(57)【要約】  本発明は、様々な美容及び治療用途において軟部組織を増大、充填又は置換するための、無菌性のｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性多糖類組成物に関する。該組成物は、求核基により官能化された第１の多糖類誘導体及び求電子基により官能化された第２の多糖類誘導体を含む。該求核官能基及び該求電子官能基は、患者体内への混注後、自発的に共有結合をｉｎ  ｓｉｔｕ形成することにより、混注部位において架橋ヒドロゲルを形成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
美容用途において架橋ヒドロゲルをｉｎ  ｓｉｔｕ形成させるための、第１の多糖類誘導体及び第２の多糖類誘導体の使用であって、前記第１の多糖類誘導体が求核基により官能化されており、前記第２の多糖類誘導体が求電子基により官能化されており、前記第１及び第２の両多糖類誘導体は滅菌されており、前記第１及び第２の多糖類誘導体の患者体内の標的部位への混注後、前記求核基及び前記求電子基が共有結合をｉｎ  ｓｉｔｕ形成することにより、前記標的部位において架橋ヒドロゲルを形成する、使用。
【請求項２】
共有結合の前記ｉｎ  ｓｉｔｕ形成が、混注後自発的に起き、及び／又は、共有結合の前記ｉｎ  ｓｉｔｕ形成によって、水以外の他の副生成物が放出されない、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記第１の多糖類誘導体が第１の無菌性前駆体溶液の形態で存在し、前記第２の多糖類誘導体が第２の無菌性前駆体溶液の形態で存在する、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記第１及び第２の無菌性前駆体溶液が、１Ｈｚ及び２５℃における振動レオロジー測定による測定で０．００１Ｐａ・ｓ〜５．０Ｐａ・ｓの複素粘度を各々有する、若しくは、１．０ｍＬのガラスシリンジを使用し、押出速度０．２１ｍｍ／秒で３０Ｇの針を通過させた測定で０．０１Ｎ〜１５Ｎの注入力を各々有する、又は、これらの両方である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記第１の前駆体溶液及び前記第２の前駆体溶液が、混注の際に、ただし、患者の体内に入る前に混合され、液体ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性組成物を形成し、前記液体ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性組成物が、好ましくは、１Ｈｚ及び２５℃における振動レオロジー測定による測定で０．１Ｐａ・ｓ〜１００Ｐａ・ｓの複素粘度を有する、若しくは、１．０ｍＬのガラスシリンジを使用し、押出速度０．２１ｍｍ／秒で３０Ｇの針を通過させた測定で０．０１Ｎ〜２０Ｎの注入力を有する、又は、これらの両方である、請求項３又は４に記載の使用。
【請求項６】
前記第１の前駆体溶液中に存在する前記第１の多糖類誘導体の濃度が０．１重量％〜５．０重量％であり、及び前記第２の前駆体溶液中に存在する前記第２の多糖類誘導体の濃度が０．１重量％〜５．０重量％であり、並びに／又は患者体内の標的部位に注入される前記液体ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性組成物に含まれる、前記第１の多糖類誘導体対前記第２の多糖類誘導体の重量比が１５：８５〜８５：１５である、請求項３〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記求核基がヒドラジド部分であり、前記求電子基がアルデヒド部分であり、前記アルデヒド部分が、好ましくは、前記多糖類骨格の繰り返しの糖類の環を壊すことなく、前記多糖類に導入されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記第１及び第２の多糖類誘導体が、独立して、カルボキシル化セルロース及びカルボキシル化セルロース誘導体、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルスターチ、ヒアルロン酸、アルギネート、ヘパロサン、ヘパリン、ヘパリンサルフェート、ペクチン、コンドロイチンサルフェート、デルマタンサルフェート、セルロース、キトサン又はキチンからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記第１の多糖類誘導体がヒドラジド官能化による第１のヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体であり、前記第２の多糖類誘導体が、アルデヒド官能化による第２のヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体であり、前記第１のＨＡ誘導体は、好ましくはＨＡの糖類単位のカルボキシル基がヒドラジド部分によって官能化されている、若しくは、前記第２のＨＡ誘導体は、好ましくは、−ＣＨ２ＯＨ基の−ＣＨＯ基への変換によって生成されたアルデヒド部分によって官能化されている、又は、これらの両方である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性組成物が、皮膚の皺及び皺線、眉間の皺線、鼻唇溝、頤の皺、マリオネットライン、下顎の輪郭、頬側交連、口周囲の皺、目尻の皺、皮膚陥凹み、傷痕、こめかみ、額の真皮支持、頬骨及び頬脂肪体、涙溝、鼻、唇、頬、頤、口周囲部、眼窩下部、及び顔面非対称の処置に使用される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
治療用途の架橋ヒドロゲルの前記ｉｎ  ｓｉｔｕ形成のための、特に、腹圧性尿失禁、膣の乾燥、膀胱尿管逆流、声帯不全、及び声帯内方移動の処置に使用するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の、第１の多糖類誘導体及び第２の多糖類誘導体。
【請求項１２】
請求項９に記載の、第１のヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体及び第２のヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体の組み合わせ。
【請求項１３】
少なくとも、（ａ）請求項３〜９のいずれか一項に記載の第１の前駆体溶液が一方のバレルに、及び（ｂ）請求項３〜９のいずれか一項に記載の第２の前駆体溶液がもう一方のバレルに予め充填された、マルチバレルシリンジシステム。
【請求項１４】
（ｉ）請求項３〜９のいずれか一項に記載の第１の前駆体溶液が入っている第１の容器と、（ｉｉ）請求項３〜９のいずれか一項に記載の第２の前駆体溶液が入っている第２の容器と、任意に、（ｉｉｉ）使用説明書と、を備える、架橋多糖類ヒドロゲルをｉｎ  ｓｉｔｕ形成させるためのキット。
【請求項１５】
架橋ヒドロゲルを、美容又は治療用途において、ｉｎ  ｓｉｔｕ形成させるための方法であって、
（ａ）第１の多糖類誘導体の第１の前駆体溶液と、これとは別に、第２の多糖類誘導体の第２の前駆体溶液と、を準備する工程であって、前記第１の多糖類誘導体を求核基により官能化し、及び前記第２の多糖類誘導体を求電子基により官能化し、並びに前記第１及び第２の両前駆体溶液を滅菌する工程と、
（ｂ）前記第１の前駆体溶液及び前記第２の前駆体溶液を混合することで、ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性混合溶液とする工程と、
（ｃ）前記混合溶液を患者体内の標的部位に注入する工程であって、前記第１の多糖類誘導体の前記求核基及び前記第２の多糖類誘導体の前記求電子基を、共有結合をｉｎ  ｓｉｔｕ形成することにより、前記標的部位において架橋ヒドロゲルを形成する工程と、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、様々な美容及び治療用途において軟部組織を増大、充填又は置換するための、無菌性のｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性多糖類組成物に関する。該組成物は、求核基により官能化された第１の多糖類誘導体及び求電子基により官能化された第２の多糖類誘導体を含む。該求核官能基及び求電子官能基は、患者体内への混注後、自発的に共有結合をｉｎ  ｓｉｔｕ形成することにより、混注部位において架橋ヒドロゲルを形成する。
【背景技術】
【０００２】
今日、注入可能な充填剤が、多数の治療及び美容用途において、軟部組織にボリュームを付与するために使用されている。美容医療において、皮膚充填剤は、顔及び体の選択領域を再生するためにますます使用されている。皮膚充填剤は、顔の特徴（例えば、頬及び唇）の改善、皺（例えば、鼻唇溝）及び皺線の軽減を可能とし、更に、加齢と共に生じる、皮膚及び下部にある組織のボリューム及び弾性の減少の一部を回復させることが可能である。これにより、皮膚はよりすべすべしたものとなりふっくらとして見え、従ってより若々しい外観がもたらされる。
【０００３】
多種多様な材料が、軟部組織充填剤での使用について知られている。これらの材料のほとんどは、体内に再吸収されるため（例えば、コラーゲン、ヒアルロン酸（ＨＡ）、カルシウムヒドロキシルアパタイト（ＣａＨＡ）及びポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ））、効力が一時的なもの（約３〜１８ヶ月）である。ポリメチルメタクリレートビーズ（ＰＭＭＡマイクロスフェア）をベースとするＦＤＡにより承認された充填剤材料等の、少数の永続的な（すなわち非吸収性の）充填剤もまた、存在する。いくつかの軟部組織充填剤はまた、リドカイン（局所麻酔薬）を含有する。リドカインは、注入に関連する痛み又は不快感の低減を意図している。
【０００４】
