(57)【要約】  本発明は、式(I)の化合物を開示する:【化１】2018530617.tif 000083式中、R1、R2、及びCyは本明細書に定義される通りである。本発明は、IRAKファミリーキナーゼを阻害する化合物、それらの製造方法、それを含む医薬組成物、並びに本発明の化合物を投与することによる、炎症性疾患、自己免疫疾患、及び/又は増殖性疾患の予防及び/又は治療のためにそれを使用する治療の方法に関する。【選択図】  なし
2018530617.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Iの化合物:
【化１】
2018530617.tif 000081
(式中
Cyは
−1つ以上の独立に選択されるR3により任意に置換されている単環式C3-7シクロアルキル、又は
−N、S、及びOから独立に選択される1又は2つのヘテロ原子を含み、1つ以上の独立に選択されるR3により任意に置換されている4〜7員単環式ヘテロシクロアルキルであり;
R1は
−H、
−-SO3H、
−-P(=O)(OH)2、
−C1-4アルキル、
−-C(=O)-(N、S、及びOから独立に選択される1又は2つのヘテロ原子を含む4〜7員単環式ヘテロシクロアルキル)、又は
−C1-6アルキルが1つ以上の独立に選択されるR4基により任意に置換されている-C(=O)C1-6アルキルであり;
R2は、H又はC1-4アルキルであり;
各R3は:
−OH、
−=O、
−ハロ、及び
−C1-4アルキル
から独立に選択され;
各R4は:
−-NR5aR5b、
−-C(=O)OH、
−N、S、及びOから独立に選択される1又は2つのヘテロ原子を含み、1つ以上の独立に選択されるC1-4アルキルにより任意に置換されている4〜7員単環式ヘテロシクロアルキル、及び
−-NHC(=O)-C1-4アルキル-NH2
から独立に選択され;且つ
R5a及びR5bは、独立に、H又はC1-4アルキルである）;
又はその医薬として許容し得る塩若しくは溶媒和物又は溶媒和物の塩。
【請求項２】
Cyが、1又は2つの独立に選択されるR3により置換されている単環式C3-7シクロアルキルである、請求項１記載の化合物又はその医薬として許容し得る塩。
【請求項３】
Cyが、それぞれ1又は2つの独立に選択されるR3により任意に置換されているテトラヒドロピラニル又はテトラヒドロチオピラニルである、請求項１又は２記載の化合物又はその医薬として許容し得る塩。
【請求項４】
R3が、OH、=O、F、及び-CH3から選択される、請求項１〜３のいずれか一項記載の化合物又はその医薬として許容し得る塩。
【請求項５】
式IIa、IIb、IIc、IId、IIe又はIIfによる、請求項１記載の化合物又はその医薬として許容し得る塩:
【化２】
2018530617.tif 000082
。
【請求項６】
R1が、H、-CH3、-SO3H、又は-P(=O)(OH)2である、請求項１〜５のいずれか一項記載の化合物又はその医薬として許容し得る塩。
【請求項７】
R1が、C1-6アルキルが1又は2つの独立に選択されるR4により置換されている-C(=O)C1-6アルキルである、請求項１〜５のいずれか一項記載の化合物又はその医薬として許容し得る塩。
【請求項８】
R1が、C1-6アルキルが1又は2つの独立に選択される-C(=O)OH、-NH2、-NHCH3、又は-N(CH3)2により置換されている-C(=O)C1-6アルキルである、請求項１〜５のいずれか一項記載の化合物又はその医薬として許容し得る塩。
【請求項９】
R2がH又は-CH3である、請求項１〜８のいずれか一項記載の化合物又はその医薬として許容し得る塩。
【請求項１０】
下記から選択される請求項１記載の化合物又はその医薬として許容し得る塩:
6-[6-[2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-エトキシ]-5-(テトラヒドロ-ピラン-4-イルアミノ)-イミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル]-ニコチノニトリル、及び
(S)-2-アミノ-3-メチル-酪酸2-{2-[3-(5-シアノ-ピリジン-2-イル)-5-(テトラヒドロ-ピラン-4-イルアミノ)-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イルオキシ]-エトキシ}-エチルエステル。
【請求項１１】
医薬として許容し得る担体及び医薬として有効な量の請求項１〜１０のいずれか一項記載の化合物又はその医薬として許容し得る塩を含む医薬組成物。
【請求項１２】
さらなる治療剤を含む、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記さらなる治療剤が、炎症性疾患、自己免疫疾患、及び/又は増殖性疾患の予防及び/又は治療のための薬剤である、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
医薬に使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項記載の化合物若しくはその医薬として許容し得る塩又は請求項１１〜１３のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項１５】
炎症性疾患、自己免疫疾患、及び/又は増殖性疾患の予防及び/又は治療に使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項記載の化合物若しくはその医薬として許容し得る塩又は請求項１１〜１３のいずれか一項記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、炎症性疾患、自己免疫疾患、及び/又は増殖性疾患の予防及び/又は治療に有用な化合物に関する。特に、本発明の化合物は、炎症性疾患、自己免疫疾患、及び/又は増殖性疾患に関与するキナーゼのファミリーであるインターロイキン-1受容体関連キナーゼ(IRAK)を、より具体的にはIRAK-4を阻害し得る。本発明は、本発明の化合物の製造方法、本発明の化合物を含む医薬組成物、本発明の化合物を投与することによる、炎症性疾患、自己免疫疾患、及び/又は増殖性疾患の予防及び/又は治療の方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
キナーゼは、細胞生理機能の多くの必須プロセス、例えばタンパク質リン酸化に関与している。特に、プロテインキナーゼ及び脂質キナーゼは、細胞の活性化、成長、分化、及び生存に関与している。プロテインキナーゼは、優先的にチロシン残基をリン酸化するものと、優先的にセリン残基及び/又はスレオニン残基をリン酸化するものに分けることができる。
【０００３】
長年にわたり、キナーゼは、抗炎症性薬物の開発の非常に重要な標的になった(Cohenの文献、2009)。特に、IRAKキナーゼ、より詳細にはIRAK-4は、炎症及び自己免疫疾患において役割を果たすと特定された(Ringwood及びLiの文献、2008;Wangらの文献、2009)。
【０００４】
IRAKは多くの細胞型で発現され、インターロイキン-1(IL-1)及びToll様受容体(TLR)を含む種々の細胞受容体からのシグナルを媒介する。IRAKファミリー中に、4つのメンバー、すなわちIRAK1〜4が特定され(Wangらの文献、2009)、ファミリーの一番新しいメンバーであるIRAK-4は魅力的な治療標的である(Liらの文献、2002)。実際に、IRAK-4は、IL-1受容体及びTLR(TLR3は除く)のすぐ下流で(early downstream)活性化され、IRAK-1及びIRAK-2の迅速な活性化によるシグナル伝達を開始させ、自然免疫応答をもたらす主要なプロテインキナーゼであると考えられている。また、IL-18及びIL-33など他のインターロイキンは、シグナル伝達に関してIRAK-4に依存している。したがって、これらのサイトカインが病原性プロセスに関与している疾患(例えば、線維症(Liらの文献、2014;McHedlidzeらの文献、2013;Rankinらの文献、2010)及びアトピー性皮膚炎(Salimiらの文献、2013))は、IRAK-4阻害剤による治療の潜在的な標的疾患である。
【０００５】
野生型の代りに不活性なIRAK-4変異体を発現しているマウスにおいて、数種のTLRアゴニストによりトリガーされる敗血症ショックに対する完全な耐性並びにIL-1に対する低下した応答が観察される。さらに、野生型の代りに不活性なIRAK-4変異体を発現するマウスは、関節リウマチ(Koziczak-Holbroらの文献、2009)及び多発性硬化症(Staschkeらの文献、2009)などの自己免疫疾患のいくつかのモデルにおいて部分的に保護されている。興味深いことに、関節リウマチ及び全身性エリテマトーデス患者の血清が、IRAK-4依存的に形質細胞様樹状細胞を活性化することが示された(Chiangらの文献、2011)。最後に、再発性化膿性細菌感染が、IRAK-4不活性につながる遺伝子欠損を患っている小児に観察された。これらの化膿性感染が、不活性化するIRAK-4変異を保持する成人には観察されないので、IRAK-4シグナル伝達系は、成人の自然免疫の特定の局面には冗長であるようである。
【０００６】
自然免疫系のシグナル伝達成分の調節不全も、癌の開始及び進行における重要な因子としてますます認識されている(Rhyasen及びStarczynowskiの文献、2015)。実際に、IL-1が、腫瘍細胞成長、血管新生、浸潤、薬剤耐性、及び転移において直接的な役割を果たしていることの証拠がある(Carmiらの文献、2013;Vidal-Vanaclochaらの文献、2000)。さらに、TLRは、腫瘍細胞の状況に応じて多数の腫瘍形成促進（protumor)反応に関与している。IL-1受容体及びTLRシグナル伝達の必須メディエーターとして、IRAKファミリーキナーゼは、期待の持てる癌薬物標的である。さらに、いくつかの癌タイプが、IRAK-4を活性化するTLR及びIL-1Rの下流のアダプター分子、MYD88の活性化された形態に依存性であることが示された。活性化MYD88変異は、例えば、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)(Ngoらの文献、2011)、及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症(Treonらの文献、2012)において特定された。別な報告は、腫瘍学の分野、特にT細胞急性リンパ芽球性白血病(T-ALL)におけるIRAK-4の役割を支持している(Liらの文献、2015)。IRAK-4の薬理学的阻害は、化学療法剤に対するT-ALLの感受性を高めることが示された。
【０００７】
IL-33が、線維性疾患及びアレルギー性疾患、特に喘息及びアトピー性皮膚炎の発生において役割を果たすことが示された(Nabeの文献、2014)。このサイトカインはIRAK-4依存性経路によりシグナル伝達するので(Kroegerらの文献、2009)、これらの疾患もIRAK-4阻害剤の標的であり得る。
【０００８】
最後に、いくつかの自己炎症性疾患が、IL-1活性に依存性であることが示され、その結果、IL-1遮断生物製剤は、これらの患者にとってのいくらかの利点を示す。痛風、若年性特発性関節炎、マックル・ウェルズ病、家族性地中海熱、ベーチェット病、成人発症スティル病は、そのような自己炎症性疾患の例である(Dinarelloらの文献、2012)。
【０００９】
小分子によるサイトカインシグナル伝達の阻害は、免疫炎症性疾患において疾患の転帰を減少させることに役立ち得る(Sundbergらの文献、2014)。特に、サイトカインは、病原体及び感染に対する生物の防衛において役割を果たし得る。しかし、免疫炎症性疾患の新たな療法を開発する場合、複数のサイトカイン応答経路の同時の阻害は免疫系を過度に弱め得るので、獲得免疫及び/又は自然免疫応答を損なわずに阻害できる経路に関与する標的を選択することが一方で重大である。しかし、キナーゼに対する薬物選択性は達成が困難であるが(Bainらの文献、2003;Fabianらの文献、2005)、特に慢性治療の状況ではオフターゲット関連副作用を避けるために非常に望ましい(Broekmanらの文献、2011;Dy及びAdjeiの文献、2013;Force及びKolajaの文献、2011)。
【００１０】
特に、IL-1遮断剤(アナキンラ)及びTNFαブロッカー(エタネルセプト)の同時使用が、好中球減少症及び感染の危険性増大をもたらすことが最近示された(Genoveseらの文献、2003、EMEA public statement EMEA/31631/02, 05 Feb 2003)。この知見は、新たな医薬を開発する際に選択性が重要な要素であることを強調しており、したがって、他のシグナル伝達経路に影響を与えずに、あるシグナル伝達経路を選択的に調節できる化合物、特に、TNFαシグナル伝達経路に影響を与えずにIL-1応答を選択的に調節できる化合物を開発することが望ましいだろう。
【００１１】
現在の療法は満足できるものではないので、炎症性疾患、自己免疫疾患、及び/又は増殖性疾患の予防及び/又は治療において役立ち得る、オフターゲット関連副作用が減少したさらなる化合物を特定する必要が依然として存在する。
【発明の概要】
【００１２】
（発明の概要）
本発明は、新規化合物の特定、並びに炎症性疾患、自己免疫疾患、及び/又は増殖性疾患の予防及び/又は治療におけるそれらの使用に基づいている。特に、本発明の化合物は、IRAK阻害剤、より詳細にはIRAK-4阻害剤であり得る。本発明は、これらの化合物の製造方法、これらの化合物を含む医薬組成物、並びに本発明の化合物を投与することによる、炎症性疾患、自己免疫疾患、及び/又は増殖性疾患の予防及び/又は治療の方法も提供する。
【００１３】
したがって、本発明の第1の態様において、式(I)を有する本発明の化合物が提供される:
【化１】
2018530617.tif 000003
(式中、
Cyは、
−1つ以上の独立に選択されるR3により任意に置換されている単環式C3-7シクロアルキル、又は
−N、S、及びOから独立に選択される1又は2つのヘテロ原子を含み、1つ以上の独立に選択されるR3により任意に置換されている4〜7員単環式ヘテロシクロアルキルであり;
R1は
−H、
−-SO3H、
−-P(=O)(OH)2、
−C1-4アルキル、
−-C(=O)-(N、S、及びOから独立に選択される1又は2つのヘテロ原子を含む4〜7員単環式ヘテロシクロアルキル)、又は
−C1-6アルキルが1つ以上の独立に選択されるR4基により任意に置換されている-C(=O)C1-6アルキルであり;
R2は、H又はC1-4アルキルであり;
各R3は:
−OH、
−=O、
−ハロ、及び
−C1-4アルキル
から独立に選択され;
各R4は:
−-NR5aR5b、
−-C(=O)OH、
−N、S、及びOから独立に選択される1又は2つのヘテロ原子を含み、1つ以上の独立に選択されるC1-4アルキルにより任意に置換されている4〜7員単環式ヘテロシクロアルキル、及び
−-NHC(=O)-C1-4アルキル-NH2
から独立に選択され;且つ
R5a及びR5bは、独立に、H又はC1-4アルキルである）。
【００１４】
一態様において、本発明の化合物は、炎症性疾患、自己免疫疾患、及び/又は増殖性疾患の予防及び/又は治療における使用のために提供される。特定の態様において、本発明の化合物は、IRAKキナーゼファミリーメンバー、より詳細にはIRAK-4を阻害し得る。別の特定の態様において、本発明の化合物は、密接に関連したアナログと比べて、IRAKファミリーキナーゼ、より詳細にはIRAK-4への改善された選択性を示し得て、そのためオフターゲット関連毒性が減少する。さらなる態様において、本発明の化合物は、良好な代謝安定性を示し得るが、それは経口バイオアベイラビリティを改善し得る。
【００１５】
なおさらなる態様において、本発明の化合物は、IRAK-4への選択性を示し得て、それは、安全性を改善し、オフターゲット関連副作用を減少させ得る。特定の態様において、本発明の化合物は、IL-1の選択的阻害剤であり得る。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、本発明の化合物及び医薬担体、賦形剤、又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。特定の態様において、該医薬組成物は、本発明の化合物と組み合わせて使用するのに好適なさらなる治療有効成分をさらに含み得る。より特定の態様において、該さらなる治療有効成分は、炎症性疾患、自己免疫疾患、及び/又は増殖性疾患の予防及び/又は治療のための薬剤である。
【００１７】
さらに、本明細書に開示される医薬組成物及び治療方法において有用な本発明の化合物は、調製及び使用されるときに、医薬として許容し得るものである。
【００１８】
本発明のさらなる態様において、本発明は、本明細書に列記されるものの中から選択される病態、特に、炎症性疾患、自己免疫疾患、及び/又は増殖性疾患に罹患している、哺乳動物、特にヒトを治療する方法であって、有効量の本明細書に記載される本発明の医薬組成物又は化合物を投与することを含む方法を提供する。
【００１９】
本発明はまた、医薬において使用するための、本発明の化合物、及び好適な医薬担体、賦形剤、又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。特定の態様において、該医薬組成物は、炎症性疾患、自己免疫疾患、及び/又は増殖性疾患の予防及び/又は治療において使用するためのものである。
【００２０】
追加の態様において、本発明は、以下で本明細書に開示される代表的な合成プロトコル及び経路を用いて、本発明の化合物を合成する方法を提供する。
【００２１】
他の目的及び利点は、次の詳細な説明の考察から、当業者に明らかになるであろう。
【００２２】
本発明の化合物が代謝されて、生体活性のある代謝物を生じることが認識されるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
（定義）
以下の用語は、それとともに以下に提示される意味を有することが意図され、本発明の説明及び意図される範囲を理解する際に有用である。
【００２４】
化合物、そのような化合物を含む医薬組成物、並びにそのような化合物及び組成物を使用する方法を含み得る本発明を説明する場合、以下の用語は、存在する場合、特記されない限り、以下の意味を有する。本明細書に記載される場合、下記に定義される部分はいずれも、種々の置換基で置換され得ること、及びそれぞれの定義が、そのような置換部分を以下に示されるようなその範囲内に含むことが意図されることも理解されるべきである。特記されない限り、「置換された」という用語は、以下に示されるように定義されるものとする。「基」及び「ラジカル」という用語が、本明細書で使用される場合、互換的であるとみなされ得ることがさらに理解されるべきである。
【００２５】
「a」及び「an」という冠詞は、本明細書において、1つ又は複数の(すなわち、少なくとも1つの)該冠詞の文法上の対象を指すように使用され得る。例として、「アナログ(an analogue)」は、1つのアナログ又は複数のアナログを意味する。
【００２６】
「アルキル」は、明示された数の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖の脂肪族炭化水素を意味する。特定のアルキル基は、1〜6つの炭素原子又は1〜4つの炭素原子を有する。分岐鎖は、メチル、エチル、又はプロピルなどの１つ以上のアルキル基が直鎖アルキル鎖に結合していることを意味する。特定のアルキル基は、メチル(-CH3)、エチル(-CH2-CH3)、n-プロピル(-CH2-CH2-CH3)、イソプロピル(-CH(CH3)2)、n-ブチル(-CH2-CH2-CH2-CH3)、tert-ブチル(-CH2-C(CH3)3)、sec-ブチル(-CH2-CH(CH3)2)、n-ペンチル(-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3)、n-ヘキシル(-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3)、及び1,2-ジメチルブチル(-CHCH3)-C(CH3)H2-CH2-CH3)である。特定のアルキル基は1〜4つの炭素原子を有する。
【００２７】
「アルコキシ」は、アルキル基が明示された数の炭素原子を有する基O-アルキルを指す。特に、該用語は、基-O-C1-6アルキルを指す。特定のアルコキシ基は、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、tert-ブトキシ、sec-ブトキシ、n-ペントキシ、n-ヘキソキシ、及び1,2-ジメチルブトキシである。特定のアルコキシ基は、低級アルコキシ、すなわち1〜6つの炭素原子を有するものである。さらなる特定のアルコキシ基は、1〜4つの炭素原子を有する。
【００２８】
「アルケニル」は、明示された数の炭素原子を有する一価オレフィン系(不飽和)炭化水素基を指す。特定のアルケニルは、2〜8つの炭素原子、より特には2〜6つの炭素原子を有し、それは直鎖でも分岐鎖でもよく、少なくとも1つ、特に1〜2つのオレフィン系不飽和部位を有する。特定のアルケニル基には、エテニル(-CH=CH2)、n-プロペニル(-CH2CH=CH2)、イソプロペニル(-C(CH3)=CH2)などがある。
【００２９】
「アミノ」はラジカル-NH2を指す。
【００３０】
「アリール」は、親芳香環系の単一の炭素原子からの1つの水素原子の除去により誘導された一価芳香族炭化水素基を指す。特に、アリールは、明示された数の環原子を有する、単環式又は多環式の芳香環構造を指す。具体的には、この用語は、6〜10個の環員を含む基を含む。アリール基が単環式環系である場合、それは優先的に6つの炭素原子を含有する。特に、アリール基には、フェニル及びナフチルがある。
【００３１】
「シクロアルキル」は、明示された数の環原子を有する、単環式、縮合多環式、架橋多環式、又はスピロ環式の非芳香族ヒドロカルビル環構造を指す。シクロアルキルは、3〜12個の炭素原子、特に、3〜10個、より特には3〜7個の炭素原子を有し得る。そのようなシクロアルキル基には、例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、及びシクロヘプチルなどの単環構造がある。
【００３２】
「シアノ」はラジカル-CNを指す。
【００３３】
「ハロ」又は「ハロゲン」は、フルオロ(F)、クロロ(Cl)、ブロモ(Br)、及びヨード(I)を指す。特定のハロ基は、フルオロかクロロのいずれかである。
【００３４】
化合物又は化合物上に存在する基を説明するために使用される場合の「ヘテロ」は、該化合物又は基中の1つ以上の炭素原子が窒素、酸素、又は硫黄ヘテロ原子により置き換えられていることを意味する。ヘテロは、1〜4つ、特に1、2又は3つのヘテロ原子、より典型的には1又は2つのヘテロ原子、例えば単一のヘテロ原子を有するアルキル、例えばヘテロアルキル、シクロアルキル、例えばヘテロシクロアルキル、アリール、例えばヘテロアリールなど、上述のヒドロカルビル基のいずれにも適用され得る。
【００３５】
「ヘテロシクロアルキル」は、O、N、及びSから独立に選択される１つ以上のヘテロ原子及び明示された数の環原子を含む、単環式、縮合多環式、スピロ環式、又は架橋多環式の非芳香族完全飽和環構造を意味する。ヘテロシクロアルキル環構造は、4〜12個の環員、特に4〜10個の環員、より特には4〜7個の環員を有し得る。各環は、典型的には窒素、硫黄、及び酸素から選択される、最大で4つのヘテロ原子を含み得る。典型的には、ヘテロシクロアルキル環は、最大4つのヘテロ原子、より典型的には最大3つのヘテロ原子、より普通には2つまで、例えば単一のヘテロ原子を含むだろう。複素環式環の例には、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル(例えば、1-ピロリジニル、2-ピロリジニル、及び3-ピロリジニル)、テトラヒドロフラニル(例えば、1-テトラヒドロフラニル、2-テトラヒドロフラニル、及び3-テトラヒドロフラニル)、テトラヒドロチオフェニル(例えば、1-テトラヒドロチオフェニル、2-テトラヒドロチオフェニル、及び3-テトラヒドロチオフェニル)、ピペリジニル(例えば、1-ピペリジニル、2-ピペリジニル、3-ピペリジニル、及び4-ピペリジニル)、テトラヒドロピラニル(例えば、4-テトラヒドロピラニル)、テトラヒドロチオピラニル(例えば、4-テトラヒドロチオピラニル)、モルホリニル、チオモルホリニル、ジオキサニル、又はピペラジニルがあるが、これらに限定されない。
【００３６】
単環式環の特定の例は以下の実例に示される:
【化２】
2018530617.tif 000004
（式中、各W及びYは、-CH2-、-NH-、-O-、及び-S-から独立に選択される）。
【００３７】
縮合二環式環の特定の例は以下の実例に示される:
【化３】
2018530617.tif 000005
（式中、各W及びYは、-CH2-、-NH-、-O-、及び-S-から独立に選択される）。
【００３８】
架橋二環式環の特定の例は以下の実例に示される:
【化４】
2018530617.tif 000006
（式中、各W及びYは、-CH2-、-NH-、-O-、及び-S-から独立に選択される）。
【００３９】
スピロ環式環の特定の例は以下の実例に示される:
【化５】
2018530617.tif 000007
（式中、各Yは、-CH2-、-NH-、-O-、及び-S-から選択される）。
【００４０】
「ヒドロキシル」は、ラジカル-OHを指す。
【００４１】
「オキソ」は、ラジカル=Oを指す。
【００４２】
「置換された」は、1つ以上の水素原子が、それぞれ独立に、同じ又は異なる置換基(複数可)により置換されている基を指す。
【００４３】
「スルホ」又は「スルホン酸」は、-SO3Hなどのラジカルを指す。
【００４４】
本明細書で使用される通り、「1つ以上により置換された」という用語は、1〜4つの置換基を指す。一実施態様において、この用語は、1〜3つの置換基を指す。さらなる実施態様において、この用語は、1又は2つの置換基を指す。またさらなる実施態様において、この用語は、1つの置換基を指す。
【００４５】
有機合成の分野の当業者は、芳香族であるか非芳香族であるかに関わらず、安定で、化学的に実現可能なヘテロ環式環中のヘテロ原子の最大数が、環のサイズ、不飽和度、及びヘテロ原子の原子価によって決定されることを認識しているであろう。一般に、ヘテロ環式環は、芳香族ヘテロ環が化学的に実現可能で且つ安定である限り、1〜4つのヘテロ原子を有し得る。
