(57)【要約】  本発明は、抗体に関し、具体的には、アルツハイマー病及びパーキンソン病などの神経変性障害の診断及び治療において使用される抗体に関する。本発明は、神経変性障害の診断及び治療の方法、ならびにこのような疾患の治療用の新規治療化合物を単離するためのアッセイ及びスクリーニングにまで及ぶ。【選択図】図２５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３またはその変異体もしくはフラグメントに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
配列番号２に結合しない、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
配列番号４に結合しない、請求項１または請求項２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
配列番号８に結合しない、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
ポリクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
ウサギ、マウス、またはラット、好ましくはウサギにおいて生成される、請求項１〜５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
前記その抗原結合フラグメントが、配列番号３に特異的であるか、または配列番号３内のエピトープに免疫特異的である、請求項１〜７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号３のＣ末端における１個以上のアミノ酸に特異的に結合する、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号５における１個以上のアミノ酸に特異的に結合する、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、前記エピトープにおけるＣ末端リジン（Ｋ）残基に特異的に結合する、請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号６における１個以上のアミノ酸に特異的に結合する、請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号６に特異的に結合する、請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
（ｉ）宿主生物を、配列番号３もしくは配列番号７またはその変異体もしくはフラグメントで免疫化することと、
（ｉｉ）前記抗体またはその抗原結合フラグメントを、前記宿主から収集することと、を含む方法によって得られる、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
前記宿主が、哺乳動物である、請求項１４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
前記変異体またはフラグメントが、配列番号６を含むかまたはそれからなる、請求項１４または請求項１５に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
前記方法が、前記宿主動物から採血することと、次いで前記抗体またはその抗原結合フラグメントを血清から収集することと、を含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
前記血清が、共有結合したペプチド支持体を有する重力カラムを通過させられる、請求項１７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
抗原として使用するための、配列番号３もしくは配列番号７またはその変異体もしくはフラグメント。
【請求項２０】
前記抗原が、抗体が結合するエピトープとして作用する、請求項１９に記載の使用のための配列番号３もしくは配列番号７またはその変異体もしくはフラグメント。
【請求項２１】
前記変異体またはフラグメントが、配列番号６を含むかまたはそれからなる、請求項１９または請求項２０に記載の使用のための配列番号３もしくは配列番号７またはその変異体もしくはフラグメント。
【請求項２２】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、及び細胞毒性部分を含む、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）。
【請求項２３】
治療または診断における使用のための、各々が必要に応じて誘導体化される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項２１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項２４】
神経変性障害の治療、予防、または寛解における使用のための、各々が必要に応じて誘導体化される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項２１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項２５】
前記神経変性障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動ニューロン病、脊髄小脳１型、２型、及び３型、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ならびに前頭側頭型認知症からなる群から選択される、請求項２４に記載の使用のための抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２６】
前記神経変性障害が、アルツハイマー病である、請求項２４または２５に記載の使用のための抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２７】
各々が必要に応じて誘導体化される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項２１に記載の抗体薬物複合体、及び必要に応じて薬学的に許容されるビヒクルを含む、薬剤組成物。
【請求項２８】
請求項２７に記載の薬剤組成物の作製プロセスであって、各々が必要に応じて誘導体化される、治療上有効な量の請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項２１に記載の抗体薬物複合体を、薬学的に許容されるビヒクルと複合することを含む、プロセス。
【請求項２９】
前記組成物が、神経変性障害の治療組成物である、請求項２７に記載の組成物、または請求項２８に記載のプロセス。
【請求項３０】
神経変性障害の検出または診断用のバイオマーカーとして使用するための配列番号３またはその変異体もしくはフラグメント。
【請求項３１】
バイオマーカーとして使用される前記配列番号３の変異体またはフラグメントが、配列番号６を含むかまたはそれからなる、請求項３０に記載の配列番号３またはその変異体もしくはフラグメント。
【請求項３２】
神経変性障害に罹患している被検体、もしくはそれに対する素因の診断、または前記被検体の病態の予後判定の提供のためのキットであって、前記キットが、試験被検体からの試料中に存在する抗原の濃度の検出のための検出手段を含み、前記検出手段が、必要に応じて誘導体化される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、前記試料中の抗原の存在が、前記被検体が神経変性障害に罹患していることを示唆する、キット。
【請求項３３】
神経変性障害に罹患している被検体、もしくはそれに対する素因の診断方法、または前記被検体の病態の予後判定の提供方法であって、前記方法が、被検体から得られた試料中に存在する前記抗原の濃度を検出することを含み、前記検出が、必要に応じて誘導体化される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを使用して達成され、前記試料中の抗原の存在が、前記被検体が神経変性障害に罹患していることを示唆する、方法。
【請求項３４】
前記試料が、脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む、請求項３２に記載のキット、または請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記試料が、血液、尿、または組織を含む、請求項３２に記載のキット、または請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記試料が、血液を含む、請求項３５に記載のキットまたは方法。
【請求項３７】
前記神経変性障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動ニューロン病、脊髄小脳１型、２型、及び３型、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ならびに前頭側頭型認知症からなる群から選択され、好ましくは、アルツハイマー病である、請求項３０または請求項３１に記載の使用のための、配列番号３またはその変異体もしくはフラグメント、あるいは請求項３２〜３６のいずれか１項に記載のキットまたは方法。
【請求項３８】
神経変性障害の治療、予防、または寛解における使用のための治療化合物の特定のための薬物発見スクリーニングにおける、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
【請求項３９】
Ｔ１４ペプチド（配列番号３）の合成または活性を阻害する薬剤の特定のための比色標識または蛍光標識Ｔ１４ペプチド（配列番号３）のエクスビボ使用。
【請求項４０】
神経変性障害の治療、予防、または寛解における使用のための候補薬剤の特定方法であって、
（ｉ）インビトロまたはエクスビボで、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの存在下、細胞を試験薬剤と接触させるステップと、
（ｉｉ）前記抗体またはその抗原結合フラグメントを使用して、Ｔ１４ペプチド（配列番号３）の存在、濃度、または活性を検出するステップと、を含み、Ｔ１４ペプチドの不在、または対照と比較したＴ１４ペプチドの合成、濃度、もしくは活性の低減が、前記薬剤が、不適切な補体活性化を特徴とする疾患の治療、寛解の予防のための候補であることの指標である、方法。
【請求項４１】
Ｔ１４ペプチド（配列番号３）の合成または活性を阻害する薬剤の特定のためのアッセイであって、
（ｉ）細胞ベースの発現系と、
（ｉｉ）請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの試験薬剤の、前記発現系との接触を可能にするように構成された容器と、を含む、アッセイ。
【請求項４２】
Ｔ１４ペプチド（配列番号３）の合成または活性を調節する薬剤の特定方法であって、
（ｉ）インビトロまたはエクスビボで、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの存在下、細胞を試験薬剤と接触させることと、
（ｉｉ）前記抗体またはその抗原結合フラグメントを使用して、Ｔ１４ペプチド（配列番号３）の存在、濃度、または活性を検出することと、を含み、対照と比較したＴ１４の合成、濃度、または活性における変化が、前記試験薬剤がＴ１４ペプチド（配列番号３）の合成または活性を調節することの指標である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体に関し、具体的には、アルツハイマー病及びパーキンソン病などの神経変性障害の診断及び治療において使用される抗体に関する。本発明は、神経変性障害の診断及び治療の方法、ならびにこのような疾患の治療用の新規治療化合物の特定のためのアッセイ及びスクリーニングにまで及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、主に６５歳超の男女に影響を及ぼし、その疾患が診断される可能性は、実質的に年齢と共に増加する。６５歳超の成人の割合が今後４０年にわたって世界的に増大すると予想される中、アルツハイマー病の発生率は、２倍を超えて、２０１０年の２１００万症例から２０５０年には５３００万症例にまで上昇すると予想される（ｗｗｗ．ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓｒｅｓｅａｒｃｈｕｋ．ｏｒｇ及びｗｗｗ．ａｌｚ．ｏｒｇからの統計）。アルツハイマー病を呈する患者の予想数におけるこの急激な増加は、未だ満たされていない医療ニーズの主要な部分に相当するだけでなく、この疾患を治療する十分に有効な方法が現在のところ存在しないため、治療法及び診断法のための大きな市場機会を提供する。
【０００３】
過去１０年間、具体的にはアルツハイマー病と闘うための新薬も、より一般的には神経変性と闘うためのものも存在していない。この理由は、今までのところ、結果として薬学的に標的とされ得る、基本的な根底にある脳機序が未だ特定されていないことである。神経変性のプロセスを説明するための主要な候補は、ニューロン死が、死後のアルツハイマー脳に特徴的なアミロイドの毒性沈着物による細胞膜の破壊に起因し、アミロイド前駆体タンパク質の異常な切断から生じるという「アミロイド仮説」である。しかしながら、この「アミロイド仮説」は、アルツハイマー病及びパーキンソン病で頻繁に観察される共病理学も、全脳細胞におけるアミロイドの潜在的偏在性にもかかわらず、変性を受け易い細胞の特徴的な選択性も、認知症の動物モデルにおけるアミロイド沈着物の不在も、認知障害が明らかでないある特定の脳領域におけるアミロイドの発生をも説明しない。過去２０年間にわたり薬学的標的としてのアミロイド形成が注目を集めているにもかかわらず、この理論に基づく治療は、現在のところ有効性が証明されていない。より可能性が高いのは、一旦神経変性プロセスが進み始めると、アミロイドが、より特異性の低い二次的な増悪効果として付加的に生成されるということである。
【発明の概要】
【０００４】
神経変性の一次機序を特定するための１つの手掛かりは、単に様々なニューロン群が、本来脆弱であるということであり得る。さらに、アルツハイマー病、パーキンソン病、及び運動ニューロン病になり易い種々の細胞下位群が、それにもかかわらず互いに隣接して、すべてが散乱突起をより高い脳中心へと上向き及び外向きに送る、脳幹から前脳まで延びる連続「ハブ」を形成する。したがって、伝達物質におけるそれらの異質性にもかかわらず、これらのニューロン群は、小脳、視床、皮質などの脳の大半の他の部分における良く知られている局在回路からそれらを区別するために、集合的に「グローバル」ニューロンと名付けられた。これらの選択的に脆弱なグローバルニューロンは、異なる専門用語（「等樹状突起コア」）を使用してではあるが、数十年前に神経変性の中枢として既に特定されていた。
【０００５】
グローバルニューロンの下位群は、脳内の他の場所にあるそれらの相対物が、脳卒中によって損傷された場合でさえも進行的に死に至らないのに対して（それらは、成長「栄養因子」を補助し、持続させる物質に対する特異的な感受性を伴って、成人期へと、また成人期を通じて強い柔軟性を保持する）、なぜこれらの細胞のみがそうなるのかに関する不可解で未だに解明されていない質問を説明するかもしれない、共通する特定の特徴を有する。発達中の脳において、栄養因子は、細胞内で一連の事象を誘発するカルシウム流入を刺激することによって作用し、最終的に選択的分化及び成長をもたらす。しかしながら、より高い用量またはより長い暴露の場合、持続的なカルシウム流入は、ニューロンに対して毒性となり得る。最も重要なことに、カルシウム流入が栄養作用を誘発するか、または毒性作用を誘発するかに関するさらなる決定因子は年齢であり、ニューロンが成熟するにつれて、かつては栄養レベルであった細胞内カルシウムが致死的になる。
【０００６】
