(57)【要約】  内部水性コンパートメントを規定する脂質層、内部水相に捕捉されたアントラサイクリン薬物および脂質層に含まれるマイトマイシンＣプロドラッグを含むリポソームを含む組成物が記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部水性コンパートメントを規定する脂質層、内部水性コンパートメントに捕捉されたアントラサイクリン薬物および脂質層に取り込まれたマイトマイシンＣプロドラッグを含むリポソーム；および
薬学的に許容される担体
を含む、組成物。
【請求項２】
プロドラッグが親油性部分に遊離可能に結合したマイトマイシンＣのコンジュゲートである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
親油性部分がリン脂質である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
脂質層が脂質二重層である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
アントラサイクリン薬物がドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシンおよびイダルビシンから選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
アンモニウム塩をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
アンモニウム塩がビスホスホネートのアンモニウム塩である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
ビスホスホネートがアレンドロネート、パミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、イバンドロネート、リセドロネートおよびゾレドロネートから選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
アンモニウム塩がスルフェート、ホスフェート、グルクロニド、スクラルファート、またはデキストランスルフェートのアンモニウム塩である、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
プロドラッグが親油性部分に遊離可能に結合したマイトマイシンＣのコンジュゲートであり、アントラサイクリン薬物がドキソルビシンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
スルフェートまたはアレンドロネートのアンモニウム塩をさらに含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物を提供すること；および
該組成物を投与することまたは投与するように指示すること
を含む、患者における腫瘍を処置するための方法。
【請求項１３】
前記投与することまたは投与するように指示することが、注射により投与することまたは投与するように指示することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記注射が静脈内、動脈内、腹腔内、胸膜内、髄腔内、膀胱内または腫瘍内注射による、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
提供が治療上有効量のマイトマイシンＣをインビボで産生する量の組成物を提供することを含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
患者における腫瘍が脳癌、頭頸部癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、卵巣癌または膀胱癌である、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物を提供すること；および
該組成物を投与することまたは投与するように指示すること
を含む、固形腫瘍を処置するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２０１５年１０月１５日に出願された米国特許仮出願第６２／２４２,０９７号の利益を主張するものであり、その全体を参照することにより本明細書に包含させる。
【０００２】
技術分野
本明細書に記載の発明は、共封入されたドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム製剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
癌はアメリカにおける死亡原因の第１位であり、世界中の人々に影響を与える。手術、放射線療法および化学療法は、最も広く用いられる治療様式である。処置される対象に対して相乗効果および最小の毒性を提供する癌治療のための新しい組成物および処置レジメンの開発が有利である。
【発明の概要】
【０００４】
次の態様および下に記載および説明するその実施態様は例示的および説明的なものであり、範囲を限定するものではない。
【０００５】
ある態様において、内部水性コンパートメントを規定する脂質層、内部水相に捕捉されたアントラサイクリン薬物、脂質層に取り込まれたマイトマイシンＣプロドラッグおよび薬学的に許容される担体を含むリポソームを含む組成物が提供される。ある実施態様において、組成物は、投与されると、ある量のマイトマイシンＣのプロドラッグがインビボで治療上有効量のマイトマイシンＣを産生するように製剤化される。
【０００６】
ある実施態様において、プロドラッグは親油性部分に遊離可能に結合したマイトマイシンＣのコンジュゲートである。ある実施態様において、親油性部分はリン脂質である。
【０００７】
別の実施態様において、脂質層は脂質二重層である。
【０００８】
さらに別の実施態様において、アントラサイクリン薬物はドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシンおよびイダルビシンから選択される。
【０００９】
さらに別の実施態様において、組成物はさらにアンモニウム塩を含む。ある実施態様において、アンモニウム塩はビスホスホネートのアンモニウム塩である。典型的なビスホスホネートはアレンドロネート、パミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、イバンドロネート、リセドロネートおよびゾレドロネートを含む。別の実施態様において、アンモニウム塩はスルフェート、ホスフェート、グルクロニド、スクラルファートまたはデキストランスルフェートのアンモニウム塩である。
【００１０】
ある実施態様において、プロドラッグは親油性部分に遊離可能に結合したマイトマイシンＣのコンジュゲートであり、アントラサイクリン薬物はドキソルビシンである。
【００１１】
別の態様において、患者における腫瘍を処置するための方法が提供される。該方法は、本明細書に記載の組成物を提供すること、および該組成物を投与することまたは投与するように指示することを含む。
【００１２】
ある実施態様において、投与することまたは投与するように指示することは、注射により投与することまたは投与するように指示することを含む。
【００１３】
別の実施態様において、注射は静脈内、動脈内、腹腔内、胸膜内、髄腔内、膀胱内または腫瘍内注射による。
【００１４】
さらに別の実施態様において、提供はインビボで治療上有効量のマイトマイシンＣを産生する量の組成物を提供することを含む。
【００１５】
他の実施態様において、患者における腫瘍は脳癌、頭頸部癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌または膀胱癌である。
【００１６】
別の態様において、固形腫瘍を処置するための方法が提供される。該方法は本明細書に記載の組成物を提供すること、および該組成物を投与することまたは投与するように指示することを含む。ある実施態様において、血液の癌ではない何らかの腫瘍が企図される。
【００１７】
ある実施態様において、組成物はドキソルビシンおよびマイトマイシンＣを含むポリマー−脂質ハイブリッドナノ粒子ではない。
【００１８】
本発明の方法および組成物などのさらなる実施態様は、以下の記載、図面、実施例および特許請求の範囲から明らかである。前記および後記から理解できるように、本明細書に記載のそれぞれのおよび全ての特徴ならびにそれぞれのおよび全ての２以上のこのような特徴の組合せは本発明の範囲内に含まれるが、ただし、このような組合せに含まれる特徴は互いに矛盾しない。さらに、いずれかの特徴または特徴の組合せは、本発明のいずれかの実施態様から特定的に除外される。さらなる態様および本発明の利点は、特に、添付の実施例および図面とともに考慮されるとき、以下の記載および特許請求の範囲において説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ−１Ｄ】ある実施態様により調製された共封入されたドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームの電子低温顕微鏡写真。
【図２Ａ−２Ｂ】血漿中のリポソーム安定性の評価に由来するデータを示し、ここで共封入されたドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームのインキュベート後のセファロースカラムから回収した溶離液のフラクションにおけるマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート(略称ＭＬＰ)(図２Ａ)およびドキソルビシン(略称Ｄｏｘ)(図２Ｂ)の緩衝液(菱形)およびヒト血漿(三角)中での遊離が示される。ブラッドフォードタンパク質アッセイを用いて血漿タンパク質の溶離を測定した(６２０ｎｍの吸光度、四角)。
【図３Ａ−３Ｂ】遊離ドキソルビシン(遊離ｄｏｘ)、捕捉ドキソルビシンを含むリポソーム(リポソーム−ｄｏｘ、またはＤＯＸＩＬ(登録商標)、図３Ａのみ)、マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰまたはＰＲＯＭＩＴＩＬ)と捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(リポソーム−ｄｏｘまたはＤＯＸＩＬ)の混合物、マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰまたはＰＲＯＭＩＴＩＬ、図３Ｂのみ)、ならびに共封入されたドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ−ｄｏｘ)とインキュベートしたＴ２４膀胱癌細胞におけるドキソルビシン(図３Ａ)およびマイトマイシンＣプロドラッグ(図３Ｂ)の取り込みを示す棒グラフ。
【００２０】
【図４Ａ】遊離ドキソルビシン(丸)、捕捉ドキソルビシンを含むリポソーム(リポソーム−ｄｏｘまたはＤＯＸＩＬ、四角)および共封入されたドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ−ｄｏｘ、三角)と３７℃で７２時間インキュベート後、対照(緩衝液のみの処理)細胞に対する割合として、１リットルあたりのマイクロモル濃度(μＭ)でドキソルビシン濃度の関数としてＴ２４膀胱癌細胞の増殖を示す、インビトロ細胞毒性試験に由来するグラフ。
【図４Ｂ】遊離マイトマイシンＣ(丸)、マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ、四角)、および共封入されたドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ−ｄｏｘ、三角)と３７℃で７２時間インキュベート後、対照(緩衝液のみの処理)細胞に対する割合として、１リットルあたりのマイクロモル濃度(μＭ)でマイトマイシンＣ濃度の関数としてＴ２４膀胱癌細胞の増殖を示す、インビトロ細胞毒性試験に由来するグラフ。
