(57)【要約】  本発明は、結腸直腸癌幹細胞の検出及び/又は定量のための、結腸直腸癌幹細胞を標識するための手段としてのフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンの使用、ならびに結腸直腸癌治療を適合させるために、悪性度、再発リスク及び予後値を診断するための方法における前記レクチンの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するための、該結腸直腸癌幹細胞の第１の標識手段としての、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチン、有利にはＵＥＡ−１又はＴＪＡ−ＩＩの使用。
【請求項２】
フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンと、結腸直腸癌幹細胞の少なくとも１つの第２の標識手段、好ましくは抗ＯＣＴ４抗体との、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンと、抗ＯＣＴ４抗体と、Ｔ抗原を認識する少なくとも１つのレクチン、有利にはＡＣＡ、ＡＢＡ及びジャカリンから選択されるレクチンとの、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
発色団、フルオロフォア、及び発色基質Ｂを還元することができる酵素から有利に選択される、フコースα１−２ガラクトース単位を認識する前記レクチンの顕色手段Ａが、ストレプトアビジンに接合されており、フコースα１−２ガラクトース単位を認識する該レクチンはビオチン化されている、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
発色団、フルオロフォア、又は発色基質Ｄを還元することができる酵素から有利に選択される、前記抗ＯＣＴ４抗体の顕色手段Ｃが、前記抗ＯＣＴ４抗体を認識する二次抗体に結合されている、請求項２〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
結腸直腸の生体試料が組織切片である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
・前記生体試料が組織切片であり、
・フコースα１−２ガラクトース単位を認識する前記レクチンがビオチン化ＵＥＡ−１であり、
・前記顕色手段Ａが西洋ワサビペルオキシダーゼであり、
・前記発色基質Ｂがジアミノベンジジンであり、
・前記顕色手段Ｃが二次抗体に結合したアルカリホスファターゼであり、
・前記発色基質Ｄが３−アミノ−４−メトキシベンズアミドである、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンによって標識された結腸直腸生体試料中で該レクチンを可視化するステップを含む、結腸直腸生体試料中の結腸直腸癌幹細胞をインビトロで検出及び/又は定量する方法。
【請求項９】
(ａ)前記生体試料中で標識された結腸直腸癌幹細胞を得るために、該生体試料中で前記結腸直腸癌幹細胞を、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンで標識するステップと、
(ｂ)前記結腸直腸生体試料中の前記レクチンを可視化するステップと、
(ｃ)前記生体組織において前記レクチンによって標識された前記結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するステップと
を含む、請求項８に記載のインビトロで検出及び/又は定量する方法。
【請求項１０】
結腸直腸癌治療を適合させるために予後値を定義する結腸直腸癌の再発リスク及び/又は結腸直腸癌の悪性度のインビトロ診断についての、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンの、場合により抗ＯＣＴ４抗体との使用。
【請求項１１】
(ａ３)組織学的試料中で結腸直腸癌幹細胞を得るために、結腸直腸組織の組織切片において結腸直腸癌幹細胞を抗ＯＣＴ４抗体で標識するステップと、
(ｂ３)ステップ(ａ３)で得られた前記組織切片を、顕色手段Ｃに結合した前記抗ＯＣＴ４抗体を認識する二次抗体と接触させるステップと、
(ｃ３)前記抗ＯＣＴ４抗体を可視化するステップと、
(ｄ３)前記組織切片でフコースα１−２ガラクトース単位を認識するビオチン化レクチンによって標識され、場合によりＴ抗原を認識する少なくとも１つのビオチン化レクチンによっても標識された結腸直腸癌幹細胞を得るために、ステップ(ｃ３)で得られた前記組織切片の前記結腸直腸癌幹細胞を、フコースα１−２ガラクトース単位を認識する前記ビオチン化レクチンで、場合によりＴ抗原を認識する前記少なくとも１つのビオチン化レクチンでも標識するステップと、
(ｅ３)ステップ(ｄ３)で得られた前記組織切片を、顕色手段Ａに結合したストレプトアビジン、アビジン又は抗ビオチン抗体と接触させるステップと、
(ｆ３)フコースα１−２ガラクトース単位を認識する前記レクチンを、場合によりＴ抗原を認識する前記少なくとも１つのレクチンをも可視化するステップと、
(ｇ３)ステップ(ｆ３)で得られた前記組織切片において前記結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するステップと、
(ｈ３)結腸直腸癌幹細胞の存在及び/又は数に基づいて、結腸直腸癌治療を適合させるための予後値を定義する結腸直腸癌の再発リスク及び/又は悪性度を推定するステップと
を含む、結腸直腸癌治療を適合させるための予後値を定義する結腸直腸癌の再発リスクのインビトロ診断のための方法。
【請求項１２】
・フコースα１−２ガラクトース単位を認識するビオチン化レクチンと、場合により、ＡＢＡ、ＡＣＡ及びジャカリンから有利に選択されるＴ抗原を認識する少なくとも１つのビオチン化レクチンと、
・西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジンと、
・抗ＯＣＴ４抗体と、
・アルカリホスファターゼに結合した、前記抗ＯＣＴ４抗体を認識する二次抗体と
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌幹細胞、特に結腸直腸癌幹細胞の検出の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
結腸直腸癌(ＣＲＣ)は、世界で３番目に頻度の高い疾患である。他の癌と同様に、それは、腫瘍塊の出現を引き起こす、健常組織(この場合は結腸粘膜)における異常な細胞増殖として要約することができる。腫瘍の発生、耐性機序及び再発を説明するために提唱される理論の１つは癌幹細胞の存在にある。放射線療法及び化学療法による治療からの腫瘍の治療エスケープは、腫瘍内でのこの細胞の存在に依存する。結果として、腫瘍組織内におけるこの細胞の検出が、腫瘍の悪性度レベルを定義する手段を構成する。したがって、癌幹細胞の特異的バイオマーカーの特徴付けは、癌の治療において診断的及び予後的に非常に重要である。しかしながら、他の腫瘍細胞から確実に癌幹細胞(ＣＳＣ)を区別することができる特異的マーカーは、現在のところ存在しない。
【０００３】
数が少ないこと、及び特異的マーカーが存在しないことから、ＣＳＣを研究する上での大きな困難は、それらの単離及びそれらの特徴付けにある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、結腸直腸腫瘍において結腸直腸癌幹細胞を検出できるようにする方法の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、その必要性を満たす。本発明の発明者は、結腸直腸癌幹細胞のマーカーとして、この細胞集団の表面上に発現する特異的グリカンを同定した。適切な手段によるこれらの特異的マーカーの認識は、非癌性非幹細胞、癌非幹細胞及び非癌幹細胞も存在する結腸直腸組織内で結腸直腸癌幹細胞を検出及び定量することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、ＵＥＡ１によって標識した(上図)、抗ＯＣＴ４抗体によって標識した(中央図)、及びＵＥＡ−１/抗ＯＣＴ４抗体によって二重標識した(下図)一連の健常組織の組織切片を表す。健常組織には、二重標識による発色が存在しないことが分かる。
【図２】図２は、ＵＥＡ１によって標識した(上図)、抗ＯＣＴ４抗体によって標識した(中央図)、及びＵＥＡ−１/抗ＯＣＴ４抗体によって二重標識した(下図)一連の腫瘍組織の組織切片を表す。この腫瘍組織には、ＵＥＡ−１及び抗ＯＣＴ４抗体による二重標識に起因する顕著な暗色染色が見られる(実際に得られた画像では褐色である)。
【図３】図３は、ＵＥＡ−１/Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８に接合したストレプトアビジン及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４に接合した抗ＯＣＴ３抗体によって二重標識された健常組織の画像を示す。蛍光が見られないことにより、結腸直腸癌幹細胞の不存在が示唆される。
【図４】図４は、ＵＥＡ−１/Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８に接合したストレプトアビジン及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４に接合した抗ＯＣＴ４抗体よって二重標識された腫瘍組織の画像を示す。画像の色の薄い領域は、ＵＥＡ−１/Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８に接合したストレプトアビジン及び抗ＯＣＴ４抗体とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４とによる癌幹細胞の二重標識に起因するものである。二重標識により多数の結腸直腸癌幹細胞の存在が明らかになる。
【図５】図５は、ＵＥＡ−１/Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８に接合したストレプトアビジン及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４に接合した抗ＯＣＴ４抗体を用いた健常組織の二重標識によって得られた、Ｚスタック法を用いた後の調整された共焦点顕微鏡画像を示す。左上象限は抗ＯＣＴ４抗体によって標識された細胞に対応し、左下象限は未標識細胞に対応し、右下象限はＵＥＡ−１によって標識された細胞に対応する。右上象限はＵＥＡ−１及び抗ＯＣＴ４抗体によって二重標識された細胞に対応する。二重標識された細胞が存在しないことは、この組織が結腸直腸幹細胞を含んでいないことを裏付けている。
