(57)【要約】  本発明は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に罹っている又はそれに罹る危険性のある被験体を治療する方法であって、治療的有効量の、少なくとも１種の妊娠特異的糖タンパク質１（ＰＳＧ１）若しくはＰＳＧ９を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法に関する。【選択図】なし
2018529625.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に罹っている又はそれに罹る危険性のある被験体を治療する方法であって、治療的有効量の、
ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドと、
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドと、
ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドと、
ｄ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドと、
からなる群から選択される少なくとも１種のペプチドを投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記ペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチドの投与経路は、血管内注射、腹腔内注射、筋内注射、鼻内投与又は経口投与である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１種のペプチドの投与は、少なくとも２種のペプチドの併用投与を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも２種のペプチドの１つは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも２種のペプチドの１つは、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも２種のペプチドの２つは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列と、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列とを含むペプチドである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチドは、ＧｖＨＤを発症する危険性のある被験体に予防薬として投与される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載］
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号１Ｒ２１ＡＩ１０１９７９による政府の支援を受けてなされたものである。合衆国政府は本発明における一定の権利を有し得る。
【０００２】
［配列表の参照］
２０１６年９月１６日頃に作成された約１５ｋｂのファイルサイズを有する「０４４５０８−５０５９−ＷＯ−ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」というタイトルのコンピュータ読み出し可能なテキストファイルは、本出願のための配列表を収録しており、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【０００３】
本発明は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に罹っている又はそれに罹る危険性のある被験体を治療する方法であって、治療的有効量の、少なくとも１種の妊娠特異的糖タンパク質１（ＰＳＧ１）若しくはＰＳＧ９、又はそのそれぞれの多様体を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
造血幹細胞移植は、多くの疾患に治効があるが、それは、しばしば移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の結果として、かなりの罹患率及び死亡率を伴うことがある。ＧｖＨＤは、ドナー側のＴ細胞が宿主側の抗原を異物として認識することで、ドナー側のＴ細胞の増殖及び宿主組織への攻撃が引き起こされる免疫介在反応である。感染因子に対する免疫応答を維持しながら寛容原性免疫環境を確立することは、骨髄移植のために必要とされており、ＧｖＨＤが、成功を阻む大きな障害である。
【０００５】
妊娠特異的糖タンパク質（ＰＳＧ）は、妊娠初期に胎盤によって合成され、母子免疫系による胎児の拒絶を抑えるための寛容原性免疫環境の維持において役割を担うと考えられている。１つの特定のＰＳＧタンパク質であるＰＳＧ１は、免疫寛容の誘導に充てられる経路に関与することが実証されていることから、特に注目されるべきである。ＰＳＧ１は、炎症性Ｔ細胞の抑制に必須であり、かつ寛容誘導性のＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性ＦｏｘＰ３陽性の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、つまりＧｖＨＤの予防に重要であることが分かっている細胞集団の分化のために重要なサイトカインであるトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）の活性化に関与している。
【０００６】
ＰＳＧ９は、ＰＳＧタンパク質ファミリーのもう一つのメンバーである。このタンパク質もＰＳＧ１と同様に、血小板−フィブリノゲン相互作用を阻害することが報告されており、抗血栓作用が示唆されている。また、ＰＳＧ９は、結腸直腸癌にあたり上向き調節されることも報告されている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に罹っている又はそれに罹る危険性のある被験体を治療する方法であって、治療的有効量の、少なくとも１種の妊娠特異的糖タンパク質１（ＰＳＧ１）若しくはＰＳＧ９、又はそのそれぞれの多様体を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＰＳＧ１が、ＴＧＦβ１の小型潜在型ＴＧＦ複合体（ＳＬＣ）及び潜在性関連ペプチド（ＬＡＰ）と直接結合して、活性ＴＧＦβ１のレベルを増大させることを示す図である。ＰＳＧ１−ＦｃとＴＧＦ−β１のＳＬＣ（Ａ）又はＬＡＰ（Ｂ）との相互作用の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。（Ｃ）ＰＳＧ１−ＧＳＴ−Ｂ２又はＧＳＴを、その濃度を高めながら、５０ｎｇ／ｍＬのＳＬＣと共に３７℃で１時間にわたってインキュベートし、活性化されたＳＬＣの％を、ＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃ捕捉ＥＬＩＳＡで測定した。（Ｄ）２．５μｇ／ｍＬのＰＳＧ１−ＧＳＴ−Ｂ２又はＧＳＴを、５０ｎｇ／ｍＬのＳＬＣと共に３７℃で１時間にわたってインキュベートし、次いでＥＬＩＳＡによって活性ＴＧＦ−β１について分析した。
【図２】ＴＧＦβ１に依存するナイーブマウス由来のＴｒｅｇ細胞及びヒトＴ細胞のＰＳＧ１誘導型分化を示す図である。（Ａ）Ｔ細胞は、ＦｏｘＰ３−ＧＦＰトランスジェニックマウス、つまりＦｏｘＰ３陽性Ｔｒｅｇ細胞においてＧＦＰを発現するマウスモデルから回収された脾臓から単離した。それらの細胞を、マウスＴ細胞アクチベーターＤｙｎａｂｅａｄｓ（抗ＣＤ３／ＣＤ２８）で、ＩＬ−２（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−２＋ＰＳＧ１（１００μｇ／ｍｌ）、ＩＬ−２＋Ｆｌａｇコントロールタンパク質（等モル濃度）又は先に示した組み合わせ＋ＴＧＦβ受容体ＩインヒビターＳＢ−４３１５４２の存在下に刺激した。フローサイトメトリーを実施して、ＦｏｘＰ３発現を測定した（赤色＝アイソタイプコントロール、青色＝実験群）。（Ｂ）Ｔ細胞をヒト全血から単離し、（Ａ）と同様に刺激した。ＩＬ−２及びＴＧＦβ１（２ｎｇ／ｍｌ）の更なる組み合わせを、ＦｏｘＰ３発現のためのコントロールとして含めた。全ての結果は、ＣＤ４陽性細胞にゲーティングされる。
