(57)【要約】  １分以下のＲＴインキュベーションおよび１サイクルあたり２０秒未満のＰＣＲサイクルを用いてＲＴ−ＰＣＲを行うための方法、キットおよび混合物を提供する。
2018538007.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増幅中の生体サンプル中の標的ＲＮＡを増幅する方法であって、
前記生体サンプル、逆転写酵素、熱安定性ポリメラーゼ、および前記生体サンプル中の前記標的ＲＮＡを増幅するように構成されたプライマーを含む反応混合物を提供するステップと、ここで、前記ポリメラーゼが少なくとも０．５μＭの濃度で提供され、かつ、プライマーがそれぞれ少なくとも２μＭの濃度で提供され、
５分以下の逆転写時間にわたりインキュベートすることによって前記ＲＮＡをＤＮＡに逆転写するステップと、
エクストリーム温度サイクリングプロファイルを使用して、複数の増幅サイクルにわたり少なくとも変性温度と伸長温度との間で前記生体サンプルを熱的にサイクリングすることによるポリメラーゼ連鎖反応によって、前記ＤＮＡを増幅するステップと、ここで、各サイクルが１サイクルあたり２０秒未満のサイクル時間で完了する、
を含む方法。
【請求項２】
前記逆転写時間が、１分以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記逆転写時間が、１６秒以下である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記逆転写時間が、８秒以下である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記逆転写時間が、４秒以下である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記逆転写時間が、２秒以下である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記生体サンプルに糖もさらに添加される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記糖が、少なくとも０．２Ｍのトレハロースである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記逆転写するステップが、５４℃から６２℃の間の温度で起こる、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記逆転写するステップが、５６℃の温度で起こる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記プライマーがそれぞれ、少なくとも４μＭの濃度で提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記プライマーがそれぞれ、少なくとも６μＭの濃度で提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記増幅するステップが、前記逆転写するステップと同じ反応混合物中で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記反応混合物が、１０ｍＭ以下のＫＣｌ濃度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記反応混合物が、カリウムを実質的に含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記反応混合物が、還元剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記逆転写酵素が、約１．０から約５０Ｕ／μｌで提供されるＭＭＬＶである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記転写酵素が、４．０ユニット／μＬ以下の濃度で提供されるＭＭＬＶである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記逆転写酵素が、約０．１から約１０Ｕ／μｌで提供されるＡＭＶである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記逆転写酵素が、０．８ユニット／μＬ以下の濃度で提供されるＡＭＶである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記増幅するステップが、前記サイクル時間に前記サイクルの回数をかけた値に等しい増幅時間を有し、
前記方法が、前記逆転写時間と前記増幅時間との合計に等しい全体時間を有し、
前記逆転写時間が、前記全体時間の５０％以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記逆転写時間が、前記全体時間の２０％以下である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記逆転写時間が、前記全体時間の１０％以下である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記反応混合物が、６〜１２ｍＭの間のＭｇＣｌ２を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記反応混合物の第１の部分が凍結された状態で提供され、前記反応混合物の第２の部分が冷却された状態で提供され、前記逆転写するステップの前に前記第１の部分および前記第２の部分を混合するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２の部分中に、ｄＮＴＰおよびＭｇＣｌ２が提供される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記反応混合物の第１の部分が、第１のプライマーと共に提供され、前記反応混合物の第２の部分が、第２のプライマーと共に提供され、前記逆転写するステップの前に前記第１の部分および前記第２の部分を混合するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の部分または前記第２の部分の少なくとも一方が、混合前に遠心分離される、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記混合するステップが完了して１秒以内に、前記逆転写するステップが始まる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１の部分および前記第２の部分の一方が、前記逆転写酵素を含み、前記第１の部分および前記第２の部分の他方が、前記熱安定性ポリメラーゼを含む、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記反応混合物が、アプタマーをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記アプタマーが、少なくとも１μＭの濃度で提供される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記アプタマーが、ＲＮＡアプタマーである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記アプタマーが、ＲＮＡアプタマーおよびＤＮＡアプタマーの混合物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記アプタマーが、３’−ブロッカーで修飾されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記３’−ブロッカーが、Ｃ６−アミノ末端修飾剤である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記３’−ブロッカーが、正電荷を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記アプタマーが、安定化されたヘアピンループを有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
ＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行うためのキットであって、
ｄＮＴＰと、
逆転写酵素と、
少なくとも０．５μＭの濃度で提供されるポリメラーゼと、
少なくとも２μＭの濃度でそれぞれ提供される、標的核酸を増幅するように構成された一対のプライマーと
を含むキット。
【請求項４０】
糖をさらに含む、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
前記糖が、トレハロースおよびスクロースからなる群から選択される、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記糖が、０．６Ｍで提供される、請求項４０に記載のキット。
【請求項４３】
前記糖が、０．２Ｍで提供される、請求項４０に記載のキット。
【請求項４４】
還元剤をさらに含む、請求項３９に記載のキット。
【請求項４５】
前記ｄＮＴＰ、前記逆転写酵素、前記ポリメラーゼ、および前記一対のプライマーが、カリウムを実質的に含まない混合物中に提供される、請求項３９に記載のキット。
【請求項４６】
ＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行うための反応混合物であって、
ｄＮＴＰと、
逆転写酵素と、
少なくとも０．５μＭの濃度で提供されるポリメラーゼと、
少なくとも２μＭの濃度でそれぞれ提供される、標的核酸を増幅するように構成された一対のプライマーと
を含む反応混合物。
【請求項４７】
１０ｍＭ以下のＫＣｌ濃度を有する、請求項４６に記載の反応混合物。
【請求項４８】
カリウムを実質的に含まない、請求項４７に記載の反応混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［優先権の陳述］
本出願は、合衆国法典第３５巻１１９条（ｅ）に基づき、その全体の内容が参照により本明細書の一部をなすものである２０１５年１１月５日付けで出願された米国仮出願第６２／２５１，４００号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、分子生物学において広く使用されている技術である。その名称は、その主要な構成要素の１つである、インビトロでの酵素的複製によってＤＮＡ断片を増幅するのに使用されるＤＮＡポリメラーゼに由来する。ＰＣＲが進行するにつれて、生成したＤＮＡ（アンプリコン）はそれ自身、複製のためのテンプレートとして使用される。それにより連鎖反応が始まり、ＤＮＡテンプレートが指数関数的に増幅する。ＰＣＲを用いれば、ＤＮＡ断片の単一または少数のコピーを、数桁を越えて増幅して、数百万またはそれより多くのＤＮＡ断片のコピーを生成することが可能になる。ＰＣＲは、熱安定性ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、および一対のプライマーを用いる。
【０００３】
ＰＣＲは概念的には３つの反応に分けられ、各反応は通常、それぞれ３つの温度で所定期間起こると考えられる。このようなＰＣＲの「平衡パラダイム」は、サイクルごとに３つの温度で３つの期間にわたり起こる３つの反応（変性、アニーリング、および伸長）によって容易に理解される。しかし、この平衡パラダイムは、物理学的な実態とはあまりよく合致しない。即時の温度変化が起こらない、すなわちサンプルの温度を変化させるには時間がかかる。さらに、個々の反応速度が温度に応じて変動し、一度プライマーのアニーリングが起これば、それに続いてポリメラーゼ伸長が即座に起こる。特に迅速ＰＣＲ（ｒａｐｉｄ  ＰＣＲ）の場合、反応速度と温度が常に変化するという動力学的パラダイムがより正確である。生成物が変性しプライマーがアニールしさえすれば、ＰＣＲ中に温度を一定に保つことは必ずしも必要ではない。ＰＣＲの動力学的パラダイムのもとでは、生成物の変性、プライマーのアニーリング、およびポリメラーゼ伸長は、一時的に重複し、それらの速度は温度に応じて連続的に変動する場合がある。平衡パラダイムのもとでは、サイクルは、それぞれ所定期間保持される３つの温度によって定義されるが、それに対して動力学的パラダイムは、遷移速度と標的温度を必要とする。図１５ａ〜１５ｂに、平衡パラダイムと動力学的パラダイムの例示的な時間／温度プロファイルを示す。しかし、これらの温度プロファイルは単に例示的なものであって、いくつかのＰＣＲの実行においては、必要な温度が２つだけになるようにアニーリングステップと伸長ステップとが一緒になっていることが理解される。
【０００４】
パラダイムが正しいか間違っているかということではなく、これらは有用性の点で異なっている。平衡パラダイムは理解が簡単であり、工学的な見方および機器製造に向いている。動力学的パラダイムは、生化学、迅速サイクルＰＣＲ、および融解曲線分析により大きく関連する。
【０００５】
１９８０年代後半にＰＣＲが最初に広まったとき、そのプロセスは遅かった。典型的なプロトコールは、変性は９４℃で１分、アニーリングは５５℃で２分、および伸長は７２℃で３分であった。温度間の遷移時間が含まれる場合、８分のサイクルが典型的であり、その結果、３０サイクルが完了するのに４時間を要した。サイクル時間の２５パーセントが温度遷移に費やされていた。サイクル速度が増加するにつれて、温度遷移に費やされる時間の比率も増加することから、動力学的パラダイムがますます重要となっていった。迅速サイクルＰＣＲ中、通常、温度は変化している。短い生成物（＜１００ｂｐ）の迅速サイクルＰＣＲの場合、時間の１００％が温度遷移に費やされる場合があり、保持時間は必要ではない。より長い生成物の迅速サイクルＰＣＲの場合、温度を最適な伸長温度で保持することを含む場合がある。
【０００６】
用語「迅速ＰＣＲ」は、相対的な場合と曖昧な場合のそれぞれの意味がある。１時間のＰＣＲは、４時間と比べれば迅速であるが、１５分と比べると遅い。さらに、より高いテンプレート濃度で開始したり、またはより少ないサイクルを使用したりすれば、ＰＣＲプロトコールをより短くできる。より具体的な尺度は、各サイクルに必要な時間である。したがって、１９９４年に、「迅速サイクルＰＣＲ」（または「迅速サイクリング」）は、１０〜３０分で完了する３０サイクルと定義され（１）、この場合、それぞれのサイクルは２０〜６０秒になる。これらの各段階間で温度に傾斜をつけるのに時間を要するため、この各サイクルの実際の時間は、多くの場合、変性、アニーリング、および伸長に関してプログラムされた時間の合計よりも長い。１９９０年代初頭における初期の研究で、温度制御にキャピラリーチューブと熱風を使用した迅速サイクリングの実行可能性が確立された。長年かけて、システムはより速くなり、変性、アニーリング、および伸長の動力学的な必要条件がより明確になってきた。
【０００７】
初期の迅速システムの１つにおいて、チャンバー内には、ヘアドライヤーからの加熱要素およびファン、熱電対、ならびにキャピラリーチューブ中のＰＣＲサンプルが同梱されていた（２）。ファンは、熱電対およびキャピラリーを通過する加熱空気の迅速フローを生じさせた。熱電対の熱的応答をサンプルと合致させることにより、温度が変化している間でさえも熱電対の温度を厳密にサンプルの温度に合わせて変化させた。空気の熱伝導率は低いが、キャピラリーによって晒された大きい表面積に対して空気を迅速に移動させることは、変性、アニーリング、および伸長温度間でサンプルをサイクリングさせるのに十分であった。電子制御器により温度をモニターし、加熱要素への出力を調節することにより求められるタイミングとサイクル数が達成された。冷却するために、制御器によりソレノイドを活性化することにより、入口を外気に向かって開いて、別の方法で閉じたチャンバーに冷却空気を導入した。
【０００８】
キャピラリー／空気システムを使用すれば、温度を迅速に変化させることができる。低熱質量チャンバー、循環空気、およびガラスキャピラリー中のサンプルを使用して、わずか１０分のＰＣＲ（各２０秒の３０サイクル）の後に、５００ｂｐより大きいＰＣＲ生成物をエチジウムブロマイドで染色したゲルで可視化した（３）。生成物の収量は、伸長時間とポリメラーゼ濃度の影響を受けた。３０秒サイクル時間（伸長は、７０℃から８０℃の間で約１０秒）の場合、ポリメラーゼ濃度を反応液１０μｌあたり０．１ユニットから０．８ユニットに増加させるにつれてバンドの強度も増加した。ポリメラーゼのユニットの定義は紛らわしいことがあることが知られている。天然型Ｔａｑポリメラーゼの場合、０．４Ｕ／１０μｌは、典型的な迅速サイクリング条件下では約１．５ｎＭである（５０）。
【０００９】
迅速プロトコールで使用される変性温度およびアニーリング温度における保持時間は、瞬時または「０」秒である。すなわち、温度−時間プロファイルは、変性およびアニーリングの際の温度の急激な上昇は示すが最高温度および最低温度の保持は示さない。変性およびアニーリングは、極めて急速に起こる場合がある。
【００１０】
迅速かつ正確な温度制御は、ＰＣＲに必要な温度および時間の分析的研究を可能にする。例示的なヒトゲノムＤＮＡの５３６ｂｐのフラグメント（β−グロビン）の場合、９１℃から９７℃の間の変性温度が、１秒未満から１６秒までの変性時間と同等に有効であった。しかし、実際には１６秒よりも長い変性時間は生成物の収量を減少させることが見出された。プライマーのアニーリングにかかる時間が制限される限りは、５０〜６０℃のアニーリング温度で特異的生成物が優れた収量で得られた。すなわち、変性からアニーリングへの迅速な冷却と１秒未満のアニーリング時間によって最良の特異性が得られた。７５〜７９℃の伸長温度で収量は最大になり、最大約４０秒の伸長時間で増加した。
【００１１】
この初期の研究の結論は以下の通りである。１）ＰＣＲ生成物の変性は極めて迅速であるため、変性温度を保持する必要はない、２）プライマーのアニーリングは極めて急速に起こる場合があるため、アニーリング温度の保持は必要ではない場合がある、および３）必要な伸長時間は、ＰＣＲ生成物の長さとポリメラーゼ濃度によって決まる。また迅速サイクルＰＣＲは、温度を正確に制御しさえすれば、より速いだけでなく、特異性および収量に関してもより優れている（４、５）。ＰＣＲの速度は、利用され得る生化学によって制限されないが、サンプルの温度を厳密にまたは迅速に制御しない機器によっては制限される。
【００１２】
しかし、現行の実験室用ＰＣＲ機器の多くは、瞬時の変性時間およびアニーリング時間に関する性能はあまり高くなく、多くは「０」秒の保持期間のプログラミングすら不可能である。コニカルチューブの壁を介して熱が移動することによる時間遅延、低い表面積対体積の比率、および大きいサンプルの加熱のために、ほとんどの機器は、サンプルが確実に望ましい温度に達するようにするために変性時間およびアニーリング時間の延長に頼らざるを得ない。これらの時間遅延により、時間経過に対する正確な温度が不確定になる。その結果、市販品における再現性は悪く、市販品間でのばらつきが大きい（６）。多くの機器は、温度遷移中に著しい温度の変動を示す（７、８）。温度のアンダーシュートおよび／またはオーバーシュートは、試みられたサンプル体積に依存するソフトウェアでの予測ではほとんど解決しない慢性的な問題である。このような難点は、経時的に変化する場合がある機器の熱的性質によってさらに悪化する。
【００１３】
時間が経って、「薄壁」管における漸進的な改善、サンプル間のより高い伝導熱分布、低熱質量のブロック、および他の「速い」改変により、従来のヒートブロック機器はより速くなりつつある。それにもかかわらず、これらのシステムにとって、６０秒未満でサイクルを完了させる程度に迅速にサイクリングすることはめったにない。ほんの少数のヒートブロックシステムが６０秒未満のサイクルを達成できるが、通常は制限された温度範囲での２温度サイクリングに限定される。サンプル容器を平板化すれば、抵抗加熱と空気冷却によって（９）、または一定温度に維持された加熱ゾーン間をフレキシブルなチューブでサンプルを移動させることによって迅速サイクリングを達成できる（米国特許第６，７０６，６１７号）。
【００１４】
ＰＣＲ用の空気／キャピラリーシステムの商業用バージョンは１９９１年から利用でき（１）、リアルタイムＰＣＲ用のものは１９９６年から利用できるようになった（１０、１１）。他の機器の迅速サイクリング性能は、初めて２０〜６０秒のサイクルを実証した空気／キャピラリーの標準品と比較されることが多い。不思議なことに、長年にわたりキャピラリー／空気システムをより遅く運用する傾向があるが、おそらくこれは、多くの使用者による「０」秒の変性時間およびアニーリング時間への不信感を反映しているのであろう。また熱で活性化される酵素は長い活性化期間も必要とすることから、「速い」活性化酵素が使用されたとしても運転時間も二倍になることが多い。迅速サイクリングからの別の妥協点は、プラスチックキャピラリーの使用である。これらのキャピラリーは機器と熱的に適合していないため、標的温度に達するまで変性およびアニーリング時の２０秒の保持が必要になることが多い（１２）。
【００１５】
マイクロシステムにおいて、ＰＣＲのサイクル時間をさらに減少させるいくつかの進歩が起こっており、この場合、処理される体積は当然ながら小さい（１３、１４）。しかし、高い表面積対体積比を有するサンプルチャンバーを用いたとしても、加熱要素が高い熱質量を有し、チャンバーの外部にある場合、サイクルは長くなる場合がある（１５）。サンプル近傍で薄膜の抵抗加熱器と温度センサーを用いることにより、１０〜３０分の増幅が達成できる（１６、１７）。
【００１６】
低熱質量システムの冷却は、通常、受動的な熱拡散および／または強制空気によってなされるが、いくつかの興味深い加熱方法が開発されている。赤外線放射は、温度のモニタリングのための較正された赤外線高温測定（１９）を用いて加熱に使用できる（１８）。あるいは、ガラスキャピラリー上の薄い金属膜が、迅速サイクリングのための抵抗加熱要素と温度センサーの両方として役立つ場合がある（２０）。最後に、電解質の抵抗によるＰＣＲ溶液の直接のジュール加熱と温度モニタリングが考えられ、キャピラリーで実施もされている（２１）。上記の方法はいずれも、固定されたサンプルに熱を移動させたり、固定されたサンプルから熱を移動させたりするものである。
【００１７】
静止サンプルへの熱伝達、および静止サンプルからの熱伝達の代わりに、異なる温度の槽へ、または固定された温度ゾーンを有するチャネルを介してサンプルを物理的に移動させてもよい。ＰＣＲの流体がチャネル内で変性温度、アニーリング温度、および伸長温度で維持された様々なセグメントを通過するマイクロ流体工学的な方法が普及するようになってきた。連続流型ＰＣＲは、３つの温度ゾーンを行き来する蛇行チャネル内（２２）で、さらに半径が徐々に増加または減少する３つの温度セクターを通過するループ内で実証されている（２３）。蛇行レイアウトを有する改変型は、ＰＣＲの動力学的パラダイムにより厳密に適合させるために、等温ゾーンの代わりに固定された熱勾配を使用している（２４）。ＰＣＲに必要なマイクロチャネルの長さを制限するために、いくつかのシステムは、二方向性の圧力駆動のフロー（２５）、空気力学（２６）、または動電学的な力（２７）によって温度ゾーン間で前後にサンプルを往復させる。直線的なサンプル往復の代わりに、単一の円形のチャネルを、強磁性流体として（２８）、または対流によって（２９）駆動するサンプルの動きと共に使用できる。連続流方式を包含するマイクロシステムＰＣＲの考えられる利点の１つは、サイクル速度である。
【００１８】
いくつかのマイクロシステムはそれでもなお６０秒より長いサイクルを必要とするが、多くは、迅速サイクルＰＣＲの２０〜６０秒のサイクル範囲で稼働する（１３、３０）。赤外線加熱の場合、１６〜３７秒の範囲の最小のサイクル時間が報告されている（１８、１９）。金属でコーティングされたキャピラリーは、４０秒のＰＣＲサイクルを達成しており（２０）、一方で直接の電解質加熱は、２１秒のサイクルで増幅した（２０）。閉ループ対流型ＰＣＲの場合、２４〜４２秒の範囲の最小のサイクル時間が報告されている（２９、３１）。いくつかのグループは、ＰＣＲサイクル時間を、１９９０年に最初に実証された迅速サイクルＰＣＲの元の定義よりも速い２０秒未満に短くすることに注目してきた。静止サンプルの薄膜抵抗加熱は、２５μｌのサンプルではサイクル時間を１７秒に短くし（３２）、１００ｎｌのサンプルでは８．５秒に短くした（１７）。連続流システムは、熱勾配ＰＣＲ（２４）とサンプル往復（２６）を用いて１２〜１４秒のサイクルを達成したが、強磁性流体ループにより９秒のサイクルでのＰＣＲが成功したことが主張されている（２８）。ガラス基板およびプラスチック基板による連続流システムは、様々なサイズのＰＣＲ生成物で６．９秒（２２）および５．２秒（２３）のサイクル時間を達成している。アルミニウム基板を介した交互の熱水および冷水の伝導により、油の下で１μｌの液滴を５．２５秒のサイクルで増幅した（３３）。同様に、多孔質の銅ブロックを介した水の伝導により、５μｌのサンプルを４．６秒のサイクルで増幅した（３４）。蒸気圧によって増大した１μｌの反応プラグの連続流デバイスは、３秒のサイクルを達成した（３５）。加えて、ペルチエ素子の間に挟まれたガリウムにキャピラリーを浸漬することによって、キャピラリー中で大腸菌のＳｔｘバクテリオファージの８５ｂｐのフラグメントを２．７秒のサイクルで増幅することを主張する報告がなされている（３６）。あるいは、加圧した熱いガスおよび冷たいガスでサイクリングしたキャピラリーでのＰＣＲ増幅により、２．６秒のサイクルが達成された（４８）。