今日の、世界的に最も一般的に使用されている軟部組織充填剤の材料はヒアルロン酸（ＨＡ）である。これは、ＨＡの、ボリュームを生じさせる優れた能力及び好ましい安全性による。ＨＡは天然に生じるグルコサミノグリカンで、例えば、真皮の細胞外マトリックス中に存在し、交互に結合したβ−Ｄ−（１→３）グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）残基及びβ−Ｄ−（１→４）−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基から構成される。ＨＡは、ゲル形態で水と結合して膨潤することができ、すべすべにする効果／充填効果をもたらす。ほとんどの場合、皮膚充填剤に使用されるＨＡは、体内でより長期間（約６〜１８ヶ月）持続するよう架橋されている。
【化１】
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【０００５】
多糖類（例えば、ＨＡ）分子のポリマー鎖を共に共有結合させ、分子間及び分子内架橋を有する充填剤材料マトリックスを形成させる様々な架橋アプローチが、当該技術分野において既知である。広範にわたって使用されるアプローチは、化学薬品による化学架橋である。これらの薬品は、通常、多糖類のヒドロキシル官能基及び／又はカルボキシル官能基と反応する。一般的に使用される架橋剤としては、限定はしないが、以下のものが挙げられる。すなわち、ＤＶＳ（ジビニルスルホン）、二又は多官能性エポキシド（例えば、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ））、１，２−ビス（２，３−エポキシプロポキシ）エチレン（ＥＧＤＧＥ）及び１，２，７，８−ジエポキシオクタン（ＤＥＯ））、ＰＥＧ系架橋剤（例えば、ペンタエリスリトールテトラグリシジルエーテル（ＰＥＴＧＥ））、ビスカルボジイミド（ＢＣＤＩ）（例えば、フェニレンビス−（エチル）−カルボジイミド及び１，６−ヘキサメチレンビス−（エチルカルボジイミド））、ジ−アミン又はマルチアミン架橋剤（例えば、ヘキサメチレンジアミン（ＨＭＤＡ）及び３−［３−（３−アミノプロポキシ）−２，２−ビス（３−アミノ−プロポキシメチル）−プロポキシ］−プロピルアミン（４ＡＡ））、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ）、１−（２，３−エポキシプロピル）−２，３−エポキシシクロヘキサン、エピクロロヒドリン、アルデヒド（例えば、ホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒド）、及びヒドラジド（ビス−、トリス−及び多価ヒドラジド化合物、例えば、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ））である。
【０００６】
注入可能な多糖類ヒドロゲルの架橋に使用されてきたその他の方法としては、メタクリレート化ポリマーの光化学架橋（Ｍｏｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ  ２０１１，３４：９３−１０２）、マイケル付加架橋（Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００２，３：１３０４−１３１１）、シッフ塩基反応架橋（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００９，３０：２４９９−２５０６）、チオール−エン反応又はアジド−アルキン付加環化等の反応を使用した「クリック」ケミストリーアプローチ（Ｈｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２０１０，３９：１３５５−１３８７；ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２００９，２０：２００１−２０１６）が挙げられる。軟部組織を増大させるための、光架橋した多糖類系充填剤もまた、当該技術分野において既知である（例えば、国際公開第２０１１／０６９４７５号を参照のこと）。加えて、「内部」で分子間及び／又は分子内エステル系架橋を形成する（「自己架橋ポリマー」又は「ＡＣＰ」と称される）、酸性多糖類のカルボキシル官能基と、同一又は異なる多糖類分子のヒドロキシル基とのエステル化が、当該技術分野において研究されてきた。更に、米国特許公開第２００６／００８４７５９号は、チラミン修飾及び架橋されたＨＡヒドロゲル材料を記載している。該材料においては、ペルオキシダーゼによるジチラミン結合により、架橋がもたらされ、それをｉｎ  ｖｉｖｏで実施可能である。
【０００７】
しかしながら、従来の予め形成されたヒドロゲルには、粘性が高く、細針では注入できないという欠点があることが多い。従って、様々な用途に好適な、ｉｎ  ｓｉｔｕでゲル化するヒドロゲル組成物を開発するために、多くの試みがなされてきた。これらの組成物は、予め形成されたゲルの形態ではなく、液体の形態で組織に注入される。例えば、国際公開第９５／１５１６８号は、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）カップリングケミストリーを使用した、ＨＡヒドラジド誘導体の合成を記載している。ヒドラジド−ＨＡは、ホモ若しくはヘテロ二官能性又はトラウト架橋剤によって架橋され、薬物送達用のヒドロゲルを形成することができる。国際公開第００／０１６８１８号は、ＨＡのアルデヒド又はアミン官能化誘導体（例えば、アジピン酸ジヒドラジド−ＨＡ）を、ホモ又はヘテロ二官能性架橋剤（例えば、（ＳＰＡ）１−ＰＥＧ等の二官能性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル架橋剤）と架橋することによる、ヒドロゲルのｉｎ  ｓｉｔｕ形成を開示している。
【０００８】
更に、国際公開第０１／４０３１４号は、酸化多糖類（例えば、アルデヒド基を有するアルギネートポリマー（ＰＡＧ））及びヒドロゲル系内の多糖類を可逆的に架橋可能な、２個以上の官能基を有する少なくとも１種の架橋剤（アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）架橋剤等）を含む、ヒドロゲル組成物を開示している。更に、国際公開第２０１１／１００４６９号は、硝子体代替生体材料として使用するための架橋ＨＡヒドロゲルであって、アルデヒド官能基含有酸化ＨＡ（オキシ−ＨＡ）を、ジヒドラジド架橋剤（例えば、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ））と反応させることにより製造されるものを開示している。
【０００９】
加えて、国際公開第２００９／１０８１００号は、アルデヒド修飾ＨＡ及びヒドラジド修飾ポリビニルアルコール（ＰＶＡＨ）架橋剤を混合し、複数のヒドロキシル基を呈する架橋構造を形成させることによってｉｎ  ｓｉｔｕで調製した、ＨＡ系ヒドロゲルを開示している。国際公開第２０１１／０６９４７５号は、グルコサミン繰り返し単位のＣ６位にある一級ヒドロキシル基を、ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６−テトラメチル−ピペリジニルオキシル）／共酸化剤系を使用して酸化することによって、アルデヒド基を含有するアルデヒド−ＨＡ誘導体を調製する方法、及びジアミン化合物（例えば、ヘキサンジアミン）又はアミン−ＨＡ（例えば、ヘキサンジアミン置換ＨＡ）と反応させて、架橋ＨＡヒドロゲルを調製するための、該アルデヒド−ＨＡ誘導体の使用を開示している。
【００１０】
Ｄａｈｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１３，３４：９４０−９５１）は、十分に明確な、ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性のアルギネート及び心筋組織工学用のＨＡヒドロゲルを記載している。ヒドロゲルは、ヒトＩ型コラーゲン及び新生仔ラット心筋細胞（ＮＲＨＣ）の存在下で、アルデヒド及びヒドラジド官能化アルギネート並びにＨＡを反応させることで調製され、ヒドラゾン架橋ヒドロゲル系生体人工心臓組織が得られる。
【００１１】
Ｏｓｓｉｐｏｖ  ｅｔ  ａｌ（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１０，１１：２２４７−２２５４）は、水溶液中のＨＡのカルボキシレート残基とのアミド型反応が可能な、中心に二価の保護基を有する、対称な二官能性の特定の試薬を使用したヒドラジド官能化ＨＡの合成を開示している。ヒドラジド官能化ＨＡは、アルデヒドＨＡ誘導体と混合することでヒドラゾンＨＡヒドロゲルのｉｎ  ｓｉｔｕ形成に使用可能である。得られたヒドロゲルは、組織工学用途の成長因子送達媒体としての使用に好適である。
【００１２】
Ｖａｒｇｈｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９，１３１：８７８１−８７８３）は、ヒドラジド基及びアミノメチレンビスホスホネート基で二重に官能化されたＨＡ誘導体であって、ビスホスホネート（ＢＰ、抗破骨細胞及び抗腫瘍低分子薬）を共有結合可能なものについて報告している。該二重に官能化されたＨＡをアルデヒド官能化ＨＡと混合すると、埋植箇所でＢＰ薬剤を制御放出するための、注入可能なＨＡヒドロゲルのｉｎ  ｓｉｔｕ形成が行われる。
【００１３】
Ｏｏｍｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ  ２０１３，３２３：１２７３−１２８０）は、ＨＡ−アルデヒド誘導体をカルボジヒドラジド（ＣＤＨ）官能化ＨＡ誘導体と混合し、ヒドラゾン結合を有するＨＡヒドロゲルを得ることにより調製されたＨＡヒドロゲルを記載している。更に、治療用タンパク質（例えば、遺伝子組換え型ヒト成長因子ＢＭＰ−２）の存在下、ヒドロゲルをｉｎ  ｓｉｔｕＨＡ形成させることによって、骨組織の再生のために成長因子を送達することが可能な、ｉｎ  ｖｉｖｏ用途のヒドロゲルが得られたことも記載されている。
【００１４】
ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性多糖類ヒドロゲルは、細針であっても容易に注入することができるため、多くの臨床用途に望ましく、注入速度のより良好な制御に役立ち、シリンジの取り扱いを改善する。加えて、ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性多糖類ヒドロゲルは、任意の複雑な形状に形成され、その後に架橋することが可能であり、生物活性剤及び／又は細胞と容易に混合可能であり、また、ゲル形成中に所与の組織に癒着する。
