(57)【要約】  本発明は、デジタル蛍光画像を作成するための方法に関するものであり、当該方法においては、ピクセルごとに対象物平面から来る放出光が、それぞれ１つの測定時点に割り当てられた一連の振幅（Ｉ）へ変換され、また、一連の振幅（Ｉ）が少なくとも１つの時間シフトだけ互いにシフトされて自己相関が求められ、それぞれの時間シフト（τ）に関して１つの特有の相関振幅（Ｋτ）が形成され、当該相関振幅（Ｋτ）から全振幅が検出される。
2018529106.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デジタル蛍光画像を作成するための方法であって、蛍光性の色素を有する試料が、レーザー走査顕微鏡の対象面に配され、また時間的に連続して、１ピクセル単位でピクセル滞在時間（Ｔ）に渡って励起光で作用され、それによりピクセルごとに放射光が発生され、当該放射光は検出器によって検出され、それぞれ１つの測定時点に割り当てられた振幅（Ｉ）の連続へと変換され、そこから全振幅が形成され、全てのピクセルの複数の全振幅が、１枚の蛍光画像へとまとめられる方法において、
後の測定時点（ｔｍ）から始まる複数の振幅（Ｉ）の連続が、前の測定時点（ｔｎ）から始まる複数の振幅の同様の連続と、少なくとも一度自己相関され、前記前の測定時点（ｔｎ）は前記後の測定時点（ｔｍ）に対して時間シフト（τ）を有しており、時間シフトの１つに特有の１つの相関振幅（Ｋτ）がその都度形成され、また、形成された相関振幅（Ｋτ）の少なくとも１つから前記全振幅が算出されること、
を特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載方法において、
前記相関振幅（Ｋτ）が以下の式
Ｋτ＝（（Ｉ（ｔｎ）−Ｉ平均）ｘ（Ｉ（ｔｍ）−Ｉ平均））平均
を用いて算出され、
その際、Ｉ（ｔｎ）は前記前の測定時点（ｔｎ）の振幅（Ｉ）、Ｉ（ｔｍ）は前記後の測定時点（ｔｍ）の振幅（Ｉ）、ｍ＝ｎ＋τ、そしてＩ平均は振幅（Ｉ）の平均値であること、
を特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載方法において、
前記相関振幅（Ｋτ）が、前記振幅（Ｉ）の平均値の２乗で割られることにより正規化されること、
を特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１から３の何れか一項に記載方法において、
異なる時間シフト（τ）に対して前記相関振幅（Ｋτ）が算出され、また、比較の上最大の相関振幅（Ｋτ）を有する当該時間シフト（τ）が確定され、また全振幅として用いられること、
を特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載方法において、
前記比較の上最大の全振幅を有する前記時間シフト（τ）が、蛍光性物質に割り当てられ、また、データベースに保存されること、
を特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１から５の何れか一項に記載方法において、
異なる時間シフト（τ）に対して前記相関振幅（Ｋτ）が算出され、また、複数の前記相関振幅（Ｋτ）の平均値が確定され、また全振幅として用いられること、
を特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１から６の何れか一項に記載方法において、
異なる時間シフト（τ）に対して前記相関振幅（Ｋτ）が算出され、また、複数の前記相関振幅（Ｋτ）の合計が確定され、全振幅として用いられること、
を特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１から７の何れか一項に記載方法において、
前記測定時点の総数が４００を超えており、また、前記時間シフト（τ）が５０から１５０の間にあること、