【００１９】
表１に、最初に「迅速ＰＣＲ」を定義した２０秒のサイクルより短い時間にＰＣＲサイクル時間を最小化するための研究を要約する。過去２０年にわたり、サイクル速度をさらに向上させた新しいプロトタイプ機器が開発されてきた。しかし、実用的なＰＣＲ性能（効率および収量）が不十分であることが多い。一般的な原則として、サイクルが短くなればなるほど、ＰＣＲの成功に求められることは、より高い開始濃度で使用される標的（細菌、ファージ、多コピープラスミド、またはさらにはＰＣＲ生成物）の複雑度がどれだけ低いかに関わってくる（例えば、初発サンプルとして５ｎｇのアンプリコンが使用された米国特許第６，２１０，８８２号を参照）。実際に、表１で列挙した研究のうち、２０秒未満のサイクルで例えばヒトＤＮＡなどの複雑な真核ＤＮＡを使用したものは皆無である。成功が求められる前にほとんど増幅しなくてもいいように、初発のテンプレート分子のコピー数が極めて高いことが多い（例えば、１μｌあたり１８０，０００，０００のλファージのコピー）。さらに、多くの研究において、特に高いテンプレート濃度を用いた環境での肯定的な結果の有効性に関して、テンプレート非含有対照がないことが疑問視されることもない。ある機器に注目した報告は、熱的サイクリングデバイスの設計およびモデリングについて広範に調べており、最後の短時間ＰＣＲの実証では、高濃度の複雑度が低い標的を使用している。ＰＣＲサンプル非存在下でのモデリングおよび測定に基づいて、加熱速度および冷却速度（最大１７５℃／秒）が報告されている（１７）。
【００２０】
【表１−１】
2018538007.tif 000003
【表１−２】
2018538007.tif 000004
【００２１】
サイクル時間を短くする方法の１つは、温度サイクリングの必要条件を簡易化するためにＰＣＲプロトコールにバリエーションを導入することである。より長いプライマーはより高いＴｍを有するため、アニーリング温度が高くなる場合がある。生成物の長さとそのＴｍを制限することによって、生成物のＴｍをわずかに超えた温度まで変性温度を低くできる。より高いアニーリング温度とより低い変性温度とを組み合わせることにより、増幅の成功に必要な温度範囲を減少させる。また３ステップサイクリング（変性、アニーリング、および伸長）を２ステップ（変性および併合されたアニール／伸長ステップ）に減らすことも、温度サイクリングの必要条件を簡易化する。温度範囲の減少と２ステップサイクリングはいずれも、表１に記載された２０秒未満のサイクル時間を用いた研究において典型的である。しかし、併合されたアニール／伸長ステップが、７０℃よりも低い温度から、ポリメラーゼが最も活性化する最適な８０℃までの温度で行われる場合、２ステップサイクリングはポリメラーゼ伸長速度を遅くする場合がある。ポリメラーゼ伸長速度は、約７０〜８０℃までの温度では対数線形を示し、６０〜１２０ｂｐ／秒の最大値が報告されている（５０）。
【００２２】
プロトコールのバリエーションを用いたとしても、サイクル時間が２０秒未満である場合、対照反応と比較して、増幅効率および収量は不十分であることが多い（２２、２３）。これらのより速いＰＣＲに向けられた努力は工学面に偏りすぎているようであり、生化学面はほとんど注目されていない。サイクル時間が２０秒から２秒に短くなるにつれて、ＰＣＲ収量は減少し、最終的には収量ゼロになるが、これは、単純な標的を高コピー数で用いた場合でさえもロバスト性が欠如することを反映している。
【００２３】
表１で開示された様々な参考文献に記載の機器は、反応条件が合えば極めて速いＰＣＲに適している場合がある。本明細書において開示されたように、プライマー、ポリメラーゼ、およびＭｇ＋＋の濃度を高めることに注目することにより、反応ロバスト性と収量を保持しつつ「エクストリームＰＣＲ（ｅｘｔｒｅｍｅ  ＰＣＲ）」（２０秒未満のサイクル（１０分未満で３０サイクル）のＰＣＲ）が実現化される。また本明細書において開示されたように、プライマー、逆転写酵素の濃度の増加、および例えばトレハロースなどの糖の包含に重点を置くことによって、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）での使用のためにより速い逆転写（ＲＴ）が可能になる。
【発明の概要】
【００２４】
本発明の一実施態様において、増幅中の生体サンプル中の標的ＲＮＡを増幅する方法であって、生体サンプル、逆転写酵素、熱安定性ポリメラーゼ、および生体サンプル中の標的ＲＮＡを増幅するように構成されたプライマーを含む反応混合物を提供するステップと、ここで、ポリメラーゼが少なくとも０．５μＭの濃度で提供され、プライマーがそれぞれ少なくとも２μＭの濃度で提供され；５分以下の時間でインキュベートすることによってＲＮＡをＤＮＡに逆転写するステップと；エクストリーム温度サイクリングプロファイルを使用して、複数の増幅サイクルにわたり少なくとも変性温度と伸長温度との間で生体サンプルを熱的にサイクリングすることによるポリメラーゼ連鎖反応によって、ＤＮＡを増幅するステップと、ここで、各サイクルが１サイクルあたり２０秒未満のサイクル時間で完了する、を含む方法が提供される。
【００２５】
キットおよび反応混合物も、本明細書で提供される。
【００２６】
以下に記載された、現在認識される本発明を実行するにあたり最良の形態を例示した好ましい実施形態の詳細な説明を考察すれば、本発明の追加の特徴が当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１ａ】エクストリームＰＣＲを行うための略図である。
【図１ｂ】水槽中の１つのサンプルチューブをモニタリングするためのリアルタイム機能を有するエクストリームＰＣＲを行うための例示的なデバイスを示す図である。
【図１ｃ】３温度サイクリングを用いた例示的なエクストリームＰＣＲを行うためのデバイスを示す図である。
【図１ｄ】温度参照キャピラリーを共に示した図１ｂにおけるデバイスの光学素子の拡大図である。
【図２ａ】図１ｂのサンプルホルダーの位置（点線）にサンプル温度（直線）を重ね合わせたグラフである。
【図２ｂ】図１ｂに示したデバイスを使用したエクストリームＰＣＲの温度を示したグラフである。
【図２ｃ】図２ｂとの比較のために示された回転式のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を使用した迅速サイクルＰＣＲの温度を示したグラフである。
【図３ａ】図２ｂの温度プロファイルを使用して増幅した、エクストリームＰＣＲ生成物（点線）および迅速サイクルＰＣＲ生成物（二点鎖線）の微分融解曲線をエクストリームサイクリングの陰性対照（直線）および迅速サイクリングの陰性対照（一点鎖線）と共に示すグラフである。
【図３ｂ】図３ａの同じサンプルの２％ＳｅａＫｅｍ  ＬＥアガロースゲルの写真であり、レーン１および８はサイズマーカーであり、レーン２および３は３０秒のエクストリームＰＣＲの結果得られた生成物であり、レーン４は３０秒のエクストリームＰＣＲのテンプレート非含有対照であり、レーン５および６は１２分のＰＣＲの結果得られた生成物であり、レーン７は１２分のＰＣＲのテンプレート非含有対照である。
【図３ｃ】図３ａおよび３ｂで示されたのと同じ生成物を増幅したエクストリームＰＣＲの温度の軌跡（点線）を、同じ反応のリアルタイムモニタリング（直線）と共に示すグラフである。
【図４ａ】温度制御により伸長速度を増加させたエクストリームＰＣＲの温度の軌跡を示すグラフである。
【図４ｂ】図１ｂのサンプルホルダーの位置（直線）にサンプル温度（点線）を重ね合わせた、図４ａの部分拡大図である。
【図４ｃ】ＩＲＬ１０ＲＢの５８ｂｐのアンプリコンの負の微分融解曲線（−ｄＦ／ｄＴ）を示すグラフであり、ＡＡ（直線）、ＡＧ（一点鎖線）、およびＧＧ（点線）の遺伝子型が示される。
【図５ａ】エクストリームＰＣＲを使用して、ポリメラーゼ濃度対プライマー濃度対ＰＣＲ生成物濃度をプロットした３次元グラフである。
【図５ｂ】図５ａで使用されたエクストリームＰＣＲの温度の軌跡を示すグラフである。
【図５ｃ】図５ａからの４μＭのＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ（ＫＴ  ＰＯＬ）生成物の負の微分融解曲線を示すグラフである。
【図５ｄ】図５ａに基づき１０μＭのプライマー濃度で様々なポリメラーゼ濃度を使用したエクストリームＰＣＲの結果を示すアガロースゲルの写真である。
【図６ａ】１９ゲージのステンレス鋼チューブ中で行われたエクストリームＰＣＲの温度の軌跡を示すグラフである。
【図６ｂ】図６ａのエクストリーム温度サイクルによって生産されたＰＣＲ生成物のゲルの写真である。
【図７ａ】長い（１秒の）併合されたアニール／伸長ステップを用いたエクストリームＰＣＲの温度の軌跡を示すグラフである。
【図７ｂ】１０２ｂｐの生成物にエクストリームＰＣＲを使用して、ポリメラーゼ濃度対プライマー濃度対ＰＣＲ生成物濃度をプロットした３次元グラフである。
【図８ａ】１秒の併合されたアニール／伸長ステップを使用して２２６ｂｐの生成物を増幅するのに使用されるエクストリームＰＣＲの温度プロファイルを示すグラフである。
【図８ｂ】４秒の併合されたアニール／伸長ステップを使用して４２８ｂｐの生成物を増幅するのに使用されるエクストリームＰＣＲの温度プロファイルを示すグラフである。
【図８ｃ】図８ａから得られたリアルタイムの結果と、２秒のアニール／伸長ステップを使用した類似の温度の軌跡を示すグラフであり、それぞれテンプレート非含有対照を包含する。
【図８ｄ】図８ｂから得られたリアルタイムの結果と、５秒のアニール／伸長ステップを使用した類似の温度の軌跡を示すグラフであり、それぞれテンプレート非含有対照を包含する。
【図９ａ】異なる開始濃度でのＫＣＮＥ１の４５ｂｐのフラグメントの増幅曲線を示すグラフである。
【図９ｂ】図９ａからのデータのＣｑ対ｌｏｇ１０（最初のテンプレートのコピー数）のプロットである。反応は５連で行われた。
【図９ｃ−９ｄ】ＮＱＯ１の１０２ｂｐのフラグメントの増幅が示されていることを除いては図９ａ〜９ｂと同様のグラフである。
【図１０ａ】３００ｂｐの生成物にエクストリームＰＣＲを使用して（２０サイクル、１サイクルあたり４．９秒）、ポリメラーゼ濃度対プライマー濃度対ＰＣＲ生成物濃度をプロットした３次元グラフである。
【図１０ｂ】ＫＡＰＡ２Ｇ  ＦＡＳＴポリメラーゼおよび１〜５秒の伸長時間を使用した５００ｂｐの合成テンプレートのＰＣＲ増幅に関する蛍光対サイクル数のプロットである。
【図１０ｃ】数種のＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ濃度およびＫＡＰＡ２Ｇ  ＦＡＳＴポリメラーゼに関する伸長した長さ対最小の伸長時間のプロットである。
【図１１ａ】１００ｂｐのサイズを有する生成物のＰＣＲ増幅に関する蛍光対サイクル数のプロットである。
【図１１ｂ】２００ｂｐのサイズを有する生成物のＰＣＲ増幅に関する蛍光対サイクル数のプロットである。
【図１１ｃ】３００ｂｐのサイズを有する生成物のＰＣＲ増幅に関する蛍光対サイクル数のプロットである。
【図１１ｄ】４００ｂｐのサイズを有する生成物のＰＣＲ増幅に関する蛍光対サイクル数のプロットである。
【図１１ｅ】５００ｂｐのサイズを有する生成物のＰＣＲ増幅に関する蛍光対サイクル数のプロットである。
【図１２ａ】様々なマグネシウム濃度を使用したエクストリームＰＣＲの３５サイクル後における、ＡＫＡＰ１０の６０ｂｐのフラグメントの負の微分融解曲線を示すグラフである。
【図１２ｂ】図１２ａの負の微分融解曲線で示されたＰＣＲ生成物のゲルの写真である。
【図１３ａ】５ｍＭのＭｇ＋＋と共に様々なサイクル時間を使用した３５サイクル後における、ＡＫＡＰ１０の６０ｂｐのフラグメントの負の微分融解曲線を示すグラフである。サイクル時間は、０．３２秒（直線）、０．４２秒（二点鎖線）、０．５２秒（一点鎖線）、および０．６２秒（点線）であった。サイクル時間には、６０°の槽中での０．１〜０．４秒の保持時間が包含される。
【図１３ｂ】図１３ａの負の微分融解曲線で示されたＰＣＲ生成物のゲルの写真である。
【図１４ａ】３種の異なる機器、（１）エクストリームＰＣＲ、（２）ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ、および（３）ＣＦＸ９６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で増幅した場合の、ＡＫＡＰ１０の６０ｂｐのフラグメントの負の微分融解曲線を示すグラフである。
【図１４ｂ】図１４ａの負の微分融解曲線で示されたＰＣＲ生成物のゲルの写真である。
【図１５ａ−１５ｂ】ＰＣＲの平衡パラダイム（図１５ａ）および動力学的パラダイム（図１５ｂ）に関する例示的なプロファイルを示すグラフである。黒く塗り潰された部分は、熱的サイクリング中の核酸の変性を示し、斜線部分はアニーリングを示し、白一色の部分は伸長を示す。
【図１６ａ−１６ｃ】二重鎖ＲＴ−ＰＣＲプロトコールにおけるＡＫＡＰ１０およびＡＣＴＢの増幅プロファイル（図１６ａ）、融解プロファイル（図１６ｂ）、および融解ピーク（図１６ｃ）を示す図である。２回の運転が示される。
【図１７】３０分のインキュベーション時間と比較したより短いインキュベーション時間でのパーセントＲＴを示す図である。
【図１８】ＲＴステップに関して様々な温度および時間を使用したＲＴ−ＰＣＲのＰＣＲ生成物のゲルの図である。レーン１〜３は、それぞれ１５、２０、および２５秒にわたる４５℃のインキュベーションを示し、レーン４〜６は、それぞれ１５、２０、および２５秒にわたる４７．５℃のインキュベーションを示し、レーン７〜９は、それぞれ１５、２０、および２５秒にわたる５０℃のインキュベーションを示し、レーン１０〜１１は、それぞれ１５および２０秒にわたる５５℃のインキュベーションを示す。
【図１９ａ−１９ｂ】トレハロースあり（直線）およびトレハロースなし（点線）でｉＳｃｒｉｐｔを使用した（図１９ａ）、ならびに両方ともトレハロースありでｉＳｃｒｉｐｔ（直線）およびＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔ（点線）を使用した（図１９ｂ）、様々なＲＴインキュベーション温度でのＲＴステップにおける、０．６Ｍのトレハロースの作用を示すグラフである。
【図２０】２０秒（点線）および６０秒（直線）のインキュベーションを含む２ステップＲＴ−ＰＣＲにおけるリバースプライマー濃度の作用を示すグラフである。
【図２１】５，０００、５００、５０、または５コピーでのＲＳＶのＲＮＡの１ステップＲＴ−ＰＣＲ増幅を示すゲルの図である（左から右に、３連で）。
【図２２】１０ミリ秒から２０秒間のインキュベーション時間を用いたＲＴ−ＰＣＲを示すゲルの図である。
【図２３】ＲＳＶのＲＮＡの５，０００個の最初のテンプレートのコピーを、５秒のＲＴステップおよび４５サイクルのＰＣＲと共に使用した、１ステップＲＴ−ＰＣＲのリアルタイム結果を示す図である。
【図２４】例示的なＲＴステップの非常に短い時間を示すゲルである。左から右へ、２つの左のレーンは、陰性対照（ＮＣ）であり、次の３つのレーンは、５６℃で０、１、および５秒のインキュベーションを用いた、低温で調製されたサンプルであり、最後の３つのレーンは、５６℃で０、１、および５秒のインキュベーションを用いた、室温で１分のサンプルである。
【図２５】例示的なＲＴステップに対するトレハロースの作用を比較するゲルの図である。トレハロースのセットは左側であり、（左から右に）テンプレートなしの対照、ブランク、１、２、５、および１０秒のインキュベーション、続いて同じ順番でトレハロースなしである。
【図２６】様々な時間およびＭｇ＋＋濃度で、４２℃で酵素としてＡＭＶを用いて行われた１ステップＲＴ−ＰＣＲを示すゲルの図である。Ｍｇ＋＋は、３（左上）、６（右上）、１０（左下）、および１３（右下）ｍＭのＭｇＣｌ２で包含され、それぞれ１、２、５、および１０秒のＲＴ時間（左から右に）であった。
【図２７】１秒（左上）、５秒（右上）、および１０（左下）秒継続する４２℃でのＲＴステップで、０、１０、２０、４０、および７５（右から左に）ｍＭのＫＣｌで行われた、例示的な１ステップＲＴ−ＰＣＲプロトコールの結果を示すゲルの図である。
【図２８】０、１０、または３８ｍＭのＤＴＴおよび０または４０ｍＭのＫＣｌ（示された通り）を、４２℃で１秒（左上）、５秒（右上）、および１０秒（左下）のＲＴインキュベーションにより行われた、例示的な１ステップＲＴ−ＰＣＲプロトコールの結果を示すゲルの図である。
【図２９】ＭＭＬＶ濃度およびＲＴ時間のＣｑに対する作用を示すグラフである。
【図３０】２秒のＲＴ反応時間での、ＡＭＶ濃度のＣｑに対する作用を示すグラフである。
【図３１】８ｍＭのＭｇ＋＋を含有するＡＭＶ、４８℃で２秒の反応時間を使用する反応、および３．８ｍＭのＭｇ＋＋を含有するＭＭＬＶ、４５℃で２．５秒の反応時間を使用する反応による、ＭＭＬＶおよびＡＭＶ濃度のＣｑに対する作用を示すグラフである。
【図３２】ＲＴ温度および時間のＣｑに対する作用を示すグラフである。
【図３３】ＲＴ酵素としてＡＭＶを用いた、ＲＴ温度のＣｑに対する作用を示すグラフである。
【図３４】ＭＭＬＶおよびＡＭＶの両方を使用した結果を示す、ＲＴ温度のＣｑに対する作用を示すグラフであり、白丸は、ＭＭＬＶを表し、黒丸は、ＡＭＶを表す。
【図３５】ＡＭＶを使用し、２秒のＲＴ反応時間を使用した、Ｍｇ＋＋濃度のＣｑに対する作用を示すグラフである。
【図３６】ＭＭＬＶを使用し、２秒および５秒のＲＴ反応時間を使用した、Ｍｇ＋＋濃度のＣｑに対する作用を示すグラフであり、実線（黒丸）は２秒のＲＴを表し、点線（白丸）は５秒のＲＴを表す。
【図３７】ＭＭＬＶを、１．２５Ｕ／μＬ、４５℃で２秒（塗り潰されたひし形）およびＡＭＶを、０．３１Ｕ／μＬ、４５℃で２秒（白抜きの四角形）で使用した、Ｍｇ＋＋濃度のＣｑに対する作用を示すグラフである。
【図３８】７．４ｍＭのＭｇＣｌ２と共にＭＭＬＶを１．２５Ｕ／μＬ、４５℃で２秒で使用した、ＲＴ反応時間のＣｑに対する作用を示すグラフである。
【図３９】１１ｍＭのＭｇＣｌ２と共にＡＭＶを０．３１Ｕ／μＬ、４５℃で２秒使用した、ＲＴ反応時間のＣｑに対する作用を示すグラフである。
【図４０】図３８〜３９に示された結果を、ＡＭＶ（白丸）およびＭＭＬＶ（黒丸）と組み合わせたグラフである。
【図４１】ジカテンプレートありおよびなし（２つの左のバー）ならびにｈＲＳＶテンプレートありおよびなし（２つの右のバー）の氷結技術（ｇｌａｃｉａｔｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を使用したＣｑ間の差を示すグラフである。
【図４２】氷結技術を使用した異なる凍結および冷却された部分を比較するグラフであり、実験番号１、番号２、番号３は実施例２６に記載され、実験番号１は表４に対応し、実験番号２は表５に対応し、実験番号３は表６に対応する。
【図４３】実施例２６に記載される氷結技術を使用した、陽性および陰性対照の温度のＣｑに対する作用を示すグラフである。
【図４４】ヒトゲノムＤＮＡおよび迅速サイクルＰＣＲを使用した、陽性対照、陰性対照のＣｑ、およびそれらの差（デルタＣｑ）へのアプタマーＴｒｎｃ．２−３０の作用のグラフであり、ひし形は、陰性対照のＣｑを表し、四角形は、陽性対照のＣｑを表し、三角形は、デルタＣｑを表す。
【図４５】３’−ブロッカーありおよびなしの異なるＤＮＡアプタマーの作用を比較するグラフであり、なしは、ブロッカーなし、Ｐｈｏｓは、３’−ホスフェートあり、アミノは、３’末端でＣ６−アミノ末端修飾剤で修飾されていることである。
【図４６】ＤＮＡアプタマー濃度のＣｑに対する作用を示すグラフであり、ひし形は、陰性対照のＣｑを表し、四角形は、陽性対照のＣｑを表し、三角形は、デルタＣｑを表す。
【図４７】ＲＮＡアプタマー濃度のＣｑに対する作用を示すグラフであり、ひし形は、陰性対照のＣｑを表し、四角形は、陽性対照のＣｑを表し、三角形は、デルタＣｑを表す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、１つまたは複数を意味し、状況が不適切でない限り複数形を包含するものと定義される。範囲は、本明細書では、「およその」１つの特定の値から、および／または「およその」別の特定の値までと表される場合がある。用語「約」は、本明細書では、およそ、ほぼ、だいたい、または概ねを意味するものとして使用される。用語「約」が数値範囲と共に使用される場合、「約」は、明示された数値よりも上および下に境界を広げることによりその範囲を修正する。一般的に、用語「約」は、本明細書では、述べられている値よりも５％の偏差で上および下に数値を修正するために使用される。このような範囲が示される場合、他の実施形態は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを包含する。同様に、接頭語「約」の使用によって値が近似値として示される場合、特定の値により他の実施形態が形成されるものと理解されよう。さらに、それぞれの範囲の端点は、他方の端点と関連して、かつ他方の端点とは独立してどちらも有意であることが理解されよう。
【００２９】
単語「または」は、本明細書で使用される場合、具体的に列挙されたもののうちいずれか１つのものを意味し、さらにその列挙されたもののいずれかの組合せも包含する。
【００３０】
語句「から本質的になる」は、本明細書で使用される場合、特許請求の範囲は、請求項に列挙された特定された材料またはステップであるが、特許請求された発明の「基礎的な新規の特徴に実質的に影響を与えないもの」を包含すると解釈されることを意味する。Ｉｎ  ｒｅ  Ｈｅｒｚ，５３７Ｆ．２ｄ５４９，５５１−５２，１９０Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｑ．４６１，４６３（ＣＣＰＡ１９７６）（原文において強調）を参照されたい；ＭＰＥＰ§２１１１．０３も参照されたい。したがって、用語「から本質的になる」は、本発明の特許請求の範囲で使用される場合、「含む」と同等であると解釈されることを意図しない。
【００３１】
「サンプル」は、動物；動物からの組織または臓器；細胞（対象内の細胞、対象から直接採取した細胞、または培養物中で維持された細胞もしくは培養細胞株からの細胞のいずれか）；細胞溶解産物（または溶解産物画分）または細胞抽出物；細胞、細胞材料、またはウイルス材料から誘導された１種または複数の分子（例えばポリペプチドまたは核酸）を含有する溶液；または本明細書で説明されているようなアッセイされる天然に存在する核酸もしくは天然に存在しない核酸を含有する溶液を意味する。またサンプルは、細胞、細胞成分、または核酸を含有する任意の体液または排出物（例えば、これらに限定されないが、血液、尿、便、唾液、涙、胆汁など）であってもよい。
【００３２】
語句「核酸」は、本明細書で使用される場合、天然に存在する、または合成のオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドを指し、これらは、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、一本鎖または二本鎖、センスまたはアンチセンスかどうかにかかわらず、ワトソン−クリック塩基対形成によって相補的核酸にハイブリダイズ可能なものである。また本発明の核酸は、ヌクレオチド類似体（例えば、ＢｒｄＵ、ｄＵＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ）、およびヌクレオシド間の非ホスホジエステル結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはチオジエステル結合）を包含していてもよい。特に、核酸としては、これらに限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。
【００３３】
「プローブ」、「プライマー」、または「オリゴヌクレオチド」は、相補配列を含有する第二のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子（「標的」）と塩基対を形成できる限定された配列の一本鎖のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を意味する。その結果得られたハイブリッドの安定性は、長さ、ＧＣ含量、最隣接のスタッキングエネルギー、および発生する塩基対形成の程度によって決まる。塩基対形成の程度は、例えばプローブと標的分子との相補性の程度などのパラメーター、およびハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの程度の影響を受ける。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの程度は、例えば温度、塩濃度、および例えばホルムアミドなどの有機分子の濃度といったパラメーターの影響を受け、当業者に公知の方法によって決定される。プローブ、プライマー、およびオリゴヌクレオチドは、当業者に周知の方法で、放射性標識、蛍光標識、または非放射性標識のいずれかによって検出できるように標識されていてもよい。ｄｓＤＮＡ結合色素（二本鎖ＤＮＡに結合すると、一本鎖ＤＮＡに結合するかまたは溶液中で遊離状態である場合よりも強い蛍光を発する色素）を使用して、ｄｓＤＮＡを検出することができる。「プライマー」は、ポリメラーゼによって伸長するように特異的に構成されるが、それに対して「プローブ」または「オリゴヌクレオチド」は、そのように構成されていてもよいし、または構成されなくてもよいことが理解されている。
