳＦ６Ｂにより、ＤｃＲ３タンパク質の遺伝子改変が生じる。
【００３１】
一部の実施態様において、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂにおける対立遺伝子変異体は、ＤｃＲ３活性の低減と関連している場合がある。例えば、一部の事例において、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ又はＤｃＲ３における遺伝子改変は、例えば、ＤｃＲ３の発現の減少、例えば野生型コントロールと比較して細胞上清中のＤｃＲ３レベルが低減していることから明らかなＤｃＲ３の細胞内分泌の低減（「分泌欠損型」改変）、並びに／又はＤｃＲ３とそのリガンド、例えばＴＬ１Ａ、ＬＩＧＨＴ、及びＦａｓＬなどのうちの１つ若しくは複数とのリガンド結合の低減に起因して、ＤｃＲ３のレベル又は活性の低減の観察をもたらす。
【００３２】
「単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）」は、本明細書において「単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）」とも互換可能に称され、ＤＮＡにおける単一の塩基がその位置の通常の塩基とは異なる変化を指す。これらの単一の塩基の変化は、ＳＮＰ又は「スニップ」と呼ばれることが多い。ヒトゲノムでは、数百万のＳＮＰが分類登録されている。鎌状細胞をもたらすものなど、一部のＳＮＰは、疾患に関与している。他のＳＮＰは、ゲノムにおける通常の変異である。
【００３３】
「ＡＩＤ関連ＳＮＰ又はＡＩＤ関連特異的マーカー」又は「ＡＩＤ関連マーカー」は、ＡＩＤを発症するリスクの増大と関連し、ＡＩＤを有さない正常対象においては低い頻度で見出されるか又は通常見出されない、ＳＮＰ又はマーカーである。このようなマーカーには、核酸、それによってコードされるタンパク質、又は他の小分子が含まれ得るがこれらに限定されない。一部の事例において、ＳＮＰ又はマーカーは、ＡＩＤ関連ＳＮＰ又はＡＩＤ関連マーカーである。
【００３４】
「ＤｃＲ３リガンド阻害剤」という用語は、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、又はＴＬ１ＡといったＤｃＲ３リガンドの機能を阻害する分子である。ＤｃＲ３リガンド阻害剤には、小分子又は生物製剤が含まれ得、また、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、又はＴＬ１ＡといったＤｃＲ３リガンドに結合するアンタゴニスト抗体、並びにそれらのリガンドのトラップとして作用するタンパク質が含まれ得る。
【００３５】
本明細書において「抗体」という用語は、広義に使用され、所望される抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含むがこれらに限定されない様々な抗体構造体を包含する。本明細書に使用されるとき、この用語は、少なくとも重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びに少なくとも軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む分子を指し、ここで、この分子は、抗原に結合することができる。抗体という用語には、抗原に結合することができる断片、例えば、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及び（Ｆａｂ’）２が含まれるが、これらに限定されない。抗体という用語にはまた、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及びマウス、カニクイザルなどの様々な種の抗体も含まれるがこれらに限定されない。
【００３６】
「重鎖」という用語は、リーダー配列の有無にかかわらず、少なくとも重鎖可変領域を含むポリペプチドを指す。一部の実施態様において、重鎖は、重鎖定常領域の少なくとも一部分を含む。「完全長重鎖」という用語は、リーダー配列の有無にかかわらず、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含むポリペプチドを指す。
【００３７】
「重鎖可変領域」という用語は、重鎖の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、フレームワーク領域（ＦＲ）２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、及びＣＤＲ３を含む領域を指す。一部の実施態様において、重鎖可変領域はまた、ＦＲ１の少なくとも一部分及び／又はＦＲ４の少なくとも一部分も含む。一部の実施態様において、重鎖ＣＤＲ１はＫａｂａｔの残基３１〜３５に対応し、重鎖ＣＤＲ２はＫａｂａｔの残基５０〜６５に対応し、重鎖ＣＤＲ３はＫａｂａｔの残基９５〜１０２に対応する。例えば、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７及び１９９１、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．）を参照されたい。
【００３８】
「軽鎖」という用語は、リーダー配列の有無にかかわらず、少なくとも軽鎖可変領域を含むポリペプチドを指す。一部の実施態様において、軽鎖は、軽鎖定常領域の少なくとも一部分を含む。「完全長軽鎖」という用語は、リーダー配列の有無にかかわらず、軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含むポリペプチドを指す。「軽鎖可変領域」という用語は、軽鎖ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＨＶＲ２、ＦＲ３、及びＨＶＲ３を含む領域を指す。一部の実施態様において、軽鎖可変領域はまた、ＦＲ１及び／又はＦＲ４も含む。一部の実施態様において、軽鎖ＣＤＲ１はＫａｂａｔの残基２４〜３４に対応し、軽鎖ＣＤＲ２はＫａｂａｔの残基５０〜５６に対応し、軽鎖ＣＤＲ３はＫａｂａｔの残基８９〜９７に対応する。例えば、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７及び１９９１、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．）を参照されたい。
【００３９】
「キメラ抗体」は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる源又は種に由来する、抗体を指す。一部の実施態様において、キメラ抗体は、第１の種（例えば、マウス、ラット、カニクイザルなど）に由来する少なくとも１つの可変領域、及び第２の種（例えば、ヒト、カニクイザルなど）に由来する少なくとも１つの定常領域を含む、抗体を指す。一部の実施態様において、キメラ抗体は、少なくとも１つのマウス可変領域及び少なくとも１つのヒト定常領域を含む。一部の実施態様において、キメラ抗体は、少なくとも１つのカニクイザル可変領域及び少なくとも１つのヒト定常領域を含む。一部の実施態様において、キメラ抗体の可変領域のすべてが第１の種に由来し、キメラ抗体の定常領域のすべてが、第２の種に由来する。
【００４０】
「ヒト化抗体」は、非ヒト可変領域のフレームワーク領域内の少なくとも１つのアミノ酸が、ヒト可変領域に由来する対応するアミノ酸と置き換えられている、抗体を指す。一部の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも１つのヒト定常領域又はその断片を含む。一部の実施態様において、ヒト化抗体は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、（Ｆａｂ’）２などである。
【００４１】
本明細書において使用される「ヒト抗体」は、ヒトにおいて産生される抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含む非ヒト動物、例えばＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）において産生される抗体、ファージディスプレイなどのインビトロ方法を使用して選択される抗体を指し、ここで、抗体のレパートリーは、ヒト免疫グロブリン配列に基づく。
【００４２】
「リーダー配列」という用語は、哺乳動物細胞からのポリペプチドの分泌を促進する、ポリペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸残基の配列を指す。リーダー配列は、ポリペプチドが哺乳動物細胞の外へ輸送され、成熟タンパク質が形成されると、切断され得る。リーダー配列は、天然であっても合成であってもよく、リーダー配列は、それらが結合するタンパク質にとって異種であっても同種であってもよい。
【００４３】
ペプチド配列、ポリペプチド配列、又は抗体配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」及び「相同性」は、特定のペプチド配列又はポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義され、これは、配列をアライメントし、必要に応じて最大の配列同一性パーセントを達成するようにギャップを導入した後のものであり、いずれの保存的置換も配列同一性の一部とは考えない。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のアライメントは、当業者の技能の範囲内である様々な手段で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭＥＧＡＬＩＧＮＴＭ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者であれば、比較されている配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するのに適したパラメーターを決定することができる。
【００４４】
「阻害」又は「阻害する」という用語は、任意の事象（タンパク質リガンド結合など）の減少若しくは停止、又は任意の表現型特性の減少若しくは停止、又はその特性の発生、程度、若しくは可能性の減少若しくは停止を指す。「低減する」こと又は「阻害する」ことは、基準と比較して、活性、機能、及び／又は量を、減少、低減、又は停止することである。必ずしも阻害又は低減が完全なものである必要はない。例えば、ある特定の実施態様において、「低減する」又は「阻害する」とは、２０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。別の実施態様において、「低減する」又は「阻害する」とは、５０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。さらに別の実施態様において、「低減する」又は「阻害する」とは、７５％、８５％、９０％、９５％、又はそれ以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。
【００４５】
「連鎖」は、複数の遺伝子、対立遺伝子、遺伝子座、又は遺伝子マーカーが、同じ染色体上でのそれらの位置の結果として一緒に受け継がれる傾向を説明し、２つの遺伝子、対立遺伝子、遺伝子座、又は遺伝子マーカー間の組換えパーセント（組換え割合、すなわちθとも呼ばれる）で測定される。２つの遺伝子座が染色体上で物理的に近くにあるほど、組換え割合は低くなる。通常、疾患を引き起こしている遺伝子内の多型部位を、疾患との連鎖に関して試験すると、組換え割合はゼロとなり、疾患と疾患を引き起こしている遺伝子とが、常に一緒に受け継がれることを示す。まれな事例では、ある遺伝子が非常に大きなゲノムセグメントに及んでいる場合、その遺伝子の一方の末端の多型部位と、他方の末端の病因的突然変異との間で組換えを観察する可能性もあり得る。しかしながら、病因的突然変異が疾患との連鎖に関して試験されている多型である場合、組換えは観察されない。
【００４６】
「センチモルガン」は、２つの遺伝子マーカー、対立遺伝子、遺伝子、又は遺伝子座の間の連鎖を表す遺伝的距離の単位であり、任意の減数分裂事象に関して２つのマーカー又は遺伝子座の間の組換えの確率１％に相当する。
【００４７】
「連鎖不平衡」又は「対立遺伝子相関」は、集団内の任意の特定の対立遺伝子の頻度に関して、染色体上の位置が近傍にある、特定の対立遺伝子、遺伝子座、遺伝子、又は遺伝子マーカーと、ある特定の対立遺伝子、遺伝子座、遺伝子、又は遺伝子マーカーとに、偶然に予想されるよりも高い頻度での優先的な相関性があることを意味する。
【００４８】
本明細書において使用される「固体マトリックス」という用語は、ビーズ、微小粒子、マイクロアレイ、微量滴定ウェル若しくは試験管の表面、ディップスティック、又はフィルタなど、任意の形式を指す。マトリックスの材料は、ポリスチレン、セルロース、ラテックス、ニトロセルロース、ナイロン、ポリアクリルアミドゲル、デキストラン、又はアガロースであり得る。
【００４９】
特定のヌクレオチド又はアミノ酸に言及する場合の「から本質的になる」という語句は、所与の配列番号又は化合物の特性を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸配列に言及して使用される場合、この語句は、その配列自体、並びにその配列の機能的特性及び新規な特性に影響を及ぼさないであろう分子修飾形態を含む。同様に、この語句は、親化合物の機能的特性及び新規な特性に影響を及ぼさない修飾を有する化合物を指す。方法もまた、引用される一連の工程から本質的になり得る。
【００５０】
本明細書において使用される「標的核酸」は、複合核酸混合物中に存在する核酸の既定の領域を指し、ここで、既定の野生型領域は、少なくとも１つの既知のヌクレオチド変異を含み、この変異はＡＩＤと関連している場合もあればしていない場合もある。核酸分子は、ｃＤＮＡクローニング若しくはサブトラクティブハイブリダイゼーションによって天然源から単離され得るか、又は手作業で合成され得る。核酸分子は、トリエステル合成法によって手作業で合成され得るか、又は自動ＤＮＡ合成装置を使用して合成され得る。
【００５１】
本発明において使用される核酸に関して、「単離核酸」という用語が用いられることがある。この用語は、ＤＮＡに適用される場合、ＤＮＡ分子が由来する生物体の天然に存在するゲノムにおいてそのＤＮＡ分子が直接連続している（５’方向及び３’方向に）配列から分離された、ＤＮＡ分子を指す。例えば、「単離核酸」は、ベクター、例えば、プラスミドベクター若しくはウイルスベクターに挿入されているか、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれている、ＤＮＡ分子を含み得る。「単離核酸分子」はまた、ｃＤＮＡ分子を含み得る。ベクターに挿入された単離核酸分子はまた、本明細書において、組換え核酸分子と称されることもある。
【００５２】
ＲＮＡ分子に関して、「単離核酸」という用語は、主として、上記に定義された単離ＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子を指す。あるいは、この用語は、あるＲＮＡ分子がその天然の状態で関連しているであろうＲＮＡ分子（すなわち、細胞若しくは組織中の）から十分に分離されており、結果として、「実質的に純粋な」形態で存在する、ＲＮＡ分子を指し得る。
【００５３】
核酸に関する「多く含む」という用語の使用は、目的の細胞又は溶液中に存在する全ＤＮＡ又は全ＲＮＡのうち、特定のＤＮＡ又はＲＮＡ配列が、正常な細胞又は配列が得られた細胞においてよりも、有意に高い割合（２〜５倍）を占めることを意味する。これは、ある人物が、存在する他のＤＮＡ若しくはＲＮＡの量を優先的に低減することによって、又は特定のＤＮＡ配列若しくはＲＮＡ配列の量を優先的に増大することによって、又はこれら２つの組合せによって、引き起こすことができる。しかしながら、「多く含む」は他のＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列が存在しないことを示すものではなく、単に目的の配列の相対量が有意に増大していることに留意されたい。
【００５４】
一部の目的では、ヌクレオチド配列が精製された形態であることも有利である。核酸に関する「精製された」という用語は、絶対的な純度（均一な調製物など）を必要とするものではなく、配列が、天然の環境よりも相対的に純粋であるという示度を表す（天然のレベルと比較して、このレベルは、例えば、ｍｇ／ｍｌ単位で、少なくとも２〜５倍高くあるべきである）。ｃＤＮＡライブラリーから単離した個々のクローンを、電気泳動的均一性まで精製してもよい。これらのクローンから得られる特許請求されるＤＮＡ分子は、全ＤＮＡ又は全ＲＮＡから直接得ることができる。ｃＤＮＡクローンは、天然に存在するのではなく、むしろ部分的に精製された天然に存在する物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作によって得ることが好ましい。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの構築は、合成物質（ｃＤＮＡ）の作製を伴い、純粋な個々のｃＤＮＡクローンは、そのｃＤＮＡライブラリーを有する細胞をクローニングにより選択することによって、合成ライブラリーから単離することができる。したがって、このプロセスは、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの構築及び異なるｃＤＮＡクローンの単離を含み、天然のメッセージのおよそ１０６倍の精製物をもたらす。したがって、少なくとも１桁分、好ましくは２桁分又は３桁分、より好ましくは４桁分又は５桁分の精製が、明示的に企図される。したがって、「実質的に純粋」という用語は、ある調製物が目的の化合物（例えば、核酸、オリゴヌクレオチドなど）を少なくとも５０〜６０重量％含むことを指す。調製物は、目的の化合物を少なくとも７５重量％含むことが好ましく、９０〜９９重量％含むことが最も好ましい。純度は、目的の化合物に適した方法によって測定される。
【００５５】
「相補的」という用語は、２つのヌクレオチドが互いに複数の良好な相互作用を形成し得ることを指す。例えば、アデニンはチミンに対して相補的であるが、これは、これらが２つの水素結合を形成し得るためである。同様に、グアニンとシトシンは、３つの水素結合を形成できるため、相補的である。したがって、核酸配列が以下の塩基配列、チミン、アデニン、グアニン、及びシトシンを含む場合、この核酸分子の「相補体」は、チミンの場所にアデニン、アデニンの場所にチミン、グアニンの場所にシトシン、及びシトシンの場所にグアニンを含む分子となる。相補体は、親核酸分子と最適な相互作用を形成する核酸配列を含むため、そのような相補体は、親分子に高い親和性で結合することができる。選択的にハイブリダイズする核酸間の相補性のレベルは、様々であり得るが、典型的には８０％を上回り、好ましくは９０〜９５％である。
【００５６】