を特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光性の色素を有するサンプルからデジタル蛍光画像（電子的画像データ）を作成するために用いられる方法に関している。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の局在化や組織試料及び細胞（以下「試料」と称する）内部でのタンパク質の分布を描写するため、蛍光顕微鏡は非常に効果的な光学顕微鏡の手段である。それに関連し、タンパク質にドッキングする蛍光性の色素が、顕微対象の試料へと狙って導入される。用いられる色素に応じて、特定の波長（励起波長）の光（励起光）で照射することによって、この色素は励起され、また、色素分子（蛍光色素）の電子はより高いエネルギーレベルへと上昇される。短い滞在時間の後、励起された複数の電子はそれぞれ、励起波長よりも長い特定の波長（放出波長）の光（放出光）を放出しながら、再びその基底状態へと戻る。１つの個別の電子はその際、１つの光子又はフォトンを放出する。この特性が、タンパク質やその他の物質を可視化するために用いられる。
【０００３】
蛍光顕微鏡が試料の視覚的な観察のみ限らずに利用される場合、蛍光顕微鏡は、カメラ及びマトリックス状に配設された複数の検出器を有する典型的な広視野顕微鏡、及び、１つの単独の検出器のみ有するレーザー走査顕微鏡、に大別される。どちらの種類の顕微鏡も今日一般的であるが、レーザー走査顕微鏡は、典型的な広視野蛍光顕微鏡に比べて、多くの長所を有している。
【０００４】
レーザー走査顕微鏡は、通常、共焦点型顕微鏡である、すなわち、対象平面へ入れられる励起光の焦点は、１つの共役面、画像面へ描写され、そこには、１つの単独の検出器が、通常は前方に配されるピンホールと共に、配置されている。当該ピンホールによって、僅かな対象野部分（オブジェクトフィールド部分）の放射光のみが、すなわち極僅かなピクセルの放射光のみが、検出器へと導かれる。これは、典型的な広視野蛍光顕微鏡に比べて、焦点平面のみから来る放射光の光子が検出されまた信号形成に寄与する、という決定的な長所を有している。この様態では、複数の試料（サンプル）が層ごとに顕微観察され得て、また、顕微観察された層ごとの信号から作成された蛍光画像が１枚の３次元的な画像へと合成される。
【０００５】
通常は２つのガルバノミラーから構成されるなるレーザー走査システムにより１つのスキャン周波数で対象野が走査されることによって、層ごとの蛍光画像は獲得される。なおその際、当該スキャン周波数から、ピクセルごとにピクセル滞在時間がもたらされる。ピクセル滞在時間の間に検出器によって検知された放射光は、この検出器により電気的にアナログの検出信号へと変換され、当該検出信号は、レーザー走査システムのそれぞれの位置の情報に基いて、それぞれ１つのピクセルに割り当てられる。アナログの検出信号は先ず、予め設定（プリセット）されているクロック周波数を用いてデジタル化される。それに関して、レーザー走査顕微鏡の分野では、基本的に２種類のデジタル化の方法が知られている。
【０００６】
第１の種類のデジタル化は、アナログ信号に関しての積分である。それは、信号検出の継続時間（検出時間）が、ピクセル滞在時間と同一のオーダー（スケール）である場合に用いられる、すなわち検出時間がピクセル滞在時間よりも僅かにだけ短い場合に用いられる。この場合アナログ信号に関して形成された積分値及び検出時間から、検出器の一度の読み出しで、ピクセルごとに１つの平均値（平均振幅）が導き出される。なお、当該平均値は当該ピクセルに割り当てられる全振幅を表している。
【０００７】
比較的大きな全振幅を形成することが可能であるので、蛍光性の色素の光線の強度がごく僅かのみであったことを理由に、以前は特にこの積分方法が用いられた。
【０００８】
第２の種類のデジタル化は、アナログの検出信号の高速な走査（サンプリング）である。それは、有利には検出時間が明らかにより短い場合に用いられる、特にはピクセル滞在時間と比較して数オーダー分だけより短い場合に用いられる。従って、ピクセル滞在時間に関して、複数の測定時点（信号検出の期間が簡略化され１つの時点と見なされる、或いは、測定時点は検出器の読み出し時点である）に対して、それぞれ１つの振幅が作り出される、また、一連の振幅から平均値（平均振幅）が作成される。なお、当該平均振幅は全振幅としてその都度１つのピクセルに割り当てられる。
