(57)【要約】本発明は、医薬として使用するための、配列番号：１に示すアミノ酸配列と少なくとも８５％一致するアミノ酸配列を含むペプチドであって、それに含まれる残基Lys905、Arg909、及びArg912が存在するペプチド、特にＦＧＦ−２で誘発される血管新生のインヒビターとして使用するためのものに関する。
2018508461.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１に示すアミノ酸配列と少なくとも８５％一致するアミノ酸配列を含み、それに含まれる残基Lys905、Arg909、及びArg912が存在する、医薬として使用するためのペプチド。
【請求項２】
ターゲット細胞に対する、ＦＧＦ−２で誘発される生物学的効果のインヒビターとして使用するための請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ＦＧＦ−２で誘発される血管新生のインヒビターとして使用するための請求項１又は２のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項４】
ガン治療において、特に固形腫瘍治療において、薬物として使用するための請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号：２に示すアミノ酸配列を含む請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項６】
配列番号：３に示すアミノ酸配列を含む請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項７】
そのアミノ酸配列が、配列番号：１に示す配列に存する請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項８】
細菌、酵母又は真核細胞などの生体システムにおいて生成される請求項１〜７のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項９】
検出可能なラベルに結合される請求項１〜８のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１０】
動物又は個体に前記ペプチドの有効量を投与することにより、血管新生又は腫瘍部位（一箇所以上）における前記ペプチドの蓄積が得られる、医薬として使用するための請求項３〜９のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項記載の少なくとも１つのペプチドの有効量と、薬学的に許容し得る賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１２】
血管新生を阻害する別の化合物、及び／又は抗炎症性化合物、及び／又は抗ガン性有効成分をさらに含む請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一項記載のペプチドの有効量、並びに血管新生を阻害する別の化合物、及び／又は抗炎症性化合物、及び／又は抗ガン性有効成分を含む、パーツのキット。
【請求項１４】
配列番号：１に示すアミノ酸配列と少なくとも８５％一致するアミノ酸配列を含み、それに含まれる残基Lys905、Arg909、及びArg912が存在し、検出可能なラベルに結合されるペプチド。
【請求項１５】
前記ペプチドが、放射活性ラベル、親和性ラベル、磁気粒子、蛍光性又は発光性のラベルに結合される請求項９又は１４に記載のペプチド。
【請求項１６】
インビボのイメージング剤としての、請求項１４又は１５に記載のペプチドの使用。
【請求項１７】
動物の、又はヒト個体の、血管新生部位をイメージングするための方法であって、前記動物に、又は前記ヒト個体に、予め投与されている請求項１４又は１５のいずれか一項記載のペプチドのラベルを検出する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生プロセスの分野、具体的にはＦＧＦ−２で誘発される血管新生に関する。本発明は、さらに詳細にはガン治療の分野における血管新生プロセスの阻害に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生（新しい血液−血管成長のプロセス）は、発生、再生成及び修復で必須の役割を果たす。しかしながら、病理学的血管新生は、腫瘍形成においてのみならず、「血管新生依存性疾患」として共に分類され得る非腫瘍性疾患の範囲においても起こる。
【０００３】
血管新生は、腫瘍成長及び転移において枢軸的な役割を果たす。実際に、血管新生因子は腫瘍で過剰発現される。ガン治療のための抗血管新生の戦略を開発すべく、多大な努力が払われてきている。
【０００４】
特許出願ＵＳ ２０１４／０１００１６４は、抗血管新生活性を呈するペプチドを記載している。抗血管新生活性に関連する一般的なペプチドモチーフは、ヒトタンパク質の３つのファミリー：Ｉ型トロンボスポンジンドメイン含有タンパク質、ＣＸＣケモカイン及びコラーゲンから同定された。IV型コラーゲンから生じるペプチドは、抗血管新生活性を呈するものとして同定された。
【０００５】
特許出願ＵＳ ２０１３／０３１６９５０も、コラーゲンIVから由来するペプチド、及びガンにおける血管新生に限定してのそれらの使用を記載している。
【０００６】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子））は、血管新生現象において中心的な役割を果たす。したがって、選択的にＶＥＧＦをターゲティングする薬剤、及びそのレセプターが研究されて、臨床試験で有望な活性が示されている。特に、抗血管新生薬物が、Avastin（登録商標）及びEndostar（登録商標）という名称で開発されている。
【０００７】
しかしながら、前臨床及び臨床の両方の現場で、これらの処置の恩恵は良くても一過性であり、後に腫瘍成長の復元そして進行に至る。実際に、患者によってはこれらの薬物に対して最終的に耐性が生じるようである。この耐性の機構としてあげられているものの一つは、他の血管新生促進性因子の、特に線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）の腫瘍性組織におけるアップレギュレーションである。
【０００８】
βＦＧＦ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ−β又は塩基性線維芽細胞成長因子としても公知であるＦＧＦ−２は、ヘパリン結合性線維芽細胞成長因子のファミリーに属する。ＦＧＦ−２は、２つの別異のクラスのレセプター、すなわち、細胞表面上及び細胞外マトリックス内に存在する、高親和性チロシンキナーゼレセプター（ＦＧＦＲ）及び低親和性ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）を介して内皮細胞と相互作用する。ＦＧＦ−２は、正常な組織の癒傷の際、及び腫瘍発生の際に、内皮細胞に対して作用する。ＶＥＧＦ経路が抗血管新生性薬物によってブロックされると、ＦＧＦ−２アップレギュレーションが観察され、腫瘍血管新生及び再成長を許容する。
【０００９】
抗ＶＥＧＦ治療からの、この「腫瘍回避」を防ぐために、特にＦＧＦ−２が介する血管新生に対する、新しい抗血管新生方法及び薬物の開発に研究の焦点が当てられている。
【００１０】
ＦＧＦ−２アンタゴニスト長ペントラキシン３（ＰＴＸ３）が、高親和性及び特異性をもってＦＧＦ−２に結合することが示されている。ＰＴＸ３から由来する合成ペプチドは、ＦＧＦ−２を直接的にターゲティングするもので、抗血管新生活性を示す（Alessi et al., 2009）。
【００１１】
有意且つ特有な、抗ＦＧＦ−２が介する血管新生活性を示す他の合成ペプチドを同定するための取り組みがなされている。
【００１２】
［発明の要約］
驚くべきことに、発明者らは、医薬として使用され得る、ヒトコラーゲンＶｐｒｏα１鎖から由来するペプチドを同定している。
【００１３】
このペプチドは、医薬として、特にＦＧＦ−２で誘発される生物学的効果のインヒビターとして、及びより詳細にはＦＧＦ−２で誘発される血管新生プロセスのインヒビターとして、とりわけガンを処置するために使用されてもよい。実際、このペプチドは動物又は患者に投与されると、特有の抗血管新生特性を呈する。