【図５Ａ】遊離ドキソルビシン(丸)、捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(リポソーム−ｄｏｘまたはＤＯＸＩＬ、四角)、マイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰまたはＰＲＯＭＩＴＩＬ)と捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(リポソーム−ｄｏｘまたはＤＯＸＩＬ)の混合物(菱形)および共封入されたドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを含むリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ−ｄｏｘ、三角)と３７℃で７２時間インキュベート後、対照細胞に対する割合として、１リットルあたりのマイクロモル濃度(μＭ)でドキソルビシン濃度の関数としてＮ８７胃癌細胞の増殖を示す、インビトロ細胞毒性試験に由来するグラフ。
【図５Ｂ】遊離マイトマイシンＣ(丸)、マイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(四角)、捕捉ドキソルビシンを有するリポソームとマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームの混合物(菱形)および共封入されたドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(三角)と３７℃で７２時間インキュベート後、対照細胞に対する割合として、１リットルあたりのマイクロモル濃度(μＭ)でマイトマイシンＣ(ＭＭＣ)濃度の関数としてＮ８７胃癌細胞の増殖を示す、インビトロ細胞毒性試験に由来するグラフ。
【００２１】
【図６Ａ】遊離ドキソルビシン(丸)、捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(ＤＯＸＩＬ、四角)、マイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(ＰＲＯＭＩＴＩＬ)と捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(ＤＯＸＩＬ)の混合物(菱形)ならびに捕捉ドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(三角)と３７℃で７２時間インキュベート後、対照細胞に対する割合として、１リットルあたりのマイクロモル濃度(μＭ)でドキソルビシン濃度の関数としてＩＧｒｏｖ−１卵巣癌細胞の増殖を示す、インビトロ細胞毒性試験に由来するグラフ。
【図６Ｂ】遊離マイトマイシンＣ(丸)、マイトマイシンＣプロドラッグを含むリポソーム(四角)、捕捉ドキソルビシンを有するリポソームとマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームの混合物(菱形)および捕捉ドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(三角)と３７℃で７２時間インキュベート後、対照細胞に対する割合として、１リットルあたりのマイクロモル濃度(μＭ)でマイトマイシンＣ(ＭＭＣ)濃度の関数としてＩＧｒｏｖ−１卵巣癌細胞の増殖を示す、インビトロ細胞毒性試験に由来するグラフ。
【図７Ａ】遊離ドキソルビシン(丸)、捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(ＤＯＸＩＬ、四角)、マイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(ＰＲＯＭＩＴＩＬ)と捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(ＤＯＸＩＬ)の混合物(菱形)ならびに捕捉ドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(三角)と３７℃で７２時間インキュベート後、対照細胞に対する割合として、１リットルあたりのマイクロモル濃度(μＭ)でドキソルビシン濃度の関数として多剤耐性１０９Ｒ肺癌細胞の増殖を示す、インビトロ細胞毒性試験に由来するグラフ。
【図７Ｂ】遊離マイトマイシンＣ(丸)、マイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(四角)、捕捉ドキソルビシンを有するリポソームと共封入したアレンドロネートとマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームの混合物(菱形)ならびに共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを含むリポソーム(該ドキソルビシンはアンモニウムアレンドロネートイオン勾配を用いて充填)(三角)と３７℃で７２時間インキュベート後、対照細胞に対する割合として、１リットルあたりのマイクロモル濃度(μＭ)でマイトマイシンＣ(ＭＭＣ)濃度の関数として多剤耐性１０９Ｒ肺癌細胞の増殖を示す、インビトロ細胞毒性試験に由来するグラフ。
【００２２】
【図８Ａ】遊離ドキソルビシン(丸)、捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(ＤＯＸＩＬ、四角)、マイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(ＰＲＯＭＩＴＩＬ)と捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(ＤＯＸＩＬ)の混合物(菱形)ならびに共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(三角)と３７℃で７２時間インキュベート後、対照細胞に対する割合として、１リットルあたりのマイクロモル濃度(μＭ)でドキソルビシン濃度の関数としてＮＣＩ／ＡＤＲ細胞の増殖を示す、インビトロ細胞毒性試験に由来するグラフ。
【図８Ｂ】遊離マイトマイシンＣ(丸)、マイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(四角)、捕捉ドキソルビシンを含むリポソームとマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームの混合物(菱形)ならびに共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(三角)と３７℃で７２時間インキュベート後、対照細胞に対する割合として、１リットルあたりのマイクロモル濃度(μＭ)でマイトマイシンＣ(ＭＭＣ)濃度の関数としてＮＣＩ／ＡＤＲ細胞の増殖を示す、インビトロ細胞毒性試験に由来するグラフ。
【図９Ａ】遊離ドキソルビシン(丸)、捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(リポソーム−ｄｏｘ、ＤＯＸＩＬ、四角)、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(該ドキソルビシンはアンモニウムアレンドロネート勾配を用いてリポソームに充填)(三角)、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(該ドキソルビシンはアンモニウムスルフェート勾配を用いてリポソームに充填した)(菱形)と３７℃で７２時間インキュベート後、対照(未処理)細胞の割合として、１リットルあたりのマイクロモル(μＭ)でドキソルビシン濃度の関数としてＴ２４膀胱癌細胞の増殖を示す、インビトロ細胞毒性試験に由来するグラフ。
【図９Ｂ】遊離マイトマイシンＣ(円)、マイトマイシンＣプロドラッグおよびアンモニウムアレンドロネートを有するリポソーム(四角)、マイトマイシンＣプロドラッグおよびアンモニウムスルフェートを有するリポソーム(×印)、アンモニウムアレンドロネート勾配を用いてリポソームに充填したドキソルビシン(三角)、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(該ドキソルビシンはアンモニウムスルフェート勾配を用いてリポソームに充填した)(菱形)と３７℃で７２時間インキュベート後、対照(未処理)細胞に対する割合として、１リットルあたりのマイクロモル濃度(μＭ)でマイトマイシンＣ(ＭＭＣ)濃度の関数としてＴ２４膀胱癌細胞の増殖を示す、インビトロ細胞毒性試験に由来するグラフ。
【００２３】
【図１０Ａ−１０Ｂ】共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームを３７℃で１時間、ＤＴＴとインキュベートしたときの、対照に対する割合として、ｍＭで、ジチオトレイトール(ＤＴＴ)濃度の関数としてマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートの開裂(図１０Ａ)およびマイトマイシンＣの遊離(図１０Ｂ)を示すグラフ。
【図１０Ｃ−１０Ｄ】捕捉したマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームを３７℃で１時間、ＤＤＴとインキュベートしたときの、対照に対する割合として、ｍＭで、ジチオトレイトール(ＤＴＴ)濃度の関数としてマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートの開裂(図１０Ｃ)およびマイトマイシンＣの遊離(図１０Ｄ)を示すグラフ。
【図１１】遊離マイトマイシンＣ(遊離ＭＭＣ、破線)、マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム(ＭＬＰ−リポソーム、十字線)および共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ−ｄｏｘ、垂直線による線)で処置した、または未処置(実線)のマウスの生存率のグラフ。
【図１２】(ｉ)ドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを共封入したリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ−ｄｏｘ)、(ｉｉ)マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ)または(ｉｉｉ)捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(リポソーム−ｄｏｘ)とマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ)の組合せの注射２４時間後の、血流におけるマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート(ＭＬＰ)のパーセントを示す棒グラフ。
【００２４】
【図１３Ａ−１３Ｂ】共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ−ｄｏｘ、ドット柄)、マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ)と捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(リポソーム−ｄｏｘ)の混合物(横線)またはマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ、図１３Ａのみ、レンガ状横破線)もしくはドキソルビシンを有するリポソーム(リポソーム−ｄｏｘ、図１３Ｂのみ、斜線)の注射２４時間後のマウスの血漿におけるマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート(ＭＬＰ、図１３Ａ)およびドキソルビシン(Ｄｏｘ、図１３Ｂ)の注射投与量のパーセントを示す棒グラフ。
【図１４Ａ】共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ−ｄｏｘ)の注射２４時間後の、マウスの肝臓、脾臓、肺および腎臓におけるマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート(白抜き)およびドキソルビシン(ドット柄)の組織１グラムあたりの注射用量のパーセントを示すグラフ。
【図１４Ｂ】マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート(リポソーム−ＭＬＰ)を有するリポソーム注射２４時間後の、マウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓および心臓におけるマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート(白抜き)の組織１グラムあたりの注射用量のパーセントを示すグラフ。