【００４６】
「医薬として許容し得る」とは、動物、より特にはヒトでの使用について、連邦政府若しくは州政府の規制当局又は米国以外の国の対応する規制当局により承認されている又は承認され得ること、或いは米国薬局方又は他の一般に認められた薬局方に収載されていることを意味する。
【００４７】
「医薬として許容し得る塩」は、医薬として許容し得て、親化合物の所望の薬理活性を有する本発明の化合物の塩を指す。特に、そのような塩は非毒性であり、無機又は有機の酸付加塩及び塩基付加塩であり得る。具体的には、そのような塩には、(1)塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸により形成された酸付加塩;又は酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、3-(4-ヒドロキシベンゾイル)安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、1,2-エタン-ジスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、4-クロロベンゼンスルホン酸、2-ナフタレンスルホン酸、4-トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、4-メチルビシクロ[2.2.2]-オクタ-2-エン-1-カルボン酸、グルコヘプトン酸、3-フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、tert-ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸などの有機酸により形成された酸付加塩;或いは(2)親化合物中に存在する酸性プロトンが、金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、若しくはアルミニウムイオンにより置換されているか;又は有機塩基、例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、N-メチルグルカミンなどと配位するときに形成される塩がある。塩としては、ほんの一例として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウムなど;及び化合物が塩基性官能基を含有する場合、無毒な有機酸又は無機酸の塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩などがさらに挙げられる。「医薬として許容し得るカチオン」という用語は、酸性官能基の許容し得るカチオン性対イオンを指す。そのようなカチオンは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウムカチオンなどにより例示される。
【００４８】
「医薬として許容し得るビヒクル」は、それとともに本発明の化合物が投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又は担体を指す。
【００４９】
「プロドラッグ」は、切断可能な基を有し、且つ加溶媒分解によるか又は生理的条件下で、インビボで医薬として活性がある本発明の化合物になる、本発明の化合物の誘導体を含む化合物を指す。そのような例としては、コリンエステル誘導体及び同類のもの、N-アルキルモルホリンエステル及び同類のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
「溶媒和物」は、溶媒と、通常、加溶媒分解反応によって会合している化合物の形態を指す。この物理的会合には、水素結合が含まれる。従来の溶媒としては、水、エタノール、酢酸などが挙げられる。本発明の化合物は、例えば、結晶形態で調製することができ、溶媒和されたものであっても、水和されたものであってもよい。好適な溶媒和物には、医薬として許容し得る溶媒和物、例えば水和物が含まれ、さらに、化学量論的溶媒和物と非化学量論的溶媒和物の両方が含まれる。ある例において、溶媒和物は、例えば、1つ以上の溶媒分子が、結晶性固体の結晶格子中に組み込まれている場合、分離することができる。「溶媒和物」は、溶液相と分離可能溶媒和物との両方を包含する。代表的な溶媒和物としては、水和物、エタノラート、及びメタノラートが挙げられる。
【００５１】
「対象」には、ヒトが含まれる。「ヒト」、「患者」、及び「対象」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
【００５２】
「有効量」は、疾患の治療のために対象に投与されたとき、そのような疾患の治療をもたらすのに十分である、本発明の化合物の量を意味する。「有効量」は、化合物、疾患及びその重症度、並びに治療されるべき対象の年齢、体重などによって異なり得る。
【００５３】
「予防する」又は「予防」は、疾患又は障害を獲得又は発症するリスクを低下させること(すなわち、疾患を引き起こす原因物質に暴露され得るか、又は疾患に罹る素因を有し得る対象において、疾患の発症前に疾患の臨床症状の少なくとも1つを発症させないこと）を指す。
【００５４】
「予防(prophylaxis)」という用語は、「予防(prevention)」に関連し、その目的が、疾患を治療し、又は治癒させることではなく、疾患を予防することである対策又は処置を指す。予防対策の非限定的な例としては、ワクチンの投与;例えば、動けないことが原因で血栓症のリスクがある入院患者への低分子量ヘパリンの投与;及びマラリアが風土病であるか、又はマラリアに罹るリスクが高い地理的地域への訪問に先立つ抗マラリア剤、例えば、クロロキンの投与を挙げることができる。
【００５５】
任意の疾患若しくは障害を「治療する」又は任意の疾患若しくは障害の「治療」は、一実施態様において、疾患又は障害を改善させること(すなわち、疾患を止めること、又はその臨床症状のうちの少なくとも1つの徴候、範囲、若しくは重症度を低下させること)を指す。別の実施態様において、「治療する」又は「治療」は、対象によって認識され得ない少なくとも1つの身体的パラメーターを改善させることを指す。また別の実施態様において、「治療する」又は「治療」は、疾患又は障害を、身体的に調節すること(例えば、認識可能な症状の安定化)、生理的に調節すること(例えば、身体的パラメーターの安定化)、又はその両方のいずれかを指す。さらなる実施態様において、「治療する」又は「治療」は、疾患の進行を遅らせることに関する。
【００５６】
本明細書で使用される通り、用語「アレルギー性疾患(複数可)」は、アレルギー性気道疾患(例えば、喘息、鼻炎)、アトピー性皮膚炎、副鼻腔炎、湿疹及び蕁麻疹、並びに食物アレルギー又は昆虫毒に対するアレルギーを含む、免疫系の過敏症障害を特徴とする病態の群を指す。
【００５７】
本明細書で使用される通り、本明細書で使用される用語「喘息」は、あらゆる原因(内因性、外因性、又は両方;アレルギー性又は非アレルギー性)の気道収縮と関連する肺の気流の変動を特徴とする、肺のあらゆる疾患を指す。用語喘息は、原因を示す１つ以上の形容詞と共に使用され得る。
【００５８】
本明細書で使用される通り、用語「炎症性疾患(複数可)」は、関節リウマチ、変形性関節症、若年性特発性関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、アレルギー性気道疾患(例えば、喘息、鼻炎)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、炎症性腸疾患(IBD、例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎)、過敏性腸症候群、内毒素により推進される病態(例えば、バイパス手術後の合併症又は例えば慢性心不全の一因となる慢性内毒素状態)、成人発症スティル病、マックル・ウェルズ症候群、家族性寒冷自己炎症性症候群(FCAS)、ベーチェット病、家族性地中海熱、痛風、新生児発症多臓器炎症性疾患(NOMID)、シュニッツラー症候群、及び関節の疾患など軟骨が関与する関連疾患を含む病態の群を指す。特に、該用語は、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、乾癬、変形性関節症、アレルギー性気道疾患(例えば、喘息)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、及び炎症性腸疾患を指す。より特に、該用語は、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、乾癬、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、及び炎症性腸疾患を指す。
【００５９】
本明細書で使用される通り、用語「自己免疫疾患(複数可)」は、COPD、喘息(例えば、内因性喘息、外因性喘息、塵埃喘息、小児喘息)、特に慢性又は難治性喘息(例えば、遅発性喘息及び気道過剰反応性)などの病態を含む閉塞性の気道疾患、気管支喘息を含む気管支炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、皮膚エリテマトーデス、ループス腎炎、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、乾癬、ドライアイ疾患、I型糖尿病及びそれと関連する合併症、アトピー性湿疹(アトピー性皮膚炎)、甲状腺炎(橋本甲状腺炎及び自己免疫性甲状腺炎)、接触性皮膚炎及びさらなる湿疹性皮膚炎、炎症性腸疾患(例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎)、アテローム性動脈硬化、並びに筋萎縮性側索硬化症を含む疾患の群を指す。特に、該用語は、COPD、喘息、全身性エリテマトーデス、I型糖尿病、及び炎症性腸疾患を指す。
【００６０】
本明細書で使用される通り、用語「線維症」は、全身性強皮症、特発性肺線維症、並びに他の形態の肺線維症及び間質性肺疾患、アルコール性脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、腎線維症、並びに炎症性腸疾患の結果としての結腸の線維症を指す。
【００６１】
本明細書で使用される通り、「増殖性疾患」という用語は、癌(例えば、子宮平滑筋肉腫若しくは前立腺癌)、骨髄増殖性障害(例えば、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、及び骨髄線維症)、白血病(例えば、急性骨髄性白血病、急性及び慢性リンパ芽球性白血病)、多発性骨髄腫、乾癬、再狭窄、強皮症、又は線維症などの病態を指す。特に、該用語は、癌、白血病、多発性骨髄腫、及び乾癬を指す。
【００６２】
本明細書で使用される通り、「癌」という用語は、皮膚における、又は例えば、非限定的に、乳房、前立腺、肺、腎臓、膵臓、胃、若しくは腸などの身体器官における細胞の悪性又は良性増殖を指す。癌は、隣接組織に浸潤し、遠隔器官、例えば、骨、肝臓、肺、又は脳に拡大(転移)する傾向がある。本明細書で使用される通り、癌という用語は、転移性腫瘍細胞型(例えば、非限定的に、黒色腫、リンパ腫、白血病、線維肉腫、横紋筋肉腫、及び肥満細胞腫)と組織癌型(例えば、非限定的に、結腸直腸癌、前立腺癌、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌、乳癌、膵癌、膀胱癌、腎臓癌、胃癌、膠芽腫、原発性肝癌、卵巣癌、前立腺癌、並びに子宮平滑筋肉腫)の両方を含む。特に、「癌」という用語は、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星細胞腫、非定型奇形腫様/横紋筋様腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌(骨肉腫及び悪性線維性組織球腫)、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、脳脊髄腫瘍、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、子宮頸癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚T細胞リンパ腫、胚芽腫、子宮内膜癌、上衣芽細胞腫、上衣腫、食道癌、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、眼癌、網膜芽腫、胆嚢癌、胃(gastric)(胃(stomach))癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍(GIST)、消化管間質細胞腫瘍、胚細胞腫瘍、神経膠腫、有毛細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞(肝臓)癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内メラノーマ、膵島細胞腫瘍(内分泌膵臓)、カポジ肉腫、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球増加症、喉頭癌、白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、バーキットリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、髄芽腫、髄様上皮腫、黒色腫、中皮腫、口腔癌、慢性骨髄性白血病、骨髄性白血病、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵癌、乳頭腫症、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、中等度分化型の松果体実質腫瘍、松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞新生物/多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞(腎臓)癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、カポジ肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮細胞癌、胃(stomach)(胃(gastric))癌、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、T細胞リンパ腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、並びにウィルムス腫瘍を指す。
【００６３】
本明細書で使用される通り、「白血病」という用語は、血液及び造血器官の腫瘍性疾患を指す。そのような疾患は、宿主を極めて感染及び出血しやすい状態にする骨髄及び免疫系の機能障害を引き起こし得る。特に、白血病という用語は、急性骨髄性白血病(AML)及び急性リンパ芽球性白血病(ALL)及び慢性リンパ芽球性白血病(CLL)を指す。
【００６４】
「本発明の化合物(複数可）」及び等価な表現は、本明細書に記載される式(複数可)の化合物を包含することを意味し、文脈上許容される場合、その表現には、医薬として許容し得る塩、及び溶媒和物、例えば、水和物、並びに医薬として許容し得る塩の溶媒和物が含まれる。同様に、中間体への言及は、それら自体が特許請求されているかどうかに関わらず、文脈上許容される場合、それらの塩及び溶媒和物を包含することを意味する。
【００６５】
本明細書において範囲が言及される場合(例えば、非限定的に、C1-8アルキル)、範囲の引用は、該範囲の各々のメンバーの表示とみなされるべきである。
【００６６】
本発明の化合物の他の誘導体は、それらの酸と酸誘導体形態の両方で活性を有するが、酸感受性形態は、多くの場合、哺乳動物での溶解性、組織適合性、又は遅延放出という利点を提供する(Bundgaardの文献、1985)。プロドラッグには、当業者に周知の酸誘導体、例えば、親酸と好適なアルコールとの反応により調製されるエステル、又は親酸化合物と置換若しくは非置換アミンとの反応により調製されるアミド、又は酸無水物、又は混合無水物などが含まれる。本発明の化合物についている酸性基から誘導される単純な脂肪族又は芳香族エステル、アミド、及び無水物は、特に有用なプロドラッグである。場合によっては、(アシルオキシ)アルキルエステル又は((アルコキシカルボニル)オキシ)アルキルエステルなどの二重エステル型プロドラッグを調製することが望ましい。特定のそのようなプロドラッグは、本発明の化合物のC1-8アルキル、C2-8アルケニル、C6-10により任意に置換されたアリール、及び(C6-10アリール)-(C1-4アルキル)エステルである。
【００６７】
本明細書で使用される通り、「同位体変種」という用語は、そのような化合物を構成する原子のうちの1つ以上において非天然の比率の同位体を含有する化合物を指す。例えば、化合物の「同位体変種」は、例えば、重水素(2H又はD)、炭素-13(13C)、窒素-15(15N)、又は同類のものなどの1以上の非放射性同位体を含有し得る。そのような同位体置換が行なわれる化合物において、以下の原子は、存在する場合、例えば、任意の水素が2H/Dとなり得、任意の炭素が13Cとなり得、又は任意の窒素が15Nとなり得るように、異なり得るということ、並びにそのような原子の存在及び配置は当技術分野の技量の範囲内で決定され得ることが理解されるであろう。同様に、本発明は、例えば、得られる化合物を薬物及び/又は基質の組織分布研究に使用できる場合、放射性同位体を用いた同位体変種の調製を含み得る。放射性同位体トリチウム、すなわち3H、及び炭素-14、すなわち14Cは、それらの取込みが容易であり、且つ検出手段が整っていることを考慮すると、本目的に特に有用である。さらに、11C、18F、15O、及び13Nなどの陽電子放出同位体により置換されており、且つ陽電子放出断層撮影(PET)研究において基質受容体占有率を調べるのに有用である化合物を調製することができる。
【００６８】
同じ分子式を有するが、その原子の結合の性質若しくは配列、又はその原子の空間内での配置が異なる化合物が「異性体」と称されることも理解されるべきである。その原子の空間内での配置が異なる異性体は、「立体異性体」と称される。
【００６９】
互いの鏡像でない立体異性体は「ジアステレオマー」と称され、互いの重ね合わせることのできない鏡像である立体異性体は「エナンチオマー」と称される。化合物が不斉中心を有する場合、例えば、それが4つの異なる基に結合している場合、エナンチオマー対が可能である。エナンチオマーは、その不斉中心の絶対配置によって特徴付けることができ、カーン及びプレローグのR-及びS-順位則によって記述されるか、又は分子が偏光面を回転させる様式によって記述され、右旋性若しくは左旋性として(すなわち、それぞれ(+)又は(-)-異性体として)明示される。キラル化合物は、個々のエナンチオマーとしても、その混合物としても存在し得る。同じ比率のエナンチオマーを含有する混合物は、「ラセミ混合物」と呼ばれる。
【００７０】
「互変異性体」は、特定の化合物構造の互換的形態であり、且つ水素原子及び電子の転位の点で異なる化合物を指す。したがって、2つの構造は、π電子及び原子(通常、H)の移動を介して平衡となり得る。例えば、エノールとケトンは、酸か塩基のいずれかによる処理により速やかに相互変換されるので、互変異性体である。互変異性の別の例は、フェニルニトロメタンのアシ形態及びニトロ形態であり、これらは酸又は塩基による処理により同様に形成される。
【００７１】
互変異性形態は、対象となる化合物の最適な化学反応性及び生体活性の実現に関連し得る。
【００７２】
本発明の化合物は、1つ以上の不斉中心を有することがあり;したがって、そのような化合物は、個々の(R)-若しくは(S)-立体異性体としても、それらの混合物としても製造され得る。
【００７３】
別途示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲における特定の化合物の記載又は命名は、個々のエナンチオマーと、ラセミ体かそうでないかにかかわらず、その混合物の両方を含むことが意図される。立体化学の決定及び立体異性体の分離のための方法は、当技術分野において周知である。
【００７４】
本発明の化合物が代謝されて、生体活性のある代謝体を生じることが認識されるであろう。
【００７５】
(本発明）
本発明は、新規化合物の特定、炎症性疾患、自己免疫疾患、及び/又は増殖性疾患の予防及び/又は治療におけるその使用に基づいている。特に、該化合物は、IRAK、より詳細にはIRAK-4を阻害し得る。
【００７６】
本発明は、これらの化合物の製造方法、これらの化合物を含む医薬組成物、並びに、本発明の化合物を投与することによる、炎症性疾患、自己免疫疾患、及び/又は増殖性疾患の予防及び/又は治療の方法も提供する。
【００７７】
したがって、本発明の第1の態様において、式(I)を有する本発明の化合物が提供される:
【化６】
2018530617.tif 000008
（式中、
Cyは
−1、2、又は3つの独立に選択されるR3により任意に置換されている単環式C3-7シクロアルキル、又は
−N、S、及びOから独立に選択される1又は2つのヘテロ原子を含み、1、2、又は3つの独立に選択されるR3により任意に置換されている4〜7員単環式ヘテロシクロアルキルであり;
R1は
−H、
−-SO3H、
−-P(=O)(OH)2、
−C1-4アルキル、
−-C(=O)-(N、S、及びOから独立に選択される1又は2つのヘテロ原子を含む4〜7員単環式ヘテロシクロアルキル)、又は
−C1-6アルキルが1つ以上の独立に選択されるR4により任意に置換されている-C(=O)C1-6アルキルであり;
R2は、H又はC1-4アルキルであり;
各R3は:
−OH、
−=O、
−ハロ、及び
−C1-4アルキル
から独立に選択され;
各R4は:
−-NR5aR5b、
−-C(=O)OH、
−N、S、及びOから独立に選択される1又は2つのヘテロ原子を含み、1つ以上の独立に選択されるC1-4アルキルにより任意に置換されている4〜7員単環式ヘテロシクロアルキル、及び
−-NHC(=O)-C1-4アルキル-NH2
から独立に選択され;且つ
R5a及びR5bは、独立に、H又はC1-4アルキルである）。
【００７８】
一実施態様において、本発明の化合物は、Cyが単環式C3-7シクロアルキルである式Iによるものである。特定の実施態様において、Cyはシクロヘキシルである。
【００７９】
一実施態様において、本発明の化合物は、Cyが、1、2、又は3つの独立に選択されるR3により置換されている単環式C3-7シクロアルキルである式Iによるものである。特定の実施態様において、Cyは、1、2、又は3つの独立に選択されるR3により置換されているシクロヘキシルである。別の特定の実施態様において、Cyは、1又は2つのR3により置換されている単環式C3-7シクロアルキルである。より特定の実施態様において、Cyは、1又は2つの独立に選択されるR3により置換されているシクロヘキシルである。
【００８０】
一実施態様において、本発明の化合物は、Cyが、N、S、及びOから独立に選択される1又は2つのヘテロ原子を含む4〜7員単環式ヘテロシクロアルキルである式Iによるものである。特定の実施態様において、Cyは、テトラヒドロピラニル又はテトラヒドロチオピラニルである。より特定の実施態様において、Cyは
【化７】
2018530617.tif 000009
である。
【００８１】
一実施態様において、本発明の化合物は、Cyが、N、S、及びOから独立に選択される1又は2つのヘテロ原子を含み、1、2、又は3つの独立に選択されるR3により置換されている単環式4〜7員単環式ヘテロシクロアルキルである式Iによるものである。別の実施態様において、Cyは、それぞれ1、2、又は3つの独立に選択されるR3により置換されているテトラヒドロピラニル又はテトラヒドロチオピラニルである。特定の実施態様において、Cyは、N、S、及びOから独立に選択される1又は2つのヘテロ原子を含み、1又は2つのR3により置換されている4〜7員単環式ヘテロシクロアルキルである。別の特定の実施態様において、Cyは、それぞれ1又は2つの独立に選択されるR3により置換されているテトラヒドロピラニル又はテトラヒドロチオピラニルである。より特定の実施態様において、Cyは、それぞれ1又は2つの独立に選択されるR3により置換されている
【化８】
2018530617.tif 000010
である。
【００８２】
一実施態様において、本発明の化合物は、各R3が、OH、=O、ハロ、及びC1-4アルキルから選択される式Iによるものである。特定の実施態様において、各R3は、OH、=O、F、及び-CH3から選択される。より特定の実施態様において、各R3は、OH及び-CH3から選択される。別のより特定の実施態様において、各R3はFである。さらに別のより特定の実施態様において、各R3は=Oである。
【００８３】
一実施態様において、本発明の化合物は、式IIa、IIb、IIc、IId、IIe、又はIIfによるものである:
【化９】
2018530617.tif 000011
（式中、R1及びR2は上述の通りである）。
【００８４】
一実施態様において、本発明の化合物は、R1が、H、-SO3H、又は-P(=O)(OH)2である、式I〜IIfのいずれか1つによるものである。
【００８５】
一実施態様において、本発明の化合物は、R1がC1-4アルキルである、式I〜IIfのいずれか1つによるものである。特定の実施態様において、R1は、-CH3、-CH2CH3、又は-CH(CH3)2である。より特定の実施態様において、R1は-CH3である。
【００８６】
一実施態様において、本発明の化合物は、R1が、-C(=O)-(N、S、及びOから独立に選択される1又は2つのヘテロ原子を含む4〜7員単環式ヘテロシクロアルキル)である、式I〜IIfのいずれか1つによるものである。特定の実施態様において、R1は-C(=O)-ピロリジニルである。
【００８７】
一実施態様において、本発明の化合物は、R1が-C(=O)C1-6アルキルである、式I〜IIfのいずれか1つによるものである。特定の実施態様において、R1が、C1-6アルキルが、-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、又は-CH2(CH(CH3)2)から選択される-C(=O)C1-6アルキルである。
【００８８】
