(57)【要約】    試料中の標的分子の存在を特定するために直線二色性を利用する方法が提供される。本方法は、第１結合領域を含み、５：１を超える高アスペクト比を有する整列可能な足場を準備することと、整列可能な足場のＬＤシグナルが、非結合で整列された足場に比べて、減少するか、または最小化されるように、標的分子の不在下において、第１結合領域に結合する第２結合領域を含み、第１および第２結合領域の片方は、標的分子に結合することができる受容体である基質を準備することと、受容体への標的分子の結合が存在するなら、該結合が、基質から基質に結合した足場を解放するように、基質に結合した足場を試料にさらすことと、試料にさらす前後で足場のＬＤシグナルを測定することとを含む。本方法における使用のための試薬および装置も提供される。
2018529100.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的分子の存在を検出するための方法であって、
第１結合領域を含み、５：１を超える高アスペクト比を有する整列可能な足場を準備する工程と、
整列可能な足場のＬＤシグナルが、非結合で整列された足場に比べて減少するか、または最小化されるように、標的分子の非存在下において第１結合領域に結合する第２結合領域を含み、第１および第２結合領域の片方は、標的分子に結合可能な受容体である基質を準備する工程と、
受容体への標的分子の結合が存在するなら、該結合が、基質から基質に結合した足場を開放するように、基質に結合した足場を試料にさらす工程と、
試料にさらす前後で、足場のＬＤシグナルを測定する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
受容体は、第１結合領域であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
受容体を足場に付着させ、受容体／足場複合体を形成する初期工程を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
受容体は、第２結合領域であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
受容体を基質に付着させる初期工程を含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＬＤシグナルは、溶液中の足場の整列を誘導することによって、たとえば流路を備えることによって測定されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
整列は、せん断流、磁気的整列、または圧搾ゲルの使用によって誘導されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
足場部分は、合成ポリマー、天然ポリマー、カーボンナノチューブ、および生体分子繊維から選択されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
生体分子繊維は、脂質小胞、糸状バクテリオファージ、アミノ酸ポリマー、または核酸ポリマーであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
生体分子繊維は、Ｍ１３，ｆ１，ｆｄ，Ｉｋｅ，Ｎ１，またはペプチド核酸（ＰＮＡ）であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
第１結合領域は、標的分子に対する受容体であり、基質は、標的分子の少なくとも一部を含む１以上の第２結合領域を含むことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
第２結合領域は、共有結合性相互作用によって基質に付着したリガンドの形態であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
リガンドは、基質の反応基に対する、リガンドの、アミン、カルボン酸、スルフヒドリル、またはリン酸反応基を介して基質に付着することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
検出されたＬＤシグナルの増加は、試料中の前記標的分子の濃度に比例し、
遊離標的分子および関連結合領域は、該標的分子および該関連結合領域の間における受容体の競合が化学的平衡を生じるように、非共有結合性相互作用によって受容体に結合していることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
