(57)【要約】本開示は、同時に、個別に、または逐次的に使用する、組成物および組み合わせに関する。上記組成物および組み合わせは、（ａ）サイトカインおよびカルボキシルエステラーゼ酵素を発現する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと、好ましくは、（ｂ）癌用コドラッグとを含む。本開示はまた、癌の治療のためのそれらの使用に関連する。
2018526450.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカインおよびカルボキシルエステラーゼ酵素を発現する腫瘍溶解性合成ワクシニアウイルスであって、活性型のチミジンキナーゼを発現しない腫瘍溶解性合成ワクシニアウイルスを含む組成物。
【請求項２】
上記カルボキシルエステラーゼ酵素は、Ｃ末端保持配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
上記Ｃ末端保持配列はＨＴＥＬ（配列番号１）である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
上記カルボキシルエステラーゼ酵素は、Ｃ末端保持配列を含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
上記カルボキシルエステラーゼ酵素はＣＥＳ２、好ましくは、ヒトＣＥＳ２（ｈＣＥＳ２）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
上記カルボキシルエステラーゼ酵素の発現は、後初期ＶＡＣＶｐ７．５プロモーター、ワクシニア改変Ｈ５（ｍＨ５）プロモーター、ワクシニア短縮合成初後期ｐＳプロモーター、ｐＣ１１Ｒプロモーター、ｐＦ１１Ｌプロモーター、ｐｓＦＪ１−１０合成初期プロモーター、ｐＨｙｂ合成初期プロモーター、任意の未改変ワクシニア初期プロモーター、および、後初期最適化（ＬＥＯ）プロモーターの制御下にある、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
上記サイトカインは、インターフェロン−ベータ−１（好ましくは、ヒトインターフェロン−ベータ−１）、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４  ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、および、ＣＸＣＲ４からなる群から選ばれる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
上記サイトカインは、インターフェロン−ベータ−１（好ましくは、ヒトインターフェロン−ベータ−１）である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
上記サイトカインの発現は、後初期ＶＡＣＶｐ７．５プロモーター、ワクシニア改変Ｈ５（ｍＨ５）プロモーター、ワクシニア短縮合成初後期ｐＳプロモーター、ｐＣ１１Ｒプロモーター、ｐＦ１１Ｌプロモーター、ｐｓＦＪ１−１０合成初期プロモーター、ｐＨｙｂ合成初期プロモーター、任意の未改変ワクシニア初期プロモーター、および、後初期最適化（ＬＥＯ）プロモーターの制御下にある、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
上記ワクシニアウイルスは、Wyeth株、Copenhagen株、Western Reserve株、または、Lister株である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
上記ワクシニアウイルスは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（好ましくは、ヒトＧＭ−ＣＳＦ）、シトシンデアミナーゼタンパク質、および、ソマトスタチン受容体２型タンパク質のうち１つ以上を発現する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
上記ワクシニアウイルスは、活性型のワクシニア成長因子（ＶＧＦ）遺伝子を発現しない、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
上記ワクシニアウイルスはWestern Reserve株であり、上記カルボキシルエステラーゼはＣ末端保持配列を有するヒトＣＥＳ２酵素であり、上記サイトカインはヒトインターフェロン−ベータ−１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
上記Ａ３４Ｒ遺伝子は、Ｋ１５１Ｅ変異を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
上記組成物は、１×１０６〜１×１０１２プラーク形成単位（ｐｆｕ）、好ましくは、１×１０７〜１×１０１０ｐｆｕを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
能動的塞栓術に適した、生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
上記生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質は、分解性デンプン、ポリビニルアルコール、ゼラチンフォームおよびスルホン化ポリビニルアルコールヒドロゲルからなる群より選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
上記生体適合性微粒子物質の微粒子の大きさは、１００μｍ〜２０００μｍ、１５０μｍ〜３５０μｍ、１５０μｍ〜２００μｍ、２００μｍ〜２５０μｍ、２５０μｍ〜３００μｍ、または３００μｍ〜３５０μｍである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
上記生体適合性微粒子物質の個々の粒子は、約０μｍ〜約１００μｍ、約０μｍ〜約５０μｍ、または約０μｍ〜約２５μｍの範囲で大きさが異なっている、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
上記生体適合性微粒子物質の個々の粒子は、直径の平均差が、１００μｍ以下、約５０μｍ以下、約２５μｍ以下、約１０μｍ以下、または約５μｍ以下である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
上記生体適合性微粒子物質の個々の粒子は、１０〜２００μｍの粒子または１０〜１００μｍの粒子の凝集体である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
上記親水性高分子ゲル物質は、１０〜２００μｍの粒子または１０〜１００μｍの粒子を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
上記生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質は、一時的な塞栓物質または永久的な塞栓物質である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
哺乳動物の癌を治療する方法であって、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組成物を有効量、当該哺乳動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項２５】
上記癌は、結腸直腸癌、肺癌、黒色腫、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、または肝臓癌である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
上記哺乳動物はヒトである、請求項２４〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
上記癌は、１つ以上の化学療法薬を用いた治療に対して難治性、および／または、１つ以上の抗体を用いた治療に対して難治性である、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
上記癌は、トポイソメラーゼ阻害剤を用いた治療、好ましくは、イリノテカンを用いた治療に対して難治性である、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
上記癌は黒色腫である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
上記癌は、フルオロピリミジンおよびオキサリプラチンを含む治療に対して難治性、および／または、セツキシマブおよび／またはパニツムマブを含む治療に対して難治性である、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
上記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを、１回以上の投与量で、１×１０６〜１×１０１２プラーク形成単位（ｐｆｕ）、好ましくは１×１０７〜１×１０１０ｐｆｕ、腫瘍内投与または静脈内投与する、請求項２４〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
１つ以上の追加の抗癌剤、好ましくは、５−フルオロウラシル（ＦＵ）、フォリン酸（ＦＡ）、メトトレキサート、カペシタビン、オキサリプラチン、ベバシズマブ、セツキシマブ、およびそれらの任意の組み合わせから選ばれる１つ以上の追加の抗癌剤を、上記哺乳動物に投与する工程を更に含む、請求項２４〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
（ａ）上記腫瘍溶解性合成ワクシニアウイルスを含む上記組成物は、（ｂ）癌用コドラッグを更に含む有効量の組み合わせの一部である、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
上記癌用コドラッグは、トポイソメラーゼ阻害剤である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
上記トポイソメラーゼ阻害剤は、イリノテカンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
上記癌用コドラッグは、活性化可能な癌用コドラッグである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
上記活性化可能な癌用コドラッグは、トポイソメラーゼ阻害剤、パクリタクセル−２−エチルカーボネート（パクリタクセルに変換される）、カペシタビン（５’−デオキシ−５−フルオロシチジン（５−ＦＵ）に変換される）、および既存の化学療法薬の任意の第３級アミドメチルエステルプロドラッグから選ばれる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
相乗作用をもたらす有効量の（ａ）および（ｂ）を投与する、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
逐次的に、同時に、または個別に（ａ）および（ｂ）を投与する、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
（ａ）および（ｂ）を、同じ製剤で、上記哺乳動物に同時投与する、請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
（ａ）および（ｂ）を、異なる製剤で、上記哺乳動物に同時投与する、請求項３３〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
（ａ）および（ｂ）を同じ経路で上記哺乳動物に投与する、好ましくは、（ａ）および（ｂ）の両方を静脈内投与する、請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの初回投与を、癌用コドラッグの初回投与の前に行う、請求項３３〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
投与量１２０〜２５０ｍｇ／ｍ２の上記癌用コドラッグを１週間おきに投与する、
好ましくは、上記癌用コドラッグはイリノテカンであり、投与量約１８０ｍｇ／ｍ２の当該イリノテカンを１週間おきに投与する、請求項３３〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
上記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを毎週または１週間おきに投与し、
上記癌用コドラッグを１週間おきに投与し、好ましくは、上記癌用コドラッグの投与を、上記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの第２週目の投与の１〜３日後に開始する、請求項３３〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
上記組成物の上記投与は、上記組成物を哺乳動物の血管系に導入する工程を含み、上記組成物は、能動的塞栓術に適した上記生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質を含む、請求項２４〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔関連出願の相互参照〕
本願は、２０１５年９月８日に出願された米国仮特許出願第６２／２１５，６５１号の利益を主張するものであり、該米国仮特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、概して、サイトカインおよびカルボキシルエステラーゼ酵素を発現するよう改変された腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、好ましくは活性型のチミジンキナーゼを発現しない腫瘍溶解性ワクシニアウイルスに関連する、組成物および方法に関する。上記組成物および方法は、任意構成で、癌用コドラッグ、好ましくはトポイソメラーゼ阻害剤を併用する。
【背景技術】
【０００３】
正常組織のホメオスタシスは、高度に調節された細胞増殖および細胞死のプロセスである。細胞増殖または細胞死の不均衡は、癌状態に発展し得る。例えば、子宮頸癌、腎臓癌、肺癌、膵臓癌、結腸直腸癌および脳腫瘍は、結果として生じ得る数多くの癌のうちのほんの一例に過ぎない。事実、癌の発生は高く、米国だけでも、１年につき５０万人以上が癌により死亡している。
【０００４】
現在、一般的な癌型の治療について効果的な選択肢はほとんどない。特定の個人に対する治療方針は、診断、疾病の進行段階、および、患者の年齢、性別、総体的な健康などの要素によって決まる。癌治療の最も常套的な選択肢は、外科手術、放射線療法、および化学療法である。化学療法には、生活の質に悪影響を与え得る相当な毒性が付き物である。外科手術は、癌の診断および治療において中心的役割を果たす。通常、外科的アプローチは、生体組織検査に必要であり、また、癌腫を取り除くために必要である。しかしながら、癌が転移し、広範囲に及んでいると、外科手術によって治癒する可能性が低く、代替アプローチを採らなければならない。癌患者の寿命を伸ばし、生活の質を改善するために、新しい薬剤および療法が必要とされている。
【０００５】
複製選択的腫瘍溶解性ウイルスにより、癌の治療が期待できる。これらのウイルスは、複製に直接依存する腫瘍溶解効果により、腫瘍細胞の死をもたらし得る。加えて、ウイルスは、宿主内において、細胞媒介性の抗腫瘍免疫を増強させることができる。これらのウイルスは、また、腫瘍内において治療導入遺伝子を発現して、抗腫瘍効果が向上するよう設計することができる。しかしながら、この治療アプローチにも大きな制限がある。
【０００６】
したがって、癌を治療するためのさらなる療法が必要とされている。免疫応答を増強させ、化学療法効果を高める要素を発現する腫瘍溶解性ウイルスの使用は、潜在的な発展領域である。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書に開示された組成物、組み合わせ、および方法のある態様は、本明細書に開示された、サイトカインおよびカルボキシルエステラーゼ酵素を発現するよう改変された腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによる、逐次的かつ集学的な標的腫瘍殺傷効果に基づく。好ましい実施形態では、逐次的かつ集学的な治療によって、既存の療法が改善され、腫瘍がより効果的に小さくなる。腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの選択性は、サイトカインおよびカルボキシルエステラーゼ酵素の発現が腫瘍環境に大きく限定されることを意味する。腫瘍溶解性ワクシニアウイルスまたはインターフェロン−ベータ−１などのサイトカインを単独で投与するよりも、該腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと該サイトカインとを併用する方が、いずれも、より効果的に腫瘍塊を小さくするよう働く。ウイルス媒介性細胞溶解の後、ウイルスのゲノムから発現したカルボキシルエステラーゼ酵素は、局所腫瘍環境に放出され、主に該局所腫瘍環境内において癌用コドラッグを活性型に理想的に変換する。これにより、局所的に高い濃度で活性型の薬剤の形態が存在するようになる。このメカニズムによって、ウイルス媒介性細胞溶解およびサイトカインによる複合的な縮小効果を経ても除去されずに腫瘍に残存している癌細胞を、効果的に治療するために必要な癌用コドラッグの投与量を、潜在的に少なくする（そのため、安全にする）ことができる。これらの複合効果は、これら３つのうちいずれか１つ単独よりも、より徹底的かつ効果的に集学的な腫瘍殺傷をもたらす。最後に、それぞれが異なる様態で作用するので、さらなる治療に対して耐性を示す癌細胞を選抜する可能性を減らすことができる。
【０００８】
本発明の一態様は、サイトカインおよびカルボキシルエステラーゼ酵素を発現する腫瘍溶解性合成ワクシニアウイルスであって、活性型のチミジンキナーゼを発現しない腫瘍溶解性合成ワクシニアウイルスを含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、上記カルボキシルエステラーゼ酵素は、Ｃ末端保持配列を含む。いくつかの実施形態では、上記Ｃ末端保持配列はＨＴＥＬ（配列番号１）である。いくつかの実施形態では、上記カルボキシルエステラーゼ酵素は、Ｃ末端保持配列を含まない。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記カルボキシルエステラーゼ酵素はＣＥＳ２、好ましくは、ヒトＣＥＳ２（ｈＣＥＳ２）である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記カルボキシルエステラーゼ酵素の発現は、後初期ＶＡＣＶｐ７．５プロモーター、ワクシニア改変Ｈ５（ｍＨ５）プロモーター、ワクシニア短縮合成初後期ｐＳプロモーター、ｐＣ１１Ｒプロモーター、ｐＦ１１Ｌプロモーター、ｐｓＦＪ１−１０合成初期プロモーター、ｐＨｙｂ合成初期プロモーター、任意の未改変ワクシニア初期プロモーター、および、後初期最適化（Late-Early Optimized；ＬＥＯ）プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記サイトカインは、インターフェロン−ベータ−１（好ましくは、ヒトインターフェロン−ベータ−１）、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４  ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、および、ＣＸＣＲ４からなる群から選ばれる。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記サイトカインはインターフェロン−ベータ−１（好ましくはヒトインターフェロン−ベータ−１）である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記サイトカインの発現は、後初期ＶＡＣＶｐ７．５プロモーター、ワクシニア改変Ｈ５（ｍＨ５）プロモーター、ワクシニア短縮合成初後期ｐＳプロモーター、ｐＣ１１Ｒプロモーター、ｐＦ１１Ｌプロモーター、ｐｓＦＪ１−１０合成初期プロモーター、ｐＨｙｂ合成初期プロモーター、任意の未改変ワクシニア初期プロモーター、および、後初期最適化（ＬＥＯ）プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記ワクシニアウイルスは、Wyeth株、Copenhagen株、Western Reserve株、または、Lister株である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記ワクシニアウイルスは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（好ましくは、ヒトＧＭ−ＣＳＦ）、シトシンデアミナーゼタンパク質、および、ソマトスタチン受容体２型タンパク質のうち１つ以上を発現する。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記ワクシニアウイルスは、活性型のワクシニア成長因子（ＶＧＦ）遺伝子を発現しない。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記組成物は、１×１０６〜１×１０１２プラーク形成単位（ｐｆｕ）、好ましくは、１×１０７〜１×１０１０ｐｆｕを含む。いくつかの実施形態では、上記ワクシニアウイルスはWestern Reserve株であり、上記カルボキシルエステラーゼはＣ末端保持配列を有するヒトＣＥＳ２酵素であり、上記サイトカインはヒトインターフェロン−ベータ−１である。いくつかの実施形態では、上記Ａ３４Ｒ遺伝子は、Ｋ１５１Ｅ変異を含む。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記組成物は、能動的塞栓術に適した、生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質をさらに含む。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質は、分解性デンプン、ポリビニルアルコール、ゼラチンフォームおよびスルホン化ポリビニルアルコールヒドロゲルからなる群より選択される。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質の微粒子の大きさは、１００μｍ〜２０００μｍ、１５０μｍ〜３５０μｍ、１５０μｍ〜２００μｍ、２００μｍ〜２５０μｍ、２５０μｍ〜３００μｍ、または３００μｍ〜３５０μｍである。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質の個々の粒子は、約０μｍ〜約１００μｍ、約０μｍ〜約５０μｍ、または約０μｍ〜約２５μｍの範囲で大きさが異なっている。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質の個々の粒子は、直径の平均差が、１００μｍ以下、約５０μｍ以下、約２５μｍ以下、約１０μｍ以下、または約５μｍ以下である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質の個々の粒子は、１０〜２００μｍの粒子または１０〜１００μｍの粒子の凝集体である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記親水性高分子ゲル物質は、１０〜２００μｍの粒子または１０〜１００μｍの粒子を含む。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質は、一時的な塞栓物質または永久的な塞栓物質である。
【０００９】
