(57)【要約】本発明は、コンピュータシステムを使用して：ウイルス配列内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣のヌクレオチド鎖を読取り；ホストゲノムが、所定の類似性基準によるとそのヌクレオチド鎖にマッチし、かつＰＡＭに隣接する任意の領域を欠くことを決定し；そのヌクレオチド鎖に少なくとも部分的に相補的なガイド配列を提供することによる、ホストゲノムからウイルス遺伝子配列を除去するためのシステムおよび方法に関する。ガイド配列を提供することは、ヌクレオチド鎖に相補的な部分を含むガイドＲＮＡを合成することを含み得る。
2018516596.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホストゲノムからウイルス配列を除去するための方法であって、
前記ウイルス配列内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣りのヌクレオチド鎖を読取ることと、
前記ホストゲノムが、所定の類似性基準によると前記ヌクレオチド鎖とマッチし、かつ前記ＰＡＭに隣接する任意の領域を欠くことを決定することと、
前記ヌクレオチド鎖に少なくとも部分的に相補的なガイド配列を提供することと
のために、メモリに連結したプロセッサを含むコンピュータシステムを使用することを含む、方法。
【請求項２】
前記ガイド配列を提供することが、前記ヌクレオチド鎖に相補的な部分を含むガイドＲＮＡを合成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＡＭがＮＧＧであり、Ｎが任意のヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ホストゲノムが、ヒトゲノムである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記所定の類似性基準が、前記ＰＡＭの５’側の２０ヌクレオチド以内の少なくとも１２個のマッチするヌクレオチドを必要とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記所定の類似性基準がさらに、前記ＰＡＭの５’側の１０ヌクレオチド以内の少なくとも７個のマッチするヌクレオチドを必要とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ウイルス配列の特徴を識別する、前記ウイルス配列のアノテーションを受け取ることと、
前記ウイルス配列の選択された特徴内の前記ウイルス配列内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の前記ヌクレオチド鎖を発見することと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ゲノムデータベースから前記ウイルス配列および前記アノテーションを得ること
をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記選択された特徴が、ウイルス複製起点、末端反復、複製因子結合部位、プロモーター、コード配列、および反復領域からなる群から選択される１つを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記読取るステップおよび決定するステップに従って、前記ウイルス配列のコード配列内の１つ超の候補標的を発見することと、
前記ガイド配列として最も５’側の候補標的を提供することと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記読取るステップおよび決定するステップに従って、複数のガイド配列を提供することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ウイルス配列を関連ウイルスゲノムの相同配列に対してアラインして、複数の配列アラインメントを創出することと、
前記複数の配列アラインメント内の、平均密度より大きい保存位置に及ぶ前記ウイルス配列内の保存領域を識別することと、
前記保存領域内で前記読取るステップおよび決定するステップを行って、前記保存領域の部分に少なくとも部分的に相補的な前記ガイド配列を提供することと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ウイルス配列内で、かつ前記読取るステップおよび決定するステップに従って、１つ超の候補標的を発見することと、
中程度のＧＣ含有量を有するガイド配列を優先的に選択することと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ガイド配列を提供することの前に、検証アッセイで前記ヌクレオチド鎖を検証することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
検証アッセイが、ｉｎ  ｖｉｖｏで、前記ホストゲノムおよび前記ウイルス配列を有する核酸を、前記ヌクレオチド鎖に少なくとも部分的に相補的なＲＮＡおよびｃａｓ９タンパク質に曝露することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ガイド配列をコードする発現ベクターを合成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記発現ベクターがさらに、ｃａｓ９遺伝子を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記発現ベクターがさらに、ウイルス複製起点を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記発現ベクターがさらに、プロモーターを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ウイルス配列が、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）−１、ＨＳＶ−２、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）−６、ＨＨＶ−７、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、パルボウイルスｂ１９、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、およびアデノウイルスからなる群から選択されるウイルス由来である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１５年５月２９日に出願された米国仮特許出願番号第６２／１６８，１８３号の優先権および利益を主張しており、その内容は参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は概して、ホスト生物ゲノムからウイルス遺伝子配列を除去するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
一部のウイルス感染は、いわゆるウイルス潜伏中、長い間対象において不活性なまま潜む。潜伏は、初感染後、ウイルス増殖が中止している、ウイルス生活環の期間である。しかしながら、ウイルスゲノムは、完全には根絶されていない。結果として、ウイルスは、新規感染を一切伴わずに、再活性化し、急性感染を引き起こし、大量の子孫を生成し得る。これは、口唇ヘルペス等の症状を生成し得る一方で、潜伏感染のより重篤な結果は、細胞を形質転換する可能性を含み、これは制御されない細胞分裂を引き起こす。かかるウイルスは可能性として、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ：ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）；水痘、エプスタイン・バーウイルス、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２）を含むヘルペスウイルスファミリー（ヘルペスウイルス科）；ならびに肝炎を含む。
【０００４】
核酸を消化する酵素であるヌクレアーゼは、ＨＩＶ−１またはエプスタイン・バーウイルスを根絶するために使用されてきた。例えば、それぞれ、Huら、２０１４年、PNAS、１１１巻（３１号）：１１４６１〜１１４６６頁；またはWangおよびQuake、２０１４年、PNAS、１１１巻（３６号）：１３１５７〜１３１６２頁を参照のこと。しかしながら、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ：ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）−１、ＨＳＶ−２、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ：ｖａｒｉｃｅｌｌａ  ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ：ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ：ｈｕｍａｎ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）−６、ＨＨＶ−７、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ：Ｋａｐｏｓｉ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、パルボウイルスｂ１９、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ：ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、およびアデノウイルス等の他のウイルスについては、ホストゲノムからウイルス配列を除去するための報告されている方法は公知でない。したがって、潜伏感染により人に影響を及ぼし続け、潜伏ウイルスゲノムを根絶する報告されている方法がまだ公知でない、いくつかのウイルスがある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Huら、２０１４年、PNAS、１１１巻（３１号）：１１４６１〜１１４６６頁
【非特許文献２】WangおよびQuake、２０１４年、PNAS、１１１巻（３６号）：１３１５７〜１３１６２頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（要旨）
