(57)【要約】本発明は、関節リウマチ（“ＲＡ”）の査定を補助する方法に関する。本方法は特に、関節リウマチの非存在または存在をインビトロで査定する際に使用される。本方法は、たとえば生化学マーカーを分析することにより実施され、試料において抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤの濃度を測定し、そして決定した濃度を関節リウマチの非存在または存在に関連付けることを含む。本発明の方法におけるＲＡの査定をさらに改善するために、抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤと共に１種類以上の追加マーカーのレベルを決定し、ＲＡの非存在または存在に関連付けることができる。本発明は関節リウマチの診断における抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤを含むマーカーパネルの使用にも関係し、本発明は本発明方法を実施するためのキットを教示する。さらに、本発明はまた、ＲＡを他の自己免疫疾患、好ましくは変形性関節症（ＯＡ）から鑑別するための、抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤを含むマーカーパネルの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節リウマチ（ＲＡ）の非存在または存在をインビトロで生化学マーカーにより査定するための、下記を含む方法：
ａ）全血、血漿または血清試料において、少なくとも抗環状シトルリン化ペプチド（抗ＣＣＰ）および抗ＰＩＫ３ＣＤの濃度をそれぞれ測定する；
ｂ）（ａ）において抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定した濃度値を組み合わせる；そして
ｃ）工程（ｂ）において決定した組合わせ数値をＲＡの非存在または存在と関連付ける；その際、基準集団から抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定したカットオフ組合わせ濃度値と比較して増大した組合わせ数値は、ＲＡの存在の指標となる。
【請求項２】
試料がヒト対象に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
その方法の工程（ａ）がイムノアッセイ法である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤを、それぞれ抗原としての１種類以上のＣＣＰおよび／または抗原としての１種類以上のＰＩＫ３ＣＤにより捕捉する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）の組合わせ濃度値を、ＲＡ陽性患者を除外した、明らかに健康な者ならびに変形性関節症（ＯＡ）患者および他の自己免疫疾患患者からなる群から選択される患者を含む基準集団から得られたカットオフ値と比較する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
さらに、抗ＭＣＭ３および抗ＰＩＫ３ＣＤからなる群から選択される少なくとも１種類の追加マーカーの測定を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
関節リウマチ（ＲＡ）の重症度をインビトロで生化学マーカーにより査定するための、下記を含む方法：
ａ）全血、血漿または血清試料において、少なくとも抗環状シトルリン化ペプチド（抗ＣＣＰ）および抗ＰＩＫ３ＣＤの濃度をそれぞれ測定する；
ｂ）（ａ）において抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定した濃度値を組み合わせる；そして
ｃ）（ｂ）からの組合わせ数値をＲＡの重症度に関連付ける；その際、基準集団から抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定したカットオフ組合わせ濃度値と比較してより高い組合わせ数値は、その患者のＲＡの重症度の指標となる。
【請求項８】
関節リウマチ（ＲＡ）をインビトロで生化学マーカーにより他の自己免疫疾患から鑑別するための、下記を含む方法：
ａ）全血、血漿または血清試料において、少なくとも抗環状シトルリン化ペプチド（抗ＣＣＰ）および抗ＰＩＫ３ＣＤの濃度をそれぞれ測定する；
ｂ）（ａ）において抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定した濃度値を組み合わせる；そして
ｃ）（ｂ）からの増大した組合わせ数値により、ＲＡを他の自己免疫疾患から鑑別する；その際、基準集団から抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定したカットオフ組合わせ濃度値と比較して増大した組合わせ数値は、ＲＡの存在の指標となる。
【請求項９】
関節リウマチ（ＲＡ）の非存在または存在をインビトロで全血、血漿または血清試料から査定するための、少なくとも抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤを含むマーカーパネルの使用；その際、基準集団から抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定したカットオフ組合わせ濃度値と比較して増大した、抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定した組合わせ濃度は、ＲＡの存在の指標となる。
【請求項１０】
マーカーパネルが、抗ＣＣＰ、抗ＰＩＫ３ＣＤ、ならびに抗ＭＣＭ３および抗Ｃａｓｐ８からなる群から選択される少なくとも１種類の追加マーカーをさらに含む、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
マーカーパネルが、抗ＣＣＰ、抗ＰＩＫ３ＣＤおよび抗ＭＣＭ３を含む、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
ＲＡを他の自己免疫疾患、好ましくは他の関節疾患から鑑別するための、請求項８に記載の方法の使用。
【請求項１３】
他の関節疾患が変形性関節症（ＯＡ）である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
ＲＡの非存在または存在の査定における、少なくとも抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤを含むマーカーパネルについての最適化多変量カットオフの使用；その際、最適化多変量カットオフは抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定した濃度値を組み合わせることにより得られる。
【請求項１５】
抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤをそれぞれ特異的に測定するために必要な試薬、ならびに場合により測定を実施するための補助試薬を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチ(rheumatoid arthritis)（“ＲＡ”）の査定を補助する方法に関する。本方法は特に、関節リウマチの非存在または存在をインビトロで査定する際に使用される。本方法は、たとえば生化学マーカーを分析することにより実施され、試料において抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤの濃度を測定し、そして決定した濃度を関節リウマチの非存在または存在に関連付けることを含む。本発明の方法におけるＲＡの査定をさらに改善するために、抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤと共に１種類以上の追加マーカーのレベルを決定し、ＲＡの非存在または存在に関連付けることができる。本発明は関節リウマチの診断における抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤを含むマーカーパネルの使用にも関係し、本発明は本発明方法を実施するためのキットを教示する。さらに、本発明はまた、ＲＡを他の自己免疫疾患、好ましくは変形性関節症(osteoarthritis)（ＯＡ）から鑑別するための、抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤを含むマーカーパネルの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（“ＲＡ”）は慢性、炎症性の全身疾患であり、それの最も顕著な症状発現は罹患した関節、特に手足の関節に生じる。関節リウマチの発症は数週間から数カ月にわたって徐々に起きる可能性があり、あるいはその状態は急性様式で急激に表面化する可能性がある。
【０００３】
ＲＡは世界的に分布し、すべての人種に関係する。この疾患はいかなる年齢でも起きる可能性があるが、罹患率は年齢と共に増大し、ピーク発症率は４０〜６０代である。北米人集団についての罹患率推定値は０．３％から１．５％にまで及ぶ。現在、米国だけで２，５００，０００人を超える人々が関節リウマチを伴うと診断されており、ある統計は６５０万〜８００万人がこの疾患に潜在罹患していると指摘する。女性は男性より２〜３倍多く罹患する。
【０００４】
関節リウマチの初期症状は関節の腫脹または圧痛を伴う関節痛など大部分が関節特異的であるが、かなり非特異的な症状発現、たとえば硬直、発熱、皮下結節および疲労も含まれる場合がある。きわめて特徴的なことは対称的な関節罹患である。手、足、膝および手首の関節が最も一般的に罹患し、最終的に股関節、肘関節および肩に波及する。疾患が進行するのに伴っていかなるタイプの動きも著しい痛みおよび困難を伴い、最終的には罹患関節の機能が失われる。より重篤な関節リウマチの症例は激痛および関節破壊に至る可能性がある。関節炎関連の関節破壊から生じる痛みおよび運動性喪失を軽減するために、毎年ほぼ３００，０００の骨および関節置換外科処置が行なわれている。
【０００５】
ＲＡを分類するために最も広く用いられていた方式は、ＲＡの分類のための米国リウマチ学会(American College of Rheumatology)  １９８７改訂基準であった(Arnett, F. C., et al., Arthritis Rheum. 31 (1988) 315-324)。この慣例は、２０１０年、下記のリストにより説明される新たな方式を規定することによりＡＣＲ／ＥＵＬＡＲに置き換えられた(Mjaavatten and Bykerk, Best Practice & Research Clinical Rheumatology, 2010から引用)：
ＲＡに関するＡＣＲ／ＥＵＬＡＲ  ２０１０分類基準。６以上のスコアにより患者をＲＡと定義する。
【０００６】
【表Ａ】
2018506720.tif 000002
【０００７】
患者は少なくとも１つの関節が明確な臨床的滑膜炎（腫脹）を伴うべきであり、その滑膜炎は他の疾患によってより良く説明されるものではない。ＡＣＲ，米国リウマチ学会(American College of Rheumatology)；ＥＵＬＡＲ，欧州リウマチ学会(European League Against Rheumatism)；ＲＦ，リウマチ因子(rheumatoid factor)；ＡＣＰＡ，抗シトルリン化タンパク質抗体(anti-citrullinated protein antibody)；ＣＲＰ，Ｃ反応性タンパク質(C-reactive protein)；ＥＳＲ，赤血球沈降速度(erythrocyte sedimentation rate)。
【０００８】
