(57)【要約】  本開示は、一般に、心臓疾患を治療するために、ホルミル−ペプチド受容体２／リポキシンＡ４受容体（ＦＰＲ２／ＡＬＸ）による炎症の収束を刺激することに基づく、治療法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
心臓疾患の治療方法であって、治療的に効果的な量のＦＰＲ２／ＡＬＸアゴニストをその必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項２】
心臓疾患が、狭心症、不安定狭心症、心筋梗塞、心不全、急性冠状動脈疾患、急性心不全、慢性心不全、および心原性損傷からなる群より選択されるところの、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
治療が心筋梗塞後であるところの、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
治療が慢性心不全と関連付けられるところの、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
治療が心筋創傷治癒を改善するものであるところの、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
治療が心筋線維症を軽減させるものであるところの、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アゴニストが１−（４−クロロフェニル）−３−（５−イソプロピル−１−メチル−３−オキソ−２−フェニル−２,３−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）尿素またはその医薬的に許容される塩であるところの、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本仮出願は、出典を明示することによりその全内容が本明細書に組み込まれる、２０１５年１１月２４日付け出願の米国仮出願番号６２／２５９,４９８の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、心臓疾患を治療するために、ホルミルペプチド受容体２／リポキシンＡ４受容体（ＦＰＲ２／ＡＬＸ）によって炎症の収束を刺激することに基づく、治療方法を記載する。
【背景技術】
【０００３】
心臓疾患はますます蔓延している状態にあり、それは臨床的および経済的に著しい負担を及ぼす。患者数の増加は、心筋梗塞を生きのび、次第に有害な心臓リモデリングおよび左心室機能不全に変化する累積的心筋障害に至る、患者によって推進される（Viau DMら、Heart, 2015, 101, 1862-7、Paulus WJ., Tschope C.、J. Am. Coll. Cardiol., 2013, 62, 263-71）。この疾患の患者数および社会的負担が増大しているにも拘わらず、治療における最近の進歩は、あるとしても、ほとんどない。ＰＣＩ後の急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）の患者に対する標準的治療として、アスピリン、スタチン、ベータ−遮断剤、およびＡＣＥ阻害剤／ＡＲＢ治療剤によるものが挙げられる（Zouein FAら、J. Cardiovasc. Pharmacol., 2013, 62, 13-21）。
【０００４】
ホルミルペプチド受容体２／リポキシンＡ４（ＦＰＲ２／ＡＬＸ）は、主に哺乳類の食細胞白血球により発現され、宿主防御および炎症において重要な役割を果たすことが知られている、７回膜貫通ドメインのＧタンパク質結合受容体の小さな群に属する。ＦＰＲ２／ＡＬＸはＦＰＲ１およびＦＰＲ３と有意な配列相同性を共有する。集合的に、これらの受容体は、化学誘引物質として作用し、食細胞を活性化する、Ｎ−ホルミルおよびノンホルミルペプチドを含む、多くの構造的に多様なアゴニスト群と結合する。内因性ペプチドのアネキシン１およびそのＮ−末端フラグメントもヒトＦＰＲ１およびＦＰＲ２／ＡＬＸと結合する。大事なこととして、新たに見出された小型炎症収束メディエイター（small pro-resolution mediators：SPMs）の群に属するエイコサノイドリポキシンＡ４が、最近になって、ＦＰＲ２の特異的アゴニストであると同定された（Ye RD.ら、Pharmacol. Rev., 2009, 61, 119-61）。
【０００５】
