(57)【要約】  本発明の実施形態は、ａ）固体支持体の表面に試料を堆積させる工程と、ｂ）固体支持体の少なくとも一部分を１種以上の被検体に対する特異的結合アッセイの実施に適した容器に移す工程と、ｃ）その一部分を必要に応じて洗浄する工程と、ｄ）各被検体に対する単一の特異的結合パートナーであって、オリゴヌクレオチド配列で標識された結合パートナーを容器に添加する工程と、ｅ）上記一部分を核酸増幅試薬と混合する工程と、ｆ）オリゴヌクレオチド配列を増幅する工程と、ｇ）増幅された核酸を検出する工程とを含む、試料由来の１以上の被検体の検出方法を提供する。本発明はさらに、試料由来の１以上の被検体の検出方法とともに使用するキットを提供する。【選択図】図１
2018506020.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料由来の１種以上の被検体の検出方法であって、
ａ）固体支持体の表面に試料を堆積させる工程と、
ｂ）固体支持体の少なくとも一部分を１種以上の被検体に対する特異的結合アッセイの実施に適した容器に移す工程と、
ｃ）一部分を必要に応じて洗浄する工程と、
ｄ）各被検体に対する単一の特異的結合パートナーであって、オリゴヌクレオチド配列で標識された結合パートナーを容器に添加する工程と、
ｅ）一部分を核酸増幅試薬と混合する工程と、
ｆ）オリゴヌクレオチド配列を増幅する工程と、
ｇ）増幅された核酸を検出する工程と
を含む方法。
【請求項２】
増幅された核酸の量に基づいて被検体を定量する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固体支持体が、セルロース系紙、人工又はアルギン酸塩のような天然ポリマー繊維を含む繊維性材料の織布又は不織布、ガラス繊維材料等の鉱物繊維系材料、或いは、例えば、レーザーエッチングした表面を含む化学的又は機械的に処理した材料などの表面処理固体材料を含み、いずれも保持に十分な粗さの微小表面粗さを備え、いずれも必要に応じて安定化試薬又は混合試薬で化学的に処理された、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
固体支持体表面が、弱塩基、キレート剤、アニオン性界面活性剤、及び必要に応じて酸化防止剤等の化学物質で含浸される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
固体支持体表面がカオトロープで含浸される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
固体支持体が、界面活性剤で処理したセルロース系固体支持体である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
添加工程及び混合工程が、界面活性剤の酵素活性の阻害又は特異的結合パートナーの結合を弱めるために、金属イオン封鎖剤の存在下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
金属イオン封鎖剤がシクロデキストリンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
固体支持体が特異的結合部位又は表面電荷修飾剤でコーティングされている、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
特異的結合パートナーが抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
特異的結合パートナーがアプタマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
特異的結合パートナーが、天然又は組換えタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
特異的結合パートナーが、組換えプレクストリン相同性ドメイン、ＦＹＶＥドメイン、ＰＸドメイン、ＥＮＴＨドメイン、ＣＡＬＭドメイン、ＰＤＺドメイン、ＰＴＢドメイン、ＦＥＲＭドメイン又はメタロチオネインである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
試料が生物学的試料に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
試料が、薬物、又は環境由来の汚染物質、除草剤、農薬、金属等である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
試料が犯罪現場に由来し、法医学目的に使用される血液、精液、毛根、繊維、アルコール、乱用薬物、爆発物及び火薬等であるが、これらに限定されるものではない、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
核酸増幅反応が等温増幅を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
等温増幅反応がローリングサークル増幅を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
増幅産物が、ハイブリダイゼーション反応によって測定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
固有のオリゴヌクレオチド配列でそれぞれ標識された、各特異的結合パートナーに関連する増幅された核酸配列を検出することにより、複数の被検体が同時に、個別に検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
固体支持体と、オリゴヌクレオチド配列で標識された各被検体に対する特異的結合パートナーと、オリゴヌクレオチド配列を増幅するための試薬と、ユーザー用取扱説明書とを含むキット。
【請求項２３】
１種以上の被検体について特異的結合アッセイを実施するために適した容器をさらに含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