【００１５】
しかしながら、既存のｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性ヒドロゲル組成物は、それらの使用目的に対して所望又は要求される１つ以上の特性を呈さないという点で十分ではない。一般に、ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性ヒドロゲル組成物は、生体適合性、非免疫原性、非炎症性で、更に安全でなくてはならない。該ヒドロゲル組成物は、周辺組織の生物学的成分と反応してはならず、有害な副生成物を生じてはならず、更に、投与後ｉｎ  ｓｉｔｕで効率的に架橋しなくてはならない。また、該ヒドロゲル組成物は生分解性でなくてはならないが、同時に、十分に長いｉｎ  ｖｉｖｏ残存性をもたらさなくてはならない。更に重要なことに、ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性ヒドロゲルは細針によって注入可能でなくてはならないが、細針の場合、注入されるｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性ヒドロゲル組成物の粘度は十分に低い必要がある。
【００１６】
本発明の目的
上記を鑑み、本発明の目的は、ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性組成物を提供することである。該組成物は、細針から容易に押し出すことが可能であり、投与後ｉｎ  ｓｉｔｕで所望の特性（例えば、機械的、化学的、レオロジー、生物学的及び免疫学的特性に関する特性）を有する架橋ヒドロゲルを形成し、様々な美容及び治療用途において、軟部組織を増大させ、充填し、置換する。
【発明の概要】
【００１７】
上記目的は、患者体内への注入後（すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下）、自発的に共有結合性架橋を形成する２種の官能化多糖類誘導体を提供することによって解決される。このように形成されたヒドロゲルの形態のｉｎ  ｓｉｔｕ架橋した多糖類網状構造は、軟部組織充填剤、例えば皮膚充填剤として作用する。本発明のｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性多糖類組成物は、２種の官能化多糖類誘導体が液体の形態で混注可能であるため、細針であっても、低い押出力で混注が可能となるという点で有利である。望ましくは、ｉｎ  ｓｉｔｕゲル形成では、いかなる有害副生成物も生成しない。唯一の副生成物は、水である。水は、形成されたヒドロゲル及び／又は周辺組織に速やかに吸収される。加えて、ｉｎ  ｓｉｔｕ形成されたヒドロゲルは、組織との一体化（tissue integration）、皮膚の改善、組織成形能力及びボリューム形成能力に関し、所望の特性を有する。
【００１８】
第１の態様では、本発明は、美容用途において架橋ヒドロゲルをｉｎ  ｓｉｔｕ形成させるための、第１の多糖類誘導体及び第２の多糖類誘導体の使用に関する。第１の多糖類誘導体は求核基により官能化されており、かつ第２の多糖類誘導体は求電子基により官能化されている。更に、第１及び第２の両多糖類誘導体は滅菌されている。求核基及び求電子基は、第１及び第２の多糖類誘導体の患者体内の標的部位への混注後、共有結合をｉｎ  ｓｉｔｕ形成することにより、標的部位において架橋ヒドロゲルを形成する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、本明細書で規定される、治療用途における架橋ヒドロゲルｉｎ  ｓｉｔｕ形成のために、第１の多糖類誘導体を、好ましくは第１の前駆体溶液の形態で、第２の多糖類誘導体を、好ましくは第２の前駆体溶液の形態で提供する。治療用途又は適応症としては、腹圧性尿失禁、膣の乾燥、膀胱尿管逆流、声帯不全、及び声帯内方移動（vocal fold medialization）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
更なる態様では、本発明は、本明細書で規定される第１のヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体及び第２のヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体の組み合わせを、好ましくは第１のヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体を含む第１の前駆体溶液、及び第２のヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体を含む第２の前駆体溶液、の形態で提供する。
【００２１】
なおも更なる態様では、本発明は、少なくとも、（ａ）本明細書で規定される第１の多糖類誘導体を含む第１の前駆体溶液が一方のバレルに、及び（ｂ）本明細書で規定される第２の多糖類誘導体を含む第２の前駆体溶液がもう一方のバレルに、予め充填されたマルチバレルシリンジシステムを提供する。
【００２２】
更に別の態様では、本発明は、（ｉ）本明細書で規定される第１の多糖類誘導体の第１の前駆体溶液が入っている第１の容器と、（ｉｉ）本明細書で規定される第２の多糖類誘導体の第２の前駆体溶液が入っている第２の容器と、任意に、（ｉｉｉ）使用説明書と、を備える、架橋多糖類ヒドロゲルをｉｎ  ｓｉｔｕ形成させるためのキットを提供する。
【００２３】
更に別の態様では、本発明は、美容又は治療用途における、架橋多糖類ヒドロゲルを、ｉｎ  ｓｉｔｕ形成させる方法であって、該方法が、
（ａ）第１の多糖類誘導体の第１の前駆体溶液と、これとは別に、第２の多糖類誘導体の第２の前駆体溶液と、を準備する工程であって、第１の多糖類誘導体を求核基により官能化し、及び第２の多糖類誘導体を求電子基により官能化し、並びに第１及び第２の両前駆体溶液を滅菌する工程と、
（ｂ）第１の前駆体溶液及び第２の前駆体溶液を混合することで、ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性混合溶液とする工程と、
（ｃ）混合溶液を患者体内の標的部位に注入する工程であって、第１の多糖類誘導体の求核基及び第２の多糖類誘導体の求電子基を、共有結合をｉｎ  ｓｉｔｕ形成することにより、標的部位において架橋ヒドロゲルを形成する工程と、を含む、方法を提供する。
【００２４】
本発明の特定の実施形態は、添付の特許請求の範囲に明示される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
本発明をより完全に理解するために、以下の説明及び添付図面を参照する。
【００２６】
【図１】試験用ウサギ１の皮膚内の、台形塊状充填を示す写真である。該充填は、被験物質１の２００μＬを、１つのトンネル（tunnel）として（部位Ｄ、左上）、２つのトンネルとして（部位Ｉ、右上）及び４つのボーラスとして（部位Ｊ、右下）皮内注射した後、ｔ＝０時間において、ｉｎ  ｖｉｖｏで被験物質１がゲル化することにより形成された。ＰＢＳ対照（２００μＬ）を、部位Ｅ（左下）に注入している。
【００２７】
【図２】被験物質２により形成された隆起を示す肉眼写真である。該隆起は、皮膚を開いた後に１０００μＬをウサギ２に皮下注射した後、ｔ＝４時間で形成された。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の無菌性ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性多糖類組成物は、細針によって低い注入力で容易に注入可能であり、皮膚の改善、皮膚の成形又は良好なボリューム形成効果をもたらす。より具体的には、ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性組成物は、２種の無菌性前駆体溶液を単純に物理的に混合して注入することに付随して生成した無菌性低粘度液体混合物の形態で注入することにより、標的組織に好都合に適用できる。各前駆体溶液は、異なる官能化多糖類誘導体を含有している。これにより、有利には細針の使用が可能となり、ひいては患者の快適さを高め（注入時の痛みの低減、背圧の低下）、更に施術者が正確にかつ安全に（管の目詰まりなしに）ヒドロゲルを様々な皮膚層等の所望の標的部位に注入可能となる。
【００２９】
更に、注入された前駆体溶液の混合物は、迅速にかつ効率的にｉｎ  ｓｉｔｕ架橋し、体内の標的部位において共有結合性架橋ヒドロゲルを形成する。架橋反応を引き起こすために、添加剤、触媒、ｐＨスイッチ、紫外線照射、更にその他の外的刺激（又は「トリガ」）のいずれも必要としない。特に、架橋剤は使用されず、必要でもない。架橋反応により生成する唯一の副生成物は、典型的には水である。水は、ヒドロゲル及び／又は周辺組織に速やかに吸収される。更に、本発明の官能化多糖類誘導体は比較的単純な方法、通常は単一段階の反応で合成することができ、更に有利には、湿熱滅菌（例えば、蒸気滅菌、好ましくは高圧蒸気滅菌）により好都合に滅菌することができる。
【００３０】
更に、ｉｎ  ｓｉｔｕ形成された架橋ヒドロゲルは、軟部組織充填剤材料として使用するのに好ましい機械的、化学的及びレオロジー特性を呈する。特に、ｉｎ  ｓｉｔｕ形成された架橋ヒドロゲルは、高いボリューム生成能力を有している。また、本発明のｉｎ  ｓｉｔｕ架橋ヒドロゲルは、依然として生分解性ではあるものの、長期のｉｎ  ｖｉｖｏ滞留時間を有している。加えて、本発明のｉｎ  ｓｉｔｕ架橋ヒドロゲルは、望ましくは、麻酔薬（例えば、リドカイン）及び様々なその他の成分（例えば、幹細胞及び脂肪細胞を含む細胞、脂肪、脂質、成長因子並びにビタミン）を含むことが可能である。従って、本発明のｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性組成物は、美容（エステティック）目的での皮膚充填剤としての使用に特に好適である。
【００３１】