基質は、足場が、整列不可形態にあるように足場に結合し、それによって足場のＬＤシグナルを最小化する、または減少させることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
基質は、整列不可能な部分（ＮＡＭ）を含むか、または該部分からなることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
基質は、足場に結合することによって整列不可能にのみされる整列可能な部分を含むか、または該部分からなることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
足場部分および基質は、実質的に同一であることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
基質は、ＬＤ分光計によって観察可能な反応容器内の表面を含むか、または該表面からなり、表面は、該表面に付着した１以上のリガンドを有し、該リガンドは足場の第１結合領域に結合し、それによって足場を整列不可能な形態で表面に隔離することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項２０】
基質は、ＬＤ分光計によって観察可能ではない、反応容器内の表面を含むか、または該表面からなり、遊離標的分子の存在下における足場の解放は、整列可能な足場をＬＤ分光計の範囲内に移動させることを可能にし、それによってＬＤシグナルを記録することを可能にすることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項２１】
標的分子は、足場の４０％未満の寸法であることを特徴とする請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法において使用するための試薬であって、
第１結合領域を含み、高アスペクト比を有する整列可能な足場と、
第２結合領域を含む基質と、
第１および第２結合領域の片方は、標的分子に結合可能な受容体であり、
標的分子の不在下において、基質と足場とは、足場が整列されないように、それらの各結合領域を介して結合することを特徴とする試薬。
【請求項２３】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法において使用するための装置であって、
偏光源と、
整列可能な足場の結合領域に結合するために適合された表面を含む反応容器と、
標的分子を潜在的に含む試料に整列能力を付与するための手段と、
試料を通った後、偏光源から光を受けるように配置された検出器とを含み、
光路は、偏光源と検出器との間に規定されることを特徴とする装置。
【請求項２４】
表面は、使用中、光路の外になるように配置されることを特徴とする請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
表面は、整列不可能な形態で足場に結合するように構成されることを特徴とする請求項２３に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の標的分子の存在を、特に小さな標的分子の存在を特定するために直線二色性を利用する方法に関する。また、本発明は、前記方法において使用するための試薬および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
もともと、生物は、多くの複合分子と、分子集合体とを含む。最も重要な分子および集合体のうちのいくつかは、大きく、高いアスペクト比を有する（すなわち、１つの軸が、他のどの軸よりも有意に長い）。これらの高アスペクト比の分子を特異的に検出するために光学的な装置を使用することが知られている。そのような装置は、これらの長い分子が偏光（すなわち、電界が一方向にのみある光）と相互作用する方法に依存している。
【０００３】
上述の装置において利用されている現象は、二色性として知られている。入射光は、直線偏光されて直線二色性（ＬＤ）を生じさせるか、円偏光されて、円二色性（ＣＤ）を生じさせるかのいずれかとなる。ＬＤは、直線偏光が、２つの直交軸に沿って別個に吸収される、いくつかの分子構造によって示される特性である。ＣＤは、左円偏光および右円偏光の吸収の差異に関連している。選択的光吸収が可能である分子は、発色団として知られている。二色性分子、すなわち二色性特性を示す分子は、特定の種類の発色団である。二色性材料の例としては、いくつかの天然結晶、延伸ポリマー、および他の非等方性分子である。生体分子は、広い範囲の発色団（芳香族側鎖、ヌクレオチド、およびペプチド骨格など）を含む。
【０００４】