特異的結合パートナー又はオリゴヌクレオチド配列を増幅するための試薬が、周囲温度で安定な、乾燥形態で提供される、請求項２２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料由来の１以上の被検体を検出する方法に関する。より具体的には、本発明は、固体支持体上の被検体の超高感度検出方法、並びにこの方法を実施するための試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
イムノポリメラーゼ連鎖反応（ｉＰＣＲ）は、タンパク質及び他の抗原の超高感度分析のための有望な技術である。これは、確立されたＥＬＩＳＡ方法論とＰＣＲのシグナル増幅能力とを組合せたものであるｉＰＣＲは、従来のＥＬＩＳＡと比較して〜１０００倍から１０，０００倍の感度の増加をもたらし（Ａｄｌｅｒ，Ｍ．，Ｗａｃｋｅｒ，Ｒ．，＆Ｎｉｅｍｅｙｅｒ，Ｃ．Ｍ．，Ａ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｒｏｕｔｉｎｅ  ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２００３）３０８，２４０−２５０．）、６桁までの非常に広いリニアダイナミックレンジを示す。したがって、イムノポリメラーゼ連鎖反応（ｉＰＣＲ）及びリアルタイムｉＰＣＲアッセイの使用は、従来のイムノアッセイでは検出しにくい複雑な生物学的試料中の微量のバイオマーカー検出を可能にする。
【０００３】
従来のＥＬＩＳＡ法は、９０３／ガスリーカードに塗工された試料からのＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ＨＣＶ及び他の多くの疾患マーカーの検出に既に使用されており（Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．Ｐ．＆Ｃｕｂｉｔｔ，Ｗ．Ｄ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９９９）５２，６３３−６３９．）、例えば、市販のヒト免疫不全ウイルス１型ｐ２４抗原ＥＬＩＳＡアッセイは、乾燥全血スポット（すなわち、９０３紙に塗工された血液）溶出液に使用するために首尾よく改変され、乳児診断の信頼できる試験として使用されている（Ｐａｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｇ．Ｇ．，Ｃｏｏｖａｄｉａ，Ａ．Ｈ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｗ．Ｓ．，＆Ｍｅｙｅｒｓ，Ｔ．Ｍ．，Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００６），１３（１），１５２−１５５．）。イムノＰＣＲは、プリオン、毒素、ホルモン、農薬、ウイルス及び他の抗原の検出等、古典的ＥＬＩＳＡと同じ用途の多くに使用されている。ｉＰＣＲは、がん原遺伝子ＥＴＳ１（Ｚｈｏｕ，Ｈ．，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒ．Ｊ．，＆Ｐａｐａｓ，Ｔ．Ｓ．，Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ  ｆｏｒ  ｕｌｔｒａ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（１９９３）２１，６０３８−６０３９．）、ＴＮＦ−α（Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｓ  ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｂｙ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（２００１）４７，１２９７−１３０１．）、インターロイキン−３及び幹細胞因子（Ｐｏｔｕｃｋｏｖａ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ，ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ  ａｎｄ  ＥＬＩＳＡ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１１）３７１，３８−４７．）、Ｔ細胞レセプター（Ｓｐｅｒｌ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｓｓａｙ  ｉｎ  ｆｌｕｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｖｉａ  ＥＬＩＳＡ  ｏｒ  ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９５）１８６，１８１−１９４．）、アンジオテンシノーゲン（Ｓｕｇａｗａｒａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｏｇｅｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｆｉｒｓｔ  ａｎｄ  ｓｅｃｏｎｄ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ（２０００）２９９，４５−５４．）、タンパク質毒素（Ｈｅ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｈｉｇａ  ｔｏｘｉｎ  ２  ａｎｄ  ｓｏｍｅ  ｏｆ  ｉ���ｓ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｉｎ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｂｙ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ  ａｓｓａｙ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０１１）７７，３５５８−３５６４；Ｚｈａｎｇ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｗ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｈｉｇａ  ｔｏｘｉｎ  ２  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｖａｒｉａｎｔｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００８）４６，１２９２−１２９７．）