(57)【要約】  本開示は、より良好な安定性および活性を有し、改善された収量で微生物からさらに回収され得るＡＬＤＣ酵素を含む方法、組成物、装置およびキットを提供する。【選択図】図１
2018516076.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｉ）バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞であって、親細胞と比較して低減された量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ（ｖｐｒ）および／または細胞壁プロテアーゼ（ｗｐｒＡ）を前記宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含む、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を用意する工程であって、前記宿主細胞は、プロモーターと作動可能に結合した異種ＡＬＤＣ酵素をコードする核酸で形質転換されている、工程；および
ｉｉ）前記異種ＡＬＤＣ酵素の産生に好適な条件下で前記宿主細胞を培養する工程であって、それにより前記異種ＡＬＤＣ酵素が産生される、工程；または
Ｂｉ）バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞であって、親細胞と比較して低減された量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ（ｖｐｒ）および／または細胞壁プロテアーゼ（ｗｐｒＡ）を前記宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含む、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を用意する工程であって、前記宿主細胞は、前記宿主細胞に、ＡＬＤＣ酵素をコードする内因性核酸配列を前記親細胞と比較して過剰に発現させる核酸で形質転換されている、工程；および
ｉｉ）ＡＬＤＣ酵素の産生に好適な条件下で前記宿主細胞を培養する工程であって、それによりＡＬＤＣ酵素が産生される、工程
を含む、アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ＡＬＤＣ）酵素を製造する方法。
【請求項２】
前記産生されたＡＬＤＣ酵素を回収する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｅｐｒ）をさらに欠失している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素（ＩｓｐＡ）および／または内因性バシロペプチダーゼＦ酵素（Ｂｐｒ）をさらに欠失している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、中性メタロプロテアーゼ酵素（ＮｐｒＥ）を欠失している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記宿主細胞は、内因性セリンアルカリプロテアーゼ酵素（ＡｐｒＥ）をさらに欠失している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記宿主細胞は、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｖｐｒ）をさらに欠失している、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞は、内因性細胞壁関連プロテアーゼ酵素（ＷｐｒＡ）をさらに欠失している、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主細胞は、低減された量の、ａｍｐＳ、ａｐｒＸ、ｂｐｆ、ｃｌｐＣＰ、ｃｌｐＥＰ、ｃｌｐＸＰ、ｃｏｄＷＸ、ｌｏｎＡ、ｌｏｎＢ、ｎｐｒＢ、ｍａｐ、ｍｌｐＡ、ｍｐｒ、ｐｅｐＴ、ｐｅｐＦ、ｄｐｐＡ、ｙｑｙＥ、ｔｅｐＡ、ｙｆｉＴ、ｙｆｌＧ、ｙｍｆＦ、ｙｐｗＡ、ｙｒｒＮ、ｙｒｒＯおよびｙｗａＤからなる群から選択される１種以上の追加のプロテアーゼをさらに有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子変異は、前記親細胞に存在する遺伝子の破壊を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記破壊は、前記遺伝子の全部または一部の欠損の結果である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子の破壊は、前記遺伝子を含むゲノムＤＮＡの一部の欠損の結果である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子の破壊は、変異誘発の結果である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子の破壊は、部位特異的組み換えを用いて行われる、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記遺伝子の破壊は、前記遺伝子の遺伝子座への選択マーカーの導入と組み合わされて行われる、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＡＬＤＣ酵素は、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ブレビバクテリウム・アセチリカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｙｌｉｃｕｍ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ロイコノストック・ラクティス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｌａｃｔｉｓ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＤＸまたはバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＡＬＤＣ酵素は、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）またはバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＡＬＤＣ酵素は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号８、またはそれらのいずれかの機能的断片から選択されるいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
プロモーターと作動可能に結合した異種ＡＬＤＣ酵素をコードする核酸を含むバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞であって、低減された量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ（ｖｐｒ）および細胞壁プロテアーゼ（ｗｐｒＡ）を前記宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含む、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞、またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞であって、低減された量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ（ｖｐｒ）および／もしくは細胞壁プロテアーゼ（ｗｐｒＡ）を前記宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含み、前記宿主細胞に、ＡＬＤＣ酵素をコードする内因性核酸配列を親細胞と比較して過剰に発現させる核酸を含む、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項２１】
前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項２０に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項２２】
前記宿主細胞は、低減された量の内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｅｐｒ）をさらに有する、請求項２０または２１に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項２３】
前記宿主細胞は、低減された量の内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素（ＩｓｐＡ）および／または内因性バシロペプチダーゼＦ酵素（Ｂｐｒ）をさらに有する、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項２４】
前記宿主細胞は、低減された量の中性メタロプロテアーゼ酵素（ＮｐｒＥ）をさらに有する、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項２５】
前記宿主細胞は、低減された量の内因性セリンアルカリプロテアーゼ酵素（ＡｐｒＥ）をさらに有する、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項２６】
前記宿主細胞は、低減された量の内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｖｐｒ）をさらに有する、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項２７】
前記宿主細胞は、低減された量の内因性細胞壁関連プロテアーゼ酵素（ＷｐｒＡ）をさらに有する、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項２８】
前記宿主細胞は、低減された量の、ａｍｐＳ、ａｐｒＸ、ｂｐｆ、ｃｌｐＣＰ、ｃｌｐＥＰ、ｃｌｐＸＰ、ｃｏｄＷＸ、ｌｏｎＡ、ｌｏｎＢ、ｎｐｒＢ、ｍａｐ、ｍｌｐＡ、ｍｐｒ、ｐｅｐＴ、ｐｅｐＦ、ｄｐｐＡ、ｙｑｙＥ、ｔｅｐＡ、ｙｆｉＴ、ｙｆｌＧ、ｙｍｆＦ、ｙｐｗＡ、ｙｒｒＮ、ｙｒｒＯおよびｙｗａＤからなる群から選択される１種以上の追加のプロテアーゼをさらに有する、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項２９】
前記ＡＬＤＣ酵素は、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ブレビバクテリウム・アセチリカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｙｌｉｃｕｍ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ロイコノストック・ラクティス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｌａｃｔｉｓ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＤＸまたはバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来する、請求項２０〜２８のいずれか一項に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項３０】
前記ＡＬＤＣ酵素は、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）またはバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来する、請求項２０〜２９のいずれか一項に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項３１】
前記ＡＬＤＣ酵素は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号８、またはそれらのいずれかの機能的断片から選択されるいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項２０〜３０のいずれか一項に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項３２】
プロモーターと作動可能に結合した異種ＡＬＤＣ酵素をコードする核酸を含むバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞であって、低減された量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ、および／もしくは細胞壁プロテアーゼ、および／もしくは前記ＡＬＤＣ酵素のＣ末端から配列を切断することができる中性メタロプロテアーゼを前記宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含む、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞、またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞であって、低減された量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ、および／もしくは細胞壁プロテアーゼ、および／もしくは前記ＡＬＤＣ酵素のＣ末端から配列を切断することができる中性メタロプロテアーゼを前記宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含み、前記宿主細胞に、ＡＬＤＣ酵素をコードする内因性核酸配列を親細胞と比較して過剰に発現させる核酸を含む、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項３３】
前記ＡＬＤＣ酵素は、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）ＡｌｄＢであり、かつ前記プロテアーゼは、前記ＡＬＤＣ酵素の前記Ｃ末端から配列ＱＶＨＱＡＥＳＥＲＫを切断することができる、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項３２または３３に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項３５】
プロモーターと作動可能に結合した異種ＡＬＤＣ酵素をコードする核酸を含むバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞であって、親細胞と比較して低減された量の少なくとも１種のプロテアーゼを前記宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含み、前記プロテアーゼは、前記ＡＬＤＣ酵素のＣ末端および／もしくはＮ末端を開裂することができる、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞、またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞であって、前記親細胞と比較して低減された量のプロテアーゼを前記宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含み、前記プロテアーゼは、前記ＡＬＤＣ酵素のＣ末端および／もしくはＮ末端を開裂することができ、前記宿主細胞は、前記宿主細胞に、ＡＬＤＣ酵素をコードする内因性核酸配列を前記親細胞と比較して過剰に発現させる核酸を含む、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項３６】
前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項３５に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項３７】
前記プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＣ末端の２７５位で開裂することができる、請求項３５または３６に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項３８】
前記プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＣ末端の２７６位で開裂することができる、請求項３５または３６に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項３９】
前記プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の３７位で開裂することができる、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項４０】
前記プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の３８位で開裂することができる、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項４１】
前記プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の３９位で開裂することができる、請求項３５、３７または３８のいずれか一項に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項４２】
前記プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の４０位で開裂することができる、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項４３】
前記プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の４２位で開裂することができる、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項４４】
前記プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の４３位で開裂することができる、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項４５】
前記プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の３９位で開裂することができる、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項４６】
ＡＬＤＣ酵素は、配列番号５、配列番号２または配列番号７と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３５〜４５のいずれか一項に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項４７】
前記ＡＬＤＣ酵素は、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）ＡｌｄＢであり、かつ前記プロテアーゼは、前記ＡＬＤＣ酵素の前記Ｃ末端から配列ＱＶＨＱＡＥＳＥＲＫを開裂することができる、請求項３５〜４６のいずれか一項に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項４８】
前記プロテアーゼは、中性メタロプロテアーゼである、請求項３５〜４７のいずれか一項に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項４９】
前記プロテアーゼは、サーモリシンである、請求項３５〜４８のいずれか一項に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年５月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／１６５６９０号明細書、２０１５年５月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／１６６６１６号明細書および２０１５年５月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／１６８４１５号明細書の優先権および利益を主張するものであり、各仮特許出願の名称は「ＡＬＤＣ方法」である。
【０００２】
配列表の参照による組み込み
２０１６年５月５日に作成され、本明細書に添付される、１６，７９５バイトのサイズを有する「２０１６０５０５＿ＮＢ４０７３７＿ＰＣＴ＿ＳＥＱＳ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイルで提供される配列表は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
ジアセチルは、場合により、炭水化物を含有する基質、例えば、麦汁またはブドウ果汁の発酵プロセスの望ましくない副生物となることがある。ジアセチルの生成は、その強く不快な臭いのために最も不都合であり、ビールの場合、約０．１０〜０．１５ｍｇ／リットルという少量でもビールの風味に負の効果をもたらす。ビールの熟成中、ジアセチルは酵母細胞中の還元酵素によってアセトインに変わる。風味に関し、アセトインは、ビールではジアセチルよりかなり高濃度でも許容可能である。
【０００４】
アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ＡＬＤＣ）もジアセチルの生成を防ぐ酵素として使用することができる。α−アセト乳酸は、発酵中、ＡＬＤＣ酵素を添加することにより、アセトインに変換することができる。しかしながら、ＡＬＤＣは発酵条件下で、特に麦芽量の少ない発酵条件下で不安定であり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、より良好な安定性および／または活性を有するＡＬＤＣ酵素を提供することであり、任意選択により、微生物から回収し得るＡＬＤＣ酵素の収量が改善される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、ＡＬＤＣ酵素のための組成物および方法を提供する。
【０００７】
これらの組成物および方法の態様および実施形態を、以下の個別に番号を付した段落に記載する。
１．
Ａｉ）バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞であって、親細胞と比較して低減された量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ（ｖｐｒ）および／または細胞壁プロテアーゼ（ｗｐｒＡ）を宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含む、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を用意する工程であって、その宿主細胞は、プロモーターと作動可能に結合した異種ＡＬＤＣ酵素をコードする核酸で形質転換されている、工程；および
ｉｉ）異種ＡＬＤＣ酵素の産生に好適な条件下で宿主細胞を培養する工程であって、それにより異種ＡＬＤＣ酵素が産生される、工程；または
Ｂｉ）バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞であって、親細胞と比較して低減された量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ（ｖｐｒ）および／または細胞壁プロテアーゼ（ｗｐｒＡ）を宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含む、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を用意する工程であって、その宿主細胞は、宿主細胞に、ＡＬＤＣ酵素をコードする内因性核酸配列を親細胞と比較して過剰に発現させる核酸で形質転換されている、工程；および
ｉｉ）ＡＬＤＣ酵素の産生に好適な条件下で宿主細胞を培養する工程であって、それによりＡＬＤＣ酵素が産生される、工程
を含む、アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ＡＬＤＣ）酵素を製造する方法。
２．産生されたＡＬＤＣ酵素を回収する工程をさらに含む、段落１の方法。
３．バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、段落１または２の方法。
４．バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｅｐｒ）をさらに欠失している、段落１〜３のいずれか１つの方法。
５．バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素（ＩｓｐＡ）および／または内因性バシロペプチダーゼ（ｂａｃｉｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）Ｆ酵素（Ｂｐｒ）をさらに欠失している、段落１〜４のいずれか１つの方法。
