(57)【要約】  生物学的産物を生成するためのシステムおよび方法。いくつかの態様では、前記システムは、実質的に長手方向に沿って延在する複数の入口チャネルが内部に形成された第１の基板と、前記複数の入口チャネルに対応し、実質的に長手方向に沿って延在する複数の出口チャネルが内部に形成された第２の基板とを含み、前記第２の基板は、前記第１の基板と解放可能に係合するように構成される。前記システムはまた、前記基板の間に配置され、それぞれの入口チャネルと出口チャネルとの間にマイクロ流体経路を形成し、生物学的産物を生成することができる生物源材料を選択的に捕捉するように構成された透過性膜を含み、少なくとも１つのチャネルは、前記透過性膜を通して灌流を調節する圧力差プロファイルを制御するため、横方向にテーパ状である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的産物を生成するためのシステムであって、
実質的に長手方向に沿って延在する複数の入口チャネルが内部に形成された第１の基板、
前記複数の入口チャネルに対応し、実質的に長手方向に沿って延在する複数の出口チャネルが内部に形成され、前記第１の基板と解放可能に係合するように構成された第２の基板および
前記基板の間に配置され、それぞれの入口チャネルと出口チャネルとの間にマイクロ流体経路を形成し、生物学的産物を生成し得る生物源材料を選択的に捕捉するように構成された透過性膜を含み、
少なくとも１つのチャネルが、透過性膜を通して灌流を調節する圧力差プロファイルを制御するために、横方向にテーパ状である、システム。
【請求項２】
前記基板が、係合させた場合にそれぞれの入口チャネルと出口チャネルとの間にハーメチックシールを形成するよう構成される、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
少なくとも１つのチャネルの表面と長手方向との間に形成されたテーパ角が約０〜５度の範囲である、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記複数の入口チャネルが、前記第１の基板に形成された入口マニホールドに接続され、前記入口マニホールドが、生物源材料が導入される前記入口チャネルにわたり均一にまたは異なって分布するように構成された、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記システムがさらに、前記第２の表面に形成された出口マニホールドを含み、前記出口マニホールドが、前記出口チャネルに接続され、少なくとも、生成された生物学的産物を含む流体媒体を出口へ導くよう構成された、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記生物源材料が巨核球を含み、前記生物学的産物が血小板または巨核球成分産物を含む、請求項４に記載のシステム。
【請求項７】
前記システムがさらに、１つ以上の生物学的物質を含む流体媒体を前記チャネルに導入することにより、前記システムを選択的に機能化するように構成された供給源を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
１つ以上の生物学的物質が、巨核球；内皮細胞；骨髄細胞；血液細胞；肺細胞および基底膜を含む細胞；ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１０、ＳＤＦ−１、ＦＧＦ−４、Ｓ１ＰＲ１、ＲＧＤＳ、メチルセルロース、ならびにコラーゲン、フィブロネクチン（ｆｉｂｒｉｎｅｃｔｉｎ）、フィブリノゲン、ラミニン、ビトロネクチン、およびそれらの組み合わせを含む細胞外マトリックスタンパク質を含む小分子を含む、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
前記流体媒体が、細胞培養培地、全血、血漿、血小板添加溶液、懸濁培地およびそれらの組み合わせを含む、請求項７に記載のシステム。
【請求項１０】
前記供給源がさらに、生物学的産物の産生を容易にするために選択された所定の範囲内の剪断速度を生成するよう、前記チャネル内の流量を制御するように構成された、請求項７に記載のシステム。
【請求項１１】
前記基板が、ＰＤＭＳ、熱可塑性物、ゼオノアシクロオレフィンポリマー、ガラス、およびそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記透過性膜が、ＰＤＭＳ、熱可塑性物、シルク、ハイドロゲル、またはポリカーボネートを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記透過性膜が、約３マイクロメートル〜約１０マイクロメートルの範囲の大きさの細孔を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記圧力差プロファイルが、各入口および出口チャネルの重なりによって透過性膜において確定される活性領域の少なくとも一部にわたって実質的に均一である、請求項１に記載のシステム。
【請求項１５】
生物学的産物を生成するための方法であって、
所望の生物学的産物を生成し得る生物源材料をバイオリアクタアセンブリに播種する工程であって、前記バイオリアクタアセンブリが、
実質的に長手方向に沿って延在する複数の入口チャネルが内部に形成された第１の基板、
前記第１の基板と解放可能に係合するように構成され、前記複数の入口チャネルに対応し、実質的に長手方向に沿って延在する複数の出口チャネルが内部に形成された第２の基板であって、少なくとも１つのチャネルが内部の圧力差プロファイルを制御するよう横方向にテーパ状となった基板、
前記基板の間に配置され、それぞれの入口チャネルと出口チャネルとの間にマイクロ流体経路を形成し、生物源材料を選択的に捕捉するように構成された透過性膜、を含む工程、
前記所望の生物学的産物を生成するため、所定の流量で前記バイオリアクタアセンブリに流体媒体を導入する工程および
前記バイオリアクタアセンブリから前記所望の生物学的産物を収集する工程、を含む方法。
【請求項１６】
前記生物学的産物が血小板を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記生物源材料が巨核球を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法がさらに、骨髄、末梢血、臍帯血、胎児肝、卵黄嚢、脾臓細胞、または多能性幹細胞から前記生物源材料を生成する工程を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法がさらに、前記バイオリアクタアセンブリを１つ以上の生物学的物質で機能化する工程を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ以上の生物学的物質が、内皮細胞；骨髄細胞；血液細胞および基底膜を含む細胞；ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１０、ＳＤＦ−１、ＦＧＦ−４、Ｓ１ＰＲ１、ＲＧＤＳ、メチルセルロース、ならびにコラーゲン、フィブロネクチン（ｆｉｂｒｉｎｅｃｔｉｎ）、フィブリノゲン、ラミニン、ビトロネクチン、およびそれらの組み合わせを含む細胞外マトリックスタンパク質を含む小分子を