本発明者らは、神経変性プロセスが、実際は異常に活性化した発達プロセスであることを以前に提議した。この仮説を支持して、脳幹「ハブ」ニューロンの肥大が、アルツハイマー脳において実際に報告されている（Ｂｏｗｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．７：７２３−３０）。このハブの大きな領域が損傷されると、頻繁に見られるが未だに説明されていない、アルツハイマー病とパーキンソン病の共病理学の症例において起こるように、１つを超える神経変性疾患が存在することになる。興味深いことに、グローバルニューロンの脆弱なハブ内のすべてのニューロンは、伝達物質の異質性にもかかわらず、すべてが良く知られている酵素アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）を含有する。したがって、ノルアドレナリン作動性青斑核、ドーパミン作動性黒質、またはセロトニン作動性縫線核などの細胞の下位群が、この従来物質のアセチルコリンを含有することはないため、ＡＣｈＥは、その正常な機能を行うことができない場合、ニューロン内に存在する。その正常な酵素的役割からのさらなる予想外の逸脱は、ＡＣｈＥが、恐らくはそれ自体の能力においてある種の細胞内メッセンジャーとして、実際にグローバルニューロンから放出されることである。一般に、ＡＣｈＥは現在、神経性組織及び非神経性組織の両方において、多種多様な状況で栄養活性を有するシグナル伝達分子として広く十分に確立されている。
【０００７】
本発明者らは、その酵素作用から独立して栄養作用物質として作動するＡＣｈＥが、ニューロンへのカルシウム流入を実際に誘発することを以前に示した。したがって、グローバルニューロン内で、ＡＣｈＥは、量、利用可能期間、及び最も重要なことに年齢に応じて、栄養性−毒性軸に沿った二重の非古典的作用を有することが可能である。脳卒中と同様に、標準ニューロンが成人期に損傷される場合、他のものが機能的に補償することになる。対照的に、グローバルニューロンは、再生を試みて、それらの栄養資源を要求することによって応答する。しかし、後次のカルシウム流入は、より古い成熟細胞では致死的となるため、結果として生じる損傷が、神経変性を特徴とする悪性循環において、さらなる補償の試行を誘発することになる。
【０００８】
アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）は、異なる発達段階で様々な形態で発現され、これらはすべて同一の酵素活性を有するが、非常に異なる分子組成を有する。「末端付加（ｔａｉｌｅｄ）」（Ｔ−ＡＣｈＥ）は、シナプスにおいて発現され、本発明者らは以前に、そのＣ末端から切断することができる２つのペプチドを特定し、一方は「Ｔ１４」と称され、他方の「Ｔ３０」として知られているもの中に含まれ、そして両者はβ−アミロイド相当領域に対して強い配列相同性を有する。ＡＣｈＥ  Ｃ末端ペプチド「Ｔ１４」は、その非加水分解作用の範囲に関与するＡＣｈＥ分子の突出部として特定された。合成１４アミノ酸ペプチド類似体（すなわち、「Ｔ１４」）、及びそれが埋め込まれる後次のより大きく、より安定し、かつより有能なアミノ酸配列（すなわち、「Ｔ３０」）は、「非コリン作動性」ＡＣｈＥに関して報告されたものに相当する作用を示すが、Ｔ３０配列内の不活性残基（すなわち、「Ｔ１５」）は、効果がない。
【０００９】
Ｔ１４及びＴ３０の急性効果は、それらが、（ｉ）数ミリ秒から数時間までのタイムスケールにわたって脳切片内のニューロンへのカルシウム流入を調節すること、（ｉｉ）ＰＣ１２細胞における、またインビトロでのニューロン器官型培養物における細胞生存性を低下させること、（ｉｉｉ）ニューロン及びＰＣ１２細胞からの「補償的」カルシウム誘導型ＡＣｈＥ放出を調節すること、（ｉｖ）脳切片内の卵母細胞及びニューロンにおけるカルシウム流を活性化すること、（ｖ）毒性作用においてアミロイドと相乗作用すること、及び（ｖｉ）アミロイド前駆体タンパク質の産生及びアミロイドβ（Ａβ）ペプチドの放出に関与することである。Ｔ１４及びＴ３０の慢性効果は、それらが、（ｉ）ニューロンの成長を低減すること、（ｉｉ）アポトーシスを誘導すること、（ｉｉｉ）ＡＣｈＥの放出を増加させること、（ｉｖ）α７ニコチン受容体に結合し、調節すること、及び（ｖ）細胞表面上のα７受容体の発現を２４時間にわたって強化し、それにより、さらなる毒性のためのフィードフォワード機序を提供することである。
【００１０】
Ｔ１４及びＴ３０は、細胞毒性の誘導においてβ−アミロイドよりも選択的であり、また毒性を悪化させるアミロイドと相乗的であるため、Ｔ１４またはＴ３０の毒性作用をブロックする任意の薬剤もまた、アミロイドの低選択性かつ後次の毒性作用を低減すると仮定されてきた。
【００１１】
実施例に論じられているように、本発明者らは、高い特異性でＴ１４ペプチド（配列番号３）に結合し、Ｔ３０ペプチド（配列番号２）またはβ−アミロイドに結合しない新規の抗体を識別した。したがって、この抗体は、アルツハイマー病またはパーキンソン病などの神経変性障害の診断及び治療において重要な実用性を有するであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
したがって、本発明の第１の態様により、配列番号３またはその変異体もしくはフラグメントに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００１３】
好都合なことに、実施例に記載されているデータは、本発明の抗体が、非常に高い特異性でＴ１４ペプチドに結合することを示す。Ｔ３０に結合する任意の抗体は、実際により大きなペプチドの不活性成分である抗原を検出する危険性を高めるため、避けるべきである。しかしながら、代わりに本発明による抗体は、Ｔ１４またはその変異体もしくはフラグメントにだけ特異的に結合し、Ｔ３０には結合しないため、その生理活性、毒性作用が特定され、かつブロックされることを確実にすることができる。驚くべきことに、この抗体は、深温凍結された組織であっても、生物組織内で生存可能である。中でも最も驚くべきことは、対照脳と比較して、アルツハイマー病試料において有意差が検出され得ることである。したがって、これらの発見は、本発明の抗体が、診断ツールとして、ならびに治療介入において使用され得ることを示唆する。
【００１４】
アセチルコリンエステラーゼは、アセチルコリンを加水分解するセリンプロテアーゼであり、当業者に周知である。脳で発見されるアセチルコリンエステラーゼの主要な形態は、末端付加アセチルコリンエステラーゼ（Ｔ−ＡＣｈＥ）として知られている。ヒト末端付加アセチルコリンエステラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ６８１５１．１）の一実施形態のタンパク質配列は、長さが６１４アミノ酸であり、本明細書では配列番号１として以下のように提供される。
【００１５】
【化１】
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【００１６】
Ｔ３０のアミノ酸配列（配列番号１の最後の３０個のアミノ酸残基に相当する）は、本明細書では配列番号２として以下のように提供される。
【００１７】
【化２】
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【００１８】
好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２に結合しない。上述されるように、Ｔ３０を標的とする抗体を開発することによって、実際にはより大きなペプチドの不活性成分である抗原を検出する危険性がある。しかしながら、好都合なことに、本発明の抗体は、代わりにＴ１４に特異的に結合するため、それがＴ１４のみの生理活性、毒性作用を識別し、かつブロックすることを確実にすることができる。
【００１９】
Ｔ１４のアミノ酸配列（配列番号１の端部に向かって位置する１４個のアミノ酸残基に相当し、かつＴ３０に見られる最後の１５個のアミノ酸を欠く）は、本明細書では配列番号３として以下のように提供される。
【００２０】
【化３】
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【００２１】
Ｔ１５のアミノ酸配列（配列番号１の最後の１５個のアミノ酸残基に相当する）は、本明細書では配列番号４として以下のように提供される。
【００２２】
【化４】
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【００２３】
好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４に結合しない。Ｔ１５は、Ｔ３０の不活性成分であり、したがって、Ｔ１４の抗体の選択性に関する適切な対照としての役割を果たす。
【００２４】
β−アミロイド（Ａβ）の一部のアミノ酸配列は、本明細書では配列番号８として以下のように提供される。
【００２５】
【化５】
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【００２６】
好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号８に結合しない。
【００２７】
本発明は、配列番号３に対して免疫特異性を有する全抗体（すなわち、免疫グロブリン）、ならびに対応する完全長抗体の抗原結合フラグメントまたは領域にまで及ぶ。
【００２８】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、一価、二価、または多価であってもよい。一価抗体は、ジスルフィド架橋によって軽鎖（Ｌ）と関連付けられた重（Ｈ）鎖を含む二量体（ＨＬ）である。二価抗体は、少なくとも１つのジスルフィド架橋によって関連付けられた２つの二量体を含む四量体（Ｈ２Ｌ２）である。多価抗体は、例えば、複数の二量体を結合することによって産生されてもよい。抗体分子の基本構造は、非共役的に関連し、ジスルフィド結合によって結合され得る、２つの同一軽鎖及び２つの同一重鎖からなる。各重鎖及び軽鎖は、約１１０個のアミノ酸のアミノ末端可変領域、及び残りの鎖に定常配列を含有する。この可変領域は、抗体分子の抗原結合部位を形成し、抗原、すなわち配列番号３またはその変異体もしくはフラグメント（例えば、エピトープ）に対するその特異性を決定する、いくつかの超可変領域、または相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。重鎖及び軽鎖のＣＤＲのいずれかの側には、ＣＤＲを係留し、配向するアミノ酸の比較的保存された配列である、フレームワーク領域がある。抗体フラグメントは、二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含んでもよい。
【００２９】
定常領域は、５つの重鎖配列（μ、γ、ζ、α、またはε）のうちの１つ、及び２つの軽鎖配列（κまたはλ）のうちの１つからなる。重鎖定常領域配列は、抗体のアイソタイプ及び分子のエフェクター機能を決定する。
【００３０】
好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、単離されるか、または精製される。
【００３１】
好ましい一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ポリクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。抗体またはその抗原結合フラグメントは、ウサギ、マウス、またはラットにおいて生成されてもよい。
【００３２】
実施例に記載されているように、本発明者らは、高度に特異的なポリクローナル抗体をウサギから調製した。好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、宿主動物を配列番号３またはその変異体もしくはフラグメントで免疫化し、次いで抗体またはその抗原結合フラグメントを収集することによって得られる。宿主動物は、最も好ましくはウサギである。
【００３３】
別の好ましい実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。好ましくは、本発明の抗体は、ヒト抗体である。本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、配列番号３またはその変異体もしくはフラグメントに対して免疫特異性を呈する特定のヒト抗体において見出されるものと実質的に同じ重鎖及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む、モノクローナル抗体などの抗体を意味し得る。重鎖及び軽鎖ＣＤＲと実質的に同じアミノ酸配列は、基準配列と比較した場合、相当量の配列同一性を呈する。このような同一性は、特定のヒト抗体のアミノ酸配列を表すものとして決定的に知られているか、または認識可能である。実質的に同じ重鎖及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列は、例えば、アミノ酸のわずかな修飾または保存的置換を有し得る。このようなヒト抗体は、配列番号３またはその変異体もしくはフラグメントに選択的に結合するその機能を維持する。
【００３４】
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、例えば、ファージライブラリーによるか、リンパ球によるか、またはハイブリドーマ細胞による産生などの組み換え方法によって産生されたヒトＣＤＲアミノ酸配列を実質的に、または全体的に有するモノクローナル抗体を含み得る。
【００３５】
「ヒト化抗体」という用語は、そのタンパク質配列が、ヒトにおいて天然に産生される抗体に対するそれらの類似性を増加させるように修飾された非ヒト種（例えば、マウスまたはウサギ）からの抗体を意味し得る。
【００３６】
抗体は、組み換え抗体であってもよい。「組み換えヒト抗体」という用語は、組み換えＤＮＡ技術を使用して産生されたヒト抗体を含み得る。
【００３７】
「抗原結合領域」という用語は、その標的抗原、例えば、配列番号３またはその変異体もしくはフラグメントに対して特定の結合親和性を有する抗体の領域を意味し得る。好ましくは、このフラグメントは、エピトープである。結合領域は、超可変ＣＤＲまたはその機能的部分であり得る。ＣＤＲの「機能的部分」という用語は、標的抗原に対して特定の親和性を示すＣＤＲ内の配列を意味し得る。ＣＤＲの機能的部分は、配列番号３またはその変異体もしくはフラグメントに特異的に結合するリガンドを含んでもよい。
【００３８】
「ＣＤＲ」という用語は、可変重鎖及び軽鎖における超可変領域を意味し得る。抗体の重鎖及び軽鎖の各々において、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のＣＤＲが存在し得る。通常、少なくとも３つのＣＤＲが各鎖上に存在してもよく、これらは、一緒に構成されると、抗原結合部位、すなわち抗原が結合するか、または特異的に反応する３次元複合部位を形成する。しかしながら、いくつかの抗体の重鎖において、４つのＣＤＲが存在し得ると仮定されてきた。
【００３９】
ＣＤＲの定義には、互いに比較した場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットも含まれる。特定のＣＤＲまたはその機能的部分を包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及びサイズに応じて変動する。当業者であれば、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを日常的に決定することができる。
【００４０】
抗体の「機能的フラグメント」という用語は、機能的活性を保持する抗体の部分を意味し得る。機能的活性は、例えば、抗原結合活性または特異性であり得る。機能的活性は、例えば、抗体定常領域によって提供されるエフェクター機能でもあり得る。「機能的フラグメント」という用語はまた、例えば、ヒトモノクローナル抗体のプロテアーゼ消化または低減によって、及び当業者に知られている組み換えＤＮＡ方法によって産生されるフラグメントを含むことも意図される。ヒトモノクローナル抗体機能的フラグメントには、例えば、ＶＬ、ＶＨ及びＦｄなどの個々の重鎖または軽鎖及びそのフラグメント；Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦａｂ’などの一価フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２などの二価フラグメント；一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）；ならびにＦｃフラグメントが含まれる。
【００４１】
「ＶＬフラグメント」という用語は、ＣＤＲを含む軽鎖可変領域の全部または一部を含む、ヒトモノクローナル抗体の軽鎖のフラグメントを意味し得る。ＶＬフラグメントは、軽鎖定常領域配列をさらに含み得る。
【００４２】
「ＶＨフラグメント」という用語は、ＣＤＲを含む重鎖可変領域の全部または一部を含む、ヒトモノクローナル抗体の重鎖のフラグメントを意味し得る。
【００４３】