一般的に受け入れられている（前記の基準を参照）、ＲＡ診断を補助する唯一の生化学マーカーは、血清中に検出されるリウマチ因子（ＲＦ）、すなわち抗ＣＣＰ（前記においてＡＣＰＡと呼ばれる）およびＣＲＰである。
【０００９】
ＲＡにおける組織変化は疾患特異的ではなく、関係する臓器によって大幅に左右される。初期の炎症性関節病変は滑膜に関係する。最も初期の変化は滑膜微細血管系に対する傷害であり、電子顕微鏡により記録される内腔の閉塞、内皮細胞の腫脹、および内皮細胞間のギャップを伴う。この病期は通常は表在性ライニング細胞層の軽度の増殖を伴う。２つの細胞タイプが滑膜ライニングを構成している：マクロファージの特徴をもつ骨髄由来のタイプＡ滑膜細胞、および間葉性タイプＢ滑膜細胞。両方の細胞タイプが滑膜過形成に関与し、これはこれら２つの細胞タイプ間のパラクリン（傍分泌）相互作用を示唆する。この病期の炎症は、うっ血、浮腫、およびフィブリン浸出を伴う。細胞浸潤は初期疾患において起き、最初は主にＴリンパ球からなる。炎症の結果、滑膜は、血管および滑膜線維芽細胞の増殖により、また滑膜ライニング層の増倍および拡張により、肥厚性になる。
【００１０】
肉芽組織は軟骨にまで広がり、パンヌスとして知られる。この組織は活発に侵襲し、関節周囲の骨、および滑膜と骨の境界にある軟骨を破壊し、びらん性ＲＡとして知られる。
ＲＡの関節症状発現は２つのカテゴリーに分けることができる：炎症性滑膜炎に関連する可逆性の徴候と症状、および滑膜炎により引き起こされる不可逆的構造損傷。この概念は、病期を決定して予後を判定するためだけでなく、医療処置または外科処置を選択するためにも有用である。一般的な患者における構造損傷は、通常は疾患の１年目と２年目の間のある時点で開始する(Van der Heijde, D. M., Br. J. Rheumatol. 34 (1995) 74-78)。滑膜炎は変動性パターンを伴う傾向があるが、構造損傷はそれ以前の滑膜炎の量の直線関数として進行する。
【００１１】
ＲＡにおける初期事象の病因は依然として理解し難い。自己免疫的要素が現在では広く受け入れられているが、他の要因もなお論争されている。細菌またはウイルス感染の可能性が精力的に追及されてきた。単離、電子顕微鏡または分子生物学により感染因子とＲＡを関連づけるすべての努力は失敗した。ＲＡの単一の主因があるのではなく、種々のメカニズムが初期の組織傷害をもたらし、滑膜炎症を促進するという可能性がある。
【００１２】
滑膜炎の臨床徴候は捕え難い可能性があり、しばしば主観的である。ほてって膨潤し、明らかに炎症している関節は、通常は炎症性滑膜炎の最も活発な時期に初めて見られる。軟骨減量および関節周囲骨のびらんは、構造損傷の特徴である。構造損傷に関係する臨床像は、進行性の機能的および解剖学的な劣化が目印となる。関節に対する構造損傷は不可逆的かつ相加的である。
【００１３】
関節リウマチの効果的処置は、一般に薬物療法、運動、休憩、および適切な関節保護療法の組合わせを含む。個々の患者のための療法は、疾患の重症度および関係する関節により左右される。非ステロイド系抗炎症薬、コルチコステロイド、金塩、メトトレキセートおよび全身用免疫抑制薬が、炎症および関節破壊を低減するために広く用いられている。しかし、ステロイドおよび免疫抑制薬の使用は、毒性および潜在的に致命的状態に陥りやすいことの両方に関して重大なリスクおよび副作用をもつ。より最近になって、“生物製剤”をベースとする療法薬がＲＡ療法に導入された。そのような療法薬は、たとえばＴＮＦ−αを指向する可溶性受容体または抗体であり、それらは炎症を有意に軽減する。生物製剤はきわめて有望ではあるが、高価であるため依然として使用は限定されている。
【００１４】
縦断的な臨床試験および疫学試験からのデータは、処置のためのガイドラインを提供する。これらの試験は、１）早期診断の必要性、２）予後要因の同定、および３）早期の攻撃的処置を強調する。早期の、好ましくは症状発現後の最初の数カ月以内の診断および処置は、不可逆的な関節損傷を防止するのに役立つ可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Arnett, F. C., et al., Arthritis Rheum. 31 (1988) 315-324
【非特許文献２】Mjaavatten and Bykerk, Best Practice & Research Clinical Rheumatology, 2010
【非特許文献３】Van der Heijde, D. M., Br. J. Rheumatol. 34 (1995) 74-78
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
よって、特に生化学的パラメーターに基づいて関節リウマチの査定を補助する方法に対するニーズがある。本発明は、関節リウマチの非存在または存在をインビトロで査定するためのそのような方法および試薬を提供する。本方法は、ＲＡに罹患している患者における処置の有効性のモニタリングも補助するであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、関節リウマチ（ＲＡ）をインビトロで生化学マーカーにより査定するための方法であって、試料において抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤの濃度を測定し、決定した濃度をＲＡの非存在または存在に関連付けることを含む方法に関する。
【００１８】
さらに本発明は、関節リウマチ（ＲＡ）の重症度をインビトロで生化学マーカーにより査定するための方法であって、試料において抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤの濃度を測定し、それらの濃度をＲＡの重症度に関連付けることを含む方法に関する。
【００１９】
本発明はまた、関節リウマチ（ＲＡ）をインビトロで生化学マーカーにより他の自己免疫疾患から鑑別するための方法であって、試料において抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤの濃度を測定し、組合わせ濃度値の増大により、ＲＡを他の自己免疫疾患、好ましくは他の関節疾患から鑑別することを含む方法に関する。
【００２０】
さらに、ＲＡを他の自己免疫疾患、好ましくは他の関節疾患から鑑別する方法の使用を開示する。
さらに、関節リウマチ（ＲＡ）の非存在または存在をインビトロで試料から査定するための、抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤを含むマーカーパネルの使用を開示する。
【００２１】
さらに、ＲＡの非存在または存在の査定における、少なくとも抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤを含むマーカーパネルについての最適化多変量カットオフ(optimized multivariate cut-off)の使用を開示し、その際、最適化多変量カットオフは抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定した濃度値を組み合わせることにより得られる。
【００２２】
抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤをそれぞれ特異的に測定するために必要な試薬、ならびに場合により測定を実施するための補助試薬を含む、本発明による方法を実施するためのキットも開示される。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
第１の好ましい態様において、本発明は、関節リウマチ（ＲＡ）の非存在または存在をインビトロで生化学マーカーにより査定するための、下記を含む方法に関する：ａ）全血、血漿または血清試料において、少なくとも抗環状シトルリン化ペプチド（抗ＣＣＰ）および抗ＰＩＫ３ＣＤの濃度をそれぞれ測定する；ｂ）（ａ）において抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定した濃度値を組み合わせる；そしてｃ）工程（ｂ）において決定した組合わせ数値をＲＡの非存在または存在と関連付ける；その際、基準集団から抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定したカットオフ組合わせ濃度値と比較して増大した組合わせ数値は、ＲＡの存在の指標となる。
【００２４】
第２の好ましい態様において、本発明は、関節リウマチ（ＲＡ）の重症度をインビトロで生化学マーカーにより査定するための、下記を含む方法に関する：ａ）全血、血漿または血清試料において、少なくとも抗環状シトルリン化ペプチド（抗ＣＣＰ）および抗ＰＩＫ３ＣＤの濃度をそれぞれ測定する；ｂ）（ａ）において抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定した濃度値を組み合わせる；そしてｃ）（ｂ）からの組合わせ数値をＲＡの重症度に関連付ける；その際、基準集団から抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定したカットオフ組合わせ濃度値と比較してより高い組合わせ数値は、その患者のＲＡの重症度の指標となる。
【００２５】
第３の好ましい態様において、本発明は、関節リウマチ（ＲＡ）をインビトロで生化学マーカーにより他の自己免疫疾患から鑑別するための、下記を含む方法に関する：ａ）全血、血漿または血清試料において、少なくとも抗環状シトルリン化ペプチド（抗ＣＣＰ）および抗ＰＩＫ３ＣＤの濃度をそれぞれ測定する；ｂ）（ａ）において抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定した濃度値を組み合わせる；そしてｃ）（ｂ）からの増大した組合わせ数値により、ＲＡを他の自己免疫疾患から鑑別する；その際、基準集団から抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定したカットオフ組合わせ濃度値と比較して増大した組合わせ数値は、ＲＡの存在の指標となる。好ましくは、１態様において他の自己免疫疾患は変形性関節症（ＯＡ）である。
【００２６】
本明細書中で用いる下記の用語は、それぞれこのセクションにおいてそれに付随する意味をもつ。
冠詞“a”および“an”は、本明細書中で、その冠詞の目的語が１または１より多い（すなわち、少なくとも１である）ことを表わすために用いられる。たとえば、“a marker”は１つのマーカーまたは１より多いマーカーを意味する。
【００２７】
本明細書中で用いる用語 “マーカー”または“生化学マーカー”は、患者の検査試料を分析するためのターゲットとして用いられる分子を表わす。そのような分子ターゲットの例は、試料中に存在するタンパク質またはポリペプチドそのもの、および抗体である。本発明においてマーカーとして用いるタンパク質またはポリペプチドは、そのタンパク質のいずれかのバリアント、およびそのタンパク質またはそのバリアントのフラグメント、特に免疫学的に検出できるフラグメントを含むものとする。細胞により放出されるか、または細胞外マトリックス中に存在し、たとえば炎症に際して損傷を受けたタンパク質が、分解または開裂してそのようなフラグメントになる可能性があることを、当業者は認識しているであろう。あるマーカーは不活性な形態で合成され、それがその後にタンパク質分解により活性化される可能性がある。当業者が認識しているように、タンパク質またはそのフラグメントは複合体の一部として存在する可能性もある。そのような複合体も、本発明の意味においてマーカーとして使用できる。マーカーポリペプチドのバリアントは同じ遺伝子によりコードされるが、それらのＰＩもしくはＭＷ、または両方が異なり（たとえば、オルタナティブｍＲＮＡもしくはｐｒｅ−ｍＲＮＡプロセシング、たとえばオルタナティブスプライシング、または限定されたタンパク質分解の結果として）、さらに、またはその代わりに、差示的な翻訳後修飾（たとえば、グリコシル化、アシル化、および／またはリン酸化）から生じる可能性がある。