一本鎖核酸、特にオリゴヌクレオチドに関して、「特異的にハイブリダイズする」という用語は、当技術分野で一般的に使用される所定の条件下においてそのようなハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に相補的な（「実質的に相補的な」と称されることもある）配列の２つの一本鎖ヌクレオチド分子間における、標的配列と非標的配列とを区別するのに十分な配列特異性での結合を指す。具体的には、この用語は、オリゴヌクレオチドと、本発明の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子内に含まれる実質的に相補的な配列とのハイブリダイゼーションを指すが、オリゴヌクレオチドと非相補的な配列の一本鎖核酸とのハイブリダイゼーションは実質的に除外される。例えば、特異的ハイブリダイゼーションは、ある配列が、任意のＡＩＤ特異的マーカー核酸にハイブリダイズするが、他のヌクレオチドにはハイブリダイズしないことを指し得る。また、「特異的にハイブリダイズする」ポリヌクレオチドは、本明細書に含まれる表に示されている単一のＡＩＤ特異的マーカーにのみハイブリダイズし得る。様々な相補性の一本鎖核酸分子の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする適切な条件は、当業者に周知である。
【００５７】
例えば、指定された配列相同性の核酸分子間でのハイブリダイゼーションを達成するのに必要なストリンジェンシー条件を計算するための一般的な式を、以下に記載する（Sambrookら、Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)）。
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（ホルムアミド％）−６００／二重鎖の塩基数
【００５８】
上記の式の例として、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］、５０％ホルムアミド、ＧＣ含量４２％、及び平均プローブサイズ２００塩基を使用すると、Ｔｍは５７℃となる。ＤＮＡ二重鎖のＴｍは、相同性が１％減少するごとに１〜１．５℃低下する。したがって、約７５％を上回る配列同一性を有する標的は、４２℃のハイブリダイゼーション温度を使用すると観察されるであろう。
【００５９】
ハイブリダイゼーション及び洗浄のストリンジェンシーは、主として、溶液の塩濃度及び温度に依存する。一般に、プローブとその標的とのアニーリング率を最大化するために、ハイブリダイゼーションは、通常、そのハイブリッドの計算されたＴｍよりも２０〜２５℃低い、塩及び温度条件で行われる。洗浄条件は、標的に対するプローブの同一性の度合いにとって可能な限りストリンジェントであるべきである。一般に、洗浄条件は、ハイブリッドのＴｍよりもおよそ１２〜２０℃低くなるように選択される。本発明の核酸に関しては、中等度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、及び１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、４２℃におけるハイブリダイゼーション、並びに２×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中において５５℃で１５分間の洗浄として定義される。高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、及び１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、４２℃におけるハイブリダイゼーション、並びに１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中において６５℃で１５分間の洗浄として定義される。非常に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、及び１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、４２℃におけるハイブリダイゼーション、並びに０．１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中において６５℃で１５分間の洗浄として定義される。
【００６０】
本明細書において使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを２つ以上、好ましくは３つを上回って含む、核酸分子として定義される。オリゴヌクレオチドの厳密なサイズは、様々な要因に依存し、オリゴヌクレオチドの具体的な用途及び使用に依存するであろう。プローブ及びプライマーを含め、オリゴヌクレオチドは、３ヌクレオチドから核酸分子の完全長までの任意の長さであってよく、３からポリヌクレオチドの完全長までの連続する核酸のうちの可能な数すべてを明示的に含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１０ヌクレオチド長であり、より好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長であり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長である。
【００６１】
本明細書において使用される「プローブ」という用語は、精製された制限酵素消化物のように天然に存在するか、又は合成で生成されたかに関係なく、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又はＲＮＡ若しくはＤＮＡのいずれかである核酸を指し、これは、プローブに相補的な配列を有する核酸とアニーリングするか又は特異的にハイブリダイズすることができる。プローブは、一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよい。プローブの厳密な長さは、温度、プローブ源、及び方法の用途を含む、多数の要因に依存するであろう。例えば、診断用途については、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプローブは、典型的に、１０〜２５、１５〜５０、及び１５〜１００又はそれ以上のヌクレオチドを含むが、プローブが含むヌクレオチドはより少数であってもよい。本明細書におけるプローブは、特定の標的核酸配列の様々な鎖に相補的となるように選択される。これは、プローブが、所定の条件セット下において、そのそれぞれの標的鎖に「特異的にハイブリダイズする」か又はアニーリングすることができるように、十分に相補的でなければならないことを意味する。したがって、プローブ配列は、必ずしも標的の厳密な相補的配列を反映するものではない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片が、プローブの５’末端又は３’末端に結合し、プローブ配列の残りの部分が標的鎖に相補的であってもよい。あるいは、非相補的塩基又はより長い配列が、プローブに散在していてもよいが、ただし、プローブ配列が、標的核酸の配列と特異的にアニーリングするのに十分な相補性を有することを条件とする。単一ヌクレオチド多型を含む核酸配列は、ｄｂＳＮＰデータベースに集められており、「ｒｓ」番号によって指定されている。ｒｓ番号をデータベースの検索ボックスに入れることにより、罹患遺伝子の指定された核酸位置にＳＮＰ変異がある配列が得られる。このような核酸は、天然に存在しない標識で検出可能に標識することができ、患者から単離された核酸試料において遺伝子変異体を特定するためのプローブ又はプライマーとして有利に使用することができる。
【００６２】
本明細書において使用される「プライマー」という用語は、適切な環境におかれたときに、鋳型依存的核酸合成の開始剤として機能的に作用することができる、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか、一本鎖又は二本鎖のいずれか、生物系に由来するか、制限酵素消化によって生成されたか、又は合成で産生されたかのいずれのオリゴヌクレオチドを指す。適切な核酸鋳型、核酸の好適なヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、好適な補助因子及び条件、例えば、好適な温度及びｐＨが提示されると、プライマーは、ポリメラーゼの作用又は同様の活性によるヌクレオチドの付加によってその３’末端が伸長されて、プライマー伸長産物を得ることができる。プライマーは、具体的な条件及び用途要件に応じて、長さが多様であり得る。例えば、診断用途では、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的に、１５〜２５、１５〜３５、１０〜４０又はそれ以上のヌクレオチド長である。プライマーは、所望される伸長産物の合成を開始するために、すなわち、ポリメラーゼ又は同様の酵素による合成の開始に使用するのに適した並列位置にプライマーの３’ヒドロキシル部分を提供するのに十分な様式で、所望される鋳型鎖とアニーリングすることができるように、所望される鋳型に対して十分な相補性のものでなければならない。プライマー配列が、所望される鋳型の厳密な相補体を表すことは、必須ではない。例えば、非相補的ヌクレオチド配列が、それ以外は相補的なプライマーの５’末端に付加されてもよい。あるいは、非相補的塩基が、オリゴヌクレオチドプライマー配列内に散在していてもよいが、ただし、プライマー配列が、伸長産物の合成のための鋳型−プライマー複合体を機能的に提供するのに十分な、所望される鋳型鎖の配列との相補性を有することを条件とする。
【００６３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、米国特許第４６８３１９５号、同第４８００１９５号、及び同第４９６５１８８号に記載されており、これらの全開示が、本明細書に参照により援用される。
【００６４】
「ｓｉＲＮＡ」は、標的とされる遺伝子の配列との相同性を有する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を提供することによる、配列特異的転写後遺伝子サイレンシング又は遺伝子ノックダウンのためのＲＮＡ干渉プロセスに関与する分子を指す。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、インビトロで合成され得るか、又はリボヌクレアーゼＩＩＩ切断によってより長いｄｓＲＮＡから生成され得、配列特異的ｍＲＮＡ分解の媒介因子である。好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイト及び従来的なＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を使用して化学的に合成される。ｓｉＲＮＡは、２つの別個の相補的ＲＮＡ分子として合成することもでき、又は２つの相補的な領域を有する単一のＲＮＡ分子として合成することもできる。合成ＲＮＡ分子又は合成試薬の供給業者としては、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、Ｃｏｌｏ．、ＵＳＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．、ＵＳＡの一部）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｖａ．、ＵＳＡ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）、及びＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ、ＵＫ）が挙げられる。ＡＩＤ  ｍＲＮＡを阻害するための具体的なｓｉＲＮＡコンストラクトは、例えば、１５〜３５ヌクレオチド長であり得、より典型的には約２１ヌクレオチド長であり得る。
【００６５】
「ベクター」という用語は、細胞に感染させるか、トランスフェクトするか、又は形質転換することができ、独立してか又は宿主細胞のゲノム内で複製することができる、一本鎖又は二本鎖の環状核酸分子を指す。環状二本鎖核酸分子を、切断し、それによって、制限酵素で処理して線状化することができる。各種のベクター、制限酵素、及び制限酵素によって標的とされるヌクレオチド配列に関する情報は、当業者であれば容易に入手可能であり、これらとしては、任意のレプリコン、例えば、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、又はウイルスが挙げられ、別の遺伝子配列又はエレメント（ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれか）がこれらに結合して、結合した配列又はエレメントの複製物がもたらされ得る。本発明の核酸分子は、ベクターを制限酵素で切断することによって、又は２つの部分を一緒にライゲーションすることによって、ベクターに挿入され得る。重複又は欠失を含む遺伝子領域をクローニングする際、当業者であれば、罹患領域の上流及び下流にある好適な長さの隣接する配列が、クローニングプロセスに利用されることを十分に認識している。そのようなベクターは、例えば、そのような改変がコードされるタンパク質に対して有する影響を研究するための細胞株において、有用性を有するであろう。
【００６６】
当業者であれば、発現コンストラクトを原核生物体又は真核生物体に形質転換、トランスフェクション、又は形質導入するのを容易にするための多数の技法が利用可能である。「形質転換」、「トランスフェクション」、及び「形質導入」という用語は、核酸及び／又は発現コンストラクトを細胞又は宿主生物体に挿入する方法を指す。これらの方法には、宿主細胞外膜又は細胞壁に目的の核酸分子が透過するように高濃度の塩、電界、又は界面活性剤で細胞を処理すること、マイクロインジェクション、ＰＥＧ−融合などといった、様々な技法が含まれる。
【００６７】
「プロモーターエレメント」という用語は、適切な細胞内に入ると、転写因子及び／又はポリメラーゼ結合、並びに続いてベクターＤＮＡの部分のｍＲＮＡへの転写を促進することができる、ベクターに組み込まれているヌクレオチド配列を説明する。一実施態様において、本発明のプロモーターエレメントは、ＡＩＤ特異的マーカー核酸分子の５’末端よりも前にあり、結果として、その後のものがｍＲＮＡに転写される。次いで、宿主細胞の機序により、ｍＲＮＡがポリペプチドに翻訳される。
【００６８】
当業者であれば、核酸ベクターが、プロモーターエレメント及びＡＩＤ特異的マーカーコード核酸以外の核酸エレメントを含み得ることを理解するであろう。これらの他の核酸エレメントとしては、複製開始点、リボソーム結合部位、薬物耐性酵素又はアミノ酸代謝酵素をコードする核酸配列、及び分泌シグナル、局在化シグナル、又はポリペプチド精製に有用なシグナルをコードする核酸配列が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６９】
「レプリコン」は、主にそれ自体の制御下において複製することができる、任意の遺伝子エレメント、例えば、プラスミド、コスミド、バクミド、プラスチド、ファージ、又はウイルスである。レプリコンは、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれであってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
【００７０】
「発現オペロン」は、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（例えば、ＡＴＧ又はＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、終結因子などの転写及び翻訳制御配列を有し得、宿主細胞又は生物体においてポリペプチドコード配列の発現を促進する、核酸断片を指す。
【００７１】
本明細書に使用されるとき、「レポーター」、「レポーター系」、「レポーター遺伝子」、又は「レポーター遺伝子産物」という用語は、核酸が、発現されるとレポーターシグナルを生じる産物をコードする遺伝子を含み、これを、例えば、生物アッセイ、イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、又は比色法、蛍光法、化学発光法、若しくは他の方法によって容易に測定することができる、動作性遺伝子系を意味するものとする。核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡ、線形又は環状、一本鎖又は二本鎖、アンチセンス極性又はセンス極性のいずれであってもよく、レポーター遺伝子産物の発現に必要な制御エレメントに動作的に連結されている。必要とされる制御エレメントは、レポーター系の性質、及びレポーター遺伝子がＤＮＡの形態であるかＲＮＡの形態であるかに応じて多様であるが、限定することなく、プロモーター、エンハンサー、翻訳制御配列、ポリＡ付加シグナル、転写終結シグナルなどのエレメントを挙げることができる。
【００７２】
導入された核酸は、レシピエント細胞又は生物体の核酸に組み込まれる（共有結合で連結される）場合もあれば、そうでない場合もある。例えば、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、及び哺乳動物細胞において、導入された核酸は、エピソームエレメント又はプラスミドなどの独立したレプリコンとして、維持されてもよい。あるいは、導入された核酸は、レシピエント細胞又は生物体の核酸に組み込まれ、その細胞又は生物体において安定に維持され、さらに、レシピエント細胞又は生物体の子孫細胞又は生物体に継代されるか受け継がれてもよい。最終的には、導入された核酸は、レシピエント細胞又は宿主生物体に一過性に存在するだけであってもよい。
【００７３】
「選択可能なマーカー遺伝子」という用語は、発現されると、形質転換された細胞に、選択可能な表現型、例えば抗生物質耐性を与える、遺伝子を指す。
【００７４】
「動作可能に連結された」という用語は、コード配列の発現に必要な調節配列が、コード配列の発現を達成できるように、ＤＮＡ分子内でコード配列に対して適切な位置にあることを意味する。この同じ定義は、発現ベクターにおける転写ユニット及び他の転写制御エレメント（例えば、エンハンサー）の配置に適用される。
【００７５】
「組換え生物体」又は「トランスジェニック生物体」という用語は、新しい組合せの遺伝子又は核酸分子を有する生物体を指す。新しい組合せの遺伝子又は核酸分子は、当業者であれば利用できる多様な核酸操作技法を使用して、生物体に導入することができる。「生物体」という用語は、少なくとも１つの細胞を含む任意の生命体に関する。生物体は、１つの真核細胞ほどに単純であってもよく、哺乳動物のように複雑であってもよい。したがって、「組換え生物体」という語句は、組換え細胞、並びに真核生物体及び原核生物体を包含する。
【００７６】
「単離されたタンパク質」又は「単離され精製されたタンパク質」という用語が、本明細書においてしばしば使用される。この用語は、主として、本発明の単離核酸分子の発現によって産生されたタンパク質を指す。あるいは、この用語は、あるタンパク質が、天然に関連しているであろう他のタンパク質から、「実質的に純粋な」形態で存在するように、十分に分離されていることを指し得る。「単離された」とは、他の化合物若しくは物質との人工的混合物若しくは合成混合物を除外することを意味するものでも、基本的な活性を妨害しない不純物の存在、例えば、不完全な精製、安定剤の添加、又は例えば免疫原性調製物若しくは薬学的に許容される調製物への調合に起因して存在し得る不純物の存在を除外することを意味するものでもない。