【図３】炎症性サイトカインの発現が、Ｔ細胞のＰＳＧ１での処置にあたり低減されるが、寛容誘導性のサイトカインＩＬ−９は増大されることを示す図である。正常なＢ６マウス脾臓から回収された細胞を、ＰＳＧ１（１００μｇ／ｍｌ）、ＴＧＦβ１（２ｎｇ／ｍｌ）又はＦｌａｇコントロールタンパク質（等モル濃度）で処置した。炎症性サイトカインのＧＭ−ＣＳＦ、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ及びＩＬ−１３を、マルチプレックスイムノアッセイキットを使用して測定した。寛容誘導性のサイトカインであるＩＬ−９は、ＰＳＧ１で処置された細胞において増大した。ＩＬ−２は、Ｔｒｅｇの安定性及び分化のためにｉｎ  ｖｉｖｏで重要であり、その転写はＴＧＦβによって抑制されるので、バイオアッセイを、ＩＬ−２を添加せずにＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞で実施した。添加されたＩＬ−２が存在しないとき、ＰＳＧ１での処置は、活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞によるＩＬ−２分泌の阻害をもたらした。
【図４】ＧｖＨＤのマウスモデル及び表現型を示す図である。骨髄細胞を、８週齢〜９週齢の雌のドナーの大腿骨及び脛骨から回収した。全細胞からＴ細胞を除去することで、Ｔ細胞除去骨髄を得た。精製されたＴ細胞を、ドナーマウスの脾臓から取得した。２つの移植レシピエント群、つまり遺伝的に適合された（Ｂ６Ｄ２Ｆ１／ＪドナーをＢ６Ｄ２Ｆ１／Ｊレシピエントへ）コントロールマウス（ＢＭのみ）及び遺伝的に不適合な（Ｃ５７ＢＬ／６ドナーをＢ６Ｄ２Ｆ１／Ｊレシピエントへ）実験マウスを使用した。移植は、８週齢〜９週齢の雌のレシピエントを８５０ラドの照射で前処置を行うことによって行った。２４時間後に、マウスに側面尾静脈注入によってドナー細胞を移植した。分析は、誘導４週間後に実施した。ＧｖＨＤマウスは、体重減少を示し、見た目はみすぼらしく（scruffy）円背位であり、死亡率が高まる（丸印＝ＧｖＨＤマウス、四角印＝ＢＭのみのコントロール）。ＧｖＨＤマウス由来の小腸（ＳＩ）及び結腸切片のＨ／Ｅ染色は、ドナーのＴ細胞によって引き起こされた炎症に関連する組織損傷を示している。
【図５】ＰＳＧ１が、Ｔｒｅｇ細胞の誘導によりＧｖＨＤをｉｎ  ｖｉｖｏで緩和することを示す図である。ＧｖＨＤマウスを、１００μｇのＰＳＧ１で腹腔内（Ｉ．Ｐ．）注射を介して一日置きに１８日間にわたって処置した。データは、誘導後２８日目に収集した。（Ａ）ＰＳＧ１で処置されたマウスにおいて生存率が向上した。（Ｂ）ＦｏｘＰ３発現は、マウスをＰＳＧ１で処置した後に、脾臓でかなり増大し、そして結腸で増大した。（Ｃ）結腸のＨ／Ｅ染色は、ＰＳＧ１で処置されたマウスの生理学的改善を示している。さらに、シングルポジティブなＣＤ４陽性細胞（Ｃ）及びＣＤ３陽性細胞（Ｄ）は、ＰＳＧ１で処置されたマウスの結腸において減少し、恐らくそれにより、これらの組織中に観察される炎症の減少が導かれた。
【図６】炎症性サイトカインの発現が、ＰＳＧ１で処置されたＧｖＨＤマウスにおいて低減されることを示す図である。移植２６日後に血液を採集し、炎症性サイトカインのＩＬ−５、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ及びＩＬ−１ａの血清濃度を、マルチプレックスイムノアッセイキットと共にＢｉｏｐｌｅｘシステムを用いて測定した。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に罹っている又はそれに罹る危険性のある被験体を治療する方法であって、治療的有効量の、
配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドと、
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドと、
配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドと、
配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドと、
からなる群から選択される少なくとも１種のペプチドを投与することを含む、方法。
【００１０】
本明細書で使用される場合に、「投与する」及び「投与」は、少なくとも１種のペプチドを含む少なくとも１種の化合物を被験体中に導入することを表すために用いられる。投与が治療目的のためである場合に、該物質は、ＧｖＨＤの初発症状のような、治療が必要とされる症状又は病状の発現の時点又はその後に供給される。この物質の治療的投与は、何らかの症状を和らげる、又は更なる症状が発生するのを防ぐ役割を果たす。投与が、症状が現れるのを防ぐ目的のためである場合に（「予防的投与」）、ＰＳＧ１及び／又はＰＳＧ９、又はそのそれぞれの多様体は、何らかの目に見える又は検出することができる症状に先立って供給される。該少なくとも１種のペプチドの予防的投与は、その後に現れる症状を和らげる、又は症状が現れるのを完全に防ぐ役割を果たす。該化合物の投与経路には、限定されるものではないが、本明細書に開示されるように、局所経路、経皮経路、鼻内経路、経膣経路、直腸内経路、経口経路、皮下経路、静脈内経路、動脈内経路、筋内経路、骨内経路、腹腔内経路、硬膜外経路及び髄腔内経路が含まれる。
【００１１】
さらにまた、本発明の方法は、少なくとも２種の本発明のペプチドを併用投与することも含むこととなる。用語「併用投与」は、それぞれの生物学的活性又は効果の期間が重複する時間枠の間に、少なくとも２種の化合物のそれぞれが投与されることを示す。したがって、該用語には、本発明の化合物のいずれかの連続的な同一範囲の投与も含まれる。そして、化合物の投与と同様に、２種以上の本発明の物質又はペプチドの併用投与は、治療目的及び／又は予防目的であってよい。２種以上の本発明の物質又はペプチドが併用投与される場合に、該２種以上の物質の投与経路は、同じである必要はない。
【００１２】
本明細書で使用される場合に、「接触させる」とは、本発明の方法に関して使用される場合には、少なくとも１種の本発明のペプチドを、特定の結合事象又は生物学的効果が可能となるほど、ターゲット分子、組織又は細胞に近づけることを意味する。したがって、「接触させる」には、少なくとも１種の本発明のペプチドを培養培地に添加して、該培養培地を培養中の細胞に適用することが含まれ得る。また、「接触させる」は、細胞を本明細書に記載される少なくとも１種のベクターでトランスフェクションさせ、その細胞が本発明のペプチドを産生可能にすることも含む。もちろん、「接触させる」には、本発明のペプチド又は本発明のその医薬組成物を、インタクトな生物内の細胞に投与することも含まれることとなる。本発明のペプチドを投与するための組成物は、本明細書に記載される。
【００１３】
治療方法は、糖タンパク質の投与に関連する。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」は、本明細書で互換的に使用される。糖タンパク質は、グリコシル化されたタンパク質であると理解され、したがって、或るタンパク質のグリコシル化されたものも、グリコシル化されていないものも、同一のアミノ酸配列を共有するものとする。本明細書においてタンパク質、ポリペプチド又はペプチドについて述べられる場合に、それらの分子はグリコシル化されていても、グリコシル化されていなくてもよいと理解される。本明細書で使用される場合に、「単離されたタンパク質」は、本来の環境から完全に又は部分的に分離されたタンパク質（又は糖タンパク質）を意味すると解釈される。例えば、細胞から分離又は精製されたタンパク質（又は糖タンパク質）は、単離されたものとみなされる。加えて、宿主細胞中に含まれる組換えによって産生されたタンパク質（又は糖タンパク質）分子も、本発明では、単離されたものとみなされる。さらに、通常タンパク質（又は糖タンパク質）が発現されないか、又は見出されることのない細胞、組織又は基質中で見出されたタンパク質（又は糖タンパク質）も、本発明では、「単離された」ものとみなされる。同様に、合成されたタンパク質（又は糖タンパク質）も、単離されたタンパク質（又は糖タンパク質）であるとみなされる。「精製された」は、その一方で、当該技術分野でよく理解されており、一般的に、該タンパク質（又は糖タンパク質）が、緩衝剤又は溶剤はあっても、それ以外に、細胞物質、細胞成分、化学的前駆体又はその他の化学物質を本質的に含まないことを意味する。「本質的に含まない」は、該タンパク質（又は糖タンパク質）以外の成分を検出することができないことを意味するものとは解釈されない。投与される本発明のタンパク質（又は糖タンパク質）は、単離又は精製されてよい。
