(57)【要約】本発明は、グリコシル化パターンに従って潜在的に多様にグリコシル化された複数のリソソームタンパク質を含む（該グリコシル化パターンは少なくとも４５％の小マンノシド型（paucimannosidic）Ｎ−グリカンを有する）リソソームタンパク質組成物；コケ植物植物体またはコケ植物細胞において該リソソームタンパク質組成物を製造する方法；および該リソソームタンパク質組成物の医薬的および非医薬的使用；に関する。例えば、該リソソームタンパク質はファブリー病の治療のためのα−ガラクトシダーゼ、または、ゴーシェ病の治療のためのβ−グルコセラミダーゼ（β−Glucoceramidase）であることができる。独特なグリコシル化は、驚くべきことに、マンノース−６−リン酸（これはＣＨＯ細胞産生リソソームタンパク質では一般的）なしに−治療効果の改善をもたらす。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リソソームタンパク質をコードする導入遺伝子をコケ植物植物体またはコケ植物細胞中で発現させることを含むリソソームタンパク質組成物を製造する方法であって、該リソソームタンパク質はＮ−末端分泌シグナルを有して発現し、該分泌シグナルは細胞内プロセシングの間に任意に除去されてもよく、該方法はさらに発現したリソソームタンパク質を該植物体または細胞から得ることをさらに含む、該方法。
【請求項２】
該発現したリソソームタンパク質が該植物体または細胞の分泌物から、好ましくは該生産細胞または植物体を破壊すること無く、得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該リソソームタンパク質が、配列ＶＤＴＭ（配列番号１）を有するＣ−末端液胞シグナルを欠き、および／または配列ＫＤＥＬ（配列番号２）を有するＣ−末端ＥＲ保留シグナルを欠く、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該リソソームタンパク質が、Ｃ−末端ＥＲ保留シグナル配列を欠き、および／またはＣ−末端液胞シグナル配列を欠く、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該リソソームタンパク質が、天然のリソソームタンパク質またはそのトランケーションのアミノ酸のＣ−末端で終了する発現したアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該コケ植物植物体またはコケ植物細胞が蘚類（好ましくはP. patens）植物体または細胞であり、および／または該コケ植物植物体またはコケ植物細胞がα１，３−フコシルトランスフェラーゼおよび／またはβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼを抑制しているか、または除去している、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかの方法によって得られるリソソームタンパク質組成物。
【請求項８】
グリコシル化パターンに従って潜在的に多様にグリコシル化された複数のリソソームタンパク質を含むリソソームタンパク質組成物であって、該グリコシル化パターンは少なくとも４５％の小マンノシド型（paucimannosidic）Ｎ−グリカン（モル％）を有する、リソソームタンパク質組成物。
【請求項９】
該リソソームタンパク質が、
α−ガラクトシダーゼ、好ましくはα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）；β−グルコセラミダーゼ（β-Glucoceramidase）、β−グルコシダーゼ（グルコセレブロシダーゼ）；α−マンノシダーゼ；アスパルチルグルコサミニダーゼ；β−マンノシダーゼ；酸性セラミダーゼ（Acid Ceremidase）；α−フコシダーゼ；β−ガラクトシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ活性化タンパク質；ガラクトセレブロシダーゼ、ガラクトセラミダーゼ（Galactoceramidase）；リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）；α−イズロニダーゼ；イズロン酸−２−スルファターゼ；グルコサミン−Ｎ−スルファターゼ、ヘパランスルファスルファミダーゼ（Heparansulfatsulfamidase）（ＳＧＳＨ）；α−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）；α−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ；Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ；β−ガラクトシダーゼ；Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ；β−グルコロニダーゼ（β-Glucoronidase）；ノイラミニダーゼ；スフィンゴミエリナーゼ、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ；酸性α−１，４−グルコシダーゼ；β−ヘキソサミニダーゼ、またはそのαサブユニット；α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ＮＡＧＡ）、α−ガラクトサミニダーゼ；β−ヘキソサミニダーゼＡ；ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ；ヒアルロニダーゼ；
から選択されるいずれか１つである、請求項７または８に記載のリソソームタンパク質組成物。
【請求項１０】
該リソソームタンパク質が式１：
【化１】
2018509906.tif 000007
（式１）
［式中、
四角はＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を表し、
丸はマンノース（Ｍａｎ）を表し、および
Ｔ付きの丸は末端マンノースを表す］
の構造を含む小マンノシド型（paucimannosidic）Ｎ−グリカンを１または複数有し、
１または複数の該ＧｌｃＮＡｃまたはＭａｎサブユニットがα１，３−フコシル化、α１，６−フコシル化および／またはβ１，２−キシロシル化されていても良く、
好ましくは該組成物のリソソームタンパク質のＮ−グリカンの少なくとも１０％（モル％）が式１の構造を含むかまたは該構造からなる、
請求項７〜９のいずれか１項に記載のリソソームタンパク質組成物。
【請求項１１】
該グリコシル化パターンは式ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈｅｘ２−メチル−ＨｅｘのＮ−グリカンを少なくとも１％有し；および／または
該グリコシル化パターンは下記のＮ−グリカンを含み：
０％〜３５％、好ましくは１％〜３０％、−ＧｌｃＮＡｃ２−（Ｍａｎ２メチル−Ｈｅｘ）；
３０％〜８０％、好ましくは４０％〜７０％、−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ３；
０％〜３０％、好ましくは４％〜２２％、−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ３−ＧｌｃＮＡｃ；
０％〜１５％、好ましくは２％〜１２％、−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ３−ＧｌｃＮＡｃ２；
０％〜５％、好ましくは０％〜３％、−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ３−Ｈｅｘ２；
０％〜１１％、好ましくは１％〜８％、−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ３−Ｈｅｘ３；
０％〜１０％、好ましくは１％〜７％、−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ３−Ｈｅｘ４；
０％〜１０％、好ましくは１％〜７％、−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ３−Ｈｅｘ５；
ここで、これらの化合物の全ては合わせて合計１００％であるか、または１００％未満であり；
式中、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンサブユニットであり、Ｍａｎはマンノースサブユニットであり、Ｈｅｘは六炭糖サブユニットであり、メチル−Ｈｅｘはメチル化六炭糖サブユニット（好ましくは２−Ｏメチル六炭糖）であり；
ただし−ＧｌｃＮＡｃ２−（Ｍａｎ２メチル−Ｈｅｘ）と−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ３は合わせて少なくとも４５％であり（全ての％はモル％である）、
特に好ましくは、上記Ｎ−グリカンのいずれか１つにおいてＨｅｘはＭａｎであり；
該グリカンの還元末端の該ＧｌｃＮＡｃは、上記Ｎ−グリカンのいずれか１つにおいて、フコシル化されていてもよく、またはフコシル化されていなくても良く；
分岐点のＭａｎは、上記Ｎ−グリカンのいずれか１つにおいて、キシロシル化されているか、またはキシロシル化されていない、
請求項１０に記載のリソソームタンパク質組成物。
【請求項１２】
非リン酸化リソソームタンパク質を含む、請求項７〜１１のいずれか１項に記載のリソソームタンパク質組成物。
【請求項１３】
請求項１に定義される（好ましくは請求項２〜６のいずれか１つにさらに定義される）リソソームタンパク質をコードする導入遺伝子を含む、請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法を実施するのに適したコケ植物細胞またはコケ植物植物体。
【請求項１４】
複合型Ｎ−グリカンを含むリソソームタンパク質をプロセシングするためのインビトロの方法であって、該方法は、請求項７〜１２のいずれか１項に記載のリソソームタンパク質を試料中に提供し、該試料をコケ植物ＨＥＸＯ（好ましくはＨＥＸＯ３）酵素と接触させ、これにより該コケ植物ＨＥＸＯ酵素は末端ＧｌｃＮＡｃ残基を該リソソームタンパク質から切断して、小マンノシド型（paucimannosidic）Ｎ−グリカンが生産されることを含む、該方法。
【請求項１５】
請求項７〜１２のいずれか１項に記載のリソソームタンパク質組成物を投与することを含む、リソソーム蓄積症の治療方法であって、好ましくは該疾患およびリソソームタンパク質が下表から選択される、該治療方法。
2018509906.tif 000008
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物発現系と比較して改変されたグリコシル化を得るための植物における組換えタンパク質発現の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は生命を脅かす遺伝性疾患であり；それらの多くは１つのリソソーム酵素またはタンパク質の欠損によって引き起こされ、細胞内に基質の異常な蓄積をひき起こす。現在のところ、酵素補充療法（ＥＲＴ）は、いくつかのＬＳＤにとって唯一利用可能な特殊療法である。これらの疾患では、失われた酵素を静脈内に注入することによって、多くの標的組織においてリソソームの貯蔵を取り除くことができる。従来、ＥＲＴに使用される組換え酵素は、培養された哺乳動物細胞において生産される。例えば、米国６，０８３，７２５は、ヒト細胞由来のα−ガラクトシダーゼを記載する。近年、代替法として、植物ベースの発現系が治療用リソソーム酵素を製造するために使用されている(Shaaltiel et al.(2007)Plant Biotechnol J 5:579-590; Du et al.(2008)J Lipid Res 49:1646-1657; De Marchis et al.(2011)Plant Biotechnol J 9:1061-1073; He et al.(2012)Nat Commun 3:1062)。哺乳動物細胞ベースの系に比べて、植物ベースの系には、低い生産コスト、哺乳動物の病原体による汚染のリスクの回避、および、蘚類の場合にはＮ−グリコシル化経路の操作が比較的容易であるなど、いくつかの利点がある。しかしながら、ＥＲＴに関する植物細胞産生酵素の主な懸念は、哺乳動物細胞産生酵素とはＮ−グリカン構造が異なることである。特に、植物細胞中で発現したリソソーム酵素は通常、人工のリン酸化なしには末端マンノース残基がマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）化していない。糖鎖はＥＲＴにおいて重要な役割を果たす。静脈内投与されたリソソーム酵素は、該酵素の糖鎖構造を認識する細胞表面受容体を介して組織によって取り込まれる。Ｍ６Ｐ受容体（Ｍ６ＰＲ）およびマンノース受容体（ＭＲ）は、この取り込みのシステムに関し主要な貢献者の２つである。
【０００３】
大部分のリソソーム酵素は、Ｍ６Ｐ残基を持っている。一般的に、大抵のＬＳＤに対するＥＲＴにおいて、Ｍ６ＰＲ媒介エンドサイトーシス経路は十分な酵素送達に欠かせないと考えられている（Sly et al.(2006)Proc Natl Acad Sci USA 103:15172-15177; Sands et al.(2001)J Biol Chem 276:43160-43165）。対してＭＲはマクロファージ上に存在するので、これらの細胞中の酵素置換を狙うＥＲＴの治療効果のみを促進すると考えられている。
【０００４】
ＷＯ０２／０８４０４およびＷＯ２０１２／０９８５３７は、タバコにおける様々なリソソーム酵素の生産を記載している。
【０００５】
ＷＯ０３／０７３８３９は、植物種子、特にタバコ植物の種子におけるリソソーム酵素の生産を記載する。
【０００６】
米国７，０１１，８３１は、昆虫細胞における複合型Ｎ−グリカングリコシル化を有するリソソーム酵素の生産を記載する。
【０００７】
ＷＯ２００８／１３２７４３は、ＥＲシグナルペプチドおよび液胞標的シグナルを有する発現構築体を用いるタバコにおける高マンノースグリコシル化リソソーム酵素の産生を記載する。
【０００８】
ＥＰ  ２  ７８９  ６８６  Ａ１は、哺乳動物型リン酸化グリカンを製造するための植物グリコシル化経路の改変を記載する。
【０００９】
米国２００６／０４０３５３は、ベータ−ガラクトースのＮ結合型グリカンへの移動を記載する。マンノース−６−リン酸を有する糖タンパク質が、リソソーム病の治療に提案されている。
【００１０】
Ｃｈｉｂａらは、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからヒトα−ｇａｌＡを生産した（Chiba et al.(2002)Glycobiology 12:821-828）。このケースにおいては、Ｍ６Ｐは末端マンノースでカバーされ、細菌α−マンノシダーゼでマンノース残基の除去することにより、培養線維芽細胞における該酵素のＭ６ＰＲ依存性取り込みは改善された。近年、α−ｇａｌＡが別の遺伝子操作された酵母株（これはマンノシルリン酸トランスフェラーゼの正のレギュレーターであるＭＮＮ４を過剰発現する）で発現された（Tsukimura et al.(2012)Mol Med 18:76-82）。このα−ｇａｌＡ調製物中のリン酸化されたＮ−グリカン含量は、アガルシダーゼα中のそれよりも高かった（２８．７％ ｖｓ． １５．３％）。ファブリー病マウスへのこの酵素の反復注射は、アガルシダーゼαを注射したマウスにおける心臓Ｇｂ３および腎臓Ｇｂ３と同様の減少をもたらした。最近では、Ｋｉｚｈｎｅｒらはタバコ細胞培養物から産生されたヒトα−ｇａｌＡの精製および特徴付けを報告した（Kizhner et al.(2015)Mol Genet Metab 114(2): 259-267）。他の植物由来のリソソーム酵素のように、このａＧａｌは非リン酸化である。しかしながら、このタンパク質は化学的に架橋され、ＰＥＧ化されている。これらの改変は、アガルシダーゼαまたはβと比較してインビトロ安定性が増加し、循環半減期が劇的に延長する（〜１０時間）といった、タンパク質特性における有意な変化を伴う。この酵素の取り込み機構はまだ解明されていない。しかしながら、著しく遅い血漿クリアランスは、その取り込みがＭ６ＰＲ媒介またはＭＲ媒介エンドサイトーシスを介さないことを示唆する。
【００１１】
米国特許第６，８８７，６９６号は、タバコ植物（高等植物）における、２つのリソソームタンパク質、すなわちアルファ−グルコセレブロシダーゼおよびアルファ−ガラクトシダーゼの発現方法を記載する。該タバコ産生リソソームタンパク質は、多量の複合型Ｎ−グリカン、特にＧｎＭＸＦ、ＭＧｎＸＦ、ＧｎＧｎＸＦ、ＧｎＭｘ、およびＭＧｎＸを有する多様なグリコシル化パターンを有していた。
【００１２】
本発明の目的は、適切なグリコシル化を必要とする、リソソーム蓄積症の治療のための治療剤として有効である、リソソームタンパク質の生産のための代替的な供給源を提供することである。
【発明の概要】
【００１３】
本発明のこの目的は下記の驚くべき知見に基づく本発明によって解決される：ｉ）リソソームタンパク質上の小マンノシド型（paucimannosidic）グリコシル化が治療選択肢に対する適合性を与える；およびｉｉ）このような小マンノシド型（paucimannosidic）グリコシル化はコケ植物発現系において容易に得られる。
【００１４】
本発明はリソソームタンパク質をコードする導入遺伝子をコケ植物植物体またはコケ細胞において発現させることを含むリソソームタンパク質組成物の製造方法を提供し、前記リソソームタンパク質はＮ末端分泌シグナルを持って発現され、前記分泌シグナルは細胞内プロセシングの間に任意に除去され、特に、該リソソームタンパク質は配列ＶＤＴＭ（配列番号１）を持つＣ末端液胞シグナルを欠いており、および、前記方法は、前記植物体または細胞から発現したリソソームタンパク質を得ることをさらに含む。本発明はさらに、本発明の方法によって得られるリソソームタンパク質組成物を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、グリコシル化パターンに従って潜在的に多様にグリコシル化された複数のリソソームタンパク質を含むリソソームタンパク質組成物を提供し、前記グリコシル化パターンは、少なくとも４５％の小マンノシド型（paucimannosidic）Ｎ−グリカン（モル％）を有する。このようなタンパク質組成物は、本発明の方法によって得ることができる。
