(57)【要約】  本発明は、医学生物学の分野に関し、プログラム死リガンド（ＰＤＬ１）に対する、単一ドメイン抗体およびその誘導体タンパク質を開示する。特に、本発明は、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ１）結合分子ならびにその使用、特にＰＤＬ１関連疾患、たとえば腫瘍の処置および／または防止または診断に対する使用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤＬ１に特異的に結合することができ、式Ａ−Ｌ−Ｂに示すアミノ酸配列からなるプログラム死リガンド１（ＰＤＬ１）結合分子であって、Ａが、免疫グロブリン単一可変ドメインを表し、Ｌが、存在しないかまたはアミノ酸リンカーを表し、Ｂが、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域を表す、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ１）結合分子。
【請求項２】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃ領域である、請求項１に記載のＰＤＬ１結合分子。
【請求項３】
前記免疫グロブリンＦｃ領域を変異させて、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性を除去してある、請求項１に記載のＰＤＬ１結合分子。
【請求項４】
前記免疫グロブリンＦｃ領域の配列が、配列番号７〜９から選択される、請求項１に記載のＰＤＬ１結合分子。
【請求項５】
前記リンカーが、長さ１〜２０アミノ酸である、請求項１から４のいずれか一項に記載のＰＤＬ１結合分子。
【請求項６】
前記ＰＤＬ１結合分子が、配列番号１０〜２７から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１から５のいずれか一項に記載のＰＤＬ１結合分子。
【請求項７】
以下の特徴：
（ａ）１×１０-7Ｍ未満のＫＤでヒトＰＤＬ１に結合する；；
（ｂ）ＰＤＬ１とＰＤ−１との相互作用を遮断する；
（ｃ）ＰＢＭＣおよび／またはＴ細胞の活性化を増強する；
（ｄ）腫瘍成長を阻害する
のうち少なくとも１つを有する、請求項１から６のいずれか一項に記載のＰＤＬ１結合分子。
【請求項８】
１×１０-7Ｍ未満、好ましくは１×１０-8Ｍ未満、より好ましくは１×１０-9Ｍ未満、より好ましくは１×１０-10Ｍ未満、さらにより好ましくは１×１０-11Ｍ未満のＫＤでＰＤＬ１に結合する、請求項１から７のいずれか一項に記載のＰＤＬ１結合分子。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載のＰＤＬ１結合分子をコードしている核酸分子。
【請求項１０】
発現調節エレメントに作動的に連結されている請求項９に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載の核酸分子を含む、または請求項１０に記載の発現ベクターで形質転換されており、前記ＰＤＬ１結合分子を発現することができる宿主細胞。
【請求項１２】
ａ）前記ＰＤＬ１結合分子の発現を可能にする条件下で請求項１１に記載の宿主細胞を培養することと；
ｂ）工程ａ）の前記培養から前記宿主細胞によって発現される前記ＰＤＬ１結合分子を回収することと；
ｃ）任意に、工程ｂ）から得られる前記ＰＤＬ１結合分子をさらに精製および／または修飾することと
を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のＰＤＬ１結合分子を産生する方法。
【請求項１３】
請求項１から８のいずれか一項に記載のＰＤＬ１結合分子および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
対象に請求項１から８のいずれか一項に記載のＰＤＬ１結合分子または請求項１３に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、対象においてがんを防止および／または処置する方法。
【請求項１５】
前記対象に追加の抗腫瘍治療的手段を投与することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記追加の抗腫瘍治療的手段が、化学療法、放射線療法または他の腫瘍特異抗原に対する抗体を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
他の腫瘍特異抗原に対する前記抗体が、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥＧＦＲバリアント抗体、抗ＶＥＧＦａ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、または抗ＣＭＥＴ抗体を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
他の腫瘍特異抗原に対する前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記がんが、肺がん、卵巣がん、大腸がん、直腸がん、黒色腫、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、肝臓がん、リンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部がん、膠腫、胃がん、鼻咽頭がん、喉頭がん、子宮頸がん、子宮体がん、骨肉腫からなる群から選択される、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
対象に請求項１から８のいずれか一項に記載のＰＤＬ１結合分子または請求項１３に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、対象において感染性疾患を防止および／または処置する方法。
【請求項２１】
前記感染性疾患が、ＨＩＶ、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、ジアルジア、プラスモディウム、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からなる群から選択される病原体によって引き起こされる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
対象に請求項１から８のいずれか一項に記載のＰＤＬ１結合分子または請求項１３に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、対象において慢性炎症性疾患を防止および／または処置する方法。
【請求項２３】
前記慢性炎症性疾患が、扁平苔癬またはＴ細胞により媒介される慢性炎症性皮膚粘膜疾患である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
がん、感染性疾患もしくは慢性炎症性疾患を防止および／または処置するための医薬の調製における、請求項１から８のいずれか一項に記載のＰＤＬ１結合分子または請求項１３に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学生物学の分野に関し、プログラム死リガンド（ＰＤＬ１）に対する、単一ドメイン抗体およびその誘導体タンパク質を開示する。特に、本発明は、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ１）結合分子ならびにその使用、特にＰＤＬ１関連疾患、たとえば腫瘍の処置および／または防止または診断に対する使用を開示する。
【背景】
【０００２】
プログラム死１（ＰＤ−１）は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１およびＢＴＬＡを含む受容体のＣＤ２８ファミリーのメンバーである。ファミリーの初期メンバー、ＣＤ２８およびＩＣＯＳは、モノクローナル抗体の添加後にＴ細胞増殖を増大させる機能的効果によって発見された（Ｈｕｔｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ３９７：２６３〜２６６；Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｓ  １０：２４７〜２６０）。ＰＤ−１に対する細胞表面糖タンパク質リガンドの２つ、ＰＤＬ１およびＰＤ−Ｌ２が同定され、ＰＤ−１に結合するとＴ細胞活性化およびサイトカイン分泌を下方調節することが示された（Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２：１０２７〜３４；Ｌａｔｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：２６１〜８；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２：６３４〜４３；Ｏｈｉｇａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：２９４７〜５３）。ＰＤＬ１（Ｂ７−Ｈ１）とＰＤＬ２（Ｂ７−ＤＣ）の両方は、ＰＤ−１には結合するが、他のＣＤ２８ファミリーメンバーには結合しないＢ７ホモログである（Ｂｌａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）。細胞表面におけるＰＤＬ１の発現が、ＩＦＮ−γ刺激によって上方調節されることも示されている。
【０００３】
ＰＤＬ１発現は、ヒト肺、卵巣および結腸癌腫ならびに様々な骨髄腫を含めたいくつかのマウスおよびヒトがんに見られた（Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＰＮＡＳ  ９９：１２２９３〜７；Ｏｈｉｇａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：２９４７〜５３）。現在利用可能な結果から、腫瘍細胞において過剰発現するＰＤＬ１は、Ｔ細胞のアポトーシスを増加させることによる腫瘍免疫回避に重要な役割を果たすことが明らかである。研究者らは、ＰＤＬ１遺伝子をトランスフェクトされたＰ８１５腫瘍細胞株は、ＣＴＬによる特定の溶解に抵抗性になることができ、催腫瘍性および浸潤活性を増加させたことを見いだした。これらの生物活性は、ＰＤＬ１を遮断することによって後退させることができる。ＰＤＬ１をノックアウトしてＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用を遮断したマウスに移植した腫瘍細胞は、腫瘍を形成することができない（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ８：７９３〜８００）。ＰＤＬ１は、腸粘膜の炎症に関係する可能性があり、ＰＤＬ１の阻害が、大腸炎と関連する消耗性疾患を抑制することも示唆された（Ｋａｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：４１５６〜６３）。
【０００４】
高い親和性でＰＤＬ１に結合することができ、ＰＤ−１へのＰＤＬ１の結合を遮断することができる抗ＰＤＬ１抗体、特にＰＤＬ１に対する重鎖単一ドメイン抗体に対する必要性が、当業者にはなお存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、ファージディスプレイ技術でスクリーニングすることによって高い特異性、高い親和性および高い安定性を持つ抗ＰＤＬ１重鎖単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）を得た。
【０００６】
第１の側面において、本発明は、配列番号１〜６から選択されるアミノ酸配列およびヒト免疫グロブリンＦｃ領域からなる免疫グロブリン単一可変ドメインを含むＰＤＬ１結合分子を提供する。
【０００７】
別の側面において、本発明は、ＰＤＬ１結合分子をコードしている核酸分子ならびに前記核酸分子を含有する発現ベクターおよび宿主細胞に関する。
【０００８】
本発明は、発明のＰＤＬ１結合分子を含む、医薬組成物にさらに関する。
【０００９】
本発明は、本発明のＰＤＬ１結合分子を産生する方法にさらに関する。
【００１０】
本発明は、本発明のＰＤＬ１結合分子および医薬組成物の使用、特にＰＤＬ１関連疾患を防止および／または処置するための使用ならびに方法にさらに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＰＤ１／ＰＤＬ１相互作用に対するＰＤＬ１重鎖単一ドメイン抗体の遮断効果を示す。
【図２】図２は、ＰＤＬ１抗原タンパク質に対するＰＤＬ１重鎖単一ドメイン抗体の結合曲線を示す。
【図３】図３は、ＰＤ１／ＰＤＬ１相互作用に対するＰＤＬ１重鎖単一ドメイン抗体の遮断曲線を示す。
【図４】図４は、抗体番号５の５つのヒト化バリアント配列の整列化を示す。
【図５】図５は、ＰＤＬ１に対するＰＤＬ１単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質の結合曲線を示す（ＥＬＩＳＡによる）。
【図６】図６は、ＰＤ１／ＰＤＬ１相互作用に対するＰＤＬ１単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質の遮断曲線を示す（競合ＥＬＩＳＡによる）。
【図７】図７は、ＣＤ８０／ＰＤＬ１相互作用に対するＰＤＬ１単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質の遮断曲線を示す（競合ＥＬＩＳＡによる）。
【図８】図８は、ＰＤ１／２９３−ＰＤＬ１相互作用に対する、ＰＤＬ１単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質の遮断曲線を示す（ＦＡＣＳによる）。
【図９】図９は、Ｊｕｒｋｅｔ−ＰＤ１／ＰＤＬ１相互作用に対するＰＤＬ１単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質の遮断曲線を示す（ＦＡＣＳによる）。
【図１０】図１０は、フローサイトメトリーによって検出されるＰＤＬ１タンパク質に対するＰＤＬ１単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質の結合特異性を示す。
【図１１】図１１は、フローサイトメトリーによって検出されるサルＰＤＬ１タンパク質に対するＰＤＬ１単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質の結合を示す。
【図１２】図１２は、ＰＤＬ１単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質が、患者由来組織切片上のＰＤＬ１陽性細胞集団を同定することを示す。
【図１３】図１３は、ＰＤＬ１単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質によるＰＢＭＣの活性化を示す。
【図１４】図１４は、ＰＤＬ１単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質によるＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示す。
【図１５】図１５は、ＰＤＬ１単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質が、ＩＬ−２の分泌を促進することを示す。
【図１６】図１６は、変異させたＦｃを保有するＰＤＬ１単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質のＣＤＣおよびＡＤＣＣ活性を示す。
【図１７】図１７は、ＰＤＬ１単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質による処置後の腫瘍成長曲線を示す。
【図１８】図１８は、ＰＤＬ１単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質を様々な回数投与することによる腫瘍成長の阻害を示す。
【図１９】図１９は、ｈｕ５６Ｖ２−Ｆｃおよび２．４１の腫瘍成長阻害活性の比較を示す。Ａ、Ａ３７５：ＰＢＭＣ＝５：１；Ｂ、Ａ３７５：ＰＢＭＣ＝１：１。
【図２０】図２０は、ＰＤＬ１単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質の活性に対するアルカリおよび酸化処理の影響を示す。
【発明の詳細な説明】
【００１２】
定義
特に明記および規定されない限り、使用される用語はすべて当技術分野における通常の意味を有し、それは当業者に明らかになる。参照は、たとえば、標準的なハンドブック、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（２ｎｄ  Ｅｄ．）、ｖｏｌ．１〜３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｌｅｗｉｎ、「Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９９０）ａｎｄ  Ｒｏｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（２ｎｄ  Ｅｄ．）、Ｇｏｗｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｌｏｎｄｏｎ、  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）ならびにここで引用した一般的な背景技術に得られる。さらに、特に明記されない限り、特別に詳述されていない方法、工程、技術および操作はすべて、当業者に明らかになるようなそれ自体公知の様式で実行することができ、実行された。参照は、たとえば標準的なハンドブック、上記の一般的な背景技術、およびその中のさらなる引用文献に同様に得られる。
【００１３】
特に明記されない限り、交換可能な用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、重鎖抗体または従来通りの４鎖抗体を指すためにここで使用されるかどうかにかかわらず、完全サイズ抗体、その個々の鎖と、そのすべての部分、ドメインまたは断片（抗原結合ドメインまたは断片、たとえばそれぞれＶＨＨドメインまたはＶＨ／ＶＬドメインを含むがこれに限定されない）の両方を含む一般的な用語として使用される。加えて、ここで使用される用語「配列」（たとえば「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「（単一）可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」または「タンパク質配列」の様な用語において）は、文脈がより限定的な解釈を必要としない限り、関連するアミノ酸配列と核酸配列または同じものをコードしている核酸配列の両方を含むと一般に理解されるべきである。
【００１４】
ここで使用される用語（ポリペプチドまたはタンパク質の）「ドメイン」とは、タンパク質の他の部位とは独立した３次構造を保持する能力を有する折り畳まれたタンパク質構造のことを指す。一般に、ドメインは、タンパク質の別々の機能特性に関与し、多くの場合、タンパク質および／もしくはドメインの残りの機能を失うことなく他のタンパク質に付加、除去または移し得る。
【００１５】