【００１４】
配列番号１のアミノ酸配列は、ＰＳＧ１の全長アミノ酸配列を表す。該タンパク質は一般に、通常はＮ末端からＣ末端までにシグナル配列及び「成熟」ペプチドを含むプロペプチドとして形成される。以下のＰＳＧ１に関して、シグナル配列は、配列番号１のアミノ酸残基１〜３４で見られ、「成熟」ペプチドは、配列番号１の残基３５〜４１９で見られる。ｈＰＳＧ１のアミノ酸配列は、以下の通りであり、ＵｎｉＰｒｏｔコンソーシアムのデータベース内でＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１１４６４としても入手することができ、そのレコード全体は、引用することにより本明細書の一部をなす。本明細書で使用される場合に、用語「ＰＳＧ１」は、ＰＳＧ１のプロペプチド、成熟ＰＳＧ１、ＰＳＧ１のプロペプチドの多様体（以下に定義される）又は成熟ＰＳＧ１の多様体（以下に定義される）を意味し得る。ＰＳＧ１の様々な実施形態のいずれかは、グリコシル化されていても、グリコシル化されていなくてもよい。
ＭＧＴＬＳＡＰＰＣＴ  ＱＲＩＫＷＫＧＬＬＬ  ＴＡＳＬＬＮＦＷＮＬ  ＰＴＴＡＱＶＴＩＥＡ  ＥＰＴＫＶＳＥＧＫＤ  ＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱ
ＮＬＴＧＹＩＷＹＫＧ  ＱＭＲＤＬＹＨＹＩＴ  ＳＹＶＶＤＧＥＩＩＩ  ＹＧＰＡＹＳＧＲＥＴ  ＡＹＳＮＡＳＬＬＩＱ  ＮＶＴＲＥＤＡＧＳＹ
ＴＬＨＩＩＫＧＤＤＧ  ＴＲＧＶＴＧＲＦＴＦ  ＴＬＨＬＥＴＰＫＰＳ  ＩＳＳＳＮＬＮＰＲＥ  ＴＭＥＡＶＳＬＴＣＤ  ＰＥＴＰＤＡＳＹＬＷ
ＷＭＮＧＱＳＬＰＭＴ  ＨＳＬＫＬＳＥＴＮＲ  ＴＬＦＬＬＧＶＴＫＹ  ＴＡＧＰＹＥＣＥＩＲ  ＮＰＶＳＡＳＲＳＤＰ  ＶＴＬＮＬＬＰＫＬＰ
ＫＰＹＩＴＩＮＮＬＮ  ＰＲＥＮＫＤＶＬＮＦ  ＴＣＥＰＫＳＥＮＹＴ  ＹＩＷＷＬＮＧＱＳＬ  ＰＶＳＰＲＶＫＲＰＩ  ＥＮＲＩＬＩＬＰＳＶ
ＴＲＮＥＴＧＰＹＱＣ  ＥＩＲＤＲＹＧＧＩＲ  ＳＤＰＶＴＬＮＶＬＹ  ＧＰＤＬＰＲＩＹＰＳ  ＦＴＹＹＲＳＧＥＶＬ  ＹＬＳＣＳＡＤＳＮＰ
ＰＡＱＹＳＷＴＩＮＥ  ＫＦＱＬＰＧＱＫＬＦ  ＩＲＨＩＴＴＫＨＳＧ  ＬＹＶＣＳＶＲＮＳＡ  ＴＧＫＥＳＳＫＳＭＴ  ＶＥＶＳＤＷＴＶＰ（配列番号１）
【００１５】
したがって、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたペプチドの使用方法を提供する。特定の一実施形態において、該方法は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドの使用を含む。更なる実施形態においては、本発明の方法で使用されるペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列を含む。更なる実施形態においては、本発明の方法で使用されるペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列からなる。
【００１６】
以下の配列番号２のアミノ酸配列は、シグナル配列を有さない成熟ＰＳＧ１タンパク質を表し、配列番号１のアミノ酸残基３５〜４１９に相当する。したがって、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドの使用方法を提供する。特定の一実施形態において、該方法は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドを使用する。更なる実施形態においては、本発明の方法で使用されるペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列を含む。更なる実施形態においては、本発明の方法で使用されるペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列からなる。配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドは、本明細書では、「野生型ＰＳＧ１」を定義するために用いられる。したがって、野生型ＰＳＧ１の多様体は、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するペプチドだけでなく、配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列を含むペプチドも含む。一実施形態においては、ＰＳＧ１の多様体は、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを含まない。
ＱＶＴＩＥＡＥＰＴＫ  ＶＳＥＧＫＤＶＬＬＬ  ＶＨＮＬＰＱＮＬＴＧ  ＹＩＷＹＫＧＱＭＲＤ  ＬＹＨＹＩＴＳＹＶＶ  ＤＧＥＩＩＩＹＧＰＡ
ＹＳＧＲＥＴＡＹＳＮ  ＡＳＬＬＩＱＮＶＴＲ  ＥＤＡＧＳＹＴＬＨＩ  ＩＫＧＤＤＧＴＲＧＶ  ＴＧＲＦＴＦＴＬＨＬ  ＥＴＰＫＰＳＩＳＳＳ
ＮＬＮＰＲＥＴＭＥＡ  ＶＳＬＴＣＤＰＥＴＰ  ＤＡＳＹＬＷＷＭＮＧ  ＱＳＬＰＭＴＨＳＬＫ  ＬＳＥＴＮＲＴＬＦＬ  ＬＧＶＴＫＹＴＡＧＰ
ＹＥＣＥＩＲＮＰＶＳ  ＡＳＲＳＤＰＶＴＬＮ  ＬＬＰＫＬＰＫＰＹＩ  ＴＩＮＮＬＮＰＲＥＮ  ＫＤＶＬＮＦＴＣＥＰ  ＫＳＥＮＹＴＹＩＷＷ
ＬＮＧＱＳＬＰＶＳＰ  ＲＶＫＲＰＩＥＮＲＩ  ＬＩＬＰＳＶＴＲＮＥ  ＴＧＰＹＱＣＥＩＲＤ  ＲＹＧＧＩＲＳＤＰＶ  ＴＬＮＶＬＹＧＰＤＬ
ＰＲＩＹＰＳＦＴＹＹ  ＲＳＧＥＶＬＹＬＳＣ  ＳＡＤＳＮＰＰＡＱＹ  ＳＷＴＩＮＥＫＦＱＬ  ＰＧＱＫＬＦＩＲＨＩ  ＴＴＫＨＳＧＬＹＶＣ
ＳＶＲＮＳＡＴＧＫＥ  ＳＳＫＳＭＴＶＥＶＳ  ＤＷＴＶＰ（配列番号２）
【００１７】
配列番号３のアミノ酸配列は、ＰＳＧ９の全長アミノ酸配列を表す。該タンパク質は一般に、通常はＮ末端からＣ末端までにシグナル配列及び「成熟」ペプチドを含むプロペプチドとして形成される。以下のＰＳＧ９に関して、シグナル配列は、配列番号３のアミノ酸残基１〜３４で見られ、「成熟」ペプチドは、配列番号３の残基３５〜４４２６で見られる。ｈＰＳＧ９のアミノ酸配列は、以下の通りであり、ＵｎｉＰｒｏｔコンソーシアムのデータベース内でＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ００８８７としても入手することができ、そのレコード全体は、引用することにより本明細書の一部をなす。本明細書で使用される場合に、用語「ＰＳＧ９」は、ＰＳＧ９のプロペプチド、成熟ＰＳＧ９、ＰＳＧ９のプロペプチドの多様体（以下に定義される）又は成熟ＰＳＧ９の多様体（以下に定義される）を意味し得る。ＰＳＧ９の様々な実施形態のいずれかは、グリコシル化されていても、グリコシル化されていなくてもよい。
ＭＧＰＬＰＡＰＳＣＴ  ＱＲＩＴＷＫＧＬＬＬ  ＴＡＳＬＬＮＦＷＮＰ  ＰＴＴＡＥＶＴＩＥＡ  ＱＰＰＫＶＳＥＧＫＤ  ＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱ
ＮＬＰＧＹＦＷＹＫＧ  ＥＭＴＤＬＹＨＹＩＩ  ＳＹＩＶＤＧＫＩＩＩ  ＹＧＰＡＹＳＧＲＥＴ  ＶＹＳＮＡＳＬＬＩＱ  ＮＶＴＲＫＤＡＧＴＹ
ＴＬＨＩＩＫＲＧＤＥ  ＴＲＥＥＩＲＨＦＴＦ  ＴＬＹＬＥＴＰＫＰＹ  ＩＳＳＳＮＬＮＰＲＥ  ＡＭＥＡＶＲＬＩＣＤ  ＰＥＴＬＤＡＳＹＬＷ
ＷＭＮＧＱＳＬＰＶＴ  ＨＲＬＱＬＳＫＴＮＲ  ＴＬＹＬＦＧＶＴＫＹ  ＩＡＧＰＹＥＣＥＩＲ  ＮＰＶＳＡＳＲＳＤＰ  ＶＴＬＮＬＬＰＫＬＰ
ＩＰＹＩＴＩＮＮＬＮ  ＰＲＥＮＫＤＶＬＡＦ  ＴＣＥＰＫＳＥＮＹＴ  ＹＩＷＷＬＮＧＱＳＬ  ＰＶＳＰＧＶＫＲＰＩ  ＥＮＲＩＬＩＬＰＳＶ
ＴＲＮＥＴＧＰＹＱＣ  ＥＩＲＤＲＹＧＧＬＲ  ＳＮＰＶＩＬＮＶＬＹ  ＧＰＤＬＰＲＩＹＰＳ  ＦＴＹＹＲＳＧＥＮＬ  ＤＬＳＣＦＴＥＳＮＰ