【００１６】
また、複合型Ｎ−グリカンを含むリソソームタンパク質を処理する方法も提供され、当該方法はサンプル中にリソソームタンパク質を提供し、かつ、該サンプルをコケ植物ＨＥＸＯ（好ましくはＨＥＸＯ３）酵素と接触させることを含み、該コケ植物ＨＥＸＯ酵素はリソソームタンパク質から末端ＧｌｃＮＡｃ残基を切断して、小マンノシド型（paucimannosidic）Ｎ−グリカンが生産される。ＨＥＸＯ酵素は、細胞、特に植物細胞に存在し得る。リソソームタンパク質は、医薬としてまたは医薬組成物として提供されることができる。
【００１７】
本発明はまた、本発明の方法を実施するのに適した、前記のリソソームタンパク質をコードする導入遺伝子を含むコケ植物細胞またはコケ植物体を提供する。
【００１８】
本発明はまた、本発明のリソソームタンパク質組成物を、治療を必要とする患者に投与することを含むリソソーム蓄積症の治療方法に関する。
【００１９】
これらの態様はすべて相互に関連しており、本明細書に提示された全発明の一部を同様に形成しており、任意の組み合わせにおける本発明の好ましい実施形態は、これらの態様のいずれか１つに関連し得、例えば所定の構築物または方法によって形質転換された植物体または細胞は、本発明によってグリコシル化される任意のリソソームタンパク質の生産に提供または使用されることができる。任意の実施形態または好ましい特徴に関する以下の詳細な説明は、すべての態様に同様に関連する。例えば、リソソームタンパク質の産物の特徴は、この方法が、その産物の特徴を有するこのリソソームタンパク質を生産するために選択されることを意味する。特定の方法の工程に関する説明は、この方法の工程によって改変されたタンパク質についても同様に記載している。本発明の細胞は、当該細胞における任意の本発明の製造方法を容易にするように形質転換される。すべてのリソソームタンパク質は、リソソームタンパク質を（治療的または非治療的に）用いる本発明の方法に使用することができる。本発明は、特許請求の範囲においてさらに定義される。
発明の詳細な説明
【００２０】
リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、リソソーム機能の欠陥に起因する約５０種のまれな遺伝性代謝障害の一群である。リソソームはいくつかの重要な酵素を伴って様々な分子を分解する役割を担っている。突然変異のためにこれらの酵素の１つに欠陥があると、大分子は細胞内に蓄積し、最終的にはそれを殺す。リソソーム蓄積症は、通常、脂質、糖タンパク質、またはムコ多糖の代謝に必要なただ１つの酵素の欠損の結果として、リソソームの機能不全によって引き起こされる。
【００２１】
リソソーム蓄積症の治療は主に症候性であり、酵素補充療法が最も一般的である。ＥＲＴは、活性なリソソームタンパク質の取り込み経路を介した細胞中へ投与を必要とする。
【００２２】
伝統的に、ＥＲＴに使用される組換え酵素は、培養された哺乳動物細胞において生産される。近年、代替アプローチとして、植物ベースの発現系が、治療用途のためのリソソーム酵素を産生するために利用されている。哺乳動物細胞ベースの系に比べて、植物ベースの系には、低い生産コスト、哺乳動物の病原体による汚染のリスクの回避、および、蘚類の場合にはＮ−グリコシル化経路の操作が比較的容易であるなど、いくつかの利点がある。しかしながら、植物細胞産生酵素をＥＲＴに使用することを検討する際の主な懸念は、哺乳動物細胞産生酵素とはＮ−グリカン構造が異なることである。特に、植物細胞中で発現されるリソソーム酵素は通常、末端マンノース残基上にマンノース６−リン酸（Ｍ６Ｐ）改変を獲得しない。
【００２３】
本発明は、植物細胞、特にコケ植物細胞において形質転換リソソームタンパク質を産生する新しい方法を提供し、これは驚くべきことに、高度な小マンノシド型（paucimannosidic）グリコシル化、すなわち、分岐−Ｍａｎ＜（Ｍａｎ）２構造中にマンノース残基が少ししかない（例えば２マンノース残基）グリコシル化末端を伴う糖タンパク質の形成をもたらした。これらの構造は、とりわけリソソーム蓄積症の影響を受けた細胞において、取り込みに非常に有効であることが判明した。この改変されたグリコシル化は、リソソームタンパク質にとって非天然であるが、驚くべきことに、該改変されたタンパク質は依然として非常に有効な治療用タンパク質である。
【００２４】
本発明の方法において使用されるリソソームタンパク質は導入遺伝子（例えば哺乳類由来）であって、その起源の哺乳類におけるＥＲＴにおける使用のためのものである。コケ植物において生産されるこれらの形質転換リソソームタンパク質は、リソソーム蓄積症の治療のための治療用タンパク質として使用することができる。従って、当該リソソームタンパク質は、投与されると活性な酵素であり、特にｐＨ約５のようなリソソーム中で生じる状態では活性である。当然ながら、例えば凍結乾燥するなど、不活性な貯蔵形態は可能である。本発明の小マンノシド型（paucimannosidic）グリコシル化は、酵素活性を実質的には妨げないが、リソソームタンパク質の取り込みおよび安定性を媒介する。驚くべきことに、本発明のリソソームタンパク質上のＮ−グリカンは、その治療的使用、特にリソソーム蓄積症の治療における使用を可能にする高い有効性をもたらす。
【００２５】
本発明は、コケ植物に導入遺伝子を導入するための公知の方法を利用することができる。異種タンパク質の生産のためのコケ植物の生物工学的利用に適した形質転換系が開発されている。例えば、成功した形質転換は、パーティクルガンを用いた原糸体組織への直接的なＤＮＡ移入によって行われた。蘚類プロトプラストへのＰＥＧ媒介ＤＮＡ導入も成功裏に達成されている。ＰＥＧ媒介形質転換法は、ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）について何度も記載されており、一過性形質転換体および安定形質転換体の両方をもたらしている（K. Reutter and R. Reski, Pl. Tissue culture and Biotech., 2, 142-147 (1996)）。さらに、マーカーフリーの形質転換は、同様にコケ植物を用いたＰＥＧ媒介形質転換法によって達成することができ（Stemmer C, Koch A and Gorr G (2004), Moss 2004, The 7th Annual Moss International Conference, Freiburg, Germany）、続く複数のヌクレオチド配列の導入のために使用されることができる。
【００２６】
本発明における使用に適したコケ植物の培養に関する詳細な情報、例えばバイオリアクターにおけるのナシゴケ（Leptobryum pyri-forme）およびムラサキミズゴケ（Sphagnum magellanicum）が従来技術において知られている（E. Wilbert, ”Biotechnological studies concerning the mass culture of mosses with particular consideration of the ara-chidonic acid metabolism”, Ph.D. thesis, University of Mainz (1991); H. Rudolph and S. Rasmussen, Crypt. Bot., 3, 67-73 (1992)）。ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）の使用が本発明の目的のために特に好ましい。なぜなら、分子生物学技術がこの生物で行われているからである（R. Reski Bot. Acta, 111, pp. 1-15 (1998)）。コケ植物の培養のために、微量元素のようなサプリメントを含む（Baur et al. (2005) Plant Biotechnol J 3, 331-340）またはを含まない（Weise et al. (2006) Appl. Microbiol. Biotechnol., 70, 337-345）培地を使用することができる。
【００２７】
本発明のリソソームタンパク質組成物の製造方法は、好ましくは、リソソームタンパク質をコードする導入遺伝子をコケ植物植物体またはコケ植物細胞において発現させることを含み、ここで前記リソソームタンパク質はＮ末端分泌シグナルを持って発現され、かつ、該リソソームタンパク質は配列ＶＤＴＭ（配列番号１）を有するＣ末端液胞シグナルを欠く。これにより液胞への標的指向性が回避されるであろう（液胞への標的指向性はリソソームタンパク質の液胞中への貯蔵（排出とは反対に）をもたらし、潜在的には液胞中での異なるグリコールプロセッシングが引き起こされる。依然として小マンノシド型（paucimannosidic）グリコフォームは依然としてある程度は可能である）。驚くべきことに、ゴルジにおいて、液胞への標的指向性なしに、コケ植物特異的組換えタンパク質相互作用に基づいて、異なるグリコシル化経路が、液胞プロセッシングとは無関係に多量の小マンノシド型（paucimannosidic）グリコシル化をもたらした。これは非常に驚くべきことである。なぜならタバコでは、分泌性の非液胞経路は小マンノシド型（paucimannosidic）グリコシル化ではなく主に複合型Ｎ−グリカンの形成を引き起こしたからである（ＵＳ６８８７６９６）。コケ植物はこの改変をもたらす、リソソームタンパク質の特有の認識を有するようである。
【００２８】
配列番号１は効率的な液胞標的指向性をもたらすＣ末端植物液胞標的シグナルである。ある実施形態においては、別の液胞標的シグナルは存在していてもよい（特に非植物シグナル、効率的でない液胞標的指向性および液胞を回避する分泌経路の発現減少をもたらす）。しかしながら、最も好ましい実施形態では、発現中にあるいは最終的に得られた産物においても、液胞標的シグナルは存在しない。液胞標的シグナルはまた、細胞からタンパク質を得た後に、人工的に除去されてもよい。
【００２９】
小マンノシド型（paucimannosidic）Ｎ−グリカンは、複合型Ｎ−グリカンのトリミングに基づいている。ゴルジでは末端のマンノースを残して複合型グリカンから末端ＧｌｃＮＡｃが除去される。コケ植物系の場合、これは（以前は複合型の）Ｎ−グリカンの両分岐に末端マンノースを残すので非常に効率的である。
【００３０】
本発明によれば、通常アミノ酸配列のＮ末端にある、分泌シグナル配列が使用される。Ｎ末端分泌シグナルは輸送ペプチドまたはＥＲシグナル配列とも呼ばれる。それはコードされかつ発現されたアミノ酸配列の一部である。分泌シグナルは細胞のＥＲ中に発現を直接もたらし、分泌のための経路をセットする（または血管性（vascular）シグナルが存在する場合には液胞指定をもたらす）。分泌シグナルは通常、発現中にタンパク質アミノ酸配列から内因的に除去される。これは植物細胞において自然なプロセスである。導入遺伝子の発現産物の適切な局在化を可能にするために、リソソームタンパク質の遺伝子を改変して、植物細胞における局在化を可能にすることができる。好ましくは、ハイブリッド核酸配列が、植物または植物細胞の形質転換のための構築物において使用される。局在化関連領域（例えば哺乳類の酵素の）は、例えば植物体中のＥＲ中および／またはゴルジ中で正確な局在化および細胞輸送を達成するために、植物配列によって置換される。植物分泌シグナルの例は配列番号５であるが、任意の他の植物分泌シグナルが使用されてもよい。それは使用されるコケ植物種の内因性配列であっても、あるいは、それは外来植物配列であっても良いが、まだコケ植物配列であることが好ましい。
【００３１】
本発明の方法は植物（コケ植物）液胞シグナル（配列ＶＤＴＭ（配列番号１）を有する）のないリソソームタンパク質の発現を含む。これによりＥＲからゴルジへの発現経路がもたらされ最終的には分泌に至り、液胞中での最終局在は回避される。コケ植物においては、当該分泌は培養培地中へ直接なされることができる。他の植物では植物細胞のアポプラスト区画への分泌であり得る。驚くべきことに、本発明の方法によって、液胞への留置がなくても、高度のpaucomannosidicグリコシル化が達成されることができた。
【００３２】
最後の工程として、前記植物体または細胞から発現されたリソソームタンパク質が得られる。この目的のために、リソソームタンパク質は細胞からの抽出プロセスより収集され得、これは破壊的であっても非破壊的であっても良い。好ましくは、発現されたリソソームタンパク質は、植物体または細胞の分泌物から、例えば培養培地から、好ましくは産生細胞または産生植物を破壊することなく得られる。次いで、得られたリソソームタンパク質は、例えば、少なくとも８０％（ｍ／ｖ）、好ましくは少なくとも９０％（ｍ／ｖ）、特に好ましくは少なくとも９５％（ｍ／ｖ）、または少なくとも９８％（ｍ／ｖ）または少なくとも９９％（ｍ／ｖ）の濃度に、精製されてもよい。
【００３３】
好ましくは、コケ植物植物体またはコケ植物細胞は、蘚類（好ましくはヒメツリガネゴケ（P.patens））植物体または蘚類細胞である。コケ植物はいずれのコケ植物であってもよいが、好ましくは蘚類、苔類、またはツノゴケ類から選択され、特にｂｒｙｏｐｓｉｄａ網、またはＰｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ属、Ｆｕｎａｒｉａ属、Ｓｐｈａｇｎｕｍ属、Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ属、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ属、およびＳｐｈａｅｒｏｃａｒｐｏｓ属が好ましい。ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）は、高い相同組換え率を有するので、特に好ましい系である。
【００３４】
本発明の主題は、植物体および植物細胞である。本明細書で使用する「植物細胞」とは、単離された細胞、単数化された細胞（singularized cell）を意味しうるが、また、植物組織（好ましくはカルス、原糸体、師部、木部、葉肉、幹、葉、葉状体、クロロネマ（chloronema）、カウロネマ（caulonema）、仮根、または茎葉体（gametophore）から選択される組織）中またはそれの細胞、または植物生物中の細胞も意味しうる。該細胞はプロトプラスト細胞であってもよい。好ましい実施形態では、単離された植物細胞または植物体組織さえも、本発明に従って形質転換され、次いで植物または植物組織に生長するか、または懸濁培養物（例えばバイオリアクター）などの植物細胞培養物のままである（Hohe & Reski, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 81, 2005: 307-311）。
【００３５】
好ましくは、リソソームタンパク質は、さらに、配列ＫＤＥＬ（配列番号２）を持つＣ末端ＥＲ保留シグナルを欠損している。ＥＲ保留シグナルは、ＥＲまたはゴルジ系中での保留をもたらす。これは発現タンパク質に見られるグリコシル化パターンに対して大きな影響を与え得る。なぜならグリコシル化は、改変される基質タンパク質を奪い合ういくつかのグリコシル化酵素による競合的プロセスであるからである。小マンノシド型（paucimannosidic）トリミングはＥＲ保留から利益を得るであろうことは予想することができたが、驚くべきことに、本発明のリソソームタンパク質は、この（または任意の）ＥＲ保留シグナルなしに多量の小マンノシド型（paucimannosidic）Ｎ−グリカンを持って発現された。
【００３６】
配列番号２は、効率的なＥＲまたはゴルジ保持をもたらすＣ末端ＥＲ保留シグナルである。また、Ｃ末端ジリジンモチーフ（ＫＸＫＸ）（これも幾分ＥＲ保留の原因である）も欠損していることが好ましい。いくつかの実施形態では、他のＥＲ保留シグナルが存在してもよい（特に非植物シグナル、効率の低いＥＲ／ゴルジ保留および分泌に向けた区画から区画へのより速いプロセシングをもたらす）。しかしながら、最も好ましい実施形態では、ＥＲ保留シグナルは発現の間も最終的に得られる産物中にも存在しない。ＥＲ保留シグナルは細胞からタンパク質を得た後に人工的に除去されてもよい。
【００３７】
本発明の特に好ましい実施形態に関し、リソソームタンパク質は、植物Ｃ末端ＥＲ保留シグナル配列および植物Ｃ末端液胞シグナル配列を欠いており、特に好ましくは、それはいずれのＣ末端ＥＲ保留シグナル配列もいずれのＣ末端液胞シグナル配列も欠いている。植物シグナルは植物起源であり、植物、特にコケ植物に見られる。それらは、コケ植物において機能的である。上記で説明したように、本発明のコケ植物発現系における高度の小マンノシド型（paucimannosidic）グリコシル化に関し、ＥＲ保留は必須ではなく、液胞処理さえ必要とされない。
【００３８】
好ましくは、リソソームタンパク質は、天然のリソソームタンパク質のアミノ酸を持つＣ末端またはそのトランケーションで終結する発現されたアミノ酸配列を含む。これは当該タンパク質配列への付加は存在しないことを意味する。例え好ましくなくても、トランケーションは可能である。当然のことながらトランケーションは実質的には本発明のリソソームタンパク質の活性に影響を及ぼさない、これは上述のとおり依然として要件である。酵素活性は、哺乳動物、特にヒトの細胞におけるリソソーム条件（例えばｐＨが５）下の天然のリソソームタンパク質と比較して、例えば最大２０％まで減少しうる。トランケーションは最大で５０個、好ましくは最大で４０個、最大で３０個、最大で２０個、最大で１０個、最大で５個、もしくは１個、またはこれらの値のいずれかの範囲（例えば、１個〜１０個等）の天然のリソソームタンパク質のＣ末端アミノ酸の欠失であり得る。トランケーションされたアルファ−ガラクトシダーゼは、例えば米国特許第６，８８７，６９６  Ｂ２（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、このようなトランケーションで活性であることが知られている。
【００３９】
