(57)【要約】本発明は、とりわけ、癌及び自己免疫に対する免疫療法などの、疾患の治療に使用されるキメラタンパク質を含む組成物及び方法に関する。部分的に、本発明は、様々な実施形態において、刺激効果または抑制効果を有し得る膜貫通タンパク質の細胞外ドメインの融合体を提供する。本発明は、様々な態様において、癌免疫療法において有用である、例えば治療的利益が得られるように免疫シグナルを操作または改変する組成物及び方法を提供する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｎ末端またはその近傍にＩ型膜貫通タンパク質の第１の細胞外ドメイン、（ｂ）Ｃ末端またはその近傍にＩＩ型膜貫通タンパク質の第２の細胞外ドメイン、及び（ｃ）リンカーを含み、第１及び第２の細胞外ドメインの一方が免疫抑制シグナルであり、かつ第１及び第２の細胞外ドメインの一方が免疫刺激シグナルである、異種キメラタンパク質。
【請求項２】
前記免疫抑制シグナルが、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＰＤ−１、ＴＭＩＧＤ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１７２ａ／ＳＩＲＰα、ＶＳＩＧ８、またはその変種のうちの１つ以上である、請求項１に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項３】
前記免疫抑制シグナルがＰＤ−１またはその変種である、請求項１に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項４】
前記免疫刺激シグナルが、４−１ＢＢリガンド、ＧＩＴＲリガンド、ＯＸ−４０リガンド、ＬＩＧＨＴ（ＣＤ２５８）、ＣＤ７０、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＴＲＡＩＬ、及びＴＬ１Ａ、またはその変種のうちの１つ以上である、請求項１に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項５】
前記免疫抑制シグナルがＯＸ４０リガンドまたはその変種である、請求項４に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項６】
前記キメラタンパク質が、（ｉ）ＰＤ−１の細胞外ドメインと、（ｉｉ）ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインとを含む、請求項１に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項７】
前記キメラタンパク質が、配列番号２２と少なくとも９５％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項８】
前記キメラタンパク質が、（ｉ）ＰＤ−１の細胞外ドメインと、（ｉｉ）ＧＩＴＲＬの細胞外ドメインとを含む、請求項１に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項９】
前記キメラタンパク質が、（ｉ）ＢＴＬＡの細胞外ドメインと、（ｉｉ）ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインとを含む、請求項１に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１０】
前記キメラタンパク質が、（ｉ）ＴＩＧＩＴの細胞外ドメインと、（ｉｉ）ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインとを含む、請求項１に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１１】
前記キメラタンパク質が、（ｉ）ＴＩＭ３の細胞外ドメインと、（ｉｉ）ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインとを含む、請求項１に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１２】
前記キメラタンパク質が、（ｉ）ＣＤ１７２ａの細胞外ドメインと、（ｉｉ）ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインとを含む、請求項１に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１３】
前記融合体が、（ｉ）ＣＤ１１５の細胞外ドメインと、（ｉｉ）ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインとを含む、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項１４】
前記キメラタンパク質が、組換え融合タンパク質である、請求項１に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１５】
前記細胞外ドメインの１つが抑制性免疫シグナルを減少させる、遮断する、または消失させることができる、請求項１に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１６】
前記細胞外ドメインの１つが、免疫刺激シグナルを増加させる、模擬する、または活性化させることができる、請求項１に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１７】
前記キメラタンパク質が、（ｉ）免疫抑制シグナルを減少または消失させること、かつ（ｉｉ）免疫刺激シグナルを増加または活性化させることができる、請求項１に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１８】
前記キメラタンパク質が、制御性Ｔ細胞に対するエフェクターＴ細胞の比率を増加させることができる、請求項１に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項１９】
前記キメラタンパク質が、細胞傷害性Ｔ細胞の亜集団；エフェクターメモリーＴ細胞；セントラルメモリーＴ細胞；ＣＤ８＋幹細胞メモリーエフェクター細胞；ＴＨ１エフェクターＴ細胞；ＴＨ２エフェクターＴ細胞；ＴＨ９エフェクターＴ細胞；ＴＨ１７エフェクターＴ細胞；ならびに／またはＩＬ−２、ＩＬ−４、及び／もしくはＩＦＮ−γを分泌するエフェクターＴ細胞を増加させる、及び／または減少を妨げることができる、請求項１に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２０】
前記キメラタンパク質がもたらす動物の末梢血におけるサイトカイン応答を前記キメラタンパク質の適切な用量を決定する手段として使用することができる、請求項１に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２１】
前記リンカーが、可動性のアミノ酸配列、ＩｇＧヒンジ領域、または抗体配列から場合に応じて選択されるポリペプチドである、請求項１に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２２】
前記リンカーが合成リンカー、場合によりＰＥＧである、請求項１に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２３】
前記リンカーが、ＩｇＧ１、場合によりヒトＩｇＧ１に由来するヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含む、請求項２１に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２４】
前記リンカーが、ＩｇＧ１、場合によりヒトＩｇＧ４に由来するヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含む、請求項２１に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２５】
前記キメラタンパク質が、哺乳動物宿主細胞において、分泌可能かつ完全に機能する単一ポリペプチド鎖として産生可能である、請求項１に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項２６】
先行請求項のいずれかに記載の異種キメラタンパク質を含む、医薬組成物。
【請求項２７】
先行請求項のいずれかに記載の異種キメラタンパク質をコードする核酸を含む、発現ベクター。
【請求項２８】
前記発現ベクターが哺乳動物の発現ベクターである、請求項２７に記載の発現ベクター。
【請求項２９】
前記発現ベクターがＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項２８に記載の発現ベクター。
【請求項３０】
請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３１】
先行請求項のいずれかに記載のキメラタンパク質をコードする核酸配列を含む、ウイルス。
【請求項３２】
請求項２６に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、癌の治療方法。
【請求項３３】
請求項２６に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、自己免疫疾患または自己免疫障害の治療方法。
【請求項３４】
請求項２６に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、患者の免疫応答を調節する方法。
【請求項３５】
前記患者のＴ細胞が、免疫刺激シグナルを有する前記細胞外ドメインによって活性化される、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記患者が腫瘍を有し、かつ１つ以上の腫瘍細胞が、免疫抑制シグナルを有する前記細胞外ドメインによって活性化される免疫抑制シグナルを伝達できない、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
（ｉ）配列番号３９〜５５のうちの１つ、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と；
（ｉｉ）配列番号５６〜６９のうちの１つ、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列とを含む、異種キメラタンパク質。
【請求項３８】
（ｉｉｉ）配列番号７０〜７２のうちの１つ、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列をさらに含み、（ｉｉｉ）が（ｉ）と（ｉｉ）との間に転置されている、請求項３７に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項３９】
（ｉｖ）配列番号７３〜７８のうちの１つのアミノ酸配列の１つ以上をさらに含み、（ｉｖ）が（ｉｉｉ）に隣接している、請求項３７に記載の異種キメラタンパク質。
【請求項４０】
配列番号２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、異種キメラタンパク質。
【請求項４１】
配列番号５のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、異種キメラタンパク質。
【請求項４２】
配列番号７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、異種キメラタンパク質。
【請求項４３】
配列番号９のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、異種キメラタンパク質。
【請求項４４】
配列番号１１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、異種キメラタンパク質。
【請求項４５】
配列番号１３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、異種キメラタンパク質。
【請求項４６】
配列番号１５のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、異種キメラタンパク質。
【請求項４７】
配列番号２２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、異種キメラタンパク質。
【請求項４８】
請求項３７〜４７のいずれか１項に記載の異種キメラタンパク質を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、２０１５年１０月１日出願の米国仮出願第６２／２３５，７２７号、２０１５年１２月４日出願の米国仮出願第６２／２６３，３１３号、２０１６年８月９日出願の米国仮出願第６２／３７２，５７４号に対する利益及び優先権を主張するものであり、そのすべてが全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、とりわけ、癌及び自己免疫に対する免疫療法などの、疾患の治療に使用されるキメラタンパク質を含む組成物及び方法に関する。
電子的に提出されたテキストファイルに関する説明事項
本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピューター可読形式コピー（ファイル名：ＨＴＢ−０２３ＰＣ−ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；記録日：２０１６年９月２９日；ファイルサイズ：１４０ＫＢ）。
【背景技術】
【０００３】
癌と免疫系との相互作用は複雑で多面的である。ｄｅ  Ｖｉｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ（２００６）６：２４−３７を参照のこと。癌患者の多くが抗腫瘍免疫応答を発現すると思われる一方で、癌もまた免疫による検出及び破壊を回避する手段を講じる。近年、癌及び他の障害を治療及び予防するための免疫療法が開発されている。免疫療法は、他の治療法に不足する細胞特異性という利点をもたらす。そのため、免疫に基づく療法の有効性を増強する方法は臨床的に有益であり得る。免疫応答を制御する機構及び分子の特定が進み、癌治療の新規治療標的が提供されてきた。例えば、共刺激分子及び共抑制分子は、Ｔ細胞免疫応答の制御において中心的な役割を果たしている。しかしながら、例えば抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１を含むこれらの共刺激分子及び共抑制分子を標的とする抗体薬剤に対する患者の反応が顕著であるにもかかわらず、依然としてチェックポイント阻害療法が奏功しない患者が多数存在する。したがって、大部分の癌療法と同様、こうした薬剤の有効性を改善することができる新しい組成物及び方法が引き続き必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ｄｅ  Ｖｉｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ（２００６）６：２４−３７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
それに伴い、本発明は、様々な態様において、癌免疫療法に有用である、例えば治療的利益が得られるように免疫シグナルを操作または改変する組成物及び方法を提供する。様々な実施形態において、本発明は、免疫抑制シグナルを逆転または抑制すると同時に、免疫活性化シグナルまたは共刺激シグナルを有益な状況で生じさせる。例えば、一態様では、本発明は、（ａ）Ｎ末端またはその近傍にＩ型膜貫通タンパク質の第１の細胞外ドメイン、（ｂ）Ｃ末端またはその近傍にＩＩ型膜貫通タンパク質の第２の細胞外ドメイン、及び（ｃ）リンカーを含み、その場合、第１及び第２の細胞外ドメインの一方が免疫抑制シグナルであり、かつ第１及び第２の細胞外ドメインの一方が免疫刺激シグナルであるキメラタンパク質を提供する。これら２つの分子を機能的方向に連結することにより、正のシグナルと負のシグナルとの調整を達成することができる。例えば、本発明は、様々な実施形態において、負の免疫シグナルの遮断と正の免疫シグナルの刺激を単一の構築物で提供する。様々な実施形態において、提供する組成物は、抗体でもなく、または抗体由来の抗原結合ドメイン（例えば、相補性決定領域、ＣＤＲ）に基づくものでもなく、むしろ直接的な受容体／リガンド相互作用を生じさせるものである。
【０００６】
癌患者において、腫瘍抗原に対する免疫応答を刺激することで、患者自身の免疫系を活性化し、腫瘍細胞を死滅させることができる。しかしながら、癌細胞によっては、免疫編集と呼ばれる過程で免疫応答を回避するための手段を講じるものがある。これには、特定の抗原の下方制御、ＭＨＣ  Ｉの下方制御、免疫制御表面分子（ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＥＡＣＡＭ１、ガレクチン−９、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４７など）の上方制御、または可溶性免疫抑制分子（ＩＤＯ、ＴＧＦ−β、ＭＩＣＡなど）の上方制御を含むが、これらに限定されない。一般に、腫瘍細胞はこれらの手段を利用して、腫瘍浸潤性免疫キラー細胞が腫瘍細胞に遭遇したときに、免疫抑制因子によってキラー細胞を直接抑制化することで、腫瘍細胞を死滅させることができないようにする。免疫応答を抑制するために腫瘍細胞が利用する免疫抑制リガンドの多くは、Ｉ型膜タンパク質である受容体と相互作用する。いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ４、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ２４４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１７２ａ／ＳＩＲＰα、ＶＩＳＴＡ／ＶＳＩＧ８、ＣＤ１１５、ＣＤ２００、ＣＤ２２３、及びＴＭＩＧＤ２のうち１つ以上を含むが、これらに限定されない免疫抑制剤の細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、免疫抑制特性を有するＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインを含む。様々な実施形態において、キメラタンパク質は、非限定的な例として、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２との結合、ならびに／またはＣＤ１７２ａとＣＤ４７との結合、ならびに／またはＴＩＭ−３とガレクチン−９及び／もしくはホスファチジルセリンのうち１つ以上との結合によって、免疫抑制シグナルの伝達を妨害、遮断、低減、及び／または抑制するように遺伝子操作される。
【０００７】
さらに、免疫抑制シグナル伝達の抑制に加えて、多くの場合、例えば患者の抗腫瘍免疫応答を高めるために免疫刺激シグナルの伝達を強化して免疫応答を増強することが望ましい。いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、限定するものではないが、ＯＸ−４０リガンド、ＬＩＧＨＴ（ＣＤ２５８）、ＧＩＴＲリガンド、ＣＤ７０、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ１３７リガンド、ＴＲＡＩＬ、及びＴＬ１Ａのうちの１つ以上である、免疫刺激シグナルの細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、免疫刺激特性を有するＩＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインを含む。様々な実施形態において、キメラタンパク質は、非限定的な例として、ＧＩＴＲと１つ以上のＧＩＴＲリガンドとの結合、ならびに／またはＯＸ４０とＯＸ４０Ｌ及び／もしくはＣＤ４０とＣＤ４０リガンドとの結合によって、免疫刺激シグナルの伝達を増強、増加、及び／または刺激するように遺伝子操作される。
【０００８】
様々な実施形態において、キメラタンパク質は、免疫抑制受容体の細胞外ドメインと、免疫刺激リガンドの細胞外ドメインとを含み、限定するものではないが、それによって腫瘍細胞の免疫抑制シグナルを遮断すると同時にＴ細胞に免疫刺激を与えることができる。様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫抑制シグナルから免疫刺激シグナルへの置き換えを効果的に引き起こすことにより、免疫治療利益の改善をもたらす。例えば、（ｉ）ＰＤ−１の細胞外ドメインと（ｉｉ）ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインとを含むキメラタンパク質構築物は、抑制性ＰＤ−Ｌ１／Ｌ２シグナルを妨害し、かつそのシグナルを刺激性ＯＸ４０Ｌに置き換えることができる。したがって、本発明のキメラタンパク質は、いくつかの実施形態において、抑制性免疫シグナルの低減または消失、及び／または免疫刺激シグナルの増加または活性化が可能であるか、またはそれらに関与する方法に使用することができる。本発明のキメラタンパク質の単一構築物手法は、そのような有益な特性を強化するものである。例えば、シグナルの置き換えをほぼ同時に生じさせることができ、かつシグナルの置き換えが臨床的に重要な部位（例えば、腫瘍の微小環境）に局在化するように調整される。さらなる実施形態は、例えば、主として、（ｉ）ＰＤ−１の細胞外ドメインと（ｉｉ）ＧＩＴＲＬの細胞外ドメイン；（ｉ）ＢＴＬＡの細胞外ドメインと（ｉｉ）ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン；（ｉ）ＴＩＧＩＴの細胞外ドメインと（ｉｉ）ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン；（ｉ）ＴＭＩＧＤ２の細胞外ドメインと（ｉｉ）ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン；（ｉ）ＴＩＭ３の細胞外ドメインと（ｉｉ）ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン；及び（ｉ）ＣＤ１７２ａまたはＣＤ１１５の細胞外ドメインと（ｉｉ）ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインなどの他のキメラタンパク質構築物に同じ原則を適用している。
【０００９】
さらになお、いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、免疫細胞のバランスを腫瘍の免疫攻撃に有利にシフトさせることが可能であるか、またはそれに関与する方法に使用される。例えば、本発明のキメラタンパク質は、臨床的に重要な部位での免疫細胞の比率を、腫瘍を死滅させることができる細胞（例えば、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔヘルパー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、抗腫瘍マクロファージ（例えば、Ｍ１マクロファージ）、Ｂ細胞、及び樹状細胞）に有利に、かつ腫瘍を保護する細胞（例えば、骨髄由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）；腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）、Ｍ２マクロファージ、及び腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ））に反するようにシフトすることができる。いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、制御性Ｔ細胞に対するエフェクターＴ細胞の比率を増加させることができる。
【００１０】
様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、予想外に、長い解離速度（ＫｄまたはＫｏｆｆ）で細胞外ドメイン成分と対応する結合パートナーとを結合させ、それによって、特にリガンドに対する受容体の占有、及び受容体に対するリガンドの占有を延長させる。例えば、いくつかの実施形態では、これは、持続的な負のシグナル遮断効果をもたらす。さらに、いくつかの実施形態では、これは、例えば、エフェクター細胞が適切に刺激されるように（例えば、サイトカインのような刺激シグナルの増殖及び／または放出のため）、正のシグナル効果を延長させる。また、細胞（例えば、負のシグナルを有する腫瘍細胞、及び腫瘍を攻撃できるＴ細胞）のこの安定したシナプスにより、腫瘍細胞を攻撃するようにＴ細胞を配置する、及び／または本発明のキメラタンパク質によって遮断されるもの以外の負のシグナルを含めた、腫瘍細胞による負のシグナルの送達を立体的に防止するなどの、腫瘍の縮小に有利となる空間方向が得られる。なおもさらなる実施形態では、これは、キメラタンパク質の血清ｔ１／２よりもオンターゲットでの（例えば、腫瘍内の）半減期（ｔ１／２）を長くする。そのような特性は、キメラタンパク質の全身分布に付随するオフターゲット毒性を減少させるという利点を併せ持つことができる。
【００１１】
また、様々な態様において、本発明のキメラタンパク質は、キメラタンパク質を含む有効量の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、癌の治療方法に使用される。さらなる態様において、本発明のキメラタンパク質は、ウイルス感染または他の細胞内病原体を含むがこれらに限定されない感染症の治療方法に使用される。なおもさらなる態様において、本発明のキメラタンパク質は、自己免疫疾患の治療方法に使用される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】細胞膜におけるＩ型（左）及びＩＩ型（右）膜タンパク質の配向の図解を示す。パネル左のＩ型膜タンパク質では、アミノ末端（「Ｎ」で表す）が細胞外環境に面し、カルボキシ末端（「Ｃ」で表す）が細胞内環境に位置している。対照的に、パネル右のＩＩ型膜タンパク質は、カルボキシ末端が細胞外に面し、アミノ末端が細胞内空間にあることを特徴とする。
【図２】本発明に関連する免疫抑制シグナル伝達及び免疫刺激シグナル伝達を示す（出典：Ｍａｈｏｎｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２０１５：１４；５６１−５８５）。
【図３】Ｉ型及びＩＩ型の膜タンパク質（パネルＡ）の遺伝子操作方法を示す模式図である。この方法では、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを除去し（パネルＢ）、リンカー配列を使用して連結し（パネルＣ）、単一の融合タンパク質を作製できる。その場合、単一の融合タンパク質において、Ｉ型膜タンパク質とＩＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインはそれぞれ外向きに面している（パネルＤ）。パネルＣは、Ｉ型及びＩＩ型膜タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを除去して各タンパク質を連結したものを示し、その場合、各タンパク質から遊離した細胞外ドメイン（ＥＣＤ）はリンカー配列によって連結されている。この図のＥＣＤは、一般的に細胞膜の外側に位置する候補Ｉ型タンパク質または候補ＩＩ型タンパク質の全アミノ酸配列か、または目的の受容体またはリガンドへの結合を保持するその任意の部分を含み得る。パネルＤは、連結後の細胞外ドメインを示し、線状の構築物において、Ｉ型膜タンパク質の細胞外ドメインは構築物の「左」側を向いており、ＩＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインは構築物の「右」側を向いている。
【図４】腫瘍細胞は細胞表面にＰＤ−Ｌ１を発現する場合があり（パネルＡ）、Ｔ細胞が発現するＰＤ−１に結合できる（パネルＢ）ことを示す。この相互作用は、Ｔ細胞の活性化を抑制する。ＰＤ−１の細胞外ドメインがＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインと連結された融合タンパク質は、腫瘍細胞表面のＰＤ−Ｌ１に結合し、Ｔ細胞表面のＰＤ−１への結合を妨げることができる（パネルＣ）。さらに、この融合タンパク質は腫瘍細胞表面から「ぶら下がる」ことができ、それによって融合タンパク質のＯＸ４０Ｌ部分が、Ｔ細胞表面に発現するＯＸ４０に結合することができる。それによって、抑制性ＰＤ−Ｌ１シグナルが共刺激性ＯＸ４０Ｌシグナルに置き換えられ、Ｔ細胞の抗腫瘍活性が増強されることになる。
【図５】マウスＩｇＧ捕捉ＥＬＩＳＡアッセイ及び抗ｍＩｇＧ検出ＥＬＩＳＡアッセイを用いて検出されたＣＨＯ−Ｋ１細胞由来のキメラマウス（ｍ）ＰＤ−１−Ｆｃ及びＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０リガンド（Ｌ）の発現を示す。
【図６】ｍＯＸ４０へのｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合を確認するＥＬＩＳＡアッセイから得た結果を示す。パネルＡは、ｍＯＸ４０へのｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合を検出する際に使用したＥＬＩＳＡ法の模式図を示す。ヒトＦｃに融合した組換えｍＯＸ４０（ｍＯＸ４０−ｈＦｃ）を使用して、培地中のｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを捕捉した。ｍＰＤ−１に対するウサギポリクローナル抗体を使用して、キメラタンパク質中のｍＰＤ−１ドメインを検出し、続いてそれをウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートポリクローナル抗体を使用して検出した。パネルＢは、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌタンパク質を含有するＣＨＯ−Ｋ１培地の２倍段階希釈物を、プレート結合したｍＯＸ４０−ｈＦｃとインキュベートし、結合を４５０ｎｍでの吸光度によって測定した結果を示す。ｍＰＤ−１−Ｆｃタンパク質（組換えマウスＯＸ４０への結合が予測されない）を含有する培地、ならびに培地単独を陰性対照として使用した。
【図７】ｍＰＤ−Ｌ１へのｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合を確認するＥＬＩＳＡアッセイから得た結果を示す。パネルＡは、ｍＰＤ−Ｌ１へのｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合を検出する際に使用したＥＬＩＳＡ法の模式図を示す。ヒトＦｃに融合した組換えｍＰＤ−Ｌ１（ｍＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃ）を使用して、培地中のｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を捕捉した。結合したタンパク質の検出には、マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートポリクローナル抗体を使用した。パネルＢは、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌタンパク質を含有するＣＨＯ−Ｋ１培地の２倍段階希釈物を、プレート結合したｍＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃとインキュベートし、結合を４５０ｎｍでの吸光度によって測定した結果を示す。ｍＰＤ−１−Ｆｃタンパク質を含有する培地を陽性対照として使用し、培地単独を陰性対照として使用した。
【図８】マウス（ｍ）ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０ＬをコードするプラスミドＤＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍内送達により、抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞が増殖したことを示す。「ＥＰのみ」はエレクトロポレーション陰性対照である。この実験では、腫瘍接種の２日前にオボアルブミン特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞（ＯＴ−Ｉ）でＣ５７ＢＬ／６マウスを養子移入した。次いで、０日目にＢ１６−Ｆ１０卵巣腫瘍を各マウスの後側腹部に移植した。７日間で樹立したＢ１６−Ｆ１０卵巣腫瘍にｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０ＬをコードするプラスミドＤＮＡを注射し、その直後の７日目と１０日目にエレクトロポレーションし、ＥＰのみの対照と比較した。フローサイトメトリーにより、指定日に末梢血中でのＯＴ−Ｉ細胞の頻度を測定した。
【図９】ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０ＬをコードするプラスミドＤＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍内送達が、Ｂ１６．Ｆ１０卵巣黒色腫腫瘍モデルにおいて腫瘍退縮を引き起こしたことを示す。「ＥＰのみ」はエレクトロポレーション陰性対照である。マウスは図９に示したように処置し、指定日に腫瘍径を測定した。
【図１０−１】ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌのさらなる特性決定の結果を示す。パネルＡは、ｍＰＤ−１（左のゲル）、ｍＦｃ（中央のパネル）、及びｍＯＸ４０Ｌ（右のパネル）の抗体でプローブし、還元条件下または非還元条件下で、脱グリコシル化酵素ＰＮＧａｓｅ  Ｆあり、またはなしで（上記各ブロットに「＋」または「−」マークで示す）泳動させたウェスタンブロット分析を示す。マウスタンパク質は、単量体タンパク質としての予測分子量が約６０ｋＤａである。パネルＢは、ｍＰＤ−Ｌ１及びｍＯＸ４０へのｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合を実証する機能的ＥＬＩＳＡアッセイから得た結果を示す。一連の各ヒストグラムに関して、バーは、左から右に、精製されたｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質の段階希釈を表す。パネルＣは、ｍＦＣへのｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合を実証する機能的ＥＬＩＳＡアッセイから得た結果を示す（各濃度において、ＯＸ４０−Ｈｉｓが左のバー、ＨＶＥＭ−Ｈｉｓが右のバーである）。パネルＤは、ＨＬＡ  Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ＋ＰＤ−Ｌ１＋（ＡＰＣ＋ＰＤ−Ｌ１＋）及びＣＤ４＋ＯＸ４０＋細胞で検出したときの活性化マウス脾細胞へのｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合を示す（各グラフにおいて、左側の細胞集団はＡＰＣ−ＰＤ−Ｌ１−細胞またはＣＤ４−ＯＸ４０−細胞を表し、右側の細胞集団はＡＰＣ＋ＰＤ−Ｌ１＋細胞またはＣＤ４＋ＯＸ４０＋細胞を表す）。パネルＥは、ＰＤ−Ｌ１ｌｏｗ（４Ｔ１）細胞株及びＰＤ−Ｌ１ｈｉｇｈ（Ｂ１６．Ｆ１０）細胞株の同定を示す。パネルＦは、脾細胞／腫瘍共培養アッセイの結果を示す。ＩＬ２  ＥＬＩＳＡは、最初の採取から５日後に実施した。線グラフは左から右に、＋４Ｔ１細胞（−ＦＰ）、＋４Ｔ１細胞（＋５００ｎｇ  ＦＰ）、＋４Ｔ１細胞（＋５ｕｇ  ＦＰ）、＋Ｂ１６細胞（−ＦＰ）、＋Ｂ１６細胞（＋５００ｎｇ  ＦＰ）、及び＋Ｂ１６細胞（＋５ｕｇ  ＦＰ）を表す。
【図１０−２】同上
【図１１−１】ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの抗腫瘍効果を示す。パネルＡは、指定されたレジメンを用いた治療後のＭＣ３８腫瘍増殖速度を示す。Ｂａｌｂ．ｃマウスの後側腹部に２．５×１０５のＭＣ３８卵巣腫瘍細胞を接種した。５日目及び８日目に、指定された処置群でマウスを処置した。抗ＯＸ４０処置動物には、２日間それぞれ１００μｇのＯＸ８６  ｍＡｂを与え、抗ＰＤ−Ｌ１処置動物には、２日間それぞれ１００μｇの１０Ｆ．９Ｇ２  ｍＡｂを与え、抗ＯＸ４０と抗ＰＤ−Ｌ１の併用処置動物には、２日間それぞれＯＸ８６及び１０Ｆ．９Ｇ２を１００μｇずつ与え、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ処置マウスには、２日間それぞれｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを合計１００μｇ与えた。指定日に電子ノギスを使用して垂直腫瘍径の測定を行うことによって腫瘍面積を算出した。４０日目に、前腫瘍を完全に拒絶したマウス（可視または触診可能な腫瘍が残っていない）に、何も追加の処置をせずに、２．５×１０５のＭＣ３８親（卵細胞発現していない）腫瘍細胞を投与し、腫瘍面積を上記のように算出した。パネルＢは、ＩＡＣＵＣプロトコルに従い、腫瘍全体の大きさが１５０ｍｍ２を超えると判定された、各処置群の実験期間にわたる全生存率を示す（６５日目で、曲線は上から下に、αＯＸ４０／αＰＤ−Ｌ１、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、αＯＸ４０、αＰＤ−Ｌ１、及び未処置である）。パネルＣは、指定された各処置群についての末梢血分析によるＣＤ４／ＣＤ８比（上段）及びＦＯＸＰ３＋  Ｔｒｅｇ細胞（下段）のパーセント比を示す（いずれのグラフも、処置群は左から右に、未処置、αＯＸ４０、αＰＤ−Ｌ１、αＯＸ４０／αＰＤ−Ｌ１、及びｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌである）。パネルＤは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ４、及びＩＬ６の血清サイトカイン分析を示す。各一連のデータで、線グラフは左から右に、未処置、α−ＯＸ４０、α−ＰＤ−Ｌ１、α−ＯＸ４０／α−ＰＤ−Ｌ１、及びｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを表す（４つのグラフで、処置群は左から右に、未処置、αＯＸ４０、αＰＤ−Ｌ１、αＯＸ４０／αＰＤ−Ｌ１、及びｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌである）。パネルＥは、実験１３日目の各処置群の平均腫瘍サイズを示す（各グラフで、サンプルは左から右に、未処置、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＧＩＴＲＬ、ｍＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ、αＯＸ４０、αＰＤ−Ｌ１、及びαＧＩＴＲである）。パネルＦは、実験１３日目の各処置群において、腫瘍から単離されたＫＳＰ四量体特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞（ＴＩＬ）のパーセント比を示す（各グラフで、サンプルは左から右に、未処置、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＧＩＴＲＬ、ｍＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ、αＯＸ４０、αＰＤ−Ｌ１、及びαＧＩＴＲである）。パネルＧは、実験１３日目の各処置群における、明確に特性決定された「免疫記憶」マーカーによるＣＤ８＋脾細胞の表現型を示す（各グラフで、サンプルは左から右に、未処置、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＧＩＴＲＬ、ｍＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ、αＯＸ４０、αＰＤ−Ｌ１、及びαＧＩＴＲである）。パネルＨは、実験１３日目の各処置群における、末梢血（左のパネル）、���臓（中央のパネル）、及び腫瘍（右のパネル）でのＣＤ４対ＣＤ８細胞の比を示す（各グラフで、サンプルは左から右に、未処置、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＧＩＴＲＬ、ｍＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ、αＯＸ４０、αＰＤ−Ｌ１、及びαＧＩＴＲである）。パネルＩは、ＣＴ２６結腸腫瘍モデルを使用した各実験で、各動物をどのように処置したかを示す模式図を示す。パネルＪは、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製のＬｅｇｅｎｄ  Ｐｌｅｘビーズアレイキットを使用した、指定された各血清サイトカインの血清濃度の算出に使用した代表的なフローサイトメトリープロットを示す。パネルに含まれる指定された各サイトカインが示され、血清中の各サイトカインの相対濃度を算出するには各ビーズクラスターの平均蛍光強度を使用する。パネルＫは、ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質の用量反応の薬力学的バイオマーカーとして、Ｌｅｇｅｎｄ  Ｐｌｅｘアッセイをどのように使用できるかについて一例を示す。一例としてＩＦＮγの濃度を使用して、このサイトカイン濃度の増加が、ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの処置量の増加に対応することが示されている（パネルＫは左から右に、未処置、４０ｕｇ×１、４０ｕｇ×２、１００ｕｇ×１、及び１００ｕｇ×２を示す）。パネルＬは、各処置群のＣＴ２６腫瘍増殖速度を示す。