ここで使用される用語「免疫グロブリンドメイン」は、抗体鎖（たとえば従来通りの４鎖抗体または重鎖抗体の鎖など）の球状領域、またはそのような球状領域から本質的になるポリペプチドのことを指す。免疫グロブリンドメインは、抗体分子の免疫グロブリンフォールドの特徴を保持することを特徴とし、免疫グロブリンフォールドは、２つのβシート間に配置された約７つの逆平行β鎖の２層サンドイッチからなり、保存されているジスルフィド結合によって任意に安定化される。
【００１６】
ここで使用される用語「免疫グロブリン可変ドメイン」は、４つの「フレームワーク領域」から本質的になる免疫グロブリンドメインを意味し、フレームワーク領域は、当技術分野および以下においてそれぞれ「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」；および「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」と称され；フレームワーク領域は、３つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」によって中断され、相補性決定領域は、当業者および以下においてそれぞれ「相補性決定領域」または「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」；および「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」と称される。したがって、免疫グロブリン可変ドメインの全体構造または配列は：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４と示すことができる。これが、抗原結合部位を保有することによって抗体に抗原に対する特異性を付与する免疫グロブリン可変ドメインである。
【００１７】
ここで使用される用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」とは、さらなる可変免疫グロブリンドメインと対合せずに抗原のエピトープに特異的に結合できる免疫グロブリン可変ドメインを意味する。本発明の意味における免疫グロブリン単一可変ドメインの１例は、「ドメイン抗体」、たとえば免疫グロブリン単一可変ドメインＶＨおよびＶＬ（ＶＨドメインおよびＶＬドメイン）である。免疫グロブリン単一可変ドメインの別の例は、以下に定義されるラクダ科動物由来の「ＶＨＨドメイン」（または、単に「ＶＨＨ」）である。
【００１８】
「ＶＨＨドメイン」、別名重鎖単一ドメイン抗体、ＶＨＨ、ＶHＨドメイン、ＶＨＨ抗体断片およびＶＨＨ抗体は、「重鎖抗体」（すなわち、「軽鎖がない抗体」）の抗原結合免疫グロブリン可変ドメインである（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  Ｃ，Ａｔａｒｈｏｕｃｈ  Ｔ，Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｓ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｇ，Ｈａｍｅｒｓ  Ｃ，Ｓｏｎｇａ  ＥＢ，Ｂｅｎｄａｈｍａｎ  Ｎ，Ｈａｍｅｒｓ  Ｒ．：「Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｅｖｏｉｄ  ｏｆ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ」；Ｎａｔｕｒｅ  ３６３、４４６〜４４８（１９９３））。用語「ＶＨＨドメイン」は、これらの可変ドメインを従来通りの４鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（ここで「ＶＨドメイン」と称する）および従来通りの４鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（ここで「ＶＬドメイン」と称する）と区別するために選ばれた。ＶＨＨドメインは、（エピトープが、ＶＨドメインと一緒になったＶＬドメインによって認識される従来通りの４鎖抗体におけるＶＨまたはＶＬドメインとは対照的に）追加の抗原結合ドメインなしにエピトープに特異的に結合することができる。ＶＨＨドメインは、単一の免疫グロブリンドメインによって形成される小さく、強力で、効果的な抗原認識単位である。
【００１９】
本発明の文脈において、用語重鎖単一ドメイン抗体、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ、ＶHＨドメイン、ＶＨＨ抗体断片、ＶＨＨ抗体ならびに「ナノボディ［登録商標］」および「ナノボディ［登録商標］ドメイン」（「ナノボディ」は、企業Ａｂｌｙｎｘ  Ｎ．Ｖ．；Ｇｈｅｎｔ；Ｂｅｌｇｉｕｍの商標である）は、互換的に使用される。
【００２０】
ラクダ科動物由来のＶＨＨドメインのアミノ酸残基は、たとえばＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１、２５〜３８（１９９９）の図２に示されるように、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、アメリカ合衆国公衆衛生局、ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、公開番号９１）によって提供されるＶＨドメインの一般的な番号付けにしたがって付番される。
この番号付けによると、
・ＦＲ１はアミノ酸残基１〜３０位を含み、
・ＣＤＲ１はアミノ酸残基３１〜３５位を含み、
・ＦＲ２はアミノ酸３６〜４９位を含み、
・ＣＤＲ２はアミノ酸残基５０〜６５位を含み、
・ＦＲ３はアミノ酸残基６６〜９４位を含み、
・ＣＤＲ３はアミノ酸残基９５〜１０２位を含み、
・ＦＲ４はアミノ酸残基１０３〜１１３位を含む。
【００２１】
しかしながら、ＶＨドメインおよびＶＨＨドメインについて当技術分野において周知であるように、ＣＤＲのそれぞれにおけるアミノ酸残基の総数は変動してもよく、Ｋａｂａｔ付番によって示されるアミノ酸残基の総数と一致しなくてもよい点に留意する必要がある（すなわち、Ｋａｂａｔ付番による１つ以上の位置が、実際の配列において使用されていなくてもよく、または実際の配列が、Ｋａｂａｔ付番によって可能になる数より多くのアミノ酸残基を含有してもよい）。これは、一般に、Ｋａｂａｔによる番号付けが、実際の配列におけるアミノ酸残基の実際の番号付けと一致してもしなくてもよいことを意味する。
【００２２】
ＶＨＨドメインと類似の様式で適用することもできる、ＶＨドメインのアミノ酸残基を番号付けする別法が当業者に公知である。しかしながら、特に明記されない限り本説明、請求項および図において、Ｋａｂａｔにしたがい、上記の通りＶＨＨドメインに適用された番号付けに、したがうことになる。
【００２３】
ＶＨＨドメイン中のアミノ酸残基の総数は、通常１１０〜１２０、しばしば１１２〜１１５になる。しかしながら、より小さいおよびより長い配列が、ここで記述される目的に適切であってもよい点に留意すべきである。
【００２４】
ＶＨＨドメインおよび同じものを含有するポリペプチドのさらなる構造的特徴および機能特性を、以下の通り要約することができる：
ＶＨＨドメイン（軽鎖可変ドメインの存在なしに、およびそれとどんな相互作用もなしに抗原に機能的に結合するように天然に「設計されている」）は、単一の、比較的小さい機能的抗原結合構造単位、ドメインまたはポリペプチドとして機能することができる。これにより、ＶＨＨドメインは従来通りの４鎖抗体のＶＨおよびＶＬドメインと区別され、一般に、ＶＨおよびＶＬドメインは、それだけでは単一抗原結合タンパク質または免疫グロブリン単一可変ドメインとしての実際の適用に適しておらず、機能的抗原結合単位を得るにはなんらかのまたは別の形態と組み合わせる必要がある（たとえば従来通りの抗体断片、たとえばＦａｂ断片；ＶＬドメインと共有結合したＶＨドメインからなるｓｃＦｖなど）。
【００２５】
これらの特異な性質のため、ＶＨＨドメインの、単独またはより大きなポリペプチドの一部としていずれかの使用は、従来通りのＶＨおよびＶＬドメイン、ｓｃＦｖまたは従来通りの抗体断片（たとえばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2断片）の使用より有意な利点を多く提供し：
・高い親和性および高い選択性で抗原を結合するのに単一ドメインだけを必要とし、したがって別々のドメインが２つ存在する必要性はなく、これら２つのドメインが正しい空間的立体配座および構成で存在する（すなわち、ｓｃＦｖと同じ特別に設計されたリンカーの使用による）ことを保証する必要もない；
・ＶＨＨドメインは、単一遺伝子から発現させることができ、翻訳後の畳み込みまたは修飾を必要としない；
・ＶＨＨドメインは、多価および多重特異的形式（形式化された）に容易に操作することができる；
・ＶＨＨドメインは高溶解性であり、凝集傾向を有さない；
・ＶＨＨドメインは、熱、ｐＨ、プロテアーゼおよび他の変性剤または条件に対して非常に安定しており、したがって、冷凍装置を使用せずに調製、貯蔵または輸送されてもよく、運搬費用、時間および環境の節約になる；
・ＶＨＨドメインは、生産に必要とする規模でも、調製が容易であり、比較的安価である；
・ＶＨＨドメインは、従来通りの４鎖抗体およびその抗原結合断片と比較して比較的小さく（およそ１５ｋＤａ、または従来通りのＩｇＧより１０倍小さい）、したがって組織への（より）高い侵入を示し、従来通りの４鎖抗体およびその抗原結合断片より高い用量で投与することができる；
・ＶＨＨドメインは、いわゆる空洞結合特性（特に、従来通りのＶＨドメインと比較して拡張されたＣＤＲ３ループによる）を示すことができ、したがって従来通りの４鎖抗体ならびにその抗原結合断片には接近しにくい標的およびエピトープに接近することもできる。
【００２６】
特定の抗原またはエピトープに結合するＶＨＨドメインを得る方法は、たとえばＷＯ２００６／０４０１５３およびＷＯ２００６／１２２７８６；Ｒ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４０（２０００）１８５〜１９５；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２８７（２０１２）１３７１３〜１３７２１；Ｄｅｆｆａｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｆｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．８（１２）、ｐｐ．２６４５〜２６５２、２００９年６月１７日およびＷＯ９４／０４６７８に以前に記述されている。
【００２７】
ラクダ科動物から得られるＶＨＨドメインは、元のＶＨＨ配列のアミノ酸配列中にある１つ以上のアミノ酸残基を、人間の従来通りの４鎖抗体由来ＶＨドメインの対応する位置に存在する１つ以上のアミノ酸残基で置き換えることによって「ヒト化する」ことができる。ヒト化ＶＨＨドメインは、１つ以上の完全ヒトフレームワーク領域配列を含有することができ、特定の態様において、ＩＧＨＶ３ヒトフレームワーク領域配列を含有する。
【００２８】
一般に、用語「特異性」とは、特定の抗原結合分子または抗原結合タンパク質（たとえば本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン）分子が結合し得る異なる型の抗原もしくはエピトープの数のことを指す。抗原結合分子の特異性は、親和性および／または結合活性に基づいて決定することができる。抗原と抗原結合タンパク質との解離に対する平衡定数によって表される親和性（ＫＤ）は、エピトープと抗原結合タンパク質上の抗原結合部位との結合強度の尺度であり：ＫＤ値がより小さいほど、エピトープと抗原結合分子の間の結合強度はより強い（別法として、親和性は親和定数（ＫＡ）として表すこともでき、それは１／ＫＤである）。当業者には明らかになるように、親和性は、対象となる特定の抗原に応じて、それ自体公知の様式で決定することができる。結合活性は、抗原結合分子（たとえば免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、またはそれを含有するポリペプチド）と関連抗原との結合の強度の尺度である。結合活性は、エピトープと抗原結合分子上の抗原結合部位との親和性と抗原結合分子に存在する関連結合部位の数の両方と関係する。
【００２９】
一般に、特異的な結合分子は、１０-7〜１０-11モル／リットル（Ｍ）、好ましくは１０-8〜１０-11モル／リットル、より好ましくは１０-9〜１０-11モル／リットル、さらにより好ましくは１０-10〜１０-11モル／リットルもしくはそれ未満の解離定数（ＫＤ）（ＢｉａｃｏｒｅまたはＫｉｎＥｘＡアッセイにおいて測定される）、および／または少なくとも１０7Ｍ-1、好ましくは少なくとも１０8Ｍ-1、より好ましくは少なくとも１０9Ｍ-1、より好ましくは少なくとも１０10Ｍ-1、たとえば少なくとも１０10Ｍ-1の会合定数（ＫＡ）でＰＤＬ１に結合することになる。１０-4Ｍより大きいどんなＫＤ値も、非特異的結合を示すと一般に見なされる。抗原またはエピトープへの抗原結合タンパク質の特異的結合は、たとえば、ここで記述されるアッセイ、スキャッチャード解析ならびに／または競合結合アッセイ、たとえば放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイを含めたそれ自体公知の任意の適切な様式で決定することができる。
【００３０】
アミノ酸残基は、一般に公知であり、当業者に同意されているので、標準的な３文字または１文字アミノ酸コードにしたがって示すことになる。２つのアミノ酸配列を比較する場合、用語「アミノ酸の差異」とは、第２の配列と比較して、参照配列の位置に表示された数のアミノ酸残基の挿入、欠失または置換のことを指す。置換の場合、そのような置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換であることになり、保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が類似の化学構造の別のアミノ酸残基で置き換えられることを意味し、その置換は、ポリペプチドの機能、活性もしくは他の生物学的特性に影響がほとんどないまたは本質的にない。そのような保存的アミノ酸置換は、当業者に周知であり、保存的アミノ酸置換は、好ましくは以下の群（ｉ）〜（ｖ）内の１つのアミノ酸が同じ群内の別のアミノ酸残基によって置換される置換である：（ｉ）小さい脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＰｒｏおよびＧｌｙ；（ｉｉ）極性の、負荷電を持つ残基およびそれらの（無荷電の）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｉｎ；（ｉｉｉ）極性の、正荷電を持つ残基：Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓ；（ｉｖ）大きな脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｈｅ、ＶａｌおよびＣｙｓ；ならびに（ｖ）芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ。特に好ましい保存的アミノ酸置換は、以下の通りである：ＡｌａからＧｌｙまたはＳｅｒへ；ＡｒｇからＬｙｓへ；ＡｓｎからＧｌｎまたはＨｉｓへ；ＡｓｐからＧｌｕへ；ＣｙｓからＳｅｒへ；ＧｌｎからＡｓｎへ；ＧｌｕからＡｓｐへ；ＧｌｙからＡｌａまたはＰｒｏへ；ＨｉｓからＡｓｎまたはＧｌｎへ；ＩｌｅからＬｅｕまたはＶａｌへ；ＬｅｕからＩｌｅまたはＶａｌへ；ＬｙｓからＡｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｕへ；ＭｅｔからＬｅｕ、ＴｙｒまたはＩｌｅへ；ＰｈｅからＭｅｔ、ＬｅｕまたはＴｙｒへ；ＳｅｒからＴｈｒへ；ＴｈｒからＳｅｒへ；ＴｒｐからＴｙｒへ；ＴｙｒからＴｒｐまたはＰｈｅへ；ＶａｌからＩｌｅまたはＬｅｕへ。
【００３１】
ポリペプチドまたは核酸分子は、たとえば、それが得られた天然の生物学的供給源および／または反応培地もしくは培養培地と比較した際に、前記供給源または培地中に通常付随する少なくとも１つの他の構成要素、たとえば別のタンパク質／ポリペプチド、別の核酸、別の生物学的構成要素もしくは巨大分子または少なくとも１つの夾雑物、不純物もしくは微量構成要素から分離されている場合、「本質的に単離されている」と見なされる。特に、ポリペプチドまたは核酸分子は、それが少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、より特に少なくとも１００倍、および１０００倍またはより高くまで精製されている場合、「本質的に単離されている」と見なされる。「本質的に単離されている形態の」ポリペプチドまたは核酸分子は、適切な技術、たとえば適切なクロマトグラフ技術、たとえばポリアクリルアミドゲル電気泳動法を使用して決定されるように好ましくは本質的に同質である。
【００３２】
ここで使用される用語「対象」とは、哺乳動物、特に霊長類、特にヒトのことを指す。
本発明のＰＤＬ１結合分子
第１の側面において、本発明は、ＰＤＬ１に特異的に結合することができ、式Ａ−Ｌ−Ｂに示すアミノ酸配列からなるプログラム死リガンド１（ＰＤＬ１）結合分子を提供し、Ａは、免疫グロブリン単一可変ドメインを表し、Ｌは、存在しないかまたはアミノ酸リンカーを表し、Ｂは、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域を表し、免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号１〜６から選択されるアミノ酸配列からなり、前記ＰＤＬ１結合分子は、前記ヒト免疫グロブリンＦｃ領域によってホモ二量体を形成することができる。
【００３３】
ここで使用される「ヒト免疫グロブリンＦｃ領域」とは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の定常領域（定常領域のアミノ酸配列は、ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇタンパク質データベースにおけるアイテムＰ０１８５７、Ｐ０１８５９、Ｐ０１８６０、Ｐ０１８６１を指す）由来のＦｃ領域のことを指し、ヒンジ領域もしくはヒンジ領域の部分、免疫グロブリン定常領域のＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む。本発明において、「ヒト免疫グロブリンＦｃ領域」のアミノ酸配列のＣＨ２領域内のアミノ酸１〜５個を突然変異させることによってＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性を増加もしくは除去してもよく、またはＦｃＲｎの親和性を増加もしくは低下させてもよく；またはヒンジ領域内のアミノ酸１〜４個を突然変異させることによってタンパク質安定性を増加させることができる。しかしながら、本発明において、「ヒト免疫グロブリンＦｃ領域」は、Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進または防止するいかなる突然変異も含まず、またＦｃ断片のＮ末端またはＣ末端に他の機能的タンパク質配列を付加するいかなる修飾も含まない。
【００３４】
好ましい態様において、前記免疫グロブリンＦｃ領域を変異させて、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性を除去してある。特定の態様において、前記免疫グロブリンＦｃ領域の配列は、配列番号７〜９から選択される。