好ましくは、コケ植物植物体またはコケ植物細胞は、ＨＥＸＯ３導入遺伝子を含むかまたは含まない。ＨＥＸＯ３は植物に天然に存在する酵素である。それは、ＨＥＸＯ３活性をさらに増加させるために、導入遺伝子として供給されてもよい（または供給されなくてもよい）。導入遺伝子の導入はリソソームタンパク質導入遺伝子が植物体または細胞に組み込まれるのと同じ方法、例えばゲノム組換えハイブリダイゼーションまたはプラスミド導入によってによって促進され得る。ＨＥＸＯ３は植物の原形質膜を囲むアポプラストにおけるいくつかのpauimannosidicグリコシル化の原因であると言われている（Liebminger et al., J Biol Chem 2011, 286: 10793-10802; Bosch et al., Curr Pharm Des. 2013;19(31):5503-12）が、しかしながら、シロイヌナズナにおいてＬｉｅｂｍｉｎｇｅｒによって見出されたＨＥＸＯ活性は、コケ植物で見出された高度の小マンノシド型（paucimannosidic）グリコシル化を説明することができない。関連酵素ＨＥＸＯ１はいくつかの液胞型小マンノシド型（paucimannosidic）グリコシル化の原因であり、ＨＥＸＯ２はシロイヌナズナではほとんど活性を持たないようである。コケ植物ではより高い活性またはより良い利用可能性がある。
【００４０】
コケ植物のＨＥＸＯはリソソームタンパク質に対して特に活性が高いようである。したがって、本発明は複合型Ｎ−グリカンを含むリソソームタンパク質をプロセシングするインビトロの方法を提供し、該方法は試料中にリソソームタンパク質を提供し、該試料をコケ植物ＨＥＸＯ（好ましくはＨＥＸＯ３酵素）と接触させることを含み、コケ植物ＨＥＸＯ酵素はリソソームタンパク質から末端ＧｌｃＮＡｃ残基を切断し、それによって、小マンノシド型（paucimannosidic）Ｎ−グリカンを産生する。本質的に、コケ植物に見いだされる天然のリソソームタンパク質グリコシル化経路はまた、コケ植物細胞の外で特にインビトロにおいて単離されたＨＥＸＯ酵素を用いて、または他の細胞（好ましくは植物細胞）においてその植物のものをコケ植物（特にヒメツリガネゴケ（p.patens）のような蘚類）由来の活性ＨＥＸＯ酵素で置換することによって、実行されることができる。上述のようにＨＥＸＯ（好ましくはＨＥＸＯ３）遺伝子量を増加するために、この植物は非コケ植物（例えば高等植物）またはコケ植物であり得る。
【００４１】
好ましくは、コケ植物植物体またはコケ植物細胞は、α１，３−フコシルトランスフェラーゼおよび／またはβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼを抑制しているかまたは取り除いている。このような植物酵素は、少なくともゴルジのような天然の活性の場所において、それらの活性または濃度を減少させていてもよい。好ましくは除去される酵素は、ＷＯ２００４／０５７００２に記載されている、アルファ−１，３−フコシルトランスフェラーゼおよび／またはベータ−１，２−キシロシルトランスフェラーゼである。従って、好ましい実施形態によれば、前記植物細胞は、具体的にはノックアウト（特に好ましくは前記植物のα−１，３−フコシルトランスフェラーゼおよび／またはβ−１，２−キシロシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を妨害することによって（好ましくは組換え技術によって発現されたタンパク質のいずれか１つの遺伝子によって中断することによって））に起因する、α−１，３−フコシルトランスフェラーゼおよび／またはβ−１，２−キシロシルトランスフェラーゼの低下した活性（好ましくは完全な機能喪失）をさらに有する。この手段はヒトなどの哺乳動物において免疫原性であり得る植物型グリコシル化の形成を防ぐ。
【００４２】
また、この方法を行うのに適したコケ植物細胞または植物体が提供される。該細胞または植物体は、本方法について比較的に（paratively）記載されたリソソームタンパク質をコードする導入遺伝子、および任意に上記のようなさらなる改変または導入遺伝子を含む。
【００４３】
本発明は本明細書に記載のいずれかの製造方法によって得ることができるリソソームタンパク質組成物をさらに提供する。該リソソームタンパク質は、上記の方法または好ましい改変（variant）または実施形態によって達成されるような任意の特徴を有し得る。該リソソームタンパク質は通常、（トランスジェニック）リソソームタンパク質に関してコケ植物において観察される本発明のリソソーム型グリコシル化パターンを持った複数の該リソソームタンパク質の形で得られる。
【００４４】
特に、本発明は、グリコシル化パターンに従って潜在的に多様にグリコシル化された複数のリソソームタンパク質を含むリソソームタンパク質組成物を提供し、前記グリコシル化パターンは、少なくとも４５％、好ましくは少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、または少なくとも７０％の小マンノシド型（paucimannosidic）Ｎ−グリカンを有する。
【００４５】
本明細書に示された全てのパーセンテージ値は、別段の指示がない限り、モルパーセント（molar percentage）である。
【００４６】
「複数」は本発明のタンパク質の調製物に関するもので、すなわち個別化されたタンパク質ではなく、該細胞または植物体から得られたそのようなタンパク質の肉眼的調製物を含むものであって、これは発現されたときに２つ以上のリソソームタンパク質を含む。当該調製物は、少なくとも１０００タンパク質分子、特に好ましくは少なくとも１０００００分子または少なくとも１００万分子を有しうる。
【００４７】
好ましくは、該組成物のリソソームタンパク質、または本発明の方法によって製造される、または本発明の方法において使用されるリソソームタンパク質は、下記から選択されるいずれか１つである：
α−ガラクトシダーゼ、好ましくはα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）；β−グルコセラミダーゼ（β-Glucoceramidase）、β−グルコシダーゼ（グルコセレブロシダーゼ）；α−マンノシダーゼ；アスパルチルグルコサミニダーゼ；β−マンノシダーゼ；酸性セラミダーゼ（Acid Ceremidase）；α−フコシダーゼ；β−ガラクトシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ活性化タンパク質；ガラクトセレブロシダーゼ、ガラクトセラミダーゼ（Galactoceramidase）；リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）；α−イズロニダーゼ；イズロン酸−２−スルファターゼ；グルコサミン−Ｎ−スルファターゼ、ヘパランスルファスルファミダーゼ（Heparansulfatsulfamidase）（ＳＧＳＨ）；α−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）；（ヘパラン）α−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ；Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ；β−ガラクトシダーゼ；Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ；β−グルコロニダーゼ（β-Glucoronidase）；ノイラミニダーゼ；スフィンゴミエリナーゼ、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ；酸性α−１，４−グルコシダーゼ；β−ヘキソサミニダーゼ、またはそのαサブユニット；α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ＮＡＧＡ）、α−ガラクトサミニダーゼ；β−ヘキソサミニダーゼＡ；ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ；ヒアルロニダーゼ。本発明のすべての実施形態において特に好ましいのはα−ガラクトシダーゼである。好ましいα−ガラクトシダーゼは、ヒトα−ガラクトシダーゼ（例えば配列番号３が挙げられ、これは配列番号４の核酸配列から発現させることができる）またはそこからトランケーションされたα−ガラクトシダーゼである。グルコセレブロシダーゼ、例えばヒトグルコセレブロシダーゼ（例えば配列番号６、これは配列番号７の核酸配列から発現させることができる）も好ましい。α−グルコシダーゼ、例えばヒトα−グルコシダーゼ（例えば配列番号８、これは配列番号９の核酸配列から発現されることができる）も好ましい。他の実施形態において、グルコセレブロシダーゼおよびα−グルコシダーゼは本発明のリソソームタンパク質の群から除外される。
【００４８】
好ましくは、リソソームタンパク質は、式１の構造を含む１つ以上の小マンノシド型（paucimannosidic）Ｎ−グリカンを有する：
【化１】
2018509906.tif 000002
（式１）
［式中、
四角はＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を表し、丸はマンノース（Ｍａｎ）を表し、Ｔ付きの丸は末端マンノースを表す］。この式１（本明細書において「ＭＭ」グリカンとも呼ばれる）は、さらに改変されていてもよいコア構造を表し、小マンノシド型（paucimannosidic）Ｎ−グリカンにおいては、このさらなる改変はまた当該Ｔ−マンノースが末端にある（すなわち該糖鎖の非還元末端にある）限り可能である。末端マンノースはメチル化されていてもよく、特にＯ−メチル化されていてもよい。一般的な改変は、ＧｌｃＮＡｃまたはＭａｎサブユニットの１つ以上が、α１，３−フコシル化、α１，６−フコシル化、および／またはβ１，２−キシロシル化（β1,2-xylosylated）されている場合がある。α１，３−フコシル化およびα１，６−フコシル化（α1,6-fucosylatations）は、還元性ＧｌｃＮＡｃに共通して見出される。β１，２−キシロシル化（xylosylation）は、通常、非末端マンノース（式１においてＴを有さない円）で見られる。本発明によれば、α１，３−フコシル化および／またはβ１，２−キシロシル化は、上記のような生産間にそれぞれの酵素の阻害により防止または低減されることが好ましい。α１，６−フコシル化は存在してもしなくてもよい。植物では珍しいことであるが、それは発現細胞または発現植物体にα１，６−フコシルトランスフェラーゼを導入することで達成されうる。好ましくは、本発明の組成物のリソソームタンパク質のＮ−グリカンのうち、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、式１の構造を含むかまたはそれからなる（モル％）。
【００４９】
本発明の小マンノシド型（paucimannosidic）Ｎ−グリカン構造は、式（２）によって表すこともできる。
【化２】
2018509906.tif 000003
（式２）
【００５０】
式２はさらに糖質サブユニット連結のタイプを示す。右側のＧｌｃＮＡｃは、リソソームタンパク質のアミノ酸配列に結合している。オリゴ糖の還元末端および非還元末端は通常、一番右側に還元末端単糖残基が、そして一番左側に非還元末端が描かれる（例えば式２のように）。一方、本明細書中に記載される短い式では、還元性ＧｌｃＮＡｃは、例えば−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ３のように左側に示されていることに留意されたい。Ｎ−グリカンにおいて、還元性−ＧｌｃＮＡｃは、リソソームタンパク質のアミノ酸鎖中のアスパラギンに結合する。これは左側の「−」（Ａｓｎ残基への結合）によって示されている。小マンノシド型（paucimannosidic）グリコフォームでは、２つの非還元性マンノース末端が存在する（式２では左、式１では上）。
【００５１】
式（２）は高マンノース型および複合型Ｎ−グリカンを含む大抵のＮ−グリカンの共通のコアである（Rayon et al., J Exp. Botany, 1998, 49(326): 1463-1472を参照）。小マンノシド型（paucimannosidic）構造の場合、式（２）の左上および左下の両方のＭａｎが末端であり、一方、高マンノースおよび複合Ｎ−グリカンでは、少なくとも１つのＭａｎは別のＭａｎまたはＧｌｃＮＡｃへのさらなる結合を有している。このコアのα１，３−フコシル化、α１，６−フコシル化および／またはβ１，２−キシロシル化は任意である。α１，３−フコシル化およびβ１，２−キシロシル化は、それぞれの酵素が阻害されない限り、植物においては一般的である（例えば、ＷＯ２００４／０５７００２またはCox et al., Nature Biotechnology 24(12), 2006: 1591-7）。
【００５２】
発現したリソソームタンパク質はある程度のＭＧｎグリカン（式２の末端Ｍａｎの一方にＮ−アセチルグルコサミンが１つ付加）またはＧＧグリカン（式２の各末端ＭａｎにＮ−アセチルグルコサミンが１つ付加）を有しており、これらのＭＧｎグリカンおよびＧＧグリカンは、ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによる処理によって、式１または２の構造に変換することができる。小マンノシド型（paucimannosidic）グリカンを増加させるために、ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ処理は任意の蘚類産生のリソソームタンパク質で行うことができる。小マンノシド型（paucimannosidic）グリカンはもともと高濃度で存在するため、蘚類発現α−ガラクトシダーゼＡは通常β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを必要としない。培養条件によっては、蘚類産生のグルコセレブロシダーゼとα−グルコシダーゼは、時にはβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ処理を必要としうる。本発明のグリコシル化リソソームタンパク質を作製するための他の方法には、昆虫または昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）での発現、糖操作された酵母細胞での発現、および液胞標的シグナルをもつ蘚類での発現を含む（該シグナルは哺乳類の患者において免疫原性であり得るためあまり好ましくない）。本明細書中の「蘚類産生」または「コケ植物産生」リソソームタンパク質は、製造の実際の方法に関わりなく、コケでの生産によって得られうる（すなわち本明細書中に記載されるような多量の本発明の小マンノシド型（paucimannosidic）Ｎ−グリカンを有する）生産物に関する。いずれの製造方法も本発明の生産物を製造するために選択することができ、「蘚類産生」または「コケ植物産生」はまた、非蘚類生産方法におけるこれらの生産物も意味する。「蘚類産生」または「コケ植物産生」は、蘚類で見出されかつ本明細書（例えばプロダクトクレームにおいておよびそのようなプロダクトの説明に）で具体的に定義されるユニークなグリコシル化パターンを表現するために使用される。
【００５３】
本発明の方法によるリソソームタンパク質のコケ植物Ｎ−グリコシル化のユニークな特徴は、本発明のＮ−グリカンにおけるメチル化六炭糖（Ｈｅｘ）、好ましくはメチル化マンノース（Ｍａｎ）の存在である。これらのメチル化マンノースは、末端であれば、本発明のリソソームタンパク質の取り込みを妨げず、それを高めることさえできる。好ましくは、本発明の組成物のグリコシル化パターンは、式ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈｅｘ２−メチル−ＨｅｘのＮ−グリカン（Ｈｅｘは好ましくはマンノースである）を少なくとも１％、より好ましくは少なくとも２％、少なくとも３％、または少なくとも４％（モル％）有する。本発明の方法によれば、該メチル化は通常マンノースの酸素のメチル化であり、特に２−Ｏ−メチル化である。これらは本発明の組成物のリソソームタンパク質の好ましいメチル化である。好ましくは、組成物のＮ−グリカンの少なくとも１％、より好ましくは少なくとも２％、少なくとも３％、または少なくとも４％（モル％）が、メチル化、特にＯ−（例えば２−Ｏ−）メチル化を有する。好ましくは、これらのメチル化Ｎ−グリカンにおいて、少なくとも２つの末端（非還元性）マンノースのうちの１つのみがメチル化されている。
【００５４】
好ましくは、該グリコシル化パターンは以下のＮ−グリカンを含み：
ｉ）  ０％〜３５％、好ましくは０．５％〜３０％、−ＧｌｃＮＡｃ２−（Ｍａｎ２メチル−Ｈｅｘ）；
ｉｉ）  ３０％〜８０％、好ましくは４０％〜７０％、特に好ましくは４５％〜６０％、−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ３；
ｉｉｉ）０％〜３０％、好ましくは４％〜２２％、−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ３−ＧｌｃＮＡｃ；
ｉｖ）  ０％〜１５％、好ましくは２％〜１２％、−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ３−ＧｌｃＮＡｃ２；
ｖ）    ０％〜５％、好ましくは０％〜３％、−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ３−Ｈｅｘ２；
ｖｉ）０％〜１１％、好ましくは１％〜８％、−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ３−Ｈｅｘ３；
ｖｉｉ）０％〜１０％、好ましくは１％〜７％、−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ３−Ｈｅｘ４；
ｖｉｉｉ）０％〜１０％、好ましくは１％〜７％、−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ３−Ｈｅｘ５；