本発明は、ウイルス配列およびホストゲノム配列に規則のセットを適用して、ホストゲノムの健全を妨害することなくウイルス配列を分解のために標的にするために使用され得る組成物を提供することにより、ホストゲノムからウイルス配列を除去するための方法およびシステムを提供する。提供される組成物は、ウイルス配列内の標的にハイブリダイズする配列を有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ：ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）を含み得る。本組成物はさらに、標的にされたヌクレアーゼ、例えばｃａｓ９酵素、またはかかるヌクレアーゼをコードするベクターを含み得、これはｇＲＮＡを使用してウイルスゲノムに排他的に結合し、二本鎖を切断し、これによりホストからウイルス配列を除去する。ｇＲＮＡまたはガイド配列の配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ：ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｍｏｔｉｆ）に隣接しており、そしてホストゲノムではプロトスペーサーモチーフに隣接するホストゲノムには現れない約２０ヌクレオチドの領域を発見するための、ウイルス配列の調査により決定することができる。本発明のシステムはさらに、ある特定の類似性基準（例えばＰＡＭにより近い領域に向かってバイアスされた同一性で少なくとも６０％同一）を満たすガイド配列を設計するための規則を適用することができるので、このガイド配列に従って作製したｇＲＮＡ／ｃａｓ９複合体は、ホストゲノムを妨害することなく、ウイルス配列内の特定の特徴または標的に結合し、消化する。システムは、ウイルス配列を使用し、かつホストゲノムを参照して、そのホストのバックグラウンドに対してそのウイルスを標的にするために設計されたｇＲＮＡを提供することができるので、そのウイルスを取り扱った公知の報告された方法がない場合でさえも、システムは、潜伏ウイルス感染の除去のための材料を提供するために使用することができる。したがって、本発明のシステムおよび方法は、ヒトゲノムバックグラウンドを害することなく、潜伏ウイルスゲノムを取り除くための高性能ｇＲＮＡ／ヌクレアーゼ組成物の設計および合成のパイプラインを提供する。この設計および合成のパイプラインは、一般的な適用可能性があり、まだ除去のための標的にされていないウイルス、またはさらにはまだ完全に知られていないか、もしくは理解されていないウイルスを取り扱うために使用することができる。
【０００７】
ある特定の態様では、本発明は、ホストゲノムからウイルス配列を除去するための方法を提供する。本方法は、メモリに連結したプロセッサを含むコンピュータシステムを使用して、ウイルス配列内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（例えばＮＧＧ、ここでＮは任意のヌクレオチドである）の隣のヌクレオチド鎖を読取ることを含む。コンピュータシステムは、ホストゲノムが、（１）所定の類似性基準によるとそのヌクレオチド鎖とマッチし、かつ（２）またＰＡＭに隣接する任意の領域を欠くことを決定する。コンピュータシステムは、そのヌクレオチド鎖に少なくとも部分的に相補的なガイド配列を提供する。ガイド配列を提供することは、ヌクレオチド鎖に相補的な部分を含む、ガイドＲＮＡを合成することを含み得る。
【０００８】
所定の類似性基準は、例えば、ＰＡＭの５’側の２０ヌクレオチド以内の少なくとも１２個のマッチするヌクレオチドの必要条件を含み得、またＰＡＭの５’側の１０ヌクレオチド以内の少なくとも７個のマッチするヌクレオチドの必要条件を含み得る。本方法は、ウイルス配列の特徴を識別する、ウイルス配列についてのアノテーションを受け取ることと、ウイルス配列の選択された特徴（例えばウイルス複製起点、末端反復、複製因子結合部位、プロモーター、コード配列、または反復領域）内のウイルス配列のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣のヌクレオチド鎖を発見することとを含み得る。ウイルス配列およびアノテーションは、ゲノムデータベースから得ることができる。本方法は、読取るステップおよび決定するステップに従って、ウイルス配列のコード配列内の１つ超の候補標的を発見するために使用することができる。選択規則は、ガイド配列として最も５’側の候補標的を好み得る。読取るステップおよび決定するステップに従って、複数のガイド配列を提供することができる。本方法は、中程度（例えば４０％〜６０％）のＧＣ含有量を有する配列を優先的に選択し得る。
【０００９】
ある特定の実施形態では、ウイルス配列を、関連ウイルスゲノムの相同配列に対してアラインして、複数の配列アラインメントを創出し、ウイルス配列内の保存領域（例えば複数の配列アラインメント内の、平均密度より大きい保存位置に及ぶ領域）を識別する。読取るステップおよび決定するステップを、保存領域内で行って、保存領域の部分に少なくとも部分的に相補的なガイド配列を提供することができる。
【００１０】
一部の実施形態では、本方法は、ウイルス配列内の１つ超の候補標的を発見するために、読取るステップおよび決定するステップに従って使用される。ある特定の実施形態では、ガイド配列を提供する前に、検証アッセイにおいてヌクレオチド鎖を検証する。検証アッセイは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ホストゲノムおよびウイルス配列を有する核酸を、ヌクレオチド鎖に少なくとも部分的に相補的なＲＮＡおよびｃａｓ９タンパク質に曝露することを含み得る。本発明の方法は、ガイド配列をコードする（例えばまた、ｃａｓ９遺伝子と、ウイルス複製起点と、プロモーターとの任意の組合せを含む）発現ベクターを合成することを含み得る。本発明の方法は、ウイルス、例えば単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）−１、ＨＳＶ−２、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）−６、ＨＨＶ−７、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、パルボウイルスｂ１９、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、またはアデノウイルスを標的にするために使用することができる。
【００１１】
関連する態様では、本発明は、ホストゲノムからウイルス配列を除去するためのシステムを提供する。本システムは、メモリに連結したプロセッサを含むコンピュータシステムを含み、本システムは、ウイルス配列内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣のヌクレオチド鎖を読取ることと、ホストゲノムが、所定の類似性基準によるとそのヌクレオチド鎖とマッチし、かつＰＡＭに隣接する任意の領域を欠くことを決定することと、そのヌクレオチド鎖に少なくとも部分的に相補的なガイド配列を提供することとのために使用することができる。任意選択で、本システムは：ゲノムデータベースからウイルス配列およびアノテーションを得る；ヌクレオチド鎖に相補的な部分を含むガイドＲＮＡを合成する；読取るステップおよび決定するステップに従って複数のガイド配列を提供する；またはこれらの任意の組合せのために使用することができる。本システムは、核酸合成のための器具を含んでもよく、この器具はガイドＲＮＡを合成するために作動することができる。本システムは、ウイルス配列についてのアノテーションを受け取ることができ、ここでアノテーションは、ウイルス配列の特徴を識別し、本システムは、ウイルス配列の選択された特徴内のウイルス配列のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣のヌクレオチド鎖を発見することができる。本システムは、上記に説明する特定の方法論のいずれかを実行することができる。例えば、本システムは、ウイルス配列を関連ウイルスゲノムの相同配列に対してアラインして複数の配列アラインメントを創出し、複数の配列アラインメント内の、平均超の密度の保存された位置に及ぶウイルス配列内の保存領域を識別し、保存領域内で読取るステップおよび決定するステップを行って保存領域の一部に少なくとも部分的に相補的なガイド配列を提供するように作動することができる。本システムは、ガイド配列と、ｃａｓ９遺伝子、ウイルス複製起点、またはプロモーターのいずれかとをコードする発現ベクターを合成するために使用することができる。本システムは、ウイルス、例えば単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）−１、ＨＳＶ−２、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）−６、ＨＨＶ−７、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、パルボウイルスｂ１９、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、およびアデノウイルスの潜伏感染を排除するために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ウイルスゲノム配列を標的にするためのｇＲＮＡの創出を図示する。
【図２】図２は、本発明の実施形態に従うシステムの図解を示す。
【図３】図３は、ｇＲＮＡ等の核酸を合成するための方法の使用を例示する。
【図４】図４は、標的選択を補助するために提供され得るユーザーインターフェースを示す。
【図５】図５は、ｇＲＮＡを選択するための例示的な方法を示す。
【図６】図６は、ある特定の実施形態に従う類似性基準を概略する。
【図７】図７は、保存領域を識別するための複数の配列アラインメントを示す。
【図８】図８は、ある特定の実施形態に従うベクターを図示する。
【図９】図９は、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡにより標的化されるＨＢＶゲノムの重要部分を示す。
【図１０】図１０は、ＨＢＶに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＲＩＳＰＲアッセイから得られるゲルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（詳細な説明）
本発明は、コンピュータシステムを使用して：ウイルス配列内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣のヌクレオチド鎖を読取り；ホストゲノムが、所定の類似性基準によるとそのヌクレオチド鎖とマッチし、かつＰＡＭに隣接する任意の領域を欠くことを決定し；そのヌクレオチド鎖に少なくとも部分的に相補的なガイド配列を提供することによる、ホストゲノムからウイルス遺伝子配列を除去するためのシステムおよび方法に関する。ガイド配列を提供することは、ヌクレオチド鎖に相補的な部分を含むガイドＲＮＡを合成することを含み得る。
【００１４】
