(57)【要約】  本明細書には、老化メラノサイトの製造方法と、製造方法によって製造された老化細胞、及び前記老化細胞を用いて老化改善又は皮膚美白用物質をスクリーニングする方法が開示される。前記細胞を紫外線刺激の累積による細胞老化現象と色素沈着機転を研究するのに用いることができる。特に、老化改善と皮膚美白の効果を併せ持つ物質を選別することができるため有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
老化したメラノサイトを製造する方法であって、
当該方法は、
紫外線を、１０〜３０ｍＪ／ｃｍ２の強さで、１〜１２回継代培養したヒト初代メラノサイト（ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）に２回以上照射する段階を含む、老化したメラノサイトの製造方法。
【請求項２】
前記紫外線が照射されたメラノサイトを２４時間以上培養させる段階をさらに含む、請求項１に記載の老化したメラノサイトの製造方法。
【請求項３】
前記紫外線が照射されたメラノサイトを７日以上培養させる、請求項２に記載の老化したメラノサイトの製造方法。
【請求項４】
前記紫外線は、紫外線Ｂである、請求項１に記載の老化したメラノサイトの製造方法。
【請求項５】
前記紫外線の強さは、１５〜２５ｍＪ／ｃｍ２である、請求項１に記載の老化したメラノサイトの製造方法。
【請求項６】
前記紫外線の照射は、１８〜３０時間置きに実施する、請求項１に記載の老化したメラノサイトの製造方法。
【請求項７】
前記紫外線の照射は、２回実施する、請求項１に記載の老化したメラノサイトの製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか一項に記載の方法によって製造された、分離された、老化したメラノサイト。
【請求項９】
請求項１に記載の細胞に、皮膚老化改善用又は皮膚美白用候補物質を処理する段階；及び前記候補物質の処理前後の老化指標又は美白指標を検出する段階を含む、皮膚老化改善用又は皮膚美白用物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記候補物質の処理後における老化指標又は美白指標の発現量が、候補物質を処理していない対照群に比べて減少又は増加すると、皮膚老化改善用又は皮膚美白用物質と決める段階をさらに含む、請求項９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記老化指標及び美白指標の発現量がいずれも減少又は増加すると、皮膚老化改善と皮膚美白の効果とを併せ持つ物質と決める、請求項１０に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記老化指標は、β-ガラクトシダーゼ（β-ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）、ｐ１６、ｐ２１、及びｐ５３からなる群から選択された一つ以上である、請求項９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記美白指標はメラニンである、請求項９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
請求項８に記載の細胞；及び
指示書を含み、
前記指示書には、候補物質の処理前後の老化指標又は美白指標を測定して、発現量が、候補物質の処理後において候補物質を処理していない対照群に比べて減少又は増加した場合、皮膚老化改善用又は皮膚美白用物質と判断する内容を含む、皮膚老化改善用又は皮膚美白用物質のスクリーン用キット。
【請求項１５】
前記細胞は、冷凍保存又は担体保存した状態のものである、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記老化指標は、β-ガラクトシダーゼ（β-ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）、ｐ１６、ｐ２１、及びｐ５３からなる群から選択された一つ以上である、請求項１４に記載のキット。
