(57)【要約】  金属銀（Ａｇ）のナノサイズ粒子、カルボラート基を含むポリマー、Ａｇに結合できる少なくとも１つの基を含むカルボキシラート分子、および金属イオンを含むゲルであって、局所的に適用される抗菌剤として有用なゲル。【選択図】図６
2018538235.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲルであって、
（ｉ）金属銀（Ａｇ）のナノサイズ粒子、
（ｉｉ）カルボキシラート基を含むポリマー、
（ｉｉｉ）Ａｇに結合できる少なくとも１つの基を含むカルボキシラート分子、および
（ｉｖ）金属イオン
を含むゲルであって、
前記Ａｇ粒子の少なくとも一部が式（Ｉ）：
Ａｇ−Ｘ−Ｍ−Ｘ−Ａｇ  （Ｉ）
（式中Ｘはカルボキシラート分子であり、およびＭは金属イオンである）
に示されるようにカルボキシラート−金属イオン架橋を介して互いに結合しており、および
前記Ａｇ粒子の少なくとも一部が式（ＩＩ）：
Ａｇ−Ｘ−Ｍ−Ｙ  （ＩＩ）
（式中Ｘはカルボキシラート分子であり、Ｍは金属イオンであり、およびＹは前記ポリマーのカルボキシラート基である）
に示されるようにカルボキシラート−金属イオン架橋を介してポリマー鎖に結合している、ゲル。
【請求項２】
前記ポリマーが多糖である、請求項１に記載のゲル。
【請求項３】
前記ポリマーがアルギン酸、ヒアルロン酸、ポリグルタミン酸、ポリガラクツロン酸、およびカルボキシメチルセルロースを含む群から選択される、請求項１または請求項２に記載のゲル。
【請求項４】
前記Ａｇに結合できる基がチオール基またはアミン基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のゲル。
【請求項５】
前記カルボキシラート分子がアルキルカルボキシラート分子である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のゲル。
【請求項６】
前記アルキルカルボキシラート分子が直鎖状もしくは分枝状、環式もしくは非環式、芳香族もしくは非芳香族のＣ４−Ｃ１０アルキルカルボキシラート分子である、請求項５に記載のゲル。
【請求項７】
前記カルボキシラート分子が６−メルカプトヘキサン酸、８−メルカプトオクタン酸、メルカプトコハク酸、４−メルカプト安息香酸、４−メルカプトフェニル酢酸、リポ酸、ジヒドロリポ酸、グルタチオン、ペニシラミン、５−（４−アミノ−６−ヒドロキシ−２−メルカプト−５−ピリミジニル）ペンタン酸、および２−メルカプト−４−メチル−５−チアゾール酢酸を含む群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のゲル。
【請求項８】
前記金属イオンが二価金属イオンである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のゲル。
【請求項９】
前記二価金属イオンがカルシウムイオン、亜鉛イオン、マグネシウムイオンまたはストロンチウムイオンである、請求項８に記載のゲル。
【請求項１０】
２３０〜１０２５μｇ／ｍＬの範囲でＡｇ濃度を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載のゲル。
【請求項１１】
請求項１に記載のゲルを調製する方法であって、
（ｉ）Ａｇのナノサイズ粒子を形成するために還元剤でＡｇ塩を処理するステップ、
（ｉｉ）Ａｇ−カルボキシラート分子の溶液を形成するためにカルボン酸でＡｇ粒子を処理するステップ、および
（ｉｉｉ）前記ゲルを形成するために１種または複数種の金属イオンの存在下でＡｇ−カルボキシラート分子をポリマーで処理するステップ
を含む、方法。
【請求項１２】
微生物感染症を処置するまたは防止するための請求項１に記載のゲルの使用。
【請求項１３】
前記微生物感染症が細菌感染症である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記細菌感染症がミュータンスレンサ球菌（ストレプトコッカス・ミュータンス）、ミティスレンサ球菌（ストレプトコッカス・ミティス）、口腔レンサ球菌（ストレプトコッカス・ゴルドニ）、大便レンサ球菌（エンテロコッカス−フェカリス）、オックスフォードブドウ球菌（スタフィロコッカス・オックスフォード）、緑膿菌（シュードモナス・エルジノーサ）または大腸菌（エシェリキア・コリ）によって引き起こされる感染症である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記感染症が歯周炎またはインプラント周囲炎である、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
前記微生物感染症が真菌感染症である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１７】
前記真菌感染症がカンジダ感染症である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記感染症が義歯性口内炎である、請求項１６または請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、銀ナノ粒子を含有する抗菌ゲルに関する。具体的には、本発明は、互いに結合し、かつ官能化アルキルカルボキシラート分子および金属イオンを介してポリマー鎖に結合している銀ナノ粒子を含む構造を有するゲルに関する。本発明は、細菌感染症および真菌感染症を処置または防止するための抗菌剤としてのゲルの使用にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの抗菌治療薬は、経口投与または静脈内投与を目的とする。しかし、そのような方法による投与は、すべての状況で効果的であるというわけではない。例えば、抗菌剤は、感染の部位または感染の高いリスクに曝される部位で局所に適用される必要があり得る。歯周炎（歯肉病）は、抗菌剤の局所適用がより効果的な一疾患である。義歯性口内炎は義歯の装着面下の口腔粘膜に影響を及ぼす炎症状態であり、症例の９０％超においてカンジダが関与している。処置は、抗真菌剤の局所適用を必要とする。抗菌剤の局所適用が必要な、または好ましい他の状況としては、局所止血剤（Ａｃｈｎｅｃｋ，Ｈ．Ｅ．ら，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，２０１０，２５１，２１７−２２８）、皮膚／火傷治癒（Ａｂｄｅｌｂａｒｙ，Ｇ．Ａ．ら，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１４，８６，１７８−１８９；Ｋａｎｔ，Ｖ．ら，Ａｃｔａ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．，２０１４，１１６，５−１３）、皮膚損傷の抗菌処置（Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ら，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，２０１４，８，２９００−２９０７；Ｊｏｄａｒら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１５，１０４，２２４１−２２５４）、および例えば、口腔、乳房、皮膚、膣などを含むがこれらに限定されない部位のカンジダ症を処置するための抗真菌剤の局所送達（Ｊａｉｎ，Ｓ．ら，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．，２０１０，１７，４４３−４５１；Ｓｏｂｅｌ，Ｊ．Ｄ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．，２００３，１８９，１２９７−１３００）が挙げられる。
【０００３】
歯周炎は、歯周辺の支持組織の細菌感染に起因する炎症性疾患である。これは歯の欠損を引き起こし、心血管疾患、脳卒中および早産を含む重態に関連づけられてきた。欠損歯は、歯科用チタンインプラントネジおよび歯冠を使用して置き換えることができる。この極めて効率の高い処置は一般的であるが、高価で、歯肉病に対して脆弱でもある。インプラント周囲粘膜炎は、インプラント周囲の柔らかい歯肉組織に限定される炎症性病変であるが、インプラント周囲炎は支持骨にも影響を及ぼし、痛みを伴い外観を損なう疾患を引き起こし、その結果インプラントが緩み最終的にインプラントが抜け落ちる。インプラント周囲炎はインプラントを有する人の約４０％に見られ、インプラント周囲粘膜賞は約５０％に見られる。
原因となる細菌は、歯周炎および歯の欠損の原因であるものと同じである。歯周炎およびインプラント周囲炎の両方のための現在の多様な療法の戦略は、バイオフィルムの物理的破壊および消毒薬と抗生物質による化学療法を含むが、すべてたいした成果もなく、よくても疾患経過を遅らせることができるだけである。
【０００４】
金属銀（Ａｇ）ナノ粒子（ＮＰ）は、耐性の発生なしに、これらの疾病経過に関連するグラム陽性菌およびグラム陰性菌に対する強い抗菌活性を示す。Ａｇナノ粒子は一般的に、感染部位に直接適用される（インプラント周囲炎の処置に効果があると証明されている全身に送達される抗生物質とは異なる）。
【０００５】
ヨウ素またはクロルヘキシジンなどの消毒リンスとは対照的に、抗菌剤がゲル構造で送達される場合、持続的な抗菌活性が可能であると見込まれる。ゲルは、より長い間ポケット感染スペース内に保持される可能性が高い。
【０００６】
アルギン酸塩またはアルギン酸は、Ｄ−マンヌロン酸塩（Ｍ）とＬ−グルロン酸塩（Ｇ）のユニットを含む天然起源の親水性で線状のコポリマーである。アルギン酸塩とアルギン酸塩系材料は、一般にヒドロゲル形態で、組織工学、創傷被覆材とドラッグデリバリーを含む生物医学的応用のために開発された。ヒドロゲルは、大量の水または生体液を蓄積できる架橋親水性ポリマー鎖の相互に貫通する、３次元網状組織からなる材料の種類であり、材料を膨張させることができる。アルギン酸塩のヒドロゲルは、隣接したポリマー鎖の物理的（例えば、イオン相互作用）および／または共有結合的な架橋を通して形成できる。
【０００７】
アルギン酸ヒドロゲルを生成する最も一般的な方法は、イオン架橋による方法である。アルギン酸塩は、二価金属イオン（例えばＢａ２＋、Ｓｒ２＋とＣａ２＋）をＬ−グルロン酸塩（Ｇ）で選択的に結合する。このように、隣接するポリマー鎖のＧ−ブロックがカルボキシラート部分との相互作用を介して二価陽イオンによって架橋されると、ゲル網状組織が形成され得る。
【０００８】
銀イオンおよび／またはＡｇナノ粒子をアルギン酸溶液および／またはゲルに組み込む試みは種々の方法を使用してなされており、成果の程度は様々である。ガンマ照射を使用してアルギン酸溶液（ゲルではなく）中でＡｇナノ粒子を合成して、アルギン酸ポリマーによって安定化されたＡｇナノ粒子によるコロイド状Ａｇナノ粒子分散物をもたらした。アルギン酸塩安定化Ａｇナノ粒子の水性懸濁液が、アルギン酸ナトリウムの粘性溶液の存在下でＮａＢＨ４によるＡｇＮＯ３の還元によって生成された。凍結乾燥、架橋を誘導するためのＣａＣｌ２への曝露、およびさらなるプロセシングの後で、不溶性アルギン酸−Ａｇナノ粒子複合スポンジが形成され、これは黄色ブドウ球菌および肺炎桿菌に対して、アルギン酸スポンジと比較して、向上した抗菌活性を有すると報告された。水性媒体中でのアルギン酸塩安定化Ａｇナノ粒子のマイクロ波支援合成が報告されており、この合成ではアルギン酸ナトリウムが還元剤と安定化剤の両方として機能した。アルギン酸塩安定化Ａｇナノ粒子懸濁液は、大腸菌（Ｅ．コリ）および黄色ブドウ球菌（Ｓ．アウレウス）に対して活性であることがわかった（しかし試験されたサンプルの最終銀濃度は報告されていない）。Ａｇナノ粒子／アルギン酸懸濁液からヒドロゲルを調製する試みはなされなかった。電気化学的に合成されたＡｇナノ粒子を含有するアルギン酸コロイド溶液の静電気押出しによってＡｇナノ粒子を組み込む、アルギン酸ヒドロゲルマイクロビーズ（直径約４８８μｍ）が調製された。黄色ブドウ球菌に対するマイクロビーズの抗菌活性が示され、結果は、３２μｇ／ｍＬ（約０．３ｍＭ）までの銀がＡｇ＋イオンまたはＡｇナノ粒子のいずれかの形でマイクロビーズから放出され、殺菌効果を誘発することを示した。