一実施態様において、本発明の化合物は、R1が、C1-6アルキルが1つ以上の独立に選択されるR4により置換されている-C(=O)C1-6アルキルである、式I〜IIfのいずれか1つによるものである。特定の実施態様において、R1は、C1-6アルキルが、それぞれ1つ以上の独立に選択されるR4により置換されている-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、又は-CH2(CH(CH3)2)から選択される-C(=O)C1-6アルキルである。別の特定の実施態様において、R1は、C1-6アルキルが、1又は2つの独立に選択されるR4により置換されている-C(=O)C1-6アルキルである。より特定の実施態様において、R1は、C1-6アルキルが、それぞれ1又は2つの独立に選択されるR4により置換されている-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、又は-CH2(CH(CH3)2)から選択される-C(=O)C1-6アルキルである。
【００８９】
一実施態様において、本発明の化合物は、式I〜IIfのいずれか1つによるものであり、R4は-NR5aR5bであり、ここで、各R5a及びR5bは、独立に、H又はC1-4アルキルである。特定の実施態様において、各R5a及びR5bは、独立に、H、-CH3、又は-CH2CH3である。より特定の実施態様において、R5aはHであり、R5bは、H、-CH3、又は-CH2CH3である。最も特定の実施態様において、R4は、-NH2、-NHCH3、又は-N(CH3)2である。
【００９０】
一実施態様において、本発明の化合物は、R4が-C(=O)OHである、式I〜IIfのいずれか1つによるものである。
【００９１】
一実施態様において、本発明の化合物は、R4が、N、S、及びOから独立に選択される1又は2つのヘテロ原子を含み、1つ以上の独立に選択されるC1-4アルキルにより任意に置換されている4〜7員単環式ヘテロシクロアルキルである、式I〜IIfのいずれか1つによるものである。特定の実施態様において、R4は、それぞれ1つ以上の独立に選択されるC1-4アルキルにより任意に置換されているモルホリニル、ピペリジニル、又はピペラジニルである。別の特定の実施態様において、R4は、N、S、及びOから独立に選択される1又は2つのヘテロ原子を含み、1つのC1-4アルキルにより任意に置換されている4〜7員単環式ヘテロシクロアルキルである。より特定の実施態様において、R4は、N、S、及びOから独立に選択される1又は2つのヘテロ原子を含み、1つの-CH3により任意に置換されている4〜7員単環式ヘテロシクロアルキルである。別のより特定の実施態様において、R4は、それぞれ1つ以上の-CH3により任意に置換されているモルホリニル、ピペリジニル、又はピペラジニルである。最も特定の実施態様において、R4は、それぞれ1つの-CH3により任意に置換されているモルホリニル、ピペリジニル、又はピペラジニルである。
【００９２】
一実施態様において、本発明の化合物は、R4が-NHC(=O)-C1-4アルキル-NH2である、式I〜IIfのいずれか1つによるものである。特定の実施態様において、R4は-NHC(=O)-CH2-NH2である。
【００９３】
一実施態様において、本発明の化合物は、R1が、-C(=O)CH2NH2、-C(=O)CH2NHCH3、-C(=O)CH2N(CH3)2、-C(=O)CH2CH2N(CH3)2、-C(=O)CH(NH2)CH(CH3)2、-C(=O)CH2CH2C(=O)OH、-C(=O)CH(NH2)CH2C(=O)OH、-C(=O)CH(NH2)CH2CH2C(=O)OH、-C(=O)CH(CH(CH3)2)NHC(=O)CH2NH2、
【化１０】
2018530617.tif 000012
である、式I〜IIfのいずれか1つによるものである。
【００９４】
一実施態様において、本発明の化合物は、R2がHである、式I〜IIfのいずれか1つによるものである。
【００９５】
一実施態様において、本発明の化合物は、R2がC1-4アルキルである、式I〜IIfのいずれか1つによるものである。特定の実施態様において、R2は-CH3である。
【００９６】
一実施態様において、本発明の化合物は、下記から選択される式Iによるものである:
6-[6-[2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-エトキシ]-5-(テトラヒドロ-ピラン-4-イルアミノ)-イミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル]-ニコチノニトリル、
6-{5-(1,1-ジオキソ-テトラヒドロ-2H-チオピラン-4-イルアミノ)-6-[2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-エトキシ]-イミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル}-ニコチノニトリル、
6-{6-[2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-エトキシ]-5-[((cis-1,4)-4-ヒドロキシ-4-メチル-シクロヘキシル)-メチル-アミノ]-イミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル}-ニコチノニトリル、
6-{6-[2-(2-メトキシ-エトキシ)-エトキシ]-5-[メチル-(テトラヒドロ-ピラン-4-イル)-アミノ]-イミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル}-ニコチノニトリル、
6-[6-[2-(2-メトキシ-エトキシ)-エトキシ]-5-(テトラヒドロ-ピラン-4-イルアミノ)-イミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル]-ニコチノニトリル、
6-{5-(3-ヒドロキシ-シクロヘキシルアミノ)-6-[2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-エトキシ]-イミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル}-ニコチノニトリル、
6-{5-(4,4-ジフルオロ-シクロヘキシルアミノ)-6-[2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-エトキシ]-イミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル}-ニコチノニトリル、
硫酸モノ-(2-{2-[3-(5-シアノ-ピリジン-2-イル)-5-(テトラヒドロ-ピラン-4-イルアミノ)-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イルオキシ]-エトキシ}-エチル)エステル、
(S)-2-アミノ-3-メチル-酪酸2-{2-[3-(5-シアノ-ピリジン-2-イル)-5-(テトラヒドロ-ピラン-4-イルアミノ)-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イルオキシ]-エトキシ}-エチルエステル、
(S)-2-アミノ-3-メチル-酪酸2-{2-[3-(5-シアノ-ピリジン-2-イル)-5-(テトラヒドロ-ピラン-4-イルアミノ)-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イルオキシ]-エトキシ}-エチルエステルシュウ酸塩、
6-[6-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]-5-[[(cis-3,4)-4-ヒドロキシテトラヒドロピラン-3-イル]アミノ]イミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル]ピリジン-3-カルボニトリル、
6-[6-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]-5-[((cis-1,4)-4-ヒドロキシ-4-メチルシクロヘキシル)アミノ]イミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル]ピリジン-3-カルボニトリル、
6-[5-[((cis-1,4)-4-ヒドロキシ-4-メチル-シクロヘキシル)-メチル-アミノ]-6-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]イミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル]ピリジン-3-カルボニトリル、
6-[5-[((cis-1,4)-4-ヒドロキシ-4-メチルシクロヘキシル)アミノ]-6-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]イミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル]ピリジン-3-カルボニトリル、
2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エチル2-(ジメチルアミノ)アセタート、
2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エチル2-アミノアセタート、
2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エチル2-(メチルアミノ)アセタート、
2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エチル(2S)-ピロリジン-2-カルボキシラート、
2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エチル(2S)-2-[(2-アミノアセチル)アミノ]-3-メチル-ブタノアート、
2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エチル2-モルホリノアセタート、
2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エチル2-(4-メチルピペラジン-1-イル)アセタート、
2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エチル3-(ジメチルアミノ)プロパノアート、
2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エチル2-(ジメチルアミノ)アセタートシュウ酸塩、
2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エチル2-アミノアセタートシュウ酸塩、
2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エチル2-(メチルアミノ)アセタートシュウ酸塩、
2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エチル(2S)-ピロリジン-2-カルボキシラートシュウ酸塩、
(3S)-3-アミノ-4-[2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エトキシ]-4-オキソ-ブタン酸塩酸塩、
(4S)-4-アミノ-5-[2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エトキシ]-5-オキソ-ペンタン酸塩酸塩、
2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エチル(2S)-2-[(2-アミノアセチル)アミノ]-3-メチル-ブタノアートシュウ酸塩、
2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エチル2-モルホリノアセタートシュウ酸塩、
2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エチル2-(4-メチルピペラジン-1-イル)アセタートシュウ酸塩、
2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エチル3-(ジメチルアミノ)プロパノアートシュウ酸塩、及び
4-[2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エトキシ]-4-オキソ-ブタン酸。
【００９７】
一実施態様において、本発明の化合物は、6-[6-[2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-エトキシ]-5-(テトラヒドロ-ピラン-4-イルアミノ)-イミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル]-ニコチノニトリルである、式Iによるものである。
【００９８】
一実施態様において、本発明の化合物は、6-[6-[2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-エトキシ]-5-(テトラヒドロ-ピラン-4-イルアミノ)-イミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル]-ニコチノニトリルではない、式Iによるものである。
【００９９】
一実施態様において、本発明の化合物は、(S)-2-アミノ-3-メチル-酪酸2-{2-[3-(5-シアノ-ピリジン-2-イル)-5-(テトラヒドロ-ピラン-4-イルアミノ)-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イルオキシ]-エトキシ}-エチルエステルである、式Iによるものである。
【０１００】
一実施態様において、本発明の化合物は、(S)-2-アミノ-3-メチル-酪酸2-{2-[3-(5-シアノ-ピリジン-2-イル)-5-(テトラヒドロ-ピラン-4-イルアミノ)-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イルオキシ]-エトキシ}-エチルエステルではない、式Iによるものである。
【０１０１】
一実施態様において、本発明の化合物は、同位体変種ではない。
【０１０２】
一態様において、本明細書に記載の実施態様のいずれか1つによる本発明の化合物は、遊離塩基として存在する。
【０１０３】
一態様において、本明細書に記載の実施態様のいずれか1つによる本発明の化合物は、医薬として許容し得る塩である。
【０１０４】
一態様において、本明細書に記載の実施態様のいずれか1つによる本発明の化合物は、該化合物の溶媒和物である。
【０１０５】
一態様において、本明細書に記載の実施態様のいずれか1つによる本発明の化合物は、化合物の医薬として許容し得る塩の溶媒和物である。
【０１０６】
各々の実施態様についての明示された基は、全般的に先に個別に列記されてきたが、本発明の化合物は、上記の式及び本明細書に提示される他の式におけるいくつかの又は各々の実施態様が、各々の変数についてそれぞれ指定された特定のメンバー又は基の1つ以上から選択される化合物を含む。したがって、本発明は、そのような実施態様の全ての組合せをその範囲内に含むことが意図される。
【０１０７】
各々の実施態様についての明示された基は、全般的に先に個別に列記されてきたが、本発明の化合物は、1つ以上の変数(例えば、R基)が、先に列記された式のいずれかによる1つ以上の実施態様から選択される化合物であり得る。したがって、本発明は、開示された実施態様のいずれかに由来する変数の全ての組合せをその範囲内に含むことが意図される。
【０１０８】
或いは、ある基若しくは実施態様、又はそれらの組合せに由来する明示された変数の1つ以上の排除も、本発明によって企図される。
【０１０９】
ある態様において、本発明は、上記の式による化合物のプロドラッグ及び誘導体を提供する。プロドラッグは、代謝的に切断可能な基を有し、且つ加溶媒分解によるか又は生理的条件下で、インビボで医薬として活性がある本発明の化合物になる、本発明の化合物の誘導体である。そのような例としては、コリンエステル誘導体及び同類のもの、N-アルキルモルホリンエステル及び同類のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
本発明の化合物の他の誘導体は、それらの酸形態と酸誘導体形態の両方で活性を有するが、酸感受性形態は、多くの場合、哺乳動物での溶解性、組織適合性、又は遅延放出という利点を提供する(Bundgaardの文献、1985)。プロドラッグには、当業者に周知の酸誘導体、例えば、親酸と好適なアルコールとの反応により調製されるエステル、又は親酸化合物と置換若しくは非置換アミンとの反応により調製されるアミド、又は酸無水物、又は混合無水物などが含まれる。本発明の化合物についている酸性基から誘導される単純な脂肪族又は芳香族エステル、アミド、及び無水物は、好ましいプロドラッグである。場合によっては、(アシルオキシ)アルキルエステル又は((アルコキシカルボニル)オキシ)アルキルエステルなどの二重エステル型プロドラッグを調製することが望ましい。特に有用であるのは、本発明の化合物のC1〜C8アルキル、C2〜C8アルケニル、アリール、C7〜C12置換アリール、及びC7〜C12アリールアルキルエステルである。
【０１１１】
（医薬組成物）
医薬として利用される場合、本発明の化合物は、通常、医薬組成物の形態で投与される。そのような組成物は、医薬分野で周知の様式で調製され、式Iによる少なくとも1種の本発明の活性化合物を含むことができる。通常、本発明の化合物は、医薬として有効な量で投与される。実際に投与される本発明の化合物の量は、通常、治療されるべき状態、選択された投与経路、投与される実際の本発明の化合物、個々の患者の年齢、体重、及び応答、患者の症状の重症度などを含む関連状況を考慮して、医師により決定される。
【０１１２】
本発明の医薬組成物は、経口、直腸、経皮、皮下、関節内、静脈内、筋肉内、及び鼻腔内を含む、種々の経路により投与することができる。意図される送達経路に応じて、本発明の化合物は、好ましくは、注射用若しくは経口組成物として、又は全て経皮投与用の、軟膏として、ローションとして、若しくはパッチとしてのいずれかで製剤化される。
【０１１３】
経口投与用の組成物は、バルク液体溶液若しくは懸濁液、又はバルク粉末の形態を取ることができる。しかしながら、より一般的には、該組成物は、正確な投薬を容易にするために単位剤形で提示される。「単位剤形」という用語は、ヒト対象及び他の哺乳動物用の単位投薬量として好適な物理的に別個の単位を指し、各々の単位は、所望の治療効果を与えるように計算された所定量の活性材料を、好適な医薬賦形剤、ビヒクル、又は担体と共に含有する。典型的な単位剤形としては、液体組成物の予め充填され、予め測定されたアンプル若しくは注射器、又は固体組成物の場合、丸剤、錠剤、カプセル剤などが挙げられる。そのような組成物において、式Iによる本発明の化合物は、通常、より少ない成分(約0.1〜約50重量％又は好ましくは約1〜約40重量％)であり、残りは、様々なビヒクル又は担体及び所望の投薬形態を形成するのに役立つ加工助剤である。
【０１１４】
経口投与に好適な液体形態は、緩衝剤、懸濁化剤及び分散剤、着色料、香料などを含む好適な水性又は非水性のビヒクルを含むことができる。固体形態は、例えば、以下の成分:結合剤、例えば、微結晶性セルロース、トラガカントガム、若しくはゼラチン;賦形剤、例えば、デンプン若しくはラクトース、崩壊剤、例えば、アルギン酸、プリモジェル(登録商標)、若しくはトウモロコシデンプン;滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム;流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素;甘味剤、例えば、スクロース若しくはサッカリン;又は着香剤、例えば、ペパーミント若しくはオレンジ香料のうちのいずれか、或いは類似の性質の本発明の化合物を含むことができる。
【０１１５】
注射用組成物は、通常、当技術分野で公知の注射用滅菌生理食塩水若しくはリン酸緩衝生理食塩水又は他の注射用担体に基づく。上述の通り、そのような組成物中の式Iによる本発明の活性化合物は、通常、より少ない成分で、多くの場合、約0.05〜10重量％であり、残りは注射用担体などである。
【０１１６】
経皮組成物は、通常、有効成分(複数可)を、一般に、約0.01〜約20重量％、好ましくは、約0.1〜約20重量％、好ましくは、約0.1〜約10重量％、より好ましくは、約0.5〜約15重量％の範囲の量で含有する局所軟膏剤又はクリーム剤として製剤化される。軟膏剤として製剤化される場合、有効成分は、通常、パラフィン性軟膏基剤か水混和性軟膏基剤のいずれかと組み合わされる。或いは、有効成分は、例えば、水中油型クリーム基剤とともにクリーム中に製剤化することができる。そのような経皮製剤は当技術分野で周知であり、通常、有効成分又は製剤の安定性の皮膚透過性を増進する追加成分を含む。全てのそのような公知の経皮製剤及び成分は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１１７】
本発明の化合物は、経皮装置により投与することもできる。したがって、経皮投与は、貯留槽型若しくは多孔性膜型又は固体マトリクス型のいずれかのパッチ剤を用いて達成することができる。
【０１１８】
経口投与可能な、注射可能な、又は局所投与可能な組成物のための上記の成分は、代表的なものであるに過ぎない。他の材料及び加工技術などは、引用により本明細書中に組み込まれる、レミントンの医薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)、第17版、1985、Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaのパート8に記載されている。
【０１１９】
本発明の化合物は、持続放出形態でも、持続放出薬物送達系からでも投与することもできる。代表的な持続放出材料の説明は、レミントンの医薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)に見出すことができる。
【０１２０】
以下の製剤例は、本発明に従って調製され得る代表的な医薬組成物を例示したものである。しかしながら、本発明は、以下の医薬組成物に限定されない。
【０１２１】
(製剤1-錠剤)
式Iによる本発明の化合物を、乾燥粉末として、乾燥ゼラチン結合剤と約1:2の重量比で混合することができる。微量のステアリン酸マグネシウムを滑沢剤として添加することができる。混合物を、打錠機で240〜270mg錠(1錠当たり80〜90mgの式Iによる本発明の活性化合物)に成形することができる。
【０１２２】
(製剤2-カプセル剤)
式Iによる本発明の化合物を、乾燥粉末として、デンプン希釈剤と約1:1の重量比で混合することができる。混合物を、250mgカプセル(1カプセル当たり125mgの式Iによる本発明の活性化合物)中に充填することができる。
【０１２３】
(製剤3-液剤)
式Iによる本発明の化合物(125mg)をスクロース(1.75g)及びキサンタンガム(4mg)と混合することができ、結果として得られる混合物をブレンドし、No.10メッシュU.S.シーブに通し、その後、予め作製しておいた微結晶性セルロース及びカルボキシメチルセルロースナトリウム(11:89、50mg)の水溶液と混合することができる。安息香酸ナトリウム(10mg)、香料、及び着色料を水で希釈し、撹拌しながら添加することができる。その後、十分な水を撹拌しながら添加することができる。その後、さらなる十分な水を添加して、5mLの総体積を生じさせることができる。
【０１２４】
(製剤4-錠剤)
式Iによる本発明の化合物を、乾燥粉末として、乾燥ゼラチン結合剤と約1:2の重量比で混合することができる。微量のステアリン酸マグネシウムを滑沢剤として添加することができる。混合物を、打錠機で450〜900mg錠(150〜300mgの式Iによる本発明の活性化合物)に成形することができる。
【０１２５】
(製剤5-注射剤)
式Iによる本発明の化合物を、緩衝滅菌生理食塩水の注射用水性媒体に、約5mg/mLの濃度まで溶解又は懸濁させることができる。
【０１２６】
(製剤6-局所剤)
ステアリルアルコール(250g)及び白色ワセリン(250g)を約75℃で融解させることができ、その後、水(約370g)に溶解させた式Iによる本発明の化合物(50g)、メチルパラベン(0.25g)、プロピルパラベン(0.15g)、ラウリル硫酸ナトリウム(10g)、及びプロピレングリコール(120g)の混合物を添加することができ、得られる混合物を凝固するまで撹拌することができる。
【０１２７】
（治療の方法）
一実施態様において、本発明は、医薬において使用するための、本発明の化合物又は本発明の化合物を含む医薬組成物を提供する。特定の実施態様において、本発明は、炎症性疾患、自己免疫疾患、及び/又は増殖性疾患の予防及び/又は治療において使用するための、本発明の化合物又は本発明の化合物を含む医薬組成物を提供する。
【０１２８】
別の実施態様において、本発明は、炎症性疾患、自己免疫疾患、及び/又は増殖性疾患の予防及び/又は治療に使用するための医薬の製造に使用するための、本発明の化合物又は本発明の化合物を含む医薬組成物を提供する。
【０１２９】
治療態様の追加の方法において、本発明は、炎症性疾患、自己免疫疾患、及び/又は増殖性疾患に罹患している哺乳動物の予防及び/又は治療の方法であって、有効量の本発明の化合物又は本明細書に記載される医薬組成物の１種以上の、前記病態の治療又は予防のための投与を含む方法を提供する。
【０１３０】
一実施態様において、本発明は、本発明の化合物及び別の治療剤を含む医薬組成物を提供する。特定の実施態様において、他の治療剤は、炎症性疾患、自己免疫疾患、及び/又は増殖性疾患の予防及び/又は治療のための薬剤である。
【０１３１】
