(57)【要約】ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）などの免疫調節因子を分泌する免疫隔離同種異系細胞を含む少なくとも１つの回収可能な生体適合性マクロカプセルと、自系腫瘍細胞または感染因子などの抗原成分とを含むワクチン組成物が、本明細書において提供される。ワクチン組成物を含むキットおよび医薬組成物、ならびに腫瘍または感染因子に対する治療的または予防的ワクチン接種のためのそれらの使用方法もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも２０ｎｇ／２４時間のＧＭ−ＣＳＦを分泌する約１×１０５〜約１×１０６個の免疫隔離同種異系細胞を含む少なくとも１つの回収可能な生体適合性マクロカプセル、および
（ｂ）抗原成分
を含むワクチン組成物であって、
前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが、
前記同種異系細胞および内部コイルを含むコアであって、前記同種異系細胞が前記内部コイル上に分布したコア；および
前記コアを取り囲む半透膜であって、それを通したＧＭ−ＣＳＦの拡散を可能にする半透膜
を含む、ワクチン組成物。
【請求項２】
前記半透膜が、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）および熱可塑性ポリウレタンからなる群より選択される材料から構成される、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記内部コイルがアルミニウムまたはチタンから構成される、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記内部コイル上のらせん間の距離が約１ｍｍ±０．１ｍｍである、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが円筒形状を有する、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが長さ約１２ｍｍである、請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが回収チューブをさらに含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記回収チューブがポリウレタンから構成される、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルの前記膜が前記回収チューブに固定されている、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記回収チューブが、埋め込み後に前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルの回収を容易にするための回収フックをさらに含む、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
前記回収フックが、アイレットと、前記回収チューブへの取り付けを容易にするための少なくとも２つのレッグとを含む、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
前記回収フックがステンレス鋼である、請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
紫外線硬化性接着剤を使用して、前記回収フックが前記回収チューブに固定されている、請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
埋め込み後に前記回収フックを固定するために、前記アイレットを通して縫合糸が配置されている、請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
コネクタを用いて、前記回収チューブが前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルの前記膜に固定されている、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
前記コネクタがステンレス鋼である、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
前記膜に挿入される前記コネクタの端部が切頂円錐形状を有する、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが、細胞の装填を容易にするための装填ハブをさらに含む、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
前記装填ハブが切頂円錐端部を有する、請求項１８に記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
前記装填ハブが、前記膜にフリクションフィットされる、請求項１９に記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが、チューブ本体およびチューブキャップを含む輸送チューブ内に含まれる、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
前記チューブ本体および前記チューブキャップが１つまたはそれを超える穴部を含む、請求項２１に記載のワクチン組成物。
【請求項２３】
前記チューブキャップがルアーロックを含み、前記ルアーロックが前記キャップにフリクションフィットされる、請求項２２に記載のワクチン組成物。
【請求項２４】
装填ハブが、前記キャップ内の前記ルアーロックに嵌合係合されている、請求項２３に記載のワクチン組成物。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが約８×１０５個の免疫隔離同種異系細胞を含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項２６】
２つの生体適合性マクロカプセルを含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項２７】
各マクロカプセル内の前記免疫隔離同種異系細胞が、少なくとも１週間にわたって少なくとも２０ｎｇ／２４時間のＧＭ−ＣＳＦを分泌する、請求項２６に記載のワクチン組成物。
【請求項２８】
前記抗原成分が自系腫瘍細胞を含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項２９】
前記腫瘍細胞が放射線照射されている、請求項２８に記載のワクチン組成物。
【請求項３０】
前記抗原成分が約１×１０６〜約１×１０７個の自系腫瘍細胞を含む、請求項２９に記載のワクチン組成物。
【請求項３１】
前記抗原成分が約４×１０６個の自系腫瘍細胞を含む、請求項３０に記載のワクチン組成物。
【請求項３２】
前記抗原成分が感染因子に由来する、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３３】
前記感染因子が、ウイルス、細菌、寄生病原体または真菌に由来する、請求項３２に記載のワクチン組成物。
【請求項３４】
前記抗原成分が、不活性化病原体、感染因子溶解物、タンパク質抽出物、組換えタンパク質、ペプチドまたはＤＮＡである、請求項３３に記載のワクチン組成物。
【請求項３５】
前記ウイルスが、ＨＩＶ、ＣＭＶ、再発性ヘルペス感染、Ｂ型肝炎、エプスタイン・バーウイルス、Ｃ型肝炎およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）からなる群より選択される、請求項３３に記載のワクチン組成物。
【請求項３６】
前記細菌が、マイコバクテリア感染、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉおよび髄膜炎菌感染からなる群より選択される、請求項３３に記載のワクチン組成物。
【請求項３７】
前記寄生病原体が、マラリア、トキソプラズマ、ニューモシスチスおよびエキノコックスからなる群より選択される、請求項３３に記載のワクチン組成物。
【請求項３８】
前記真菌が、カンジダおよびアスペルギルスからなる群より選択される、請求項３３に記載のワクチン組成物。
【請求項３９】
前記免疫隔離同種異系細胞が、少なくとも１つのさらなる免疫調節因子をさらに分泌する、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項４０】
前記少なくとも１つのさらなる免疫調節因子が、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−４、インターフェロンガンマ、ケモカインまたは樹状細胞成長因子、ＩＬ−３、ＩＬ−９、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＦＮγの膜貫通受容体、可溶性または膜性幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＦＬ（Ｆｌｔ３リガンド）、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＬＲ７アゴニスト、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン−３（ＴＩＭ−３）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲファミリー関連遺伝子（ＧＩＴＲ）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）、Ｖｉｓｔａ、Ｂリンパ球およびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４（ＯＸ４０）、ＣＤ４０、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤ２７、インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３９に記載のワクチン組成物。
【請求項４１】
前記マクロカプセルの前記コア内の前記免疫隔離同種異系細胞を取り囲む膜が選択的透過性である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項４２】
前記膜の分子量カットオフ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔ  ｏｆ）（ＭＷＣＯ）が約２８０ｋＤａである、請求項４１に記載のワクチン組成物。
【請求項４３】
前記免疫隔離同種異系細胞が、ＧＭ−ＣＳＦを発現するように遺伝子改変されている、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項４４】
前記遺伝子改変が、プラスミドによるトランスフェクションまたはウイルスによる感染によって達成される、請求項４３に記載のワクチン組成物。
【請求項４５】
前記免疫隔離同種異系細胞がヒト樹立細胞株である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項４６】
前記ヒト樹立細胞株が非接着性細胞株である、請求項４５に記載のワクチン組成物。
【請求項４７】
前記非接着性細胞株が造血起源である、請求項４６に記載のワクチン組成物。
【請求項４８】
前記免疫隔離同種異系細胞が不死性であるか、または不死化されている、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項４９】
前記免疫隔離同種異系細胞が非腫瘍性である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項５０】
前記免疫隔離同種異系細胞が哺乳動物起源である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項５１】
前記免疫隔離同種異系細胞がヒトである、請求項５０に記載のワクチン組成物。
【請求項５２】
前記免疫隔離同種異系細胞が放射線照射されている、請求項５１に記載のワクチン組成物。
【請求項５３】
前記免疫隔離同種異系細胞が、約８０〜約９６０×１０−１５ｇ／２４時間のＧＭ−ＣＳＦを分泌する、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項５４】
前記免疫隔離同種異系細胞が、１０×１０−１５ｇ／２４時間を超えるＧＭ−ＣＳＦを分泌する、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項５５】
前記免疫隔離同種異系細胞が、１００×１０−１５ｇ／２４時間を超えるＧＭ−ＣＳＦを分泌する、請求項５４に記載のワクチン組成物。
【請求項５６】
前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが、５０〜１５０ｎｇ／日のＧＭ−ＣＳＦを分泌する、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項５７】
１つまたはそれを超えるさらなる治療剤をさらに含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項５８】
前記１つまたはそれを超えるさらなる治療剤が免疫チェックポイント調節物質である、請求項５７に記載のワクチン組成物。
【請求項５９】
免疫チェックポイント調節物質が、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質（ＣＴＬＡ−４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、プログラム細胞死タンパク質１リガンド（ＰＤ−Ｌ１）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン−３（ＴＩＭ−３）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲファミリー関連遺伝子（ＧＩＴＲ）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）、Ｖｉｓｔａ、Ｂリンパ球およびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４（ＯＸ４０）、ＣＤ４０、ＣＤ１３７（４１ＢＢとしても公知である）、ＣＤ２７、インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される１つまたはそれを超える免疫調節分子をターゲティングする、請求項５８に記載のワクチン組成物。
【請求項６０】
前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルおよび前記抗原成分が凍結される、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項６１】
使用前に、前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルおよび前記抗原成分が解凍される、請求項６０に記載のワクチン組成物。
【請求項６２】
前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが、以下：
（ｉ）回収チューブ；
（ｉｉ）前記回収チューブに固定された回収フックであって、埋め込み後に前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルの回収を容易にする回収フック；
（ｉｉｉ）前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルの前記膜を前記回収チューブに固定するコネクタ；
（ｉｖ）前記細胞の装填を容易にする装填ハブ；および
（ｖ）チューブ本体およびチューブキャップを含む輸送チューブ
の１つまたはそれよりも多くをさらに含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項６３】
請求項１に記載のワクチン組成物と、生理学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
【請求項６４】
請求項１に記載のワクチン組成物または請求項６３に記載の医薬組成物と、使用説明書とを含む、キット。
【請求項６５】
前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが滅菌される、請求項６４に記載のキット。
【請求項６６】
滅菌後に、前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが滅菌パウチに個別にパッケージングされる、請求項６５に記載のキット。
【請求項６７】
前記抗原成分が、１つまたは複数の抗原を産生または放出する細胞をさらに含む、請求項６４に記載のキット。
【請求項６８】
前記１つまたは複数の抗原を産生または放出する細胞が腫瘍細胞である、請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
前記腫瘍細胞が放射線照射される、請求項６８に記載のキット。
【請求項７０】
前記抗原成分が感染因子から得られる、請求項６４に記載のキット。
【請求項７１】
前記感染因子が、ウイルス、細菌、寄生病原体または真菌に由来する、請求項７０に記載のキット。
【請求項７２】
治療的または予防的ワクチン接種のための、請求項１に記載のワクチン組成物、請求項６３に記載の医薬組成物または請求項６４に記載のキットの使用。
【請求項７３】
前記治療的または予防的ワクチン接種が癌の治療またはワクチン接種である、請求項７２に記載の使用。
【請求項７４】
前記癌が、肺癌、メラノーマ、乳癌、結腸癌、膵臓癌、腎臓癌、急性白血病、慢性白血病、グリア芽細胞腫、低悪性度リンパ腫、高悪性度リンパ腫、多発性骨髄腫、肉腫、骨癌、脳腫瘍、胃癌、食道癌、頭頸部癌、甲状腺癌、膀胱癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮癌、脊索腫および子宮頸癌からなる群より選択される、請求項７３に記載の使用。
【請求項７５】
前記癌が肺癌である、請求項７４に記載の使用。
【請求項７６】
前記癌が膵臓癌腫である、請求項７４に記載の使用。
【請求項７７】
前記癌が卵巣癌腫である、請求項７４に記載の使用。
【請求項７８】
前記癌が頭頸部癌である、請求項７４に記載の使用。
【請求項７９】
前記治療的または予防的ワクチン接種が感染因子の治療またはワクチン接種である、請求項７２に記載の使用。
【請求項８０】
前記感染因子が、ウイルス、細菌、寄生生物および真菌からなる群より選択される、請求項７９に記載の使用。
【請求項８１】
前記ウイルスが、ＨＩＶ、ＣＭＶ、再発性ヘルペス感染、Ｂ型肝炎、エプスタイン・バーウイルス、Ｃ型肝炎およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）からなる群より選択される、請求項８０に記載の使用。
【請求項８２】
前記細菌が、マイコバクテリア感染、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉおよび髄膜炎菌感染からなる群より選択される、請求項８０に記載の使用。
【請求項８３】
前記寄生病原体が、マラリア、トキソプラズマ、ニューモシスチスおよびエキノコックスからなる群より選択される、請求項８０に記載の使用。
【請求項８４】
前記真菌が、カンジダおよびアスペルギルスからなる群より選択される、請求項８０に記載の使用。
【請求項８５】
前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルおよび前記抗原成分が埋め込まれ、続いて、前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが除去される、請求項７２に記載の使用。
【請求項８６】
前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルおよび前記抗原成分が、近接または接触して皮膚下に逐次投与される、請求項８５に記載の使用。
【請求項８７】