「Ｆｄフラグメント」という用語は、第１の重鎖定常領域、すなわち、ＶＨ及びＣＨ−１に結合された重鎖可変領域を意味し得る。「Ｆｄフラグメント」は、軽鎖、または重鎖の第２及び第３の定常領域を含まない。
【００４４】
「Ｆｖフラグメント」という用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域の全部または一部を含み、重鎖及び軽鎖の定常領域が不在である、ヒトモノクローナル抗体の一価抗原結合フラグメントを意味し得る。重鎖及び軽鎖の可変領域は、例えば、ＣＤＲを含む。例えば、Ｆｖフラグメントは、重鎖及び軽鎖両方の約１１０個のアミノ酸のアミノ末端可変領域の全部または一部を含む。
【００４５】
「Ｆａｂフラグメント」という用語は、Ｆｖフラグメントよりも大きなヒトモノクローナル抗体の一価抗原結合フラグメントを意味し得る。例えば、Ｆａｂフラグメントは、可変領域、ならびに重鎖及び軽鎖の第１定常ドメインの全部または一部を含む。ゆえにＦａｂフラグメントは、例えば、重鎖及び軽鎖の約１１０〜約２２０個のアミノ酸残基を付加的に含む。
【００４６】
「Ｆａｂ’フラグメント」という用語は、Ｆａｂフラグメントよりも大きなヒトモノクローナル抗体の一価抗原結合フラグメントを意味し得る。例えば、Ｆａｂ’フラグメントには、軽鎖のすべて、重鎖の可変領域のすべて、及び重鎖の第１及び第２定常ドメインの全部または一部を含む。例えば、Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖の２２０〜３３０個のアミノ酸残基一部または全部を付加的に含み得る。
【００４７】
「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」という用語は、ヒトモノクローナル抗体の二価抗原結合フラグメントを意味し得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、例えば、２つの重鎖及び２つの軽鎖の可変領域の全部または一部を含み、２つの重鎖及び２つの軽鎖の第１定常ドメインの全部または一部をさらに含み得る。
【００４８】
「一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」という用語は、短いリンカーペプチドと接続された重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合を意味し得る。
【００４９】
「二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）」という用語は、より短い結合ペプチドによって互いに結合された２つのｓｃＦｖを含む二重特異性抗体を意味し得る。
【００５０】
当業者であれば、抗体のフラグメントの正確な境界は、そのフラグメントが機能的活性を維持する限り重要でないことが分かる。周知の組み換え方法を使用して、当業者は、特定の用途に望まれる任意のエンドポイントを有する機能的フラグメントを発現するように、ポリヌクレオチド配列を設計することができる。抗体の機能的フラグメントは、ヒト抗体と実質的に同じ重鎖及び軽鎖可変領域を有するフラグメントを含み得るかまたはそれからなり得る。
【００５１】
好ましくは、その抗原結合フラグメントは、本発明の第１の態様に関して、配列番号３に特異的であるか、または配列番号３内のエピトープに対して免疫特異的である。その抗原結合フラグメントは、ＶＨ、ＶＬ、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｃフラグメントからなる群から選択されるフラグメントのうちのいずれかを含み得るかまたはそれからなり得る。
【００５２】
その抗原結合フラグメントは、ＶＬの抗原結合領域配列のうちのいずれか１つ、ＶＨの抗原結合領域配列のうちのいずれか１つ、またはヒト抗体のＶＬ及びＶＨ抗原結合領域の組み合わせを含み得るかまたはそれからなり得る。ＶＨ及びＶＬ抗原結合領域配列の適切な数及び組み合わせは、抗原結合フラグメントの所望の親和性及び特異性、ならびに意図される用途に応じて当業者により決定され得る。抗体の機能的フラグメントまたは抗原結合フラグメントは、当業者に周知の方法を使用して容易に産生され、単離され得る。このような方法には、例えば、タンパク質溶解法、組み換え法及び化学合成が含まれる。機能的フラグメントの単離のためのタンパク質溶解方法は、ヒト抗体を出発物質として使用することを含む。ヒト免疫グロブリンのタンパク質溶解に好適な酵素には、例えば、パパイン及びペプシンが含まれ得る。好適な酵素は、例えば、一価フラグメントまたは二価フラグメントのいずれが必要とされるかに応じて、当業者により容易に選択され得る。例えば、パパイン切断は、抗原及びＦｃフラグメントに結合する２つの一価Ｆａｂ’フラグメントをもたらす。ペプシン切断は、例えば、二価Ｆ（ａｂ’）フラグメントをもたらす。本発明のＦ（ａｂ’）２フラグメントを、例えば、ＤＴＴまたは２−メルカプトエタノールを使用してさらに還元して、２つの一価Ｆａｂ’フラグメントを産生することができる。
【００５３】
タンパク質溶解によって産生される抗体の機能的または抗原結合フラグメントは、親和性及びカラムクロマトグラフィー手順によって精製され得る。例えば、未消化の抗体及びＦｃフラグメントは、タンパク質Ａへの結合によって除去され得る。さらに、機能的フラグメントは、例えば、イオン交換及びゲル濾過クロマトグラフィーを使用して、それらの負荷及びサイズによって精製されてもよい。このような方法は、当業者に周知である。
【００５４】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、組み換え方法によって産生され得る。好ましくは、最初に、抗体重鎖及び軽鎖の所望の領域をコードするポリヌクレオチドを単離する。このような領域には、例えば、重鎖及び軽鎖の可変領域の全部または一部が含まれ得る。好ましくは、このような領域は、特に重鎖及び軽鎖の抗原結合領域、好ましくは抗原結合部位、最も好ましくはＣＤＲを含み得る。
【００５５】
本発明による抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、当業者に既知の方法を使用して産生され得る。抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、当該技術分野において既知のオリゴヌクレオチド合成方法によって直接合成されてもよい。あるいは、より小さなフラグメントを合成し、接合して、当該技術分野において既知の組み換え方法を使用してより大きな機能的フラグメントを形成することができる。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「免疫特異性」という用語は、結合領域が、配列番号３またはその変異体もしくはフラグメントと特異的に結合することによって、それとの免疫反応が可能であることを意味し得る。抗体またはその抗原結合フラグメントは、およそ１０−５〜１０−１３Ｍ−１、好ましくは１０−６〜１０−９Ｍ−１、さらにより好ましくは、１０−１０〜１０−１２Ｍ−１の親和性定数を有する抗原（例えば、配列番号３またはその変異体もしくはフラグメント）と選択的に相互作用し得る。材料及び方法の節において、抗体濃度がどのように決定されるかを説明する詳細が提供される。
【００５７】
「免疫反応する」という用語は、結合領域が、配列番号３またはそのエピトープとの結合時に免疫応答を誘発することができることを意味し得る。
【００５８】
「エピトープ」という用語は、抗体またはその抗原結合フラグメントの結合領域を誘発し、それと複合する能力を有する抗原の任意の領域を意味し得る。
【００５９】
好ましくは、本発明による抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３のＣ末端における１個以上のアミノ酸に特異的に結合する。好ましくは、本発明による抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号５における１個以上のアミノ酸（すなわち、ＳＹＭＶＨＷＫ、配列番号３のＣ末端アミノ酸番号７〜１４）に特異的に結合する。好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、エピトープ内のＣ末端リジン（Ｋ）残基に特異的に結合する。
【００６０】
実施例に記載されているように、本発明者らは、驚くべきことに、本明細書では配列番号６として記載される、配列番号３におけるＣ末端アミノ酸配列ＶＨＷＫ（すなわち、配列番号３のＣ末端アミノ酸番号１０〜１４）が、本発明による抗体またはその抗原結合フラグメントに対するエピトープとして作用することを観察した。したがって、より好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号６における１個以上のアミノ酸に特異的に結合する。最も好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号６に特異的に結合する。したがって、抗体が結合するエピトープが、配列番号６を含むかまたはそれからなることが理解されよう。
【００６１】
本明細書に記載されるポリクローナル抗体は、Ｔ１４ペプチド、特にＣ末端配列−ＶＨＷＫに高度に特異的であることを証明した。さらに、全ＡＣｈＥタンパク質のその認識は、このエピトープ配列が暴露され、三次構造でアクセス可能であることを示唆する。この抗体が、直鎖Ｔ３０ペプチドフラグメント（その内部でＴ１４が起こる）を認識しなかったという事実は、Ｔ３０配列のＣ末端における暴露されたリジン（Ｋ）の不在に起因すると考えられる。
【００６２】
Ｔ１４ペプチド内の−ＶＨＷＫエピトープの発見に基づいて、本発明者らは、これらの配列が、有用な抗体の産生のための抗原として使用され得ると考える。実施例に記載されているように、Ｔ１４ペプチド（配列番号３）は、宿主において免疫応答を刺激する担体タンパク質として作用する、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にシステイン架橋した。Ｔ１４に架橋したＫＬＨタンパク質は、本明細書では配列番号７と称される。
【００６３】
したがって、第２の態様において、抗原として使用するための、配列番号３もしくは配列番号７またはその変異体またはフラグメントが提供される。
【００６４】
好ましくは、この抗原は、抗体が結合するエピトープとして作用する。好ましくは、変異体またはフラグメントは、配列番号６を含むかまたはそれからなる。
【００６５】
第３の態様において、
（ｉ）宿主生物を、配列番号３もしくは配列番号７またはその変異体もしくはフラグメントで免疫化することと、
（ｉｉ）抗体またはその抗原結合フラグメントを宿主から収集することと、を含む方法によって得られる抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００６６】
宿主は、哺乳動物であり得、ヒト、ウサギ、またはマウスであり得る。好ましくは、変異体またはフラグメントは、配列番号６を含むかまたはそれからなる。好ましくは、この方法は、宿主動物から採血することと、次いで抗体またはその抗原結合フラグメントを血清から収集することとを含む。好ましくは、血清は、共有結合したペプチド支持体を有する重力カラムを通過させられる。洗浄に続いて、抗体またはその抗原結合フラグメントは、好ましくは酸性緩衝液中に溶出され、次いで溶液は中和され得る。この方法は、好適な緩衝液（例えば、ＰＢＳ）に対する透析、及び必要に応じで凍結乾燥をさらに含んでもよい。
【００６７】
好都合なことに、本発明の第１の態様による抗体またはその抗原結合フラグメントは、それ自体の能力で治療薬の実用性を有する。しかしながら、さらに、抗体またはその抗原結合フラグメントのＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介型細胞毒性）及び／またはＣＤＣ（補体依存性細胞毒性）活性、細胞毒性部分への複合、例えば、放射、細胞毒性薬、または毒素を強化するためのグリコシル化操作を含む、薬効を最大化する技術が評価されてきた。
【００６８】
ゆえに、第４の態様において、第１または第３の態様の抗体またはその抗原結合フラグメント、及び細胞毒性部分を含む、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）が提供される。
【００６９】
抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を使用して、有能な細胞毒性薬を、抗体を介して標的細胞に選択的に送達することができる。ＡＤＣ開発のための１つの重要なパラメータは、抗体が、標的抗原、すなわち配列番号３または配列番号６への結合時に細胞内に取り込まれることが可能であり得ることである。したがって、細胞内に取り込まれた抗体は、複合薬を標的細胞中に送達することができる。
【００７０】
細胞毒性部分は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ：Ｆｒｏｍ  Ｐｒｅ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｔｏ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１１８ページを参照されたい）に記載されるものなどの任意の毒素であり得る。またＡＤにおける抗体療法の特定の例は、以下のとおりである。ＳＯＬＡＮＥＺＵＭＡＢ（Ｌｉｌｌｙ）：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｌｚｆｏｒｕｍ．ｏｒｇ／ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／ｓｏｌａｎｅｚｕｍａｂ
ＧＡＮＴＥＮＥＲＵＭＡＢ（Ｒｏｃｈｅ）：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｌｚｆｏｒｕｍ．ｏｒｇ／ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／ｓｏｌａｎｅｚｕｍａｂ
他の例（Ｉ相からＩＩＩ相にあるアルツハイマーのためのすべての免疫療法を含む）：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｌｚｆｏｒｕｍ．ｏｒｇ／ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／ｓｅａｒｃｈ？ｆｄａ＿ｓｔａｔｕｓｅｓ＝＆ｔａｒｇｅｔ＿ｔｙｐｅｓ％５Ｂ％５Ｄ＝１７０＆ｔｈｅｒａｐｙ＿ｔｙｐｅｓ％５Ｂ％５Ｄ＝１６２＆ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ％５Ｂ％５Ｄ＝１４５＆ｋｅｙｗｏｒｄｓ−ｅｎｔｒｙ＝＆ｋｅｙｗｏｒｄｓ＝。
【００７１】
薬物部分は、２２５Ａｃ標識などのα放出放射性ヌクレオチドであり得る。これらの毒素は、ジスルフィド結合、ヒドラゾンリンカー、もしくはペプチドリンカーなどの切断可能なリンカーを介して、またはＳＭＣＣ（Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート）リンカーを使用するチオエーテル結合などの切断可能でないリンカーを介して、抗体またはその抗原結合フラグメントに結合され得る。
【００７２】
実施例に記載されているように、本発明の抗体は、非常に高い特異性でＴ１４ペプチドに結合する。この抗体は、驚くべきことに、深温凍結されていた組織であっても、生物組織内で生存可能である。このデータはまた、Ｔ１４様ペプチド（すなわち、配列番号３またはその変異体もしくはフラグメント）が、独立した生化学的実体として存在することを示し、これは、アルツハイマー病などの神経変性障害に罹患しているか、またはそれに対する素因がある患者において検出され得る。したがって、これらの発見は、本発明の抗体が、診断ツールとして、ならびに神経変性障害を治療するための治療的介入において使用され得る。
【００７３】
したがって、第５の態様により、第１もしくは第３の態様による抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または第４の態様による抗体薬物複合体（各々が必要に応じて誘導体化される）が、治療または診断における使用のために提供される。
【００７４】
抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗体薬物複合体は、神経変性障害の治療、寛解、または予防において使用され得る。
【００７５】
したがって、第６の態様により、第１もしくは第３の態様による抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または第４の態様による抗体薬物複合体（各々が必要に応じて誘導体化される）が、神経変性障害の治療、予防、または寛解における使用のために提供される。