第１の態様では、本発明は、美容用途において架橋ヒドロゲルをｉｎ  ｓｉｔｕ形成させるための、第１の多糖類誘導体及び第２の多糖類誘導体の使用に関する。第１の多糖類誘導体は求核基により官能化されており、第２の多糖類誘導体は求電子基により官能化されている。更に、第１及び第２の両多糖類誘導体は滅菌されている。求核基及び求電子基は、第１及び第２の多糖類誘導体の患者体内の標的部位への混注後、共有結合をｉｎ  ｓｉｔｕ形成することにより、標的部位において架橋ヒドロゲルを形成する。
【００３２】
本明細書で使用する場合、用語「ｉｎ  ｓｉｔｕ」は、投与部位におけることを意味する。従って、投与部位でのヒドロゲル形成のため、第１及び第２の多糖類誘導体は、概して、混注され、又は別の方法で患者体内の特定部位（標的部位）、例えば、組織をエステティック面の理由により増大させる必要がある部位に、共に適用され、混注部位において共有結合性架橋する。本発明において、用語「ｉｎ  ｓｉｔｕ」及び「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、互換的に使用され得る。本発明の意味において、「患者」は、例えば、美容（エステティック）又は治療目的のための、任意の個体又は被験体、例えば、特定の病状、容態又は疾患の処置を必要とする、哺乳動物及び好ましくはヒト等であり得る。
【００３３】
本発明との関係において、用語「混注」は、概して、第１の多糖類誘導体及び第２の多糖類誘導体を、単一の液体組成物、例えば溶液として、患者体内の標的部位に、共に注入することを意味する。本明細書で使用する場合、用語「注入可能」又は「注入」は、ｉｎ  ｓｉｔｕヒドロゲル形成組成物をシリンジ又はシリンジシステムから投与可能であることを示す。特に、用語「混注」は、好ましくは、第１の多糖類誘導体及び第２の多糖類誘導体を、針の先から射出して患者体内の標的部位に導入する前に、混合、特に均質に混合した後、患者体内の標的部位に混合物として注入することを意味する。本発明において、用語「注入」又は「混注」は、皮内（intra−）注射、皮内（inter−）注射若しくは皮下（subdermal）注射又は皮下（subcutaneous）注射を指し得る。更に、本明細書で使用する場合、用語「針」は、「カニューレ」又は任意のその他の注入に好適な針状物を含む、又は、これらと同義であることが意図されている。
【００３４】
本明細書で使用する場合、用語「ヒドロゲル」は、共有結合性架橋ポリマー鎖からなる、水で膨潤した３次元網状構造を意味する。好ましくは、ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋（又は「ゲル化」）ヒドロゲルは凝集性である。本発明の意味において、用語「凝集性」又は「凝集力」は、材料（例えば、ヒドロゲル）が、該材料分子の互いの親和性のために分離しない能力であると定義される。凝集力は、ゲル埋植（例えば、本明細書に記載のｉｎ  ｓｉｔｕゲル化ヒドロゲル）の鍵となる特性であり、ゲルの固相及び流体相が無欠性を保つために必要であり、従ってゲルの一体性に必要であると考えられている。本発明との関係において、多糖類ヒドロゲル、特にＨＡ系ヒドロゲルの凝集力は、Ｇａｖａｒｄ−Ｓｕｎｄａｒａｍ凝集力基準（Cohesivity Scale）（Ｓｕｎｄａｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．１３６：６７８−６８６，２０１５）を使用して測定することができる。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語「自発的」、「自発的に」は、第１の多糖類誘導体の求核基及び第２の多糖類誘導体の求電子基が、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で共有結合を形成する、すなわち、患者体内の標的部位に混注した後、熱又は紫外線のようないずれの外的刺激（「トリガ」とも称される。）がなくても、標的部位において架橋多糖類ヒドロゲルがｉｎ  ｓｉｔｕ形成されるという事実を指すことを意図している。
【００３６】
本発明において、ｉｎ  ｓｉｔｕ（又はｉｎ  ｖｉｖｏ）形成ヒドロゲルは、概して軟部組織充填剤に好適であり、軟部組織充填剤として使用され、かつ／又は軟部組織充填剤として機能する。本明細書で使用する場合、用語「軟部組織充填剤」は、概して軟部組織が不足している領域にボリュームを付加するよう設計された材料を指す。これは、例えば、軟部組織を増大、充填、又は置換することを含む。本明細書において、用語「軟部組織」は、概して、体のその他の構造及び器官を、結合し、支持し、又は取り囲む組織に関する。軟部組織としては、例えば、筋肉、腱（筋肉を骨に結合する線維帯）、線維組織、脂肪、血管、神経、及び滑膜組織（関節周囲の組織）が挙げられる。本発明との関係において、軟部組織充填剤は、好ましくは皮膚充填剤である。
【００３７】
本明細書で使用する場合、用語「誘導体」は、好ましくは求核基又は求電子基により官能化され、患者体内の投与部位における架橋多糖類ヒドロゲルのｉｎ  ｓｉｔｕ（又はｉｎ  ｖｉｖｏ）形成の目的に好適である多糖類を指す。好ましくは、本発明の官能化多糖類誘導体は、求核基又は求電子基以外の、その他の化学修飾を含まない。
【００３８】
第１及び第２の多糖類誘導体は、通常両方とも滅菌されている。本明細書で使用する場合、用語「滅菌されている」又は「無菌性」は、加熱滅菌、特に湿熱滅菌（例えば、蒸気滅菌）を、更に好ましくは、高圧蒸気滅菌を指すことを意図している。高圧蒸気滅菌は、温度１２０℃〜１３２℃で０．３分間〜２０分間、又は温度１２１℃〜１３０℃で０．５分間〜１０分間、例えば、温度１２１℃で０．５分間〜２分間実施され得る。
【００３９】
第１の多糖類誘導体は、好ましくは、第１の無菌性前駆体溶液の形態で存在し、第２の多糖類誘導体は、好ましくは、第２の無菌性前駆体溶液の形態で存在する。
【００４０】
第１及び第２の無菌性前駆体溶液は、典型的には、１Ｈｚ及び２５℃における振動レオロジー測定による測定で、０．００１Ｐａ・ｓ〜５．０Ｐａ・ｓ、特に０．００５Ｐａ・ｓ〜３．０Ｐａ・ｓ、好ましくは０．００１Ｐａ・ｓ〜１．０Ｐａ・ｓ、より好ましくは０．００１Ｐａ・ｓ〜０．１Ｐａ・ｓの低複素粘度を有する。更に、第１及び第２の前駆体溶液は、両方とも、標準的な１．０ｍＬのガラスシリンジ（ＢＤ  Ｈｙｐａｋ  ＳＣＦ、１ｍＬの長さのＲＦ−ＰＲＴＣ、ＩＳＯ１１０４０、内径６．３５ｍｍ）を使用し、押出速度約０．２１ｍｍ／秒で３０Ｇの針（ＴＳＫ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を通過させた測定で、０．０１Ｎ〜１５Ｎ、好ましくは０．１Ｎ〜１０Ｎ、より好ましくは０．５Ｎ〜７．５Ｎ、最も好ましくは０．０１Ｎ〜５０Ｎ又は１．０Ｎ〜５．０Ｎである、低い押出力を特徴とし得る。
【００４１】
本発明によれば、第１及び第２の多糖類誘導体は混注の過程で混合され、第１及び第２の多糖類誘導体混合物を含む液体のｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性組成物を形成する。通常、第１の多糖類誘導体及び第２の多糖類誘導体の両方は、別々の第１の前駆体溶液及び第２の前駆体溶液として、それぞれ存在している。これらの２種の前駆体溶液を注入中に混合（又は「混注」）することにより、最終的に針から射出され体内に埋植される液体のｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性組成物が得られる。
【００４２】
液体のｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性組成物は、上記の通り測定するとき、好ましくは０．１Ｐａ・ｓ〜１００Ｐａ・ｓ又は０．１Ｐａ・ｓ〜７５Ｐａ・ｓ又は１．０Ｐａ・ｓ〜７５Ｐａ・ｓ、より好ましくは１Ｐａ・ｓ〜５０Ｐａ・ｓ又は５Ｐａ・ｓ〜５０Ｐａ・ｓの複素粘度を有する。更に、組成物の注入力は、上記の通り測定するとき、好ましくは０．０１Ｎ〜２０Ｎ又は０．０１〜１０Ｎ、より好ましくは０．１Ｎ〜１０Ｎ、また、最も好ましくは１．０Ｎ〜５．０Ｎである。
【００４３】
混合及び注入（又は「混注」）は、本明細書にて以下に記載するダブルバレルシリンジ又はその他の好適なシリンジシステムを使用して実施することができる。ダブルバレルシリンジ又はその他の好適なシリンジシステムの内部において、第１及び第２の多糖類誘導体は、物理的に隔離された後、同時に押し出され、これに付随して混合され、混合された第１及び第２の多糖類誘導体が針（カニューレ）を通して患者体内に混注される。従って、混注は、第１及び第２の多糖類誘導体が体内の標的部位において沈着するより前の、先行的な架橋を回避する程度に迅速でなければならない。一方、ゲル化時間は、混注した材料が周辺組織へと散在してしまうことを回避するために、適度に短くなければならない。
【００４４】
第１の前駆体溶液中に存在する第１の多糖類誘導体の量は、０．１重量％〜５．０重量％、好ましくは０．５重量％〜４．０重量％、より好ましくは１．０重量％〜３．０重量％、また、最も好ましくは１．５重量％〜２．５重量％であり得、第２の前駆体溶液中に存在する第２の多糖類誘導体の量は、０．１重量％〜５．０重量％、好ましくは０．５重量％〜４．０重量％、より好ましくは１．０重量％〜３．０重量％、最も好ましくは１．５重量％〜２．５重量％であり得る。更に、混注した第１及び第２の多糖類誘導体の重量比は、好ましくは１５：８５〜８５：１５、より好ましくは３０：７０〜７０：３０、また、最も好ましくは４０：６０〜６０：４０、又は５０：５０（第１の誘導体対第２の誘導体の比）である。
【００４５】
更に、第１及び／又は第２の前駆体溶液は、幹細胞及び脂肪細胞を含む細胞、脂肪、脂質、成長因子、サイトカイン、薬物、並びに生物活性物質等の更なる物質を含み得る。より具体的には、第１及び／又は第２の前駆体溶液は、局所麻酔薬、多価アルコール、ビタミン、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩、金属、抗酸化剤、アミノ酸、並びにセラミック粒子を含み得る。
【００４６】