ＰＡＥＹＦＷＴＩＮＧ  ＫＦＱＱＳＧＱＫＬＦ  ＩＰＱＩＴＲＮＨＳＧ  ＬＹＡＣＳＶＨＮＳＡ  ＴＧＫＥＩＳＫＳＭＴ  ＶＫＶＳＧＰＣＨＧＤ
ＬＴＥＳＱＳ（配列番号３）
【００１８】
したがって、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたペプチドの使用方法を提供する。特定の一実施形態において、該方法は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドの使用を含む。特定の一実施形態において、該方法は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドを使用する。更なる実施形態においては、本発明の方法で使用されるペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列を含む。更なる実施形態においては、本発明の方法で使用されるペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列からなる。
【００１９】
以下の配列番号４のアミノ酸配列は、シグナル配列を有さない成熟ＰＳＧ９タンパク質を表し、配列番号１のアミノ酸残基３５〜４２６に相当する。したがって、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドの使用方法を提供する。特定の一実施形態において、該方法は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドを使用する。更なる実施形態においては、本発明の方法で使用されるペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列を含む。更なる実施形態においては、本発明の方法で使用されるペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列からなる。配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドは、本明細書では、「野生型ＰＳＧ９」を定義するために用いられる。したがって、野生型ＰＳＧ９の多様体は、配列番号４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するペプチドだけでなく、配列番号４のアミノ酸配列の少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列を含むペプチドも含む。一実施形態においては、ＰＳＧ９の多様体は、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドを含まない。
ＥＶＴＩＥＡＱＰＰＫ  ＶＳＥＧＫＤＶＬＬＬ  ＶＨＮＬＰＱＮＬＰＧ  ＹＦＷＹＫＧＥＭＴＤ  ＬＹＨＹＩＩＳＹＩＶ  ＤＧＫＩＩＩＹＧＰＡ
ＹＳＧＲＥＴＶＹＳＮ  ＡＳＬＬＩＱＮＶＴＲ  ＫＤＡＧＴＹＴＬＨＩ  ＩＫＲＧＤＥＴＲＥＥ  ＩＲＨＦＴＦＴＬＹＬ  ＥＴＰＫＰＹＩＳＳＳ
ＮＬＮＰＲＥＡＭＥＡ  ＶＲＬＩＣＤＰＥＴＬ  ＤＡＳＹＬＷＷＭＮＧ  ＱＳＬＰＶＴＨＲＬＱ  ＬＳＫＴＮＲＴＬＹＬ  ＦＧＶＴＫＹＩＡＧＰ
ＹＥＣＥＩＲＮＰＶＳ  ＡＳＲＳＤＰＶＴＬＮ  ＬＬＰＫＬＰＩＰＹＩ  ＴＩＮＮＬＮＰＲＥＮ  ＫＤＶＬＡＦＴＣＥＰ  ＫＳＥＮＹＴＹＩＷＷ
ＬＮＧＱＳＬＰＶＳＰ  ＧＶＫＲＰＩＥＮＲＩ  ＬＩＬＰＳＶＴＲＮＥ  ＴＧＰＹＱＣＥＩＲＤ  ＲＹＧＧＬＲＳＮＰＶ  ＩＬＮＶＬＹＧＰＤＬ
ＰＲＩＹＰＳＦＴＹＹ  ＲＳＧＥＮＬＤＬＳＣ  ＦＴＥＳＮＰＰＡＥＹ  ＦＷＴＩＮＧＫＦＱＱ  ＳＧＱＫＬＦＩＰＱＩ  ＴＲＮＨＳＧＬＹＡＣ
ＳＶＨＮＳＡＴＧＫＥ  ＩＳＫＳＭＴＶＫＶＳ  ＧＰＣＨＧＤＬＴＥＳ  ＱＳ（配列番号４）
【００２０】
参照アミノ酸配列、例えば配列番号２と少なくとも、例えば約９５％「同一である」アミノ酸配列を有するポリペプチドとは、該アミノ酸配列が、参照アミノ酸配列の１００個のアミノ酸毎に約５個までの改変を含み得ることを除いて、該ポリペプチドのアミノ酸配列が、参照配列と同一であることを意味するものと理解される。換言すると、参照アミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドを得るためには、参照配列のアミノ酸残基の約５％までが、欠失されるか、若しくは別のアミノ酸で置換されていてよく、又は参照配列中の全アミノ酸の約５％までの数のアミノ酸が参照配列中に挿入されていてもよい。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のＮ末端若しくはＣ末端に存在してもよく、又はこれらの末端位の間で、参照配列中のアミノ酸のなかで個別に、若しくは参照配列内で１つ以上の連続した群で散在してどこに存在してもよい。
【００２１】
本明細書で使用される場合に、「同一性」は、参照ヌクレオチド又はアミノ酸配列と比較したヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般的に、それらの配列は、最高の一致性が得られるようにアライメントされる。「同一性」自体は、当該技術分野で認められている意味を有し、公表された技術を使用して計算することができる（例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York (1988)、Biocomputing: Informatics And Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York (1993)、Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994)、von Heinje, G., Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press (1987)、及びSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York (1991)を参照）。２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の間で同一性を測定するために幾つかの方法が存在するが、用語「同一性」は、当業者に良く知られている（Carillo, H. & Lipton, D., Siam J Applied Math 48:1073 (1988)）。２つの配列間の同一性又は類似性を測定するために通常使用される方法には、限定されるものではないが、Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego (1994)及びCarillo, H. & Lipton, D., Siam J Applied Math 48:1073 (1988)に開示される方法が含まれる。また、コンピュータプログラムは、同一性及び類似性を計算する方法及びアルゴリズムを含み得る。２つの配列間の同一性及び類似性を測定するためのコンピュータプログラム法の例には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(i):387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＥｘＰＡＳｙ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Atschul, S. F., et al., J Molec Biol 215:403 (1990)）及びＦＡＳＴＤＢが含まれる。同一性及び類似性を測定するための方法の例は、Michaels, G. and Garian, R., Current Protocols in Protein Science, Vol 1, John Wiley & Sons, Inc. (2000)で言及されており、それは引用することにより本明細書の一部をなす。
【００２２】