Ｄ１およびアネキシン１を分解するリポキシンＡ４などの内因性ＦＰＲ２／ＡＬＸの炎症収束リガンドは、Ｇｉカップリング、Ｃａ２＋動員およびβ−アレスチンのリクルートなどの多数の細胞質カスケード反応を惹起する受容体と結合する。ＦＰＲ２／ＡＬＸのリポキシンＡ４による活性化は、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）などのペプチド性アゴニストの作用を修飾し、細胞の型に応じて、リン酸化経路に対して別の作用を有する。リポキシンは、好中球、マクロファージ、Ｔ−およびＢ−細胞を含む、先天性および適応性の両方の免疫系の構成要素を調節する。好中球にて、リポキシンは運動、細胞毒性および生存期間を調節する。マクロファージでは、リポキシンはアポトーシスを防止し、エフェロサイトーシスを強化する。大部分の炎症細胞にて、リポキシンはまた、ＩＬ−６、ＩＬ−１βおよびＩＬ−８などの数種の消炎性サイトカインの発現をダウンレギュレートし、ならびに抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の発現をアップレギュレートする（Chandrasekharan JA、Sharma-Walia N、J. Inflamm. Res., 2015, 8, 181-92）。
【０００６】
リポキシンの好中球およびマクロファージに対する主たる作用は、炎症を終わらせ、炎症の収束を開始させることである。後者は、主として、抗線維性創傷治癒の向上、および損傷した組織のホメオスタシスへの復帰に関与する（Romano M.ら、Eur. J. Pharmacol., 2015, 5, 49-63）。ＦＰＲ２／ＡＬＸの、リポキシンＡ４（ＬＸＡ４）などの内因性の小型炎症収束メディエイター（ＳＰＭｓ）および合成化合物による活性化は、アポトーシス細胞のエフェロサイトーシスを強化し、壊死細胞片のクリアランスを促進するように、単球の非催炎性リクルート（non-phlogistic recuitment）の刺激およびマクロファージの活性化をもたらす。ＦＰＲ２／ＡＬＸ活性の刺激は好中球リクルートの抑制ももたらす。
【０００７】
心臓血管系において、ＦＰＲ２／ＡＬＸ受容体およびその炎症収束アゴニストの両方が、動脈硬化性プラークの安定化および治癒に関与していることが判明した（Petri MH.ら、Cardiovasc. Res., 2015, 105, 65-74；およびFredman G.ら、Sci. Trans. Med., 2015, 7(275); 275ra20）。リポキシンおよびその受容体も、慢性炎症性ヒト疾患（感染性疾患、乾癬、皮膚炎、眼炎症、敗血症、疼痛、代謝性疾患／糖尿病、がん、ＣＯＰＤ、喘息およびアレルギー性疾患、嚢胞性線維症、急性肺障害および線維症、関節リウマチおよび他の関節疾患、アルツハイマー病、腎線維症、および臓器移植を含む）の前臨床モデルにおいて利益のあることが示された（Romano M.ら、Eur. J. Pharmacol., 2015, 5, 49-63；Perrett, M.ら、Trens in Pharm. Sci., 2015, 36, 737-755）。
【発明の概要】
【０００８】
慢性炎症は多くのヒト疾患を発症する経路の一部であり、ＦＰＲ２／ＡＬＸアゴニストを用いて収束経路を刺激することは保護および修復の両方の作用を有し得る。虚血−再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害は、心筋梗塞および発作などの、高い罹患率および死亡率と関連する数種の疾患に共通する特徴である。虚血−再灌流傷害に起因する心筋細胞死および病理学的リモデリングに付随する非生産的創傷治癒は、瘢痕形成、線維症、および心機能の進行的喪失に至る。本発明の種々の態様は、瘢痕形成、線維症、および心機能の進行的喪失に至りうる、心筋細胞死および病理学的リモデリングに付随する非生産的創傷治癒を含む、心臓疾患の治療におけるＦＰＲ２／ＡＬＸアゴニストの使用を提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の種々の態様は、炎症の収束を、ホルミルペプチド受容体２／リポキシンＡ４受容体（ＦＰＲ２／ＡＬＸ）によって刺激することに基づく、心臓疾患の治療方法を記載する。
【００１０】
化合物１は１−（４−クロロフェニル）−３−（５−イソプロピル−１−メチル−３−オキソ−２−フェニル−２,３−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）尿素（Burli, R. W.ら、Biorg. Med. Chem. Lett. 16, 3713-3718 （2006））であり、次の構造式：
【化１】
2018538367.tif 000002
で示される。
【００１１】
