(57)【要約】  本発明は、ヒトまたは哺乳動物に由来し、抗凝固剤と混合された血液試料または吸引試料中の上皮細胞の濃度を決定するための方法に関する。ここで、それぞれ上皮細胞に特異的な抗原に対する抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物を添加した後、細胞への抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の結合の低下した結合速度が達成されるまで試料をインキュベートする。そこで初めて、標識された細胞の数および、血液試料または吸引試料中の最初の細胞の濃度が決定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは哺乳動物に由来し、および抗凝固剤と混合された血液試料または吸引試料中の上皮細胞の濃度を決定する方法であって、以下のステップ：
ａ）赤血球の溶解をもたらす緩衝液の添加により血液試料中または吸引試料中に存在する赤血球を溶解すること、この過程で溶解しなかった細胞を分離すること、および分離した細胞を緩衝液に懸濁させること、
ｂ）それぞれが少なくとも１つの標識を有し、およびそれぞれが上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）および／または少なくとも１つの上皮細胞に特異的な他の抗原に対する抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物を、ステップａ）で得られた細胞懸濁液または前記細胞懸濁液の部分量へ添加すること、ここで該部分量は分離によって得られたものであり、抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物と細胞懸濁液または該部分量とを混合すること、および結果として得られた混合物を、少なくとも抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の細胞への結合の結合速度の低下の達成に必要な時間インキュベートすること、ここでインキュベーションが少なくとも１２時間行われ、
ｃ）ステップｂ）で得られた混合物中の抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の結合によって標識された細胞の数を決定すること、および
ｄ）ステップｃ）で決定された標識細胞数の、血液試料または吸引試料中の濃度を計算すること、
を含む前記方法。
【請求項２】
以下のさらなるステップ：
ａ１）ステップａ）で得られた細胞懸濁物の少なくとも１つの部分量またはさらなる部分量を分離すること、
ａ２）それぞれが少なくとも１つの標識を有し、およびそれぞれが上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）および／または少なくとも１つの上皮細胞に特異的な他の抗原に対する抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物を、さらなる部分量中のそれらの濃度がステップｂ）の細胞懸濁液または部分量中の抗体、抗体フラグメントまたは抗体の濃度と同一であるような量でさらなる部分量へ添加すること、該抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物とさらなる部分量とを混合すること、および結果として得られた混合物を所定の温度でインキュベートすること、および
ａ３）前記さらなる部分量中に存在する細胞に結合した抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の量を、ステップａ２）の混合から開始する時間関数として連続的または反復的に決定すること、そこから結合速度を確定すること、および抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の前記細胞への結合の結合速度の低下の達成に必要な時間を決定すること、
が、ステップａ）とｂ）との間に実施され、ステップｂ）におけるインキュベーションが、所定の温度で行われ、ステップｂ）の時間が、少なくともステップａ３）で決定された時間と同じ長さであるように選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｂ）のインキュベーションが、所定の温度で行われる、および／または所定の温度が、０〜３０℃、特に０〜２０℃、特に２〜１５℃、特に８〜１５℃の範囲の温度である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｂ）のインキュベーションが、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも１８時間、少なくとも１９時間、少なくとも２０時間、少なくとも２１時間、少なくとも２２時間、少なくとも２３時間、少なくとも２４時間、少なくとも２５時間、少なくとも２６時間、少なくとも２７時間、少なくとも２８時間、少なくとも２９時間、または少なくとも３０時間で行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
標識が、蛍光色素による蛍光標識、発色団による色標識、またはビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはいくつかの他のアフィニティータグ、エピトープタグもしくはプロテインタグによる間接的に検出可能な標識である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップａ３）の結合された抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の量の決定および／またはステップｃ）の抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の結合によって標識された細胞の数の決定が、レーザー走査型サイトメトリー、蛍光顕微鏡または光学顕微鏡法によって行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
結合された抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の量の決定および／または標識された細胞の数の決定が、蛍光顕微鏡法または光学顕微鏡法によって行われ、および細胞を同定するために画像認識ソフトウェアが用いられる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
標識が蛍光標識であり、およびそれぞれの細胞についてレーザー走査型サイトメトリーまたは蛍光顕微鏡法で動的に決定されるものが、細胞あたりの総蛍光および前記細胞についてのバックグラウンド蛍光であり、いずれの場合にも特定の細胞について確認された全蛍光と前記細胞について確認されたバックグラウンド蛍光との間の差異として、細胞について同等の蛍光値が得られる、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