【００３４】
「特異的にハイブリダイズする」は、プローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチドが、高いストリンジェンシー条件下で実質的に相補的な核酸（例えばサンプル核酸）を認識し物理的に相互作用して（すなわち塩基対を形成して）、他の核酸とは実質的に塩基対を形成しないことを意味する。
【００３５】
「高いストリンジェンシー条件」は、典型的には、ほぼ融解温度（Ｔｍ）マイナス５℃で（すなわちプローブのＴｍより５°低い温度で）起こることを意味する。機能的には、高いストリンジェンシー条件は、少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を同定するのに使用される。
【００３６】
例示的な実施形態において、２０秒未満のサイクル時間を用いたＰＣＲ、いくつかの実施形態では１０秒未満、５秒未満、２秒未満、１秒未満、および０．５秒未満のサイクル時間を使用したＰＣＲのための方法およびキットが提供される。これらのサイクル時間を用いれば、３０サイクルのＰＣＲは、それぞれ１０分未満、５分未満、２．５分未満、１分未満、３０秒未満、および１５秒未満で完了する。ＰＣＲ速度が速くなればなるほど、プライマー濃度もしくはポリメラーゼ濃度またはその両方が増加することによりＰＣＲ効率および収量が維持される。
【００３７】
ＰＣＲの３要素反応（プライマーのアニーリング、ポリメラーゼ伸長、およびテンプレート変性）のどれが不十分になっても、ＰＣＲの効率および収量が制限される場合がある。例えば、プライマーがテンプレートの９５％にしかアニールしない場合、たとえそのテンプレートの１００％が変性してプライマーが結合したテンプレートの１００％が伸長して全長生成物になったとしても、ＰＣＲ効率が９５％よりも大きくなることはできない。同様に、伸長効率がわずか９５％である場合も、可能な最大のＰＣＲ効率は９５％でしかない。ＰＣＲ生成物濃度をサイクルごとに２倍にするためには、全ての要素が、１００％の達成率を得なければならない。以降の段落で、変性、アニーリング、および伸長を順次考察する。
【００３８】
遅いＰＣＲ（６０秒未満のサイクル）、迅速ＰＣＲ（２０〜６０秒のサイクル）、およびエクストリームＰＣＲ（２０秒未満のサイクル）の温度サイクリングにおいて、ＰＣＲの失敗に関する一般的な原因は、不十分な変性である。目標は、各サイクルでの変性を完全に行い、プライマーのアニーリングで定量的なテンプレートが利用できるようにすることである。ＰＣＲ前の最初のテンプレートの変性、特にゲノムＤＮＡの変性は通常、ＰＣＲ中の増幅生成物の変性よりもより厳しい条件を必要とする。元の迅速サイクルＰＣＲの最適化（４）は、テンプレートを沸騰させた後に行われているが、これは、最初のゲノムＤＮＡを確実に変性させる優れた方法である。不完全な最初の変性は、高いＴｍを有する標的、特に高い安定性のフランキング領域を有する標的の場合に起こる場合がある（３７）。そのために、特に、変性中のわずかな温度差がＰＣＲ効率に影響を与える場合、例えばゲノムの挿入または欠失に関して、定量的ＰＣＲの性能が損なわれる場合がある（３７〜３９）。先に行われた沸騰または制限消化（３７）が望ましくなく、より高い変性温度がポリメラーゼ性能を損なう場合、生成物のＴｍを下げるアジュバントを使用して変性を補助してもよい。
【００３９】
変性のための初期設定の標的温度として９４℃が使用されることが多いが、それが最適であることはめったにない。ＰＣＲ生成物は、主にＧＣ含量と長さに応じて４０℃より高い温度範囲で融解する（４３）。ＰＣＲ生成物が、より低い変性温度が使用できるように十分低い温度で融解する場合、低い変性標的温度は、速度の利点と特異性の利点の両方を有する。変性温度が低ければ低いほど、サンプルはより速く変性温度に到達でき、より速くＰＣＲを行うことができる。より高い変性温度で発生し得る生成物は二本鎖のままであり、プライマーのアニーリングに利用できないと予想されるため、これらの発生し得る全ての生成物を排除することによりさらに特異性が高められる。高いＴｍの生成物を増幅するために、標的温度を９４℃より高くする必要がある場合がある。しかし、現行の熱安定性ポリメラーゼのほとんどは９７℃より高温で変性し始め、ＰＣＲ溶液は標高に応じて９５℃（または未満）から１００℃の間で沸騰する場合があるため、温度を高める余地がさほどない。１価の塩およびＭｇ＋＋濃度を低くすると、生成物のＴｍが下がる。同様に、ｄＵＴＰおよび／または７−デアザ−ｄＧＴＰを取り込むことによっても生成物のＴｍは下がるが、ポリメラーゼ伸長速度を減少させる場合がある。ほとんどの独自のＰＣＲの「エンハンサー」は、生成物のＴｍを下げて高いＴｍの生成物の変性（および増幅）を可能にする単純な有機物質である。これらのなかでも最も一般的に普及しているものは、ＤＭＳＯ、ベタイン、グリセロール、エチレングリコール、およびホルムアミドである。Ｔｍを下げることに加えて、これらの添加剤のうちいくつかは、ＰＣＲ混合物の沸点も上昇させる（特に高い標高で有用である）。エンハンサー濃度が増加するにつれ、生成物のＴｍは下がるが、ポリメラーゼ阻害が増加する場合がある。
【００４０】
しかし、エクストリームサイクリング条件下であっても変性が律速である必要はない。なぜなら、温度が生成物のＴｍからわずかしか上回っていなくても、ＤＮＡの巻き戻しが最初に極めて速く起こる（１０〜１００ミリ秒）ためである。変性は、増幅生成物のＴｍよりも測定が困難な２〜３℃高い温度で迅速に起こるが、アンプリコンの完全な変性はおそらく０．１秒未満で起こる。複数のドメインで生成物が融解する場合、標的の変性温度は、最も高い融解ドメインよりも２〜３℃高いと予想される。サンプルがこの温度に到達する限りは、長い生成物であったとしても変性は極めて速い。キャピラリーおよび水槽を使用すれば（４０）、２０ｋＢを超えるＰＣＲ生成物の完全な変性が１秒未満で起こる（５２）。生成物のＴｍおよび融解ドメインは、例示的には、ＤＮＡ色素および高解像度融解を用いて実験的に決定される（４１）。Ｔｍの推測はソフトウェアでの予測により達成できるが（４２）、その精度は限定的である。さらに、観察されたＴｍは、例えば塩濃度および任意の色素やアジュバントの存在などの局所的な反応条件に強く依存する。したがって、観察されたＴｍは通常、より反応条件に適合されている。
【００４１】
効率への影響がなければ、変性への接近速度は、可能な限り速くてもよく、例えば図２ａおよび図６ａで示されるように２００〜４００℃／秒であってもよい。これらの速度では、変性温度に到達するのに約０．１〜０．２秒しか要さない。しかし、標的温度に接近するときのより遅い速度は、標的温度を上回る危険を減少させ、起こり得るポリメラーゼの不活性化または溶液の沸騰を回避する。より遅い接近温度を達成する例示的な方法の１つは、標的温度よりも５〜１０℃高い温度の高温槽にサンプルを浸すことである。標的と槽温度との温度差により指数関数的な接近曲線が定められ、差が小さくなるにつれてこの接近曲線は自動的に遅くなる。温度を連続的にモニタリングすることによって、変性の目標が達成されたら次の相（アニーリングまで冷却すること）が始動する。まとめると、ＰＣＲにおける完全な生成物の変性は、生成物の最も高い融解ドメイン温度よりも２〜３℃高い温度で０．２秒未満を必要とし、可能な限り迅速に、例示的には４０〜４００℃／秒で変性温度に接近し得る。変性は最初に起こるため、その速度は生成物の濃度にのみ依存し、効率（または変性される生成物のパーセンテージ）は生成物の濃度とは無関係である。
【００４２】
低品質のＰＣＲでは、不完全なかつ／または間違ったプライマーのアニーリングが生じる場合がある。全てのテンプレート部位にプライマーが結合しない場合に、効率が低くなる。さらに、望ましくない部位でプライマー結合が起こる場合、別の生成物が生産される場合がある。目標は、実質的に、各サイクルで望ましい部位でのみ完全なプライマーのアニーリングを達成し、ポリメラーゼ伸長のために定量的なプライマーが結合したテンプレートを提供することである。
【００４３】
２０〜６０秒のサイクルを用いた迅速ＰＣＲプロトコールは、５００ｎＭのプライマーのＴｍよりも５℃低い温度で１秒未満のアニーリング時間を提唱している（５２）。２０秒未満のサイクルを試みた機器の場合のプライマー濃度は、それぞれ２００〜１，０００ｎＭの範囲である（表１）。これらの濃度は、長いアニーリング時間が使用される従来のＰＣＲ（６０秒未満のサイクル）で使用される濃度に類似している。プライマー濃度を低くすることは、特異性を向上させるために使用されることが多く、プライマー濃度を増加させることは、非特異的増幅に関する懸念のために考慮されることはまれである。しかし、迅速サイクリングを用いる場合、特異性の向上はより短いアニーリング時間に起因している（５）。この傾向が継続すれば、エクストリームＰＣＲの極めて短いアニーリング時間は、高いプライマー濃度を容認するものと想像できる。アニーリングを促進するために、２０〜６０秒のサイクルの場合、プライマーのＴｍよりも５℃低いアニーリング温度が推奨される。Ｔｍは、増幅で使用されるのと同じ緩衝液条件下で飽和させたＤＮＡ色素およびオリゴヌクレオチドを使用した融解分析によって最もよく実験的に測定される。プライマーを、ダングリング末端（ｄａｎｇｌｉｎｇ  ｅｎｄ）として５’−伸長部分を有するその相補標的と組み合わせることにより、そのテンプレートにアニールしたプライマーの安定性を最適に概算し、融解分析が行われる。
【００４４】
変性と対照的に、アニーリング効率はプライマー濃度に依存する。プライマーのアニーリングは、極めて速いサイクル速度で制限的になる場合がある。プライマーのアニーリングは、２番目に起こる反応であり、プライマー濃度と標的濃度の両方に依存する。しかし、多くのＰＣＲにおいて、プライマー濃度は標的濃度よりもかなり高く、実際的にはアニーリングは擬似的に最初に起こり、プライマー濃度にのみ依存する。このケースにおいて、プライマーが結合した生成物の比率（アニーリング効率）は、プライマー濃度にのみ依存して生成物濃度には依存しないことから、より高いプライマー濃度は、より短いアニーリング時間を可能にすると予想される。さらに、理論にとらわれずにいえば、その関係は直線的であると考えられる。アニーリング時間がより短くなればなるほど、ＰＣＲの効率および収量を維持するためにはプライマー濃度の増加が必要になる。例えば、迅速サイクリングは、プライマーのＴｍよりも５℃低い温度で約１〜３秒のアニーリングを可能にする（３）。エクストリームＰＣＲにおいて、このアニーリング時間（Ｔｍ−５℃、またはそれより低い温度で）を１０倍短くする場合、プライマー濃度を１０倍増加させれば類似のプライマー結合効率が期待される。有効なアニーリング時間が次第に短くなるにつれて、プライマー濃度もほぼ同じ倍率で次第に高くなるべきである。典型的な迅速ＰＣＲプロトコールは、５００ｎＭの各プライマーを使用する。エクストリームＰＣＲにおいてアニーリング時間が３倍から４０倍短くなると、同じプライマー結合効率を得るのに必要なプライマー濃度は、各プライマーで１，５００〜２０，０００ｎＭである。これは、プライマーの合計で３，０００〜４０，０００ｎＭと同等であり、表１に記載されたいずれのプライマー濃度よりも高い。これは、先に行われた試みで２０秒未満のサイクリングでの効率が不十分であることの理由の１つは、不十分なプライマー濃度の後に起こる不十分なアニーリング効率であることを示唆している。エクストリームＰＣＲでは、プライマー濃度をそれぞれ１．５〜２０μＭに増加させることにより、０．０５〜０．３秒のアニーリング時間にもかかわらず優れたアニーリング効率を達成している。増加させたプライマー濃度を使用すれば、アニーリング時間の短縮を相殺して同じアニーリング効率を達成することが可能なため、より短いアニーリング時間でもさらにより高いプライマー濃度を考慮できる。市販されているほとんどの機器は少なくとも１秒の保持時間を必要とし、わずかな機器が「０」秒の保持時間を許容することが知られているが、わずかな秒の保持時間を許容する市販の機器はない。エクストリームＰＣＲのいくつかの実例について、０．１秒または０．０１秒きざみの保持時間が望ましい場合がある。
【００４５】
効率を犠牲にすることなくアニーリング速度を増加させアニーリング時間を短くする別の方法は、例示的にはＭｇ＋＋濃度を増加させることによって、イオン強度を増加させることである。アニーリング速度は、イオン強度の増加に伴い増加し、プライマーのアニーリングを包含するハイブリダイゼーション速度を増加させるには２価カチオンが特に有効であることが当分野において知られている。
【００４６】
例示的には、アニーリングの標的温度への接近速度は、可能な限り速くてもよい。例えば、２００〜８００℃／秒で（図２ａおよび図６ａ）、０．０５〜０．２秒でアニーリング温度に到達することが可能である。また迅速な冷却も、全長生成物の再ハイブリダイゼーションを最小化する。冷却中に二重鎖増幅生成物が形成される程度になると、プライマーは二重鎖生成物にアニールできないため、ＰＣＲ効率は低下する。これはＰＣＲ初期ではめったに起こらないが、生成物濃度が増加するにつれて、冷却中に二重鎖がますます形成されるようになる。ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩを用いた連続的なモニタリングから、このような生成物の再アニーリングが、ＰＣＲがプラトーになる主な原因である場合があることが示唆される（４４）。
【００４７】
ポリメラーゼ伸長も時間を必要とし、伸長時間が短い場合にＰＣＲ効率を限定する場合がある。より長い生成物は、ＰＣＲ中により長い伸長時間を必要とすることが知られており、推定上全ての生成物の伸長を完了させるために、ＰＣＲの最後に数分の最終的な伸長が付け足されることが多い。長い生成物のための通常のアプローチは、伸長にかかる時間を長くすることである。プライマーのアニーリングおよびポリメラーゼ伸長が同じ温度で行われる２ステップサイクリングのいくつかのケースと同様に、より低い伸長温度を使用することにより必要な時間がさらに長くなる。
【００４８】
最適なＰＣＲ効率のためには、各サイクルにおけるプライマーが結合したテンプレートの実質的に完全な伸長が必要である。ほとんどのポリメラーゼ伸長速度は、温度に伴い所定の最大値まで増加する。Ｔａｑポリメラーゼの場合、最大値は７５〜８０℃で約１００ヌクレオチド／秒であり、温度が１０℃低下するごとに約４倍減少する（５０）。５３６ｂｐのベータグロビン生成物の場合、迅速サイクルＰＣＲでは７６℃が最適であることが見出された（４）。近年、商業的な要求に応じて、全体のＰＣＲ時間を短くできるより速いポリメラーゼが導入されつつあり、これは、このようなポリメラーゼが、より長い生成物のための伸長保持時間を不要にするかまたは短くできることを示唆している。
【００４９】
より速いポリメラーゼ伸長速度の代替策またはそれを補強する策として、ポリメラーゼ濃度を増加させると、必要な伸長時間が短くなることが発見された。５００ｎＭの各プライマーと共に、ＰＣＲにおいて標準的なＴａｑポリメラーゼ濃度（０．０４Ｕ／μｌ）または１．５ｎＭ（４９）を使用すると仮定すれば、各プライマーがテンプレートに結合する場合、一度にテンプレートの０．１５％が伸長する程度のポリメラーゼしか存在していないため、新しいプライマーが結合したテンプレート全てを伸長させるためにはポリメラーゼをそれらに何度も再利用することが必要となる。ポリメラーゼ濃度を増加させることにより、プライマーが結合した有効なテンプレートのより多くが一度に伸長され、テンプレート全てを伸長させるのに必要な時間を短くするが、これはおそらく、より速い伸長速度によるのではなく、いずれの時点においてもプライマーが結合したテンプレートのより高い比率を伸長することによるものと予想される。
【００５０】
一次近似によれば、小さいＰＣＲ生成物の場合（１００ｂｐ未満）、必要な重合時間は、酵素の重合速度（それ自身が温度の関数である）およびポリメラーゼ濃度に正比例するようである。また必要な時間は、伸長させようとするテンプレートの長さ（生成物の長さからプライマーの長さを引いた長さ）に反比例する。ポリメラーゼ活性を、ＰＣＲにおいて標準的な活性である０．０４Ｕ／μｌの２０〜３００倍に増加させることにより、２０秒未満のサイクルを用いたエクストリームＰＣＲは、特異的生成物の高い収量を達成できる。すなわち、０．８〜１２Ｕ／μｌ（１〜１６μＭのＫｌｅｎＴａｑ）の活性は、０．１〜１．０秒の併合されたアニール／伸長時間を用いた２ステップのエクストリームＰＣＲを可能にする。これまでに使用された最大のポリメラーゼ活性は、０．５Ｕ／μｌであった（表１）。エクストリームＰＣＲの実例で使用される２ステップＰＣＲの場合、７０〜７５℃での併合されたアニール／伸長ステップがより速い重合速度にとって有利である。さらに、２ステップＰＣＲは温度サイクリングを簡易化するため、エクストリームサイクリング（２０秒未満のサイクル）の実例では典型的には２ステップＰＣＲが使用され、迅速なアニーリングと迅速な伸長の両方が、併合されたアニール／伸長ステップの間に起こらなければならない。それゆえに、実例では増加させたプライマー濃度と増加させたポリメラーゼ濃度の両方が使用され、その結果として、エクストリーム２温度サイクリング下でロバストなＰＣＲがもたらされる。例示的には、以下に記載される実施例で例示されるように、５０〜７５℃で０．０５〜５．０秒の併合されたアニール／伸長時間を用いる場合、それぞれ１．５〜２０μＭのプライマー濃度と、任意の標準的なポリメラーゼの０．４〜１２Ｕ／μｌのポリメラーゼ濃度（０．５〜１６μＭのＫｌｅｎＴａｑ）とが必要である。アニーリングおよび伸長の両方に対して１つのＰＣＲサイクリングセグメントしかないため、エクストリームＰＣＲ条件は、例示的にはプライマー濃度とポリメラーゼ濃度の両方を増加させることによって両方のプロセスを強化することを必要とする。
【００５１】
また、エクストリーム３温度サイクリングも想定され、その場合、アニーリングステップおよび伸長ステップは異なる温度で別々に維持される。このケースにおいて、アニーリングステップおよび伸長ステップに配分される時間を個々に制御して、具体的な要求に合わせることが可能である。例えば、アニーリング時間のみが短く（０．０５〜０．２秒）伸長時間が比較的長く維持される場合（例示的には１、２、５、１０または１５秒）、効率的なＰＣＲのためにはプライマー濃度だけを増加させればよい。あるいは、伸長時間は短いが（７０〜８０℃の範囲内で１秒未満）、アニーリング時間は長い場合、効率的なＰＣＲを達成するためにはポリメラーゼ濃度だけを増加させればよいと考えられる。効率的なＰＣＲは、例示的には少なくとも７０％、さらに例示的には少なくとも８０％、最も例示的には少なくとも９０％の効率を有し、多くの例において９５％を超える効率も達成可能であることが理解される。
【００５２】
１００ｂｐよりも長い生成物の場合、エクストリームＰＣＲを使用した効率的な伸長は、高いポリメラーゼ濃度と増加させた伸長時間との組合せを必要とする場合がある。ポリメラーゼが過量に存在する場合、例示的には、最小の時間は、塩基の伸長の長さ（生成物の長さからプライマーの長さを引いた長さと定義される）を塩基／秒単位のポリメラーゼ伸長速度で割った値であるはずである。しかし、これまで述べてきたように、ポリメラーゼが飽和しているのは通常、テンプレート濃度がポリメラーゼ濃度よりも大きくなる前の、ＰＣＲの開始時のみである。サイクル時間を短くする方法の１つは、ポリメラーゼの最大温度近傍、典型的には７０〜８０℃で、２温度ＰＣＲを使用することである。必要な伸長時間は、リアルタイムＰＣＲを使用して定量サイクル、すなわちＣｑをモニタリングすることによって実験的に決定できる。例えば、７５℃で１００塩基／秒のポリメラーゼ伸長速度では、ポリメラーゼ濃度が過量である場合、２００ｂｐの生成物は、約２秒を要すると予想される。同様に、４００ｂｐの生成物は、これと同じポリメラーゼを使用した場合、その濃度が、伸長されるテンプレートの濃度よりも高い限りは約４秒を要すると予想される。ポリメラーゼが過量ではない場合、より多くのポリメラーゼを添加することによって、より多くのテンプレートが同時に伸長されて、ポリメラーゼ濃度に比例して必要な伸長時間を短くすることが可能になる。
【００５３】
任意のＤＮＡ分析方法の有用性は、どれだけ速く行うことができるか、どれだけ多くの情報が得られるか、およびどの程度難しいかによって決まる。従来のクローニング技術と比較して、ＰＣＲは速くかつ簡単である。迅速サイクルＰＣＲおよびエクストリームＰＣＲは、必要な時間の連続的な短縮に重点を置いている。リアルタイムＰＣＲは、各サイクルでデータを得ることにより情報量を増加させる。ＰＣＲ中またはＰＣＲ後に融解分析を行って、温度を増加させながらＤＮＡハイブリダイゼーションを連続的にモニターできる。
【００５４】
ＰＣＲの平衡パラダイムおよび動力学的パラダイムに戻って考えると（図１５ａ〜１５ｂ）、１００ｂｐ未満の生成物のエクストリームＰＣＲは、動力学的モデルがよく当てはまることが実証されている。温度は常に変化しており、変性、アニーリング、および伸長の速度は温度依存性であることから、ＰＣＲの適切な評価は、温度全域にわたる各要素の反応速度を統合することでしか得られない。１００ｂｐより大きい生成物の場合、より長い伸長時間を要する場合があり、反応速度論モデルと平衡モデルのどちらの要素でも適切である。
【００５５】
本明細書に記載の少なくとも１つの実施形態に従って反応条件が構成される場合、いくつかの実施形態に関して例示すれば、２秒未満のサイクル時間を用いて、完全な増幅のために１分未満で、極めて速い速度でＰＣＲを行うことができることが発見された。例示的には、このエクストリームＰＣＲに、増加させたポリメラーゼ濃度とプライマー濃度との様々な組合せが使用される。いずれの特定の理論にとらわれずにいえば、過剰な濃度のプライマーは、概して完全なプライマーのアニーリングを可能にし、それによってＰＣＲ効率を増加させると考えられる。同様にいずれの特定の理論にとらわれずにいえば、ポリメラーゼ濃度を増加させることによっても、より完全な伸長がもたらされるためにＰＣＲ効率が向上すると考えられる。ポリメラーゼ濃度を増加させることにより、アニールしたプライマーへの結合が促進され、さらに完全な伸長の前にポリメラーゼが離れた場合でも再結合が促進される。以下に記載の実施例で、複雑な真核生物ゲノムＤＮＡおよび単一コピー標的を用いて開始した場合でもエクストリームＰＣＲが成功したことを示す。
【００５６】
以下に記載される実施例ではＫｌｅｎＴａｑを使用したが、類似の活性を有する任意の熱安定性ポリメラーゼが、ポリメラーゼ伸長速度を考慮した類似の方式により、エクストリームＰＣＲで性能を発揮すると考えられる。本明細書で提示されたように、例示的には酵素の活性化率（ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒａｔｅ）の差で調節することにより濃度を増加させて使用した場合、エクストリームＰＣＲを可能にすると予想されるポリメラーゼの市販の調製物としては、例えば、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ、Ｋａｐａ２Ｇ  ＦＡＳＴ、ＫＯＤ  Ｐｈｕｓｉｏｎ、天然のまたはクローニングしたサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ、ＧｏＴａｑ、およびＦａｓｔ  Ｓｔａｒｔが挙げられる。
【００５７】
２秒のサイクル時間を可能にする現行の市販のＰＣＲ機器はないため、システム４を組み立てて、エクストリームＰＣＲの構想の証明試験を行った。しかし、システム４は例示的なものであり、迅速に熱サイクリング可能な他のシステムも本開示の範囲内であることが理解される。図１ａで示されるように、９５．５℃（本発明の実施例が行われた場所であるユタ州ソルトレイクシティでの沸騰水の温度）の高温の水槽１０、および３０〜６０℃の低温の水槽１４を使用して、サンプル容器２０中に入れられた１〜５μｌのサンプルの温度を変化させる。例示的な水槽１０、１４は４．５クォートのステンレス鋼製ドレッシング用ジャー（Ｌａｂ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｓｕｐｐｌｙ、番号４１６３４）であるが、いくつかの実施例では５００ｍｌのガラスビーカーを使用して、磁気撹拌しながら電気ホットプレート１２、１６（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｓｏｔｅｍｐデジタルホットプレート（番号１１−３００−４９ＳＨＰ）で加熱が行われる。しかし、他の実施形態が、サンプルを加熱したり冷却したりするのに使用され得ることが理解される。図１ａに示される実施形態において、サンプル容器２０は、ガラス／プラスチック複合材の反応チューブ（ＢｉｏＦｉｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、番号１７２０、内径０．８ｍｍおよび外径１．０ｍｍ）である。しかし、他の実施例では、サンプル容器２０として、皮下注射針（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、番号３０５１８７、内径０．０４２インチ、外径０．０７５インチ）と、ステンレス鋼管材料で構成されＢｉｏＦｉｒｅチューブのプラスチックの頂上部に適合させたステンレス鋼／プラスチック複合材の反応チューブ（Ｓｍａｌｌ  Ｐａｒｔｓ、内径０．０４２インチ／外径０．０７５インチ、内径０．０３５インチ／外径０．０４２インチ、または内径０．０２６５インチ／外径０．０３５インチ）とを使用した。その他のサンプル容器も本発明の範囲内であるが、大きい表面積対体積比を有し、速い熱伝達速度を有するサンプル容器が望ましい。所定の実施形態に関して、金属管材料の開放端をガス炎を使用して赤色から白色に加熱し、万力で圧縮することによって密封した。リアルタイムＰＣＲの場合、光学的に透明であるか、または光学的に透明な部分を有するチューブが望ましい。短時間の遠心分離によりサンプルを各チューブの底部に沈降させた。