、プリオンタンパク質（Ｂａｒｌｅｔｔａ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｓｃｒａｐｉｅ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｂｒａｉｎ  ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００５）１２７，１５４−１６４．）、潜在的ウイルス抗原並びに細菌抗原（Ｎｉｅｍｅｙｅｒ，Ｃ．Ｍ．，Ａｄｌｅｒ，Ｍ．，＆Ｗａｃｋｅｒ，Ｒ．，Ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ：ｈｉｇｈ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００５）２３（４），２０８−２１６；Ｐｅｒｅｚ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｉｍｍｕｎｏ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０１１）４１０，１４１−１４８．）、マイコバクテリアのＲＤ抗原（Ｍｅｈｔａ，Ｐ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＲＤ  ａｎｔｉｇｅｎｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｒｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ（２０１２）７２，１６６−１７４．）の検出に使用されており、様々な感染症の新しい診断ツールとして適合させることができる（Ｍａｌｏｕ，Ｎ．＆Ｒａｏｕｌｔ，Ｄ．，Ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ：ａ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０１１）１９，２９５−３０２．）。
【０００４】
一例として、ｉＰＣＲは、固相固定化抗原の検出に使用することができる。伝統的に、ビオチン化ＩｇＧ及びストレプトアビジン酵素コンジュゲートを使用するＥＬＩＳＡアッセイは、固相固定化抗原の検出に使用される。リアルタイムｉＰＣＲは、抗体−ＤＮＡコンジュゲートを使用して、より感度の高いアッセイとして使用することができる。ｒｔ−ｉＰＣＲアッセイの性能を高めるために、内部標準となる競合ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅の前にＰＣＲ混合物に添加することができる。増幅されるＤＮＡそれぞれに、蛍光体標識ＴａｑＭａｎプローブを添加する。ＰＣＲ増幅中に、ＴａｑＭａｎプローブはポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によって分解され、その結果、遊離した蛍光色素が機器によりその場で定量される。別の例として、サンドイッチｉＰＣＲアッセイは、例えば抗組換えヴィスクミン抗体−ＤＮＡ凝集体を使用してヒト血漿試料中の組換えヴィスクミンの検出に適用することができる。間接ｉＰＣＲアッセイは、検出すべき抗原に結合した一次抗体検出のための二次試薬として、特定の種からのＩｇＧに対して結合特異性を有するＤＮＡ−抗体コンジュゲートを使用する。例えば、抗ウサギ二次試薬（「ＲＳＲ」、ＣＨＩＭＥＲＡ  ＢＩＯＴＥＣ）と呼ばれるウサギＩｇＧに特異的なＤＮＡ−抗体コンジュゲートがウサギＩｇＧの検出に、又はマウスＩｇＧの検出に抗マウス二次試薬（「ＭＳＲ」、ＣＨＩＭＥＲＡ  ＢＩＯＴＥＣ）が使用された（Ａｄｌｅｒ，Ｍ．，Ｗａｃｋｅｒ，Ｒ．，＆Ｎｉｅｍｅｙｅｒ，Ｃ．Ｍ．，Ａ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｒｏｕｔｉｎｅ  ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２００３）３０８，２４０−２５０）。
【０００５】
被検体を固体支持体から分離する必要なく、固体支持体上に堆積した低含量の被検体を検出するために、ｉＰＣＲ及び関連方法の適用が必要である。乾燥したフォーマットは、非液体フォーマットにおける試料保存の利便性及び安定性に関連する利点を強化する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１４／０１１３２９４号明細書
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、試料から低含量の被検体の検出を可能にする新規の方法及びキットを説明する。したがって、一態様において、試料由来の１以上の被検体を検出する方法を提供する。方法は、ａ）固体支持体の表面に試料を堆積させる工程と、ｂ）固体支持体の少なくとも一部分を１種以上の被検体に対する特異的結合アッセイの実施に適した容器に移す工程と、ｃ）その一部分を必要に応じて洗浄する工程と、ｄ）各被検体に対する単一の特異的結合パートナーであって、オリゴヌクレオチド配列で標識された結合パートナーを容器に添加する工程と、ｅ）上記一部分を核酸増幅試薬と混合する工程と、ｆ）オリゴヌクレオチド配列を増幅する工程と、ｇ）増幅された核酸を検出する工程とを含む。
【０００８】
別の態様において、本発明は新規の方法を実施するためのキットを提供する。キットは、固体支持体と、オリゴヌクレオチド配列で標識された各被検体に対する特異的結合パートナーと、そのオリゴヌクレオチド配列を増幅するための試薬と、ユーザー用取扱説明書とを含む。
【０００９】
本発明のさらなる詳細及び利点は、以下の説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】固体支持体からのモデルタンパク質（ＩＬ−２）の測定値を示す。