【図６】図６は、ＵＥＡ−１/Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８に接合したストレプトアビジン及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４に接合した抗ＯＣＴ４抗体を用いた腫瘍組織の二重標識によって得られた、Ｚスタック法を用いた後の調整された共焦点顕微鏡画像を示す。左上象限は抗ＯＣＴ４抗体よって標識された細胞に対応し、左下象限は未標識細胞に対応し、右下象限はＵＥＡ−１によって標識された細胞に対応する。右上象限は、ＵＥＡ−１及び抗ＯＣＴ４抗体によって二重標識された細胞に対応する。右上象限における細胞の存在は、１６．６％の結腸直腸癌幹細胞の存在を示唆している。
【図７】図７は、抗ＯＣＴ４抗体及びＵＥＡ−１によって二重標識された健常組織の画像(上の画像)、及び抗ＯＣＴ４抗体及びＵＥＡ−１によって二重標識された、多数の結腸直腸癌幹細胞が存在する腫瘍細胞の画像(下の画像)を示す。健常組織は二重標識を示さないが、腫瘍組織では多数の細胞が標識される(実際に得られた画像では暗褐色である)。
【図８】図８〜１１は、実施例３に記載される後ろ向き臨床試験に対応する、異なるステージの結腸直腸癌に罹患した患者の腫瘍組織に関する組織化学的標識の結果を示す。図８は、生存したステージＩ結腸直腸癌に罹患した患者(好適な症例、患者Ｉ)、及び生存しなかったステージＩ結腸直腸癌に罹患した患者(好適でない症例、患者ＩＩ)について得られた結果を示す。標識は、抗ＯＣＴ４抗体(Ｉａ及びＩＩａ)を用いて、又は抗ＯＣＴ４抗体及びＵＥＡ−１/ＡＣＡ/ジャカリンレクチン混合物(Ｉｂ及びＩＩｂ)を用いて、又はＵＥＡ−１/ＡＣＡ/ジャカリンレクチン混合物(Ｉｃ及びＩＩｃ)を用いて行った。
【図９】図９は、生存したステージＩＩ結腸直腸癌に罹患した患者(好適な症例、患者Ｉ)、及び生存しなかったステージＩＩ結腸直腸癌に罹患した患者(好適でない症例、患者ＩＩ)について得られた結果を示す。標識は、抗ＯＣＴ４抗体(Ｉａ及びＩＩａ)を用いて、又は抗ＯＣＴ２４抗体及びＵＥＡ−１(Ｉｂ及びＩＩｂ)を用いて、又はＵＥＡ−１(Ｉｃ及びＩＩｃ)を用いて行った。
【図１０】図１０は、生存したステージＩＩＩ結腸直腸癌に罹患した患者(好適な症例、患者Ｉ)、及び生存しなかったステージＩＩＩ結腸直腸癌に罹患した患者(好適でない症例、患者ＩＩ)について得られた結果を示す。標識は、抗ＯＣＴ４抗体(Ｉａ及びＩＩａ)を用いて、又は抗ＯＣＴ４抗体及びＵＥＡ−１/ＡＣＡ/ジャカリンレクチン混合物(Ｉｂ及びＩＩｂ)を用いて、又はＵＥＡ−１/ＡＣＡ/ジャカリンレクチン混合物(Ｉｃ及びＩＩｃ)を用いて達成した。
【図１１】図１１は、化学療法による治療で生存したステージＩＶ結腸直腸癌に罹患した患者(好適な症例、患者Ｉ)、及び生存しなかったステージＩＶ結腸直腸癌に罹患した患者(好適でない症例、患者ＩＩ)について得られた結果を示す。標識は、抗ＯＣＴ４抗体(Ｉａ及びＩＩａ)を用いて、又は抗ＯＣＴ２４抗体及びＵＥＡ０１(Ｉｂ及びＩＩｂ)を用いて、又はＵＥＡ−１(Ｉｃ及びＩＩｃ)を用いて行った。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
第１の態様において、本発明は、結腸直腸癌幹細胞(ＣＳＣ)をインビトロで検出及び/又は定量するためのレクチンと、場合により結腸直腸癌幹細胞を標識する第２の手段との使用に関する。
【０００８】
第２の態様において、本発明は、結腸直腸生体試料中の結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量する方法に関する。
【０００９】
第３の態様において、本発明は、結腸直腸癌治療を適合させるための予後値を定義する結腸直腸癌の再発リスク及び/又は悪性度を診断する方法に関する。
【００１０】
第４の態様において、本発明は、レクチン及び結腸直腸癌幹細胞を標識する第２の手段を含むキット、ならびに、結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するため、具体的には、結腸直腸癌治療を適合させるための予後値を定義する結腸直腸癌の再発リスク及び/又は悪性度を診断するための前記キットの使用に関する。
【００１１】
よって、本発明の第１の主題は、結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するための、フコースα１−２ガラクトース単位が特異的に認識されるようにする手段、特にフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンの使用に関する。
【００１２】
本発明は、特に、結腸直腸生体試料中の結腸直腸癌幹細胞をインビトロで検出及び/又は定量するための、フコースα１−２ガラクトース単位が特異的に認識されるようにする手段、具体的にはフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンの使用に関する。
【００１３】
結腸直腸癌幹細胞は、自己再生が可能であり、化学療法で使用される多数の物質に抵抗性を示す、静止細胞の集団である。それらは癌/腫瘍始原細胞(ＴＩＣ)としても知られている。結腸直腸癌幹細胞は、例えば、Ｖａｉｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｓ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２０１２(３０)，３６３−３７１及びＲｉｃｃｉ−Ｖｉｔｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２００９，８７(１１)，１０９７−１１０４に既に記載されており、検討の対象となっている。
【００１４】
本発明はまた、結腸直腸生体試料中の結腸直腸癌幹細胞をインビトロで検出及び/又は定量する方法を実施するための、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンの第１の標識手段としての使用にも関する。
【００１５】
本発明の意味において、「結腸直腸癌幹細胞を標識する手段」は、結腸直腸癌幹細胞の表面に発現するマーカーに特異的に結合することができる物質を意味する。標識手段は、特に、糖タンパク質、タンパク質又はグリカン等の抗原決定基に対する抗体であってもよい。
【００１６】
本発明によるフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンは、Ｕｌｅｘ  Ｅｕｒｏｐａｅｕｓ凝集素Ｉ(ＵＥＡ−Ｉ)及びＴｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ  Ｊａｐｏｎｉｃａ凝集素ＩＩ(ＴＪＡ−ＩＩ)から有利に選択される。好ましくは、Ｕｌｅｘ  Ｅｕｒｏｐａｅｕｓ凝集素Ｉである。
【００１７】
フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンによって標識された細胞が結腸直腸癌幹細胞であることを保証するために、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンに加えて、結腸直腸癌幹細胞を標識する第２の手段を使用することが有利である。この第２の標識手段は、癌性又は非癌性の幹細胞に対して特異的であり得る。
【００１８】
結腸直腸癌幹細胞マーカーの例として、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＣＤ１６６(ＡＬＣＡＭ)、ＣＤ２４、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＥｐＣＡＭ、Ｏｃｔ−４、及びＳｏｘ−２が挙げられる。
【００１９】
好ましくは、結腸直腸癌幹細胞を標識する第２の手段は抗ＯＣＴ４(遺伝子ＰＯＵ５Ｆ１によってコードされるオクタマー結合性転写因子４：octamer-binding transcription factor 4)抗体である。
【００２０】
よって、本発明はまた、結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するための、Ｕｌｅｘ  Ｅｕｒｏｐａｅｕｓ凝集素Ｉ(ＵＥＡ−Ｉ)及びＴｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ  Ｊａｐｏｎｉｃａ凝集素ＩＩ(ＴＪＡ−ＩＩ)から有利に選択されるフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンの使用にも関する。
【００２１】
一実施形態によれば、結腸直腸癌幹細胞は、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンと、抗ＯＣＴ４抗体と、Ｔ抗原を認識する少なくとも１つのレクチンとによって標識することができる。
【００２２】
Ｔ抗原を認識するレクチンは、特にＡｇａｒｉｃｕｓ  Ｂｉｓｐｏｒｕｓ凝集素(ＡＢＡ)、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ  Ｃａｕｄａｔｕｓレクチン(ＡＣＡ)及びジャカリンから選択され得る。
【００２３】
結腸直腸癌幹細胞を標識するために、Ｔ抗原を認識するレクチンの混合物、特にＡＢＡとＡＣＡの混合物、ＡＢＡとジャカリンの混合物及びＡＣＡとジャカリンの混合物から選択される２つのレクチンの混合物も使用され得る。有利には、レクチンはＵＥＡ−１、ジャカリン及びＡＣＡである。
【００２４】
有利には、３つのレクチンの混合物は、６２５〜１２５００：１６〜３２０：１〜２０、有利には５０００〜７０００：５０〜２５０：５〜１５、特に６２５０：１６０：１０のモル比のフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチン：ジャカリン：ＡＢＡ又はＡＣＡからなる。
【００２５】
更により有利には、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンはＵＥＡ−１であり、Ｔ抗原を認識するレクチンはジャカリン及びＡＣＡであり、ＵＥＡ−１：ジャカリン：ＡＣＡのモル比は６２５０：１６０：１０である。
【００２６】