【００７６】
第７の態様により、被検体における神経変性障害の治療、予防、または寛解方法が提供され、この方法は、このような治療を必要とする患者に、治療上有効な量の、第１もしくは第３の態様による抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または第４の態様による抗体薬物複合体（各々が必要に応じて誘導体化される）を投与することを含む。
【００７７】
「誘導体化される」という用語は、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または複合体が、好ましくは、その誘導体または変異体を産生するように、使用前に修飾され得ることを意味し得る。誘導体化の例には、ＰＥＧ化抗体もしくはＰＥＧ化抗体フラグメント、または抗体−サイトカイン融合タンパク質が含まれ得る。しかしながら、いくつかの実施形態において、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または複合体は、誘導体化されない場合がある。
【００７８】
好ましくは、神経変性障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動ニューロン病、脊髄小脳１型、２型及び３型、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ならびに前頭側頭型認知症からなる群から選択される。最も好ましくは、神経変性障害は、アルツハイマー病である。
【００７９】
本発明による抗体、そのフラグメント、及び複合体（本明細書では集合的に「薬剤」と称される）が、神経変性障害の治療、寛解、または予防のための単剤療法（例えば、抗体もしくはその抗原結合フラグメントの単独使用、または抗体薬物複合体の単独使用）において使用され得ることが理解されよう。あるいは、本発明による薬剤は、他のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤などの、神経変性障害の治療、寛解、または予防のための既知の療法の補助として、またはそれと組み合わせて使用されてもよい。
【００８０】
本発明による薬剤は、特に、組成物を使用する手法に応じて、多くの異なる形態を有する組成物と組み合わせてもよい。したがって、例えば、組成物は、粉末、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮パッチ、リポソーム懸濁液の形態、または治療を必要とするヒトまたは動物に投与してもよいいずれかの他の適切な形態であってもよい。本発明による医薬品のビヒクルは、投与される被検体が十分に耐えうるものであるべきであり、ならびに好ましくは、血液脳関門を横切る薬剤の送達を可能にするものであると理解される。
【００８１】
本発明の薬剤を含む医薬品は、多くの方法で使用され得る。例えば、薬剤が、例えば錠剤、カプセル、または液体の形態で経口的に摂取され得る組成物に含有され得る場合、経口投与が必要とされ得る。本発明の薬剤及び医薬品を含む組成物は、吸入によって（例えば、鼻腔内的に）投与されてもよい。組成物は、局所用途のために製剤化されてもよい。例えば、クリームまたは軟膏が、例えば脳に隣接した皮膚に適用され得る。
【００８２】
本発明による薬剤及び医薬品はまた、徐放性または遅延放出性デバイス内に組み込むこともできる。このようなデバイスは、例えば、皮膚の上または下に挿入することができ、医薬品は、数週間または数ヶ月にわたって放出され得る。デバイスは、少なくとも治療部位、すなわち脳に少なくとも隣接して配置されてもよい。そのようなデバイスは、本発明により使用される薬剤による長期治療が必要であって、かつ頻繁な投与（少なくとも毎日の注射）を通常必要とする場合に、特に有利であり得る。
【００８３】
好ましい実施形態において、本発明による薬剤及び医薬品は、血流への注射または治療を必要とする部位への直接的な注射によって、被検体に投与され得る。例えば、医薬品は、少なくとも脳に隣接して注射されてもよい。注射は、静脈内（ボーラスまたは点滴）または皮下（ボーラスまたは点滴）、または皮内（ボーラスまたは点滴）であり得る。
【００８４】
必要とされる抗体、フラグメント、及び複合体（すなわち、薬剤）の量は、その生物学的活性及び生物学的利用能によって決定され、それは順次投与様式、薬剤の生理化学的性質、及びそれが単独療法または併用療法のいずれで使用されるのかに依存すると理解されよう。また、投与頻度は、治療される被検体内の薬剤の半減期に影響される。投与される最適用量は、当業者によって決定され、使用における特定の薬剤、薬剤組成物の強度、投与様式、細菌感染の進行によって異なる。治療される特定の被検体に依存する追加因子は、被検体の年齢、体重、性別、食事、及び投与時間を含んで、用量を調整する必要性が生じる。
【００８５】
一般的に、神経変性障害を治療、寛解、または予防するために、本発明による薬剤を、使用する薬剤に依存して、０．００１μｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の一日用量で使用してよい。より好ましくは、薬剤の一日用量は、０．０１μｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．１μｇ／ｋｇ体重〜１００μｇ／ｋｇ体重、最も好ましくはおよそ０．１μｇ／ｋｇ体重〜１０μｇ／ｋｇ体重である。
【００８６】
薬剤は、神経変性障害の発症前、発症中または発症後に投与してもよい。毎日の用量は、単回投与（例えば、１日１回の注射）として与えられてもよい。あるいは、薬剤は、１日２回以上の投与を必要としてもよい。一例として、薬剤は、（すなわち、体重７０ｋｇを仮定して）０．０７μｇ〜７００ｍｇの量で、１日２回（または、治療される神経変性障害の重症度によってはそれ以上）投与してもよい。治療を受ける患者は、起床時に１回目の投与を、夕方（２回投与の場合）またはそれから３〜４時間空けて２回目の投与を受けてもよい。あるいは、複数回投与を必要としない患者に対して、最適な用量の本発明による薬剤を提供するために、徐放デバイスを用いてもよい。本発明による薬剤の特定の配合、及び（薬剤の一日用量や投与頻度などの）正確な治療計画を形成するのに、製薬業界で従来採用されているものなど既知の方法（例えば、インビボ実験、臨床治験など）を用いてもよい。
【００８７】
本発明の第８の態様において、第１もしくは第３の態様による抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または第４の被検体による抗体薬物複合体（各々が必要に応じて誘導体化される）、及び必要に応じて薬学的に許容されるビヒクルを含む薬剤組成物が提供される。
【００８８】
薬剤組成物は、好ましくは抗神経変性疾患組成物、すなわち、アルツハイマー病などの被検体における神経変性障害の治療的寛解、予防、または治療に使用される薬学的製剤である。
【００８９】
抗体もしくはその機能的フラグメント、ペプチド、または核酸は、誘導体化されない場合がある。
【００９０】
また、本発明は、第９の態様において、第８の態様による薬剤組成物を作製するプロセスを提供し、このプロセスは、治療上有効な量の、第１もしくは第３の態様において定義される抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または第４の態様において定義される抗体薬物複合体を、薬学的に許容されるビヒクルと複合することを含む。
【００９１】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、第１の態様に関して定義されてもよい。
【００９２】
「被検体」は、脊椎動物、哺乳類、または家畜動物であってよい。したがって、本発明による医薬品は、任意の哺乳動物、例えば、家畜（例えば、馬）、ペットを治療するのに使用してもよく、または他の獣医学的適用において使用してもよい。最も好ましくは、被検体は、ヒトである。
【００９３】
抗体またはその抗原結合フラグメントの「治療上有効な量」は、被検体に投与した際、神経変性疾患を治療するか、または所望の効果を生じるのに必要とされる薬剤量である任意の量である。
【００９４】
例えば、使用される抗体またはそのフラグメントの治療上有効な量は、約０．００１ｎｇ〜約１ｍｇ、及び好ましくは約０．０１ｎｇ〜約１００ｎｇであってもよい。抗体またはフラグメントの量は、約０．１ｎｇ〜約１０ｎｇ、及び最も好ましくは約０．５ｎｇ〜約５ｎｇの量であることが好ましい。
【００９５】
本明細書で称される「薬学的に許容されるビヒクル」は、当業者にとって薬剤組成物を処方するのに有用であると知られている、いずれかの既知の化合物または既知の化合物の組み合わせである。
【００９６】
一実施形態において、薬学的に許容されるビヒクルは、固体であってもよく、組成物は粉末または錠剤の形態であってもよい。固体の薬学的に許容されるビヒクルは、香味剤、潤沢剤、可溶化剤、懸濁剤、染料、充填剤、滑剤、圧縮助剤、不活性結合剤、甘味剤、保存剤、染料、コーティング、または錠剤崩壊剤としても作用し得る１つ以上の物質を含み得る。ビヒクルは、封止材料であってもよい。粉末において、ビヒクルは、微細に分割された固体であり、本発明による微細に分割された活性剤との混和物中にある。錠剤において、活性剤は、好適な比率で必要な圧縮特性を有するビヒクルと混合され、所望の形状及びサイズに圧縮され得る。粉末及び錠剤は、好ましくは、活性剤の９９％までを含有する。好適な固体ビヒクルには、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、スターチ、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリドン、低融点蝋、及びイオン交換樹脂が含まれる。別の実施形態において、薬学的ビヒクルは、ゲルであってもよく、組成物は、クリームなどの形態であり得る。
【００９７】
しかしながら、薬学的ビヒクルは、液体であり得る、薬剤組成物は、溶液の形態である。液体ビヒクルは、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシル、及び加圧組成物を調製する際に使用される。本発明による活性剤は、水、有機溶媒、薬学的に許容される油または脂肪の両方の混合物などの薬学的に許容される液体ビヒクルに溶解または懸濁され得る。液体ビヒクルは、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、保存剤、甘味剤、香味剤、懸濁剤、増粘剤、着色剤、粘度調節剤、安定剤、または浸透圧調節剤などの他の好適な薬学的添加物を含有し得る。経口投与及び非経口投与に好適な液体ビヒクルの例には、水（上記の添加剤を部分的に含有する、例えば、セルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液）、アルコール（一価アルコール及び多価アルコールを含む、例えば、グリコール）及びそれらの誘導体、ならびに油（例えば、分留ココナッツ油及び落花生油）が含まれる。非経口投与の場合、ビヒクルは、オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルなどの油性エステルであってもよい。滅菌液体ビヒクルは、非経口投与のための滅菌液体形態の組成物において有用である。加圧組成物のための液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される推進剤であり得る。
【００９８】
滅菌された溶液または懸濁液である液体薬剤組成物は、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内、特に皮下注入によって利用することができる。薬剤は、滅菌水、生理食塩水、または他の適切な滅菌注入媒質を使用して、投与時に溶解または懸濁され得る滅菌固体組成物として調製されてもよい。
【００９９】
本発明の薬剤及び組成物は、他の溶質や懸濁剤（例えば、溶液を等張にするのに十分な生理食塩水またはグルコース）、胆汁酸塩、アカシア、ゼラチン、ソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０（ソルビトールのオレイン酸エステル及びエチレンオキシドと共重合したその無水物）などを含む、滅菌溶液または懸濁液の形態で経口投与されてもよい。また、本発明により使用される薬剤は、液体または固体の組成物形態で経口投与することができる。経口投与に好適な組成物は、ピル、カプセル剤、顆粒剤、錠剤及び粉末などの固体形態、ならびに溶液、シロップ、エリキシル及び懸濁液などの液体形態を含む。非経口投与に有用な形態としては、滅菌溶液、エマルジョン及び懸濁液が含まれる。
【０１００】
本明細書に記載されるように、本発明の抗体は、Ｔ１４ペプチド（すなわち、配列番号３）、及び特にエピトープとして作用するＣ末端配列、−ＶＨＷＫ（すなわち、配列番号６）に対して高度に特異的または選択的である。この抗体は、驚くべきことに、深温凍結されていたものであっても、生物組織内で生存可能である。さらに、データは、Ｔ１４様ペプチドが、独立した生物化学的実体として存在することを示す。これらの発見は、検出可能な配列（すなわち、−ＶＨＷＫエピトープ）が、診断ツールとして使用され得ることを示唆する。
【０１０１】
したがって、第１０の態様において、神経変性障害を検出または診断するためのバイオマーカーとしての使用のための配列番号３またはその変異体もしくはフラグメントが提供される。
【０１０２】
好ましくは、配列番号３またはその変異体もしくはフラグメントは、抗体または抗原結合フラグメント、好ましくは第１の態様または第３の態様による抗体または抗原結合フラグメントによって結合され得るエピトープとして作用する。
【０１０３】
好ましくは、バイオマーカーとして使用される配列番号３の変異体またはフラグメントは、配列番号６を含むかまたはそれからなる。
【０１０４】
また、本発明は、神経変性疾患に罹患している患者の診断キットを提供する。
【０１０５】
したがって、本発明の第１１の態様により、神経変性障害に罹患している被検体もしくはそれに対する素因を診断するため、または被検体の病態の予後判定を提供するためのキットが提供され、このキットは、試験被検体からの試料中に存在する抗原濃度を検出するための検出手段を含み、この検出手段は、第１または第３の態様による抗体またはその抗原結合フラグメント（必要に応じて誘導体化される）を含み、試料中の抗原の存在は、被検体が神経変性障害に罹患していることを示唆する。
【０１０６】
第１２の態様により、神経変性障害に罹患している患者もしくはそれに対する素因を診断するため、または被検体の病態の予後判定を提供するための方法が提供され、この方法は、被検体から得られた試料中に存在する抗原濃度を検出することを含み、検出は、第１または第３の態様による抗体またはその抗原結合フラグメント（必要に応じて誘導体化される）を使用して達成され、試料中の抗原の存在は、被検体が神経変性障害に罹患していることを示唆する。
【０１０７】
好都合なことに、本発明の抗体を使用して、個人が神経変性障害（アルツハイマー病またはパーキンソン病など）を発症する危険性が高いかどうかを、現在可能であるよりもはるかに容易に決定することができ、それにより早期治療が提供され得るか、または生活様式及び食事に関して、より十分な情報を得たうえでの決定を助けるために情報が提供され得る。さらに、神経変性障害の早期診断、または被検体が神経変性障害を発症し得る危険性の早期検出は、医師が医薬品を処方するのに大いに助けとなる。
【０１０８】
好ましくは、抗原は、配列番号３、より好ましくは配列番号５、最も好ましくは配列番号６を含むかまたはそれからなる。
【０１０９】
好ましくは、試料は、生物試料を含む。試料は、タンパク質を得ることができる被検体から得ることができる任意の材料であり得る。試料は、脳、例えば、皮質外皮、青斑核、または海馬を含み得る。
【０１１０】
図１８〜２０は、驚くべきことに、ＣＳＦ中のＴ１４に結合することを示す。したがって好ましくは、試料は、脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む。
【０１１１】
試料は、血液、尿、組織などを含み得る。
【０１１２】
図２３は、抗体が、驚くべきことに、それ自体が血中のＴ１４に結合することを示す。したがって最も好ましくは、試料は、血液試料を含む。血液は、静脈血または動脈血であってよい。
【０１１３】
