(57)【要約】本発明はゲノムスケールのＴ細胞活性アレイ（ＧＳ−ＴＣＡＡ）およびこれらのアレイを作成する方法およびそれを使用して免疫モジュレーターを同定する方法を提供する。本発明は、Ｔ細胞生物学的ネットワークの調節に関与するヒト膜タンパク質の同定を可能にする新規のゲノムスケールのＴ細胞活性アレイ（ＧＳ−ＴＣＡＡ）の開発に少なくとも部分的に基づく。ＧＳ−ＴＣＡＡにより、新しい細胞ベースの蛍光レポーターシステムを使用して、９０％を超える全ヒト膜遺伝子についての増殖、抑制、および消耗のような異なるＴ細胞活性の研究が可能となる。
2018538240.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のウェルを含む固体支持構造体を含むゲノムスケールのＴ細胞活性アレイ（ＧＳ−ＴＣＡＡ）であって、
前記複数のウェルのそれぞれが：
膜結合抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片を発現する第１の細胞であって、複数のヒト膜遺伝子のうちの１つによってコードされるタンパク質の前記第１の細胞上への提示が可能になるように、前記複数のヒト膜遺伝子をコードするｃＤＮＡライブラリーでトランスフェクトされている、第１の細胞；
細胞表面上の受容体およびレポーター遺伝子を発現する第２の細胞；
を含み、
前記受容体と前記抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片との間の相互作用が一次シグナルを提供し、前記第２の細胞株の活性を刺激し、
前記レポーター遺伝子の発現レベルの上昇が、前記複数のヒト膜遺伝子のうちの１つによってコードされる前記提示されたタンパク質が刺激性共シグナル伝達分子として作用し、前記第２の細胞株の活性を刺激することを示し、前記レポーター遺伝子の発現レベルの低下が、前記複数のヒト膜遺伝子のうちの１つによってコードされる前記提示されたタンパク質が阻害性共シグナル伝達分子として作用し、前記第２の細胞株の活性を阻害することを示す、アレイ。
【請求項２】
前記固体支持構造体がマルチウェルプレートである、請求項１に記載のアレイ。
【請求項３】
前記マルチウェルプレートが、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートおよび１５３６ウェルプレートからなる群から選択される、請求項２に記載のアレイ。
【請求項４】
前記第１の細胞がヒト２９３Ｔ細胞である、請求項１に記載のアレイ。
【請求項５】
前記第１の細胞が、免疫関連アダプターを発現するヒト２９３Ｔ．２Ａ細胞である、請求項１に記載のアレイ。
【請求項６】
前記免疫関連アダプターが、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＲγおよびＣＤ３Ｅからなる群から選択される、請求項５に記載のアレイ。
【請求項７】
前記第２の細胞が免疫細胞である、請求項１に記載のアレイ。
【請求項８】
前記免疫細胞が、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）である、請求項７に記載のアレイ。
【請求項９】
前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項７に記載のアレイ。
【請求項１０】
前記Ｔ細胞が、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞、消耗Ｔ細胞、アネルギー性Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞からなる群から選択される、請求項９に記載のアレイ。
【請求項１１】
前記レポーター遺伝子が、細胞毒性関連レポーター構築物、アポトーシス関連レポーター構築物および増殖関連レポーター構築物からなる群から選択されるＤＮＡ構築物に含まれる、請求項１に記載のアレイ。
【請求項１２】
前記細胞毒性関連レポーター構築物が蛍光ベースのレポーター構築物である、請求項１１に記載のアレイ。
【請求項１３】
前記アポトーシス関連レポーター構築物が、蛍光ベースのレポーター構築物である、請求項１１に記載のアレイ。
【請求項１４】
前記蛍光ベースのレポーター構築物が、Ｔ細胞関連転写応答エレメントと、それに続く最小ＣＭＶプロモーターおよびＧＦＰレポーター遺伝子を含む、請求項１２または１３に記載のアレイ。
【請求項１５】
前記Ｔ細胞関連転写応答エレメントが、ＮＦ−ｋｂ、ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ−１、ＥＧＲ２、ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋからなる群から選択される、請求項１４に記載のアレイ。
【請求項１６】
前記増殖関連レポーター構築物中のレポーター遺伝子がサイトカイン遺伝子である、請求項１１に記載のアレイ。
【請求項１７】
前記サイトカインが、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファおよびＩＬ−１０からなる群から選択される、請求項１６に記載のアレイ。
【請求項１８】
前記複数のヒト膜遺伝子が、受容体遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、トランスポーター遺伝子およびシグナル伝達遺伝子から選択される遺伝子を含む、請求項１に記載のアレイ。
【請求項１９】
前記複数のヒト膜遺伝子が約１，０００〜７，０００の遺伝子を含む、請求項１に記載のアレイ。
【請求項２０】
前記複数のヒト膜遺伝子が約２，０００〜５，０００個の遺伝子を含む、請求項１に記載のアレイ。
【請求項２１】
前記複数のヒト膜遺伝子が約４，０００〜７，０００個の遺伝子を含む、請求項１に記載のアレイ。
【請求項２２】
前記第２の細胞の前記活性が、細胞増殖、細胞抑制、細胞消耗、細胞アポトーシス、および細胞からのサイトカイン放出からなる群から選択される、請求項１に記載のアレイ。
【請求項２３】
ゲノムスケールのＴ細胞活性アレイ（ＧＳ−ＴＣＡＡ）を作製する方法であって、
複数のウェルを含む固体支持構造体を提供するステップ；
膜結合抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片を発現する第１の細胞を、前記複数のウェルのそれぞれに培養するステップ；
複数のヒト膜遺伝子の１つによってコードされたタンパク質の前記第１の細胞上への提示が可能となるように、前記複数のヒト膜遺伝子をコードするｃＤＮＡライブラリーで前記第１の細胞をトランスフェクトするステップ；および
細胞表面上の受容体およびレポーター遺伝子を発現する第２の細胞を、前記複数のウェルのそれぞれに共培養し、それによってゲノムスケールのＴ細胞活性アレイを調製するステップ
を含み、
前記受容体と前記抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片との間の相互作用が、一次シグナルを提供し、前記第２の細胞株の活性を刺激し、
前記レポーター遺伝子の発現レベルの上昇が、前記複数のヒト膜遺伝子のうちの１つによってコードされる前記提示されたタンパク質が刺激性共シグナル伝達分子として作用し、前記第２の細胞株の活性を刺激することを示し、前記レポーター遺伝子の発現レベルの低下が、前記複数のヒト膜遺伝子のうちの１つによってコードされる前記提示されたタンパク質が阻害性共シグナル伝達分子として作用し、前記第２の細胞株の活性を阻害することを示す、方法。
【請求項２４】
前記固体支持構造体がマルチウェルプレートである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記マルチウェルプレートが、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートおよび１５３６ウェルプレートからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１の細胞がヒト２９３Ｔ細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１の細胞が、免疫関連アダプターを発現するヒト２９３Ｔ．２Ａ細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記免疫関連アダプターが、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＲγおよびＣＤ３Ｅからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２の細胞が免疫細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記免疫細胞が骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）である、請求項２９に記載のアレイ。
【請求項３１】
前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｔ細胞が、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞、消耗Ｔ細胞、アネルギーＴ細胞および制御性Ｔ細胞からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記レポーター遺伝子が、細胞毒性関連レポーター構築物、アポトーシス関連レポーター構築物および増殖関連レポーター構築物からなる群から選択されるＤＮＡ構築物に含まれる、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞毒性関連レポーター構築物が蛍光ベースのレポーター構築物である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記アポトーシス関連レポーター構築物が蛍光ベースのレポーター構築物である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記蛍光ベースのレポーター構築物が、Ｔ細胞関連転写応答エレメントと、それに続く最小ＣＭＶプロモーターおよびＧＦＰレポーター遺伝子を含む、請求項３４または３５に記載のアレイ。
【請求項３７】
前記Ｔ細胞関連転写応答エレメントが、ＮＦ−ｋＢ、ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ−１、ＥＧＲ２、ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記増殖関連レポーター構築物中のレポーター遺伝子がサイトカイン遺伝子である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記サイトカインが、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファおよびＩＬ−１０からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
免疫モジュレーターを同定する方法であって、
請求項１に記載のゲノムスケールのＴ細胞活性アレイ（ＧＳ−ＴＣＡＡ）を提供するステップ；
第１の細胞中の前記複数のヒト膜遺伝子の１つを発現させるステップ、
前記第１の細胞と前記第２の細胞とを共培養するステップ；
前記第２の細胞における前記レポーター遺伝子の発現レベルを検出するステップ；および
前記レポーター遺伝子の発現レベルを、前記複数のヒト膜遺伝子の１つでトランスフェクトされていない対照の第１の細胞と共培養された対照の第２の細胞中の前記レポーター遺伝子の発現レベルと比較するステップ
を含み、
前記レポーター遺伝子の発現レベルの上昇が、前記複数のヒト膜遺伝子のうちの１つによってコードされる前記提示されたタンパク質が刺激性共シグナル伝達分子として作用し、前記第２の細胞株の活性を刺激することを示し、前記レポーター遺伝子の発現レベルの低下が、前記複数のヒト膜遺伝子のうちの１つによってコードされる前記提示されたタンパク質が阻害性共シグナル伝達分子として作用し、前記第２の細胞株の活性を阻害することを示し、それによって免疫モジュレーターが同定される、方法。
【請求項４１】
前記免疫モジュレーターが、ＦＯＬＨ１、ＦＡＳ、ＩＬ３ＲＡ、ＣＤ２４８、ＴＨＢＤ、Ｂ７．１、ＧＪＢ１、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬおよびＢ７．２からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記免疫モジュレーターが、ＦＬＴ１、ＣＸＣＲ６、ＳＥＭＡ６ａ、ＲＨＣＥ、ＦＣＲＬＡ、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＳＥＣ２２ｂ、Ｂ３ＧＮＴ１、ＮＦＡＭ１．ＬＹ６およびＧＰ１ＢＡからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記免疫モジュレーターが、ＦＬＴ１、ＳＥＭＡ６ａ、ＳＥＣ２２ｂおよびＧＰ１ＢＡからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
自動化されている、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
ロボット工学を使用して実行される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
ロボット液体ハンドリング技術を使用して実行される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
自動プレートハンドリングシステムを使用して実行される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイ、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ、受容体アレイアッセイ、バイオインフォマティクスアッセイ、またはそれらの組合せからなる群から選択されるアッセイを実行することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイが、
前記複数のヒト膜遺伝子の１つおよび膜結合抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片を発現する前記第２の細胞を初代Ｔ細胞と共に培養すること；および
増殖アッセイ、アポトーシスアッセイおよびサイトカイン放出アッセイからなる群から選択されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイを実行すること
を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記初代Ｔ細胞が、ヒト初代ＣＤ８細胞および／またはヒト初代ＣＤ４細胞である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記受容体アレイアッセイが、前記免疫モジュレーターの相互作用タンパク質を同定するために実行される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記受容体アレイが：
複数のウェルを含む固体支持構造体
を含み、前記複数のウェルのそれぞれが：
複数の受容体遺伝子の１つによってコードされる受容体の前記細胞上での提示が可能になるように、前記複数の受容体遺伝子をコードするｃＤＮＡライブラリーでトランスフェクトされた細胞；
タグと融合した免疫モジュレーターを含む組換えタンパク質；
前記タグに特異的な蛍光標識された抗体
を含み；
検出可能な蛍光シグナルが、前記免疫モジュレーターが前記受容体と相互作用することの指標である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記タグが、マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃタグ、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃタグ、ＦＬＡＧタグおよび６ｘＨｉｓタグからなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記免疫モジュレーターが前記免疫モジュレーターの全長タンパク質である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記免疫モジュレーターが、前記免疫モジュレーターの細胞外ドメインである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイが、前記免疫モジュレーターを自己免疫疾患またはがんの動物モデルに投与することを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５７】
前記動物モデルが、ヒトメラノーマ細胞および腫瘍反応性Ｔ細胞を注射されたＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒガンマｎｕｌｌマウスモデルである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記動物モデルがヒト化マウスモデルである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記ヒト化マウスモデルが、免疫患者由来の異種移植（免疫ＰＤＸ）モデルである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
それを必要とする対象における自己免疫疾患またはがんを治療する方法であって、請求項４０に記載の方法によって同定された免疫モジュレーターの有効量を前記対象に投与し、それにより前記対象における自己免疫疾患またはがんを治療することを含む、方法。
【請求項６１】
それを必要とする対象における自己免疫疾患またはがんを治療する方法であって、請求項４０に記載の方法によって同定された免疫モジュレーターの調節物質の有効量を前記対象に投与し、それにより前記対象における自己免疫疾患またはがんを治療することを含む、方法。
【請求項６２】
前記免疫モジュレーターが、ＦＯＬＨ１、ＦＡＳ、ＩＬ３ＲＡ、ＣＤ２４８、ＴＨＢＤ、Ｂ７．１、ＧＪＢ１、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬおよびＢ７．２からなる群から選択される、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記免疫モジュレーターが、ＦＬＴ１、ＣＸＣＲ６、ＳＥＭＡ６ａ、ＲＨＣＥ、ＦＣＲＬＡ、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＳＥＣ２２ｂ、Ｂ３ＧＮＴ１、ＮＦＡＭ１．ＬＹ６およびＧＰ１ＢＡからなる群から選択される、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記免疫モジュレーターの調節物質が、前記免疫調節物質の発現レベルおよび／または活性レベルを上昇させる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
前記免疫モジュレーターの調節物質が、前記免疫調節物質の発現レベルおよび／または活性レベルを低下させる、請求項６１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年１０月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／２４１，４６６への優先権の利益を主張し、当該出願の内容全体は、本明細書において参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