【００５８】
サンプル容器２０は、アーム２１によりステッピングモーターのシャフト２６に取り付けられたチューブホルダー２２によって保持される。反応溶液が６．５〜７．５ｃｍの半径で保持されるように２〜５個のサンプル容器２０を保持するためのチューブホルダー２２を、黒いデルリン（Ｄｅｌｒｉｎ）プラスチックから機械製作した（図１ａでは１つのサンプル容器２０のみを図示したが、このようなサンプル容器２０の列が存在してもよい）。図１ａでは図示されていないが、熱電対（Ｏｍｅｇａ  ｔｙｐｅ  Ｔ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ細線熱電対、番号５ＳＲＴＣ−ＴＴ−Ｔ−４０−３６、３６インチのリード線、０．００３インチの直径、テフロン製絶縁材を有する）を使用して、温度を測定できる。図１ｂと類似したチューブホルダーおよびアームを示す図１ｄを参照すれば（同様の数値は類似の構成要素を示す）、２つのサンプル容器を保持するように設計されたチューブホルダー２２２が存在しており、チューブホルダー２２２における一方の場所は熱電対２２８によって占められている。本明細書で説明される実施形態のいずれにおいても、図１ｄで示されるように、任意の数のサンプル容器２０または２２０を熱電対と共に使用してもよいし、熱電対熱電対なしで使用してもよいことが理解される。熱電対による増幅および線状化は、Ａｎａｌｏｇ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＡＤ５９５チップ（示さず）を用いて行われる。まず、Ｔ型電圧＝（ＡＤ５９５の出力／２４７．３）−１１μＶに従って、ＡＤ５９５の出力から熱電対の電圧を計算した。次いで、Ｔ型熱電対の電圧／温度相関に関するアメリカ国立標準技術研究所の係数を使用して熱電対の電圧を温度に変換した。アナログシグナルをデジタル化し（ＰＣＩｅ−６３６３収集ボード）、ＣＰＵ４０にインストールされたＬａｂＶｉｅｗソフトウェア（バージョン２０１０、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で処理し、ユーザーインターフェース４２に表示した。例示的には、ステッパーの動きを８７〜９２℃および６０〜７５℃で動的に引き起こすか、またはコンピューターで制御された期間にわたり各水槽中にステッパーを保持してもよい。典型的には３０〜５０サイクルが行われる。
【００５９】
チューブホルダー２２中の全てのサンプル容器２０が水槽１０と水槽１４との間を素早く移動して、サンプルが入っている各サンプル容器２０の一部が完全に浸されるように、ステッピングモーター２４（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、番号ＨＴ２３−４０１、３Ｖ、３Ａ）が水槽１０と水槽１４との間に配置される。ステッピングモーター２４は、例示的には４ＳＸ−４１１ｎｕＤｒｉｖｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、示さず）で作動し、ＰＣＩ−７３４４運動制御器とＣＰＵ４０にインストールされたＮＩ−Ｍｏｔｉｏｎソフトウェア（バージョン８．２、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）とで制御される。ステッピングモーター２４は、水槽１０と水槽１４との間を約０．１秒で回転する。図２ａは、９０℃および５０℃でステッパーの動きが引き起こされた運転に関して、サンプル容器２０の位置の軌跡（直線）の上にサンプルの温度の軌跡（点線）を重ねて示す。図２ａからわかるように、５０℃よりも低い温度にいくつかのオーバーシュートがあるが、これは水槽１４からサンプル容器２０に移動させるのに必要な時間によるものと推定される。したがって、上記で論じられたように、いくらかより高い温度でステッピングモーター２４を始動させることが望ましい場合がある。以下の実施例において、示された温度は、到達したサンプルの温度であって、トリガー温度ではない。図２ａから計算された最大の加熱速度は３８５℃／秒であり、最大の冷却速度は３３３℃／秒である。例示的には、エクストリームＰＣＲは、少なくとも２００℃／秒の傾斜速度で行ってもよい。他の実施形態において、傾斜速度は、３００℃／秒であってもよいし、またはそれよりも大きくてもよい。
【００６０】
いくつかの実施例では、システム４はまた、リアルタイムモニタリングのために構成される。図１ａで示されるように、リアルタイムモニタリングの場合、サンプル容器２０がステッピングモーター２４により高温の水槽１０から低温の水槽に移動したとき、このモニタリング位置を保ちながら、または保たずにサンプル容器２０が光ファイバーチップ５０を通過するように、光学素子ブロック２５の光ファイバーチップ５０がサンプル容器２０上に取り付けられる。この例示的な実施形態において、光ファイバーチップは、水槽の上の空気中に提供される。熱的サイクリングデバイス４をＣＰＵ４０によって制御してユーザーインターフェース４２に表示してもよい。
【００６１】
図１ｂは、図１ａに類似した実施形態を示す。ホットプレート２１２および２１６は、高温の水槽２１０および低温の水槽２１４の温度を制御するために備えられている。ステッピングモーター２２４は、例示的にはアルミニウムで作製されたアーム２２１とチューブホルダー２２２を動かしてサンプル容器２２０と熱電対２２８（図１ｄに示される）を動かすために備えられている。しかし、この実施形態において、ブロック２５４を配置させることにより、光ファイバーケーブル２５２のチップ２５０は水槽２１４中に保持される。光ファイバーケーブル２５２は、ポート２４８を介して水槽２１４に入り、光学素子ブロック２２５にシグナルを与える。熱的サイクリングデバイス２０４をＣＰＵ２４０によって制御してユーザーインターフェース２４２に表示してもよい。
【００６２】
Ｏｃｅａｎ  ＯｐｔｉｃｓのＬＬＳ−４５５ＬＥＤ光源２５６からの光を、光ファイバーケーブル２５２（Ｏｃｅａｎ  ＯｐｔｉｃｓのＰ６００−２−ＵＶ−ＶＩＳ、ファイバーコア直径６００μｍ）によって４４０＋／−２０ｎｍの励起干渉フィルター、ビーム分割のための４５８ｎｍのダイクロイックフィルターおよび４９０＋／−５ｎｍの放出フィルター（全てＳｅｍｒｏｃｋより、示さず）を備えたＨａｍａｍａｔｓｕ  Ｏｐｔｉｃｓの光学素子ブロック２５８に導いた。より低温の水槽中に配置されたきに、１つのサンプルのキャピラリーからおよそ１〜２ｍｍの距離で一列に置かれた別の光ファイバーケーブル（示さず）を用いて、キャピラリーの落射蛍光照明が達成された。放出検出は、ＨａｍａｍａｔｓｕのＰＭＴ６２を用いて行われた。
【００６３】
図１ｃは、３温度ＰＣＲのための例示的なシステム３０４を示す。９５．５℃の高温の水槽３１０、３０〜６０℃の低温の水槽３１４、および７０〜８０℃の中程度の温度の水槽３１３を使用して、サンプル容器３２０中に入れられている１〜５μｌのサンプルの温度を変化させ、磁気撹拌しながら３つの電気ホットプレート３１２、３１６、および３１８で加熱する。サンプル容器３２０は、アーム３２１でステッピングモーター３２４に取り付けられたチューブホルダー３２２によって保持される。また熱電対３２８も、チューブホルダー３２２によって保持される。ステッピングモーター３２４が回転するときに、アーム３２１を持ち上げることができる。光ファイバーチップ３５０は、例示的には、中程度の温度の水槽３１３中に提供されるが、図１ａの場合のように空気中に置かれていてもよいことが理解される。この例示的な実施形態の構成のために、３つの水槽３１０、３１３、および３１４を互いに等距離で設けることは不可能であった。したがって、サンプルの冷却は高温の水槽３１０と低温の水槽３１４との間でなされることが望ましく、それに対してサンプルの加熱は、サンプルがその他の水槽間を移動することによってなされるために、高温の水槽３１０と低温の水槽３１４との間に最も大きいスペースを設けた。しかし、この構成は単なる例示であり、他の構成も本開示の本質の範囲内であることが理解される。２つのステッピングモーターが同時に使用されるために（一方はキャピラリーを水から持ち上げるためであり、もう一方は水槽間を移動させるためである）、それぞれの角運動を最小化することにより、槽間の運動時間を短くできる。２つの水槽によるシステムでは、槽間でサンプルを移動させるのに必要なステッパーの角運動は、２７０度よりも大きい。しかし、３つの水槽によるシステムでは、サンプルを持ち上げるステッピングモーターは４５度未満で横断する必要があり、一方でサンプルを水槽間で移動させるステッパーは、わずか９０度またはそれ未満で移動する必要がある。また水槽は、必要な角運動をさらに制限するために円形のセクター（扇形のくさび）として構成されてもよい。角運動を最小化することにより、水槽間の移動時間が短くなる。１００ミリ秒未満の移動時間、または５０ミリ秒未満もの移動時間が想定される。このシステム３０４の他の構成要素は図１ａ〜ｂに示されるシステム４、２０４と類似しており、図１ｃでは示されていない。４つの水槽によるシステムへの拡張も想定される。第４の水槽の用途としては、低温での開始を確実にして最初のＰＣＲ変性前の伸長の量を制限するための氷水槽、およびＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の前の逆転写のための３７〜５６℃の水槽などが挙げられる。低温での開始と逆転写の両方が必要な場合、５つの水槽によるシステムを使用してもよい。
【実施例】
【００６４】
［実施例１］
特に他の指定がない限り、５０ｍＭのトリス（２５℃でｐＨ８．３）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、５００μｇ／ｍｌの非アセチル化ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、２％（ｖ／ｖ）グリセロール（Ｓｉｇｍａ）、５０ｎｇの精製ヒトゲノムＤＮＡ、および１×ＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標）プラス（ＢｉｏＦｉｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含有する５μｌの反応体積でＰＣＲを行った。プライマー濃度およびポリメラーゼ濃度は、具体的な実験プロトコールに従って変更した。Ｋｌｅｎｔａｑ１（商標）ＤＮＡポリメラーゼをＡＢ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯまたはワシントン大学（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）のＷａｙｎｅ  Ｂａｒｎｅｓのいずれかから得た。ＫｌｅｎＴａｑの分子量は６２．１ｋＤであり、２８０ｎｍにおける吸光係数は、配列から計算した場合、６９，１３０Ｍ−１ｃｍ−１である（米国特許第５，４３６，１４９号）。質量分析法で、主たる分子量は６２ｋＤであることが確認され、変性ポリアクリルアミドゲルで、主要なバンドは合計で８０％より高い純度を有することが示された。吸光度および純度を使用して濃度を計算したところ、１０％グリセロール中、８０μＭのストックであることが示された。最終的なポリメラーゼ濃度は、典型的には０．２５〜１６μＭであった。１μＭのＫｌｅｎＴａｑは、０．７５Ｕ／μｌに等しく、この場合の１ユニットは、活性化サケ精子ＤＮＡを用いて７２℃で３０分で合成された生成物１０ｎｍｏｌと定義される。ユタ大学のコア施設でプライマーを合成し、脱塩し、濃度をＡ２６０によって決定した。各プライマーの最終濃度は、典型的には２．５〜２０μＭの間で様々であった。
【００６５】
プライマーＣＣＣＡＴＴＣＡＡＣＧＴＣＴＡＣＡＴＣＧＡＧＴＣ（配列番号１）およびＴＣＣＴＴＣＴＣＴＴＧＣＣＡＧＧＣＡＴ（配列番号２）を使用して、ヒトゲノムＤＮＡからＫＣＮＥ１の４５ｂｐのフラグメントを増幅した。これらのプライマーはバリアントｒｓ番号１８０５１２８（ｃ．２５３Ｇ＞Ａ）を間に挟み、配列：ＣＣＣＡＴＴＣＡＡＣＧＴＣＴＡＣＡＴＣＧＡＧＴＣＣ（Ｇ／Ａ）ＡＴＧＣＣＴＧＧＣＡＡＧＡＧＡＡＧＧＡ（配列番号３）を増幅した。
【００６６】
図３ａには、図１ａに示されるデバイスを使用したエクストリームＰＣＲによって生成したＰＣＲ生成物の融解曲線が示され、この場合、０．６４μＭのＫｌｅｎＴａｑおよび１０μＭの各プライマーを使用して、図２ｂで示されるように９１℃から５０℃の間で、３５サイクルおよび２８秒の総増幅時間でサイクリングされた。各サイクルは０．８秒を要した。さらに図３ａには、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒでの迅速サイクリングによって生成した同じアンプリコンの融解曲線も示され、この場合、０．０６４μＭのＫｌｅｎＴａｑおよび０．５μＭの各プライマーを使用して、３５サイクルおよび１２分の総増幅時間で、９０℃から５０℃の間でサイクリングされた（図２ｃ）。各サイクルは１０．３秒を要した。図２ｂおよび２ｃでは時間の尺度が異なるため、図２ｂの全体のエクストリームＰＣＲプロトコールは、それに対応する迅速サイクルの２サイクル未満で完了することに留意されたい。両方の反応により、類似のＴｍを有しゲル電気泳動で強いバンドを示すアンプリコンが生産されたのに対し（図３ｂ）、陰性対照は融解分析またはゲル電気泳動のどちらによっても増幅は示されなかった。この実例において、エクストリームＰＣＲ条件は、ゲルで分析したところ（図３ｂ）、迅速サイクルＰＣＲ条件よりも高い収量を示した。融解曲線におけるＴｍの０．５℃の差は、ポリメラーゼ貯蔵緩衝液中のグリセロール含量から生じる、各反応液におけるグリセロールの量の違いに起因すると考えられる（ＰＣＲにおけるグリセロールの最終濃度は、エクストリーム条件下では１．３％であり、迅速条件下では０．１％であった）。また、図３ｂからも、アンプリコンのサイズが類似しており、予測通りであったことが確認される。加えて、ポリメラーゼ濃度とプライマー濃度とが高いにもかかわらず、反応は特異的のようであり、非特異的生成物は認められなかった。しかし、高解像度融解分析では３種の遺伝子型を区別することはできなかった。プライマーの総濃度に対するポリメラーゼの化学量論的なパーセンテージは、エクストリームＰＣＲの場合は３％であり、迅速サイクルＰＣＲの場合は６．４％であった。
【００６７】
１μＭのポリメラーゼ、１０μＭの各プライマー、および１．３％グリセロールを使用して、４５ｂｐのＫＣＮＥ１の反応をリアルタイムでモニタリングした。図１ａのデバイスを使用して、２つの水槽間の空気中のサンプルを各サイクルでモニターした。密封されたチャンバーの空気の温度を７０℃に保持し、各サイクル０．２秒でサンプルを調査した。温度参照キャピラリーで測定しながら、サンプルを図３ｃで示されるように６０℃から９０℃の間でサイクリングした。位置決めと測定の時間が追加されたために、サイクル時間が０．８秒から１．１２秒に増加した。したがって、５０サイクルは５６秒で完了した。約３０サイクルでの、すなわち約３４秒後の蛍光の増加から、増幅が認められた（図３ｃ）。測定のためにサンプルが空気中にあり、ポリメラーゼの伸長速度が制限される間も、温度はほぼ６０℃に保たれた。
【００６８】
図３ｃで観察されるように、この反応は、約２５サイクルの定量サイクル（Ｃｑ）を有するが、少なくとも５０サイクルまではプラトーにはならないようである。またこの反応は６４サイクル後に停止したため、アンプリコンの量が増加し続け、かなり後にならないとプラトーに達しない場合もある。理論にとらわれずにいえば、プライマー濃度を増加させることにより、収量を向上させ、さらに、プラトーを例示的にはＣｑ後に２０サイクル、より例示的にはＣｑ後に２５サイクルまたはそれより多くのサイクル遅延させることができると考えられる。
【００６９】
［実施例２］
この実施例では、インターロイキン１０ベータ受容体中のＡ＞Ｇバリアント（ｒｓ番号２８３４１６７）を間に挟む５８ｂｐのフラグメントを、プライマーＣＴＡＣＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＡＣＣＴＧＣ（配列番号４）およびＧＧＴＡＣＴＧＡＧＣＴＧＴＧＡＡＡＧＴＣＡＧＧＴＴ（配列番号５）を用いて増幅し、以下のアンプリコン：ＣＴＡＣＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＡＣＣＴＧＣＴＴＴＴＧＣＣ（Ａ／Ｇ）ＡＡＧＧＧＡＡＣＣＴＧＡＣＴＴＴＣＡＣＡＧＣＴＣＡＧＴＡＣＣ（配列番号６）を生成した。実施例１で説明したようにして、図１ａに示される機器を使用してエクストリームＰＣＲを行った。１μＭのポリメラーゼ、１０μＭの各プライマー、および１．３％グリセロールを使用した（全プライマーに対するポリメラーゼのパーセンテージは５％）。ポリメラーゼがより高い伸長速度を有する場合、ポリメラーゼ伸長のために温度を７０〜８０℃に増加させるために、様々な位置決定プロトコールを使用した。アニーリング温度に達した後、モニターするために空気中で即座に位置決定する代わりに、伸長温度に達するまでサンプルを高温の水槽に移した。次いでサンプルを高温の水槽の真上の空気中に配置させて、図４ａおよび４ｂに示した温度サイクルを生じさせることにより、７０℃から７７℃の間の最適な温度でより速いポリメラーゼ伸長を可能にした。３種の異なる遺伝子型をそれぞれ、０．９７秒のサイクルを使用して３９サイクルを３８秒で完了させるエクストリームＰＣＲによって増幅した。エクストリームＰＣＲの後、ＬＣ２４キャピラリーが適合するように改変されたＨＲ−１機器で各遺伝子型の高解像度融解曲線を得た。図４ｃから明らかなように、３種の遺伝子型全てが予想通りに増幅され、区別された。
【００７０】
［実施例３］
実施例１における反応混合物はエクストリームＰＣＲおよび迅速サイクルＰＣＲの両方で同じであるが、見たところ図３ａで観察されるＴｍのシフトの原因と思われるポリメラーゼおよびプライマーの量、ならびにグリセロール濃度のわずかな差が認められた。この実施例およびこの先全ての実施例において、グリセロール濃度は、必要に応じてその濃度を均一化することにより２％に保持された。エクストリームＰＣＲの場合、１μＭのポリメラーゼおよび１０μＭの各プライマーを使用し、迅速サイクルＰＣＲの場合、０．０６４μＭのポリメラーゼおよび０．５μＭの各プライマーを使用した。上記で論じられたように、より速いアニーリング時間は、プライマー特異性の向上をもたらすと考えられる。この特異性の向上に伴い、増加させたプライマー濃度を使用してもよく、それにより、プライマーの結合が促進されてアニーリング時間が短くなると考えられる。同様に、増加させたポリメラーゼ濃度によりアニールしたプライマーへの結合も促進されて、完全な伸長の前にポリメラーゼが離れた場合に、不完全なアンプリコンへの再結合も促進される。加えて、ポリメラーゼ濃度が高ければ高いほど、ＰＣＲの後半でさえもより大量のプライマーが結合したテンプレートが一度に伸長でき、１つのポリメラーゼが伸長させなければならないテンプレート数が少なくなるため、全体の伸長時間が短くなる。
【００７１】
図５ａに、様々なポリメラーゼ濃度およびプライマー濃度を用いたエクストリームＰＣＲサイクリングの結果を要約する。この実施例において、インターロイキン１０ベータ受容体の４９ｂｐのフラグメントを、プライマーＧＧＧＡＧＴＣＡＣＣＴＧＣＴＴＴＴＧＣＣ（配列番号７）およびＴＡＣＴＧＡＧＣＴＧＴＧＡＡＡＧＴＣＡＧＧＴＴＣＣ（配列番号８）、ならびに３ｍＭのＭｇＣｌ２を用いて増幅して、ＧＧＧＡＧＴＣＡＣＣＴＧＣＴＴＴＴＧＣＣＡＡＡＧＧＧＡＡＣＣＴＧＡＣＴＴＴＣＡＣＡＧＣＴＣＡＧＴＡ（配列番号９）を生成した。各エクストリームＰＣＲ反応で、図１ｂに示されるデバイスを、リアルタイムでモニタリングせずに使用した。図５ｂで示されるように、２６秒より少し短い総反応時間（０．７３秒のサイクル）で、９０℃と６３℃の間で３５サイクル、温度をサイクリングした。図５ａで示されるようにポリメラーゼおよびプライマーの量を変更したこと以外は、実施例１で論じられた通りの反応条件を用いた。図５ａの縦軸は、ＨＲ−１機器で正規化しないで得られた融解曲線の負の微分プロットのピークとして数値化したものである。０．５μＭのポリメラーゼでは、いずれのレベルのプライマー濃度でも実質的に増幅は観察されなかった。しかし、１．０μＭのポリメラーゼでは、５μＭおよびそれを超えるプライマー濃度で認識できるレベルの増幅が観察された。ポリメラーゼレベルが増加するにつれて、アンプリコンの量も最大約４μＭのレベルまで増加する。８μＭのポリメラーゼでは、アンプリコンの量はプライマー濃度に応じてプラトーになるかまたは低下し、より低いプライマー濃度では１６μＭで有意な低下が見られた。これらの４９ｂｐの生成物の場合のエクストリーム温度サイクリング条件下では、ポリメラーゼの好ましい濃度範囲は、プライマー濃度に応じて、約１μＭから８μＭの間であり、より具体的には２μＭから８μＭの間であると考えられる。
【００７２】
同様に、２．５μＭのプライマー濃度ではほとんど増幅が観察されなかった。しかし、５μＭのプライマーでは、２〜８μＭのＫｌｅｎＴａｑ濃度を用いたところ増幅が成功し、増幅は濃度の増加に伴い向上し続けた。約１０〜２０μＭのプライマー濃度を用いたところ優れた増幅が達成された。図５ｃは、４μＭのＫｌｅｎＴａｑで様々なプライマー濃度を用いた場合の融解曲線を示し、一方で図５ｄは、プライマー濃度を１０μＭに保持しながらポリメラーゼ濃度を変更したときの生成物のサイズを実証している。高濃度のポリメラーゼおよびプライマーにもかかわらず、非特異的増幅は観察されていない。
【００７３】
理論にとらわれずにいえば、酵素の量もプライマーの量も閾値を超えているのであれば、酵素の量とプライマーの量との比率が、エクストリームＰＣＲサイクリングにとって重要であると考えられる。上記の量は、各プライマーをベースにして示されることに留意されたい。ポリメラーゼが二重鎖になったプライマーのそれぞれに結合することを考えれば、プライマーの総濃度が最も重要である場合がある。ＫｌｅｎＴａｑの場合、好適な比率は０．０３〜０．４（プライマーの総濃度に対して３〜４０％の酵素）であり、例示的には最小で約０．５μＭのＫｌｅｎＴａｑ濃度であり、より例示的には、エクストリームＰＣＲの場合、約１．０μＭである。プライマーは、等モル量で提供されてもよいし、または非対称ＰＣＲの場合のように一方が過量に提供されてもよい。最適なポリメラーゼ：プライマーのパーセンテージはまた、温度サイクリング条件と生成物のサイズにも依存し得る。例えば、標準的な（遅い）温度サイクリングは、かなり低いプライマーに対するポリメラーゼのパーセンテージを使用することが多く、典型的には、１．５ｎＭ（０．０４Ｕ／μｌ）のポリメラーゼ（４９）および０．１５％のパーセンテージの１，０００ｎＭのプライマーの総濃度が使用され、これは、エクストリームＰＣＲに関して有効であると見出されたパーセンテージよりも１０倍以上低い。
【００７４】
［実施例４］
熱の移動とサイクル速度を増加させるために、１９ゲージの鋼の皮下注射針で８μＭのポリメラーゼおよび２０μＭの各プライマーを用いて、実施例３におけるのと同じＰＣＲ標的を増幅した。全プライマーに対するポリメラーゼのパーセンテージは２０％であった。図１ｂの機器で増幅を行ったところ、各０．４６秒で３５サイクル（図６ａ）、９１℃から５９〜６３℃の間のサイクリングを使用して、１６秒で増幅が完了した。サイクリング中の最大の加熱速度は４０７℃／秒であり、最大の冷却速度は８１５℃／秒であったことから、保持を行わずに４００℃／秒より速い傾斜速度でＰＣＲを実行できることが実証された。４％ＮｕＳｉｅｖｅの３：１アガロースゲルでの生成物分析により、正しいサイズの強い特異的なバンドが現れた（図６ｂ）。テンプレート非含有対照は、４９ｂｐで生成物を示さなかったが、陽性サンプルに類似した顕著な量のプライマーバンドを示した。
【００７５】
［実施例５］