本発明のシステムおよび方法は、ホストゲノムからウイルス配列を除去するために、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９が使用するための１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供するために使用することができる。Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素である。Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓの免疫系の部分として発見され、それは、ガイドＲＮＡの２０塩基対スペーサー領域に相補的な領域を探し、その後そこで切断するために外来ＤＮＡを巻き戻すことにより、外来ＤＮＡを記憶し、後に切断する。Ｃａｓ９は、ＤＮＡの部位特異的二本鎖切断を行うために使用することができ、これは遺伝子不活性化、または非相同末端結合および相同組換えを通した異種遺伝子の導入をもたらすことができる。遺伝子編集の他の例示的なツールとして、亜鉛フィンガーヌクレアーゼおよびＴＡＬＥＮタンパク質が挙げられる。
【００１５】
Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡに相補的なほとんど任意の配列を切断することができる。ネイティブＣａｓ９は、連合してガイドを生じる２つの異種のＲＮＡである、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ＲＮＡ）から構成されるガイドＲＮＡを使用する。加えて、またはあるいは、Ｃａｓ９標的化は、キメラ単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ：ｓｉｎｇｌｅ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）の操作を通して単純化することができる。
【００１６】
Ｃａｓ９はＲＮアーゼＨおよびＨＮＨエンドヌクレアーゼ相同ドメインを含有し、これらはそれぞれ、２つの標的ＤＮＡ鎖の切断を担っていることが研究により示唆されている。ＲＮアーゼＨに類似する配列は、ＲｕｖＣ折畳みを有し（ＲＮアーゼＨファミリーの一員）、ＨＮＨ領域は、Ｔ４  Ｅｎｄｏ  ＶＩＩとして折畳む（ＨＮＨエンドヌクレアーゼファミリーの一員）。Ｃａｓ９についての以前の研究は、ＨＮＨドメインが標的ＤＮＡの相補配列切断を担い、ＲｕｖＣが非相補配列を担うことを示している。
【００１７】
ＣＲＩＳＰＲに基づくゲノム編集は、ヒト細胞に適用されており、遺伝性疾患を治す見込みがあることを示している（Cell  Stem  Cell.、２０１３年、１３巻（６号）：６５３〜８頁）。しかしながら、ウイルスを取り扱うために標的にされたヌクレアーゼを使用することは、ケースバイケースを基本に試されているのみである。例えばHuら、２０１４年、PNAS、１１１巻（３１号）：１１４６１〜１１４６６頁；またはWangおよびQuake、２０１４年、PNAS、１１１巻（３６号）：１３１５７〜１３１６２頁を参照のこと。本発明は、ヒトバックグラウンドに対する使用のための抗ウイルスｇＲＮＡ／ヌクレアーゼを設計および評価するために使用され得るシステムおよび方法を提供する。本発明は、ヒトゲノムバックグラウンドを害することなく、潜伏ウイルスゲノムを取り除くための高性能抗ウイルスガイドＲＮＡ／ヌクレアーゼを設計および生成するためのパイプライン、ならびにホストゲノム配列に影響を及ぼすことなく、ウイルスゲノム配列を標的にするために１つまたは複数のｇＲＮＡを使用する抗ウイルス組成物およびシステムを創出するための方法を提供する。
【００１８】
図１は、ホストゲノム配列に影響を及ぼすことなく、ウイルスゲノム配列を標的にするｇＲＮＡを創出するための方法１０１を図示する。本方法は、ウイルスゲノムにアクセスし、ウイルス配列内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣のヌクレオチド鎖を読取るためにコンピュータシステムを使用することを含む。これは、ウイルスゲノムをスキャンして、ＰＡＭを発見することにより行うことができる。ｃａｓ９について、ＰＡＭはＮＧＧであり、Ｎは任意のヌクレオチドである。エンドヌクレアーゼによるＲＮＡ誘導型標的化についての追加のバックグラウンドは、米国特許公開公報第２０１５／００５０６９９号、米国特許公開公報第２０１４０３５６９５８号、米国特許公開公報第２０１４／０３４９４００号、米国特許公開公報第２０１４／０３４２４５７号、米国特許公開公報第２０１４／０２９５５５６号、および米国特許公開公報第２０１４／０２７３０３７号で説明されており、これらの公報の各々の内容は、全ての目的について参照により組み込まれる。コンピュータは、ウイルス配列全体を通してスキャンし、ＮＧＧを発見する。ウイルス配列内のＮＧＧの発見に際して、コンピュータは、ＮＧＧ（すなわちＰＡＭ）に隣接する２０ヌクレオチドのウイルス配列を読取る。それらの２０ヌクレオチドは、暫定的にｇＲＮＡ用になる可能性のある配列と考えられる。ｇＲＮＡ用の配列として使用されるためには、ホストゲノムが、（１）いくつかの所定の類似性基準によるとそのヌクレオチド鎖とマッチし、かつ（２）またホストゲノム内のＰＡＭに隣接する任意の領域を欠くことを決定することが好ましい。例示的な所定の類似性基準を、より詳細に説明するが、１つの平易な類似性基準は、マッチについての必要条件である。コンピュータは、ホストゲノムをスキャンして、ホストゲノムがこのような任意の領域（すなわち、暫定的に考慮されており、かつＰＡＭに隣接する配列に対してある特定の類似性を有する２０ヌクレオチド）を欠くことを決定する。ホストゲノムがこのような領域を欠くことが確立されると、コンピュータは、暫定的に考慮されている配列の相補物を取り、それをガイド配列、すなわち、ｇＲＮＡで使用される配列として提供する。ある特定の実施形態では、ガイド配列を提供することは、ヌクレオチド鎖に相補的な部分を含むｇＲＮＡを合成することを含む。一部の実施形態では、本発明の方法および材料は、ｃａｓ９遺伝子と、短鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ：ｓｈｏｒｔ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）の少なくとも１つの遺伝子とを含むプラスミドを使用する。ｓｇＲＮＡは、ウイルスゲノムの部分に相補的である。
【００１９】
図２は、本発明の実施形態に従うシステム２０１の図を示す。好ましくは、システム２０１は、ユーザーによる使用のためのコンピュータ２３３（例えばラップトップ、デスクトップ、またはタブレット）を含み、またサーバーコンピュータ２０９を含んでもよい。サーバーコンピュータは、データベース２０５にアクセスすることができる。システム２０１は、ｇＲＮＡまたは他の材料を創出するための合成器具２５５を含み得る。合成器具２５５は任意選択で、それ自体の、例えば専用の、分析コンピュータ２５１（入力／出力機構と、１つまたは複数のプロセッサと、メモリとを含む）を含むか、またはそれに作動可能に連結され得る。加えて、またはあるいは、器具２５５を、コミュニケーションネットワーク２１５を介してサーバー２０９またはコンピュータ２３３に作動可能に連結してもよい。
【００２０】
システム２０１で例示される各コンピュータは好ましくは、メモリおよび少なくとも１つの入力／出力デバイスに連結したプロセッサを含む。
【００２１】
プロセッサは、演算処理作動を行う、任意のデバイスまたはデバイスのシステムを指す。プロセッサは一般的に、中枢演算処理ユニット（ＣＰＵ：ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｕｎｉｔ）を提供するためのチップ、例えば単一コアまたは多数コアチップを含む。演算処理は、Ｉｎｔｅｌ社またはＡＭＤ社からのチップにより提供することができる。プロセッサは、任意の好適なプロセッサ、例えばＩｎｔｅｌ社（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）により商品名ＸＥＯＮ  Ｅ７で販売されるマイクロプロセッサ、またはＡＭＤ社（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）により商品名ＯＰＴＥＲＯＮ  ６２００で販売されるマイクロプロセッサであってもよい。
【００２２】
メモリは、機械で読取り可能な形式のデータまたは命令を記憶する、デバイスまたはデバイスのシステムを指す。メモリは、開示されるコンピュータのプロセッサの１つまたは複数により実行される場合、本明細書で説明する方法または機能のいくつかまたは全てを達成することができる、１つまたは複数の命令のセット（例えばソフトウェア）を含むことができる。好ましくは、各コンピュータは、非一過性メモリ、例えばソリッドステートドライブ、フラッシュドライブ、ディスクドライブ、ハードドライブ、加入者識別モジュール（ＳＩＭ：ｓｕｂｓｃｒｉｂｅｒ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｍｏｄｕｌｅ）カード、セキュアデジタルカード（ＳＤ（ｓｅｃｕｒｅ  ｄｉｇｉｔａｌ）カード）、マイクロＳＤカード、もしくはソリッドステートドライブ（ＳＳＤ：ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ  ｄｒｉｖｅ）、光学および磁気媒体、その他、またはこれらの組合せを含む。
【００２３】
入力／出力デバイスは、コンピュータへ、またはコンピュータからデータを移動させるための機構またはシステムである。例示的な入力／出力デバイスとして、ビデオディスプレイユニット（例えば液晶ディスプレイ（ＬＣＤ：ｌｉｑｕｉｄ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｄｉｓｐｌａｙ）またはブラウン管（ＣＲＴ：ｃａｔｈｏｄｅ  ｒａｙ  ｔｕｂｅ））；英数字入力デバイス（例えばキーボード）；カーソル制御デバイス（例えばマウス）；ディスクドライブユニット；信号発生デバイス（例えばスピーカー）；タッチスクリーン；加速度計；マイクロフォン；セルラー無線周波アンテナ；および例えばネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ：ｎｅｔｗｏｒｋ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｃａｒｄ）、Ｗｉ−Ｆｉカード、またはセルラーモデムであり得るネットワークインターフェースデバイスが挙げられる。
【００２４】