６．バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、中性メタロプロテアーゼ酵素（ＮｐｒＥ）を欠失している、段落１〜５のいずれか１つの方法。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、内因性中性メタロプロテアーゼ酵素（ＮｐｒＥ）を欠失している、段落６の方法。
７．宿主細胞は、内因性セリンアルカリプロテアーゼ酵素（ＡｐｒＥ）をさらに欠失している、段落１〜６のいずれか１つの方法。
８．宿主細胞は、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｖｐｒ）をさらに欠失している、段落１〜７のいずれか１つの方法。
９．宿主細胞は、内因性細胞壁関連プロテアーゼ酵素（ＷｐｒＡ）をさらに欠損している、段落１〜８のいずれか１つの方法。
１０．宿主は、低減された量の、ａｍｐＳ、ａｐｒＸ、ｂｐｆ、ｃｌｐＣＰ、ｃｌｐＥＰ、ｃｌｐＸＰ、ｃｏｄＷＸ、ｌｏｎＡ、ｌｏｎＢ、ｎｐｒＢ、ｍａｐ、ｍｌｐＡ、ｍｐｒ、ｐｅｐＴ、ｐｅｐＦ、ｄｐｐＡ、ｙｑｙＥ、ｔｅｐＡ、ｙｆｉＴ、ｙｆｌＧ、ｙｍｆＦ、ｙｐｗＡ、ｙｒｒＮ、ｙｒｒＯおよびｙｗａＤからなる群から選択される１種以上の追加のプロテアーゼをさらに有する、段落１〜９のいずれか１つの方法。宿主は、低減された量の、ａｍｐＳ、ａｐｒＸ、ｂｐｆ、ｃｌｐＣＰ、ｃｌｐＥＰ、ｃｌｐＸＰ、ｃｏｄＷＸ、ｌｏｎＡ、ｌｏｎＢ、ｎｐｒＢ、ｍａｐ、ｍｌｐＡ、ｍｐｒ、ｐｅｐＴ、ｐｅｐＦ、ｄｐｐＡ、ｙｑｙＥ、ｔｅｐＡ、ｙｆｉＴ、ｙｆｌＧ、ｙｍｆＦ、ｙｐｗＡ、ｙｒｒＮ、ｙｒｒＯ、およびｙｗａＤからなる群から選択される１種以上の追加の内因性プロテアーゼをさらに有する、段落１〜９のいずれか１つの方法。
１１．遺伝子変異は、親細胞に存在する遺伝子の破壊を含む、段落１〜１０のいずれか１つの方法。
１２．破壊は、遺伝子の全部または一部の欠損の結果である、段落１１の方法。
１３．遺伝子の破壊は、遺伝子を含むゲノムＤＮＡの一部の欠損の結果である、段落１１の方法。
１４．遺伝子の破壊は、変異誘発の結果である、段落１１〜１３のいずれか１つの方法。
１５．遺伝子の破壊は、部位特異的組み換えを用いて行われる、段落１１〜１４のいずれか１つの方法。
１６．遺伝子の破壊は、遺伝子の遺伝子座への選択マーカーの導入と組み合わされて行われる、段落１１〜１５のいずれか１つの方法。
１７．ＡＬＤＣ酵素は、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ブレビバクテリウム・アセチリカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｙｌｉｃｕｍ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ロイコノストック・ラクティス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｌａｃｔｉｓ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕ  ｓｂｒｅｖｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＤＸまたはバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来する、段落１〜１６のいずれか１つの方法。
１８．ＡＬＤＣ酵素は、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）またはバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来する、段落１〜１７のいずれか１つの方法。
１９．ＡＬＤＣ酵素は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号８、またはそれらのいずれかの機能的断片から選択されるいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、段落１〜１８のいずれか１つの方法。
２０．プロモーターと作動可能に結合した異種ＡＬＤＣ酵素をコードする核酸を含むバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞であって、親細胞と比較して低減された量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ（ｖｐｒ）および／もしくは細胞壁プロテアーゼ（ｗｐｒＡ）を宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含む、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞、またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞であって、親細胞と比較して低減された量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ（ｖｐｒ）および／もしくは細胞壁プロテアーゼ（ｗｐｒＡ）を宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含み、宿主細胞に、ＡＬＤＣ酵素をコードする内因性核酸配列を親細胞と比較して過剰に発現させる核酸を含む、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
２１．バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、段落２０のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
２２．宿主は、低減された量の内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｅｐｒ）をさらに有する、段落２０または段落２１のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
２３．宿主は、低減された量の内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素（ＩｓｐＡ）および／または内因性バシロペプチダーゼＦ酵素（Ｂｐｒ）をさらに有する、段落２０〜２２のいずれか１つのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
２４．宿主は、低減された量の中性メタロプロテアーゼ酵素（ＮｐｒＥ）をさらに有する、段落２０〜２３のいずれか１つのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。宿主は、低減された量の内因性中性メタロプロテアーゼ酵素（ＮｐｒＥ）をさらに有する、段落２０〜２３のいずれか１つのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
２５．宿主は、低減された量の内因性セリンアルカリプロテアーゼ酵素（ＡｐｒＥ）をさらに有する、段落２０〜２４のいずれか１つのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
２６．宿主細胞は、低減された量の内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｖｐｒ）をさらに有する、段落２０〜２５のいずれか１つのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
２７．宿主細胞は、低減された量の内因性細胞壁関連プロテアーゼ酵素（ＷｐｒＡ）をさらに有する、段落２０〜２６のいずれか１つのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
２８．宿主は、低減された量の、ａｍｐＳ、ａｐｒＸ、ｂｐｆ、ｃｌｐＣＰ、ｃｌｐＥＰ、ｃｌｐＸＰ、ｃｏｄＷＸ、ｌｏｎＡ、ｌｏｎＢ、ｎｐｒＢ、ｍａｐ、ｍｌｐＡ、ｍｐｒ、ｐｅｐＴ、ｐｅｐＦ、ｄｐｐＡ、ｙｑｙＥ、ｔｅｐＡ、ｙｆｉＴ、ｙｆｌＧ、ｙｍｆＦ、ｙｐｗＡ、ｙｒｒＮ、ｙｒｒＯおよびｙｗａＤからなる群から選択される１種以上の追加のプロテアーゼをさらに有する、段落２０〜２７のいずれか１つのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。宿主は、低減された量の、ａｍｐＳ、ａｐｒＸ、ｂｐｆ、ｃｌｐＣＰ、ｃｌｐＥＰ、ｃｌｐＸＰ、ｃｏｄＷＸ、ｌｏｎＡ、ｌｏｎＢ、ｎｐｒＢ、ｍａｐ、ｍｌｐＡ、ｍｐｒ、ｐｅｐＴ、ｐｅｐＦ、ｄｐｐＡ、ｙｑｙＥ、ｔｅｐＡ、ｙｆｉＴ、ｙｆｌＧ、ｙｍｆＦ、ｙｐｗＡ、ｙｒｒＮ、ｙｒｒＯおよびｙｗａＤからなる群から選択される１種以上の追加の内因性プロテアーゼをさらに有する、段落２０〜２７のいずれか１つのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
２９．ＡＬＤＣ酵素は、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ブレビバクテリウム・アセチリカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｙｌｉｃｕｍ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ロイコノストック・ラクティス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｌａｃｔｉｓ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＤＸまたはバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来する、段落２０〜２８のいずれか１つのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
３０．ＡＬＤＣ酵素は、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）またはバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来する、段落２０〜２９のいずれか１つのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
３１．ＡＬＤＣ酵素は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号８、またはそれらのいずれかの機能的断片から選択されるいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、段落２０〜３０のいずれか１つのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
３２．プロモーターと作動可能に結合した異種ＡＬＤＣ酵素をコードする核酸を含むバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞であって、親細胞と比較して低減された量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ、および／もしくは細胞壁プロテアーゼ、および／もしくはＡＬＤＣ酵素のＣ末端から配列を切断することができる中性メタロプロテアーゼを宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含む、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞、またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞であって、親細胞と比較して低減された量の内因性細胞外セリンプロテアーゼ、および／もしくは細胞壁プロテアーゼ、および／もしくは前記ＡＬＤＣ酵素のＣ末端から配列を切断することができる中性メタロプロテアーゼを宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含み、宿主細胞に、ＡＬＤＣ酵素をコードする内因性核酸配列を親細胞と比較して過剰に発現させる核酸を含む、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
３３．ＡＬＤＣ酵素は、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）ＡｌｄＢであり、かつＣ末端の配列は、ＱＶＨＱＡＥＳＥＲＫである、段落３２の宿主細胞。ＡＬＤＣ酵素は、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）ＡｌｄＢであり、かつこのプロテアーゼは、前記ＡＬＤＣ酵素の前記Ｃ末端から配列ＱＶＨＱＡＥＳＥＲＫ（配列番号９）を切断することができる、段落３２の宿主細胞。
３４．バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、段落３２のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
３５．プロモーターと作動可能に結合した異種ＡＬＤＣ酵素をコードする核酸を含むバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞であって、親細胞と比較して低減された量のプロテアーゼを宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含み、そのプロテアーゼは、ＡＬＤＣ酵素のＣ末端および／もしくはＮ末端を開裂することができる、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞、またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞であって、親細胞と比較して低減された量のプロテアーゼを宿主細胞に産生させる遺伝子変異を含み、そのプロテアーゼは、ＡＬＤＣ酵素のＣ末端および／もしくはＮ末端を開裂することができ、その宿主細胞は、宿主細胞に、ＡＬＤＣ酵素をコードする内因性核酸配列を親細胞と比較して過剰に発現させる核酸を含む、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
３６．バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、段落３５のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
３７．プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＣ末端の２７５位で開裂することができる、段落３５または３６のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
３８．プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＣ末端の２７６位で開裂することができる、段落３５または３６のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
３９．プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の３７位で開裂することができる、段落３５または３６のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
４０．プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の３８位で開裂することができる、段落３５または３６のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
４１．プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の３９位で開裂することができる、段落３５または３６のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
４２．プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の４０位で開裂することができる、段落３５または３６のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
４３．プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の４２位で開裂することができる、段落３５または３６のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
４４．プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の４３位で開裂することができる、段落３５または３６のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
４５．プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の３９位で開裂することができる、段落３５または３６のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
４６．ＡＬＤＣ酵素は、配列番号５、配列番号２または配列番号７と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、段落３５〜４５のいずれか１つのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
４７．ＡＬＤＣ酵素は、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）ＡｌｄＢであり、かつＣ末端の配列は、ＱＶＨＱＡＥＳＥＲＫである、段落３５〜４６のいずれか１つのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。前記ＡＬＤＣ酵素は、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）ＡｌｄＢであり、かつこのプロテアーゼは、前記ＡＬＤＣ酵素の前記Ｃ末端から配列ＱＶＨＱＡＥＳＥＲＫを開裂することができる、段落３５〜４６のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
４８．プロテアーゼは、中性メタロプロテアーゼである、段落３５〜４７のいずれか１つのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
４９．プロテアーゼは、サーモリシンである、段落３５〜４８のいずれか１つのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【０００８】
本発明の特徴および利点は、本発明の原理を用いた実施形態を記載する以下の詳細な説明、および以下の添付図面により、より深く理解できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】アセト乳酸デカルボキシラーゼ、ａｌｄＢを発現させるためのプラスミドマップを示す。
【図２】アセト乳酸デカルボキシラーゼ、ａｌｄＢを発現させるためのＲＩＨＩ−ａｌｄＢのプラスミドマップを示す。
【図３】バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株において様々な時点で発現したａｌｄＢの切断変異体を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、同定されたＡｌｄＢ変異体はドットでマークされている。レーン：１）２４時間、２−欠損株、２）２４時間、５−欠損株、３）２４時間、７−欠損株、４）４８時間、２−欠損株、５）４８時間、５−欠損株、６）４８時間、７−欠損株、７）７２時間、２−欠損株、８）７２時間、５−欠損株および９）７２時間、７−欠損株。
【図４】４０℃でのインキュベーション２日後（左）および１０日後（右）の２−欠損、５−欠損および７−欠損バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株の２つのカゼインスポットプレートアッセイを示す。プロテアーゼ活性後、ホワイトハロー形成を行ってもよい。プレートにラベルを記載し、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の中性プロテアーゼをポジティブコントロールとして使用し、バッファをネガティブコントロールとして使用した。
【図５】各種の宿主細胞由来のａｌｄＢ酵素：Ａ）２−欠損株由来のａｌｄＢ、Ｂ）５−欠損株由来のａｌｄＢおよびＣ）７−欠損株由来のａｌｄＢの存在下または非存在下での３種の個々の麦芽を使用した発酵におけるビシナルジケトン（ＶＤＫ）の相対的生成を示す。比較のため、計算により算出されたＶＤＫ含有量（ジアセチルと２，３−ペンタンジオンとの合計と定義される）を、酵素を含まないコントロール試料で得られた最高値に正規化した（１００％）。全てのａｌｄＢ酵素に類似のＡＬＤＣ活性０．０４Ｕ／ｍｌ−麦汁を与えた。１４℃で８日間の発酵中、ＶＤＫの生成を追った。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本開示は、より良好な安定性および／または活性を有するＡＬＤＣ酵素を含み、任意選択により、微生物から回収し得るＡＬＤＣ酵素の収量が改善される、方法、組成物、装置およびキットを提供する。
【００１１】
特に定義しない限り、本明細書において使用する全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，２０  ＥＤ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、およびＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は、本開示で使用される用語の多くの一般辞書を当業者に提供する。
【００１２】
本開示は、本明細書に開示の例示的な方法および材料により限定されず、本明細書に記載のものと類似のまたは均等な任意の方法および材料を本開示の実施形態の実施または試験において使用することができる。数値範囲には、範囲を定義する数字が含まれる。特に明記しない限り、核酸配列はいずれも左から右に５’から３’に向けて記載され；アミノ酸配列は、左から右にアミノ基からカルボキシ基に向けてそれぞれ記載される。
【００１３】
本明細書において提供される見出しは、本明細書を全体として参照することにより有し得る本開示の種々の態様にも実施形態にも限定されない。したがって、この直下に定義した用語は、本明細書全体を参照することにより、より十分に定義される。
【００１４】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上特に明記されない限り、複数形の指示対象も含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「プロテアーゼ」への言及は、そのような酵素を複数種含み、「食事」への言及は、１食分以上の食事および当業者に知られたその均等物を含む。
【００１５】
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日よりも先に開示されているという意味でのみ提供される。本明細書において、このような刊行物が本明細書に添付の特許請求の範囲に対する先行技術を構成することの容認と解釈すべきでない。
【００１６】
本明細書で言及する特許および刊行物は全て参照により組み込まれる。
【００１７】
ＡＬＤＣ
いくつかの態様において、本発明は、より良好な安定性および／または活性を有するＡＬＤＣ酵素を提供し、任意選択により、微生物から回収し得るＡＬＤＣ酵素の収量が改善される。
【００１８】
アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ＡＬＤＣ）は、炭素−炭素結合の開裂を担っているカルボキシラーゼのファミリーに属する酵素である。アセト乳酸デカルボキシラーゼは、２−アセト乳酸（２−ヒドロキシ−２−メチル−３−オキソブタン酸としても知られる）の２−アセトインへの変換を触媒し、ＣＯ２を放出する。「ＡＬＤＣ」と「ＡＬＤＣ酵素」とは、本明細書では互換的に使用され得る。
【００１９】
アセト乳酸デカルボキシラーゼは、分類ＥＣ４．ｌ．ｌ．５（アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性）および遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語ＩＤ、ＧＯ：００４７６０５に属する酵素反応を触媒する。ＧＯ用語ＩＤは、この関連したＧＯ用語を有しているとされた任意のタンパク質が、アセト乳酸デカルボキシラーゼ触媒活性を有する酵素をコードすることを規定する。
【００２０】