【００１４】
前記ペプチドは、配列番号：１に示すアミノ酸配列と少なくとも８５％一致するアミノ酸配列を含み、それに含まれる残基Lys905、Arg909、及びArg912が存在することを特徴とする。
【００１５】
このペプチドは、コラーゲンＶからのα１鎖のフラグメント［Ile824〜Pro950］から由来し、より明確には、完全鎖α１（Ｖ）（ｐｒｏ−α１（Ｖ）鎖）でのアミノ酸のナンバリングが保存されている。
【００１６】
具体的な実施形態では、前記ペプチドはペプチド「ＨＥＰＶ」、すなわち、以前にヘパリンに結合するペプチドとして報告されている、残基Ile824〜Pro950に存するコラーゲンＶｐｒｏ−α１鎖の１２kDaフラグメントである（Delacoux et al., 1998; Delacoux et al., 2000; Ricard-Blum et al., 2006）。
【００１７】
本ペプチドを含む、医薬組成物及びパーツのキットもまた、本願の目的とするものである。
【００１８】
配列番号：１［Ile824-Pro950］に示すアミノ酸配列と少なくとも８５％一致するアミノ酸配列を含み、、それに含まれる残基Lys905、Arg909、及びArg912が存在し、検出可能なラベルに結合されるペプチドもまた、本願の目的とするものである。
【００１９】
本願はまた、動物又はヒト個体の、血管新生部位をイメージングするための方法であって、前記動物に、又は前記ヒト個体に、予め投与されている前記ペプチドのラベルを検出する工程を含む方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】鎖ｐｒｏα１（Ｖ）から由来するペプチドＨＥＰＶの構造  Ａ．プロコラーゲンＶヘテロトリマー［α１（Ｖ）］２α２（Ｖ）の構造。ＣＲＲ：システインリッチリピートドメイン；ＶＲ：可変領域；ＴＳＰＮ：トロンボスポンジンＮ−末端様ドメイン。  Ｂ．ｐｒｏα１（Ｖ）及びｐｒｏα２（Ｖ）鎖の構造。黒色帯部は、小トリプルヘリックスドメインと主要トリプルヘリックスドメインとの間に位置する非コラーゲン性ドメイン（ＮＣ２）を表す。  Ｃ．フラグメントＨＥＰＶのアミノ−酸配列。塩基性残基アルギニン及びリシンを太字で示す。ヘパリン結合を担う配列に下線を付している。
【図２】ＨＥＰＶはコラーゲンＩＶ及びＸＶＩＩＩα１鎖の発現を刺激する  ＨＥＰＶで４、１２及び２４時間処理されたヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）におけるCOL14A1及びCOL18A1 ｍＲＮＡの発現、リアルタイムＰＣＲにより分析。数値は、ハウスキーピング遺伝子Ｌ３０に標準化される。定量化は、対照（ＨＥＰＶなしの同条件にて培養された細胞）に対して表される。数値は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。
【図３】ペプチドＨＥＰＶ、ＨＥＰＶ−ΔＨＢＳから由来する非機能性突然変異体の生成  Ａ．ＨＥＰＶ−ΔＨＢＳのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析。レーン１：リコンビナントＨＥＰＶ−ΔＨＢＳを含有するE. coli細菌溶解液。レーン２：カチオン交換クロマトグラフィー後のＨＥＰＶ−ΔＨＢＳ含有画分。レーン３：カチオン交換クロマトグラフィーを用いた精製の第二工程後の、精製されたＨＥＰＶ−ΔＨＢＳ含有画分。  Ｂ．ヘパリンに対するＨＥＰＶ及びＨＥＰＶ−ΔＨＢＳの親和性。アラニンで突然変異されているＨＥＰＶ塩基性残基に下線を付している。ヘパリン結合部位を含むフラグメントの領域G901-P923のみを示す。精製されたＨＥＰＶ及びＨＥＰＶ-ΔＨＢＳをヘパリン−セファロース親和性クロマトグラフィーに通して、ＮａＣｌ勾配（点線）で溶出させた。ＨＥＰＶは０．３５M ＮａＣｌで溶出され、ＨＥＰＶ-ΔＨＢＳは０．２M ＮａＣｌで溶出される。
【図４】ＨＥＰＶは内皮細胞において、ＦＧＦ−２で誘発されるＥＲＫ１／２及びＡｋｔリン酸化を阻害する。  ＥＲＫ１／２、ｐ−ＥＲＫ１／２、Ａｋｔ及びｐ−Ａｋｔに対する抗体と共に、ＨＥＰＶ又はＨＥＰＶ−ΔＨＢＳの存在下、ＦＧＦ−２（Ａ）又はＶＥＧＦ（Ｂ）で処理した内皮細胞溶解物のウエスタンブロット、並びに定量化。リン酸化されたｐ−ＥＲＫ１／２及びｐ−Ａｋｔタンパク質が、特異抗体で検出される。
【図５】ＨＥＰＶは、マウスにおける血管の形成に作用する  （Ａ）蛍光性ペプチドＨＥＰＶ及びＨＥＰＶ−ΔＨＢＳの、血管新生部位を認識する能力。ＦＧＦ−２又はＰＢＳを含浸したスポンジをヌードマウスに移植する。Alexa700でラベルされた蛍光性ペプチドを静脈内注射した後、スポンジの血管新生領域におけるそれらの蓄積を2D蛍光反射イメージングを用いて定量化する（矢印を参照）。その後、スポンジで放射される経口の相対強度を計算して、２００ms（ミリ秒）の間の参照光単位（ＲＬＵ）として表される。  （Ｂ）ＦＧＦ−２又はＰＢＳを含浸したスポンジを移植したヌードマウスにおける新しい血管の形成。ペプチドＨＥＰＶ又はＨＥＰＶ−ΔＨＢＳでの反復処置の後、スポンジを抽出して、ヘモグロビンの存在を定量化する。ヘモグロビンの存在は、写真により立証されるとおり、血管含量を反映する。
【図６】ＨＥＰＶは、ヌードマウスにおいて移植された腫瘍の腫瘍成長に影響を及ぼす。  （Ａ）皮下に移植されたマウスＴｓａ／Ｐｃ乳ガン細胞を第５日から２日に一度、ＨＥＰＶペプチドの５０μg対照（ＨＥＰＶ−ΔＨＢＳ）を含有する５０μｌ ＰＢＳの腫瘍周囲の注射により繰り返して処置する。観察できるとおり、腫瘍成長は、ＨＥＰＶで処理された動物において有意に（ｐ＜０．０５）遅くなる。腫瘍切片は、血管（Ｂ）を検出する抗ＣＤ３１抗体又は増殖性の細胞（Ｃ）を染色する抗Ｋｉ６７抗体を用いて免疫染色された。  新しい血管の形成は、ペプチドＨＥＰＶでの処置の間、ヌードマウスにて移植された乳房腫瘍において、とりわけ最初の２０日のあいだ阻害される。また、この処置は増殖性の腫瘍細胞の数を減少させる。
【００２１】
発明の詳細な説明
本願明細書で使用される技術用語はすべて当業者に周知であり、Sambrookらの名称「Molecular Cloning: a Laboratory Manual」からの参照マニュアルで広く定義されている。
【００２２】
本発明は、配列番号：１に示すアミノ酸配列と少なくとも８５％一致するアミノ酸配列を含み、それに含まれる残基Lys905、Arg909、及びArg912が存在する、医薬として使用するためのペプチドに関する。
【００２３】
残基は、配列番号：５に示すように、１８３８残基を含むコラーゲンＶのｐｒｏα１（Ｖ）鎖の完全配列でのそれらの位置に従って命数される。
【００２４】
配列番号：１配列は、ヒトコラーゲンｐｒｏα１（Ｖ）鎖から由来するペプチドの配列を表し、配列番号：５にて下線を付すように、第８２４位のイソロイシンで始まり、第９５０位のプロリンで終わる１２７残基を含む。
【００２５】
「配列番号：１に示すアミノ酸配列と少なくとも８５％一致するアミノ酸配列」という表現は、参照配列と８５％のアミノ酸同一性を共有する候補配列を示す。これは、アライメント後に、候補配列のアミノ酸の８５％が、参照配列の対応するアミノ酸と一致することを必要とする。
【００２６】
「アミノ酸の同一性」によって意味するのは、両方の配列で同じアミノ酸が観察されることである。同一性は、アミノ酸において起こり得る翻訳後修飾を度外視するものであり、例えば、ヒドロキシル化プロリンは非ヒドロキシル化プロリンと同一であると考えられる。
【００２７】
本発明の同一性は、コンピューター解析（ClustalWコンピューターアライメントプログラムなど）、及びそこで示唆されるデフォルトパラメータの補助によって求められる。ClustalWソフトウェアは、http://www.clustal.org/clustal2/から入手できる。このプログラムをそのデフォルト設定で使用することによって、クエリの一部と参照ポリペプチドの一部のアラインメントが行われる。完全に保存された残基の数が計数され、参照ポリペプチドの長さで割られる。
【００２８】
「少なくとも８５％」の用語は、クエリと配列番号：１配列の参照ポリペプチドの両配列間の同一性の百分率が、少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％ことを示す。
