(57)【要約】ウイルス（たとえば、インフルエンザ、フニン、チクングンヤ、デング、HIV、RHDV）に感染する宿主または宿主細胞において、AR-12およびAR-12アナログを施与することによって、ウイルスタンパク質生成、ウイルス感染、およびウイルス複製を抑制するための組成物および方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスに感染する宿主においてウイルスタンパク質生成を抑制するにあたり、AR-12を、ウイルスタンパク質生成が未処置宿主に比較して少なくとも約50%だけ減らされる宿主に施与することを含む、方法。
【請求項２】
ウイルスタンパク質はインフルエンザによって生成される、請求項1の方法。
【請求項３】
インフルエンザウイルスはインフルエンザAである、請求項2の方法。
【請求項４】
ウイルスタンパク質は構造タンパク質である、請求項2の方法。
【請求項５】
ウイルスタンパク質は非構造タンパク質である、請求項2の方法。
【請求項６】
ウイルスに感染する宿主においてウイルス複製を抑制するにあたり、AR-12を、宿主に、宿主においてウイルス複製を少なくとも約50％減少させるのに十分な量で施与することを含む、方法。
【請求項７】
ウイルスは、I型ウイルス、IV型ウイルス、V型ウイルス、およびVII型ウイルスからなる群より選ばれる、請求項6の方法。
【請求項８】
ウイルスは、インフルエンザ、HIV、HIV-1、HIV-2、薬物耐性HIV、フニンウイルス、チクングンヤウイルス、黄熱病ウイルス、デングウイルス、ピチンデウイルス、ラッサウイルス、アデノウイルス、麻疹ウイルス、プンタトロウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、リフトバレーウイルス、RHDV、SARSコロナウイルス、タカリベウイルス、およびウエストナイルウイルスからなる群より選ばれる、請求項6の方法。
【請求項９】
AR-12は、宿主に、約0.1μMから約7μMまでの血液、組織、または器官濃度を達成するのに十分な量で提供される、請求項6の方法。
【請求項１０】
チクングンヤウイルスに感染する宿主においてウイルス感染を減らすにあたり、AR-12を、宿主に、約1μMから100μMまでの血液、組織、または臓器濃度に十分な量で施与することを含む、方法。
【請求項１１】
ウイルスはチクングンヤウイルスのファビピラビル耐性株である、請求項10の方法。
【請求項１２】
フニンウイルスに感染する宿主においてウイルス感染を減らすにあたり、AR-12を、宿主に、約0.15μMないし0.55μMの血液、組織、または器官濃度を達成するのに十分な量で施与することを含む、方法。
【請求項１３】
レトロウイルスに感染する宿主においてレトロウイルス複製を抑制するにあたり、AR-12を、宿主に、約0.1μMないし約20μMの血液、組織、または器官濃度を達成するのに十分な量で施与することを含む、方法。
【請求項１４】
AR-12は、宿主に、約0.30μMの血液または組織濃度を達成するのに十分な量で施与される、請求項13の方法。
【請求項１５】
少なくとも第二の化合物を宿主に施与することをさらに含む、請求項13の方法。
【請求項１６】
第二の化合物は、チプラナビル、インジナビル、アタザナビル、サキナビル、ロピナビル、リトナビル、ダルナビル、アタザナビル、ネルフィナビル、エムトリシタビン、ラミブジン｛3TC｝、ジドブジン｛AZT｝、ジダノシン、テノホビル、スタブジン、アバカビル、リルピビリン、エトラビリン、ネビラピン、デラビルジン、エファビレンツ、T-20、マラビロク、ラルテグラビル、およびドルテグラビルからなる群より選ばれる、請求項15の方法。
【請求項１７】
HIV DRに感染する宿主においてHIV DRの複製を抑制するにあたり、AR-12を、宿主に、少なくとも約0.30μMの血液、組織、または器官濃度を達成するのに十分な量で施与することを含む、方法。
【請求項１８】
ウイルス誘発性劇症肝不全を有する宿主の生存率を高めるにあたり、AR-12を、宿主に、少なくとも約25mg/kgの量で施与することを含む、方法。
【請求項１９】
AR-12は、宿主に、25mg/kgの少なくとも4つの用量の量で施与される、請求項18の方法。
【請求項２０】
宿主の生存率は少なくとも約20％だけ高められる、請求項19の方法。
【請求項２１】
デングウイルスに感染する宿主においてデングウイルス感染を減らすにあたり、AR-12を、宿主に、少なくとも約1μMの血液、組織、または器官濃度を達成するのに十分な量で施与することを含む、方法。
【請求項２２】
血液、組織、または器官濃度は少なくとも約4μMである、請求項21の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
この出願は、2015年1月28日付け出願の米国仮特許出願第62/108,960号、2015年2月20日付け出願の米国仮特許出願第62/118,766号、2015年5月8日付け出願の米国仮特許出願第62/159,129号、および2015年7月9日付け出願の米国仮特許出願第62/190,706号に対する優先権を主張する。上記参照出願は、あたかも略さずに再び述べるかのようにここに組み込む。ここで引用したすべての特許および非特許参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
5および20％の間の人口が任意の年にインフルエンザウイルスに感染し、そしてこのウイルスの、およびその合併症は、米国におけるヒト死亡率の上位10の原因の1つである[1, 2]。目下、ワクチンは疾患の減少のための最も一般的な手段である。しかしながら、ウイルスタンパク質における変異によって引き起こされる抗原シフトは、既存の適応免疫を有するものでさえ感染の影響を受けやすくする。同様に、ワクチンは新生インフルエンザウイルスに対する防御をほとんど提供せず、パンデミック、たとえば、1918年のスペインインフルエンザパンデミックおよび2009年のH1N1パンデミック[1]などのようなものの可能性が生み出される。近年、有毒なH5N1型およびH7N9型のウイルスもまた、小さなアウトブレイクを引き起こし、これらのウイルスがヒト間で容易に伝達可能に進化する場合には、広範囲の病気についての懸念を引き起こす[3-7]。したがって、インフルエンザウイルスは常に存在する健康上の懸念であり、そして防御の包括的な戦略が必要とされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
インフルエンザウイルス感染を処置するために目下使用されている薬物は、ノイラミニダーゼインヒビターおよびアダマンタンの二つのクラスに限られている[8]。どちらのクラスもウイルスタンパク質を標的とする。ノイラミニダーゼインヒビターは、ウイルスノイラミニダーゼ、それはウイルス複製の最終ステップとしてウイルスを細胞から分離させるものであり、それを標的とする。したがって、有意な効果を有するためには、ノイラミニダーゼインヒビターを感染の初期に用いなければならない。アダマンタン、たとえば、薬物のアマンタジンなどのようなものは、細胞感染の間にウイルスの脱外被に必要なイオンチャネルであるウイルスM2タンパク質を抑制する。インフルエンザウイルスは極めて変異しがちであるため、これらの薬物クラスの一方または双方への耐性が観察され、そして循環系統はアマンタジンに対する完全耐性に発達したため、この薬物がもはや臨床的に有用ではなくなった[8]。このようにして、新しい薬物が必要とされる。哺乳動物細胞はウイルスよりもはるかに変異が起こり難いため、耐性の問題に対処する方法の一つは、ウイルス複製に不可欠な宿主細胞経路を標的とする薬物を利用することである。
【０００４】
AR-12は、経口で生物学的に利用可能な小分子セレコキシブ誘導体（以前はOSU-03012として知られる）であり、それはオハイオ州立大学で発見された。この化合物は、最初に腫瘍学の環境で開発され、そしてフェーズIの研究では、33週間までの長期の経口曝露で許容可能な安全性プロファイルが示された。腫瘍学研究において調査されたAR-12用量は、感染症の設定で必要とされる曝露を実質的に超える可能性が最も高い。AR-12は、抗腫瘍、抗真菌、および抗菌活性を見せることが以前に示された。AR-12は、細胞内細菌を伴う細胞のオートファジーを誘導すると考えられ、および一定の細菌に対して直接的な活性を有することが実証されている。支持的前臨床試験では、AR-12は血液脳関門の浸透が速く、および組織内での蓄積が認められ、血中濃度は数倍を超える[1]。
【０００５】
AR-12は、オートファジーの誘導を含め、細胞において複数の生物学的活性を有することが示された[9-16]。AR-12について提案された様々な細胞標的は、それがインフルエンザウイルス感染に対してどんな効果を有するかを先験的に不明確にする。同様に、インフルエンザウイルス感染および複製に対するオートファジーの効果は明らかではない。たとえば、インフルエンザウイルスM2タンパク質は、細胞のオートファジーを抑制すると説明されており、この細胞プロセスはウイルスに有害であることが示唆されている[17]。しかしながら、他の研究では、逆に、インフルエンザウイルスタンパク質が細胞のオートファジーを誘導し、およびそのオートファジーはウイルス複製に有益であることが示された[18, 19]。したがって、われわれは、AR-12前処置の効果をマクロファージで、それは炎症性サイトカイン、活性酸素種、およびインフルエンザウイルス感染中の急性肺傷害に寄与する他の要因の重要な供給源であるものであり[20, 21]、そのインフルエンザウイルス感染に対して実験的に調べた。
【０００６】
インフルエンザウイルスに加え、他のウイルスは、ヒトおよび動物の双方において相当量の疾患を引き起こす。たとえば、フニン、デング、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、ヘルペス、およびチクングンヤ（チクングニアとも言う）のウイルスは、長期および短期感染の双方を伴うヒト集団に死亡および長期の疾病をもたらす可能性がある。効果的なワクチンおよび処置は、多くのウイルス感染について見出すことが困難であり、およびウイルス変異体および目下の処置に対する耐性の発達に起因して限られた有効性しかない。
【０００７】
ウイルス分類
【０００８】
ボルチモア分類は、以下のように、核酸（DNAまたはRNA）、鎖要素（一本鎖または二本鎖）、センス、および複製の方法を含め、基準に基づいてウイルスをグループに分類する。
【０００９】
【表１】
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【００１０】
正確な抗ウイルス機構の作用が継続して評価されているが、AR-12（OSU-03012）は宿主エフェクター細胞オートファジーの誘導物質であり、従って細胞性免疫応答を増強することが確立された証拠により実証される。AR-12はGRP78を抑制することが知られ（また、BiP、HSPA5としても知られ、PERKのアップレギュレーション（上方制御とも言う）がもたらされ、それは、次に、オートファゴソームの形成を誘導し、そして続いて宿主細胞オートファジーを誘導する。AR-12もまたシャペロンタンパク質HSP70、HSP27およびHSP90をダウンレギュレート（下方制御とも言う）する。宿主シャペロンタンパク質の利用または「ハイジャッキング」は、ウイルスの複製、アセンブリおよび恒常性にとって重要である。GRP78のダウンレギュレーションはPERKのアップレギュレーションをもたらし、それは宿主細胞オートファジーの誘導物質であると知られ、そして従って、上記に概説した二つの作用機序は、関連しているか、または依存している可能性がある。
【００１１】
ウイルス複製における分子シャペロンの役割
【００１２】
アンフォールディング（折り畳まれていないとも言う）タンパク質応答
【００１３】
分子シャペロンまたはタンパク質シャペロンは、タンパク質のクオリティコントロールにおいて不可欠なエフェクターであり、およびポリペプチドの三次元立体配座構造への適切なフォールディング（折り畳みとも言う）を組織化/補助するための主要チェックポイントとして役立ち、ミスフォールド（誤って折り畳まれたとも言う）タンパク質が変性および凝集することを防ぎ、およびミスフォールドしたタンパク質を分解のためにタンパク質分解系に向けるように機能することができる。Xiao（シャオ）2010[61]は、フォールディングにおけるタンパク質シャペロンの関与、およびウイルスタンパク質のフォールディングのクオリティコントロール、ならびにウイルスタンパク質およびバイロンの細胞内の機能的コンフォメーションへのアセンブリ（組立て）を例示する。
【００１４】
ウイルスは、実行可能なウイルス複製のために基礎となる宿主細胞機構に依存する。複数のウイルス病原体は、膨大な量のウイルスタンパク質を生産するために宿主タンパク質のクオリティコントロール機構、たとえば、折り畳まれていないタンパク質応答（UPR）のようなものを利用（例は、タンパク質の折り畳みの増強）および破壊し、それによりウイルスのライフサイクルの完了を可能にするように進化した機構を有する。加えて、最近の研究では、ウイルスの中には独自のウイルスシャペロン様タンパク質をコードするものがあり、それによって感染性が増強されることが示された[61]。
【００１５】
UPRおよびタンパク質アセンブリを含め、宿主細胞タンパク質のクオリティコントロール要素の調節は、ウイルス複製にとって重要である。翻訳後修飾を必要とするタンパク質は、小胞体（ER）で処理され、そして多数の細胞性「ストレス」がERの機能不全を導くことがあり、そして折り畳まれていないポリペプチド負荷/ミスフォールドタンパク質負荷および細胞のタンパク質折り畳み能力のひずみをもたらす。細胞は、ERおよびゴルジ体の双方が関与するタンパク質の折り畳みを監視するために固有のクオリティコントロールシステムを有する。折り畳まれていないか、またはミスフォールドされたタンパク質は、分解のためにタグ付けされるか、またはフォールディングサイクルを通して戻される。折り畳まれていないポリペプチドまたは不正確に折り畳まれたタンパク質の持続的な蓄積はUPRを引き起こす可能性がある。UPRは、3つの膜貫通ER受容体、すなわち、（1）活性化転写因子6（ATF6）、（2）イノシトール要求キナーゼ1（IRE1）および（3）二本鎖RNA活性化タンパク質キナーゼ（PKR）様小胞体キナーゼ（PERK）によって媒介されるシグナル伝達プログラムである。哺乳類細胞では、高度に保存されたER常在シャペロン、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（BiP）〔また、グルコース調節タンパク質78（GRP78）としても知られる〕および熱ショック70kDaタンパク質5（HSPA5）は、新生タンパク質の折り畳み、および組立てに関与し、およびUPRのマスターコントロールとして働き、3つのメディエーター、すなわち、PERK、ATF6およびIRE1と相互作用する。Reid（リード）2014[57]、He（ホー）2006[41]、Lee（リー）2005[48]。