前記抗原成分の前に、前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが埋め込まれる、請求項８６に記載の使用。
【請求項８８】
前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが１２日間未満埋め込まれる、請求項８７に記載の使用。
【請求項８９】
前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが４〜１０日間埋め込まれる、請求項８８に記載の使用。
【請求項９０】
前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが５〜７日間埋め込まれる、請求項８９に記載の使用。
【請求項９１】
前記予防的または治療的ワクチン接種が複数回注射を含む、請求項７２に記載の使用。
【請求項９２】
前記複数回注射が規則的な間隔で行われる、請求項９１に記載の使用。
【請求項９３】
前記予防的または治療的ワクチン接種が癌の治療またはワクチン接種を含むとき、前記規則的な間隔が、４週間にわたる週１回の注射とそれに続く２週間ごとの２回の追加免疫化を含む、請求項９２に記載の使用。
【請求項９４】
前記予防的または治療的ワクチン接種が感染因子の治療またはワクチン接種を含むとき、前記規則的な間隔が、少なくとも２週間にわたる週１回の注射を含む、請求項９２に記載の使用。
【請求項９５】
前記複数回注射が皮下注射である、請求項９２に記載の使用。
【請求項９６】
治療的または予防的ワクチン接種のための方法であって、有効量の請求項１に記載のワクチン組成物、請求項６３に記載の医薬組成物または請求項６４に記載のキットをその必要のある患者に投与することを含む、方法。
【請求項９７】
前記治療的または予防的ワクチン接種が癌の治療またはワクチン接種である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記癌が、肺癌、メラノーマ、乳癌、結腸癌、膵臓癌、腎臓癌、急性白血病、慢性白血病、グリア芽細胞腫、低悪性度リンパ腫、高悪性度リンパ腫、多発性骨髄腫、肉腫、骨癌、脳腫瘍、胃癌、食道癌、頭頸部癌、甲状腺癌、膀胱癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮癌、脊索腫および子宮頸癌からなる群より選択される、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記癌が肺癌である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記癌が膵臓癌腫である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記癌が卵巣癌腫である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０２】
前記癌が頭頸部癌である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０３】
前記治療的または予防的ワクチン接種が感染因子の治療またはワクチン接種である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０４】
前記感染因子が、ウイルス、細菌、寄生生物および真菌からなる群より選択される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ウイルスが、ＨＩＶ、ＣＭＶ、再発性ヘルペス感染、Ｂ型肝炎、エプスタイン・バーウイルス、Ｃ型肝炎およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）からなる群より選択される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記細菌が、マイコバクテリア感染、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉおよび髄膜炎菌感染からなる群より選択される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
前記寄生病原体が、マラリア、トキソプラズマ、ニューモシスチスおよびエキノコックスからなる群より選択される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０８】
前記真菌が、カンジダおよびアスペルギルスからなる群より選択される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０９】
前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルおよび前記抗原成分が埋め込まれ、続いて、前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが除去される、請求項９６に記載の方法。
【請求項１１０】
前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルおよび前記抗原成分が、近接または接触して皮膚下に逐次投与される、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記抗原成分の前に、前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが埋め込まれる、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが１２日間未満埋め込まれる、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１３】
前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが４〜１０日間埋め込まれる、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１４】
前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが５〜７日間埋め込まれる、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記予防的または治療的ワクチン接種が複数回注射を含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項１１６】
前記複数回注射が規則的な間隔で行われる、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記予防的または治療的ワクチン接種が癌の治療またはワクチン接種を含むとき、前記規則的な間隔が、４週間にわたる週１回の注射とそれに続く２週間ごとの２回の追加免疫化を含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記予防的または治療的ワクチン接種が感染因子の治療またはワクチン接種を含むとき、前記規則的な間隔が、少なくとも２週間にわたる週１回の注射を含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１９】
前記複数回注射が皮下注射である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２０】
請求項１８に記載のワクチン組成物において使用される前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルを調製する方法であって、
（ａ）同種異系細胞がＧＭ−ＣＳＦを確実に分泌するために、前記同種異系細胞を少なくとも２継代培養すること；
（ｂ）前記培養細胞を細胞培養培地に再懸濁すること；
（ｃ）前記細胞を前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルに装填すること；および
（ｄ）前記装填ハブを除去するために、前記回収チューブを切断すること
を含む、方法。
【請求項１２１】
滅菌空気圧を使用して、前記細胞を前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルに装填する、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記回収チューブの切断端部をシーリングする工程をさらに含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルを洗浄および冷凍保存する工程をさらに含む、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
治療的または予防的ワクチン接種において使用するための、請求項１〜６２のいずれか一項に記載のワクチン組成物、請求項６３に記載の医薬組成物または請求項６４〜７１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２５】
前記治療的または予防的ワクチン接種が癌の治療またはワクチン接種であり、場合により、前記癌が、肺癌、メラノーマ、乳癌、結腸癌、膵臓癌、腎臓癌、急性白血病、グリア芽細胞腫、低悪性度リンパ腫、高悪性度リンパ腫、多発性骨髄腫、肉腫、骨癌、脳腫瘍、胃癌、食道癌、頭頸部癌、甲状腺癌、膀胱癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮癌、脊索腫および子宮頸癌からなる群より選択される、請求項１２４に記載の使用のためのワクチン組成物、医薬組成物またはキット。
【請求項１２６】
前記治療的または予防的ワクチン接種が感染因子の治療またはワクチン接種であり、場合により、前記感染因子が、ウイルス、細菌、寄生生物および真菌からなる群より選択される、請求項１２４に記載の使用のためのワクチン組成物、医薬組成物またはキット。
【請求項１２７】
前記ウイルスが、ＨＩＶ、ＣＭＶ、再発性ヘルペス感染、Ｂ型肝炎、エプスタイン・バーウイルス、Ｃ型肝炎およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）からなる群より選択され、前記細菌が、マイコバクテリア感染、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉおよび髄膜炎菌感染からなる群より選択され、前記寄生病原体が、マラリア、トキソプラズマ、ニューモシスチスおよびエキノコックスからなる群より選択され、または前記真菌が、カンジダおよびアスペルギルスからなる群より選択される、請求項１２６に記載の使用のためのワクチン組成物、医薬組成物またはキット。
【請求項１２８】
前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルおよび前記抗原成分が埋め込まれ、続いて、前記少なくとも１つのマクロカプセルが除去され、場合により、前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルおよび前記抗原成分が、近接または接触して皮膚下に逐次投与され、または前記抗原成分の前に、前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが埋め込まれる、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載の使用のためのワクチン組成物、医薬組成物またはキット。
【請求項１２９】
前記少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが１２日間未満、４〜１０日間または５〜７日間埋め込まれる、請求項１２８に記載の使用のためのワクチン組成物、医薬組成物またはキット。
【請求項１３０】
前記予防的または治療的ワクチン接種が複数回注射を含み、場合により、前記複数回注射が規則的な間隔で行われ、場合により、前記複数回注射が皮下注射である、請求項１２４〜１２９のいずれか一項に記載の使用のためのワクチン組成物、医薬組成物またはキット。
【請求項１３１】
（ｉ）前記予防的または治療的ワクチン接種が癌の治療またはワクチン接種を含むとき、前記規則的な間隔が、４週間にわたる週１回の注射とそれに続く２週間ごとに２回の追加免疫化を含むか、または（ｉｉ）前記予防的または治療的ワクチン接種が感染因子の治療またはワクチン接種を含むとき、前記規則的な間隔が週１回を含む、請求項１３０に記載の使用のためのワクチン組成物、医薬組成物またはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年９月２５日に出願された米国出願第６２／２３２，９４０号および２０１６年９月７日に出願された米国出願第６２／３８４，４１６号に基づく優先権を主張しており、これら出願の各々の内容は、それらの全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、免疫学の分野、特に腫瘍に対する細胞ベースの免疫化および感染因子に対するワクチン接種に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ワクチン接種の分野では、第１世代のワクチンは、免疫応答が望まれる抗原のみを含んでいた。しかしながら、ほとんどの場合、抗原の存在だけでは非常に低効率であるので、この免疫応答を増強するためにワクチン接種組成物が免疫調節物質として１つまたはそれを超えるアジュバント（すなわち、ＧＭ−ＣＳＦ単独で、または他のアジュバントと組み合わせて）を含む第２世代のワクチンが開発された。有効であるために、アジュバントは、ワクチン接種部位において数日間にわたって安定に放出されなければならない。
【０００４】
アジュバントをワクチン接種部位に提供するためのいくつかの異なる技術が報告されており、この技術の選択は免疫化の状況に依存する。
【０００５】
例えば、（細胞ベースのワクチンとは対照的に）抗原ベースのワクチンの状況では、広く適用可能な技術は、ワクチン接種組成物中で抗原をアジュバントと単に組み合わせることである。得られた組成物を被験体に直接投与し、それにより、抗原およびアジュバントを同時かつ共局在的に供給する。
【０００６】
しかしながら、この単純なアプローチは、すべてのワクチン接種の状況で使用することができない。例えば、ほとんどの癌（例えば、肺、結腸、胃、リンパ腫および脳）では、ワクチン接種のための有用な抗原が不明であることが多い。したがって、これらの癌型では、腫瘍に対する細胞ベースの免疫化戦略が必要である。細胞ベースのワクチンを伴う免疫化戦略では、抗原は、被験体に埋め込まれた細胞全体によって産生される。このような戦略は、アジュバントの効率的な送達を確実にするために、より精巧な技術の使用を必要とする。
【０００７】
一例では、免疫調節物質は、ペグ化リポソームマイクロスフェアを使用して、「ネイキッドな」形態または徐放製剤のいずれかで、ワクチン接種部位に直接注射される。しかしながら、アジュバントの全身投与は効率的ではなく毒性であり得、ＧＭ−ＣＳＦは、ヒトの体内ではわずか数時間の半減期を有する不安定なタンパク質であるため、アジュバントとして使用されている組換えタンパク質（すなわち、ＧＭ−ＣＳＦ）の局所放出は信頼性がないので、この戦略は、技術的および生化学的な困難性によって制限されることが多い。したがって、有効であるために、ＧＭ−ＣＳＦは、治療的に有効であるためにインサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で継続的に産生されなければならない。
【０００８】
直接注射技術から生じる問題を回避するために使用される別の例は、免疫調節物質を局所的に産生する「バイスタンダー細胞」の使用である。これらの方法では、必要なアジュバントを産生する細胞を抗原の供給源に近接して埋め込み、それにより、ワクチン部位におけるアジュバントの効率的な局所放出を提供する。
【０００９】
しかしながら、このアプローチもまた、いくつかの欠点を有する。ヒト免疫化では、複数回の免疫化が必要であり、同系バイスタンダー細胞は容易に入手可能ではないので、同種異系細胞が最も頻繁に使用される。したがって、１回目の注射後、バイスタンダー細胞は宿主の免疫系によって認識され（アロ認識）、拒絶され、それにより、免疫調節物質のさらなる安定な持続的産生が妨げられ、ワクチンの抗原性物質に対する所望の免疫応答が損なわれる。
【００１０】
このアロ認識問題を克服するために、Ｂｏｒｒｅｌｌｏら、（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９，１０（１２），１９８３−１９９１）には、細胞表面上でＭＣＨ分子を発現せず、ＨＬＡクラスＩまたはＩＩ抗原を発現することができない細胞株Ｋ−５６２（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−２４３）をＧＭ−ＣＳＦ供給細胞にし、それにより、反復免疫化によって生じるアロ反応の規模を潜在的に減少させる戦略が記載されている。しかしながら、これらの細胞はヒト癌細胞であり、ＨＬＡクラスＩまたはＩＩタンパク質が関与せずに起こる強力な拒絶機構（これは、特異性がより低いが非常に迅速であり、細胞破壊が強力である）に対して非常に感受性である。例えば、Ｋ−５６２細胞は、ＮＫ細胞に対しておよびγδ  Ｔ細胞に対しても非常に感受性であり、同種異系細胞の迅速な排除に至ることが公知である。
【００１１】
したがって、ワクチン部位に注射されたＫ−５６２バイスタンダー細胞は、免疫調節物質の放出を有意に減少させ得る非ＭＨＣ依存性細胞傷害性機構によって効率的かつ迅速に破壊され得る。
【００１２】
また、ＮＫ細胞による迅速な破壊に対して非常に感受性であることに加えて、Ｋ−５６２細胞はまた、インターフェロンγ曝露によりＭＨＣクラスＩを発現し得る。１回目の免疫化中または反復免疫化後、ワクチン接種部位においてインターフェロンγが存在し得るかまたは放出され得るので、このようなＭＨＣクラスＩのアップレギュレーションはまた、古典的な細胞性免疫を介して迅速な細胞破壊をもたらし得る。
【００１３】
これらの理由により、ワクチン接種におけるＫ−５６２などの細胞の使用は、多数の欠点を伴う。
【００１４】
細胞ベースのワクチンの状況で広く使用される別の解決策は、抗原の供給源である細胞を操作して免疫調節物質も供給することによって、抗原の産生と免疫調節物質の放出とをカップルすることである。例えば、癌ワクチンでは、通常、抗原の供給源は腫瘍細胞全体であり、例えばトランスフェクションによって、必要なアジュバントを同時に産生するようにこれを操作し得る。
【００１５】
マウスモデルにおいて得られた好ましい結果を考慮して、最初のヒト試験は同じ戦略を使用した。しかしながら、レトロウイルス感染のために、外科的に採取された患者の細胞をインビトロでエクスパンションする必要があり、それにより、前記方法の幅広い使用が妨げられるので、この技術は、非常に労働集約的で時間がかかることが判明した。
【００１６】
レトロウイルスベクターの使用で観察される困難性を回避するために、腫瘍細胞を感染させるための他のウイルスベクターの使用も提案されている。
【００１７】
それにもかかわらず、ほとんどの場合、試験した新たなウイルスに関連する主な問題は、感染後に、いくつかのウイルスタンパク質が腫瘍細胞から発現され、これらのウイルスタンパク質が外来感染因子として免疫系によって強く認識されるということである。したがって、弱い腫瘍抗原に対する免疫応答を増大する初期目標は歪められ、またはウイルスタンパク質に向けられ、その結果、抗腫瘍免疫応答が遮蔽され、その後の免疫化に対してレシピエントがプライミングされ、感染細胞の破壊がさらに増加し、抗腫瘍免疫化スキームの有効性が低下する可能性がある。
【００１８】
したがって、抗原およびアジュバントの組み合せ供給源としての操作された自系腫瘍細胞の使用は、望ましくない免疫応答のリスクを最小化すると推測される（ａ  ｐｒｉｏｒｉ）が、ウイルス感染の工程それ自体が重大な問題を生じさせる。
【００１９】
自系細胞のウイルス感染から生じる問題を制限するために、患者の細胞を必要としない新たな戦略が開発されている。これらの技術では、類似の癌型を有する他の患者由来の細胞株によって抗原供給源が提供され、患者は、ＧＭ−ＣＳＦを分泌する放射線照射同種異系（別のヒト由来の）腫瘍細胞の反復注射によって免疫化される。これらの技術を使用した研究において免疫応答を示す患者の割合は、予想よりも低かった。