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記流体媒体が、細胞培養培地、全血、血漿、血小板添加溶液、懸濁培地およびそれらの組み合わせを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記所定の流量が、血小板を生成するため、出口チャネル内の生理的剪断速度を誘導するように構成された、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記生理的剪断速度が約１０／秒〜２０００／秒の範囲である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記所定の流量が約５，０００〜１５０，０００の範囲である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１つのチャネルの表面と長手方向との間に形成されたテーパ角が約０〜５度の範囲である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記圧力差プロファイルが、各入口および出口チャネルの重なりによって透過性膜において確定される活性領域の少なくとも一部にわたって実質的に均一である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年９月８日に出願された、「ＰＬＡＴＥＬＥＴ  ＢＩＯＲＥＡＣＴＯＲ」と題された米国仮特許出願第６１／２１５，３６９号に基づくものであり、その利益を主張し、それを援用する。
連邦支援研究に関する声明
【０００２】
本開示は、米国国立衛生研究所によって授与されたＲ００ＨＬ１１４７１９号の下で政府の支援を受けてなされたものである。米国政府は本開示において一定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、一般にマイクロ流体デバイス、そのようなデバイスを含むシステム、ならびにそのようなデバイスを使用する方法およびシステムを含む流体システムに関する。より詳細には、本開示は、生物学的産物を生成するためのデバイス、システム、および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
血小板（ｂｌｏｏｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔ）、すなわち血小板（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅ）は、血液中を循環する不規則な円盤状の細胞フラグメントであり、止血、血管新生、および先天性免疫に不可欠である。インビボ（生体内）では、血小板は細胞により産生され、巨核球として知られる。図１に示すように、骨髄で生成された巨核球は移動し、血管を覆う内皮細胞に接触する。そこで、巨核球は、内皮の間隙を介して、血小板前駆細胞と呼ばれる長い分岐した細胞構造を血管空間に伸長させる。血流に起因する剪断速度を経験することにより、血小板前駆細胞は伸長し、血小板を循環系に放出する。一般的に、正常な血小板数は、１マイクロリットルの血液あたり１５０，０００〜４００，０００個の範囲である。しかしながら、血小板数が低レベルに下がると、患者は、血小板減少症として知られる状態を発生し、出血による死亡の危険にさらされる。血小板減少症の既知の原因としては、悪性腫瘍およびそれを処置するために使用される化学療法、免疫障害、感染ならびに外傷が挙げられる。
【０００５】
有害な免疫系反応、敗血症に起因する危険性、およびウイルス汚染に関する深刻な臨床上の懸念にもかかわらず、血小板減少症の処置は、一般的に、完全にヒトドナーから誘導される代替血小板を使用することを含む。しかしながら、輸血から血小板を得るプロセスは、時間がかかり、費用がかかり、そして多くの場合、複数の適合するドナーを見つけることを必要とする。さらに、収集した血小板の有用性は、細菌試験および劣化による短い貯蔵寿命のため制限される。そのうえ、存在が知られていないウイルスのスクリーニングは不可能である。需要の増加によるドナー不足とドナーのプールにほぼ動きがないこととが組み合わさって、医療従事者が血小板減少症や低血小板数に関連する他の状態の患者を適切にケアすることが困難になってきている。輸血の代替としては人工的な血小板代替物の使用が挙げられるが、これまでのところ、生理的血小板産物の置換に失敗してきた。
【０００６】
いくつかのアプローチでは、様々な細胞培養技術を用いた機能性ヒト血小板の産生が試みられてきた。具体的には、種々の幹細胞から得られた巨核球を使用して、実験室で血小板が産生されてきた。用いられる幹細胞としては、典型的には、胚性幹細胞、臍帯血幹細胞および誘導多能性幹細胞が挙げられてきた。他の幹細胞源としては、骨髄、胎児肝臓および末梢血中に見出される幹細胞が挙げられてきた。しかしながら、実験室において機能性血小板の産生に成功したにもかかわらず、臨床環境における使用には多くの制限が残っている。
【０００７】
たとえば、最先端の培養方法を用いて、ヒト巨核球の約１０％のみが血小板前駆細胞の産生を開始することが示された。これにより、ＣＤ３４＋臍帯血由来または胚性幹細胞由来の巨核球当たり、１０〜１００個の血小板の収量が得られたが、ＣＤ３４＋臍帯血由来または胚性幹細胞由来の巨核球自体の入手可能性が制限されている。たとえば、平均的な単一のヒト臍帯血ユニットは、約５・１０６個のＣＤ３４＋幹細胞を産生することができる。これは、エキソビボでの血小板産生において大きな制約となる。さらに、細胞培養物は、生理的微小環境を再現することができず、これにより、細胞外マトリックスの組成、骨髄の硬さ、内皮細胞の接触、および血管の剪断速度の個別制御は制限されていた。そのうえ、細胞培養物は血小板前駆細胞の産生を同期化することに成功せず、その結果、血小板の貯蔵寿命の道理である６〜８日間にわたり、不均一な血小板が放出されていた。
【０００８】
したがって、上記観点から、増加する臨床上の必要性を満たし、ドナー収集および貯蔵に関する危険および費用を回避することができる、臨床的に適切な血小板収量を産生する効率的な方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本開示は、血小板および他の生物学的産物の効率的かつ拡張性のある生産が可能なシステムおよび方法を提供することによって、上述の技術の欠点を克服するものである。具体的には、本開示は、臨床的および商業的に適切な生物学的産物の生成を目的とした多くの特徴および能力を含む様々なバイオリアクタの実施形態を記載する。いくつかの態様では、本明細書に記載のシステムおよび方法は、血小板注入に使用できる高い血小板収量を生成するために用いられ得る。このように、現在の置換療法の多くの重大な欠点は、主にヒトドナーからの輸血に依存しているため、克服することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
以下に説明するように、いくつかの態様では、提供されるバイオリアクタの実施形態は、ヒト体内における血小板産生に関する生理的状態およびプロセスを再現するように構成され得る。具体的には、提供されるバイオリアクタの実施形態は、血小板産生を促進することができる様々な材料および物質を使用した選択的機能化のために構成され得る。また、均一な生物学的材料の捕捉および制御可能な剪断応力のための能力を含むことにより、血小板および他の生物学的産物の効率的な産生が記載された、バイオリアクタの実施形態を用いて達成され得る。いくつかの設計において、提供されるバイオリアクタの実施形態は、迅速な組み立ておよび分解のために構成され、熱可塑性成形および他の大規模製造プロセスに適合させることができる。