【００２９】
特に、配列番号：１に示すアミノ酸配列と少なくとも８５％一致するアミノ酸配列は、配列番号：１と少なくとも９０％の同一性を呈する。
【００３０】
特に、配列番号：１に示すアミノ酸配列と少なくとも８５％一致するアミノ酸配列は、配列番号：１と少なくとも９５％の同一性を呈する。
【００３１】
特に、配列番号：１に示すアミノ酸配列と少なくとも８５％一致するアミノ酸配列は、配列番号：１と少なくとも９８％の同一性を呈する。
【００３２】
本発明によれば、配列番号：１に示すアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を示すアミノ酸配列は、以下の保存された残基：Lys905、Arg909、及びArg912を呈する。これらの残基は、当該ペプチドの特異性及び活性にとって必須であり、そのペプチドの特異性及び／又は活性を変えるリスクのもとに、修飾されることもできない。
【００３３】
本発明の実施形態では、配列番号：１に示すアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を示すアミノ酸配列は、以下の保存された残基：Lys905、Arg909、Arg912、Arg918及びArg921を呈する。ヘパリン結合部位に包含されるこれらのアミノ酸の存在は、医薬としての前記ペプチドの活性にとっても重要であるかもしれない。
【００３４】
理論によって拘束されることを望むものではないが、発明者らは、本発明に係るペプチドがヘパリン及びヘパラン硫酸に特異的に結合することを観察しており、両分子は細胞とマトリックスとの相互作用に関与している（Delacoux et al., 2000; Ricard-Blum et al., 2006）。結合部位が消失するか、又は機能性を失ってしまえば、実施例のセクションで呈示されるようにＦＧＦ−２シグナル伝達経路が阻害される。
【００３５】
「医薬として使用するための」という表現は、治療における、特にヒト治療における前記ペプチドの使用を示す。
【００３６】
「医薬」は、「調合薬物」、「薬剤」、「処方薬」又は「医薬品」の同義語であり、疾患を治療、処置、または予防するための内用又は外用が意図される有効化合物を示す。
【００３７】
驚くべきことに、本発明者らは以前報告したとおり、医薬として使用されることができる有効化合物として前記ペプチドを同定している。有利なことに、このペプチドは血液系に注射した後、肝臓に蓄積しないので動物又はヒトに無毒である。
【００３８】
ペプチドの使用
第一の実施形態によれば、本発明に係るペプチドは、ターゲット細胞に対する、ＦＧＦ−２で誘発される生物学的効果のインヒビターとして使用される。本実施形態は、インビボ又はインビトロで実施されることができる。
【００３９】
「インヒビター」の用語は、そのターゲット細胞に対するＦＧＦ−２の生物活性を低減するか又は抑制もするペプチドの作用の態様を示す。特に、一般的に観察されるＦＧＦ−２の生物学的効果が、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％低下するものであり、好ましい実施形態では、ターゲット細胞に対するＦＧＦ−２の生物学的効果が１００％阻害される、すなわちそれらの効果が完全に抑制されるものである。
【００４０】
「ターゲット細胞に対する、ＦＧＦ−２で誘発される生物学的効果」の表現は、十分な量のＦＧＦ−２の存在によって特異的に誘発される全ての生物学的効果を意味する。主要な効果は、新しい血管の形成であるが、ＦＧＦ−２は骨石灰化の調節にも作用する。
【００４１】
ＦＧＦ−２のターゲット細胞は、因子ＦＧＦ−２を結合でき、その細胞にシグナルを伝達することができるレセプターを発現している細胞である。現在までに２つのクラスのレセプター、すなわち高親和性チロシン−キナーゼレセプター（ＦＧＦＲ）及び低親和性ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）が同定されている。ターゲット細胞は主に内皮細胞であるが、心筋細胞及び骨芽細胞関連細胞でもよい。
【００４２】
ＦＧＦ−２は数多くの生理学的機能に関与し、したがってＦＧＦ−２で誘発される生物学的効果のインヒビターとして作用するペプチドは、いくつかの疾患の処置において、特に多形神経膠芽腫、心不全、アルツハイマー病、糸球体硬化症、及び骨髄化生随伴の骨髄線維症の処置において使用され得る。
【００４３】
多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、中枢神経系腫瘍の最も悪性型のものであり、現行の療法はほとんどがこのガンの処置に有効でない。これは、最も高度に血管が新生したガンの一つでもある。ＧＢＭ細胞によるＦＧＦ−２の分泌は、内皮細胞の血液脳関門機能を増強し、これはＧＢＭにおける薬物抵抗性にも寄与する。神経膠芽腫幹細胞又は幹様細胞（ＧＳＣ）、すなわち、腫瘍を自己更新及び生成する能力を持つ多能性ガン細胞の稀少型の存在が、このガンの処置への耐性、及びこのガンが致命的であることに寄与する重要な因子であり得ると考えられる。ＦＧＦ−２は、ＧＢＭ及びＧＳＣを調節するのに重大な役目を果たすことが示されている（Haley and Kim, Cancer letters, 2014）。
【００４４】
心不全は、病的状態及び死亡の主要な原因となっている。ＦＧＦ−２は、ＦＧＦレセプター１ｃ（ＦＧＦＲ）の活性化を通じてＭＡＰＫシグナル伝達を活性化することにより心臓肥大症及び線維症を促進する。ＦＧＦ−２シグナル伝達を調節することは、心不全の潜在的な治療手法となり得る（Itho and Ohta, Front Physiol, 2013）。
【００４５】
神経発生は、年齢を重ねたヒトの歯状回でも存続するが、神経栄養環境が変わるアルツハイマー病（ＡＤ）などの病態でのその役割及び調節はあまり理解されていない。ラット成体由来の海馬前駆細胞では、ＦＧＦ−２は量依存的に微小管結合タンパク質２を減少させ、またｔａｕレベルを増加させたが、これによりＦＧＦ−２で誘発される、樹状突起の軸索への極性シフトが示唆される。ＡＤの病変形成は、歯状回神経発生、とりわけ神経極性の、異常に高められたＦＧＦ−２関連性異常調節が関わるかもしれない。セレブロライシン、すなわちＡＤ患者の認知及び気分を改善することが示されている神経栄養性薬物は、アポトーシスを低下させること、及びＦＧＦ−２で誘発される極性シフトを相殺することの両方によって、培養においてニューロン様に分化したラット成体海馬前駆細胞を増加させることが見出された（Tatebayashi et al, Acta Neuropathol, 2003）。ＦＧＦ−２活性を相殺することは、本疾患の有望な治療的ターゲットを表し得る。
【００４６】
腎臓において、ＦＧＦ−２は糸球体タンパク質透過性を増加させ、糸球体硬化症を促進する（Chen et al, Current Vascular Pharmacology, 2004）。同種移植片の新生内膜及び糸球体において、ＦＧＦ−２の膨大な蓄積が観察された。ヘパラン硫酸多糖側鎖のプロファイリングで、対照における非ＦＧＦ−２結合性ヘパラン硫酸表現型、及び同系移植された腎臓からの、同種移植片におけるＦＧＦ２結合性表現型への変換が明らかになった。ＦＧＦ２で誘発される増殖は、硫酸化に依存し、外添されたヘパラン硫酸により阻害されることができる。ヘパリン結合フラグメントＨＥＰＶによるＦＧＦ−２シグナル伝達の相殺は、糸球体硬化症の発生、及び慢性移植機能障害における新生内膜形成を遅延させることができた（Katta ら、Am J Pathol、2013）。
【００４７】