【０００９】
現代的なＡ／Ｄ変換器を用いる場合この方法の複数の長所が優勢であるので、この高速走査は今日、レーザー走査顕微鏡において一般的である。
【００１０】
通常、検出信号は一定のスキャンレートで変換され、当該スキャンレートは、可能な最短のピクセル滞在時間よりも明らかに高い、好ましくは少なくとも１オーダー高い、特には２オーダー高い。ピクセルごとの測定時点の数は、ピクセル滞在時間からもたらされる。それに対しこのピクセル滞在時間は、スキャン調整（フレームレート、ピクセル数、スキャンサイズ）によって決定される。ピクセル滞在時間を長くすることは、従って、ピクセルごとの測定時点の数の増加を導く。
【００１１】
信号ノイズ比を改善するため、通常はピクセル待機時間が増加される。それに伴う欠点は、全てのピクセルのための複数の全振幅からラスターグラフィクスの形態で形成される蛍光画像を獲得するためのトータル時間が増加しまたフレームレートが減少することである。信号ノイズ比は全振幅における割合の比率によって特定され、当該全振幅は一方では放射光により、そして他方ではノイズに起因するものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、フレームレートを維持したままで、改善された信号ノイズ比を有するデジタル蛍光画像を提供する方法を見つけ出すことである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この課題はデジタル蛍光画像を作成する方法のために解決される。当該方法においては、蛍光性の色素を有する試料が、レーザー走査顕微鏡の対象面に配され、また時間的に連続して、１ピクセル単位でピクセル滞在時間に渡って励起光による作用を受け、それによりピクセルごとに放射光が発生される。ピクセルごとの放射光は、１つの検出器によって検出され、それぞれ１つの測定時点に割り当てられた一連の振幅（振幅のシーケンス）へと変換される。これらの複数の振幅から、ピクセルごとにその都度１つの全振幅が作成される。全てのピクセルの複数の全振幅は、１枚の蛍光画像へとまとめられる。それぞれ１つのピクセルに割り当てられた全振幅は、１つ又は複数の相関振幅から算出され、また従って、ノイズは全振幅にはほぼ入り込まず、その結果より高い信号ノイズ比を有する蛍光画像が生じることが、本発明にとって本質的である。
【００１４】
そのため、後の測定時点から始まる複数の振幅の連続（一連の振幅、振幅のシーケンス）が、前の測定時点から始まる複数の振幅の同一の連続と、少なくとも一度相関が見られる。後の測定時点及び前の測定時点は、その際、少なくとも１つの時間シフト（タイムラグ）を有している。すなわち、１つの時間シフトを用いたただ一度の自己相関の代わりに、複数の振幅の連続は、複数回自己相関されてもよく、その際、自己相関毎に別の時間シフトが用いられる。時間シフトごとに、それぞれの時間シフトに特有の（特性的な）１つの相関振幅が形成され、そして全振幅が形成された複数の相関振幅から算出される。相関可能な振幅ペアの数は、時間シフトを差し引きピクセル滞在時間ごとの全ての測定時点の数に対応する。
【００１５】
好ましくは、相関振幅は以下の式、
Ｋτ＝（（Ｉ（ｔｎ）−Ｉ平均）ｘ（Ｉ（ｔｍ）−Ｉ平均））平均
を用いて算出される。その際、Ｉ（ｔｎ）は前の測定時点ｔｎでの振幅、Ｉ（ｔｍ）は後の測定時点ｔｍでの振幅、ｍ＝ｎ＋τであり、Ｉ平均は全ての振幅の平均値として算出される平均振幅である。
【００１６】
相関振幅Ｋτが平均振幅の２乗Ｉ平均２で割られることにより正規化（規格化）される場合、有利である。
【００１７】
異なる時間シフトτのために相関振幅Ｋτが算出され、比較の上最大の相関振幅Ｋτを有する時間シフトが、確定されまたそれが全振幅として用いられる場合、蛍光画像の質を改善することが出来る。
【００１８】
比較の上最大の相関振幅Ｋτに割り当てられた時間シフトτは、有利には、蛍光性の色素に割り当ててデータベースに保存され得る。