本発明の一実施形態においては、２つ以上のポリペプチドの間の同一性を測定するために使用されるアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＰである。本発明のもう一つの実施形態においては、２つ以上のポリペプチドの間の同一性を測定するために使用されるアルゴリズムは、Brutlagらのアルゴリズム（Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)、これは引用することにより本明細書の一部をなす）を基礎とするＦＡＳＴＤＢである。ＦＡＳＴＤＢ配列アライメントにおいては、クエリ配列及び参照配列は、アミノ配列である。配列アライメントの結果は、パーセント同一性で表される。一実施形態においては、アミノ酸配列のＦＡＳＴＤＢアライメントでパーセント同一性を計算するために使用することができるパラメータには、限定されるものではないが、以下が含まれる：行列（Matrix）＝ＰＡＭ、ｋ−タプル（k-tuple）＝２、ミスマッチペナルティー（Mismatch Penalty）＝１、結合ペナルティー（Joining Penalty）＝２０、無作為化グループ長（Randomization Group Length）＝０、カットオフスコア（Cutoff Score）＝１、ギャップペナルティー（Gap Penalty）＝５、ギャップサイズペナルティー（Gap Size Penalty）０．０５、ウィンドウサイズ（Window Size）＝５００又はサブジェクトアミノ配列の長さのどちらか短い方。
【００２３】
参照配列がクエリ配列よりも短い又は長いことが、Ｎ末端又はＣ末端の付加又は欠失によるものであって、内部の付加又は欠失によるものではない場合には、手動で修正が行われ得る。それというのも、ＦＡＳＴＤＢプログラムは、パーセント同一性を計算する場合には、参照配列のＮ末端及びＣ末端の欠損又は付加を考慮に入れていないからである。クエリ配列が、参照配列に対してＮ末端又はＣ末端で欠損している場合には、パーセント同一性は、クエリ配列のマッチング／アライメントされない参照配列側のＮ末端及びＣ末端の残基数を、クエリ配列の全塩基のパーセントとして計算することによって修正される。ＦＡＳＴＤＢ配列アライメントの結果から、マッチング／アライメントが決定される。次いで、アライメントのパーセンテージは、特定されたパラメータを使用して上記ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されたパーセント同一性から減算されて、最終的なパーセント同一性スコアが得られる。この修正されたスコアは、パーセント同一性と同様にアライメントが互いにどのように「相応する」のかを決定する目的のために使用することができる。クエリ配列のＮ末端又はＣ末端を越えて延びる参照配列の残基は、パーセント同一性スコアを手動で調節する目的のために考慮することができる。つまり、パーセント同一性スコア又はアライメントの番号付けが手動で調節される場合に、比較配列のＮ末端又はＣ末端とマッチング／アライメントされない残基を数に入れることができる。
【００２４】
例えば、パーセント同一性を測定するために、９０アミノ酸残基のクエリ配列が１００残基の参照配列とアライメントされる。クエリ配列のＮ末端に欠失が存在し、したがって、ＦＡＳＴＤＢアライメントは、Ｎ末端の最初の１０残基のマッチング／アライメントを示さない。１０個のペアになっていない残基は、参照配列の１０％（マッチングされないＮ末端及びＣ末端の残基の数／参照配列中の残基の全数）に相当するため、１０％をＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されたパーセント同一性スコアから減算する。残りの９０残基が完全にマッチングされた場合（１００％アライメント）、最終的なパーセント同一性は、９０％となる（１００％アライメント−１０％のマッチングされないオーバーハング）。もう一つの例においては、欠失が内部欠失である場合を除き、９０残基のクエリ配列を１００残基の参照配列と比較する。この場合には、ＦＡＳＴＤＢによって計算されたパーセント同一性は手動で修正されない。それというのも、該クエリとマッチング／アライメントされないサブジェクト配列のＮ末端又はＣ末端には残基が存在しないからである。更にもう一つの例においては、パーセント同一性を測定するために、１１０アミノ酸のクエリ配列が１００残基の参照配列とアライメントされる。クエリ中の付加が、クエリ配列のＮ末端に存在し、したがって、ＦＡＳＴＤＢアライメントは、Ｎ末端の最初の１０残基でマッチング／アライメントを示し得ない。クエリ配列の残りの１００アミノ酸残基が、参照配列の全長と９５％の同一性を有する場合に、該クエリのＮ末端の付加は無視されることとなり、該クエリの参照配列に対するパーセント同一性は９５％となる。
【００２５】
本明細書で使用される場合に、用語「〜に相応する」及び「〜に相応している」は、それらが配列アライメントに関連するときに、参照タンパク質、例えば野生型ＰＳＧ１内の列挙された位置及び該参照タンパク質上の位置とアライメントする突然変異又は関連のＰＳＧ１中のこれらの位置を意味するものと解釈される。したがって、サブジェクトペプチドのアミノ酸配列が、参照ＰＳＧ１のアミノ酸配列、例えば配列番号２とアライメントされる場合に、参照配列の特定の列挙された位置「に相応する」サブジェクト配列中のアミノ酸は、参照配列、例えば配列番号２のこれらの位置とアライメントするアミノ酸であるが、必ずしも参照配列のこれらの正確な数値的な位置にあるわけではない。配列間の相応するアミノ酸を決定するための配列のアライメント法は、本明細書に記載される。したがって、本発明は、配列番号１、２、３又は４の配列に相応する配列の新規のペプチドを提供する。
【００２６】
本発明は、本発明のＰＳＧ１又はＰＳＧ９に相応するアミノ酸配列を有する、その他の種の、好ましくは哺乳動物のホモログを更に含む。種のホモログは、「オルソログ」と呼ばれることもあり、一般に、そのタンパク質のヒトのものと少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を共有する。そのような相応する配列は、様々な種にわたるＰＳＧ１又はＰＳＧ９タンパク質、例えばイヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、サル等のＰＳＧ１又はＰＳＧ９に当たる。
【００２７】
もう一つの実施形態においては、本発明は、配列番号１、２、３又は４の配列に相応し、かつ少なくとも幾らかの最小機能を維持する配列の新規のペプチドを提供する。
【００２８】
位置−１に追加のメチオニン残基を有する野性型ＰＳＧ１又は野生型ＰＳＧ９（Ｍｅｔ−１−ペプチド）が検討され、位置−２及び位置−１に追加のメチオニン残基及びリジン残基を有する多様体（Ｍｅｔ−２−Ｌｙｓ−１−ペプチド）も検討される。追加のＭｅｔ残基、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ残基又はＬｙｓ残基（又は一般に１つ以上の塩基性残基）を有する野性型ＰＳＧ１又は野生型ＰＳＧ９の多様体は、細菌宿主細胞中で組換えタンパク質産生を増強するために特に有用である。
【００２９】
野生型ＰＳＧ１又は野生型ＰＳＧ９をコードするポリヌクレオチドを発現ベクター系中に挿入することで得られる多様体も検討される。例えば、野生型ＰＳＧ１又は野生型ＰＳＧ９のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端を別のポリペプチドと融合させた場合に、多様体（通常は挿入）を得ることができる。
【００３０】
もう一つの態様においては、本発明は、野生型ＰＳＧ１又は野生型ＰＳＧ９タンパク質中の１つ以上のアミノ酸残基が除去される欠失多様体を提供する。欠失は、ペプチドの一方の末端若しくは両方の末端で行うことができ、又は該ペプチドの１つ以上の非末端アミノ酸残基の除去により行うことができる。したがって、欠失多様体は、本明細書に開示される野生型ＰＳＧ１又は野生型ＰＳＧ９ペプチドの全ての断片を含む。
【００３１】
開示されたパーセント同一性の範囲内で、本発明はまた、本発明の開示されたポリペプチドの置換多様体に関する。置換多様体は、野生型ＰＳＧ１又は野生型ＰＳＧ９の１つ以上のアミノ酸残基が除去され、代替残基と置き換えられるこれらのポリペプチドを含む。一態様においては、置換は本来保存的なものであるが、本発明は、非保存的でもある置換を含む。この目的のための保存的置換は、以下の表中に示されるように定義することができる。アミノ酸は、物理的特性並びに二次タンパク質構造及び三次タンパク質構造への寄与に従って分類することができる。保存的置換は、当該技術分野においては、１つのアミノ酸を、類似の特性を有する別のアミノ酸と置換するものと認識される。保存的置換の例を、以下に示す。