一実施態様において、本発明は、炎症性疾患の予防及び/又は治療に使用するための本発明の化合物又は本発明の化合物を含む医薬組成物を提供する。特定の実施態様において、該炎症性疾患は、関節リウマチ、変形性関節症、若年性特発性関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、アレルギー性気道疾患(例えば、喘息、鼻炎)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、炎症性腸疾患(例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎)、内毒素により推進される病態(例えば、バイパス手術後の合併症又は例えば慢性心不全の一因となる慢性内毒素状態)、及び関節の疾患など軟骨が関与する関連疾患から選択される。より詳細には、該炎症性疾患は、乾癬又は若年性特発性関節炎である。
【０１３２】
別の実施態様において、本発明は、炎症性疾患の予防及び/又は治療に使用するための医薬の製造に使用するための本発明の化合物又は本発明の化合物を含む医薬組成物を提供する。特定の実施態様において、該炎症性疾患は、 関節リウマチ、変形性関節症、若年性特発性関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、アレルギー性気道疾患(例えば、喘息、鼻炎)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、炎症性腸疾患(例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎)、内毒素により推進される病態(例えば、バイパス手術後の合併症又は例えば慢性心不全の一因となる慢性内毒素状態)、及び関節の疾患など軟骨が関与する関連疾患から選択される。より詳細には、該炎症性疾患は、乾癬又は若年性特発性関節炎である。
【０１３３】
治療態様の追加の方法において、本発明は、炎症性疾患に罹患している哺乳動物の予防及び/又は治療の方法であって、有効量の本発明の化合物又は本明細書に記載される医薬組成物の１種以上の、前記病態の治療又は予防のための投与を含む方法を提供する。特定の実施態様において、該炎症性疾患は、関節リウマチ、変形性関節症、若年性特発性関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、アレルギー性気道疾患(例えば、喘息、鼻炎)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、炎症性腸疾患(例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎)、内毒素により推進される病態(例えば、バイパス手術後の合併症又は例えば慢性心不全の一因となる慢性内毒素状態)、及び関節の疾患など軟骨が関与する関連疾患から選択される。より詳細には、該炎症性疾患は、乾癬又は若年性特発性関節炎である。
【０１３４】
一実施態様において、本発明は、自己免疫疾患の予防及び/又は治療に使用するための本発明の化合物又は本発明の化合物を含む医薬組成物を提供する。特定の実施態様において、該自己免疫疾患は、COPD、喘息(例えば、内因性喘息、外因性喘息、塵埃喘息、小児喘息)、特に、慢性又は難治性喘息(例えば遅発性喘息及び気道過剰反応性)などの病態を含む閉塞性の気道疾患、気管支喘息を含む気管支炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、皮膚エリテマトーデス、ループス腎炎、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、乾癬、ドライアイ疾患、I型糖尿病及びそれと関連する合併症、アトピー性湿疹(アトピー性皮膚炎)、甲状腺炎(橋本甲状腺炎及び自己免疫性甲状腺炎)、接触性皮膚炎及びさらなる湿疹性皮膚炎、炎症性腸疾患(例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎)、アテローム性動脈硬化、及び筋萎縮性側索硬化症から選択される。より詳細には、該自己免疫疾患は全身性エリテマトーデスである。
【０１３５】
別の実施態様において、本発明は、自己免疫疾患の予防及び/又は治療に使用するための医薬の製造に使用するための本発明の化合物又は本発明の化合物を含む医薬組成物を提供する。特定の実施態様において、該自己免疫疾患は、COPD、喘息(例えば、内因性喘息、外因性喘息、塵埃喘息、小児喘息)特に、慢性又は難治性喘息(例えば遅発性喘息及び気道過剰反応性)などの病態を含む閉塞性の気道疾患、気管支喘息を含む気管支炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、皮膚エリテマトーデス、ループス腎炎、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、乾癬、ドライアイ疾患、I型糖尿病及びそれと関連する合併症、アトピー性湿疹(アトピー性皮膚炎)、甲状腺炎(橋本甲状腺炎及び自己免疫性甲状腺炎)、接触性皮膚炎及びさらなる湿疹性皮膚炎、炎症性腸疾患(例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎)、アテローム性動脈硬化、及び筋萎縮性側索硬化症から選択される。より詳細には、該自己免疫疾患は全身性エリテマトーデスである。
【０１３６】
治療態様の追加の方法において、本発明は、自己免疫疾患に罹患している哺乳動物の予防及び/又は治療の方法であって、有効量の本発明の化合物又は本明細書に記載される医薬組成物の１種以上の、前記病態の治療又は予防のための投与を含む方法を提供する。特定の実施態様において、該自己免疫疾患は、COPD、喘息(例えば、内因性喘息、外因性喘息、塵埃喘息、小児喘息)特に、慢性又は難治性喘息(例えば遅発性喘息及び気道過剰反応性)などの病態を含む閉塞性の気道疾患、気管支喘息を含む気管支炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、皮膚エリテマトーデス、ループス腎炎、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、乾癬、ドライアイ疾患、I型糖尿病及びそれと関連する合併症、アトピー性湿疹(アトピー性皮膚炎)、甲状腺炎(橋本甲状腺炎及び自己免疫性甲状腺炎)、接触性皮膚炎及びさらなる湿疹性皮膚炎、炎症性腸疾患(例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎)、アテローム性動脈硬化、及び筋萎縮性側索硬化症から選択される。より詳細には、該自己免疫疾患は全身性エリテマトーデスである。
【０１３７】
一実施態様において、本発明は、増殖性疾患の予防及び/又は治療に使用するための本発明の化合物又は本発明の化合物を含む医薬組成物を提供する。特定の実施態様において、該増殖性疾患は、癌(例えば、子宮平滑筋肉腫又は前立腺癌)、骨髄増殖性疾患(例えば、真性多血病、本態性血小板血症、及び骨髄線維症)、白血病(例えば、急性骨髄性白血病、急性及び慢性リンパ芽球性白血病)、多発性骨髄腫、乾癬、再狭窄、強皮症、又は線維症から選択される。
【０１３８】
別の実施態様において、本発明は、増殖性疾患の予防及び/又は治療に使用するための医薬の製造に使用するための本発明の化合物又は本発明の化合物を含む医薬組成物を提供する。特定の実施態様において、該増殖性疾患は、癌(例えば、子宮平滑筋肉腫又は前立腺癌)、骨髄増殖性疾患(例えば、真性多血病、本態性血小板血症、及び骨髄線維症)、白血病(例えば、急性骨髄性白血病、急性及び慢性リンパ芽球性白血病)、多発性骨髄腫、乾癬、再狭窄、強皮症、又は線維症から選択される。
【０１３９】
治療態様の追加の方法において、本発明は、増殖性疾患に罹患している哺乳動物の予防及び/又は治療の方法であって、有効量の本発明の化合物又は本明細書に記載される医薬組成物の１種以上の、前記病態の治療又は予防のための投与を含む方法を提供する。特定の実施態様において、該増殖性疾患は、癌(例えば、子宮平滑筋肉腫又は前立腺癌)、骨髄増殖性疾患(例えば、真性多血病、本態性血小板血症、及び骨髄線維症)、白血病(例えば、急性骨髄性白血病、急性及び慢性リンパ芽球性白血病)、多発性骨髄腫、乾癬、再狭窄、強皮症、又は線維症から選択される。
【０１４０】
注射用量レベルは、全て約1〜約120時間、特に24〜96時間の間に、約0.1mg/kg/時〜少なくとも10mg/kg/時の範囲である。適正な定常状態レベルを達成するために、約0.1mg/kg〜約10mg/kg又はそれ以上の予充填ボーラスを投与することもできる。最大総用量は、40〜80kgのヒト患者の場合、約1g/日を超えないと考えられる。
【０１４１】
変性状態などの長期状態の予防及び/又は治療について、治療用レジメンは、通常、数カ月又は数年にわたるため、患者の便宜及び忍容性のために経口投与が好ましい。経口投与の場合、1日に1〜4回(1〜4)の常用量、特に、1日に1〜3回(1〜3)の常用量、典型的には、1日に1〜2回(1〜2)の常用量、最も典型的には、1日に1回(1)の常用量が代表的なレジメンである。或いは、長期持続作用型薬物について、経口投薬の場合、1週間おき、1週間に1回、及び1日に1回が代表的なレジメンである。特に、投薬レジメンは、1〜14日おき、より特には、1〜10日おき、さらにより特には、1〜7日おき、最も特には、1〜3日おきであり得る。
【０１４２】
これらの投薬様式を用いて、各々の用量は、約1〜約1000mgの本発明の化合物を提供するが、特定の用量は、各々約10〜約500mg、特に約30〜約250mg提供する。
【０１４３】
経皮用量は、通常、注射用量を用いて達成されるのと同様又はそれよりも低い血液レベルを提供するように選択される。
【０１４４】
疾患の開始を妨げるために使用される場合、本発明の化合物は、該疾患を発症するリスクのある患者に、通常、医師の助言に従い、且つその監督下で、上記の投薬量レベルで投与される。特定の疾患を発症するリスクのある患者には、通常、該疾患の家族歴を有する者、又は遺伝子検査若しくはスクリーニングによって該疾患を特に発症しやすいことが確認されている者が含まれる。
【０１４５】
本発明の化合物は、唯一の活性剤として投与することができ、或いはそれは、同一若しくは同様の治療活性を示し、且つそのような併用投与に安全且つ有効であることが明らかにされている本発明の他の化合物を含む、他の治療剤と組み合わせて投与することができる。具体的な実施態様において、2つ(又はそれより多く)の薬剤の共投与によって、それぞれの著しく少ない用量を使用し、それにより、認められる副作用を低下させることが可能になる。
【０１４６】
一実施態様において、本発明の化合物又は本発明の化合物を含む医薬組成物は、医薬として投与される。具体的な実施態様において、該医薬組成物は、さらなる有効成分をさらに含む。
【０１４７】
一実施態様において、本発明の化合物は、炎症を伴う疾患の治療及び/又は予防のための別の治療剤と共投与され、特定の薬剤としては、免疫調節剤、例えば、アザチオプリン、コルチコステロイド(例えば、プレドニゾロン又はデキサメタゾン)、シクロホスファミド、シクロスポリンA、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、ムロモナブ-CD3(OKT3、例えば、オルソクローン(登録商標))、ATG、アスピリン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、ナプロキセン、及びピロキシカムが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４８】
一実施態様において、本発明の化合物は、関節炎(例えば、関節リウマチ)の治療及び/又は予防のための別の治療剤と共投与され、特定の薬剤としては、鎮痛薬、非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDS)、ステロイド、合成DMARDS(例えば、非限定的に、メトトレキセート、レフルノミド、スルファサラジン、オーラノフィン、金チオリンゴ酸ナトリウム、ペニシラミン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、アザチオプリン、トファシチニブ、バリシチニブ、ホスタマチニブ、及びシクロスポリン)、並びに生物学的DMARDS(例えば、非限定的に、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、リツキシマブ、及びアバタセプト)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４９】
一実施態様において、本発明の化合物は、増殖性障害の治療及び/又は予防のための別の治療剤と共投与され、特定の薬剤としては、非限定的に:ニンテダニブ、ピルフェニドン、メトトレキセート、ロイコボリン、アドリアマイシン、プレドニゾン、ブレオマイシン、シクロホスファミド、5-フルオロウラシル、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ドキソルビシン、タモキシフェン、トレミフェン、酢酸メゲストロール、アナストロゾール、ゴセレリン、抗HER2モノクローナル抗体(例えば、ハーセプチン(商標))、カペシタビン、塩酸ラロキシフェン、EGFR阻害剤(例えば、イレッサ(登録商標)、タルセバ(商標)、エルビタックス(商標))、VEGF阻害剤(例えば、アバスチン(商標))、プロテアソーム阻害剤(例えば、ベルケイド(商標))、グリベック(登録商標)、及びhsp90阻害剤(例えば、17-AAG)が挙げられる。さらに、式Iによる本発明の化合物は、非限定的に、放射線療法又は外科手術を含む他の療法と組み合わせて投与することができる。具体的な実施態様において、該増殖性疾患は、線維症、癌、骨髄増殖性疾患、又は白血病から選択される。
【０１５０】
一実施態様において、本発明の化合物は、自己免疫疾患の治療及び/又は予防のための別の治療剤と共投与され、特定の薬剤として、非限定的に:グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤(例えば、プリンアナログ)、アルキル化剤、(例えば、ナイトロジェンマスタード(シクロホスファミド)、ニトロソウレア、白金配位錯体)、代謝拮抗剤(例えば、メトトレキサート、アザチオプリン、及びメルカプトプリン)、細胞傷害性抗生物質(例えば、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンC、ブレオマイシン、及びミトラマイシン)、抗体(例えば、抗CD20、抗CD25、又は、抗CD3(OTK3)モノクローナル抗体、アトガム(登録商標)及びサイモグロブリン(登録商標))、シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン(シロリムス)、インターフェロン(例えば、IFN-β)、TNF結合タンパク質(例えば、インフリキシマブ、エタネルセプト、又はアダリムマブ)、ミコフェノレート、フィンゴリモド、及びミリオシンが挙げられる。
【０１５１】
一実施態様において、本発明の化合物は、喘息及び/又は鼻炎及び/又はCOPDの治療及び/又は予防のための別の治療剤と共投与され、特定の薬剤としては:β2-アドレナリン受容体作動薬(例えば、サルブタモール、レバルブテロール、テルブタリン、及びビトルテロール)、エピネフリン(吸入又は錠剤)、抗コリン作動薬(例えば、臭化イプラトロピウム)、及びグルココルチコイド(経口又は吸入)、長時間作用型β2-作動薬(例えば、サルメテロール、ホルモテロール、バンブテロール、及び持続放出性経口アルブテロール)、吸入ステロイドと長時間作用型気管支拡張薬の組合せ(例えば、フルチカゾン/サルメテロール、ブデソニド/ホルモテロール)、ロイコトリエン拮抗薬及び合成阻害剤(例えば、モンテルカスト、ザフィルルカスト、及びジロイトン)、メディエーター放出阻害剤(例えば、クロモグリケート及びケトチフェン)、IgE応答の生体調節因子(例えば、オマリズマブ)、抗ヒスタミン薬(例えば、セチリジン、シンナリジン、フェキソフェナジン)、並びに血管収縮薬(例えば、オキシメタゾリン、キシロメタゾリン、ナファゾリン、及びトラマゾリン)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５２】
さらに、本発明の化合物は、喘息及び/又はCOPDの緊急治療と組み合わせて投与することができ、そのような治療としては、酸素又はヘリオックス投与、噴霧型サルブタモール又はテルブタリン(抗コリン作動薬(例えば、イプラトロピウム)と任意に組み合わされる)、全身性ステロイド(経口又は静脈内、例えば、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、又はヒドロコルチゾン)、静脈内サルブタモール、非特異的β-作動薬、注射又は吸入(例えば、エピネフリン、イソエタリン、イソプロテレノール、メタプロテレノール)、抗コリン作動薬(IV又は噴霧、例えば、グリコピロレート、アトロピン、イプラトロピウム)、メチルキサンチン(テオフィリン、アミノフィリン、バミフィリン)、気管支拡張作用を有する吸入麻酔薬(例えば、イソフルラン、ハロタン、エンフルラン)、ケタミン、及び静脈内硫酸マグネシウムが挙げられる。
【０１５３】
一実施態様において、本発明の化合物は、炎症性腸疾患(IBD)の治療及び/又は予防のための別の治療剤と共投与され;特定の薬剤としては:グルココルチコイド(例えば、プレドニゾン、ブデソニド)、合成疾患修飾性免疫調整剤(例えば、メトトレキセート、レフルノミド、スルファサラジン、メサラジン、アザチオプリン、6-メルカプトプリン、及びシクロスポリン)、並びに生体疾患修飾性免疫調整剤(インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ、エトロリズマブ、ベドリズマブ、ウステキヌマブ、リツキシマブ、及びアバタセプト)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５４】
一実施態様において、本発明の化合物は、SLEの治療及び/又は予防のための別の治療剤と共投与され、特定の薬剤としては:ヒトモノクローナル抗体(ベリムマブ(ベンリスタ(登録商標)))、疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)、例えば、抗マラリア薬(例えば、プラケニル(登録商標)、ヒドロキシクロロキン)、免疫抑制剤(例えば、メトトレキセート及びアザチオプリン)、シクロホスファミド及びミコフェノール酸、免疫抑制薬及び鎮痛薬、例えば、非ステロイド性抗炎症薬、オピエート(例えば、デキストロプロポキシフェン及びココダモール)、オピオイド(例えば、ヒドロコドン、オキシコドン、MSコンチン(登録商標)、又はメタドン)、並びにデュラジェシック(登録商標)フェンタニル経皮パッチが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５５】
一実施態様において、本発明の化合物は、乾癬の治療及び/又は予防のための別の治療剤と共投与され、特定の薬剤としては:コールタール、ジトラノール(アントラリン)、デスオキシメタゾン(トピコート(商標))などのコルチコステロイド、フルオシノニド、ビタミンD3類似体(例えば、カルシポトリオール)、アルガン油、及びレチノイド(エトレチナート、アシトレチン、タザロテン)を含有する浴溶液、保湿剤、薬用クリーム、及び軟膏剤などの局所治療薬、メトトレキセート、シクロスポリン、レチノイド、チオグアニン、ヒドロキシウレア、スルファサラジン、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、タクロリムス、フマル酸エステルなどの全身治療薬、又はアメビブ(商標)、エンブレル(商標)、ヒュミラ(商標)、レミケード(商標)、ラプティバ(商標)、及びウステキヌマブ(IL-12及びIL-23遮断薬)などの生物製剤が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明の化合物は、非限定的に、光線療法又は光化学療法(例えば、ソラレン長波長紫外線療法(PUVA))を含む他の療法と組み合わせて投与することができる。
【０１５６】
一実施態様において、本発明の化合物は、アレルギー反応の治療及び/又は予防のための別の治療剤と共投与され、特定の薬剤としては:抗ヒスタミン薬(例えば、セチリジン、ジフェンヒドラミン、フェキソフェナジン、レボセチリジン)、グルココルチコイド(例えば、プレドニゾン、ベタメタゾン、ベクロメタゾン、デキサメタゾン)、エピネフリン、テオフィリン、又は抗ロイコトリエン剤(例えば、モンテルカスト又はザフィルルカスト)、抗コリン剤、及び充血除去剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５７】
当業者には明らかである通り、共投与により、2種以上の治療剤を同じ治療レジメンの一部として患者に送達するあらゆる手段が含まれる。該2種以上の薬剤は、単一の製剤中で、すなわち単一の医薬組成物として同時に投与することができるが、これは必須ではない。該薬剤は、異なる製剤中で、且つ異なる時間に投与してもよい。
【実施例】
【０１５８】
（化学合成手順）
（概要）
本発明の化合物は、以下の一般的方法及び手順を用いて容易に入手可能な出発物質から調製することができる。典型的な又は好ましいプロセス条件(すなわち、反応温度、時間、反応物のモル比、溶媒、圧力など)が与えられる場合、別途明記されない限り、他のプロセス条件も使用できることが理解されるであろう。最適な反応条件は、使用される特定の反応物又は溶媒によって異なり得るが、そのような条件は、当業者によりルーチンの最適化手順により決定され得る。
【０１５９】
さらに、当業者には明らかである通り、特定の官能基が望ましくない反応を受けるのを防ぐために、従来の保護基が必要となる場合がある。特定の官能基のための好適な保護基、並びに保護及び脱保護のための好適な条件の選択は、当技術分野において周知である。例えば、多くの保護基並びにその導入及び除去は、T. W. Greene及びP. G. M. Wutsの文献、「有機合成における保護基（Protecting Groups in Organic Synthesis）」, Wiley Blackwell;第4改訂版(2006)、及びその中に引用されている参考文献(Wuts及びGreeneの文献、2006)に記載されている。
【０１６０】
以下の方法は、本明細書において上で定義されている本発明の化合物の調製及び比較例に関して詳細に提示されている。本発明の化合物は、有機合成の分野の当業者により公知の又は市販の出発材料及び試薬から調製され得る。
【０１６１】
全ての試薬は商用等級であり、別途明記されない限り、さらに精製することなく、受け取った状態で使用される。市販の無水溶媒は、不活性雰囲気下で実施される反応に使用される。別途規定されない限り、試薬等級溶媒は、他の全ての場合に使用される。カラムクロマトグラフィーは、シリカ標準（silica standard）(30〜70μm)上で実施される。薄層クロマトグラフィーは、予めコーティングされたシリカゲル60F-254プレート(0.25mm厚)を用いて実施される。1H NMRスペクトルは、400 MHz Bruker Avance分光計又は300 MHz Bruker Avance DPX分光計で記録される。1H NMRスペクトルの化学シフト(δ)は、内部基準としてのテトラメチルシラン(δ0.00)又は適当な残留溶媒ピークと比べた百万分率(ppm)で報告される。多重度は、一重線(s)、二重線(d)、三重線(t)、四重線(q)、五重線(quin)、多重線(m)、及びブロード(br)として与えられる。エレクトロスプレーMSスペクトルは、WatersプラットフォームLC/MS分光計又はWaters Acquity PDA検出器及びSQD質量分析計を備えたWaters Acquity UPLCで得られる。使用されたカラム:UPLC BEH C18 1.7μm、2.1×5 mm VanGuardプレカラムとAcquity UPLC BEH C18 1.7μm、2.1×30 mmカラム又はAcquity UPLC BEH C18 1.7μm、2.1×50 mmカラム。全方法は、MeCN/H2O勾配を使用している。MeCN及びH2Oは、0.1%ギ酸か0.05% NH3のいずれかを含む。分取LCMS:使用されたカラム、Waters XBridge Prep C18 5μm ODB 30×100 mm(分取カラム)及びWaters XBridge C18 5μm、4.6 mm×100 mm(分析カラム）。全方法は、MeOH/H2O勾配を使用している。MeCN及びH2Oは、0.1％ギ酸か0.1％ジエチルアミンのいずれかを含む。
表I．実験セクションに使用される略語のリスト
【表１】
2018530617.tif 000013
2018530617.tif 000014
2018530617.tif 000015
【０１６２】
(本発明の化合物の合成的調製)
(実施例1.一般的合成方法)
(1.1.合成方法の概略)
【化１１】
2018530617.tif 000016
(1.2.一般的な方法）
(1.2.1.一般的な方法A)
【化１２】
2018530617.tif 000017
NaH(2当量、鉱油中60%)の0℃に冷却された乾燥THF溶液に、対応する6-アミノ-ニコチノニトリル(1.1〜1.2当量)を加える。0℃で30分後、2-クロロ-3-ニトロピリジン(1当量)を加え、該反応物を室温で撹拌し、UPLC-MSによりモニターする。反応が完了していない場合、該反応物を再び0℃に冷却し、さらなるNaHを加え、それに続いてさらなるアミンを加える。該反応混合物を氷水に注ぎ、2時間撹拌する。沈殿物をろ去し、H2Oで洗浄し、真空下で風乾させると、所望の化合物を与える。
【０１６３】
（一般的方法Aの例示的合成:）
（6-(6-クロロ-3-ニトロ-ピリジン-2-イルアミノ)-ニコチノニトリル(中間体1)）
【化１３】
2018530617.tif 000018
NaH(2.07g、51.81mmol、2当量、鉱油中60%)の0℃に冷却された乾燥THF(50mL)溶液に、6-アミノ-ニコチノニトリル(3.4g、28.5mmol、1.1当量)を加える。0℃で30分後、2,6-ジクロロ-3-ニトロ-ピリジン(5g、25.91mmol、1当量)を加え、該反応物を室温で16時間撹拌する。該反応物を0℃に冷却し、NaH(0.5g、13mmol、0.5当量)を加え、該反応物を、0℃で1時間、次いで室温で2時間撹拌する。該反応混合物を氷水に注ぎ、2時間撹拌する。沈殿物をろ去し、H2Oで洗浄し、真空下で風乾させる。得られた固体をMeCN(75mL)に吸収させ、室温で1時間30分、0℃で1時間撹拌する。次いで、それをろ過し、MeOHで洗浄すると、所望の化合物を与える。