アセト乳酸デカルボキシラーゼ酵素をコードする種々のアセト乳酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ａｌｓＤまたはａｌｄＢなど）は、当技術分野で知られている。ＡＬＤＣ酵素をコードするａｌｓＤ遺伝子は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来するものであっても、由来し得るものであってもよい。ＡＬＤＣ酵素をコードするａｌｄＢ遺伝子は、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に由来するものであっても、由来し得るものであってもよい。ＡＬＤＣ酵素をコードするａｌｓＤ遺伝子は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来するものであっても、由来し得るものであってもよい。ＵＮＩＰＲＯＴアクセッション番号Ｑ６５Ｅ５２．１は、ＡＬＤＣ酵素の一例である。ＵＮＩＰＲＯＴアクセッション番号Ｑ６５Ｅ５２．１は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来するか、または由来し得るＡＬＤＣ酵素の一例である。アセト乳酸デカルボキシラーゼ遺伝子の例としては、限定はされないが、以下のものが挙げられる：ｇｉ｜３７５１４３６２７｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００５００６０６８．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［ニアステラ・コリエンシス（Ｎｉａｓｔｅｌｌａ  ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）ＯＲ２０−１０］；ｇｉ｜３６１０５７６７３｜ｇｂ｜ＡＥＶ９６６６４．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［ニアステラ・コリエンシス（Ｎｉａｓｔｅｌｌａ  ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）ＯＲ２０−１０］；ｇｉ｜２１８７６３４１５｜ｇｂ｜ＡＣＬ０５８８１．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［デスルファチバチラム・アルケニボランス（Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｂａｃｉｌｌｕｍ  ａｌｋｅｎｉｖｏｒａｎｓ）ＡＫ−０１］；ｇｉ｜２２０９０９５２０｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００２４８４８３１．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［シアノセイス種（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．）ＰＣＣ７４２５］；ｇｉ｜２１８７８２０３１｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００２４３３３４９．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［デスルファチバチラム・アルケニボランス（Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｂａｃｉｌｌｕｍ  ａｌｋｅｎｉｖｏｒａｎｓ）ＡＫ−０１］；ｇｉ｜２１３６９３０９０｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００２３２３６７６．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［ビフィドバクテリウム・ロングム亜種インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）ＡＴＣＣ１５６９７＝ＪＣＭ１２２２］；ｇｉ｜１８９５００２９７｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１９５９７６７．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［クロロビウム・ファエオバクテロイデス（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｐｈａｅｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＢＳ１］；ｇｉ｜１８９４２３７８７｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１９５０９６４．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［ゲオバクター・ロブレイ（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｌｏｖｌｅｙｉ）ＳＺ］；ｇｉ｜１７２０５８２７１｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１８１４７３ｌ．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［エキシグオバクテリウム・シビリクム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ）２５５−１５］；ｇｉ｜１６３９３８７７５｜ｒｅｆ｜��Ｐ＿００１６４３６５９．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［バチルス・ウェイヘンステファネンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）ＫＢＡＢ４］；ｇｉ｜１５８５２２３０４｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５３０１７４．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［デスルホコッカス・オレオボランス（Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）Ｈｘｄ３］；ｇｉ｜５７３７１６７０｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４７９６５９．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［セラチア・プロテアマキュランス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ）５６８］；ｇｉ｜１５０３９５１１１｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３１７７８６．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［スタフィロコッカス・アウレウス亜種アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ）ＪＨｌ］；ｇｉ｜１５０３９４７１５｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３１７３９０．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［スタフィロコッカス・アウレウス亜種アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ）ＪＨ１］；ｇｉ｜１４６３１１６７９｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１７６７５３．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［エンテロバクター種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）６３８］；ｇｉ｜１０９９０００６１｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿６６３３１６．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［シュードアルテロモナス・アトランティカ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ａｔｌａｎｔｉｃａ）Ｔ６ｃ］；ｇｉ｜２１９８６６１３１｜ｇｂ｜ＡＣＬ４６４７０．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［シアノセイス種（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．）ＰＣＣ７４２５］；ｇｉ｜２１３５２４５５１｜ｇｂ｜ＡＣＪ５３２９８．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［ビフィドバクテリウム・ドロングム亜種インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）ＡＴＣＣ１５６９７＝ＪＣＭ１２２２］；ｇｉ｜１８９４２００４６｜ｇｂ｜ＡＣＤ９４４４４．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［ゲオバクター・ロブレイ（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｌｏｖｌｅｙｉ）ＳＺ］；ｇｉ｜１５８５１１１３０｜ｇｂ｜ＡＢＷ６８０９７．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［デスルホコッカス・オレオボランス（Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）Ｈｘｄ３］；ｇｉ｜１５７３２３４３４｜ｇｂ｜ＡＢＶ４２５３１．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［セラチア・プロテアマキュランス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ）５６８］；ｇｉ｜１４５３１８５５５｜ｇｂ｜ＡＢＰ６０７０２．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［エンテロバクター種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）６３８］；ｇｉ｜１４９９４７５６３１ｇｂ｜ＡＢＲ５３４９９．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［スタフィロコッカス・アウレウス亜種アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ）ＪＨ１］；ｇｉ｜１４９９４７１６７｜ｇｂ｜ＡＢＲ５３１０３．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［スタフィロコッカス・アウレウス亜種アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏ��ｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ）ＪＨ１］；ｇｉ｜１６３８６０９７２｜ｇｂ｜ＡＢＹ４２０３１．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［バチルス・ウェイヘンステファネンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）ＫＢＡＢ４］；ｇｉ｜１０９７０２３４２｜ｇｂ｜ＡＢＧ４２２６２．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［シュードアルテロモナス・アトランティカ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ａｔｌａｎｔｉｃａ）Ｔ６ｃ］；ｇｉ｜１８９４９５７３８｜ｇｂ｜ＡＣＥ０４２８６．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［クロロビウム・ファエオバクテロイデス（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｐｈａｅｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＢＳ１］；ｇｉ｜１７１９９０７９２｜ｇｂ｜ＡＣＢ６１７１４．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［エキシグオバクテリウム・シビリクム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ）２５５−１５］；ｇｉ｜２２３９３２５６３｜ｒｅｆ｜ＺＰ＿０３６２４５６４．１アセト乳酸デカルボキシラーゼ［ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）８９／１５９１］；ｇｉ｜１９４４６７５３１｜ｒｅｆ｜ＺＰ＿０３０７３５１８．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［ラクトバチルス・ロイテリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）１００−２３］；ｇｉ｜２２３８９８８３４｜ｇｂ｜ＥＥＦ６５１９４．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）８９／１５９１］；ｇｉ｜１９４４５４５６７｜ｇｂ｜ＥＤＸ４３４６４．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［ラクトバチルス・ロイテリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）１００−２３］；ｇｉ｜３８４２６７１３５｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００５４２２８４２．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［バチルス・アミロリクエファシエンス亜種プランタルム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＹＡＵＢ９６０１−Ｙ２］；ｇｉ｜３７５３６４０３７｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００５１３２０７６．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［バチルス・アミロリクエファシエンス亜種プランタルム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＣＡＵＢ９４６］；ｇｉ｜３４０７９３２３｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００４７５８６９４．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［コリネバクテリウム・バリアビレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｒｉａｂｉｌｅ）ＤＳＭ４４７０２］；ｇｉ｜３３６３２５１１９｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００４６０５０８５．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［コリネバクテリウム・レジステンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｓｉｓｔｅｎｓ）ＤＳＭ４５１００］；ｇｉ｜１４８２６９０３２｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２４７９７５．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［スタフィロコッカス・アウレウス亜種アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ）ＪＨ９］；ｇｉ｜１４８２６８６５０｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２４７５９３．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［スタフィ��コッカス・アウレウス亜種アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ）ＪＨ９］；ｇｉ｜１４８５４３３７２１｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２７０７４２．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［ラクトバチルス・ロイテリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ２００１６］；ｇｉ｜３８０５００４８８｜ｅｍｂ｜ＣＣＧ５１５２６．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［バチルス・アミロリクエファシエンス亜種プランタルム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＹＡＵＢ９６０１−Ｙ２］；ｇｉ｜３７１５７００３１｜ｅｍｂ｜ＣＣＦ０６８８１．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［バチルス・アミロリクエファシエンス亜種プランタルム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＣＡＵＢ９４６］；ｇｉ｜３４０５３３１４１｜ｇｂ｜ＡＥＫ３５６２１．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［コリネバクテリウム・バリアビレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｒｉａｂｉｌｅ）ＤＳＭ４４７０２］；ｇｉ｜３３６１０１１０１｜ｇｂ｜ＡＥ１０８９２１．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［コリネバクテリウム・レジステンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｓｉｓｔｅｎｓ）ＤＳＭ４５１００］；ｇｉ｜１４８５３０４０６｜ｇｂ｜ＡＢＱ８２４０５．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［ラクトバチルス・ロイテリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ２００１６］；ｇｉ｜１４７７４２１０１｜ｇｂ｜ＡＢＱ５０３９９．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［スタフィロコッカス・アウレウス亜種アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ）ＪＨ９］；ｇｉ｜１４７７４１７１９｜ｇｂ｜ＡＢＱ５００１７．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［スタフィロコッカス・アウレウス亜種アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ）ＪＨ９］；ｇｉ｜３９２５２９５１０｜ｒｅｆ｜ＺＰ＿１０２７６６４７．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［カーノバクテリウム・マルタロマティカム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍ  ａｌｔａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ３５５８６］；ｇｉ｜３６６０５４０７４｜ｒｅｆ
｜ＺＰ＿０９４５１７９６．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［ラクトバチルス・スエビカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｅｂｉｃｕｓ）ＫＣＴＣ３５４９］；ｇｉ｜３３９６２４１４７｜ｒｅｆ｜ＺＰ＿０８６５９９３６．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［フルクロバチルス・イルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｒｕｃｔｏｓｕｓ）ＫＣＴＣ３５４４］；ａｎｄｇｉ｜３３６３９３７２７｜ｒｅｆ｜ＺＰ＿０８５７５１２６．１｜アセト乳酸デカルボキシラーゼ［ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種トルクエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｔｏｒｑｕｅｎｓ）ＫＣＴＣ３５３５］。ＵＮＩＰＲＯＴアクセッションアクセッション番号Ｐ２３６１６．１（Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎｅｔａｌ．，ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９０）１７２（８）：４３１５）は、ＡＬＤＣ酵素の一例である。ＵＮＩＰＲＯＴアクセッション番号Ｐ２３６１６．１は、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に由来するか、または由来し得るＡＬＤＣ酵素の一例である。前述のアクセッション番号と結び付いた各配列は参照により本明細書に組み込まれる。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本発明は、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）（Ｇｏｄｔｆｒｅｄｓｅｎ，１９８４）、ブレビバクテリウム・アセチリカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｙｌｉｃｕｍ）（Ｏｓｈｉｒｏ，１９８９）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、（ＶｉｎｃｅｎｔＰｈａｌｉｐ，１９９４）、ロイコノストック・ラクティス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｌａｃｔｉｓ）（Ｏｓｕｌｉｖａｎ，２００１）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）（Ｂｌｏｍｑｕｉｓｔ，１９９３）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｒｅｎｎａ，１９９３）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）（Ｓｖｅｎｄｓｅｎ，１９８９）およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＤＸ（Ｙｕｘｉｎｇ，２０１４）由来のＡＬＤＣ酵素に関する。いくつかの実施形態において、ＡＬＤＣ酵素は、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ブレビバクテリウム・アセチリカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｙｌｉｃｕｍ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ロイコノストック・ラクティス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｌａｃｔｉｓ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＤＸまたはバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来する。本明細書で使用する場合、「ＡＬＤＣ酵素は由来する」という用語は、ＡＬＤＣ酵素が由来するかまたは由来し得ることを指す。
【００２２】
好適なＡＬＤＣ酵素、すなわち、任意の微生物から産生した、活性が金属イオンに依存するＡＬＤＣはいずれも本発明に使用することができると理解されるべきである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法および組成物に使用されるＡＬＤＣは、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）またはバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のＡＬＤＣである。
【００２３】