二色性効果を観察可能にするために、発色団を、入射偏光ビームに関して、整列させることが、または少なくとも部分的に整列させることが必要である。この要件は、非整列分子の環境における整列分子からのみ、データの抽出を可能にするという利点を有する。しかし、この要件が、上述の技術の用途を、主に高アスペクト比を有する巨大分子の研究に限定してきた。なぜなら、これらは、容易に整列可能だからである。分子は、一つの軸が他の軸よりも実質的に長い場合、高アスペクト比を有すると考えられる。適切な分子は、棒状、円盤状、または十字形状とすることが可能である。分子の剛性に依存して、１００：１のアスペクト比が、整列を促進するために十分であってもよいが、１０００：１よりも大きなアスペクト比が好ましい。うまく整列された関心部分のいくつかの例は、ＤＮＡ、繊維性タンパク質、および膜（膜タンパク質など）の形態である直線状生体分子を含む（Marrington R, Small E, Rodger A, Dafforn TR, Addinall SG, 「FtsZfiber bundling is triggered by a conformational change in bound GTP」 J Biol Chem 2004;279(47):48821-48829; Dafforn TR, Rajendra J, Halsall DJ, Serpell LC, Rodger A, 「Protein fiber linear dichroism for structure determination and kinetics in a low-volume, low-wavelength couette flow cell」 Biophys J 2004;86(1 Pt 1):404-410; Dafforn TR, Rodger A, 「Linear dichroism of biomolecules: which way is up?」 CurrOpinStructBiol 2004;14(5):541-546; Halsall DJ, Rodger A, Dafforn TR, 「Linear dichroism for the detection of single base pair mutations」 Chem Commun (Camb) 2001(23):2410-2411）。
【０００５】
そのような分子を整列させるための特に便利な方法は、分子を含む溶液を作製し、続いてその溶液を流過させることである。分子の細長い性質のゆえに、流れによって生じたせん断力の結果として整列が生じ、試料を直線二色性の効果を示すために適したものとする。
【０００６】
公知の装置において、関心分子が整列されていれば、直線偏光は、整列された分子の軸に実質的に垂直な方向から溶液を通って方向付けられる。光の吸収が分子内に生じるが、それは、特定の波長において、放射電界は、分子中の電子を特定の方向に促すからである。いくつかの分子が同様に整列されるとき、各分子の電子の特徴は、同一の好ましい正味変位方向である。ＬＤは、２つの直交する偏光の間における入射光の吸光度の差異の尺度である。入射光の波長を変化させ、試料から現れる光を検出することで、波長に対する試料の吸光度を示すスペクトルを得ることができる。
【０００７】
分子のＬＤスペクトルは、存在する発色団についての、発色団の配向（したがって、分子配座）、および偏光軸に対する発色団の配向などの情報を提供する。この情報は、分子構造を理解する上で重要である。ＬＤは、試料のバルク特性の尺度であることを示すことに留意されたい。吸光強度は、試料中に存在する標的分子の数を定量化するために使用することができる。また、ＬＤは、整列の変化に非常に敏感であるので、分子構造の異常を検出することができる。たとえば、ＬＤは、ＤＮＡの１３００ｂｐ（塩基対）フラグメントにおける１つのミスマッチ水素結合によって生じる歪みを検出することができる。
【０００８】
さらに、ＬＤは、複合体の形成に非常に敏感である。なぜなら、整列された分子の第２分子に対する結合は、以下の２つの測定可能な効果を有するからである。
１）整列部分の形状が変化すると、その結果、その整列も変化させ、そして観察されるＬＤスペクトルにおける変化をもたらす。
２）第２分子自体は、整列された分子に対する付着によって整列する。このことは、予め整列されていない第２分子の発色団についてのＬＤシグナルの発生をもたらす。したがって、複合体構造の情報を得ることができる。上述の効果は双方とも、複合体の形成を検出するために使用することができる検出可能な現象をもたらす。複合体の性質に関して、構造的情報が分かるだけではなく、相互作用の親和性も測定することができる。
【０００９】