【０００９】
アルギン酸塩系でないヒドロゲル網状組織も、Ａｇナノ粒子の組み込みおよび／または調製で使用されている。例えば、Ａｇナノ粒子は、ＮａＢＨ４によるＡｇＮＯ３のｉｎ−ｓｉｔｕ還元によりＮ−イソプロピルアクリルアミドとアクリル酸ナトリウムに基づくヒドロゲル網状組織内で調製された。ポリマー網状組織内に含まれる金属塩のｉｎ−ｓｉｔｕ還元により調製されたそのようなナノ粒子含有ヒドロゲルは、Ａｇナノ粒子の粒径および／または表面化学を正確に調整できない。これはその以降の抗菌活性に影響を与える。
【００１０】
特定の粒径で粒径分布が狭いＡｇナノ粒子の調製、ならびにＡｇナノ粒子がゲル内の架橋部位として役割を果たすことができるように特定の分子で粒子表面を官能化する能力を有し、それによって架橋されたヒドロゲルマトリックス中へのＡｇナノ粒子の組み込みを可能にするＡｇナノ粒子の調製のための簡単な方法の必要性が依然として存在する。現在、本出願者は、物理的架橋を介してＡｇナノ粒子を安定化し、したがってナノ粒子の凝集または非活性化を防止するゲル構造を開発した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、本発明の目的は、微生物感染症を処置するまたは防止するために有用なＡｇナノ粒子含有ゲルを提供すること、または少なくとも有用な代替物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第１の態様において、
（ｉ）金属銀（Ａｇ）のナノサイズ粒子、
（ｉｉ）カルボキシラート基を含むポリマー鎖、
（ｉｉｉ）カルボキシラート分子、および
（ｉｖ）金属イオン
を含むゲルが提供され、ここで
Ａｇ粒子の少なくとも一部が式（Ｉ）：
Ａｇ−Ｘ−Ｍ−Ｘ−Ａｇ  （Ｉ）
（式中Ｘはカルボキシラート分子であり、およびＭは金属イオンである）
に示すように、カルボキシラート−金属イオン架橋を介して互いに結合しており、および
Ａｇ粒子の少なくとも一部が式（ＩＩ）：
Ａｇ−Ｘ−Ｍ−Ｙ  （ＩＩ）
（式中Ｘはカルボキシラート分子であり、Ｍは金属イオンであり、およびＹはポリマー鎖のカルボキシラート基である）
に示すように、カルボキシラート−金属イオン架橋を介してポリマー鎖に結合している。
【００１３】
本発明の第２の態様において、
（ｉ）Ａｇのナノサイズ粒子を形成するために還元剤でＡｇ塩を処理するステップ、
（ｉｉ）Ａｇ−カルボキシラート分子溶液を形成するためにカルボン酸でＡｇ粒子を処理するステップ、および
（ｉｉｉ）ゲルを形成するために１または複数種の金属イオンの存在下でＡｇ−カルボキシラート分子をポリマーで処理するステップ
を含むゲルを調製する方法が提供される。
【００１４】
本発明の別の態様において、微生物の感染を処置するまたは防止するためのゲルの使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】チオクト酸被覆Ａｇナノ粒子の水性懸濁液のｐＨ滴定グラフを示す。
【図２】チオクト酸被覆Ａｇナノ粒子のＴＥＭ画像を示す。
【図３】複数のＴＥＭ顕微鏡像から測定したチオクト酸被覆Ａｇナノ粒子の水性懸濁液中の粒度分布を示すグラフである。
【図４】グラフを示す。
【図５】Ａｇナノ粒子含有アルギン酸ゲルのクライオＴＥＭ顕微鏡像を示す。
【図６】Ａｇナノ粒子含有アルギン酸ゲルの推定構造を示す。
【図７】グラフを示す。
【図８】ａ）口腔レンサ球菌、ｂ）ミティスレンサ球菌、ｃ）ミュータンスレンサ球菌、ｄ）オックスフォードブドウ球菌、ｅ）大便レンサ球菌、ｆ）大腸菌、およびｇ）緑膿菌に関する無処置対照バイオフィルムのＳＥＭ画像を示す。
【図９】ａ）口腔レンサ球菌、ｂ）ミティスレンサ球菌、ｃ）ミュータンスレンサ球菌、ｄ）オックスフォードブドウ球菌、ｅ）大腸菌、およびｆ）緑膿菌に関するアルギン酸ゲル（Ａｇナノ粒子を含まない）で処理したバイオフィルムのＳＥＭ画像を示す。
【図１０】ａ）口腔レンサ球菌、ｂ）ミティスレンサ球菌、ｃ）ミュータンスレンサ球菌、ｄ）オックスフォードブドウ球菌、ｅ）大便レンサ球菌、ｆ）大腸菌、およびｇ）緑膿菌に関する、直接接触方法によりＡｇナノ粒子含有アルギン酸ゲルで処理したバイオフィルムのＳＥＭ画像を示す。
【図１１】ａ）口腔レンサ球菌、ｂ）ミティスレンサ球菌、ｃ）ミュータンスレンサ球菌、ｄ）オックスフォードブドウ球菌、ｅ）大便レンサ球菌、およびｆ）緑膿菌に関する、ニトロセルロース膜方法によりＡｇナノ粒子含有アルギン酸ゲルで処理したバイオフィルムのＳＥＭ画像を示す。
【図１２】カンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０２６１に対するＡｇナノ粒子Ｐ含有アルギン酸ゲルの抗真菌活性を示す。
【図１３】疾患がない対疾患の、インプラント部位での微生物学的サンプルの二次元ＰＣ空間でのＰＣＡスコアプロットを示す。
【図１４】疾患がない対疾患の、小臼歯部位での微生物学的サンプルの二次元ＰＣ空間でのＰＣＡスコアプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のゲルは、Ａｇナノ粒子を含有するポリマーマトリックスを含む。一部のＡｇナノ粒子はアルキルカルボキシラート分子と金属イオンを介して互いに結合するが、他のＡｇナノ粒子はアルキルカルボキシラート分子と金属イオンを介してポリマー鎖にも結合する。
【００１７】
「ナノ−」または「ナノサイズ」という用語は、ナノメートル範囲で、一般的には数ナノメートル〜数百ナノメートルで、少なくとも１つのサイズ、寸法または尺度を有することを意味する。「ナノ粒子」または「ＮＰ」はしたがって、数ナノメートル〜数百ナノメートルの範囲で少なくとも１つの寸法、例えば直径を有するあらゆる粒子である。
【００１８】
「アルキル」という用語は、分岐状か直鎖状か、および飽和か不飽和かを含む任意の炭化水素部分を意味する。
【００１９】
「カルボキシラート」という用語は、カルボン酸、すなわち−ＣＯＯ，の共役塩基を意味する。
【００２０】
「アルキルカルボキシラート」という用語は、アルキルカルボン酸、すなわちＲがアルキル基であるＲＣＯＯ−の共役塩基を意味する。
【００２１】
「ゲル」という用語は、定常状態にある場合に流れを示さない、実質的に希釈された架橋系を意味する。
【００２２】
「ヒドロゲル」という用語は、親水性であるポリマー鎖の網状組織を含むゲルを意味する。ヒドロゲルは、吸収性が高い（９０％以上の水分を含み得る）天然のまたは合成のポリマー網状組織である。
【００２３】
「ポリマー」という用語は、複数の繰り返しサブユニットを含む合成のまたは天然の高分子を意味する。
【００２４】
「ポリマー鎖」という用語は、鎖の形で共に連結した複数のサブユニットを含むある長さのポリマーを意味する。
【００２５】
本発明のゲルは、
（ｉ）金属銀（Ａｇ）のナノサイズ粒子、
（ｉｉ）カルボキシラート基を含むポリマー、
（ｉｉｉ）Ａｇに結合できる少なくとも１つの基を含むカルボキシラート分子、および
（ｉｖ）金属イオン
を含み、ここで
Ａｇ粒子の少なくとも一部が式（Ｉ）：
Ａｇ−Ｘ−Ｍ−Ｘ−Ａｇ  （Ｉ）
（式中Ｘはカルボキシラート分子であり、およびＭは金属イオンである）
に示すように、カルボキシラート−金属イオン架橋を介して互いに結合しており、および
Ａｇ粒子の少なくとも一部が式（ＩＩ）：
Ａｇ−Ｘ−Ｍ−Ｙ  （ＩＩ）
（式中Ｘはカルボキシラート分子であり、Ｍは金属イオンであり、およびＹはこのポリマーのカルボキシラート基である）
に示すように、カルボキシラート−金属イオン架橋を介してポリマー鎖に結合している。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態において、ポリマーは多糖、例えばアルギン酸、ヒアルロン酸、ポリグルタミン酸、ポリガラクツロン酸、およびカルボキシメチルセルロースまたは任意の他の適切な多糖もしくは多糖の混合物である。
【００２７】
ポリマーは、主鎖ポリマー鎖（多糖であっても、なくても）を含んでよく、および多糖鎖、例えば主鎖ポリマー鎖からの側鎖もしくは補助鎖としてのアルギネート鎖もしくは修飾アルギネート鎖を含んでよい。さらに、多糖鎖は、側鎖、補助鎖および／または主鎖の間で架橋されてもよい。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態において、Ａｇに結合できる基は、チオール基またはアミン基である。
【００２９】
アルキルカルボキシラート分子は、Ａｇに結合できる２つ以上の基、例えばジスルフィド部分の２つのチオール基を含み得る。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態において、カルボキシラート分子は、アルキルカルボキシラート分子である。好ましくは、アルキルカルボキシラート分子は直鎖状もしくは分枝状の、環式もしくは非環式の、芳香族もしくは非芳香族のＣ４−Ｃ１０アルキルカルボキシラート分子である。
【００３１】
カルボキシラート分子の例としては、６−メルカプトヘキサン酸、８−メルカプトオクタン酸、メルカプトコハク酸、４−メルカプト安息香酸、４−メルカプトフェニル酢酸、リポ酸（チオクト酸）、ジヒドロリポ酸、グルタチオン、ペニシラミン、５−（４−アミノ−６−ヒドロキシ−２−メルカプト−５−ピリミジニル）ペンタン酸、および２−メルカプト−４−メチル−５−チアゾール酢酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３２】
ゲルは任意の適切な金属イオン、または金属イオンの混合物を含んでよいが、二価金属イオン、例えばＣａ２＋イオン、Ｚｎ２＋イオンまたはＳｒ２＋イオンが好ましい。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態において、Ａｇは２３０〜１０２５μｇ／ｍＬの範囲の濃度でゲル中に存在する。
【００３４】
本発明のゲルは、任意の適切な方法によって調製されてよい。一方法は、
（ｉ）Ａｇのナノサイズ粒子を形成するために還元剤でＡｇ塩を処理する、
（ｉｉ）Ａｇ−カルボキシラート分子の溶液を形成するためにカルボン酸でＡｇ粒子を処理する、および
（ｉｉｉ）ゲルを形成するために１または複数種の金属イオンの存在下でＡｇ−カルボキシラート分子をポリマーで処理する
ステップを含む。
【００３５】
ステップ（ｉ）でＡｇ塩は、水中の分散剤として水溶液中に存在してよく、またはマイクロエマルション剤の形で存在してもよい。
【００３６】
本発明のゲルは、抗菌活性と抗真菌活性の両方を示すことがわかった。ゲルは、ミュータンスレンサ球菌（ストレプトコッカス・ミュータンス）、ミティスレンサ球菌（ストレプトコッカス・ミティス）、口腔レンサ球菌（ストレプトコッカス・ゴルドニ）、大便レンサ球菌（エンテロコッカス−フェカリス）、オックスフォードブドウ球菌（スタフィロコッカス・オックスフォード）、緑膿菌（シュードモナス・エルジノーサ）または大腸菌（エシェリキア・コリ）を含むがこれに限定されない広範囲にわたる細菌に対して活性であると予想される。ゲルは、カンジダ・アルビカンスを含むがこれに限定されない広範囲の真菌に対して活性であることも予想される。
【００３７】
ゲルは、感染症を処置する、または防止するために任意の部位に局所的に適用され得る。
【００３８】
本発明は、チオクト酸（リポ酸）を使用するＡｇナノ粒子の安定化に関して詳細に後述されるが、種々のカルボキシラート分子が同様に機能することが理解されよう。
【００３９】
実施例１は、チオクト酸安定化Ａｇナノ粒子の調製を記述する。ｐＨ９でチオクト酸被覆Ａｇナノ粒子の水性懸濁液は褐色を呈し、これは高濃度での極めて小さな分散したＡｇナノ粒子の特徴である。使用した合成条件によって、懸濁液の最終銀濃度は２３０と１０２５μｇ／ｍＬの間にわたった。これにより、アルギン酸ゲル中に組み込むことができるＡｇナノ粒子懸濁液の量と濃度に関してかなりの柔軟性が可能になる。
【００４０】