キットは、抽出された試料を受容するための試料収集容器を含み得る。血液試料は、Ｔ１４レベルに関して速やかにアッセイされ得る。あるいは、血液試料は、Ｔ１４アッセイが行われる前に、低温で、例えば冷蔵庫内で貯蔵され得るか、またはさらには冷凍され得る。Ｔ１４の検出は、全血で実行され得る。しかしながら、好ましくは、血液試料は、血清を含む。好ましくは、血液試料は、血漿を含む。
【０１１４】
血液は、Ｔ１４アッセイが行われる前にさらに処理されてもよい。例えば、クエン酸（クエン酸ナトリウムなど）、ヒルジン、ヘパリン、ＰＰＡＣＫ、またはフッ化ナトリウムなどの抗凝固剤が付加されてもよい。ゆえに、試料収集容器は、血液試料が凝固するのを防ぐために、抗凝固剤を含有してもよい。あるいは、血液試料は、血漿または血清分留を調製するために遠心分離または濾過されてもよく、これが分析に使用され得る。したがって、Ｔ１４は、血漿または血清試料中で分析またはアッセイされることが好ましい。Ｔ１４濃度は、被検体から採取された血清試料または血漿試料からインビトロで測定されることが好ましい。
【０１１５】
好ましくは、このキットまたは方法は、試料中のＴ１４陽性細胞（すなわち、配列番号３またはその変異体もしくはフラグメントを含む細胞）の存在または不在を特定するか、または試料中のその濃度を決定するために使用される。検出手段は、試料中のＴ１４陽性細胞の存在及び／または不在を検出するように適応されたアッセイを含み得る。このキットまたは方法は、アッセイが比較され得る正の対照及び／または負の対照の使用を含み得る。例えば、キットは、神経変性障害を罹患している個体（すなわち、正の対照）または罹患していない個体（すなわち、負の対照）からの試料中のＴ１４陽性細胞の濃度に関する基準を含み得る。
【０１１６】
このキットは、検出され得る標識をさらに含み得る。「標識」という用語は、抗体またはそのフラグメントに結合され得る部分を意味し得る。部分は、例えば、治療または診断手順に使用され得る。治療的標識には、例えば、本発明の抗体またはそのフラグメントに結合され、Ｔ１４ペプチド（すなわち、配列番号３）またはそのフラグメント、例えば、配列番号５または配列番号６への抗体の結合を監視するために使用され得る部分が含まれる。本明細書に記載されるように、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３またはその変異体もしくはフラグメントに特異的に結合する。好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２（すなわち、Ｔ３０）に結合しない。好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４（すなわち、Ｔ１５）またはβ−アミロイドに結合しない。
【０１１７】
診断的標識には、例えば、分析方法によって検出され得る部分が含まれる。分析方法には、例えば、定性的及び定量的手順が含まれる。定性的分析方法には、例えば、免疫組織化学及び間接的免疫蛍光が含まれる。定量的分析方法には、例えば、放射免疫測定、ＥＬＩＳＡ、またはＦＡＣＳ分析などの免疫親和性手順が含まれる。分析方法には、インビトロ及びインビボ両方の撮像手順も含まれる。分析手段によって検出され得る診断的標識の特定例には、酵素、放射性同位体、蛍光色素、化学発光マーカー、及びビオチンが含まれる。
【０１１８】
標識は、本発明の抗体もしくはそのフラグメントに直接結合され得るか、または本発明の分子に特異的に結合する二次結合剤に結合され得る。このような二次結合剤は、例えば、二次抗体であり得る。二次抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかであり、ヒト、齧歯類、またはキメラ起源であり得る。
【０１１９】
本発明者らは、本発明の抗体が、薬物送達プロセスにおける新たな治療化合物のスクリーニングの一部として使用され得ると考える。例えば、毒性ペプチドＴ１４を検出する方法及びアッセイは、候補化合物のスクリーニング（例えば、ＨＴＳ及び選択的ライブラリースクリーン、及び構造ベースの設計）のため、有効な治療をもたらし得るヒット、ならびに二次アッセイ（例えば、インビトロ及びエクスビボ二次アッセイ）を特定するため、医薬品の「ヒットからリードへの」開発の一部として使用することができる。
【０１２０】
したがって、本発明の第１３の態様では、薬物発見スクリーンにおいて、神経変性障害の治療、予防、または寛解における使用のための治療化合物を特定するための、第１または第３の態様による抗体またはその抗原結合フラグメントの使用が提供される。
【０１２１】
第１４の態様において、Ｔ１４ペプチド（配列番号３）の合成または活性を阻害する薬剤の特定のための、比色分析的または蛍光的に標識されたＴ１４ペプチド（配列番号３）のエクスビボ使用が提供される。
【０１２２】
第１５の態様において、神経変性障害の治療、予防、または寛解における使用のための候補薬剤の特定方法が提供され、この方法は、以下の、
（ｉ）インビトロまたはエクスビボで、第１または第３の態様による抗体またはその抗原結合フラグメントの存在下、細胞を試験薬剤と接触させるステップと、
（ｉｉ）抗体またはその抗原結合フラグメントを使用して、Ｔ１４ペプチド（配列番号３）の存在、濃度、または活性を検出するステップと、を含み、Ｔ１４ペプチドの不在、または対照と比較したＴ１４ペプチド合成、濃度、または活性の低減は、その薬剤が、不適切な補体活性を特徴とする疾患の治療、予防、または寛解のための候補であることの指標である。
【０１２３】
第１５の態様において、Ｔ１４ペプチド（配列番号３）の合成または活性を阻害する薬剤の特定のためのアッセイが提供され、このアッセイは、
（ｉ）細胞ベースの発現系と、
（ｉｉ）第１または第３の態様による抗体またはその抗原結合フラグメントと、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの試験薬剤の、発現系との接触を可能にするように構成された容器とを含む。
【０１２４】
第１６の態様において、Ｔ１４ペプチド（配列番号３）の合成または活性を調節する薬剤の特定のための方法が提供され、この方法は、
（ｉ）インビトロまたはエクスビボで、第１または第３の態様による抗体またはその抗原結合フラグメントの存在下、細胞を試験薬剤と接触させることと、
（ｉｉ）抗体またはその抗原結合フラグメントを使用して、Ｔ１４ペプチド（配列番号３）の存在、濃度、または活性を検出することと、を含み、対照と比較したＴ１４合成、濃度、または活性の変化は、試験薬剤が、Ｔ１４ペプチド（配列番号３）の合成または活性を調節することの指標である。
【０１２５】
抗体またはその抗原結合フラグメントを使用して、本発明のアッセイ及び方法において、毒性ペプチドＴ１４（配列番号３）の存在、濃度、または活性を検出できることが理解されよう。したがって、抗体が、試験化合物の存在に応答して、Ｔ１４またはその濃度もしくは活性の増加を検出する場合、これは、試験化合物が、神経変性障害の治療のための有用な候補を表さないことを示す。逆に、抗体によって毒性Ｔ１４が検出されない場合、またはそれが試験化合物の存在下でその濃度または活性の減少を検出する場合、これは、試験化合物が、神経変性障害の治療のための有用な治療法であることを示す。これらの方法及びアッセイは、Ｔ１４ペプチドの合成または活性を低減または予防する薬剤を特定することを含むことが好ましい。
【０１２６】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかは、インビトロまたはエクスビボで実行され得る。接触は、実質的に無細胞系においてであり得る。これらの方法のうちのいずれかは、細胞ベース系において、及び／または非ヒト哺乳動物においてインビボで同じ活性の陽性指標を示す薬剤をスクリーニングすることを含み得る。
【０１２７】
本発明は、いずれかの核酸もしくはペプチド、またはその変異体、誘導体、もしくは類似体にまで及ぶものであり、その変異体またはフラグメントを含む、本明細書で言及される配列のいずれかのアミノ酸または核酸配列を実質的に含むかそれからなることと理解されよう。「実質的にアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列」、「変異体」及び「フラグメント」という用語は、本明細書において言及される配列のうちのいずれか１つのアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列と少なくとも４０％の配列同一性、例えば、配列番号３（すなわち、Ｔ１４ポリペプチド配列）または配列番号６（すなわち、ＶＨＷＫエピトープ）などとして特定される配列と４０％の同一性を有する配列であってよい。
【０１２８】
また、言及される配列のいずれかと５０％超、より好ましくは６５％超、７０％超、７５％超、さらにより好ましくは８０％超である配列同一性を有するアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列についても想定される。好ましくは、アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列は、言及される配列のいずれかと少なくとも８５％の同一性を有し、より好ましくは少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、最も好ましくは、本明細書で言及される配列のいずれかと少なくとも９９％の同一性を有する。
【０１２９】
熟練した技術者であれば、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性率（ｐｅｒｓｅｎｔａｇｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）の計算方法を理解するであろう。２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性率を計算するためには、まず２つの配列のアラインメントを準備し、配列同一性値を計算する。２つの配列の同一性率は、（ｉ）配列のアラインするために使用される方法、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（異なるプログラムで実施される）、または３Ｄ比較による構造的アラインメント、及び（ｉｉ）アラインメント方法によって使用されるパラメータ、例えば、ローカル対グローバルアラインメント、使用されるペアスコアマトリックス（例えば、ｂｌｏｓｕｍ６２、ｐａｍ２５０、ｇｏｎｎｅｔなど）、及びギャップペナルティ（例えば、関数形式や定数）に依存して、異なる値をとり得る。
【０１３０】
アラインメント後、２つの配列間の同一性率を計算する方法は多数ある。例えば、一致数（ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）を、（ｉ）最短配列長さ、（ｉｉ）アラインメント長さ、（ｉｉｉ）配列の平均長さ、（ｉｖ）非ギャップ位置数、または（ｉｖ）オーバーハングを除く等価位置数で、除してもよい。さらに、同一性率は長さにも大きく依存すると理解されよう。ゆえに、配列の短いペアでは、より高い配列同一性が偶然に起こることが予想される。
【０１３１】
したがって、タンパク質またはＤＮＡ配列の正確なアラインメントは、複雑なプロセスであることが理解されよう。有名な多重アラインメントプログラムであるＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，４６７３−４６８０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４，４８７６−４８８２）は、本発明によるタンパク質またはＤＮＡの多重アラインメントを生成するうえで好適な方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷに好適なパラメータは下記のとおりである：ＤＮＡアラインメントの場合：ギャップオープンペナルティ＝１５．０、ギャップ伸長ペナルティ＝６．６６、及びマトリックス＝アイデンティティ。タンパク質アラインメントの場合：ギャップオープンペナルティ＝１０．０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．２、及びマトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ。ＤＮＡ及びタンパク質のアラインメントの場合：ＥＮＤＧＡＰ＝−１及びＧＡＰＤＩＳＴ＝４。当業者であれば、最適な配列アラインメントのためにこれら及び他のパラメータを変更することが必要なことに気づくであろう。
【０１３２】
好ましくは、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性率の計算は、次に（Ｎ／Ｔ）＊１００などのアラインメントから計算してもよく、式中、Ｎは、同一の残基を共有する配列における位置の数であり、Ｔは、ギャップを含みオーバーハングを除く位置の総数である。したがって、２つの配列間の同一性率を計算するための最も好ましい方法は、（ｉ）例えば、上記のように、好適な一連のパラメータを用いてｃｌｕｓｔａｌｗプログラムを用いて配列アラインメントを調製することと、（ｉｉ）ｎ及びｔの値を次式：配列同一性＝（Ｎ／Ｔ）＊１００に挿入することとを含む。
【０１３３】
類似する配列を特定するための他の方法は、当業者にとって既知である。例えば、実質的に類似するヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下で本明細書に示される核酸配列のうちのいずれか、またはそれらの相補体にハイブリダイズする配列によってコードされる。ストリンジェントな条件では、ヌクレオチドを４５℃で３×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でフィルターに結合したＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズさせた後、約２０〜６５℃で０．２×ｓｓｃ／０．１％ＳＤＳ中少なくとも１回洗浄することを意味する。あるいは、実質的に類似するポリペプチドは、本明細書で示される配列とは、少なくとも１個のアミノ酸、しかし５、１０、２０、５０、または１００個未満のアミノ酸が異なっていてもよい。
【０１３４】
遺伝コードの縮退により、本明細書に記載される任意の核酸配列は、これによってコードされるタンパク質配列に実質的に影響を及ぼすことなく、変異または変化して、その機能的変異体を提供できることは明らかである。好適なヌクレオチド変異体は、配列内で同一のアミノ酸をコードし、このためサイレントな変化を生じる異なるコドンの置換によって変更された配列を有するものである。他の好適な変異体は、対応するヌクレオチド配列を有するが、置換されるアミノ酸と同様の生物物理学的性質の側鎖を有するアミノ酸をコードする、異なるコドンの置換によって変更されて保守的な変化を生じる、配列の全部または一部を含むものである。例えば、小さい非極性の疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン及びメチオニンが含まれる。大きい非極性の疎水性アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが含まれる。極性の中性アミノ酸としては、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン及びグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、リジン、アルギニン及びヒスチジンが含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。ゆえに、いずれのアミノ酸が同様の生物物理学的性質を有するアミノ酸で置換できるかが理解され、熟練した技術者であればこれらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が分かるであろう。
【０１３５】
本明細書（添付の特許請求の範囲、要約書及び図面を含む）で記載された特徴のすべて、及び／または開示されたいずれかの方法またはプロセスの過程のすべては、少なくともこのような特徴及び／または過程の幾つかが相互に排他的である組み合わせを除き、任意の組み合わせで上記の態様のいずれかと組み合わせてもよい。
【０１３６】
本発明のより良い理解のため、及び本発明の実施形態を有効に実施することができる方法を示すために、ここで例として添付の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】ＥＬＩＳＡによるＰｅｐ４（配列番号７）の標準曲線である。
【図２】ＥＬＩＳＡによるＴ１４（配列番号３）の標準曲線である。
【図３】ＥＬＩＳＡによるＴ３０（配列番号２）の標準曲線である。