したがって、当技術分野では、免疫調節因子の一定供給源と、自然免疫系または適応免疫系との望ましくない相互作用が実質的にない抗原成分との両方を提供するワクチン組成物を開発する必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｂｏｒｒｅｌｌｏら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９，１０（１２），１９８３−１９９１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
発明の要旨
優れた抗原駆動性癌免疫療法の開発は、適切な位置、適切な抗原材料（すなわち、自系腫瘍細胞）、適切な免疫刺激シグナル（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ（単独でまたは他のアジュバントと組み合わせて））、必要なアジュバントの持続的送達、アジュバントおよび抗原成分の安定かつ再現可能な送達、臨床グレードの材料のアベイラビリティ、ならびに生産をスケールアップする能力を必要とする。強力な抗癌免疫化は、腫瘍特異的抗原および強力なアジュバントを必要とする。免疫化部位において数日間にわたってＧＭ−ＣＳＦなどの免疫調節物質を安定に局所放出することが、最も強力なアジュバントである。試験したすべてのマウス癌型において、それは、強力な長期持続性特異的抗腫瘍免疫を誘導する。しかしながら、ＧＭ−ＣＳＦの全身送達は、ＭＳＤＣをリクルートして癌免疫を増強しないので、優れたアジュバントではない。
【００２２】
カプセル化細胞療法（ＥＣＴ）を使用して、臨床グレードの皮下プラットフォームを作製した。本発明は、二成分ワクチン組成物を利用する臨床グレード免疫化戦略に関する。ワクチン組成物の一方の成分は、抗原成分（すなわち、致死的に放射線照射された自系腫瘍細胞または１つもしくはそれを超える感染因子）であり、他方の成分は、少なくとも１週間にわたって有効量の免疫調節因子（すなわち、ＧＭ−ＣＳＦ）を分泌するかまたは分泌するように遺伝子操作された免疫隔離同種異系細胞を含む少なくとも１つの回収可能な生体適合性マクロカプセルである。これらの免疫隔離同種異系細胞は、抗原成分のごく近傍において継続的かつ非免疫原性的な方法で活性型の免疫調節物質を分泌する。
【００２３】
本発明は、以前の免疫化戦略に関連する欠点を克服する新たなアプローチであって、国際公開第２００３／１０５８９５号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている組成物および方法に基づく新たなアプローチを提供する。
【００２４】
本明細書に記載されるワクチン接種戦略は、いかなるオーダーメイド遺伝子療法プロトコールも必要とせず、いかなるウイルスベクターの使用も伴わない。むしろ、標準アジュバント（すなわち、ＧＭ−ＣＳＦ）は、抗原成分に近接してマクロカプセルから皮下放出される。この細胞ベースの免疫療法は、ＧＭ−ＣＳＦの安定な持続的標準局所放出と腫瘍特異的抗原とを合わせる。
【００２５】
本明細書に記載されるワクチン組成物はいずれも、癌治療もしくは処置（本明細書では互換的にＯｎｃｏ−Ｍａｘｉ−ＶａｘまたはＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１とも称される）のための、または感染因子治療もしくは予防（本明細書では互換的にＩｍｍｕｎｏ−Ｍａｘｉ−ＶａｘまたはＩＡ−Ｍａｘｉ−Ｖａｘとも称される）のための治療的または予防的ワクチン接種に使用され得る。癌細胞を排除するために、抗癌治療は、患者自身の自然免疫応答機構をトリガーすることに基づくので、それは、固形腫瘍および血液関連癌の両方を含むすべての癌型において使用され得る。
【００２６】
（ａ）少なくとも２０ｎｇ／２４時間のＧＭ−ＣＳＦを分泌する約１×１０５〜約１×１０６個の免疫隔離同種異系細胞（例えば、約８×１０５個の免疫隔離同種異系細胞）を含む少なくとも１つの回収可能な生体適合性マクロカプセル、および（ｂ）抗原成分を含むワクチン組成物であって、該少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが、該同種異系細胞および内部コイルを含むコアであって、該同種異系細胞が該内部コイル上に分布したコア；および該コアを取り囲む半透膜であって、それを通したＧＭ−ＣＳＦの拡散を可能にする半透膜を有するワクチン組成物が本明細書で提供される。生体適合性マクロカプセル内のいくつかの異なる濃度の同種異系細胞を試験した（例えば、５、８、１０および１５×１０５個の細胞）。非限定的な一実施形態では、最小の変動性で長期放出に適切な最良の長期安定性を提供するので、８×１０５個の細胞を選択した。
【００２７】
半透膜は、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）および熱可塑性ポリウレタンからなる群より選択される材料から作製され、ならびに／または内部コイルは、アルミニウムまたはチタンから作製される。いくつかの異なる孔径を有するいくつかの膜厚を試験した（例えば、ＰＥＳ  ５、ＵｌｔｒａＰＥＳ  ０．８、Ｕｌｔｒａ  ＰＥＳ  ０．７）。いくつかの実施形態では、内部コイル上のらせん間の距離は、約１ｍｍ±０．１ｍｍである。内部コイルは、アルミニウム、チタンなどから作製され得る。
【００２８】
各生体適合性カプセルは、円筒形状であり得る。いくつかの実施形態では、各生体適合性マクロカプセルは、長さ５〜２５ｍｍ（すなわち、長さ約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ｍｍ）である。埋め込み、ハンドリング、製造および細胞装填の手順のための最適なサイズとして、１２ｍｍを選択した。
【００２９】
マクロカプセルはまた、任意の適切な材料（限定されないが、ポリウレタンが挙げられる）から作製され得る回収チューブを含有し得る。少なくとも１つのマクロカプセルの膜は、回収チューブに固定され得る。例えば、コネクタ（例えば、ステンレス鋼コネクタ）は、回収チューブを少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルの膜に固定するために使用され得る。膜に挿入されるコネクタの端部は、好ましくは、切頂円錐形状を有する。
【００３０】
回収チューブは、埋め込み後に少なくとも１つのマクロカプセルの回収を容易にするための回収フックをさらに含有し得る。例えば、フックは、埋め込み中にマクロカプセルを固定するために使用され得、規定された時間後にマクロカプセルを除去するために使用され得る。
【００３１】
いくつかの実施形態では、回収フックは、アイレットと、回収チューブへの取り付けを容易にするための少なくとも２つのレッグとを含む。
【００３２】
回収フックは、限定されないが、ステンレス鋼を含む任意の適切な材料から作製され得、それは、紫外線硬化性接着剤を使用して回収チューブに固定され得る。
【００３３】
埋め込み後に回収フックを固定するために、アイレットを通して縫合糸が配置され得る。
【００３４】
少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルは、細胞の装填を容易にするための装填ハブをさらに含む。いくつかの実施形態では、装填ハブは、切頂円錐端部を有する。装填ハブは、膜にフリクションフィットされ得る。
【００３５】
他の実施形態では、少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルは、１つまたはそれを超える穴部を含有し得るチューブ本体およびチューブキャップを有する輸送チューブ内に含まれる。加えて、チューブキャップはまた、キャップにフリクションフィットされたルアーロックを含有し得る。装填ハブは、キャップ内のルアーロックに嵌合係合され得る。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、２つの生体適合性マクロカプセルを含む。
【００３７】
各マクロカプセル内の免疫隔離同種異系細胞は、少なくとも１週間にわたって少なくとも２０ｎｇ／２４時間のＧＭ−ＣＳＦを分泌する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、抗原成分は、場合により放射線照射され得る自系腫瘍細胞である。これらの実施形態では、抗原成分は、約１×１０６〜約１×１０７個の自系腫瘍細胞（例えば、約４×１０６個の自系腫瘍細胞）である。致死的に放射線照射された腫瘍細胞は、長期保存のために最大１２カ月間（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２カ月間）凍結保存され得る。
【００３９】
他の実施形態では、抗原成分は、感染因子（例えば、ウイルス、細菌、寄生病原体または真菌）に由来する。例えば、適切な抗原成分としては、不活性化病原体、感染因子溶解物、タンパク質抽出物、組換えタンパク質、ペプチドまたはＤＮＡが挙げられる。非限定的な例として、ウイルスは、ＨＩＶ、ＣＭＶ、再発性ヘルペス感染、Ｂ型肝炎、エプスタイン・バーウイルス、Ｃ型肝炎およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）からなる群より選択される；細菌は、マイコバクテリア感染、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉおよび髄膜炎菌感染からなる群より選択される；寄生病原体は、マラリア、トキソプラズマ、ニューモシスチスおよびエキノコックスからなる群より選択される；ならびに／または、真菌は、カンジダおよびアスペルギルスからなる群より選択される。
【００４０】
本明細書に記載されるワクチン組成物ではいずれも、免疫隔離同種異系細胞は、少なくとも１つのさらなる免疫調節因子（例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−４、インターフェロンガンマ、ケモカインまたは樹状細胞成長因子、ＩＬ−３、ＩＬ−９、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＦＮγの膜貫通受容体、可溶性または膜性幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＦＬ（Ｆｌｔ３リガンド）、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＬＲ７アゴニスト、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン−３（ＴＩＭ−３）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲファミリー関連遺伝子（ＧＩＴＲ）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）、Ｖｉｓｔａ、Ｂリンパ球およびＴリンパ球アテニュエーター（ＣＤ２７２としても公知である）（ＢＴＬＡ）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）（ＣＤ２７８としても公知である）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４（ＯＸ４０）（ＣＤ１３４またはＴＮＦＲＳＦ４としても公知である）、ＣＤ４０、ＣＤ１３７（４１ＢＢとしても公知である）、ＣＤ２７およびそれらの組み合わせ）をさらに分泌する。
【００４１】
マクロカプセルのコア内の免疫隔離同種異系細胞を取り囲む膜は、選択的透過性である。例えば、膜の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）は、約２８０ｋＤａである。
【００４２】
いくつかの実施形態では、免疫隔離同種異系細胞は、例えばプラスミドによるトランスフェクションまたはウイルスによる感染によって、ＧＭ−ＣＳＦを発現するように遺伝子改変される。
【００４３】
免疫隔離同種異系細胞は、ヒト樹立細胞株（例えば、非接着性細胞株、例えば造血起源の細胞）である。いくつかの実施形態では、免疫隔離同種異系細胞は不死性であるかもしくは不死化され、および／または非腫瘍性である。免疫隔離同種異系細胞は、哺乳動物起源（例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物）のものである。いくつかの実施形態では、免疫隔離同種異系細胞は、放射線照射される。
【００４４】
免疫隔離同種異系細胞は、約８０〜約９６０×１０−１５ｇ／２４時間のＧＭ−ＣＳＦ、１０×１０−１５ｇ／２４時間を超えるＧＭ−ＣＳＦ、または１００×１０−１５ｇ／２４時間を超えるＧＭ−ＣＳＦを分泌する。
【００４５】
特定の実施形態では、少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルは、５０〜１５０ｎｇ／日（例えば、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５または１５０ｎｇ／日）のＧＭ−ＣＳＦを分泌する。
【００４６】
また、本明細書に記載されるワクチン組成物はいずれも、１つまたはそれを超えるさらなる治療剤を含有し得る。いくつかの実施形態では、１つまたはそれを超えるさらなる治療剤は、免疫チェックポイント調節物質である。例えば、免疫チェックポイント調節物質は、１つまたはそれを超える免疫調節分子、例えば細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質（ＣＴＬＡ−４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、プログラム細胞死タンパク質１リガンド（ＰＤ−Ｌ１）、ＴＩＭ−３、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ−３、Ｖｉｓｔａ、ＢＴＬＡ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ１３７（４１ＢＢとしても公知である）、ＣＤ２７、インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）およびそれらの組み合わせなどをターゲティングする生成物または作用物質（例えば、タンパク質、抗体、化合物など）であり得る。
【００４７】
したがって、標的が、阻害（すなわち、アンタゴニスト）能力または増強（すなわち、アゴニスト）能力を有する免疫チェックポイントであるかに応じて、カプセル化細胞は、阻害活性または増強活性のいずれかを有する分子を産生するように操作され得る。
【００４８】
細胞ベースの免疫化とＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１遮断との間の相乗効果は、前臨床モデルにおいて実証されている。好ましくは、ＣＴＬＡ−４の局所産生が望ましい。
【００４９】
少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルおよび／または抗原成分は、凍結され、保存され、使用前に解凍され得る。
【００５０】
本明細書に記載されるワクチン組成物ではいずれも、少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルはまた、以下：ｉ）回収チューブ；ｉｉ）該回収チューブに固定された回収フックであって、埋め込み後に該少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルの回収を容易にする回収フック；ｉｉｉ）該少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルの該膜を該回収チューブに固定するコネクタ；ｉｖ）該細胞の装填を容易にする装填ハブ；および／またはｖ）チューブ本体およびチューブキャップを有する輸送チューブを含有し得る。
【００５１】
記載されるワクチン組成物のいずれかと、１つまたはそれを超える生理学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物も提供される。
【００５２】
ワクチン組成物および／または医薬組成物と、使用説明書とを含むキットも提供される。例えば、このようなキットでは、抗原成分は、１つまたは複数の抗原を産生または放出する細胞、例えば場合により放射線照射された腫瘍細胞を含有し得る。あるいは、抗原成分は、感染因子（例えば、ウイルス、細菌、寄生病原体または真菌）から得られたものであり得る。
【００５３】
本明細書に記載されるキットではいずれも、少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルは、（例えば、使用前に）滅菌される。滅菌後、保存、輸送および／または送達のために、少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルは、滅菌パウチに個別にパッケージングされ得る。
【００５４】
治療的または予防的ワクチン接種（例えば、癌の治療またはワクチン接種）のための、本明細書に記載されるワクチン組成物、医薬組成物および／またはキットの使用も提供される。非限定的な例として、癌は、肺癌、メラノーマ、乳癌、結腸癌、膵臓癌、腎臓癌、急性白血病、慢性白血病、グリア芽細胞腫、低悪性度リンパ腫、高悪性度リンパ腫、多発性骨髄腫、肉腫、骨癌、脳腫瘍、胃癌、食道癌、頭頸部癌、甲状腺癌、膀胱癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮癌、脊索腫および子宮頸癌からなる群より選択され得る。いくつかの実施形態では、癌は、肺癌；膵臓癌腫；卵巣癌腫；または頭頸部癌である。
【００５５】
他の実施形態では、治療的または予防的ワクチン接種は、感染因子の治療またはワクチン接種である。例えば、感染因子は、ウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＣＭＶ、再発性ヘルペス感染、Ｂ型肝炎、エプスタイン・バーウイルス、Ｃ型肝炎またはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、細菌（例えば、マイコバクテリア感染、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉまたは髄膜炎菌感染）、寄生生物（例えば、マラリア、トキソプラズマ、ニューモシスチスまたはエキノコックス）および真菌（例えば、カンジダまたはアスペルギルス）からなる群より選択される。
【００５６】
これらの使用ではいずれも、少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルおよび抗原成分が埋め込まれ、続いて、少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが除去される。例えば、少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルおよび抗原成分は、近接または接触して皮膚下に逐次投与される。抗原装填（すなわち、放射線照射癌細胞または感染因子の一部）は除去されない。むしろ、それらは、免疫系によって分解される。
【００５７】
抗原成分の前に、少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが埋め込まれる。
【００５８】
少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルは、１２日間未満；４〜１０日間；または５〜７日間埋め込まれる。
【００５９】
これらの使用ではいずれも、予防的または治療的ワクチン接種は、複数回注射、例えば規則的な間隔で行われる複数回注射を伴う。予防的または治療的ワクチン接種が癌の治療またはワクチン接種である場合、規則的な間隔は、４週間にわたる週１回の注射とそれに続く２週間ごとに２回の追加免疫化を伴う。予防的または治療的ワクチン接種が感染因子の治療またはワクチン接種である場合、規則的な間隔は、少なくとも２週間にわたる週１回の注射を伴う。好ましくは、複数回注射は、皮下注射である。
【００６０】