ＷＯ２００８／０５９２８０は、センサ素子が、高アスペクト比を有する足場部分であって、それに付着した受容体部分を有する足場部分を包含した分子センサを開示している。整列可能な足場部分を受容体部分の付着のために使用することは、受容体部分自体も、標的分子も固有の整列特性を必要としないことを意味する。二色性スペクトルを得ることによって整列された分子を検出することができるとともに、センサは、整列された分子を定量し、ミスマッチなどの分子異常の存在を検出するために使用することができる。受容体部分と標的分子との結合特性は、センサを用いて調べられてもよい。二色性分子の固有の性質は、センサが非常に高感度であることを意味する。
【００１０】
このシステムは、多くの例において有用であるが、多くの実際的な制限を有する。第１に、標的分子は、ＬＤシグナルにおける変化を検出するために、受容体部分への結合後、整列可能な足場の整列を顕著に変更するために十分に大きくなければならない。このことは、システムの用途を、整列可能な足場のサイズと同様な大きさ、またはより大きな標的分子の、検出および分析に制限する。このシステムの第２の制限は、整列可能な足場と、標的分子との間の結合によって生成されるシグナルが、減少することである。診断産業内において、標的が存在するときにアッセイシグナルが増加する利点が示されている。
【００１１】
本発明は、ＷＯ２００８／０５９２８０に開示されたシステムがさらに開発されたものであり、検出においてＬＤシグナルの増加をもたらす小さな標的を検出するために使用可能なアッセイを提供する。
【発明の概要】
【００１２】
試料中の標的分子の存在を検出するための方法は、
第１結合領域を含み、高アスペクト比を有する整列可能な足場を準備する工程と、
整列可能な足場のＬＤシグナルが、非結合で整列された足場に比べて、減少するか、または最小化されるように、標的分子の非存在下において、第１結合領域に結合する第２結合領域を含み、第１および第２結合領域のうちの片方が、標的分子に結合可能な受容体である基質を準備する工程と、
受容体への標的分子の結合が存在するなら、該結合が、基質から基質に結合した足場を解放するように、基質に結合した足場を試料にさらす工程と、
ＬＤ分光計を用いて、試料にさらす前後の足場のＬＤシグナルを測定する工程とを含む。
【００１３】
基質結合足場を試料にさらした後、足場のＬＤシグナルの増加は、試料中の標的分子の存在の指標である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、受容体は、第１結合領域であってもよいことが理解される。それらの実施形態において、受容体は、足場の一体的部分であってもよく、またはそれに代えて、本方法は、受容体／足場複合体を形成するために、受容体を足場に付着させる工程を含んでもよい。同様に、第２結合領域は、基質の一体的部分を形成してもよく、またはこれに代えて本方法は、第２結合領域を含み／構成する部分の付着によって基質を修飾する工程を含んでもよい。標的分子にさらした後、複合体は、足場／受容体と標的分子との間において形成される。これらは、受容体が第２結合領域である実施形態に必要な変更を加えて適用される。それらの実施形態において、標的分子は、基質へ（受容体を介して）結合する。
【００１５】
本発明の方法は、したがって、足場のＬＤシグナルの増加が、受容体への標的分子の結合によって検出可能である。標的分子の非存在下において、足場は、足場のＬＤシグナルを最小化するか、または減少させるために、基質によって結合されるか、または隔離される。標的分子の存在下において、足場は、基質から解放され、整列させられ、それによって増大したＬＤシグナルをもたらす。有利には、ＬＤシグナルの増加の程度は、標的分子のサイズに依存しないが、代わりに基質による足場の結合および解放に依存するので、本方法は、足場の整列に顕著な変化をもたらすことができる小さな標的分子を検出するために特に有用である。
【００１６】
足場のＬＤシグナルを検出するための方法は、当業者に知られている。ＬＤシグナルは、たとえば、流路を備えることによって、溶液中における足場の整列を誘導することによって測定可能である。流路は、クエットセルによって好都合に備えられてもよい。整列のための他の方法は、せん断流、磁気的整列、または圧搾ゲルの使用を含む。偏光は、続いて、流路を通り、流路を通った後に検出される。
【００１７】
足場部分は、（少なくとも、第１結合領域が組み込まれたとき）流れ条件下において整列可能である任意の材料であってもよい。整列可能とするために、足場部分は、高アスペクト比を有さなければならない。本明細書において、高アスペクト比は、５：１，２０：１，５０：１，７５：１よりも大きなアスペクト比に関し、いくつかの実施形態において、１００：１よりも大きい。