共シグナル伝達表面受容体−リガンド経路は、Ｔ細胞の生物学的ネットワークを厳密に制御するＴ細胞の活性化および阻害に必須である。過去の１０年間で、この分野は、共シグナル伝達分子および経路を標的とし、自己免疫疾患および種々のがんを含む多くの疾患と闘う免疫調節治療アプローチの開発を見てきた。ＰＤ−１／Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１）経路を標的とする抗体の臨床試験およびＦＤＡ規制当局の承認が最近成功したことにより、広い範囲の進行したヒトがんにおける最小の有害作用を伴う前例のない臨床的応答がもたらされた（Brahmer,  JRら、N  Engl  J  Med  ３６６巻（２６号）：２４５５〜２４６５頁、２０１２年；Topalian,  SLら、N  Engl  J  Med  ３６６巻（２６号）：２４４３〜２４５４頁、２０１２年）。この治療のタイプは、有効性、毒性、および耐久性に関して他の治療よりも優れており、がん治療のための腫瘍部位Ｔ細胞免疫調節戦略の利点を代表する（Sznol  MおよびChen  L、Clin  Cancer  Res  １９巻（５号）：１０２１〜１０３４頁、２０１３年）。しかしながら、この興奮させる応答にもかかわらず、がん患者の大部分は抗ＰＤ−１療法に応答しない。したがって、原発性および後天性免疫耐性にどのような他の因子が関わるか（Sznol  MおよびChen  L、Clin  Cancer  Res  １９巻（５号）：１０２１〜１０３４頁、２０１３年）、ＰＤ−１／Ｂ７−Ｈ１経路の他にどのような追加機構が免疫回避の原因であるかを決定する強い必要性がある。ヒト細胞表面分子がどのようにＴ細胞応答を調節するかについての包括的な理解は、新規の免疫モジュレーターの同定を助け、新しい免疫療法剤の開発に重要な方向性を示す。
【０００３】
膜タンパク質は、細胞の機能において重要な役割を果たす。伝達は最も重要な役割の１つであり、細胞表面タンパク質は、受容体として作用し、細胞間でシグナルを伝えるか、あるいは内部および外部環境間で相互作用を媒介することができる。細胞が情報を収集し、シグナルを中継する手段として役立つのに加え、膜タンパク質は、トランスポーターとしても機能することができ、細胞膜を渡る物質の交換を制御することに関与している。膜タンパク質は、そのより接近可能な性質のため、治療薬の標的として特に興味深い。しかしながら、ほとんどのヒト膜タンパク質の免疫機能についてはほとんど知られておらず、ゲノムレベルでＴ細胞活性をアッセイするための十分に確立されたシステムはない。したがって、成功率を広げ、抗腫瘍および自己免疫療法を十分に活用するため、薬物潜在性を有する新規の免疫調節膜タンパク質を同定することができる組成物および方法については、進行中で未だ対処されていない必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Brahmer,  JRら、N  Engl  J  Med  ３６６巻（２６号）：２４５５〜２４６５頁、２０１２年
【非特許文献２】Topalian,  SLら、N  Engl  J  Med  ３６６巻（２６号）：２４４３〜２４５４頁、２０１２年
【非特許文献３】Sznol  MおよびChen  L、Clin  Cancer  Res  １９巻（５号）：１０２１〜１０３４頁、２０１３年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、Ｔ細胞生物学的ネットワークの調節に関与するヒト膜タンパク質の同定を可能にする新規のゲノムスケールのＴ細胞活性アレイ（ＧＳ−ＴＣＡＡ）の開発に少なくとも部分的に基づく。ＧＳ−ＴＣＡＡにより、新しい細胞ベースの蛍光レポーターシステムを使用して、９０％を超える全ヒト膜遺伝子についての増殖、抑制、および消耗のような異なるＴ細胞活性の研究が可能となる。このアプローチは、ヒト細胞表面分子がどのようにしてＴ細胞応答を調節するかについて包括的な理解を提供し、新規の免疫モジュレーターの同定を援助する。ＧＳ−ＴＣＡＡを用いて、自己免疫疾患およびがんに存在する未知の共シグナル伝達分子および経路を同定することによって、治療について標的化、同定および開発を行うことができる。
【０００６】
したがって、一態様では、本発明は、複数のウェルを含む固体支持構造体を含むゲノムスケールのＴ細胞活性アレイ（ＧＳ−ＴＣＡＡ）であって、複数のウェルのそれぞれが：膜結合抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片を発現する第１の細胞であって、複数のヒト膜遺伝子の１つによってコードされるタンパク質の第１の細胞上の提示が可能になるように、複数のヒト膜遺伝子をコードするｃＤＮＡライブラリーでトランスフェクトされている、第１の細胞；細胞表面上の受容体およびレポーター遺伝子を発現する第２の細胞を含み；受容体と抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片との間の相互作用が、一次シグナルを提供し、第２の細胞株の活性を刺激し、レポーター遺伝子の発現レベルの上昇が、複数のヒト膜遺伝子の１つによってコードされる提示されたタンパク質が刺激性共シグナル伝達分子として作用し、第２の細胞株の活性を刺激することを示し、レポーター遺伝子の発現レベルの低下が、複数のヒト膜遺伝子の１つによってコードされる提示されたタンパク質が阻害性共シグナル伝達分子として作用し、第２の細胞株の活性を阻害することを示す、アレイを含む。
【０００７】
一部の実施形態では、固体支持構造体はマルチウェルプレートである。他の実施形態では、マルチウェルプレートは、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートおよび１５３６ウェルプレートからなる群から選択される。
【０００８】
一部の実施形態では、第１の細胞はヒト２９３Ｔ細胞である。他の実施形態では、第１の細胞は、免疫関連アダプターを発現するヒト２９３Ｔ．２Ａ細胞である。一部の実施形態では、免疫関連アダプターは、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＲγおよびＣＤ３Ｅからなる群から選択される。
【０００９】
一部の実施形態では、第２の細胞は免疫細胞である。他の実施形態では、免疫細胞は骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）である。一部の実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞、消耗Ｔ細胞（exhausted  T  cell）、アネルギーＴ細胞および制御性Ｔ細胞からなる群から選択される。
【００１０】
一部の実施形態では、レポーター遺伝子は、細胞毒性関連レポーター構築物、アポトーシス関連レポーター構築物および増殖関連レポーター構築物からなる群から選択されるＤＮＡ構築物に含まれる。他の実施形態では、細胞毒性関連レポーター構築物は蛍光ベースのレポーター構築物である。一部の実施形態では、アポトーシス関連レポーター構築物は蛍光ベースのレポーター構築物である。一部の実施形態では、蛍光ベースのレポーター構築物は、最小ＣＭＶプロモーターおよびＧＦＰレポーター遺伝子が後に続くＴ細胞関連転写応答エレメントを含む。他の実施形態では、Ｔ細胞関連転写応答エレメントは、ＮＦ−ｋｂ、ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ−１、ＥＧＲ２、ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋからなる群から選択される。一部の実施形態では、増殖関連レポーター構築物の中のレポーター遺伝子は、サイトカイン遺伝子である。一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファおよびＩＬ−１０からなる群から選択される。
【００１１】
一部の実施形態では、複数のヒト膜遺伝子は、受容体遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、トランスポーター遺伝子およびシグナル伝達遺伝子から選択される遺伝子を含む。一部の実施形態では、複数のヒト膜遺伝子は、約１，０００〜７，０００個の遺伝子を含む。他の実施形態では、複数のヒト膜遺伝子は、約２，０００〜５，０００個の遺伝子を含む。さらに別の実施形態では、複数のヒト膜遺伝子は、約４，０００〜７，０００個の遺伝子を含む。
【００１２】
一部の実施形態では、第２の細胞の活性は、細胞増殖、細胞抑制、細胞消耗、細胞アポトーシス、および細胞からのサイトカイン放出からなる群から選択される。
【００１３】
一態様では、本発明は、ゲノムスケールのＴ細胞活性アレイ（ＧＳ−ＴＣＡＡ）を作製する方法であって、複数のウェルを含む固体支持構造体を提供するステップと；膜結合抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片を発現する第１の細胞を複数のウェルのそれぞれに培養するステップと；複数のヒト膜遺伝子のうちの１つによってコードされるタンパク質の第１の細胞上への提示が可能になるように、複数のヒト膜遺伝子をコードするｃＤＮＡライブラリーで第１の細胞をトランスフェクトするステップ；および、細胞表面の受容体を発現する第２の細胞とレポーター遺伝子とを複数のウェルのそれぞれの中で共培養し、そのことにより、ゲノムスケールのＴ細胞活性アレイを調製するステップを含む、方法であって、受容体と抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片との間の相互作用が、一次シグナルを提供し、第２の細胞株の活性を刺激し、レポーター遺伝子の発現レベルの上昇が、複数のヒト膜遺伝子のうちの１つによってコードされる提示されたタンパク質が刺激性共シグナル伝達分子として作用し、第２の細胞株の活性を刺激することを示し、レポーター遺伝子の発現レベルの低下が、複数のヒト膜遺伝子のうちの１つによってコードされる提示されたタンパク質が阻害性共シグナル伝達分子として作用し、第２の細胞株の活性を阻害することを示す。
【００１４】
一部の実施形態では、固体支持構造体はマルチウェルプレートである。一部の実施形態では、マルチウェルプレートは、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートおよび１５３６ウェルプレートからなる群から選択される。
【００１５】
一部の実施形態では、第１の細胞はヒト２９３Ｔ細胞である。他の実施形態では、第１の細胞は、免疫関連アダプターを発現するヒト２９３Ｔ．２Ａ細胞である。一部の実施形態では、免疫関連アダプターは、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＲγおよびＣＤ３Ｅからなる群から選択される。
【００１６】
一部の実施形態では、第２の細胞は免疫細胞である。他の実施形態では、免疫細胞は骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）である。一部の実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞、消耗Ｔ細胞、アネルギーＴ細胞および制御性Ｔ細胞からなる群から選択される。
【００１７】
一部の実施形態では、レポーター遺伝子は、細胞毒性関連レポーター構築物、アポトーシス関連レポーター構築物および増殖関連レポーター構築物からなる群から選択されるＤＮＡ構築物に含まれる。他の実施形態では、細胞毒性関連レポーター構築物は蛍光ベースのレポーター構築物である。一部の実施形態では、アポトーシス関連レポーター構築物は蛍光ベースのレポーター構築物である。一部の実施形態では、蛍光ベースのレポーター構築物は、最小ＣＭＶプロモーターおよびＧＦＰレポーター遺伝子が後に続くＴ細胞関連転写応答エレメントを含む。他の実施形態では、Ｔ細胞関連転写応答エレメントは、ＮＦ−ｋｂ、ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ−１、ＥＧＲ２、ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋからなる群から選択される。一部の実施形態では、増殖関連レポーター構築物の中のレポーター遺伝子は、サイトカイン遺伝子である。一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファおよびＩＬ−１０からなる群から選択される。
【００１８】
一部の実施形態では、複数のヒト膜遺伝子は、受容体遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、トランスポーター遺伝子およびシグナル伝達遺伝子から選択される遺伝子を含む。一部の実施形態では、複数のヒト膜遺伝子は、約１，０００〜７，０００個の遺伝子を含む。他の実施形態では、複数のヒト膜遺伝子は、約２，０００〜５，０００個の遺伝子を含む。さらに別の実施形態では、複数のヒト膜遺伝子は、約４，０００〜７，０００個の遺伝子を含む。
【００１９】
一部の実施形態では、第２の細胞の活性は、細胞増殖、細胞抑制、細胞消耗、細胞アポトーシス、および細胞からのサイトカイン放出からなる群から選択される。
【００２０】
本発明の一態様は、免疫モジュレーターを同定する方法であって、本明細書に記載のようにゲノムスケールのＴ細胞活性アレイ（ＧＳ−ＴＣＡＡ）を提供するステップ；第１の細胞の中の複数のヒト膜遺伝子の１つを発現させるステップ、第１の細胞および第２の細胞を共培養するステップ；第２の細胞中のレポーター遺伝子の発現レベルを検出するステップ；およびレポーター遺伝子の発現レベルを対照の第２の細胞中のレポーター遺伝子の発現レベルと比較するステップであって、対照の第２の細胞が、複数のヒト膜遺伝子の１つでトランスフェクトされていない対照の第１の細胞と共培養されている、ステップを含み、レポーター遺伝子の発現レベルの上昇が、複数のヒト膜遺伝子のうちの１つによってコードされる提示されたタンパク質が刺激性共シグナル伝達分子として作用し、第２の細胞株の活性を刺激することを示し、レポーター遺伝子の発現レベルの減少が、複数のヒト膜遺伝子のうちの１つによってコードされる提示されたタンパク質が阻害性共シグナル伝達分子として作用し、第２の細胞株の活性を阻害することを示し、それによって免疫モジュレーターが同定される。
【００２１】
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＦＯＬＨ１、ＦＡＳ、ＩＬ３ＲＡ、ＣＤ２４８、ＴＨＢＤ、Ｂ７．１、ＧＪＢ１、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬおよびＢ７．２からなる群から選択される。他の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＦＬＴ１、ＣＸＣＲ６、ＳＥＭＡ６ａ、ＲＨＣＥ、ＦＣＲＬＡ、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＳＥＣ２２ｂ、Ｂ３ＧＮＴ１、ＮＦＡＭ１．ＬＹ６およびＧＰ１ＢＡからなる群から選択される。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＦＬＴ１、ＳＥＭＡ６ａ、ＳＥＣ２２ｂおよびＧＰ１ＢＡからなる群から選択される。
【００２２】
一部の実施形態では、本方法は自動化される。他の実施形態では、本方法はロボット工学を用いて実行される。一部の実施形態では、本方法はロボット液体操作技術を使用して実行される。他の実施形態では、本方法は自動プレート操作システムを使用して実行される。
【００２３】
一部の実施形態では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイ、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ、受容体アレイアッセイ、バイオインフォマティクスアッセイ、またはそれらの組合せからなる群から選択されるアッセイを実行することをさらに含む。
【００２４】
一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイは、複数のヒト膜遺伝子の１つおよび膜結合抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片を発現する第２の細胞を初代Ｔ細胞と共に培養するステップ；および増殖アッセイ、アポトーシスアッセイおよびサイトカイン放出アッセイからなる群から選択されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイを実行することを含む。一部の実施形態では、初代Ｔ細胞は、ヒト初代ＣＤ８細胞および／またはヒト初代ＣＤ４細胞である。
【００２５】
一部の実施形態では、受容体アレイアッセイは、免疫モジュレーターの相互作用タンパク質を同定するために実行される。他の実施形態では、受容体アレイは：複数のウェルを含む固体支持構造体を含み、複数のウェルのそれぞれが：複数の受容体遺伝子のうちの１つによってコードされる受容体の細胞上での提示が可能になるように、複数の受容体遺伝子をコードするｃＤＮＡライブラリーでトランスフェクトされた細胞；タグと融合した免疫モジュレーターを含む組換えタンパク質；タグに特異的な蛍光標識された抗体を含み；検出可能な蛍光シグナルは、免疫モジュレーターが受容体と相互作用することの指標である。
【００２６】
一部の実施形態では、タグは、マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃタグ、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃタグ、ＦＬＡＧタグおよび６ｘＨｉｓタグからなる群から選択される。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、免疫モジュレーターの全長タンパク質である。他の実施形態では、免疫モジュレーターは、免疫モジュレーターの細胞外ドメインである。
【００２７】
一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは、自己免疫疾患またはがんの動物モデルに免疫モジュレーターを投与することを含む。一部の実施形態では、動物モデルは、ヒトメラノーマ細胞および腫瘍反応性Ｔ細胞を注射されたＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒガンマｎｕｌｌマウスモデルである。他の実施形態では、動物モデルはヒト化マウスモデルである。さらに別の実施形態では、ヒト化マウスモデルは、免疫患者由来の異種移植（免疫ＰＤＸ）モデルである。
【００２８】
本発明の１つの態様は、本明細書に記載の方法によって同定された有効量の免疫モジュレーターを対象に投与し、それにより対象における自己免疫疾患またはがんを治療することを含む、それを必要とする対象における自己免疫疾患またはがんを治療する方法を提供する。
【００２９】
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＦＯＬＨ１、ＦＡＳ、ＩＬ３ＲＡ、ＣＤ２４８、ＴＨＢＤ、Ｂ７．１、ＧＪＢ１、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬおよびＢ７．２からなる群から選択される。他の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＦＬＴ１、ＣＸＣＲ６、ＳＥＭＡ６ａ、ＲＨＣＥ、ＦＣＲＬＡ、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＳＥＣ２２ｂ、Ｂ３ＧＮＴ１、ＮＦＡＭ１．ＬＹ６およびＧＰ１ＢＡからなる群から選択される。