有効量の本明細書に記載されるワクチン組成物、医薬組成物またはキットのいずれかを、それを必要とする患者に投与することによる治療的または予防的ワクチン接種のための方法も提供される。例えば、治療的または予防的ワクチン接種は、癌の治療またはワクチン接種である。非限定的な例として、癌は、肺癌、メラノーマ、乳癌、結腸癌、膵臓癌、腎臓癌、急性白血病、慢性白血病、グリア芽細胞腫、低悪性度リンパ腫、高悪性度リンパ腫、多発性骨髄腫、肉腫、骨癌、脳腫瘍、胃癌、食道癌、頭頸部癌、甲状腺癌、膀胱癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮癌、脊索腫および子宮頸癌からなる群より選択され得る。いくつかの実施形態では、癌は、肺癌；膵臓癌腫；卵巣癌腫；または頭頸部癌である。
【００６１】
他の実施形態では、治療的または予防的ワクチン接種は、感染因子の治療またはワクチン接種である。例えば、感染因子は、ウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＣＭＶ、再発性ヘルペス感染、Ｂ型肝炎、エプスタイン・バーウイルス、Ｃ型肝炎またはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、細菌（例えば、マイコバクテリア感染、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉまたは髄膜炎菌感染）、寄生生物（例えば、マラリア、トキソプラズマ、ニューモシスチスまたはエキノコックス）および真菌（例えば、カンジダまたはアスペルギルス）からなる群より選択される。
【００６２】
これらの方法のいずれかでは、少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルおよび抗原成分が埋め込まれ、続いて、少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが除去される。例えば、少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルおよび抗原成分が、近接または接触して皮膚下に逐次投与される。
【００６３】
抗原成分の前に、少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが埋め込まれる。
【００６４】
少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが１２日間未満、４〜１０日間または５〜７日間埋め込まれる。
【００６５】
これらの方法のいずれかでは、予防的または治療的ワクチン接種が複数回注射、例えば、規則的な間隔で行われる複数回注射を含む。予防的または治療的ワクチン接種が癌の治療またはワクチン接種であるとき、規則的な間隔が、４週間にわたる週１回の注射とそれに続く２週間ごとの２回の追加免疫化を含む。予防的または治療的ワクチン接種が感染因子の治療またはワクチン接種であるとき、規則的な間隔が、少なくとも２週間にわたる週１回の注射を含む。好ましくは、複数回注射が皮下注射である。
【００６６】
最後に、本明細書に記載されるワクチン組成物のいずれかにおいて使用される少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルを調製する方法も提供される。例えば、このような方法は、（ａ）該同種異系細胞を、該細胞がＧＭ−ＣＳＦを確実に分泌するために、少なくとも２継代培養する工程；（ｂ）該培養細胞を細胞培養培地に再懸濁する工程；（ｃ）（例えば、滅菌空気圧を使用して）該細胞を該少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルに装填する工程；および／または（ｄ）該装填ハブを除去するために、該回収チューブを切断する工程を伴い得る。このような方法はまた、回収チューブの切断端部をシーリングする工程、ならびに／または（例えば、液体窒素の気相を使用して）少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルを洗浄および冷凍保存するさらなる工程を伴い得る。
【００６７】
治療的または予防的ワクチン接種において使用するための、本明細書に記載されるワクチン組成物、医薬組成物および／またはキットも提供される。
【００６８】
例えば、治療的または予防的ワクチン接種は癌の治療またはワクチン接種であり、場合により、癌は、肺癌、メラノーマ、乳癌、結腸癌、膵臓癌、腎臓癌、急性白血病、グリア芽細胞腫、低悪性度リンパ腫、高悪性度リンパ腫、多発性骨髄腫、肉腫、骨癌、脳腫瘍、胃癌、食道癌、頭頸部癌、甲状腺癌、膀胱癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮癌、脊索腫および子宮頸癌からなる群より選択される。
【００６９】
他の実施形態では、治療的または予防的ワクチン接種は感染因子の治療またはワクチン接種であり、場合により、感染因子は、ウイルス、細菌、寄生生物および真菌からなる群より選択される。非限定的な例として、ウイルスは、ＨＩＶ、ＣＭＶ、再発性ヘルペス感染、Ｂ型肝炎、エプスタイン・バーウイルス、Ｃ型肝炎およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）からなる群より選択され得、細菌は、マイコバクテリア感染、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉおよび髄膜炎菌感染からなる群より選択され、前記寄生病原体が、マラリア、トキソプラズマ、ニューモシスチスおよびエキノコックスからなる群より選択され、または真菌は、カンジダおよびアスペルギルスからなる群より選択される。
【００７０】
本明細書中に記載の使用のためのワクチン組成物、医薬組成物またはキットのいずれかでは、少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルおよび前記抗原成分が埋め込まれ、続いて、少なくとも１つのマクロカプセルが除去され、場合により、少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルおよび抗原成分が、近接または接触して皮膚下に逐次投与され、または抗原成分の前に、少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが埋め込まれる。例えば、本明細書中に記載の使用のためのワクチン組成物、医薬組成物またはキットのいずれかでは、少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルが１２日間未満、４〜１０日間または５〜７日間埋め込まれる。
【００７１】
これらの使用のためのワクチン組成物、医薬組成物またはキットでは、予防的または治療的ワクチン接種は複数回注射を含み、場合により、複数回注射は規則的な間隔で行われ、場合により、複数回注射は皮下注射である。
【００７２】
（ｉ）予防的または治療的ワクチン接種が癌の治療またはワクチン接種であるとき、規則的な間隔が、４週間にわたる週１回の注射とそれに続く２週間ごとに２回の追加免疫化であるか、または（ｉｉ）予防的または治療的ワクチン接種が感染因子の治療またはワクチン接種であるとき、規則的な間隔が週１回である、本明細書中に記載の使用のためのワクチン組成物、医薬組成物またはキットもまた提供される。
【００７３】
特に定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験では、本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料が使用され得るが、適切な方法および材料が以下に記載される。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。加えて、材料、方法および例は例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。
【００７４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｅは、ワクチン組成物において使用した生体適合性マクロカプセルの一連の概略図である。図１Ａは、同種異系細胞が分布した内部コイル（詳細Ｊ）と、コネクタ（詳細Ｈ）と、回収のためのフック（詳細Ｉ）とを含む生体適合性マクロカプセル全体の概略図である。図１Ｂは、内部コイルの詳細図である。図１Ｃは、コネクタの詳細図である。図１Ｄは、埋め込み後に生体適合性マクロカプセルを適所に保持するために使用した縫合糸を示す。図１Ｅは、装填ハブ／輸送チューブの詳細図である。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｅは、ワクチン組成物において使用した生体適合性マクロカプセルの一連の概略図である。図１Ａは、同種異系細胞が分布した内部コイル（詳細Ｊ）と、コネクタ（詳細Ｈ）と、回収のためのフック（詳細Ｉ）とを含む生体適合性マクロカプセル全体の概略図である。図１Ｂは、内部コイルの詳細図である。図１Ｃは、コネクタの詳細図である。図１Ｄは、埋め込み後に生体適合性マクロカプセルを適所に保持するために使用した縫合糸を示す。図１Ｅは、装填ハブ／輸送チューブの詳細図である。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｅは、ワクチン組成物において使用した生体適合性マクロカプセルの一連の概略図である。図１Ａは、同種異系細胞が分布した内部コイル（詳細Ｊ）と、コネクタ（詳細Ｈ）と、回収のためのフック（詳細Ｉ）とを含む生体適合性マクロカプセル全体の概略図である。図１Ｂは、内部コイルの詳細図である。図１Ｃは、コネクタの詳細図である。図１Ｄは、埋め込み後に生体適合性マクロカプセルを適所に保持するために使用した縫合糸を示す。図１Ｅは、装填ハブ／輸送チューブの詳細図である。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｅは、ワクチン組成物において使用した生体適合性マクロカプセルの一連の概略図である。図１Ａは、同種異系細胞が分布した内部コイル（詳細Ｊ）と、コネクタ（詳細Ｈ）と、回収のためのフック（詳細Ｉ）とを含む生体適合性マクロカプセル全体の概略図である。図１Ｂは、内部コイルの詳細図である。図１Ｃは、コネクタの詳細図である。図１Ｄは、埋め込み後に生体適合性マクロカプセルを適所に保持するために使用した縫合糸を示す。図１Ｅは、装填ハブ／輸送チューブの詳細図である。
【図１Ｅ】図１Ａ〜１Ｅは、ワクチン組成物において使用した生体適合性マクロカプセルの一連の概略図である。図１Ａは、同種異系細胞が分布した内部コイル（詳細Ｊ）と、コネクタ（詳細Ｈ）と、回収のためのフック（詳細Ｉ）とを含む生体適合性マクロカプセル全体の概略図である。図１Ｂは、内部コイルの詳細図である。図１Ｃは、コネクタの詳細図である。図１Ｄは、埋め込み後に生体適合性マクロカプセルを適所に保持するために使用した縫合糸を示す。図１Ｅは、装填ハブ／輸送チューブの詳細図である。
【００７６】
【図２】図２は、本明細書に記載される二成分癌ワクチン戦略（Ｏｎｃｏ−Ｍａｘｉ−Ｖａｘ）を示す概略図である。
【００７７】
【図３】図３は、本明細書に記載される癌治療ワクチン接種戦略を示す概略図である。このプロトコールでは、自系腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を処理し、放射線照射し、皮下注射の前に凍結する。同様に、ＧＭ−ＣＳＦを分泌する免疫隔離同種異系細胞を含む生体適合性マクロカプセルを埋め込み前に凍結する。処置の時点において、放射線照射自系腫瘍細胞を皮下注射し、マクロカプセルを同様の位置に埋め込む。皮下に埋め込んだカプセルは７日後に除去するが、放射線照射腫瘍細胞は患者の免疫系によって破壊される。このプロトコールは複数回注射を伴い、処置患者における抗腫瘍免疫応答および潜在的腫瘍退縮の誘導をもたらす。
【００７８】
【図４】図４は、肺転移に対するＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１処置の効果を示す一連の写真である。
【００７９】
【図５】図５は、ＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１処置後の進行性難治性卵巣癌におけるＣａ１２５血清マーカーの減少を示すグラフである。
【００８０】
【図６】図６は、難治性再発性脊索腫を有する患者における処置前、処置中および処置後のＭＲＩ結果を示す。部分応答が確認され、１２カ月間を超えて継続中である。
【００８１】
【図７】図７は、ＭＶＸ−１細胞株によって産生されたＧＭ−ＣＳＦの生物学的活性を決定するために実施した機能細胞ベースのアッセイの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
詳細な説明
定義
「宿主」、「被験体」、「患者」などの用語は、本明細書では、免疫化を受けている被験体を指すために互換的に使用される。
【００８３】
本出願の文脈では、以下の用語は、以下のように定義される：
【００８４】
本明細書で使用される「免疫調節物質」または「免疫調節因子」などの用語は、抗原または免疫原に対する免疫応答を増強、増幅または低減し得る化合物または組成物を指す。免疫調節物質の非限定的な一例は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である。当業者であれば、当技術分野で公知の任意の他の適切な免疫調節物質が、本明細書に記載されるワクチン組成物において使用され得ることを認識し得る。
【００８５】
「免疫刺激因子」または「免疫活性化因子」などは、抗原または免疫原に対する免疫応答を特異的に増強または増幅する免疫調節物質である。「免疫刺激因子」または「免疫活性化因子」という用語は、本明細書では、「アジュバント」という用語と同義的に使用される。
【００８６】
宿主に導入された際、宿主の免疫応答から細胞が物理的に保護される（すなわち、細胞と免疫系のエフェクターとの間に物理的な接触がないことを条件として、細胞表面抗原、分泌タンパク質などを含むいかなる細胞成分に対しても有意な後天性免疫応答または自然免疫応答がない）場合に、細胞は「免疫隔離された」とみなされる。その結果として、宿主生物では、細胞に対する有意な抗体または細胞性免疫応答は見られない。
【００８７】
免疫隔離同種異系細胞は免疫系によって検出不可能であり、それらに対するいかなる免疫応答も防止されるので、およびそれらはいかなる免疫応答からも物理的に保護されるので、それらは、宿主の免疫応答によって攻撃または破壊されない。
【００８８】
本明細書で使用される「カプセル化」または「カプセル化された」などの用語は、宿主生物に対して非免疫原性の材料（例えば、プラスチック）のカプセルを含む生体適合性デバイス（すなわち、マクロカプセルまたはカプセル化細胞療法（ＥＣＴ）デバイス）に細胞を免疫隔離する特定の手段を指す。生体適合性マクロカプセルなどのバリアデバイスに細胞または細胞集団を囲う操作は、マクロカプセル化として公知である。「カプセル」、「デバイス」、「マクロカプセル」などの用語は、本明細書では、本明細書に記載されるワクチン組成物の成分の１つを構成するマクロカプセルを指すために互換的に使用される。
【００８９】
ワクチン組成物
治療的および／または予防的ワクチン接種における使用では、本明細書に記載されるワクチン組成物は、２つの成分（抗原成分と、免疫調節物質（すなわち、ＧＭ−ＣＳＦ）を分泌する同種異系細胞を含む少なくとも１つの回収可能な生体適合性マクロカプセルと）を含む。好ましくは、カプセル化細胞は免疫調節物質を産生するように操作されるが、免疫調節物質を天然に産生する細胞および細胞株の使用も包含される。
【００９０】
これとの関連で使用され得る医薬組成物およびキットも提供される。本明細書に記載されるワクチン組成物、医薬組成物またはキットはいずれも、治療的および／または予防的ワクチン接種における使用に適切である。同様に、本明細書に記載されるワクチン組成物、医薬組成物またはキットはいずれも、治療的および／または予防的ワクチン接種の方法において使用され得る。
【００９１】
例えば、治療的または予防的ワクチン接種は、腫瘍もしくは癌の治療的もしくは予防的ワクチン接種、または１つもしくはそれを超える感染因子に対する治療的もしくは予防的ワクチン接種であり得る。
【００９２】
産生される免疫調節因子は、マクロカプセル化同種異系細胞によって合成されたタンパク質であり得るが、それはまた、例えば、脂質などの細胞成分、または細胞によってさらに形質転換された外因性分子、例えば抗原提示細胞によってプロセシングされた抗原、または代謝産物であり得る。一実施形態では、免疫調節因子は、ｈｕＧＭ−ＣＳＦである。細胞ベースの癌免疫化プロトコールでは、抗原は、有意な免疫応答をトリガーするためには弱すぎることが多く、この応答に関与するいくつかの分子は、それを増強または増幅することが公知であるので、免疫調節因子は、好ましくは、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を誘引することによって機能し得る免疫刺激因子であって、ＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞の活性も刺激し得る免疫刺激因子である。
【００９３】
特に強力な免疫刺激因子は、サイトカインファミリーに属する。適切なサイトカインとしては、限定されないが、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球および顆粒球マクロファージ刺激因子）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−７（インターロイキン）、ＩＦＮγの膜貫通受容体、可溶性または膜性ＳＣＦ（幹細胞因子）、ＦＬ（Ｆｌｔ３リガンド）、Ｇ−ＣＳＦおよびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。好ましい免疫刺激因子は、ＧＭ−ＣＳＦ（例えば、ヒトＧＭ−ＣＳＦ）およびＦＬである。
【００９４】
癌治療との関連では、ＧＭ−ＣＳＦは、全身性抗腫瘍免疫を活性化するための最も強力なサイトカインであると確認されているので、免疫刺激因子として特に推奨される（Ｄｒａｎｏｆｆら、１９９３，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９０（８）：３５３９−４３を参照のこと）。しかしながら、ＧＭ−ＣＳＦはまた、感染因子のワクチン接種および治療における免疫刺激因子として有効である。
【００９５】
十分な免疫応答を誘導するために、異なる経路を刺激し得るいくつかの免疫調節因子を組み合わせることが非常に有利であり得る。例えば、１つの好ましい組み合わせは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＦＬである。しかしながら、２つまたはそれを超える免疫調節因子の任意の他の組み合わせも使用され得る。適切な組み合わせの決定は、当該分野の技能の慣用のレベル内である。
【００９６】
免疫隔離は、Ｋ−５６２細胞株などのＨＬＡ陰性細胞の使用に関連する重大な欠点を克服する。カプセル化細胞は、免疫系から完全に保護されるので、先天性免疫拒絶に関与する非カプセル化Ｋ−５６２細胞とは対照的に、それらは、先天性免疫または細胞性免疫によって破壊されない。生存し、タンパク質を長期間分泌し、複数回の免疫化を可能にするマクロカプセル化細胞の能力は、マクロカプセルの物理的バリアに直接関連する。また、カプセルの埋め込み後における患者へのＧＭ−ＣＳＦ放出の量および持続時間は、彼または彼女の先天性免疫または免疫抑制に応じて個体ごとに異なる可能性は低い。対照的に、非免疫隔離細胞（すなわち、ＧＭ−ＣＳＦを分泌するＫ−５６２細胞）が使用される場合、ＧＭ−ＣＳＦ放出の安定性は、１回目の免疫化からその後の免疫化において任意の所与の患者で有意に変動し、さらには患者ごとに有意に変動する可能性が高い。
【００９７】
細胞を免疫隔離する好ましい方法は、一般的な免疫系からそれらを「隠す」物理的バリアを提供することであり、細胞を含むコアと、半透膜によって取り囲まれたその上に分布した細胞を有する内部コイルとを有する生体適合性マクロカプセルなどのバリアデバイスによって達成され得る。