プライマーＣＴＣＴＧＴＧＣＴＴＴＣＴＧＴＡＴＣＣＴＣＡＧＡＧＴＧＧＣＡＴＴＣＴ（配列番号１０）およびＣＧＴＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＧＴＧＣＣＣＡＡＴＧＣＴＡＴＡ（配列番号１１）、ならびにリアルタイム要素を用いない図１ｂの機器を使用して、ＮＱＯ１遺伝子の１０２ｂｐのフラグメントを増幅した。ポリメラーゼ濃度を０．２５から４μＭの間で変更し、各プライマー濃度を０．５から８μＭの間で変更した。併合されたアニール／伸長期での伸長がポリメラーゼにとってより最適な温度で起こるように、より高温で（低出力で７０秒）アニールするようにプライマーを設計した。これらの温度でのより速い重合速度は、より長い生成物の増幅を可能にすると期待された。より低温の水槽を７２℃に制御して、アニール／伸長期の終了を温度ではなく時間（１秒）で誘発した。３０サイクルの間の７２℃から９０℃の間のサイクリングには、１．９３秒のサイクルを使用したところ５８秒を要した（図７ａ）。図７ａで観察されるように、サンプルの温度は、空気を通って高温の水槽まで移動する間にアニール／伸長温度から約３℃低くなる。図７ｂは、図５ａに示されるように融解曲線を定量することによって得られた増幅した生成物の量を示す。融解曲線分析では、８４℃のＴｍを有する唯一の生成物が示された。０．２５μＭのポリメラーゼまたは１μＭの各プライマーでは極めてわずかな生成物しか観察されなかった。２μＭの各プライマーでもある程度の増幅は起こり、最良の増幅は２〜４μＭのポリメラーゼおよび８μＭの各プライマーで起こる。２〜４μＭのプライマー濃度では、ポリメラーゼ濃度が増加するにつれて収量は減少するが、これは８μＭのプライマー濃度では観察されなかった。熱的サイクリングおよび標的長さが実施例３とは異なるが、プライマーの総濃度に対するポリメラーゼ濃度が、３．１から５０％のときに最良の増幅が起こる。
【００７６】
［実施例６］
図１ｂに示される機器をリアルタイムモニタリングしながら使用して、ＢＢＳ２遺伝子の１３５ｂｐおよび３３７ｂｐのフラグメントをエクストリームＰＣＲにより増幅した。エクストリームＰＣＲに対する生成物の長さの影響と、様々なプライマーの起こり得る交絡的影響の調整を研究するために、まず共通の５’末端伸長部分を有するプライマーを使用してゲノムＤＮＡからフラグメントを増幅した。１３５ｂｐのフラグメントの場合、プライマーは、ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＡＡＡＡＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＴＴＡＡＡＴＡＣＧ（配列番号１２）およびＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＧＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＧ（配列番号１３）であった。３３７ｂｐのフラグメントの場合、プライマーは、ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＡＡＡＡＧＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＣＴＡＴＡＧＡＡＣＴＧＡＴＴ（配列番号１４）およびＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＣＣＡＧＡＧＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＧＧ（配列番号１５）であった。ゲノムＤＮＡからの標準的なＰＣＲ増幅の後に、プライマーおよびｄＮＴＰをＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＣＡ）によって分解し、続いてＱｕｉｃｋＳｔｅｐ（商標）２ＰＣＲ精製キット（カタログ番号３３６１７、Ｅｄｇｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用してＰＣＲ生成物を精製した。ＰＣＲ生成物をおよそ１００万倍に希釈し、標準的なリアルタイムＰＣＲにより得られたＣｑを等しくすることにより等しい濃度に調節し、２５サイクルのＣｑ（反応液１０μｌあたりおよそ１０，０００コピー）を達成した。
【００７７】
総体積５μｌの増幅したテンプレートの１，０００コピーに、２μＭのポリメラーゼおよび２％グリセロールと共に共通のプライマーＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＡＡＡＡ（配列番号１６）およびＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡ（配列番号１７）をそれぞれ２μＭで使用してエクストリームＰＣＲを行った。１３５ｂｐのＢＢＳ２フラグメントからは２２６ｂｐの生成物が得られ、（プライマーに応じて）１７６塩基または１８５塩基の伸長を必要としたが、３３７ｂｐのＢＢＳ２フラグメントからは４２８ｂｐのＰＣＲ生成物が得られ、３７８塩基または３８７塩基の伸長を必要とした。アガロースゲルで、さらに融解分析によって特異的増幅を検証した。図８ａに、２２６ｂｐの生成物に使用された、７５℃の１秒の併合されたアニール／伸長および８７℃の変性を含むエクストリームＰＣＲの温度プロファイルを示す。さらに同じ温度で２秒のアニール／伸長期も行った（軌跡示さず）。図８ｃに示されたこれらの増幅に関するリアルタイムＰＣＲの結果から、１秒の伸長を用いた場合、２秒の伸長と比較してＣｑが約５サイクル高くシフトしたことが明らかになったが、これはおそらく伸長時間が短くなるにつれて効率も減少したことを反映しているものと思われる。図８ｂに、７５℃の４秒の併合されたアニール／伸長および８７℃の変性を示し、これは、４２８ｂｐの生成物に使用されたエクストリームＰＣＲの温度プロファイルを示す。さらに同じ温度で５秒のアニール／伸長期も行った（軌跡は示さず）。図８ｄに示されたこれらの増幅に関するリアルタイムＰＣＲの結果から、４秒の伸長を用いた場合、５秒の伸長と比較してＣｑが約２サイクル高くシフトしたことが明らかになったが、これはおそらく伸長時間が短くなるにつれて効率も減少したことを反映しているものと思われる。
【００７８】
［実施例７］
実施例５のＮＱＯ１の１０２ｂｐのフラグメントおよび実施例１のＫＣＮＥ１の４５ｂｐのフラグメントに関して、ヒトゲノムＤＮＡの希釈系列を使用して、ＮＱＯ１には２μＭのＫｌｅｎＴａｑおよび８μＭの各プライマー、ならびにＫＮＣＥ１には８μＭのＫｌｅｎＴａｑおよび２０μＭの各プライマーを使用して、図１ｂのリアルタイム機器を使用してＰＣＲの定量性能を評価した。図９ａおよび図９ｂで見られるように、少なくとも４０のダイナミックレンジを用いたところ、標準曲線から計算された増幅効率は、ＮＱＯ１では９５．８％であり、ＫＣＮＥ１では９１．７％であった。テンプレート不使用の対照反応では、５０サイクル後に増幅は起こらず、単一コピーの複製物（平均コピー数は、１反応あたり１．５コピー）は、増幅曲線の形状および強度においてより高い濃度と類似していた（図９Ａおよび図９Ｃ）。０．１５コピー／反応の平均コピー数では、二項展開により計算された０．１３コピー／反応の期待値を用いたところ、（ＮＱＯ１の試験とＫＣＮＥ１の試験の両方を合わせた）１７の反応のうち２つの反応が陽性であった。
【００７９】
［実施例８］
リアルタイムＰＣＲを使用する際、様々な生成物の長さに応じた伸長時間が必要である（図１０ａ〜ｃ）。様々なプライマーの起こり得る交絡的影響を調整するため、１００〜５００ｂｐの合成テンプレートと共に以下の共通の高いＴｍ（７７℃）を有するプライマーを使用した。
ＡＣＴＣＧＣＡＣＧＡＡＣＴＣＡＣＣＧＣＡＣＴＣＣ（配列番号１８）およびＧＣＴＣＴＣＡＣＴＣＧＣＡＣＴＣＴＣＡＣＧＣＡＣＡ（配列番号１９）
【００８０】
合成テンプレート配列は以下の通りである。
１００ｂｐのテンプレート：
ＡＣＴＣＧＣＡＣＧＡＡＣＴＣＡＣＣＧＣＡＣＴＣＣＧＧＡＴＧＧＡＴＴＧＴＧＡＡＧＡＧＧＣＣＣＡＡＧＡＴＡＣＴＧＧＴＣＡＴＡＴＴＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＡＧＣＴＣＴＣＡＣＴＣＧＣＡＣＴＣＴＣＡＣＧＣＡＣＡ（配列番号２０）
【００８１】
２００ｂｐのテンプレート：
ＡＣＴＣＧＣＡＣＧＡＡＣＴＣＡＣＣＧＣＡＣＴＣＣＴＣＡＡＴＧＣＴＧＡＣＡＡＡＴＣＧＡＡＡＧＡＡＴＡＧＧＡＡＴＡＧＣＧＴＡＡＴＴＡＣＴＡＧＡＧＧＡＣＴＣＣＡＡＴＡＴＡＧＴＡＴＡＴＴＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＧＴＡＣＴＧＴＡＧＧＡＡＣＡＣＴＡＣＣＧＣＧＧＴＴＡＴＡＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＡＧＣＡＡＴＣＴＡＣＣＣＴＧＴＴＧＧＧＡＴＣＴＧＴＴＴＡＡＧＴＧＧＣＴＣＴＣＡＣＴＣＧＣＡＣＴＣＴＣＡＣＧＣＡＣＡ（配列番号２１）
【００８２】
３００ｂｐのテンプレート：
ＡＣＴＣＧＣＡＣＧＡＡＣＴＣＡＣＣＧＣＡＣＴＣＣＣＣＴＴＣＧＡＡＴＡＴＡＡＡＧＴＡＣＧＡＣＡＴＴＡＣＴＡＧＣＡＡＴＧＡＣＡＧＴＴＣＣＡＧＧＡＴＴＴＡＡＧＡＡＡＧＴＡＧＴＧＴＴＣＣＡＣＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＡＴＣＣＡＧＴＧＡＡＡＧＣＡＴＡＡＣＧＴＣＡＡＡＡＡＡＡＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＧＴＴＣＧＣＧＡＴＣＴＧＧＡＣＴＴＡＣＴＴＡＧＡＴＴＴＧＴＴＧＴＡＧＴＣＡＡＧＣＣＧＧＣＴＡＴＣＡＧＣＧＡＴＴＴＡＴＣＣＣＧＧＡＡＡＣＡＣＡＴＡＣＴＡＧＴＧＡＧＴＴＡＴＴＴＧＴＡＴＧＴＴＡＣＣＴＡＧＡＡＴＡＧＣＴＧＴＣＡＣＧＡＡＴＣＡＣＴＡＡＴＡＣＡＴＴＣＡＣＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＴＣＡＣＴＣＧＣＡＣＴＣＴＣＡＣＧＣＡＣＡ（配列番号２２）
【００８３】
４００ｂｐのテンプレート：
ＡＣＴＣＧＣＡＣＧＡＡＣＴＣＡＣＣＧＣＡＣＴＣＣＴＧＡＡＴＡＣＡＡＧＡＣＧＡＣＡＧＴＣＣＴＧＡＴＴＡＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＴＡＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＴＴＴＡＡＴＴＡＴＧＡＴＧＡＡＴＡＴＴＡＡＣＧＧＡＡＴＴＡＡＡＴＡＴＧＴＡＴＴＧＡＴＡＡＧＴＡＣＴＡＡＧＴＡＡＴＧＧＴＴＴＡＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＴＣＴＡＴＡＴＧＣＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＴＴＡＡＣＡＡＡＴＴＴＡＡＡＣＡＴＣＴＧＡＴＧＴＧＧＡＣＡＡＡＡＣＴＴＧＴＡＡＴＧＴＧＧＴＡＴＡＧＴＴＡＡＡＡＡＴＡＴＡＧＧＴＴＴＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＴＡＡＧＴＡＴＣＴＡＴＣＴＴＧＡＡＴＧＴＴＴＡＡＧＴＡＧＧＴＣＣＴＧＴＣＴＡＣＣＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＴＣＧＣＧＴＴＣＡＴＣＧＧＧＣＴＧＴＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＣＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＴＴＣＧＴＧＴＴＧＣＡＣＡＧＧＡＧＧＡＡＣＴＴＴＣＧＡＧＧＧＴＴＣＧＴＡＴＧＡＧＣＴＣＴＣＡＣＴＣＧＣＡＣＴＣＴＣＡＣＧＣＡＣＡ（配列番号２３）
【００８４】
５００ｂｐのテンプレート：
ＡＣＴＣＧＣＡＣＧＡＡＣＴＣＡＣＣＧＣＡＣＴＣＣＡＣＣＧＣＴＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＧＧＧＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＡＡＴＣＴＡＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＴＡＣＡＴＡＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＧＡＴＣＧＴＣＴＡＡＴＡＴＡＴＴＧＧＡＣＴＡＡＴＧＣＣＣＧＡＴＴＴＣＴＧＡＴＣＡＡＴＴＡＣＴＣＴＡＧＧＣＧＡＴＡＣＴＴＣＡＴＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＡＴＴＴＧＧＡＴＴＴＴＧＣＴＣＡＡＧＴＧＣＴＡＡＡＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＡＡＴＡＣＴＡＧＴＣＴＧＡＣＡＴＣＡＧＴＣＡＡＧＡＣＣＴＧＣＴＡＴＣＴＧＡＡＡＡＣＴＡＣＴＡＧＡＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＴＡＡＣＡＡＣＴＴＴＡＧＴＧＧＡＴＡＡＡＴＣＡＧＧＴＣＴＧＧＡＧＡＴＴＧＴＣＡＴＡＴＡＡＴＧＣＣＡＣＴＡＧＧＧＴＣＡＧＡＡＧＧＣＴＧＴＧＴＣＡＡＡＧＴＴＡＧＴＧＧＴＴＡＧＴＡＧＧＴＣＴＣＣＧＣＴＣＴＧＣＧＧＴＡＣＴＡＴＴＣＴＴＡＴＡＴＴＣＴＣＴＴＡＣＴＡＴＧＣＡＴＣＡＡＡＣＡＡＡＡＴＡＧＡＡＴＧＣＡＴＡＧＡＣＡＡＡＣＣＧＣＣＴＧＣＣＡＡＧＴＴＴＡＣＡＡＧＡＴＡＡＣＴＴＧＣＧＴＡＴＡＧＧＴＴＴＡＴＡＡＧＧＧＴＴＣＴＴＣＴＧＴＡＴＣＧＣＴＣＴＣＡＣＴＣＧＣＡＣＴＣＴＣＡＣＧＣＡＣＡ（配列番号２４）
【００８５】
まず、中程度の長さの３００ｂｐの生成物に関して、４秒の併合されたアニール／伸長セグメントを１サイクルあたり４．９秒で使用して、プライマーおよびポリメラーゼの最適な濃度を決定した（図１０ａ）。次いで全ての生成物の長さに関して、同一のプライマー濃度（４μＭ）およびポリメラーゼ濃度（２μＭ）を使用して、最小の伸長時間を決定した（図１１ａ〜ｅ）。生成物の長さに応じて、伸長時間が増加すると、さらなる変化が観察されなくなるまでの定量サイクル（Ｃｑ）がわずかに減少したことから、効率的なＰＣＲに必要な最小の伸長時間が示された。例えば、図１０Ｂに、ＫＡＰＡ２Ｇ（商標）ＦＡＳＴポリメラーゼ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した５００ｂｐの生成物に関する増幅曲線を示す。ＫＡＰＡ２Ｇ  ＦＡＳＴポリメラーゼを使用した場合の最小の伸長時間は３秒であり、これに対してＫｌｅｎＴａｑ１（Ｔａｑポリメラーゼの欠失突然変異体、ＡＢ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を使用した場合は７秒であった。ポリメラーゼの同一性が一定に維持される場合、より長い生成物はより長い伸長時間を必要とした（図１０ｃ）。ＫｌｅｎＴａｑ１ポリメラーゼの場合、６０ｂｐごとに約１秒を要し、一方でＫＡＰＡ２Ｇ  ＦＡＳＴポリメラーゼの場合、１５８ｂｐごとに１秒を要する。これらの２種のポリメラーゼは十分な濃度で市販されているが、その他ほとんどのポリメラーゼはこのような高濃度では市販されていないために、これらのポリメラーゼが選ばれたことに留意されたい。伸長に必要な時間は、伸長させようとする長さに直接的かつ直線的に依存しており、ポリメラーゼ濃度およびポリメラーゼ速度とは反比例することが理解される。これらの３種のパラメーターを関連付ける比例定数（ｋ２）は、以下のように定義することができる。
必要な伸長時間＝ｋ２＊（伸長の長さ）／（［ポリメラーゼ］＊（ポリメラーゼ速度））
【００８６】
［実施例９］
エクストリームＰＣＲ時間は、高いＭｇ＋＋濃度を用いて短くすることもできる。プライマー：ＧＣＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＣＴＡＡＡＡＴＧＡＴＡＧＴＣＡＧＴＧ（配列番号２５）およびＴＴＧＡＴＣＡＴＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＴＡＡ（配列番号２６）を用いてＡＫＡＰ１０の６０ｂｐのフラグメントを増幅し、アンプリコンＧＣＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＣＴＡＡＡＡＴＧＡＴＡＧＴＣＡＧＴＧＡＣ（Ａ／Ｇ）ＴＴＡＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＴＣＡＧＴＡＴＧＡＴＣＡＡ（配列番号２７）を生成した。
【００８７】
各反応は、体積１μｌで、３５サイクルを時間ベースで制御して（９４℃の水槽中で０．０７秒、６０℃の水槽中で０．１〜０．４秒）、２〜７ｍＭのＭｇＣｌ２を使用して行われた。サンプル体積は１μｌであり、５ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ、２０μＭのプライマー、および８μＭのポリメラーゼを含んでいた。１サイクルあたり０．４２秒のプロトコールを使用したところ、ＭｇＣｌ２が２〜３ｍＭのときに、融解曲線（図１２ａ）およびゲル（図１２ｂ）で生成物は観察されなかった。４ｍＭで最低限の生成物が存在したが、５〜７ｍＭのＭｇＣｌ２で増幅した後に大量の生成物が観察された。５ｍＭのＭｇＣｌ２では、０．３２秒のサイクル時間を用いた場合、融解曲線（図１３ａ）およびゲル（図１３ｂ）で生成物は観察されなかったが、０．４２秒、０．５２秒、および０．６２秒のサイクル時間では大量の生成物が示され、このことは、１５秒（１４．７秒で３５サイクル）で行われたＰＣＲにおいて特異的な高収量の６０ｂｐの生成物が得られることを実証している。したがって、例示的なＭｇ＋＋濃度は、少なくとも４ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも６ｍＭ、少なくとも７ｍＭ、またはそれより高く、これらの例示的なＭｇ＋＋濃度は、本明細書で説明される実施形態のいずれかと共に使用できることが理解される。
【００８８】
［実施例１０］
エクストリームＰＣＲで使用される高濃度のプライマーおよびポリメラーゼは、より遅いサイクル速度で使用すると有害作用を有する場合がある。それぞれ３２倍または１０６倍遅い迅速サイクルまたはブロックベースの機器では、非特異的生成物が生じた。図１４ａ〜ｂは、実施例９で使用されたＡＫＡＰ１０の６０ｂｐの生成物の増幅を比較した結果を示すが、この場合、増幅は、２０μＭの各プライマー、８μＭのＫｌｅｎＴａｑ、および１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを使用して、（１）およそ１７秒の総時間をもたらす９４℃で０．５秒および６０℃で０．２秒の設定時間を用いたエクストリームＰＣＲ、（２）およそ９分の総時間をもたらす９４℃で１０秒の最初の変性、続いて０秒で８５℃および０秒で６０℃のサイクルの設定時間を使用した迅速サイクルＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）、および（３）およそ３０分の総時間をもたらす９４°で１０秒の最初の変性、続いて８５℃で０秒および６０℃で５秒の温度サイクリングを用いた旧来の（ブロック）温度サイクリング（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ９６）を４０サイクルで使用して行われた。示されたように、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒの迅速サイクリングでさえもかなりの非特異的増幅を生じたが、エクストリームサイクリング条件では単一の融解ピークと、ゲルにおける最小の非特異的増幅が達成された。
【００８９】
また注目すべきことに、エクストリームＰＣＲでは、高いプライマー濃度およびポリメラーゼ濃度によっても収量が強化される。比較のために定量的ＰＣＲを使用したところ、エクストリームＰＣＲは迅速サイクルＰＣＲと比較して３０倍を超える量の生成物を生産した（データは示さず）。
【００９０】
実施例１〜１７は全て、図１ａ〜１ｄに記載されるデバイスの１つまたは複数、またはそれらの構成をわずかに変更したものを、ｑＰＣＲの結果を確認するためのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒで行われる特定のステップと共に使用して行われた。しかし、本明細書で説明される方法および反応は、様々な機器で起こる場合があることが理解される。これらの実施例で使用される水槽およびチューブは、濃度を高めたプライマーおよびポリメラーゼの作用を研究するのに十分な迅速な温度変化をもたらす。しかし、他の実施形態が商業的により好適である場合がある。低容量および高い表面積対体積比のマイクロ流体システムが、エクストリームＰＣＲによく適している場合がある。このようなシステムは、エクストリームＰＣＲで使用される高濃度のプライマーおよびポリメラーゼで求められる迅速な温度変化を可能にする。マイクロ流体システムは、サンプルを変性ゾーン、アニーリングゾーン、および伸長温度ゾーンに繰り返し通す小型化されたチャネルを取り入れたマイクロフローシステム（３５、５３）を包含する。これらのシステムのいくつかは、複雑度がより低い標的で３秒もの速いサイクル時間の有効なＰＣＲであることがすでに実証されている。ポリメラーゼが少なくとも０．５μＭの濃度で提供され、プライマーはそれぞれ少なくとも２μＭの濃度で提供される場合、このようなシステムでより複雑な標的を増幅できることが期待される。また定置式のＰＣＲチップおよびＰＣＲ液滴形成システム（５４）は、１ｎｌまたはそれ未満もの小さい体積が可能であり、さらに極めて迅速なサイクリングを許容するほど十分に低くできることから、プライマーおよびプローブの濃度の増加によって利益を得る場合もある。より遅いサイクル速度でより高いプライマー濃度を用いることに伴う特異性を損なうことなく増加させたプライマー濃度およびポリメラーゼ濃度を利用できるほど十分速く機器の温度がサイクリングするのであれば、本発明にとって正確な機器は重要ではないことが理解される。
【００９１】
上記の実施例はいずれもＰＣＲを用いたが、ＰＣＲは単なる例示であり、ＰＣＲ以外の核酸増幅方法にも増加したプライマー濃度および酵素濃度とより短い増幅時間との組合せが想定されることが理解される。程度を増加させることができる例示的な酵素活性としては、重合（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）、ライゲーション、へリックスの巻き戻し（ヘリカーゼ）、またはエキソヌクレアーゼ活性（５’から３’または３’から５’）、鎖の置換および／もしくは切断、エンドヌクレアーゼ活性、ならびにＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ消化（ＲＮアーゼＨ）が挙げられる。増幅反応としては、これらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、転写介在増幅（例えば転写ベースの増幅システム、自家持続配列複製法、および核酸配列ベースの増幅など）、鎖置換増幅、全ゲノム増幅、多置換増幅、アンチセンスＲＮＡ増幅、ループ介在増幅、線形結合増幅（ｌｉｎｅａｒ−ｌｉｎｋｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ローリングサークル増幅、分岐増幅（ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、等温オリゴヌクレオチド増幅、ヘリカーゼ連鎖反応、および連続侵入シグナル増幅（ｓｅｒｉａｌ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などが挙げられる。
【００９２】
一般的には、酵素活性が変化すると、同じ倍率で増幅時間は反比例して変化する。プライマーを包含する反応の場合、プライマー濃度が変化すると、同じ倍率で増幅時間は反比例して変化する。プライマーと酵素の両方が増幅に必要な場合、反応速度を最大化するためには酵素濃度とプライマー濃度の両方を変化させるべきである。増幅サイクルの固有のセグメント（例えば、３温度ＰＣＲ中の固有の温度）でプライマーのアニーリングが起こる場合、そのセグメントにおいてプライマーのアニーリングが十分に完了するのに必要な時間は、プライマー濃度と反比例すると予想される。同様に、増幅サイクルの固有のセグメント（例えば、３温度ＰＣＲ中の固有の温度）で酵素活性が必要な場合、そのセグメントにおいて酵素的なプロセスが十分に完了するのに必要な時間は、所定の範囲内で酵素濃度に反比例すると予想される。プライマー濃度または酵素濃度の変更は、それら個々のセグメントに要する時間を変化させるのに使用でき、または同じ条件下で（例えば２温度ＰＣＲにおいて、または等温反応プロセス中に）その両方が起こる場合、１つの反応が反応速度を制限しないように両方の濃度の変更が必要であることが予想される。増幅プロセスをさらに加速するために、Ｍｇ＋＋濃度の増加を酵素濃度およびプライマー濃度の増加と組み合わせて使用してもよい。より高いＭｇ＋＋濃度は、プライマーのアニーリングの速度を増加させ、かつ核酸増幅で使用される多くの酵素反応にかかる時間を短くする。
【００９３】