本発明との関係において、局所麻酔薬の添加は、注入時の痛みを和らげる能力を考慮すると、特に望ましい。代表的な局所麻酔薬としては、アンブカイン、アモラノン、アミロカイン、ベノキシネート、ベンゾカイン、ベトキシカイン、ビフェナミン、ブピバカイン、ブタカイン、ブタンベン、ブタニリカイン、ブテタミン、ブトキシカイン、カルチカイン、クロロプロカイン、コカエチレン、コカイン、シクロメチカイン、ジブカイン、ジメチソキン、ジメトカイン、ジペロドン、ジシクロミン、エクゴニジン、エクゴニン、エチルクロライド、エチドカイン、β−ユーカイン、ユープロシン、フェナルコミン（fenalcomine）、ホルモカイン（formocaine）、ヘキシルカイン、ヒドロキシテトラカイン、イソブチルｐ−アミノベンゾエート、ロイシノカインメシレート、レボキサドロール、リドカイン、メピバカイン、メプリルカイン、メタブトキシカイン、メチルクロライド、ミルテカイン、ネパイン、オクトカイン（octocaine）、オルトカイン、オキセサゼイン、パレトキシカイン、フェナカイン、フェノール、ピペロカイン、ピリドカイン、ポリドカノール、プラモキシン、プリロカイン、プロカイン、プロパノカイン、プロパラカイン、プロピポカイン、プロポキシカイン、プソイドコカイン、ピロカイン、ロピバカイン、サリチルアルコール、テトラカイン、トリカイン、トリメカイン、ゾラミン、及びこれらの塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
好ましくは、麻酔剤は、リドカインＨＣｌの形態等のリドカインである。第１及び／又は第２の前駆体溶液は、例えば、０．０５重量％〜８．０重量％、０．１重量％〜４．０重量％、０．２重量％〜３．０重量％、０．３重量％〜２．０重量％、又は０．４重量％〜１．０重量％のリドカイン濃度を有し得る。
【００４８】
本明細書での使用に好適なポリオールとしては、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、プロピレングリコール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、及びラクチトールが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書での使用に特に好適なポリオールは、マンニトール及びグリセロールである。更に、ポリオールは、好ましくはグリコールで、任意に、前述のポリオール化合物のうちの１種以上、特にマンニトールと組み合わされる。好適なビタミンとしては、ビタミンＣ、ビタミンＥ及びビタミンＢ群、すなわちビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ９及びＢ１２のうちの１種以上が挙げられる。ビタミンが存在することで、細胞代謝を刺激し、維持し得、それにより、コラーゲン産生を促進し得る。本明細書での使用に特に好ましいものは、ビタミンＣ、ビタミンＥ及びビタミンＢ６である。軟部組織充填剤組成物での使用に好ましい塩は、亜鉛塩である。セラミック粒子は、好ましくはヒドロキシアパタイト粒子、例えば、カルシウムヒドロキシルアパタイト（ＣａＨＡ）粒子である。
【００４９】
本発明において、求電子基は好ましくはアルデヒド部分であり、求核基はアミノ、アミノオキシ、カルバゼート又はヒドラジド部分から選択され得、更に好ましくはヒドラジド部分である。本明細書で使用する場合、用語「アルデヒド部分」は、アルデヒド官能基（すなわち−ＣＨＯが「ホルミル」）又はペンダント−ＣＨＯ官能基、特にアルデヒド（すなわち−ＣＨＯ）末端基（例えば、末端−ＣＨＯ基を有する、直鎖状又は分岐鎖状Ｃ１〜Ｃ６アルキル基又はアルケニル基）を有する、任意の基又は残基を含む。
【００５０】
本発明にて使用するアルデヒド官能化多糖類誘導体は、無欠の、繰り返しの多糖類の環を有することが好ましい。これは、アルデヒド官能化多糖類誘導体が、多糖類内に、糖類単位のいかなる酸化開環（「直鎖状化」糖類単位とも称される）も有さないことを意味する。従って、この好ましい実施形態に従い、多糖類の繰り返しの糖類単位の開環をもたらさないこと限り、アルデヒド官能化多糖類誘導体を調製するための任意の方法が、本明細書に用いるのに好適である。従って、パーアイオデート（例えば、ＮａＩＯ４）を使用してモノマー糖類単位内の隣接ジオールの酸化によってアルデヒド基を多糖類に導入するために従来技術でよく使用されていた方法は、使用しないのが好ましく、本発明から除外するのが好ましい。
【００５１】
本明細書で使用する場合、用語「ヒドラジド部分」は、通常炭素原子の総数が１５、１０、５、４、３又は２個以下である、ヒドラジド官能基及びヒドラジド末端基又は残基を含む。ヒドラジド部分は、好ましくはヒドラジド（すなわち、［多糖類］−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２）又はジヒドラジド部分、特に一般式
［多糖類］−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｒ１−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
［式中、Ｒ１は、共有結合、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ２、（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ２であり、Ｒ２は、直鎖状又は分岐鎖状Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５若しくはＣ６アルキル基又はアルケニル基である］のジヒドラジド部分である。特に本明細書にて使用するのに好ましいのは、カルボジヒドラジド（ＣＤＨ）である。ＣＤＨがヒドラジド部分として使用され、多糖類のカルボキシル基と結合すると、得られた修飾多糖類は、以下のペンダントヒドラジド末端部分、すなわち、多糖類−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ［式中、ＲはＮＨ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２である。］を有する。
【００５２】
第１及び第２の多糖類誘導体の多糖類は、天然多糖類及び半合成多糖類から選択され得る。好適なカルボキシル多糖類の具体例としては、カルボキシル化セルロース及びカルボキシル化セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース）、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルスターチ、アルギネート、ヒアルロン酸、ペクチン、キチン、コンドロイチンサルフェート、デルマタンサルフェート、ヘパリン、ヘパリンサルフェート、ヘパロサン等が挙げられる。
【００５３】
第１の多糖類誘導体は、ヒアルロン酸、アルギネート、ヘパロサン、ヘパリン又はヘパリンサルフェートをベースとするものが好ましく、第２の官能化多糖類は、ヒアルロン酸、セルロース、キトサン、キチン又はヘパロサンをベースとするものが好ましい。特に好ましくは、第１の多糖類誘導体及び第２の多糖類誘導体の両方が、ヒアルロン酸をベースとする、あるいは、ヘパロサンをベースとすることである。又は、第１の多糖類誘導体がヘパロサンをベースとし、第２の多糖類誘導体がヒアルロン酸をベースとすることである。又は、第１の多糖類誘導体がヒアルロン酸をベースとし、第２の多糖類誘導体がヘパロサンをベースとすることである。
【００５４】
本発明の好ましい態様によれば、第１の多糖類誘導体は（第１の）ヒドラジド官能化ヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体であり、第２の多糖類誘導体は、（第２の）アルデヒド官能化ヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体である。ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋が形成されると、ヒドラジド官能化ＨＡ誘導体及びアルデヒド官能化ＨＡ誘導体はヒドラゾン架橋ヒアルロン酸（ＨＡ）ヒドロゲルを形成する。
【００５５】
上に示した第１及び第２の「多糖類」誘導体の使用に関する全ての定義、説明、及び記載は、特に指示しない限り、第１及び第２のヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体にもまた当てはまる。更に、ヒアルロン酸又はＨＡへのあらゆる特定の言及は、ヘパロサンもまた含み得る。換言すれば、本願を通して、用語「ヒアルロン酸」又は「ＨＡ」は、「ヘパロサン」を含み得る、又は、「ヘパロサン」に置き換えられ得る。
【００５６】
ヒドラジド官能化ヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体のヒドラジド部分及びアルデヒド官能化ヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体のアルデヒド部分は、好ましくは本明細書で上に定義したものである。従って、ヒドラジド部分は好ましくはヒドラジド基若しくはジヒドラジド基又は残基、特に上に定義した、カルボジヒドラジド（ＣＤＨ）である。好ましくは、第１のＨＡ誘導体は、ＨＡの糖類単位のカルボキシル基が、ヒドラジド部分によって官能化されている。
【００５７】
カルボキシル基の修飾は、当該技術分野において既知である、水溶性のカップリング試薬を使用する任意の方法によって実施され得る。例えば、好適な方法は標準的なカルボジイミドケミストリーの使用を伴い、例えば、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）をカップリング試薬として使用し、ヒドラジド末端部分をカルボキシル基でカップリングし、対応するＨＡアシルヒドラジドを形成する（例えば、国際公開第９５／１５１６８号を参照）。その他の使用可能なカップリング試薬は、ＤＭＴＭＭ（４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−ｙｌ）−４−メチルモルホリニウムクロライド、例えば、国際公開第２０１６／０９７２１１号を参照）等のトリアジン化合物、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート等の活性エステル、及びテトラメチルアミニウム塩（例えば、ＨＡＴＵ）である。
【００５８】