【図１５】未処置(対照)腫瘍担持マウス(黒菱形)および(ｉ)遊離ドキソルビシン(白四角)、(ｉｉ)マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ、白三角)、(ｉｉｉ)ドキソルビシンを有するリポソーム(リポソーム−ｄｏｘ、×印)、(ｉｖ)マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ)と捕捉ドキソルビシンを含むリポソーム(リポソーム−ｄｏｘ)の組合せ(逆白三角)または(ｖ)共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(黒丸)で処置した腫瘍担持マウスでの、マウスにおける４Ｔ１乳房腫瘍の中央腫瘍サイズをｍｍで、時間(日)の関数として示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
詳細な説明
Ｉ．定義
次に、種々の態様をこれ以降さらに詳細に記載する。しかしながら、このような態様は多くの異なる形態に具現化され得て、本明細書で説明される実施態様に限定されると解釈されるべきではなく；むしろ、これらの実施態様は本開示が綿密かつ完全であり、その範囲を当業者に十分に伝えることを目的として提供される。
【００２６】
本明細書で使用される「投与する(administering)」または「投与(administration)」は、外来分子の細胞または宿主への導入を意味する。該用語は「送達(delivery)」または「送達する(delivering)」という用語と同義であることを意図する。適切な投与の方法は、限定されないが、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、胸膜内、髄腔内、膀胱内もしくは腫瘍内、滑膜内、点滴、舌下、経皮、経口または局所である。
【００２７】
本明細書で使用される語句「化学療法剤」は「抗新生物剤」または「抗増殖剤」と同義であり、癌、または過増殖性細胞が増殖することを阻害する化合物をいう。一般に、抗新生物剤は(１)ＤＮＡを複製する細胞の能力を妨害するおよび(２)癌細胞における細胞死および／またはアポトーシスを誘導することにより、癌細胞が増殖することを阻害し得る。
【００２８】
投与後に治療有効量のマイトマイシンＣをもたらすリポソーム−マイトマイシンＣプロドラッグの量は、単回投与または複数回投与で新生物の臨床的機能障害または症状を改善するまたは最小限にするために有効なマイトマイシンＣの量である。
【００２９】
本明細書で使用される「腫瘍」または「新生物」は、細胞の異常増殖により特徴付けられる増殖性疾患を意味する。一般に、新生物は癌および腫瘍形成と関連する。本明細書で使用される「固形腫瘍」は乳房または結腸のような臓器で発生する腫瘍である。
【００３０】
用語「患者」は、新生物により特徴付けられる疾患を有する個体をいう。特に、患者(すなわち、宿主)は動物(すなわち、哺乳動物)またはヒトである。
【００３１】
本明細書で使用される「医薬製剤」は、顕著な有害作用を有さないヒトおよび動物使用のための製剤を含む。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」は、本発明の薬物の所望の活性のために最も適切な身体的位置への効果的分布を可能にする組成物または製剤をいい、「薬学的に許容される担体」は緩衝液、安定化剤または当業者に既知の他の物質をいう。このような物質は非毒性であるべきであり、活性成分の有効性を妨げるべきではない。担体または他の物質の詳細な性質は投与経路に依存し得る。
【００３２】
本明細書で使用される「プロドラッグ」は、対象への投与後、該プロドラッグが腫瘍の細胞に対して有毒である生成物に変換されるように、いくつかの化学的または生理学的過程によりインビボで薬物を遊離する薬物前駆体である化合物をいう。
【００３３】
本明細書で使用される「相乗効果」または「治療的相乗効果」は、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームの注射により対象に投与されたマイトマイシンＣおよびドキソルビシンの組合せ剤が、リポソーム−マイトマイシンＣプロドラッグ単独で投与したマイトマイシンＣと捕捉ドキソルビシンを有するリポソームにより投与したドキソルビシンの相加効果よりも高い効果を提供する臨床的観察をいう。
【００３４】
「治療有効量」の記載は、個体に対して利益を示すために十分な化合物の量を意図する。この量は、腫瘍重量または体積の減少または腫瘍増殖速度の減速のように、患者における新生組織形成に関連する症状を予防し、軽減し、寛解し、または他の点で重症度を軽減する。
【００３５】
本明細書で使用される用語「処置する」、「処置」および「治療効果」は、細胞増殖速度を低下もしくは停止させる(例えば、腫瘍増殖を減速または停止させる)または増殖する癌細胞の数を減少させることをいう。
【００３６】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限および下限の間の間に入る各値およびその記載された範囲内の他の何らかの記載されたまたは間に入る値はその開示の範囲内に包含されることが意図される。例えば、１μｍ〜８μｍの範囲が記載されるならば、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍおよび７μｍならびに１μｍ以上の範囲および８μｍ以下の範囲もまた、明示的に開示される。
【００３７】
単数形「ある(a)」、「ある(an)」および「その(the)」は、特に明記されない限り、複数の対象を含む。従って、例えば、「リポソーム」の記載は単数のリポソームならびに２以上の同一または異なるリポソームを含み、「添加物」の記載は単一の添加物ならびに２以上の同一または異なる添加物などを含む。
【００３８】
ＩＩ．アントラサイクリンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを共封入するリポソーム
ある態様において、ドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを共封入するリポソームを含む組成物が提供される。リポソーム組成物の成分をこれから記載する。
【００３９】
ある実施態様において、本明細書に記載の方法における使用のために提供されるマイトマイシンＣのリポソームプロドラッグコンジュゲートは、親油性または疎水性部分に遊離可能に結合したマイトマイシンＣを含み、一般に次の形態
【化１】
2018530623.tif 000002
〔式中、
Ｌは疎水性部分であり、
Ｒ１はジチオベンジル部分に共有結合したマイトマイシンＣ残基を表す〕
のものである。ＣＨ２Ｒ１基の位置はオルト位またはパラ位から選択される。コンジュゲートの合成は米国特許番号第６,３６５,１７９号；第６,９８４,３９６号；および第７,３０３,７６０号に記載され、これらの各々は本明細書に参照により包含させる。
【００４０】
疎水性部分、Ｌは一般にジアシルグリセロール、ステロール、リン脂質、これらの脂質の誘導体、他の天然に存在する脂質およびそれらの合成アナログのような脂質である。疎水性部分はリポソーム送達ビークルにマイトマイシンＣコンジュゲートを固定するための、リポソーム二重層への取り込みに適切である。
【００４１】
還元条件、すなわち、システインまたはグルタチオンのような還元剤への曝露により、リポソーム−マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートは分解してマイトマイシンＣを産生する。つまり、コンジュゲートのチオール開裂は疎水性部分およびジチオベンジル部分の生成物によりマイトマイシンＣおよび非毒性副産物を産生する。理解できるとおり、プロドラッグコンジュゲートは対象へのインビボでの投与のためのリポソームに容易に取り込まれ得る。プロドラッグコンジュゲートは非毒性であり、投与後および内在の還元剤への曝露または外来の還元剤への曝露により、コンジュゲートは分解して天然状態でかつ生物活性を有するマイトマイシンＣを産生する。
【００４２】
本明細書に記載の方法の裏付けとして実施した試験では、プロドラッグコンジュゲート、パラ−ジアシルジグリセロールジチオベンジルマイトマイシンＣを使用した。プロドラッグコンジュゲート、オルト−ジアシルジグリセロールジチオベンジルマイトマイシンＣもまた使用できる。実施例１で説明するとおりにコンジュゲートを合成した。コンジュゲートは本明細書において「マイトマイシンＣプロドラッグ」または「マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート」と称され、図では「ＭＬＰ」(マイトマイシンＣリポソームプロドラッグコンジュゲート)と略記される。
【００４３】
リポソームはまた、アントラサイクリンを含む。アントラサイクリンの例はドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシンおよびイダルビシンである。
【００４４】
ある実施態様において、リポソームはさらに、アンモニウム塩を含む。該アンモニウム塩は、リポソーム内にアントラサイクリン薬物のような両親媒性またはイオン性化合物を充填するために、リポソームの内側(低いｐＨ)から外側(高いｐＨ)までのｐＨ勾配(すなわち、リポソーム脂質単層または二重層を横断するｐＨ勾配)を確立するためのリポソーム内のアンモニウムイオン濃度を提供する。この方法は、参照により本明細書に包含させる米国特許第５,１９２,５４９号に詳細が記載されている。ある実施態様において、アンモニウム塩はビスホスホネートのアンモニウム塩である。例はアレンドロネート、パミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、イバンドロネート、リセドロネートおよびゾレドロネートのアンモニウム塩を含む。別の実施態様において、アンモニウム塩はスルフェート、グルクロニド、スクロースオクタスルフェート(スクラルファート)、メタンスルホネート、ホスフェートまたはデキストランスルフェートのアンモニウム塩である。アンモニウムスクロースオクタスルフェート(スクラルファート)のようなアルキルまたはアリールスルホネート勾配またはアンモニウムメタンスルホネート勾配を用いた薬物の充填は、参照により本明細書に包含させる国際公開第２０１３／１１４３７７号に記載される。
【００４５】
マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートおよびアントラサイクリン薬物ドキソルビシンを含むリポソームは、実施例１に詳細に記載されるとおりに調製した。リポソームの例は、例えば、参照により本明細書に包含させる米国特許第５,０１３,５５６号に記載のように、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)の外部コーティングを有する。リポソームは水素化ダイズホスファチジルコリン(ＨＳＰＣ)、ｍＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ(ジステロイルホスファチジルエタノールアミンに結合したメトキシポリエチレングリコール(ＭＷ２,０００ダルトン))、コレステロールおよびマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートをそれぞれ５５：５：３０：１０のパーセントモル濃度比で使用して調製した。アレンドロネートのアンモニウム塩をリポソームに共封入し、その後ドキソルビシンとインキュベートし、リポソームの水性空間にドキソルビシンを充填した。共封入したドキソルビシン、アレンドロネートおよびマイトマイシンＣプロドラッグを含むリポソームを本明細書に記載の試験の大部分に使用した。別の試験において、図１１についてもまた記載されるように、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを含むリポソームを調製し、ここでアレンドロネートスルフェート勾配ではなくアンモニウムスルフェート勾配を用いてドキソルビシンをリポソームに充填した。