【図４】ＥｌＩＳＡによるＴ１５（配列番号４）の標準曲線である。
【図５】Ｃ末端にＶＨＷＫモチーフ（配列番号６）を有する９、１０、１１、１２、１３、及び１４個のアミノ酸ペプチドのＥＬＩＳＡ検出を示す。
【図６】Ｃ末端にＶＨＷＫモチーフを有しない９、１０、１１、１２、１３、及び１４個のアミノ酸ペプチドのＥＬＩＳＡ検出を示す。
【図７】１１個のアミノ酸ペプチドのＥＬＩＳＡ検出を示す。
【図８】１２個のアミノ酸ペプチドのＥＬＩＳＡ検出を示す。
【図９】１３個のアミノ酸ペプチドのＥＬＩＳＡ検出を示す。
【図１０】１４個のアミノ酸ペプチドのＥＬＩＳＡ検出を示す。
【図１１】本発明による抗体の一実施形態を使用する、ＥＬＩＳＡによるＡＣｈＥ分子の検出を示す。
【図１２】ＡＣｈＥ単独の活性、及びエルマンアッセイによって決定される本発明による抗体の一実施形態との組み合わせでの活性を示す。
【図１３】ＡＣｈＥ単独の活性、及びエルマンアッセイによって決定される本発明による抗体の一実施形態との組み合わせでの活性を示す。
【図１４】ＡＣｈＥ単独の活性、及びエルマンアッセイによって決定される本発明による抗体の一実施形態との組み合わせでの活性を示す。
【図１５】ラットホモジネートの異なる希釈液中のＴ１４様ペプチドの検出を示す。
【図１６】総タンパク質（ｍｇ）当たりのＴ１４様ペプチド（μｇ）として発現される、ヒト脳対照及びＡＤを示す。ＡＤ試料は、Ｐ＝０．０３において著しく高い濃度を示す。
【図１７】Ｔ１４に対する抗体の特異性の検証を示す。ヒストグラムは、１００ｎＭの外因性Ｔ１４、Ｔ３０、Ｔ１５、アミロイド、及び最終Ｋ残基が付加されていないＴ１４に対する応答を示す。全例において、ｎ＝３。抗体に対する明らかな応答は、Ｔ１４を用いる場合にのみ見られる。
【図１８】対照及びＡＤ患者の１０同年齢対に関するウェスタンブロット（ＷＢ）データを示し、患者コード、性別、年齢、ＣＥＲＡＤ状態、及びＢｒａａｋステージを表す。ＣＳＦ中のＴ１４レベルは、本発明の抗体の実施形態を使用するウェスタンブロッティングを使用して試験したＡＤの症例の大半（８０％）において増加し、ゆえに、その仮説を証明し、Ｔ１４をバイオマーカーとして特定する。
【図１９】本発明の抗体の実施形態を使用して、ＡＤ患者におけるＣＳＦ中で上昇したＴ１４レベルを示すが、Ａβは未変化のままである。図１９（Ａ）：代表的なウェスタンブロットにおける対照及びＡＤ患者の死後ＣＳＦ中のＴ１４発現。集合に起因して、Ｔ１４（Ｂｏｎｄ，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９，Ｃｏｔｔｉｎｇｈａｍ，Ｈｏｌｌｉｎｇｓｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．２００２）は、より低速の電気泳動可動性（５０ＫＤａ）と共に見られる。対照：男性、８０歳、ＣＥＲＡＤ正常、Ｂｒａａｋ  Ｉ。ＡＤ：男性、８１歳、ＣＥＲＡＤ明確、Ｂｒａａｋ  Ｖ；図１９（Ｂ）：代表的なウェスタンブロットにおける対照及びＡＤ患者の死後ＣＳＦ中のＡβ発現。対照：男性、８０歳、ＣＥＲＡＤ正常、Ｂｒａａｋ  Ｉ。ＡＤ：男性、８１歳、ＣＥＲＡＤ明確、Ｂｒａａｋ  Ｖ。左から右へ：対照：女性、８２歳、ＣＥＲＡＤ正常；ＡＤ：女性、８１歳、ＣＥＲＡＤ明確、Ｂｒａａｋ  ＶＩ；対照：男性、８３歳、ＣＥＲＡＤ正常、Ｂｒａａｋ  Ｉ／ＩＩ；ＡＤ：男性、７９歳、ＣＥＲＡＤ明確、Ｂｒａａｋ  Ｖ／ＶＩ；図１９（Ｃ）：Ｔ１４発現の定量；及び図１９（Ｄ）：対照（ｎ＝１０）及びＡＤ患者（ｎ＝１０）の死後ＣＳＦ中のＡβ発現。Ｔ１４レベルを、Ｂｌｏｔ−ＦａｓｔｓｔａｉｎＴＭ（Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）によって検出され、対照＋／−ＳＥＭの平均のパーセンテージとして表される、総タンパク質発現に対して正規化した。レベルＰ＜０．０００１での有意差は、＊＊＊＊によって示される。
【図２０】Ｔ１４レベルが、本発明の抗体の実施形態を使用して、３つの脳領域と比較して、対照及びＡＤ患者のＣＳＦ中で一貫して高いことを示す。しかしながら、これは、Ａβには該当しない。Ｔ１４レベルを、ＣＳＦ及び３つの脳領域において測定した（ＣＣ：皮質外皮、ＬＣ：青斑核、ＨＣ：海馬）。脳領域及びＣＳＦにおけるＴ１４の量は、Ａ）対照及びＢ）ＡＤ患者両方におけるＣＳＦ中のＴ１４量の％として表した。Ａβレベルを測定し、Ｃ）対照及びＤ）ＡＤ患者に関して上記と同じ方法で表す。Ｅ）次いで、ＣＳＦ中のＴ１４及びＡβの相対量（黒色の棒）を一緒にプロットした。
【図２１】Ｔ１４集合が、指数関数的に成長し、Ｔ１４モノマープールが未変化のままであることを示す。外因性Ｔ１４ストック溶液（２０ｍＭ）溶液を、蒸留水中の再懸濁によって作成した。その後、ストック溶液を、ＰＢＳ（ｐＨ１０．５）で作用ストック溶液（４００μＭ）に希釈した。ＰＢＳ（ｐＨ５）を付加することによって作用ストック溶液を中和して、最終濃度を２００μＭにすることにより集合を開始させ、これを０、１、２、３、４時間にわたって２５℃でインキュベートした。さらに、Ｔ１４モノマー対照を、作用ストックをＰＢＳ（ｐＨ１０．５）で２００μＭに希釈し、２５℃で４時間インキュベートすることによって作成した。ｐＨ５及びｐＨ１０．５ＰＢＳを一緒に混合し、２５℃で４時間インキュベートすることによって、さらなるペプチド不含対照を作成した。次いでＷＢ（Ａ）及びＥＬＩＳＡ（Ｂ）を、上記のＴ１４集合試料上で行い、定量した。
【図２２】臨床脳組織（皮質及び海馬）におけるＴ１４レベルが、本発明の抗体の実施形態を使用して、ＡＤ脳において著しく上昇する（タンパク質１ｍｇ当たり）ことを示す。
【図２３】濾過したヒト血清（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）が、本発明の抗体の実施形態を使用し、Ｔ１４  ＥＬＩＳＡによって測定して、Ｔ１４の存在が検出可能なレベルであることを示すことを示す。
【図２４】進行したアルツハイマー患者のグローバルニューロンにおけるＴ１４の存在を示す抗体を使用した免疫組織化学結果を示す。
【図２５】非神経学的対照及び重度ＡＤの両方における抗Ｔ１４抗体切片によるヒト中脳の免疫組織化学染色を示す。
【実施例】
【０１３８】
「末端付加（ｔａｉｌｅｄ）」アセチルコリンエステラーゼ（Ｔ−ＡＣｈＥ）は、シナプスにおいて発現され、本発明者らは以前に、そのＣ末端から切断することができる２つのペプチドを特定し、一方は「Ｔ１４」（１４アミノ酸長）と称され、他方の「Ｔ３０」（３０アミノ酸長）として知られているもの中に含まれ、そして両者はβ−アミロイド相当領域に対して強い配列相同性を有する。「Ｔ１５」と称されるさらなるペプチドは、Ｔ３０の最後の１５個のアミノ酸残基に対応する。
【０１３９】
線状ペプチドのアミノ酸配列、Ｔ１４は、ＡＥＦＨＲＷＳＳＹＭＶＨＷＫ［配列番号３］である。
【０１４０】
線状ペプチドのアミノ酸配列、Ｔ３０は、ＫＡＥＦＨＲＷＳＳＹＭＶＨＷＫＮＱＦＤＨＹＳＫＱＤＲＣＳＤＬ［配列番号２］である。Ｔ３０の後の１５個のアミノ酸残基に対応する線状ペプチドのアミノ酸配列、Ｔ１５は、ＮＱＦＤＨＹＳＫＱＤＲＣＳＤＬ［配列番号５］である。
【０１４１】
ＡＣｈＥのＣ末端ペプチド「Ｔ１４」は、非加水分解作用の領域を担うＡＣｈＥ分子の際立った部分として特定されている。合成の１４個のアミノ酸のペプチド類似体（すなわち「Ｔ１４」）、続いてそれが埋め込まれたより大きく、より安定で、より強力なアミノ酸配列（すなわち「Ｔ３０」）は、「非コリン作動性（ｎｏｎ−ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ）」ＡＣｈＥとして報告されているものに匹敵する作用を示す。
【０１４２】
また、本発明者らは以前に、１４アミノ酸長の環状Ｔ１４ペプチド（すなわち「ＮＢＰ−１４」）を調製している。これは、Ｔ１４のアミノ酸配列、すなわち、ＡＥＦＨＲＷＳＳＹＭＶＨＷＫ［配列番号３］に基づくが、末端アラニン（Ａ）及びリジン（Ｋ）残基を介して環化されている。環化は、いくつかの異なる手段によって達成することができる。例えば、Ｇｅｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（フランス）は、線状ペプチドをＮ末端からＣ末端のラクタムに変換することによってＴ１４の環化を行った。環状ＮＢＰ１４を作製するためのＴ１４の環化は、両端（すなわち、ＨＷＫ−ＡＥＦ）を一緒に結合する。本発明者らは、環状ＮＢＰ−１４が、ＡＣｈＥの非古典的な効果（すなわち、その酵素活性から独立したＡＣｈＥの効果）及び／またはその末端ペプチドをインビトロで選択的に阻害し、神経変性障害を治療するために使用され得ることを以前に示した。ＮＢＰ１４は、α７ニコチン受容体上で作用し、細胞を直鎖Ｔ１４、Ｔ３０、及びβ−アミロイド毒性から保護する。それはまた、直鎖Ｔ１４及びＴ３０の毒性によって誘導される相補的ＡＣｈＥ放出をブロックする。さらに、単独で付与された場合、環状ＮＢＰ１４は、ラット脳スライスにおけるＣａ２＋濃度に著しい効果を有しないが、Ｔ３０の効果をブロックする。
【０１４３】
早期研究に基づいて、本発明者らは、非常に高い特異性でＡＣｈＥ  Ｃ末端ペプチド「Ｔ１４」に結合する、抗体を開発した。本発明者らは、この抗体が、神経変性障害を診断するための診断ツールとして、高い信頼性で使用され得ることを示した。また、本発明者らは、抗体が治療法において使用され得ると考える。
【０１４４】
材料及び方法
ポリクローナル抗体の合成
抗体は、Ｇｅｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）によって合成した。２羽のニュージーランドウサギを使用し、免疫原としてＫＬＨ−ペプチドを用い、７０日間にわたって４回免疫化した（「Ｐｅｐ４」：Ｔ１４−ハプテンＣＡＥＦＨＲＷＳＳＹＭＶＨＷＫ−配列番号７）。動物から４回採血し、血液をプールした。次いで抗血清を、共有結合したペプチド支持体を有する重力カラムを通過させ、洗浄した後、抗体を酸性緩衝液中に溶出し、溶液を中和した。ＰＢＳ緩衝液に対するさらなる透析及び凍結乾燥でプロセスを完了した。
【０１４５】
【表１】
2018516849.tif 000008
【０１４６】
Ｔ１４抗体条件の最適化
抗体に関する製造元の報告を使用して、最適条件でＥＬＩＳＡの実験を行った。この報告において、製造元は、抗体の濃度に関する最適密度（下記の表を参照されたい）、及びこの手順に使用されるＥＬＩＳＡプロトコル（下記のプロトコルを参照されたい）を特定している。
【０１４７】
製造元からのプロトコル：
抗原を、ＥＩＡストリップ上に１ウェル当たり１０μｇでコーティングした。ウェルを、２００μＬ  ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。
【０１４８】
抗血清を連続希釈し、別個のウェルに付加して、２時間インキュベートした。未結合の抗体を洗浄し、抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ複合体を付加した。プレートを洗浄し、ＴＭＢ基剤を用いて発色現像を１５分間行った。吸光度を４０５ｎｍ（２．００ＡＵＦＳ）で読み取った。色強度は、抗体の量に直接比例していた。吸光度が、免疫前血清の吸光度よりも２倍超である場合、抗体は陽性であった。免疫前血清のバックグラウンド吸光度は、０．１〜０．３に到達し得る。
【０１４９】
結論：
本明細書に記載されるすべての実験に対して、選択される抗体希釈は、１：１０００であった。
【０１５０】
抗体を使用することによる試料中のペプチドの検出（ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡアッセイの手順は以下のとおりであった。
【０１５１】
標準曲線及び試料を３回実施した。Ｔ１４、Ｐｅｐ４、Ｔ１５、及びアミロイドの検出の場合、各々を８ナノモル濃度でＥＬＩＳＡに使用した。一方で、モチーフ決定実験の場合、ペプチド変異体の各々を、１つの濃度の１００ｎＭのみで使用した。ラット脳試料上のＴ１４の検出の場合、タンパク質の異なる希釈を使用した。ヒトホモジネート試料の値に起因して、これらを１：１６０の希釈のみで使用した。脳組織内のＴ１４ペプチドの決定に関する標準曲線、及び脳組織試料を、ＰＢＳ緩衝液中に希釈した。標準曲線は、８〜１００ｎＭのＴ１４の範囲であった。つまり、９６ウェルイムノプレート（ＮＵＮＣ）を、１００μＬ／ウェルの試料または標準Ｔ１４でコーティングし、パラフィルムで被覆して、４℃で一晩インキュベートした。翌日、この試料を、水を流したシンク上でプレートをはじくことによって除去し、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水、及びＴｗｅｅｎ２０（ＴＢＳ−Ｔ）中に２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する２００μＬのブロッキング溶液を付加し、室温で４時間インキュベートした。次いでブロッキング溶液を除去し、ブロッキング溶液中に１μｇ／ｍＬまで希釈した１００μＬの抗体を付加し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、一次抗体を除去し、ウェルを３回、２００μＬのＴＢＳ−Ｔで洗浄した。その後、ブロッキング溶液中に０．１μｇ／ｍＬまで希釈した１００μＬの二次抗体を付加し、室温で２時間インキュベートした。すべてのインキュベーションの間、プレートをパラフィルムで被覆した。２時間後、プレートを４回、ＴＢＳ−Ｔで洗浄した。３，３，５，５−テトラメチルベンジジンの付加が、発色反応を開始した。この反応を、１５〜３０分後に、２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を含有する停止溶液で停止させ、吸光度を、Ｖｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）において４５０ｎｍで測定した。
【０１５２】
ＡＣｈＥ活性に関するエルマンアッセイ
ＡＣｈＥ活性は、ＡＣｈＥ活性の結果としてのチオール基の存在を測定するエルマン試薬を使用して測定した。Ｇ４実験の場合、ＡＣｈＥ（Ｇ４）を単独で、またはＮＢＰ−１４と組み合わせて、またはガランタミンと組み合わせてアッセイした。細胞生存性アッセイに関する実験の前日に細胞を播種した。細胞を、異なる濃度のＮＢＰ−１４（０．１〜１００μＭ）及びＴ３０、Ｔ１４、ならびにＡβ１０μＭ単独で、またはＮＢＰ−１４（０．１及び０．７μＭ）と組み合わせて処理した。処理後、各処理の上澄（灌流液）を収集し、各条件の２５μＬを、新たな平底９６ウェルプレートに付加し、続いて１７５μＬのエルマン試薬を付加した（溶液Ａ：ＫＨ２ＰＯ４  １３９ｍＭ、及びＫ２ＨＰＯ４  ７９．６６ｍＭ、ｐＨ７．０；溶液Ｂ（基質）：ヨウ化アセチルチオコリン  １１．５ｍＭ；溶液Ｃ（試薬）：５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）８ｍＭ、及びＮａＨＣＯ３  １５ｍＭ）。エルマン試薬は、３つの溶液の混合物として、３３（Ａ）：３（Ｂ）：４（Ｃ）の比率で調製した。吸光度測定値は、４０５ｎｍにおいて、実験を通して規則的な間隔（３、１０、３０、及び６０分）で記録した。
【０１５３】
脳ホモジネートの調製（ラット及びヒト）
試料は、以下のように調製した。脳試料を計量した後、ダウンス内に配置し、脳物質１ｍｇ当たり１．５μＬのＰＢＳを付加した。ダウンスの底部にある脳試料を、「ルースな」プランジャーを使用して少なくとも１０回、ダウンスの底部に至るまでプランジすることによって均質化した。「タイトな」プランジャーを使用して材料をさらに均質化し、最低１０回の完全プランジを確実にした。均質化した試料を、２ｍＬのエッペンドルフに収集し、４℃で冷蔵した遠心分離器内で、１３，０００ｇで１５分間遠心分離した。一旦遠心分離が終了すると、懸濁液を、調製した０．５ｍＬの３０ＫＤａ  ＭＷＣＯフィルターに収集した。これらの試料を、１３，０００ｇで３０分間遠心分離し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＲｏｃｈｅコンプリートＰＩＣ０４６９３１１６００１）を濾過物に付加した。これを、Ｔ１４ペプチドに関するＥＬＩＳＡに使用した。未濾過の試料残余分（＞３０ｋＤａ）を、フィルターを反転させることによって、別個の微量遠心分離管に収集し、これを使用し、ピアースアッセイを使用して、初期試料のタンパク質濃度を決定した（下記のとおり）。
【０１５４】
タンパク質定量