本発明は、該化合物の医薬的に許容される塩のすべての形態を包含する。医薬的に許容される塩は、その中に含まれる対イオンが化合物の生理的活性または毒性に有意に寄与しておらず、塩それ自体が薬理学的均等物として機能する、ものである。これらの塩は、商業的に利用可能な試剤を利用する一般的な有機合成法に従って、製造され得る。陰イオン塩のいくつかの形態は、酢酸塩、アシストラート、ベシル酸塩、臭化物、塩化物、クエン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、ヨウ化物、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トルエンスルホン酸塩、およびキシナホ酸塩を包含する。陽イオン塩のいくつかの形態は、アンモニウム、アルミニウム、ベンザチン、ビスマス、カルシウム、コリン、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、リチウム、マグネシウム、メグルミン、４−フェニルシクロヘキシルアミン、ピペラジン、カリウム、ナトリウム、トロメタミン、および亜鉛を包含する。
【００１２】
医薬組成物および使用方法
本発明の化合物はＦＰＲ２／ＡＬＸを調節する。従って、本発明の一の態様は、心臓疾患の治療方法であって、治療的に効果的な量のＦＰＲ２／ＡＬＸアゴニストをその必要とする患者に投与することを含む、方法である。
【００１３】
本発明のもう一つ別の態様は、心臓疾患が狭心症、不安定狭心症、心筋梗塞、心不全、急性冠状動脈疾患、急性心不全、慢性心不全、および心原性損傷からなる群より選択されるところの方法である。
【００１４】
本発明のもう一つ別の態様は、心臓疾患が心筋梗塞後の症状であるところの方法である。
【００１５】
本発明のもう一つ別の態様は、心臓疾患が慢性心不全に付随するところの方法である。
【００１６】
本発明のもう一つ別の態様は、治療が心筋創傷治癒を改善することであるところの方法である。
【００１７】
本発明のもう一つ別の態様は、治療が心筋線維症を改善することであるところの方法である。
【００１８】
本発明のもう一つ別の態様は、アゴニストが１−（４−クロロフェニル）−３−（５−イソプロピル−１−メチル−３−オキソ−２−フェニル−２,３−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）尿素、またはその医薬的に許容される塩であるところの方法である。
【００１９】
「治療的に効果的な量」とは、心臓血管疾患および症状の分野における当業者によって理解されるような、患者に有意義な利益を提供するのに必要とされる量を意味する。
【００２０】
「患者」は、心臓血管疾患および症状の分野における当業者によって決定されるような、治療に適する心臓血管症状のある、ヒトを含む、哺乳類種を意味する。
【００２１】
本明細書中で用いられる「治療する」または「治療」は、哺乳類、特にヒトにおける疾患状態の治療を包含し、（ａ）疾患状態を阻害すること、即ち、その進行を停止させること；および／または（ｂ）疾患状態を軽減すること、即ち、疾患状態の退縮を引き起こすこと；および／または（ｃ）疾患状態の予防を包含する。本明細書中で用いられる「予防」は、治療上有効量の本発明の少なくとも１つの化合物あるいはその立体異性体、互変異性体、医薬的に許容される塩または溶媒和物を患者に投与することにより疾患状態を発症する危険性を減少および／または最低限とするか、あるいはその再発の危険性を減少させる、疾患状態の予防的治療である。患者は、予防的治療のために、一般的集団と比べて、臨床的な疾患状態に罹患する危険性を増大させることが分かっている因子に基づいて選択されてもよい。予防的治療の場合には、その臨床的疾患状態の症状があっても、未だなくてもよい。「予防」的治療は（ａ）一次予防および（ｂ）二次予防に分類できる。一次予防は、未だ臨床的疾患状態にない患者における疾患状態の危険性を減少または最小限とする治療と定義され、それに対して二次予防は、同じまたは類似の臨床的疾患状態の再発または２回目の出現の危険性を最小限とするか、減少させるものとして定義される。
【００２２】
本明細書にて使用される「予防」は、臨床性疾患状態の発生確率を下げることを目的とした、哺乳類、特にヒトにおける無症候性病態の予防的処置に及ぶ。患者は、一般的集団と比べて、臨床性疾患状態に罹患する危険性を増加させることが知られている因子に基づいて予防的治療のために選択される。
【００２３】
もう一つ別の実施態様において、本発明は、本発明の化合物と、治療において同時に、別々に、または連続的に使用される、別の治療剤との併用製剤を提供する。
【００２４】