【００４６】
共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを含むリポソームを電子低温顕微鏡(ｃｒｙｏＴＥＭ)により観察した。画像を図１Ａ〜１Ｄに示す。一般的に≦１００ｎｍの直径の単層リポソームである楕円体小胞の優占集団が見られる。単層の小胞の内側の水相における沈殿結晶であるアレンドロネート塩またはドキソルビシン塩が明らかである(図１Ｄ)。これらの沈殿形成は、脂質二重層にアンモニウムスルフェートで充填したドキソルビシンを有するがマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有さないリポソーム(ＤＯＸＩＬ)およびアンモニウムアレンドロネートで充填したドキソルビシンを含むがマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有さないリポソームについて先に報告された棒状形成と異なる。いくつかのリポソームにおける沈殿は星状形成である。また、画像のいくつか、例えば図１Ａ、図１Ｃおよび図１Ｄは、直線接触面(曲線ではない)を有する「接触小胞」を示す。いくつかのリポソームにおいて、ドキソルビシンアレンドロネートおよびマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートの共沈殿の存在を示唆する、高電子密度帯が二重層において見られる。
【００４７】
共封入したドキソルビシンアレンドロネートおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームの血漿安定性を実施例２に記載のように評価した。ヒト血漿中でのインキュベーション後のマイトマイシンＣプロドラッグおよびドキソルビシンの遊離を測定し、緩衝液中での遊離と比較した。図２Ａはヒト血漿(三角)および緩衝液(菱形)におけるリポソームのインキュベート後にカラムから回収した溶離液のフラクションにおけるマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートの遊離を示す。図２Ｂは、ヒト血漿(三角)および緩衝液(菱形)中でリポソームのインキュベートした後の溶離液フラクションにおけるドキソルビシンの遊離を示す同様のグラフである。血漿タンパク質の溶離はブラッドフォードタンパク質アッセイを用いて測定した(６２０ｎｍの吸光度、四角)。
【００４８】
データは、フラクション４〜７にリポソームが溶離するが、ほとんど全てのマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートおよびドキソルビシンがリポソームに結合したままであることを示す。血漿タンパク質はフラクション７〜１１に大部分溶離する。血漿タンパク質に分割された顕著なマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートまたはドキソルビシンは存在せず、検出可能なマイトマイシンＣの遊離は存在しなかった。マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートまたはドキソルビシンと血漿タンパク質の最小限の重複が観察され、マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートがタンパク質と置き換わるおよび／または血漿での遊離マイトマイシンＣへの開裂が不十分であることを示す遊離マイトマイシンＣの遅いピークは存在しなかった。フラクション６に存在する小さなタンパク質ピークはリポソームへのタンパク質の吸着によるものであり得る。
【００４９】
共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームを評価するために実施した別の試験において、リポソームの細胞毒性をヒト細胞株、Ｔ２４膀胱癌、Ｎ８７胃癌およびＩＧＲＯＶ−１卵巣癌細胞、多剤耐性Ｍ１０９Ｒ肺癌細胞株およびＮＣＩ／Ｃで評価した。比較のために、捕捉ドキソルビシンおよびポリエチレングリコール(ＰＥＧ)コーティングを有するリポソーム(商品名ＤＯＸＩＬ(登録商標)で入手可能)、脂質二重層に取り込まれたマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートおよびＰＥＧコーティングを有するリポソーム(文献において商品名ＰＲＯＭＩＴＩＬ(登録商標)と称されることがある；本明細書においてリポソーム−ＭＬＰまたはマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを含むリポソームと称されることがある)のコーティングを有するリポソームもまた、遊離ドキソルビシンおよび共封入したドキソルビシンアレンドロネートおよびＰＥＧコーティングを有するリポソーム(参照により本明細書に包含させる米国特許第２０１４／０３２８８９９号)とともに、これら細胞株で評価した。
【００５０】
取り込み試験の詳細は実施例３で説明される。手短には、リポソーム組成物または遊離ドキソルビシンを６.５μモル／Ｌ(３.７μｇ／ｍＬ)の濃度のドキソルビシンおよび５μモル／Ｌ(５.７μｇ／ｍＬ)の最終濃度のマイトマイシンＣ脂質プロドラッグコンジュゲートと３時間インキュベートした。
【００５１】
Ｔ２４膀胱癌細胞を用いた試験の結果を図３Ａ〜３Ｂおよび以下の表に示す。
【表１】
2018530623.tif 000003
【００５２】
図３Ａについて、ドキソルビシンをアンモニウムアレンドロネート勾配に対してリポソームに充填した共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(実施例１)は、細胞をリポソーム−捕捉ドキソルビシンで処理したときと同程度の低い低細胞取り込みを示し(図３Ａのリポソーム−ＭＬＰ−ｄｏｘと記された棒グラフとリポソーム−ｄｏｘ(ＤＯＸＩＬ)と記された棒グラフを比較)、細胞を遊離ドキソルビシンで処理したときの細胞取り込みと比較してドキソルビシンの細胞取り込みが低い。捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(リポソーム−ｄｏｘ)とマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ)の混合物は、同様に、遊離ドキソルビシンでの処理について観察された取り込みと比較して低いドキソルビシンの細胞取り込みを提供した。リポソーム組成物はそれぞれ全ての場合において遊離ドキソルビシンより低い同様のドキソルビシン取り込みをもたらした。
【００５３】
マイトマイシンＣプロドラッグの取り込みを試験したとき(図３Ｂ)、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ−ｄｏｘ)で処理した細胞およびマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ)で処理した細胞で同様のマイトマイシンＣプロドラッグレベルが測定された。リポソーム−捕捉ドキソルビシンとリポソームマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソームの混合物で処理した細胞は、マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートの同程度の取り込みを達成した。細胞へのマイトマイシンＣの取り込みは、遊離薬物が細胞ＤＮＡと急速に相互作用し、測定を困難にする化学的変化を受けるため測定できない。また、細胞内のマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートのレベルは、マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートの遊離マイトマイシンＣへの急速な開裂および前記した細胞内の遊離マイトマイシンＣを測定する困難性のため、ドキソルビシンのレベルより低い。
【００５４】
図３Ｂのデータは、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ−ｄｏｘ)およびマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ)を用いた処理が細胞内に同等レベルのマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートをもたらすことを明らかにする。下に示すように、ドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグと共封入したリポソームで処理した細胞の増大した細胞毒性の顕著な利点は、マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートの細胞取り込みデータに鑑みて驚くべきものである。同様に、図３Ａのデータは、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ−ｄｏｘ)およびマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ)が細胞内に同等レベルのドキソルビシンをもたらすことを明らかにする。下に示すように、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームで処理した細胞の増大した細胞毒性の顕著な利点は、リポソーム−捕捉ドキソルビシンまたは共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームとして投与したとき、薬物取り込みに差異がないことを示すドキソルビシンの細胞取り込みデータに鑑みて驚くべきものである。
【００５５】
インビトロ細胞毒性の結果を図４〜９に示す。まず図４Ａについて、遊離ドキソルビシン(丸)、捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(ＤＯＸＩＬ、四角)および共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(三角)と３７℃で７２時間インキュベート後、対照細胞に対する割合として、ドキソルビシン濃度の関数として１リットルあたりのマイクロモルでＴ２４膀胱癌細胞の増殖を示す。図４ＢはＴ２４膀胱癌細胞を用いた試験についての同様のグラフであり、遊離マイトマイシンＣ(丸)、マイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(四角)および共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(三角)と７２時間、３７℃でインキュベート後、細胞増殖を、マイトマイシンＣ(ＭＭＣ)濃度の関数として、１リットルあたりのマイクロモル濃度で示す。共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームは、捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(ＤＯＸＩＬ)と捕捉されたマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソームの混合物を用いて処理するより細胞に対する細胞毒性が高い。顕著には、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームでの処理は遊離ドキソルビシンまたは遊離マイトマイシンＣを用いた処置とほぼ同程度の細胞毒性を示す。Ｔ２４細胞におけるＩＣ５０値を表２に示す。
【表２】
2018530623.tif 000004
【００５６】