【０１６４】
【化１４】
2018530617.tif 000019
【０１６５】
（1.2.2.一般的方法B）
【化１５】
2018530617.tif 000020
DMSO中の6-クロロ-3-ニトロ-ピリジン-2-イルアミノ誘導体(1当量)に、対応するアミン(1.1当量)及びDIPEA(2当量)を加え、次いで、該反応混合物を、反応の完了まで110〜130℃でマイクロ波処理する。該混合物をH2Oで希釈し、沈殿物をろ去し、真空下で風乾させると、所望の化合物を与える。
【０１６６】
（一般的方法Bの例示的合成:）
（（6-[3-ニトロ-6-(テトラヒドロ-ピラン-4-イルアミノ)-ピリジン-2-イルアミノ]-ニコチノニトリル(中間体8)）
【化１６】
2018530617.tif 000021
DMSO(20mL)中の6-(6-クロロ-3-ニトロ-ピリジン-2-イルアミノ)ニコチノニトリル(中間体1、4g、14.51mmol、1当量)に、テトラヒドロ-ピラン-4-イルアミン(1.65mL、15.96mmol、1.1当量)及びDIPEA(5.05mL、29.02mmol、2当量)を加え、次いで、該反応混合物を130℃で20分間マイクロ波処理する。該混合物をH2O及びEt2Oで希釈し、沈殿物をろ去し、真空下で風乾させると、所望の化合物を与える。
【０１６７】
【化１７】
2018530617.tif 000022
【０１６８】
（1.2.3.一般的方法C）
【化１８】
2018530617.tif 000023
NBS(1.1〜2当量)を、3-ニトロ-ピリジン-2,6-ジアミノ誘導体(1当量)の乾燥MeCN溶液に加え、該反応物を室温で撹拌し、UPLC-MSによりモニターする。完全な完了に達しない場合、出発物質が全く残されなくなるまで、追加のNBSを加える。形成された沈殿物をろ去し、Et2Oで洗浄し、真空下で風乾させると、所望の化合物を与える。
【０１６９】
（一般的方法Cの例示的合成:）
（6-[5-ブロモ-3-ニトロ-6-(テトラヒドロ-ピラン-4-イルアミノ)-ピリジン-2-イルアミノ]-ニコチノニトリル(中間体11)）
【化１９】
2018530617.tif 000024
NBS(2.04g、11.46mmol、1.3当量)を、6-[3-ニトロ-6-(テトラヒドロ-ピラン-4-イルアミノ)-ピリジン-2-イルアミノ]-ニコチノニトリル(中間体8、3g、8.81mmol、1当量)の乾燥MeCN(150mL)溶液に加え、該反応物を室温で4時間撹拌する。NBS(0.31g、1.76mmol、0.2当量)を加え、該反応物を室温でさらに16時間撹拌する。形成された沈殿物をろ去し、Et2Oで洗浄し、真空下で風乾させると、所望の化合物を与える。
【０１７０】
【化２０】
2018530617.tif 000025
【０１７１】
(1.2.4.一般的方法D）
【化２１】
2018530617.tif 000026
LiOtBu(3当量)を、対応するアルコール(5当量)の乾燥1,4-ジオキサン溶液に、又は溶媒として使用される対応するアルコール中に少量ずつ加える。次いで、2-アミノ-3-ブロモピリジン誘導体(1当量)を加え、それに続いてCuI(0.6当量)を加える。該反応物を、反応の完了まで、マイクロ波照射下で、80〜120℃に、又は110〜150℃に加熱する。該混合物を氷水に注ぐか、HClの1N水溶液を加える。沈殿物をろ去し、真空下で風乾させる。次いで、残渣をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーによる精製すると、所望の化合物を与える。
【０１７２】
（一般的方法Dの例示的合成:）
（6-[5-[2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-エトキシ]-3-ニトロ-6-(テトラヒドロ-ピラン-4-イルアミノ)-ピリジン-2-イルアミノ]-ニコチノニトリル(中間体19)）
【化２２】
2018530617.tif 000027
LiOtBu(2.87g、35.8mmol、3当量)を、2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-エタノール(5.7mL、59.7mmol、5当量)の乾燥1,4-ジオキサン(50mL)溶液に少量ずつ加える。6-[5-ブロモ-3-ニトロ-6-(テトラヒドロ-ピラン-4-イルアミノ)-ピリジン-2-イルアミノ]-ニコチノニトリル(中間体11、5.0g、11.9mmol、1当量)を加え、それに続いてCuI(1.36g、7.2mmol、0.6当量)を加える。次いで、該反応物を120℃に4時間加熱する。該混合物を0℃に冷却し、HClの1N水溶液(50mL)を加え、生じた混合物を室温で20分間撹拌する。沈殿物をろ過し、真空下で乾燥させる。次いで、残渣を、DCM中0〜5%のMeOHから溶出させてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製すると、所望の化合物を与える。
【０１７３】
MW(計算値):444.45;MW(観測値):445.18 ES+。
【０１７４】
【化２３】
2018530617.tif 000028
【０１７５】
(1.2.5.一般的方法E）
【化２４】
2018530617.tif 000029
2,6-ジアミノ-5-ニトロ-ピリジン誘導体(1当量)の乾燥MeOH溶液に、オルトギ酸トリメチル(0.1mmolの2,6-ジアミノ-5-ニトロ-ピリジン誘導体に対しておよそ0.1mL)及びギ酸(0.1mmolの2,6-ジアミノ-5-ニトロ-ピリジン誘導体に対しておよそ0.1mL)を加える。次いで、NH4Cl(4当量)及びZn(4〜5当量)を加え、該混合物を、反応の完了まで70℃に加熱する。次いで、該反応混合物を室温に冷却する。
【０１７６】
冷却時に沈殿物が観察される場合、該固体をろ過し、DCM/CHCl3及び2%ギ酸水溶液による水性の後処理に付すると、所望の化合物を与える。
【０１７７】
冷却時に沈殿が起こらない場合、溶媒を蒸発させ、次いで、残渣をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製すると、所望の化合物を与える。
【０１７８】
（一般的方法Eの例示的合成:）
（6-[6-[2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-エトキシ]-5-(テトラヒドロ-ピラン-4-イルアミノ)-イミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル]-ニコチノニトリル(化合物1)）
【化２５】
2018530617.tif 000030
6-[5-[2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-エトキシ]-3-ニトロ-6-(テトラヒドロ-ピラン-4-イルアミノ)-ピリジン-2-イルアミノ]-ニコチノニトリル(中間体19、2.3g、5.2mmol、1当量)の乾燥MeOH(60mL)溶液に、オルトギ酸トリメチル(10mL)及びギ酸(10mL)を加える。次いで、NH4Cl(1.1g、20.7mmol、4当量)及びZn(1.4g、20.7mmol、4当量)を加え、該混合物を2時間還流に加熱する。MeOH(30mL)を加え、該反応混合物を1時間還流に加熱する。
【０１７９】
該混合物を室温に冷却し、形成された沈殿物をろ過し、真空下で乾燥させる。MeOH(100mL)及びギ酸(2mL)を加え、生じた混合物を還流下で1時間撹拌する。該混合物を室温に冷却し、氷水に注ぎ、形成された沈殿物をろ過し、真空下で乾燥させる。該固体をDCMとCHCl3の混合物に懸濁させ、セライトに通してろ過し、ろ液を2%ギ酸水溶液で洗浄する。有機相をNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、濃縮乾固すると所望の化合物を与える。
【０１８０】
MW(計算値):424.46;MW(観測値):425.40 ES+
【０１８１】
【化２６】
2018530617.tif 000031
【０１８２】
(1.2.6.一般的方法F）
【化２７】
2018530617.tif 000032
化合物1、対応するカルボン酸(1.5当量)、DMAP(1.5当量)、及びEDCI(2.25当量)の混合物を、反応の完了まで、DCM中で、室温で撹拌する。該反応物をH2Oによりクエンチし、DCMで抽出し、次いで、有機層をMgSO4で乾燥させ、蒸発乾固させる。残渣をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製すると、所望の化合物を得る。
【０１８３】
（一般的方法Fの例示的合成:）
（(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-メチル-酪酸2-{2-[3-(5-シアノ-ピリジン-2-イル)-5-(テトラヒドロ-ピラン-4-イルアミノ)-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イルオキシ]-エトキシ}-エチルエステル(中間体30)）
【化２８】
2018530617.tif 000033
化合物1(42mg、0.1mmol、1当量)、boc-(S)-バリン(33mg、0.15mmol、1.5当量)、DMAP(19mg、0.15mmol、1.5当量)、及びEDCI(45mg、0.225mmol、2.25当量)の混合物を、DCM(5mL)中で、室温で3時間撹拌する。該反応物をH2Oによりクエンチし、DCMで抽出し、次いで、有機層をMgSO4で乾燥させ、蒸発乾固させる。残渣を、ヘプタン中0〜100%のEtOAcから溶出させてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製すると、所望の化合物を与える。
【０１８４】
（1.2.7.一般的方法G:塩化方法）
出発物質を、熱EtOAc中に、又はEtOAcとMeOH(5/1)の熱混合物に溶解させる。シュウ酸(EtOAc中0.2 M、1当量)を、該熱溶液に加える。沈殿物が形成し、それをろ過し、Et2Oですすぎ、乾燥させると、所望の化合物を出発物質のシュウ酸塩として与える。
【０１８５】
（一般的方法Gの例示的合成:）
（(S)-2-アミノ-3-メチル-酪酸2-{2-[3-(5-シアノ-ピリジン-2-イル)-5-(テトラヒドロ-ピラン-4-イルアミノ)-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イルオキシ]-エトキシ}-エチルエステルシュウ酸塩(化合物10)）
【化２９】
2018530617.tif 000034
化合物9(100mg、0.19mmol、1当量)を熱EtOAc(10mL)に溶解させ、シュウ酸(EtOAc中0.2 M、0.96mL、0.19mmol、1当量)を該熱溶液に加える。形成された沈殿物をろ過し、Et2Oですすぎ、乾燥させると所望の化合物を与える。
【０１８６】
（1.2.8.(3,4 cis)-3-アミノ-テトラヒドロ-ピラン-4-オール(中間体28)の合成）
【化３０】
2018530617.tif 000035
（工程i):3,7-ジオキサ-ビシクロ[4.1.0]ヘプタン）
m-クロロ過安息香酸(23.51g、136.2mmol、2当量)のDCM(15mL)溶液に、3,6-ジヒドロ-2H-ピラン(5.73g、68.1mmol、1当量)のDCM(10mL)溶液を加える。該反応混合物を室温で6時間撹拌し、その後m-クロロ過安息香酸(11.76g、68.1mmol、1当量)を加える。該反応混合物を室温で16時間撹拌し、ろ去する。ろ液を、Na2SO3、NaHCO3の飽和溶液、及び水で洗浄する。次いで、有機層をNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、真空中で濃縮すると、所望の化合物を与え、さらに精製せずに次の工程に使用する。
【０１８７】
（工程ii):(3,4 trans)-3-ベンジルアミノ-テトラヒドロ-ピラン-4-オール）
EtOH(10mL)中の3,7-ジオキサ-ビシクロ[4.1.0]ヘプタン(2.7mmol、1当量)及びベンジルアミン(300μL、2.7mmol、1当量)の混合物を、還流温度で18時間加熱する。次いで、EtOHを蒸発させ、粗製物を、DCM:MeOH:NH4OH 10:1:0.1により溶出させてシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより精製すると、所望の化合物を与える。
【０１８８】
（工程iii):N-ベンジル-N-((3,4 trans)-4-ヒドロキシ-テトラヒドロ-ピラン-3-イルl)-ベンズアミド）
塩化ベンゾイル(78μL、0.68mmol、1当量)を、前の工程からの(3,4 anti)-3-ベンジルアミノ-テトラヒドロ-ピラン-4-オール(140mg、0.68mmol、1当量)及びTEA(280μL、2.03mmol、3当量)のDCM(2mL)中の氷冷溶液に滴加する。該反応混合物を室温で1時間撹拌する。次いで、該混合物を2N HCl水溶液で2回洗浄する。水層をDCMで抽出し、次いで、合わせた有機層をNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、真空中で濃縮すると、所望の化合物を与える。
【０１８９】
（工程iv):(3,4 cis)-3-ベンジルアミノ-テトラヒドロ-ピラン-4-オール）
N-ベンジル-N-((3,4 trans)-4-ヒドロキシ-テトラヒドロ-ピラン-3-イル)-ベンズアミド(220mg、0.71mmol、1当量)のDCM(2.5mL)溶液を、0℃の塩化チオニル(195μL、2.68mmol、3.8当量)に滴加する。該反応混合物を室温で4時間撹拌し、次いで真空中で濃縮する。残渣に、6N HCl水溶液(2mL)を加え、生じた混合物を還流温度で18時間加熱する。冷却後、沈殿物をろ去し、水で洗浄し、ろ液をEtOAcで抽出する。水層にEt2Oを加え、2N NaOH水溶液を加えて、混合物をアルカリ性にする。相を分離し、水相をDCM及びEtOAcで抽出する。次いで、合わせた有機層をNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、真空中で濃縮すると、所望の化合物を与える。
【０１９０】
（工程v):(3,4 cis)-3-アミノ-テトラヒドロ-ピラン-4-オール）
(3,4 cis)-3-ベンジルアミノ-テトラヒドロ-ピラン-4-オール(100mg、0.48mmol、1当量)のMeOH(3mL)溶液を、10% Pd/C(40mg)上で、1.5時間、室温で1気圧のH2下で水素化する。触媒を、セライトに通すろ過により除き、MeOHで洗浄し、ろ液を蒸発させると、所望の化合物を与える。
【０１９１】
(1.2.9.(cis-1,4)-1-メチル-4-メチルアミノ-シクロヘキサノール(中間体29)の合成）
【化３１】
2018530617.tif 000036
（工程i):(cis-1,4)-(4-ヒドロキシ-4-メチル-シクロヘキシル)カルバミン酸tert-ブチルエステル）
MeCN(15mL)中のcis-4-アミノ-1-メチルシクロヘキサノール(1.0g、7.74mmol、1当量)の懸濁液に、二炭酸ジtert-ブチル(1.85g、8.47mmol、1.1当量)を加え、該混合物を室温で16時間撹拌する。沈殿物をろ過し、ヘキサンで洗浄し、乾燥させると所望の化合物を与える。
【０１９２】
（工程ii):(cis-1,4)-1-メチル-4-メチルアミノ-シクロヘキサノール）
2.0M LiAlH4のTHF溶液(7mL、14.0mmol、4.9当量)を、(cis-1,4)-(4-ヒドロキシ-4-メチル-シクロヘキシル)カルバミン酸tert-ブチルエステル(660mg、2.9mmol、1当量)に室温で少量ずつ加える。該反応混合物を、室温で1時間及び還流状態で45分間撹拌する。該反応混合物を室温に冷却し、次いで、水及びTHFを加える。沈殿物をろ去し、THFで洗浄する。ろ液を濃縮乾固すると、所望の化合物を与える。
【０１９３】
（1.2.10.中間体34:2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エチル(2S)-2-[[2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)アセチル]アミノ]-3-メチル-ブタノアート）
【化３２】
2018530617.tif 000037
化合物9(170mg、0.40mmol、1当量)、2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)酢酸(Boc-Gly-OH、105mg、0.60mmol、1.5当量)、EDCI(173mg、0.90mmol、2.25当量)、及びDMAP(73mg、0.6mmol、1.5当量)をDCM(4mL)中で混合し、室温で一晩撹拌する。該反応液をブラインによりクエンチし、DCMで抽出し、合わせた有機相を蒸発させると、所望の化合物を与える。
表II.本発明の化合物に向けて使用される中間体
SM=出発物質、Mtd=方法、MS Mes'd=測定された質量
【表２】
2018530617.tif 000038
2018530617.tif 000039
2018530617.tif 000040
2018530617.tif 000041
2018530617.tif 000042
2018530617.tif 000043
2018530617.tif 000044
2018530617.tif 000045
【０１９４】
（実施例2.本発明の化合物の調製）
(2.1化合物3:6-{6-[2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-エトキシ]-5-[((cis-1,4)-4-ヒドロキシ-4-メチル-シクロヘキシル)-メチル-アミノ]-イミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル}-ニコチノニトリル）
【化３３】
2018530617.tif 000046
ホルムアルデヒド(3.1μL、0.11mmol、1当量)を、TFA/DCMの混合物(2mL、1/1)中の化合物12(50mg、0.11mmol、1当量)の溶液に加える。室温で30分間撹拌した後、NaBH(OAc)3(47mg、0.22mmol、2当量)を加え、該反応物を1時間室温で撹拌する。次いで、該反応混合物を蒸発乾固させ、該粗生成物を分取HPLC-MSにより精製すると、所望の化合物を得る。
【０１９５】
(2.2.化合物8:硫酸モノ-(2-{2-[3-(5-シアノ-ピリジン-2-イル)-5-(テトラヒドロ-ピラン-4-イルアミノ)-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イルオキシ]-エトキシ}-エチル)エステル）
【化３４】
2018530617.tif 000047
化合物1(84mg、0.2mmol、1当量)を、ピリジン-SO3錯体(127mg、0.8mmol、4当量)のピリジン(5mL)溶液に加え、該反応物を16時間還流に加熱する。次いで、該混合物を蒸発乾固させ、100% EtOAcから100%(DCM/MeOH/AcOH/H2O:90/10/1/1)へ、次いで100%(DCM/MeOH/AcOH/H2O:85/15/2/2)に溶出させてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製すると、所望の化合物を与える。
【０１９６】
（2.3.化合物9:(S)-2-アミノ-3-メチル-酪酸2-{2-[3-(5-シアノ-ピリジン-2-イル)-5-(テトラヒドロ-ピラン-4-イルアミノ)-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イルオキシ]-エトキシ}-エチルエステル）
【化３５】
2018530617.tif 000048
TFA(0.5mL)を、中間体30(20mg、0.032mmol、1当量)のDCM(10mL)溶液に加え、該混合物を室温で1時間撹拌する。該反応物を飽和NaHCO3水溶液によりクエンチし、EtOAcで抽出する。有機層をMgSO4で乾燥させ、蒸発乾固させる。残渣を溶媒系ペンタン中のDCM/Et2Oから再結晶化すると、所望の化合物を与える。
【０１９７】
(2.4.化合物16:2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エチル2-アミノアセタート）
【化３６】
2018530617.tif 000049
中間体31(195mg、0.34mmol、1当量)をTFA/DCM混合物(1/5mL)中に配置し、該反応物を室温で2時間撹拌する。次いで、該反応混合物をトルエンで希釈し、蒸発乾固させる。残渣をDCMに吸収させ、飽和NaHCO3水溶液で洗浄し、有機相を蒸発乾固させる。残渣を最低量のDCMに溶解させ、大量のEt2Oを加え、形成された固体を放置してフラスコの底に沈殿させる。固体をフラスコに残しながら溶媒を慎重に除去し、ペンタンを加え、該固体をろ過すると所望の化合物を与える。
【０１９８】
（2.5.化合物17:2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エチル2-(メチルアミノ)アセタート）
【化３７】
2018530617.tif 000050
中間体32(205mg、0.34mmol、1当量)をTFA/DCM混合物(1/5mL)中に配置し、該反応物を室温で2時間撹拌する。次いで、該反応混合物をトルエンで希釈し、蒸発乾固させる。残渣をDCMに吸収させ、飽和NaHCO3水溶液で洗浄し、有機相を蒸発乾固させる。残渣を最低量のDCMに溶解させ、大量のEt2Oを加え、形成された固体を放置してフラスコの底に沈殿させる。固体をフラスコに残しながら溶媒を慎重に除き、ペンタンを加え、該固体をろ過すると所望の化合物を与える。
【０１９９】
(2.6.化合物18:2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エチル(2S)-ピロリジン-2-カルボキシラート）
【化３８】
2018530617.tif 000051
中間体33(211mg、0.34mmol、1当量)をTFA/DCM混合物(1/5mL)中に配置し、該反応物を室温で2時間撹拌する。次いで、該反応混合物をトルエンで希釈し、蒸発乾固させる。残渣をDCMに吸収させ、飽和NaHCO3水溶液で洗浄し、有機相を蒸発乾固させる。残渣を最低量のDCMに溶解させ、大量のEt2Oを加え、形成された固体を放置してフラスコの底に沈殿させる。固体をフラスコに残しながら溶媒を慎重に除き、ペンタンを加え、該固体をろ過すると所望の化合物を与える。
【０２００】
（2.7.化合物19:2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エチル(2S)-2-[(2-アミノアセチル)アミノ]-3-メチル-ブタノアート）
【化３９】
2018530617.tif 000052
中間体34(212mg、0.31mmol、1当量)をTFA/DCM混合物(1/5mL)中に配置し、該反応物を室温で2時間撹拌する。次いで、トルエンを加え、溶媒を蒸発乾固させる。残渣をDCMに溶解させ、飽和NaHCO3水溶液の添加後固体が沈殿する。それをろ過し、乾燥させると所望の化合物を与える。
【０２０１】
(2.8.化合物27:(3S)-3-アミノ-4-[2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エトキシ]-4-オキソ-ブタン酸塩酸塩）
【化４０】
2018530617.tif 000053
HClの1,4-ジオキサン溶液(4 M、0.4mL、1.6mmol、5当量)を、1,4-ジオキサン(4mL)中の中間体35(222mg、0.32mmol、1当量)に加える。該混合物を室温で3時間撹拌し、次いで、蒸発乾固させる。残渣をHClの1,4-ジオキサン溶液(4 M、6mL)に吸収させ、該反応物を室温で2時間撹拌し、さらなるHClの1,4-ジオキサン溶液(4 M、2mL)を加える。室温で1時間撹拌後、溶媒を蒸発乾固させると所望の化合物を与える。
【０２０２】
(2.9.化合物28:4S)-4-アミノ-5-[2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エトキシ]-5-オキソ-ペンタン酸塩酸塩）
【化４１】
2018530617.tif 000054
HClの1,4-ジオキサン溶液(4 M、0.41mL、1.63mmol、5当量)を、1,4-ジオキサン(4mL)中の中間体36(232mg、0.33mmol、1当量)に加える。該混合物を室温で3時間撹拌し、次いで、蒸発乾固させる。残渣をHClの1,4-ジオキサン溶液(4 M、6mL)に吸収させ、該反応物を室温で2時間撹拌する。溶媒を蒸発乾固させると所望の化合物を与える。
【０２０３】
(2.10.化合物33:4-[2-[2-[3-(5-シアノ-2-ピリジル)-5-(テトラヒドロピラン-4-イルアミノ)イミダゾ[4,5-b]ピリジン-6-イル]オキシエトキシ]エトキシ]-4-オキソ-ブタン酸）
【化４２】
2018530617.tif 000055
中間体37(90mg、0.16mmol、1当量)をTFA/DCM混合物(1/5mL)中に配置し、該反応物を室温で2時間撹拌する。次いで、トルエンを加え、溶媒を蒸発乾固させる。残渣を、DCM中の0〜6% MeOHから溶出させてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、得られた生成物をMeOHから沈殿させると、ろ過後に所望の化合物を与える。
表III.例示的な本発明の化合物
SM=出発物質、Mtd=方法、MS Mes'd=測定された質量
【表３】
2018530617.tif 000056
2018530617.tif 000057
2018530617.tif 000058
2018530617.tif 000059
2018530617.tif 000060
2018530617.tif 000061
2018530617.tif 000062
2018530617.tif 000063
表IV.代表的な本発明の化合物のNMRデータ
【表４】
2018530617.tif 000064
2018530617.tif 000065
2018530617.tif 000066
2018530617.tif 000067
【０２０４】