より高いＭｇ＋＋、酵素、およびプライマーの濃度は、より短い増幅時間またはセグメントと共に使用される場合、特に有用である。時間を短くしないでより高い濃度を使用すると、いくつかのケースにおいて、反応の「ストリンジェンシー」が低下するために非特異的な増幅生成物が生じる場合がある。増幅時間またはセグメント時間（秒）を短くすることは、増加した反応物濃度によるストリンジェンシーの損失を埋め合わせるように見えるより高いストリンジェンシーを導入する。逆に言えば、増幅時間またはセグメント時間を増加させることによりこれらのより低い濃度を相殺すれば、反応物濃度を低下させることによって試薬のコストを最小化できる。
【００９４】
ポリメラーゼ濃度を増加させることにより、長時間のＰＣＲ、例示的には標的が５〜５０ｋｂである場合のＰＣＲに必要な時間を短くできる。大きい標的を増幅するには、典型的には１０分〜３０分の伸長期間が使用されるが、これはなぜなら、１）ポリメラーゼが単一の標的の伸長を完了させるため、および２）再利用された酵素が、追加のプライマーが結合したテンプレートを重合させるためにそのような時間が必要になるほど大きい標的が長いためである。ＰＣＲの開始時には、プライマーが結合したテンプレート分子よりも利用可能な酵素が多く存在するため、このようなポリメラーゼの再利用は必要ない。しかし、対数期が終わる前でも、ポリメラーゼ分子の数が限界になることがしばしばあり、酵素の再利用が必要である。ポリメラーゼ濃度を増加させることによって、高いプライマー濃度に起因する収量増加を維持しつつ必要な伸長期間を５分未満まで、場合によっては２分未満まで短くできる。実際の酵素の速度は増加しないが、それほど再利用は必要ではなく、必要な最小の時間は、ほぼ直線的に酵素濃度の影響を受ける。
【００９５】
プライマー濃度とポリメラーゼ濃度とを増加させることによりサイクルシーケンシング時間も短くできる。典型的には、標準的なサイクルシーケンシングプライマー濃度は０．１６μＭであり、併合されたアニール／伸長期間は５０〜６０℃で１０分である。プライマー濃度とポリメラーゼ濃度とを１０倍増加させることによって、アニール／伸長に必要な時間をおよそ１０倍短くできる。長いＰＣＲとサイクルシーケンシングの両方において、予想される必要な時間は、ポリメラーゼまたはプライマー濃度のどちらか限定的な方に反比例する。
【００９６】
エクストリーム温度サイクリングとより高い濃度のプライマー、ポリメラーゼ、および／またはＭｇ＋＋とを組み合わせることによって、大規模並列配列決定のための調製においてプライマーとして使用されるリンカーがライゲーションしたフラグメントのＰＣＲを、現行のものよりもかなり短い時間で完了させることができる。
【００９７】
上記した全ての用途において、より短い増幅時間で反応特異性が維持されるものと予想される。当業者であれば、高いプライマー濃度およびポリメラーゼ濃度は非特異的増幅による問題を引き起こすことを想像するであろうが、全体のサイクル時間および／または個々のセグメント時間を最小化することにより、ＰＣＲの高い特異性および効率がもたらされる。
【００９８】
【表２】
2018538007.tif 000005
【００９９】
【表３】
2018538007.tif 000006
【０１００】
表２に、エクストリームＰＣＲの具体的な条件を示す。同時に行われた標的のうち３種に関するポリメラーゼおよびプライマー濃度の最適化実験以外の全てのデータが示される。表３に、変数間の定量的な関係が詳述されている。必要なアニーリング時間をプライマー濃度に関連付ける反比例関係はほぼ一定（ｋ１）であり、方程式（必要なアニーリング時間）＝ｋ１／［プライマー］によって定義される。旧来の（標準）ＰＣＲ、迅速サイクルＰＣＲ、およびエクストリームＰＣＲの条件下でこれらの変数の典型的な値の範囲を使用することにより反比例定数の範囲が得られ、その大部分は重複している（旧来のＰＣＲは０．７５〜３０、迅速サイクルＰＣＲは０．２〜１０、およびエクストリームＰＣＲは１〜２０である）。この反比例定数によって、現行のものの範囲から外れる望ましいアニーリング時間は、望ましい時間に必要なプライマー濃度を予測するのに使用できる。例えば、０．０１秒のアニーリング時間で５（秒＊μＭ）の定数を使用すれば、５００μＭのプライマー濃度の計算が可能である。逆に言えば、０．０１μＭのプライマー濃度が望ましい場合、必要なアニーリング時間は５００秒と予想される。これらの条件は旧来のＰＣＲおよびエクストリームＰＣＲ両方の範囲の外側であるが、これらの条件によりＰＣＲの成功に有用なプライマー濃度とアニーリング時間との関係が予測される。旧来のＰＣＲ、迅速サイクルＰＣＲ、およびエクストリームＰＣＲ全てにおいて適切なｋ１の範囲は、０．５〜２０（秒×μＭ）であり、より好ましくは１〜１０（秒×μＭ）であり、最も好ましくは３〜６（秒×μＭ）である。
【０１０１】
また類似の計算を行うことによっても、望ましい伸長時間と、ポリメラーゼ濃度、ポリメラーゼ速度、および増幅させようとする生成物の長さとを関連付けることができる。しかし、長期にわたり様々な実験室で行われてきた旧来のＰＣＲ、迅速サイクルＰＣＲ、およびエクストリームＰＣＲに影響を与える多くの追加の変数（ポリメラーゼ、Ｍｇ＋＋、緩衝液）については、本明細書において変数間の反比例関係を確立するために示されたよく制御されたエクストリームＰＣＲ条件を調べることが最善である場合がある。それにより、エクストリームＰＣＲ条件下でのポリメラーゼ濃度、ポリメラーゼ速度、生成物の長さ、および必要な伸長時間を定量的に表すことができる。定義方程式は、（必要な伸長時間）＝ｋ２（生成物の長さ）／（［ポリメラーゼ］＊（ポリメラーゼ速度））である。実験的に決定されたｋ２は、上記の方程式において、温度、Ｍｇ＋＋、ポリメラーゼのタイプ、緩衝液、添加剤、およびｄｓＤＮＡ色素濃度を一定にした条件下での比例定数と定義される。［ポリメラーゼ］および［プライマー］の二次元最適化がなされた３種のエクストリームＰＣＲ標的に関して、プライマー濃度全体にわたり成功した増幅の境界線にある［ポリメラーゼ］を見極めて、他の３つの変数と関連付けることができる。表３で示されるように、これらの３種の異なる標的に関するｋ２値は２未満の倍率で変化していることから、ｋ２は定数であり、他方がわかっているときにある変数を予測するのに使用できると推測される。必要な伸長時間は、伸長の長さ（生成物の長さからプライマーの長さを引いた長さ）に比例し、ポリメラーゼ速度とポリメラーゼ濃度に反比例する。ｋ２は（１／μＭ）の単位で示され、本明細書において使用されるエクストリームＰＣＲ条件にとって最適な値は、０．３〜０．７（１／μＭ）の範囲のうち０．５（１／μＭ）である。ポリメラーゼのタイプ、Ｍｇ＋＋濃度、または異なる緩衝液もしくは色素の状態の点で異なる他の反応条件でも、類似のｋ２値が誘導される場合がある。
【０１０２】
エクストリームＰＣＲは、サンプルの温度を迅速に、好ましくは均一に変化させることができるのであれば、どのような種類の容器で行ってもよい。多くの用途において、例示として異なるサンプルの異なるＰＣＲ効率が直接定量のエラーにつながる定量的ＰＣＲに関して、サンプル内およびサンプル間の均一性の両方が重要である。標準的なチューブおよびキャピラリーに加えて、油のストリーム中に懸濁した水性反応物の微小液滴または薄い２次元ウェーハが、優れた熱的接触をもたらす。エクストリームＰＣＲの速さに必要な温度制御のための優れた方法は、空間的なセグメントを様々な温度で通過するサンプルストリームの連続流ＰＣＲ（液滴として分散する、気泡で分離する、または他の手段で混合を防ぐことのいずれか）である。誘導加熱は、その全体が参照により本明細書の一部をなすものであるＷＯ２０１５／０６９７４３に記載されたように、エクストリームＰＣＲにとって好適な方法およびデバイスを提供することができる。
【０１０３】
［実施例１１］
ＰＣＲは、特異的なＤＮＡフラグメントの検出および定量化のための調査および臨床診断における基本的な方法であるが、ＲＮＡは、ＰＣＲで直接増幅することができない。ＲＮＡは、まずＤＮＡに逆転写しなければならない。典型的には、これは、「逆転写酵素」と呼ばれる酵素によって、酵素的になされる。酵素反応は時間を要し、逆転写に推奨される典型的な時間は、３０〜５０分である（例えば、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素、ＭＡＮ０００１３４２の製品説明書、報告日：２０１０年５月２０日、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒを参照）。
【０１０４】
迅速逆転写（ＲＴ）が有用であると予想される場合、例えば、ＲＮＡウイルスに関するポイントオブケアの臨床診断において、結果を得るまでの時間が迅速であることが試験の価値を高め、患者にとって、または参照遺伝子使用または不使用の特異的なｍＲＮＡ転写の単一、二重もしくは多重増幅において重要であり得る多くの状況がある。上記で論じられたように、エクストリームＰＣＲは、わずか１５秒またはそれ未満でＤＮＡを増幅することが可能な技術である。しかし、ｍＲＮＡまたはウイルスＲＮＡの逆転写が３０分またはそれより長くかかる場合、１分未満のＰＣＲはそれほど有用ではない。より速いＲＴ−ＰＣＲが望ましいと予想され、ＲＴステップとＰＣＲステップの両方が同じ反応混合物中で起こる１ステップＲＴ−ＰＣＲプロトコールを有することが特に望ましいと予想される。
【０１０５】
この実施例では、共通の参照遺伝子ＡＣＴＢを用いた迅速１ステップＲＴ−ＰＣＲ二重（ｄｕｐｌｅｘ）反応を行う。２つのヒト転写物（ＡＫＡＰ１０およびＡＣＴＢ）を逆転写し、ＡＫＡＰ１０のプライマー（ＧＣＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＣＴＡＡＡＡＴＧＡＴＡＧＴＣＡＧＴＧ（配列番号２５）およびＴＴＧＡＴＣＡＴＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＴＡＡ（配列番号２６））と、ＡＣＴＢのプライマー（ＴＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＴＣ（配列番号２８）およびＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧＣＧＧＡＴＧＣ（配列番号２９））とを用いて、１ステップで増幅した。１０μｌの反応物中に、迅速ＰＣＲのマスター溶液（１×ＬＣＧｒｅｅｎプラス色素、０．２μＭの各ｄＮＴＰ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．３、２５ｎｇ／μｌのウシ血清アルブミン、０．４ＵのＫｌｅｎＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＡＢ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）および６４ｎｇの抗Ｔａｑ抗体（ｅＥｎｚｙｍｅ））中の、０．５μＭの各プライマー、ヒト血液白血球から抽出された６０ｎｇの全ＲＮＡ、３００ユニットのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、および０．１Ｍのジチオスレイトールを入れた。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒキャピラリーチューブ（Ｒｏｃｈｅ）中にサンプルを入れ、逆転写のために、４５℃で５分インキュベートし、次いでリアルタイム増幅のために、回転トレーのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ上で９４から５５℃の間で４０サイクル（保持なし）でサイクリングした（図１６ａ）。次いでサンプルを、９５℃での瞬時の変性によりＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ中で融解させ、６０℃に冷却し、最終的に０．２℃／秒で９５℃に加熱することによって蛍光を獲得した（図１６ｂ〜１６ｃ）。７９℃のピークはＡＫＡＰ１０アンプリコンであり、８３℃のピークはＡＣＴＢである。これらの結果から、二重鎖標的を含めてＲＮＡを増幅するのに、より速いＲＴ時間、すなわち３０分よりかなり短い時間（例えば５分）を使用することができることが示される。
【０１０６】
［実施例１２］
ＲＴ−ＰＣＲの一貫性および品質は、特異的なタイプのＲＴ酵素などの多くの事柄によって決まる（６０）。ＲＴ−ＰＣＲには２つのタイプのＲＴ酵素が一般的に使用され、１つはマウス白血病ウイルス（モロニーマウス白血病ウイルス−ＭＭＬＶ）由来であり、１つはトリウイルス（トリ骨髄芽球腫ウイルス−ＡＭＶ）由来であるが、他のＲＴ酵素も当分野において知られており、ＲＮアーゼＨ活性がより低く（またはより高く）、温度安定性が増加したＭＭＬＶの操作されたバリアントが商業的に利用可能である。Ｂｕｓｔｉｎ（６０）は、数種の逆転写酵素を一貫性および収量に関して試験し、より優れた酵素の１つが、ｉＳｃｒｉｐｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）として販売されているＭＭＬＶであることを決定した。
【０１０７】
ＲＴの１「ユニット」は、本明細書で使用される場合、テンプレート／プライマーとしてポリ（ｒＡ）／オリゴ（ｄＴ）２５を使用して、１０分、３７℃で、酸で沈殿し得る材料に１ｎモルのｄＴＴＰを取り込むのに必要な酵素の量である。ＭＭＬＶのユニット活性を決定するのに使用される緩衝液は、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．３、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、および１０ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）である。ＡＭＶのユニット活性を決定するのに使用される緩衝液は、７５ｍＭの酢酸カリウム、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、８ｍＭの酢酸マグネシウムおよび１０ｍＭのＤＴＴである。ＭＭＬＶのＲＴ反応に使用されるユニット数（１０Ｕ／μｌ）は、典型的にはＡＭＶのＲＴ反応（１Ｕ／μｌ）の１０倍である。ここで使用されるＲＴ酵素としては、１）天然のクローニングされたＭＭＬＶ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、２）Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（低いＲＮアーゼＨ活性と増加した熱安定性を有する改変ＭＭＬＶ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、３）ｉＳｃｒｉｐｔ（強いＲＮアーゼＨ活性を有する改変ＭＭＬＶ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、４）ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔ（増加したＲＮアーゼＨ活性および増加した熱安定性を有する改変ＭＭＬＶ、Ｂｉｏｎｅｅｒ）、および５）天然のクローニングされたＡＭＶ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）が挙げられる。これらの酵素のほとんどについて、ユニットの定義および酵素の濃度は、製造元により明示されている。例外は、公知の活性を有する酵素に対する滴定によって活性が決定されるＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔ、さらに、製造元が使用される濃度を開示していないｉＳｃｒｉｐｔである。しかし、ｉＳｃｒｉｐｔのケースでも、示唆された手順（２０μｌのＲＴ反応体積中に１μｌの酵素）は他のＲＴ酵素の手順と同一であり、これは、ｉＳｃｒｉｐｔの濃度は、２００Ｕ／μｌのストック溶液であり、ＲＴ反応で、他の製造元によって提供され示唆される濃度である１０Ｕ／μｌに希釈されることを示唆している。
【０１０８】
ｉＳｃｒｉｐｔ  ＭＭＬＶに推奨されるインキュベーション時間は、３０分である。ＲＴ反応の時間経過を研究するために、２ステップＲＴ−ＰＣＲを行った。この２ステップ方法を用いて、ＲＴを、異なる期間で水槽中のマイクロ遠心管中で別々に行い、次いでリアルタイムＰＣＲを、キャピラリーＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ中で行った。実施例１１に列挙したＡＣＴＢリバースプライマーを用いて、４５℃で様々な時間（１分から３０分）でＲＴステップを行った。ＲＮアーゼ阻害剤を含む２μｌのｉＳｃｒｉｐｔ  ＭＭＬＶ（推定で１０Ｕ／μｌの最終濃度につき）を、別段の指定がない限りランダムヘキサマー、オリゴ（ｄＴ）、安定剤、ｄＮＴＰ、および緩衝液を包含する反応混合物と組み合わせた。４０μｌの反応物には、２５６ｎｇの白血球由来全ＲＮＡおよび０．２５μＭのＡＣＴＢリバースプライマーが包含されていた。４５℃でインキュベートした後、８５℃で５分加熱することによって反応を止め、混合物を水で３倍に希釈した。２μｌの希釈したｃＤＮＡテンプレートおよび単独のＡＣＴＢプライマーを使用したことを除いて実施例１１と同様にして、ｑＰＣＲを行った。３０分の対照の定量サイクル（Ｃｑ）に対する各曲線のＣｑを使用して、ＡＣＴＢのｃＤＮＡの相対濃度を、１００％の増幅効率と仮定して計算した。図１７に結果を示す。最初の５分でｃＤＮＡのおよそ６０％が形成され、８０％が１０分、１００％が２０分で形成された。インキュベーション時間を変え（０．５、１、２、４、８、１６、３０分）、プライマー濃度を変えた（０．１２５、０．２５、０．５、１μＭ）追加の研究から、プライマー濃度を増加させることにより短いインキュベーション時間が補われることが示された。マイクロ遠心管では温度平衡が遅いために、０．５分より速い時間を研究することはできなかった。
【０１０９】
上記で論じられたように、エクストリームＰＣＲは、迅速温度サイクリングを高いプライマーおよびポリメラーゼ濃度と組み合わせることにより、２分またはそれ未満でのＰＣＲを可能にする。高いプライマー濃度が、プライマー濃度の増加に正比例してより速く反応を駆動させるため、アニーリング時間を低減することができる。同様に、酵素量が律速の場合、酵素濃度を高くすれば、伸長ステップの速度を比例的に高めることになる。ＲＴに例えれば、より高いプライマーおよび酵素濃度も、ＲＴ反応の速度を高めることを助け得ることが示唆される。しかし、２つの異なる酵素を用いてＲＴステップとＰＣＲステップの両方を１つの反応に組み合わせることは困難である。一般的に、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼの反応条件は、両立できるとは考えられない。例えば、ＲＴ反応ではＫＣｌが使用されるが、ＫＣｌはポリメラーゼ活性を５０ｍＭのＫＣｌで８０％阻害するため、実施例１１の迅速ＰＣＲマスター溶液には存在しない（６１）。以下に示す通り、１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応では、０から１０ｍＭのＫＣｌのＫＣｌ濃度が適切である場合があると考えられる。通常、ＲＴでは、ＰＣＲで使用される場合より高い濃度のｄＮＴＰ（それぞれ、それぞれ０．２ｍＭ（ＰＣＲ）に対して、０．５〜１．０ｍＭ（ＲＴ））およびＭｇ＋＋（１．５〜５ｍＭ（ＰＣＲ）に対して、３〜１５ｍＭ（ＲＴ））が使用される。この問題に対する１つの解決法は、逆転写酵素活性とＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を有する１つの酵素、例えばＲＮＡをテンプレートとしても使用できる組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるｒＴｔｈなどを使用することである（６２）。しかし、このような酵素は限界があり、様々な理由で２つの酵素の使用が好ましいことが多い。１つの反応で２つの酵素を組み合わせる場合、両方の酵素に対処する条件を見出さなければならない。エクストリームＰＣＲのための条件（緩衝液、［Ｍｇ＋＋］、塩、［ｄＮＴＰ］、ｐＨ、［プライマー］、［酵素］）は、ＲＴのために機能しない場合があり、逆もまた同様である。しかし、ＲＴとＰＣＲの両方に適合する条件が本明細書において提示され、ｉＳｃｒｉｐｔと共に販売される反応混合物の代わりに、本明細書に記載のさらなる実施例の多くで、実施例１１の迅速ＰＣＲのマスター溶液（時にはＭｇ＋＋およびジチオスレイトールが補充される）を使用した。
【０１１０】
［実施例１３］
ＲＮＡは、ＤＮＡより高度な二次構造を有し、強い二次構造がＲＴを阻害すると考えられる。温度を上昇させることは、ＲＮＡの逆転写がより簡単になるようにＲＮＡの二次構造を緩める１つの方法である。しかし、一般的に使用されるＲＴ酵素は熱不安定性であると考えられ、したがって逆転写酵素を不活性化することなく二次構造がフォールディングしないようにどの程度サンプルを加熱できるかにも限界がある。より短い反応時間が、いずれかのＲＮアーゼへの曝露時間を制限することと、化学分解を制限することの両方によって、ＰＣＲのために生成した核酸のより多くを保存することが期待されると予想される。
【０１１１】
図１ｃに示されるものに類似した水槽／ステッピングモーターＰＣＲ機器を使用して、通常のプライマー濃度の８倍を使用した１ステップＲＴ−ＰＣＲを１分未満で行った。５μｌの１ステップＲＴ−ＰＣＲは、４μＭの各ＡＣＴＢプライマーと、２５ｎｇの全白血球ＲＮＡと、ランダムヘキサマーまたはポリ（ｄＴ）が包含されていないこと以外は実施例１２と同様の５０ＵのｉＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ（最終濃度１０Ｕ／μｌ）と、２μＭのＫｌｅｎＴａｑと、抗Ｔａｑ抗体以外は実施例１１の迅速ＰＣＲのマスター溶液中に含まれるすべてを含んだ。サンプルを、水槽３１０のセット中で、４５、４７．５、５０、または５５℃で、それぞれ１５、２０、または２４秒間インキュベートし、次いで水槽３１３および３１４を使用して、５５℃から９４℃の間でサイクリングした。３５回のサイクルにわたり、各サイクルは１．０５秒を要し、水槽３１３および３１４間の２回の移動を包含し、各移動は１２５ミリ秒を要し、水槽３１３および３１４のそれぞれで４００ミリ秒で２回静止状態で保持した。ＲＴが１５秒のサンプルにおけるＲＴおよびＰＣＲの合計時間は、５３秒であった。アガロースゲルで測定したところ、全てのサンプルが等しく増幅されたようであった（図１８）。ｉＳｃｒｉｐｔ中に存在する安定剤は開示されていないが、安定剤としてはＤＴＴが挙げられると考えられる。
【０１１２】
［実施例１４］
トレハロースは、ＲＴ酵素を熱安定化および熱活性化するのに使用されてきた糖であり、ＰＣＲのエンハンサーとして使用することができる（６３）。０．６ＭのトレハロースありおよびなしのｉＳｃｒｉｐｔ  ＭＭＬＶの温度プロファイルを、２ステップＲＴ−ＰＣＲで測定した。ＲＮＡ源が５ｎｇ／μｌで包含される複数の組織から得られたヒト参照全ＲＮＡサンプル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）であり、逆転写のインキュベーションが４２〜６９℃の温度で２０秒間であったことを除いて、条件は、実施例１３と同じであった。キャピラリーを６０秒かけて１２５ミリ秒で８５℃の水槽に移動させることによる即時のＲＴ不活性化を用いて、様々な温度で、水槽中のキャピラリーでＲＴを行った。次いでサンプルを希釈し、実施例１２に記載したようにして、ｑＰＣＲのためのキャピラリーＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒに移動させた。テンプレートなしの対照は陰性であり、４２℃で３０分のＲＴ運転によりサンプルを陽性対照と比較した。ＲＴステップにおける５５〜６３℃で、トレハロースは保護的作用を有し、ｑＰＣＲで測定したところ生成物の量が２０〜４０％増加した（図１９ａ）。
【０１１３】
類似の実験で、ｉＳｃｒｉｐｔ  ＭＭＬＶ  ＲＴを、ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔ  ＭＭＬＶ  ＲＴ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）と比較した。１００ＵのＲＴ（最終濃度１０Ｕ／μｌ）、１０ｍＭのジチオスレイトール、０．２５ｍＭの各ｄＮＴＰ、および０．５ＵのＲＮアーゼ阻害剤を含む１０μｌの反応物中でＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔ  ＲＴを行ったことを除いて、セットアップおよび分析は同じであった。試験された温度範囲にわたり、２つの酵素について非常に類似した結果が得られた（図１９Ｂ）。これは、これらの操作されたＭＭＬＶ突然変異体は、同じまたは類似の酵素であり得ることを示唆している。両方の製造元は、それらのＭＭＬＶ突然変異体が天然の酵素より安定であり、ＲＮアーゼＨ活性を有すると主張している。
【０１１４】
［実施例１５］
実施例１４で決定されたように、逆転写に０．６Ｍのトレハロースおよび５６℃を使用して、１〜８μＭのプライマー濃度を２ステップＲＴ−ＰＣＲで研究した。５６℃で２０または６０秒で、それ以外は実施例１４の手順に従って、逆転写を行った。６０秒のＲＴを用いたところ、プライマーが４μＭまでは相対量が増加し、次いで４〜８μＭ間で横ばいになった（図２０）。２０秒のＲＴを用いたところ、プライマーが８μＭまでは相対量が増加し続けたことから、より短い時間は、ＲＴプライマーの濃度をより高くすることで補うことができることが示唆される。