【図２】ヘパリンで処理し、様々な固体支持体上に保存したヒト血液由来の５００ｂｐのゲノムＤＮＡ断片の直接増幅の結果を示す。
【図３】ＥＤＴＡで処理し、様々な固体支持体上に保存したヒト血液由来の１ｋｂ、３．８ｋｂ及び７．５ｋｂのゲノムＤＮＡアンプリコンの直接ＰＣＲの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一態様において、本発明は、ｉＰＣＲを使用して９０３ガスリーカード、３１−ＥＴＦ紙、ＦＴＡ又はＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ等の固体支持体に付着した抗体又は抗原を検出する方法及びキットを提供する。本発明は、現在の適用によって検出するには通常は濃度が低すぎる場合の体液（唾液、血液、尿、リンパ等）又は単一細胞分析に使用される試料の診断を可能にする。これにより、これまで実現できなかった疾患の診断に９０３カード（及び他の固体支持体）の使用を可能にする。ＰＣＲ増幅法は、等温増幅（例えば、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを使用するローリングサークル増幅等）に置き換えることもできる。
【００１２】
したがって、一実施形態では、ａ）固体支持体の表面に試料を堆積させる工程と、ｂ）固体支持体の少なくとも一部分を１種以上の被検体に対する特異的結合アッセイの実施に適した容器に移す工程と、ｃ）移した固体支持体の一部分を必要に応じて洗浄する工程と、ｄ）各被検体に対する単一の特異的結合パートナーであって、オリゴヌクレオチド配列で標識された結合パートナーを容器に添加する工程と、ｅ）上記一部分を核酸増幅試薬と混合する工程と、ｆ）オリゴヌクレオチド配列を増幅する工程と、ｇ）増幅された核酸を検出する工程とを含む、試料由来の１以上の被検体の検出方法を提供する。
【００１３】
用語「被検体」は、分析手順で対象とする物質又は化学成分を意味し、通常は検査室で検出される。したがって、被検体は、被分析物質又は被分析化学成分である。
【００１４】
用語「容器」は、本発明の実施形態による被検体の検出のために、被検体を含む固体支持体の一部分の収容に使用される中空の物体を意味する。容器の例は、チューブ、試験管、マイクロタイタープレート、クラスターウェル、ディッシュ、ボトル等であるが、これらに限定されるものではない。容器の製造に使用される材料の例は、ガラス、プラスチック、金属、ゴム、テフロン（登録商標）及びポリエチレンであるが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
特異的結合アッセイは、通常は溶液中で、特異的結合パートナー、抗体又は免疫グロブリン、アプタマー、核酸配列、リガンド或いは特異的結合タンパク質又は受容体の使用により、分子の存在又は濃度を測定する生化学的試験である。特異的結合アッセイによって検出される分子は、多くの場合、被検体と呼ばれる。特異的結合アッセイを使用して測定された被検体は、臨床、研究、環境、法医学及び他の分析目的のために頻繁に使用される。
【００１６】
用語「オリゴヌクレオチド」は、長さ１５〜５００ｎｔ、好ましくは２０〜４００ｎｔ、最も好ましくは３０〜３００ｎｔの一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指す。ＰＣＲ又はＰＣＲ増幅反応のバリエーションでは、オリゴヌクレオチドは、抗体又は特異的屈曲部位に連結され、増幅のためのタグ又はテンプレートとして使用される。いくつかの他の増幅法において、オリゴヌクレオチドはプライマーとして、例えば、抗体に直鎖状オリゴヌクレオチドが結合するＲＣＡの場合に使用することができる。次いで、直鎖状オリゴヌクレオチドに結合する（直鎖状オリゴヌクレオチドに対する相補的配列を含む）一本鎖環状オリゴヌクレオチドを加えることができる。直鎖オリゴヌクレオチドは、その後、ＤＮＡ／ＲＮＡ複製のためのプライマーとなる。
【００１７】
特定の実施形態では、試料由来の１以上の被検体の検出方法は、増幅された核酸の量に基づいて被検体を定量する工程をさらに含む。例えば、増幅された核酸は、核酸イメージングシステムを使用して、又はｑＰＣＲ／Ｔａｑｍａｎアッセイによって定量することができる。
【００１８】
特定の実施形態では、固体支持体は、セルロース系紙、人工又はアルギン酸塩のような天然ポリマー繊維を含む繊維性材料の織布又は不織布、ガラス繊維材料等の鉱物繊維系材料、或いは、例えば、レーザーエッチングした表面を含む化学的又は機械的に処理した材料などの表面処理固体材料を含み、いずれも保持に十分な粗さの微小表面粗さを備え、いずれも必要に応じて安定化試薬又は混合試薬で化学的に処理される。固体支持体は、ナイロン又はニトロセルロース材料で作られていてもよい。
【００１９】
特定の実施形態では、固体支持体は、繊維状であり、例えばセルロース繊維材料、又はガラス繊維／超極細繊維材料である。
【００２０】
特定の実施形態では、固体支持体は、多孔質ポリマーであり、例えばポリエステル、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリアミド（ナイロン）、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリカーボネート、硝酸セルロース、酢酸セルロース、アルギン酸塩又は酸化アルミニウム等の多孔質膜材料である。
【００２１】
特定の他の実施形態では、固体支持体は、ＦＴＡ紙、ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ紙、Ｗｈａｔｍａｎ  ９０３紙、Ｗｈａｔｍａｎ  ３１−ＥＴＦ紙、アルギン酸塩、又はアルギン酸塩でコーティングした支持体であるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
