(57)【要約】本発明は、ＡＮＯ５遺伝子を発現するＡＡＶベクター、ならびに筋肉再生を誘導する方法及び筋ジストロフィーを治療する方法としての抗酸化剤療法を提供する。筋ジストロフィーを治療する方法であって、１）配列番号１の核酸配列と少なくとも８５％同一の核酸配列、２）ストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド、または３）ＡＮＯ５活性を呈するタンパク質をコードする配列番号１の核酸の断片を含む組換えＡＡＶベクターの治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋ジストロフィーを治療する方法であって、１）配列番号１の核酸配列と少なくとも８５％同一の核酸配列、２）ストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド、または３）ＡＮＯ５活性を呈するタンパク質をコードする配列番号１の核酸の断片を含む組換えＡＡＶベクターの治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項２】
必要としている対象における筋肉を再生する方法であって、１）配列番号１の核酸配列と少なくとも８５％同一の核酸配列、２）ストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド、または３）ＡＮＯ５活性を呈するタンパク質をコードする配列番号１の核酸の断片を含む組換えＡＡＶベクターを、筋肉を再生するのに有効な量で前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３】
慢性筋肉消耗を治療する方法であって、１）配列番号１と少なくとも８５％同一の核酸配列、２）ストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド、または３）ＡＮＯ５活性を呈するタンパク質をコードする配列番号１の核酸の断片を含む組換えＡＡＶベクターの治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項４】
前記組換えＡＡＶが、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記組換えＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、またはＡＡＶ  ｒｈ．７４である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記組換えＡＡＶベクターが、筋肉特異的制御要素に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記筋肉特異的制御要素が、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋トロポニンＩ遺伝子要素、低酸素誘導性核因子、ステロイド誘導性要素、またはグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記対象が、筋ジストロフィーに罹患している、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記筋ジストロフィーが、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、または三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチーである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象が、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記組換えＡＡＶベクターが、筋肉内または静脈内注射により投与される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
抗酸化剤組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与するステップをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
筋ジストロフィーを治療する方法であって、抗酸化剤組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
慢性筋肉消耗を治療する方法であって、抗酸化剤組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項１７】
筋ジストロフィーの進行を遅延させる方法であって、抗酸化剤組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項１８】
慢性筋肉消耗の進行を遅延させる方法であって、抗酸化剤組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項１９】
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
筋ジストロフィーが、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、または三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチーである、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
酸化ストレスが、前記対象の骨格筋において低減される、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象の骨格筋機能が改善される、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象が、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗酸化剤組成物が経口投与される、請求項１２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗酸化剤が、同じ組成物中にある、請求項１２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗酸化剤が、別個の組成物中にある、請求項１２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗酸化剤組成物の前記抗酸化剤が同時に投与される、請求項１２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗酸化剤組成物の前記抗酸化剤が、別個の時点で、または連続して投与される、請求項１２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗酸化剤組成物が、１日１回、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、または２ヶ月に１回投与される、請求項１２〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
必要としている対象における筋ジストロフィーの治療のための、組換えＡＡＶベクターの治療有効量を含む組成物であって、前記組換えＡＡＶベクターが、１）配列番号１の核酸配列と少なくとも８５％同一の核酸配列、２）ストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド、または３）ＡＮＯ５活性を呈するタンパク質をコードする配列番号１の核酸の断片を含む、組成物。
【請求項３２】
必要としている対象における筋肉の再生のための、組換えＡＡＶベクターを含む組成物であって、前記組換えＡＡＶベクターが、１）配列番号１と少なくとも８５％同一の核酸配列、２）ストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド、または３）ＡＮＯ５活性をそれを必要とする対象に呈するタンパク質をコードする配列番号１の核酸の断片を含む、組成物。
【請求項３３】
必要としている対象における慢性筋肉消耗の治療のための、組換えＡＡＶベクターの治療有効量を含む組成物であって、前記組換えＡＡＶベクターが、１）配列番号１の核酸配列と少なくとも８５％同一の核酸配列、２）ストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド、または３）ＡＮＯ５活性を呈するタンパク質をコードする配列番号１の核酸の断片を含む、組成物。
【請求項３４】
前記組換えＡＡＶが、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記組換えＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、またはＡＡＶ  ｒｈ．７４である、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記組換えＡＡＶベクターが、筋肉特異的制御要素に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記筋肉特異的制御要素が、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋トロポニンＩ遺伝子要素、低酸素誘導性核因子、ステロイド誘導性要素、またはグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）である、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記対象が、筋ジストロフィーに罹患している、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記筋ジストロフィーが、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、または三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチーである、請求項３１〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記対象が、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する、請求項３１〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
筋肉内または静脈内注射用に製剤化される、請求項３１〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
抗酸化剤組成物の治療有効量をさらに含む、請求項３１〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む、請求項４２または４３に記載の組成物。
【請求項４５】
必要としている対象における筋ジストロフィーの治療のための、抗酸化剤組成物の治療有効量を含む組成物。
【請求項４６】
必要としている対象における慢性筋肉消耗の治療のための、抗酸化剤組成物の治療有効量を含む組成物。
【請求項４７】
必要としている対象における筋ジストロフィーの進行の遅延のための、抗酸化剤組成物の治療有効量を含む組成物。
【請求項４８】
必要としている対象における慢性筋肉消耗の進行の遅延のための、抗酸化剤組成物の治療有効量を含む組成物。
【請求項４９】
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む、請求項４５〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む、請求項４５〜４９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５１】
筋ジストロフィーが、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、または三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチーである、請求項４５〜５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５２】
酸化ストレスが、前記対象の骨格筋において低減される、請求項４５〜５１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５３】
前記対象の骨格筋機能が改善される、請求項４５〜５１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５４】
前記対象が、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する、請求項４５〜５１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５５】
経口投与用に製剤化される、請求項４２〜５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５６】
前記薬剤が、同じ組成物中にある、請求項４２〜５５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５７】
前記薬剤が、別個の組成物中にある、請求項４２〜５５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５８】
前記抗酸化剤組成物の前記抗酸化剤が同時に投与される、請求項４２〜５５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５９】
前記抗酸化剤組成物の前記抗酸化剤が、別個の時点で、または連続して投与される、請求項４２〜５５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６０】
前記抗酸化剤組成物が、１日１回、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、または２ヶ月に１回投与される、請求項４５〜５９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６１】
筋ジストロフィーの治療を必要とする対象における筋ジストロフィーの治療用の薬剤の調製のための組換えＡＡＶベクターの使用であって、前記組換えＡＡＶベクターが、１）配列番号１の核酸配列と少なくとも８５％同一の核酸配列、２）ストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド、または３）ＡＮＯ５活性を呈するタンパク質をコードする配列番号１の核酸の断片を含む、使用。
【請求項６２】
筋肉の再生を必要とする対象における筋肉の再生用の薬剤の調製のための組換えＡＡＶベクターの使用であって、前記組換えＡＡＶベクターが、１）配列番号１の核酸配列と少なくとも８５％同一の核酸配列、２）ストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド、または３）ＡＮＯ５活性を呈するタンパク質をコードする配列番号１の核酸の断片を含む、使用。
【請求項６３】
慢性筋肉消耗症候群の治療用の薬剤の調製のための組換えＡＡＶベクターの使用であって、前記組換えＡＡＶベクターが、１）配列番号１の核酸配列と少なくとも８５％同一の核酸配列、２）ストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド、または３）ＡＮＯ５活性を呈するタンパク質をコードする配列番号１の核酸の断片を含む、使用。
【請求項６４】
前記組換えＡＡＶが、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む、請求項６１〜６３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６５】
前記組換えＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、またはＡＡＶ  ｒｈ．７４である、請求項６１〜６３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６６】
前記組換えＡＡＶベクターが、筋肉特異的制御要素に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む、請求項６１〜６５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６７】
前記筋肉特異的制御要素が、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋トロポニンＩ遺伝子要素、低酸素誘導性核因子、ステロイド誘導性要素、またはグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）である、請求項６６に記載の使用。
【請求項６８】
前記対象が、筋ジストロフィーに罹患している、請求項６１〜６７に記載の使用。
【請求項６９】
前記対象が、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、または三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチーに罹患している、請求項６１〜６８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７０】
前記対象が、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する、請求項６１〜６９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７１】
前記薬剤が、筋肉内または静脈内注射用に製剤化される、請求項６１〜７０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７２】
抗酸化剤組成物の治療有効量を必要とする対象に対する、抗酸化剤組成物の治療有効量をさらに含む、請求項６１〜７１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７３】
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む、請求項７２に記載の使用。
【請求項７４】
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む、請求項７２または７３に記載の使用。
【請求項７５】
必要としている対象における筋ジストロフィーの治療用の薬剤の調製のための、抗酸化剤組成物の治療有効量の使用。
【請求項７６】
慢性筋肉消耗症候群の治療用の薬剤の調製のための、抗酸化剤組成物の治療有効量の使用。
【請求項７７】
必要としている対象における筋ジストロフィーの進行の遅延用の薬剤の調製のための、抗酸化剤組成物の治療有効量の使用。
【請求項７８】
必要としている対象における慢性筋肉消耗症候群の進行の遅延用の薬剤の調製のための、抗酸化剤組成物の治療有効量の使用。
【請求項７９】
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む、請求項７５〜７８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８０】
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む、請求項７５〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記対象が、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、または三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチーに罹患している、請求項７５〜８０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８２】
酸化ストレスが、前記対象の骨格筋において低減される、請求項７５〜８１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８３】
前記対象の骨格筋機能が改善される、請求項７５〜８１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８４】
前記対象が、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する、請求項７５〜８１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８５】
前記薬剤が、経口投与用に製剤化される、請求項５５〜８４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８６】