【００１１】
本開示の１つの態様によれば、生物学的産物を生成するためのシステムおよび方法が提供される。前記システムは、実質的に長手方向に沿って延在する複数の入口チャネルが内部に形成された第１の基板と、前記複数の入口チャネルに対応し、実質的に長手方向に沿って延在する複数の出口チャネルが内部に形成された第２の基板とを含み、前記第２の基板は、前記第１の基板と解放可能に係合するように構成される。前記システムはまた、前記基板の間に配置され、それぞれの入口チャネルと出口チャネルとの間にマイクロ流体経路を形成し、生物学的産物を生成することができる生物源材料を選択的に捕捉するように構成された透過性膜を含み、少なくとも１つのチャネルは、前記透過性膜を通して灌流を調節する圧力差プロファイルを制御するため、横方向にテーパ状である。
【００１２】
本開示の別の態様によれば、生物学的産物を生成するための方法が提供される。この方法は、所望の生物学的産物を生成することができる生物源材料をバイオリアクタアセンブリに播種することを含み、前記バイオリアクタアセンブリは、実質的に長手方向に沿って延在する複数の入口チャネルが内部に形成された第１の基板と、前記複数の入口チャネルに対応し、実質的に長手方向に沿って延在する複数の出口チャネルが内部に形成され、前記第１の基板と解放可能に係合するように構成された第２の基板とを含み、少なくとも１つのチャネルは、内部の圧力差プロファイルを制御するため、横方向にテーパ状である。前記バイオリアクタアセンブリはまた、前記基板の間に配置され、それぞれの入口チャネルと出口チャネルとの間にマイクロ流体経路を形成し、生物源材料を選択的に捕捉するように構成された透過性膜を含む。前記方法はまた、所望の生物学的産物を生成するため、所定の流量で前記バイオリアクタアセンブリに流体媒体を導入すること、および前記バイオリアクタアセンブリから所望の生物学的産物を収集することを含む。
【００１３】
本開示の上述および他の態様ならびに利点は、以下の説明から明らかになるであろう。以下の説明では、本明細書の一部を形成し、本開示の好ましい実施形態を例として示す添付の図面が参照される。しかしながら、そのような実施形態は必ずしも本開示の全範囲を表すものではなく、したがって、本開示の範囲を解釈するために特許請求の範囲および本明細書が参照される。
【００１４】
以下に添付の図面を参照して本開示を説明し、ここで、同様の参照番号は同様の要素を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】骨髄におけるインビボでの血小板産生を示す図である。
【図２】本開示の態様による生物学的産物を産生するためのシステムの概略図である。
【図３】本開示の態様によるバイオリアクタの実施形態を示す図である。
【図４Ａ】図３のバイオリアクタを含むバイオリアクタアセンブリの一実施形態を示す斜視図である。
【図４Ｂ】図４Ａに示す実施形態の断面図である。
【図４Ｃ】図４Ａに示す実施形態の別の断面図である。
【図５Ａ】本開示の態様による例示的なシステムを示す。
【図５Ｂ】図５Ａのシステムに含まれるバイオリアクタを示す。
【図６】本開示の態様によるバイオリアクタの実施形態を示す。
【図７Ａ】本開示の態様による分解されたバイオリアクタアセンブリの実施形態を示す。
【図７Ｂ】図７Ａのバイオリアクタアセンブリを示す。
【図８】本開示の態様によるシステムの別の実施形態を示す。
【図９Ａ】本開示の態様によるバイオリアクタのさらに別の実施形態を示す。
【図９Ｂ】本開示の態様によるバイオリアクタのさらに別の実施形態を示す。
【図１０】本開示の態様によるシステムを示す概略図である。
【図１１】本開示の態様によるバイオリアクタのさらに別の実施形態を示す。
【図１２】本開示の態様によるバイオリアクタのさらに別の実施形態を示す。
【図１３】本開示の態様によるプロセスの工程を示すフローチャートである。
【図１４Ａ】静的培養を用いて産生された巨核球を示すグラフである。
【図１４Ｂ】静的培養を用いて産生された血小板前駆細胞および血小板を示すグラフである。
【図１４Ｃ】本開示の態様に従って産生された巨核球を示すグラフである。
【図１４Ｄ】本開示の態様に従って産生された血小板前駆細胞および血小板を示すグラフである。
【図１５】本開示の態様による血小板産生のタイムラインを示すグラフである。
【図１６】本開示の態様によるバイオリアクタのさらに別の実施形態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本開示は、血小板および他の生物学的産物の効率的かつ拡張性のある生産が可能なシステムおよび方法を提供する。
【００１７】
図２を参照すると、血小板および他の生物学的産物を産生するための例示的なシステム１００の概略図が示されている。一般的に、システム１００は、生物源１０２、バイオリアクタアセンブリ１０４、および出力１０６を含み、生物源１０２および出力１０６は、アセンブリ１０４の種々の入力および出力にそれぞれ接続可能である。
【００１８】
具体的には、生物源１０２は、血小板などの所望の生物学的産物を効率的に産生するために、異なる生物源材料、物質、気体または流体媒体をアセンブリ１０４に導入するための様々な能力を備えて構成され得る。たとえば、生物源１０２は、バイオリアクタアセンブリ１０４内の流体媒体を送達または維持するための１つ以上のポンプを含み得る。例としては、マイクロ流体ポンプ、シリンジポンプ、蠕動ポンプなどが挙げられる。
【００１９】
図２に示すように、いくつかの実施例では、システム１００はまた、生物源１０２を制御するためのコントローラ１０８を含み得る。具体的には、コントローラ１０８は、中に導入された生物源材料、物質、流体媒体またはガスのタイミング、量、およびタイプを含む、バイオリアクタアセンブリ１０４の運転を制御するように構成されたプログラム可能なデバイスまたはシステムであってもよい。いくつかの態様では、コントローラ１０８は、ヒト体内における血小板産生に関する生理的状態およびプロセスを再現するために、アセンブリ１０４を選択的に機能化および／または操作するように構成され得る。たとえば、コントローラ１０８は、選択された数の巨核球をアセンブリ１０４に送達するようにプログラムされ得る。さらに、コントローラ１０８は、血小板前駆細胞の伸長および血小板産生を促進するために、バイオリアクタアセンブリ１０４内の流体流量または流体圧力を制御し得る。たとえば、コントローラ１０８は、バイオリアクタアセンブリ１０４内に構成された種々のチャネルにおいて最大１５０，０００マイクロリットル／時間の流量を確立し得る。
【００２０】
コントローラ１０８は、生物源１０２とは別個のものとして図２に示されているが、これらは単一のユニットに組み合わされてもよいことが理解されよう。たとえば、生物源１０２およびコントローラ１０８は、プログラム可能なマイクロ流体ポンプまたは注入システムで具体化され得る。さらに、いくつかの実施例では、コントローラ１０８および／または生物源１０２はまた、バイオリアクタアセンブリ１０４の温度、露光、振動、および他の条件を調節できるシステムまたはハードウェア（図２には示さず）を含み、それらと通信し、またはそれらからのフィードバックを受信してもよい。一例として、図８は、ヒータ８０４に接続されたコントローラ８０２と、温度を監視および制御するための熱電対８０６とを含むバイオリアクタシステム８００を示す。図８に示す構成は非限定的であると理解されるべきであり、任意の数のヒータおよびヒータ配置が可能であり得る。