【００２８】
本発明に従った前記のマーカーという用語は、試料中に存在する抗体にも関係する。ＲＡの場合、これらの抗体は自己抗体、すなわち患者試料中の抗体であり、それらは患者自身の細胞中もしくは細胞上に存在するかまたはそれらの細胞により産生される抗原に結合する。
【００２９】
本明細書中で用いる用語“試料”は、インビトロでの評価の目的で得られた生体試料を表わす。本発明の方法において、試料または患者試料は、好ましくはいずれかの体液を含むことができる。好ましい検査試料には、血液、血清、血漿、尿、唾液、および滑液が含まれる。好ましい試料は全血、血清または血漿であり、血漿または血清が最も好ましい。さらに好ましいものはヒト対象からの試料である。
【００３０】
当業者が認識しているように、そのような診断はいずれもインビトロで行なわれる。患者試料はその後、廃棄される。患者試料は単に本発明のインビトロ診断法のために用いられ、患者試料の材料が患者の体内へ戻されることはない。一般に、試料は液体試料である。
【００３１】
用語“関節リウマチを査定する”は、本発明による方法が（他の変量、たとえばＡＲＡにより提示される基準（前記を参照）と共に）、医師が自身のＲＡ診断を確立するのを補助するであろうということを示すために用いられる。好ましい態様において、この査定はＲＡの存在または非存在に関するものであろう。当業者が認識しているように、特定の疾患について１００％の特異度と同時に１００％の感度で診断する生化学マーカーはなく、むしろ生化学マーカーはある尤度または推定値で疾患の存在または非存在を査定するために用いられる。好ましくは、本発明による方法（単数または複数）はＲＡの存在または非存在を査定するのを補助する。さらなる好ましい態様において、本発明による方法（単数または複数）はＲＡの存在または非存在を検出するのを補助する。よりさらなる好ましい態様において、本発明による方法（単数または複数）はＲＡの存在または非存在を診断するのを補助する。
【００３２】
当業者が認識しているように、マーカーレベルをＲＡの存在または非存在に関連付ける工程は種々の方法で実施および達成できる。一般に、基準集団を選択し、正常範囲を確立する。抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤの両方について適宜な基準集団を用いて正常範囲を確立するのはルーティン実験にすぎない。正常範囲はある程度（限られた程度ではあるが）それが確立される基準集団により左右されることは一般に受け入れられている。理想的な基準集団は、数が多く（たとえば数百ないし数千）、年齢、性別、および場合により着目する他の変量が調和する。絶対値、たとえば特定の濃度に関する正常範囲は、採用するアッセイおよびそのアッセイを行なう際に用いる標準化によっても左右される。
【００３３】
抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤのレベルは、実施例のセクションに示すアッセイ法で測定および確証された。異なるアッセイが異なるカットオフ値をもたらす可能性があり、それは本発明の範囲から逸脱しないことを理解すべきである。
【００３４】
シトルリン化ペプチドは、ＲＡを伴う患者の血清中にみられるかなり重要な自己抗体についての抗原である。それらはこの数年間、幾つかの研究者グループによって集中的に研究されてきた(たとえば、WO 98/08946; WO 98/22503; WO 99/28344; WO 99/35167; WO 01/46222; およびWO 03/050542を参照)。最近、Schellekensおよび協同研究者ら(Schellekens, G. A. et al., Arthritis Rheum. 43 (2000) 155-163)は、特異的な環状シトルリン化ペプチド（ＣＣＰ）に基づくＥＬＩＳＡ試験が、線状ペプチドを用いる同じアッセイと比較してＲＡの診断正確度に関して卓越した性能を示すと報告した。
【００３５】
ＣＣＰに対する自己抗体、すなわち患者血清中を循環しているシトルリン化ポリペプチドと反応性である可能性が最も高く、インビトロアッセイにおいてＣＣＰに結合する抗体は、“抗ＣＣＰ”と呼ばれる。Venrojiらによる特許出願(WO 98/22503)には、あるシトルリン化ペプチドが記載され、環化は各ペプチドの反応性改善をもたらすことが示されている。具体例において、一般式ＨＱＣＨＱＥＳＴＸＧＲＳＲＧＲＣＧＲＳＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）（Ｘはシトルリンを表わす）のペプチドをシステイン残基間のジスルフィド結合により環化すると、対応する線状ペプチドペプチドに対する３６％と比較して感度が６３％に増大することが示されている。患者血清中の自己抗体は異なる環状ペプチドに対してわずかに異なる反応性をもつので、アッセイをさらに改善するためにWO 98/22503にはペプチドの組合わせが示唆されている。
【００３６】
好ましい態様において、抗ＣＣＰをvan VenroijらによるWO 03/05054２の記載に従って測定する。要約すると、一般式Ｘ−ＧおよびＸ−ｎｏｎＧ（式中、Ｘはシトルリン、Ｇはグリシン、ｎｏｎＧはアミノ酸Ｈ、Ｉ、Ｗ、Ｓ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｆ、Ｖ、Ｐ、Ｃｉｔのいずれかを表わす）のエピトープ部位を含むペプチドまたはそのアナログの組合わせを用いて試料中の抗ＣＣＰ抗体（抗ＣＣＰ）のレベルを査定する。そのような査定に有用なペプチドはWO 03/050542に記載されている。当業者が容易に認識するように、抗ＣＣＰを測定するためのアッセイに用いる環状シトルリン化ペプチド抗原に関して、たとえば環状シトルリン化ペプチド配列の配列変更を生じるさらなる改善および改良が可能である。しかし、そのような改変は本発明の精神から逸脱しないであろう。
【００３７】
ＣＣＰに結合する抗体、すなわち抗ＣＣＰは、血清学的アッセイで測定される。好ましくは、そのようなアッセイは、１種類以上のＣＣＰを抗原として用い、ＣＣＰ抗原への試料中に存在する抗ＣＣＰ抗体の結合を適宜な手段で検出することにより設定される。
【００３８】
ＭＣＭ３タンパク質(ミニ染色体維持タンパク質３(minichromosome maintenance protein 3）)，Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  ＩＤ：Ｐ２５２０５（ＥＣ＝３．６．４．１２），ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５は、核局在化配列(nuclear localization sequence)を含む１１０ｋＤのＤＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅである。ＭＣＭ３タンパク質は、ＤＮＡを細胞周期当たり１回複製させる作用をするＤＮＡ複製開始前複合体(DNA pre-replication complex)の構成要素である。ＭＣＭ３は構成性発現し、アセチル化により修飾される可能性がある。ＭＣＭ３のアセチル化はＤＮＡ複製の開始を阻害する。ＭＣＭ３はＭＣＭ５（ＣＤＣ４６）およびＭＣＭ３ＡＰタンパク質と相互作用すると報告されている。
【００３９】
ＭＣＭ３に対する自己抗体、すなわち患者血清中を循環しているミニ染色体維持タンパク質３（ＭＣＭ３）ポリペプチドと反応する可能性が最も大きく、インビトロアッセイでＭＣＭ３に結合する抗体は、“抗ＭＣＭ３”と呼ばれる。
【００４０】
ＭＣＭ３に結合する抗体、すなわち抗ＭＣＭ３は、血清学的アッセイで測定される。好ましくは、そのようなアッセイは、１種類以上のＭＣＭ３を抗原として用い、ＭＣＭ３抗原への試料中に存在する抗ＭＣＭ３抗体の結合を適宜な手段で検出することにより設定される。
【００４１】
カスパーゼ８(Caspase-8)（Ｃａｓｐ８）タンパク質，ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＩＤ：Ｑ１４７９０（ＥＣ：３．４．２２．６１），ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６は、不活性プロ酵素として合成される５５ｋＤａの細胞質ゾルタンパク質である。Ｃａｓｐ８の活性化は２工程タンパク質分解を伴う：Ｃａｓｐ８が開裂して４３ｋＤａおよび１２ｋＤａのフラグメントを生成し、これがさらにプロセシングされて１０ｋＤａになり、次いでｐ４３が次に開裂してｐ２６を生成し、活性部位を含むｐ１８が放出される。
【００４２】
Ｃａｓｐ８に対する自己抗体、すなわち患者血清中を循環しているカスパーゼ８（Ｃａｓｐ８）ポリペプチドと反応する可能性が最も大きく、インビトロアッセイでＣａｓｐ８に結合する抗体は、“抗Ｃａｓｐ８”と呼ばれる。
【００４３】
Ｃａｓｐ８に結合する抗体、すなわち抗Ｃａｓｐ８は、血清学的アッセイで測定される。好ましくは、そのようなアッセイは、１種類以上のＣａｓｐ８を抗原として用い、Ｃａｓｐ８抗原への試料中に存在する抗Ｃａｓｐ８抗体の結合を適宜な手段で検出することにより設定される。
【００４４】
ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート  ３−キナーゼ触媒サブユニットＰＩ３−キナーゼ(Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit PI3-Kinase)（ＰＩＫ３ＣＤ）タンパク質，ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＩＤ：Ｏ００３２９，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７は、シグナル伝達における関与が示唆されているＰＩ３脂質キナーゼ(PI3-lipid kinase)（ＰＩ３−Ｋ）のファミリーに属する。ＰＩ３−Ｋは２つのサブユニットからなる；ｐ８５およびｐ１１０。ｐ８５サブユニットはＰＩ３−Ｋ活性を細胞膜へ局在化させ、これに対しｐ１１０サブユニットはＰＩ３−Ｋの触媒ドメインを含む。ｐ１１０の４つのイソ形が見出されている；アルファ、ベータ、ガンマおよびデルタサブユニット。デルタイソ形は主に白血球に発現し、それのＳＨ２／ＳＨ３ドメインを介して、ｐ８５およびＧＴＰ結合Ｒａｓと相互作用することが示された。
【００４５】
ＰＩＫ３ＣＤに対する自己抗体、すなわち患者血清中を循環しているホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート  ３−キナーゼ触媒サブユニットＰＩ３−キナーゼ（ＰＩＫ３ＣＤ）ポリペプチドと反応する可能性が最も大きく、インビトロアッセイでＰＩＫ３ＣＤに結合する抗体は、“抗ＰＩＫ３ＣＤ”と呼ばれる。
【００４６】
PＩＫ３ＣＤに結合する抗体、すなわち抗ＰＩＫ３ＣＤは、血清学的アッセイで測定される。好ましくは、そのようなアッセイは、１種類以上のＰＩＫ３ＣＤを抗原として用い、ＰＩＫ３ＣＤ抗原への試料中に存在する抗ＰＩＫ３ＣＤ抗体の結合を適宜な手段で検出することにより設定される。
【００４７】
好ましい検出手段は、特異的結合アッセイ、特にイムノアッセイである。イムノアッセイは当業者に周知である。そのようなアッセイを実施するための方法ならびに実際の適用および操作は関連文献に概説されている。そのような関連文献の例は、Tijssen, P., In: Practice and theory of enzyme immunoassays, eds. R. H. Burdon and v. P. H. Knippenberg, Elsevier, Amsterdam (1990) 221-278、およびMethods in Enzymologyの各巻, eds. S.P. Colowick, N.O. Caplan and S.P., Academic Press, 免疫学的検出方法に関するもの、特にvolume 70, 73, 74, 84, 92および121である。