【請求項１７】
前記美白指標は、メラニンである、請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書には、繰り返しの紫外線への露出及び一定期間の培養による色素形成細胞の老化現象の研究及び老化性色素沈着の研究に用いることができる老化色素形成細胞を製造する方法、その方法によって製造された老化したメラノサイト細胞と、その細胞を用いて老化改善又は皮膚美白用物質をスクリーニングする方法が開示される。
【背景技術】
【０００２】
近年、生活水準の向上につれ、現代人は健康な身体の保持に加えて健康な皮膚の保持にも多くの関心を傾けている。したがって、皮膚の美容や皮膚老化改善に関する関心が高まってきている。
【０００３】
皮膚は、人体における最も大きな器官であって、人体の全体積の略１６％を占め、外部環境と直に接しており、且つ人体中へ侵入しようとする致命的な多くの有害因子、例えば、温度、湿度、及び紫外線などから人体を保護する重要な保護膜の役割を担う。しかし、各種の汚染物質、強い紫外線のような外部環境によって皮膚細胞が損傷を受け、細胞増殖が正常になされなくなることで、皮膚にしわ、弾力損失及び角質化、不規則な色素沈着などが発生する。
【０００４】
皮膚老化は、自然老化（又は、内因性老化）と外因性老化とに大別され、自然老化は遺伝的な要素に影響を受けることから人為的な調節が難しいのに対し、外因性老化は環境的な要素に影響を受けることから人為的な調節が比較的容易である。代表的な外因性老化因子としては、紫外線、活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）及びストレスなどが知られている。
【０００５】
したがって、近年、外因性老化を改善するための方法が活発に研究されており、特に老化の防止又は改善のための物質を究明するための努力が続いている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１４−５２０１６６号公報
【特許文献２】特開２０１４−１１２０７３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一側面において、本発明の目的は、老化性色素沈着の研究に用いることができる老化した色素形成細胞（メラノサイト）を製造する方法を提供することである。
【０００８】
他の側面において、本発明の目的は、繰り返しの紫外線への露出及び一定期間の培養によって得られた老化したメラノサイトを提供することである。
【０００９】
他の側面において、本発明の目的は、メラノサイトの老化を誘導して老化改善又は美白効果のある物質をスクリーニングする方法を提供することである。
【００１０】
他の側面において、本発明の目的は、メラノサイトの老化を誘導して老化改善効果と美白効果とを併せ持つ物質をスクリーニングする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一側面において、本発明は、紫外線を、１０〜３０ｍＪ／ｃｍ２の強さで、１〜１２回継代培養したヒト初代メラノサイト（ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）に２回以上照射する段階を含む、老化したメラノサイトの製造方法を提供する。
【００１２】
他の側面において、本発明は、老化したメラノサイトに皮膚老化改善用又は皮膚美白用候補物質を処理する段階；及び前記候補物質の処理前後の老化指標又は美白指標を検出する段階を含む、皮膚老化改善用又は皮膚美白用物質のスクリーニング方法を提供する。
【００１３】
他の側面において、本発明は、老化したメラノサイト及び指示書を含み、前記指示書には、老化メラノサイトに候補物質の処理前後の老化指標又は美白指標の発現量を測定して、該発現量が、候補物質の処理後において候補物質を処理していない対照群に比べて減少又は増加した場合、皮膚老化改善用又は皮膚美白用物質と判断する内容を含む、皮膚老化改善用又は皮膚美白用物質のスクリーン用キットを提供する。