本発明の化合物は、１または複数の、好ましくは１ないし３種の、次の：ループ利尿剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断剤（ＡＲＢ）、アンジオテンシン受容体−ネプリライシン阻害剤（ＡＲＮＩ）、ベータ遮断剤、鉱質コルチコイド受容体アンタゴニスト、ニトロキシルドナー、ＲＸＦＰ１アゴニスト、ＡＰＪアゴニストおよび強心剤より選択される心不全用治療剤と一緒に用いられてもよい。これらの薬剤は、限定されないが、フロセミド、ブメタニド、トルセミド、サクビトリル−バルサルタン、チアジド利尿剤、カプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、カルベジロール、メトポロール、ビソプロロール、セレラキシン、スピロノラクトン、エプレレノン、イバブラジン、カンデサルタン、エプロサルタン、イルベスタライン、ロサルタン、オルメサルタン、テルミサルタン、およびバルサルタンを包含する。
【００２５】
心臓疾患は、狭心症、不安定狭心症、心筋梗塞、心不全、急性冠状動脈疾患、急性心不全、慢性心不全、および心原性損傷を包含する一連の疾患、ならびに心血管疾患および症状の分野における当業者によって理解されるような他の関連する疾患である。
【００２６】
本発明の化合物は、一般に、治療的に効果的な量のＦＰＲ２／ＡＬＸ化合物と、医薬的に許容される担体とを含み、従来の賦形剤を含有してもよい、医薬組成物として投与される。治療的に効果的な量は、患者に有意義な利益を提供するのに必要とされる量である。医薬的に許容される担体は、許容される安全性を有するそれらの慣用的に知られる担体である。組成物は、カプセル、錠剤、ロゼンジ、および散剤、ならびに液体懸濁液、シロップ、エリキシル、および液剤を含む、あらゆる共通の固体および液体の形態を包含する。組成物は一般的な製剤技法を用いて製造され、従来の賦形剤（結合剤および湿潤剤など）およびベヒクル（水およびアルコールなど）が一般に組成物に使用される。例えば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, 17th edition, Mack Publishing Company, Easton, PA（1985）を参照のこと。
【００２７】
固形組成物は、通常、投与量単位にて処方され、用量当たり約１ないし１０００ｍｇの活性成分を提供する組成物が好ましい。投与量のいくつかの例が、１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇ、５００ｍｇ、および１０００ｍｇである。
【００２８】
液体組成物は、通常、単位投与量の範囲にて投与される。一般に、液体組成物の単位投与量の範囲は１−１００ｍｇ／ｍＬであろう。投与量のいくつかの例が、１ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、および１００ｍｇ／ｍＬである。
【００２９】
本発明は従来のすべての投与方法を包含する；経口および非経口方法が好ましい。一般に、投与計画は臨床的に使用される他の心臓血管剤と同様であろう。典型的には、日用量は一日に付き体重１ｋｇ当たり０.１−１００ｍｇであろう。一般に、経口的には、より多くの化合物が必要とされ、非経口的にはそれよりも少ない。しかしながら、個々の投与計画は医師の正当な医学的判断に基づいて決定されるであろう。
【００３０】
生物学的方法および結果
ＦＰＲ２およびＦＰＲ１  ｃＡＭＰアッセイ
ホルスコリン（ＦＰＲ２／ＡＬＸの場合は最終５μＭ、またはＦＰＲ１では最終１０μＭ）およびＩＢＭＸ（最終２００μＭ）の混合物を、試験化合物／ＤＭＳＯ（最終１％）を１.７ｎＭ〜１００μＭの範囲の最終濃度で予め点在させた、３８４ウェルのプロキシプレート（Proxiplate）（Perkin-Elmer）に添加した。ヒトＦＰＲ１またはヒトＦＰＲ２／ＡＬＸ受容体を過剰発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を、１０％正規ＦＢＳ、２５０μｇ／ｍｌのゼオシン、および３００μｇ／ｍｌのヒグロマイシン（Life Technologies）を補足した、Ｆ−１２（Hams）培地にて培養した。ウェル当たり２,０００個のヒトＦＰＲ２細胞、またはウェル当たり４,０００個のヒトＦＰＲ１細胞を、０.１％ＢＳＡ（Perkin-Elmer）を補足したダルベッコ（Dulbecco）ＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムを含む）（Life Technologies）中にて添加することにより、反応を開始した。その反応混合物を室温で３０分間インキュベートした。細胞内ｃＡＭＰのレベルを、ＨＴＲＦ  ＨｉＲａｎｇｅ  ｃＡＭＰアッセイ試薬キット（Cisbio）を用い、製造業者の指示に従って測定した。クリプタート接合した抗ｃＡＭＰおよびｄ２フルオロフォア標識のｃＡＭＰの溶液を供給された溶菌緩衝液にて別々に作製した。反応の終了の際に、細胞を等容量のｄ２−ｃＡＭＰ溶液および抗ｃＡＭＰ溶液を用いて溶菌させた。室温で１時間インキュベートさせた後、時間分解蛍光強度を、Envision（Perkin-Elmer）を用いて、４００ｎｍで励起を、５９０ｎｍと６６５ｎｍで二色発光を測定した。較正曲線を、ｃＡＭＰの外部標体を１μＭから０.１ｐＭの範囲の濃度で用い、６６５ｎｍの発光の蛍光強度を５９０ｎｍの発光の強度に対する割合をｃＡＭＰ濃度に対してプロットすることにより、作成した。次に、化合物のｃＡＭＰ生成を阻害する能力および活性を、ｃＡＭＰレベルと化合物の濃度とのプロットから由来の４パラメータロジスティック方程式に適合させることにより決定した。