チオクト酸安定化Ａｇナノ粒子のサンプルのゼータ電位を、実施例２に従って測定した。水中のチオクト酸被覆金属ナノ粒子の安定性は、予想通り、ｐＨ依存性であることが観察された。図１は、滴定基準液として０．１Ｍ  ＨＣｌを用い、ｐＨ９．１１〜２．３０のｐＨの関数として懸濁液のゼータ電位プロファイルを示す。結果は、ζ＜−３０ｍＶによって明示されるように、ｐＨ４で、脱プロトン化カルボキシル基の負電荷（図１）が、経時的にコロイドが安定な状態を保つために十分な静電気反発力を懸濁液中のナノ粒子間にもたらすことを示す。反対に、十分に低いｐＨ（ｐＨ＜４）では、カルボキシル基のプロトン化の増加はζ≧−３０ｍＶをもたらし、ナノ粒子の沈降、およびコロイドの不安定化を引き起こす。このｐＨ依存性沈降は、懸濁液のｐＨをＨＣｌおよびＮＨ４ＯＨにより約２と約９の間で交互に切り替えることによって、およびナノ粒子の可逆沈降と再分散を観察することによって、チオクト酸被覆銀ナノ粒子について確認された。
【００４１】
懸濁液中のＡｇナノ粒子の安定性を経時的に維持するために（適切な有効期間を確実にするために）、懸濁液を、調製直後にｐＨ９に調整し（ζ約−５３ｍＶ）、後続のアルギン酸ゲル中への組み込みのためにこのｐＨで暗所で保管してよい。
【００４２】
実施例３に記述するように、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用してＡｇナノ粒子の凝集を調べた。チオクト酸被覆Ａｇナノ粒子の代表的なＴＥＭ画像を図２に示す。顕微鏡像は、凝集のエビデンスがなく、分散し分離したＡｇナノ粒子を示し、チオクト酸によるナノ粒子の良好で効果的な被覆を示している。
【００４３】
粒径の統計サンプルを、１５９５粒子の直径を直接測定することによって得た。
これらの測定値から、粒度分布ヒストグラムを作成し、これを図３に示す。分布はログ−正規粒度分布にうまくフィットし、そこから平均粒径と標準偏差（４．１±１．６ｎｍ）を得た。大部分の粒子が直径７ｎｍ未満であるという事実は、哺乳動物でのナノ毒性の低減されたリスクを示す。
【００４４】
コロイド形態でのチオクト酸安定化Ａｇナノ粒子の抗菌活性を、実施例４に従って決定した。マイクロタイタープレート中の各ウェルから得られた緑色蛍光シグナル対赤色蛍光シグナルの比率（ＦＧ／Ｒ）を算出し、各ウェル内の生菌体の相対的存在量の尺度として使用した。平均ＦＧ／Ｒ値を、各時点で、各細菌の種類について、各チオクト酸被覆Ａｇナノ粒子処理についての３反復実験から算出した。データを、各時点での平均ＦＧ／Ｒ値を同じ時点で無処理対照細菌について得られたそれに分割することによって正規化し、結果をパーセンテージとして報告する。このように、示される結果は、１００％に正規化された無処理細胞（対照サンプル）と比較した、種々の時間の間のチオクト酸被覆Ａｇナノ粒子への曝露後の生菌の相対的存在量の変化を反映する。
【００４５】
チオクト酸被覆Ａｇナノ粒子の一定量（１１．６μＬ）の水性懸濁液の抗菌活性を、７種の微生物に対して検査した。懸濁液の銀濃度は、実施例５の方法に従って、ＩＣＰ−ＭＳによって４３１μｇ／ｍＬと決定された。したがって、マイクロタイタープレート中の各ウェルに加えられた銀の総質量は５．０μｇであった。経時的な生菌のパーセンテージの減少は、計１８０分の間１５分間隔で調査された抗菌活性の時間依存性を示す図４から見られる。
【００４６】
将来のＡｇナノ粒子含有ゲル製剤が比較されることになる対照として用いるために、アルギン酸ゲルをＡｇナノ粒子の不在下で調製した。実施例６に記述したように、ゲルをよく確立された手法を使用して調製した。カルシウムイオン源をアルギン酸ナトリウムの水溶液に加え、その結果Ｃａ２＋との急速な架橋によりゲル化が生じた。文献でたびたび報告されるように、ＣａＣｌ２をＣａ２＋イオン源として使用したが、ＣａＳＯ４およびＣａＣＯ３を含む、代替供給源の使用もアルギン酸ゲルの生成で報告されている。ゲル化速度は結果として生じるゲルの均一性および強度に影響を及ぼすことが知られているので、Ｃａ２＋イオン源は、ゲル化の所望の速度に基づいて選択されることが多い。ＣａＳＯ４およびＣａＣＯ３は水溶液中でＣａＣｌ２より溶解性が低く、したがって、より緩慢なおよび／またはより制御されたゲル化のプロセスが好ましい場合に一般的に選択される。しかし、追加の試薬が、ゲル化の進行のために必要とされることもあり得る。例えば、ＣａＣＯ３は中性ｐＨで水に溶解しない。結果としてＤ−グルコノ−δ−ラクトン（ＧＤＬ）が、ｐＨを低下させるためにＣａＣＯ３を含有するアルギン酸溶液に加えられることが多く、ＣａＣＯ３からＣａ２＋の解離を引き起こす。
【００４７】
Ａｇナノ粒子含有アルギン酸ゲルを、実施例７に従って調製した。Ａｇナノ粒子を、チオクト酸被覆銀ナノ粒子を含有するアルギン酸ナトリウムの水性懸濁液（ｐＨ９）に、０．１ＭのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏを加えることによって、上記のアルギン酸ゲル製剤中に組み込んだ。有色の、展性のあるゲルが直ちに形成された。ナノ粒子含有ゲルは、アルギン酸塩だけのゲルと同じ稠度、均一性およびインジェクタビリティを有することが観察された。しかし、２つの製剤の間で最も明らかな直接の違いは、Ａｇナノ粒子含有ゲルの明るい色であった。色の均一性は、平均密度を超えるナノ粒子、またはナノ粒子の大きなクラスターを含有する少数の個別の領域とは対照的に、ゲルが、マトリックス全体にわたり、一様な分布のＡｇナノ粒子を含有する、またはＡｇナノ粒子の極めて小さいクラスターを含有するという強いエビデンスを与える。
【００４８】
アルギン酸ヒドロゲルの相互に貫通する膜の網状構造とアルギン酸ヒドロゲルの不均一な形態の高解像度画像を得るために、ならびにゲルマトリックス全体にわたるチオクト酸被覆Ａｇナノ粒子の分布についての情報を得るために、クライオＴＥＭ分析をＡｇナノ粒子含有アルギン酸ゲルで行った。Ａｇナノ粒子含有ゲルの代表的なクライオ−ＴＥＭ画像を図５（ａ）に示す。ゲルの多孔質構造が、明確に見られる。相互に連結したゲルの網状組織は暗く見えるが、周囲の／封入されたガラス状の水は明るく見える。ランダムに選択された、小さな領域の顕微鏡像の拡大図を図５（ｂ）に示す。この画像は、意図されるように、ゲルマトリックス全体にわたり分布された、かなり均一な粒径の、高密度のＡｇナノ粒子の小さな集合体を表す。単一ナノ粒子の直径より小さい隣接するＡｇナノ粒子間の距離で、集合体を構成する個別のＡｇナノ粒子間の均一な粒子間の間隔があるように見える。この観察は、集合体を形成するＡｇナノ粒子間の良好で持続的なイオン（Ｃａ２＋）架橋を示す。粒子間間隔がＡｇナノ粒子表面の最大曝露／有効性を示すので、これは好ましく、それは最適な抗菌活性を達成するために重要である可能性が高い。
【００４９】
Ａｇナノ粒子含有ゲルについて得られた結果に基づいて、ゲルの推定構造を図６に模式的に示す。このモデル構造において、Ｃａ２＋イオンは、３つの役割をもつ。第１に、このイオンは、ナノ粒子−Ｃａ２＋−ナノ粒子架橋を介して小集合体へと共にチオクタ酸被覆Ａｇナノ粒子を連結し、そのＡｇナノ粒子の表面でチオクタ酸分子の末端カルボキシラート基を利用すると見られる。第２に、Ｃａ２＋イオンは、ナノ粒子−Ｃａ２＋−Ｌ−グルロン酸イオン架橋を介してアルギンサンポリマー鎖にＡｇナノ粒子集合体を架橋し、この場合もチオクタ酸分子の末端カルボキシラート基を利用すると見られる。アルギン酸塩が小さいＡｇナノ粒子集合体を囲んで安定させるという事実は、クライオ−ＴＥＭ分析によって確認された（図５（ａ））。最後に、Ｃａ２＋イオンは、カルボキシラート部分との相互作用を介して隣接するアルギン酸鎖のＧ−ブロックを連結すると示される。
【００５０】
０．１ｇのＡｇナノ粒子含有ゲル（８．９μｇの総銀含有量、ＩＣＰ−ＭＳによって決定された）を、実施例４に従って７種の微生物に対して検査した。ゲルは、生菌の集団に対して即効性を有した。各種類の細菌をゲル（ｔ＝０）に曝すと、緑膿菌を除くすべての微生物について生菌の数が急速に減少した。検査された７種類の微生物のうち、５種類は、同じ銀濃度でチオクタ酸安定化Ａｇナノ粒子の水性懸濁液で観察されたよりもｔ＝０時点での生菌のパーセンテージで大きな減少を示した。さらに、検査された７種類のすべての微生物は、アルギン酸のみのゲルの同じ質量で観察されたよりもｔ＝０時点での生存可能細菌において大きな減少を示し、このように抗菌活性がゲル内のＡｇナノ粒子によってもたらされたことを裏付けた。
【００５１】
微生物集団を、３時間にわたり１５分ごとに行われた蛍光測定によってモニターし、その結果を図７に示す。注目すべきことに、すべての微生物（おそらくミュータンスレンサ球菌を除いて）は生菌数の時間依存的減少を示し、それは１８０分の全実験を通して続いた。
【００５２】
バイオフィルムの処置は、抗菌性薬物の開発および評価の中で重要な段階である。バイオフィルムは、細胞外高分子物質（ＥＰＳ）のマトリックスによって囲まれた付着性の表面結合した細菌の密集したコミュニティである。この組織化された細菌コミュニティは浮遊プランクトン様細胞より高度なレベルの構造を形成し、細胞の付着、増殖および成熟の漸進的段階を経て、複合体構造に剛性を与える。バイオフィルム内に含まれる微生物とそれらのプランクトン様細胞対応物の間に生理的および行動的な両方の差がある。このため、バイオフィルムは抗生物質療法に対する低減された感受性をしばしば示す。したがって、臨床的に関連するバイオフィルムについて特定の治療の抗菌活性を評価するために、プランクトン様細胞を使用して行われた実験から得られた結果を単純に当てはめることは適切でない。
【００５３】
細菌バイオフィルムを、実施例８に従って調製した。実施例９は、細菌バイオフィルムの感受性についてのアッセイを記述する。ＳＥＭ分析を実施例１０に従って実施し、共焦点レーザー顕微鏡検査（ＣＬＳＭ）分析を実施例１１に従って行った。無処置（対照）バイオフィルムについて得られた代表的なＳＥＭ画像を、図８に示す。７つの画像は、調査した７種類の微生物の各々から形成されたバイオフィルムを示す。画像は、一般的な球菌とバチルス菌であると知られている明確に定義された細胞形態が対照バイオフィルムサンプルで得られたことを示す。細胞は、強力なバイオフィルム形態で個々の健常な細胞のように見えた。細胞形態は予想通りであった。バイオフィルム特有の特定の特徴が画像中で識別でき、それらは小さい領域中の高密度の細胞、および細胞間の「繊維質の結合」のように見える、ＥＰＳの存在などである。ＥＰＳは、強力で頑丈な、耐性のあるバイオフィルムの特徴である。
【００５４】
アルギン酸ゲル（Ａｇナノ粒子を含まない）で処理したバイオフィルムについて得られた代表的なＳＥＭ画像を図９に示す。６つの画像は、調査した６種類の微生物の各々から形成された、処理されたバイオフィルムを示す。アルギン酸ゲル処理バイオフィルムは、強化されたＥＰＳ産生を示すことが観察された。ＥＰＳは、処理されたバイオフィルムの全例のＳＥＭ画像においてより豊富にみえた。明確に定義された細胞形態がすべての場合において保持され、細菌がアルギン酸ゲル処理の後に健常なままであったことを示した。
【００５５】
直接接触を介してＡｇナノ粒子含有アルギン酸ゲルで処理したバイオフィルムについて得られた代表的なＳＥＭ画像を図１０に示す。７つの画像は、調査した７種類の微生物の各々から形成された、処理されたバイオフィルムを示す。画像は、細胞へのかなりの形態変化（対照と比較した場合）、および細胞凝集体と不規則な細胞形状の発現を示す。Ａｇナノ粒子含有アルギン酸ゲルが直接バイオフィルムに適用された場合、不規則な細胞形態に加えて、多数の細胞凝集体がＳＥＭ画像で観察され、いくつかの例では、明らかに平板化した表面が観察された。これらの特徴は、細胞死と整合している。さらに、いくつかの例では、凝集した材料の相互に結合した網状組織の形成があるように見え、おそらく溶解した細菌からの細胞内材料で構成され、「溶融した細胞」の外観を呈した。これは、特に、大便レンサ球菌（図１０（ｅ））および大腸菌（図１０（ｆ））について得られたＳＥＭ画像で明白である。Ａｇナノ粒子Ｐ含有アルギン酸ゲルで処理された緑膿菌バイオフィルムの細菌細胞（図１０（ｇ））は、おそらく脱水効果による、崩壊したまたは「収縮した」タイプの外観を有する。
【００５６】
ニトロセルロース膜方法によりＡｇナノ粒子含有アルギン酸ゲルで処理したバイオフィルムについて得られた代表的なＳＥＭ画像を図１１に示す。Ａｇナノ粒子含有アルギン酸ゲルがニトロセルロース膜の上部に適用されると、それほど明白ではないが、このゲルが直接接触を介して適用される場合のような、細菌細胞に対する同じ変化が生じるように見える（すなわち細胞形態の著しい崩壊）。
【００５７】