ステップａ）の分離が、遠心分離、沈降または濾過によって行われる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
非特異的結合部位および／またはＦｃ受容体をブロックするためのブロッキング試薬が、ｂ）およびａ２）の、それぞれが少なくとも１つの標識を有する、抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の添加の前に、細胞懸濁液、細胞懸濁液の部分量またはさらなる部分量に、いずれの場合も添加され、細胞懸濁液、細胞懸濁液の部分量またはさらなる部分量と混合される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
いずれのステップにおいても界面活性剤が使用されず、および／またはいずれのステップにおいても細胞が固定されない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
方法の全てのステップまたは少なくともステップｂ）およびｃ）または少なくともステップｂ）、ａ２）、ａ３）およびｃ）のステップが、この目的のために設計された機械によって自動化された方法で実施される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップａ１）において、２つ以上の部分量が分離され、ステップａ２）において抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物いずれの場合にも異なる量が各部分量へ添加され、およびそれぞれの部分量と混合され、ステップａ３）において、結合率の低下に達するのに必要な時間をそれぞれの部分量について求め、所望の時間内に低下する結合率が達成される量の抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物がその後ステップｂ）の実施のために選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
上皮細胞に特異的な他の抗原が、以下の群：
アンドロゲン受容体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦ受容体）、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ−１）、メランＡ、Ｂ７−Ｈ３、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ受容体）、Ｋｉ６７、インシュリン様成長因子受容体（ＩＧＦ受容体）およびＨｅｒ２ｎｅｕ、
から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
血液試料または吸引試料が、赤血球が溶解される前に、０〜４０℃の温度で少なくとも１４時間、特に少なくとも１６時間、特に少なくとも１８時間、特に少なくとも２０時間、特に少なくとも２２時間、特に少なくとも２４時間保存される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトまたは哺乳動物に由来し、抗凝固剤と混合された血液試料または吸引試料中の上皮細胞の濃度を決定するための方法に関する。吸引試料は、骨髄吸引物、胸膜吸引物または腹腔吸引物の試料であり得る。
【０００２】
そのような方法は、ＵＳ７,６１５,３５８Ｂ２から公知である。前記方法において、体液中に存在する上皮腫瘍細胞は、モノクローナル抗体ＨＥＡ１２５によって認識されるヒト上皮抗原に対する抗体または抗体フラグメントの添加によって標識される。続いてサンプルを支持体に適用し、腫瘍細胞を支持体に接着させるためにインキュベートされる。これに関連して、支持体の表面は、例えばポリ−Ｌ−リジンなどの非特異的な細胞結合を支持する薬剤で被覆することができる。
【０００３】
細胞の接着は通常１０〜１５分かかる。その後、接着している上皮腫瘍細胞の生存細胞を、それらの形態を介して同定し、定量し、体液中の生存上皮腫瘍細胞の濃度を計算する。これは、レーザー走査型サイトメトリーにより接着上皮腫瘍細胞の形態を分析することを含み、生きている腫瘍細胞はその独特の表面染色によって検出され、死細胞はその細胞内染色に基づいて除かれる。
【０００４】
ＷＯ２０１４／０４７２８５Ａ１は、タキサン治療から利益を得ることができる前立腺癌患者のサブグループを検出および／または治療するための方法を開示する。前記方法では、アンドロゲン受容体スプライスバリアントが患者から採取された試料中に存在するかどうかが決定される。この目的のために、循環腫瘍細胞を試料から捕捉し、特異的スプライスバリアントの１種の存在について試験することができる。捕捉は、固定化された抗体によって行うことができる。試験は、試料をスプライスバリアントに対する抗体と接触させ、スプライスバリアントへの抗体の結合を検出することを含む。
【０００５】
Pizon, M. et al., PLOS ONE, February 2013, volume 8, issue 2, e56836, pages 1 to 6は、乳癌患者からの血液試料中の循環上皮腫瘍細胞上のＩＧＦ受容体１およびＶＥＧＦ受容体２を決定するための方法を開示している。前記方法において、抗凝血剤としてＥＤＴＡで処理した血液サンプルは、採取後４８時間以内に処理された。さらに、血液サンプル中の赤血球を溶解した。
【０００６】
残りの細胞を、ＶＥＧＦ受容体２に対するＰＥ標識マウスモノクローナル抗体ならびにＥｐＣＡＭに対するＦＩＴＣコンジュゲートマウス抗体、またはＩＧＦ受容体１に対するＰＥ標識マウスモノクローナル抗体ならびにＥｐＣＡＭに対するＦＩＴＣコンジュゲートマウス抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。得られた細胞懸濁液の規定量をＥＬＩＳＡプレートのウェルに移し、レーザー走査型サイトメーターを用いて測定した。
【０００７】
Hekimian, K. et al., Clin. Chem. Lab. Med. 2012; 50(4), pages 701&#8211;708は、乳癌患者中を循環する上皮腫瘍細胞上の上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を脱マスクするＴｗｅｅｎ（登録商標）２０処理を開示している。この刊行物は、ＥｐＣＡＭが糖タンパク質または膜リポタンパク質によってマスクされていることを推測しており、結果として抗体結合が妨げられることを示唆している。
【０００８】
ある実験では、抗凝固処理された末梢血の１ｍｌを、２０μlのＴｗｅｅｎ２０とともにまたは界面活性剤を含まずに、いずれの場合も回収日、回収後１日目および回収後２日目に５分間インキュベートした。その後、そこに存在する赤血球を赤血球溶解緩衝液で溶解した。そして、ＥｐＣＡＭに対する抗体を用いて上皮細胞を検出した。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で処理した場合、回収日、回収後１日目および回収後２日目に許容範囲内で均等に高い細胞数を検出することが可能であることが見出された。