【００７７】
「特異的結合対」は、互いに対して特定の特異性を有し、通常の条件下において、他の分子よりも優先的に互いに結合する、特異的結合メンバー（ｓｂｍ）及び結合パートナー（ｂｐ）を含む。特異的結合対の例としては、抗原と抗体、リガンドと受容体、及び相補的なヌクレオチド配列がある。当業者であれば、他の多数の例を把握している。さらに、「特異的結合対」という用語はまた、特異的結合メンバー及び結合パートナーのうちの一方又は両方が、より大きな分子の一部を成す場合にも適用可能である。特異的結合対が核酸配列を含む実施態様において、それらは、アッセイの条件下において互いにハイブリダイズする長さ、好ましくは、１０ヌクレオチド長より長い、より好ましくは１５又は２０ヌクレオチド長より長いものであろう。典型的には、特異的結合対のうちの一方又は両方が、天然に存在しない検出可能な標識を含むであろう。
【００７８】
「試料」又は「患者試料」又は「生物学的試料」は、一般に、特定の分子、例えば、ＡＩＤ特異的マーカー分子、例えば、下記に提供される表に示されるマーカーに関して試験することができる試料を指す。試料としては、細胞、体液、例えば、血液、血清、血漿、尿、唾液、涙、胸膜液などを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００７９】
「薬剤」及び「試験化合物」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生体高分子、又は生物学的物質、例えば、細菌、植物、真菌、若しくは動物（特に哺乳動物）の細胞若しくは組織などから作製された抽出物を指す。生体高分子としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチド／ＤＮＡ複合体、及び本明細書に記載されるＳＮＰ含有核酸又はそれらによってコードされるタンパク質の活性を調節する能力を呈する任意の核酸に基づく分子が挙げられる。薬剤は、本明細書において後述されるスクリーニングアッセイを含め、可能性のある生物活性に関して評価される。
【００８０】
本明細書に言及される「患者」又は「対象」とは、成人（１８歳以上）又は小児対象（１８歳未満）のいずれであってもよい。これらの２つの用語は、概して、本明細書において互換可能に使用される。
【００８１】
本明細書において使用される「治療」には、ヒトを含む哺乳動物における疾患（本明細書において「障害」又は「状態」とも称される）のための治療薬の投与又は適用が含まれ、疾患若しくは疾患の進行を阻害すること、疾患若しくはその進行を阻害若しくは遅延すること、その発達を停止させること、疾患を部分的若しくは完全に軽減すること、疾患の１つ若しくは複数の症状を部分的若しくは完全に軽減すること、又は消失、欠落、若しくは欠損した機能を回復若しくは修復すること、又は不十分なプロセスを刺激することが含まれる。
【００８２】
「有効量」又は「治療有効量」という用語は、１つ又は複数の症状の部分的又は完全な軽減など、対象における疾患又は障害の治療に有効な薬物の量を指す。一部の実施態様において、有効量は、所望される治療的結果又は予防的結果を達成するために、必要とされる投薬量及び期間で、有効な量を指す。
【００８３】
遺伝子改変の特定
一部の実施態様において、対象、又は対象から得られた生物学的試料をアッセイして、ＤｃＲ３ネットワーク遺伝子、又はそれらのタンパク質配列、例えば、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ遺伝子座若しくはＤｃＲ３タンパク質配列における遺伝子改変（複数可）の存在又は不在を決定する。一部の実施態様において、遺伝子改変は、ＤＲ３、ＴＬ１Ａ、ＬＩＧＨＴ、ＦａｓＬ、若しくはそれらの受容体の活性の増強、又はＤｃＲ３の活性の低減と関連している。一部の実施態様において、遺伝子改変は、Ｔ細胞活性の増大又はＩＦＮ−ガンマ産生の増大など、炎症活性の増大と関連している。
【００８４】
一部の実施態様において、患者がＤｃＲ３ネットワーク遺伝子又はそのタンパク質配列に遺伝子改変を有するかどうかに関する情報を分析し、この情報に基づいて治療が開始される。
【００８５】
一部の実施態様において、ＤｃＲ３遺伝子改変は、ＤｃＲ３のレベル又は活性の低減と関連しており、例えば、一部の実施態様においては、細胞からのＤｃＲ３の分泌の低減と関連しており、すなわち、分泌欠損型改変であるが、一方で他の実施態様においては、この改変は、ＤｃＲ３の発現の低減又はリガンド結合の減少をもたらす。したがって、一部の実施態様において、本方法は、対象が、ＤｃＲ３の分泌の低減、ＤｃＲ３の発現の低減、又はＤｃＲ３のリガンド結合活性の低減など、ＤｃＲ３のレベル又は活性の低減と関連している遺伝子改変を有するかどうかを決定することを包含する。
【００８６】
ＤｃＲ３は、２９３Ｔ細胞に一過的にトランスフェクトした場合に、高レベルで発現される。一部の実施態様において、分泌欠損型のＤｃＲ３表現型をもたらす改変が存在するかどうかを決定するために、２９３Ｔ細胞組織培養上清中のＤｃＲ３の量を、例えば、そのような上清レベルが低減されているかどうかを決定する手段としてサンドイッチＥＬＩＳＡ（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＤｕｏＳｅｔ）を使用して、アッセイすることができる。定量的蛍光ウェスタンブロット（例えば、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ）を使用して、全細胞内ＤｃＲ３をアッセイし、そのレベルをβ−アクチンなどのハウスキーピングローディングコントロールに対して正規化してもよい。
【００８７】
下記の実施例ＩＩＩでは、小児ＩＢＤ症例においてコントロールと比較して少なくとも２倍多く含むＤｃＲ３及び他のＤｃＲ３ネットワーク遺伝子におけるＳＮＶのリストを提供する。一部の実施態様において、対象は、それらの遺伝子改変のうちの１つ又は複数を有し得る。一部の実施態様において、対象は、配列番号１の野生型ＤｃＲ３配列と比較して、次のＤｃＲ３突然変異のうちの１つ又は複数を有し得る：Ｇｌｙ６Ａｒｇ、Ｐｒｏ２３Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２９Ａｒｇ、Ａｌａ１０２Ｔｈｒ、Ａｒｇ１０３Ｇｌｎ、Ａｒｇ１１６Ｈｉｓ、Ｇｌｙ１２４Ｖａｌ、Ａｒｇ１７２Ｈｉｓ、Ｇｌｙ１７８Ａｓｐ、Ｇｌｙ１７８Ｇｌｕ、Ｃｙｓ２１１Ｇｌｙ、Ｖａｌ２１５Ｉｌｅ、Ａｌａ２２０Ｖａｌ、Ａｒｇ２５８Ｃｙｓ、Ａｒｇ２８１Ｃｙｓ、又はＶａｌ２８２Ｍｅｔ。一部の実施態様において、ＤｃＲ３突然変異は、Ｇｌｙ２９Ａｒｇ、Ａｒｇ１１６Ｈｉｓ、Ａｒｇ１７２Ｈｉｓ、Ｇｌｙ１７８Ｇｌｕ若しくはＡｓｐ、Ｃｙｓ２１１Ｇｌｙ、又はＡｒｇ２５８Ｃｙｓなど、分泌欠損型として特定されるものであってもよい。他の実施態様において、ＤｃＲ３突然変異は、Ｇｌｙ６Ａｒｇ、Ｐｒｏ２３Ｌｅｕ、Ａｌａ１０２Ｔｈｒ、Ａｒｇ１０３Ｇｌｎ、Ｖａｌ２１５Ｉｌｅ、Ａｌａ２２０Ｖａｌ、又はＶａｌ２８２Ｍｅｔなど、分泌正常型として特定されるものであってもよい。そのような場合、ＤｃＲ３突然変異は、１つ又は複数のリガンドに対する親和性の低減など、ＤｃＲ３機能に対する他の影響を有し得る。
【００８８】
一部の実施態様において、ＤｃＲ３ネットワーク遺伝子、例えば、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂの遺伝子改変は、ＤＮＡレベルで検出することができる。例えば、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ遺伝子座の改変は、ＳＮＰ  ｒｓ２３１５００８、ｒｓ４８０９３３０、及びｒｓ２７３８７７４を使用してＳＮＰ分析において特定されている。例えば、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂの対立遺伝子変異体は、ｒｓ２３１５００８の６１８１４４００位がＴであるもの、及びｒｓ４８０９３３０の６１８２００３０位がＡであるものが特定されており、これらの突然変異体は、ＩＢＤのリスクの増大と相関している。（国際公開第２００９／１０５５９０号の表１を参照されたい）。他のＤｃＲ３ネットワーク遺伝子の対立遺伝子変異体もまた、下記の実施例ＩＩＩの表に提供されている。ＤＮＡレベルで突然変異を検出する方法としては、例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、及びＰＣＲに基づく方法が挙げられる。一部の実施態様において、ＳＮＰ分析を、例えば、ＰＣＲ増幅と組み合わせてもよい。
【００８９】
一部の実施態様において、ＤｃＲ３の分泌又は発現に影響を及ぼす遺伝子改変は、間接的な手段、例えば、体液中のＤｃＲ３  ｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルを調べることによって、検出してもよい。例えば、アッセイは、血液試料、尿試料、血清試料、及び胃洗浄体液試料、並びに白血球若しくは単核細胞などの細胞試料を用いて行われ得る。
【００９０】
ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ又は他のネットワーク遺伝子における遺伝子改変を特定する方法
一部の実施態様において、ＤｃＲ３ネットワーク遺伝子、例えば、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂにおける遺伝子改変は、核酸レベルで検出することができる。血液、尿、血清、胃洗浄、ＣＮＳ流体、任意の種類の細胞（例えば、脳細胞、白血球、単核細胞）又は身体組織を含むがこれらに限定されない、任意の生物学的試料を使用することができる。ＤＮＡを抽出することができる任意の生物源材料を使用することができる。試料は、新たに採取してもよく、又は試料は、任意の用途／目的のために以前に採取され、遺伝子改変に関して試験するときまで保管されていてもよい。以前に異なる目的で精製されたＤＮＡもまた、使用され得る。
【００９１】
定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、微小液滴ＰＣＲ、及びＴａｑＭａｎプローブ（すなわち、定量的ＰＣＲの特異性を増大させるように設計された加水分解プローブ）といった標準的な分子生物学的手法を、例えば、配列決定と併せて使用して、ある遺伝子における遺伝子改変を評価することができる。蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）プローブもまた、遺伝子改変を評価するために使用することができる。
【００９２】
以下のものを含め、遺伝子改変を決定するための様々な他の方法が公知であり、それらのうちのいくつかは、さらなる遺伝子並びにＴＮＦＲＳＦ６Ｂにおける改変を探索する際に有用であり得る。
【００９３】
単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）／単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）ジェノタイピング
患者がある遺伝子に遺伝子改変を有するかどうかを決定することは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ又はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘから市販のものなどのＳＮＶ／ＳＮＰジェノタイピングアレイを使用して、ＳＮＶ／ＳＮＰジェノタイピングによって行うことができる。「単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）」は、本明細書において「単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）」とも互換可能に称され、ＤＮＡにおける単一の塩基がその位置の通常の塩基とは異なる変化を指す。
【００９４】
ＳＮＶジェノタイピングにおいて、ＳＮＶは、相補的ＤＮＡプローブをＳＮＶ部位にハイブリダイズすることによって決定することができる。様々な試料スループット、多重鎖形成能力、及び化学的性質に対応するために、広範なプラットフォームをＳＮＶジェノタイピングツールとともに使用することができる。高密度ＳＮＶアレイでは、何十万ものプローブが、１つの小さなチップに並べられており、結果として、標的ＤＮＡをチップ上で処理するときに多数のＳＮＶを同時に探索することができる。アレイにおいて試料中の標的ＤＮＡとプローブ（又は冗長なプローブ）とのハイブリダイゼーションの量を決定することにより、特異的なＳＮＶ対立遺伝子を決定することができる。ＳＮＶジェノタイピングにアレイを使用することにより、大規模なＳＮＶ検索が可能となる。
【００９５】
ＳＮＶを分析した後にＣＮＶを分析する場合、ＣＮＶデータが得られるように、コンピュータプログラムを使用してＳＮＶデータを操作する必要がある。そのため、ＰｅｎｎＣＮＶ又は類似のプログラムを使用して、ゲノム全体のシグナルパターンを検出し、コピー数の変化を有する連続的な遺伝子マーカーを特定することができる。（Wang K.及びBucan M.(June 2008) Cold Spring Harb Protoc Vol. 3(6); doi10: 1101/pdb.top46を参照されたい）。ＰｅｎｎＣＮＶは、キロベースの分解能でのＣＮＶ検出を可能にする。（Wang Kら(Nov 2007) Genome Res. 17(11): 1665-74を参照されたい）。
【００９６】
ＣＮＶ分析において、ＳＮＶジェノタイピングデータを、正常な２倍体ＤＮＡの挙動と比較する。このソフトウェアは、ＳＮＶジェノタイピングデータを使用して、シグナル強度データ及びＳＮＶ対立遺伝子比の分布を決定し、次いで、これらのデータを使用して、ＣＮＶの存在を示す正常な２倍体状態のＤＮＡからの逸脱を特定する。これは、部分的には、ＳＮＶの２つの対立遺伝子の全シグナル強度の正規化された値である対数Ｒ比（ＬＲＲ）を使用することによって行われる（Ｗａｎｇ  ２００８）。ソフトウェアが、強度（ＬＲＲ）が０を下回る傾向にある近接するＳＮＶの領域を検出した場合、これは、ＣＮＶ欠失を示す。ソフトウェアが、代わりに、強度（ＬＲＲ）が０を上回る傾向にある近接するＳＮＶの領域を検出した場合、これは、ＣＮＶ重複を示す。２倍体ＤＮＡの挙動と比較してＬＲＲに変化が観察されなかった場合、配列は、正常な２倍体状態にあり、ＣＮＶは存在していない。ソフトウェアは、対立遺伝子がＣＮＶ欠失又は重複により失われたか又は増えた場合に変化する、２つの対立遺伝子の対立遺伝子強度比の正規化された値である、Ｂ対立遺伝子頻度（ＢＡＦ）も使用する。例えば、ＣＮＶ欠失は、ＬＲＲ値の減少、及びＢＡＦ値におけるヘテロ接合体の欠如の両方によって示される。対照的に、ＣＮＶ重複は、ＬＲＲ値の増大、及びヘテロ接合型ジェノタイプＢＡＦクラスターが２つの異なるクラスターに別れることの両方によって示される。ソフトウェアは、ＬＲＲ及びＢＡＦの計算を自動で行って、全ゲノムＳＮＶデータのＣＮＶ欠失及び重複を検出する。強度とジェノタイプデータを同時に分析することにより、正常な２倍体状態が正確に定まり、ＣＮＶが決定される。
【００９７】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、及びＡｇｉｌｅｎｔなどのアレイプラットフォームを、ＳＮＶジェノタイピングに使用することができる。カスタムアレイもまた、本明細書に記載されるデータに基づいて設計し、使用することができる。
【００９８】
比較ゲノムハイブリダイゼーション
比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）は、遺伝子改変を評価するために使用することができる別の方法である。ＣＧＨは、競合的蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して、遺伝子改変を基準試料と比較して分析するための分子細胞遺伝学的方法である。ＤＮＡを、患者及び基準源から単離し、ＤＮＡの変性後に、蛍光分子（すなわち、フルオロフォア）で独立して標識する。フルオロフォアと得られた試料とのハイブリダイゼーションを、各染色体の長さにわたって比較して、２つの源の間での染色体の相違を特定する。色の不一致は、特定の領域における試験試料内の物質の増減を示し、一方で色の一致は、特定の領域において試験試料と基準試料との間でコピー数などの遺伝子改変に相違がないことを示す。
【００９９】
配列決定方法
全ゲノム配列決定、全エクソーム配列決定、又は標的化配列決定もまた、複数の遺伝子における遺伝子改変を分析するために使用することができる。全ゲノム配列決定（全長ゲノム配列決定、完全ゲノム配列決定、又はゲノム全体配列決定としても知られている）は、タンパク質をコードする遺伝子又はコードしない遺伝子を含め、種の全ゲノムを配列決定することを含む。全エクソーム配列決定は、対照的に、ゲノム内のタンパク質をコードする遺伝子のみ（ゲノムのおよそ１％）の配列決定である。標的化配列決定は、ゲノムの選択された部分のみの配列決定を含む。
【０１００】
対象から精製されたＤＮＡに全ゲノム配列決定、全エクソーム配列決定、又は標的化配列決定を行うための広範な技法が、当業者には公知であろう。同様の技法を、異なる種類の配列決定に使用することができる。全ゲノム配列決定に使用される技法としては、ナノポア技術、フルオロフォア技術、ＤＮＡナノボール技術、及びピロ配列決定（すなわち、合成による配列決定）が挙げられる。特に、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、ＤＮＡの小さな断片数百個を並行して配列決定し、続いて、それらの断片からの配列決定データをつなぎ合わせるためにバイオインフォマティクス分析を使用することを伴う。
【０１０１】
全エクソーム配列決定は、全ゲノム配列決定ほど多くの量のＤＮＡを配列決定する必要がないため、広範な技法を使用することができる。全エクソーム配列決定の方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応法、ＮＧＳ法、分子反転プローブ、マイクロアレイを使用したハイブリッド捕捉、溶液中捕捉、及び古典的なサンガー配列決定が挙げられる。標的化配列決定により、全ゲノムではなく特定の遺伝子の配列データを提供することが可能であり、目的の配列決定する遺伝子の物質を含む特別なマイクロアレイを含む、他の種類の配列決定に使用される技法のうちのいずれかを使用することができる。ゲノムマッピング技術を使用する独自の手法、例えば、ＢｉｏＮａｎｏ又はＯｐＧｅｎのものなども、遺伝子改変を評価するために使用することができる。
【０１０２】
ＤｃＲ３リガンド阻害剤を用いたＤｃＲ３関連の遺伝子改変を有する自己免疫疾患患者の治療