【０１１５】
同じ０．６Ｍのトレハロース、６μＭリバースプライマーでの５６℃で２０秒間のＲＴインキュベーションを使用した別の実験セットにおいて、ｉＳｃｒｉｐｔ  ＭＭＬＶ  ＲＴ酵素の量を、１０Ｕ／μｌ（通常）から４０Ｕ／μｌに変更した。酵素濃度が増加するにつれてＣｑが減少したことから、これらの条件下で、より高い酵素濃度がより大きいｃＤＮＡ収量をもたらしたことが示される。
【０１１６】
０．６Ｍのトレハロースならびにより高い濃度のＲＴ（４０Ｕ／μｌ）およびプライマー（６μＭ）の両方を使用したさらなる実験において、０．５、１、２、４、８、および１６秒のＲＴ時間を、４２℃で３０分のＲＴ時間と比較した。定量的ＰＣＲから、５６℃で４、８、および１６秒のＲＴインキュベーション時間と、３０分、４２℃の対照との間に差がないことが解明され、これは、これらの条件下で、全ＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲにとって４秒が十分であることを示す。
【０１１７】
［実施例１６］
上記の実験は、全ＲＮＡから特異的なｍＲＮＡの転写物を増幅した。ＲＴ−ＰＣＲの別のごく一般的な用途は、ＲＮＡウイルスの検出および定量化における用途である。例えば、ＨＩＶおよびＨＣＶのためのウイルス負荷量アッセイは多くの需要があり、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）などの呼吸器ウイルスの検出である。
【０１１８】
ＲＳＶのＲＮＡの、５６秒未満での１ステップＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った。ＲＳＶのＲＮＡを、ＡＴＣＣ、カタログ番号ＶＲ−３２３３ＳＤから得た。ＲＳＶプライマーは、フォワード：ＴＧＧＧＧＣＡＡＡＴＡＴＧＴＣＡＣＧＡＡＧ（配列番号３０）およびリバース：ＣＣＡＴＴＴＡＡＧＣＡＡＴＧＡＣＣＴＣＧＡＡＴＴＴＣＡ（配列番号３１）であり、結果生じるアンプリコンの長さは、６３ｂｐであった。逆転写およびＰＣＲを５μｌで行い、これには、抗Ｔａｑ抗体を除いた実施例１１の迅速ＰＣＲのマスター溶液中、６μＭの各プライマー、（４０Ｕ／μｌの）ｉＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ、２μＭのＫｌｅｎＴａｑ、０．６Ｍのトレハロース、および５，０００、５００、５０、または５コピーの新たに希釈したＲＳＶのＲＮＡが含まれていた。逆転写を５６℃で２０秒間行い、続いて実施例１３に記載したように３５サイクルのＰＣＲを行った。図２１に、様々な最初のテンプレートのコピー数でのＰＣＲ生成物のゲル（３連）を示す。最初のテンプレートのコピー数が５，０００および５００の左のレーンで、強いプライマーおよび生成物のバンドが見られる。生成物のバンドは５０コピーでわずかに減少し、最初の５コピーでさらに明確に強度が低くなっていることから、感受性が少なくとも５コピーまで落ちていることが実証される。この例示的な１ステップＲＴ−ＰＣＲプロトコールを使用すれば、単一のコピーを検出することが可能であると考えられる。
【０１１９】
［実施例１７］
１秒未満に短くした逆転写インキュベーションを用いたＲＳＶのＲＮＡの１ステップＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った。実施例１６の場合と同様にして、５，０００コピーのＲＳＶのＲＮＡを初期テンプレートを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。全ての溶液を氷上で混合して、５６℃で反応を開始させる前のいかなる逆転写も制限した。５６℃でのＲＴ時間は、２０秒間から１秒未満まで様々であった。最短の期間は、「１０ミリ秒」と標識され、これは、キャピラリーが静止しているときの５６℃の水槽中の時間を示す。水槽へのおよび水槽からの移動を包含する時間および１０ミリ秒の静止状態の保持は、サンプルを所定温度にするための５６℃における十分な曝露ではなかった場合がある。驚くべきことに、全てのサンプルが、２０、１０、５、２、１秒、および「１０ミリ秒」のＲＴ時間で強い特異的なＰＣＲ生成物を示したが、ＮＴＣ（テンプレートなしの対照）は陰性のままであった（図２２）。図２３に、５秒のＲＴステップでのリアルタイムのサンプルのモニタリングを示す。
【０１２０】
非常に短いＲＴ時間をさらに調査するために、５、１、および０秒のインキュベーションを比較した。ここで「０秒」のインキュベーションは、５６℃の水槽を回避したものである。すなわち、調製されたサンプルを、専用のＲＴ温度でのインキュベーションを行わないエクストリームＰＣＲで直接増幅した。全ての反応液は、氷上に集められ、最後の短い（２０秒の）遠心分離は、２℃で制御された遠心分離機中で行われた。１つのサンプルセットを即座にエクストリームＰＣＲで処理し、他のセットを室温で６０秒そのままにして、調製中ずっと低温を維持することにあまり配慮がなされない状態を模擬した。結果は、陰性対照（テンプレートなしおよびＲＴなし）と、全ての時間および条件では強いバンドを示した（図２４）。左から右に、陰性対照は２つの左のレーンであり、次の３つのレーンは、５６℃で０、１、および５秒のインキュベーションを用いた低温で調製されたサンプルであり、最後の３つのレーンは、０、１、および５秒のインキュベーションを用いた室温で１分のレーンである。
【０１２１】
［実施例１８］
さらに、ＲＴに対するトレハロースおよびスクロースの作用を検査した。０．６Ｍのトレハロースありおよびなしの実施例１７の、１、２、５および１０秒のＲＴインキュベーションの条件を使用して、反応あたり５，０００コピーのＲＳＶのＲＮＡおよび４５サイクルの１ステップＰＣＲを用いて試験した。図２５に結果を示す。図２５において、トレハロースのセットは左側であり、（左から右に）テンプレートなしの対照、ブランク、１、２、５、および１０秒のインキュベーション、続いて同じ順番のトレハロースなしのセットである。ゲルは終点で採取されるが、トレハロースは最終的な収量を増加させると考えられる。トレハロースを、０．２、０．４および０．６Ｍスクロースのスクロースと比較したところ、融解分析によれば全てのサンプルがよく増幅し、０．４Ｍのスクロースが最大の収量をもたらしたことが示された（データは示さず）。スクロースは、トレハロースと同等に優れているかまたはそれより優れているようであり、これは、グルコースおよびフルクトースなどの他の糖も類似の作用を有し得ることを示唆している。他の安定剤も同様に使用される場合がある。
【０１２２】
［実施例１９］
Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓからのＡＭＶ−ＲＴは、クローニングされた天然のＲＴであり、通常、ジチオスレイトール（１０〜２５０ｍＭ）などの還元剤、高いＭｇ＋＋濃度（８〜１３ｍＭ）、および高いＫＣｌ（７５ｍＭ）の存在下で４２℃で使用される。製造元の緩衝液（反応液中の最終濃度）は、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．３、７５ｍＭの酢酸Ｋ、８ｍＭの酢酸Ｍｇ、および１０ｍＭのＤＴＴであった。この混合物に、ガラスキャピラリーチューブとの適合性のためにＢＳＡ（５００μｇ／ｍｌの反応液中の最終濃度）を補充した。この緩衝液を、最終的な反応液中に１０ｍＭのＤＴＴおよび１０ｍＭのＭｇ＋＋（合計１３ｍＭのＭｇ＋＋）が補充された実施例１１の迅速ＰＣＲのマスター溶液と比較した。２つの緩衝液間の主要な差は、迅速ＰＣＲ混合物中にはＫ＋が含まれないが、製造元の緩衝液には７５ｍＭのＫ＋が包含されていることである。カリウムイオンの存在は、これまでにＲＴ反応にとって重要であるとみなされている（６４）。２ステップＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。各緩衝液に、２５０コピー／μＬのＲＳＶのＲＮＡ、２．５Ｕ／μｌのＡＭＶ−ＲＴ、および１５μＭのリバースＲＳＶプライマーを添加し、ＲＴを４２℃で１秒、５秒、２０秒、１分、または１０分間行った。ＲＴ後、逆転写酵素を９３℃で６０秒間不活性化し、室温に冷却し、キャピラリーＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒでのＰＣＲのために１：１０に希釈した。各１０μｌのＰＣＲは、迅速ＰＣＲのマスター溶液中、０．５μＭのＲＳＶプライマーおよび２μｌの１：１０のｃＤＮＡを包含していた。９４から５５℃の間で４５サイクル（保持なし）でサイクリングすることによりリアルタイムＰＣＲを行った。次いでサンプルを、９５℃での瞬時の変性によりＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ中で融解させ、６０℃に冷却し、最終的に０．２℃で９５℃に加熱することによって蛍光を獲得した。
【０１２３】
リアルタイムの結果、融解曲線、およびゲル分析から、全ての反応が７９℃のＴｍで単一の生成物を増幅したことが解明された。各緩衝液で全ての時間（１秒、２秒、２０秒、１分、２０分）にわたり類似の結果が見られた（データ示さず）。しかし、市販の緩衝液（７５ｍＭのＫ＋を包含する）中での全ての増幅が、補充された迅速ＰＣＲのマスター溶液で行われた増幅と比較して平均４．６サイクル分遅くなった。すなわち、Ｋ＋なしの迅速ＰＣＲ溶液における定量サイクル（Ｃｑ）は、市販の緩衝液におけるＣｑより４．６サイクル少なかったことから、ＲＴ反応においてＫ＋の必要性が主張されているにもかかわらず、Ｋ＋による重度のＰＣＲ阻害が示唆される。
【０１２４】
次いで１ステップＲＴ−ＰＣＲを、４２℃でＡＭＶを用いて行って、ＲＴ時間およびＭｇ＋＋濃度の作用を研究した。Ｍｇ＋＋は、３、６、１０、および１３ｍＭで包含され、それぞれのＲＴ時間は１、２、５、および１０秒であった。１ステップ反応は、実施例１１の迅速ＰＣＲのマスター溶液（抗Ｔａｑ抗体なし）、２．５Ｕ／μｌのＡＭＶ−ＲＴ、２５０コピー／μｌのＲＳＶのＲＮＡ、４μＭの各ＲＳＶプライマー、および１０ｍＭのＤＴＴを包含していた。サイクリング条件は、実施例１３の場合と同様であった。図２６に、結果を示す。パネルは、３（左上）、６（右上）、１０（左下）、および１３（右下）ｍＭのＭｇＣｌ２を包含する。各パネル中、ＲＴ時間は、左から右に１、２、５、および１０秒であった。３ｍＭのＭｇＣｌ２では、ＡＭＶ−ＲＴにおいて生成物は観察されず、６および１０ｍＭのＭｇＣｌ２では、強度が様々な生成物が観察されたがＲＴインキュベーション時間について明確な傾向はなく、１３ｍＭのＭｇＣｌ２では全てのＲＴ時間で強いバンドが観察された。Ｋ＋がなければ増幅されないことを示唆する従来技術からの予想に反して、Ｋ＋が全く存在していなくても、１３ｍＭのＭｇＣｌ２で優れた増幅が起こった。したがって、反応混合物が実質的にカリウムを含まない１ステップＲＴ−ＰＣＲプロトコールを使用して、良好な結果を得ることができる。
【０１２５】
［実施例２０］
ＮＥＢから入手した天然のＭＭＬＶを、Ｂｉｏ−Ｒａｄから入手した遺伝子改変されたＭＭＬＶであるｉＳｃｒｉｐｔと比較した。ｉＳｃｒｉｐｔの製造元は、ｉＳｃｒｉｐｔは、より大きいＲＮアーゼＨ活性およびより大きい熱安定性を有すると主張している。ＲＳＶのＲＮＡを含む実施例１１の迅速ＰＣＲのマスター溶液および０．６Ｍのトレハロース中の５６℃で５秒間のＲＴを使用した初期の研究から、ｉＳｃｒｉｐｔ（１０Ｕ／μｌ）を使用した場合、良好な特異的融解曲線が示されたが、天然のＭＭＬＶ（２．５Ｕ／μｌ）では増幅しなかった。各酵素を４倍に増加した場合、類似の結果が見出された。最後に、２０秒のＲＴステップを用いてＲＴ温度を３７、４２、または４７℃に低くした。結果は良好な増幅を示すｉＳｃｒｉｐｔと同じであったが、天然のＭＭＬＶは増幅を示さなかった。反応液にＤＴＴまたはＫ＋は全く含有されていなかった。
【０１２６】
実施例１９の実験に類似した２ステップ実験を２つの異なる緩衝液、すなわち一方はＢＳＡ（５００μｇ／ｍｌ）およびｄＮＴＰ（各５００μＭ）が補充された製造元の緩衝液（５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．３、３ｍＭのＭｇＣｌ２、７５ｍＭのＫＣｌおよび１０ｍＭのＤＴＴ）に基づき、他方は１０μＭのＤＴＴおよび７５ｍＭのＫＣｌが補充された実施例１１の迅速ＰＣＲのマスター溶液（５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．３、３ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、および２５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ）に基づく２つの異なる緩衝液を用いて行った。各反応で、ＡＭＶの代わりに、２０Ｕ／μｌのＭＭＬＶを使用し、加えて６μＭのリバースＲＳＶプライマーを使用した。また各反応には、２５０コピーのＲＳＶのＲＮＡ／μＬも包含されていた。結果に影響を与えないと予想されるｄＮＴＰおよびＢＳＡ濃度のわずかな差はあるが、ＤＴＴおよびＫＣｌの両方は、両方の緩衝液中に同じ濃度で存在していた。ＲＴを４２℃で１秒、１０秒、１分、または１０分間行った。ＲＴ後、逆転写酵素を９３℃で６０秒不活性化し、室温に冷却し、キャピラリーＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒでのＰＣＲのために１：２０に希釈した。各１０μｌのＰＣＲは、実施例１１の迅速ＰＣＲのマスター溶液中に０．５μＭのＲＳＶプライマーおよび２μｌの１：２０のｃＤＮＡを包含していた。実施例１９で詳述した２ステップの手順の場合と同様にしてリアルタイムＰＣＲおよび融解を行った。
【０１２７】
両方の緩衝液からの全てのタイムポイントから、特異的融解曲線および互いに３サイクル以内のＣｑで増幅したことが明らかになった。しかし、平均Ｃｑ（２９．４）は、ＫＣｌを包含しない実施例１９のサンプル（平均Ｃｑ＝２０）と比較して非常に遅く、これは、Ｋ＋での強いＲＴ−ＰＣＲ阻害を示唆している。理論に縛られることはないが、ＫＣｌは、ＰＣＲ中の阻害の原因であると考えられる。
【０１２８】
ＫＣｌでの阻害を実証するために、１ステップＲＴ−ＰＣＲを、４２℃で１、５または１０秒継続するＲＴステップにより０、１０、２０、４０、および７５ｍＭのＫＣｌで行った。迅速ＰＣＲのマスター溶液に、２５０コピー／μｌのＲＳＶのＲＮＡ、２０Ｕ／μｌのＭＭＬＶ、４μＭの各ＲＳＶプライマー、１０ｍＭのＤＴＴ、および２μＭのＫｌｅｎＴａｑを様々な濃度のＫＣｌと共に入れた。実施例１９の１ステッププロトコールと同様にして増幅を行った。図２７において、ＫＣｌ濃度を増加させた１秒（左上）、５秒（右上）および１０（左下）秒のＲＴ時間のアガロースゲルを各パネル内に示す。０ｍＭのＫＣｌを用いて１、５または１０秒の時間で強い増幅が起こった。１０および２０ｍＭのＫＣｌを用いた反応により生じたバンドは、０ｍＭのＫＣｌにおけるバンドより弱かったが、ＲＴインキュベーション時間の増加に伴い増加した。４０または７５ｍＭのＫＣｌで増幅は観察されなかった。
【０１２９】
ＤＴＴは、遊離のスルフヒドリル基を有する一部の酵素に必要な強力なスルフヒドリル還元剤である。前記の段落に類似した１ステップＲＴ−ＰＣＲを、４２℃での１、５、または１０秒のＲＴインキュベーションにより、０、１０、または３８ｍＭのＤＴＴおよび０または４０ｍＭのＫＣｌを用いて行った。結果（図２８）は、左から右に様々なＤＴＴ／ＫＣｌ処理を用いた１秒（左上）、５秒（右上）、および１０秒（左下）のパネルを示す（０ｍＭのＫＣｌ／０ｍＭのＤＴＴ、０ｍＭのＫＣｌ／１０ｍＭのＤＴＴ、０ｍＭのＫＣｌ／３８ｍＭのＤＴＴ、４０ｍＭのＫＣｌ／０ｍＭのＤＴＴ、４０ｍＭのＫＣｌ／１０ｍＭのＤＴＴ、および４０ｍＭのＫＣｌ／３８ｍＭのＤＴＴ）。ＤＴＴもＫＣｌも添加されない場合、増幅は通常起こらないが、５秒のパネルは弱いバンドを示す。ＤＴＴの活性化作用は、全てのパネルで、３８ｍＭでより一層明るい別個の１０ｍＭのＤＴＴバンドとして明らかに見られる。ＫＣｌが４０ｍＭで存在するときはいつでも、ＤＴＴが存在するときでさえも、増幅は視認できない。これらのデータは、ＤＴＴがＲＴ−ＰＣＲ増幅を活性化し、ＫＣｌがそれを抑制することを示す。他の還元剤、例示としてベータ−メルカプトエタノールなどは、同様に増幅を活性化する場合がある。
【０１３０】
［実施例２１］
４５サイクルのエクストリームＰＣＲの後にゲルまたは融解分析によってＰＣＲ生成物を分析する場合（図２１、２２、２４、および２５）、ほとんどの定量的情報が失われる。その原因は、ゲルのバンドが逆転写（ＲＴ）の時系列後では等しく見えるとしても、ＰＣＲ要素の濃度を制限することによってサンプル間のあらゆる定量的な差が均一化され得ることである可能性がある。定量結果に関して、リアルタイムＰＣＲは、ゲルまたは融解分析よりかなり優れていることが多い。各リアルタイム曲線から誘導される定量サイクル（Ｃｑ）は、最初のテンプレート濃度のｌｏｇに反比例する。それゆえに、低いＣｑは、大量の最初のテンプレートを示し、これは逆転写では逆転写反応によって生成したｃＤＮＡの量と同等である。
【０１３１】
Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手したクローニングされた天然ＭＭＬＶを滴定して、最も低いＣｑ値によって示されるＲＴ−ＰＣＲ増幅を最大化するのに必要なユニット数を検査した。製造元のプロトコールは、ＲＴ反応に関して１０ユニット／μＬのＭＭＬＶを示唆している。しかし、初期の結果から、エクストリーム１ステップＲＴ−ＰＣＲにはそれより低い量が最適であったことが示唆されたため、４５℃で様々なＲＴインキュベーション時間（２．５、５、１０、２０、４０、および８０秒）で５、２．５、１．２５、０．６２５および０．３１３ユニット／μＬを検査した。
【０１３２】
ＡＴＣＣ、カタログ番号ＶＲ−２６Ｄから得られたＲＳＶのＲＮＡを用いて１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。ＲＳＶプライマーは、ＴＧＧＧＧＣＡＡＡＴＡＴＧＴＣＡＣＧＡＡＧ（配列番号３０）およびＣＣＡＴＴＴＡＡＧＣＡＡＴＧＡＣＣＴＣＧＡ（配列番号３１）であった。ガラスキャピラリーで、５μＬの体積で、５μＭの各プライマー、および３．８ｍＭのＭｇＣｌ２を含むエクストリームＰＣＲのマスター溶液（１×ＬＣＧｒｅｅｎプラス色素、０．２μＭの各ｄＮＴＰ、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．３）、１．６５μＭのＫｌｅｎＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、および２５ｎｇ／μＬのウシ血清アルブミン）を用いて、逆転写およびＰＣＲを行った。各陽性サンプルは、５μＬ中に、６０００コピーのＲＳＶテンプレートを包含していた。陰性サンプルは、テンプレートを包含していなかった（テンプレートなしの対照）。
【０１３３】
全ての溶液を氷上で混合して、反応開始前のあらゆる酵素活性を制限した。サンプル温度を３つの水槽によるシステム（図１ｃ）で制御し、まず望ましいＲＴ温度で望ましい時間にわたりサンプルを水槽に移動させるものであり、次いで９５℃および５５℃に設定された他の２つの水槽間で各水槽につき４００ミリ秒の保持で交替する。サンプルを、各サイクルにつき蛍光をモニタリングしながら３３回サイクリングし、ＰＣＲの完了には約３０秒を要した。
【０１３４】
結果から、ＲＴ時間の増加に伴いＣｑがわずかに減少したこと（２サイクル未満）が示された（図２９）。しかし、最短時間（２．５秒）で、高濃度のＭＭＬＶが全体的な反応を強く阻害した（１０サイクルまで）。２．５秒で１．２５Ｕ／μＬが最適なようであり、これは推奨された濃度である１０Ｕ／μＬの８分の１の減少であった。ＲＴ−ＰＣＲの全体時間を低減させることを目的とすれば、２．５秒は約３０秒のＰＣＲ時間と比較してわずかであり、全体時間の１０％未満の貢献に過ぎない。エクストリームＲＴ−ＰＣＲにおいてＲＴ時間が全体時間の５０％未満であることが好ましく、より好ましくは全体時間の２０％未満であり、最も好ましくは全体時間の１０％未満である。より短いＲＴ時間は、高温および高いマグネシウム濃度でのＲＮＡの劣化を最小化する。より長い生産のために、ＲＴ時間とＰＣＲ時間の両方を比例して増加させてもよい。加えて、逆転写酵素の量は、意図した生産の長さの増加に比例して増加させてもよく、ただし短い長さが使用される場合、より少ない量のＲＴが最適である。逆転写酵素は、例えばＴａｑポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼを阻害することが報告されており、これが、１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応におけるＲＴ濃度を限定する別の理由である。
【０１３５】
［実施例２２］
クローニングされた天然型ＡＭＶ（ＮＥＢ）を希釈して、低いＣｑ値によって決定された最適な濃度を決定した。製造元によるＲＴ−ＰＣＲにおけるＡＭＶの推奨濃度は、１．２５Ｕ／μＬである。しかし、初期の実験から、最適な濃度はそれより低いことが示された。１．２５、０．６３、０．３１、０．１５６、０．０７８、および０．０３９Ｕ／μＬのＡＭＶ濃度で反応を試験した。
【０１３６】
８ｍＭのＭｇＣｌ２と共にＡＭＶを使用し（上記の濃度で）、ＲＴ反応を４８℃で２秒間行ったことを除いて実施例２１の場合と同様にして、ＲＳＶのＲＮＡを用いて１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。ＡＭＶの各濃度でサンプルを３連で試行した。
【０１３７】
ＡＭＶは、１．２５Ｕ／μＬの推奨された濃度の４分の１よりも低い０．３１Ｕ／μＬの濃度で最もよく性能を発揮するが（図３０）、特により大きいアンプリコンの場合、より多くの量、例示として０．５、０．８、および１．０ユニット／μＬを使用することができる。図３１は、実施例２１と実施例２２両方の結果の組合せであり、製造元の推奨された濃度を共に示す。
【０１３８】
［実施例２３］
ＭＭＬＶを使用したエクストリーム１ステップＲＴ−ＰＣＲを、ＲＴステップに関する様々な温度（３７、４２、４５、および４８℃）および保持時間（２．５、５、１０、２０、４０、および８０秒）にわたり分析した。ＲＴ−ＰＣＲは、ＭｇＣｌ２濃度を７．４ｍＭとし、１．２５Ｕ／μＬのＭＭＬＶを使用したことを除いて実施例２１に従った。全体的に、Ｃｑは、必ずではないが、ＲＴ時間が増加するにつれて減少した（図３２）。さらに、ＭＭＬＶにとって最適な温度を決定することはできなかった。
【０１３９】
２秒のＲＴ時間を選択して、生成したｃＤＮＡの量の尺度としてＣｑを使用して、様々な温度（３９、４２、４５、４８、５１、５４、および５７℃）の範囲にわたりＡＭＶを試験した。０．３１Ｕ／μＬのＡＭＶを用いて実施例２２の手順に従った。３連での測定により多くのバリエーションが示され（図３３）、そのため最良の温度を確認することが困難であった。最も低い平均Ｃｑは４５℃であったが、これは、ＡＭＶを使用するＲＴのための製造元の推奨された温度でもある。図３４は、ＭＭＬＶのデータとＡＭＶのデータの組合せである。最適な温度は明らかではない。実際に、類似のＲＴ活性が多様な温度にわたり出現する。
【０１４０】
［実施例２４］
反応時間を低減するマグネシウムの触媒性の能力のために、ＭＭＬＶとＡＭＶの両方を用いてＭｇＣｌ２濃度を研究した。上述したように（実施例２１および２２）ＲＳＶを用いて１ステップＲＴ−ＰＣＲを行った。全てのサンプルを、４５℃で２秒（ＡＭＶ）または２および５秒（ＭＭＬＶ）のＲＴ保持で処理し、続いて即座に３３サイクルのＰＣＲ増幅によって処理した。
【０１４１】
サンプルは、実施例２２の場合と同様に１×ＰＣＲ緩衝液中にＲＳＶテンプレートおよび０．３１Ｕ／μＬのＡＭＶを包含していた。ＭｇＣｌ２濃度を、３ｍＭから２０ｍＭの間の様々な増加量で分析した。１１ｍＭで最も低いＣｑ値が測定された（図３５）。１１ｍＭ未満のＭｇＣｌ２を用いた反応は迅速に効率性が落ち始めたが、Ｃｑのみが１１から２０ｍＭの間でゆっくりと上昇した。
【０１４２】
ＭＭＬＶを含有する１ステップＲＴ−ＰＣＲサンプルを、１×ＰＣＲ緩衝液（実施例２１）および１．２５ユニット／μＬのＲＴを用いて行った。ＭｇＣｌ２を２ｍＭから１５ｍＭの間で滴定して、最適な濃度を決定した。このケースにおいて、２秒および５秒のＲＴ時間の両方を研究した。ＲＴ時間に応じて８から１１ｍＭの間のＭｇＣｌ２で最も低いＣｑが見出されたが（図３６）、６から１２ｍＭの間のＭｇＣｌ２が有効であった。Ｃｑは、５秒のＲＴ時間から２秒のＲＴ時間にかけて約１サイクル増加した。両方の酵素は、図３７で２秒のＲＴ時間を用いて比較されている。ＭＭＬＶは、全てのＭｇ＋＋濃度でＡＭＶより活性であった。
【０１４３】
［実施例２５］
先の実施例で決定されたＡＭＶおよびＭＭＬＶの反応条件下で、１ステップＲＴ−ＰＣＲに必要な最小の臨界的なＲＴ保持の再確立を行った。ＲＴ−ＰＣＲ反応の大多数をＡＭＶおよびＭＭＬＶのために最適化して、Ｃｑに対するＲＴ保持時間の作用を再度分析した。両方の逆転写酵素反応を、４５℃のＲＴ温度および９５℃から５５℃の間の３３回のサイクリングで行った。