【０００９】
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０が存在しない場合、回収日に細胞を検出することは不可能であったが、１日目にはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０処理よりも幾分少ない細胞を検出することが可能であり、２日目にはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０処理の場合と同様に多くの細胞を検出することが可能であった。このことは、抗体とのインキュベーション前の血液試料の保存もまた、抗体に対する細胞上のＥｐＣＡＭのアクセシビリティを増加させることを示す。
【００１０】
本発明の目的は、ヒトまたは哺乳動物に由来し、および抗凝固剤と混合された血液試料または吸引試料中の上皮細胞の濃度を決定する代替方法を提供することである。
当該目的は、請求項１の特徴によって達成される。適切な態様は、請求項２〜１５の特徴によって明らかになる。
【００１１】
本発明は、ヒトまたは哺乳動物に由来し、抗凝固剤と混合された血液試料または吸引試料中の上皮細胞の濃度を決定する方法を提供する。前記方法において、上皮細胞に特異的な抗原に対する抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物をそれぞれ添加した後、時間関数としての細胞結合抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の数の増加が減速するまで、すなわち、結合速度が低下するまで、または時間に対する結合をプロットすることによって得られた結合曲線が平坦化し始め、飽和領域に入るまで、試料が保存される。
【００１２】
そこで初めて標識細胞の数、および、そこから血液試料または吸引試料中の前記細胞のもとの濃度が決定される。具体的には、驚くべきことに、飽和曲線の平坦化の開始の達成は、所与の数の結合パートナーについて予想されるよりも非常に長い時間を要することがわかった。上皮細胞に特異的な抗原の多くは、最初はマスクされた状態で存在し、時間の経過により、はじめて抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の結合が可能になると考えられている。そこで初めて、確実に細胞数を決定することが可能である。
【００１３】
具体的には、本発明によるヒトまたは哺乳動物に由来し、抗凝固剤と混合された血液試料または吸引試料中の上皮細胞の濃度を決定する方法は、以下：
ａ）赤血球の溶解をもたらす緩衝液の添加により血液試料中または吸引試料中に存在する赤血球を溶解すること、この過程で溶解しなかった細胞を分離すること、および分離した細胞を緩衝液に懸濁させること、
ｂ）それぞれが少なくとも１つの標識を有し、およびそれぞれが上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）および／または少なくとも１つの上皮細胞に特異的な他の抗原に対する抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物を、ステップａ）で得られた細胞懸濁液または前記細胞懸濁液の部分量へ添加すること、ここで該部分量は分離によって得られたものであり、抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物と細胞懸濁液または該部分量とを混合すること、および結果として得られた混合物を、少なくとも抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の細胞への結合の結合速度の低下の達成に必要な時間インキュベートすること、ここでインキュベーションが少なくとも１２時間行われ、
ｃ）ステップｂ）で得られた混合物中の抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の結合によって標識された細胞の数を決定すること、および
ｄ）ステップｃ）で決定された標識細胞数の、血液試料または吸引試料中の濃度を計算すること、のステップを含む。
【００１４】
方法全体が、人体の外および動物の体の外で行われる。抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物およびステップｂ）の部分量の混合は、抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物を部分量に添加した直後に行うことができる。ステップｂ）のインキュベーションは、所定の温度、例えば０〜２０℃、特に２〜１５℃で行うことができる。
【００１５】
ステップｄ）の血液試料または吸引試料において、ステップｃ）で決定された標識細胞の数の濃度を計算する場合、以前に実施された血液試料または吸引試料についての細胞の希釈および／または濃縮を考慮する必要がある。
【００１６】
通常、上皮細胞は循環血液中には見出されない。しかしながら、例えば、肺腫瘍、乳房腫瘍、腸腫瘍または前立腺腫瘍などの悪性上皮腫瘍の患者の血液中には、循環中の上皮腫瘍細胞が血液中に見出されることが明らかになっている。
さらに、慢性関節リウマチ、喘息、ＣＯＰＤ、クローン病または潰瘍性大腸炎などの上皮組織の慢性炎症性疾患を有する患者の血液中には、例えば前記組織の上皮細胞が末梢血中に見出され得る。
【００１７】
さらに、上皮細胞は、例えば、手術または挫傷など上皮組織に損傷を与える事象の結果として末梢血中に入る。したがって、ヒトまたは哺乳類に由来する血液試料または吸引試料中の上皮細胞の濃度を可能な限り正確に決定することができた場合、上皮腫瘍疾患または上皮組織の慢性炎症疾患の診断、疾患経過または治癒プロセスのモニタリング、および健康診断またはマススクリーニングのための目的に有用である。これに関連して、細胞は、上皮腫瘍の細胞、炎症組織由来の上皮細胞または上皮組織に損傷を与える事象の結果として血流に入った他の上皮細胞であり得る。
【００１８】
抗凝固剤は、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸塩またはヘパリンであり得る。
抗体フラグメントは、例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2またはＦａｂであり得る。しかしながら、それらは組換え抗体フラグメント、例えばｓｃＦｖ、ｄｉ−ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ（単一領域抗体）、または化学的に結合した抗体フラグメント、例えばＦ（ａｂ’）2であり得る。抗体模倣物は、抗原と結合することができる抗体と同様であるが、抗体または抗体フラグメント自体ではない化合物である。ほとんどの場合、通常それらは人工ペプチド、タンパク質またはレクチンである。
【００１９】