【００３０】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の方法によって同定された免疫モジュレーターの調節物質の有効量を対象に投与し、それにより、対象における自己免疫疾患またはがんを治療することを含む、それを必要とする対象における自己免疫疾患またはがんを治療する方法を特徴とする。
【００３１】
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＦＯＬＨ１、ＦＡＳ、ＩＬ３ＲＡ、ＣＤ２４８、ＴＨＢＤ、Ｂ７．１、ＧＪＢ１、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬおよびＢ７．２からなる群から選択される。他の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＦＬＴ１、ＣＸＣＲ６、ＳＥＭＡ６ａ、ＲＨＣＥ、ＦＣＲＬＡ、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＳＥＣ２２ｂ、Ｂ３ＧＮＴ１、ＮＦＡＭ１．ＬＹ６およびＧＰ１ＢＡからなる群から選択される。一部の実施形態では、免疫モジュレーターの調節物質は、免疫調節物質の発現レベルおよび／または活性レベルを上昇させる。他の実施形態では、免疫モジュレーターの調節物質は、免疫調節物質の発現レベルおよび／または活性レベルを低下させる。
【００３２】
本発明は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない以下の図面および詳細な説明によって説明される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１Ａは、ゲノムスケールのＴ細胞活性アレイ（ＧＳ−ＴＣＡＡ）の基本原理を図示的に表す図である。簡潔には、膜結合抗ヒトＣＤ３抗体ＳｃＦｖ（２９３Ｔ．２Ａ／ｍ抗ＣＤ３）を安定に発現する２９３Ｔ．２Ａ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ／レポーター細胞においてＴ細胞活性化を刺激し、検出可能なＧＦＰシグナルを生成する。ｃＤＮＡライブラリーからの個々の膜遺伝子のトランスフェクションは、潜在的にＴ細胞活性の結果に影響を及ぼす。分子が有効でない場合、ＧＦＰシグナルは同様のままである。分子が刺激性である場合、より強いＧＦＰシグナルが検出される。分子が阻害性である場合、より弱いＧＦＰシグナルが観察される。図１Ｂは、ＣＤ５Ｌ遺伝子のシグナルペプチド配列を含み、抗ＣＤ３  ＳｃＦｖおよび膜付着配列により隣接されている膜結合抗ヒトＣＤ３抗体ＳｃＦｖ構築物を、図示的に表す図である。図１Ｃは、Ｔ細胞関連転写因子応答エレメント（ＴＦＲＥ）に続いて最小ＣＭＶプロモーターおよびＧＦＰレポーター遺伝子を含むＧＦＰレポーター構築物を、図示的に表す図である。
【００３４】
【図２】図２Ａは、ｍ抗ＣＤ３構築物でトランスフェクトされた２９３Ｔ．２Ａ細胞およびＧＦＰレポーターを発現するＪｕｒｋａｔ細胞を、Ｔ細胞活性に刺激性である膜遺伝子を検出するために用いる有効性を示す図である。簡潔には、２９３Ｔ．２Ａ細胞は、ｍｏｃｋ構築物（ｃｔｒ）、他のＴ細胞関連膜遺伝子（例えば、Ｂ７．２、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ３およびＢ７−Ｈ４）を有するかまたは有さないｍ抗ＣＤ３プラスミドでトランスフェクトし、その後、精製ヒトＴ細胞またはＰＢＭＣと共培養した。チミジン取り込み（thymidine  corporation）によって示されたＴ細胞増殖が、４８時間後に現れた。図２Ｂは、ｍ抗ＣＤ３プラスミドトランスフェクションを伴うまたは伴わない２９３Ｔ．２Ａ細胞をＪｕｒｋａｔ／ＮＦ−Ｋｂ  ＧＦＰ細胞と共に共培養したとき、共培養の１２時間後、ＧＦＰシグナルがｍ抗ＣＤ３を有する細胞においてのみ検出されたことを示す画像である。１５３６イメージングプレートにおいてデータを取得した。
【００３５】
【図３】図３は、ＧＳ−ＴＣＡＡからＴ細胞活性に対する刺激または阻害機能のいずれかで同定された膜遺伝子を示す一連の画像である。簡潔には、２９３Ｔ．２Ａ細胞を、ｍｏｃｋ構築物（ｃｔｒ）、他のＴ細胞関連膜遺伝子を有するかまたは有さないｍ抗ＣＤ３プラスミドでトランスフェクトし、その後、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦ−Ｋｂ  ＧＦＰ細胞と共に共培養した。共培養の１２時間後にＧＦＰシグナルが検出された。１５３６イメージングプレートにおいてデータを取得した。
【００３６】
【図４】図４は、Ｔ細胞活性に対する刺激または阻害機能のいずれかを有するＧＳ−ＴＣＡＡから同定された膜遺伝子を示す図である。簡潔には、２９３Ｔ．２Ａ細胞に、ｍｏｃｋ構築物（ｃｔｒ）、他のＴ細胞関連膜遺伝子を有するかまたは有さないｍ抗ＣＤ３プラスミドをトランスフェクトし、その後、Ｊｕｒｋａｔと共培養した。ＩＦＮ−γ放出を定量化した。
【００３７】
【図５】図５は、ＧＳ−ＴＣＡＡヒットの代表的な分析を示すグラフである。Ｔ細胞活性に対して刺激機能を有する膜遺伝子でトランスフェクトされた細胞は、対照よりも高いＧＦＰ値を持ち、Ｔ細胞活性に対して阻害機能を有する膜遺伝子でトランスフェクトされた細胞は、より低いＧＦＰ値をもたらした。
【００３８】
【図６】図６は、オンコミンデータベース（Ｏｎｃｏｍｉｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）の分析による様々なタイプのがんにおけるＦＬＴ１の示差的発現を示すグラフである。
【００３９】
【図７】図７は、オンコミンデータベース（Ｏｎｃｏｍｉｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）の分析による様々なタイプのがんにおけるＳＥＭＡ６ａの示差的発現を示すグラフである。
【００４０】
【図８】図８は、オンコミンデータベース（Ｏｎｃｏｍｉｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）の分析による様々なタイプのがんにおけるＳＥＣ２２ｂの示差的発現を示すグラフである。
【００４１】
【図９】図９は、オンコミンデータベース（Ｏｎｃｏｍｉｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）の解析による様々なタイプのがんにおけるＧＰ１ＢＡの示差的発現を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明は、新規の免疫モジュレーター、例えばＴ細胞を調節する免疫モジュレーターを同定するために使用することができる新規なゲノムスケールのＴ細胞活性アレイ（ＧＳ−ＴＣＡＡ）の開発に少なくとも部分的に基づく。ＧＳ−ＴＣＡＡは、新しい細胞ベースの蛍光レポーターシステムを使用した、全ヒト膜遺伝子の９０％より多くにおける増殖、抑制、および消耗のような異なるＴ細胞活性の研究を可能にする。このアプローチは、ヒト細胞表面分子がどのようにＴ細胞応答を調節し、新規な免疫モジュレーターの同定を援助するかについての包括的な理解を提供する。ＧＳ−ＴＣＡＡを用いて、治療は、自己免疫疾患およびがんに存在する未知の共シグナル伝達分子および経路を同定することによって、標的化、同定および開発することができる。
【００４３】
したがって、本発明は、一実施形態では、ゲノムスケールのＴ細胞活性アレイ（ＧＳ−ＴＣＡＡ）、およびゲノムスケールのＴ細胞活性アレイ（ＧＳ−ＴＣＡＡ）の作製方法を提供する。本発明の別の実施形態では、ゲノムスケールのＴ細胞活性アレイ（ＧＳ−ＴＣＡＡ）を使用する免疫モジュレーターの同定に関する方法を含む。さらなる実施形態では、本発明は、免疫モジュレーターおよび／または免疫モジュレーターの調節物質を対象に投与することによって、自己免疫疾患またはがんを治療するための方法および組成物を含む。
Ｉ．定義
【００４４】
本発明をより容易に理解できるように、特定の用語を最初に定義する。
【００４５】
本明細書中で他に定義されない限り、本発明に関連して使用される科学技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。しかしながら、用語の意味および範囲は明確であるべきであるが、潜在的な曖昧性がある場合は、本明細書において提供される定義が任意の辞書または外的な定義よりも優先される。
【００４６】
本明細書において他に指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、本発明を記載する文脈における用語「１つの（a）」および「１つの（an）」および「その（the）」ならびに同様の参照対象の使用は（特に以下の特許請求の範囲の文脈において）、単数形および複数形の両方（すなわち、１つまたは複数）を包含するものと解釈されるべきである。用語「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」および「含む（containing）」は、他に注釈がない限り、オープンエンドの用語（すなわち、「を含むが、これらに限定されない」という意味）として解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の記述は、本明細書中に他の指示がない限り、記述された、またはその範囲内に入るそれぞれ別個の値を個別に参照する省略的な方法として役立つように意図されているのみであり、それぞれ別個の値は、あたかも個別に記述されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書中に提供される範囲は、範囲内の全ての値についての省略表現であると理解される。例えば、１から５０の範囲とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０からなる群から、任意の数、数字の組合せを含むかまたは１０〜４０、２０〜５０、５〜３５、等からなる群からの部分範囲を含むことと理解される。
【００４７】
本明細書に記載されているように、用語「ウェル」は、一般的に、容器の中の有界領域のことを指し、離散的であっても（例えば、単離された試料を提供するため）、または１つまたは複数の他の有界領域と通じていても（例えば、ウェル内の１つまたは複数の試料間の流体連絡を提供するため）よい。例えば、基板上で増殖した細胞は、通常、生細胞のための培養培地を含むこともできるウェルの中に含まれる。基板は、プラスチック、ガラスなどのような任意の適した材料を含むことができる。プラスチックは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の維持および／または増殖のために従来から使用されている。
【００４８】
「マルチウェルプレート」は、アレイ中に複数のウェルを含む基板の一例である。本発明において有用なマルチウェルプレートは、様々な標準的なフォーマット（例えば、２、４、６、２４、９６、３８４、または１５３６個などのウェルを有するプレート）の任意のものであり得るが、以下でさらに詳細に記載される非標準フォーマットであってもよい。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「細胞」は、原核細胞および真核細胞を含む。一実施形態では、本発明のアレイおよび方法における使用に適した細胞は、細菌細胞である。別の実施形態では、本発明のアレイおよび方法における使用に適した細胞は、酵母細胞のような真菌細胞である。別の実施形態では、本発明のアレイおよび方法における使用に適した細胞は、鳥類細胞または哺乳動物細胞のような脊椎動物細胞である。好ましい実施形態では、本発明のアレイおよび方法における使用に適した細胞は哺乳動物細胞である。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語「免疫細胞」は、造血起源であり、免疫応答において役割を果たす細胞を含む。免疫細胞には、自然免疫系の細胞および適応免疫系の細胞が含まれる。免疫細胞としては、例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞のようなリンパ球；ナチュラルキラー細胞；単核球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球、および顆粒球のような骨髄細胞が挙げられる。
【００５１】
一実施形態では、免疫細胞は自然免疫系の細胞である。「自然免疫系」は、より特異的な適応免疫系が特異的抗体および／またはＴ細胞を産生することができるまで、薬剤への身体の応答を制御する非特異的免疫系である（Modlinら、N.  Engl.  J.  Med  １９９９年、３４０巻：１８３４〜１８３５頁）。自然免疫系は、一般に、食細胞（例えば、好中球、単核球およびマクロファージ）；炎症性メディエーターを放出する細胞（例えば、好塩基球、肥満細胞および好酸球）；ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）；および樹状細胞（ＤＣ）を含む。対照的に、「適応性のある」または「獲得された免疫系」は、その応答において非常に特異的である。それは、病原体の感染に対する適応として個体の生存期間中に起こるため、適応系と呼ばれる。適応免疫は、ワクチン（抗原）に応答するものとして、もしくは抗体を投与することによって、人工的に獲得することができ、または感染によって自然に獲得することができる。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、「抗原提示細胞」は、その表面上に主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と複合体化した外来抗原を提示し、その後、Ｔ細胞受容体を用いてＴ細胞によって認識される細胞を指す。抗原提示細胞は、ＭＨＣ分子を構成的に発現する細胞（例えば、Ｂリンパ球、単核球、樹状細胞、およびランゲルハンス細胞）ならびにＭＨＣ分子を構成的に発現しない他の抗原提示細胞（例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、星状細胞、線維芽細胞、および希突起膠細胞）を含む。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｔ細胞」（すなわち、Ｔリンパ球）は、哺乳動物（例えばヒト）からの胸腺細胞、未成熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞などを含むＴ細胞系統内の全ての細胞を含むことが意図される。Ｔ細胞は、ＣＤ４またはＣＤ８のいずれかを発現し、その両方ではなく、およびＴ細胞受容体を発現する成熟Ｔ細胞を含む。本明細書に記載の様々なＴ細胞集団は、それらのサイトカインプロファイルおよびその機能に基づいて定義することができる。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語「ナイーブＴ細胞」は、同種抗原に曝露されていないＴ細胞であって、そのため活性化されていない細胞または記憶細胞を含む。ナイーブＴ細胞は循環的（ｃｙｃｌｉｎｇ）ではなく、ヒトナイーブＴ細胞はＣＤ４５ＲＡ＋である。ナイーブＴ細胞が抗原を認識し、抗原の量、投与経路および投与のタイミングに依存するが、これらに限定されない追加のシグナルを受ける場合、それらは増殖し、様々なＴ細胞のサブセット、例えばエフェクターＴ細胞に分化し得る。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、用語「エフェクターＴ細胞」は、抗原を排除するように機能する（例えば、他の細胞の活性化を調節するサイトカインの産生によって、または細胞傷害活性によって）Ｔ細胞を含む。用語「エフェクターＴ細胞」は、Ｔヘルパー細胞（例えば、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞）および細胞傷害性Ｔ細胞を含む。Ｔｈ１細胞は、遅延型過敏性応答およびマクロファージ活性化を仲介するが、Ｔｈ２細胞は、Ｂ細胞への補助を提供し、アレルギー応答において重要である（MosmannおよびCoffman、１９８９年、Annu.Rev.Immunol.  ７巻、１４５〜１７３頁；PaulおよびSeder、１９９４年、Cell  ７６巻、２４１〜２５１頁；ArthurおよびMason、１９８６年、J.  Exp.  Med.  １６３巻、７７４〜７８６頁；Paliardら、１９８８年、J.Immunol.  １４１巻、８４９〜８５５頁；Finkelmanら、１９８８年、J  Immunol.  １４１巻、２３３５〜２３４１頁）。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、用語「制御性Ｔ細胞」は、低レベルのＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１２を産生するＴ細胞を含む。制御性Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞よりも低いレベルではあるものの、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−１０を産生する。ＴＧＦβは制御性Ｔ細胞によって産生される主なサイトカインであるが、サイトカインはＴｈ１またはＴｈ２細胞よりも低いレベル、例えばＴｈ１またはＴｈ２細胞よりも一桁低いレベルで産生される。制御性Ｔ細胞は、細胞のＣＤ４＋ＣＤ２５＋集団において見出すことができる（例えば、WaldmannおよびCobbold、２００１年．  Immunity.  １４巻：３９９頁を参照のこと）。制御性Ｔ細胞は、培地内において活性化シグナル（例えば、抗原および抗原提示細胞またはＭＨＣの背景で抗原を模倣するシグナル、例えば、抗ＣＤ３抗体プラス抗ＣＤ２８抗体）で刺激されたＴｈ１、Ｔｈ２、またはナイーブＴ細胞の増殖およびサイトカイン産生を活発に抑制する。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、用語「消耗Ｔ細胞」は、Ｔ細胞機能の段階的かつ進行的な喪失を特徴とする機能不全のＴ細胞を指し、応答する細胞が物理的に欠失することが結果的にあり得る。消耗Ｔ細胞は、慢性感染症およびがんの間に生じ得る。例えば、消耗は、慢性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス感染の際によく定義されており、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびヒト免疫不全ウイルス感染を含む重大な公衆衛生上の懸念がある多くの慢性感染の後に起こる抗原持続の条件下で一般に発生する（例えば、John  Wherry、Nature  Immunology  １２巻、４９２〜４９９頁、２０１１年を参照されたい）。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、用語「アネルギー性Ｔ細胞」とは、機能的に不活性化され、完全共刺激の存在下で抗原に遭遇しても生産的応答を開始することができないＴ細胞を指す（例えば、Macian  F.ら、Curr  Opin  Immunol.  ２００４年、１６巻（２号）：２０９〜１６頁）。Ｔ細胞アネルギーは、リンパ球が抗原遭遇の後、本質的に機能的に不活性化されるが、反応性低下状態で長期間生存し続ける耐性機構である。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の両方に影響を及ぼすＴ細胞アネルギーのモデルは、２つの広いカテゴリーに分類される。１つは、クローンアネルギーであり、主に増殖停止状態であるが、他方は、適応耐性またはｉｎ  ｖｉｖｏアネルギーであり、増殖およびエフェクター機能のより一般的な阻害を表す（例えば、Schwartz  RH.  Annu  Rev  Immunol.  ２００３年；２１巻：３０５〜３４頁を参照されたい）。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、用語「免疫モジュレーター」は、免疫系を調節することができるＧＳ−ＴＣＡＡを用いて同定された任意の分子を指す。例えば、本発明のアレイおよび方法によって同定された免疫モジュレーターは、Ｔ細胞活性を調節する分子である。例えば、免疫モジュレーターは、Ｔ細胞活性を上昇させ得るか、またはＴ細胞活性を低下させ得る。免疫モジュレーターは、自己免疫疾患および／またはがんを治療するために使用され得る。