ヒトＮ８７胃癌細胞を用いた細胞毒性試験の結果を図５Ａ〜５Ｂおよび表３に示す。図５Ａは遊離ドキソルビシン(丸)、捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(ＤＯＸＩＬ、四角)、マイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ、ＰＲＯＭＩＴＩＬ)と捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(リポソーム−ｄｏｘ、ＤＯＸＩＬ)の混合物(菱形)ならびに共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(三角)で７２時間、３７℃でインキュベート後、Ｎ８７胃癌細胞の増殖を対照細胞に対する割合として、ドキソルビシン濃度の関数として１リットルあたりのマイクロモル濃度で示す。図５Ｂは、マイトマイシンＣについて、遊離マイトマイシンＣ(丸)、マイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(四角)、捕捉ドキソルビシンを有するリポソームとマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームの混合物(菱形)および共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(三角)と７２時間、３７℃でインキュベートした後の、Ｎ８７胃癌細胞の増殖についての結果を、マイクロモル濃度で、マイトマイシンＣ(ＭＭＣ)濃度の関数として示す。共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームは、マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート有するリポソーム、またはマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソームと捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(ＤＯＸＩＬ)の組合せ剤よりはるかに高い細胞毒性活性、ならびに遊離の薬物であるドキソルビシンおよびマイトマイシンＣとほぼ同等の活性を提供する。
【表３】
2018530623.tif 000005
【００５７】
図６Ａ〜６Ｂおよび表４に見られるように、同様の結果がＩＧＲＯＶ−１細胞において観察された。図６Ａはインビトロ細胞毒性試験に由来するグラフであり、遊離ドキソルビシン(丸)、捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(ＤＯＸＩＬ、四角)、マイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(ＰＲＯＭＩＴＩＬ)と捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(ＤＯＸＩＬ)の混合物(菱形)および共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(三角)と７２時間、３７℃でインキュベートした後のＩＧｒｏｖ−１卵巣癌細胞の増殖を、対照細胞に対する割合として、マイクロモルで、ドキソルビシン濃度の関数として示す。
【００５８】
図６Ｂはインビトロ細胞毒性試験に由来するグラフであり、遊離マイトマイシンＣ(丸)、マイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(四角)、捕捉ドキソルビシンを有するリポソームとマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームの混合物(菱形)および共封入した捕捉ドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(三角)と３７℃で７２時間インキュベートした後のＩＧｒｏｖ−１卵巣癌細胞の増殖を、対照細胞に対する割合として、マイクロモルで、マイトマイシンＣ(ＭＭＣ)濃度の関数として示す。
【表４】
2018530623.tif 000006
【００５９】
多剤耐性Ｍ１０９Ｒ肺癌細胞を用いた細胞毒性試験の結果を図７Ａ〜７Ｂおよび表５に示す。図７Ａは、遊離ドキソルビシン(丸)、捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(ＤＯＸＩＬ、四角)、マイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(ＰＲＯＭＩＴＩＬ)と捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(ＤＯＸＩＬ)の混合物(菱形)および共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(三角)と３７℃で７２時間インキュベートした後の多剤耐性Ｍ１０９Ｒ肺癌細胞の増殖を、対照細胞に対する割合として、マイクロモルでドキソルビシン濃度の関数として示す。図７Ｂは、遊離マイトマイシンＣ(丸)、マイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(四角)、捕捉ドキソルビシンを有するリポソームとマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(菱形)の混合物および共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(三角)と３７℃で７２時間インキュベートした後の多剤耐性Ｍ１０９Ｒ肺癌細胞の増殖を、対照細胞に対する割合として、マイクロモルでマイトマイシンＣ(ＭＭＣ)濃度の関数として示す。Ｍ１０９Ｒ肺癌細胞について予想されるように、細胞は捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(ＤＯＸＩＬ)におけるドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム(ＰＲＯＭＩＴＩＬ)におけるマイトマイシンＣに対して耐性である。しかしながら、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームは捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(ＤＯＸＩＬ)とマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム(ＰＲＯＭＩＴＩＬ)の混合物とインキュベートした細胞と比較しても、増強された細胞毒性を示す。
【表５】
2018530623.tif 000007
【００６０】
多剤耐性ＮＣＩ／ＡＤＲ卵巣癌細胞を用いた細胞毒性の結果を図８Ａ〜８Ｂおよび表６に示す。図８Ａは、遊離ドキソルビシン(丸)、捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(ＤＯＸＩＬ、四角)、マイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(ＰＲＯＭＩＴＩＬ)と捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(ＤＯＸＩＬ)の混合物(菱形)および共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(三角)と３７℃で７２時間インキュベートした後のＮＣＩ／ＡＤＲ細胞の増殖を、対照細胞に対する割合として、マイクロモルでドキソルビシン濃度の関数として示す。図８Ｂは、遊離マイトマイシンＣ(丸)、マイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(四角)、捕捉ドキソルビシンを有するリポソームとマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームの混合物(菱形)および共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(三角)と３７℃で７２時間インキュベートした後のＮＣＩ／ＡＤＲ細胞の増殖を、対照細胞に対する割合として、マイクロモルでマイトマイシンＣ(ＭＭＣ)濃度の関数として示す。共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームがドキソルビシンを有するリポソーム(ＤＯＸＩＬ)またはマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム(ＰＲＯＭＩＴＩＬ)、および／またはドキソルビシンを有するリポソームとマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソームの混合物よりも、細胞に対する細胞毒性が高いことに注目することは興味深い。顕著には、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームで達成される細胞毒性はＮＣＩ／ＡＤＲ癌細胞における遊離ドキソルビシンの細胞毒性活性と近い。これらの結果は、リポソームビークル中にマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートおよびドキソルビシンが共封入されるとき、相乗的細胞毒性寄与を明らかに示す。
【表６】
2018530623.tif 000008
【００６１】
実施例１に記載のように、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームは、ドキソルビシンをアンモニウムスルフェートイオン勾配に対してまたはアンモニウムアレンドロネートイオン勾配に対してリポソームに充填することにより調製される。もしあるならば、２つの充填塩を用いて調製された共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームのインビトロ細胞毒性に対する効果を評価するために試験を実施した。Ｔ２４膀胱癌細胞を用いて試験を行い、結果を図９Ａ〜９Ｂに示す。図９Ａは、遊離ドキソルビシン(丸)、捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(リポソーム−ｄｏｘ、ＤＯＸＩＬ、四角)、アンモニウムアレンドロネート勾配を用いてドキソルビシンをリポソームに充填した、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(三角)および、アンモニウムスルフェート勾配を用いてドキソルビシンをリポソームに充填した、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(菱形)と３７℃で７２時間インキュベートした後のＴ２４膀胱癌細胞の増殖を、対照細胞(未処理)に対する割合として、ドキソルビシン濃度の関数として示す。共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームの細胞毒性は、充填する塩にかかわらず同様である。
【００６２】
マイトマイシンＣ(ＭＭＣ)濃度の関数としての細胞増殖を評価したとき、同様の結果が図９Ｂにおいて見られる。アンモニウムアレンドロネート勾配を用いてドキソルビシンをリポソームに充填した、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(三角)、およびスルフェート勾配を用いてドキソルビシンリポソームに充填した共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(菱形)で処理したＴ２４膀胱癌細胞はほぼ同一の細胞毒性プロファイルを有した。共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームの細胞毒性は充填塩にかかわらず同様である。遊離マイトマイシンＣ(丸)、マイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームおよびアンモニウムアレンドロネート(四角)ならびにマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームおよびアンモニウムスルフェート(×印)で処理した細胞についての結果を図９Ｂにもまた示す。充填塩、マイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームおよび同様の細胞毒性レベルを達成するアンモニウムアレンドロネート塩またはアンモニウムスルフェート塩にかかわらず同様の細胞毒性を産生する共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームについて、同様の結果が観察された。
【００６３】