骨髄化生随伴の骨髄線維症（ＭＭＭ）は、髄質線維症及び造血のクローン展開により特徴付けられる骨髄増殖性疾患である。以前の結果により、初期造血細胞の調節にも関わる２つの強力な線維形成性因子、すなわち、トランスホーミング成長因子−ベータ１（ＴＧＦ−ベータ１）及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ又はＦＧＦ−２）の、ＭＭＭの患者における生成の増加が示されている。本疾患の骨髄増殖特性は、ＣＤ３４＋造血前駆細胞の異常増殖に起因し得る。正常なＣＤ３４＋細胞で検出されるＦＧＦ−２及びそのＩ型及びＩＩ型レセプターの極低発現は、有意に高い、患者のＣＤ３４＋細胞で観察されるものと対照をなす。ＭＭＭ患者由来のＣＤ３４＋前駆細胞においてＴＧＦ−β結合レセプターの低減と関連する、ＦＧＦ−２及びそのレセプターの発現の増加は、それらの成長及び／又は生存を刺激することによるのみならず、負の調節性シグナルを克服することによっても、造血前駆細胞の展開を促進するかもしれない（Le Bousse-Kerdiles, Blood, 1996; Le Bousse-Kerdiles and Martyre, Ann Hamatol, 1999）。ＦＧＦ−２活性を相殺することは、本疾患の有望な治療的ターゲットを表し得る。
【００４８】
糖尿病性網膜症及び関節リウマチなどの他の疾患が、本発明に係るペプチドで処置されることができる。この抗血管新生ペプチドは、加齢性黄斑変性症などの眼の増殖性疾患の処置においても使用され得る。
【００４９】
第二の実施形態によれば、本発明に係るペプチドはＦＧＦ−２で誘発される血管新生のインヒビターとして使用される。
【００５０】
「血管新生」とは、血管形成、血管リモデリング、血管安定化、血管成熟、及び機能性血管ネットワークの確立を含む動的プロセスを言う。血管新生のこのプロセスは、主に内皮細胞である特有のターゲット細胞に対して十分な量のＦＧＦ−２の存在で誘発される。
【００５１】
血管新生は、川崎病（ＫＤ）の慢性相での冠状動脈（ＣＡ）動脈瘤など、いくつかの疾患において調節不全となることが示されている。急性ＫＤ ＣＡ動脈瘤及び心筋で、疾患の発症後直ちに有意な血管化が起こり、複数の血管新生因子が関与しており、そしてその血管新生の異常調節がＫＤ脈管障害に寄与する可能性がある（Freeman et al, 2005, Pediatr Cardiol）。ＦＧＦ２活性を相殺することは、本疾患の有望な治療的ターゲットを表し得る。
【００５２】
第三の実施形態によれば、本発明に係るペプチドは、ガン治療において、特に固形腫瘍治療において、薬物として使用される。
【００５３】
ガンとは一般的に、隣接している組織又は身体の他の部分に広がることができる細胞の、制御されない異常成長によって引き起こされる疾患の群の一つを言う。特に、ガン細胞は、制御されない増殖、特殊機能の喪失、不死性、転移潜在性、迅速な成長及び増殖速度、並びに特有の形態学的な特徴及び細胞マーカーを呈する。ガン細胞は、身体の特有の部位で固形腫瘍を形成でき、その中ではガン細胞が集結している。
【００５４】
具体的な態様では、ガン治療において薬物として使用されるペプチドには、乳ガン、肺ガン、前立腺ガン、結腸直腸ガン、胃ガン、皮膚ガン、脳ガン及び子宮頚ガンを含む最も通例のガンの一つを処置するように意図される。
【００５５】
ペプチドの特徴
本発明は、配列番号：１に示すアミノ酸配列と少なくとも85%一致するアミノ酸配列を含み、それに含まれる残基Lys905、Arg909、及びArg912が存在する、医薬として使用するためのペプチドに関する。
【００５６】
本発明の具体的な態様では、前記ペプチドは、配列番号：２に示す配列［X-K905-X-X-X-R909-X-X-R912-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X］（Xは、任意のアミノ酸を表す）を含む。２０アミノ酸の本配列は、医薬としてのペプチドの活性にとって重要な、保存された残基Lys905、Arg909、及びArg912を含む
【００５７】
参照配列、配列番号：１は１２７残基に存する。これらの残基のうち、ヘパリンへの結合の特有の部位は保存された残基Lys905、Arg909、Arg912の寄与が必須であるところとして同定されており（実施例セクション参照）；さらに、残基Arg918及びArg921が、絶対的に必要ではないとしても、ヘパリンへの結合活性に役割を果たすものとして同定されている（Ricard-Blum et al., 2006）。
【００５８】
本発明に係るペプチドは、これらの必須のアミノ酸を含み、そうでなくても、配列番号：１に示す参照配列との８５％の同一性の範囲内で、特に残基の欠失、付加又は置換によって修飾されることができる。特に、前記ペプチドは、その半減期を増加するために、そのバイオアベイラビリティーを増加するために、及び／又はタンパク質分解に対して低感受性とするために修飾されることができる。これらの修飾は、ペプチドの環化、Ｄ−アミノ酸の組み込み、又は非天然アミノ酸の組み込みを含み得る。修飾のいずれも、ペプチドの所望の生物活性を実質的に妨げるべきでない。
【００５９】
本発明の具体的な態様では、ペプチドは、配列番号：３に示すアミノ酸配列を含む。
【００６０】
【化１】
2018508461.tif 000003
【００６１】
本実施形態によれば、ペプチドは、配列番号：３の残基G904と残基P923の間に含まれる２０アミノ酸の配列と１００％の同一性を呈する配列、及びＮ−末端及びＣ−末端部分の他の残基を含む。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態では、前記ペプチドは、配列番号：１に示すような配列に存するアミノ酸配列を有する。
【００６３】
ペプチドは、当業者に公知のあらゆる手段によって、例えば化学合成によって、又は細菌、酵母若しくは真核細胞（動物及び植物細胞など）などの生体システムを用いることによって調製されることができる。ペプチドの合成のために好ましい微生物はE. coli及び酵母である。
【００６４】
適宜に、ペプチドをエンコードする核酸の分子を担持しているベクターを、任意の好適なトランスフォーメーションの技術によって細菌又は真核細胞に導入する。微生物は次いで、一定の攪拌下に好適な培地中で、好適な温度、例えば３７℃で成育され、ベクターによってエンコードされるようなペプチドを生成する。当該ペプチドは次いで、医薬として使用される前に、例えばイオン交換カラムで精製される。特に、精製されたペプチドは質量分析によって分析されて、精製試料中に細菌性混入物質が存在しないことを確認する。
【００６５】
本発明によれば、「ペプチド」の用語は常に、「精製された」又は「単離された」ペプチドを示し、これは細菌用の成長培地に元来存在するタンパク質及び有機分子などの他の成分から、そのペプチドが分離されていることを示す。
【００６６】
本発明の特有の実施形態では、前記ペプチドは検出可能なラベルに結合される。
【００６７】
検出可能なラベルは、それが着色性、蛍光性又は発光性であるので、特にイメージング手順において「検出可能な」化合物を示す。特定の実施形態では、検出可能なラベルは放射活性ラベル、親和性ラベル、磁気粒子、蛍光性又は発光性のラベルのうちから選択される。
【００６８】
特に、検出可能部分は、造影剤又は検出可能なタンパク質であり得る。当業者はいくつかの検出可能なタンパク質（緑色蛍光性タンパク質など）、及びいくつかの蛍光染料（Alexa Fluorファミリーなど）を知っている。
【００６９】
検出可能なラベルは、蛍光性タンパク質であり得る。特に、ペプチドが生体システムにおいて生成されるのであれば、そのペプチドをエンコードする核酸を担持しているベクターはこのような蛍光性タンパク質をエンコードする核酸も含む。
【００７０】
本発明の具体的な態様では、ペプチド及び検出可能なタンパク質の双方を含む融合タンパク質を形成するように、両核酸は、共に転写及び翻訳されるべく同じプロモーターのコントロール下、ベクターに編成される。
【００７１】
本発明の別の態様では、前記ペプチドは発色団基に化学的に融合される。
【００７２】
有利には、前記ペプチドは動物又は患者の体内で、当業者に周知の技術によるインビボイメージングに付されることができる。
【００７３】
ペプチドの投与
本発明の好ましい態様において、医薬としてのその使用で、動物又は個体に前記ペプチドの有効量が投与され、血管新生又は腫瘍部位（一箇所以上）における当該ペプチドの蓄積が得られる。
【００７４】
ペプチドの「有効量」とは、所望の生物学的応答を引き出すのに必要な量を言う。当業者によって認められることができるとおり、有効量は所望の生物学的終点、ペプチドの構造、及び／又はターゲット組織などの因子によって変動し得る。
【００７５】