実施例１１に記述されるように、処理および無処理の両バイオフィルムの総バイオマスにわたってＣＬＳＭ分析によって検出された赤色蛍光対緑色蛍光のパーセンテージを表１に報告する。これらの結果から、すべての場合において、バイオフィルム内の非生存細胞数の大幅な増加を示す無処理対照と比較して、Ａｇナノ粒子含有アルギン酸ゲルによるバイオフィルムの処理は赤色蛍光量の著しい増加をもたらすことが明らかである。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
実施例１２は、寒天の下に達するバイオフィルムを通して、いずれのイオン化形態またはナノ粒子形態のいずれかで、銀の浸透を評価するためのアッセイを記述する。寒天の誘導結合プラズマ質量分光（ＩＣＰ−ＭＳ）分析を、寒天の既知の質量内に含まれる銀の質量を定量するために行った。このアッセイを、大腸菌菌体から構成されるバイオフィルム上で行った。処理バイオフィルム（およびポリカーボネート膜）下の領域から採取した寒天サンプルのＩＣＰ−ＭＳ分析は、０．５８ｍｇの銀が０．０５ｇの寒天内に含まれていた（コロイド処理を介して加えられた銀の総量の６．３％）ことを明らかにした。無処置バイオフィルムで行われた同様の分析は、＜０．００００５μｇの銀が０．０５ｇの寒天内に含まれていた（すなわち、銀がもし存在していたとしても、計器の検出限界未満であった）ことを明らかにした。これらの結果は、銀の一部がバイオフィルムの全質量にわたりうまく浸透して下の寒天に達したことを明らかに示す。
【００６０】
本発明のＡｇナノ粒子含有アルギン酸ゲルが抗真菌性を有することもわかった。実施例１３は、ゲルが強力な殺真菌性効果を有することを示す。Ｃａ２＋イオン、Ｚｎ２＋イオンおよびＳｒ２＋イオンの混合物を含むがＡｇナノ粒子を含まないアルギン酸ゲル（０．５、０．１および０．２ｇ）は、生存真菌集団を著しく減少させるが、陰性対照のレベル未満ではないことがわかった。しかし、同じ金属イオンの混合物とＡｇナノ粒子（極めて低いＡｇナノ粒子濃度でも）を含有する同じ量（０．５、０．１および０．２ｇ）でのアルギン酸ゲルは、生存真菌集団を陰性対照のレベル未満に減少させることがわかった。結果を図１４に示す。
【００６１】
ヒトにおけるインプラント周囲炎および歯周炎の処置と防止のための本発明のゲルの抗菌活性および生体適合性の確認を、歯の周りに人工結紮によって誘導される歯周炎と、一方はブラスト表面を、他方は酸化表面を有する一対の歯科インプラントの周りの（対側の）インプラント周囲炎とからなる、スプリットマウスデザインを有する新規のヒツジモデルにおいて行った。疾患病変をヒツジで確立し、抗菌ゲル製剤を適用した。ヒツジを犠牲にすることで、歯周組織およびインプラント周囲組織の組織形態計測的な分析が可能になり、疾患の進行を防止し、および喪失した組織を再生するための潜在的戦略を促進する際の抗菌活性の効果を確認した。
【００６２】
実施例１４の微生物学試験のハイスループットシーケンシングは、サンプル内に存在する種々の細菌属を示唆した。シーケンシングによって特定されたすべての属は、口腔マイクロバイオーム内で見つかることが知られている。しかし、歯周炎／インプラント周囲炎の開始は、多数の要因に依存している。これらの要因の１つは、種々の属の特定のレベル／比率であり、これにより病原性感染の発生の可能性が増加し得る。「ベースライン」サンプル（インプラントおよび小臼歯の両部位から採取した）と称する結紮糸配置前の動物から採取したサンプルは、病変サンプルと比較すると、より多量のプロテオバクテリアからなっており（インプラント部位ｐ＜０．００００３）、それらは環境内および口腔内で一般的に見られるグラム陰性細菌である。注目すべきことに、プレボテラ属、バクテロイデス属、ポルフィロモナス属、およびタンネレラ属などのバクテロイデス門は、ベースラインサンプルと比較すると、病変ヒツジサンプル中でより高レベルで一貫して検出され（インプラント部位ｐ＜０．０１）、これは歯周炎およびインプラント周囲炎に関する文献報告と一致している。サンプル中で特定された残りの属、フソバクテリウム属、ファーミキューテス、アクチノバクテリア、およびＳＲ１はグラム陽性嫌気性菌であり、歯周感染部位で顕著にみられることが知られている。シネルギステス門は、歯周の健常な歯肉からの歯肉縁下のプラーク中にみられない。スピロヘータは、歯根管感染症、歯冠周囲炎、歯肉炎および歯周炎で見つかるらせん状の細胞であり、進行した辺縁性歯周炎でフローラの最高５６％を構成することが報告されている。歯周疾患がインプラントおよび小臼歯の両部位に誘導された場合、すべての属は、プロテオバクテリアは別として、量が増加するように見えた（インプラント部位：フソバクテリウム  ｐ＜０．０４、ファーミキューテスｐ＜０．０１、ＳＲ１  ｐ＜０．００３、シネルギステス  ｐ＜０．０００３およびスピロヘータ  ｐ＜０．０６、アクチノバクテリアでは統計差は示されなかった）。
統計はＦ検定を用いて行われ、２つのベースラインと病変サンプル群との間の分散、およびデータに依存する不等分散または等分散両側ｔ検定を示した。
【００６３】
微生物学的データは、歯周およびインプラント周囲の疾患のこの結紮誘導モデルが、歯周およびインプラント周囲疾患と一致しかつ健常な口腔部位にかかわるフローラとは明確に異なる細菌フローラに占められていたことを示唆する。
【００６４】
実施例１４の組織学調査は、本発明のＡｇゲルには炎症を減少させ歯およびインプラント周辺の治癒を促進する効果があり、かつこの効果が最高４ヵ月（ヒトにおいて５〜６ヵ月に相当）の間持続したことを示す。
【００６５】
１週間後に、試験動物（Ｎ＝２ヒツジ）で小臼歯は、優れた治癒を示した。Ａｇゲルであり得る材料のいくらかの残存物があった。１週間での試験動物の治癒は、より明白な炎症性浸潤と持続する歯周ポケットを示した対照動物（Ｎ＝２）より良好なように見えた。前方インプラント（試験および対照とも）は、後方インプラントより非常に大きな炎症性反応を有し、インプラント表面の種類がゲル処理の効果に影響を与えた可能性を示唆した。
対照ヒツジの一匹は、外科的欠損を作成する前に、Ｎｏｂｅｌインプラントを１つ既に消失していた。前方位置において試験１週間インプラントと対照１週間インプラントをほとんど区別できなかった（群あたりＮ＝２ヒツジ）。試験１週間の後方インプラント（Ａｇゲル処理Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ）は、外科的に作成された慢性炎症性欠損の最根尖部に限定された小さい炎症性浸潤物を有するように見えたが、対照インプラント（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ、歯石除去のみ）は、前方（Ｎｏｂｅｌ）インプラントよりも良好に一体化されていたが、外科的欠損の底部で歯髄腔と海綿骨に広がった大きな炎症性浸潤物を有した。これらの結果は、後方のＳｏｕｔｈｅｒｎインプラントへのゲル製剤の単一適用が炎症を軽減するのに効果的だったことを示唆する。
【００６６】
１６週間後に、試験動物（Ｎ＝２ヒツジ）で小臼歯は、良好な治癒を示し、上皮深行増殖の徴候がほとんどなく、軽度の炎症性浸潤だけを示した。骨は、外科的欠損に対して冠状再生した。対照動物（Ｎ＝２ヒツジ）からの小臼歯は、骨再生の徴候がほとんどなく深いポケットを伴う、より著しい持続する炎症を有した。これらの結果は、ゲル処理の単一適用が、結紮糸により誘発された人為的歯周炎モデルにおける炎症に影響し、それが適用後最高４ヵ月間持続したことを示唆する。
【００６７】
１６週間のインプラントの場合、前方の位置でただ一つのＮｏｂｅｌインプラントが残った。しかし、インプラントは十分に一体化されており、外科的に作られたインプラント周囲炎の病変は炎症または進行の徴候をほとんど示していないように見えた。２匹の試験ヒツジにおいて両後方のインプラントは、依然として存在し、十分に一体化されており、ほんの限られた炎症といくらかの骨修復のエビデンスを有した。比較すると、２匹の対照ヒツジはそれらの間で、ただ１つの残存する前方のインプラントを有し、残存する後方のインプラントはなく、かつ唯一残っていた前方のインプラントは完全に骨統合が消失し、大きな炎症性浸潤物に囲まれ、じきに同じように消失しそうであった。これは、ゲルの単一適用が、結紮により誘導された人工動物モデルの重症のインプラント周囲炎において進行性炎症および骨喪失を限定すること、または減少させることに効果的であったこと、およびこの効果が単一の適用後最高４ヵ月間持続したことを示唆する。
【００６８】
本明細書において先行技術文献のいかなる参照も、そのような先行技術が広く知られている、または当分野での一般的な知識の一部を形成していることを容認するとなされるべきではない。
【００６９】
本明細書で用いる場合、「含む」、「含んでいる」という語句および類似した語句は、排他的または網羅的な意味で解釈されるべきではない。換言すれば、これらの語句は、「含むが、限定されない」ことを意味することを意図する。
【００７０】
本発明は、以下の実施例を参照してさらに記述される。特許請求された発明がこれらの実施例によって多少なりとも制限されることを意図しないことが理解されよう。
【実施例】
【００７１】
材料および方法
ナトリウム・ビス（２−エチルヘキシル）スルホサクシネート（ＡＯＴ、９９％）、硝酸銀（ＡｇＮＯ３、９９％）、１，２−ジチオラン−３−ペンタン酸（チオクト酸、９９％）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４、９８％）およびアルギン酸ナトリウム（低粘度）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。塩化カルシウム２水和物（ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、＞９９％）をＧｌｏｂａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅから、ｎ−ヘプタン（９５％）をＵｎｉｖａｒから購入した。脱イオン（ＤＩ）水を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉ−ＱＲＧ超純水システムによって純化した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）ＢａｃＬｉｇｈｔ（商標）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙキット（Ｌ７０１２）をＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。このキットは、生存能力プローブとして使用される２種類の蛍光染料、ＳＹＴＯ（登録商標）９（ＤＭＳＯ中３．３４ｍＭ）とヨウ化プロピジウム（ＰＩ、ＤＭＳＯ中２０ｍＭ）を含んだ。
【００７２】
実施例１：チオクト酸安定化Ａｇナノ粒子の調製
２種のマイクロエマルションを調製した。第１のマイクロエマルションを、ＡｇＮＯ３水溶液（０．１３Ｍ、ω＝１０）をｎ−ヘプタン中のＡＯＴ（０．３３Ｍ）混合物に加えることによって調製し、第２のマイクロエマルションを、ＮａＢＨ４水溶液（１．８４Ｍ、ω＝１０）をｎ−ヘプタン中のＡＯＴに加えることによって調製した。ＮａＢＨ４を含有するマイクロエマルションを撹拌しながらＡｇＮＯ３含有マイクロエマルションに滴下した。淡い黄色から濃い黄褐色への急速な色変化が観察された。混合物を暗所で５時間、撹拌させ、その後１ｍＭのチオクト酸（０．２５ｍＬのエタノール中に溶解させた）をＡｇナノ粒子含有マイクロエマルジョン系に加え、次いでこの混合物をさらに１時間撹拌させた。撹拌を中断し、１：１の量のアセトン／メタール（使用したｎ−ヘプタンの総量に相当する量）を混合物に加え、チオクト酸被覆Ａｇナノ粒子をＡＯＴ  ＲＭから放出させ、２つの異なる相；の褐色の非極性の有機「上」相との白濁色の極性の「下」相がすぐに明らかになった。反応容器を一晩静置させると上相は無色になり、液−液界面で濃い色の粒子が次いで観察された。有機相を同系から除去し廃棄した。界面からの粒子を収集して、エタノールで３回洗浄し、次いで必要に応じて、ＮＨ４ＯＨでｐＨ９に事前調整しておいた１〜６ｍＬの脱イオン水中に混合して再分散させた。生じた黄褐色の水性懸濁液を次いで１３，０００ｒｐｍで４５分間遠心分離し、さらなる特徴づけのために上清を取っておいた。