ここで、これらの化合物は全て合わせて合計１００％または１００％未満であり、これは明かである（全ての％はモル％である）。上記のリストに特定されていない他のＮ−グリカンが存在しうるので、１００％未満が可能である。このような他のＮ−グリカンは、０％〜３０％、好都合には０．０１％〜２０％、特に好ましくは０．１％〜１０％であり得る。該特定されたＮ−グリカンｉ）〜ｖｉｉｉ）のいずれか１つは、０％の代わりに少なくとも０．０１％の量であり得る。ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンサブユニットであり、Ｍａｎはマンノースサブユニットであり、Ｈｅｘは六炭糖サブユニットであり、メチル−Ｈｅｘはメチル化六炭糖サブユニット（好ましくは２−Ｏメチル六炭糖）である。このグリコシル化パターンにおいて、−ＧｌｃＮＡｃ２−（Ｍａｎ２メチル−Ｈｅｘ）および−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ３は合わせて少なくとも４５％（モル％）に達する。すなわち、これらは本発明の概要で述べたようこの量に寄与する小マンノシド型（paucimannosidic）Ｎ−グリカンである。上記Ｎ−グリカンｉ）〜ｖｉｉｉ）のいずれか１つにおいて特に好ましいＨｅｘはＭａｎである。上記Ｎ−グリカンｉ）〜ｖｉｉｉ）のいずれか１つにおいて、グリカンの還元末端のＧｌｃＮＡｃはフコシル化されていてもよいし、フコシル化されていなくてもよい。上記のＮ−グリカンｉ）〜ｖｉｉｉ）のいずれかにおいて、分岐点のＭａｎがキシロシル化されているか、またはキシロシル化されていない。
【００５５】
特定の好ましい実施形態において、上記ｉ）〜ｖｉｉｉ）に列挙されるすべてのＮ−グリカンは、前の段落で与えられる好ましい量にある。
【００５６】
また好ましくは、グリコシル化パターンはＮ−グリカンｉ）−ＧｌｃＮＡｃ２−（Ｍａｎ２メチル−Ｈｅｘ）を少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、または少なくとも３％の量で含む。特に好ましくは、それは多くとも３０％、多くとも２５％、多くとも２０％または多くとも１５％の量である。その量は０．５％〜３０％、１％〜２５％、または２％〜２０％の範囲でありうる。
【００５７】
また好ましくは、グリコシル化パターンはＮ−グリカンｉｉ）−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ３を少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％の量で含む。特に好ましくは、それは多くとも８０％、多くとも７５％、多くとも７０％、または多くとも６５％の量である。その量は３０％〜８０％、４０％〜７０％、または４５％〜６０％の範囲でありうる。これは、本発明の最も重要なＮ−グリカンであり、本発明の任意の実施形態においてこれらの量で存在し得る。
【００５８】
また好ましくは、グリコシル化パターンはＮ−グリカンｉｉｉ）−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ３−ＧｌｃＮＡｃを少なくとも０．５％、少なくとも２％、少なくとも４％、または少なくとも６％の量で含む。特に好ましくは、それは多くとも３０％、多くとも２５％、多くとも２０％、または多くとも１５％の量である。その量は０．５％〜３０％、１％〜２５％、または２％〜２０％の範囲であり得る。
【００５９】
また好ましくは、グリコシル化パターンはＮ−グリカンｉｖ）−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ３−ＧｌｃＮＡｃ２を少なくとも０．２％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、または少なくとも２％の量で含む。特に好ましくは、それは多くとも２０％、多くとも１５％、多くとも１２％、または多くとも１０％の量である。その量は０．５％〜１５％、１％〜１２．５％、または２％〜１０％の範囲であり得る。
【００６０】
また好ましくは、グリコシル化パターンはＮ−グリカンｖ）−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ３−Ｈｅｘ２を少なくとも０．０１％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、または少なくとも０．５％の量で含む。特に好ましくは、それは多くとも５％、多くとも４％、多くとも３％、または多くとも２％の量である。その量は０．１％〜５％、０．２％〜４％、または０．５％〜３％の範囲であり得る。
【００６１】
また好ましくは、グリコシル化パターンはＮ−グリカンｖｉ）−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ３−Ｈｅｘ３を少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．７５％、または少なくとも１％の量で含む。特に好ましくは、それは多くとも１１％、多くとも１０％、多くとも８％、または多くとも６％の量である。その量は０．５％〜１１％、１％〜１０％、または２％〜９％の範囲であり得る。
【００６２】
また好ましくは、グリコシル化パターンはＮ−グリカンｖｉｉ）−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ３−Ｈｅｘ４を少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、または少なくとも０．４％の量で含む。特に好ましくは、それは多くとも１０％、多くとも８％、多くとも６．５％、または多くとも５％の量である。その量は０．１％〜１０％、０．２％〜８．５％、または０．３％〜７％の範囲であり得る。
【００６３】
また好ましくは、グリコシル化パターンはＮ−グリカンｖｉｉｉ）−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ３−Ｈｅｘ５を少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、または少なくとも０．４％の量で含む。特に好ましくは、それは多くとも１０％、多くとも８％、多くとも６．５％、または多くとも５％の量である。その量は０．１％〜１０％、０．２％〜８．５％、または０．３％〜７％の範囲であり得る。
【００６４】
本発明のリソソームタンパク質は任意の供給源、好ましくは哺乳動物、特にヒトまたは非ヒト動物（例えばげっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ラクダ、ブタ）のものであることができる。
【００６５】
植物産生糖タンパク質（本発明のコケ植物産生リソソームタンパク質を含む）は通常マンノースリン酸化されていない。また、本発明にしたがって、Ｎ−グリカンは非マンノースリン酸化されていてもよく、特に全くリン酸化されていなくてもよい。リン酸化は、リン酸化酵素を発現細胞に導入することによって、または該細胞からタンパク質を単離した後にリン酸化することによって、人為的に行うことができる。したがって、本発明のリソソームタンパク質組成物は非リン酸化またはリン酸化リソソームタンパク質を含む。好ましくは組成物のリソソームタンパク質のリン酸化Ｎ−グリカンの量は２０％未満、特に好ましくは１５％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満、または０．５％未満（例えば０％）（モル％）である。
【００６６】
本発明のリソソームタンパク質はＰＥＧ化されていても非ＰＥＧ化であってもよい。ペグ化は、患者に投与されたときの溶解性、バイオアベイラビリティ、およびインビボ半減期を改変し得る。Ｎ−グリカン構造が小さいために本発明の小マンノシド型に（paucimannosidiclyグリコシル化されたリソソームタンパク質の半減期は哺乳類産生のリソソームタンパク質と比較して減少することを考えると、ＰＥＧ化はこの欠点を補うのに特に好ましい。インビボでＰＥＧ化の少なくとも部分的な喪失をもたらす可逆的なＰＥＧ化が特に好ましく、例えば加水分解性の結合（例えばシッフ塩基）を導入することにより、細胞取り込みを妨げないようにすることができる。また、細胞取り込み妨害を減少させる手段として、ＰＥＧ化は、短いＰＥＧ鎖（例えば４〜１０００、好ましくは８〜１００、または１０〜５０サブユニットのＰＥＧ）のものであることができる。ＰＥＧの代わりに、短い親水性ポリマーを使用して半減期を増加させることができ、好ましくは１００ｋＤａ未満、１０ｋＤａ未満、または１ｋＤａ未満の分子量である。好ましくは、ＰＥＧは２〜２００、好ましくは３〜１００、または４〜５０のグリコールサブユニットを有する。リソソーム性（lysosomatic）タンパク質は、ＰＥＧ分子の間接的結合のための手段として連結部分を介してＰＥＧ化されることができる。あるいは、直接的結合も可能である。
【００６７】
好ましくは、本発明のリソソームタンパク質は架橋されていない。架橋は細胞の取り込みおよび安定性を妨害する可能性があり、あまり好ましくない。好ましくは、架橋はＰＥＧ化と組み合わされる。例えば、特にタンパク質への結合のための少なくとも２つの官能基を有する二官能性または多官能性ＰＥＧ（例えばビス−ＣＯＯＨ−ＰＥＧまたはビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ）の場合、ＰＥＧは架橋剤として使用されうる。細胞取り込みおよび安定性の妨害を引き起こすという架橋のネガティブな側面を、ＰＥＧ化はマスクすることができうる。
【００６８】
架橋は多量体のリソソームタンパク質、特に好ましくは二量体のリソソームタンパク質の形成をもたらしうる（例えばα−ガラクトシダーゼについて、国際公開第２０１１／１０７９９０号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載さているように）。架橋されたタンパク質では、少なくとも２つのリソソームタンパク質が直接的にまたは連結部分を介して間接的に連結されている。
【００６９】
架橋および／またはＰＥＧ化は、連結部分によってであることができる。例えば、連結部分は、任意に、リソソームタンパク質モノマーの側鎖、Ｎ末端、もしくはＣ末端、または翻訳後の改変に関連する部分（例えば、糖部分）、ならびに別のリソソームタンパク質モノマーの側鎖、Ｎ末端、もしくはＣ末端、または翻訳後の改変に関連する部分（例えば、糖部分）に共有結合する部分である。例示的なそのような連結部分について、以下に詳細に記載される。
【００７０】
あるいは、連結部分は結合しているリソソームタンパク質モノマーの一部（例えば、リソソームタンパク質モノマーの側鎖、Ｎ末端、もしくはＣ末端、または翻訳後の改変に関連する部分（例えば、糖部分）、ならびに、別のリソソームタンパク質モノマーの側鎖、Ｎ末端、もしくはＣ末端、または翻訳後の改変に関連する部分（例えば、糖部分）の一部）を形成する。従って、例えば、連結部分は、モノマーの側鎖、Ｎ末端、Ｃ末端、または翻訳後の改変に関連する部分の官能基（例えばアミン）と別のモノマーの側鎖、Ｎ末端、Ｃ末端または翻訳後の改変に関連する部分の相補的な官能基（例えばカルボキシル）との間の共有結合（例えばアミド結合）であることができる（そのような共有結合はα−ガラクトシダーゼのネイティブ型には存在しない）。他の共有結合、例えばエステル結合（ヒドロキシ基とカルボキシルとの間）；チオエステル結合；エーテル結合（２つのヒドロキシ基の間）；チオエーテル結合；無水結合（anhydride bond）（２つのカルボキシルの間）；チオアミド結合；カルバメート結合またはチオカルバメート結合が挙げられる。任意に、連結部分はジスルフィド結合を欠いている。しかしながら、モノマー間で連結を形成しない位置でジスルフィド結合を含む結合部分（例えば、ジスルフィド結合の切断はモノマー間の連結を切断しない）は、本発明のこの実施形態の範囲内である。ジスルフィド結合がない連結部分の潜在的な利点は、穏やかな還元性条件ではジスルフィド結合のようには切断されないことである。任意に、連結部分は非ペプチド性部分である（例えば、連結部分はアミド結合、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドから構成されない）。あるいは、連結部分はペプチド性部分（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチド）であるか、またはそれを含みうる。任意に、連結部分は、そこに結合するリソソームタンパク質モノマーのいずれかの単なる直線状の延長ではない（すなわち、ペプチド性部分のＮ−末端およびＣ−末端はいずれかのリソソームタンパク質モノマーのＣ−末端またはＮ−末端に直接的には結合しない）。あるいは、連結部分は、融合ポリペプチドを生み出すように、リソソームタンパク質モノマーのＮ−末端と別のリソソームタンパク質モノマーのＣ−末端との直接的な共有結合によって形成される。そのようなポリペプチドはα−ガラクトシダーゼの天然型ではないであろう（それは天然型の２つのリソソームタンパク質モノマーを本質的に含みうるが）。しかしながら、本明細書に記載されたα−ガラクトシダーゼモノマーの共有結合はＮ末端からＣ末端への直接結合以外の形態であることが好ましい。結合部分は、１０〜１０００Ｄａ、好ましくは２０〜５００Ｄａの小さい部分であることが好ましい。
【００７１】
架橋結合および／またはペグ化において、連結部分はリソソームタンパク質への結合のための１つ以上の反応基を含み得る。該反応基は、例えば、チオール基と反応して、またはアミン基と反応して、アミド結合を形成しうる。本明細書において、「反応基」は、結合形成を通常もたらす化学反応を受けることができる化学基を記載する。結合は、本実施形態によれば、好ましくは（例えば、反応基の各々のための）共有結合である。結合形成をもたらす化学反応には、例えば求核性および求電子性置換、求核性および求電子性付加反応、アルキル化、付加脱離反応、環化付加反応、転位反応、および官能基に関係する他の既知の有機反応、ならびにそれらの組合せが挙げられる。反応基は、例えば、反応基の反応性部分を本明細書に記載の連結部分（例えばポリ（アルキレングリコール）またはそのアナログ）に結合する働きをしうる非反応性部分（例えば、アルキル）を任意に含み得る。反応基は、好ましくは、リソソームタンパク質との共役（conjugation）を可能にするように選択される。例示的な反応基には、これらに限定されないが、カルボキシレート（例えば−ＣＯ２Ｈ）、チオール（−ＳＨ）、アミン（−ＮＨ２）、ハロ、アジド（−Ｎ３）、イソシアネート（−ＮＣＯ）、イソチオシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）、ヒドロキシ（−ＯＨ）、カルボニル（例えばアルデヒド）、マレイミド、スルフェート、フォスフェート、スルホニル（例えばメシル、トシル）など、ならびに活性化された基（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（例えばＮＨＳエステル）、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、無水物、ハロゲン化アシル（−Ｃ（＝Ｏ）−ハロゲン）等）が挙げられる。いくつかの実施形態において、反応基は脱離基、例えば求核性置換の影響を受けやすい脱離基（例えばハロ、スルフェート、フォスフェート、カルボキシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を含む。
【００７２】
本発明はまた、本発明のリソソームタンパク質または組成物を医薬として提供する。リソソームタンパク質組成物を患者（例えば哺乳動物）に投与することを含む、リソソーム蓄積症の治療方法がさらに提供される。これに関連して、本発明は、リソソーム蓄積症の治療に使用するための本発明のリソソームタンパク質を提供する。患者は、哺乳動物、特にヒトまたは非ヒト動物（例えばげっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ラクダ、ブタなど）であることができる。タンパク質アミノ酸鎖に対する免疫反応を防ぐため、好ましくは、リソソームタンパク質は、患者と同一種に由来する。
【００７３】
好ましくは、疾患とリソソームタンパク質は下記の表から選択される：
【表１】
2018509906.tif 000004
【００７４】
投与量は好ましくは０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、特に好ましくは０．３〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．３、１、または３ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００７５】
リソソーム蓄積症の治療法はないため、定期的に酵素補充を繰り返し投与する長期的な治療が必要となる。好ましくは、本発明のリソソームタンパク質は、１〜３０日、好ましくは２〜２５日、より好ましくは３〜２３、またはさらには４〜２２日、５〜２１日、６〜２０日、７〜１９日、８〜１８日、９〜１７日、１０〜１６日、または１１〜１５日の間隔で投与される。１４日間隔が特に好ましい。このような間隔での投与は、タンパク質クリアランスに対抗して、細胞リソソームにおける安定した酵素活性を可能にする。
【００７６】
リソソームタンパク質は血管系、特に血流に達する機能的酵素をもたらす任意の経路によって投与され得る。静脈内（ｉ．ｖ．）注入が好ましい。さらなる投与経路には、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、および皮下（ｓ．ｃ．）投与が含まれる。Ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．およびｓ．ｃ．投与経路では、標的組織（心臓、腎臓、肝臓、および脾臓のような）におけるリソソームタンパク質の分布は減少するかもしれず、これらの経路を介してさらに十分な量をこれらの組織に向けて投与することができる。これらの非ｉ．ｖ．経路、特にｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．およびｓ．ｃ．は、より良好な患者の承諾からの利益があり、通常その利益は標的組織分布の減少を上回るものである。さらに、治療用酵素が患者の血漿中で長期間にわたって利用可能であるので、非ｉ．ｖ．投与の薬物動態プロファイルは有益である。