本発明の酵素組成物のＡＬＤＣ活性は、本明細書に記載のＡＬＤＣアッセイ、または当技術分野で知られている任意の好適なアッセイにより測定される。標準的なアッセイはｐＨ６．０で行われ、酵素のさらなる特性評価および特定は、異なるｐＨ値および温度で行われ得る。
【００２４】
ＡＬＤＣ活性の１単位は、アッセイ条件下（例えば、ｐＨ６．０（または指定のｐＨ）および３０℃）、１分当たり１μモルのアセトインを生成する酵素量と定義される。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ＡＬＤＣ酵素は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、またはそれらのいずれかの機能的断片と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明の一態様は、ＡＬＤＣ活性を示す酵素に関し、その酵素は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、および配列番号８、またはそれらのいずれかの機能的断片から選択されるいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＬＤＣ酵素は、配列番号１、配列番号４、配列番号６、またはそれらのいずれかの機能的断片と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する核酸配列によってコードされる。本明細書で使用する「核酸」、「核酸配列」および「ヌクレオチド配列」という用語は互換可能である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、この酵素は、５〜８０℃の範囲、例えば、５〜４０℃または１５〜８０℃の範囲、例えば、２０〜８０℃の範囲、例えば、５〜１５℃、１０〜４０℃、１０〜５０℃、１５〜２０℃、４５〜６５℃、５０〜６５℃、５５〜６５℃または６０〜８０℃の範囲に最適温度を有する。いくつかの実施形態において、この酵素は、４５〜６５℃の範囲に最適温度を有する。いくつかの実施形態において、この酵素は、約６０℃の最適温度を有する。
【００２７】
いくつかの実施形態において、この酵素はアミノ酸の総数が３５０未満、例えば、３４０未満、例えば、３３０未満、例えば、３２０未満、例えば、３１０未満、例えば、３００未満、例えば、２００〜３５０の範囲、例えば、２２０〜３４５の範囲である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、この酵素のアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号８、またはそれらのいずれかの機能的断片から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と比較したとき、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のアミノ酸が置換されている。
【００２９】
いくつかの実施形態において、この酵素のアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号８、またはそれらのいずれかの機能的断片から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と最大で１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のアミノ酸が置換されている。
【００３０】
いくつかの実施形態において、この酵素は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、またはそれらのいずれかの機能的断片のいずれか１つで特定されるアミノ酸配列を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、この酵素は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、またはそれらのいずれかの機能的断片のいずれか１つで特定されるアミノ酸配列から構成される。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本発明のＡＬＤＣ組成物、培地および方法は、任意の１種以上のさらなる酵素を含む。いくつかの実施形態において、１種以上のさらなる酵素は、アセト乳酸レダクトイソメラーゼ、アセト乳酸イソメラーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、エンドグルカナーゼおよび関連ベータ−グルカン加水分解アクセサリー酵素、キシラナーゼ、キシラナーゼアクセサリー酵素（例えば、アラビノフラノシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、およびキシランアセチルエステラーゼ）、ベータ−グルコシダーゼ、ならびにプロテアーゼからなる一覧から選択される。
【００３３】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物、培地および方法は、ＡＬＤＣ活性を示す酵素を含み、前記ＡＬＤＣ酵素の活性はタンパク質１ｍｇ当たり９５０〜２５００単位の範囲にある。いくつかの実施形態において、本発明の組成物、培地および方法は、ＡＬＤＣ活性を示す酵素を含み、前記ＡＬＤＣ酵素の活性はタンパク質１ｍｇ当たり１０００〜２５００単位の範囲にある。いくつかの実施形態において、本発明の組成物、培地および方法は、ＡＬＤＣ活性を示す酵素を含み、前記ＡＬＤＣ酵素の活性はタンパク質１ｍｇ当たり１５００〜２５００単位の範囲にある。いくつかの実施形態において、ＡＬＤＣ活性を示す酵素は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号８またはそれらのいずれかの機能的断片から選択されるいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素である。いくつかの実施形態において、ＡＬＤＣ活性を示す酵素は、配列番号１、配列番号４、配列番号６、またはそれらのいずれかの機能的断片と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列によってコードされる。
【００３４】
宿主
一態様において、本発明は、ＡＬＤＣ酵素の収量を増大させ、かつ／または安定性および／もしくは活性が増大したＡＬＤＣ酵素を産生する、１つ以上の遺伝子変異を有する宿主細胞を提供する。「遺伝子変異を含む宿主細胞」、「宿主細胞は遺伝子変異を含む」、「変異宿主細胞」、「変異株」、「変異体」、「宿主細胞」および「微生物」は、本明細書では互換的に使用され得る。本明細書で使用する場合、「遺伝子変異」は、親宿主細胞との比較で少なくとも１つの遺伝子変異を有する宿主細胞を指し、通常、遺伝子変異は宿主細胞のゲノムの変化である。宿主細胞の遺伝子変異は、自然突然変異および／または遺伝子工学（ベクターによる細胞の形質転換、ゲノムの特定遺伝子の除去など）の結果であり得る。遺伝子変異の例としては、親細胞と比較して低減された量の少なくとも１種の内因性プロテアーゼを変異株の細胞に産生させる遺伝子変異が挙げられる。一実施形態では、変異株は、親細胞と比較して異種のＡＬＤＣ酵素をコードする核酸配列を含むようにさらに改質される。一実施形態では、親株は、ＡＬＤＣ酵素をコードする異種核酸配列を含む。一実施形態では、変異株は、ＡＬＤＣ酵素をコードする内因性核酸配列を親株と比較して過剰に発現するように改質されている。一実施形態では、変異種は、宿主細胞に、ＡＬＤＣ酵素をコードする内因性核酸配列を親株と比較して過剰に発現させる核酸で形質転換される。本明細書で使用する場合、「過剰発現している」、「過剰発現」および「過剰発現する」という用語は、ＡＬＤＣをコードする核酸配列の発現を許容する同じ条件下で培養したときの、変異株におけるＡＬＤＣ酵素をコードする核酸配列の発現が、親株におけるＡＬＤＣ酵素をコードする核酸配列の発現と比較して増加することを指す。例えば、変異株によるＡＬＤＣ酵素をコードする核酸配列の発現は、親株によるＡＬＤＣ酵素をコードする核酸配列の発現より少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％高い。理論に拘束されることを望むものではないが、宿主細胞におけるＡＬＤＣ酵素をコードする内因性核酸配列の過剰発現は、宿主細胞におけるＡＬＤＣ酵素の産生量を、親細胞におけるＡＬＤＣ酵素の産生量より増大させる。宿主細胞は、親細胞と比較してプロテアーゼ活性および／またはプロテアーゼ機能が低下した細胞をスクリーニングすることにより確認し得る。遺伝子変異は、例えば、プロテアーゼをコードする１つ以上の遺伝子の破壊であってもよい。そのような遺伝子によってコードされるプロテアーゼの例としては、ｗｐｒＡ、ｖｐｒ、ｅｐｒ、ｉｓｐＡ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ａｐｒＥ、ａｍｐＳ、ａｐｒＸ、ｂｐｆ、ｃｌｐＣＰ、ｃｌｐＥＰ、ｃｌｐＸＰ、ｃｏｄＷＸ、ｌｏｎＡ、ｌｏｎＢ、ｎｐｒＢ、ｍａｐ、ｍｌｐＡ、ｍｐｒ、ｐｅｐＴ、ｐｅｐＦ、ｄｐｐＡ、ｙｑｙＥ、ｔｅｐＡ、ｙｆｉＴ、ｙｆｌＧ、ｙｍｆＦ、ｙｐｗＡ、ｙｒｒＮ、ｙｒｒＯおよびｙｗａＤが挙げられる。遺伝子変異は、例えば、プロテアーゼをコードする遺伝子の調節配列（例えば、プロモーター）、またはプロテアーゼの発現を制御し得る核酸配列の破壊であってもよい。理論に拘束されることを望むものではないが、破壊は、遺伝子および／または調節配列の全部または一部の欠損を引き起こし得る。遺伝子変異は、例えば、プロテアーゼをコードする核酸配列に結合可能なアンチセンス核酸配列をコードする核酸配列、またはプロテアーゼの発現を制御し得る核酸配列の宿主細胞への導入によってもたらされてもよい。遺伝子変異は、例えば、プロテアーゼをコードする１つ以上の遺伝子（ＷｐｒＡ、Ｖｐｒ、Ｅｐｒ、ＩｓｐＡ、Ｂｐｒ、ＮｐｒＥ、ＡｐｒＥ、ａｍｐＳ、ａｐｒＸ、ｂｐｆ、ｃｌｐＣＰ、ｃｌｐＥＰ、ｃｌｐＸＰ、ｃｏｄＷＸ、ｌｏｎＡ、ｌｏｎＢ、ｎｐｒＢ、ｍａｐ、ｍｌｐＡ、ｍｐｒ、ｐｅｐＴ、ｐｅｐＦ、ｄｐｐＡ、ｙｑｙＥ、ｔｅｐＡ、ｙｆｉＴ、ｙｆｌＧ、ｙｍｆＦ、ｙｐｗＡ、ｙｒｒＮ、ｙｒｒＯおよびｙｗａＤなど）、またはプロテアーゼをコードする遺伝子の発現を制御し得る核酸配列の全部または一部の欠損であってもよい。遺伝子変異は、例えば、プロテアーゼをコードする遺伝子の調節配列（例えば、プロモーター）、またはプロテアーゼの発現を制御し得る核酸配列の欠損であってもよい。遺伝子変異は、例えば、プロテアーゼをコードする遺伝子、またはプロテアーゼをコードする遺伝子の発現を制御し得る核酸配列を含むゲノムＤＮＡの一部の欠損であってもよい。ＡＬＤＣ酵素の収量に関連した「改善された」という用語および「増加した」という用語は、遺伝子変異を有する宿主細胞を培養したときに生成される（例えば、回収される）ＡＬＤＣ活性を有するタンパク質量が、親宿主細胞を同じ条件（例えば、同じ時間および温度）下で培養したときに生成されるＡＬＤＣ活性を有するタンパク質量と比較して増加したことを意味する。本明細書で使用する「より良好な安定性」および「増大した安定性」という用語は、遺伝子変異を有する宿主細胞が産生したＡＬＤＣ酵素のＡＬＤＣ活性が、同じ条件（例えば、同じ温度）下で培養された親株が産生したＡＬＤＣ酵素のＡＬＤＣ活性と比較して、より長期間維持されることを意味する。本明細書で使用する「より良好な活性」および「増大した活性」という用語は、遺伝子変異を有する宿主細胞が産生したＡＬＤＣ酵素が、同じ条件（例えば、同じ温度）下で培養された親株が産生したＡＬＤＣ酵素のＡＬＤＣ活性と比較して、より高いＡＬＤＣ活性を有していることを意味する。プロテアーゼに関連した「低減された量」という用語は、本明細書で使用する場合、遺伝子変異を有する宿主細胞が産生するプロテアーゼの量が、同じ条件下で培養した親株が産生するプロテアーゼの量と比較して低減されていることを意味する。機能性プロテアーゼに関連した「低減されたた量」という用語は、本明細書で使用する場合、遺伝子変異を有する宿主細胞が産生するプロテアーゼの量および／または活性が、同じ条件下で培養した親株が産生するプロテアーゼの量および／または活性と比較して低減されていることを意味する。プロテアーゼ活性は、本明細書に記載のプロテアーゼアッセイ（例えば、カゼインスポットプレートアッセイ）、または当技術分野で知られている任意の好適なアッセイで測定される。いくつかの実施形態において、本発明の宿主細胞では、実施例に記載のカゼインアッセイによるインキュベーション２日、５日または１０日後に明確なハロー形成が見られない。
【００３５】
いくつかの実施形態において、ＡＬＤＣ酵素は、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）（Ｇｏｄｔｆｒｅｄｓｅｎ，１９８４）、ブレビバクテリウム・アセチリカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｙｌｉｃｕｍ）（Ｏｓｈｉｒｏ，１９８９）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、（ＶｉｎｃｅｎｔＰｈａｌｉｐ，１９９４）、ロイコノストック・ラクティス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｌａｃｔｉｓ）（Ｏｓｕｌｉｖａｎ，２００１）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）（Ｂｌｏｍｑｕｉｓｔ，１９９３）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｒｅｎｎａ，１９９３）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕ  ｓｂｒｅｖｉｓ）（Ｓｖｅｎｄｓｅｎ，１９８９）およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＤＸ（Ｙｕｘｉｎｇ，２０１４）由来のＡＬＤＣ酵素である。
【００３６】
いくつかの実施形態において、ＡＬＤＣ酵素は、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）、ブレビバクテリウム・アセチリカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｙｌｉｃｕｍ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ロイコノストック・ラクティス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｌａｃｔｉｓ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＤＸまたはバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来する。いくつかの実施形態において、ＡＬＤＣ酵素は、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）またはバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のＡＬＤＣである。
【００３７】
一実施形態では、親細胞に由来するか、または由来し得る変異宿主細胞が提供される。一態様において、変異宿主細胞は、親細胞と比較して低減された量の１つ以上のプロテアーゼを変異株の細胞に産生させる遺伝子変異を１つ以上含む。前記プロテアーゼは、好ましくは、ＷｐｒＡ、Ｖｐｒ、Ｅｐｒ、ＩｓｐＡ、Ｂｐｒ、ＮｐｒＥ、ＡｐｒＥ、ａｍｐＳ、ａｐｒＸ、ｂｐｆ、ｃｌｐＣＰ、ｃｌｐＥＰ、ｃｌｐＸＰ、ｃｏｄＷＸ、ｌｏｎＡ、ｌｏｎＢ、ｎｐｒＢ、ｍａｐ、ｍｌｐＡ、ｍｐｒ、ｐｅｐＴ、ｐｅｐＦ、ｄｐｐＡ、ｙｑｙＥ、ｔｅｐＡ、ｙｆｉＴ、ｙｆｌＧ、ｙｍｆＦ、ｙｐｗＡ、ｙｒｒＮ、ｙｒｒＯ、およびｙｗａＤからなる群から選択される。本明細書では、そのような宿主細胞を「プロテアーゼ欠乏」または「プロテアーゼマイナス株」と称することがある。一態様において、変異宿主細胞は、異種ＡＬＤＣ酵素をコードする核酸配列を含む。一態様において、変異宿主細胞は、宿主細胞に、ＡＬＤＣ酵素をコードする内因性核酸配列を親細胞と比較して過剰に発現させる遺伝子変異を１つ以上含む。一態様において、変異宿主細胞は、宿主細胞に、ＡＬＤＣ酵素をコードする内因性核酸配列を親細胞と比較して過剰に発現させる核酸を含む。一態様において、親細胞に由来する変異宿主細胞が提供され、その変異宿主細胞は、親細胞と比較して低減された量の機能性プロテアーゼを変異種細胞に産生させる遺伝子変異を含み、ここで、そのプロテアーゼは、ＡＬＤＣ酵素のＣ末端および／またはＮ末端を開裂することができる。本明細書で使用する「プロテアーゼはＡＬＤＣ酵素のＣ末端および／またはＮ末端を開裂することができる」という用語は、プロテアーゼがＡＬＤＣ酵素をＣ末端および／またはＮ末端で開裂することを意味する。例えば、プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の２７５または２７６のアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置でＡＬＤＣ酵素を開裂することができ、さらにまたは代替として、プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の３７、３８、３９、４０、４２または４３のアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置でＡＬＤＣ酵素を開裂することができる。配列番号５、配列番号２または配列番号７の２７５または２７６位のアミノ酸は、ＡＬＤＣのＣ末端にある。配列番号５、配列番号２または配列番号７の３７、３８、３９、４０、４２または４３位のアミノ酸は、ＡＬＤＣのＮ末端にある。本明細書で言及するプロテアーゼは、ＡＬＤＣ酵素、例えば、配列番号５、配列番号２または配列番号７として示す配列と少なくとも８０％の同一性を有するＡＬＤＣのＣ末端から配列ＱＶＨＱＡＥＳＥＲＫを開裂し得る。「切断する」と「開裂する」とは、本明細書では互換的に使用され得る。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＣ末端の２７５位で開裂することができる。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＣ末端の２７６位で開裂することができる。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の３７位で開裂することができる。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の３８位で開裂することができる。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の３９位で開裂することができる。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の４０位で開裂することができる。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の４２位で開裂することができる。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の４３位で開裂することができる。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の３９位で開裂することができる。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、中性メタロプロテアーゼである。ＮｐｒＥは、中性メタロプロテアーゼの一例である。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、サーモリシンである。サーモリシンは、グルテン加水分解および／または穀物加工に使用することができる。
【００３８】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）などの細菌宿主である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である。いくつかの実施形態において、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。いくつかの実施形態において、ＡＬＤＣ酵素はバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の培養によって製造することができる。
【００３９】
いくつかの実施形態において、本発明は、親細胞と比較して低減された量の機能性内因性細胞壁関連プロテアーゼ酵素（ＷｐｒＡ）を変異株の細胞に産生させる遺伝子変異を含む変異宿主細胞を提供する。ここで、宿主細胞は、プロモーターと作動可能に結合した異種ＡＬＤＣ酵素をコードする核酸で形質転換されている。いくつかの実施形態において、本発明は、親細胞と比較して低減された量の機能性内因性細胞壁関連プロテアーゼ酵素（ＷｐｒＡ）を変異株の細胞に産生させる遺伝子変異を含む変異宿主細胞を提供する。ここで、宿主細胞は、宿主細胞に、ＡＬＤＣ酵素をコードする内因性核酸配列をコードする核酸を親細胞と比較して過剰に発現させる核酸で形質転換されている。「細胞壁関連プロテアーゼ」および「ＷｐｒＡ」という用語は、本明細書で使用する場合、「細胞壁プロテアーゼ」および「ｗｐｒＡ」という用語と互換可能であり得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である。いくつかの実施形態において、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【００４０】
いくつかの実施形態において、遺伝子変異は、親株に存在するｗｐｒＡ遺伝子の破壊を含む。いくつかの実施形態において、ｗｐｒＡ遺伝子の破壊は、ｗｐｒＡ遺伝子の全部または一部の欠損の結果である。いくつかの実施形態において、ｗｐｒＡ遺伝子の破壊は、ｗｐｒＡ遺伝子を含むゲノムＤＮＡの一部の欠損の結果である。いくつかの実施形態において、ｗｐｒＡ遺伝子の破壊は、ｗｐｒＡ遺伝子の突然変異誘発の結果である。
【００４１】
いくつかの実施形態において、ｗｐｒＡ遺伝子の破壊は、部位特異的組み換えを用いて行われる。いくつかの実施形態において、ｗｐｒＡ遺伝子の破壊は、ｗｐｒＡ遺伝子の遺伝子座への選択マーカー（例えば、スペクチノマイシン耐性遺伝子など）の導入と組み合わされて行われる。
【００４２】
いくつかの実施形態において、変異株は機能性ｗｐｒＡタンパク質を産生しない。いくつかの実施形態において、変異株はｗｐｒＡタンパク質を産生しない。
【００４３】
いくつかの実施形態において、ＷｐｒＡタンパク質の産生量の低減は、当技術分野で知られている任意の好適な方法、例えば、アンチセンスＲＮＡで達成される。
【００４４】
いくつかの実施形態において、本発明は、親細胞と比較して低減された量の機能性細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｖｐｒ）を変異株の細胞に産生させる遺伝子変異を含む変異宿主細胞を提供する。ここで、宿主細胞は、プロモーターと作動可能に結合した異種ＡＬＤＣ酵素をコードする核酸で形質転換されている。いくつかの実施形態において、本発明は、親細胞と比較して低減された量の機能性細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｖｐｒ）を変異株の細胞に産生させる遺伝子変異を含む変異宿主細胞を提供する。ここで、宿主細胞は、宿主細胞に、ＡＬＤＣ酵素をコードする内因性核酸配列をコードする核酸を親細胞と比較して過剰に発現させる核酸で形質転換されている。「細胞外セリンプロテアーゼ酵素」および「Ｖｐｒ」という用語は、本明細書で使用する場合、「微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素」、「Ｖｐｒ」、「ｅｐｒ」および「Ｅｐｒ」という用語と互換可能であり得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である。いくつかの実施形態において、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【００４５】
いくつかの実施形態において、遺伝子変異は、親株に存在するｖｐｒ遺伝子の破壊を含む。いくつかの実施形態において、ｖｐｒ遺伝子の破壊は、ｖｐｒ遺伝子の全部または一部の欠損の結果である。いくつかの実施形態において、ｖｐｒ遺伝子の破壊は、ｖｐｒ遺伝子を含むゲノムＤＮＡの一部の欠損の結果である。いくつかの実施形態において、ｖｐｒ遺伝子の破壊は、ｖｐｒ遺伝子の突然変異誘発の結果である。
【００４６】
いくつかの実施形態において、ｖｐｒ遺伝子の破壊は、部位特異的組み換えを用いて行われる。いくつかの実施形態において、ｖｐｒ遺伝子の破壊は、ｖｐｒ遺伝子の遺伝子座への選択マーカー（例えば、カナマイシン耐性遺伝子など）の導入と組み合わされて行われる。
【００４７】
いくつかの実施形態において、変異株は機能性ｖｐｒタンパク質を産生しない。いくつかの実施形態において、変異株はｖｐｒタンパク質を産生しない。
【００４８】
いくつかの実施形態において、Ｖｐｒタンパク質の産生量の低減は、当技術分野で知られている任意の好適な方法、例えば、アンチセンスＲＮＡで達成される。