結腸直腸癌幹細胞を検出及び定量するために、結腸直腸癌幹細胞を標識するための手段は生体試料中で見出すことができなければならない。
【００２７】
したがって、標識手段は、顕色手段に直接的又は間接的に結合される。
【００２８】
本発明の意味において、「顕色手段」は、標識手段を認識することができ、例えば直接視又は分光光度法により、組織内で検出され得るシグナルを発することができる物質又は一群の物質を意味する。
【００２９】
本発明の意味における「直接的に結合された」は、顕色手段が結腸直腸癌細胞を標識する手段に共有結合的に結合していることを意味する。顕色手段は、例えば、標識手段に共有結合的に結合した、発色団、フルオロフォア、又は発色基質を還元することができる酵素であってもよい。
【００３０】
本発明の意味における「間接的に結合された」は、顕色手段が二次物質に共有結合していることを意味し、前記二次物質は、標識手段を特異的に認識することができる。顕色手段は、例えば、アビジン、ストレプトアビジン又は抗ビオチン抗体に共有結合してもよく、標識手段はビオチン化されてもよい。
【００３１】
よって、本発明はまた、結腸直腸生体試料中の結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量する方法を実施するための、顕色手段Ａに結合した、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンの使用にも関する。
【００３２】
顕色手段Ａは、発色団；フルオロフォア；フルオロフォア若しくは発色団に直接的若しくは間接的に結合した、フコースα１−２ガラクトース単位を認識する抗体；又は発色基質Ｂを還元することができる酵素であってもよい。
【００３３】
有利には、顕色手段Ａは、発色基質Ｂを還元することができる酵素である。
【００３４】
一実施形態において、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンはビオチン化され、顕色手段Ａはストレプトアビジンに結合される。有利には、顕色手段Ａは、発色基質を還元することができる酵素、特に西洋ワサビペルオキシダーゼである。発色基質Ｂを還元することができる前記酵素は、シグナル増幅系に組み込まれてもよい。そのようなシグナル増幅系は、例えば、Ｌｅｉｃａ又はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている。
【００３５】
発色基質Ｂは、使用される酵素のクラスに依存する。西洋ワサビペルオキシダーゼの場合、それは、例えば、３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)、オルト−フェニレンジアミン(ＯＰＤ)、３，３'−ジアミノベンジジン(ＤＡＢ)、１０−アセチル−１０Ｈ−フェノキサジン−３，７−ジオール(ＡｍｐｌｅｘＲｅｄ(登録商標))、ホモバニリン酸、ルミノール、３−アミノ−９−エチルカルバゾール(ＡＥＣ)、及び２，２'−アジノ−ビス(３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸(ＡＢＴＳ)からなる群から選択される発色基質であってもよい。
【００３６】
有利には、発色基質Ｂは、３，３'−ジアミノベンジジン(ＤＡＢ)である。
【００３７】
第２の標識手段は、好ましくは抗ＯＣＴ４抗体であり、発色団、フルオロフォア、又は発色基質Ｄを還元することができる酵素から有利に選択される顕色手段Ｃに結合される。
【００３８】
前記顕色手段Ｃは、結腸直腸癌幹細胞の標識手段に直接的又は間接的に結合されてもよい。
【００３９】
有利には、顕色手段Ｃは、第２の標識手段を認識する二次抗体に結合される。例えば、標識手段は、第１の動物種において産生される抗体であってもよく、顕色手段Ｃが結合する抗体は、標識手段として使用される抗体の動物種に特異的で、免疫グロブリン鎖の配列に特異的なエピトープを認識する、別の動物種において産生される抗体である。代替として、顕色手段Ｃは、第２の標識手段を認識する二次抗体、特に抗ＯＣＴ４抗体を認識する三次抗体に結合させることができる。
【００４０】
一実施形態において、第２の結腸直腸癌幹細胞標識手段は抗ＯＣＴ４抗体であり、顕色手段Ｃは、抗ＯＣＴ４抗体を認識する抗体に結合される。有利には、前記顕色手段Ｃは、発色基質Ｄを還元することができる酵素、特にアルカリホスファターゼである。発色基質Ｄを還元することができる前記酵素は、特にシグナル増幅系に組み込まれてもよい。そのようなシグナル増幅系は、例えば、Ｌｅｉｃａ又はＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている。ある特定の実施形態において、抗ＯＣＴ４抗体はウサギにおいて産生される抗体であり、顕色手段は、例えばマウス抗ウサギ免疫グロブリン抗体に結合される。
【００４１】
発色基質Ｄは、使用される酵素のクラスに依存する。アルカリホスファターゼの場合、それは例えば、５−ブロモ、４−クロロ、３−インドリルホスフェート(ＢＣＩＰ)、ニトロブルーテトラゾリウム(ＮＢＴ)、ＢＣＩＰ/ＮＢＴ混合物、４−ニトロフェニルホスフェート(ｐ−ＮＰＰ)、３−インドキシルホスフェート、７−ブロモ−Ｎ−(２−メトキシフェニル)−３−(ホスホノオキシ)−２−ナフタレンカルボキシアミド及び３−アミノ−４−メトキシベンズアミド(Ｆａｓｔ  ＲＥＤ(登録商標))からなる群から選択される発色基質であってもよい。
【００４２】
有利には、発色基質は、３−アミノ−４−メトキシベンズアミド(Ｆａｓｔ  ＲＥＤ(登録商標))又はＢＣＩＰ/ＮＢＴ混合物である。
【００４３】
有利には、発色基質Ｂと発色基質Ｄとは異なる色の発色団の形成をもたらし、第１の標識手段によって標識された細胞と第２の標識手段によって標識された細胞との識別を可能にする。
【００４４】
よって、本発明はまた、結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量する方法を実施するための、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するビオチン化レクチンと、抗ＯＣＴ４抗体と、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートと、アルカリホスファターゼに結合した、抗ＯＣＴ４抗体を認識する抗体との使用にも関する。有利には、発色基質ＢはＤＡＢであり、発色基質ＤはＦａｓｔ  ＲＥＤ(登録商標)又はＢＣＩＰ/ＮＢＴである。
【００４５】
発色基質Ｂを還元することができる酵素の顕色手段Ａとしての使用、及び発色基質Ｄを還元することができる酵素の顕色手段Ｃとしての使用は、免疫組織化学的方法において、特に組織切片に対する使用に、特に有利である。
【００４６】
ある特定の実施形態において、本発明は、免疫組織化学的検出法における、上記のとおりのフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンの使用に関する。
【００４７】
この特定の実施形態において、生体試料は、結腸直腸生体試料、特に腫瘍切除生検又は結腸直腸生検の組織切片である。
【００４８】
この特定の実施形態において、顕色手段Ａは、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンに共有結合させることができる。また、顕色手段Ａは、アビジン、ストレプトアビジン又は抗ビオチン抗体に結合させることができ、そして、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンはビオチン化される。
【００４９】
この特定の実施形態において、顕色手段Ｃは、第２の標識手段に共有結合させることができる。また、顕色手段Ｃは、第２の標識手段を認識する二次抗体を認識する三次抗体に共有結合させることもできる。好ましくは、第２の標識手段は抗ＯＣＴ４抗体であり、顕色手段Ｃは、抗ＯＣＴ４抗体に共有結合されるか、又は抗ＯＣＴ４抗体を認識する二次抗体に共有結合される。また、顕色手段Ｃは、抗ＯＣＴ４抗体を認識する二次抗体を認識する三次抗体に共有結合させることもできる。
【００５０】
この特定の実施形態において、本発明は、好ましくは、結腸直腸組織の組織切片において結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するための、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するビオチン化レクチンと、ストレプトアビジンに結合した発色基質Ｂを還元することができる酵素と、抗ＯＣＴ４抗体と、抗ＯＣＴ４抗体を認識する二次抗体に結合した発色基質Ｄを還元することができる酵素との使用に関する。
【００５１】
最も好ましくは、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するビオチン化レクチンはＵＥＡ−１であり、第２の標識手段は抗ＯＣＴ４抗体であり、顕色手段Ａは西洋ワサビペルオキシダーゼであり、発色基質Ｂはジアミノベンジジンであり、顕色手段Ｃは二次抗体に結合したアルカリホスファターゼであり、発色基質Ｄは３−アミノ−４−メトキシベンズアミド(Ｆａｓｔ  ＲＥＤ(登録商標))である。
【００５２】
本発明の第２の主題は、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンの、該レクチンによって標識された結腸直腸生体試料中での顕色ステップを含む、結腸直腸生体試料中の結腸直腸癌幹細胞をインビトロで検出及び/又は定量する方法に関する。
【００５３】
本発明の意味における「顕色ステップ」は、結腸直腸癌幹細胞に結合したフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンを、該レクチンを生体試料と接触させた後に、分光法又は分光光度法により視覚的に検出することを目的とするステップを意味する。
【００５４】
より具体的には、本発明は、
(ａ)前記生体試料中で標識された結腸直腸癌幹細胞を得るために、該生体試料中で前記結腸直腸癌幹細胞を、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンで標識するステップと、
(ｂ)前記結腸直腸生体試料中の前記レクチンを可視化するステップと、
(ｃ)前記生体組織において前記レクチンによって標識された前記結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するステップと