１）配列番号１の核酸配列と少なくとも８５％同一の核酸配列、２）ストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド、または３）ＡＮＯ５活性を呈するタンパク質をコードする配列番号１の核酸の断片を含む組換えＡＡＶベクターの治療有効量を、それを必要とする対象に、抗酸化剤組成物の治療有効量と組み合わせて投与することをさらに含む、請求項１５〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む、請求項８６または８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記組換えＡＡＶベクターが、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む、請求項８６〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記組換えＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、またはＡＡＶ  ｒｈ．７４である、請求項８６〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記組換えＡＡＶベクターが、筋肉内または静脈内注射により投与される、請求項８６〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記抗酸化剤組成物が経口投与される、請求項８６〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記組換えＡＡＶベクター及び前記抗酸化剤組成物が、同じ組成物中にある、請求項８６〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記組換えＡＡＶベクター及び前記抗酸化剤組成物が、別個の組成物中にある、請求項８６〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記組換えＡＡＶベクター及び前記抗酸化剤組成物が同時に投与される、請求項８６〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記組換えＡＡＶベクター及び前記抗酸化剤組成物が、別個の時点で、または連続して投与される、請求項８６〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記組換えＡＡＶベクター及び前記抗酸化剤組成物が、１日１回、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、または２ヶ月に１回投与される、請求項８６〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０１５年１１月１２日出願の米国仮特許出願第６２／２５４５３９号及び２０１６年１１月９日出願の米国仮特許出願第６２／４１９７９３号に対する優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＡＮＯ５遺伝子を発現するＡＡＶベクター、ならびに筋肉再生を誘導する方法及び筋ジストロフィーを治療する方法としての抗酸化剤療法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
移動運動及び呼吸等の日常活動ならびに全身代謝のための筋肉量及び筋力の重要性は明白である。筋肉機能の欠損により、筋肉衰弱及び消耗を特徴とする筋ジストロフィー（ＭＤ）が引き起こされ、生活の質に深刻な影響を与える。最も良く特徴付けられたＭＤは、ジストロフィン関連タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）のメンバーをコードする遺伝子における変異に起因する。これらのＭＤは、ＤＡＰＣによる筋鞘−細胞骨格繋留の損失に関連した膜脆弱性に起因する。対照的に、他のＭＤのサブセットは、筋鞘修復の欠陥によって引き起こされると考えられる。収縮中に筋鞘が受ける機械的ストレスのため、健常な筋肉でさえも、損傷した膜をパッチするための修復機構を常に必要としている。筋鞘パッチ修復は、損傷部位における膜小胞の融合に依存し、このプロセスの減衰は、ジスフェルリンにおける変異によって引き起こされるＭＤであるジスフェルリノパチーの主な原因と推定的に考えられる。
【０００４】
近年、ジスフェルリノパチーと同様の特徴を有し、かつ筋鞘病変を特徴とする新たなＭＤが、ＡＮＯ５（ＴＭＥＭ１６Ｅ）における劣性変異に関係している。ＡＮＯ５変異により、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ（ＬＧＭＤ２Ｌ）及び三好型ミオパチージストロフィー３（ＭＭＤ３）が引き起こされる。ＡＮＯ５変異に関連する表現型は可変であるが、典型的には、この疾患は、近位下肢衰弱、高血清中クレアチンキナーゼレベル、非対称筋萎縮及び衰弱を伴って成人（２０〜５０歳）に現れ、典型的には、ジスフェルリノパチーに類似した筋鞘病変を伴う（Ｂｏｌｄｕｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８６，２１３−２２１（２０１０））、Ｈｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ：ａ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １３４，１７１−１８２（２０１１）、Ｂｏｕｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖｕｅ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｑｕｅ  １６８，１３５−１４１（２０１２））。現在までに、約７２の異なるＡＮＯ５変異がＭＤ患者において報告されており、他の既知のＬＧＭＤ遺伝子における変異を欠くＬＧＭＤ患者におけるＡＮＯ５変異についてのスクリーニングは、ＡＮＯ５変異がＬＧＭＤのより一般的な原因のうちの１つであり得ることを示す（Ｂｏｌｄｕｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８６，２１３−２２１（２０１０））、Ｈｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ：ａ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １３４，１７１−１８２（２０１１）、Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ７８，８９７−９０３（２０１２））。
【０００５】
アノクタミン／ＴＭＥＭ１６ファミリーは、２つのカテゴリに機能的に分けられている。創立メンバーであるＡＮＯ１（ＴＭＥＭ１６Ａ）及びＡＮＯ２（ＴＭＥＭ１６Ｂ）がカルシウム活性化クロライドチャネルをコードする一方で、他のＡＮＯは、クロライド電流を伝導することができず、リン脂質スクランブリング（ＰＬＳ）におけるそれらの役割について特定されている。しかしながら、ＡＮＯ５は、骨格筋における新規の機能を提案するこれらの２つの活性のいずれかを呈することが見出されていない。この新規性を考慮して、ＡＮＯ５機能の欠損がＬＧＭＤ表現型をどのように誘発するか、具体的には、Ａｎｏ５変異が臨床的に同様の方法でスフェルリン関連ＭＤになぜ現れるかは不明のままである。
【０００６】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、１４５ヌクレオチド逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂ長である。ＡＡＶの複数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が既知である。例えば、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ゲノムのヌクレオチド配列は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，４５：５５５−５６４（１９８３）（Ｒｕｆｆｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，７５：３３８５−３３９２（１９９４）により修正）に提示されている。他の例として、ＡＡＶ−１完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００２０７７に提供されており、ＡＡＶ−３完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿１８２９に提供されており、ＡＡＶ−４完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８２９に提供されており、ＡＡＶ−５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８５７１６に提供されており、ＡＡＶ−６完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８６２に提供されており、ＡＡＶ−７ゲノム及びＡＡＶ−８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９に提供されており（ＡＡＶ−８に関して、米国特許第７，２８２，１９９号及び同第７，７９０，４４９号も参照のこと）、ＡＡＶ−９ゲノムは、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１−６３８８（２００４）に提供されており、ＡＡＶ−１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７−７６（２００６）に提供されており、ＡＡＶ−１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５−３８３（２００４）に提供されている。ＡＡＶ  ｒｈ．７４ゲノムの配列は、本明細書に提供される。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞染色体組込みを指示するＣｉｓ作用配列が、ＩＴＲ内に含まれる。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置に対してｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と名付けられる）は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一ＡＡＶイントロンの差異的スプライシング（例えば、ＡＡＶ２ヌクレオチド２１０７及び２２２７において）により連結された２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子からの４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連カプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７−１２９（１９９２）に概説されている。
【０００７】
ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、サイレントかつ無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞を感染させ、インビボで多くの異なる組織を標的とする可能性を可能にする。さらに、ＡＡＶは、緩徐に分裂する細胞及び非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として本質的にそれらの細胞の寿命にわたって存続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド内のクローニングされたＤＮＡとして感染性である。さらに、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成、及び組込みを指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれるため、内部およそ４．３ｋｂのゲノム（複製タンパク質及び構造カプシドタンパク質をコードするもの、ｒｅｐ−ｃａｐ）のいくらかは全てが、プロモーター、目的とするＤＮＡ、及びポリアデニル化シグナルを含む遺伝子カセット等の外来ＤＮＡで置き換えられ得る。ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃〜６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥され得る。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性を示さない。
【０００８】
複数の研究は、筋肉内での長期（１．５年超）の組換えＡＡＶ媒介タンパク質発現を実証している。Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，８：６５９−６６９（１９９７）、Ｋｅｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ  Ｓｃ．ＵＳＡ，９３：１４０８２−１４０８７（１９９６）、及びＸｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８−８１０８（１９９６）を参照されたい。Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，２：６１９−６２３（２０００）及びＣｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，４：２１７−２２２（２００１）も参照されたい。さらに、筋肉が高度に血管新生されるため、組換えＡＡＶ形質導入により、Ｈｅｒｚｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４：５８０４−５８０９（１９９７）及びＭｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４：１３９２１−１３９２６（１９９７）に記載されるように、筋肉内注射後に体循環に導入遺伝子産物の出現がもたらされた。さらに、Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９−８７７５（２００２）は、骨格筋線維が、正しい抗体グリコシル化、折り畳み、及び分泌に必要な細胞因子を有することを実証し、筋肉が分泌タンパク質治療薬を安定して発現することができることを示す。
本明細書に示されるように、マウスにおけるＡｎｏ５遺伝子の破壊により、いくつかのジストロフィー筋組織病理学的特徴、運動不耐性、筋鞘修復不全、及び筋芽細胞融合欠陥が引き起こされる。加えて、提供されるデータは、これらの欠陥が、ＡＮＯ５によって媒介される細胞内膜及び／または膜及び／または筋鞘膜動態の変化に関連することを実証する。本発明は、筋肉修復を誘導する方法及び／またはＭＤを治療する方法におけるＡｎｏ５遺伝子を発現するＡＡＶベクターの使用に関する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｏｌｄｕｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８６，２１３−２２１（２０１０）
【非特許文献２】Ｈｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ：ａ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １３４，１７１−１８２（２０１１）
【非特許文献３】Ｂｏｕｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖｕｅ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｑｕｅ  １６８，１３５−１４１（２０１２）
【非特許文献４】Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ７８，８９７−９０３（２０１２）
【非特許文献５】Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，４５：５５５−５６４（１９８３）
【非特許文献６】Ｒｕｆｆｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，７５：３３８５−３３９２（１９９４）
【非特許文献７】Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１−６３８８（２００４）
【非特許文献８】Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７−７６（２００６）
【非特許文献９】Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５−３８３（２００４）
【非特許文献１０】Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７−１２９（１９９２）
【非特許文献１１】Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，８：６５９−６６９（１９９７）
【非特許文献１２】Ｋｅｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ  Ｓｃ．ＵＳＡ，９３：１４０８２−１４０８７（１９９６）
【非特許文献１３】Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８−８１０８（１９９６）
【非特許文献１４】Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，２：６１９−６２３（２０００）
【非特許文献１５】Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，４：２１７−２２２（２００１）
【非特許文献１６】Ｈｅｒｚｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４：５８０４−５８０９（１９９７）
【非特許文献１７】Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４：１３９２１−１３９２６（１９９７）
【非特許文献１８】Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９−８７７５（２００２）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＡＮＯ５タンパク質またはその機能的に活性な断片をコードするヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクターを対象とする。実施例１〜４に記載の実験は、筋肉再生及び修復におけるＡｎｏ５の重要な役割を実証する。ＡＮＯ５の損失は、ＬＧＭＤ２Ｌ患者を連想させるマウスにおけるジストロフィー表現型を引き起こし、筋肉、運動不耐性、再生障害、及びクレアチンキナーゼレベルの上昇によって変化する軽度の組織病理を伴う。ミトコンドリア異常が、若齢及び高齢Ａｎｏ５−／−マウスの両方で観察された。電子顕微鏡撮像により表示されるミトコンドリアの構造的欠陥に加えて、クエン酸シンターゼ定量アッセイは、ミトコンドリアが機能欠損を有することも実証した。クエン酸シンターゼの定量的酵素分析は、損傷したミトコンドリアの存在を示唆する。これらの結果は、ミトコンドリア異常が、アノクタミン５タンパク質の損失によって引き起こされる二次的影響であり得ることを示唆する。本明細書に記載の実験は、ヒトＡＮＯ５のウイルス発現によってレスキューされるＡｎｏ５−／−線維における筋鞘パッチ修復の減衰を実証し、Ａｎｏ５の破壊が初代筋芽細胞の融合誘導性質を混乱させることを見出す。
【００１１】
一実施形態では、本発明は、ＡＮＯ５核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶベクターを提供する。ＡＮＯ５核酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿２１３５９９．２（配列番号１３）として示される。ＡＡＶベクター中のＡＮＯ５タンパク質をコードする例示の核酸配列は、配列番号１として示される。本発明の組換えベクターは、配列番号１または配列番号１３の核酸と少なくとも少なくとも８５％同一のポリヌクレオチド配列を含むか、またはストリンジェントな条件下で配列番号１または配列番号１３のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチドを含むか、またはＡＮＯ５活性を呈するタンパク質をコードする配列番号１または配列番号１３の核酸の断片を含む。一態様では、本発明の組換えＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、またはＡＡＶ  ｒｈ．７４である。
【００１２】
本発明の組換えＡＡＶベクターは、ＰＬＳ活性に関与するドメインを含むタンパク質をコードする配列番号１の断片を含み、このタンパク質は、ＰＬＳ活性を保持する。別の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＮＯ５活性を保持するタンパク質をコードする配列番号１または配列番号１３の断片を含む。
【００１３】
本発明の組換えＡＡＶベクターは、例えば、配列番号１または配列番号１３と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より典型的には、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、さらにより典型的には、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のポリヌクレオチド配列を含み、このポリヌクレオチドは、ＡＮＯ５活性を保持するタンパク質をコードする。