本開示は、ＤｃＲ３リガンド阻害剤、例えば、ＦａｓＬ、ＴＬ１Ａ、又はＬＩＧＨＴ阻害剤、例えば、ＦａｓＬ、ＴＬ１Ａ、又はＬＩＧＨＴアンタゴニスト抗体を用いて自己免疫疾患を治療する方法を包含する。一部の実施態様において、治療を受けている対象は、少なくとも１つのＴＮＦＲＳＦ６Ｂ遺伝子改変を有するか、又はＤｃＲ３若しくはＤｃＲ３ネットワークタンパク質に少なくとも１つの突然変異を有する。一部の実施態様において、対象は、そのような改変、例えば、ＤｃＲ３の分泌、発現、又はリガンド結合活性を低減する改変に関して、ヘテロ接合型又はホモ接合型である。一部の実施態様において、対象は、別のＤｃＲ３ネットワーク遺伝子に少なくとも１つの遺伝子改変を有する。
【０１０３】
一部の実施態様において、自己免疫疾患は、強直性脊椎炎（ＡＳ）、乾癬（ＰＳ又はＰＳＯＲ）、セリアック病（ＣＥＬ）、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、クローン病（ＣＤ）、円形脱毛症（ＡＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群（ＳＪＯ）、全身性硬化症（ＳＳＣ）、脊椎関節症（ＳＰＡ）、白斑（ＶＩＴ）、喘息、又は甲状腺炎（ＡＩＴＤ、ＴＨＹ、又はＴＨ）のうちの１つ又は複数である。一部の実施態様において、治療を受ける対象は、ＴＮＦアルファモノクローナル抗体療法に対して低応答性である。一部の実施態様において、対象は、ＴＮＦアルファモノクローナル抗体療法に対して耐性を既に発症しているか、又は発症途中である。一部の実施態様において、自己免疫疾患は、上述のもののうちの１つ又は複数の小児形態である。
【０１０４】
一部の実施態様において、本方法は、患者が、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ遺伝子座に遺伝子改変を有するかどうかを決定すること、並びに改変が検出された場合には、その患者をＤｃＲ３リガンド阻害剤で治療することを包含する。
【０１０５】
一部の実施態様において、ＤｃＲ３リガンド阻害剤は、小分子であるが、一方で別の実施態様においては、阻害剤は、生物製剤、例えば、抗体、ＤｃＲ３経路タンパク質のドメインを含む可用性ペプチドなどのリガンドトラップ、アプタマー、又は低分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）若しくはアンチセンス核酸などの核酸である。一部の実施態様において、ＤｃＲ３リガンド阻害剤は、抗体、例えば、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、又はＴＬ１Ａのアンタゴニスト抗体である。一部の実施態様において、ＤｃＲ３リガンド阻害剤は、ＴＬ１Ａの阻害剤ではない。一部の実施態様において、ＤｃＲ３リガンド阻害剤は、ＦａｓＬの阻害剤ではない。
【０１０６】
現在開発中である一部のＦａｓＬ阻害剤としては、例えば、ＡＰＧ  １０１（ａｐｏｃｅｐｔ）（Ａｐｏｇｅｎｉｘ  ＧｍｂＨ）、ＡＰＧ  １０３、ＫＡＨＲ  １０２、ＫＡＨＲ  １０３（ＫＡＨＲ  Ｍｅｄｉｃａｌ）、及びＭＦａｓ−Ｌ（Ｍｅｍｇｅｎ  ＬＬＣ）が挙げられる。
【０１０７】
一部の実施態様において、ＤｃＲ３リガンド阻害剤は、ＬＩＧＨＴのアンタゴニスト抗体（すなわち、抗ＬＩＧＨＴ抗体）である。本治療方法に好適な抗ＬＩＧＨＴ抗体としては、例えば、国際公開第２００８／０２７３３８号、米国特許第２０１３０３１５９１３号、米国特許第２０１３０３２３２４０号、及び国際公開第２０１５／１０７３３１号に記載のものが挙げられ、これらは、その全体が本明細書に参照により援用される。一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、ＬＩＧＨＴの生物学的機能、例えば、そのリガンドのうちの１つ、例えば、ＨＶＥＭ又はＬＴβＲへの結合を阻害する。
【０１０８】
ＤｃＲ３リガンド阻害剤は、非経口、経口の固体製剤及び液体製剤、点眼、坐薬、エアロゾル、局所、又は他の類似の製剤で、全身投与され得る。ＤｃＲ３リガンド阻害剤などの適切な活性成分に加えて、適切な薬学的組成物は、薬学的に許容される担体及び薬物投与を増強させ容易にすることが知られている他の成分を含有し得る。したがって、このような組成物は、任意選択的に、アジュバント、例えば、水酸化アルミニウム及び水酸化マグネシウムの水性懸濁液、並びに／又は生理食塩水などの他の薬学的に許容される担体を含有してもよい。ナノ粒子、リポソーム、放出型赤血球（ｒｅｓｅａｌｅｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）、及び免疫学に基づく系などの他の可能性のある製剤もまた、本発明の方法に従って患者に活性成分を投与するために使用することができる。ｓｉＲＮＡ又は発現ベクターを送達するのにナノ粒子を使用すること、並びに使用することができる細胞膜透過性ペプチド担体は、Ｃｒｏｍｂｅｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｖ３５：ｐ４４（２００７）に説明されている。
【０１０９】
抗ＬＩＧＨＴ抗体
一部の実施態様において、ＤｃＲ３リガンド阻害剤は、抗ＬＩＧＨＴ抗体である。抗ＬＩＧＨＴ抗体は、Ｅ１抗体、Ｅ１３抗体、Ｅ６３抗体、Ｆ１９抗体、又はＦ２３抗体のＣＤＲ配列を含み得、これらの抗体は、国際公開第２００８／０２７３３８号及び米国特許第８０５８４０２号Ｂ２、米国特許第８４６１３０７号Ｂ２、及び米国特許第８９７４７８７号Ｂ２に記載されており、これらのそれぞれは、本明細書に参照により援用される。
【０１１０】
一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、それぞれが配列番号２、３、及び４のそれぞれを含む、３つのＣＤＲ配列を含む、重鎖を含む。一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、それぞれが配列番号５、６、及び７のそれぞれを含む、３つのＣＤＲ配列を含む、軽鎖を含む。一部の実施態様において、抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、それぞれが配列番号２、３、及び４のそれぞれを含む３つのＣＤＲ配列を含み、軽鎖は、それぞれが配列番号５、６、及び７のそれぞれを含む３つのＣＤＲ配列を含む。
【０１１１】
一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、配列番号８を含むか又は配列番号８に少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一である、重鎖可変領域配列を含む。一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、配列番号９を含むか又は配列番号９に少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一である、軽鎖可変領域配列を含む。一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、配列番号８を含むか又は配列番号８に少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一である、重鎖を含む。一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、配列番号９を含むか又は配列番号９に少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一である、軽鎖を含む。一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、配列番号８を含むか又は配列番号８に少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一である重鎖、及び配列番号９を含むか又は配列番号９に少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一である軽鎖の両方を含む。
【０１１２】
一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、それぞれが配列番号１０、１１、及び１２のそれぞれを含む、３つのＣＤＲ配列を含む、重鎖を含む。一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、それぞれが配列番号１３、１４、及び１５のそれぞれを含む、３つのＣＤＲ配列を含む、軽鎖を含む。一部の実施態様において、抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、それぞれが配列番号１０、１１、及び１２のそれぞれを含む３つのＣＤＲ配列を含み、軽鎖は、それぞれが配列番号１３、１４、及び１５のそれぞれを含む３つのＣＤＲ配列を含む。
【０１１３】
一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、それぞれが配列番号１６、１７、及び１８のそれぞれを含む、３つのＣＤＲ配列を含む、重鎖を含む。一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、それぞれが配列番号１９、２０、及び２１のそれぞれを含む、３つのＣＤＲ配列を含む、軽鎖を含む。一部の実施態様において、抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、それぞれが配列番号１６、１７、及び１８のそれぞれを含む３つのＣＤＲ配列を含み、軽鎖は、それぞれが配列番号１９、２０、及び２１のそれぞれを含む３つのＣＤＲ配列を含む。
【０１１４】
一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、それぞれが配列番号２２、２３、及び２４のそれぞれを含む、３つのＣＤＲ配列を含む、重鎖を含む。一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、それぞれが配列番号２５、２６、及び２７のそれぞれを含む、３つのＣＤＲ配列を含む、軽鎖を含む。一部の実施態様において、抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、それぞれが配列番号２２、２３、及び２４のそれぞれを含む３つのＣＤＲ配列を含み、軽鎖は、それぞれが配列番号２５、２６、及び２７のそれぞれを含む３つのＣＤＲ配列を含む。
【０１１５】
一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、それぞれが配列番号２８、２９、及び３０のそれぞれを含む、３つのＣＤＲ配列を含む、重鎖を含む。一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、それぞれが配列番号３１、３２、及び３３のそれぞれを含む、３つのＣＤＲ配列を含む、軽鎖を含む。一部の実施態様において、抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、それぞれが配列番号２８、２９、及び３０のそれぞれを含む３つのＣＤＲ配列を含み、軽鎖は、それぞれが配列番号３１、３２、及び３３のそれぞれを含む３つのＣＤＲ配列を含む。
【０１１６】
一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、それぞれが配列番号３４、３５、及び３６のそれぞれを含む、３つのＣＤＲ配列を含む、重鎖を含む。一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、それぞれが配列番号３７、３８、及び３９のそれぞれを含む、３つのＣＤＲ配列を含む、軽鎖を含む。一部の実施態様において、抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、それぞれが配列番号３４、３５、及び３６のそれぞれを含む３つのＣＤＲ配列を含み、軽鎖は、それぞれが配列番号３７、３８、及び３９のそれぞれを含む３つのＣＤＲ配列を含む。
【０１１７】
一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、それぞれが配列番号４０、４１、及び４２のそれぞれを含む、３つのＣＤＲ配列を含む、重鎖を含む。一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、それぞれが配列番号４３、４４、及び４５のそれぞれを含む、３つのＣＤＲ配列を含む、軽鎖を含む。一部の実施態様において、抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、それぞれが配列番号４０、４１、及び４２のそれぞれを含む３つのＣＤＲ配列を含み、軽鎖は、それぞれが配列番号４３、４４、及び４５のそれぞれを含む３つのＣＤＲ配列を含む。
【０１１８】
一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、それぞれが配列番号４６、４７、及び４８のそれぞれを含む、３つのＣＤＲ配列を含む、重鎖を含む。一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、それぞれが配列番号４９、５０、及び５１のそれぞれを含む、３つのＣＤＲ配列を含む、軽鎖を含む。一部の実施態様において、抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、それぞれが配列番号４６、４７、及び４８のそれぞれを含む３つのＣＤＲ配列を含み、軽鎖は、それぞれが配列番号４９、５０、及び５１のそれぞれを含む３つのＣＤＲ配列を含む。
【０１１９】
一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、米国公開第２０１３／０３２３２４０号及び米国特許第８５２４８６９号Ｂ２に記載されている抗体のＣＤＲ配列を含んでもよく、これらは、本明細書に参照により援用される。例えば、一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、それぞれが配列番号５２、５３、及び５４のそれぞれを含む、３つのＣＤＲ配列を含む、重鎖を含む。一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、それぞれが配列番号５５、５６、及び５７のそれぞれを含む、３つのＣＤＲ配列を含む、軽鎖を含む。一部の実施態様において、抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、それぞれが配列番号５２、５３、及び５４のそれぞれを含む３つのＣＤＲ配列を含み、軽鎖は、それぞれが配列番号５５、５６、及び５７のそれぞれを含む３つのＣＤＲ配列を含む。
【０１２０】
一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、配列番号５８を含むか又は配列番号５８に少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一である、重鎖可変領域配列を含む。一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、配列番号５９を含むか又は配列番号５９に少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一である、軽鎖可変領域配列を含む。一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、配列番号５８を含むか又は配列番号５８に少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一である、重鎖を含む。一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、配列番号５９を含むか又は配列番号５９に少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一である、軽鎖を含む。一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、配列番号５８を含むか又は配列番号５８に少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一である重鎖、及び配列番号５９を含むか又は配列番号５９に少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一である軽鎖の両方を含む。
【０１２１】
一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、米国公開第２０１３／０３２３２４０号の配列表に記載されているＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３配列の以下のセット：米国公開第２０１３／０３２３２４０号の配列番号１８、１９、２０、及び配列番号３８、４１、４２；米国公開第２０１３／０３２３２４０号の配列番号１８、１９、２１、及び配列番号３９、４１、４２；米国公開第２０１３／０３２３２４０号の配列番号１８、１９、２２、及び配列番号４０、４１、４２；米国公開第２０１３／０３２３２４０号の配列番号２３、２４、２５、及び配列番号４３、４４、４５；米国公開第２０１３／０３２３２４０号の配列番号２６、２７、２８、及び配列番号４６、４７、４８；米国公開第２０１３／０３２３２４０号の配列番号２９、３０、３１、及び配列番号４９、５０、５１；米国公開第２０１３／０３２３２４０号の配列番号３２、３３、３４、及び配列番号５２、５３、５４；並びに米国公開第２０１３／０３２３２４０号の配列番号３５、３６、３７、及び配列番号５５、５０、５１のうちの１つをともに含む、重鎖及び軽鎖を含み得る。
【０１２２】
一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、これもまた本明細書に参照により援用される国際公開第２０１５／１０７３３１号に記載されている１８Ｅ０４抗体、９８Ｃ０７抗体、１Ｃ０２抗体、１Ｃ０６抗体、１３Ｈ０４抗体、３１Ａ１０抗体、９８Ｃ０７抗体、４２Ａ０２抗体、２９Ｃ０２抗体、１４Ｂ０９抗体、１１７Ｃ０６抗体、１１４Ｆ０５抗体、及び６２Ｃ０１抗体のＣＤＲ配列を含む。
【０１２３】
例えば、一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、それぞれが配列番号６０、６１、及び６２のそれぞれを含む、３つのＣＤＲ配列を含む、重鎖を含む。一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、それぞれが配列番号６３、６４、及び６５のそれぞれを含む、３つのＣＤＲ配列を含む、軽鎖を含む。一部の実施態様において、抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、それぞれが配列番号６０、６１、及び６２のそれぞれを含む３つのＣＤＲ配列を含み、軽鎖は、それぞれが配列番号６３、６４、及び６５のそれぞれを含む３つのＣＤＲ配列を含む。
【０１２４】