前記ペプチドは、任意の投与経路によって投与されることができる。好適な経路は、経口、口腔内、吸入スプレーによる、舌下、直腸、経皮、膣内、経粘膜、鼻内若しくは腸内投与、非経口送達（筋肉内、皮下及び静脈内注射を含む）、又は他の送達の態様を含み得る。
【００７６】
好ましい投与方法は、動物又は個体の血液系への非経口投与である。
【００７７】
ガン処置の場合には、血管新生部位（一箇所以上）は主として固形腫瘍を取り囲む部位であり、ここで特にＦＧＦ−２の存在によって動的血管新生プロセスが刺激される。
【００７８】
本発明は特に、その使用がガンの処置のためである前記ペプチドに関し、動物又は個体に前記ペプチドの有効量を投与することにより、血管新生又は腫瘍部位（一箇所以上）における前記ペプチドの蓄積が得られる。
【００７９】
後記の実施例４及び図５Ａは、アミノ酸Lys905、Arg909、及びArg912を含むペプチドＨＥＰＶはマウスの血液系に注射されると血管新生の部位に蓄積するものの、その３つの必須のアミノ酸がアラニンで置換されている対照ペプチドの場合はそうでないことを立証している。
【００８０】
医薬組成物及びパーツのキット
本発明はまた、少なくとも１つの前記ペプチドの有効量と、薬学的に許容し得る賦形剤とを含む医薬組成物にも関する。
【００８１】
薬学的に許容し得る賦形剤は、必要のある動物又は患者に有効化合物を投与するために有用な、無毒の成分で調製される生理的に許容できる賦形剤である。
【００８２】
前記医薬組成物は、異なるペプチド、特に本願で開示されたペプチドから選択される少なくとも２種のペプチドを含み得る。
【００８３】
本医薬組成物はさらに、血管新生を阻害する化合物、特にＶＥＧＦで誘発される血管新生を阻害する化合物を含み得る。
【００８４】
少なくとも１つの前記ペプチドの有効量と、薬学的に許容し得る賦形剤とを含む本医薬組成物は、さらに抗炎症性化合物を含み得る。
【００８５】
少なくとも１つの前記ペプチドの有効量と、薬学的に許容し得る賦形剤とを含む本医薬組成物は、さらに抗ガン性有効成分を含み得る。
【００８６】
少なくとも１つの前記ペプチドの有効量と、薬学的に許容し得る賦形剤とを含む本医薬組成物は、さらにＶＥＧＦで誘発される血管新生を阻害する化合物と消炎剤とを含み得る。
【００８７】
少なくとも１つの前記ペプチドの有効量と、薬学的に許容し得る賦形剤とを含む本医薬組成物は、さらに血管新生を阻害する化合物と抗ガン性有効成分とを含み得る。
【００８８】
少なくとも１つの前記ペプチドの有効量と、薬学的に許容し得る賦形剤とを含む本医薬組成物は、さらに血管新生を阻害する化合物と、消炎剤と抗ガン性有効成分とを含み得る。
【００８９】
有利には、動物又は個体の血液系への前記医薬組成物の投与の後、血管新生又は腫瘍部位（一箇所以上）に前記ペプチドの蓄積が得られる。この特徴は、図５Ａに示すとおり、医薬としての前記ペプチドの使用のために非常に有利である。
【００９０】
本発明はまた、前記ペプチドの有効量、並びに血管新生を阻害する別の化合物、特にＶＥＧＦで誘発される血管新生を阻害する化合物、及び／又は抗炎症性化合物、及び／又は抗ガン性有効成分を含む、パーツのキットにも関する。
【００９１】
前記パーツのキットは、前記ペプチド、並びに血管新生を阻害する化合物、及び／又は抗炎症性化合物、及び／又は抗ガン性有効成分の、異なる時間での患者への投与を可能とする。これらの２成分又は３成分の投与は、同時に又は順次に実施されることができる。
【００９２】
特に、前記パーツのキットは、前記ペプチドの有効量と、血管新生を阻害する化合物とを含む。
【００９３】
別の実施形態では、前記パーツのキットは、前記ペプチドの有効量と、化学療法化合物などの抗ガン性有効成分とを含む。
【００９４】
別の実施形態では、前記パーツのキットは、前記ペプチドの有効量と、抗炎症性化合物とを含む。
【００９５】
別の実施形態では、前記パーツのキットは、前記ペプチドの有効量と、血管新生を阻害する化合物と、化学療法化合物などの抗ガン性有効成分とを含む。
【００９６】
別の実施形態では、前記パーツのキットは、前記ペプチドの有効量と、血管新生を阻害する化合物と、抗炎症性化合物とを含む。
【００９７】
別の実施形態では、前記パーツのキットは、前記ペプチドの有効量と、血管新生を阻害する化合物と、抗炎症性化合物と、抗ガン性有効成分とを含む。特に、前記患者は、第一工程において、血管新生を阻害する化合物、及び／又は抗炎症性化合物、及び／又は抗ガン性有効成分で処置され得、もしその患者がなおも腫瘍周辺で活発な血管新生プロセスを呈しているようであれば、処置の第二工程において、抗ガン性有効成分を伴って又は伴わずに、本発明に係るペプチドが投与される。
【００９８】
有利には、前記患者は他の方法で処置され得る。このような方法は、化学療法、放射線療法又は外科手術を含み得るが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物の投与は、他のガン治療の前に、その間に、又はその後に行われ得る。
【００９９】
本発明はまた、インビトロ又はエクスビボで、ターゲット細胞に対するＦＧＦ−２の生物学的効果を阻害するための方法であって、配列番号：１に示すアミノ酸配列［Ile824-Pro950］と少なくとも８５％一致するアミノ酸配列を含むペプチド（それに含まれる残基Lys905、Arg909及びArg912が存在する）の有効量に、前記細胞を接触させることを含む方法にも関する。
【０１００】
本発明の別の態様では、本ペプチドに、Lys905、Arg909、Arg912、Arg918及びArg921の５残基が保存されている。
【０１０１】
前記方法は、特に、前記ペプチドが配列番号：２に示す保存配列［X-K905-X-X-X-R909-X-X-R912-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X］（Xは任意のアミノ酸である）を含んで実施される。
【０１０２】
本発明の具体的な態様では、前記ペプチドは、配列番号：３に示す保存されたアミノ酸配列［G-K905-P-G-P-R909-G-Q-R912-G-P-T-G-P-R918-G-E-R921-G-P］を含む。
【０１０３】
本発明の好ましい実施形態では、本方法で使用されるペプチドは、配列番号：１に示す配列に存するアミノ酸配列を有する。
【０１０４】
ラベルされたペプチド及びその使用
本発明はまた、配列番号：１に示すアミノ酸配列と少なくとも８５％一致するアミノ酸配列を含み、それに含まれる残基Lys905、Arg909、及びArg912が存在し、検出可能なラベルに結合されるペプチドにも関する。
【０１０５】
本発明の別の態様では、このラベルされたペプチドに、Lys905、Arg909、Arg912、Arg918及びArg921の５残基が保存されている。
【０１０６】
本発明の具体的な態様では、前記ラベルされたペプチドは、配列番号：２に示す保存配列［X-K905-X-X-X-R909-X-X-R912-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X］（Xは任意のアミノ酸である）を含む。
【０１０７】
本発明の具体的な態様では、前記ラベルされたペプチドは、配列番号：３に示す保存されたアミノ酸配列［G-K905-P-G-P-R909-G-Q-R912-G-P-T-G-P-R918-G-E-R921-G-P］を含む。
【０１０８】
本発明の好ましい実施形態では、前記ラベルされたペプチドは、配列番号：１に示す配列に存するアミノ酸配列を有する。
【０１０９】
検出可能なラベルは特に、放射活性ラベル、親和性ラベル、磁気粒子、蛍光性又は発光性のラベルである。検出可能なラベルは、蛍光性タンパク質であり得る。
【０１１０】
本発明の別の態様では、前記ペプチドは、発色団基に化学的に融合される。
【０１１１】
有利には、前記ペプチドは動物又は患者の体内で、当業者に周知の技術によるインビボイメージングに付されることができる。
【０１１２】
本発明はまた、前記ラベルされたペプチドの、特にインビボで用いられるべき、イメージング剤としての使用にも関する。
【０１１３】
本発明はまた、動物の、又はヒト個体の、血管新生部位をイメージングするための方法であって、前記動物に、又は前記ヒト個体に、予め投与されている前記定義のペプチドのラベルを検出する工程を含む方法にも関する。
【０１１４】