【００１４】
本発明の組換えＡＡＶベクターは、例えば、配列番号２と少なくとも少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より典型的には、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、さらにより典型的には、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のＡＮＯ５をコードするポリヌクレオチド配列を含み、このポリヌクレオチドは、ＡＮＯ５活性を保持するタンパク質をコードする。
【００１５】
本発明の組換えＡＡＶベクターは、ストリンジェントな条件下で配列番号１または配列番号１３の核酸配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列またはその補体を含み、この断片は、約５個を超えるヌクレオチド、好ましくは７個のヌクレオチド、より好ましくは９個を超えるヌクレオチド、最も好ましくは１７個を超えるヌクレオチドである。例えば、選択的な（すなわち、本発明のポリヌクレオチドのうちのいずれか１つに特異的にハイブリダイズする）１５個、１７個、または２０個以上のヌクレオチドの断片が企図され、これらの断片は、ＡＮＯ５活性を保持する。ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることができるプローブは、本発明のＮＴＨｉポリヌクレオチド配列を同じ遺伝子ファミリー内の他のポリヌクレオチド配列と区別することができるか、またはＮＴＨｉ遺伝子を他の細菌遺伝子と区別することができ、好ましくは、固有のヌクレオチド配列に基づく。
【００１６】
「ストリンジェントな」という用語は、ストリンジェントとして当該技術分野において一般に理解される条件を指すために使用される。ハイブリダイゼーションストリンジェシーは、主に、温度、イオン強度、及びホルムアミド等の変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーション及び洗浄のためのストリンジェントな条件の例は、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、６５〜６８℃の０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウムまたは０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、及び４２℃の５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照されたい。よりストリンジェントな条件（より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤等）も使用され得るが、ハイブリダイゼーションの速度に影響が及ぼされるであろう。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが懸念される例では、追加の例示のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、３７℃（１４塩基オリゴ）、４８℃（１７塩基オリゴ）、５５℃（２０塩基オリゴ）、及び６０℃（２３塩基オリゴ）での６×ＳＳＣ  ０．０５％ピロリン酸ナトリウム中での洗浄が挙げられる。
【００１７】
非特異的及び／またはバックグラウンドハイブリダイゼーションを低減する目的のために、他の薬剤がハイブリダイゼーション及び洗浄緩衝液中に含まれ得る。例には、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニル−ピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳＯ４、（ＳＤＳ）、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理鮭精子ＤＮＡ（または他の非相補的ＤＮＡ）、及び硫酸デキストランがあるが、他の好適な薬剤を使用することもできる。これらの添加物の濃度及び種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を及ぼすことなく変化させることができる。ハイブリダイゼーション実験は、通常、６．８〜７．４で行われるが、典型的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーションの速度は、ｐＨとほぼ無関係である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｈ．４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照されたい。ハイブリダイゼーション条件は、これらの可変物を適応し、かつ異なる配列関連性を有するＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にするために、当業者によって調整され得る。
【００１８】
別の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、筋肉特異的制御要素に作動可能に連結され得る。例えば、筋肉特異的制御要素は、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素（ＭＣＫ）、ＭＣＫの三重コピー（ｔＭＣＫ）、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋トロポニンＩ遺伝子要素、低酸素誘導性核因子、ステロイド誘導性要素、またはグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）である。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、本発明の任意の組換えＡＡＶベクターでトランスフェクトされた細胞を培養することと、トランスフェクトされた細胞の上清から組換えＡＡＶ粒子を回収することとを含む、組換えＡＡＶベクター粒子を産生する方法を提供する。本発明は、本発明の組換えＡＡＶベクターのうちのいずれかを含むウイルス粒子も提供する。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、本発明のいずれの組換えＡＡＶベクターの治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、筋ジストロフィーを治療する方法を提供する。一態様では、必要としている対象は、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する。本方法は、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチーを治療することができる。加えて、筋ジストロフィーを治療するための前述の方法のうちのいずれかが、抗酸化剤組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与するステップをさらに含む。例えば、抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む。具体的には、抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む。
【００２１】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明のいずれの組換えＡＡＶベクターの治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、必要としている対象における筋肉を再生する方法を提供する。一態様では、必要としている対象は、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する。別の態様では、必要としている対象は、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチー等の筋ジストロフィーに罹患している。加えて、筋肉を再生する前述の方法のうちのいずれかは、抗酸化剤組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与するステップをさらに含む。例えば、抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む。具体的には、抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えＡＡＶベクターのうちのいずれかの治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、慢性筋肉消耗を治療する方法を提供する。一態様では、必要としている対象は、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する。別の態様では、必要としている対象は、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、または三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチー等の筋ジストロフィーに罹患している。加えて、慢性筋肉消耗を治療するための前述の方法のうちのいずれかは、抗酸化剤組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与するステップをさらに含む。例えば、抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む。具体的には、抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む。
【００２３】
本発明は、必要としている対象における筋ジストロフィーまたは慢性筋肉消耗症候群の治療のための、本発明のいずれかの組換えＡＡＶを含む組成物も提供する。本発明は、必要としている対象における筋肉の再生のための、本発明のいずれかの組換えＡＡＶを含む組成物も提供する。一態様では、本発明の組成物は、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する対象に投与される。別の態様では、本発明の組成物は、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチー等の筋ジストロフィーに罹患している対象に投与される。本発明の組成物のうちのいずれかが、筋肉内または静脈内注入用に製剤化される。本発明の組成物のうちのいずれかが、抗酸化剤組成物の治療有効量をさらに含む。例えば、抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む。具体的には、抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む。
【００２４】
別の実施形態では、本発明は、筋ジストロフィーまたは慢性筋肉消耗症候群の治療を必要とする対象における筋ジストロフィーまたは慢性筋肉消耗症候群の治療用の薬剤の調製のための本発明のいずれかの組換えＡＡＶベクターの使用を提供する。加えて、本発明は、筋肉の再生を必要とする対象における筋肉の再生用の薬剤の調製のための本発明の組換えＡＡＶベクターのうちのいずれかの使用を提供する。一態様では、薬剤は、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する対象に投与される。別の態様では、本発明の薬剤は、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチー等の筋ジストロフィーに罹患している対象に投与される。本発明の薬剤のうちのいずれかが、筋肉内または静脈内注入用に製剤化される。本発明の薬剤のうちのいずれかが、抗酸化剤組成物の治療有効量をさらに含む。例えば、抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む。具体的には、抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む。
【００２５】
別の実施形態では、本発明は、抗酸化剤組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、筋ジストロフィーまたは慢性筋肉消耗を治療する方法を提供する。抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様では、抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む。一態様では、必要としている対象は、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する。別の態様では、酸化ストレスは、対象の骨格筋において低減される。別の態様では、対象の骨格筋機能が改善される。別の態様では、対象は、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチーに罹患している。
【００２６】
本発明は、抗酸化剤組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、筋ジストロフィーまたは慢性筋肉消耗の進行を遅延させるための方法も提供する。抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様では、抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む。一態様では、必要としている対象は、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する。別の態様では、酸化ストレスは、対象の骨格筋において低減される。別の態様では、対象の骨格筋機能が改善される。別の態様では、対象は、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチーに罹患している。
【００２７】
本発明の方法のうちのいずれかでは、抗酸化剤組成物は、経口投与される。本発明の方法のうちのいずれかでは、抗酸化剤は、同じ組成物中で投与されるか、または抗酸化剤は、別個の組成物中で投与される。抗酸化剤が同時ではなく別個に投与される場合。加えて、本発明の方法のうちのいずれかでは、抗酸化剤は、別個の時点で、または連続して投与される。本発明の方法のうちのいずれかでは、抗酸化剤組成物は、１日１回、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、または２ヶ月に１回投与される。
【００２８】
本発明は、抗酸化剤組成物の治療有効量を含む組成物も提供する。抗酸化剤組成物は、必要としている対象における筋ジストロフィーまたは慢性筋肉消耗症候群を治療するために、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む。
【００２９】
本発明は、治療有効量、抗酸化剤組成物の治療有効量を含む組成物も提供する。抗酸化剤組成物は、必要としている対象における筋ジストロフィーまたは慢性筋肉消耗の進行を遅延させるために、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様では、抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む。
【００３０】
一態様では、本発明の組成物のいずれかが、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する対象に投与される。別の態様では、酸化ストレスは、組成物の投与後に対象の骨格筋において低減される。別の態様では、対象の骨格筋機能は、組成物の投与後に改善される。別の態様では、本発明の組成物のうちのいずれかが、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチー等の筋ジストロフィーに罹患している対象に投与される。本発明の組成物のうちのいずれかが、筋肉内または静脈内注入用に製剤化される。
【００３１】
別の実施形態では、本発明は、筋ジストロフィーまたは慢性筋肉消耗症候群の治療を必要とする対象における筋ジストロフィーまたは慢性筋肉消耗症候群の治療用の薬剤の調製のための抗酸化剤組成物の使用を提供する。本発明の薬剤のうちのいずれかにおける抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む。
【００３２】
加えて、本発明は、筋肉の再生を必要とする対象における筋肉の再生用の薬剤の調製のための抗酸化剤組成物の使用を提供する。本発明の薬剤のうちのいずれかにおける抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様では、抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む。
【００３３】
加えて、本発明は、筋ジストロフィーまたは筋肉消耗症候群の進行の遅延を必要とする対象における筋ジストロフィーまたは筋肉消耗症候群の進行の遅延用の薬剤の調製のための抗酸化剤組成物の使用を提供する。本発明の薬剤のうちのいずれかにおける抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様では、抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む。
【００３４】
本発明の薬剤のうちのいずれかが、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する対象に投与される。別の態様では、酸化ストレスは、対象の骨格筋において低減される。別の態様では、対象の骨格筋機能が改善される。別の態様では、本発明の薬剤のうちのいずれかが、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチー等の筋ジストロフィーに罹患している対象に投与される。加えて、本発明の薬剤のいずれかが、筋肉内または静脈内注入用に製剤化される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、抗酸化剤組成物は、経口投与される。いくつかの態様では、抗酸化剤は、同じ組成物中にある。他の態様では、抗酸化剤は、別個の組成物中にある。いくつかの態様では、抗酸化剤組成物の抗酸化剤は、同時に投与される。いくつかの態様では、抗酸化剤組成物の抗酸化剤は、別個の時点で、または連続して投与される。いくつかの実施形態では、抗酸化剤組成物は、１日１回、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、または２ヶ月に１回投与される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、Ａｎｏ５−／−マウスモデルの生成を例証する。パネル（ａ）は、ポリアデニル化終結シグナルを有する外因性イントロン及びｌａｃＺコードエクソンを含むＡｎｏ５標的ベクターを示す。結果として得られたｍＲＮＡは、エクソン８で終結する。パネル（ｂ）は、同腹子の尾部クリッピングから単離されたゲノムＤＮＡを示す。レーン１は、野生型（ＷＴ）マウスであり、レーン２は、Ａｎｏ５＋／−マウスであり、レーン３は、Ａｎｏ５−／−マウスであり、ＷＴ対立遺伝子は、３００ｂｐの断片であり、Ａｎｏ５対立遺伝子は、２００ｂｐの断片である。パネル（ｃ）は、Ａｎｏ５を標的とする２つのプライマーセットを使用したＡｎｏ５−／−筋肉組織におけるＡｎｏ５転写物の証拠を示さないＲＴ−ＰＣＲ由来の産物を示す。レーン１：ＧＡＰＤＨ対照、レーン２：エクソン１０〜１４に及ぶｅ１０〜１４プライマー、レーン３：エクソン１７〜２０に及ぶｅ１７〜２０プライマー。パネル（ｄ）は、ＲＮＡレベルでのＡＮＯ５の９９％超の相対発現低減が、Ａｎｏ５−／−マウス（Ｐ＜０．００１）から抽出した大腿四頭（ＱＤ）筋、腓腹（ＧＡＳ）筋、及び前脛骨（ＴＡ）筋におけるｑＲＴ−ＰＣＲにより確認されたことを示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｆは、Ａｎｏ５−／−欠損マウスの特徴付けを例証する。パネル（ａ）は、血清中クレアチンキナーゼが９ヶ月齢のＡｎｏ５−／−マウス（Ｐ＜０．０５、ｔ検定）において著しく上昇することを示す。パネル（ｂ）は、９ヶ月齢のＡｎｏ５−／−マウス由来の横隔膜条片の比収縮力が対照（Ｐ＜０．０１、ｔ検定）と比較して著しく低減したことを示す。パネル（ｃ）は、９ヶ月齢のＡｎｏ５−／−マウス由来のＥＤＬ筋及び前脛骨（ＴＡ）筋の比収縮力が対照（Ｐ＞０．０５、ｔ検定）とは著しく異ならなかったことを示す。パネル（ｄ）は、ＷＴ対照と比較した、Ａｎｏ５−／−マウスのＴＡ及びＧＡＳにおける中心核、線維サイズ変動性、及び壊死面積を含む、軽度のジストロフィー病理を示すヘマトキシリン及びエオシン染色組織切片を示す。尺度バー＝５０μｍ。パネル（ｅ）は、特にＧＡＳ筋（Ｐ＜０．０００１、ｔ検定）におけるＷＴと比較して線維径サイズの低減を示す筋線維径測定結果を提供する。パネル（ｆ）は、Ａｎｏ５−／−マウスがトレッドミル疲労研究を行ったときに頻繁な休止を示したことを示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｅは、Ａｎｏ５−／−マウスの生理学的特徴付けを提供する。パネル（ａ）：乳酸レベルは、トレッドミル走行後にＷＴ対照と比較してＡｎｏ５−／−マウスにおいてわずかに低減した（Ｐ＝０．１５）。パネル（ｂ）：筋肉の電気生理学的特性。電気生理学的振幅は、Ａｎｏ５−／−（４５．１±２．２ｍＶ）とＷＴ（４０．８±２．４ｍＶ）（ｐ＝０．２２）との間に有意差はなかった。Ａｎｏ５−／−動物もＷＴ動物も、線維自発電位を示さなかった。パネル（ｃ〜ｅ）：５０ｋＨｚでの筋肉のインピーダンス特性（それぞれ、位相、リアクタンス、抵抗）。Ａｎｏ５−／−（３１．０±２．７、２４８．１±３７．８Ω、４１１．４±３４．６Ω）とＷＴ線維（３１．７±３．９、２６９．０±８３．９Ω、４２４．３±７３．９Ω）との間に差はなかった（位相：ｐ＝０．５９、リアクタンス：ｐ＝０．４４、抵抗：ｐ＝０．５９）。１００ｋＨｚで、Ａｎｏ５−／−（３６．５±２．４、２１６．２±２７．３Ω、２９０．７±２２．０Ω）とＷＴ線維（３７．０±４．８、２２８．４±６３．９Ω、２９５．８±３６．１Ω）との間に差は観察されなかった（位相：ｐ＝０．７７、リアクタンス：ｐ＝０．５５、抵抗：ｐ＝０．６８）。