ステップｃ）の結合した抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の量の決定は、ステップｂ）の混合から開始する時間関数として行われる。結合速度がどのように決定されるかは、抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の基質への結合を研究する分野において当業者に知られている。
【００２０】
本発明の発明者らは、循環上皮細胞の表面上の上皮細胞特異的抗原に対する標識された抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の結合が、予期されるようにその添加および混合の数分後に飽和を達成はせず、その代わり、飽和が数時間後に初めて達成されることをした。これは単に抗原−抗体反応のみに基づき得ないため、以前にマスクされたエピトープのアクセシビリティが増加していると推定される。
【００２１】
アクセシビリティは、Hekimian, K. et al.から知られているように、抗体とのインキュベーションに先立って保管によって既に増加している。しかしながら、抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の存在下での長期インキュベーションによって再び増加する。その理由は、その結合の結果として、抗原の脱マスクが達成され得るからであろう。そのような効果は、当業者には全く驚くべきことである。
【００２２】
以下のさらなるステップは、ステップａ）およびｂ）の間で実施され得る。
ａ１）ステップａ）で得られた細胞懸濁物の少なくとも１つの部分量またはさらなる部分量を分離すること、
ａ２）それぞれが少なくとも１つの標識を有し、およびそれぞれが上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）および／または少なくとも１つの上皮細胞に特異的な他の抗原に対する抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物を、さらなる部分量中のそれらの濃度がステップｂ）の細胞懸濁液または部分量中の抗体、抗体フラグメントまたは抗体の濃度と同一であるような量でさらなる部分量へ添加すること、該抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物とさらなる部分量とを混合すること、および結果として得られた混合物を所定の温度でインキュベートすること、および
【００２３】
ａ３）前記さらなる部分量中に存在する細胞に結合した抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の量を、ステップａ２）の混合から開始する時間関数として連続的または反復的に決定すること、そこから結合速度を確定すること、および抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の前記細胞への結合の結合速度の低下の達成に必要な時間を決定すること、
【００２４】
ここでステップｂ）におけるインキュベーションが、所定の温度で行われ、ステップｂ）の時間が、少なくともステップａ３）で決定された時間と同じ長さであるように選択される。
【００２５】
ステップａ３）において決定される抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の量は、相対量または絶対量であり得る。相対量は、減少する結合率の決定には十分である。同一条件でａ）〜ｃ）またはａ）〜ｄ）を繰り返し実施する場合には、ステップａ３）の時間を決定するステップａ１）〜ａ３）を１回のみ実施すれば十分であり、ステップｂ）は、ステップａ３）において１回だけ決定された時間と少なくとも同じ長さになるように、それぞれの場合において選択される。
【００２６】
結合実験において慣習的であるように、ステップａ２）およびｂ）における抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物は、それぞれ細胞懸濁液、部分量またはさらなる部分量中のそれらの濃度がはるかに超えるような量で添加されるが、少なくとも２倍が、ＥｐＣＡＭまたは上皮細胞に特異的な他の抗原の適した濃度である。ステップｂ）およびａ２）では、ステップｃ）およびａ３）の決定においてより良好な測定結果を得るために、例えば未結合の抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物から生じるバックグラウンドシグナルを減じるために、抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物を添加し、５分〜６０分間のインキュベートの後、例えば１５分後、またはステップｂ）およびｃ）またはａ２）およびａ３）の間に、例えばＰＢＳを用いて懸濁液の希釈を実施し得る。
【００２７】
ステップａ３）の決定の結果、上皮細胞の濃度の信頼できる決定に必要とされる抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物との細胞のインキュベーション時間が決定される。前記時間は８時間から２５時間の間であり得る。しかしながら、比較的高い温度が選択されると、例えば６〜８時間後などに、より早く結合速度を達成することもできる。逆に、比較的低い温度、すなわち０〜８℃、特に２〜８℃の場合には、結合速度の低下には２５時間以上が必要であり、例えば、２５〜３０時間後で初めて起こる。
【００２８】
所定の温度は、０〜３０℃、特に０〜２０℃、特に２〜１５℃、特に８〜１５℃の範囲の温度であり得る。
ステップｂ）のインキュベーションは、例えば、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも１８時間、少なくとも１９時間、少なくとも２０時間、少なくとも２１時間、少なくとも２２時間、少なくとも２３時間、少なくとも２４時間、少なくとも２５時間、少なくとも２６時間、少なくとも２７時間、少なくとも２８時間、少なくとも２９時間、または少なくとも３０時間である。
【００２９】
標識は、蛍光色素、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）、発色団による色標識、またはビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはいくつかの他の親和性タグ、エピトープタグまたはタンパク質タグによる間接的に検出可能な標識であり得る。抗体の直接標識は、例えば二次抗体による間接標識と比較して、上皮細胞の一部が通常失われる洗浄工程を省くことができるという利点を有する。
【００３０】
ステップａ３）の結合抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の量の決定および／またはステップｃ）の抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の結合によって標識された細胞の数の決定は、レーザー走査型サイトメトリー、蛍光顕微鏡法、より詳細には定量蛍光顕微鏡法、または光学顕微鏡法、より詳細には定量的光学顕微鏡法によって行なうことができる。結合された抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の量の決定および／または標識された細胞の数の決定が蛍光顕微鏡法または光学顕微鏡法によって行われる場合、画像認識ソフトウェアを用いて細胞を同定することができる。