を含む、上記のとおりのインビトロ検出及び/又は定量方法に関する。
【００５５】
標識ステップは、抗原を曝露させるために設計された緩衝液を用いた組織洗浄等の、生体試料を調製することを目的とする従来のステップの後に行われる(二重標識の場合、ｐＨは有利には６である)。
【００５６】
標識ステップは、有利には、飽和力を有し、非特異的結合を妨げることができる希釈液中で行われる(例えば、ＰＢＳ−ＢＳＡ希釈液)。
【００５７】
標識ステップは、有利には、１０〜３０分に及ぶインキュベーション時間、１０〜３０℃の温度で実施される。
【００５８】
よって、本発明は、有利には、
(ａ２)組織切片において標識された結腸直腸癌幹細胞を得るために、該組織切片の結腸直腸癌幹細胞を、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するビオチン化レクチンで標識するステップと、
(ｂ２)ステップ(ａ２)で得られた組織切片を、ストレプトアビジン、アビジン又は抗ビオチン抗体に結合した顕色手段Ａと接触させるステップと、
(ｃ２)フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンを可視化するステップと、
(ｄ２)前記組織切片において前記レクチンによって標識された結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するステップと、
を含む、結腸直腸組織の組織切片において結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量する方法に関する。
【００５９】
有利には、前述の方法は、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンと、ＡＣＡ、ＡＢＡ及びジャカリンから有利に選択される、Ｔ抗原を認識する少なくとも１つのレクチン、より有利には、ＡＢＡとＡＣＡの混合物、ＡＢＡとジャカリンの混合物及びＡＣＡとジャカリンの混合物から選択されるＴ抗原を認識するレクチンの混合物(有利には、ＡＣＡとジャカリンの混合物)とを用いて、ステップ(ａ)で実施することができる。
【００６０】
有利には、レクチンの混合物は、６２５〜１２５００：１６〜３２０：１〜２０、有利には５０００〜７０００：５０〜２５０：５〜１５、特に６２５０：１６０：１０のモル比のフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチン：ジャカリン：ＡＢＡ又はＡＣＡからなる。
【００６１】
特に有利には、ステップ(ａ)は、ＵＥＡ−１とＡＣＡとジャカリンとの混合物、好ましくは６２５０：１６０：１０のＵＥＡ−１：ジャカリン：ＡＣＡ比のＵＥＡ−１とＡＣＡとジャカリンとの混合物を用いて実施される。
【００６２】
前述の方法は、上記のとおりの癌幹細胞を標識する第２の手段で標識するステップの後に行われてもよい。特に、前述の方法は、抗ＯＣＴ４抗体によって標識するステップの後に行われてもよい。
【００６３】
よって、本発明は、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンによる標識のステップ(ａ)又は(ａ２)の前に、
(ａ'１)前記生体試料中で抗ＯＣＴ４抗体によって標識された結腸直腸癌幹細胞を得るために、前記結腸直腸生体試料の結腸直腸癌幹細胞を第２の標識手段、好ましくは抗ＯＣＴ４抗体で標識するステップと、
(ａ'２)前記第２の標識手段、好ましくは前記抗ＯＣＴ４抗体を可視化するステップと、
を含む方法に関する。
【００６４】
標識ステップは、抗原を曝露させるために設計された緩衝液を用いた組織洗浄等の、生体試料を調製するために設計された従来のステップの後に行われる(二重標識の場合、ｐＨは有利には６である)。
【００６５】
標識ステップは、有利には、飽和力を有し、非特異的接着を妨げることができる希釈液中で行われる(例えば、ＰＢＳ−ＢＳＡ希釈液)。
【００６６】
標識ステップは、有利には、１０〜３０分に及ぶインキュベーション時間、１０〜３０℃の温度で実施される。
【００６７】
よって、本発明はまた、
(ａ３)前記組織学的試料中で前記第２の標識手段によって標識された結腸直腸癌幹細胞を得るために、結腸直腸組織の組織切片において、結腸直腸癌幹細胞を結腸直腸癌幹細胞の第２の標識手段、好ましくは抗ＯＣＴ４抗体で標識するステップと、
(ｂ３)ステップ(ａ３)で得られた組織切片を、顕色手段Ｃに結合した、第２の標識手段、好ましくは抗ＯＣＴ４抗体を認識する二次抗体と接触させるステップと、
(ｃ３)第２の標識手段を可視化するステップと、
(ｄ３)前記組織切片においてフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンによってされ、場合によりＴ抗原を認識する少なくとも１つのレクチンによっても標識された癌幹細胞を得るために、ステップ(ｃ３)で得られた組織切片の結腸直腸癌幹細胞を、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するビオチン化レクチンで、場合によりＴ抗原を認識する少なくとも１つのビオチン化レクチンでも標識するステップと、
(ｅ３)ステップ(ｄ３)で得られた組織切片を、ストレプトアビジン、アビジン又は抗ビオチン抗体に結合した顕色手段Ａと接触させるステップと、
(ｆ３)フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンを、場合によりＴ抗原を認識する少なくとも１つのレクチンをも可視化するステップと、
(ｇ３)組織切片においてフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンと第２の標識手段、好ましくは抗ＯＣＴ４抗体とによって標識された結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するステップと、
を含む前述の方法にも関する。
【００６８】
特定の実施形態において、本発明は、
(ａ４)前記組織切片において抗ＯＣＴ４抗体によって標識された結腸直腸幹細胞を得るために、結腸直腸組織の組織切片において結腸直腸癌幹細胞を抗ＯＣＴ４抗体で標識するステップと、
(ｂ４)ステップ(ａ４)で得られた組織切片を、発色基質を還元することができる酵素に結合した、抗ＯＣＴ４抗体を認識する二次抗体と接触させるステップと、
(ｃ４)抗ＯＣＴ４抗体を発色基質で可視化するステップと、
(ｄ４)前記組織切片においてフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンによって標識され、場合によりＴ抗原を認識する少なくとも１つのレクチンによっても標識された結腸直腸癌幹細胞を得るために、ステップ(ｃ４)で得られた組織切片の結腸直腸癌幹細胞を、Ｔ抗原を認識するビオチン化レクチンで標識するステップと、
(ｅ４)ステップ(ｄ４)で得られた組織切片を、発色基質を還元することができる酵素に結合したストレプトアビジン、アビジン又は抗ビオチン抗体と接触させるステップと、
(ｆ４)フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンを、場合によりＴ抗原を認識する少なくとも１つのレクチンをも発色基質で可視化するステップと、
(ｇ４)組織切片においてフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンと、場合によりＴ抗原を認識する少なくとも１つのビオチン化レクチンと、抗ＯＣＴ４抗体とによって標識された結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するステップと、
を含む、結腸直腸組織切片において結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量する方法に関する。
【００６９】
好ましい実施形態において、本発明は、
(ａ５)前記組織切片において抗ＯＣＴ４抗体によって標識された結腸直腸幹細胞を得るために、結腸直腸組織の組織切片において結腸直腸癌幹細胞を抗ＯＣＴ４抗体で標識するステップと、
(ｂ５)ステップ(ａ５)で得られた組織切片を、アルカリホスファターゼに結合した、抗ＯＣＴ４抗体を認識する二次抗体と接触させるステップと、
(ｃ５)抗ＯＣＴ４抗体をＦａｓｔＲＥＤ(登録商標)又はＢＣＩＰ/ＮＢＴ混合物で可視化するステップと、
(ｄ５)ＵＥＡ−１によって標識され、場合によりＡＣＡ及びジャカリンによっても標識された結腸直腸癌幹細胞を得るために、ステップ(ｃ５)で得られた組織切片の結腸直腸癌幹細胞を、ビオチン化ＵＥＡ−１で、場合により６２５０：１６０：１０のＵＥＡ−１：ジャカリン：ＡＣＡ比のビオチン化ＵＥＡ−１、ビオチン化ＡＣＡ及びビオチン化ジャカリンで標識するステップと、
(ｅ５)ステップ(ｄ５)で得られた組織切片を、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジンと接触させるステップと、
(ｆ５)ＵＥＡ−１を、場合によりＡＣＡ及びジャカリンをもＤＡＢで可視化するステップと、
(ｇ５)組織切片においてＵＥＡ−１と抗ＯＣＴ４抗体と場合によりＡＣＡ及びジャカリンとによって標識された結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するステップと
を含む、結腸直腸組織切片において結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量する方法に関する。
【００７０】
別の実施形態において、本出願に記載される一般的な方法は、結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するために、フローサイトメトリーを用いることによって実施することができる。一実施形態において、癌幹細胞は、フローサイトメトリーによって検出及び/又は定量することができる。この方法はまた、適切な機器を使用することによって結腸直腸癌幹細胞の単離も可能にする。
【００７１】
生体試料は、予め細胞が互いに解離されている結腸直腸腫瘍組織の生検であってもよく、例えば、表面のグリカンに影響を与えることなく組織の解離を可能にする、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社から販売されている製品Ｌｉｂｅｒａｓｅ(商標)によって細胞が互いに解離されていてもよい。
【００７２】