本発明の他の態様は、哺乳動物の癌を治療する方法であって、サイトカインおよびカルボキシルエステラーゼ酵素を発現する腫瘍溶解性合成ワクシニアウイルスであって、活性型のチミジンキナーゼを発現しない腫瘍溶解性合成ワクシニアウイルスを含む組成物を有効量、当該哺乳動物に投与する工程を含む方法を含む。いくつかの実施形態では、上記カルボキシルエステラーゼ酵素は、Ｃ末端保持配列を含む。いくつかの実施形態では、上記Ｃ末端保持配列はＨＴＥＬ（配列番号１）である。いくつかの実施形態では、上記カルボキシルエステラーゼ酵素は、Ｃ末端保持配列を含まない。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記カルボキシルエステラーゼ酵素はＣＥＳ２、好ましくは、ヒトＣＥＳ２（ｈＣＥＳ２）である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記カルボキシルエステラーゼ酵素の発現は、後初期ＶＡＣＶｐ７．５プロモーター、ワクシニア改変Ｈ５（ｍＨ５）プロモーター、ワクシニア短縮合成初後期ｐＳプロモーター、ｐＣ１１Ｒプロモーター、ｐＦ１１Ｌプロモーター、ｐｓＦＪ１−１０合成初期プロモーター、ｐＨｙｂ合成初期プロモーター、任意の未改変ワクシニア初期プロモーター、および、後初期最適化（ＬＥＯ）プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記サイトカインは、インターフェロン−ベータ−１（好ましくは、ヒトインターフェロン−ベータ−１）、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８，ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４  ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、および、ＣＸＣＲ４からなる群から選ばれる。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記サイトカインはインターフェロン−ベータ−１（好ましくはヒトインターフェロン−ベータ−１）である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記サイトカインの発現は、後初期ＶＡＣＶｐ７．５プロモーター、ワクシニア改変Ｈ５（ｍＨ５）プロモーター、ワクシニア短縮合成初後期ｐＳプロモーター、ｐＣ１１Ｒプロモーター、ｐＦ１１Ｌプロモーター、ｐｓＦＪ１−１０合成初期プロモーター、ｐＨｙｂ合成初期プロモーター、任意の未改変ワクシニア初期プロモーター、および、後初期最適化（ＬＥＯ）プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記ワクシニアウイルスは、Wyeth株、Copenhagen株、Western Reserve株、または、Lister株である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記ワクシニアウイルスは、顆粒球マクロ��ァージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（好ましくは、ヒトＧＭ−ＣＳＦ）、シトシンデアミナーゼタンパク質、および、ソマトスタチン受容体２型タンパク質のうち１つ以上を発現する。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記ワクシニアウイルスは、活性型のワクシニア成長因子（ＶＧＦ）遺伝子を発現しない。いくつかの実施形態では、上記ワクシニアウイルスはWestern Reserve株であり、上記カルボキシルエステラーゼはＣ末端保持配列を有するヒトＣＥＳ２酵素であり、上記サイトカインはヒトインターフェロン−ベータ−１である。いくつかの実施形態では、上記Ａ３４Ｒ遺伝子は、Ｋ１５１Ｅ変異を含む。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記組成物は、１×１０６〜１×１０１２プラーク形成単位（ｐｆｕ）、好ましくは、１×１０７〜１×１０１０ｐｆｕを含む。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記方法は、能動的塞栓術に適した、生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質をさらに含む。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質は、分解性デンプン、ポリビニルアルコール、ゼラチンフォームおよびスルホン化ポリビニルアルコールヒドロゲルからなる群より選択される。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質の微粒子の大きさは、１００μｍ〜２０００μｍ、１５０μｍ〜３５０μｍ、１５０μｍ〜２００μｍ、２００μｍ〜２５０μｍ、２５０μｍ〜３００μｍ、または３００μｍ〜３５０μｍである。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質の個々の粒子は、約０μｍ〜約１００μｍ、約０μｍ〜約５０μｍ、または約０μｍ〜約２５μｍの範囲で大きさが異なっている。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質の個々の粒子は、直径の平均差が、１００μｍ以下、約５０μｍ以下、約２５μｍ以下、約１０μｍ以下、または約５μｍ以下である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質の個々の粒子は、１０〜２００μｍの粒子または１０〜１００μｍの粒子の凝集体である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記親水性高分子ゲル物質は、１０〜２００μｍの粒子または１０〜１００μｍの粒子を含む。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質は、一時的な塞栓物質または永久的な塞栓物質である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記癌は、結腸直腸癌、肺癌、黒色腫、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、または肝臓癌である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記癌は、１つ以上の化学療法薬を用いた治療に対して難治性、および／または、１つ以上の抗体を用いた治療に対して難治性である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記癌は、トポイソメラーゼ阻害剤を用いた治療、好ましくは、イリノテカンを用いた治療に対して難治性である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記癌は黒色腫である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記癌は、フルオロピリミジンおよびオキサリプラチンを含む治療に対して難治性、および／または、セツキシマブおよび／またはパニツムマブを含む治療に対して難治性である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを、１回以上の投与量で、１×１０６〜１×１０１２プラーク形成単位（ｐｆｕ）、好ましくは１×１０７〜１×１０１０ｐｆｕ、腫瘍内投与または静脈内投与する。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記方法は、１つ以上の追加の抗癌剤、好ましくは、５−フルオロウラシル（ＦＵ）、フォリン酸（ＦＡ）、メトトレキサート、カペシタビン、オキサリプラチン、ベバシズマブ、セツキシマブ、およびそれらの任意の組み合わせから選ばれる１つ以上の追加の抗癌剤を、上記哺乳動物に投与する工程を更に含む。
【００１０】
本発明の他の態様は、哺乳動物の癌を治療する方法であって、（ａ）サイトカインおよびカルボキシルエステラーゼ酵素を発現する腫瘍溶解性合成ワクシニアウイルスであって、活性型のチミジンキナーゼを発現しない腫瘍溶解性合成ワクシニアウイルスを含む組成物と、（ｂ）癌用コドラッグとを含む組み合わせを有効量、当該哺乳動物に投与する工程を含む方法を含む。いくつかの実施形態では、上記癌用コドラッグは、トポイソメラーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、上記癌用コドラッグは、活性化可能な癌用コドラッグである。いくつかの実施形態では、上記活性化可能な癌用コドラッグは、トポイソメラーゼ阻害剤、パクリタクセル−２−エチルカーボネート（パクリタクセルに変換される）、カペシタビン（５’−デオキシ−５−フルオロシチジン（５−ＦＵ）に変換される）、および既存の化学療法薬の任意の第３級アミドメチルエステルプロドラッグから選ばれる。いくつかの実施形態では、上記カルボキシルエステラーゼ酵素は、Ｃ末端保持配列を含む。いくつかの実施形態では、上記Ｃ末端保持配列はＨＴＥＬ（配列番号１）である。いくつかの実施形態では、上記カルボキシルエステラーゼ酵素は、Ｃ末端保持配列を含まない。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記カルボキシルエステラーゼ酵素はＣＥＳ２、好ましくは、ヒトＣＥＳ２（ｈＣＥＳ２）である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記カルボキシルエステラーゼ酵素の発現は、後初期ＶＡＣＶｐ７．５プロモーター、ワクシニア改変Ｈ５（ｍＨ５）プロモーター、ワクシニア短縮合成初後期ｐＳプロモーター、ｐＣ１１Ｒプロモーター、ｐＦ１１Ｌプロモーター、ｐｓＦＪ１−１０合成初期プロモーター、ｐＨｙｂ合成初期プロモーター、任意の未改変ワクシニア初期プロモーター、および、後初期最適化（ＬＥＯ）プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記サイトカインは、インターフェロン−ベータ−１（好ましくは、ヒトインターフェロン−ベータ−１）、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８，ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４  ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、および、ＣＸＣＲ４からなる群から選ばれる。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記サイトカインはインターフェロン−ベータ−１（好ましくはヒトインターフェロン−ベータ−１）である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記サイトカインの発現は、後初期ＶＡＣＶｐ７．５プロモーター、ワクシニア改変Ｈ５（ｍＨ５）プロモーター、ワクシニア短縮合成初後期ｐＳプロモーター、ｐＣ１１Ｒプロモーター、ｐＦ１１Ｌプロモ��ター、ｐｓＦＪ１−１０合成初期プロモーター、ｐＨｙｂ合成初期プロモーター、任意の未改変ワクシニア初期プロモーター、および、後初期最適化（ＬＥＯ）プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記ワクシニアウイルスは、Wyeth株、Copenhagen株、Western Reserve株、または、Lister株である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記ワクシニアウイルスは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（好ましくは、ヒトＧＭ−ＣＳＦ）、シトシンデアミナーゼタンパク質、および、ソマトスタチン受容体２型タンパク質のうち１つ以上を発現する。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記ワクシニアウイルスは、活性型のワクシニア成長因子（ＶＧＦ）遺伝子を発現しない。いくつかの実施形態では、上記ワクシニアウイルスはWestern Reserve株であり、上記カルボキシルエステラーゼはＣ末端保持配列を有するヒトＣＥＳ２酵素であり、上記サイトカインはヒトインターフェロン−ベータ−１である。いくつかの実施形態では、上記Ａ３４Ｒ遺伝子は、Ｋ１５１Ｅ変異を含む。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記組成物は、１×１０６〜１×１０１２プラーク形成単位（ｐｆｕ）、好ましくは、１×１０７〜１×１０１０ｐｆｕを含む。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記方法は、能動的塞栓術に適した、生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質をさらに含む。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質は、分解性デンプン、ポリビニルアルコール、ゼラチンフォームおよびスルホン化ポリビニルアルコールヒドロゲルからなる群より選択される。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質の微粒子の大きさは、１００μｍ〜２０００μｍ、１５０μｍ〜３５０μｍ、１５０μｍ〜２００μｍ、２００μｍ〜２５０μｍ、２５０μｍ〜３００μｍ、または３００μｍ〜３５０μｍである。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質の個々の粒子は、約０μｍ〜約１００μｍ、約０μｍ〜約５０μｍ、または約０μｍ〜約２５μｍの範囲で大きさが異なっている。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質の個々の粒子は、直径の平均差が、１００μｍ以下、約５０μｍ以下、約２５μｍ以下、約１０μｍ以下、または約５μｍ以下である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のう��任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質の個々の粒子は、１０〜２００μｍの粒子または１０〜１００μｍの粒子の凝集体である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記親水性高分子ゲル物質は、１０〜２００μｍの粒子または１０〜１００μｍの粒子を含む。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質は、一時的な塞栓物質または永久的な塞栓物質である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記癌は、結腸直腸癌、肺癌、黒色腫、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、または肝臓癌である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記癌は、１つ以上の化学療法薬を用いた治療に対して難治性、および／または、１つ以上の抗体を用いた治療に対して難治性である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記癌は、トポイソメラーゼ阻害剤を用いた治療、好ましくは、イリノテカンを用いた治療に対して難治性である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記癌は黒色腫である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記癌は、フルオロピリミジンおよびオキサリプラチンを含む治療に対して難治性、および／または、セツキシマブおよび／またはパニツムマブを含む治療に対して難治性である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを、１回以上の投与量で、１×１０６〜１×１０１２プラーク形成単位（ｐｆｕ）、好ましくは１×１０７〜１×１０１０ｐｆｕ、腫瘍内投与または静脈内投与する。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記方法は、１つ以上の追加の抗癌剤、好ましくは、５−フルオロウラシル（ＦＵ）、フォリン酸（ＦＡ）、メトトレキサート、カペシタビン、オキサリプラチン、ベバシズマブ、セツキシマブ、およびそれらの任意の組み合わせから選ばれる１つ以上の追加の抗癌剤を、上記哺乳動物に投与する工程を更に含む。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、相乗作用をもたらす有効量の（ａ）および（ｂ）を投与する。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形���では、上記コドラッグは、カンプトテシン類似体であり、好ましくは、トポテカンおよびイリノテカンから選ばれ、より好ましくは、イリノテカンである。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、逐次的に、同時に、または個別に（ａ）および（ｂ）を投与する。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、（ａ）および（ｂ）を、同じ製剤で、上記哺乳動物に同時投与する。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、（ａ）および（ｂ）を、異なる製剤で、上記哺乳動物に同時投与する。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、（ａ）および（ｂ）を同じ経路で上記哺乳動物に投与し、好ましくは、（ａ）および（ｂ）の両方を静脈内投与する。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの初回投与を、癌用コドラッグの初回投与の前に行う。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、１２０〜２５０ｍｇ／ｍ２の上記癌用コドラッグを１週間おきに投与し；好ましくは、上記癌用コドラッグはイリノテカンであり、約１８０ｍｇ／ｍ２の当該イリノテカンを１週間おきに投与する。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを毎週または１週間おきに投与し、上記癌用コドラッグを１週間おきに投与し；好ましくは、上記癌用コドラッグの投与を、上記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの第２週目の投与の１〜３日後に開始する。
【００１１】
本発明の他の態様は、哺乳動物の癌を治療する方法であって、（i）サイトカインおよびカルボキシルエステラーゼ酵素を発現する腫瘍溶解性合成ワクシニアウイルスであって、活性型のチミジンキナーゼを発現しない腫瘍溶解性合成ワクシニアウイルスと、（ii）能動的塞栓術に適した生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質と、を含む組成物を当該哺乳動物の血管系に導入する工程を含む方法を含む。いくつかの実施形態では、上記カルボキシルエステラーゼ酵素は、Ｃ末端保持配列を含む。いくつかの実施形態では、上記Ｃ末端保持配列はＨＴＥＬ（配列番号１）である。いくつかの実施形態では、上記カルボキシルエステラーゼ酵素は、Ｃ末端保持配列を含まない。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記カルボキシルエステラーゼ酵素はＣＥＳ２、好ましくは、ヒトＣＥＳ２（ｈＣＥＳ２）である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記カルボキシルエステラーゼ酵素の発現は、後初期ＶＡＣＶｐ７．５プロモーター、ワクシニア改変Ｈ５（ｍＨ５）プロモーター、ワクシニア短縮合成初後期ｐＳプロモーター、ｐＣ１１Ｒプロモーター、ｐＦ１１Ｌプロモーター、ｐｓＦＪ１−１０合成初期プロモーター、ｐＨｙｂ合成初期プロモーター、任意の未改変ワクシニア初期プロモーター、および、後初期最適化（ＬＥＯ）プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記サイトカインは、インターフェロン−ベータ−１（好ましくは、ヒトインターフェロン−ベータ−１）、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４  ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、および、ＣＸＣＲ４からなる群から選ばれる。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記サイトカインはインターフェロン−ベータ−１（好ましくはヒトインターフェロン−ベータ−１）である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記サイトカインの発現は、後初期ＶＡＣＶｐ７．５プロモーター、ワクシニア改変Ｈ５（ｍＨ５）プロモーター、ワクシニア短縮合成初後期ｐＳプロモーター、ｐＣ１１Ｒプロモーター、ｐＦ１１Ｌプロモーター、ｐｓＦＪ１−１０合成初期プロモーター、ｐＨｙｂ合成初期プロモーター、任意の未改変ワクシニア初期プロモーター、および、後初期最適化（ＬＥＯ）プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記ワクシニアウイルスは、Wyeth株、Copenhagen株、Western Reserve株、または、Lister株である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合��せることが可能であり、これらの実施形態では、上記ワクシニアウイルスは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（好ましくは、ヒトＧＭ−ＣＳＦ）、シトシンデアミナーゼタンパク質、および、ソマトスタチン受容体２型タンパク質のうち１つ以上を発現する。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記ワクシニアウイルスは、活性型のワクシニア成長因子（ＶＧＦ）遺伝子を発現しない。いくつかの実施形態では、上記ワクシニアウイルスはWestern Reserve株であり、上記カルボキシルエステラーゼはＣ末端保持配列を有するヒトＣＥＳ２酵素であり、上記サイトカインはヒトインターフェロン−ベータ−１である。いくつかの実施形態では、上記Ａ３４Ｒ遺伝子は、Ｋ１５１Ｅ変異を含む。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記組成物は、１×１０６〜１×１０１２プラーク形成単位（ｐｆｕ）、好ましくは、１×１０７〜１×１０１０ｐｆｕを含む。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記方法は、能動的塞栓術に適した、生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質をさらに含む。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質は、分解性デンプン、ポリビニルアルコール、ゼラチンフォームおよびスルホン化ポリビニルアルコールヒドロゲルからなる群より選択される。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質の微粒子の大きさは、１００μｍ〜２０００μｍ、１５０μｍ〜３５０μｍ、１５０μｍ〜２００μｍ、２００μｍ〜２５０μｍ、２５０μｍ〜３００μｍ、または３００μｍ〜３５０μｍである。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質の個々の粒子は、約０μｍ〜約１００μｍ、約０μｍ〜約５０μｍ、または約０μｍ〜約２５μｍの範囲で大きさが異なっている。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質の個々の粒子は、直径の平均差が、１００μｍ以下、約５０μｍ以下、約２５μｍ以下、約１０μｍ以下、または約５μｍ以下である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質の個々の粒子は、１０〜２００μｍの粒子または１０〜１００μｍの粒子の凝集体である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記親水性高分子ゲル物質は、１０〜２００μｍの粒子または１０〜１００μｍの粒子を含む。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質は、一時的な塞栓物質または永久的な塞栓物質である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記癌は、結腸直腸癌、肺癌、黒色腫、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、または肝臓癌である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記癌は、１つ以上の化学療法薬を用いた治療に対して難治性、および／または、１つ以上の抗体を用いた治療に対して難治性である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記癌は、トポイソメラーゼ阻害剤を用いた治療、好ましくは、イリノテカンを用いた治療に対して難治性である。いくつかの実施形態では、上記癌は黒色腫である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記癌は、フルオロピリミジンおよびオキサリプラチンを含む治療に対して難治性、および／または、セツキシマブおよび／またはパニツムマブを含む治療に対して難治性である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを、１回以上の投与量で、１×１０６〜１×１０１２プラーク形成単位（ｐｆｕ）、好ましくは１×１０７〜１×１０１０ｐｆｕ、腫瘍内投与または静脈内投与する。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記方法は、１つ以上の追加の抗癌剤、好ましくは、５−フルオロウラシル（ＦＵ）、フォリン酸（ＦＡ）、メトトレキサート、カペシタビン、オキサリプラチン、ベバシズマブ、セツキシマブ、およびそれらの任意の組み合わせから選ばれる１つ以上の追加の抗癌剤を、上記哺乳動物に投与する工程を更に含む。
【００１２】