【００９８】
免疫調節物質を分泌する細胞の免疫隔離は、遊離細胞の埋め込み（これは一般に、宿主の免疫系からそれらを保護するために免疫抑制薬を必要とする）に関連する重大な欠点を克服する。免疫攻撃を機械的に遮断することによって、マクロカプセルなどのバリアデバイスの使用は、免疫抑制療法の必要性を除去する。また、所望により、所定時間後に細胞を容易に回収し得るので、免疫調節因子の切替可能な放出が可能である。埋め込まれたデバイスを回収することによって、作用物質の放出を停止させ、免疫化プロセスの終了後に不要な分子が存在することを防止する。
【００９９】
本明細書に記載されるワクチン組成物において使用される生体適合性マクロカプセルなどのバリアデバイスは、選択的透過性かつ非免疫原性の合成膜によって、宿主の免疫系から生細胞を分離する。半透膜の使用は、外部と内部との間における栄養素、タンパク質、酸素および生物治療物質の自由な交換を可能にする。小分子（例えば、細胞の生存に必要な分子）は、マクロカプセルの膜内の細孔を通過し得るのに対して、免疫細胞または抗体などの高分子量物質は排除される。この膜はまた炎症細胞を排除し、それにより、組織拒絶からカプセル化細胞を保護する。
【０１００】
逆に、細胞によって産生される免疫調節因子は、細孔を通って外部培地に送達され得る。好ましくは、デバイスがその免疫防御特性を保持するために、小分子またはタンパク質および免疫調節物質がバリアを通過することが可能であり、免疫グロブリンのようなより大きいものがバリアを通過することが不可能な範囲内で、細孔の直径は選択される。
【０１０１】
カプセルは、様々な形状およびサイズを有し得る。具体的には、カプセルは、生物活性を維持して製品または機能の送達のためのアクセスを提供するために適切な任意の構成であり得る（例えば、円筒形状、長方形、円盤形状、パッチ形状、卵形、星形または球形を含む）。埋め込まれた後にカプセルを回収する場合、埋め込み部位からのカプセルの移動をもたらす傾向がある構成、例えばレシピエント宿主の血管中を移動するために十分小さい球状カプセルは好ましくない。長方形、パッチ、円盤、円筒および平板などの特定の形状はより大きい構造的完全性を提供し、回収が望まれる場合に好ましい。一実施形態では、マクロカプセルは、円筒形状である。
【０１０２】
本明細書に記載されるデバイスの半透膜は、選択的透過性かつ免疫防御性の膜から、または限外ろ過膜もしくは精密ろ過膜から作製される。当業者であれば、半透膜は、典型的には、約１００ｎｍの平均孔径を有することを認識し得る。また他の実施形態では、半透膜は、非多孔質膜材料（例えば、ヒドロゲルまたはポリウレタン）から作製され得る。
【０１０３】
ポリスルホン（ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）を含む）、ポリアクリレート（アクリルコポリマーを含む）、ポリビニリデン、ポリ塩化ビニルコポリマー、ポリウレタン（熱可塑性ポリウレタンを含む）、ポリスチレン、ポリアミド、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリホスファゼン、ポリアクリロニトリル、ポリ（アクリロニトリル／塩化ビニル）ならびにそれらの誘導体、コポリマーおよび混合物を含む様々なポリマーおよびポリマーブレンドが、包囲半透膜を製造するために使用され得る。非限定的な例として、カプセルのためのポリマーは、熱可塑性ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）中空繊維（ＯＤ：７２０μｍ；ＩＤ：５２４μｍ、分子量カットオフ：３２および８０ｋＤａ；Ａｋｚｏ  Ｎｏｂｅｌ  Ｆａｓｔｅｒ  ＡＧ，Ｗｕｐｐｅｒｔｈａｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＡＮ−６９ポリマー（アクリロニトリルおよびナトリウムメタリルスルホン酸アニオンコポリマー、Ｈｏｓｐａｌ  Ｒ＆Ｄ  Ｉｎｔ，Ｍｅｙｚｉｅｕ，Ｆｒａｎｃｅ）である。
【０１０４】
本明細書に記載されるマクロカプセルではいずれも、半透膜の公称分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）は、５００ｋＤである。いくつかの実施形態では、ＭＷＣＯは、約２８０ｋＤである。
【０１０５】
いくつかの細孔寸法を有するいくつかの異なる膜厚を試験した（例えば、ＰＥＳ５、ＵｌｔｒａＰＥＳ  ０．８およびＵｌｔｒａＰＥＳ  ０．７）。最終的に、臨床試験において使用するために、ＵｌｔｒａＰＥＳ０．７（Ｍｅｍｂｒａｎａ  ＧｍｂＨ，Ｗｕｐｐｅｒｔａｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を選択した。同様に、様々なカプセルの長さも試験し、埋め込み、ハンドリング、製造および細胞装填の手順のための最良のサイズとして１２ｍｍを選択した。
【０１０６】
好ましくは、半透膜は、約９０〜１２０μｍの厚さである。本明細書に記載されるデバイスはいずれも、円筒形、中空繊維または平坦なシートとして構成され得る。デバイスの長さは、約４ｍｍ〜１５ｍｍであり得る。いくつかの実施形態では、デバイスは、約０．９ｍｍ〜１．２ｍｍの内径を有する。デバイスの端部は、コネクタまたはメタクリル酸メチルを使用してシーリングされ得る。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、マクロカプセル化は、皮下に埋め込まれるように設計された膜から形成される予形成マクロカプセルを使用する。これらのマクロカプセルはまた、真皮と皮下層との間に配置される回収チューブを含む。いくつかの実施形態では、回収チューブは、医療グレードのポリマー（熱可塑性ポリウレタン、低密度ポリエチレンおよび高密度ポリエチレン、ＰＥＥＫ、ポリカーボネートウレタンならびに／または熱可塑性エラストマーを含む）から作製される。
【０１０８】
医師の近位にある（すなわち、膜の遠位にある）端部において、回収チューブは、埋め込み後にカプセルの回収を容易にするために使用され得るテザーフック（回収フックとも称される）を有する。好ましくは、回収フックは、一方の端部においてアイレットを有し、他方の端部において、回収チューブの内部への取り付けを容易にするための少なくとも２つのレッグを有する。非限定的な例として、回収フックは、医療グレードのステンレス鋼（すなわち、ステンレス鋼合金３１６ＬＶＭ、３１６Ｌ、３０２および／または３０４）から作製される。回収フックは、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して固定され得る。非限定的な例として、それは、紫外線（ＵＶ）硬化性接着剤を使用して固定され得、および／または縫合糸は、回収フック中のアイレットを通して配置され得、マクロカプセルの埋め込み後において、これは依然として皮膚の外部にある。
【０１０９】
コネクタは、マクロカプセルの膜と回収チューブとの接続を容易にするために使用され得る。非限定的な例として、ステンレス鋼製コネクタが膜に接着され得る。いくつかの実施形態では、膜に挿入されるコネクタの端部は、円錐形状の端部（例えば、切頂円錐形状）を有する。
【０１１０】
マクロカプセルは、医療グレードの金属、例えばアルミニウムまたはチタンなどから作製された内部コイルを含有し、これは、コネクタの切頂円錐端部に挿入され得る。この内部コイルは、カプセル内部の細胞の秩序、具体的には均一な分布を保証し、壁における凝集を防止する。内部コイルはまた、細胞の凝集を防ぎ、かつデバイス内の細胞分布を改善し得る（国際公開第９６／０２６４６号を参照のこと）。
【０１１１】
適切な内部コイルは、１センチメートル当たり規定された数のらせん巻き（ｓｐｉｒｅ）を有し得る。例えば、コイルは、特定のらせん巻き間の距離（例えば、１ｍｍ±０．１ｍｍ）を有する強化バネを形成するように引き伸ばされた原材料（Ｈｅｆａｅｕｓ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）から形成され得る（図１Ｂを参照のこと）。
【０１１２】
適切な内部コイルを形成したら、膜を強化バネ（すなわち、内部コイル）上でスライドさせ、ＵＶ硬化性接着剤を使用して回収チューブにシーリングする。一実施形態では、膜をポリウレタンコアに約２ｍｍ入れて配置し、コネクタの切頂円錐端部の直前に接着する。他の実施形態では、膜を固定するために、接着剤を回収チューブ全体に充填する。
【０１１３】
例えば、エチレンオキシド（ＥＯ）で滅菌された装填ハブ（例えば、ＢＤ  Ｖａｓｃｕｌｏｎ（商標）またはＢＤ  Ｉｎｓｙｔｅ−Ｗ（商標）０．９ｍｍ×２５ｍｍ）を使用して、内部コイルを空のマクロカプセルに装填し得る。例えば、ＵＶ光硬化性接着剤を使用して、この装填ハブを膜に固定する。いくつかの実施形態では、装填ハブは、コネクタの膜端部にフリクションフィットする切頂円錐端部を有する。
【０１１４】
輸送チューブは、１つまたはそれを超える穴部をチューブ本体およびツールキャップに穿孔することによって、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）１４ｍＬチューブから改変され得る。当業者であれば、良好なＥＯ滅菌を保証するために挿入する際に、これらの穴部を膜と整列させるべきであることを認識し得る。ルアーロックを挿入し、キャップにフリクションフィットし得る。次いで、装填ハブをルアーロックキャップに嵌合係合し得る。次いで、完成した輸送チューブを滅菌し、滅菌パウチに戻して個々にパッケージングする。
【０１１５】
マクロカプセルは、数マイクロメートルから３〜４センチメートルの範囲の様々なサイズを有し得る。カプセルのサイズおよび細胞のサイズに応じて、２００，０００個もの細胞を１ｃｍデバイスに装填し得る。いくつかの実施形態では、デバイスは円筒形状であり、約１２ｍｍの長さである。当業者であれば、いかなる過度な実験も伴わずに、本明細書に記載されるワクチン組成物において使用されるマクロカプセルのための最適な構成（すなわち、形状、サイズ、長さ、細胞数など）を決定し得る。
【０１１６】
本明細書に記載されるマクロカプセルにおいて使用するための適切な同種異系細胞は、液体ガス中に保存された１アリコート当たり５×１０６個の細胞を含むワーキングセルバンクから入手され得る。使用前にこれらの細胞を解凍し、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびＧ４１８（選択的抗生物質）を含む完全培地ＲＰＭＩ１６４０中で２〜３継代培養して、細胞がＧＭＣＳＦを確実に分泌するようにする。次いで、約８００，０００個の細胞を３０μｌの完全培地に再懸濁し、次いで、滅菌空気圧を使用して３０μｌ全部を各カプセルに装填する。次いで、回収チューブを切断して装填ハブを除去し、ＵＶ接着剤を用いて回収チューブの端部をシーリングする。
【０１１７】
次いで、完全培地（無菌）でカプセルを洗浄し、無菌完全培地（約３〜５ｍｌの培地）を含む６ウェルディッシュ中でインキュベートする。
【０１１８】
マクロカプセルは、カプセル１個当たり１×１０５個の同種異系細胞〜１×１０６個の同種異系細胞（例えば、８×１０５個の細胞）を含有し得る。これらの細胞はマクロカプセルのコア内に含まれ、マクロカプセル内の内部コイル上に分布し、半透膜によって取り囲まれる。
【０１１９】
培養前に、安全／品質管理（ＱＣ）工程が行われ得る。この安全ＱＣ工程の目的は、細胞の微生物学的な、マイコプラズマの、およびＬＡＬ／エンドトキシンの「状態」を評価することである。微生物学的なおよびマイコプラズマの評価は、上清をサンプリングし、それを選択寒天上で培養することによって実施される。ＬＡＬ／エンドトキシンもまた、上清のサンプルにおいてではあるが、細菌エンドトキシンおよび／またはリポ多糖との反応を介して定量される。
【０１２０】
７日間の培養後、上清は、ＧＭ−ＣＳＦ分泌について測定される。好ましくは、デバイスは、少なくとも２０ｎｇ／カプセル／日を分泌する。典型的には、約５０〜１５０ｎｇ／カプセル／日が分泌される。したがって、特許請求の範囲に記載されているマクロカプセルは、低用量の免疫刺激因子（すなわち、ＧＭ−ＣＳＦ）の持続的送達に適切である。
【０１２１】
マクロカプセル内のいくつかの濃度の細胞を試験した（例えば、５、８、１０および１５×１０５個の細胞）。８×１０５個の細胞は、最小の変動で長期放出のための最良の長期安定性を提供するので、選択した濃度であった。
【０１２２】
製造したら、当技術分野で公知の任意の方法を使用して、使用前にマクロカプセルデバイスを冷凍保存し得る。例えば、いくつかの実施形態では、冷凍保存は、液体窒素の気相で実施される。
【０１２３】
本明細書に記載されるワクチン組成物において使用される免疫隔離同種異系細胞は生きており、好ましくは、選択された免疫調節因子を長期的に（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日間またはそれを超えて）提供する。一実施形態では、免疫隔離細胞は、少なくとも７日間にわたって免疫調節因子を分泌する。
【０１２４】
免疫隔離同種異系細胞は免疫調節因子を天然に産生するか、またはそれらは免疫調節因子を発現するように遺伝子操作され得る。免疫調節因子を通常は産生しない細胞を遺伝子操作することによって、ワクチン組成物は、それを天然に産生する細胞に限定されない。突然変異タンパク質が改善された活性を発揮することがあることは公知であるので、適切な免疫調節因子は、天然に存在するものに限定されない。したがって、免疫調節因子は、野生型タンパク質に代えて改変型のタンパク質であり得る。いくつかの場合では、その分泌を達成するために、細胞は、可溶性の膜タンパク質を分泌するように遺伝子操作される。
【０１２５】
また、細胞を遺伝子改変することによって、免疫調節因子の発現レベルを制御することも可能である。１つの特に魅力的な状況は、使用される細胞において非常に強力であることが公知のプロモーターの制御下にその配列をクローニングすることによる作用物質の過剰発現である。このようにして、改変細胞は、高レベルの免疫調節因子を産生する操作された工場になる。免疫調節物質発現のレベルの制御のために、プロモーターは、その活性にしたがって選択され得る。別の実施形態では、免疫調節因子の遺伝子を天然に含む細胞が使用され得、前記遺伝子は、その特定の細胞において転写的にサイレントである。この状況では、転写は、適切な調節配列の挿入によって、例えば相同組換えによって活性化され得る。物質、光などの特異的刺激に応答する誘導性調節配列も使用され得る。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、免疫調節因子分泌細胞は、１０ｎｇ／細胞１０６個／２４時間を超える免疫調節因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）を分泌し得る。例えば、細胞は、１００ｎｇ／細胞１０６個／２４時間に等しいもしくはそれを超える、または５００ｎｇ／細胞１０６個／２４時間を超える量の免疫調節因子を分泌し得る。１０×１０−１５ｇ／２４時間を超える免疫調節因子、または１００×１０−１５ｇ／２４時間を超える免疫調節因子を分泌する同種異系細胞が使用され得る。例えば、８０〜９６０×１０−１５ｇ／２４時間または５００×１０−１５ｇ／２４時間を超える免疫調節因子を分泌する同種異系細胞が使用され得る。本明細書に記載されるデバイスは、少なくとも２０ｎｇ／カプセル／日を分泌し得る。例えば、デバイスは、５０〜１５０ｎｇ／カプセル／日（例えば、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５または１５０ｎｇ／カプセル／日）を分泌し得る。
【０１２７】
必要であれば、所望の分泌レベルを達成するために、いくつかのカプセル（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを超える）が同時に埋め込まれ得る。
【０１２８】
当技術分野で公知の任意の遺伝子改変方法が、免疫隔離同種異系細胞を遺伝子改変するために使用され得る。例えば、トランスフェクションによって導入される操作されたプラスミドおよび感染によって導入されるウイルスが使用され得る。レトロウイルスは、免疫調節因子をコードする遺伝子を宿主細胞のゲノムに導入するように操作され得るので使用され得る。
【０１２９】
適切な同種異系細胞は、目的の免疫調節因子を天然に産生する細胞に限定されない。むしろ、様々な細胞が使用され得る。好ましくは、細胞は、形質転換またはトランスフェクト、培養および増殖が容易なものである。本明細書に記載されるワクチン組成物ではいずれも、バイスタンダー免疫調節物質産生源として腫瘍細胞を使用する必要は必ずしもない。当業者であれば、異なる細胞型、例えば不死化非腫瘍性線維芽細胞、筋芽細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、線維芽細胞または造血起源の細胞などを利用し得る。適切な細胞型の決定は、当該分野の技能の慣用のレベル内である。
【０１３０】
製造上の理由により、容易に凍結保存され得る非接着性細胞（線維芽細胞または上皮細胞を除く）が使用され得る。安全上の理由により、バイオセーフティーレベル１の細胞のみを試験した。カプセル化を受ける能力について、５つの異なる細胞株：ＣＣＬ２４３、ＣＣＬ２４６、ＣＣＬ２４６．１、ＴＩＢ２０２およびＣＲＬ１５８２を試験した。最終的に、ＣＣＬ２４３（造血起源の細胞）を選択し、続いて、ｈｕＧＭ−ＣＳＦを発現するように遺伝子改変した。ＭＶＸ−１は、遺伝子改変ＣＣＬ２４３細胞株の単一細胞クローニングから得られた細胞株である。最大１８カ月間（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８カ月間まで）の長期保存のために効率的に凍結される能力により、ＭＶＸ−１細胞を装填したカプセルを選択した。機能細胞ベースのアッセイでは、ＭＶＸ−１細胞株によって産生されるＧＭ−ＣＳＦは、市販のＧＭ−ＣＳＦと同等であるとみなされた（以下の実施例６を参照のこと）。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、同種異系細胞は、不死性細胞株または不死化細胞株であり、これらは一度遺伝子改変されたら、本明細書に記載されるすべての組成物および方法に使用され得る。細胞は、生体適合性マクロカプセル内で免疫隔離されているので、それらは宿主の免疫系によって危険にさらされず、不死化細胞の使用は、それらの近傍の他の細胞を危険にさらさない。
【０１３２】
重要なことに、細胞はマクロカプセル化されるので、同種異系細胞または異種細胞が使用され得る。したがって、自己細胞を利用する必要は必ずしもない。ワクチン組成物において使用される細胞は、好ましくは、ヒト細胞である。
【０１３３】
免疫調節因子の供給源はユニークな個体に限定されないので、当業者であれば、細胞を生体適合性マクロカプセル内に免疫隔離することが有利であることを認識し得る。
【０１３４】
マクロカプセル内の同種異系細胞は生きているので、免疫調節物質は、少なくとも数日間（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日間またはそれを超える日数）にわたって継続的に産生される。
【０１３５】
埋め込み（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）
冷凍保存カプセルを解凍し、埋め込み前に少なくとも７日間培養する。１〜４日目には完全培地中で培養を行い、５〜７日目にはペニシリンおよびストレプトマイシンを欠く還元培地中で培養を行う。次いで、７日目に、ＧＭ−ＣＳＦ分泌について、カプセルをアッセイする。埋め込み前に、カプセルをインキュベーター内で維持し、還元培地を含むファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）１５ｍＬチューブに入れ、手術室または埋め込み室に移す。
【０１３６】
適切な埋め込みプロトコールの決定は、当該分野の技能の慣用のレベル内である。
【０１３７】