【００３１】
ｄＨＬ６０非接着性細胞株を用いるＦＬＩＰＲアッセイ
ＨＬ６０細胞を１.５ｘ１０５細胞／ｍｌに希釈し、１.３％ＤＭＳＯ含有の培地にて３７℃で５日間培養した。６日目に、細胞の生存率が約９５％であることを確かめるために細胞を計数した。１.２ｘ１０７細胞をスピンダウンさせ、細胞をアッセイ緩衝液で１回洗浄した。上清を除去し、細胞をＦｌｕｏ−４ＡＭローディング色素と共に１２ｍｌの緩衝液に再び懸濁させ、細胞を３７℃で３０分間標識させた。ローディング緩衝液：ＨＢＳＳ（Invitrogen、カタログ番号１４０７５）、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０.１％ＦＡＦ−ＢＳＡ、１５μｌの０.０２５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７（Invitrogen、Ｐ３０００ＭＰ）、２.５ｍＭプロベネシド、１.９μＭ  Ｆｌｕｏ−４ＡＭ（Invitrogen、Ｆ１４２０１）。インキュベーションの後、細胞を反応緩衝液で１回洗浄し、色素を除去し、１ｘ１０６細胞／ｍｌで再び懸濁させた。洗浄した後、ポリ−Ｄ−リシンで予めコーティングした９６ウェルアッセイプレートに１００μｌ／ウェルにて細胞をプレートした。アッセイプレートを１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離に付し、次にＦＬＩＰＲに入れ、カルシウムフラックスアッセイを行った。
【００３２】
β−アレスチンリクルートアッセイ
ディスカバーＸ（DiscoverX）標準プロトコルを用いた。
【００３３】
ＨＬ−６０細胞の培養および分化
ＨＬ−６０細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２４０、ロット番号：６０３９８４１１）を、２０％ウシ胎児血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、および５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足したＩＭＤＭ（Life Tech、カタログ１２４４０−０５３）中に３７℃の５％ＣＯ２で維持した。細胞をＤＭＳＯで顆粒球系統に分化させた；２.５ｘ１０５細胞／ｍｌを１.２５％ＤＭＳＯと共に５日間インキュベートした。
【００３４】
好中球およびＨＰ−６０細胞の遊走アッセイ（アゴニスト様式）
５日間の分化の後、細胞を３ｘ１０７細胞／ｍｌの濃度で、脂肪酸不含のＢＳＡを０.２％で含む、フェノール不含のＲＰＭＩ（Invitrogen、カタログ１１８３５）に再び懸濁させた。ｄＨＬ−６０細胞（１００μｌに１０５）を各ＨＴＳトランズウェル−９６ウェルプレート（Corning番号３３８７）の上部チャンバーに加えた。化学誘引物質をトランズウェルプレートの底部チャンバーに、ｄＨＬ６０細胞を頂部チャンバーに入れることにより遊走を誘発させた。細胞を３７℃の５％ＣＯ２で５ミクロンのフィルターを通して１２０分間遊走させた。遊走の後、トランズウェルの下部チャンバーにある好中球またはｄＨＬ−６０細胞（遊走フラクション）をCellTiter-Glo（登録商標）発光細胞生死判別アッセイ（Promega、Ｇ７５７１）を用いて定量した。
【００３５】
好中球およびＨＰ−６０細胞の遊走アッセイ（アンタゴニスト様式）
５日間の分化の後、細胞を３ｘ１０７細胞／ｍｌの濃度で、脂肪酸不含のＢＳＡを０.２％で含む、フェノール不含のＲＰＭＩ（Invitrogen、カタログ１１８３５）に再び懸濁させた。ｄＨＬ−６０細胞（１００μｌに１０５）を種々の濃度の化学誘因物質と共に３７℃の５％ＣＯ２で１５分間予めインキュベートした。次に、０.８μＭの組換え血清アミロイドＡ１ペプチド（ｒＳＡＡ１、PeproTech、カタログ番号３００−５３）を各ＨＴＳトランズウェル−９６ウェルプレート（Corning番号３３８７）の底部チャンバーに加えた。化学誘引物質およびｄＨＬ６０細胞の混合物をトランズウェルプレートの頂部チャンバーに入れることで遊走を誘発させた。細胞を３７℃の５％ＣＯ２で５ミクロンのフィルターを通して１２０分間遊走させた。遊走の後、トランズウェルの下部チャンバーにある好中球またはｄＨＬ−６０細胞（遊走フラクション）をCellTiter-Glo（登録商標）発光細胞生死判別アッセイ（Promega、Ｇ７５７１）を用いて定量した。