【００４８】
さらなる態様によれば、本発明による方法（単数または複数）の工程（ａ）はイムノアッセイ法により実施される。
本発明による方法（単数または複数）、好ましくはイムノアッセイ法（単数または複数）において、抗ＣＣＰは抗原としての１種類以上のＣＣＰにより捕捉される。
【００４９】
本発明による方法（単数または複数）、好ましくはイムノアッセイ法（単数または複数）において、抗Ｃａｓｐ８は抗原としての１種類以上のＣａｓｐ８により捕捉される。
本発明による方法（単数または複数）、好ましくはイムノアッセイ法（単数または複数）において、抗ＭＣＭ３は抗原としての１種類以上のＭＣＭ３により捕捉される。
【００５０】
本発明による方法（単数または複数）、好ましくはイムノアッセイ法（単数または複数）において、抗ＰＩＫ３ＣＤは抗原としての１種類以上のＰＩＫ３ＣＤにより捕捉される。
【００５１】
１態様において、１種類以上のキャプチャー抗原は、全長タンパク質またはそのタンパク質から選択されるポリペプチドフラグメントである。
好ましい態様において、キャプチャー抗原はＣＣＰまたはそのポリペプチドフラグメントである。
【００５２】
好ましい態様において、キャプチャー抗原はＣａｓｐ８またはそのポリペプチドフラグメントである。
好ましい態様において、キャプチャー抗原はＭＣＭ３またはそのポリペプチドフラグメントである。
【００５３】
好ましい態様において、キャプチャー抗原はＰＩＫ３ＣＤまたはそのポリペプチドフラグメントである。
さらなる態様において、ポリペプチドフラグメントは、そのタンパク質から選択される１０〜２５ＡＡの抗原性配列である。
【００５４】
よりさらなる好ましい態様において、抗ＭＣＭ３に対する１種類以上のキャプチャー抗原はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５から選択される。
よりさらなる好ましい態様において、抗抗Ｃａｓｐ８に対する１種類以上のキャプチャー抗原はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６から選択される。
【００５５】
よりさらなる好ましい態様において、抗抗ＰＩＫ３ＣＤに対する１種類以上のキャプチャー抗原はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７から選択される。
よりさらなる好ましい態様において、ＭＣＭ３キャプチャー抗原はペプチドＰＡＴＫＫＴＩＥＲＲＹＳＤＬＴ（Ｙ１５９，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）である。
【００５６】
よりさらなる好ましい態様において、Ｃａｓｐ８キャプチャー抗原はペプチドＮＫＳＬＬＫＩＩＮＤＹＥＥＦＳ（Ｙ１７８，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）である。
よりさらなる好ましい態様において、ＰＩＫ３ＣＤキャプチャー抗原はペプチドＤＱＬＫＴＧＥＲＣＬＹＭＷＰＳ（Ｙ４４０，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）および／またはペプチドＤＱＬＫＴＧＥＲＳＬＹＭＷＰＳ（Ｙ４４０＊，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）である。
【００５７】
本発明方法（単数または複数）によるある態様において、１種類以上のキャプチャー抗原を固定化する。さらに、１態様において、１種類以上のキャプチャー抗原を固体支持体上に、好ましくは粒子またはバイオチップの表面に固定化する。
【００５８】
“固体支持体”は不溶性の官能化されたポリマー材料であり、それにライブラリーメンバーまたは試薬を付着または共有結合させて（しばしばリンカーを介して）固定化し、あるいはそれらを過剰の試薬、可溶性の反応副産物、または溶媒から容易に分離させることができる（濾過、遠心分離、洗浄など）。
【００５９】
抗ＣＣＰ、抗ＰＩＫ３ＣＤ、抗Ｃａｓｐ８および抗ＭＣＭ３について、試料中に含まれる（自己）抗体をそれぞれ測定することができる。
抗ＣＣＰ抗体は均一アッセイ方式により、たとえばＣＣＰでコーティングしたラテックス粒子の凝集により検出できる。
【００６０】
好ましくは、不均一イムノアッセイを用いて抗ＣＣＰを測定する。そのような不均一測定は、固相にＣＣＰを直接または間接的にコーティングし、抗ＣＣＰ抗体がＣＣＰに結合できる条件下で、抗ＣＣＰ抗体を含むことが分かっているかまたはその疑いがある試料と共に固相をインキュベートし、そして結合した抗ＣＣＰ抗体を直接または間接的に検出することに基づく。さらなるアッセイ方式は、いわゆる二重抗原架橋アッセイであり、その際、抗ＣＣＰ測定の場合にはこのイムノアッセイの固相側と検出側の両方にＣＣＰを用い、患者試料中の自己抗体がこれらの“二重”抗原間に架橋を形成する。必要または適切な場合には、不均一イムノアッセイの実施中に洗浄工程を含める。
【００６１】
本発明による１態様において、環状シトルリン化ペプチドに対する抗体（抗ＣＣＰ）を免疫学的アッセイ、好ましくはＥＬＩＳＡまたは電気化学発光イムノアッセイ(electrochemiluminescence immunoassay)（ＥＣＬＩＡ）で測定する。
【００６２】
本発明によれば、環状シトルリン化ペプチドに対する抗体（抗ＣＣＰ）を、特定の１態様においては市販のＥｌｅｃｓｙｓ  Ａｎｔｉ−ＣＣＰアッセイで測定する。抗ＣＰアッセイは、たとえばＥｌｅｃｓｙｓ  ２０１０、ＭＯＤＵＬＡＲ  ＡＮＡＬＹＴＩＣＳ  Ｅ１７０、ｃｏｂａｓ  ｅ  ４１１、ｃｏｂａｓ  ｅ  ６０１またはｃｏｂａｓ  ｅ  ６０２分析計（実施例２）で実施できる。本発明方法による特定の態様において、ＲＡ陽性についての抗ＣＣＰアッセイカットオフは≧５Ｕ／ｍＬである。さらなる特定の態様において、ＲＡ陰性についての抗ＣＣＰアッセイカットオフは＜５Ｕ／ｍＬである。
【００６３】
抗Ｃａｓｐ８抗体は均一アッセイ方式により、たとえばＣａｓｐ８でコーティングしたラテックス粒子の凝集により検出できる。
好ましくは、不均一イムノアッセイを用いて抗Ｃａｓｐ８を測定する。そのような不均一測定は、固相にＣａｓｐ８を直接または間接的にコーティングし、抗Ｃａｓｐ８抗体がＣａｓｐ８に結合できる条件下で、抗Ｃａｓｐ８抗体を含むことが分かっているかまたはその疑いがある試料と共に固相をインキュベートし、そして結合した抗Ｃａｓｐ８抗体を直接または間接的に検出することに基づく。さらなるアッセイ方式は、いわゆる二重抗原架橋アッセイであり、その際、抗Ｃａｓｐ８測定の場合にはこのイムノアッセイの固相側と検出側の両方にＣａｓｐ８を用い、患者試料中の自己抗体がこれらの“二重”抗原間に架橋を形成する。必要または適切な場合には、不均一イムノアッセイの実施中に洗浄工程を含める。
【００６４】
本発明による１態様において、カスパーゼ−８に対する抗体（抗Ｃａｓｐ８）を免疫学的アッセイ、好ましくはＥＬＩＳＡまたは電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）で測定する。
【００６５】
実施例１および表１ならびに本発明による方法に示す基準集団について、マーカー抗［Ｃａｓｐ８］についてのカットオフ４９．９Ｕ／ｍＬを選択した。
特定の態様において、 ＲＡ陽性についての抗Ｃａｓｐ８アッセイカットオフは≧４９．９Ｕ／ｍＬである。さらなる特定の態様において、ＲＡ陰性についての抗Ｃａｓｐ８アッセイカットオフは＜４９．９Ｕ／ｍＬである。
【００６６】
抗ＭＣＭ３抗体は、均一アッセイ方式により、たとえばＭＣＭ３でコーティングしたラテックス粒子の凝集により検出できる。
好ましくは、不均一イムノアッセイを用いて抗ＭＣＭ３を測定する。そのような不均一測定は、固相にＭＣＭ３を直接または間接的にコーティングし、抗ＭＣＭ３抗体がＭＣＭ３に結合できる条件下で、抗ＭＣＭ３抗体を含むことが分かっているかまたはその疑いがある試料と共に固相をインキュベートし、そして結合した抗ＭＣＭ３抗体を直接または間接的に検出することに基づく。さらなるアッセイ方式は、いわゆる二重抗原架橋アッセイであり、その際、抗ＭＣＭ３測定の場合にはこのイムノアッセイの固相側と検出側の両方にＭＣＭ３を用い、患者試料中の自己抗体がこれらの“二重”抗原間に架橋を形成する。必要または適切な場合には、不均一イムノアッセイの実施中に洗浄工程を含める。
【００６７】
本発明による１態様において、ミニ染色体維持タンパク質３に対する抗体（抗ＭＣＭ３）を免疫学的アッセイ、好ましくはＥＬＩＳＡまたは電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）で測定する。
【００６８】
実施例１および表１ならびに本発明による方法に示す基準集団について、マーカー抗ＭＣＭ３についてのカットオフ１５．１Ｕ／ｍＬを選択した。
特定の態様において、ＲＡ陽性についての抗ＭＣＭ３アッセイカットオフは≧１５．１Ｕ／ｍＬである。さらなる特定の態様において、ＲＡ陰性についての抗ＭＣＭ３アッセイカットオフは＜１５．１Ｕ／ｍＬである。
【００６９】
抗ＰＩＫ３ＣＤ抗体は、均一アッセイ方式により、たとえばＰＩＫ３ＣＤでコーティングしたラテックス粒子の凝集により検出できる。
好ましくは、不均一イムノアッセイを用いて抗ＰＩＫ３ＣＤを測定する。そのような不均一測定は、固相にＰＩＫ３ＣＤを直接または間接的にコーティングし、抗ＰＩＫ３ＣＤ抗体がＰＩＫ３ＣＤに結合できる条件下で、抗ＰＩＫ３ＣＤ抗体を含むことが分かっているかまたはその疑いがある試料と共に固相をインキュベートし、そして結合した抗ＰＩＫ３ＣＤ抗体を直接または間接的に検出することに基づく。さらなるアッセイ方式は、いわゆる二重抗原架橋アッセイであり、その際、抗ＰＩＫ３ＣＤ測定の場合にはこのイムノアッセイの固相側と検出側の両方にＰＩＫ３ＣＤを用い、患者試料中の自己抗体がこれらの“二重”抗原間に架橋を形成する。必要または適切な場合には、不均一イムノアッセイの実施中に洗浄工程を含める。
【００７０】
本発明による１態様において、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート  ３−キナーゼ触媒サブユニットＰＩ３−キナーゼ（ＰＩＫ３ＣＤ）を免疫学的アッセイ、好ましくはＥＬＩＳＡまたは電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）で測定する。
【００７１】
実施例１および表１ならびに本発明による方法に示す基準集団について、マーカー抗ＰＩＫ３ＣＤについてのカットオフ１５．１Ｕ／ｍＬを選択した。
特定の態様において、ＲＡ陽性についての抗ＰＩＫ３ＣＤアッセイカットオフは≧１５．１Ｕ／ｍＬである。さらなる特定の態様において、ＲＡ陰性についての抗ＰＩＫ３ＣＤアッセイカットオフは＜１５．１Ｕ／ｍＬである。
【００７２】
診断に理想的なシナリオは、たとえば感染性疾患におけるように単一の事象またはプロセスがそれぞれの疾患を引き起こす状況であろう。他のすべての症例において、特にＲＡの症例のようにその疾患の病因が完全には理解されていない場合は、適性な診断はきわめて困難な可能性がある。したがって、ＲＡの診断のためには一般に種々の臨床症状および生物学的マーカーを合わせて考慮する。マーカーは個別に測定することができ、あるいは本発明の好ましい態様においてはチップ（バイオチップ）またはビーズベースのアレイ技術を用いてそれらを同時に測定することができる。次いで、各マーカーについての個々のカットオフを用いてバイオマーカーの濃度を独立して解釈し、あるいは解釈のためにそれらを組み合わせる。
【００７３】
本発明の好ましい態様において、工程（ｂ）の組合わせ濃度値を、ＲＡ陽性患者を除外した、明らかに健康な者ならびに変形性関節症（ＯＡ）患者および他の自己免疫疾患患者からなる群から選択される患者を含む基準集団から得られたカットオフ値と比較する。