非限定的な例として、患者は、埋め込み前に局所麻酔薬を投与され得る。医師は、回収縫合糸ループ（例えば、ポリアミド縫合糸ループ）を回収ループに取り付け、１４ゲージ針を使用してカテーテル（例えば、Ｂ  Ｂｒａｕｎ  １４ゲージＶａｓｏｆｉｔカテーテル）を導入し得る。次いで、カプセルをカテーテルに挿入し、挿入器具を使用して、カプセルをカテーテルのバレルの下方に移動させる。次いで、カテーテルを取り外すが、挿入ツールを使用して、取り外しの間にカプセルが皮下の適所に確実に留まるようにする。
【０１３８】
免疫隔離同種異系細胞は、数日間、例えば１２日間未満（例えば、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１日間未満）、例えば４〜１０日間、例えば５〜７日間埋め込まれる。このような短期間にわたる免疫隔離同種異系細胞の埋め込みは、免疫調節因子の放出によって誘導される顕著な線維症をもたらさない。また、ワクチン接種部位における、および／またはマクロカプセル周辺の炎症は、カプセル内における細胞生存率の減少を誘導しないので、その時間枠内における免疫調節因子の産生および放出を妨げない。
【０１３９】
埋め込み前に、マクロカプセルは、例えば、Ｘ線によって放射線照射され得る。放射線照射は、カプセルの破壊が起こった場合であっても、封入細胞が確実に増殖することができないようにする。また、放射線照射は、免疫調節因子の分泌が、放射線照射誘導細胞死により約１０日後に確実に停止するようにする。そして、分泌された免疫調節因子が激しい炎症反応を生じさせる場合、これは有利であり得る。具体的には、ＧＭ−ＣＳＦを分泌するマクロカプセル化免疫隔離同種異系細胞の皮下埋め込みは、１５日間〜１カ月間を超えて埋め込まれた場合に、皮膚壊死を誘導し得る。埋め込み前のカプセルまたは細胞の放射線照射は、その後のカプセルの回収を妨げない。
【０１４０】
特定の実施形態では、２つのカプセルは、約５〜１５ｍｍ離れて（すなわち、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ｍｍ離れて）患者に埋め込まれる。重要なことに、本明細書に記載される治療方法の固有の作用機構により、腫瘍に近接して埋め込みを行うべきではない。カプセルの適切な位置および分離距離の選択は、当該分野の技能の慣用のレベル内である。
【０１４１】
カプセルが患者に埋め込まれる際、それらが埋め込み部位から移動することを防止するために、それらは、ステリストリップなどのパッチで固定され得る。ワクチン接種部位をモニタリングするために、患者の皮膚から突き出る縫合糸を有する埋め込まれたカプセルは、透明パッチでカバーされる。
【０１４２】
ＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１
本明細書に記載されるワクチン組成物、医薬組成物またはキットはいずれも、癌治療との関連で、または癌の処置方法において使用され得る。この製品は、「ＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１」（これは、免疫化の間に物理的に近接する２つの成分から作製される治療用製品（治療用ワクチン）である）と命名されている。
【０１４３】
ＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１系の１つの成分は腫瘍抗原の供給源（すなわち、抗原成分）であり、処置すべき患者から採取された放射線照射自系細胞から作製され、各患者に特異的である。好ましくは、患者組織は、非放射線照射患者から取られる。使用前に、病理学者は、切除腫瘍または癌細胞が切除されたことを確認し得る。固形腫瘍の場合、約５〜１０ｇ（例えば、５、６、７、８、９または１０ｇ）の組織が切除される。
【０１４４】
一実施形態では、１つの成分は、約１×１０６〜約１×１０７個の自系腫瘍細胞（例えば、約４×１０６個の自系腫瘍細胞）を含む。最大抗原曝露を確実にするために、抗原の供給源は、生検、手術または穿刺（ｔａｐ）から得られ得る各患者自身の腫瘍細胞から作製される。
【０１４５】
胸水（または他の液体サンプル）の場合、約１リットルを収集し、液体サンプルを遠心分離し、緩衝液（すなわち、ハンクス平衡塩類溶液）で洗浄し、細胞を計数する。
【０１４６】
固体サンプルの場合、組織を消化するために、ＧＭＰグレードのコラゲナーゼＩＶを使用し得る。あるいはまたは加えて、組織を小片に切断するために、手術用メスによる機械的消化を使用し得る。次いで、得られた組織片をプラスチックバッグに入れ、実験用パドルまたはブレードブレンダーを使用してさらに機械的圧力で消化する。
【０１４７】
次に、消化組織断片を５０ｍＬファルコンチューブに分与し、遠心分離する。上清を廃棄し、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を欠く緩衝液でペレットを洗浄して、コラゲナーゼ（これは、活性のために二価カチオンの存在を必要とする）を不活性化する。次いで、ペレットを再懸濁し、７０μｍメッシュ（これは、単一細胞の通過を許容する）でろ過する。次いで、細胞を再びペレット化し、細胞を計数する。当業者であれば、細胞生存性のためのトリパンブルー試験も実施し得ることを認識し得る。
【０１４８】
細胞懸濁液を得るために、液体または固形腫瘍サンプルのいずれかから得られた細胞を消化し、次いで、液体窒素中で分割保存する前に１００００Ｒａｄ（すなわち、１５〜１５０グレイ（Ｇｙ））で放射線照射する。患者に再注射されている腫瘍細胞のいかなる成長も防止するために、安全対策として放射線照射が実施される。致死的に放射線照射された腫瘍細胞は、最大１２カ月間（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２カ月間まで）の長期保存のために凍結され得る。
【０１４９】
ワクチン接種プロセスが癌分野において使用される場合、抗原成分は、腫瘍細胞全体である。いくつかの抗原は同じ系統からの多くの腫瘍上に存在するので、腫瘍細胞は同種異系のものであり得る。しかしながら、腫瘍細胞は、患者に対して自系である。
【０１５０】
放射線照射自系細胞は、単回ワクチン接種のための適切な用量に等分され得る。好ましくは、微生物学的な、マイコプラズマおよび／またはエンドトキシンのスクリーニングのために、上清を貯蔵する。次いで、個々のアリコートをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で冷凍保存し得る。埋め込み前に、ＤＭＳＯを洗い流し得、少量の懸濁液を調製し得る。非限定的な例として、４×１０６個の細胞のＨＢＳＳ溶液５００μｌを調製し得る。
【０１５１】
すべての患者に共通するＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１の他の成分は、免疫調節因子プロバイダーである。この成分は、免疫調節因子を分泌する免疫隔離同種異系細胞を含む少なくとも１つの回収可能な生体適合性マクロカプセルを含む。一実施形態では、マクロカプセルは、少なくとも２０ｎｇ／２４時間のＧＭ−ＣＳＦ（例えば、２０〜５００ｎｇ／２４時間）を分泌する約１×１０５〜約１×１０６個の免疫隔離同種異系細胞（例えば、約８×１０５個の細胞）を含む。様々な実施形態では、免疫隔離同種異系細胞は、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００ｎｇ／２４時間またはそれを超えるＧＭ−ＣＳＦ）を分泌する。
【０１５２】
ＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１ワクチン組成物では、カプセル化細胞は、免疫刺激分子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）を分泌するように遺伝子操作され、ワクチン接種部位において強力な免疫刺激シグナルを産生および分泌する免疫隔離バイオリアクターとして機能する。現在のところ、ＧＭ−ＣＳＦは、抗腫瘍免疫応答を生成するための最も強力な免疫刺激分子である。したがって、カプセル化細胞は、ＧＭ−ＣＳＦのみを分泌するように遺伝子操作され得る。しかしながら、相乗作用研究に応じて、容易に他の免疫調節分子を追加しまたはＧＭ−ＣＳＦと置き換え得る。例えば、他のサイトカイン、例えばＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−４、インターフェロンガンマ、ケモカインまたは樹状細胞成長因子、ＩＬ−３、ＩＬ−９、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＦＮγの膜貫通受容体、可溶性または膜性幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＦＬ（Ｆｌｔ３リガンド）、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＩＭ−３、ＧＩＴＲ、ＴＩＭ−３  ＧＩＴＲ、ＬＡＧ−３、Ｖｉｓｔａ、ＢＴＬＡ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ１３７（４１ＢＢとしても公知である）、ＣＤ２７およびそれらの任意の組み合わせを追加し、またはＧＭ−ＣＳＦと置き換え得る。
【０１５３】
本明細書に記載される癌ワクチン組成物の２つの成分は、近接または接触して患者の皮膚下に配置される。例えば、放射線照射自系細胞を含む溶液が、２つのマクロカプセル間に埋め込まれ得る。いくつかの実施形態では、免疫学的に平静な（ｕｎ−ｄｉｓｔｕｒｂｅｄ）位置においてワクチン接種を実施するために、成分は、原発腫瘍または転移から遠隔の部位に埋め込まれる。しかしながら、いくつかの実施形態では、ワクチン組成物を腫瘍の近傍に投与することも可能である。
【０１５４】
埋め込みの５〜７日後、カプセルは、例えば、それに取り付けられたフック、テザーまたは糸を使用して除去される。抗原成分は除去されない。むしろ、それは徐々にプロセシングされ、天然に存在する機構を介して患者の免疫系によって除去される。
【０１５５】
Ｏｎｃｏ−Ｍａｘｉ−Ｖａｘによるワクチン接種処置は、反復免疫化を伴う。フレキシブルなワクチン接種スケジュールを維持することが重要である。例えば、ワクチン組成物は、４週間にわたって皮下投与され得、続いて、２週間ごとに２回追加免疫化され得る。反復免疫化は、患者の体の同一または同様の位置において行われ得る。１つのプロトコールでは、４つの異なる埋め込み部位が用いられ（例えば、両腕および両大腿）、ワクチンの埋め込みは、処置の経過の間に各部位全体でローテーションされる。
【０１５６】
癌治療に使用される場合、自系腫瘍細胞の用量は、患者から採取された細胞の量に応じて調整され得る。試験に必要な細胞（すなわち、２８×１０６個）に加えて、免疫化１回当たり約１０６〜１０７個の細胞とすることが推奨される。自系腫瘍細胞の用量の決定および／または調整は、当該分野の技能の慣用のレベル内である。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、抗原成分の供給源である腫瘍細胞と、免疫調節成分の供給源である免疫隔離同種異系細胞とは異なり、腫瘍細胞は、採取および／または放射線照射以外の操作が不要であるので、過去のワクチン接種戦略に対して有利である。
【０１５８】
この抗腫瘍免疫化は、広範な腫瘍型に対して実施され得る。上記のように、カプセル化免疫隔離同種異系細胞は、あらゆる患者について同一である。しかしながら、抗原成分は患者に固有であり、固形原発腫瘍から、転移から、および／または腫瘍細胞を含む流体（胸膜、腹膜、骨髄または血液）から採取され得る腫瘍細胞から得られ得る。
【０１５９】
臨床腫瘍学では、ほとんどの患者は、原発腫瘍または転移性病変を示す。しかしながら、すべての腫瘍または転移が等しく処理容易なわけではない。したがって、試験される腫瘍型は、実行可能性の点で様々な基準を満たす必要がある。採取され得る原発腫瘍を有する可能性が高い癌としては、限定されないが、グリア芽細胞腫などの中枢神経系腫瘍；肺腫瘍（非小細胞肺癌）；前立腺腫瘍；胃癌腫；乳癌腫；リンパ腫；膵臓癌腫；肝細胞癌腫（肝腫瘍）；結腸癌腫；腎細胞癌腫；卵巣癌腫；子宮癌腫；肉腫（軟組織）；白血病（リンパ節または血液）；および／または多発性骨髄腫（血液、骨髄、リンパ節、軟組織）が挙げられる。
【０１６０】
採取され得る転移を有する可能性が高い癌は、転移の位置に依存する。技術的な理由により、骨転移を採取することは他の位置よりも困難である。これらの癌としては、限定されないが、頭頸部癌腫（リンパ節転移）；肺癌（肺、肝臓、軟組織、脳、副腎転移）；前立腺（非骨転移）；乳癌腫（肺、肝臓、軟組織、胸膜液）；胃癌腫（肝臓）；膵臓癌腫（肝臓）；結腸癌腫（肝臓）；メラノーマ（肺、リンパ節、軟組織、肝臓、脳）；腎細胞癌腫（肺、肝臓）；卵巣癌腫（腹水または胸膜液、肝臓）；胚腫瘍（肺）；および／または膀胱癌腫（肝臓、リンパ節）が挙げられ得る。
【０１６１】
本明細書に記載されるワクチン組成物、医薬組成物およびキットはいずれも、癌に対する治療免疫化のために、または癌の処置方法において使用され得る。非限定的な例として、処置される癌としては、限定されないが、肺癌、メラノーマ、乳癌、結腸癌、膵臓癌、腎臓癌、急性白血病、慢性白血病、グリア芽細胞腫、低悪性度リンパ腫、高悪性度リンパ腫、多発性骨髄腫、肉腫、骨癌、脳腫瘍、胃癌、食道癌、頭頸部癌、甲状腺癌、膀胱癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮癌、脊索腫および子宮頸癌が挙げられ得る。
【０１６２】
ワクチン接種後、腫瘍進行は、当技術分野で公知の任意の方法を使用してモニタリングされ得る。例えば、ＣＴスキャンなどのイメージングは、固形腫瘍効果判定（ＲＥＣＩＳＴ）基準または免疫関連応答基準（ｉｒＲＣ）などの有効なツールに基づいて、腫瘍体積の変化を記録するために使用され得る。同様に、限定されないが、ＣＡ１５３、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＮＳＥ、ＣＡ１２５を含む血清学的腫瘍マーカーがモニタリングされ得る。
【０１６３】
可能な限り、腫瘍構造の任意の変化を記録するために、転移の外科的切除が試行される。二次元測定による古典的な腫瘍評価は、免疫化処置の潜在的な有効性を評価するための最良の評価方法ではない可能性があることが十分に記載されている。腫瘍細胞の破壊は非常に効率的であり得、放射線検査における検出可能なサイズ変化を伴わずに、線維細胞または炎症細胞で置き換えられ得る。この状況では、ＰＥＴスキャンによる評価としての代謝活性が適切であり得る。免疫化後の腫瘍病変の分析は、処置によってターゲティングされる腫瘍抗原候補の特性評価などの免疫学的分析のために非常に重要である。
【０１６４】
ＩＡ−Ｍａｘｉ−Ｖａｘ
別の実施形態では、本明細書に記載されるワクチン組成物はいずれも、様々な感染性疾患に対する治療的または予防的免疫化との関連で使用される。この製品は、「ＩＡ−Ｍａｘｉ  Ｖａｘ」（感染因子）と称される。
【０１６５】
ＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１のように、「ＩＡ−Ｍａｘｉ−Ｖａｘ」は、物理的に近接した２つの成分から作製される治療用または予防用製品（ワクチン）として使用され得る。
【０１６６】
ＩＡ−Ｍａｘｉ−Ｖａｘでは、抗原成分は、感染因子由来の１つまたはそれを超える成分を含む。したがって、特定の感染症を患っているかまたはそれを発症するリスクを有する患者はすべて、同じ製品で処置される。ウイルス、細菌、寄生生物または真菌病原体によって引き起こされる感染性疾患において、多くの公知の抗原成分が記載されており、免疫化戦略に現在使用されている。これらの抗原はいずれも、不活性化病原体、感染因子の溶解物、タンパク質抽出物、組換えタンパク質、ペプチド、ＤＮＡまたは他の形態として使用され得る。いくつかの症状では、感染因子または宿主の病状に応じて、免疫化は弱いかまたは非防御性であり、有意な罹患率または死亡率につながる。
【０１６７】
ＩＡ−Ｍａｘｉ−Ｖａｘワクチン組成物では、ワクチンの１つの成分は、所定の感染因子のための抗原の組み合わせまたは抗原のプールを含む。ＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１と同様に、ＩＡ−Ｍａｘｉ−Ｖａｘの他の成分は、ＧＭ−ＣＳＦを分泌する免疫隔離同種異系細胞を含む少なくとも１つの生体適合性マクロカプセルである。
【０１６８】
「ＩＡ−Ｍａｘｉ−Ｖａｘ」によるワクチン接種処置は、異なる皮下部位における反復免疫化を伴う。ワクチン接種の総回数は、プロトコールおよび投与量に依存し、具体的な各症例において調整されなければならない。例えば、ワクチン接種は、少なくとも２週間（例えば、２、３、４、５、６、７週間またはそれを超える）にわたって週１回の注射を必要とし得る。投与量の決定および／または調整は、当該分野の技能の慣用のレベル内である。
【０１６９】
「ＩＡ−Ｍａｘｉ−Ｖａｘ」を使用して予防または処置され得る症状の例としては、限定されないが、以下のものが挙げられる：
・ウイルス感染症：
標的：様々な病期のＨＩＶ患者（初期ステージは、より強力な免疫系を有するより良好な候補であり得る）
標的：特定の症状におけるＣＭＶ感染症（臓器移植の前または後）
標的：再発性ヘルペス感染症
Ｂ型肝炎またはエプスタイン・バーウイルス
Ｃ型肝炎
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）
・細菌感染症：
標的：マイコバクテリア感染症は、ＨＩＶ患者などの特定の集団である
標的  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉは、胃潰瘍または胃炎の大部分の原因因子である。
・寄生生物感染症：
マラリア、トキソプラズマ、ニューモシスチス、エキノコッカス（Ｅｃｈｉｎｏｃｃｕｓ）
・真菌感染症：
カンジダ、アスペルギルス
【０１７０】
遅延型過敏症（ＤＴＨ）
遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応は、単核白血球によって誘発される炎症反応である。遅延という用語は、抗原曝露の４８〜７２時間後に現れる二次細胞応答と、抗原チャレンジの１２分以内に一般に現れる即時型過敏性反応とを区別するために使用される。これらの反応は、抗体ではなくＴ細胞および単球／マクロファージによって媒介される。それらはまた、ＩＶ型過敏性反応と称される。
【０１７１】
腫瘍免疫療法との関連では、ＤＴＨ試験は、非罹患皮膚に皮内注射される放射線照射自系腫瘍細胞を用いて実施される。２４時間および４８時間の時点で、局所炎症反応の存在および規模は、肥厚表皮のサイズを評価することによって記録される。ＤＴＨは、ＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１治療前、ＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１治療中およびＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１治療後に実施される。
【０１７２】
通常、処置中および／または処置後に陰性処置前ＤＴＨが陽性ＤＴＨに変わる患者は、本明細書に記載されるワクチン組成物によって、より良好な転帰を示す傾向がある。その結果、ワクチン接種前にＤＴＨ＋応答について患者を試験することが有用である。ＤＴＨ＋応答試験は、少なくとも３×１０６個の細胞（ワクチン接種前に１×１０６個の細胞；５〜６週目に１×１０６個の細胞；およびワクチン接種後１２週目に１×１０６個の細胞）を必要とする。
【０１７３】
好ましくは、ＤＴＨ応答は、カプセル埋め込み部位とは反対の身体部位で試験される。
【０１７４】
適切な投薬スケジュールおよび／または埋め込み部位の決定は、当該分野の技能の慣用のレベル内である。投薬スケジュールの非限定的な一例は、以下の表に示されている：
【表１】
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【０１７５】
十分なワクチン接種および試験プロトコールのために、少なくとも２８×１０６個またはそれを超える細胞が必要である：
ワクチン接種のために６×４×１０６個の細胞；
ＤＴＨ試験のために３×１×１０６個の細胞；ならびに
０．５×１０６個の放射線照射細胞および０．５×１０６個の非放射線照射細胞（これらを１０日間培養して計数する）。放射線照射アリコートの細胞は、０．５×１０６個未満でなければならない。細胞が適切に放射線照射されたことを保証するために、この試験は実施される。