本発明はまた、動物の血管新生部位をイメージングするための方法であって、
（ａ）検出可能なラベルを、少なくとも１つの前記のようなペプチドに結合させ、
（ｂ）前記ラベルされたペプチドを前記動物に投与し、及び
（ｃ）動物の殺処分後にラベルを検出する
工程を含む方法にも関する。
【０１１５】
本発明の好ましい態様において、インビボのイメージング剤としてのその使用で、動物又はヒト個体に前記ペプチドの有効量が投与され、血管新生又は腫瘍部位（一箇所以上）における当該ペプチドの蓄積が得られる。
【０１１６】
前記ペプチドは、任意の投与経路によって投与されることができる。好適な経路は、経口、口腔内、吸入スプレーによる、舌下、直腸、経皮、膣内、経粘膜、鼻内若しくは腸内投与、非経口送達（筋肉内、皮下及び静脈内注射を含む）、又は他の送達の態様を含み得る。
【０１１７】
ラベルの検出は、当業者に周知の任意の技術によって実施される。
【０１１８】
実施例
材料及び方法
ＨＥＰＶ及びΔＨＢＳ−ＨＥＰＶの調製及び発現及び精製
リコンビナントＨＥＰＶフラグメント及びΔＨＢＳ−ＨＥＰＶ構築体は、以前に報告されたとおりに調製され、pT7/7発現ベクターのEcoRI及びPstII部位に挿入された。予め得られたpR905Aプラスミド（第９０５位のアルギニンがアラニンで置換されている）を鋳型として用い、QuikChange II部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene, UK）を使用することによって三重突然変異体R905/R909/R912を生成した。点変異は、下記オリゴヌクレオチドを用いて導入した。
【０１１９】
【化２】
2018508461.tif 000004
【０１２０】
ΔＨＢＳ−ＨＥＰＶの同一性は、ヌクレオチド配列決定によって実証された。pHEPVと名付けられたリコンビナント野生型プラスミド、及び得られた突然変異体pΔHBS-HEPVは、塩誘導性proUプロモーターのコントロール下にあるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を担持するE. coli株（ＢＬ２１ ＳＩ−ＧＪ１１５８）に形質転換された。０．２M ＮａＣｌで２０時間誘導した後、細胞を遠心分離によって回収し、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４に再懸濁させ、次いで超音波処理した。遠心分離及び濾過の後、細菌上清を先ずHiTrapSPカラム（Amersham）を用いたカチオン交換クロマトグラフィーに付してほとんどの混入細菌性タンパク質を除去し、Mono Qカラム（Amersham）を用いて均質にまで精製した。画分を含むリコンビナントタンパク質を、１５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に対して透析した。リコンビナントＨＥＰＶフラグメント及びΔＨＢＳ−ＨＥＰＶは、使用まで−２０℃で保管した。
【０１２１】
ヘパリン親和性クロマトグラフィー
Heparin-Sepharose親和性カラム（HiTrap Heparin, Amersham）を５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に平衡化させた。タンパク質試料をカラムにロードして、プログラムされた０〜５００mM ＮａＣｌ、１M Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）の直線勾配を０．５ml／分の流速で適用し、連続的伝導率測定によって確認した。画分（１ml）を集め、及びタンパク質試料の溶出プロファイルを２１４nmでの吸光度をモニターすることによって求めた。突然変異体の溶出位置を正確に比較するために、標準ＨＥＰＶ溶出と対比してＮａＣｌ勾配でのその溶出を成し遂げた。
【０１２２】
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを８×１０６細胞からフェノール−クロロホルム−イソプロパノール抽出（Trizol Reagent, Invitrogen）によって単離した。１μgのＲＮＡに対してＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Promega）を用い、逆転写酵素反応を実施した。I-Cycler Optical System（Biorad）を使用し、SYBR Green Supermix（Biorad）及び特有のプライマーを用いて定量的ＰＣＲを実施した。以下のプライマーが使用された。 
【０１２３】
【化３】
2018508461.tif 000005
【０１２４】
Ｌ３０をハウスキーピング遺伝子として選択し、標準化のために使用した。相対的な転写物存在量は、当業者に周知のとおりに定量された。相対的な遺伝子発現は、２−ΔΔＣＴ法を用いて求められた。スチューデントｔ−検定を用いて、統計的有意性（ｎ＝４）を求めた。
【０１２５】
リン酸化アッセイ
ＨＵＶＥＣは、６ウェルプレートにおいてＥＣＧＭ２に２．１０５細胞／ウェルで播種された。細胞を無血清培地中にて、ＨＥＰＶ又はΔＨＢＳ−ＨＥＰＶ（８μg/mL）で２４時間処理し、次いでＦＧＦ−２又はＶＥＧＦ（５０ng/mL）で３７℃にて５分間、又は２０分間刺激した。次いで細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、擦り取って溶解緩衝液１％ＮＰ−４０（１５０mM ＮａＣｌ、５０mM Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、５mM ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％ＮＰ−４０、完全プロテアーゼインヒビターカクテル（Roche）、１mM Ｎａ３ＶＯ４）にて４℃で溶解させた。遠心分離（１３０００ ｇ、１５分、４℃）後、可溶性タンパク質を集めた。タンパク質量は、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Pierce）によって定量し、等量のタンパク質（１０μg）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードして１００Ｖで１時間かけてＰＶＤＦ膜に転写した。ブロットをＴＢＳ−Ｔ緩衝液（２０αmM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）中５％ＢＳＡでブロッキングし、５％ウシ血清アルブミンを含有するＴＢＳＴ中の一次抗体と、４℃で一晩インキュベーションした。免疫反応性は、Bioradから購入されたセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体及びＥＣＬ検出試薬との順次のインキュベーションによって検出した。ホスホタンパク質検出のために使用した抗体は、以下のとおりであった：抗ＡＫＴ、抗ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、抗ＥＲＫ１／２及び抗ホスホ−ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、Ｔｈｒ１８５／Ｔｙｒ１８７）（全てCell Signaling Technologyより入手）。
【０１２６】
動物実験
全ての動物実験は、実験用動物ケアのＥＥＣガイドライン及び原理（NIH publication 14, no. 86-23, revised 1985）に沿って実施し、そのプロトコールはAnimal Care and Use Committeeによって承認された。雌性無胸腺ＮＭＲＩヌードマウス（Janvier, Le Genest-Isle, France）を本研究で使用し、特定病原体除去条件で維持した。局所外科手術は、一般的な麻酔下に実施され、これはDomitor（Pfizer, Orsay, France）及びImalgene（登録商標）（Merial, Lyon, France）の腹腔内注射を介して誘導された。
【０１２７】
スポンジの移植