本発明の他の態様は、哺乳動物の癌を治療する方法であって、（ａ）サイトカインおよびカルボキシルエステラーゼ酵素を発現する腫瘍溶解性合成ワクシニアウイルスであって、活性型のチミジンキナーゼを発現しない腫瘍溶解性合成ワクシニアウイルスと、能動的塞栓術に適した生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質と、を含む組成物を当該哺乳動物の血管系に導入する工程と、（ｂ）有効量の癌用コドラッグを含む組成物を当該哺乳動物に投与する工程と、を含む方法を含む。いくつかの実施形態では、上記癌用コドラッグは、トポイソメラーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、上記癌用コドラッグは、活性化可能な癌用コドラッグである。いくつかの実施形態では、上記癌用コドラッグは、トポイソメラーゼ阻害剤、パクリタクセル−２−エチルカーボネート（パクリタクセルに変換される）、カペシタビン（５’−デオキシ−５−フルオロシチジン（５−ＦＵ）に変換される）、および既存の化学療法薬の任意の第３級アミドメチルエステルプロドラッグなどの（ただし、これらに限定されない）、カルボキシルエステラーゼによって活性化可能な任意の抗癌剤である。いくつかの実施形態では、上記カルボキシルエステラーゼ酵素は、Ｃ末端保持配列を含む。いくつかの実施形態では、上記Ｃ末端保持配列はＨＴＥＬ（配列番号１）である。いくつかの実施形態では、上記カルボキシルエステラーゼ酵素は、Ｃ末端保持配列を含まない。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記カルボキシルエステラーゼ酵素はＣＥＳ２、好ましくは、ヒトＣＥＳ２（ｈＣＥＳ２）である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記カルボキシルエステラーゼ酵素の発現は、後初期ＶＡＣＶｐ７．５プロモーター、ワクシニア改変Ｈ５（ｍＨ５）プロモーター、ワクシニア短縮合成初後期ｐＳプロモーター、ｐＣ１１Ｒプロモーター、ｐＦ１１Ｌプロモーター、ｐｓＦＪ１−１０合成初期プロモーター、ｐＨｙｂ合成初期プロモーター、任意の未改変ワクシニア初期プロモーター、および、後初期最適化（ＬＥＯ）プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記サイトカインは、インターフェロン−ベータ−１（好ましくは、ヒトインターフェロン−ベータ−１）、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４  ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、および、ＣＸＣＲ４からなる群から選ばれる。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記サイトカインはインターフェロン−ベータ−１（好ましくはヒトインターフェロン−ベータ−１）である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、��記サイトカインの発現は、後初期ＶＡＣＶｐ７．５プロモーター、ワクシニア改変Ｈ５（ｍＨ５）プロモーター、ワクシニア短縮合成初後期ｐＳプロモーター、ｐＣ１１Ｒプロモーター、ｐＦ１１Ｌプロモーター、ｐｓＦＪ１−１０合成初期プロモーター、ｐＨｙｂ合成初期プロモーター、任意の未改変ワクシニア初期プロモーター、および、後初期最適化（ＬＥＯ）プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記ワクシニアウイルスは、Wyeth株、Copenhagen株、Western Reserve株、または、Lister株である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記ワクシニアウイルスは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（好ましくは、ヒトＧＭ−ＣＳＦ）、シトシンデアミナーゼタンパク質、および、ソマトスタチン受容体２型タンパク質のうち１つ以上を発現する。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記ワクシニアウイルスは、活性型のワクシニア成長因子（ＶＧＦ）遺伝子を発現しない。いくつかの実施形態では、上記ワクシニアウイルスはWestern Reserve株であり、上記カルボキシルエステラーゼはＣ末端保持配列を有するヒトＣＥＳ２酵素であり、上記サイトカインはヒトインターフェロン−ベータ−１である。いくつかの実施形態では、上記Ａ３４Ｒ遺伝子は、Ｋ１５１Ｅ変異を含む。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記組成物は、１×１０６〜１×１０１２プラーク形成単位（ｐｆｕ）、好ましくは、１×１０７〜１×１０１０ｐｆｕを含む。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記方法は、能動的塞栓術に適した、生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質をさらに含む。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質は、分解性デンプン、ポリビニルアルコール、ゼラチンフォームおよびスルホン化ポリビニルアルコールヒドロゲルからなる群より選択される。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質の微粒子の大きさは、１００μｍ〜２０００μｍ、１５０μｍ〜３５０μｍ、１５０μｍ〜２００μｍ、２００μｍ〜２５０μｍ、２５０μｍ〜３００μｍ、または３００μｍ〜３５０μｍである。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質の個々の粒子は、約０μｍ〜約１００μｍ、約０μｍ〜約５０μｍ、または約０μｍ〜約２５μｍの範囲で大きさが異なっている。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質の個々の粒子は、直径の平均差が、１００μｍ以下、約５０μｍ以下、約２５μｍ以下、約１０μｍ以下、または約５μｍ以下である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質の個々の粒子は、１０〜２００μｍの粒子または１０〜１００μｍの粒子の凝集体である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記親水性高分子ゲル物質は、１０〜２００μｍの粒子または１０〜１００μｍの粒子を含む。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質は、一時的な塞栓物質または永久的な塞栓物質である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記癌は、結腸直腸癌、肺癌、黒色腫、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、または肝臓癌である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記癌は、１つ以上の化学療法薬を用いた治療に対して難治性、および／または、１つ以上の抗体を用いた治療に対して難治性である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記癌は、トポイソメラーゼ阻害剤を用いた治療、好ましくは、イリノテカンを用いた治療に対して難治性である。いくつかの実施形態では、上記癌は黒色腫である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記癌は、フルオロピリミジンおよびオキサリプラチンを含む治療に対して難治性、および／または、セツキシマブおよび／またはパニツムマブを含む治療に対して難治性である。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを、１回以上の投与量で、１×１０６〜１×１０１２プラーク形成単位（ｐｆｕ）、好ましくは１×１０７〜１×１０１０ｐｆｕ、腫瘍内投与または静脈内投与する。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記方法は、１つ以上の追加の抗癌剤、好ましくは、５−フルオロウラシル（ＦＵ）、フォリン酸（ＦＡ）、メトトレキサート、カペシタビン、オキサリプラチン、ベバシズマブ、セツキシマブ、およびそれらの任意の組み合わせから選ばれる１つ以上の追加の抗癌剤を、上記哺乳動物に投与する工程を更に含む。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、相乗作用をもたらす有効量の（ａ）および（ｂ）を投与する。いくつ���の実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記コドラッグは、カンプトテシン類似体であり、好ましくは、トポテカンおよびイリノテカンから選ばれ、より好ましくは、イリノテカンである。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、逐次的に、同時に、または個別に（ａ）および（ｂ）を投与する。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、（ａ）および（ｂ）を、同じ製剤で、上記哺乳動物に同時投与する。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、（ａ）および（ｂ）を、異なる製剤で、上記哺乳動物に同時投与する。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、（ａ）および（ｂ）を同じ経路で上記哺乳動物に投与し、好ましくは、（ａ）および（ｂ）の両方を静脈内投与する。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの初回投与を、癌用コドラッグの初回投与の前に行う。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、１２０〜２５０ｍｇ／ｍ２の上記癌用コドラッグを１週間おきに投与し；好ましくは、上記癌用コドラッグはイリノテカンであり、約１８０ｍｇ／ｍ２の当該イリノテカンを１週間おきに投与する。いくつかの実施形態は、先行する実施形態のうち任意の実施形態と組み合わせることが可能であり、これらの実施形態では、上記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを毎週または１週間おきに投与し、上記癌用コドラッグを１週間おきに投与し；好ましくは、上記癌用コドラッグの投与を、上記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの第２週目の投与の１〜３日後に開始する。
【００１３】
本開示の他の実施形態については、本願全体にわたって説明する。本開示のある態様について説明している実施形態は、本開示の他の態様にも適用され、逆もまた同様である。実施例の項目における実施形態は、本開示の全ての態様に適用可能な、本開示の実施形態であると理解される。
【００１４】
特許請求の範囲および／または明細書で用いられる場合、「阻害する（inhibiting）」、「減らす（reducing）」、「阻止（prevention）」との用語、またはこれらの変化形は、望ましい結果をもたらす、測定可能な減少または完全な阻害を含む。
【００１５】
本明細書で用いる「組み合わせ（combination）」との用語は、抗癌剤（すなわち、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス）および癌用コドラッグの併用投与を意味する。これらの抗がん剤および癌用コドラッグは、（i）独立して投与することもできるし、（ii）異なる量の組み合わせ相手の量が異なっている、様々な固定された組み合わせを用いて投与することもできる。つまり、同じ時点で投与することも、異なる時点で投与することもできる。「組み合わせ（combination）」との用語は、また、「キット（kit）」を定義する。この場合、当該キットは、組み合わせ相手を含む。この組み合わせ相手は、例えば、（i）同時に投与することもできるし、（ii）時間をずらして投与することもできる（すなわち、異なる時点において、時間的に等間隔または様々な間隔で、当該キットの任意のパーツについて、時間をずらして投与することもできる）。好ましくは、時間間隔は、薬剤の組み合わせが相乗効果を示すよう、選択される。本明細書で用いる「相乗作用の（synergistic）」または「相乗作用（synergy）」との用語は、この開示に含まれる抗癌剤の組み合わせによって得られる効果が、単剤療法として抗癌剤（すなわち、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス）を用いることによりもたらされる効果と、単剤療法として癌用コドラッグを用いることによりもたらされる効果の和よりも大きいことを意味する。このような相乗作用は、好都合なことに、同じ投与量でより大きな効果をもたらす、および／または、多剤耐性の形成を阻止あるいは遅延させる。
【００１６】
「癌用コドラッグ（cancer co-drug）」との用語は、（i）カルボキシルエステラーゼによって活性化可能な任意の抗癌剤、および、（ii）任意のトポイソメラーゼを含む。トポイソメラーゼ阻害剤は、遊離形態または薬学的に許容される塩の形態の、トポイソメラーゼＩ阻害剤およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤を含む。トポイソメラーゼＩ阻害剤としては、限定はされないが、例えば、ＣＰＴ−１１としても知られているイリノテカン（例えば、イリノテカン塩酸塩）；トポテカン（例えば、トポテカン塩酸塩）、ギマテカン（ＬＢＱ７０７としても知られている）、カンプトテシンおよびその誘導体、９−ニトロカンプトテシンおよびカンプトテシン共役ＰＮＵ−１６６１４８（ＷＯ９９／１７８０４の化合物Ａ１）；１０−ヒドロキシカンプトテシン酢酸塩；エトポシド；イダルビシン塩酸塩；テニポシド；ドキソルビシン；エピルビシン塩酸塩；ミトキサントロン塩酸塩；ドキサゾリジンのｐ−アミノベンジルカルバメートのペンチルカルバメート（ＰＰＤ）；およびダウノルビシン塩酸塩、が挙げられる。イリノテカンは、例えば、CAMPTOSAR（商標）などとして販売されている形態で、投与することができる。トポテカンは、例えば、HYCAMTIN（商標）などとして販売されている形態で、投与することができる。トポイソメラーゼＩＩ阻害剤としは、限定はされないが、例えば、CAELYX（商標）などのドキソルビシン（リポソーム製剤を含む）、DAUNOSOME（商標）などのダウノルビシン（リポソーム製剤を含む）、エピルビシン、イダルビシン、ネモルビシンなどのアントラサイクリン；ミトキサントロン、ロソキサントロンなどのアントラキノン；エトポシド、テニポシドなどのポドフィロトキシン、が挙げられる。エトポシドはETOPOPHOS（商標）として販売されており；テニポシドはVM 26-BRISTOL（商標）として販売されており；ドキソルビシンはADRIBLASTIN（商標）またはADRIAMYCIN（商標）として販売されており；エピルビシンはFARMORUBICIN（商標）として販売されており；イダルビシンはZAVEDOS（商標）として販売されており；ミトキサントロンはNOVANTRON（商標）として販売されている。トポイソメラーゼ阻害剤に加えて、カルボキシルエステラーゼによって活性化される他の抗癌剤も使用することができる。当該他の抗癌剤としては、パクリタクセル−２−エチルカーボネート（パクリタクセルに変換される）、カペシタビン（５’−デオキシ−５−フルオロシチジン（５−ＦＵ）に変換される）、および、一般に、既存の化学療法薬の任意の第３級アミドメチルエステルプロドラッグ（カルボン酸の形態またはアミンの形態に変換される）、が挙げられる。
【００１７】
「活性化可能な癌用コドラッグ（activatable cancer co-drug）」との用語は、カルボキシルエステラーゼによって活性型に転換される、任意の抗癌剤（イリノテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤を含む）を含む。例えば、カルボキシルエステラーゼは、トポイソメラーゼまたは抗癌剤の原物質から、活性を有する代謝物への変換を触媒する。
【００１８】
本明細書において、「難治性癌（refractory cancer）」との用語は、（i）抗腫瘍薬治療に対して好ましい反応を示さない癌、または、（ii）抗腫瘍薬治療に対して好ましい反応を示した後、再発もしくは再燃する癌を指す。従って、本明細書において、「治療に対して難治性である癌（a cancer refractory to a treatment）」は、（i）治療に対して好ましい反応を示さない癌、（ii）治療に対して耐性を示す癌、または、（iii）治療に対して好ましい反応を示した後、再発もしくは再燃する癌を意味する。例えば、このような前治療は、イリノテカンを含む化学療法レジメンであり得る。
【００１９】
特許請求の範囲および／または明細書において「含む（comprising）」との用語とともに用いられる場合、単語「a」または「an」は、「１つ」を意味し得るが、「１つ以上（one or more）」「少なくとも１つ（at least one）」および「１つまたは複数（one or more than one）」も意味し得る。
【００２０】
本明細書において説明するいずれの実施形態も、本開示の任意の方法、組成物、または組み合わせについて実施することができ、逆もまた同様であることが意図される。さらに、本開示の組成物、組み合わせ、およびキットは、本開示の方法を達成するために用いることができる。
【００２１】
本出願にわたって、「約（about）」との用語は、値が誤差の標準偏差を含むことを示すために用いられる。この誤差の標準偏差とは、当該値の測定に利用されている装置または方法に関する、誤差の標準偏差である。
【００２２】
特許請求の範囲における「または（or）」との用語は、代替物のみを指すことが明示的に示されていない限り、または、代替物が相互排他的でない限り、「および／または（and/or）」を意味するために用いられる。しかし本開示は、代替物および「および／または（and/or）」のみを指す定義を支持する。
【００２３】
本明細書および特許請求の範囲で用いられる単語「含む（comprising）（および、compriseやcomprisesなどのcomprisingの任意の語形）」、「有する（having）（および、haveやhasなどのhavingの任意の語形）」、「含む（including）（および、includesやincludeなどのincludingの任意の語形）」または「含有する（containing）（および、containsやcontainなどのcontainingの任意の語形）」は、包括的または非制限的な単語であり、追加の、記載されていない要素または方法の工程を排除するものではない。
【００２４】
本開示の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、この詳細な説明から、本開示の趣旨および範囲内における種々の変更および改変が、当業者にとって明らかになるであろう。それゆえ、詳細な説明および具体例は、本開示の特定の実施形態を示す一方で、例示のためにのみ与えられていることを理解されたい。
【００２５】
本件特許または本件出願のファイルは、少なくとも１つのカラーで作成された図面を含む。カラー図面を含む本件特許または本件特許出願公報のコピーは、要求に応じて、必要な手数料を支払えば、当局により提供されるであろう。
【００２６】
以下の図面は本明細書の一部を成し、本開示のある態様をさらに説明するために含まれる。本明細書に示されている特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうち１つ以上を参照することにより、本開示をよりよく理解することができるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、ｈＩＦＮｂレポーター細胞アッセイによる、様々なＳＪ−８１５ウイルスクローンにおける機能性インターフェロンタンパク質の検出を示す。
【図１Ｂ】上記に記載の通り。
【図１Ｃ】図１Ｃおよび１Ｄは、ｐ−ＮＰＡアッセイによる、ＳＪ−８１５ウイルスの様々な単離集団におけるカルボキシルエステラーゼ機能の検出を示す。ｐＮＰＡアッセイ用緩衝液を添加した５分後に４０５ｎｍで測定した吸光度から、０分に測定した吸光度を差し引くことで、活性単位を計算した。
【図１Ｄ】上記に記載の通り。
【図２】図２は、インターフェロン導入遺伝子の両側を特異的に標的とするプライマーの使用を説明する、遺伝子地図を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、６ウェルプレートに播種し、播種から２４時間後に表示のウイルスに感染させた、Ｕ−２  ＯＳ細胞のプラーク像を示す。７２時間後に、当該細胞をクリスタルバイオレットで着色した。
【図３Ｂ】図３Ｂは、６ウェルプレートに播種し、ＷＲまたはＳＪ−８１５に感染させた、Ｕ−２  ＯＳ細胞およびＢＳ−Ｃ−１細胞を示す。プラークを図３Ａと同様に着色した。各代表実験につき、１つの像を示している。
【図４Ａ】図４Ａは、ヒト膵臓癌細胞株およびヒト子宮頸癌細胞株における、ＳＪ−８１５のＥＣ５０（ｐｆｕ／細胞）を示す。膵臓癌細胞株およびＨｅＬａ細胞を、ＳＪ−８１５、または、対照ウイルス（ＷＲ．Ａ３４Ｒ．ＴＫ−；「ＴＫ−」と表示）のいずれかを用いて、様々な感染多重度で処置した。ＣＣＫ−８による感染から４８時間後における、細胞生存率を評価した。ＥＣ５０を求めて、プロットした。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ヒト膵臓癌細胞およびヒト子宮頸癌細胞における、ＳＪ−８１５の複製を示す。膵臓癌細胞株およびＨｅＬａ細胞を、１ＰＦＵ／細胞で、ＳＪ−８１５またはＷＲ．Ａ３４Ｒ．ＴＫ−に感染させた。感染から４８時間後に、当該細胞を回収した。そして、各癌細胞において産生された感染性ウイルスを、Ｕ−２  ＯＳ細胞でプラークアッセイを行うことによって、測定した。１つの代表的実験から得られたデータを示す（３回同じ方法で繰り返した）。
【図５Ａ】図５Ａは、ヒト結腸癌細胞株における、ＳＪ−８１５のＥＣ５０（ｐｆｕ／細胞）を示す。結腸癌細胞株を、ＳＪ−８１５、または、対照ウイルス（ＷＲ．Ａ３４Ｒ．ＴＫ−；ＴＫ−と表示）を用いて、様々な感染多重度で処置した。ＣＣＫ−８による感染から４８時間後における、細胞生存率を評価した。ＥＣ５０を求めて、プロットした。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ヒト結腸癌細胞における、ＳＪ−８１５の複製を示す。結腸癌細胞株を、１ＰＦＵ／細胞の多重度で、ＳＪ−８１５またはＷＲ．Ａ３４Ｒ．ＴＫ−に感染させた。感染から４８時間後に、当該細胞を回収した。そして、各膵臓細胞において産生された感染性ウイルスを、Ｕ−２  ＯＳ細胞でプラークアッセイを行うことによって、測定した。１つの代表的実験から得られたデータを示す（３回同じ方法で繰り返した）。
【図６Ａ】図６Ａは、ヒト肝臓癌細胞株における、ＳＪ−８１５のＥＣ５０（ｐｆｕ／細胞）を示す。肝臓癌細胞株を、ＳＪ−８１５、ｍＳＪ−８１５、または対照ウイルス（ＷＲ．Ａ３４Ｒ．ＴＫ−）を用いて、様々な感染多重度で処置した。ＣＣＫ−８による感染から４８時間後における、細胞生存率を評価した。ＥＣ５０を求めて、プロットした。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ヒト肝臓癌細胞における、ＳＪ−８１５の複製を示す。肝臓癌細胞株を、１ＰＦＵ／細胞の多重度で、ＳＪ−８１５、ｍＳＪ−８１５、およびＷＲ．Ａ３４Ｒ．ＴＫ−に感染させた。感染から４８時間後に、当該細胞を回収した。そして、各肝臓細胞において産生された感染性ウイルスを、Ｕ−２  ＯＳ細胞でプラークアッセイを行うことによって、測定した。３回の異なる実験から得られたデータを、３重にして示す。対応のないｔ検定を用いて、当該データを解析した（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１）。
【図７Ａ】図７Ａ〜Ｄは、骨髄腫癌細胞および黒色腫癌細胞の処置において、ウイルスの濃度を高めた後の細胞生存率を示す。骨髄腫癌細胞および黒色腫癌細胞である、ＳＫ−ＭＥＬ  ５（図７Ａ）、ＳＫ−ＭＥＬ  ２（図７Ｂ）、ＲＰＭＩ８２２６（図７Ｃ）、およびＩＭ−９（図７Ｄ）を、ＳＪ−８１５、ｍＳＪ−８１５、または対照ウイルス（ＷＲ．Ａ３４Ｒ．ＴＫ−）を用いて、様々な感染多重度で処置した。ＣＣＫ−８による感染から４８時間後における、細胞生存率を評価した。３回の異なる実験から得られたデータを、３重にして示す。
【図７Ｂ】上記に記載の通り。
【図７Ｃ】上記に記載の通り。
【図７Ｄ】上記に記載の通り。
【図８】図８は、ヒト肝臓癌細胞におけるＳＪ−８１５の複製を示す。骨髄腫癌細胞株および黒色腫癌細胞株を、１ＰＦＵ／細胞の多重度で、ＳＪ−８１５、ｍＳＪ−８１５、およびＷＲ．Ａ３４Ｒ．ＴＫ−に感染させた。感染から４８時間後に、当該細胞を回収した。そして、各細胞株において産生された感染性ウイルスを、Ｕ−２  ＯＳ細胞でプラークアッセイを行うことによって、測定した。３回の異なる実験から得られたデータを、３重にして示す。対応のないｔ検定を用いて、当該データを解析した（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１）。
【図９Ａ】図９Ａ〜Ｆは、マウス癌細胞株の処置において、ウイルスの濃度を高めた後の細胞生存率を示す：ＴＩＢ−７５肝細胞癌（図９Ａ）、ＣＴ−２６結腸癌（図９Ｂ）、Ｂ１６−Ｆ１０皮膚黒色腫（図９Ｃ）、ＭＣ−３８結腸癌（図９Ｄ）、ＲＥＮＣＡ腎細胞癌（図９Ｅ）、および４Ｔ１乳癌（図９Ｆ）を、ｍＳＪ−８１５またはＷＲ．ｍＧＭ−ＣＳＦを用いて、様々な感染多重度で処置した。ＣＣＫ−８による感染から４８時間後における、細胞生存率を評価した。３回の異なる実験から得られたデータを、３重にして示す。
【図９Ｂ】上記に記載の通り。
【図９Ｃ】上記に記載の通り。
【図９Ｄ】上記に記載の通り。
【図９Ｅ】上記に記載の通り。