【００１９】
代替的には、相関振幅Ｋτが異なる時間シフトτに関して算出されてもよく、また、相関振幅Ｋτの平均値が確定されそして全振幅として用いられてもよい。
【００２０】
また、相関振幅Ｋτが異なる時間シフトτに関して算出されてもよく、また、相関振幅Ｋτの合計が確定されそして全振幅として用いられてもよい。
【００２１】
測定時点の総数は４００を超えており、また、時間シフトτは５０から１５０の間にと有利であり、その結果少なくとも２５０の振幅ペアの相関が求められる。
【００２２】
本発明に従う方法は、蛍光性の色素が放出光を発する際に少なくとも相関プロセスの影響下にあることを利用している、すなわち、ピクセル滞在時間の継続時間に渡る放出光の強度を表す蛍光信号が少なくとも１つの関数の影響下にあることを利用している。
【００２３】
この場合、相関プロセスとしては、例えば、フォトブリンキング（蛍光明滅現象）やフォトブリーチング（蛍光褪色現象）が知られている。
【００２４】
フォトブリンキングとしては、暗状態と交替して特定の時間間隔に対する光子の放出が理解される。励起光を照射される蛍光性の色素の電子は、高いエネルギーレベルへと励起され、また、エネルギー的に低位のレベルへ戻る際に、光子を放出する。しかしながらそれは連続的に発生せず、その間に、光子が放出されない暗状態と称されるフェーズが存在する。この暗状態は、例えば所謂三重項状態、又は、蛍光放射が起こり得ないその他の状態、であり得る。蛍光色素分子（フルオロフォア）を観察する際に、検知時間内に１つの光子のみが検出器に当たる程に短い検知時間が用意される場合、これは典型的なオンオフ現象を導く。この減少のタイムスケール及びその正確な原因は、多岐に渡っており、またその細部までは知られていない。蛍光色素分子が静的に振る舞うこと前提とする場合、すなわち１つのピクセル内のそれらの総数が少なくともピクセル滞在時間に渡って変更せずに保たれることを前提とする場合、短い滞在時間において、ブリンキングに基づく周期的な強度変動が検出され得る。
【００２５】
フォトブリーチングとしては、非蛍光状態への蛍光色素分子の非可逆的な移行が理解される。これに関しても、タイムスケール及び原因は多岐に渡りその細部までは知られていない。励起光の強度に対するフォトブリーチングの依存性が知られている。とりわけ、共焦点型顕微鏡において励起光が試料へ通常のように強集束する場合では、フォトブリーチングは非常に素早く進行するプロセスである。フォトブリーチングは観察期間の進行とともに蛍光信号の減少を導くので、一般的に蛍光顕微鏡内でのフォトブリーチングは望まれない事象である。
【００２６】
また、両方の現象（フォトブリーチング及びフォトブリンキング）が、異なる蛍光性物質に関して、また、異なる環境条件（温度、ｐＨ値、酸素濃度）において、異なる特性で発現することも知られている。
【００２７】
フォトブリンキングと同様にフォトブリーチングも、悪化した全信号を導くが、それは複数の光子の合計によって形成される僅かな放出光が検出され、そしてそれに伴い信号ノイズ比を悪化させるからである。
【００２８】
本発明に従う方法を実行するためには、上述のこれらのプロセスや場合によっては発生する相関性のある別のプロセスの経過及びタイムスケールを知っている必要はなく、これらが発生しまた信号処理のために使用されるという事実のみが必要である。
【００２９】
１つのピクセルのためにその都度の１つの全振幅が、従来技術のように例えば一連の複数の振幅の平均値形成を介して形成されるのではなく、一連の振幅（振幅シーケンス）の自己相関を介して形成されることにより、複数の相関プロセスが信号処理のために用いられる。
【００３０】
自己相関は、基本的に信号処理から知られており、また、１つの信号（関数）の相関又は連続する振幅の相関にして、より前の時点に対するそれ自体との相関を表す。
【００３１】