【発明の効果】
【００１４】
一側面において、本発明の製造方法によって製造された老化したメラノサイトは、紫外線刺激の累積による細胞老化現象と色素沈着機転を研究するのに用いることができる。また、前記細胞を用いて老化改善又は皮膚美白効果のある物質をスクリーニングすることができ、有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】紫外線の強さに応じた細胞生存率を示す図である。
【図２】紫外線の強さに応じた細胞表現型を観察した図である：老化細胞を矢印で示している。
【図３ａ】紫外線の強さに応じた２週経過後のβ-ガラクトシダーゼの活性を測定した図である（*；ｐ＜０．０５）。
【図３ｂ】２０ｍＪ／ｃｍ２の紫外線を２回照射してから２週経過時のβ-ガラクトシダーゼの活性を染色して示した図である。
【図３ｃ】２０ｍＪ／ｃｍ２の紫外線を２回照射してから２週経過時のｐ５３とｐ２１の発現を示す図である。
【図４ａ】色素形成細胞を破壊し、その沈殿物の色を比較した図である。
【図４ｂ】紫外線の強さに応じたメラニンの含量を確認した図である（*；ｐ＜０．０５）。
【図５ａ】美白用物質Ａを処理した後のβ-ガラクトシダーゼの活性変化を示す図である（*；ｐ＜０．０５）。
【図５ｂ】美白用物質Ａを処理した後のメラニンの含量変化を示す図である（*；ｐ＜０．０５）。
【図６ａ】美白用物質Ａを処理した場合における、ｐ１６及びｐ２１の発現変化を示す図である（*；ｐ＜０．０５、**；ｐ＜０．０１）。
【図６ｂ】美白用物質Ｂを処理した場合における、ｐ１６及びｐ２１の発現変化を示す図である（*；ｐ＜０．０５、**；ｐ＜０．０１）。
【図６ｃ】美白用物質Ｃを処理した場合における、ｐ１６及びｐ２１の発現変化を示す図である（*；ｐ＜０．０５、**；ｐ＜０．０１）。
【図６ｄ】美白用物質Ａ、Ｂ及びＣをそれぞれ処理した場合における、メラニン含量の変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１７】
一側面において、本発明は、老化したメラノサイトを製造する方法であって、紫外線を、１０〜３０ｍＪ／ｃｍ２の強さで、１〜１２回継代培養したヒト初代メラノサイト（ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）に２回以上照射する段階を含む、老化したメラノサイトの製造方法である。
【００１８】
紫外線は、一般的に波長によって紫外線Ａ（ＵＶＡ）、紫外線Ｂ（ＵＶＢ）及び紫外線Ｃ（ＵＶＣ）に分けられ、通常、３２０ｎｍ〜４００ｎｍの波長は紫外線Ａ、２８０ｎｍ〜３２０ｎｍの波長は紫外線Ｂ、１００ｎｍ〜２８０ｎｍは紫外線Ｃという。
【００１９】
前記のような側面において、前記紫外線は紫外線Ｂであってよいが、これに制限されるものではない。例えば、紫外線Ａ又は紫外線Ｃであってもよい。
【００２０】
一具現例において、細胞に紫外線Ｂを照射した場合、最適化した状態の老化したメラノサイトを得ることができる。なお、照射する紫外線が紫外線Ｂの領域に含まれるものであれば、波長に応じた大きな効果の差はないはずである。
【００２１】
また、前記のような側面において、前記紫外線の強さは、１０〜３０ｍＪ／ｃｍ２であってよく、１５〜２５ｍＪ／ｃｍ２であってもよいが、これに制限されず、１５ｍＪ／ｃｍ２以上、１６ｍＪ／ｃｍ２以上、１７ｍＪ／ｃｍ２以上、１８ｍＪ／ｃｍ２以上、１９ｍＪ／ｃｍ２以上、２０ｍＪ／ｃｍ２以上、２１ｍＪ／ｃｍ２以上、２２ｍＪ／ｃｍ２以上、２３ｍＪ／ｃｍ２以上、２４ｍＪ／ｃｍ２以上であってよく、２５ｍＪ／ｃｍ２以下、２４ｍＪ／ｃｍ２以下、２３ｍＪ／ｃｍ２以下、２２ｍＪ／ｃｍ２以下、２１ｍＪ／ｃｍ２以下、２０ｍＪ／ｃｍ２以下、１９ｍＪ／ｃｍ２以下、１８ｍＪ／ｃｍ２以下、１７ｍＪ／ｃｍ２以下、１６ｍＪ／ｃｍ２以下であってよいが、これらに制限されるものではない。
【００２２】
一具現例において、紫外線Ｂを２０ｍＪ／ｃｍ２の強さで照射するとき、最適化した状態の老化したメラノサイトを得ることができる。
