(57)【要約】  本発明の開示は、５Ｔ４腫瘍胎児性抗原（ＴＰＢＧ、５Ｔ４、Ｗｎｔ活性化阻害因子１、ＷＡＩＦ１）を標的とするＣＤＲを定義した抗体に関し、これはヒト５Ｔ４抗原に対して結合親和性を呈し、この結合親和性は、カニクイザル５Ｔ４に対するそれらの抗体の親和性と同じオーダーである。抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、ならびにヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療におけるその使用が、請求される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．  配列番号１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｂ．  配列番号３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｃ．  配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｄ．  配列番号７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｅ．  配列番号９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｆ．  配列番号１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｇ．  配列番号１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号１４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｈ．  配列番号１５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号１６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｉ．  配列番号１７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号１８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｊ．  配列番号１９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号２０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｋ．  配列番号２１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号２２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｌ．  配列番号２３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号２４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｍ．  配列番号２５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号２６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｎ．  配列番号２７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号２８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｏ．  配列番号２９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号３０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｐ．  配列番号３１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号３２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
ｑ．  配列番号３３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号３４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列
からなる群から選択される重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）可変領域（ＶＲ）相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗５Ｔ４抗体。
【請求項２】
ａ．  配列番号１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｂ．  配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｃ．  配列番号１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
からなる群から選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ  ＣＤＲを含み；
前記抗体はヒト化されている、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ａ．  配列番号１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに配列番号３５のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４５のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｂ．  配列番号１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに配列番号３６のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４５のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｃ．  配列番号１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに配列番号３７のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４４のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｄ．  配列番号１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに配列番号３７のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４６のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｅ．  配列番号１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに配列番号４０のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号５１のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｆ．  配列番号１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに配列番号４１のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号５１のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｇ．  配列番号１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに配列番号４２のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４９のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｈ．  配列番号１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに配列番号４３のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号５０のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｉ．  配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに配列番号３８のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４７のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｊ．  配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに配列番号３９のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４７のＬＣＶＲアミノ酸配列；ならびに
ｋ．  配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに配列番号３９のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４８のＬＣＶＲアミノ酸配列
を含む、請求項２に記載のヒト化抗体。
【請求項４】
前記抗体が、重鎖フレームワーク領域または軽鎖フレームワーク領域中の位置に少なくとも１つの操作されたシステインを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
重鎖４０、４１および８９（Ｋａｂａｔナンバリングによる）；ならびに
軽鎖４０および４１（Ｋａｂａｔナンバリングによる）から選択される前記抗体の１つ以上の位置に、前記少なくとも１つの操作されたシステインが存在する、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体を含む抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項７】
請求項４または５に記載の抗体を含み、リンカー薬物が、前記少なくとも１つの操作されたシステインを介して前記抗体に部位特異的にコンジュゲートされている、請求項６に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項８】
式（Ｉ）
【化１】
2018538368.tif 000021
の請求項６または７に記載の抗体−薬物コンジュゲート
（式中、
ｎは、０〜３であり、
ｍは、１〜６の平均ＤＡＲを表し、
Ｒ1は、
【化２】
2018538368.tif 000022
から選択され、
ｙは、１〜１６であり、
Ｒ2は、
【化３】
2018538368.tif 000023
から選択される）。
【請求項９】
請求項８に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、
ｎは、０〜１であり、
ｍは、１．５〜２の平均ＤＡＲを表し、
Ｒ1は、
【化４】
2018538368.tif 000024
であり、
ｙは、１〜４であり、
Ｒ2は、
【化５】
2018538368.tif 000025
から選択される、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１０】
式（ＩＩ）
【化６】
2018538368.tif 000026
の請求項６から９のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１１】
前記抗５Ｔ４抗体が：
ａ．  配列番号６１のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号５１のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｂ．  配列番号６２のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号５１のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｃ．  配列番号６３のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４９のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｄ．  配列番号６４のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号５０のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｅ．  配列番号５９のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４７のＬＣＶＲアミノ酸配列；ならびに
ｆ．  配列番号６０のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４８のＬＣＶＲアミノ酸配列；
からなる群から選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含むヒト化抗体であり、
前記リンカー薬物は、重鎖４１位での前記操作されたシステインを介して前記抗５Ｔ４抗体に部位特異的にコンジュゲートされている、請求項６から１０のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１２】
請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体または請求項６から１１のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートおよび１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤を含み、好ましくは凍結乾燥された粉末の形態である医薬組成物。
【請求項１３】
薬剤として使用するための、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体、請求項６から１１のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートまたは請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療に使用するための、請求項１３に記載の抗体、抗体−薬物コンジュゲートまたは医薬組成物。
【請求項１５】
前記ヒト固形腫瘍が、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、卵巣癌、肺癌、および中皮腫からなる群から選択される、請求項１４に記載の使用のための、抗体、抗体−薬物コンジュゲートまたは医薬組成物。
【請求項１６】
ヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療に使用するための、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体、請求項６から１１のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートまたは請求項１２に記載の医薬組成物と、５Ｔ４抗原以外の癌関連標的に対する、治療抗体、化学療法剤および／またはＡＤＣとの組合せ。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、５Ｔ４（腫瘍胎児性）抗原に対する抗体および対応する抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に関する。
【本発明の背景】
【０００２】
５Ｔ４腫瘍胎児性抗原は、ヒト胎盤シンシチウム栄養芽層微絨毛膜からのコムギ胚芽凝集素単離糖タンパク質に対するモノクローナル抗体により定義した７２ｋＤａ糖タンパク質である。このモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＷＯ８９／０７９４７において５Ｔ４と名付けられた。５Ｔ４抗原は正常組織中で限定的に発現されるのに対して、様々なタイプの癌細胞により（過剰）発現される。このことから、５Ｔ４抗原は特異的な癌標的とされ、潜在的かつ有望な治療標的とされる。しかしながら、その標的は８０年代後半に発見されたにもかかわらず、認可された治療抗体はなお入手不可能である。
【０００３】
ＷＯ２００６／０３１６５３は、当初のｍＡｂ５Ｔ４（すなわち、Ｈ８およびそのヒト化バージョン）を開示し、その双方が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの前臨床（毒性）研究において一般に使用される様々なヒト以外の動物種に対して交差反応性ではない。これらの前臨床研究は、引き続くヒトにおける用量増加スキームのための初期の安全な用量を同定すること；可逆的なまたは不可逆的な毒性作用の潜在的な標的である健常組織または器官を同定すること；および臨床モニタリングについての安全性パラメータを同定することを目的としている。モノクローナル抗体などのバイオ医薬に関して、規制ガイドラインは、少なくとも１つの妥当性のある種における試験を必要としている（たとえば、ＩＣＨ  Ｓ６規制ガイドライン）。モノクローナル抗体が、種に対して交差反応性ではない場合に、種は妥当ではなく、したがって、前記種において十分に強力であるとはいえない。このような場合に、代替の動物モデルが使用されていてもよく、たとえば遺伝的に改変された種である。しかしながら、これは、広範な努力を必要とし、モデルを開発するだけでなく、規制当局に受け入れられる科学的な正当性を提供できることも必要とされる。
【０００４】
ＷＯ２００７／１０６７４４は抗５Ｔ４抗体Ａ１、Ａ２およびＡ３を開示するが、これらの３つの抗体は、ヒト以外の動物種（たとえば、カニクイザル）に対していくらかの交差反応性を呈し、ヒト５Ｔ４に対するそれらの親和性はヒト５Ｔ４に対するＨ８の親和性よりもかなり低い。
【０００５】
４−（４'−アセチルフェノキシ）−ブタン酸を介してカリケアマイシンに連結した抗５Ｔ４抗体Ｈ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３は、ＷＯ２００７／１０６７４４の７３頁に開示された。ＷＯ２０１２／１３１５２７は、マレイミドカプロン酸−モノメチルアウリスタチンＦに連結したＡ１（Ａ１−ｍｃ−ＭＭＡＦ）を開示する。
【０００６】
５Ｔ４抗原を標的とするほんのわずかの治療法だけが、臨床試験段階に達している。５Ｔ４抗原をコードする改変されたワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）ベクターのワクチンは、５Ｔ４抗原に対する内在性抗体応答を誘導するが、その転移性腎臓癌における第三相研究は、生存性の増加の主要エンドポイントに適合することに失敗した。別の例はナプツモマブエスタフェナトクス（naptumomab estafenatox）であり、これは改変されたブドウ球菌エンテロトキシンＥにコンジュゲートしたｍＡｂ５Ｔ４のＦａｂ断片である。このコンジュゲートは、腫瘍に近接してＴ細胞応答を活性化すると考えられる。しかしながら、進行性腎細胞癌におけるナプツモマブエスタフェナトクス＋ＩＦＮ−α対ＩＦＮ−αの無作為化第ＩＩ／ＩＩＩ相研究は、その長期生存性の主要エンドポイントに適合しなかった。最近同じく、Ａ１−ｍｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣを評価する臨床開発は、中止された。現在、進行中の臨床試験は、米国および欧州臨床試験レジスター（US and EU clinical trials registers）に列挙されていない。
【０００７】
ＷＯ２０１５／１５５３４５は、新しい抗５Ｔ４抗体および対応するＡＤＣを開示しており、ここで抗５Ｔ４抗体は、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＤＢ）二量体またはチューブリシン（tubulysin）に（部位特異的に）連結されている。しかしながら、臨床データは、まだ利用可能ではない。
【０００８】
上記のことから、臨床的に試験した５Ｔ４標的治療、すなわち、抗体、抗体−薬物コンジュゲートおよびワクチンが、癌治療の必要条件に達しないとの結論がもたらされる。したがって、５Ｔ４抗原に対する新しい抗体および癌治療に対する対応する抗体−薬物コンジュゲートに対する必要性が存在する。前臨床設定におけるこれらの抗体および対応するＡＤＣの適合性を決定するため、そのような抗体は、薬物候補の前臨床開発に関して妥当性のあるヒト以外の動物種の５Ｔ４抗原に対して交差反応性であるべきである。
【本発明の簡単な説明】
【０００９】
本発明は、臨床試験における試験に適切である、ヒト５Ｔ４腫瘍胎児性抗原に対する抗体および対応するＡＤＣに関する。前臨床設定における適切な抗体および対応するＡＤＣは、薬物候補の前臨床開発に関して関連性のあるヒト以外の動物種の５Ｔ４抗原に対して交差反応性であるべきである。
【００１０】
好ましくは、抗体は、ヒトおよびカニクイザルに対して交差反応性であり、ヒト５Ｔ４抗原（ｈｕ  ５Ｔ４）に対して親和性を呈し、この親和性は、カニクイザル５Ｔ４抗原（ｃｙｎｏ  ５Ｔ４）に対するそれら抗体の親和性と同じオーダーである。
【００１１】
本発明は、固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療における抗体および対応するＡＤＣの使用にさらに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】キメラｍＡｂ、ヒト化ｍＡｂ（ＨＣ−４１Ｃ変異を有する）および対応する抗５Ｔ４  ＡＤＣとｈｕ  ５Ｔ４発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯＺＮ）の結合と対比してＨ８およびＡ１（図１Ａ  クローン７８９）の結合を示す。
【図１Ｂ】キメラｍＡｂ、ヒト化ｍＡｂ（ＨＣ−４１Ｃ変異を有する）および対応する抗５Ｔ４  ＡＤＣとｈｕ  ５Ｔ４発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯＺＮ）の結合と対比してＨ８およびＡ１（図１Ｂ  クローン８３３）の結合を示す。
【図１Ｃ】キメラｍＡｂ、ヒト化ｍＡｂ（ＨＣ−４１Ｃ変異を有する）および対応する抗５Ｔ４  ＡＤＣとｈｕ  ５Ｔ４発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯＺＮ）の結合と対比してＨ８およびＡ１（図１Ｃ  クローン８２５）の結合を示す。
【図２Ａ】キメラｍＡｂ、ヒト化ｍＡｂ（ＨＣ−４１Ｃ変異を有する）および対応する抗５Ｔ４  ＡＤＣとｃｙｎｏ  ５Ｔ４発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯＺＮ）の結合と対比してＨ８およびＡ１（図２Ａ  クローン７８９）の結合を示す。
【図２Ｂ】キメラｍＡｂ、ヒト化ｍＡｂ（ＨＣ−４１Ｃ変異を有する）および対応する抗５Ｔ４  ＡＤＣとｃｙｎｏ  ５Ｔ４発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯＺＮ）の結合と対比してＨ８およびＡ１（図２Ｂ  クローン８３３）の結合を示す。
【図２Ｃ】キメラｍＡｂ、ヒト化ｍＡｂ（ＨＣ−４１Ｃ変異を有する）および対応する抗５Ｔ４  ＡＤＣとｃｙｎｏ  ５Ｔ４発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯＺＮ）の結合と対比してＨ８およびＡ１（図２Ｃ  クローン８２５）の結合を示す。
【図３】免疫不全マウスにおける５Ｔ４−陽性ＢＴ４７４細胞系異種移植片における抗５Ｔ４  ＡＤＣ  ８３３ａ−、８３３ｂ−、８３３ｃ−、８３３ｄ−、８２５ａ−、８２５ｃ−ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡと対比したＨ８−ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡおよび結合しない対照リツキシマブ−ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を示す。
【本発明の詳細な説明】
【００１３】
５Ｔ４腫瘍胎児性抗原が正常組織中では限定的に発現されるのに対し、様々な癌細胞により（過剰）発現されることから、５Ｔ４抗原が特異的な癌標的にされ、潜在的かつ有望な治療標的にされる。しかしながら、標的が８０年代後半に発見されたにもかかわらず、この標的を対象とする認可された治療は、現在のところ存在しない。
【００１４】
本発明は、ｃｙｎｏ  ５Ｔ４に対して交差反応性であり、ｈｕ  ５Ｔ４抗原に対して優秀な親和性も呈する、５Ｔ４抗原に対する抗体および対応する抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に関する。本発明による抗５Ｔ４抗体およびＡＤＣは、ｈｕ  ５Ｔ４に対するそれらの親和性と同じオーダーにおいてｃｙｎｏ  ５Ｔ４抗原に対して親和性を示す。用語「同じオーダー」は、ｈｕおよびｃｙｎｏ  ５Ｔ４抗原に対する親和性が、互いにファクター１０未満で異なることを意味する。本発明の抗５Ｔ４抗体は、先行技術の抗５Ｔ４抗体Ａ１およびＡ３と比較してｈｕ  ５Ｔ４抗原に対する親和性が改善され、先行技術の抗５Ｔ４抗体Ｈ８と比較してｃｙｎｏ  ５Ｔ４抗原に対する親和性が改善される。親和性は、ｈｕまたはｃｙｎｏ  ５Ｔ４抗原を発現する細胞を使用する細胞ベースアッセイにおいてμｇ／ｍｌでのＥＣ50として好ましくは測定される。本発明者らは、ｈｕ  ５Ｔ４またはｃｙｎｏ  ５Ｔ４を発現するよう操作された様々な細胞、たとえばＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＰＡ−１およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞においてＥＣ50を測定した。本発明の抗体は、ｈｕ  ５Ｔ４またはｃｙｎｏ  ５Ｔ４抗原を発現する細胞を使用し、４℃で３０分間の抗体での細胞のインキュベーション後に、測定して０．８μｇ／ｍｌより低いＥＣ50を一般に呈する。
【００１５】
先行技術の抗５Ｔ４抗体Ａ１は、ＵＳ８０４４１７８、配列番号２、２０−１３８位からのマウスＡ１アミノ酸配列の重鎖（ＨＣ）可変領域（ＶＲ）およびＵＳ８０４４１７８、配列番号４、２１−１２７位からのマウスＡ１アミノ酸配列の軽鎖（ＬＣ）ＶＲにより特徴付けられる。先行技術の抗５Ｔ４抗体Ａ３は、ＵＳ８０４４１７８、配列番号１０、２０−１４１位からのマウスＡ３アミノ酸配列のＨＣＶＲおよびＵＳ８０４４１７８、配列番号１２、２１−１２７位からのマウスＡ３アミノ酸配列のＬＣＶＲにより特徴付けられる。先行技術の抗５Ｔ４抗体Ｈ８は、配列番号５２のＨＣＶＲおよび配列番号５３のＬＣＶＲにより特徴付けられる。
【００１６】
本明細書を通して使用される用語「抗体」は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含むモノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはその抗原結合断片、たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'またはＦ（ａｂ'）2断片、単鎖（ｓｃ）抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン（ｓｄ）抗体、ダイアボディ、またはミニボディを指す。抗体は、任意のアイソタイプ、たとえばＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ抗体であってもよい。好ましくは、抗体は、ＩｇＧ抗体、より好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体である。抗体は、キメラ、ヒト化またはヒト抗体であってもよい。好ましくは、本発明の抗体は、ヒト化抗体である。なお一層好ましくは、抗体は、ヒト化またはヒトＩｇＧ抗体、最も好ましくはヒト化またはヒトＩｇＧ１  ｍＡｂである。抗体は、κ（カッパ）またはλ（ラムダ）軽鎖、好ましくはκ（カッパ）軽鎖を有してもよい（すなわち、ヒト化またはヒトＩｇＧ１−κ抗体）。
【００１７】
ヒト化抗体において、ＨＣおよびＬＣの可変領域にある抗原結合性の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ヒト以外の種、一般にマウス、ラットまたはウサギからの抗体から由来する。これらのヒト以外のＣＤＲは、ＨＣおよびＬＣの可変領域のヒトフレームワーク（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）内に配置されてもよい。ヒトＦＲ中の選択されたアミノ酸は、低い免疫原性を保持すると同時に、結合親和性を改善させるため、対応する当初のヒト以外の種のアミノ酸と交換されてもよい。あるいは、当初のヒト以外の種のＦＲの選択されたアミノ酸は、抗体の結合親和性を保持と同時に、免疫原性を減少させるため、それらの対応するヒトのアミノ酸と交換される。したがって、ヒト化可変領域は、ヒト定常領域と組み合わされる。
【００１８】
本発明は：