【００１６】
UPRは、三つの機能、すなわち、適応、アラームおよびアポトーシスを実行する。UPR適応フェーズ中、細胞は、タンパク質の折り畳みを増強するシャペロンの発現を誘導することによって、フォールディングホメオスタシスを再確立しようと試みる。同時に、細胞翻訳が減少してERタンパク質のフォールディング負荷が低下し、および折り畳まれていないタンパク質の分解が増加する。これらの二つのステップがうまくいかない場合、UPRは、ミトコンドリア媒介性アポトーシスの誘発に伴う細胞のアラームを誘導する。Chakrabarti（チャクラバーチ）2011[27]。He 2006[41]はウイルス感染の間のUPRの調節を例示する。
【００１７】
ヒト免疫不全ウイルス（HIV）は、第VI群レトロウイルスであり、後天性免疫不全症候群（AIDS）で、それは抗ウイルス薬に対する耐性機構の発達に二次的に処置することが極めて困難であると判明した疾患であり、その原因因子として識別されるものである。HIVは、レンチウイルスに分類される一本鎖RNAレトロウイルスである。レンチウイルスには、また、SIV（シミアン免疫不全ウイルス、FIV（ネコ免疫不全ウイルス）、ビスナ、およびCAEV（カプリリア関節炎脳炎ウイルス））も含まれる。
【００１８】
HIVは、細胞表面上の糖タンパク質であるCD4（分化4のクラスター）および他の受容体に結合すること、および細胞膜と融合して細胞に対して侵入することによってマクロファージおよびCD4+T細胞に感染する。ウイルス感染（例は、逆転写酵素、インテグラーゼ、リボヌクレアーゼ、およびインテグラーゼ）に必要とされるウイルスタンパク質は、転写され、および生産される。HIV RNAは、宿主細胞DNAに組み込まれる二本鎖DNAに逆転写される。能動的ウイルス複製の間、組み込まれたDNAプロウイルスは、ウイルスタンパク質に転写され、および新しいウイルス粒子にパッケージングされるmRNAに転写される。新しいウイルス粒子は細胞を出て、および次いで追加の宿主細胞を感染させ、または別の宿主に伝えられことができる。逆転写酵素プロセスは非常に誤りを生じがちであり、その結果、抗ウイルス薬耐性の発達につながることができる変異がもたらされる。
【００１９】
目下の治療には、ヌクレオシドアナログ（ヌクレオシド類似体とも言う）、逆転写酵素インヒビター（逆転写酵素抑制物質とも言う）、プロテアーゼインヒビター、融合または侵入インヒビター、およびインテグラーゼインヒビターが含まれる。しかしながら、これらの療法の長期間の使用は、ウイルス抵抗性の発達または治療の有効性を低下させる耐性HIV株の選択をもたらし、そして付随する副作用および薬物-薬物相互作用についての潜在性と共に薬物の組合せの使用を要求されうる。
【００２０】
ラビット出血性疾患ウイルス（RHDV）は、ファミリー（系統群とも言う）のCaliciviridae（カリシウイルス科）の第IV群のウイルスであり、およびラビット出血性疾患（RHD）の原因物質である。肝障害および損傷はRHDにおいて中心的な病原性の役割を果たし、およびRHD肝臓損傷の組織病理学は、包括的にヒトにおいて劇症の肝不全を引き起こすウイルス性肝炎と呼ばれるウイルス感染と同様である。RHDVモデルは、劇症肝不全の動物モデルの多くの要件を満たす。〔Vallejo（バエホー）2014〕[64]。
【００２１】
デング感染は、世界の熱帯および亜熱帯地域において深刻なウイルス性疾患である。それは毎年少なくとも50万人の入院を占め、および大規模な病院の資源を消費する。デング熱は世界の多くの熱帯および亜熱帯地域での風土病であり、および蚊のベクター、Aedes aegypti（アエデス・アエジプチ、ネッタイシマカとも言う）およびAedes albopictus（アエデス・アルボピクタス、ヒトスジシマカとも言う）が見出される他の国にも急速に広がる。この蚊媒介性疾患は、熱帯および亜熱帯地域の風土病地域に住む少なくとも25億人の人々に健康上の脅威をもたらすと推定される。目下、最も急速に広まっている蚊媒介性疾患の一つである。
【００２２】
デングウイルス（DENV）は、4つの異なる遺伝子型（DENV-1、DENV-2、DENV-3およびDENV-4）を有するエンベロープウイルスおよびフラビウイルス科のメンバーである。目下では、特定の抗デング剤は利用できず、および治療手技は支持療法に過ぎない。さらに加えて、利用可能な承認されたデング熱ワクチンは存在していない。したがって、デング熱ウイルスに対する抗ウイルス治療を見つけることが急務である。
【００２３】
ウイルス複製、自己組立て、および特定のウイルスに特異的なプロセスから「上流」の繁殖に不可欠なメカニズムを妨害する広域スペクトルの抗ウイルス化合物が必要とされている。そのような化合物は、耐性ウイルスの発生の危険性が低く、および副作用がより少なくなるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
概略
ここに説明する態様は、ウイルス感染をAR-12により抑制し、および/または防止するための方法および組成物を提供する。
【００２５】
AR-12は様々な提案がされた細胞標的を有する生物学的に活性な分子である。本発明者らは、AR-12が、インフルエンザウイルス感染における急性肺傷害を媒介する重要な細胞型であるマクロファージのインフルエンザウイルス感染を抑制することを見出した。我々の結果は、AR-12が、同様の侵入または複製戦略を利用するインフルエンザウイルスおよび他のウイルスによって引き起こされる疾患の予防または処置のための有益な薬物でありうることを示す。さらに、本発明者らは、制限されないが、ラッサ、HIV-1、HIV-2、薬物耐性HIV、デング熱、5型アデノウイルス、麻疹、（流行性）耳下腺炎、コクサッキー、サイトメガロウイルス（CMV）およびチクングンヤ熱（Chikungunya）（ChikV）が含まれる多数のウイルス性病原体を含め、これらにわたってAR-12が実質的な抗ウイルス活性を有することを見出した。
【００２６】
AR-12による宿主タンパク質シャペロンの抑制は、AR-12の広範囲の抗ウイルス活性および一定の抗ウイルス薬耐性機構を克服する能力をもたらすと考えられる。理論によって拘束されるものではないが、AR-12の抗ウイルス効果は、GRP78および他のタンパク質シャペロンのダウンレギュレーション/抑制と共に自食作用の増強から生じると考えられる。
【００２７】
ここに開示される態様は、AR-12を宿主に施与することによってウイルスに感染する宿主においてウイルスタンパク質生成を抑制する方法を提供し、そこでは、ウイルスタンパク質生成は未処理宿主と比較して少なくとも約50％だけ減少する。
【００２８】
ここに開示される態様はまた、AR-12を宿主細胞に施与することによって宿主細胞のウイルス感染を減少させる方法を提供し、そこでは、感染細胞の割合は未処理細胞と比較して少なくとも約50％だけ減少する。
【００２９】
ここに開示されるさらなる態様は、宿主においてウイルス複製を少なくとも約50％だけ低下させるのに十分な量でAR-12を宿主に施与することによって、ウイルスに感染する宿主においてウイルス複製を抑制させる方法を提供する。
【００３０】
ここに開示される態様は、約1μMから100μMまでの血液、組織、または器官濃度を達成するのに十分な量でAR-12を宿主に施与することにより、チクングンヤウイルスに感染する宿主においてウイルス感染を減少させる方法を提供する。
【００３１】
ここに開示される態様はまた、約0.15μMないし0.55μMの血液、組織、または器官濃度を達成するのに十分な量でAR-12を宿主に施与することを含む、フニンウイルスに感染する宿主においてウイルス感染を減少させる方法を提供する。
【００３２】
AR-12（別名、OSA-03012）は、抗腫瘍、抗真菌、および抗細菌活性を見せることが以前に示された。AR-12は、細胞内細菌を有する細胞のオートファジーを誘導すると考えられる。しかし、今までのところ、AR-12活性のこの機構は、インフルエンザおよび他のウイルスに関して示されていない。
【００３３】
さらなる態様をここに記載し、AR-12によるレトロウイルス複製および/または増殖を抑制および/または防止するための方法および組成物を提供する。一態様では、レトロウイルスはレンチウイルスである。別の態様では、レンチウイルスは、HIV-1、薬剤耐性（DR）を伴うHIV-1、およびHIV-2からなる群より選ばれる。別の態様において、AR-12は、少なくとも約0.30μMの血液または組織濃度を達成するのに十分な量でHIV DR株に感染する宿主に提供される。
【００３４】
追加の態様は、AR-12を少なくとも約25mg/kgの量で宿主に施与することを含む、ウイルス誘発性劇症肝不全を有する宿主の生存率を増加させる方法を提供する。
【００３５】
さらなる態様は、AR-12を少なくとも約1μMの血液、組織、または器官濃度を達成するのに十分な量で宿主に施与することによって、デングウイルスに感染する宿主におけるデングウイルス感染を減少させる方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
本開示の特長および性質は、添付の図面と併せられるとき以下に述べる詳細な説明からより一層明らかになるであろう。
【図１】AR-12がRAW264.7細胞においてインフルエンザA（influence A）ウイルスタンパク質の生成物（核タンパク質およびマトリクスタンパク質1）を抑制することを表す例示的なウエスタンブロットを示す。
【図２】AR-12がRAW264.7細胞のインフルエンザウイルスA感染を防ぐことを示す。
【図３】HEK293Tレポーター細胞系〔ELVIRA(R)（エルビラ商標）〕においてインフルエンザAのH3N2株の発現および細胞生存率に及ぼすAR-12の模範的な効果を示す。
【図４】HEK293Tレポーター細胞系（ELVIRA(R)）においてインフルエンザAのH1N1株の発現および細胞生存率に対するAR-12の模範的な効果を示す。
【図５】AR-12により処置したVero（ベロ）およびA549細胞の細胞傷害性（細胞毒性とも言う）に関する模範的な用量反応曲線を示す。
【図６】AR-12による処置後のフニンウイルスの三つの株におけるVero（上部パネル）およびA549細胞（下部パネル）での模範的なウイルス力価結果を示す。
【図７】チクングンヤウイルスに感染したVero A細胞におけるAR-12の模範的な抗ウイルス効果および代謝拮抗作用を示す。
【図８】チクングンヤウイルスの野生型（WT）およびT-705（ファビピラビル）耐性（RES）株に感染したVero A細胞におけるAR-12の模範的な抗ウイルス効果を示す。
【図９】AR-12によるPBMC細胞におけるHIV-1 91US001複製の抑制の模範的研究の結果を示す。
【図１０】AR-12によるPBMC細胞におけるHIV-1 92HT599複製の抑制の模範的研究の結果を示す。
【図１１】AR-12によるPBMC細胞におけるHIV-2 CBL20 H9複製の抑制の模範的研究の結果を示す。
【図１２】AR-12によるPBMC細胞におけるHIV-2 CDC 310319複製の抑制の模範的研究の結果を示す。
【図１３】AR-12によるPBMC細胞におけるHIV-1 MDR769複製の抑制の模範的研究の結果を示す。
【図１４】AZTによるPBMC細胞におけるHIV-1 91US001複製の抑制の模範的研究の結果を示す。
【図１５】AZTによるPBMC細胞におけるHIV-1 92HT599複製の抑制の模範的研究の結果を示す。
【図１６】AZTによるPBMC細胞におけるHIV-2 CBL20 H9複製の抑制の模範的研究の結果を示す。
【図１７】AZTによるPBMC細胞におけるHIV-2 CDC 310319複製の抑制の模範的研究の結果を示す。
【図１８】AZTによるPBMC細胞におけるHIV-1 MDR769複製の抑制の模範的研究の結果を示す。
【図１９】エファビレンツ（Efavirenz）によるPBMC細胞におけるHIV-1 MDR769複製の抑制の模範的研究の結果を示す。
【図２０】ロピナビルによるPBMC細胞におけるHIV-1 MDR769複製の抑制の模範的研究の結果を示し；および
【図２１】RHDVによる感染後の生存率の模範的研究の結果を示し、およびRHDVによる感染およびAR-12または媒体による処置後の生存ラビットのパーセンテージを提供する。
【図２２】血液生化学に対するRHDV感染およびAR-12処置の効果の模範的研究の結果を示し；および
【図２３】デングウイルスに感染した細胞についてウイルス収量低下の模範的研究の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
詳細な説明
下記の開示された方法、組成物、およびデバイスは、包括的ならびに具体的に記載されうる。ある態様について説明が特異的であるとき、その態様は、決して本方法の範囲を制限するものではないことに留意すべきである。
【００３８】
AR-12は複数の細胞経路を標的とするために提案された。ウイルス感染を抑制するために宿主経路を標的化することは、哺乳動物細胞が複製中に変異する傾向が少ないため、薬剤耐性の可能性を減少させる。さらに、AR-12がマクロファージのインフルエンザウイルス感染を抑制するという我々の実験は、アマンタジン耐性である株を利用した。AR-12がチクングンヤウイルスを抑制するという我々の実験は、T-705（ファビピラビル）耐性である株を利用した。したがって、AR-12は、他の治療法に耐性があるウイルス株に対して活性であることができる。
【００３９】
AR-12は抗菌剤であることが示されているが、以前にはまだこの化合物について抗ウイルス活性は報告されていない。我々の結果は、AR-12によるインフルエンザウイルス感染の抑制を最初に示すものである。