【００１８】
適切な足場部分（第１結合領域を含むように実質的に修飾されてもよい）の例は、合成ポリマーおよび天然ポリマー、カーボンナノチューブ、および生体分子繊維を含む。本明細書において使用されるように、生体分子繊維は、必要な高アスペクト比を有する任意の生体分子であり、流れ条件下において整列可能である。生体分子繊維の例は、脂質小胞、糸状バクテリオファージ、およびアミノ酸ポリマー（すなわち、ポリペプチド、またはタンパク質）、および核酸ポリマー（すなわち、ＲＮＡまたはＤＮＡ）などのポリマーを含む。いくつかの実施形態において、生体分子繊維は、Ｍ１３，ｆ１，ｆｄ，Ｉｋｅ，Ｎ１などの糸状バクテリオファージ、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）である。
【００１９】
いくつかの実施形態において、修飾された足場部分は、可視スペクトルにおいて二色性を示す。
【００２０】
足場部分は、２以上の別々の第１結合領域を含んでもよい。
【００２１】
一実施形態において、第１結合領域は、標的分子に対する受容体であり、基質は、標的分子の少なくとも一部を含む１以上の第２結合領域を含む。さらなる実施形態において、第２結合領域は、標的分子からなる。
【００２２】
第２結合領域は、リガンドの形態であってもよい。リガンドは、共有結合性相互作用によって基質に付着してもよい。リガンドと基質との間における強力な共有結合性の、相互作用または結合は、基質からのリガンドの「脱離」または分離を妨げる。これに代えて、リガンドは、非共有結合性相互作用によって基質に付着してもよい。
【００２３】
リガンドは、該リガンドにおける、アミン、カルボン酸、スルフヒドリル、リン酸、または他の反応基を介して基質の反応基に付着してもよい。このことは、たとえば、容易に利用可能である、ホモ／ヘテロ２機能性架橋の使用によって実施可能であった。好適な架橋リンカは、マレイミド基およびコハク酸イミド基を用いるものを含む。他の手法は、たとえば、ストレプトアビジンとビオチンと（基質におけるものと、リガンドにおけるものと）の間の強力な非共有結合性相互作用の使用を含むことができる。
【００２４】
したがって、試料中における遊離標的分子の非存在下における、基質の第２結合領域（リガンド）と足場の第１結合領域との間の相互作用は、足場のＬＤシグナルを最小化するか、または減少させる。基質に結合した足場が試料にさらされるとき、試料中に存在する任意の遊離標的分子は、受容体と競合する。受容体への遊離標的分子の結合（足場または基質の一部であろうとなかろうと）は、基質から足場を解放し、それが整列することを可能にする。当然、本明細書において、足場の整列は、標的分子に結合した足場／受容体複合体を表すか、または単に足場とその関連する結合領域とを表してもよい（後者の場合、標的分子は、基質／受容体複合体に結合する）。
【００２５】
一実施形態において、検出されたＬＤシグナルの増加は、試料中における標的分子の濃度に比例する。この実施形態において、遊離標的分子および関連結合領域は、標的分子および関連結合領域の間の受容体の競合が化学的平衡をもたらすように、非共有結合性相互作用を介して受容体に結合する。
【００２６】
一実施形態において、基質は、結合した足場のＬＤシグナルが実質的にゼロになるように足場に結合する。
【００２７】
実施形態の第１シリーズにおいて、基質は、足場が整列不可能な形態である（すなわち、基質によって整列が妨げられる）ように足場に結合し、それによって、足場のＬＤシグナルを最小化するか、または減少させる。基質は、整列不可能な部分（ＮＡＭ）を含んでもよく、またはＮＡＭからなってもよい。
【００２８】
ＮＡＭは、反応容器に適用される条件下において、低い整列を示す任意の種類であってもよい。このことは、整列不可能部分が小さなＬＤシグナルを有するので、ＮＡＭ結合足場も小さなＬＤシグナルを有することを裏付ける。一実施形態において、ＮＡＭは、実質的に球状である。球状の物体は、整列させることができないので、非常に低いＬＤシグナルを有する。好適なＮＡＭの例は、ビーズ（たとえば、アガロースもしくはセファロースビーズ）、磁鉄、または他の金属粒子を含む。
【００２９】
実施形態の代替的シリーズにおいて、基質は、足場に結合されることによって整列不可能にされる整列可能な部分を含むか、または該部分からなってもよい。いくつかの実施形態において、足場部分と基質とは、実質的に同一であってもよい。
【００３０】