システム２０１またはシステム２０１の構成要素は、本明細書で説明する方法を行うために使用することができる。任意の方法ステップについての命令はメモリに記憶することができ、プロセッサはそれらの命令を実行することができる。ソフトウェアのいずれも、物理的に様々な位置に位置することができ、これは、機能の部分が異なる物理的位置で実行されるように分散されることを含む。システム２０１またはシステム２０１の構成要素は、ホストゲノムからウイルス配列を除去するための方法で使用することができる。具体的には、図２で示される構成要素は：ウイルス配列内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣のヌクレオチド鎖を読取り；ホストゲノムが、所定の類似性基準によるとそのヌクレオチド鎖とマッチし、かつホストＰＡＭに隣接する任意の領域を欠くことを決定し；そのヌクレオチド鎖に少なくとも部分的に相補的なガイド配列を提供するように作動することができる。
【００２５】
図３は、ｇＲＮＡ等の核酸、プラスミド等のベクター、（例えば増幅またはベクターへの組み込みのための）鋳型、またはホストゲノムからのウイルス遺伝子配列の標的化除去での使用に好適な任意の他の核酸を合成するための方法１０１の使用を例示する。図３で示されるように、サーバーコンピュータ２０９は、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベース２０５からのウイルスゲノムにアクセスすることができる。
【００２６】
例示される例では、サーバーコンピュータ２０９は、ウイルスゲノム配列と、ウイルスゲノムの特徴を識別するアノテーションとを得ている。一部の実施形態では、本発明のシステムおよび方法は、エンドヌクレアーゼ消化のためにウイルスゲノム内の重要な特徴を標的にする。以下により詳細に説明するように、この特徴を標的にすることは、例えばＧｅｎＢａｎｋ形式のファイルの見出し部で見られるようなアノテーションで報告される特徴を指し得る。
【００２７】
図３で示されるように、コンピュータ２３３およびサーバー２０９は、１つまたは複数のｇＲＮＡを設計するために使用されている。方法１０１のステップに従って、かつ類似性基準および以下に説明する他の設計パラメータを適用して、システム２０１は、ウイルス配列内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣のヌクレオチド鎖を読取った後、それから、そのヌクレオチド鎖に少なくとも部分的に相補的なガイド配列を提供することができる。コンピュータ２３３は、ユーザーインターフェース４０１を有し、ユーザーインターフェース４０１によりユーザーは類似性基準または他の設計パラメータを確立または選択することができることに留意されたい。加えて、ガイド配列は、ユーザーインターフェース４０１上のディスプレイにより提供することができる。ある特定の実施形態では、ガイド配列は、ガイド配列を具体化するｇＲＮＡを合成することにより提供される。システム２０１は、合成器具２５５を作動させることによりｇＲＮＡを合成することができる。ユーザーは、器具コンピュータ２５１と相互作用して、合成器具２５５の作動を制御することができる。
【００２８】
合成器具２５５は、オリゴヌクレオチド、例えばｇＲＮＡまたは単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を合成するために使用することができる。任意の好適な器具または化学が、ｇＲＮＡを合成するために使用することができる。一部の実施形態では、合成器具２５５は、Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ社（Ｉｒｖｉｎｇ、ＴＸ）からのＭｅｒＭａｄｅ  ４  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成器である。かかる器具は、５０、２００または１，０００ナノモルプレパックカラムのいずれかを使用して、同時に最大１２種の異なるオリゴヌクレオチドを合成することができる。合成器具２５５は、１回のラン当たり多数の分子を調製することができる。これらの分子（例えばオリゴ）は、個々のプレパックカラム（例えば９６本の群に整列した）またはウェルプレートを使用して作製されることができる。
【００２９】
説明される手段により、本発明のシステムおよび方法は、特にヒトゲノムのバックグラウンドに対する抗ウイルス適用のための（例えば潜伏ウイルス感染があるヒトゲノムからウイルス遺伝子配列を根絶するための）ｇＲＮＡを提供するために使用することができる。一部の実施形態では、システム２０１は、ｇＲＮＡの配列を含む合成核酸を提供するために、例えばｇＲＮＡそれ自体を提供するか、またはこのｇＲＮＡをコードするプラスミド等のベクターにクローニングするか、もしくは組合せるエレメントを提供するために、作動可能である。本発明の重要な特徴は、システム２０１がｇＲＮＡを設計するために使用され得ることである。実際に、十分な入力（例えばウイルスのアイデンティティまたはゲノムデータバンクのゲノム受託番号、バックグラウンドまたはヒトゲノム配列、および任意選択でウイルス遺伝子配列内の特徴を識別するアノテーション）を与えられれば、システム２０１は、自動的にｇＲＮＡを設計するように作動可能であり、抗ウイルス適用における使用のためのｇＲＮＡの配列を提供することができる。
【００３０】
本発明は、制御システム２０９／２３３に共に取り込まれ、具体化されると、潜伏ウイルス感染を根絶するための高性能ガイドＲＮＡを提供する規則のセットの創出を含み、この規則およびシステムは、まだ研究されていないか、または取り扱われていないウイルスを取り扱うためのツールを提供する。すなわち、本発明のシステムを使用して、まだ標的化エンドヌクレアーゼが取り扱っていないウイルスについて、そのゲノムをヒトゲノムから消化することができる。本システムは、ウイルスゲノムと、ホストゲノムと、好ましくは標的を識別することを補助するアノテーションのセットとを使用して作動する。これらの目的を得るために、本システムは、自動的に（システム２０１により）高性能抗ウイルスガイドＲＮＡを設計することにおいて使用されるべき上記に挙げられる規則のセットを具体化する。
【００３１】
本分野で公知の任意の開発環境または言語が、本発明の実施形態を実行するために使用することができる。例示的な言語、システム、および開発環境として、Ｐｅｒｌ、Ｃ＋＋、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｒｕｂｙ  ｏｎ  Ｒａｉｌｓ、ＪＡＶＡ（登録商標）、Ｇｒｏｏｖｙ、Ｇｒａｉｌｓ、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ  ．ＮＥＴが挙げられる。本発明において有用なリソースの概略は、Barnes（編）、Bioinformatics  for  Geneticists:  A  Bioinformatics  Primer  for  the  Analysis  of  Genetic  Data、Wiley、Chichester、West  Sussex、England（２００７年）；ならびにDudleyおよびButte、A  quick  guide  for  developing  effective  bioinformatics  programming  skills、PLoS  Comput  Biol、５巻（１２号）：ｅ１０００５８９（２００９年）で呈示されている。
【００３２】
一部の実施形態では、方法は、Ｐｅｒｌで開発されたコンピュータアプリケーションにより（例えば任意選択でＢｉｏＰｅｒｌを使用して）実行される。Tisdall、Mastering  Perl  for  Bioinformatics、O'Reilly  &  Associates,  Inc.、Sebastopol、CA、２００３年を参照のこと。一部の実施形態では、アプリケーションは、オブジェクト指向バイオインフォマティクスアプリケーション開発を可能にするＰｅｒｌモジュールのコレクションであるＢｉｏＰｅｒｌを使用して開発される。ＢｉｏＰｅｒｌは、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｐｅｒｌ  Ａｒｃｈｉｖｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＰＡＮ）のウェブサイトからダウンロードすることができる。また、Dwyer、Genomic  Perl、Cambridge  University  Press（２００３年）、およびZak、CGI/Perl、第１版、Thomson  Learning（２００２年）を参照のこと。
【００３３】
ある特定の実施形態では、アプリケーションは、Ｊａｖａ（登録商標）、および任意選択でＭａｔｔｈｅｗ  ＰｏｃｏｃｋおよびＴｈｏｍａｓ  Ｄｏｗｎにより１９９８年にＥＢＩ／Ｓａｎｇｅｒ社で開発されたＢｉｏＪａｖａ（登録商標）オブジェクトコレクションを使用して開発される。ＢｉｏＪａｖａ（登録商標）は、アプリケーションプログラミングインターフェース（ＡＰＩ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）を提供し、Hollandら、BioJava:  an  open-source  framework  for  bioinformatics、Bioinformatics、２４巻（１８号）：２０９６〜２０９７頁（２００８年）で説明されている。Ｊａｖａ（登録商標）でのプログラミングは、Liang、Introduction  to  Java  Programming、Comprehensive（第８版）、Prentice  Hall、Upper  Saddle  River、NJ（２０１１年）で、およびPooら、Object-Oriented  Programming  and  Java、Springer  Singapore、Singapore、３２２頁（２００８年）で説明されている。
【００３４】
アプリケーションは、Ｒｕｂｙプログラミング言語、および任意選択でＢｉｏＲｕｂｙ、Ｒｕｂｙ  ｏｎ  Ｒａｉｌｓ、またはこれらの組合せを使用して開発することができる。ＲｕｂｙまたはＢｉｏＲｕｂｙは、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、Ｍａｃ  ＯＳ  Ｘ、およびＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で、ならびにＪａｖａ（登録商標）  Ｖｉｒｔｕａｌ  Ｍａｃｈｉｎｅ上のＪＲｕｂｙで実行することができ、オブジェクト指向開発を支持する。Metz、Practical  Object-Oriented  Design  in  Ruby:  An  Agile  Primer、Addison-  Wesley（２０１２年）、およびGotoら、BioRuby:  bioinformatics  software  for  the  Ruby  programming  language、Bioinformatics、２６巻（２０号）：２６１７〜２６１９頁（２０１０年）を参照のこと。
【００３５】