【０１７６】
医薬組成物およびキット
本明細書に記載されるワクチン組成物を含む医薬組成物およびキットも本明細書で提供される。これらの製品はすべて、デバイスの「万能（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）」特徴により大量生産が容易であるので、工業生産に特に適切である。同種異系細胞は免疫隔離されているので、同じカプセル化細胞は、すべての患者に適切である。ワクチンまたは医薬組成物の複数回注射が必要とされる癌治療では、この「万能」特徴は特に興味深い。
【０１７７】
本発明の医薬組成物は、生理学的および／または薬学的に許容され得る担体と組み合わされた医薬組成物を含む。当技術分野で公知の任意の適切な生理学的または薬学的に許容され得る担体が使用され得る。このような組成物はまた、細胞の生存のために、および投与または埋め込みの成功のために必要な任意の医薬添加物を含有し得る。
【０１７８】
使用説明書と一緒に、本明細書に記載されるワクチン組成物を含むキットが本明細書で提供される。
【０１７９】
治療的および／または予防的ワクチン接種において使用するためのワクチン組成物、医薬組成物およびキットのいずれかの使用、ならびに本明細書に記載されるワクチン組成物、医薬組成物および／またはキットのいずれかを使用した治療的および／または予防的ワクチン接種の方法も本明細書で提供される。例えば、ワクチン接種は、癌の治療的ワクチン接種または感染因子に対する治療的もしくは予防的ワクチン接種であり得る。癌の免疫化では、患者は、典型的には、処置前に疾患を患っている。感染因子の免疫化では、患者は、疾患もしくは障害を患っているか、またはそれらを発症するリスクを有する。
【０１８０】
好ましくは、被験体はヒト患者であるが、動物も企図される。予防的免疫化は、良性疾患のような場合に好ましく、または例えば重篤な流行病の場合に必要であるので、被験体は、様々な理由によりワクチン接種を必要とし得る。
【０１８１】
遅かれ早かれ患者は抗原成分と接触するので、感染因子のワクチン接種は予防的であり得る。同様に、患者は抗原成分と既に接触していたが、自身では十分な免疫応答を発生させることができないので、感染因子の免疫化は治療的でもあり得る。
【０１８２】
所望のワクチン接種の性質に応じて、異なるワクチン接種プロトコールが使用され得る。両成分の投与は、同時に、別個にまたは逐次に行われ得る。投与を時間的に切り離すことが有利であり得る。実際、同種異系細胞は、生体適合性マクロカプセル中で免疫隔離されているので、それらは、典型的には長期持続性効果を有する。対照的に、抗原成分は、宿主の免疫系によって非常に迅速にプロセシングおよび排除される可能性が高い。このような事例では、成分の投与が切り離される場合、抗原成分の投与は、免疫隔離同種異系細胞の単回投与で反復され得る。
【０１８３】
最適な効果を生じさせるために、抗原性因子および免疫調節因子は共局在しなければならない。
【０１８４】
最適化免疫化プロセスでは、投与は、規則的な間隔で数回反復される。例えば、予防的または治療的ワクチン接種が癌の治療またはワクチン接種である場合、規則的な間隔は、４週間にわたる週１回の注射とそれに続く２週間ごとに隔週２回の追加免疫化である。同様に、予防的または治療的ワクチン接種が感染因子の治療またはワクチン接種である場合、規則的な間隔は、２週間にわたる週１回の注射である。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、皮下位置は樹状細胞が豊富であるので、ワクチン組成物はこの領域に投与される。しかしながら、当業者であれば、投与が皮内的に、または予想免疫応答を促す可能性が高い他の任意の位置において行われ得ることを認識し得る。例えば、投与組成物は注射され得、摂取され得、埋め込まれ得、適用され得、または任意の他の投与手段であり得る。
【実施例】
【０１８６】
本発明を説明してきたが、以下の実施例は、限定ではなく例示目的で提供される。
【０１８７】
実施例
実施例１：いかなる標準治療も不適またはもはや不適の固形腫瘍患者におけるＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１の安全性および忍容性を評価する非盲検第Ｉ相臨床試験（臨床試験ＮＣＴ０２１９３５０３）
目的：
研究の目的は、進行中の進行性転移性固形腫瘍を有する患者であって、彼らの腫瘍疾患のいかなる標準治療も不適またはもはや不適の患者に皮下投与（注射およびカプセル埋め込み）したＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１（臨床グレードのカプセル化細胞療法（ＥＣＴ）製品）の６回のワクチン投与の安全性および忍容性を評価することであった。
【０１８８】
評価項目：
研究の主要評価項目は、有害かつ重篤な有害事象（発生率、因果関係、重症度）、施された治験処置に対する局所耐性および全身耐性、固形腫瘍患者における検査値および生命徴候の変化を含む安全性および実行可能性パラメータを評価することであった。研究の副次的評価項目は、臨床活性および免疫モニタリングを評価する（例えば、イメージング技術、血清学的腫瘍マーカーおよび代謝モニタリングを使用していくつかの腫瘍応答を測定する）ことであった。
【０１８９】
研究デザイン：
これは非盲検第Ｉ相試験であり、難治性のまたは標準化学療法に不適の進行性固形腫瘍を有する１５人の患者が含まれていた。
【０１９０】
倫理的な理由により、この研究のための腫瘍材料を得ることを唯一の目的として外科手術を実証することは許容不可能である。したがって、悪性細胞を含む液体を除去するために肋膜穿刺もしくは腹水穿刺を受けている患者、または臨床プロトコールに関係のない医学的な理由により必要であった手術を受けている患者からのみ、腫瘍材料は入手可能であった。
【０１９１】
腫瘍組織の調達：術前および手術
患者は、術前および臨床インフォームドコンセント用紙に署名し、自系腫瘍細胞ワクチンの生産のために余分な腫瘍組織を使用および操作することを許可した。
【０１９２】
外科的および組織病理学的な記録
手術室で、または腫瘍細胞にアクセスする滅菌手順によって、患者の自系細胞を採取した（腹水穿刺、胸水、骨髄、ＣＴガイド生検）。細胞採取の手術報告は、疾患の程度、および標本と共に隣接器官が摘出されたか否かについての具体的な言及を伴う手術所見の記載を含んでいた。
【０１９３】
解離および自系腫瘍細胞ワクチンの製造
個々の各患者から得られた組織に対して、ワクチン調製のための腫瘍細胞の処理を行った。ＬＴＣ標準操作手順（ＳＯＰ）にしたがって無菌技術を厳密に遵守した現行の医薬品適正製造基準（ｃＧＭＰ）条件下で、解離およびワクチン用量の製造を行った。プロセスが完了したら、細胞を凍結し、専用タンクの液体窒素の気相中に保存した。
【０１９４】
処置および短期経過観察
腫瘍沈着から離れた健常皮膚において、免疫化を実施した。４×１０６個の放射線照射自系腫瘍細胞と、７日間にわたって２０ｎｇ／２４時間を超えるｈｕＧＭＣＳＦを産生するように遺伝子操作した８×１０５個のＭＶＸ−１細胞をそれぞれ含む２つのマクロカプセルとを組み合わせた６回の皮下（ｓｃ）免疫化（１−２−３−４−６−８週目）で、患者を処置した。
【０１９５】
適格患者は、研究１日目（ＳＤ１）から４週間にわたってワクチン処置を毎週受け、続いて、２週離してで２回の追加注射を受けた。研究１８週目の終了時（完全ワクチン接種サイクルのための９週間＋経過観察の９週間）において、安全性および有効性の分析を実施した。ベースライン時において、ならびに６週目、１２週目および１８週目において、腫瘍サイズを評価した。
【０１９６】
７日後にマクロカプセルを除去し、ｈｕＧＭ−ＣＳＦ産生について分析した。
【０１９７】
長期経過観察
研究１日目（ＳＤ１）以後死亡または５年目のいずれか早い方まで、安全性について患者を経過観察する。また、重大なプロトコール違反、管理不良の重篤な合併症または重篤な有害事象、プロトコール不履行または管理上の理由によＺＷ、患者は研究から除外した。
【０１９８】
研究対象集団：
研究対象集団には、進行中の進行性転移性固形腫瘍を有する患者であって、彼らの腫瘍型のいかなる標準治療も不適またはもはや不適の患者が含まれていた。
組み入れ基準：
・すべての認められている処置が尽きたか、または実行不可能な様々な部位の進行中の進行性転移性癌［肺（小細胞または非小細胞のいずれか）、結腸、乳房、膵臓（外分泌または内分泌）、胃、食道、頭頚部、甲状腺、腎臓、膀胱、前立腺、卵巣、子宮（子宮頸部または子宮体部）の癌腫；軟組織、骨、子宮の肉腫、メラノーマ；原発脳腫瘍］を有する１８歳またはそれを超える年齢の男性患者または女性患者
・平均余命：少なくとも４カ月間の推定
・一般状態グレード０〜２（ＷＨＯ悪性度分類）
・重大な肝機能障害なし（ＡＬＴが正常範囲の上限の２．５倍未満であり、ビリルビンが正常範囲内である（例外：肝転移：ＡＬＴがＵＬＮの５倍未満である；ビリルビンがＵＬＮの３倍未満である）
・重大な腎機能障害なし（クレアチニンが正常範囲の上限の１．５倍以下である）
・重大な骨髄機能障害なし（ヘモグロビンが９．０ｇ／ｄｌ超であり、ＷＢＣが２．５×１０９／Ｌ超であり、好中球が１．５×１０９／ｌ以上であり、血小板が５０×１０９／ｌ以上である）
・原発腫瘍および／または転移が部分的／全体的な手術または穿刺に適したものであり、その後の細胞採取推定値が細胞２７×１０６個超である
・臨床試験のコンセプトを理解する能力
・患者情報用紙およびインフォームコンセント用紙を理解することができる
・書面によるインフォームドコンセントの提出
除外基準：
・前４週間において他の治験研究に参加していたか、または研究を妨げると考えられる実験的治療手順を受けていた
・前４週間において化学療法処置を受けていた
・重篤な合併症
・治癒目的で処置され、完全寛解が５年間未満であった二次癌の病歴
・通常の薬物療法によって管理されない癌以外の全身性疾患を有する患者
・未処置の脳転移（無症候性患者であってもスクリーニングＣＴまたはＭＲＩが必須）。脳転移の病歴を有する患者であって、スクリーニング時において手術／放射線療法後に脳再発の証拠がない患者は参加することができる
・３０ｍｇ／日を超えるかまたはそれに等しいコルチゾンの慢性免疫抑制処置（ステロイドを含む）
・クマリンまたは連続静脈内ヘパリンによる抗凝固治療。皮下埋め込みの数時間前に処置を差し控えることができる限り、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）は許容される
・陽性ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１、Ｂ型肝炎表面抗原またはＣ型肝炎抗体
・妊娠もしくは授乳しているか、または適切な避妊（手術、ホルモンまたは二重障壁、すなわちコンドームおよびペッサリー）を使用していない出産可能な女性
・ペニシリン、ストレプトマイシンのような研究製品（ＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１）中の試薬に対する既知のアレルギー。
【０１９９】
治験医薬品（ＩＭＰ）：
製造上の理由により、容易に凍結保存され得る非接着性細胞（線維芽細胞または上皮細胞を除く）を使用することができる。安全上の理由により、バイオセーフティーレベル１の細胞のみを試験した。カプセル化を受ける能力について、５つの異なる細胞株：ＣＣＬ２４３、ＣＣＬ２４６、ＣＣＬ２４６．１、ＴＩＢ２０２およびＣＲＬ１５８２を試験した。最終的に、ＣＣＬ２４３（造血起源の細胞）を選択し、続いて、ｈｕＧＭ−ＣＳＦを発現するように遺伝子改変した。ＭＶＸ−１は、遺伝子改変ＣＣＬ２４３細胞株の単一細胞クローニングから得られた細胞株である。
【０２００】
ＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１は、活性特異的免疫療法（ＡＳＩ）（腫瘍細胞に対する患者の免疫応答を刺激および／または増大するプロセス）の一形態である。
【０２０１】
ＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１は、
ａ．免疫保護マクロカプセル化遺伝子改変同種異系細胞株（ＭＶＸ−１）から放出される免疫調節物質（ＧＭ−ＣＳＦ：顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子）、および
ｂ．抗原の供給源としての放射線照射自系腫瘍細胞
から構成される細胞ベースの患者特異的免疫療法である。
【０２０２】
最大１８カ月間（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８カ月間まで）の長期保存のために効率的に凍結される能力により、ＭＶＸ−１細胞を装填したカプセルを選択した。ＭＶＸ−１細胞を装填したマクロカプセルを処理し、凍結保存する。
【０２０３】
ワクチン投与：
１回の埋め込みは、７日間にわたって安定量の（２０ｎｇ／２４時間を超える）ＧＭ−ＣＳＦを放出するように遺伝子操作したＭＶＸ−１細胞株と、最低４×１０６個の自系腫瘍細胞とを含む２つのマクロカプセルから構成されていた。
【０２０４】
優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）条件で、すべての治療用製品を処理した。
【０２０５】
投与：
局所麻酔下で、２つのマクロカプセルを平行して１ｃｍ離して皮下に埋め込んだ。放射線照射自系細胞を２つのカプセル間に皮下注射した。最低２７×１０６個の放射線照射自系腫瘍細胞（４×１０６個の細胞による６回のワクチン＋１×１０６個の細胞による３回の遅延型皮膚過敏症試験）が利用可能である場合にのみ、患者を処置した。
【０２０６】
投与量およびスケジュール：
抗原装填の最適量に関する文献には、データが存在しなかった。したがって、この最初の臨床試験では、腫瘍細胞数を増加させなかった。安定疾患または部分応答／完全応答のいずれかを示す試験患者については、最初の６回の注射後に自系細胞が依然として利用可能である場合には、長期免疫化を月１回提供した。
【０２０７】
ヒトＧＭ−ＣＳＦを産生する８×１０５個のＭＶＸ−１細胞をそれぞれ装填した２つの生体適合性マクロカプセルと、４×１０６個の放射線照射自系腫瘍細胞の皮下注射とを４週間にわたって週１回投与した。２回の追加投与を２週間ごとに与えた。埋め込みの７日後（すなわち、埋め込み第８日目）、マクロカプセルを外植した。
【０２０８】
データ分析および統計：
最後の参加患者が１８週目（Ｗ１８）の評価を完了したら、データ管理および統計分析を行った。すべての有効性パラメータを記述的に分析した。患者の生存曲線に応じて、補足分析を規則的な間隔で行った。
【０２０９】
スクリーニング段階で評価した患者の特徴を目視比較のために集計した。定量的変数については、以下の記述統計を示した：Ｎ、平均、標準偏差、最小値、中央値および最大値；定性的変数については、患者の頻度および割合を提供した。
【０２１０】
ベースラインで、以下のパラメータを記載した：
・患者人口統計
・診断、疾患活動性の状況、以前の処置を含むベースライン疾患特徴。
・治療を含む二次症状。
・病歴。
・過去および併用の薬
【０２１１】
予測集積：
安全上の理由により、１番目の患者が最初の４つのワクチンを服用した後にのみ、２番目の患者はワクチン接種を受けた。２番目の患者が彼らの最初の４つのワクチンを服用した後にのみワクチン接種を受けた３番目の患者について、同じ待機／観察期間を観察した。続いて、隔週で１人の参加者を集積平均した（１２人の患者でさらに２４週間）。
【０２１２】
患者による研究期間：
スクリーニング＋細胞採取＋ワクチン用量の製造（２週間）＋１回の完全ワクチン接種処置（９週間）＋経過観察（９週間）：約６カ月間。
【０２１３】
研究フローチャートの概要は、以下の表に示されている：
【表２】
2018529706.tif 000003
【０２１４】
結果：
治療試験に含まれる１５人の患者全員を処置した。臨床試験のＧＭＰおよびＳＯＰにしたがって、各患者のＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１を成功裏に製造し、ＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１のエンドトキシンおよび／またはマイコプラズマに関する細菌試験はすべて陰性であった。
【０２１５】
調製した治療用ワクチン組成物はいずれも、品質上の懸念により廃棄しなければならないものはなかった。
【０２１６】
ＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１で処置される癌型としては、卵巣、頭頸部、膵臓、前立腺、結腸直腸が挙げられる。これまでに、７７個のワクチンを投与した。
【０２１７】
皮下埋め込み前の装填済カプセルからのＧＭ−ＣＳＦ分泌のレベルは、すべての場合において指定限界内であった。加えて、皮下に埋め込んだマクロカプセルはすべて、埋め込みの７日後に成功裏に除去した。除去後、その後のＧＭ−ＣＳＦ放出についてすべてのマクロカプセルを試験したところ、すべてが安定な高レベルの分泌を示した。除去後、１つのカプセルが壊れた。
【０２１８】
この試験との関連では、疑われる予想外の重篤な有害反応（ＳＵＳＡＲ）は観察されなかった。また、重篤な有害事象（ＳＡＥ）または全身有害事象（ＡＥ）は、ＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１製品との関係で報告されなかった。むしろ、すべてのＳＡＥは、疾患進行に関係していた。２２件の関連ＡＥが報告されたが、いずれも重篤ではなかった。６件は、マクロカプセルの小欠陥によるものであり、１件のグレード２の埋め込み部位外傷および５件のグレード１の埋め込み部位外傷をもたらした。１６件の報告された重篤ではない薬物関連薬物有害反応のうち、１２件はグレード１の埋め込み部位血腫であり、３件はグレード１の微熱であり、１件はグレード３の血管迷走神経反応であった。ワクチン接種部位におけるグレード１〜２の局所ＡＥは、埋め込み中の痛み、局所の不快感、および／または限定的な炎症を含んでいた。
【０２１９】
実行可能性の結果の概要は、以下に示されている：
【表３】
2018529706.tif 000004
【０２２０】
したがって、この研究の結果は、ＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１製品が安全でありかつ非常に忍容性良好であることを示しており、これらの結果は、臨床グレードのＩＭＰの製造およびこの革新的戦略による患者の処置が実行可能であることを示している。加えて、ＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１製品はまた、９９．５％ＧＭＰグレードのＩＭＰとしてロバストである。
【０２２１】
短期経過観察の終了時（１８週目）において、６人の患者（４０％）が生存しており、９人が死亡（６０％）した。長期経過観察では、４人の患者が死亡し、２人の患者が生存していた。全生存期間（ＯＳ）は、４６日間〜４４１日間の範囲であった（平均：１９９日間（ＳＤ：１２１日間）、中央値１３４日間）。ＲＥＣＩＳＴ  １．１．基準によれば、１５人の患者のうち２人（１３．３３％）は部分応答を示し、６人（４０．００％）は、任意の時点における最良の全体反応として安定疾患を示した。
【０２２２】
有効性の結果の概要は、以下に示されている：
【表４】
2018529706.tif 000005
【０２２３】
結論：
ヒトにおけるこの最初の試験により、この細胞ベースの新規な患者特異的免疫療法の非常に優れた安全性プロファイルおよび実行可能性が実証された。また、副次的評価項目により、進行中の進行性難治性固形悪性腫瘍を有する患者の相当割合について臨床的利益が示された。免疫モニタリングパラメータの早期分析は、ＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１による免疫化時に、自身の腫瘍細胞に対して遅延型過敏症反応を誘導することができる患者が、より良好な生存を有する傾向があることを示している。加えて、長期部分応答を有する１人の患者におけるＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１による免疫化前、免疫化中および免疫化後のリンパ球サブセットの予備分析により、抗原特異的免疫応答が示された。