【０１４４】
ＭＭＬＶ反応液は、１．２５Ｕ／μＬの酵素、１×ＰＣＲ緩衝液（実施例２１）、および７．４ｍＭのＭｇＣｌ２を含有していた。図３８に、結果を２連で示し、Ｘ軸は対数である。１秒から２秒の間に大きいＣｑの低下があり、２秒から４０秒の間に１サイクル未満の差がある。ｃＤＮＡの大多数は、ＲＴの最初の数秒以内に生じるようである。
【０１４５】
ＡＭＶ反応液は、０．３１Ｕ／μＬの酵素、１×ＰＣＲ緩衝液、および１１ｍＭのＭｇＣｌ２を含有していた。図３９に、結果を３連で示し、Ｘ軸は対数である。ここでもＣｑのほとんどの低下は２秒までに出現しており、これらの条件下で、ｃＤＮＡの大多数は、ＲＴの最初の数秒以内に生じるようであると示唆される。
【０１４６】
図４０に、ＭＭＬＶおよびＡＭＶからのデータの組合せを示す。一部のｃＤＮＡはＲＴ保持なしでも生成するが、保持時間を２秒に増加させることでｃＤＮＡ合成が実質的に増大し、それ以降はわずかしか増加しない。ここでもＭＭＬＶが、ｃＤＮＡの生成においてほとんどのタイムポイントでＡＭＶより効率的なようである。２秒またはそれ未満で逆転写を行う能力は、ＲＴ反応時間を有意に低下させ、試薬の添加が必要ではない１ステップＰＣＲにおいてとりわけ有用であり、診断試験において特に有用である。
【０１４７】
［実施例２６］
プライマーおよびポリメラーゼ濃度を増加させたエクストリーム条件下での１ステップＲＴ−ＰＣＲの感受性は、低い特異性のために限定される場合がある。標的に応じて、テンプレートなしの対照の明白な増幅が観察される場合があり、テンプレートなしの対照と低コピー数の陽性サンプルとの間のＣｑの差はわずかである。さらに、このような反応で生成したプライマー二量体は、特異的な生成物融解温度でまたはその近傍で融解する場合があるため、プライマー二量体を望ましい生成物と区別しにくくしている。これらの作用を軽減するために、ホットスタート技術が考慮された。熱活性化されたポリメラーゼ、プライマー、およびｄＮＴＰは商業的に入手可能であるが、いずれも活性化するのに、エクストリームＲＴ−ＰＣＲに必要な時間より長い数分を要し、このようなホットスタート技術は、方法の価値の多くを低減する場合がある。またポリメラーゼに対する抗体も入手可能であるが、エクストリームＰＣＲの場合のようにポリメラーゼ濃度を１０〜２０倍に増加させる場合、抗体の必要量およびコストがどちらも高い。別の選択肢は、例えばＦｉｌｍＡｒｒａｙ（ＢｉｏＦｉｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  、ＬＬＣ）などの混合中に溶液を高温で保持する機器内で要素を混合することである。高温は、反応開始前にプライマー結合を低減したりまたは無くしたりするが、これは、特殊化した機器を必要とし、このような機器は多くの用途にとって必要でない可能性がある。
【０１４８】
全てのＲＴ−ＰＣＲの要素が存在する場合、非特異的なテンプレートの増幅またはテンプレート以外の増幅（プライマー二量体）が、調製中に室温で起こる場合がある。それゆえに、ポリメラーゼまたはｄＮＴＰのような重要な反応要素は、典型的には、調製中できる限り反応混合物から除外される。プライマー二量体の形成は、エクストリームＰＣＲに見出される高いプライマーおよびポリメラーゼ濃度でより容易に起こる。しかし、１つのみのプライマーがポリメラーゼに曝露される場合、プライマー二量体は起こらず、すなわちプライマー二量体の形成には２つの異なるプライマーが必要である（６５）。本発明の業績から、エクストリームＲＴ−ＰＣＲにおけるプライマー二量体の形成は、ＲＴの直前に混合される２つの半反応液にプライマーを分けることによって低減できることが実証される。テンプレートなしの対照反応のＣｑは、ＲＴ−ＰＣＲの直前まで２つの半反応液にプライマーを分けた場合、それらを一緒に調製した場合に比べてより高かった（より優れた特異性、すなわち、より優れた感受性であった）。
【０１４９】
プライマー二量体はまた、十分混合された反応を低温に維持し、ＲＴ−ＰＣＲ前の混合後の時間を制限することによっても減少または防止することができる。例えば、混合後に氷上でサンプルを維持すること、およびＰＣＲの前にサンプルを低温で遠心分離することが、テンプレートなしの対照のＣｑを増加させたことが発見された。一般的に、より優れた結果は、最後の混合の後、ただしＲＴ−ＰＣＲの前に時間と温度の両方を最小化することによって得ることができる。加えて、混合温度（例示として０から２５℃）からＲＴ温度（３７から９０℃）に温度を迅速に高めることが、プライマー二量体の形成を少なくする。混合後のＲＴ温度への温度変化は、例示として１秒未満で、さらなる例示として０．５秒未満で、最もよい例示としては２００ミリ秒未満で、行うことができる。他の研究とは対照的に、本発明の業績は、短いＲＴ時間で、広範囲の許容できるＲＴ温度があることを示す。
【０１５０】
さらに、ＫｌｅｎＴａｑなどのポリメラーゼと逆転写酵素の両方が同じ反応チューブ中に存在する場合、ＰＣＲの阻害が起こる可能性がある（６６〜６８）。本発明の業績から、デルタＣｑ、すなわち陽性対照の増幅と陰性対照の増幅との間のＣｑの差の増加によって証明されたように、ＤＮＡを標的とするポリメラーゼ（例えば、ＫｌｅｎＴａｑ）とＲＮＡを標的とするポリメラーゼ（逆転写酵素）とを２つの別個の半反応液に分けることも、プライマー二量体を少なくすることが示される。追加の実験から、逆転写酵素を含有する半反応液がリバースプライマーを含有する場合、すなわち、いずれかのテンプレートにアニールできるプライマーが存在し、ｄＮＴＰおよびＭｇ＋＋が存在する場合、プライマーを伸長させる場合、より優れた結果が示された。
【０１５１】
まとめると、プライマー二量体の対照は、１ステップＲＴ−ＰＣＲ調製物を２つの半反応液に分けることによって得られた。一実施態様において、第１の半反応液は、ＤＮＡを標的とするポリメラーゼ（例えば、ＫｌｅｎＴａｑ）、テンプレートにアニールしないプライマー（フォワードプライマー）、および１×緩衝液（例えば、トリス、ＢＳＡ、および１×蛍光色素、例えば、ＬＣＧｒｅｅｎプラス）を含有する。第２の半反応液は、逆転写酵素、テンプレートにアニールするプライマー（リバースプライマー）、１×緩衝液、Ｍｇ＋＋、ｄＮＴＰ、およびテンプレート）を含有する。混合後、溶液は、ＲＴ反応の前、できる限り低温に（例示として２５℃未満、さらなる例示として５℃未満、よりさらなる例示として２未満）、できる限り短時間にわたり（例示として６０秒未満、さらなる例示として３０秒未満、よりさらなる例示として１０秒未満）維持され、できる限り迅速にＲＴ温度に高められる（例示として１秒未満、さらなる例示として５００ミリ秒未満、よりさらなる例示として２００ミリ秒未満）。
【０１５２】
例示的な１ステップＲＴ−ＰＣＲは、第１の凍結された半反応液と第２の冷却された（ただし液体の）半反応液とに分けた要素を包含していた。２つの半反応液の一部を１ステップＲＴ−ＰＣＲ運転の直前に合わせたが、以下これを「氷結」技術と称する。
【０１５３】
氷結技術の実証は、ＡＴＣＣ、カタログ番号ＶＲ−２６Ｄから得たＲＳＶのＲＮＡを利用した。ＲＳＶプライマーは、フォワード：ＴＧＧＧＧＣＡＡＡＴＡＴＧＴＣＡＣＧＡＡＧ（配列番号３０）およびリバース：ＣＣＡＴＴＴＡＡＧＣＡＡＴＧＡＣＣＴＣＧＡ（配列番号３１）であった。半分に分割した反応液の両方は、１×ＬＣＧｒｅｅｎプラス色素、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．３）、および２５ｎｇ／μＬのウシ血清アルブミンを含有していた。氷上で作業する場合、凍結しようとする半分の反応液は、加えて、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、３．２ｍＭのＫｌｅｎＴａｑおよび１０μＭのフォワードプライマーを含有していた。このサンプルのうち２つの半分のμＬをピペットで各ガラスキャピラリーに採取し、短時間で遠心分離し（５秒未満）、最短でも２０分かけて−２０℃で凍結した。
【０１５４】
反応液の凍結された半分を−２０℃の冷凍庫に入れ、冷却された部分を氷上で調製した。冷却された部分は、１０μＭのリバースプライマー、１２ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５ユニット／μＬのＭＭＬＶ、および２４００コピー／μＬのＲＳＶを包含していた。ＭＭＬＶは、凍結されたキャピラリーに添加する直前まで、冷却された溶液に添加されなかった。２つから３つの凍結された反応キャピラリーを冷凍庫から取り出し、即座に氷水槽に入れた。次いで、２．５μＬの冷却された溶液をピペットで取り、各キャピラリーの上部に添加し、迅速に卓上遠心分離機を断続的に駆動させ（３秒未満）、敏速に氷槽に戻した。次いでＲＴ−ＰＣＲを５０℃で２秒のＲＴ保持を用いて行い、９５℃から５５℃の間で４５回サイクリングした。
【０１５５】
この同じ実験を、ＡＴＣＣ（カタログ番号ＶＲ−１８３８ＤＱ）から得られた不活性化ジカウイルスＲＮＡを用いても行った。ジカフォワードプライマーは、ＣＡＧＧＴＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＡＴ（配列番号３２）であり、リバースプライマーは、ＴＴＴＧＴＡＡＣＧＴＧＣＣＡＣＡＴＧＧＴ（配列番号３３）であった。ＲＴ−ＰＣＲ反応液５μＬあたり１２５０コピーのジカＲＮＡを使用した。
【０１５６】
ＲＳＶおよびジカウイルス実験の両方からの結果は、氷上で混合されたものと比較して、氷結技術によって作製されたＲＴ−ＰＣＲ反応のテンプレートなしの対照におけるΔＣｑの実質的な増加（約１０サイクル、または１０００の感受性の増加）を示した（図４１）。さらに、テンプレートなしの対照の融解曲線はより低温にシフトし、陽性サンプルと容易に区別できるようになった。
【０１５７】
一連の３つの実験を実行して、氷結ＲＴ−ＰＣＲ手順の凍結されたまたは冷却された部分のいずれかにＭｇＣｌ２およびｄＮＴＰを入れる作用を決定した（表４〜６）。キャピラリー中で半分の反応液（２．５μＬ）を−２０℃で凍結することによってサンプルを作製した。次いで凍結されたサンプルを氷槽中に入れ、そこで実施例２６の場合と同様にして２．５μＬの冷却された溶液を添加した。全ての実験において、２つのプライマーを異なる溶液に分け、ＫｌｅｎＴａｑおよびＭＭＬＶを分けた。リバースプライマーを、ＲＮＡおよびＭＭＬＶと組み合わせて、それらが２つの溶液の混合前に結合できるようにした。これにより、フォワードプライマーをＭＭＬＶおよびＲＮＡと組み合わせることより優れた結果が得られた。
【０１５８】
【表４】
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【０１５９】
【表５】
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【０１６０】
【表６】
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【０１６１】
実験１（表４）において、両方の溶液にＭｇＣｌ２を等量で入れた。実験２（表５）において、ＭｇＣｌ２の全てを冷却された半反応液に入れて、ＫｌｅｎＴａｑからＭｇ＋＋を分けることがテンプレートなしの対照の増幅を低減するかどうかを調べた。最終的に、実験３（表６）で、冷却された溶液にｄＮＴＰとＭｇＣｌ２の両方を入れた。仮定として、逆転写酵素がテンプレートなしの対照の増幅に関与する場合、このような増幅は、ｄＮＴＰおよびＭｇＣｌ２の存在下で増加する可能性がある。代替として、テンプレートなしの対照の増幅がＫｌｅｎＴａｑによって媒介される場合、Ｍｇ＋＋またはｄＮＴＰは、ＫｌｅｎＴａｑによって伸長に利用できないと予想されるが、陽性サンプルは、ｃＤＮＡ合成にとって完全な条件を有すると予想される。１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応のΔＣｑ値に基づけば、実験３で概説した実験パラメーターは、最適な条件をもたらす（図４２）。
【０１６２】
［実施例２７］
ＲＴ温度のＲＴ−ＰＣＲへの作用を、２秒のＲＴを使用した氷結技術により研究した。実施例２６の実験３で概説した手順をジカプライマーを使用して行い、陽性（５μＬのＲＴ−ＰＣＲあたり１２５０コピー）およびテンプレートなしの対照の両方を３０から９０℃のＲＴ温度の範囲にわたり分析した。Ｃｑ値は、４〜８サイクルのΔＣｑで６０℃の温度範囲にわたり極めて一定であった（図４３）。エクストリームＲＴ−ＰＣＲ条件を使用したＭＭＬＶの場合、５０〜６０℃が最適であった。氷結技術を使用しても、なお向上の余地がある。陽性対照とテンプレートなしの対照との間のより大きいΔＣｑが、感受性をさらに改善すると予想される。
【０１６３】
［実施例２８］
エクストリームＲＴ−ＰＣＲにおけるテンプレートなしの対照の「プライマー二量体」増幅を減少させるための手段として、アプタマーを調査した。アプタマーはこれまで、ＤＮＡを標的とするＤＮＡポリメラーゼ（６９〜７０）およびＲＮＡを標的とするＤＮＡポリメラーゼ（７１）の両方に特異的に重合反応を阻害するのに過去に使用されてきた。アプタマーは、インビトロでの進化的選択によって誘導される。本明細書において研究されたアプタマーの塩基配列は、以下に列挙した通りである（５’−３’）：
Ｔａｑアプタマー配列（７０）：
６−１０：ＣＡＡＧＡＣＧＧＧＣＧＧＧＴＧＴＧＧＴＡＧＧＣＧＣＣＣＧＴＧ（配列番号３４）
４−１：ＡＣＴＴＧＡＴＧＧＣＧＧＧＴＧＴＧＧＴＡＧＧＣＧＣＣＡＴＣＴ（配列番号３５）
Ｓｔｏｆｆｅｌ（ＫｌｅｎＴａｑ）アプタマー配列（６９）：
Ｔｒｎｃ．Ａ−３０：ＡＡＧＡＣＣＡＧＡＣＡＡＴＧＴＡＣＡＧＴＡＴＴＧＧＣＣＴＧＡ（配列番号３６）
Ｔｒｎｃ．２−３０：ＧＣＣＧＧＣＣＡＡＴＧＴＡＣＡＧＴＡＴＴＧＧＣＣＧＧＣ（配列番号３７）
Ｔｃｔｗ．Ａ−３０：ＣＣＧＧＡＣＡＡＴＧＴＡＣＡＧＴＡＴＴＧＧＣＣＣＧＧ（配列番号３８）
ＭｕＬＶアプタマー配列（７１）：
ｄｍ．１．１：ＵＵＡＣＣＡＣＧＣＧＣＵＣＵＵＡＡＣＵＧＣＵＡＧＣＧＣＣＡＵＧＧＣ（配列番号３９）
ｍ．１．１：ＣＵＵＡＣＣＡＣＧＣＧＣＵＣＵＵＡＡＣＵＧＣＵＡＧＣＧＣＣＡＵＧＧＣＣＡＡＡＡＣＵ（配列番号４０）。
【０１６４】
上記のＤＮＡアプタマーのそれぞれを、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ）合成によって３つの形態で合成した。第１の形態は、３’末端で修飾されていないものであり、第２の形態は、３’−ホスフェートで修飾されたものであり、第３の形態は、３’末端でＣ６−アミノ末端修飾剤で修飾されたものであった（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。表７に、これらのオリゴヌクレオチドのそれぞれの名称を、そのテンプレート、３’−ブロッカーおよび文献番号と共に示す。３’−ブロックを添加して、起こり得るＤＮＡアプタマーからの伸長を防止した。アプタマーをホスフェートおよびＣ６アミノ基でブロックすることが本明細書に記載されるが、追加の３’−ブロッカー、例えば異なる炭素鎖長を有するアミノ修飾剤、例示として２個の炭素（Ｃ２）、３個の炭素（Ｃ３）、および最大１２個の炭素（Ｃ１２）のリンカーを有するものなどが予期される。正電荷を有するあらゆる３’−ブロッカーも予期され、本明細書に記載されるアプタマーの結合および有効性を増加させると考えられるが、他のブロッカーも使用することができる。オリゴヌクレオチドＴｃｔｗ．Ａ−３０、Ｔｃｔｗ．Ａ−３０Ｐｈｏｓ、およびＴｃｔｗ．Ａ−３０アミノは、アプタマーＴｒｎｃ．Ａ−３０のヘアピンループおよびヘアピンステムの非対称な内部ループを維持しながら、ステムの塩基対の１つをＡ：：ＴからＧ：：Ｃに変更し、追加のＧ：：Ｃ塩基対によってステムの長さを増加させることによって安定性を追加していることから、これらは本出願の新規の態様である。加えて、その二次構造（ヘアピンループおよび非対称の内部ループ）を維持しながらステムの安定性を増加させるＴｒｎｃ．Ａ−３０に対する他の修飾により、本明細書に記載される用途のための３’−アミノ修飾剤を併用してもまたは併用しなくても有用なアプタマーを生産することが期待される。Ｔｒｎｃ．Ａ−３０およびＴｒｎｃ．２−３０の二次構造は公開されている（６９）。ＭＭＬＶのためのＲＮＡアプタマーは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されないはずなので、これらはブロックされていない。
【０１６５】
【表７】
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【０１６６】
ＤＮＡアプタマーをまず迅速サイクルＰＣＲを用いて試験した。ヒトゲノムＤＮＡ標的は、以下のＰＵＭ１（イントロン２）プライマー：ＡＧＧＴＡＧＧＴＧＡＧＧＡＧＡＣＴＴＡＡＧ（配列番号４１）およびＴＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡ（配列番号４２）によって定義された。１０μＬの反応液中、５０ｎｇのＤＮＡテンプレートを、３ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．３中の０．５μＭの各プライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５００μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１×ＬＣＧｒｅｅｎプラス、０．０６４μＭのＫｌｅｎＴａｑ１ＤＮＡポリメラーゼ、および様々な量のアプタマーＴｒｎｃ．２−３０と共に提供した。冷却またはプライマー二量体を防止する他のいかなる手段も用いずに、サンプルを室温で混合した。ゲノム変性のために９５℃に５秒間加熱し、続いて９５℃で０秒間および５５℃で０秒間４５サイクル行うことによりサンプルを増幅して、キャピラリーＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ１．５（Ｒｏｃｈｅ）で定量サイクル値（Ｃｑ）を決定した。次いでＰＣＲ生成物を６０〜９５℃から０．２℃／秒で融解させて、連続的に蛍光を獲得した。
【０１６７】
図４４に、異なるＴｒｎｃ．２−３０濃度のＣｑに対する作用を示す。デルタＣｑ（ΔＣｑ）は、感受性の尺度として使用され、ΔＣｑが高い程、アッセイの感受性がより優れている。アプタマーの非存在下で、ΔＣｑは約１４サイクルであり、０．２５μＭで２６サイクルまで上昇する。より高い濃度では、陽性対照のＣｑはほぼ一定にもかかわらず、陰性対照のＣｑは低下し、ΔＣｑも減少する。
【０１６８】
上記で決定された見かけの最適なアプタマー濃度０．２５μＭを使用して、表７における全てのＤＮＡアプタマーのΔＣｑを、同じＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＰＵＭ１ＰＣＲアッセイを使用して決定した。陽性対照は１．４サイクル未満で変動し、Ｃｑは約２４〜２５サイクルであったが、陰性対照は広範に変動した（データ示さず）。図４５にΔＣｑ値の結果を示す。６〜１０および４〜１アプタマーの添加は、陰性（アプタマーなしの対照）に比べてそれほど優れた結果を提供しなかった。最良のアプタマーは、３’末端がＣ６アミノで終結したものであり、最大のΔＣｑのアプタマーは、Ｔｃｔｗ．Ａ−３０アミノであった。このアプタマーは、そのＣ６アミノ末端とその配列において公開された文献と比べて独特である（６９）。
【０１６９】
１５分間のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＰＣＲに関して上記で最適であることが見出されたＴｃｔｗ．Ａ−３０アミノアプタマーを使用して、その濃度をエクストリームＰＣＲのために最適化した。一部の実施態様において、エクストリームＲＴ−ＰＣＲでは、プライマー濃度がＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ実験より１０倍高いため、アプタマー濃度を増加させなければならない場合がある。エクストリームの化学物質（５μＭのプライマーおよび１．６μＭポリメラーゼ）およびエクストリームの増幅（９０℃から６０℃の間でおよそ１秒のサイクル）を除き、上記のＰＵＭ１（イントロン２）の増幅の条件を使用した。図４６に結果を示す。陽性対照反応のＣｑはＤＮＡアプタマー濃度が増加するにつれてゆっくり上昇したが、両方の陰性対照のＣｑおよびΔＣｑは０から１．２５μＭの間で迅速に上昇し、次いで横ばいになったようであった。エクストリーム条件下での最適なＴｃｔｗＡ−３０濃度は、約２μＭのようであった。ある特定のＤＮＡアプタマーがＭＭＬＶなどの一部の逆転写酵素を部分的に阻害するため（７２）、１つのＤＮＡアプタマーを、ＲＴ−ＰＣＲにおいて両方の酵素を阻害するのに使用することができる。代替として、１つは逆転写酵素に特異的であり、１つはＤＮＡを標的とするポリメラーゼに特異的な２つのアプタマーをＲＴ−ＰＣＲで使用することができる。
【０１７０】
特異的なＲＮＡアプタマーはＭＭＬＶを阻害するのに利用可能であるため、表７に列挙したＲＮＡアプタマーｄｍ１．１およびｍ．１．１を使用して、ＲＴ−ＰＣＲにおけるプライマー二量体形成を阻害した。まず、これらのＲＮＡアプタマーを、いかなるＤＮＡアプタマーも用いずに試験した。条件は上記のＰＵＭ１（イントロン２）の増幅に従い、ＲＴは６０℃で２秒であった。図４７に示されるｍ．１．１の結果は、Ｃｑに対するアプタマー濃度の作用を示す。３μＭのアプタマーで陰性対照とΔＣｑの両方が最大であった。次に、同じシステムを使用して、それぞれ３μＭのアプタマーｍ．１．１とアプタマーｄｍ１．１とを比較した。ｍ．１．１のΔＣｑ（９．０）は、ｄｍ１．１のΔＣｑ（７．５）より優れていた。それゆえに、ＲＴ−ＰＣＲにおける単離（ＤＮＡアプタマーなし）にＲＮＡアプタマーが使用される場合、プライマー二量体を減少させることができ、アプタマーｍ．１．１が良好な選択である。
【０１７１】
ＲＮＡおよびＤＮＡアプタマーの両方を、試験された設定からエクストリーム条件下で別々に最適化した場合、ＲＮＡアプタマーにとっての最良の選択は、３μＭでｍ．１．１であり、ＤＮＡアプタマーにとっての最良の選択は、２μＭでＴｃｔｗ．Ａ−３０アミノであった。予備実験において、両方のアプタマーを一緒に試験し、１つのみのアプタマーの対照およびアプタマーが全くない対照と比較した場合、ΔＣｑ値は、両方のアプタマーが存在する場合に最大であった。ＲＮＡおよびＤＮＡアプタマーがもたらすΔＣｑが相加的または相乗的であると予想される条件は、エクストリームＲＴ−ＰＣＲにおけるプライマー二量体の形成に逆らう力を大きく増加させると予想される。
【０１７２】
参考文献
【表８Ａ】
2018538007.tif 000011
【表８Ｂ】
2018538007.tif 000012
【表８Ｃ】
2018538007.tif 000013
【表８Ｄ】
2018538007.tif 000014
【表８Ｅ】
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【表８Ｆ】
2018538007.tif 000016
【０１７３】
本発明が関係する分野の最新技術を説明するために明細書中に数々の特許、特許公報および非特許文書が引用されている。これらの文書および引用のそれぞれは、全てが記載されたのと同等に参照により本明細書の一部をなすものとする。
【０１７４】
所定の実施形態を参照しながら本発明を詳細に説明したが、以下の特許請求の範囲で記載および定義された本発明の範囲および趣旨内にある変更形態および改変形態が存在する。
【図１ａ】
2018538007.tif 000017
【図１ｂ】
2018538007.tif 000018
【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
2018538007.tif 000030
【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図６ａ】
2018538007.tif 000034
【図６ｂ】
2018538007.tif 000035
【図７ａ】
2018538007.tif 000036
【図７ｂ】
2018538007.tif 000037
【図８ａ】
2018538007.tif 000038
【図８ｂ】
2018538007.tif 000039
【図８ｃ】
2018538007.tif 000040
【図８ｄ】
2018538007.tif 000041
【図９ａ】
2018538007.tif 000042
【図９ｂ】
2018538007.tif 000043
【図９ｃ】
2018538007.tif 000044
【図９ｄ】
2018538007.tif 000045
【図１０ａ】
2018538007.tif 000046
【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１１ｅ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１６ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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