【００４０】
ここに使用される「AR-12」という用語は、〔C26H19F3N4Oおよび2-アミノ-N-(4-(5-(フェナントレン-2-イル)-3-(トリフルオロメチル)-1H-ピラゾール-1-イル)フェニル)アセトアミド〕〕に言及し、次の構造を有する。
【００４１】
【化１】
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【００４２】
「AR-12」という用語にはまた、塩および、たとえば、AR-12のアナログ（類似体とも言う）が含まれる（例は、米国特許第7,576,116号、第8,546,441号、第8,541,460号、第8,039,502号、および第8,080,574号明細書に記載されている化合物であり、ここに参照することによってそれらをそのまま組み込む。）。
【００４３】
ここに記載の態様は、AR-12を宿主に施与することによってウイルスに感染する宿主においてウイルスタンパク質生成を抑制する方法を証明しており、そこでは、ウイルスタンパク質生成は未処理宿主と比較して約50％だけ減らされる。ここに使用される「施与する」または「施与される」という用語は、処置を必要とする宿主またはペイシェント（主として患者）を処置するために有効成分の適用、摂取、吸入または注入、または処方を指す。宿主は哺乳動物（例は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシ）でありうる。「未処置の宿主」は、AR-12または別の抗ウイルス処置を受けていない宿主である。
【００４４】
別の態様において、ウイルスタンパク質は、インフルエンザまたはインフルエンザAによって生産される。さらなる態様において、ウイルスタンパク質は、構造タンパク質または非構造タンパク質である（例は、それぞれ、マトリクスタンパク質および核タンパク質）。
【００４５】
まださらなる態様は、AR-12を宿主細胞に施与することによって、ウイルスタンパク質生産を含め、宿主細胞のウイルス感染を減少させる方法を提供し、感染細胞の割合は未処理細胞と比較して約50％だけ減少する。この態様において、ウイルスタンパク質は、インフルエンザまたはインフルエンザAによって生産される。さらに、この態様において、ウイルスタンパク質は、構造タンパク質または非構造タンパク質でありうる（例えば、それぞれマトリクスタンパク質または核タンパク質）。
【００４６】
別の態様は、AR-12を、宿主に、宿主において約50％だけウイルス複製を減少させるのに十分な量で施与することによってウイルスに感染する宿主においてウイルス複製を抑制する方法を提供する。この態様において、ウイルスは、第I群ウイルス、第IV群ウイルス、第V群ウイルス、および第VII群ウイルスからなる群より選ばれる。
【００４７】
この態様では、ウイルスは、インフルエンザ株（例は、H3N2およびH1N1）、フニンウイルス、チクングンヤウイルス、HIV（薬物耐性HIVを含む）、ラビット出血熱ウイルス（RHDV）、黄熱病ウイルス、デングウイルス、ピチンデウイルス（ピキンデスウイルスとも言う）、麻疹ウイルス、プンタトロウイルス（Punta Toro virus）、呼吸器合胞体ウイルス、リフトバレーウイルス、SARSコロナウイルス、タカリベウイルス、およびウエスト（西）ナイル（熱）ウイルスからなる群より選ぶことができる。
【００４８】
一態様では、AR-12は、約0.1μMから約7μMまでの血液、組織、または器官濃度を達成するのに十分な量で宿主に提供される。
【００４９】
別の態様では、AR-12は、約1μMないし100μMの宿主細胞中の濃度を達成するのに十分な量でチクングンヤウイルスに感染する宿主に提供することができる。さらに別の態様では、チクングンヤウイルスはチクングンヤウイルスのファビピラビル耐性株である。この態様において、AR-12は、ウイルスRNA依存性のRNAポリメラーゼにおいてユニークな変異（K291R）に続発するファビピラビル（T-705）に耐性であるCHIKV（チクングンヤウイルス-第IV群）株の複製に対して活性を有することが示された。ウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼにおいてマッチした291位でのリシンは、第IV群（プラスの一本鎖RNA）ウイルスにおいて高度に保存されており、およびファビピラビル（T-705）の標的を与える。ファビピラビル（T-705）および第IV群のウイルスにおける他のウイルスRNAポリメラーゼインヒビターに対するこの耐性のメカニズムはAR-12に抵抗性を与えない。
【００５０】
図1に示すように、AR-12はウイルスタンパク質生成を抑制する。この態様において、RAW264.7細胞を、5μMのAR-12またはDMSOで1時間前処理した。細胞を培地+/-薬剤においてインフルエンザAウイルス（IAV）PR8（H1N1）株に感染させ、感染24時間後に収集し、およびウエスタンブロッティングのために溶解した。さらに、この態様では、ウイルスタンパク質生成は、少なくとも約50％だけ減少する。ウエスタンブロットは、核タンパク質（α-NP）、マトリクスタンパク質（α-M1）およびα-GAPDH（グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ-コントロール）のレベルを示す。
【００５１】
図2に示されるように、AR-12はウイルス感染を妨げる。この態様では、RAW264.7細胞を、5μMのAR-12またはDMSOで1時間前処理し、培地+/-薬物においてA型インフルエンザウイルス（IAV）株PR8（H1N1）で感染させ、感染24時間後に収集し、パラホルムアルデヒドにより固定し、およびインフルエンザウイルスのNP発現について染色した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、％感染率を決定した。パネル「A」は、感染細胞についての代表的なフローサイトメトリーデータを示す。パネル「B」は、三回のサンプル+/-標準偏差の代表的な定量化である。
【００５２】
以下のテーブル2は、示されたウイルスに関するAR-12のEC50およびEC90を測定する模範的なインビトロ研究においての結果を提供する。
【００５３】
【表２】
2018506529.tif 000005
【００５４】
別の態様において、AR-12は、上記のウイルスによって引き起こされる病気および/または疾患を処置または防止するために使用することができる。
【００５５】
一態様では、AR-12は、ここに説明されるような第VII群ウイルスのウイルス複製を抑制する。
【００５６】
AR-12は、ウイルス複製が抑制される血液、組織、または器官の濃度を達成するのに十分な量でレトロウイルス（例は、レンチウイルス）に感染する宿主に施与することができる。
【００５７】
ここに説明する態様は、AR-12を、宿主に、約0.1μMないし約20μMの血液、組織、または器官濃度を達成するのに十分な量で施与することを含む、レトロウイルスに感染する宿主においてレトロウイルス複製を抑制する方法を提供する。
【００５８】
一態様では、AR-12は、宿主に、少なくとも約0.30μMの血液または組織濃度を達成するのに十分な量で施与される。
【００５９】
さらなる態様は、宿主に、少なくとも第二の化合物〔例は、アジドチミジン（AZT）、エファビレンツ、およびロピナビル〕を施与することを含む。
【００６０】
さらに別の態様は、AR-12を、宿主に、少なくとも約0.30μMの血液、組織、または器官濃度を達成するのに十分な量で施与することによって、HIV DRに感染する宿主においてHIV DRの複製を抑制する方法を提供する。
【００６１】
用語「IC50」は、ウイルス複製が50％だけ抑制されるAR-12の抑制濃度に言及する。一態様において、AR-12についてIC50は約0.5μM未満である。別の態様では、IC50は約0.2μMより大きい。さらに別の態様では、IC50は、約0.24μM、約0.27μM、約0.37μM、または約0.31μMである。
【００６２】
用語「TC50」は、毒性濃度（50％のテスト細胞が死滅する濃度）に言及する。「TC50/IC50比」（選択指標としても知られる）は、実験でテストされた細胞の50％に毒性を引き起こす薬物のレベルを、ウイルスの複製能力において50％低下させる薬物のレベルで割った尺度である。一つの態様において、AR-12についてそのTC50/IC50比は、約30未満である。別の態様では、AR-12についてのTC50/IC50比は、約25.6、約22.6、約19.9、約16.4、または約12である。
【００６３】
以下のテーブル3は、示されたHIV分離体に感染した末梢血単核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells、PBMCs）においてAR-12、AZT（アジドチミジン）、エファビレンツ、およびロピナビルについてのIC50、TC50を測定し、TC50/IC50比を提供する模範的なインビトロ研究の結果を提供する。
【００６４】
【表３】
2018506529.tif 000006
【００６５】
テーブル3に示すように、すべてのテストしたHIV株に関してIC50はマイクロモル範囲にある（例は、0.24ないし0.51μM）。抗ウイルス指標についての>10は潜在的有効性対認容性の良好なマージンを提供する。
【００６６】
別の態様において、AR-12は、単独または他の抗ウイルス薬物、プロテアーゼインヒビター（例は、チプラナビル、インジナビル、アタザナビル、サキナビル、ロピナビル、リトナビル、ダルナビル、アタザナビル、ネルフィナビル）、ヌクレオシド/ヌクレオチド逆転写酵素インヒビター（例は、エムトリシタビン、ラミブジン{3TC}、ジドブジン{AZT}、ジダノシン、テノホビル、スタブジン、アバカビル）、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（例は、リルビビリン、エトラビリン、ネビラピン、デラビルジン、エファビレンツ）、侵入インヒビター（HIV-1）/融合インヒビター（T-20、マラビロク）、およびHIV-1、薬物耐性HIV-1およびHIV-2によって引き起こされる病気および/または疾患を処置または防止するためのインテグラーゼインヒビター（ラルテグラビル、ドルテグラビル）を含めたものとの併用を用いることができる。宿主生物学に依存するそれらのウイルス複製プロセスを標的とすることにより、ウイルスゲノム（例は、変異ウイルスRNAポリメラーゼ）において変異に続く耐性機構を迂回し、または宿主タンパク質シャペロン標的および折り畳まれていないタンパク質応答経路が進化的に保存されるとき耐性が発達するのを妨げる可能性が許容される。
【００６７】
ここに説明する態様は、AR-12を、宿主に、少なくとも約25mg/kgの量で施与することによってウイルス誘発性劇症肝不全を有する宿主の生存率を増加させる方法を提供する。別の態様において、25mg/kgの用量は少なくとも四回（例は、感染後0、24、36、48時間）管理される。この態様において、宿主の生存率は少なくとも約20％だけ増加する。
【００６８】
ここに説明するAR-12は、経口、非経口（IV、IM、デポー-IM、SQ、およびデポー-SQ）、舌下、鼻腔内、吸入、くも膜下（腔内）（髄腔内とも言う）、局所、眼科的経路によって、または直腸施与することができる。当業者（熟練の者とも言う）に知られる剤形は、ここに説明するAR-12のデリバリーに適する。
【００６９】
AR-12は、適切な薬学的調剤物、たとえば、クリーム、ゲル、懸濁物、眼科用調剤物、錠剤、カプセル、吸入器、または経口投与のためのエリキシル剤など、または非経口投与のための無菌溶液または懸濁液におけるようなものに製剤化することができる。AR-12は、当技術分野でよく知られた技術および手順を用いて薬剤組成物に調剤することができる。
【００７０】
一態様では、約0.1ないし1000mg、約5ないし約200mg、または約10ないし約50mgのAR-12、または生理学的に許容可能な塩またはエステルを、生理学的に許容可能なビヒクル（媒体とも言う）、担体、賦形剤、結合剤、保存剤、鎮痛剤、安定剤、香料、等と共に、許容可能な製薬実務によって要求される単位剤形において配合することができる。AR-12を含む組成物または調剤物において活性物質の量は、示された範囲内の適切な投薬量が得られるような量である。
【００７１】
別の態様では、組成物は単位剤形において調剤することができ、各投与量は約1から約1000mgまで、約1ないし約500mg、または約10ないし約200mgの活性成分が含まれる。用語「単位剤形（unit dosage from）」は、ヒト対象および他の哺乳動物のための単位投薬量として適切な物理的に別個の単位に言及し、各単位は、適切な薬学的賦形剤と関連して、望ましい治療効果を生じるように計算された所定量の活性物質を含む。
【００７２】
一態様では、AR-12の一またはそれよりも多く（一以上とも言う）を適切な薬学的に許容可能な担体と混合して組成物を形成する。化合物（群、複数もありうることを示す）を混合または添加することにより、得られる混合物は、クリーム、ゲル、溶液、懸濁物、エマルション、またはその種の他のものなどであってもよい。リポソームの懸濁物も、薬学的に許容可能な担体として使用しうる。これらは、当業者に知られる方法に従って調製されてよい。得られる混合物の形態は、意図された施与様式および選定された担体またはビヒクルにおいて化合物の可溶性を含め、多数の因子に依存する。一態様では、有効濃度は、処置される疾患、障害、または状態の少なくとも一の症状を軽減または緩和するのに十分であり、および経験的に決定されうる。
【００７３】
ここに説明するAR-12の施与に適する薬学的担体またはビヒクルには、特定の施与様式に適する任意のそのような担体が含まれる。さらに、活性物質はまた、望ましい作用を損なわない他の活性物質、または望ましい作用を補い、または別の作用を有する物質と混合することもできる。化合物は、組成物において唯一の薬学的に活性な成分として製剤化してよく、または他の有効成分と組み合わせてよい。
【００７４】
別の態様では、AR-12が不十分な溶解性しか示さない場合、可溶化のための方法を使用することができる。そのような方法は知られており、および制限されるものではないが、共溶媒、たとえば、ジメチルスルホキシド（DMSO）などのようなものの使用、界面活性剤〔例は、TWEEN（ツィーン）、ポロキサマー〕の使用および重炭酸ナトリウム水溶液中での溶解が含まれる。たとえば、塩またはプロドラッグなどのような化合物の誘導体もまた、有効な薬剤組成物の調剤において使用されてよい。