Disc Cellsponセルローススポンジ（厚さ２mm、直径１０mm; Cellomeda, Turku, Finland）をマウスの皮下に移植した。移植に先駆けて、スポンジを５０μlのＰＢＳ（陰性対照）又はＦＧＦ−２（２００ng／５０μl；陽性血管新生対照）（リコンビナントＦＧＦ−２、Eurobio-AbCys, Les Ulis, France）で水和させた。移植後、第１日及び第２日に被検ＨＥＰＶペプチドの有無両方で、２００ng ＦＧＦ−２（陽性対照）含有又は非含有（陰性対照）のいずれかの５０μl ＰＢＳと共に、皮膚を通してスポンジを再注射した。
【０１２８】
２Ｄ（二次元）蛍光インビボイメージング
血管新生を第７日に調べた。２Ｄ蛍光イメージングのために、マウス尾静脈へ２００μl ＨＥＰＶ−Ｃｙ５又はＨＥＰＶΔＨＢＳ−ＡｌｅｘＦｌｕｏ７００を静脈内注射し（５０μg）、注射後３時間にイメージングした。干渉フィルターを備えた６６０nm発光ダイオードでマウスを照射して、蛍光イメージ、さらには白黒写真が、ハイパスＲＧ ９フィルタ（Schott, Clichy, France）を取り付けた裏面入射型電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラによって−８０℃で得られた（ORCAII-BT-512G; Hamamatsu, Massy, France）。次いで２００msの間の光子／ピクセルの数を測定するために、ＲＯＩをスポンジ上に配置した。
【０１２９】
ヘモグロビン測定
ＰＢＳ又はＦＧＦ−２で処理されたスポンジの移植、並びに第０、２、３及び５日に５０μg ＨＥＰペプチドを含有する５０μlで処置した後、第８日にヘモグロビン含量を測定した。Doletal （登録商標）の致死注射でマウスを殺処分し、その後直ちにスポンジを摘出して写真を撮った。各スポンジをプロテアーゼインヒビターのカクテルを含有するＲＩＰＡ溶解緩衝液 １ mL中でホモジナイズし、２００ ｇで遠心分離してその上清を定量化した。スポンジ移植片の血管新生の度合いは、Drabkin’s試薬（Sigma-Aldrich、Saint-Quentin Fallavier、フランス）を用いてヘモグロビンの濃度を測定することによって評価した。その結果をmg/mlで表す。
【０１３０】
抗腫瘍性活性
ＴＳ／Ａｐｃ−ｐＧＬ３は、ｐＧＬ３−ルシフェラーゼレポーター遺伝子（Promega, Charbonnieres, France）で安定にトランスフェクトされた原発腺ガンＴＳ／Ａｐｃマウス細胞株から由来する細胞株である。細胞は、１％グルタミン、１０％ウシ胎仔血清、５０単位/ml ペニシリン、５０μg/ml ストレプトマイシン、β−メルカプトエタノール（２５μM）及び７００μg/ml Geneticin（登録商標）（G418硫酸塩; Gibco, Paisley, UK）が追加されたRPMI 1640において、加湿された５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で培養された。
【０１３１】
Janvierat（Le Genest Saint Isle, France）から６〜８週齢で購入した２０匹の雌性無胸腺Swissヌードマウスを使用し、特定病原体除去条件で維持した。マウスは、ＰＢＳ ２００μLに懸濁された１０６ＴＳ／Ａｐｃ−ｐＧＬ３細胞の皮下（ｓ．ｃ．）注射を右側腹部に受けたが、通常は１週間後に６〜８mm直径の腫瘍の形成にいたる。ｓｃ移植後第５日に開始して、マウスは、ＨＥＰ（ｎ＝１０）又はＨＥＰＶΔＨＢＳ（ｎ＝１０）ペプチド ５０μgを含有するＰＢＳ溶液５０μlの腫瘍周囲注射を２箇所、２日ごとに受けた。腫瘍成長はカリパスを用いて評価した。
【０１３２】
第２０日に、３匹のマウス／群を免疫組織学研究用に殺処分した。移植後第３５日には、残っている腫瘍全てを摘出した。
【０１３３】
腫瘍からの凍結切片（８μm）をアセトンで１０分固定した。その後０．１％ Tween 20を含有するトリス緩衝性生理食塩水にて５分間３回、切片を洗浄し、内在性のペルオキシダーゼはメタノール中０．１％Ｈ２Ｏ２で２０分ブロッキングした。次いで切片を、ラットモノクローナル抗ＣＤ３１抗体（ＭＥＣ１３．３；１：５００；Pharmingen）又はウサギ抗Ｋｉ６７（１：１００；ＡｂＣＡＭ）と１時間、そしてＣＤ３１に対するヤギ抗ラット抗体（１：５００；細胞−シグナル伝達）又はＫｉ６７に対するヤギ抗ウサギ（１：２００；Dako）と１時間、連続してインキュベーションした。色原体としてのジアミノベンジジンテトラクロリド（Dako; San Antonio、TX、USA）を用いてペルオキシダーゼ活性を明らかにした。切片をヘマトキシリンで対比染色し、全てをマウントした。
【０１３４】
免疫組織化学による内皮マーカーＣＤ３１に対して染色し、その後低倍率視野（１００×）下に各腫瘍５視野（条件により５腫瘍）を観察した。次いで、ImageJソフトウェア（http:// rsbweb.nih.gov/ij）を利用して、これらの領域の各々における血管量を測定した。全ての計数は盲検的に実施した。
【０１３５】
Ｋｉ６７に対する免疫組織化学染色後、スライドを高倍率視野（２００ｘ）下に観察した。６〜９の腫瘍による領域の写真を撮った。これらの写真をplugging ImmunoRatio in ImageJソフトウェア（http://rsbweb.nih.gov/ij）によって分析した。Ｋｉ６７指数を盲検的に評価し、一視野における、全腫瘍細胞で除したＫｉ６７陽性細胞として算出した。
【０１３６】
実施例１  コラーゲンの発現に対するＨＥＰＶの役割
ＨＥＰＶで調節される遺伝子を同定するために、トランスクリプトームの分析を実施している。内皮ＨＤＭＥＣ細胞は、ＨＥＰＶの有無のもとに４、１２及び２４時間処理された。２１９のアップレギュレーションされる遺伝子のリストで、コラーゲンＩＶ及びＸＶＩＩＩのα１鎖をそれぞれコードする遺伝子COL4A1及びCOL18A1が、血管内皮基底膜内に位置し、切断後に強い抗血管新生活性を持つタンパク質をエンコードするので、非常に関連性ありとして同定されている。
【０１３７】
これらの遺伝子のアップレギュレーション（Up-degulation）は、定量的ＰＣＲによって検証されている（図２）。
【０１３８】
したがってＨＥＰＶは、血管新生プロセスのコントロールに関わるタンパク質の発現を誘導するようである。
【０１３９】
実施例２  ＨＥＰＶ：ΔＨＢＳ−ＨＥＰＶの非機能性突然変異体の調製
前記ペプチドＨＥＰＶは、配列番号：１に示す配列を呈する。
【０１４０】
前記ペプチドΔＨＢＳ−ＨＥＰＶは、配列番号：４に示す配列を呈するが、ここで以下の残基： Lys905、Arg909及びArg912がアラニンで置換されている。
【０１４１】
両ペプチドは、Escherichia coliの細菌系にて生成されている。ペプチドΔＨＢＳ−ＨＥＰＶは、イオン交換 クロマトグラフィのカラムで精製される。図３Ａは、カラム精製前（ライン１）、第一工程後（ライン２）及び第二工程後（ライン３）のEscherichia coli成長培地の上清を示す。
【０１４２】
両ペプチドのヘパリンに対する親和性をヘパリン−セファロースカラムで比較し、これはペプチドを溶出するのに必要なＮａＣｌの量で判定される。
【０１４３】
ＨＥＰＣペプチドは０．３５M ＮａＣｌの濃度で溶出されるが、突然変異ペプチドΔＨＢＳ−ＨＥＰＶは、生理的ＮａＣｌ濃度（０．１５M）に近い０．２Mの濃度で溶出される（図３Ｂ）。
【０１４４】
したがって、ペプチドＨＥＰＶに比べて突然変異体はヘパリンへの結合の重大な能力障害を呈し、陰性対照として次の実験に使用されるのに好適であるらしい。
【０１４５】
実施例３  ＨＥＰＶはＦＧＦ−２及びＶＥＧＦのシグナル伝達経路に作用する
図４に示される実験の目的は、内皮細胞をペプチドＨＥＰＶとインキュベーションした後、ＦＧＦ−２に対する応答が本ペプチドの存在により影響されるかどうかを調べることであった。ＦＧＦ−２に対する測定された応答は、特異抗体で調べられた、ＦＧＦ−２及びＶＥＧＦのシグナル伝達経路に関わるタンパク質ERK 1/2及びAktのリン酸化のレベルである。
【０１４６】
内皮細胞ＨＵＶＥＣは、ＨＥＰＶ又は対照ペプチドΔＨＢＳ−ＨＥＰＶで２４時間処理され、次いで ＦＧＦ−２（図４Ａ）又はＶＥＧＦ（５０ng/ml）（図４Ｂ）で刺激されている。
【０１４７】