【００６０】
本明細書で使用される場合、用語「免疫モジュレーターの調節物質」は、上に記載のような免疫モジュレーターの発現および／または活性を調節することができる任意の薬剤を指す。免疫モジュレーターの調節物質は、免疫モジュレーターの発現および／または活性を上昇または低下させることができる。一実施形態では、免疫モジュレーターの調節物質は、免疫モジュレーターに直接作用し、例えば、それは免疫モジュレーターに結合し、その機能を活性化または阻害させる抗体である。免疫モジュレーターの調節物質もまた、自己免疫疾患および／またはがんを治療するために使用され得る。
【００６１】
用語「培養する」は、様々な種類の培地上または培地中の細胞または生物体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を指す。培地中で増殖された細胞の子孫は、親細胞と完全に同一ではない（すなわち、形態学的に、遺伝的に、または表現型的に）ことがあり得ることは理解される。
【００６２】
本明細書で使用する用語「相互作用する」は、例えば蛍光ベースの検出方法、酵母ツーハイブリッドアッセイ、クロマチン免疫沈降、または共免疫沈降を用いて検出することができるような、分子間の検出可能な相互作用を含むことが意味される。用語「相互作用する」は、分子間の「結合」相互作用を含むこともまた意味する。相互作用は、実際には、タンパク質−タンパク質またはタンパク質−核酸であり得る。
【００６３】
用語「トランスフェクション」は、核酸、タンパク質または他の巨大分子が発現されるかまたは細胞内で生物学的機能を有するように、核酸、タンパク質または他の巨大分子の標的細胞への送達を意味するために、本明細書において使用される。
【００６４】
用語「蛍光」は、より短い波長の光子の分子吸収によって引き起こされる光の放出である「蛍光」（または「フォトルミネッセンス」）を発することができる任意の物質または薬剤を指す。したがって、蛍光は、フルオロフォアから発するより長い波長の蛍光「発光」とは異なる「励起光源」に依存する。蛍光発光を検出するためには、発光にのみ応答し、励起光には応答しない検出器が必要である。
ＩＩ．ゲノムスケールのＴ細胞活性アレイ（ＧＳ−ＴＣＡＡ）
【００６５】
一態様では、本発明は、ゲノムスケールのＴ細胞活性アレイ（ＧＳ−ＴＣＡＡ）を特徴とする。本発明のアレイは、複数のウェルを含む固体支持構造体を含み、複数のウェルのそれぞれは、第１の細胞および第２の細胞を含む。第１の細胞は、膜結合抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片を発現し、複数のヒト膜遺伝子のうちの１つによってコードされたタンパク質の第１の細胞上での提示が可能になるように、複数のヒト膜遺伝子をコードするｃＤＮＡライブラリーでトランスフェクトもされている。第２の細胞は、第１の細胞上に提示される抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片と相互作用する受容体をその細胞表面上に発現し、第２の細胞の活性を刺激する一次シグナルを提供する。さらに、第２の細胞はレポーター遺伝子を発現し、レポーター遺伝子の発現レベルの上昇が、第１の細胞にトランスフェクトされた複数のヒト膜遺伝子のうちの１つによってコードされる提示されたタンパク質が刺激性共シグナル伝達分子として作用し、第２の細胞株の活性を刺激することを示し、レポーター遺伝子の発現レベルの低下が、複数のヒト膜遺伝子のうちの１つによってコードされる提示されたタンパク質が阻害性共シグナル伝達分子として作用し、第２の細胞株の活性を阻害することを示す。
【００６６】
本発明で使用される固体支持構造体は、培養細胞を保持し、増殖を可能にさせることに適した任意の支持体であり得る。固体支持体として使用されるために適した材料には、プラスチック、ガラス、ポリマー、金属などが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、固体支持体はマルチウェルプレートである。本発明において有用なマルチウェルプレートは、例えば、４ウェルプレート、６ウェルプレート、２４ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、および１５３６ウェルプレートのような、種々の標準的なフォーマットのいずれかであってよい。あるいは、本発明で使用されるマルチウェルプレートは、例えば、少なくとも５００個、少なくとも１０００個、少なくとも１５００個または少なくとも２０００個のウェルを有するプレートのような非標準フォーマットであってよい。
【００６７】
本発明のアレイにおける使用に適した細胞には、真核細胞および原核細胞の全てのタイプが含まれる。好ましい実施形態では、細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、本発明のアレイに使用される細胞は、少なくとも１つの異種核酸配列を用いて形質転換された細胞のような、遺伝子操作された細胞である。そのような核酸分子は、Ｔ細胞受容体または任意のヒト膜タンパク質をコードし得る。遺伝子操作された細胞は、複数の異種核酸配列を含むことができる。本明細書に記載の核酸配列または分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはハイブリッドまたはＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかの誘導体であり得る。本発明のアレイにおいて使用するための核酸分子は、核酸分子（例えば、転写または翻訳制御領域）、完全長または部分コード領域、およびそれらの組合せの発現を制御する調節領域を含むことができる。核酸分子の任意の部分は：（１）その天然の環境から分子を単離すること；（２）組換えＤＮＡ技術（例えば、ＰＣＲ増幅、クローニング）を用いること；または（３）化学合成法を用いることにより、生産することができる。遺伝子は、例えば、その遺伝子によってコードされる細胞表面受容体の産生を制御する制御領域（例えば、転写、翻訳または翻訳後制御領域のような、ただしこれに限定されない）ならびにコード領域自体のような天然の細胞表面受容体遺伝子に関連する全ての核酸配列を含む。
【００６８】
核酸分子には、タンパク質をコードする天然核酸分子の機能的等価物またはタンパク質により結合させることができる天然核酸配列の機能的等価物を含むことができる。天然の核酸分子の機能的等価物には、そのような配列にコードされる産物の機能に悪影響を及ぼすことなく、ヌクレオチドがそのような分子に挿入、欠失、置換および／または逆位された、天然の対立遺伝子変異体および修飾核酸分子を含むことができるが、それに限定されない。一部の実施形態では、核酸はヒト膜タンパク質をコードする。一部の実施形態では、核酸はレポーター遺伝子である。
【００６９】
本発明のアレイにおける使用に適した細胞への異種の核酸分子（例えば、異種の細胞表面受容体をコードする核酸分子）の形質転換は、そのことにより遺伝子を細胞に挿入することができる任意の方法によって達成することができる。形質転換技術には、トランスフェクション、レトロウイルス感染、エレクトロポレーション、リポフェクション、細菌輸送およびスフェロプラスト融合が含まれるが、これらに限定されない。本発明のアレイの使用に適した細胞に形質転換された核酸分子は、染色体外ベクター（一過性トランスフェクション）上に残るか、または細胞ゲノムに組み込まれ得る（安定なトランスフェクション）。安定な細胞株を生成するために、目的の遺伝子および適切なウイルス転写プロモーターを、抗生物質、例えばネオマイシンのような増殖抑制化合物に対する耐性を付与する選択マーカーを含む、プラスミドまたはレトロウイルスのような適切なベクターに挿入する。ＤＮＡ構築物は、細胞に導入され、宿主細胞株のゲノムに安定に組み込まれて、操作された細胞が耐性である適切な抗生物質の存在下で選択的に培養され得る安定な細胞株を提供する。あるいは、アデノウイルスベクターを用いて、宿主細胞の一過性形質導入を適切に行うことができる。ベクターＤＮＡ分子は宿主クロマチンへ組み込まれないが、細胞型に依存して典型的に２４〜９６時間の寿命を有する染色体外分子として存在する。
【００７０】
細胞内での本発明の核酸分子の発現は、当業者に公知の技術を用いて達成することができる。簡潔には、核酸分子は、遺伝子が宿主細胞に形質転換された時に、遺伝子の構成的発現または調節発現のいずれかが可能であるように、核酸分子が転写制御配列に作動可能に連結される様式で発現ベクターに挿入される。本明細書で使用される語句「組換え分子」は、発現ベクター上の少なくとも１つの転写制御配列に作動可能に連結された遺伝子を指す。本明細書で使用される語句「発現ベクター」は、宿主細胞を形質転換することができ、宿主細胞内で複製することができ、作動可能に連結された遺伝子の発現に影響を及ぼすことができるＤＮＡまたはＲＮＡベクターを指す。発現ベクターは、その固有の特性に依存して、高いかまたは低いコピー数のいずれかに複製することができる。産生されるタンパク質の量を制御することができる転写制御配列には、転写の開始、伸長および終結を制御する配列が含まれる。特に重要な転写制御配列は、プロモーターおよび上流活性化配列のような転写開始を制御するものである。
【００７１】
発現システムは、当業者に公知の方法を用いて核酸配列に作動可能に連結された任意の公知の制御エレメントから構築することができる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Sambrookら、１９８９年、Molecular  Cloning:A  Laboratory  Manual，Cold  Spring  Harbor  Labs  Pressを参照されたい。
【００７２】
好ましい実施形態では、複数のヒト膜遺伝子が、これらの遺伝子が発現され、細胞表面上に個別に提示され得るように、第１の細胞にトランスフェクトされる。このことを達成するために、実施例のセクションに記載の最適化された逆転写プロトコールを使用してもよい。あるいは、遺伝子の発現および個々の提示は、レトロウイルス形質導入、レンチウイルス形質導入、リポフェクションおよびＣＲＩＳＰＲを含むが、これらに限定されない任意の公知の遺伝子導入技術によって達成され得る。
【００７３】
本発明の固体支持構造体中の第１の細胞は、ヒト膜遺伝子、例えばヒト２９３Ｔ細胞のトランスフェクションおよび発現に適した当技術分野で公知の任意の標準的細胞であり得る。あるいは、第１の細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。第１の細胞の他の例は、ＣＯＳ−７細胞である。好ましい実施形態では、第１の細胞は、免疫関連アダプターを発現するヒト２９３Ｔ．２Ａ細胞である。免疫関連アダプターの例としては、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＲγおよびＣＤ３Ｅが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の第２の細胞は、その活性が第１の細胞上に提示されるタンパク質との相互作用により調節される免疫細胞である。一部の実施形態では、本発明のアレイにおける第２の細胞は免疫細胞、例えば、Ｔ細胞である。例示的なＴ細胞には、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞、消耗Ｔ細胞、アネルギーＴ細胞および制御性Ｔ細胞が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、第２の細胞は、骨髄由来サプレッサー細胞であってもよい。
【００７４】
一部の実施形態では、本発明のアレイにおける第２の細胞は、細胞アッセイセンサーまたは、例えば、細胞アッセイの読み取り値を提供するために、蛍光タンパク質もしくは酵素を発現するレポーター遺伝子のような検出可能なレポーターを安定に発現するように操作される。一部の実施形態では、レポーター遺伝子は、レポーター遺伝子の発現を駆動する誘導性転写制御エレメントを含む構築物の中に含まれる。一部の実施形態では、レポーター構築物は細胞毒性関連レポーター構築物である。他の実施形態では、レポーター構築物は、アポトーシス関連レポーター構築物である。さらに別の実施形態では、レポーター構築物は、増殖関連レポーター構築物である。
【００７５】
レポーター遺伝子技術は、シグナル伝達および遺伝子発現に関与する細胞事象をモニターするために広く使用される。本発明の文脈において、レポーター遺伝子という用語は、バックグラウンドに対して簡単に区別することができる容易に測定可能な表現型を用いて、例えばＴ細胞のような細胞の活性に対するヒト膜遺伝子の効果の検出を可能にする遺伝子を指すために使用される。レポーター遺伝子構築物は、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現のためのＴ細胞関連転写応答エレメントを使用して、レポーター遺伝子の発現を駆動する誘導性転写制御エレメントを含む。例示的なＴ細胞関連転写応答エレメントには、ＮＦ−ｋＢ、ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ−１、ＥＧＲ２、ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋが含まれるが、これらに限定されない。本発明のアレイに使用するのに適したレポーター遺伝子には、酵素、蛍光タンパク質、光タンパク質、融合タンパク質およびエピトープタグが含まれるが、これらに限定されない。酵素レポーター遺伝子の例には、ベータ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ラクタマーゼ、ルシフェラーゼおよびニトロ還元酵素が含まれるが、これらに限定されない。蛍光タンパク質の例としては、オワンクラゲ（Aequorea  victoria）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびその変異体（例えば、シアン蛍光タンパク質および黄色蛍光タンパク質）が挙げられるが、これらに限定されない。好適な光タンパク質としては、エクオリンが挙げられるが、これに限定されない。あるいは、本発明のレポーター遺伝子は、サイトカイン遺伝子である。例示的なサイトカイン遺伝子には、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファおよびＩＬ−１０が含まれるが、これらに限定されない。
【００７６】
本発明に従って行い得るレポーター遺伝子アッセイの一例は、例えばＥＧＦＰ、ＹＦＰ、またはＢＦＰのようなＧＦＰまたはその任意の変異体から誘導され得る蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子の導入によって操作される細胞を使用しており（Shaner，N.Cら、Nat.Methods、２００５年、２巻（１２号）、９０５〜９頁）、核酸分子は、例えば、ＮＦ−ｋＢ、ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ−１、ＥＧＲ２、ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋを含むがこれらに限定されないＴ細胞関連転写応答エレメントのような発現制御配列に作動可能に連結され、制御される。その後、Ｔ細胞の活性を測定する手段として、ＧＦＰまたは機能的なＧＦＰアナログの蛍光放出をモニターする。本方法は、第１の細胞にトランスフェクトされた膜遺伝子の、第２の細胞の全体の活性に対する効果を検出および比較するために使用され得る。
【００７７】
本発明のアレイは、複数のヒト膜遺伝子をコードするｃＤＮＡライブラリーもまた含む。ｃＤＮＡライブラリーを生成する方法は、当技術分野で周知である。簡潔には、ｃＤＮＡライブラリーを構築するための古典的方法において、まずｍＲＮＡを特定の細胞から単離し、その後、このプロセスの連続工程において異なる酵素およびアルカリで処理する。平行して、ベクター（例えば、プラスミドｐＢＲ３２２）は、合成されたｃＤＮＡの挿入が可能なように処理される。ｃＤＮＡおよび前処理されたベクターのアニーリングの後、適した宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株）をベクター−ｃＤＮＡ構築物で形質転換し、適した基質上にプレーティングし、インキュベートする。このようにして得られた形質転換した細胞からの全てのコロニーがｃＤＮＡライブラリーを構成する（Gublerら、Gene、２５巻（２〜３号）：２６３〜２６９頁、１９８３年）。一部の実施形態では、複数のヒト膜遺伝子には、約１，０００〜７，０００の遺伝子、約２，０００〜５，０００の遺伝子、約４，０００〜７，０００の遺伝子または約１００〜５，０００の遺伝子が含まれる。例えば、複数のヒト膜遺伝子には、少なくとも約５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００または７０００個のヒト膜遺伝子が含まれる。一部の実施形態では、複数のヒト膜遺伝子には、全ヒト膜遺伝子の９０％より多くをカバーする６，０００を超えるヒト膜遺伝子が含まれる。
【００７８】
本発明のアレイにおいて使用するための膜遺伝子は、ヒト膜ゲノムの全スペクトルを表す。一部の実施形態では、膜遺伝子は受容体遺伝子である。他の実施形態では、膜遺伝子はシグナル伝達遺伝子である。さらに別の実施形態では、膜遺伝子は免疫グロブリン遺伝子である。一部の実施形態では、膜遺伝子はトランスポーター遺伝子である。
【００７９】
本発明のアレイは、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体が抗原提示細胞上で抗原／ＭＨＣ複合体と相互作用するか、またはＭＨＣ（例えば、抗ＣＤ３抗体）の背景において抗原を模倣するシグナルが起きる、細胞増殖、抑制、消耗、細胞毒性、アポトーシス、およびサイトカイン放出を含むがこれらに限定されない種々のＴ細胞活性のスクリーニングを可能にする。本明細書中で使用される場合、Ｔ細胞の「活性化」とは、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞分化、および／または細胞産物（例えば、サイトカイン）の産生をもたらす、Ｔ細胞におけるシグナル伝達経路の誘導を指す。
【００８０】
本発明によれば、本明細書に記載のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、具体的にはＴ細胞の抗原受容体を指す。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４５、ＣＤ４３およびＴｈｙ−１を含むがこれらに限定されない、Ｔ細胞応答において重要であり、Ｔ細胞によって発現される種々の他の受容体があることが当技術分野において認識されている。Ｔ細胞受容体は、Ｔ細胞受容体をコードする天然に存在する遺伝子および／または細胞に形質転換された異種の核酸分子の発現によって産生することができる。同様に、本明細書に記載の膜タンパク質は、天然に存在する遺伝子の発現によって、および／または細胞に形質転換された異種の核酸分子の発現によって、細胞中で産生され得る。
【００８１】
本発明のアレイにおいて、第１の細胞（例えば、抗原提示細胞として働くヒト２９３Ｔ．２Ａ細胞）を、第２の細胞と（例えば、Ｔ細胞）、細胞が生存細胞として維持される条件（例えば、培養培地、温度、酸素、ＣＯ２、インキュベーション時間）で培養し、他の細胞と相互作用させてシグナル伝達経路を活性化させる。このように、細胞は、炭素、窒素および微量栄養素のような細胞増殖に必要な成分を含む任意の適した培地内で培養することができる。そのような細胞のために適した培養培地および増殖条件の決定は、十分に当業者の技術範囲内である。