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  ６６０ｎｍタンパク質アッセイは、ウシ血清アルブミンのタンパク質標準物と比較して、（Ａ６６０ｎｍ）総タンパク質濃度を速やかに測定するための既製の洗剤及び還元剤適合性アッセイ試薬である。このアッセイの場合、ＰＢＳ中に１：１０で希釈した１０μＬの各ヒト脳ホモジネート試料を、マイクロタイター９６ウェルプレートに付加し、続いて１５０μＬのピアースアッセイを付加した。５分のインキュベーション後、吸光度を、Ｖｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）内で、６６０ｎｍで測定し、光学密度の結果を、ＢＳＡの標準曲線に挿入して、１μＬ当たりのミリグラムを得た。
【０１５５】
データの分析
すべての実験に関して、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びＧｒａｐｈＰＡＤ  Ｉｎｓｔａｔ（ＧｒａｐｈＰＡＤ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用するターキー事後検定によって、複数治療群と同じ対照との間の比較を行った。これらの試験は、あらゆる処置手段を、あらゆる他の処置手段と比較し、すなわち、すべての対合比較の組に同時に適用し、２つの手段の差が、許容することが予想される標準誤差より大きい場合を特定する。統計的有意差は、Ｐ値＜０．０５において記録した。グラフを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを使用してプロットした。
【０１５６】
ヒト脳実験の場合、データの分析は、５名の対照及び７名のアルツハイマー患者の値の平均として図に表され、平均の標準誤差には、ベッセル補正を適用する（ｎ−１）。光学密度の読み取り値を各試料中のＴ１４のマイクログラムに変換するために、較正曲線を使用し、外因性Ｔ１４の異なる既知の濃度を、「指数関数モデル」を使用して、それぞれの読み取り値に対してプロットした。最後に値を、総タンパク質に対するＴ１４の含有量に関して標準化した（μｇ／ｍｇ）。
【０１５７】
脳試料の供給源
ラット：Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒからの３５日齢の雄ウィスターラットからの新鮮な均質化した全脳。
【０１５８】
ヒト：Ｔｈｏｍａｓ  Ｗｉｌｌｉｓ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ｃ／ｏ  Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ  Ｍａｒｇａｒｅｔ  Ｅｓｉｒｉ）によって供給された深温凍結組織からの中脳切片。倫理適用は、Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ＮＨＳによって承認され、Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｃｔ、Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  Ｃｏｄｅｓ  ｏｆ  Ｐｒａｃｔｉｓｅ及び死後検査及び組織の使用に関する他の法律に基づいて実施された。具体的に、約５ｍｍのコロナルスライスは、中脳中心灰白質を上に、大脳脚及び黒質を下に有し、背側縫線、赤核、及び第３神経核を含む。
【０１５９】
ウェスタンブロッティング
脳試料の調製
１０名の死後ＡＤ患者及び同年齢対照からの皮質外皮、青斑核、海馬、及びＣＳＦ部分は、寛大にもＰｒｏｆ．Ｍａｒｇａｒｅｔ  Ｅｓｉｒｉ及びＤｒ  Ｇａｂｒｉｅｌｅ  ＤｅＬｕｃａによってＪｏｈｎ  Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｂａｎｋ，Ｏｘｆｏｒｄから寄付された。各脳試料を計量し、デュースに配置した。１μｇの脳物質当たり、ミニＥＤＴＡ遊離プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＲｏｃｈｅコンプリートＰＩＣ０４６９３１１６００１）を含有する２μＬのＰＢＳ（１倍）を、デュースに付加し、最初に「ルースな」プランジャーを使用し、続いて「タイトな」プランジャーを使用して均質化を行った。続いて、試料を１３，０００ｇで３０分間、４℃で回転させ、上澄を採取した。ＣＳＦ試料は調製を必要としなかった。全試料を−８０℃で貯蔵した。
【０１６０】
タンパク質試料濃度の測定
上記試料からのタンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）６６０ｎｍタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。手短に言えば、連続希釈（０〜２ｍｇ／ｍＬ）を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の１０ｍｇ／ｍＬストックから作製した。１０μＬのタンパク質を透明な９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に移すことによって、各ＢＳＡ濃度の３つの複製を調製した。次いで、試料を、３つの濃度（１：１、１：２、１：１０）で希釈し、各濃度の３つの複製を、１０μＬの試料を含有する各複製と共に、同じ９６ウェルプレートに配置した。続いて、１５０μＬのピアース試薬を標準物質及び全試料に付加し、混合物を放置して５分間、優しく振りながらインキュベートした。最後に、プレートを、分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で、６６０ｎｍで読み取った。これらの試料のタンパク質濃度は、ＢＳＡ標準曲線からの傾斜及びｙ切片を使用して決定され、両者はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを介して計算される。
【０１６１】
タンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動
ポリアクリルアミドゲル（ミニＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ  ｓｔａｉｎ  ｆｒｅｅ（商標）ゲル、ＢＩＯ−ＲＡＤ）を、電気泳動タンク（ＢＩＯ−ＲＡＤ、ミニＰＲＯＴＥＡＮテトラシステム）内に入れ、走行緩衝液（２５ｍＭ  ＴＲＩＳベース、ｐＨ８．６、１９２ｍＭグリシン、０．１％  ＳＤＳ）を、ゲル及びタンク貯蔵器（ＢｉｏＲａｄ）に付加した。タンパク質試料を、蒸留水及び４×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（最終濃度：６９．５ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、１．１％  ＬＤＳ、１１．１％（ｗ／ｖ）グリセロール、０．００５％ブロモフェノールブルー、ＢＩＯ−ＲＡＤ）、及び２．５％メルカプトエタノール（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を混合することによって調製した。また、試料相当濃度の外因性Ｔ１４も調製し、これが、外因性Ｔ１４ペプチドを測定するための正の対照として作用した。これらの混合物を、９５℃で５分間加熱した後、氷上で冷却した。試料及び正の対照をゲル中に負荷し、分子量マーカー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ  Ｘｔｒａ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、ＢＩＯ−ＲＡＤ）と共に、３５ｍＶで９０分間電気泳動させた。氷ブロックを、走行タンクの内側に配置して、いかなる過熱も防止した。
【０１６２】
ＰＶＤＦ膜上へのタンパク質試料の移動
濃縮ゲルを切り落とし、分離するゲルをＭｉｎｉ  Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ  Ｃｅｌｌ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）内のＰＶＤＦ移動膜（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の上に移動させた。つまり、ＰＶＤＦ移動膜を、メタノールに１分間浸漬し、続いて蒸留水に２分間浸漬することによって活性化した。続いて、すべての層を移動緩衝液で飽和させた（２０ｍＭ  ＴＲＩＳベースｐＨ８．６、１５４ｍＭグリシン、０．８％  ｗ／ｖ  ＳＤＳ、及び２０％メタノール）。底部から上部の順に、移動スポンジ、ブロッティングペーパー、ゲル、ＰＶＤＦ移動膜、ブロッティングペーパー、移動スポンジからなる移動サンドイッチを、移動カセットの中に配置し、これを移動緩衝液で充填されたＭｉｎｉ  Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ  Ｃｅｌｌに挿入した。最後に、電気泳動移動は、２００ｍＡで９０分間行った。氷ブロックを、移動タンクの内側に配置して、いかなる過熱も防止した。
【０１６３】
ＰＶＤＦ膜の染色
ＢＬＯＴ−Ｆａｓｔｓｔａｉｎ（商標）（Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）を使用して、負荷対照として作用する総タンパク質を染色した（Ｃｏｌｉｎｓら、２０１５）。電気泳動移動の直後に、ＰＶＤＦ移動膜を、希釈したＢＬＯＴ−Ｆａｓｔｓｔａｉｎ（商標）固定剤溶液（１０倍）で２分間、優しく振りながら染色した。次いでこの膜を、希釈したＢＬＯＴ−Ｆａｓｔｓｔａｉｎ（商標）現像液（４倍）で１分間、優しく振りながらインキュベートした。続いて、この膜を４℃の暗所において現像液中で３０分間貯蔵して、タンパク質バンドを最大強度に到達させた。最後に、この膜を冷水で洗浄し、地汚れを排除し、Ｇ  ｂｏｘ（Ｓｙｎｇｅｎｅ）を使用して撮像した。次いでこの膜を、温かい脱イオン水（４０〜４５℃）を使用して脱染し、ブロッキング段階のために準備することができる。
【０１６４】
タンパク質バンドの検出
ＰＶＤＦ移動膜を、５％脱脂粉乳を含有するＴＢＳ（ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水、２０ｍＭ  ＴＲＩＳベースｐＨ７．５、０．５ｍＭ  ＮａＣｌ）中で１時間ブロックし、次いで各々７分間、ＴＴＢＳ（０．０５％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ−２０で補充したＴＢＳ）中で２回洗浄した。この膜を、１％脱脂粉乳を含有するＴＴＢＳ中に希釈した一次抗体を用いて、４℃で一晩インキュベートした（表１）。翌日、一次抗体を除去した。この膜を、各々５分間、ＴＴＢＳ中で３回洗浄し、次いで二次抗体を用いて、室温で１時間インキュベートした。選択される二次抗体は、使用される一次抗体の種類に依存する。それは、１％脱脂粉乳を含有するＴＴＢＳ中に希釈されたＨＲＰ（ａ９３０９、Ｓｉｇｍａ）に複合されたヤギ抗マウス二次抗体（作用濃度：１：１０００）、または１％脱脂粉乳を含有するＴＴＢＳ中に希釈されたＨＲＰ（ａｂ６７２１、ａｂｃａｍ）に複合された抗ウサギ二次抗体（作用濃度：１：５０００）のいずれかであり得る。二次抗体インキュベーション後、膜を５分間、ＴＴＢＳ中で３回洗浄した後、最後に１０分間、ＴＢＳ中で洗浄した。タンパク質バンドを、Ｇ  ｂｏｘ（Ｓｙｎｇｅｎｅ）を使用して検出した。
【０１６５】
【表２】
2018516849.tif 000009
【０１６６】
タンパク質バンドの撮像及びデータ分析
ＰＶＤＦ膜を、Ｇ  ｂｏｘ（Ｓｙｎｇｅｎｅ）内に配置した。焦点及びズーム設定は、確実に膜が画面の中心で最大になるように調整した。Ｃｌａｒｉｔｙ（商標）Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＥＣＬ基質（ＢＩＯ−Ｒａｄ）からのルミノール及びペルオキシド溶液を等量部で混合し、膜に適用した。画像を、暗所において１分間隔で５分間にわたって撮影して、タンパク質バンドのための最適シグナルを得た。それに続いて、この膜を、分子ラダーの画像を得るために、自動設定を使用して白色光に暴露した。次いでブロット画像を、画像Ｊを使用して分析した。等しいサイズのボックスを、各レーンのタンパク質バンドの周りに配置し、タンパク質バンドの強度の測定を可能にした。次いで、バックグラウンドをバンド強度から差し引いて、結果をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ及びＧｒａｐｈｐａｄソフトウェアにおいて分析した。
【０１６７】
再検出のための抗体剥片
ＰＶＤＦ移動膜からのタンパク質シグナルを剥離し、異なるタンパク質に関して再検出することができる。つまり、この膜をマイルドな剥離緩衝液（２００ｍＭグリシン、３．５ｍＭ  ＳＤＳ、１％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ２．２）で２回、各々１０分間にわたって洗浄した。続いてこの膜を、ＰＢＳで２回、各々１０分間洗浄した後、ＴＴＢＳで２回、各々５分間洗浄した。Ｃｌａｒｉｔｙ（商標）Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＥＣＬ基質（ＢＩＯ−Ｒａｄ）を膜に付加し、残留タンパク質シグナルをチェックするために、Ｇ  Ｂｏｘ（Ｓｙｎｇｅｎｅ）を使用して撮像した。残留シグナルが強すぎる場合、次いで剥離プロセス全体を繰り返した。次いでこの膜を、続くブロッキング段階及び一次抗体検出のために準備した（上記を参照されたい）。
【０１６８】
ヒト血清（ＨＳ）の調製
ＨＳを、リーズ大学分子細胞生物学研究所のＰｒｏｆｅｓｓｏｒ  Ｎｉｇｅｌ  Ｈｏｏｐｅｒによって提供された対照及びＡＤ患者の群から採取した。これらの試料は、２００８年にオックスフォード大学薬理学部のＳｕｓａｎ  Ｇｒｅｅｎｆｉｌｅｄチームの一員として勤務していた前博士研究員のＡｍｙ  Ｈａｌｌｉｄａｙにより、分子量カットオフフィ（ＭＷＣＯ）フィルターで濾過された。血清を濾過し、３０ｋＤａ超、３０〜１０ｋＤａ、及び１０ｋＤａ未満の分留に分離した。この研究の場合、３０〜１０ｋＤａ、及び１０ｋＤａ未満の部分を等量で組み換えて、３０ｋＤａ未満のＨＳ中に存在するＴ１４のスペクトルを付与した。
【０１６９】
Ｔ１４ペプチド抗体に関するＥＬＩＳＡ
標準曲線及び試料を、３回実施した。ヒト脳ホモジネート試料を、１：１６０、ヒト血清で希釈した。組織試料中のＴ１４ペプチドの決定のための標準曲線を、ＰＢＳ緩衝液中で希釈した。標準曲線は、８〜１００ｎＭのＴ１４の範囲であった。つまり、９６ウェルイムノプレート（ＮＵＮＣ）を、１００μＬ／ウェルの試料または標準Ｔ１４でコーティングし、パラフィルムで被覆して、４℃で一晩インキュベートした。翌日、この試料を、水を流したシンク上でプレートをはじくことによって除去し、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水、及びＴｗｅｅｎ２０（ＴＢＳ−Ｔ）中に２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する２００μＬのブロッキング溶液を付加し、室温で４時間インキュベートした。次いでブロッキング溶液を除去し、ブロッキング溶液中で１μｇ／ｍＬに希釈した１００μＬの抗体を付加し、４℃で一晩インキュベートした。翌日に一次抗体を除去し、ウェルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ブロッキング溶液中で０．１μｇ／ｍＬに希釈した１００μＬの二次酵素複合抗体を付加し、室温で２時間インキュベートした後、全インキュベーション中にプレートをパラフィルムで被覆した。２時間後、プレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄した。３，３，５，５−テトラメチルベンジジンは、発色反応を開始した。この反応を、３０分後に２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を含有する停止溶液で停止させ、吸光度を、脳ホモジネートの場合はＶｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）において、ヒト血清の場合はＶｅｒｓａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）において、４５０ｎｍで測定した。
【０１７０】
Ｔ１４に対して向けられた抗体によるヒト及びラット脳切片の免疫組織化学染色
１．脳試料を１０％ホルマリン中に固定する。
【０１７１】
２．組織ブロックを脱水し、パラフィン蝋に埋め込む。
【０１７２】
３．６μｍ切片を各パラフィンに埋め込まれた組織ブロックから切り取る。
【０１７３】