【図４】図４Ａ〜４Ｇは、Ａｎｏ５−／−筋肉における細胞内組織病理学を提供する。パネル（ａ）は、１０ヶ月齢のＡｎｏ５−／−ＴＡ筋及びＷＴ  ＴＡ筋のゴモリトリクローム染色を提供する。Ａｎｏ５−／−筋肉は、膜凝集体（矢印）を含む。尺度バー＝２０μｍ。パネル（ｂ）は、ＷＴ（ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析）と比較したＡｎｏ５−／−のＴＡ筋及びＧＡＳ筋中に凝集体を含む線維の数の定量化を提供する。パネル（ｃ、ｄ）は、Ａｎｏ５−／−筋肉中の膜凝集体の存在を示す電子顕微鏡像を提供する。凝集体は、けば状の内部小管を有する緩く密集した相互接続管形成（白色の矢印）であるか、小胞膜もしくは管膜の密に密集した蓄積（黒色の矢印）であった。尺度バー＝５００ｎｍ。パネル（ｅ）は、ミトコンドリア（矢印）及び変性ミトコンドリア（星印）の筋鞘下蓄積がＡｎｏ５−／−筋肉において電子顕微鏡法により頻繁に特定されたことを示す。尺度バー＝５００ｎｍ（左）及び２μｍ（右）。パネル（ｆ）は、ＷＴには存在しなかった筋鞘肥厚及び被膜線維を示した１０ヶ月齢のＡｎｏ５−／−ＴＡ筋のコハク酸デヒドロゲナーゼ染色を提供する。尺度バー＝１０μｍ。パネル（ｇ）は、コハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）染色した１０ヶ月齢のＡｎｏ５−／−マウスのＴＡ筋の凍結切片を提供する。矢印は、ＳＤＨ（左）を染色しない凝集体を示す。１０ヶ月齢のＡｎｏ５−／−マウス由来の連続切片は、トリクローム染色で観察された多くの膜凝集体（白色の矢印）がＳＥＲＣＡ１（右）に対して陽性であることを示し、それらが筋小胞体に由来することを示唆する。尺度バー＝４０μｍ。
【図５】図５Ａ〜５Ｅは、Ａｎｏ５−／−マウスにおける膜修復が欠損していることを示す。パネル（ａ）は、損傷５秒後及び１９０秒後に示されたレーザーパルスによって損傷を受けたＡｎｏ５−／−筋線維及びＷＴ筋線維の画像を提供する。赤色の矢印は、ＦＭ１−４３色素がＷＴと比較してＡｎｏ５−／−筋肉中に素早く蓄積する損傷部位を示す。尺度バー＝５０μｍ。パネル（ｂ）は、蛍光強度のレーザー誘起損傷後の蛍光強度の測定結果を提供する。Ａｎｏ５−／−筋肉は、損傷１００秒超後常に、ＷＴ及びＡＡＶ．ＡＮＯ５線維とは統計的に異なる（二元配置分散分析、Ｐ＜０．００１）。パネル（ｃ）は、５×１０１０ｖｇ  ＡＡＶ．ＡＮＯ５．ＦＬＡＧベクターを注入したＡｎｏ５−／−筋肉におけるＡＮＯ５−ＦＬＡＧの発現を示す。抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫蛍光法は、処置された筋肉（上）における細胞表面で、処置されたＡｎｏ５−／−筋肉（下）には不在であったＡＮＯ５−ＦＬＡＧ発現を示した。尺度バー＝４０μｍ。パネル（ｄ）は、心臓毒誘導筋肉損傷からの回復を示す。心臓毒注入１、３、７、１４、３０、及び９０日後に、ＷＴ及びＡｎｏ５−／−ＴＡ筋の組織切片をヘマトキシリン及びエオシン染色した（３日目、７日目、１４日目、及び３０日目を示す）。Ａｎｏ５−／−筋肉は、ＷＴと比較してより損傷を受けており、再生の障害を示した。パネル（ｅ）は、Ａｎｏ５−／−筋肉の筋線維サイズが、心臓毒注入後３０日目（心臓毒Ｄ３０）及び９０日目（心臓毒Ｄ９０）のＷＴと比較して統計的により小さいままである（Ｐ＜０．０５、ｔ検定）。
【図６】図６は、抗酸化剤またはプラセボ食餌で処置したＡｎｏ５−／−マウスの自発的活動を示す。このグラフは、抗酸化剤食餌またはプラセボ対照を１２週間及び１６週間受けたＡｎｏ５−／−マウスの自発的活動（４５分間以内にマウスが水平及び／または垂直レーザー光線を遮断した回数）を示す。三重抗酸化剤療法で処置したＡｎｏ５−／−マウスは、１６週時点でプラセボ処置と比較して著しく増加した活動を有する。
【図７】図７は、三重抗酸化剤療法またはプラセボ食餌のいずれかを与えたＡｎｏ５−／−マウス及びプラセボ食餌を与えたＷＴ対照マウスの横隔膜への比力の測定結果を示す。三重抗酸化剤療法で処置したＡｎｏ５−／−マウスは、１６週時点でプラセボ処置と比較して著しく増加した横隔膜比力を呈した。
【図８】図８Ａ〜８Ｂは、三重抗酸化剤処置のミトコンドリア新生及び機能への影響を示す。雄腓腹筋組織を使用して、三重抗酸化剤を与えたマウスにおけるミトコンドリア新生マーカー、ミトコンドリア新生ＰＧＣ−１ａ発現、及びクエン酸シンターゼ活性を測定した。パネル（ａ）は、三重抗酸化剤療法またはプラセボ食餌のいずれかを与えたマウスのＰＧＣ−１ａ発現を示す。パネル（ｂ）は、三重抗酸化剤療法またはプラセボ食餌のいずれかを与えた雄及び雌Ａｎｏ５−／−マウス及びＷＴマウスのクエン酸シンターゼ（ＣＳ）活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
ＡＮＯ５は、筋肉修復に極めて重要な役割を果たし、本発明は、ＭＤの治療のためのＡＮＯ５遺伝子を含むＡＡＶベクターを提供する。ＡＮＯ５の破壊は、マウスモデルにおけるジスフェルリン発現の損失を密に表現型模写し、ジスフェルリン変異により、ＡＮＯ５ミオパチーに類似したＭＤ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ（ＬＧＭＤ２Ｂ）及び三好型ミオパチージストロフィー１（ＭＭＤ１）対肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ（ＬＧＭＤ２Ｌ）及び三好型ミオパチージストロフィー３（ＭＭＤ３））が引き起こされる。
【００３８】
Ａｎｏ５−／−マウスは、ＡＮＯ５−ミオパチー、筋鞘修復、及び筋原細胞融合の研究用の重要なモデルを表す。以下の実施例に提供される実験的証拠は、Ａｎｏ５−／−マウスのＡＡＶ．ＡＮＯ５−ＦＬＡＧ処置により膜修復表現型を部分的に救助することによるＡＮＯ５−ミオパチーの治療戦略としての遺伝子置換療法のための方法を支持する。
ＡＡＶ
【００３９】
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの一般的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、ある特定の機能が同時感染ヘルパーウイルスによって提供される細胞内でのみ成長する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。現在、以下の表１に示されるように、特徴付けられているＡＡＶの血清型が１３存在する。ＡＡＶの一般的な情報及び概説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９−２２８、及びＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３−１７６４，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）で見つけることができる。しかしながら、様々な血清型が遺伝子レベルでさえも構造的及び機能的の両方で非常に密接に関連していることがよく知られているため、これらの同じ原理が追加のＡＡＶ血清型に適用可能であることが十分に予想される。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５−１７４  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．、及びＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３：１−６１（１９７４）を参照のこと）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を明らかに呈し、これらは全て、ＡＡＶ２で発現されたもの等の関連カプシドタンパク質を有する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った遺伝子型間の広範な交差ハイブリダイゼーション、及び「逆方向末端反復配列」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似の自己アニーリングセグメントの存在を明らかにするヘテロ二本鎖分析によってさらに示唆される。類似の感染性パターンは、各血清型における複製機能が類似の調節制御下にあることも示唆する。
【００４０】
本明細書で使用される「ＡＡＶベクター」とは、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している１つ以上の目的とするポリヌクレオチド（またはトランス遺伝子）を指す。かかるＡＡＶベクターは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物をコード及び発現するベクターでトランスフェクトされた宿主細胞中に存在する場合に、感染ウイルス粒子に複製及びパッケージングされ得る。
【００４１】
「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシド形成されたポリヌクレオチドＡＡＶベクターから成るウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳類細胞に送達されるトランス遺伝子等の野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは、典型的には、「ＡＡＶベクター粒子」または単に「ＡＡＶベクター」と称される。したがって、かかるベクターがＡＡＶベクター粒子内に含有されるため、ＡＡＶベクター粒子の産生には、必然的にＡＡＶベクターの産生が含まれる。
【００４２】
ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ  ５´逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と、転写調節要素、すなわち、１つ以上のプロモーター及び／またはエンハンサーに作動可能に連結されたタンパク質コード配列に隣接するＡＡＶ  ３´ＩＴＲと、ポリアデニル化配列と、任意に、タンパク質コード配列のエクソン間に挿入された１つ以上のイントロンとを有する一本鎖核酸または二本鎖核酸のいずれかであり得る。一本鎖ＡＡＶベクターは、ＡＡＶウイルス粒子のゲノム中に存在する核酸を指し、本明細書に開示される核酸配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかであり得る。かかる一本鎖核酸のサイズは、塩基単位で提供される。二本鎖ＡＡＶベクターは、プラスミドのＤＮＡ中に存在する核酸、例えば、ｐＵＣ１９、または二本鎖ウイルスのゲノム、例えば、ＡＡＶベクター核酸を発現または輸送するために使用されるバキュロウイルスを指す。かかる二本鎖核酸のサイズは、塩基対（ｂｐ）単位で提供される。
【００４３】
本明細書で使用される「逆方向末端反復（ＩＴＲ）」という用語は、ＤＮＡ複製の起源及びウイルスゲノムのパッケージングシグナルとしてシスで機能するＡＡＶゲノムの５´及び３´末端に見られる当該技術分野で認識されている領域を指す。ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域と一緒になって、宿主細胞ゲノムからの効率的な切除及びレスキュー、ならびに２つの隣接するＩＴＲ間に置かれたヌクレオチド配列の宿主細胞ゲノムへの組み込みを提供する。ある特定のＡＡＶ関連ＩＴＲの配列は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（１）：３６４−３７９（２００５）に開示されている。
【００４４】
「転写制御要素」とは、プロモーターを含む遺伝子転写の調節に関与するゲノムのヌクレオチド配列、ならびに応答要素、ＲＮＡポリメラーゼ結合を支援し、かつ発現を促進するための活性化因子及びエンハンサー配列、及びリプレッサータンパク質がＲＮＡポリメラーゼ結合を遮断し、かつ発現を阻止するために結合するオペレーターまたはサイレンサー配列を指す。
【００４５】
ＡＡＶ「ｒｅｐ」及び「ｃａｐ」遺伝子とは、それぞれ、複製及びカプシド形成タンパク質をコードする遺伝子である。ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、現在までに試験された全てのＡＡＶ血清型に見つけられており、本明細書及び引用される参考文献に記載されている。野生型ＡＡＶにおいて、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、概して、ウイルスゲノム内で互いに隣接した状態で見られ（すなわち、それらは、隣接しているか、または重複している転写単位として一緒に「カップリング」されており）、それらは、一般に、ＡＡＶ血清型間で保存される。ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、個別にかつ集合的に、「ＡＡＶパッケージング遺伝子」とも称される。本発明によるＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子は、ｒｅｐ及びアデノヘルパー機能の存在下でＡＡＶベクターをパッケージングすることができ、かつ標的細胞受容体に結合することができるＣａｐタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子は、特定のＡＡＶ血清型、例えば、表１に示される血清型及びＡＡＶ  ｒｈ．７４（米国特許第９，４３４，９２８号を参照のこと）に由来するアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質をコードする。他のタイプのｒＡＡＶ変異体、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，２２（１１）：１９００−１９０９（２０１４）を参照されたい。
【００４６】
【表１】
2018538261.tif 000003
【００４７】
ＡＡＶの産生に用いられるＡＡＶ配列は、任意のＡＡＶ血清型のゲノムに由来し得る。概して、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸及び核酸レベルで有意な相同性のゲノム配列を有し、同様の組の遺伝機能を提供し、本質的に物理的及び機能的に同等であるビリオンを産生し、実質的に同一の機構によって複製及び組み立てられる。ＡＡＶ血清型のゲノム配列及びゲノム類似性の考察については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ８９７９０、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ０１９０１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０４３３０３、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８５７１６、Ｃｈｌｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．７１：６８２３−３３（１９９７）、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．４５：５５５−６４（１９８３）、Ｃｈｌｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．７３：１３０９−１３１９（１９９９）、Ｒｕｔｌｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．７２：３０９−３１９（１９９８）、及びＷｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．７４：８６３５−４７（２０００）を参照されたい。
【００４８】
全ての既知のＡＡＶ血清型のゲノム編成は非常に類似している。ＡＡＶのゲノムは、約５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）長未満の直鎖一本鎖ＤＮＡ分子である。逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、非構造複製（Ｒｅｐ）タンパク質及び構造（ＶＰ）タンパク質の固有のコードクレオチド配列に隣接している。ＶＰタンパク質は、カプシドを形成する。末端１４５ｎｔは自己相補的であり、Ｔ字形ヘアピンを形成するエネルギー的に安定した分子内二本鎖を形成するように編成されている。これらのヘアピン構造は、細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとしての機能を果たすウイルスＤＮＡ複製の起源として機能する。Ｒｅｐ遺伝子は、Ｒｅｐタンパク質、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０をコードする。Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８は、ｐ５プロモーターから転写され、Ｒｅｐ  ５２及びＲｅｐ４０は、ｐ１９プロモーターから転写される。ｃａｐ遺伝子は、ＶＰタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから転写される。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列は、Ｓｆ９またはＨＥＫ細胞等の特定の細胞型での発現のために発現制御配列に動作可能に連結している。昆虫宿主細胞または哺乳類宿主細胞で外来遺伝子を発現するための当業者に既知の手技を使用して、本発明を実施することができる。昆虫細胞におけるポリペプチドの分子工学及び発現のための方法論は、例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ．１９８６．Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌ．Ｎｏ．７５５５，Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｔｅｘ．、Ｌｕｃｋｏｗ．１９９１．Ｉｎ  Ｐｒｏｋｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ´  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，９７−１５２、Ｋｉｎｇ，Ｌ．Ａ．ａｎｄ  Ｒ．Ｄ．Ｐｏｓｓｅｅ，１９９２，Ｔｈｅ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ、Ｏ´Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｌ．Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｖ．Ａ．Ｌｕｃｋｏｗ，１９９２，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．  Ｄ．，１９９５，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ  ３９、米国特許第４，７４５，０５１号、ＵＳ２００３１４８５０６、及びＷＯ０３／０７４７１４に記載されている。ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写に特に好適なプロモーターは、例えば、多角体プロモーターである。しかしながら、昆虫細胞で活性の他のプロモーター、例えば、ｐ１０、ｐ３５、またはＩＥ−１プロモーターが当該技術分野で既知であり、上記の参考文献に記載されるさらなるプロモーターも企図される。
【００５０】