【図９Ｆ】上記に記載の通り。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＩＶおよびＩＴの経路で、ｍＳＪ−８１５およびＷＲ．ＴＫ−．ｍＧＭＣＳＦウイルスを用いて処置した、ＭＣ−３８結腸癌腫瘍を有するＢ５７ＢＬ／６マウスの生存を示す。各処置レジメンについての、Kaplan-Meier曲線を示す。腫瘍体積が１，５００ｍｍ３に達したとき、動物を致死させた。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、様々な群についての、体重の平均を示す（最初の注入処置から数日間を追跡した）。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ＭＣ−３８腫瘍を有するマウスを、ｍＳＪ−８１５およびＷＲ．ＴＫ−．ｍＧＭＣＳＦで処置し、腫瘍の大きさを、最初の腫瘍の大きさに対する割合で、経時的に示したものである（０日目、３日目、６日目、および９日目）。投与経路はＩＴおよびＩＶであり、対照（ＰＢＳ）と比較した。群の平均を示す（ｎ＝５）。いずれの群も、２１日目、２４日目、および２７日目を除いて、ＰＢＳ（対照）群に対して統計的に有意な差を示さなかった。なお、２１日目、２４日目、および２７日目では、ｍＳＪ−８１５群の腫瘍体積は小さく、ＰＢＳ群に対して統計的に有意であった。２１日目および２４日目についてはＰ＜０．０５であり、２７日目についてはＰ＜０．０１であった。
【図１１】図１１は、（i）ＳＪ−８１５のみを用いて腫瘍内処置を施した（０日目、７日目、および１４日目）、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２腫瘍を有するマウス（投与量を、１×１０５、１×１０６、および１×１０７ＰＦＵと漸増させた）、（ii）イリノテカンのみを用いて静脈内処置を施した（３日目、１０日目、および１７日目）、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２腫瘍を有するマウス、および、（iii）ＳＪ−８１５（１×１０６）とイリノテカンとを用いて併用処置を施した（上記スケジュールの組み合わせ）、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２腫瘍を有するマウスについて、対照（ＰＢＳ）と比較した腫瘍の大きさを、経時間的に示す。群の平均を示す（ｎ＝３）。
【図１２Ａ】図１２Ａは、表示されている各処置レジメンについての、Kaplan-Meier曲線を示す。腫瘍体積が１，５００ｍｍ３に達したとき、動物を致死させた。ログ・ランク（Mantel-Cox）検定によって解析したデータによると、有意な違いが見られた（Ｐ＝０．００２）。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、様々な群についての、体重の平均および体重の標準偏差を示す（最初の注入処置から数日間を追跡した）。
【図１３Ａ】図１３Ａは、様々な濃度および投与量のｍＳＪ−８１５を用いて処置した、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫腫瘍を有するＢ５７ＢＬ／６マウスの、腫瘍の大きさの平均を示す。各群について腫瘍の大きさの平均を計算し、ＳＥＭをプロットした。プロットの傾向の違いは、致死させた動物によるものである。データを一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）で解析し、続いてDunnett多重比較検定および対応のないｔ検定によって解析した。データは、統計的に有意ではなかった（Ｐ＝０．３７５５）。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、処置後１２日目における、各マウスの腫瘍の大きさを示す。一方向ＡＮＯＶＡによれば、データは統計的に有意である（Ｐ＝０．０１１９）。Dunnett多重比較検定によれば、全ての群がＰＢＳ群とは統計的に異なっていた（Ｐ＜０．０５）。
【図１４】図１４は、表示されている各処置レジメンについての、Kaplan-Meier曲線を示す。腫瘍体積が１，５００ｍｍ３に達したとき、動物を致死させた。ログ・ランク（Mantel-Cox）検定によって解析したデータによると、有意な違いが見られた（Ｐ＜０．０００１）。
【図１５Ａ】図１５Ａは、（i）ワクシニアウイルスのみ、（ii）ＣＰＴ−１１のみ、および、（iii）ウイルスとイリノテカンとを併用して処置した、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫腫瘍を有するＢ５７ＢＬ／６マウスの、腫瘍の大きさの平均を示す。１匹の死亡したマウスの腫瘍体積の値は、この図および解析から除いた。各群について腫瘍の大きさの平均を計算し、ＳＥＭをプロットした。対応のないｔ検定によってデータを解析した。９日目および１３日目において、ＰＢＳ（対照群）と、ＷＲ．  Ａ３４Ｒ．ＴＫ−（ＷＲ．ＴＫ−）、ｍＳＪ−８１５、またはウイルスとＣＰＴ−１１とを併用して処置した動物との間で、データは統計的に異なっていた。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、処置後１６日目までにおける、各群の腫瘍の大きさの平均を示す。１匹の死亡したマウスの腫瘍体積の値は、この図および解析から除いた。対応のないｔ検定によれば、データは統計的に有意であった。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、（i）ワクシニアウイルスのみ、（ii）ＣＰＴ−１１のみ、および、（iii）ウイルスとイリノテカンとを併用して処置した、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫腫瘍を有するＢ５７ＢＬ／６マウスの、腫瘍の大きさの平均を示す。表示されたデータは、１匹の死亡したマウスの腫瘍体積の値が含まれていることを除き、図１５Ａに示すデータと同じである。各群の腫瘍の大きさの平均を計算し、ＳＥＭをプロットした。データを対応のないｔ検定によって解析した。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、処置後１６日目までの各群の腫瘍の大きさの平均を示す。表示されたデータは、１匹の死亡したマウスの腫瘍体積値が含まれていることを除き、図１５Ｃに示すデータと同じである。
【図１６】図１６は、（i）ワクシニアウイルス、および（ii）イリノテカンを併用して処置した、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫腫瘍を有するＢ５７ＢＬ／６マウスの様々な群についての、体重の平均および標準偏差を示す。処置後、週に２回マウスを測定した。データを一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）で解析し、続いてDunnett多重比較検定によって解析した。データは、統計的に有意ではなかった（Ｐ＝０．１８４５）。Dunnett多重比較検定では、いずれの群の間で有意な違いはなかった。
【図１７Ａ】図１７Ａ〜Ｄは、ｍＳＪ−８１５を用いて腫瘍内処置または静脈内処置を施した、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫腫瘍を有するＢ５７ＢＬ／６マウスの、肝臓の重量（図１７Ａ）、腎臓の重量（図１７Ｂ）、脳の重量（図１７Ｃ）、および肺の重量（図１７Ｄ）を示す。飼育終了時に臓器を回収して重量を測定し、当該重量を体重で標準化した。
【図１７Ｂ】上記に記載の通り。
【図１７Ｃ】上記に記載の通り。
【図１７Ｄ】上記に記載の通り。
【図１８Ａ】図１８Ａおよび１８Ｂは、ｍＳＪ−８１５を用いて静脈内処置（図１８Ａ）または腫瘍内処置（図１８Ｂ）を施した、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫腫瘍を有するＢ５７ＢＬ／６マウスの、脾臓の重量を示す。飼育終了時に臓器を回収して重量を測定し、当該重量を体重で標準化した。
【図１８Ｂ】上記に記載の通り。
【図１９】図１９は、動物を致死させた日における、腫瘍内、筋肉内、卵巣内、および肝臓内のウイルス価を示す。バーは、平均値の標準偏差（ＳＤ）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書で説明する本開示のある態様は、サイトカインおよびカルボキシルエステラーゼ酵素を発現するように設計した腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによって、癌の治療において予期しない改善がもたらされる（癌用コドラッグを併用した場合においても）、という驚くべき発見に基づく。理論に拘束されるものではないが、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによる、サイトカイン（好ましくはヒトインターフェロンベータ１（ｈＩＦＮｂ１）など）の発現は、抗癌免疫応答を刺激し、癌選択性を向上させる。
【００２９】
本明細書で説明する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと、癌用コドラッグ（好ましくは、活性化可能な癌用コドラッグ）とを用いる併用療法は、癌の治療において予期しない改善をもたらすことが見出された。腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと癌用コドラッグ（特に、活性化可能な癌用コドラッグ）とを同時に、逐次的に、または、個別に投与すると、これらは互いに作用して、一方の成分を単独で投与するよりも、より一層、癌細胞を殺傷する。この予期しない改善によって、各成分の必要投与量を減らすことができ、これにより、副作用が減少し、化合物および治療の臨床効果が向上すると考えられる。イリノテカンなどの癌用コドラッグは、下痢、嘔吐、発汗、腹部痙攣、流涙過剰，鼻漏などの、頻繁かつ重度の胃腸障害を含む、重大な副作用を引き起こし得る。症状の頻度および重篤度は、投与量に依存し、より多くの投与を受けた患者はより重度の症状を示す。よって、本明細書で説明する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと併用した場合には、必要とされる癌用コドラッグの投与量が潜在的に減少するので、臨床的副作用の低下をもたらすであろう。
【００３０】
〔Ｉ．腫瘍溶解性ワクシニアウイルス〕
本開示のある態様は、サイトカインおよびカルボキシルエステラーゼ酵素を発現する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、好ましくは、活性型のチミジンキナーゼを発現しない腫瘍溶解性ワクシニアウイルスに関する。ワクシニアウイルスは、およそ２５０の遺伝子をコードしている線状二本鎖ＤＮＡゲノム（約１９０Ｋｂｐ）を有する、大きく複雑なエンベロープウイルスである。ワクシニアウイルスは、大きさがおよそ３６０ｎｍ×２５０ｎｍの、大きなウイルスである。ワクシニアは、天然痘を撲滅したワクチンとしての役割でよく知られている。天然痘の撲滅後、科学者たちは、生体組織へ遺伝子を送達する道具として、あるいは、生体組織に対するワクチンとして、ワクシニアウイルスの利用を研究してきた（遺伝子療法および遺伝子工学）。
【００３１】
ワクシニアウイルスは、細胞の基底面・側面から選択的に感染するが、その子孫ウイルスは、頂端面から放出される。極性細胞としては、限定はされないが、上皮細胞、内皮細胞、免疫細胞、破骨細胞、ニューロン、および線維芽細胞が挙げられる。
【００３２】
ワクシニアウイルスは、宿主細胞の細胞質においてのみ複製するため、ＤＮＡウイルスの中でも、独特なウイルスである。そのため、ウイルスＤＮＡの複製に必要な種々の酵素およびタンパク質をコードするために、大形態のゲノムが必要とされる。複製中、ワクシニアは、外膜が異なるいくつかの感染形態を産生する。すなわち、細胞内成熟ビリオン（intracellular mature virion；ＩＭＶ）、細胞内エンベロープビリオン（intracellular enveloped virion；ＩＥＶ）、細胞随伴エンベロープビリオン（cell-associated enveloped virion；ＣＥＶ）、および細胞外エンベロープビリオン（extracellular enveloped virion；ＥＥＶ）を産生する。ＩＭＶは最も多い感染形態であり、宿主間における拡散を担っていると考えられている。一方、ＣＥＶは細胞間における拡散の役割があると考えられており、ＥＥＶは宿主の生体内での長距離伝播に重要であると考えられている。本開示の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、任意構成で、Ａ３４Ｒ遺伝子（ワクシニアウイルスの細胞外エンベロープ形態（ＥＥＶ）を増加させることで知られている）を突然変異させることにより、ＥＥＶ産生量が増加するよう改変され得る。
【００３３】
ワクシニアウイルスのいずれの既知の腫瘍溶解性株も、本開示の組成物および組み合わせのワクシニアウイルス成分として用いてもよい。好ましい実施形態では、本開示の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Copenhagen株、Western Reserve株、Lister、またはWyeth株であり、最も好ましくは、Western Reserve株またはWyeth株である。また、（i）感染個体から単離・同定された他の株、または、（ii）腫瘍特異的な標的特性を選抜する生物選抜法によって単離・同定された他の株を用いてもよい。
【００３４】
本開示の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（すなわちＧＭ−ＣＳＦ）などの外来タンパク質を発現するよう設計され得る。ＧＭ−ＣＳＦは、マクロファージによって分泌されるタンパク質であって、幹細胞を刺激して、顆粒球（好中球、好酸球、および好塩基球）ならびにマクロファージを産生するタンパク質である。ヒトＧＭ−ＣＳＦは、第２３アミノ酸残基（ロイシン）、第２７アミノ酸残基（アスパラギン）および第３９アミノ酸残基（グルタミン酸）がグリコシル化されている（米国特許第５，０７３，６２７号を参照。なお、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ワクシニアウイルスは、シトシンデアミナーゼタンパク質を発現するよう設計される。シトシンデアミナーゼは、シトシンのウラシルへの加水分解を触媒する。シトシンデアミナーゼは、ピリミジン再利用経路における役割を担っている。この経路によって、細胞は、ピリミジンヌクレオチドの合成にシトシンを利用できる。シトシンデアミナーゼは、（i）イソグアニンの脱アミノ反応、ＤＮＡ中の変異原性アデニン酸化物の脱アミノ反応、および、イソシトシンの脱アミノ反応を触媒することも可能であり、（ii）５−フルオロシトシン（５ＦＣ）の５−フルオロウラシル（５ＦＵ）への変換も触媒する。この機能により、非細胞傷害性前駆体から、細胞傷害性化学療法薬を生成することができる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ワクシニアウイルスは、ソマトスタチン受容体２型タンパク質を発現するよう設計される。ソマトスタチン受容体２型は、ソマトスタチン−１４およびソマトスタチン−２８の受容体である。ソマトスタチン受容体２型は、百日咳毒素感受性Ｇタンパク質と共役し、アデニリルシクラーゼを阻害する。また、（i）ホスホチロシンホスファターゼおよびＰＬＣを刺激し、（ii）電位依存性カルシウムチャネルを抑制することによりカルシウム流入を阻害し、（iii）ＭＡＰＫ１およびＭＡＰＫ２のリン酸化を強化することにより細胞増殖を阻害し、（iv）ニューロン移動および軸索伸長を刺激し、（v）ＰＴＰＮ６によるインスリン受容体シグナリングの負の制御を媒介し、（vi）ヘテロ二量化に伴いＳＳＴＲ３受容体機能を不活性化する。
【００３７】
腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、当該ウイルスの癌選択性を高めるために、１つ以上の機能遺伝子を欠失するよう設計されてもよい。好ましい実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＴＫ活性を欠失するよう設計される。ＴＫ欠失ワクシニアウイルスは、ＤＮＡ合成にチミジン三リン酸を必要とする。これにより、分裂細胞（特に、癌細胞）において選択的な複製が行われる。他の態様では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ワクシニアウイルス成長因子（ＶＧＦ）を欠失するよう設計されてもよい。この分泌タンパク質は、感染過程の初期に産生され、感染のために、分裂促進因子として、周囲の細胞を刺激するよう働く。他の態様では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＶＦＧ活性およびＴＫ活性の両方を欠失するよう設計されてもよい。他の態様では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Ｅ３Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ｂ１８Ｒ、または、Ｂ８Ｒなどの、宿主インターフェロン（ＩＦＮ）応答の回避に関与する１つ以上の遺伝子を欠失するよう設計されてもよい。いくつかの好ましい実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Western Reserve株またはWyeth株であり、機能性ＴＫ遺伝子を欠失している。他の実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、機能性Ｂ１８Ｒ遺伝子および／または機能性Ｂ８Ｒ遺伝子を欠失しているWestern Reserve株である。
【００３８】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、機能性ＴＫ遺伝子を欠失しており、ヒトＧＭ−ＣＳＦを発現する。好ましい実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、機能性ＴＫ遺伝子を欠失しているWyeth株腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、ヒトＧＭ−ＣＳＦを発現するWyeth株腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである。
【００３９】
＜Ａ．カルボキシルエステラーゼ酵素＞
上記組み合わせの腫瘍溶解性ワクシニアウイルス成分は、カルボキシルエステラーゼを発現するよう設計され得る。カルボキシルエステラーゼは、主に肝臓（カルボキシルエステラーゼ１）および腸（カルボキシルエステラーゼ２）に存在するセリンエステラーゼ酵素であり、様々な生体異物の解毒に関与すると考えられている。本明細書において、カルボキシルエステラーゼには、イリノテカンから活性代謝物ＳＮ−３８への変換を触媒する酵素（ブチリルコリンエステラーゼなど）を含む。ＳＮ−３８はイリノテカンと同じようにトポイソメラーゼＩ阻害剤であるが、元々の薬剤よりも１００倍から１０００倍、活性が高い。イリノテカンを用いた標準的な治療を受けているヒト癌患者において、イリノテカンのごく一部のみがＳＮ−３８に変換される。カルボキシルエステラーゼ１のカルボキシル末端にある４つのアミノ酸（ＨＩＥＬ）、およびカルボキシルエステラーゼ２のカルボキシル末端にある４つのアミノ酸（ＨＴＥＬ）によって、酵素が細胞に残留する。これらの末端の４つのアミノ酸を取り除くことにより、酵素が分泌される。
【００４０】
本願は、イリノテカンと、カルボキシルエステラーゼを発現するよう遺伝子設計されたワクシニアウイルスとを用いた併用療法によって、イリノテカンのＳＮ−３８への変換が腫瘍特異的に増加することを示す。カルボキシルエステラーゼ導入遺伝子を発現しないウイルスと比べると、カルボキシルエステラーゼ２を発現するワクシニアウイルスによる細胞の感染の後では、様々な細胞株において細胞生存率の大きな低下が見られた。ワクシニアウイルスがカルボキシルエステラーゼ２を発現する場合に、いくつかのヒト癌細胞株で優れた結果が観察された。
【００４１】
好ましい実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、ヒトカルボキシルエステラーゼ２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔアセッション番号０００７４８。なお、参照により本明細書に組み込まれる）を発現する。いくつかの実施形態では、ワクシニアウイルスは、ヒトカルボキシルエステラーゼ２と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％同一のポリペプチドを発現するよう設計される。他の実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ウサギカルボキシルエステラーゼ２（ＵｎｉＰｒｏｔアセッション番号Ｐ１４９４３。なお、参照により本明細書に組み込まれる）、またはウサギカルボキシルエステラーゼ２と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％同一のポリペプチドを発現する。関連する実施形態では、ワクシニアウイルスは、カルボキシルエステラーゼが分泌されるように、カルボキシル末端の４つのアミノ酸が欠失したカルボキシルエステラーゼ２を発現する。
【００４２】
いくつかの好ましい実施形態では、カルボキシルエステラーゼ酵素は、Ｃ末端保持配列を含む。いくつかの実施形態では、上記Ｃ末端保持配列はＨＴＥＬ（配列番号１）である。いくつかの実施形態では、上記カルボキシルエステラーゼ酵素は、Ｃ末端保持配列を含まない。いくつかの実施形態では、カルボキシルエステラーゼ酵素はＣＥＳ２、好ましくは、ヒトＣＥＳ２（ｈＣＥＳ２）である。いくつかの実施形態では、カルボキシルエステラーゼ酵素の発現は、後初期ＶＡＣＶｐ７．５プロモーター、ワクシニア改変Ｈ５（ｍＨ５）プロモーター、ワクシニア短縮合成初後期ｐＳプロモーター、ｐＣ１１Ｒプロモーター、ｐＦ１１Ｌプロモーター、ｐｓＦＪ１−１０合成初期プロモーター、ｐＨｙｂ合成初期プロモーター、任意の未改変ワクシニア初期プロモーター、および、後初期最適化（ＬＥＯ）プロモーターの制御下にある。
【００４３】
＜Ｂ.サイトカイン＞
ある実施形態では、本開示の組成物、組み合わせ、および方法に用いられる腫瘍溶解性ウイルスは、サイトカインを発現するよう設計される。
【００４４】
サイトカインおよびケモカインは、強力な抗腫瘍効果をもたらすことができる（Vicari et al., 2002; Homey et al., 2002）。これらの効果は、腫瘍細胞そのものに直接もたらされ得る、または、非癌性細胞に対する効果を介して間接的にもたらされ得る。後者の例として、ＴＮＦが挙げられる。ＴＮＦは、腫瘍関連血管に毒性効果を及ぼすことにより、抗腫瘍効果をもたらすことができる。これにより、腫瘍に血流が届かなくなり、当該腫瘍はネクローシスする。加えて、サイトカインおよびケモカインは、免疫エフェクター細胞（好中球、好酸球、マクロファージおよび／またはリンパ系細胞など）を動員するように、そして場合によっては活性化するように作用することができる。これら免疫エフェクター細胞は、多くの機構によって腫瘍の破壊を引き起こすことができる。これら機構としては、抗腫瘍サイトカインの発現、Ｆａｓリガンドの発現、パーフォリンおよびグランザイムの発現、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の動員などが挙げられる。炎症反応は、最終的に、全身性の腫瘍特異免疫を誘発することができる。最後に、これらサイトカインまたはケモカインの多くは、化学療法あるいは放射線療法との併用で、腫瘍を破壊するように作用する。
【００４５】
これら免疫賦活タンパク質の組み換えタンパク質を、臨床上効果的に全身投与することは、次の理由から実現不可能である：（１）全身投与によって重篤な毒性効果が誘発される；また、（２）局所的な浸潤および抗腫瘍効果を促すためには、腫瘍組織内における局所的な発現が必要である。腫瘍塊内におけるこれら分子の濃度を局所的に高めつつ、体循環におけるレベルを最小限にするためのアプローチが必要とされている。ウイルスは、その効力を向上させるために、サイトカイン遺伝子またはケモカイン遺伝子を発現するよう設計され得る。複製選択的ベクターからのこれら遺伝子の発現には、非複製ベクターからの発現に勝る潜在的な利点がある。複製ウイルスからの発現により、腫瘍塊内における濃度を局所的に高くすることができる。加えて、複製ウイルスは、腫瘍細胞破壊／腫瘍溶解および炎症誘発環境中への腫瘍抗原の放出によって、抗腫瘍免疫を誘発する一助となることができる。
【００４６】
いくつかの実施形態では、サイトカインは、インターフェロン−ベータ−１（好ましくは、ヒトインターフェロン−ベータ−１）、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４  ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、および、ＣＸＣＲ４からなる群から選ばれる。ある実施形態では、サイトカインはインターフェロン−ベータ−１、好ましくはヒトインターフェロン−ベータ−１である。ヒトインターフェロンベータ、すなわち、Ｉ型インターフェロンは、ウイルス感染または二本鎖ＲＮＡに対する曝露に反応して、線維芽細胞により分泌される１６６アミノ酸のグリコシル化タンパク質である。インターフェロンベータは、２本鎖からなる受容体（インターフェロン−アルファ受容体１（ＩＦＮＡＲ１）およびインターフェロン−アルファ受容体２（ＩＦＮＡＲ２））を通じて、シグナルを送る。受容体と結合すると、ＩＦＮｂは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を活性化する。これにより、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２のリン酸化が行われる。その後、ＳＴＡＴタンパク質は二量化し、インターフェロン制御因子３（ＩＲＦ３）と共に、細胞核内でインターフェロン応答因子と結合する。これら因子は、インターフェロン応答遺伝子を刺激する。これにより、インターフェロンベータの下流効果がもたらされる。インターフェロンベータは、抗ウイルス活性および増殖抑制作用を有し、特定の種類の腫瘍の化学療法および多発性硬化症の治療に用いられてきた。本明細書で説明する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによるＩＦＮ−ベータ−１の発現は、抗癌免疫応答を刺激し、癌選択性を向上させる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、サイトカインの発現は、後初期ＶＡＣＶｐ７．５プロモーター、ワクシニア改変Ｈ５（ｍＨ５）プロモーター、ワクシニア短縮合成初後期ｐＳプロモーター、ｐＣ１１Ｒプロモーター、ｐＦ１１Ｌプロモーター、ｐｓＦＪ１−１０合成初期プロモーター、ｐＨｙｂ合成初期プロモーター、任意の未改変ワクシニア初期プロモーター、および、後初期最適化（ＬＥＯ）プロモーターの制御下にある。