溶液中に溶解した（または懸濁した）ＮＡＭは、整列可能な足場のＬＤシグナルを顕著に阻害しないようなスペクトラル特性を有さなければならない。このことは、ＮＡＭが、整列可能な足場のＬＤシグナルのスペクトルの領域内において、吸収するべきではなく、蛍光、または燐光を発するべきではないことを意味する。
【００３１】
これらの実施形態において、ＬＤシグナルが、溶液中における足場の整列を誘導することによって測定される場合、基質は、反応容器内の表面を含むか、または該表面からなってもよい。１以上のリガンドは、足場の第１結合領域に結合する表面に付着してもよく、それによって、足場を整列不可能な形態で表面に隔離する。
【００３２】
実施形態の第２シリーズにおいて、ＬＤ分光計の偏光ビームの外に保持されるように、基質が足場に結合する。基質は、それ自体が、ＬＤ分光計のビームの外にある表面であってもよい。基質は、反応容器の表面であってもよい。本実施形態において、遊離標的分子の存在下における足場の解放は、整列可能な足場をビーム内に移動させることを可能にし、ＬＤシグナルを記録することを可能にする。
【００３３】
基質（整列不可能な部分、もしくは表面）とリガンドとの間の親和性は、受容体部分と標的分子との間の親和性よりも大きくなければならない。一実施形態において、整列不可能部分または表面とリガンドとの間の親和性は、受容体部分と標的分子との間の親和性よりも顕著に大きい。
【００３４】
理想的には、標的分子は、足場／受容体複合体の受容体部分に結合した後、標的が足場の整列を低下させず、整列可能な足場のＬＤシグナルを減少させないように、整列可能な足場よりも顕著に小さい。標的分子は、足場のサイズの、４０％未満、２５％未満、または１０％未満であってもよい。
本発明の第２態様によれば、本発明の第１態様の方法における使用のための試薬であって、
第１結合領域を含み、高アスペクト比を有する整列可能な足場と、
第２結合領域を含み、第１および第２結合領域の片方は、標的分子に結合可能な受容体である基質と、
標的分子の非存在下において、基質および足場は、足場が整列しないように、それらの各結合領域を介して結合する試薬を提供する。
【００３５】
本発明の第３態様によれば、本発明の第１態様の方法における使用のための装置であって、
偏光源と、
整列可能な足場の結合領域に結合するために適合された表面を含む反応容器と、
整列能力を、標的分子を潜在的に含む試料に付与するための手段と、
前記偏光源からの光を、前記試料を通った後に受けるように配置された検出器とを含み、
光路が、前記偏光源と前記検出器との間に規定される装置を提供する。「整列能力を適用するための手段」は、整列をもたらし、それによって直線二色性を観察することができる全ての公知のメカニズムを包含する。実施例は、限定されないが、フローセル、クエットセル、磁気的整列、または圧搾ゲルの使用を含む。
【００３６】
一実施形態において、表面は、使用中、光路の外にあるように配置されてもよい。代替的実施形態において、表面は、整列不可能な形態で足場に結合するように構成される。たとえば、足場は、基質の表面を覆う抗原（たとえば、コラーゲン）に特異的な抗体を備えてもよい。
【００３７】
本発明の第１態様に関する上述の実施形態は、本発明の第２および第３態様にも関連してもよいことが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
本発明の実施形態は、添付図面を参照して一例として以下に説明される。
【図１】図１ａは、本発明の一実施形態に係る、足場／受容体複合体に結合する前の、リガンドに付着された整列不可能部分の模式図である。図１ｂは、遊離標的分子の存在下における、図１ａの整列不可能部分からの足場／受容体複合体の解放を示す模式図である。
【図２】本発明の代替的実施形態に係る、遊離標的分子の存在下においてリガンドによって誘導される、表面からの足場／受容体複合体の解放を示す模式図である。
【図３】０．０７ｍｇ／ｍＬの抗ＦＩＴＣに結合したＭ１３（Ｍ１３＋抗フルオレセイン）と、０．０８ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣに結合したＭ１３（Ｍ１３＋ＦＩＴＣ）のＵＶ／Ｖｉｓスペクトルである。
【図４】本発明の実施形態のＬＤスペクトルである。
【図５】様々な濃度のフルオレセインを標的分子として含む溶液のＬＤスペクトルを示す棒グラフである。
【図６】爆発性トリニトロトルエン（ＴＮＴ）の検出の一例である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