全てのリポソーム製剤について薬物取り込みが同程度である薬物取り込み試験(図３Ａ〜３Ｂ)を考慮すると、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームで処理した細胞について増大した細胞毒性を示すインビトロ細胞毒性試験(図４〜９)は、ドキソルビシンまたはマイトマイシンＣプロドラッグの高い取り込みにより説明されない。その代わりに、２つの物質が共封入されたリポソーム送達ビークルから投与されたとき、ドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグの組合せの存在は相乗的な結果を提供する。
【００６４】
文献ではマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソームはジチオトレイトールのような還元剤との１時間以内のインキュベート時間で、還元剤(ジチオトレイトール)とほぼ化学量論量のマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを産生すると報告されている。つまり、約１：１のジチオトレイトール：マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートモル濃度比が提供され、マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートの本質的に完全な分解をもたらすということである。反応が完結することを可能にする３０〜６０分の時間経過内にマイトマイシンＣの＞９９％が開裂するために、０.５ｍＭのジチオトレイトール濃度が必要である。従って、このジチオトレイトール濃度は反応物に存在するマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートのモル濃度(０.４４ｍＭ)よりわずかに高いため、反応はほぼ化学量論的である。共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム中のマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートの濃度はマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソームと比較して約２倍低いため、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームのほぼ全ての開裂をもたらすべきジチオトレイトールの当量濃度は０.２５ｍＭである。この概念を探索するために、実施例４に記載のように試験を実施した。
【００６５】
共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームからの薬物遊離アッセイの結果を図１０Ａ〜１０Ｂに示し、そこでは、ジチオトレイトール濃度による３７℃でのマイトマイシンＣプロドラッグ活性化、すなわちマイトマイシンＣ−脂質プロドラッグコンジュゲートの開裂および遊離マイトマイシンＣの遊離が示される。データは、インキュベートを１時間まで伸ばしたとき、単純な化学量論反応により予測されたとおり、マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート：ジチオトレイトールの１：１のモル濃度比はマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを完全に開裂させてマイトマイシンＣを遊離させることができず、マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートのみを有するリポソームと比較して、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームはジチオトレイトールによるマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートのチオール開裂に対してより耐性であることを示すことを示唆する。これらの結果はより高濃度のジチオトレイトールがマイトマイシンＣプロドラッグ開裂に使用されたときに確認された。図１０Ａ〜１０Ｂにおけるデータは、０.５ｍＭおよび１ｍＭのジチオトレイトール濃度であっても、マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートは完全に開裂せず、マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソームと比較して、マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートが共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームにおける活性化に対してより耐性であることを示すことを示す(図１０Ｃ〜１０Ｄ)。これは直線のｌｏｇ勾配から明らかであり、そこでは、０.５ｍＭまでのジチオトレイトールでマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートの遊離のｌｏｇ勾配は、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソームについての勾配(ｌｏｇ勾配３.９)よりマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソームについての勾配(ｌｏｇ勾配４.５)よりはるかに大きい。
【００６６】
実施例５に記載のように、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームで処置される対象における腫瘍の処置を評価するためにインビボ試験を実施した。マウス腫瘍転移Ｃ２６モデルを用いて、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームの毒性および治療効果を遊離マイトマイシンＣおよびマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム(ＭＬＰ−リポソームまたはＰＲＯＭＩＴＩＬ)ならびに共封入したマイトマイシンＣプロドラッグおよびドキソルビシンを有するリポソームと比較した。腫瘍細胞接種後５日および１２日に、実施例５に記載の用量で試験物質を静脈内投与した。
【００６７】
結果を図１１に示し、そこでは、腫瘍担持マウスの生存率が時間の関数として示される。未処置のままのマウス(実線)は中央生存２７.５日であった。遊離マイトマイシンＣ(破線)で処置したマウスは中央生存３１日であった。マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソームで処置したマウス(斜線)は中央生存３３日であった。共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームで処置したマウス(垂直線塗)は中央生存３６日であった。３６日目で、他の処置と比較して、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームを用いた処置では、１８日目に１匹のマウスを屠殺した以外、処置による明らかな毒性効果は存在しなかった。共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームの治療効果は生存時間に基づき他の処置群より優れていた(ｐ値を参照)。
【００６８】
共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームの薬物動態プロファイルを決定するために、別のインビボ試験を実施した。本試験において、リポソームは、したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを共封入するために本明細書に記載のように封入調製した。ドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを共封入したリポソームもしくはマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソームまたは捕捉ドキソルビシンを有するリポソームとマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソームの組合せを動物に注射した。注射２４時間後に血液サンプルを回収し、注射用量と比較した血液血漿中のマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートの量を測定した。結果を図１２に示す。マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰまたはＰＲＯＭＩＴＩＬ)および捕捉ドキソルビシンを有するリポソームとマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソームの組合せ(リポソーム−ＭＬＰ＋リポソーム−ｄｏｘ)は、注射２４時間後、血漿中に約１１％のマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート(ＭＬＰ)を有した。共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームは、注射２４時間後、血漿中に２２％のマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート(ＭＬＰ)を有した。ドキソルビシン(または別のアントラサイクリン)を有するリポソームに共封入してマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを投与するときの、投与２４時間後の血流中のマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートの量は、マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソームおよび捕捉ドキソルビシンを有するリポソームを、それぞれの薬物を別々のリポソームビークルで共投与するときより約２倍高い。共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームで処置される動物についてのドキソルビシンに対するマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートの初期比は１.２６であり、ドキソルビシンに対するマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートの血漿比は０.８３であった。しかしながら、マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート濃度は、リポソームドキソルビシンを伴うまたは伴わないマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームを用いた処置についての濃度より、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームを用いた処置についての濃度が２倍大きかった。
【００６９】