【００７３】
実施例２：ゼータ電位
チオクト酸安定化Ａｇナノ粒子サンプルの電気泳動移動度を、Ｍ３−ＰＡＬＳ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５５を用いてＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；  Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）上で、２５℃で測定した。サンプルのゼータ電位を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒソフトウェア（ｖ．６．２０；Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉの式によって算出した。自動ｐＨ滴定も行い、そこでＭＰＴ−２滴定装置付属品（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を用いて９．１１〜２．３０のｐＨ範囲でゼータ電位測定を行った。滴定剤として０．１ＭのＨＣｌを使用した。結果を図１に示す。
【００７４】
実施例３：透過電子顕微鏡観察
透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を、ＭｅｇａＶｉｅｗ  ＩＩＩオリンパスデジタルカメラを取り付けたＬａＢ６エミッターを備えたＰｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ１００  ＢｉｏＴＷＩＮ透過電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ／ＦＥＩ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ，Ｈｏｌｌａｎｄ）を使用して取得した。分析用のサンプルを、炭素被覆（４００メッシュ）銅格子上に１０μＬの量を堆積させることによって準備した。６０秒後に、過剰量を濾過紙で慎重に吸い取り、分析の前にサンプルを風乾させた。ナノ粒子径を、ＴＥＭ拡大像を使用して、ａｎａｌｙＳＩＳ３．１ソフトウェア（Ｓｏｆｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＧｍｂＨ）による粒子検出プロセス（最少限２００粒子を測定）によって測定した。
【００７５】
実施例４：チオクト酸安定化Ａｇナノ粒子の抗菌活性
ミュータンスレンサ球菌（ストレプトコッカス・ミュータンス）（ＵＡＢ１５９）、ミティスレンサ球菌（ストレプトコッカス・ミティス）（ＩＬＢ）、口腔レンサ球菌（ストレプトコッカス・ゴルドニ）（ＤＬ１）、大便レンサ球菌（エンテロコッカス−フェカリス）（ＪＨ２２）、オックスフォードブドウ球菌（スタフィロコッカス・オックスフォード）、緑膿菌（シュードモナス・エルジノーサ）（ＯＴＩＳ）および大腸菌（エシェリキア・コリ）（ＤＨ５α）の純粋保存培養株をニュージーランドオタゴ大学口腔科学部から取得した。ミュータンスレンサ球菌、ミティスレンサ球菌、口腔レンサ球菌、大便レンサ球菌、オックスフォードブドウ球菌、緑膿菌および大腸菌のコロニーをトリプシン大豆ブロス中で３７℃にて２４時間好気的に増殖させた。
【００７６】
細菌調製：各々の細菌培養物の１０ｍＬを、７，０００×ｇで５分間遠心分離した。上清を取り除き、ペレットを約５ｍＬの１０ｍＭトリス緩衝生理食塩水（８．５ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌと０．１％のペプトンとで調製し、次いで１Ｍ  ＨＣｌを用いてｐＨ７．５に調整した）中に再懸濁した。懸濁液を５，０００×ｇで２分間さらに２回再遠心分離し、毎回ペレットを約５ｍＬのトリス緩衝液中に再懸濁した。Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ６３００  ｐｒｏ  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定したとき、６７０ｎｍで１．０の光学密度（ＯＤ６７０）を得るように、再懸濁のために使用したトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）の最終量を調整した。
【００７７】
生／死染色の準備：ＢａｃＬｉｇｈｔ（商標）染料の保存溶液を以下の通りに調製した：等量（６μＬ）のＳＹＴＯ（登録商標）９と、ＰＩとを組み合わせ、十分に混合し、無菌脱イオン水で２ｍＬに希釈した。
【００７８】
チオクト酸安定化Ａｇナノ粒子に曝した後の細菌生存度の決定：８０μＬの細菌調製物を９６ウェルマイクロタイタープレートの３ウェル（すなわち、３連で行う）のそれぞれに入れ、続いて１００μＬの事前調製した染料混合物を入れた。最終的な陽性対照として用いるために、８０μＬの「生」菌標準も３ウェルのそれぞれに入れ、続いて１００μＬの染料混合物を入れた。最終的な陰性対照として用いるために、８０μＬの「死」細菌標準（前もって７０℃の水浴中に３０分間静置した）を３ウェルのそれぞれに入れ、続いて１００μＬの染料混合物を入れた。アッセイ対照として用いるために、８０μＬのトリス緩衝液を３ウェルのそれぞれに入れ、続いて１００μＬの染料混合物を入れた。マイクロタイタープレートを暗所にて室温で１５分間インキュベートした。２０μＬの無菌脱イオン水を、陽性対照および陰性対照として用いるために選択されたウェルのそれぞれに加えた。
残りのウェルに、検査されるＡｇナノ粒子懸濁液の量（６．１、１１．６または２３．２μＬ）をそれぞれのウェルに加えた。生細胞（緑色蛍光）および死細胞（赤色蛍光）の両方からの蛍光発光を、Ｓｙｎｅｒｇｙ２マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ  Ｔｅｋ（登録商標）、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ，ＵＳＡ）でλ励起＝４８５ｎｍ；生染色（ＳＹＴＯ９）についてはλ発光（緑色）＝５３０ｎ；死染色（ＰＩ）についてはλ発光（赤色）＝６３０ｎｍにてｔ＝０〜ｔ＝１８０分に１５分ごとに２４〜２５．６℃で測定した。
【００７９】
各ウェル中の各細胞懸濁液について得られたデータを、発光１（ｅｍ１）（緑色）での染色された細胞懸濁液（Ｆｃｅｌｌ）の蛍光強度を発光２（ｅｍ２）（赤色）での蛍光強度で割ることによって分析して、緑色対赤色の蛍光強度の比率（ＲａｔｉｏＧ／Ｒ、またはＦＧ／Ｒ）を得た。これは生菌の相対数に比例する。
【数１】
2018538235.tif 000004
【００８０】
３連の測定値を用いて、それぞれの細菌調製物について平均ＦＧ／Ｒを算出した。各「生」菌標準について得られた平均ＦＧ／Ｒ値は１００％生存可能細菌を表すとみなされた。したがって、残存する生菌の割合（一般的にパーセンテージとして報告される）を算出するために、チオクト酸安定化Ａｇナノ粒子に曝された各細菌調製物について得られた平均ＦＧ／Ｒを関連する「生」標準（陽性対照）について得られた平均値で割った。
【００８１】
Ａｇナノ粒子含有アルギン酸ゲルへの曝露後の細菌生存能の決定：検査する０．０５ｇ、０．１ｇまたは０．２ｇのＡｇナノ粒子含有ゲルを、９６ウェルマイクロタイタープレートの３ウェル（すなわち、３連で行う）のそれぞれに入れ、続いて１００μＬの事前調製した染料混合物と、１００μＬの生菌とを入れた。アルギン酸ゲル対照として用いるために、ＣａＣｌ２で調製したアルギン酸ゲル０．０５ｇと０．１ｇも、３ウェルのそれぞれに入れ、続いて１００μＬの事前調製した染料混合物と、１００μＬの生菌とを入れた。
蛍光発光を、Ｓｙｎｅｒｇｙ２マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ  Ｔｅｋ（登録商標）、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ，ＵＳＡ）でλ励起＝４８５ｎｍ；λ発光（緑色）＝５３０ｎ；λ発光（赤色）＝６３０ｎｍにてｔ＝０〜ｔ＝１８０分に１５分ごとに２４〜２５．６℃で測定した。
【００８２】
実施例５：銀含有量の決定
誘導結合プラズマ質量分光（ＩＣＰ−ＭＳ）分析のために０．１ｍＬの各Ａｇナノ粒子含有サンプルを、テフロン消化槽中で４ｍＬの濃縮ＨＮＯ３を加え、続いてゆるやかに加熱することによって調製した。サンプルを次いで９５℃で１時間、消化した。この間に、消化溶液の量は、およそ０．２ｍＬに減少し、次いでＭｉｌｌｉ−Ｑ水で総量を３ｍＬにした。ＩＣＰ−ＭＳ分析をＡｇｉｌｅｎｔ  ７５００ｃｅ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で行い、各サンプル中の銀濃度を決定した。
【００８３】
実施例６：アルギン酸ゲルの調製
０．５ｍＬの０．１Ｍ  ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏを静かに撹拌しながら３ｍＬの１．５重量％の水性アルギン酸ナトリウム溶液（中性ｐＨで）に、滴下し、瞬時のゲル化をもたらした。
【００８４】
実施例７：Ａｇナノ粒子含有アルギン酸ゲルの調製
アルギン酸ナトリウムを、ｐＨ９にて３ｍＬ（１．５重量％）のチクト酸被覆Ａｇナノ粒子の水性懸濁液で水和した（水性懸濁液中のＡｇナノ粒子濃度は、ゲル内の所望のナノ粒子密度に応じて変えた）。０．５ｍＬの０．１Ｍ  ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏを静かに撹拌しながら滴下し、有色のゲルを直ちに形成した。ゲルの色は黄色から褐色にわたり、より高いＡｇナノ粒子濃度によってより濃い色が生じた。ゲルを凍結乾燥し、生じた固形物を小顆粒に粉砕してもよい。水での再構成によりハイドロゲルが再形成し膨張する。
【００８５】
実施例８：細菌バイオフィルムの調製
静的コロニーバイオフィルムアッセイ手法を使用してバイオフィルムを形成した。播種したレンサ球菌用のトリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）、またはブレーンハートインフュージョンブロス（ＢＨＩ）を３７℃で終夜培養した。６００ｎｍで１．０の光学濃度（ＯＤ６００）（１×１０９ｃｆｕ／ｍＬ数に起因する）を有する細菌培養液を播種培養として用いた。細孔径０．４５μｍを有する２５ｍｍの黒色ポリカーボネート膜をトリプシン大豆寒天（ＴＳＡ）、または嫌気性菌用のＣｏｌｕｍｂｉａヒツジ血液寒天（ＣＳＡ）上に配置し、次いで２０μＬｍの細菌培養液をフィルタの中心に配置した。この量を用いて、直径１２ｍｍのバイオフィルムを生成した。寒天平板をひっくり返し３７℃で４８時間インキュベートし、その間、２４時間ごとに栄養寒天を補充した。
【００８６】
実施例９：細菌バイオフィルム感受性アッセイ
４８時間のインキュベーション期間の後、バイオフィルム感受性アッセイを成熟バイオフィルムで行った。アッセイの略図を図１に示す。アッセイは、所与の処置（表２）を施し、次いでその処置を所定の位置に２４時間置いたままにすることによって行った。処置を、図１（ｄ）に示すように、成熟バイオフィルムの上部に処置を直接配置することによる直接の物理的接触を介して、またはニトロセルロース膜（直径１２ｍｍ、細孔径０．４５μｍ）の上部に処置を配置することによる拡散機構の使用を介してのいずれかでバイオフィルムに適用した。２４時間の処置レジメンの後、処理およびニトロセルロース膜（存在する場合）を除去した。バイオフィルムおよびポリカーボネート膜を寒天から続いて除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で静かにすすいで非接着細胞を取り除いた。処置したバイオフィルムを次いで、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）および共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）手法を使用して分析した。
【００８７】
【表２】
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【００８８】