本発明のシステムおよび方法は、Ｇｒｏｏｖｙプログラミング言語およびウェブ開発フレームワークＧｒａｉｌｓを使用して開発することができる。Ｇｒａｉｌｓは、オープンソースのモデル・ビュー・コントローラー（ＭＶＣ：ｍｏｄｅｌ−ｖｉｅｗ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）ウェブフレームワーク、およびビューによる表示のためのアプリケーションデータを有するドメインクラスを提供する開発プラットフォームである。Ｇｒａｉｌｓは、ウェブアプリケーションを含むアプリケーションの開発プラットフォーム、ならびにデータベースおよびＧｒａｉｌｓ  Ｏｂｊｅｃｔ  Ｒｅｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｐｐｉｎｇ（ＧＯＲＭ）と呼ばれるオブジェクト関係マッピングフレームワークを提供する。ＧＯＲＭは、オブジェクトを関係データベースにマッピングし、それらのオブジェクト間の関係を表すことができる。ＧＯＲＭは、Ｈｉｂｅｒｎａｔｅオブジェクト関係パーシステンスフレームワークに依存して、複雑なドメインクラスを関係データベース表にマッピングする。Ｇｒａｉｌｓはさらに、Ｊｅｔｔｙウェブコンテナおよびサーバー、ならびにウェブ構成要素を創出するためのウェブページレイアウトフレームワーク（ＳｉｔｅＭｅｓｈ）を含む。ＧｒｏｏｖｙおよびＧｒａｉｌｓは、Juddら、Beginning  Groovy  and  Grails、Apress、Berkeley、CA、４１４頁（２００８年）；Brown、The  Definitive  Guide  to  Grails、Apress、Berkeley、CA、６１８頁（２００９年）で説明されている。
【００３６】
かかるツールを、システム２０９／２３３を制御するために使用して、高性能ガイドＲＮＡを提供することができる。ヒトゲノム操作のためのガイドＲＮＡ／ヌクレアーゼ設計での経験は、抗ウイルスガイドＲＮＡ／ヌクレアーゼ設計における手引きとなり得る。感染細胞におけるヒトゲノムバックグラウンドの存在のために、ウイルスゲノムに対する高効率およびヒトゲノムに対する低いオフターゲット効果を確実にするためのステップのセットが提供される。それらのステップは、（１）ウイルスゲノム内の標的選択、（２）ホストゲノム内のＰＡＭ＋標的配列を避けること、（３）株間で保存されているウイルス標的を方法論的に選択すること、（４）適切なＧＣ含有量を有する標的を選択すること、（５）細胞内でのヌクレアーゼ発現の制御、（６）ベクター設計、（７）検証アッセイ、その他およびこれらの様々な組合せを含み得る。本発明のシステムおよび方法は、システム２０１を使用して、それらのステップを実行するために設計されたソフトウェアを使用して、実行および制御することができる。
【００３７】
１．ウイルスゲノム内の標的選択
ヌクレアーゼに基づくヒトゲノム編集と抗ウイルス療法との間の１つの重要な相違は、目的に関連する。ヒトゲノム編集の目的は、特定の部位で制御された改変を生ずることであり、一方、本発明に従う抗ウイルス療法は、ウイルスゲノムの計画的な破壊を目指す。ガイドＲＮＡは、ウイルスゲノム内の配列の広範な選択を標的にすることができるが、得られるエンドヌクレアーゼ消化は、劇的に異なる生理学的効果をもたらす場合がある。それゆえ、ウイルス標的の選択は、特定の遺伝子を超えて、より高いレベルで考えられるべきである。ウイルス標的の選択を補助するために、本発明は、自動的にある特定の規則に基づいてある特定の標的を決定または示唆し、かつユーザーによる最終的な選択のための選択肢のメニューを提供することができるツールを提供する。
【００３８】
システム２０１は、図３で示されるように、作動して、ウイルスリファレンスゲノム、好ましくはアノテーション付けされたウイルスリファレンスゲノムを得る。これは、ＮＣＢＩおよびウイルスの特定の協会のデータベースで検索することにより達成することができる。リファレンスゲノムは、設計ガイドとして働くことができる。
【００３９】
ある特定の実施形態では、システム２０１は、アノテーションを参照して、（ｉ）潜伏関連標的、（ｉｉ）感染および症状関連標的、ならびに（ｉｉｉ）構造関連標的等のある特定のカテゴリー内で標的を選択する。システム２０１は、アノテーションを通して読取り（例えば、ときにはＲｅｇＥｘとして公知の、規則的発現等のパターンマッチングを使用して）、重要な特徴（以下により詳細に説明する）、例えば末端反復、タンデム反復、または複製起点について座標を発見することができる。
【００４０】
図４は、標的選択を補助するためにシステム２０１により提供され得る、ユーザーインターフェース４０１を示す。一部の実施形態では、システム２０１は、ユーザーによる最終的な選択のための、事前に選択した標的選択肢のメニューを提供する。ある特定の実施形態では、システム２０１は、自動的に優先順位（例えば、複製起点＞プロモーター＞キャプシドタンパク質）に基づいて標的を単純に選択する。本発明は、潜在的な標的は、ある特定のカテゴリーに入り、それらの生物学的重要性のために、それらのカテゴリーの標的をヌクレアーゼ消化の標的として優れた候補にする、という洞察を含む。
【００４１】
ｇＲＮＡのための標的の第１のカテゴリーは、潜伏関連標的を含む。ウイルスゲノムは、潜伏を維持するためにある特定の特徴を必要とする。これらの特徴として、マスター転写調節因子、潜伏特異的プロモーター、ホスト細胞と連通するシグナル伝達タンパク質等が挙げられるが、これらに限定されない。潜伏中にホスト細胞が分裂する場合、ウイルスゲノムは、ゲノムコピーレベルを維持するために複製システムを必要とする。ウイルス複製起点、末端反復、および複製起点に結合する複製因子は、優れた標的である。これらの特徴の機能が破綻すると、ウイルスは再活性化する場合があり、これは従来の抗ウイルス療法により治療することができる。
【００４２】
ｇＲＮＡのための標的の第２のカテゴリーは、感染関連および症状関連標的を含む。ウイルスは、様々な分子を生成して、感染を促進する。ホスト細胞への入口が得られると、ウイルスは溶解性周期を開始する場合があり、これは細胞死および組織損傷（ＨＢＶ）を引き起こす場合がある。ＨＰＶ１６等のある特定の場合、細胞生成物（Ｅ６およびＥ７タンパク質）はホスト細胞を変形させ、がんを引き起こす場合がある。これらの分子を生成する重要なゲノム配列（プロモーター、コード配列等）を破綻させることは、疾患を治さないとしても、さらなる感染を防ぎ、および／または症状を軽減することができる。
【００４３】
ｇＲＮＡのための標的の第３のカテゴリーは、構造関連標的を含む。ウイルスゲノムは、ゲノム統合、複製、または他の機能を支持するための反復領域を含有し得る。反復領域を標的にすると、ウイルスゲノムを壊して、多数の片にすることができ、これは物理的にゲノムを破壊する。
【００４４】
開示される設計パイプラインで具体化される設計規則は、標的の選択において５’バイアスを好む規則を含み得る。具体的には、開示されるステップに従って（例えば図１および／または図６）、ウイルス配列のコード配列で１つ超の候補標的が発見される場合、本システムは、自動的にガイド配列として最も５’側の候補標的を提供し得る。
【００４５】
タンパク質コード領域に対するガイドＲＮＡを設計する場合、単一の切断が、コード配列内の始めのほうで挿入／欠失およびフレームシフトを導入することができるように、５’末端に焦点を当てることが好ましい場合がある。他のガイドＲＮＡと組合せると、この設計は、遺伝子本体の大部分を削除することができる可能性がある。プロモーターおよび複製起点について、ＤＮＡ上のタンパク質結合部位を識別するべきである。ガイドＲＮＡ／ヌクレアーゼによる結合部位の破壊は、ＤＮＡとタンパク質との間の結合アフィニティを消失させることができる。上記に挙げるように、複数のガイドＲＮＡの組合せは、ウイルスゲノム破壊に必須である。単鎖ＲＮＡの設計は配列破綻効果を最大限にするべきであるが、また、システム２０１により、必須配列の長いストレッチをゲノムから除去することができるように、副数のガイドの設置も慎重に考慮され得る。さらに、複数のヌクレアーゼ消化から生ずる小片は、再び組立てられて、機能的ウイルスゲノムに戻る機会はより少ない。
【００４６】
広範な標的化領域またはカテゴリーが識別されると、特定のガイドＲＮＡの選択はさらに、以下の様々なステップまたは原理の参照を含み得る。例えば、ウイルス遺伝子配列内のある特定の標的領域を与えられると、システム２０１は、構造化された規則のセットを実行して、その標的領域内の特定の２０ヌクレオチドの標的配列を発見することができる。
【００４７】
２．プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）
各ｃａｓタンパク質は、標的化配列の隣の（ガイドＲＮＡ内ではない）特異的ＰＡＭを必要とする。これは、ヒトゲノム編集についてと同様である。現在の理解では、ガイドＲＮＡ／ヌクレアーゼ複合体が最初にＰＡＭに結合し、その後ガイドＲＮＡと標的ゲノムとの間のホモロジーを検索する。Sternbergら、２０１４年、DNA  interrogation  by  the  CRISPR  RNA-guided  endonuclease  Cas9、Nature、５０７巻（７４９０号）：６２〜６７頁。認識されると、ＤＮＡは、ＰＡＭの３ヌクレオチド上流で消化される。これらの結果は、オフターゲット消化は、ホストＤＮＡ内のＰＡＭ、およびガイドＲＮＡとＰＡＭの直前のホストゲノムとの間の高アフィニティを必要とすることを示唆する。
【００４８】
上記に挙げるオフターゲット消化機構に基づいて、本発明は、以下のようにヒトゲノム消化を避ける方法を提供する。最初に、ウイルスゲノム内の候補標的ｇＲＮＡを選択しなければならない。
【００４９】
図５は、ウイルス標的領域内のｇＲＮＡを選択するための例示的な方法を説明する。システム２０１は、ウイルスコード配列をスキャンし、使用されるべきヌクレアーゼのためのＰＡＭを発見する。例えば、消化システムがｃａｓ９を含む予定である場合、システム２０１は、ＮＧＧの標的をスキャンし、ここでＮは任意のヌクレオチドである。ウイルスゲノム内のＰＡＭの発見に際して、システム２０１は、ウイルスゲノム内のＰＡＭに隣接する２０ヌクレオチド鎖を読取る。この２０ヌクレオチド鎖は、暫定的にｇＲＮＡ用になる可能性のある配列として扱われる。最後に、ｇＲＮＡ用のヌクレオチド鎖を選択することは、そのヌクレオチド鎖がホストゲノム内のあらゆる領域について類似性基準を満たすかどうかを決定することを含む（すなわち、定義された基準によると十分に類似するホストゲノム内の領域がない場合のみ、ｇＲＮＡが選択される）。
【００５０】
任意の好適な類似性基準を使用することができる。例えば、１つの類似性基準は、ヌクレオチド鎖の全ての２０塩基についての完全マッチの必要条件であってもよい。他の基準は、１９または１８塩基がマッチすること等を含み得る。好ましい実施形態では、本発明は、有用なｇＲＮＡを実際に発見する必要条件を、ホスト内のいくつかのマッチ部分の可能性、すなわち、完全な２０ヌクレオチドマッチがない場合でも、ｇＲＮＡのいくつかは、それでもホストゲノムに結合し、ヌクレアーゼ作用を開始し得る可能性と釣り合わせる、類似性基準を含む。ホストゲノムに対するオフターゲット作用を最小限にする類似性基準が含まれる。