【００３５】
当業者は、本発明のＰＤＬ１結合分子が、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域のため、ホモ二量体の形態を一般に示すことになると理解しよう。
【００３６】
ここで使用される用語「リンカー」とは、２次またはより高次の構造を持たない長さ１〜２０アミノ酸残基の非機能的アミノ酸配列を意味する。たとえば、前記リンカーは、可動性リンカー、たとえばＧＧＧＳ、ＧＳ、ＧＡＰなどである。
【００３７】
いくつかの態様において、本発明のＰＤＬ１結合分子は、配列番号１０〜２７から選択されるアミノ酸配列からなる。
【００３８】
本発明のＰＤＬ１結合分子は、以下の特徴のうち少なくとも１つを有する：
（ａ）１×１０-7Ｍ未満のＫＤでヒトＰＤＬ１に結合する；
（ｂ）ＰＤＬ１とＰＤ−１との相互作用を遮断する；
（ｃ）ＰＢＭＣおよび／またはＴ細胞の活性化を増強する；
（ｄ）腫瘍成長を阻害する。
【００３９】
本発明のＰＤＬ１結合分子は、１×１０-7Ｍ未満、好ましくは１×１０-8Ｍ未満、より好ましくは１×１０-9Ｍ未満、より好ましくは１×１０-10Ｍ未満およびさらにより好ましくは１×１０-11Ｍ未満のＫＤでＰＤＬ１に結合してもよい。
【００４０】
いくつかの態様において、本発明のＰＤＬ１結合分子は、ヒトＰＤＬ１に特異的に結合し、ＰＤＬ１とＰＤ−１との相互作用を遮断することができる。いくつかの態様において、本発明のＰＤＬ１結合分子は、ヒトＰＤＬ１に特異的に結合し、ＰＤＬ１とＣＤ８０との相互作用を遮断することができる。
【００４１】
本発明のＰＤＬ１結合分子は、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％およびより好ましくは少なくとも約８０％腫瘍成長を阻害することができる。
【００４２】
さらにまた、本発明のＰＤＬ１結合分子は、アルカリ処理および酸化処理に抵抗性である。たとえば、本発明のＰＤＬ１結合分子は、強塩基（たとえば５００ｍＭ重炭酸アンモニウム）で約８時間、好ましくは約１６時間、より好ましくは約２４時間、より好ましくは約３２時間処理した後にその活性を維持する。別法として、本発明のＰＤＬ１結合分子は、酸化剤（１％過酸化水素）で約２時間、好ましくは約４時間、より好ましくは約８時間処理した後にその活性を維持している。
【００４３】
加えて、本発明のＰＤＬ１結合分子は、高濃度で安定している。たとえば、本発明のＰＤＬ１結合分子は、凝集体を形成することなく約１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約１５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約２００ｍｇ／ｍｌ、またはより好ましくは約２５０ｍｇ／ｍｌの濃度で安定した状態を保つ。
核酸、ベクターおよび宿主細胞
別の側面において、本発明は、本発明のＰＤＬ１結合分子をコードする核酸分子に関する。本発明の核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡであってもよい。本発明の一態様によると、本発明の核酸は、本質的に単離された形態である。
【００４４】
本発明の核酸は、ベクター、たとえばプラスミド、コスミドもしくはＹＡＣの形態であってもよく、存在してもよくおよび／またはその部分であってもよい。特に、ベクターは発現ベクター、すなわちｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで（すなわち適切な宿主細胞、宿主生物および／または発現系で）ＰＤＬ１結合分子の発現を提供することができるベクターであってもよい。そのような発現ベクターは、１つ以上の適切な調節エレメント、たとえばプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどに作動的に連結される本発明の核酸を少なくとも１つ一般に含む。特定の宿主における特定の配列の発現を考慮するとそのようなエレメントおよびその選択は、当業者の周知の事実である。本発明のＰＤＬ１結合分子を発現するのに有用または必要な調節エレメントおよび他のエレメントの特定の例には、たとえばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、組み込み因子、選択マーカー、リーダー配列、レポーター遺伝子などがある。
【００４５】
本発明の核酸は、ここで与えられる本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に関する情報に基づいてそれ自体公知の様式で（たとえばオートメーション化したＤＮＡ合成および／または組換えＤＮＡ技術によって）調製もしくは得られてもよく、および／または適切な天然の供給源から単離することができる。
【００４６】
別の側面において、本発明は、本発明のＰＤＬ１結合分子を１つ以上発現するもしくは発現できる；および／または本発明の核酸を含有する宿主細胞に関する。特に好ましい態様によると、前記宿主細胞は、細菌細胞であり；他の有用な細胞は、酵母細胞、真菌細胞または哺乳動物細胞である。
【００４７】
適切な細菌細胞には、グラム陰性細菌株、たとえば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、プロテウス属およびシュードモナス属の株ならびにグラム陽性細菌株、たとえばバシラス属、ストレプトマイセス属、スタフィロコッカス属およびラクトコッカス属の株由来の細胞がある。
【００４８】
適切な真菌細胞には、トリコデルマ属、アカパンカビ属およびアスペルギルス属の種由来の細胞がある。適切な酵母細胞には、サッカロミセス属（たとえば、酵母［Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ］）、シゾサッカロミセス属（たとえば、シゾサッカロミセス・ポンベ［Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）］）、ピキア属（たとえば、ピキア・パストリス［Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ］およびピキア・メタノリカ［Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ］）およびハンゼヌラ属の種由来の細胞がある。
【００４９】
適切な哺乳動物細胞には、たとえばＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞などがある。
【００５０】
しかしながら、異種タンパク質の発現のために当業者に使用される両生類細胞、昆虫細胞、植物細胞および他の任意の細胞も、同様に使用することができる。
【００５１】
本発明は、本発明のＰＤＬ１結合分子を製造する方法をさらに提供し、そのような方法は：
・本発明のＰＤＬ１結合分子の発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程と；
・培養から宿主細胞によって発現されたＰＤＬ１結合分子を回収する工程と；
・任意に、本発明のＰＤＬ１結合分子をさらに精製および／または修飾する工程と
を一般に含む。
【００５２】
好ましい態様において、本発明のＰＤＬ１結合分子は、哺乳動物細胞を使用することによって産生される。本発明のＰＤＬ１結合分子は、哺乳動物細胞において高発現を達成することができる。たとえば、発現レベルは、最高約５ｇ／Ｌ、好ましくは約６ｇ／Ｌ、好ましくは約７ｇ／Ｌ、好ましくは約８ｇ／Ｌ、好ましくは約９ｇ／Ｌ、好ましくは約１０ｇ／Ｌまたはより高くあり得る。
【００５３】
本発明のＰＤＬ１結合分子は、上に示したように細胞内的に細胞内（たとえばサイトソル内、ペリプラズム内または封入体内）で産生され、次いで宿主細胞から単離され、任意にさらに精製されてもよく；またはそれらは細胞外（たとえば、宿主細胞が培養される培地中）で産生され、次いで培養培地から単離され、任意にさらに精製され得るかいずれかである。
【００５４】
ポリペプチドの組換え生産に使用される方法および試薬、たとえば特定の適切な発現ベクター、形質転換またはトランスフェクション方法、選択マーカー、タンパク質発現の誘導の方法、培養条件などは、当業者に公知である。同様に、本発明のＰＤＬ１結合分子の製造の方法に有用なタンパク質単離および精製技術は、当業者に周知である。
【００５５】
しかしながら、本発明のＰＤＬ１結合分子は、タンパク質を生産するための当業者に公知の他の方法、たとえば固相または液相合成を含めた化学合成によって得ることもできる。
医薬組成物
別の側面において、本発明は、組成物、たとえば、本発明のＰＤＬ１結合分子の１つまたは組み合わせを含有し、薬学的に許容可能な担体と一緒に処方された医薬組成物を提供する。そのような組成物は、本発明のＰＤＬ１結合分子の１つもしくは組み合わせ（たとえば、異なる２つ以上）を含んでもよい。当業者は、本発明のＰＤＬ１結合分子が、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域のため、ホモ二量体の形態を一般に示すことになると理解しよう。
【００５６】
本発明の医薬組成物は、併用療法で、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。たとえば併用療法は、少なくとも１つの他の抗腫瘍薬と組み合わされた本発明のＰＤＬ１結合分子を含むことができる。たとえば、本発明のＰＤＬ１結合分子は、他の腫瘍特異抗原を標的としている抗体と組み合わせて投与されてもよい。他の腫瘍特異抗原を標的とする前記抗体には、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥＧＦＲバリアント抗体、抗ＶＥＧＦａ抗体、抗ＨＥＲ２抗体または抗ＣＭＥＴ抗体があるが、これに限定されない。好ましくは、前記抗体は、モノクローナルである。
【００５７】
ここで使用される「薬学的に許容可能な担体」には、生理的に適合するあらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などがある。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（たとえば、注射または輸液による）に適切である。投与経路によっては、活性化合物、すなわち抗体またはイムノコンジュゲートは、化合物を不活性化する可能性がある酸および他の天然の条件の作用から化合物を保護するための材料でコーティングされてもよい。
【００５８】
本発明の医薬化合物は、１つ以上の薬学的に許容できる塩を含んでもよい。「薬学的に許容できる塩」とは、親化合物の所望の生物活性を保持し、任意の望ましくない毒物学的な効果をもたらさない塩のことを指す（たとえば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１〜１９を参照のこと）。そのような塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩がある。酸付加塩には、無毒性無機酸、たとえば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸など、ならびに無毒性有機酸、たとえば脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などから得られるものがある。塩基付加塩には、アルカリ土類金属、たとえばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど、ならびに無毒性有機アミン、たとえばＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどから得られるものがある。
【００５９】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される抗酸化剤も含んでもよい。薬学的に許容される抗酸化剤の例には：（１）水溶性抗酸化剤、たとえばアスコルビン酸、塩酸システイン、硫化水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）脂溶性抗酸化剤、たとえばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど；および（３）金属キレート剤、たとえばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などがある。
【００６０】
これらの組成物は、アジュバント、たとえば防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤を含有してもよい。
【００６１】
微生物の存在の防止は、上記の殺菌手順と様々な抗菌および抗真菌薬、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの内包の両方によって確保されてもよい。組成物に等張薬剤、たとえば糖、塩化ナトリウムなどを含めることが望まれてもよい。加えて、注射可能な薬品形態の持続的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの内包によってもたらされてもよい。
【００６２】
薬学的に許容される担体には、無菌の注射可能な液剤または分散剤を即時調製するための無菌の水溶液もしくは分散剤および無菌の粉剤がある。薬学的に活性な物質に対するそのような媒体および薬剤の使用は、当業者に公知である。任意の通常媒体または薬剤が、活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるその使用が企図される。補助活性化合物を組成物に混ぜることもできる。
【００６３】
治療用組成物は、一般に滅菌され、製造および貯蔵条件下で安定していなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは高薬物濃度に適切な他の秩序ある構造として処方することができる。担体は、たとえば、水、エタノール、多価アルコール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）を含有する溶媒または分散媒およびそれらの適切な混合物であることができる。適当な流動性は、たとえば、被覆剤、たとえばレシチンの使用により、分散剤の場合には必要とする粒径を維持することにより、および界面活性剤の使用により維持することができる。
【００６４】
滅菌した注射可能な溶液は、適当な溶媒中の必要量の活性化合物を上で挙げた成分の１つまたは組み合わせと混ぜることによって調製することができ、必要に応じて、その後精密ろ過殺菌される。一般に、分散剤は、基本的な分散媒および上で挙げた成分と別の必要とされる成分を含有する滅菌媒体に活性化合物を混ぜることによって調製される。滅菌された注射可能な溶液を調製するための滅菌した粉剤の場合、調製の好ましい方法は、有効成分の粉剤＋任意の追加の所望の成分をあらかじめ滅菌ろ過したその溶液から生ずる真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【００６５】
担体材料と組み合わせて単一の剤形を産生することができる有効成分の量は、処置される対象、および投与の特定の様式に応じて変動することになる。担体材料と組み合わせて単一の剤形を産生することができる有効成分の量は、一般に治療効果を生む組成物の量になる。一般に、１００％中で、この量は、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて約０．０１％〜約９９％の有効成分、好ましくは約０．１％〜約７０％、最も好ましくは約１％〜約３０％の有効成分の範囲になる。
【００６６】
用量計画は、最適期待応答（たとえば、治療応答）を得るために調整される。たとえば、単回ボーラス投与が投与されてもよく、数回の分割用量で経時的に投与されてもよくまたは治療状況の緊急性に示されるように用量を比例して減少もしくは増加させてもよい。投与の容易さおよび用量の均一性のために用量単位形態で非経口組成物を処方することが特に有利である。ここで使用される用量単位形態とは、処置すべき対象に対する単位用量として適している物理的に別々の単位のことを指し；各単位は、所望の治療効果を生むために算出した既定量の活性化合物を必要とされる医薬用担体と共に含有する。本発明の用量単位形態の仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特性および達成すべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体における感受性を処置するためにそのような活性化合物を調合する当業者に特有の制限による影響を受け、それによって直接決まる。
【００６７】
抗体分子を投与する場合、用量は、対象体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より通常には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇである。たとえば、用量は０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、１０ｍｇ／ｋｇ体重または２０ｍｇ／ｋｇ体重、または１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲内であることができる。典型的な処置療法は、１週間に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、１カ月に１回、３カ月毎に１回もしくは３〜６カ月毎に１回、または開始時に短い投与間隔（たとえば１週間に１回から３週間毎に１回）、次いで後に長い間隔（たとえば１カ月に１回から３〜６カ月毎に１回）での投与を伴う。
【００６８】
別法として、抗体は、徐放性処方として投与することができ、その場合頻繁な投与を必要としない。用量および頻度は、患者内での抗体の半減期によって変動する。一般に、ヒト抗体は最も長い半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。投与の用量および頻度は、処置が予防的か治療的かによって変動し得る。予防的適用においては、比較的低用量が、長期間にわたって比較的低頻度の間隔で投与される。一部の患者は、一生処置を受け続ける。治療適用においては、疾患の進行が減少または停止するまで、好ましくは患者が疾患の症候の部分的または完全な回復を示すまで比較的短い間隔で比較的高い用量がときには必要とされる。その後患者は、予防的療法を投与されることができる。
【００６９】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の用量レベルを変動させて、特定の患者、組成物および投与様式に対して患者に毒性にならずに所望の治療応答を達成するのに有効な有効成分の量を得てもよい。選択される用量レベルは、利用される本発明の特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与の時間、利用される特定の化合物の排出速度、治療期間、利用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／もしくは材料、年齢、性別、体重、症状、健康状態、および処置される患者の既往歴、ならびに医術において周知の因子などを含めた様々な薬物動態学的因子によって決まることになる。
【００７０】