実施例１０：走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）分析
処置および無処置の両方の成熟バイオフィルム試料を０．１Ｍカコジル酸緩衝液中の２．５％グルタルアルデヒド中で最低２時間固定した。試料を、エタノール溶液（３０〜１００％）を段階的に連続で使用して、各溶液中に５分間浸漬することによって化学的脱水させた。続いて、臨界点乾燥（ＣＰＤ）を行った。その詳細は以下の通りである。試料をＣＰＤチャンバー中で１００％エタノール中に浸漬し、次いでエタノールをゆっくりと除去した。ＣＯ２を用いて、その量を置き換えた。これを１０℃未満で行い、次いで温度を３５℃に上げた。固定した試料をアルミニウムＳＥＭスタブ上に配置しカーボンテープで取り付けた。取り付けた試料を金でスパッタコーティングし、ＪＥＯＬ  ６７００ＦＥＳＥＭを使用して分析した。
【００８９】
実施例１１：共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）分析
ＢａｃＬｉｇｈｔ（商標）生／死染色の保存溶液を以下の通り調製した。等量（６μＬ）のＳＹＴＯ（登録商標）９と、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）とを組み合わせ、十分に混合し、無菌脱イオン水で２ｍＬに希釈した。処置したバイオフィルムを２００μＬのこれらの溶液で次いで染色し、暗所で１５分間、そのまま放置した。この染色されたバイオフィルムをＰＢＳですすぎ、次いで顕微鏡スライド上に載せ、その上にカバーガラスを配置し、余分な液体をティッシュで吸い取った。ＣＬＳＭを、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７１０共焦点顕微鏡を使用して行なった。処置および無処置バイオフィルムの両方から取得した各バイオフィルム画像スタックを、各バイオフィルムの総バイオマス内に現れる緑色／赤色蛍光の割合を定量化するために、コンピュータプログラム（Ｈｅｙｄｏｒｎ，Ａ．，ら，Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｐｒｏｇｒａｍ  ＣＯＭＳＴＡＴ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０００，１４６，２３９５−２４０７）を使用して分析した。
【００９０】
実施例１２：細菌バイオフィルム浸透アッセイ
４８時間のバイオフィルム形成に続いて、バイオフィルム浸透アッセイを成熟バイオフィルム上で行った。このアッセイは、処置を施し処置を所定の位置に２４時間置いたままにすることによって行った。このアッセイでは、１つの処置だけを、すなわちチオクト酸被覆Ａｇナノ粒子の水性懸濁液を、３１０μｇ／ｍＬの銀濃度で検査した。３０μＬ量の懸濁液をニトロセルロース膜の上部に適用した。その結果、総質量９．３μｇのＡｇがこの処置レジメンで施された。施された量のＡｇナノ粒子懸濁液が膜を通してのみ拡散され、膜の周りには拡散しないことを確実にするように注意を払った。２４時間後に、直径１０ｍｍのボーラーを用いて、バイオフィルムおよびポリカーボネート膜直下の部位から０．０５ｇの寒天サンプルを取り出し、これを誘導結合プラズマ質量分光（ＩＣＰ−ＭＳ）分析を用いて続いて分析して、寒天内に含まれていた銀の質量（バイオフィルムおよび膜を通って浸透し寒天に達した量と想定される）を定量した。
【００９１】
実施例１３：チオクト酸安定化Ａｇナノ粒子を含有するゲルの抗真菌活性
Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋およびＳｒ２＋の３種類の二価陽イオンの等量混合物を含有し、Ａｇナノ粒子を含むアルギン酸ゲルと、含まないアルギン酸ゲルとを実施例７に従って調製したが、０．１ＭのＣａＣｌ２を静かに撹拌しながら０．５ｍＬ滴下してゲルを形成する代わりに、０．１ＭのＺｎＣｌ２、０．１ＭのＣａＣｌ２および０．１ＭのＳｒＣｌ２の３種の溶液をそれぞれ０．１６７ｍＬ用いた。溶液を、総量を使用するまで交互パターン（すなわち、ＺｎＣｌ２を１滴、ＣａＣｌ２を１滴、ＳｒＣｌ２を１滴、を繰り返すサイクル）で滴下した。ゲルを、カンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０２６１（移植可能医用機器で見つかることが多い真菌の一種）に対して検査した。結果を図１２に示す。実験は、実施例４に従って行った。手短に言うと、カンジダ・アルビカンスの純粋保存培養株をニュージーランドオタゴ大学口腔科学部から取得した。１０ｍＬの細菌培養液を酵母エキスペプトンデキストロース中３１℃で２４時間好気的に増殖させた。培養液を７，０００×ｇで５分間、遠心分離し、上清を取り除き、ペレットを約５ｍＬの１０ｍＭトリス緩衝生理食塩水（８．５ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌと０．１％のペプトンで調製し、次いで１ＭのＨＣｌを用いてｐＨ７．５に調整した）中に再懸濁した。懸濁液を５，０００×ｇで２分間さらに２回再遠心分離し、毎回ペレットを約５ｍＬのトリス緩衝液中に再懸濁した。Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ６３００  ｐｒｏ  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定する際、６７０ｎｍで１．０の光学密度（ＯＤ６７０）を得るように、再懸濁のために使用したトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）の最終量を調整した。
【００９２】
生／死蛍光生存率アッセイを使用し、等量（６μＬ）のＳＹＴＯ（登録商標）９とＰＩとを組み合わせ、それを十分に混合し、無菌脱イオン水で２ｍＬに希釈した。Ａｇナノ粒子を含むゲルと、Ａｇナノ粒子を含まないゲルの両方を、０．０５ｇ、０．１ｇおよび０．２ｇを含む種々の重量でウェルに注入し、これを３連で行った。１００μＬの事前に混合された生／死染色混合物を各ウェルに入れた。陽性対照として用いるために、１００μＬのＣ．アルビカンス懸濁液を３つのウェルのそれぞれにゲル（Ａｇナノ粒子の有無にかかわらず）を添加せずに入れた。陰性対照として用いるために、１００μＬの「死滅」Ｃ．アルビカンス（前もって７０℃の水浴中に３０分間入れておいた）を３つのウェルのそれぞれに入れ、続いて１００μＬの染色混合物を入れた。
最後に、Ｃ．アルビカンス調製物を９６ウェルマイクロタイタープレートのゲルを含む各ウェル（各重量について３連で行う）に入れた。蛍光を直ちにモニターした。
生細胞（緑色蛍光）および死細胞（赤色蛍光）の両方からの蛍光発光を、Ｓｙｎｅｒｇｙ２マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ  Ｔｅｋ（登録商標）、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ，ＵＳＡ）でλ励起＝４８５ｎｍ；生染色（ＳＹＴＯ９）についてはλ発光（緑色）＝５３０ｎ；死染色（ＰＩ）についてはλ発光＝６３０ｎｍにて、ｔ＝０〜ｔ＝１８０分に１５分ごとに２４〜２５．６℃で測定した。得られたデータを実施例４に従って分析した。
【００９３】
実施例１４：ヒツジモデルにおける歯周炎およびインプラント周囲炎を処置するためのゲル製剤の有効性
Ａｇナノ粒子ゲル製剤：アルギン酸ナトリウムを、ｐＨ９にて１０ｍＬ（１．５重量％）のチオクト酸被覆Ａｇナノ粒子（実施例１に従って調製した）の水性懸濁液で水和した。等量の０．１ＭのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２およびＳｒＣｌ．６Ｈ２Ｏ（各々０．２５０ｍＬで）を静かに撹拌しながら滴下した。形成されたゲル（約１０ｍＬ）の量を２５０ｍＬの丸底フラスコに入れ、液体窒素を使用して凍結し、続いて室温にて８．６〜１０−２ミリバール気圧下で２４時間凍結乾燥した。凍結乾燥した固形物を小顆粒になるまで粉砕した。凍結乾燥したゲル（０．０３ｇ）を１ｍＬの７％Ｍｅｔｈｏｃｅｌ（商標）（ＤＯＷ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐａｎｙ、メチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースポリマー）に入れて、Ａｇナノ粒子を含有する粘膜接着性複合ゲルを生成した。ヒツジ試験で用いたＡｇナノ粒子含有ゲルは１９７μｇ／ｇの［Ａｇ］を含んだ（試験期間中、部位当たり約２００μｇのゲルを使用した）。
【００９４】
外科的処置：ヒツジに関する全身麻酔、抜歯、インプラント埋入および組織プレパラートのための手法の詳細は、これまでに報告されている（Ｄｕｎｃａｎら，２００８，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ａｕｓｔｒａｌａｓｉａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｓｕｒｇｅｏｎｓ  １９：１５２−１５６；Ｄｕｎｃａｎら，２０１５，Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｉｎｔ．  ２０１５：８５７９６９；Ｄｕｎｃａｎら，２０１６  Ｃｌｉｎ．  Ｏｒａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  Ｒｅｓ．２７（８）：９７５−８０；  Ｓｈａｒｍａら，２０１６，Ｊ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｓｃｉ，  Ｍａｔｅｒ．  Ｍｅｄ．；２７（５）：８６；Ｌｉｕら，２０１６，Ｃｌｉｎ．  Ｏｒａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  Ｒｅｓ．  ２７（７）：７６２−７０）。左側下顎の第１、第２および第３下顎歯を全身麻酔下で抜歯し、部位が治癒するように３ヵ月間放置した。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ＭＳＣテーパー型１４×直径３．７５ｍｍのインプラント１つをより後方部位に配置した。これらのインプラントは、上部が機械加工（平滑に）されたブラスト表面を有し、インプラント周囲感染症の存在下でより容易に洗浄できるように設計されている。Ｎｏｂｅｌ系インプラント（直径３．７５〜５ｍｍ、長さ８．５〜１５ｍｍ、平行平面の構成）１つを左側の前方部位に配置した。両方のインプラントは２段階プロトコルを用いて配置し、インプラントを埋めて、完全に治癒するまで２．５ヵ月間放置した。２．５ヵ月後、両インプラントの歯冠部を露出させた。適当なトレフィンバーを使用して、各インプラントのショルダーの周りに深さ５ｍｍのトラフを作成した。カバー締めネジを取り外し、トランス歯肉ヒーリングアバットメントを配置し、３−０絹糸結紮をインプラント体のネジ山の周りに結び、作成した外科的骨縁下欠損内に配置した。手術部位を再吸収性縫合糸で閉じた。同時に、全層歯肉弁を下顎の右側の第１および第２下顎小臼歯の周囲に立ち上げた。トラフを、ラウンドバーとラウンド電圧チップとを使用して、頬側の歯の周囲および舌側面に作成し、隣接歯間に広げた。３−０結紮絹糸をインプラント体のネジ山の周りに結び、作製した外科的骨縁下欠損中に配置した。手術部位を再吸収性縫合糸で閉じた。すべての部位を試験開始時にＰ．ジンジバリス純培養で潅注した。すべての部位のＸ線像を撮り、疾患の開始の前にキュレットを使用して、微生物フローラのサンプルを採取した。さらに４匹の雌羊は、新たな抜歯部位にインプラントを直ちに受けた。これらの動物は歯またはインプラントのいずれかの周囲に疾患が生じておらず、したがって無処置対照群を形成した。結紮によって疾患が誘導されてから７週間後に、２０匹の試験および対照動物のすべては、全身麻酔下で結紮糸を除去された。０．５ｍｍボールエンドおよびＷｉｌｌｉａｍｓマーキング（１、２、３、５、７，８，９，１０ｍｍ）とともに標準歯周プローブを使用する歯周またはインプラント周囲プロービングを使用して、歯およびインプラント臨床測定値を記録した。６箇所の部位を、各歯の周囲で測定した（近心頬側と近心舌側、中間頬側と中間舌側、遠心頬側と遠心下側）。４箇所の部位を、インプラント周囲で記録した（近心側、頬側���舌側、遠心）。歯肉退縮または粘膜退縮およびポケット深度を別々に記録し、算術的に組み合わせて付着レベルを決定した。すべての部位のＸ線像を撮った。微生物叢を、すべてのヒツジにおいてインプラント、小臼歯および前切歯の周辺から歯周キュレットを用いてサンプル採取した。２０匹のヒツジを試験群と対照群に分け、各群は１０匹のヒツジを含んだ。超音波スケーラーと手用器具を使用して、すべての病変小臼歯およびインプラント部位を次いで歯石除去しおよびルートプレーニングした。シリンジと鈍端カニューレを使用して、Ａｇゲル製剤を試験動物だけに適用した。測定した１ｍＬの用量を、小臼歯とインプラントの周囲に均一に割り当てた。２匹の試験ヒツジと２匹の対照ヒツジを次いで１、２、４、８および１６週間後に、安楽死させた。インプラント周囲臨床測定、Ｘ線撮影および微生物サンプリングを、４匹の動物について安楽死前の各時点で繰り返した。ヒツジに頸動脈を通して次いでカニューレを挿入し、ホルマリンとの同時潅流で頸静脈から失血させた。インプラントおよび下顎小臼歯を下顎骨と一括摘出し、ホルマリンでさらに固定した。