図１ａを参照すると、直線二色性を用いる、試料中の標的分子の存在を検出するための試薬１０は、その表面１６に付着した複数の模倣リガンド（ＤＬ）１４を有する実質的に球形の整列不可能部分１２の形状の基質を含む。試薬１０は、受容体部分２２に付着した足場部分２０を含む整列可能な足場／受容体複合体１８をさらに含む。受容体２２は、標的分子（リガンドＬ、示されていない）に特異的である。
【００４０】
図１ｂに示されるように、標的分子（リガンドＬ）の非存在下において、受容体部分２２は、整列不可能部分１２の表面１６上の模倣リガンド１４に結合し、これによって、足場／受容体複合体１８を整列不可能な形態で隔離する。ＮＡＭ結合足場／受容体複合体１８は、遊離の整列足場／受容体複合体に比べて非常に低下したＬＤシグナルを有する。そのように、標的分子Ｌの非存在下における足場／受容体複合体１８のＬＤシグナルは、最小化される。試薬１０が遊離標的分子Ｌを含む試料にさらされるとき、遊離標的分子Ｌは、整列可能な足場２０上の受容体結合部位２２についてＮＡＭ１２上の模倣リガンド１４と競合する。このことは、（受容体結合標的分子Ｌを有する）足場／受容体複合体１８をＮＡＭ１２から解放し、それらが整列し、ＬＤシグナルの増加をもたらすことを可能にする。
【００４１】
図２に示される代替的実施形態において、基質は、多数の付着模倣リガンド１４に付着された表面２４の形状をとる。模倣リガンド１４は、足場／受容体複合体１８がＬＤ分光計の偏光ビーム２６の外に保持され、観察されるＬＤシグナルがゼロであるように受容体２２に結合する。遊離標的分子Ｌの添加によって、足場／受容体複合体１８は、受容体２２への標的分子Ｌの競合的結合によって表面２４から解放され、受容体２２の結合部位から模倣リガンド１４を隔離する。（結合した標的分子Ｌを有する）解放された足場／受容体複合体１８は、続いてＬＤ分光計のビーム２６中に自由に移動し、ＬＤシグナルを記録することを可能にする。
【００４２】
実施例１
Ｍ１３バクテリオファージ凝集アッセイは、競合アッセイのようにふるまう。それは、抗標的抗体標識化Ｍ１３を有する複合体を形成する、標的抗原に結合したＭ１３からなる。この複合体は、ＬＤシグナルを減少させる。未知量の標的分子の添加は、Ｍ１３バクテリオファージの結合部位についてＭ１３に結合した標的抗原と競合する。結合したＭ１３の複合体からの分離は、Ｍ１３バクテリオファージの優先的整列を可能にする。このことは、ＬＤシグナルの出現をもたらし、したがって試料中の標的分子の存在を示す。
【００４３】
検出のために選択された標的分子は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）であった。ＦＩＴＣは、アミド結合を形成することによってｐ８被覆タンパク質上の遊離アミン基（１つはＮ末端、１つはリジン残基）に共有的に結合した。第２Ｍ１３バクテリオファージ上のｐ８共タンパク質に共有結合した抗フルオレセイン抗体を含む第２試薬が、続いて構築された。
【００４４】
Ｍ１３を抗ＦＩＴＣに結合するために、Ｍ１３は、ＳＡＴＡを用いて修飾されなければならず、抗ＦＩＴＣは、ＳＭＣＣを用いて修飾されなければならなかった。ＳＡＴＡは、スルフヒドリル基を、ｐ８被覆タンパク質上の遊離アミン基に付着させた。ＳＭＣＣは、マレイミド基を抗体（Ａｂ）に付着させ、マレイミド基は、チオエーテル結合を形成するために、Ｍ１３上のスルフヒドリル基に反応可能であった。
【００４５】
徐々に増加する濃度のフルオレセイン（０．０１ｍＭ，０．０２ｍＭ，０．０４ｍＭ，０．１ｍＭ，０．２ｍＭ，０．５ｍＭ，１ｍＭ，および２ｍＭ）は、抗フルオレセインに結合したＭ１３に添加され、一晩インキュベートされた。フルオレセインに結合したＭ１３は、溶液に添加され、その後、徐々に増加するフルオレセインが、抗フルオレセイン抗体（Ａｂｓ）に結合するために、Ｍ１３上のフルオレセインと競合可能であるかを示すためにＬＤシグナルが測定された。これらのシグナルは、抗フルオレセインに結合したＭ１３と、フルオレセインに結合したＭ１３とからなり、フルオレセインを含んでいないコントロールと比較された。別のコントロールが設計され、０．０２ｍＭのローダミンが、アッセイの特異性を決定するためにアッセイに添加された。
【００４６】
ＬＤと、抗フルオレセインおよびフルオレセイン標識Ｍ１３とを用いるフルオレセインの検出
本アッセイにおいてフルオレセインの検出に必要とされる試薬は、抗フルオレセインに結合したＭ１３、およびフルオレセインに結合したＭ１３を含んでいた。ＵＶ／Ｖｉｓ吸収スペクトルは、濃度を決定するために測定された。
【００４７】
フルオレセイン色素は、４９４ｎｍにて吸収し、図３は、フルオレセイン標識Ｍ１３が、４９４ｎｍにおいて実際に大きなピークを生じることを示し、このことは、溶液中における色素の存在を裏付ける。ＬＤシグナルは、ＬＤスペクトルにおいて４９４ｎｍにおけるピークが存在するので、フルオレセインがＭ１３に共有結合したことを裏付ける（図４）。同様の濃度のフルオレセインと抗フルオレセインとに結合したＭ１３が使用された。