【図１１−２】同上
【図１１−３】同上
【図１１−４】同上
【図１１−５】同上
【図１２】パネルＡは、ＲａｐｔｏｒＸによって決定されたヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの予測される３次構造を示す。パネルＢは、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデリングアルゴリズム、ｉＴｏｐｅ（ＡＮＴＩＴＯＰＥ／ＡＢＺＥＮＡ）を使用し、独自のＴ細胞エピトープデータベースを相互参照した、ヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０の免疫原性評価を示す。
【図１３−１】ヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ（ＳＬ−２７９２５２とも称する）の特性決定を示す。パネルＡは、安定的トランスフェクション（内製）及び／または一過性トランスフェクション（Ｔｈｅｒｍｏ）調製物から精製したＳＬ−２７９２５２からのプロテインＡ溶出ピーク（ＯＤ４５０）を示す。各溶出ピークからのＥＬＩＳＡ結果を吸光度測定値と重ね合わせたものであり、カラムからの最初の溶出ピーク内にＳＬ２７９２５２タンパク質が含まれていることを示す。パネルＢは、精製したタンパク質をヒト抗ＰＤ−１抗体（左のゲル）、抗Ｆｃ抗体（中央のゲル）、及び抗ＯＸ４０Ｌ（右のゲル）抗体でプローブして、非還元条件下または還元条件下で、脱グリコシル化酵素ＰＮＧａｓｅ  Ｆあり、またはなしで実施したＳＬ−２７９２５２のウェスタンブロット分析を示す。単量体ＳＬ−２７９２５２の予測分子量は６０．３ｋＤａである。パネルＣは、組換えヒトＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ標準と比較した、組換えｈＯＸ４０での捕捉及びＧｔ−ｈＯＸ４０Ｌ／Ｇｔ−ＨＲＰでの検出を使用した機能的ＥＬＩＳＡからの結果を示す。パネルＤは、ＳＬ−２７９２５２の両側の機能的結合を同時に試験するように設計された機能的ＥＬＩＳＡの結果を示す。具体的には、組換えヒトＰＤ−Ｌ１をプレートに吸着させ、ＳＬ−２７９２５２の捕捉に使用した。次いで、捕捉されたタンパク質の特異性を、組換えｈＯＸ４０−ｈｉｓ／ＨＲＰウサギ抗ｈｉｓ対ＨＶＥＭ−ｈｉｓを陰性対照として使用し、検出した。
【図１３−２】同上
【図１４−１】ＳＬ−２７９２５２の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析及び半減期分析を示す。ヒトＰＤ−Ｌ１（パネルＡ）、ヒトＰＤ−Ｌ２（パネルＢ）、ヒトＯＸ４０（パネルＣ）、ヒトＦｃγＲ１Ａ（パネルＤ）、及びＦｃＲｎ（パネルＥ）と結合させたときのＳＬ−２７９２５２の「結合速度（Ｋａ）」、「解離速度（Ｋｄ）」、及び結合親和性（ＫＤ）を決定し、適切な対照と比較した。パネルＦは、試験した各条件での結合速度（Ｋａ）、解離速度（Ｋｄ）、及び結合親和性（ＫＤ）をまとめたものである。また、ＦｃＲｎへの結合を増加させるために異なるリーダーペプチドに加えＦｃ領域の変異を含む改変型ＳＬ−２７９２５２構築物を、ヒトＰＤ−Ｌ１（パネルＧ）、ヒトＰＤ−Ｌ２（パネルＨ）、ヒトＯＸ４０（パネルＩ）、ヒトＦｃγＲ１Ａ（パネルＪ）、及びＦｃＲｎ（パネルＫ）と結合させたときの結合を試験し、適切な対照と比較した。パネルＬは、試験した各条件での結合速度（Ｋａ）、解離速度（Ｋｄ）、及び結合親和性（ＫＤ）をまとめたものである。パネルＭは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＳＬ−２７９２５２のｉｎ  ｖｉｖｏ血清半減期を示す。パネルＮは、片側の側腹部にヒトＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍（ＨｅＬａ−ＰＤ−Ｌ１）を、及び対側の側腹部にＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍（ＨｅＬａ）を移植した免疫不全（ＮＳＧ）マウスにおけるＳＬ−２７９２５２のｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍内半減期を示す。指定日に２つの腫瘍を切除し、二分した。二分した腫瘍の半分を分離して、ヒトＯＸ４０Ｌに対する抗体を用いたフローサイトメトリーによりＳＬ−２７９２５２の結合について試験した。パネルＯは、ＳＬ−２７９２５２の単回注射による処置から６時間後、２日後、及び５日後に、二分された腫瘍のもう半分から得た凍結切片を示す。この図は、投与後少なくとも５日間、ＳＬ−２７９２５２が持続したことを示す。
【図１４−２】同上
【図１４−３】同上
【図１５−１】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞へのＳＬ−２７９２５２の結合を示す。パネルＡでは、親Ｊｕｒｋａｔ細胞（左の細胞集団）及びＪｕｒｋａｔ／ｈＯＸ４０細胞（右の細胞集団）を、ｈＯＸ４０−ＡＰＣ抗体を用いたフローサイトメトリーによって評価した。パネルＢでは、親ＣＨＯ−Ｋ１細胞（左の細胞集団）及びＣＨＯ−Ｋ１／ｈＰＤ−Ｌ１（右の細胞集団）を、ｈＰＤ−Ｌ１−ＡＰＣ抗体を用いたフローサイトメトリーによって評価した。パネルＣでは、親ＣＨＯ−Ｋ１細胞（左の細胞集団）及びＣＨＯ−Ｋ１／ｈＣＤ４７（右の細胞集団）を、ｈＣＤ４７−ＡＰＣ抗体を用いたフローサイトメトリーによって評価した。パネルＤでは、漸増濃度のＳＬ−２７９２５２を親ＣＨＯ−Ｋ１細胞（左のパネル）及びＣＨＯ−Ｋ１／ｈＰＤ−Ｌ１（中央のパネル）とインキュベートし、抗ヒトＯＸ４０Ｌ−ＡＰＣ抗体で検出した。右のパネルは、ＳＬ−２７９２５２濃度の増加に応じた滴定曲線を示す。パネルＥでは、漸増濃度のＳＬ−２７９２５２を親Ｊｕｒｋａｔ細胞（左のパネル）またはＪｕｒｋａｔ／ｈＯＸ４０（中央のパネル）とインキュベートし、抗ヒトＯＸ４０Ｌ−ＡＰＣ抗体で検出した。右のパネルは、ＳＬ−２７９２５２濃度の増加に応じた滴定曲線を示す。パネルＦでは、漸増濃度のｈＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを親ＣＨＯ−Ｋ１細胞（左のパネル）またはＣＨＯ−Ｋ１−ＣＤ４７（中央のパネル）とインキュベートし、抗ヒトＯＸ４０Ｌ−ＡＰＣ抗体で検出した。右のパネルは、ｈＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ濃度の増加に応じた滴定曲線を示す。パネルＧは、漸増濃度のｈＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの、親Ｊｕｒｋａｔ細胞（左のパネル）またはＪｕｒｋａｔ／ｈＯＸ４０細胞（中央のパネル）との結合を示す。右のパネルは、ｈＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ濃度の増加に応じた滴定曲線を示す。パネルＨでは、ヒトＰＤ−Ｌ１ｌｏｗ（ＰＣ３細胞；左の細胞集団）及びＰＤ−Ｌ１ｈｉｇｈ（ＨＣＣ８２７；右の細胞集団）をフローサイトメトリーによって同定した。パネルＩでは、漸増濃度のＳＬ−２７９２５２をＰＣ３細胞とインキュベートした。パネルＪでは、漸増濃度のＳＬ−２７９２５２をＨＣＣ８２７細胞と２時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによってＳＬ−２７９２５２の結合（Ｆｃ−ＰＥ抗体）について分析した。
【図１５−２】同上
【図１５−３】同上
【図１５−４】同上
【図１６−１】ＳＬ−２７９２５２のｅｘ  ｖｉｖｏでの機能的特性決定を示す。パネルＡでは、ＰＭＡ／ＰＨＡ／イオノマイシン（Ｉｏｎ．）で２日間処理したＰＢＭＣから単離したヒトＴ細胞でのＯＸ４０の発現を検出した。パネルＢでは、活性化ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞（Ｆｃ−ＰＥ２次）においてＳＬ−２７９２５２の結合を評価した。パネルＣは、Ｔ細胞の活性化を検出するためのＴ細胞／腫瘍共培養アッセイ、ならびに実験のタイムラインの模式図を示す。パネルＤでは、共培養培地を、初回のＴ細胞単離から６日後にＩＬ２  ＥＬＩＳＡによって評価した。線グラフは左から右に、＋ＰＣ３（−ＦＰ）、＋ＰＣ３（＋５００ｎｇ  ＦＰ）、＋ＰＣ３（＋５ｕｇ  ＦＰ）、＋ＨＣＣ８２７（−ＦＰ）、＋ＨＣＣ８２７（＋５００ｎｇ  ＦＰ）、及び＋ＨＣＣ８２７（＋５ｕｇ  ＦＰ）を表す。パネルＥでは、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞（Ｋｉ６７）の増殖については、初回の単離から５日後、及びＣＤ８＋細胞におけるサイトカイン発現については、単離の７日後に、共培養Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって分析した。線グラフは左から右に、＋ＨＣＣ８２７（−ＦＰ）、＋ＨＣＣ８２７（＋５００ｎｇ  ＦＰ）、及び＋ＨＣＣ８２７（＋５ｕｇ  ＦＰ）を表す。
【図１６−２】同上
【図１７−１】パネルＡは、ｈＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ｈＰＤ１−Ｆｃ−ＴＬ１Ａ、ｈＢＴＬＡ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ｈＴＭＩＧＤ２−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ｈＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＧＩＴＲＬ、ｍＰＤ１−Ｆｃ−４−１ＢＢＬ、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＴＬ１Ａ、ｍＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌを含む、種々のキメラタンパク質のウェスタンブロット分析を示す。各キメラタンパク質を、各結合末端及び中心のＦｃドメインに特異的な抗体でプローブした。ＥＬＩＳＡアッセイを実施して、種々のキメラタンパク質のヒトＯＸ４０への結合を確認した。パネルＢは、ヒトＯＸ４０へのキメラタンパク質の結合を検出する際に使用したＥＬＩＳＡ法の模式図を示す。パネルＣは、親Ｊｕｒｋａｔ細胞（左パネル、左曲線）またはＪｕｒｋａｔ／ＯＸ４０細胞（左パネル、右曲線）へのヒトＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ結合の結果を示す。ヒトＰＤ１−Ｆｃ−ＴＬ１Ａ（中央のパネル）及びイヌＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ（右のパネル）という２つの陰性対照を使用して特異性を実証した。パネルＤは、ＲａｐｔｏｒＸによって決定されたヒトＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの予測される３次構造を示す。パネルＥは、クマシーゲル（左上）、抗ＩｇＧウェスタンブロット（右上）、溶出したタンパク質濃度（左下）、及びアフィニティークロマトグラフィーからの溶出プロファイル（右下）を含む、ヒトＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ（ＳＬ−２７９２５２）の産生及び精製の例を示す。パネルＦは、クマシーゲル（左上）、抗ＩｇＧウェスタンブロット（右上）、溶出したタンパク質濃度（左下）、及びアフィニティークロマトグラフィーからの溶出プロファイル（右下）を含む、ヒトＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの産生及び精製の例を示す。パネルＧは、精製パラメーター（上段の表）及びＬａｂＣｈｉｐ精製タンパク質分析（下段のパネル）を含む、マウスＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの産生及び精製の例を示す。パネルＨは、クマシーゲル（左上）、抗ＩｇＧウェスタンブロット（右上）、溶出したタンパク質濃度（左下）、及びアフィニティークロマトグラフィーからの溶出プロファイル（右下）を含む、ヒトＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの産生及び精製の例を示す。パネルＩは、固定化された組換えＣＤ４７に対するヒトＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合親和性を示す。パネルＪは、固定化された組換えヒトＯＸ４０に対するヒトＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合親和性を示す。パネルＫは、固定化された組換えヒトＦｃγＲ１Ａに対するヒトＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合親和性を示す。パネルＬは、固定化された組換えヒトＦｃＲｎに対するヒトＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合親和性を示す。パネルＭは、試験した各条件での結合速度（Ｋａ）、解離速度（Ｋｄ）、及び結合親和性（ＫＤ）の一覧を示す。パネルＮは、クマシーゲル（左上）、抗ＩｇＧウェスタンブロット（右上）、溶出したタンパク質濃度（左下）、及びアフィニティークロマトグラフィーからの溶出プロファイル（右下）を含む、イヌＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの産生及び精製の例を示す。パネルＯは、クマシーゲル（左上）、抗ＩｇＧウェスタンブロット（右上）、溶出し���タンパク質濃度（左下）、及びアフィニティークロマトグラフィーからの溶出プロファイル（右下）を含む、マウスＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの産生及び精製の例を示す。パネルＰは、クマシーゲル（左上）、抗ＩｇＧウェスタンブロット（右上）、溶出したタンパク質濃度（左下）、及びアフィニティークロマトグラフィーからの溶出プロファイル（右下）を含む、マウスＰＤ１−Ｆｃ−ＧＩＴＲＬの産生及び精製の例を示す。パネルＱは、クマシーゲル（左上）、抗ＩｇＧウェスタンブロット（右上）、溶出したタンパク質濃度（左下）、及びアフィニティークロマトグラフィーからの溶出プロファイル（右下）を含む、マウスＰＤ１−Ｆｃ−４１ＢＢＬの産生及び精製の例を示す。パネルＲは、クマシーゲル（左上）、抗ＩｇＧウェスタンブロット（右上）、溶出したタンパク質濃度（左下）、及びアフィニティークロマトグラフィーからの溶出プロファイル（右下）を含む、マウスＰＤ１−Ｆｃ−ＴＬ１Ａの産生及び精製の例を示す。パネルＳは、クマシーゲル（左上）、抗ＩｇＧウェスタンブロット（右上）、溶出したタンパク質濃度（左下）、及びアフィニティークロマトグラフィーからの溶出プロファイル（右下）を含む、マウスＣＤ１１５−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌの産生及び精製の例を示す。パネルＴは、クマシーゲル（左上）、抗ＩｇＧウェスタンブロット（右上）、溶出したタンパク質濃度（左下）、及びアフィニティークロマトグラフィーからの溶出プロファイル（右下）を含む、ヒトＰＤ１−Ｆｃ−ＧＩＴＲＬの産生及び精製の例を示す。
【図１７−２】同上
【図１７−３】同上
【図１７−４】同上
【図１７−５】同上
【図１７−６】同上
【図１７−７】同上
【図１７−８】同上
【図１７−９】同上
【図１７−１０】同上
【図１７−１１】同上
【図１７−１２】同上
【図１７−１３】同上
【図１７−１４】同上
【図１７−１５】同上
【図１７−１６】同上
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、免疫調節膜貫通タンパク質の細胞外領域すなわちエフェクター領域から、このようなタンパク質の配向（例えば、Ｉ型対ＩＩ型）を利用し、それによって免疫刺激シグナルかつ／または免疫抑制シグナルの送達を可能にするような方法でキメラタンパク質を遺伝子操作できるという発見に部分的に基づいており、その方法には例えば、癌治療において免疫抑制シグナルを遮断し、かつそれを免疫刺激シグナルに置き換えることを含む。
【００１４】
キメラタンパク質
一態様では、本発明は、（ａ）Ｎ末端またはその近傍にＩ型膜貫通タンパク質の第１の細胞外ドメイン、（ｂ）Ｃ末端またはその近傍にＩＩ型膜貫通タンパク質の第２の細胞外ドメイン、及び（ｃ）リンカーを含み、第１及び第２の細胞外ドメインの一方が免疫抑制シグナルであり、かつ第１及び第２の細胞外ドメインの一方が免疫刺激シグナルであるキメラタンパク質に関する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質とは、組換え融合タンパク質、例えば、本明細書に記載の細胞外ドメイン（及び場合によりリンカー）を有する単一のポリペプチドを指す。例えば、様々な実施形態において、キメラタンパク質は、細胞内で単一ユニットとして翻訳される。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質とは、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏで単一ユニットを生じるように（例えば、本明細書に記載の１つ以上の合成リンカーを用いて）連結された複数のポリペプチド、例えば本明細書に記載の複数の細胞外ドメインの組換えタンパク質を指す。
【００１６】
いくつかの実施形態では、細胞外ドメインとは、細胞外環境と相互作用することができる膜貫通タンパク質の一部を指す。様々な実施形態において、細胞外ドメインとは、リガンドまたは受容体に結合するのに十分であり、かつシグナルを細胞に効果的に伝達する膜貫通タンパク質の一部を指す。様々な実施形態において、細胞外ドメインは、細胞または細胞膜の外側にある膜貫通タンパク質の全アミノ酸配列である。様々な実施形態において、細胞外ドメインは、細胞または細胞膜の外側にある膜貫通タンパク質のアミノ酸配列の一部であり、当技術分野において既知の方法（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏリガンド結合アッセイ及び／または細胞活性化アッセイ）を使用して試験できるようなシグナル伝達及び／またはリガンド結合に必要とされる。
【００１７】
いくつかの実施形態では、免疫抑制シグナルとは、免疫応答を減衰または消失させるシグナルを指す。例えば、腫瘍学との関連において、そのようなシグナルは、抗腫瘍免疫を減衰または消失させることができる。正常な生理条件下では、抑制シグナルは、自己寛容の維持（例えば、自己免疫の防止）に有用であり、また免疫系が病原感染に応答しているときには組織を損傷から保護するのに有用である。例えば、限定するものではないが、免疫抑制シグナルは、そのような抑制シグナルがブロックされた場合の細胞増殖、サイトカイン産生、細胞殺傷活性、または貪食活性の増加を検出することによって特定することができる。そのような抑制シグナルの具体例としては、抗体媒介性遮断を用いた、またはＰＤ−１を含む融合タンパク質を使用したＰＤ−Ｌ１／Ｌ２の競合阻害によるＰＤ−Ｌ１／Ｌ２のＰＤ−１の遮断が挙げられる。そのような抑制シグナルがＰＤ−Ｌ１／Ｌ２の阻害によってブロックされると、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２によってそれ以上阻害されなくなるため、Ｔ細胞による腫瘍殺傷活性が増強されることになる。別の例において、ＣＤ１７２ａを発現するマクロファージに対するＣＤ４７によって抑制シグナルを生じさせることができる。ＣＤ４７とＣＤ１７２ａとの結合は通常、マクロファージが標的細胞を貪食する能力を阻害するが、遮断抗体によるＣＤ４７の遮断またはＣＤ１７２ａを含む融合タンパク質を使用したＣＤ４７の競合阻害によって貪食能力を回復させることができる。
【００１８】
いくつかの実施形態では、免疫刺激シグナルとは、免疫応答を増強するシグナルを指す。例えば、腫瘍学との関連において、そのようなシグナルは、抗腫瘍免疫を増強させることができる。例えば、限定するものではないが、免疫刺激シグナルは、白血球の増殖、サイトカイン産生、殺傷活性、または貪食活性を直接刺激することによって特定することができる。具体例としては、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、またはＴＮＦＲＳＦ２５などのＴＮＦスーパーファミリー受容体を、受容体アゴニスト抗体のいずれかを使用して、またはそのような受容体に対するリガンド（それぞれＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＴＬ１Ａ）をコードする融合タンパク質を使用して、直接刺激することが挙げられる。これらの受容体のいずれか１つからの刺激は、個々のＴ細胞サブセットの増殖及びサイトカイン産生を直接刺激することができる。別の例としては、そのような免疫抑制細胞の活性を阻害する受容体を用いた免疫抑制細胞の直接刺激が挙げられる。これには、例えば、ＧＩＴＲアゴニスト抗体、またはＧＩＴＲＬを含む融合タンパク質によるＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の刺激によって、これらの制御性Ｔ細胞が従来のＣＤ４＋またはＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖を抑制する能力を減少させることを含む。別の例では、これには、ＣＤ４０アゴニスト抗体またはＣＤ４０Ｌを含む融合タンパク質を使用した抗原提示細胞表面のＣＤ４０の刺激によって、抗原提示細胞の活性化を引き起こすことを含み、これには、Ｂ７またはＴＮＦスーパーファミリーのものを含めた、適切な天然の共刺激分子の場合に、抗原提示細胞が抗原を提示する能力を増強することも含まれる。
【００１９】
膜タンパク質は一般に、細胞外ドメイン、１つまたは一連の膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインからなる。理論に束縛されるものではないが、膜タンパク質の細胞外ドメインは、可溶性または膜結合性の受容体またはリガンドと相互作用する役割を果たす。理論に束縛されるものではないが、膜貫通ドメイン（複数可）はタンパク質を形質膜に局在化させる役割を果たす。理論に束縛されるものではないが、膜タンパク質の細胞内ドメインは、細胞シグナル伝達分子との相互作用を調整して、細胞外環境との細胞内応答（または細胞内環境との細胞外応答）を調整する役割を果たす。単一経路の膜タンパク質には、細胞外アミノ末端及び細胞内カルボキシ末端を有するもの（Ｉ型）と、細胞外カルボキシ末端及び細胞内アミノ末端を有するもの（ＩＩ型）の２種類がある。Ｉ型及びＩＩ型膜タンパク質はいずれも、受容体でもリガンドでもあり得る。Ｉ型膜タンパク質の場合、タンパク質のアミノ末端が細胞外に面しており、そのため、細胞外環境にある他の結合パートナー（リガンドまたは受容体のいずれか）と相互作用する役割を果たす機能ドメインはアミノ末端に含まれる（図１、画像左）。ＩＩ型膜タンパク質の場合、タンパク質のカルボキシ末端が細胞外に面しており、そのため、細胞外環境にある他の結合パートナー（リガンドまたは受容体のいずれか）と相互作用する役割を果たす機能ドメインはカルボキシ末端に含まれる（図１、画像右）。このように、２種類のタンパク質は互いに逆方向を向いている。
【００２０】
Ｉ型及びＩＩ型膜タンパク質の外側に面するドメインが逆であるため（図１）、各分子の「外側に面する」ドメインをまた互いに相対するように、Ｉ型及びＩＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインを連結することが可能である（図３）。したがって、得られる構築物は、分子の「左」側にあるＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインと、リンカー配列を使用して分子の「右」側に連結されたＩＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインから構成されることになる。この構築物は、これらの３つの断片（Ｉ型タンパク質の細胞外ドメイン、続いてリンカー配列、続いてＩＩ型タンパク質の細胞外ドメイン）をベクター（プラスミド、ウイルス、またはその他）にクローニングすることにより作製することができ、その場合に、完全配列のアミノ末端はＩ型タンパク質を含んでいる分子の「左」側に対応し、完全配列のカルボキシ末端はＩＩ型タンパク質を含んでいる分子の「右」側に対応する。したがって、様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質はそのように遺伝子操作される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、この細胞外ドメインを使用して、その受容体のリガンドによるシグナル伝達を競合的に阻害する可溶性タンパク質を産生することができる。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインを使用して、人工的なシグナル伝達を生じさせることができる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、Ｉ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは免疫抑制シグナルである。いくつかの実施形態では、ＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは免疫刺激シグナルである。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、Ｉ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、またはその機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、またはその機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、Ｉ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、またはその機能的断片と、ＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、またはその機能的断片とを含む。
【００２４】
様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、表１に引用したようなヒトＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、またはその機能的断片を含む。様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、表２に引用したようなヒトＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、またはその機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、表１に引用したようなＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、またはその機能的断片と、表２に引用したようなＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、またはその機能的断片とを含む。表１及び表２は、本明細書で別記する。
【００２５】
様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、限定するものではないが、ＳＬＡＭＦ４、ＩＬ−２Ｒα、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９、ＩＬ−２Ｒβ、ＡＬＣＡＭ、Ｂ７−１、ＩＬ−４Ｒ、Ｂ７−Ｈ３、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−７Ｒα、ＩＬ−１０Ｒα、ＩＬ−１０Ｒβ、ＩＬ−１２Ｒβ１、ＩＬ−１２Ｒβ２、ＣＤ２、ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−１３、ＣＤ３、ＣＤ４、ＩＬＴ２／ＣＤＳ５ｊ、ＩＬＴ３／ＣＤＳ５ｋ、ＩＬＴ４／ＣＤＳ５ｄ、ＩＬＴ５／ＣＤＳ５ａ、インテグリンα４／ＣＤ４９ｄ、ＣＤＳ、インテグリンαＥ／ＣＤ１０３、ＣＤ６、インテグリンαＭ／ＣＤ１１ｂ、ＣＤＳ、インテグリンαＸ／ＣＤ１１ｃ、インテグリンβ２／ＣＤＩＳ、ＫＩＲ／ＣＤ１５Ｓ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＣＤ２Ｓ、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦＳ、ＫＩＲ２ＤＬ４／ＣＤ１５Ｓｄ、ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＬＡＧ−３、ＣＤ４３、ＬＡＩＲ１、ＣＤ４５、ＬＡＩＲ２、ＣＤＳ３、ロイコトリエンＢ４−Ｒ１、ＣＤＳ４／ＳＬＡＭＦ５、ＮＣＡＭ−Ｌ１、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ９７、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２Ｆ−１０／ＳＬＡＭＦ９、ＮＴ−４、ＣＤ６９、ＮＴＢ−Ａ／ＳＬＡＭＦ６、共通γ鎖／ＩＬ−２Ｒγ、オステオポンチン、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＰＤ−１、ＣＲＴＡＭ、ＰＳＧＬ−１、ＣＴＬＡ−４、ＲＡＮＫ／ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸ３ＣＬ１、Ｌ−セレクチン、ＳＩＲＰ  β１、ＳＬＡＭ、ＴＣＣＲ／ＷＳＸ−１、ＤＮＡＭ−１、チモポエチン、ＥＭＭＰＲＩＮ／ＣＤ１４７、ＴＩＭ−１、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ−２、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６、ＴＩＭ−３、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＴＩＭ−４、Ｆｃγ  ＲＩＩＩ／ＣＤ１６、ＴＩＭ−６、ＴＮＦＲ１／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、グラニュライシン、ＴＮＦ  ＲＩＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＩＣＡＭ−１／ＣＤ５４、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＩＣＡＭ−２／ＣＤ１０２、ＴＲＡＩＬＲ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＩＦＮ−γＲ１、ＴＲＡＩＬＲ４／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＩＦＮ−γ  Ｒ２、ＴＳＬＰ、ＩＬ−１  Ｒ１、及びＴＳＬＰ  Ｒの細胞外ドメイン（該当する場合）を含む、ヒト白血球上に存在する１つ以上の分子を標的とするように遺伝子操作することができる。
【００２６】
制御性Ｔ細胞の活性化は、共刺激シグナル及び共抑制シグナルによって重要な影響を受ける。共刺激分子の２つの主要ファミリーとして、Ｂ７ファミリーと腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーが挙げられる。各ファミリーの分子は、それぞれＣＤ２８受容体ファミリーまたはＴＮＦ受容体ファミリーに属するＴ細胞表面の受容体と結合する。Ｂ７ファミリー及びＣＤ２８ファミリーに属する多くの共抑制因子及びその受容体が明確に定義されている。
【００２７】
様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ／ＶＳＩＧ８、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０（ＢＹ５５とも称される）、ＣＨＫ１及びＣＨＫ２キナーゼ、Ａ２ａＲ、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、及び／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ならびに種々のＢ−７ファミリーリガンド（Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−ＤＣ、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５、Ｂ７−Ｈ６、及びＢ７−Ｈ７を含むが、これらに限定されない）を含む、免疫抑制に関与する１つ以上の分子を標的とするように遺伝子操作することができる。
【００２８】
様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＳＩＲＰα／ＣＤ１７２ａ、２Ｂ４、ＶＩＳＴＡ、ＶＳＩＧ８、ＬＡＧ３、ＣＤ２００、及びＴＭＩＧＤ２の１つ以上を含むが、これらに限定されない免疫抑制剤の細胞外ドメインを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、免疫抑制特性を有するＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインを含む。様々な実施形態において、キメラタンパク質は、非限定的な例として、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２との結合、ならびに／またはＣＤ１７２ａとＣＤ４７との結合、ならびに／またはＴＩＭ−３とガレクチン−９及び／もしくはホスファチジルセリンとの結合によって、免疫抑制シグナルの伝達を妨害、遮断、低減、及び／または抑制するように遺伝子操作される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＯＸ−４０リガンド（ＯＸ−４０Ｌ）、ＬＩＧＨＴ（ＣＤ２５８）、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）、ＣＤ７０、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ１３７リガンド、ＴＲＡＩＬ、及びＴＬ１Ａのうちの１つ以上である、免疫刺激シグナルの細胞外ドメインを含む。
【００３１】
様々な実施形態において、キメラタンパク質は、抑制シグナルリガンドとその同種受容体（例えばＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２；例えばＣＤ１７２ａとＣＤ４７；例えばＣＤ１１５とＣＳＦ１；例えばＴＩＭ−３とガレクチン−９またはホスファチジルセリン）との結合を刺激するが、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、マクロファージ、または他の白血球）への抑制シグナル伝達を阻害する。
【００３２】
様々な実施形態において、キメラタンパク質は、免疫抑制受容体の細胞外ドメインと、免疫刺激リガンドの細胞外ドメインとを含み、限定するものではないが、それによって腫瘍細胞の免疫抑制シグナルを遮断しながらＴ細胞に免疫刺激を与えることができる。様々な実施形態において、キメラタンパク質は、最終的な結果としてＴ細胞を活性化するシグナルを送達する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、免疫抑制シグナルの受容体のＥＣＤである免疫抑制シグナルを含み、これは免疫抑制シグナルの同種リガンドを有する腫瘍細胞に作用する。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、免疫刺激シグナルのリガンドのＥＣＤである免疫刺激シグナルを含み、これは免疫刺激シグナルの同種受容体を有するＴ細胞に作用する。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、（ｉ）免疫抑制シグナルの受容体である免疫抑制シグナルを含み、これは免疫抑制シグナルの同種リガンドを有する腫瘍細胞に作用し、かつ、（ｉｉ）免疫刺激シグナルのリガンドである免疫刺激シグナルを含み、これは免疫刺激シグナルの同種受容体を有するＴ細胞に作用する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＭａｈｏｎｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２０１５：１４；５６１−５８５に記載される免疫調節剤のうちの１つ以上の細胞外ドメインを含む。例えば、本発明の図２を参照すると、キメラタンパク質は、対となる受容体（すなわち図の右側）である免疫抑制シグナル（「−」で示す）を有し、腫瘍細胞は図の左側から選択されるリガンドを有する。さらなる例として、本発明の図２を参照すると、キメラタンパク質は、対となるリガンド（すなわち図の左側）である免疫刺激シグナル（「＋」で示す）を有し、腫瘍細胞は図の右側から選択される受容体を有する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、免疫刺激特性を有するＩＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインを含む。様々な実施形態において、キメラタンパク質は、非限定的な例として、ＧＩＴＲと１つ以上のＧＩＴＲリガンドとの結合、及び／またはＯＸ４０とＯＸ４０Ｌとの結合、及び／またはＣＤ４０とＣＤ４０リガンドとの結合によって、免疫刺激シグナルの伝達を増強、増加、及び／または刺激するように遺伝子操作される。