ＩＩＩ．ゲノムスケールのＴ細胞活性アレイ（ＧＳ−ＴＣＡＡ）を作製する方法
【００８２】
本発明はまた、ゲノムスケールのＴ細胞活性アレイ（ＧＳ−ＴＣＡＡ）を作製する方法を提供する。本方法は、複数のウェルを含む固体支持構造体を提供することを含み、複数のウェルのそれぞれは、第１の細胞および第２の細胞を含む。第１の細胞は、膜結合抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片を安定に発現するようにトランスフェクトされる。第２の細胞は、第１の細胞上に提示された抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片と相互作用する細胞表面上の受容体を発現し、第２の細胞の活性を刺激する一次シグナルを提供する。本発明の方法はまた、膜結合抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片を発現する第１の細胞を、複数のウェルのそれぞれに培養するステップ；複数のヒト膜遺伝子のうちの１つによってコードされるタンパク質の第１の細胞上への提示が可能になるように、複数のヒト膜遺伝子をコードするｃＤＮＡライブラリーで第１の細胞をトランスフェクトするステップ；および細胞表面上の受容体およびレポーター遺伝子を発現する第２の細胞を用いて複数のウェルのそれぞれに共培養するステップを含む。第２の細胞はレポーター遺伝子を発現し、レポーター遺伝子の発現レベルの上昇が、第１の細胞にトランスフェクトされた複数のヒト膜遺伝子の１つによってコードされる提示されたタンパク質が、刺激性共シグナル伝達分子として作用し、第２の細胞の活性を刺激することを示し、レポーター遺伝子の発現レベルの低下が、複数のヒト膜遺伝子のうちの１つによってコードされる提示されたタンパク質が阻害性共シグナル伝達分子として作用し、第２の細胞の活性を阻害することを示す。
【００８３】
本発明の方法において使用される固体支持構造体は、上に記載のように、培養細胞を保持し、増殖することを可能にさせるのに適した任意の支持体であり得る。一実施形態では、固体支持体はマルチウェルプレートである。本発明において有用なマルチウェルプレートは、例えば、４ウェルプレート、６ウェルプレート、２４ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、および１５３６ウェルプレートのような種々の標準的なフォーマットのいずれかであり得る。あるいは、本発明で使用されるマルチウェルプレートは、例えば、少なくとも５００個、少なくとも１０００個、少なくとも１５００個または少なくとも２０００個のウェルを有するプレートのような、非標準フォーマットであり得る。
【００８４】
本発明の方法における使用に適した細胞には、上に記載のような全てのタイプの真核細胞および原核細胞が含まれる。好ましい実施形態では、細胞は真核細胞、特には、哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、本発明の方法で使用される細胞は、少なくとも１つの異種の核酸配列で形質転換された細胞のような遺伝子操作された細胞である。そのような核酸分子は、Ｔ細胞受容体、ヒト膜タンパク質、またはレポーターをコードすることができる。そのような核酸分子は、当技術分野で公知の任意の分子生物学技術、またはセクションＩＩにおいて上に記載した任意の方法によって産生され得る。
【００８５】
本発明の方法における使用に適した細胞へのこのような異種の核酸分子（例えば、異種の膜タンパク質をコードする核酸分子）の形質転換は、上に記載のように、遺伝子を細胞に挿入することができる任意の方法によって達成できる。好ましい実施形態では、複数のヒト膜遺伝子が、これらの遺伝子が発現され、細胞表面上に個別に提示されるように、第１の細胞にトランスフェクトされる。このことを達成するために、実施例のセクションに記載の最適化された逆転写プロトコールを使用してもよい。あるいは、遺伝子の発現および個々の提示は、レトロウイルス形質導入、レンチウイルス形質導入、リポフェクションおよびＣＲＩＳＰＲを含むが、これに限定されない任意の公知の遺伝子導入技術によって達成し得る。
【００８６】
本発明の固体支持構造体中の第１の細胞は、例えばヒト２９３Ｔ細胞のようなヒト膜遺伝子のトランスフェクションおよび発現に適した当技術分野で公知の任意の標準的細胞であり得る。あるいは、第１の細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。第１の細胞の別の例は、ＣＯＳ−７細胞である。好ましい実施形態では、第１の細胞は、免疫関連アダプターを発現するヒト２９３Ｔ．２Ａ細胞である。免疫関連アダプターの例としては、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＲγおよびＣＤ３Ｅが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の第２の細胞は、その活性が第１の細胞上に提示されるタンパク質との相互作用により調節される免疫細胞である。一部の実施形態では、本発明の方法における第２のものは免疫細胞、例えばＴ細胞である。例示的なＴ細胞には、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞、消耗Ｔ細胞、アネルギーＴ細胞および制御性Ｔ細胞が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、第２の細胞は、骨髄由来サプレッサー細胞であってもよい。
【００８７】
一部の実施形態では、本発明の方法における第２の細胞は、細胞アッセイセンサーまたは検出可能なレポーター、例えば、蛍光タンパク質または酵素を発現するレポーター遺伝子を安定に発現するように操作され、細胞アッセイの読み取り値を提供する。一部の実施形態では、レポーター遺伝子は、レポーター遺伝子の発現を駆動する誘導性転写制御エレメントを含む構築物に含まれる。一部の実施形態では、レポーター構築物は、細胞毒性関連レポーター構築物である。他の実施形態では、レポーター構築物は、アポトーシス関連レポーター構築物である。さらに別の実施形態では、レポーター構築物は、増殖関連レポーター構築物である。
【００８８】
Ｔ細胞の活性に対するヒト膜遺伝子の効果を検出するために使用されるレポーター遺伝子は、当技術分野で公知の任意の標準的方法によって生成することができる。上に記載のように、レポーター遺伝子構築物は、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現のためのＴ細胞関連転写応答エレメントを使用して、レポーター遺伝子の発現を駆動する誘導性転写制御エレメントを含む。例示的なＴ細胞関連転写応答エレメントには、ＮＦ−ｋＢ、ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ−１、ＥＧＲ２、ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋが含まれるが、これらに限定されない。本発明に適したレポーターには、酵素、蛍光タンパク質、光タンパク質、融合タンパク質およびエピトープタグが含まれるが、これらに限定されない。酵素レポーターの例には、ベータ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ラクタマーゼ、ルシフェラーゼおよびニトロ還元酵素が含まれるが、これらに限定されない。蛍光タンパク質の例には、オワンクラゲ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびその変異体（例えば、シアン蛍光タンパク質および黄色蛍光タンパク質）が含まれるが、これらに限定されない。適した光タンパク質には、エクオリンが含まれるが、これに限定されない。あるいは、本発明のレポーター遺伝子は、サイトカイン遺伝子である。例示的なサイトカインには、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファおよびＩＬ−１０が含まれるが、これらに限定されない。
【００８９】
本発明の方法において、第１の細胞（例えば、抗原提示細胞として働くヒト２９３Ｔ．２Ａ細胞）は、第２の細胞（例えば、Ｔ細胞）と共に培養される。用語「培養する」は、様々な種類の培地上または培地中の細胞または生物体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を指す。培養中で増殖させた細胞の子孫は、親細胞と完全に同一ではない（例えば、形態学的に、遺伝的に、または表現型的に）ことがあり得ることは、理解される。細胞は、そのような細胞が生存細胞として維持することができ、他の細胞と相互作用してシグナル伝達経路を活性化することができる条件（例えば、培養培地、温度、酸素、ＣＯ２、インキュベーション時間）下で培養する。したがって、細胞は、炭素、窒素および微量栄養素のような細胞成長に必要な成分を含む任意の適した培養培地で培養することができる。そのような細胞に適した培養培地および増殖条件の決定は、十分に当業者の範囲内である。
【００９０】
本発明の方法において使用される細胞は、種々の培地中で培養されてもよい。Ｈａｍ'ｓ  Ｆ１０（商標）（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（商標）（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（商標）（ＤＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）のような市販の培地が、細胞培養に適している。さらに、Hamら、Meth.Enz.  ５８巻：４４頁（１９７９年）、Barnesら、Anal.Biochem.  １０２巻：２５５頁（１９８０年）、米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第４，５６０，６５５号；もしくは第５，１２２，４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；または米国特許第Ｒｅ．３０，９８５号は、細胞の培養培地として使用してもよく、その教示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。これらの培地のいずれかには、必要に応じて、（インスリン、トランスフェリンまたは上皮増殖因子のような）ホルモンおよび／または他の成長因子、（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸のような）塩、（ＨＥＰＥＳのような）緩衝液、（アデノシンおよびチミジンのような）ヌクレオチド、（ゲンタマイシン薬物のような）抗生物質、（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）微量元素、ならびにグルコースまたは同等のエネルギー源を補充してもよい。他の必要な栄養補助剤もまた、当業者に公知の適切な濃度で含まれていてもよい。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明らかであろう。
ＩＶ．ゲノムスケールのＴ細胞活性アレイ（ＧＳ−ＴＣＡＡ）を用いたスクリーニングアッセイ
【００９１】
本発明は、自己免疫疾患および／またはがんの治療における潜在的な治療の用途を有し得る免疫モジュレーターを同定する方法もまた提供する。本方法は、セクションＩＩに記載されるゲノムスケールのＴ細胞活性アレイ（ＧＳ−ＴＣＡＡ）を提供するステップ、第１の細胞中の複数のヒト膜遺伝子のうちの１つを発現させるステップ；第１の細胞と第２の細胞とを共培養するステップ；第２の細胞におけるレポーター遺伝子の発現レベルを検出するステップ；レポーター遺伝子の発現レベルと対照の第２の細胞中のレポーター遺伝子の発現レベルとを比較するステップであって、対照の第２の細胞が複数のヒト膜遺伝子の１つでトランスフェクトされていない対照の第１の細胞と共培養されているステップを含む。レポーター遺伝子の発現レベルの上昇が、複数のヒト膜遺伝子のうちの１つによってコードされる提示されたタンパク質が刺激性共シグナル伝達分子として作用し、第２の細胞株の活性を刺激することを示し、レポーター遺伝子の発現レベルの低下が、複数のヒト膜遺伝子のうちの１つによってコードされた提示されたタンパク質が阻害性共シグナル伝達分子として作用し、第２の細胞株の活性を阻害することを示す。
【００９２】
最適なＴ細胞活性化には、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介する抗原特異的一次シグナルおよび二次シグナル伝達に関わる共シグナル伝達の両方が必要である。一実施形態では、本発明の方法によって同定される免疫モジュレーターは、免疫系、特にＴ細胞活性を調節する。例えば、免疫モジュレーターは、Ｔ細胞活性を調節する共シグナル伝達分子であり得る。一部の実施形態では、免疫モジュレーターはＴ細胞活性を活性化する。他の実施形態では、免疫モジュレーターはＴ細胞活性を阻害する。さらに他の実施形態では、免疫モジュレーターは、自己免疫疾患および／またはがんを治療するために使用してもよい。
【００９３】
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＦＯＬＨ１、ＦＡＳ、ＩＬ３ＲＡ、ＣＤ２４８、ＴＨＢＤ、Ｂ７．１、ＧＪＢ１、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬおよびＢ７．２からなる群から選択され、免疫モジュレーターはＴ細胞活性を上昇または増強させる。あるいは、免疫モジュレーターは、ＦＬＴ１、ＣＸＣＲ６、ＳＥＭＡ６ａ、ＲＨＣＥ、ＦＣＲＬＡ、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＳＥＣ２２ｂ、Ｂ３ＧＮＴ１、ＮＦＡＭ１．ＬＹ６およびＧＰ１ＢＡからなる群から選択され、ここで免疫モジュレーターはＴ細胞活性の阻害効果を示す。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＦＬＴ１、ＳＥＭＡ６ａ、ＳＥＣ２２ｂおよびＧＰ１ＢＡからなる群から選択される。
【００９４】
本発明は、多くの薬物同定および発見スキーム、好ましくはハイスループットスクリーニングフォーマットにおける使用に適した、広い細胞ベースのスクリーニングアプローチを提供する。自動ハイスループットスクリーニングは、例えば、Burbaumら、１９９７年、Current  Opinion  in  Chemical  Biology、１巻：７２〜７８頁；およびSchullekら、１９９７年、Analyt.  Biochem.  ２４６巻：２０〜２９頁に記載されている。一部の実施形態では、本発明の方法は、ロボット工学、例えばロボット液体ハンドリングシステムを使用して実施される。非限定的な例として、本発明に記載のハイスループットスクリーニングにおいては、液体ハンドリング操作を、ロボットＴｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  ＥＶＯ２００液体ハンドリングプラットフォームによって行うことができる。スクリーニングに必要な他の装置（例えば、インキュベーター、プレート洗浄機、プレートハンドリングシステム、プレートリーダー）は、必要に応じて自動機能に適合させることができるか、または自動モジュールとして商業的に購入することができる。例えば、自動プレートハンドリングシステム（Ｍａｔｒｉｘ  ＰｌａｔｅＭａｔｅ  Ｐｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、アッセイを通して試料の移動を行うことができる。
【００９５】
本明細書中で使用される場合、「ハイスループットスクリーニング」は、同時にスクリーニングされる複数の候補薬剤、試料または試験化合物を提供するアッセイを指す。そのようなアッセイの例としては、少量の試薬および試料を用いて多数のアッセイを同時に実行できるため、特に便利なマイクロタイタープレートの使用を含み得る。本発明の方法は、９６ウェル、３８４ウェルおよび１５３６ウェルのフォーマットを含むがこれらに限定されないマルチウェルフォーマットにおいて容易に実行され、自動化される。
【００９６】
一部の実施形態では、本発明のアッセイは、スペクトル（例えば、蛍光）特性の変化を検出するために細胞上で顕微鏡画像を用いて実行される。他の実施形態では、アッセイはマルチウェルフォーマットで実行され、スペクトル特性はマイクロプレートリーダーを使用して決定される。本発明の方法における使用に適した装置は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（ＦＬＥＸｓｔａｔｉｏｎ（商標）マイクロプレートリーダーおよび流体輸送システムまたはＦＬＩＰＲ（商標）システム）、Ｈａｍａｍａｔｓｕ（ＦＤＳＳ６０００）、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣｅｌｌＬｕｘ（商標））、「ＶＩＰＲ」電圧イオンプローブリーダー（Ａｕｒｏｒａ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州、米国）およびＩｎＣｅｌｌ  Ｉｍａｇｅｒ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）などから市販されている。一部の実施形態では、本発明の方法において使用するためのＧＦＰ検出装置は、ＩｎＣｅｌｌ  Ｉｍａｇｅｒである。他の実施形態では、本発明の方法の画像分析は、Ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒソフトウェアを使用して実行される。
【００９７】
統合した液体ハンドリングを有するいくつかの市販の蛍光イメージングシステムが市販されている。これらには、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＣｅｌｌＬｕｘ−Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ＷｏｒｋｓｔａｔｉｏｎおよびＨａｍａｍａｔｓｕ  ＦＤＳＳ６０００  Ｓｙｓｔｅｍが含まれるが、これらに限定されない。励起／発光特性は、蛍光体ごとに異なり、したがって、それぞれのアッセイについて選択されたフルオロフォアを検出するように機器が構成される。適切なフルオロフォアの選択およびそれぞれの実験について選択されたフルオロフォアを検出するための機器の構成は、当業者の技術範囲内である。
【００９８】
本発明の方法における使用に適した細胞イメージングのための構成は、コンピュータシステムを備えた顕微鏡の使用を含み得る。コンピュータは、パラメータフィールドのセットへのユーザー入力の形態であるか、または例えば様々な異なる特定の操作のために予めプログラムされているような、予めプログラムされた命令の形態の、ユーザーの指示を受け取るための適切なソフトウェアを含むことができる。ソフトウェアは、場合によって、これらの命令を（例えば、流体ハンドリングエレメント、ロボットエレメントおよび／またはレーザを制御するための）システムの構成要素の操作を制御するための適切な言語に変換する。また、コンピュータは、例えば、検出器からのような他のシステムの構成要素からデータを受け取ることができ、データを解釈することができ、人間が読める形式でユーザーに提供したり、そのデータを使用して、ユーザーによる任意のプログラミングに従って、さらなる操作を開始することができる。そのような構成の一例である、Ｃａｒｌ  ＺｅｉｓｓからのＡＴＴＯのＡｔｔｏｆｌｕｏｒ（商標）ＲａｔｉｏＶｉｓｉｏｎ（商標）リアルタイムデジタル蛍光分析器は、生存細胞および調製標本における蛍光プローブの分析のための完全に統合された作業ステーションである（ＡＴＴＯ、ロックヴィル、メリーランド州）。