本明細書中のＦＴＡ（ＦＴＡマイクロカード、ＦＴＡ指示薬付、及びＦＴＡクラシックを含む）は、例えば弱塩基、キレート剤及びアニオン性界面活性剤等の安定化剤で処理されたセルロース繊維紙であり、支持表面は安定化剤によって含浸されている。このようにして、生物学的試料物質は、固体支持体上で乾燥した物質として数ヶ月間又は数年間にもわたって保存することが可能であり、それにより、必要に応じて固体支持体を検査室に、周囲温度で輸送する時間を得ることができる。その後、例えば、固体支持体から生物学的試料物質を精製することによって、容易に回収が可能である。或いは、試料は、直接又は洗浄後にパンチ−インプロトコルを使用して処理することができる。固体支持体上での試料の保存は、必要に応じて試料の一部分を切り出し、その部分を試験することによって、長期にわたり試料を再試験することも可能にする。
【００２３】
本明細書中のＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅは、同様の紙であるが、チオシアン酸グアニジン等のカオトロピック剤でコーティングされている。本明細書中のＷｈａｔｍａｎ  ９０３は、コーティングされていないセルロース繊維紙である。
【００２４】
特定の実施形態では、固体支持体表面は、弱塩基、キレート剤、アニオン性界面活性剤、及び必要に応じて抗酸化剤等の化学物質で含浸される。
【００２５】
特定の実施形態では、固体支持体表面はカオトロープで含浸される一実施形態では、カオトロピック塩はグアニジン塩である。別の実施形態では、グアニジン塩は、チオシアン酸グアニジン、塩化グアニジン及び塩酸グアニジンからなる群から選択される。一実施形態では、カオトロピック塩はヨウ化ナトリウム等のナトリウム塩である。
【００２６】
特定の実施形態では、固体支持体はセルロース系マトリックスである。いくつかの実施形態では、固体支持体は、界面活性剤処理したセルロース系固体支持体である。用語「界面活性剤」は、２液体間又は液体と固体との間の表面張力（又は界面張力）を低下させる化合物を指す。界面活性剤は、洗剤、湿潤剤、乳化剤、発泡剤及び分散剤として作用することができる。
【００２７】
特定の固体支持体は、国際公開２０１２１１３９１１、同２０１２１１３９０７、同２０１２１１３９０６及び同２０１３１６５８７０に記載されており、それらの開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【００２８】
上記の固体支持体は、概して平坦な形態で使用されることが意図されているが、代替方法として、例えば、ロール状で使用されてもよい。
【００２９】
特定の実施形態では、１以上のアッセイは、試料を含む固体支持体から切り抜いたパンチディスクから直接実施される。したがって、アッセイは、試料が塗工された固体支持体から切り抜いたパンチディスクから直接実施することができる。試料を含むパンチディスクは、アッセイ反応に直接添加することができる。必要に応じて、単純な「パンチ−イン」による添加を実施することができ、切り抜いたパンチディスク（固体支持体プラス試料）は、反応に添加する前に洗浄して、潜在的な阻害性化学物質を除去する。
【００３０】
特定の実施形態では、添加及び混合工程は、界面活性剤の酵素活性の阻害又は特異的結合パートナーの結合を弱めるために、金属イオン封鎖剤の存在下で実施する。特定の実施形態では、金属イオン封鎖剤はシクロデキストリンである。シクロデキストリンは、特定の固体支持体の外側をコーティングする界面活性剤の封鎖剤として作用し、それによりＤＮＡ増幅が向上して、特異的結合アッセイを実施することができる。
【００３１】
特定の実施形態では、固体支持体は、特異的結合部位、又は表面電荷修飾剤でコーティングされる。特異的結合部位は、例えば、ポリクローナル及びモノクローナルの両方の抗体、特異的受容体タンパク質、リガンド、核酸配列、及び検体中の物質との特異的結合又は化学反応を介して検体中の個々の化学物質又は被検体の同定、測定及び定量に使用することが意図された類似の試薬である。表面電荷修飾剤は、カチオン性又はアニオン性に帯電したセルロース紙等のイオン交換紙を含む。
【００３２】
特定の実施形態では、試料は生物学的試料に由来する。生物学的試料（又は生体検体とも呼ばれる生物学的検体）は、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、リンパ液、唾液、頬粘膜、尿、糞便、皮膚、毛髪又は組織を含むが、これらに限定されない生物学的試料である。他の生物学的試料は、感染性物質（バクテリア、ウイルス、リケッチア、寄生生物、又は真菌等）及び動物から得たそれらの試料である。
【００３３】
特定の実施形態では、試料は、薬物或いは環境由来の汚染物質、除草剤、農薬、重金属又は薬物等である。「環境」とは、全体的な、又は特定の地理的領域としての自然界を意味する。
【００３４】
特定の実施形態では、試料は、犯罪現場に由来し、法医学目的に使用される血液、精液、毛根、繊維、アルコール、乱用薬物、爆発物、及び火薬等であるが、これらに限定されるものではない。「犯罪現場」とは、犯罪が発生した場所、又は犯罪の証拠が見つかる可能性のある別の場所を意味し、法執行官によって物理的証拠が回収される領域を含む。
【００３５】
特定の実施形態では、特異的結合パートナーは抗体である。
【００３６】
特定の他の実施形態では、特異的結合パートナーはアプタマーである。
【００３７】
他の実施形態では、特異的結合パートナーは天然又は組換えタンパク質である。
【００３８】
さらに他の実施形態では、特異的結合パートナーは、組換えプレクストリン相同性ドメイン、ＦＹＶＥドメイン、ＰＸドメイン、ＥＮＴＨドメイン、ＣＡＬＭドメイン、ＰＤＺドメイン、ＰＴＢドメイン、ＦＥＲＭドメイン又はメタロチオネインである。これらの特異的結合パートナーは、いずれもイノシタイド認識モジュールであり、すなわち、これらはいずれもイノシトールリン酸の特異的結合パートナーである。
【００３９】
別の実施形態では、特異的結合パートナーは、クラスリンアダプタータンパク質又はアレスチンファミリーに属する。クラスリンアダプタータンパク質は、特定のタンパク質（可溶性受容体等）及び脂質に対する特異的結合パートナーとして作用し、アレスチンはＧタンパク質共役受容体に対する特異的結合パートナーである。
【００４０】
さらに別の実施形態では、特異的結合パートナーは、システインに富む低分子量（分子量５００〜１４０００Ｄａの範囲）のタンパク質のファミリーであるメタロチオネインである。メタロチオネインは、生理学的、及び重金属汚染物質の両方に対する特異的結合パートナーとして使用することができる。メタロチオネインは、システイン残基のチオール基を介して亜鉛、銅、セレンカドミウム、水銀、銀、ヒ素、鉛、鉄金属に結合する能力を有する。