【００７５】
化合物の濃度は、化合物が施与される障害の少なくとも一の症状を軽減または緩和する管理の際の量のデリバリーに有効である。典型的には、組成物は単一投薬量施与用に調剤される。
【００７６】
別の態様では、ここに説明するAR-12は、たとえば、徐放性製剤またはコーティングなどのような、本体からの迅速な放出に対してそれらを保護する担体を用いて調製しうる。そのような担体には、制限されないが、たとえば、マイクロカプセル化デリバリーシステムなどのような放出制御製剤が含まれる。活性化合物は、処置されるペイシェントに望ましくない副作用の不存在下で治療的に有用な効果を発揮するのに十分な量で薬学的に許容可能な担体において含めることができる。治療上有効な濃度は、処置される障害についての既知のインビトロおよびインビボモデルシステムにおいて化合物を試験することによって経験的に決定することができる。
【００７７】
別の態様において、ここに記載のAR-12および組成物は、複数または単一用量容器に封入することができる。封入される化合物および組成物はキットで提供することができ、たとえば、使用のために組み立てることができる構成部品を含む。たとえば、凍結乾燥形態においてAR-12および適切な希釈剤は、使用前の組み合わせのための分離した成分として提供されうる。キットはAR-12および同時施与のための第二の治療剤を含んでよい。AR-12および第二の治療剤は、別々の構成要素として提供されてもよい。キットは、複数の容器を含んでよく、各容器は、ここに記載のAR-12の一以上の単位用量を保持する。一の態様において、容器は、望ましい施与様式に適合させることができ、制限されないが、経口投与のための懸濁物、溶液、錠剤、ゲルカプセル、徐放性カプセル、およびその他同種類のものなど；非経口施与のためのデポー生成物、プレ充填シリンジ、アンプル、バイアル、およびその他同種類のものなど；および局所施与のためのパッチ、メディパッド、ゲル、懸濁物、クリーム、およびその他同種類のものなどが含まれる。
【００７８】
薬剤組成物においてAR-12の濃度は、活性化合物の吸収、不活性化、および排泄率、投薬スケジュール、および施与される量ならびに当業者に知られる他の因子に依存する。
【００７９】
別の態様では、活性成分は、一回に施与してもよく、または時間間隔で施与されるより一層少ない用量に分割してもよい。正確な投与量および処置期間は、処置される疾患の関数であり、および既知の試験プロトコルを使用して、またはインビボまたはインビトロ試験データからの外挿によって、経験的に決定され得ることが理解される。濃度および投与量の値は、緩和される状態の重篤度によってまた変動しうることに注目される。任意の特定の対象にとって、個々の必要性および組成物の投与を管理または監督する者の専門的判断に従って特定の投与計画を経時的に調整すべきであること、およびここに記載の濃度範囲は、模範的なだけであり、および請求される組成物の範囲または実行を制限することを意図するものではないことがさらに理解される。
【００８０】
経口組成物は概して、不活性希釈剤または食用担体を含み、およびタブレットに圧縮されるか、またはゼラチンカプセルに封入されうる。経口治療管理の目的のために、活性化合物または化合物群は、賦形剤を伴って組み込まれ、および錠剤、カプセル、またはトローチの形態で使用されうる。薬学的に適合性の結合剤およびアジュバント物質は、組成物の一部として含めることができる。
【００８１】
錠剤、丸薬、カプセル、トローチ、およびその他同種類のものなどは、以下の任意の成分または類似の性質の化合物を含むことができ：結合剤、たとえば、制限されないが、トラガカント、アカシア（アラビアゴム）、コーンスターチ、またはゼラチンなどのようなもの；賦形剤（例は、任意の適切な充填剤/増量剤）、たとえば、微晶質セルロース、デンプン、またはラクトースなどのようなもの；崩壊剤、たとえば、制限されないが、アルギン酸およびコーンスターチなどのようなもの；潤滑剤、たとえば、制限されないが、ステアリン酸マグネシウムなどのようなもの；流動促進剤、たとえば、制限されないが、コロイド状二酸化ケイ素などのようなもの；甘味剤、たとえば、制限されないが、スクロースまたはサッカリンなどのようなもの；および香味剤、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはフルーツフレーバーなどのようなものである。
【００８２】
投薬量単位形態がカプセルであるとき、それは、上記タイプの材料に加えて、たとえば、脂肪油などのような液体担体を含有することができる。さらに、投薬量単位形態は、様々な他の物質、それは投薬量単位の物理的形態を修飾するもので、たとえば、糖および他の腸溶性薬剤のコーティングを含むことができる。化合物はまた、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハー（オブラートとも言う）、チューインガムまたはその種の他のものなどの成分として施与することもできる。シロップは、活性化合物に加えて、甘味剤としてスクロースおよびある種の保存剤、染料および着色剤、および香味料を含有してもよい。
【００８３】
活性物質はまた、望ましい作用を損なわない他の活性物質と、または望ましい作用を補う物質と混合または同時施与することもできる。AR-12は、たとえば、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、鎮痛剤、または化粧品〔例は、オセルタミビル｛Tamiflu(R)（タミフル）（商標）｝およびザナミビル｛Relenza(R)（リレンザ）（商標）｝などの抗インフルエンザ剤または他の適切な抗-HIV薬〕と組み合わせて用いることができる。
【００８４】
一態様では、非経口、皮内、皮下、吸入、または局所適用に使用される溶液または懸濁物は、任意の以下の成分を含むことができ、すなわち：たとえば、注射用水、塩類溶液、固定油などのような滅菌希釈剤、たとえば、ゴマ油、ココナツ油、ピーナッツ油、綿実油、およびその他同種類のものなどのような自然発生性植物油、またはたとえば、オレイン酸エチル、およびその他同種類のものなどのような合成脂肪族ビヒクル、アルコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；たとえば、ベンジルアルコールおよびメチルパラベンなどのような抗微生物性物質；たとえば、アスコルビン酸および重亜硫酸ナトリウムなどのような抗酸化剤；たとえば、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）などのようなキレート剤；たとえば、酢酸塩、クエン酸塩、およびリン酸塩などのような緩衝剤；およびたとえば、塩化ナトリウムおよびデキストロースなどのような張性の調節剤である。非経口調製物は、ガラス、プラスチック、または他の適切な物質で作られたアンプル、処分可能なシリンジ、または複数用量バイアルに封入することができる。緩衝剤、保存剤、抗酸化剤、およびその他同種類のものなどは、必要に応じて組み込むことができる。
【００８５】
静脈内投与される場合、適切な担体には、制限されないが、生理学的塩類溶液、リン酸緩衝化塩類溶液（PBS）、およびたとえば、グルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エタノール、N-メチルピロリドン、界面活性剤およびそれらの混合物などのような増粘剤および可溶化剤を包含する溶液が含まれる。組織標的化リポソームを含むリポソーム懸濁物もまた、薬学的に許容可能な担体として適切でありうる。これらは、当該分野で知られる方法に従って調製することができる。
【００８６】
別の態様では、AR-12は、徐放性製剤またはコーティングのような本体からの迅速な排出に対して化合物を保護する担体を用いて調製することができる。そのような担体には、たとえば、制限されないが、インプラントおよびマイクロカプセル化デリバリーシステムなどのような制御放出調剤物、ならびにたとえば、コラーゲン、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、およびその他同種類のものなどのような生分解性、生体適合性ポリマーが含まれる。そのような調剤物の調製方法は当業者に既知である。
【００８７】
さらに別の態様において、本開示の方法において採用される化合物は、経腸的にまたは非経口的に施与されうる。経口投与されるとき、本開示の方法において採用される化合物は、当業者によく知られるように経口投与のための通常の剤形で施与することができる。これらの剤形には、錠剤およびカプセル剤の通常の固体単位剤形、ならびに液状剤形、たとえば、溶液、懸濁物、およびエリキシル剤などのようなものが含まれる。固形剤形が使用されるとき、それらは、ここに説明される方法で採用される化合物が一日に一回または二回だけ施与される必要があるように、持続放出型であることができる。
【００８８】
剤形は、ペイシェントに、一日1、2、3、または4回施与することができる。ここに説明するようにAR-12は、一日三回またはそれ未満、または一日一回または二回でさえも、または一日おきに施与することができる。
【００８９】
「治療上有効な量」および「治療上有効な時間の期間」という用語は、ウイルス感染、ウイルス複製、および/またはウイルスレベルを低下させるのに有効な投薬量および時間の期間での処置を意味するために使用される。上記のように、そのような施与は、非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻腔内、または直腸内であることができる。一態様では、全身投与されるとき、治療上の組成物は、約0.1μMから約20μMまでの化合物の血中濃度を達成するのに十分な投薬量で施与することができる。局所的施与のために、これよりもはるかに低い濃度が有効であることができ、およびはるかに高い濃度が許容されてよい。当業者は、AR-12のより一層低い有効濃度をもたらすそのような治療効果が、処置される組織、器官、または特定の動物またはペイシェントに依存して著しく変動しうることを理解するであろう。ペイシェントは一回の用量で開始することができるが、その用量はペイシェントの状態が変化するにつれて変動しうることも理解される。
【００９０】
施与の正確な投薬量および頻度は、施与される開示の方法において採用される特定化合物、処置される特定の状態、処置される状態の重篤度、特定のペイシェントの齢、重量、一般的な身体状態、および他の薬物療法に依存し、個々に、この分野の熟練した管理医師によく知られるように採用されうる。
【実施例】
【００９１】
例
ここに記載されたすべての要素が必要とされるわけではない。実際には、当業者は、ここに記載された方法の多数の追加的な使用および変形を見出し、それらは本発明者らにより請求項によってだけ制限されることが意図される。ここで引用したすべての参考文献は、その全体が参考として組み込まれる。ここに記載されている一定の例に記載されている研究は、本発明者らの指示どおり、「In Vitro Testing Resources for HIV Therapeutics and Topical Microbicides（HIV治療薬および局所的殺菌剤のためのインビトロ試験用リソース）」と題する契約HHSN272201400010Iの下にDivision of AIDS, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health（AIDSの部門、米国国立アレルギー感染病研究所、国立衛生研究所）からのフェデラルファンドを用いるSouthern Research Institute（南部諸州研究学会）によって行った。
【００９２】
例1
【００９３】
RAW264.7細胞を、10％ウシ胎仔血清を補充したDulbecco's Modified Eagle Medium（ダルベッコ改変イーグル培地）において37℃にておよび5％CO2レベルにより維持された加湿インキュベーター内で増殖させた。示されたウイルスによる感染に先立ち一時間に、細胞を、DMSOに溶解した原液から細胞増殖培地中に希釈した5uMのAR-12で処理するか、または増殖培地中で等容量のDMSOにより処理した。
【００９４】
例2
【００９５】
インフルエンザウイルスA/PR/8/34（H1N1）ストックを、10日間の孵化鶏卵において37℃で48時間増殖させ、およびMadin Darby Canine Kidney cells（メイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞）において力価測定した。薬物またはDMSOで細胞を1時間前処理した後、DMSOまたはAR-12を含む培地中で5つの感染多重度でウイルスを細胞に添加した。フローサイトメトリーまたはウエスタンブロッティングのための細胞収集に先立ち感染を37℃で24時間進行させた。
【００９６】
例3
【００９７】
ウエスタンブロッティングのために、細胞を、1％Brij97およびプロテアーゼインヒビターを含有する緩衝剤により溶解した。インフルエンザウイルス核タンパク質（NPとして知られる）およびマトリクスタンパク質1（M1として知られる）に対する抗体を、感染細胞において産生されるこれらのタンパク質のレベルを調べるためにブロッティング用に使用した。GAPDHに対する抗体を用いて、異なるレーンにおいて匹敵するタンパク質負荷を実証した。フローサイトメトリーのために、細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定し、PBS中の0.1％Triton（トライトン）X-100で透過処理し、および蛍光色素Alexafluor（アレクサフルーア）-647に直接コンジュゲートしたインフルエンザNPに対する抗体で染色した。Beckton Dickinson（ベクトンディッキンソン）FACSCanto IIフローサイトメーターで細胞を分析し、および生データはFlowjoソフトウェアを用いて分析した。
【００９８】
例4-収率低下アッセイによる一次EBOV抗ウイルス試験
【００９９】