【００９９】
潜在的な治療用免疫モジュレーターが本発明の方法およびアレイに基づいて同定された後、検証のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデル分析を探求することができる。一部の実施形態では、本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイ、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ、受容体アレイアッセイ、バイオインフォマティクスアッセイ、またはそれらの組合せからなる群から選択されるアッセイとともに、ゲノムスケールのＴ細胞活性アレイを実行することを含む。
【０１００】
本発明の方法における使用に適したｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイとしては、増殖アッセイ、アポトーシスアッセイまたはサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−２またはＩＬ−１０）放出アッセイが含まれるが、それに限定されない、当技術分野で公知の任意の標準的Ｔ細胞アッセイが含まれる。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイには、複数のヒト膜遺伝子の１つを発現する第２の細胞および膜結合抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片を初代Ｔ細胞とともに培養し、Ｔ細胞アッセイを実行することが含まれる。本発明の方法における使用に適した初代Ｔ細胞は、任意のタイプの初代細胞を含む。例示的な初代細胞には、ヒト初代ＣＤ８細胞またはヒト初代ＣＤ４細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０１】
本発明の方法は、受容体アレイ技術と組み合わせて実行してもよい。受容体アレイ技術は、標的タンパク質のカウンター受容体をスクリーニングするための十分に確立された技術である（Zhu  Yら、Nat  Commun、４巻：２０４３頁、２０１３年；Yao  Sら、Immunity、３４巻（５号）：７２９〜７４０頁、２０１１年）。簡潔には、受容体アレイは、複数のウェルを含む固体支持構造体を含み、複数のウェルのそれぞれが、受容体タンパク質をコードする遺伝子でトランスフェクトされた細胞を含む。標的遺伝子（分泌タンパク質をコードする）または標的遺伝子の細胞外ドメイン（膜貫通タンパク質、例えば免疫モジュレーターをコードする）は、タグ遺伝子（マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ、ＦＬＡＧ、または６ｘＨＩＳ）に遺伝的に融合させ、以前に記載されたように（Chapoval,  AI.ら、Mol  Biotechnol  ２１巻（３号）：２５９〜２６４頁、２００２年）融合遺伝子を調製する。個々の融合遺伝子の２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションに際して、精製組換え融合タンパク質を用いて受容体アレイに対してスクリーニングする。タグに対する蛍光標識二次抗体を適用して、標的タンパク質、例えば、本発明の方法に基づいて同定された免疫モジュレーターの、トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞への結合を検出し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ８２００細胞検出システムでスクリーニングし、ＣＤＳ  ８２００ソフトウェアで分析する。前述の参考文献の内容の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０２】
本発明の方法によって同定された免疫モジュレーターの治療可能性は、例えば、免疫疾患またはがんの動物モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏでさらに試験することができる。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは、自己免疫疾患またはがんの動物モデルに免疫モジュレーターを投与することを含む。本発明の方法における使用に適した自己免疫疾患またはがんのための動物モデルには、例えば、ヒトメラノーマ細胞および腫瘍反応性Ｔ細胞を用いて注射されたＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒガンマｎｕｌｌマウスモデルのような、当技術分野で公知の自己免疫疾患またはがんのための任意のタイプの動物モデルが含まれる。他の実施形態では、動物モデルはマウスモデルである。あるいは、動物モデルは、ラットモデル、ウサギモデル、またはサルモデルである。別の実施形態では、動物モデルはヒト化マウスモデル、例えば免疫患者由来異種移植（免疫ＰＤＸ）モデルである。
【０１０３】
本発明の方法はまた、バイオインフォマティクス分析と組み合わせて実行してもよい。自己免疫疾患およびがんに関与する遺伝子を絞り込むために、バイオインフォマティクスアプローチを利用することができる。疾患の進行中に有意に変化し、疾患の病因の潜在的なシグネチャー遺伝子である遺伝子を同定するために複数の厳格な基準が選択される。一実施形態では、ランキングシステムは、特定の自己免疫疾患またはがんにおいてのみ調節される特定の遺伝子を同定するように設定される。あるいは、異なる自己免疫疾患またはがんの間で共通の遺伝子を選択し得る。このことを達成するために、実施例セクションに記載された特定の選択基準を使用してもよい。
Ｖ．治療の方法
【０１０４】
１つの態様では、本発明は、自己免疫疾患またはがんを、それを必要とする対象において治療する方法を提供する。本方法は、上に記載のような本発明のスクリーニング方法により同定された有効量の免疫モジュレーターを、それを必要とする対象に投与し、それにより対象における自己免疫疾患またはがんを治療することを含む。他の実施形態では、本発明のスクリーニング方法によって同定された免疫モジュレーターの調節物質の有効量は、それを必要とする対象に投与され、それにより対象における自己免疫疾患またはがんを治療する。
【０１０５】
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＦＯＬＨ１、ＦＡＳ、ＩＬ３ＲＡ、ＣＤ２４８、ＴＨＢＤ、Ｂ７．１、ＧＪＢ１、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬおよびＢ７．２からなる群から選択される。他の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＦＬＴ１、ＣＸＣＲ６、ＳＥＭＡ６ａ、ＲＨＣＥ、ＦＣＲＬＡ、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＳＥＣ２２ｂ、Ｂ３ＧＮＴ１、ＮＦＡＭ１．ＬＹ６およびＧＰ１ＢＡからなる群から選択される。
【０１０６】
本発明の方法における使用に適した免疫モジュレーターの調節物質は、上に記載のような免疫モジュレーターの発現および／または活性レベルを調節することができる任意の薬剤を含む。一部の実施形態では、免疫モジュレーターの調節物質は、免疫調節物質の発現レベルおよび／または活性レベルを上昇させる。一部の実施形態では、免疫モジュレーターの調節物質は、免疫調節物質の発現レベルおよび／または活性レベルを低下させる。一実施形態では、免疫モジュレーターの調節物質は、免疫モジュレーターに結合し、その機能を活性化または阻害する。免疫モジュレーターの例示的な調節物質には、免疫モジュレーターに特異的な抗体、もしくはその抗原結合性断片、免疫モジュレーターに特異的な小分子、および／または免疫モジュレーターに特異的に結合するアプタマーが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、免疫モジュレーターの調節物質は、自己免疫疾患および／またはがんを治療するために使用してもよい。
【０１０７】
本発明の方法に基づいて同定される免疫モジュレーターおよび／または免疫モジュレーターの調節物質は、非経口投与（例えば、注射、注入）を含む任意の適した手段によって投与することができ、皮下、腹腔内、肺内、および鼻腔内、ならびに必要に応じて局所治療のために、病変内投与によって投与されてもよい。非経口注入には、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内または皮下投与が含まれる。さらに、本発明の方法に基づいて同定された免疫モジュレーターおよび／または免疫モジュレーターの調節物質は、パルス注入によって、特に用量を減少させて適切に投与される。投薬は、静脈内注射または皮下注射のような注射によって行うことができる。投与の経路は、投与が短時間であるかまたは慢性であるかのような様々な要因に応じて選択することができる。局所投与、特に経皮投与、経粘膜投与、直腸投与、経口投与または局所投与、例えば、所望の部位の近くに配置されたカテーテルを介した投与を含む他の投与方法が企図される。注射、特に静脈注射には関心がある。
【０１０８】
一部の実施形態では、本方法は、治療有効量の本明細書に記載の免疫モジュレーターを対象に投与することを含む。一部の実施形態では、本方法は、治療有効量の免疫モジュレーターの調節物質を対象に投与することを含む。免疫モジュレーターまたは免疫モジュレーターの調節物質の治療有効量は、対象の疾患を治療するために十分な量である。本明細書に記載の免疫モジュレーターおよび／または免疫モジュレーターの調節物質の治療有効用量は、対象と対象の間でいくらか異なり、対象の年齢、体重および状態ならびに送達経路のような因子に依存するであろう。そのような用量は、当業者に公知の手順に従って決定することができる。
【０１０９】
本発明の方法で治療することができる疾患には、自己免疫疾患またはがんが含まれるが、それらに限定されない。「治療する」とは、患者、例えば疾患に罹患しているか、または疾患を発症するリスクのある患者に利益を与える任意のタイプの治療のことを指す。治療には、患者の状態（例えば、１つまたは複数の症状の緩和）の改善、疾患の発症または進行の遅延の目的のためにとられた行為と回避された行為とが含まれる。
【０１１０】
本明細書に記載されているように、「自己免疫疾患」は、体内に通常存在する物質および組織に対する身体の異常な免疫応答から生じる疾患であり、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、若年性慢性関節炎（ＪＣＡ）、甲状腺炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、強皮症、真性糖尿病、グレーブス病、アレルギー、これらに限定されないが、例えば腎臓移植、心臓移植、骨髄移植、肝臓移植、膵臓移植、小腸移植、肺移植および皮膚移植のような同種移植に伴う急性または慢性免疫疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１１】
本明細書に記載されているように、用語「がん」は、隣接する組織または身体の他の部分に広がる可能性がある、制御されていない異常な細胞増殖によって引き起こされる疾患群の１つのことを指す。がん細胞は、がん細胞が密集した固形腫瘍を形成するか、または、白血病の場合のように分散細胞として存在することができる。本発明の方法によって治療されるために適したがんのタイプには、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳ腫瘍、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、胆嚢がん、胃腸がん、腎臓がん、喉頭がんおよび下咽頭がん、白血病、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、皮膚リンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、皮膚がん、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ウォルデントロンマクログロブリン血症、ならびにウィルムス腫瘍が含まれるが、それらに限定されない。
医薬製剤
【０１１２】
本発明の方法に基づいて同定された免疫モジュレーターおよび／または本発明の免疫モジュレーターの調節物質を含む医薬製剤は、所望の純度を有するタンパク質または核酸を、保存のために、随意の生理的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合させ（Remington's  Pharmaceutical  Sciences第１６版、Osol,  A.編（１９８０年））、水溶液、凍結乾燥または他の乾燥製剤の形態で調製されてもよい。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される用量および濃度でレシピエントに無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩、ヒスチジンおよび他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンのようなアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールのような糖類；ナトリウムのような塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびに／またはＴｗｅｅｎ（商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤を含む。
【０１１３】
本明細書の製剤はまた、治療される特定の適応症に必要な２つ以上の活性化合物を含んでもよい。例えば、自己免疫疾患が治療される場合、免疫モジュレーターまたは免疫調節物質の調節物質を含む本発明の製剤は、例えばメチルプレドニゾロン（methylprednisolone）、ケナログ（kenalog）、メドロール（medrol）、プレドニゾロン（prednisolone）、コルテフ（cortef）、ヒドロコルチゾン（hydrocortisone）、コルチゾン（cortisone）、トリアムシノロン・アセトニド（triamcinolone  acetonide）、セレストン・ソルスパン（celestone  soluspan）、メチルプレドニゾロン・アセテート（methylprednisolone  acetate）、オラプレドＯＤＴ（orapred  ODT）、バリプレド２０（veripred  20）、ソル−メドロール（Solu-Medrol）またはメチルプレドニゾロンナトリウム（methylprednisolone  sodium）のような自己免疫疾患を治療することが公知の薬物と組み合わせられてもよい。がんを治療する場合、免疫モジュレーターまたは免疫調節物質の調節物質を含む本発明の製剤は、アビラテロンアセテート（Abiraterone  Acetate）、ＡＢＩＴＲＥＸＡＴＥ（メトトレキセート；Methotrexate）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（パクリタキセル（Paclitaxel）アルブミン−安定化ナノ粒子製剤）、ＡＤＣＥＴＲＩＳ（ブレンツキシマブベドチン；Brentuximab  Vedotin）、アド−トラスツズマブ・エムタンシン（Ado-Trastuzumab  Emtansine）、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（ドキソルビシン（Doxorubicin）塩酸塩）、ＡＤＲＵＣＩＬ（フルオロウラシル；Fluorouracil）、アファチニブニマレイン酸塩（Afatinib  Dimaleate）、ＡＦＩＮＩＴＯＲ（エベロリムス；Everolimus）、ＡＬＤＡＲＡ（イミキモド；Imiquimod）、アルデスロイキン（Aldesleukin）、アレムツズマブ（Alemtuzumab）、ＡＬＩＭＴＡ（ペメトレキセド二ナトリウム；Pemetrexed  Disodium）、ＡＬＯＸＩ（パロノセトロン塩酸塩；Palonosetron  Hydrochloride）、ＡＭＢＯＣＨＬＯＲＩＮ（クロラムブシル；Chlorambucil）、ＡＭＢＯＣＬＯＲＩＮ（クロラムブシル；Chlorambucil）、アミノレブリン酸（Aminolevulinic  Acid）、アナストロゾール（Anastrozole）、アプレピタント（Aprepitant）、ＡＲＥＤＩＡ（パミドロネート二ナトリウム；Pamidronate  Disodium）、ＡＲＩＭＩＤＥＸ（アナストロゾール；Anastrozole）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（エキセメスタン；Exemestane）、ＡＲＲＡＮＯＮ（ネララビン；Nelarabine）、三酸化ヒ素、ＡＲＺＥＲＲＡ（オファツムマブ；Ofatumumab）、アスパラギナーゼ・エルウィニア・クリサンテミ（Asparaginase  Erwinia  chrysanthemi）、ＡＶＡＳＴＩＮ（ベバシズマブ；Bevacizumab）、アキシチニブ（Axitinib）、アザシチジン（Azacitidine）、ベンダムスチン塩酸塩（Bendamustine  Hydrochloride）、ベバシズマブ（Bevacizumab）、ベキサロテン（Bexarotene）、ＢＥＸＸＡＲ（トシツモマブ（Tositumomab）およびＩ１３１ヨウ素トシツモマブ）、ブレオマイシン（Bleomycin）、ボルテゾミブ（Bortezomib）、ＢＯＳＵＬＩＦ（ボスチニブ（Bosutinib））、カバジタキセル（Cabazitaxel）、カボザンチニブ−Ｓ−りんご酸塩（Cabozantinib-S-Malate）、ＣＡＭＰＡＴＨ（アレムツズマブ；Alemtuzumab）、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（塩酸イリノテカン；Irinotecan  Hydrochloride）、カペシタビン（Capecitabine）、カルボプラチン（Carboplatin）、カルフィルゾミブ（Carfilzomib）、ＣＥＥＮＵ（ロムスチン；Lomustine）、ＣＥＲＵＢＩＤＩＮＥ（塩酸ダウノルビシン；Daunorubicin  Hydrochloride��、セツキシマブ（Cetuximab）、クロラムブシル（Chlorambucil）、シスプラチン（Cisplatin）、ＣＬＡＦＥＮ（シクロホスファミド）、クロファラビン（Clofarabine）、ＣＯＭＥＴＲＩＱ（カボザンチニブ−Ｓ−りんご酸塩）、ＣＯＳＭＥＧＥＮ（ダクチノマイシン；Dactinomycin）、クリゾチニブ（Crizotinib）、シクロホスファミド、ＣＹＦＯＳ（イホスファミド；Ifosfamide）、シタラビン（Cytarabine）、ダブラフェニブ（Dabrafenib）、ダカルバジン（Dacarbazine）、ＤＡＣＯＧＥＮ（デシタビン；Decitabine）、ダクチノマイシン（Dactinomycin）、ダサチニブ（Dasatinib）、ダウノルビシン（Daunorubicin）塩酸塩、デシタビン（Decitabine）、デガレリキス（Degarelix）、デニロイキン・ジフチトキス（Denileukin  Diftitox）、デノスマブ（Denosumab）、デキスラゾキサン（Dexrazoxane）塩酸塩、ドセタキセル（Docetaxel）、ドキソルビシン（Doxorubicin）塩酸塩、ＥＦＵＤＥＸ（フルオロウラシル）、ＥＬＩＴＥＫ（ラスブリカーゼ；Rasburicase）、ＥＬＬＥＮＣＥ（塩酸エピルビシン（Epirubicin））、ＥＬＯＸＡＴＩＮ（オキサリプラチン；Oxaliplatin）、エルトロンボパグ・オラミン（Eltrombopag  