【００７７】
好ましい実施形態において、本願のリソソームタンパク質（コケ植物産生）による治療は、同じタイプで同じ質的な酵素活性であるが非植物（特に哺乳動物または真菌の細胞）産生リソソームタンパク質と組合せられる。非植物産生リソソームタンパク質は、マンノース−６−リン酸受容体（Ｍ６ＰＲ）認識および細胞取り込みのためのリン酸化マンノースを有しうる。また、任意の供給源の（人工的に）リン酸化されたマンノースを有するリソソームタンパク質も本願のリソソームタンパク質と組み合わせて使用されうる。このようなリン酸化または非コケ植物リソソームタンパク質は既に使用されている：例えば、ファブリー病の治療に適するアルファガラクトシダーゼの場合には、アガルシダーゼアルファ（リプレガル（登録商標））およびアガルシダーゼベータ（ファブラザイム（登録商標））；ゴーシェ病の治療に適するβ−グルコセレブロシダーゼとして、アルグルセラーゼ（Ｃｅｒｅｄａｓｅ（登録商標））、イミグルセラーゼ、ベラグルセラーゼアルファ（ＶＰＲＩＶ）；ポンペ病の治療に適しているアルグルコシダーゼアルファ（Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標））；ハンター症候群（ＭＰＳ−ＩＩ）の治療に適しているリソソーム酵素、イズロン酸−２−スルファターゼであるイデュルスルファーゼ（Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標））。他の植物産生リソソームタンパク質（例えばグルコセレブロシダーゼであるタリグルセラーゼアルファ（Ｅｌｅｌｙｓｏ（登録商標）））も組み合わせて使用することが可能である。リン酸化および／または非コケ植物のリソソームタンパク質は、小マンノシド型（paucimannosidic）リソソームタンパク質と架橋されていてもよい。架橋されたダイマーまたはマルチマーは、好ましくはさらにＰＥＧ化されている。これにより、安定性、半減期および取り込みが改善される。
【００７８】
本発明の小マンノシド型（paucimannosidic）グリコシル化を有するリソソームタンパク質はまた、シャペロン、具体的には、同じタイプで同じ質的な酵素活性のリソソームタンパク質の特異的または非特異的シャペロンと組み合わされ得る。リソソームタンパク質の薬理的なシャペロンは、例えば１−デオキシガラクトノジリマイシン（ミガラスタト）である。シャペロンは、リソソーム蓄積症における機能不全の内在性リソソームタンパク質の活性をいくらか改変（再構築）することができる。該内在性リソソームタンパク質はリン酸化リソソームタンパク質であることができるまたは通常そうあり、リン酸化または非コケ植物タンパク質の投与の併用療法に関して上記に記載されるように、本発明の小マンノシド型（paucimannosidic）リソソームタンパク質の受容体相互作用を補完することができる。特定の治療法に限定されるものではないが、シャペロンはリソソーム蓄積症を引き起こす変異が原因で活性が損なわれたリソソームタンパク質の酵素活性を回復または増加することができるようである。特に好ましくは、ミガラスタトは本発明の小マンノシド型（paucimannosidic）またはコケ植物産生α−ガラクトシダーゼと組み合わせて使用され、かつ／またはファブリー病の治療に使用される。
【００７９】
リン酸化または非コケ植物リソソーム酵素（特にリン酸化によりＭ６ＰＲ認識を有するもの）との組合せは本発明の酵素の取り込み活性を補完し、高い効率性およびより広い適用範囲でもって治療的に関連性ある細胞全てに到達するこを可能とする。
【００８０】
本発明は、以下の図および実施例によってさらに説明されるが、本発明のこれらの実施形態に限定されるものではない。実施例のいずれの要素も、上記の本発明の概念と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】リソソームタンパク質（タンパク質配列：ＧＬＡ）発現用のリニアライズされた発現カセット
【図２】α−ｇａｌＡの代表的な精製の中間および最終結果（銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【図３】培養上清からのグルコセレブロシダーゼの精製（クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【図４】培養上清からのα−グルコシダーゼの精製。ＣｏｎＡ−クロマトグラフィーからの濃縮溶出液のクマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ。Ａ）蘚類ＧＡＡ溶出液対アル−グルコシダーゼアルファ（ミオザイム）。Ｂ）蘚類ＧＡＡ溶出液対分子量標準。
【図５】酵素インビトロ特性化。（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシーブルーで染色した酵素調製物。レーン１および２はそれぞれ蘚類ａＧａｌおよびアガルシダーゼアルファである。レーン３および４はＰＮＧａｓｅＦで切断された蘚類ａＧａｌおよびアガルシダーゼアルファである。矢印、切断後のα−ｇａｌＡ酵素；矢頭、ＰＮＧａｓｅＦ（３６ＫＤａ）。タンパク質標準および分子量は左側に示される。（ｂ）ヒトα−ｇａｌＡ特異的ポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロットにより検出された蘚類ａＧａｌおよびアガルシダーゼアルファ（各１ｎｇ）。３つの独立した実験の代表的なデータが示される。（ｃ）人工の基質４−ＭＵ−α−Ｄ−ガラクトピラノシドを用いて測定された酵素調製物の特異的α−ｇａｌＡ活性。タンパク質濃度はＢＣＡアッセイにより測定された。（ｄ）緩衝ヒト血漿に希釈し３７℃で加熱した酵素の安定性（データは３回の平均である）。高ｍａｎｎ：高マンノースａＧａｌ；蘚類ａＧａｌ：蘚類由来のα−ガラクトシダーゼ；Ａｇａｌ−α：アガルシダーゼアルファ；Ａｇａｌ−β：アガルシダーゼベータ。
【図６】インビトロ取り込み試験。（ａ）５ｍＭのＭ６Ｐまたは２ｍｇ／ｍｌの酵母マンナンの存在下または不存在下において、様々な酵素で終夜インキュベートした後のファブリー患者の線維芽細胞（ＤＭＮ９６．１２５）の細胞内α−ｇａｌＡ活性。（ｂ）Ｇｂ３蛍光免疫染色は、無処理ファブリー患者の線維芽細胞におけるＧｂ３の大量のリソソーム蓄積（上）および蘚類ａＧａｌで処理された該細胞において有意に減少したＧｂ３を（下）を示す。（ｃおよびｄ）ファブリー患者の線維芽細胞および微小血管内皮細胞ＩＭＦＥ１におけるＭＲ発現。ＩＭＦＥ１細胞は、ウエスタンブロット（ｃ）および蛍光免疫染色（ｄ）の両方でＭＲポジティブであり、一方、該線維芽細胞はＭＲネガティブであった。（ｅ）５ｍＭのＭ６Ｐまたは２ｍｇ／ｍｌの酵母マンナンの存在下または不存在下において、様々な酵素と終夜インキュベーションした後のＩＭＦＥ１細胞の細胞内α−ｇａｌＡ活性。（ｆ）ＩＭＦＥ１細胞における様々な酵素の取り込み速度。記載の時点で細胞を採取し、細胞内活性を測定した。＊＊＊Ｐ＜０．００１、蘚類ａＧａｌ ｖｓ． 高ｍａｎｎ ａＧａｌまたはアガルシダーゼアルファ。（ｇ）様々な酵素調製物と３時間インキュベーションした後の、ＩＭＦＥ１細胞に内在化されたα−ｇａｌＡのウエスタンブロット分析。（ｈ）様々な酵素のＩＭＦＥ１細胞への結合。４℃で３時間インキュベートした後、細胞表面に結合した酵素を酵素アッセイで測定した。点線はこのアッセイにおけるモック処理されたＩＭＦＥ１細胞の活性レベル（すなわち、バックグラウンドレベル）を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。グラフ中の全てのデータは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３〜４）として示されている。
【図７】血漿薬物動態。（ａ）酵素活性により分析された注入された蘚類ａＧａｌおよびアガルシダーゼアルファの血漿クリアランス。（ｂ）注入１０分後の血漿におけるα−ｇａｌＡのウエスタンブロット。（ｃ）注入５分後および１０分後に、血漿中のα−ｇａｌＡタンパク質量；ウエスタンブロットバンド強度をデンシトメトリーで測定した。（ｄ）注入１０分後の血漿中のα−ｇａｌＡタンパク質量と酵素活性との相関。（ａ）および（ｃ）のデータは平均±ＳＥＭ（ｎ＝４〜５）として示されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１．
【図８】注入された酵素の組織分布。酵素調製物をファブリー病マウスに注射し、腎臓、心臓、脾臓および肝臓におけるα−ｇａｌＡ活性を注射２時間後に測定した。（ａ）臓器における特異的な活性。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）として示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。（ｂ）全臓器における活性を計算し、データは４臓器から回収された総活性に対する％として表示される。（ｃ）ウエスタンブロットにより検出された腎臓ホモジネート中のα−ｇａｌＡタンパク質。矢印、蘚類ａＧａｌ−注入マウスにおける特異的α−ｇａｌＡバンド。アガルシダーゼアルファ注入マウスでは検出可能な特異的バンドは見られなかった。矢頭、アガルシダーゼアルファバンドが移動し得るおおよその位置（図２ｂ、４ｂに示された知見に基づく）。
【図９】注入された蘚類ａＧａｌおよびアガルシダーゼアルファの細胞局在。心臓および腎臓における注入された酵素の細胞分布を、免疫組織化学（ｎ＝２）によって検出した。代表的写真が示された。（ａ）心臓。アステリスクは免疫染色ポジティブ細胞（内皮細胞である可能性が高い）を持つ血管を示し、矢印はポジティブ血管周囲細胞（おそらくマクロファージ）を示す。（ｂ）腎臓。矢印は免疫染色ポジティブ尿細管上皮細胞を示す。スケールバー：２５μｍ。オリジナルの拡大：４００ｘ。
【図１０】：注入された酵素の組織動態学。酵素調製物をファブリー病マウスに注射し、腎臓（ａ）、心臓（ｂ）、脾臓（ｃ）および肝臓（ｄ）におけるα−ｇａｌＡ活性を注射から２、２４、４８、および９６時間後に測定した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝４〜５）として示される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１
【図１１】組織において蓄積したＧｂ３の除去における蘚類ａＧａｌの有効性。腎臓（ａ）、心臓（ｂ）、および肝臓（ｃ）におけるＧｂ３量を、様々な用量の蘚類ａＧａｌまたはアガルシダーゼアルファのいずれかを単回注入した７日後に分析した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４−５）として示される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。各アガルシダーゼアルファ−注入群の上部に示された統計学的有意性はアガルシダーゼアルファおよび同用量の蘚類ａＧａｌ間の差を示す。
【図１２】ｉ．ｐ．投与についての血漿および組織活性
【図１３】ｉ．ｍ．投与についての血漿および組織活性
【図１４】ｓ．ｃ．投与についての血漿および組織活性
【実施例】
【００８２】
実施例１：蘚類におけるヒトα−ガラクトシダーゼの産生
【００８３】
実施例１．１：発現株の構築
天然のシグナル配列の無いα−ガラクトシダーゼＡ（α−ｇａｌＡ）（配列番号３）をコードするヒトＧＬＡ遺伝子（NCBI Reference Sequence:NM_000169.2）のＤＮＡ配列をコドン最適化バージョン（配列番号４）として合成し、GeneArt / Thermo Fisher Scientific（GENEART AG, Regensburg, Germany）によって蘚類発現ベクター中へサブクローニングした。α−ｇａｌＡ発現コンストラクトおよびネオマイシン耐性付与遺伝子（ｎｐｔ  ＩＩ）コンストラクトを有する配列を、制限酵素を用いて該プラスミドからリニアーな発現カセット（図１）として切り取った。
【００８４】
安定なα−ｇａｌＡ産生蘚類細胞株を作るために、Ｎ−グリカン上に植物特異的なα−１，３−フコースおよびβ−１，２−キシロース残基を欠く蘚類ダブルノックアウト株のプロトプラスト（Koprivova et al. (2004) Plant Biotechnol. J. 2, 517-523; Weise et al. (2007) Plant Biotechnol. J. 5(3), 389-401; WO 2004/057002）を、ＰＥＧベース形質転換法（Strepp et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 4368）において、当該精製された発現カセットで形質転換した。形質転換された蘚類細胞を再生し、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性で選択した。２０００の耐性蘚類小植物を、バイオマスあたりの全α−ｇａｌＡ蓄積について、最良株を標準産生株として２回の連続的なラウンドでスクリーニングした。
【００８５】
線状化された発現カセットは以下の遺伝要素を含む：Physcomitrellaアクチンプロモーター（Ｐアクチン）および５’ＵＴＲ、植物シグナルペプチド（ＳＰ）、天然のシグナル配列（ＧＬＡ）のないヒトα−ｇａｌのｃＤＮＡ配列、Physcomitrellaチューブリン３’ＵＴＲ、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Ｐ３５Ｓ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）、およびカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓターミネーター（Ｔ３５Ｓ）（図１）。該植物シグナルペプチドは配列ＭＡＦＹＫＩＳＳＶＦＦＩＦＣＦＦＬＩＡＬＰＦＨＳＹＡ（配列番号５）を含んだ。
【００８６】
発現株は、蘚類由来調節因子の遺伝子制御下でそのゲノムに安定に組み込まれたａＧａｌ導入遺伝子を有する、完全に再生された蘚類植物である。
【００８７】
実施例１．２：酵素生産：
該α−ｇａｌＡ産生株をＷａｖｅ（商標）Ｒｅａｃｔｏｒ  Ｒｏｃｋｅｒ（BioWave 20 SPS, Wave Biotech AG, Switzerland）に設置された２０Ｌ容使い捨てバック（Cellbag 20, GE Healthcare, Germany）中で４週間（２７日）培養した。培養パラメータは以下の通りであった：振とう速度２５〜３０ｒｐｍ、８°角度、ＳＭ０７−培地（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、６．６ｍＭ  ＫＣＬ、２．０ｍＭ  ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、１．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２０．４ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２×４Ｈ２Ｏ、０．０５ｍＭ  ＦｅＮａ−ＥＤＴＡ、４．９ｍＭ  ＭＥＳ、０．１％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００、１００．２６μＭ  Ｈ３ＢＯ３、０．１１μＭ  ＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ、０．１μＭ  ＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ、５μＭ  ＫＩ、８５．３９μＭ  ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ、１．０３μＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ、０．１１ｍＭ  ＮｉＣｌ２×６Ｈ２Ｏ、０．０４μＭ  Ｎａ２ＳｅＯ３×５Ｈ２Ｏ、０．０３９μＭ  Ｚｎ−酢酸×２Ｈ２Ｏ）、２５℃、０．３Ｌ×ｍｉｎ−１加圧エアー（２％〜４％ＣＯ２補充）、および１３０〜３１０μＥ×ｍ−２×ｓ−１での照明、２４時間明るい／日、Osram FQ 24W 840 HO, Lumilux Cool White装備の照明パネルから供給。さらに、１０００×Ｎｉｔｓｃｈビタミン混合物（Nitsch vitamin mixture, Duchefa, Netherlands）をメーカーの指示に従って添加した。発酵のｐＨは、ＷＡＶＥＰＯＤ Ｉ（GE Healthcare）をＰｕｍｐ２０（GE Healthcare）と組み合わせて使って、０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４および０．５Ｍ  ＮａＯＨによる滴定によってｐＨ５〜６で自動的に制御した。
【００８８】
培養終了後、培養ブロスから以下の３段階のろ過カスケードを経て、蘚類フリーの浄化された無菌ろ液を得た：
１）Ｚｅｔａｐｌｕｓ（01SP B3002, 3M, Germany）を装着したカスタマイズされたＰＰろ過ハウジング（Grosse et al. (2014) WO 2014/013045 A1）ケーキろ過による蘚類の収集；
２）二重層スケールアップカプセル（E0340FSA60SP03A, 3M, Germany）による深層ろ過；および
３）最終の無菌ろ過工程（Millipore ExpressTM Plus, 0,22 μm, Millipore, Germany）。
【００８９】
その後、その無菌ろ液を濃縮し、接線流ろ過（ＴＦＦ）（Pall Centramate 500S, 30kDaカットオフセルロース膜）を用いてバッファーを交換した。一連の３つのクロマトグラフィー工程（ブチル−６５０Ｍ、ＤＥＡＥ、Ｓ）の後、単離されたα−ｇａｌＡおよび高ｍａｎｎ α−ｇａｌＡをそれぞれ、約０．５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、製剤用バッファーに移し、特徴付けをした。酵素は、その後の使用まで≦６５℃で保存した。代表的な精製プロセスの結果を図２に示す。
【００９０】
酵素活性の測定：