【００７４】
１態様におけるマーカーパネルは、単一テストデバイス内で、たとえばチップまたはアレイフォーマットで組み合わせられる。本発明によるマーカーパネルは、ある態様において、バイオチップアレイ（タンパク質アレイ）技術を用いて決定される。アレイはアドレス指定可能な個々のマーカーの集合体である。そのようなマーカーは空間的にアドレス指定可能である；たとえば、マイクロタイタープレート内に収容され、または平面状の表面にプリントされ、各マーカーが別個のＸおよびＹ座標に存在するアレイ。あるいは、タグ、ビーズ、ナノ粒子または物理的特性に基づいてマーカーをアドレス指定することができる。バイオチップアレイは当業者に既知の方法に従って作成できる（たとえば、US 5,807,522; Robinson, W.H., et al., Nat. Med. 8 (2002) 295-301; Robinson, W.H., et al., Arthritis Rheum. 46 (2002) 885-893を参照）。本発明において用いるアレイは、多数のアドレス指定可能なマーカーを用いるいずれかの免疫学的アッセイを表わす。バイオチップアレイ（当業者にはマイクロアレイとしても知られている）は小型化した形態のアレイである。
【００７５】
用語“チップ”、“バイオチップ”、“ポリマーチップ”または“プロテインチップ”は互換性をもって用いられ、シリコンウェハー、ナイロンストリップ、プラスチックストリップ、またはスライドガラスの一部であってもよい共通の支持体上に配列された多数のプローブ、マーカーまたは生化学マーカーの集合体を表わす。
【００７６】
“アレイ”、“マクロアレイ”または“マイクロアレイ”は、アレイを形成する支持体または固体表面、たとえばガラス、プラスチック、シリコンチップまたは他の材料上に付着または加工した、分子、マーカー、開口、ミクロコイル、検出器および／またはセンサーなどの物体の意図的に作成された集合体である。それらのアレイを用いて多数の、たとえば数十、数千または数百万の反応または結合のレベルを同時に測定できる。アレイは少数の、たとえば数個または１ダースの物体を収容することもできる。アレイ中の物体は互いに同一または異なる形態であってもよい。アレイは多様な形態をとることができる；たとえば、樹脂ビーズ、シリカチップ、または他の固体支持体に繋ぎ止めた、可溶性分子のライブラリー、固定化した分子のライブラリー、固定化した抗体のライブラリー、化合物のライブラリー。アレイは、アレイ上のパッドのサイズに応じてマクロアレイまたはマイクロアレイのいずれであってもよい。マクロアレイは一般に約３００ミクロン以上のパッドサイズを含み、ゲルおよびブロットスキャナーによって容易にイメージングできる。マイクロアレイは一般に約３００ミクロン未満のパッドサイズをもつであろう。
【００７７】
ある態様において、本発明は、固定化したキャプチャー抗原ＣＣＰ、ならびに抗ＰＩＫ３ＣＤ、抗ＭＣＭ３および抗Ｃａｓｐ８からなる群から選択される少なくとも１種類またはそれより多い固定化したキャプチャー抗原を含むバイオチップアレイに関する。
【００７８】
本発明はまた、ある態様において、抗ＣＣＰ、ならびに抗ＰＩＫ３ＣＤ、抗ＭＣＭ３および抗Ｃａｓｐ８からなる群から選択される少なくとも１種類またはそれより多いマーカーの濃度を特異的に決定する本発明による方法を実施するためのバイオチップアレイ、ならびに場合により測定を実施するための補助試薬を提供する。
【００７９】
本発明はまた、ある態様において、抗ＣＣＰ、ならびに抗ＰＩＫ３ＣＤ、抗ＭＣＭ３および抗Ｃａｓｐ８からなる群から選択される少なくとも１種類またはそれより多いマーカーの濃度を特異的に決定する本発明による方法を実施するためのバイオチップアレイ、ならびに場合によりＲＡの存在または非存在を査定する際の補助試薬を提供する。
【００８０】
実施例のセクションに示すように、２種類のマーカー抗ＣＣＰおよび抗Ｃａｓｐ８の組合わせだけでもＲＡについての診断正確度を有意に改善する。
本発明による方法において、少なくともバイオマーカー抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤそれぞれの濃度を決定し、マーカーの組合わせをＲＡの非存在または存在に関連付ける。
【００８１】
当業者が認識しているように、調べている診断問題を改善するために２種類以上のマーカーの測定値を使用するための多数の方法がある。きわめて単純ではあるが、それにもかかわらずしばしば有効な方法では、調べた少なくとも１種類のマーカーについて試料が陽性であれば陽性結果と査定する。これは、たとえばエイズのような感染性疾患を診断する場合に当てはまるであろう。しかし、多くの場合、マーカーの組合わせを評価する。
【００８２】
好ましくは、マーカーパネルのマーカー、たとえば抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定した数値を数学的に組み合わせ、その組合わせ数値を根底にある診断問題に関連付ける。マーカー値を当技術分野における適宜な数学的方法により組み合わせることができる。マーカーの組合わせを疾患に関連付けるための周知の数学的方法は、下記のような方法を採用する：判別分析(discriminant analysis)（ＤＡ）（すなわち、線形(linear-)、二次(quadratic-)、正側化(regularized-)ＤＡ）、カーネル法(Kernel Method)（すなわち、ＳＶＭ）、ノンパラメトリック法(Nonparametric Method)（すなわち、ｋ−最近傍識別器(k-Nearest-Neighbor Classifiers))、ＰＬＳ(Partial Least Squares)（部分的最小二乗）、樹木モデル法(Tree-Based Method)（すなわち、ロジック回帰(Logic Regression)、ＣＡＲＴ、ランダムフォレスト法(Random Forest Method)、ブースティング／バギング法(Boosting/Bagging Method))、一般化線形モデル(Generalized Linear Model)（すなわち、ロジスティック回帰(Logic Regression))、主成分ベースの方法(Principal Components based Method)（すなわち、ＳＩＭＣＡ）、一般化加法モデル(Generalized Additive Model)、ファジィ論理ベースの方法(Fuzzy Logic based Method)、神経回路網および遺伝学的アルゴリズムをベースとする方法。本発明のマーカー組合わせを評価するのに適した方法を選択する際に、当業者には何の問題も無いであろう。 好ましくは、本発明のマーカー組合わせを、たとえばＲＡの非存在または存在に関連付ける際に用いる方法は、ＤＡ（すなわち、線形、二次、正側化判別分析）、カーネル法（すなわち、ＳＶＭ）、ノンパラメトリック法（すなわち、ｋ−最近傍識別器）、ＰＬＳ（部分的最小二乗）、樹木モデル法（すなわち、ロジック回帰、ＣＡＲＴ、ランダムフォレスト法、ブースティング法）、または一般化線形モデル（すなわち、ロジスティック回帰）から選択される。これらの統計学的方法に関するは詳細は下記の参考文献中にある：Ruczinski, I., Kooperberg C., LeBlanc, M., Logic regression, J. of Computational and Graphical Statistics, 12 (2003) 475-511; Friedman, J. H. , Regularized Discriminant Analysis, J. of the American Statistical Association, Vol. 84 (1989) 165-175; Hastie, Trevor, Tibshirani, Robert, Friedman, Jerome, The Elements of Statistical Learning, Springer Series in Statistics, 2001; Breiman, L., Friedman, J. H., Olshen, R. A., Stone, C. J. (1984) Classification and regression trees, California: Wadsworth; Breiman, L., Random Forests, Machine Learning, 45 (2001) 5-32; Pepe, M. S., The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction, Oxford Statistical Science Series, 28 (2003); およびDuda, R. O., Hart, P. E., Stork, D. G., Pattern Classification, Wiley Interscience, 2nd Edition (2001)。
【００８３】
本発明方法による方法（単数または複数）の好ましい態様において、工程（ｂ）で測定した濃度値を、判別分析、カーネル法、ノンパラメトリック法、部分的最小二乗、樹木モデル法、一般化線形モデル、主成分ベースの方法、一般化加法モデル、ファジィ論理ベースの方法、神経回路網および遺伝学的アルゴリズムをベースとする方法からなる群から選択されるメンバーの使用により数学的に組み合わせる。
【００８４】
本発明の好ましい態様は、基礎となる生物学的マーカーの組合わせについての最適化多変量カットオフを使用し、状態Ａを状態Ｂから、たとえば罹患状態を健康な状態から識別することである。このタイプの分析において、マーカーはもはや独立したものではなく、マーカーパネルを形成する。抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤの測定値を組み合わせることは、健康な対照と比較して、または同様に査定した変形性関節症（ＯＡ）を伴う患者と比較して、ＲＡについての診断正確度を実際に著しく改善することを確証できた。特に、ＯＡを伴う患者とＲＡを伴う患者はそれぞれかなり異なる処置を必要とする可能性があるので、後の知見はきわめて重要である。
【００８５】
診断方法の正確度は、それの受信者動作特性(receiver-operating characteristic)（ＲＯＣ）によって最も良く記述される(参照：特にZweig, M. H., and Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577)。ＲＯＣグラフは、判定閾値を観察データの全範囲にわたって連続的に変動させることから得られるすべての感度／特異度の対をプロットしたものである。
【００８６】
試験室検査の臨床性能は、それの診断正確度、すなわち対象を臨床関係サブグループに正しく分類する能力により左右される。診断正確度はその検査が被験対象の２つの異なる状態を正しく識別する能力の尺度となる。そのような状態は、たとえば健康な状態と疾患、または良性疾患と悪性疾患である。
【００８７】
それぞれの場合、ＲＯＣプロットは、判定閾値の全範囲について感度を１−特異度に対してプロットすることにより、２つの分布間のオーバーラップを表わす。ｙ軸には、感度、または真陽性画分［（真陽性検査結果の数）／（真陽性検査結果の数＋偽陰性検査結果の数）として定義］がある。これは、ある疾患または状態の存在下での陽性度とも呼ばれている。それは罹患サブグループのみから計算される。ｘ軸には偽陽性画分、または１−特異度［（偽陽性結果の数）／（真陰性結果の数＋偽陽性結果の数）として定義］がある。それは特異度の指標であり、完全に非罹患サブグループから計算される。真陽性と偽陽性の画分は２つの異なるサブグループから完全に別個に計算されるので、ＲＯＣプロットは試料における罹患率とは無関係である。ＲＯＣプロット上の各点は、特定の判定閾値に対応する感度／１−特異度の対を表わす。完全識別を伴う検査（結果の２分布にオーバーラップが無い）は上左角を通るプロットをもち、その際、真陽性画分は１．０、または１００％（完全感度）であり、偽陽性画分は０（完全特異度）である。識別無し（２グループについての結果が同一の分布）を伴う検査についての理論的プロットは、下左角から上右角までの４５°の対角線である。大部分のプロットはこれら２極端の間にある（ＲＯＣプロットが４５°の対角線より完全に下側にあれば、これは“陽性度”についての基準を“より大”から“より小”へ逆転させることによって容易に救済できる；逆についても同様）。定量的には、プロットが上左角に近いほどその検査の全体的正確度はより高い。