【００４８】
（具体的な例示的実施形態）
特に好ましい実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＳＪ−８１５である。ＳＪ−８１５は、Western Reserveワクシニア親株のＷＲ  Ａ３４Ｒ  Ｋ１５１Ｅに由来する、弱毒化形質転換腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである。ＷＲ  Ａ３４Ｒ  Ｋ１５１Ｅは、ＥＥＶ産生を増加させるため、Ｋ１５１Ｅ変異を有するＡ３４Ｒ遺伝子を含む（Blasco 1993）。ＳＪ−８１５は、ヒトＣＥＳ２遺伝子およびヒトＩＦＮｂｅｔａ１遺伝子を（それぞれ、合成初後期プロモーターとｐ７．５初後期プロモーターの制御下で）、親ウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子に挿入し、これにより、ＴＫ遺伝子を不活性化して作出された。ＴＫ遺伝子の不活性化は、ワクシニアウイルスの毒性を低減し、腫瘍特異的な複製を増加させることが示されている。
【００４９】
他の好ましい実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、野生型（ＷＴ）Ａ３４Ｒ遺伝子を有するWestern Reserveワクシニア親株に由来する、弱毒化形質転換腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである。この株は、ヒトＣＥＳ２の遺伝子およびヒトＩＦＮｂｅｔａ１の遺伝子を（それぞれ、合成初後期プロモーターとｐ７．５初後期プロモーターの制御下で）、親ウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子に挿入し、これにより、ＴＫ遺伝子を不活性して作出された。ＴＫ遺伝子の不活性化は、ワクシニアウイルスの毒性を低減し、腫瘍特異的な複製を増加させることが示されている。
【００５０】
マウスモデル用に特に好ましい実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスはｍＳＪ−８１５である。ｍＳＪ−８１５は、Western Reserveワクシニア親株のＷＲ  Ａ３４Ｒ  Ｋ１５１Ｅに由来する、弱毒化形質転換腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである。ＷＲ  Ａ３４Ｒ  Ｋ１５１Ｅは、ＥＥＶ産生を増加させるため、Ｋ１５１Ｅ変異を有するＡ３４Ｒ遺伝子を含む（Blasco 1993）。ＳＪ−８１５は、ヒトＣＥＳ２の遺伝子とマウスＩＦＮｂｅｔａ１の遺伝子とを（それぞれ、合成初後期プロモーターとｐ７．５初後期プロモーターの制御下で）親ウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子に挿入し、これにより、ＴＫ遺伝子を不活性して作出された。ＴＫ遺伝子の不活性化は、ワクシニアウイルスの毒性を低減し、腫瘍特異的な複製を増加させることが示されている。
【００５１】
〔ＩＩ．開示された組成物を使用する方法〕
本開示に係る腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、局所投与、局部投与、または全身投与され得る。例えば、限定はされないが、本開示に係る腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、血管内投与（動脈内投与または静脈内投与）、腫瘍内投与、筋肉内投与、皮内投与、腹腔内投与、皮下投与、経口投与、非経口投与、鼻腔内投与、気管内投与、経皮投与、髄腔内投与、眼内投与、または頭蓋内投与することができる。好ましくは、ワクシニアウイルスは、血管内投与および／または腫瘍内投与される。腫瘍内投与は、一般的に、腫瘍塊への注射または腫瘍関連血管系への注射を伴う。ある態様では、ウイルスの投与前に、または、投与中に、腫瘍を画像化する。
【００５２】
本開示に係る腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、単回投与または複数回投与され得る。ウイルスの投与量は、１×１０５プラーク形成単位（ＰＦＵ）、５×１０５ＰＦＵ、少なくとも１×１０６ＰＦＵ、５×１０６または約５×１０６ＰＦＵ、１×１０７、少なくとも１×１０７ＰＦＵ、１×１０８または約１×１０８ＰＦＵ、少なくとも１×１０８ＰＦＵ、約または少なくとも５×１０８ＰＦＵ、１×１０９または少なくとも１×１０９ＰＦＵ、５×１０９または少なくとも５×１０９ＰＦＵ、１×１０１０ＰＦＵまたは少なくとも１×１０１０ＰＦＵ、５×１０１０または少なくとも５×１０１０ＰＦＵ、１×１０１１または少なくとも１×１０１１、１×１０１２または少なくとも１×１０１２、１×１０１３または少なくとも１×１０１３であり得る。ウイルスの投与量は、例えば、約１０７〜１０１３ｐｆｕ、約１０８〜１０１３ｐｆｕ、約１０９〜１０１２ｐｆｕ、または約１０８〜１０１２であり得る。好ましくは、ウイルスの投与量は１０７〜１０１０ｐｆｕである。
【００５３】
１回分の投与量のウイルスは、０．１時間、０．５時間、１時間、２時間、５時間、１０時間、１５時間、２０時間、または、２４時間（なお、これらの間の全ての値を含む）にわたり、被検体または腫瘍に投与される量を表すと理解される。投与量を、ある期間にわたって投与してもよいし、複数の注射によって投与してもよい。通常は、複数回分の投与量を、おおよそ同じ標的部位に対して投与する（例えば、腫瘍の近く、または、静脈内投与の場合、被検体の血流あるいはリンパ系における特定の侵入点の近く）。ある態様では、ウイルスの投与量は、（i）１本の針で複数のポートに供給できる針を備える注射装置、（ii）シリンジに取付けられた複数のプロング、または、（iii）これらの組み合わせ、により送達される。１回分の投与量のワクシニアウイルスが投与されてもよく、または、複数回分の投与量のワクシニアウイルスが治療期間にわたって投与されてもよい。当該治療期間としては、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、またはそれ以上の期間が挙げられる。例えば、ワクシニアウイルスは、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、またはそれ以上の期間にわたって、１日おき、毎週、１週間おき、３週間毎に投与されてもよい。
【００５４】
ワクシニアウイルスは、Earl and Moss in Ausubel et al.（1994）に記載の方法または国際公開公報第２０１３／０２２７６４号に記載の方法を用いて、増殖されてもよい。なお、これらは両方とも、ワクシニアウイルスの増殖方法について、参照により本明細書に組み込まれるが、これらの文献で定義された用語については本明細書に組み込まれない。
【００５５】
〔ＩＩＩ．癌用コドラッグ〕
腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと併用可能な癌用コドラッグとしては、トポイソメラーゼＩ阻害剤およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤が挙げられる。なお、トポイソメラーゼ阻害剤との表記は、それらの薬学的に許容される塩を含むことを意図していると理解されたい。トポイソメラーゼ阻害剤は、少なくとも１つの塩基性基を有していると、酸付加塩を形成することができる。また、酸性基を有するトポイソメラーゼ阻害剤も、塩基と共に塩を形成することができる。トポイソメラーゼ阻害剤とそれらの塩は、水和物の形態で用いられてもよく、他の溶媒（例えば、結晶化に用いられる溶媒）を含んでいてもよい。
【００５６】
トポイソメラーゼＩ阻害剤としては、カンプトテシンおよびその誘導体、海洋アルカロイド、および、インデノイソキノリン類似体が挙げられる。カンプトテシンの誘導体としては、イリノテカンやトポテカンなどが挙げられる。海洋アルカロイドとしては、ラメラリンＤ（３，１１−ジヒドロキシ−１４−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−２，１２−ジメトキシ−６Ｈ−クロメノ［４’，３’：４，５］ピロロ［２，１−ａ］イソキノリン−６−オン）などが挙げられる。イデノイソキノリン類似体としては、インドテカン（ＬＭＰ４００、または、２，３−ジメトキシ−６−（３−モルホリノプロピル）−５Ｈ−［１，３］ジオキソロ［４’，５’：５，６］インデノ［１，２−ｃ］イソキノリン−５，１２（６Ｈ）−ジオンとも呼ばれる）、インジミテカン（ＬＭＰ７７６、または、６−（３−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）プロピル）−２，３−ジメトキシ−６，６ａ−ジヒドロ−５Ｈ−［１，３］ジオキソロ［４’，５’：５，６］インデノ［１，２−ｃ］イソキノリン−５，１２（１２ａＨ）−ジオンとも呼ばれる）、ＮＳＣ−７０６７４４などが挙げられる。
【００５７】
トポイソメラーゼＩＩ阻害剤としては、エトポシド（ＶＰ−１６とも呼ばれる）、テニポシド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、エリプチシン、オーリントリカルボン酸、ＨＵ−３３１およびＩＣＲＦ−１９３、ＩＣＲＦ−１８７、ならびにメルバロンが挙げられる。リン酸エトポシドは、約２５〜１１５ｍｇ／ｍ２の範囲の投与量で、ヒトに投与され得る。テニポシドは、２週間毎に、約７５〜１５０ｍｇ／ｍ２の範囲の投与量で、ヒトに投与され得る。ドキソルビシンは、約１０〜１００ｍｇ／ｍ２の範囲の投与量で、ヒトに投与され得る。エピルビシンは、約１０〜２００ｍｇ／ｍ２の範囲の投与量で、ヒトに投与され得る。例えば、３〜４週間毎に１００ｍｇ／ｍ２のエピルビシンがヒトに静脈内投与され得る。イダルビシンは、約０．５〜５０ｍｇ／ｍ２の投与量が、ヒトに投与され得る。
【００５８】
カンプトテシン誘導体は、上記組み合わせに好ましいトポイソメラーゼ阻害剤である。カンプトテシン誘導体は、トポイソメラーゼＩを阻害する抗癌剤である。これら化合物は、通常、注射により投与される。より具体的には、無菌液または無菌エマルジョンの形態で静脈内投与される。しかしながら、カンプトテシン誘導体は、固形製剤または液体製剤の状態で経口投与することもできる。本開示において有用な代表的なカンプトテシン誘導体としては、イリノテカン、トポテカン（ハイカムチン、または、（Ｓ）−１０−［（ジメチルアミノ）メチル］−４−エチル−４，９−ジヒドロキシ−１Ｈ−ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−３，１４（４Ｈ，１２Ｈ）−ジオン一塩酸塩とも呼ばれる）、ＤＢ−６７（ＡＲ６７、または、７−ｔ−ブチルジメチルシリル−１０−ヒドロキシカンプトテシンとも呼ばれる）、ＢＮＰ−１３５０（７−［（２−トリメチルシリル）エチル］−２０（Ｓ）−カンプトテシン）、エキサテカン（（１Ｓ，９Ｓ）−１−アミノ−９−エチル−５−フルオロ−１，２，３，９，１２，１５−ヘキサヒドロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０Ｈ，１３Ｈ−ベンゾ（ｄｅ）ピラノ（３’，４’：６，７）インドリジノ（１，２−ｂ）キノリン−１０，１３−ジオン）、ルルトテカン（ＧＩ１４７２１１、または、７−（４−メチルピペラジノメチレン）−１０，１１−エチレンジオキシ−２０（Ｓ）−カンプトテシン二塩酸塩）、ＳＴ−１４８１（７−ｔ−ブトキシイミノメチルカンプトテシンとも呼ばれる）、および、ＣＫＤ−６０２（（２０Ｓ）−７−（２−イソプロピルアミノ）−エチルカンプトテシン）が挙げられる。トポテカンは、約１〜５ｍｇ／ｍ２の範囲の投与量で、ヒトに投与され得る。例えば、１．５ｍｇ／ｍ２のトポテカンが、５日間連続で、１日につき３０分にわたって、静脈内注入によりヒトに投与され得る。
【００５９】
イリノテカン（ＣＰＴ−１１、Camptosar、または、（Ｓ）−４，１１−ジエチル−３，４，１２，１４−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−３，１４−ジオキソ１Ｈ−ピラノ［３’，４’：６，７］−インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−９−イル−［１，４’ビピペラジン］−１’−カルボキシレートとしても知られている）は、特に好ましいカンプトテシン誘導体である。イリノテカンは、カルボキシルエステラーゼ酵素によって、ＳＮ−３８（７−エチル−１０−ヒドロキシ−カンプトテシン）として知られる活性薬剤に変換されるプロドラッグである（Satoh T. et al., Biol. Pharm. Bull., 17:662-664 (1994)）。イリノテカンは、トポイソメラーゼＩ−ＤＮＡ複合体に結合することによって、ＤＮＡ鎖が再びライゲーションすることを阻害するように作用し、二本鎖ＤＮＡの切断と細胞死を引き起こす。イリノテカンは、それ単独でも、また、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）やオキサリプラチンなどの他の薬剤と併用しても、癌の治療において特に有効であると、示されている。事実、イリノテカンは、５−ＦＵによる前治療が失敗に終わった後の転移癌における、標準治療である。この点に関し、イリノテカンは、化学療法をそれまでに受けていない転移癌患者において、標準的な５−ＦＵ／フォリン酸（ＦＡ）と少なくとも同じくらい活性を有することが、示されている。結腸癌に加えて、卵巣癌、肺癌、胃癌、食道癌、および子宮頸癌でも活性を有することが観察されている。
【００６０】
腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによるカルボキシルエステラーゼの発現を考慮に入れた上で、従来知られている治療プロトコルに従って、イリノテカンを（好ましくは、塩酸塩として）投与してもよい。これにより、腫瘍環境における濃度が局所的に高くなる。例えば、癌の治療においてイリノテカンを単剤として用いる場合、通常は、（i）開始時の投与量として５０ｍｇ／ｍ２のイリノテカンを、３週間毎に９０分間にわたって静脈内投与する。投与は、患者に臨床的な効能が見られる限り行う。この投与量は、患者に臨床的な効能が見られる限り、患者の耐性に応じて、５０ｍｇ／ｍ２刻みで２００ｍｇ／ｍ２まで減らしてもよい。あるいは、（ii）開始時の投与量として１２５ｍｇ／ｍ２のイリノテカンを、週１回、９０分間にわたって静脈内投与する。この投与量は、患者に臨床的な効能が見られる限り、患者の耐性に応じて、２５〜５０ｍｇ／ｍ２刻みで１５０ｍｇ／ｍ２まで増やす、または、５０ｍｇ／ｍ２まで減らしてもよい。イリノテカンを５−ＦＵおよびＦＡと併用する場合、一般的に、（i）１２５ｍｇ／ｍ２のイリノテカンを、週１回、９０分にわたって静脈内投与し、投与は４回行う。あるいは、（ii）１８０ｍｇ／ｍ２の投与量のイリノテカンを、１週間おきに９０分にわたって静脈内投与し、投与は３回行う。このように、本開示では、イリノテカンは、５０〜３５０ｍｇ／ｍ２の範囲の投与量で投与され得る。例えば、（i）１２５ｍｇ／ｍ２の投与量のイリノテカンを、１週間に１回、９０分にわたる持続注入により投与してもよい。あるいは、（ii）１８０ｍｇ／ｍ２の投与量のイリノテカンを、１週間おきに、９０分にわたる持続注入により投与してもよい。イリノテカンの投与は、臨床的な効能が見られる限り続ける。
【００６１】
トポイソメラーゼ阻害剤に加えて、カルボキシルエステラーゼによって活性化される他の抗癌剤も使用することができる。当該他の抗癌剤としては、パクリタクセル−２−エチルカーボネート（パクリタクセルに変換される）、カペシタビン（５’−デオキシ−５−フルオロシチジン（５−ＦＵ）に変換される）、および、一般的に、既存の化学療法薬の任意の第３級アミドメチルエステルプロドラッグ（カルボン酸の形態またはアミンの形態に変換される）、が挙げられる。腫瘍溶解性ワクシニアによるカルボキシルエステラーゼの発現を考慮に入れて、これら他の抗癌剤に合わせて、投与量を適切に変更することができる。これにより、腫瘍環境における濃度が局所的に高くなる。
【００６２】
〔ＩＶ．治療レジメンおよび組み合わせの医薬製剤〕
本開示のいくつかの態様は、カルボキシルエステラーゼ酵素およびサイトカインを発現する腫瘍溶解性合成ワクシニアウイルスであって、好ましくは活性型のチミジンキナーゼを発現しない腫瘍溶解性合成ワクシニアウイルスを有効量、哺乳動物に投与することにより、当該哺乳動物の癌を治療する方法に関し、理想的には、癌用コドラッグを併用する方法に関する。本開示のいくつかの態様は、（ａ）サイトカインおよびカルボキシルエステラーゼ酵素を発現する腫瘍溶解性合成ワクシニアウイルスであって、好ましくは活性型のチミジンキナーゼを発現しない腫瘍溶解性合成ワクシニアウイルスを含む組成物と、（ｂ）癌用コドラッグと、を含む組み合わせを有効量投与することにより、哺乳動物の癌を治療する方法に関する。
【００６３】
腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよび癌用コドラッグは、同時に、逐次的に、または、個別に投与され得る。同時投与は、例えば、これら薬剤を含む１つの固定された組み合わせの形態で行われてもよいし、各薬剤を独立した製剤として同時に投与することにより行われてもよい。逐次使用（投与）は、好ましくは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよび癌用コドラッグを、異なる時点で、すなわち、時間をずらして投与することを意味する。好ましくは、逐次使用（投与）は、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよび癌用コドラッグを独立して投与するよりも、これらの組み合わせがより有効となるように、投与することを意味する。個別使用（投与）は、好ましくは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよび癌用コドラッグを、異なる時点で、それぞれ独立して投与することを意味する。したがって、本開示はすべてのそのような同時治療レジメンまたは交互治療レジメンを含むと理解され、「投与（administering）」との用語はそれに応じて解釈されたい。
【００６４】
腫瘍溶解性ウイルスおよび癌用コドラッグを同時に投与しない場合、腫瘍溶解性ウイルスおよび癌用コドラッグの投与の順番は変更され得る。つまり、まず腫瘍溶解性ウイルス投与し、その後、癌用コドラッグを投与してもよく、あるいは、まず癌用コドラッグを投与し、その後、腫瘍溶解性ウイルスを投与してもよい。腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよび癌用コドラッグを同時に投与しない実施形態では、各薬剤は、好ましくは、有益な複合効果が細胞に対してもたらされるように投与される。このような場合、これら薬剤をおおよそ同じ時間枠内、好ましくは２週間以内、より好ましくは１週間以内に投与することが考えられる。場合によっては、治療期間を大幅に延ばし、それぞれの投与の間に数日（例えば、２日、３日、４日、５日、６日、または７日）が経過することが望ましい。好ましい組み合わせでは、腫瘍溶解性ウイルスおよび癌用コドラッグの逐次投与としては、まず腫瘍溶解性ウイルスを１回分の投与量以上投与し、その後、癌用コドラッグを１回分の投与量以上投与することが挙げられる。それぞれの薬剤の投与の間には、１４日以下（例えば、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、２日、１日、または０日）の介在期間があることが好ましい。「介在期間」とは、腫瘍溶解性ウイルスの最後の投与の終了から、癌用コドラッグの最初の投与の開始までの期間を意味する。介在期間が０日である実施形態では、癌用コドラッグは腫瘍溶解性ウイルスの最後の投与の後すぐに投与される。
【００６５】
特に好ましい逐次治療プロトコルとしては、（i）まず腫瘍溶解性ウイルスを投与し、（ii）１日から３日の介在期間を設け、（iii）腫瘍溶解性ウイルスの毎週の投与と、癌用コドラッグの１週間おきの投与とをずらすことが、挙げられる。例えば、癌用コドラッグの１週間おきの投与が、腫瘍溶解性ウイルスの第２週目の投与の１〜３日後に開始されてもよい：
腫瘍溶解性ウイルス（１日目、８日目、１５日目、２２日目、２９日目…）
癌用コドラッグ（９日目、２３日目、３７日目、５１日目、６５日目…）。
【００６６】
腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよび癌用コドラッグの投与は、（もしあれば）治療の毒性を考慮に入れて、各々の特定の療法の一般的な実施プロトコルに従う。治療サイクルは必要に応じて繰り返されることが予期される。また、様々な標準的療法および外科的介入が、本開示の療法に加えて、適用され得ることが考えられる。
【００６７】
治療レジメンは異なっていてもよく、しばしば、腫瘍の種類、腫瘍の位置、疾病の進行、および、患者の健康や年齢に左右される。ある種類の腫瘍はより積極的な治療を必要とし、一方でそれと同時に、ある患者はより負担の重いプロトコルに耐えることができない。臨床医は、治療製剤の既知の有効性および（あれば）毒性に基づいて、そのような決定を行うのに最も適しているであろう。
【００６８】
ある実施形態では、治療中の腫瘍は、（少なくとも当初のうちは）切除可能でない場合がある。本開示の併用療法を用いた治療により、周辺部が収縮するため、あるいは特に浸潤した部位が消失することによって、腫瘍の切除可能性が上昇し得る。治療後、切除が可能となり得る。切除後のさらなる治療が、腫瘍部位における微小な残存疾病を除去することに役立つであろう。
【００６９】
１つ以上の成分間の相乗的相互作用を定めること、効果の最適範囲を定めること、および当該効果について各成分の絶対投与量の範囲を定めることは、治療を必要としている患者に対して、様々なｗ／ｗ比の範囲および投与量で当該成分を投与することにより、最終的に判断され得る。ヒトに関しては、患者に対して臨床研究を行うことは複雑かつコストを要するため、このような形のテストを相乗作用の一次モデルとして利用することは非実用的である。しかしながら、１つの種において相乗作用を観察することにより、他の種における効果を予測することができる。本明細書で説明するように、相乗効果を判断するために動物モデルが存在している。そして、そのような研究の結果は、薬物動態学的／薬物動力学的方法の適用により、他の種で必要とされる有効投与量および血漿中濃度比の範囲、ならびに、絶対投与量および絶対血漿中濃度を予測するためにも用いることができる。腫瘍モデルとヒトで見られる効果との間において実証されている相関関係によれば、動物における相乗作用が、例えば、ヒト異種移植腫瘍モデルで立証され得るということが示唆される（後述の実施例で説明する）。
【００７０】
ある態様では、上記組み合わせは、哺乳動物の癌を治療するために用いられる。当該癌は、脳腫瘍、頭頸部癌、食道癌、皮膚癌、肺癌、胸腺癌，胃癌、結腸癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌、腎臓癌、精巣癌、直腸癌、乳癌、および膵臓癌からなる群より選ばれる。いくつかの実施形態では、上記組み合わせは、結腸直腸癌、肺癌、黒色腫、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、および肝臓癌からなる群より選ばれる癌を治療するために用いられる。
【００７１】
上記方法は、治療有効量の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよび癌用コドラッグを投与する工程を含む。治療有効量とは、腫瘍溶解、すなわち、癌細胞の破壊または溶解を誘発するのに十分な量と定義される。好ましくは、相乗作用をもたらす有効量の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよび癌用コドラッグを投与する。当該用語は、腫瘍の増殖または腫瘍の大きさを遅延させること、阻害すること、減少させることを含み、場合によっては、腫瘍を根絶することを含む。ある態様では、有効量のワクシニアウイルスは、腫瘍に対する当該治療ウイルスの全身性播種、例えば、注入されていない腫瘍の感染をもたらす。
【００７２】
〔Ｖ．塞栓物質〕