共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームの相乗作用を立証するために、他のインビボ試験を実施した。実施例６に記載のように、ある試験において、リポソーム製剤の注射２４時間後のマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートおよびドキソルビシンの薬物動態および組織分布を決定した。試験製剤を動物に静脈内投与し、２４時間後に、血漿中のマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート(ＭＬＰ)およびドキソルビシンの濃度を決定した。結果を図１３Ａ〜１３Ｂに示し、マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートの注射用量のパーセントを図１３に示し、ドキソルビシンの注射用量のパーセントを図１３Ｂに示す。図１３Ａは、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ−ｄｏｘ、ドット柄)の投与がマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ)と捕捉ドキソルビシンを有するリポソームの混合物(リポソーム−ｄｏｘ)の混合物(横線)またはマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ、レンガ状横破線)の投与から提供される量より２倍近く高い量の血漿におけるマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを提供することを示す。このデータはリポソーム−ＭＬＰ−ｄｏｘ製剤の長い血液循環期間および、リポソーム−ＭＬＰ−ｄｏｘ製剤の一部であるときの、ＭＬＰコンジュゲートの安定性を示す。図１３Ｂは、ドキソルビシンがリポソーム−ＭＬＰ−ｄｏｘ(ドット柄)、リポソーム−ＭＬＰおよびリポソーム−ｄｏｘの混合物(横線)またはドキソルビシンを有するリポソーム(リポソーム−ｄｏｘ、斜線)の形態で提供されるとき、ドキソルビシンの血漿薬物動態に有意な差異がないことを示す。従って、ある実施態様において、本明細書に記載の共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソームは、単一の処置剤またはドキソルビシンで捕捉されたリポソームと共投与で投与するマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートで捕捉されたリポソームと比較して１０％、１５％、２０％、２５％または３０％長い血液循環寿命を提供する。
【００７０】
リポソーム−ＭＬＰ−ｄｏｘで処置したマウスにおけるマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート(ＭＬＰ)およびドキソルビシンの分布を決定した。リポソーム−ＭＬＰで処置したマウスにおけるＭＬＰの分布もまた、決定した。図１４Ａは、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ−ｄｏｘ)の注射２４時間後の、ＭＬＰ(白抜き)およびドキソルビシン(ドット柄)の組織１グラムあたりの注射用量のパーセントを示す。共封入したＭＬＰ−ドキソルビシンリポソーム製剤でＭＬＰを投与したとき、マウスの肝臓、脾臓、肺および腎臓にＭＬＰおよびドキソルビシンが存在し、これらの組織のそれぞれに注射用量の約１％のＭＬＰが検出可能であった(図１４Ａ)。対照的に、ＭＬＰをリポソーム−捕捉マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートの形態で投与したとき、ＭＬＰは肝臓または肺において検出されない(図１４Ｂ)。このデータは、ドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを共封入するリポソームの形態で投与されたＭＬＰは、リポソーム−捕捉ＭＬＰの形態で投与されたＭＬＰと比較して遅い分解および／または開裂速度を有することを示す。ある実施態様において、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム製剤は、マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートで捕捉されたリポソームと比較して、肝臓、肺および／または脾臓において１０％、１５％、２０％、２５％、または３０％多い量のＭＬＰを提供する。
【００７１】
共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームの抗腫瘍活性を評価するために、４Ｔ１乳房腫瘍を有するマウスを用いて別のインビボ試験を実施した。実施例７に記載のように、腫瘍を有するマウスを遊離ドキソルビシンまたはリポソーム製剤で処置した。処置後７０日間、２日毎に腫瘍サイズを測定した。結果を図１５に示す。未処置の腫瘍担持マウスを黒菱形で示し、リポソーム製剤で処置した薬物処置腫瘍担持マウスは以下の通りである：(ｉ)遊離ドキソルビシン(白四角)、(ｉｉ)マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ、黒三角)、(ｉｉｉ)捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(リポソーム−ｄｏｘ、×印)、(ｉｖ)マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ)と捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(リポソーム−ｄｏｘ)の混合物(逆白三角)または(ｖ)共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(黒円)。
【００７２】
図１５に関して、未処置の腫瘍担持マウス(黒菱形)および遊離ドキソルビシンで処置したマウス(白四角)は、継続的かつ急速な腫瘍増殖を経験し、腫瘍は処置１０日後に５．５ｍｍに達した。リポソーム−ＭＬＰで処置した腫瘍担持マウス(黒三角)は、継続的腫瘍増殖を経験し、腫瘍は処置２０日後に５．５ｍｍに達した。リポソーム−ｄｏｘで処置した腫瘍担持マウス(×印)の群において、腫瘍増殖は遊離ドキソルビシンで処置したマウスまたは未処置のマウスと比較して遅く、１／８の動物が腫瘍を有さないままであった。リポソーム−ＭＬＰおよびリポソーム−ｄｏｘの混合物で処置したマウス(逆白三角)の群において、腫瘍増殖は遊離ドキソルビシン、リポソーム−ｄｏｘ、リポソーム−ＭＬＰで処置したマウスまたは未処置のマウスと比較して遅く、２／８の動物が腫瘍を有さないままであった。リポソーム−ＭＬＰ−ｄｏｘで処置した腫瘍を有するマウス(共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム、黒円)の群において、腫瘍増殖は覆され、４／８の動物が腫瘍を有さないままであった。
【００７３】
このインビボ試験のデータは、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソームの、本製剤の相乗的活性により生じる有効性を示す。特に、腫瘍サイズの減少および無腫瘍対象数により証明されるように、他の試験製剤と比較した共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートの増加した有効性は、リポソーム捕捉マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート(リポソーム−ＭＬＰまたはＰＲＯＭＩＴＩＬ)で投与されるより低用量のマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートで達成された。従って、ある実施態様において、本明細書に記載の共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム製剤は、単一の処置剤として投与されるか、またはリポソーム捕捉ドキソルビシンと共投与されるリポソーム捕捉マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートと比較して、リポソーム捕捉マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート組成物で投与されるより３０％、２５％、２０％または１５％低用量であるマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートの用量で、１０％、２０％、２５％または３０％増加した有効性を提供する。
【００７４】
処置手順および患者集団
上記の試験に基づいて理解できるように、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームを含むリポソーム組成物に基づく処置方法は、処置を必要とする対象における新生物の相乗的処置を提供する。本処置方法が特に有用な新生物は、限定されないが、癌、特に膀胱、乳房、子宮頸、結腸、頭頸部、黒色腫、肺、卵巣、膵臓、食道、肛門および胃の癌を含む。好ましい実施態様において、方法は乳房、直腸または結腸直腸、胃、食道および膵臓癌の相乗的処置のために提供される。有利には、相乗的方法は哺乳動物宿主における腫瘍増殖の減少、腫瘍量の減少および／または腫瘍退縮の誘発を含む有益な効果を達成する。該方法はまた、腫瘍を有する哺乳動物の生存を延長する。
【００７５】
当業者は、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームの集合体を含む医薬組成物は腫瘍への直接的注入、経口または静脈内、筋肉内、皮下、眼窩内、鼻腔内、嚢内、腹腔内、大槽内、気管内もしくは関節内のような非経腸を含む種々の経路により対象に投与され得ると理解する。特定の実施態様において、組成物は通常の食塩水の溶液として非経腸的に投与される。
【００７６】
リポソーム組成物の実際の用量は処置される患者の要求および状態の重症度により変化し得る。特定の状況についての適切な用量の決定は当分野の技術範囲内である。また、経験のある臨床医の知識により、治療プロトコル(例えば、投与の用量および時間)は投与される治療剤の患者に対して観察される効果を考慮して、および投与される治療剤に対して観察される患者の反応を考慮して変更され得る。
【実施例】
【００７７】
ＩＩＩ．実施例
以下の実施例は本質的には例示的であり、限定することを全く意図しない。
【００７８】
実施例１
リポソーム調製
親油性部分に遊離可能に結合したマイトマイシンＣのプロドラッグコンジュゲート、パラ−ジアシルジグリセロールジチオベンジル−マイトマイシンＣを、参照により本明細書に包含させる米国特許第７,３０３,７６０号の実施例２に記載のとおり、合成した。
【００７９】
エタノール注入、水和および細孔径０.０８μｍまでのポリカーボネート膜押出縮小を用いて、標準的な方法によりリポソーム形成を実施した。具体的には、水素化ダイズホスファチジルコリン(ＨＳＰＣ)、ｍＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ(ジステロイルホスファチジルエタノールアミンに結合したメトキシポリエチレングリコール(ＭＷ２,０００ダルトン))、コレステロールおよびマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートをそれぞれ５５：５：３０：１０のパーセントモル濃度比で用いてポリエチレングリコールおよびマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートの外部コーティングを有するリポソームを調製した。２５０ｍＭ  アンモニウムアレンドロネート(ｐＨ６.７)を含む緩衝液中で再水和することにより、アレンドロネートのアンモニウム塩をリポソームに封入した。透析後に陰イオン交換樹脂ＤＯＷＥＸ(登録商標)を通過させることにより、非封入アレンドロネートアンモニウム塩を除去した。遊離アレンドロネートについて検査するためにＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標)カラムクロマトグラフィーを行った。
【００８０】
水相にアレンドロネートを含み、かつ脂質二重層にマイトマイシンＣプロドラッグを含むリポソームをドキソルビシン塩酸塩(ｄｏｘ)溶液と６０℃で６０分間インキュベートした。得られたリポソーム懸濁液を陽イオン交換樹脂ＤＯＷＥＸに通過させて非封入ドキソルビシンを除去した。０.４５μｍおよび０.２２μｍフィルターを用いて製剤を滅菌した。残存遊離ドキソルビシンがいくらか存在するかどうかを決定するためにおよび共封入安定性を観察するために、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥゲルクロマトグラフィー分別を使用して非共封入、低分子量物質からリポソーム物質を分離した。Ｆｏｌｃｈ抽出後にリン脂質およびアレンドロネート含有量を決定した。ドキソルビシン吸光度を酸性化したイソプロパノール抽出後に５９０ｎｍ(Ｅｘ：４７０ｎｍ)の蛍光発光でおよびマイトマイシンＣプロドラッグをイソプロパノール抽出後に３６０ｎｍでのＵＶ検出による逆相ＨＰＬＣで測定した。
【００８１】
アンモニウムアレンドロネート勾配の代わりに、ｐＨ５.８の２５０ｍＭ  アンモニウムスルフェートのアンモニウムスルフェートイオン勾配を用いてドキソルビシンをリポソームに充填した以外、類似するリポソーム組成物を調製した。
【００８２】
リポソーム組成物の最終製剤を以下の表に示す。
【表７】