一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、それぞれが配列番号６６、６７、及び６８のそれぞれを含む、３つのＣＤＲ配列を含む、重鎖を含む。一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、それぞれが配列番号６９、７０、及び７１のそれぞれを含む、３つのＣＤＲ配列を含む、軽鎖を含む。一部の実施態様において、抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、それぞれが配列番号６６、６７、及び６８のそれぞれを含む３つのＣＤＲ配列を含み、軽鎖は、それぞれが配列番号６９、７０、及び７１のそれぞれを含む３つのＣＤＲ配列を含む。
【０１２５】
一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、それぞれが配列番号７２、７３、及び７４のそれぞれを含む、３つのＣＤＲ配列を含む、重鎖を含む。一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、それぞれが配列番号７５、７６、及び７７のそれぞれを含む、３つのＣＤＲ配列を含む、軽鎖を含む。一部の実施態様において、抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、それぞれが配列番号７２、７３、及び７４のそれぞれを含む３つのＣＤＲ配列を含み、軽鎖は、それぞれが配列番号７５、７６、及び７７のそれぞれを含む３つのＣＤＲ配列を含む。
【０１２６】
一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、それぞれが配列番号７８、７９、及び８０のそれぞれを含む、３つのＣＤＲ配列を含む、重鎖を含む。一部の実施態様において、抗ＬＩＧＨＴ抗体は、それぞれが配列番号８１、８２、及び８３のそれぞれを含む、３つのＣＤＲ配列を含む、軽鎖を含む。一部の実施態様において、抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、それぞれが配列番号７８、７９、及び８０のそれぞれを含む３つのＣＤＲ配列を含み、軽鎖は、それぞれが配列番号８１、８２、及び８３のそれぞれを含む３つのＣＤＲ配列を含む。
【０１２７】
さらなるＤｃＲ３リガンド阻害剤
一部の実施態様において、ＤｃＲ３リガンド阻害剤は、ＡＩＤ関連ｍＲＮＡの発現を阻害する、ｓｉＲＮＡなどの核酸分子であってもよい。例えば、ｓｉＲＮＡを、ＤｃＲ３リガンドを下方制御する手段として使用して、ＤｃＲ３リガンドを標的とすることができる。ｓｉＲＮＡは、以下に記載のように、担体を用いて全身的又は局所的のいずれかで患者にインビボで送達することができる。本発明の組成物は、単独で使用してもよく、又は組成物の有効性を増強するための他の薬剤若しくはタンパク質をコードする遺伝子と組み合わせて使用してもよい。ＡＩＤを治療するために本発明のｓｉＲＮＡをインビボ投与するには、ネイキッドｓｉＲＮＡ送達、ｓｉＲＮＡコンジュゲーション及び送達、リポソーム担体媒介型送達、ポリマー担体送達、ナノ粒子組成物、プラスミドに基づく方法、及びウイルスの使用を含むがこれらに限定されない、いくつかの手段が存在する。
【０１２８】
本発明のｓｉＲＮＡ組成物は、対象への投与のためのリポソームを含む送達ビヒクル、担体、及び希釈剤、並びにそれらの塩を含み得、かつ／又は薬学的に許容される製剤で存在し得る。これは、ｓｉＲＮＡが細胞膜を越え、分解を回避するのを可能にするために必要であり得る。核酸分子の送達のための方法は、Ａｋｈｔａｒら、１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，２，１３９；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ａｋｈｔａｒ（編），１９９５，Ｍａｕｒｅｒら、１９９９，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，１６，１２９−１４０；Ｈｏｆｌａｎｄ及びＨｕａｎｇ，１９９９，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３７，１６５−１９２に説明されており、Ｌｅｅら、２０００，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，７５２，１８４−１９２；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎらの米国特許第６３９５７１３号及びＳｕｌｌｉｖａｎらのＰＣＴ国際公開第９４／０２５９５号は、核酸分子の送達のための一般的な方法をさらに説明している。
【０１２９】
他の手法において、本明細書に記載される遺伝子変異のない野生型タンパク質の発現レベルを増大させることが望ましい場合がある。この手法においては、野生型ＤｃＲ３タンパク質をコードするベクターが、標的細胞に導入されるであろう。このようなベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びレンチウイルスベクター等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３０】
一部の実施態様において、ＤｃＲ３リガンド阻害剤は、リガンドトラップであってもよい。ＤｃＲ３は、ＬＩＧＨＴ及びＴＬ１Ａなどのリガンドに結合すると、それ自体がこれらのリガンドの免疫刺激活性を阻害するように作用するため、一部の実施態様において、リガンドトラップは、ＤｃＲ３、ＤｃＲ３融合分子、又はＤｃＲ３アプタマーなど、ＤｃＲ３自体に基づくものであり得る。
【０１３１】
ＤＣＲ３リガンドＦａｓＬの細胞傷害性効果に対するＤＣＲ３遺伝子改変の影響
ＥＢＶ（エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ））を形質転換した、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ（ＳＮＰ  ｒｓ２３１５００８から）に遺伝子改変を有するＩＢＤ患者及び有さないＩＢＤ患者に由来する細胞株において、ＤｃＲ３によって媒介される免疫調節を、下記の実施例Ｉに説明されるように行った。ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ遺伝子の改変を有するＩＢＤ患者に由来するＥＢＶ細胞株は、差次的パターンのＤｃＲ３発現及びＮＦ−κＢ活性化を呈し得、これが、ＩＢＤ対象において炎症を促進し得る。結果は、ＩＢＤにおける病原性炎症が、部分的に、非カノニカル発生シグナルがＮＦ−κＢシグナル伝達に影響を及ぼしている結果であり得ることを示唆する。
【０１３２】
例えば、ヘテロ接合型ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ遺伝子改変を有する患者のＥＢＶ細胞は、この実験モデルにおいて、そのような突然変異を有さない細胞と比較して、より攻撃的な炎症マーカーの上方制御を呈し得る。実験により、これらのＥＢＶ細胞が、ＤＣＲ３  ｓｉＲＮＡを用いたＤｃＲ３発現のノックダウンにより利益を得るかどうかを試験した。可溶性ＦａｓＬコンストラクト（ｓＦａｓＬ）とともにＤｃＲ３  ｓｉＲＮＡを受容した細胞は、コントロールｓｉＲＮＡ（ＣｓｉＲＮＡ）及びｓＦａｓＬを受容した細胞と比較して、細胞増殖の減少を示した。これらの結果は、ｓｉＲＮＡによるＤｃＲ３発現のノックダウンが、ＦａｓＬの細胞傷害性作用を増強することを示唆する。
【０１３３】
ＮＦ−κＢ阻害剤を用いたＤｃＲ３遺伝子改変を有する自己免疫疾患患者の治療
上述の結果は、非カノニカルＮＦ−κＢ経路に作用することもまた、ＤｃＲ３ネットワークタンパク質における遺伝子改変、例えば、ＤｃＲ３の発現、分泌、又はリガンド結合の低減と関連する改変を有する自己免疫疾患患者を治療する手段であり得ることを示唆する。
【０１３４】
一部の実施態様において、ＮＦ−κＢ阻害剤は、非カノニカルＮＦ−κＢ経路を標的とする分子、例えば、ＮＦ−κＢ活性化因子ＲＡＮＫＬ又はＢＡＦＦ、例えばデノスマブなどのＲＡＮＫＬ阻害剤から選択され得る。ＮＦ−κＢ活性に影響し得る他の分子としては、小分子、例えば、アンドログラホリド、バルドキソロンメチル、グルコン酸銅、クルクミン（ｃｕｒｃｕｒｍｉｎ）、デクロプラミド、デクスリポタム（ｄｅｘｌｉｐｏｔａｍ）、ジスルフィラム、ドコサヘキサンエン酸、メナジオン重亜硫酸ナトリウム、メサラミン、オレアンドリン、オマベロキソロン（ｏｍａｖｅｌｏｘｏｌｏｎｅ）、オラジポン（ｏｒａｚｉｐｏｎｅ）、パーフルブロン、ピリジルシアノグアニジン、タレンフルルビル、及びチロキサポールが挙げられる。開発中である他のＮＦ−κＢに作用する分子としては、４ＳＣ３０１（Ｔａｋｅｄａ）、ＡＣＵ−Ｄ１（Ａｃｃｕｉｔｉｓ）、ＡＭＧ０１０１、ＭＰ４０、ＭＰ４１、及びＭＰ４２（Ｓｈｉｏｎｏｇｉ）、Ｃ１５０（Ａｖｉｄｉｎ  Ｌｔｄ．）、ＣＡＴ１００２、ＣＡＴ１００４、ＣＡＴ１０４０、及びＣＡＴ４００１（Ｃａｔａｂａｓｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＣＨＳ８２８及びＯＳＨ１０１（ＬＥＯ  Ｐｈａｒｍａ）、ＣＩＧＮ  ５５２（Ｃｅｎｔｒｏ  ｄｅ  Ｉｎｇｅｎｉｅｒｉａ  Ｇｅｎｅｔｉｃａ  ｙ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ）、ＣＸＳ２１０１（ＣｈｅｍＧｅｎｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＤＡ９２０１（Ｄｏｎｇ−Ａ  Ｓｏｃｉｏ  Ｈｏｌｄｉｎｇｓ）、ＤＰ  １５５（Ｄ−Ｐｈａｒｍ  Ｌｔｄ．）、ＥＣ  ７０１２４（ＥｎｔｒｅＣｈｅｍ  ＳＬ）、ＦＹ１０１Ｃ及びＦＹ１０３Ｂ（ＦｙＭｅｄ  Ｉｎｃ．）、ＧＴｘ  １８６（ＧＴｘ  Ｉｎｃ．）、ＨＥ  ３１７７及びＨＥ  ３４１３及びＨＥ  ３２８６（Ｈａｒｂｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＨＭＰＬ  ００４及びＨＭＰＬ  ０１０（Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ）、ＩＭＤ  ０５６０（ＩＭＭＤ  Ｉｎｃ．）、ＩＮＶ  ４０４及びＩＮＶ  ４０５（ＩｎＶａｓｃ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＡＶＥ  ０５４７（Ｓａｎｏｆｉ）、ＩＲＦＩ  ０４２（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ  Ｆｏｓｃａｍａ  Ｇｒｏｕｐ）、ＭＣＬ  ００７１（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃｓ  Ｌｔｄ．）、ＭＲｘ  １０２（ＭｙｅｌｏＲｘ  ＬＬＣ）、ＮＰＩ１３４２及びＮＰＩ１３８７（Ｎｅｒｅｕｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＯＲ１３８４（Ｏｒｉｏｎ  Ｃｏｒｐ．）、ＡＱＰ１６３９（Ａｑｕａｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．）、ＰＢＩ１３０８（ＰｒｏＭｅｔｒｉｃ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．）、ＰＦ  １８４（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＰＰＬ００３（Ｐｏｒｔａｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）、ＰＢＳ１０８６（Ｐｒｏｆｅｃｔｕｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）、ＳＣ７１５７０（４ＳＣ  ＡＧ）、ＷＡＹ  ２０４６８８（Ｗｙｅｔｈ）、ＴＧ１０６０（ＴＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）、ＴＸ１５３（ＯＸＩＳ  Ｉｎｔｌ．）、ＶＢＰ  １５（ＲｅｖｅｒａＧｅｎ）、並びにＧＩＴ  ０２７（Ｇａｎｉａｌ）が挙げられる。
【０１３５】
キット及び製品
前述の生成物のいずれも、ＡＩＤ関連ＳＮＰ特異的マーカーポリヌクレオチド又はＧｅｎｅ  Ｃｈｉｐに固定化された１つ若しくは複数のそのようなマーカー、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、抗体、１つ若しくは複数の天然に存在しない検出可能な標識、マーカー、若しくはレポーター、薬学的に許容される担体、生理学的に許容される担体、使用のための説明書、容器、投与のための器、アッセイ基板、又はそれらの組合せを含む、キットに組み込むことができる。
【０１３６】
さらなる治療剤の開発のためのＡＩＤ関連ＳＮＰの使用
ある特定のＳＮＰは、ＤｃＲ３シグナル伝達経路が関与するＡＩＤの病因と関連付けられている。したがって、ＤｃＲ３ネットワークにこのようなＳＮＰを含む遺伝子及びそれらの遺伝子によりコードされる産物の活性を調節する薬剤を特定するための方法は、ＡＩＤ、ある特定の実施態様ではｐＡＩＤの治療に有効な治療剤の生成をもたらし得る。
【０１３７】
本明細書に記載される染色体領域は、それらの活性を調節する治療剤の合理的な設計に好適な標的を提供するタンパク質コード領域を含む。これらの領域に対応する小ペプチド分子を使用することで、コードされるタンパク質の活性を効果的に調節する治療剤の設計に役立ち得る。
【０１３８】
分子モデル化により、機能に必要な構造又は重要なアミノ酸残基に基づいて、ＳＮＰを含む核酸によってコードされるタンパク質の活性部位に結合する能力を有する特異的な有機分子の特定が容易となり得る。コンビナトリアル化学の手法を使用して、最も高い活性を有する分子を特定することができ、次いで、これらの分子の繰り返しが、さらなるサイクルのスクリーニングに展開され得る。ある特定の実施態様においては、候補薬物を、合成化合物又は天然化合物の大きなライブラリーからスクリーニングすることができる。１つの例は、ヒトによって使用することができるＦＤＡに認可された化合物ライブラリーである。加えて、化合物ライブラリーは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ、Ｃｏｒｎｗａｌｌ、ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ  Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ）、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、ＡＫｏｓ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ＧｍｂＨ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ａｍｂｉｎｔｅｒ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）、Ａｓｉｎｅｘ（Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ）、Ａｕｒｏｒａ（Ｇｒａｚ、Ａｕｓｔｒｉａ）、ＢｉｏＦｏｃｕｓ  ＤＰＩ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，Ｂｉｏｎｅｔ（Ｃａｍｅｌｆｏｒｄ、ＵＫ）、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＣｈｅｍＤｉｖ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｌｏｃｋ  Ｌｔ（Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ）、ＣｈｅｍＳｔａｒ（Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ）、Ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｌｔｄ（Ｏｂｎｉｎｓｋ、Ｒｕｓｓｉａ）、Ｅｎａｍｉｎｅ（Ｋｉｅｖ、Ｕｋｒａｉｎｅ）、Ｅｖｏｔｅｃ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｉｎｄｏｆｉｎｅ（Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏｕｇｈ、ＮＪ）、Ｉｎｔｅｒｂｉｏｓｃｒｅｅｎ（Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ）、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ（Ｍｏｎｔｌｕｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）、Ｌｉｆｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｏｒａｎｇｅ、ＣＴ）、Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｔｄ．（Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ）、Ｏｔａｖａ（Ｔｏｒｏｎｔｏ、ＯＮ）、ＰｈａｒｍＥｘ  Ｌｔｄ．（Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ）、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ（Ｍｏｎｍｏｕｔｈ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ、ＮＪ）、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ（Ｃｅｎｔｅｒ  Ｏｓｓｉｐｅｅ、ＮＨ）、Ｓｐｅｃｓ（Ｄｅｌｆｔ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ＴｉｍＴｅｃ（Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．（Ｎｏｒｔｈ  Ｙｏｒｋ  ＯＮ）、ＵｋｒＯｒｇＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｋｉｅｖ、Ｕｋｒａｉｎｅ）、Ｖｉｔａｓ−Ｍ（Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ）、Ｚｅｌｉｎｓｋｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ）、及びＢｉｃｏｌｌ（Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）を含むがこれらに限定されない、多数の企業から市販されている。
【０１３９】