本開示のいくつかの態様は、（i）サイトカインおよびカルボキシルエステラーゼ酵素を発現する腫瘍溶解性合成ワクシニアウイルスであって、好ましくは活性型のチミジンキナーゼを発現しない腫瘍溶解性合成ワクシニアウイルスと、（ii）能動的塞栓術に適した生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質と、を含む組成物を哺乳動物の血管系に導入することによって、当該哺乳動物の癌を治療する方法に関する。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよび癌用コドラッグの組み合わせが血管系に導入される。本開示のいくつかの態様は、（ａ）サイトカインおよびカルボキシルエステラーゼ酵素を発現する腫瘍溶解性合成ワクシニアウイルスであって、好ましくは活性型のチミジンキナーゼを発現しない腫瘍溶解性合成ワクシニアウイルスと、能動的塞栓術に適した生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質と、を含む組成物を哺乳動物の血管系に導入することによって投与する工程と、（ｂ）有効量の癌用コドラッグを含む組成物を当該哺乳動物に投与する工程、によって当該哺乳動物の癌を治療する方法に関する。上記の通り、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよび癌用コドラッグは、同時に、逐次的に、または、個別に投与され得る。同時投与は、例えば、これら薬剤を含む１つの固定された組み合わせの形態で行われてもよいし、各薬剤を独立した製剤として同時に投与することにより行われてもよい。逐次使用（投与）は、好ましくは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよび癌用コドラッグを、異なる時点で、すなわち、時間をずらして投与することを意味する。好ましくは、逐次使用（投与）は、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよび癌用コドラッグを独立して投与するよりも、これらの組み合わせがより有効となるように、投与することを意味する。個別使用（投与）は、好ましくは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよび癌用コドラッグをそれぞれ独立して異なる時点で投与することを意味する。好ましくは、個別使用（投与）は、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよび癌用コドラッグを、両薬剤の血中レベルが測定可能な状態で（同時に）重複して存在しないように投与することを意味する。独立して投与される場合、能動的塞栓術に適した生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質を用いた能動的塞栓術によって一方または両方が投与され得る。したがって、本開示はすべてのそのような同時治療レジメンまたは交互治療レジメンを含むと理解され、「投与（administering）」との用語はそれに応じて解釈されたい。
【００７３】
多くの生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質が、本開示の組成物、組み合わせ、および方法において使用され得る。好ましい実施形態において、上記生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質は、分解性デンプン微粒子、ポリビニルアルコール微粒子、ゼラチンフォーム微粒子およびスルホン化ポリビニルアルコールヒドロゲル微粒子から選択される。
【００７４】
生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質（「塞栓物質」）は、一時的なものであっても、永久的なものであってもよい。一時的な塞栓物質の代表例としては、ゼルフォーム、コラーゲン、およびトロンビンが挙げられる。永久的な塞栓物質の代表例としては、微粒子（ポリビニルアルコール微粒子（polyvinyl alcohol；ＰＶＡ）およびembosphereなど）、コイル（pushableコイル、injectableコイル、detachableコイル、mechanicalコイル、electrolyticコイルおよびhydrolyticコイルなど）、液状物質（膠、Ｏｎｙｘ、アルコールおよびＡＬＧＥＬ（商標）（アルギナートの誘導体である糖類高分子・ヒドロゲル）など）、および他の物質（Amplatzerプラグ、Gianturco-Grifka血管閉塞デバイス（Gianturco-Grifka vascular occlusive device；ＧＧＶＯＤ）および離脱型バルーンなど）が挙げられる。塞栓術を施す血管の大きさ、塞栓術後における血管閉塞部の所望の長さ、および、閉塞後に塞栓術を施した組織を生存させたままにするか否かに応じて、異なる塞栓物質を用いてもよい。数多の塞栓術が施されていることを鑑みると、熟練の画像下治療技師ならば、物質の適切な種類、物質の適切な粒度範囲などを選択して、所望の塞栓術を実現することに困難はないであろう。血管閉塞は、外傷および出血などの臨床シナリオにおいて、または、塞栓術を繰り返し施すことが望ましい場合に有用である。このような場合には、本明細書に開示されている腫瘍溶解性ウイルスを用いた腫瘍塞栓術が望ましいこともある。
【００７５】
一実施形態において、生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質は、ゼラチンフォーム微粒子である。ゼラチンフォームの代表例としては、ゼルフォーム（Alicon/Scion Medical Technologies製）が挙げられる。ゼルフォームは、精製皮膚ゼラチン製の生体物質で、無菌シートまたは粉末状に製剤されている。ゼルフォームは、３０年以上にわたって塞栓術の施術に用いられており、廉価かつ多用途な塞栓物質である。ゼルフォームは、機械的な閉塞によって血流を低下させる。ゼルフォーム粉末は、大きさが１５０〜１０００μｍの粒子からなり、吸水すると凝集して大きな集合体粒子を形成することができる。ゼルフォームシートは、種々の異なる寸法および形状に切断することができ、注入に際しては所望の用途に応じて他の液状薬剤と共に製剤することができる。造影剤およびゼルフォームスポンジの両方を含むゼルフォームスラリーは、近位の塞栓血管の「鋳型」を形成するために用いることができる。一方、細い柱状または立方体状のゼルフォームは、より大きな血管に用いることができる。ゼルフォームは、血流を低下させ、血栓形成を促進し、血栓の足場として機能することによって、一時的に血管を閉塞させる。
【００７６】
一実施形態において、生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質は、分解性デンプン微粒子である。分解性デンプン微粒子（degradable starch microparticles；ＤＳＭ）の代表例としては、EMBOCEPTS粒子（Pharmacept製）およびSPHEREX粒子（Mangle Life Sciences製）が挙げられる。EMBOCEPTS粒子（有効成分：Amilomer）は、加水分解した馬鈴薯デンプンから構成される架橋粒子である。これらの粒子は、半減期が約３５分間であり、分解性であるため、一時的塞栓術に好適である。SPHEREX粒子は、ＤＳＭ−Ｓ微粒子から構成されており、無菌化されて食塩水中に懸濁されている。分子量を減らした精製アミロペクチン系デンプンの水溶液から、デンプン微粒子を調製してもよい。この場合、（i）重合体溶液の外相でデンプン小滴のエマルジョンを形成させ、（ii）デンプン小滴をゲルに変換させ、（iii）デンプン粒子を乾燥させることによって調製する。また任意構成で、上記粒子に放出制御用外殻を追加してもよい。非経口投与の後、生分解性微粒子は体内で分解されて、最終的には内因性物質を形成する（例えばグルコース）。生分解性は、好適な酵素（例えばαアミラーゼ）と共にインキュベートすることによって、in vitroで判定または検査することができる。また、微粒子を非経口注入し（例えば、皮下注入または筋肉内注入）、時間の関数として組織を組織学的に検査することによっても、生分解性を検査することができる。生分解性デンプン微粒子は、通常、数週間以内に、一般的には一週間以内に、組織から消失する。デンプン微粒子が放出制御用外殻で被覆されている場合は（例えば被覆）、一般的に、当該外殻が生分解速度を決定する。そしてその後、今度は、いつαアミラーゼがデンプン基質に到達するかを、上記外殻は決定する。
【００７７】
一実施形態において、生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）微粒子である。ポリビニルアルコール微粒子の代表例は、Boston Scientific Corporation (Natick、MA)によって製造されている。ＰＶＡ粒子は、ＰＶＡフォームシートを真空乾燥させ、細片化して製造される。上記粒子は篩別され、大きさ１００μｍ〜１１００μｍのものが利用できる。ポリビニルアルコール粒子の大きさおよび形状は不定であるため、凝集が促進される。懸濁後のＰＶＡ粒子は、長円形、楕円形、不定形、尖った形、角張った形の小片でありうる。ポリビニルアルコール粒子は、血管壁に付着し、当該粒子が通過できる最小の血管を封鎖することによって、永久的な閉塞をもたらす。ＰＶＡによる閉塞の結果、炎症反応、局所的な血管のネクローシス、および、それに引き続く血管の線維化が生じる。
【００７８】
一実施形態において、生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質は、スルホン化ポリビニルアルコールヒドロゲル微粒子である。スルホン化ポリビニルアルコールヒドロゲル微粒子の代表例は、ＤＣビーズ（Biocompatibles（UK、Surrey、UK）製）である。ＤＣビーズは、スルホン基で修飾されたポリビニルアルコールヒドロゲルを主成分とする、塞栓用微粒子製品である。ＤＣビーズは、アントラサイクリン化合物の塩（例えばドキソルビシン塩酸塩）を溶液から能動的に隔離し、当該化合物を制御下で継続的に放出することができる。薬剤は、塞栓術の直前に添加することができる。これによって、薬剤および装置を、一段階の工程で同時に送達することができる。その結果、当該薬剤を局所的かつ継続的に送達することになる。
【００７９】
上述したように、特に腫瘍血管系の大きさおよび所望の塞栓術の性質に基づいて、適切な大きさの生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質を、当業者は容易に選択することができる。好ましい実施形態において、生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質の大きさは、１００μｍ〜２０００μｍである。好ましい実施形態において、生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質の大きさは、１５０〜３５０μｍである。一実施形態において、生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質の大きさは、１５０〜２００μｍである。一実施形態において、生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質の大きさは、２００〜２５０μｍである。一実施形態において、生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質の大きさは、２５０〜３００μｍである。一実施形態において、生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質の大きさは、３００〜３５０μｍである。
【００８０】
ある実施形態では、生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質の大きさは均一である。これは、個々の粒子の直径の差が、約０μｍ〜約１００μｍ、約０μｍ〜約５０μｍ、または約０μｍ〜約２５μｍであることを意味する。いくつかの実施形態では、上記微粒子の直径の差は、１００μｍ以下、約５０μｍ以下、約２５μｍ以下、約１０μｍ以下または約５μｍ以下である。
【００８１】
〔ＶＩ．塞栓術を施す方法〕
一態様において、本開示は、（i）本開示の腫瘍溶解性ウイルスと、（ii）能動的塞栓術に適している生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲルと、を任意構成で癌用コドラッグと併用して哺乳動物の血管系に導入することによって、当該哺乳動物の血管上の部位に能動的塞栓術を施す方法を提供する。
【００８２】
生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質、腫瘍溶解性ウイルスならびに本開示の組成物および組み合わせの導入は、通常、腫瘍近傍の血管内への注入によって行われる。ある実施形態では、生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質、腫瘍溶解性ウイルスならびに本開示の組成物および組み合わせは、カテーテルによって導入される。他の実施形態において、生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質、腫瘍溶解性ウイルスならびに本開示の組成物および組み合わせは、シリンジを装着したカテーテルによる注入を介して導入される。いくつかの実施形態では、導入は、腫瘍または腫瘍の一部を直接に栄養している血管内に行われる。他の実施形態においては、導入は、作用部位に直接行われる（例えば、腫瘍の近位端にある血管内）。本開示に係る生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質は、腫瘍溶解性ウイルスを既に含ませた状態（すなわち、本開示の組成物）および／または癌用コドラッグを既に含ませた状態（すなわち、本開示の組み合わせ）で導入することができる。他の実施形態においては、生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質を、腫瘍溶解性ウイルスと組み合わせて導入する。このとき、ウイルスの導入は、生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質の導入前であってもよいし、導入と同時であってもよいし、導入後であってもよい。導入に際して、生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質、腫瘍溶解性ウイルスならびに本開示の組成物および組み合わせは、注入に適している。特定の施形態においては、生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質、腫瘍溶解性ウイルスならびに本開示の組成物および組み合わせは、無菌化されている。
【００８３】
生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質、腫瘍溶解性ウイルスならびに本開示の組成物および組み合わせを、カテーテルまたはマイクロカテーテルを用いて送達してもよい。生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質、腫瘍溶解性ウイルスならびに本開示の組成物および組み合わせを送達するカテーテルは、径の小さい医療用カテーテルであってもよい。生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質、腫瘍溶解性ウイルスならびに本開示の組成物および組み合わせに対して適合性のあるカテーテルの材質としては、ポリエチレン、フッ素系高分子およびシリコーンが挙げられる。カテーテルの設置後すぐに、生体適合性微粒子物質もしくは親水性高分子ゲル物質、腫瘍溶解性ウイルス、本開示の組成物または組み合わせは、当該カテーテルを通じて緩やかに導入される（通常は、蛍光透視ガイドの補助を伴って）。生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質、腫瘍溶解性ウイルスならびに本開示の組成物および組み合わせは、標的血管内に直接導入してもよいし、標的血管の上流に導入してもよい。塞栓術の施術に際して導入される、生体適合性微粒子物質もしくは親水性高分子ゲル物質、または本開示の組成物または組み合わせの量は、塞栓に十分な量である（例えば、標的血管の血流を減少または封鎖するために充分な量）。生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質、腫瘍溶解性ウイルスならびに本開示の組成物および組み合わせの送達量は、例えば、塞栓すべき血管系の大きさまたは範囲、ならびに腫瘍の大きさおよび性質に応じて変化しうる。塞栓術の施術後、施術の完了を確認するために、別途、動脈造影を行ってもよい。塞栓術の施術箇所に近接する正常な体組織に向けては、動脈の血流がある程度存在している。しかし、疾患部位または標的部位に向けた血流は、封鎖されている。また、施術を容易にするために、術前、術中または術後の患者に、血管拡張薬（例えばアデノシン）を投与してもよい。
【００８４】
医学または塞栓術に関する当業者ならば、本明細書に記載の生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質、腫瘍溶解性ウイルスならびに本開示の組成物および組み合わせを、種々の塞栓術の工程においてどのように使用できるかを理解し、正しく評価できるであろう。ここで、上記塞栓術の工程とは、（i）所望の血管上の部位に送達機構をガイドし、（ii）適量の生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質、腫瘍溶解性ウイルス、本開示の組成物または組み合わせを当該部位に送達して、（iii）１つ以上の所望の血管に拘束、閉塞、充填または封鎖を生じせしめ、当該血管の血流を減少または停止させることによるものである。上記の工程を何らかの具体的な塞栓術の工程に適用するにあたって、考慮、制御または調節されうるであろう要素としては、（i）選択される生体適合性微粒子物質もしくは親水性高分子ゲル物質、腫瘍溶解性ウイルス、本開示の組成物および／または組み合わせ（例えば、放射線不透過性粒状担体を画像化、追跡および検出するために）；（ii）体の部位に送達される生体適合性微粒子物質または親水性高分子ゲル物質、腫瘍溶解性ウイルスならびに本開示の組成物および組み合わせ；（iii）送達の方法（使用する特定の装置（例えばカテーテル）、カテーテルの注入端を所望の体の位置に設置するために用いる方法および経路など）；などが挙げられる。当業者は、これらの要素のそれぞれを正しく評価するであろうし、これらの要素を容易に扱って、無数にある塞栓術の施術方法に上述の方法を適用できる。
【００８５】
〔ＶＩＩ．追加の抗癌治療〕
本開示の組成物および組み合わせと共に投与され得る１つ以上の追加の化学療法薬には、限定されないが、５−フルオロウラシル（ＦＵ）、フォリン酸（ＦＡ）（すなわちleucovorin）、メトトレキサート、カペシタビン（Xeloda；５−ＦＵの経口プロドラッグ）、オキサリプラチン（Eloxatin）、ベバシズマブ（Avastin）、セツキシマブ（Erbitux）、およびパニツムマブ（Vectibix）およびその任意の組み合わせが含まれる。これらの薬剤は、既知の治療プロトコルにしたがって投与され得る。一般的に、追加の化学療法薬は、静脈内に投与される（経口製剤であるカペシタビンを除く）。
【００８６】
５−ＦＵは通常、５−ＦＵ活性を向上させるためにＦＡと共に投与される。一態様において、５−ＦＵおよびＦＡは本開示の組成物または組み合わせと共に投与される。
【００８７】
関連する一態様において、５−ＦＵ、ＦＡ、およびオキサリプラチンは、本開示の組成物または組み合わせと共に投与される。例えば、本開示の組成物と共に、ＦＯＬＦＯＸ治療プロトコルが哺乳動物に対して施され得る。ＦＯＬＦＯＸ治療では、５−ＦＵ（１日目に、４００ｍｇ／ｍ２を２時間にわたってＩＶ投与）、ＦＡ（１日目に、４００ｍｇ／ｍ２を２時間にわたってＩＶ投与）およびオキサリプラチン（２日間、１２００ｍｇ／ｍ２／日で持続注入）が取り入れられており、２週間毎に繰り返し、４サイクル行う。あるいは、本開示の組成物と共に、ＦＬＯＸ治療プロトコルが施され得る（１日目、１５日目および２９日目に８５ｍｇ／ｍ２のオキサリプラチン、ならびに、１日目、８日目、１５日目、２２日目、２９日目および３６日目に５００ｍｇ／ｍ２のＦＡ、その後１日目、８日目、１５日目、２２日目、２９日目および３９日目に５００ｍｇ／ｍ２の５−ＦＵを２サイクル）。
【００８８】
別の関連する一態様においては、カペシタビンおよびオキサリプラチンが、例えばＸＥＬＯＸ治療レジメンとして、本開示の組成物または組み合わせと共に投与される。
【００８９】
別の関連する一態様においては、本開示の組成物または組み合わせと共に、また任意構成で５−ＦＵ／ＦＡと共に、ベバシズマブ、セツキシマブまたはパニツムマブなどのモノクローナル抗体が投与される。血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）を標的として阻害するベバシズマブは、転移癌患者のための一次治療として認可されている。セツキシマブおよびパニツムマブは、上皮成長因子（ＥＧＦＲ）を標的とする。
【００９０】
他の態様においては、本開示の方法は、さらに、放射線療法、ホルモン療法、外科手術、およびこれらの組み合わせなどの追加の癌治療を施す工程を含む。
【００９１】
放射線療法としては、限定されないが、γ線、Ｘ線、および／または放射性同位体の腫瘍細胞への直接の送達が挙げられる。マイクロ波およびＵＶ−照射などの、ＤＮＡ損傷要素の他の形態も考えられる。これらの要素は全て、ＤＮＡ、ＤＮＡ前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体の集合および維持に対して広範囲の損傷をもたらす。Ｘ線の用量範囲は、１日量で５０〜２００レントゲンの長期間投与（３〜４週間）から、１回量で２０００〜６０００レントゲンの投与までおよぶ。放射性同位体の用量範囲はばらつきが大きく、同位体の半減期、放射される放射線の強度ならびに種類、および癌化細胞による取り込みに依存する。
【００９２】
癌患者の約６０％は、予防目的、診断目的、病期分類目的、治療目的、および苦痛緩和目的の外科手術を含む、何かしらの外科手術を受けている。治療目的の外科手術は、本開示の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子治療、および／または代替療法などの他の療法と併せて用いられ得る癌治療である。
【００９３】
治療目的の外科手術は、癌組織の全部または一部を物理的に除去、摘出、および／または破壊する切除術を含む。腫瘍の切除術とは、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを意味する。腫瘍の切除術に加えて、外科手術による治療は、レーザー手術、冷凍手術、電気外科手術、および顕微鏡制御下の外科手術（モース術）を含む。本開示は、表在性の癌、前癌、または偶発的な量の正常組織の除去と併せて用いられることも、さらに考えられる。
【００９４】
癌細胞、組織、または腫瘍の、一部または全部の摘出の際は、体内に腔が形成されてもよい。治療は、追加の抗癌治療と共に、潅流、直接注入、または当該領域への局所的な適用によって実現されてもよい。このような治療は、例えば１日、２日、３日、４日、５日、６日、もしくは７日毎、または１週間、２週間、３週間、４週間、および５週間毎、または１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、もしくは１２カ月毎に繰り返されてもよい。また、これらの治療は、異なる投与量で行われてもよい。
【００９５】
現行手法と併せて用いられる治療の別の形態として、患者の組織が高温（最高で華氏１０６度）に曝露する施術である温熱療法を含まれる。局所温熱療法、局部温熱療法、または全身温熱療法の適用においては、外部または内部加熱器が含まれていてもよい。局所温熱療法は、腫瘍などの小さい面積への熱の印加を含む。熱は、腫瘍を標的とする体外装置からの高周波数の波を用いた、外部で生成されたものであってもよい。内部熱には、無菌化されたプローブが関係していてもよい。当該無菌化されたプローブとしては、（i）薄い加熱されたワイヤ、または（ii）温水で満たされた中空の管、（iii）埋入されたマイクロ波アンテナもしくは高周波電極が挙げられる。
【００９６】
患者の臓器または肢は、局部治療のために加熱される。この加熱は、磁石などの高エネルギーを生成する装置を使用して実現される。あるいは、患者の血液の一部を、内部加熱される領域に潅流させる前に、除去および加熱してもよい。全身加熱は、癌が全身に広がっている場合に行われてもよい。この目的のために、温水ブランケット、ホットワックス、誘導コイル、およびサーマルチャンバーを使用してもよい。
【００９７】
ホルモン療法は、本開示と併せて、または前述の他の癌治療のいずれかと組み合わせて使用されてもよい。ホルモンは、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、または子宮頸癌などの特定の癌の治療において、テストステロンまたはエストロゲンなどの特定のホルモンのレベルを低下させたり影響を阻害したりするために使用されてもよい。
【００９８】
〔ＶＩＩＩ．組成物および製剤〕
癌または腫瘍細胞へ腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを送達する好ましい方法は、腫瘍内注入または血管内注入を介したものである。しかし、本明細書に開示される薬学的組成物は、その代わりに、非経口投与、皮内投与、筋肉内投与、経皮投与されてもよいし、または、米国特許第５，５４３，１５８号、米国特許第５，６４１，５１５号、および米国特許第５，３９９，３６３号（それぞれ、参照によりその全体が具体的に本明細書に組み込まれる）に記載されているように、腹腔内投与によって投与されてもよい。
【００９９】
腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの注入は、注入に必要な針の特定のゲージを発現コンストラクトが通過することができるならば、シリンジを使用してもよいし、溶液の注入に使用される他の任意の方法を採用してもよい。新規の無針注入システムが最近開示されており（米国特許第５，８４６，２３３号）、当該システムは、溶液を保持するためのアンプルチャンバーを規定するノズル、および溶液をノズルから送達部位に押し出すエネルギー装置を有する。遺伝子治療に使用されるシリンジシステムも開示されており、当該シリンジシステムは、任意の深さにおいて正確に所定量の溶液を複数回注入することを可能にする（米国特許第５，８４６，２２５号）。
［０１３１］