α−ｇａｌＡ活性を、５ｍＭ  ４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドを用いる蛍光分析により、ｐＨ４．４で０．１Ｍ  Ｎ−アセチルガラクトサミン（α−ガラクトシダーゼＢの特異的阻害剤）の存在下で測定した。タンパク質濃度を、供給者の指示に従ってＢＣＡタンパク質アッセイキット（Pierce）を用いて測定した。該活性はμｍｏｌ／ｍｇタンパク質／時間として表した。結果を図５ｃにまとめた。
【００９１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色：
試料を、還元剤（Invitrogen）を添加したＳＤＳサンプルバッファー中、９５℃で５分間変性させた。ＮｕＰＡＧＥビス−トリス４〜１２％ゲル（Invitrogen）をタンパク質分離に使用した。ＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔ（商標）染色キット（Invitrogen）を使用して、供給業者のマニュアルに従って銀染色を行った。
【００９２】
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）−ＥＬＩＳＡ
精製されたα−ｇａｌＡにおける残存するＨＣＰレベルを定量するために、新規なＨＣＰ  ＥＬＩＳＡが開発された（Biogenes GmbH, Germany）。手短に言えば、それぞれの野生型とのモック発酵を行い、培地を収集し、濃縮した。濃縮されたタンパク質溶液をウサギの免疫化に使用した。総ＩｇＧを用いて、ＨＣＰ定量のためのサンドイッチＥＬＩＳＡを作成した。結果は、精製プロセスにわたり、ＨＣＰの１００００倍の代表的な減少を示す。
【００９３】
実施例１．４：生産の概要
蘚類ａＧａｌの生産を光独立栄養的発酵法にてwave（商標）-rockerに設置された１０Ｌ単回使用使い捨てバック中で行った。抗生物質の不在下で培養された該蘚類は、蘚類ａＧａｌを純粋なミネラル培養培地中に分泌した。培養バッグの照明は、２００μｍｏｌ／ｍ２ｓの平均光子束で外部から行った。最終の培養密度に達した後、蘚類をケーキろ過により培地から分離し、後者を二重層深層フィルターシステムおよび最終の無菌ろ過により浄化した。得られた浄化培地を濃縮し、接線流ろ過で再緩衝化（rebuffered）した。
【００９４】
この濃縮された採取物から、疎水性相互作用（ＨＩＣ）−、陰イオン交換（ＡＩＥ）−および陽イオン交換（ＣＩＥ）−カラムを連続的に用いる３段階クロマトグラフィーアプローチによって酵素を精製した。最後に、最後のカラムからの溶出液を再緩衝化（rebuffered）し、０．５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。精製スキームは、純粋な蘚類ａＧａｌ（宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）レベル〜１００ｐｐｍ、クマシーＳＤＳページ上に単一バンド、ＳＥ−ＨＰＬＣ純度９９％）を代表的な収率３０％で提供した。
【００９５】
実施例２：α−ガラクトシダーゼＡ比較
実施例２．１：酵素生産および活性アッセイ：
小マンノシド型（paucimannosidic）蘚類ａＧａｌを実施例１に記載したようにして得た。この産生株を、高ｍａｎｎ ａＧａｌ産生株を得るために、唯一のヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ遺伝子（Gnt I）を標的とするノックアウトコンストラクトでさらに形質転換した。酵素の細胞取り込みに対する末端マンノシル基の増加の影響を試験するために、遺伝的にβ−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧＮＴ−Ｉ）活性が減らされた株中でもα−ｇａｌＡを産生させた。このノックアウト改変は、その後の酵素工程の基質を欠くため、蘚類の複合型グリカンプロセシングを不能にする。したがって、シス−ゴルジにおけるα−マンノシダーゼＩ媒介トリミングが最後のプロセシング工程であり、それ故、この株の全てのＮ−グリカンは高マンノース型である。この株で生産されたヒトα−ガラクトシダーゼを高ｍａｎｎ ａＧａｌと呼ぶ。生産および精製は実施例１と同じスキームに従った。
【００９６】
哺乳動物細胞産生アガルシダーゼアルファ（Ｓｈｉｒｅ、リプレガル（登録商標））およびアガルシダーゼベータ（ジェンザイム、ファブラザイム（登録商標））を比較試験のために入手した。
【００９７】
細胞ペレットまたはマウス組織を生理食塩水中の氷冷０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中に溶解した。溶解物を１４，０００ｒｐｍで１５分間４℃で遠心分離し、上清を酵素アッセイに使用した。α−ｇａｌＡ活性を、ｐＨ４．４で、０．１Ｍ  Ｎ−アセチルガラクトサミン（α−ガラクトシダーゼＢの特異的阻害剤）の存在下、５ｍＭ  ４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドを用いる蛍光分析によって測定した。タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Pierce）を用いて測定した。活性はｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質／時間として表した。
【００９８】
実施例２．２：グリカン分析：
ＨＩＬＩＣ−ＵＰＬＣ−ＭＳを用いてProtagen protein Services（Dortmund, Germany）によって、蘚類ａＧａｌおよびアガルシダーゼアルファのグリカン分析を行った。手短に言えば、Ｎ−グリカンをＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いて酵素的に該タンパク質から放出した。清浄化および脱塩後、単離したグリカンを２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）を用いて標識した。標識されたグリカンをリニアグラジエント７８％〜５５．９％Ｂ（バッファーＡ：１００ｍＭギ酸アンモニウムｐＨ４．５、バッファーＢ：アセトニトリル）を用いるＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  グリカン（２．１ｘ１００ｍｍ）カラムで３８．５分、６０℃、流量０．５ｍｌ／分で分離した。溶出するグリカンのシグナルを、蛍光検出器（３３０ｎｍ励起、４２０ｎｍ発光）で記録した。それぞれのグリカンへの蛍光ピークの割り当てを記録されたｍ／ｚ値（Xevo-QTOF MS, Waters）およびMasLynx software（Version 4.1, Waters）を用いて行った。
【００９９】
高ｍａｎｎ ａＧａｌのグリカン分析を以下のように行った。約２５μｇのａ−Ｇａｌを還元（１５ｍＭ  ＤＴＴ）、カルバミドメチル化（５５ｍＭヨードアセトアミド）、およびアセトン沈殿（アセトン：水相４：１）した。ペレットを０．１Ｍ重炭酸アンモニウムバッファーに再溶解し、３７℃でトリプシンまたはキモトリプシン（共にシークエンシンググレードのプロテアーゼ、Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のいずれかで１２時間消化した。
【０１００】
約３μｇの各消化物を、水性溶媒として６０ｍＭギ酸アンモニウムバッファーを用いてＢｉｏＢａｓｉｃ  Ｃ１８カラム（ＢｉｏＢａｓｉｃ−１８、１５０×０．３２ｍｍ、５  μｍ、Thermo Scientific）に充填した。３〜７５％アセトニトリルのグラジエントを流量６μＬ／分で２５分かけて展開した。ポジティブイオンモードの標準ＥＳＩ源を装備したＷａｔｅｒｓ  Ｑ−ＴＯＦ  Ｕｌｔｉｍａ質量分析計で検出した。データ解析はＭａｓｓＬｙｎｘ４．０にて手動で行った。
【０１０１】
テーブル１：蘚類ａＧａｌおよび対照酵素のＮ−グリカン分析結果
【表２】
2018509906.tif 000005
【０１０２】
グリカン生化学を考慮して、ＨｅｘＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり、およびＨｅｘはマンノースと見なすことができる。蘚類ａＧａｌのライン１および２、Ｍａｎ３およびＭａｎ３＋メチルは小マンノシド型（paucimannosidic）グリコシル化を示す。驚くべきことに、この画分は約８０％を生じた。高ｍａｎｎおよびアガルシダーゼアルファは対照産物を示す。
【０１０３】
アガルシダーゼアルファと比較して、蘚類ａＧａｌは非常に均質な構造組成を有し、高いバッチ間一貫性を有する。バッチ間の高い一貫性は、再現性と機能期待を保証するために望ましい特性である。
【０１０４】
テーブル２：グリカン均一性／バッチ間安定性
【表３】
2018509906.tif 000006
【０１０５】
実施例２．３：インビトロ熱安定性：
酵素を健常人から得た血漿で希釈し、３７℃で指示の時間加熱した。中性のｐＨを維持するために、ＨＥＰＥＳを最終濃度２０ｍＭで該血漿に加えた。加熱後、α−ｇａｌＡ活性を測定した。
【０１０６】
実施例２．４：インビトロ特性化
蘚類ａＧａｌは、主な構造としてコア型Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を持つ非常に均一なＮ−グリカンを有した（図５）。蘚類ａＧａｌの糖鎖はほとんど独占的にマンノースおよびＧｌｃＮＡｃによって構成されており、その〜８５％はマンノース末端、〜１０％がマンノースとＧｌｃＮＡｃの両方の末端残基を有し、そして〜４％はＧｌｃＮＡｃ末端であった（テーブル１）。これに対し、高ｍａｎｎ ａＧａｌにおいてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は最も量の多いグリカン構造であり（テーブル１）、Ｍａｎ４、Ｍａｎ６、およびＭａｎ７は少量であった。予想どおり、リン酸化グリカンは蘚類ａＧａｌにも高ｍａｎｎ ａＧａｌにも無かった。アガルシダーゼアルファは高度に不均質なグリカン構造を示し、その〜２４％はリン酸化グリカンであり、〜７％がマンノース末端グリカンであり、そして６３％が様々な構造であった（テーブル１）。
【０１０７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、アガルシダーゼアルファよりも速い移動性を持つ単一の主要なバンドとして蘚類ａＧａｌを検出し（図５ａ）、これは蘚類ａＧａｌにおける低糖質量を反映する。ＰＮＧａｓｅ  ＦによりＮ−グリカンを除去した後、蘚類ａＧａｌおよびアガルシダーゼアルファは共に同じ位置に移動した（図５ａ）。高ｍａｎｎ ａＧａｌは蘚類ａＧａｌと同様の移動性を示した。ウエスタンブロット分析において、蘚類ａＧａｌおよびアガルシダーゼアルファの両方をヒトα−ｇａｌＡに対するポリクローナル抗体で検出した（図５ｂ）。同じ量のタンパク質を添加した場合、ウエスタンブロットにおける蘚類ａＧａｌバンドの強度はアガルシダーゼアルファの２．１４±０．５８倍（ｎ＝３）であり、蘚類ａＧａｌ中の短い糖鎖はエピトープへの抗体の接近可能性を促進する可能性があるため、おそらくこのことに起因する。
【０１０８】
蘚類ａＧａｌおよび高ｍａｎｎ ａＧａｌの特異的活性はアガルシダーゼアルファおよびアガルシダーゼベータと類似していた（図５ｃ）。
【０１０９】
ヒト血漿で希釈し３７℃で加熱したとき、蘚類ａＧａｌおよび高マンノース蘚類ａＧａｌはアガルシダーゼアルファまたはアガルシダーゼベータとほとんど同じ安定性を示した（図２ｄ）
【０１１０】
実施例３：ゴーシェ病の治療に適する、蘚類におけるヒトグルコセレブロシダーゼの産生
実施例３．１発現株構築
ヒトＧＢＡ遺伝子（Uniprot identifier P04062- GLCM_HUMAN, NCBI Reference Sequence: NM_000157.3）のｃＤＮＡ配列を合成し、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）（Thermo Fisher Scientific, GENEART AG, Regensburg, Germany）で蘚類発現ベクターにサブクローニングした。使用された配列（配列番号７）は、天然のアノテートされたシグナルペプチド（ＳＰ）の無い（これは２６ａａ植物ＳＰで置き換えられた）（シグナルＰ４．１  web-toolによれば、正確な切断はスコア０．５２２で予測される）ヒトＧＢＡ（配列番号６）をコードした。クローニングを促進（ＨｉｎｄＩＩＩ制限サイトを避けながら）するために、ＧＢＡ配列を、アミノ酸リジンの代替のコドンを用いて、１つの単独塩基内（配列番号７の塩基２１位、ＡＡＡ→ＡＡＧ）で改変した。ＧＢＡ発現コンストラクトおよびネオマイシン耐性付与遺伝子（ｎｐｔ  ＩＩ）コンストラクトを有する配列をリニアーな発現カセットとして、プラスミドから制限酵素を用いて切り出した。
【０１１１】
実施例１．１に記載されているようにそのＮ−グリカン上に植物特異的なα−１，３−フコースおよびβ−１，２−キシロース残基を欠くダブルノックアウト株に基づいた蘚類細胞株を使用した。安定なグルコセレブロシダーゼ産生蘚類細胞株を作成するために、実施例１．１に記載されているように、このグリコ操作されたベーシックな細胞株のプロトプラストをＰＥＧベース形質転換法において精製された発現カセット（図１）で形質転換した。リニアライズされた発現カセットは、α−ｇａｌ配列（ＧＬＡ）の代わりにヒトＧＢＡ配列を使用したことを除いて実施例１．１および図１に記載されたのと同じ遺伝的要素を含む。形質転換された蘚類細胞を再生して、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性で選択した。約７００の耐性蘚類小植物をバイオマスあたりの総グルコセレブロシダーゼ蓄積について、最良株を標準産生株として２回の連続的なラウンドでスクリーニングした。この株で産生されたヒトグルコセレブロシダーゼを蘚類ＧＢＡと呼ぶ。
【０１１２】
実施例３．２：酵素生産および特性化
実施例１．２および実施例２について記載したのと同じ条件および工程を生産のために使用した。グルコセレブロシダーゼを、１０ｋＤａセルロースカセット、陽イオン交換クロマトグラフィー（CaptoS）（捕獲）、およびゲルろ過（Sephadex）（仕上げ）を用いて、接線流ろ過により精製した。精製／濃縮グルコセレブロシダーゼをウエスタンブロッティング、クーマシー／銀染色ＳＤＳページ、および酵素活性アッセイによって分析する。精製した酵素は、その後の使用まで−２０℃で保存した。精製工程を図３に示す。同様に高マンノースリッチグリコシル化を得た。戻って、ＭＧｎおよびＧｎＧｎの形態のより高いＧｌｕｃＮａｃ末端グリカンが見られた。β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによる処置で、高量の小マンノシド型（paucimmanosidic）グリカン体の分布を回復した。
【０１１３】
実施例３．３：酵素アッセイ
精製したグルコセレブロシダーゼの活性をインビトロ酵素活性アッセイによって評価する。グルコセレブロシダーゼを６０ｍＭ  Ｎａ−Ｃｉｔｒａｔ、１．３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、０．１２５％タウロコール酸ナトリウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド中、ｐＨ６、３７℃でインキュベートした。１Ｍ  ＮａＯＨで反応を停止させ、生成物の形成を分光学的に４０５ｎｍで測定した。
【０１１４】
実施例４：ポンペ病の治療に適した蘚類におけるヒトリソソームα−グルコシダーゼの生産
実施例４．１  発現株の構築
ヒトＧＡＡ遺伝子のｃＤＮＡ配列（Uniprot identifier P10253 (LYAG_HUMAN), NCBI Reference Sequence: NM_000152.4）を合成し、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）（Thermo Fisher Scientific, GENEART AG, Regensburg, Germany）によって蘚類発現ベクターにサブクローニングした。使用した配列（配列番号９）は、天然のアノテートされたシグナルペプチド（ＳＰ）の無い（これは２６ａａ植物ＳＰ（シグナルＰ４．１  web-toolによれば、正確な切断はスコア０．８４７で予想された）およびトランケートされるプロペプチドで置き換えられた）ヒトＧＡＡ前駆体（配列番号８）をコードする。（ＰｖｕＩ制限サイトを回避して）クローニングを促進するために、アミノ酸スレオニンの代替コドンを用いることとし、ＧＡＡ配列を１塩基改変した（配列番号９の２４８４位の塩基、ＡＣＧ→ＡＣＡ）。ＧＡＡ発現コンストラクトおよびネオマイシン耐性付与遺伝子（ｎｐｔ  ＩＩ）コンストラクトを有する配列をリニアーな発現カセットとしてプラスミドから制限酵素を用いて切り出した。
【０１１５】
実施例１．１に記載されたように、Ｎ−グリカンに植物特異的なα−１，３−フコースおよびβ−１，２−キシロース残基を欠くダブルノックアウト株に基づく蘚類細胞株を用いた。安定なα−グルコシダーゼ産生蘚類細胞株を作成するために、実施例１．１に記載されているように、このグリコ操作されたベーシックな細胞株のプロトプラストをＰＥＧベース形質転換法において精製された発現カセット（図１）で形質転換した。リニアライズされた発現カセットは、α−ｇａｌ配列（ＧＬＡ）の代わりにヒトＧＡＡ配列（配列番号９）を使用したことおよびおよび蘚類プロモーターが異なるを除いて実施例１．１および図１に記載されたのと同じ遺伝的要素を含む。形質転換された蘚類細胞を再生して、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性で選択した。約６００の耐性蘚類小植物をバイオマスあたりの総α−グルコシダーゼ前駆体蓄積について、最良株を標準産生株として２回の連続的なラウンドでスクリーニングした。この株で産生されたヒトリソソームα−グルコシダーゼを蘚類ＧＡＡと呼ぶ。
【０１１６】
実施例４．２：酵素生産および特性化