【００３１】
標識が蛍光標識である場合、それぞれの細胞についてレーザー走査型サイトメトリーまたは蛍光顕微鏡において動的に決定され得るものは、細胞あたりの全蛍光および前記細胞についてのバックグラウンド蛍光であり、特定の細胞について確認された全蛍光と該細胞について確認されたバックグラウンド蛍光との間の差異として、各細胞について同等の蛍光値を得ることが可能である。
【００３２】
バックグラウンド蛍光を動的に決定する場合、細胞の全蛍光を測定する際に、該測定の時に、前記細胞の領域、すなわち、前記細胞の細胞膜から細胞直径の約半分までの距離におけるバックグラウンドの蛍光もまた測定される。これにより、特定の測定の精度と測定結果の有効性を高めることができる。
【００３３】
ステップａ）の未溶解細胞の分離は、遠心分離、単なる沈降または濾過によって行うことができる。ステップａ）の緩衝液中の分離細胞の懸濁は、分離の直後、すなわち、細胞が乾燥せず、分離後の乾燥によって損傷されないように行われる。緩衝液はＰＢＳ、すなわちリン酸緩衝生理食塩水であってもよい。
【００３４】
この方法の一態様において、非特異的結合部位および／またはＦｃ受容体をブロックするためのブロッキング試薬は、いずれの場合も、それぞれｂ）およびａ２）の、少なくとも１つの標識を有する、抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物を添加する前に、細胞懸濁液、細胞懸濁液の部分量またはさらなる部分量に添加され、細胞懸濁液、細胞懸濁液の部分量またはさらなる部分量と混合される。
【００３５】
本方法の１つの態様において、いずれのステップにおいても界面活性剤が使用されず、および／またはいずれのステップにおいても細胞が固定されていない。その結果、上皮細胞への損傷を避けることができ、測定結果に影響を与えることがある。これは、損傷のない細胞膜を有する細胞の濃度または生きた上皮細胞の濃度さえも、この方法で決定されることが意図される場合に特に顕著である。
【００３６】
本方法の全てのステップまたは少なくともステップｂ）およびｃ）または少なくともステップｂ）、ａ２）、ａ３）およびｃ）は、この目的のために設計された機械によって自動化された方法で実施することができる。その結果、測定結果の再現性を客観化し、改善することができる。
【００３７】
この方法の一態様において、ステップａ１）において、２つ以上の部分量が分離され、ステップａ２）において、抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物いずれの場合にも異なる量が各部分量へ添加され、特に、即座にそれぞれの部分量と混合され、ここでステップａ３）において、前記結合率の低下に達するのに必要な時間を前記それぞれの部分量について求められ、所望の時間内に低下する結合率が達成される量の抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物がその後ステップｂ）の実施のために選択される。
【００３８】
上皮細胞に特異的な他の抗原は、例えばアンドロゲン受容体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦ受容体）、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、プログラム死リガンド（ＰＤＬ−１）、メランＡ、Ｂ７−Ｈ３、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ受容体）、Ｋｉ６７、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ受容体）およびＨｅｒ２ｎｅｕから選択される。
【００３９】
血液試料または吸引試料は、前記血液試料または前記吸引試料が、赤血球が溶解される前に、０〜４０℃の温度で少なくとも１４時間、特に少なくとも１６時間、特に少なくとも１８時間、特に少なくとも２０時間、特に少なくとも２２時間、特に少なくとも２４時間保存し得る。結果として、上皮細胞に特異的な抗原のアクセシビリティのさらなる改善を達成することが可能である。
【００４０】
本発明は、例示的な態様に基づいて以下により詳細に説明される。ＥＤＴＡで抗凝固処理した血液１ｍｌを室温で２４時間放置する。その後、試料を赤血球溶解緩衝液（１５５ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、１ｍＭ  ＫＨＣＯ３）で１５ｍｌまで充填し、８℃で１５分間保存する。その後、試料を７８０ｇで７分間遠心分離する。上清は、完全に廃棄される。ペレットを５００μｌのＰＢＳ  ＥＤＴＡ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．８ｍＭ  ＫＣｌ、８．１ｍＭ  ＮａＨＰＯ４、１．４７ｍＭ  ＮａＨＰＯ４、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．４）に再懸濁する。
【００４１】
試料から、５０μｌを反応チューブに添加し、１５μｌのＦｃＲブロッキング試薬（Miltenyi Biotec GmbH）と混合し、８℃で１５分間インキュベートする。その後、ＥｐＣＡＭ（HEA-125、Miltenyi Biotec GmbH）に対するモノクローナル抗体５μｌを添加し、懸濁液と混合する。これに続いて、光からの保護下で８℃で１５分間インキュベートする。その後、４３０μｌのＰＢＳ−ＥＤＴＡを添加し、懸濁液と混合する。
【００４２】
得られた懸濁液を８℃の暗所でインキュベートする。改めて混合した後、ｉＣｙｓレーザー走査型顕微鏡（CompuCyte、Beckman Coulter GmbH）を用いて異なる時間の後に一度に１００μｌを取り出した。測定は、蛍光捕捉に適した異なる顕微鏡を用いて行うこともできる。異なる時間における測定された結合から、抗体との混合から開始して、結合速度が低下するのに必要な時間を決定することが可能である。
【００４３】
その後、ＰＢＳ−ＥＤＴＡに再懸濁した細胞ペレット５０μｌを１５μｌのＦｃＲブロッキング試薬と混合し、混合後、８℃で１５分間インキュベートする。その後、ＥｐＣＡＭに対する上記抗体５μｌを添加し、細胞懸濁液と混合する。光からの保護下で８℃で１５分間インキュベートした後、４３０μｌのＰＢＳ−ＥＤＴＡを添加し、懸濁液と混合する。その後、懸濁液を８℃の暗所で、結合速度が低下するのに必要な時間、例えば１４時間または１６時間インキュベートする。
【００４４】
懸濁液を改めて混合した後、１００μｌを取り出し、レーザー走査顕微鏡または蛍光捕捉に適した別の顕微鏡下で検査する。前記検査において、抗体の結合によって標識された細胞の数が決定され、これから元の血液試料中の前記細胞の濃度が決定される。
【手続補正書】