フローサイトメトリーによって細胞を検出及び/又は定量するために、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンは、フルオロフォアＥに直接的又は間接的に結合される。第２の標識手段、好ましくは抗ＯＣＴ４抗体は、フルオロフォアＦに、直接的、又は(例えば抗ＯＣＴ４抗体を認識する二次抗体を介して)間接的に結合される。有利には、フルオロフォアＥとＦとは互いに異なる。好ましくは、フルオロフォアＥは、ストレプトアビジンに結合したＡｌｅｘａ  ４８８であり、そして、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンはビオチン化されており、フルオロフォアＦは、抗ＯＣＴ４抗体に直接的に結合したＡｌｅｘａ  ６３３である。
【００７３】
本発明はまた、検出ステップが、フルオロフォアを顕色手段として用いてフローサイトメトリーによって実施される、前述の結腸直腸生体試料中の結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量する方法にも関する。
【００７４】
本発明による方法は、結腸直腸癌幹細胞の検出及び定量を可能にするため、特に、病理解剖学的又は病理組織学的試験を用いた結腸直腸癌の診断に特に適している。
【００７５】
癌幹細胞は、腫瘍を含む他の細胞とは異なる。これらは、自己再生が可能であり、従来の化学療法及び放射線療法による治療に抵抗性を示す。したがって、癌幹細胞は、腫瘍を排除することが可能な従来の化学療法/放射線療法の後であってもなお、腫瘍の再発を引き起こす。腫瘍組織におけるこの細胞の検出は、したがって、化学療法又は放射線療法による治療を受けた患者における再発リスクを評価する上で基本的関心事である。癌幹細胞の定量は、癌の悪性度を決定するためにも必要不可欠である。更に、腫瘍組織における癌幹細胞の検出は、治療中に予後の確立を可能にし、したがってこの細胞をより効果的に標的するように治療を変更する可能性を提供し、腫瘍の悪性度及び再発リスクを低減する。
【００７６】
よって、本発明は、結腸直腸癌治療を適合させるために予後値を定義する結腸直腸癌の再発リスク及び/又は結腸直腸癌の悪性度のインビトロ診断についての、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンと、場合により抗ＯＣＴ４抗体との使用に関する。
【００７７】
一実施形態において、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチン(有利にはＵＥＡ−１)と、抗ＯＣＴ４抗体と、Ｔ抗原を認識する少なくとも１つのレクチン(ＡＣＡ、ＡＢＡ及びジャカリンから有利に選択される)又はＴ抗原を認識するレクチンの混合物(ＡＶＡとＡＣＡの混合物、ＡＢＡとジャカリンの混合物、ＡＣＡとジャカリンの混合物から選択され、有利にはＡＣＡとジャカリンとの混合物)とを使用して、標識化が達成される。有利には、ＵＥＡ−１：ジャカリン：ＡＣＡの比は６２５０：１６０：１０である。
【００７８】
本発明は、より具体的には、
(ａ)前記生体試料中でフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンによって標識された結腸直腸癌幹細胞を得るために、結腸直腸生体試料中の結腸直腸癌幹細胞を、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンで標識するステップと、
(ｂ)結腸直腸組織中の結腸直腸癌幹細胞を可視化するステップと、
(ｃ)フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンによって標識された癌幹細胞を検出及び/又は定量するステップと、
(ｄ)結腸直腸癌幹細胞の量に基づいて結腸直腸癌の再発リスク及び/又は悪性度、及び/又は結腸直腸癌治療の予後値を推定するステップと、
を含む、結腸直腸癌の再発リスク及び/又は悪性度、及び/又は結腸直腸癌治療の予後値のインビトロ診断法に関する。
【００７９】
有利には、本発明は、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンと、結腸直腸癌細胞を標識する第２の手段、好ましくは抗ＯＣＴ４抗体とを使用することによって実施される。
【００８０】
本発明者は、実際に、二重標識が最適な感度及び特異性をもたらし、ひいてはフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンによる癌非幹細胞又は非癌幹細胞の標識化に起因し得る擬陽性のリスクを劇的に軽減することを示した。
【００８１】
よって、本発明はまた、
(ａ６)組織切片において標識された結腸直腸癌細胞を得るために、結腸直腸組織の組織切片において結腸直腸癌幹細胞を第２の標識手段、好ましくは抗ＯＣＴ４抗体で標識するステップと、
(ｂ６)ステップ(ａ６)で得られた組織切片を、顕色手段Ｃに結合した、第２の標識手段を認識する二次抗体と接触させるステップと、
(ｃ６)第２の標識手段、好ましくは抗ＯＣＴ４抗体を可視化するステップと、
(ｄ６)組織切片においてフコースα１−２ガラクトース単位を認識するビオチン化レクチンによって標識され、場合によりＴ抗原を認識する少なくとも１つのビオチン化レクチンによっても標識された結腸直腸癌幹細胞を得るために、ステップ(ｃ６)で得られた組織切片の結腸直腸癌幹細胞を、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するビオチン化レクチンで、場合によりＴ抗原を認識する少なくとも１つのビオチン化レクチンでも標識するステップと、
(ｅ６)ステップ(ｄ６)で得られた組織切片を、顕色手段Ａに結合したストレプトアビジン、アビジン又は抗ビオチン抗体と接触させるステップと、
(ｆ６)フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンを、場合によりＴ抗原を認識する少なくとも１つのレクチンをも可視化するステップと、
(ｇ６)ステップ(ｆ６)で得られた組織切片において結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するステップと、
(ｈ６)結腸直腸癌幹細胞の存在及び/又は数に基づいて、結腸直腸癌の再発リスク及び/又は悪性度、及び/又は結腸直腸癌治療の予後値を推定するステップと、
を含む、結腸直腸癌治療を適合させるための予後値を定義する再発リスク及び/又は悪性度のインビトロ診断法にも関する。
【００８２】
好ましい実施形態において、本発明は、
(ａ７)組織切片において抗ＯＣＴ４抗体によって標識された結腸直腸癌幹細胞を得るために、結腸直腸組織の組織切片において結腸直腸癌幹細胞を抗ＯＣＴ４抗体で標識するステップと、
(ｂ７)ステップ(ａ７)で得られた組織切片を、顕色手段Ｃ、好ましくは発色基質を還元することができる酵素、特にアルカリホスファターゼに結合した、抗ＯＣＴ４抗体を認識する二次抗体と接触させるステップと、
(ｃ７)抗ＯＣＴ４抗体を、好ましくはＦａｓｔ  Ｒｅｄ(登録商標)又はＢＣＩＰ/ＮＢＴ混合物で可視化するステップと、
(ｄ７)組織切片においてフコースα１−２ガラクトース単位を認識するビオチン化レクチンによって標識され、場合によりＴ抗原を認識する少なくとも１つのビオチン化レクチンによっても標識された結腸直腸癌幹細胞を得るために、ステップ(ｃ７)で得られた組織切片の結腸直腸癌幹細胞を、ビオチン化ＵＥＡ−１で又は６２５０：１６０：１０のモル比のＵＥＡ−１：ジャカリン：ＡＣＡの混合物で標識するステップと、
(ｅ７)ステップ(ｄ７)で得られた組織切片を、顕色手段Ａ、好ましくは発色基質を還元することができる酵素に結合したストレプトアビジン、アビジン又は抗ビオチン抗体と接触させるステップと、
(ｆ７)ＵＥＡ−１、又はＵＥＡ−１、ジャカリン及びＡＣＡを、好ましくはＤＡＢで可視化するステップと、
(ｇ７)ステップ(ｆ７)で得られた組織切片において結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するステップと、
(ｈ７)結腸直腸癌幹細胞の存在及び/又は数に基づいて、結腸直腸癌の再発リスク及び/又は悪性度、及び/又は結腸直腸癌治療の予後値を推定するステップと、
を含む、結腸直腸癌の再発リスク及び/又は悪性度、及び/又は結腸直腸癌治療の予後値のインビトロ診断法に関する。
【００８３】
本発明の第５の主題は、
・フコースα１−２ガラクトース単位を認識するビオチン化レクチンと、場合によりＴ抗原を認識する少なくとも１つのビオチン化レクチンと、
・有利にはシグナル増幅系に組み込まれた、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジンと、
・抗ＯＣＴ４抗体と、
・(有利には増幅系に組み込まれた）発色基質を還元することができるアルカリホスファターゼに結合した、抗ＯＣＴ４抗体を認識する二次抗体と、
を含むキット、具体的には結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するように設計されたキットに関する。
【００８４】
本発明によるキットは、前述の要素に加えて、西洋ワサビペルオキシダーゼによって還元され得る発色基質、及びアルカリホスファターゼによって還元され得る発色基質も含むことができる。
【００８５】
本発明によるキットは、緩衝液、洗浄液、希釈剤、及び指示書も含むことができる。
【００８６】
好ましい実施形態において、本発明は、
・ビオチン化ＵＥＡ−１と、場合によりビオチン化ＡＣＡ及びビオチン化ジャカリンと、
・抗ＯＣＴ４抗体と、
・アルカリホスファターゼに結合した、抗ＯＣＴ４抗体を認識する二次抗体と、
・西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジンと、
・場合によりＤＡＢと、
・場合によりＦａｓｔ  Ｒｅｄ(登録商標)又はＢＣＩＰ/ＮＢＴ混合物と、
・場合により洗浄液と、
・場合により希釈剤と、
・場合により緩衝液と、
を含むキット、具体的には結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するように設計されたキットに関する。
【００８７】
本発明はまた、結腸直腸組織の組織切片において結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するインビトロ法を実施するための、上記のとおりキットの使用にも関する。
【００８８】
本発明はまた、結腸直腸癌の治療を適合させるための予後値を定義する結腸直腸癌の再発リスク及び/又は悪性度のインビトロ診断法を実施するための、上記のとおりのキットの使用にも関する。