本発明のＰＤＬ１結合分子の「治療上有効な量」は、病徴の重症度の低下、病徴がない期間の頻度および持続時間の増加、または疾患の苦痛による心的障害もしくは身体的障害の防止を好ましくはもたらす。たとえば、ＰＤＬ１関連腫瘍の処置の場合、「治療上有効な量」は、無治療の対象と比較して少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、なおより好ましくは少なくとも約８０％細胞成長または腫瘍成長を好ましくは阻害する。腫瘍成長を阻害する能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価することができる。別法として、組成物のこの特性は、細胞成長を阻害する化合物の能力を調べることによって評価することができ；そのような阻害は、熟練した実務者に公知のアッセイによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定することができる。治療的化合物の治療上有効な量は、腫瘍サイズを低下させる、さもなければ対象の症候を回復させることができる。通常の知識を有する当業者は、因子、たとえば対象のサイズ、対象の症候の重症度および選択される特定の組成物または投与経路に基づいてそのような量を決定できるであろう。
【００７１】
本発明の組成物は、当業者に公知の様々な方法のうち１つ以上を使用して１つ以上の投与経路で投与することができる。当業者によって認識されることになるように、投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じて変動することになる。本発明のＰＤＬ１結合分子に好ましい投与経路には、静脈内、筋肉内、真皮内、腹膜内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路、たとえば注射もしくは輸液による、がある。ここで使用される成句「非経口投与」は、通常は注射による、腸内および局所投与以外の投与様式を意味し、それだけには限らないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄膜内、嚢内、眼窩内、心臓内、真皮内、腹膜内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、髄腔内、硬膜外ならびに胸骨内注射および輸液を含む。
【００７２】
別法として、本発明のＰＤＬ１結合分子は、非非経口経路、たとえば局所、表皮または粘膜投与経路、たとえば鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下もしくは局所的に投与することができる。
【００７３】
活性化合物は、迅速な放出に対して化合物を保護することになる担体、たとえば移植片、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化した送達系を含めた放出制御製剤と共に調製することができる。生分解性、生体適合性ポリマー、たとえばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。そのような処方を調製するための多くの方法は、特許権を得ているまたは当業技術者に一般に公知である。たとえば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、ｅｄ．、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８を参照のこと。
【００７４】
治療用組成物は、当業者に公知の医用デバイスで投与することができる。たとえば、好ましい態様において、本発明の治療用組成物は、無針皮下注射デバイス、たとえば米国特許第５，３９９，１６３号；第５，３８３，８５１号；第５，３１２，３３５号；第５，０６４，４１３号；第４，９４１，８８０号；第４，７９０，８２４号；または第４，５９６，５５６号に開示されているデバイスで投与することができる。本発明において有用な周知の移植片およびモジュールの例には：制御された速度で治療薬を投薬するための移植可能なマイクロ輸液ポンプを開示している米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を通して医薬を投与するための治療的デバイスを開示している米国特許第４，４８６，１９４号；正確な輸液速度で治療薬を送達するための治療薬輸液ポンプを開示している米国特許第４，４４７，２３３号；連続的な薬物送達ための移植可能な可変流量輸液装置を開示している米国特許第４，４４７，２２４号；複数室区画を有する浸透性薬物送達系を開示している米国特許第４，４３９，１９６号；および浸透性薬物送達系を開示している米国特許第４，４７５，１９６号がある。これらの特許を、参照によりここに組み込む。他の多くのそのような移植片、送達系およびモジュールは、当業技術者に公知である。
【００７５】
特定の態様において、本発明のＰＤＬ１結合分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの適当な分布を確実にするように処方することができる。たとえば、血液脳関門（ＢＢＢ）は多くの親水性の高い化合物を排除する。本発明の治療的化合物が、（必要に応じて）ＢＢＢを横断することを確実にするために、たとえば、リポソーム中に処方することができる。リポソームを製造する方法については、たとえば、米国特許第４，５２２，８１１号；第５，３７４，５４８号；および第５，３９９，３３１号を参照のこと。リポソームは、特定の細胞または器官に選択的に輸送され、したがって標的化した薬物送達を増強する部分を１つ以上含んでもよい（たとえば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５を参照のこと）。典型的な標的化部分には、葉酸またはビオチン（たとえば、Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，４１６，０１６号を参照のこと）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８）：抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０）；界面活性剤プロテインＡ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４）；ｐｌ２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０）がある：Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ；Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４６：１２３；ＪＪ．Ｋｉｌｌｉｏｎ；ＬＪ．Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２７３も参照のこと。
疾患の防止および処置
別の側面において、本発明は、ＰＤＬ１関連疾患を防止および／または処置するためのＰＤＬ１結合分子、核酸、宿主細胞および本発明の医薬組成物の使用、ならびに対応する方法を提供する。本発明のＰＤＬ１結合分子で防止および／または処置することができるＰＤＬ１関連疾患を、以下に詳細に記述する。
がん
本発明のＰＤＬ１結合分子によるＰＤＬ１の遮断は、患者においてがん性細胞に対する免疫応答を増強することができる。ＰＤＬ１は、正常なヒト細胞において発現されないが、様々なヒトがんにおいて豊富である（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ８：７８７〜９）。ＰＤ−１とＰＤＬ１との相互作用は、腫瘍浸潤性リンパ球の低下、Ｔ細胞受容体により媒介される増殖の低下、およびがん性細胞による免疫回避をもたらす（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ  ＭｏＩ  Ｍｅｄ  ８１：２８１〜７；Ｂｌａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．［ｅｐｕｂ］；Ｋｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：５０９４〜１００）。免疫抑制は、ＰＤ−１に対するＰＤＬ１の局所相互作用を阻害することによって後退させることができ、ＰＤ−１に対するＰＤＬ２の相互作用が同様に遮断される場合、効果は相加的である（Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＰＮＡＳ  ９９：１２２９３〜７；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．ＪＴＯ：１２５７〜６６）。本発明のＰＤＬ１結合分子を単独で使用して、がん性腫瘍の成長を阻害してもよい。別法として、本発明のＰＤＬ１結合分子は、下記の通り他の免疫原性薬、標準的がん処置、または他の抗体と併用して使用されてもよい。
【００７６】
したがって、一態様において、本発明は、対象に本発明のＰＤＬ１結合分子の治療上有効な量を投与して、対象において腫瘍細胞の成長を阻害することを含む、対象においてがんを防止または処置する方法を提供する。
【００７７】
本発明の抗体を使用して成長が阻害される可能性がある好ましいがんは、免疫療法に一般に応答するがんを含む。処置に対して好ましいがんの非限定的な例には、肺がん、卵巣がん、大腸がん、直腸がん、黒色腫（たとえば、転移性悪性黒色腫）、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、肝臓がん、リンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部がん、膠腫、胃がん、鼻咽頭がん、喉頭がん、子宮頸がん、子宮体がん、骨肉腫がある。本発明の方法を使用して処置されてもよいがんの他の例には、骨がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、肛門部のがん、精巣がん、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含めた慢性もしくは急性白血病、小児期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱のがん、腎臓または尿管のがん、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、鱗状細胞がん、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘導されるがんを含めた環境的に誘導されるがん、および前記がんの組み合わせがある。本発明は、転移性がん、特にＰＤＬ１発現転移性がんの処置にも有用である（Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１３３〜１４４）。
【００７８】
任意に、本発明のＰＤＬ１結合分子は、免疫原性薬、たとえばがん性細胞、精製した腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含める）、細胞および免疫刺激サイトカインをコードしている遺伝子をトランスフェクトした細胞と組み合わせることができる（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：４９１９〜２８）。使用できる腫瘍ワクチンの非限定的な例には、黒色腫抗原のペプチド、たとえばｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴｌおよび／もしくはチロシナーゼのペプチド、またはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞がある。
【００７９】
ヒトにおいて、いくつかの腫瘍、たとえば黒色腫は、免疫原性であることが示されている。本発明のＰＤＬ１結合分子によるＰＤＬ１遮断薬によってＴ細胞活性化の閾値を上げることにより、宿主における腫瘍応答を活性化することが可能になると予期される。ＰＤＬ１遮断薬（たとえばＰＤＬ１抗体、たとえば、本発明のＰＤＬ１結合分子）は、ワクチン接種プロトコルと組み合わせた場合に、最も有効になる可能性が高い。腫瘍に対するワクチン接種のために多くの実験的戦略が、考案されてきた（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．２０００、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：６０〜６２；Ｌｏｇｏｔｈｅｔｉｓ，Ｃ、２０００、ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：３００〜３０２；Ｋｈａｙａｔ，Ｄ．２０００、ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：４１４〜４２８；Ｆｏｏｎ，Ｋ．２０００、ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：７３０〜７３８を参照のこと；また、ＤｅＶｉｔａ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ中のＲｅｓｔｉｆｏ，Ｎ．  ａｎｄ  Ｓｚｎｏｌ，Ｍ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｃｈ．６１、ｐｐ．３０２３〜３０４３を参照のこと）。これら戦略の１つにおいて、ワクチンは、自己由来または同種の腫瘍細胞を使用して調製される。これらの細胞性ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ−ＣＳＦを発現するように形質導入されている場合に最も有効であることが示されている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種の抗原提示の強力な活性化物質であることが示されている（Ｄｒａｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：３５３９〜４３）。
【００８０】
様々な腫瘍における遺伝子発現および大規模遺伝子発現パターンの研究から、いわゆる腫瘍特異抗原の定義がもたらされた（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ＳＡ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：２８１〜７）。多くの場合、これらの腫瘍特異抗原は、腫瘍ならびに腫瘍が発生した細胞において発現される分化抗原、たとえばメラニン細胞抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原およびＴｒｐ−２である。より重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主に見られる腫瘍特異性Ｔ細胞の標的になることが示され得る。本発明のＰＤＬ１結合分子を腫瘍において発現される組換えタンパク質および／またはペプチドのコレクションと併用して使用して、これらタンパク質に対する免疫応答を生成してもよい。これらタンパク質は通常、免疫系によって自己抗原として見られ、したがってそれらに対して寛容になる。腫瘍抗原は、タンパク質テロメラーゼを含んでもよく、テロメラーゼは、染色体のテロメアの合成に必要であり、ヒトがんの８５％より多く、および限られた数の体細胞組織においてのみ発現される（Ｋｉｍ，Ｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：２０１１〜２０１３）。腫瘍抗原は、タンパク質配列を改変するまたは２つの無関係な配列間で融合タンパク質を作製する（すなわちフィラデルフィア染色体におけるｂｃｒ−ａｂｌ）体細胞突然変異によりがん細胞において発現される「新抗原」であってもよい。
【００８１】
他の腫瘍ワクチンは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶおよびＨＣＶ）およびカポジヘルペス肉腫ウイルス（ＫＨＳＶ）のようなヒトがんに関係するウイルス由来タンパク質を含んでもよい。ＰＤＬ１遮断薬（たとえばＰＤＬ１抗体、たとえば、本発明のＰＤＬ１結合分子）と併用して使用されてもよい腫瘍特異抗原の別の形態は、腫瘍組織自体から単離される精製した熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）である。これらの熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞由来タンパク質の断片を含有し、これらＨＳＰは、腫瘍免疫を引き起こす抗原提示細胞への送達に非常に効果的である（Ｓｕｏｔ，Ｒ  ＆  Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｐ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：１５８５〜１５８８；Ｔａｍｕｒａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：１１７〜１２０）。
【００８２】
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的応答を刺激するために使用できる強力な抗原提示細胞である。ＤＣは、ｅｘ  ｖｉｖｏで産生することができ、様々なタンパク質およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物をロードすることができる（Ｎｅｓｔｌｅ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：３２８〜３３２）。ＤＣを遺伝的手段によって形質導入して、これらの腫瘍抗原を同様に発現させてもよい。ＤＣはまた、免疫化の目的で腫瘍細胞に直接融合された（Ｋｕｇｌｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：３３２〜３３６）。ワクチン接種の方法として、ＤＣ免疫化をＰＤＬ１遮断薬（たとえばＰＤＬ１抗体、たとえば、本発明のＰＤＬ１結合分子）と効果的に組み合わせて、より強力な抗腫瘍応答を活性化してもよい。
【００８３】
ＣＡＲ−Ｔ（キメラ抗原受容体Ｔ−細胞免疫療法）は、腫瘍を処置するためのもう１つの細胞療法である。キメラ抗原受容体Ｔ−細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させるためにＣＤ３−ζ鎖またはＦｃεＲＩγの細胞内部分と結合された、特定の腫瘍抗原に対する抗体の抗原結合部分のキメラタンパク質を遺伝的に感染させた患者由来のＴ細胞である。また、共刺激シグナル配列を導入して、細胞毒性活性、Ｔ細胞の増殖および生存を増加させ、サイトカインの放出を促進させてもよい。再プログラム後に、患者由来Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大して、多数の腫瘍特異性ＣＡＲ−Ｔ細胞を産生させ、次いで腫瘍を処置するために患者へ輸注し戻した。ＰＤＬ１遮断薬剤（たとえばＰＤＬ１抗体、たとえば、本発明のＰＤＬ１結合分子）を、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法と組み合わせて使用して、より強力な抗腫瘍応答を活性化してもよい。
【００８４】