【００３６】
食作用の強化
採取する４日前に、１ｍｌのＰＢＳ（−／−）中１％バイオゲル（Biogel）を腹膜注射することによりマクロファージを５匹のＣ５７ＢＬ７マウスの腹膜に誘発させた。腹膜滲出物を採取し、合わせ、次に濾過してバイオゲルビーズを取り除く。まず、７０μｍの細胞ストレーナーに通し、つづいて連続して２つの４０μｍの細胞ストレーナーに通して濾過する。滲出液を１Ｘ  ＰＳＳ（−／−）で５０ｍｌに希釈し、４℃にて１０分間にわたって３００ｘで遠心分離に供する。細胞ペレットを２０−３０ｍｌの１Ｘ  ＰＢＳ（＋／＋）に穏やかに再懸濁させ、Nexelcom Cellometer計数機を用いて細胞を計数する。細胞の濃度を１ｍｌの１Ｘ  ＰＢＳ（＋／＋）中に１,２５０,０００細胞となるように調整する。１００μｌ（１２５Ｋ）の細胞を９６ウェルのコスター（Costar）３９０４プレートの各ウェルに入れる。該プレートを１５０ｘｇで３０秒間遠心分離に供して接着を促進する。３７℃／５％ＣＯ２で９０分間インキュベートした後、非接着性細胞を吸引し、接着したマクロファージ（約５０Ｋ）を１５０μｌの１Ｘ  ＰＢＳ（−／−）で１回洗浄し、次に１３５μｌの予め加温に供した血清不含マクロファージＳＦＭ／１Ｘ  ペニシリン−ストレプトマイシン（Pen-Strep）媒体中、３７℃／５％ＣＯ２で一夜インキュベートする。翌日、１５μｌの新たに調製した１０Ｘ  化合物／血清不含マクロファージＳＦＭ媒体を各ウェルに加え、混合し、３７℃／５％ＣＯ２で１５分間インキュベートする。１０倍過剰量（１２５Ｋ／μｌを４μｌ）のオプソニン化ＦＩＴＣ  Ｚｙｍｏｓａｎ粒子（Life Technologies）を添加することで食作用を開始させる。食作用を３７℃／５％ＣＯ２で４５分間進行させる。ウェルを吸引し、食作用を１５０μｌの氷冷した１Ｘ  ＰＢＳ（−／−）／２ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて阻止し、再び吸引する。摂取されないＺｙｍｏｓａｎ粒子からの蛍光シグナルを１５０μｌの氷冷したトリパンブルー（Trypan Blue）溶液（１：１５  希釈）で２分間クエンチさせ、次に吸引して除去した。最後に、プレートを１５０μｌのトリパンブルー（１：５０  希釈）においてSpectra MAX Gemini EM蛍光プレートリーダーで読み取る。プレートリーダー設定＝Bottom Read：Excitation 493nm：Emission 525nm：Cutoff 515nm：Automix Off：Calibrate On：PMT=Auto：Column Priority：Reads／Well=20
【００３７】
心不全についてのＦＰＲ２／ＡＬＸアゴニスト
リポキシンＡ４（ＬＸＡ４）、アスピリントリガー性１５−エピ−リポキシンＡ４（ＡＴＬ）およびリゾルビンＤ１（ＲｖＤ１）などの内因性の小型炎症収束メディエイター（ＳＰＭｓ）ならびに化合物１などの合成小型分子によるＦＰＲ２／ＡＬＸの活性化は、アポトーシス細胞のエフェロサイトーシスを強化し、壊死細胞片のクリアランスを促進するように、単球の非催炎性リクルートの刺激およびマクロファージの活性化をもたらす。ＦＰＲ２／ＡＬＸ活性の刺激は好中球リクルートの抑制ももたらす。両方の機構の活性化は創傷治癒機構を強化し、損傷した心臓をホメオスタシスに復帰するのに必要であると提案されている。
【００３８】
化合物１の前臨床性インビトロ薬理作用
リポキシンＡ４などのＦＰＲ２／ＡＬＸの天然の炎症収束リガンドは、Ｇｉカップリング、Ｃａ２＋動員およびβ−アレスチンのリクルートなどの多数の細胞質カスケードの反応を惹起する受容体と結合する。ＦＰＲ２／ＡＬＸのリポキシンＡ４による活性化は、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）などのペプチド性アゴニストの作用を修飾し、細胞の型に応じて、リン酸化経路に対して別の作用を奏する。好中球では、リポキシンはその運動、細胞毒性および生存期間を調節する。マクロファージでは、リポキシンはそのアポトーシスを防止し、エフェロサイトーシスを強化する。大部分の炎症細胞にて、リポキシンはまた、ＩＬ−６、ＩＬ−１βおよびＩＬ−８などの数種のプロ炎症性サイトカインの発現をダウンレギュレートし、ならびに抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の発現をアップレギュレートする。リポキシンの好中球およびマクロファージに対する主たる作用は、炎症の終了および炎症の収束の開始の両方に関与すると考えられる。後者は主に、抗線維性創傷治癒の向上、および損傷した組織のホメオスタシスへの復帰に関与する。化合物１は、ＦＰＲ２／ＡＬＸの小型分子のアゴニストであり、それはＦＰＲ２／ＡＬＸ天然ＳＰＭｓと同様に炎症の収束を強化することを通して創傷の治癒を促進すると考えられる。