【００２３】
本明細書において最適化された状態の老化したメラノサイトとは、例えば、細胞群集のうち老化が進行していない正常細胞及び既に細胞死滅が起きて生きていない細胞を除いた代謝活動が低下した細胞であって、老化改善或いは防止物質の処理時に、老化が遅延し又は生じないことがある細胞を意味していてよい。すなわち、さらなる細胞増殖を誘導せず、且つ許容可能な生存率を示す状態のメラノサイトを意味していてよい。
【００２４】
また、本明細書において老化性色素沈着モデルとは、老化によって色素沈着が生じた細胞を意味していてよく、さらなる色素誘発刺激源がないにも関わらず、老化指標の増加とともに色素沈着が増加しているメラノサイトと意味が混用されることがある。
【００２５】
また、前記老化進行程度は、例えば、老化指標と知られている、ｐ１６、ｐ２１、ｐ５３などの発現増加、β-ガラクトシダーゼの活性増加、細胞増殖率低下、及び細胞の表現型変化から観察して確認することができる。
【００２６】
本明細書において紫外線Ｂは、例えば、２８０ｎｍ〜３２０ｎｍの波長を有する紫外線領域を意味していてよい。
【００２７】
前記のような側面において、前記老化したメラノサイトの製造方法は、前記紫外線が照射されたメラノサイトを２４時間以上培養させる段階をさらに含んでいてよい。
【００２８】
例えば、前記紫外線が照射された細胞を、紫外線の照射から２４時間以上、１日以上、２日以上、３日以上、５日以上、７日以上、９日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、１４日以上、１５日以上、又は１６日以上間培養させていてよい。
【００２９】
前記のような側面において、前記紫外線の照射は、１８時間〜３０時間置きに２回以上実施していてよい。紫外線の照射回数は制限されず、１回、２回、３回、又はそれ以上であってよい。
【００３０】
また、紫外線の照射の間隔は、１８時間〜３０時間であってよいが、これに制限されるものではない。例えば、紫外線の２回目の照射は、紫外線の１回目の照射から１７時間経過後、１８時間経過後、１９時間経過後、２０時間経過後、２１時間経過後、２２時間経過後、２３時間経過後、２３時間３０分経過後、２３時間４５分経過後、２４時間経過後、２４時間１０分経過後、２４時間１５分経過後、２４時間３０分経過後、２５時間経過後、２６時間経過後、２７時間経過後、２８時間経過後、２９時間経過後、３０時間経過後、又は３１時間経過後に実施されていてよい。
【００３１】
また、一具現例において、紫外線Ｂを２０ｍＪ／ｃｍ２の強さでメラノサイトに１回照射してから２４時間経過後、１回目の紫外線の照射時と同じ条件で２回目の紫外線を照射した場合、最適化した状態の老化したメラノサイトを得ることができる。
【００３２】
前記のような側面において、前記紫外線の照射を受ける細胞は、ヒト初代色素形成細胞（ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）であってよい。
【００３３】
本発明は、他の側面において、前記方法によって製造された、分離された、老化したメラノサイトである。
【００３４】
本発明は、また他の側面において、老化改善用又は皮膚美白用物質をスクリーニングするための老化したメラノサイトの用途に関するものであってよい。
【００３５】
本発明は、また他の側面において、老化改善または皮膚美白物質スクリーン用の老化したメラノサイトに関するものであってよい。
【００３６】
他の側面において、本発明は、皮膚老化改善用又は皮膚美白用候補物質を処理する段階；及び前記候補物質の処理前後の老化指標又は美白指標を検出する段階を含む、皮膚老化改善用又は皮膚美白用物質のスクリーニング方法である。
【００３７】
本明細書において老化指標とは、老化した細胞で特異的に発現量が増加し又は減少して、細胞の老化程度を確認することができる遺伝子、該遺伝子の発現産物を意味していてよい。老化指標は、例えば、β-ガラクトシダーゼ（β-ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）の活性、ｐ１６、ｐ２１、又はｐ５３遺伝子若しくはそのタンパク質であってよいが、これらに制限されるものではなく、当業界における周知の老化指標を含む。