本発明のＰＤＬ１結合分子は、標準的ながん処置と組み合わせられてもよい。本発明のＰＤＬ１結合分子は、化学療法の体制と効果的に組み合わせられてもよい。これらの例において、投与される化学療法試薬の用量を減少させることが可能になる場合がある（Ｍｏｋｙｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：５３０１〜５３０４）。そのような組み合わせの例は、黒色腫の処置のためのダカルバジンと組み合わせる抗ＰＤＬ１抗体である。そのような組み合わせの別の例は、黒色腫の処置のためのインターロイキン２（ＩＬ−２）と組み合わせる抗ＰＤＬ１抗体である。本発明のＰＤＬ１結合分子と化学療法を組み合わせた使用の背後にある科学的合理性は、ほとんどの化学療法化合物の細胞毒性作用の帰結である細胞死が、抗原提示経路において腫瘍抗原レベルの増加をもたらすはずであるということである。細胞死によってＰＤＬ１遮断薬と相乗効果をもたらしてもよい他の併用療法は、放射線、手術およびホルモン欠乏である。これらプロトコルのそれぞれは、宿主において腫瘍抗原の供給源を作製する。血管形成阻害剤も、本発明のＰＤＬ１結合分子と組み合わされてよい。血管形成の阻害は、腫瘍抗原を宿主抗原提示経路に送り込むことができる腫瘍細胞死をもたらす。
【００８５】
本発明のＰＤＬ１結合分子は、他の腫瘍特異抗原に対する抗体と組み合わせて使用することもできる。他の腫瘍特異抗原に対する前記抗体には、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥＧＦＲバリアント抗体、抗ＶＥＧＦａ抗体、抗ＨＥＲ２抗体または抗ＣＭＥＴ抗体があるが、これに限定されない。好ましくは、前記抗体は、モノクローナル抗体である。
【００８６】
本発明のＰＤＬ１結合分子は、腫瘍細胞にＦｃαまたはＦｃγ受容体発現エフェクター細胞を標的とする二重特異性抗体と組み合わせて使用することもできる（たとえば、米国特許第５，９２２，８４５号および第５，８３７，２４３号を参照のこと）。二重特異性抗体を使用して、別々の２つの抗原を標的とすることができる。たとえば、抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原（たとえば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）二重特異性抗体を使用して、腫瘍の部位へとマクロファージを標的化した。この標的化は、腫瘍特異性応答をより効果的に活性化してもよい。これらの応答のＴ細胞群（Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｒｍ）は、ＰＤＬ１遮断薬の使用によって増大されることになる。別法として、抗原は、腫瘍抗原および樹状細胞特異的細胞表面マーカーに結合する二重特異性抗体の使用によってＤＣに直接送達されてもよい。
【００８７】
腫瘍は、様々な機序によって宿主免疫監視を回避する。これら機序の多くは、腫瘍によって発現され免疫抑制的であるタンパク質を不活性化することによって克服されてもよい。これらは、とりわけＴＧＦβ（Ｋｅｈｒｌ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３：１０３７〜１０５０）、ＩＬ−１０（Ｈｏｗａｒｄ，Ｍ．  ＆  Ｏ’Ｇａｒｒａ，Ａ．（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １３：１９８〜２００）およびＦａｓリガンド（Ｈａｈｎｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：１３６３〜１３６５）を含む。これら実体のそれぞれに対する抗体を本発明のＰＤＬ１結合分子と組み合わせて使用して、免疫抑制剤の効果を打ち消し、宿主による腫瘍免疫応答を有利に働かせてもよい。
【００８８】
宿主免疫応答性を活性化するために使用してもよい他の抗体を、抗ＰＤＬ１と組み合わせて使用することができる。これらには、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する樹状細胞の表面にある分子がある。抗ＣＤ４０抗体は、Ｔ細胞ヘルパー活性を効果的に置換することができ（Ｒｉｄｇｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７４〜４７８）、本発明のＰＤＬ１結合分子と併用して使用することができる（Ｉｔｏ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１（５）５２７〜４０）。Ｔ細胞共刺激分子に対する活性化抗体、たとえばＯＸ−４０（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：２１６０〜２１６９）、４−１ＢＢ（Ｍｅｌｅｒｏ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３：６８２〜６８５（１９９７）、およびＩＣＯＳ（Ｈｕｔｌｏｆｆ，Ａ．ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ３９７：２６２〜２６６）、ならびに負の共刺激分子の活性を遮断する抗体、たとえばＣＴＬＡ−４（たとえば、米国特許第５，８１１，０９７号）またはＢＴＬＡ（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４：６７０〜９）、Ｂ７−Ｈ４（Ｓｉｃａ，ＧＬ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８：８４９〜６１）は、Ｔ細胞活性化レベルの増加も提供できる。
【００８９】
骨髄移植は、造血起原の様々な腫瘍を処置するために現在使用されている。移植片対宿主疾患はこの処置の帰結であるが、治療的有用性が、移植片対腫瘍応答から得られてもよい。ＰＤＬ１遮断薬を使用して、ドナー移植された腫瘍特異性Ｔ細胞の有効性を増加させることができる。腫瘍に対する抗原特異性Ｔ細胞のための、抗原特異性Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの活性化および拡大ならびにレシピエントへのこれらの細胞の養子移入を含むいくつかの実験的処置プロトコルも存在する（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｒ．＆  Ｒｉｄｄｅｌｌ，Ｓ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：５４６〜５１）。これらの方法を使用して、感染因子、たとえばＣＭＶに対するＴ細胞応答を活性化してもよい。本発明のＰＤＬ１結合分子の存在下におけるｅｘ  ｖｉｖｏでの活性化は、養子移入したＴ細胞の頻度および活性を増加させると期待されてもよい。
感染性疾患
本発明の他の方法を使用して、特定の毒素または病原体に曝露された患者が処置される。したがって、本発明の別の側面は、対象が感染性疾患を処置されるように、対象に本発明のＰＤＬ１結合分子を投与することを含む、対象において感染性疾患を防止または処置する方法を提供する。
【００９０】
前述の腫瘍に対する適用と類似して、ＰＤＬ１遮断薬を単独でまたはアジュバントとしてワクチンと組み合わせて使用して、病原体、毒素および自己抗原に対する免疫応答を刺激することができる。この治療的手法が特に有用になり得る病原体の例には、現在有効なワクチンがない病原体、または従来通りのワクチンが、完全に有効とは限らない病原体がある。これらには、ＨＴＶ、肝炎（Ａ、ＢおよびＣ）、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）があるが、これに限定されない。ＰＤＬ１遮断薬は、薬剤により確立された感染、たとえば感染過程で改変された抗原を示すＨＩＶ、に対して特に有用である。これらの新規のエピトープは、抗ヒトＰＤＬ１投与時に外来と認識され、したがってＰＤＬ１による負のシグナルによって低減されない強力なＴ細胞応答を惹起する。
【００９１】
本発明の方法によって処置可能な感染を引き起こす病原性ウイルスのいくつかの例には、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、ＢまたはＣ）、ヘルペスウイルス（たとえば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩおよびＣＭＶ、エプスタインバーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス（cornovirus）、呼吸系発疹ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルスがある。
【００９２】
本発明の方法によって処置可能な感染を引き起こす病原性細菌のいくつかの例には、クラミジア、リケッチア細菌、抗酸菌、ブドウ球菌、レンサ球菌、肺炎球菌（pneumonococci）、髄膜炎菌およびコノコッカス（conococci）、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、バシラス、コレラ、破傷風、ボツリヌス中毒、炭疽菌、ペスト、レプトスピラ症、およびライム病細菌がある。
【００９３】
本発明の方法によって処置可能な感染を引き起こす病原性真菌のいくつかの例には、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）（アルビカンス［ａｌｂｉｃａｎｓ］、クルーセイ［ｋｒｕｓｅｉ］、グラブラータ［ｇｌａｂｒａｔａ］、トロピカリス［ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ］等）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（フミガーツス［ｆｕｍｉｇａｔｕｓ］、ニガー［ｎｉｇｅｒ］等）、Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）（ムコール［ｍｕｃｏｒ］、アブシディア［ａｂｓｉｄｉａ］、リゾプス［ｒｈｉｚｏｐｕｓ］（rhizophus））、スポロトリックス・シェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）（Sporothrix schenkii）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、コクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）およびヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）がある。
【００９４】
本発明の方法によって処置可能な感染を引き起こす病原性寄生体のいくつかの例には、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、大腸バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉ）、フォーラーネグレリア（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ  ｆｏｗｌｅｒｉ）、アカントアメーバ属種、ジアルジア・ランブリア（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）（Giardia lambia）、クリプトスポリジウム属種、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、ネズミバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ブルーストリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ）、トクソプラズマ・ゴンディイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ（Toxoplasma gondi））、ニッポストロンギルス・ブラジリエンシス（Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）がある。
【００９５】
上の方法のすべてにおいて、ＰＤＬ１遮断薬は、他の形態の免疫療法、たとえばサイトカイン（たとえば、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２）処置、または二重特異性抗体治療と組み合わせることができ、そのことは、腫瘍抗原の提示の増強をもたらす（たとえば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８；Ｐｏｌｊａｋ（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１〜１１２３を参照のこと）。
自己免疫反応
抗ＰＤＬ１抗体は、自己免疫反応を惹起および増幅してもよい。したがって、疾患処置のために様々な自己タンパク質と併用して抗ＰＤＬ１遮断薬を使用して、これら自己タンパク質に対する免疫応答を効率的に生成するためのワクチン接種プロトコルを考案することを考えることができる。
【００９６】
たとえば、アルツハイマー病は、脳内のアミロイド沈着におけるＡβペプチドの不適当な蓄積と関係し；アミロイドに対する抗体応答は、これらのアミロイド沈着を一掃することができる（Ｓｃｈｅｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ４００：１７３〜１７７）。他の自己タンパク質が、標的として、たとえばアレルギーおよび喘息の処置に対するＩｇＥ、ならびに関節リウマチに対するＴＮＦａ、使用されてもよい。最終的に、様々なホルモンに対する抗体応答が、抗ＰＤＬ１抗体の使用によって誘導されてもよい。生殖ホルモンに対する中和抗体応答を使用して避妊してもよい。ホルモンおよび特定の腫瘍の成長に必要な他の可溶性因子に対する中和抗体応答が、考え得るワクチン接種標的と見なされてもよい。
【００９７】
抗ＰＤＬ１抗体の使用について上述した類似の方法を使用して、治療的自己免疫反応を誘導し、それによって他の自己抗原の不適当な蓄積、たとえばアルツハイマー病におけるＡβを含めたアミロイド沈着、サイトカイン、たとえばＴＮＦａ、およびＩｇＥが有る患者を処置することができる。
慢性的炎症性疾患
抗ＰＤＬ１抗体を使用して、疾患、たとえば慢性炎症性疾患、たとえば扁平苔癬、Ｔ細胞により媒介される慢性炎症性皮膚粘膜疾患を処置してもよい（Ｙｏｕｎｇｎａｋ−Ｐｉｂｏｏｎｒａｔａｎａｋｉｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ９４：２１５〜２２）。したがって、別の側面において、本発明は、対象に本発明のＰＤＬ１結合分子を投与することを含む、Ｔ細胞によって慢性炎症性疾患を無効にする方法を提供する。
ワクチンアジュバント
一側面において、本発明は、ワクチンアジュバントとしての本発明のＰＤＬ１結合分子の使用を提供する。抗ＰＤＬ１抗体を使用して、抗ＰＤＬ１抗体と対象とする抗原（たとえば、ワクチン）の同時投与によって抗原特異的免疫応答を刺激してもよい。
【００９８】
したがって別の側面において、本発明は、対象において抗原に対する免疫応答が増強されるように、対象に：（ｉ）抗原；および（ｉｉ）本発明のＰＤＬ１結合分子を投与することを含む、対象において抗原に対する免疫応答を増強する方法を提供する。抗原は、たとえば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体由来抗原であることができる。そのような抗原の非限定的な例には、上の節で考察したもの、たとえば上述の腫瘍抗原（または腫瘍ワクチン）またはウイルス、細菌もしくは上述した他の病原体由来の抗原がある。
キット
また、本発明の範囲には、本発明のＰＤＬ１結合分子、イムノコンジュゲートまたは医薬組成物および使用のための説明書を含むキットがある。キットは、少なくとも１つの追加の試薬または１つ以上の追加の本発明のＰＤＬ１結合分子（たとえば、ＰＤＬ１内の異なるエピトープに結合する結合分子）をさらに含有することができる。キットは、キットの内容の使用目的を示すラベルを一般に含む。用語ラベルは、キット上に提供されるまたはキットに同梱される、さもなければキットに付随する任意の筆記もしくは記録材料を含む。
【００９９】
［実施例］
本発明は、以下の例によってさらに例示されるが、本発明の範囲は、特定の例に決して限定されるべきでない。
【０１００】
例１：ＰＤＬ１に対する重鎖単一ドメイン抗体のスクリーニング
１．１  ライブラリ構築
免疫化用のＰＤＬ１−Ｆｃ融合タンパク質（配列番号２８）をＣＨＯ細胞によって発現させ（ｐＣＤＮＡ４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ  Ｖ８６２２０）、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって精製した。一頭のフタコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ）を、免疫化ために選んだ。４回の免疫化後に、リンパ球をラクダ末梢血１００ｍｌから単離し、トータルＲＮＡをＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ）で抽出した。抽出したＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＦＩＲＳＴ  ＳＴＲＡＮＤＳＵＰＥＲＭＩＸキットを使用して説明書にしたがってｃＤＮＡに逆転写した。
【０１０１】
重鎖抗体をコードしている核酸断片を、ネステッドＰＣＲによって増幅した：
第１ＰＣＲ：
上流プライマー：  ＧＴＣＣＴＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴＡＣＡＡＧＧＣ（配列番号２９）；
下流プライマー：ＧＧＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＴＧＴＴＣＣ（配列番号３０）。
【０１０２】
第２ＰＣＲ：
鋳型として第１ＰＣＲからのＰＣＲ産物、
上流プライマー：ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＲＧＧＡＧＧ（配列番号３１）；
下流プライマー：ＧＧＡＣＴＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＧＴ（配列番号３２）。
【０１０３】
標的重鎖単一ドメイン抗体の核酸断片を回収し、エンドヌクレアーゼＰｓｔＩおよびＮｏｔＩ（ＮＥＢ製）を使用してファージディスプレイベクターｐＣＤｉｓｐｌａｙ−３（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃａｔ：ＶＰＴ４０２３）にクローニングした。次いで産物を、大腸菌コンピテント細胞ＴＧ１に電気穿孔し、ＰＤＬ１に対する重鎖単一ドメイン抗体のファージディスプレイライブラリを構築し、検証した。段階希釈を平板培養することにより、ライブラリ能力を１．３３×１０8と決定した。ライブラリの挿入率を決定するために、２４個のクローンをコロニーＰＣＲ用に無作為に選択した。結果から、１００％の挿入率が明らかになった。
１．２  ＰＤＬ１に対する重鎖単一ドメイン抗体のパニング