異種タンパク質の発現のための昆虫細胞の使用は、ベクター、例えば、昆虫細胞適合性ベクター等の核酸をかかる細胞に導入する方法及びかかる細胞を培養中に維持する方法として十分に立証されている。例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，ｅｄ．Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９５）、Ｏ´Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＶＥＣＴＯＲＳ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．６３：３８２２−８（１９８９）、Ｋａｊｉｇａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ´ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：  ４６４６−５０（１９９１）、Ｒｕｆｆｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．６６：６９２２−３０（１９９２）、Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒ．２１９：３７−４４（１９９６）、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒ．２７２：３８２−９３（２０００）、及びＳａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，２０４，０５９号を参照されたい。いくつかの実施形態では、昆虫細胞中のＡＡＶをコードする核酸構築物は、昆虫細胞適合性ベクターである。本明細書で使用される「昆虫細胞適合性ベクター」または「ベクター」とは、昆虫または昆虫細胞の増殖性形質転換またはトランスフェクションが可能な核酸分子を指す。例示の生物学的ベクターとしては、プラスミド、直鎖核酸分子、及び組換えウイルスが挙げられる。昆虫細胞適合性である限り、いずれのベクターも使用され得る。ベクターは、昆虫細胞ゲノムに組み込まれ得るが、昆虫細胞中のベクターの存在は、恒久的である必要はなく、一時的なエピソームベクターも含まれる。ベクターは、任意の既知の手段によって、例えば、細胞の化学的処理、電気穿孔法、または感染によって導入され得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、バキュロウイルス、ウイルスベクター、またはプラスミドである。より好ましい実施形態では、ベクターは、バキュロウイルスであり、すなわち、構築物は、バキュロウイルスベクターである。バキュロウイルスベクター及びそれらを使用するための方法は、昆虫細胞の分子工学に関する上記で引用された参考文献に記載されている。
【００５１】
バキュロウイルスは、節足動物のエンベロープＤＮＡウイルスであり、この２つのメンバーは、細胞培養物中に組換えタンパク質を産生するための周知の発現ベクターである。バキュロウイルスは、大きなゲノム含有量の特定の細胞への送達を可能にするように操作され得る環状二本鎖ゲノム（８０〜２００ｋｂｐ）を有する。ベクターとして使用されるウイルスは、一般に、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａマルチカプシド核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）またはＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ（Ｂｍ）ＮＰＶ）である（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【００５２】
バキュロウイルスは、組換えタンパク質の発現のために昆虫細胞の感染に一般的に使用される。具体的には、昆虫における異種遺伝子の発現は、例えば、米国特許第４，７４５，０５１号、Ｆｒｉｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８６）、ＥＰ１２７，８３９、ＥＰ１５５，４７６、Ｖｌａｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）、Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）、Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ（１９８５）、Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ（１９８５）、Ｍｉｙａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）、及びＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）に記載されるように達成され得る。タンパク質産生に使用され得る多数のバキュロウイルス株及び変異体ならびに対応する許容昆虫宿主細胞は、Ｌｕｃｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８６）、Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ（１９８５）、及びＭｃＫｅｎｎａ（１９８９）に記載されている。
【００５３】
一態様では、本発明は、ｒＡＡＶゲノムを提供する。ｒＡＡＶゲノムは、ＡＮＯ５タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に隣接する１つ以上のＡＡＶ  ＩＴＲを含む。ポリヌクレオチドがＡＮＯ５タンパク質をコードする場合、ポリヌクレオチドは、転写制御ＤＮＡ、具体的には、遺伝子カセットを形成するために標的細胞、例えば、筋肉細胞内で機能的なプロモーターＤＮＡ及びポリアデニル化シグナル配列ＤＮＡに動作可能に連結される。遺伝子カセットは、哺乳類細胞で発現された場合にＲＮＡ転写物の処理を促進するためのイントロン配列も含み得る。例えば、ＡＡＶゲノムは、ＡＮＯ５遺伝子のエクソン８及びエクソン９等のＡＮＯ５遺伝子の１つ以上のエクソンに隣接する１つ以上のＡＡＶ  ＩＴＲを含む。ＡＡＶゲノムは、イントロン、レポート遺伝子（Ｌａｃ−Ｚ  β−ガラクトシダーゼまたはネオマイシン耐性遺伝子等）、ＣＲＥ−Ｌｏｘ組換え部位（Ｌｏｘ  Ｐ等）、及び内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥ  Ｓ）のうちの１つ以上を含む。
組換えＡＡＶを産生するための方法
【００５４】
本開示は、昆虫または哺乳類細胞において組換えＡＡＶを産生するための材料及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、ウイルス構築物は、目的とする１つ以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入を可能にするためのプロモーター及びそのプロモーターの下流の制限部位をさらに含み、プロモーター及び制限部位は、５´ＡＡＶ  ＩＴＲの下流及び３´ＡＡＶ  ＩＴＲの上流に位置する。いくつかの実施形態では、ウイルス構築物は、制限部位の下流及び３´ＡＡＶ  ＩＴＲの上流に転写後節要素をさらに含む。いくつかの実施形態では、ウイルス構築物は、制限部位に挿入され、かつプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドは、目的とするタンパク質のコード領域を含む。当業者が認識するように、本出願に開示されるＡＡＶベクターのうちのいずれか１つが、ウイルス構築物として組換えＡＡＶを産生するための方法で使用され得る。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムの感染性ウイルス粒子への組込みのために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）の感染に許容される細胞に導入される。ＡＡＶゲノムがパッケージングされるｒＡＡＶ粒子、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供されるｒＡＡＶ粒子を産生する技法は、当該技術分野において標準である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ヘルパー機能は、アデノウイルスまたはバキュロウイルスヘルパー遺伝子を含む１つ以上のヘルパープラスミドまたはヘルパーウイルスによって提供される。アデノウイルスまたはバキュロウイルスヘルパー遺伝子の非限定的な例としては、ヘルパー機能をＡＡＶパッケージングに提供することができるＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
ＡＡＶのヘルパーウイルスは、当該技術分野で既知であり、例えば、アデノウイルス科ファミリー及びヘルペスウイルス科ファミリーからのウイルスが含まれる。ＡＡＶのヘルパーウイルスの例としては、米国公開第２０１１０２０１０８８号（この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載のＳＡｄＶ−１３ヘルパーウイルス及びＳＡｄＶ−１３様ヘルパーウイルス、ヘルパーベクターｐＨＥＬＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｖｉｒｏｍｉｃｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、適切なヘルパー機能をＡＡＶに提供することができるＡＡＶの任意のヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドが本明細書で使用され得ることを理解する。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子は、プラスミド中に存在する。プラスミドは、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子をさらに含み得る。任意のＡＡＶ血清型由来のｃａｐ遺伝子及び／またはｒｅｐ遺伝子（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ  ｒｈ．７４、及びそれらの任意の変異形を含むが、これらに限定されない）を本明細書で使用して、組換えＡＡＶを産生することができる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子は、血清型１、血清型２、血清型４、血清型５、血清型６、血清型７、血清型８、血清型９、血清型１０、血清型１１、血清型１２、血清型１３、またはそれらの変異形由来のカプシドをコードする。
【００５８】
いくつかの実施形態では、昆虫または哺乳類細胞は、ヘルパープラスミドまたはヘルパーウイルスでトランスフェクトされ得、ウイルス構築物及びＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドは、共トランスフェクション後の様々な時点で収集され得る。例えば、組換えＡＡＶウイルスは、約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約９６時間、約１２０時間、またはこれらの２つの時点のうちのいずれかの間の時点で収集され得る。
【００５９】
組換えＡＡＶは、感染性組換えＡＡＶの産生に好適な当該技術分野で既知の任意の従来の方法を使用して産生され得る。いくつかの例では、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ粒子産生に必要な成分のうちのいくつかを安定的に発現する昆虫または哺乳類細胞を使用することによって産生され得る。例えば、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにネオマイシン耐性遺伝子等の選択可能なマーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノム内に組み込まれ得る。その後、昆虫または哺乳類細胞は、ヘルパーウイルス（例えば、ヘルパー機能を提供するアデノウイルスまたはバキュロウイルス）、ならびに５´及び３´ＡＡＶ  ＩＴＲ（ならびに所望の場合、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列）を含むウイルスベクターに同時感染させられ得る。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、組換えＡＡＶの大規模産生に好適であることである。別の非限定的な例として、プラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを使用して、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入することができる。さらに別の非限定的な例として、５´及び３´ＡＡＶ  ＬＴＲを含有するウイルスベクターもｒｅｐ−ｃａｐ遺伝子もいずれも、産生細胞のＤＮＡに安定して組み込まれ得、ヘルパー機能は、組換えＡＡＶを産生するために野生型アデノウイルスによって提供され得る。
【００６０】
パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要な成分を全て安定して発現する細胞株を作製することである。例えば、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、及びネオマイシン耐性遺伝子等の選択可能なマーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７−２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５−７３）、または直接平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ  ＆  Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１−４６６６）等の手法によって細菌プラスミドに導入されている。その後、パッケージング細胞株は、アデノウイルス等のヘルパーウイルスに感染させられる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためにプラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いる。
【００６１】
ｒＡＡＶ産生の一般的原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３−５３９、及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７−１２９）に概説されている。様々なアプローチが、Ｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）．Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５及び対応する米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：１２４４−１２５０、Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：６０９−６１５、Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：１１２４−１１３２、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、及び米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。前述の文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ産生に関する文書の部分を特に強調する。
【００６２】
したがって、本発明は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、及びＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）等の安定して形質転換された癌細胞であり得る。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換された癌細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ−５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ−３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、及びＦＲｈＬ−２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。
【００６３】
ｒＡＡＶは、当該技術分野で標準の方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によって精製され得る。ｒＡＡＶベクターをヘルパーウイルスから精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１−１０３９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９  ４２７−４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号、及びＷＯ９８／０９６５７に開示されている方法が含まれる。
【００６４】
ＡＡＶ産生で使用される細胞型
本発明のＡＡＶベクターを含むウイルス粒子は、ＡＡＶまたは生物学的産物の産生を可能にし、かつ培養中に維持され得る任意の無脊椎動物細胞型を使用して導入され得る。例えば、使用される昆虫細胞株は、ＳＦ９、ＳＦ２１、ＳＦ９００＋等のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞株、蚊細胞株、例えば、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ由来の細胞株、ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ｓｉｌｋｗｏｒｍ細胞株、例えば、Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ細胞株、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ細胞株、例えば、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞、またはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ細胞株、例えば、Ａｓｃａｌａｐｈａ  ｏｄｏｒａｔａ細胞株由来であり得る。好ましい昆虫細胞は、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ、Ｓｆ９、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲ１、Ｓｆ９、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４、ＭＧ−１、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍ１、ＢＭ−Ｎ、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５、及びＡｏ３８を含む、バキュロウイルス感染にかかりやすい昆虫種由来の細胞である。
【００６５】
バキュロウイルスは、節足動物のエンベロープＤＮＡウイルスであり、この２つのメンバーは、細胞培養物中に組換えタンパク質を産生するための周知の発現ベクターである。バキュロウイルスは、大きなゲノム含有量の特定の細胞への送達を可能にするように操作され得る環状二本鎖ゲノム（８０〜２００ｋｂｐ）を有する。ベクターとして使用されるウイルスは、一般に、Ａｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ  ｃａｌｆｏｒｉｃｉｎｅマルチカプシド核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）またはＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ（Ｂｍ  ＮＰＶ）である（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【００６６】
バキュロウイルスは、組換えタンパク質の発現のために昆虫細胞の感染に一般的に使用される。具体的には、昆虫における異種遺伝子の発現は、例えば、米国特許第４，７４５，０５１号、Ｆｒｉｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８６）、ＥＰ１２７，８３９、ＥＰ１５５，４７６、Ｖｌａｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）、Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）、Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ（１９８５）、Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ（１９８５）、Ｍｉｙａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）、及びＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）に記載されるように達成され得る。タンパク質産生に使用され得る多数のバキュロウイルス株及び変異体ならびに対応する許容昆虫宿主細胞は、Ｌｕｃｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８６）、Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ（１９８５）、及びＭｃＫｅｎｎａ（１９８９）に記載されている。
【００６７】