ａ．  配列番号１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｂ．  配列番号３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｃ．  配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｄ．  配列番号７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｅ．  配列番号９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｆ．  配列番号１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｇ．  配列番号１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号１４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｈ．  配列番号１５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号１６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｉ．  配列番号１７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号１８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｊ．  配列番号１９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号２０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｋ．  配列番号２１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号２２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｌ．  配列番号２３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号２４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｍ．  配列番号２５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号２６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｎ．  配列番号２７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号２８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｏ．  配列番号２９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号３０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｐ．  配列番号３１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号３２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
ｑ．  配列番号３３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号３４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列
からなる群から選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ  ＣＤＲを含む抗５Ｔ４抗体に特に関する。
【００１９】
明確さのため、先に記述したａからｑの下で列挙される抗体のＨＣＶＲのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列およびＬＣＶＲのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列は、本発明の説明の最後に付与した配列表で下線が引かれている。
【００２０】
一態様において、本発明の抗５Ｔ４抗体は：
ａ．  配列番号１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｂ．  配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｃ．  配列番号１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｄ．  配列番号１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号１４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｅ．  配列番号１７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号１８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
ｆ．  配列番号２５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号２６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列
からなる群から選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ  ＣＤＲを含む。
【００２１】
好ましい態様において、本発明の抗５Ｔ４抗体は：
ａ．  配列番号１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｂ．  配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
ｃ．  配列番号１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列
からなる群から選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ  ＣＤＲを含む。
【００２２】
より好ましい態様において、本発明の抗５Ｔ４抗体は：
ａ．  配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
ｂ．  配列番号１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列
からなる群から選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ  ＣＤＲを含む。
【００２３】
別の態様において、本発明は：
ａ．  配列番号３５のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４５のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｂ．  配列番号３６のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４５のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｃ．  配列番号３７のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４４のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｄ．  配列番号３７のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４６のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｅ．  配列番号４０のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号５１のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｆ．  配列番号４１のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号５１のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｇ．  配列番号４２のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４９のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｈ．  配列番号４３のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号５０のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｉ．  配列番号３８のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４７のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｊ．  配列番号３９のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４７のＬＣＶＲアミノ酸配列；ならびに
ｋ．  配列番号３９のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４８のＬＣＶＲアミノ酸配列
からなる群から選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含むヒト化抗５Ｔ４抗体に関する。
【００２４】
本発明の第１の態様において、ヒト化抗５Ｔ４抗体は、配列番号３５のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４５のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。
【００２５】
本発明の第２の態様において、ヒト化抗５Ｔ４抗体は、配列番号３６のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４５のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。
【００２６】
本発明の第３の態様において、ヒト化抗５Ｔ４抗体は、配列番号３７のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４４のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。
【００２７】
本発明の第４の態様において、ヒト化抗５Ｔ４抗体は、配列番号３７のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４６のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。
【００２８】
本発明の第５の好ましい態様において、ヒト化抗５Ｔ４抗体は、配列番号４０のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号５１のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。
【００２９】
本発明の第６の好ましい態様において、ヒト化抗５Ｔ４抗体は、配列番号４１のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号５１のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。
【００３０】
本発明の第７の好ましい態様において、ヒト化抗５Ｔ４抗体は、配列番号４２のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４９のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。
【００３１】
本発明の第８の好ましい態様において、ヒト化抗５Ｔ４抗体は、配列番号４３のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号５０のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。
【００３２】
本発明の第９の好ましい態様において、ヒト化抗５Ｔ４抗体は、配列番号３８のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４７のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。
【００３３】
本発明の第１０の態様において、ヒト化抗５Ｔ４抗体は、配列番号３９のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４７のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。
【００３４】
本発明の第１１の好ましい態様において、ヒト化抗５Ｔ４抗体は、配列番号３９のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４８のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。
【００３５】
本発明は、さらに、リンカー薬物が、本発明による抗５Ｔ４抗体にコンジュゲートされる、ＡＤＣに関する。
【００３６】
一態様において、本発明は、リンカー薬物が、鎖間ジスルフィド結合の還元によって遊離させた天然のシステインによって本発明による抗５Ｔ４抗体に無作為にコンジュゲートされる、ＡＤＣに関する。
【００３７】
別の態様において、本発明は、リンカー薬物が、操作されたシステインによって本発明による抗５Ｔ４抗体に部位特異的にコンジュゲートされる、ＡＤＣに関する（部位特異的なＡＤＣ）。
【００３８】
ＨＣまたはＬＣにおいて少なくとも１つの操作されたシステインを含む抗５Ｔ４抗体は、いくつかの利点を有する。部位特異的なＡＤＣを調製可能とする、操作されたシステインを含む抗体は、リンカー薬物と優れた反応性を示し、同時に抗体間で追加のジスルフィド結合を形成する（凝集をもたらす）または抗体構造を妨げる危険性が低いコンジュゲーション位置を提供することができる。ＨＣまたはＬＣにおける特定の位置にシステインを有する追加の利点は、得られるＡＤＣの疎水性低下の効果である。
【００３９】
リンカー薬物結合に対する複数の適切なコンジュゲーション位置が、全ての抗体構造中に存在する、腔内およびそれに近接して同定され、すなわち、ＷＯ２０１５／１７７３６０に開示され、請求されたように、これらの位置において操作されたシステインの近接性は優れていた。
【００４０】
ここで請求されたようにリンカー薬物が抗５Ｔ４抗体の特定の位置でコンジュゲートされる場合に、前記リンカー薬物は抗体の定常重鎖１（ＣＨ１）、可変重鎖（ＶＨ）、可変軽鎖（ＶＬ）および定常軽鎖（ＣＬ）領域によって形成されるＦａｂ腔に嵌まる。その結果、リンカー薬物（大抵のトキシン／リンカー薬物は疎水性である）は、リンカー薬物が抗体の天然の鎖間ジスルフィド結合システインを介してコンジュゲートされているＡＤＣと比較して疎水性がより低く、リンカー薬物が異なる位置で部位特異的にコンジュゲートされているＡＤＣと比較してかなり疎水性が低いので、抗体およびＡＤＣを囲む親水性水性環境から保護され、そこではリンカー薬物が抗体の外側に押しやられており、すなわち親水性水性環境に向けてより露出している。
【００４１】
本発明の好ましい態様において、本発明による抗５Ｔ４抗体は、ＨＣ可変領域ＦＲまたはＬＣ可変領域ＦＲ中の位置で少なくとも１つの操作されたシステインを含む。本明細書を通して使用される用語「操作されたシステイン」は、抗体のＨＣまたはＬＣにおける非システインアミノ酸をシステインにより置きかえることを意味する。当業者に公知であるように、これはアミノ酸レベルで、またはたとえば部位特異的突然変異誘発法を使用することによりＤＮＡレベルのいずれかで行うことができる。好ましくは、このような操作されたシステインは、当初の／親抗体における既存のアミノ酸を置きかえる特定の点突然変異により導入される。
【００４２】