【００３６】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、免疫抑制剤ＰＤ−１の細胞外ドメインを含み、次のように免疫刺激剤と対になっている：ＰＤ−１／４−１ＢＢＬ；ＰＤ−１／ＯＸ−４０Ｌ；ＰＤ−１／ＬＩＧＨＴ；ＰＤ−１／ＧＩＴＲＬ；ＰＤ−１／ＣＤ７０；ＰＤ−１／ＣＤ３０Ｌ；ＰＤ−１／ＣＤ４０Ｌ；及びＰＤ−１／ＴＬ１Ａ。
【００３７】
一実施形態では、キメラタンパク質は、免疫抑制剤ＰＤ−１の細胞外ドメインを含み、免疫刺激剤ＯＸ−４０Ｌと対になっている。一実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。様々な実施形態において、キメラタンパク質は、約１ｎＭ〜約５ｎＭ、例えば、約１ｎＭ、約１．５ｎＭ、約２ｎＭ、約２．５ｎＭ、約３ｎＭ、約３．５ｎＭ、約４ｎＭ、約４．５ｎＭ、または約５ｎＭのＫＤでヒトＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２と結合する。様々な実施形態において、キメラタンパク質は、約５ｎＭ〜約１５ｎＭ、例えば、約５ｎＭ、約５．５ｎＭ、約６ｎＭ、約６．５ｎＭ、約７ｎＭ、約７．５ｎＭ、約８ｎＭ、約８．５ｎＭ、約９ｎＭ、約９．５ｎＭ、約１０ｎＭ、約１０．５ｎＭ、約１１ｎＭ、約１１．５ｎＭ、約１２ｎＭ、約１２．５ｎＭ、約１３ｎＭ、約１３．５ｎＭ、約１４ｎＭ、約１４．５ｎＭ、または約１５ｎＭのＫＤでヒトＰＤ−Ｌ１と結合する。
【００３８】
様々な実施形態において、キメラタンパク質は、安定性及びタンパク質半減期の向上を示す。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は高親和性でＦｃＲｎに結合する。様々な実施形態において、キメラタンパク質は、約７０ｎＭ〜約８０ｎＭのＫＤでＦｃＲｎに結合し得る。例えば、キメラタンパク質は、約７０ｎＭ、約７１ｎＭ、約７２ｎＭ、約７３ｎＭ、約７４ｎＭ、約７５ｎＭ、約７６ｎＭ、約７７ｎＭ、約７８ｎＭ、約７９ｎＭ、または約８０ｎＭのＫＤでＦｃＲｎに結合し得る。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、エフェクター機能を有する他のＦｃ受容体（すなわち、ＦｃＲｎ以外）に実質的に結合しない。
【００３９】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、免疫抑制剤ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメインを含み、次のように免疫刺激受容体と対になっている：ＰＤ−Ｌ１／４−１ＢＢ；ＰＤ−Ｌ１／ＯＸ−４０；ＰＤ−Ｌ１／ＨＶＥＭ；ＰＤ−Ｌ１／ＧＩＴＲ；ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ２７；ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ２８；ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ３０；ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１／ＣＤ１３７。
【００４０】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、免疫抑制剤ＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメインを含み、次のように免疫刺激受容体と対になっている：ＰＤ−Ｌ２／４−１ＢＢ；ＰＤ−Ｌ２／ＯＸ−４０；ＰＤ−Ｌ２／ＨＶＥＭ；ＰＤ−Ｌ２／ＧＩＴＲ；ＰＤ−Ｌ２／ＣＤ２７；ＰＤ−Ｌ２／ＣＤ２８；ＰＤ−Ｌ２／ＣＤ３０；ＰＤ−Ｌ２／ＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ２／ＣＤ１３７。
【００４１】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、免疫抑制剤ＴＩＭ−３の細胞外ドメインを含み、次のように免疫刺激剤と対になっている：ＴＩＭ−３／ＯＸ−４０Ｌ；ＴＩＭ−３／ＬＩＧＨＴ；ＴＩＭ−３／ＧＩＴＲＬ；ＴＩＭ−３／ＣＤ７０；ＴＩＭ−３／ＣＤ３０Ｌ；ＴＩＭ−３／ＣＤ４０Ｌ；ＴＩＭ−３／ＣＤ１３７Ｌ；ＴＩＭ−３／ＴＬ１Ａ；及びＴＩＭ−３／ＯＸ４０Ｌ。
【００４２】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、免疫抑制剤ＢＴＬＡの細胞外ドメインを含み、次のように免疫刺激剤と対になっている：ＢＴＬＡ／ＯＸ−４０Ｌ；ＢＴＬＡ／ＬＩＧＨＴ；ＢＴＬＡ／ＧＩＴＲＬ；ＢＴＬＡ／ＣＤ７０；ＢＴＬＡ／ＣＤ３０Ｌ；ＢＴＬＡ／ＣＤ４０Ｌ；ＢＴＬＡ／ＣＤ１３７Ｌ；ＢＴＬＡ／ＴＬ１Ａ；及びＢＴＬＡ／ＯＸ４０Ｌ。
【００４３】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、免疫抑制剤ＣＤ１７２ａ／ＳＩＲＰαの細胞外ドメインを含み、次のように免疫刺激剤と対になっている：ＣＤ１７２ａ／ＯＸ−４０Ｌ；ＣＤ１７２ａ／ＬＩＧＨＴ；ＣＤ１７２ａ／ＣＤ７０；ＣＤ１７２ａ／ＣＤ３０Ｌ；ＣＤ１７２ａ／ＣＤ４０Ｌ；ＣＤ１７２ａ／ＣＤ１３７Ｌ；ＣＤ１７２ａ／ＴＬ１Ａ；及びＣＤ１７２ａ／ＯＸ４０Ｌ。
【００４４】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、免疫抑制剤ＣＤ１１５の細胞外ドメインを含み、次のように免疫刺激剤と対になっている：ＣＤ１１５／ＯＸ−４０Ｌ；ＣＤ１１５／ＬＩＧＨＴ；ＣＤ１１５／ＣＤ７０；ＣＤ１１５／ＣＤ３０Ｌ；ＣＤ１１５／ＣＤ４０Ｌ；ＣＤ１１５／ＣＤ１３７Ｌ；ＣＤ１１５／ＴＬ１Ａ；及びＣＤ１１５／ＯＸ４０Ｌ。
【００４５】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、免疫抑制剤ＴＩＧＩＴの細胞外ドメインを含み、次のように免疫刺激剤と対になっている：ＴＩＧＩＴ／ＯＸ−４０Ｌ；ＴＩＧＩＴ／ＬＩＧＨＴ；ＴＩＧＩＴ／ＧＩＴＲＬ；ＴＩＧＩＴ／ＣＤ７０；ＴＩＧＩＴ／ＣＤ３０Ｌ；ＴＩＧＩＴ／ＣＤ４０Ｌ；ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１３７Ｌ；ＴＩＧＩＴ／ＴＬ１Ａ；及びＴＩＧＩＴ／ＯＸ４０Ｌ。
【００４６】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、免疫抑制剤ＴＭＩＧＤ２の細胞外ドメインを含み、次のように免疫刺激剤と対になっている：ＴＭＩＧＤ２／ＯＸ−４０Ｌ；ＴＭＩＧＤ２／ＬＩＧＨＴ；ＴＭＩＧＤ２／ＧＩＴＲＬ；ＴＭＩＧＤ２／ＣＤ７０；ＴＭＩＧＤ２／ＣＤ３０Ｌ；ＴＭＩＧＤ２／ＣＤ４０Ｌ；ＴＭＩＧＤ２／ＣＤ１３７Ｌ；ＴＭＩＧＤ２／ＴＬ１Ａ；及びＴＭＩＧＤ２／ＯＸ４０Ｌ。
【００４７】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、免疫抑制剤ＬＡＧ３の細胞外ドメインを含み、次のように免疫刺激剤と対になっている：ＬＡＧ３／ＯＸ−４０Ｌ；ＬＡＧ３／ＬＩＧＨＴ；ＬＡＧ３／ＧＩＴＲＬ；ＬＡＧ３／ＣＤ７０；ＬＡＧ３／ＣＤ３０Ｌ；ＬＡＧ３／ＣＤ４０Ｌ；ＬＡＧ３／ＣＤ１３７Ｌ；ＬＡＧ３／ＴＬ１Ａ；及びＬＡＧ３／ＯＸ４０Ｌ。
【００４８】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、免疫抑制剤ＶＳＩＧ８の細胞外ドメインを含み、次のように免疫刺激剤と対になっている：ＶＳＩＧ８／ＯＸ−４０Ｌ；ＶＳＩＧ８／ＬＩＧＨＴ；ＶＳＩＧ８／ＧＩＴＲＬ；ＶＳＩＧ８／ＣＤ７０；ＶＳＩＧ８／ＣＤ３０Ｌ；ＶＳＩＧ８／ＣＤ４０Ｌ；ＶＳＩＧ８／ＣＤ１３７Ｌ；ＶＳＩＧ８／ＴＬ１Ａ；及びＶＳＩＧ８／ＯＸ４０Ｌ。
【００４９】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、免疫抑制剤ＣＤ２００の細胞外ドメインを含み、次のように免疫刺激剤と対になっている：ＣＤ２００／ＯＸ−４０Ｌ；ＣＤ２００／ＬＩＧＨＴ；ＣＤ２００／ＧＩＴＲＬ；ＣＤ２００／ＣＤ７０；ＣＤ２００／ＣＤ３０Ｌ；ＣＤ２００／ＣＤ４０Ｌ；ＣＤ２００／ＣＤ１３７Ｌ；ＣＤ２００／ＴＬ１Ａ；及びＣＤ２００／ＯＸ４０Ｌ。
【００５０】
様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、例えば、細胞外ドメイン、例えばヒト細胞外ドメインの既知のアミノ酸配列または核酸配列、例えば配列番号１〜１５のうちの１つ以上の全配列またはその中の指定されたドメインに対して、少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列である、本明細書に記載の細胞外ドメインの変種を含み得る。細胞外ドメインを下線または太字で示し、リンカーを通常のテキストで示す、配列番号１〜１５のような、様々な例示的配列を本明細書に含む。様々な実施形態において、リンカーは、本明細書に記載の別のものと置き換えることができる。
【００５１】
例示的実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ヒトＩｇＧ４抗体配列由来のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを使用した、ＰＤ−１の細胞外ドメイン及びＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインを含む。本実施形態では、以下のように、ＰＤ−１の細胞外ドメインが下線で示され、続いてヒトＩｇＧ４のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン及び短いリンカー（通常のテキスト）、続いてＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン（太字）である：
【化１−１】
2018529363.tif 000003
【化１−２】
2018529363.tif 000004
【００５２】
本配列は、以下のアミノ酸配列をもつタンパク質をコードする：
【化２】
2018529363.tif 000005
【００５３】
さらに、このアミノ酸配列、ならびに本明細書に記載の細胞外ドメインのいずれかのアミノ酸配列（明示的に記載されているか否かを問わない）はまた、チャイニーズハムスター（ＣＨＯ）細胞による発現に最適化された以下の配列などのコドン最適化核酸配列で得てもよい：
【化３−１】
2018529363.tif 000006
【化３−２】
2018529363.tif 000007
【００５４】
本発明のキメラタンパク質の別の実施形態は、ＰＤ−１の細胞外ドメイン、及びＴＬ１Ａ、４−１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７、またはＣＤ４０Ｌなどの共刺激リガンドの細胞外ドメインを含む。ＰＤ−１の細胞外ドメイン（下線）−Ｆｃ（通常のテキスト）−ＴＬ１Ａの細胞外ドメイン（太字）をコードする配列の例は以下の通りである：
【化４−１】
2018529363.tif 000008
【化４−２】
2018529363.tif 000009
【００５５】
配列番号４のこのヌクレオチド配列は、以下のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするように、コドン最適化されていてもよい：
【化５】
2018529363.tif 000010
【００５６】
同種受容体の細胞外ドメインをコードする融合タンパク質によって遮断することができる、腫瘍細胞によって発現される多くのＩ型膜タンパク質が存在する。その他の例には、Ｆｃを介してＯＸ４０Ｌに連結されたＢＴＬＡの細胞外ドメインをコードする融合タンパク質が含まれる。そのような構築物は、以下の核酸配列によってコードされ得る：
【化６−１】
2018529363.tif 000011
【化６−２】
2018529363.tif 000012
【００５７】
本ヌクレオチド配列は、以下のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする：
【化７】
2018529363.tif 000013
【００５８】
別の例には、Ｆｃリンカーを介してＯＸ４０Ｌに連結されたＴＩＧＩＴの細胞外ドメインを組み込んでいる融合タンパク質が含まれる：
【化８−１】
2018529363.tif 000014
【化８−２】
2018529363.tif 000015
【００５９】
本配列は、以下のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするようにコドン最適化することができる：
【化９−１】
2018529363.tif 000016
【化９−２】
2018529363.tif 000017
【００６０】
別の例には、Ｆｃ領域を介してヒトＯＸ４０Ｌに連結されたＴＩＭ３の細胞外ドメインを組み込んでいる融合タンパク質が含まれる：
【化１０−１】
2018529363.tif 000018
【化１０−２】
2018529363.tif 000019
【００６１】
そのような配列は、以下のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするようにコドン最適化することができる：
【化１１−１】
2018529363.tif 000020
【化１１−２】
2018529363.tif 000021
【００６２】
別の例は、Ｆｃリンカー配列によってヒトＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインと連結されたＣＤ１７２ａの細胞外ドメインを含み得る：
【化１２−１】
2018529363.tif 000022
【化１２−２】
2018529363.tif 000023
【００６３】
そのような配列は、以下のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするようにコドン最適化することができる：
【化１３−１】
2018529363.tif 000024
【化１３−２】
2018529363.tif 000025
【００６４】
別の例は、Ｆｃリンカー配列によってヒトＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインと連結されたＴＭＩＧＤ２の細胞外ドメインを含み得る：
【化１４−１】
2018529363.tif 000026
【化１４−２】
2018529363.tif 000027
【００６５】
そのような配列は、以下のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするようにコドン最適化することができる：
【化１５】
2018529363.tif 000028
【００６６】
様々な実施形態において、キメラタンパク質は、本明細書に記載のタンパク質配列のいずれかと比較して、１つ以上のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸変異を、置換、挿入、欠失、及び短縮から独立して選択することができる。
【００６７】
いくつかの実施形態では、アミノ酸変異はアミノ酸置換であり、かつ保存的置換及び／または非保存的置換を含み得る。
【００６８】
「保存的置換」は、例えば、関与するアミノ酸残基の極性、電荷、サイズ、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性といった性質の類似性に基づいて行うことができる。２０種の天然型アミノ酸は、以下の６つの標準アミノ酸群に分類することができる：（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性；Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「保存的置換」は、あるアミノ酸を上記の６つの標準アミノ酸群の同じ群内に列挙された別のアミノ酸に交換することであると定義される。例えば、ＡｓｐをＧｌｕに交換しても、そのように修飾されたポリペプチドには１つの負電荷が保持される。加えて、グリシンとプロリンとは、α−ヘリックスを妨害するその能力により、互いに置換することができる。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「非保存的置換」は、あるアミノ酸を上記（１）〜（６）の６つの標準アミノ酸群の異なる群内に列挙された別のアミノ酸に交換することであると定義される。
【００７１】
様々な実施形態において、この置換にはまた、非古典的アミノ酸（例えば、セレノシステイン、ピロリジン、Ｎ−ホルミルメチオニンβ−アラニン、ＧＡＢＡ及びδ−アミノレブリン酸、４−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン（ｓａｒｃｏｓｍｅ）、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えば一般にβメチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、及びアミノ酸類似体）も含み得る。
【００７２】
コドン縮重の考慮を含め、遺伝子コードを参照して、キメラタンパク質のヌクレオチド配列に変異を加えることもできる。
【００７３】
様々な実施形態において、キメラタンパク質はリンカーを含む。様々な実施形態において、リンカーは、天然型マルチドメインタンパク質に由来してもよく、例えば、内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈｉｃｈｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２２（２）：１５３−１６７、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３），Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７−１３６９に記載されているような、実験から得たリンカーであってもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３），Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７−１３６９及びＣｒａｓｔｏ  ｅｔ．ａｌ．，（２０００），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１３（５）：３０９−３１２に記載されたものなどの、リンカー設計データベース及びリンカー設計コンピュータープログラムを使用して設計することができる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、リンカーはＰＥＧなどの合成リンカーである。
【００７５】
他の実施形態では、リンカーはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、リンカーは、約５００アミノ酸長、約４５０アミノ酸長、約４００アミノ酸長、約３５０アミノ酸長、約３００アミノ酸長、約２５０アミノ酸長、約２００アミノ酸長、約１５０アミノ酸長、または約１００アミノ酸長未満である。例えば、リンカーは、約１００、約９５、約９０、約８５、約８０、約７５、約７０、約６５、約６０、約５５、約５０、約４５、約４０、約３５、約３０、約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、または約２アミノ酸長未満であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは可動性である。別の実施形態では、リンカーは堅固である。
【００７６】
様々な実施形態において、リンカーは、実質的にグリシン残基及びセリン残基（例えば、約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または約９７％のグリシン及びセリン）で構成される。
【００７７】
様々な実施形態において、リンカーは、（例えば、サブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ならびにＩｇＡ１及びＩｇＡ２）を包含する、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥの）抗体のヒンジ領域である。ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥクラスの抗体に見られるヒンジ領域は、Ｆａｂ部分が空間内を自由に移動できるようにする可動性のスペーサーとして機能する。定常領域とは対照的に、ヒンジドメインは構造的に多様であり、免疫グロブリンクラス及びサブクラス間で配列と長さの両方が異なる。例えば、ヒンジ領域の長さと柔軟性はＩｇＧサブクラス間で異なる。ＩｇＧ１のヒンジ領域はアミノ酸２１６〜２３１を含んでおり、また自由に可動するため、Ｆａｂ断片がその対称軸を中心として回転し、２つの重鎖間ジスルフィド架橋のうち第１の架橋を中心とする球内を移動することができる。ＩｇＧ２はＩｇＧ１よりもヒンジが短く、１２個のアミノ酸残基と４個のジスルフィド架橋を有する。ＩｇＧ２のヒンジ領域はグリシン残基を欠き、比較的短く、追加の重鎖間ジスルフィド架橋によって安定化された堅固なポリ−プロリン二重らせんを含む。これらの特性は、ＩｇＧ２分子の可動性を制限する。ＩｇＧ３は、６２個のアミノ酸（２１個のプロリン及び１１個のシステインを含む）を含み、可動性のないポリ−プロリン二重らせんを形成する、独自の伸長ヒンジ領域（ＩｇＧ１ヒンジの約４倍の長さ）である点が他のサブクラスと異なる。ＩｇＧ３の場合、Ｆａｂ断片はＦｃ断片から比較的離れており、分子に大きな可動性を与えている。ＩｇＧ３の伸長ヒンジはまた、他のサブクラスと比較して高分子量となる原因でもある。ＩｇＧ４のヒンジ領域は、ＩｇＧ１のヒンジ領域よりも短く、その可動性はＩｇＧ１とＩｇＧ２との中間である。ヒンジ領域の可動性は、ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ４＞ＩｇＧ２の順に減少することが報告されている。他の実施形態では、リンカーは、ヒトＩｇＧ４に由来してもよく、二量体化またはＦｃＲｎ結合を増強する１つ以上の変異（Ｓ２２８Ｐを含む）を含み得る。
【００７８】
結晶学的研究によれば、免疫グロブリンのヒンジ領域は機能上、上部ヒンジ領域、コア領域、及び下部ヒンジ領域という３つの領域にさらに細分化することができる。Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３０：８７を参照のこと。上部ヒンジ領域は、ＣＨ１のカルボキシル末端から、動作を制限するヒンジの第１残基、すなわち一般に２つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合を形成する第１のシステイン残基までのアミノ酸を含む。上部ヒンジ領域の長さは、抗体のセグメント可動性と相関する。コアヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド架橋を含み、下部ヒンジ領域は、ＣＨ２ドメインのアミノ末端に結合し、前述のＣＨ２に残基を含む。野生型ヒトＩｇＧ１のコアヒンジ領域は、配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓを含み、これがジスルフィド結合形成により二量体化されると、ピボットとして作用すると考えられる環状オクタペプチドが得られ、それにより可動性を付与している。様々な実施形態において、本発明のリンカーは、（例えば、サブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ならびにＩｇＡ１及びＩｇＡ２）を包含する、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥの）任意の抗体の、１つ、または２つ、または３つの上部ヒンジ領域、コア領域、及び下部ヒンジ領域を含む。ヒンジ領域はまた、糖鎖付加のためのいくつかの構造的に異なる種類の部位を含む、１つ以上のグリコシル化部位を含み得る。例えば、ＩｇＡ１はヒンジ領域の１７アミノ酸セグメント内に５つのグリコシル化部位を含み、分泌免疫グロブリンにとって有利な特性と考えられる、ヒンジ領域ポリペプチドの腸プロテアーゼに対する耐性を付与している。様々な実施形態において、本発明のリンカーは、１つ以上のグリコシル化部位を含む。
【００７９】
様々な実施形態において、リンカーは、（例えば、サブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ならびにＩｇＡ１及びＩｇＡ２）を包含する、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥの）抗体のＦｃドメインを含む。様々な実施形態において、リンカーは、ヒトＩｇＧ４抗体に由来するヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含む。様々な実施形態において、リンカーは、ヒトＩｇＧ１抗体に由来するヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する親和性の増加及び結合の増強を示す。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＦｃＲｎに対する親和性を増加させ、結合性を増強する１つ以上の変異を含む。理論に束縛されるものではないが、ＦｃＲｎに対する親和性の増加及び結合の増強は、本発明のキメラタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増加させると考えられる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインリンカーは、アミノ酸残基２５０、２５２、２５４、２５６、３０８、３０９、３１１、４２８、４３３、または４３４（Ｋａｂａｔ番号付けに従う）またはその等価物に１つ以上のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、アミノ酸残基２５０におけるアミノ酸置換は、グルタミンによる置換である。一実施形態では、アミノ酸残基２５２におけるアミノ酸置換は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはスレオニンによる置換である。一実施形態では、アミノ酸残基２５４におけるアミノ酸置換は、スレオニンによる置換である。一実施形態では、アミノ酸残基２５６におけるアミノ酸置換は、セリン、アルギニン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはスレオニンによる置換である。一実施形態では、アミノ酸残基３０８におけるアミノ酸置換は、スレオニンによる置換である。一実施形態では、アミノ酸残基３０９におけるアミノ酸置換は、プロリンによる置換である。一実施形態では、アミノ酸残基３１１におけるアミノ酸置換は、セリンによる置換である。一実施形態では、アミノ酸残基３８５におけるアミノ酸置換は、アルギニン、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、ヒスチジン、リジン、アラニン、またはグリシンによる置換である。一実施形態では、アミノ酸残基３８６におけるアミノ酸置換は、スレオニン、プロリン、アスパラギン酸、セリン、リジン、アルギニン、イソロイシン、またはメチオニンによる置換である。一実施形態では、アミノ酸残基３８７におけるアミノ酸置換は、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、またはアラニンによる置換である。一実施形態では、アミノ酸残基３８９におけるアミノ酸置換は、プロリン、セリン、またはアスパラギンによる置換である。一実施形態では、アミノ酸残基４２８におけるアミノ酸置換は、ロイシンによる置換である。一実施形態では、アミノ酸残基４３３におけるアミノ酸置換は、アルギニン、セリン、イソロイシン、プロリン、またはグルタミンによる置換である。一実施形態では、アミノ酸残基４３４におけるアミノ酸置換は、ヒスチジン、フェニルアラニン、またはチロシンによる置換である。
【００８１】
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインリンカー（例えば、ＩｇＧ定常領域を含む）は、アミノ酸残基２５２、２５４、２５６、４３３、４３４、または４３６（Ｋａｂａｔ番号付けに従う）の置換などの１つ以上の変異を含む。一実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、トリプレットＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ変異またはＹＴＥ変異を含む。別の実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、トリプレットＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ／Ｙ４３６Ｈ変異またはＫＦＨ変異を含む。さらなる実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、ＹＴＥ変異とＫＦＨ変異との組み合わせを含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本発明の修飾ヒト化抗体は、アミノ酸残基２５０、２５３、３０７、３１０、３８０、４２８、４３３、４３４、及び４３５に１つ以上の変異が含まれたＩｇＧ定常領域を含む。例示的な変異としては、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ４２８Ｌ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｆ、Ｎ４３４Ｓ、及びＨ４３５Ａが挙げられる。一実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ変異またはＬＳ変異を含む。別の実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ変異またはＱＬ変異を含む。別の実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｎ４３４Ａ変異を含む。別の実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ変異またはＡＡＡ変異を含む。別の実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ変異またはＩＨＨ変異を含む。別の実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ変異を含む。別の実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６ＥとＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを組み合わせた変異を含む。
【００８３】
ＩｇＧ定常領域におけるその他の例示的な変異は、例えば、Ｒｏｂｂｉｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（２０１３），５７（１２）：６１４７−６１５３、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ（２００６），２８１（３３）：２３５１４−２４、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２），１６９：５１７１−８０、Ｋｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１４）５１４：６４２−６４５、Ｇｒｅｖｙｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１５），１９４（１１）：５４９７−５０８、及び米国特許第７，０８３，７８４号に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号７０のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する。様々な実施形態において、安定性及び／または半減期を増加させるため、配列番号７０に変異が加えられている。例えば、いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号７１または７２のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する。例示的なＦｃ安定化変異体はＳ２２８Ｐである。例示的なＦｃ半減期延長変異体は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ３０８Ｔ、Ｌ３０９Ｐ、及びＱ３１１Ｓであり、本発明のリンカーは、これらの変異体のうち１つ、または２つ、または３つ、または４つ、または５つを含み得る。
【００８５】
さらに、１つ以上の連結リンカーを用いて、本発明のＩｇＧリンカー（例えば、配列番号７０、７１、もしくは７１のうちの１つ、またはそれに対して少なくとも９０％、または９３％、または９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一）と細胞外ドメインとを連結することができる。例えば、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、またはその変種のうちのいずれか１つが、本明細書に記載の細胞外ドメインと本明細書に記載のリンカーとを連結することができる。場合により、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、またはその変種のうちのいずれか１つを、本明細書に記載の細胞外ドメインと本明細書に記載のリンカーとの間に転置することができる。
【００８６】
その他の例示的なリンカーとしては、配列ＬＥ、ＧＧＧＧＳ（配列番号２３）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎ＝１〜４）、（Ｇｌｙ）８、（Ｇｌｙ）６、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎ＝１〜３）（配列番号２４）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（ｎ＝２〜５）（配列番号２５）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号２６）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａ（配列番号２７）、ＰＡＰＡＰ（配列番号２８）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号２９）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号３０）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号３１）、及び（ＸＰ）ｎ（Ｘは任意のアミノ酸を示し、例えば、Ａｌａ、Ｌｙｓ、またはＧｌｕである）を有するリンカーが挙げられが、これらに限定されない。
【００８７】
様々な実施形態において、リンカーは機能的であり得る。例えば、限定するものではないが、リンカーは、本キメラタンパク質の、折りたたみ及び／または安定性を改善し、発現を改善し、薬物動態を改善し、及び／または生物活性を改善するように機能することができる。別の例では、リンカーは、キメラタンパク質を特定の細胞型または位置に標的化するように機能することができる。
【００８８】
様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫活性化（例えば、抗腫瘍）の促進が可能であり、かつそれを含む方法に使用することができる。様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、（例えば、腫瘍の生存を可能にする）免疫阻害の抑制が可能であり、かつそれを含む方法に使用することができる。様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、構築物のキメラ性がもたらすシグナル伝達の近接性により、免疫活性化を改善し、かつ／または免疫阻害の抑制を改善する。
【００８９】
様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫応答の大きさの調節（例えば、エフェクター産生のレベル調節）が可能であるか、またはそれを含む方法に使用することができる。いくつかの実施形態では、例えば、癌の治療に使用される場合、本発明のキメラタンパク質は、免疫抑制と比較して免疫刺激の程度を変化させて、Ｔ細胞応答の大きさを増加させ、これには、サイトカインの産生、増殖、または標的殺傷が見込まれるレベルを増加させる刺激が含まれるが、これには限定されない。
【００９０】
様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、いくつかの実施形態で、腫瘍細胞表面の抑制リガンドを遮断し、かつその免疫抑制リガンドを免疫刺激リガンドに置き換えることが可能であるか、またはそれに関与する方法に使用することができる（例えば、図４を参照）。例えば、（ｉ）ＰＤ−１の細胞外ドメインと（ｉｉ）ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインとを含むキメラタンパク質構築物は、抑制性ＰＤ−Ｌ１シグナルを妨害し、かつそのシグナルを刺激性ＯＸ４０Ｌに置き換えることができる。したがって、本発明のキメラタンパク質は、いくつかの実施形態において、抑制性免疫シグナルの低減または消失、及び／または免疫刺激シグナルの増加または活性化が可能であるか、またはそれらに関与する方法に使用することができる。例えば、抑制シグナルを有する（かつ、それによって免疫応答を回避する）腫瘍細胞を、代わりにＴ細胞上の正のシグナルと結合させ、その結果、腫瘍細胞を攻撃することができる。したがって、いくつかの実施形態では、抑制性免疫シグナルが本発明の構築物によって遮断され、刺激性免疫シグナルが活性化される。本発明のキメラタンパク質の単一構築物手法は、そのような有益な特性を強化するものである。例えば、シグナルの置き換えをほぼ同時に生じさせることができ、かつシグナルの置き換えが臨床的に重要な部位（例えば、腫瘍の微小環境）に局在化するように調整される。さらなる実施形態は、例えば、主として、（ｉ）ＰＤ−１の細胞外ドメインと（ｉｉ）ＧＩＴＲＬの細胞外ドメイン；（ｉ）ＢＴＬＡの細胞外ドメインと（ｉｉ）ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン；（ｉ）ＴＩＧＩＴの細胞外ドメインと（ｉｉ）ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン；（ｉ）ＴＩＭ３の細胞外ドメインと（ｉｉ）ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン；及び（ｉ）ＣＤ１７２ａの細胞外ドメインと（ｉｉ）ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン；及び（ｉ）ＣＤ１１５の細胞外ドメインと（ｉｉ）ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン；ならびに（ｉ）ＴＩＭ３の細胞外ドメインと（ｉｉ）ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン；及び（ｉ）ＴＩＧＩＴの細胞外ドメインと（ｉｉ）ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインなどの他のキメラタンパク質構築物に同じ原則を適用している。