【００３９】
化合物１は次のインビトロにて細胞ベースのアッセイで試験された。ヒトＦＰＲ２／ＡＬＸ（ｈＦＰＲ２／ＡＬＸ）およびヒトＦＰＲ１（ｈＦＰＲ１）受容体を過剰発現するＣＨＯ−Ａ１２細胞株にて、化合物１はｈＦＰＲ２／ＡＬＸ  Ｇｉカップリングの強力な（５０ｎＭ）活性化剤であり、ｃＡＭＰトラフアデニルシラーゼ阻害の低下をもたらす。化合物１は密接に関連するｈＦＰＲ１受容体の等しく強力な（１０ｎＭ）活性化剤である。１のｈＦＰＲ２／ＡＬＸの、２のマウスオルトログ、ｍＦＰＲ２およびｍＦＰＲ３を過剰発現するＣＨＯ−Ａ１２細胞株において、化合物１はｍＦＰＲ２／ＡＬＸの極めて強力な（２０ｎＭ）であり、ｍＦＰＲ３に対して活性を有さない（＞１０,０００ｎＭ）。同様に、ヒトｈＦＰＲ１において、化合物１はｍＦＲＰ１受容体と約５０ｎＭの機能アフィニティを有し、選択的ではない。好中球様ヒトＨＬ６０細胞株において、化合物１は細胞質Ｃａ２＋レベルを大きく増加させた（５０ｎＭ）。化合物１はまた、ディスカバーＸ  Ｐａｔｈｈｕｎｔｅｒ  ＣＨＯ−Ｋ１  ｈＦＰＲ２／ＡＬＸ細胞株において、β−アレスチンのリクルートを３１００ｎＭの効能で刺激した。
【００４０】
好中球における細胞質カルシウム動員の調節、およびマクロファージにおけるｃＡＭＰレベルは、各々、細胞運動（走化性）または食細胞−エフェロサイトーシスの強化のいずれかと関連付けられる。これらの活性は共に、化合物をＦＰＲ２／ＡＬＸ受容体の炎症収束アゴニストとして分類するのに不可欠である。ヒトＨＬ６０細胞株を用い、化合物１は、それ自体が７８ｎＭの効能で、走化性を刺激した。化合物１はまた、ＳＡＡにより誘発される走化性を１８９ｎＭのアフィニティで拮抗した。バイオゲル誘発のマウス腹膜マクロファージにおいて、化合物１は、ピコモルの範囲にて、未処理の対照細胞と比べて、実験条件に応じて２５０ないし６０％の間で蛍光標識されたザイモサンの食作用を強化した。この化合物は、ｍＦＰＲ２およびｍＦＰＲ３の一つ、またはｍＦＰＲ２／ＦＰＲ３の２つをノックアウトしたマウスのいずれかより単離したバイオゲル誘発の腹膜マクロファージにおいてそのような強化を示さなかった。
【００４１】
動物実験
左前下行枝の回りに置いた結紮糸を用いて永続的冠状動脈閉塞をマウスにて実施し、心筋梗塞を誘発させた。心筋梗塞の２４時間後に、化合物１を経口投与する処理（１および１０ｍｇ／ｋｇ；ＱＤ）、または化合物を含まない溶液を服用する処理（ＱＤ；ベヒクルと称される）を開始した。開胸術に付したが、梗塞を生じないマウスは、外科的「擬似」対照に含めた。心筋梗塞の２８日後にマウスを診断し、構造／機能の関係を評価した。心臓をマウスから摘出し、心筋の受動的機構を評価した。この評価を行うために、左心室のエクスビボでの圧力−体積の関係を、摘出された心臓の左心室内に配置されたバルーンの膨脹と収縮のサイクルを通して測定した。心筋瘢痕の二次元ストレインも測定し、梗塞組織のコンプライアンスを決定した。心臓も組織学的に処理し、左心室の寸法、梗塞の面積、および梗塞コラーゲンの組成を測定した。
【００４２】
心筋線維症を評価するために、マウスをアンジオテンシンＩＩで攻撃し、心肥大および左心室コラーゲン沈着を刺激した。皮下に移植された浸透圧ミニポンプを用いてアンジオテンシンＩＩ（約２ｍｇ／ｋｇ／日）をマウスに投与した。別群のマウスにセイライン含有の皮下ポンプを移植し（外科的「擬似」群）、これらのマウスをポンプ移植術の対照に供した。個々の研究デザインに応じて、アンジオテンシンＩＩ移植の２４時間前に、ポンプ移植と同時に、またはポンプ移植の３日後のいずれかで、マウスを化合物１（１および１０ｍｇ／ｋｇ；ＱＤ）で処理するか、あるいは化合物不含の投与溶液（ＱＤ、ベヒクルと称される）で処理した。正確な研究デザインに応じて、治療を２−３週間続けた。治療段階の終わりに、心臓を動物から摘出し、心筋中ヒドロキシプロリンについて標準的な比色アッセイを用い、あるいは心臓の断面組織構造により、コラーゲンレベル／線維症について評価した。
【００４３】
両方の実験において、炎症収束および心臓治癒の強化におけるＦＰＲ２／ＡＬＸの役割を支持する次の評価項目が観察された。
【００４４】
治療は存命期全体にわたって良好に許容され、マウスの生理機能に悪影響のないことが認められた。高用量で処置されたマウスは死亡数全体の減少を示し、治療による生存利益を示唆した。
【００４５】