【００８９】
第７の主題において、本発明は、
顕色手段で修飾された、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンを、該レクチンによって標識された結腸直腸生体試料中で可視化するステップを含む、結腸直腸生体試料中の結腸直腸癌幹細胞をインビトロで検出及び/又は定量する方法に関する。
【００９０】
本発明は、より具体的には、
(ａ)生体試料中で標識された結腸直腸癌幹細胞を得るために、前記生体試料中で結腸直腸癌幹細胞を、顕色手段で修飾された、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンで標識するステップと、
(ｂ)結腸直腸生体試料中の前記レクチンを可視化するステップと、
(ｃ)前記生体組織において前記レクチンによって標識された結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するステップと、
を含む、上記のとおりのインビトロ検出及び/又は定量方法に関する。
【００９１】
よって、本発明は、有利には、顕色手段がビオチンである、上記のとおりの、結腸直腸組織の組織切片において結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量する方法であって、
(ａ２)組織切片中において結腸直腸癌幹細胞を得るために、組織切片の結腸直腸癌幹細胞を、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するビオチン化レクチンで標識するステップと、
(ｂ２)ステップ(ａ２)で得られた組織切片を、ストレプトアビジン、アビジン又は抗ビオチン抗体に結合した顕色手段Ａと接触させるステップと、
(ｃ２)フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンを可視化するステップと、
(ｄ２)組織切片において前記レクチンによって標識された結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するステップと、
を含む方法に関する。
【００９２】
有利には、前述の方法は、顕色手段で修飾された、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンと、ＡＣＡ、ＡＢＡ及びジャカリンから有利に選択され、顕色手段で修飾された、Ｔ抗原を認識する少なくとも１つのレクチン、より有利には、ＡＢＡとＡＣＡの混合物、ＡＢＡとジャカリンの混合物及びＡＣＡとジャカリンの混合物から選択され、顕色手段で修飾された、Ｔ抗原を認識するレクチンの混合物(有利には、ＡＣＡとジャカリンとの混合物)とを用いて、ステップ(ａ)で実施することができる。
【００９３】
有利には、レクチン混合物は、６２５〜１２５００：１６〜３２０：１〜２０、有利には５０００〜７０００：５０〜２５０：５〜１５、特に６２５０：１６０：１０のモル比のフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチン：顕色手段で修飾されたジャカリン：顕色手段で修飾されたＡＢＡ又は顕色手段で修飾されたＡＣＡからなる。
【００９４】
特に有利には、ステップ(ａ)は、好ましくは６２５０：１６０：１０のＵＥＡ−１：ジャカリン：ＡＣＡ比の、顕色手段で修飾されたＵＥＡ−１と顕色手段で修飾されたＡＣＡと顕色手段で修飾されたジャカリンとの混合物を用いて実施される。
【００９５】
前述の方法は、上記のとおりの第２の幹細胞標識手段で標識するステップの後に行われてもよい。特に、前述の方法は、抗ＯＣＴ４抗体によって標識するステップにの後に行われてもよい。
【００９６】
よって、本発明は、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンによる標識のステップ(ａ)又は(ａ２)の前に、
(ａ'１)前記生体試料中で抗ＯＣＴ４抗体によって標識された結腸直腸癌幹細胞を得るために、前記結腸直腸生体試料の結腸直腸癌幹細胞を第２の標識手段、好ましくは抗ＯＣＴ４抗体で標識するステップと、
(ａ'２)前記第２の標識手段、好ましくは抗ＯＣＴ４抗体を可視化するステップと、
を含む方法に関する。
【００９７】
よって本発明はまた、
(ａ'３)前記組織切片中で前記第２の標識手段によって標識された癌幹細胞を得るために、結腸直腸組織の組織切片において、結腸直腸癌幹細胞を標識する第２の手段、好ましくは抗ＯＣＴ４抗体で標識するステップと、
(ｂ３)ステップ(ａ３)で得られた組織切片を、顕色手段Ｃに結合した、第２の標識手段、好ましくは抗ＯＣＴ４抗体を認識する二次抗体と接触させるステップと、
(ｃ３)第２の標識手段を可視化するステップと、
(ｄ３)前記組織切片においてフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンによって標識され、場合によりＴ抗原を認識する少なくとも１つのレクチンによっても標識された癌幹細胞を得るために、ステップ(ｃ３)で得られた組織切片の結腸直腸癌幹細胞を、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するビオチン化レクチンで、場合によりＴ抗原を認識する少なくとも１つのビオチン化レクチンでも標識するステップと、
(ｅ３)ステップ(ｄ３)で得られた組織切片を、ストレプトアビジン、アビジン又は抗ビオチン抗体に結合した顕色手段Ａと接触させるステップと、
(ｆ３)フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンを、場合によりＴ抗原を認識する少なくとも１つのレクチンをも可視化するステップと、
(ｇ３)組織切片において、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンと、第２の標識手段、好ましくは抗ＯＣＴ４抗体とによって標識された結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するステップと、
を含む前述の方法にも関する。
【００９８】
特定の実施形態において、本発明は、
(ａ４)記組織切片において抗ＯＣＴ４抗体によって標識された結腸直腸幹細胞を得るために、結腸直腸組織の組織切片において結腸直腸癌幹細胞を抗ＯＣＴ４抗体で標識するステップと、
(ｃ４)抗ＯＣＴ４抗体を発色基質で可視化するステップと、
(ｄ４)前記組織切片においてフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンによって標識され、場合によりＴ抗原を認識する少なくとも１つのレクチンによっても標識された結腸直腸癌幹細胞を得るために、ステップ(ｃ４)で得られた組織切片の結腸直腸癌幹細胞を、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するビオチン化レクチンで、場合によりＴ抗原を認識する少なくとも１つのビオチン化レクチンでも標識するステップと、
(ｅ４)ステップ(ｄ４)で得られた組織切片を、発色基質を還元することができる酵素に結合したストレプトアビジン、アビジン又は抗ビオチン抗体と接触させるステップと、
(ｆ４)フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンを、場合によりＴ抗原を認識する少なくとも１つのレクチンをも発色基質で可視化するステップと、
(ｇ４)組織切片においてフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンと、場合によりＴ抗原を認識する少なくとも１つのビオチン化レクチンと、抗ＯＣＴ４抗体とによって標識された結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するステップと、
を含む、結腸直腸組織切片において結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量する方法に関する。
【００９９】
好ましい実施形態において、本発明は、
(ａ５)組織切片において抗ＯＣＴ４抗体によって標識された結腸直腸幹細胞を得るために、結腸直腸組織の組織切片において結腸直腸癌幹細胞を抗ＯＣＴ４抗体で標識するステップと、
(ｂ５)ステップ(ａ５)で得られた組織切片を、アルカリホスファターゼに結合した、抗ＯＣＴ４抗体を認識する二次抗体と接触させるステップと、
(ｃ５)抗ＯＣＴ４抗体をＦａｓｔ  ＲＥＤ(登録商標)又はＢＣＩＰ/ＮＢＴ混合物で可視化するステップと、
(ｄ５)ＵＥＡ−１によって標識され、場合によりＡＣＡ及びジャカリンによっても標識された結腸直腸癌幹細胞を得るために、ステップ(ｃ５)で得られた組織切片の結腸直腸癌幹細胞を、ビオチン化ＵＥＡ−１で、場合によりビオチン化ＵＥＡ−１、ビオチン化ＡＣＡ及びビオチン化ジャカリン(ＵＥＡ−１：ジャカリン：ＡＣＡ比＝６２５０：１６０：１０の)で標識するステップと、
(ｅ５)ステップ(ｄ５)で得られた組織切片を、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジンと接触させるステップと、
(ｆ５)ＵＥＡ−１を、場合によりＡＣＡ及びジャカリンをもＤＡＢで可視化するステップと、
(ｇ５)組織切片において、ＵＥＡ−１及び抗ＯＣＴ４抗体によって標識され、場合によりＡＣＡ及びジャカリンによっても標識された結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するステップと、
を含む、結腸直腸組織切片において結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量する方法に関する。
【０１００】
別の実施形態において、本出願に記載される一般的な方法は、結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するために、フラックスサイトメトリーを用いることによって実施することができる。一実施形態において、癌幹細胞は、フラックスサイトメトリーによって検出及び/又は定量することができる。この方法はまた、適切な機器を使用することによって結腸直腸癌幹細胞の単離も可能にする。
【０１０１】
生体試料は、予め細胞が互いから解離されている結腸直腸腫瘍組織の生検であってもよく、例えば、表面のグリカンに影響を与えることなく組織の解離を可能にする、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社から販売されている製品Ｌｉｂｅｒａｓｅ(商標)によって細胞が解離されいてもよい。