【提出日】平成29年9月7日(2017.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは哺乳動物に由来し、および抗凝固剤と混合された血液試料または吸引試料中の上皮細胞の濃度を決定する方法であって、以下のステップ：
ａ）赤血球の溶解をもたらす緩衝液の添加により血液試料中または吸引試料中に存在する赤血球を溶解すること、この過程で溶解しなかった細胞を分離すること、および分離した細胞を緩衝液に懸濁させること、ここで赤血球が溶解される前に、血液試料または吸引試料を０℃〜４０℃の温度で少なくとも２４時間保存し、
ｂ）それぞれが少なくとも１つの標識を有し、およびそれぞれが上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）および／または少なくとも１つの上皮細胞に特異的な他の抗原に対する抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物を、ステップａ）で得られた細胞懸濁液または前記細胞懸濁液の部分量へ添加すること、ここで該部分量は分離によって得られたものであり、抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物と細胞懸濁液または該部分量とを混合すること、および結果として得られた混合物を、少なくとも抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の細胞への結合の結合速度の低下の達成に必要な時間インキュベートすること、ここでインキュベーションが少なくとも１２時間行われ、
ｃ）ステップｂ）で得られた混合物中の抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の結合によって標識された細胞の数を決定すること、および
ｄ）ステップｃ）で決定された標識細胞数の、血液試料または吸引試料中の濃度を計算すること、
を含む前記方法。
【請求項２】
以下のさらなるステップ：
ａ１）ステップａ）で得られた細胞懸濁物の少なくとも１つの部分量またはさらなる部分量を分離すること、
ａ２）それぞれが少なくとも１つの標識を有し、およびそれぞれが上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）および／または少なくとも１つの上皮細胞に特異的な他の抗原に対する抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物を、さらなる部分量中のそれらの濃度がステップｂ）の細胞懸濁液または部分量中の抗体、抗体フラグメントまたは抗体の濃度と同一であるような量でさらなる部分量へ添加すること、該抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物とさらなる部分量とを混合すること、および結果として得られた混合物を所定の温度でインキュベートすること、および
ａ３）前記さらなる部分量中に存在する細胞に結合した抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の量を、ステップａ２）の混合から開始する時間関数として連続的または反復的に決定すること、そこから結合速度を確定すること、および抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の前記細胞への結合の結合速度の低下の達成に必要な時間を決定すること、
が、ステップａ）とｂ）との間に実施され、ステップｂ）におけるインキュベーションが、所定の温度で行われ、ステップｂ）の時間が、少なくともステップａ３）で決定された時間と同じ長さであるように選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｂ）のインキュベーションが、所定の温度で行われる、および／または所定の温度が、０〜３０℃、特に０〜２０℃、特に２〜１５℃、特に８〜１５℃の範囲の温度である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｂ）のインキュベーションが、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも１８時間、少なくとも１９時間、少なくとも２０時間、少なくとも２１時間、少なくとも２２時間、少なくとも２３時間、少なくとも２４時間、少なくとも２５時間、少なくとも２６時間、少なくとも２７時間、少なくとも２８時間、少なくとも２９時間、または少なくとも３０時間で行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
標識が、蛍光色素による蛍光標識、発色団による色標識、またはビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはいくつかの他のアフィニティータグ、エピトープタグもしくはプロテインタグによる間接的に検出可能な標識である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップａ３）の結合された抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の量の決定および／またはステップｃ）の抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の結合によって標識された細胞の数の決定が、レーザー走査型サイトメトリー、蛍光顕微鏡または光学顕微鏡法によって行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
結合された抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の量の決定および／または標識された細胞の数の決定が、蛍光顕微鏡法または光学顕微鏡法によって行われ、および細胞を同定するために画像認識ソフトウェアが用いられる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
標識が蛍光標識であり、およびそれぞれの細胞についてレーザー走査型サイトメトリーまたは蛍光顕微鏡法で動的に決定されるものが、細胞あたりの総蛍光および前記細胞についてのバックグラウンド蛍光であり、いずれの場合にも特定の細胞について確認された全蛍光と前記細胞について確認されたバックグラウンド蛍光との間の差異として、細胞について同等の蛍光値が得られる、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
ステップａ）の分離が、遠心分離、沈降または濾過によって行われる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
非特異的結合部位および／またはＦｃ受容体をブロックするためのブロッキング試薬が、ｂ）およびａ２）の、それぞれが少なくとも１つの標識を有する、抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の添加の前に、細胞懸濁液、細胞懸濁液の部分量またはさらなる部分量に、いずれの場合も添加され、細胞懸濁液、細胞懸濁液の部分量またはさらなる部分量と混合される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