【００９１】
様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫刺激受容体／リガンド対の結合を刺激または増強することが可能であるか、またはそれを含む方法に使用される。例示的なＴ細胞共刺激受容体及びそのリガンドとしては、ＯＸ−４０：ＯＸ４０−Ｌ、ＣＤ２７：ＣＤ７０、ＣＤ３０：ＣＤ３０−Ｌ、ＣＤ４０：ＣＤ４０−Ｌ、ＣＤ１３７：ＣＤ１３７−Ｌ、ＨＶＥＭ：ＬｌＧＨＴ、ＧＩＴＲ：ＧＩＴＲ−Ｌ、ＴＮＦＲＳＦ２５：ＴＬ１Ａ、ＤＲ５：ＴＲＡＩＬ、及びＢＴＬＡ：ＨＶＥＭが挙げられる。様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、免疫抑制受容体／リガンド対の結合を阻害または低減することが可能であるか、またはそれを含む方法に使用される。例示的なＴ細胞共抑制受容体及びそのリガンドとしては、例えば、主として、ＣＴＬＡ−４：ＣＤ８０／ＣＤ８６、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２、ＢＴＬＡ：ＨＶＥＭ、ＴＩＭ−３：ガレクチン−９／ホスファチジルセリン、ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５またはＣＤ１１２、ＶＩＳＴＡ／ＶＳＩＧ８、ＣＤ１７２ａ／ＣＤ４７、Ｂ７Ｈ３Ｒ／Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４Ｒ／Ｂ７Ｈ４、ＣＤ２４４／ＣＤ４８、ＴＭＩＧＤ２／ＨＨＬＡ２が挙げられる。
【００９２】
様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ２、ならびに／またはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ２との結合を遮断、低減、及び／または阻害する。様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＣＴＬＡ−４の活性化、ならびに／またはＣＴＬＡ−４とＡＰ２Ｍ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＳＨＰ−２、及びＰＰＰ２Ｒ５Ａのうちの１つ以上との結合を遮断、低減、及び／または阻害する。様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＧＩＴＲ、及び／またはＧＩＴＲと１つ以上のＧＩＴＲリガンドとの結合を増加及び／または刺激する。様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＯＸ４０、及び／またはＯＸ４０と１つ以上のＯＸ４０リガンドとの結合を増加及び／または刺激する。
【００９３】
他の実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、免疫調節を増強、回復、促進及び／または刺激することが可能であるか、またはそれらに関与する方法に使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本発明のキメラタンパク質は、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔヘルパー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、抗腫瘍マクロファージ（例えば、Ｍ１マクロファージ）、Ｂ細胞、及び樹状細胞を含むが、それに限定されない、腫瘍細胞に対する１つ以上の免疫細胞の活性または活性化を回復、促進、及び／または刺激する。いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、Ｔ細胞の活性及び／または活性化を増強、回復、促進、及び／または刺激するが、これには、非限定的な例として、生存促進シグナル；オートクリン増殖シグナルもしくはパラクリン増殖シグナル；ｐ３８  ＭＡＰＫ−、ＥＲＫ−、ＳＴＡＴ−、ＪＡＫ−、ＡＫＴ−、もしくはＰＩ３Ｋ−媒介性シグナル；抗アポトーシスシグナル；ならびに／または炎症誘発性サイトカイン産生もしくはＴ細胞遊走もしくはＴ細胞腫瘍浸潤のうちの１つ以上を促進する、及び／もしくはそれに必要とされるシグナルを含む、１つ以上のＴ細胞固有のシグナルの活性化及び／または刺激を含む。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、Ｔ細胞（限定するものではないが、細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔヘルパー細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、樹状細胞、単球、及びマクロファージ（例えば、Ｍ１及びＭ２のうちの１種以上）のうちの１種以上の増加を腫瘍または腫瘍微小環境において引き起こすことが可能であるか、またはそれに関与する方法に使用される。いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、免疫抑制細胞（例えば、骨髄由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）、Ｍ２マクロファージ、及び腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）））の腫瘍及び／または腫瘍微小環境（ＴＭＥ）への動員の減少を阻害する及び／または引き起こすことが可能であるか、またはそれに関与する方法に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の治療法は、腫瘍部位及び／またはＴＭＥにおけるＭ１マクロファージ対Ｍ２マクロファージの比率をＭ１マクロファージに有利になるように変化させることができる。
【００９５】
様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、腫瘍に対するＴ細胞の不活性化及び／または免疫寛容を阻害及び／または低減することが可能であり、かつそれを含む方法に使用することができ、本明細書に記載の有効量のキメラタンパク質を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、及びＩＬ−２２のうちの１種以上を含むが、これらに限定されない様々なサイトカインの血清レベルを上昇させることができる。いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、治療対象の血清中のＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ＴＮＦα、またはＩＦＮγを増強させることできる（例えば、図１１のパネルＪを参照）。このようなサイトカイン応答の検出により、示されたキメラ融合タンパク質に最適な投与レジメンを決定する手段を得ることができる（例えば、図１１のパネルＫを参照）。
【００９６】
様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、抗腫瘍ＣＤ８＋  Ｔ細胞及び／またはＣＤ４＋  Ｔ細胞の細胞死を阻害、遮断、及び／または低減する；あるいは腫瘍促進Ｔ細胞の細胞死を刺激、誘発、及び／または増加させる。Ｔ細胞の枯渇は、最終的にクローン欠損に至る、増殖機能及びエフェクター機能の進行性消失を特徴とするＴ細胞の機能不全状態である。したがって、腫瘍促進Ｔ細胞とは、多くの慢性感染及び癌の罹患時に生じるＴ細胞の機能不全状態を指す。この機能不全は、増殖機能及び／またはエフェクター機能が不十分であり、抑制受容体が持続的に発現し、転写状態が機能エフェクターまたはメモリーＴ細胞のものとは異なることによって規定される。枯渇により、感染及び腫瘍の最適な制御が妨げられる。これに加えて、抗腫瘍ＣＤ８＋  Ｔ細胞及び／またはＣＤ４＋  Ｔ細胞とは、腫瘍に対して免疫応答を生じさせることができるＴ細胞を指す。例示的な腫瘍促進Ｔ細胞としては、Ｔｒｅｇ、１種以上のチェックポイント阻害受容体を発現するＣＤ４＋  Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞、Ｔｈ２細胞、ならびにＴｈ１７細胞が挙げられるが、これらに限定されない。チェックポイント阻害受容体とは、制御されない免疫応答を防止または阻害する、免疫細胞に発現する受容体（例えば、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＴＩＭ−３）を指す。
【００９７】
様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、制御性Ｔ細胞に対するエフェクターＴ細胞の比率を増加させることが可能であり、またそれを含む方法に使用することができる。例示的なエフェクターＴ細胞としては、ＩＣＯＳ＋エフェクターＴ細胞；細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、αβＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＯ＋）；ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞（例えば、αβＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＩＬ−７Ｒ／ＣＤ１２７＋）；ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞（例えば、αβＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＩＬ−７Ｒ／ＣＤ１２７＋）；エフェクターメモリーＴ細胞（例えば、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ、ＣＤ４４＋、ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＩＬ−７Ｒ／ＣＤ１２７＋、ＩＬ−１５Ｒ＋、ＣＣＲ７ｌｏｗ）；セントラルメモリーＴ細胞（例えば、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２７＋；またはＣＣＲ７ｈｉ、ＣＤ４４＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＩＬ−７Ｒ／ＣＤ１２７＋、ＩＬ−１５Ｒ＋）；ＣＤ６２Ｌ＋エフェクターＴ細胞；初期エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ２７＋ＣＤ６２Ｌ−）及び後期エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ２７−ＣＤ６２Ｌ−）（それぞれＴｅｍＥ及びＴｅｍＬ）を含む、ＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）；ＣＤ１２７（＋）ＣＤ２５（ｌｏｗ／−）エフェクターＴ細胞；ＣＤ１２７（−）ＣＤ２５（−）エフェクターＴ細胞；ＣＤ８＋幹細胞メモリーエフェクター細胞（ＴＳＣＭ）（例えば、ＣＤ４４（ｌｏｗ）ＣＤ６２Ｌ（ｈｉｇｈ）ＣＤ１２２（ｈｉｇｈ）ｓｃａ（＋））；ＴＨ１エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＸＣＲ３＋、ＣＸＣＲ６＋、及びＣＣＲ５＋；またはαβＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＬ−１２Ｒ＋、ＩＦＮγＲ＋、ＣＸＣＲ３＋）、ＴＨ２エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＣＲ３＋、ＣＣＲ４＋、及びＣＣＲ８＋；またはαβＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＬ−４Ｒ＋、ＩＬ−３３Ｒ＋、ＣＣＲ４＋、ＩＬ−１７ＲＢ＋、ＣＲＴＨ２＋）；ＴＨ９エフェクターＴ細胞（例えば、αβＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋）；ＴＨ１７エフェクターＴ細胞（例えば、αβＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＬ−２３Ｒ＋、ＣＣＲ６＋、ＩＬ−１Ｒ＋）；ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋エフェクターＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７（−）エフェクターＴ細胞；ならびにＩＬ−２、ＩＬ−４、及び／またはＩＦＮ−γを分泌するエフェクターＴ細胞が挙げられる。例示的な制御性Ｔ細胞としては、ＩＣＯＳ＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５−制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ制御性Ｔ細胞、ＴＩＭ−３＋ＰＤ−１＋制御性Ｔ細胞、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）＋制御性Ｔ細胞、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ１５２＋制御性Ｔ細胞、ニューロピリン１（Ｎｒｐ−１）＋制御性Ｔ細胞、ＣＣＲ４＋ＣＣＲ８＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ−セレクチン）＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＢｌｏｗ制御性Ｔ細胞、ＣＤ１２７ｌｏｗ制御性Ｔ細胞、ＬＲＲＣ３２／ＧＡＲＰ＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ３９＋制御性Ｔ細胞、ＧＩＴＲ＋制御性Ｔ細胞、ＬＡＰ＋制御性Ｔ細胞、１Ｂ１１＋制御性Ｔ細胞、���ＴＬＡ＋制御性Ｔ細胞、１型制御性Ｔ細胞（Ｔｒ１細胞）、Ｔヘルパー３型（Ｔｈ３）細胞、ナチュラルキラーＴ細胞表現型の制御性細胞（ＮＫＴｒｅｇ）、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ２８−制御性Ｔ細胞、ならびに／またはＩＬ−１０、ＩＬ−３５、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ガレクチン１、ＩＦＮ−γ、及び／もしくはＭＣＰ１を分泌する制御性Ｔ細胞が挙げられる。
【００９８】
様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、エフェクターＴ細胞を約１２時間以下、約２４時間以下、約４８時間以下、約７２時間以下、または約９６時間以下、または約１週間以下、または約２週間以下の間、一過性に刺激することが可能であり、またそれを含む方法に使用することができる。様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、制御性Ｔ細胞を約１２時間以下、約２４時間以下、約４８時間以下、約７２時間以下、または約９６時間以下、または約１週間以下、または約２週間以下の間、一過性に枯渇させるまたは阻害することが可能であり、またそれを含む方法に使用することができる。様々な実施形態において、エフェクターＴ細胞の一過性刺激及び／または制御性Ｔ細胞の一過性枯渇または阻害は実質的に、患者の血流中、または例えば、骨髄、リンパ節、脾臓、胸腺、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）などのリンパ系組織、非リンパ組織を含む特定の組織／位置、または腫瘍の微小環境に存在する。
【００９９】
様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、使いやすさ及び作製しやすさを含むが、それに限定されない利点をもたらす。これは、２種類の免疫療法剤が単一の製品に複合化されていることで、２つの独立した製造工程ではなく、製造工程の単一化が可能になるためである。加えて、２つの個別の薬剤ではなく単一の薬剤を投与することにより、投与が容易になり、患者のコンプライアンスが向上する。さらに、例えば、多数のジスルフィド結合、及びグリコシル化などの翻訳後修飾を含む大きな多量体タンパク質であるモノクローナル抗体とは対照的に、本発明のキメラタンパク質は製造が容易であり、製造時の費用対効果が高い。
【０１００】
様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、哺乳動物宿主細胞において、分泌可能かつ完全に機能する単一ポリペプチド鎖として産生可能である（例えば、図１３のパネルＡ、図１７のパネルＥ〜Ｈ、図１７のパネルＮ〜Ｓを参照）。
【０１０１】
様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は予想外に、解離速度（ＫｄまたはＫｏｆｆ）の遅い、細胞外ドメイン成分とその対応する結合パートナーとの結合をもたらす。いくつかの実施形態では、これは、予想外に長い、受容体のリガンドに対する相互作用、及びリガンドの受容体に対する相互作用をもたらす。そのような効果は、持続的な負のシグナルの遮断効果を可能にする（例えば、図１４、図１７のパネルＩ〜Ｍを参照）。さらに、いくつかの実施形態では、これは、例えば、エフェクター細胞が抗腫瘍効果を十分に刺激できるように、正のシグナル効果を延長させる。例えば、本発明のキメラタンパク質は、例えば、解離速度が長い結合によって、Ｔ細胞増殖をもたらし、抗腫瘍攻撃を可能にするのに十分なシグナル伝達を可能にする。さらなる例として、本発明のキメラタンパク質は、例えば、解離速度が長い結合によって、例えばまたサイトカインなどの刺激シグナルを放出させるのに十分なシグナル伝達を可能にする。本発明の薬剤が促進する、細胞（例えば、負のシグナルを有する腫瘍細胞及び腫瘍を攻撃できるＴ細胞）の安定したシナプスにより、腫瘍細胞を攻撃するようにＴ細胞を配置する、及び／または本発明のキメラタンパク質によって遮断されるもの以外の負のシグナルを含めた、腫瘍細胞による負のシグナルの送達を立体的に防止するなどの、腫瘍の縮小に有利となる空間方向が得られる。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、これは、キメラタンパク質の血清ｔ１／２よりもオンターゲットでの（例えば、腫瘍内の）半減期（ｔ１／２）を長くする。そのような特性は、キメラタンパク質の全身分布に付随するオフターゲット毒性を減少させるという利点を併せ持つことができる（例えば、図１４のパネルＭ〜Ｏを参照）。
【０１０３】
さらに、様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、２つの免疫療法剤の部位特異的相互作用の改善を可能にするような相乗的治療効果を与える。いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、離れた部位及び／または全身の毒性を低減する可能性を提供する。
【０１０４】
疾患；治療方法及び患者選択
様々な実施形態において、本発明は、癌及び／または腫瘍に関し、例えば、癌及び／または腫瘍の治療または予防に関する。本明細書で別記するように、癌の治療は、様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質を用いて免疫抑制よりも免疫刺激を有利にするように免疫系を調節することを含み得る。
【０１０５】
癌または腫瘍とは、身体器官及び身体系の正常な機能を妨害する、細胞の制御されない増殖及び／または異常な細胞生存の増加及び／またはアポトーシスの阻害を指す。良性及び悪性の癌、ポリープ、過形成、ならびに休眠腫瘍または微小転移巣が含まれる。また、免疫系によって阻害されない異常な増殖を有する細胞（例えば、ウイルス感染細胞）も含まれる。癌は、原発癌または転移癌であり得る。原発癌は、臨床的に検出可能となる原発部位の癌細胞の領域であり得、また原発腫瘍であり得る。対照的に、転移癌は、ある器官または部分から別の非隣接器官または部分への疾患の拡散であり得る。転移癌は、局所領域周辺の正常組織を透過して浸潤する能力を獲得し、局所転移となり得る新しい腫瘍を形成する癌細胞によって引き起こされ得る。癌はまた、リンパ壁及び／または血管壁を透過する能力を獲得する癌細胞によって引き起こされる場合があり、その後、癌細胞は、血流を通って身体の他の部位及び組織へと循環することができる（それによって循環腫瘍細胞となる）。癌は、リンパまたは血液による拡散などの過程に起因するものであり得る。癌はまた、別の部位で休止し、血管または壁を再透過して、増殖し続け、最終的に臨床的に検出可能な別の腫瘍を形成する腫瘍細胞によって引き起こされ得る。癌はこの新しい腫瘍であり得、それは転移（または二次）腫瘍であり得る。
【０１０６】
癌は、転移した腫瘍によって引き起こされる場合があり、それは二次腫瘍または転移腫瘍であり得る。腫瘍の細胞は、原発腫瘍のものと同様であり得る。一例として、乳癌または結腸癌が肝臓に転移した場合、二次腫瘍は、肝臓に存在するが、異常な肝細胞ではなく、異常な乳細胞または結腸細胞から構成される。したがって、肝臓にある腫瘍は、転移乳癌または転移結腸癌であり、肝臓癌ではない場合がある。
【０１０７】
癌は、任意の組織に由来し得る。癌は、黒色腫、結腸、乳房、または前立腺に由来する場合があり、それゆえ本来はそれぞれ皮膚、結腸、乳房、または前立腺であった細胞から構成され得る。癌はまた血液悪性腫瘍であり得るが、それは白血病またはリンパ腫であり得る。癌は、肝臓、肺、膀胱、または腸などの組織に侵入する場合がある。
【０１０８】
本発明の代表的な癌及び／または腫瘍としては、基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脳及び中枢神経系の癌；乳癌；腹膜の癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸及び直腸癌；結合組織癌；消化器系の癌；子宮内膜癌；食道癌；眼癌；頭頸部の癌；胃癌（胃腸癌を含む）；神経膠芽細胞腫；肝癌；肝細胞癌；上皮内腫瘍；腎臓（ｋｉｄｎｅｙまたはｒｅｎａｌ）癌；喉頭癌；白血病；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌）；黒色腫；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔癌（口唇、舌、口、及び咽頭）；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸癌；呼吸器系の癌；唾液腺癌；肉腫；皮膚癌；扁平上皮細胞癌；胃癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮癌または子宮内膜癌；泌尿器系の癌；外陰部癌；ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、ならびにＢ細胞リンパ腫を含むリンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；及びワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；ならびに他の癌腫及び肉腫；及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、及びメイグス症候群に関連する異常な血管増殖が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、治療抵抗性癌を有する対象の治療に使用される。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、１種以上の免疫調節剤に抵抗性である対象の治療に使用される。例えば、いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、１２週間程度の治療後に、治療に対する反応を示さないか、または進行さえしない対象の治療に使用される。例えば、いくつかの実施形態では、対象は、ＰＤ−１及び／またはＰＤ−Ｌ１及び／またはＰＤ−Ｌ２薬剤に抵抗性であり、例えば、ニボルマブ（ＯＮＯ−４５３８／ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＯＰＤＩＶＯ、ＢＲＩＳＴＯＬ  ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ、ＭＥＲＣＫ）、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１、ＣＵＲＥ  ＴＥＣＨ）、ＭＫ−３４７５（ＭＥＲＣＫ）、ＢＭＳ９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬ  ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、イブルチニブ（ＰＨＡＲＭＡＣＹＣＬＩＣＳ／ＡＢＢＶＩＥ）、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ、ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）、及び／またはＭＰＤＬ３２８ＯＡ（ＲＯＣＨＥ）抵抗性患者を含む。例えば、いくつかの実施形態では、対象は、抗ＣＴＬＡ−４薬剤に抵抗性であり、例えばイピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ）抵抗性患者（例えば、黒色腫患者）である。したがって、様々な実施形態において、本発明は、１種以上の免疫調節剤の単独療法を含む、様々な療法に不応性である患者を救う癌治療の方法を提供する。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、本明細書に記載の様々な化学療法剤を包含するが、これに限定されない、本明細書で別記する「追加薬剤」などの追加薬剤に抵抗性である患者に本キメラタンパク質による治療を提供する。
【０１１１】
いくつかの態様では、本発明のキメラ薬剤は、細胞内病原を消失させるために使用される。いくつかの態様では、本発明のキメラ薬剤は、１種以上の感染症の治療に使用される。いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ウイルス感染症（例えば、ＨＩＶ及びＨＣＶを含む）、寄生虫感染症（例えば、マラリアを含む）、及び細菌感染症の治療方法に使用される。様々な実施形態において、感染症は免疫抑制を誘導する。例えば、ＨＩＶ感染症は、感染した対象に免疫抑制をもたらす場合が多い。したがって、本明細書で別記するように、そのような感染症の治療は、様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質を用いて免疫抑制よりも免疫刺激を有利にするように免疫系を調節することを含み得る。あるいは、本発明は、免疫活性化を誘導する感染症の治療方法を提供する。例えば、腸管蠕虫感染症は慢性免疫活性化と関連している。これらの実施形態では、そのような感染症の治療は、本発明のキメラタンパク質を用いて免疫刺激よりも免疫抑制を有利にするように免疫系を調節することを含み得る。
【０１１２】
様々な実施形態において、本発明は、例えば気道の急性または慢性ウイルス感染症、パピローマウイルス感染症、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染症、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、及び肝炎ウイルス感染症などの内臓器官のウイルス感染症を含むが、これらに限定されないウイルス感染症の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、ウイルス感染症は、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスは、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、及びＣ型肝炎ウイルスから選択される。他の実施形態では、ウイルス感染症は、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス、例えばポリオウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルスによって引き起こされる。他の実施形態では、ウイルス感染症は、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅのメンバー、例えばインフルエンザウイルスによって引き起こされる。他の実施形態では、ウイルス感染症は、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅのメンバー、例えばレンチウイルスによって引き起こされる。他の実施形態では、ウイルス感染症は、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅのメンバー、例えば呼吸器合胞体ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、ルブラウイルス（例えば、ムンプスウイルス）、麻疹ウイルス、及びヒトメタニューモウイルスによって引き起こされる。他の実施形態では、ウイルス感染症は、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅのメンバー、例えばハンタウイルスによって引き起こされる。他の実施形態では、ウイルス感染症は、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅのメンバー、例えばロタウイルスによって引き起こされる。
【０１１３】
様々な実施形態において、本発明は、原虫感染症または蠕虫感染症などの寄生虫感染症の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、寄生虫感染症は、寄生原虫によるものである。いくつかの実施形態では、ｏｒｉｔｉｚｉａｂ寄生虫は、消化管内原虫、組織寄生原虫、または血液内原虫から選択される。例示的な寄生原虫としては、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｙｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｍｕｒｉｓ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａ  ｇａｍｂｉｅｎｓｅ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａ  ｃｒｕｓｉ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、及びＨｉｓｔｏｍｏｎａｓ  ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、寄生虫感染症は、線虫（例えば、Ａｄｅｎｏｐｈｏｒｅａ）などの寄生蠕虫によるものである。いくつかの実施形態では、寄生虫は、Ｓｅｃｅｍｅｎｔｅａ（例えば、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｔｒｉｃｈｉｕｒａ、Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ  ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｅ、Ｎｅｃａｔｏｒ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ、Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ、Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ  ｍｅｄｉｎｅｎｓｉｓ）から選択される。いくつかの実施形態では、寄生虫は、吸虫（例えば、住血吸虫、肝吸虫、腸内吸虫、及び肺吸虫）から選択される。いくつかの実施形態では、寄生虫は、以下から選択される：Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ、Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｇｉｇａｎｔｉｃａ、Ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｅｓ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｅｓ、Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ  ｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ。いくつかの実施形態では、寄生虫は、条虫（例えば、Ｔａｅｎｉａ  ｓｏｌｉｕｍ、Ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ、Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ  ｎａｎａ、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ）から選択される。
【０１１４】
様々な実施形態において、本発明は、細菌感染症の治療方法を提供する。様々な実施形態において、細菌感染症は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、好気性細菌、及び／または嫌気性細菌である。様々な実施形態において、細菌は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｒｃｉｎａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｉｓｓｅｒｉａ、Ｂａｃｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、及び他の生物体から選択されるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細菌は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｔｕａｒｔｉｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉ���ｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｋｉｎｇｅｌｌａ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ３４５２Ａ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｇｒｏｕｐ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｅｇｇｅｒｔｈｉｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｈｙｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ、またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓから選択されるが、これらに限定されない。
【０１１５】
いくつかの態様では、本発明のキメラ薬剤は、１種以上の自己免疫疾患または自己免疫障害の治療に使用される。様々な実施形態においては、自己免疫疾患または自己免疫障害の治療は、本発明のキメラタンパク質を用いて免疫刺激よりも免疫抑制を有利にするように免疫系を調節することを含み得る。本発明のキメラタンパク質を用いて治療可能な例示的な自己免疫疾患または自己免疫障害には、例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、真性糖尿病、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病）、多発性硬化症、サルコイドーシス、乾癬、グレーブス病、橋本甲状腺炎、乾癬、過敏症反応（例えばアレルギー、花粉症、ぜんそく、及び急性浮腫はＩ型過敏反応を引き起こす）、及び血管炎などの、身体自身の抗原が免疫応答を標的にするものを含む。
【０１１６】
さらに別の他の態様では、本発明は、限定するものではないが、本明細書で別記する疾患または障害、炎症性疾患または障害、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植拒絶反応、及びＴ細胞増殖障害などの、Ｔ細胞媒介性疾患及び障害の治療及び予防方法を目的とする。この方法の使用に有用なＩ型ＥＣＤドメインの具体例としては、主にＴＮＦＲＳＦ１ｂ、ＢＴＮＬ２、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ１３７が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
いくつかの態様では、本発明のキメラ薬剤は、例えば免疫刺激シグナルを有する細胞外ドメインによってＴ細胞を活性化する方法に使用される。
【０１１８】
いくつかの態様では、本発明のキメラ薬剤は、免疫抑制シグナルの細胞透過を防止する方法に使用される。
【０１１９】
併用療法及びコンジュゲート
いくつかの実施形態では、本発明は、キメラタンパク質、及び追加薬剤を対象に投与することをさらに含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、共投与及び／または共製剤化に関する。本明細書に記載のいずれの組成物も、共製剤化及び／または共投与することができる。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のいずれのキメラタンパク質も、別の薬剤と共投与された場合に相乗的に作用し、そのような薬剤が単独療法として使用される場合に通常使用される用量よりも低い用量で投与される。様々な実施形態において、本明細書で参照する任意の薬剤を、本明細書に記載のキメラタンパク質のいずれかと併用することができる。
【０１２１】