本発明の別の態様では、本発明の方法は、ＡＡＶの複製または生物学的産物の産生を可能にし、かつ培養中に維持され得る任意の哺乳類細胞型を用いても実行される。使用される好ましい哺乳類細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＢＨＫ、ＨＴ  １０８０、Ａ５４９、Ｃｏｓ−７、ＡＲＰＥ−１９、及びＭＲＣ−５細胞であり得る。
【００６８】
組成物
別の実施形態では、本発明は、本発明のｒＡＡＶ及び／または抗酸化剤を含む組成物を企図する。これらの組成物を使用して、筋肉を再生、強化、もしくは修復し、かつ／または筋肉機能を改善することができる。
【００６９】
本発明の組成物は、薬学的に許容される担体中にｒＡＡＶを含む。本組成物は、希釈剤及びアジュバント等の他の成分も含み得る。許容される担体、希釈剤、及びアジュバントは、レシピエントに非毒性であり、好ましくは、用いられる投薬量及び濃度で不活性であり、リン酸、クエン酸、もしくは他の有機酸等の緩衝剤；抗酸化剤；低分子量ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトールもしくはソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；ならびに／またはＴｗｅｅｎ、プルロニクス、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が含まれる。
【００７０】
インビボまたはインビトロでのｒＡＡＶで標的細胞を形質導入する方法が、本発明によって企図される。インビボ方法は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物の有効用量または有効複数回用量を、それを必要とする動物（ヒト患者を含む）に投与するステップを含む。対象への本開示のｒＡＡＶを含む組成物の組み合わせの有効用量または有効複数回用量は、治療される疾患に関連する筋肉病理を予防するか、その進行を遅延させるか、または改善する用量である。筋肉病理への影響は、例えば、絶対筋比力、伸張性筋肉収縮中の力減衰、血清ＣＫレベル、血清心臓トロポニンレベル、血清ＭＭＰ９レベル、握力、四肢トルク、四肢可動性または柔軟性、歩行、６分間歩行試験、膝屈筋または伸筋力、最大自発的等尺性筋肉収縮、Ｎｏｒｔｈ  Ｓｔａｒ歩行評価、筋肉量、脂肪減少、または四肢Ｔ２加重ＭＲＩ測定による浮腫、筋拘縮、肢関節角度、心機能（心拍数、心拍出量、短縮率パーセント、１回拍出量）、呼吸（呼吸速度、血液酸素化、酸素補給の必要性を含む）、筋壊死、筋肉再生、筋肉消耗、筋肉炎症、筋肉石灰化、筋肉中心核化、筋肉サイズまたは筋原線維サイズ、寿命、及びジストロフィンまたはラミニンアルファ２代理タンパク質発現（ユートロフィン、プレクチン１、ラミニンアルファ５、アグリン）等の当該技術分野で標準の１つ以上の評価基準の改善によって実証され得る。例えば、Ｆｏｒｂｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，２６９（１）：１９８−２０７（２０１３）、Ｇｏｖｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，７０（２３）：４５８５−４６０２（２０１３）、及びＣｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒａｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，４７９：２９１−３２２（２０１０）を参照されたい。用量が疾患の発症前に投与される場合、投与は、予防的である。用量が疾患の発症後に投与される場合、投与は、治療的である。したがって、治療される疾患を予防し、その進行を遅延もしくは予防し、その程度を弱め、その（部分的もしくは全体的な）寛解をもたらし、かつ／またはその生存期間を延長するための本明細書に記載の方法による対象の治療が企図される。
【００７１】
併用療法も本発明によって企図される。本明細書で使用される併用療法は、同時治療または連続治療を含む。新規の療法との併用等の本発明の方法と標準の医療処置（例えば、筋ジストロフィーのためのコルチコステロイド）との併用が特に企図される。この点において、筋肉損傷を軽減または抑制するか、筋肉を強化するか、または筋肉修復を誘導するためにＡＮＯ５の発現を誘導することができ、その後、二次治療を提供することができる。筋ジストロフィーのかかる二次治療は、抗酸化剤（例えば、リポ酸、補酵素Ｑ１０、及びα−トコフェロール）、ＩＧＦ−１、干渉ＲＮＡアプローチ、エクソンスキッピング、カルパイン阻害、ジストロフィン上方調節、及びジストログリカン発現の使用を含み得る。さらに、筋肉増強効果を強化するために、ＡＮＯ５の発現が追加され得る。例えば、ＩＧＦ−１もしくは他の栄養因子の添加または筋肉前駆体注入が行われ得る。
【００７２】
本発明に開示される方法で投与されるｒＡＡＶの用量は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与様式、治療目標、治療される個体及び細胞型（複数可）に応じて異なり、当該技術分野で標準の方法によって決定され得る。投与される各ｒＡＡＶの力価は、ＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）１ｍＬ当たり約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３、約１×１０１４、または約１×１０１５以上の範囲であり得る。投薬量は、ウイルスゲノムの単位（ｖｇ）でも表され得る（すなわち、それぞれ、１×１０７ｖｇ、１×１０８ｖｇ、１×１０９ｖｇ、１×１０１０ｖｇ、１×１０１１ｖｇ、１×１０１２ｖｇ、１×１０１３ｖｇ、１×１０１４ｖｇ、１×１０１５）。ＡＡＶを滴定するための方法は、Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１０：１０３１−１０３９（１９９９）に記載されている。
【００７３】
本組成物の有効用量の投与は、筋肉内、非経口、静脈内、経口、口腔、鼻腔、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、または膣内を含むが、これらに限定されない当該技術分野で標準の経路により得る。本発明のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（具体的には、ＡＡＶ  ＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の投与経路及び血清型（複数可）は、治療される病状ＡＮＯ５タンパク質を発現する標的細胞／組織（複数可）を考慮して、当業者によって選択及び／または適合され得る。いくつかの実施形態では、経路は、患者の大腿四頭筋への１回以上の筋肉内注射である。いくつかの実施形態では、経路は、患者の大腿四頭筋の３つの主要筋肉群の各々への１回以上の筋肉内注射である。
【００７４】
具体的には、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。本発明による投与としては、筋肉内への注入、血流への注入、及び／または肝臓への直接注入が挙げられるが、これらに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水中にｒＡＡＶを単に再懸濁させることが、筋肉組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与され得る担体または他の成分に対する既知の制限はない（が、ＤＮＡを分解する組成物がｒＡＡＶとの通常の方法で避けられるべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉等の目的とする特定の標的組織を標的とするように修飾され得る。例えば、開示が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。薬学的組成物は、注射可能な製剤として、または経皮輸送によって筋肉に送達される局所製剤として調製され得る。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の製剤が以前に開発されており、本発明を実施する際に使用され得る。ｒＡＡＶは、投与及び取扱い易くするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用され得る。
【００７５】
筋肉内注射の目的のために、例えば、ゴマ油もしくはピーナッツ油等のアジュバント中の溶液、または水性プロピレングリコール中の溶液、ならびに滅菌水溶液が用いられ得る。かかる水溶液は、所望の場合、緩衝され、液体希釈剤は、最初に生理食塩水またはグルコースで等張性にする。遊離酸としてのｒＡＡＶ溶液（ＤＮＡが酸性リン酸基を含有する）または薬理学的に許容される塩は、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と好適に混合された水中で調製され得る。ｒＡＡＶ分散剤は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中、ならびに油中でも調製され得る。通常の保管及び使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を阻止するために防腐剤を含有する。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に周知の標準の技法によって容易に得ることが可能である。
【００７６】
注射可能な使用に好適な薬学的形態としては、滅菌水溶液または分散剤、及び注射可能な滅菌溶液または分散剤の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。あらゆる場合において、この形態は、滅菌でなければならず、容易なシリンジ注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性でなければならない。これは、製造及び保管条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌等の微生物の混入作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの好適な混合物、及び植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散の場合には必要な粒径の維持によって、かつ界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の保護は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の様々な抗細菌剤及び抗真菌剤によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらされ得る。
【００７７】
注射可能な滅菌溶液は、必要に応じて、必要量のｒＡＡＶを、上に列挙される様々な他の成分を有する適切な溶媒に組み込み、その後、濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散剤は、滅菌活性成分を、塩基性分散媒体及び上に列挙されるものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。注射可能な滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分に加えて、その以前に滅菌濾過された溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末を産生する、真空乾燥及びフリーズドライ技法である。
【００７８】
ｒＡＡＶでの形質導入もインビトロで行われ得る。一実施形態では、所望の標的筋肉細胞は、対象から除去され、ｒＡＡＶで形質導入され、対象に再導入される。あるいは、同系または異種筋肉細胞が対象において不適切な免疫応答を生成しない場合、同系または異種筋肉細胞が使用され得る。
【００７９】
対象への形質導入細胞の形質導入及び再導入のための好適な方法は、当該技術分野で既知である。一実施形態では、細胞は、例えば適切な培地中でｒＡＡＶを筋肉細胞と組み合わせ、サザンブロット及び／またはＰＣＲ等の従来の技法を使用して目的とするＤＮＡを持つ細胞についてスクリーニングすることによって、または選択可能なマーカーを使用することによってインビトロで形質導入され得る。その後、形質導入された細胞は、薬学的組成物に製剤化され得、この組成物は、筋肉内、静脈内、皮下、及び腹腔内注射等の様々な技法によって、または例えばカテーテルを使用して、平滑心筋に注射することによって対象に導入される。
【００８０】
本発明のｒＡＡＶでの細胞の形質導入は、ＡＮＯ５タンパク質の持続発現をもたらす。したがって、本発明は、ＡＮＯ５を動物、好ましくはヒトに発現するｒＡＡＶを投与／送達する方法を提供する。これらの方法は、本発明の１つ以上のｒＡＡＶでの形質導入組織（筋肉等の組織、肝臓及び脳等の臓器、ならびに唾液腺等の腺を含むが、これらに限定されない）を含む。形質導入は、組織特異的制御要素を含む遺伝子カセットで行われ得る。例えば、本発明の一実施形態は、アクチン及びミオシン遺伝子ファミリーに由来する制御要素、例えば、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリーに由来する制御要素［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６１−７６６（１９９１）を参照のこと］、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ−２［Ｃｓｅｒｊｅｓｉ  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１：４８５４−４８６２（１９９１）］、ヒト骨格アクチン遺伝子に由来する制御要素［Ｍｕｓｃａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，７：４０８９−４０９９（１９８７）］、心臓アクチン遺伝子、筋肉クレアチンキナーゼ配列要素［Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，９：３３９３−３３９９（１９８９）を参照のこと］及びマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）要素、例えば、マウスｍＣＫの三重コピーであるＭＣＫ７またはｔＭＣＫ、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子、及び遅筋トロポニンＩ遺伝子に由来する制御要素、低酸素誘導核因子（Ｓｅｍｅｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８８：５６８０−５６８４（１９９１））、グルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）を含むステロイド誘導要素及びプロモーター［Ｍａｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５６０３−５６０７（１９９３）］、ならびに他の制御要素を含むが、これらに限定されない筋肉特異的制御要素によって誘導される筋肉細胞及び筋肉組織を形質導入する方法を提供する
【００８１】
筋肉組織は、重要な臓器ではなく、アクセスが容易であるため、インビボ遺伝子送達及び遺伝子療法のための魅力的な標的である。本発明は、形質導入筋原線維由来の生物学的に活性なＡＮＯ５タンパク質の持続発現を企図する。
【００８２】
「筋肉細胞」または「筋肉組織」とは、任意の種類の筋肉（例えば、消化管、膀胱、血管、または心臓組織由来の、例えば、骨格筋及び平滑筋）に由来する細胞または細胞群を意味する。かかる筋肉細胞は、筋芽細胞、筋細胞、筋管、心筋細胞、及び心筋芽細胞等の分化または未分化のものであり得る。筋肉組織が循環系に容易にアクセス可能であるため、インビボで筋肉細胞及び組織によって産生及び分泌されたタンパク質は、全身送達のために論理的に血流に入り、それにより、筋肉からの治療レベルのタンパク質分泌の持続を提供する。
【００８３】
「形質導入」という用語は、レシピエント細胞による機能的ＡＮＯ５タンパク質の発現をもたらす、本発明の複製欠損ｒＡＡＶを介するインビボまたはインビトロのいずれかでのＡＮＯ５  ＤＮＡのレシピエント細胞への投与／送達を指すために使用される。
【００８４】
抗酸化剤組成物
骨格筋収縮中の反応性酸素種の産生が十分に確立されている。長期間の運動中、これらの酸化体の量の増加は、タンパク質及び脂質に損傷を与え、複数のストレス応答シグナル伝達経路の活性化につながる（Ｐｏｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ５１：  ９４２−５０（２０１１））。結果として、いくつかの研究は、骨格筋における酸化ストレスを緩和する手段としての長期抗酸化剤補給の使用を調査している。最近の一研究は、雌マウスの食餌に補給された３つの抗酸化剤（ビタミンＥ、α−リポ酸、及び補酵素Ｑ１０）の製剤が、走行性能、ならびにミトコンドリア機能のマーカーを改善したことを報告した（Ａｂａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．８：ｅ６０７２２（２０１３））。しかしながら、他の研究は、同様に修正された食餌（ビタミンＥ＋α−リポ酸）が、ラットにおけるミトコンドリア新生を低減したことを報告した（Ｓｔｒｏｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｅｘｅｒｃ．４３：１０１７−２４（２０１１））。現在、長期抗酸化剤補給の骨格筋健康への影響における共通認識が当該技術分野に存在せず、疾患によって衰弱した筋肉にはほとんど注意が払われていない。しかしながら、本発明は、抗酸化剤食餌がＡｎｏ５−／−マウスの骨格筋に有益な影響を与えるという証拠を提供する。
【００８５】
抗酸化剤
本発明は、筋ジストロフィーに罹患している対象における筋肉生理学及び機能を改善するための抗酸化剤組成物の投与を提供する。本明細書に開示される抗酸化剤組成物は、少なくとも１つの抗酸化剤を利用する。加えて、本発明は、少なくとも２つまたは少なくとも３つの抗酸化剤を含む抗酸化剤組成物を提供し、これらの組成物において、抗酸化剤は、異なる細胞機能を有する。好ましい抗酸化剤は、経年劣化の産物としてミトコンドリア損傷を特異的に逆転させることが示されているものである。例えば、本発明は、補酵素Ｑ１０、α−リポ酸、カロテノイド（α−カロチン、β−カロチン、リコピン、ルテイン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、及びゼアキサンチン）、ビタミンＡ（レチノール、３，４−ジデヒドロレチノール、及び３−ヒドロキシレチノール）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、及びビタミンＥ（α−トコフェロール）等のビタミン、ビタミン補因子、ポリフェノール及びフラボノイド（レスベラトロル、ジンジェロール、クルクミン）、または鉱物（鉄、マグネシウム、セレン、銅、亜鉛、マンガン、ヨウ化物）のうちの少なくとも１つを含む抗酸化剤組成物を提供する。好ましい実施形態では、これらの抗酸化剤は、補酵素Ｑ１０、ビタミンＥ、α−リポ酸である。
【００８６】
補酵素Ｑ１０（別名、Ｑ１０、ビタミンＱ１０、ユビキノン、ユビデカレノン、または補酵素Ｑ）は、脂溶性物質である。補酵素Ｑ１０は、電子伝達鎖（ＥＴＣ）に不可欠な電子シャトル化合物である。ＥＴＣは、細胞へのエネルギーの重要な源であるＡＴＰ合成を駆動する。ビタミンＥ（別名、α−トコフェロール）は、膜（ミトコンドリア膜を含む）の重要な成分であり、脂質フリーラジカルを除去する機能を果たす。
【００８７】
α−リポ酸（別名、チオクト酸）は、最終的にＡＴＰ産生をもたらすＫｒｅｂｓサイクルの適切な機能のためのピルビン酸デヒドロゲナーゼ等のミトコンドリアデヒドロゲナーゼの必須補因子であるオクタン酸に由来する有機硫黄化合物である。α−リポ酸はまた、ＰＧＣ１αを介してミトコンドリア新生を調節する細胞中のエネルギーセンサーであるＡＭＰＫを活性化することによって骨格筋に直接影響する。
【００８８】
ポリフェノールとしては、フェノール酸及びフラボノイドが挙げられる。例えば、フェノール酸としては、プロトカテク酸、没食子酸、ヒドロキシ安息香酸、ヒドロキシ桂皮酸、例えば、コーヒー酸、クロロゲン酸、クマル酸、フェルラ酸、シナピン酸、アントシアニン、例えば、シアニジン、ペラルゴニジン、ペオニジン、デルフィニジン、及びマルビジンが挙げられる。例示のフラボノイドとしては、フラボノール、例えば、ケルセチン、ケンペロール、ミリセチン、フラボン、例えば、アピゲニン及びルテオリン、グラバオノン（ｇｌａｖａｏｎｏｎｅ）、例えば、ヘスペレチン、ナリンゲニン、及びエリオジクチオール、イソフラボン、例えば、ダイゼイン、ゲニステイン、及びグリシテイン、ならびに単量体フラボノール、例えば、カテキン及びエピカテキンが挙げられる。
【００８９】
投与及び投薬
本開示は、少なくとも１つの抗酸化剤を使用して筋ジストロフィー及び慢性筋肉消耗を治療するための材料及び方法を提供する。少なくとも１つの抗酸化剤を投与すること、または少なくとも２つの抗酸化剤を投与すること、または少なくとも３つの抗酸化剤を投与することを含む、筋ジストロフィーを治療する例示の組成物及び方法。例えば、本発明は、α−リポ酸、補酵素Ｑ１０、及びα−トコフェロール（別名、ビタミンＥ）を含む抗酸化剤組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗酸化剤組成物は、単独で、またはＡＮＯ５タンパク質もしくはその機能的に活性な断片をコードするヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクターと組み合わせて投与され得る。