【００４１】
核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応を含むことができる。したがって、本発明の特定の態様は、固体支持体上に堆積した試料に対するイムノＰＣＲの適用に関する。前述したように、従来のＥＬＩＳＡ法は、９０３／ガスリーカード等の固体支持体上に堆積した試料からのＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ＨＣＶ及び他の多くの疾患マーカーの検出に既に使用されている（Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．Ｐ．＆Ｃｕｂｉｔｔ，Ｗ．Ｄ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９９９）５２，６３３−６３９）。例えば、市販のヒト免疫不全ウイルス１型ｐ２４抗原ＥＬＩＳＡアッセイは、乾燥全血スポット（すなわち、９０３紙に塗工された血液）溶出液に使用するために首尾よく改変され、乳児診断の信頼できる試験として使用されている（Ｐａｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｇ．Ｇ．，Ｃｏｏｖａｄｉａ，Ａ．Ｈ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｗ．Ｓ．，＆Ｍｅｙｅｒｓ，Ｔ．Ｍ．，Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００６）１３（１），１５２−１５５）。イムノＰＣＲの感受性が顕著に向上したことにより、本発明の特定の態様による方法を使用して、低含量の試料が首尾よく検出されるようになった。
【００４２】
特定の実施形態では、核酸増幅反応は、等温増幅反応を含むことができる。等温増幅反応は、ローリングサークル増幅を含むことができる。核酸増幅反応がローリングサークル増幅を含む場合、オリゴヌクレオチドは、Ｔ４リガーゼで環化され、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼで増幅することができる。或いは、環状ＤＮＡの使用により、オリゴヌクレオチドを環状ＤＮＡにハイブリダイズするプライマーとして作用させてもよく、ＲＣＡをＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼの存在下で進行させてもよい。
【００４３】
特定の実施形態では、核酸増幅は、ループ介在等温増幅、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅又は核酸配列ベース増幅を含む。
【００４４】
特定の実施形態では、試料由来の１以上の被検体を検出する方法は、増幅された核酸の量に基づいて被検体を定量する工程をさらに含むことができる。核酸増幅産物を定量する方法はよく知られている。例えば、増幅産物は、ハイブリダイゼーション反応によって測定することができる。
【００４５】
特定の実施形態では、この方法は多重化することができる。したがって、固有のオリゴヌクレオチド配列でそれぞれ標識した各特異的結合パートナーに関連する増幅された核酸配列を検出することにより、複数の被検体を同時に、個別に検出することができる。「マルチプレックスアッセイ」又は「マルチプレックス法」は、同一源からの複数のメッセージから、情報又はシグナルを測定又は通信する方法に関連する、又はその方法である。簡単に言えば、マルチプレックスアッセイは、アッセイの１回の実行／サイクルにおいて複数の被検体を同時に測定するアッセイの一種である。一度に１つの被検体を測定する手順とは区別される（マルチプレックスアッセイの一例は、Ｕｇｏｚｚｏｌｉら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，３０７，４７−５３）によって報告されている）。
【００４６】
特定の実施形態では、１以上のアッセイは、凍結乾燥試薬を使用して実施される。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのｉｌｌｕｓｔｒａ  Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ（ＲＴＧ）製品等の凍結乾燥試薬がよく知られている。これらの試薬は、特異的結合パートナー、及び／又は特異的オリゴヌクレオチドを分析するための試薬などを含むことができる。
【００４７】
特定の実施形態では、試料は、固体支持体上に予め保存され、室温で保存される。試料は、単に固体支持体に塗工し、保存のために周囲温度で乾燥させればよい。固体支持体上に保存した生物学的試料は、長期間にわたり安定であることが可能であり、例としてＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｔｅ２９−００８２−３３ＡＡを参照されたい。このように、試料は、固体支持体上に少なくとも３０分間保存することができる。試料は、固体支持体上に長期間、例えば、少なくとも２４時間、少なくとも７日間、少なくとも３０日間、少なくとも９０日間、少なくとも１８０日間、少なくとも１年間、及び少なくとも１０年間、固定化することができる。このようにして、試料は、その後の分析に適した乾燥形態で保存することができる。典型的には、試料は、−２００℃〜４０℃の温度で保存される。さらに、保存された試料は、必要に応じて乾燥又は脱水状態或いは不活性雰囲気下で保存することができる。
【００４８】
ｉＰＣＲの能力は、固体支持体材料に堆積した試料からの抗体又は抗原の超高感度検出を可能にし、特にウイルス感染又は分離困難な選好性細菌による微生物疾患の検出に新しいツールをもたらす。この方法論はまた、古典的な血清学的方法では感染の初期段階で抗体を検出することができず、セロコンバージョンの検出に数週間かかるリケッチア又はサイトメガロウイルス感染等のいくつかの細菌性又はウイルス性疾患の血清学的診断に大いに寄与する。
【００４９】