Olamine）、ＥＭＥＮＤ（アプレピタント；Aprepitant）、エンザルタミド（Enzalutamide）、エピルビシン（Epirubicin）塩酸塩、ＥＲＢＩＴＵＸ（セツキシマブ）、メシル酸エリブリン（Eribulin）、ＥＲＩＶＥＤＧＥ（ビスモデジブ；Vismodegib）、エルロチニブ（Erlotinib）塩酸塩、ＥＲＷＩＮＡＺＥ（アスパラギナーゼ・エルウィニア・クリサンテミ）、エトポシド（Etoposide）、エベロリムス（Everolimus）、ＥＶＩＳＴＡ（塩酸ラロキシフェン（Raloxifene））、エキセメスタン（Exemestane）、ＦＡＲＥＳＴＯＮ（トレミフェン；Toremifene）、ＦＡＳＬＯＤＥＸ（フルベストラント；Fulvestrant）、ＦＥＭＡＲＡ（レトロゾール；Letrozole）、フィルグラスチム（Filgrastim）、ＦＬＵＤＡＲＡ（フルダラビン（Fludarabine）リン酸）、フルダラビンホスフェート、ＦＬＵＯＲＯＰＬＥＸ（フルオロウラシル）、フルオロウラシル、フォリン酸（Folinic  acid）、ＦＯＬＯＴＹＮ（プララトレキサート；Pralatrexate）、フルベストラント（Fulvestrant）、ゲフィチニブ（Gefitinib）、ゲムシタビン（Gemcitabine）塩酸塩、ゲムツズマブ・オゾガミシン（Gemtuzumab  Ozogamicin）、ＧＥＭＺＡＲ（塩酸ゲムシタビン）、ＧＩＬＯＴＲＩＦ（二マレイン酸アファチニブ（Afatinib））、ＧＬＥＥＶＥＣ（メシル酸イマチニブ（Imatinib））、ＨＡＬＡＶＥＮ（メシル酸エリブリン（Eribulin））、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（トラスツズマブ；Trastuzumab）、ＨＹＣＡＭＴＩＮ（塩酸トポテカン（Topotecan））、イブリツモマブ・チウキセタン（Ibritumomab  Tiuxetan）、ＩＣＬＵＳＩＧ（塩酸ポナチニブ（Ponatinib））、イホスファミド（Ifosfamide）、メシル酸イマチニブ、イミキモド（Imiquimod）、ＩＮＬＹＴＡ（アキチニブ；Axitinib）、イントロンＡ（組換えインターフェロンアルファ−２ｂ）、ヨード１３１トシツモマブ（Tositumomab）およびトシツモマブ、イピリムマブ（Ipilimumab）、イレッサ（ゲフィチニブ；Gefitinib）、イリノテカン（Irinotecan）塩酸塩、ＩＳＴＯＤＡＸ（ロミデプシン；Romidepsin）、イクサベピロン（Ixabepilone）、ＪＡＫＡＦＩ（ルキソリチニブ（Ruxolitinib）リン酸塩）、ＪＥＶＴＡＮＡ（カバジタキセル；Cabazitaxel）、Ｋａｄｃｙｌａ（アド−トラスツズマブ・エムタンシン；Ado-Trastuzumab  Emtansine）、ＫＥＯＸＩＦＥＮＥ（塩酸ラロキシフェン（Raloxifene））、ＫＥＰＩＶＡＮＣＥ（パリフェルミン；Palifermin）、ＫＹＰＲＯＬＩＳ（カルフィルゾミブ；Carfilzomib）、ラパチニブ（Lapatinib）・ジトシレート、レナリドミド（Lenalidomide）、レトロゾール（Letrozole）、ロイコボリン（Leucovorin）カルシウム、ロイプロリド（Leuprolide）アセテート、ロムスチン（Lomustine）、ＬＵＰＲＯＮ（ロイプロリド（Leuprolide）アセテート、ＭＡＲＱＩＢＯ（ビンクリスチン（Vincristine）硫酸塩リポソーム）、ＭＡＴＵＬＡＮＥ（プロカルバジン塩酸塩）、メクロレタミン（Mechlorethamine）塩酸塩、ＭＥＧＡＣＥ（酢酸メゲストロール（Megestrol））、酢酸メゲストロール、ＭＥＫＩＮＩＳＴ（トラメチニブ；Trametinib）、メルカプトプリン、メスナ（Mesna）、ＭＥＴＨＡＺＯＬＡＳＴＯＮＥ（テモゾロマイド；Temozolomide）、メトトレキセート、マイトマイシン（Mitomycin）、ＭＯＺＯＢＩＬ（プレリキサフォール）、ＭＵＳＴＡＲＧＥＮ（メクロレタミン塩酸塩）、ＭＵＴＡＭＹＣＩＮ（マイトマイシンＣ）、ＭＹＬＯＳＡＲ（アザシチジン；Azacitidine）、ＭＹＬＯＴＡＲＧ（ゲムツズマブ・オゾガミシン；Gemtuzumab  Ozogamicin）、ナノ粒子パクリタキセル（パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子製剤）、ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（酒石酸ビノレルビン（Vinorelbine））、ネララビン（Nelarabine）、ＮＥＯＳＡＲ（シクロホスファミド）、ＮＥＵＰＯＧＥＮ（フィルグラスチム；Filgrastim）、ＮＥＸＡＶＡＲ（ソラフェニブトシレート；Sorafenib  Tosylate）、ニロチニブ（Nilotinib）、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（クエン酸タモキシフェン（Tamoxifen））、ＮＰＬＡＴＥ（ロミプロスチム；Romiplostim）、オファツムマブ（Ofatumumab）、オムアセタキシン・メプスクシネート（Omacetaxine  Mepesuccinate）、ＯＮＣＡＳＰＡＲ（ペガスパルガーゼ；Pegaspargase）、ＯＮＴＡＫ（デニロイキン・ジフチトキス；Denileukin  Diftitox）、オキサリプラチン（Oxaliplatin）、パクリタキセル（Paclitaxel）、パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子製剤、パリフェルミン（Palifermin）、パロノセトロン（Palonosetron）塩酸塩、パミドロネート（Pamidronate）二ナトリウム、パニツムマブ（Panitumumab）、パゾパニブ（Pazopanib）塩酸塩、ペガスパルガーゼ（Pegaspargase）、ペグインターフェロン（Peginterferon）アルファ−２ｂ、ＰＥＧ−イントロン（ペグインターフェロンアルファ−２ｂ）、ペメトレキセド（Pemetrexed）二ナトリウム、ペルツズマブ（Pertuzumab）、プラチノール（シスプラチン；Cisplatin）、ＰＬＡＴＩＮＯＬ−ＡＱ（シスプラチン）、プレリキサフォール（Plerixafor）、ポマリドマイド（Pomalidomide）、ＰＯＭＡＬＹＳＴ（ポマリドマイド）、ポナチニブ（Ponatinib）塩酸塩、プララトレキセート（Pralatrexate）、プレドニゾン（Prednisone）、プロカルバジン（Procarbazine）塩酸塩、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（アルデスロイキン；Aldesleukin）、ＰＲＯＬＩＡ（デノスマブ；Denosumab）、ＰＲＯＭＡＣＴＡ（エルトロンボパグオールアミン；Eltrombopag  Olamine）、ＰＲＯＶＥＮＧＥ（シプロイセル−Ｔ；Sipuleucel-T）、ＰＵＲＩＮＥＴＨＯＬ（メルカプトプリン；Mercaptopurine）、二塩化ラジウム２２３、ラロキシフェン（Raloxifene）塩酸塩、ラスブリカス（Rasburicas）、組換えインターフェロンアルファ−２ｂ、レ���ラフェニブ（Regorafenib）、ＲＥＶＬＩＭＩＤ（レナリドミド；Lenalidomide）、ＲＨＥＵＭＡＴＲＥＸ（メトトレキサート；Methotrexate）、リツキシマブ（Rituximab）、ロミデプシン（Romidepsin）、ロミプロスチム（Romiplostim）、ＲＵＢＩＤＯＭＹＣＩＮ（塩酸ダウノルビシン（Daunorubicin））、ルキソリチニブ（Ruxolitinib）リン酸塩、シプロイセル−Ｔ、ソラフェニブ（Sorafenib）トシレート、ＳＰＲＹＣＥＬ（ダサチニブ；Dasatinib）、ＳＴＩＶＡＲＧＡ（レゴラフェニブ；Regorafenib）、マレイン酸スニチニブ（Sunitinib）、ＳＵＴＥＮＴ（マレイン酸スニチニブ）、ＳＹＬＡＴＲＯＮ（ペグインターフェロンアルファ−２ｂ）、ＳＹＮＯＶＩＲ（サリドマイド；Thalidomide）、ＳＹＮＲＩＢＯ（オムアセタキシン・メプコハク酸塩；Omacetaxine  Mepesuccinate）、ＴＡＦＩＮＬＡＲ（ダブラフェニブ；Dabrafenib）、タモキシフェン（Tamoxifen）クエン酸塩、ＴＡＲＡＢＩＮＥ  ＰＦＳ（シタラビン；Cytarabine）、ＴＡＲＣＥＶＡ（エルロチニブ（Erlotinib）塩酸塩）、ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（ベキサロテン；Bexarotene）、ＴＡＳＩＧＮＡ（ニロチニブ；Nilotinib）、ＴＡＸＯＬ（パクリタキセル；Paclitaxel）、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（ドセタキセル；Docetaxel）、ＴＥＭＯＤＡＲ（テモゾロマイド；Temozolomide）、テモゾロマイド（Temozolomide）、テムシロリムス（Temsirolimus）、サリドマイド（Thalidomide）、ＴＯＰＯＳＡＲ（エトポシド；Etoposide）、塩酸トポテカン（Topotecan）、トレミフェン（Toremifene）
、ＴＯＲＩＳＥＬ（テムシロリムス；Temsirolimus）、トシツモマブ（Tositumomab）およびＩ１３１ヨードトシツモマブ、ＴＯＴＥＣＴ（塩酸デキスラゾキサン（Dexrazoxane））、トラメチニブ（Trametinib）、トラスツズマブ（Trastuzumab）、ＴＲＥＡＮＤＡ（塩酸ベンダムスチン（Bendamustine））、ＴＲＩＳＥＮＯＸ（三酸化ヒ素）、ＴＹＫＥＲＢ（ラパチニブ（Lapatinib）ジトシレート）、バンデタニブ（Vandetanib）、ＶＥＣＴＩＢＩＸ（パニツムマブ；Panitumumab）、ＶｅｌＰ、ＶＥＬＢＡＮ（硫酸ビンブラスチン（Vinblastine））、ＶＥＬＣＡＤＥ（ボルテゾミブ；Bortezomib）、ＶＥＬＳＡＲ（硫酸ビンブラスチン）、ベムラフェニブ（Vemurafenib）、ＶＥＰＥＳＩＤ（エトポシド；Etoposide）、ＶＩＡＤＵＲ（酢酸ロイプロリド（Leuprolide））、ＶＩＤＡＺＡ（アザシチジン）、ビンブラスチン（Vinblastine）硫酸塩、ビンクリスチン（Vincristine）硫酸塩、ビノレルビン（Vinorelbine）酒石酸塩、ビスモデジブ（Vismodegib）、ＶＯＲＡＸＡＺＥ（グルカピダーゼ；Glucarpidase）、ボリノスタット（Vorinostat）、ＶＯＴＲＩＥＮＴ（塩酸パゾパニブ（Pazopanib））、ＷＥＬＬＣＯＶＯＲＩＮ（ロイコボリン（Leucovorin）カルシウム）、ＸＡＬＫＯＲＩ（クリゾチニブ（Crizotinib））、ＸＥＬＯＤＡ（カペシタビン；Capecitabine）、ＸＧＥＶＡ（デノスマブ；Denosumab）、ＸＯＦＩＧＯ（ラジウム２２３二塩化物）、ＸＴＡＮＤＩ（エンザルタミド；Enzalutamide）、ＹＥＲＶＯＹ（イピリムマブ；Ipilimumab）、ＺＡＬＴＲＡＰ（Ｚｉｖ−アフリベルセプト；Ziv-Aflibercept）、ＺＥＬＢＯＲＡＦ（ベムラフェニブ；Vemurafenib）、ゼバリン（イブリツモマブ・チウキセタン；Ibritumomab  Tiuxetan）、ＺＩＮＥＣＡＲＤ（塩酸デキスラゾキサン（Dexrazoxane））、Ｚｉｖ−アフリベルセプト、ゾレドロン酸（Zoledronic  Acid）、ＺＯＬＩＮＺＡ（ボリノスタット；Vorinostat）、ＺＯＭＥＴＡ（ゾレドロン酸）、ＺＹＴＩＧＡ（酢酸アビラテロン（Abiraterone））のようながんを治療することが公知の薬剤と組み合わせてもよい。
【０１１４】
活性成分はまた、例えばコアセルベーション技術によって、または例えば、ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン−マイクロカプセル、およびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルなどの界面重合によって、それぞれ、（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセルのような）コロイド状薬物送達システム中かまたはマクロエマルジョン中に、調製されたマイクロカプセルに包装されてもよい。このような技術は、Remington's  Pharmaceutical  Sciences第１６版、Osol,  A.編（１９８０年）に開示されている。
【０１１５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通じた濾過によって容易に達成される。
【０１１６】
一般に、組成物の成分は、例えば活性剤の量を示すアンプルまたはサシェのような密封された容器中に、乾燥した凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、単位剤形で別途にまたは一緒に混合して供給される。投与様式が注入である場合、組成物は、無菌の医薬グレードの水または生理食塩水を含む注入ボトルで分配することができる。投与様式が注射である場合、投与の前に成分を混合することができるように、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。別の実施形態では、本発明の医薬組成物の１つまたは複数は、密閉した容器内に液体形態で供給され、薬剤の量および濃度を示す。
【０１１７】
活性薬剤は、典型的には注射可能な溶液として調製される、非経口投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。注射用溶液は、フリントまたはアンバーバイアル、アンプルまたは事前に満たしたシリンジ中に、液体または凍結乾燥剤形のいずれかで構成することができる。液体または凍結乾燥された投与量は、緩衝液（例えば、Ｌ−ヒスチジン、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム、塩化ナトリウム）、凍結防止剤（例えば、ショ糖トレハロースまたはラクトース）、増量剤（例えば、マンニトール）、安定化剤（例えば、Ｌ−メチオニン、グリシン、アルギニン）、アジュバント（ヒアルロニダーゼ）をさらに含んでもよい。
【０１１８】
本発明の組成物は、様々な形態であり得る。これらには、例えば、液体溶液（例えば、注射可能および注入可能な溶液）、マイクロエマルジョン、分散液、リポソームまたは懸濁液、錠剤、丸剤、散剤、リポソームおよび坐剤のような液体、半固体および固体剤形が含まれる。好ましい形態は、意図される投与様式および治療用途に依存する。典型的な投与様式には、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）注射または経口投与が含まれる。
【０１１９】
本明細書に記載の免疫モジュレーターまたは免疫モジュレーターの調節物質を含む医薬組成物は、特定の組織への投与のために製剤化されてもよい。例えば、特定の実施形態では、様々な器官における結合組織および／または腫瘍部位に、免疫モジュレーターまたは免疫モジュレーターの調節物質を投与することが望ましい場合がある。
【０１２０】
一実施形態では、本明細書に記載の治療方法は、ヒトに対して行われる。さらなる実施形態では、本明細書に記載の方法は、マウスまたは他の非ヒト動物では行われない。
【０１２１】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これは決して限定することを意図してはいない。本出願を通して引用された全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容の全体ならびに図は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１２２】
（実施例１）
ゲノムスケールのＴ細胞活性アレイ（ＧＳ−ＴＣＡＡ）の構築
将来の免疫療法の標的のヒトゲノム全域検索を行うために、ゲノムスケールのＴ細胞活性アレイを開発した。ヒト膜ゲノムの９０％をカバーする６４０２ヒト膜ｃＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して調製し、ＧＳ−ＴＣＡＡ構築のために定量し、希釈した。
【０１２３】
最適なＴ細胞活性化には、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介する抗原特異的一次シグナルと二次シグナル伝達に関与する共シグナル伝達の両方が必要である。機能性Ｔ細胞アッセイを用意するために、基底のＴ細胞活性化を刺激する人工的な抗原提示細胞株に基づく２９３Ｔ細胞を設計し、蛍光レポーターをＴ細胞活性の指標として使用した（図１Ａ）。具体的には、２９３Ｔ．２Ａ細胞を活性アレイに使用した。これらの２９３Ｔ．２Ａ細胞は、免疫関連膜遺伝子の最適な発現のための主要な免疫関連アダプター（ＤＡＰ１０／ＤＡＰ１２／ＦｃＲγ／ＣＤ３Ｅ）を発現する２９３Ｔ細胞を操作したものであった。また、ＣＤ１４  ＧＰＩアンカーに連結されたＯＫＴ−３モノクローナル抗体の膜型ｓｃｆｖである、膜結合抗ＣＤ３抗体ＳｃＦｖを発現するように、さらに２９３Ｔ．２Ａ細胞を操作した（図１Ｂ）。これらの２９３Ｔ．２Ａ／ｍ抗ＣＤ３細胞は、抗原提示細胞および個々の膜遺伝子を発現する細胞の両方として働く。
【０１２４】
ＧＦＰレポーターの制御下にある（ＮＦ−ｋｂ、ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ−１またはＥＧＲ２のような）Ｔ細胞関連転写因子応答エレメント（ＴＦＲＥ）を含むいくつかの構築物を、このアッセイのために設計し、Ｔ細胞活性の指標として使用した（図１Ｃ）。例えば、ＮＦ−ＫＢ−ＧＦＰを安定に発現するＪｕｒｋａｔ細胞株が得られた。これらの細胞は、２９３Ｔ．２Ａ細胞と共培養した場合、可視的なＧＦＰシグナルを生成しなかった。しかしながら、膜抗ＣＤ３抗体および免疫関連膜遺伝子を発現する２９３Ｔ．２Ａ細胞とオーバーナイトで共培養した後は、有意なＧＦＰシグナルが観察された（図２Ａおよび２Ｂ）。Ｊｕｒｋａｔ細胞株に加えて、ナイーブＴ細胞またはエフェクターＴ細胞、消耗、アネルギーＴ細胞またはＴｒｅｇを含む初代免疫細胞もまた含まれていた。
【０１２５】
活性アレイについての読み取りには、サイトカイン（ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファまたはＩＬ−１０）を含む、増殖関連レポーター、およびＴ細胞の細胞毒性またはアポトーシスの蛍光ベースのシグナル検出が含まれた。増殖アッセイについては、Ｔ細胞共培養の直前に２９３Ｔ．２Ａ．ｍ抗ＣＤ３細胞を照射した（１０，０００ｒａｄ）。約７２時間後、１μｌのＣＣＫ−８試薬（Ｄｏｊｉｎｄｏ）をプレートのウェルのそれぞれに入れ、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）による４５０ｎｍでの吸光度読み取りの前に２時間インキュベートした。細胞毒性アッセイについては、ＲＦＰを安定して発現する２９３Ｔ．２Ａ．ｍ抗ＣＤ３を使用した。簡潔には、ＧＳ−ＴＣＡＡプレート中の遺伝子プラスミドを、ＲＦＰを有する２９３Ｔ．２Ａ．ｍ抗ＣＤ３細胞中に逆にトランスフェクトした。２４時間後、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）キネティック・カスパーゼ−３／７アポトーシスアッセイ試薬（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＯＫＴ３前活性化またはアロＰＢＭＣ活性化（allo-PBMC  activated）ヒトＰＢＭＣをプレートに添加した。共培養後、別々の時点で、両方のＲＦＰおよびＧＦＰシグナルが、ｉｎＣｅｌｌ分析計（ＧＥ）によって検出された。Ｔ細胞アポトーシスアッセイについては、ＯＫＴ３前活性化またはアロＰＢＭＣ活性化ヒトＰＢＭＣを、ｃｅｌｌＴｒａｃｅバイオレット色素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で標識し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）キネティック・カスパーゼ−３／７アポトーシスアッセイ試薬（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と混合させ、プレートの中に入れた。ＲＦＰおよびＧＦＰの両方およびＣｅｌｌｔｒａｃｅバイオレットシグナルは、共培養後の異なる時点で、ｉｎＣｅｌｌ分析計（ＧＥ）によって検出された。Ｔ細胞の細胞毒性を（％ＲＦＰ＋ＧＦＰ＋細胞／ＲＦＰ＋細胞）により計算し、Ｔ細胞のアポトーシスを（％Ｃｅｌｌｔｒａｃｅバイオレット＋ＧＦＰ＋細胞／Ｃｅｌｌｔｒａｃｅバイオレット＋細胞）により計算した。