細菌抽出物、真菌抽出物、植物抽出物、及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、市販されているか、又は当該技術分野で周知の方法によって容易に調製することができる。天然源、例えば、動物、細菌、真菌、葉及び樹皮を含む植物源、並びに海洋試料から単離された化合物が、有用な可能性のある薬学的薬剤の存在に関して、候補としてアッセイされ得ることが提案される。スクリーニングしようとする薬学的薬剤は、化学的組成物又は人工化合物に由来するか又はそれらから合成されてもよいことを理解されたい。いくつかの市販ライブラリーを、スクリーニングに使用することができる。
【０１４０】
薬物スクリーニングアッセイに用いられるポリペプチド又は断片は、溶液中で遊離しているか、固体支持体又は細胞内に固定されているかのいずれであってもよい。薬物スクリーニングの１つの方法は、ポリペプチド又は断片を発現する組換えポリヌクレオチドが安定に形質転換されている真核生物宿主細胞又は原核生物宿主細胞を、好ましくは競合的結合アッセイにおいて、利用する。このような細胞は、生きた状態又は固定された形式のいずれかで、標準的な結合アッセイに使用することができる。例えば、ポリペプチド若しくは断片と試験されている薬剤との間における複合体の形成を決定してもよく、又はポリペプチド若しくは断片と既知の基質との間における複合体の形成が、試験されている薬剤によって妨害される程度を試験してもよい。
【０１４１】
薬物スクリーニングの別の技法では、コードされるポリペプチドに対して好適な結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングが得られ、これは、１９８４年９月１３日に公開されたＧｅｙｓｅｎのＰＣＴ公開出願第８４／０３５６４号に詳述されている。簡単に述べると、多数の異なる小ペプチド試験化合物、例えば、上述のものを、固体基板、例えば、プラスチックピン又は何らかの他の表面上に合成する。ペプチド試験化合物を、標的ポリペプチドと反応させ、洗浄する。結合したポリペプチドを、次いで、当技術分野で周知の方法によって検出する。
【０１４２】
薬物スクリーニングのためのさらなる技法は、機能していないか又は改変されたＡＩＤ関連遺伝子を有する宿主真核細胞株又は細胞（気道平滑筋細胞など）の使用を伴う。これらの宿主細胞株又は細胞は、ポリペプチドレベルで欠損している。宿主細胞株又は細胞を、薬物化合物の存在下において増殖させる。例えば、ＡＩＤが喘息である場合、宿主細胞の収縮又は弛緩の割合を測定して、化合物が、欠損型細胞において気道の応答性を制御することができるかどうかを決定する。
【０１４３】
本発明における使用が企図される宿主細胞としては、細菌細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ細胞、樹状細胞、上皮細胞、真菌細胞、昆虫細胞、及び任意の好適な種類の哺乳動物細胞が挙げられるがこれらに限定されない。ＡＩＤ関連ＳＮＰコードＤＮＡ分子は、そのような発現によって付与される細胞の表現型を評価するために、単独でそのような宿主細胞に導入してもよく、又は組み合わせて導入してもよい。ＤＮＡ分子を導入するための方法もまた、当業者には周知である。そのような方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．  １９９５に記載されており、この開示は、本明細書に参照により援用される。ある特定の実施態様において、遺伝子変異が有益な機能の欠如と関連しており、遺伝子変異のないタンパク質の細胞内レベルを増大させることが治療的に有効であろう場合には、適切な発現ベクターに入れた核酸が、標的細胞に導入される。
【０１４４】
本発明の新規なＤＮＡ配列を発現するように修飾することができる広範な発現ベクターが、利用可能である。本明細書に例示される具体的なベクターは、単なる例示であり、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。発現方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ又はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６．３−１７．４４（１９８９）に記載されている。サッカロミセス属における発現方法もまた、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９）に記載されている。
【０１４５】
本発明を実施する際に使用するのに好適なベクターとしては、原核生物ベクター、例えば、ｐＮＨベクター（Stratagene Inc., 11099 N. Torrey Pines Rd., La Jolla, Calif. 92037）、ｐＥＴベクター（Novogen Inc., 565 Science Dr., Madison, Wis. 53711）、及びｐＧＥＸベクター（Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, N.J. 08854）が挙げられる。本発明を実施する際に有用な真核生物ベクターの例としては、ｐＲｃ／ＣＭＶベクター、ｐＲｃ／ＲＳＶベクター、及びｐＲＥＰベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１５８８  Ｓｏｒｒｅｎｔｏ  Ｖａｌｌｅｙ  Ｒｄ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．９２１２１）；ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５＆Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；並びに酵母ベクター、例えば、ＹＲＰ１７、ＹＩＰ５、及びＹＥＰ２４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）、並びにｐＲＳ４０３及びｐＲＳ４１３  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．）；レトロウイルスベクター、例えばＰＬＮＣＸ及びｐＬＰＣＸ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；並びに様々な血清型のアデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。
【０１４６】
本発明の発現ベクターにおいて使用するためのプロモーターとしては、原核細胞又は真核細胞において動作可能なプロモーターが挙げられる。原核細胞において動作可能なプロモーターとしては、ラクトース（ｌａｃ）制御エレメント、バクテリオファージラムダ（ｐＬ）制御エレメント、アラビノース制御エレメント、トリプトファン（ｔｒｐ）制御エレメント、バクテリオファージＴ７制御エレメント、及びそれらのハイブリッドが挙げられる。真核細胞において動作可能なプロモーターとしては、エプスタイン・バーウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、並びにサッカロミセス属プロモーター、例えばｇａｌ４誘導性プロモーター及びＰＧＫ構成的プロモーターが挙げられる。加えて、本発明のベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を容易にする多数の様々なマーカーのうちのいずれか１つを含んでもよい。このようなマーカーとしては、温度感受性と関連する遺伝子、薬物耐性と関連する遺伝子、宿主生物体の表現型特性と関連する酵素が挙げられる。
【０１４７】
本発明のＡＩＤ関連ＳＮＰ又はその機能的断片を発現する宿主細胞は、ＡＩＤの発症を調節する能力に関して可能性のある化合物又は薬剤をスクリーニングするシステムを提供する。したがって、一実施態様において、本発明の核酸分子は、例えば、異常な気管支収縮又は上皮膜を超える細胞輸送など、ＡＩＤと関連する異常なサイトカインシグナル伝達の態様を調節する薬剤を特定するためのアッセイにおいて使用するための組換え細胞株を作成するのに使用することができる。ＳＮＰを含む核酸によってコードされるタンパク質の機能を調節することができる化合物をスクリーニングするための方法もまた、本明細書において提供される。
【０１４８】
別の手法は、ＳＮＰを含む核酸によってコードされるポリペプチドの断片をファージ表面に発現するように操作されたファージディスプレイライブラリーの使用を伴う。このようなライブラリーを、次いで、コンビナトリアル化学ライブラリーと、発現されたペプチドと化学ライブラリーの構成成分との間の結合親和性を検出することができる条件下において、接触させる。米国特許第６０５７０９８号及び同第５９６５４５６号は、そのようなアッセイを行うための方法及び装置を示す。
【０１４９】
合理的な薬物設計の目標は、例えばより活性若しくは安定な形態のポリペプチドであるか、又は例えばインビボでポリペプチドの機能を増強若しくは妨害する、薬物を得るために、目的の生物学的に活性なポリペプチド又はそれらが相互作用する小分子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤）の構造的類似体を生成することである。Ｈｏｄｇｓｏｎ（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１９−２１を参照されたい。上述の１つの手法において、目的のタンパク質、又は例えばタンパク質−基質複合体の３次元構造は、ｘ線結晶構造解析によって、核磁気共鳴によって、コンピュータでのモデル化によって、又は最も典型的には手法の組合せによって、解明される。それほど頻繁ではないが、相同なタンパク質の構造に基づくモデル化によって、ポリペプチドの構造に関する有用な情報が得られる場合もある。合理的な薬物設計の例は、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の開発である（Ericksonら(1990) Science 249:527-533）。加えて、ペプチドは、アラニンスキャニングによって分析してもよい（Wells, (1991) Meth. Enzym. 202:390-411）。この技法においては、アミノ酸残基を、Ａｌａで置き換え、ペプチドの活性に対するその影響を決定する。ペプチドのアミノ酸残基のそれぞれを、この様式で分析して、ペプチド内の重要な領域を決定する。
【０１５０】
機能的アッセイによって選択された標的特異的抗体を単離し、次いで、その結晶構造を解明することもまた、可能である。原理としては、この手法により、その後の薬物設計の基礎となり得る薬学的コア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）が得られる。
【０１５１】
機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗−ｉｄ）を生成することによって、タンパク質の結晶構造解析をまとめて回避することができる。鏡像の鏡像として、抗−ｉｄの結合部位は、元々の分子の類似体となることが予測されるであろう。次いで、抗−ｉｄを使用して、化学的又は生物学的に産生されたペプチド集団の集団から、ペプチドを特定し、単離することができる。次いで、選択されたペプチドが、薬学的コアとして機能するであろう。
【０１５２】
このように、例えば、向上したポリペプチド活性若しくは安定性を有する薬物、又はポリペプチド活性の阻害剤、アゴニスト、アンタゴニストなどとして作用する薬物を設計することができる。本明細書に記載されるＳＮＰを含む核酸配列が利用可能であることにより、十分な量のコードされたポリペプチドを、ｘ線結晶構造解析などの解析研究を行うために利用することができるようになり得る。加えて、本明細書に提供されるタンパク質配列に関する情報により、ｘ線結晶構造解析の代わりに、又はそれに加えて、コンピュータモデル化技法を用いるものが導かれるであろう。
【０１５３】
別の実施態様において、ＡＩＤ関連ＳＮＰを含む核酸が利用可能であることにより、本発明のＡＩＤ関連ＳＮＰを保有する研究室マウス株の産生が可能となる。本発明のＡＩＤ関連ＳＮＰを発現するトランスジェニックマウスは、ＳＮＰを含む核酸によってコードされるタンパク質の、ＡＩＤの発症及び進行における役割を調べるためのモデル系を提供する。研究室マウスに導入遺伝子を導入する方法は、当業者には公知である。３つの一般的な方法としては、１．初期胚に目的の外来遺伝子をコードするレトロウイルスベクターを組み込むこと、２．ＤＮＡを新たな受精卵の前核に注入すること、及び３．遺伝子操作した胚性幹細胞を初期胚に組み込むことが挙げられる。上述のトランスジェニックマウスの産生により、標的タンパク質がＡＩＤ表現型と関連する様々なプロセスにおいて果たす役割の分子的解明が促進されるであろう。そのようなマウスは、全動物モデルにおいて推定上の治療薬を研究するためのインビボスクリーニングツールを提供するものであり、本発明に包含される。
【０１５４】
「動物」という用語は、ヒトを除き、すべての脊椎動物を含んで本明細書に使用される。これにはまた、胚段階及び胎児段階を含む、すべての発達段階における個々の動物も含まれる。「トランスジェニック動物」は、細胞以下のレベルで入念な遺伝子操作によって、例えば、標的化された組換え又はマイクロインジェクション、又は組換えウイルスでの感染によって、直接的又は間接的に、遺伝情報が改変又は受容された１つ又は複数の細胞を含む任意の動物である。「トランスジェニック動物」という用語は、古典的な異種交配又はインビトロでの受精を包含することを意味するのではなく、むしろ、１つ又は複数の細胞が組換えＤＮＡ分子によって改変されているか、又はそれを受容した、動物を包含することを意味する。この分子は、定義された遺伝子座を特異的に標的とし得るか、染色体内にランダムに組み込まれ得るか、又は染色体外でＤＮＡを複製し得る。「生殖細胞株トランスジェニック動物」という用語は、遺伝子改変又は遺伝情報が、生殖細胞株に導入されており、それによって、遺伝情報を子孫に伝える能力を付与したトランスジェニック動物を指す。そのような子孫が、実際に、その改変又は遺伝情報のうちの一部又はすべてを有する場合、それらも、トランスジェニック動物である。
【０１５５】
遺伝情報の改変は、レシピエントが属する動物種にとって外来のものであり得るか、若しくは特定の個々のレシピエントにとってのみ外来であり得るか、又はレシピエントが既に有している遺伝情報であり得る。最後の事例では、改変又は導入された遺伝子は、本来の遺伝子とは異なって発現され得る。そのような改変されたか又は外来の遺伝情報は、ＡＩＤ関連ＳＮＰを含むヌクレオチド配列の導入を含むであろう。
【０１５６】
標的遺伝子を改変するために使用されるＤＮＡは、ゲノム源からの単離、単離したｍＲＮＡ鋳型からのｃＤＮＡの調製、直接合成、又はこれらの組合せを含むがこれらに限定されない、様々な技法によって得ることができる。
【０１５７】
導入遺伝子を導入するのに好ましい種類の標的細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞は、インビトロで培養された着床前の胚から得ることができる（Evansら(1981) Nature 292:154-156；Bradleyら(1984) Nature 309:255-258；Gosslerら(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. 83:9065-9069）。導入遺伝子は、ＤＮＡトランスフェクション又はレトロウイルス媒介型形質導入などの標準的な技法によって、ＥＳ細胞に効率的に導入することができる。結果として得られた形質転換ＥＳ細胞を、次いで、非ヒト動物に由来する胚盤胞と合わせることができる。導入されたＥＳ細胞が、次いで、胚にコロニー形成し、結果として得られるキメラ動物の生殖系列に寄与する。
【０１５８】
個々の遺伝子及びそれらの発現産物の寄与を決定する問題に対する１つの手法は、単離されたＡＩＤ関連ＳＮＶ／ＳＮＰ遺伝子を、分化全能性ＥＳ細胞（上述のものなど）において野生型遺伝子を選択的に不活性化するための挿入カセットとして使用し、次いで、トランスジェニックマウスを生成することである。遺伝子標的化トランスジェニックマウスの生成において遺伝子標的化ＥＳ細胞を使用することは、説明されており、他の箇所で考察されている（Frohmanら(1989) Cell 56:145-147；Bradleyら(1992) Bio/Technology 10:534-539）。
【０１５９】
標的化相同組換えを使用して特定の変化を染色体対立遺伝子に挿入することによって、任意の遺伝子領域を不活性化するか又は所望される突然変異に改変するための技法が、利用可能である。しかしながら、ほぼ１００％の頻度で生じる相同的染色体外組換えと比較して、相同的プラスミド−染色体組換えは、当初、１０−６〜１０−３の頻度でしか検出されないことが報告されていた。非相同的プラスミド−染色体の相互作用は、同等の相同的挿入よりも１０５倍から１０２倍高いレベルでより頻繁に生じる。
【０１６０】
マウスＥＳ細胞におけるこの低い割合の標的化組換えに対処するために、まれな相同組換え体を検出又は選択するための様々な戦略が開発されている。相同的改変事象を検出するための１つの手法では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、相同的挿入のための形質転換体細胞のプールをスクリーニングし、続いて個々のクローンをスクリーニングする。あるいは、相同的挿入が生じた場合にのみ活性となるマーカー遺伝子を構築し、これらの組換え体を直接選択することができる、陽性遺伝子選択手法が開発されている。改変の直接的な選択が存在しない遺伝子のために開発された陽性−陰性選択（ＰＮＳ）法が、相同的組換え体を選択するために開発された最も強力な手法のうちの１つである。ＰＮＳ法は、マーカー遺伝子がそれ自体のプロモーターを有するため、高いレベルで発現されない遺伝子を標的とするのにより効率的である。非相同的組換え体は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子を使用し、ガンシクロビル（ＧＡＮＣ）又は（１−（２−デオキシ−２−フルオロ−Ｂ−Ｄアラビノフルラノシル）−５−ヨードウラシル（ＦＩＡＵ）などの効果的なヘルペス薬により非相同的挿入に対して選択を行うことによって、選択される。この対抗選択によって、生存している形質転換体中の相同的組換え体の数が増大し得る。ＡＩＤ関連ＳＮＰを含む核酸を標的化挿入カセットとして用いることで、例えば、ＡＩＤ関連ＳＮＰ核酸によってコードされるポリペプチドに免疫学的に特異的な抗体に対する免疫反応性の獲得によって可視化されるように、挿入の成功を検出するための手段が得られ、所望されるジェノタイプを有するＥＳ細胞のスクリーニング／選択が容易となる。
【０１６１】
本明細書に使用されるとき、ノックイン動物とは、内因性マウス遺伝子が、例えば、本発明のヒトＡＩＤ関連ＳＮＶ／ＳＮＰを含む遺伝子と置き換えられているものである。このようなノックイン動物は、ＡＩＤの発症を研究するための理想的なモデル系を提供する。
【０１６２】
本明細書に使用されるとき、ＡＩＤ関連ＳＮＰを含む核酸、その断片、又はＡＩＤ関連ＳＮＰ融合タンパク質の発現は、ＡＩＤ関連ＳＮＰのすべて又は一部分をコードする核酸配列が、特定の組織又は細胞型においてコードされるタンパク質の発現を誘導する制御配列（例えば、プロモーター及び／又はエンハンサー）に動作可能に連結されているベクターを使用して、「組織特異的様式」又は「細胞型特異的様式」で標的とすることができる。このような制御エレメントは、インビトロ及びインビボの両方の用途に有利に使用され得る。組織特異的タンパク質を誘導するためのプロモーターは、当技術分野で周知であり、本明細書に記載されている。