【００９０】
本開示の方法は、注射、経口摂取、鼻腔内、局所、経皮、非経口、吸入噴霧、膣内、または直腸投与を含むが、これらに限定されない、薬剤を哺乳類対象に直接または間接的に投与するための任意の医学的に許容されている手段を使用して行われる。本明細書で使用される非経口という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、及び嚢内注射、ならびにカテーテルまたは注入技法を含む。皮内、腹腔内、髄腔内、球後、肺内注射による投与、及びまたは特定の部位における外科的移植も企図される。
【００９１】
一実施形態では、投与は、部位への直接注射による治療または持続送達もしくは持続放出機構を介する治療を必要とする罹患組織（例えば、筋肉）で行われ、製剤を内部に送達することができる。例えば、組成物の持続送達が可能な生分解性微小球もしくはカプセルまたは他の生分解性ポリマー構成（例えば、溶性ポリペプチド、抗体、または小分子）が、罹患組織の近くに、または罹患組織に埋め込まれる本開示の製剤に含まれ得る。
【００９２】
いくつかの実施形態では、抗酸化剤及びＡＮＯ５を含むＡＡＶベクターの同時投与は、薬剤が治療効果を発揮している期間に重複が存在する限り、薬剤が同時にまたは同じ経路により投与されることを必要としない。異なる日または週の投与としての同時または連続投与が企図される。
【００９３】
いくつかの実施形態では、抗酸化剤及び／またはＡＡＶベクター組成物は、患者の複数の部位にも送達され得る。複数回投与は、同時に行われるか、またはある期間にわたって投与され得る。ある特定の場合、治療用組成物の連続流動を提供することが有益である。付加療法は、ある期間に基づいて、例えば、１時間に１回、１日１回、２日に１回、週２回、週３回、週１回、２週間に１回、３週間に１回、月１回、またはより長い間隔で投与され得る。
【００９４】
本開示の薬剤が同じ製剤で同時に与えられ得ることが企図される。薬剤が別個の製剤で投与され、かつ同時に投与されることがさらに企図され、同時とは、互いに３０分以内に与えられることを指す。
【００９５】
したがって、本発明は、例えば、ＡＮＯ５をコードするｒＡＡＶ及び／または抗酸化剤の有効用量（または本質的に同時に投与される用量もしくはある間隔で与えられる用量）を、それを必要とする患者に投与する方法を提供する。
【００９６】
所与の投薬量中の抗酸化剤組成物の量は、療法が投与される個体のサイズ、ならびに治療される障害の特徴に従って異なり得る。例示の治療では、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％のリポ酸、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％の補酵素Ｑ１０、及び約１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００ＩＵのα−トコフェロールまたはビタミンＥを含む抗酸化剤食餌の投与が必要であり得る。これらの濃度は、単一剤形として、または複数回用量として投与され得る。最初に動物モデル、その後に臨床試験における標準の用量応答研究により、特定の病状及び患者集団の最適な投薬量が明らかになる。
【００９７】
従来の治療薬が本開示の治療薬と組み合わせて投与される場合、投薬が修正されてもよいことも明らかであろう。
【実施例】
【００９８】
実施例１
Ａｎｏ５−／−マウスモデルの単離及び生成
Ａｎｏ５ノックアウトマウスを、エクソン８からエクソン９までＡｎｏ５を標的とするベクターを使用して生成して、図１Ａに示される切断転写物を産生した。標的構築物を、ヌル対立遺伝子がＴｅｓｌａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅｓｉｓ  ３８，１５１−１５８（２００４）に記載されるようにｌａｃＺ捕捉要素へのスプライシングにより生成されるように、「ノックアウトファースト」条件付き準備（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｒｅａｄｙ）構築物として設計した。このｌａｃＺタグ付き変異対立遺伝子Ａｎｏ５：ｔｍ１ａ（ＫＯＭＰ）Ｗｔｓｉ標的ベクターを、ＵＣ  Ｄａｖｉｓ  ＫＯＭＰ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ＰＧ０００９７＿Ｚ＿１＿Ｇ０、Ｋａｒｎｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７４，３３７−３４２（２０１１）から入手した。標的カセットを、隣接ＦＲＴ及びｌｏｘＰ部位が存在するエクソン８の後に挿入して、胚致死が顕著であった場合に、条件付き対立遺伝子を生成した。
【００９９】
胚幹細胞標的及び移植後、遺伝子型をゲノムＰＣＲによって検証した（図１ｂ）。クローンを、エクソン１〜６（ｅ１〜６）またはエクソン１７〜２０（ｅ１７〜２０）に及ぶ以下のプライマーセットを使用してＲＴ−ＰＣＲによってスクリーニングし、それらは、図１ｃに示されるように、内因性Ａｎｏ５遺伝子座から３００ｂｐのアンプリコン及びＡｎｏ５カセット挿入遺伝子座から２００ｂｐのアンプリコンを産生した：
遺伝子型決定Ｆ  ５´−ＡＧＴＣＣＴＴＴＴＣＡＧＣＡＣＡＧＴＣＴＴＴＧ−３´（配列番号３）
遺伝子型決定Ｒ  ５´−ＴＧＡＧＧＣＡＧＴＧＴＧＧＡＧＴＧＡＧＴＡ−３´（配列番号４）
ＤＦ３８７００  ５´−ＧＣＣＡＡＴＣＡＴＡＴＧＧＴＣＴＣＡＧＴ−３´（配列番号５）
ＬＲ−ｌｏｘｐ  Ｒ  ５´−ＡＣＴＧＡＴＧＧＣＧＡＧＣＴＣＡＧＡＣＣ−３´（配列番号６）
【０１００】
その後、うまく標的とされたＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞に注入し、胚を移植して、生殖細胞系列伝達のためにキメラを生成した。トランスジェニックヘテロ接合体を遺伝子型決定によって検証し、Ｃ５７ＢＬ／６野生型に４回戻し交配した後に繁殖させてホモ接合性にした。Ａｎｏ５−／−マウス及びＣ５７ＢＬ／６マウスの種族を繁殖させ、ＲＩＮＣＨの動物飼育施設内でホモ接合性動物として標準条件下で維持した。それらを、１２時間：１２時間の暗所：明所サイクルで、Ｔｅｋｌａｄ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ（３．８％食物繊維、１８．８％タンパク質、５％脂肪飼料）で維持した。
【０１０１】
定量ＰＣＲを行い、Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で分析した。反応物を、試料毎に三連で、Ａｎｏ５（Ｍｍ００６２４６２９＿ｍ１、Ｍｍ０１３３５９８１＿ｍ１）、Ａｎｏ６（Ｍｍ００６１４６９３＿ｍ１）、及びＧａｐｄｈ（Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１）のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓプライマー−ＦＡＭプローブカクテルを用いて泳動させた。△△Ｃｔ法を使用して、野生型と比較したＡｎｏ５−／−筋肉中のＡｎｏ５及びＡｎｏ６  ｍＲＮＡの正規化された倍数変化減少を計算した。全ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）を使用して新鮮凍結筋肉シェービングから単離した。その後、ＲＮＡを、ＲＮＡＥａｓｙ法（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してカラム精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐＬｉｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して分光測光によって定量した。ｃＤＮＡを、１反応当たり等量（２００〜５００ｎｇ）の試料ＲＮＡを使用して、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｔｉｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で生成した。半定量ＰＣＲの場合、等体積のｃＤＮＡを３０回のＰＣＲサイクルに供し、続いて、アガロースゲル電気泳動を行った。使用したプライマーは、以下の通りであった。
ｍβＡＣｔ−ｒｔ−５´  ＣＣＴＧＧＣＣＧＴＣＡＧＧＣＡＧＡＴ（配列番号７）
ｍβＡｃｔ−ｒｔ−３´  ＧＡＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣ（配列番号８）
ｍＡｎｏ５−ｒｔ−Ｆ１  ＣＣＡＡＣＡＧＡＡＴＧＡＧＡＡＣＣＴ（配列番号９）
ｍＡｎｏ５−ｒｔ−Ｒ１  ＧＡＣＡＧＧＧＧＴＧＧＧＴＡＣＴＴＴＧＧ（配列番号１０）
ｍＡｎｏ５−ｒｔ−Ｆ３  ＣＧＴＴＧＧＣＡＧＣＡＡＧＡＴＣＡＴ（配列番号１１）
ｍＡｎｏ５−ｒｔ−Ｒ３  ＧＧＧＴＡＣＣＴＡＴＡＡＴＣＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣ（配列番号１２）
【０１０２】
定量ＲＴ−ＰＣＲは、試験した全ての筋肉において、カセット前転写物の約８０％の低減及びカセット後ＡＮＯ５転写物の９９％超の低減を示した（図１ｄ）。胚致死も繁殖困難も顕著ではなかった。Ａｎｏ５がＡｎｏ６に著しい配列相同性を共有し、かつＡｎｏ６がいくつかの条件下で骨格筋において発現されることが既知であるため、ＲＴ−ＰＣＲを行って、Ａｎｏ５−／−マウス筋肉のＡＮＯ６  ｃＤＮＡの相対発現を測定した。定量ＲＴ−ＰＣＲは、Ａｎｏ５欠損筋肉におけるＡｎｏ６転写物の適度であるが、統計的に有意ではない上昇を示す。
【０１０３】
実施例２
Ａｎｏ５−／−マウスの臨床及び組織病理学的評価
Ａｎｏ５−／−マウスは、増加したクレアチンキナーゼレベル、筋肉間での可変衰弱、筋線維径の変化、及び運動不耐性を含む、ヒトＡＮＯ５ミオパチーの特性を示す多くの特徴を呈した。血清クレアチンキナーゼは、Ａｎｏ５−／−マウスにおいておよそ２倍上昇する（図２ａ）。
【０１０４】
強縮力測定結果を、１０ヶ月齢のマウス（１系統当たりｎ＝６匹のマウス）の指伸長筋（ＥＤＬ）、４ヶ月齢のマウス（１系統当たりｎ＝５匹のマウス）の前脛骨筋（ＴＡ）、及び１０ヶ月齢のＡｎｏ５−／−マウス及びＷＴマウス（１系統当たりｎ＝４匹のマウス）の横隔膜筋から得た。ＥＤＬを腱で切除し、生理学プロトコルに供して、Ｒｏｄｉｎｏ−Ｋｌａｐａｃ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５：４５，２００７）及びＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２４５−２５６，２００５）によって以前に説明されたように、修正を加えて機能を評価した。伸張性収縮プロトコル中、５％伸長再長期化手順を５００〜７００ミリ秒間実行した（１００ミリ秒にわたって５％伸長し、続いて、１００ミリ秒後に最適な長さに戻す）。強縮及び伸張性収縮プロトコル後、マウスを安楽死させ、筋肉を切除し、湿潤秤量し、トラガカントガムを使用してチャック上に取り付け、その後、液体窒素中で冷却したメチル−ブタン中で凍結した。ＴＡにおける力測定を、Ｈａｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１０：１６５６−１６６３，２０１１）及びＷｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０：９９２−１０００，２０１４）によって説明されるように行った。
【０１０５】
横隔膜力測定の場合、マウスを安楽死させ、横隔膜を、肋骨が付いた状態で、かつ腱中心を無傷の状態で切除し、Ｂｅａｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７９：２４６４−２４７４，２０１１）、Ｒａｆｅａｌ−Ｆｏｒｔｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｒｃ．１２４：５８２−５８８，２０１１）、及びＧｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓ．Ｎｅｕｒｏｌ．１：３４−４４，２０１４）によって以前に説明されたように、クレブス−ヘンゼライト（Ｋ−Ｈ）緩衝液中に置いた。２〜４ｍｍ幅の横隔膜切片を単離した。横隔膜条片を腱中心で編組外科用絹糸（６／０、Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ，Ｒｅａｄｉｎｇ，ＰＡ）を用いてしっかり結び、条片の遠位端に取り付けられた肋骨の一部分を通して縫合した。各筋肉を、３７℃で維持した酸素化Ｋ−Ｈ溶液を充填した水浴に移した。筋肉を水平に整列させ、固定ピンとデュアルモード力変換器サーボモーター（３０５Ｃ、Ａｕｒｏｒａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａｕｒｏｒａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）との間で直接結んだ。２つの白金プレート電極を、筋肉の長さに隣接するように臓器浴内に位置付けた。筋肉を１ｇの最適な張力に伸長させ、１０分間静置させた後に、強縮プロトコルを開始した。筋肉が安定した時点で、筋肉を、３０秒毎に３回の１Ｈｚ攣縮、続いて、１分毎に３回の１５０Ｈｚ攣縮からなるウォームアップに供した。３分間の休止期間後、横隔膜を、各刺激間に２分間の休止期間を設けて、２０、５０、８０、１２０、１５０、１８０Ｈｚで各々２５０ミリ秒間刺激して、最大強縮力を決定した。筋肉の長さ及び重量を測定した。強縮力を、筋肉の重量及び長さに対して正規化した（ＣＳＡ：筋肉量（ｍｇ）／｛Ｌｆ（ｍｍ）×筋肉密度（１．０６ｍｇ／ｍｍ３）｝）。統計的有意性を、比力についての対応のないスチューデントｔ検定及び伸張性収縮プロトコルに対する耐性の繰り返し測定を伴う二元配置分散分析を使用して評価した。
【０１０６】
筋肉収縮の比力は、横隔膜で約１５％著しく減少した（図２ｂ）が、Ａｎｏ５−／−マウスの指伸長（ＥＤＬ）筋及び前脛骨（ＴＡ）筋には本質的に影響を及ぼさなかった（図２ｃ）。筋肉間のこのばらつきは、ＡＮＯ５ミオパチーの特徴であり、異なる筋肉の組織学的分析においても観察された。野生型（ＷＴ）と比較して、平均筋線維径は、Ａｎｏ５−／−マウス由来の腓腹（ＧＡＳ）筋において著しく小さく（Ａｎｏ５−／−：３５．８±８．３μｍ、ＷＴ：４１．８±１１．０μｍ、Ｐ＜０．００１）、ＴＡ筋においてより小さい程度に小さかった（Ａｎｏ５−／−：３８．１±１１．８μｍ、ＷＴ：４４．３±１２．２μｍ、Ｐ＜０．００１）（図２ｄ、ｅ）。Ａｎｏ５−／−筋肉は、中心核及び偶発的な壊死線維を含む軽度の組織病理学を呈した（図２ｄ、ｅ）。
【０１０７】
運動耐性を評価するために、７．５ヶ月齢一致のＡｎｏ５−／−マウス及びＷＴマウスを、毎週１時間の運動レジメンに２ヶ月間供した。各マウスを、１５ｍ／分の速度で−１０°下降で週に１回走らせ、疲労に達するまで毎分１ｍ増加させた（１系統当たりｎ＝３匹のマウス）。マウスが電気刺激を２０Ｖに設定した衝撃板（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）上に運動を試みることなく１０秒超にわたって留まったときに、各個々の試験を止めた。中断を、マウスが走行を止め、トレッドミルベルトが衝撃板に戻っている間に休憩した時間と定義する。ＷＴ対照マウスが中断なしに一貫した速度で走行した一方で、Ａｎｏ５−／−マウスは、トレッドミルベルトが衝撃板に戻るまで走行を止めたトレッドミル上での頻繁な中断の傾向があった（図２ｆ）。
【０１０８】
電気生理学を、Ａｒｎｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓ．Ｎｅｕｒｏｌ．１：３４−４４，２０１４）に記載の方法と同様の方法を使用して、６〜８ヶ月齢のＡｎｏ５−／−筋肉及び対照筋肉上で行った。マウスを、吸入イソフルランを使用して麻酔し、後肢をマウスの身体から離して４５ｏで伸長させた状態で腹臥位に置いた。複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）振幅を、変異マウス（ｎ＝６匹の動物、１２の後肢）及び対照マウス（ｎ＝７匹の動物、１４の後肢）における最大上坐骨神経刺激後に両側下腿三頭筋から測定した。針筋電図法を右側ＧＡＳ筋肉で行い、線維自発電位の存在または不在について評価した。局所インピーダンス測定または電気インピーダンス筋運動記録法（ＥＩＭ）を、筋萎縮性側索硬化症及び筋ジストロフィーのマウスモデルにおいて以前に報告された方法と同様の方法（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８：ｅ６５９７６，２０１３、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｓｃｌｅ  ＆  Ｎｅｒｖｅ  ４９：８２９−８３５，２０１４）を用いて、Ｓｋｕｌｐｔ  Ｉｎｃ  ＥＩＭ１１０３システム（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を使用して１０００Ｈｚ〜１０ＭＨｚの周波数で両側ＧＡＳ筋に行った。１ｍｍ離間した４つの２６ゲージ絶縁筋電図針電極（Ｎａｔｕｓ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ）を有する固定電極アレイを表面電極の代わりに使用した。電極アレイを、筋線維方向に関して長手方向構成で両側腓腹筋の腹部に挿入し、各筋肉におけるインピーダンス測定の２回の試行結果を得て、各肢における単一値について平均した（各群ｎ＝６匹の動物、１２の後肢）。以前に公開されたＥＩＭ研究慣習を使用して、かつ単純化のために、リアクタンス、抵抗、及び位相を、２つの電流周波数５０ｋＨｚ及び１００ｋＨｚで分析した。ＣＭＡＰ振幅及びインピーダンス特性を、両側ｔ検定を使用して比較した。針筋電図法、誘発複合筋活動電位記録、及び電気インピーダンス筋運動記録法を、Ａｎｏ５−／−マウス及びＷＴマウスの後肢に行ったが、ヒト疾患と同様に、有意な変化を示さなかった（図３）。
【０１０９】
ヒトＡＮＯ５ミオパチーの別の特性的特徴は、筋肉内堆積物を有する過剰な数の筋線維の存在である。断面筋線維径を、６ヶ月齢のＡｎｏ５−／−マウス及びＷＴ系統対照マウス（１系統当たりｎ＝３匹のマウス）由来のＴＡ筋及び腓腹（ＧＡＳ）筋から決定した。筋肉を切片化し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。１動物当たり４つのランダム２０倍画像をＺｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＣａｍ  ＭＲＣ５カメラで撮影した。線維径を、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ  ＬＥ４ソフトウェアを使用して筋線維にわたって最も短い距離を測定することによって決定した。線維径ヒストグラムを、１ＴＡ当たり５００〜６００個の線維及び１ＧＡＳ当たり６００〜７００個の線維の平均から生成した。対応のないｔ検定を使用して、Ａｎｏ５−／−線維サイズとＷＴ線維サイズとの間の有意差を試験した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【０１１０】
筋肉内の凝集体を定量化した。１０ヶ月齢のＡｎｏ５−／−マウス及びＷＴマウス（１組織及び１系統当たりｎ＝３匹のマウス）のＴＡ筋及びＧＡＳ筋からの筋肉切片を、Ｇｏｍｏｒｉ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅで染色した。４つの２０倍画像を撮影し、１つ以上の凝集体を有する線維の数を、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して計数し、総線維数のパーセンテージとして表した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して、一元配置分散分析を、Ａｎｏ５−／−線維とＷＴ線維との間の有意性を試験するために使用した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【０１１１】
加えて、コハク酸デヒドロゲナーゼ染色（ＳＤＨ）を、凝集体及び筋肉で行った。前脛骨（ＴＡ）筋及び大腿四頭筋を１８μｍで切片化し、０．１Ｍコハク酸及び０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に溶解した０．２％ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）からなるＳＤＨ溶液で染色し、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、スライドを水ですすぎ、連続アルコール中で脱水し、その後、キシレンで透徹した。スライドをＺｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＣａｍ  ＭＲＣ５カメラ上で撮像した。
【０１１２】