【００２１】
再び図２を参照すると、一般的に、出力１０６は、バイオリアクタアセンブリ１０４内で生成された様々な生物学的産物を含む流体媒体を受け取るように構成される。しかしながら、いくつかの実施例では、以下に説明するように、そのような流出物はバイオリアクタアセンブリ１０４内に再送するかまたは循環させて戻してもよい。このようにして、より少ない流体体積を利用することができ、生成された生物学的産物をより濃縮することができる。いくつかの態様では、出力１０６はまた、受け取った流体媒体を収集し、格納し、および／またはさらに処理する能力を含み得る。
【００２２】
上述のシステム１００は、広範囲の機能を有し、生理的条件またはプロセスを複製すること、または血小板を産生することに限定される必要はないことが理解されよう。すなわち、システム１００は、多種多様な生物学的産物を生成するために使用され得る。たとえば、システム１００は、巨核球および他の細胞などの様々な生物源材料または物質を分離、分解または溶解し、それらの産物または内容物を収集するために使用され得る。具体的には、流体の流れおよび圧力ならびに他の条件を制御することによって、捕捉された生物源材料の種々の内容物が放出され、その後収集され得る。いくつかの態様では、システム１００はまた、所望の生物学的産物を生成するのに必要な生物源材料を得るため、巨核球などの様々な細胞、生物学的物質または材料を分化および／または培養するのに利用され得る。生物学的産物の例としては、成長因子、および細胞内に見られる他の成分が挙げられる。本開示による産生された生物学的産物は、臨床用途に加えて、細胞培養培地、および化粧品、シャンプー、皮膚用添加物、クリームまたは洗浄剤などの美容製品の成分としての使用を含む様々な用途において使用され得る。
【００２３】
次に、上記システム１００の様々な実施形態を説明する。これらは非限定的な例であって、実際に様々な修正または組み合わせが可能であり、当業者によって本出願の意図された範囲内にあるとみなされることが理解されよう。
【００２４】
ここで図３を参照すると、本開示の態様による非限定的なマイクロ流体バイオリアクタ３００が示されている。一般的に、バイオリアクタ３００は、第１の基板３０２と、第２の基板３０６と、これらの間に配置された透過性膜３０４とを含む。
【００２５】
特に、第１の基板３０２は、その内部に形成された多数の入口チャネル３０８または入口チャンバを含み得る。図３に示すように、いくつかの実施形態では、前記チャネルは互いにほぼ平行に配置され、実質的に長手方向（たとえば、ｘ方向）に沿って延在し得る。しかしながら、本開示に記載されているように、血小板および他の生物学的産物の産生を達成することができる任意のチャネル配置が可能であり得ることが理解されよう。また、入口チャネル３０８は、第１の基板３０２に形成された入口マニホールド３１２を介して入口ポート３１０に接続されてもよく、入口マニホールド３１２は、それを通過する流体媒体のための類似または同等の流体経路を提供するように構成される。このような構成は、バイオリアクタ３００全体にわたって、均一に様々な生物学的物質または材料を分配するために有利であり得るか、または異なる流体経路内で様々な生物学的物質または材料を選択的または差別的に分配するように操作され得る。たとえば、流体媒体中に分散されたある濃度の血小板産生巨核球細胞は、１回の注入工程で入口ポート３１０に導入され、透過性膜３０４を通じて同様の密度または空間分布を達成することができる。代替的な構成では、各入口チャネル３０８は、異なる大きさのまたは別個の入口ポートを含み得る。
【００２６】
第１の基板３０６は、それぞれが各入口チャネルに対応し、実質的に長手方向に沿って平行に延在する、複数の出口チャネル３１０または出口チャンバを含み得る。同様に、第２の基板３０４も、内部に形成された出口マニホールド３１６を含むことができ、前記出口マニホールド３１６は出口チャネル３１４に接続され、様々な生物学的産物、物質または材料を含む流体媒体が、出口ポート３１８を介して出力するように構成される。
【００２７】
一例として、上述の基板は、１０ｍｍ〜１００ｍｍの範囲の横方向寸法、および１〜１０ｍｍの範囲の厚さを有し得るが、他の寸法をとることも可能である。また、入口チャネル３０８および／または出口チャネル３１４の長手方向寸法は、１０００〜３０，０００マイクロメートルの範囲であり、より具体的には１０００〜３０００マイクロメートルの範囲内であり、少なくとも１つの横方向寸法は、１００〜３，０００マイクロメートルの範囲であってもよく、より具体的には１００〜３００マイクロメートルの範囲であってもよい。他の寸法をとることも可能である。以下に説明するように、いくつかの実施形態では、入口チャネル３０８または出口チャネル３１４は、透過性膜３０４を通して灌流を調節する活性接触領域にわたって、チャネル間の剪断速度または圧力差を制御するために、全体的にまたは長手方向寸法の一部にわたって横方向にテーパ状であってもよい。
【００２８】
特定の用途または用途に応じ、バイオリアクタ３００の様々な実施例が可能である。特に、いくつかの実施形態では、入口チャネル３０８および出口チャネル３１４は、バイオリアクタ３００の他のマイクロ流体要素と共に、縦方向（たとえば、図３に示すｘ方向に沿って）および横方向（ｙ方向およびｚ方向）に、骨髄および血管に見られるような生理的状態を再現する形状および寸法を有し得る。たとえば、チャネルの形状および寸法は、図１を参照して説明したように、インビボでの血小板産生に関するものに類似した生理的な流量、剪断速度、流体圧力または圧力差を達成するように選択され得る。さらに、バイオリアクタ３００の構成は、顕微鏡またはカメラなどの他の機器との連携を可能にするように選択され得る。たとえば、バイオリアクタ３００は、標準的なマイクロプレートの寸法に接着するように構成され得る。
【００２９】
バイオリアクタ３００のいくつかの構成において、図３に示すように、入口チャネル３０８および出口チャネル３１４は、それぞれの基板で終端し、入口ポート３１０から出口ポート３１８まで単一の流体導管３２０を形成する。すなわち、入口ポート３１０に導入された流体媒体は、出口ポート３１８から抽出される必要がある。しかしながら、バイオリアクタ３００では追加の入口ポートおよび出口ポートも可能であり得ることが理解されよう。たとえば、第１の基板３０２は、入口チャネル３０８に接続された１つ以上の出力を含むこともできる。同様に、第２の基板３０６は、出口チャネル３１４に接続された１つ以上の入力を含むこともできる。このように、複数の流体経路が可能であってもよく、これによりバイオリアクタ３００の種々の部分を独立して選択的に作製することが可能となる。
【００３０】