【００５１】
図６は、自動的にシステム２０１により適用され得る、ある特定の実施形態に従う類似性基準６０１を概略する。ホストゲノムの消化を避けるために、システムは、ある特定の原理を具体化する検索基準を適用する。システム２０１は好ましくは、ヒトゲノムに対して任意の１２ヌクレオチド以上のストレッチのＤＮＡのホモロジーを有する任意の標的配列を避けようとする。ヒトゲノムに対するホモロジーが避けられない場合、ヒトゲノム内でＰＡＭが後に続かないガイドＲＮＡ候補はオフターゲット消化を引き起こさず、優先性を与えられるべきである。相同配列およびＰＡＭの両方がヒトゲノム内に存在する場合、二本鎖切断が起こるＰＡＭの隣の半分で、ヒトゲノムに対する低いホモロジー（例えば４０％未満類似）を有するガイドＲＮＡ候補を選択するべきである。
【００５２】
これらの原理に達するために、図６で図示するように、システム２０１は、ウイルス配列内のＰＡＭに隣接する２０ヌクレオチドのヌクレオチド鎖内を読取る。システム２０１は、そのヌクレオチド鎖に対して１２ヌクレオチド以上の同一性を有する任意のセグメントについてホストゲノムを調べる。かかるセグメントが発見されない場合（Ｎ）、そのヌクレオチド鎖は、ウイルスゲノム内のその２０ヌクレオチドを標的にするガイド配列として提供される。かかるセグメントがヒトゲノム内で発見された場合（Ｙ）、次いでシステム２０１は、ホストゲノム内のそのセグメントがＰＡＭに隣接するかどうかを決定する。ホストゲノム内のそのセグメントがＰＡＭに隣接しない場合（Ｎ）、次いでそのヌクレオチド鎖は、ウイルスゲノム内のその２０ヌクレオチドを標的にするガイド配列として提供される。ホストゲノム内のそのセグメントがＰＡＭに隣接する場合（Ｙ）、次いでシステム２０１は、ＰＡＭに最も近いそのセグメントの半分がそのヌクレオチド鎖に対して４０％未満しか類似しないかどうかを決定する。ＰＡＭに最も近いそのセグメントの半分がそのヌクレオチド鎖に対して４０％未満しか類似しない場合（Ｙ）、次いでそのヌクレオチド鎖は、ウイルスゲノム内のその２０ヌクレオチドを標的にするガイド配列として提供される。ＰＡＭに最も近いそのセグメントの半分がそのヌクレオチド鎖に対して４０％以上類似する場合、システム２０１は、次いでＰＡＭに隣接するウイルスゲノム配列内の次の２０ヌクレオチドのヌクレオチド鎖内を読取り、その次の候補鎖についてのステップを繰返す。ステップの周期は任意選択で、少なくとも１つのガイド配列が提供されるまで繰返される。任意選択で、ステップは、いくつかのまたは全ての可能性のあるガイド配列が提供されるまで、繰返してもよい。
【００５３】
３．保存ウイルス配列
システム２０１は、自動的に高度に保存されたウイルスゲノムの部分を標的にするように作動することができる。ウイルスゲノムは、ヒトゲノムよりずっと変化しやすい。様々な株を標的にするために、ガイドＲＮＡは好ましくは、保存領域を標的にする。ＰＡＭは初期配列認識に重要であるので、また、保存領域でＰＡＭを有することは必須である。システム２０１は、保存領域内でＰＡＭのインスタンスの位置を決定するように作動することができる。システム２０１は、複数の配列アラインメントの使用を通して、保存領域内でＰＡＭのインスタンスの位置を決定することができる。
【００５４】
図７は、保存領域（ここでは、＊で印を付けた保存部位であるＨＢＶ  ＰｒｅＳ１。複数の配列アラインメントは、図７で示される６つのエントリーを超える多くのエントリーを含有し得ることに留意されたい）を識別するために使用され得る複数の配列アラインメントを示す。
【００５５】
具体的には、図７で示されるように、システム２０１は、関連ウイルスゲノムの相同配列のセットを得、これらの配列をアラインして、複数の配列アラインメントを創出することができる。複数の配列アラインメントでは、各カラムは、含まれる配列間の示される部位でのホモロジーの推定で表す。実質的な数（例えば全て）の含まれる配列がその部位で同じヌクレオチドを有する場合、その部位は「保存されている」と言うことができる。複数の配列アラインメント内の保存部位の存在は、その部位がウイルスゲノム内の保存部位であるという推定の理由として使用することができる。かかる標準を使用して、システム２０１は、ウイルスゲノム内の保存部位を識別することができる。システム２０１は、保存領域を識別するためのスキーマにおいて、保存部位を識別する能力を使用することができる。例えば、ある特定の密度を超える保存部位（例えば、平均密度超、または５０％超）を含むゲノム内の領域は、保存領域として識別することができる。かかる手段により、システム２０１は、ウイルス配列内の保存領域（例えば複数の配列アラインメント内の、平均超の密度の保存された位置に及ぶウイルス配列内の領域）を識別することができる。システム２０１は、保存領域内で方法１０１の読取るステップおよび決定するステップを行い、これにより保存領域の一部に少なくとも部分的に相補的なガイド配列を提供することができ、したがってウイルスゲノムの保存領域を標的にする。
【００５６】
長いストレッチの保存領域が利用可能でない場合、ＰＡＭおよびＰＡＭの直前の領域は、少なくとも保存的であるべきである。これは、節２で挙げたのと同じ原理に基づくが、ここでは反対の様式で、配列認識を促進するためである。
【００５７】
４．ＧＣ含有量
高いＧＣ含有量は、ガイドＲＮＡと標的ゲノムとの間の安定性を改善するが、また標的ＤＮＡが巻き戻されることを困難にする。それゆえ、ガイドＲＮＡおよび隣接標的領域は、標的ＤＮＡ内および標的ＤＮＡ間の安定性を釣り合わせる、中程度のＧＣ含有量（４０〜６０％）を有するべきである。ここでもまた、ＰＡＭの直前の領域は、より厳密にこのＧＣ含有量規則に従うべきである。
【００５８】
５．細胞内でのヌクレアーゼ発現の制御
好ましい実施形態では、本発明の方法およびシステムは、核酸を細胞へ送達するために使用される。細胞へ送達される核酸は、決定されたガイド配列を有するｇＲＮＡを含んでもよく、または核酸は、標的遺伝子材料に対して作用する酵素をコードするプラスミド等のベクターを含んでもよい。その酵素の発現は、その酵素が標的遺伝子材料を分解するか、または別の方法で妨害することを可能にする。酵素は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ等のヌクレアーゼであってもよく、また、核酸は、決定されたガイド配列を有する１つまたは複数のｇＲＮＡをコードしてもよい。
【００５９】
ｇＲＮＡは、ヌクレアーゼを標的遺伝子材料に標的させる。標的遺伝子材料がウイルスのゲノムを含む場合、そのゲノムの部分に相補的なｇＲＮＡは、ヌクレアーゼによるそのゲノムの分解を誘導し、これにより任意のさらなる複製を防ぐか、またはさらには任意の無傷のウイルスゲノムを細胞から完全に除去することができる。これらの手段により、潜伏ウイルス感染を、標的にして根絶することができる。
【００６０】
ホスト細胞は、特定の細胞種に基づいて、異なる速度で成長し得る。高いヌクレアーゼ発現は速く複製する細胞に必要であり、一方で、低い発現は非感染細胞におけるオフターゲット切断を避けることを補助する。ヌクレアーゼ発現の制御は、いくつかの態様を通して達成することができる。ヌクレアーゼがベクターから発現される場合、ベクター内にウイルス複製起点を有すると、感染細胞においてのみ、ベクターコピー数を劇的に増大させることができる。各プロモーターは、異なる組織で異なる活性を有する。遺伝子転写は、異なるプロモーターを選択することにより変えることができる。また、転写産物およびタンパク質の安定性は、配列内に安定化または不安定化（ユビキチン標的化配列等）モチーフを組み込むことにより変えることができる。
【００６１】
システム２０１は、ｇＲＮＡ配列、ヌクレアーゼ（例えばｃａｓ９）、他のエレメント、またはこれらの組合せに特異的なプロモーターを提供することができる。例えば、一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｕ６プロモーターにより駆動される。タンパク質発現のためのプロモーターを含むベクターを設計してもよい（例えばＬｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ社（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により商品名ＰＭＡＸＣＬＯＮＩＮＧで販売されているベクターで説明されるプロモーターを使用）。したがって、システム２０１は、ｇＲＮＡのためのＲＮＡポリメラーゼプロモーター、およびｃａｓ９等のタンパク質に好適なプロモーターを提供することができる。一部の実施形態では、システム２０１は、それらのエレメントのいくつかまたは全てを含むプラスミドを創出するために使用される。
【００６２】
６．ベクター設計
図８は、ある特定の実施形態に従うベクター８０１を図示する。ベクター８０１は、プラスミド（例えば、合成器具２５５および組換えＤＮＡラボ設備により創出される）であってもよい。ある特定の実施形態では、プラスミドは、Ｕ６プロモーター駆動ｇＲＮＡまたはキメラガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、および遍在性プロモーター駆動ｃａｓ９を含む。任意選択で、ベクター８０１は、後のｃａｓ９＋細胞の選択が可能となるように、マーカー、例えばｃａｓ９タンパク質の後に融合したＥＧＦＰを含み得る。ｃａｓ９は、相補性トランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と共にｇＲＮＡ（元の細菌システムのＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に類似する）を使用して、このｇＲＮＡに相補的なウイルス配列を標的にすることができることが認識される。また、ｃａｓ９は、ｇＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとのキメラである単一のＲＮＡ分子でプログラム化することができることが示されている。単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、プラスミドにコードされる場合があり、ｓｇＲＮＡの転写は、ｃａｓ９のプログラミングおよびｔｒａｃｒＲＮＡの機能を提供することができる。背景について、Jinek、２０１２年、A  programmable  dual-RNA-guided  DNA  endonuclease  in  adaptive  bacterial  immunity、Science、３３７巻：８１６〜８２１号、およびとりわけその中の図５Ａを参照のこと。
【００６３】