別の態様において、本発明は、試料に由来する１以上の被検体の検出方法を実施するためのキットを提供する。キットは、固体支持体と、オリゴヌクレオチド配列で標識された各被検体に対する特異的結合パートナーと、そのオリゴヌクレオチド配列を増幅するための試薬と、ユーザー用取扱説明書とを含む。
【００５０】
特定の実施形態では、キットは、１種以上の被検体に対する特異的結合アッセイを実施するために適した容器をさらに含む。
【００５１】
特定の実施形態では、キット中の上述したオリゴヌクレオチド配列を増幅するための特異的結合パートナー又は試薬は、周囲温度で安定な乾燥形態で提供される。
【実施例】
【００５２】
以下の実施例は、本発明による方法及び実施形態を例示することのみを意図しており、特許請求の範囲に限定を課すものと解釈されるべきではない。
【００５３】
実施例１：固体支持体からのインターロイキンの直接測定
組換えＩＬ−２±担体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、それぞれ、カタログ２０２−ＩＬ−ＣＦ−１０μｇ、ロットＡＥ４３０９１１２及びカタログ２０２−ＩＬ−１０μｇ、ロットＡＥ４３０９０８１）を５０ｐｇ／μｌ又は１００ｐｇ／μｌで血液（ＴＣＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に溶解した。一定分量（１μｌ、ＩＬ−２を５０ｐｇ（Ｂ）又は１００ｐｇ（Ａ）含有する）をＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ９０３濾紙に塗工した。
【００５４】
これらの試料を周囲温度及び湿度で一晩乾燥させた。適切なサイズのパンチを使用して、それぞれのタイプの濾紙から直径３ｍｍのパンチディスクを切り抜いた。未使用のＩＬ−２  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログＤ２０５０、ロット  ２７３２７５）の試薬により、ＩＬ−２についてパンチディスクを１つずつ直接分析した。直接アッセイは、「パンチインウェル」、すなわち、９０３濾紙の一部分をパンチで打ち抜き、従来のマルチウェルプレートの反応ウェル内に配置するプロトコルを実施した。
【００５５】
アッセイの完了時に、光学密度を４５０ｎｍで測定した。ＩＬ−２の回収は、既知のＩＬ−２濃度の標準曲線と値を比較することによって決定した。回収量を図１に示し、タンパク質を固体支持体上に堆積した場合に有効量のタンパク質が回収可能であることを実証する。
【００５６】
このように、血液又は脳脊髄液等の生物学的試料由来のタンパク質は、固体支持体上で安定であり、ＥＬＩＳＡ等の免疫学的方法を使用して検出及び定量することができる。
【００５７】
実施例２：Ｗｈａｔｍａｎ  ＦＴＡ及び９０３カードに保存した血液からの直接ＰＣＲ
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  ＫｉｔがＷｈａｔｍａｎ９０３、ＦＴＡ及びＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅカードを含む様々な固体支持体に保存した血液試料からのＤＮＡの増幅を直接サポートすることが示された（Ｃｈｕｍ  ａｎｄ  Ａｎｄｒｅ，  ２０１３；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。ＦＴＡ及びＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅカードは、化学的にコーティングされた紙ベースのカードの例であり、９０３カードは化学的にコーティングされていない。直接増幅ワークフローにおいて、事前のＤＮＡ抽出又は精製工程は不要であり、カードは単にＰＣＲ反応混合物に添加される。
【００５８】
試料調製：新鮮血液又はヘパリン（１．４ＩＵ／ｍＬ）、Ｋ2ＥＤＴＡ（１．８ｍｇ／ｍＬ）、又はクエン酸ナトリウム（１０９ｍＭ）を添加して保存した血液をＷｈａｔｍａｎ９０３カード、ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅカード、又はＦＴＡ  Ｇｅｎｅカードに塗工し、製造元の指示に従って乾燥させた。直接ＰＣＲ用に、直径１ｍｍのパンチディスクをカード上の試料から打ち抜き、ＰＣＲ反応容量をＷｈａｔｍａｎ９０３は１０−５０μｌ、ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅカードは２５−５０μｌ、ＦＴＡ  Ｇｅｎｅカードは５０μｌとして使用した。
【００５９】
より大きいパンチディスク又はより少ない反応容量を使用した場合、パンチディスクを水２０μＬで、５０℃で３分間洗浄した。水を除去した後、洗浄したパンチディスクにＰＣＲコンポーネントを直接添加した。使用したパラメータ及び試薬は、以下の表１、表２、表３に記載した。
【００６０】
【表１】
2018506020.tif 000003
【００６１】
【表２】
2018506020.tif 000004
【００６２】
【表３】
2018506020.tif 000005
図２は、ヘパリンで処理し、様々なカード上に保存したヒト血液からの５００ｂｐゲノムＤＮＡ断片の直接増幅の結果を示す。反応は、容量５０μｌ、２５μｌ又は１０μｌのＰＣＲ反応液に１ｍｍのパンチディスクを洗浄して、又は直接入れて実施した。説明した２−ステップＰＣＲプロトコルを使用した。
【００６３】
図３は、ＥＤＴＡで処理し、様々なカードに保存したヒト血液由来の１ｋｂ、３．８ｋｂ及び７．５ｋｂのｇＤＮＡアンプリコンの直接ＰＣＲの結果を示す。反応は、５０μｌ反応液において１ｍｍのパンチディスクにより実施した（ＦＴＡ  Ｇｅｎｅカードのパンチディスクは、７．５ｋｂ断片については水で濯ぐことによって洗浄した）。１ｋｂ断片及び７．５ｋｂ断片に２−ステッププロトコルを使用し、３．８ｋｂアンプリコンに３−ステッププロトコルを使用した。
【００６４】
ＰＣＲ試験により、ＤＮＡが様々なフィルターカード上に保存した血液から直接増幅可能であることが確認された。
【００６５】