図３には示されていないが、バイオリアクタ３００はまた、チャネルに接続され、入口ポート３１０と出口ポート３１８との間に延在する様々な流体経路に沿った様々なポイントに配置された、多数のマイクロ流体濾過要素および抵抗要素を含むこともできる。たとえば、１つ以上の濾過要素を入口ポート３１０に近接して配置して、入力流体媒体から汚染物質または望ましくない物質または物質を捕捉することができる。さらに、１つ以上の抵抗要素も、流量中の流力または湿度の変動を制御するために含まれ得る。抵抗要素および濾過要素に加えた要素も含まれ得る。たとえば、気泡トラップは、気泡がバイオリアクタ３００に入ることを排除するために、１つ以上の入力で構成され得る。
【００３１】
一例として、図６は、上記説明による例示的なバイオリアクタ６００の入力６０４に結合されたマイクロ流体コネクタ６０２を示す。図示されるように、入力６０４は、メッシュ６１０によって分離された拡散領域６０６および円錐領域６０８を含む。たとえば、メッシュ６１０は約１４０マイクロメートルの大きさを有し得るが、他の値をとることも可能である。前記構成のように、入力６０４は、気泡がバイオリアクタ６００に入るのを防止することができる。
【００３２】
再び図３のバイオリアクタ３００を参照すると、各基板は１６個の入口チャネル３１２と１６個の出口チャネル３１４とを含むよう示されている。より多くのまたはより少ないチャネルまたはチャンバが可能であり得ることは容易に理解されよう。たとえば、図９Ａのバイオリアクタ９００に示されるように、２つの入口チャネル９０２および２つの出口チャネル９０４が利用され得る。入口チャネルおよび出口チャネルに加えて、図３のバイオリアクタ３００の基板に追加の導管を形成することもできる。たとえば、図９Ａおよび図９Ｂに示すように、灌流チャネル９０６をバイオリアクタ９００に含めることもできる。具体的には、灌流チャネル９０６はガスの流れを可能とすることが考えられ、その後、基板材料を通ってバイオリアクタ９００の入口／出口チャネルへ灌流され得る。たとえば、５％ＣＯ２ガス混合物をチャネルに灌流することができる。
【００３３】
一般的に、図３の透過性膜３０４は、内部に形成されたマイクロ流体経路を介して、対応する入口チャネル３０８および出口チャネル３１４を接続するように構成された、任意の剛性または可撓性の層、フィルム、メッシュまたは材料構造を含み得る。一実施形態では、透過性膜３０４内のマイクロ流体経路は、透過性膜３０４の周りに、周期的または非周期的に、任意の密度で分布した、細孔、間隙またはマイクロチャネルを用いて形成され得る。別の実施形態では、透過性膜３０４は、そこを通って流体を通過させるように配置された、織り合わされたマイクロ繊維またはナノ繊維を使用して形成された三次元構造を含み得る。図３では矩形で示されるが、透過性膜３０４は、円形、楕円形などを含む任意の形状を有し得ることが理解されよう。本開示の態様によれば、透過性膜３０４は、所望の生物学的産物を産生するために特定の生物源材料または物質を選択的に捕捉するように構成され得る。たとえば、透過性膜３０４は、血小板産生細胞を選択的に捕捉し、そこを通って血小板前駆細胞の伸長を可能にするように構成され得る。
【００３４】
一例として、透過性膜３０４は、１〜１００ミリメートルの範囲の長手方向および横方向の寸法を含み、０．１〜２０マイクロメートルの範囲の厚さを有するが、他の寸法をとることも可能である。また、透過性膜３０４は、約３マイクロメートル〜１０マイクロメートル、より具体的には約５マイクロメートル〜８マイクロメートルの範囲の大きさの細孔、間隙またはマイクロチャネルを含み得る。いくつかの態様では、細孔、間隙またはマイクロチャネルの大きさ、数、および密度は、所望の生物学的産物および産物収量ならびにフローインピーダンス、剪断速度、圧力差、流体流量、および他の運転パラメータを含む多数の因子に依存し得る。
【００３５】
図３から理解されるように、入口チャネル３０８および出口チャネル３１４は重なって、透過性膜３０４内の活性接触領域を画定する。たとえば、活性接触領域３２６は、利用されるチャネルの寸法および数に依存して、他の値をとることもできるが、１ｍｍ２〜２０ｍｍ２の範囲内にあってもよい。いくつかの実施例では、所望の生物学的産物の収量を得るため、透過性膜３０４の特性から活性接触領域を最適化することができる。たとえば、４７ｍｍの直径、５％の活性接触領域、および１・１０５個／ｃｍ２の孔密度を有する透過性膜３０４は、所望の血小板収量などの所望の生物学的産物収量を生成する可能性がある２００，００部位を提供し得ることが考えられる。いくつかの用途では、活性接触領域は、少なくとも約１・１０４個の巨核球を捕捉するように構成され得る。
【００３６】
バイオリアクタ３００は、生体適合性材料、不活性材料、ならびに、加圧ガスおよび流体の流れまたはガス拡散を支持し、構造的支持を提供することができる材料の任意の組み合わせを用いて製造することができる。いくつかの態様では、バイオリアクタ３００に利用される材料は、射出成形などの特定の製造プロセスと適合し得る。さらに、利用される材料は、流体媒体、およびバイオリアクタ３００の様々な部分に存在するまたは流動する他の物質を可視化するため、光学的に透明であってもよい。
【００３７】
一例として、第１の基板３０２もしくは第２の基板３０６、またはその両方、またはその一部は、ポリジメチルシロキサン（「ＰＤＭＳ」）などの細胞不活性シリコン系有機ポリマー材料、ゼオノアシクロオレフィンポリマー（「ＣＯＰ」）などの熱可塑性材料、ガラス、アクリル樹脂などを用いて製造され得る。一方、透過性膜３０４は、ＰＤＭＳ、熱可塑性樹脂、絹、シルク、ハイドロゲル、細胞外マトリックスタンパク質、ポリカーボネート材料、ポリエーテルスルホン材料、ポリ塩化ビニル材料、ポリエチレンテレフタレート材料、および他の合成または有機材料を用いて製造され得る。
【００３８】
本開示の態様によれば、バイオリアクタ３００は、様々な生物学的物質および材料を用いて選択的に機能化され得る。具体的には、バイオリアクタ３００は、そこに導入される所望の生物学的物質および材料を含む流体媒体によって選択的に機能化され得る。あるいは、またはさらに、バイオリアクタ３００またはその構成要素は、様々な作製または製造プロセスを用いて機能化されてもよい。たとえば、透過性膜３０４は、バイオリアクタ３００の組み立て前に、血小板産生細胞で予め作製されてもよい。いくつかの態様では、バイオリアクタ３００は、巨核球、および他の細胞、生物学的物質または材料を、分化および／または培養するために利用され得る。
【００３９】
記載されるように、いくつかの態様では、バイオリアクタ３００は、血小板または他の生物学的産物を産生するため、インビボでの生理的条件を複製するのに有利に機能化され得る。たとえば、１つの用途では、透過性膜３０４の上面３２２は、たとえば、細胞外マトリックスタンパク質で選択的にコーティングされてもよく、底面３２２はコーティングなしのままでもよく、または異なるタンパク質または物質でコーティングされてもよい。これは、たとえば、細胞外マトリックスタンパク質を含有する第１の流体媒体に、第１の基板３０２における入力および出力を用いて注入することによって達成することができる。実質的に同時に、第２の流体媒体の流れは、それぞれの入力および出力を用いて第２の基板３０６内に維持することができ、第２の流体媒体は、タンパク質を全く含まないか、異なるタンパク質または物質を含まなくてもよい。好ましくは、第１および第２の流体媒体の流量は、流体の混合がほとんどまたは全く起こらないように構成され得る。このような選択的機能化は、導入された血小板産生細胞が、たとえば上面３２２に乗って、細胞外マトリックスタンパク質に接触し、透過性膜３０４を通って伸びた血小板前駆細胞およびそこから放出された血小板が細胞外マトリックスタンパク質と接触しない、または異なるタンパク質もしくは生物学的物質と接触することを確実にする。