限定するものではないが、癌用途を含むいくつかの実施形態では、本発明は、追加薬剤としての化学療法剤に関する。化学療法剤の例としては、限定するものではないが、チオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮシクロスホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドパ、カルボコン、メトレドパ、及びウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホルアミド、及びトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミン及びメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（例えば、ブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン合成類似体、カルゼレシン合成類似体、及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（例えば、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンなどのニトロソウレア；エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマＩＩ及びカリケアマイシンオメガＩＩ（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）を参照）などの抗生物質；ジネマイシンＡを含むジネマイシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラマイシン；ならびにネオカルチノスタチン発色団及び関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎ）、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン（ｃａｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；ミノグルテチミド（ｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈｉｍｉｄｅ）、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎薬；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの葉酸補充剤（ｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシン及びアンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ）などのマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（例えば、Ｔ−２毒素、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡ、及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬパクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、パクリタキセルのＡＢＲＡＸＡＮＥクレモフォール非含有アルブミン組換えナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，１１１．）、及びＴＡＸＯＴＥＲＥドセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン、及びカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ．ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプ���リン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（カンプトサール、ＣＰＴ−１１）（５−ＦＵ及びロイコボリンを含むイリノテカンの治療レジメンを含む）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン治療レジメン（ＦＯＬＦＯＸ）を含むオキサリプラチン；ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ）；細胞増殖を減少させるＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ（例えば、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ））、及びＶＥＧＦ−Ａの阻害剤；ならびに上記いずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。加えて、治療方法には放射線の使用をさらに含めることができる。加えて、治療方法には光線力学療法の使用をさらに含めることができる。
【０１２２】
限定するものではないが、癌用途を含む、様々な実施形態において、本発明の追加薬剤は、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ２、及び／またはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ２との結合を遮断、低減、及び／または阻害する薬剤（非限定的な例として、ニボルマブ（ＯＮＯ−４５３８／ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＯＰＤＩＶＯ、ＢＲＩＳＴＯＬ  ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ、Ｍｅｒｃｋ）、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１、ＣＵＲＥ  ＴＥＣＨ）、ＭＫ−３４７５（ＭＥＲＣＫ）、ＢＭＳ９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬ  ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ、ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）、ＭＰＤＬ３２８ＯＡ（ＲＯＣＨＥ）のうちの１種以上）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、及び／またはＣＤ１３７（４−１ＢＢ）と１つ以上の４−１ＢＢリガンドとの結合を増加及び／または刺激する薬剤（非限定的な例として、ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３及び抗４−１ＢＢ抗体）、ならびにＣＴＬＡ−４の活性化、及び／またはＣＴＬＡ−４とＡＰ２Ｍ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＳＨＰ−２、及びＰＰＰ２Ｒ５Ａのうちの１つ以上との結合、及び／またはＯＸ４０とＯＸ４０Ｌとの結合を遮断、低減、及び／または阻害する薬剤（非限定的な例として、ＧＢＲ  ８３０（ＧＬＥＮＭＡＲＫ）、ＭＥＤＩ６４６９（ＭＥＤＩＭＭＵＮＥ））から選択される１種以上の免疫調節剤である。
【０１２３】
限定するものではないが、感染性疾患用途を含むいくつかの実施形態では、本発明は、追加薬剤としての抗感染薬に関する。いくつかの実施形態では、抗感染薬は、アバカビル、アシクロビル、アデホビル、アンプレナビル、アタザナビル、シドフォビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エファビレンツ、エルビテグラビル、エムトリシタビン、エンフビルチド、エトラビリン、ファムシクロビル、及びホスカネットを含むが、これらに限定されない抗ウイルス剤である。いくつかの実施形態では、抗感染薬は、セファロスポリン抗生物質（セファレキシン、セフロキシム、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、及びセフトビプロール）；フルオロキノロン抗生物質（シプロ、レバクイン、フロキシン、テクイン、アベロックス、及びノルフロックス）；テトラサイクリン抗生物質（テトラサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、及びドキシサイクリン）；ペニシリン抗生物質（アモキシシリン、アンピシリン、ペニシリンＶ、ジクロキサシリン、カルベニシリン、バンコマイシン、及びメチシリン）；モノバクタム抗生物質（アズトレオナム）；及びカルバペネム抗生物質（エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、及びメロペネム）を含むが、これらに限定されない抗菌薬である。いくつかの実施形態では、抗感染薬には、抗マラリア剤（例えば、クロロキン、キニーネ、メフロキン、プリマキン、ドキシサイクリン、アルテメテル／ルメファントリン、アトバコン／プログアニル、及びスルファドキシン／ピリメタミン）、メトロニダゾール、チニダゾール、イベルメクチン、パモ酸ピランテル、及びアルベンダゾールを含む。
【０１２４】
限定するものではないが、自己免疫用途を含む、いくつかの実施形態では、追加薬剤は免疫抑制剤である。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤は、ステロイド性抗炎症剤または非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）などの抗炎症剤である。ステロイド、特に副腎皮質ステロイド及びそれらの合成類似体は、当技術分野で周知されている。本発明に有用なコルチコステロイドの例としては、限定するものではないが、ヒドロキシルトリアムシノロン、アルファ−メチルデキサメタゾン、ベータ−メチルベタメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、安息香酸ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、吉草酸クロベタゾール、デソニド、デスオキシメタゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾンジアセテート、吉草酸ジフルコルトロン、フルアドレノロン（ｆｌｕａｄｒｅｎｏｌｏｎｅ）、フルクロロロンアセトニド、ピバル酸フルメタゾン、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルコルチンブチルエステル、フルオコルトロン、フルプレドニデン（フルプレドニリデン）アセテートフルランドレノロン、ハルシノニド、ヒドロコルチゾンアセテート、ヒドロコルチゾンブチレート、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、コルチゾン、コルトドキソン、フルセトニド、フルドロコルチゾン、ジフルオロゾンジアセテート、フルラドレノロンアセトニド、メドリゾン、アムシナフェル、アムシナフィド、ベタメタゾン及びそのエステルの残部、クロロプレドニゾン、クロコルテロン、クレシノロン（ｃｌｅｓｃｉｎｏｌｏｎｅ）、ジクロリゾン、ジフルプレドネート、フルクロロニド、フルニソリド、フルオロメタロン、フルペロロン、フルプレドニソロン、ヒドロコルチゾン、メプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾンが挙げられる。本発明に使用することができる（ＮＳＡＩＤ）としては、サリチル酸、アセチルサリチル酸、サリチル酸メチル、サリチル酸グリコール、サリチルアミド、ベンジル−２，５−ジアセトキシ安息香酸、イブプロフェン、フルリンダク（ｆｕｌｉｎｄａｃ）、ナプロキセン、ケトプロフェン、エトフェナメート、フェニルブタゾン、及びインドメタシンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤は、アルキル化剤、代謝拮抗物質（例えば、アザチオプリン、メトトレキサート）、細胞傷害性抗生物質、抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ、及びムロモナブ）、抗イムノフィリン（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス）、インターフェロン、オピオイド、ＴＮＦ結合タンパク質、ミコフェノレート、及び小生物薬剤（例えば、フィンゴリモド、ミリオシン）などの細胞増殖抑制剤であり得る。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のキメラタンパク質（及び／または追加薬剤）には、修飾された誘導体、すなわち、共有結合が組成物の活性を妨げないように、任意の種類の分子を組成物に共有結合することによる誘導体を含む。例えば、限定するものではないが、誘導体には、特にグリコシル化、脂質化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質との連結などにより修飾された組成物を含む。多数の化学修飾のうちいずれかを、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツリカマイシン（ｔｕｒｉｃａｍｙｃｉｎ）の代謝合成などを含むが、これらに限定されない既知の技術によって実施することができる。さらに、誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含むことができる。さらに他の実施形態では、本明細書に記載のキメラタンパク質（及び／または追加薬剤）は、例示的実施形態において、毒素、化学療法剤、放射性同位体、及びアポトーシスまたは細胞死を引き起こす薬剤を含む細胞殺傷剤をさらに含む。そのような薬剤は、本明細書に記載の組成物にコンジュゲートすることができる。
【０１２６】
したがって、本明細書に記載のキメラタンパク質（及び／または追加薬剤）を翻訳後修飾して、化学的リンカーなどのエフェクター部分、例えば蛍光色素、酵素、基質、生物発光物質、放射性物質、及び化学発光部分などの検出可能部分、または、例えばストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、細胞毒素、細胞殺傷剤、及び放射性物質などの機能的部分を追加することができる。
【０１２７】
製剤化
本明細書に記載のキメラタンパク質（及び／または追加薬剤）は、無機酸もしくは有機酸と反応することができる十分な塩基性の官能基、または無機塩基もしくは有機塩基と反応することができるカルボキシル基を有し、薬学的に許容される塩を形成することができる。薬学的に許容される酸付加塩は、当技術分野で周知のように、薬学的に許容される酸から形成される。そのような塩として、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，２−１９（１９７７）及びＴｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ．Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｖｅｒｌａｇ，Ｚｕｒｉｃｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）２００２に列記されている薬学的に許容される塩が挙げられ、各文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、薬学的に許容される塩の形態である。
【０１２９】
さらに、本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／または追加薬剤）を、薬学的に許容される担体またはビヒクルを含む組成物の成分として対象に投与することができる。そのような組成物は、場合により、適切な投与のための形態を得るために、適切な量の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。医薬賦形剤は、水及び油などの液体であってよく、油には落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物、植物、または合成起源のものを含む。医薬賦形剤は、例えば、生理食塩水、アラビアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素などであり得る。加えて、補助剤、安定化剤、増粘剤、滑沢剤、及び着色剤を使用することができる。一実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、対象に投与する際に滅菌される。水は、本明細書に記載の任意の薬剤を静脈内投与する場合に有用な賦形剤である。生理食塩水ならびにデキストロース水溶液及びグリセロール水溶液もまた、液体賦形剤として、特に注射液用に使用することができる。好適な医薬賦形剤としては、また、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。本明細書に記載の任意の薬剤は、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むこともできる。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物を緩衝生理食塩水（ＴＢＳ、ＰＢＳなどを含むが、これらに限定されない）に再懸濁する。
【０１３１】
様々な実施形態において、キメラタンパク質は、半減期を延長するため、またはそれ以外の薬力学的特性及び薬物動態特性を改善するために、別の薬剤とコンジュゲート及び／または融合することができる。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、ＰＥＧ、ＸＴＥＮ（例えば、ｒＰＥＧとして）、ポリシアル酸（ＰＯＬＹＸＥＮ）、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミンまたはＨＡＳ）、エラスチン様タンパク質（ＥＬＰ）、ＰＡＳ、ＨＡＰ、ＧＬＫ、ＣＴＰ、トランスフェリンなどのうち１つ以上と融合またはコンジュゲートすることができる。様々な実施形態において、個々のキメラタンパク質のそれぞれが、ＢｉｏＤｒｕｇｓ（２０１５）２９：２１５−２３９（内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載された１つ以上の薬剤と融合される。
【０１３２】
投与、用量、及び治療レジメン
本発明は、記載されたキメラタンパク質（及び／または追加薬剤）を様々な製剤に含む。本明細書に記載のいずれのキメラタンパク質（及び／または追加薬剤）も、溶液、懸濁液、乳濁液、滴剤、錠剤、丸薬、ペレット、カプセル、液体を含有するカプセル、散剤、徐放性製剤、坐剤、乳濁液、エアゾール、スプレー、懸濁液の形態、または使用に適した他の任意の形態をとることができる。タンパク質配列をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ構築物もまた使用することができる。一実施形態では、組成物はカプセルの形態である（例えば、米国特許第５，６９８，１５５号を参照）。好適な医薬賦形剤の他の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １４４７−１６７６（Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄｓ．，１９ｔｈ  ｅｄ．１９９５）に記載されており、それは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３３】
必要に応じて、キメラタンパク質（及び／または追加薬剤）を含む製剤はまた、可溶化剤を含むことができる。また、当技術分野で既知の好適なビヒクルまたは送達デバイスを用いて薬剤を送達することができる。本明細書で概説した併用療法は、単一の送達ビヒクルまたは送達デバイスで同時送達することができる。投与される組成物は、場合により、注射部位での痛みを軽減するために、例えばリグノカインなどの局所麻酔薬を含むことができる。
【０１３４】
本発明のキメラタンパク質（及び／または追加薬剤）を含む製剤は、単位剤形で提供するのが好都合であり、薬学分野で周知の方法のいずれかによって調製することができる。そのような方法は一般に、１つ以上の補助成分を構成する担体と治療薬を混合状態にする工程を含む。通常は、液体担体、微粉化固体担体、またはその両方と治療薬を均一かつ緊密な混合状態にし、次いで、必要に応じて、所望する製剤の剤形に製品を成形することにより製剤を調製する（例えば、湿式造粒または乾式造粒、粉末ブレンドなどに続いて当技術分野で既知の従来方法を用いて錠剤化する）。
【０１３５】
一実施形態では、本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／または追加薬剤）を、通常の手順に従って、本明細書に記載の投与様式に適合させた組成物として製剤化することができる。
【０１３６】
投与経路は、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、鼻腔内、脳内、膣内、経皮、直腸、吸入、または特に耳、鼻、目、もしくは皮膚といった局所を含む。いくつかの実施形態では、投与は、経口的に、または非経口注射によって行われる。ほとんどの場合、投与により、本明細書に記載の任意の薬剤が血流へと放出される。
【０１３７】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／または追加薬剤）は経口投与することができる。そのようなキメラタンパク質（及び／または追加薬剤）はまた、他の任意の好都合な経路、例えば、静脈内注入またはボーラス注射によって、上皮内層または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜、及び腸粘膜など）からの吸収によって投与することもでき、また別の生物学的に活性な薬剤とともに投与することもできる。投与は全身でも局所でもあり得る。様々な送達系、例えば、リポソーム、微小粒子、マイクロカプセル、カプセルなどへの封入が知られており、これを投与に使用することができる。
【０１３８】
特定の実施形態では、治療を必要とする領域に局所的に投与することが望ましい場合がある。一実施形態では、癌を治療する場合に、キメラタンパク質（及び／または追加薬剤）は、腫瘍微小環境（例えば、腫瘍細胞を取り囲む及び／または摂食する細胞、分子、細胞外マトリックス、及び／または血管、例えば、腫瘍脈管構造；腫瘍浸潤リンパ球；細網線維芽細胞；内皮前駆細胞（ＥＰＣ）；癌関連線維芽細胞；周皮細胞；他の間質細胞；細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分；樹状細胞；抗原提示細胞；Ｔ細胞；制御性Ｔ細胞；マクロファージ；好中球；及び腫瘍に局在的に近位する他の免疫細胞を含む）、またはリンパ節に投与され、かつ／または腫瘍微小環境またはリンパ節を標的とする。様々な実施形態において、癌を治療する場合に、本キメラタンパク質（及び／または追加薬剤）は腫瘍内に投与される。
【０１３９】
様々な実施形態において、本発明のキメラタンパク質は二相性効果を可能にし、従来の免疫療法（例えば、ＯＰＤＩＶＯ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ、ＹＥＲＶＯＹ、及びＴＥＣＥＮＴＲＩＱのうちの１種以上による治療）に見られるよりも副作用を軽減する。例えば、本発明のキメラタンパク質は、皮膚、消化管、腎臓、末梢神経系及び中枢神経系、肝臓、リンパ節、眼、膵臓を含む様々な組織及び器官、ならびに内分泌系に影響する、一般に観察される免疫関連有害事象、例えば脳下垂体炎、大腸炎、肝炎、肺炎、発疹、及びリウマチ性疾患を軽減または予防する。さらに、本発明の局所投与、例えば腫瘍内投与は、従来の免疫療法（例えば、ＯＰＤＩＶＯ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ、ＹＥＲＶＯＹ、及びＴＥＣＥＮＴＲＩＱのうちの１種以上による治療）で使用されるような標準的な全身投与、例えばＩＶ注入で見られる有害事象を未然に防ぐ。
【０１４０】
非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、及び関節内注射及び注入）に適した剤形としては、例えば、溶液、懸濁液、分散液、乳濁液などが挙げられる。それらはまた、使用直前に滅菌注射用媒体に溶解または懸濁させることができる滅菌固体組成物（例えば、凍結乾燥組成物）の形態で製造することもできる。それには、例えば、当技術分野で既知の懸濁液または分散液を含み得る。
【０１４１】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／または追加薬剤）の投与量ならびに投与計画は、限定するものではないが、治療される疾患、対象の全身健康状態、及び投与する医師の裁量を含む、様々なパラメーターによって決定することができる。本明細書に記載の任意のキメラタンパク質は、追加薬剤の投与前（例えば、５分前、１５分前、３０分前、４５分前、１時間前、２時間前、４時間前、６時間前、１２時間前、２４時間前、４８時間前、７２時間前、９６時間前、１週間前、２週間前、３週間前、４週間前、５週間前、６週間、８週間前、または１２週間前）、投与と同時、または投与に続いて（例えば、５分後、１５分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、８週間後、または１２週間後）、それを必要とする対象に投与することができる。様々な実施形態において、本明細書に記載の任意のキメラタンパク質及び追加薬剤は、１分間隔、１０分間隔、３０分間隔、１時間間隔未満、１時間間隔、１時間〜２時間間隔、２時間〜３時間間隔、３時間〜４時間間隔、４時間〜５時間間隔、５時間〜６時間間隔、６時間〜７時間間隔、７時間〜８時間間隔、８時間〜９時間間隔、９時間〜１０時間間隔、１０時間〜１１時間間隔、１１時間〜１２時間間隔、２４時間間隔以下、４８時間間隔以下で投与される。
【０１４２】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／または追加薬剤）の投与量は、病態の重度、病態の治療であるか予防であるか、ならびに治療される対象の年齢、体重、及び健康状態を含む複数の要因によって決定することができる。さらに、特定の対象に関する薬理ゲノミクス情報（遺伝子型が治療の薬物動態、薬力学、または有効性プロファイルに及ぼす影響）が、使用される投与量に影響を及ぼす場合がある。さらに、正確な個々の投与量は、投与される薬剤の具体的な組み合わせ、投与時間、投与経路、製剤の性質、排泄速度、治療される具体的な疾患、障害の重度、及び障害の解剖学的位置を含む、様々な要因に応じて、ある程度調節することができる。投与量のある程度の変動を予測することができる。
【０１４３】
非経口注射による本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／または追加薬剤）の投与の場合、投与量は通常、１日あたり０．１ｍｇ〜２５０ｍｇ、１日あたり１ｍｇ〜２０ｍｇ、または１日あたり３ｍｇ〜５ｍｇである。注射は１日４回まで行うことができる。一般に、経口投与または非経口投与の場合、本明細書に記載の任意の薬剤の投与量は通常、１日あたり０．１ｍｇ〜１５００ｍｇ、または１日あたり０．５ｍｇ〜１０ｍｇ、または０．５ｍｇ〜５ｍｇである。１日あたり最大３０００ｍｇの投与量を投与することができる。
【０１４４】
別の実施形態では、小胞、特にリポソーム中で送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３；Ｔｒｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）を参照）。
【０１４５】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／または追加薬剤）は、制御放出手段もしくは持続放出手段によって、または当業者に周知の送達デバイスによって投与することができる。例として、限定するものではないが、米国特許第３，８４５，７７０号；同第３，９１６，８９９号；同第３，５３６，８０９号；同第３，５９８，１２３号；同第４，００８，７１９号；同第５，６７４，５３３号；同第５，０５９，５９５号；同第５，５９１，７６７号；同第５，１２０，５４８号；同第５，０７３，５４３号；同第５，６３９，４７６号；同第５，３５４，５５６号；及び同第５，７３３，５５６号に記載のものが挙げられ、それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる。そのような剤形は、例えば、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、浸透膜、浸透圧システム、多層コーティング、微小粒子、リポソーム、ミクロスフィア、またはそれらの組み合わせを使用して、１種以上の活性成分の制御放出または持続放出をもたらし、様々な比率で所望の放出プロファイルを得るのに有用であり得る。活性成分の制御放出または持続放出は、ｐＨの変化、温度の変化、適切な波長の光による刺激、酵素の濃度または供給量、水の濃度または供給量、または他の生理学的条件もしくは生理化合物を含むが、これらに限定されない様々な条件によって刺激することができる。
【０１４６】
別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ  （ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照；また、Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５を参照）。
【０１４７】
別の実施形態では、制御放出系を、治療すべき標的領域の近傍に配置することができ、したがって全身用量のほんの一部しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ（前掲），ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）を参照）。Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３）による概説で考察されている他の制御放出系を使用することができる。
【０１４８】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／または追加薬剤）の投与は独立して、１日に１〜４回、または１か月に１〜４回、または１年に１〜６回、または２年、３年、４年、もしくは５年に１回であり得る。投与は、１日または１か月、２か月、３か月、６か月、１年、２年、３年の期間にわたってもよく、さらには対象の生涯にわたってもよい。
【０１４９】
本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／または追加薬剤）を利用する投与レジメンを、対象の体型、種、年齢、体重、性別、及び医学的状態；治療される病態の重度；投与経路；対象の腎機能または肝機能；個体の薬理ゲノミクス構造；ならびに用いられる本発明の具体的な化合物を含む、様々な要因に従って選択することができる。本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／または追加薬剤）は、１日１回用量で投与することができ、または１日総量を１日２回、３回、または４回の分割用量で投与することができる。さらに本明細書に記載の任意のキメラタンパク質（及び／または追加薬剤）は、投与レジメンを通じて、断続的ではなく連続的に投与することができる。
【０１５０】
細胞及び核酸
様々な実施形態において、本発明は、本明細書に記載のキメラタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。様々な実施形態において、発現ベクターはＤＮＡまたはＲＮＡを含む。様々な実施形態において、発現ベクターは哺乳動物の発現ベクターである。
【０１５１】
原核生物と真核生物いずれのベクターも、キメラタンパク質の発現に使用することができる。原核生物ベクターには、Ｅ．ｃｏｌｉ配列に基づく構築物が含まれる（例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  １９９６，６０：５１２−５３８を参照）。Ｅ．ｃｏｌｉでの発現に使用することができる制御領域の非限定的な例として、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７、及びλＰＬが挙げられる。原核生物の発現ベクターの非限定的な例には、λｇｔ１１（Ｈｕｙｎｈ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  “ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．Ｉ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，”１９８４，（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．），ｐｐ．４９−７８，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）などの一連のλｇｔベクター、及び一連のｐＥＴベクター（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９９０，１８５：６０−８９）を含み得る。ただし、原核宿主−ベクター系は哺乳動物細胞の翻訳後プロセシングの多くを行うことができない。したがって、真核宿主−ベクター系が特に有用であり得る。哺乳動物宿主細胞でのキメラタンパク質の発現には、様々な制御領域を使用することができる。例えば、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス長末端反復（ＲＳＶ−ＬＴＲ）プロモーターを使用することができる。哺乳動物細胞において有用であり得る誘導性プロモーターには、メタロチオネインＩＩ遺伝子、マウス乳癌ウイルス糖質コルチコイド応答性長末端反復（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）、β−インターフェロン遺伝子、及びｈｓｐ７０遺伝子に関連するプロモーターが含まれるが、これらに限定されない（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９８９，４９：２７３５−４２；及びＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９９０，１０：１６５−７５を参照）。ヒートショックプロモーターまたはストレスプロモーターはまた、組換え宿主細胞における融合タンパク質の発現を促進する際に有利となり得る。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本発明の発現ベクターは、哺乳動物細胞において機能的である発現制御領域またはその相補体に機能可能に連結された、キメラタンパク質（及び／または追加薬剤）またはその相補体をコードする核酸を含む。発現制御領域は、発現ベクターで形質転換されたヒト細胞においてブロック剤及び／または刺激剤が生成されるように、機能可能に連結されたブロック剤及び／または刺激剤をコードする核酸の発現を誘導することができる。
【０１５３】
発現制御領域は、機能可能に連結された核酸の発現に影響を及ぼすプロモーター及びエンハンサーなどの制御性ポリヌクレオチド（本明細書では、場合によってエレメントと称する）である。本発明の発現ベクターの発現制御領域は、ヒト細胞において、機能可能に連結されたコード核酸を発現することができる。一実施形態では、細胞は腫瘍細胞である。別の実施形態では、細胞は非腫瘍細胞である。一実施形態では、発現制御領域は、機能可能に連結された核酸に制御可能な発現を付与する。シグナル（場合によっては刺激と称する）は、そのような発現制御領域に機能可能に連結された核酸の発現を増加または減少させることができる。シグナルに応答して発現を増加させるこのような発現制御領域は、誘導性と呼ばれることが多い。シグナルに応答して発現を減少させるこのような発現制御領域は、抑制性と呼ばれることが多い。通常、このような要素によって与えられる増加または減少の量は、存在するシグナルの量に比例する。すなわち、シグナルの量が多いほど、発現の増加または減少はより大きくなる。
【０１５４】
一実施形態では、本発明は、合図に応答して一過性に高レベルの発現を生じさせることができる誘導性プロモーターの使用を企図する。例えば、腫瘍細胞の近傍にある場合に、そのような発現制御配列を含むキメラタンパク質（及び／または追加薬剤）に対する発現ベクターで形質転換された細胞は、形質転換細胞が適切な合図に接することにより高レベルの薬剤を一過性に産生するように誘導される。例示的な誘導性発現制御領域には、小分子化学化合物などの合図で刺激される誘導性プロモーターを含むものが挙げられる。具体例は、例えば、米国特許第５，９８９，９１０号、同第５，９３５，９３４号、同第６，０１５，７０９号、及び同第６，００４，９４１号で参照することができ、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５５】
発現制御領域及び遺伝子座制御領域は、天然プロモーター及びエンハンサーエレメントなどの完全長プロモーター配列に加え、完全長または非変異型の機能の全部または一部を保持する部分配列またはポリヌクレオチド変種を含む。本明細書で使用される場合、用語「機能的」及びその文法的変形は、核酸配列、部分配列、または断片に関して使用される場合、その配列が天然核酸配列（例えば、非変異配列または非改変配列）の１つ以上の機能を有することを意味する。
【０１５６】
本明細書で使用される場合、「機能的に連結」とは、意図された方法で機能できるものとして記載された構成要素の物理的な並置を指す。核酸と機能的に連結されている発現制御エレメントの例では、制御エレメントが核酸の発現を調節するような関係である。通常、転写を調節する発現制御領域は、転写された核酸の５’末端付近（すなわち「上流」）に並置される。発現制御領域はまた、転写された配列の３’末端（すなわち「下流」）または転写産物内部（例えば、イントロン内）に位置することもできる。発現制御エレメントは、転写された配列から（例えば、核酸から１００〜５００、５００〜１０００、２０００〜５０００、またはそれ以上のヌクレオチド）離れた距離に位置することができる。発現制御エレメントの具体例はプロモーターであり、これは通常、転写された配列の５’側に位置する。発現制御エレメントの別の例はエンハンサーであり、これは転写された配列の５’もしくは３’側に、または転写された配列内部に位置し得る。
【０１５７】
ヒト細胞で機能する発現系は、当技術分野で周知であり、これにはウイルス系を含む。一般に、ヒト細胞で機能するプロモーターは、哺乳動物のＲＮＡポリメラーゼと結合し、ｍＲＮＡへのコード配列の下流（３’）転写を開始することができる任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して配置される転写開始領域と、一般的に転写開始部位の２５〜３０塩基対上流に位置するＴＡＴＡボックスを有することになる。ＴＡＴＡボックスは、正しい部位でＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩを誘導すると考えられている。プロモーターはまた、一般的には、ＴＡＴＡボックスの上流１００〜２００塩基対内に一般的に位置する上流プロモーターエレメント（エンハンサーエレメント）も含むことになる。上流のプロモーターエレメントは、転写開始速度を決定し、いずれかの方向に作用することができる。プロモーターとして特に有用なのは、哺乳動物ウイルス遺伝子由来のプロモーターであるが、その理由はウイルス遺伝子が高度に発現される場合が多く、宿主範囲が広いためである。例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、及びＣＭＶプロモーターが挙げられる。