実施例１．２および実施例２について記載したのと同じ条件および工程を生産のために使用した。α−グルコシダーゼを、Ｃｏｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂを用いてアフィニティークロマトグラフィーで精製した。α−グルコシダーゼ含有培地を同量の５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ５．２と混合して、適切な結合条件に調整し、クロマトグラフィーカラムに充填した。溶出は、α−Ｄ−メチルグルコシドの濃度を段階的に増加することによって達成した。精製／濃縮されたα−グルコシダーゼをウエスタンブロッティング、クーマシー／銀染色ＳＤＳページおよび酵素活性アッセイによって分析する。精製された酵素は、さらに使用するまで４℃または−２０℃で保存した。濃縮された蘚類ＧＡＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図４に示す。ＭＳ分析により、蘚類ＧＡＡを含むバンドを同定した。
【０１１７】
α−グルコシダーゼは、７つのグリコシル化部位（Ｇ１−Ｇ７と呼ばれる）を有する。ＭＳ／ＭＳで各部位のグリコフォームを決定した。ほとんどの部位（７３％のＧＳ２−ＧｎＭを除いて）の最も強いピークは、ＧｎＧｎ−グリコフォームのピークであることが分かった。したがって、酵素調製物をβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼで処理して、末端ＧｌｃＮａｃを切断して、ＧｎＭおよびＧｎＧｎを小マンノシド型（paucimmanosidic）グリカンに変換した。
【０１１８】
実施例５：蘚類産生α−ガラクトシダーゼＡのマンノース受容体媒介送達は効率的にファブリー病における酵素欠損を是正する
実施例５．１：インビトロ取り込み試験：
ファブリー病患者由来の皮膚線維芽細胞（ＤＭＮ９６．１２５）および内皮細胞株（ＩＭＦＥ１）を、１０％  ＦＢＳのＤＭＥＭおよびＥＧＭ−２ＭＶ（Ｌｏｎｚａ）中でそれぞれ培養した。両方の細胞株は非常に低いα−ｇａｌＡ活性を有し、免疫染色によって検出可能なリソソームＧｂ３蓄積を有する（Shen et al. (2008) Mol Genet Metab 95:163-168）。該細胞をα−ｇａｌＡ調製物（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）と共に５ｍＭ  Ｍ６Ｐまたは２ｍｇ／ｍｌ酵母マンナンの存在下または不存在下で指示された時間インキュベートした。その後、細胞を細胞外α−ｇａｌＡも除去するトリプシン処理（０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ、３７℃）によって収集した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞ペレットを酵素アッセイまたはウエスタンブロット用に溶解した。
【０１１９】
蓄積したＧｂ３の分解における蘚類酵素の能力を試験するために、ＤＮＮ９６．１２５細胞をα−ｇａｌＡ調製物（１０μｇ／ｍｌ）と共に４日間、１〜２日毎に培地を置き換えて、インキュベートした。モック処理細胞を無処理対照として用いた。Ｇｂ３を下記の様に免疫染色で検出した。
【０１２０】
酵素取り込み試験を、ファブリー病患者由来線維芽細胞にて外因性酵素（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を使って行った。１８時間のインキュベーション後、アガルシダーゼアルファまたはアガルシダーゼベータを有する線維芽細胞は細胞内α−ｇａｌＡ活性を著しく増加した（無処理細胞の活性のそれぞれ１１６倍および１３４倍）（図６ａ）。これらの酵素の取り込みはＭ６Ｐによってほぼ完全に阻害され、酵母マンナンによって部分的に阻害され、この取り込みは主にＭ６ＰＲによって行われたことが確認された。蘚類ａＧａｌまたは高ｍａｎｎ ａＧａｌと共にインキュベートされた線維芽細胞は細胞内α−ｇａｌＡ活性の増加は著しく低かった（それぞれ無処理細胞の６．４倍および４．８倍）（図６ａ）。蘚類ａＧａｌおよび高ｍａｎｎ ａＧａｌの両方の取り込みはＭ６Ｐによってもマンナンによっても阻害されなかった。これは、これらの細胞におけるＭＲの発現が少ししか無いことまたは全くないことと一致した（図６ｃ、ｄ）。当該低い取り込みにも関わらず、ファブリー病患者の線維芽細胞におけるＧｂ３のリソソーム蓄積は、４日間の蘚類ａＧａｌまたは高ｍａｎｎ ａＧａｌによる処理後に著しく低下し（図６ｂ）、このことは蘚類α−ｇａｌＡ酵素がリソソームにおける基質の蓄積を下げることができることを示唆する。
【０１２１】
ＥＲＴにおいて静脈内注入された酵素は血管内皮（これは血液と組織の残りの間の最初のバリアを形成する）によって最も良く取り込まれる。さらに、内皮細胞は、ファブリー病のようないくつかのＬＳＤにおいて、主要な疾患関連細胞タイプである。そこで、我々はファブリー病由来微小血管内皮細胞（ＩＭＦＥ１）における酵素的取込みを試験した。ウエスタンブロットおよび免疫染色（図６ｃ，ｄ）により検出した結果、ＩＭＦＥ１細胞はＭＲポジティブであった。一晩のインキュベーション後、蘚類α−ｇａｌＡ酵素はＩＭＦＥ１細胞によって効率的に取り込まれた（図６ｅ）。ＩＭＦＥ１細胞による蘚類ａＧａｌまたは高ｍａｎｎ ａＧａｌの取り込みは酵母マンナンによって主に阻止（〜６０−８０％阻害）され、Ｍ６Ｐによっては少しの阻害であり（〜２−１０％）、このことはＭＲがこの取り込みに主に寄与することを示唆する。ＩＭＦＥ１細胞によるアガルシダーゼアルファまたはアガルシダーゼベータの取り込みは、Ｍ６Ｐ（〜７５−８２％）によって、またマンナンによっても、ほとんど阻害された。
【０１２２】
インビトロ取り込みは、典型的には、一晩のインキュベーション後にプラトーフェーズに達する。動的なフェーズにおける様々なα−ｇａｌＡ調製物の取り込み速度を比較するために、ＩＭＦＥ１細胞を酵素（１０μｇ／ｍｌ）と短時間インキュベートした。高ｍａｎｎ ａＧａｌおよびアガルシダーゼアルファの取り込みは３時間まではほぼ直線的であり、高ｍａｎｎ ａＧａｌの取り込み速度はアガルシダーゼアルファに比べて著しく高かった（図６ｆ）。１時間のインキュベーション後の蘚類ａＧａｌの取り込みは、高ｍａｎｎ ａＧａｌおよびアガルシダーゼアルファよりも著しく高く、１〜３時間でプラトーに達した（図６ｆ）。より多い酵素量（４０μｇ／ｍｌ）の場合を含む繰り返した実験においても同様の結果が得られた。ウエスタンブロットは、タンパク質レベルでこれらの結果をさらに確認した（図６ｇ）。
【０１２３】
酵素結合効率を評価するために、ＩＭＦＥ１細胞を、４℃、Ｍ６Ｐまたはマンナンの存在下または不存在下で、種々の酵素調製物（１０μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。３時間後、細胞表面結合α−ｇａｌＡを酵素活性アッセイにより測定した。この実験条件下で、高ｍａｎｎ ａＧａｌまたはアガルシダーゼアルファとインキュベートされた細胞では、バックグラウンドレベル（無処理細胞の活性）以上のα−ｇａｌＡ活性は検出されなかった（図６ｈ）。蘚類ａＧａｌは、高ｍａｎｎ ａＧａｌまたはアガルシダーゼアルファと比較して、著しく高い細胞結合を有した（図６ｈ）。蘚類ａＧａｌの結合は、Ｍ６Ｐによってではなく、マンナンによって著しく阻害された。
【０１２４】
これらの結果は、培養線維芽細胞と比べておそらくインビボＥＲＴにより関連性が高い培養微小血管内皮細胞を用いたアッセイ系において、蘚類α−ｇａｌＡ酵素の結合および取り込みはアガルシダーゼアルファと比べてより効率的であり、この結合／取り込みはＭＲを介して生じることを示した。これらのインビトロデータはまた、蘚類産生酵素はインビボＥＲＴに適するであろうことを示唆した。蘚類ａＧａｌの結合／取り込みは高ｍａｎｎ ａＧａｌと比べてより効率的であるため、我々はその後の動物研究のために前者を選択した。
【０１２５】
実施例５．２：インビトロ結合試験：
マルチウェルプレート中のＩＭＦＥ１細胞を５ｍＭ  Ｍ６Ｐまたは２ｍｇ／ｍｌマンナンの存在下または不存在下、４℃でα−ｇａｌＡ酵素（１０  μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。培養培地ＥＧＭ−２ＭＶ（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ補充）を使用した。３時間後、細胞を氷冷ＰＢＳで４回洗浄し、４℃で０．２％Ｔｒｉｔｏｎで直接溶解した。該ライセートをタンパク質アッセイおよびα−ｇａｌＡ酵素アッセイに使用した。
【０１２６】
実施例５．３：ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット：
サンプルを、２．５％２−メルカプトエタノールを含むＬＤＳサンプル緩衝液（Invitrogen）中、７０℃で１０分間変性させた。ＮｕＰＡＧＥビス−トリス４−１２％または１０％ゲル（Invitrogen）をタンパク質分離のために使用した。これまでに記載されたように（Shen et al. (2008) Biochem Biophys Res Commun 369:1071-1075）、ウエスタンブロットを行った。使用した一次抗体は、ヒトα−ｇａｌＡに対するウサギポリクローナル抗体（Shire Human Genetic Therapies, Cambridge, MA）、マンノース受容体に対するマウスモノクローナル抗体（clone 15-2, Abcam, Cambridge, MA）、およびＧＡＰＤＨに対するヤギポリクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）であった。α−ｇａｌＡタンパク質レベルをImageJ softwareを用いてデンシトメトリーにより定量化した。
【０１２７】
実施例５．４：免疫蛍光法：
これまでに記載されたように（Shen et al. (2008) Mol Genet Metab 95:163-168）、蛍光免疫染色を行った。使用した一次抗体は、Ｇｂ３に対するマウスモノクローナル抗体（Seikagaku、東京、日本）、およびマンノース受容体（clone 15-2, Abcam）であった。細胞をＤＡＰＩで対比染色した。
【０１２８】
実施例５．５：動物および手順：
ファブリー病マウスをヘミ接合性雄およびホモ接合性雌のペアの交配によって作成した。成体（３〜６月齢）の雌ファブリー病マウスを試験を通して使用した。各実験について、同じ月齢の動物を使用した。Ｇｂ３クリアランス研究に関し、雌ファブリー病マウスは雄ファブリー病マウスよりも研究される。なぜなら雄マウスはテストステロン誘導Ｇｂ３合成を腎臓に有し、蓄積したＧｂ３の分解における注入酵素の影響を混乱させるからである。全ての注射に関し、酵素調製物は生理食塩水に希釈して総量２００μｌ／マウスとし、尾静脈を介してファブリー病マウスに注入した。
【０１２９】
実施例５．６：血漿薬物動態：
酵素調製物を１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で注射した（各ｎ＝５）。血液試料をヘパリン処置されたキャピラリーを用いて尾の出血によって注射後１、５、１０、２０および３０分に採取した。血漿を分離し、血漿中のα−ｇａｌＡ酵素活性を測定した。
【０１３０】
蘚類ａＧａｌまたはアガルシダーゼアルファを１ｍｇ／ｋｇ体重（ＢＷ）の用量で尾静脈からファブリー病マウスに注射し、インビトロα−ｇａｌＡ酵素アッセイにより血漿クリアランスを分析した。蘚類ａＧａｌは、アガルシダーゼアルファと比べてより速く循環から排除された（図７ａ）。蘚類ａＧａｌの短い血漿半減期が、循環におけるより速い酵素不活性化（変成）よりもむしろ、組織によるよりロバストな取り込みに起因することを確認するために、マウス血漿における酵素をウエスタンブロットにより分析した（図７ｂ）。蘚類ａＧａｌに対する抗体のより高い反応性に応じて（図５ｂ）、蘚類ａＧａｌバンドの強度を２．１４のファクターで修正した。結果は、蘚類ａＧａｌ注入マウスの注射後５および１０分のα−ｇａｌＡタンパク質レベルはアガルシダーゼアルファ−注入マウスと比べて著しく低いことを明かにした（図７ｃ）。５および１０分での血漿における蘚類ａＧａｌのタンパク質レベルはそれぞれアガルシダーゼアルファの３７％および２８％であり、これらはおおよそ酵素活性データと一致する（これらの２時点での蘚類ａＧａｌ注入マウス血漿における特異的活性は、アガルシダーゼアルファ注入マウスの４９％および２８％であった）。さらに、血漿中のタンパク質レベルと酵素活性の間には強い相関があった（図７ｄ）。これらのデータは、インビトロ取り込み試験の結果（図６ｆ〜ｈ）と合わせて、静脈内に投与された蘚類ａＧａｌは、アガルシダーゼアルファと比較して、組織における血管内皮細胞および他の細胞により、より効率的に取り込まれることを示唆した。
【０１３１】
実施例５．７：生体内分布：
酵素調製物を１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で注射した（各ｎ＝５）。注射２時間後、マウスに生理食塩水を灌流し（血液を除くために）、心臓、腎臓、脾臓および肝臓を採取した。当該臓器全体をホモジナイズし、α−ｇａｌＡ活性を測定した。腎臓については、両方の腎臓を合わせてホモジナイズした。
【０１３２】
蘚類ａＧａｌまたはアガルシダーゼアルファをファブリー病マウス静脈内注射（１ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ）した２時間後、酵素調製物の組織分布を評価した。蘚類ａＧａｌ注入マウスの腎臓はアガルシダーゼアルファと比べて有意に高い酵素活性を有した（図８ａ）。心臓および脾臓における蘚類ａＧａｌおよびアガルシダーゼアルファのレベルは同等であった（図８ａ）。肝臓における蘚類ａＧａｌのレベルはアガルシダーゼアルファと比べて有意に低かった（図８ａ）。臓器全体あたりの活性を算出し、他の臓器との比を比較した（図８ｂ）。回収された総活性のうち、蘚類ａＧａｌの９４．９％およびアガルシダーゼアルファの９７．５％が肝臓に送達された（Ｐ＜０．０５）。蘚類ａＧａｌ注入マウスの腎臓は全活性の１．９６％を有し、これはアガルシダーゼアルファ注入マウス（０．５８％）よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０５）。ウエスタンブロット分析は腎臓における蘚類ａＧａｌの取り込みがアガルシダーゼアルファと比べて高いことを確認した（図８ｃ）。
【０１３３】
注入された酵素の細胞分布を調べるために、蘚類ａＧａｌまたはアガルシダーゼアルファを１ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ注射した２４時間後のファブリー病マウス組織について免疫組織化学を行った。特異的なシグナルは粒状の細胞質パターンを示し、これはおそらく該酵素のリソソーム局在化を反映する。心臓および腎臓におけるこれら２つの酵素の細胞局在は本質的に同一であった。心臓では、蘚類ａＧａｌおよびアガルシダーゼアルファの両方が毛細管および血管周囲細胞で検出されたが、筋細胞では検出されなかった（図９ａ）。腎臓皮質尿細管上皮細胞（kidney cortical tubular epithelial cell）でいずれかの酵素に関し、特異的な染色が認められるだけであった（図９ｂ）。これらの結果は、アガルシダーゼアルファの細胞分布と一致する。
【０１３４】
実施例５．８：免疫組織化学：
蘚類ａＧａｌまたはアガルシダーゼアルファを尾静脈から１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で注射した（各ｎ＝２）。酵素注射１日後に心臓および腎臓を採取した。無処理雌ファブリー病マウス組織をネガティブコントロールとして使用した。組織をホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、５ミクロン切片を作製した。免疫組織化学は、ジョージタウン大学（ワシントンＤ．Ｃ．）のHistopathology and Tissue Shared Resourceで行なった。手短に言えば、クエン酸緩衝液中での熱誘導エピトープ賦活化の後、切片を３％過酸化水素および１０％正常ヤギ血清で処理し、ヒトα−ｇａｌＡに対するウサギポリクローナル抗体（Shire）と共にインキュベートした。ＨＲＰ標識二次抗体とのインキュベーション後、ＤＡＢ色素原によりシグナルを検出し、切片をヘマトキシリンで対比染色した。シグナル特異性は、一次抗体インキュベーションを省略した対照染色で検証した。無処理のコントロールにおける明るくおよび拡散した非特異的染色と比較して、特異的なシグナルは顆粒状細胞質パターンを示した。
【０１３５】
実施例５．９：組織安定性：
蘚類ａＧａｌまたはアガルシダーゼアルファを尾静脈から１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で注射した。注射２４、４８および９６時間後にマウス（ｎ＝４〜５／群）を灌流し、臓器を採取して、生体内分布で記載されているようにホモジナイズした。
【０１３６】
実施例５．１０：組織動態学
単回静脈内注射の後に、種々の臓器における蘚類ａＧａｌおよびアガルシダーゼアルファのインビボ動態学を調べた。注射の２時間後および２４時間後に、アガルシダーゼアルファ注入マウスと比較して蘚類ａＧａｌ注入マウスの腎臓は有意に高い酵素活性を有した。しかしながら、活性は４８時間と９６時間で同じであった（図１０ａ）。心臓では、２および２４時間で酵素の２つの形態間に有意な差は無かった；しかしながら、注射後４８時間および９６時間で蘚類ａＧａｌの活性はアガルシダーゼアルファと比べて低かった（図１０ｂ）。アガルシダーゼアルファ注入マウスと比較して、蘚類ａＧａｌ注入マウスは、分析した全ての時点で、脾臓において同レベルの活性を、肝臓においては有意に低い活性を有した（図１０ｃ，ｄ）。腎臓および心臓における蘚類ａＧａｌおよびアガルシダーゼアルファの半減期は２〜３日であった。蘚類ａＧａｌは両方の臓器で〜２５％短い半減期を有した。肝臓における蘚類ａＧａｌの半減期はアガルシダーゼアルファに比べて有意に短かった（２４ ｖｓ． ５７時間）。脾臓における両方の酵素形態の半減期は同様であった（〜３０時間）。
【０１３７】
実施例５．１１：組織Ｇｂ３のクリアランス：