化合物１を用いる治療により、左心室のエクスビボでの受動的機構を測定することにより決定されるような心筋の正常なコンプライアンス特性が保護された。治療段階の終わりに、高カリウム含有の心臓麻痺溶液を用いて心臓を拡張期で停止させた。修飾されたバルーンカテーテルアセンブリーを左心室に配置し、バルーンを膨脹および収縮させて圧力−体積の関係を、左心室の心筋の受動的コンプライアンス特性を測定した。化合物１で処理されたマウスの圧力−体積曲線は用量−依存的に左方向にシフトし、それは左心室の体積が減少したことを示した。化合物１の処理で左心室体積が小さくなることは、梗塞後のリモデリングが少なくなることを示唆する。化合物１で処理されたマウスの圧力−体積の勾配は、ベヒクルよりも大きく、正常な擬似対照マウスと同じくらいであり、これはベヒクルと比べて心筋の堅さを増大させ、梗塞のない擬似対照と同様の正常なコンプライアンス特性を保持することを示した。
【００４６】
二次元瘢痕ストレイン（すなわち、伸張性）を圧力−体積測定と同時にデジタル式ビデオカメラを用いて測定した。化合物１での処理は、ベヒクル処理と関連して、周方向および長手方向のストレインを減らし、これは瘢痕の剛性を大きくし、瘢痕拡張の傾向を減少させることを示した。ストレインは正常な擬似対照の心臓と同様であり、このことは治癒された瘢痕の正常なコンプライアンスが保存されたことを示した。
【００４７】
心臓の組織学的評価は化合物１で処理した左心室チャンバーの面積が減少したことを明らかにした。チャンバーの面積は梗塞していない擬似対照と近似するレベルまで減少した（ベヒクル処理した心臓と比べて、１および１０ｍｇ／ｋｇで、各々、２８−３０％減少した；ｐ＜０.０５）。
【００４８】
梗塞の部位（前左心室自由壁）での左心室壁厚の組織学的評価は、ベヒクルと比べて、化合物１処理した壁の厚みが増加したことを明らかにした。前壁の厚みの平均値は梗塞していない擬似対照で観察されるレベルに近づき、これは心筋の完全性が保存されたことを示した（ベヒクルと比べて、壁の厚みが４５−６５％増加した；ｐ＜０.０５）。
【００４９】
組織学的に測定される梗塞の面積（左心室の面積の％として）は、化合物１で減少した（ベヒクルと比べて、１および１０ｍｇ／ｋｇで、各々、４４−４９％減少した；ｐ＜０.０５）。該データは化合物１での処理が心筋梗塞後の梗塞拡大を縮め、梗塞壁の薄化を減少させることを示唆する。
【００５０】
皮下浸透圧ミニポンプによりアンジオテンシンＩＩを連続的に投与して攻撃したマウスにおいて心筋線維症を評価した。
【００５１】
化合物１を用いて心筋線維症を前処理した効果を、アンジオテンシンＩＩで攻撃する２４時間前にマウスを胃管で経口的に処理することにより試験した。この設計は線維症の防止を評価するように構成される。処理したマウスに経口胃管により毎日２週間にわたって投与した。処理群は、低用量および高用量の化合物１、ベヒクル対照、およびアンジオテンシンＩＩで攻撃されない未処理の擬似群からなる。化合物１の処理とアンジオテンシンＩＩ攻撃とを同時に行い、２週間経過した後、心臓をコラーゲンの沈着について評価した。左心室のヒドロキシプロリン含量は、コラーゲンの代替として測定され、対照と比べて、化合物１の処理で減少した（ベヒクルと比べて、１ｍｇ／ｋｇで８３％、１０ｍｇ／ｋｇで７５％減少した；ｐ＜０.０５）。レベルは擬似群より採取された正常な攻撃されない心臓にて測定されたレベルに近づいた。間質コラーゲンの同程度の減少が左心室の組織構造により確かめられた。データはＦＰＲ２／ＡＬＸアゴニストが心筋線維症を減衰させうることを示す。
【００５２】
化合物１を用いる処理がアンジオテンシンＩＩの攻撃と同時になされた場合、ヒドロキシプロリン含量および組織構造によって間質コラーゲンレベルの両方で同程度の減少が観察された。
【００５３】
化合物１の処理は、心筋線維症の発症後に処理された場合でも、心筋線維症を減少させた。この設計は化合物１の介入療法として心筋線維症を改善する能力を評価するように構成される。線維症を発症させるのにアンジオテンシンＩＩで３日間攻撃したマウスを、アンジオテンシンＩＩの暴露を継続して行う中で、化合物１で２.５週間処理した。処理段階の終わりに、心臓を組織構造により評価した。化合物１の処理はベヒクルと比べて左心室における間質線維症を軽減させた（ベヒクルと比べて約７４％の軽減；ｐ＜０.００１）。線維症レベルはアンジオテンシンＩＩ攻撃のない未処理の擬似群にて測定されるレベルと同程度であった。
【００５４】
当業者にとって、本開示が上記の例示として実施例に限定されないこと、および本開示がその本質的な属性から逸脱することなく他の特定の形態にて実施され得ることは明らかであろう。従って、これらの実施例は、すべての点で例示であって、限定するものではないと考えるのが望ましく、上記の実施例よりもむしろ添付した特許請求の範囲を照会すべきであり、従って特許請求の範囲の意義および均等の範囲の範囲内にある変形はすべてそこに包含されるものとする。
【国際調査報告】
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