好ましくは、少なくとも１つの操作されたシステインは、ＨＣ４０、４１および８９（Ｋａｂａｔナンバリングによる）；ならびにＬＣ４０および４１（Ｋａｂａｔナンバリングによる）から選択される、本発明による抗５Ｔ４抗体の１つ以上の位置に存在する。表現「Ｋａｂａｔナンバリング」とは、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．  （１９９１）において抗体のＨＣ可変領域またはＬＣ可変領域の編集に一般に使用されるナンバリングシステムを指す。このナンバリングシステムを使用して、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変領域のＦＲまたはＣＤＲの短縮もしくはそれらへの挿入に対応する少ないもしくは追加のアミノ酸を含有していてもよい。残基のＫａｂａｔナンバリングは、抗体の配列の相同性領域における「標準的な」Ｋａｂａｔナンバリングされた配列との整列化により所与の抗体について決定され得る。
【００４３】
先に開示したＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ  ＣＤＲを含む抗５Ｔ４抗体ならびにＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含むヒト化抗体に加えて、本発明は、ＨＣ４０、４１および８９、およびＬＣ４０および４１から選択される位置で少なくとも１つの操作されたシステインをＨＣおよび／またはＬＣにおいて含む前記抗体にも関する。
【００４４】
好ましい態様において、本発明の抗５Ｔ４抗体は、ＨＣ４０、４１および８９、およびＬＣ４０および４１から選択される位置で少なくとも１つの操作されたシステインを含み：
ａ．  配列番号１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｂ．  配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
ｃ．  配列番号１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列
からなる群から選択されるＨＣＶＲおよびＨＣＶＲ  ＣＤＲを含む。
【００４５】
別の好ましい態様において、本発明は、ＨＣ４０、４１および８９、およびＬＣ４０および４１から選択される位置で少なくとも１つの操作されたシステインを含み：
ａ．  配列番号４０のＨＣアミノ酸配列および配列番号５１のＬＣアミノ酸配列；
ｂ．  配列番号４１のＨＣアミノ酸配列および配列番号５１のＬＣアミノ酸配列；
ｃ．  配列番号４２のＨＣアミノ酸配列および配列番号４９のＬＣアミノ酸配列；
ｄ．  配列番号４３のＨＣアミノ酸配列および配列番号５０のＬＣアミノ酸配列；
ｅ．  配列番号３８のＨＣアミノ酸配列および配列番号４７のＬＣアミノ酸配列；ならびに
ｆ．  配列番号３９のＨＣアミノ酸配列および配列番号４８のＬＣアミノ酸配列
からなる群から選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含むヒト化抗５Ｔ４抗体に関する。
【００４６】
ＨＣ４０、４１および８９ならびにＬＣ４０および４１位は、抗体の可変領域ＦＲにおよび抗体のＦａｂ部分に位置する。
【００４７】
好ましい態様において、本発明は、リンカー薬物が、ＨＣ４０、４１および８９（Ｋａｂａｔナンバリングによる）ならびにＬＣ４０および４１（Ｋａｂａｔナンバリングによる）から選択される前記抗５Ｔ４抗体の１つ以上の位置で操作されたシステインを介して本発明による抗５Ｔ４抗体に部位特異的にコンジュゲートされているＡＤＣに関する。
【００４８】
本発明者らは、本発明の部位特異的にコンジュゲートされているＡＤＣが、リンカー薬物が抗５Ｔ４抗体の天然の鎖間ジスルフィド結合システインを介してコンジュゲートされている従来のＡＤＣと比較して、物理化学的、薬理学的および／または薬物動態学的特性の改善を示すことを驚くべきことに発見した。
【００４９】
抗体の可変部分の修飾は、抗原結合親和性の部分的または完全な喪失をもたらし得るので、一般に避けられる。しかしながら、一般的な予想に反して、抗体のＨＣおよびＬＣのＦＲにある特定の残基は両方ともコンジュゲーションに適しており、リンカー薬物のコンジュゲーション後に抗原結合の（著しい）減少をもたらさないことが判明した。特に好ましい態様において、本発明は、前記操作されたシステインが、（前記抗体のＦａｂ部分における）ＨＣ４０および４１、およびＬＣ４０および４１から選択される前記抗５Ｔ４抗体の１つ以上の位置にある、ＡＤＣに関する。好ましくは、前記操作されたシステインは、ＨＣ４１またはＬＣ４０もしくは４１位、より好ましくはＨＣ４１位にある。
【００５０】
文献から公知であるように、腫瘍微小環境における腫瘍関連プロテアーゼは、ヒンジ領域の下でＦｃ定常ドメインを部分的に切断することができ、Ｆａｂ部分におけるコンジュゲーションはＦｃ部分におけるコンジュゲーションより好ましい。Ｆｃ定常ドメインの切断は、Ｆｃコンジュゲートリンカー薬物を喪失させることになり、それは同様にｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＤＣの活性低下をもたらす可能性がある（Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０１２；１４：Ｒ１１６およびＢｒｅｚｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ  ２００９；１０６：１７８６４−１７８６９）。さらに、Ｆａｂ部分におけるこれらの位置に対するコンジュゲーションは、ここで開示される抗５Ｔ４抗体の抗原結合断片の使用も可能にする。
【００５１】
本発明による（部位特異的な）ＡＤＣは、元の抗体（naked antibodies）と類似の結合親和性および優れたｉｎ  ｖｉｖｏ効力を有し、先行技術から公知である５Ｔ４−標的化ＡＤＣに対してｉｎ  ｖｉｖｏプロファイルが改善される。本発明による部位特異的なＡＤＣが、先行技術の５Ｔ４−標的化ＡＤＣと比較してｉｎ  ｖｉｖｏで低い非特異的な毒性を呈することが期待される。本発明の抗５Ｔ４  ＡＤＣにおいて、リンカー薬物は、保護され（細胞外プロテアーゼによる切断に対してＡＤＣの感受性を低くさせる）、したがって、薬物が早まって放出される可能性は低い。
【００５２】
本発明によると、天然のまたは操作されたシステインのチオール基と反応することができる化学基、一般にマレイミドまたはハロアセチル基を有する場合には、ＡＤＣの当業者に公知の任意のリンカー薬物を使用して、本発明による抗体に（部位特異的に）コンジュゲーションさせることができる。適切なリンカー薬物は、細胞毒性薬としてデュオカルマイシン、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、マイタンシノイドまたはオーリスタチン誘導体を含んでいてもよい。本発明による切断可能なまたは切断不可能ないずれかのリンカーを使用してもよい。好ましくは、細胞毒性薬は、デュオカルマイシン、マイタンシノイドまたはオーリスタチン誘導体である。マイタンシノイド薬物の適切な例には、ＤＭ１およびＤＭ４が含まれる。オーリスタチン薬物の適切な例には、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦが含まれる。
【００５３】
これらの略語は、当業者に周知である。当業者に公知の適切なリンカー薬物の例には、ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（ｍｃ−ｖｃ−ＭＭＡＥおよびｖｃ−ＭＭＡＥとも略記される）、ｍｃ−ＭＭＡＦおよびｍｃ−ｖｃ−ＭＭＡＦが含まれる。好ましくは、使用されるリンカーは、バリン−シトルリン（ｖｃ）またはバリン−アラニン（ＶＡ）を含む切断可能なリンカーである。
【００５４】
本発明による（部位特異的な）ｖｃ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣおよびｍｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの一般的な分子構造を、以下に表す。
【００５５】
【化１】
2018538368.tif 000002
【００５６】
【化２】
2018538368.tif 000003
【００５７】
一態様において、本発明は、リンカー薬物がデュオカルマイシン誘導体を含むＡＤＣに関する。
【００５８】
ストレプトマイセス種の培養液から最初に単離されたデュオカルマイシンは、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡおよびＣＣ−１０６５を含む抗腫瘍抗生物質ファミリーのメンバーである。デュオカルマイシンは、ＤＮＡの副溝に結合し、その後、ＤＮＡの不可逆的なアルキル化を引き起こす。これにより、核酸構造が破壊され、最終的に腫瘍細胞死がもたらされる。
【００５９】
ＷＯ２０１１／１３３０３９は、ＣＣ−１０６５のデュオカルマイシン誘導体を含む一連のリンカー薬物を開示する。本発明により使用される適切なリンカー−デュオカルマイシン誘導体については、１８２〜１９７頁に開示されている。これら多数のリンカー薬物の化学合成については、ＷＯ２０１１／１３３０３９の例１〜１２に記述されている。
【００６０】
一態様において、本発明は、式（Ｉ）のＡＤＣに関し、
【００６１】
【化３】
2018538368.tif 000004
【００６２】
式中、
「抗５Ｔ４抗体」は、ここで開示されるＨＣまたはＬＣにおいて少なくとも１つの操作されたシステインを有さないまたは有する、本発明による抗５Ｔ４抗体であり、
ｎは、０〜３、好ましくは０〜１であり、
ｍは、１〜６、好ましくは１〜４の平均ＤＡＲを表し、
Ｒ1は、
【００６３】
【化４】
2018538368.tif 000005
【００６４】
から選択され、
ｙは、１〜１６であり、
Ｒ2は、
【００６５】
【化５】
2018538368.tif 000006
【００６６】
から選択される。
【００６７】
好ましい態様において、式（Ｉ）のＡＤＣは、リンカー薬物が、操作されたシステインを介して抗５Ｔ４抗体に部位特異的にコンジュゲートされている、ＨＣまたはＬＣにおいて少なくとも１つの操作されたシステインを含む、本発明による抗５Ｔ４抗体を含む。好ましくは、操作されたシステインは、ＨＣ４０、４１もしくは８９位またはＬＣ４０もしくは４１位、より好ましくはＨＣ４１位またはＬＣ４０もしくは４１位、最も好ましくはＨＣ４１位である。
【００６８】
本明細書に示される構造式において、ｎは、０〜３の整数を表し、一方、ｍは、１〜６の平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）を表す。当技術分野において周知であるように、ＤＡＲおよび薬物搭載量分布は、たとえば、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）または逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用することにより決定できる。ＨＩＣは、平均ＤＡＲを決定するのに特に適している。
【００６９】
本発明による式（Ｉ）のＡＤＣは、当業者に周知の方法および手順によって得ることができる。
【００７０】
デュオカルマイシンリンカー薬物の非特異的（ランダムな）コンジュゲーション（すなわち、天然のシステインに対するコンジュゲーション）のための適切な方法は、ＷＯ２０１１／１３３０３９の例１５に開示され、他方で、Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １７（２００６）：１１４−１２４は、ｍｃ−ＭＭＡＦとの非特異的コンジュゲーションを記述する。
【００７１】
リンカー薬物を部位特異的にコンジュゲートする適切な方法は、たとえば、抗体にリンカー薬物ｖｃ−ＭＭＡＥを（部分的に）搭載するための完成した還元戦略について記述しているＷＯ２００５／０８４３９０の例７および８、ならびにリンカー薬物を含むマイタンシン（ＤＭ１）の部位特異的コンジュゲーションについて記述しているＷＯ２００６／０３４４８８の例１１および１２に見ることができる。
【００７２】
特定の態様において、本発明は、先に開示した式（Ｉ）のＡＤＣに関し、式中のｎは、０〜１であり、ｍは、１〜６、好ましくは１〜４、より好ましくは１〜２、なお一層好ましくは１．５〜２、最も好ましくは１．８〜２の平均ＤＡＲを表し、
Ｒ1は、
【００７３】
【化６】
2018538368.tif 000007
【００７４】
から選択され、
ｙは、１〜１６、好ましくは１〜４であり、
Ｒ2は、
【００７５】
【化７】
2018538368.tif 000008
【００７６】
から選択される。
【００７７】
特定の態様において、本発明は、先に開示した構造式（Ｉ）のＡＤＣに関し、式中のｎは、０〜１であり、ｍは１．５〜２、好ましくは１．８〜２の平均ＤＡＲを表し、Ｒ1は、
【００７８】
【化８】
2018538368.tif 000009
【００７９】
であり、
ｙは、１〜４であり、Ｒ2は、
【００８０】
【化９】
2018538368.tif 000010
【００８１】
から選択される。
【００８２】
特に好ましい態様において、本発明は式（ＩＩ）のＡＤＣに関し、
【００８３】
【化１０】
2018538368.tif 000011
【００８４】
式中の「抗５Ｔ４抗体」は、ここで開示されるＨＣまたはＬＣにおいて少なくとも１つの操作されたシステインを有さないまたは有する、本発明による抗５Ｔ４抗体であり、ｍは１．５〜２、好ましくは１．８〜２の平均ＤＡＲを表す。
【００８５】
好ましい態様において、式（ＩＩ）のＡＤＣは、リンカー薬物が、操作されたシステインを介して抗体に部位特異的にコンジュゲートされている、ＨＣまたはＬＣにおいて少なくとも１つの操作されたシステインを含む、本発明による抗５Ｔ４抗体を含む。好ましくは、前記操作されたシステインは、ＨＣ４０、４１もしくは８９位またはＬＣ４０もしくは４１位、より好ましくはＨＣ４１位またはＬＣ４０もしくは４１位、最も好ましくはＨＣ４１位である。
【００８６】
好ましい態様において、本発明は：
ａ．  配列番号１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｂ．  配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
ｃ．  配列番号１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列
からなる群から選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ  ＣＤＲを含む抗５Ｔ４抗体を含む式（ＩＩ）のＡＤＣに関する。
【００８７】
より好ましい態様において、本発明は：
ａ．  配列番号４０のＨＣアミノ酸配列および配列番号５１のＬＣアミノ酸配列；
ｂ．  配列番号４１のＨＣアミノ酸配列および配列番号５１のＬＣアミノ酸配列；
ｃ．  配列番号４２のＨＣアミノ酸配列および配列番号４９のＬＣアミノ酸配列；
ｄ．  配列番号４３のＨＣアミノ酸配列および配列番号５０のＬＣアミノ酸配列；
ｅ．  配列番号３８のＨＣアミノ酸配列および配列番号４７のＬＣアミノ酸配列；ならびに
ｆ．  配列番号３９のＨＣアミノ酸配列および配列番号４８のＬＣアミノ酸配列
からなる群から選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含むヒト化抗５Ｔ４抗体を含む式（ＩＩ）のＡＤＣに関する。
【００８８】
なお一層好ましい態様において、本発明は、リンカー薬物が、操作されたシステインを介して抗５Ｔ４抗体に部位特異的にコンジュゲートされている、ＨＣ４０および４１ならびにＬＣ４０および４１から選択される１つ以上の位置に少なくとも１つの操作されたシステインを含む本発明による抗５Ｔ４抗体を含む式（ＩＩ）のＡＤＣに関する。好ましくは、前記操作されたシステインは、ＨＣ４１またはＬＣ４０もしくは４１位、最も好ましくはＨＣ４１位にある。