時間に関する関数としての放出光の強度の変化から情報が獲得される蛍光相関顕微鏡からも、自己相関法の使用は知られている。１つの相関関数が、それ自体が相関する関数の１つの時間シフトに渡り形成される。形成された相関関数からは、例えば拡散時間を導き出すことが可能である。当該拡散時間は、相関振幅が最大から相関する関数の間の時間シフトが最小のみである場合において特定の大きさ例えば半分の大きさに減少する時間、に対応する。
【００３２】
本発明に従う方法は、以下において図面を用いて実施例を参照しながらより詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ピクセル滞在時間Ｔに渡り時間ｔに応じて変化する蛍光の光線強度（振幅）Ｉ（ｔ）を表している。
【図２ａ】視覚化されたデジタル蛍光画像を示しており、当該蛍光画像においては画像ピクセルのグレースケールを決定する全振幅は、従来技術に従う平均値形成によって算出される（異なるグレースケールはこの図面では異なるハッチングで表されている）。
【図２ｂ】視覚化されたデジタル蛍光画像を示しており、当該蛍光画像においては画像ピクセルのグレースケールを決定する全振幅は、従来技術に従う平均値形成によって算出される（異なるグレースケールはこの図面では異なるグレースケールレベルで表されている）。
【図３ａ】視覚化されたデジタル蛍光画像を示しており、当該蛍光画像においては画像ピクセルのグレースケールを決定する全振幅は、本発明に従い自己相関によって算出される（異なるグレースケールはこの図面では異なるハッチングで表されている）。
【図３ｂ】視覚化されたデジタル蛍光画像を示しており、当該蛍光画像においては画像ピクセルのグレースケールを決定する全振幅は、本発明に従い自己相関によって算出される（異なるグレースケールはこの図面では異なるグレースケールレベルで表されている）。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明に従う方法は、１つのピクセル滞在時間内の複数の個別の測定時点に割り当てられた複数の振幅を獲得するまでは、高速走査（サンプリング）によるアナログ検出信号のデジタル化を用いた従来技術で説明される方法と同じものである。
【００３５】
アナログの検出信号が、複数回の走査（検出器の読み出し）によって、多数の振幅の連続へとデジタル化されることが重要である。これは実際には、単独の検出器のみを用いて、また従って１つのレーザー走査顕微鏡を用いて可能であり、それは通常はシングルスポット装置として実施され得て、しかしながらまたマルチスポット装置としても実施され得るものであって、当該装置においては例えば４本の別々の光線が同時に試料上を走査（スキャン）し、その結果、蛍光光線は４つの割り当てられた個別の検出器によって検出される。原理上、対象野（対象フィールド）は、１ピクセルずつ励起光で作用させる代わりに、同時に照射されてもよく、また、その間に１つのカメラの１つの検出装置が複数回読み出されてもよい。しかしながら実際には、通常のカメラを用いては、フォトブリンキングを検出するために必要なμ秒範囲の短い検出時間は達成されない。更に、自己相関のための十分多くのそして十分に大きな振幅を獲得するために、それぞれのピクセルに作用するであろう光線強度は小さすぎ、また、可能な測定時点の数は少なすぎる。
【００３６】
蛍光画像を作成するため、励起光は、励起光源から来て対象平面へ、スキャンシステムを用いて順次連続してその都度のピクセル滞在時間Ｔに渡って個別の対象野部分（ピクセル）に合焦（フォーカス）される。尚その際、対象平面は、蛍光性の色素を用いてマーキングされた試料内又は試料上に存在している。その際、それぞれの関連するピクセル内の蛍光色素分子（フルオロフォア）は、放出光（エミッション光）を放出するために励起される。ピクセル滞在時間Ｔの間に１つのピクセルから発せられる放出光の強度は、放出される光子（フォトン）の総数によって特定されるものであり、検出器を介して検知される。
【００３７】
図１には、蛍光の光線強度Ｉ（ｔ）のアナログ信号が、ピクセル滞在時間Ｔに渡る時間ｔとの関連で示されている。それは、フォトブリーチングに起因しまた減衰的な指数関数に類似の関数、及び、フォトブリンキングに起因しまたより短い時間スケールで変動する関数、の影響下にある。