（生物学的実施例）
（実施例3.インビトロアッセイ）
(3.1.ヒトIRAK-4に対するIC50決定）
IRAK-4に対するIC50値を、放射性のフィルタープレートアッセイにおいて決定する。アッセイの原理は、[γ-33P]ATP及びATPを使用する酵素IRAK-4によるリン酸化時の、RIP140基質内への取り込まれた33Pの測定にある。取り込まれなかった33Pは、フィルタープレートへの試料のローディング(ハーベスター（PerkinElmer社製）を使用)及び6回のその後の洗浄工程により除去する。RIP140中の取り込まれた33Pを、MicroScint(商標)-20(PerkinElmer社製、6013621)のフィルタープレートへの添加後に、シンチレーションカウンター(Topcount、PerkinElmer社製)により測定する。
【０２０５】
100% DMSOストック溶液からの、1/5希釈の試験化合物の水希釈系列(20μM又は6.6μMの最高濃度から出発)の5μLをウェルに加える(反応アッセイ中の最終DMSO濃度1%)。IRAK-4(Carna Biosciences社製、09-145)及びRIP140(配列番号1、表VII参照)を、それぞれ、10ng/mL及び4μMの最終濃度で使用する。該酵素及び基質を、25mMトリスpH 7.5、0.025% トリトンX-100、5mM MnCl2、及び2mM DTT中で、総体積11μLに希釈する。9μLの1μM ATP(Sigma社製、A6419-5G)+0.25μCi[γ-33P]ATP(PerkinElmer社製、NEG602K001MC)の添加により反応を開始させ、該酵素及び基質と同じ緩衝液に希釈する。該混合物を、30℃で45分間インキュベートする。25μLの150mMリン酸(VWR社製、1.00573.1000)を加えることにより、反応を終了させる。試料をフィルタープレートに移し、取り込まれた放射能を、シンチレーションカウンターを使用して測定する。
【０２０６】
10μMスタウロスポリン(1% DMSO)を陽性対照(100%阻害)として;ビヒクル(水+1% DMSO)を陰性対照(0%阻害)として使用する。
表V．本発明の化合物のインビトロヒトIRAK-4 IC50
【表５】
2018530617.tif 000068
2018530617.tif 000069
【０２０７】
(3.2.キナーゼ選択性プロファイリング((ブロードなパネル(broad panel)）
ヒトキナーゼの阻害を、REACTION BIOLOGY(Reaction Biology Corp., 1 Great Valley Parkway, Suite 2 Malvern, PA 19355, USA)で、放射分析キナーゼアッセイで決定する。
【０２０８】
そのIC50を決定するために、化合物を、10μM(最高濃度)で始まり、3倍段階希釈を有する10種の投与量で試験する。IC50値を、残存酵素活性の%(DMSO対照に対する)の用量反応曲線をフィッティングすることにより誘導する。
【０２０９】
(3.3.キナーゼ選択性プロファイリング((集中されたパネル(focused panel)）
このアッセイの目的は、阻害される場合望ましくない副作用をもたらし得る選択された範囲のヒトキナーゼに対する、本発明の化合物の活性及び選択性を決定することである(Dy及びAdjeiの文献、2013;Force及びKolajaの文献、2011)。
【０２１０】
(3.3.1.アッセイプロトコル）
オフターゲットキナーゼに対するIC50値を、放射性のフィルタープレートアッセイで決定する。アッセイの原理は、[γ-33P]ATP及びATPを使用するキナーゼ酵素によるリン酸化時の、ペプチド基質内への取り込まれた33Pの測定にある。取り込まれなかった33Pは、フィルタープレートへの試料のローディング(ハーベスター（PerkinElmer社製）を使用)及び6回のその後の洗浄工程により除去する。ペプチド基質中の取り込まれた33Pを、MicroScint(商標)-20(PerkinElmer社製、6013621)のフィルタープレートへの添加後に、シンチレーションカウンター(Topcount、PerkinElmer社製)により測定する。
【０２１１】
100% DMSOストック溶液からの、1/5希釈の試験化合物の水希釈系列(20μM又は6.6μMの最高濃度から出発)の5μLをウェルに加える(反応アッセイ中の最終DMSO濃度1%)。酵素及びペプチド基質を最適な濃度で使用する(表VI参照)。該酵素及び基質を、アッセイ緩衝液中で、総体積11μLに希釈する。該酵素及び基質と同じ緩衝液に希釈した、9μLのATP+[γ-33P]ATPの添加により反応を開始させる。該混合物を、30℃でインキュベートする。25μLの150mMリン酸を加えることにより、反応を終了させる。試料をフィルタープレートに移し、取り込まれた放射能を、シンチレーションカウンターを使用して測定する。
【０２１２】
インキュベーション時間、アッセイ緩衝液組成、並びにATP、酵素、及び基質の濃度を、例のキナーゼオフターゲットアッセイに関する表VIに報告する。
【０２１３】
10μMスタウロスポリン(1% DMSO)を陽性対照(100%阻害)として;ビヒクル(水+1% DMSO)を陰性対照(0%阻害)として使用する。
表VI.ヒトキナーゼオフターゲット阻害アッセイの条件
【表６】
2018530617.tif 000070
表VII.ヒトキナーゼオフターゲット阻害アッセイに使用されたペプチド基質
【表７】
2018530617.tif 000071
表VIII.例示的な本発明の化合物のインビトロヒトキナーゼオフターゲットIC50
【表８】
2018530617.tif 000072
【０２１４】
(3.3.2.結論）
表VIIIのデータは、表Vのデータと関連して、IRAK-4中に対してキナーゼオフターゲット中での本発明の化合物のより低い阻害性効力を示す。これらのデータは、IRAK-4に対する本発明の化合物の選択性を確認し、そのため、キナーゼオフターゲット阻害と関連する副作用のリスクを限定する。
【０２１５】
(3.4.細胞アッセイ:PBMC中でのCL097活性化TNFα放出阻害）
本発明の化合物を、初代単離ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を使用する細胞アッセイにおいて試験して、特異的なTLR7/8アゴニスト、CL097を使用するTLR活性化時の炎症性サイトカインTNFαの分泌を測定する。細胞培養上清中のTNFαタンパク質の放出を、ヒトTNFα酵素結合免疫吸着測定(ELISA)プロトコルにより定量化する。
【０２１６】
(3.4.1.ヒトのバフィーコートからのヒト初代PBMCの単離）
ヒトのバフィーコート(the Croatian Institute for Transfusion Medicineにより提供)を、一晩4℃に保ち、翌日PBMCの単離のために処理する。PBMCを、Ficoll Paque(商標）PLUS(GE HealthCare社製、17-1440-02)を使用して密度勾配遠心分離により単離する。等体積のバフィーコートを、滅菌されたPBS(1X)で1:4に希釈し、適切な50mL Falcon(登録商標)チューブ中で、35mLを15mLのFicoll Paque PLUSの上に注意深く層状に置く。チューブを35分間1500rpmで、室温で、加速も中断もせずに遠心分離する。遠心分離後、上の血漿層を除去し、単核細胞のリングを慎重に単離して、新しいFalcon(登録商標)チューブに移す。単離された細胞懸濁液を、PBS中で50mLまで希釈し、それに続いて1300rpmで、10分間室温で遠心分離工程を行う。2回の追加のPBS中での洗浄工程及び細胞プーリング（cell pooling）の後、残存する赤血球を、50mLのAKL溶解緩衝液(150mM NH4Cl、10mM NaHCO3、1mM Na2EDTA、pH 7.4)中への細胞ペレットの再懸濁とそれに続く穏やかな混合により溶解させる。次いで、50mLの懸濁液を、1300rpmで10分間室温で遠心分離し、それに続いて上清を除去し、細胞ペレットを、培地(RPMI 1640(Gibco、21875)+56℃で30分間熱非働化された10%ウシ胎児血清(FBS、Biowest社製、S1810)+Pen/Strep(Gibco、15240))中に再懸濁させる。
【０２１７】
(3.4.2. PBMCアッセイにおける化合物処理及びトリガリング）
細胞を、血液分析器(Sysmex社製XS 500i)を使用して計数し、ウェルあたり4.0×105細胞の密度で、96ウェル培養プレート中の160μL培地に播種する。その後に、PBMCを、20μLの10倍濃度の化合物溶液の添加により試験化合物と共に、1時間37℃及び5% CO2でプレインキュベートする。化合物を異なる濃度で試験し、DMSO中の10mMストック溶液からの3倍段階希釈と、それに続く1% FBS及び1% Pen/Strepを補った2X M199培地(Gibco、21157-029)中での1:50希釈工程により調製する。アッセイ中の最終試験濃度は、20μMから始まり、その後3倍段階希釈され、0.2%の等しい最終DMSO濃度である。化合物プレインキュベーション工程の後、20μLの10μg/mL CL097溶液(InvivoGen社製、tlrl-c97-5)をウェルへ添加し、最終アッセイ体積をウェルあたり200μLとし1μg/mLの最終CL097トリガー濃度として、PBMCをトリガーする。陰性対照は、CL097トリガーなしに等しいDMSO濃度に調整する。次いで、アッセイプレートを、加湿インキュベーター中で、37℃及び5% CO2で、4時間インキュベートする。次いで、細胞上清を、細胞培地を384ディープウェルプレートに移すことにより収集し、ヒトTNFαの定量化のために直ちにELISAプレートに移す。
【０２１８】
(3.4.3. ELISAによるTNFαの定量化）
細胞上清中の分泌されたTNFαのレベルを、抗体捕捉活性アッセイ(ELISA)で定量化する。白色のGreiner Lumitrac（商標）384ウェルプレートを、ウェルあたり40μLのPBS中に希釈された1μg/mL抗ヒトTNFα抗体溶液(MAb1;BD Biosciences社製、551220)により、4℃での一晩のインキュベーションの間被覆する。100μL PBSによりウェルを洗浄した後、残っている結合部位を100μLのブロッキング緩衝液(PBS+1%ウシ血清アルブミン+5%スクロース)でブロックし、室温で4時間インキュベートする。ブロッキング工程に続いて、ウェルを、ツイーン20を含むPBS(PBST)で1回洗浄し、それに続いて試料及び標準を加える。TNFαを含む試料を、希釈緩衝液で1/3に希釈し、40μLを4℃での一晩のインキュベーションのために加える。次いで、250ng/mLの最終濃度での1/2000希釈フォーマットの35μLの二次ビオチン化抗TNFα検出抗体(MAb11;BD Biosciences社製、554511)を加えた後、ウェルを、3回（PBSTにより2回、PBSにより1回）洗浄する。室温での2時間のインキュベーション及び適切な洗浄工程(2×PBST、1×PBS)の後、ウェルを、35μLの1/4000希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン溶液(Life Technologies社製、SNN2004)と共にインキュベートし、それに続いて、室温で暗所での45分のインキュベーション工程を行う。次いで、ウェルを3回洗浄し(2×PBST、1×PBS)、それに続いて、50μLのChemiluminescence ELISA Substrate溶液(Roche社製、11582950001)と共に5分のインキュベーションを行う。転化された基質発光シグナルを、PerkinElmer EnVision 2104 Multilabelプレートリーダーで測定する。
【０２１９】
(3.4.4.データ分析）
全対照を、ELISAのヒトTNFα標準曲線の直線範囲内で測定する。全データを、アッセイの品質パラメーターに対する妥当性に関して確認する(シグナル/バックグラウンド＞2及びZ'＞0.3)。
【０２２０】
刺激されていない試料(トリガーなし/ビヒクル(0.2% DMSO))を陽性対照(100%阻害)として使用する。陰性対照(0%阻害)として、刺激された試料(トリガー/ビヒクル(0.2% DMSO))を使用する。陽性対照及び陰性対照を使用して、以下の式により、Z'及び阻害パーセント(PIN)値を計算する:
【数１】
2018530617.tif 000073
（式中、RCLU=相対化学ルミネセンス光単位）。
【０２２１】
PIN値を、濃度反応モードで試験された化合物に関してプロットし、非線形回帰(S字状)カーブフィッティングを適用して、IC50値を、GraphPad Prism(登録商標)ソフトウェアを使用して誘導する。
【０２２２】
(3.5.細胞アッセイ:癌細胞アッセイ）
(3.5.1.細胞株）
OCI-Ly3、OCI-Ly10、OCI-Ly7、及びOCI-Ly19細胞株(DSMZ、Germany又はATTC、USから)由来のヒトリンパ腫細胞を、10%ウシ胎児血清(Invitrogen、S7524)又は20%ヒト血清(Invitrogen、34005100)を補ったIMDM(Gibco(登録商標)、21980-032)中で、37℃で5% CO2中で培養する。
【０２２３】
(3.5.2.細胞成長アッセイ）
リンパ腫細胞(2〜7×103)を96ウェルプレート中に播種し、30μM(1/3希釈、8点)からの異なる投与量の試験化合物により処理する。処理された細胞を、7日間37℃で5% CO2中でインキュベートする。スタウロスポリン(10μM)を陽性対照として使用する。
【０２２４】
細胞成長を、製造者の説明に従って、アラマーブルー(登録商標)(Invitrogen、DAL 1025)と共に細胞をインキュベートすることにより決定する。PerkinElmer EnVision(登録商標)プレートリーダーを使用して蛍光を測定する。DMSOビヒクル値を0%阻害として、スタウロスポリン値を100%阻害として使用して、成長阻害のパーセンテージを計算する。
【０２２５】
(3.6. SW1353細胞におけるIL-1及びTNFα反応細胞アッセイ）
このアッセイの目的は、インビトロヒト細胞アッセイ状況中での活性化されたTLR/IRAK-4経路に対する本発明の化合物の選択性を評価することである。SW1353細胞は軟骨細胞株由来であり、インターロイキン1(IL-1)とTNFαサイトカイントリガーの両方に感受性がある。両サイトカイントリガーは、これらの細胞によるインターロイキン6(IL-6)及びMMP13の発現を誘導する。IL-6及びMMP13放出は、このアッセイにおける読取り値(readouts)として使用され、試験される化合物によるTLR/IRAK-4経路の阻害のレベルの尺度を表す。IL-1トリガーは、IRAK-4依存性経路を介してシグナル伝達するが、TNFαはシグナル伝達にIRAK-4を要さない。したがって、IRAK-4のみを選択的に阻害する化合物は、SW1353細胞による、IL-1により推進されるMMP13又はIL-6の発現に影響し、TNFαにより推進されるこれらのタンパク質の発現には影響しない。
【０２２６】
(3.6.1.SW1353細胞の採取及び播種）
SW1353細胞を、10% FBS及び1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補ったDMEM中で培養する。細胞を、5% CO2の加湿された雰囲気中で、37℃でインキュベートし、週に2回継代培養する。継代培養の間、トリプシン-EDTAを使用して細胞を剥がし、それに続いて細胞培地による中和工程を行う。遠心分離(5分の間1,000rpm)の後、ペレットを、細胞培地中に再懸濁させ、細胞を、自動セルカウンター(Invitrogen Countess（商標）)を使用して計数する。
【０２２７】
細胞を16継代で使用し、ウェルあたり15,000細胞の密度で、96ウェル培養プレート中の120μL細胞培地に播種する。細胞を、一晩のインキュベーションの間に接着させる。
【０２２８】
(3.6.2. SW1353アッセイにおける化合物処理及びトリガリング）
SW1353細胞を、15μLの10倍濃度の化合物溶液を加えることにより、試験化合物と共に2時間37℃及び5% CO2でプレインキュベートする。化合物を異なる濃度で試験し、DMSO中の10mMストック溶液からの3倍段階希釈と、それに続いて細胞培地中の1/50希釈工程により調製する。アッセイ中の最終試験濃度は20μMから始まり、その後3倍段階希釈され、0.2%の等しい最終DMSO濃度である。化合物プレインキュベーション工程後、15μLの10倍濃度IL-1β(Peprotech社製、200-01B)又はTNFαトリガー(Peprotech社製、300-01A)を、ウェルに、最終アッセイ体積をウェルあたり150μLにして、最終トリガー濃度をそれぞれ1ng/mL及び10ng/mLにして加えることにより、SW1353細胞をトリガーする。陰性対照を、トリガーなしで、等しいDMSO濃度により調整する。次いで、アッセイプレートを、加湿インキュベーター中で、37℃及び5% CO2でインキュベートする。細胞上清を、細胞培地をV字底ポリプロピレン96-ウェルプレートに移すことにより24時間及び48時間後に収集し、ELISA読取りまで-80℃で保存する。
【０２２９】
（3.6.3. ELISAによるIL-6の定量化）
細胞上清中の分泌されたIL-6のレベルを、酵素結合免疫吸着法(ELISA)で定量化する。白色のLumitrac（商標） 384-ウェルプレートを、ウェルあたり40μLのPBSで希釈した1μg/mL抗-ヒトIL-6マウス抗体(R&D Systems社製、MAB206)溶液により、4℃で一晩被覆する。100μLのPBSTで2回及びPBSで1回ウェルを洗浄した後、残存する結合部位を、100μLのブロッキング緩衝液(PBS中1% BSA及び5%スクロース)でブロックし、室温で4時間インキュベートする。ブロッキング工程の後、ウェルをPBSTで1回洗浄し、それに続いて、試料か、標準としての組換え型ヒトIL-6(R&D Systems社製、206-IL-050)のいずれかを加える。試料を希釈緩衝液中で1/20に希釈し、40μLを4℃での一晩のインキュベーションのために加える。次いで、35μLの二次ビオチン化抗-IL-6検出抗体(ヒトIL-6ビオチン化ヤギポリクローナル抗体(R&D Systems社製、BAF206))を50ng/mLの最終濃度で加えた後で、ウェルを、3回（PBSTにより2回、PBSにより1回）洗浄する。室温での2時間のインキュベーション及び適切な洗浄工程(PBSTにより2回及びPBSにより1回)の後、ウェルを、35μLの1/2,000希釈されたストレプトアビジン-HRP溶液(Invitrogen、SNN2004)と共にインキュベートし、それに続いて、室温で、暗所で45分インキュベーションを行う。次いで、ウェルを3回(PBSTにより2回及びPBSにより1回)洗浄し、それに続いて、50μLの化学発光ELISA基質溶液(Roche社製、11 582 950 001)と共に5分インキュベーションを行う。転化された基質のルミネセンスを、Luminoskan（商標）Ascent照度計により測定する。
【０２３０】
(3.6.4. ELISAによるMMP13の定量化）
細胞上清中の分泌されたMMP13のレベルを、抗体捕捉活性アッセイで定量化する。この目的のために、黒色のNunc(登録商標)MaxiSorp(商標）384-ウェルプレートを、35μLの1.5μg/mL抗-ヒトMMP13抗体溶液により一晩4℃で被覆する。ウェルを2回PBSTで洗浄した後、残存する結合部位を、100μLのPBS中の5%脱脂粉乳により24時間4℃でブロックする。ブロッキング工程の後で、ウェルをPBSTにより2回洗浄し、それに続いて試料及び標準を添加する。試料を、希釈緩衝液中で1/5に希釈し、35μLを4時間室温で加える。次いで、ウェルをPBSTで2回洗浄する。その後に、MMP13タンパク質を、35μLの1.5mM APMA溶液(Sigma-Aldrich社製、A9563)の添加により完全に活性化し、37℃1時間インキュベートする。次いで、ウェルをPBSTで2回洗浄し、35μL MMP13基質(OMNIMMP(登録商標)蛍光発生基質(BIOMOL、P-126))を加える。37℃で1時間のインキュベーション後、転化された基質の蛍光を、PerkinElmer EnVision(登録商標)(励起波長:320nm、発光波長:405nm)により測定する。
【０２３１】
(3.6.5.データ分析及び計算）
全対照を、ELISAのヒトIL-6及びMMP13標準曲線の直線範囲内で測定する。発生した全データを、アッセイ品質パラメーターに対する妥当性に関して確認する(シグナル/バックグラウンド＞2及びZ'＞0.3)。
【０２３２】
刺激されない試料(トリガーなし/ビヒクル(0.2% DMSO))を陽性対照(100%阻害)として使用する。陰性対照(0%阻害)として、刺激された試料(トリガー/ビヒクル(0.2% DMSO))を使用する。陽性対照及び陰性対照を使用して、Z'及び阻害パーセント(PIN)値を計算する。
【０２３３】
阻害パーセンテージ(PIN)=((RUトリガー/ビヒクル-RU試験化合物)/(RUトリガー/ビヒクル-RUトリガーなし/ビヒクル)*100);ここで、RUは、それぞれIL-6及びMMP13 ELISAの相対化学ルミネセンス光単位又は相対蛍光単位である。PIN値を、濃度反応で試験された試験化合物に関してプロットし、IC50値を、非線形回帰(S字状)カーブフィッティングを適用し、GraphPad Prism(登録商標)ソフトウェアを使用して誘導する。
表IX.例示的な本発明の化合物のSW1353細胞選択性アッセイ結果
【表９】
2018530617.tif 000074
【０２３４】
(3.6.6.結論）
表IXのデータは、本発明の化合物が、IL-1βによりトリガーされたSW1352細胞中でIL-6及びMMP13発現を強力に阻害するが、TNFαによりトリガーされた事象に対するそのような化合物の効果が、効力と最大の大きさの両方の点で限定的であることを示す。これらのデータは、TNFαシグナル伝達に対しては非常に限定的な影響しかないIRAK-4により推進される経路に向けた本発明の化合物の選択性を確認するが、それは、好中球減少症及び感染など、治療と関連する副作用の発生を限定し得る。
【０２３５】
（実施例４．ADMEアッセイ）
(4.1.動力学的溶解度）
化合物の3.3mM DMSOストック溶液から出発して、化合物の段階希釈液を、1/2希釈を実施することによりDMSO中で調製する:3.3、1.6、0.83、0.41、及び0.21mM。この希釈系列を、透明なV字底96ウェルプレート(Greiner社製、651201)に移し、さらに、0.1 Mリン酸緩衝液pH 7.4又は0.1 Mクエン酸緩衝液pH 3.0中で1/33.5に希釈する。最終化合物濃度は、99.5、49.7、24.9、12.4、及び6.22μMである。最終DMSO濃度は、3%以下である。沈殿の陽性対照として、ピレン(30mM)を、各96ウェルプレートの角のウェルに加える。アッセイプレートを密封し、230rpmで振とうしながら37℃で1時間インキュベートする。次いで、プレートを白色光顕微鏡下でスキャンすると、1濃度あたりの沈殿物の個別の写真(50倍の倍率)を得る。各ウェルを画像解析ソフトウェアにより解析し、化合物が完全に溶解したように見える最高濃度を報告する。
【０２３６】
(4.2.ミクロソーム安定性）
DMSO中の化合物の10mMストック溶液をDMSOに3倍希釈する。次いで、この予備希釈された化合物溶液を、96ディープウェルプレート(Nunc、278752)中で、105mMリン酸緩衝液(pH 7.4)中で2μMに希釈し、37℃で事前に温める。
【０２３７】
700U/mLのグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(G6PDH、Roche社製、10127671001)使用ストック溶液を、105mMリン酸緩衝液、pH 7.4中で1:700の倍率で希釈する。0.528M MgCl2.6H2O(Sigma社製、M2670)、0.528M D-グルコース-6-リン酸(Sigma社製、G7879)、及び0.208M NADP+(Sigma社製、N0505)を含むコファクターミックスを、105mMリン酸緩衝液、pH 7.4中で1:8の倍率で希釈する。
【０２３８】
対象の種(例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ)の1mg/mL肝臓ミクロソーム(Tebu-bio社製)、1.2U/mL G6PDH、及びコファクターミックス(6.6mM MgCl2、6.6mMグルコース-6-リン酸、2.6mM NADP+)を含む使用溶液を製作する。この混合物を、15分間、決して20分を超えずに室温でプレインキュベートする。
【０２３９】
プレインキュベーション後に、化合物希釈液及びミクロソームを含む混合物を等量で加え、30分間300rpmでインキュベートする。0分の時点で、ミクロソーム混合物を加える前に、2体積のMeCNを化合物希釈液に加える。インキュベーションの間の最終濃度は、1μM試験化合物又は対照化合物、0.2% DMSO、0.5mg/mLミクロソーム、0.6U/mL G6PDH、3.3mM MgCl2、3.3mMグルコース-6-リン酸、及び1.3mM NaDP+である。
【０２４０】
37℃での30分のインキュベーションの後で、反応を2体積のMeCNで停止させる。
【０２４１】
試料を混合し、遠心分離し、上清を、LC-MS/MSでの分析のために収集する。残存する化合物のパーセンテージを決定するために、装置応答(すなわち、ピーク高さ)の基準を零時点の試料(100%と考えられる)にする。プロプラノロール及びベラパミルを、アッセイデザインにおいて基準として含める。
【０２４２】
ミクロソーム安定性に関するデータを、30分のインキュベーション後に残存する化合物の総量のパーセンテージとして表す。
【０２４３】
(4.3.S9細胞分画における代謝安定性）
このアッセイの目的は、アルデヒドオキシダーゼによる化合物代謝を、S9細胞分画におけるそのインビトロ代謝安定性の決定により評価することである。
【０２４４】