収率低下アッセイのために、10％ウシ胎仔血清（FBS）、および1X GlutaMaxを含む改変イーグル培地（MEM）中に維持されたHepG2細胞を、24ウェルプレートにおいて平板培養する。コンフルエントな単層を、0.1のMOIにて37℃で1時間、15分ごとに揺動させてEBOVに感染させる。感染後、ウイルス含有培地を除去し、およびプレートをPBSで四回洗浄して残留ウイルスを除去する。洗浄後、AR-12を二重に6つの濃度で培地に添加し、およびプレートを37℃にて72時間インキュベートする。ウイルスRNA標準と比較してEBOVゲノム同等物を決定するために、リアルタイムRT-PCRによっての評価用に感染の72時間後で培地を収集する。カルボサイクリック3-デアザアデノシンまたはファビピラビル（T-705）を陽性コントロールとして使用し、および培地だけの陰性コントロール（ウイルスなし）およびウイルスだけのコントロール（化合物なし）を含む。抗ウイルス活性は、EBOV RNAレベルにおいての低下（EC50およびEC90値の決定）から計算することができる（有効濃度；EC）。化合物の細胞毒性（細胞傷害性とも言う）（CC50）は非感染細胞においてPromega’s（プロメガ社の）CellTiter（セルタイター）GloまたはCellTiter96（MTS）によって測定することができる。選択性指標（SI50）はCC50/EC50として計算することができる。
【０１００】
例5-収率低下アッセイによる二次EBOV抗ウイルス試験
【０１０１】
二次アッセイは標準的なプラークアッセイによるEBOV収率低下の評価を含むことができる。プラークアッセイはリアルタイムRT-PCRよりも面倒である。その結果、プラークアッセイは、一次スクリーニングには適していないが、RT-PCRエンドポイントによって生成された収率低下の結果を確認するために二次的方法として使用することができる。二次アッセイは、上記の一次アッセイと同様の方法で行うことができ；しかし、アッセイの終わりにて、アッセイプレートから収集した試料は、EBOV力価についてリアルタイムRT-PCRの代わりにプラークアッセイによって評価される。プラークアッセイは、6ウェルプレートにおいて90-100％コンフルエントVero（ベロ）E6細胞を用いて完了させることができる。滴定のためのサンプルは10倍に連続希釈することができ、および200μLを各ウェルに添加することができる。プレートは37℃で1時間、15分ごとに揺動してインキュベートされる。1×EMEM、5％FBS、および0.9％アガロースを含有する一次オーバーレイを各ウェルに添加することができる。プレートを37℃にて4-7日間インキュベートし、次に二次オーバーレイが続き、それは5％ニュートラルレッドの添加を伴い一次オーバーレイと同じである。PFUは感染後7-10日目に計数する。
【０１０２】
例6-インフルエンザAウイルス
【０１０３】
一態様では、アッセイは、インフルエンザAウイルス（IAV）感染に対するAR-12の効果を評価するために、HEK293Tレポーター細胞系〔ELVIRA（エルビラ）(R)〕において行うことができる。これらの細胞は、インフルエンザAウイルスプロモーターによって駆動されるホタルルシフェラーゼ（ffLuc）発現カセットで安定にトランスフェクトされている。IAVに感染すると、IAVポリメラーゼは細胞内で発現され、およびffLucの発現を駆動する。ffLucの活性は細胞集団における感染の程度に直接対応する。この態様において、AR-12による細胞の処理は、IAV感染を用量依存的マナーで抑制し、たとえば、インフルエンザ株H3N2に関しては図1に、およびインフルエンザ株H1N1に関しては図2において示すように、ffLuc活性の低下をもたらす。化合物SRI35204はAR-12を指す。
【０１０４】
【表４】
2018506529.tif 000007
【０１０５】
図3および図4に示すように、インフルエンザ株H3N2株およびH1N1株でそれぞれAR-12の濃度が約0.15nmから約1.25nmに増加するにつれて、IAVポリメラーゼの発現（残留ルミネセンスのパーセントによって測定される）は用量依存的マナーにおいて減少する。約1.25nmよりも高い濃度で、ルミネセンスおよび細胞生存率はゼロに近づく。
【０１０６】
テーブル3に示すように、インフルエンザ株H3N2およびH1N1についてのEC50（半最大有効濃度）は、それぞれ0.33uMおよび0.37uMである。比較のために、AR-12およびリバビリンについてのEC50およびCC50（細胞増殖抑制濃度-細胞増殖を50％だけ減少させるのに必要な濃度）値を示す。
【０１０７】
例7-フニンウイルス
【０１０８】
細胞傷害性アッセイ
【０１０９】
AR-12の細胞傷害性を、VeroおよびA549細胞の培養物において比色MTS法によってテストした。
【０１１０】
細胞系Vero（アフリカミドリザル腎臓）およびA549（肺がん腫ヒト細胞）を、5％ウシ胎仔血清を補充したEagle’s（イーグル）最小必須培地（MEM）中で増殖させた。生物学的アッセイにおいて、血清濃度を維持培地（MM）について1.5％に減少させた。
【０１１１】
AR-12をジメチルスルホキシド（DMSO）において10mMにて溶解した。細胞試験のための希釈をMMにおいてさらに実行した。細胞生存率は、MTS[3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム、内部塩；CellTiter（セルタイター）96(R)AQueous One Solution Reagent Promega（アクエアウス・ワン・ソリューション・リージェント・プロメガ）]法によって測定した。VeroおよびA549細胞のコンフルエントな培養物を、96ウェルプレートにおいて、抗ウイルスアッセイで使用されたものと同等のインキュベーション条件（後述参照）を用いてAR-12の連続濃度に曝露した。MTS含有MMの10μlを各ウェルに添加した。37℃で2時間インキュベートした後、吸光度をマイクロプレートリーダーで490nmにて測定した。細胞傷害性濃度50％（CC50）は、細胞生存率を50％だけ低下させるのに必要な化合物濃度として算出した。すべての測定を二回、およびそれぞれを三重で行った。
【０１１２】
図5に示すように、AR-12の存在下でのVeroおよびA549細胞の双方の生存率は、12.5μMより低い濃度で80-90％より高いレベルに維持された。より一層高い濃度では、細胞生存率は用量依存的マナーにおいて減少した。用量反応曲線から、VeroおよびA549細胞についてのAR-12のCC50sは、それぞれ、28.2±2.1および19.3±0.1μMであった。
【０１１３】
抗ウイルス活性アッセイ
【０１１４】
AR-12の抗ウイルス活性を、VeroおよびA549細胞においてウイルス収量抑制アッセイによってテストした。
【０１１５】
この例では、以下のフニンウイルス（JUNV）の弱毒化ウイルス株を使用した：ワクチン株Candid（カンジド）-1[Maiztegui（メイズテグイ）ら、J. Infect. Dis.（ザ・ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジーズ）177、277-83、1998]；非病原性XJCl3株、プロトタイプXJ株由来[de Guerrero（デ・ゲレロ）ら、Medicina（メディシナブル）（Bs.As.）29、1-5、1969]；および軽度のヒト症例から取得された自然に弱毒化されたIV4454株[Contigiani（コンティジャニ）ら、Medicina（Bs.As.）37、244-51、1977]。アレナウイルスタカリベ（The arenavirus Tacaribe）（TCRV）、TRLV11573株[Downs（ダウンズ）ら、Am. J. Trop. Med. Hyg.（ジ・アメリカン・ジャーナル・オブ・トロピカル・メディシン・アンド・ハイジーン）12、640-46、1963]もまたアッセイした。
【０１１６】
ウイルス収量抑制アッセイのため、24ウェルプレートで増殖させたVeroおよびA549細胞のコンフルエントな単層を、0.1PFU/細胞の感染多重度で各ウイルス株により感染させた。37℃で1時間吸着させた後、細胞をMMにより洗浄し、および一連の非細胞毒性濃度のAR-12を含むMMを再供給した。37℃で48時間インキュベーションして後、上清培養物を収集し、およびVero細胞におけるプラークアッセイによって細胞外ウイルス収量を定めた。有効濃度50％（EC50）は、用量反応曲線から、未処理のものと比較して、化合物で処理した培養物においてウイルス収量を50％だけ減少させるのに必要な化合物濃度として算出した。
【０１１７】
図6に示すように、三つのJUNV株の複製は、AR-12によって濃度依存的に抑制された。EC50値は用量反応曲線から算出し、ウイルス株および宿主細胞に依存して0.15-0.55μMの範囲内であり、および選択性指標（比CC50/EC50）は35.1および128.7の間で変動した。TCRVに対する活性は、JUNVに抗原的に密に関連し、これもまたテストした。VeroおよびA549細胞におけるTCRVについてのEC50値は、それぞれ0.35±0.03および0.84±0.02μMであり、および対応する選択性指標は80.6および23.0であった。
【０１１８】
【表５】
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aEC50（有効濃度50％）：感染48時間後にウイルス収量を50％だけ減少させるのに必要な濃度。
bS1（選択性指標）：比CC50/EC50。AR-12のCC50値は、VeroおよびA549細胞についてそれぞれ28.2および19.3μMであった。
【０１１９】
例8-チクングンヤウイルス
【０１２０】
約4mgの化合物をガラスバイアルに移し、およびDMSOを添加して最終濃度10mg/mを有する原液を取得した。DMSOストックは、使用しないとき、-20℃で貯蔵した。各実験の前に、解凍DMSOストックを沈殿物の存在についてチェックし、そして沈殿物が見られないときにだけ使用した。
【０１２１】
1日目に、Vero A細胞を、100μlのアッセイ培地［2％のウシ胎児血清〔Gibco（ギブコ社）〕、1％重炭酸ナトリウム（Gibco、2508006）および1％のL-グルタミン（25030024）を補充したMEM Rega 3培地｛Cat.N°19993013；Invitrogen（インビトロゲン社）｝］中で96ウェル組織培養プレート〔Becton Dickinson（ベクトンディッキンソン社）において2.5×10 4細胞/ウェルの密度で播種し、そして37℃および5％CO2でのインキュベーターにおいて一昼夜接着させた。
【０１２２】
2日目に、AR-12およびT-705（1：3の希釈係数）の2×（2倍）連続希釈物を細胞の最上部のアッセイ培地で調製し、その後直ちに2×希釈の100μlのCHIKV 899（野生型またはT-705耐性）を各ウェルに添加した（細胞コントロールウェルを除く）。化合物の最終出発濃度は、AR-12およびT-705についてそれぞれ100μMおよび200μMであり、最終感染多重度（MOI）は0.001であった。化合物の細胞傷害性を評価するために、同様のプロトコルに従ったが、ウイルス接種物の代わりにアッセイ培地を細胞に添加した。抗ウイルスアッセイを設定する際の持ち越し効果（carry-over effects）を防止するために、各希釈段階の間に先端チップの変更を行った。細胞傷害性実験には先端チップの変更の必要はないと考えられた。セットアップ後、アッセイプレートをインキュベーター（37℃）に5日間戻し、その時間に未処理の感染コントロール条件において最大の細胞変性効果が観察される。
【０１２３】
抗ウイルス効果の定量のために、未処理の感染コントロールが100％ウイルス誘発細胞死（または顕微鏡検査により評価した細胞変性効果）に近づいた時点でアッセイ培地を吸引し、次いでフェノールレッドフリー培地中の10％MTS/PMS（3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム/フェナジンメトサルフェート、Promega）溶液の100μlの添加を続け、および光学濃度（OD値）が0.6-0.8の範囲になるまでの1.5時間（37℃、5％CO2、95-99％相対湿度）インキュベートした。吸光度を498nmの波長にて測定し〔Infinite（インフィニット）F50、Tecan（テカン）〕、および未処理コントロールのパーセンテージに換算した。
【０１２４】
EC50値の生データ、クオリティコントロール（品質管理とも言う）および計算の分析は、カスタムメイドのデータ処理ソフトウェアパッケージ〔Accelrys（アクセルリス）〕を用いて行った。EC50（用量反応曲線から導き出される値）は、ウイルス誘発細胞死の50％抑制が観察される化合物の濃度を表す。すべてのアッセイウェルを、ウイルス誘導性細胞変性効果（CPE）の軽微な徴候または化合物によって引き起こされる細胞に対する変化について顕微鏡検査でチェックした。化合物は、少なくとも一の濃度で、宿主細胞および単層形態への大きな変化なしに、ウイルス誘発性細胞変性効果の任意の徴候からの細胞の十分な保護が観察される場合、ヒット選定基準に合致すると考えられる。CC50（用量反応曲線から導かれる値）は、化合物が非感染細胞の全宿主細胞代謝を50％だけ低下させる化合物の濃度を表す）。選択性指標（SI=CC50/EC50）は、このウイルスセルに基づくアッセイにおいて化合物の治療上のウインドウの指示を提供する）。標準偏差の計算を除いて、それ以上の統計分析は実行しなかった。
【０１２５】
図7に示されるように、AR-12について、1μM未満の濃度では、ウイルス誘導性細胞死の抑制はない（抗ウイルス活性なし、記号黒四角が観察される）が、その一方、これらの濃度での化合物は、宿主細胞の代謝にほとんど影響を及ぼさない（抗代謝効果が観察されないか、またはわずかであるに過ぎない
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）。0.14および3.7μMの間のAR-12の濃度では、細胞生存の急激な増加が観察され、それは明確な細胞保護（抗ウイルス）効果を指す。3.7μMより高い濃度では、AR-12の抗代謝効果は、細胞の全体的な代謝活性の喪失の原因となる（直接的な抗代謝効果の組合せから観察される結果である抗代謝効果で、化合物は宿主細胞代謝および/または細胞増殖抑制効果および/または細胞傷害効果を誘導しうる）。
【０１２６】
並列実験において、AR-12およびT-705の抗ウイルス効果を、野生型およびT-705耐性チクングンヤウイルスの複製について評価した（図8）。
【０１２７】