【００３８】
また、本明細書において美白指標とは、細胞内色素沈着の有無を確認することができる遺伝子、該遺伝子の発現産物を意味していてよい。例えば、メラニンであってよい。
【００３９】
前記のような側面において、前記皮膚老化改善用又は皮膚美白用候補物質のスクリーニング方法は、前記候補物質の処理後における老化指標又は美白指標の発現量が、候補物質を処理していない対照群に比べて減少又は増加すると、皮膚老化改善用又は皮膚美白用物質と決める段階をさらに含んでいてよい。
【００４０】
前記のような側面において、皮膚老化改善用候補物質と皮膚美白用候補物質の処理後に前記老化指標とメラニンの蓄積量がいずれも減少又は増加すると、皮膚老化改善と皮膚美白の効果とを併せ持つ物質と決めていてよい。
【００４１】
他の側面において、本発明は、皮膚老化改善用又は皮膚美白用物質のスクリーン用キットである。前記キットは、前記老化したメラノサイト及び指示書を含んでいてよく、前記指示書には、老化メラノサイトに候補物質の処理前後の老化指標又は美白指標の発現量を測定して、該発現量が、候補物質を処理していない対照群に比べて減少又は増加した場合、皮膚老化改善用又は皮膚美白用物質と判断する内容を含んでいてよい。
【００４２】
前記のような側面において、正常又は前記老化したメラノサイトは、冷凍保存又は担体保存した状態のものであってよい。前記キット内に含まれる老化したメラノサイトは、さらなる細胞増殖や老化を最小化するために、前記挙げられた技術の他、当業界における周知の技術によって、最適の老化状態が保存されたままキット内に含まれていてよい。
【００４３】
前記のような側面において、前記老化指標は、β-ガラクトシダーゼ（β-ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）、ｐ１６、ｐ２１、及びｐ５３からなる群から選択された一つ以上であってよいが、これらに制限されるものではない。また、前記美白指標はメラニンであってよいが、これに制限されるものではない。
【００４４】
以下、下記の実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。なお、下記の実施例は本発明に関する理解を助けるための目的から例示したものに過ぎず、本発明の範疇及び範囲がこれに限定されるものではない。
【００４５】
［実施例１］色素形成細胞の培養及び紫外線Ｂの照射
ヒト初代色素形成細胞（ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）をヒト色素形成細胞成長補充物（ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＨＭＧＳ）、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、ＮＹ、ＵＳＡ）を添加したＭ-２５４培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、ＮＹ、ＵＳＡ）を利用して、常温、５％のＣＯ２培養器で培養した後、細胞数が２×１０５になるように１００ｍｍ培養皿に敷いて、一晩中細胞が器壁にくっ付くことを待った後、１１ｍＪ／ｃｍ２、２０ｍＪ／ｃｍ２、３０ｍＪ／ｃｍ２の強さの紫外線Ｂを２４時間置きに２回照射した。
【００４６】
前記メラニン細胞を３日に一度ずつ培地を交換するとともに最大２週間培養しながら細胞毒性、表現型、老化指標などを観察した。
【００４７】
［実施例２］色素形成細胞への紫外線Ｂの照射後の細胞増殖及び生存の観察
さらなる細胞増殖を誘導することなく、許容可能な生存率を示す紫外線Ｂの照射条件を見出すために、ｗｓｔ-１（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）溶液を用いて細胞の増殖及び生存率を調査した。実施例１の細胞と、紫外線Ｂを照射せずに培養した細胞（対照群）の４８時間、１週間、２週間後の生存率を観察した（図１）。