いずれのステップにおいても界面活性剤が使用されず、および／またはいずれのステップにおいても細胞が固定されない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
方法の全てのステップまたは少なくともステップｂ）およびｃ）または少なくともステップｂ）、ａ２）、ａ３）およびｃ）のステップが、この目的のために設計された機械によって自動化された方法で実施される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップａ１）において、２つ以上の部分量が分離され、ステップａ２）において抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物いずれの場合にも異なる量が各部分量へ添加され、およびそれぞれの部分量と混合され、ステップａ３）において、結合率の低下に達するのに必要な時間をそれぞれの部分量について求め、所望の時間内に低下する結合率が達成される量の抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物がその後ステップｂ）の実施のために選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
上皮細胞に特異的な他の抗原が、以下の群：
アンドロゲン受容体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦ受容体）、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ−１）、メランＡ、Ｂ７−Ｈ３、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ受容体）、Ｋｉ６７、インシュリン様成長因子受容体（ＩＧＦ受容体）およびＨｅｒ２ｎｅｕ、
から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成30年4月9日(2018.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは哺乳動物に由来し、および抗凝固剤と混合された血液試料または吸引試料中の上皮細胞の濃度を決定する方法であって、以下のステップ：
ａ）赤血球の溶解をもたらす緩衝液の添加により血液試料中または吸引試料中に存在する赤血球を溶解すること、この過程で溶解しなかった細胞を分離すること、および分離した細胞を緩衝液に懸濁させること、ここで赤血球が溶解される前に、血液試料または吸引試料を０℃〜４０℃の温度で少なくとも２４時間保存し、
ｂ）それぞれが少なくとも１つの標識を有し、およびそれぞれが上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）および／または少なくとも１つの上皮細胞に特異的な他の抗原に対する抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物を、ステップａ）で得られた細胞懸濁液または前記細胞懸濁液の部分量へ添加すること、ここで該部分量は分離によって得られたものであり、抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物と細胞懸濁液または該部分量とを混合すること、および結果として得られた混合物を、少なくとも抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の細胞への結合の結合速度の低下の達成に必要な時間インキュベートすること、ここでインキュベーションが少なくとも１２時間行われ、
ｃ）ステップｂ）で得られた混合物中の抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の結合によって標識された細胞の数を決定すること、および
ｄ）ステップｃ）でその数が決定された標識細胞の、血液試料または吸引試料中の濃度を計算すること、
を含む前記方法。
【請求項２】
以下のさらなるステップ：
ａ１）ステップａ）で得られた細胞懸濁物の少なくとも１つの部分量またはさらなる部分量を分離すること、
ａ２）それぞれが少なくとも１つの標識を有し、およびそれぞれが上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）および／または少なくとも１つの上皮細胞に特異的な他の抗原に対する抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物を、さらなる部分量中のそれらの濃度がステップｂ）の細胞懸濁液または部分量中の抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の濃度と同一であるような量でさらなる部分量へ添加すること、該抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物とさらなる部分量とを混合すること、および結果として得られた混合物を所定の温度でインキュベートすること、および
ａ３）前記さらなる部分量中に存在する細胞に結合した抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の量を、ステップａ２）の混合から開始する時間関数として連続的または反復的に決定すること、そこから結合速度を確定すること、および抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の前記細胞への結合の結合速度の低下の達成に必要な時間を決定すること、
が、ステップａ）とｂ）との間に実施され、ステップｂ）におけるインキュベーションが、所定の温度で行われ、ステップｂ）の時間が、少なくともステップａ３）で決定された時間と同じ長さであるように選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｂ）のインキュベーションが、所定の温度で行われる、および／または所定の温度が、０〜３０℃、特に０〜２０℃、特に２〜１５℃、特に８〜１５℃の範囲の温度である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｂ）のインキュベーションが、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも１８時間、少なくとも１９時間、少なくとも２０時間、少なくとも２１時間、少なくとも２２時間、少なくとも２３時間、少なくとも２４時間、少なくとも２５時間、少なくとも２６時間、少なくとも２７時間、少なくとも２８時間、少なくとも２９時間、または少なくとも３０時間で行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