【表６】
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【０１２８】
予測されるように、T-705の抗ウイルス活性はより一層高い濃度にシフトした（7.4から138μMにまで、それはT-705の抗ウイルス効果に対するファクター19を伴う感受性の低下である）。AR-12の抗ウイルス活性は無変化に維持された。
【０１２９】
細胞培養において評価するとき、AR-12はチクングンヤウイルス誘導細胞死を1.1±0.5μMのEC50により抑制する。同じ設定において、化合物は6.6±0.3μMのCC50により宿主細胞の代謝に悪影響を及ぼし、それはこのアッセイにおいて5.8の選択性指標をもたらす。
【０１３０】
T-705耐性チクングンヤウイルスを用いた並列実験では（図8）、AR-12の抗ウイルス能力は影響を受けない。このことから、T-705の抗ウイルス効果に対して感受性を低くするウイルスが獲得する変異はAR-12の抗ウイルス効果に影響しないと結論付けることができる。微視的観察を考慮すると（図7および8）、このウイルス-細胞ベースのアッセイにおけるAR-12の抗ウイルス活性は、化合物の有害作用が支配し始める端部に位置する（一のアッセイにおいて、一の濃度では部分的な保護が、および次の濃度では細胞傷害性効果があるが、その一方で他のアッセイでは、前のアッセイで部分的な保護が観察されたのと同じ濃度で十分な保護がある）。
【０１３１】
例9-インビトロウイルススクリーン
【０１３２】
様々なウイルスに対するAR-12の活性の模範的なインビトロスクリーニングの結果を以下に概略する。
【０１３３】
【表７】
2018506529.tif 000011
【０１３４】
図8は、チクングンヤウイルスの野生型（WT）およびT-705（ファビピラビル）耐性（RES）株に感染したVero A細胞におけるAR-12の模範的な抗ウイルス効果を示す。示されるように、AR-12は、二つの細胞タイプにおいて、チクングンヤウイルスの野生型およびファビピラビル耐性株の双方に対するその抗ウイルス効果を保持する。
【０１３５】
例10-新鮮なヒトPBMCsにおける抗HIV有効性評価
【０１３６】
新鮮なヒトPBMCsで、HIVおよびHBVについて血清反応陰性のものをスクリーニングドナーから分離する〔Biological Specialty Corporation（バイオロジカル・スペシャルティ・コーポレーション）、Colmar（コルマール）、PA（ペンシルベニア州）〕。細胞を低速遠心分離およびPBS中での再懸濁することにより2-3回ペレット化/洗浄して、汚染血小板を除去する。次いで、Leukophoresed（白色素胞化）血液をDulbecco's Phosphate Buffered Saline（ダルベッコのホスフェート緩衝化塩類溶液）（DPBS）で1：1に希釈し、そして14mLのリンパ球分離培地〔Lymphocyte Separation Medium、LSM；Mediatech, Inc.（メディアテク社）によるCellgro（セルグロ）(R)；密度1.078 +/-0.002g/ml；Cat. ＃（カタログ番号）85-072-CL〕を50mLの遠心管に層状に重ね入れ、および次いで600×gにて30分間遠心分離した。バンドに分かれたPBMCsを結果として得られた界面から穏やかに吸引し、そして続いて低速遠心分離によってPBSで2回洗浄する。
【０１３７】
最終的な洗浄の後、細胞をトリパンブルー排除によって計数し、および15％ウシ胎仔血清（FBS）、および2mMのLグルタミン、4μg/mLフィトヘマグルチニン〔PHA、Sigma（シグマ）〕を補充したRPMI 1640中に1×10 6細胞/mLで再懸濁する。細胞を37℃で48-72時間インキュベートさせる。インキュベーション後、PBMCsを遠心分離し、および15％FBS、2mMのL-グルタミン100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、およびおよそ100-150U/mL組換えヒトIL-2〔R＆D Systems, Inc（R&Dシステム社）〕を伴うRPMI 1640において再懸濁する。IL-2は、PHA分裂促進刺激によって惹起される細胞分裂を維持するために培養培地において含まれる。PBMCsは、アッセイプロトコルで使用されるまで、隔週培地交換によって1-2×10 6細胞/mLの濃度でこの培地中に維持される。細胞は、アッセイに使用するには古過ぎるとみなされ、および廃棄される前に、最大二週間培養される。組織培養フラスコへの付着の結果として、MDMsは培養物から枯渇する。
【０１３８】
標準的なPBMCアッセイについて、少なくとも二の正常ドナーからのPHA刺激細胞をプールし（一緒に混合して）、新鮮な培地において1×106細胞/mLの最終濃度に希釈し、および96ウェル丸底マイクロプレートの内部ウェルにSouthern Research Institute（南部諸州研究学会）の感染症研究部門（Infectious Disease Research department）によって開発された標準的なフォーマットにおいて、50μL/ウェル（5×104細胞/ウェル）にてプレーティング（平板培養とも言う）する。
【０１３９】
一よりも多いドナーからの単核細胞のプール（混合）を使用して、HIV感染における定量的および定性的な相違および一次リンパ球集団のPHAおよびIL-2に対する全体的応答から生じる個々のドナー間で観察される変動性を最小にする。各プレートは、ウイルス/細胞コントロールウェル（細胞プラスウイルス）、実験ウェル（薬物プラス細胞プラスウイルス）および化合物コントロールウェル（細胞傷害性のMTSモニタリングに必要な細胞を伴わない薬物プラス培地）を含む。このインビトロアッセイでは、PBMCの生存率は、インキュベーション期間の持続期間全体にわたって高いままである。したがって、感染したウェルは、抗ウイルス活性および細胞傷害性の双方の評価において用いられる。試験薬物希釈物をマイクロタイター管において2×濃度にて調製し、および各濃度100μL（合計九の濃度）を標準的なフォーマットを用いて適切なウェルに入れる。50μLのウイルスストックの所定の希釈物を各試験ウェルに入れる
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【０１４０】
PBMC培養物を、感染後37℃、5％CO2で七日間維持する。この期間の後、逆転写酵素活性および/またはp24抗原含量の分析のために、細胞フリーの上清サンプルを収集する。上清サンプル（上清試料とも言う）を取り出した後、化合物の細胞傷害性は、細胞生存能力の決定用にプレートにMTSを添加することによって測定する。ウェルはまた、顕微鏡で検査され、および何らかの異常が注目される。
【０１４１】
例11-逆転写酵素活性アッセイ
【０１４２】
マイクロタイタープレートベースの逆転写酵素（RT）反応を利用する〔Buckheit（バックハイト）ら、AIDS Research and Human Retroviruses（エイズ・リサーチ・アンド・ヒューマン・レトロウイルシーズ）7：295-302、1991〕。トリチウム化チミジン三リン酸（3H-TTP、80Ci/mmol、NEN）を1：1のdH2O：エタノールにおいて1mCi/mLにて受け入れる。ポリrA：オリゴdT鋳型：プライマー〔GE Healthcare（GEヘルスケア）〕を、150μLのポリrA（20mg/mL）を0.5mLのオリゴdT（20単位/mL）および5.35mLの滅菌dH2Oと合わせて、次いで分注する（1.0 mL）ことにより、ストック溶液として調製し、および-20℃で貯蔵した。RT反応緩衝剤は毎日のように新鮮に調製し、および1.0M EGTAの125μL、dH2Oの125μL、20％Triton X100の125μL、1.0M Tris（pH7.4）の50μL、1.0M DTTの50μL、および40μL の1.0M MgCl2からなる。最終的な反応混合物は、1部の3H-TTP、4部のdH2O、2.5部のポリrA：オリゴdTストックおよび2.5部の反応緩衝剤を合わせることによって調製する。この反応混合物10マイクロリットルを丸底マイクロタイタープレートに入れ、そしてウイルス含有上清15μLを添加して混合する。プレートを37℃で60分間インキュベートする。インキュベーション後、反応容量をDE81フィルターマット〔Wallac（ウォラック社）〕上にスポットし、5％リン酸ナトリウム緩衝剤または2×SSC〔Life Technologies（ライフ・テクノロジー社）〕中でそれぞれ5分間5回洗浄する。次に、それらを蒸留水中でそれぞれ1分間2回、70％エタノール中でそれぞれ1分間2回洗浄し、そして次いで乾燥させる。組み込まれた放射能（1分当たりのカウント数、CPM）は、標準的な液体シンチレーション技術を用いて定量化される。
【０１４３】
例12-細胞傷害性を測定するためにPBMC生存能力用のMTS染色
【０１４４】
アッセイ終了時に、アッセイプレートを可溶性テトラゾリウムベースの色素MTS〔CellTiter 96 Reagent、Promega（プロメガ社）〕で染色して細胞生存率を決定し、および化合物の毒性を定量する。代謝的に活性な細胞のミトコンドリア酵素はMTSを代謝して可溶性ホルマザン生成物を生じる。これにより、細胞生存率および化合物の細胞傷害性の迅速な定量分析が可能になる。MTSは使用前に準備の必要がない安定した溶液である。アッセイの終了時に、ウェル当たり20μLのMTS試薬を添加する。次いで、マイクロタイタープレートを37℃で4-6時間インキュベートする。インキュベーション間隔は、最適な色素減少について経験的に決定された時間に基づいて選ばれた。接着性プレートシーラーを蓋の代わりに使用し、密閉プレートを数回反転させて可溶性ホルマザン生成物を混合し、そしてプレートを分光光度的に490/650nmにてMolecular Devices（モレキュラー・デバイシーズ社）により読み取る。
【０１４５】
VmaxまたはSpectraMaxPlus（スペクトラマックスプラス）プレートリーダー。
【０１４６】
データ分析
【０１４７】
コンピュータプログラムを用い、IC50（ウイルス複製の50％抑制）、IC90（ウイルス複製の90％抑制）、IC95（ウイルス複製の95％抑制）、TC50（50％細胞傷害性）、TC90（90％細胞傷害性）、TC95（95％細胞傷害性）および治療上の指標値（TI=TC/IC；また抗ウイルス指数またはAIとも呼ばれる）が提供される。個々の化合物の活性を要約した印刷物において、データのグラフ表示を伴う抗ウイルス活性および毒性の双方について生データが提供される。
【０１４８】
例13-RHDVに感染したラビットの処置
【０１４９】
【表８】
2018506529.tif 000013
【０１５０】
テーブル9に示す実験デザインに従い12時間の光サイクルにより、21℃で気候条件に順応された部屋において9週齢のニュージーランド・ホワイトラビット（白ウサギとも言う）に、標準乾燥ウサギ食物および水を自由に与えた。生存調査のために、14の動物に、RHDV分離物Ast/89の2×104の赤血球凝集単位を用いて筋肉内注射し、およびそれらのうち6体を、感染後（一日当たり50mg/kg）0、12、24、および36時間にAR-12（25mg/kg体重）で処置した。それらの群の動物は自然に死亡させた。
【０１５１】
図21に示されるように、感染後のウサギの生存率は、感染後少なくとも約24時間に著しく増加した（たとえば、約20％）（初期数n=グループあたり7、フィッシャー試験で*p<0.05）。
【０１５２】
図22に示されるように、AR-12は、感染後約36時間に肝臓毒性のマーカー〔ALT（アラニントランスアミナーゼ）、AST（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）、LDH（乳酸脱水素酵素）、およびGGT（ガンマ-グルタミルトランスフェラーゼ）のレベルを低下させた（12 hpiと比較して*p<0.05。RHDVと比較して#p<0.05）。これらの結果は、AR-12がウイルス誘発性劇症肝不全に関連した症状を治療、改善、または軽減することができることを指し示す。
【０１５３】
例14-標準的なPBMC細胞に基づくマイクロタイター抗HIVアッセイにおけるAR-12の抗ウイルス活性および細胞傷害性
【０１５４】
AR-12の抗ウイルス活性および細胞傷害性を、異なるHIV薬物耐性プロファイルを表す六（6）つの分離物に対する標準的なPBMC細胞ベースのマイクロタイター抗HIVアッセイにおいて試験した。
【０１５５】
AR-12を乾燥粉体として供給し、およびテーブル10に記載のように可溶化した。ストックをアッセイの日まで4℃で貯蔵した。化合物のストック溶液を用いて、アッセイ設定の各日にアッセイで使用する作用薬物希釈物を生成した。作業溶液は、各実験について新鮮にし、および異なる日に実行した後の実験において再使用のために保存しなかった。化合物は、10μM（10,000nM）の高試験濃度を、八つの追加の連続1：2希釈（濃度範囲=39.1nMないし10μM）を伴って用いるアッセイにおいて評価した。
【０１５６】
同様に、ジドブジン（AZT；ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター；NRTI）を、半対数希釈および100pMから1.0μM（1,000nM）までの濃度範囲を用いて、陽性コントロール抗ウイルス化合物として含めた。種々の追加コントロールも、ウイルスの耐性プロファイルに依存するアッセイのために含めた。ネビラピン（非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター；NNRTI）およびリトナビル（プロテアーゼインヒビター；PI）を1.0nMから10μM（10,000nM）までの濃度範囲を用いて試験した。デラビルジン（NNRTI）およびT-20（融合インヒビター）を、200pMから2.0μM（2,000nM）までの濃度範囲を用いて試験した。エルビテグラビル（インテグラーゼインヒビター；INI）を、100pMから1.0μM（1,000nM）までの濃度範囲を用いて試験した。最後に、ラルテグラビル（INI）を10pMから100nMまでの濃度範囲を用いて試験した。
【０１５７】
【表９】
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【０１５８】