【００４９】
いくつかの実施形態において、本発明は、親細胞と比較して低減された量の機能性細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｖｐｒ）を変異株の細胞に産生させる遺伝子変異を含む変異宿主細胞を提供する。ここで、宿主細胞は、プロモーターと作動可能に結合した異種ＡＬＤＣ酵素をコードする核酸で形質転換されている。いくつかの実施形態において、本発明は、親細胞と比較して低減された量の機能性細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｖｐｒ）および機能性内因性細胞壁関連プロテアーゼ酵素（ＷｐｒＡ）の両方を変異株の細胞に産生させる遺伝子変異を含む変異宿主細胞を提供する。ここで、宿主細胞は、宿主細胞に、ＡＬＤＣ酵素をコードする内因性核酸配列を親細胞と比較して過剰に発現させる核酸で形質転換されている。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である。いくつかの実施形態において、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。いくつかの実施形態において、タンパク質の産生量の低減は、本明細書に記載の方法のいずれか、または当技術分野で知られている任意の好適な方法、例えば、アンチセンスＲＮＡで達成される。いくつかの実施形態において、変異株は機能性ＶｐｒおよびＷｐｒＡタンパク質を産生しない。いくつかの実施形態において、変異株はＶｐｒおよびＷｐｒＡタンパク質を産生しない。
【００５０】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、低減された量の機能性細胞外セリンアルカリプロテアーゼ酵素（ＡｐｒＥ）および内因性細胞外中性メタロプロテアーゼ酵素（ＮｐｒＥ）の両方を変異株の細胞に産生させる遺伝子変異をさらに有する。ここで、宿主細胞は、プロモーターと作動可能に結合した異種ＡＬＤＣ酵素をコードする核酸で形質転換されている。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、低減された量の機能性細胞外セリンアルカリプロテアーゼ酵素（ＡｐｒＥ）および内因性細胞外中性メタロプロテアーゼ酵素（ＮｐｒＥ）の両方を変異株の細胞に産生させる遺伝子変異をさらに有する。ここで、宿主細胞は、宿主細胞に、ＡＬＤＣ酵素をコードする内因性核酸配列を親細胞と比較して過剰に発現させる核酸で形質転換されている。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である。いくつかの実施形態において、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。いくつかの実施形態において、タンパク質の産生量の低減は、本明細書に記載の方法のいずれか、または当技術分野で知られている任意の好適な方法、例えば、アンチセンスＲＮＡで達成される。いくつかの実施形態において、変異株は機能性ＮｐｒＥおよびＡｐｒＥタンパク質を産生しない。いくつかの実施形態において、変異株は機能性ＮｐｒＥおよびＡｐｒＥタンパク質を産生しない。
【００５１】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、低減した量の内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｅｐｒ）をさらに有する。「欠失する」という用語は、本明細書で使用する場合、「低減された量」という用語と互換可能である。さらなる実施形態において、宿主細胞は、内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素（ＩｓｐＡ）および内因性バシロペプチダーゼＦ酵素（Ｂｐｒ）の一方、または両方をさらに欠失している。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である。いくつかの実施形態において、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。いくつかの実施形態において、タンパク質の産生量の低減は、本明細書に記載の方法のいずれか、または当技術分野で知られている任意の好適な方法、例えば、アンチセンスＲＮＡで達成される。いくつかの実施形態において、変異株は機能性Ｅｐｒ、ＩｓｐＡおよびＢｐｒタンパク質を産生しない。いくつかの実施形態において、変異株はＥｐｒ、ＩｓｐＡおよびＢｐｒタンパク質を産生しない。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本発明は、低減された量の内因性セリンアルカリプロテアーゼ酵素（ＡｐｒＥ）、内因性細胞外中性メタロプロテアーゼ酵素（ＮｐｒＥ）、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｖｐｒ）、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｅｐｒ）、内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素（ＩｓｐＡ）および内因性バシロペプチダーゼＦ酵素（Ｂｐｒ）を有する宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である。いくつかの実施形態において、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。いくつかの実施形態において、タンパク質の産生量の低減は、本明細書に記載の方法のいずれか、または当技術分野で知られている任意の好適な方法、例えば、アンチセンスＲＮＡで達成される。いくつかの実施形態において、変異株は機能性ＡｐｒＥ、ＮｐｒＥ、Ｖｐｒ、Ｅｐｒ、ＩｓｐＡおよびＢｐｒタンパク質を産生しない。いくつかの実施形態において、変異株はＡｐｒＥ、ＮｐｒＥ、Ｖｐｒ、Ｅｐｒ、ＩｓｐＡおよびＢｐｒタンパク質を産生しない。
【００５３】
いくつかの実施形態において、本発明は、低減された量の内因性セリンアルカリプロテアーゼ酵素（ＡｐｒＥ）、内因性細胞外中性メタロプロテアーゼ酵素（ＮｐｒＥ）、内因性細胞壁関連プロテアーゼ酵素（ＷｐｒＡ）、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｅｐｒ）、内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素（ＩｓｐＡ）および内因性バシロペプチダーゼＦ酵素（Ｂｐｒ）を有する宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である。いくつかの実施形態において、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。いくつかの実施形態において、タンパク質の産生量の低減は、本明細書に記載の方法のいずれか、または当技術分野で知られている任意の好適な方法、例えば、アンチセンスＲＮＡで達成される。いくつかの実施形態において、変異株は機能性ＡｐｒＥ、ＮｐｒＥ、ＷｐｒＡ、Ｅｐｒ、ＩｓｐＡおよびＢｐｒタンパク質を産生しない。いくつかの実施形態において、変異株はＡｐｒＥ、ＮｐｒＥ、ＷｐｒＡ、Ｅｐｒ、ＩｓｐＡおよびＢｐｒタンパク質を産生しない。
【００５４】
いくつかの実施形態において、本発明は、低減された量の内因性セリンアルカリプロテアーゼ酵素（ＡｐｒＥ）、内因性細胞外中性メタロプロテアーゼ酵素（ＮｐｒＥ）、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｖｐｒ）、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｅｐｒ）、内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素（ＩｓｐＡ）、内因性バシロペプチダーゼＦ酵素（Ｂｐｒ）および内因性細胞壁関連プロテアーゼ酵素（ＷｐｒＡ）を有する宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である。いくつかの実施形態において、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。いくつかの実施形態において、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。いくつかの実施形態において、タンパク質の産生量の低減は、本明細書に記載の方法のいずれか、または当技術分野で知られている任意の好適な方法、例えば、アンチセンスＲＮＡで達成される。いくつかの実施形態において、変異株は機能性ＡｐｒＥ、ＮｐｒＥ、ＷｐｒＡ、Ｖｐｒ、Ｅｐｒ、ＩｓｐＡおよびＢｐｒタンパク質を産生しない。いくつかの実施形態において、変異株はＡｐｒＥ、ＮｐｒＥ、ＷｐｒＡ、Ｖｐｒ、Ｅｐｒ、ＩｓｐＡおよびＢｐｒタンパク質を産生しない。
【００５５】
さらなる実施形態において、宿主細胞は、低減された量の１種以上の追加のプロテアーゼ、例えば、ａｍｐＳ、ａｐｒＸ、ｂｐｆ、ｃｌｐＣＰ、ｃｌｐＥＰ、ｃｌｐＸＰ、ｃｏｄＷＸ、ｌｏｎＡ、ｌｏｎＢ、ｎｐｒＢ、ｍａｐ、ｍｌｐＡ、ｍｐｒ、ｐｅｐＴ、ｐｅｐＦ、ｄｐｐＡ、ｙｑｙＥ、ｔｅｐＡ、ｙｆｉＴ、ｙｆｌＧ、ｙｍｆＦ、ｙｐｗＡ、ｙｒｒＮ、ｙｒｒＯ、ｙｗａＤ、または当業者に知られている他のプロテアーゼをさらに有する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である。いくつかの実施形態において、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【００５６】
さらに、本発明は、本明細書に記載の宿主を培養することによって製造されるＡＬＤＣ酵素を含む組成物を提供する。ここで、組成物は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼ活性量が低減されている。いくつかの実施形態において、組成物は、０．５０Ｕ／ｍｌ未満のプロテアーゼ活性、好ましくは０．０５Ｕ／ｍｌ未満のプロテアーゼ活性、より好ましくは０．００５Ｕ／ｍｌ未満のプロテアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態において、組成物では、実施例に記載のカゼインアッセイによるインキュベーション１０日後に明確なハロー形成が見られない。いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載の宿主を培養することによって製造されるＡＬＤＣ酵素を含む組成物を提供する。ここで、この組成物は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）セリンプロテアーゼ酵素（ＡｐｒＥ）により実質的に汚染されていない。いくつかの好ましい実施形態において、含まれるＡｐｒＥ汚染は、そのＡＬＤＣ酵素の約１重量％未満である。いくつかの好ましい実施形態において、ＡｐｒＥ汚染のプロテアーゼ活性は、０．５０Ｕ／ｍｌ未満であり、好ましくは０．０５Ｕ／ｍｌ未満であり、より好ましくは０．００５Ｕ／ｍｌ未満である。いくつかの特に好ましい実施形態において、ＡＬＤＣ組成物は、アセト乳酸レダクトイソメラーゼ、アセト乳酸イソメラーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、エンドグルカナーゼおよび関連ベータ−グルカン加水分解アクセサリー酵素、キシラナーゼ、キシラナーゼアクセサリー酵素（例えば、アラビノフラノシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、およびキシランアセチルエステラーゼ）、ベータ−グルコシダーゼ、ならびにプロテアーゼから選択される少なくとも１種の追加酵素または酵素誘導体をさらに含む。いくつかの実施形態において、組成物は、ＡＬＤＣ酵素を少なくとも約０．０００１重量パーセント、好ましくは約０．００１〜約５．０重量パーセント含む。いくつかの実施形態において、組成物は、ＡＬＤＣ酵素を０．０１〜約３．０重量パーセント含む。いくつかの実施形態において、組成物は、ＡＬＤＣ酵素を０．５〜約２．０重量パーセント含む。いくつかの実施形態において、組成物は、ＡＬＤＣ酵素を０．８〜約１．０重量パーセント含む。
【００５７】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物および方法は、ＡＬＤＣ活性を示す酵素を含み、前記ＡＬＤＣ酵素の活性はタンパク質１ｍｇ当たり約９５０〜２５００単位の範囲にある。いくつかの実施形態において、本発明の組成物および方法は、ＡＬＤＣ活性を示す酵素を含み、前記ＡＬＤＣ酵素の活性はタンパク質１ｍｇ当たり１０００〜２５００単位、または１５００〜２５００単位の範囲にある。いくつかの実施形態において、ＡＬＤＣ活性を示す酵素は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号８、またはそれらのいずれかの機能的断片から選択されるいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００５８】
いくつかの実施形態において、ＡＬＤＣ酵素は、ＡＬＤＣ誘導体を生成するためにグルタルアルデヒドで処理されるか、または処理されている。いくつかの実施形態において、ＡＬＤＣ酵素は、純粋なＡＬＤＣ酵素１ｇ当たり約０，１〜約５ｇのグルタルアルデヒドに相当する濃度のグルタルアルデヒドで処理されるか、または処理されている。
【００５９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＡＬＤＣ酵素組成物は、飲料製造プロセス、例えば、ビール、ワイン、サイダー、もしくはペリー、または酒の発酵および／または成熟中にジアセチル濃度を低下させるために使用される。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「飲料」および「飲料製品」という用語には、１００％麦芽醸造ビール、異なる制御法で醸造されるビール、エール、ドライビール、ニアビール、ライトビール、低アルコールビール、低カロリービール、ポーター、ボックビール、スタウト、モルトリカー、ノンアルコールビール、ノンアルコールモルトリカーなどの発泡性発酵飲料が含まれる。「飲料」または「飲料製品」という用語にはまた、非発泡ビール、ならびに果実風味の麦芽飲料、例えば、レモン、オレンジ、ライムまたはベリー風味などの柑橘類風味麦芽飲料、リカー風味の麦芽飲料、例えば、ウオッカ、ラムまたはテキーラ風味の麦芽リカー、またはカフェイン風味麦芽リカーなどのコーヒー風味麦芽飲料などの代替麦芽飲料なども含まれる。「飲料」または「飲料製品」という用語にはまた、大麦麦芽と異なる代替材料、例えば、ライ麦、コーン、カラスムギ、米、キビ、ライ小麦、キャッサバ、小麦、大麦、ソルガムおよびこれらの組み合わせで作られたビールも含まれる。「飲料」または「飲料製品」という用語にはまた、ワイン、サイダー、ペリーまたは酒などの他の発酵製品も含まれる。
【００６１】
ビールは、従来、大麦粒由来の麦芽などの麦芽と、任意選択により、植物材料（例えば、穀物）を含有するデンプンなどの添加物とから生成され、かつ任意選択により、例えば、ホップで風味を付けられたアルコール飲料といわれている。本発明との関連において、「ビール」という用語には、植物材料含有デンプンの発酵／醸造によって製造されたあらゆる発酵麦汁が含まれ、したがって、特に添加物、または麦芽と添加物との任意の組み合わせからのみ製造されるビールも含まれる。ビールは、様々なデンプン含有植物材料から実質的に同じ方法で作ることができる。ここで、デンプンは、主として、グルコース残基が、アルファ−１，４−結合またはアルファ−１，６−結合により、主成分である前者と結合しているグルコースホモポリマーからなる。ビールは、ライ麦、コーン、カラスムギ、米、キビ、ライ小麦、キャッサバ、小麦、大麦、ソルガム、およびこれらの組み合わせなどの代替材料で作ることができる。
【００６２】
方法
いくつかの態様において、本発明は、微生物からのＡＬＤＣの回収を改善する方法を提供する。他の態様において、本発明は、本明細書に記載の宿主細胞中でＡＬＤＣを生成する方法を提供する。
【００６３】
いくつかの実施形態において、本発明は、親細胞と比較して低減された量の機能性プロテアーゼを変異株の細胞に産生させる遺伝子変異と、プロモーターと作動可能に結合した異種ＡＬＤＣ酵素をコードする核酸とを含む宿主細胞を用意する工程であって、そのプロテアーゼは、ＡＬＤＣ酵素のＣ末端および／またはＮ末端を開裂することができる、工程と、異種ＡＬＤＣ酵素の産生に好適な条件下で、形質転換された宿主細胞を培養する工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＣ末端の２７５位で開裂することができる。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＣ末端の２７６位で開裂することができる。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の３７位で開裂することができる。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の３８位で開裂することができる。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の３９位で開裂することができる。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の４０位で開裂することができる。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の４２位で開裂することができる。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の４３位で開裂することができる。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、配列番号５、配列番号２または配列番号７の対応するＮ末端の３９位で開裂することができる。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、中性メタロプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、サーモリシンである。
【００６４】
いくつかの実施形態において、方法は、産生された異種ＡＬＤＣ酵素を回収する工程をさらに含む。
【００６５】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）などの細菌宿主である。いくつかの実施形態において、ＡＬＤＣ酵素はバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の培養によって製造される。
【００６６】
いくつかの実施形態において、本発明は、親細胞と比較して低減された機能性内因性細胞壁関連プロテアーゼ酵素（ＷｐｒＡ）を変異株の細胞に産生させる遺伝子変異を含む宿主細胞を用意する工程であって、宿主細胞は、プロモーターと作動可能に結合した異種ＡＬＤＣ酵素をコードする核酸で形質転換されている、工程と、異種ＡＬＤＣ酵素の産生に好適な条件下で、形質転換された宿主細胞を培養する工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、親細胞と比較して低減された量の機能性内因性細胞壁関連プロテアーゼ酵素（ＷｐｒＡ）を変異株の細胞に産生させる遺伝子変異を含む宿主細胞を用意する工程であって、宿主細胞は、変異株の細胞に、ＡＬＤＣ酵素をコードする内因性核酸配列を親細胞と比較して過剰に発現させる核酸で形質転換されている、工程と、ＡＬＤＣ酵素の産生に好適な条件下で、形質転換された宿主細胞を培養する工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である。いくつかの実施形態において、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【００６７】
いくつかの実施形態において、本発明は、親細胞と比較して低減された量の機能性細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｖｐｒ）を変異株の細胞に産生させる遺伝子変異を含む宿主細胞を用意する工程であって、宿主細胞は、プロモーターと作動可能に結合した異種ＡＬＤＣ酵素をコードする核酸で形質転換されている、工程と、異種ＡＬＤＣ酵素の産生に好適な条件下で、形質転換された宿主細胞を培養する工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、親細胞と比較して低減された量の機能性細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｖｐｒ）を変異株の細胞に産生させる遺伝子変異を含む宿主細胞を用意する工程であって、宿主細胞は、変異株の細胞に、ＡＬＤＣ酵素をコードする内因性核酸配列を親細胞と比較して過剰に発現させる核酸で形質転換されている、工程と、ＡＬＤＣ酵素の産生に好適な条件下で、形質転換された宿主細胞を培養する工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である。いくつかの実施形態において、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【００６８】
いくつかの実施形態において、本発明は、親細胞と比較して低減された量の機能性細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｖｐｒ）および機能性内因性細胞壁関連プロテアーゼ酵素（ＷｐｒＡ）の両方を変異株の細胞に産生させる遺伝子変異を含む宿主細胞を用意する工程であって、宿主細胞は、プロモーターと作動可能に結合した異種ＡＬＤＣ酵素をコードする核酸で形質転換されている、工程と、異種ＡＬＤＣ酵素の産生に好適な条件下で、形質転換された宿主細胞を培養する工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、親細胞と比較して低減された量の機能性細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｖｐｒ）および機能性内因性細胞壁関連プロテアーゼ酵素（ＷｐｒＡ）の両方を変異株の細胞に産生させる遺伝子変異を含む宿主細胞を用意する工程であって、宿主細胞は、変異株の細胞に、ＡＬＤＣ酵素をコードする内因性核酸配列を親細胞と比較して過剰に発現させる核酸で形質転換されている、工程と、ＡＬＤＣ酵素の産生に好適な条件下で、形質転換された宿主細胞を培養する工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である。いくつかの実施形態において、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本発明は、親細胞と比較して低減された量の内因性セリンアルカリプロテアーゼ酵素（ＡｐｒＥ）および内因性細胞外中性メタロプロテアーゼ酵素（ＮｐｒＥ）の両方を変異株の細胞に産生させる遺伝子変異を含む宿主細胞を用意する工程であって、宿主細胞は、プロモーターと作動可能に結合した異種ＡＬＤＣ酵素をコードする核酸で形質転換されている、工程と、異種ＡＬＤＣ酵素の産生に好適な条件下で、形質転換された宿主細胞を培養する工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、親細胞と比較して低減された量の機能性内因性セリンアルカリプロテアーゼ酵素（ＡｐｒＥ）および内因性細胞外中性メタロプロテアーゼ酵素（ＮｐｒＥ）の両方を変異株の細胞に産生させる遺伝子変異を含む宿主細胞を用意する工程であって、宿主細胞は、変異株の細胞に、ＡＬＤＣ酵素をコードする内因性核酸配列を親細胞と比較して過剰に発現させる核酸で形質転換されている、工程と、ＡＬＤＣ酵素の産生に好適な条件下で、形質転換された宿主細胞を培養する工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である。いくつかの実施形態において、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【００７０】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、低減された量の内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｅｐｒ）をさらに有する。さらなる実施形態において、宿主細胞は、内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素（ＩｓｐＡ）および内因性バシロペプチダーゼＦ酵素（Ｂｐｒ）の一方または両方をさらに欠失している。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である。いくつかの実施形態において、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本発明は、低減された量の内因性セリンアルカリプロテアーゼ酵素（ＡｐｒＥ）、内因性細胞外中性メタロプロテアーゼ酵素（ＮｐｒＥ）、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｖｐｒ）、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｅｐｒ）、内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素（ＩｓｐＡ）および内因性バシロペプチダーゼＦ酵素（Ｂｐｒ）を有する宿主細胞を用意する工程であって、宿主細胞は、プロモーターと作動可能に結合した異種ＡＬＤＣ酵素をコードする核酸で形質転換されている、工程と、異種ＡＬＤＣ酵素の産生に好適な条件下で、形質転換された宿主細胞を培養する工程とを含む方法を提供する。