【００３８】
アナログ／デジタル変換プロセスでは、より多くの測定時点に対して検出器が読み出され、また、測定時点毎に１つの振幅が形成される。その際、それぞれの測定時点の間隔は検出時間によって決定されている。従って、ピクセル滞在時間Ｔに渡る放出光の強度についてのアナログ信号は、強度に対して比例的な一連の振幅を用いて、デジタル信号へと変換される。それらの強度は、１つの検出時間の間にその都度検出され、また１つの測定時点に割り当てられる。ピクセル滞在時間Ｔに対する比率において検出時間がより短くなるほど、スキャン周波数また従ってアナログの関数の分解能は高くなる。
【００３９】
１つの測定時点に割り当てられた強度は、その都度の測定時点に割り当てられた検出時間内での通常のノイズの寄与並びに作用する光子の合計によって、形成される。
【００４０】
従って、１つのピクセル滞在時間Ｔの後には、１つのピクセルに対して、複数の振幅が存在し、当該複数の振幅は、それらを１つの測定時点に対してその都度割り当てることにより、１つのシーケンスを形成する。全ての振幅の平均値から得られる全振幅が平均振幅として形成される従来技術とは異なり、本発明に従う方法によれば、一連の振幅（振幅シーケンス）の、時間シフト（タイムラグ）τだけ延期されたそれ自体との自己相関によって、相関振幅Ｋτが形成される。この場合時間シフトτは無次元であって、それ自体と相関される一連の振幅との間にある測定点の数として理解されるべきものである。すなわち、第１の測定時点ｔ１から始まる一連の振幅及び第２０の測定時点ｔ２０から始まる一連の振幅が相関されるとすると、時間シフトτは１９である。時間シフトτの実際の継続時間は検出時間及び時間シフトτからもたらされる。
【００４１】
その都度１つの振幅ペアを形成する複数の振幅であって、固定的な時間シフトτを有しその結果ｍ＝ｎ＋τであるような先の測定時点ｔｎ及び後の測定時点ｔｍの複数の振幅が、連続的に相互相関される。見やすさのため、振幅は、光学的信号を電気的信号へ変換した後でも、Ｉ（ｔ）を用いて表される。相関振幅Ｋτはその都度、１つの時間シフトτに対して、先の振幅Ｉ（ｔｎ）及び後の振幅Ｉ（ｔｍ）の相関、及び、振幅の平均値Ｉ平均から、以下の数式
Ｋτ＝（（Ｉ（ｔｎ）−Ｉ平均）ｘ（Ｉ（ｔｍ）−Ｉ平均））平均
に従ってもたらされ、その際、先の振幅Ｉ（ｔｎ）及び後の振幅Ｉ（ｔｍ）の測定時点は互いに時間シフトτを有している。
【００４２】
有利には相関振幅Ｋτは、規格化されてもよく、例えば振幅の平均値（平均振幅）の２乗を用いて規格化されてもよく、以下の数式
Ｋτ＝（（Ｉ（ｔｎ）−Ｉ平均）ｘ（Ｉ（ｔｍ）−Ｉ平均））平均／Ｉ平均２
に従って、もたらされる。
又は、振幅の最大値の２乗を用いて、以下の数式
Ｋτ＝（（Ｉ（ｔｎ）−Ｉ平均）ｘ（Ｉ（ｔｍ）−Ｉ平均））平均／Ｉ最大２
に従って、もたらされる。
【００４３】
それぞれの後の測定時点ｔｍについて、関連する先の測定時点ｔｎに対する振幅Ｉ（ｔｎ）と全ての振幅の平均値Ｉ（ｔ平均）の間の差、及び、それぞれの後の測定時点ｔｎ＋τに対する振幅Ｉ（ｔｎ＋τ）と全ての振幅の平均値Ｉ（ｔ平均）の間の差、からの積が形成される。後の測定時点ｔｍに割り当てられた一連の積値（積値の連続、積値シーケンス）がもたらされ、当該積値の平均値は、相関振幅Ｋτを表す。ノイズは相関の影響下にはないので、そのようにして獲得される相関振幅Ｋτはノイズを含まない（ノイズフリーである）。
【００４４】
例えば１画像毎秒で２５６ｘ２５６ピクセルのスキャンを行う場合、ピクセル滞在時間Ｔ＝１５μｓ及びスキャン周波数４０ＭＨｚでは、６１０の測定時点がもたらされる。従って、所謂先の測定時点ｔｎの６１０個の振幅Ｉ（ｔｎ）が使用可能であり、その際、１≦ｎ≦６１０である。
【００４５】
相関振幅Ｋτの特定のため、所謂後の測定時点ｔｍの多数の振幅Ｉ（ｔｎ＋τ）を自己相関のために使用可能とするために、時間シフトτの継続時間は、好ましくはピクセル滞在時間Ｔの半分よりも短いべきであるが、ピクセル滞在時間Ｔの１／５よりは長いべきである。本例においては従って、時間シフトτは有利には、第１の測定時点ｔ１及び第１２０の測定時点ｔ１２０の間の数に対応し得て、従って時間シフトτは１１９となるであろう。この場合、４１０の振幅ペアが相関されであろう。