ヒト末梢血単核細胞（PBMCs）における有効性評価
【０１５９】
ウイルス分離情報
【０１６０】
これらの実験での使用のために、六つ（6）のHIV-1分離物を選定した。これらのウイルスには、AR-12との交差耐性を評価するために様々な薬物耐性HIV-1分離物が含まれる。特に断りがない限り、これらのウイルス分離物は、NIAID AIDS Research and Reference Reagent Program（NIAID AIDSリサーチ・アンド・リファレンス・リージェント・プログラム）から入手した。ウイルス分離物1022-48は、Merck Research Laboratories（メルク・リサーチ・ラボラトリーズ）のDr. William A Schief（ウィリアムAシーフ博士）から入取した。MDR769およびMDR807は、Stanford University（スタンフォード大学）のDr. Thomas C. Merigan（トーマスC. メリガン博士）から入手した。新鮮なヒトPBMCsを用いて各ウイルスの低継代ストック（low passage stock）を調製し、そして液体窒素中に蓄えた。テーブル11には、各々のウイルスについて利用可能な追加情報を挙げる。ウイルスの予め滴定されたアリコートを冷凍庫から取り出し、および使用直前に生物学的安全キャビネット内で室温にまで急速に解凍した。
【０１６１】
【表１０】
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【０１６２】
新鮮なヒトPBMCsにおける抗HIV有効性評価
【０１６３】
新鮮なヒトPBMCsを、HIVおよびHBV（Biological Specialty Corporation、Colmar、PA）について血清陰性であるスクリーニングされたドナーから分離した。細胞を、低速遠心分離およびダルベッコのリン酸緩衝化塩類溶液（PBS）中への再懸濁によって2-3回ペレット化/洗浄して汚染血小板を除去した。次いで、白色素胞化（白血球を採取したとも言う。leukophoresed）血液をPBSで1：1で希釈し、および50mLの遠心チューブにおいて14mLのFicoll-Hypaque（フィコール・ハイパック）密度勾配〔Lymphocyte Separation Medium, Cell Grow（リンパ球分離培地、細胞増殖）＃85-072-CL、密度1.078±0.002gm/mL〕を層状に入れ、次いで600×gで10分間遠心分離した。
【０１６４】
バンド化したPBMCsを、得られた界面から穏やかに吸引し、そして続いて低速遠心分離によってPBSで2×洗浄した。最後の洗浄の後、細胞をトリパンブルー排除によって計数し、および15％ウシ胎仔血清（FBS）、2mMのL-グルタミン、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、および4μg/mLフィトヘマグルチニン（PHA；Sigma、St.Louis、MO；カタログ番号L1668）を補充したRPMI 1640中に1×106細胞/ mLにて再懸濁させた。細胞を37℃で48-72時間インキュベーションした。
【０１６５】
インキュベーション後、PBMCsを遠心分離し、および15％FBS、L-グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、非必須アミノ酸〔MEM/NEAA；Hyclone（ハイクローン）；カタログ番号SH3023.01〕、および20U/mL組換えヒトIL-2（R＆D Systems, Inc.、ミネアポリス、ミネソタ州：カタログ＃202IL）を伴うRPMI1640に再懸濁した。PBMCsをこの培地中に1-2×106細胞/mLの濃度で維持し、それらをアッセイプロトコルで使用するまで毎週2回培地を交換した。単球由来マクロファージは組織培養フラスコへの接着の結果として培養物から消費された。
【０１６６】
標準的なPBMCアッセイについて、少なくとも二体の正常ドナー由来のPHA刺激細胞をプールし（互いに混合し）、新鮮な培地において1×106細胞/mLの最終濃度に希釈し、および96ウェルの丸底マイクロプレートの内部ウェルに南部諸州研究学会の感染症研究部門により開発された標準的なフォーマットで、100μL/ウェル（5×104細胞/ウェル）にてプレーティング（平板培養とも言う）した。一次リンパ球集団のHIV感染およびPHAおよびIL-2に対する全体的応答の定量的および質的差から生じ、個々のドナー間で観察される変動性を最小にするために、一よりも多くのドナーからの単核細胞のプール（混合）が使用される。各プレートは、ウイルスコントロールウェル（細胞プラスウイルス）および実験ウェル（薬物プラス細胞プラスウイルス）を含む。試験薬物希釈物をマイクロタイターチューブにおいて4×濃度にて調製し、および各濃度の50μLを標準的なフォーマットを用いて適切なウェルにおいて配置した。ウイルスストックの予め定める希釈物の五十（50）μLを各試験ウェルにおいて配置した
2018506529.tif 000016
MTSアッセイシステムを用いる薬物細胞毒性試験についてウイルスなしで別々のプレートを同じく調製した（以下に説明する；細胞傷害性プレートには、また、MTSアッセイに影響を及ぼす着色化合物についてコントロールするために細胞を伴わない薬物プラス培地が含まれる化合物コントロールウェルも含む）。感染後六日間、PBMC培養物を37℃、5％CO2にて維持した。この期間の後、逆転写酵素活性の分析のために細胞フリーの上清サンプルを収集し、およびMTSを、別個の細胞生存率の測定用の細胞傷害性プレートに添加することによって化合物の細胞傷害性を測定した。ウェルをまた顕微鏡検査し、および何らかの異常に注目した。
【０１６７】
逆転写酵素活性アッセイ
【０１６８】
マイクロタイタープレートベースの逆転写酵素（RT）反応を利用した（Buckheitら、AIDS Research and Human Retroviruses、7：295-302、1991）。トリチウム化チミジン三リン酸〔3H-TTP、80Ci/mmol、PerkinElmer（パーキンエルマー社）〕を1：1のdH2O：エタノールにおいて1mCi/mLにて受け入れた。ポリrA：オリゴdT鋳型：プライマー（GE HealthCare）は、150μLのポリrA（20mg/mL）を0.5mLのオリゴdT（20単位/mL）および5.35mLの滅菌dH2Oと合わせ、次いで分注する（1.0mL）ことによってストック溶液として調製し、および-20℃で貯蔵した。RT反応緩衝剤は毎日のように新鮮に調製され、および1.0M EGTAの125μL、dH2Oの125μL、20％Triton X100の125μL、1.0M Tris（pH7.4）の50μL、1.0M DTTの50μL、および1.0M MgCl2の40μLからなった。最終的な反応混合物は、1部の3H-TTP、4部のdH2O、2.5部のポリrA：オリゴdTストックおよび2.5部の反応緩衝剤を合わせることによって調製した。この反応混合物の十マイクロリットルを丸底マイクロタイタープレートに置き、そしてウイルス含有上清の15μLを添加し、および混合した。プレートを37℃で60分間インキュベートした。インキュベーション後、反応容量をDE81フィルターマット（Wallac）上にスポットし、5％リン酸ナトリウム緩衝剤または2×SSC（Life Technologies）においてそれぞれ5分間5回、蒸留水においてそれぞれ1分間2回、70％エタノールにおいてそれぞれ1分間2回洗浄し、そして次いで乾燥させた。組み込まれた放射能（1分当たりのカウント数、CPM）は、標準的な液体シンチレーション技術を用いて定量化した。
【０１６９】
細胞生存率のためのMTS染色
【０１７０】
アッセイ終了時に、未感染アッセイプレートを可溶性テトラゾリウムベースの色素MTS（CellTiter 96 Reagent、Promega）で染色して細胞生存率を決定し、および化合物の毒性を定量する。MTSは、代謝的に活性な細胞のミトコンドリア酵素によって代謝されて可溶性ホルマザン生成物を生じ、細胞生存率および化合物の細胞傷害性の迅速な定量分析が可能になる。この試薬は使用前に準備の必要がない安定な、単一の溶液である。アッセイの終了時に、ウェル当たり20-25μLのMTS試薬を添加し、および次いで、マイクロタイタープレートを37℃/5％CO2で細胞生存率を評価するために4-6時間インキュベートした。接着性プレートシーラーを蓋の代わりに使用し、密閉プレートを数回反転させて可溶性ホルマザン生成物を混合し、そしてプレートを分光光度的に490/650nmにてMolecular Devices SpectraMax i3プレートリーダーにより読み取った。
【０１７１】
データ分析
【０１７２】
社内コンピュータプログラムを用い、PBMCデータ分析には、IC50（ウイルス複製の50％抑制）、IC90（ウイルス複製の90％抑制）、IC95（ウイルス複製の95％抑制）、TC50（50％細胞傷害性）、TC90（90％細胞傷害性）、TC95（95％細胞傷害性）および治療上の指標値（TI=TC/IC；また抗ウイルス指数またはAIとも呼ばれる）の算出が含まれる。個々の化合物の活性を概略した印刷物において、データのグラフ表示による抗ウイルス活性および毒性の双方について生データが提供される。
【０１７３】
結果
【０１７４】
PBMCsにおけるHIV-1に対するAR-12の試験からの結果を、以下のテーブル12に概略し、そして図を下記に説明する。
【０１７５】
【表１１−１】
2018506529.tif 000017
【０１７６】
【表１１−２】
2018506529.tif 000018
【０１７７】
図9に示されるように、ウイルスコントロールのパーセントは、黒円によって示されるウイルス複製の減少を表す。この例では、ウイルス複製の50％（TC50）抑制を達成するために0.24μMのAR-12濃度が必要とされる。細胞コントロールのパーセント（例は、AR-12の細胞傷害性）は、オープン四角によって示される。この例では、PBMCの50％（CC50）毒性を達成するために6.12μMのAR-12濃度が必要である。
【０１７８】
図10に示されるように、ウイルスコントロールのパーセントは、ウイルス複製の減少を表し、そして黒円によって示される。この例では、ウイルス複製の50％（TC50）抑制を達成する（achive）ために0.27μMのAR-12濃度が必要とされる。細胞コントロールのパーセント（例は、AR-12の細胞傷害性）は、オープン四角によって示される。この例では、PBMCの50％（CC50）毒性を達成するために6.12μMのAR-12濃度が必要とされる。
【０１７９】
図11に示されるように、ウイルスコントロールのパーセントは、ウイルス複製の減少を表し、そして黒円で示される。この例では、0.51μMのAR-12濃度が、ウイルス複製の50％（TC50）抑制を達成するために必要とされる。細胞コントロールのパーセント（例は、AR-12の細胞傷害性）はオープン四角で示される。この例では、PBMCの50％（CC50）毒性を達成するために6.12μMのAR-12濃度が必要とされる。
【０１８０】
図12に示されるように、ウイルスコントロールのパーセントは、ウイルス複製の減少を表し、そして黒円で示される。この例では、0.37μMのAR-12濃度がウイルス複製の50％（TC50）抑制を達成するために必要とされる。細胞コントロールのパーセント（例は、AR-12の細胞傷害性）はオープン四角で示される。この例では、PBMCの50％（CC50）毒性を達成するために6.12μMのAR-12濃度が必要とされる。
【０１８１】
図13に示されるように、ウイルスコントロールのパーセントは、ウイルス複製の減少を表し、そして黒円で示される。この例では、ウイルス複製の50％（TC50）抑制を達成するために0.31μMのAR-12濃度が必要である。細胞コントロールのパーセント（例は、AR-12の細胞傷害性）はオープン四角で示される。この例では、PBMCの50％（CC50）毒性を達成するために6.12μMのAR-12濃度が必要とされる。
【０１８２】
図14に示されるように、ウイルスコントロールのパーセントは、ウイルス複製の減少を表し、そして黒円で示される。この例では、ウイルス複製の50％（TC50）抑制を達成するために、17.4nMのAZT濃度が必要とされる。細胞コントロールのパーセント（例は、AZTの細胞傷害性）はオープン四角で示される。この例では、PBMCの50％（CC50）毒性を達成するために>1000nMのAZT濃度が必要である。
【０１８３】
図15に示されるように、ウイルスコントロールのパーセントは、ウイルス複製の減少を表し、そして黒円で示される。この例では、ウイルス複製の50％（TC50）抑制を達成するために11.9nMのAZT濃度が必要である。細胞コントロールのパーセント（例は、AZTの細胞傷害性）はオープン四角で示される。この例では、PBMCの50％（CC50）毒性を達成するために>1000nMのAZT濃度が必要である。
【０１８４】
図16に示されるように、ウイルスコントロールのパーセントは、ウイルス複製の減少を表し、そして黒円で示され、ウイルス複製の50％（TC50）抑制をもたらすために必要な<0.10nMのAZT濃度を有する。細胞コントロールのパーセント（例は、AZTの細胞傷害性）はオープン四角で示される。この例では、PBMCの50％（CC50）毒性を達成するために>1000nMのAZT濃度が必要である。
【０１８５】
図17に示されるように、ウイルスコントロールのパーセントは、ウイルス複製の減少を表し、および黒円で示される。この例では、ウイルス複製の50％（TC50）抑制を達成するために、5.73nMのAZT濃度が必要とされる。細胞コントロールのパーセント（例は、AZTの細胞傷害性）はオープン四角で示される。この例では、PBMCの50％（CC50）毒性を達成するために>1000nMのAZT濃度が必要である。
【０１８６】
図18に示されるように、ウイルスコントロールのパーセントは、ウイルス複製の減少を表し、そして黒円で示される。この例では、ウイルス複製の50％（TC50）抑制を達成するために>1000nMのAZT濃度が必要とされる。細胞コントロールのパーセント（例は、AZTの細胞傷害性）は、オープン（四角）によって指し示され、PBMCの50％（CC50）毒性をもたらすために必要とされる>1000nMのAZT濃度を有する。
【０１８７】