例示的な一実施形態では、本発明のシステムおよび方法は、ヒトホストにおけるＢ型肝炎の潜伏感染を標的にするために使用される。ウイルスゲノムがＢ型肝炎ゲノムである場合、プラスミドベクター８０１は、Ｂ型肝炎ゲノム内の１つまたは複数のｓｇＲＮＡ標的化位置の遺伝子、例えばＰｒｅＳ１、ＤＲ１、ＤＲ２、ポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ：ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）ドメイン、Ｈｂｘ、およびコアＯＲＦを含有し得る。好ましい実施形態では、１つまたは複数のｓｇＲＮＡは、ｓｇＨＢＶ−ＣｏｒｅおよびｓｇＨＢＶ−ＰｒｅＳ１からなる群から選択される１つを含む。
【００６４】
提供されたガイド配列を含有するベクター８０１をヒト細胞へ送達することにより、ベクターの転写は、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ、および転写されてｃａｓ９を創出するｍＲＮＡの発現をもたらす。ｃａｓ９タンパク質はｇＲＮＡと複合体を形成し、細胞内でウイルス遺伝子配列内の標的切断部位を見つける。さらに明らかにするために、ｃａｓ９の標的化機構は、Sternberg、２０１４年、DNA  interrogation  by  the  CRISPR  RNA-guided  endonuclease  Cas9、Nature、５０７巻（７４９０号）：６２〜６７頁；Hsu、２０１３年、DNA  targeting  specificity  of  RNA-guided  Cas9  nucleases、Nature  Biotechnology、３１巻（９号）：８２７〜８３２頁；およびJinek、２０１２年、A  programmable  dual-RNA-guided  DNA  endonuclease  in  adaptive  bacterial  immunity、Science、３３７巻：８１６〜８２１頁で説明されており、当該文献の各々の内容は、参照により援用する。エンドヌクレアーゼは、ウイルス遺伝子配列に誘導されるので、それは標的化位置で配列を切断する。標的化位置は、ある特定のカテゴリー、例えば（ｉ）潜伏関連標的、（ｉｉ）感染および症状関連標的、または（ｉｉｉ）構造関連標的内であるように選択されるので、それらの配列の切断はウイルスを不活性化し、ウイルスをホストから除去する。標的化ＲＮＡ（ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）は、ホストゲノムのオフターゲットマッチを一切伴わずに、ウイルス遺伝子配列内の標的とマッチする類似性基準６０１を満たすように設計されるので、ホストゲノムの妨害を一切伴うことなく、潜伏ウイルス遺伝子材料はホストから除去される。したがって、本発明のシステムおよび方法は、潜伏ウイルス感染を根絶するために使用することができ、しかも特にまだ根絶のために研究されていないウイルス、例えば単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）−１、ＨＳＶ−２、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）−６、ＨＨＶ−７、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、パルボウイルスｂ１９、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、およびアデノウイルスを取り扱うために使用することができる、設計および合成パイプラインを提供する。
【００６５】
７．検証アッセイ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ検証アッセイを行うことは、好ましく、かつ有用である場合がある。各ｇＲＮＡ候補について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ検証アッセイは、推定上のｇＲＮＡ標的部位に隣接する約３００〜１０００ｂｐの領域を増幅するように設計されたＰＣＲプライマーを使用するべきである。アンプリコンのエンドヌクレアーゼ消化が、アンプリコンとは好適に異なるサイズを有する生成物が明らかであることをもたらすように（例えばゲル上で電気泳動したとき）、予想される切断部位は、アンプリコンの中心に向かって存在するべきである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写は、ガイドＲＮＡを生成するために使用することができる。ガイドＲＮＡ、ｃａｓ９タンパク質、および各標的に隣接するＰＣＲアンプリコンを組合せて、最初のエンドヌクレアーゼアッセイを行う。消化された標的ＤＮＡアンプリコンの割合に基づいて、活性を評価する。
【００６６】
一部の実施形態では、細胞検証アッセイを行う。細胞内でのヌクレアーゼ活性を試験するために、標的ウイルスを有する細胞を検索する。各標的の隣接領域をシークエンスして、標的配列多様性を確証する。また、ウイルス標的の隣接配列をクローニングし、このＤＮＡを細胞に送達して、一過性細胞モデルを生成してもよい。ｃａｓタンパク質（直接送達されるか、または発現ベクターから細胞内で生成される）、ガイドＲＮＡ（直接送達されるか、または発現ベクターから細胞内で生成される）、および標的ＤＮＡ（ウイルスゲノムまたはクローニングされたウイルス断片）で、細胞エンドヌクレアーゼアッセイを行う。
【００６７】
細胞内でのインキュベーション後、細胞を回収し、ゲノムＤＮＡを抽出する。ウイルスＤＮＡ二本鎖切断が修復されることが予想される場合、小さな挿入および欠失が、切断部位の周囲で存在し得る。ＰＣＲで隣接領域を増幅し、ＤＮＡ分子を再アニーリングし、ミスマッチ認識アッセイを行ってもよい。長い欠失が予想される場合、また、欠失の外側で末端をつなぎ合わせることにより特異的ＤＮＡ生成物を増幅するためのプライマーを設計してもよい。
【００６８】
ウイルスＤＮＡが短い（数千塩基対）場合、ＤＮＡは消化後に修復されない場合がある。二本鎖切断に隣接するプライマーでの定量的ＰＣＲを使用して、消化効率を評価してもよい。
【００６９】
参照による援用
他の文書、例えば特許、特許出願、特許公開公報、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツの参照および引用は、本開示全体を通してなされている。全てのかかる文書は、全ての目的についてそれらの全体を参照により本明細書に援用する。
【００７０】
均等物
本発明は、その趣旨または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化することができる。それゆえ、上記実施形態は、本明細書で説明する本発明についての限定ではなく、全ての点において例示であると考えられるべきである。したがって、本発明の範囲は、上記の説明ではなく、付属の特許請求の範囲により示され、それゆえ、特許請求の範囲の均等の意味および範囲内に入る全ての変化はその中に包含されると意図される。
【実施例】
【００７１】
（実施例１）
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ：ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ）の標的化
本発明の方法および材料は、標的とされたエンドヌクレアーゼを特定の遺伝子材料、例えばＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のような潜伏ウイルスゲノムに適用するために使用することができる。本発明はさらに、標的細胞（例えば肝細胞）への核酸（例えばＤＮＡプラスミド）の効率的かつ安全な送達を提供する。一実施形態では、本発明の方法は、ＨＢＶを標的にするためにハイドロダイナミック遺伝子送達を使用する。
【００７２】
図９は、ＨＢＶゲノムを図示する。ヒトゲノムからＨＢＶゲノムを除去するために、システム２０１は、ＨＢＶゲノム内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣のヌクレオチド鎖を読取るために使用される。ヒトゲノムが、所定の類似性基準６０１によるとそのヌクレオチド鎖とマッチし、かつＰＡＭに隣接する任意の領域を欠くことが決定される。すなわち、システム２０１は、ＨＢＶ全体をスキャンし、ＮＧＧ（Ｎは任意のヌクレオチドである）を発見する。ＨＢＶゲノム内のＮＧＧの発見に際して、システム２０１は、ＮＧＧ（すなわち、ＰＡＭ）に隣接するＨＢＶゲノムの２０ヌクレオチドを読取る。
【００７３】
システム２０１は、その後、ヒトゲノム全体を通して読取り、その中のＮＧＧの任意のインスタンスで、システム２０１は、ＰＡＭ（すなわち、ＮＧＧ）のそのインスタンスに隣接する２０ヌクレオチドのヒトゲノムを読取る。システム２０１のプロセッサの１つを使用して、ヒトゲノムのその２０個をＨＢＶゲノムの２０ヌクレオチドと比較する。
【００７４】
したがって、システム２０１は、その形態の特徴（「ＨＢＶゲノムの２０ヌクレオチド」＋「ＮＧＧ」）についてヒトゲノムを検索する。システム２０１が、かかる特徴を識別しなかった場合、その２０ヌクレオチドは、酵素分解による標的化の候補になる。
【００７５】
ＨＢＶゲノムのアノテーション（すなわち、ゲノムの重要な特徴を識別する）を受け取り、それらの特徴、例えばウイルス複製起点、末端反復、複製因子結合部位、プロモーター、コード配列、および反復領域のうちの１つの中にある、酵素分解による標的化の候補を選択することが、好ましい場合がある。
【００７６】
ＨＢＶは、ヘパドナウイルス科のプロトタイプの一員であり、４２ｎｍの部分的二本鎖ＤＮＡウイルスであり、表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含有する外側のリポタンパク質コート（エンベロープとも呼ばれる）により囲まれた２７ｎｍのヌクレオキャプシドコア（ＨＢｃＡｇ）から構成される。このウイルスは、３〜３．３ｋｂの弛緩した円形の部分的二重鎖ＤＮＡを含有するエンベロープを有するビリオンと、ビリオンＤＮＡ鋳型内のギャップを修復することができ、かつ逆転写酵素活性を有するビリオン関連ＤＮＡ依存性ポリメラーゼとを含む。ＨＢＶは、約３２００ｂｐの円形の部分的二本鎖ＤＮＡウイルスであり、ポリメラーゼ（Ｐ）、コア（Ｃ）、表面（Ｓ）、およびＸタンパク質をコードする４つの重複ＯＲＦを有する。感染では、ウイルスヌクレオキャプシドが細胞に入り、核に達し、そこでウイルスゲノムが送達される。核内では、第２の鎖のＤＮＡ合成が完了され、両方の鎖内のギャップが修復されて、共有結合的に閉鎖した円形ＤＮＡ分子を生じ、これは３．５、２．４、２．１、および０．７ｋｂ長の４つのウイルスＲＮＡの転写の鋳型として働く。これらの転写産物は、ポリアデニル化され、細胞質に輸送され、そこでそれらはウイルスヌクレオキャプシドおよびプレコア抗原（Ｃ、プレ−Ｃ）、ポリメラーゼ（Ｐ）、エンベロープＬ（大）、Ｍ（中）、Ｓ（小）、ならびに転写トランス活性化型タンパク質（Ｘ）に翻訳される。エンベロープタンパク質は、それ自体が一体型膜タンパク質として小胞体（ＥＲ：ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）の脂質膜に挿入される。ゲノム全体に及び、プレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ：ｐｒｅｇｅｎｏｍｉｃ  ＲＮＡ）と呼ばれる３．５ｋｂの種は、ＨＢＶポリメラーゼおよびタンパク質キナーゼと共にコア粒子にパッケージングされ、そこでそれはマイナス鎖ＤＮＡの逆転写の鋳型として働く。ＲＮＡからＤＮＡへの変換はこの粒子内で起こる。