【００４６】
しかしながら基本的に時間シフトτは、実施例に比べて非常に少なく、１０程度まで小さくてもよいし、また、非常に多く、５５０程度まで多くてもよい。
【００４７】
複数のデジタル蛍光画像は、通常ラスターグラフィクス（ビットマップ画像）として表示及び保存される。すなわち、複数のピクセルに割り当てられた複数の振幅は、対象平面内のピクセルの配置に対して相関するラスター内に保存される。
【００４８】
異なる蛍光性物質を備える試料のために作成されるべき蛍光画像の作成のためには、実験を介してその都度１つの最適な時間シフトτを見つけ出すこと、及び、最適な時間シフトτのための継続時間がデータベース内に保存されることが合目的である。その際当該時間シフトτに関して、もたらされる相関振幅Ｋτは最大限に大きい。
【００４９】
そのためには、特には対象平面の領域にして大きな蛍光信号が期待される領域における、個別のピクセルでの自動化された短時間の局所的測定を実施してもよく、また、その際獲得される複数の振幅を上述のように異なる時間シフトτのために算出してもよい。この局所的な測定は、対象領域に渡って確率的に又は等間隔で、自動的に分配され得る。局所的な測定の位置は、特に重要な試料部位を分析するために、利用者によって設定されてもよい。
【００５０】
最適な時間シフトτの継続時間は、データベースから求められてもよい。特性的なフォトブリンキング時間は、多くの一般的な色素に対して、文献から既知であり、また、時間シフトτの最適な継続時間である。これらの文献値は、蛍光性物質に割り当て、データベースに保存することが可能であり、それは、同一の蛍光性物質を有するその後のサンプルの顕微鏡検査のために、検出時間を鑑みて、少なくとも１つのスタート‐時間シフトを保存出来ることを目的としている。
【００５１】
従来技術としての平均値形成は通常、ＦＰＧＡ（現場でプログラム可能なゲートアレイ（field-programmable gate array））上で行われる。同様にして、自己相関振幅の形成もＦＰＧＡ上で実行することが出来る。
【００５２】
ピクセル滞在時間Ｔの間の複数の測定時点にそれぞれ割り当てられた複数の振幅Ｉによって生成される、１つの同一のデジタル検出信号からは、並行して又は連続的に、全振幅が平均値形成及び自己相関によって算出され得て、また蛍光画像として表示され得る。
【００５３】
上述のように、１つのピクセルについての相関振幅Ｋτが、異なる時間シフトτに対して算出され得て、また、それらのうちの１つが蛍光画像を表示するために用いられ得る。また、蛍光画像の表示に関するピクセルごとに、異なる時間シフトτに対して計算された複数の相関振幅Ｋτが足し合わされ、及び／又は、平均されてもよい。そうして、特には時間シフトτの最適な継続時間が事前に知られていない場合に、信号ノイズ比を更に改善することが出来る。
【００５４】
図２ａ及び図２ｂには、それぞれ１つの蛍光画像が示されており、当該蛍光画像は従来技術に従いピクセルごとに１つの平均振幅を割り当てることによって作成される。これらの画像は、異なる大きさの平均振幅が、一方では異なるハッチングで表されており、他方では異なるグレースケールで表されている点で、異なっている。
【００５５】
図３ａ及び図３ｂには、それぞれ１つの蛍光画像が示されており、当該蛍光画像は本発明に従いピクセルごとに１つの相関振幅Ｋτを割り当てることによって作成される。これらの画像は、異なる大きさの平均振幅が、一方では異なるハッチングで表されており、他方では異なるグレースケールで表されている点で、異なっている。
【００５６】
図３ａ及び図３ｂでは、所謂クラスター形成（クラスタリング）が認められ、それは対象平面における蛍光性物質の局所的な集中を示している。その種のクラスター形成は、図２ａ及び図２ｂにおいて、蛍光信号及びノイズの重ね合わせに基いては、認めることが出来ない。
【図１】