【０１５８】
一般的には、哺乳動物細胞によって認識される転写終結配列及びポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する制御領域であり、したがってプロモーターエレメントとともにコード配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的翻訳後切断及びポリアデニル化によって形成される。転写ターミネーター及びポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０由来のシグナルが挙げられる。発現構築物にはイントロンもまた含まれ得る。
【０１５９】
生存細胞に核酸を導入する際に利用可能な様々な技術が存在する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの哺乳動物細胞への核酸の導入に適した技術としては、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ポリマー系システム、ＤＥＡＥ−デキストラン、ウイルス形質導入、リン酸カルシウム沈降法などが挙げられる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子導入には、リポソーム；キトサン及びゼラチンなどの天然ポリマー系送達ビヒクルを含む多数の技術及び試薬も使用することができ、ウイルスベクターはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏ形質導入に適している。場合によっては、腫瘍細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体またはリガンドなどの標的薬剤を提供することが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型に対して向性であるカプシドタンパク質またはその断片、循環時に内在化を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし、細胞内半減期を拡張するタンパク質を、標的化及び／または取り込みの促進に使用することができる。受容体媒介性エンドサイトーシスの技術は、例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９−４４３２（１９８７）；及びＷａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，３４１０−３４１４（１９９０）に記載されている。
【０１６０】
該当する場合に、例えば、組み込み配列などの遺伝子送達剤を使用することもできる。多数の組み込み配列が当技術分野で既知である（例えば、Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：３９１−４０６，１９９８；Ｓａｄｗｏｓｋｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：３４１−３５７，１９８６；Ｂｅｓｔｏｒ，Ｃｅｌｌ，１２２（３）：３２２−３２５，２００５；Ｐｌａｓｔｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＧ  １５：３２６−３３２，１９９９；Ｋｏｏｔｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４３：４１３−４３９，２００３を参照）。それには、リコンビナーゼ及びトランスポザーゼが含まれる。例としては、Ｃｒｅ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：４６７−４８６，１９８１）、ｌａｍｂｄａ（Ｎａｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ，２４７，５４３−５４５，１９７４）、Ｆｌｐ（Ｂｒｏａｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２９：２２７−２３４，１９８２）、Ｒ（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７２：６１０−６１８，１９９０）、ｃｐＣ３１（例えば、Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：６６７−６７８，２００４を参照）、ｍａｒｉｎｅｒファミリーのトランスポザーゼであるｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ（Ｐｌａｓｔｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，前掲）、及びレトロウイルスまたはレンチウイルスのＬＴＲ配列及びＡＡＶのＩＴＲ配列などのウイルス組み込みをもたらす構成要素を有するＡＡＶ、レトロウイルス、及び抗ウイルスなどの、ウイルスを組み込むための構成要素（Ｋｏｏｔｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４３：４１３−４３９，２００３）が挙げられる。加えて、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥＮ、及びメガヌクレアーゼ遺伝子編集技術を含む、直接的かつ標的化された遺伝子組み込み手法を使用して、キメラ融合タンパク質をコードする核酸配列を挿入することができる。
【０１６１】
一態様では、本発明は、ウイルスベクターであるキメラタンパク質（及び／または追加薬剤）を発現させる発現ベクターを提供する。遺伝子治療に有用であるウイルスベクターが多数知られている（例えば、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１：１  １７，１２２，２００３を参照）。例示的なウイルスベクターとしては、抗ウイルス（ＬＶ）、レトロウイルス（ＲＶ）、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及びαウイルスから選択されるものが挙げられるが、他のウイルスベクターもまた使用することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用には、αウイルス及びアデノウイルスなどの、宿主ゲノムに組み込まれないウイルスベクターが使用に適している。αウイルスの例示的な種類としては、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルス、Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ（ＶＥＥ）ウイルス、及びＳｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔウイルス（ＳＦＶ）が挙げられる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用には、レトロウイルス、ＡＡＶ、及び抗ウイルスなどの、宿主ゲノムに組み込まれるウイルスベクターが適している。一実施形態では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏで固形腫瘍を本発明のウイルスベクターと接触させることを含む、ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト細胞の形質導入方法を提供する。
【０１６２】
様々な実施形態において、本発明は、本明細書に記載のキメラタンパク質を含んでいる発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０１６３】
発現ベクターを宿主細胞に導入して、本発明のキメラタンパク質を産生することができる。細胞は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されてもよく、または遺伝子操作されてもよい。有用な哺乳動物宿主細胞としては、ヒト、サル、及び齧歯類由来の細胞が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ  ｉｎ  “Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”  １９９０，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．を参照）。これには、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓細胞株（例えば、ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓株（例えば、２９３、２９３−ＥＢＮＡ、または懸濁培養での増殖用にサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  １９７７，３６：５９）；ベビーハムスター腎臓細胞（例えば、ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞ＤＨＦＲ（例えば、ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ、及びＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８０，７７：４２１６）；ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、マウスセルトリ細胞（Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  １９８０，２３：２４３−２５１）；マウス線維芽細胞（例えば、ＮＩＨ−３Ｔ３）、サル腎臓細胞（例えば、ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（例えば、ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（例えば、ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（例えば、Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ８０６５）；及びマウス乳癌細胞（例えば、ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）が挙げられる。本明細書に記載の融合タンパク質を発現するための例示的な癌細胞型としては、マウス線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３、マウスルイス肺癌細胞株ＬＬＣ、マウス肥満細胞腫細胞株Ｐ８１５、マウスリンパ腫細胞株ＥＬ４及びそのオボアルブミントランスフェクタントＥ．Ｇ７、マウス黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０、マウス線維肉腫細胞株ＭＣ５７、ならびにヒト小細胞肺癌細胞株ＳＣＬＣ＃２及びＳＣＬＣ＃７が挙げられる。
【０１６４】
宿主細胞は、健康なヒト、癌患者、及び感染性疾患の患者を含む、正常なまたは罹患した対象、民間研究室の寄託物、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎなどの公共培養コレクション、または商業的供給元から得ることができる。
【０１６５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏでの本発明のキメラタンパク質の産生に使用することができる細胞としては、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞；種々の幹細胞または前駆細胞、特に造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば骨髄から得られるもの）、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などが挙げられるが、これらに限定されない。細胞型の選択は、治療または予防しようとする腫瘍または感染性疾患の種類に依存し、当業者が決定することができる。
【０１６６】
対象及び／また動物
いくつかの実施形態では、対象及び／または動物は、哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、またはサル、チンパンジー、もしくはヒヒなどの非ヒト霊長類である。他の実施形態では、対象及び／または動物は、非哺乳動物、例えばゼブラフィッシュなどである。いくつかの実施形態では、対象及び／または動物は、蛍光標識細胞（例えば、ＧＦＰによる）を含み得る。いくつかの実施形態では、対象及び／または動物は、蛍光細胞を含むトランスジェニック動物である。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、対象及び／または動物はヒトである。いくつかの実施形態では、ヒトは小児のヒトである。他の実施形態では、ヒトは成人のヒトである。他の実施形態では、ヒトは高齢のヒトである。他の実施形態では、ヒトを患者と呼ぶ場合がある。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、ヒトの年齢は、約０か月齢〜約６か月齢、約６〜約１２か月齢、約６〜約１８か月齢、約１８〜約３６か月齢、約１〜約５歳、約５〜約１０歳、約１０〜約１５歳、約１５〜約２０歳、約２０〜約２５歳、約２５〜約３０歳、約３０〜約３５歳、約３５〜約４０歳、約４０〜約４５歳、約４５〜約５０歳、約５０〜約５５歳、約５５〜約６０歳、約６０〜約６５歳、約６５〜約７０歳、約７０〜約７５歳、約７５〜約８０歳、約８０〜約８５歳、約８５〜約９０歳、約９０〜約９５歳、または約９５〜約１００歳の範囲である。
【０１６９】
他の実施形態では、対象は非ヒト動物であり、したがって本発明は獣医学的使用に関する。特定の実施形態では、非ヒト動物は家庭用ペットである。別の特定の実施形態では、非ヒト動物は家畜動物である。
【０１７０】
キット
本発明は、本明細書に記載の任意の薬剤の投与を容易にすることができるキットを提供する。本発明の例示的なキットは、本明細書に記載の任意の組成物を単位剤形で含む。一実施形態では、単位剤形は、本明細書に記載の任意の薬剤及び薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはビヒクルを収容する、滅菌できるプレフィルドシリンジなどの容器である。キットは、本明細書に記載の任意の薬剤の使用法を指示するラベルまたは印刷された説明書をさらに含むことができる。キットはまた、開瞼器、局所麻酔剤、及び投与場所の清浄剤を含み得る。キットはまた、本明細書に記載の１つ以上の追加薬剤をさらに含み得る。一実施形態では、キットは、有効量の本発明の組成物及び有効量の本明細書に記載されるような別の組成物を収容する容器を含む。以下の実施例で本発明をさらに説明するが、これは特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１７１】
実施例１．マウスＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ構築物の構築及び特性決定
キメラマウスＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ構築物を作製し、マウスＩｇＧ捕捉ＥＬＩＳＡアッセイを使用してＣＨＯ−Ｋ１細胞での発現を確認した（ここでのＦｃはＩｇＧ１に由来する）。具体的には、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、Ｆｃに融合したＰＤ−１のマウス細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ｍＰＤ−１−Ｆｃ）またはＯＸ４０ＬのＥＣＤに融合したｍＰＤ−１−Ｆｃ（ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ）のいずれかを発現するｐＶＩＴＲＯ２−ＧＳ−ｈｙｇｒｏベクターまたはｐｃＤＮＡ３．４ベクターで安定的にヌクレオフェクションした。抗生物質耐性単一細胞クローンを、限界希釈法によって単離した。培地に分泌された各キメラタンパク質の濃度を、ｍＩｇＧ捕捉ＥＬＩＳＡによって図５に示すように決定した。
【０１７２】
結合アッセイを実施し、マウスＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０ＬがｍＯＸ４０に加え、ｍＰＤ−Ｌ１にも結合する能力を特性決定した。図６のパネルＡは、ｍＯＸ４０へのマウスＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合を検出する際に使用したＥＬＩＳＡアッセイの模式図を示す。具体的には、ヒトＦｃに融合した組換えｍＯＸ４０（ｍＯＸ４０−ｈＦｃ）を使用して、培地中のｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを捕捉した。ｍＰＤ−１に対するウサギポリクローナル抗体を使用して、キメラタンパク質のｍＰＤ−１ドメインを検出し、続いてそれをウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートポリクローナル抗体を使用して検出した。図６のパネルＢは、マウスＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０ＬがｍＰＤ−１−Ｆｃ陰性対照と比較して効率的にＯＸ４０と結合することを示している。図７のパネルＡは、ｍＰＤ−Ｌ１へのマウスＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合を検出する際に使用したＥＬＩＳＡアッセイの模式図を示す。具体的には、ヒトＦｃに融合した組換えｍＰＤ−Ｌ１（ｍＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃ）を使用して、培地中のｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を捕捉した。結合したタンパク質の検出には、マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートポリクローナル抗体を使用した。図７のパネルＢは、マウスＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌが陰性培地対照及び組換えマウスＰＤ１−Ｆｃを使用した陽性対照と比較して効率的にＰＤ−Ｌ１と結合することを示している。
【０１７３】
Ｔ細胞応答の誘発及び腫瘍の治療におけるマウスＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの活性を特性決定する実験を実施した。Ｂ１６．Ｆ１０卵巣腫瘍細胞（５×１０５）をマウスの右側腹部に接種する２日前に、ニワトリのオボアルブミン抗原特異的ＯＴ−Ｉ／ＥＧＦＰ、ＣＤ８＋Ｔ細胞（５×１０５）を尾静脈注射によりＣ５７／ＢＬ６アルビノマウスに養子移入した。腫瘍が直径３〜５ｍｍに達したら、ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを発現するＤＮＡ（５０μｇ）を、１００μＳで８パルスを用いた規定の電気パルス（１５００Ｖ／ｃｍ）を使用して腫瘍にエレクトロポレーションした。末梢血中のＣＤ８＋  ＯＴ−Ｉ／ＥＧＦＰ細胞のパーセント比を、エレクトロポレーション後の指定時間経過にわたりフローサイトメトリー分析によって定量化した。図８に示すように、マウス（ｍ）ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌのｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍内送達により、抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞が増殖した。
【０１７４】
図９は、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌのｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍内送達が、Ｂ１６．Ｆ１０卵巣腫瘍モデルにおいて腫瘍退縮も引き起こしたことを示している。ＣＤ８＋  ＯＴ−Ｉ／ＥＧＦＰ細胞で養子移入されたＣ５７／ＢＩ６アルビノマウスにＢ１６．Ｆ１０卵巣腫瘍を生成し、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを発現するＤＮＡ（５０μｇ）で１回エレクトロポレーションした。対照マウスにはＤＮＡを与えなかったが、エレクトロポレーションは施した（ＥＰのみ）。エレクトロポレーション後の指定時間経過にわたり、デジタルノギスを使用して腫瘍直径を測定した。図９は、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの投与が腫瘍の大きさを有意に減少させたことを示す。
【０１７５】
実施例２．マウスＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ構築物の追加特性決定
ＩｇＧ１由来のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを介してＯＸ４０ＬのＥＣＤに融合したＰＤ−１のマウス細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ）を含めた、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ構築物を作製した。ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ構築物を２９３細胞中で一過性発現させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。ウェスタンブロット法及び機能的ＥＬＩＳＡ分析を実施して、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの３つの構成要素すべての検出及び結合を確認した（図１０のパネルＡ）。ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの定量は、マウスＩｇＧ捕捉及び検出ＥＬＩＳＡを使用して評価することができる（図１０のパネルＢ）。ｍＰＤ−Ｌ１−Ｆｃを用いてｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを捕捉し、それをｍＯＸ４０−Ｈｉｓ、続いてＨｉｓ−ＨＲＰで化学発光定量を検出することにより、ｍＰＤ−１及びｍＯＸ４０ＬのそれぞれのパートナーであるｍＰＤ−Ｌ１及びｍＯＸ４０への結合を同時に実証した（図８のパネルＣ）。ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの単量体及び二量体の立体構造が存在することも示された。
【０１７６】
ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌのｅｘ  ｖｉｖｏ細胞結合を評価するため、初代マウス脾細胞を単離し、ＰＭＡ／ＰＨＡ／イオノマイシンで２日間活性化して、ＯＸ４０及びＰＤ−Ｌ１の発現を上方制御した。次に、活性化された脾細胞を５００ｎｇ／ｍＬのｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌで処理し、フローサイトメトリーによって結合（Ｆｃ−ＰＥ）を分析した（図８のパネルＤ）。ＰＤ−Ｌ１発現細胞を単離するために、抗原提示細胞のＭＨＣＩＩ（Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ）を標的とする抗体で脾細胞を共染色した。ＯＸ４０発現細胞を単離するために、脾細胞をＣＤ４で共染色した。ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌは、脾細胞のＰＤ−Ｌ１＋及びＯＸ４０＋集団の両方に有意に結合し、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌがコンピテントに産生及び精製され、初代由来細胞上の標的と結合することを示した。ＰＤ−Ｌ１を発現する初代マウス腫瘍細胞株に対するｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合活性も評価した。マウス４Ｔ１腫瘍細胞株は、少量のＰＤ−Ｌ１を発現すると同定され、Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍細胞株は比較的多量のＰＤ−Ｌ１を発現した。ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌは、ＰＤ−Ｌ１の低い４Ｔ１腫瘍細胞株よりもＰＤ−Ｌ１陽性Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍細胞株と結合する程度が大きいことが示された（図１０のパネルＥ）。
【０１７７】
ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌのその他の機能的活性を、Ｔ細胞活性化／腫瘍共培養アッセイを使用して特性決定した。まず、マウスＰＤ−Ｌ１ｌｏｗ（４Ｔ１）及びＰＤ−Ｌ１ｈｉｇｈ（Ｂ１６．Ｆ１０）細胞をフローサイトメトリーによって同定した（図８のパネルＥ）。次に、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ及び飽和濃度以下のＩＬ２でマウス脾細胞を２日間活性化した。２日後、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの存在下または不在下で、放射線照射した４Ｔ１またはＢ１６．Ｆ１０細胞それぞれと活性化脾細胞を共培養した。脾細胞の最初の単離から５日後、培地を採取し、ＥＬＩＳＡによりサイトカインＩＬ２について分析した（図８のパネルＦ）。ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌは、特にＰＤ−Ｌ１ｈｉｇｈ腫瘍細胞を含有する共培養液において、ＩＬ２分泌の有意な誘導が可能であることが観察された。理論に束縛されるものではないが、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０ＬはＰＤ−Ｌ１の抑制効果を遮断すると同時に、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌシグナル伝達を介してＴ細胞を活性化し、それによりＩＬ２分泌も誘導すると考えられる。総合すると、これらの知見は、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌが前臨床モデルにおいて有意な抗腫瘍免疫を生じ得ることを示唆している。
【０１７８】
いくつかの前臨床腫瘍モデル系を使用して、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの抗腫瘍効力を試験した。具体的には、結腸直腸癌のマウスモデル（ＣＴ２６及びＭＣ３８）を使用して、腫瘍成長、全生存率、及び治療後の血清サイトカイン応答の誘導に対するｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの効果を評価した。これらの実験は、単独療法として、または併用して、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌと同等の活性用量（各１００ｕｇを２用量）で腹腔内注射により投与した、広く特性決定されたＯＸ４０アゴニスト（ＯＸ８６）及びＰＤ−Ｌ１ブロック（１０Ｆ．９Ｇ２）抗体との直接比較で実施した。図１１のパネルＡに示すように、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌは、ＭＣ３８モデルにおいて腫瘍の大きさを有意に減少させた。より具体的には、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの投与は、個別にまたは併用して投与されたＯＸ４０アゴニスト及びＰＤ−Ｌ１ブロック抗体よりも大きな腫瘍退縮をもたらした。重要な点として、親ＭＣ３８腫瘍細胞株による原発腫瘍を拒絶したマウスの反復曝露を各群に実施した。これらのデータは、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌで処置したマウスは、反復処置していない場合、他の処置群のいずれよりも大幅に親腫瘍による再曝露を拒絶できることを示した（図１１のパネルＡ及びＢ）。さらに、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＧＩＴＲＬ及びｍＰＤ１−Ｆｃ−４１ＢＢＬを含む他の融合構築物を作製し、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌについて上記したような腫瘍保持マウスに使用した。ＧＩＴＲＬ及び４１ＢＢＬを含む構築物はいずれも、処置動物において腫瘍の大きさを減少させた。
【０１７９】
腫瘍の大きさを測定することに加えて、ｉｎ  ｖｉｖｏでのｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌシグナル伝達に関する薬力学的バイオマーカーもまた決定した。具体的には、抗ＰＤ−Ｌ１及び抗ＯＸ４０抗体ならびにＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌで処置したマウスの血清サイトカイン分析を実施した。図１１のパネルＢ及びＣに示されるように、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌによる処置後に用量依存的なサイトカインのシグネチャーが見られ、これは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７Ａ、及びＩＬ−２２の増加を含め（図１１のパネルＣ、Ｄ、及びＪ）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び抗ＯＸ４０抗体の併用投与後に観察されたサイトカインのシグネチャーと著しく類似していた。重要な点として、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌによる処置後の血清サイトカイン応答の検出は用量依存的であることが示された。具体的には、４０μｇの１回または２回の注射による処置では、検出可能な血清サイトカイン応答は生じなかったが、１００μｇ１回の処置では、中等度のサイトカイン応答が生じ、１００μｇ２回の処置ではさらに高いサイトカイン応答が生じた（図１１のパネルＫ）。ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＧＩＴＲＬによるマウスの処置はまた、特異的血清サイトカイン応答を刺激することが示された。
【０１８０】
一部の実験では、ＭＣ３８腫瘍を保持するマウスを実験１３日目に犠牲死させ、腫瘍、末梢血、及び脾臓の細胞免疫応答を評価した。実験１３日目に、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＧＩＴＲＬ、及びｍＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌはすべて、未処置の動物、またはＯＸ４０アゴニスト抗体、ＧＩＴＲアゴニスト抗体、もしくはＰＤ−Ｌ１ブロック抗体で処置した動物と比較して、腫瘍成長の減少を引き起こしていたことが示された（図１１のパネルＥ）。これらのデータによれば、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０ＬまたはｍＰＤ１−Ｆｃ−ＧＩＴＲＬで処置したマウスは、実験の１３日目に腫瘍抗原特異的な腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の数が増加していたことが示された（図１１のパネルＦ）。ＣＤ８＋  Ｔ細胞の脾臓における記憶表現型の分析を実施し（図１１のパネルＧ）、ＣＤ４／ＣＤ８  Ｔ細胞比もまた複数の処置にわたって比較した（図１１のパネルＨ）。
【０１８１】
ＣＴ２６モデルを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌシグナル伝達に関する薬力学的バイオマーカーもまた決定した。具体的には、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び抗ＯＸ４０抗体で個別にまたは併用して処置したマウス、ならびにＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌで処置したマウスの血清サイトカイン分析を実施した。図１１のパネルＤに示されるように、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌによる処置後のサイトカインのシグネチャーは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び抗ＯＸ４０抗体の併用投与後に観察されたサイトカインのシグネチャーと著しく類似していた。具体的には、サイトカインのシグネチャーは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、及びＩＬ−２２の増加からなる（図１１のパネルＪ及びＫ）。
【０１８２】
ＭＣ３８モデルから得た結果と一致して、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの投与はまた、ＣＴ２６結腸直腸癌モデルにおいて腫瘍の大きさを有意に減少させた。特に、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの使用は、ＯＸ４０アゴニスト及びＰＤ−Ｌ１ブロック抗体よりも大きな腫瘍退縮をもたらした（図１１のパネルＬ）。さらに、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを投与したマウスは、ＯＸ４０アゴニスト及びＰＤ−Ｌ１ブロック抗体を投与したマウスよりも生存期間の延長を示した（図１１のパネルＬ）。加えて、ＰＤ１−Ｆｃ−ＧＩＴＲＬ、ＰＤ１−Ｆｃ−４１ＢＢＬ、及びＰＤ１−Ｆｃ−ＴＬ１Ａを含む他のキメラ融合タンパク質構築物はすべて、ＣＴ２６モデルにおいて腫瘍成長の遅延と腫瘍退縮を生じさせることが示された（図１１のパネルＬ）。
【０１８３】
総合すると、これらのデータは、とりわけ、ｉｎ  ｖｉｖｏでのｍＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの機能的活性を明確に実証している。
【０１８４】
実施例３．ヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの構築及び特性決定
ヒト免疫グロブリン４（ＩｇＧ４）抗体由来のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを介してＯＸ４０Ｌに連結したヒトＰＤ−１を含むヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを構築した。この構築物をＳＬ−２７９２５２と称した。
【０１８５】
ヒトＯＸ４０ＬのｍＲＮＡ配列は以下の通りであった：
【化１６−１】
2018529363.tif 000029
【化１６−２】
2018529363.tif 000030
【０１８６】
ヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸配列は以下の通りであった（網掛け−細胞外ドメイン）：
【化１７】
2018529363.tif 000031
【０１８７】
ヒトＩｇＧ４由来のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３配列の核酸配列は以下の通りであった：
【化１８】
2018529363.tif 000032
【０１８８】
ヒトＰＤ−１のｃＤＮＡ配列は以下の通りであった：
【化１９】
2018529363.tif 000033
【０１８９】
ヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの核酸配列は以下の通りであった：
【化２０−１】
2018529363.tif 000034
【化２０−２】
2018529363.tif 000035
【０１９０】
この配列をチャイニーズハムスター（ＣＨＯ）細胞による発現に合わせて、以下のようにコドン最適化した：
【化２１−１】
2018529363.tif 000036
【化２１−２】
2018529363.tif 000037
【０１９１】
その結果、ＳＬ−２７９２５２のアミノ酸配列は以下の通りであった：
【化２２】
2018529363.tif 000038
【０１９２】
あるいは、ＳＬ−２７９２５２には、ヒトコラーゲンＶまたはヒトＩｇＧ重鎖由来のものなどの他のシグナル伝達ペプチドを含むことができる。あるいは、ＳＬ−２７９２５２は、上述したように、安定性を増加させるため、またはＦｃＲｎに対する結合親和性を増加させるために、Ｆｃドメインに１つ以上の変異を含み得る。ヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ構築物をタンパク質３次構造予測ソフトウェアＲａｐｔｏｒＸにインポートし、３つの主要ドメインの折りたたみが適切であることを確認した（図１２のパネルＡを参照）。各構成要素（すなわち、ＰＤ−１、Ｆｃ、及びＯＸ４０Ｌ）の３次構造は、より大きな巨大分子内でその本来の立体構造を採っており、これはＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌがすべてのドメインの結合能力及び分子機能を保持することを示唆していた。次に、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分子モデリングアルゴリズムを使用して、Ｔ細胞エピトープデータベースを相互参照し、ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの免疫原性確率を評価した（ＡＢＺＥＮＡ／ＡＮＴＩＴＯＰＥ、図１２のパネルＢ）。すべてのコード配列はヒトであったが、処置後にリード配列及びリンカー配列が免疫応答を誘発する可能性は最小限であった。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏのｉＴｏｐｅ抗原予測技術（ＡＮＴＩＴＯＰＥ）を使用して、さらに分析を実施した。この分析に基づくと、特定可能なＴ細胞エピトープは検出されなかったため、ＳＬ−２７９２５２の免疫原性は「低リスク」であると予測された。したがって、ＳＬ−２７９２５２は低い免疫原性を有することが予想された。
【０１９３】
次に、ＳＬ−２７９２５２のコドン最適化ＤＮＡ配列を合成し、ｐｃＤＮＡ３．４−ｈｙｇｒｏ−ｍｃｓ（ＴＨＥＲＭＯ  ＦＩＳＨＥＲ）及びｐＶＩＴＲＯ２−ｈｙｇｒｏ−ｍｃｓ（ＩＮＶＩＶＯＧＥＮ）発現ベクターに一方向にクローニングした。次いで、ベクターをＣＨＯ−Ｋ１細胞及び２９３Ｔ細胞に一過性にまたは安定的にトランスフェクトし、標準的なプロテインＡアガロースアフィニティークロマトグラフィーを使用して培養上清を精製した。精製タンパク質の溶出画分（安定的トランスフェクション実験から得た）に対するヒトＦｃ／ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡは、一過性トランスフェクション実験から得た大規模精製から検出された第１の主要ピークと一致する明確なピークを示した（図１３のパネルＡ）が、これはＳＬ−２７９２５２の産生が、プロテインＡのような通常のタンパク質精製技術を使用して適切に達成できることを示している。