【００７７】
ＨＢＶゲノム上の塩基対の番号付けは、制限酵素ＥｃｏＲ１の切断部位に基づくか、またはＥｃｏＲ１部位がない場合、相同部位に基づく。しかしながら、また、コアタンパク質の開始コドンに、またはＲＮＡプレゲノムの最初の塩基に基づいた他の番号付け方法も使用される。ＨＢＶゲノム内のどの塩基対も、ＨＢＶタンパク質の少なくとも１つをコードすることに関わっている。しかしながら、このゲノムはまた、転写レベルを調節し、ポリアデニル化の部位を決定し、さらに特定の転写産物をヌクレオキャプシドへのキャプシド形成のために印付けする遺伝エレメントを含む。変動するフレーム内開始コドンの使用を通して、４つのＯＲＦは、７つの異なるＨＢＶタンパク質の転写および翻訳をもたらす。例えば、リボソームがａｄｗゲノムの１５５位のＡＴＧで翻訳を開始した場合、小さいＢ型肝炎表面タンパク質（ｓｍａｌｌ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が生じる。リボソームが３２１１位の上流ＡＴＧで開始し、タンパク質の５’末端に５５個のアミノ酸の付加をもたらした場合、中程度の大きさのＢ型肝炎表面タンパク質（ｍｉｄｄｌｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が生じる。
【００７８】
ＯＲＦ  Ｐはゲノムの大部分を占め、Ｂ型肝炎ポリメラーゼタンパク質をコードする。ＯＲＦ  Ｓは、３つの表面タンパク質をコードする。ＯＲＦ  Ｃは、Ｅ型肝炎およびコアタンパク質の両方をコードする。ＯＲＦ  Ｘは、Ｂ型肝炎Ｘタンパク質をコードする。ＨＢＶゲノムは、ウイルス複製が起こるのに必要な多くの重要なプロモーターおよびシグナル領域を含有する。４つのＯＲＦ転写は、４つのプロモーターエレメント（プレＳ１、プレＳ２、コア、およびＸ）および２つのエンハンサーエレメント（ＥｎｈＩおよびＥｎｈＩＩ）により制御される。全てのＨＢＶ転写産物は、ゲノム内の１９１６〜１９２１に及ぶ領域内に位置する通常のアデニル化シグナルを共有する。生ずる転写産物は、長さが３．５ヌクレオチド〜０．９ヌクレオチドに及ぶ。コア／プレゲノムプロモーターの位置のために、ポリアデニル化部位は、異なる形で利用される。規準的な真核生物ポリアデニル化シグナル配列（ＡＡＴＡＡＡ）とは対照的に、ポリアデニル化部位は、ヘキサヌクレオチド配列（ＴＡＴＡＡＡ）である。ＴＡＴＡＡＡは、非効率的に働くことが公知であり（９）、ＨＢＶによる、異なる形での使用に好適である。
【００７９】
Ｃ、Ｘ、Ｐ、およびＳと呼ばれるゲノムによりコードされる、４つの公知の遺伝子がある。コアタンパク質は遺伝子Ｃ（ＨＢｃＡｇ）によりコードされ、その開始コドンに、上流にあるフレームの合ったＡＵＧ開始コドンが先行し、上流のフレーム内ＡＵＧ開始コドンから、プレコアタンパク質が生成される。ＨＢｅＡｇは、プレコアタンパク質のタンパク質分解プロセシングにより生成する。ＤＮＡポリメラーゼは、遺伝子Ｐによりコードされる。遺伝子Ｓは、表面抗原（ＨＢｓＡｇ）をコードする遺伝子である。ＨＢｓＡｇ遺伝子は、１つの長いオープンリーディングフレームであるが、遺伝子を３つの区分、プレ−Ｓ１、プレ−Ｓ２、およびＳに分ける３つのフレームの合った開始（ＡＴＧ）コドンを含む。複数の開始コドンのために、Ｌ、Ｍ、およびＳと呼ばれる３つの異なるサイズのポリペプチド（プレ−Ｓ１＋プレ−Ｓ２＋Ｓ、プレ−Ｓ２＋Ｓ、またはＳ）が生成される。遺伝子Ｘによりコードされるタンパク質の機能は、完全には理解されていないが、それは肝臓がんの発症と関連付けられる。それは、細胞成長を促進する遺伝子を刺激し、成長調節分子を不活性化する。
【００８０】
図９を参照して、ＨＢＶは、ＰｒｅＳ１でホスト細胞に結合することにより、その感染周期を開始する。ＰｒｅＳ１に対するガイドＲＮＡは、コード配列の５’末端に位置する。エンドヌクレアーゼ消化は挿入／欠失を導入し、これはＰｒｅＳ１翻訳のフレームシフトをもたらす。ＨＢＶは、両端に同一の反復ＤＲ１およびＤＲ２、ならびに５’末端にＲＮＡキャプシド形成シグナルイプシロンを有する、長いＲＮＡの形態を通してそのゲノムを複製する。ポリメラーゼ遺伝子の逆転写酵素ドメイン（ＲＴ）は、ＲＮＡをＤＮＡに変換する。Ｈｂｘタンパク質は、ウイルス複製およびホスト細胞機能の重要な調節因子である。ＲＴに対するＲＮＡにより誘導される消化は、挿入／欠失を導入し、これはＲＴ翻訳のフレームシフトをもたらす。ガイドＲＮＡ  ｓｇＨｂｘおよびｓｇＣｏｒｅは、ＨｂｘおよびＨＢＶコアタンパク質のコード化におけるフレームシフトのみでなく、ＤＲ２−ＤＲ１−イプシロンを含有する全領域の欠失も、もたらすことができる。また、組合せの４つのｓｇＲＮＡは、ＨＢＶゲノムの全体的破壊をもたらし、小片にすることができる。
【００８１】
ＨＢＶは、ＲＮＡ中間体の逆転写によりそのゲノムを複製する。ＲＮＡ鋳型は最初に、単鎖ＤＮＡ種（マイナス鎖ＤＮＡ）に変換され、これは続いて、プラス鎖ＤＮＡ合成の鋳型として使用される。ＨＢＶにおけるＤＮＡ合成は、プラス鎖ＤＮＡ合成のためにＲＮＡプライマーを使用し、これは主として単鎖ＤＮＡ上の内部位置で開始する。プライマーは、ＲＮＡ鋳型の５’末端からの配列独立尺度であるＲＮアーゼＨ切断を介して発生する。この１８ヌクレオチドのＲＮＡプライマーは、マイナス鎖ＤＮＡの３’末端にアニーリングし、プライマーの３’末端は、１２ヌクレオチドの直列反復、ＤＲ１内に位置する。プラス鎖ＤＮＡ合成の大部分は、プライマー転移の結果として、マイナス鎖ＤＮＡの他方の末端近くに位置する１２ヌクレオチドの直列反復、ＤＲ２から開始する。プラス鎖プライミング部位は、重要性を有する。生体内原位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）でのプライミングは、二重直鎖（ＤＬ：ｄｕｐｌｅｘ  ｌｉｎｅａｒ）ＤＮＡゲノムをもたらし、一方で、ＤＲ２からのプライミングは、第２の鋳型転換の完了後に、環状化と呼ばれる弛緩円形（ＲＣ：ｒｅｌａｘｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ）ＤＮＡゲノムの合成をもたらす場合がある。ヘパドナウイルスが、なぜプラス鎖ＤＮＡ合成のプライミングについて、この追加された複雑性を有するのかは不明なままであるが、プライマー転移の機構は、療法標的として可能性がある。ウイルス複製はヘパドナウイルス（ヒト病原体、Ｂ型肝炎ウイルスを含む）の慢性保因状態の維持に必要であるので、複製を理解し、療法標的を明らかにすることは、保因者において疾患を制限するために重要である。
【００８２】
一部の実施形態では、本発明のシステムおよび方法は、ＰｒｅＳ１等の特徴内でヌクレオチド鎖を発見することにより、ＨＢＶゲノムを標的にする。ＰｒｅＳ１に対するガイドＲＮＡは、コード配列の５’末端に位置する。したがって、それはコード配列内の最も５’側標的の１つとなるので、標的化のための優れた候補である。エンドヌクレアーゼ消化は、挿入／欠失を導入し、これはＰｒｅＳ１翻訳のフレームシフトをもたらす。ＨＢＶは、両端に同一の反復ＤＲ１およびＤＲ２、ならびに５’末端にＲＮＡキャプシド形成シグナルイプシロンを有する、長いＲＮＡの形態を通してそのゲノムを複製する。ポリメラーゼ遺伝子の逆転写酵素ドメイン（ＲＴ）は、ＲＮＡをＤＮＡに変換する。Ｈｂｘタンパク質は、ウイルス複製およびホスト細胞機能の重要な調節因子である。ＲＴに対するＲＮＡにより誘導される消化は、挿入／欠失を導入し、これはＲＴ翻訳のフレームシフトをもたらす。ガイドＲＮＡ  ｓｇＨｂｘおよびｓｇＣｏｒｅは、ＨｂｘおよびＨＢＶコアタンパク質のコード化におけるフレームシフトのみでなく、ＤＲ２−ＤＲ１−イプシロンを含有する全領域の欠失も、もたらすことができる。また、組合せの４つのｓｇＲＮＡは、ＨＢＶゲノムの全体的破壊をもたらし、小片にすることができる。一部の実施形態では、本発明の方法は、ゲノム、例えば図９で示されるＨＢＶゲノム内の重要な特徴に対する１つまたはいくつかのガイドＲＮＡを創出することを含む。
【００８３】
図９は、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡにより標的とされるＨＢＶゲノム内の重要な部分を示す。細胞内でＣＲＩＳＰＲ活性を達成するために、ｃａｓ９およびガイドＲＮＡをコードする発現プラスミドを目的の細胞（例えばＨＢＶ  ＤＮＡを有する細胞）に送達する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで示すために、抗ＨＢＶ効果は、細胞増殖、成長、および形態をモニターすること、ならびに細胞内のＤＮＡ完全性およびＨＢＶ  ＤＮＡロードを分析することにより評価することができる。説明する方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して検証することができる。示すために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを、ｃａｓ９タンパク質および標的領域に隣接するＤＮＡアンプリコンで行う。ここでは、標的を増幅し、アンプリコンをｃａｓ９、および標的化のために選択したヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡと共にインキュベートする。図１０で示すように、ＤＮＡ電気泳動は、標的部位での強い消化を示す。
【００８４】
図１０は、ＨＢＶに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＲＩＳＰＲアッセイから得られたゲルを示す。レーン１、３、および６：ＲＴ、Ｈｂｘ−Ｃｏｒｅ、およびＰｒｅＳ１に隣接するＨＢＶゲノムのＰＣＲアンプリコン。レーン２、４、５、および７：ｓｇＨＢＶ−ＲＴ、ｓｇＨＢＶ−Ｈｂｘ、ｓｇＨＢＶ−Ｃｏｒｅ、ｓｇＨＢＶ−ＰｒｅＳ１で処理したＰＣＲアンプリコン。とりわけレーン５および７で見られる多数の断片の存在は、ｓｇＨＢＶ−ＣｏｒｅおよびｓｇＨＢＶ−ＰｒｅＳ１がＨＢＶに関してとりわけ魅力的な標的を提供すること、ならびに本発明のシステムおよび方法の使用がｉｎ  ｖｉｔｒｏ検証アッセイにより有効であることが示され得ることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2018516596.tif 000011
【図１０】
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【国際調査報告】
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