【０１６３】
本発明のＡＩＤ関連ＳＮＰをコードする核酸配列は、トランスジェニック動物における発現のために、様々な異なるプロモーター配列に動作可能に連結され得る。このようなプロモーターとしては、米国特許第５８７７３９９号及びＢｏｒｃｈｅｌｔらＧｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．１３（６）（１９９６）ｐ１５９−１６３に記載されているハムスター及びマウスプリオンプロモーター（ＭｏＰｒＰ）などのプリオン遺伝子プロモーター；米国特許第５６１２４８６号及び同第５３８７７４２号に記載されているラットニューロン特異的エノラーゼプロモーター；米国特許第５８１１６３３号に記載されている血小板由来成長因子Ｂ遺伝子プロモーター；米国特許第５８４９９９９号に記載されている脳特異的ジストロフィンプロモーター；Ｔｈｙ−１プロモーター；ＰＧＫプロモーター；並びに気道平滑筋細胞における導入遺伝子の発現のためのＣＭＶプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１６４】
本発明のトランスジェニックマウスの使用方法もまた、本明細書に提供される。ＡＩＤ関連ＳＮＰを含む核酸又はそのコードされたタンパク質が導入されているトランスジェニックマウスは、例えば、治療剤をスクリーニングしてＡＩＤの発症を調節することができるものを特定するためのスクリーニング方法を開発するのに有用である。
【実施例】
【０１６５】
以下の実施例は、本発明のある特定の実施態様を例示するために提供される。これらは、決して本発明を制限することを意図するものではない。
【０１６６】
実施例Ｉ
ＩＢＤにおけるＤｃＲ３変異体の役割の特徴をより良好に明らかにするために、多数の白色人種の小児ＩＢＤ症例及び健常コントロールにおいてＴＮＦＲＳＦ６Ｂのエクソンの配列決定を行った。ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ遺伝子座に、培養細胞からのＤｃＲ３分泌に影響を及ぼす複数のミスセンス変異体を発見し、これは、ＩＢＤ症例において有意に多く含まれた。これらのサイトカインは、炎症促進性であるため、ＤｃＲ３の発現、分泌、又はリガンド結合の欠損は、対抗するものがない炎症性シグナル及びＩＢＤの増悪を引き起こし、このような変異を有するＤｃＲ３は、ＩＢＤ症例において炎症を引き起こすリガンドの下方制御があまり効果的でない可能性があることが示唆される。したがって、ＤＣＲ３は、自然免疫系及び獲得免疫系において複数の複雑な役割を有し、この免疫系は、正確な内容に基づいて、また特定の配列変異体によってさらに修飾され、炎症促進性作用又は抗炎症作用をもたらし得る（参考文献７、８）。
【０１６７】
ＩＢＤの発症機序におけるＮＦ−κＢの役割は、近年の研究において調査されている。活動性疾患を有するＩＢＤ患者に由来する結腸生検は、ＮＦ−κＢ  ｐ６５タンパク質のレベルの増大を示し、これは、腸炎症の重症度と相関性がある（９）。転写因子ＮＦ−κＢの異常な活性化は、ＩＢＤの発症機序に関与する多数の炎症性サイトカインの遺伝子の発現を制御する（１０）。本明細書において、ＥＢＶを形質転換した、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂにリスク変異体を有するか又は有さない小児コントロール及び患者に由来する細胞株におけるＤｃＲ３の免疫調節的役割について記載するが、これは、タグＳＮＰ、ｒｓ２３１５００８によって最も良好に捕捉される。
【０１６８】
ＩκＢα分解
ＤｃＲ３がＩκＢαの分解を誘導する能力を、イムノブロット解析によって決定した。簡単に述べると、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂにリスク変異体（Ａ対立遺伝子）を有するコントロール及びＩＢＤ患者のＥＢＶ形質導入細胞株に由来する１×１０６個の細胞を、経時変化実験においてＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）で活性化し、これを使用して０分〜６０分の範囲の時点のＩκＢα分解の動態を評価した。細胞を、次いで、ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ試料バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に溶解させ、ローディング前に５分間煮沸した。試料当たり合計１０ｕｇのタンパク質を、ＭＯＰＳ  ＳＤＳランニングバッファー中４−１２％のビス−トリスの密度勾配ゲルで分離し、ニトロセルロース膜の膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に移し、これを、３％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０でブロッキングした後、ウサギポリクローナル抗ＩκＢα  Ｃ−２１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏ−  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともにインキュベートした。結合した抗体を、ＨＲＰコンジュゲートロバ抗ウサギ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＥＣＬ検出系（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して検出した。指定されている場合、膜を、ＴＢＳ中の０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．５）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、及び１４０ｍＭ  ＮａＣｌにおいて、５０℃で３０分間ストリッピングし、３％ＢＳＡでブロッキングし、マウス抗β−アクチンモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で再プローブした。
【０１６９】
ＮＦ−κＢ動態
ＮＦ−κＢ動態を、経時変化実験において、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）で活性化した細胞からの細胞質抽出物及び核抽出物のイムノブロット解析によって決定した。簡単に述べると、核抽出物は、細胞を１ｍｌの氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、１ＭのＨＥＰＥＳ、０．５ＭのＥＤＴＡ、０．１ＭのＥＧＴＡ、２ＭのＫＣｌ、０．１ＭのＤＴＴ、５ｕｇ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤ミックス（Ｒｏｃｈｅ）、及び１０％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０を含有する４００ｕｌの氷冷溶解バッファーに再懸濁させ、時々かき混ぜながら氷上で１５分間インキュベートして、完全な細胞溶解物及び核の放出を得た。チューブを、１３，４００×ｇで１分間遠心分離し、上清（細胞質抽出物）を採取し、残りの核を、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ  ＤＴＴ、並びに５ｕｇ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤の混合物（Ｒｏｃｈｅ）を含有する２５ｕｌの氷冷核抽出バッファー中に再懸濁させ、３０分間氷上でインキュベートし、１３，４００×ｇで５分間遠心分離した。可溶性核タンパク質を含有する上清を、予備冷蔵したチューブにアリコートを取り、液体窒素で瞬間冷凍し、使用するまで−８０℃で保管した。界面活性剤適合タンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して決定した等量のタンパク質量の抽出物（１０ｕｇ）を、これらの実験で使用した。
【０１７０】
ＭＴＴ分析
細胞増殖に対するＤｃＲ３の作用を、ＭＴＴ（マイクロタイターテトラゾリウム、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）に基づくアッセイを使用した比色ＭＴＴアッセイによって測定した。簡単に述べると、細胞（５，０００／ｍｌ）を、示されている時間、最終体積０．２ｍｌで９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）において３重にインキュベートした。その後、２０μｌのＭＴＴ溶液（５ｇ／Ｌ）を各ウェルに添加し、次いで、１２時間インキュベートした。遠心分離の後、上清を各ウェルから取り出した。ＭＴＴから析出した有色のホルマザン結晶を、０．１５ｍｌのＤＭＳＯ中に溶解させ、次いで、光学密度（ＯＤ）値を、マイクロプレートリーダーで測定した。各実験を２重に行い、５回繰り返した。
【０１７１】
ウェスタンブロット解析によるカスパーゼ
経時変化実験でのＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）活性化細胞に由来する全細胞溶解物のアリコート（１０μｇのタンパク質）を、４−１２％のビス−トリスゲルで分離させ、ニトロセルロース膜にブロッティングし、カスパーゼ−８、カスパーゼ−３、カスパーゼ−９、及びＢｃｌ−２に対する抗体（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）でプローブした。膜を、ＰＢＳ中０．０５％（体積／体積）のＴｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ７．６）で洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体の１：１０，０００希釈物とともに室温で６０分間インキュベートした。結合した抗体を、ＥＣＬ検出系（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して検出した。指定されている場合、膜を、ＴＢＳ中の０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．５）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、及び１４０ｍＭ  ＮａＣｌにおいて、５０℃で３０分間ストリッピングし、３％ＢＳＡでブロッキングし、マウス抗β−アクチンモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で再プローブした。
【０１７２】
ｓｉＲＮＡによるＤｃＲ３発現のノックダウン
ＤｃＲ３の発現を、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂにリスク変異体（Ａ対立遺伝子）を有するコントロール及びＩＢＤ患者に由来するＥＢＶを形質転換した細胞株においてｓｉＲＮＡを使用して低減させた。簡単に述べると、３×１０６個の細胞に、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ及びプログラムＴ−２０を使用して、１００ｎＭのＤｃＲ３  ｓｉＲＮＡ二重鎖又はＤｃＲ３非サイレンシングコントロールをトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞を、ヌクレオフェクション後に４８時間インキュベートし、コントロールｓｉＲＮＡの導入と比べたノックダウンの程度を、全細胞溶解物におけるＤｃＲ３マウスモノクローナル抗体（Ａｂｇｅｎｔ）を使用したウェスタンブロットによって確認した。２１量体ｓｉＲＮＡを、ＤＨＡＲＭＡＣＯＮによって合成した。ＤｃＲ３  ｓｉＲＮＡ配列は、以下の通りであった：センス配列、５’−ＧＣＣ  ＡＧＧ  ＣＵＣ  ＵＵＣ  ＣＵＣ  ＣＣＡ  ＵｄＴｄＴ−３’（配列番号１）；アンチセンス配列、５’−ＡＵＧ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＧＣＣ  ＵＧＧ  ＣｄＴｄＴ−３’（配列番号２）。非サイレンシングコントロールｓｉＲＮＡ配列は、以下の通りであった：センス配列、５’−ＧＣＣ  ＣＧＣ  ＵＵＵ  ＣＣＣ  ＵＣＡ  ＧＣＡ  ＵｄＴｄＴ−３’（配列番号３）；アンチセンス配列、５’−ＡＵＧ  ＣＵＧ  ＡＧＧ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＧＧＧ  Ｃ−３（配列番号４）。
【０１７３】
結果
ＥＢＶを形質転換した非分泌型コントロール及び患者に由来する細胞株におけるＤｃＲ３の発現
ＤｃＲ３は、膜貫通配列が欠如しており、可溶性タンパク質であるため、イムノブロットアッセイを使用して、コントロール及び患者由来の固定化細胞株（ＴＮＦ受容体スーパーファミリー６Ｂ遺伝子にリスク変異体を有するもの及び有さないもの）に由来する全細胞溶解物及び培地上清におけるＤｃＲ３の発現を、ＤｃＲ３に対するマウスモノクローナル抗体を使用して決定した。非分泌型細胞株を、アッセイモデルの開発のためのベースラインコントロールとして使用した。図１に示されるように、リスク対立遺伝子１及び２（１はＡ又はＴを指し、２はＧ又はＣを指す）がホモ接合型のコントロール及び患者は、全細胞溶解物及び上清において内因性ＤｃＲ３タンパク質の同様な発現レベルを示した。コントロールと比較して、ヘテロ接合型の患者（１／２）は、全細胞溶解物及び上清の両方において、ＤｃＲ３タンパク質レベルの増大を示した。しかしながら、非分泌型は、全細胞溶解物において低い内因性ＤｃＲ３タンパク質のレベルを示し、上清では検出可能なレベルは示さず、トランスフェクトした２９３Ｔ細胞において前述した、ＩＢＤ患者及びコントロールに由来するヒト由来のＥＢＶ細胞における分泌欠損が強調された。
【０１７４】
デコイレセプター３は、核内因子カッパＢの急速な活性化を誘導する
ＮＦ−κＢは、ＩＢＤの免疫学的環境における重要な制御因子のうちの１つであり、したがって、ＩＢＤにおける治療的介入の非常に有望な標的と考えられる。続いて、異なる組合せのリスク変異体を有することが、ＤｃＲ３によって誘導されるＮＦ−κＢの差次的活性化をもたらすかどうか、これが、その機能に差次的に影響を及ぼすかどうかを評価した。まず、０分間〜６０分間の範囲の時間で、ＴＮＦ−αで活性化したこれらの細胞株におけるＩκＢα分解の動態を評価した。図２に示されるように、コントロールと比較して、リスク変異体対立遺伝子１がホモ接合型である患者は、３０分以内での早期な最大ＩκＢα分解を示した。しかしながら、リスク対立遺伝子変異体がホモ接合型（２／２）及びヘテロ接合型（１／２）である患者は、最大６０分までのＩκＢα分解の延長を示した。この活性が、患者細胞で特異的に制限されていたことをさらに確認するために、各群からのコントロール細胞及び患者細胞を、ＲＰＭＩ培地、コントロール上清、ＤｃＲ３含有上清、及びその逆の処理に、６０分間供した。すべての場合において、患者由来のＤｃＲ３上清でのコントロール細胞の短時間の処理は、ＮＦ−κＢ活性化を示すＩκＢαの実質的な分解をもたらした（図３）。
【０１７５】
次に、リスク対立遺伝子変異体の存在が、細胞増殖に対する差次的影響と関連するかどうかを調査した。３つの異なる組合せのリスク変異体（１／１、１／２、及び２／２）を有するコントロール細胞及び患者細胞、並びに非分泌型細胞を、ＭＴＴ増殖アッセイに供した。１／２ヘテロ接合型及び２／２ホモ接合型のリスク対立遺伝子を有する患者細胞は、コントロールと比較して、最大の増殖を呈した。非分泌型は、低い増殖率を呈した（図４）。このデータは、異なる組合せのリスク変異体を有することで、ＤｃＲ３によって媒介される機能が差次的に改変されることを示す。
【０１７６】
慢性腸炎症におけるＤｃＲ３の機能的関連性
アポトーシスが組織のホメオスタシスの制御において中心的な役割を果たすことを考慮すると、細胞死と細胞生存を支持する増殖との間の不均衡は、慢性腸炎症をもたらす可能性がある。続いて、ＤｃＲ３のリスク対立遺伝子変異体を有することによる、外因性及び内因性の細胞アポトーシス経路及び細胞生存に対する差次的影響を調査した。カスパーゼ−８／９／３及び抗アポトーシスＢｃｌ−２のタンパク質発現に関して、０分間〜６０分間の範囲の経時変化実験において、ＴＮＦ−αで活性化した非分泌型、コントロール、及び患者のＥＢＶ形質転換細胞の全細胞溶解物に、ウェスタンブロット解析を行った（図５Ａ）。ホモ接合型リスク対立遺伝子１を有する患者細胞は、コントロール細胞と比較して、カスパーゼ−８、９、及び３のレベルに差異を呈さないが、高い抗アポトーシスＢｃｌ２タンパク質レベルを呈する。ヘテロ接合型リスク対立遺伝子（１／２）を有する患者ＥＢＶ細胞は、コントロール細胞と比較して、高いレベルのカスパーゼ−９及び３を呈し、高いレベルの抗アポトーシスＢｃｌ２タンパク質レベルを呈する。ホモ接合型リスク対立遺伝子２を有する患者ＥＢＶ細胞は、コントロール細胞と比較して、減少したレベルのカスパーゼ８、９、３を示し、低いレベルの抗アポトーシスＢｃｌ２タンパク質を示した。しかしながら、非分泌型は、棒グラフに示される時間過程にわたって、カスパーゼ８及び９のみを示し、検出可能なレベルのカスパーゼ３は示さず、低いレベルの抗アポトーシスＢｃｌ２を示した（図５Ｂ）。これらのデータは、異なる組合せのＤｃＲ３リスク変異体の存在が、細胞の死滅及び生存の機能の差次的な制御及び活性化をもたらすことを暗示する。
【０１７７】
ＩＢＤにおけるＮＦ−κＢの役割
ＮＦ−κＢは、ＩＢＤの免疫学的環境における重要な制御因子のうちの１つであり、したがって、ＩＢＤにおける治療介入の非常に有望な標的と考えられるが、いずれにせよ、ＮＦ−κＢが、正常な細胞の生理学にも関与することを念頭に置くことが重要である。続いて、ＮＦ−κＢ調節の状況において、ＤｃＲ３のリスク対立遺伝子変異体の存在と関連する作用を調査した。ＮＦ−κＢファミリーの転写因子には、ＲｅｌＡ（ｐ６５）、ＲｅｌＢ、ｃ−Ｒｅｌ、ＮＦ−ｋＢ１（ｐ５０）、及びＮＦ−ｋＢ２（ｐ５２）の５つのメンバーが含まれる。これらのタンパク質の間に多様性が存在することにより、特定の機能が、異なる刺激に応答して特定のヘテロダイマー又はホモダイマーによって誘導され得る可能性をもたらしている。ｐ６５（ＲｅｌＡ）及びｐ５０又はｃ−Ｒｅｌからなるヘテロダイマーが、最も典型的である。ＮＦ−κＢ活性化の具体的なパラダイム及び個々のＮＦ−κＢファミリーメンバーがヒトＩＢＤの発症機序に果たし得る役割についてはほとんど知られていないため、非分泌型、コントロール、及び患者に由来するＥＢＶ形質転換細胞株におけるＮＦ−κＢ複合体の活性化及び発現パターンの基本的な生理学の理解を試みた。ＮＦ−ΚＢ成分の発現の増強及び局在化も小児ＩＢＤ患者において検出可能であるかどうかを決定するために、細胞質抽出物並びに核抽出物を、非分泌型、コントロール、及び患者の形質転換ＥＢＶ細胞株から調製した。異なるＮＦ−κＢファミリーメンバーの存在及び正確な核転位を、ＴＮＦ−αで活性化した細胞から、経時変化実験においてウェスタンブロットによって決定した（図６Ａ及びＢ）。β−アクチンを、細胞質抽出物のコントロールとして含み、これにより、アクチンが少ない核画分が確認される。ホモ接合型リスク対立遺伝子１を有する患者細胞は、コントロール細胞と比較して、ｃ−Ｒｅｌ、ｐ５２（非古典的成分）の核局在化の増大を呈し、古典的ヘテロダイマーｐ６５及びｐ５０は類似のレベルで呈した。別の重要な発見としては、ヘテロ接合型リスク対立遺伝子（１／２）を有する患者ＥＢＶ細胞の核に、古典的及び非古典的の両方のＮＦ−κＢ経路メンバーが存在することである。ヘテロ接合型リスク対立遺伝子（１／２）を有する患者ＥＢＶ細胞は、コントロール細胞と比較して、相対的に高いレベルの核内ｐ５０、ｃ−Ｒｅｌ、ＲｅｌＢ、及びｐ５２を呈し、類似のレベルのｐ６５を呈する。ホモ接合型リスク対立遺伝子２を有する患者ＥＢＶ細胞は、コントロール細胞と比較して、高いレベルのｐ５０を示し、類似のレベルのｐ６５及びｐ５２を示す。しかしながら、非分泌型は、核内に古典的ＮＦ−κＢ経路のメンバーのみを示した。加えて、ｐ５０は、対立遺伝子のバックグラウンドに関係なく、すべての静止コントロールＥＢＶ細胞及び患者ＥＢＶ細胞の核内に優先的に集中しており、これは、阻害性の役割を果たすことについて既述の核内ｐ５０ホモダイマーの存在と一致する（２１、２２）。これらのデータは、異なる組合せのＤｃＲ３リスク変異体を有することにより、ＮＦ−κＢファミリーメンバーの発現及び局在化が差次的に制御されることを示唆する。