６ヶ月の雌ファブリー病マウスを用いた。蘚類ａＧａｌまたはアガルシダーゼアルファを０．３、１および３ｍｇ／ｋｇ体重の用量で尾静脈を介して注射した（各ｎ＝４〜５）。心臓、腎臓、および肝臓を単回注射１週間後に採取した。年齢および性別が一致した無処理のファブリー病およびＷＴマウスを対照として使用した（ｎ＝５）。これまでに記載されたように（Durant et al. (2011) J Lipid Res 52:1742-1746）、組織をホモジナイズし、スフィンゴ糖脂質抽出し、その後、質量分析によるＧｂ３の分析に供した。８つのアイソフォームを分析し、示された結果はこれらのアイソフォームの合計である。Ｇｂ３含有量はμｇ／ｍｇ総タンパク質として表した。
【０１３８】
いずれかの酵素を６箇月のファブリー病マウスに単回静脈内注射した７日後に、蓄積したＧｂ３の分解における蘚類ａＧａｌおよびアガルシダーゼアルファの有効性を比較した。三つの異なる用量（０．３、１および３ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ）を試験した。無処理ファブリー病マウスは、無処理ＷＴコントロールと比較して、腎臓、心臓および肝臓において有意に増加したＧｂ３レベルを有した（図１１ａ−ｃ）。両酵素はこれらの臓器において用量依存的にＧｂ３を減少した（図１１ａ−ｃ）。蘚類ａＧａｌおよびアガルシダーゼアルファは、腎臓および心臓（図１１ａ，ｂ）におけるＧｂ３の除去において、最も高い用量（３ｍｇ／ｋｇ）でアガルシダーゼアルファの心臓のＧｂ３クリアランスが良好であったことを除いては、同等の有効性を示した。肝臓Ｇｂ３の除去において、アガルシダーゼアルファは、蘚類ａＧａｌと比較して、０．３および１ｍｇ／ｋｇの用量ではるかに有効であった（図１１ｃ）。より高い用量（３ｍｇ／ｋｇ）で、これら２つの酵素は同様の肝臓Ｇｂ３レベルをもたらした。
【０１３９】
実施例６：非静脈内経路を介した、ファブリー病のマウスモデルへの蘚類産生組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡの送達
これらの実験の目的は、マウスモデルにおける組織を標的とする蘚類αＧａｌの送達における、非静脈内経路の潜在的有用性を試験することである。
【０１４０】
実施例６．１：方法
実施例１に記載の蘚類ａＧａｌを０．６９ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した。成体（８〜１１ヶ月）雄ファブリー病マウスを用いた。蘚類ａＧａｌを腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、または皮下（ｓ．ｃ．）経路で注射した。後ろ２つの経路では、大腿筋（両側）中および肩の間の緩んだ皮膚の下に酵素をそれぞれ注射した。１、３または１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で試験した。注射後０．５、１、２、４、６および２４時間に血液を採取し、２４時間で臓器を解剖した。サンプルは使用するまで−８０℃で保存した。無処理ファブリー病マウスの血漿（ｎ＝５）をベースライン活性として使用した。血漿および組織中のα−ＧａｌＡ活性を標準な４ＭＵ方法を用いて測定した。
【０１４１】
分光法：酵素反応後、ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ  Ｍ５（Molecular Devices）を用いて放出された４ＭＵの蛍光強度を測定した。この装置をｉ．ｐ．およびｉ．ｍ．注入マウスからの試料（および最近の５年間に我々がアッセイした全ての試料）の分析に使用した。しかし、機械的な問題が最近発生したため、ｓ．ｃ．注入マウス試料については、ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ  Ｐａｒａｄｉｇｍ（Molecular Devices）を用いて蛍光を測定した。ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ  Ｐａｒａｄｉｇｍにおける４ＭＵ標準曲線は優れた直線性（line-arity）を示し、分析したマウス組織および血漿のα−ｇａｌＡ活性は先にＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ  Ｍ５を用いて測定したもの（同一試料を試験した）と非常に近かった。したがって、この研究で２つの異なる分光法を使用することによるデータ変動は非常に小さいはずである。
【０１４２】
実施例６．２：結果および考察：
ｉ．ｐ．経路（図１２）：血漿活性は注射後０．５〜２時間にピークに達し、その後減少し、６時間でベースライン値に戻った。活性は用量依存的であった。心臓、腎臓、肝臓および脾臓における活性は用量依存的に増加した。
【０１４３】
ｉ．ｍ．経路（図１３）：血漿活性は注射後０．５時間でピークに達し、その後急速に減少し、４時間でベースラインレベルに戻った。心臓、腎臓、肝臓および脾臓における活性は用量依存的に増加した。１匹のマウス（＃１４、１０ｍｇ／ｋｇの用量）は、同じ群の他のマウスよりも組織活性が著しく高かった；このサンプルをデータ分析から除外した。
【０１４４】
ｓ．ｃ．経路（図１４）：血漿活性はｉ．ｍ．投与と同様のパターンを示した。全体として、組織活性は用量依存的に増加した。しかしながら、１および３ｍｇ／ｋｇの用量間に心臓および腎臓活性における実質的な差は無かった；これはこの経路の吸収速度が比較的制限されていることに起因するのかもしれない。１０ｍｇ／ｋｇの用量では、組織活性は大きな変動を示した；マウス５匹中２匹は他のマウスよりも劇的に活性が高かった。
【０１４５】
実施例６．３：比較
酵素送達効率はｉ．ｐ．＞ｓ．ｃ．＞（または同様）ｉ．ｍ．の順である。
【０１４６】
ｉ．ｐ． ｖｓ． ｉ．ｖ．：ｉ．ｐ．注射した（１ｍｇ／ｋｇ）マウスの心臓、腎臓、肝臓および脾臓におけるα−ＧａｌＡ活性はｉ．ｖ．注射したマウスの１６％、４９％、１７％および３５％であった（組織安定性試験、１ｍｇ／ｋｇ、注射２４時間後のデータ）。
【０１４７】
ｓ．ｃ． ｖｓ． ｉ．ｐ．／ｉ．ｖ．：ｓ．ｃ．注射はｉ．ｐ．注射と比べて組織への酵素送達は少なかったが、異なる臓器における減少率は比例しなかった。１ｍｇ／ｋｇの用量では、ｓ．ｃ．注射されたマウスの心臓、腎臓、肝臓および脾臓におけるα−ｇａｌＡ活性はｉ．ｐ．注射マウスの６７％、４３％、２２％および２４％であった。これはｓ．ｃ．経路は肝臓および脾臓と比べてより多く酵素を心臓および腎臓へ送達する傾向があることを示唆する。ｉ．ｖ．と比較したとき、同様のパターンが見られた。ｓ．ｃ．の上記臓器における活性はｉ．ｖ．注射マウスの１１％、２１％、４％および９％であった。
【０１４８】
非ｉｖ経路はＥＲＴの代替的な方法である。ｉ．ｐ．は良い方法と思われる。人間での使用を考慮すると、ｓ．ｃ．は良好な候補であるかもしれない。組織量はｉ．ｖ．投与においてよりも低いが、組織では少量しか必要無いので十分な量を投与することができる。単回投与の低い組織活性（例えばｓ．ｃ．  ｖｓ  ｉ．ｖ．）が心臓および腎臓において蓄積されたＧｂ３を減少させるのに十分でない場合、注射を繰り返すことでこの問題を克服することができる。まとめると、改善された患者受容性のようなｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．およびｓ．ｃ．投与のポジティブな側面は、標的組織分布の減少を上回る。
【０１４９】
実施例７：考察
タンパク質の特性と計画されている用途に応じて、異なる発現宿主が選択される。工業的および食品／飼料用のバルクタンパク質は大部分が大腸菌のような原核生物宿主で発現されるのに対して、医薬品タンパク質産生はしばしば、例えばＣＨＯ−（チャイニーズ−ハムスター−卵巣）または植物細胞のような高等真核細胞細胞での発現に依存する。後者の選択肢は、医薬タンパク質（大抵ヒトオリジン）は、例えばＮ−グリコシル化のような複雑な翻訳後修飾（ＰＴＭ）を必要とするという事実に主に基づいている。したがって、異なる真核生物発現系における同一のタンパク質のパラレルな組換え発現は、ＰＴＭに関し異なる生成物品質を生み出す。例えば、Ｎ−グリコシル化の場合、哺乳動物細胞発現系は、同じタンパク質生成物上に数十から数百の異なるＮ−グリカン種を持つ非常に不均一な生成物混合物を生じる傾向がある。対照的に植物ベースの発現系は、産生されたタンパク質に少数（典型的には１０以下）の異なるグリカン種しか存在しない非常に均質なＮ−グリコシル化パターンを特徴とする。
【０１５０】
製薬タンパク質産生の場合、生産システムの選択は、しばしば製品の構造および品質要求によって引き起こされる。本発明は、ＬＳＤに罹患している患者を治療するために組換えリソソームタンパク質を製造する必要性によって推進された。これらの患者は、遺伝性の遺伝子突然変異のためにこの酵素の機能的なバージョンが欠けているので、組換え生産物が通常の酵素補充療法（例えば静脈内注入）による代替物として使用される。標的細胞の表面のマンノース−受容体に結合することによる血流からの効率的な取り込みのためには、末端マンノース残基を有するＮ−グリカンで修飾される必要がある。
【０１５１】
マンノース−末端化Ｎ−グリカンを持つａＧａｌのバージョンを植物発現系で生産するために、通常の方法はＮ−末端へ分泌シグナルおよびＣ−末端へ液胞標的シグナルを加えることによる該タンパク質の液胞指向化を用いたであろう。このアプローチでは、分泌シグナルは新生タンパク質を小胞体（ＥＲ）（ここでそれは前駆体−グリカンで修飾される）中に向かわせる。デフォルトの分泌経路に続いて、タンパク質はゴルジ体に輸送され、そのグリカンはさらに切断および加工され、典型的な複雑な植物Ｎ−グリカン形態にされるであろう。これらのグリカンは２つの末端Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基（グリカンの末端となりうるマンノースを含んでいる）で終わる。
【０１５２】
グリカンアームの最後から２番目のこれら２つのマンノースの露出は次いで、第二の標的ペプチドであるＣ−末端の液胞標的シグナルによって達成される。このペプチドはトランス−ゴルジ−ネットワーク（ＴＧＮ）における液胞局在化受容体に結合し、結合したタンパク質の液胞への標的化を開始する。ここで、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは末端Ｇｌｃ−ＮＡｃｓを切断し、それによりマンノース残基を露出させる。得られたグリカン、「小マンノシド型（paucimannosidic）」と分類され、植物液胞タンパク質では通常である。
【０１５３】
対照的に、本発明は、Ｃ末端液胞シグナルをタンパク質配列に組み込む工程を省く。したがって、組換え産物は、ＴＧＮにおいて液胞に選別されないが、さらにデフォルトの分泌経路をたどる。このアプローチでは、複雑なＮ−グリカンのトリミングおよび末端マンノースの関連する露出は期待されない。なぜなら、小マンノシド型（paucimannosidic）構造は液胞特異的であるとアサインされているからである（Castilho & Steinkellner, 2012, Biotechnology Journal, 7(9), 1088-1098）。
【０１５４】
本発明は、コケ植物におけるＮ−グリカン−トリミングを達成し、そのＮ−グリカンの末端マンノースが露出し、液胞シグナルのないリソソームタンパク質の組換えバージョンを作成した。これは分泌経路につながり、それにもかかわらず、リソソームタンパク質の場合には高量の小マンノシド型（paucimannosidic）糖タンパク質を持つ生成物をもたらす液胞グリコール−プロセシングとは無関係である。
【０１５５】
蘚類ａＧａｌはＭＲを発現する内皮細胞によって効率的に取り込まれ、この取り込みは酵母マンナン、ＭＲ媒介エンドサイトーシスの特異的阻害剤によってブロックされた。蘚類ａＧａｌは、ＭＲを発現しないヒト皮膚線維芽細胞によって効率的には取り込まれなかった。これらの結果は、蘚類ａＧａｌの取り込みがＭＲによって媒介されることを示している。これとは対照的に、アガルシダーゼアルファの取り込みにはＭＲおよびＭ６ＰＲの両方が関わっていた。動物実験では、マウスの心臓および腎臓における蘚類ａＧａｌの酵素活性および貯蔵クリアランス能力は、全体的にアガルシダーゼアルファのそれに匹敵することが明らかになった。これらの結果は、マンノース末端化酵素が、ファブリー病および他のＬＳＤの治療におけるＭ６Ｐ含有酵素と同じ程度に有効であり得ることを示唆している。
【０１５６】
試験された蘚類ａＧａｌは、タンパク質配列および構造に関してそのヒト対応物と一致する。均一なおよび大部分がマンノース末端化されたＮ−グリコシル化は、カスタマイズされた蘚類株における発現によって達成された。さらに、高ｍａｎｎ ａＧａｌの生産に関し、ＧＮＴ−Ｉ（Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ−グルコサミニル（glycosaminyl）トランスフェラーゼＩ）はノックアウトされている。この酵素によるＮ−アセチルグルコサミンの新生グリカンへの転移は、複合型へのさらなるプロセシングのための必須基質を形成する。従って、複合グリカンプロセシングはこのノックアウトにおいてブロックされ、全てのグリコフォームは高ｍａｎｎ型となる。
【０１５７】
我々の研究は蘚類がα−ｇａｌＡおよび他のリソソーム酵素を発現するための有用なプラットフォームであることを示した。１つの態様において、蘚類それ自体が非常に均一なＮ−グリコシル化を特徴とし、例えば哺乳類細胞と比較して、そのタンパク質は高度に再現可能な百分率分布（percentual distribution）でもってグリコフォームの数の劇的な減少を示す。医薬的生産に関して、Ｎ−グリカンの質がタンパク質の治療効力にとって決定的な場合には、これは非常に有利である。
【０１５８】
内皮細胞による蘚類ａＧａｌの取り込みは、アガルシダーゼアルファよりもはるかに効率的であった。これは、注入された蘚類ａＧａｌがインビボで循環からより速く排除されたことと一致していた。内皮細胞がファブリー病における脈管障害および他の症状の病態生理において重要な役割を果たしうることを考慮すると、内皮細胞への有効な送達は、疾患病状を予防または是正するのに有利である。我々の研究はまた、末端マンノース残基が増加したにもかかわらず、高ｍａｎｎ ａＧａｌの内皮細胞への結合／取込みが、小マンノシド型（paucimannosidic）蘚類ａＧａｌよりも効率が悪いことを示した。これは、ＭＲ結合効率が、露出したマンノース残基の絶対数よりむしろ、グリカンのコンフォメーションにより依存するであろうことを示唆した。
【０１５９】
免疫組織化学によって、蘚類ａＧａｌは心臓内の血管内皮および血管周囲細胞で検出され、これはＭＲ分布パターンと全体的にみて一致している。心筋細胞はマンノシル化されたリガンドをＭＲまたはＭＲ様受容体を介して取り込む（endocytose）ことが知られている。当該酵素は筋細胞では検出されなかったが、著しく減少した心臓のＧｂ３（１．０または３．０ｍｇ／ｋｇの蘚類ａＧａｌを投与されたファブリー病マウスにおける〜４５％の減少）は、我々の免疫染色法では検出限界下である少量の酵素は心筋細胞に送達されるかもしれないことを示唆する。腎臓において、蘚類ａＧａｌは尿細管上皮細胞で検出のみされた。腎尿細管がＭＲを発現することは報告されていないため、この取り込みのメカニズムは不明である。可能な解釈は、尿細管細胞がマンノース末端化糖タンパク質のエンドサイトーシスを媒介する他の受容体を発現するということである。ＭＲ様結合活性を持つこの未確認の受容体の存在は、マウス脾臓およびリンパ節において報告されている。メガリン媒介エンドサイトーシスを介した尿細管細胞によるろ過された酵素の再吸収はもう一つの可能性である。
【０１６０】
注射２時間後に分析したとき、蘚類ａＧａｌおよびアガルシダーゼアルファは異なる組織分布を示した。アガルシダーゼアルファに比べて、蘚類ａＧａｌの腎臓への標的指向性は著しく拡張され、肝臓への送達は著しく減少した。腎臓はこの病気で影響を受ける主要な臓器の１つであるので、蘚類ａＧａｌのこの分布パターンは有利である。肝臓では、注入されたアガルシダーゼアルファは、肝細胞および類洞（sinus lining）細胞（内皮および／またはクッパー細胞）の両方に、おそらくＭ６ＰＲ、アシアロ糖タンパク質受容体およびＭＲを介して送達される。注入されたリン酸化酵素に接近可能な大部分のＭ６ＰＲは肝臓に含有される。対照的に、蘚類ａＧａｌは、ＭＲを介して内皮およびクッパー細胞に選択的に送達されるであろう。
【０１６１】
心臓および腎臓において内在化された蘚類ａＧａｌの半減期は、アガルシダーゼアルファよりも短かった。蘚類ａＧａｌにおける低い糖質含量はリソソームにおけるタンパク質分解に対する酵素の感受性の増大をもたらすかもしれず、これはそのことにおそらく関連するのであろう。より速い代謝回転率のため、注射４日後の腎臓における蘚類ａＧａｌの活性はアガルシダーゼアルファのそれと同様であった。腎臓および心臓におけるＧｂ３貯蔵の減少は、注射後４日で残存酵素活性を反映した。
【０１６２】
蘚類ａＧａｌおよびアガルシダーゼアルファの比較は、アガルシダーゼアルファの組織取り込みにおけるＭ６ＰＲおよびＭＲの役割を研究するための有用なモデルとして役立ちうる。前述したように、Ｍ６ＰＲおよびＭＲは両方とも、インビトロでアガルシダーゼアルファの送達を媒介するので、どの受容体経路が体内分布および特定の標的臓器におけるこの酵素の治療反応に対してより責任があるかを決定することは困難である。糖鎖が著しく異なるにもかかわらず、アガルシダーゼアルファおよび蘚類ａＧａｌの心臓および腎臓における細胞局在は驚くほど類似していた。これらの臓器における貯蔵物クリアランス効力も類似していた。言い換えれば、完全な非リン酸化酵素と比較して、アガルシダーゼアルファにおけるＭ６Ｐ残基は、予想されたような、より広い分布やより完全なＧｂ３クリアランスをもたらさなかった。これらの知見は、アガルシダーゼアルファが心臓および腎臓を標的にすることにおいてＭＲ経路がＭ６ＰＲと比べてより重要な役割を果たしているのかもしれないことを示唆した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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