マルチウェルプレートを、ＰＤＬ１−Ｆｃ融合タンパク質１０μｇ／ウェルで、４℃で終夜コーティングした。次の日、１％スキムミルクで、室温で２時間ブロッキングした後、ファージ１００μｌ（８×１０11ｔｆｕ、１．１において構築したラクダ重鎖単一ドメイン抗体のファージディスプレイライブラリ由来）を添加し、室温で１時間置いた。次いで結合していないファージを、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中に０．０５％  ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄することによって除去した。ＰＤＬ１に特異的に結合するファージを、トリエチルアンモニウム（１００ｍＭ）で解離させ、それを使用して対数期の大腸菌ＴＧ１に感染させ、ファージを産生させ、次回のスクリーニング用として次いで精製した。同じスクリーニングを、３〜４回繰り返した。それによって陽性クローンを富化し、ファージディスプレイ技術による抗体ライブラリからＰＤＬ１特異的抗体を選択する目的を達成した。
１．３  ファージ酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）による個々の陽性クローンの特異的選択
３〜４回のパニングした後に得られたＰＤＬ１結合陽性ファージを使用して空の大腸菌に感染させ、平板培養した。９６個の単一コロニーを無作為に選択して培養し、ファージを産生させ、それぞれ精製した。プレートを、ＰＤＬ１−Ｆｃ融合タンパク質で、４℃で終夜コーティングし；得られたサンプルファージ（対照として空のファージ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後に１次抗体、マウス抗ＨＡタグ抗体（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｋａｎｇｗｅｉ  Ｓｈｉｊｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｔｄ．）を添加し、反応のために室温で１時間インキュベートした。洗浄後に２次抗体、ヤギ抗マウスアルカリ性ホスファターゼ標識抗体（Ａｍｙｊｅｃｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄ．）を添加し、反応のために室温で１時間インキュベートした。洗浄後にアルカリホスファターゼ発色溶液を添加し、吸収値を４０５ｎｍ波長で読み取った。サンプルウェルのＯＤが、対照ウェルのＯＤより３倍高い場合、サンプルを陽性と決定する。プラスミド抽出およびその後の配列決定用として陽性のウェル内の細菌を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンで補充したＬＢ液体培地に移し、培養した。
【０１０４】
各クローンのタンパク質配列を、配列整列化ソフトウェアＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩにより分析した。異なるＣＤＲ配列を持つクローンを異なる抗体と見なし、同じＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を持つクローンを同じ抗体と見なす。
【０１０５】
例２  ＰＤＬ１に対する重鎖単一ドメイン抗体の予備評価
２．１  大腸菌における重鎖単一ドメイン抗体の発現およびその精製
配列決定分析によって得られた重鎖単一ドメイン抗体のコード配列を、発現ベクターＰＥＴ３２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ、製品番号６９０１６−３）にサブクローニングし、正しい組換えプラスミドを、発現宿主株ＢＬ１（ＤＥ３）（Ｔｉａｎｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＣＢ１０５−０２）に形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ固体培地上で、３７℃で終夜平板培養した。単一コロニーを植菌し、終夜培養し、次の日振盪培養による３７℃での拡大に移した。培養がＯＤ値０．６〜１に達したら、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して、振盪培養で、２８℃で終夜誘導した。次の日、細菌を遠心分離によって採取し、溶解して、抗体粗抽出物を得た。ニッケルイオン親和性クロマトグラフィーを使用して、抗体タンパク質を次いで精製し、純度９０％以上の抗体タンパク質を得た。
２．２  ヒトＰＤＬ１タンパク質に対する候補ＰＤＬ１重鎖単一ドメイン抗体の特異的結合
プレートを、ＰＤＬ１−Ｆｃ融合タンパク質で、４℃で終夜コーティングし、例２．１で得た重鎖単一ドメイン抗体（対照は、ＰＤＬ１−Ｆｃタンパク質に結合しない単一ドメイン抗体であった）１００ｎｇを各ウェルに添加し、室温で１時間反応させておいた。洗浄後に、１次抗体抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｋａｎｇｗｅｉ  Ｃｅｎｔｕｒｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．社から購入した）を添加し、室温で１時間反応させた。洗浄後に、ヤギ抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼ標識２次抗体（Ｙｉｑｉａｏ  Ｓｈｅｎｚｈｏｕ、Ｃａｔ：ＳＳＡ００７２００）を添加し、室温で１時間反応させた。洗浄後に、発色剤を添加し、吸光度を４０５ｎｍで読み取った。
【０１０６】
プレートを、Ｆｃタンパク質で、４℃で終夜コーティングし、例２．１で得た重鎖単一ドメイン抗体（対照は、他の無関係な標的に対する単一ドメイン抗体であった）１００ｎｇを各ウェルに添加し、室温で１時間反応させておいた。洗浄後に、ウサギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｐｕ  Ｘｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．から購入した）を添加し、室温で１時間反応させた。洗浄後に、ヤギ抗ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗体（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｐｕ  Ｘｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．から購入した）を添加し、室温で１時間反応させた。洗浄後に、発色剤を添加し、吸光度を４０５ｎｍで読み取った。
【０１０７】
ＰＤＬ１−Ｆｃタンパク質のＯＤ値を空の対照のＯＤ値で割った比が４以上である場合、候補抗体はＰＤＬ１−Ｆｃタンパク質に結合すると見なし；同時に、ＰＤＬ１−Ｆｃに対する結合のＯＤ値をＦｃタンパク質結合のＯＤ値で割った比が、≧５である場合、ＰＤＬ１−Ｆｃ抗原タンパク質に結合することができる上記の抗体は、Ｆｃ部分ではなくＰＤＬ１部分に特異的に結合すると見なす。
【０１０８】
結果は、抗体番号５６が、Ｆｃに結合せずにＰＤＬ１に特異的に結合する可能性があることを示した。特定の結果を、以下の表１に示す：
【０１０９】
【表１】
2018529375.tif 000002
【０１１０】
２．３  マウスＰＤＬ１タンパク質に対するＰＤＬ１重鎖単一ドメイン抗体の結合
マウスＰＤＬ１−Ｆｃタンパク質（配列番号３３）を、ＨＥＫ２９３細胞における発現によって得た（ｐＣＤＮＡ４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ  Ｖ８６２２０）。
【０１１１】
プレートを、マウスＰＤＬ１−Ｆｃ融合タンパク質０．５μｇ／ウェルで、４℃で終夜コーティングし、例２．１で得た重鎖単一ドメイン抗体（対照群は、他の無関係な標的に対する単一ドメイン抗体である）１００ｎｇを添加し、室温で１時間反応させておいた。洗浄後に、１次抗体抗Ｈｉｓタグ抗体を添加し、室温で１時間反応させた。洗浄後に、ヤギ抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗体を添加し、室温で１時間反応させた。洗浄後に、発色剤を添加し、吸光度を４０５ｎｍで読み取った。結果を、表２に示す。
【０１１２】
【表２】
2018529375.tif 000003
【０１１３】
本発明のヒトＰＤＬ１の重鎖単一ドメイン抗体が、マウスＰＤＬ１−Ｆｃタンパク質に結合しないことが分かる。
２．４  競合ＥＬＩＳＡによるＰＤ−１とＰＤＬ１との相互作用に対するＰＤＬ１重鎖単一ドメイン抗体の遮断効果の調査
ＰＤＬ１−Ｆｃタンパク質およびＰＤ１−Ｆｃタンパク質（配列番号３４）を、ＨＥＫ２９３細胞における発現によって得た（ｐＣＤＮＡ４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ  Ｖ８６２２０）。ビオチン化タンパク質ＰＤ１−Ｆｃ−ビオチンを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｂｉｏｔｉｎｌｙｔｉｏｎキットを使用して得た。
【０１１４】
プレートを、ＰＤＬ１−Ｆｃ融合タンパク質０．５μｇ／ウェルで、４℃で終夜コーティングし、その後例２．１で得た重鎖単一ドメイン抗体（対照は、他の無関係な標的に対する単一ドメイン抗体または単に緩衝液である）１００ｎｇおよびＰＤ１−Ｆｃ−ビオチン１０μｇ（空の群には抗体なしまたはタンパク質を添加し、等量の緩衝液だけを添加した）を添加し、室温で１時間反応させておいた。ＳＡ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａから購入した）を添加し、室温で１時間反応させておいた。発色溶液を添加後に、吸光度を波長４０５ｎｍで読み取った。対照ＯＤ値と比較してサンプルＯＤ値が＜０．８である場合、抗体は遮断効果を持つと見なす。
【０１１５】
表３に示すように、抗体番号５６は、ＰＤ−１／ＰＤＬ１相互作用に対する遮断効果を示した。
【０１１６】
【表３】
2018529375.tif 000004
【０１１７】
２．５  細胞表面におけるＰＤＬ１とＰＤ−１との相互作用に対するＰＤＬ１重鎖単一ドメイン抗体の遮断効果を、ＦＡＣＳによって調査した
膜上でヒトＰＤＬ１タンパク質を一過性に発現しているＨＥＫ２９３細胞（２９３−ＰＤＬ１細胞）を、ヒトＨＥＫ２９３細胞にヒトＰＤＬ１完全長遺伝子を保有しているプラスミド（ｐＣＤＮＡ４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ  Ｖ８６２２０）を一過性トランスフェクションすることによって得た。
【０１１８】
２９３−ＰＤＬ１細胞を採取し、９６ウェルプレート中の０．５％ＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液に再懸濁し、検出しようとする上述の抗体を添加した。陰性対照を同時に設定し、陰性対照は、他の標的に対する単一ドメイン抗体２μｇであった。ｈＰＤ−１−Ｆｃ−ビオチンおよびｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＳＡ−ＰＥ  ０．３μｇをすべてのサンプルに添加し、染色後にフローサイトメトリーを実行した。蛍光値が、抗体を含まない群と比較して空の方向へ移動する場合、抗体は、ＰＤＬ１とＰＤ−１との細胞表面相互作用を遮断すると見なす。このようにして、細胞表面でＰＤ−１に対するＰＤＬ１抗原の結合を遮断する抗体を同定した。
【０１１９】
結果を図１に示し、抗体番号５６は、ＰＤ−１／ＰＤＬ１相互作用に対する遮断効果を呈する。
２．６  ＰＤＬ１抗原タンパク質に対するＰＤＬ１重鎖単一ドメイン抗体の結合曲線
プレートを、得られたＰＤＬ１重鎖単一ドメイン抗体０．５μｇ／ウェルで、４℃で終夜コーティングし、その後ＰＤＬ１−Ｆｃ融合タンパク質の勾配希釈系列を添加し、室温で１時間反応させておいた。洗浄後に、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗体を添加し、室温で１時間反応させておいた。洗浄後に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ発色現像溶液を添加し、波長４０５ｎｍで吸光度を読み取った。データ処理およびマッピング分析にＳｏｔｆＭａｘ  Ｐｒｏ  ｖ５．４を使用して、４−パラメータフィッティングによってＰＤＬ１に対する抗体の結合曲線およびＥＣ５０値（約５ｎｇ／ｍｌ）を得た。結果を、図２に示す。
２．７  ＰＤ−１とＰＤＬ１との相互作用に対するＰＤＬ１重鎖単一ドメイン抗体の遮断曲線
プレートを、ＰＤＬ１−Ｆｃ融合タンパク質０．５μｇ／ウェルで、４℃で終夜コーティングし、その後、ウェル当たり、ＰＤＬ１を遮断する１００μｌの単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の勾配希釈系列（１００μｇ／ｍＬ  ＰＤ１−Ｆｃ−ビオチンを含有する）を１００μｌ添加し、室温で１時間反応させておいた。ＳＡ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａから購入した）を添加し、室温で１時間反応させておいた。発色溶液を添加後に、吸光度を波長４０５ｎｍで読み取った。
【０１２０】
データ処理およびマッピング分析にＳｏｔｆＭａｘ  Ｐｒｏ  ｖ５．４を使用して、４−パラメータフィッティングによってＰＤＬ１／ＰＤ−１に対する抗体番号５６の遮断曲線およびＩＣ５０値を得た（抗体番号５６のＩＣ５０は、１４３ｎｇ／ｍＬである）。結果を、図３に示す。
【０１２１】
例３  ＰＤＬ１単一ドメイン抗体のヒト化
ヒト化は、タンパク質表面のアミノ酸ヒト化（表面再建）の方法およびＶＨＨヒト化のための普遍的フレームワーク移植方法（普遍的フレームワークへのＣＤＲ移植）によって実行される。
【０１２２】
ヒト化の工程は、以下の通りである：抗体番号５６の相同モデリングを、モデリングソフトウェアＭｏｄｅｌｌｅｒ９で実行した。相同な参照配列は、ＮｂＢｃＩＩ１０抗体（ＰＤＢコード：３ＤＷＴ）であり、アミノ酸の相対的な溶媒接触性は、タンパク質の３次元構造により算出される。抗体番号５６のアミノ酸のうち１つが溶媒に曝露されている場合、すべての置換が完了するまで、そのアミノ酸は、参照ヒト抗体ＤＰ−４７配列の同じ位置にあるアミノ酸で置き換えられた。
【０１２３】
ＶＨＨヒト化のための普遍的フレームワーク移植方法の特定の工程は、以下の通りである：第１に、普遍的ヒト化ＶＨＨフレームワークｈ−ＮｂＢｃＩＩ１０ＦＧＬＡ（ＰＤＢコード：３ＥＡＫ）が、配列相同性に基づいてＣｅｃｉｌｅ  Ｖｉｎｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．によって設計され、フレームワークは、ナノボディＮｂＢｃＩＩ１０（ＰＤＢコード：３ＤＷＴ）に基づいて設計され；タンパク質表面アミノ酸のヒト化は、ヒト抗体ＤＰ−４７を参照して実行され、ＶＨＨ配列フレームワーク２の部分的なアミノ酸ＦＧＬＡが修飾された。フレームワークとしてｈ−ＮｂＢｃＩＩ１０ＦＧＬＡを直接使用し、ＣＤＲを抗体番号５６のＣＤＲ領域で置き換えて、抗体のヒト化を達成した。
【０１２４】
抗体番号５６をヒト化し、抗体番号５６のヒト化バリアントを５つ得た。これらのヒト化バリアントの配列番号およびその中のアミノ酸変化を表４に挙げ、アミノ酸残基番号は、Ｋａｂａｔ付番に従った。図４は、ヒト化配列の整列化を示す。
【０１２５】
【表４】
2018529375.tif 000005
【０１２６】
例４  哺乳動物細胞を使用するＰＤＬ１遮断抗体タンパク質の調製
４．１  ＰＤＬ１単一ドメイン抗体のＦｃ融合タンパク質の調製
ヒトＩｇＧｌ−Ｆｃ領域のアミノ酸配列（配列番号７）を、ヒト免疫グロブリンγ１（ＩｇＧ１）の定常領域アミノ酸配列に基づいて、タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔ（Ｐ０１８５７）から得た。ヒトＩｇＧ１−Ｆｃをコードしている核酸断片を、逆転写ＰＣＲによってヒトＰＢＭＣトータルＲＮＡから得、上記の例で得たＰＤＬ１単一ドメイン抗体およびＦｃの融合タンパク質をコードしている核酸断片を、オーバーラッピングＰＣＲによって得、次いでベクターｐＣＤＮＡ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ  Ｖ８６２２０）にサブクローニングした。ＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性を部位特異的突然変異誘発によって除去したＦｃ領域配列、たとえば配列番号８または９を使用してもよい。
【０１２７】
組換え単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質プラスミドを、抗体発現のためにＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。組換え発現プラスミドを、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３培地で希釈し、トランスフォーメーション用のＰＥＩ（ポリエチレンイミン）溶液に添加した。各プラスミド／ＰＥＩ混合物を、ＨＥＫ２９３細胞懸濁液に添加し、９０ｒｐｍで、３７℃および１０％ＣＯ2でインキュベートした。同時に、５０μｇ／Ｌ  ＩＧＦ−１を添加した。４時間後に、２ｍＭ  グルタミンおよび５０μｇ／Ｌ  ＩＧＦ−１が補充されたＥＸ２９３培地を、１３５ｒｐｍで培養した。２４時間後、３．８ｍＭ  ＶＰＡを添加した。培養５〜６日間後に、一過性発現上清を採集し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製して、標的ＰＤＬ１単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質を得た。
【０１２８】
得られたＰＤＬ１単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質の配列を、配列番号１０〜２７に示す。
４．２  ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  ＬＬＣおよびＲｏｃｈｅ製ＰＤＬ１抗体の調製
ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  ＬＬＣ、Ｉｎｃ．製の抗ＰＤＬ１抗体の遺伝子を、米国特許出願公開第２０１３００３４５５９号の２．１４Ｈ９の方法によってクローニングし、ベクターｐＣＤＮＡ４にクローニングした。ＴＭ００４は、Ｒｏｃｈｅの抗ＰＤＬ１抗体である。抗体遺伝子を、米国特許出願公開第２０１３００４５２０１号Ａ１のＹＷ２４３．５５．Ｓ７０．ｈＩｇＧにしたがってクローニングし、ベクターｐＣＤＮＡ４にクローニングした。
【０１２９】
組換えプラスミドを、例４．１と同じ方法によってＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトし、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  ＬＬＣの得られた抗ＰＤＬ１抗体を、２．４１Ｈ９０Ｐと改名し；Ｒｏｃｈｅの抗ＰＤＬ１抗体を２４３．５５と改名した。
４．３  ＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質と既知の２つのＰＤＬ１抗体との発現の比較
同じ発現系および一過性トランスフェクション条件を使用した場合、本発明のＰＤＬ１単一ドメイン抗体のＦｃ融合タンパク質の発現レベルは、２００ｍｇ／Ｌより高かったが、抗体２．４１Ｈ９０Ｐの発現レベルは、約８０ｍｇ／Ｌ、抗体２４３．５５の発現レベルは、約４０ｍｇ／Ｌであった。この結果は、本発明のＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質が、構造的により安定であり、他の２つの公知のＰＤＬ１抗体より高い発現レベルをもたらし得ることを示す。