【０１０２】
フローサイトメトリーによって細胞を検出及び/又は定量するために、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンは、フルオロフォアＥに直接的又は間接的に結合される。第２の標識手段、好ましくは抗ＯＣＴ４抗体は、フルオロフォアＦに、直接的、又は(例えば抗ＯＣＴ４抗体を認識する二次抗体を介して)間接的に結合される。有利には、フルオロフォアＥとＦとは互いに異なる。好ましくは、フルオロフォアＥは、ストレプトアビジンに結合したＡｌｅｘａ  ４８８であり、そして、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンはビオチン化されており、フルオロフォアＦは、抗ＯＣＴ４抗体に直接的に結合したＡｌｅｘａ  ６３３である。
【０１０３】
したがって、本発明はまた、検出ステップが、フルオロフォアを顕色手段として用いてフローサイトメトリーによって実施される、前述の結腸直腸生体試料中の結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量する方法にも関する。
【０１０４】
一実施形態において、標識化は、顕色手段で修飾されたフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチン(有利にはＵＥＡ−１)と、抗ＯＣＴ４抗体と、顕色手段で修飾された、Ｔ抗原を認識する少なくとも１つのレクチン(有利には、ＡＣＡ、ＡＢＡ及びジャカリンから選択される)又はＡＢＡとＡＣＡの混合物、ＡＢＡとジャカリンの混合物及びＡＣＡとジャカリンの混合物から選択される、顕色手段で修飾された、Ｔ抗原を認識するレクチンの混合物(有利にはＡＣＡとジャカリンの混合物)とを用いて行われる。有利には、ＵＥＡ−１：ジャカリン：ＡＣＡ比は、６２５０：１６０：１０である。
【０１０５】
本発明は、より具体的には、
(ａ)生体試料でフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンによって標識された結腸直腸癌幹細胞を得るために、結腸直腸生体試料中の結腸直腸癌幹細胞を、顕色手段で修飾された、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンで標識するステップと、
(ｂ)結腸直腸組織中の結腸直腸癌幹細胞を可視化するステップと、
(ｃ)フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンよって標識された結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するステップと、
(ｅ)結腸直腸癌幹細胞の量に基づいて、結腸直腸癌の再発リスク及び/又は悪性度、及び/又は結腸直腸癌治療の予後値を推定するステップと、
を含む、結腸直腸癌の再発リスク及び/又は悪性度、及び/又は結腸直腸癌治療の予後値のインビトロ診断法に関する。
【０１０６】
有利には、本発明は、顕色手段を含むフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンと、結腸直腸癌細胞を標識する第２の手段、好ましくは抗ＯＣＴ４抗体とを用いて実施される。
【０１０７】
本発明者は、実際に、二重標識が最適な感度及び特異性をもたらし、ひいてはフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンによる癌非幹細胞又は非癌幹細胞の標識に起因し得る擬陽性のリスクを劇的に軽減することを明らかにした。
【０１０８】
よって本発明はまた、
(ａ６)組織切片において標識された結腸直腸癌細胞を得るために、結腸直腸組織の組織切片において結腸直腸癌幹細胞を、第２の標識手段、好ましくは抗ＯＣＴ４抗体で標識するステップと、
(ｂ６)ステップ(ａ６)で得られた組織切片を、顕色手段Ｃに結合した、第２の標識手段を認識する二次抗体と接触させるステップと、
(ｃ６)第２の標識手段、好ましくは抗ＯＣＴ４抗体を可視化するステップと、
(ｄ６)組織切片においてフコースα１−２ガラクトース単位を認識するビオチン化レクチンによって標識され、場合によりＴ抗原を認識する少なくとも１つのビオチン化レクチンによっても標識された結腸直腸癌幹細胞を得るために、ステップ(ｃ６)で得られた組織切片の結腸直腸癌幹細胞を、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するビオチン化レクチンで、場合によりＴ抗原を認識する少なくとも１つのビオチン化レクチンでも標識するステップと、
(ｅ６)ステップ(ｄ６)で得られた組織切片を、顕色手段Ａに結合したストレプトアビジン、アビジン又は抗ビオチン抗体と接触させるステップと、
(ｆ６)フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンを、場合によりＴ抗原を認識する少なくとも１つのレクチンをも可視化するステップと、
(ｇ６)ステップ(ｆ６)で得られた組織切片において結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するステップと、
(ｈ６)結腸直腸癌幹細胞の存在及び/又は数に基づいて、結腸直腸癌の再発リスク及び/又は悪性度、及び/又は結腸直腸癌治療の予後値を推定するステップと、
を含む、結腸直腸癌治療を適合させるための予後値を定義する再発リスク及び/又は悪性度のインビトロ診断法にも関する。
【０１０９】
好ましい実施形態において、本発明は、
(ａ７)組織切片において抗ＯＣＴ４抗体によって標識された結腸直腸癌幹細胞を得るために、結腸直腸組織の組織切片において結腸直腸癌幹細胞を抗ＯＣＴ４抗体で標識するステップと、
(ｂ７)ステップ(ａ７)で得られた組織切片を、顕色手段Ｃ、好ましくは発色基質を還元することができる酵素、特にアルカリホスファターゼに結合した、抗ＯＣＴ４抗体を認識する二次抗体と接触させるステップと、
(ｃ７)抗ＯＣＴ４抗体を、好ましくはＦａｓｔ  Ｒｅｄ(登録商標)又はＢＣＩＰ/ＮＢＴ混合物で可視化するステップと、
(ｄ７)組織切片においてフコースα１−２ガラクトース単位を認識するビオチン化レクチンによって標識され、場合によりＴ抗原を認識する少なくとも１つのビオチン化レクチンによっても標識された結腸直腸癌幹細胞を得るために、ステップ(ｃ７)で得られた組織切片の結腸直腸癌幹細胞を、ビオチン化ＵＥＡ−１、又は６２５０：１６０：１０のモル比のＵＥＡ−１：ジャカリン：ＡＣＡの混合物で標識するステップと、
(ｅ７)ステップ(ｄ７)で得られた組織切片を、顕色手段Ａ、好ましくは発色基質を還元することができる酵素に結合したストレプトアビジン、アビジン又は抗ビオチン抗体と接触させるステップと、
(ｆ７)ＵＥＡ−１を、又はＵＥＡ−１とジャカリンとＡＣＡとを、好ましくはＤＡＢで可視化するステップと、
(ｇ７)ステップ(ｆ７)で得られた組織切片において結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は定量するステップと、
(ｈ７)結腸直腸癌幹細胞の存在及び/又は数に基づいて、結腸直腸癌の再発リスク及び/又は悪性度、及び/又は結腸直腸癌治療の予後値を推定するステップと、
を含む、結腸直腸癌の再発リスク及び/又は悪性度、及び/又は結腸直腸癌治療の予後値のインビトロ診断法に関する。
【実施例】
【０１１０】
実施例１：組織切片上で可視の二重標識
パラフィン中でレクチン/ＯＣＴ４を用いる二重標識プロトコル
使用した器具：パラフィンブロック、氷、ミクロトーム、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ(登録商標)スライド、コンピュータ付きＢｏｎｄ  Ｍａｘ自動染色装置(Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ)、Ｌｅｉｃａ社製消耗品(アルコール、洗浄緩衝液、ＥＲ１緩衝液、脱ワックス緩衝液、ラベル、カバーガラス、試験管)、５％ＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液、抗ＯＣＴ４抗体(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)、Ｂｏｎｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｒｅｆｉｎｅ  Ｒｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット(Ｌｅｉｃａ)、Ｌｅｉｃａ社製封入剤、スライド、及び顕微鏡。
【０１１１】
番号によって特定された各患者からのＣＲＣ試料を含むパラフィンブロック(病理解剖部より提供)を約１時間氷で包んで冷却し、ミクロトームで厚さ４μｍの切片にしやすくした。
【０１１２】
切片組織の最大接着力を達成するために使用される、いわゆる「スーパーフロスト」スライドを、ブロックの番号と同じ番号によって特定した。これらのスライドの各々の中心に、水を一滴載せた。
【０１１３】
ミクロトーム切片を作製し、事前に置いた水滴の上に載せた。次いで、スライドを３７℃のホットプレートに載せ、それらの接着を促進し、かつ余分な水を除去した。作製した全てのスライドを３７℃のオーブンに入れて乾燥させた。
【０１１４】
残りの操作は、染色装置を制御するためにソフトウェアを実行するコンピュータに接続されたＬｅｉｃａ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｂｏｎｄ  Ｍａｘ染色装置によって処理した。
【０１１５】
スライドがオーブンに入っている間、二重標識操作の準備を行った：操作を行う必要のある生成物の各々について染色装置内のレベルを確認することから始め、次いで、染色装置動作ソフトウェアを使用して、それらの同じ番号によってスライドを特定した。標準化されたプロトコルを可能にする標識を作製した。抗体の希釈率及びそれらの量を計算し、必要な種々のキットを調製した。各実験の前に、使用する生成物の各々を走査しなければならず、レベルをゼロにリセットする必要があったことに留意されたい。
【０１１６】
次いで、オーブンから取り出したスライドに対応するラベルを貼付し、各スライドにカバーガラスを載せ、接触特性を利用して生成物をスライドの表面全体に行きわたらせる。
【０１１７】
スライドラックを染色装置内に配置し、各要素がリーダーによって認識され、スライドがそれらのラベルのバーコードによって特定された後に操作を開始した。