2018529106.tif 000003
【図２ａ】
2018529106.tif 000004
【図２ｂ】
2018529106.tif 000005
【図３ａ】
2018529106.tif 000006
【図３ｂ】
2018529106.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成28年12月19日(2016.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デジタル蛍光画像を作成するための方法であって、蛍光性の色素を有する試料が、レーザー走査顕微鏡の対象面に配され、また時間的に連続して、１ピクセル単位でピクセル滞在時間（Ｔ）に渡って励起光で作用され、それによりピクセルごとに放射光が発生され、当該放射光は検出器によって検出され、それぞれ１つの測定時点に割り当てられた振幅（Ｉ）の連続へと変換され、そこから全振幅が形成され、全てのピクセルの複数の全振幅が、１枚の蛍光画像へとまとめられる方法において、
ピクセルごとに、後の測定時点（ｔｍ）から始まる複数の振幅（Ｉ）の連続が、前の測定時点（ｔｎ）から始まる複数の振幅の同様の連続と、少なくとも一度自己相関され、前記前の測定時点（ｔｎ）は前記後の測定時点（ｔｍ）に対して時間シフト（τ）を有しており、前記時間シフトに特有の少なくとも１つの相関振幅（Ｋτ）がその都度形成され、また、形成された相関振幅（Ｋτ）の少なくとも１つから前記全振幅が算出されること、
を特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載方法において、
前記相関振幅（Ｋτ）が以下の式
Ｋτ＝（（Ｉ（ｔｎ）−Ｉ平均）ｘ（Ｉ（ｔｍ）−Ｉ平均））平均
を用いて算出され、
その際、Ｉ（ｔｎ）は前記前の測定時点（ｔｎ）の振幅（Ｉ）、Ｉ（ｔｍ）は前記後の測定時点（ｔｍ）の振幅（Ｉ）、ｍ＝ｎ＋τ、そしてＩ平均は振幅（Ｉ）の平均値であること、
を特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載方法において、
前記相関振幅（Ｋτ）が、前記振幅（Ｉ）の平均値の２乗で割られることにより正規化されること、
を特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１から３の何れか一項に記載方法において、
異なる時間シフト（τ）に対して前記相関振幅（Ｋτ）が算出され、また、比較の上最大の相関振幅（Ｋτ）を有する当該時間シフト（τ）が確定され、また全振幅として用いられること、
を特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載方法において、
前記比較の上最大の全振幅を有する前記時間シフト（τ）が、蛍光性物質に割り当てられ、また、データベースに保存されること、
を特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１から３の何れか一項に記載方法において、
異なる時間シフト（τ）に対して前記相関振幅（Ｋτ）が算出され、また、複数の前記相関振幅（Ｋτ）の平均値が確定され、また全振幅として用いられること、
を特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１から３の何れか一項に記載方法において、
異なる時間シフト（τ）に対して前記相関振幅（Ｋτ）が算出され、また、複数の前記相関振幅（Ｋτ）の合計が確定され、全振幅として用いられること、
を特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１から７の何れか一項に記載方法において、
前記測定時点の総数が４００を超えており、また、前記時間シフト（τ）が５０から１５０の間にあること、
を特徴とする方法。
【国際調査報告】
2018529106.tif 000008
2018529106.tif 000009
2018529106.tif 000010
2018529106.tif 000011