図19に示されるように、ウイルスコントロールのパーセントは、ウイルス複製の減少を表し、および黒円で示される。この例では、ウイルス複製の50％（TC50）抑制を達成するために、0.66nMのエファビレンツ濃度が必要である。細胞コントロールのパーセント（例は、エファビレンツの細胞傷害性）はオープン四角で示される。この例では、PBMCの50％（CC50）毒性を達成するために>1000nMのエファビレンツ濃度が必要とされる。
【０１８８】
図20に示されるように、ウイルスコントロールのパーセントは、ウイルス複製の減少を表し、そして黒円で示される。この例では、ウイルス複製の50％（TC50）抑制を達成するために877nMのロピナビル濃度が必要である。細胞コントロールのパーセント（例は、ロピナビルの細胞傷害性）はオープン四角で示される。この例において、PBMCの50％（CC50）毒性を達成するために>1000nMのロピナビル濃度が必要とされる。
【０１８９】
AR-12は、試験したすべてのウイルス分離物についてウイルス複製において用量依存的な減少を示し、812nMの平均IC50値（IC50範囲=489nMないし1016nM）を有した。中程度の細胞傷害性が観察され（TC50=5532nM）、6.8の平均治療指標（TI範囲=5.45ないし11.3）がもたらされた。AR-12は、この試験で評価された任意のHIV薬物耐性分離物のAR-12に対する明らかな耐性はなく、これらの分離物が抵抗性であるNRTI、NNRTI、PI、INIおよびエントリーインヒビターとは異なるメカニズムによってHIVを抑制することが示唆された。
【０１９０】
全体のアッセイ性能は、各々のアッセイにおいて予想される抗ウイルス活性レベルを示したコントロール化合物（AZT、リトナビル、ラルテグラビル、エルビテグラビル、ネビラピン、デラビルジンおよびT-20）によって検証された。マイクロタイタープレートの各ウェルにおける細胞の肉眼観察により、MTS代謝色素で細胞を染色した後に得られた細胞傷害性の結果が確認された。
【０１９１】
例15-デングウイルス
【０１９２】
DMSOを、凍結乾燥抽出物AR-12を溶解させるために用い、および調製したストックソリューション（原液とも言う）を-20℃で貯蔵した。原液は、細胞培養培地を用いて希釈し、および各実験の直前に0.2ミクロンの孔径を有するシリンジフィルター〔Millipore（ミリポア社）、MA、USA〕によって滅菌した。
【０１９３】
細胞およびウイルス
【０１９４】
C6/36のモスキート（蚊とも言う）細胞系を、研究に用いたすべてのDENV分離物の繁殖のために使用した。Vero（ベロ）細胞系を抗ウイルス活性の評価のために使用した。細胞系は、10％ウシ胎仔血清（FBS、Gibco、NY、USA）を含むEMEM（Gibco、NY、USA）中で維持および増殖させた。C6/36およびVero細胞を、それぞれ3％および5％CO2の存在下、28℃および37℃でインキュベートした。ウイルス接種および抗ウイルスアッセイの時点で、FBSの濃度は2％まで低下した。DENVの4つの血清型（DENV-1、DENV-2、DENV-3およびDENV-4）を表す4つの異なる臨床的DENV分離物を分析に使用した。血清型は、University Malaya Medical Centre（マラヤ大学メディカルセンター）（UMMC）のペイシェントのサンプルから、TIDREC〔Tropical Infectious Diseases Research & Education Centre, Malaysia（マレーシア熱帯感染症研究教育センター）〕において確認された。十分なゲノム配列決定法を用いて四つの臨床的分離物のすべてを遺伝子型決定した。四つのすべての臨床分離物はC6/36細胞系で増殖した。ウイルス分離物を滴定した後、実験でさらに使用するまでストックを-80℃で貯蔵した。
【０１９５】
インビトロ細胞傷害性アッセイ
【０１９６】
Vero細胞に対するAR-12の毒性を定めるために、MTSアッセイを実行した。手短に言えば、96ウェルマイクロプレートにおいてコンフルエント（稠密培養したとも言う）Vero細胞を、異なる濃度のAR-12で三重に処理した。処理した細胞を、37℃での抗ウイルスアッセイ試験の期間と同じく2日間インキュベートした後、15μlのMTS溶液（Promega、WI、USA）を各ウェルに添加した。マイクロプレートを37℃でさらに4時間インキュベートした。次に、100μlの可溶化/停止溶液を各ウェルに添加した。未処理細胞を含むすべてのウェルの光学密度（OD）を、プレートリーダー〔TECAN、Mannendorf、Switzerland（メンネドルフ、スイス）〕によって570nm波長フィルタを用いて読み取った。Graph Pad Prism（グラフパッドプリズム）5〔Graph Pad Software Inc.（グラフパッド・ソフトウェア社）、San Diego、CA〕を用いて、その用量反応曲線プロットと共にAR-12の細胞傷害性を算出した。
【０１９７】
抗ウイルス活性アッセイ
【０１９８】
インビトロでDENVsに対するAR-12の効果を定めるために、Vero細胞系のコンフルエントな単層を200FFUの各DENV血清型により感染させ、および37℃で1時間ウイルス吸着させた後、感染した単層を滅菌PBSで2回すすぎ、および異なる濃度のAR-12を有するEMEMを含む2％FBSを補充した。後に、5％CO2の存在下、プレートを37℃で2日間インキュベートした。DENVsの収量は定量的RT-PCRによって評価された。
【０１９９】
定量的RT-PCR
【０２００】
AR-12の抗ウイルス効果は、処置後2日後にDENVs RNAコピー数を測定することによるqRT-PCRを用いるウイルス収量減少アッセイによって確認された。各ワンステップ（各一段階とも言う）qRT-PCRは、5μlの希釈RNA、1μlのプローブ/プライマー混合物、10μlのリアルタイムマスターミックスおよび4μlのヌクレアーゼフリー水〔PrimerDesign（プライマーデザイン社）、Southampton（サウサンプトン）、UK〕を含有する20μlの最終容量において遂行した。定量的PCR測定は、StepOnePlus（ステップワンプラス）リアルタイムPCRシステム〔Applied Biosystems（アプライド・バイオシステムズ社）、USA〕を製造者のプロトコルに従って用いて実行した。生データはStepOneTMSoftware（ステップワン商品名ソフトウェア）v2.2.1によりCtについてベースラインおよび閾値を定めるために分析した（付属書Aを参照）。
【０２０１】
統計分析
【０２０２】
この研究では、最大の細胞傷害性濃度の半分（CC50）および最大抑制濃度の半分（IC50）を主なパラメーターとして用いた。GraphPad PRISM for Windows（ウィンドウズ用グラフパッドプリズム）、バージョン5（GraphPad Software Inc.、San Diego、CA、2005）をすべての統計分析に使用した。
【０２０３】
結果
【０２０４】
AR-12の細胞傷害活性
【０２０５】
Vero細胞でのAR-12の細胞傷害性を、MTSアッセイを用いて評価した。MNTDは>10μMであった。したがって、我々は後で抗ウイルスアッセイのための最高濃度としてその濃度を選定した。
【０２０６】
DENVsに対するAR-12の抗ウイルスアッセイ
【０２０７】
4つのDENV血清型のすべてに対して特異的なqRT-PCRを用いるウイルス収量減少アッセイを用いて、AR-12のインビトロ抗デング熱活性を評価した（図1）。
【０２０８】
AR-12は、以下のテーブル13に示すように、最大抑制濃度の半分の値（IC50）でVero細胞における4つのDENV遺伝子型の複製すべてに対して用量依存的抑制効果を示し、AR-12は、DENVの異なる遺伝子型に対して著しい抗ウイルス活性をもつ。
【０２０９】
【表１２】
2018506529.tif 000019
【０２１０】
テーブル13．DENV血清型に対するAR-12のIC50値。すべての結果は三つの無関係な実験から取得した。
【０２１１】
図23は、示されたDENV血清型のパーセントウイルス収量の減少を示す。すべての場合において、パーセントウイルス収率の減少は、少なくとも約1μMの濃度で減少し、およびAR-12濃度が約4μMを超えて後に100％にまで増加する。q-RT-PCRを用いるウイルス収量減少アッセイを、AR-12のインビトロ抗デングウイルス活性を評価するために用いた。細胞をウイルス感染の1時間後にAR-12で処理し、および感染後2日まで連続して処置した。それぞれのDENV RNAコピー数（感染の2日後）は、qRT-PCRを用いて定量した。パーセンテージDENV収率抑制は、並行して維持された未処理コントロールに対して比較することによって取得された。三回の実験からのデータを、Graph Pad Prism Version 5（Graph Pad Software Inc.、San Diego、CA）を用いてプロットした。
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【０２１２】
ここに記載されるすべての要素が必要とは限らない。実際に、当業者は、ここに記載された方法の多数の追加的な使用および変形を見出すであろうし、本発明者らは、それが請求の範囲によってのみ制限されることを意図する。ここに引用されるすべての参考文献は、それらの全体が参考として組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年9月29日(2017.9.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスに感染する宿主においてウイルスタンパク質生成を抑制するための、AR-12を含む薬剤組成物であって、
AR-12が、ウイルスタンパク質生成が未処置宿主に比較して少なくとも約50%だけ減らされるように宿主に施与される、薬剤組成物。
【請求項２】
ウイルスタンパク質はインフルエンザによって生成される、請求項１の薬剤組成物。
【請求項３】
インフルエンザウイルスはインフルエンザAである、請求項２の薬剤組成物。
【請求項４】
ウイルスタンパク質は構造タンパク質である、請求項２の薬剤組成物。
【請求項５】
ウイルスタンパク質は非構造タンパク質である、請求項２の薬剤組成物。
【請求項６】
ウイルスに感染する宿主においてウイルス複製を抑制するための、AR-12を含む薬剤組成物であって、
AR-12が、宿主に、宿主においてウイルス複製を少なくとも約50％減少させるのに十分な量で施与される、薬剤組成物。
【請求項７】
ウイルスは、I型ウイルス、IV型ウイルス、V型ウイルス、およびVII型ウイルスからなる群より選ばれる、請求項６の薬剤組成物。
【請求項８】
ウイルスは、インフルエンザ、HIV、HIV-1、HIV-2、薬物耐性HIV、フニンウイルス、チクングンヤウイルス、黄熱病ウイルス、デングウイルス、ピチンデウイルス、ラッサウイルス、アデノウイルス、麻疹ウイルス、プンタトロウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、リフトバレーウイルス、RHDV、SARSコロナウイルス、タカリベウイルス、およびウエストナイルウイルスからなる群より選ばれる、請求項６の薬剤組成物。
【請求項９】
AR-12は、宿主に、約0.1μMから約7μMまでの血液、組織、または器官濃度を達成するのに十分な量で提供される、請求項６の薬剤組成物。
【請求項１０】
チクングンヤウイルスに感染する宿主においてウイルス感染を減らすための、AR-12を含む薬剤組成物であって、
AR-12が、宿主に、約1μMから100μMまでの血液、組織、または臓器濃度を達成するのに十分な量で施与される、薬剤組成物。
【請求項１１】
ウイルスはチクングンヤウイルスのファビピラビル耐性株である、請求項１０の薬剤組成物。
【請求項１２】
フニンウイルスに感染する宿主においてウイルス感染を減らすための、AR-12を含む薬剤組成物であって、
AR-12が、宿主に、約0.15μMないし0.55μMの血液、組織、または器官濃度を達成するのに十分な量で施与される、薬剤組成物。
【請求項１３】
レトロウイルスに感染する宿主においてレトロウイルス複製を抑制するための、AR-12を含む薬剤組成物であって、
AR-12が、宿主に、約0.1μMないし約20μMの血液、組織、または器官濃度を達成するのに十分な量で施与される、薬剤組成物。
【請求項１４】
AR-12は、宿主に、約0.30μMの血液または組織濃度を達成するのに十分な量で施与される、請求項１３の薬剤組成物。
【請求項１５】
少なくとも第二の化合物をさらに含む、請求項１３の薬剤組成物。
【請求項１６】
第二の化合物は、チプラナビル、インジナビル、アタザナビル、サキナビル、ロピナビル、リトナビル、ダルナビル、アタザナビル、ネルフィナビル、エムトリシタビン、ラミブジン｛3TC｝、ジドブジン｛AZT｝、ジダノシン、テノホビル、スタブジン、アバカビル、リルピビリン、エトラビリン、ネビラピン、デラビルジン、エファビレンツ、T-20、マラビロク、ラルテグラビル、およびドルテグラビルからなる群より選ばれる、請求項１５の薬剤組成物。
【請求項１７】
HIV DRに感染する宿主においてHIV DRの複製を抑制するための、AR-12を含む薬剤組成物であって、
AR-12が、宿主に、少なくとも約0.30μMの血液、組織、または器官濃度を達成するのに十分な量で施与される、薬剤組成物。
【請求項１８】
ウイルス誘発性劇症肝不全を有する宿主の生存率を高めるための、AR-12を含む薬剤組成物であって、
AR-12が、宿主に、少なくとも約25mg/kgの量で施与される、薬剤組成物。
【請求項１９】
AR-12は、宿主に、25mg/kgの少なくとも４つの用量の量で施与される、請求項１８の薬剤組成物。
【請求項２０】
宿主の生存率は少なくとも約20％だけ高められる、請求項１９の薬剤組成物。
【請求項２１】
デングウイルスに感染する宿主においてデングウイルス感染を減らすための、AR-12を含む薬剤組成物であって、
AR-12が、宿主に、少なくとも約1μMの血液、組織、または器官濃度を達成するのに十分な量で施与される、薬剤組成物。
【請求項２２】
血液、組織、または器官濃度は少なくとも約4μMである、請求項２１の薬剤組成物。
【国際調査報告】
2018506529.tif 000046
2018506529.tif 000047
2018506529.tif 000048