第２のＨＡ誘導体は、好ましくは、繰り返しの糖類の環を壊すことなく、例えば、ＨＡ骨格を直鎖状化することなく、アルデヒド部分によって官能化されている。このような直鎖状化糖類単位は、例えば、ＨＡの糖類単位の繰り返しの環状構造中へのアルデヒド基の導入をもたらす古典的なパーアイオデート酸化によって生成し、従って、並行して、ＨＡ骨格を壊し、「直鎖状化」を来す。更なる詳細については、上記の対応する説明を参照されたい。なお、上記の説明は、本箇所についても同じように当てはまる。
【００５９】
好ましくは、第２のＨＡ誘導体は、−ＣＨ２ＯＨ基の−ＣＨＯ基への変換により製造され、特にアルデヒド官能化ＨＡ誘導体は、好ましくは、ＨＡのＮ−アセチルグルコサミン単位のＣ６にあるヒドロキシル基が酸化され、ホルミル（−ＣＨＯ）官能基となるように修飾されている。後の修飾に好適な方法は、例えば、国際公開第２０１１／０６９４７５号に記載されており、それによれば、ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ）を酸化剤として使用し、一級アルコール基をアルデヒドに変換している。
【００６０】
患者体内に導入される液体ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性ＨＡ組成物、すなわち、２種の前駆体溶液の混合物は、好ましくは総量０．１重量％〜５．０重量％のヒドラジド及びアルデヒド官能化ＨＡ誘導体を含有し、及び／又はヒドラジド官能化ＨＡ誘導体対アルデヒド官能化ＨＡ誘導体の重量比は、好ましくは１５：８５〜８５：１５の範囲内である。該総量及び該重量比の好ましい範囲については、多糖類に関する、上に提示したコメントが参照され、該コメントは、好ましい多糖類としてのヒアルロン酸についても同じように当てはまる。
【００６１】
本発明によれば、液体組成物中に存在するヒドラジド及びアルデヒド官能化ＨＡ誘導体の総量は、好ましくは０．１重量％〜５．０重量％、特に０．５重量％〜４．０重量％、より好ましくは１．０重量％〜３．０重量％、最も好ましくは１．５重量％〜２．５重量％である。更に、ヒドラジド官能化ＨＡ誘導体対アルデヒド官能化ＨＡ誘導体の重量比は、好ましくは１５：８５〜７５：２５、より好ましくは２５：７５〜６０：４０、特に好ましくは４０：６０〜６０：４０であり、最も好ましくは５０：５０である。
【００６２】
ヒドラジド官能化ＨＡ誘導体及びアルデヒド官能化ＨＡ誘導体は、互いに独立して、３．０×１０４〜５．０×１０６Ｄａ、より好ましくは０．１×１０６〜４．０×１０６Ｄａ、また、最も好ましくは０．３×１０６〜３．０×１０６Ｄａ、又は０．５×１０６〜２．０×１０６Ｄａの平均分子量を有するＨＡ出発物質から製造され、又は、該ＨＡ出発物質をベースとする。本明細書で使用する場合、用語「ヒアルロン酸」又は「ＨＡ」は、ヒアルロン酸、ヒアルロネート、及びヒアルロン酸ナトリウム等の任意のヒアルロン酸塩を含む。
【００６３】
第１及び／又は第２の前駆体溶液は非架橋ＨＡを更に含み得、非架橋ＨＡは、優先的に５．０×１０５〜４．０×１０６Ｄａ、好ましくは１．０×１０６Ｄａ〜３．０×１０６Ｄａの分子量を有する。架橋ＨＡ対非架橋ＨＡの重量比は、１：１〜１：０．００１、特に１：０．５〜１：０．００５、又は１：０．１〜１：０．０１であり得る。
【００６４】
ヒドラジド官能化ＨＡ誘導体及びアルデヒド官能化ＨＡ誘導体の修飾の程度は、ヒドラジド部分又はアルデヒド部分の合計対ＨＡ二糖類単位の合計の比として表され、互いに独立して０．１％〜５０％、好ましくは０．５％〜２５％、０．５％〜１５％、又は０．５％〜５．０％の範囲であり得る。修飾の程度は、とりわけ、ＮＭＲ、ＵＶ−ＶＩＳ及びＩＲ等の分光測定及び／又は分光学的分析法、滴定、ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、粘度によって測定可能である。好都合なことに、修飾の程度は、１Ｈ−ＮＭＲによって測定可能である。
【００６５】
本明細書では、多糖類（例えばＨＡ）の「分子量」、「分子質量」、「平均分子量」又は「平均分子質量」を表す全ての数は、単位ダルトン（Ｄａ）で、質量平均モル質量（又は質量平均分子質量）又はＭｗ（ｗは重量で、重量平均分子量（ＷＡＭＷ）とも称される）を示すものと理解する。質量平均モル質量（Ｍｗ）は、以下のように規定される。
Ｍｗ＝ΣｉＮｉＭｉ２／ΣｉＮｉＭｉ
式中、Ｎｉは、分子質量がＭｉである分子の数である。
【００６６】
本明細書では、ＨＡの分子量を測定するために、固有粘度測定（例えば、欧州薬局方７．０−Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ  ｍｏｎｏｇｒａｐｈ  Ｎｏ．１４７２，０１／２０１１）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）（例えば、Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，２００２，１６：１４１−４５による）、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）（例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２００８，１０９：６３−７７０による）及びサイズ排除クロマトグラフィーと組み合わせた多角度レーザー光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ）（例えば、Ｈｏｋｐｕｔｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，２００３，３２：４５０−４５６による）等の各種方法を適用できる。
【００６７】
本発明の枠組みでは、ＨＡポリマーの質量平均モル質量（Ｍｗ）は、好ましくは、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）又はＭａｒｋ−Ｈｏｕｗｉｎｋの式による粘度測定法により測定される。ＧＰＣ技術は、最大数百バールの圧力で、ポリマー溶液を、架橋ポリマー粒子のマトリックス中を強制的に通過させることを伴う。当業者に公知であるように、低分散性標準物質の使用によって保持時間を分子量に関係させることができる。
【００６８】
Ｍａｒｋ−Ｈｏｕｗｉｎｋの式を使用して求めた質量平均モル質量（Ｍｗ）は、粘度平均モル質量又はＭｖと称することもある。Ｍａｒｋ−Ｈｏｕｗｉｎｋの式は、固有粘度（η）と分子量Ｍとの関係を与え、固有粘度のデータからポリマーの分子量を求めることができ、その逆も可能である。本発明との関係において、固有粘度は、好ましくは、欧州薬局方７．０（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ  ｍｏｎｏｇｒａｐｈ  Ｎｏ．１４７２，０１／２０１１）に規定の手順に従って測定される。固有粘度データからＨＡの分子量を計算するため、本明細書では、以下のＭａｒｋ−Ｈｏｕｗｉｎｋの式を使用する。
［η］＝Ｋ×Ｍａ
式中、［η］は固有粘度であり、単位はｍ３／ｋｇである。Ｍは分子量であり、Ｋ＝２．２６×１０−５、かつａ＝０．７９６である。
【００６９】
本発明によれば、美容用途としては、皮膚の皺及び皺線、眉間の皺線、鼻唇溝、頤の皺、マリオネットライン、下顎の輪郭、頬側交連、口周囲の皺、目尻の皺、皮膚陥凹み、傷痕、こめかみ、額の真皮支持、頬骨及び頬脂肪体、涙溝、鼻、唇、頬、頤、口周囲部、眼窩下部、及び顔面非対称の処置を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００７０】
本発明が対象としている治療用途としては、腹圧性尿失禁、膣の乾燥、膀胱尿管逆流、声帯不全、及び声帯内方移動の処置が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
更なる態様では、本発明は、本明細書で規定される第１のヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体及び第２のヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体の組み合わせに関し、第１のＨＡ誘導体はヒドラジド部分によって官能化されており、第２のＨＡ誘導体はアルデヒド部分によって官能化されており、該ヒドラジン部分及び該アルデヒド部分は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下において、共有結合をｉｎ  ｓｉｔｕ形成可能である。
【００７２】
好ましくは、第１のヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体は、第１の前駆体溶液の形態であり、第２のヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体は、第２の前駆体溶液の形態である。
【００７３】
ヒドラジド官能化ＨＡ誘導体、アルデヒド官能化ＨＡ、第１及び第２の無菌性前駆体溶液、並びにヒドラゾン架橋ヒアルロン酸（ＨＡ）ヒドロゲルのｉｎ  ｓｉｔｕ形成については、本明細書に上記定義した通りに、更に定義され得る。
【００７４】
更なる態様では、本発明は架橋多糖類ヒドロゲルのｉｎ  ｓｉｔｕ形成用のマルチバレルシリンジシステムに関し、マルチバレルシリンジは、少なくとも、（ａ）本明細書に記載の求核基により官能化された第１の多糖類誘導体の第１の前駆体溶液が一方のバレルに、及び（ｂ）本明細書に記載の求電子基により官能化された第２の多糖類誘導体の第２の前駆体溶液がもう一方の（すなわち別の）バレルに、予め充填されている。第１及び第２の両前駆体溶液は、上記の通り、無菌性である。
【００７５】
具体的には、本発明はマルチバレルシリンジシステム、好ましくは、ダブルバレル又はトリプルバレルシステムに関し、該シリンジシステムは、少なくとも、（ａ）本明細書で規定される求核基により官能化された第１の多糖類誘導体の第１の（無菌性）前駆体溶液が一方のバレルに、及び（ｂ）本明細書で規定される求電子基により官能化された第２の多糖類誘導体の第２の（無菌性）前駆体溶液がもう一方の（別の）バレルに、更に任意に、追加の成分（例えば、脂肪、脂肪酸、幹細胞、ビタミン、ポリオール、無機塩、リドカイン等の麻酔薬、抗酸化剤、アミノ酸、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩）の溶液が任意に存在する第３のバレルに、予め充填されている。好ましくは、シリンジシステムは、（ａ）本明細書で規定される第１の前駆体溶液及び（ｂ）本明細書で規定される第２の前駆体溶液が他方のバレルに予め充填されたダブルバレルシリンジシステムである。