４．６０℃で２０分間焼成することによって、各スライド上に組織を溶解する。
【０１７４】
５．スライドをｈｉｓｔｏｃｌｅａｒ内でインキュベートして（３×５分）蝋を溶解する。
【０１７５】
６．段階的エタノール系（１０×浸液  １００％  ＥＴｏＨ、１０×浸液  １００％  ＥＴｏＨ、１０×浸液  １００％  ＥＴｏＨ、１０×浸液  ９０％  ＥＴｏＨ、１０×浸液  ７０％  ＥＴｏＨ）を使用してスライドを水和する。
【０１７６】
７．スライドを、３％過酸化水素中で３０分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ活性を抑制する。
【０１７７】
８．ＥＤＴＡを含有するｐＨ９緩衝液中でスライドをオートクレーブする（１２１℃で１０分間）。
【０１７８】
９．スライドをカセットの上に載せ、シーケンザ（ｓｅｑｕｅｎｚａ）に固定する。
【０１７９】
１０．スライドを、０．０５％  ｔｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳ／Ｔ）を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水で洗浄する（２×５分）。
【０１８０】
１１．一次抗Ｔ１４抗体を１時間適用する。
【０１８１】
１２．スライドをＴＢＳ／Ｔで洗浄する（２×５分）。
【０１８２】
１３．ホースラディッシュペルオキシダーゼに複合された二次抗体を４０分間にわたって適用する（Ｄａｋｏによって提供される、カタログ番号Ｋ５００７）。二次抗体は、Ｔ１４一次抗体の不可変領域を認識する。二次抗体は、その二次抗体に付着した色素原の検出を可能にする反応を触媒する酵素である、ホースラディッシュペルオキシダーゼに複合され、これがＴ１４一次抗体に結合される。したがって、これは、脳切片における免疫標識されたＴ１４の検出を可能にする。
【０１８３】
１４．スライドをＴＢＳ／Ｔで洗浄する（２×５分）。
【０１８４】
１５．Ｉｍｐａｃｔ  ＶＩＰペルオキシダーゼ基質を、製造元の指示に概説されるように、平坦に置かれたスライドに１５分間にわたって適用する（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって提供される、カタログ番号ＳＫ−４６０５）。
【０１８５】
１６．スライドをＴＢＳ／Ｔで洗浄する（２×５分）。
【０１８６】
１７．スライドをＤＰＸマウンタントと共に載せる。
【０１８７】
別途指示されない限り、すべてのインキュベーションは、室温で実行した。
【０１８８】
結果
実施例１−ペプチド認識
本発明者らは、ポリクローナル抗体をウサギから単離した。図１〜４は、１：１０００抗体の用量反応、及び異なるペプチド（すなわち、ＰＥＰ４、Ｔ１４、Ｔ３０、及びＴ１５）の指定ナノモル濃度を示す。
【０１８９】
図１に示されるように、抗体は、その合成に使用される抗ペプチド、すなわち、ＰＥＰ４（ＣＡＥＦＨＲＷＳＳＹＭＶＨＷＫ−配列番号７）を特異的に検出する。図２に示されるように、抗体は、Ｔ１４（ＡＥＦＨＲＷＳＳＹＭＶＨＷＫ−配列番号３）にも特異的に結合する。しかしながら、図３及び４に示されるように、抗体は、Ｔ３０（ＫＡＥＦＨＲＷＳＳＹＭＶＨＷＫＮＱＦＤＨＹＳＫＱＤＲＣＳＤＬ−配列番号２）またはＴ１５（ＮＱＦＤＨＹＳＫＱＤＲＣＳＤＬ−配列番号５）には結合しない。これは、検出のための要件が、暴露される特定の末端アミノ酸、及びそれらが獲得する可能な三次構造に基づくことを意味する。
【０１９０】
さらに、図１７に示されるように、抗体は、アミロイドを認識しなかった。これは、前述されるように、抗体による認識が、暴露されるアミノ酸の異なる組み合わせに依存することを意味する。
【０１９１】
したがって、本発明者らは、本発明のポリクローナル抗体の驚くほど高い特異性を示した。
【０１９２】
実施例２−ペプチド結合領域
本発明者らは、一連の異なる線状ペプチドとの結合実験を行うことによって、本発明の抗体の免疫特異性を調査する。抗体の免疫特異性を決定するために使用される線状ペプチドの配列は、表２及び３に示される。
【０１９３】
【表３】
2018516849.tif 000010
【０１９４】
【表４】
2018516849.tif 000011
【０１９５】
図５に示されるように、抗体は、ペプチドを検出することができるように、Ｃ末端における−ＶＨＷＫアミノ酸モチーフまたはエピトープ（すなわち、配列番号６）の存在を具体的に必要とする。モチーフを含有するが、Ｃ末端Ｋアミノ酸を有しないそのようなペプチドは、図６に示されるように、抗体によって認識されない。さらに、−ＶＨＷＫモチーフを含有するが、配列の最後においてではないそのようなペプチドもまた、図６に示されるように、抗体によって認識されない。
【０１９６】
図７〜１０は、異なる１１、１２、１３、及び１４−ｍｅｒ線状ペプチドに対する抗体の結合を表し、必要とされるＣ末端−ＶＨＷＫモチーフを有するものもあれば、それがないものもある。明らかに見ることができるように、ペプチド１１０７、１２０６、１３０５、及び１４０４の各々はすべて、抗体が強力に結合するＣ末端−ＶＨＷＫモチーフを有する。
【０１９７】
実施例３−ＡＣｈＥ認識
図１１に示されるように、抗体は、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ、すなわち、「Ｇ４」）を検出し、図１２〜１４に示されるように、またＡＣｈＥ活性が高濃度の抗体に対して低い場合にのみ著しく、酵素の最終活性に影響を及ぼすことなく、アセチルコリンの加水分解の速度を変更する。脳及び体内のＡＣｈＥ活性が非常に高く、治療法としてのいずれの抗体も、より低い用量範囲内であることを考慮して、酵素活性を低下させることから生じるいかなる副作用も最小限に抑えられ得る。さらに、抗体は、臨床用途の薬物であるガランタミンとは対照的に、およそ１５％、ＡＣｈＥを最大限にブロックし、これが活性をはるかに多く、すなわち５０％阻害する（ＷＯ２０１５／００４４３０を参照されたい）。
【０１９８】
実施例４−ラット及びヒト組織における検出
ラット及びヒト試料で検出を行う場合、試料を３０ＫＤａ  ＭＷＣＯフィルターで濾過し、酵素の検出を妨げるＡＣｈＥ、及び試料中の偽陽性を除去した。結果は、抗体が、両方の試料においてどのようにペプチドを検出するかを示す。図１５は、ラット脳ホモジネートにおける結果を示し、図１６は、対照及びアルツハイマー病（ＡＤ）ヒト脳ホモジネートからの結果を示す。
【０１９９】
考察
抗体の特異性
ポリクローナル抗体は、Ｔ１４ペプチド（決定的に、Ｃ末端配列、−ＶＨＷＫ）に高度に特異的であることが証明された。完全ＡＣｈＥタンパク質のその認識は、この配列が暴露され、三次構造で入手可能であることを示唆する。抗体が、線状Ｔ３０ペプチドフラグメント（その中でＴ１４が起こる）を認識しなかったという事実は、獲得された三次構造の暴露されないＴ３０配列の最後におけるリジン（Ｋ）の不在に起因すると考えられる。
【０２００】
ラット及びヒト脳としての複合試料において検出する能力
これらのデータは、抗体が、驚くべきことに、深温凍結されていたものでも生物組織内で生存可能であること、及びＴ１４様ペプチドが、間接的な証拠のみによって以前に示唆されているように、独立して生化学的実体として存在することを示す（Ｇａｒｃｉａ−Ａｙｌｌｏｎ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ａｌｔｅｒｅｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｐｌａｓｍａ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ５，ｅ８７０１，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００８７０１（２０１０）、Ａｒｅｎｄｔ，Ｔ．，Ｂｒｕｃｋｎｅｒ，Ｍ．Ｋ．，Ｌａｎｇｅ，Ｍ．＆Ｂｉｇｌ，Ｖ．Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｂｕｔｙｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｓｅｍｂｌｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ−−ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｏｒｍｓ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ２１，３８１−３９６（１９９２）。中でも最も特筆すべきことは、対照脳と比較して、ＡＤにおいて有意差が検出され得ることである。
【０２０１】
検出された配列の重要性
これらの発見は、検出可能な配列（すなわち、−ＶＨＷＫエピトープ）、及び特にＣ末端における暴露されたＫ残基が、診断ツールとして、ならびに細胞毒性部分に結合される場合、抗体自体の可能な使用を含めて、治療介入のための標的として使用され得ることを示唆する。後者の適用は、抗体が、ＡＣｈＥ酵素反応の速度を低減し得るが、ＡＣｈＥに対する触媒速度は非常に高いため、閾値を超え得るという発見によって制限され得、なぜガランタミン及びアリセプトなどの薬物が、それにもかかわらず依然として臨床用途にあるかを実際に説明する。
【０２０２】
実施例５−ウェスタンブロット（ＷＢ）によって示される、ＣＳＦにおけるＴ１４の検出
本発明の抗体を使用して、本発明者らは次に、脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＴ１４フィブリル及びＡβを比較した。本発明者らは、Ｔ１４が、フィブリルを形成するため、ウェスタンブロッティングによって５０ＫＤａバンドとして検出されることを発見した。これは、Ｔ１４ウェスタンブロットシグナルの増加によって示されるように、経時的に集合する外因性Ｔ１４によるさらなる証拠である（図２１Ａを参照されたい）。
【０２０３】
次に図１８を参照すると、ＣＳＦ中のＴ１４フィブリルは、ウェスタンブロッティングを使用してこれまでに試験したＡＤ症例１０件のうち８件（８０％）において増加する。全１０症例がプールされた場合、この増加は、対照と比較して、ＡＤ患者において約２４％である（ｐ＜０．０００１、図１９Ｃを参照されたい）。興味深いことに、全１０ＡＤ症例がプールされた場合、対照とＡＤ患者との間でＣＳＦにおけるＡβレベルの変化はなかった（図１９Ｄを参照されたい）。見られるように、Ｔ１４及びＡβレベルは、対照患者のＣＳＦ中のレベルに相当する。しかしながら、驚くべきことに、Ｔ１４レベルは、ＡＤ患者において増加したが、Ａβレベルは、変わらないままである（図２０Ｄを参照されたい）。したがって、本発明者らは、ＣＳＦ中のＴ１４が、Ａβよりも良好かつ頑強なＡＤ診断バイオマーカーであり、疾患の早期検出に使用され得ることを明らかに示した。
【０２０４】
次いで本発明者らは、Ｔ１４フィブリル及びＡβを、ＣＳＦと３つの脳領域（皮質外皮、青斑核、及び海馬）との間で比較した。本発明者らは、Ｔ１４レベルが、対照及びＡＤ患者の両方に関して試験した３つの脳領域と比較して、ＣＳＦ中で高いことを示し、Ｔ１４が、ＣＳＦ中に放出され、そこで集合することを示唆する（図２０Ａ及び２０Ｂを参照されたい）。対照的に、本発明者らは、Ａβレベルが、対照患者の場合、ＣＳＦと比較して３つの脳領域（皮質外皮、青斑核、及び海馬）においてより高いこと（図２０Ｃを参照されたい）、及び対照患者の場合、皮質外皮、青斑核、及びＣＳＦの間でＡβレベルに有意差がないこと（図２０Ｄを参照されたい）を観察した。また、Ａβレベルは、ＡＤ患者の場合、ＣＳＦよりも海馬においてより低い（図２０Ｄを参照されたい）。
【０２０５】
したがって、ＣＳＦ中のアミロイドが、Ｔ１４ほど一貫してＡＤを反映しないことは明らかである。Ｔ１４レベルは、脳組織内よりもＣＳＦ中ではるかに高く、Ｔ１４が、脳組織内で、アミロイドと同様に、集合するのではなく長距離のシグナル伝達のために遊離分子として主に放出されることを示唆する。したがって、Ｔ１４は、ＡＤ内のアミロイドよりもはるかに良好なバイオマーカーであり、Ｔ１４は、パーキンソン病ならびにアルツハイマー病の高感度指標として明らかに可能性がある。
【０２０６】
ゆえに、本発明の抗体を明らかに使用して、試験した脳領域内、ならびにＣＳＦ中のＴ１４を検出することができ、Ｔ１４レベルが上昇するため、検出がより容易である。
【０２０７】
実施例６−脳試料中のＴ１４モノマーに関するＥＬＩＳＡデータ
実施例５から引き続き、本発明者らは、次にＴ１４のＣ末端に特異的なポリクローナル抗体を使用して、追加の脳試料中のＴ１４モノマーを検出した。本発明者らは、脳皮質及び海馬内のＴ１４レベルを比較した。これらの試料を、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯフィルターを使用して濾過し、ＡＣｈＥ及びアルブミンなどのより大きなタンパク質を排除し、それによりバックグラウンドシグナルを低減する。
【０２０８】
図２２に示されるように、本発明者らは、対照及びＡＤ患者の４つの同年齢ペアを比較する研究において、Ｔ１４レベルが、ＡＤ脳の皮質及び海馬の両方において著しく上昇する（タンパク質１ｍｇ当たり）ことを見出した。本発明者らは、したがって、Ｔ１４が、アルツハイマー病における損傷と関連することが周知されている脳領域において増加することを示した。
【０２０９】
実施例７−対照及びＡＤヒト血清中のＴ１４のレベルを比較する
実施例５及び６から明らかであるが、Ｔ１４は、本発明の抗体を使用して脳及びＣＳＦにおいて容易に検出することができ、生きている患者から脳及びＣＳＦ試料を得ることは、高度に侵襲的かつ危険な行為である。したがって、本発明者らは、長期間にわたって−８０℃で貯蔵されたヒト血清（ＨＳ）試料中のＴ１４を検出するために、抗体を使用する可能性について調査した。この研究のねらいは、これらの試料を使用して、処理され得るより新鮮なＨＳ試料と共に使用するために、ＥＬＩＳＡを最適化することである。これらの試料は、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯフィルターを使用して濾過され、ＡＣｈＥ及びアルブミンなどのより大きなタンパク質が排除されており、それによりバックグラウンドシグナルを低減する。
【０２１０】
図２３を参照すると、対照及びＡＤ患者ＨＳの１２同年齢ペアのパイロット研究は、驚くべきことに、抗体を使用して、濾過したヒト血清中のＴ１４を検出することが可能であることを明らかにした。さらに、Ｔ１４は、対照と比較した場合、ＡＤにおいて上昇する。したがって、このデータは、ＨＳ中のＴ１４を検出することが可能であり、そのため、簡単な非侵襲的診断ツールとして使用することができ、神経変性障害を有するか、または有することが疑われる患者からＣＳＦ（または脳）試料を得ることが好ましいことを示す。
【０２１１】
実施例８−免疫組織化学
図２４を参照すると、免疫組織化学による進行したアルツハイマー病におけるグローバルニューロンに存在するＴ１４の第１の可視化が示される。示されるこの特定領域は、パーキンソン病において典型的に脆弱であるため、２つの変性疾患が、毒性Ｔ１４に基づいて共通の機序を共有するという理論を支持する。
【０２１２】
実施例９−抗Ｔ１４抗体によるヒト中脳切片の免疫組織化学染色
図２５を参照すると、対照及び重度のアルツハイマー病（ＡＤ）試料における中脳の黒質のＴ１４免疫組織が、４０倍及び２００倍の拡大で示される。重度のＡＤにおける細胞外Ｔ１４免疫標識された沈着物（矢印）は、対照及びＡＤにおける典型的なドーパミン作動性ニューロン細胞質Ｔ１４免疫染色パターン（矢頭）と同様に示される。一連のＴ１４ニューロン細胞質染色パターンが、視野内で捕捉される。図に見られるように、Ｔ１４は、ＡＤ試料の細胞から放出されるが（矢印）、対照では放出されない。ＡＤ細胞からのＴ１４放出または分泌は、瀕死のニューロンからの漏出に起因すると考えられる。Ｔ１４の細胞外沈着物は、暗色メラニン、すなわちドーパミンと癒合すると思われる。
【図１】
2018516849.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2018516849.tif 000027
【図１７】
2018516849.tif 000028
【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
2018516849.tif 000031
【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2018516849.tif 000039
2018516849.tif 000040
2018516849.tif 000041
2018516849.tif 000042