【０１１８】
最初に、Ｌｅｉｃａ  Ｄｅｗａｘ製品を利用して加熱によりパラフィンを除去し、その結果、抗体への接近を可能にした。このステップ及び他の全てのステップの後、以前に希釈したＢｏｎｄ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １０×中で３回洗浄した。
【０１１９】
このステップの後、ｐＨ６のＬｅｉｃａ  ＥＲ１緩衝液で５分間前処理して、この二重標識手順の間に得られた抗原を曝露させた。
【０１２０】
最初に、抗ＯＣＴ４抗体(ウサギ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)を、その飽和力に起因する非特異的結合を回避するために５％ＰＢＳ−ＢＳＡ中に希釈し、１：５００で２０分間適用した。
【０１２１】
次いで、この抗体は、Ｌｅｉｃａ社製Ｂｏｎｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｒｅｆｉｎｅ  Ｒｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット(アルカリホスファターゼポリマーアダプターとの抗ウサギ抗体コンジュゲート)を用いて、Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ(登録商標)により赤色可視スペクトルで可視化することができた。
【０１２２】
ビオチン化レクチン又はビオチン化レクチン混合物、すなわち、１：４０のＵＥＡ−１、又は１：４０のＵＥＡ−１と１：４００のジャカリン及び１：２５０００のＡＣＡとから構成される１：３レクチン混合物(常に５％ＰＢＳ−ＢＳＡ希釈液を使用)を２０分間適用した。操作が確実に順調に進行するためには、標識の順序が重要であることに留意されたい。
【０１２３】
このビオチン化レクチン又はこのビオチン化レクチン混合物は、ストレプトアビジン−ＨＲＰの介入により二次抗体の役割を果たすＢｏｎｄ  Ｉｎｔｅｎｓｅ  Ｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットにより、ビオチン/ストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体を認識するＤＡＢの特性を利用して、褐色に可視化することができた。
【０１２４】
次いで、ヘマトキシリンの存在により青に染色される対比染色ステップを７分間行い、確実に試料全体が特定され得るようにした。
【０１２５】
染色装置からスライドを取り外した。次いで、アルコール浴にスライドを５分間ずつ２回マニュアルで浸漬することによって切片を再水和させた。この再水和ステップの後には、同じく５分間のトルエン浴が続いた。
【０１２６】
次いで、封入剤(Ｌｅｉｃａ)の液滴を適用することによりスライドを封入することができた。この特定の封入剤は生体接着剤であり、それぞれの標識、特に赤色標識が劣化及び溶解するのを防ぐ。
【０１２７】
最後に、顕微鏡下でスライドを観察し、倍率２０倍で撮像した。
【０１２８】
その結果を図１及び図２に示す。
【０１２９】
ＵＥＡ−１及び抗ＯＣＴ４抗体による健常組織の二重標識により、細胞の二重標識が見られないことが示された。したがって、この組織には結腸直腸癌幹細胞が存在しないと推定することができる。
【０１３０】
腫瘍組織にはいくつかの細胞の種類が存在する：非幹性腫瘍細胞、非腫瘍性幹細胞、腫瘍性幹細胞、及び非腫瘍性非幹細胞。ＵＥＡ−１単独で、又はＵＥＡ−１及び抗ＯＣＴ４抗体で腫瘍組織を標識することにより、レクチンＵＥＡ−１が結腸直腸癌幹細胞を選択的に染色する能力を証明する(より暗色の領域)。ＯＣＴ４は、(腫瘍性及び非腫瘍性)幹細胞を標識することができ、ＵＥＡ−１によって標識された細胞が結腸直腸癌幹細胞であることを裏付ける。
【０１３１】
実施例２：組織切片の二重蛍光標識
４〜６μｍの切片をいくつか、下記のとおりインキュベートした：
・抗ＯＣＴ４抗体(ウサギ、１：２００希釈)の存在下、４℃で一晩インキュベートし、次いで切片をＰＢＳで３回洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)に接合した抗ウサギ二次抗体で１時間インキュベートした。
・ビオチン化ＵＥＡ−１(１：２００希釈)の存在下、周囲温度で２０〜３０分間インキュベートし、次いで切片をＰＢＳで３回洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８に接合したストレプトアビジン４８８により３０分間可視化した。
・抗ＯＣＴ４抗体(ウサギ、１：２００希釈)の存在下、４℃で一晩インキュベートし、次いで切片をＰＢＳで３回洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)に接合した抗ウサギ二次抗体で１時間インキュベートした。次いで、ビオチン化ＵＥＡ−１(１：２００希釈)の存在下、周囲温度で２０〜３０分間切片をインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８に接合したストレプトアビジン４８８により３０分間可視化した。
【０１３２】
ＰＢＳ中で３回洗浄した後、ＤＡＰＩ(１：１００００)で５分間、核染色した。水中で更に３回ＤＡＰＩを洗浄した後、切片をスライドに載せ、関連ソフトウェアを使用してＬＳＭ  ５１０  ＭＥＴＡ共焦点顕微鏡(Ｚｅｉｓｓ)下で調べた。
【０１３３】
その結果を図３及び図４に示す。
【０１３４】
健常組織には二重標識は観察されなかった(図３)。対照的に、腫瘍組織には、結腸直腸癌幹細胞の二重標識が見られる(図４、画像の色の薄い領域)。
【０１３５】
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４に接合した抗ＯＣＴ４抗体、及びビオチン化ＵＥＡ−１/Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８に接合したストレプトアビジンでインキュベートした細胞を共焦点顕微鏡により分析し、Ｚスタック法により画像を調整した。
【０１３６】
その結果を図５及び図６に示す。
【０１３７】
健常組織(図５)には、二重標識された細胞はなく、結腸直腸癌幹細胞が存在しないことが示唆される。
【０１３８】
腫瘍組織では、調整した画像の分析によってＵＥＡ−１及び抗ＯＣＴ４抗体によって二重標識された細胞の検出が可能になる。これらの細胞の量は、全細胞数の１６．６％に相当する。
【０１３９】
これらのデータに基づいて、この腫瘍が再発を引き起こす可能性のある結腸直腸癌幹細胞を含むと結論付けることが可能である。腫瘍の悪性度及び再発リスクが明らかになり、したがって、この後には治療が行われなければならず、また適正に適合されなければならないと結論付けることができる。
【０１４０】
実施例３
異なるステージの結腸直腸癌に罹患した１００人の患者の腫瘍組織に関する後ろ向き臨床試験を行った。
【０１４１】
この試験の目的は、癌幹細胞の特異的レクチンを使用した免疫組織化学的測定による結腸直腸癌悪性度試験の正当性を立証することであった。６０ヶ月を超える試験における患者の生存率を知るために、５年遡った患者のコホートから意図的に試料を選択した。また、５年にわたって患者の帰結をモニタリングすることは、３年であると推定されている化学療法による治療の作用期間を超えることを可能にする。
【０１４２】
癌の各ステージにつき２つの例を挙げる。６０ヶ月後に患者が生存していた癌幹細胞標識の陰性試料の好適な症例。患者が生存しなかった癌幹細胞標識陽性試料の好適でない症例。
【０１４３】
ステージＩ結腸直腸癌の例として、患者は、腫瘍が除去され、化学療法を行われなかった。これは、ステージＩ結腸直腸癌の治療のための従来のプロトコルである。
【０１４４】
ステージＩＩ結腸直腸癌の例として、患者は、腫瘍が除去され、化学療法を行われなかった。これは、十分な数の末梢神経節を示すステージＩＩ結腸直腸癌の治療のための従来のプロトコルである。
【０１４５】
ステージＩＩＩ結腸直腸癌の例として、患者は、腫瘍が除去され、化学療法を行われなかった。これらは、ステージＩＩＩ結腸直腸癌治療の特殊な症例であり、通常、患者は手術に加えて化学療法も受ける。
【０１４６】
ステージＩＶ結腸直腸癌の例として、患者は腫瘍が除去され、化学療法による治療を系統的に行われた。ここに示す好適でない症例では、患者は化学療法による治療を行う前に死亡した。
【０１４７】
標識は以下のように行った：
ステージＩ結腸直腸癌
二重標識：ＯＣＴ４＋レクチン混合物(ＵＥＡ−１、ジャカリン、ＡＣＡ)
グリコシル化標識：レクチン混合物(ＵＥＡ−１、ジャカリン、ＡＣＡ)
ステージＩＩ結腸直腸癌
二重標識：ＯＣＴ４＋ＵＥＡ−１レクチンのみ
グリコシル化標識：ＵＥＡ−１レクチンのみ
ステージＩＩＩ結腸直腸癌
二重標識：ＯＣＴ４＋レクチン混合物(ＵＥＡ−１、ジャカリン、ＡＣＡ)
グリコシル化標識：レクチン混合物(ＵＥＡ−１、ジャカリン、ＡＣＡ)
ステージＩＶ結腸直腸癌
二重標識：ＯＣＴ４＋ＵＥＡ−１レクチンのみ
グリコシル化標識：ＵＥＡ−１レクチンのみ
【０１４８】
各ステージ(Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ)につき、分析により陽性及び陰性の(癌幹細胞を示す又は示さない)試験結果を有する患者の群を同定することができた。この試験は、医療従事者にさらなる情報を提供し、陽性の結果を示した患者に対する具体的な治療又はモニタリングを想定させる。
【０１４９】
その結果を図８〜図１１に示す。
【図１】
2018538550.tif 000002
【図２】
2018538550.tif 000003
【図３】
2018538550.tif 000004
【図４】
2018538550.tif 000005
【図５】
2018538550.tif 000006
【図６】
2018538550.tif 000007
【図７】
2018538550.tif 000008
【図８】
2018538550.tif 000009
【図９】
2018538550.tif 000010
【図１０】
2018538550.tif 000011
【図１１】
2018538550.tif 000012
【国際調査報告】
2018538550.tif 000013
2018538550.tif 000014
2018538550.tif 000015
2018538550.tif 000016
2018538550.tif 000017
2018538550.tif 000018