【００９５】
組織学：インプラントを個々のサンプルに分けた。小臼歯は、２つの下顎小臼歯を含むブロックにカットした。マイクロＣＴスキャンを、Ｓｋｙｓｃａｎ  １１７２マイクロＣＴスキャナを使用して１週目と１６週目の試料について得た。すべての組織を次いで、脱水し、メタクリル酸樹脂中に包埋し、薄片にし、プラスチックスライドに接着し、９０〜１３０μｍの最終の厚さに磨滅し研磨し、ＭａｃＮｅｉｌｓ  Ｔｅｔｒａｃｈｒｏｍｅ  ＆  Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ青色で染色した。場合によっては、切片を頬側−舌側および近心−遠心の方向で得たが、ほとんどの場合、方向づけは頬側−舌側だった。いくつかのスライドを、アシッドレッドで対比染色した。炎症の程度を、各試料から最も中心部分について記載した。
【００９６】
１週間の小臼歯−試験試料：骨縁下欠損の調製に対応する切痕が１つの歯根面で観察された。ヒツジにおいて見られる幅広い歯根膜（ヒトと比較して）も観察された。銀ゲル材料である可能性のある材料残存物が観察された。セメント−エナメル境の領域において歯肉は歯に密接に適合している（この種においてエナメル質は歯肉下に伸びることに留意されたい）。炎症のエビデンスはほとんどなかった。分岐部領域の断面は、いくつかの骨細片とともに根分岐部入口内にある残存する銀ゲルを示した。歯根膜は、根分岐部まで損なわれていなかった。切痕のある歯根への歯肉結合組織および銀ゲルが占めていた残存する歯肉ポケットも見られた。
【００９７】
１週間の小臼歯−対照試料：一試料において、歯槽頂部骨のレベルは、舌側よりも頬側で明らかにより根尖しており、これは歯槽外面の新生骨の堆積と、悪化する凝血塊および炎症性浸潤物を伴う開口歯周ポケットの存在とに関連している。２つの小臼歯間の隣接歯間の領域の断面は、食物残渣、残留する凝血塊および根底にある著しい炎症性浸潤物の埋伏を示した。別の試料において、頬側舌側の試料が既に除去されている２つの小臼歯を通る縦（矢状）断面は、第１と第２小臼歯の間の隣接歯間の領域を示した。第１小臼歯の近心面上の切痕、および第２小臼歯の根分岐部の切痕は、両方とも炎症性浸潤物と関連している。頬側舌側断面は、ゆるく組織された海綿骨内に残留する凝血塊が見られたが、良好な隣接歯間の治癒を示した。
【００９８】
１週間のインプラント−試験試料：１週間の前方試験インプラントは、ＴｉＵｎｉｔｅ表面を有するＮｏｂｅｌ  Ｂｒａｎｅｍａｒｋ  Ｍａｒｋ  ＩＩＩ直径３．７５ｍｍ×長さ１１．５ｍｍのインプラントと、ＴｉＵｎｉｔｅ表面を有するＮｏｂｅｌ  Ｂｒａｎｅｍａｒｋ  Ｍａｒｋ  ＩＩＩ直径４．０ｍｍ×長さ１５ｍｍのインプラントとであった。後方のインプラントは、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｉｍｐｌａｎｔ  ＭＳｃ直径４．０×長さ１３ｍｍであった。
【００９９】
前方試験インプラント：第１の前方の１週間試験インプラントは、骨喪失と、インプラントの長さの半分まで広がる炎症性浸潤物とを示した。歯根尖部分は、依然として骨統合していた。骨の残存物は、トレフィンバーを用いる骨縁下外科創傷の作成後に、インプラント表面に接着したままであった．他の前方試験インプラントは、歯根尖端近くまで広がる骨喪失と炎症性浸潤とを示した。インプラントは、歯根尖端で依然として骨統合していた。骨の残存物は、依然として存在していた。上皮ポケットライニングの根尖範囲が見られた。同様の特徴は、同じインプラントからの近遠心側断面で、ならびに銀ゲルの残存物で見られた。同じインプラントからの試料は、歯根尖端まで及ぶ広範囲な炎症、骨質腐骨形成、および下顎骨の外面上の新生骨の反応性堆積を示した。
【０１００】
後方試験インプラント：第１の後方の１週間試験インプラントは、ほとんどのインプラント長に対して十分に一体化され、上皮深行増殖が根尖に５ネジ山（５ｍｍ）広がるのに対してトレフィン欠損が根尖に９ｍｍ広がり、および辺縁骨の炎症性浸潤物と関連していた。いくらかの残存ゲルが、骨縁下病変内に見えた。近遠心側断面は、このインプラントの遠心面と無処置大臼歯の近心面を示した。銀ゲルの残存物がポケット内に存在しているように見えたが、隣接する歯槽中の疎な海綿骨内にもあるように見えた。第２の後方の１週間試験インプラントも、ほとんどのインプラント長に対して十分に一体化されていた。上皮深行増殖は、最初の１〜３ネジ山に限定され、トレフィン欠損に対応した。炎症性浸潤は、病変の浅部に限定された。近遠心側断面は、炎症性浸潤がトレフィン欠損の底部の下の上皮深行増殖の根尖範囲から辺縁骨へと広がったことを裏付けた。この断面も、下顎骨上部に疎な皮質骨および下部に密な皮質骨を有する大きな歯髄腔を明確に示した。インプラントの中央の空白は、頬側舌側の試料のために除去された領域を表す。
【０１０１】
対照試料：１週間の前方試験インプラントは、ＴｉＵｎｉｔｅ表面を有するＮｏｂｅｌ  Ｒｅｐｌａｃｅ直径４．０ｍｍ×長さ１３ｍｍのインプラントと、ＴｉＵｎｉｔｅ表面を有するＮｏｂｅｌ  Ｂｒａｎｅｍａｒｋ  Ｍａｒｋ  ＩＩＩ直径３．７５ｍｍ×長さ１５ｍｍのインプラントとであった。後方のインプラントは、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ＭＳｃ直径４．０×長さ１３ｍｍであった。
【０１０２】
前方試験インプラント：第１の前方の１週間対照インプラントは、試験開始時の欠損が形成される前に不能になった。第２のインプラントは、依然として存在し、インプラント長の５０％が骨統合していた。多量の再吸収されない凝血塊が、いくらかの食物残屑といくらかの骨残存物とともに、トレファン病変を占めていた。外部の反応骨が存在した。近遠心側欠損は、上部の皮質骨がインプラント表面のかなり手前で止まっている、大きなサイズのトレフィン欠損を示した。凝血塊および残屑が欠損部を満たしていた。歯髄腔は、歯髄腔への炎症性浸潤の拡大を示した。
【０１０３】
後方試験インプラント：第１の後方の１週間対照インプラントは、依然として歯根尖端近くで骨統合していたが、インプラントの歯根尖端に広がる炎症を伴う凝血塊、残屑および化膿で満ちた大きなポケットがあった。このインプラントは１週間後、ほぼ機能しなかった。第２の後方のインプラントは十分に骨統合しており、トレフィンバーのはっきりした輪郭、ならびに炎症性浸潤と限られた上皮深行増殖を伴うポケット内のいくらかの凝血塊が見られた。近遠心側断面は、同様の特徴を示した。
【０１０４】
１６週間の小臼歯−試験試料：第１の試験動物は歯周炎のエビデンスをほとんど示さず、きわだった上皮深行増殖がなく、軽度の炎症性浸潤物をわずかに有した。同じ動物からの第２の断面は、外科的に形成された欠損からの頬側面に切痕を示し、そこへ向かって上皮が治癒した。骨への外科的欠損の範囲が見られ、新生骨が欠損を満たしていた。第２の動物は頬側面でさらなる退縮を示したが、元の欠損の治癒は良好であった。上皮深行増殖のエビデンスはほとんどなかった。近遠心側断面は、第２小臼歯根分岐部内の完全な治癒と、近心面の切痕とを示した。
【０１０５】
対照試料：第１の対照動物は、炎症性細胞浸潤を伴う持続性歯周炎を有し、かつ頬側面に上皮深行増殖が存在しており、欠損上に骨再生のエビデンスがほとんどなかった。根面中の切痕は、進行性の歯根吸収を示した。この動物からの第２小臼歯を通る断片も、深い頬側ポケットを示し、頬側面に骨再生がほとんど見られなかった。第２の対照動物は、ここでも、欠損が形成されたとき残された切痕に隣接した深いポケットを示し、上皮形成が見られ骨再生はほとんど見られなかった。
【０１０６】
１６週間のインプラント−試験試料：１週間の前方の試験インプラントは、ＴｉＵｎｉｔｅ表面を有するＮｏｂｅｌ  Ｂｒａｎｅｍａｒｋ  Ｍａｒｋ  ＩＶ直径４．０ｍｍ×長さ１０ｍｍのインプラントと、ＴｉＵｎｉｔｅ表面を有するＮｏｂｅｌ  Ｂｒａｎｅｍａｒｋ  Ｍａｒｋ  ＩＶ直径４．０ｍｍ×長さ８ｍｍのインプラントとであった。後方インプラントは、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｉｍｐｌａｎｔ  ＭＳｃ直径４．０×長さ１３ｍｍであった。
【０１０７】
前方試験インプラント：第１の前方の１６週間試験インプラントは、消失していた。第２の前方の試験インプラントは、短い長さのインプラントであったが、良好な一体化を示した。
多少の材料を保持したポケットが存在したが、これが残屑なのか残余ゲルなのか不明であった。骨縁下ポケットの底部は、結合組織で十分に囲まれていた。
【０１０８】
後方試験インプラント：第１の後方の１６週間試験インプラントは、その長さの半分が十分に一体化されたままであった。骨縁下ポケットは、上皮で内側を覆われた結合組織の組織化された帯によって十分に囲まれていた。残屑および骨残存物がポケットを満たしていたが、欠損部への新生骨成長のきざしの多少のエビデンスがあり、持続的な炎症のエビデンスはほとんどなかった。第２の後方の試験インプラントも、その長さの半分が十分に一体化され、残存ゲルを十分に含んでいた可能性があるオレンジの残屑を含有し、上皮で内側を覆われた骨縁下ポケットによって十分に囲まれており、骨再生のエビデンスを示していた。近心遠心面の試料は、同様の特徴を示した。
【０１０９】
対照試料：１週間の前方対照インプラントは、ＴｉＵｎｉｔｅ表面を有するＮｏｂｅｌ  Ｂｒａｎｅｍａｒｋ  Ｍａｒｋ  ＩＩＩ直径５．０ｍｍ×長さ１１．５ｍｍのインプラントと、ＴｉＵｎｉｔｅ表面を有するＮｏｂｅｌ  Ｂｒａｎｅｍａｒｋ  Ｍａｒｋ  ＩＩＩ直径５．０ｍｍ×長さ１３ｍｍのインプラントとであった。後方インプラントは、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｉｍｐｌａｎｔ  ＭＳｃ直径４．０×長さ１３ｍｍであった。
【０１１０】
前方対照インプラント：第１の前方の１６週間対照インプラントは、依然として存在していたが、骨統合が完全に失われ、機能しなくなるところであった。上皮で内側を覆われた炎症性浸潤は、インプラントの周辺に完全に広がっていた。第２の前方の対照インプラントは、機能せず、もはや存在していなかった。
【０１１１】
後方対照インプラント：第１の後方の１６週間対照インプラントは機能せず、もはや存在していなかった。第２の後方の対照インプラントも、機能せず、もはや存在していなかった。
【０１１２】
微生物学：小臼歯とインプラント領域からのプラークサンプルを機械的スクレイピング方法によって採取し、１ｍＬの無菌ＰＢＳ緩衝液中に入れた。これは、以下の段階でｉｎ  ｖｉｖｏで行った。ｉ）結紮糸配置前（インプラント部位ｎ＝９；小臼歯部位ｎ＝１１）、ｉｉ）疾患誘導後（インプラントｎ＝１９；小臼歯ｎ＝１９）、およびｉｉｉ）１週間、２週間、４週間、８週間および１６週間のＡｇナノ粒子含有ヒドロゲル処置（試験動物ｎ＝２；対照動物ｎ＝２）。プラークサンプルは、分析まで−２０℃で保管した。解凍したチューブを１０，０００〜１２，０００ｒｐｍで１分間、遠心分離し、上清を除去し廃棄した。２０ｍＬ量のＩｎｓｔａＧｅｎｅ（商標）マトリックス（Ｃｈｅｌｅｘ樹脂ビーズを含む）をマグネチックスターラで連続して混合して、樹脂ビーズ懸濁液を維持した。撹拌している間、ワイドポアピペットを用いて１００μＬの懸濁液を各プラークペレットに加えた。プラークペレットを５６℃で１５〜３０分間インキュベートし、次いで、高速で１０秒間ボルテックスし、続いて１００℃で８分間インキュベートした。試料を次いで高速で１０秒間ボルテックスし、１０，０００〜１２，０００ｒｐｍで２〜３分間遠心分離した。