標識が、蛍光色素による蛍光標識、発色団による色標識、またはビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはいくつかの他のアフィニティータグ、エピトープタグもしくはプロテインタグによる間接的に検出可能な標識である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップａ３）の結合された抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の量の決定および／またはステップｃ）の抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の結合によって標識された細胞の数の決定が、レーザー走査型サイトメトリー、蛍光顕微鏡または光学顕微鏡法によって行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
結合された抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の量の決定および／または標識された細胞の数の決定が、蛍光顕微鏡法または光学顕微鏡法によって行われ、および細胞を同定するために画像認識ソフトウェアが用いられる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
標識が蛍光標識であり、およびそれぞれの細胞についてレーザー走査型サイトメトリーまたは蛍光顕微鏡法で動的に決定されるものが、細胞あたりの総蛍光および前記細胞についてのバックグラウンド蛍光であり、いずれの場合にも特定の細胞について確認された全蛍光と前記細胞について確認されたバックグラウンド蛍光との間の差異として、細胞について同等の蛍光値が得られる、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
ステップａ）の分離が、遠心分離、沈降または濾過によって行われる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
非特異的結合部位および／またはＦｃ受容体をブロックするためのブロッキング試薬が、ｂ）およびａ２）の、それぞれが少なくとも１つの標識を有する、抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の添加の前に、細胞懸濁液、細胞懸濁液の部分量またはさらなる部分量に、いずれの場合も添加され、細胞懸濁液、細胞懸濁液の部分量またはさらなる部分量と混合される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
いずれのステップにおいても界面活性剤が使用されず、および／またはいずれのステップにおいても細胞が固定されない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
方法の全てのステップまたは少なくともステップｂ）およびｃ）または少なくともステップｂ）、ａ２）、ａ３）およびｃ）のステップが、この目的のために設計された機械によって自動化された方法で実施される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップａ１）において、２つ以上の部分量が分離され、ステップａ２）において抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物いずれの場合にも異なる量が各部分量へ添加され、およびそれぞれの部分量と混合され、ステップａ３）において、結合率の低下に達するのに必要な時間をそれぞれの部分量について求め、所望の時間内に低下する結合率が達成される量の抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物がその後ステップｂ）の実施のために選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
上皮細胞に特異的な他の抗原が、以下の群：
アンドロゲン受容体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦ受容体）、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ−１）、メランＡ、Ｂ７−Ｈ３、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ受容体）、Ｋｉ６７、インシュリン様成長因子受容体（ＩＧＦ受容体）およびＨｅｒ２ｎｅｕ、
から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
具体的には、本発明によるヒトまたは哺乳動物に由来し、抗凝固剤と混合された血液試料または吸引試料中の上皮細胞の濃度を決定する方法は、以下：
ａ）赤血球の溶解をもたらす緩衝液の添加により血液試料中または吸引試料中に存在する赤血球を溶解すること、この過程で溶解しなかった細胞を分離すること、および分離した細胞を緩衝液に懸濁させること、
ｂ）それぞれが少なくとも１つの標識を有し、およびそれぞれが上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）および／または少なくとも１つの上皮細胞に特異的な他の抗原に対する抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物を、ステップａ）で得られた細胞懸濁液または前記細胞懸濁液の部分量へ添加すること、ここで該部分量は分離によって得られたものであり、抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物と細胞懸濁液または該部分量とを混合すること、および結果として得られた混合物を、少なくとも抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の細胞への結合の結合速度の低下の達成に必要な時間インキュベートすること、ここでインキュベーションが少なくとも１２時間行われ、
ｃ）ステップｂ）で得られた混合物中の抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物の結合によって標識された細胞の数を決定すること、および
ｄ）ステップｃ）でその数が決定された標識細胞の、血液試料または吸引試料中の濃度を計算すること、のステップを含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
ステップｄ）の血液試料または吸引試料において、ステップｃ）でその数が決定された標識細胞の濃度を計算する場合、以前に実施された血液試料または吸引試料についての細胞の希釈および／または濃縮を考慮する必要がある。
【国際調査報告】
2018529085.tif 000002
2018529085.tif 000003
2018529085.tif 000004
2018529085.tif 000005
2018529085.tif 000006
2018529085.tif 000007