９０３カード由来の試料は、ほとんど阻害が認められず、１ｍｍのパンチディスクを１０μｌという低反応容量で使用することができた。ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ及びＦＴＡ  カードでは、様々なレベルの阻害が認められた。ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅは、直接ＰＣＲ反応でわずかに阻害が認められ、１ｍｍのパンチディスクは、２５〜５０μｌ反応では良好に機能したが、１０μｌ反応では、ＰＣＲは完全に阻害された。ＦＴＡ  Ｇｅｎｅカードは、最も高レベルの阻害が認められた。前処理なしでは、ＦＴＡ  Ｇｅｎｅカードの１ｍｍパンチディスクは、５０μｌ反応容量でのみ良好に機能した。反応容量を小さくするためには、非常に単純な洗浄プロトコルによってＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ及びＦＴＡ  Ｇｅｎｅカードの両方から阻害物質を除去することで十分であった。パンチディスクを水で３分間洗浄した後は、試料は、試験したすべての反応容量においてＰｈｕｓｉｏｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  Ｋｉｔによる直接ＰＣＲ反応での使用に十分な純度であった。
【００６６】
９０３カードからのパンチディスク並びにＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ及びＦＴＡ  Ｇｅｎｅカードからの洗浄したパンチディスク（いずれも直径１ｍｍ）を、１ｋｂ、３．８ｋｂ及び７．５ｋｂのアンプリコンに特異的なプライマーを添加した５０μｌ反応容量において使用した。いずれの場合も、ＰＣＲ反応は、適切なサイズの増幅産物を生成した。
【００６７】
固体支持体でのｉＰＣＲの例
組換えヒトＩＬ−２をＭＡＤＢ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、２Ｍ  グアニジン）で希釈し、固体支持体に添加して４℃で一晩静置した。抗原を固体支持体に永久的に付着させるには、この単純な添加で十分であった。固定した抗原をＴｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）で３回洗浄し、固体支持体上の非特異的結合部位にＭＥＳＴＢＳ（４．５％脱脂粉乳、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ及び０．２％アジ化ナトリウムを添加したＴＢＳ）を使用して３７℃で、１時間ブロッキングを行った。固体支持体は、ＴＥＴＢＳ（０．０４％  Ｔｗｅｅｎ及び０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを添加したＴＢＳ）で３回洗浄した。その後の洗浄工程はすべてこの手順に従った。
【００６８】
使い捨てのＨａｒｒｉｓ  ３ｍｍ  Ｕｎｉ−ｃｏｒｅパンチを使用して、複数のパンチディスクを固体支持体から切り抜き、その後ＰＣＲに適した９６ウェルプレートに加えた。
【００６９】
ビオチン化ヤギ抗ＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログコードＢＡＦ２０２）を、ＭＥＳＴＢＳにＴＥＴＢＳを１対９で加えて調製した試薬希釈緩衝液（ＲＤＢ）で希釈し、固体支持体のパンチディスクが入っている９６ウェルプレートに添加した。ＩＬ−２抗原及びビオチン化抗体を室温（２２℃）で１時間インキュベートし、その後ＴＥＴＢＳを使用して３分間洗浄工程を行った。洗浄は５回繰り返した。
【００７０】
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ００３５９６（ＩＭＡＧＥ；３５４４７１４、ＭＧＣ；６４６）に記載されているｐ５３  ｃＤＮＡの２１７〜１２５５に対応するｐ５３  ｍＲＮＡの１０３８ｂｐ断片を、イムノＰＣＲ反応の鋳型として使用した。適切なサイズのｐ５３  ＤＮＡ断片をベクターから切り出し、ビオチンｄ−ＣＴＰを使用して、エキソヌクレアーゼ活性の欠如したクレノウＤＮＡポリメラーゼ断片を用いたランダムプライミングＤＮＡビオチン化キット（ＫＰＬ、カタログコード６０−０１−００）を使用してビオチン化した。
【００７１】
ビオチン化抗体をビオチン化Ｐ５３断片に連結するために、遊離ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ、カタログコードＳ４７６２）を使用した。
【００７２】
ｉＰＣＲ検出反応は、ｐ５３特異的フォワードプライマー１；５’−ＧＣＧＣＡＣＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＡＡＴＣ−３’及びリバースプライマー２；５’−ＣＣＡＡＧＧＣＣＴＣＡＴＴＣＡＧＣＴＣＴ−３’（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）を使用して２５０ｂｐのＰＣＲ産物の生成を伴った。
【００７３】
ＰＣＲアンプリコンは、ＰＣＲマスターミックス（液量９５μｌ、１Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、２０ｐｍｏｌ  フォワードプライマー及びリバースプライマー）を使用して生成し、それに応じて増幅した（変性９４℃で３分、９４℃で３０秒と  ５５℃で１分と７２℃で２分とを３０サイクル、最終浸漬７２℃で１０分）。
【００７４】
得られたアンプリコンは、１％アガロースゲル上で可視化した（データは示していない）。
【００７５】
本発明の特定の実施形態を示し説明したが、本発明の教示から逸脱することなく、変更及び修正を行い得ることは、当業者には明らかであろう。前述の説明及び添付の図面に記載された事項は、例示の目的でのみ提供され、限定としてではない。本発明の実際の範囲は、従来技術に基づいた適切な観点から捉えた場合に、以下の特許請求の範囲において定められることが意図される。
【図１】
2018506020.tif 000006
【図２】
2018506020.tif 000007
【図３】
2018506020.tif 000008
【配列表】
2018506020000001.app
【国際調査報告】
2018506020.tif 000009