【００７２】
いくつかの実施形態において、本発明は、低減された量の内因性セリンアルカリプロテアーゼ酵素（ＡｐｒＥ）、内因性細胞外中性メタロプロテアーゼ酵素（ＮｐｒＥ）、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｖｐｒ）、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｅｐｒ）、内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素（ＩｓｐＡ）および内因性バシロペプチダーゼＦ酵素（Ｂｐｒ）を有する宿主細胞を用意する工程であって、宿主細胞は、変異株の細胞に、ＡＬＤＣ酵素をコードする内因性核酸配列を親細胞と比較して過剰に発現させる核酸で形質転換されている、工程と、ＡＬＤＣ酵素の産生に好適な条件下で、形質転換された宿主細胞を培養する工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である。いくつかの実施形態において、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本発明は、低減された量の内因性セリンアルカリプロテアーゼ酵素（ＡｐｒＥ）、内因性細胞外中性メタロプロテアーゼ酵素（ＮｐｒＥ）、内因性細胞壁関連プロテアーゼ酵素（ＷｐｒＡ）、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｅｐｒ）、内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素（ＩｓｐＡ）および内因性バシロペプチダーゼＦ酵素（Ｂｐｒ）を有する宿主細胞を用意する工程であって、宿主細胞は、プロモーターと作動可能に結合した異種ＡＬＤＣ酵素をコードする核酸で形質転換されている、工程と、異種ＡＬＤＣ酵素の産生に好適な条件下で、形質転換された宿主細胞を培養する工程とを含む方法を提供する。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本発明は、低減された量の内因性セリンアルカリプロテアーゼ酵素（ＡｐｒＥ）、内因性細胞外中性メタロプロテアーゼ酵素（ＮｐｒＥ）、内因性細胞壁関連プロテアーゼ酵素（ＷｐｒＡ）、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｅｐｒ）、内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素（ＩｓｐＡ）および内因性バシロペプチダーゼＦ酵素（Ｂｐｒ）を有する宿主細胞を用意する工程であって、宿主細胞は、変異株の細胞に、ＡＬＤＣ酵素をコードする内因性核酸配列を親細胞と比較して過剰に発現させる核酸で形質転換されている、工程と、ＡＬＤＣ酵素の産生に好適な条件下で、形質転換された宿主細胞を培養する工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である。いくつかの実施形態において、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本発明は、低減された量の内因性セリンアルカリプロテアーゼ酵素（ＡｐｒＥ）、内因性細胞外中性メタロプロテアーゼ酵素（ＮｐｒＥ）、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｖｐｒ）、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｅｐｒ）、内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素（ＩｓｐＡ）、内因性バシロペプチダーゼＦ酵素（Ｂｐｒ）および内因性細胞壁関連プロテアーゼ酵素（ＷｐｒＡ）を有する宿主細胞を用意する工程であって、宿主細胞は、プロモーターと作動可能に結合した異種ＡＬＤＣ酵素をコードする核酸で形質転換されている、工程と、異種ＡＬＤＣ酵素の産生に好適な条件下で、形質転換された宿主細胞を培養する工程とを含む方法を提供する。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本発明は、低減された量の内因性セリンアルカリプロテアーゼ酵素（ＡｐｒＥ）、内因性細胞外中性メタロプロテアーゼ酵素（ＮｐｒＥ）、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｖｐｒ）、内因性微量細胞外セリンプロテアーゼ酵素（Ｅｐｒ）、内因性主要細胞内セリンプロテアーゼ酵素（ＩｓｐＡ）、内因性バシロペプチダーゼＦ酵素（Ｂｐｒ）および内因性細胞壁関連プロテアーゼ酵素（ＷｐｒＡ）を有する宿主細胞を用意する工程であって、宿主細胞は、変異株の細胞に、ＡＬＤＣ酵素をコードする内因性核酸配列を親細胞と比較して過剰に発現させる核酸で形質転換されている、工程と、ＡＬＤＣ酵素の産生に好適な条件下で、形質転換された宿主細胞を培養する工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である。いくつかの実施形態において、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【００７７】
さらなる実施形態において、宿主細胞は、低減された量の１種以上の追加のプロテアーゼ、例えば、ａｍｐＳ、ａｐｒＸ、ｂｐｆ、ｃｌｐＣＰ、ｃｌｐＥＰ、ｃｌｐＸＰ、ｃｏｄＷＸ、ｌｏｎＡ、ｌｏｎＢ、ｎｐｒＢ、ｍａｐ、ｍｌｐＡ、ｍｐｒ、ｐｅｐＴ、ｐｅｐＦ、ｄｐｐＡ、ｙｑｙＥ、ｔｅｐＡ、ｙｆｉＴ、ｙｆｌＧ、ｙｍｆＦ、ｙｐｗＡ、ｙｒｒＮ、ｙｒｒＯ、ｙｗａＤ、または当業者に知られている他のプロテアーゼをさらに有する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である。いくつかの実施形態において、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【００７８】
いくつかの実施形態において、アセトインを製造する方法が本開示で提供される。いくつかの実施形態において、アセト乳酸を分解する方法が本開示で提供される。これらの方法は、本明細書に記載のＡＬＤＣ酵素組成物で基質を処理する工程を含む。
【００７９】
いくつかの実施形態において、ＡＬＤＣ酵素は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号８、またはそれらのいずれかの機能的断片から選択されるいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８０】
いくつかの実施形態において、発酵飲料の製造中にアセトインを製造する方法が本開示で提供される。いくつかの実施形態において、発酵飲料の製造中にアセトインを分解する方法が本開示で提供される。
【００８１】
発酵生成物
一態様において、本発明は、炭水化物含有基質の微生物による発酵により、ジアセチル低含有発酵アルコール製品を製造する方法に関する。「ジアセチル低含有」発酵アルコール製品は、本明細書で使用する場合、炭水化物含有基質を、本明細書に記載の宿主細胞、ならびに／または本明細書に記載のＡＬＤＣおよび／もしくはＡＬＤＣ誘導体組成物による発酵によって製造される発酵アルコール製品（例えば、ビール、ワイン、サイダー、ペリーおよび／または酒）であって、ジアセチル濃度が本明細書に記載の宿主細胞、ならびに／または本明細書に記載のＡＬＤＣおよび／もしくはＡＬＤＣ誘導体組成物の非存在下において同じ発酵条件（例えば、同じ温度で、同じ時間）で炭水化物含有基質を発酵させることによって製造される発酵アルコール製品と比較して低い製品を指す。ジアセチル低含有発酵アルコール製品の例としては、ジアセチル濃度が約１ｐｐｍ未満、および／またはジアセチル濃度が約０．５ｍｇ／Ｌ未満の発酵アルコール製品がある。一実施形態において、ジアセチル濃度は、約０．５ｐｐｍ未満、約０．１ｐｐｍ未満、約０．０５ｐｐｍ未満、約０．０１ｐｐｍ未満、または約０．００１ｐｐｍ未満である。一実施形態において、ジアセチル濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ未満、約０．０５ｍｇ／Ｌ未満、約０．０１ｍｇ／Ｌ未満、または約０．００１ｍｇ／Ｌ未満である。
【００８２】
麦汁（例えば、麦芽量の少ない麦汁）内容物、またはフルーツジュース（ブドウジュース、リンゴジュースまたはナシジュースなど）などの炭水化物含有基質を酵母またはその他の微生物で発酵させると、アルコール発酵に加え、様々なプロセスが起こり、例えば、非常に低濃度であっても強く不快な臭いを有するジアセチルを生成するなど、望ましくない副生物を生成することがある。したがって、ビール、ワイン、サイダー、ペリーまたは酒などのアルコール飲料は、ジアセチル含有量がある限界（例えば、いくつかのビールでの場合、約０．１ｐｐｍ）を大きく超えると、許容できない香気および風味を有し得る。
【００８３】
蒸留によりエタノールからジアセチルを分離することが難しいため、エタノールの工業生産でもジアセチルの生成は不都合である。エタノールをベンゼンとの共沸蒸留によって脱水する絶対エタノールの製造において、特有の問題が起こる。共沸蒸留中、ベンゼン層にジアセチルが蓄積して、ジアセチルとベンゼンとの混合物が生成され、共沸蒸留に使用したベンゼンの回収が困難になるおそれがある。
【００８４】
ビールの従来の醸造では、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓａｅ）またはサッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）などの好適な酵母種による麦汁で発酵させることを含む。
【００８５】
一般に従来の醸造では、発酵は、通常、二工程、すなわち、通常５〜１２日間の主発酵と、最大で１２週間を要し得る二次発酵、いわゆる熟成プロセスとで行われる。主発酵の期間中、麦汁中の炭水化物の殆どはエタノールと二酸化炭素とに転換する。熟成は、通常、残存する丈量の酵母の存在下において低温で行われる。熟成の目的は、特に望ましくない高分子量化合物を沈澱させ、望ましくない化合物をジオールなどの風味および香気に影響しない化合物に転換させるためである。例えば、ビール中のアセト酪酸とジアセチルの最終変換生成物であるブタンジオールとは、一般に、中性の感覚特性を有する化合物として報告されている。
【００８６】
いくつかの態様において、本発明は、本明細書に記載の宿主細胞、および／または本発明に記載の組成物の、ビール、ワイン、サイダー、ペリーおよび／または酒の発酵における使用に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、ビール、ワイン、サイダー、ペリーおよび／または酒の発酵または熟成期間中のアセト乳酸の分解のための、本明細書に記載の宿主細胞、および／または本明細書に記載のＡＬＤＣ組成物の使用を含む。本発明はまた、ビール、ワイン、サイダー、ペリーおよび／または酒の発酵または熟成期間中のアセト乳酸の分解のための、本明細書に記載の宿主細胞、および／または本明細書に記載のＡＬＤＣ誘導体の使用を含む。
【００８７】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、したがって、発酵プロセス、例えば、熟成の期間中またはそれに続いて、本明細書に記載の宿主細胞、および／または本明細書に記載のＡＬＤＣを含む組成物またはＡＬＤＣ誘導体で基質を処理することを特徴としている。
【００８８】
したがって、いくつかの実施形態において、アセト乳酸は酵素によりアセトインに脱カルボキシル化され、その結果、望ましくない場合にアセト乳酸からのジアセチルの生成が回避される。いくつかの実施形態において、α−アセト乳酸の転換に、他の酵素が宿主細胞および／またはＡＬＤＣと併用される。そのような酵素の例としては、限定はされないが、アセト乳酸レダクトイソメラーゼまたはイソメラーゼが挙げられる。
【００８９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の宿主細胞、ならびに／または本明細書に記載のＡＬＤＣおよび／もしくはＡＬＤＣ誘導体組成物がバッチ式発酵において通常の酵母とともに使用される。
【００９０】
酵母を遊離した状態で使用する代わりに固定した状態で使用してもよく、酵素は、発酵中または発酵に続いて（例えば、熟成中に）添加される。固定酵素はまた、発酵麦汁またはビールを通過させるカラムに維持させてもよい。酵素は酵母細胞と別に固定してもよく、酵母細胞と同時固定してもよく、また、アセト乳酸デカルボキシラーゼを使用してもよい。
【００９１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の宿主細胞、ならびに／または本明細書に記載のＡＬＤＣおよび／もしくはＡＬＤＣ誘導体組成物は、ジアセチル濃度を約１ｐｐｍ未満、約０．５ｐｐｍ未満、約０．１ｐｐｍ未満、約０．０５ｐｐｍ未満、約０．０１ｐｐｍ未満、または約０．００１ｐｐｍ未満に低減するために、ビール、ワイン、サイダー、ペリーおよび／または酒の発酵または熟成期間中に使用される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の宿主細胞、ならびに／または本明細書に記載のＡＬＤＣおよび／もしくはＡＬＤＣ誘導体組成物は、ジアセチル濃度を０．１ｐｐｍ未満に低減するために、ビール、ワイン、サイダー、ペリーおよび／または酒の発酵または熟成期間中に使用される。
【００９２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の宿主細胞、ならびに／または本明細書に記載のＡＬＤＣおよび／もしくはＡＬＤＣ誘導体組成物は、ＶＤＫを約０．１ｍｇ／Ｌ未満、約０．０５ｍｇ／Ｌ未満、約０．０１ｍｇ／Ｌ未満、または約０．００１ｍｇ／Ｌ未満に低減するために、ビール、ワイン、サイダー、ペリーおよび／または酒の発酵または熟成期間中に使用される。ＶＤＫ総量は、ジアセチルに２，３−ペンタンジオンをプラスした量を指す。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の宿主細胞、ならびに／または本明細書に記載のＡＬＤＣおよび／もしくはＡＬＤＣ誘導体組成物は、ＶＤＫ総含有量を０．１ｍｇ／Ｌ未満に低減するために、ビール、ワイン、サイダー、ペリーおよび／または酒の発酵または熟成期間中に使用される。
【００９３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の宿主細胞、ならびに／または本明細書に記載のＡＬＤＣおよび／もしくはＡＬＤＣ誘導体組成物は、ジアセチル濃度を約０．５ｍｇ／Ｌ未満、約０．１ｍｇ／Ｌ未満、約０．０５ｍｇ／Ｌ未満、約０．０１ｍｇ／Ｌ未満、または約０．００１ｍｇ／Ｌ未満に低減するために、ビール、ワイン、サイダー、ペリーおよび／または酒の発酵または熟成期間中に使用される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の宿主細胞、ならびに／または本明細書に記載のＡＬＤＣおよび／もしくはＡＬＤＣ誘導体組成物は、ジアセチル濃度を０．１ｍｇ／Ｌ未満に低減するために、ビール、ワイン、サイダー、ペリーおよび／または酒の発酵または熟成期間中に使用される。
【００９４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の宿主細胞、ならびに／または本明細書に記載のＡＬＤＣおよび／もしくはＡＬＤＣ誘導体組成物は、他のビシナルケトンを約０．１ｍｇ／Ｌ未満、約０．０５ｍｇ／Ｌ未満、約０．０１ｍｇ／Ｌ未満、または約０．００１ｍｇ／Ｌ未満に低減するために、ビール、ワイン、サイダー、ペリーおよび／または酒の発酵または熟成期間中に使用される。
【００９５】
本発明のプロセスは、ビールの醸造に関連して使用することができるだけでなく、ジアセチル濃度またはビシナルジケトンの量を低減することが望まれる好適なアルコール飲料（例えば、ワイン、酒、サイダー、ペリーなど）の製造にも好適である。いくつかの実施形態において、本発明のプロセスは、類似の利点、特に熟成中の低減およびプロセスの簡略化が達成されるワインの製造に特に使用することができる。これに関連して特に興味深いのは、いわゆるマロラクティック発酵に関連したアセト酪酸変換酵素の使用である。ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）またはペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）種などの微生物によってなされるこのプロセスは、ワインの主発酵後、製品のｐＨおよびその生物学的安定性を増大させ、かつワインの風味を高めるために行われる。さらに、そのような発酵を行うことは、それにより急速な瓶詰が可能となり、ワイナリーのキャッシュフローを実質的に改善するため、非常に望ましい。しかし、残念ながら、このプロセスは、ジアセチルによって異臭が発生するおそれがある。ジアセチルの生成はアセト乳酸変換酵素を用いて低減することができる。
【００９６】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明のプロセスは、本明細書に記載の宿主細胞、ならびに／または本明細書に記載のＡＬＤＣおよび／もしくはＡＬＤＣ誘導体組成物を使用しないプロセスと比較してジアセチル含有量が少ないアルコール飲料の製造であって、ジアセチル含有量の少ないアルコール飲料の製造に要する時間が、本明細書に記載の宿主細胞、ならびに／または本明細書に記載のＡＬＤＣおよび／もしくはＡＬＤＣ誘導体組成物を使用しないプロセスと比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％低減される製造を提供する。いくつかの実施形態において、本発明のプロセスは、本明細書に記載の宿主細胞、ならびに／または本明細書に記載のＡＬＤＣおよび／もしくはＡＬＤＣ誘導体組成物を使用しないプロセスと比較してジアセチル含有量が少ないアルコール飲料の製造であって、熟成工程が完全に除かれる製造を提供する。
【００９７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の宿主細胞、ならびに／または本明細書に記載のＡＬＤＣおよび／もしくはＡＬＤＣ誘導体組成物は、本明細書に記載の宿主細胞、ならびに／または本明細書に記載のＡＬＤＣおよび／もしくはＡＬＤＣ誘導体組成物を使用しないプロセスと比較して、発酵プロセスに要する時間が、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％低減されるように発酵プロセス（ビール、ワイン、サイダー、ペリーおよび／または酒の発酵）において使用される。
【００９８】
いくつかの実施形態において、本発明のプロセスは、本明細書に記載の宿主細胞、ならびに／または本明細書に記載のＡＬＤＣおよび／もしくはＡＬＤＣ誘導体組成物を使用しないプロセスと比較してジアセチル含有量が少ないアルコール飲料の製造であって、熟成工程が完全に除かれる製造を提供する。
【００９９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の宿主細胞、ならびに／または本明細書に記載のＡＬＤＣおよび／もしくはＡＬＤＣ誘導体組成物は、本明細書に記載の宿主細胞、ならびに／または本明細書に記載のＡＬＤＣおよび／もしくはＡＬＤＣ誘導体組成物を使用しないプロセスと比較して、発酵プロセスに要する時間が少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％低減されるように熟成またはコンディショニングプロセス（例えば、ビールの熟成またはコンディショニング）において使用される。いくつかの実施形態において、本発明のプロセスは、本明細書に記載の宿主細胞、ならびに／または本明細書に記載のＡＬＤＣおよび／もしくはＡＬＤＣ誘導体組成物を使用しないプロセスと比較してジアセチル含有量が少ないアルコール飲料の製造であって、熟成工程が完全に除かれる製造を提供する。
【０１００】
さらに、いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプロセスは、ジアセチルを含有しないか、実質的に含有しない発酵製品が得られ、それにより、蒸留工程、特に絶対エタノール、すなわち、純粋な無水エタノールを得るための共沸蒸留の場合の工程が簡略化されることから、エタノールを発酵製品として工業生産することに優位性を付与するために使用することができる。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載の１種以上の宿主細胞、ならびに／または本明細書に記載のＡＬＤＣおよび／もしくはＡＬＤＣ誘導体組成物を添加することを含む、ビール、ワイン、サイダー、ペリーおよび／または酒の製造方法を提供する。
【０１０２】
ＡＬＤＣ酵素の製造
一態様において、本発明は、本明細書に記載のＡＬＤＣ酵素の異種発現体を有する宿主細胞に関する。他の態様において、宿主細胞は、本明細書に記載のプラスミドまたは発現ベクターを含み、好ましくは、それによって形質添加されている。他の態様において、本発明は、ＡＬＤＣ酵素をコードする内因性核酸配列を親細胞と比較して過剰に発現させる核酸で形質転換されている宿主細胞に関する。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）などの細菌宿主である。いくつかの実施形態において、ＡＬＤＣ酵素は、ＡＬＤＣ酵素（例えば、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）のＡＬＤＣ）をコードし、発現する遺伝子を含有するバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株を培養することによって製造される。そのような宿主細胞の例およびそれらの培養については、ＤＫ１４９３３５Ｂに記載されている。いくつかの実施形態において、ＡＬＤＣ酵素は、ＡＬＤＣ酵素をコードし、過剰発現する遺伝子を含有するバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株を培養することによって製造される。
【０１０４】