【００４０】
バイオリアクタ３００を機能化するための生物学的物質および材料の非限定的な例は、巨核球、内皮細胞、骨髄細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、幹細胞、血液細胞、間葉細胞、肺細胞および基底膜を含む細胞などのヒトおよび非ヒト細胞を含み得る。他の例は、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１０、ＳＤＦ−１、ＦＧＦ−４、Ｓ１ＰＲ１、ＲＧＤＳ、メチルセルロースなどの小分子を含み得る。さらに他の例は、ウシ血清アルブミン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン（ｆｉｂｒｉｎｅｃｔｉｎ）、フィブリノゲン、ラミニン、ビトロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質を含み得る。特に、三次元細胞外マトリックス組織および生理的骨髄剛性を再現するため、細胞はヒドロゲル溶液中に注入されてもよく、その後当該ヒドロゲル溶液は重合されてもよい。ヒドロゲル溶液は、アルギン酸、マトリゲル、アガロース、コラーゲンゲル、フィブリン／フィブリノゲンゲルを含み得るが、これらに限定されない。
【００４１】
いくつかの態様では、バイオリアクタ３００の様々な部分は、組み立ておよび分解を可能にするように構成され得る。具体的には、図３に示すように、第１の基板３０２、透過性膜３０４、および第２の基板３０６は、互いに取り外し可能に連結されるように構成され得る。留め具、クリップ、または他の解除可能な係止機構を用いて係合させた場合、入力部３１０と出力部３１８との間の流体経路の完全性を回復させるため、基板および透過性膜３０４の様々な表面の間に、たとえば、ハーメチックシールを形成することができる。この性能により、上述のように、作製を容易にすることができ、また、繰り返し使用のための洗浄を容易にすることができる。さらに、分解により、様々な構成要素の迅速な交換、再利用または迅速なプロトタイピングが可能になる。たとえば、異なる孔径を有する透過性膜３０４、または異なる作製物を、容易に交換することができる。
【００４２】
あるいは、バイオリアクタ３００は、射出成形技術を用いてサンプル用に単一のデバイスとして製造されてもよく、この場合、透過性膜３０４が基板に成形される。そのような実施例は、大規模製造技術に有利に組み込まれ得る。一例として、図１６は、成形技術を用いて生成されたバイオリアクタ１６００を示す。バイオリアクタ１６００は、ＰＤＭＳ、熱可塑性樹脂（コポリマー（「ＣＯＰ」）、環状オレフィンコポリマー（「ＣＯＣ」）、ポリメチルメタクリレート（「ＰＭＭＡ」）、ポリカーボネート（「ＰＣ」）など）、および他の材料を用いて形成され得る。図１６に示すように、いくつかの実施形態では、バイオリアクタ１６００は、バイオリアクタ１６００の上部もしくは下部のいずれかまたは両方にガラス基板１６０２を含み得る。あるいは、バイオリアクタ１６００は、単独で、またはガラスまたはアクリル基板と組み合わせて、アクリル上部基板１６０４を含み得る。これらの基板は、バイオリアクタ１６００に構造的支持を提供するために使用することができる。
【００４３】
一例として、図７Ａ〜図７Ｂは、それぞれ、分解された、および組み立てられた例示的なバイオリアクタアセンブリ７００を示す。図７Ａに示すように、バイオリアクタアセンブリ７００は、一般的に、ベースプレート７０２、クランプアーム７０４、上部クランプフレーム７０６、留め具７０８、およびバイオリアクタ７１０を含む。図７Ｂに示すように、バイオリアクタ７１０に圧縮がかけられ、バイオリアクタ７１０の各基板の間にハーメチックシールが形成される。いくつかの設計では、バイオリアクタアセンブリ７００は、漏れを防止し、過圧縮を回避するために、バイオリアクタ７１０の上面および底面にわたって均一な圧力を加えることができるように、バネを有するハードストップを組み込んでもよい。たとえば図５Ａまたは図８に示すように、他の固定機構またはその変形も可能である。
【００４４】
ここで図４Ａ〜図４Ｃを参照すると、本開示の態様によるマイクロ流体バイオリアクタアセンブリ４００の非限定的な実施形態が示されている。図４Ｂの断面図を特に参照すると、バイオリアクタアセンブリ４００は、上部基板４０２、下部基板４０４、および、それぞれの基板に形成された多数の対応する入口チャネル４０８および出口チャネル４１０を接続する、基板間の膜４０６を含む。記載されるように、膜４０６は、たとえば、その中に含まれる細孔を介して、基板間に流体経路を形成するように構成される。図４Ａに示すように、バイオリアクタアセンブリ４００はまた、たとえばねじを使用して、膜４０６および基板を一緒に固定するように構成された基部４１２および頂部４１４を含み得る。簡略化のため、図４Ａは、バイオリアクタアセンブリ４００の一部のみを示す。固定されたとき、基部４１２および頂部４１４は、漏れることなくチャネル内に流体またはガスが流れるよう、基板を、その間にハーメチックシールを形成できるよう調節された係合状態（たとえば、ガイド、溝または穴を使用して）とする。逆に、固定を解除したとき、バイオリアクタアセンブリ４００の様々な部分は個別に作製、交換、洗浄、再使用され得る。
【００４５】
記載されるように、いくつかの構成では、バイオリアクタアセンブリ４００は、運転中に可視化できるよう構成され得る。図４Ｂに示すように、各基板は、近接して配置されたガラス層４１６を有することができ、ガラス／基板／膜／基板／ガラスを含む積層体を形成する。代替的な構成では、ガラス層は含まれず、基板および／または膜４０６が、適切な構造的完全性、および流体媒体の可視化を可能にするのに適した透明性などの、所望の材料特性を有するように構成されてもよい。理解されるように、バイオリアクタアセンブリ４００およびその一部の特定の構成ならびに組み立て方法は、特定用途の仕様に変更または適合されてもよい。
【００４６】
バイオリアクタアセンブリ４００の入口チャネル４０８および出口チャネル４１０は、同じ寸法を有する必要はない。すなわち、図４Ｂに示すように、入口チャネル４０８は、出口チャネル４１０と比較して、少なくとも１つの横方向（または長手方向）の寸法において、より大きく（またはより小さく）することができる。一例として、入口チャネルは、約０．１ｍｍの第１の横方向寸法またはチャネル高さ、または約０．７ｍｍの第２の横方向寸法またはチャネル幅を有していてもよく、出口チャネルは、約０．１ｍｍのチャネル高さおよび約０．５ｍｍのチャネル幅を有していてもよい。チャネルは、約２５ｍｍの長手方向寸法または長さを有していてもよい。様々な他の寸法をとることも可能であり得る。いくつかの態様では、チャネルの深さおよび幅を含む寸法は、巨核球がチャネルの中心で所望の剪断応力を受けるよう、また、チャネル壁で捕捉されることを回避するように構成され得る。
【００４７】
さらに、いくつかの態様では、少なくともいくつかの入口チャネル４０８もしくは出口チャネル４１０、またはその両方は、活性接触領域４２２を形成する長手方向寸法の少なくとも一部にわたって、横方向にテーパ状であってもよい。一例として、チャネルの深さは０．５ｍｍから始まり、ある点までテーパを形成することができる。記載されるように、このような構成は、活性接触領域４２２内の膜４０６を通した灌流を調節するために、チャネル内での圧力差プロファイルを制御するのに有利であり得る。