遊離塩基または薬理学的に許容可能な塩である活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水の中で調製されてもよい。分散液も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物、ならびにオイルの中で調製されてもよい。通常の貯蔵および使用の条件下では、これらの調製物は微生物の成長を防止するための防腐剤を含む。注入による使用に適した医薬形態としては、無菌水溶液または分散液、ならびに無菌注入溶液または分散液の即時調合用の無菌粉末が挙げられる（米国特許第５，４６６，４６８号、参照によりその全体が具体的に本明細書に組み込まれる）。全ての場合において、当該形態は無菌化されていなければならず、また、容易にシリンジで扱えるような流体でなければならない。また、当該形態は、製造条件および貯蔵条件下において安定的でなければならず、また細菌および菌類などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、これらの好適な混合物、および／または植物油、を含む溶媒または分散媒でもよい。例えば、（i）レシチンなどのコーティングの使用、（ii）分散液の場合は必要な粒径の維持、および（iii）界面活性剤の使用などにより、適切な流動性が維持され得る。例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの種々の抗微生物剤および抗菌剤によって、微生物の作用は防止され得る。多くの場合、例えば糖または塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい。例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの、吸収を遅延させる物質を組成物において使用することにより、注入組成物の長期的な吸収が可能となる。
【０１００】
水溶液による非経口投与については、例えば、溶液は必要に応じて好適に緩衝されていなければならず、また、希釈液はまず、十分な生理食塩水またはグルコースによって等張になっていなければならない。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腫瘍内投与、および腹腔内投与に特に適している。これに関し、使用され得る無菌水性媒体は、本開示を踏まえれば当業者に理解されるであろう。例えば、１回分の投与量は、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液へ溶解されてもよく、さらに、１０００ｍｌの皮下注入液へ添加されてもよいし、注入予定の部位へ注射されてもよい（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照）。投与量におけるいくらかのばらつきは、治療被検体の状態によって避けられない。投与責任者は、どの場合においても、個々の被検体における適切な投与量を判断する。また、ヒトに対する投与において、調製物は、米国食品医薬品局の生物製剤基準に規定される、無菌基準、発熱性基準、一般的安全性基準、および純度基準を満たしていなければならない。
【０１０１】
無菌注入溶液は、必要な量の活性化合物を、（必要に応じて）上記に列挙された種々の他の成分と共に、適切な溶媒に含ませることで調製される。一般的に、分散液は、基礎分散媒および上記に列挙された他の必要な成分を含む無菌ビヒクルに、種々の無菌化された有効成分を含ませることで調製される。無菌注入溶液の調製用の無菌粉末の場合における好ましい調製方法は、減圧乾燥および凍結乾燥である。これにより、事前に滅菌濾過された溶液から、有効成分および任意で所望の追加成分の粉末を生成する。
【０１０２】
本明細書に開示されている組成物は、中性の形態または塩の形態に製剤され得る。薬学的に許容される塩としては、（i）酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）および、（ii）例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸を用いて形成される酸付加塩が挙げられる。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩は、例えば（i）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化鉄などの無機塩基、および（ii）イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基、に由来してもよい。製剤に関して、溶液は、投与量に適した方法で、治療効果のある量が投与される。製剤は、注入溶液、薬剤放出カプセルなどの様々な投与形態で容易に投与される。
【０１０３】
本明細書においては、「担体」は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗微生物剤およびに抗菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体液、懸濁液、コロイドなどを含む。医薬有効成分用である、このような媒体および薬剤の使用は、当該分野では周知である。有効成分との適合性がない任意の従来の媒体または薬剤を除いて、治療用組成物における媒体または薬剤の使用が考えられる。補助的な有効成分も、組成物に含ませてよい。
【０１０４】
「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」とは、ヒトに投与された際にアレルギー反応または同様の有害反応を引き起こさない、分子的実体および組成物を意味する。有効成分としてタンパク質を含む水性組成物の調製方法は、当該分野においてよく理解されている。通常、このような組成物は、溶液または懸濁液である注入物質として調製される。また、注入前の液体中の溶液（または懸濁液）に適した、固体形態も調製され得る。
【実施例】
【０１０５】
以下は、本開示の方法および組成物の実施例である。上述した全般的な記載を考慮すると、様々な他の実施形態が実施可能であることが理解されるであろう。
【０１０６】
〔実施例１：ヒトカルボキシルエステラーゼ２およびインターフェロンベータを発現する組換えワクシニアウイルスｓｊ−８１５の作製〕
＜導入＞
ヒトカルボキシルエステラーゼ２およびヒトインターフェロンベータ１を発現する組換えワクシニアウイルスＳＪ−８１５を、これら２つの遺伝子をWestern Reserve株ワクシニアウイルスのチミジンキナーゼ領域に挿入することにより作製した。親であるワクシニアウイルスWestern Reserveは、ワクシニアウイルスの細胞外エンベロープ型（ＥＥＶ）を増加させることで知られているＡ３４Ｒ遺伝子に変異を有している。
【０１０７】
対象となる２つの外来遺伝子を、移入用プラスミドベクター中にクローニングした。当該外来遺伝子の両側には、Ｊ２Ｒワクシニアウイルスゲノム由来のチミジンキナーゼ（ＴＫ）が位置していた。その後、当該トランスファープラスミドを、ワクシニアウイルスWestern Reserve A34Rに感染させた１４３Ｂ細胞内にトランスフェクションした。相同組換えが起こり、細胞溶解物中の組換えウイルスを得た。ＴＫ選抜のために、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）試薬を用いてＴＫ−ウイルスを単離した。リン酸化されたＢｒｄＵが、活性型ＴＫの存在下において、ウイルスＤＮＡ中に致死突然変異を引き起こすため、理論上は、組換えウイルスのみが生存できる。
【０１０８】
＜材料および方法＞
（ウイルス）
Ａ３４ＲにＫ１５１Ｅ変異を有しているワクシニアウイルスWestern Reserve（ＷＲ  Ａ３４Ｒ  Ｋ１５１Ｅ）を、ＳＪ−８１５のバックボーンとして選出した。これは、Western Reserve（ＷＲ）株がWyeth株よりも強力であると立証されており、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの治療指数を向上させると予想されるからである。Ａ３４Ｒ領域のコドン１５１におけるリジン（Ｋ）からグルタミン酸（Ｅ）の変異によって、Ａ３４Ｒタンパク質の能力であるＥＥＶ粒子を細胞膜に保持する能力が低下する。この変異は、in situの固形腫瘍だけでなく転移腫瘍にも影響を与えるという、組換えワクシニアウイルスＳＪ−８１５の能力を増強することを意図して含められている。
【０１０９】
親のワクシニアウイルスは、ＷＲ  Ａ３４Ｒ  Ｋ１５１Ｅであった。当該ウイルスを、接着培養したヒト子宮頚部腺癌（ＨｅＬａ）細胞中でさらに増殖させた。細胞バンクから得た、ATCC（登録商標）#CCL-2由来のＨｅＬａ細胞を、完全増殖培地（１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Hyclone（登録商標）、Cat# SH30919.03）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μ／ｍＬのストレプトマイシンを含むDulbecco's Modified Eagle Medium（ＤＭＥＭ））中に保持しながら、ＥＤＴＡ（Gibco、cat#15400-054）およびブタ由来トリプシンを用いて継代した。感染（目標ＭＯＩ＝０．１）から３日後、完全な細胞変性効果を示したＨｅＬａ細胞を回収し、上清を捨て、均質化によって細胞から細胞内ウイルスを放出させた。放出させたウイルスを、遠心分離（Beckman Avanti J-E High speed centrifuge #369001、ロータJA-20.1、１２，０００ｒｐｍ、８０分、４℃）によって半精製し、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ９．０）中に再懸濁し、超低温冷凍庫内に保存した（−７５±２０℃）。増殖させたウイルスを、Ｕ−２  ＯＳ細胞によってウイルス価を求め、濃度をプラーク形成単位（ｐｆｕ）で判定した。
【０１１０】
（プラスミドベクター）
相同組換え用のプラスミドベクターは、２つの形質転換インサートを有するｐＳＣ６５プラスミドから構成されていた。当該２つのインサートのために、ヒトカルボキシルエステラーゼ２（ｈＣＥ２）およびヒトインターフェロンベータ１（ｈＩＦＮβ１）遺伝子を新規に合成した。
【０１１１】
ヒトカルボキシルエステラーゼ２（ｈＣＥ２、１９７８塩基対、NM_003869.5；GI:297632399）用の野生型（ＷＴ）コーデング配列（ＣＤＳ）を改変して、ＳｍａＩ／ＸｍａＩ制限部位およびＢａｍＨＩ制限部位を除去し、ワクシニアウイルス合成初後期プロモーター（ｐＳＥ／Ｌ）の制御下に置いた。ヒトインターフェロンベータ（ｈＩＦＮｂ、１７３４塩基対、NM_002176.2；GI:50593016）用のＣＤＳを、ワクシニアウイルス初後期プロモーターｐ７．５の制御下に置いた。
【０１１２】
合成後、当該２つのフラグメントをゲル精製した。その後、当該２つのフラグメントをｐＳＣ６５ベクター（ＬａｃＺを除去するために事前に消化され、その後ゲル精製されたもの）のチミジンキナーゼ（ＴＫ）部位中にライゲーションして、ｐＳＣ６５−ｈＣＥ２−ｈＩＦＮβコンストラクトを作製した。この工程は、GENEWIZ, Inc. (South Plainfield, NJ)によって行われた。5' XmaIおよび3' HindIII配列を追加で含む第１の導入遺伝子ｈＣＥ２を、２つの制限酵素(XmaIおよびHindIII)を用いて消化し、5' XmaIおよび3' HindIIIを介してｐＳＣ６５−ＬａｃＺ（アンピシリン）中にクローニングした。これにより、次工程用の中間体であるｐＳＣ６５−ｈＣＥ２コンストラクトを作製した。5' HindIIIおよび3' BamHI配列を追加で含む第２の導入遺伝子ｈＩＦＮβを、２つの制限酵素(HindIIIおよびBamHI)を用いて消化し、前工程で得られたｐＳＣ６５−ｈＣＥ２（アンピシリン）中に、5' HindIIIおよび3' BamHIを介してクローニングした。こうして、最終的にｐＳＣ６５−ｈＣＥ２−ｈＩＦＮβコンストラクトを作製した。
【０１１３】
その後、最終コンストラクトを、マキシスケールのＤＮＡ調製によって１．０μｇ／ｕＬよりも高濃度に調製した。マキシスケールでのＤＮＡ調製物の半分を、BglIIを用いて線状化することで、相同組換えの効率を向上させた。線状化したコンストラクトの質および量を、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの波長における光学濃度（ＯＤ）を測定し、アガロースゲル電気泳動を行うことによって判定した。最終的な移入用プラスミドは、精製されかつエタノールに沈殿したＤＮＡフラグメントから成るものであった。
【０１１４】
（組換えワクシニアウイルスの構築）
相同組換えの原理に従って、組換えウイルスを作製した。その詳細な手順としては、公知の方法を利用する。
【０１１５】
（機能活性を有する組換えウイルスの選抜：カルボキシルエステラーゼ活性およびヒトインターフェロン活性の確認）
組換えワクシニアウイルスによって発現されているインターフェロン−βは、ヒトインターフェロンベータセンサー細胞株におけるＪＡＫ／ＳＴＡＴ／ＩＳＧＦ３経路の、ＩＦＮ−βに媒介された活性化を監視することによって測定することができる。このセンサー細胞株において、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ／ＩＳＧＦ３の刺激は、続けて分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の産生を誘発する。懸濁液中のＳＥＡＰレベルは、QUANTI-Blue（商標）システムを用いて測定することができる。このシステムでは、QUANTI-Blue（商標）培地がＳＥＡＰの存在下で紫／青に変色し、ＳＥＡＰの量に比例する比色変化を、６２０ｎｍ〜６５５ｎｍの分光光度計を用いたＯＤ測定によって評価することができる。
【０１１６】
遺伝子導入されたインターフェロン−βを発現するクローンを選抜するために、製造者の取扱説明書に従い、インターフェロンセンサー細胞を用いて、単離したクローンサンプルを分析した。９６ウェルの組織培養プレート中で、１０μＬのサンプルクローンをセンサー細胞懸濁液（５０，０００細胞／１８０μＬ）と混合した。その後、当該プレートを３７℃、５％のＣＯ２下で４８時間培養した。HEK-Blue（商標）ＩＦＮα/βセンサー細胞から得られた２０ｕＬの上清を、別の９６ウェル組織培養プレートに加え、１８０ｕＬのQUANTI-blue溶液を加えた。３時間の培養後（３７℃、５％のＣＯ２下）、分光光度計（Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, BioTek Instruments, Inc.）を用いてＳＥＡＰレベルを６５５ｎｍで測定した。６４個の単離クローン中、７個のクローンが陽性であった（図１Ａおよび図１Ｂ）。
【０１１７】
次に、機能性のインターフェロンを有する当該７個のクローンについて、ｐ−ニトロフェニル酢酸を基質として用いて、カルボキシルエステラーゼ酵素活性アッセイによりカルボキシルエステラーゼ導入遺伝子の発現を判定した。酵素によってｐ−ニトロフェニル酢酸から遊離したフェノール（塩基性溶液中）は、４０５ｎｍで検出可能である。そこで、１００μＬのＤＭＥＭ無血清培地中で再懸濁した組換えクローン２０μＬを用いて、ＨｅＬａ細胞に接種した。当該ＨｅＬａ細胞は、感染の２４時間前に２４ウェルプレートに５．０×１０４細胞／ウェルで播種され、３７℃、５％のＣＯ２下で４８時間インキュベートされたものである。リン酸緩衝食塩水を用いて細胞を１回洗浄した後に当該細胞を回収した。当該細胞を、５０μＬの溶解緩衝液（１．５％のＮ−ドデシルＢ−Ｄ−マルトシド）を用いて、氷上で２０分間インキュベートすることで溶解させた。細胞溶解物を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）によって回収し、用いた溶解緩衝液の４倍の体積のリン酸緩衝食塩水中に再懸濁した。１０μＬの細胞溶解物を、９０μＬのアッセイ用緩衝液（メタノール中に溶解した５０ｍＭのｐ−ニトロフェニル酢酸）を入れた、新たな９６ウェルプレートに移した。４０５ｎｍにおける吸光度を、１００秒毎に１０分間測定した。ｐＮＰＡアッセイ用緩衝液を添加した５分後に４０５ｎｍで測定した吸光度から、０分に測定した吸光度を差し引くことで、活性単位を計算した。
【０１１８】
７個のクローン全てが、カルボキシルエステラーゼに対して陽性であった（図１Ｃおよび図１Ｄ）。そこで、当該クローンをさらなるクローン精製のための種クローンとして用いた。このアッセイのネガティブ・コントロールとしては、親バックボーンウイルス（ＷＲ  Ａ３４Ｒ  Ｋ１５１Ｅ）、ＷＲ  Ａ３４Ｒ  ＴＫ−ウイルス、および他の潜在的組換えクローン（機能性テストにおいて単離したが、ＩＦＮ−β活性が陰性であることがわかったクローン）を用いた。上記７個のクローンを、標準的な方法を用いて複数回のクローン精製に供した。その結果、１４個の組換えクローンが得られ、その内の９個は、上述した方法においてインターフェロン活性が陽性であった。
【０１１９】
（ＰＣＲによるＴＫ破壊の確認）
インターフェロンの存在を、ＰＣＲ生成物によって確認した。インターフェロン導入遺伝子の両側を特異的に標的とするプライマーを設計し、その後、BIONEER（Daejeon, Korea）に合成を委託した（フォワード：GCCTAGATCTGTCGACTTCGAGC、リバース：AACGTATATGTGTACCGGGAGCAG）（図２）。反応混合物を、１００ｎｇのテンプレートＤＮＡを含む５００μＬのチューブ内で、製造者の取扱説明書（TaKaRa Ex Taq（商標））に従って調製した。当該チューブを、あらかじめ通常のパラメータにプログラムしたサーモサイクラー（SureCycler 8800、G8800A, Agilent Technologies）内に設置した。
【０１２０】
〔実施例２：ＳＪ−８１５ウイルスのin vitroでの特性評価〕
（導入）
ＳＪ−８１５ウイルスを、in vitro細胞培養アッセイを用いて、プラークサイズ、ウイルス産生量、感染粒子量、ウイルスタンパク質の産生、感染細胞の形態形成、および細胞外エンベロープビリオン（ＥＥＶ）の形成について評価した。
【０１２１】
（プラークアッセイ）
プラークアッセイのために、６ウェル組織培養プレート中のＵ−２  ＯＳ細胞単層またはＢＳ−Ｃ−１細胞単層を、ＷＲ、ＷＲ．Ａ３４Ｒ、ＳＪ−８１５、またはｍＳＪ−８１５ウイルスの１０倍希釈液で感染させた。２時間の吸収後、ウイルス接種材料を取り除き、２．５％のＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭまたはＥ−ＭＥＭを用いて細胞を洗浄し、３％のメチルセルロースを含む培地を添加した。感染を、３７℃で７２時間または４８時間進行させた。その後、上記単層を０．１％のクリスタルバイオレットで１時間着色し、洗浄し、プラークの数を数えた。観察されたＳＪ−８１５のプラークサイズは、Ｕ−２  ＯＳ細胞（図３Ａおよび図３Ｂ）およびＢＳ−Ｃ−１細胞（図３Ｂ）における他のウイルスのものよりも小さかった。
【０１２２】
ＯＳ細胞において観察されたプラークサイズは、ＢＳ  Ｃ−１細胞におけるプラークサイズより小さかった。さらに、ｍＳＪ−８１５のプラークサイズは、ヒト細胞株においても減少しなかった。このデータは、ＳＪ−８１５ウイルスの成分、特にｈＩＦＮβがプラーク形成に影響し、また、ＥＥＶの放出およびウイルスの感染力にも影響したであろうことを示唆している。
【０１２３】
（膵臓癌細胞株におけるＳＪ−８１５の細胞溶解および複製）
膵臓癌細胞株および子宮頸癌細胞株ＰＡＮＣ−１、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２、ＡｓＰｃ−１、Ｃａｐａｎ−１、Ｃａｐａｎ−２、ＢｘＰｃ−３、およびＨｅＬａを、９６ウェルプレート中の体積１００μＬの増殖培地に、１×１０４細胞／ウェルの濃度で播種した。プレートを、３７℃のインキュベーターで２４時間インキュベートした。１０倍単位の様々な感染希釈系列（１００ＰＦＵ／細胞から０．０００１ＰＦＵ／細胞の範囲）を用いて、細胞をＳＪ−８１５およびＷＲ．Ａ３４Ｒ．ＴＫ−に感染させた。感染から４８時間後、製造者の取扱説明書に従い、ＣＣＫ−８（Dojindo）を用いて、細胞生存率を判定した。GraphPad Prism version 5を用いてＥＣ５０を計算した。
【０１２４】
ウイルス複製（ウイルスバースト）アッセイのために、膵臓癌細胞および子宮頸癌細胞を４８ウェルプレートに播種した。３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞の数を数え、ＳＪ−８１５およびＷＲ．Ａ３４Ｒ．ＴＫ−に感染させた。３７℃を２時間保った後、接種材料を取り除き、細胞を洗浄した。感染から４８時間後、細胞を回収した。Ｕ−２  ＯＳ細胞でプラークアッセイを行うことによって、感染性ウイルスの産生を判定した。ＳＪ−８１５は、膵臓癌細胞株において、対照ウイルスと比較して、より強力な細胞溶解を誘発し（図４Ａ）、より少なく複製した（図４Ｂ）。
【０１２５】
in vitroで試験した６種類の異なる膵臓癌細胞株のうち、ＣＰＥアッセイにおけるより低いＥＣ５０に示される通り、３種類の細胞株（ＢＸＰＣ−３、Ｃａｐａｎ−１、およびＭｉａＰａｃａ−２）で、ＳＪ−８１５はＷＲＡ３４Ｒ  ＴＫ−ウイルスよりも一貫して強力であった。さらに、１種類の膵臓腫瘍細胞株（Ｃａｐａｎ−２）において、低いＭＯＩ（０．００１〜０．１）では、ＳＪ−８１５はＷＲＡ３４Ｒ  ＴＫ−よりも強力なＣＰＥを有し、高いＭＯＩでは同等の効果を有した。同じ細胞株を用いた２回目の実験では、評価した様々なＭＯＩにおいて、ＳＪ−８１５はＷＲＡ３４Ｒ  ＴＫ−よりも強力であった（データ示さず）。４種類の腫瘍細胞株においてＣＰＥは強力であったが、１細胞あたりのＳＪ−８１５の感染粒子の総産生量は、ＷＲＡ３４Ｒ  ＴＫ−よりも少なかった。ＢＸＰＣ−３およびＣａｐａｎ−１において、これらの細胞におけるＰＦＵの総産生量は２０ＰＦＵ／細胞よりも少なかったが、ＳＪ−８１５のＣＰＥはＷＲＡ３４Ｒ  ＴＫ−よりも強力であった。ＡｓＰＣ−１およびＰＡＮＣ−１において、ＳＪ−８１５のＣＰＥはＷＲＡ３４Ｒ  ＴＫ−と同等であり、感染性ウイルスの産生はＷＲＡ３４Ｒ  ＴＫ−よりも少なかった。これら全ての結果は、以下のことを示唆している。つまり、ＳＪ−８１５の複製はＷＲＡ３４Ｒ  ＴＫ−よりも著しく低かったが、それにもかかわらず、膵臓癌細胞をin vitroで殺傷する点において、ＳＪ−８１５はＷＲＡ３４Ｒ  ＴＫ−ウイルスよりも効果的であったことを示唆している。
【０１２６】
（結腸癌細胞株におけるＳＪ−８１５の細胞溶解および複製）
ヒト結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６、ＨＣＴ−１５、ＨＣＴ−８、およびＳＷ６２０を、９６ウェルプレート中の体積１００μＬの増殖培地に、１×１０４細胞／ウェルの濃度で播種した。プレートを、３７℃のインキュベーターで２４時間インキュベートした。１０倍単位の様々な感染希釈系列（１００ＰＦＵ／細胞から０．０００１ＰＦＵ／細胞の範囲）を用いて、細胞をＳＪ−８１５およびＷＲ．Ａ３４Ｒ．ＴＫ−に感染させた。感染から４８時間後、製造者の取扱説明書に従い、ＣＣＫ−８（Dojindo）を用いて、細胞生存率を判定した。GraphPad Prism version 5を用いてＥＣ５０を計算した。
【０１２７】
ウイルス複製（ウイルスバースト）アッセイのために、結腸癌細胞を４８ウェルプレートに播種した。３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞の数を数え、ＳＪ−８１５およびＷＲ．Ａ３４Ｒ．ＴＫ−に感染させた。３７℃を２時間保った後、接種材料を取り除き、細胞を洗浄した。感染から４８時間後、細胞を回収した。Ｕ−２  ＯＳ細胞でプラークアッセイを行うことによって、感染性ウイルスの産生を判定した。ＳＪ−８１５は、結腸癌細胞株において、対照ウイルスと比較して、より強力な細胞溶解を誘発し（図５Ａ）、より少なく複製した（図５Ｂ）。
【０１２８】
４種類の結腸癌細胞株を評価した（ＨＣＴ−１１６、ＨＣＴ−１１５、ＨＣＴ−８、およびＳＷ６２０）。２種類の細胞株（ＨＣＴ−１５およびＨＣＴ−８）はワクシニアウイルス感染に対してより耐性が高く、ＨＣＴ−１５は、ＷＲ．Ａ３４Ｒ．ＴＫ−よりもＳＪ−８１５にわずかに感染しやすかった。ＨＣＴ−１１６およびＳＷ６２０は、概して、ワクシニアウイルスにより感染しやすかった。ＳＷ６２０細胞株において、ＳＪ−８１５はＷＲ．Ａ３４Ｒ．ＴＫウイルスよりも強力な殺傷効果を発揮した。これらの結腸癌細胞株のワクシニアウイルスに対する感染しやすさの違いにかかわらず、感染から４８時間後の感染粒子の産生は、すべての場合において１ＰＦＵ／細胞よりも少なかった。試験した結腸癌細胞株において、ＳＪ−１８５とＷＲ．Ａ３４Ｒ．ＴＫ−ウイルスとの間で、感染粒子の産生に関する有意差は観察されなかった。このデータ全体は、以下のことを示唆している。つまり、ＳＪ−８１５の複製は著しく低かったが、それにもかかわらず、いくつかの結腸癌細胞をin vitroで殺傷する点において、ＳＪ−８１５はＷＲＡ３４Ｒ  ＴＫ−ウイルスよりも効果的であったことを示唆している。
【０１２９】
（肝臓癌細胞株におけるＳＪ−８１５の細胞溶解および複製）
ヒト肝臓癌細胞株ＳＮＵ３９８、ＳＮＵ４４９、およびＳＮＵ７３９を、９６ウェルプレート中の体積１００μＬの増殖培地に、１×１０４細胞／ウェルの濃度で播種した。プレートを、３７℃のインキュベーターで２４時間インキュベートした。１０倍単位の様々な感染希釈系列（１０ＰＦＵ／細胞から０．０００１ＰＦＵ／細胞の範囲）を用いて、細胞をＳＪ−８１５、ｍＳＪ−８１５、およびＷＲ．Ａ３４Ｒ．ＴＫ−に感染させた。感染から４８時間後、製造者の取扱説明書に従い、ＣＣＫ−８（Dojindo）を用いて、細胞生存率を判定した。GraphPad Prism version 5を用いてＥＣ５０を計算した。
【０１３０】
ウイルス複製（ウイルスバースト）アッセイのために、肝臓癌細胞を４８ウェルプレートに播種した。３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞の数を数え、ＳＪ−８１５、ｍＳＪ−８１５、およびＷＲ．Ａ３４Ｒ．ＴＫ−に感染させた。３７℃を２時間保った後、接種材料を取り除き、細胞を洗浄した。感染から４８時間後、細胞を回収した。Ｕ−２  ＯＳ細胞でプラークアッセイを行うことによって、感染性ウイルスの産生を判定した。ＳＪ−８１５は、肝臓癌細胞株において、対照ウイルスと比較して、より強力な細胞溶解を誘発し（図６Ａ）、複製レベルは同等であった（図６Ｂ）。
【０１３１】