好適な発現および／または組込み型ベクターの例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）ｓｕｐｒａ、ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ（１９８７）ｓｕｐｒａ、ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ｉｎ  Ｂｅｎｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｌａｓｕｒｅ（Ｅｄｓ．）Ｍｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．３９６−４２８、および米国特許第５，８７４，２７６号明細書に示されている。ベクターの一覧として、Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｔｒａｉｎｓ（ＦＧＳＣ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｇｓｃ．ｎｅｔ）も参照される。特に有用なベクターとしては、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよびＰｒｏｍｅｇａから得られるベクターが挙げられる。細菌細胞に使用する好適なプラスミドとしては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で複製可能なｐＢＲ３２２およびｐＵＣ１９、ならびに例えばバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ．）で複製可能なｐＥ１９４が挙げられる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での使用に好適な他の特定のベクターとしては、ｐＦＢ６、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１００、ｐＤＯＮＲＴＭ２０１、１０ｐＤＯＮＲＴＭ２２１、ｐＥＮＴＲＴＭ、ｐＧＥＭ（登録商標）３ＺおよびｐＧＥＭ（登録商標）４Ｚなどが挙げられる。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、グラム陽性菌細胞である。非限定的例として、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株（例えば、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）およびストレプトマイセス・グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕ））ｓ）およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株が挙げられる。本明細書で使用する場合、「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属」には、当業者に知られる「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」属内の全ての菌株が含まれ、例えば、限定はされないが、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・ハロドゥランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）およびバチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）が挙げられる。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属について、分類学的な再編成が継続的に行われていることは認識されている。したがって、この属が、再分類された種、例えば、限定はされないが、今日、「ゲオバチルス・ステアロサーモモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」という名前が付されているバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの生物を含むものとする。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種などのグラム陰性菌細胞である。他の実施形態において、宿主細胞は、サッカロミケス株（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）種、シゾサッカロミケス種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ピキア種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、またはカンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．）などの酵母細胞であってよい。他の実施形態において、宿主細胞は、細菌細胞または真菌細胞において、例えば欠損によって天然遺伝子が不活性化された遺伝子組み換え宿主細胞である。１つ以上の不活性化遺伝子を有する真菌宿主細胞を得ることが望ましい場合、既知の方法を使用することができる（例えば、米国特許第５，２４６，８５３号明細書、同第５，４７５，１０１号明細書および国際公報第９２／０６２０９号パンフレットに開示された方法）。遺伝子不活性化は、挿入不活化、または本来の目的で遺伝子を機能させなくする任意の他の手段で、（遺伝子が機能性タンパク質を発現することができないように）全部または一部を欠損させることによって行うことができる。他の実施形態において、宿主細胞は、プロテアーゼ欠乏株またはプロテアーゼマイナス株である。
【０１０７】
ＤＮＡコンストラクトまたはベクターの宿主細胞中への導入法としては、形質転換；電気穿孔；核微量注入；形質導入；形質移入（例えば、リポフェクション媒介性の、およびＤＥＡＥ−デキストリン媒介性の形質移入）；リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション；ＤＮＡ被覆マイクロプロジェクタイル（ＤＮＡ−ｃｏａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）による高速衝撃（ｈｉｇｈ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）；ならびにプロトプラスト融合などの手法が挙げられる。一般的な形質転換手法は当技術分野で知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ｓｕｐｒａ、ｃｈａｐｔｅｒ  ９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）ｓｕｐｒａ、およびＣａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６（１９８９）を参照）。
【０１０８】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の形質転換方法は、Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ  Ｃ．ａｎｄ  Ｊ．Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：７４１−７４６（１９６１）、および国際公開第０２／１４４９０号パンフレットなど、多くの参考文献に記載されている。
【０１０９】
一態様において、本発明は、本明細書で定義されたＡＬＤＣ酵素を単離する方法に関し、その方法は、本明細書で定義された、前記ＡＬＤＣ酵素の異種発現体を有する宿主細胞中でＡＬＤＣ酵素の合成を誘導する工程と、前記宿主細胞によって分泌された細胞外タンパク質を回収する工程と、任意選択により、ＡＬＤＣ酵素を精製する工程とを含む。一態様において、本発明は、本明細書で定義されたＡＬＤＣ酵素を単離する方法に関し、その方法は、本明細書で定義された、前記ＡＬＤＣ酵素の相同発現体を有する宿主細胞中でＡＬＤＣ酵素の合成を誘導する工程と、前記宿主細胞によって分泌された細胞外タンパク質を回収する工程と、任意選択により、ＡＬＤＣ酵素を精製する工程とを含む。さらなる態様において、本発明は、本明細書で定義されたＡＬＤＣ酵素を製造する方法に関し、その方法は、本明細書で定義された、前記ＡＬＤＣ酵素の異種発現を有する宿主細胞中でＡＬＤＣ酵素の合成を誘導する工程と、任意選択により、ＡＬＤＣ酵素を精製する工程とを含む。さらなる態様において、本発明は、本明細書で定義されたＡＬＤＣ酵素を製造する方法に関し、その方法は、本明細書で定義された、前記ＡＬＤＣ酵素の相同発現を有する宿主細胞中でＡＬＤＣ酵素の合成を誘導する工程と、任意選択により、ＡＬＤＣ酵素を精製する工程とを含む。さらなる態様において、本発明は、本明細書で定義されたＡＬＤＣ酵素を発現させる方法に関し、その方法は、本明細書で定義された宿主細胞、または当業者に知られた任意の好適な宿主細胞を得る工程と、前記宿主細胞からＡＬＤＣ酵素を発現させる工程と、任意選択により、ＡＬＤＣ酵素を精製する工程とを含む。他の態様において、本明細書で定義されたＡＬＤＣ酵素は、主要分泌タンパク質である。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、微生物からの回収量を増大するため、および／またはＡＬＤＣの安定性を高めるため、および／またはＡＬＤＣの活性を高めるため、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｂａ２＋、Ｃａ２＋およびＦｅ２＋、ならびにこれらの組み合わせなどの金属イオンがＡＬＤＣの産生中および／または産生後に培養媒体に添加される。いくつかの実施形態において、金属イオンは培養媒体に、前記金属イオンが前記媒体に約１μＭ〜約１ｍＭ、例えば、約２５μＭ〜約１５０μＭ、約４０μＭ〜約１５０μＭ、約６０μＭ〜約１５０μＭ、約２５μＭ〜約１００μＭ、約２５μＭ〜約５０μＭ、または３０μＭ〜約４０μＭの濃度で含まれるように添加される。いくつかの実施形態において、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｂａ２＋、Ｃａ２＋およびＦｅ２＋、ならびにこれらの組み合わせなどの金属イオンは、微生物からの回収量を増大するため、および／またはＡＬＤＣの安定性を高めるため、および／またはＡＬＤＣの活性を高めるため、ＡＬＤＣの産生中および／または産生後に培養媒体（発酵培地および／または熟成培地など）に添加される。いくつかの実施形態において、金属イオンは発酵培地および／または熟成培地に、前記金属イオンが前記培地に約１μＭ〜約３００μＭ、例えば、約６μＭ〜約３００μＭ、約１μＭ〜約１００μＭ、約１μＭ〜約５０μＭ、約１μＭ〜約２５μＭ、または約６μＭ〜約２５μＭの濃度で含まれるように添加される。本明細書で使用する「培養媒体」という用語は、ＡＬＤＣ産生宿主細胞などの微生物の増殖を支える培地を指す。培養媒体の例としては、例えば、主要窒素源として尿素を有し、主要炭素源としてｍａｌｔｒｉｎを含むＭＯＰｓバッファ、およびＴＳＢブロスをベースとする培地が挙げられる。本発明で使用する「発酵培地」という用語は、酵母または他の微生物によって発酵し、例えば、ビール、ワイン、サイダー、ペリーまたは酒を生成することができる炭水化物含有基質を含む培地を指す。発酵培地の例としては、麦汁およびフルーツジュース（ブドウジュース、リンゴジュースおよびナシジュース）が挙げられる。本発明で使用する「熟成培地」という用語は、酵母または他の微生物によって発酵して、例えば、ビール、ワイン、サイダー、ペリーまたは酒が生成されている炭水化物含有基質を含む培地を指す。熟成培地の例としては、一部発酵している麦汁およびフルーツジュース（ブドウジュース、リンゴジュースおよびナシジュース）が挙げられる。金属イオンが添加された培地に関連して使用される「安定性を高める」という用語は、培地に金属イオン（Ｚｎ２＋）が含まれていない場合の酵素のＡＬＤＣ活性と比較して、金属イオンが含まれていると、より長期間、そのＡＬＤＣ活性が維持されるＡＬＤＣ酵素を指す。金属イオンが添加された培地に関連して使用される「活性を高める」という用語は、培地に金属イオン（Ｚｎ２＋など）が含まれていない場合の酵素のＡＬＤＣ活性と比較して、金属イオンが含まれていると、より高いＡＬＤＣ活性を有するＡＬＤＣ酵素を指す。金属イオンが添加された培地におけるＡＬＤＣ酵素の収量に関連した「改善されている」という用語は、宿主微生物が金属���オン（Ｚｎ２＋など）の存在下にあるときに生成されるＡＬＤＣ活性が、宿主微生物が金属イオンの非存在下にあるときに生成されるＡＬＤＣ活性と比較して増大することを指す。理論に拘束されることを望むものではないが、金属イオン（Ｚｎ２＋など）は、ＡＬＤＣ酵素の安定性を高め、活性を高め、かつ／または収量を増大させるために、培養プロセス（例えば、ＡＬＤＣ生成）中および／または培養プロセス後に添加することができる。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、本発明は、金属イオンを約１μＭ〜約１ｍＭ（例えば、約２５μＭ〜約１５０μＭ、約４０μＭ〜約１５０μＭ、約６０μＭ〜約１５０μＭ、約２５μＭ〜約１００μＭ、約２５μＭ〜約５０μＭ、または３０μＭ〜約４０μＭ）の濃度で含むＡＬＤＣ産生宿主細胞用培養媒体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、金属イオンを約２５μＭ〜約１００μＭの濃度で含むＡＬＤＣ産生宿主細胞用培養媒体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、金属イオンを約２５μＭ〜約５０μＭの濃度で含むＡＬＤＣ産生宿主細胞用培養媒体を提供する。いくつかの実施形態において、金属イオンは、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｂａ２＋、Ｃａ２＋およびＦｅ２＋ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、金属イオンは、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋およびＣｏ２＋からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、金属イオンは、Ｚｎ２＋、Ｃｕ２＋およびＦｅ２＋からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、金属イオンは、Ｚｎ２＋である。硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４）は、Ｚｎ２＋イオン源の例である。硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）は、Ｍｇ２＋イオン源の一例である。硫酸マンガン（ＩＩ）（ＭｎＳＯ４）は、Ｍｎ２＋イオン源の一例である。塩化コバルト（ＩＩ）（ＣｏＣｌ２）は、Ｃｏ２＋イオン源の一例である。硫酸銅（ＩＩ）（ＣｕＳＯ４）は、Ｃｕ２＋イオン源の一例である。硫酸バリウム（ＢａＳＯ４）は、Ｂａ２＋イオン源の一例である。硫酸カルシウム（ＣａＳＯ４）は、Ｃａ２＋イオン源の一例である。硫酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＳＯ４）は、Ｆｅ２＋イオン源の一例である。いくつかの実施形態において、前記ＡＬＤＣ酵素の活性は、タンパク質１ｍｇ当たり９５０〜２５００単位の範囲である。いくつかの実施形態において、前記ＡＬＤＣ酵素の活性は、タンパク質１ｍｇ当たり１０００〜２５００単位、または１５００〜２５００単位の範囲である。本明細書で使用する「ＡＬＤＣ産生宿主細胞」という用語は、ＡＬＤＣをコードする核酸配列の発現を許容する条件下で前記宿主細胞を培養したとき、ＡＬＤＣ酵素を発現することができる宿主細胞を指す。ＡＬＤＣ酵素をコードする核酸配列は、宿主細胞に対し、異種であっても同種であってもよい。本明細書において言及する「ＡＬＤＣ産生宿主株」は、プロテアーゼ欠損株またはプロテアーゼマイナス株である。いくつかの実施形態において、ＡＬＤＣ産生宿主細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。いくつかの実施形態において、ＡＬＤＣ産生宿主細胞は、ＡＬＤＣ酵素をコードし発現する遺伝子を含むバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であり、ここで、そのＡＬＤＣ酵素は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、またはそれらのいずれかの機能的断片と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＬＤＣ産生宿主細胞は、ＡＬＤＣをコードする核酸配列を含むバチルス・サブチリス���Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であり、ここで、ＡＬＤＣをコードする前記核酸配列は、配列番号１、配列番号４、配列番号６、またはそれらのいずれかの機能的断片と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＡＬＤＣ産生宿主細胞は、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕ  ｓｂｒｅｖｉｓ）由来のＡＬＤＣをコードする遺伝子を含むバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【実施例】
【０１１２】
以下の実施例で本開示をより詳しく説明するが、特許請求の範囲の開示を決して限定しようとするものではない。添付の図面は、本開示の明細書および説明に組み込まれた一部であるとみなされることが意図されている。以下の実施例は、説明のために提示するものであり、特許請求の範囲の開示を限定するものではない。
【０１１３】
実施例１  −  アセト乳酸デカルボキシラーゼａｌｄＢの異種発現
ブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）（バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）と呼ばれることがある）のアセト乳酸デカルボキシラーゼブレビバチル（ＡＬＤＣ）ａｌｄＢ遺伝子は既に同定されており（Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９０：１７２（８）：４３１５）、その配列はＵＮＩＰＲＯＴアクセッション番号Ｐ２３６１６．１として登録されている。この遺伝子ａｌｄＢの配列を配列番号１に示す。太字および下線で強調表示したヌクレオチドはシグナルペプチドをコードするヌクレオチドである。
配列番号１は、ａｌｄＢ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【化１】
2018516076.tif 000003
配列番号６は、アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードするヌクレオチド配列の一例を示す  −  太字および下線で強調表示したヌクレオチドはシグナルペプチドをコードするヌクレオチドである。
【化２】
2018516076.tif 000004
【０１１４】
ａｌｄＢ遺伝子でコードされる酵素前駆体を配列番号２に示す。ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮによって予測されたように、このタンパク質は、Ｎ末端に２４アミノ酸長のシグナルペプチドを有する（Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２００７）２：９５３−９７１）。このシグナルペプチド配列は、配列番号２で下線が引かれ、太字で示されている。シグナルペプチドの存在は、このアセト乳酸デカルボキシラーゼが分泌酵素であることを示している。予測された完全にプロセッシングされた成熟鎖の配列（ａｌｄＢ、２６１アミノ酸）を配列番号３に示す。
配列番号２は、アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ＡＬＤＣ）ａｌｄＢのアミノ酸配列を示す。
【化３】
2018516076.tif 000005
配列番号７は、アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ＡＬＤＣ）前駆体ａｌｄＢのアミノ酸配列の一例を示す  −  シグナルペプチド配列には下線が引かれ、太字で示されている。
【化４】
2018516076.tif 000006
配列番号３は、成熟アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ＡＬＤＣ）ａｌｄＢ（２６１アミノ酸）の予測されたアミノ酸配列を示す。
【化５】
2018516076.tif 000007
配列番号８は、成熟アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ＡＬＤＣ）ａｌｄＢ（２６１アミノ酸）の予測されたアミノ酸配列の一例を示す。
【化６】
2018516076.tif 000008
【０１１５】
アセト乳酸デカルボキシラーゼ酵素（ＡＬＤＣ）をコードするａｌｄＢ遺伝子を、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内で、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥプロモーター、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥシグナルペプチド配列、成熟ａｌｄＢおよびＢＰＮ’ターミネーターからなる発現カセットを使用して生成した。このカセットをｐＢＮベースの複製シャトルベクターにクローニングし（Ｂａｂｅ’ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：１１７−１２４）、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株に形質転換した。
【０１１６】
ａｌｄＢ遺伝子を含有するｐＢＮベクター（ｐＢＮ−Ｂｂｒｅｖ−ｓｓｏＵ）のマップを図１に示す。
【０１１７】
ａｌｄＢを生成するために、１５ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブ内において、ｐＢＮ−ａｌｄＢを含むバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株の形質転換細胞を、ネオマイシン１０ｐｐｍを含むＴＳＢ（培養液）中で１６時間培養し、３００μｌのこの前培養物を、ネオマイシン１０ｐｐｍを添加した３０ｍＬの培養媒体（後述）を入れた５００ｍＬのフラスコに加えた。フラスコを３３℃で２４、４８および７２時間にわたり１８０ｒｐｍの定速で回転混合させながらインキュベートした。１４５００ｒｐｍで２０分間、コニカルチューブ内で遠心分離することにより、培養物を収穫した。培養物の上澄み液は、タンパク質の決定および分析に使用した。培養媒体は、ＭＯＰｓバッファをベースとし、尿素を主な窒素源、グルコースを主な炭素源とし、頑強な細胞増殖のために１％ソイトンを添加した強化準合成培地とした。
【０１１８】
ｐＢＮ−ａｌｄＢプラスミド中におけるａｌｄＢ遺伝子のヌクレオチド成熟配列を配列番号４に示す。
【化７】
2018516076.tif 000009
【０１１９】
ｐＢＮ−ａｌｄＢプラスミドで発現するａｌｄＢ前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号５に示す。
【化８】
2018516076.tif 000010
【０１２０】
実施例２  −  アセト乳酸デカルボキシラーゼａｌｄＢの異種発現
ブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）株由来のａｌｄＢ遺伝子は、アセト乳酸デカルボキシラーゼ酵素（ＡＬＤＣ）をコードするが、この遺伝子を、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥプロモーター、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥシグナルペプチド配列、成熟ａｌｄＢおよびＢＰＮ’ターミネーターからなる組み込み発現カセットを使用してバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内で産生させた。このカセットを、発現カセットと相同組み換えによりバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に導入したａｌｄＢ発現カセットに関して先頭を合わせた配置方向でクローニングした。
【０１２１】
ａｌｄＢ遺伝子を含有するベクター（ＲＩＨＩ−ａｌｄＢ）のマップを図２に示す。
【０１２２】
ａｌｄＢを生成するために、ａｌｄＢ発現カセットを含むバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株の形質転換細胞を、１５ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブ内の、３００ｐｐｍのベータ−クロロ−Ｄ−アラニン（ＣＤＡ）を含むＴＳＢ（培養液）中で５時間培養し、この前培養物３００μｌを、３００ｐｐｍのＣＤＡおよび５０μＭのＺｎ２＋を添加した３０ｍＬの培養媒体（後述べ）を入れた５００ｍＬのフラスコに加えた。フラスコを３３℃で２４、４８および７２時間にわたり１８０ｒｐｍの定速で回転混合させながらインキュベートした。１４５００ｒｐｍで２０分間、コニカルチューブ内で遠心分離することにより、培養物を収穫した。培養物の上澄み液は、タンパク質の決定および分析に使用した。培養媒体は、ＭＯＰｓバッファをベースとし、尿素を主な窒素源、マルトリン（マルトデキストリンおよびコーンシロップの固形物）を主な炭素源とする強化準合成培地とした。
【０１２３】
実施例３  −  タンパク質の決定法
Ｓｔａｉｎ  Ｆｒｅｅ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎによるタンパク質の決定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびＧｅｌ  Ｄｏｃ（商標）ＥＺイメージングシステムを用いた濃度測定により、タンパク質を定量した。この分析で使用した試薬：濃縮（２×）Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号１６１−０７３７）；２６−ウェルＸＴ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号３４５−０１２５）；タンパク質マーカー「Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ」（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号１６１−０３６３）；タンパク質標準ＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２３２０８）およびＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＬＣ  ６０６０。分析は以下のように行った：９６ウェル−ＰＣＲプレート中で、５０μｌの希釈酵素試料を、２．７ｍｇのＤＴＴを含有する５０μＬの試料バッファと混合した。プレートをＢｉｏ−Ｒａｄ製のＭｉｃｒｏｓｅａｌ‘Ｂ’Ｆｉｌｍで密封し、ＰＣＲ装置に入れ、７０°Ｃまで１０分間加熱した。その後、容器をランニングバッファで満たし、ゲルカセットをセットした。次いで、１０μＬの各試料および標準（０．１２５〜１．００ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）をゲル上に置き、５μＬのマーカーを加えた。その後、２００Ｖで４５分間電気泳動を行った。電気泳動に続き、ゲルを水で３回、５分間濯ぎ、その後、Ｓａｆｅｓｔａｉｎ中で終夜染色し、最後に水で脱染した。その後、ゲルをＩｍａｇｅｒに移した。各バンドの強度計算にＩｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェアを使用した。標準試料のタンパク質の量を知ることにより、検量線を作ることができる。試料の量は、バンド強度および検量線から決定することができる。以下の実施例で示す分析に使用するａｌｄＢアセト乳酸デカルボキシラーゼ酵素の試料は、タンパク質定量法を用いて調製した。