【０１９４】
ＳＬ−２７９２５２の３つのドメインすべてが無傷であり、タンパク質検出アッセイによって認識可能であることを確認するために、精製した融合タンパク質に対して、ヒト抗ＰＤ−１、抗Ｆｃ、及び抗ＯＸ４０Ｌをプローブするウェスタンブロット分析を実施した（図１３のパネルＢ）。ＳＬ−２７９２５２は、３つの抗体すべてで検出され、タンパク質を還元条件下で泳動させると、約７５ｋＤａに移動した。約５０％の非還元タンパク質が二量体として移動しており、ＯＸ４０／Ｌのシグナル伝達及び機能に関連するｉｎ  ｖｉｖｏオリゴマー化を考慮すると、これは潜在的な利点であった。ＳＬ−２７９２５２の予測分子量は６０．３ｋＤａであった。ＳＬ−２７９２５２の還元画分は高分子量で検出された。これは理論に束縛されるものではないがグリコシル化に起因し得る。ＳＬ−２７９２５２をタンパク質脱グリコシル化酵素ＰＮＧａｓｅ  Ｆで処理することにより、これを確認した（図１３のパネルＢ）。脱グリコシル化後、ＳＬ−２７９２５２の還元画分は、ちょうど予測分子量の６０．３ｋＤａに移動した。これは、ＳＬ−２７９２５２が、グリコシル化によって同時修飾／翻訳後修飾され、タンパク質の適切な折りたたみ及び安定性ならびに細胞間接着に欠かせない役割を果したという証拠を示した（Ｄａｌｚｉｅｌ  Ｍ，Ｄｗｅｋ  ＲＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１４，Ｍａｖｅｒａｋｉｓ  Ｅ，  Ｌｅｂｒｉｌｌａ  ＣＢ．Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．２０１５）。
【０１９５】
次に、機能的ＥＬＩＳＡアッセイにおいてプレート固定組換えタンパク質を使用し、ＳＬ−２７９２５２がその受容体／リガンド標的に結合できるかどうかを決定する分析を実施した。ＳＬ−２７９２５２は、組換えヒトＯＸ４０に適切に捕捉され（図１３のパネルＣ）、抗ヒトＯＸ４０Ｌ／抗ヤギＨＲＰで検出された。この点に関して、ヒトＯＸ４０によるＳＬ−２７９２５２の捕捉に続き、ヤギ抗ＯＸ４０Ｌ、続いて抗ヤギＨＲＰと２段階でインキュベーションして検出することにより、効率的な検出が得られた。ＳＬ−２７９２５２の両末端が、それぞれの対応する受容体／リガンドに同時に結合できるかどうかを確認するために、プレート吸着ヒトＰＤ−Ｌ１を使用してＳＬ−２７９２５２を捕捉し、組換えＯＸ４０−ｈｉｓを使用してＳＬ−２７９２５２を検出する別のＥＬＩＳＡアッセイを開発した（図１３のパネルＤ）。このアッセイは、ＳＬ−２７９２５２がヒトＰＤ−Ｌ１とヒトＯＸ４０に同時に結合できることを実証している。
【０１９６】
次に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を実施し、ＳＬ−２７９２５２をｈＰＤ−Ｌ１、ｈＰＤ−Ｌ１、ｈＯＸ４０、及び様々なヒトＦｃ受容体に結合させることによって親和性を決定した（図１４）。具体的には、組換えヒトＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、及びヒトＯＸ４０のポリヒスチジン標識型を、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＨＴＧ  ｔｒｉｓ−ＮＴＡチップ（ＢＩＯＲＡＤ）に結合させた。次いで、ある時間経過にわたってＳＬ−２７９２５２を、結合されたリガンド上に流し、「結合速度」（Ｋａ）及び「解離速度」（Ｋｄ）の相対指数を求め、各パートナーに対するＳＬ−２７９２５２の結合親和性（ＫＤ）を算出した。結合には、組換えヒトＰＤ−１−Ｆｃ及びＯＸ４０Ｌ−Ｆｃを陽性対照として使用した。これらの対照は、比較的「結合速度」が速く、かつ同様に「解離速度」が速いため、結果として低ナノモルの結合親和性が得られる。これらの結果と一致して、ヒトＰＤ−Ｌ１に対するＳＬ−２７９２５２の「結合速度」は迅速であったが、解離速度ははるかに低く、実際には、組換えＰＤ−１−Ｆｃの「解離速度」よりも約２０倍遅く、これは、ＳＬ−２７９２５２が迅速かつ安定的に結合し、オンターゲットで長時間滞留したことを示している（図１４のパネルＡ）。ヒトＰＤ−Ｌ１に対するＳＬ−２７９２５２の結合のＫＤは２．０８ｎＭであると算出され、ＢＭＳのＯＰＤＩＶＯの実測ＫＤ（約４ｎＭ）とほぼ同一であった。ヒトＰＤ−Ｌ２に対するＳＬ−２７９２５２の結合のＫＤは１．２４ｎＭであると算出された（図１４のパネルＢ）。ＳＬ−２７９２５２は、ヒトＯＸ４０に高親和性で結合し（２４６ｐＭ）、ここでも速い「結合速度」と、遅い「解離速度」を示した（図１４のパネルＣ）。
【０１９７】
ＳＬ−２７９２５２の分子特性をさらに定義するために、ＳＰＲを実施して、チップ結合したＦｃγ受容体ＦｃγＲ１Ａ及び新生児受容体ＦｃＲｎに対するＳＬ−２７９２５２の結合親和性を分析した。ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１は、ＦｃγＲ２ｂへの結合が低レベルであることに加え、ＦｃγＲ１Ａに対して最も高い親和性で、続いてＦｃＲｎに結合することが示された（図１４のパネルＣ及びＤ）。ＳＬ−２７９２５２は、ＦｃγＲ１ＡまたはＦｃγＲ２Ｂに結合しなかったが、７３ｎＭの親和性でＦｃＲｎに結合した（図１４のパネルＤ及びＥ）。理論に束縛されるものではないが、ＦｃＲｎが細胞表面へのＩｇＧのリサイクリングに関与し、それによってリソソーム分解を回避し、潜在的にＳＬ−２７９２５２のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長するため、この結合特性は融合タンパク質にとって重要であり得る。ＳＬ−２７９２５２の結合親和性に関する要約データも記載されている（図１４のパネルＦ）。
【０１９８】
次に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を実施し、ＦｃＲｎとの結合を増加させるコラーゲンＶリーダーペプチドとＦｃ領域変異とを含む変異型ＳＬ−２７９２５２構築物（ｃｏｌＰＤ１−ＦｃＲｎＯＸ４０Ｌと命名）によるｈＰＤ−Ｌ１、ｈＰＤ−Ｌ１、ｈＯＸ４０、及び種々のヒトＦｃ受容体への結合について試験し、親和性を決定した（図１４）。具体的には、組換えヒトＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、及びヒトＯＸ４０のポリヒスチジン標識型を、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＨＴＧ  ｔｒｉｓ−ＮＴＡチップ（ＢＩＯＲＡＤ）に結合させた。次いで、ある時間経過にわたってｃｏｌＰＤ１−ＦｃＲｎＯＸ４０Ｌを、結合されたリガンド上に流し、「結合速度」（Ｋａ）及び「解離速度」（Ｋｄ）の相対指数を求め、各パートナーに対するｃｏｌＰＤ１−ＦｃＲｎＯＸ４０Ｌの結合親和性（ＫＤ）を算出した。結合には、組換えヒトＰＤ−１−Ｆｃ及びＯＸ４０Ｌ−Ｆｃを陽性対照として使用した。これらの対照は、比較的「結合速度」が速く、かつ同様に「解離速度」が速いため、結果として低ナノモルの結合親和性が得られる。これらの結果と一致して、ヒトＰＤ−Ｌ１に対するｃｏｌＰＤ１−ＦｃＲｎＯＸ４０Ｌの「結合速度」は迅速であったが、解離速度ははるかに低く、実際には、組換えＰＤ−１−Ｆｃの「解離速度」よりも約１０倍遅く、これは、ｃｏｌＰＤ１−ＦｃＲｎＯＸ４０Ｌが迅速かつ安定的に結合し、オンターゲットで長時間滞留したことを示している（図１４のパネルＧ）。ヒトＰＤ−Ｌ１に対するｃｏｌＰＤ１−ＦｃＲｎＯＸ４０Ｌの結合のＫＤは６．３５ｎＭであると算出され、ＢＭＳのＯＰＤＩＶＯの実測ＫＤ（約４ｎＭ）とほぼ同一であった。ヒトＰＤ−Ｌ２に対するｃｏｌＰＤ１−ＦｃＲｎＯＸ４０Ｌの結合のＫＤは７．９３ｎＭであると算出された（図１４のパネルＨ）。ｃｏｌＰＤ１−ＦｃＲｎＯＸ４０Ｌは、ヒトＯＸ４０に高親和性で結合し（９．６１ｎＭ）、ここでも速い「結合速度」と、遅い「解離速度」を示した（図１４のパネルＩ）。
【０１９９】
ｃｏｌＰＤ１−ＦｃＲｎＯＸ４０Ｌの分子特性をさらに定義するために、ＳＰＲを実施して、チップ結合したＦｃγ受容体ＦｃγＲ１Ａ及び新生児受容体ＦｃＲｎに対するｃｏｌＰＤ１−ＦｃＲｎＯＸ４０Ｌの結合親和性を分析した。ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１は、ＦｃγＲ２ｂへの結合が低レベルであることに加え、ＦｃγＲ１Ａに対して最も高い親和性で、続いてＦｃＲｎに結合することが示された（図１４のパネルＪ及びＫ）。ｃｏｌＰＤ１−ＦｃＲｎＯＸ４０Ｌは、ＦｃγＲ１ＡまたはＦｃγＲ２Ｂに結合しなかったが、２．５１ｎＭの親和性でＦｃＲｎに結合した（図１４のパネルＫ）。理論に束縛されるものではないが、ＦｃＲｎが細胞表面へのＩｇＧのリサイクリングに関与し、それによってリソソーム分解を回避し、潜在的にｃｏｌＰＤ１−ＦｃＲｎＯＸ４０Ｌのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長するため、この結合特性は融合タンパク質にとって重要であり得る。ｃｏｌＰＤ１−ＦｃＲｎＯＸ４０Ｌの結合親和性に関する要約データも記載されている（図１４のパネルＬ）。
【０２００】
さらに、精製したＳＬ−２７９２５２のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を、このタンパク質２００μｇを腹腔内注射によってＣ５７ＢＬ／６マウスに注入することにより試験した。次いで、１０分、３０分、１時間、３時間、６時間、１２時間、及び２４時間で処置動物から心穿刺により血液を採取し、室温で２時間凝固させた。次いで、血清を上記で概説したヒトＩｇＧまたはＯＸ４０Ｌ特異的ＥＬＩＳＡを使用してアッセイした。図１４のパネルＭに示すように、２００μｇのタンパク質の単回注射後のマウスにおけるＳＬ−２７９２５２の血清半減期は、７〜１５時間であると判定された。ＦｃＲｎに対する結合親和性を増加させる変異を含む構築物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで半減期の延長をもたらすことが期待される。
【０２０１】
ＳＰＲによって検出された遅い解離速度は、ＳＬ−２７９２５２が血清半減期よりも長いオンターゲットでの（すなわち、腫瘍内の）半減期を有し得ることを示唆した。この問題を調べるため、免疫不全ＮＳＧマウスの片側の側腹部に、ＰＤ−Ｌ１陰性ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌）腫瘍を、対側の側腹部にＰＤ−Ｌ１を発現するＨｅＬａ腫瘍を移植した。マウスを２００μｇのＳＬ−２７９２５２の単回注射で処置し、個々のマウスを所定の時点で犠牲死させた。屠殺時に、両側のＨｅＬａ腫瘍を切除し、二分した。腫瘍の半分を分離して、フローサイトメトリーによりＳＬ−２７９２５２の結合について分析した。この分析は、ＳＬ−２７９２５２がＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍に特異的に蓄積し、ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍には特異的に蓄積しないことを実証した。ＳＬ−２７９２５２の濃度は、処置後最大４８時間腫瘍内で増加することが観察された（図１４のパネルＮ）。さらに、各腫瘍のもう半分の免疫組織化学分析により、処置の５日後にヒトＯＸ４０Ｌに対する有意な染色が存在することを実証し、単回処置の少なくとも５日後にＳＬ−２７９２５２がＰＤ−Ｌ１陽性ヒト腫瘍において検出可能であることを示唆した（図１４のパネルＯ）。
【０２０２】
実施例４．ヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの追加の機能的特性決定
先のデータは、ＳＬ−２７９２５２が低ナノモル親和性で固定化標的に結合することを示し、複数のタンパク質アッセイによって検出可能であった。ＳＬ−２７９２５２が、生細胞表面にある標的にｉｎ  ｖｉｔｒｏで結合できるかどうかを決定する追加の分析を実施した。ヒトＯＸ４０受容体へのＳＬ−２７９２５２の結合を評価するために、ヒトＡＭＬ  Ｔ細胞株Ｊｕｒｋａｔを、ＯＸ４０を過剰発現するように遺伝子操作し、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＯＸ４０細胞を作製した（フローサイトメトリーにより確認；図１５のパネルＡ）。ＰＤ−Ｌ１への結合を評価するために、ヒトＰＤ−Ｌ１を発現しないチャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ−Ｋ１をトランスフェクトして、ヒトＰＤ−Ｌ１を安定的に発現させた（図１５のパネルＢ）。ヒトＣＤ４７への結合を評価するために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞をトランスフェクトして、ヒトＣＤ４７を安定的に発現させた（図１５のパネルＣ）。
【０２０３】
次いで、ＣＨＯ−Ｋ１細胞またはＣＨＯ−Ｋ１−ＰＤ−Ｌ１細胞を、漸増量のＳＬ−２７９２５２で処理して、フローサイトメトリーによって分析し、抗ヒトＯＸ４０Ｌ−ＡＰＣ抗体を使用してヒトＯＸ４０Ｌドメインを検出した。親ＣＨＯ−Ｋ１細胞は検出可能なヒトＰＤ−Ｌ１を発現していなかったため、ＳＬ−２７９２５２はこの細胞と結合しなかった。しかしながら、ＣＨＯ−Ｋ１−ＰＤ−Ｌ１細胞のほぼ全集団が有意にシフトし、ＳＬ−２７９２５２のヒトＰＤ１構成要素が生存細胞にあるその受容体と結合できることを示した（図１５のパネルＤ）。次に、Ｊｕｒｋａｔ細胞またはＪｕｒｋａｔ／ＯＸ４０細胞を、漸増量のＳＬ−２７９２５２で処理して、フローサイトメトリーによって分析し、抗ヒトＯＸ４０Ｌ−ＡＰＣ抗体を使用してヒトＯＸ４０Ｌドメインを検出した。親Ｊｕｒｋａｔ細胞はヒトＯＸ４０の発現が少量であるため、ＳＬ−２７９２５２はこの細胞と高効率で結合しなかった。しかしながら、Ｊｕｒｋａｔ／ＯＸ４０細胞のほぼ全集団が有意にシフトし、ＳＬ−２７９２５２のヒトＯＸ４０Ｌ構成要素が生存細胞にあるその受容体と結合できることを示した（図１５のパネルＥ）。
【０２０４】
次いで、別のキメラ融合タンパク質の結合を調べるために、ヒトＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、またはＣＨＯ−Ｋ１−ＣＤ４７細胞を、漸増量のＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌで処理して、フローサイトメトリーによって分析し、抗ヒトＯＸ４０Ｌ−ＡＰＣ抗体を使用してヒトＯＸ４０Ｌドメインを検出した。親ＣＨＯ−Ｋ１細胞は検出可能なヒトＣＤ４７を発現していなかったため、ＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌはこの細胞と結合しなかった。しかしながら、ＣＨＯ−Ｋ１−ＰＤ−Ｌ１細胞のほぼ全集団が有意にシフトし、ＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０ＬのヒトＣＤ１７２ａ構成要素が生存細胞にあるその受容体と結合できることを示した（図１５のパネルＦ）。次いで、Ｊｕｒｋａｔ細胞またはＪｕｒｋａｔ／ＯＸ４０細胞を、漸増量のＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌで処理して、フローサイトメトリーによって分析し、抗ヒトＯＸ４０Ｌ−ＡＰＣ抗体を使用してヒトＯＸ４０Ｌドメインを検出した。親Ｊｕｒｋａｔ細胞はヒトＯＸ４０の発現が少量であるため、ＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌはこの細胞と高効率で結合しなかった。しかしながら、Ｊｕｒｋａｔ／ＯＸ４０細胞のほぼ全集団が有意にシフトし、ＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０ＬのヒトＯＸ４０Ｌ構成要素が、生存細胞にあるその受容体と結合できることを示した（図１５のパネルＧ）。
【０２０５】
さらに、いくつかのヒト腫瘍細胞株を、フローサイトメトリーによって内因性ヒトＰＤ−Ｌ１発現レベルの差についてスクリーニングした。前立腺癌細胞株（ＰＣ３）がＰＤ−Ｌ１ｌｏｗであり、肺腺癌細胞株（ＨＣＣ８２７）がＰＤ−Ｌ１ｈｉｇｈあることを同定した（図１５のパネルＨ）。ＰＣ３細胞及びＨＣＣ８２７細胞を、漸増量のＳＬ−２７９２５２とインキュベートし、フローサイトメトリーを使用して結合を検出した。ＳＬ−２７９２５２はＰＣ３細胞（ＰＤ−Ｌ１ｌｏｗ）に効率的に結合しなかった（図１５のパネルＩ）。しかしながら、ＳＬ−２７９２５２は、濃度依存的にＨＣＣ８２７細胞（ＰＤ−Ｌ１ｈｉｇｈ）と有意に結合した（図１５のパネルＪ）。これは、ＳＬ−２７９２５２が、細胞表面に発現されたヒトＯＸ４０及びＰＤ−Ｌ１の両方に結合できることを明確に示すものであり、その二重結合機能に関して説得力のある証拠を示した。
【０２０６】
これらの結果を発展させて、ＯＸ４０発現を刺激することが知られている化学的組み合わせ（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート；ＰＭＡ、フィトヘムアグルチニン；ＰＨＡ、及びイオノマイシン）とｅｘ  ｖｉｖｏで２日間誘導した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離した初代Ｔ細胞にＳＬ−２７９２５２を結合させる実験を実施した。予測された通り、ＰＭＡ／ＰＨＡ／Ｉｏｎ処理後のＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞にＯＸ４０発現の大きな増加が観察された（図１６のパネルＡ）。上記の方法を使用して、ＳＬ−２７９２５２のＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞への結合を確認した（図１６のパネルＢ）。ＳＬ−２７９２５２が、ヒトＴ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋の両方）に効率的に結合することが認められた。
【０２０７】
Ｔ細胞活性化／ＩＬ２放出アッセイを利用して、細胞を共培養したときに、腫瘍細胞でのＰＤ−Ｌ１発現が抗腫瘍形成性サイトカインＩＬ２のＴ細胞分泌を阻害する程度を評価した（図１６のパネルＣ）。２日後、活性化Ｔ細胞を、ＳＬ−２７９２５２の存在下または不在下で、放射線照射したＰＤ−Ｌ１ｌｏｗ（ＰＣ３）及びＰＤ−Ｌ１ｈｉｇｈ（ＨＣＣ８２７）を発現する癌細胞株に播種した。初回のＴ細胞単離から最大１週間後まで、ＩＬ２分泌（図１６のパネルＤ）、増殖及びサイトカイン発現（図１６のパネルＥ）を含む、Ｔ細胞活性化の様々な測定値を評価した。ＩＬ２分泌のベースラインレベル（ＳＬ−２７９２５２の不在時）は、Ｔ細胞単離の６日後、ＰＤ−Ｌ１ｈｉｇｈのＨＣＣ８２７細胞との共培養よりも、ＰＤ−Ｌ１ｌｏｗのＰＣ３との共培養の方が有意に高く、腫瘍ＰＤ−Ｌ１発現が、ＩＬ２の分泌によって測定される、Ｔ細胞のさらなる活性化を直接的にも間接的にも抑制することを示唆した（図１６のパネルＤ）。ＰＣ３及びＨＣＣ８２７いずれの共培養でもＳＬ−２７９２５２の添加は、ＩＬ２の分泌を濃度依存的に増加させた。具体的には、ベースライン（ＳＬ−２７９２５２なし）から５ｕｇ／ｍＬのＳＬ−２７９２５２までのＨＣＣ８２７共培養（ＰＤ−Ｌ１ｈｉｇｈ）から観察されたＩＬ−２の増加は、ＰＣ３細胞（ＰＤ−Ｌ１ｌｏｗ）と共培養した場合の１．２７倍と比較して、１．９２倍あった。
【０２０８】
さらに、増殖マーカーＫｉ６７の発現を含む、Ｔ細胞活性化のさらなる特性を分析した（図１６のパネルＥ；上段）。活性化Ｔ細胞とＰＤ−Ｌ１ｈｉｇｈのＨＣＣ８２７細胞との共培養は、ＨＣＣ８２７細胞の不在下（黒線）で観察されたレベルと比較して増殖を阻害した。共培養物にＳＬ−２７９２５２を添加すると、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の両方でＫｉ６７染色が増加した。さらに、活性化Ｔ細胞は、Ｔ細胞を単独で培養した場合よりも、ＨＣＣ８２７細胞と共培養した場合にサイトカインＩＦＮγ及びＴＮＦαをより高レベルで発現した（図１６のパネルＥ；下段）が、おそらくこれは腫瘍細胞による他の刺激因子の分泌に起因するものである。これらのサイトカインの発現は、ＳＬ−２７９２５２による処理後に有意に増加した。
【０２０９】
総合すると、これらのデータは、とりわけ、ＳＬ−２７９２５２がそのパートナーＰＤ−Ｌ１及びＯＸ４０と強く結合し、かつｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＤ−Ｌ１陽性ヒト腫瘍細胞によるＰＤ−Ｌ１媒介性Ｔ細胞阻害を逆転できたことを示している。
【０２１０】
実施例５．追加のキメラタンパク質の構築及び特性決定
追加のヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ構築物、ならびにヒトｈＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ｈＰＤ１−Ｆｃ−ＴＬ１Ａ、ｈＢＴＬＡ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ｈＴＭＩＧＤ２−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ｈＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＧＩＴＲＬ、ｍＰＤ１−Ｆｃ−４１ＢＢＬ、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＴＬ１Ａ、ｍＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ、ｈＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、及びイヌＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを含む追加の構築物を作製した。これらの構築物のそれぞれを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の発現にコドン最適化して、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、個々のクローンから高発現したものを選抜した。次いで、高発現クローンを、無血清培地中の撹拌バイオリアクターでの小規模製造に使用し、関連するキメラ融合タンパク質をプロテインＡ結合樹脂カラムで精製した。図１７のパネルＡは、ｈＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ｈＰＤ１−Ｆｃ−ＴＬ１Ａ、ｈＢＴＬＡ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ｈＴＭＩＧＤ２−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ｈＴＩＭ３−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＧＩＴＲＬ、ｍＰＤ１−Ｆｃ−４１ＢＢＬ、ｍＰＤ１−Ｆｃ−ＴＬ１Ａ、ｍＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ、ｈＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを含む、種々のキメラタンパク質のウェスタンブロットによる特性決定を示す。
【０２１１】
結合アッセイを実施し、種々のヒトＥＣＤ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ構築物がｈＯＸ４０に結合する能力を特性決定した。ｈＸＥＣＤ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌに関して、Ｘとは左側の括弧内に列挙された各タンパク質のＥＣＤを指す（図１７のパネルＢを参照）。図１７のパネルＢは、ｈＯＸ４０へのｈＸＥＣＤ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合を検出する際に使用したＥＬＩＳＡ法の模式図を示す。ヒトＦｃに融合した組換えｈＯＸ４０（ｈＯＸ４０−ｈＦｃ）を使用して、培地中のｈＸＥＣＤ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを捕捉した。標的融合タンパク質を捕捉するために使用したｈＯＸ４０融合タンパク質はｈＩｇＧ領域も含んでいるため、標的融合タンパク質を含有する培養上清とインキュベートする前に非ＨＲＰコンジュゲート抗ｈＩｇＧを使用してブロッキングを行った。ｈＩｇＧに対するウサギポリクローナル抗体を使用して、キメラタンパク質中のｈＩｇＧドメインを検出し、続いてそれをウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートポリクローナル抗体を使用して検出した。
【０２１２】
Ｊｕｒｋａｔ細胞の細胞表面に発現したＯＸ４０へのＳＬ−２７９２５２の結合を、フローサイトメトリーによって、ヒトＯＸ４０に結合しないと予測される２つの陰性対照タンパク質と比較した。これらのデータは、ＳＬ−２７９２５２がヒトＯＸ４０に効率的に結合する（左のパネル）が、ヒトＰＤ１−Ｆｃ−ＴＬ１ＡまたはイヌＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０ＬはいずれもヒトＯＸ４０に結合しないことが観察されたことを示している（図１７のパネルＣ）。
【０２１３】
ヒトＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ構築物をタンパク質３次構造予測ソフトウェアＲａｐｔｏｒＸにインポートし、３次構造を決定した。予測される３次構造を図１７のパネルＤに示す。
【０２１４】
複数のキメラ融合タンパク質のコドン最適化ＤＮＡ配列を合成し、ｐＶＩＴＲＯ２、ｐｃＤＮＡ３．４、及び他の発現ベクターに一方向にクローニングした。次いで、ベクターを、ＣＨＯ細胞または２９３細胞に一過性にまたは安定的にトランスフェクトし、個々のクローンから高発現したものを選抜した。例えば、２９３細胞からの一過性トランスフェクションによりＳＬ−２７９２５２を産生し、アフィニティークロマトグラフィーによってプロテインＡカラムを通して精製し、クマシー染色、ウェスタンブロット法で評価し、ＢＣＧ標準と比較して定量した（図１７のパネルＥ）。
【０２１５】
別の例では、２９３細胞からの一過性トランスフェクションによりＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを産生し、アフィニティークロマトグラフィーによってプロテインＡカラムを通して精製し、クマシー染色、ウェスタンブロット法で評価し、ＢＣＧ標準と比較して定量した（図１７のパネルＦ）。別の例では、２９３細胞からの一過性トランスフェクションによりＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌを産生し、アフィニティークロマトグラフィーによってプロテインＡカラムを通して精製し、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐシステムによって評価し、ＢＣＧ標準と比較して定量した（図１７のパネルＧ）。別の例では、２９３細胞からの一過性トランスフェクションによりヒトＴＩＧＩＴ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを産生し、アフィニティークロマトグラフィーによってプロテインＡカラムを通して精製し、クマシー染色、ウェスタンブロット法で評価し、ＢＣＧ標準と比較して定量した（図１７のパネルＨ）。
【０２１６】
ｈＣＤ４７、ｈＯＸ４０、及び種々のヒトＦｃ受容体に対するヒトＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によって評価した（図１７のパネルＩ〜Ｍ）。具体的には、組換えヒトＣＤ４７及びヒトＯＸ４０のポリヒスチジン標識型を、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＨＴＧ  ｔｒｉｓ−ＮＴＡチップ（ＢＩＯＲＡＤ）に結合させた。次いで、ある時間経過にわたってＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを、結合されたリガンド上に流し、「結合速度」（Ｋａ）及び「解離速度」（Ｋｄ）の相対指数を求め、各パートナーに対するＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合親和性（ＫＤ）を算出した。結合には、組換えヒトＣＤ４７−Ｆｃ及びＯＸ４０Ｌ−Ｆｃを陽性対照として使用した。これらの対照は、比較的「結合速度」が速く、かつ同様に「解離速度」が速いため、結果として低ナノモルの結合親和性が得られる。これらの結果と一致して、ヒトＣＤ４７に対するＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの「結合速度」は迅速であったが、解離速度ははるかに低く、実際には、組換えＣＤ４７−Ｆｃの「解離速度」よりも約４０倍遅く、これは、ＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌが迅速かつ安定的に結合し、オンターゲットで長時間滞留したことを示している（図１７のパネルＩ）。ヒトＣＤ４７に対するＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合のＫＤは３．５９ｎＭであると算出された。ＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌは、ヒトＯＸ４０に高親和性で結合し（８６９ｐＭ）、ここでも速い「結合速度」と、遅い「解離速度」を示した（図１７のパネルＪ）。
【０２１７】
ＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの分子特性をさらに定義するために、ＳＰＲを実施して、チップ結合したＦｃγ受容体ＦｃγＲ１Ａ及び新生児受容体ＦｃＲｎに対するＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合親和性を分析した。ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１は、ＦｃγＲ２ｂへの結合が低レベルであることに加え、ＦｃγＲ１Ａに対して最も高い親和性で、続いてＦｃＲｎに結合することが示された（図１７のパネルＫ及びＬ）。ＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌは、ＦｃγＲ１ＡまたはＦｃγＲ２Ｂに結合しなかったが、７９０ｎＭの親和性でＦｃＲｎに結合した（図１７のパネルＬ）。理論に束縛されるものではないが、ＦｃＲｎが細胞表面へのＩｇＧのリサイクリングに関与し、それによってリソソーム分解を回避し、潜在的にＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長するため、この結合特性は融合タンパク質にとって重要であり得る。ＣＤ１７２ａ−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合親和性に関する要約データも記載されている（図１７のパネルＭ）。
【０２１８】
複数の追加キメラ融合タンパク質のコドン最適化ＤＮＡ配列を合成し、ｐＶＩＴＲＯ２、ｐｃＤＮＡ３．４、及び他の発現ベクターに一方向にクローニングした。次いで、ベクターを、ＣＨＯ細胞または２９３細胞に一過性にまたは安定的にトランスフェクトし、個々のクローンから高発現したものを選抜した。例えば、２９３細胞からの一過性トランスフェクションによりイヌＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを産生し、アフィニティークロマトグラフィーによってプロテインＡカラムを通して精製し、クマシー染色、ウェスタンブロット法で評価し、ＢＣＧ標準と比較して定量した（図１７のパネルＮ）。別の例では、２９３細胞からの一過性トランスフェクションによりマウスＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを産生し、アフィニティークロマトグラフィーによってプロテインＡカラムを通して精製し、クマシー染色、ウェスタンブロット法で評価し、ＢＣＧ標準と比較して定量した（図１７のパネルＯ）。別の例では、２９３細胞からの一過性トランスフェクションによりマウスＰＤ１−Ｆｃ−ＧＩＴＲＬを産生し、アフィニティークロマトグラフィーによってプロテインＡカラムを通して精製し、クマシー染色、ウェスタンブロット法で評価し、ＢＣＧ標準と比較して定量した（図１７のパネルＰ）。別の例では、２９３細胞からの一過性トランスフェクションによりマウスＰＤ１−Ｆｃ−４１ＢＢＬを産生し、アフィニティークロマトグラフィーによってプロテインＡカラムを通して精製し、クマシー染色、ウェスタンブロット法で評価し、ＢＣＧ標準と比較して定量した（図１７のパネルＱ）。別の例では、２９３細胞からの一過性トランスフェクションによりマウスＰＤ１−Ｆｃ−ＴＬ１Ａを産生し、アフィニティークロマトグラフィーによってプロテインＡカラムを通して精製し、クマシー染色、ウェスタンブロット法で評価し、ＢＣＧ標準と比較して定量した（図１７のパネルＲ）。さらに別の例では、２９３細胞からの一過性トランスフェクションによりＣＤ１１５−Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌを産生し、アフィニティークロマトグラフィーによってプロテインＡカラムを通して精製し、クマシー染色、ウェスタンブロット法で評価し、ＢＣＧ標準と比較して定量した（図１７のパネルＳ）。
【０２１９】
各精製タンパク質を、マーカー、例えば、目的の抑制リガンドならびに目的の共刺激受容体に結合させ、ＥＬＩＳＡアッセイによって特性決定する。例えば、精製したヒトＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの結合を試験するには、組換えＰＤ−Ｌ１−Ｆｃをマイクロタイタープレートに吸着させ、ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌの捕捉に使用する。次に、結合した任意のＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌを、ビオチンと結合した組換えヒトＯＸ４０−Ｆｃを使用して検出し、次いでこれを発色アッセイでストレプトアビジン−ＨＲＰとの結合により検出する。
【０２２０】
さらに、各精製タンパク質を、目的の抑制リガンドならびに目的の共刺激受容体に結合させ、フローサイトメトリーによって特性決定する。例えば、ヒト腫瘍細胞株は、いくつかのヒト黒色腫腫瘍細胞株で特に豊富であることが見出された、ＰＤ−Ｌ１の内因性発現を特徴とする。この同じ腫瘍細胞株は、ヒトＯＸ４０Ｌに対して陰性を示した。ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌとのインキュベーション後、結合した任意のキメラ融合タンパク質をヒトＯＸ４０Ｌ特異的抗体で検出する。同様に、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞をヒトＯＸ４０でトランスフェクトし、これがヒトＰＤ−Ｌ１に対して陰性であることが示された。キメラＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ構築物とのインキュベーション後、抗ヒトＰＤ−Ｌ１特異的抗体を使用して任意の結合複合体を検出する。一連のスクリーニング細胞株を作製して、キメラ融合タンパク質それぞれの対応する受容体／リガンドへの特異的細胞表面結合を検出した。細胞株には以下を含む：ＣＨＯ−Ｋ１−ＣＤ４７、ＣＨＯ−Ｋ１−ＰＤ−Ｌ１、ＣＨＯ−Ｋ１−ＨＶＥＭ、ＣＨＯ−Ｋ１−ＨＨＬＡ２、ＣＨＯ−Ｋ１−ＶＩＳＴＡ、ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇａｌ９、ＨｅＬａ−ＰＤ−Ｌ１、ＨｅＬａ−ＣＤ４７、ＨｅＬａ−ＨＶＥＭ、ＨｅＬａ−ＨＨＬＡ２、ＨｅＬａ−ＶＩＳＴＡ、ＨｅＬａ−Ｇａｌ９。
【０２２１】
各受容体の機能的活性を決定するには、抑制リガンド陽性ヒト腫瘍細胞の存在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏＴ細胞増殖アッセイを実施する。例えば、ＰＤ−Ｌ１を発現するヒト黒色腫腫瘍細胞に、鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）に特異的なペプチドをパルスし、ＯＸ４０受容体を発現するヒトＨＥＬ特異的Ｔ細胞とインキュベートする。これらの細胞の増殖を、ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ構築物の存在下及び不在下でモニターすると、キメラ構築物の存在に対して機能的に応答性であることが認められる。同様の系において、ＨＶＥＭ、ＣＤ４７、ガレクチン−９、ＴＩＧＩＴ受容体、またはＴＭＩＧＤ２受容体を発現するヒト腫瘍を使用する。
【０２２２】
いくつかの実験では、マウスＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０ＬまたはマウスＰＤ−１−Ｆｃ−ＴＬ１Ａを、マウスＰＤ−Ｌ１に対して陽性であることが知られているマウス腫瘍（Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫、ＭＣ３８結腸癌、及びＣＴ２６結腸癌を含む）の処理に使用する。これらの系では、樹立した腫瘍を精製されたキメラ融合タンパク質で処置し、ＰＤ−１−Ｆｃ融合タンパク質、抗ＰＤ−１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体、または抗ＯＸ４０もしくは抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体と比較する。これらの実験では、キメラ構築物の活性が、個々の治療法と比較して、抗原特異的Ｔ細胞応答の増強及び腫瘍拒絶率の増加をもたらすことが観察される。いくつかの実験では、ＰＤ−１−Ｆｃ−ＯＸ４０ＬまたはＰＤ−１−Ｆｃ−ＴＬ１Ａをコードする核酸構築物を、樹立した腫瘍に直接エレクトロポレーションする。この実験では、キメラ構築物が、末梢血中及び樹立した腫瘍内部の両方で検出される腫瘍拒絶率の増加ならびに腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞増殖の増加をもたらすことが示される。
【０２２３】
精製したキメラ融合タンパク質のヒト腫瘍外植体への結合を決定するには、新鮮な凍結ヒト腫瘍サンプルを入手し、各キメラ融合タンパク質とインキュベートする。結合した任意の融合タンパク質を抗ヒトＯＸ４０Ｌで検出し、抗ヒトＯＸ４０Ｌによる個々の染色によってバックグラウンド染色を制御する。
【０２２４】
各融合タンパク質の分子特性を決定するには、精製したキメラ融合タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーによって特性決定する。例えば、ＯＸ４０Ｌ  ＥＣＤはホモ三量体を形成することが知られているが、Ｆｃ領域はホモ二量体を形成することが知られており、抑制リガンド結合受容体は単量体（例えばＰＤ−１）である場合も、ホモ多量体（例えば、ＴＩＭ３）を形成する場合もあるため、この分析は重要である。したがって、これらのキメラ構築物によって形成され得る個々の種には、いくつかの可能性が存在する。質量分析、熱安定性、ｐＨ安定性、物理的安定性、電荷プロファイル、疎水性、物理的安定性、緩衝液適合性、及び最大１００ｍｇ／ｍＬの溶解度によるさらなる分子特性決定も実施する。