【００８８】
試験室検査の診断正確度を定量するための簡便な目標のひとつは、それの性能を単一の数字により表わすことである。最も一般的な包括的尺度はＲＯＣプロット下面積である。慣例により、この面積は常に＞０．５である（そうでなければ、そうなるように判定規則を逆転することができる）。数値は１．０（２グループの検査値の完全分離）と０．５（２グループの検査値間に明らかな分布差が無い）の間の範囲にある。その面積は、プロットの特定部分、たとえば対角線に最も近い点または９０％特異度における感度だけでなく、プロット全体によっても左右される。これはそのＲＯＣプロットが完全なもの（面積＝１．０）にいかに近いかの定量的記述表現である。
【００８９】
好ましい態様において、本発明は、試料において少なくとも抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤの濃度を測定し、そして決定した濃度を関節リウマチの存在または非存在に関連付けることによって、健康な対照および／またはＯＡに罹患している患者に対比した関節リウマチについての診断正確度を改善するための方法に関するものであり、この改善によって、抗ＣＣＰのみに基づく分類と比較してより多くの患者が、健康な対照および／またはＯＡに罹患している患者に対比してＲＡに罹患していると正しく分類される。抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤを含むＲＡマーカーパネルは、ＲＡに罹患している患者について疾患の重症度の査定にももちろん使用できる。
【００９０】
当業者が認識するように、ＲＡの査定をさらに改善するために１以上の追加バイオマーカーを使用できる。ＲＡの査定のためのマーカーパネルの鍵マーカーとして用いる抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤのこの追加の可能性を説明するために、用語“少なくとも”を特許請求の範囲で用いた。言い換えると、ＲＡの査定に際して１以上の追加マーカーについて測定したレベルを抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤの測定値と組み合わせることができる。
【００９１】
抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤと共に用いる１種類以上の追加マーカーは、ＲＡマーカーパネル、すなわちＲＡの査定をさらに改良するのに適した一連のマーカーの一部であるとみなすことができる。ＲＡマーカーパネル中のマーカーの総数は、好ましくは２０マーカー未満、より好ましくは１５マーカー未満、同様に好ましくは１０マーカー未満であり、８以下のマーカーがよりいっそう好ましい。合計で３、４、５または６種類のマーカーを含むＲＡマーカーパネルが好ましい。
【００９２】
好ましい態様において、よって本発明は、関節リウマチの非存在または存在をインビトロで生化学マーカーにより査定するための方法であって、試料において抗ＣＣＰ、抗ＰＩＫ３ＣＤの濃度、およびさらに１種類以上の他のマーカーの濃度を測定し、そして抗ＣＣＰ、抗ＰＩＫ３ＣＤの濃度、および１種類以上の追加マーカーの濃度をＲＡの非存在または存在に関連付けることを含む方法に関する。
【００９３】
１種類以上の他のマーカーをいずれか既知または将来のＲＡマーカーと組み合わせてもよいことは認識されるであろう。マーカーは、ＲＡを伴う患者を健康な対照と比較することにより診断正確度を査定した場合にこのマーカー単独についてのＡＵＣが少なくとも０．６５であれば、ＲＡマーカーとして実際に適格である。
【００９４】
好ましくは, ある態様において、１種類以上の他のマーカーは抗ＭＣＭ３および抗ＰＩＫ３ＣＤからなる群から選択される。
関節リウマチの特徴は、パンヌスとしても知られる増殖しつつある滑膜組織の関節浸潤である。パンヌスの有意部分は血管からなり、それが増殖しつつある組織に栄養素を供給する。したがって、血管新生(angiogenesis)に関連する分子がＲＡにおいてもＲＡマーカーとしてだけでなく療法ターゲットとしても研究されている(Brenchley, P. E. C., Clin. Exp. Immunol. 121 (2000) 426-429)。これらのうち血管内皮増殖因子(vascular endothelial growth factor)（＝ＶＥＧＦ）がより詳細に評価された。ＶＥＧＦは分泌型糖タンパク質であり、それは４つの異なるイソ型にスプライシングされる。これらのイソ型のうち２つは易拡散性であり、それに対し残りのイソ型はヘパリンに強固に結合し、大部分はヘパリン含有プロテオグリカンと会合した状態でみられる。ＶＥＧＦは、内皮細胞、単球および骨芽細胞に対してケモカインとして作用し、最終的に新血管形成(neovascularization)および微小血管透過性増大をもたらす。ＶＥＧＦはＲＡ患者の滑液および血清中に検出されている(Lee, S. S., et al., Clin. Exp. Rheumathology 19 (2001) 321-324; Ballara, S., Arthritis Rheum. 44 (2001) 2055-2064)。好ましくは、血管新生のマーカーはＶＥＧＦである。
【００９５】
最も顕著な関節組織は骨、軟骨および滑膜である。関節リウマチは破壊性疾患であるので、これらの組織が最も影響を受けるであろう。それらはＲＡの分野における潜在的な生物学的マーカーの供給源である可能性がある。原則として、これらのマーカーは各組織の破壊から生じるだけでなく、修復プロセスの脱調節および／または無効から生じる可能性もある。経験豊富な当業者は、骨、軟骨または滑膜の代謝のマーカーがこれらの組織の合成または破壊のいずれにも由来する可能性があることを理解するであろう。骨、軟骨および／または滑膜の代謝の各種マーカーは２つの異なるグループのタンパク質から記述することができる。それらは多数のタイプのコラーゲンから、または非コラーゲン性タンパク質から生じる。非コラーゲン性タンパク質はしばしば細胞外マトリックスの形成に関与する。これらのマーカーのうちあるものは、３種類すべての組織に種々の量で見出すことができる。
【００９６】
好ましくは、ＲＡマーカーパネルは少なくとも３種類のマーカーを含み、それには抗ＣＣＰ、抗ＰＩＫ３ＣＤ、ならびに抗ＭＣＭ３および抗Ｃａｓｐ８からなる群から選択される第３マーカーが含まれる。
【００９７】
ＲＡの査定に際しては、抗ＣＣＰ、抗ＰＩＫ３ＣＤ、抗ＭＣＭ３および抗Ｃａｓｐ８を含むマーカーパネルが好ましい。
ＲＡマーカーのさらなる好ましいパネルは、抗ＣＣＰ、抗ＰＩＫ３ＣＤおよび抗ＭＣＭ３を含む。
【００９８】
ＲＡマーカーのさらなる好ましいパネルは、抗ＣＣＰ、抗ＰＩＫ３ＣＤおよび抗Ｃａｓｐ８を含む。
同様に好ましくは、少なくとも１種類の追加マーカーは、抗ＭＣＭ３および抗Ｃａｓｐ８からなる群から選択される。さらなる好ましい態様において、追加マーカーは抗ＭＣＭ３である。さらなる好ましい態様において、追加マーカーは抗Ｃａｓｐ８である。
【００９９】
さらに前記に述べたように（参照：ＡＲＡ規準）−著しい制限があるにもかかわらず−リウマチ因子(rheumatoid factor)（ＲＦ）は、ＲＡの診断の確立を補助するための現在受け入れられている唯一の生化学マーカーである。本発明のマーカー組合わせがＲＡの診断を著しく改善し、ＲＦアッセイを補足し、または最終的にはそれの代わりとなる可能性すらあることが、明らかに予想される。したがって、ＲＡの診断における少なくとも抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤを含むマーカーパネルの使用は、本発明のさらなる好ましい態様である。
【０１００】
当業者が認識するように、１種類以上の追加マーカーを用いて診断正確度をさらに改善することができ、あるいは要求される場合には特異度を犠牲にして診断感度を高めること、またはその逆も可能である。ある診断領域では、たとえばＨＩＶ感染の検出においては、感度が最重要である。要求される高い感度は特異度を犠牲にして達成される可能性があり、その結果、偽陽性症例の数が増加する。他の場合には、たとえば簡単な例として血液型抗原を査定する際には、特異度が最高に重要である。
【０１０１】
さらなる好ましい態様は、ＲＡの診断におけるマーカーパネルの使用に関するものであり、パネルは抗ＣＣＰ、抗ＰＩＫ３ＣＤ、ならびに抗ＭＣＭ３および抗ＰＩＫ３ＣＤからなる群から選択される少なくとも１種類の追加マーカーを含む。
【０１０２】
好ましくは、ある態様は、関節リウマチ（ＲＡ）の非存在または存在をインビトロで全血、血漿または血清試料から査定するための、少なくとも抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤを含むマーカーパネルの使用に関するものであり、その際、基準集団から抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定したカットオフ組合わせ濃度値と比較して増大した、抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定した組合わせ濃度値は、ＲＡの存在の指標となる。
【０１０３】
さらなる態様において、マーカーパネルの使用はさらに、抗ＣＣＰ、抗ＰＩＫ３ＣＤ、ならびに抗ＭＣＭ３および抗Ｃａｓｐ８からなる群から選択される少なくとも１種類の追加マーカーを含む。好ましくは、マーカーパネルは抗ＣＣＰ、抗ＰＩＫ３ＣＤおよび抗ＭＣＭ３を含む。同様に好ましくは、マーカーパネルは抗ＣＣＰ、抗ＰＩＫ３ＣＤおよび抗Ｃａｓｐ８を含む。
【０１０４】
本発明による方法は、ＲＡの重症度の査定においてもきわめて有用であろう。抗ＣＣＰのレベルが高いほど、および／または抗ＰＩＫ３ＣＤのレベルが高いほど、その疾患はより重篤である。今回使用できるようになったマーカー組合わせまたはマーカーパネルについて、たとえば疾患重症度の指標としての疾患スコアを開発することは、ルーティン実験にすぎないであろう。よって本発明による方法は、好ましくは疾患の重症度を査定するためにも使用される。
【０１０５】
本発明による方法は、ＲＡを他の自己免疫疾患、好ましくは他の関節疾患から鑑別するためにもきわめて有用であり、よりいっそう好ましくは他の関節疾患は変形性関節症（ＯＡ）である。
【０１０６】
本発明はさらに、ある態様において、ＲＡの非存在または存在の査定における、少なくとも抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤを含むマーカーパネルについての最適化多変量カットオフの使用に関するものであり、その際、その最適化多変量カットオフは抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定した濃度値を組み合わせることにより得られる。好ましくは、測定した濃度値を、判別分析、カーネル法、ノンパラメトリック法、部分的最小二乗、樹木モデル法、一般化線形モデル、主成分ベースの方法、一般化加法モデル、ファジィ論理ベースの方法、神経回路網および遺伝学的アルゴリズムをベースとする方法からなる群から選択されるメンバーの使用により数学的に組み合わせる。
【０１０７】