処理されない細胞は、ＦＧＦ−２での刺激後にＥＲＫ１のリン酸化の有意な増加（「リン酸化されたＥＲＫ１／２」につき、ラインｐ−ＥＲＫ１／２）を呈する。このリン酸化は、ＨＥＰＶで処理された細胞において阻害されている。これに対し、対照ペプチドΔＨＢＳ−ＨＥＰＶは、ＥＲＫ１／２のリン酸化の阻害に対して効果がない（図４Ａ）。
【０１４８】
ＨＥＰＶでの処置後にさえも、ＶＥＧＦで刺激された全ての細胞がＥＲＫ１／２のリン酸化を呈する（図４Ｂ）ので、ＨＥＰＶの本作用は、ＦＧＦ−２に特異的である。
【０１４９】
ＦＧＦ−２及びＶＥＧＦでの刺激後に、Ａｋｔタンパク質のリン酸化レベルについて類似の結果が観察される。
【０１５０】
実施例４  ＨＥＰＶはマウスにおいて血管の形成にインビボで作用する
ヌードマウスにおいて、セルローススポンジが皮下に移植されたが、このスポンジは血管新生を人工的に刺激するために血管新生因子（ＦＧＦ−２）を含有している。陰性対照スポンジは、ＰＢＳを含む。
【０１５１】
ＨＥＰＶ及びΔＨＢＳ−ＨＥＰＶペプチドは、フルオロフォア（Alexa Fluor 700）に融合されており、マウスの血液系に注射されている。融合タンパク質のインビボでの局在化を追跡するために、３時間ごとに写真撮影を行っている。
【０１５２】
スポンジの部位での蛍光の定量化（図５Ａ）は、以下のことを示唆する。
ＦＧＦ−２を含浸したスポンジの場合、血管新生を刺激しており、融合タンパク質ＨＥＰＶ−ｆｌｕｏはスポンジ内に強く蓄積する。
これに対し、対照の融合タンパク質ΔＨＢＳ−ＨＥＰＶ−ｆｌｕｏはスポンジ内に蓄積しない。
【０１５３】
さらに、ＦＧＦ−２を含浸したスポンジにおいて、新しく形成された血管の数は対照スポンジで観察される数の２倍である（図５Ａ、右側）。
【０１５４】
図示しないが、他の結果は、脱離が特化した臓器である腎臓及び膀胱内を除き、ペプチドＨＥＰＶが種々の器官に非特異的に蓄積しないことを立証している。さらに、このペプチドは肝臓内に蓄積せず、したがって無毒である。
【０１５５】
図５Ｂは、ＨＥＰＶの抗血管新生活性に関しての結果を示す。ＨＥＰＶ又はΔＨＢＳ−ＨＥＰＶ ２０μgを、初日、次いで２日に一度ＰＢＳ又はＦＧＦ−２と同時に注射している。処理７日後に、スポンジを取り出して分析する。血管新生のレベルは、スポンジ内に認められるヘモグロビンのレベルによって測定される。ΔＨＢＳ−ＨＥＰＶで処理されたマウスと比較して（図５Ｂ、右側）、マウスがＨＥＰＶで処理されているとヘモグロビンレベルは有意に減少される（２．５倍）。
【０１５６】
これらの結果は、（ｉ）ＨＥＰＶペプチドは、ＦＧＦ−２で誘発される血管新生を阻害できること、及び（ｉｉ）本効果を得るために、ヘパリンへの機能性結合部位が必要であることを示す。
【０１５７】
実施例５  ＨＥＰＶは腫瘍成長に影響を及ぼす
腫瘍は、ヌードマウスでのマウス乳ガン細胞（ＴＳＡ）の移植によって誘発されている。腫瘍が一旦発生すれば、ＨＥＰＶ（５０μg）の腫瘍内注射を３７日の間、２日に一度実施する。腫瘍の体積をノギスで測定する。
【０１５８】
結果を図６Ａに示す。１８日まで、全ての腫瘍が同じモデルに従って進行する。処置の２０日目から、ＨＥＰＶで処理した腫瘍の成長が実験の終了にいたるまで遅くなっている。
【０１５９】
各群からのマウスを第２０日及び第３３日に殺処分して新規な血管の形成を確認する。血管の評定は、腫瘍試料の観察によって実施される。
【０１６０】
結果を図６Ｂに示す。ΔＨＢＳ−ＨＥＰＶで処理したマウスと比較すると、ＨＥＰＶで処理したマウスにおいて、第２０日に血管密度の有意な減少が観察される。奇妙なことに、第３３日には、その差が小さくなっている。考えられる説明としては、処置のこの工程では、壊死ゾーンの存在が、血管新生プロセスの正当な続行（フォローアップ）を許容しないということにある。
【０１６１】
これらの腫瘍試料に対する抗Ｋｉ６７抗体での腫瘍細胞の増殖もまた実施される。
【０１６２】
結果を図６Ｃに示す。第２０日に、腫瘍細胞増殖の有意な減少が観察される。しかしながら、第３３日には、その増殖は甦るようである。
【０１６３】
【表１】
2018508461.tif 000006
2018508461.tif 000007
2018508461.tif 000008
【０１６４】
引用文献
特許文献
ＵＳ ２０１４／０１００１６４  
ＵＳ ２０１３／０３１６９５０
非特許文献
【表２】
2018508461.tif 000009
2018508461.tif 000010
【図１】
2018508461.tif 000011
【図２】
2018508461.tif 000012
【図３】
2018508461.tif 000013
【図４】
2018508461.tif 000014
【図５Ａ】
2018508461.tif 000015
【図５Ｂ】
2018508461.tif 000016
【図６】
2018508461.tif 000017
【配列表】
2018508461000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年11月1日(2017.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬の調製のための、配列番号：１に示すアミノ酸配列と少なくとも８５％一致するアミノ酸配列を含み、それに含まれる残基Lys905、Arg909、及びArg912が存在する、ペプチドの使用。
【請求項２】
ターゲット細胞に対する、ＦＧＦ−２で誘発される生物学的効果のインヒビターとしての請求項１に記載のペプチドの使用。
【請求項３】
ＦＧＦ−２で誘発される血管新生のインヒビターとしての請求項１又は２のいずれか一項記載のペプチドの使用。
【請求項４】
ガン治療において、特に固形腫瘍治療において、薬物としての請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチドの使用。
【請求項５】
配列番号：２又は配列番号：３に示すアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドの使用。
【請求項６】
そのアミノ酸配列が、配列番号：１に示す配列に存する請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチドの使用。
【請求項７】
細菌、酵母又は真核細胞などの生体システムにおいて生成される請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドの使用。
【請求項８】
検出可能なラベルに結合される請求項１〜７のいずれか一項記載のペプチドの使用。
【請求項９】
動物又は個体に前記ペプチドの有効量を投与することにより、血管新生又は腫瘍部位（一箇所以上）における前記ペプチドの蓄積が得られる、医薬としての請求項３〜８のいずれか一項記載のペプチドの使用。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項記載の少なくとも１つのペプチドの有効量と、薬学的に許容し得る賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１１】
血管新生を阻害する別の化合物、及び／又は抗炎症性化合物、及び／又は抗ガン性有効成分をさらに含む請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項記載のペプチドの有効量、並びに血管新生を阻害する別の化合物、及び／又は抗炎症性化合物、及び／又は抗ガン性有効成分を含む、パーツのキット。
【請求項１３】
配列番号：１に示すアミノ酸配列と少なくとも８５％一致するアミノ酸配列を含み、それに含まれる残基Lys905、Arg909、及びArg912が存在し、検出可能なラベルに結合されるペプチド。
【請求項１４】
前記ペプチドが、放射活性ラベル、親和性ラベル、磁気粒子、蛍光性又は発光性のラベルに結合される請求項８又は１３に記載のペプチド。
【請求項１５】
インビボのイメージング剤としての、請求項１４に記載のペプチドの使用。
【請求項１６】
動物の、又はヒト個体の、血管新生部位をイメージングするための方法であって、前記動物に、又は前記ヒト個体に、予め投与されている請求項１４記載のペプチドのラベルを検出する工程を含む方法。
【国際調査報告】
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