【００４８】
抗フルオレセインに結合したＭ１３が、ＦＩＴＣに結合したＭ１３（Ｍ１３−フルオレセインを生じる）に添加されたとき、フルオレセインに結合したＭ１３のみ、または抗フルオレセインに結合したＭ１３のみによって生じたＬＤシグナル（２８０ｎｍにおいて、それぞれ２．１１Ｅ−０４  ΔＯＤ、および２．３２Ｅ−０４  ΔＯＤ）に比べて、ＬＤシグナルの明らかな減少（２８０ｎｍにおいて、５．１５Ｅ−０５  ΔＯＤ）が見られた（図４）。フルオレセインおよび抗フルオレセインに結合したＭ１３の添加によって生じたシグナルは、本アッセイにおいてコントロールとして使用された。理論的には、このシグナルは、２倍大きくなければならなかった（２８０ｎｍにおいて約４．４３Ｅ−０４  ΔＯＤ）。なぜなら、２倍量のＭ１３が本試料中に存在したからである。しかしながら、コントロールは、非常に低いＬＤシグナルを生じると考えられる。なぜなら、フルオセレイン抗原が抗フルオレセイン抗体に架橋するので、Ｍ１３バクテリオファージの間に架橋が存在するからである。このことは、Ｍ１３バクテリオファージが整列することを妨げ、したがってＬＤシグナルの低下をもたらす。
【００４９】
Ｍ１３複合体の両方を含む実験は、個々の試薬からのＬＤシグナルが合計された場合に予期される（それらが相互作用しない場合に予期される）よりもＬＤシグナルの大きな低下を示した。これらのデータは、２つの複合体が（フルオレセイン−抗フルオレセイン相互作用を介して）お互いに相互作用し、低下した整列を示す複合体を形成することを示唆する。続いてこれらの試薬は、徐々に増加する濃度の遊離フルオレセインを、抗フルオレセインに結合したＭ１３に添加することによって、遊離のフルオレセインを検出するために使用された。フルオレセインとＭ１３−抗フルオレセインとの間の複合体の形成は、Ｍ１３−フルオレセインとの将来の相互作用を妨げるように機能する。本アッセイの選択性を決定するために、０．０１ｍＭ〜２ｍＭの範囲の濃度のフルオレセインは、Ｍ１３−フルオレセインの添加前に、Ｍ１３−抗フルオレセインとともに予めインキュベートされた。これらの結果は、本アッセイが、ＬＤシグナルの増加を示すことによってフルオレセインを検出可能であることを示した（図５）。この結果は、Ｍ１３−フルオレセイン：Ｍ１３−抗フルオレセイン複合体が、２８０ｎｍにおける１．１７Ｅ−０４  ΔＯＤのいくらか小さなＬＤシグナルを生じることを示す。０．０１ｍＭのフルオレセインが抗フルオレセインに結合したＭ１３に添加され、フルオレセインに結合したＭ１３と競合するとき、シグナルは、２８０ｎｍにおいて１．５３Ｅ−０４ΔＯＤに増加する。０．０２ｍＭのフルオレセインがアッセイに添加されたとき、ＬＤシグナルは、続いて２８０ｎｍにおいて２．４８Ｅ−０４ΔＯＤに顕著に増加した。さらに、０．０４ｍＭ，０．１ｍＭ，０．２ｍＭ，０．５ｍＭ，および１ｍＭへのフルオレセインの濃度の増加は、０．０２ｍＭのものと同様のＬＤシグナルを生じた（図５）。全ての結果は、本アッセイが、０．０１ｍＭのフルオレセインを検出するために十分な感度を有することを示す。
【００５０】
ＬＤと、抗ＴＮＴおよびＴＮＢＳ標識Ｍ１３とを用いるトリニトロトルエン（ＴＮＴ）の検出
上述されたフルオレセインの検出と同様に、本アッセイにおいてＴＮＴの検出に必要な試薬は、抗ＴＮＴに結合したＭ１３、およびＴＮＴ類似体のＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）に結合したＭ１３を含んでいた。ＵＶ／Ｖｉｓ吸収スペクトルは、濃度を決定するために測定された。
【００５１】
抗ＴＮＴに結合したＭ１３と、ＴＮＴ類似体のＴＮＢＳに結合したＭ１３とのＬＤシグナルとが別々に測定されるとき、それらは、図６の最初の２つの棒グラフに示される一定の値をもたらす。それらが共に混合されたとき、ＬＤシグナルは減少する（図６における、右から３番目の棒グラフ）。なぜなら、ＴＮＢＳ抗原が抗ＴＮＴ抗体に結合するので、Ｍ１３バクテリオファージの間に架橋が存在するからである。このことは、Ｍ１３バクテリオファージが整列することを妨げ、したがってＬＤシグナルの低下をもたらす。しかしながら、ＴＮＴの存在下において混合が実施されたとき、シグナルの低下は小さい（図６において左から４番目の棒グラフ）。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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