本発明の方法は、疾患の経過をモニタリングする際にもきわめて有用であろう。これは、患者試料において抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤならびに場合により追加マーカーを種々の時点で測定し、これらの種々の時点でのマーカーの絶対および／または相対レベルを比較することによって、最も容易に達成される。よって、ＲＡを伴う患者において疾患の経過をモニタリングするために本発明による方法を使用することがさらに好ましい。
【０１０８】
ＲＡのためのいずれかの処置の有効性を査定する際に本発明がきわめて有用であろうということも認識される。処置の有効性は、マーカーレベルの変化により反映されるであろう。処置が目的効果をもつならば、抗ＣＣＰまたは抗ＰＩＫ３ＣＤの２マーカーレベルのうち少なくとも１つが低減するであろう。よって本発明による方法は、好ましくは処置の有効性を査定するためにも使用される。同じ現象、すなわち抗ＣＣＰまたは抗ＰＩＫ３ＣＤのうち少なくとも１つのマーカーレベルの低減は、ＲＡにおける適正な薬物および最適な投薬の選択のために容易に適用できる。適正な薬物および／または最適な投薬の選択に際して本発明の方法を使用することも好ましい。
【０１０９】
本発明の方法は、ＲＡの分野の新規薬物の選択および同定も可能にするであろう。この適用はさらなる好ましい態様である。
臨床試験のためにその抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤのレベルが異なるサブグループの患者を臨床試験のために、および臨床試験において同定し、マーカーレベルのこの差異を治験薬物の有効性に関連付けるのが可能になったこともきわめて有利であろう。
【０１１０】
本発明はまた、この方法を実施するための、抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤをそれぞれ特異的に測定するために必要な試薬を含むキットに関する。キットは場合により、抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤの両方の測定を実施するための補助試薬を含むことができる。
【０１１１】
特定の態様において、キットは抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤの濃度を特異的に測定するための試薬を含む。
好ましい態様において、キットは、測定すべき自己抗体に応じてそれぞれＣＣＰ、ＭＣＭ３、Ｃａｓｐ８およびＰＩＫ３ＣＤからなる群から選択されるペプチドを含む。
【０１１２】
さらなる好ましい態様において、 キット中のキャプチャー抗原は、測定すべき自己抗体に応じて、それぞれ抗ＭＣＭ３の検出のためのペプチドＰＡＴＫＫＴＩＥＲＲＹＳＤＬＴ（Ｙ１５９，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、抗Ｃａｓｐ８の検出のためのペプチドＮＫＳＬＬＫＩＩＮＤＹＥＥＦＳ（Ｙ１７８，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ならびにＰＩＫ３ＣＤの検出のためのペプチドＤＱＬＫＴＧＥＲＣＬＹＭＷＰＳ（Ｙ４４０，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）および／またはペプチドＤＱＬＫＴＧＥＲＳＬＹＭＷＰＳ（Ｙ４４０＊，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）からなる群から選択される。
【０１１３】
さらなる好ましい態様において、特異的な捕捉ペプチドを固体支持体に固定化する。
本発明によるある態様において、固体支持体はビーズ、好ましくは磁性ビーズ、またはバイオチップ表面である。
【０１１４】
本発明のさらなる任意選択的な特徴および態様は、以下の好ましい態様の記載に、好ましくは特許請求の範囲と関連づけてさらに詳細に記載されるであろう。それらにおいて、それぞれの任意選択的な特徴を個別に、および当業者が認識するようにいずれか任意の組合わせで、具体的に示す。本発明の範囲はこれらの好ましい態様によって限定されない。
【０１１５】
本発明の知見をまとめると、以下の態様が好ましい：
１．  関節リウマチ（ＲＡ）の非存在または存在をインビトロで生化学マーカーにより査定するための、下記を含む方法：
ａ）全血、血漿または血清試料において、少なくとも抗環状シトルリン化ペプチド（抗ＣＣＰ）および抗ＰＩＫ３ＣＤの濃度をそれぞれ測定する；
ｂ）（ａ）において抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定した濃度値を組み合わせる；そして
ｃ）工程（ｂ）において決定した組合わせ数値をＲＡの非存在または存在と関連付ける；その際、基準集団から抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定したカットオフ組合わせ濃度値と比較して増大した組合わせ数値は、ＲＡの存在の指標となる。
【０１１６】
２．  試料がヒト対象に由来する、請求項１に記載の方法。
３．  その方法の工程（ａ）がイムノアッセイ法である、請求項１または２に記載の方法。
【０１１７】
４．  抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤを、それぞれ抗原としての１種類以上のＣＣＰおよび／または抗原としての１種類以上のＰＩＫ３ＣＤにより捕捉する、請求項３に記載の方法。
【０１１８】
５．  １種類以上のキャプチャー抗原を固定化する、請求項４に記載の方法。
６．  １種類以上のキャプチャー抗原を固体支持体、好ましくは粒子またはバイオチップの表面に固定化する、請求項５に記載の方法。
【０１１９】
７．  １種類以上のキャプチャー抗原が全長タンパク質またはそのタンパク質から選択されるポリペプチドフラグメントである、請求項４および６のいずれか１項に記載の方法。
【０１２０】
８．  ポリペプチドフラグメントがそのタンパク質から選択される１０〜２５ＡＡの抗原性配列である、請求項７に記載の方法。
９．  マーカー抗ＰＩＫ３ＣＤに対する１種類以上のキャプチャー抗原がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７から選択される、請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。
【０１２１】
１０．  マーカー抗ＰＩＫ３ＣＤに対するＰＩＫ３ＣＤキャプチャー抗原がペプチドＤＱＬＫＴＧＥＲＣＬＹＭＷＰＳ（Ｙ４４０，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）および／またはペプチドＤＱＬＫＴＧＥＲＳＬＹＭＷＰＳ（Ｙ４４０＊，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）である、請求項９に記載の方法。
【０１２２】
１１．  工程（ｂ）の組合わせ濃度値を、ＲＡ陽性患者を除外した、明らかに健康な者ならびに変形性関節症（ＯＡ）患者および他の自己免疫疾患患者からなる群から選択される患者を含む基準集団から得られたカットオフ値と比較する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【０１２３】
１２．  工程（ｂ）で測定した濃度値を、判別分析、カーネル法、ノンパラメトリック法、部分的最小二乗、樹木モデル法、一般化線形モデル、主成分ベースの方法、一般化加法モデル、ファジィ論理ベースの方法、神経回路網および遺伝学的アルゴリズムをベースとする方法からなる群から選択されるメンバーの使用により数学的に組み合わせる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【０１２４】
１３．  さらに、抗ＭＣＭ３および抗Ｃａｓｐ８からなる群から選択される少なくとも１種類の追加マーカーの測定を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
１４．  追加マーカーが抗ＭＣＭである、請求項１３に記載の方法。
【０１２５】
１５．  マーカー抗ＭＣＭに対するＭＣＭキャプチャー抗原がペプチドＰＡＴＫＫＴＩＥＲＲＹＳＤＬＴ（Ｙ１５９，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）である、請求項１４に記載の方法。
【０１２６】
１６．  追加マーカーが抗Ｃａｓｐ８である、請求項１３に記載の方法。
１７．  マーカー抗Ｃａｓｐ８に対するＣａｓｐ８キャプチャー抗原がペプチドＮＫＳＬＬＫＩＩＮＤＹＥＥＦＳ（Ｙ１７８，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）である、請求項１６に記載の方法。
【０１２７】
１８．  関節リウマチ（ＲＡ）の重症度をインビトロで生化学マーカーにより査定するための、下記を含む方法：
ａ）全血、血漿または血清試料において、少なくとも抗環状シトルリン化ペプチド（抗ＣＣＰ）および抗ＰＩＫ３ＣＤの濃度をそれぞれ測定する；
ｂ）（ａ）において抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定した濃度値を組み合わせる；そして
ｃ）（ｂ）からの組合わせ数値をＲＡの重症度に関連付ける；その際、基準集団から抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定したカットオフ組合わせ濃度値と比較してより高い組合わせ数値は、その患者のＲＡの重症度の指標となる。
【０１２８】
１９．  関節リウマチ（ＲＡ）をインビトロで生化学マーカーにより他の自己免疫疾患から鑑別するための、下記を含む方法：
ａ）全血、血漿または血清試料において、少なくとも抗環状シトルリン化ペプチド（抗ＣＣＰ）および抗ＰＩＫ３ＣＤの濃度をそれぞれ測定する；
ｂ）（ａ）において抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定した濃度値を組み合わせる；そして
ｃ）（ｂ）からの増大した組合わせ数値により、ＲＡを他の自己免疫疾患から鑑別する；その際、基準集団から抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定したカットオフ組合わせ濃度値と比較して増大した組合わせ数値は、ＲＡの存在の指標となる。
【０１２９】
２０．  他の自己免疫疾患が変形性関節症（ＯＡ）である、請求項１９に記載の方法。
２１．  関節リウマチ（ＲＡ）の非存在または存在をインビトロで全血、血漿または血清試料から査定するための、少なくとも抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤを含むマーカーパネルの使用；その際、基準集団から抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定したカットオフ組合わせ濃度値と比較して増大した、抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定した組合わせ濃度値は、ＲＡの存在の指標となる。
【０１３０】
２２．  マーカーパネルが、抗ＣＣＰ、抗ＰＩＫ３ＣＤ、ならびにさらに抗ＭＣＭ３および抗Ｃａｓｐ８からなる群から選択される少なくとも１種類の追加マーカーを含む、請求項２１に記載の使用。
【０１３１】
２３．  マーカーパネルが、抗ＣＣＰ、抗ＰＩＫ３ＣＤおよび抗ＭＣＭ３を含む、請求項２１に記載の使用。
２４．  マーカーパネルが、抗ＣＣＰ、抗ＰＩＫ３ＣＤおよび抗Ｃａｓｐ８を含む、請求項２１に記載の使用。
【０１３２】
２５．  ＲＡを他の自己免疫疾患、好ましくは他の関節疾患から鑑別するための、請求項１９に記載の方法の使用。
２６．  他の関節疾患が変形性関節症（ＯＡ）である、請求項２５に記載の使用。