（実施例２）
ゲノムスケールのＴ細胞活性アレイの検出およびスクリーニング
【０１２６】
Ｔ細胞活性アレイのためのスクリーニングシステムを最適化するために、１５３６ウェルプレートにおける２９３Ｔ／ｍ抗ＣＤ３細胞のトランスフェクション効率を試験し、これら２つの細胞共培養システムにおけるＴ細胞活性に必要な最適条件が決定された。さらに、ＩｎＣｅｌｌイメージングシステムを使用したＧＦＰ検出もまた、活性アレイに対して最適化された。
【０１２７】
自動プレートハンドリングシステム（Ｍａｔｒｉｘ  ＰｌａｔｅＭａｔｅ  Ｐｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のために最適化されたプロトコールを使用して、遺伝子クローンをＧｒｅｉｎｅｒ  １５３６ウェルイメージングプレートに移した。それぞれのＧＳ−ＴＣＡＡセットは、４つの１５３６ウェルイメージングプレートを含む。アレイスクリーニングのために、これらの遺伝子が２９３Ｔ．２Ａ／ｍ抗ＣＤ３細胞の細胞表面上に個別に提示されるように、最適化された逆トランスフェクションプロトコルを利用した。ｃＤＮＡライブラリープラスミドを個別にミニプレップし、ＯｐｔｉＭＥＭ（４μｇ／ｍｌ）に希釈し、それぞれのウェル内に２００μｌのプラスミド溶液を３８４ディープウェルプレート（ＶＷＲ）に移した。様々な遺伝子を含む４つの３８４プレートからの２μｌのプラスミド溶液を、ロボット液体ハンドリングシステム（ＰｌａｔｅＭａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって低塩基１５３６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）の各ウェルに移して、受容体アレイプレートを生成した。全ヒト膜受容体アレイは、４つの１５３６ウェルプレートを含む。指定されない限り、これらの１５３６ウェルプレートは、将来の実験のためにさらにホイルし、−８０度で保存された。
【０１２８】
ゲノムスケールのＴ細胞活性アレイの準備のために、４つの１５３６ウェルプレートを含むヒト受容体アレイのセットを−８０度から取り出し、溶液が完全に解凍するまでインキュベーターに入れた。アレイプレートをスピンダウン（６００ｇ、２分）し、続いて逆トランスフェクションした。簡潔には、１５３６ウェルアレイプレートを、１ウェル当たり、ロボットディスペンサー（Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ  Ｃｏｍｂｉ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、リポフェカミン３０００（lipofecamine  3000；７μｌ  ｌｉｐｏ／ｍｌ）を含む２μｌのｏｐｔｉＭＥＭで分注し、超高速オービタルシェーカーにより１分間急速に振盪した。全てのプレートを室温で２０分間保存し、続いてＴ細胞刺激のためにＭｕｌｔｉｄｒｏｐにより２９３Ｔ．２Ａ．ｍ抗ＣＤ３細胞を添加した（１ウェル当たり４μｌ内に２０００細胞）。その後、３７度でインキュベートする前に、プレートをさらにスピンダウンして（１０００ｇ、４分）、それぞれのウェルの内の気泡を除去した。異なるＧＦＰレポーターを用いて遺伝子操作したＪｕｒｋａｔ細胞株のようなＴ細胞レポーター細胞または初代Ｔ細胞（４０００細胞）をトランスフェクションの２４時間後にアレイプレートに入れた。プレートイメージングは、Ｔ細胞と２９３ＴベースのＴ細胞刺激物質との共培養の１２時間後に、ＩｎＣｅｌｌ画像分析装置（ＧＥ）によって行った。Ｃｅｌｌｐｒｏｆｉｌｅｒソフトウェアを用いた最適化画像解析の後、潜在的な調節機能を有する遺伝子候補が同定された。例えば、分子がＴ細胞活性を調節することについて有効でない場合、ＧＦＰシグナルは類似したままである。分子がＴ細胞活性の刺激シグナルとして作用する場合、相対的に強いＧＦＰシグナルが検出される。あるいは、分子が阻害性である場合、はるかに弱いＧＦＰシグナルが観察されるだろう。図３に示されるように、２９３Ｔ．２Ａ／ｍ抗ＣＤ３細胞は単独でＴ細胞の活性化を刺激し、基底シグナルとして働く検出可能なＧＦＰシグナルを生成した。Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＯＸ４０Ｌまたは４−１ＢＢＬの発現により、蛍光シグナルが上昇したが、それは、それらのそれぞれがＴ細胞活性の刺激シグナルとして役立ったことを示す。対照的に、２９３Ｔ．２Ａ／ｍ抗ＣＤ３細胞のＢ７−Ｈ１またはＢ７−Ｈ４を用いたトランスフェクションは、蛍光シグナルの低下をもたらし、これらの分子がＴ細胞活性を阻害することを示唆した。
【０１２９】
あるいは、特定のサイトカインの放出をレポーターとして使用して、Ｔ細胞活性の指標として役立てることができる。サイトカイン検出のために、共培養の２４時間または４８時間後に上清を回収し、ＥＬＩＳＡ（ｅＢｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって定量した。図４に示すように、ＧＪＢ１およびＦＯＬＨ１の発現は、Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ放出を刺激したが、ＦＬＴ１、ＳＥＭＡ６ａ、ＳＥＣ２２ｂおよびＧＰ１ＢＡの発現は、ＩＦＮ−γ放出を減少させた。
【０１３０】
アレイスクリーニングについては、それぞれのＴ細胞レポーター細胞を三連プレートにおいてスクリーニングし、それぞれの遺伝子の平均値を計算し、アレイ中のＧＦＰ陽性対象の密度に基づいてランク付けした。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞活性に刺激機能を有する膜遺伝子でトランスフェクトされた細胞は、対照よりも高いＧＦＰの読み取り値を有し、Ｔ細胞活性に対して阻害機能を有する膜遺伝子でトランスフェクトされた細胞は、より低いＧＦＰ読み取り値をもたらした。全てのＧＦＰシグナルを、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒソフトウェア（Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）により、それぞれのウェルのＧＦＰ陽性対象および全ＧＦＰ密度の両方で正規化および定量化した。図５に示されるように、Ｔ細胞活性に対する刺激および阻害機能を有するいくつかの遺伝子が同定された。これらのＧＳ−ＴＣＡＡスクリーニングからの阻害機能を有する最上位の候補、例えばＦＬＴ１、ＳＥＭＡ６ａ、ＳＥＣ２２ｂおよびＧＰ１Ｂａを、さらなる検証のためにまとめて蓄えた。
（実施例３）
がん／自己免疫疾患を治療する可能性を有する新規な免疫調節遺伝子の検証
【０１３１】
ＧＳ−ＴＣＡＡ研究から得られた遺伝子候補の機能をさらに検証するために、初代ヒトＴ細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイが実行される。さらに、自己免疫疾患および／またはがんに関与する遺伝子を絞り込むために、バイオインフォマティクスアプローチが利用される。いくつかの最上位の遺伝子候補は、受容体アレイシステムにおける潜在的なカウンター受容体同定についてもスクリーニングされ、およびｉｎ  ｖｉｖｏ研究のために選択され、ヒト化マウスＰＤＸモデルを含むヒト化マウス疾患モデルにおけるがん／自己免疫疾患の治療可能性を試験する。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔ細胞機能アッセイ
【０１３２】
ＧＳ−ＴＣＡＡ分析から同定された最上位の遺伝子候補は、初代Ｔ細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイによって検証される。遺伝子候補を用いて２９３Ｔ．２Ａ／ｍ抗ＣＤ３細胞をトランスフェクトし、ヒト初代ＣＤ８またはＣＤ４細胞と共培養する。Ｔ細胞増殖、アポトーシス、およびサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−２またはＩＬ−１０）の放出についてのアッセイは、上に記載のように実行される。
受容体アレイ技術（ＲＡＴ）
【０１３３】
未知のカウンター受容体をスクリーニングするために、以前に記載されたように受容体アレイ技術が実行される（Zhu  Yら、Nat  Commun、４巻：２０４３頁、２０１３年；Yao  Sら、Immunity、３４巻（５号）：７２９〜７４０頁、２０１１年）。簡潔には、標的遺伝子（分泌タンパク質をコードする）または標的遺伝子の細胞外ドメイン（膜貫通タンパク質をコードする）をタグ遺伝子（マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ、ＦＬＡＧ、または６ｘＨＩＳ）と遺伝的に融合させて、以前に記載されたような融合遺伝子を調製する（Chapoval,  AI.ら、Mol  Biotechnol  ２１巻（３号）：２５９〜２６４頁、２００２年）。個々の融合遺伝子の２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションの際に、精製組換え融合タンパク質を使用して受容体アレイに対してスクリーニングする。タグに対する蛍光標識二次抗体を適用して、標的タンパク質のトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞への結合を検出し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ８２００細胞検出システムを使用してスクリーニングし、ＣＤＳ  ８２００ソフトウェアで分析する。
【０１３４】
細胞ベースのアッセイは、全てのヒト膜ｃＤＮＡのおよそ９０％をスクリーニングし、このことにより、受容体アレイ技術を使用した大規模スクリーニングおよびＴ細胞関連表面−分子相互作用のスクリーニングが可能となる。細胞ベースのハイスループットスクリーニングのための堅牢で安定したシステムが確立され、超ハイスループット受容体−リガンドスクリーニングについてのこの革新的なシステムの開発は、ロボット工学を使用することにより拡張され、受容体アレイを元の３８４ウェルプレートフォーマットから１，５３６ウェルプレートフォーマットまでに性能向上させた。
【０１３５】
自動化のためのＴｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  ＥＶＯ  ２００液体ハンドリングプラットフォームを利用することにより、１，５３６ウェルプレートフォーマットをスクリーニングする際に、試薬の使用において４〜５倍の減少と、感度の向上が達成された。トランスフェクション手順を最適化し、１，５３６ウェルプレートフォーマットにおいて、５ｎｇの個々のプラスミドおよびリポフェクタミンの混合物でトランスフェクトすることにより、所望のタンパク質の高発現レベルが達成されたことを実証した。典型的には、トランスフェクションの１２時間後、それぞれのウェルにおいて２９３Ｔ細胞の５０〜７０％が、トランスフェクトされたプラスミドを発現した。新しいプラスミドがシステムに組み込まれた場合に、特異的モノクローナル抗体を用いて無作為に選択されたウェルにおける発現を調べることによって、品質管理実験を実行した。この最適化と性能向上により、ハンドリング時間が短縮され、タイミング、コスト、労力について４倍効率的なスクリーニングによりスクリーニング全体が改善された。
【０１３６】
したがって、受容体アレイ技術を使用することにより、Ｔ細胞活性アレイから選択された遺伝子候補について相互作用するタンパク質が同定される。相互作用するタンパク質の同定は、同定された遺伝子候補の免疫機能についてのさらなる洞察を提供し、マウス腫瘍モデルにおける治療可能性を試験するためのｉｎ  ｖｉｖｏ研究の候補の選択を促進する。
ヒトがんのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデル
【０１３７】
がんモデルにおける治療可能性を試験するために、最上位の有効な標的に特異的な抗体または最上位候補についての組換えタンパク質が生成される。６２４ヒトメラノーマ（ＧＰ１００＋ＨＬＡ−Ａ２＋）細胞および腫瘍反応性Ｔ細胞を、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒガンマｎｕｌｌマウスに注射する。これらのマウスは、遺伝子候補および／または遺伝子候補の抗体で数ラウンドの処置を受け、腫瘍増殖および腫瘍部位における免疫細胞のランドスケープまたはエフェクター機能を注意深くモニターする。
患者由来異種移植（ＰＤＸ）
【０１３８】
がん患者から採取したプレトリートメントおよびオントリートメント腫瘍標本における免疫組織化学（ＩＨＣ）、多重免疫蛍光（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ−ＩＦ）および質量分析（ＣｙＴＯＦ）分析を組み合わせて、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の異種性を試験する。これらの技術の組合せは、ヒトＴＭＥにおける機械的相互作用を同定するためのツールとして使用され得る。具体的には、ＴＭＥの免疫学的成分の差異を調べ、ベースラインおよび獲得した耐性の時点での試料を比較する。免疫患者由来の異種移植（免疫ＰＤＸ）モデルとして公知の、ヒト化マウスモデルが開発され、これらの解析と並行してヒトＴＭＥを研究するために使用することができる。これらの研究は、疾患微小環境における応答、耐性および獲得抵抗のメカニズムを明らかにするために不可欠であり、最終的にバイオマーカー開発の基礎を提供し、微小環境の比抵抗メカニズムに基づいたさらなる治療法を提供する。
バイオインフォマティクスのアプローチ
【０１３９】
バイオインフォマティクスのアプローチは、自己免疫疾患およびがんに関与する遺伝子を絞り込むために利用される。疾患の進行の間に有意に変化し、疾患の病因の潜在的なシグネチャー遺伝子である遺伝子を同定するために複数の厳格な基準が選択される。
【０１４０】
ＧＳ−ＴＣＡＡおよび潜在的遺伝子候補のさらなる機能検証の後、特定の自己免疫疾患またはがんにおいてのみ調節される特定の遺伝子を同定するために、ランキングシステムが設定される。あるいは、異なる自己免疫疾患またはがんの間で共通の遺伝子が選択され得る。
【０１４１】
例えば、膜貫通タンパク質および分泌タンパク質のみをコードする遺伝子が、主に、これらの分子の将来の操作が治療抗体または組換えタンパク質で容易になるように、選択される。さらに、この選択により、ＧＳ−ＴＣＡＡおよび受容体アレイ技術の組合せを使用して、カウンター受容体および機能の同定が可能となる。第２の基準は、複数の疾患と共有される遺伝子を選択することである。上方制御された遺伝子が、目的の標的疾患のそれぞれに存在する場合１ポイントとしてスコアリングされる、ランキングシステムが使用される。より高い数字は、異なる疾患の間で遺伝子が共有されることを示す。このことにより、異なる自己免疫疾患またはがん型の根底にある共通メカニズムが明らかになる。
【０１４２】
１つの特定の疾患に特異的に関与するが他の自己免疫疾患またはがんのタイプには関与しない遺伝子を同定するための選択基準に基づいて、単一の疾患にユニークに関与する遺伝子が選択される。続いて、特定の疾患において、カットオフとして少なくとも２倍の変化で上方制御または下方制御される遺伝子が選択される。これは主に統計的考察によるものである。特定の免疫機能に関与し得る特定のタンパク質ドメインを有する遺伝子のリスト、例えばＩｇスーパーファミリー分子が同定される。最初にこれらの基準で特定の遺伝子を同定した後、これらの標的に対するカウンター受容体スクリーニングを、受容体アレイ技術を使用して実行し、これらの分子およびそれらのカウンター受容体が免疫モジュレーションの潜在的標的であるか否かを、免疫関連機能研究により判定する。
【０１４３】
自己免疫疾患およびがん微小環境において上方制御される遺伝子およびタンパク質が同定される。ＮＣＢＩ、Ｏｎｃｏｍｉｎｅ、ＴＣＧＡがんデータベース、Ｙａｌｅ内部がんデータベースおよびヒトタンパク質Ａｔｌａｓのような主要データベースを使用して、様々な疾患の間で共有される差次的に発現される遺伝子もまた同定される。続いて、遺伝子セットエンリッチメント分析（Gene  Set  Enrichment  Analysis；ＧＳＥＡ）を使用して、免疫系、サイトカイン／ケモカインシグナル伝達、またはインターフェロンシグナル伝達に関連する遺伝子、および自己免疫疾患およびがんの発生および進行に重要な役割を果たす抗原提示経路が同定される。最後に、上方制御され、共有された疾患遺伝子は、それらの細胞内位置によって分類され、膜タンパク質は、より容易に治療薬に接近可能であるために、焦点が当てられる。特定の遺伝子については、自己免疫疾患およびがんに影響を及ぼすことが公知である、ＦｃＲ様遺伝子、ＨＬＡ関連遺伝子、および共刺激分子（ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１、別名ＣＤ２７４、およびＣＴＬＡ４）を含む、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーであるか否かを決定するために分析が行われる。
【０１４４】
自己免疫疾患およびがん微小環境において下方制御される遺伝子およびタンパク質を同定するために、同様のアプローチが、公共およびアクセス可能なデータベースのバイオインフォマティクス分析を使用して施され、様々な疾患の間で共有される遺伝子を同定する。
【０１４５】
ＧＳ−ＴＣＡＡスクリーニング、例えばＦＬＴ１、ＳＥＭＡ６ａ、ＳＥＣ２２ｂおよびＧＰ１Ｂａから同定されたＴ細胞活性に対する阻害機能を有する候補を、様々なタイプのがんにおけるそれらの発現レベルについてさらに分析した。図６〜９において実証されるように、ＦＬＴ１、ＳＥＭＡ６ａ、ＳＥＣ２２ｂ、およびＧＰ１Ｂａの発現レベルは、異なるタイプのがんにおいて異なって調節されることが示された。例えば、ＳＥＣ２２ｂの発現は、腎臓がん、前立腺がん、肝臓がん、乳がん、頭頸部がん、胃がん、結腸直腸がんおよび副腎がんのような多くのがんにおいて上方制御されたが、ＳＥＣ２２ｂは肺がんにおいて特異的に下方制御された（図８）。このバイオインフォマティクス分析は、ＧＳ−ＴＣＡＡが免疫モジュレーターの同定において重要であることをさらに確証し、がんおよび／または自己免疫疾患の治療のための潜在的治療標的として、これらの免疫モジュレーターが役立ち得ることを示唆する。
均等物
【０１４６】
当業者は、本明細書に記載された本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、またはルーチン的な実験のみを用いて確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。本出願を通じて引用される全ての参考文献、特許および公開特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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