【００８９】
最も好ましい態様において、本発明は：
ａ．  配列番号６１のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号５１のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｂ．  配列番号６２のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号５１のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｃ．  配列番号６３のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４９のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｄ．  配列番号６４のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号５０のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｅ．  配列番号５９のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４７のＬＣＶＲアミノ酸配列；ならびに
ｆ．  配列番号６０のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号４８のＬＣＶＲアミノ酸配列
からなる群から選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含むヒト化抗５Ｔ４抗体を含み；
ここで、リンカー薬物は、ＨＣ４１位での操作されたシステインを介して抗５Ｔ４抗体に部位特異的にコンジュゲートされる、式（ＩＩ）のＡＤＣに関する。
【００９０】
本発明は、先に記述した抗５Ｔ４抗体または抗５Ｔ４  ＡＤＣおよび１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物にさらに関する。治療用タンパク質、たとえばｍＡｂおよび（モノクローナル）ＡＤＣの典型的な医薬製剤は、静脈内注入前に（水性）溶解（すなわち、再構成）を必要とする凍結乾燥ケーキ（凍結乾燥した粉末）、または使用前に解凍を必要とする凍結（水性）溶液の形態をとる。
【００９１】
一般に、医薬組成物は凍結乾燥ケーキの形態で提供される。本発明による医薬組成物（凍結乾燥前）に含めるのに適切な薬学的に許容できる賦形剤には、緩衝液（たとえば水に塩を含有するクエン酸塩、ヒスチジンまたはコハク酸塩）、凍結乾燥保護剤（たとえばスクロース、トレハロース）、張性調節剤（たとえば塩化ナトリウム）、界面活性剤（たとえばポリソルベート）および増量剤（たとえばマンニトール、グリシン）が含まれる。冷凍乾燥タンパク質製剤に使用する賦形剤は、凍結乾燥プロセスの間および貯蔵の間のタンパク質変性を防止する能力に対して選択される。たとえば、Ｋａｄｃｙｌａ（商標）（Roche）の滅菌し、凍結乾燥した粉末の単回使用製剤は、注射用の静菌または滅菌水（ＢＷＦＩまたはＳＷＦＩ）で再構成した際に、ｐＨ５．０で２０ｍｇ／ｍＬ  ａｄｏ−トラスツズマブエムタンシン、０．０２％重量／体積ポリソルベート２０、１０ｍＭコハク酸ナトリウムおよび６％重量／体積スクロースを含有する。
【００９２】
本発明は、薬剤として使用する先に記述した抗５Ｔ４抗体、ＡＤＣまたは医薬組成物にさらに関する。
【００９３】
一態様において、本発明は、ヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍、好ましくはヒト固形腫瘍の治療に使用する先に記述した抗５Ｔ４抗体、ＡＤＣまたは医薬組成物に関する。
【００９４】
好ましい態様において、本発明は、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、卵巣癌、肺癌［特に非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）］、ならびに（悪性胸膜）中皮腫からなる群から選択されるヒト固形腫瘍の治療に使用するための、先に記述した抗５Ｔ４抗体、ＡＤＣまたは医薬組成物、特にデュオカルマイシン誘導体リンカー薬物を含むＡＤＣに関する。
【００９５】
さらなる態様において、本発明は、ヒト血液悪性腫瘍、特に急性リンパ性および骨髄性白血病（それぞれＡＬＬおよびＡＭＬ）からなる群から選択される白血病の治療に使用するための、先に記述した抗５Ｔ４抗体、ＡＤＣまたは医薬組成物、特にデュオカルマイシン誘導体リンカー薬物を含むＡＤＣに関する。
【００９６】
本発明は、先に記述したヒト固形腫瘍ならびに血液悪性腫瘍の治療のため、先に記述した抗５Ｔ４抗体、抗５Ｔ４  ＡＤＣもしくは医薬組成物と５Ｔ４抗原以外の癌関連標的に対する、治療抗体、化学療法剤および／またはＡＤＣとの連続してまたは同時に投与される組合せの使用にさらに関する。
【００９７】
本発明の一態様において、特にデュオカルマイシン誘導体リンカー薬物を含む抗５Ｔ４  ＡＤＣの場合、治療抗体は、ベバシズマブ、セツキシマブ、ニボルマブ、もしくはラムシルマブであり、化学療法剤は、アルキル化剤、特にシクロホスファミド、イホスファミドもしくはトリアジン、特にテモゾロミド、または白金製剤、とりわけシスプラチンもしくはカルボプラチン、代謝拮抗薬、特にゲムシタビンもしくはペメトレキセド、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、特にエトポシド、分裂抑制因子、特にタキサン、とりわけパクリタキセルもしくはドセタキセル、またはビンカアルカロイド、とりわけビンブラスチンもしくはビノレルビン、またはシグナル伝達カスケード阻害剤、特にチロシンキナーゼ阻害剤、とりわけイマチニブ、エルロチニブ、セリチニブ、クリゾチニブもしくはアファチニブである。
【００９８】
本発明のさらなる態様において、特にデュオカルマイシン誘導体リンカー薬物を含む抗５Ｔ４  ＡＤＣの場合、治療抗体は、ベバシズマブであり、化学療法剤は、アルキル化剤、特にナイトロジェンマスタード、特にイホスファミドもしくはシクロホスファミド、白金製剤、特にシスプラチンもしくはカルボプラチン、またはトリアジン、特にテモゾロミド、抗腫瘍抗生物質、特にドキソルビシン、代謝拮抗薬、特にゲムシタビン、トポイソメラーゼＩもしくはＩＩ阻害剤、特にトポテカン、イリノテカンもしくはエトポシド、または分裂抑制因子、特にタキサン、とりわけパクリタキセルもしくはドセタキセル、またはビンカアルカロイド、とりわけビンクリスチンもしくはビノレルビンである。
【００９９】
本発明のなおさらなる態様において、特にデュオカルマイシン誘導体リンカー薬物を含む抗５Ｔ４  ＡＤＣの場合、治療抗体は、アマツキシマブであり、化学療法剤は、アルキル化剤、特に白金製剤、とりわけシスプラチンまたはカルボプラチン、代謝拮抗薬、特にゲムシタビンもしくはペメトレキセド、または分裂抑制因子、特にビンカアルカロイド、とりわけビノレルビンである。
【０１００】
本発明による抗５Ｔ４抗体またはＡＤＣの治療上有効な量は、約０．０１〜約１５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、特に約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、とりわけ約０．３〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。この後者の範囲は、抗体またはＡＤＣ２０〜８００ｍｇの範囲のフラット用量（flat dose）におよそ対応する。本発明の化合物は、毎週、隔週、三週毎、毎月、または六週毎に投与してもよい。適切な治療計画は、疾患の重症度、患者の年齢、投与されている化合物および主治医により考慮される他の因子に応じる。
【０１０１】
［実施例］
免疫プロトコールおよび選択
ウサギを、ｈｕ  ５Ｔ４／ｃｙｎｏ５Ｔ４タンパク質（２ウサギ）およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（２ウサギ）の混合物で繰り返し免疫した。約２０ｍｌの血液を、異なる時点で採集した。単一のＢ細胞を、マイクロタイタープレートの単一ウェルに納めた。これらのＢ細胞を、馴化培地およびフィーダー細胞の存在下で数日培養した。この時間の間に、それらは、モノクローナル抗体を産生し、培養培地に放出（Ｂ細胞上清）した。これらの単一Ｂ細胞の上清をＩｇＧ産生について分析し、その後、ｈｕおよびｃｙｎｏ  ５Ｔ４抗原の特異的な結合および５Ｔ４発現ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の結合を決定した。１６０のＢ細胞上清を、選択し、配列決定した（これらの抗体は、ヒトおよびｃｙｎｏ  ５Ｔ４抗原の両方におよびＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞に結合したので）。抗体の重鎖および軽鎖の１３１の固有な可変領域を得て、遺伝子を合成し、ＩｇＧ１サブクラスのヒト免疫グロブリン定常部にクローニングした。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｔｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  Ｅｖｏプラットホームにおける自動化された手順を使用して免疫グロブリン配列含有プラスミドで一過性にトランスフェクトした。免疫グロブリンを、プレートオートサンプラーを備えたＤｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  ＨＰＬＣシステムにおいて親和性精製（プロテインＡ）を使用して細胞上清から精製した。生産性が非常に低い４つのサンプルを除外し、トータル数で１２７の抗体を再試験した。抗体を、それらのヒトおよびｃｙｎｏ  ５Ｔ４抗原との特異的な結合に基づいておよびヒト５Ｔ４発現ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞に対する結合に関して選択した。
【０１０２】
ｈｕおよびｃｙｎｏ  ５Ｔ４抗原への結合を、以下の手順により決定した。Ｈｕまたはｃｙｎｏ  ５Ｔ４抗原を、３８４形式のマイクロタイタープレートに被覆した。参照抗体、Ｂ細胞上清または組換えにより産生された抗体を添加し、結合を抗ウサギまたはヒト−ＰＯＤ抗体を介して検出した。
【０１０３】
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞への結合に関して、細胞を黒色細胞培養マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。Ｂ細胞上清または参照抗体に由来する特異的な抗体を、細胞と相互作用させた。結合を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識抗体を使用して検出した。蛍光を、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）装置を使用して読み取った。
【０１０４】
１７の抗体を選択し、５Ｔ４抗原に対する親和性を、ヒトまたはｃｙｎｏ  ５Ｔ４抗原を発現している、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞、ＰＡ−１細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）哺乳動物細胞を使用して測定した（表２）。現在の出願において、利用されたＣＨＯ細胞はＣＨＯＺＮと呼ばれ、その理由は、これらのヒトまたはｃｙｎｏ  ５Ｔ４抗原を発現しているＣＨＯ細胞を、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＣＨＯＺＮ（登録商標）プラットホームを使用して得たからである。ＣＨＯＺＮ細胞（ＳＡＦＣ）を、製造業者の説明書にしたがってＡｍａｘａ  ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置（Ｌｏｎｚａ）を使用して一過性にトランスフェクトした。標準の市販の哺乳動物発現ベクター（ＳＡＦＣ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した、これは、ヒトＣＭＶプロモーターが先行する、完全長ヒトおよびｃｙｎｏ  ５Ｔ４抗原コード配列（それぞれ受託番号ＮＰ＿００６６６１．１およびＱ４Ｒ８Ｙ９に従う）を含有する。一過性にトランスフェクトされたＣＨＯＺＮ細胞を、抗体結合研究に使用する前に、製造業者の説明書にしたがって培養した。１７の選択された抗体は、以下の表（表１）にしたがってアミノ酸配列により特徴付けられる。
【０１０５】
【表１】
2018538368.tif 000012
【０１０６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ親和性プロトコール
ヒトまたはｃｙｎｏ  ５Ｔ４抗原を発現している、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞、ＰＡ−１細胞またはＣＨＯＺＮ細胞（１００，０００細胞／９６ウェルプレート中のウェル）を、０．２％体積／重量ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および０．０２％体積／重量ＮａＮ3（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有している氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（１ｘＰＢＳ（Lonza））で３回洗浄し、続いて氷冷ＦＡＣＳ緩衝液中に希釈した各一次ｍＡｂ（５０μｌ／ウェル）の濃度範囲を加えた。４℃で３０分間のインキュベーション後に、細胞を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、５０μｌ／ウェルの二次ｍＡｂ（ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ'）2断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＡＰＣ、１：６，０００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を添加した。４℃で３０分後に、細胞を２回洗浄し、１５０μｌ  ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。蛍光強度を、フローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ、Ｆａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）により決定し、中央蛍光強度（ＭＦＩ）として示した。曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄプリズム（Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）のためのバージョン５．０１／６．０１、ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）において、可変的な傾き（４つのパラメータ）でのＳ字用量反応式を使用して非線形回帰により近似した。ＥＣ50値をμｇ／ｍｌにおける濃度として計算した、これは４パラメータロジスティック近似が使用される際に、曲線の最下位乃至最上位の中間点の応答を与える。