【００３２】
【表１】
2018529625.tif 000003
【００３３】
その一方で、保存的アミノ酸は、Lehninger, [Biochemsitry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY, N.Y. (1975), pp. 71 77]に記載されるように、以下に示される通りに分類することができる。
【００３４】
【表２】
2018529625.tif 000004
【００３５】
そして、更なるその他の代替的な保存的置換の例を、以下に示す。
【００３６】
【表３】
2018529625.tif 000005
【００３７】
本発明のペプチド又はポリペプチドの定義は、アミノ酸残基の挿入、欠失又は置換以外の改変を有するポリペプチドを含むと解釈されるものと理解されるべきである。例としては、該改変は本来、共有結合的なものであり、例えばポリマー、脂質、その他の有機部分及び無機部分との化学結合を含み得る。そのような誘導体は、ポリペプチドの循環半減期を増大させるように製造することができ、又は該ポリペプチドが、所望の細胞、組織若しくは器官にターゲティングする能力を改善するように設計することができる。同様に、本発明は更に、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール又はポリプロピレングリコール等の１種以上の水溶性ポリマーの結合を含むように共有結合的に改変されたＰＳＧ１又はＰＳＧ９ペプチドを含む。
【００３８】
ＰＳＧ１又はＰＳＧ９タンパク質がポリマーに結合される化学修飾ペプチド組成物は、本発明の範囲内に含まれる。該ポリマーは、生理学的環境等の水性環境においてタンパク質の沈降を抑制するために水溶性であってよい。適切な水溶性のポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、又はその他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）及びポリビニルアルコールからなる群から選択することができる。選択されたポリマーは、通常、単独の反応性基、例えばアシル化のための活性エステル又はアルキル化のためのアルデヒドを有するように変性され、こうして、重合度を制御することができる。ポリマーは任意の分子量であってよく、かつ分枝鎖状又は非分枝鎖状であってもよく、かつそのようなポリマーの混合物を使用してもよい。化学修飾されたペプチドを治療的使用に向ける場合に、薬学的に許容可能なポリマーを使用のために選択することができる。
【００３９】
ポリマーがアシル化反応によって変性されるべきであれば、該ポリマーは、単独の反応性エステル基を有するべきである。その一方で、ポリマーが還元的アルキル化によって変性されるべきであれば、該ポリマーは、単独の反応性アルデヒド基を有するべきである。好ましい反応性アルデヒドは、水中で安定性のポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、又はそれらのモノ−Ｃ１〜Ｃ１０−アルコキシ若しくはアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照、それは引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）。
【００４０】
ＰＳＧ１若しくはＰＳＧ９ペプチド又はその多様体のペグ化は、例えば以下の参考資料：Focus on Growth Factors 3, 4 10 (1992)、欧州特許第０１５４３１６号、及び欧州特許第０４０１３８４号（それぞれの参考資料は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）に記載される当該技術分野で既知のペグ化反応のいずれかによって行うことができる。好ましくは、ペグ化は、反応性ポリエチレングリコール分子（又は類似の反応性の水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応を介して行われる。ポリペプチドのペグ化のために好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、それには、限定されるものではないが、二官能性ＰＥＧが含まれる。本明細書で使用される場合に、「ポリエチレングリコール」は、その他のタンパク質を誘導体化するために使用されたＰＥＧのいずれかの形、例えばモノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシポリエチレングリコール又はアリールオキシポリエチレングリコールを含むことを表す。
【００４１】
ＰＳＧ１又はＰＳＧ９ペプチドの化学的誘導体化は、生物学的に活性な物質と活性化されたポリマー分子とを反応させるために使用されるあらゆる適切な条件下で行うことができる。ペグ化されたペプチドの製造方法は、一般的に、ポリペプチドとポリエチレングリコール、例えばＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体とを、ＰＳＧ１又はＰＳＧ９ポリペプチドが１つ以上のＰＥＧ基に結合されることとなる条件下で反応させる工程（ａ）及び反応生成物を取得する工程（ｂ）を含むであろう。最適な反応条件又はアシル化反応を既知のパラメータ及び所望の結果に基づいて選択することは、当業者には明らかであろう。
【００４２】
ペグ化されたポリペプチド、及びその他のポリマーで修飾されたポリペプチドは一般に、本明細書に記載されるＰＳＧ１又はＰＳＧ９ポリペプチドの投与によって緩和又は調節され得る病状を治療するために使用することができる。本明細書に開示される化学的に誘導体化されたＰＳＧ１又はＰＳＧ９ポリペプチド分子は、追加の活性、増強された若しくは低減された生物学的活性、又はその他の特性、例えば誘導体化されていない分子と比較して高められた又は減少された半減期を有してよい。ＰＳＧ１又はＰＳＧ９ポリペプチド、それらの断片、多様体及び誘導体は、単独で、一緒に、又はその他の医薬組成物と組み合わせて使用することができる。例えば、サイトカイン、成長因子、抗生物質、抗炎症薬及び／又は化学療法剤を、治療される適応症のために適切であるように併用投与することができる。
【００４３】
本発明は、本発明の精製されたポリペプチドを含む組成物を提供する。好ましい組成物は、本発明のポリペプチド以外に、医薬品用のビヒクル、賦形剤又は媒体として用いられる薬学的に許容可能な（すなわち、滅菌されているとともに非毒性の）液状、半固体、又は固体の希釈剤を含む。当該技術分野で既知のあらゆる希釈剤を使用することができる。希釈剤の例には、限定されるものではないが、水、生理食塩溶液、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ステアリン酸マグネシウム、メチルヒドロキシベンゾエート及びプロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、アルギン酸塩、デンプン、ラクトース、スクロース、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、リン酸カルシウム、鉱油並びにカカオ脂が含まれる。
【００４４】
また、本発明は、単離された核酸、及びこれらの核酸を含む構築物に関する。本発明の核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡ、例えばｍＲＮＡであってよい。核酸分子は、二本鎖又は一本酸であってよく、一本酸ＲＮＡ又はＤＮＡは、コーディング鎖若しくはセンス鎖であってよく、又は非コーディング鎖若しくはアンチセンス鎖であってよい。特に、該核酸は、限定されるものではないが、ＰＳＧ１及び／又はＰＳＧ９の多様体を含む本発明のペプチドのいずれかをコードし得る。例えば、本発明の核酸は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質、ポリ−ヒスチジン（例えば、Ｈｉｓ６）、ポリ−ＨＮ、ポリ−リジン、ヘマグルチニン、ＨＳＶ−タグ及びＨＩＶ−Ｔａｔの少なくとも一部をコードするポリヌクレオチド配列を含む。所望であれば、単離された核酸のヌクレオチド配列は、非コーディング３’配列及び５’配列等の追加の非コーディング配列（例えば、調節配列を含む）を含み得る。