【０２２４】
いくつかの腫瘍型（例えば、進行性膵臓癌腫、卵巣癌腫および／または頭頸部扁平上皮癌腫）および免疫チェックポイント調節物質との併用療法において、ＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１を用いた第２相試験が計画されている。例えば、以下の第ＩＩａ相臨床試験（コントロールアームなし）が企図されている：
−頭頸部癌におけるＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１
−肺癌における単剤としてＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１
−タキソールおよびカルボプラチンの標準的な第１選択療法後に再発した後の卵巣癌における有効性を改善するためのアジュバントとして、化学療法と組み合わせたＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１
−膵臓癌における単剤としてＭＶＸ−ＯＮＣＯ−１
【０２２５】
以下の理由により、頭頸部癌に関する臨床試験が企図されている：
−これらの腫瘍から細胞を容易に採取することができる、
−典型的には、この癌は予後不良（６カ月未満）である、
−それらは頻繁に生じる癌である、
−これらの腫瘍はＰＤ１／ＰＤＬ−１応答性であり、そしてそれ故、それらは免疫原性腫瘍である
【０２２６】
これらの研究の評価項目は、６カ月時点における全生存率である。
【０２２７】
実施例２：自系腫瘍細胞の採取（抗原装填）
処置すべき患者から腫瘍塊（原発病変または転移）を外科的に採取した。採取した材料の悪性性質を確認するために、前記塊の一部に対して、標準的な病理学検査を実施した。次いで、単一細胞懸濁液を得るために、それを処理した。機械的方法および酵素的方法の両方によって、これを実施した。
【０２２８】
最初に、解剖顕微鏡を使用して腫瘍塊をより小さな片に切断し、次いで、様々な酵素（コラゲナーゼ）を含む滅菌溶液を含む滅菌バッグに腫瘍を入れた。バッグを細胞混合器（Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ  Ｌａｂ  Ｓｙｓｔｅｍ）に挿入し、生成物を細胞懸濁液に処理した。３７℃で数時間にわたる酵素的活性および機械的活性の組み合わせは、腫瘍の細胞外マトリックスの効率的な解離を可能にし、それを単一細胞懸濁液にした。無血清溶液中で、これを実施した。
【０２２９】
次いで、４℃、５分間、７００ｒｐｍで冷却遠心機（Ｓｏｒｖａｌｌ）を使用して、ＨＢＳＳで細胞を３回洗浄し、ＨＢＳＳに再懸濁した。次いで、トリパンブルー（Ｆｌｕｋａ）溶液およびＮｅｕｂａｕｅｒチャンバーを使用して、細胞を計数した。
【０２３０】
選択濃度で細胞を再懸濁し、臨床用途専用の照射器によって１００００ｒａｄで放射線照射し、等分し、１０％ＤＭＳＯを含む凍結培地で凍結した。
【０２３１】
実施例３：免疫隔離サイトカインプロバイダー
ａ）ＧＭ−ＣＳＦ産生細胞の作製。
カプセルに導入されるべき細胞は、（ヒト細胞株から得られた）同種異系であった。不測の毒性を防止するために、臨床プロトコールにおいて既に承認されている細胞株、例えば不死化線維芽細胞または筋芽細胞を使用した。最初に、ヒトＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡをこれらの細胞に安定トランスフェクトした。
【０２３２】
２つのトランスフェクション方法を使用した：レトロウイルスおよびエレクトロポレーション。レトロウイルストランスフェクションでは、ｈＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡをＭＦＧレトロウイルスベクターにインフレームで挿入し、ウイルスのＬＴＲによって転写を駆動した。プラスミドは、いかなる選択マーカーまたは抗生物質耐性遺伝子も含んでいなかった。
【０２３３】
エレクトロポレーションによるトランスフェクションでは、ｈＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡはＣＭＶプロモーター下にあり、プラスミドは、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を含む。
【０２３４】
トランスフェクションのための異なる種類の細胞および異なるＧＭ−ＣＳＦプラスミドも使用することができるので、地元の衛生局の規制に対してより柔軟性がある。
【０２３５】
標準的な技術を使用して、５％ＣＯ２、無血清培地中で、サイトカイン産生細胞を３７℃で培養した。以下のように採取を実施した：１０ｃｍ培養プレート中のコンフルエントな接着性細胞の上清を除去し、５ｍｌの加熱滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を５分間かけて３７℃で１回洗浄した。次いで、ＰＢＳを除去し、２ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ  ０．５％（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｎ°２５３０００５４）を追加し、細胞を３７℃で４分間インキュベートした。トリプシン／ＥＤＴＡは、接着性腫瘍細胞の分離を可能にした。次いで、２ｍｌピペットを用いて細胞を採取し、５ｍｌのハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｎ°２４０２００９１）に希釈した。４℃、５分間、７００ｒｐｍで冷却遠心機（Ｓｏｒｖａｌｌ）を使用して、ＨＢＳＳで細胞を３回洗浄し、ＨＢＳＳに再懸濁した。次いで、トリパンブルー（Ｆｌｕｋａ）溶液およびＮｅｕｂａｕｅｒチャンバーを使用して、細胞を計数した。
【０２３６】
細胞によって産生および分泌されたｈＧＭ−ＣＳＦの量を、ろ過細胞上清に対するＥｌｉｓａ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ｋｉｔｓ）によって評価した。この分析は、最良のサイトカイン産生細胞株の選択を可能にした。
【０２３７】
ｂ）サイトカイン産生細胞の免疫隔離
同種異系細胞によるサイトカインの持続的放出を保証し、反復免疫化を可能にするために、レシピエントの免疫系からサイトカイン産生細胞を免疫隔離することが必要であった。いずれかのマクロカプセル化によって、これを実施した。
【０２３８】
サイトカイン産生細胞をマクロカプセルに装填した。本明細書に記載されるマクロカプセルのいずれかを利用することができる。細胞懸濁液を１０．５ｕｌ／分の速度でカプセルに装填した。カプセルのシーリングをポリマー接着剤によって達成したが、加熱または外科的クリップによっても行うことができる。ＧＭ−ＣＳＦ分泌細胞を含むカプセル化細胞の上清の分析により、装填後少なくとも１５日間にわたってＧＭ−ＣＳＦの安定な継続放出が達成され、サイトカインレベルが約７０ｎｇ／細胞１０５個／２４時間であることが示された。
【０２３９】
実施例４：免疫化
Ｏｎｃｏ−Ｍａｘｉ−Ｖａｘの免疫化は、ワクチン組成物の２つの成分を密接して皮下注射することを必要とした。
【０２４０】
局所麻酔下で皮膚小切開を使用して、サイトカイン産生細胞を含むカプセルを皮下組織中に入れた。サージカルテープで皮膚を閉じた。
【０２４１】
患者由来の放射線照射腫瘍細胞（＝抗原装填）を解凍し、０．９％ＮａＣｌ滅菌溶液で２回洗浄し、次いで、２４ゲージ針を使用してカプセルのごく近傍に皮下注射した。
【０２４２】
ワクチン接種を規則的な間隔で反復した。ワクチン接種部位は、各免疫化で異なっていた（腹壁、上腕、大腿、胸郭など）。
【０２４３】
実施例５：比較データ
先行技術（例えば、国際公開第２００３／１０５８９５号）に記載されているカプセルに対して様々な改善および／または変更を行うことによって、本明細書に記載されるワクチン組成物の「万能」成分を最適化しようと努めた。
【０２４４】
例えば、本明細書に記載されるワクチン組成物は、好ましくは、マクロカプセル内で非接着性細胞型を利用する。また、線維芽細胞または上皮起源の細胞の使用を企図した以前のデバイスとは対照的に、ＭＶＸ−１細胞株は造血起源である。
【０２４５】
加えて、本明細書に記載されるワクチン組成物、使用および方法は、国際公開第２００３／１０５８９５号に記載されている組成物では使用されなかった新規な凍結方法および別個のＧＭＰ調整レジメンを利用する。
【０２４６】
実施例６：ＧＭ−ＣＳＦ生物学的活性アッセイ
ＭＶＸ−１細胞株によって産生されたＧＭ−ＣＳＦの生物学的活性を決定するために、細胞ベースの機能アッセイを実施した。ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｓｓａｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（これは、テルビウム標識リン酸化部位特異的抗体（ＰＳＳＡ）と緑色蛍光タンパク質（特定のキナーゼ基質のＧＦＰ融合物）との間の時間分解共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）を使用して、レシオメトリックかつロバストなアッセイ読み出し情報であって、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）用途に適したアッセイ読み出し情報を提供する）を使用して、産生されたＧＭ−ＣＳＦを含む細胞上清の２つのサンプルを２回反復で試験した。単一の検出抗体と一緒に標的のＧＦＰ融合物を使用することは、他の２抗体「サンドイッチ」アプローチと比べて、アッセイプロトコールを簡素化し、ビーズまたはさらなる試薬の必要性を排除し、アッセイを簡素化する。
【０２４７】
アッセイ条件
試験化合物
最初に、１００％ＤＭＳＯ中、１０００×濃度ですべての試験化合物を調製する。試験化合物の連続希釈（１／２ｌｏｇ）をＤＭＳＯ中で調製する。この同じ方法で、既知の阻害剤を調製する。
【０２４８】
アッセイプレート
Ｃｏｒｎｉｎｇ３８４ウェルホワイト平底ポリスチレン組織培養処理アッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＃３５７０）。
【０２４９】
アッセイ培地
経路活性化を低下させ、その後の分析のためのベースラインを提供するために、ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ細胞アッセイは、典型的には、低血清（または無血清培地）中で行われる。
【０２５０】
溶解緩衝液
完全ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ細胞アッセイ溶解緩衝液は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＮａＦ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０（または等価物）、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｐ８３４０）、ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｐ２８５０）および２〜５ｎＭの適切なＴｂ−ＰＳＳＡからなる。
アゴニストアッセイプロトコール（一般）
１．  アッセイ培地で適切な細胞密度に希釈した３２μＬの細胞をアッセイプレートに追加する。必要な場合には、化合物を追加する前に、（細胞株の特性に応じて）細胞を３７℃／５％ＣＯ２で０〜２４時間インキュベートする。
２．  ４０ｎＬの１０００×化合物または既知の活性化剤滴定をアッセイプレート中の細胞に追加する。８μＬのアッセイ培地をこれらのウェルに追加する。
３．  ８μＬのアッセイ培地を残りの対照ウェルに追加して、容量を４０μＬにする。
４．  加湿インキュベーター内で、アッセイプレートを３７℃／５％ＣＯ２で所定時間インキュベートする（細胞株／アッセイ特異的）。
５．  所定濃度のＴｂ標識Ａｂを有する溶解緩衝液の追加によって、細胞を溶解する（アッセイ特異的）。
６．  暗所で、アッセイプレートを室温で所定時間インキュベートする（アッセイ特異的）。
７．  蛍光プレートリーダーによってプレートを読み取る。
アンタゴニストアッセイプロトコール（一般）
１．  アッセイ培地で適切な細胞密度に希釈した３２μＬの細胞をアッセイプレートに追加する。必要な場合には、化合物を追加する前に、（細胞株の特性に応じて）細胞を３７℃／５％ＣＯ２で０〜２４時間インキュベートする。
２．  ４０ｎＬの１０００×化合物または既知の阻害剤滴定＋４μＬのアッセイ培地をアッセイプレート中の細胞に追加し、加湿インキュベーター内、３７℃／５％ＣＯ２で３０分間インキュベートする。
３．  アクチベーターアッセイで決定した４μＬのＥＣ８０濃度の活性化剤を、試験化合物および既知の阻害剤を含むすべてのウェルに追加して、最終アッセイ容量を４０μＬにする。
４．  ４μＬのアッセイ培地を残りの対照ウェルに追加して、容量を４０μＬにする。
５．  加湿インキュベーター内で、アッセイプレートを３７℃／５％ＣＯ２で所定時間インキュベートする（細胞株／アッセイ特異的）。
６．  所定濃度のＴｂ標識Ａｂを有する溶解緩衝液の追加によって、細胞を溶解する（アッセイ特異的）。
７．  暗所で、アッセイプレートを室温で所定時間インキュベートする（アッセイ特異的）。
８．  蛍光プレートリーダーによってプレートを読み取る。
【０２５１】
アッセイ対照
個々の各アッセイについて、あらゆるアッセイプレート上で、以下の対照を作製する：
【０２５２】
ＭＡＸ  ＳＴＩＭ対照（該当する場合）
ＭＡＸ  ＳＴＩＭ対照（または０％阻害対照）によって、最大ＴＲ−ＦＲＥＴシグナル（発光比；５２０ｎｍ／４９０ｎｍ）を確立する。これらの対照ウェルは、０．１％ＤＭＳＯの存在下、ＥＣ１００濃度のアゴニストで刺激したＧＦＰ＋細胞を含む。
【０２５３】
ＵＮＳＴＩＭ対照
ＵＮＳＴＩＭ対照によって、最小ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルを確立する。これらの対照ウェルは、０．１％ＤＭＳＯの存在下で非刺激細胞を含む。
【０２５４】
ＥＣ８０対照（阻害剤モードのみ）
ＥＣ８０対照は、活性化剤実験によって決定したアッセイ培地中の既知の活性化剤の濃度である。阻害剤モードでは、ＥＣ８０対照を使用して、活性化または０％阻害の実際のベースラインを決定する。
【０２５５】
０％阻害
０．１％ＤＭＳＯの存在下、ＥＣ８０濃度のアゴニストで刺激した細胞を含むウェルから得られたＴＲ−ＦＲＥＴシグナル（化合物は存在しない）。
【０２５６】
既知の阻害剤滴定（該当する場合）
既知の阻害剤対照標準曲線（１０点滴定）を各アッセイプレートで行って、予想ＩＣ５０範囲内でアッセイが確実に阻害されるようにする。
【０２５７】
スクリーニングに利用可能な関連ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ細胞株は、以下に示されている：
【表５】
2018529706.tif 000006
【０２５８】
ＳＴＡＴ５  Ａ／Ｂ［ｐＴｙｒ６９４／６９９］−ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ  ＳＴＡＴ５  ＴＦ−１−活性化剤スクリーニング、ＧＭ−ＣＳＦ刺激
細胞を解凍し、アッセイ培地（ＯＰＴＩ−ＭＥＭ、０．５％ｃｓＦＢＳ、０．１ｍＭ  ＮＥＡＡ、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍＬ／１００μｇ／ｍＬ  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）に再懸濁して、細胞３，１２５，０００個／ｍＬの濃度とする。３２μＬの細胞懸濁液をホワイトＴＣ処理アッセイプレート（細胞１００，０００個／ウェル）の各ウェルに追加し、加湿インキュベーター内、３７℃／５％ＣＯ２で１６〜２４時間インキュベートする。４０ｎＬの対照活性化剤ＧＭ−ＣＳＦまたは試験化合物を適切なアッセイウェルに追加し、続いて、８μＬのアッセイ培地を追加する。加湿インキュベーター内で、アッセイプレートを３７℃／５％ＣＯ２で３０分間インキュベートする。５ｎＭのＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ抗ＳＴＡＴ５  Ａ／Ｂ［ｐＴｙｒ６９４／６９９］抗体および１０ｎＭのＴｂ−抗マウス抗体を含む３０μＬのＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ細胞アッセイ溶解緩衝液をウェルに追加する。アッセイプレートを室温で１２０分間インキュベートする。蛍光プレートリーダーを用いて、アッセイプレートを読み取る。
【０２５９】
ＳＴＡＴ５  Ａ／Ｂ［ｐＴｙｒ６９４／６９９］−ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ  ＳＴＡＴ５  ＴＦ−１−阻害剤スクリーニング、ＧＭ−ＣＳＦ刺激
細胞を解凍し、アッセイ培地（ＯＰＴＩ−ＭＥＭ、０．５％ｃｓＦＢＳ、０．１ｍＭ  ＮＥＡＡ、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍＬ／１００μｇ／ｍＬ  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）に再懸濁して、細胞３，１２５，０００個／ｍＬの濃度とする。３２μＬの細胞懸濁液をホワイトＴＣ処理アッセイプレート（細胞１００，０００個／ウェル）の各ウェルに追加し、加湿インキュベーター内、３７℃／５％ＣＯ２で１６〜２４時間インキュベートする。４０ｎＬの対照阻害剤ＪＡＫ阻害剤Ｉまたは試験化合物を適切なアッセイウェルに追加し、続いて、４μＬのアッセイ培地を追加する。加湿インキュベーター内で、アッセイプレートを３７℃／５％ＣＯ２で３０〜６０分間インキュベートする。所定ＥＣ８０濃度の４μＬの１０×対照活性化剤ＧＭ−ＣＳＦを、対照阻害剤または化合物を含むウェルに追加する。加湿インキュベーター内で、アッセイプレートを３７℃／５％ＣＯ２で３０分間インキュベートする。５ｎＭのＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ抗ＳＴＡＴ５  Ａ／Ｂ［ｐＴｙｒ６９４／６９９］抗体および１０ｎＭのＴｂ−抗マウス抗体を含む３０μＬのＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ細胞アッセイ溶解緩衝液をウェルに追加する。アッセイプレートを室温で１２０分間インキュベートする。蛍光プレートリーダーを用いて、アッセイプレートを読み取る。
【０２６０】
このアッセイの結果はすべて陽性であった（図７を参照のこと）。ＭＶＸ−１細胞株によって産生されたＧＭ−ＣＳＦは、アッセイの限度内で市販のＧＭ−ＣＳＦと同等であるとみなされた。
【０２６１】
等価物
本発明の１つまたはそれを超える実施形態の詳細は、上記付随説明に示されている。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が記載されている。本発明の他の特徴、目的および利点は、前記説明および特許請求の範囲から明らかであろう。本明細書および添付の特許請求の範囲では、文脈上特に明確に指示がない限り、単数形は、複数の指示対象を含む。他に定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書で引用されるすべての特許および刊行物は、参照により組み込まれる。
【０２６２】
上記説明は例示目的で示されているに過ぎず、開示されている厳密な形態に本発明を限定することを意図するものではなく、本明細書に添付の特許請求の範囲によることが意図される。
【図１Ａ】
2018529706.tif 000007
【図１Ｂ】
2018529706.tif 000008
【図１Ｃ】
2018529706.tif 000009
【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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