【００７６】
第１及び第２の多糖類誘導体、求核基及び求電子基、第１及び第２の無菌性前駆体溶液、並びにｉｎ  ｓｉｔｕ形成された架橋多糖類ヒドロゲルは、本明細書に上記定義した通りに、更に定義され得る。更に、ダブルバレルシリンジシステムを含むマルチバレルシリンジシステムは、美容又は治療用途における使用、特に、本明細書で規定される美容又は治療用途目的で、生物組織を置換若しくは充填する、又は生物組織のボリュームを増大させるのに好適であり、又は、エステティック用の使用において皮膚充填剤として使用することが特に好ましい。
【００７７】
本明細書で使用する場合、用語「マルチバレルシステム」は、少なくとも２個の別々のバレルを備え、かつ２個以上のプランジャを有し得る任意のシステム又はデバイス、通常はシリンジを意味することを意図する。本明細書で使用する場合、用語「ダブルバレルシリンジシステム」は、２個の別々のバレルを備え、かつ１個又は２個のプランジャを有し得る任意のシステム又はデバイス、通常はシリンジを意味することを意図する。加えて、マルチバレル、例えばダブルバレルのシリンジシステムは、概して、先端キャップ、又はシリンジシステムの末端（複数可）のを密封のための針シールドを有する、若しくは有しない、針又はカニューレを備える。バレルは、概して、十分な第１及び第２の前駆体溶液を含むための貯蔵容量を有する。バレルは、ガラス、プラスチック又は任意のその他の好適な材料で製造することができ、様々な形状、内径、材料組成、清澄度等を有し得る。更に、マルチバレルシリンジシステムは、一体に連結された２個のシリンジを有するシリンジ、すなわち、一体に連結された２個のバレルと、これらのバレルから内容物を投与するための１個又は２個のプランジャアセンブリとの形態の、ダブルバレルシリンジシステムであってもよい。また、シリンジシステムは、２個の、取り外し可能に連結されたバレル及び２個又は１個の取り外し可能に連結されたプランジャを含み得る。
【００７８】
更に、シリンジシステムは、バレルに含まれる成分を十分に混合後、アプリケータチップから投与するように構成された、（手段例えば、アプリケータチップ）も含み得る。従って、バレルは、概して連結され、プランジャアセンブリは、概して、バレルからの内容物を同時に投与するように構成され、それにより、前駆体溶液の適切な混合比が保たれる。
【００７９】
好ましくは、ダブルバレルシリンジシステムを含むマルチバレルシリンジシステムは、ヒドラゾン架橋ヒアルロン酸（ＨＡ）ヒドロゲルのｉｎ  ｓｉｔｕ形成用であり、ダブルバレルシリンジは、（ａ）ヒドラジド官能化ヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体の第１の前駆体溶液が一方のバレルに、及び（ｂ）アルデヒド官能化ＨＡ誘導体の第２の前駆体溶液がもう一方の別のバレルに、予め充填されている。ヒドラジド官能化ＨＡ誘導体、アルデヒド官能化ＨＡ誘導体、第１及び第２の無菌性前駆体溶液について、並びにヒドラゾン架橋ヒアルロン酸（ＨＡ）ヒドロゲルのｉｎ  ｓｉｔｕ形成については、好ましくは本明細書に上記定義した通りである。
【００８０】
更に別の態様では、本発明は、（ｉ）求核基により官能化された、本明細書で規定される第１の多糖類誘導体の第１の無菌性前駆体溶液が入っている第１の容器と、（ｉｉ）求電子基により官能化された、本明細書で規定される第２の多糖類誘導体の第２の無菌性前駆体溶液が入っている第２の容器と、任意に、（ｉｉｉ）使用説明書と、を備える、架橋多糖類ヒドロゲルをｉｎ  ｓｉｔｕ形成させるためのキットに関する。
【００８１】
第１及び第２の多糖類誘導体、求核基及び求電子基、第１及び第２の無菌性前駆体溶液、並びにｉｎ  ｓｉｔｕ形成された架橋多糖類ヒドロゲルは、本明細書に上記定義した通りに、更に定義され得る。本明細書で使用する場合、用語「容器」は特に限定されず、例えば、ガラス若しくはプラスチックボトル、バイアル、カープル、又はその他の任意の密封容器を含む。
【００８２】
「使用説明書」は、好ましくは美容又は治療用途、特に、本明細書で規定される美容又は治療用途目的で、生物組織を置換若しくは充填する、又は生物組織のボリュームを増大させるための使用説明書であり、又は、特に好ましくは、エステティック用の使用における皮膚充填剤としての使用説明書である。
【００８３】
好ましくは、キットはヒドラゾン架橋ヒアルロン酸（ＨＡ）ヒドロゲルのｉｎ  ｓｉｔｕ形成用であり、（ｉ）ヒドラジド官能化ＨＡ誘導体の第１の無菌性前駆体溶液が入っている第１の容器と、（ｉｉ）アルデヒド官能化ＨＡの第２の無菌性前駆体溶液が入っている第２の容器と、任意に、（ｉｉｉ）使用説明書と、を備える。ヒドラジド官能化ＨＡ誘導体、アルデヒド官能化ＨＡ誘導体、第１及び第２の無菌性前駆体溶液について、並びにヒドラゾン架橋ヒアルロン酸（ＨＡ）ヒドロゲルのｉｎ  ｓｉｔｕ形成については、本明細書に上記定義した通りに、特に本発明の第１の態様に関して定義した通りに、更に定義され得る。任意に、キットには、マルチバレルシリンジシステムに関連して述べた追加の成分を含む第３の無菌性溶液が入っていてもよい。
【００８４】
更に別の態様では、本発明は、美容又は治療用途において、架橋ヒドロゲルを。ｉｎ  ｓｉｔｕ形成させる方法であって、該方法が、
（ａ）第１の多糖類誘導体の第１の前駆体溶液と、これとは別に、第２の多糖類誘導体の第２の前駆体溶液と、を準備する工程であって、第１の多糖類誘導体を求核基により官能化し、第２の多糖類誘導体を求電子基により官能化し、並びに第１及び第２の両前駆体溶液を滅菌する工程と、
（ｂ）第１の前駆体溶液及び第２の前駆体溶液を混合することで、ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性混合溶液とする工程と、
（ｃ）混合溶液を患者体内の標的部位に注入する工程であって、第１の多糖類誘導体の求核基及び第２の多糖類誘導体の求電子基を、共有結合をｉｎ  ｓｉｔｕ形成させることにより、標的部位において架橋ヒドロゲルを形成させる工程と、を含む。方法を提供する。
【００８５】
混合及び注入は、本明細書で規定されるシリンジシステムを使用して実施可能であり、通常は、針（カニューレ）から投与する前に、両成分（すなわち、第１及び第２の前駆体組成物）を好ましくは均質な物理的混合物とすることが可能となる。本明細書で使用する場合、用語「均質な」は、混合物、分散体又は溶液全体にわたる均等な混合、分散又は希釈を意味し、全体にわたり均等な構造及び／又は組成の材料を指す。
【００８６】
本発明を、ここで以下の非限定的な実施例により、更に例証する。
【実施例】
【００８７】
以下に示す実施例では、ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性ヒアルロン酸（ＨＡ）ヒドロゲルの調製を説明し、動物試験で、ヒドロゲルが様々な美容及び治療用途に対して有望な充填剤材料であることを示す。加えて、実施例では、ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性ＨＡ組成物が、過度の力を加えずに容易に細針から注入できる一方で、依然として生物組織を増大させるために、望ましい機械的及びレオロジー特性（すなわち、複素粘度（η＊）、貯蔵弾性率（Ｇ’）、損失弾性率（Ｇ’’）、及び損失正接（ｔａｎδ））をもたらすことを実証する。
【００８８】
押出力の測定
押出力（注入力）を、１．０ｍＬのガラスシリンジ（ＢＤ  Ｈｙｐａｋ  ＳＣＦ、１ｍＬの長さのＲＦ−ＰＲＴＣ、ＩＳＯ１１０４０，内径６．３５ｍｍ）及び３０Ｇの針（ＴＳＫ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を装着した、テクスチャーアナライザ（ＴＡ．ＸＴ  Ｐｌｕｓ、Ｔｅｘｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒｐ．）によって測定した。押出力を、距離２５ｍｍにわたって、試験速度０．２１ｍｍ／秒を使用して測定した（ターゲットモード：距離、力：１００．０ｇ）。試験前及び試験後の速度を、それぞれ０．２１ｍｍ／秒及び１０．０ｍｍ／秒とした。トリガとなる力を、２．０ｇ（トリガタイプ：自動（力））で、歪みは１０．０％とした。プラトーに到達した後の平均の力を押出力とした。
複素粘度（η＊）並びに貯蔵及び損失弾性率（Ｇ’及びＧ’’）の測定
複素粘度（η＊）並びに貯蔵及び損失弾性率（Ｇ’及びＧ’’）を、コーンプレート形状（径５０ｍｍ、角度０．１°、ＣＰ５０−１、ギャップ寸法０．１ｍｍ）を装着したレオメータ（Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ  Ｐｈｙｓｉｃａ  ＭＣＲ３０２Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ、Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ  ＧｍｂＨ）を使用して２５℃で測定した。試料を１Ｐａの応力で振動させ、発振周波数を０．１〜１０Ｈｚで変化させた。
【００８９】
以下の実施例では、用語「当量（equivalent）」又は「当量（eq）」は、別段の記載がない場合は、本明細書で使用するように、ヒアルロン酸二糖類繰り返し単位を指す。別段の記載がない場合は、百分率は重量％である。
【００９０】
実施例１
ＨＡアルデヒド誘導体（ＨＡ−Ａｌｄ）の合成
国際公開第２０１１／０６９４７５号に記載の方法に従って（例えば、実施例１を参照）、アルデヒド官能化ＨＡ誘導体を、ＨＡのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）単位の一級Ｃ６ヒドロキシル基を選択的に酸化することによって調製した。つまり、ＴＥＭＰＯ／共酸化剤系（ＴＥＭＰＯ、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ）を使用して、ヒアルロン酸（ＨＡ）（Ｍｗ＝１．０×１０６Ｄａ）を酸化した。透析後、溶液を凍結乾燥し、アルデヒド官能化ＨＡ（以下、「ＨＡ−Ａｌｄ」と称する）を得た。