【０１２４】
ＭＳ−ＮおよびＣ末端アミノ酸決定法によるＡｌｄＢ配列の同定
配列確認の準備として、単離したａｌｄＢ末端切断変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、後に説明するようにＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。ＮおよびＣ末端の決定を含めた配列確認の準備として、ａｌｄＢ酵素試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのタンパク質バンドに一連の化学処理を施した。個々の工程間で、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水、５０重量％エタノールおよび絶対エタノールをそれぞれ使用してゲル片を洗浄し、収縮させた。タンパク質をＤＴＴ／ヨードアセトアミド処理により還元／アルキル化した。リシンの側鎖のアセチル化を防ぐために、グアジニン化工程を実施し、リシンをホモアルギニンへと変換した。スルホ−ＮＨＳ−酢酸（酢酸スルホスクシンイミジル）を使用するアセチル化反応は、タンパク質のＮ−末端残基のみを修飾する。４０体積％１８Ｏ水：６０体積％１６Ｏ水、およびタンパク質の消化に使用するタンパク質分解酵素（トリプシンおよびα−キモトリプシン）を含有するバッファでゲル片を膨潤させた。ペプチドの同位体パターンから明らかなように、得られたペプチドは、元の１６Ｏを維持しているカルボキシル末端を除いて、１８Ｏと１６Ｏとの混合物を含有するであろう。Ｎ末端タンパク質由来のペプチドは、単にアセチル化されたペプチドとして生成するであろう。消化後、５重量％ギ酸およびアセトニトリルを用いてゲル片からペプチドを抽出し、次いで凍結乾燥させ、０．１重量％ＴＦＡに再溶解させた。消化生成物を分離（Ｃ１８カラム）し、Ｐｒｏｘｅｏｎ  ｎａｎｏ−ＬＣシステム、続いてＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）高分解能質量分析計で分析し、ペプチドのＭＳ／ＭＳフラグメントスペクトルおよびペプチドの同位体パターンからアミノ酸配列を推定した（Ｘｃａｌｉｂｕｒ  ２．０  ＳＲ２ソフトウェアを使用）。
【０１２５】
この分析に基づき、上記のアセチル化および１８Ｏ−ラベル法により、単離された完全長タンパク質のＮ末端はＡ［２５］で始まることが確認され（配列番号２により）、また単離された完全長タンパク質のＣ−末端はＫ［２８５］位で終わることが確認された（配列番号２により）（表１を参照）。成熟ａｌｄＢのＮ−末端位Ａ［２５］は、遺伝子転写産物のＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮシステム（Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７），Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２：９５３−９７１）に設定した、Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ３．０プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）による決定で予想されたシグナルペプチドの開裂と一致する。異なるＮおよびＣ末端切断変異体をさらに同定し、配列番号２におけるそれらの個々のＮおよびＣ末端の位置を表１に示す。
【０１２６】
【表１】
2018516076.tif 000011
【０１２７】
実施例４  −  活性分析法
α−アセト乳酸デカルボキシラーゼの分光光度分析
α−アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ＡＬＤＣ）はα−アセト乳酸のアセトインへの脱カルボキシル化反応を触媒する。反応生成物のアセトインは、比色分析により定量化することができる。α−ナフト−ルおよびクレアチンと混合したアセトインは、ＯＤ５２２ｎｍで特徴的な赤色吸収を示す。ＯＤ５２２ｎｍおよびアセトイン検量線に基づいてＡＬＤＣ活性を算出した。分析は以下のように行った：１００μＬのエチル−２−アセトキシ−２−メチルアセトアセテート（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号２２０３９６）と３．６ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＯＨとを１０℃で１０分間混合することにより、２０ｍＭのアセト乳酸基質を調製した。２０ｍｌの５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）を添加し、ｐＨをｐＨ６．０に調節し、５０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．０）により体積を２５ｍｌに調節した。８０μＬの２０ｍＭアセト乳酸基質を、５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、０．６Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＢＲＩＪ３５および０．０１％ＢＳＡで希釈した２０μＬの酵素試料と混合した。基質／酵素混合物を３０℃で１０分間インキュベートした。その後、１６μＬの基質／酵素混合物を２００μＬの１Ｍ  ＮａＯＨ、１．０％α−ナフトール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号３３４２０）および０．１％クレアチン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ３６３０）中に移した。基質／酵素／発色試薬混合物を３０℃で２０分間インキュベートし、その後ＯＤ５２２ｎｍを読み取った。ＡＬＤＣ活性の１単位を、この分析条件下で毎分１μモルのアセトインを生成する酵素の量と定義する。
【０１２８】
実施例５  −  バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の各種プロテアーゼ欠損株におけるａｌｄＢの発現分析
バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるａｌｄＢ遺伝子の組み換えタンパク質発現に適した宿主を同定するために、種々の数のプロテアーゼ遺伝子をノックアウトした、３種の異なる株を試験した（２−欠損、５−欠損および７−欠損）。本明細書で使用する「ノックアウトされた」という用語は、遺伝子がノックアウトされていない親株と比べて遺伝子の発現がないか、もしくは低減するような、および／またはその遺伝子によってコードされるポリペプチドの量がゼロかもしくは減少するような遺伝子の不活性化を指す。遺伝子は、例えば、遺伝子もしくはその一部または調節要素（プロモーターなど）を欠損させることにより、または遺伝子もしくは調節要素（プロモーターなど）の少なくとも一部に配列を挿入することにより不活性化し得る。本明細書で使用する「２−欠損」という用語は、２つのプロテアーゼ遺伝子をノックアウトしたバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を指す。本明細書で使用する「５−欠損」という用語は、５つのプロテアーゼ遺伝子をノックアウトしたバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を指す。本明細書で使用する「７−欠損」という用語は、７つのプロテアーゼ遺伝子をノックアウトしたバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を指す。本明細書で使用する「５−欠損」株は「２−欠損」株から得られ、したがって、５−欠損株は、「２−欠損」で欠損した遺伝子と同じ２つのプロテアーゼ遺伝子と、別の３つのプロテアーゼ遺伝子とが欠損している。本明細書で使用する「７−欠損」株は「５−欠損」株から得られ、したがって、７−欠損株は、「５−欠損」で欠損した遺伝子と同じ５つのプロテアーゼ遺伝子と、別の２つのプロテアーゼ遺伝子（すなわち、ｖｐｒおよびｗｐｒＡ）とが欠損している。ノックアウトし得るプロテアーゼ遺伝子の例としては、ｖｐｒ、ｗｐｒＡ、Ｅｐｒ、ＩｓｐＡ、Ｂｐｒ、ＮｐｒＥ、ＡｐｒＥ、ａｍｐＳ、ａｐｒＸ、ｂｐｆ、ｃｌｐＣＰ、ｃｌｐＥＰ、ｃｌｐＸＰ、ｃｏｄＷＸ、ｌｏｎＡ、ｌｏｎＢ、ｎｐｒＢ、ｍａｐ、ｍｌｐＡ、ｍｐｒ、ｐｅｐＴ、ｐｅｐＦ、ｄｐｐＡ、ｙｑｙＥ、ｔｅｐＡ、ｙｆｉＴ、ｙｆｌＧ、ｙｍｆＦ、ｙｐｗＡ、ｙｒｒＮ、ｙｒｒＯおよびｙｗａＤをコードする遺伝子が挙げられる。「ノックアウトされた」という用語は、「破壊された」または「欠損した」という用語と互換的に使用し得る。遺伝子［配列番号４の］をｐＢＮ−ｓｓｏＵ発現ベクターに挿入し、実施例１に記載のように継時的に試料を取り出した。酵素試料を試料バッファ中で凍結させて、分解がさらに進まないよう制限し、ａｌｄＢ中に芳香族残基が存在しないことから、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色を使用して、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により全試料を一括して分析した（実施例３も参照）。２−、５−および７−欠損プロテアーゼ株におけるａｌｄＢ発現体のＳＤＳ−ｐａｇｅを、醗酵時間２４、４８および７２時間の試料のそれぞれについて図３に示す。完全長ａｌｄＢ（ゲル中で約３５ｋＤａ）として、またはその切断変異体（ゲル中で２８〜３５ｋＤａ）として同定されたバンドには、ゲル上にマークを付している。ａｌｄＢ変異体を、実施例３の方法に記載したＭＳ配列決定���より同定した。２−欠損プロテアーゼ株のａｌｄＢ発現体に顕著な分解が観察され、醗酵過程で完全長タンパク質は検出されず、２８および３０ｋＤａの分子量の切断生成物が存在した。５−欠損株でもＡｌｄＢ切断生成物が観察されたが、醗酵開始時（２４および４８時間）に完全長タンパク質が存在し、切断生成物は、２−欠損株の切断生成物と比較してより大きかった（ゲル中で３２〜３５ｋＤａ）。完全長タンパク質から２つの主要な切断生成物への転換は、５−欠損株の醗酵過程の２４時間から７２時間にかけて進行するようと思われる。７−欠損プロテアーゼ株におけるａｌｄＢ発現体は、醗酵の全過程を通して完全長ａｌｄＢタンパク質のみを生成していることが観察され、切断生成物は検出されなかった。
【０１２９】
（実施例４）に記載したように、醗酵試料からＡＬＤＣ活性を決定し、これを表２に示す。２−欠損および５−欠損株では、活性は４８時間後にピークを示し、その後、７２時間後に低下した。７−欠損株では、ａｌｄＢ発現体の活性は醗酵期間を通して増加を続けた。７２時間後に５−欠損株が最大の活性（６５８Ｕ／ｍＬ）を示し、７−欠損株（５３８Ｕ／ｍＬ）および２−欠損株（６１Ｕ／ｍＬ）が続いた。
【０１３０】
【表２】
2018516076.tif 000012
【０１３１】
Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  ＬａｂＴＭＳｏｆｔｗａｒｅ、ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使用し、標準としてウシ血清アルブミンを用い、発現したａｌｄＢタンパク質の濃度を定量し、完全長および切断生成物の総和としてａｌｄＢタンパク質の濃度を計算した（図３に示す）。ａｌｄＢタンパク質は、２−欠損および５−欠損では発酵４８時間まで増加し、７−欠損株では醗酵中に増加を続け、醗酵７２時間後に最大になった。醗酵７２時間後、ａｌｄＢ濃度は、それぞれ２−欠損株で０．３２ｍｇ／ｍＬ、５−欠損株で１．０９ｍｇ／ｍＬ、７−欠損株で０．６８ｍｇ／ｍＬであった。
【０１３２】
【表３】
2018516076.tif 000013
【０１３３】
ＡＬＤＣの比活性を計算し、表４に示す。比活性は全ての株で醗酵期間を通して減少を続ける。全ての時点で、５−欠損株および２−欠損株と比べて７−欠損株は、観察された比活性が最大であった。醗酵７２時間後の２−、５−および７−欠損株のＡＬＤＣ比活性は、１８８、６０２および７９６Ｕ／ｍｇであった。
【０１３４】
【表４】
2018516076.tif 000014
【０１３５】
５−欠損株の醗酵初期および７−欠損株からの物質に観察される高比活性（≧８００Ｕ／ｍｇ）は、試料中の完全長タンパク質の相対的な量（表４参照）と相関があり、ａｌｄＢ切断生成物が効果のより低いａｌｄＢ酵素変異体を構成していることを明確に示唆している。これは、７−欠損株でさらに欠損した２つのプロテアーゼ、すなわち細胞外セリンプロテアーゼ（ｖｐｒ）および細胞壁プロテアーゼ（ｗｐｒＡ）がａｌｄＢ酵素の発現に重要な役割を果たしていることを示唆している。
【０１３６】
【表５】
2018516076.tif 000015
【０１３７】
実施例６  −  ２−欠損、５−欠損および７−欠損バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株酵素のプロテアーゼスポットプレートアッセイ
カゼインスポットプレートアッセイの原理は、カゼインプレート上のハロー形成により、プロテアーゼ活性／加水分解を観察することである。
【０１３８】
バッファ：１００ｍＭのＭｃｌｌｗａｉｎｅ、ｐＨ６．０（２２．４８ｇのＮａ２ＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏおよび７．７４ｇのＣ６Ｈ８Ｏ７・Ｈ２Ｏを秤量し、１０００ｍｌのｄｄＨ２Ｏに溶解）、および０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファ、ｐＨ５．６０（７．４６ｇの無水酢酸ナトリウムを８００ｍｌの蒸留Ｈ２Ｏに溶解する。酢酸でｐＨを５．６０に調節する。１０００ｍｌになるまで満たし、必要に応じてｐＨを調節する）。
【０１３９】
プレート：２％カゼインおよび２％アガロースを（別々に）ＭｃＩｌｗａｉｎｅバッファに懸濁させ、両方の溶液をマイクロ波オーブンで約５分間加熱する。それらを穏やかに混合する（温度が約７０℃の場合）。約２０〜３０ｍｌをペトリ皿に注ぎ、冷やしておく。
【０１４０】
内径１ｍｍの小さｉ穴をゲルに穿ち、５μｌの酵素溶液を穴に入れ、プレートを４０℃でインキュベートした。カゼインゲル中のハローは時間の関数として形成される。比較のため、穴の１つにバッファのみのブランク液を添加した。ポジティブコントロールとして、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の中性プロテアーゼｎｐｒＥ（ＥＣ．３．４．２４．２８）を使用した。１ｇのｎｐｒＥ（Ｖｅｒｏｎ  Ｗ）試料を１０ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．６）中で希釈し、１０分間混合した。その後、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ａにより試料をろ過し、５μｌのｎｐｒＥ酵素溶液をプレートに移した。
【０１４１】
２−欠損、５−欠損および７−欠損株のａｌｄＢを含むカゼインスポットプレートを４０℃で２日間インキュベーションした後の結果を図４に示す。ポジティブコントロールおよび２−欠損株のａｌｄＢには明確なハロー形成が見られる。５−欠損および７−欠損株では、前者で非常にかすかなハロー形成が見られ、後者ではハロー形成は見られなかった。
【０１４２】
１０日間のインキュベーション後の結果では、２−欠損株からのものにおいて強いハロー形成、５−欠損株からのものにおいて小さいハローが見られ、７−欠損株からのものにはハローが見られない。これは、２−欠損株酵素でプロテアーゼ活性が最も高く、プロテアーゼのノックアウト順に、５−欠損株酵素および７−欠損株酵素で低下することを明確に示唆するものである（予想通り）。
【０１４３】
実施例７  −  ａｌｄＢによるビール醗酵時のジアセチルおよび２，３−ペンタンジオンの低減
この分析の目的は、種々のアセト乳酸デカルボキシラーゼ変異体の、１４℃、７日間の醗酵でのジアセチルおよび２，３−ペンタンジオン（ビシナルジケトン、ＶＤＫ）の生成を抑制する能力を試験することであった。
【０１４４】
ピュアモルト醸造酒の分析
１１００ｇのＭｕｎｔｏｎ製Ｌｉｇｈｔ  Ｍａｌｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｂａｔｃｈ  ＸＢ  ３５１８９、有効期限２０１４年５月２４日）抽出物を３０００ｍｌの温水道水に溶解した（４５℃）。液体が均質になるまで、このスラリーを約１０分間撹拌し、２．５Ｍ硫酸でｐＨを５．２に調節した。スラリーにＨｏｐｆｅｎｖｅｒｅｄｌｕｎｇ、Ｓｔ．Ｊｏｈａｎｎから入手したビターホップを１０ペレット加えた：アルファ酸含有量１６．０％（ＥＢＣ７．７  ０規定ＨＰＬＣ分析、２０１３年１０月１日）、その後、５００ｍｌのブルーキャップボトル（ｂｌｕｅ−ｃａｐ  ｂｏｔｔｌｅ）に分割し、１時間沸騰させることによって確実にタンパク質を沈殿させ、潜在的細菌汚染を回避した。最終の麦汁の初期比重は１０４８（すなわち１２°プラート）であった。ろ過した麦汁２００ｇを５００ｍｌのコニカルフラスコに加え（醗酵容器；ＦＶ）、その後、１３℃に冷却した。各コニカルフラスコに０．５％の最近製造された酵母、Ｗ３４／７０（Ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ）を加えた（麦汁２００ｇ当たり、酵母１．０ｇ）。類似のＡＬＤＣ活性となるよう酵素を加えた（０．０４Ｕ／ｍＬ−麦汁、麦汁２００ｇ当たり８ＡＬＤＣ単位）。酵素を加えないコントロール醗酵では、酵素試料の量に対応する量の脱イオン水を加えた。
【０１４５】
研究室の標準の試験条件で、すなわちオービタルインキュベーター内で１５０ｒｐｍの穏やかな撹拌を行いながら、１４℃で５００ｍｌコニカルフラスコ内の麦汁試料を醗酵させた。２４時間で重量減少が０．２５ｇ未満になれば、醗酵温度を７℃に下げた。トータルで８日後に醗酵を停止させた。ジアセチルおよび２，３−ペンタンジオンの分析のために、１日に２回、好ましくは１１〜１４時間の間隔で１４ｍｌの試料を採取し、醗酵の終了時には１日に１試料のみ採取した。採取前に酵母を沈降させ、各試料を１０℃で１０分間冷却し、その後、８℃で１０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離を行い、全ての残留酵母を沈殿させた。この上澄み液を酵母から分離し、ＧＣ分析用試料に試料１ｍｌ当たり０．５ｇのＮａＣｌを加えた。このスラリーをヘッドスペースバイアルに移し、６５℃で３０分間の熱処理後、質量スペクトル検出器を備えたガスクロマトグラフィー（ＧＣＭＳ）により、ジアセチルおよび２，３−ペンタンジオンを分析した。
【０１４６】
分析は、ＣｏｍｂｉＰＡＬヘッドスペースオートサンプラーならびにＭＳＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎデータ収録および分析ソフトウェアを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０Ｎ／５９７３Ｎ  ＧＣで行った。７０℃で１０分間、試料を平衡化させた後、試料上部の気相５００μｌをＪ＆Ｗ  １２２−０７６３  ＤＢ−１７０１カラム（６０ｍ×内径０．２５ｍｍ×１μｍ）に注入した。注入温度を２６０℃とし、２ｍｌ／ｍｉｎの一定のヘリウム流量でシステムを操作した。オーブン温度は、５０℃（２分間）、１６０℃（２０℃／ｍｉｎ）、２２０℃（４０℃／ｍｉｎ）とし、２分間保持した。ＭＳ検出は、選択したイオンでスプリット比５：１の５００μＬにおいて行った。全ての試料について２度行い、ジアセチルまたは２，３−ペンタンンジオンを加えた水道水を使用して標準を調製した。化合物の濃度は、次式で算出される：
【数１】
2018516076.tif 000016
式中、
ＲＦは酢酸の応答係数であり、
Ａｒｅａは酢酸のＧＣ面積であり、
Ｗｓ使用した試料の量（単位：ｍＬ）である。
【０１４７】
ジアセチルの定量限界は０．０１６ｍｇ／Ｌ、２，３−ペンタンジオンの定量限界は０．０１２ｍｇ／Ｌと決定された。
【０１４８】
ＡＬＤＣ酵素の添加が真正醗酵度（ＲＤＦ）および生成したアルコールの体積に影響を及ぼさなかったことの確認のために、Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ（ＤＭＡ  ５０００）を使用し、Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｂｒｅｗｉｎｇ，２３．８５８０−Ｂ２８に従ってＲＤＦを測定し、Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｂｒｅｗｉｎｇ，２３．８５８０−Ｂ２８によりアルコールを測定した。
【０１４９】
真正発酵度（ＲＤＦ）は、下記式により算出することができる：
【数２】
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式中、ＲＥ＝真正エキス濃度＝（０．１８０８×ｏＰｉｎｉｔｉａｌ）＋（０．８１９２×ｏＰｆｉｎａｌ）であり、ｏＰｉｎｉｔｉａｌは醗酵前の標準化麦汁の比重であり、ｏＰｆｉｎａｌはプラート度で表した醗酵麦汁の比重である。
【０１５０】
これに関連して、真正発酵度（ＲＤＦ）は比重とアルコール濃度とから決定した。
【０１５１】
Ｂｅｅｒ  Ａｌｃｏｌｙｚｅｒ  ＰｌｕｓおよびＤＭＡ  ５０００比重計（両方ともＡｎｔｏｎ  Ｐａａｒ、Ｇｒａｔｚ、Ａｕｓｔｒｉａより入手）を使用し、醗酵試料について比重およびアルコール濃度を決定した。これらの測定に基づき、下記式より真正発酵度（ＲＤＦ）を算出した：
【数３】
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式中、Ｅ（ｒ）はプラート度（°Ｐ）で表した真正エキス濃度であり、ＯＥは°Ｐを単位とする原麦汁濃度である。
【０１５２】
バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のそれぞれ２−欠損、５−欠損および７−欠損株のａｌｄＢを添加することにより、１４℃、７日間の醗酵におけるジアセチルおよび２，３−ペンタンジオン（ビシナルジケトン、ＶＤＫ）の生成を抑制する能力を調べた。３回の別々の醗酵を行い、上記のようにしてＶＤＫの生成を分析した。酵素を含む醗酵を酵素無添加のコントロールと常に比較した。比較のため、ＶＤＫ含有量（ジアセチルおよび２，３−ペンタンジオンの和と定義される）の計算値を、酵素を含まないコントロール試料で得られた最大値に対して正規化（観察された絶対最大が１．４８〜２．７６ｍｇＶＤＫ／Ｌと変動するからである）し、結果を図５に示す。コントロールと比べると、３種のａｌｄＢ酵素全てが醗酵中のＶＤＫの生成を抑制した。しかしながら、約４０時間後に形成されるＶＤＫのピークを検討すると、明らかに酵素の作用が異なることがわかる。形成されたＶＤＫピークにおける相対抑制率は、２−欠損、５−欠損および７−欠損株のａｌｄＢでそれぞれ２２．０、２５．６および６２．７％であった。さらに、ＶＤＫレベルをジアセチルのフレーバー閾値である０．１ｍｇ／ｍＬ未満より低くするのに要する醗酵時間は、２−欠損、５−欠損および７−欠損株のａｌｄＢを含有する醗酵で、それぞれ約１３８、１６３および９７時間であることが観測された。併せると、ビール醗酵中のＶＤＫの抑制に関するＡＬＤＣの性能は、７−欠損株で生成されたａｌｄＢで最大であり、５−欠損および２−欠損株のａｌｄＢではそれより低いようである。
【０１５３】
本発明の好ましい実施形態を本明細書で示し、説明してきたが、当業者には、そのような実施形態が例示のためにのみ提示されていることは明らかであろう。今や、当業者には、本発明から逸脱することなく、非常に多くの変形形態、変化形態および置換形態が想到されるであろう。本明細書に記載した本発明の実施形態に対する各種代替形態が、本発明を実施するにあたり使用され得ることは理解されるべきである。以下の請求項は、本発明の範囲を定義するものであり、これらの請求項の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの均等物は、それらの請求項に包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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