DMSO中の化合物の10mMストック溶液を、最初にDMSOに希釈して(40倍)、250μM濃度を得る。この化合物溶液を、さらに水で希釈して(5倍)、50μM化合物使用溶液を得る(1μMの化合物最終濃度を得るため)。ヒドララジン(アルデヒドオキシダーゼの選択的阻害剤)を、5mMで水中に調製する(100μMの最終濃度を得るため)。インキュベーション混合物を、10μLの肝臓S9懸濁液(ヒト、ラット、マウス、サル、BD Gentest（商標）、20mg/mL)を37℃の86μLの50mMリン酸カリウム緩衝液、pH 7.4に加える(2mgタンパク質/mLの最終濃度)ことにより調製する。2μLの5mMヒドララジンを、選択的阻害剤又は2μLの水の添加と一緒のインキュベーションのために、阻害剤なしのインキュベーションのために加える。5分の予備加温の後、該反応を、2μLの50μM試験化合物のインキュベーション混合物への添加により開始させる。0、3、6、12、18、及び30分のインキュベーションの後、該反応物(100μL)を、分析内部標準としての10ng/mLのワルファリンを含む1%酢酸を含む300μLのMeCN:MeOH(2:1)混合物により停止させる。該試料を混合し、遠心分離し、上清をLC-MS/MSにより分析する。フタラジン（Phtalazine）を陽性対照として含める。
【０２４５】
残存する化合物のパーセンテージを決定するために、装置応答(化合物と内部標準のピーク面積比)の基準を、零時点の試料(100%と考えられる)にする。残存する化合物の%のプロットを使用して、GraphPad Prism(登録商標)ソフトウェアを利用してS9インキュベーション中の半減期及び固有クリアランスを決定する。以下の式を利用して、インビトロ固有クリアランス(μL/分/mg)を計算する:
CL中間体(μL/分/mg)=0.693/t1/2(分)*(インキュベーションのmL/mgタンパク質)*1000
【０２４６】
試験化合物は、S9によるクリアランスがヒドララジンにより阻害される場合、アルデヒドオキシダーゼの基質として分類できる。試験化合物の種に特異的なクリアランスも、アルデヒドオキシダーゼによる代謝を示し得る。
【０２４７】
(4.4.肝細胞中の代謝安定性）
DMSO中の試験化合物の10mMストック溶液を、最初に、DMSO中で3mMに希釈し、次いで、改変型クレブス・ヘンゼライト緩衝液(Sigma社製、K3753)中で5μMに希釈する。この化合物希釈液を、プールされた凍結保存肝細胞(BioreclamationIVT)の懸濁液に37℃で穏やかな振とうをしながら加える。最終的な反応条件は、1μMの試験化合物、0.03% DMSO、50万の生存肝細胞/mL、及び75μLインキュベーション体積である。テストステロン(1μM)及び7-ヒドロキシクマリン(1μM)を、それぞれ、I期及びII期代謝反応対照として使用する。
【０２４８】
0、10、20、45、90、120、及び180分のインキュベーション後に、該反応を、分析内部標準としての10ng/mLのワルファリンナトリウムを含む、225μLのMeCN:MeOH(2:1)により停止させる。試料を混合し、遠心分離し、上清をLC-MS/MSにより分析する。
【０２４９】
残存する化合物のパーセンテージを決定するために、装置応答(試験化合物と内部標準のピーク面積の比率)の基準を、零時点の試料(100%と考えられる)にする。
【０２５０】
残存するパーセンテージ化合物のプロットを使用して、GraphPad Prism(登録商標)ソフトウェアを利用して肝細胞インキュベーション中の半減期及び固有クリアランスを決定する。
【０２５１】
(4.5.CYP阻害）
ヒトチトクロムP450アイソザイム(CYP1A2、2C9、2C19、2D6、及び3A4)に対する試験化合物の阻害可能性を、cDNAにより発現されるヒトチトクロムP450アイソザイム及び代謝されて蛍光性代謝物になる非蛍光基質を使用して評価する。
【０２５２】
化合物を、最終DMSO濃度を0.3%として、3.3及び10μMで試験する。化合物を酵素と共に15分間インキュベートしてから、補因子基質ミックスを加える。CYP3A4(BD Biosciences社製、456202)、CYP2C9(BD Biosciences社製、456258)、CYP2C19(BD Biosciences社製、456259)、及びCYP1A2(BD Biosciences社製、456203)アッセイ用の補因子ミックスの最終反応濃度は、0.4U/mLグルコース-6-リン酸（phophate）デヒドロゲナーゼ(G6PDH、Roche社製、10165875001)、3.3mM MgCl2(Sigma社製、M2670)、3.3mM D-グルコース-6-リン酸(Sigma社製、G7879)及び1.3mM NADP+(Sigma社製、N0505)である。CYP2D6(BD Biosciences社製、456217)では、アッセイ中の最終反応濃度は、0.4U/mL G6PDH、0.41mM MgCl2、0.41mM D-グルコース-6-リン酸、及び8.2μM NADP+である。酵素及び基質の濃度を表Xに報告する。インキュベーション期間の後に、該反応を、停止液の添加により停止させる。基質としてDBFを使用する実験では2N NaOH停止液を使用し、他の全ての基質では、停止液は80% MeCN/20% 0.5Mトリス塩基である。
【０２５３】
蛍光を、直ちに(CEC、AMMC、BFCの場合)、又は20分後(基質としてDBFを使用するCYP2C9及びCYP3A4の場合)、PerkinElmer EnVision(登録商標)リーダーで、適切な励起及び発光波長(表X参照)で読み取る。
【０２５４】
次いで、試験化合物によるCYPの阻害パーセンテージを、データをブランク試料に対して標準化することにより計算する:100%阻害は、酵素/基質ミックスの添加前に停止されたブランク試料であり、0%阻害は、酵素反応が起こった(50分)後に停止されたブランク試料である。
表X.試験された各CYP450アイソザイムに利用された阻害アッセイ条件
【表１０】
2018530617.tif 000075
AMMC:アミノエチル-7-メトキシ-4-メチルクマリン CEC:3-シアノ-7-エトキシクマリン
BFC:7-ベンジルオキシ-4-トリフルオロメチルクマリン DBF:ジベンジルフルオレセイン
【０２５５】
(4.6.MDCKII-MDR1透過性）
MDCKII-MDR1細胞は、P糖タンパク質(P-gp)をコードするヒト多剤耐性(MDR1)遺伝子を過剰発現するメイディン・ダービー（Madin-Darby）イヌ腎臓上皮細胞である。細胞は、the Netherlands Cancer Instituteから得て、24-ウェルMillicell(登録商標)セルカルチャーインサートプレート(Millipore、PSRP010R5)中での3〜4日の培養後に使用する。双方向MDCKII-MDR1透過性アッセイを、以下に記載の通り実施する。
【０２５６】
3×105細胞/mL(1.2×105細胞/ウェル)を、DMEM(Sigma社製、D5796)+1%グルタマックス-100(Sigma社製、G8541)+1%抗生物質/抗真菌剤(Sigma社製、A5955)+10% FBS(Sigma社製、F7524;56℃で30分間非働化)からなる播種培地に播種する。細胞を、CO2インキュベーター中に3〜4日間おく。培地を、播種の24時間後及び実験の日に交換する。
【０２５７】
試験化合物及び参照化合物(アンプレナビル(Moravek Biochemicals社製、M-1613)、ジクロフェナク(Sigma社製、D6889))を、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS、pH 7.4;Sigma社製、D8662)中に調製し、Millicell細胞培養プレートアセンブリーの頂端側(400μL)又は側底側(800μL)チャンバーに、10μM(アンプレナビルの場合0.5μM)の最終濃度で、最終DMSO濃度を1%として加える。レシーバー溶液(D-PBS+1% DMSO)を、Millicell細胞培養プレートの反対のチャンバーに加える。
【０２５８】
ルシファーイエロー透過をモニターすることにより細胞単層の完全性を評価するために、100μMルシファーイエロー(Sigma社製、L0259)を全ドナー緩衝溶液に加える。ルシファーイエローは、傍細胞輸送経路の蛍光マーカーであり、アッセイ中の全ての細胞単層の密着結合完全性を確認する内部対照として使用する。
【０２５９】
オービタルシェーカー上で150rpmで振とうしながら37℃で1時間インキュベートした後、75μLのアリコートを、頂端側と底側の両チャンバーから採り、96ウェルプレート中の分析用内部標準(10ng/mLワルファリン)を含む225μLのMeCN:水溶液(2:1)に加える。アリコーティングを、実験開始時にもドナー溶液から実施して、初期濃度を得る。
【０２６０】
試料中の化合物濃度を、高速液体クロマトグラフィー/質量分析法(LC-MS/MS)により測定する。
【０２６１】
ルシファーイエローを、全レシーバーウェル(側底側又は頂端側)からの150μLの液体を含む96ウェルプレート中で、Thermo Scientific Fluoroskan Ascent FL(励起波長:485nm、測定波長:530nm)により測定する。
【０２６２】
(実施例5.全血アッセイ）
(5.1.エクスビボヒトTNFα放出阻害(全血アッセイ)）
本アッセイの目的は、エクスビボヒト全血状況において活性化されたTLR/IRAK-4経路に対する本発明の化合物の活性を評価することである。Toll様受容体(TLR)は、病原体関連分子パターン(PAMP)と呼ばれる多種多様な微生物分子を認識するパターン認識受容体である。ヒトTLR7及びTLR8はイミダゾキノリン化合物(例えば、CL097)及び一本鎖RNAをその天然のリガンドとして認識する。TLRの活性化は、TLRアゴニストにより処理された細胞によるいくつかのサイトカイン(例えば、TNFα、IL-8、IL-6)の産生につながる。サイトカイン放出は、このアッセイにおける読取り値として使用され、試験される化合物によるTLR/IRAK-4経路の阻害のレベルの尺度を表す。完全な生物の状況において、例えば、マクロファージ(Fcγ受容体の活性化時(Yanらの文献、2012))又はT細胞(T細胞受容体の活性化時(Brehmらの文献、2005))など、TLR/IRAK-4経路に依存しないこれらのサイトカインの他の源が存在することに留意されたい。
【０２６３】
(5.1.1.実験計画）
血液を、健康なボランティアからヘパリンリチウムチューブに静脈穿刺により回収し、次いで凝固を防ぐために数回穏やかに反転し、ロッキングミキサーシェーカー上で少なくとも15分間37℃でインキュベートする。次いで、200μLの血液を2mLマイクロチューブに分注し、DMSO 0.3%又は異なる濃度の試験化合物(10〜0.01μM、グルタミン不含のRPMI 1640(Life Technologies、31870)中の3倍希釈)と共に15分間37℃で、二連でプレインキュベートする。このプレインキュベーションの後、血液を、CL097(1mg/mL水溶液から2μg/mL;InvivoGen社製、tlrl-c97)又はビヒクル(蒸留水)により3時間30分37℃でトリガーする。マイクロチューブを5000×gで10分間4℃で遠心分離し、およそ80μLの血漿をポリスチレン96ウェルプレート中に回収する。血漿を、新鮮なまま分析しても、トリガリング直後に-80℃で凍結してもよい。最後に、TNFαの定量化を、ヒトTNF-アルファDuoSet ELISAキット(R&D Systems社製、DY210)を製造者の説明に従って使用して、血漿を40倍希釈して実施する。光学濃度(OD)を、450nmで、PerkinElmer EnVision 2102 Multilabelプレートリーダーで決定する。
【０２６４】
(5.1.2.データ分析）
標準曲線を、x軸上の濃度に対して平均吸光度をy軸にプロットすることにより作成し、ベストフィットカーブをグラフ上の点を通して描く。線形回帰分析を実施して、式(y=ax +b)及びR2乗値を決定する。各血液試料反復実験のために、TNFα濃度を、希釈係数を考慮して、下記式を使用して計算する:
TNFα濃度試料1=40*(OD試料1-b)/a
[001]次いで、データを、各反復実験に関して、下記式を利用して阻害のパーセンテージ(PIN)として表す:
【数２】
2018530617.tif 000076
式中、「平均TNFαCL097あり」は、CL097によりトリガーされた反復実験試料の平均TNFα濃度であり;「TNFα試料1」は、試料1のTNFα濃度であり;「平均TNFαビヒクルあり」は、ビヒクルにより処理された反復実験試料の平均TNFα濃度である。
カーブフィッティングを、平均PIN±SEMを使用して生成する。グラフ及びIC50計算を、GraphPad Prism(登録商標)ソフトウェアを利用して誘導する。
【０２６５】
（5.2.エクスビボラットTNFα放出阻害(全血アッセイ)）
本アッセイの目的は、エクスビボラット全血状況において活性化されたTLR/IRAK-4経路に対する本発明の化合物の活性を評価することである。Toll様受容体(TLR)は、病原体関連分子パターン(PAMP)と呼ばれる多種多様な微生物の分子を認識するパターン認識受容体である。ヒトTLR7とTLR8はどちらもイミダゾキノリン化合物(例えば、CL097)及び一本鎖RNAをその天然のリガンドとして認識するが、齧歯動物のTLR8は、活性化にオリゴデオキシヌクレオチド(例えば、ポリ(dT))などの追加の因子を必要とする。
【０２６６】
（5.2.1.実験計画）
スプラーグドーリー（Sprague Dawley）ラット(雄、7〜8週齢、体重200〜250g)を、Janvier Labs社(フランス)から得る。
【０２６７】
血液を、放血により得て、少なくとも2匹のラットからヘパリン酸リチウムチューブ中に回収し、次いで、ロッキングミキサーシェーカー上で少なくとも15分間37℃でプレインキュベートする。全ラットから得た血液を50mLポリプロピレンチューブ中に混合して、唯一の血液バッチを得る。次いで、200μLの血液を2mLマイクロチューブに分注し、DMSO 0.3%又は異なる濃度の試験化合物(10〜0.01μM、グルタミン不含のRPMI 1640(Life Technologies社製、31870)中の3倍希釈)と共に、15分間37℃で、二連でインキュベートする。このプレインキュベーション後、血液をCL097(1mg/mL水溶液から10μg/mL、InvivoGen社製、tlrl-c97)及びポリ(dT)(100μM水溶液から1μM;InvivoGen社製、tlrl-pt17)又はビヒクル(蒸留水)により、3時間30分37℃でトリガーする。マイクロチューブを5000×gで10分間4℃で遠心分離し、およそ80μLの血漿をポリスチレン96ウェルプレート中に回収する。血漿を、新鮮なまま分析しても、トリガリングの直後に-80℃で凍結してもよい。最後に、TNFαの定量化を、ラットTNF-アルファQuantikine ELISAキット(R&D Systems社製、SRTA00)を製造者の説明に従って使用して、血漿(1:3希釈)で実施する。光学濃度(OD)を、450nmで、PerkinElmer EnVision 2102 Multilabelプレートリーダーで決定する。
【０２６８】
(5.2.2.データ分析）
標準曲線を、x軸上の濃度に対して平均吸光度をy軸にプロットすることにより作成し、ベストフィットカーブをグラフ上の点を通して描く。線形回帰分析を実施して、式(y=ax +b)及びR2乗値を決定する。各血液試料反復実験のために、TNFα濃度を、希釈係数を考慮して、下記式を使用して計算する:
TNFα濃度試料1=40*(OD試料1-b)/a
【０２６９】
次いで、データを、各反復実験に関して、下記式を利用して阻害のパーセンテージ(PIN)として表す:
【数３】
2018530617.tif 000077
式中、「平均TNFαCL097あり」は、CL097+ポリ(dT)によりトリガーされた反復実験試料の平均TNFα濃度であり;「TNFα試料1」は、試料1のTNFα濃度であり;「平均TNFαビヒクルあり」は、ビヒクルにより処理された反復実験試料の平均TNFα濃度である。
カーブフィッティングを、平均PIN±SEMを使用して生成する。グラフ及びIC50計算を、GraphPad Prism(登録商標)ソフトウェアを利用して誘導する。
【０２７０】
(実施例6.インビボアッセイ）
(6.1. TLR7/8アゴニスト、イミキモドの局所適用により誘発される乾癬様表皮過形成のマウスモデル）
(6.1.1.材料）
アルダラ(登録商標)5%イミキモドクリームをMEDA社から得る。
【０２７１】
抗マウスIL-12/IL-23 p40 FG精製抗体(C17.8)を、Affymetrix eBioscience社(カタログ番号16-7123-85)から得る。
【０２７２】
(6.1.2.動物）
Balb/cJマウス(雌、体重18〜20g)をJanvier Labs社(フランス)から得る。マウスを12時間の明暗周期(07:00〜19:00)に保つ。温度を22±2℃に維持し、餌及び水を自由に与える。
【０２７３】
(6.1.3.試験設計）
試験の設計は、Van der Fits L.ら(van der Fitsらの文献、2009)から適合させる。
【０２７４】
第1日に、イソフルランによる軽い麻酔下で、マウスの2つの耳の周囲を剃毛する。
【０２７５】
30mgの市販のイミキモドクリーム(アルダラ5%クリーム)を、各耳の内表面と外表面の両方に、連続４日間塗布するが、これは1.5mgの活性化合物の１日量ということになる。対照動物は同じ量のワセリンを受け取る。
【０２７６】
第1日から第5日に、イミキモドの塗布前に、マウスに、試験化合物を、メチルセルロース0.5%中10又は30mg/kgで経口的に1日2回投薬する(第5日には、マウスに、安楽死の2時間前に1回のみ投薬する)。
【０２７７】
陽性参照群において、動物は、第1日及び第1日の3日前に、抗-マウスIL-12/IL-23 p40抗体、10mg/kgの2回の腹腔内注射を受ける。
【０２７８】
(6.1.4.疾患の評価）
両耳の厚さを、シックネスゲージ(Mitutoyo社製、Absolute Digimatic、547-321)により毎日測定する。体重を、実験開始時及び犠死時に評価する。第5日に、最後の投薬の2時間後に、マウスを犠死させる。耳の耳介を、軟骨を除いて切除する。耳介を秤量し、次いで、1mLのRNAlater(登録商標)溶液を含むバイアル中で浸漬して遺伝子発現を評価し、又は組織学のためにホルマリンに浸漬する。
【０２７９】
１群あたり14匹のマウスがいる。結果を平均±SEMとして表し、統計分析を、一元配置ANOVAを使用し、それに続いてイミキモド-ビヒクル群に対するダネットの事後検定を使用して実施する。
【０２８０】
(6.1.5.組織学）
犠死の後、耳を回収し、3.7%ホルムアルデヒド中で固定してからパラフィンに包埋する。2μm厚さの切片を切り出し、ヘマトキシリン及びエオシンにより染色する。耳の表皮厚さを、画像解析(SisNcomソフトウェア)により、20倍の倍率で取り込まれた耳あたり6つの画像で測定する。データを平均±SEMとして表し、統計分析を、一元配置ANOVAを使用し、それに続いてイミキモド-ビヒクル群に対するダネットの事後検定を使用して実施する。
【０２８１】
（6.1.6.遺伝子発現分析）
耳をRNAlater(登録商標)溶液から取り出し、Precellys装置中での1.4 mmセラミックビーズによる破壊後にTrizol(登録商標)に入れる。次いで、全RNAを、NucleoSpin(登録商標)RNAキットを使用して精製する。cDNAを調製し、定量PCRを、ViiA7リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)中でSYBR Green技術を利用して、Qiagen社の遺伝子特異的プライマーにより実施する。各遺伝子(IL17A、IL1B、IL22、LCN2、S100A8、及びS100A9)の発現レベルを、シクロフィリンAハウスキーピング遺伝子発現レベルに対して計算する。データを、相対量の平均±SEMとして表す(RQ=2-ΔCT、ここで、ΔCT=CT試料-CTシクロフィリンA)。使用した統計的検定は、イミキモド-ビヒクル群に対するダネットの事後検定を伴うANOVA分散分析である。
【０２８２】
(6.2.IL-23の皮内注射により誘発される乾癬様表皮過形成のマウスモデル）
(6.2.1.材料）
マウス組換え型IL-23、キャリア不含(14-8231、CF)は、e-Bioscienceにより提供される。
【０２８３】
(6.2.2.動物）
Balb/cマウス(雌、体重18〜20g)をCERJ社(フランス)から得る。マウスを12時間の明暗周期(07:00〜19:00)に保つ。温度を22℃に維持し、餌及び水を自由に与える。
【０２８４】
（6.2.3.試験設計）
試験の設計をRizzo HL.ら(Rizzoらの文献、2011)から適合させる。
【０２８５】
第1日に(D1)、マウスの2つの耳の周囲を剃毛する。
【０２８６】
連続4日間(D1〜D4)、マウスは、右の耳介にマウス組換え型IL-23(PBS/0.1% BSA中1μg/20μL)を、左の耳介に20μLのPBS/0.1% BSAの毎日の皮内投与を、イソフルランの吸入により誘導された麻酔下で受ける。
【０２８７】
D1〜D5に、IL-23注射の1時間前に、マウスに、試験化合物(メチルセルロース0.5%中、10、30、又は100mg/kg、経口的、1日1回)又はビヒクルを投薬する。
【０２８８】
(6.2.4.疾患の評価）
両耳の厚さを、自動カリパスにより毎日測定する。体重を、開始時及び犠死時に評価する。第5日に、最後の投薬の2時間後、マウスを犠死させる。耳の耳介を、軟骨を除き切り取る。耳介を秤量し、次いで、1mLのRNAlater(登録商標)溶液を含むバイアル又はホルムアルデヒド中に配置する。
【０２８９】
D4に、血液試料も、PKプロファイリングのために、投薬直前(T0)及び投薬後1時間、3時間、6時間に後眼窩洞から回収する。
【０２９０】
１群あたり8匹のマウスがいる。結果を平均±SEMとして表し、統計分析を、一元配置ANOVAを使用し、それに続いてIL-23ビヒクル群に対するダネットの事後検定を使用して実施する。
【０２９１】
(6.2.5.組織学）
犠死の後、耳を回収し、3.7%ホルムアルデヒド中で固定してから、パラフィンに包埋する。2μmの厚さの薄切を行い、ヘマトキシリン及びエオシンにより染色する。耳の表皮厚さを、20倍の倍率で取り込まれた耳あたり6画像で画像解析(Sis'Ncomソフトウェア)により測定する。データを平均±SEMとして表し、統計分析を、一元配置ANOVAを使用し、それに続いてIL-23ビヒクル群に対するダネットの事後検定を使用して実施する。
【０２９２】
(6.2.6.遺伝子発現分析）
半分の耳をRNAlater(登録商標)溶液から取り出し、Precellys装置中での1.4mmセラミックビーズによる破壊の後にTrizol(登録商標)に入れる。次いで、全RNAを、NucleoSpin(登録商標)RNAキットを使用して精製する。cDNAを調製し、定量PCRを、Qiagen社の遺伝子特異的プライマーにより、SYBR Green技術を利用して、ViiA7リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)中で実施する。各遺伝子(IL17A、IL1B、IL22、LCN2、S100A8、及びS100A9)の発現レベルを、シクロフィリンAハウスキーピング遺伝子発現レベルに対して計算する。データを、相対量の平均±SEMとして表す(RQ=2-ΔCT、ここで、ΔCT=CT試料-CTシクロフィリンA)。使用した統計的検定は、IL-23ビヒクル群に対するダネットの事後検定を伴うANOVA分散分析である。
【０２９３】
(6.3.PK/PDモデル:CL097、特異的TLR7/8アゴニストにより誘発されるTNFα放出）
このアッセイの目的は、本発明の化合物の投与時のインビボのIRAK-4依存性事象の阻害とこの化合物の循環濃度レベルとの関係を決定することである。
【０２９４】
(6.3.1.材料）
CL097(カタログ番号tlrl-c97)及びポリ(dT)(カタログ番号tlrl-pt17)を、InvivoGen社から得る。
【０２９５】
AlphaLISA(登録商標)マウスTNFαキットを、Perkin-Elmer社(カタログ番号AL505C)から得る。
【０２９６】
(6.3.2.動物）
DBA/1Jマウス(雄、体重18〜20g)を、Janvier Labs社(フランス)から得る。マウスを12時間の明暗周期(07:00〜19:00)に保つ。温度を22±2℃に維持し、餌及び水を自由に与える。
【０２９７】
(6.3.3.試験設計）
マウスは、試験化合物の経口投与を受け取る。投薬を全く受けないそのままの動物の群をt=0時点として使用する。
【０２９８】
心臓内サンプリング(イソフルラン麻酔下)により得られた2つの血液試料を、投薬後30分、1時間、3時間、8時間、又は24時間で、ヘパリン酸リチウムチューブに回収する。1つを薬物動態(PK)分析に使用し、2番目を薬力学(PD)マーカー定量化に使用する。
【０２９９】
(6.3.4.血漿中の化合物レベルの定量化）
全血試料を、5000rpmで10分間遠心分離し、生じた血漿試料を分析まで-20℃で保存する。各試験化合物の血漿濃度を、LC-MS/MS法により決定する。
【０３００】
（6.3.5.薬物動態パラメーターの決定）
薬物動態パラメーターを、WinNonlin（登録商標）(Pharsight（登録商標）、アメリカ合衆国)を使用して計算する。
【０３０１】
(6.3.6.PDマーカーの定量化）
各血液試料を、CL097及びポリ(dT)により2時間37℃で刺激する。次いで、血漿を回収し、AlphaLISAにより製造者の説明に従って、TNFαに関して分析する。
【０３０２】
１群あたり6匹のマウスがいる。結果を、TNFα濃度(pg/mL)、又はt=0時点に対する阻害のパーセンテージ(PIN)として表す。データを平均±SEMとして表し、統計分析を、一元配置ANOVAを使用し、それに続いて、対応する時点のビヒクル群に対するダネットの事後検定を使用して実施する。
【０３０３】
(6.4. MC903の局所適用により誘発されるアトピー性皮膚炎のマウス予防モデル）
(6.4.1.材料）
メチルセルロース0.5%をVWR社(カタログ番号AX021233)から得る。MC903(カルシポトリオール)をTocris Bioscience社(カタログ番号2700/50)から得る。ProSense(登録商標)680をPerkinElmer社(カタログ番号NEV10003)から得る。RNAlater(登録商標)をAmbion(カタログ番号AM7021)から得る。イマルゲン（Imalgene）(登録商標)1000(Merial社)及びロンプン(登録商標)2%(Bayer社)をCentravet社(カタログ番号IMA004-6827812及びROM001-6835444)から得る。