2018530623.tif 000009
【００８３】
実施例２
リポソーム特徴付け
実施例１に従って調製されたリポソームを電子低温顕微鏡法(ｃｒｙｏＴＥＭ)により検査した。画像を図１Ａ〜１Ｄに示す。
【００８４】
１００μＬのリポソームと４００μＬのヒト血漿を３７℃で２時間インキュベートすることにより、実施例１に従って調製したリポソームの血漿安定性を評価した。インキュベート後、リポソームのサンプルをセファロース−６Ｇのカラムを通過させ、２０ｍＬの溶離剤を回収することによりＭＬＰおよびＤＯＸの遊離についてリポソームを評価した。結果を図２Ａ〜２Ｂに示す。
【００８５】
実施例３
インビトロ特徴付け：細胞取り込みおよび細胞毒性
共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソームの細胞毒性を３つのヒト細胞株：Ｔ２４膀胱癌、Ｎ８７胃癌およびＩＧＲＯＶ−１卵巣癌細胞ならびに多剤耐性Ｍ１０９Ｒ肺癌細胞株およびＮＣＩ／ＡＤＲ卵巣癌細胞において評価した。比較として、アンモニウムスルフェート勾配で捕捉したドキソルビシンおよびポリエチレングリコール(ＰＥＧ)コーティングを有するリポソーム(商品名ＤＯＸＩＬ(登録商標)として入手可能)、脂質二重層に取り込まれたマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートおよびＰＥＧコーティングを有するリポソーム(文献中で商品名ＰＲＯＭＩＴＩＬ(登録商標)と称されることもある)もまた、遊離ドキソルビシンおよびアンモニウムアレンドロネート勾配で封入したドキソルビシンおよびＰＥＧコーティングを有する共リポソーム(参照により本明細書に包含させる米国特許２０１４／０３２８８９９号)とともに、これら細胞株において評価した。
【００８６】
細胞取り込み試験を以下のようにして実施した。１ｘ１０６個の細胞を、ドキソルビシン濃度６.５マイクロモル／ｍＬ(３.７μｇ／ｍＬ)および最終マイトマイシンＣ脂質プロドラッグコンジュゲート濃度５マイクロモル／ｍＬ(５.７μｇ／ｍＬ)および捕捉ドキソルビシンを有するリポソームの濃度と同じリン脂質濃度(４０ナノモル／ｍＬ)で種々の試験剤と３時間インキュベートした。結果を図３Ａ〜３Ｂおよび表１に示す。
【００８７】
細胞毒性アッセイにおいて、細胞を９６マルチウェルプレートに播種した。一晩インキュベート後、薬物またはリポソーム組成物を種々の濃度で添加し、細胞をさらにインキュベートして総暴露時間７２時間とした。メチレンブルー染色を用いて細胞増殖を比色分析で評価し、増殖速度およびＩＣ５０値を文献において知られているように計算した。結果を図４〜９および表２〜６に示す。
【００８８】
実施例４
薬物遊離アッセイ
共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームに含まれるマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートからのマイトマイシンＣの遊離を測定するためのアッセイを、リポソームをジチオトレイトール(ＤＴＴ)とインキュベートすることにより実施した。
【００８９】
本試験において、２５０μｇのマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(ＰＲＯＭＩＴＩＬ、５０μＬ)または共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソームを種々の濃度のジチオトレイトールを含む最終体積０.５ｍＬのＰＢＳ中で振盪させながら３７℃で１時間インキュベートした。希釈により反応を停止させ、イソプロパノール(１：１０)でおよび薬物抽出を行った。マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートおよび遊離マイトマイシンＣをＨＰＬＣ分析により定量化した。結果を図１０Ａ〜１０Ｄに示す。
【００９０】
実施例５
インビボ試験：共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソームの治療効果
遊離マイトマイシンＣ、およびマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰまたはＰＲＯＭＩＴＩＬ)と比較した共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(実施例１に従って調製)の毒性および治療効果を試験するために、マウス腫瘍転移Ｃ２６モデルにおいてインビボ試験を実施した。この試験において、転移腫瘍を生じさせるために５０,０００個のＣ２６マウス結腸癌細胞を同系ＢＡＬＢ／ｃレシピエントに静脈内接種した。試験剤を細胞接種後５日および１２日に静脈内投与した。処置あたりの用量は、遊離マイトマイシンＣについては５ｍｇ／ｋｇ、マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム(ＰＲＯＭＩＴＩＬ)については３０ｍｇ／ｋｇのマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート(ＭＬＰ)、および共封入したマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートおよびドキソルビシンを有するリポソームについては１２.５ｍｇ／ｋｇのマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート(ＭＬＰ)と８ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンであった。結果を図１１に示す。
【００９１】
実施例６
インビボ試験：共封入した２剤を有するリポソームの、投与２４時間後のマイトマイシンＣプロドラッグおよびドキソルビシンの薬物動態
Ｂａｌｂ／ｃ近交系マウスおよびＳａｂｒａ非近交系マウスを、以下のリポソーム製剤の１つを用いた処置のために４群（ｎ＝＊）に無作為化した：(ｉ)共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(実施例１に従って調製；リポソーム−ＭＬＰ−ｄｏｘ)；(ｉｉ)マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ)および捕捉ドキソルビシンを有するリポソーム(リポソーム−ｄｏｘ)の混合物；(ｉｉｉ)マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲートを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ)；または(ｉｖ)ドキソルビシンを有するリポソーム(リポソーム−ｄｏｘ)。
【００９２】
リポソーム製剤は次の用量で静脈内投与した：
(ｉ)リポソーム−ＭＬＰ−ｄｏｘ：１１ｍｇ／ｋｇ  マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート(ＭＬＰ)および８ｍｇ／ｋｇ  ドキソルビシン；
(ｉｉ)リポソーム−ＭＬＰ＋リポソーム−ｄｏｘ混合物：３０ｍｇ／ｋｇ  マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート(ＭＬＰ)および５ｍｇ／ｋｇ  ドキソルビシン
(ｉｉｉ)リポソーム−ＭＬＰ：３０ｍｇ／ｋｇ  マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート(ＭＬＰ)；および
(ｉｖ)リポソーム−ｄｏｘ：８ｍｇ／ｋｇ  ドキソルビシン。
投与２４時間後、血漿中の薬物の注射した量のパーセントを決定した。結果を図１３Ａ−１３Ｂに示す。
【００９３】
製剤(ｉ)、リポソーム−ＭＬＰ−ｄｏｘで処置したマウスの肝臓、脾臓、肺および腎臓におけるマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート(ＭＬＰ)およびドキソルビシン(ｄｏｘ)の分布を決定し、図１４Ａに示す。製剤(ｉｉｉ)、リポソーム−ＭＬＰで処置したマウスの肝臓、肺、脾臓、腎臓および心臓におけるマイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート(ＭＬＰ)の分布を決定し、図１４Ｂに示す。
【００９４】
実施例７
インビボ試験：共封入したマイトマイシンＣプロドラッグおよびドキソルビシンを有するリポソームの抗腫瘍活性
未処置、腫瘍担持マウスおよび遊離ドキソルビシンまたは比較用リポソーム製剤で処置した腫瘍担持マウスと比較した、共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(実施例１に従って調製)の毒性および治療効果を評価するために、マウス４Ｔ１乳房腫瘍モデルにおいてインビボ試験を実施した。腫瘍を生じさせるために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに１００,０００個の４Ｔ１乳癌細胞を接種した。各々の処置群に約８匹の腫瘍担持マウスが存在した。
【００９５】
接種８日後、試験製剤を静脈内投与した。試験製剤および用量は次の通りであった：
(ｉ)遊離ドキソルビシン：１０ｍｇ／ｋｇ；
(ｉｉ)リポソーム−ＭＬＰ：３５ｍｇ／ｋｇ  マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート(ＭＬＰ)；
(ｉｉｉ)リポソーム−ＭＬＰ＋リポソーム−ｄｏｘ混合物：１７ｍｇ／ｋｇ  マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート(ＭＬＰ)および１０ｍｇ／ｋｇ  ドキソルビシン；
(ｉｖ)リポソーム−ｄｏｘ：１０ｍｇ／ｋｇ  ドキソルビシン；および
(ｖ)共封入したドキソルビシンおよびマイトマイシンＣプロドラッグを有するリポソーム(リポソーム−ＭＬＰ−ｄｏｘ)：１２.５ｍｇ／ｋｇ  マイトマイシンＣプロドラッグコンジュゲート(ＭＬＰ)および１０ｍｇ／ｋｇドキソルビシン
腫瘍サイズを試験製剤投与後２日ごとに測定した。結果を図１５に示す。
【００９６】
多くの例示的態様および実施態様を上で説明したが、当業者はこれらの一定の変更、並び替え、付加および部分的組合せを認識する。従って、次に添付の特許請求の範囲および以降に示される請求項は、全てのこのような変更、並び替え、付加および部分的組合せを、真の精神および範囲内にあるとして含むことを意図する。
【図１−１】
2018530623.tif 000010
【図１−２】
2018530623.tif 000011
【図２Ａ】
2018530623.tif 000012
【図２Ｂ】
2018530623.tif 000013
【図３Ａ】
2018530623.tif 000014
【図３Ｂ】
2018530623.tif 000015
【図４Ａ】
2018530623.tif 000016
【図４Ｂ】
2018530623.tif 000017
【図５Ａ】
2018530623.tif 000018
【図５Ｂ】
2018530623.tif 000019
【図６Ａ】
2018530623.tif 000020
【図６Ｂ】
2018530623.tif 000021
【図７Ａ】
2018530623.tif 000022
【図７Ｂ】
2018530623.tif 000023
【図８Ａ】
2018530623.tif 000024
【図８Ｂ】
2018530623.tif 000025
【図９Ａ】
2018530623.tif 000026
【図９Ｂ】
2018530623.tif 000027
【図１０Ａ】
2018530623.tif 000028
【図１０Ｂ】
2018530623.tif 000029
【図１０Ｃ】
2018530623.tif 000030
【図１０Ｄ】
2018530623.tif 000031
【図１１】
2018530623.tif 000032
【図１２】
2018530623.tif 000033
【図１３】
2018530623.tif 000034
【図１４】
2018530623.tif 000035
【図１５】
2018530623.tif 000036
【国際調査報告】
2018530623.tif 000037
2018530623.tif 000038
2018530623.tif 000039
2018530623.tif 000040