【００４５】
トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）は、炎症性サイトカイン分泌及びＴｒｅｇの増殖の下向き調節を含む生来の免疫系及び適応免疫系の細胞の多くの応答の制御に関与する多面発現性（pleiotropic）サイトカインである。活性ＴＧＦβ１は、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方のＴｒｅｇの誘導に必須であり、ＴＧＦβ１のレベルの増大は、ＦｏｘＰ３の発現の増大をもたらす。しかしながら、ＴＧＦβ１は、その効果に影響を及ぼすために活性化プロセスを受けねばならない。ＴＧＦβ１は、シグナルペプチド、２５０残基の潜在性関連ペプチド（ＬＡＰ）及び１１０残基の成熟ＴＧＦペプチドからなるプレ−プロ−ＴＧＦとして翻訳される。ＬＡＰは、ホモ二量体の成熟ＴＧＦβ１に非共有結合的に取り巻くことで、小型潜在型ＴＧＦ複合体（ＳＬＣ）が形成される。潜在型のＴＧＦβ１は、ＬＡＰにおけるタンパク質分解による開裂又はコンフォメーション変化により成熟ＴＧＦβ１が露出するまでは、その受容体及びシグナルに結合することはできない。
【００４６】
また、本発明は、ＴＧＦβ１の活性化方法であって、潜在型ＴＧＦβ１とＰＳＧ１の多様体及び／又はＰＳＧ９の多様体とを接触させることを含む、方法に関する。ＰＳＧ１多様体及び／又はＰＳＧ９多様体が潜在型ＴＧＦβ１と接触される環境は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、又はｉｎ  ｖｉｖｏであってよい。一実施形態においては、該方法は、潜在型ＴＧＦβ１と、配列番号２のアミノ酸配列の多様体又は配列番号４のアミノ酸配列の多様体であるペプチドとを接触させることを含む。もう一つの実施形態においては、該方法は、潜在型ＴＧＦβ１と、配列番号２のアミノ酸配列の多様体及び配列番号４のアミノ酸配列の多様体であるペプチドとを接触させることを含む。
【００４７】
また、本発明は、Ｔｒｅｇの誘導方法、すなわち誘導されたＴｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）の生成方法であって、Ｔ細胞とＰＳＧ１の多様体及び／又はＰＳＧ９の多様体とを接触させることを含む、方法に関する。ＰＳＧ１多様体及び／又はＰＳＧ９多様体がＴ細胞と接触される環境は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、又はｉｎ  ｖｉｖｏであってよい。一実施形態においては、該方法は、Ｔ細胞と、配列番号２のアミノ酸配列の多様体又は配列番号４のアミノ酸配列の多様体であるペプチドとを接触させることを含む。もう一つの実施形態においては、該方法は、Ｔ細胞と、配列番号２のアミノ酸配列の多様体及び配列番号４のアミノ酸配列の多様体であるペプチドとを接触させることを含む。
【００４８】
本発明のペプチドを含む組成物又は医薬組成物は一般的に、ペプチド及び薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書で使用される場合に、「薬学的に許容可能な担体」又は「医薬担体」は、医薬品投与と適合し得るあらゆる溶剤、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を含むものと解釈される。医薬品用担体又はその他の成分の性質は、特定の投与経路及び投与されるべき本発明の具体的な実施形態に依存することとなる。この関連において有用な技術及びプロトコールの例は、とりわけ、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Beringer et al. (Eds), 21st Ed., Lippincott Williams & Wilkins (2005)に記載されており、それは引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。そのような医薬担体又は希釈剤の例には、限定されるものではないが、水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液及び５％ヒト血清アルブミンが含まれる。リポソーム及び非水性ビヒクル、例えば不揮発性油を使用することもできる。医薬活性物質用のそのような媒体及び作用物質の使用は、当該技術分野でよく知られている。何らかの慣例的な媒体又は作用物質が活性化合物と非相容性である場合を除き、該組成物中ではその使用が検討される。補助的な活性化合物を該組成物中に導入することもできる。
【００４９】
本発明の医薬組成物は、意図される投与経路と適合し得るように製剤化される。投与経路の例には、経口投与及び非経口投与（例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、吸入投与、経皮（局所）投与、経粘膜投与及び直腸内投与）が含まれる。非経口適用、皮内適用又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液には、限定されるものではないが、滅菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール類、グリセリン、プロピレングリコール又はその他の合成溶剤、抗細菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン類、酸化防止剤、例えばアスコルビン酸又は重硫酸ナトリウム、キレート化剤、例えばエチレンジアミン四酢酸、緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩並びに張性を調整するための剤、例えば塩化ナトリウム又はデキストロースが含まれ得る。ｐＨは、酸又は塩基、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムで調整することができる。非経口用調剤は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器又は多人数用バイアル中に密封されていてよい。
【００５０】
注射用途のために適した医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液及び滅菌注射用溶液又は分散液の即時調製物のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与のために、適切な医薬担体には、生理学的食塩水、制菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（BASF、ニュージャージー州パルシッパニー）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合において、該組成物は、滅菌されていなければならず、容易な注射針通過性が存在する程度で流動性であるべきである。該組成物は、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、かつ細菌及び真菌類のような微生物の汚染作用に対して保護されねばならない。上記医薬担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）及びそれらの適切な混合物を含有する溶剤又は分散媒であってよい。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングを使用することによって、分散液の場合に所望の粒度を維持することによって、そして界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用の抑制は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成することができる。多くの場合において、等張剤、例えば糖類、多価アルコール類、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムが上記組成物中に含まれることが望ましいことがある。注射用組成物の持続的吸収は、該組成物中に吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによって引き起こすことができる。