【００４８】
特に図４Ｃの断面図を参照すると、入口チャネル４０８および出口チャネル４１０は、横方向にテーパ状であり、長手方向ｘとテーパ角αを形成することが示されている。すなわち、入口チャネル４０８または出口チャネル４１０の表面４２４、またはその両方は、図示されるように、長手方向すなわちｘ方向とテーパ角を形成する。一例として、テーパ角αは、０〜５度の値をとり得るが、他のテーパ角の値をとることも可能である。いくつかの態様では、入口チャネル４０８および出口チャネル４１０に関するテーパ角は同じである必要はない。チャネルにおけるテーパの結果として、入口４１８を介して導入され、出口４２０を介して抽出される流体媒体は、矢印によって示されるように、活性接触領域４２２にわたって均一な圧力差プロファイルを受ける。ここで、圧力差プロファイルとは、長手方向ｘに沿って異なる点に存在する入口チャネル４０８と出口チャネル４１０との間の様々な圧力差を指す。
【００４９】
一例として、図５Ａ〜図５Ｂは、図２を参照して説明したバイオリアクタシステムの一実施形態を示す。具体的に図５Ａに示すように、システム５００は、図４Ａ〜図４Ｃを参照して説明したように、プラスチックチューブ５０４を用いてバイオリアクタ・チップ・アセンブリ５０６に流体接続されたシリンジポンプ５０２を含み得る。特に、チューブ５０４は、シリンジポンプ５０２および外部出力へ、取り外し可能であり、かつ漏れが防止された接続を提供するため、ルアーロックコネクタ５０８を使用して取り付けてもよい。図示されるように、バイオリアクタ・チップ・アセンブリ５０６は、チップクランプ５１２を用いて標準的なマイクロプレート寸法の基材５１０に固定された、バイオリアクタ５５０を含む。特に図５Ｂを参照すると、バイオリアクタ５５０は、その中に含まれるＰＤＭＳ基板に形成され、それぞれの入口５５４および出口５５６のポートに接続された、複数のチャネル５５２またはチャンバを含むことが示される。記載されるように、入口および出口チャネル５５２は、透過性膜５５８によって分離される。バイオリアクタ５５０はまた、孔の有無にかかわらず、ガラススライド５６０を含み、ＰＤＭＳ基板の上部および底部に配置される。バイオリアクタ５５０は、ハーメチックシールを達成するためのＰＤＭＳ成形トラック５６２をさらに含む。
【００５０】
別の実施形態では、図２を参照して説明したバイオリアクタシステムは、図１０に示されている。具体的には、システム１０００は、生物学的入力源１００２、バイオリアクタ１００４、出力１００６、コントローラ１００８、および再循環器１０１０を含む。記載されるように、入力源１００２は複数の入口チャネル１０１２に流体接続され、出力１００６は複数の出口チャネル１０１４に流体接続され、入口チャネルおよび出口チャネルは透過性膜（図１０には示さず）によって分離される。記載されるように、血小板などの産生された生物学的産物を含む流出物は、出力１００６で受け取られ得る。
【００５１】
回収、貯蔵、またはさらなる処理のために出口チャネル１０１４から出口１００６に流出物を誘導するように構成された出口ポート１０１６に加えて、図１０に示すバイオリアクタ１００４はまた、出口チャネル１０１４に接続された別の出口ポート１０１８も含む。このような構成により、出口チャネル１０１４から流出する流出物は、再循環器１０１０を使用して、図１０の矢印で示されるように、出口チャネル１０１４に接続された入口ポート１０２０を介して出口チャネル１０１４に戻される。これにより、運転量が削減され、産生される生物学的産物を濃縮する性能が得られる。さらに、チャネル内の圧力差および剪断応力プロファイルは、コントローラ１００８によって独立して制御することができる。一例として、再循環器１０１０は蠕動ポンプであってもよく、生理的に適切な状態を達成するように構成され得る。
【００５２】
図示されていないが、バイオリアクタ１００４はまた、ＣＯ２などのガスをチャネルに灌流するための灌流チャネルを含み得る。さらに、バイオリアクタ１００４は、組立および分解が可能なバイオリアクタアセンブリに含まれてもよい。
【００５３】
これまで説明したバイオリアクタシステムの実施形態は、平面形状に限定される必要はない。たとえば、図１１および図１２に示すように、円筒形状を実施することもできる。具体的に図１１を参照すると、例示的な円筒型バイオリアクタ１１００の断面図が示されており、これは、基板１１０６に形成された外側チャンバ１１０２および内側チャンバ１１０４を含む。図示されるように、チャンバは、記載されるようにチャンバを接続するマイクロ流体経路を形成するよう構成された多孔質膜１１０８によって分離される。チャンバは、矢印で示されるように、そこを流れる流体媒体の注入および収集を容易にすることができる様々な入口ポートおよび出口ポート（図１１には図示せず）にそれぞれ接続される。いくつかの態様では、図１１に示すように、基板１１１２の内面１１１０は、チャンバ間の流体の流れを制御するよう構成された湾曲または連続テーパを含む。いくつかの態様では、湾曲は、透過性膜１１０８の活性領域にわたって均一な圧力差を達成するように構成され得る。
【００５４】
別の例では、図１２は、円筒型バイオリアクタアセンブリ１２００の断面を示す。一般的に、バイオリアクタアセンブリ１２００は、透過性膜１２０６によって第２の基板１２０４から分離された第１の基板１２０２を含む。理解されるように、この構成は、図４Ｂを参照して説明したものと同様であるが、円筒形状に適合されている。具体的には、第１の基板１２０２は、その内部に形成された複数の入口チャネル１２０８を含む。同様に、第２の基板１２０４は、その内部に形成された複数の出口チャネル１２１０を含み、入口チャネル１２０８および出口チャネル１２１０は、図１２に示す断面に垂直な長手方向に実質的に沿って延在し、活性接触領域上で重なり合う。チャネルはテーパ状であってもよく、テーパ状でなくてもよい。入口チャネル１２０８を流れる流体媒体は、次に、矢印によって示されるように、透過性膜１２０６を出口チャネル１２１０へと半径方向に横切る。
【００５５】
バイオリアクタアセンブリ１２００のチャネルは、図３を参照して説明した構成と同様に、様々な入口／出口ポート、および入口／出口マニホールド（図１２には図示せず）に接続され得る。さらに、いくつかの態様では、チャネルは、透過性膜１２０６を通して灌流を調節する圧力差を制御するために、長手方向の少なくとも一部にわたって、横方向にテーパ状であってもよい。基板がベースプレート１２１２および留め具１２１４によって係合されると、均一な圧力が透過性膜１２０６に加えられ、基板と透過性膜１２０６との間にハーメチックシールが形成される。
【００５６】
次に図１３を参照すると、本開示の態様によるプロセス１３００の工程を示すフローチャートが示されている。プロセス１３００は、プロセスブロック１３０２から、巨核球または前駆細胞または幹細胞のような生物源材料を提供して、開始することができる。いくつかの態様では、プロセスブロック１３０２において生物源材料も生成されてもよい。たとえば、臍帯血からまず幹細胞を単離し、種々の試薬を用いてそれを拡大することによって、巨核球を生成することができる。そのような拡大された細胞は、次に巨核球系列に分化させることができ、その後、血小板を生成する使用可能な成熟した巨核球を生成するため、倍数化を誘導する工程が行われる。あるいは、巨核球は、誘導された多能性細胞から得ることができる。