ここでは抽出されたＤＮＡを含有する各サンプルからの上清を収集して、１２６の別々の無菌エッペンドルフチューブに入れる。これらのサンプルをドライアイス上で、Ｍａｓｓｅｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｎｅｗ  ＺｅａｌａｎｄのＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＮＺＧＬ）に送った。生物分析ＰＣＲおよび高スループットＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングを、以下に記述するように、ＮＺＧＬによる１６Ｓユニバーサルプライマーを使用して行った。
【０１１３】
アンプリコンＰＣＲ：ＤＮＡサンプルをＰＣＲの使用によって増幅し、それによってさらなる分析のために大量の１６Ｓ領域を生成した。各サンプルについて、以下の反応（表３）を９６ウェルプレートの別々のウェル中に準備する（０．２μＬ）。ＩＵＰＡＣヌクレオチド命名法を使用する、全長プライマー配列は、以下の通りだった：
１６Ｓ  アンプリコンＰＣＲ前方プライマー＝５’
ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＴＡＣＧＧＧＮＧＧＣＷＧＣＡＧ
１６Ｓ  アンプリコンＰＣＲ後方プライマー＝５’
ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ
【０１１４】
【表３】
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【０１１５】
プレートをＭｉｃｒｏｓｅａｌ’Ａ’フィルムを用いて次いで密封し、サーマルサイクラーに入れ、以下のプログラムを使用してＰＣＲを行った。９５℃で３分間；９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を２５サイクル；７２℃で５分間、次いでサンプルを次のステップまで４℃で保持した。続いて、１μＬのＰＣＲ産物を次いでＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＤＮＡ１０００チップにかけて、サイズを確認した。
【０１１６】
ＰＣＲクリーンアップ１：遊離プライマーおよびプライマーダイマー種を、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを使用して除去した。ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを、ＰＣＲ混合物中に直ちに配置する前に、室温で維持した。「アンプリコンＰＣＲ」からの９６ウェルマイクロプレートを１，０００×ｇ、２０℃で１分間、遠心分離して、プレートの上部から濃縮物を収集した。続いて、Ｍｉｃｒｏｓｅａｌ’Ａ’フィルムを慎重に取り除いた。ＡＭＰ  ＸＰビーズを３０秒間、ボルテックスした。マルチチャネルピペットを使用して、２０μＬのＡＭＰ  ＸＰビーズをＰＣＲ９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。各カラムに対して別々のチップを使用して、ウェル量の全体を静かにピペットで上下させ、これを１０回繰り返した。ＰＣＲウェルプレートを、室温で５分間維持した。プレートを次いで磁気スタンドに載せ、ビーズ沈降の結果として上清が澄むまで、２分間放置した。上清を除去し廃棄した。いかなるペレット状の材料も除去しないように注意を払った。ＰＣＲプレートを磁気スタンドの上に置いたまま、２００μＬの新たに準備した８０％エタノールを各ウェルに加え、次いで３０秒間放置した。上清を次いで慎重に取り除き廃棄した。エタノール洗浄を２回、行った。しかし、２回目の洗浄時に、最終ステップを導入し、ここで微細ピペットを用いて過剰なエタノールを除去した。プレートの含有物を次いで１０分間、風乾させた。ＰＣＲプレートを磁気スタンドから取り外し、マルチチャネルピペットを使用して、５２．５μＬの１０ｍＭ  トリス、ｐＨ８．５を各ウェルに加えた。ウェルの含有物を次いで、各カラムごとに新たなチップを用いて、ピペットで１０回上下させ、ビーズを確実に再分散し、プレートを次いで室温で２分間維持した。ＰＣＲプレートを再び磁気スタンドの上に置き、ビーズの沈降の結果として上清が澄むまで２分間放置した。その後、各サンプルから、５０μＬの上清を新たな９６ウェルＰＣＲプレート内の新しいウェルに慎重に移した。この新しいＰＣＲプレートを次いでインデックスＰＣＲステップの前に最高１週間の間、−１５℃〜−２５℃で保管した。
【０１１７】
インデックスＰＣＲ：インデックスＰＣＲは、前のステップからの５μＬのアンプリコンＰＣＲ産物の使用を必要とするだけだった。したがって、４５μＬを−１５℃〜−２５℃でＰＣＲウェル中に保管した。５μＬの量を「ＰＣＲクリーンアップ」プレートから新しいＰＣＲプレートに移した。以下の量（表４）の材料をウェルに加えて、全量を２５μＬにした。
【０１１８】
【表４】
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【０１１９】
混合物を静かにピペットで１０回上下させた。プレートを次いでＭｉｃｒｏｓｅａｌ’Ａ’フィルムで覆い、２０℃、１，０００×ｇで次いで１分間遠心分離した。ＰＣＲは、以下のプログラムを使用してサーマルサイクラーで行った：９５℃で３分間；９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒間を８サイクル；７２℃で５分間；プレートを次いで次のステップまで４℃で保持した。
【０１２０】
ＰＣＲクリーンアップ２：第２のＰＣＲクリーンアップを、以下の修正を加え、「ＰＣＲクリナップ１」に記載のようにインデックスＰＣＲ産物で行った。５６μＬの量のＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズをインデックスＰＣＲプレートの各ウェルに移した。２回のエタノール洗浄の後、２７．５μＬの量の１０ｍＭ  トリス、ｐＨ８．５をインデックスＰＣＲプレート中のビーズに加えた。その後、各サンプルから、２５μＬの上清を新たな９６ウェルＰＣＲプレート内の新しいウェルに慎重に移した。このＰＣＲプレートを次いで、ライブラリ定量化、正規化および貯蔵のプロセスの前に最高１週間の間−１２℃〜−２５℃で保管した。
【０１２１】
ライブラリ変性およびＭｉＳｅｑサンプルローティング：最終的な貯蔵ＤＮＡ（４ｎＭ、５μｇ）を０．２Ｎ  ＮａＯＨ（５μＬ）とともにマイクロ遠心チューブに入れた。微小遠心管をボルテックスし、２０℃、２８０×ｇで１分間遠心分離した。この管を次いで室温で５分間維持することによって、ＤＮＡを一本鎖に変性させた。予備冷却したハイブリダイゼ−ション緩衝液（ＨＴ１；９９０μＬ）を次いで１０μＬの量のマイクロ遠心チューブ中の変性ＤＮＡに加えた。このようにして、マイクロ遠心チューブは１ｍＭ  ＮａＯＨ中に２０ｐＭの変性ライブラリを含み、最終希釈を行うまで氷上に静置された。
【０１２２】
変性ＤＮＡの希釈：変性ＤＮＡを次いで、表５を使用して所望の濃度に希釈した。
【０１２３】
【表５】
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【０１２４】
希釈ＤＮＡのチューブを次いで数回逆さにし、パルス遠心分離し氷上で保管した。
【０１２５】
ＰｈｉＸ対照の変性と希釈：ＰｈｉＸライブラリ（１０ｎＭ；２μＬ）をトリス、ｐＨ８．５（１０ｍＭ；３μＬ）と組み合わせて、４ｎＭの全体Ｐｈｉｘライブラリ希釈を作成した。希釈ＰｈｉＸ（５μＬ）をマイクロ遠心チューブに入れ０．２Ｎ  ＮａＯＨ（５μＬ）とさらに組み合わせた。マイクロ遠心チューブをボルテックスし、次いで室温で５分間維持して、ＰｈｉＸを一本鎖に変性させた。変性ＰｈｉＸライブラリ（１０μＬ）を次いで予備冷却したＨＴ１（９９０μＬ）に加えた。ここでの変性ＰｈｉＸの濃度は２０ｐＭであり、表５に従ってさらに希釈した。希釈ＤＮＡのチューブを次いで数回逆さにし、パルス遠心分離し氷上で保管した。
【０１２６】
アンプリコンライブラリとＰｈｉＸ対照との組合せ：変性し希釈したＰｈｉＸ対照（３０μＬ）を、変性し希釈したアンプリコンライブラリ（５７０μＬ）と組み合わせた。混合ライブラリを含むマイクロ遠心チューブを、加熱前に氷上で保管し、加熱はサンプルをＭｉＳｅｑ  ｖ３試薬カートリッジにローディングする直前にのみ行なった。ＭｉＳｅｑ試薬カートリッジは、１回のフローセルに必要なクラスタリング試薬とシーケンシング試薬を含有する、一回使い切りの消耗品である。マイクロ遠心チューブを９６℃のヒートブロック中に２分間置いた。チューブを次いで１、２回逆さにし、氷水浴中に５分間静置した。
【０１２７】
ＭｉＳｅｑ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓワークフロー：サンプルをロードしてシーケンシングをＭｉＳｅｑで行なった後、Ｖ３〜Ｖ４アンプリコンからの生物の分類を１６Ｓ  ｒＲＮＡデータ（Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅｓデータベース；ｈｔｔｐ：／／ｇｒｅｅｎｇｅｎｅｓ．ｌｂｌ．ｇｏｖ／）を使用して行った。分類は、以下の分類階級を決定する：界、門、綱、目、科、属および種。この場合、使用される方法の制約のため、信頼性のある決定に利用できる最低の分類群は、属であった。
【０１２８】
微生物学結果：インプラント部位と小臼歯部位からのベースラインサンプルおよび病変サンプルについて得られた微生物学データセットを、Ｍｉｎｉｔａｂ  １７  Ｓａｔｉｓｔｉｃａｌソフトウェアを使用して別々に主成分分析（ＰＣＡ）にかけ、スコアプロットを図１３および１４にそれぞれ示す。スコアプロットは成分空間でのサンプルのクラスタリングを示し、インプラント部位サンプルと小臼歯部位サンプルの両方が２つの群を形成し、ベースラインサンプルと病変サンプルを分離した。ヒツジの数がベースラインサンプル（Ｎ＝９とＮ＝１１）と病変サンプル（Ｎ＝１９とＮ＝１９）との間で異なっていたので、サンプルクラスタリングはベースラインヒツジと病変ヒツジの微生物プロファイルの差異をより確実に示唆するとみなすことができるが、ＰＣＡ分析において外れ値が依然として観察され得る。
【０１２９】
本発明は例として記述されているが、特許請求の範囲で定める本発明の範囲から逸脱することなく、変更および修正をなし得ることを理解すべきである。さらに、既知の均等物が特定の特徴に対して存在する場合、そのような均等物は、具体的に本明細書に参照されているかのように組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図９ｅ】
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【図９ｆ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１０ｅ】
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【図１０ｆ】
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【図１０ｇ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１１ｅ】
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【図１１ｆ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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