【０１７８】
ｓｉＲＮＡによるＤｃＲ３発現のノックダウン
これまでの研究により、ＤｃＲ３が、デコイレセプターとして作用し、ＦａｓＬに媒介されるアポトーシスシグナルを中和することが実証されている（１、４）。ヘテロ接合型のリスク対立遺伝子（１／２）を有する患者ＥＢＶ細胞は、我々の実験モデルではより攻撃的な炎症マーカーの上方制御を呈するため、次に、これらのＥＢＶ細胞が、ＤｃＲ３発現のノックダウンによって利益を受けるかどうかを試験した。図７Ａ及びＢは、Ｐ（１／２）ＥＢＶ細胞へのコントロールｓｉＲＮＡ及びＤｃＲ３  ｓｉＲＮＡのヌクレオフェクション後のＤｃＲ３発現の減少を示す。ヌクレオフェクションの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に、細胞を採取し、全細胞溶解物を、イムノブロット解析によってＤｃＲ３発現に関して評価した。ブロットは、ＤｃＲ３レベルの低減が２４時間時点で最初に確認され、少なくとも４８時間維持されたことを示す。ヌクレオフェクションは、細胞生存率に対して有害作用を有さなかった（データは示されない）。加えて、２４時間後にコントロール及びＤｃＲ３のｓｉＲＮＡをヌクレオフェクションした細胞を、ｓＦａｓＬで処理し、ＭＴＴ増殖アッセイを使用して細胞死に関して分析した。ＤｃＲ３  ｓｉＲＮＡを受容し、ｓＦａｓＬで処理した細胞は、ＣｓｉＲＮＡ及びｓＦａｓＬを受容した細胞と比較して、細胞増殖の減少を示した（図７Ｃ）。これらの結果は、ｓｉＲＮＡによるＤｃＲ３発現のノックダウンが、ＦａｓＬによって誘導される細胞傷害性作用を緩和することを示す。
【０１７９】
考察
この実施例のデータは、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ遺伝子にリスク変異体を有する患者が、差次的パターンのＤｃＲ３発現及びＮＦ−κＢ活性化を呈することを示す。このデータはまた、ＤｃＲ３ネットワーク内の他の遺伝子にリスク変異体を有する患者が、同様の差次的パターンのＤｃＲ３発現及びＮＦ−κＢ活性化を示し得ることも示す。
【０１８０】
ホモ接合型のリスク対立遺伝子１又は２（１はＡ又はＴを指し、２はＧ又はＣを指す）を有するコントロール及び患者は、全細胞溶解物及び上清において類似のレベルの内因性ＤｃＲ３タンパク質発現を示す。コントロールと比較して、ヘテロ接合型の患者（１／２）に由来する細胞は、全細胞溶解物及び上清の両方において、ＤｃＲ３タンパク質レベルの増大を示す。したがって、リスク変異体保有の状態は、ＤｃＲ３の細胞内レベルに影響を及ぼす。異なる組合せのリスク変異体が、ＤｃＲ３  ＮＦ−κＢ活性化が誘導する活性に差次的に影響を及ぼし、それによって、このシグナル伝達経路に機能的に影響を及ぼすという証拠も得た。コントロールと比較して、リスク変異体対立遺伝子１がホモ接合型である患者に由来する細胞は、３０分以内の早期な最大ＩκＢα分解を示す。しかしながら、リスク対立遺伝子がホモ接合型（２／２）又はヘテロ接合型（１／２）のいずれかである患者は、ＩκＢα分解が最大６分間延長され、このＤｃＲ３に媒介される急速なＮＦ−κＢ活性化活性は、リスク変異体を有する患者細胞に特異的に制限されていた。
【０１８１】
上述の結果により、機能的相関としてのＤｃＲ３遺伝子座におけるリスク対立遺伝子の、外因性及び内因性の細胞アポトーシス経路並びに細胞生存率に対する作用の調査が促された。ＣＤ９５ＬがＣＤ９５に結合することにより、外因性のアポトーシス経路が開始される（１１）。ホモ接合型リスク対立遺伝子１を有する患者細胞は、コントロール細胞と比較して、カスパーゼ−８、９、及び３のレベルに差異を呈さないが、高い抗アポトーシスＢｃｌ２タンパク質レベルを呈する。ヘテロ接合型リスク対立遺伝子（１／２）を有する患者ＥＢＶ細胞は、コントロール細胞と比較して、高いレベルのカスパーゼ−９及び３を呈し、高いレベルの抗アポトーシスＢｃｌ２タンパク質レベルを呈する。ホモ接合型リスク対立遺伝子２を有する患者ＥＢＶ細胞は、コントロール細胞と比較して、減少したレベルのカスパーゼ８、９、３を示し、低いレベルの抗アポトーシスＢｃｌ２タンパク質を示した。対照的に、非分泌型は、時間過程にわたって、カスパーゼ８及び９のみを示し、検出可能なレベルのカスパーゼ３は示さず、低いレベルの抗アポトーシスＢｃｌ２を示した。これらのデータは、異なる組合せのＤｃＲ３リスク変異体が、細胞の死滅及び生存の機能を差次的に制御及び活性化することを示唆する。
【０１８２】
具体的なパラダイムに関してはほとんど知られていないため、またＮＦ−κＢによって媒介される細胞特異的作用が様々であることを考慮して、コントロール及び患者由来のＥＢＶ形質転換細胞を含め、非分泌型におけるＮＦ−κＢ複合体の活性化及び発現パターンの基本的な生理学の理解を試みた。ホモ接合型リスク対立遺伝子１を有する患者細胞は、コントロール細胞と比較して、ｃ−Ｒｅｌ、ｐ５２（非古典的成分）の核局在化の増大を示し、古典的ヘテロダイマーｐ６５及びｐ５０は類似のレベルで示した。
【０１８３】
別の重要な発見としては、ヘテロ接合型リスク対立遺伝子（１／２）を有する患者ＥＢＶ細胞の核に、古典的及び非古典的の両方のＮＦ−κＢ経路メンバーが存在することである。ヘテロ接合型リスク対立遺伝子（１／２）を有する患者ＥＢＶ細胞は、コントロール細胞と比較して、相対的に高いレベルの核内ｐ５０、ｃ−Ｒｅｌ、ＲｅｌＢ、及びｐ５２を呈し、類似のレベルのｐ６５を呈する。ホモ接合型リスク対立遺伝子２を有する患者ＥＢＶ細胞は、コントロール細胞と比較して、高いレベルのｐ５０を示し、類似のレベルのｐ６５及びｐ５２を示す。しかしながら、非分泌型は、ＤｃＲ３の発現、分泌、又はリガンド結合の欠損を呈し、古典的ＮＦ−κＢ経路のメンバーが核内に存在することで、対抗するものがない炎症性シグナル及びＩＢＤの増悪がもたらされ得、ＤｃＲ３が、ＩＢＤ症例において炎症を引き起こすリガンドの下方制御があまり効果的でない可能性があることが示唆される（６、８、１２）。加えて、ｐ５０は、対立遺伝子のバックグラウンドに関係なく、すべての静止コントロールＥＢＶ細胞及び患者ＥＢＶ細胞の核内に優先的に集中しており、これは、阻害性の役割を果たすことについて既述の核内ｐ５０ホモダイマーの存在と一致する。したがって、ＣＤ患者におけるｐ１０５のプロセシングの増大及び免疫プロテアソームによるＩκＢαの急速な分解は、ｐ５０／ｃ−Ｒｅｌ及びｐ５０／ｐ６５のヘテロダイマーによって制御される炎症性遺伝子の発現の増強を担い得る。以前の研究において、ＮＦ−ΚＢ  ｐ６５が、ＣＤの発症機序に関与することが示唆されているが、我々のデータは、異なる組合せのＤｃＲ３リスク変異体により、存在量及び誘導機序が個体間で異なることを示す。市販及び開発中のほとんどのＮＦ−κＢ阻害剤は、よく知られているＮＦ−カッパＢのカノニカル経路のみを標的とする。我々の結果は、ＤｃＲ３が、カノニカル及び非カノニカルの両方のＮＦ−κＢ経路を誘導することができ、あまり知られていない非カノニカル経路が、実際には、疾患の進行及び発症機序においてより重要な役割を果たし得ることを示す。多数の上流シグナル伝達プロセスは、カノニカル経路及び非カノニカル経路の２つの経路のうちの１つのみを通じて活性化を誘導する（１３）。ＮＦ−κＢ活性化をブロックする薬物を開発するためのほとんどの努力は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファなどのその標的が、より良く理解されており、阻害が容易であるため、カノニカル経路に焦点を当ててきた。しかしながら、非カノニカル経路が疾患においてより重要な役割を果たし得るという根拠が増えてきている。Ｒｅｌ−ＭＤは、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって報告された対応研究に基づいて、多発性骨髄腫（ＭＭ）を主要な適応症として選択した。一方の研究は、Ｖｅｌｃａｄｅボルテゾミブの標的外作用が、ＭＭ細胞株及び腫瘍におけるカノニカル経路の上方制御を誘導することを示した（１４）。他方の研究は、ＭＭ細胞株における両方のＮＦ−ｋＢ活性化経路の阻害が、一方のみを標的とするよりも有効であったことを示した（１５）。したがって、非カノニカル経路は、将来的に新しい治療薬の開発においてさらに重要な役割を果たし得る。
【０１８４】
結論
まとめると、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂにリスク変異体を有する患者及び有さない患者に由来するＥＢＶ形質転換細胞株におけるＤｃＲ３の免疫調節役割を調査した。ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ（ｒｓ２３１５００８  ＳＮＰのＡ対立遺伝子など）にリスク変異体を有するＩＢＤ患者に由来するＥＢＶ形質転換細胞株は、野生型と比較して、差次的なＤｃＲ３発現パターン及びＮＦ−κＢ動態を呈し、ＦａｓＬによって誘導されるアポトーシスを阻害することによってクローン病において炎症を促進する。ヌクレオフェクションの２４時間後のｓｉＲＮＡに媒介されるノックダウンは、ＤｃＲ３発現の減少、細胞死の増大、及び細胞増殖の減少をもたらし、これらの作用は、ジェノタイプ依存性でもあった。我々の結果は、ＣＤの発症機序における非カノニカルＮＦ−κＢシグナル伝達の関与の初めての実験的根拠を提供する。ＣＤにおける病原性炎症が、部分的に、非カノニカル発生シグナルがＩκＢタンパク質のホメオスタシスが改変されたＮＦ−κＢシグナル伝達モジュールに影響を及ぼしている結果であることを提案する。我々の発見により、非カノニカルＮＦ−κＢ経路が、ＩＢＤの発症機序において重要な役割を果たすものであり、新しい治療法の開発を通じてＤｃＲ３ネットワーク遺伝子を標的とする治療的介入のための新しい道を提供することを確立される。
【０１８５】
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【０１８６】
実施例ＩＩ
ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ遺伝子改変及び複数の小児自己免疫疾患に関するＧＷＡＳ研究データ
ＴＮＦＲＳＦ６Ｂにおける遺伝子改変と炎症性腸疾患（ＩＢＤ）との間の関連性は、当初、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（ＣＨＯＰ）において行われた全ゲノム相関解析（ＧＷＡＳ）の一部として発見された。（国際公開第２００９／１０５５９０号を参照されたい）。ＴＬ１Ａ（ＴＮＦＳＦ１５）の遺伝子改変とＩＢＤとの間の相関性もまた、この研究において観察された。さらなるＧＷＡＳ解析により、現在では、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂにおける遺伝子改変と、多発性硬化症（ＭＳ）、甲状腺炎、及び乾癬などのさらなる自己免疫疾患（ＡＩＤ）との間の関連性が特定されている。そのさらなる研究の目的は、小児対象におけるＡＩＤ（ｐＡＩＤ）の発症と相関する遺伝子改変を全ゲノムで特定することであった。
【０１８７】
この研究は、１０種類の臨床的に異なるｐＡＩＤ全体で６０３５人の小児症例及び１０７１８人の集団に基づくコントロール対象にわたる組合せコホートに行った。全染色体のフェージングを行い、１０００  Ｇｅｎｏｍｅｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｐｈａｓｅ  Ｉの統合された普遍的基準パネルを、Ｈｏｗｉｅ，Ｂ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４４：９５５−９（２００８）及びＤｅｌａｎｅａｕ，Ｏ．ら、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ９：５４０（２００８）に記載のように、インピュテーションに使用した。この研究には、自己申告で祖先がヨーロッパ系の個体のみが含まれた。選択された１０種類のｐＡＩＤのそれぞれからの症例サンプル及び共通のコントロールを使用して、全ゲノム症例コントロール相関性試験を行った。ＳＮＰＴＥＳＴｖ２．５を使用して、追加のロジスティック回帰を適用した。ゲノムインフレーションの痕跡はなかった。共通しているｐＡＩＤ関連遺伝子座を特定するために、サンプルサイズのばらつき及び１０種類のｐＡＩＤで共通したコントロールの使用を考慮して、逆カイ二乗メタ解析を行った。
【０１８８】
この研究で特定された遺伝子座には、ＴＮＦＲＳＦ６ＢのＳＮＰ  ｒｓ２７３８７７４の２０ｑ１３．３３によるものがあった。このＳＮＰの遺伝子改変は、甲状腺炎、乾癬、全身性紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、クローン病、及び若年性特発性関節炎を含むいくつかのｐＡＩＤと有意に相関していた。
【０１８９】
研究のさらなる詳細並びにＴＮＦＲＳＦ６Ｂ及び他の遺伝子と関連している結果は、２０１５年８月２１日に出願された米国仮出願第６２／２０８３８３号に記載されており、これは、本明細書に参照により援用され、本出願が優先権を主張する。例えば、その出願の補足の表２Ａを参照されたい。
【０１９０】
実施例ＩＩＩ
ＩＢＤ対象におけるさらなるＤＣＲ３ネットワーク遺伝子改変の特定
小児ＩＢＤ罹患者におけるさらなるＧＷＡＳデータにより、ＩＢＤ症例において、コントロールと比較して少なくとも２倍多く含む複数のＤｃＲ３ネットワーク遺伝子の遺伝子改変（具体的には、ＳＮＰ）も明らかになっている。
【０１９１】
以下に、そのようなＳＮＰの表を示す。
2018529658.tif 000003
【０１９２】
以下の表は、小児ＩＢＤ罹患者において、コントロール対象と比較して少なくとも２倍多く含まれることが見出された、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂの突然変異のさらなるセットを示す。
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【０１９３】
実施例ＩＶ
自己免疫疾患の治療に有効な治療薬を特定するためのスクリーニングアッセイ
本明細書において上述の情報は、ＡＩＤ又はＤｃＲ３分泌の改変と関連する１つ若しくは複数の自己免疫疾患（ＡＩＤ）を発症する可能性の増大に関する患者の診断、並びに治療的介入に、臨床的に応用することができる。マイクロアレイを含む診断用組成物、及び方法は、ＡＩＤを発症する可能性を評価するために、患者に由来する核酸において本明細書に記載されるＳＮＰを特定するように設計することができる。これは、患者がクリニックに到着した後に生じ得る。患者を採血し、本明細書に記載される診断方法を使用して、臨床医は、実施例Ｉに記載されるように単一ヌクレオチド多型を検出することができる。患者試料から得られた情報は、任意選択的に、評価の前に増幅させてもよく、これを使用して、ＡＩＤを発症する可能性の増大又は減少を有する患者を診断する。本発明の診断方法を行うためのキットもまた、本明細書に提供される。このようなキットは、本明細書に提供されるＳＮＰのうちの少なくとも１つを含むマイクロアレイ、並びに上述ように患者試料を評価するのに必要な試薬を含み得る。代替として、又は追加として、キットは、試料におけるシグナルのレベルを増大させるためにＰＣＲを行うのに必要な試薬を含んでもよい。
【０１９４】
ＡＩＤ関連遺伝子の特定及び患者の結果は、どの変異体が存在しているかを示し、ＡＩＤを発症するリスクを有するもの又はリスクの改変を有するものを特定する。本明細書に提供される情報により、疾患が進行している中、これまで可能であったものよりも早期な治療的介入が可能となる。さらに、本明細書において上述のように、罹患したＤｃＲ３遺伝子は、ゲノム規模で有意なレベルでＡＩＤと関連していることが示され、したがって、この遺伝子は、これらの自己免疫障害の治療に有効な新しい治療剤の開発のための新規な標的をもたらす。
【０１９５】
実施例Ｖ
ＡＩＤと関連する症状を緩和するための試験及び治療方法
ＡＩＤを有する個体を治療するため、疾患の兆候又は症状を緩和するために、本明細書の表に開示される遺伝子を標的とする好適な薬剤を、患者に治療的利点を提供するために組み合わせて投与することができる。このような薬剤は、有効量で投与すべきである。
【０１９６】
まず、生物学的試料又はジェノタイピング情報を、患者から得ることができる。試料中に存在する核酸から収集した遺伝情報を、次いで、１つ又は複数のＡＩＤの発症と関連する核酸を含む、ＡＩＤ関連ＳＮＰの存在又は不在に関して評価することができる。ＡＩＤの存在を示すこれらのＳＮＰの存在は、罹患遺伝子（１つ又は複数）の同時特定と合わせて、どの治療剤が適しているかに関する指針を臨床医に提供し得る。全治療用量（１回、又は２つ以上の標的を調節する場合には複数回用量）は、単回用量として対象に投与してもよく、又は複数／別個の用量をより長い期間にわたって、例えば、１日投薬量の投与を可能にするように１日の期間にわたって、若しくは所望される期間にわたって用量を投与するようにより長期間にわたって、投与する、分割治療プロトコルを使用して投与してもよい。
【０１９７】
ＡＩＤを罹患している個体、特に、その疾患のより重度の形態を罹患している個体において、ＡＩＤ治療剤の投与は、例えば、そのような疾患を治療するための従来的な薬剤と組み合わせて投与した場合に、特に有用であり得る。当業者であれば、ＡＩＤ治療剤（１つ又は複数）を、単独又は組み合わせて投与することができ、肺、腸、甲状腺、炎症性機能判定、放射線学、免疫学的アッセイなどの常套的な方法、又は示される場合には組織病理学的方法を使用して、そのような治療の有効性を監視することができる。
【０１９８】
以下の表は、本出願において参照される配列を示す。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【国際調査報告】
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