【０１０７】
ヒト５Ｔ４抗原（ｈｕ  ５Ｔ４）発現ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞において測定されたキメラ抗体の親和性は、０．０４０μｇ／ｍｌから０．７３０μｇ／ｍｌのＥＣ50の範囲にあり、０．１９μｇ／ｍｌであるＨ８のＥＣ５０値に匹敵する。しかしながら、Ａ１抗体は、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞において測定されたとおり、より低い親和性（ＥＣ50値は４．７２μｇ／ｍｌである）でｈｕ  ５Ｔ４に対する結合性を呈する。ｈｕ  ５Ｔ４に対するキメラ抗体の親和性も、ｈｕ  ５Ｔ４を発現しているＰＡ−１細胞においておよびＣＨＯＺＮ細胞において測定した。キメラ抗体のＥＣ50値はやはりＨ８のＥＣ50値と同じ範囲であったが、Ａ１はｈｕ  ５Ｔ４に対して少なくとも３分の１低い結合親和性を示した（表２）。ｈｕ  ５Ｔ４を発現している３つの細胞タイプにおけるＡ３のＥＣ50値は、対応する細胞タイプにおけるキメラ抗体のＥＣ50値よりも低かった。
【０１０８】
キメラ抗５Ｔ４抗体は、表２において示されるとおり、ｈｕ  ５Ｔ４を発現しているＣＨＯＺＮまたはｃｙｎｏ  ５Ｔ４を発現しているＣＨＯＺＮ細胞を使用して測定される際に、ｈｕ  ５Ｔ４に対しておよびｃｙｎｏ  ５Ｔ４に対して類似する親和性を有する。その結合は、ｃｙｎｏ  ５Ｔ４に対するＨ８の結合と比較して、８４６（１０倍）および８２８（７倍）を除き、たいていのキメラ抗体に関して３２倍の改善を示す。
【０１０９】
【表２−１】
2018538368.tif 000013
【０１１０】
【表２−２】
2018538368.tif 000014
【０１１１】
ヒト化
ヒト化抗体を、以下に記載される通り、ＣＤＲ移植により調製した。
【０１１２】
クローン  ７８９、８２５および８３３のＣＤＲを、ナンバリングシステムＩＭＧＴ（ＬＥＦＲＡＮＣ、ＭＰ、Ｔｈｅ  ＩＭＧＴ  ｕｎｉｑｕｅ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ、Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｇ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ．  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ、７（１９９９）、ｐｐ．１３２−１３６））およびＫａｂａｔからのＣＤＲ定義を使用して同定した。
【０１１３】
ヒトＩｇＧ配列のオンライン公共データベースをＢＬＡＳＴ探索アルゴリズムを使用してウサギＶＨドメインを使用して検索し、候補ヒト可変ドメインをＢＬＡＳＴの上位２００の結果から選択した。５つの候補を、鍵となるフレームワーク残基、基準的なループ構造および免疫原性を維持する、判定基準、たとえばフレームワーク相同性に基づいて選択した。同じ手順を、抗体のＶＬドメインに関して繰り返した。全てのヒト化ＶＨバリアントを全てのヒト化ＶＬバリアントと組み合わせて、各抗体について２５のヒト化バリアントを得た。
【０１１４】
ＨＣ−４１Ｃ変異を含むヒト化バリアントを、以下の手順にしたがって合成し、それらのヒトおよびｃｙｎｏ  ５Ｔ４に対する親和性を、ヒトまたはｃｙｎｏ  ５Ｔ４のいずれかを発現しているＣＨＯＺＮ細胞を使用して測定した。１１のバリアントを、さらなる評価のため選択した。
【０１１５】
抗体の一過性発現
ａ）ｃＤＮＡ構築物および発現ベクターの調製
ＵＳ８０４４１７８からのマウスＡ１アミノ酸配列のＨＣＶＲ（配列番号２、２０−１３８位）、ＵＳ８０４４１７８からのマウスＡ３アミノ酸配列のＨＣＶＲ（配列番号１０、２０−１４１位）、および配列番号５２からのＨ８ヒト化バリアント１アミノ酸配列のＨＣＶＲを、ＨＡＶＴ２０リーダー配列（配列番号５４）に対してＮ末端におよび配列番号５５によるヒトＩｇＧ１  ＨＣの定常ドメインに対してＣ末端に各々接合した。得られたキメラアミノ酸配列を、ヒト細胞（ヒト（Homo sapiens））における発現用に最適化したｃＤＮＡ配列コドンに逆翻訳した。
【０１１６】
同様に、構築物のＬＣについてのキメラｃＤＮＡ配列を、適切な分泌シグナルの配列（またＨＡＶＴ２０リーダー配列）、ＵＳ８０４４１７８からのマウスＡ１アミノ酸配列のＬＣＶＲ（配列番号４、２１−１２７位）、ＵＳ８０４４１７８からのマウスＡ３アミノ酸配列のＬＣＶＲ（配列番号１２、２１−１２７位）、またはＨ８ヒト化バリアント１アミノ酸配列  配列番号５３のＬＣＶＲ、およびヒトＩｇＧ  κ軽鎖定常領域（配列番号５６）を接合すること、ならびにヒト細胞（ヒト）における発現用に最適化したｃＤＮＡ配列コドンに得られたアミノ酸配列を逆翻訳することにより、得た。
【０１１７】
ＨＣ−４１Ｃ変異を有するヒト化バリアントのＬＣおよびＨＣについてのｃＤＮＡ配列を、類似する手順を使用して得たが、この場合、ＨＣおよびＬＣ配列を、ウサギリーダー配列（それぞれ配列番号５７および５８）に対しＮ末端におよび配列番号５５によるヒトＩｇＧ１  ＨＣの定常ドメインに対しＣ末端に接合した。ＫａｂａｔナンバリングによるＨＣＶＲの４１位でのシステインを有する、以下の表による配列を使用した（表３）。
【０１１８】
【表３】
2018538368.tif 000015
【０１１９】
ｂ）ベクター構築およびクローニング戦略
抗体鎖の発現に関して、市販（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）の哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．３の誘導体を使用した、これはＣＭＶ：ＢＧＨｐＡ発現カセットを含有する。このベクターを、ＣＭＶプロモーターの下流のマルチプルクローニングサイトを変えることにより、わずかに適合させて、ＡｓｃＩおよびＮｈｅＩ制限部位を含有させ、発現ベクター００８０ｐｃＤＮＡ３．３−ＳＹＮを生じさせた。
【０１２０】
構築物のＨＣおよびＬＣについてのｃＤＮＡを、ＡｓｃＩおよびＮｈｅＩ制限部位を使用して００８０ｐｃＤＮＡ３．３−ＳＹＮベクターに直接的にライゲーションした。ＨＣまたはＬＣ発現カセット（それぞれＣＭＶ：ＨＣ：ＢＧＨｐＡ  ａｎｄ  ＣＭＶ：ＬＣ−ＢＧＨｐＡ）のいずれかを含有する最終的なベクターを、大腸菌（E.coli）ＮＥＢ５−アルファ細胞に移し、増やした。トランスフェクション用の最終的な発現ベクターの大規模産生を、ＭａｘｉまたはＭｅｇａｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して実行した。
【０１２１】
ｃ）哺乳動物細胞における一過性発現
市販のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を、以下の通り、製造業者の説明書にしたがってＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション剤を使用して発現ベクターでトランスフェクトした：細胞７５ｘ１０7個を３００ｍＬ  ＦｏｒｔｉＣＨＯ培地に播種し、３００μｇの発現ベクターを８００μｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション剤と組み合わせ、細胞に添加した。トランスフェクションの１日後に、Ｅｎｈａｎｃｅｒ１  １．５ｍＬおよびＥｎｈａｎｃｅｒ２  １５ｍＬを培養に添加した。トランスフェクションの６日後に、細胞培養上清を、４，０００ｇで１５分間遠心分離することにより採取し、清澄な採取物をＰＥＳボトルフィルタ／ＭＦ７５フィルタ（Ｎａｌｇｅｎｅ）によりろ過した。
【０１２２】
細胞ベースアッセイを使用する親和性測定
ヒト化抗５Ｔ４抗体は、ｈｕ  ５Ｔ４と比較してｃｙｎｏ  ５Ｔ４に対して２から３分の１低い結合を示す、８２５ａ、８２５ｂおよび８２５ｃヒト化抗５Ｔ４抗体を除き、ｈｕ  ５Ｔ４またはｃｙｎｏ  ５Ｔ４のいずれかを発現しているＣＨＯＺＮ細胞において測定されたとおり、ｈｕ  ５Ｔ４およびｃｙｎｏ  ５Ｔ４に対して類似する親和性を有する（表４）。ｃｙｎｏ  ５Ｔ４に対するＨ８の結合と比較して、結合は、ヒト化抗５Ｔ４抗体に関して４から１７倍改善される。Ａ１と比較して、結合は、同様に改善される。ｈｕ  ５Ｔ４発現ＣＨＯＺＮ細胞に対するヒト化抗５Ｔ４抗体の親和性は、Ｈ８に匹敵する。
【０１２３】
【表４】
2018538368.tif 000016
【０１２４】
一般的な部位特異的コンジュゲーション手順
システイン操作した抗５Ｔ４抗体（４．２ｍＭヒスチジン、５０ｍＭトレハロース、ｐＨ６中に５〜１０ｍｇ／ｍｌ）の溶液にＥＤＴＡ（水に２５ｍＭ、４％体積／体積）を添加した。ＴＲＩＳ（水に１Ｍ、ｐＨ８）を使用してｐＨをおよそ７．４に調整し、その後ＴＣＥＰ（水に１０ｍＭ、２０当量）を添加し、得られた混合物を室温で１〜３時間インキュベートした。過剰なＴＣＥＰを、ＰＤ−１０脱塩カラムまたは４．２ｍＭヒスチジン、５０ｍＭトレハロース、ｐＨ６を使用するＶｉｖａｓｐｉｎ遠心濃縮器（３０ｋＤａ分画、ＰＥＳ）のいずれかにより除去した。ＴＲＩＳ（水に１Ｍ、ｐＨ８）を使用して得られた抗体溶液のｐＨをおよそ７．４に上げ、その後デヒドロアスコルビン酸（水中に１０ｍＭ、２０当量）を添加し、得られた混合物を室温で１〜２時間インキュベートした。ＤＭＡ、続いてリンカー薬物溶液（ＤＭＡに１０ｍＭ）を添加した。ＤＭＡの終濃度は、５〜１０％であった。得られた混合物を、遮光下で、室温で１〜１６時間インキュベートした。過剰なリンカー薬物を除去するために、活性炭を添加し、混合物を室温で１時間インキュベートした。炭を０．２μｍ  ＰＥＳフィルタを使用して除去し、得られたＡＤＣを、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心濃縮器（３０ｋＤａ分画、ＰＥＳ）を使用して４．２ｍＭヒスチジン、５０ｍＭトレハロース、ｐＨ６中に製剤化した。最終的に、ＡＤＣ溶液は、０．２２μｍのＰＥＳフィルタを使用して濾過滅菌した。
【０１２５】
部分的に還元された天然の鎖間ジスルフィド結合システインを介するコンジュゲーションための一般的な（ランダムな）コンジュゲーションプロトコール（野生型またはｗｔコンジュゲーション）
抗５Ｔ４抗体（４．２ｍＭヒスチジン、５０ｍＭトレハロース、ｐＨ６中に５〜１０ｍｇ／ｍｌ）の溶液にＥＤＴＡ（水に２５ｍＭ、４％体積／体積）を添加した。ＴＲＩＳ（水に１Ｍ、ｐＨ８）を使用してｐＨをおよそ７．４に調整し、その後ＴＣＥＰ（水に１０ｍＭ、抗体および所望のＤＡＲに応じて１〜３当量）を添加し、得られた混合物を室温で１〜３時間インキュベートした。ＤＭＡ、続いてリンカー薬物溶液（ＤＭＡに１０ｍＭ）を添加した。ＤＭＡの終濃度は、５〜１０％であった。得られた混合物を、遮光下で、室温で１〜１６時間インキュベートした。過剰なリンカー薬物を除去するために、活性炭を添加し、混合物を室温で１時間インキュベートした。炭を０．２μｍ  ＰＥＳフィルタを使用して除去し、得られたＡＤＣを、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心濃縮器（３０ｋＤａ分画、ＰＥＳ）を使用して４．２ｍＭヒスチジン、５０ｍＭトレハロース、ｐＨ６中に製剤化した。最終的に、ＡＤＣ溶液は、０．２２μｍのＰＥＳフィルタを使用して濾過滅菌した。
【０１２６】
上記の一般的な手順を使用して、ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ（ＳＹＤ９８０；すなわち、ＷＯ２０１１／１３３０３９の２０９頁の例１０にある化合物１８ｂ、ｎ＝１）に基づいてシステイン操作したおよび野生型のＡＤＣを合成し、分析疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、遮蔽疎水性相クロマトグラフィー（Ｓｈｉｅｌｄｅｄ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｐｈａｓｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＳＨＰＣ）、ＲＰ−ＨＰＬＣならびにＬＡＬエンドトキシン−試験を使用して特徴づけた。
【０１２７】
分析ＨＩＣの場合、サンプル（１ｍｇ／ｍｌ）５〜１０μＬを、ＴＳＫｇｅｌブチル−ＮＰＲカラム（４．６ｍｍ  ＩＤｘ３．５ｃｍ  Ｌ、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１４９４７）に注入した。溶出方法は、緩衝液Ａ（２５ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．９５）１００％から緩衝液Ｂ（２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．９５、２０％イソプロパノール）１００％に０．４ｍｌ／分での２０分間の直線勾配からなった。ＰＤＡ−検出器およびＥｍｐｏｗｅｒソフトウェアを備えたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｈ−クラスＵＰＬＣシステムを使用した。吸光度を２１４ｎｍで測定し、ＡＤＣの保持時間を決定した。
分析ＨＩＣにより明らかになった通り、異なるシステイン操作したＡＤＣのＤＡＲ２種について保持時間（ＲＴ）に差異があった。同じく、ほとんどの操作されたＡＤＣのＤＡＲ２種のＲＴは、ｗｔ  Ｈ８コンジュゲートのＲＴよりも低く（表５）、２つのリンカー薬物のコンジュゲーションの際の保持時間における増加（ＲＴDAR2−ＲＴDAR0）は、ｗｔ  Ｈ８−ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡについての増加と比較してＨＣ−４１Ｃ操作したヒト化ＡＤＣに関してより低い。全ての操作されたヒト化ＡＤＣは２．１〜３．１のＲＴDAR2−ＲＴDAR0値を有し、これは３．５のｗｔ  Ｈ８−ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡのＲＴDAR2−ＲＴDAR0値よりも低く、操作されたヒト化ＡＤＣが疎水性低下を呈することを示している。
【０１２８】
【表５】
2018538368.tif 000017
【０１２９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性
（部位特異的な）抗５Ｔ４  ＡＤＣの抗原結合親和性は、ｈｕ  ５Ｔ４またはｃｙｎｏ  ５Ｔ４のいずれかを発現しているＣＨＯＺＮ細胞において測定されたとおり、結合したデュオカルマイシン誘導体リンカー薬物により影響を受けなかった（図１および２）。予測されたとおり、結合しない対照ＡＤＣ（リツキシマブ−ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ）は、高濃度でだけ５Ｔ４−発現腫瘍細胞の増殖に効果を有していた。全てのヒト化抗５Ｔ４  ＡＤＣは、５Ｔ４−陰性ヒト腫瘍細胞系であるＳＫ−ＭＥＬ−３０（細胞当たり約４００の５Ｔ４抗原結合部位）において不活性であった（ＩＣ50＞１０ｎＭ）。
【０１３０】