【０２２５】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
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【表１−１７】
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【表１−１８】
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【表１−１９】
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【表１−２０】
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【表１−２１】
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【表１−２２】
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【表１−２３】
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【表１−２４】
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【表１−２５】
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【表１−２６】
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【表１−２７】
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【表１−２８】
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【表１−２９】
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【表１−３０】
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【表１−３１】
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【表１−３２】
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【表１−３３】
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【表１−３４】
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【表１−３５】
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【表１−３６】
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【表１−３７】
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【表１−３８】
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【表１−３９】
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【表１−４０】
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【表１−４１】
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【表１−４２】
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【表１−４３】
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【表１−４４】
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【表１−４５】
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【表１−４６】
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【表１−４７】
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【表１−４８】
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【表１−４９】
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【表１−５０】
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【表１−５１】
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【表１−５２】
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【表１−５３】
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【表１−５４】
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【表１−５５】
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【表１−５６】
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【表１−５７】
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【表１−５８】
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【表１−５９】
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【表１−６０】
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【表１−６１】
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【表１−６２】
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【表１−６３】
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【表１−６４】
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【表１−６５】
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【表１−６６】
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【表１−６７】
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【表１−６８】
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【表１−６９】
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【表１−７０】
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【表１−７１】
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【表１−７２】
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【表１−７３】
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【表１−７４】
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【表１−７５】
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【表１−７６】
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【表１−７７】
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【表１−７８】
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【表１−７９】
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【表１−８０】
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【表１−８１】
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【表１−８２】
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【表１−８３】
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【表１−８４】
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【表１−８５】
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【表１−８６】
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【表１−８７】
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【０２２６】
【表２−１】
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【表２−３４】
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【表２−３５】
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【表２−３７】
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【表２−３８】
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【表２−３９】
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【表２−４０】
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【表２−４２】
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【表２−４４】
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【表２−４７】
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【表２−４８】
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【表２−４９】
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【表２−５０】
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【表２−５１】
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【表２−５２】
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【表２−５３】
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【表２−５４】
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【表２−５５】
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【表２−５６】
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【表２−５７】
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【表２−５８】
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【表２−５９】
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【表２−６０】
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【表２−６１】
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【表２−６２】
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【表２−６３】
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【表２−６４】
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【表２−６５】
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【表２−６６】
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【０２２７】
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【０２２８】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）配列番号３２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、場合により、（ｉｉｉ）配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるＩｇリンカーとを含み、その場合、同じく場合によって（ｉ）及び（ｉｉ）の１つ以上は、（ｉｖ）配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、またはその変種の連結リンカーを介して（ｉｉｉ）に連結されている。様々な実施形態において、リンカー（ｉｉｉ）または（ｉｖ）は、配列番号２３〜３１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列で代用することができる。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、場合により、（ｉｉｉ）配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるＩｇリンカーとを含み、その場合、同じく場合によって（ｉ）及び（ｉｉ）の１つ以上は、（ｉｖ）配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、またはその変種の連結リンカーを介して（ｉｉｉ）に連結されている。様々な実施形態において、リンカー（ｉｉｉ）または（ｉｖ）は、配列番号２３〜３１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列で代用することができる。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）配列番号３４のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、場合により、（ｉｉｉ）配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるＩｇリンカーとを含み、その場合、同じく場合によって（ｉ）及び（ｉｉ）の１つ以上は、（ｉｖ）配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、またはその変種の連結リンカーを介して（ｉｉｉ）に連結されている。様々な実施形態において、リンカー（ｉｉｉ）または（ｉｖ）は、配列番号２３〜３１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列で代用することができる。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）配列番号３５のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、場合により、（ｉｉｉ）配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるＩｇリンカーとを含み、その場合、同じく場合によって（ｉ）及び（ｉｉ）の１つ以上は、（ｉｖ）配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、またはその変種の連結リンカーを介して（ｉｉｉ）に連結されている。様々な実施形態において、リンカー（ｉｉｉ）または（ｉｖ）は、配列番号２３〜３１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列で代用することができる。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、場合により、（ｉｉｉ）配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるＩｇリンカーとを含み、その場合、同じく場合によって（ｉ）及び（ｉｉ）の１つ以上は、（ｉｖ）配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、またはその変種の連結リンカーを介して（ｉｉｉ）に連結されている。様々な実施形態において、リンカー（ｉｉｉ）または（ｉｖ）は、配列番号２３〜３１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列で代用することができる。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、場合により、（ｉｉｉ）配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるＩｇリンカーとを含み、その場合、同じく場合によって（ｉ）及び（ｉｉ）の１つ以上は、（ｉｖ）配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、またはその変種の連結リンカーを介して（ｉｉｉ）に連結されている。様々な実施形態において、リンカー（ｉｉｉ）または（ｉｖ）は、配列番号２３〜３１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列で代用することができる。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）配列番号３８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、場合により、（ｉｉｉ）配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるＩｇリンカーとを含み、その場合、同じく場合によって（ｉ）及び（ｉｉ）の１つ以上は、（ｉｖ）配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、またはその変種の連結リンカーを介して（ｉｉｉ）に連結されている。様々な実施形態において、リンカー（ｉｉｉ）または（ｉｖ）は、配列番号２３〜３１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列で代用することができる。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）配列番号３９のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、場合により、（ｉｉｉ）配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるＩｇリンカーとを含み、その場合、同じく場合によって（ｉ）及び（ｉｉ）の１つ以上は、（ｉｖ）配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、またはその変種の連結リンカーを介して（ｉｉｉ）に連結されている。様々な実施形態において、リンカー（ｉｉｉ）または（ｉｖ）は、配列番号２３〜３１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列で代用することができる。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）配列番号４０のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、場合により、（ｉｉｉ）配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるＩｇリンカーとを含み、その場合、同じく場合によって（ｉ）及び（ｉｉ）の１つ以上は、（ｉｖ）配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、またはその変種の連結リンカーを介して（ｉｉｉ）に連結されている。様々な実施形態において、リンカー（ｉｉｉ）または（ｉｖ）は、配列番号２３〜３１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列で代用することができる。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）配列番号４１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、場合により、（ｉｉｉ）配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるＩｇリンカーとを含み、その場合、同じく場合によって（ｉ）及び（ｉｉ）の１つ以上は、（ｉｖ）配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、またはその変種の連結リンカーを介して（ｉｉｉ）に連結されている。様々な実施形態において、リンカー（ｉｉｉ）または（ｉｖ）は、配列番号２３〜３１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列で代用することができる。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）配列番号４２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、場合により、（ｉｉｉ）配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるＩｇリンカーとを含み、その場合、同じく場合によって（ｉ）及び（ｉｉ）の１つ以上は、（ｉｖ）配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、またはその変種の連結リンカーを介して（ｉｉｉ）に連結されている。様々な実施形態において、リンカー（ｉｉｉ）または（ｉｖ）は、配列番号２３〜３１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列で代用することができる。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）配列番号４３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、場合により、（ｉｉｉ）配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるＩｇリンカーとを含み、その場合、同じく場合によって（ｉ）及び（ｉｉ）の１つ以上は、（ｉｖ）配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、またはその変種の連結リンカーを介して（ｉｉｉ）に連結されている。様々な実施形態において、リンカー（ｉｉｉ）または（ｉｖ）は、配列番号２３〜３１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列で代用することができる。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）配列番号４４のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、場合により、（ｉｉｉ）配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるＩｇリンカーとを含み、その場合、同じく場合によって（ｉ）及び（ｉｉ）の１つ以上は、（ｉｖ）配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、またはその変種の連結リンカーを介して（ｉｉｉ）に連結されている。様々な実施形態において、リンカー（ｉｉｉ）または（ｉｖ）は、配列番号２３〜３１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列で代用することができる。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）配列番号４５のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、場合により、（ｉｉｉ）配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるＩｇリンカーとを含み、その場合、同じく場合によって（ｉ）及び（ｉｉ）の１つ以上は、（ｉｖ）配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、またはその変種の連結リンカーを介して（ｉｉｉ）に連結されている。様々な実施形態において、リンカー（ｉｉｉ）または（ｉｖ）は、配列番号２３〜３１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列で代用することができる。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、場合により、（ｉｉｉ）配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるＩｇリンカーとを含み、その場合、同じく場合によって（ｉ）及び（ｉｉ）の１つ以上は、（ｉｖ）配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、またはその変種の連結リンカーを介して（ｉｉｉ）に連結されている。様々な実施形態において、リンカー（ｉｉｉ）または（ｉｖ）は、配列番号２３〜３１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列で代用することができる。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、場合により、（ｉｉｉ）配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるＩｇリンカーとを含み、その場合、同じく場合によって（ｉ）及び（ｉｉ）の１つ以上は、（ｉｖ）配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、またはその変種の連結リンカーを介して（ｉｉｉ）に連結されている。様々な実施形態において、リンカー（ｉｉｉ）または（ｉｖ）は、配列番号２３〜３１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列で代用することができる。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、場合により、（ｉｉｉ）配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるＩｇリンカーとを含み、その場合、同じく場合によって（ｉ）及び（ｉｉ）の１つ以上は、（ｉｖ）配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、またはその変種の連結リンカーを介して（ｉｉｉ）に連結されている。様々な実施形態において、リンカー（ｉｉｉ）または（ｉｖ）は、配列番号２３〜３１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列で代用することができる。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、場合により、（ｉｉｉ）配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるＩｇリンカーとを含み、その場合、同じく場合によって（ｉ）及び（ｉｉ）の１つ以上は、（ｉｖ）配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、またはその変種の連結リンカーを介して（ｉｉｉ）に連結されている。様々な実施形態において、リンカー（ｉｉｉ）または（ｉｖ）は、配列番号２３〜３１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列で代用することができる。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）配列番号５０のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、場合により、（ｉｉｉ）配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるＩｇリンカーとを含み、その場合、同じく場合によって（ｉ）及び（ｉｉ）の１つ以上は、（ｉｖ）配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、またはその変種の連結リンカーを介して（ｉｉｉ）に連結されている。様々な実施形態において、リンカー（ｉｉｉ）または（ｉｖ）は、配列番号２３〜３１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列で代用することができる。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）配列番号５１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、場合により、（ｉｉｉ）配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるＩｇリンカーとを含み、その場合、同じく場合によって（ｉ）及び（ｉｉ）の１つ以上は、（ｉｖ）配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、またはその変種の連結リンカーを介して（ｉｉｉ）に連結されている。様々な実施形態において、リンカー（ｉｉｉ）または（ｉｖ）は、配列番号２３〜３１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列で代用することができる。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）配列番号５２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、場合により、（ｉｉｉ）配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるＩｇリンカーとを含み、その場合、同じく場合によって（ｉ）及び（ｉｉ）の１つ以上は、（ｉｖ）配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、またはその変種の連結リンカーを介して（ｉｉｉ）に連結されている。様々な実施形態において、リンカー（ｉｉｉ）または（ｉｖ）は、配列番号２３〜３１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列で代用することができる。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）配列番号５３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、場合により、（ｉｉｉ）配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるＩｇリンカーとを含み、その場合、同じく場合によって（ｉ）及び（ｉｉ）の１つ以上は、（ｉｖ）配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、またはその変種の連結リンカーを介して（ｉｉｉ）に連結されている。様々な実施形態において、リンカー（ｉｉｉ）または（ｉｖ）は、配列番号２３〜３１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列で代用することができる。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）配列番号５４のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、場合により、（ｉｉｉ）配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるＩｇリンカーとを含み、その場合、同じく場合によって（ｉ）及び（ｉｉ）の１つ以上は、（ｉｖ）配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、またはその変種の連結リンカーを介して（ｉｉｉ）に連結されている。様々な実施形態において、リンカー（ｉｉｉ）または（ｉｖ）は、配列番号２３〜３１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列で代用することができる。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）配列番号５５のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列と、場合により、（ｉｉｉ）配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるＩｇリンカーとを含み、その場合、同じく場合によって（ｉ）及び（ｉｉ）の１つ以上は、（ｉｖ）配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、またはその変種の連結リンカーを介して（ｉｉｉ）に連結されている。様々な実施形態において、リンカー（ｉｉｉ）または（ｉｖ）は、配列番号２３〜３１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列で代用することができる。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、配列番号２２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、もしくは９３％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２６０】
等価物
本発明はその特定の実施形態に関連して説明されているが、さらなる改変が可能であること、ならびに本出願が、本発明の原理に一般的に従う本発明のいかなる変形例、使用法、または適合例も包含し、また本発明が関係する技術分野の範囲内で既知の慣例または慣行の範囲内で考案されるような本開示からの逸脱、及び添付の特許請求の範囲の範囲内に定められ、それに従う上記の本質的な特徴に該当し得るような逸脱を含むことを意図するものであることが理解されよう。
【０２６１】
当業者は、本明細書に具体的に記載された特定の実施形態に対する多数の等価物を認識しているか、または日常的な実験のみを用いて確認することができる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。
【０２６２】
参照による組み込み
本明細書で参照するすべての特許及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２６３】
本明細書で考察する刊行物は、本出願の出願日前のその開示のためにのみ提供される。本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明を理由としてこのような刊行物に先行する権利を与えられないことを容認するものとは見なされない。
【０２６４】
本明細書で使用される場合、すべての見出しは、単に構成のためのものであり、いかなる方法でも本開示を限定することを意図するものではない。任意の個々のセクションの内容は、すべてのセクションに等しく適用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１７−５】
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【図１７−６】
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【図１７−７】
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【図１７−８】
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【図１７−９】
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【図１７−１０】
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【図１７−１１】
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【図１７−１２】
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【図１７−１３】
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【図１７−１４】
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【図１７−１５】
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【図１７−１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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