【０１３０】
例５  ＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の特徴づけ
５．１  ＰＤＬ１に対するＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の結合能力（ＥＬＩＳＡによる）
ＰＤＬ１−Ｃｈｉｓタンパク質（配列番号３５）を、ＨＥＫ２９３における一過性の発現およびニッケルカラムアフィニティークロマトグラフィーによる精製によって得た。プレートを、得られたＰＤＬ１−Ｃｈｉｓタンパク質０．５μｇ／ウェルで、４℃で終夜コーティングした。次いで、上記の例で得たＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の勾配希釈系列を添加し、室温で１時間反応させておいた。洗浄後に、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗体を添加し、室温で１時間反応させておいた。洗浄後に、発色剤を添加し、吸光度を４０５ｎｍで読み取った。データ処理およびマッピング分析にＳｏｔｆＭａｘ  Ｐｒｏ  ｖ５．４を使用して、４−パラメータフィッティングによってＰＤＬ１に対する抗体の結合曲線およびＥＣ５０値を得（すべての試験抗体のＥＣ５０値約１５０ｎｇ／ｍＬ）、それによりＰＤＬ１に対する親和性を反映させた。
【０１３１】
結果を図５に示し、縦軸は、ＯＤ４０５であり、横軸は、ＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ−融合タンパク質の濃度（ｎｇ／ｍＬ）であり；逆三角形、三角形および正方形は、Ｆｃ融合タンパク質の異なる３つのヒト化形態：ｈｕ５６ｖ１−Ｆｃ、ｈｕ５６ｖ２−Ｆｃ、ｈｕ５６ｖ５−Ｆｃを表す。３つのタンパク質は、ＰＤＬ１に対して同程度の親和性を有する。
５．２  ＰＤＬ１に対するＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の結合能力の同定（ＳＰＲ法）、および公知の抗体との比較
上記の例で得た組換えヒトＰＤＬ１に対するＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の結合動態を、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｘ１００機器を使用して表面プラスモン共鳴法（ＳＲＰ）によって測定した。組換えヒトＰＤＬ１−Ｆｃを、ＣＭ５バイオセンサーチップに直接コーティングして、およそ１０００反応単位（ＲＵ）を得た。動力学的測定の場合、抗体をＨＢＳ−ＥＰ＋１×緩衝液（ＧＥ、ｃａｔ＃ＢＲ−１００６−６９）に段階希釈し（１．３７〜１０００ｎｍ）、２５℃で１２０秒間注射し、解離時間３０分間で、１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．０）で１２０秒間再生した。結合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）を、単純な１対１のラングミュア結合モデルを使用して算出した（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  バージョン３．２）。平衡解離定数（ｋＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出される。
【０１３２】
測定された抗ＰＤＬ１抗体の結合親和性を表５に示す。結果は、ＰＤＬ１標的タンパク質に対するＰＤＬ１−５６−Ｆｃタンパク質の親和性が、当業者に公知の２つのＰＤＬ１抗体のそれより有意に高いことを示し、そのより高いＫａおよびより低いＫｄ値は、抗体融合タンパク質がより迅速にＰＤＬ１抗原を結合することができ、したがって解離しにくいことを示し、このことは、ＰＤＬ１−５６−Ｆｃが、２つの公知のＰＤＬ１抗体より優れた特性を持つ遮断抗体であることをさらに示している。
【０１３３】
【表５】
2018529375.tif 000006
【０１３４】
５．３  ＰＤＬ１−ＰＤ１相互作用に対するＰＤＬ１単一ドメインＦｃ融合タンパク質の遮断効果（競合ＥＬＩＳＡによる）
プレートを、ＰＤＬ１−Ｆｃ融合タンパク質０．５μｇ／ウェルで、４℃で終夜コーティングし、その後上記の例で得たＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の勾配希釈系列（１００μｇ／ｍＬ  ＰＤ１−Ｆｃ−ビオチンを含有する）をウェル当たり１００μｌで添加し、室温で１時間反応させておいた。洗浄後に、ＳＡ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａから購入した）を添加し、室温で１時間反応させておいた。洗浄後に、発色剤を添加し、吸光度を４０５ｎｍで読み取った。
【０１３５】
データ処理およびマッピング分析にＳｏｔｆＭａｘ  Ｐｒｏ  ｖ５．４を使用して、４−パラメータフィッティングによってＰＤＬ１−ＰＤ１に対する抗体の遮断曲線およびＩＣ５０値を得た。結果を図６に示し、縦軸は、ＯＤ４０５であり、横軸は、ＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の濃度（ｎｇ／ｍＬ）であり；逆三角形、三角法の三角形および正方形は、Ｆｃ融合タンパク質の異なる３つのヒト化形態：ｈｕ５６ｖ１−Ｆｃ、ｈｕ５６ｖ２−Ｆｃ、ｈｕ５６ｖ５−Ｆｃを表す。３つのタンパク質は、ＰＤＬ１−ＰＤ１相互作用を遮断する類似の能力を有する。
５．４  ＰＤＬ１−ＣＤ８０相互作用に対するＰＤＬ１単一ドメインＦｃ融合タンパク質の遮断効果（競合ＥＬＩＳＡによる）
ＣＤ８０−Ｆｃタンパク質（配列番号３６）を、ＨＥＫ２９３細胞から得た。ビオチン化タンパク質ＣＤ８０−Ｆｃ−ビオチンを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｂｉｏｔｉｎｌｙｔｉｏｎキットを使用して得た。
【０１３６】
プレートを、ＰＤＬ１−Ｆｃ融合タンパク質０．５μｇ／ウェルで、４℃で終夜コーティングし、その後上記の例で得たＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の勾配希釈系列（３００μｇ／ｍＬ  ＣＤ８０−Ｆｃ−ビオチンを含有する）をウェル当たり１００μｌで添加し、室温で１時間反応させておいた。洗浄後に、ＳＡ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａから購入した）を添加し、室温で１時間反応させておいた。洗浄後に、発色剤を添加し、吸光度を４０５ｎｍで読み取った。
【０１３７】
データ処理およびマッピング分析にＳｏｔｆＭａｘ  Ｐｒｏ  ｖ５．４を使用して、４−パラメータフィッティングによってＰＤＬ１−ＣＤ８０に対する抗体の遮断曲線およびＩＣ５０値を得た。結果を図７に示し、縦軸は、ＯＤ４０５であり、横軸は、ＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質ｈｕ５６Ｖ２−Ｆｃの濃度（ｎｇ／ｍＬ）である。成績は、ＰＤＬ１を遮断する単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質ｈｕ５６Ｖ２−Ｆｃが、ＰＤＬ１とＣＤ８０との相互作用を効果的に遮断し得ることを示している。
５．５  ＰＤＬ１−ＰＤ１相互作用に対するＰＤＬ１単一ドメインＦｃ融合タンパク質の遮断効果（ＦＡＣＳによる）
ヒトＨＥＫ２９３細胞は、完全長ヒトＰＤＬ１遺伝子を含有するプラスミドの一過性トランスフェクションにより膜上にサルＰＤＬ１タンパク質を一過性に発現する。
【０１３８】
ＰＤ１−ｍｕＦｃ（配列番号３９）を、２μｇ／ｍｌの使用濃度で５×１０5個細胞／チューブグループ化により各群に添加し、次いで異なる濃度のＫＮ０３５を各群に添加した。氷上で３０分間インキュベートし、３回洗浄した後、ＰＥ標識されたヤギ抗マウス２次抗体を検出抗体として添加し、氷上で３０分間インキュベーションした後、蛍光強度をフローサイトメトリーで検出した。
【０１３９】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを、データ処理およびマッピング分析に使用した。４−パラメータフィッティングにより、２９３細胞膜において発現されるＰＤＬ１と可溶性ＰＤ１との直接相互作用に対する抗体の遮断曲線およびＩＣ５０値を得た。結果を図８に示し、縦軸は、ＭＦＩであり、横軸は、ＰＤＬ１単一ドメイン抗体融合タンパク質ｈｕ５６Ｖ１−Ｆｃｍ１の濃度（μｇ／ｍＬ）である。結果は、ＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質が、２９３細胞膜において発現されるＰＤＬ１とＰＤ１との相互作用を効果的に遮断する可能性があることを示す。
【０１４０】
ヒトＰＤ１全長遺伝子を含有するプラスミドを、Ｊｕｒｋｅｔ細胞株に形質転換し、組み込んで、ヒトＰＤ１タンパク質を安定して発現するＪｕｒｋｅｔ細胞株を得、その細胞をＪｕｒｋｅｔ−ＰＤ１と命名した。
【０１４１】
ビオチン化ＰＤＬ１−ｍｕＦｃ（配列番号３８）タンパク質（３０μｇ／ｍｌ）と共にＪｕｒｋａｔ−ＰＤ１細胞を氷上で３０分間インキュベーションした後、ＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質ｈｕ５６Ｖ１−Ｆｃｍ１の勾配希釈剤を添加し、氷上で１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、１：２５０希釈したストレプトアビジンＰＥを添加し、氷上で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。蛍光強度を、フローサイトメトリーによって検出した。
【０１４２】
データ処理およびマッピング分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して実行した。Ｊｕｒｋａｔ−ＰＤ１と可溶性ＰＤＬ１−ｍｕＦｃタンパク質との直接相互作用に対する抗体の遮断曲線およびＩＣ５０値を、４−パラメータフィッティングによって得た。結果を、図９に示し、縦軸は、ＭＦＩであり、横軸は、ＰＤＬ１単一ドメイン抗体融合タンパク質ｈｕ５６Ｖ１−Ｆｃｍ１の濃度（μｇ／ｍＬ）である。結果は、ＰＤＬ１を遮断する単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質が、Ｊｕｒｋａｔ−ＰＤ１とＰＤＬ１との相互作用を効果的に遮断する可能性があることを示している。
５．６  ＰＤＬ１タンパク質に対するＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の結合特異性
ヒトＨＥＫ２９３細胞は、全長ヒトＢ７ファミリータンパク質遺伝子を保有するプラスミド（ｐＣＤＮＡ４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ  Ｖ８６２２０）の一過性トランスフェクションにより、膜上にヒトＰＤＬ１タンパク質を一過性に発現する。膜上で発現されるＢ７ファミリータンパク質のレベルを緑色蛍光強度によって調べることができるように、このプラスミドでは、標的タンパク質のＣ末端をＥＧＦＰタンパク質に融合することもできる。構築された一過性トランスフェクトした細胞株は、２９３−ＰＤＬ１−ＥＧＦＰ、２９３−ＰＤＬ２−ＥＧＦＰ、２９３−Ｂ７Ｈ３−ＥＧＦＰおよび２９３−Ｂ７Ｈ３−ＥＧＦＰを含む。
【０１４３】
構築された細胞を、０．５％ＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液に再懸濁し、ｈｕ５６Ｖ２−Ｆｃ抗体を添加した。同時に、他の無関係な標的に対する単一ドメイン抗体２μｇの陰性対照を構成し、氷上で２０分間インキュベートした。洗浄後に、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ２次抗体抗−ｈＩｇ−ＰＥを、氷上で２０分間添加した。洗浄後に、細胞を、０．５％ＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液５００μｌに再懸濁し、フローサイトメトリーによって検出した。
【０１４４】
結果を、図１０に示す。上の列は、対照群を示し、下側の列は、サンプル群を示す。ｈｕ５６Ｖ２−Ｆｃ抗体が、他のＢ７ファミリータンパク質ではなくヒトＰＤＬ１タンパク質だけに特異的に結合することは明白である。
５．７  サルＰＤＬ１タンパク質に対するＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の結合
ヒトＨＥＫ２９３細胞は、サルＰＤＬ１遺伝子の完全長を含有するプラスミドの一過性トランスフェクションによりサルＰＤＬ１タンパク質（配列番号５７）を一過性に発現する。プラスミドは、Ｃ末端にＥＧＦＰタンパク質を融合させた標的タンパク質も可能にし、そのプラスミドは、サルＰＤＬ１タンパク質膜発現レベルを緑色蛍光強度によって調査できることを可能にする。
【０１４５】
構築された細胞を、０．５％ＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液に再懸濁し、ｈｕ５６Ｖ２−Ｆｃ抗体を添加し、氷上で２０分間インキュベートした。洗浄後に、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ２次抗体抗−ｈＩｇ−ＰＥを氷上で２０分間添加した。洗浄後に、細胞を、０．５％ＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液５００μｌに再懸濁し、フローサイトメトリーによって検出した。
【０１４６】
結果を、図１１に示す。ｈｕ５６Ｖ２−Ｆｃ抗体が、サルＰＤＬ１タンパク質に効果的に結合することは明白である。
５．８  ＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質は、患者の組織切片上のＰＤＬ１陽性細胞集団を効果的に同定することができる
ＰＤＬ１陽性肺がん患者の腫瘍組織切片を、１次抗体である５μｇ／ｍＬ  ｈｕ５６Ｖ２−Ｆｃ抗体で終夜染色し、ヤギ抗ヒトＨＲＰ標識抗体（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｃａｔ：ＮＥＦ８０２００１ＥＡ）とインキュベートし、次いで可視化した。
【０１４７】
結果を、図１２に示す。ｈｕ５６Ｖ２−Ｆｃ抗体は、肺がん患者の組織切片上のＰＤＬ１陽性細胞集団を効果的に同定することができ、ＰＤＬ１陽性腫瘍細胞およびＰＤＬ１陽性免疫細胞を同時に同定することができる。
５．９  ＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質によるＰＢＭＣの活性化
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヒトリンパ球用の単離溶液を使用する密度勾配遠心分離によって健康なドナーの末梢血から単離した（Ｔｉａｎｊｉｎ  Ｈａｏ  Ｙａｎｇ）。
【０１４８】
２．５μｇ／ｍＬ抗ＣＤ３抗体およびＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質ｈｕ５６Ｖ２−Ｆｃ（実験においてＫＮ０３５とも呼んだ）の勾配希釈系列を、細胞培養プレートに４℃で終夜コーティングした。次の日、１×１０5個のＰＢＭＣを各ウェルに添加した。５日間培養した後、上清を取り出し、上清中のＩＦＮ−γレベルをＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡキット（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で検出した。
【０１４９】
結果を、図１３に示す。抗ＣＤ３抗体と組み合わせたＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質は、ＰＢＭＣ細胞からのγ−インターフェロンの分泌を増強し得る、すなわち、ＰＤＬ１単一ドメインＦｃ融合タンパク質は、ＰＢＭＣ細胞の活性化を増強することが分かる。同時に、活性化効果は濃度依存的である。
５．１０  樹状細胞−Ｔ細胞混合リンパ反応におけるＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質によるＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化およびＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  ＬＬＣ抗ＰＤＬ１抗体との比較
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヒトリンパ球用の単離溶液を使用する密度勾配遠心分離によって健康なドナー由来の末梢血の白血球から単離した（Ｔｉａｎｊｉｎ  Ｈａｏ  Ｙａｎｇ）。次いでそれらを、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地と１〜２時間インキュベートして非接着細胞を除去し、細胞を、１０％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦおよび２０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−４を含有するＲＰＭＩ中で培養した。５〜６日間の培養後に、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−αを添加し、２４時間インキュベートして成熟した樹状細胞を得た。
【０１５０】
この方法で得られた樹状細胞を、２×１０5個／ｍｌでＲＰＭＩ完全培地に再懸濁した。次いで、ウェル当たり５０μｌを、９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ：３７９９）に添加し、インキュベーター内で培養した。
【０１５１】
ＣＤ４＋Ｔ細胞を、製造業者の指示にしたがって磁気ビーズ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ：１３０−０９６−５３３）を使用して別のドナーのＰＢＭＣから単離した。
【０１５２】
上記の方法によって得た樹状細胞１×１０4個およびＣＤ４＋Ｔ細胞１×１０5個を混合し、ＲＰＭＩ完全培地に再懸濁し、９６ウェル培養プレートに添加し、細胞混合物５０μｌを各ウェルに添加した。ウェル当たり１００μｌの、ＲＰＭＩ完全培地に希釈したｈｕ５６Ｖ２−Ｆｃを、０．１μｇ／ｍｌまたは０μｇ／ｍｌの終抗体濃度に添加した。培養５〜７日間後に上清を採集し、上清中のＩＦＮ−γレベルを、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡキット（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で検出した。
【０１５３】
結果を、図１４Ａに示す。ＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質が、混合リンパ球反応においてＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γ分泌を増強させ得ることを見て取ることができる。すなわち、ＰＤＬ１を遮断する単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質は、Ｔ細胞活性化を増強する。