【０１３３】
２７．  ＲＡの非存在または存在の査定における、少なくとも抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤを含むマーカーパネルについての最適化多変量カットオフの使用；その際、最適化多変量カットオフは抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤについて測定した濃度値を組み合わせることにより得られる。
【０１３４】
２８．  測定した濃度値を、判別分析、カーネル法、ノンパラメトリック法、部分的最小二乗、樹木モデル法、一般化線形モデル、主成分ベースの方法、一般化加法モデル、ファジィ論理ベースの方法、神経回路網および遺伝学的アルゴリズムをベースとする方法からなる群から選択されるメンバーの使用により数学的に組み合わせる、請求項２７に記載の使用。
【０１３５】
２９．  抗ＣＣＰおよび抗ＰＩＫ３ＣＤをそれぞれ特異的に測定するために必要な試薬、ならびに場合により測定を実施するための補助試薬を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキット。
【０１３６】
本発明の理解を補助するために以下の例、参考文献、配列リストおよび図面を提示し、本発明の真の範囲を特許請求の範囲に述べる。記載した方法において、本発明の精神から逸脱することなく改変を行なうことができると解釈される。
【０１３７】
配列の記載
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１  抗ＭＣＭ３を捕捉するために用いたＭＣＭ３ペプチドＰＡＴＫＫＴＩＥＲＲＹＳＤＬＴ（Ｙ１５９）
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２  抗Ｃａｓｐ８を捕捉するために用いたＣａｓｐ８ペプチドＮＫＳＬＬＫＩＩＮＤＹＥＥＦＳ（Ｙ１７８）
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３  抗ＰＩＫ３ＣＤを捕捉するために用いたＰＩＫ３ＣＤペプチドＤＱＬＫＴＧＥＲＣＬＹＭＷＰＳ（Ｙ４４０）
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４  抗ＰＩＫ３ＣＤを捕捉するために用いたＰＩＫ３ＣＤペプチドＤＱＬＫＴＧＥＲＳＬＹＭＷＰＳ（Ｙ４４０＊）。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４においては、技術的理由でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のシステイン（Ｃ）をセリン（Ｓ）により置き換えた
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５  ミニ染色体維持タンパク質３（ＭＣＭ３）ヒトタンパク質，ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＩＤ：Ｐ２５２０５
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６  カスパーゼ−８（Ｃａｓｐ８）ヒトタンパク質，ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＩＤ：Ｑ１４７９０
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７  ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート  ３−キナーゼ触媒サブユニットＰＩ３−キナーゼ（ＰＩＫ３ＣＤ）ヒトタンパク質，ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＩＤ：Ｏ００３２９
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８  WO 98/2250３の抗ＣＣＰペプチドＨＱＣＨＱＥＳＴＸＧＲＳＲＧＲＣＧＲＳＧＳ，ここで、Ｘはシトルリンを表わす；ペプチドを２つのシステイン残基間のジスルフィド結合により環化した。
【実施例】
【０１３８】
実施例１
被験集団
最大罹患期間１５年の高い特徴を示すＲＡ患者７８人からの試料を欧州の５つのセンターにおいて２年間の追跡で採集した。５３人のＲＡ患者は抗ＣＣＰ陰性であった。すべての患者がＡＲＡ基準に従ってＲＡ患者と診断され、ＡＲＡ分類基準により分類した≦ＩＩＩの機能状態にあった(Hochberg, M. C., et al., Arthritis Rheum. 35 (1992) 498-502)。すべての患者を詳細な症例報告書形式(case report form)（＝ＣＲＦ）で記録した。ＣＲＦには、下記のが含まれていた：健康評価質問表(Health Assessment Questionnaire)、ＳＦ３６質問表、腫脹した圧痛のある関節数(swollen and tender joint count)、ラーセンスコア(Larsen Score)、試験室パラメーター；関連外科処置、薬物療法、共存疾患、および共存疾患に対する薬物療法の臨床歴。標準措置に従って、毎年、Ｘ線撮影した。この試験に参加した被験者から得られたベースライン試料のみをこの分析に含めた。
【０１３９】
８９人の対照被験者から得た試料も採集した。これらの対照からＲＡ陽性被験者のみを除外し、ただし他の形態の関節炎は除外しなかった。この試験の焦点はＲＡを健康な被験者のみからではなく、他の関節疾患からも識別することであったので、脛大腿(tibiofemoral)または膝蓋大腿(patellofemoral)いずれかの膝のＯＡを伴う４０人の患者を疾患対照として加えた。これらのＯＡ患者について、臨床および試験室パラメーターを決定し、Ｘ線撮影によるケルグレン−ローレンススコア(Kellgren & Lawrence Score)を計算した(Kellgren, J. H., and Lawrence, J. S., Ann. Rheum. Dis. 16 (1957) 494-502)。
【０１４０】
被験集団についての人口統計データを表１に示す。
【０１４１】
【表１】
2018506720.tif 000003
【０１４２】
実施例２
抗ＣＣＰアッセイ
試料中のＣＣＰ自己抗体を測定するために、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）  またはｃｏｂａｓ（登録商標）  ｅ  イムノアッセイ分析計(たとえば、Ｅｌｅｃｓｙｓ  ２０１０、ＭＯＤＵＬＡＲ  ＡＮＡＬＹＴＩＣＳ  Ｅ１７０、ｃｏｂａｓ  ｅ  ４１１、ｃｏｂａｓ  ｅ  ６０１またはｃｏｂａｓ  ｅ  ６０２）（注文Ｎｏ．０５  ０３１  ６５６  １９０）に使用するための市販の抗ＣＣＰ電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）を選択した。
【０１４３】
このイムノアッセイは、ヒトの血清および血漿中の環状シトルリン化ペプチドに対するヒトＩｇＧ自己抗体のインビトロ半定量測定のためのものである。このアッセイの結果を、他の臨床および試験室所見と組み合わせて関節リウマチの診断に際して補助として用いるものとする。
【０１４４】
試験原理：
１回目のインキュベーション：１５μＬの試料を、ビオチニル化された環状シトルリン化ペプチド、およびヒトＩｇＧに対するルテニウム化（トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）−錯体（Ｒｕ（ｂｐｙ）２＋３））モノクローナル抗体と共にインキュベートすると、ＣＣＰ特異的抗体が試料中に存在する場合は複合体が形成される。
【０１４５】
２回目のインキュベーション：ストレプトアビジンコートしたマイクロ粒子を添加した後、複合体はビオチンとストレプトアビジンの相互作用により固相に結合した状態になる。
【０１４６】
反応混合物を測定セル中へ吸引し、そこでマイクロ粒子は電極表面に磁気捕獲される。結合していない基質を次いでＰｒｏＣｅｌｌ／ＰｒｏＣｅｌｌ  Ｍで除去する。次いで電極に電圧を印加すると、化学発光放出が誘導され、それを光電子増倍管により測定する。
【０１４７】
２点検量により計測器特異的に作成した検量曲線および試薬バーコードにより得られたマスター曲線により、結果を判定する。厳密なロット特異的キャリブレーター値が試験専用試薬のバーコードラベルにエンコードされている。
【０１４８】
分析計が自動的に各試料の被検体濃度Ｕ／ｍＬを計算する。
実施例３
マーカーの探査と検証
１回目の実験で、ペプチドアレイ手法（ＪＰＴ  ＰｅｐＳｔａｒ（商標））を用いて患者血清中の自己抗体を探査した。数百のタンパク質からのペプチド配列（自己抗体の潜在的ターゲット）を前記に挙げた試料集合体に問い合わせた。
【０１４９】
最良の鑑別候補を次いで同じ試料コホートにおいて、ただし確実な技術的検証を可能にするために、異なる手法（インパクトシステム(Impact system)，下記を参照，ならびにHornauer et al., Laborwelt 4 (2004), 38-39およびHornauer et al., Biospectrum Special Proteomics 10 (2004), 564を参照）、および新たに合成／品質検査したペプチド配列を用いて検証した。
【０１５０】
インパクト手法はマルチパラメーター測定のためのシステムであり、１０種類の異なるマーカー候補を単一試料アリコートから調べることができる。検査すべきマーカーをインキュベーションチャンバー内の規定領域にスポットする。この場合、目的とするペプチド配列は、インパクトチップ上のストレプトアビジンコートしたスポット上に固定化するためにビオチニル化バージョンとして合成された。
【０１５１】
実施例４
ＲＡの診断のためのマーカーパネルの同定
それぞれの自己抗体ターゲットを、表２に挙げるように短い配列範囲により表わした。それらのペプチドは、インパクトチップ上への固定化のためにビオチン−ＰＥＧ３をＮ末端に含み、無傷タンパク質内での状況を模倣するためにＣ末端のアミドで終止していた。技術的理由で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４におけるようにシステイン（Ｃ）をセリン（Ｓ）により置き換えた。
【０１５２】
【表２】
2018506720.tif 000004
【０１５３】
３種類の新規マーカー候補を検証して、ＯＡおよび他の自己免疫疾患からのＲＡの識別において表３に示すように良好な結果を得た。
参考として、現在ＡＲＡ基準の一部を形成する唯一の生化学マーカーである抗ＣＣＰ単独についての分類結果を提示する。
【０１５４】
表３に示すように、マーカー組合わせ抗ＣＣＰ＋抗ＰＩＫ３ＣＤ、およびさらに示したマーカー組合わせも、ＲＡをＯＡから鑑別することができ、かつＲＡをＯＡおよび他の自己免疫疾患に対しても鑑別することができる。
【０１５５】
本発明の目的は、ＯＡを含めた対照に対比したＲＡの正しい診断を改善することであった。
実施例１および表１に従った被験集団について、マーカー抗［ＣＣＰ］に対する５Ｕ／ｍＬのカットオフを選択した。
【０１５６】
実施例１および表１に従った被験集団について、マーカー抗［Ｃａｓｐ８］に対する４９．９Ｕ／ｍＬのカットオフを選択した。
実施例１および表１に従った被験集団について、マーカー抗［ＭＣＭ３］に対する１５．１Ｕ／ｍＬのカットオフを選択した。
【０１５７】
実施例１および表１に従った被験集団について、マーカー抗［ＰＩＫ３ＣＤ］に対する１５．１Ｕ／ｍＬのカットオフを選択した。
【０１５８】
【表３】
2018506720.tif 000005
【配列表】
2018506720000001.app
【国際調査報告】
2018506720.tif 000006
2018506720.tif 000007
2018506720.tif 000008