【００９１】
実施例２
ＨＡヒドラジド誘導体（ＨＡ−Ａｌｄ）の合成
ＨＡ（６０００．０ｍｇ、１４．９ｍｍｏｌの二糖類繰り返し単位）を、室温で１２時間をかけて、７００．０ｍＬの脱イオン水中に溶解させた。ＨＯＢｔ（２２８９．３ｍｇ、１４．９ｍｍｏｌ）を添加した後、固体ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１４２８．９ｍｇ、７．８４ｍｍｏｌ）を添加した。ｐＨを５．５〜６．５に調整し、溶液を１時間攪拌した。次に、カルボヒドラジド（ＣＤＨ；４０４３．５ｍｇ、４４．８８ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１０時間、攪拌を続けた。
【００９２】
続いて溶液を５．０Ｌのイソプロパノール中に沈殿させ、沈殿物を収集し、生理食塩水に溶解させ、透析袋（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｒｏ−６、ＭＷＣＯ  ３５００）に充填した。沈殿物を０．１ＭのＮａＣｌを含む蒸留水で透析した（２×２Ｌ、４８時間）後、生理食塩水で透析した（２×２Ｌ、２４時間）。最後に、溶液を凍結乾燥し、５０００ｍｇ〜５５００ｍｇのＨＡヒドラジド誘導体（以下、「ＨＡ−Ｈｙｄ」と称する）を得た。
【００９３】
実施例３
ＨＡヒドロゲルの形成及び特性測定
ＨＡヒドロゲルを、蒸気滅菌（１３１℃、０．７分）した実施例１のＨＡアルデヒド誘導体（「ＨＡ−Ａｌｄ」）、及び蒸気滅菌（１３１℃、０．７分）した実施例２のＨＡヒドラジン誘導体（「ＨＡ−Ｈｙｄ」）の、室温（約２５℃）での同量混合により、調製した。ＨＡ−Ａｌｄ及びＨＡ−Ｈｙｄ誘導体を、別々にｐＨ６．５〜７．５の、無菌性ＰＢＳに溶解し、それぞれ１５ｍｇ／ｍＬ及び２４．５ｍｇ／ｍＬの濃度とした。続いて、１．０ｍＬの、ＨＡ−Ａｌｄ及びＨＡ−Ｈｙｄ前駆体溶液の各々（１５ｍｇ／ｍＬ及び２４．５ｍｇ／ｍＬの濃度のそれぞれに対して別々に）を、体積比１：１で、１ｍＬのルアーロックシリンジに充填した。使用した２個のシリンジの各々を、その各先端においてＹ字コネクタに連結し、２種の前駆体溶液を、針からの押し出しと同時に、効果的に混合可能とした。
【００９４】
測定された、無菌性前駆体溶液及び無菌性前駆体溶液の混合物の平均押出力及びレオロジー特性（η＊、Ｇ’、Ｇ’’及びｔａｎ（δ））を表１に示す。
【表１】
2018530547.tif 000003
【００９５】
表１から分かるように、ＨＡ−Ｈｙｄ前駆体溶液及びＨＡ−Ａｌｄ前駆体溶液の両方の押出力及び複素粘度は非常に低く、前駆体溶液が液体（非ゲル）状態であることを示している。更に、２種の前駆体溶液の混合物は、わずか約５Ｎの押出力であることが見出された。これは概ね、別々のシリンジから３０Ｇの細針を通って押出された直後の、各前駆体溶液（１５ｍｇ／ｍＬ）の合計である。従って、混合前駆体溶液の注入は、予め形成されたヒドロゲルの形態の皮膚充填剤組成物に比べて、はるかに容易である。
【００９６】
表１に示すように、それぞれ１５ｍｇ／ｍＬ及び２４．５ｍｇ／ｍＬの前駆体溶液から、ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋ＨＡヒドロゲルをペトリ皿上で調製した。最終的なゲル状態を得るための、適切かつ十分な架橋の持続時間を、レオロジーから、約３０分であると特定した。このように、ヒドロゲルのレオロジー特性（η＊、Ｇ’、Ｇ’’及びｔａｎ（δ））を、２種の前駆体溶液を混合した３０分後に、上記のＡｎｔｏｎ  Ｐａａｒレオメータを使用して評価した。結果を表２に示す。
【表２】
2018530547.tif 000004
【００９７】
表２に示すように、ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性ヒドロゲルは、予め形成された後に患者に注入される他の市販の充填剤に匹敵するレオロジー特性を呈する。加えて、試験したｉｎ  ｓｉｔｕ架橋性ヒドロゲルは、両方ともＧａｖａｒｄ−Ｓｕｎｄａｒａｍの凝集力基準で３以上のスコアにより示されるように、凝集性である。
【００９８】
実施例４
概念実証を確証するための動物試験
予備的な動物実験
表２に示した２種の処方物を、ウサギにおけるヒドロゲルのｉｎ  ｖｉｖｏ形成に使用した。第１のヒドロゲル（「被験物質１」）を、ＨＡ−Ｈｙｄ前駆体溶液（１５ｍｇ／ｍＬ）及びＨＡ−Ａｌｄ前駆体溶液（１５ｍｇ／ｍＬ）をウサギの皮膚に混注（１：１ｖ／ｖ）して入れた。第２のヒドロゲル（「被験物質２」）を、ＨＡ−Ｈｙｄ前駆体溶液（２４．５ｍｇ／ｍＬ）及びＨＡ−Ａｌｄ前駆体溶液（２４．５ｍｇ／ｍＬ）をウサギの皮膚に混注（体積比１：１）して入れた。
【００９９】
注入深さに応じて、１００μＬ〜１０００μＬの液量を、皮内（ＩＤ）及び皮下（ＳＤ）注射によって、ウサギの異なる皮膚層内に注入し、２種の市販の皮膚充填剤（対照物質１はＢｅｌｏｔｅｒｏ  Ｂａｌａｎｃｅ、対照物質２はＢｅｌｏｔｅｒｏ  Ｖｏｌｕｍｅ）と比較した。ホスフェート緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を陰性対照として使用した。図１及び２に、結果を示す。
【０１００】
図１から分かるように、被験物質１は、皮内注射後、ＨＡ系充填剤の使用について典型的に見られるように、真皮内にほぼ台形の塊として現れている。加えて、こちらも見て分かるように、注入のタイプ（すなわち、ボーラス、１つのトンネル及び２つのトンネル状の注入）による形態の違いはもたらされていない。本質的に同一の結果が被験物質２について見られた。更に、追加の試験により、被験物質１及び２を、異なる液量で皮内注射しても、被験物質の分布において、関連性のある違いはもたらされないことが示されている（結果は示していない）。
【０１０１】
図２は、架橋した被験物質２により、ｔ＝４時間でｉｎ  ｖｉｖｏ形成された「隆起」又は「ブレブ」の肉眼写真である。図から分かるように、被験物質２は、注入後、数時間でリフティング効果をもたらす。比較すると、食塩水はその時間内に完全に消失した。同じことが、被験物質１についても観察された。ｉｎ  ｖｉｖｏ架橋後に得られたブレブは、予め形成された市販の充填剤（例えば、Ｂｅｌｏｔｅｒｏ（登録商標）充填剤レンジ（Ｍｅｒｚ  Ａｅｓｔｈｅｔｉｃｓ））と同様のレオロジー特性を有する充填剤を注入した後に得られたブレブと同様である。
【０１０２】
結論として、ウサギの皮膚において、可変量の被験物質１及び２の皮内及び皮下注射により、所望のリフティング効果がもたらされ、いずれの有害な組織病理学的効果も伴わなかった。
【０１０３】
１２週間の動物の追跡試験
１２週間の試験をウサギにおいて実施し、上記の被験物質１の皮内注射（ＩＤ）及び上記の被験物質２の皮下注射（ＳＣ）後の皮膚反応の重症度を測定した。反応を、ＩＤ注射した対照物質１（Ｂｅｌｏｔｅｒｏ  Ｂａｌａｎｃｅ）及びＳＣ注射した対照物質２（Ｂｅｌｏｔｅｒｏ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｌｉｄｏｃａｉｎｅ）と比較した。注入４週間後、部位を肉眼で観察し、組織病理学的に分析し、各物質の皮膚反応を評価した。注入後と、次いで５日間は毎日、その後終了までは毎週、全部位を肉眼で観察した。
【０１０４】
驚くべきことに、２種の被験物質（ｉｎ  ｖｉｖｏでのＨＡ充填剤）は、極小の顆粒及び針状体（spicules）を形成し、これらは、皮膚コラーゲン繊維の間に浸透していた。対照物質（Ｂｅｌｏｔｅｒｏ  Ｂａｌａｎｃｅ及びＢｅｌｏｔｅｒｏ  Ｂａｌａｎｃｅ  Ｌｉｄｏｃａｉｎｅ）は、より大きな顆粒及びくぼみを形成し、これらは真皮内で広い空隙を充填し、皮膚コラーゲンには浸透していなかった。換言すれば、Ｂｅｌｏｔｅｒｏ  Ｂａｌａｎｃｅは、その優れた組織との一体化能力で知られているが（Ｆｌｙｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏ  ａｎｄ  ｂｉｐｈａｓｉｃ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｉｌｌｅｒｓ，Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｕｒｇ．２０１１，３７：６３７−６４３、及びＭｉｃｈｅｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｄｅｒｍａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｆｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆｉｌｌｅｒｓ：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｓｔｕｄｙ，Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｕｒｇ．２０１２，３８：１１６２−１１６９）、ｉｎ  ｖｉｖｏのＨＡ充填剤は、Ｂｅｌｏｔｅｒｏ  Ｂａｌａｎｃｅのように（as Belotero Balance）、実質的により良好な組織への浸透（局所充填に対して完全な組織との一体化）をもたらした。
【０１０５】
要約すれば、１２週間のウサギでの試験は、本発明のｉｎ  ｖｉｖｏのＨＡ充填剤が市販の皮膚充填剤に匹敵すること示した。本試験は更に、ｉｎ  ｖｉｖｏのＨＡ充填剤は、局所充填とは対照的に、完全な組織との一体化をもたらす、改善された組織への浸透性等の特有の特性をもたらすことを示した。これらの結果は、本発明のｉｎ  ｖｉｖｏのＨＡ充填剤が、様々な美容及び治療用途において軟部組織を増大、充填又は置換することに対する可能性を強く示唆している。
【図１】
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【図２】
2018530547.tif 000006
【国際調査報告】
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2018530547.tif 000008
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