【００４８】
その結果、紫外線Ｂを処理していない対照群の場合、経時的にその数が急増することが分かる。これに対し、１１ｍＪ／ｃｍ２、２０ｍＪ／ｃｍ２、３０ｍＪ／ｃｍ２の紫外線Ｂの照射を受けた細胞は、処理から４８時間経過したとき、対照群の細胞数に比べてそれぞれ約９３％、８５％、７５％の生存率を示した。また、紫外線Ｂの照射から２週経過したとき、対照群に対してそれぞれ約７１％、４０％、２３％の生存率を示した。これは、紫外線Ｂの強さに依存して細胞の増殖が低下し、特に２０ｍＪ／ｃｍ２以上の紫外線Ｂの強さではその増殖率が有意に抑制されることを示す。細胞の増殖低下は代表的な老化（ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ）細胞の特性である。
【００４９】
［実施例３］紫外線Ｂの照射から２週経過後の色素形成細胞の表現型の観察
実施例１の条件で紫外線Ｂを照射した後、色素形成細胞の変化を光学顕微鏡で観察した。細胞の表現型は、培地中の生きている状態で、光学顕微鏡下で４０倍拡大して観察された。
【００５０】
その結果、紫外線Ｂを照射した場合、メラニン細胞の中にはその模様が初期に比べて扁平になり、細胞体（ｃｅｌｌ  ｂｏｄｙ）の大きさが増加し、樹状突起（ｄｅｎｄｒｉｔｅ）の個数が増加した、すなわち、老化した細胞が増加し、このような細胞の数が紫外線Ｂの強さに依存して増加することで、全体的に細胞間異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）が増加したことが分かった。なお、１１ｍＪ／ｃｍ２の強さで紫外線を照射した群では、紫外線を照射していない群と類似した表現型を示す、老化していない細胞が多く存在しており、３０ｍＪ／ｃｍ２の強さで紫外線を照射した群では、生きている細胞が比較的に少なく観察されることを確認した。
【００５１】
［実施例４］紫外線Ｂの照射から２週経過後の色素形成細胞のβ-ガラクトシダーゼ活性とｐ５３、ｐ２１タンパク質発現の調査
実施例１の条件で紫外線Ｂを照射した後、細胞の代表的老化指標であるβ-ガラクトシダーゼ活性を測定した結果、照射した紫外線Ｂの強さに比例してその活性が増加することを確認した（図３ａ）。なお、１１ｍＪ／ｃｍ２の強さの紫外線Ｂを照射した場合、一部の細胞で老化による表現型の変化が確かに観察されるものの、正常細胞が多量で存在することから、β-ガラクトシダーゼの活性が対照群に比べて有意差がみられなかった。また、図２で示された老化性表現型をみせる細胞は、正常細胞に比べて確然とβ-ガラクトシダーゼ活性を示すことを発色実験から確認した（図３ｂ）。
【００５２】
また、老化した細胞で多量発現すると知られた、ｐ５３とｐ２１のタンパク質の発現量を確認するために、細胞に各強さの紫外線Ｂを照射してから２週間培養し、細胞を培養皿から引き剥がした後、ＲＩＰＡ溶解バッファー（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、２０-１８８）を入れて細胞を壊し、１３,５００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上層液を分離して、総タンパク質を抽出した。ｐ５３特異的抗体（Ｄａｋｏ、#Ｍ７００１）とｐ２１特異的抗体（ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  #２９４７）を用いてウェスタンブロットを行った結果、２０ｍＪ／ｃｍ２の紫外線Ｂの照射後にｐ５３とｐ２１タンパク質の発現が増加したことを確認した（図３ｃ）。
【００５３】
［実施例５］紫外線Ｂの照射から２週経過後の細胞内メラニン蓄積の観察