操作されたヒト化抗５Ｔ４  ＡＤＣの効力は、ｈｕ  ５Ｔ４−発現ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞およびＰＡ−１細胞における、従来通りコンジュゲートしたＨ８−ｗｔ  ＡＤＣの効力に匹敵した（表６）。しかしながら、８３３−ＡＤＣシリーズは、ＰＡ−１細胞生存率を完全に減少させることができなかった（有効性６５から７２％）。さらに、操作されたヒト化抗５Ｔ４  ＡＤＣは、Ａ３−ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡよりも２．５倍を超えて強力であり、Ａ１−ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡよりも１４倍超強力であった。
【０１３１】
【表６−１】
2018538368.tif 000018
【０１３２】
【表６−２】
2018538368.tif 000019
【０１３３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性研究
抗５Ｔ４  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を、Ｂ６；Ｄ２−Ｃｅｓ１ｃe  Ｆｏｘｎ１nu／ＪマウスにおけるＢＴ４７４（６０齢白人女性患者からの侵襲性腺管乳癌）細胞系異種移植片モデルにおいて評価した。免疫組織化学的な染色は、ＢＴ４７４細胞系の細胞膜においてｈｕ  ５Ｔ４の存在を確認した。
【０１３４】
γ−線源（２Ｇｙ、60Ｃｏ、ＢｉｏＭｅｐ、Ｄｉｊｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）での全身照射の２４から７２時間後、１１０の雌性Ｃｅｓ１ｃeヌードマウスの右の側腹部に、マトリゲル（５０：５０、体積：体積）を含有している２００μＬ  ＲＰＭＩ１６４０培地中の２ｘ１０7個のＢＴ−４７４細胞を注射することにより、腫瘍を皮下に誘導した。腫瘍が２００−３００ｍｍ3の平均体積に達したら、マウスは３  ｍｇ／ｋｇのＨ８−、８３３ａ−、８３３ｂ−、８３３ｃ−、８３３ｄ−、８２５ａ−または８２５ｃ−ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ  ＡＤＣの単回投与を投与された。媒体および結合しないリツキシマブ−ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ  ＡＤＣを、対照として使用した。血漿においてＣｅｓ１ｃ活性を有するマウスを、分析から除外した。
【０１３５】
全ての部位特異的にコンジュゲートした抗５Ｔ４  ＡＤＣは、先行技術のＨ８−ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡよりも腫瘍体積を減少させており（図３）、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性の改善を示している。
【０１３６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態
薬物動態研究を、Ｂ６（Ｃｇ）−Ｃｅｓ１ｃtm1.1Loc／Ｊマウス系統において抗５Ｔ４  ＡＤＣで実行した。これらのマウスは、Ｃｅｓ１ｃ遺伝子のエキソン５を欠いており、酵素の機能の無効をもたらす。マウスは抗５Ｔ４  ＡＤＣ（３ｍｇ／ｋｇ、尾静脈における静脈注射）を投与され、血漿を投薬後０．２５、１、６、２４、４８、９６、１６８、３３６、および５０４時間に採集した。ＥＬＩＳＡ−ベースアッセイを使用して、全抗体およびコンジュゲートした抗体を定量した。コンジュゲートした抗体アッセイは、少なくとも１つのリンカー薬物を含有するＡＤＣ種を捕獲する。表７に提示される結果は、部位特異的なＡＤＣが、非常に安定であり、緩徐にクリアランスされ、先行技術のＨ８−ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ  ＡＤＣよりも長い半減期を有することを示す。
【０１３７】
【表７】
2018538368.tif 000020
【０１３８】
ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列中の下線が引かれたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列を有する配列表
配列番号１（クローンのＨＣＶＲ／ウェル７８９−ウサギ）
1   QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTASGFSLSS YWMSWVRQAP GKGLEWIGII
51   AGRGSTYYAS WAKGRCTISK TSTTVDLKIT SPTTEDTAAY FCARVSSIYY
101   TFNLWGQGTL VTVSS
配列番号２（クローンのＬＣＶＲ／ウェル７８９−ウサギ）
1   AQVLTQTPSS VSAAVGGTVT INCQSSQSVY SNNELSWYQQ KPGQPPKLLI
51   YYASTLASGV PSRFKGSGSG TQFTLTISGV QSDDAATYYC QGSYYSGSGW
101   YYAFGGGTEVVVK
配列番号３（クローンのＨＣＶＲ／ウェル８１１−ウサギ）
1   QSVEESGGRL VTPGTSLTLT CTASGFSLST YAMIWVRQAP GKGLEWIGII
51   NSSGYTYYAN WAKGRFTISK TSTTVDLKIT SPTTEDTATY FCARGNAGIS
101   YDVSFNLWGQ GTLVTVSS
配列番号４（クローンのＬＣＶＲ／ウェル８１１−ウサギ）
1   AYDMTQTPAS VEAGVGGTVT INCQASESIS SWLAWYQQKP GQPPNLLIYE
51   ASKLASGVPS RFSGSGSGTE FTLTISGVES ADAATYYCQQ GWTSSNIDNA
101   FGGGTEVVVK
配列番号５（クローンのＨＣＶＲ／ウェル８２５−ウサギ）
1   QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGIDLSS YGMGWVRQAP GKGLEYIGII
51   SRNSVTYYAT WAKGRFTISK TSTTVDLKMT SPTTEDTATY FCARRATYSG
101   ALGYFDIWGP GTLVTVSF
配列番号６（クローンのＬＣＶＲ／ウェル８２５−ウサギ）
1   GYDMTQTPAS VSAAVGGTVT INCQASENIY STLAWYQQKP GQPPKVLIYD
51   AFDLASGVPS RFKGSGSGTE YTLTISGVQS DDAATYYCQQ GYSGTNVDNA
104   FGGGTEVVVK
配列番号７（クローンのＨＣＶＲ／ウェル８２８−ウサギ）
1   QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSEIDLST YAMSWVRQAP GKGLEWIGII
51   SAGGSAYYAS WAKGRFTISR TSTTVDLKMT SLTTEDTATY FCARGAAYAG
101   YTYGFSFFDI WGPGTLVTVS L
配列番号８（クローンのＬＣＶＲ／ウェル８２８−ウサギ）
1   DIVMTQTPSS VSAAVGGTVT INCQASQNIY SNLAWYQQKP GQRPKLLIYG
51   ASNLESGVPS RFKGSGSGTE YTLTISDLES DDAATYYCQS IDYGNNYLGS
101   FGGGTEVVVK
配列番号９（クローンのＨＣＶＲ／ウェル８２９−ウサギ）
1   QSLEESGGRL VTPGTPLTLT CTASGFSLSS YDMSWVRQAP GKGLEYIGWI
51   NSDDGAYYAN WAKGRFTISR TSTTVDLKIT SPTTEDTATY FCARDAGSTY
101   LYGLDPWGPG TLVTVSS
配列番号１０（クローンのＬＣＶＲ／ウェル８２９−ウサギ）
1   DVVMTQTPSS VSAGVGGTVT IKCQASQSIS SYLAWYQQKP GQRPKLLIYA
51   ASTLASGVSS RFKGSGSGTE YTLTINDLES ADAATYYCQC TYYGGTYNTF
101   GGGTEVVVK
配列番号１１（クローンのＨＣＶＲ／ウェル８３３−ウサギ）
1   QSLEESGGGL VTPGGSLTLT CTGSGIDLSH YVVGWVRQAP GKGLEWIGII
51   YGSGRTYYAN WAKGRFTISK TSTTVDLRIA RPTAEDTATY FCARDASVSV
101   YYWGYFDLWG QGTLVTVSS
配列番号１２（クローンのＬＣＶＲ／ウェル８３３−ウサギ）
1   AYDMTQTPVS VEVAVGGTVT IKCQASQSIG SELAWYQQKP GQPPKLLIYR
51   ASTLESGVPS RFSGSGSGTE FTLTISGVES ADAATYYCQQ GYTYSEIDNA
101   FGGGTEVVVK
配列番号１３（クローンのＨＣＶＲ／ウェル８３４−ウサギ）
1   QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGFSLST YSMSWVRQAP GKGLEWIGVI
51   SRGGSAYYAS WAKGRFTISK TSTTVDLKVT SPTTEDTATY FCARGAISSG
101   YYVYDGMDLW GPGTLVTVSS
配列番号１４（クローンのＬＣＶＲ／ウェル８３４−ウサギ）
1   DIVMTQTPGS VEAAVGGTVT IKCQASESIS SYLAWYQQKP GQPPKFLIYS
51   ASTLASGVPS RFKGSGSGTE FTLTISDLES ADAATYYCQC TDYGSDYMGA
101   FGGGTGVVVK
配列番号１５（クローンのＨＣＶＲ／ウェル８３５−ウサギ）
1   QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGIDLSS GAMGWVRQAP GKGLEWIGLI
51   SSSPITYYAN WARGRFTISK TSTTVDLKIT SPTTADTATY FCARGYDDYG
101   EIWFNIWGPG TLVTVSL
配列番号１６（クローンのＬＣＶＲ／ウェル８３５−ウサギ）
1   AIEMTQSPPS LSASVGETVR IRCLAGEDIY SSISWYQQKP GKPPTLLIYG
51   ASNLESGVPP RFSGSGSGTD YTLTIGGVQA EDAATYYCLG GWSYSSSLTF
101   GAGTKVEIK
配列番号１７（クローンのＨＣＶＲ／ウェル８４１−ウサギ）
1   QSLEESGGRL VTPGTPLTLT CKASGFSLS TYWMSWVRQA PGKGLEWIGI
51   MLSYGNTVYA NWAKGRFTIS KTSSTTVDLK ITSPTTEDTA TYFCARGLYG
101   GYPNYGVYDL WGQGTLVTVS S
配列番号１８（クローンのＬＣＶＲ／ウェル８４１−ウサギ）
1   DVVMTQTPAS VEAAVGGTVT IKCQASQSIS SYLSWYQQKP GQPPKLLIYA
51   ASNLASGVSS RFKGSRSGTE YTLTISDLES ADAATYYCQC TDYGSNYVGA
101   FGGGTEVVVK
配列番号１９（クローンのＨＣＶＲ／ウェル８４３−ウサギ）
1   QSLEESGGRL VTPGTPLTLT CTASGFSLNN AYMNWVRQAP GKGLEWIGII
51   NTYGSTYFAT WAKGRFTFSK TSTTVDLKIT SPTTEDTATY FCARAYAPFS
101   TYSHYYGMDL WGPGTLVTVS S
配列番号２０（クローンのＬＣＶＲ／ウェル８４３−ウサギ）
1   DVVMTQTPSS VSAAVGGTVT IKCQASESIG SWLSWYQQKP GQPPKLLIYE
51   ASKLTSGVPS RFKGSGSGTE YTLTISDLES ADAATYYCQY TDYGSNYLGT
101   FGGGTEVVVK
配列番号２１（クローンのＨＣＶＲ／ウェル８４５−ウサギ）
1   QSLEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGIDLSS YTMNWVRQAP GKGLEWIGVI
51   TSHNTYYASW AKGRFTISKT STTVDLKITS PTTEDTATYF CARSNYGSTI
101   YYMGGMDPWG PGTLVTVSS
配列番号２２（クローンのＬＣＶＲ／ウェル８４５−ウサギ）
1   DVVMTQTPAS VSAAVGGTVT INCQASQSIG SYLAWYQHQP GQPPKLLIYS
51   ASTLESGVSS RFEGSRSGTE YTLTISDLDS ADAATYYCQC TDYGASYLGA
101   FGGGTEVVVK
配列番号２３（クローンのＨＣＶＲ／ウェル８４７−ウサギ）
1   QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGFSLSS YDMSWVRQAP GKGLEYIGYI
51   NSDGSAYYAS WAKGRFTISK TSSTTVDLKI TSPTTEDTAT YFCARDAGST
101   YLYGMDPWGP GTLVTVSS
配列番号２４（クローンのＬＣＶＲ／ウェル８４７−ウサギ）
1   DVVMTQTPAS VSEPVGGTVT INCQASQSIY SYLAWYQQKP GQRPKLLIYA
51   ASTLASGVSS RFKGSGSGTQ FTLTISDLES ADAATYYCQC TYYGGTFNTF
101   GGGTEVVVK
配列番号２５（クローンのＨＣＶＲ／ウェル８４８−ウサギ）
1   QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGFSLSS YTMSWVRQAP GKGLEWIGII
51   SSIGSIWYAS WAKGRFTISK TSTTVDLKMT SLTTEDTATY FCARDGTGSK
101   YYTWDRLDLW GQGTLVTVSS
配列番号２６（クローンのＬＣＶＲ／ウェル８４８−ウサギ）
1   NIVMTQTPSP VSGAVGGTVT INCQASQSIY NELSWYQQKP GQPPKLLIYY
51   TSTLASGVSS RFKGSGSGTQ FTLTISGVES VDAATYYCQQ GYSSSDVDNVF
101   GGGTEVVVK
配列番号２７（クローンのＨＣＶＲ／ウェル８４９−ウサギ）
1   QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGFSLSR YDMSWVRQAP GKGLEYIGYI
51   NRDGSAYYAN WAKGRFTISK TSTTVDLKIT SPTTDDTATY FCARHAGSTY
101   LYGMDPWGPG TLVTVSS
配列番号２８（クローンのＬＣＶＲ／ウェル８４９−ウサギ）
1   DVVMTQTPSS VSAAVGGTVT IKCQASQSIS NYLAWYQQKP GQPPKLLIYA
51   ASTLASGVSS RFKGSGSGTE FTLTISDLES ADAATYYCQC TYFGDTYNVF
101   GGGTEVVVK
配列番号２９（クローンのＨＣＶＲ／ウェル８６８−ウサギ）
1   QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTASGFSLSD YTMGWVRQAP GKGLEWIGII