４ヶ月齢及び１０ヶ月齢のＡｎｏ５−／−マウス及び対照マウス由来のＴＡ筋区分を除去し、木製舌圧子にわたってそれらの生体長に伸長させ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中３％グルタルアルデヒド中に４時間浸漬した。筋肉を長さ２ｍｍの組織ブロックに切除し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に一晩保管し、続いて、１％四酸化オスミウム中に２時間にわたって後固定し、段階的エタノール溶液中で脱水した後、プラスチック包埋した。厚さ１μｍの断面をトルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡法によって試験し、選択されたブロック由来の組織切片を、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓカメラ及びソフトウェアを利用してＨｉｔａｃｈｉ  Ｈ−７６５０  ＴＥＭ電子顕微鏡下で試験した。
【０１１３】
Ａｎｏ５−／−マウス筋肉において、これらの構造は、Ｐａｖｌｏｃｉｃｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ２２：４２５−４４０，２００３）に記載されるように、修正トリクローム染色で赤色に染まる、厳密に規定され、不規則に輪郭形成された領域として現れる。細胞質凝集体は、９ヶ月齢の初めに明らかであり、経時的に増加した（図４ａ）。同様の外観の凝集体が正常な老化マウスにおいて顕著であったため、凝集体出現を定量化した。Ａｎｏ５−／−線維のおよそ２５％がトリクローム染色時に不規則に輪郭形成された赤色領域を示した一方で、対照線維の０．０２％未満しかこれらの凝集体を有しなかった（図４ｂ）。電子顕微鏡法（ＥＭ）は、これらの凝集体が膜質材料から成ることを明らかにした。多くのＡｎｏ５−／−筋線維は、小胞膜もしくは管膜の密に密集した凝集体、または光学顕微鏡法で見られる凝集体に対応するけば状の内部小管を有する偶然に配向されて緩く密集した相互接続管形成を呈した（図４ｃ、ｄ）。ＡＮＯ５−／−マウスは、診断されたＡＮＯ５患者の病理学的所見と一致する同様の病理学的所見を示した。ＡＮＯ５遺伝子のコード領域における２つの変異に複合ヘテロ接合性の患者筋肉の電子顕微鏡法［ｃ．１５５Ａ＞Ｇ（ｐ．Ａｓｎ５２Ｓｅｒ）］＋［ｃ．１９１ｄｕｐＡ（ｐ．Ａｓｎ６４Ｌｙｓｆｓ×１５）］は、多数の凝集体及び変性ミトコンドリア領域を示す多数の部位を明らかにした。Ａｎｏ５−／−筋肉中の凝集体は、ＳＥＲＣＡ１に対して陽性に染色したが、コハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）活性に対しては陽性に染色せず、それらがミトコンドリアではなく筋小胞体に由来することを示唆した（図４ｇ）。しかしながら、Ａｎｏ５−／−マウスは、膜凝集体に加えて変性ミトコンドリア及び筋鞘下ミトコンドリア蓄積を呈した（図４ｅ）。ミトコンドリアの筋鞘下蓄積を、ＳＤＨに対して凍結切片を染色することによって確認し、それは、筋線維の表面近くの密集パッチに局在した（図４ｆ）。観察されたミトコンドリア変性が機能的意義を有したかを特定するために、クエン酸シンターゼ活性を無傷のミトコンドリアの尺度として定量化し、ＷＴ対照と比較してＡｎｏ５−／−筋肉抽出物の著しい減少があったことを示した。
【０１１４】
実施例３
Ａｎｏ５が膜修復を促進する
健常個体において、通常の運動は、（ｉ）小さい裂け目が新たな原形質膜の組立によって再封止される、（ｉｉ）より重度の破壊を有する部位が、筋芽細胞様細胞に分化し、融合して、多核筋線維を再生する衛星細胞によって修復されるという２つのプロセスによって治癒される小さい病変を原形質膜にもたらす。ＡＮＯ５発現の損失の膜修復への影響を試験するために、単離された短趾屈（ＦＤＢ）筋線維に送達される高強度レーザーパルスによってもたらされた膜損傷の影響を試験した。１２μｍの凍結切片をＦｉｓｈｅｒ  Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ顕微鏡スライド上に置き、ＰＢＳ中１０％ヤギ血清及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で、室温で１時間ブロックした。スライドを一次抗体中で、室温で１時間インキュベートした（Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｆ７４２５  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、１：１７５）、Ｓｅｒｃａ１  ＣａＦ２−５Ｄ２（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ、１：５０）。その後、スライドを室温で１時間にわたってＰＢＳで３回すすぎ、続いて、３０分間ブロックした。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４にコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体（Ａ２１１２５、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８にコンジュゲートしたヤヤギ抗ウサギ二次抗体（Ａ１１０１１、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１：２５０でブロッキング溶液中に希釈し、４５分間インキュベートし、続いて、１時間にわたってＰＢＳで３回すすいだ。切片をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）マウンティング培地にマウントし、Ｃｙ５フィルター（励起５７８ｎｍ〜５９０ｎｍ、発光６０３ｎｍ〜６７１ｎｍ）（Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）を使用してＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ  ２顕微鏡で分析した。画像露光時間を、各抗体の陽性対照を使用して毎日標準化した。画像を、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ  ４．５ソフトウェアを使用して撮影した。
【０１１５】
膜損傷を、水溶液中では蛍光性ではないが、脂質環境下では明るく蛍光を発し、かつ膜修復の研究に広く使用されている膜非透過性スチリルカチオン染料であるＦＭ１−４３の蓄積によって評価した。小さい蛍光領域が、レーザー損傷直後にＷＴ線維及びＡｎｏ５−／−線維における損傷部位で検出された（図５ａ）。蛍光の増加は、ＷＴ線維よりもＡｎｏ５−／−筋線維で大きく、約２倍速い初速度で生じた。ＷＴの蛍光が１９０秒時点で水平になるように見えた一方で、Ａｎｏ５−／−線維の蛍光は、本実験の期間中、増加し続けた（図５ｂ）。
【０１１６】
膜修復の欠陥がＡＮＯ５発現に直接関連するかを試験するために、ヒトＡＮＯ５  ｃＤＮＡを、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用してＡｎｏ５−／−筋肉で発現させた（図４ｂ、ｃ）。ヒトＡＮＯ５  ｃＤＮＡ（配列番号１）を、ＭＨＣＫ７プロモーターとポリアデニル化シグナルとの間のＮｏｔ１制限部位を使用してＡＡＶ２  ＩＴＲプラスミドにクローニングした。ｒＡＡＶベクターを改変クロスパッケージングアプローチによって産生し、これにより、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７９１−８０１，２００）に記載されるように、ＡＡＶ２型ＩＴＲを複数のＡＡＶカプシド血清型にパッケージングすることができる。産生を、ＨＥＫ２９３細胞を使用した標準の３プラスミドＤＮＡ  ＣａＰＯ４沈降法を使用して達成した。ＨＥＫ２９３細胞を、１０％コスミック仔ウシ血清（ＣＣＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＤＭＥＭ中で維持した。産生プラスミドは、（ｉ）ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ＡＮＯ５、（ｉｉ）ｃａｐ血清型８様単離ｒｈ．７４をコードするｒｅｐ２−ｃａｐ８改変ＡＡＶヘルパープラスミド、及び（ｉｉｉ）アデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ４  ＯＲＦ６、及びＶＡ  Ｉ／ＩＩ  ＲＮＡ遺伝子を発現するアデノウイルス５型ヘルパープラスミド（ｐＡｄｈｅｌｐｅｒ）であった。ベクターを、（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：１０３１−１０３９８，１９９９）に以前に記載されているように、線形ＮａＣｌ塩勾配を使用して、連続イオジキサノール勾配精製及びアニオン交換カラムクロマトグラフィーによって浄化ＨＥＫ２９３細胞溶解物から精製した。定量ＰＣＲベースの滴定法を、Ｐｒｉｓｍ  ７５００  Ｔａｑｍａｎ検出器システム（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を利用してカプシド形成ベクターゲノム（ｖｇ）力価を決定するために使用した。
【０１１７】
マウス筋肉への筋肉内注射によるＡＡＶベクターの送達。４５週齢のＡｎｏ５−／−マウスを、ＴＡ（ｎ＝４）筋またはＦＤＢ（ｎ＝４）筋への１×１０１１ｖｇのｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮＯ５．ＦＬＡＧの筋肉内注射により処置した。ＴＡ筋を注射４週間後に採取し、組織学的試験及び免疫蛍光試験のために処理した。
【０１１８】
短趾屈（ＦＤＢ）筋線維を１０週間後に採取し、レーザー誘起損傷に供した。膜修復アッセイを、Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓ．Ｎｅｕｒｏｌ．２：２５６−２７０，２０１５）によって説明されるように、Ａｎｏ５−／−マウス（ｎ＝４）及び週齢一致Ｃ５７ＢＬ６（ｎ＝４）マウスの左側及び右側ＦＤＢ筋に行った。簡潔に言えば、ＦＤＢ線維を、ＤＭＥＭ中に懸濁した２ｗ／ｖ％のコラゲナーゼＩ型を含有する溶液を使用して単離した。筋肉を解離した後、線維を、１．５ｍＭのＣａ２＋中に懸濁したダルベッコＰＢＳ（Ｃａ／Ｍｇなし）中の２．５μＭのＦＭ１−４３色素を保持するガラス底皿に置いた。線維を、ＦｌｕｏＶｉｅｗ（登録商標）ＦＶ１０００二光子共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用してレーザー損傷に供した。線維を２０％電力で４．４７９ｍｍの８５０ｎｍレーザー誘導スポットで損傷し、１９０秒間にわたって５秒毎に撮像して、ＦＭ１−４３色素取り込みを可視化した。１匹のマウスの１つの筋肉当たり平均７〜１０個の線維を撮像した（合計３１個のＷＴ線維、３９個のＡｎｏ５−／−線維、及び３０個のＡＡＶ−ＡＮＯ５レスキューＡｎｏ５−／−線維）。膜上の損傷部位を取り囲む色素浸潤の蛍光強度を、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いて、規定された領域内の画素強度の積分密度を測定することによって分析した。これを行うために、ＩｍａｇｅＪの２倍ズーム設定下で、０．７５画素×１．００画素の大きさの矩形の箱を描き、これを使用して、その領域内の色素の強度を測定した。本分析において、個々の時点で測定された蛍光強度を、ｔ＝−５秒（損傷前）で測定した初期強度に正規化した。蛍光強度を分析したときに、各系統由来の全ての線維からの値を一緒に平均化した。二元配置分散分析を行って、各時点での処置した線維と処置していない線維との間の統計的有意性を決定した（ｐ＜０．００１）。蛍光の変化を定量化するために、データ点を、Ｏｒｉｇｉｎ  Ｐｒｏ  ９．１を使用してＨｉｌｌ等式に当てはめた。全ての曲線が調整されたＲ２＞０．９９８と適合した。Ａｎｏ５−／−線維、ＷＴ線維、及びＡＡＶ．ＡＮＯ５処置Ａｎｏ５−／−線維は、損傷後１００秒時点で著しく異なった。ＡＡＶ．ＡＮＯ５は、Ａｎｏ５−／−筋肉における膜再封止を部分的に修復した（図５ａ、ｂ、ｃ）。
【０１１９】
実施例４
Ａｎｏ５  ＫＯマウスにおける再生障害
筋肉再生もＡｎｏ５−／−マウスにおいて欠損していたかの調査を、心臓毒注射によってもたらされた損傷から回復する筋肉の能力を試験することによって行った（図５ｄ）。マウスを吸入イソフルレンで麻酔し、心臓毒を２週間に１回、合計３ラウンドにわたって注射した（滅菌生理食塩水で１０μＭに希釈）。３０μＬ及び５０μＬの心臓毒を、それぞれ、８週齢のＡｎｏ５−／−マウス及び週齢一致対照の左側ＴＡ筋及び左側ＧＡＳ筋に注射した。滅菌生理食塩水を、偽対象として対側筋肉に注射した。マウス群を安楽死させ、マウスの筋肉を、心臓毒の最終注射後１、３、７及び１４、３０、及び９０日時点で採取した（１時点当たり１系統当たりｎ＝３匹のマウス）。１ＴＡ当たり４つの２０倍画像を撮像し、線維径を、Ａｘｉｏ  Ｖｉｓｉｏｎ  ４．８を使用して、心臓毒の最終注入の１ヶ月及び３ヶ月後にＨ＆Ｅ染色凍結切片上で測定した。平均５００〜６００個の筋線維を測定し、対応のないｔ検定を行って（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）、損傷Ａｎｏ５−／−マウス及び損傷対照マウスとの間の筋線維サイズの統計的有意性を決定した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【０１２０】
壊死及び再生の経時的変化を追跡するために、８週齢のマウスのＴＡ筋及びＧＡＳ筋に、心臓毒を２週間間隔で３回注射した。組織を最終注射の１、３、７、１４、３０、及び９０日後に採取した（図５ｄ）。対側を生理食塩水のみ対照として使用した。ＷＴ筋肉が心臓毒処置後に再生したため、１ヶ月までに、ＷＴ筋肉が新たに再生された線維における中心核を除いて大部分は正常であるように見えた。しかしながら、Ａｎｏ５−／−マウスにおいて、再生の大幅な遅延及び長期にわたる壊死が存在した。３ヶ月後、Ａｎｏ５−／−筋肉の平均繊維径は、ＷＴと比較して著しく減少したままであり、多くの線維が中心核を呈した（図５ｄ、ｅ）。
【０１２１】
実施例５
抗酸化剤療法の影響の評価
アノクタミン５欠損（Ａｎｏ５−／−）マウスの骨格筋に対する三重抗酸化剤食餌の潜在的利益を試験するために、２ヶ月齢の野生型（ＷＴ）ＢＬ６マウス及びＡｎｏ５−／−マウスのコホートに、通常のマウス飼料、または１０００ＩＵのビタミンＥ、０．１％α−リポ酸、及び０．２５％補酵素Ｑ１０（還元ユビキノール形態）を含む三重抗酸化剤組成物を補充した食餌のいずれかを与えた。マウスを、１６週間の期間にわたって４週間毎に３日間連続疲労するまで走行させ、屠殺して、筋肉健康（活動及び横隔膜力）ならびに酸化ストレス（クエン酸シンターゼ活性及びｐｇｃ１α発現）に関連する機能的結果評価基準を試験した。
【０１２２】
オープンフィールドケージ活動のレーザー監視
オープンフィールド活動チャンバを使用して、いくつかの修正を加えて以前に説明されたプロトコル（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５６：５１１−５（２００８）、Ｂｅａｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １７９：２４６４−７４（２０１１））に従って、実験マウスの全体活動を決定した。全てのマウスを、マウスが最も活動的である早朝からその夜の終わり間近のサイクルで、毎日同じ時間に試験した。全てのマウスを、毎回薄暗い光下で、かつ同じ飼育係により、隔離室で試験した。また、不安を軽減し、マウスの通常の行動、ひいてはアッセイの結果に影響を与える可能性があり得る可変的行動を最小限に抑えるために以前の報告で行われたように、我々は、個別に収容されていないマウスを試験した（Ｖｏｉｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｂｒａｉｎ  Ｂｅｈａｖ  ４：２４０−５２（２００５））。マウスの行動を、Ｐｈｏｔｏｂｅａｍ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して監視した。このシステムは、動物チャンバの前後かつ左右を横断する不可視赤外光線のグリッドを使用して、Ｘ−Ｙ−Ｚ平面内のマウスの位置及び動きを監視する。活動を、５分間間隔の１時間サイクルで記録した。マウスを、データ取得開始の数日前に１時間セッションで活動試験室に順応させた。マウスを、４匹１組で、個別のチャンバ内で試験した。試験機器を使用毎に掃除して、我々の結果を変化させ得るマウスの反動的な可変的行動を低減した。収集したデータをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌワークシートに変換し、全ての計算をＥｘｃｅｌプログラム内で行った。各マウスのＸ平面及びＹ平面における動きの個々の光線中断を加算して、合計歩行を表し、Ｚ平面における光線中断を加算して、１時間間隔内での垂直活動を得た。
【０１２３】
１２週及び１６週の終わりに、各群から２匹のマウスを活動ケージ内に置いて、自発的活動を監視した。全マウス活動を、マウスがトレッドミル疲労後４５分間以内に水平及び／または垂直レーザー光線を中断した回数として測定した（図６）。抗酸化剤食餌を与えたＡｎｏ５−／−マウスが１６週時点で標準の（プラセボ）食餌を与えたマウスよりも活動的であったことが見出され、抗酸化剤が疲労後の自発的活動にプラスの影響を与えることを示唆する。
【０１２４】
機能的評価のための横隔膜強縮性収縮
行動アッセイがいくらかの処置効果を示唆したが、これらの結果評価基準は、食餌とは無関係のいくつかの可変物の影響を受けやすい。抗酸化剤補給の骨格筋機能への影響を試験するために、力測定をＡｎｏ５−／−マウス及びＷＴマウスの横隔膜で行った（図７）。Ａｎｏ５−／−マウスが横隔膜力を欠損しているが、肢筋では欠損していないことが以前に実証された（Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ２５：１９００−１９１１（２０１６））ため、横隔膜を選択した。
【０１２５】
マウスを安楽死させ、横隔膜を、肋骨が付いた状態で、かつ腱中心を無傷の状態で切除し、以前に説明されたように、Ｋ−Ｈ緩衝液中に置いた（Ｂｅａｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １７９：２４６４−７４（２０１１）、Ｒａｆａｅｌ−Ｆｏｒｔｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２４：５８２−８（２０１１）、Ｍｏｏｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ７１：ｅ５００３６（２０１３））。２〜４ｍｍ幅の横隔膜切片を単離した。横隔膜条片を腱中心で編組外科用絹糸（６／０、Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ，Ｒｅａｄｉｎｇ，ＰＡ）を用いてしっかり結び、条片の遠位端に取り付けられた肋骨の一部分を通して縫合した。各筋肉を、３７℃で維持した酸素化Ｋ−Ｈ溶液を充填した水浴に移した。筋肉を水平に整列させ、固定ピンとデュアルモード力変換器サーボモーター（３０５Ｃ、Ａｕｒｏｒａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａｕｒｏｒａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）との間で直接結んだ。２つの白金プレート電極を、筋肉の長さに隣接するように臓器浴内に位置付けた。筋肉を攣縮収縮の測定のために最適な長さに伸長させ、その後、１０分間静置させた後に、強縮プロトコルを開始した。筋肉が安定した時点で、筋肉を１ｇの最適な長さに設定し、３０秒毎に３回の１Ｈｚ攣縮、続いて、１分毎に３回の１５０Ｈｚ攣縮からなるウォームアップに供した。３分間の休止期間後、横隔膜を、各刺激間に２分間の休止期間を設けて、２０、５０、８０、１２０、１５０、１８０Ｈｚで各々２５０ミリ秒間刺激して、最大強縮力を決定した。筋肉の長さ及び重量を測定した。力を、筋肉の重量及び長さに対して正規化した。プラセボ処置ａｎｏ５−／−マウスと比較して、三重抗酸化剤処置ａｎｏ５−／−マウスにおいて横隔膜比力の著しい改善が観察された（図７）。
【０１２６】
ミトコンドリア新生
三重抗酸化剤療法と酸化線維含有量との関係を確立して、ミトコンドリア新生及び機能を分析した。以前の研究は、経路を刺激する運動がミトコンドリア新生をもたらす一方で、抗酸化剤療法がこのシグナル伝達を減少させることを示している。雄腓腹筋組織の結果により、抗酸化剤処置がミトコンドリア新生の主要調節因子であるＰＧＣ−１ａの発現を減少させたことが確認された（図８ａ）。興味深いことに、クエン酸シンターゼ活性が、全ての遺伝子型−性組み合わせのうちで、抗酸化剤を与えたマウスにおいてより高いことが見出された（図８ｂ）。これに対する１つの単純な説明は、ミトコンドリア含有量の高い酸化線維の割合の増加が、１線維当たりのミトコンドリア新生のいずれの減少も隠すことである。
【０１２７】
要約すれば、三重抗酸化剤療法が、自発的活動、横隔膜強度、線維サイズ、線維型組成、及びミトコンドリア酵素活性を含む筋肉生理学及び機能のいくつかの評価基準に著しい影響を与えることが見出された。これらの結果は、ある特定の場合、性特異的であることが見出された。ＬＧＭＤ２Ｌは、より大きな影響を受けた雄で性特異的である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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