【０１５４】
対象１由来のＰＢＭＣを、５０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ２５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４と培養し、ＴＮＦ−α（５０ｎｇ／ｍｌ）による成熟の６日後にＤＣを採取し；ＣＤ４＋Ｔ細胞を、磁気ビーズ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ：１３０−０９６−５３３）によって選り分け；ＤＣ細胞を、１０4個／ウェルで９６ウェルＵ底プレートに添加し、ＣＤ４＋Ｔ細胞１０5個／ウェルを、２〜４時間後に添加し；異なる濃度のＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質ｈｕ５６Ｖ１−Ｆｃｍ１またはＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  ＬＬＣ抗ＰＤＬ１抗体２．４１Ｈ９０Ｐをそれぞれのウェルに添加し；培養５日後に、上清中のＩＦＮ−γレベルを、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡ検出キット（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で検出した。
【０１５５】
結果を、図１４Ｂに示し、灰色のヒストグラムは、ＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質によるＩＦＮ−γ分泌の刺激を示し、黒いバーは、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  ＬＬＣ抗ＰＤＬ１抗体２．４１Ｈ９０Ｐを示す。濃度を増加させたＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質は、混合リンパ球反応においてＩＦＮ−γを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞の能力を増強することができ、Ｔ細胞を活性化するＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の能力は、同じ濃度でＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  ＬＬＣ抗ＰＤＬ１抗体２．４１Ｈ９０Ｐよりわずかに強い。
５．１１  ＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質によるＪｕｒｋａｔ／Ｒａｊｉ−ＰＤＬ１混合培養系におけるＴ細胞のＩＬ−２分泌の刺激、およびＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  ＬＬＣ抗ＰＤＬ１抗体との比較
Ｔ細胞活性化系、Ｊｕｒｋａｔ／Ｒａｊｉ−ＰＤＬ１共培養系を構築して、Ｔ細胞活性化におけるＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質による効果を試験し、その効果を、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  ＬＬＣ抗ＰＤＬ１抗体と比較した。
【０１５６】
系は、エフェクター細胞としてＪｕｒｋａｔ細胞（Ｔ細胞）およびＪｕｒｋａｔ細胞活性化のための第１シグナルとして抗ヒトＣＤ３抗体を使用する。遺伝子操作され、ヒトＰＤＬ１を安定して発現するＲａｊｉ−ＰＤＬ１細胞の表面にあるＢ７ファミリーＣＤ８０は、Ｊｕｒｋｅｔ細胞を活性化するための第２の共刺激シグナルを提供し、一方で同じ細胞表面において高発現するＰＤＬ１は、ＰＤ１を結合することによって負の調節因子として作用して、Ｊｕｒｋｅｔ細胞活性化を阻害する。
【０１５７】
ｈｕ５６Ｖ１−Ｆｃｍ１および２．４１Ｈ９０Ｐ抗体タンパク質の勾配希釈を、１０％ＦＢＳ  ＋  １６４０  ＋  １５０ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ３を使用して調製し；ＪｕｒｋａｔおよびＲａｊｉ−ＰＤＬ１細胞を、３×１０6個細胞／ｍｌおよび１．５×１０6個細胞／ｍｌに調整し、５０μｌを各ウェルに添加し、３７℃で２４時間貯蔵した。培養上清１００μｌを除去し、ＩＬ−２の発現についてキットで測定した。
【０１５８】
図１５は、黒色のヒストグラムが、ＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質によるＩＬ−２分泌の刺激を示し、灰色のヒストグラムが、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  ＬＬＣ抗ＰＤＬ１抗体２．４１Ｈ９０Ｐを示す場合を示す。ＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質は、濃度が増加するのに伴ってＪｕｒｋａｔ細胞がＩＬ−２を分泌する能力を増強することができ、Ｊｕｒｋａｔ細胞を活性化する能力は、同じ濃度でＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  ＬＬＣ  ＰＤＬ１抗体２．４１Ｈ９０Ｐよりわずかに強い。
５．１２  ＦｃＲｎに対するＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の親和性
ビオチン化ＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質ｈｕ５６Ｖｌ−Ｆｃ、ｈｕ５６Ｖ２−Ｆｃ、ｈｕ５６Ｖｌ−Ｆｃｍ１およびｈｕ５６Ｖ２−Ｆｃｍ１を、１０μｇ／ｍｌに希釈し、ＳＡバイオセンサーに固定した。ヒトＦｃＲｎタンパク質（ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｔ．Ｎｏ．８６３９−ＦＣ）を、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭに希釈した。相互作用を、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製Ｏｃｔｅｔ  Ｋ２を使用して固定化１００秒間、乾燥結合６０秒間、解離３０秒間で検出した。
【０１５９】
表６は、ＦｃＲｎに対するＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の平均ＫＤが約５．１Ｅ−０７Ｍであることを示す。変異体Ｆｃ（Ｆｃｍ１）と野生型Ｆｃの間で親和性に有意差はなかった。
【０１６０】
【表６】
2018529375.tif 000007
【０１６１】
５．１３  変異体Ｆｃを持つＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質のＣＤＣおよびＡＤＣＣ活性
ＰＢＭＣを、エフェクター細胞として８×１０5個細胞／ウェルの細胞数で３００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２により２４時間活性化し；ヒトＰＤＬ１タンパク質を安定して発現するＲａｊｉ−ＰＤＬ１を、２×１０5個細胞／ウェルの細胞数で標的細胞として使用し；様々な濃度のｈｕ５６Ｖ１−Ｆｃｍ１または陽性対照であるリツキサンタンパク質を添加し、３７℃で６時間インキュベーションした後、各濃度でのＡＤＣＣ活性（％）を、ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性検出キットを使用して測定した。
【０１６２】
図１６Ａは、ｈｕ５６Ｖ１−Ｆｃｍ１が、陽性対照リツキサンと比較して有意なＡＤＣＣ活性を示さなかったことを示す。
【０１６３】
Ｒａｊｉ−ＰＤＬ１細胞を、標的細胞として２×１０4個細胞／ウェルの細胞数で、および５％カニクイザル血清を、補体を提供するために使用し、異なる濃度のｈｕ５６Ｖ１−Ｆｃｍ１および陽性対照リツキサンを添加し、３７℃で２時間培養した。サンプルのＣＤＣ活性を、ＣＣＫ−８を使用して検出した。
【０１６４】
図１６Ｂは、ｈｕ５６Ｖ１−Ｆｃｍ１が、陽性対照と比較して０．０２μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌの濃度でＣＤＣ活性を有さないことを示す。
５．１４  腫瘍成長に対するＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の阻害活性
免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（非肥満性糖尿病患者／重症複合型免疫不全症）マウスを使用して、マウスＰＤＬ１を認識できないＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質、ｈｕ５６Ｖ２−Ｆｃのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を研究した。本研究の目的は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスが、ヒトＰＤＬ１発現黒色腫細胞株Ａ３７５（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１６１９（商標））およびヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）で皮下移植された実験によって達成された。注射前にＡ３７５とＰＢＭＣを５：１の比で混合し、全容量１００μｌで皮下注射した（Ａ３７５  ５００００００個およびＰＢＭＣ  １００００００個を含有する）。抗体を０．３ｍｇ／ｋｇの用量で、腫瘍接種２４時間後、次いで週１回腹膜内投与し；ＰＢＳを、陰性対照として与えた。実験群当たり４〜６匹のマウス。腫瘍形成を週２回観察し、腫瘍の長短径をノギスで測定した。腫瘍体積を算出し、腫瘍成長曲線を記入した（図１７Ａを参照のこと）。０．３ｍｇ／ｋｇの用量で抗体ｈｕ５６Ｖ２−Ｆｃが、腫瘍成長を有意に阻害したことが分かる。
【０１６５】
同じｉｎ  ｖｉｖｏモデルを使用して、マウスＰＤＬ１も認識しないＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質、ｈｕ５６Ｖ１−Ｆｃｍ１を調べた。Ａ３７５およびヒトＰＢＭＣを、４：１の比でＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに皮下に接種した。４時間後に、異なる用量のｈｕ５６Ｖ１−Ｆｃｍ１（０．１、０．３、１、３および１０ｍｇ／ｋｇ）を腹膜内投与した。４週間、毎週投与した後にＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおけるＡ３７５／ヒトＰＢＭＣ異種移植片に対する抗腫瘍効果を研究した。ＰＢＳを、陰性対照として使用した。実験群当たり４〜６匹のマウス。腫瘍形成を週２回観察し、腫瘍の長径と短径を、ノギスを使用して測定した。腫瘍体積を算出し、腫瘍成長曲線を記入した（図１７Ｂを参照のこと）。結果は、すべての用量のｈｕ５６Ｖ１−Ｆｃｍ１（０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ）が、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスのＡ３７５／ヒトＰＢＭＣ同種異種移植片に対して有意な抗腫瘍効果を有するが、有意な用量関連性はないことを示している。抗体ｈｕ５６Ｖ１−Ｆｃｍ１は、０．１ｍｇ／ｋｇの用量でさえ腫瘍成長を有意に阻害した。
５．１５  異なる回数投与されたＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の腫瘍成長に対する阻害活性
ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスＡ３７５／ヒトＰＢＭＣ異種移植片腫瘍モデルを使用した。Ａ３７５とヒトＰＢＭＣを４：１の比でＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに皮下接種し、ｈｕ５６Ｖ１−Ｆｃｍ１（０．３ｍｇ／ｋｇ）を４時間後に腹膜内注射し、その後３日毎に１回腹腔内注射した。最終的な投与回数は、１、２、３、４回であった。腫瘍形成を３日毎に観察し、腫瘍の長径と短径をノギスで測定して、初回投与から３３日目までの腫瘍体積を算出した。腫瘍成長曲線を記入した（図１８）。結果は、研究期間内の異なる回数の投与すべてで、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスのＡ３７５／ヒトＰＢＭＣ同種異種移植片に対して有意な抗腫瘍効果が有ることを示した。
５．１６  ＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質による腫瘍成長の阻害およびＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  ＬＬＣ抗ＰＤＬ１抗体との比較
本研究の目的は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスが、ヒトＰＤＬ１発現黒色腫細胞株Ａ３７５（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１６１９（商標））およびヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）で皮下移植された実験によって達成された。注射前にＡ３７５とＰＢＭＣを５：１の比で、全容量１００μｌで混合した（Ａ３７５  ５００００００個およびＰＢＭＣ  １００００００個を含有する）。抗体を、１ｍｇ／ｋｇの用量で腫瘍接種２４時間後に腹膜内投与し、次いで週１回投与した。処置群は、ｈｕ５６Ｖ２−Ｆｃ（ｈｕ５６と表示した）およびＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  ＬＬＣ抗ＰＤＬ１抗体群（２．４１と表示した）、陰性対照としてＰＢＳを含んだ。実験群当たり４〜６匹のマウス。腫瘍形成を週２回観察し、腫瘍の長径と短径をノギスで測定した。腫瘍体積を算出し、腫瘍成長曲線を記入した（図１９Ａを参照のこと）。ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  ＬＬＣの抗ＰＤＬ１抗体は、本モデルにおいて基本的に効果がなく、３５日目に腫瘍体積は陰性対照群を上回り、したがって投与および腫瘍体積測定を中止した。このモデルの下でＡ３７５腫瘍成長阻害における１ｍｇ／ｋｇ用量のｈｕ５６Ｖ２−Ｆｃの効果は、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  ＬＬＣの抗ＰＤＬ１抗体２．４１Ｈ９０Ｐより有意に優れていることが分かる。
【０１６６】
ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  ＬＬＣ製抗ＰＤＬ１抗体は、上記系の下で腫瘍抑制を示さなかったので、系におけるＰＢＭＣの活性化は、腫瘍細胞成長を阻害するには不十分である可能性がある。したがって、混合細胞中のＰＢＭＣの含有量を増加させて、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  ＬＬＣ抗ＰＤＬ１抗体の抗腫瘍効果を再度調べた。
【０１６７】
皮下注射前にＡ３７５とＰＢＭＣを１：１で、全容量１００μｌで混合し（Ａ３７５  ５００００００個およびＰＢＭＣ  ５００００００個を含有する）、１ｍｇ／ｋｇの用量でＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  ＬＬＣ抗ＰＤＬ１抗体（２．４１Ｈ９０Ｐ）を腹膜内投与し、その後毎週投与し；ＰＢＳを陰性対照として使用した。実験群当たり４〜６匹のマウス。腫瘍形成を週２回観察し、腫瘍の長径と短径を、ノギスを使用して測定した。腫瘍体積を算出し、腫瘍成長曲線を記入した（図１９Ｂを参照のこと）。ＰＭＢＣの割合を増加させた後、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  ＬＬＣ製抗ＰＤＬ１抗体が、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて抗腫瘍効果を示すことが分かる。
【０１６８】
４２日目における抗体の平均腫瘍阻害（ＴＧＩ＝［１−処置群の腫瘍体積／対照群の腫瘍体積］×１００％）を算出し、下記の表７に示した。
【０１６９】
【表７】
2018529375.tif 000008
【０１７０】
上記のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍実験の結果は、ＰＤＬ１を遮断する本発明の単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質が、ｉｎ  ｖｉｖｏ黒色腫Ａ３７５ヌードマウスモデルにおいて既知のＰＤＬ１遮断抗体（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  ＬＬＣ製抗ＰＤＬ１抗体）に対して著しい優位性を有することを示している。
【０１７１】
例６  ＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の安定性
６．１  アルカリおよび酸化的ストレスに対するＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の抵抗性
５００ｍＭ重炭酸アンモニウムをアルカリ破壊剤として使用し、融合タンパク質を３７℃で３８時間処理した。１％過酸化水素を酸化剤として使用し、室温で８時間処理した。
【０１７２】
処置前後の上記例で得たＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の生物活性の変化を、競合ＥＬＩＳＡを使用して測定した。図２０で分かるように、アルカリおよび酸化処理は、候補ＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の活性に影響を及ぼさず、アルカリ処理３８時間後の競合ＥＬＩＳＡ活性は、０時間と比較して１０３％であった。酸化処理８時間における競合ＥＬＩＳＡ活性は、０時間と比較して１０６％であった。
６．２  高濃度でのＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の安定性
ＰＤＬ１単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質を、ＵＦ／ＤＦによって濃縮し、ＰＢＳ緩衝液に交換した。そして、その凝集体形成傾向を、ＳＥ−ＨＰＬＣによって調べた。
【０１７３】
２００ｍｇ／ｍＬに濃縮したとき、ＰＤＬ１単一ドメインＦｃ融合タンパク質の純度は、ＳＥ−ＨＰＬＣ検出によって９６．８％であった。凝集体は、低濃度（およそ２ｍｇ／ｍＬ）に対し約２．４％増加した。濃縮方法の全体を通じて、タンパク質溶液に混濁現象または凝集は起こらなかった。
Sequence listing 
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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