51   NGYGSTYYAN WAKGRFAISK TSTTVDLKIT SPATEDTATY FCARGDTGRT
101   YDMHFNLWGQ GTLVTVSS
配列番号３０（クローンのＬＣＶＲ／ウェル８６８−ウサギ）
1   AYDMTQTPAS VSAAVGGTVT IKCQASESIR SWLAWYQQKP GQPPKLLIYS
51   ASTLASGVSS RFKGSGSGTQ FTLTIGDLES ADAATYYCQQ GYTSSNLDNA
101   FGGGTEVLVK
配列番号３１（クローンのＨＣＶＲ／ウェル８９９−ウサギ）
1   QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGFSLSS YTMSWVRQAP GKGLEYIGII
51   SSSDGTWYAN WVKGRFTISK TSTTVDLKMT SLTTEDTATY FCARDGTGNK
101   YYTWDRLDLW GQGTLVTVSS
配列番号３２（クローンのＬＣＶＲ／ウェル８９９−ウサギ）
1   NIVMTQTPSP VSGAVGGTVT INCQASQSIY NELSWYQQKP GQPPKLLIYY
51   ASTLASGVSS RFKGSGSGTQ FTLTISGVES VDAATYYCQQ GYSSSNVDNV
101   FGGGTEVVVK
配列番号３３（クローンのＨＣＶＲ／ウェル９０８−ウサギ）
1   QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGFSLSN FAMSWVRQAP GKGLEWIGII
51   NGYGSIYYAT WAKGRFTISK TSTTVDLKIT SPTTEDTATY FCARGDAGRT
101   YNHYFNIWGP GTLVTVSL
配列番号３４（クローンのＬＣＶＲ／ウェル９０８−ウサギ）
1   DVVMTQTPAS VEAAVGGTVT IKCQASQSIS SWLSWYQQKP GQRPKLLIYA
51   ASNLASGVPS RFKGSGSGTQ FTLTISDLES DDAATYYCQQ GYTSYNVDNA
101   FGGGTEVVVK
システイン変異の好ましい位置４０、４１および８９に下線が引かれたヒト化ＨＣＶＲアミノ酸配列
配列番号３５（ＨＣＶＲ  ７８９  ヒト化バージョン１）
1   EVKVEESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFSLS SYWMSWVRQA PGKGLEWVSI
51   IAGRGSTYYA SWAKGRFTIS KDNSEGMVYL QMNSLRAEDT AVYYCARVSS
101   IYYTFNLWGQ GTTVTVSS
配列番号３６（ＨＣＶＲ  ７８９  ヒト化バージョン２）
1   EVQLLESGGS LVLPGGSLRL SCAASGFSLS SYWMSWVRQA PGKGLEWVSI
51   IAGRGSTYYA SWAKGRFTIS RDNSKNTLYM QMNSLRAEDT ALYFCARVSS
101   IYYTFNLWGQ GTLVTVSS
配列番号３７（ＨＣＶＲ  ７８９  ヒト化バージョン３）
1   QSVEESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFSLSS YWMSWVRQAP GKGLEWIGII
51   AGRGSTYYAS WAKGRFTISR DNSKNTLYLQ MNSLRAEDTA VYYCARVSSI
101   YYTFNLWGQG TLVTVSS
配列番号３８（ＨＣＶＲ  ８２５  ヒト化バージョン１）
1   EVQLVESGGD LAQPGGSLRL SCAVSGIDLS SYGMGWVRQA PGKGLEWVSI
51   ISRNSVTYYA TWAKGRFTIS RDNSKNTVYL QMTSLRAEDT ALYFCARRAT
101   YSGALGYFDI WGQGTLVTVS S
配列番号３９（ＨＣＶＲ  ８２５  ヒト化バージョン２）
1   EVQLEESGGG LVKPGGSLRL SCAASGIDLS SYGMGWVRQA PGKGLEWVSI
51   ISRNSVTYYA TWAKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCARRAT
101   YSGALGYFDI WGRGTLVTVS S
配列番号４０（ＨＣＶＲ  ８３３  ヒト化バージョン１）
1   EVQLVESGGG LIQPGGSLRL SCAASGIDLS HYVVGWVRQA PGKGLEWVSI
51   IYGSGRTYYA NWAKGRFTIS KDNSKNTLYV RMNSLRAEDT AVYYCARDAS
101   VSVYYWGYFD LWGQGTLVTV SS
配列番号４１（ＨＣＶＲ  ８３３  ヒト化バージョン２）
1   EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDLS HYVVGWVRQA PGKGLEWVSI
51   IYGSGRTYYA NWAKGRFTIS RDNSKNTLFL RMNSLRVEDT AVYFCARDAS
101   VSVYYWGYFD LWGQGTLVTV SS
配列番号４２（ＨＣＶＲ  ８３３  ヒト化バージョン３）
1   EVQLEESGGG LVKPGGSLRL SCAASGIDLS HYVVGWVRQA PGKGLEWVSI
51   IYGSGRTYYA NWAKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCARDAS
101   VSVYYWGYFD LWGRGTLVTV SS
配列番号４３（ＨＣＶＲ領域  ８３３  ヒト化バージョン４）
1   QSLEESGGGL VQPGGSLRLS CAASGIDLSH YVVGWVRQAP GKGLEWIGII
51   YGSGRTYYAN WAKGRFTISR HNSKNTLYLQ MNSLRAEDTA VYYCARDASV
101   SVYYWGYFDL WGQGTLVTV SS
システイン変異の好ましい位置４０および４１に下線が引かれたヒト化ＬＣＶＲアミノ酸配列
配列番号４４（ＬＣＶＲ  ７８９  ヒト化バージョン１）
1   DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCQSSQSVY SNNELSWYQQ KPGQPPKLLI
51   YYASTLASGV PDRFSGSGSG TDFTLTISSL QAEDVAVYYC QGSYYSGSGW
101   YYAFGGGTKL EIK
配列番号４５（ＬＣＶＲ  ７８９  ヒト化バージョン２）
1   EIVLTQSPSS LSASVGDRVT ITCQSSQSVY SNNELSWYQQ KPGKAPKLLI
51   YYASTLASGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QGSYYSGSGW
101   YYAFGQGTKL EIK
配列番号４６（ＬＣＶＲ  ７８９  ヒト化バージョン３）
1   AQVLTQSPSS LSASVGDRVT ITCQSSQSVY SNNELSWYQQ KPGKAPKLLI
51   YYASTLASGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QGSYYSGSGW
101   YYAFGGGTKV EIK
配列番号４７（ＬＣＶＲ  ８２５  ヒト化バージョン１）
1   EIVMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASENIY STLAWYQQKP GKAPKLLIYD
51   AFDLASGVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDFATYYCQQ GYSGTNVDNA
101   FGQGTKLEIK
配列番号４８（ＬＣＶＲ  ８２５  ヒト化バージョン２）
1   GYDMTQSPSS VSASVGDRVT ITCQASENIY STLAWYQQKP GKAPKLLIYD
51   AFDLASGVPS RFKGSGSGTE YTLTISSLQP EDFATYYCQQ GYSGTNVDNA
101   FGGGTKVEIK
配列番号４９（ＬＣＶＲ  ８３３  ヒト化バージョン１）
1   DIQMTQSPST LSASVGDRVT ITCQASQSIG SELAWYQQKP GKAPKLLIYR
51   ASTLESGVPS RFSGSGSGTE FTLTISSLQP DDFATYYCQQ GYTYSEIDNA
101   FGQGTKVEIK
配列番号５０（ＬＣＶＲ  ８３３  ヒト化バージョン２）
1   DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASQSIG SELAWYQQKP GQAPKLLIYR
51   ASTLESGVPS RFSGSGSGTE FTFTISSLQP EDLATYYCQQ GYTYSEIDNA
101   FGQGTKLEIK
配列番号５１（ＬＣＶＲ  ８３３  ヒト化バージョン３）
1   AYDMTQSPSS VSASVGDRVT ITCQASQSIG SELAWYQQKP GKAPKLLIYR
51   ASTLESGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ GYTYSEIDNA
101   FGGGTKVEIK
配列番号５２（Ｈ８  ＨＣ）
1   QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT GYYMHWVKQS PGQGLEWIGR
51   INPNNGVTLY NQKFKDRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARST
101   MITNYVMDYW GQGTLVTVSS
配列番号５３（Ｈ８  ＬＣ）
1   DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKASQSVS NDVAWYQQKP GQSPKLLISY
51   TSSRYAGVPD RFSGSGSGTD FTLTISSLQA EDVAVYFCQQ DYNSPPTFGG
101   GTKLEIK
配列番号５４（ＨＡＶＴ２０リーダー配列）
1   MACPGFLWAL VISTCLEFSM A
配列番号５５（ヒトＩｇＧ１抗体ＨＣ定常領域）
1   ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
51   HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP
101   KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS
151   HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK
201   EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC
251   LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
301   QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
配列番号５６（ヒトＩｇＧ抗体ＬＣκ定常領域）
1   RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG
51   NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK
101   SFNRGEC
配列番号５７（ＨＣウサギリーダー配列）
1   MGWTLVFLFL LSVTAGVHS
配列番号５８（ＬＣウサギリーダー配列）
1   MVSSAQFLGL LLLCFQGTRC
Ｋａｂａｔのナンバリングシステムによる４１位でのシステイン変異を有する、ヒト化ＨＣＶＲアミノ酸配列
配列番号５９（ＨＣＶＲ  ８２５  ヒト化バージョン１  ４１Ｃ）
1   EVQLVESGGD LAQPGGSLRL SCAVSGIDLS SYGMGWVRQA CGKGLEWVSI
51   ISRNSVTYYA TWAKGRFTIS RDNSKNTVYL QMTSLRAEDT ALYFCARRAT
101   YSGALGYFDI WGQGTLVTVS S
配列番号６０（ＨＣＶＲ  ８２５  ヒト化バージョン２  ４１Ｃ）
1   EVQLEESGGG LVKPGGSLRL SCAASGIDLS SYGMGWVRQA CGKGLEWVSI
51   ISRNSVTYYA TWAKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCARRAT
101   YSGALGYFDI WGRGTLVTVS S
配列番号６１（ＨＣＶＲ  ８３３  ヒト化バージョン１  ４１Ｃ）
1   EVQLVESGGG LIQPGGSLRL SCAASGIDLS HYVVGWVRQA CGKGLEWVSI
51   IYGSGRTYYA NWAKGRFTIS KDNSKNTLYV RMNSLRAEDT AVYYCARDAS
101   VSVYYWGYFD LWGQGTLVTV SS
配列番号６２（ＨＣＶＲ  ８３３  ヒト化バージョン２  ４１Ｃ）
1   EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDLS HYVVGWVRQA CGKGLEWVSI
51   IYGSGRTYYA NWAKGRFTIS RDNSKNTLFL RMNSLRVEDT AVYFCARDAS
101   VSVYYWGYFD LWGQGTLVTV SS
配列番号６３（ＨＣＶＲ  ８３３  ヒト化バージョン３  ４１Ｃ）
1   EVQLEESGGG LVKPGGSLRL SCAASGIDLS HYVVGWVRQA CGKGLEWVSI
51   IYGSGRTYYA NWAKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCARDAS
101   VSVYYWGYFD LWGRGTLVTV SS
配列番号６４（ＨＣＶＲ  ８３３  ヒト化バージョン４  ４１Ｃ）
1   QSLEESGGGL VQPGGSLRLS CAASGIDLSH YVVGWVRQAC GKGLEWIGII
51   YGSGRTYYAN WAKGRFTISR HNSKNTLYLQ MNSLRAEDTA VYYCARDASV
101   SVYYWGYFDL WGQGTLVTV SS
【図１Ａ】
2018538368.tif 000027
【図１Ｂ】
2018538368.tif 000028
【図１Ｃ】
2018538368.tif 000029
【図２Ａ】
2018538368.tif 000030
【図２Ｂ】
2018538368.tif 000031
【図２Ｃ】
2018538368.tif 000032
【図３】
2018538368.tif 000033
【配列表】
2018538368000001.app
【国際調査報告】
2018538368.tif 000034
2018538368.tif 000035