色素形成細胞にそれぞれ１１ｍＪ／ｃｍ２、２０ｍＪ／ｃｍ２、３０ｍＪ／ｃｍ２の強さの紫外線Ｂを２回照射し２週間培養した後、その細胞を培養皿から引き剥がしてその数を数え、次いで、同数の細胞をマイクロチューブに集めた後、ＲＩＰＡ溶解バッファー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、２０-１８８）を入れて細胞を壊し、１３，５００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、沈殿物を得た。沈殿物を１Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）に溶解させ、その色を比較し（図４ａ）、４５０ｎｍにおける吸光度を測定して、メラニンの含有量を比較した（図４ｂ）。
【００５４】
その結果、色素形成細胞のメラニンの含有量は、２０ｍＪ／ｃｍ２、３０ｍＪ／ｃｍ２の紫外線Ｂの照射時、その強さが増すにつれて有意に増加することを確認した。これは、色素形成細胞に特定の強さ以上の紫外線Ｂを繰り返し照射した後、特定の期間に亘って培養した場合、老化性指標の発現が増加するとともに、メラニンの含量が増加することを意味する。
【００５５】
［実施例６］紫外線Ｂの照射から２週経過後のｐ１６、ｐ２１のｍＲＮＡ発現量の観察
２０ｍＪ／ｃｍ２の強さの紫外線Ｂを２４時間置きに２回照射してから２週後の細胞からＲＮＡを収得してｃＤＮＡを製作し、ｐ１６、ｐ２１特異的プライマーを用いてＱ-ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、７５００Ｆａｓｔ）にてｍＲＮＡ量の変化を測定した。Ｑ-ＰＣＲの実験では、９５℃で１５秒、６０℃で６０秒のサイクルを総４０回繰り返し行い、対照群に比べて当該遺伝子の発現がどの程度増加したかの相対的な値を測定した。用いたプライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製の商品名ＴａｑＭａｎであって、それぞれ次のとおりである：ｐ１６（製品番号：Ｈｓ００９２３８９４_ｍ１）、ｐ２１（製品番号：Ｈｓ００３５５７８２_ｍ１）
【００５６】
その結果、対照群に比べて、老化性色素沈着モデルにおいてｐ１６とｐ２１のｍＲＮＡ発現が大きく増加することを確認した（図６）。
【００５７】
［実施例７]老化性色素沈着を改善する美白用物質のスクリーニング：美白用物質の処理後のメラニン含量変化の確認
前記実施例を通じて、最も適合した老化状態を保持すると判断された細胞、すなわち、色素形成細胞に２０ｍＪ／ｃｍ２の強さの紫外線Ｂを２４時間置きに２回照射して得た細胞を、紫外線の照射後４８時間から代表的美白機能素材である物質Ａ（ｍｅｌａｓｏｌｖ、３０μＭ）を含む培地で３日置きに該培地を交換しながら培養した（総４回）。２週後、β-ガラクトシダーゼの活性とメラニン含量を対照群（ビヒクル（ＤＭＳＯ）処理）と比較した（図５）。その結果、紫外線Ｂの処理によって増加していたβ-ガラクトシダーゼの活性が減少する（図５ａ；*、ｐ＜０．０５）とともに、メラニン含量が物質Ａの処理によって対照群の水準に確然と減少することを確認した（図５ｂ；*、ｐ＜０．０５）。このことから、前記老化細胞は、色素形成細胞の老化に起因した色素沈着を改善する物質を有用にスクリーニングすることができることを確認した。
【００５８】
［実施例８］老化性色素沈着を改善する美白用物質のスクリーニング：美白用物質の処理後のｐ１６、ｐ２１の発現変化の観察
色素形成細胞に２０ｍＪ／ｃｍ２の強さの紫外線Ｂを２４時間置きに２回照射して得た細胞に、既存に美白効果があると報告された物質Ａ、物質Ｂ、物質Ｃを、紫外線Ｂの最終照射後４８時間から２週間、３日置きに、総４回処理したとき、増加していた前記遺伝子発現が顕著に抑え込まれることを確認した（図６；*、ｐ＜０．０５、**、ｐ＜０．０１）。特に、一般の色素沈着誘導条件では美白効能を示さなかった物質Ｃを処理した場合でも美白効果が観察されたが、これは、前記老化性色素沈着モデル細胞が色素細胞老化に起因した色素沈着をスクリーニングするのに有効であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【国際調査報告】
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