３種類の肝臓癌細胞株を評価した（ＳＮＵ３９８、ＳＮＵ４４９、およびＳＮＵ７３９）。ＳＮＵ７３９において、３つのウイルスは全て同等の細胞傷害性を有し、投与量に依存した効果を示した。これらの細胞において、ウイルスは１細胞につき〜１０および２０ＰＦＵの範囲で産生された。ＳＪ−８１５、ｍＳＪ−８１５、およびＷＲＡ３４ＲＴＫ−によって産生された全体のウイルスレベルにおいて、有意差が観察された。ＳＪ−８１５によって産生された感染粒子の数は少なかったが、そのことは細胞殺傷能には影響しなかった。ＳＮＵ３９８およびＳＮＵ４４９細胞において、ＳＪ−８１５はより強い殺傷効果を有し、４８時間後に産生されたウイルスの数は、全てのウイルスの間で同等であった。これらの結果は、以下のことを示唆している。つまり、評価した３種類の肝臓癌細胞株はウイルス感染に対して敏感であり、ｍＳＪ−８１５が同じ有効性を示さなかったことから、ＳＪ−８１５がもたらしたヒトインターフェロンによって殺傷効果が増した、ということを示唆している。肝臓癌細胞株の殺傷の強化は、腫瘍細胞による感染性ウイルス粒子の産生の増加と相関していた。
【０１３２】
（骨髄腫細胞株および黒色腫細胞株におけるSJ-815の細胞溶解および複製）
ヒト骨髄腫癌細胞株および黒色腫癌細胞株ＳＫ−ＭＥＬ  ５、ＳＫ−ＭＥＬ  ２、ＲＰＭＩ８２２６、およびＩＭ−９細胞を、９６ウェルプレート中の体積１００μＬの増殖培地に播種した。プレートを、３７℃のインキュベーターで２４時間インキュベートした。１０倍単位の様々な感染希釈系列（１０ＰＦＵ／細胞から０．０００１ＰＦＵ／細胞の範囲）を用いて、細胞をＳＪ−８１５、ｍＳＪ−８１５、およびＷＲ．Ａ３４Ｒ．ＴＫ−に感染させた。感染から４８時間後、製造者の取扱説明書に従い、ＣＣＫ−８（Dojindo）を用いて、細胞生存率を判定した。Ｕ−２  ＯＳ細胞でプラークアッセイを行うことによって、感染性ウイルスの産生を判定した。細胞株ＳＫ−ＭＥＬ  ５（図７Ａ）、ＳＫ−ＭＥＬ  ２（図７Ｂ）、ＲＰＭＩ８２２６（図７Ｃ）、およびＩＭ−９（図７Ｄ）における細胞生存率の低下が示す通り、いくつかの骨髄腫細胞および黒色腫細胞において、ＳＪ−８１５は対照ウイルスよりも強力な細胞溶解を誘発した。
【０１３３】
ウイルス複製（ウイルスバースト）アッセイのために、骨髄腫癌細胞（ＲＰＭＩ８２２６およびＩＭ−９）および黒色腫癌細胞（ＳＫ−ＭＥＬ  ５およびＳＫ−ＭＥＬ  ２）を４８ウェルプレートに播種した。３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞の数を数え、１ｐｆｕ／細胞で、ＳＪ−８１５、ｍＳＪ−８１５、およびＷＲ．Ａ３４Ｒ．ＴＫ−に感染させた。インキュベーターを用いて、３７℃、５％のＣＯ２下で細胞をインキュベートし、感染から４８時間後に回収した。いくつかの骨髄腫癌細胞株および黒色腫癌細胞株において、ＳＪ−８１５の複製は対照ウイルスよりも少なかった（図８）。
【０１３４】
２種類の黒色腫癌細胞株を評価した（ＳＫ−ＭＥＬ  ２およびＳＫ−ＭＥＬ  ５）。ＳＫ−ＭＥＬ  ５において、ウイルスは同等の細胞傷害性を示し、投与量に依存した効果が観察された（図８）。これらの細胞においては、１細胞につき〜１０ＰＦＵでウイルスが産生された。試験した異なるウイルス間において、総ウイルス産生量についての有意差はなかった。ＳＫ−ＭＥＬ  ２細胞において、ＳＪ−８１５はより強い殺傷効果を示した（図８）。ＳＪ−８１５およびＷＲ．Ａ３４Ｒ．ＴＫ−ウイルスの間で、感染から４８時間後のウイルス産生量についての違いはなかった。ＳＫ−ＭＥＬ  ２細胞において産生された感染粒子の数は、ＳＫ−ＭＥＬ  ５細胞において産生された数よりも多かった。ＲＰＭＩ２８８６およびＩＭ−９骨髄腫細胞（Ｂリンパ球）は、ウイルス殺傷の影響を受けやすかった（図８）。しかしながら、ＲＰＭＩ２８８６は、ｍＳＪ−８１５  および  ＷＲＡ３４ＲＴＫ−  ９よりもＳＪ−８１５の影響を受けやすかった（図８）。興味深いことに、対照ＷＲ．Ａ３４Ｒ．ＴＫ−ウイルスと比較したとき、癌細胞中で産生されたＳＪ−８１５感染粒子の総量について有意差が観察された。懸濁細胞はより感染しにくく、そのため、１ＰＦＵ／細胞で感染させた後の、全体的なウイルスの回復は少なかった。これら全ての結果は、以下のことを示唆している。つまり、ＳＪ−８１５の複製は場合によってはＷＲＡ３４Ｒ  ＴＫ−よりも著しく低かったが、それにもかかわらず、いくつかの黒色腫癌細胞および骨髄腫癌細胞をin vitroで殺傷する点において、ＳＪ−８１５はＷＲＡ３４Ｒ  ＴＫ−ウイルスよりも効果的であったことを示唆している。
【０１３５】
（マウス癌細胞株におけるＳＪ−８１５の細胞溶解および複製）
マウス癌細胞株ＴＩＢ−７５、ＣＴ−２６、Ｂ１６−Ｆ１０、ＭＣ−３８、ＲＥＮＣＡ、および４Ｔ１を、９６ウェルプレート中の体積１００μＬの増殖培地に播種した。プレートを、３７℃のインキュベーターで２４時間インキュベートした。１０倍単位の様々な感染希釈系列（１００ＰＦＵ／細胞から０．０００１ＰＦＵ／細胞の範囲）を用いて、細胞をｍＳＪ−８１５およびＷＲ．ｍＧＭＣＳＦ．ＴＫ−に感染させた。感染から４８時間後、製造者の取扱説明書に従い、Cyto Tox-Gloアッセイ（Promega）を用いて、細胞生存率を判定した。いくつかのマウス癌細胞株（ＴＩＢ−７５肝細胞癌（図９Ａ）、ＣＴ−２６結腸癌（図９Ｂ）、Ｂ１６−Ｆ１０皮膚黒色腫（図９Ｃ）、ＭＣ−３８結腸癌（図９Ｄ）、ＲＥＮＣＡ腎細胞癌（図９Ｅ）、および４Ｔ１乳癌（図９Ｆ）など）において、ｍＳＪ−８１５ウイルスの濃度の上昇が細胞溶解を誘発した。
【０１３６】
〔実施例３：ＳＪ−８１５ウイルスの効果および傷害性のin vivoでの特性評価〕
（導入）
マウスＳＪ−８１５ウイルスの投与の影響を測定することによって、ＳＪ−８１５ウイルスをin vivoで評価した。当該評価では、マウスＳＪ−８１５ウイルスを単独投与した場合とマウスＳＪ−８１５ウイルスとイリノテカン処置とを併用した場合との両方について、腫瘍増殖、動物の生存、および臓器重量への影響を測定した。
【０１３７】
（ＭＣ−３８マウス結腸癌の増殖）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＭＣ−３８マウス結腸癌細胞を皮下移植した（２×１０６細胞／マウス）。腫瘍が形成されたとき（１００ｍｍ３〜２００ｍｍ３）、マウスを無作為に４つの処置群に分けた（ｎ＝５匹のマウス／群）：（１）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のみ、（２）ＷＲ．ＴＫ−．ｍＧＭＣＳＦ（３日毎に静脈内投与（１×１０８ｐｆｕ）を４回）、（３）ＷＲ．ＴＫ−．ｍＧＭＣＳＦ（２と同じスケジュールで腫瘍内投与）、および（４）上記と処置スケジュールで、ｍＳＪ−８１５を用いて腫瘍内投与による処置。その後、ノギスでの測定により腫瘍組織量を追跡した。腫瘍が１，５００ｍｍ３に達した時点で、そのマウスを致死させた。１週間あたり２日毎にマウスを計量した。graphpad prism version 5を用いてデータ解析を行った。２１日目、２４日目、および２７日目における腫瘍の大きさの減少に示される通り（図１０Ｃ）、ＭＣ−３８マウス結腸癌の増殖は、ｍＳＪ−８１５を用いた処置によって遅らされた。生存または体重に関しては有意な変化は観察されなかった（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。
【０１３８】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭＣ３８細胞の腫瘍増殖率を評価した。腫瘍細胞を注入後、１３日目にマウスを処置した（腫瘍の大きさの平均：１００ｍｍ３）。処置から２７日後、ほとんどの群の腫瘍の大きさの平均が１５００ｍｍ３に達した。ＪＸ−５９４およびＳＪ−８１５による処置の、腫瘍増殖および全生存に対する効果を評価した。対照群と処置群との間に、生存に関する有意差はなかった。しかしながら、２１日目、２４日目、および２７日目において、ＰＢＳ群とｍＳＪ−８１５処置群との間に、腫瘍の大きさに関する有意差があった。ＷＲ．ｍＧＭＣＳＦを用いて、ＩＶ投与による処置とＩＴ投与による処置とを評価したところ、腫瘍の大きさに関する有意差は観察されなかった。全体的に、ｍＳＪ−８１５を用いて処置した群は、ＷＲｍＧＭＣＳＦと比較して腫瘍がより減少した。
【０１３９】
（ＭＩＡ  ＰａＣａ−２ヒト膵臓癌の増殖）
雌のヌードマウスの皮下にＭＩＡ  ＰａＣａ−２ヒト膵臓癌細胞を注入し、腫瘍を生じさせた。腫瘍の体積が１００ｍｍ３〜２００ｍｍ３に達したとき、マウスを無作為に８つの処置群に分けた（ｎ＝３匹のマウス／群）：（１）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、（２）ＳＪ−８１５（１×１０５）、（３）ＳＪ−８１５（１×１０６）、（４）ＳＪ−８１５（１×１０７）を週１回腫瘍内投与（０日目、７日目、および１４日目）、（５）ＣＰＴ−１１（０．２５ｍｇ／ｋｇ）、（６）ＣＰＴ−１１（２．５ｍｇ／ｋｇ）、（７）ＣＰＴ−１１（２５ｍｇ／ｋｇ）を３日目、１０日目、および１７日目に静脈内投与、（８）ＳＪ−８１５（１×１０６）＋ＣＰＴ−１１（２５ｍｇ／ｋｇ）。ノギスを用いて腫瘍の測定を週に２回、飼育終了まで行った。平均腫瘍体積の減少が示す通り（図１１）、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２ヒト膵臓癌の増殖は、ｍＳＪ−８１５とＣＰＴ−１１（イリノテカン）との併用処置によって遅らされた。この実験は、以下の事を示す：すなわち、ヌードマウスはＴ細胞をほとんど欠失しているので免疫系が阻害されており、そのため、トポイソメラーゼ阻害剤とカルボキシルエステラーゼ酵素の発現を組み合わせることによって、サイトカイン（ｈＩＦＮ−ｂ）とは独立に、所望の効果をもたらしていた。仮にヒトＩＦＮ−ｂがマウスの免疫系に影響し得たとしても、ヌードマウスのＩＦＮ−ｂに対する応答性は依然として低いはずである。
【０１４０】
これらのデータは、ウイルス単独療法が、イリノテカン単独療法と比較して、より高い有効性の傾向を示したことを示唆している。同様に、併用療法はいずれの単独療法よりも高い有効性の傾向を示した。単独療法群の中で、最も多い投薬量が最も高い抗腫瘍反応を起こした。腫瘍に対してウイルスを全身的に送達することで、直接注射された腫瘍に見られるものと同等の抗腫瘍反応が起こった。これは、ＩＶ経路がＩＴ経路と同程度効果的である可能性を示唆している。
【０１４１】
（Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫腫瘍を有するＢ５７ＢＬ／６マウスの生存）
雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６−Ｆ１０マウス黒色腫細胞を皮下移植した（１×１０５細胞／マウス）。腫瘍が形成されたとき（５０ｍｍ３〜１００ｍｍ３）、マウスを無作為に５つの処置群に分けた（ｎ＝５匹のマウス／群）：（１）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、（２）ｍＳＪ−８１５（１×１０６）を０日目に１回投与、（３）ｍＳＪ−８１５（１×１０７）を０日目に１回投与、（４）ｍＳＪ−８１５（１×１０８）を０日目に１回投与、および（５）ｍＳＪ−８１５（１×１０６）を０日目、７日目、および１４日目に３回腫瘍内投与。その後、ノギスでの測定により腫瘍組織量を追跡した。腫瘍が１，５００ｍｍ３に達したとき、そのマウスを致死させた。週に２回マウスを計量した。graphpad prism version 5を用いてデータ解析を行った。Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫腫瘍を有するＢ５７ＢＬ／６マウスの生存は、ｍＳＪ−８１５を用いた処置によって著しく向上した（図１２Ａ）。
【０１４２】
体重データを、一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）で解析し、続いてDunnett多重比較検定によって解析した（図１２Ｂ）。データは、Ｐ＝０．０２６７で統計的に有意であった。Dunnett多重比較検定では、異なる群間で有意差はなかった。Bartlett検定を用いて分散の均一性を判定し、その結果、分散は有意なものではなかった（Ｐ＝０．３９７３）。
【０１４３】
（ｍＳＪ−８１５の腫瘍内投与とＢ１６−Ｆ１０黒色腫腫瘍の増殖）
雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６−Ｆ１０マウス黒色腫細胞を皮下移植した（１×１０５細胞／マウス）。腫瘍が形成されたとき（５０ｍｍ３〜１００ｍｍ３）、マウスを無作為に５つの処置群に分けた（ｎ＝５匹のマウス／群）：（１）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、（２）ｍＳＪ−８１５（１×１０６）を０日目に１回投与、（３）ｍＳＪ−８１５（１×１０７）を０日目に１回投与、（４）ｍＳＪ−８１５８１５（１×１０８）を０日目に１回投与、および（５）ｍＳＪ−８１５（１×１０６）を０日目、７日目、および１４日目に３回腫瘍内投与。その後、ノギスでの測定により腫瘍組織量を追跡した。腫瘍が１，５００ｍｍ３に達したとき、そのマウスを致死させた。graphpad prism version 5を用いてデータ解析を行った。腫瘍体積の減少が示す通り（図１３Ａおよび図１３Ｂ）、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫腫瘍の増殖は、ｍＳＪ−８１５を用いた併用処置によって遅らされた。
【０１４４】
各群の腫瘍の大きさの平均を計算し、ＳＥＭをプロットした。グラフ中の傾向の違いは、致死させた動物に起因するものである。データを一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）で解析し、続いてDunnett多重比較検定および対応のないｔ検定によって解析した。データは、統計的に有意ではなかった（Ｐ＝０．３７５５）。Bartlett検定を用いて分散の均一性を判定し、その結果、分散は有意差を示した（Ｐ＝０．０２４７）。対応のないｔ検定では、データは有意差を示さなかった。１２日目（ＰＢＳ群の動物の腫瘍の大きさが最大に達し致死させた日に対応する）のデータを解析した場合、一方向ＡＮＯＶＡによるデータは統計的に異なっていた（Ｐ＝０．０１１９）。この時点においては、Dunnett多重比較検定によれば、全ての群がＰＢＳ群とは統計的に異なっていた（Ｐ＜０．０５）。対応のないｔ検定によって、ＰＢＳとｍＳＪ−８１５（３ｅ７）との間に有意差が観察された（Ｐ＝０．０４３４）。
【０１４５】
（Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫腫瘍を有するＢ５７ＢＬ／６マウスの生存）
雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６−Ｆ１０マウス黒色腫細胞を皮下移植した（１×１０５細胞／マウス）。腫瘍が形成されたとき（５０ｍｍ３〜１００ｍｍ３）、マウスを無作為に８つの処置群に分けた（ｎ＝８匹のマウス／群）：（１）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、（２）ＷＲ．Ａ３４Ｒ．ＴＫ−（ＷＲ．ＴＫ−と表示）、（３）ＳＪ−８１５、（４）腫瘍内送達されたｍＳＪ−８１５、（５）静脈内送達されたｍＳＪ−８１５、（６）ＰＢＳ＋ＣＰＴ−１１、（７）ＷＲ．ＴＫ−＋ＣＰＴ−１１、および（８）ｍＳＪ−８１５＋ＣＰＴ−１１。ｍＳＪ−８１５を静脈内経路で送達した第５群を除き、全てのウイルスが腫瘍内送達された（１×１０７ＰＦＵで３回（０日目、７日目、および１４日目）の処置が施された）。２５ｍｇ／ｋｇのＣＰＴ−１１を、３日目、９日目、および１７日目に、静脈内送達した。処置後、生存を毎日判定した。graphpad prism version 5を用いてデータ解析を行った。Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫腫瘍を有するＢ５７ＢＬ／６マウスの生存は、ｍＳＪ−８１５とＣＰＴ−１１（イリノテカン）との併用処置により著しく向上した。Kaplan-Meier生存曲線を作成した（図１４）。ログ・ランク（Mantel-Cox）検定によってデータを解析したところ、有意差が見られた（Ｐ＜０．０００１）。群間比較のために、ログ・ランク（Mantel-Cox）検定によってＰ値も計算した。以下の通り、統計的に有意なＰ値が得られた。Ｇ１対Ｇ２：Ｐ＝０．０１６６、Ｇ１対Ｇ４：Ｐ＝０．００２５、Ｇ２対Ｇ４：Ｐ＝０．０１９９、Ｇ６対Ｇ７：Ｐ＝０．００５３、Ｇ６対Ｇ８：Ｐ＝０．０００７、Ｇ７対Ｇ８：Ｐ＝０．００２２。Ｇ４対Ｇ８には統計的な違いはなかった。
【０１４６】
（ｍＳＪ−８１５およびイリノテカンによる腫瘍内処置の組み合わせに伴うＢ１６−Ｆ１０黒色腫腫瘍の増殖）
雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６−Ｆ１０マウス黒色腫細胞を皮下移植した（１×１０５細胞／マウス）。腫瘍が形成されたとき（５０ｍｍ３〜１００ｍｍ３）、マウスを無作為に８つの処置群に分けた（ｎ＝８匹のマウス／群）：（１）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、（２）ＷＲ．Ａ３４Ｒ．ＴＫ−（ＷＲ．ＴＫ−と表示）、（３）ＳＪ−８１５、（４）腫瘍内送達されたｍＳＪ−８１５、（５）静脈内送達されたｍＳＪ−８１５、（６）ＰＢＳ＋ＣＰＴ−１１、（７）ＷＲ．ＴＫ−＋ＣＰＴ−１１、および（８）ｍＳＪ−８１５＋ＣＰＴ−１１。ｍＳＪ−８１５を静脈内経路で送達した第５群を除き、全てのウイルスが腫瘍内送達された（１×１０７ＰＦＵで３回（０日目、７日目、および１４日目）の処置が施された）。２５ｍｇ／ｋｇのＣＰＴ−１１を、３日目、９日目、および１７日目に、静脈内送達した。その後、ノギスでの測定により腫瘍組織量を追跡した。腫瘍が１，５００ｍｍ３に達したとき、そのマウスを致死させた。graphpad prism version 5を用いてデータ解析を行った。実験中、１匹のマウスが死亡した。死亡したマウスの腫瘍体積値は図１５Ａおよび図１５Ｂからは除き、図１５Ｃおよび図１５Ｄには含めた。図１５Ａおよび図１５Ｂは、腫瘍体積の低下を示し、これは、死亡したマウスの腫瘍体積の値を除外したことによる、人為的な結果を表す。反対に、図１５Ｃおよび図１５Ｄは致死したマウスの腫瘍体積値を含み、値の低下は観察されなかった。これらのデータは、トポイソメラーゼ阻害剤を用いても用いなくても、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによる処置が腫瘍増殖を遅らせたことを示している。
【０１４７】
概して、カルボキシルエステラーゼ酵素を発現しない腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであるＷＲ．ＴＫ−は、トポイソメラーゼ阻害剤と組み合わせた時に改善を示さなかった。このことは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスとトポイソメラーゼ阻害剤の組み合わせが、自然に改善をもたらすものではないことを示している。同様に、ＷＲ．ＴＫ−ウイルスはＳＪ−８１５と同等の結果を生じさせた。これは、（i）トポイソメラーゼ阻害剤を用いない場合におけるカルボキシルエステラーゼの発現も、（ii）ヒトサイトカイン（マウスの免疫系に顕著な影響を与えることは期待されない）の発現も、有効性を向上させないことを示している。一方、マウスサイトカインの発現は、ＷＲ．ＴＫ−ウイルスと比較して結果の向上をもたらした。トポイソメラーゼの添加は、全般的に、さらなる改善の有望な兆候を示す。各群の腫瘍の大きさの平均を計算し、ＳＥＭをプロットした。異なる日（腫瘍測定を行った日）における群間分析のために、対応のないｔ検定によってデータを解析した。以下に、統計的有意差の組み合わせを示す。Ｇ１対Ｇ２（Ｄ９）：Ｐ＝０．０５２、（Ｄ１３）：Ｐ＝０．０３２；Ｇ１対Ｇ３（Ｄ９）：Ｐ＝０．０２７、（Ｄ１３）：Ｐ＝０．００９７；Ｇ１対Ｇ４（Ｄ１３）：Ｐ＝０．０１２；Ｇ６対Ｇ７（Ｄ９）：Ｐ＝０．０２７、（Ｄ１３）：Ｐ＝０．０１０５；Ｇ６対Ｇ８（Ｄ６）：Ｐ＝０．０６７、（Ｄ９）：Ｐ＝０．０１１、（Ｄ１３）：Ｐ＝０．００４。
【０１４８】
（ワクシニアウイルス単体で処置された動物またはイリノテカンと組み合わせて処置された動物の体重）
雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６−Ｆ１０マウス黒色腫細胞を皮下移植した（１×１０５細胞／マウス）。腫瘍が形成されたとき（５０ｍｍ３〜１００ｍｍ３）、マウスを無作為に８つの処置群に分けた（ｎ＝８匹のマウス／群）：（１）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、（２）ＷＲ．Ａ３４Ｒ．ＴＫ−（ＷＲ．ＴＫ−と表示）、（３）ＳＪ−８１５、（４）腫瘍内送達されたｍＳＪ−８１５、（５）静脈内送達されたｍＳＪ−８１５、（６）ＰＢＳ＋ＣＰＴ−１１、（７）ＷＲ．ＴＫ−＋ＣＰＴ−１１、および（８）ｍＳＪ−８１５＋ＣＰＴ−１１。ｍＳＪ−８１５を静脈内経路で送達した第５群を除き、全てのウイルスが腫瘍内送達された（１×１０７ＰＦＵで３回（０日目、７日目、および１４日目）の処置が施された）。２５ｍｇ／ｋｇのＣＰＴ−１１を３日目、９日目、および１７日目に静脈内送達した。週に２回マウスを計量した。graphpad prism version 5を用いてデータ解析を行った。ワクシニアウイルス単独で処置された動物、または、ワクシニアウイルスとイリノテカンとを併用して処置された動物の体重において、有意な体重の減少は観察されず、したがって、毒性は観察されなかった（図１６）。
【０１４９】
（ｍＳＪ−８１５によって処置した動物における主要な臓器の重量変化）
雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６−Ｆ１０マウス黒色腫細胞を皮下移植した（１×１０５細胞／マウス）。腫瘍が形成されたとき（５０ｍｍ３〜１００ｍｍ３）、マウスを無作為に選択し、ｍＳＪ−８１５による腫瘍内処置または静脈内処置を施した。それぞれの動物について、肝臓、腎臓、脳、および肺を回収し、回収時における重量を測定した。データを、それぞれの動物の体重で標準化した。graphpad prism version 5を用いてデータ解析を行った。ｍＳＪ−８１５を用いて腫瘍内処置または静脈内処置を施した動物の肝臓（図１７Ａ）、腎臓（図１７Ｂ）、脳（図１７Ｃ）、または肺（図１７Ｄ）において、有意な重量変化は検出されなかった。
【０１５０】
（ｍＳＪ−８１５を用いたＩＴおよびＩＶ処置における脾臓重量）
雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６−Ｆ１０マウス黒色腫細胞を皮下移植した（１×１０５細胞／マウス）。腫瘍が形成されたとき（５０ｍｍ３〜１００ｍｍ３）、マウスを無作為に選択し、ｍＳＪ−８１５による腫瘍内処置または静脈内処置を施した。それぞれの動物について、脾臓を回収し、回収時における重量を測定した。データを、それぞれの動物の体重で標準化した。graphpad prism version 5を用いてデータ解析を行った。ｍＳＪ−８１５を用いたＩＶ（図１８Ａ）およびＩＴ（図１８Ｂ）処置によって脾臓重量が上昇し、その後、通常の脾臓重量に戻った。
【０１５１】
（腫瘍および臓器内におけるウイルスの定量化）
動物が死亡した日に、腫瘍、筋肉、卵巣、および肝臓を取り出し、０．１％のウシ血清アルブミンを含む２ｍＬの平衡塩類溶液に入れ、次の使用まで直ちに−８０℃で保管した。臓器を解凍し、１．４ｍｍサイズのセラミックビーズを入れた１．５ｍＬチューブを用いて、Bead Ruptor 24 Homogenizer（OMNI International）によって均質化した。氷水に浸したチューブ内において、均質化された組織を４５秒間隔で超音波処理した。その後、マイクロ遠心分離機Sorvall Legend Micro 17Rによって、４００×ｇで１０秒間遠心分離した。上清を分取し、Ｕ−２  ＯＳ細胞でプラークアッセイを行うことによってウイルス価を判定した。筋肉内、卵巣内、および肝臓内におけるウイルスレベルと比較して、腫瘍内におけるウイルスレベルはより高かった。処置からある程度の日数が経過すると、ウイルスは主に腫瘍内に見られるが、臓器内には見られなかった（図１９）。
【０１５２】
本明細書において開示および請求した全ての組成物および／または方法は、過度の実験をすることなく、本開示に鑑みて作製および実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態の観点から記載してきたが、本発明の概念、趣旨、および範囲を超えることなく、上記組成物および／または方法ならびに本明細書に記載の方法における工程または一連の工程に変更を適用できるということは、当業者にとって明らかであろう。より具体的には、同じまたは同等の結果が得られる場合には、本明細書に記載の薬剤を、化学的にも生理的にも関連している特定の薬剤と置き換え得ることは明らかであろう。当業者にとって明らかなそのような同等の置き換えおよび変更の全ては、添付の請求項によって規定した本発明の趣旨、範囲、および概念に含まれると考えられる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年5月9日(2018.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
（ＰＣＲによるＴＫ破壊の確認）
インターフェロンの存在を、ＰＣＲ生成物によって確認した。インターフェロン導入遺伝子の両側を特異的に標的とするプライマーを設計し、その後、BIONEER（Daejeon, Korea）に合成を委託した（フォワード：GCCTAGATCTGTCGACTTCGAGC（配列番号２）、リバース：AACGTATATGTGTACCGGGAGCAG（配列番号３））（図２）。反応混合物を、１００ｎｇのテンプレートＤＮＡを含む５００μＬのチューブ内で、製造者の取扱説明書（TaKaRa Ex Taq（商標））に従って調製した。当該チューブを、あらかじめ通常のパラメータにプログラムしたサーモサイクラー（SureCycler 8800、G8800A, Agilent Technologies）内に設置した。
【国際調査報告】
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