【００５１】
滅菌注射用溶液は、活性化合物（例えば、ＰＳＧペプチド及びその多様体）を必要とされる量で適切な溶剤中に先に列挙された成分の１つ又はその組み合わせと一緒に導入し、所望であれば引き続き濾過滅菌することによって製造することができる。一般的に、分散液は、活性化合物を、基本分散媒及び先に列挙された成分からの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に導入することによって製造される。滅菌注射用溶液の製造のための滅菌粉末の場合に、この製造方法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、該乾燥により、事前に滅菌濾過されたその溶液から、有効成分と任意の付加的な所望の成分との粉末が得られる。
【００５２】
経口用組成物は一般に、不活性希釈剤又は可食性の医薬担体を含む。それらは、ゼラチンカプセル中に封入されてよく、又は錠剤へと圧縮されてよい。経口治療的投与のために、活性化合物は、賦形剤と一緒に導入することができ、かつ錠剤、トローチ剤又はカプセル剤の形で使用することができる。経口用組成物は、マウスウォッシュとして使用するために流動性医薬担体を使用して製造することもでき、その際、流動性医薬担体中の化合物は、経口で適用され、ゆすいで吐き出されるか、又は飲み込まれる。薬学的に適合可能な結合剤及び／又はアジュバント材料は、上記組成物の一部として含まれてよい。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤等は、以下の成分又は類似の性質の化合物、例えば、限定されるものではないが、バインダー、例えば微結晶性セルロース、トラガカントガム若しくはゼラチン、賦形剤、例えばデンプン若しくはラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲル若しくはコーンスターチ、滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム若しくはＳｔｅｒｏｔｅｓ、滑剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素、甘味剤、例えばスクロース若しくはサッカリン、又はフレーバリング剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル若しくはオレンジフレーバーのいずれかを有してよい。
【００５３】
吸入による投与のためには、上記化合物は、加圧容器又は適切な噴射剤、例えば二酸化炭素のようなガスを含むディスペンサー又はネブライザーからエーロゾルスプレーの形で送達される。
【００５４】
全身性投与は、経粘膜手段又は経皮手段によるものであってもよい。経粘膜投与又は経皮投与のために、浸透するべきバリアに適切な浸透剤が製剤中に使用される。そのような浸透剤は、当該技術分野において一般的に知られており、かつ例えば経粘膜投与のためには、界面活性剤、胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻内スプレー又は坐剤を使用することによって実現することができる。経皮投与のためには、活性化合物は、当該技術分野で一般的に知られる軟膏剤、膏薬、ゲル剤又はクリーム剤へと製剤化される。
【００５５】
一実施形態においては、活性化合物は、インプラント及びマイクロカプセル化された送達システムを含む徐放性製剤のように、体内から迅速に排除されることから該化合物を保護することとなる医薬担体と一緒に調製される。生分解性の生体適合性のポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類及びポリ乳酸を使用することができる。そのような製剤の製造方法は、当業者には明らかであろう。それらの材料は、Alza Corporation及びNova Parmaceuticals, Inc.から商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体によって感染細胞にターゲティングされるリポソームを含む）は、薬学的に許容可能な担体として使用することもできる。これらの組成物は、当業者に既知の方法に従って、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載される方法に従って製造することができる。経口用組成物又は非経口用組成物を、投与を容易にし、かつ投与量を均一にするための投与単位形で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される投与単位形とは、治療される被験体のための単位投与量として適した物理的に個別の単位を指し、それぞれの単位は、所望の医薬担体と共同して所望の治療効果を生ずるように計算された予め決められた量の活性化合物を含有する。本発明の投与単位形のための仕様は、活性化合物の特有の特性及び達成されるべき具体的な治療効果によって決まり、それらに直接的に依存している。
【実施例】
【００５６】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を使用することで、ＰＳＧ１が、潜在性関連ペプチド（ＬＡＰ）、つまり成熟ＴＧＦβ１に潜在性を付与することで、ＴＧＦβ１のその受容体への結合を効果的に遮断するタンパク質に直接的に結合することが示された。さらに、バイオアッセイ及びＥＬＩＳＡのデータは、ＰＳＧ１での処置後に生体活性ＴＧＦβ１のレベルが増大することを示しており、それは、このタンパク質が、ＬＡＰとの相互作用によるＴＧＦβ１の活性化の役割を担うことを指摘している。
【００５７】
ナイーブマウスのＴ細胞を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏデータにより、ＰＳＧ１で処置することで、未処置のコントロールにおけるたった２％と比較して、ＦｏｘＰ３を発現するＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性細胞のかなりの増加があることが示された。また、ＦｏｘＰ３発現の増加は、初代ナイーブヒトＴ細胞をＰＳＧ１で処置することでも観察された。ＴＧＦβ受容体Ｉインヒビターを細胞培養に添加した場合に、このＦｏｘＰ３発現の増加は効果的に遮断され、そのことは、更にＰＳＧ１が、ＴＧＦβ１の制御を通じてＦｏｘＰ３陽性Ｔｒｅｇの発現を誘導することを指摘している。ＩＬ−２は、Ｔｒｅｇの安定性及び分化のためにｉｎ  ｖｉｖｏで重要であり、その転写はＴＧＦβによって抑制されるので、バイオアッセイを、ＩＬ−２を添加せずにＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞で実施した。添加されたＩＬ−２が存在しないと、ＰＳＧ１での処置は、活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞によるＩＬ−２分泌の阻害をもたらした。幾つかの炎症性サイトカインは、ＰＳＧ１で処置された細胞において、未処置のコントロールと比較して発現を減らしており、それは、ＰＳＧ１が、自己免疫応答の増大に関係するサイトカインの放出を減少させたことを指摘している。
【００５８】
ＧｖＨＤのマウスモデルを使用することで、ＰＳＧ１を投与したマウスが、結腸中で浸潤性の炎症性ＣＤ３陽性Ｔ細胞の数を減らし、未処置のコントロールに対して物理的及び組織学的に顕著な改善が示された。さらに、ＰＳＧ１で処置されたマウスは、未処置のＧｖＨＤコントロールと比較した場合に、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性脾臓細胞において、より大幅に高いＦｏｘＰ３発現を示した。また、炎症性サイトカインは、処置されたマウスの血清においても減少した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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