【００５７】
プロセスブロック１３０４で示されるように、提供または生成された生物源材料は、たとえば、図３〜図５を参照して説明したように、バイオリアクタアセンブリに播種することができる。いくつかの態様では、この工程は、様々な成分のバイオリアクタアセンブリを作製することを含み得る。たとえば、デバイスの組み立て前に、様々な培養およびプレーティング技術を用いて、透過性膜に生物源材料を播種することができる。あるいは、またはさらに、生物源材料を有するバイオリアクタアセンブリを作製するために、多数の注入、培養、および他の工程を実施してもよい。たとえば、流体媒体中に分散された巨核球は、バイオリアクタアセンブリ内に選択的に注入され得る。次に、適切な大きさの細孔またはマイクロチャネルにより、巨核球は透過性膜に捕捉され得る。
【００５８】
いくつかの態様では、記載されるように、バイオリアクタアセンブリは、所望の生物学的産物の産生を最適化するために、様々な生物学的物質および組成物で機能化され得る。たとえば、インビボでの血小板産生を複製するため、骨髄および血管で見出される生理的状態が再現され得る。これは、記載の工程のような選択的注入または他の作製法によって達成され得る。たとえば、バイオリアクタアセンブリは、内皮細胞、骨髄細胞、血液細胞、および基底膜を含む細胞を含む、様々な細胞で機能化されてもよい。バイオリアクタアセンブリはまた、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１０、ＳＤＦ−１、ＦＧＦ−４、Ｓ１ＰＲ１、ＲＧＤＳ、メチルセルロースおよび細胞外マトリックスタンパク質、たとえば、コラーゲン、フィブロネクチン（ｆｉｂｒｉｎｅｃｔｉｎ）、フィブリノゲン、ラミニン、ビトロネクチン、ビオチン、およびそれらの組み合わせなどを含む様々な小分子で機能化されてもよい。様々な生物学的組成物のそのような選択的注入は、連続的にまたは並行して達成され得る。いくつかの態様では、層流媒体の流れが混合しないように、複数の入口および出口を使用して並行注入を行ってもよい。任意の上記生物学的物質または組成物は、細胞培養培地、全血、血漿、血小板添加溶液、懸濁培地などを含む様々な液体媒体を用いて注入することができる。いくつかの態様では、適切な条件設定および対象範囲を検証するために、カメラ、顕微鏡などを使用して、上述の注入プロセスおよび播種プロセスを視覚的に監視することができる。さらに、プロセスブロック１３０２またはプロセスブロック１３０４のいずれかを実行中に、温度、光または振動を含む様々な条件を調整することができる。
【００５９】
再び図１３を参照すると、プロセスブロック１３０６において、流体媒体は、血小板などの所望の生物学的産物を産生するために、播種され、機能化されたバイオリアクタアセンブリに導入され得る。記載されるように、選択されたバイオリアクタアセンブリの実施形態における流体媒体流量および経路を制御することによって、条件を制御して、所望の生物学的産物の産生を促進または最適化することができる。特に、通過する流体による剪断応力に加えて、透過性膜を通る灌流量を制御することができる。一例として、流量は、用途、特定のバイオリアクタアセンブリの実施形態、および所望の生物学的産物に応じて他の値をとることも可能であるが、約５，０００〜１５０，０００マイクロリットル／時の所定の範囲内であってもよい。たとえば、流量は、バイオリアクタアセンブリが準備されているか、または所望の生物学的産物を生成するように操作されているかに応じて変更され得る。
【００６０】
いくつかの態様では、流量は、血小板などの所望の生物学的産物の効率的な産生に有利な所定の範囲の剪断速度を維持するように構成され得る。一般的に、そのような所定の範囲は、他の値をとることも可能であるが、１０／秒〜１０，０００／秒の範囲であってもよい。いくつかの態様では、インビボでの血小板前駆細胞伸長および血小板産生と一致する生理的剪断速度が望ましい場合がある。たとえば、生理的剪断速度は、５００／秒〜２５００／秒であってもよい。
【００６１】
次に、プロセスブロック１３０８において、バイオリアクタアセンブリ内で生成された生物学的産物が収集され得る。たとえば、生成された生物学的産物は、通過する流動媒体によって運ばれ、その後の使用のために流出物から回収され、分離され得る。いくつかの態様では、回収後処理を行ってもよい。たとえば、プロセスブロック１３０８は、血小板添加溶液などのＦＤＡに認可された記憶媒体中でバイオリアクタ由来血小板を透析するプロセスも含んでもよい。特に、０．７５ｍｍ、０．６５μｍＰＥＳルーメン（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ）を通して低剪断での連続流を使用する動的透析システムを使用することができる。したがって、培養培地は、ヒト患者に注入することができる媒体で置き換えることができる。さらに、いくつかの態様では、プロセスブロック１３０８における回収後処理は、生成された生物学的産物に照射するプロセスを含むこともできる。このような工程は、血小板をヒト患者に使用する前に、ＦＤＡによって要求されることが多い。
【００６２】
要約すると、本開示は、血小板および他の生物学的産物の効率的かつスケーラブルな生産のための新規アプローチを提供する。一例として、図１４Ａ〜Ｄは、従来の静的培養技術を用いた成熟巨核球および血小板前駆細胞／血小板産生と本開示のアプローチを用いて得られたものとの動物での結果を比較するフローサイトメトリーグラフを示す。特に、図１４Ａおよび１４Ｂは、それぞれ静的培養で産生された成熟巨核球および血小板前駆細胞／血小板を示し、図１４Ｃおよび１４Ｄは、それぞれ、本アプローチを用いて産生に成功した成熟巨核球および血小板前駆細胞／血小板を示す。さらに、図１４Ｃは、巨核球の閉じ込めが成功したことを示す。別の例として、図１５は、記載されるように、バイオリアクタおよび方法を使用する細胞収量のタイムラインを示すグラフを示す。図示されるように、有意な数の血小板（「ＰＬＴ」）を、バイオリアクタの運転の最初の１時間以内に生成することができる。これらの結果は、臨床的に適切な数の血小板を産生するために本アプローチが成功裏に実施され得ることを示す。
【００６３】
上に示された様々な構成は単なる例であり、決して本開示の範囲を限定するものではない。本明細書に記載された構成の変形は、当業者にとって明らかであり、そのような変形は本出願の意図された範囲内である。特に、上述の構成のうちの１つ以上からの特徴を選択して、上で明示的に説明していない特徴の部分的な組み合わせからなる代替の構成を作成してもよい。さらに、上述の構成のうちの１つ以上からの特徴を選択し、組み合わせて、上に明示的に説明していない特徴の組み合わせからなる代替の構成を作成してもよい。そのような組み合わせおよび部分的な組み合わせに適した特徴は、本出願を全体として検討した当業者にとって、直ちに明らかとなるであろう。本明細書および特許請求の範囲に記載される主題は、技術すべての適切な変更を網羅し、包含することを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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