【０３０４】
(6.4.2.動物）
BALB/cNマウス(雌、体重18〜20g)又はCD1/Swissマウス(雌、体重24〜26g)をJanvier Labs社(フランス)から得る。マウスを12時間の明暗周期(07:00〜19:00)に保つ。温度を22±2℃に維持し、餌及び水を自由に与える。
【０３０５】
(6.4.3.試験設計）
試験の設計をLi M.ら(Liらの文献、2006)から適合させる。
【０３０６】
第１日(D1)に、マウスに、イマルゲン及びロンプン(7.5%/2.5%;0.1mL/10g)の腹腔内注射により麻酔をかけ、2つの耳の周囲を剃毛する。
【０３０７】
D1より、20μL EtOHか2nmolのMC903(20μL EtOH中)のいずれかを、マウスの両耳に、連続5日間局所適用する。
【０３０８】
D1からD8に、マウスに、試験化合物(15又は30mg/kg、経口的、1日2回、メチルセルロース0.5%中)又はデキサメタゾン(5mg/kg、経口的、1日1回、メチルセルロース0.5%中)、又はビヒクルを投薬する。
【０３０９】
(6.4.4.血漿中の化合物レベルの定量化）
各試験化合物の血漿濃度を、質量分析計がポジティブ又はネガティブエレクトロスプレーモードで運転されているLC-MS/MS法により決定する。
【０３１０】
(6.4.5.薬物動態パラメーターの決定）
薬物動態パラメーターを、Phoenix(登録商標) WinNonlin(登録商標)(Pharsight(登録商標)、アメリカ合衆国)を使用して計算する。
【０３１１】
(6.4.6.疾患の評価）
両耳の厚さを、(イソフルラン吸入により誘導される麻酔の後に)試験の開始時、1日おき、及び犠死時に、シックネスゲージ(Mitutoyo社製、Absolute Digimatic、547-321)を使用して測定する。
【０３１２】
体重を、試験開始時、1日おき、及び犠死時に評価する。
【０３１３】
D4に、全群のマウスは、ProSense(登録商標) 680プローブを受け取る(0.8nmol/10g、IP)。D5に、マウスに、イマルゲン及びロンプンの腹腔内注射(7.5%/2.5%;0.1mL/10 g)により麻酔をかける。顆粒球浸潤を、インビボ分子イメージングを使用して測定する(Bruker In-Vivo Xtreme画像化システム、励起波長:630nm、発光波長:700nm、取得時間:5秒)。
【０３１４】
D8に、最後の投薬の2時間後に、マウスを犠死させ、全血液をEDTAコートされたチューブで回収し、血漿をさらなる測定のために(循環化合物を含む)凍結する。血液の試料を、ヘパリンコートされたチューブにも回収する。
【０３１５】
耳の耳介を回収し、秤量する。１つの耳を縦方向に二等分して切る。一方の半分を組織学のためにホルムアルデヒド緩衝液4%中で固定する;もう片方を、遺伝子発現を評価するために、RNAlater(登録商標)に浸漬する。
【０３１６】
１群あたり8匹のマウスがいる。結果を平均±SEMとして表し、統計分析を、一元配置ANOVAを使用し、それに続いて、耳の厚さ及び体重に関してMC903ビヒクル群に対して、体重に関してEtOHビヒクル群に対してダネットの事後検定を使用して実施する。
【０３１７】
(6.4.7.組織学）
犠死後に、半分の耳を回収し、3.7%ホルムアルデヒド中で固定してから、パラフィンに包埋する。4μm厚さの切片を、特異的細胞マーカー抗体:T細胞にはCD3及び好酸球にはEPXにより、免疫組織化学により免疫染色する。マウスあたりの切片全体からの免疫染色された細胞面積を、画像解析(CaloPixソフトウェア、TRIBVN Healthcare社製)により測定する。データを平均±SEMとして表し、統計分析を、一元配置ANOVAを使用して、それに続いてMC903ビヒクル群に対するダネットの事後検定を使用して実施する。
【０３１８】
(6.4.8.遺伝子発現分析）
耳をRNAlater(登録商標)溶液から取り出し、Bertin Instruments社製Precellys(登録商標)ホモジェナイザー中で1.4 mmセラミックビーズによる破壊の後にTrizol(登録商標)に入れる。次いで、全RNAを、フェノール/クロロホルムプロトコルを利用して抽出し、RNeasy(登録商標)96 QIAcube(登録商標)HT Kit(Qiagen社製、カタログ番号74171)を使用してQIAcubeにより精製する。cDNAを調製し、定量PCRを、Qiagen社の遺伝子特異的プライマーにより、SYBR Green技術を利用してViiA 7リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)中で実施する。各遺伝子(IL4、IL5、IL13、TSLP、IL33、ST2、IL25、IL31、IFNγ、IL6、IL10、LCN2、S100A8、及びS100A9)の発現レベルを、HPRT、GAPDH、及びβ-アクチンハウスキーピング遺伝子発現レベルに対して計算する。データを相対量の平均±SEMとして表す(RQ=2-ΔCT、ここで、ΔCT=CT試料-平均(CT HPRT、CT GAPDH、CTβ-アクチン)。使用した統計的検定は、EtOH/MC903ビヒクル群に対するダネットの事後検定を伴うANOVA分散分析である。
【０３１９】
(6.5.MC903の局所適用により誘発されるアトピー性皮膚炎のマウス治療モデル）
(6.5.1.材料）
メチルセルロース0.5%をVWR社(カタログ番号AX021233)から得る。MC903(カルシポトリオール)をTocris Bioscience社(カタログ番号2700/50)から得る。ProSense(登録商標)680をPerkinElmer社(カタログ番号NEV10003)から得る。RNAlater(登録商標)をAmbion(カタログ番号AM7021)から得る。イマルゲン(登録商標) 1000(Merial社)及びロンプン(登録商標) 2%(Bayer社)をCentravet社(カタログ番号IMA004-6827812及びROM001-6835444)から得る。
【０３２０】
(6.5.2.動物）
BALB/cNマウス(雌、体重18〜20g)又はCD1/Swissマウス(雌、体重24〜26g)をJanvier Labs社(フランス)から得る。マウスを12時間の明暗周期(07:00〜19:00)に保つ。温度を22±2℃に維持し、餌及び水を自由に与える。
【０３２１】
(6.5.3.試験設計）
試験の設計をLi M.ら(Liらの文献、2006)から適合させる。
【０３２２】
第１日に(D1)、マウスに、イマルゲン及びロンプンの腹腔内注射(7.5%/2.5%;0.1mL/10 g)により麻酔をかけ、2つの耳の周囲を剃毛する。
【０３２３】
D1より、20μL EtOHか2nmolのMC903(20μL EtOH中)のいずれかを、D9、D11、又はD15まで(週末の間を除く)マウスの両耳に局所適用する。
【０３２４】
D5から、マウスに、試験化合物(15又は30mg/kg、経口的、1日2回、メチルセルロース0.5%中)又はデキサメタゾン(5mg/kg、経口的、1日1回、メチルセルロース0.5%中)、又はビヒクルを、D10、D12、又はD16まで投薬する。
【０３２５】
（6.5.4.血漿中の化合物レベルの定量化）
各試験化合物の血漿濃度を、質量分析計がポジティブ又はネガティブエレクトロスプレーモードで運転しているLC-MS/MS法により決定する。
【０３２６】
(6.5.5.薬物動態パラメーターの決定）
薬物動態パラメーターを、Phoenix(登録商標)WinNonlin(登録商標)(Pharsight(登録商標)、アメリカ合衆国)を使用して計算する。
【０３２７】
（6.5.6.疾患の評価）
両耳の厚さを、試験開始時に、1週間に3回、及び犠死時に、シックネスゲージ(Mitutoyo社製、Absolute Digimatic、547-321)を使用して、MC903の適用前に(イソフルラン吸入により誘導される麻酔の後で)測定する。
【０３２８】
体重を、試験開始時、１週間に3回、及び犠死時に評価する。
【０３２９】
D8、D10、又はD11に、全群のマウスはProSense(登録商標)680プローブ(0.8nmol/10g、IP)を受け取る。翌日に(D9、D11、又はD12)、マウスに、イマルゲン及びロンプンの腹腔内注射(7.5%/2.5%;0.1mL/10 g)により麻酔をかける。次いで、顆粒球浸潤を、インビボ分子イメージング(Bruker In-Vivo Xtremeイメージングシステム、励起波長:630nm、発光波長:700nm、取得時間:5秒)を使用して測定する。
【０３３０】
D10、D12、又はD16に、最後の投薬の2時間後、マウスを犠死させる;全血液をEDTAコートされたチューブで回収し、血漿をさらなる測定のために(循環化合物を含む)凍結する。
【０３３１】
耳の耳介を回収する。１つの耳を縦方向に二等分して切る。一方の半分を組織学のためにホルムアルデヒド緩衝剤4%中で固定する;もう片方を、遺伝子発現を評価するために、RNAlater(登録商標)に浸漬する。
【０３３２】
1群あたり8匹のマウスがいる。結果を平均±SEMとして表し、統計分析を、一元配置ANOVAを使用して、それに続いて耳の厚さ及び体重に関してはMC903ビヒクル群に対して、体重に関してはEtOHビヒクル群に対してダネットの事後検定を使用して実施する。
【０３３３】
(6.5.7.組織学）
犠死後に、半分の耳を回収し、3.7%ホルムアルデヒド中で固定してからパラフィンに包埋する。4μmの厚さの切片を、抗-CD3抗体により、免疫組織化学により免疫染色する。マウスあたりの切片全体からの免疫染色された細胞面積を、画像解析(CaloPixソフトウェア、TRIBVN Healthcare社製)により測定する。データを平均±SEMとして表し、統計分析を、一元配置ANOVAを使用し、それに続いて、MC903ビヒクル群に対するダネットの事後検定を使用して実施する。
【０３３４】
(6.5.8.遺伝子発現分析）
耳をRNAlater(登録商標)溶液から取り出し、Bertin Instruments社製Precellys(登録商標)ホモジェナイザー中での1.4 mmセラミックビーズによる破壊の後にTrizol(登録商標)に入れる。次いで、全RNAを、フェノール/クロロホルムプロトコルを使用して抽出し、RNeasy(登録商標)96 QIAcube(登録商標)HT Kit(Qiagen社製、カタログ番号74171)を使用してQIAcubeにより精製する。cDNAを調製し、定量PCRを、Qiagen社の遺伝子特異的プライマーにより、SYBR Green技術を利用して、ViiA 7リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)中で実施する。各目的遺伝子(GOI=IL4、IL5、IL13、TSLP、IL33、ST2、IL25、IL31、IFNγ、IL6、IL10、LCN2、S100A8、及びS100A9)の発現レベルを、HPRT、GAPDH、及びβ-アクチンハウスキーピング遺伝子発現レベルに対して計算する。
【０３３５】
全qPCRデータを、標準化された相対量の平均±SEMとして表す(NRQ=2＾(ΔCq GOI)/幾何平均(2^(ΔCq HPRT)、2^(ΔCq GAPDH)、2^(ΔCqβ-アクチン))、式中、ΔCq=Cq平均-Cq試料である。使用される統計的検定は、EtOH/MC903ビヒクル群に対するダネットの事後検定を伴うANOVA分散分析である。
【０３３６】
（6.6.イミキモドの皮膚上適用により誘発される全身性エリテマトーデスのマウスモデル）
(6.6.1.材料）
アルダラ(登録商標)5%イミキモドクリームをMEDA社から得る。
【０３３７】
マウス抗-二本鎖DNA抗体ELISAキットをAlpha Diagnostic International社(カタログ番号5120)から得る。マウス尿アルブミンELISAキットをAbcam社(カタログ番号ab108792)から得る。尿クレアチニンアッセイキットをAbnova社(カタログ番号KA4344)から得る。
【０３３８】
(6.6.2.動物）
BALB/cJマウス(雌、体重18〜20g)をJanvier Labs社(フランス)から得る。マウスを12時間の明暗周期(07:00〜19:00)に保つ。温度を22±2℃に維持し、餌及び水を自由に与える。
【０３３９】
(6.6.3.試験設計）
試験の設計をYokogawa M.ら(Yokogawaらの文献、2014)から適合させる。
【０３４０】
第1日に(D1)、マウスの右の耳周囲を剃毛する。
【０３４１】
マウスは、右の耳介への1.25mgのイミキモドの皮膚上適用を、週に3回連続12週間(D1〜D86)受け取る。対照群は同じ量のワセリンを受け取る。
【０３４２】
D1からD86に、マウスに、試験化合物(30mg/kg、経口的、1日1回、メチルセルロース0.5%中)又はビヒクル(10mL/kg)を投薬する。
【０３４３】
（6.6.4.疾患の評価）
耳の厚さを、週に1回、自動ゲージ(Mitutoyo社製、Absolute Digimatic、547-321)により測定する。
【０３４４】
体重を、開始時及び犠死まで週に1回評価する。剖検時に、脾臓の重量も測定する。マウスを、最後の投薬の2時間後に犠死させる。
【０３４５】
異なる時点で(例えば、D28、D56、及びD84に)、マウスを、個別に代謝ケージに配置して、尿検査を実施し、タンパク尿(アルブミンとクレアチニンの比率)を評価する。
【０３４６】
血清を、異なる時点で(例えば、D28、D56、及びD86に)回収して、抗二本鎖-DNA IgGレベルを評価する。
【０３４７】
D13で、血液試料も、投薬直前(T0)及び投薬の1時間、3時間、6時間後に、PKプロファイリングのために後眼窩洞から回収する。
【０３４８】
１群あたり8〜19匹のマウスがいる。結果を平均±SEMとして表し、統計分析を、一元配置ANOVAを使用し、それに続いて、イミキモドビヒクル群に対するダネットの事後検定を使用して実施する。
【０３４９】
(6.6.5.血漿中の化合物レベルの定量化）
各試験化合物の血漿濃度を、質量分析計がポジティブ又はネガティブエレクトロスプレーモードで運転しているLC-MS/MS法により決定する。
【０３５０】
(6.6.6.薬物動態パラメーターの決定）
薬物動態パラメーターを、Phoenix(登録商標)WinNonlin(登録商標)(Pharsight(登録商標)、アメリカ合衆国)を使用して計算する。
【０３５１】
(6.6.7.組織学）
犠死後に、左の腎臓を回収し、縦方向に2つの部分に切断する。一方の部分を、3.7%ホルムアルデヒド中で固定してからパラフィンに包埋する。4μm厚さの切片を作製し、過ヨウ素酸（Period acid）-シッフ(PAS)により染色するか、又はCD3(T細胞)、CD20(B細胞)、及びF4/80(マクロファージ)により免疫染色する。
【０３５２】
(6.6.7.1.組織病理学）
各糸球体において、メサンギウム増殖（mesangioproliferation）、管内増殖、メサンギウムマトリックス拡張（mesangial matrix expansion）、及び分節性硬化を含む4つの異なる読取り値を、0〜2のスケールで等級付けし、次いで合計する。各腎臓で、約50の糸球体を採点し、次いで、平均して1つの糸球体病変スコアを与える(Yokogawaらの文献、2014)。データを平均±SEMとして表し、統計分析を、クラスカル・ウォリス検定を使用し、それに続いてイミキモドビヒクル群に対するダンの事後検定を使用して実施する。
【０３５３】
(6.6.7.2.細胞定量化）
各細胞型で、免疫組織化学的分析を、組織切片全体に対して20倍の倍率で画像解析(CaloPixソフトウェア、TRIBVN Healthcare社製)を利用して実施する。データを平均±SEMとして表し、統計分析を、一元配置ANOVAを使用し、それに続いて、イミキモドビヒクル群に対するダネットの事後検定を使用して実施する。
【０３５４】
(6.6.8.遺伝子発現分析）
犠死時に、左の腎臓の第2の部分を、1.4 mmセラミックビーズを含むチューブ中に配置し、Bertin Instruments社製Precellys(登録商標)ホモジェナイザーにより1% DTT RLT溶解緩衝液(Qiagen社製、カタログ番号79216)中で破壊する。次いで、全RNAを、RNeasy(登録商標)96 QIAcube(登録商標)HT Kit(Qiagen社製、カタログ番号74171)を使用してQIAcubeにより精製する。cDNAを調製し、定量PCRを、Qiagen社の遺伝子特異的プライマーによりSYBR Green技術を利用してViiA 7リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)中で実施する。各目的遺伝子(GOI=CD3、CD68、CD20、OAS1、Mx1、IFIT1、CXCL11、及びUsp18)の発現レベルを、シクロフィリン、GAPDH、及びβ-アクチンハウスキーピング遺伝子発現レベルに対して計算する。
【０３５５】
犠死時に、脾臓の3分の1を、1.4 mmセラミックビーズを含むチューブ中に配置し、Bertin Instruments社製Precellys(登録商標)ホモジェナイザーによりTrizol(登録商標)中で破壊する。全RNAを、フェノール/クロロホルムプロセスを利用して抽出し、次いで、RNeasy(登録商標)96 QIAcube(登録商標) HT Kit(Qiagen社製、カタログ番号74171)を使用してQIAcubeにより精製する。cDNAを調製し、定量PCRを、Qiagen社の遺伝子特異的プライマーにより、SYBR Green技術を利用してViiA 7リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)中で実施する。各目的遺伝子(GOI=CD20、IRF7、OAS1、Mx1、IFIT1、CXCL11、Usp18、BCL6、CXCL13、CXCR5、MAF、ICOSL、PDCD1、SH2D1a)の発現レベルを、シクロフィリン、GAPDH、及びβ-アクチンハウスキーピング遺伝子発現レベルに対して計算する。
【０３５６】
全qPCRデータを、標準化された相対量の平均±SEMとして表す(NRQ=2^(ΔCq GOI)/幾何平均(2^(ΔCqシクロフィリン)、2^(ΔCq GAPDH)、2^(ΔCqβ-アクチン))式中、ΔCq=Cq平均-Cq試料である。使用される統計的検定は、イミキモドビヒクル群に対するダネットの事後検定を伴うANOVA分散分析である。
【０３５７】
(6.7.IL-23の過剰発現により誘発される乾癬性関節炎のマウスモデル）
(6.7.1.材料）
マウスIL-23増強エピソーマル発現ベクター(EEV)をSystem Biosciences社(カタログ番号EEV651A-1)から得る。リンゲル液タブレットを、Sigma-Aldrich社(カタログ番号96724-100TAB)から得る。マウスIL-23 Quantikine ELISAキットをR&D Systems社(カタログ番号M2300)から得る。ProSense(登録商標)680及びOsteoSense(登録商標)750EXをPerkinElmer社(カタログ番号NEV10003及びNEV10053EX)から得る。RNAlater(登録商標)をAmbion(カタログ番号AM7021)から得る。イマルゲン(登録商標) 1000(Merial社)及びロンプン(登録商標) 2%(Bayer社)をCentravet社(カタログ番号IMA004-6827812及びROM001-6835444)から得る。
【０３５８】
(6.7.2.動物）
B10.RIIIマウス(雄、8週齢)をCharles River社(フランス)から得る。マウスを12時間の明暗周期(07:00〜19:00)に保つ。温度を22±2℃に維持し、餌及び水を自由に与える。
【０３５９】
(6.7.3.試験設計）
試験の設計をSherlock JP.ら(Sherlockらの文献、2012)から適合させる。
【０３６０】
第1日に(D1)、マウスは、リンゲル又はリンゲル中のIL-23 EEVの尾静脈へのハイドロダイナミック注入を受ける(3μg/2.1mL、4〜6秒の期間にわたり静脈内に注入される)。
【０３６１】
D5より、週に2回、実験の終了まで、マウスを臨床症状に関してスコア付けする。
【０３６２】
D5に、血液を、顎下腺静脈中の穿刺により回収して、血清IL-23濃度を評価する。
【０３６３】
D9に、全群のマウスは、ProSense(登録商標)680プローブ(0.8nmol/10g、IP)を受け取る。D10に、マウスに、イマルゲン及びロンプンの腹腔内注射(7.5%/2.5%;0.1mL/10 g)により麻酔をかける。次いで、顆粒球浸潤を、インビボ分子イメージング(Bruker In-Vivo Xtremeイメージングシステム、励起波長:630nm、発光波長:700nm、取得時間:5秒)を使用して測定する。
【０３６４】
D11に、無作為化を、ProSense(登録商標)680分子イメージング及びスコアリングにしたがって実施する。
【０３６５】
D12より、マウスに、試験化合物(30mg/kg、経口的、1日2回、メチルセルロース0.5%中)又はビヒクルを投薬する。
【０３６６】
D19に、最後の投薬後T0、T1時間、T3時間、及びT6時間の時点で血液をサンプリングする。血漿を分離し、バイオアナリシスまで20℃に維持する。
【０３６７】
D36に、化合物の最後の投与の2時間後に、全群のマウスを犠死させる。下記を回収する:
−左後肢の腱・靱帯付着部周囲（皮膚なし）の踵を、Precellysチューブ中で直ちに急速凍結する。指を、RNAlater(登録商標)を含むチューブ中に回収する。右後肢を、組織学評価のために、直ちにホルムアルデヒド緩衝液4%中で固定する。X線測定を固定の48時間後に実施する。
−1つの耳を、転写物分析のために、RNAlater(登録商標)を含むチューブ中に回収する。
−全血液を、血清血液チューブ中に回収し、8〜10回穏やかに反転させて混合する。凝固後に、血液試料を10分1800×gで遠心分離する。遠心分離後、血清を-80℃で保存する。
−結腸の一部(1cm遠位結腸)を、転写物分析のために、Precellysチューブ中で直ちに急速凍結する。別な部分(1cm遠位結腸)を、さらなる組織学分析のために、ホルムアルデヒド緩衝液4%中で直ちに固定する。
【０３６８】
(6.7.4.疾患の評価）
体重を、試験開始時、次いで週に2回、及び犠死時に評価する。
【０３６９】
毎週2回、炎症の臨床徴候をスコア付けする:正常な足には0;１本の指の腫脹の場合1;2本以上の指の腫脹の場合2 ;足全体の腫脹の場合3。全肢のスコアを総計して、包括的なスコアを得る。
【０３７０】
D23に、全群のマウスは、ProSense(登録商標)680プローブ(0.8nmol/10g、IP)を受け取る。D24に、マウスに、イマルゲン及びロンプンの腹腔内注射(7.5%/2.5%;0.1mL/10 g)により麻酔をかける。次いで、顆粒球浸潤を、インビボ分子イメージング(Bruker In-Vivo Xtremeイメージングシステム、励起波長:630nm、発光波長:700nm、取得時間:5秒)を利用して測定する。
【０３７１】
D32に、全群のマウスは、ProSense(登録商標)680プローブ(0.8nmol/10g、IP)及びOsteoSense(登録商標) 750EXプローブ(0.8nmol/10g、IP)を受け取る。D33に、マウスに、イマルゲン及びロンプンの腹腔内注射(7.5%/2.5%;0.1mL/10 g)により麻酔をかける。顆粒球浸潤及び骨リモデリングを、インビボ分子イメージング(Bruker In-Vivo Xtremeイメージングシステム;ProSense(登録商標)680プローブには、励起波長:630nm、発光波長:700nm、取得時間:5秒;OsteoSense(登録商標)750EXプローブには、励起波長:720nm、発光波長:790nm、取得時間:5秒)を利用して測定する。
【０３７２】
1群あたり10匹のマウスがいる。結果を平均±SEMとして表し、統計分析を、一元配置ANOVAを使用し、それに続いて、スコアリング及び画像分析に関して疾患を有するビヒクル群に対して、体重に関して偽のビヒクル群に対してダネットの事後検定を使用して実施する。
【０３７３】
(結語)
前述の説明は例示的且つ説明的な性質のものであって、本発明及びその好ましい実施態様を説明するように意図されることが当業者に理解されるであろう。ルーチンの実験を通じて、当業者は、本発明の趣旨を逸脱することなくなされ得る明白な修正及び変更を認識するであろう。添付の特許請求の範囲の範囲内に入る全てそのような修正は、その中に含まれるものとする。したがって、本発明は、上記の説明によるだけでなく、以下の特許請求の範囲及びその等価物によっても定義されるものとする。
【０３７４】
限定されないが、本明細書中に引用される特許及び特許出願を含む全ての刊行物は、各々の個々の刊行物が、あたかも完全に述べられているように引用により本明細書中に組み込まれていることが具体的に且つ個別的に示されているかのように、引用により本明細書中に組み込まれる。
【０３７５】
様々な化合物の示差的な細胞透過能力などの因子が、インビトロの生化学的アッセイと細胞アッセイでの化合物の活性の違いの一因となり得ることが理解されるべきである。
【０３７６】
本出願で与えられ、記載されている本発明の化合物の化学名の少なくとも一部は、市販の化学物質命名ソフトウェアプログラムの使用によって自動的に作り出された可能性があり、独立に確認されたものではない。この機能を実施する代表的なプログラムとしては、OpenEye Scientific Software社によって販売されているLexichem命名ツール、及びMDL Information Systems社によって販売されているAutonom Softwareツールが挙げられる。表示された化学名と図示された構造が異なる場合、図示された構造が優先する。
（参考文献）
【化４３】
2018530617.tif 000078
2018530617.tif 000079
2018530617.tif 000080
【手続補正書】
【提出日】平成30年7月18日(2018.7.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018530617000001.app
【国際調査報告】
2018530617.tif 000084
2018530617.tif 000085