(57)【要約】本発明は、高周波系デバイスを用いて表在性体液における循環細胞を測定するための方法に関する。本発明の方法は、診断ツールとして有用である個体のサンプルの抽出を必要とすることなく個人の体液中の循環細胞を検出するため、およびウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患を患う個人に実施される治療の効果を監視するために用いることが可能である。
2018529985.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者の表在性体液における循環細胞の検出および定量化を行うため、被検者内のウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患の診断のため、ウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患を患っている可能性がある被検者を特定するため、またはウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患を患う被検者に実施した治療の効果を監視するための超音波系デバイスのインビトロ使用であって、
超音波系デバイスが、１０〜１００ＭＨｚの範囲の中心周波数、２５〜１０００ｎｓのパルス継続時間、および１５〜１５０μｍの波長で作動する、超音波系デバイスのインビトロ使用。
【請求項２】
超音波系デバイスにより発せられた信号が、２０ＭＨｚの中心周波数、および／または５００ｎｓのパルス継続時間、および／または７５μｍの波長で作動する、請求項１に記載のインビトロ使用。
【請求項３】
循環細胞が白血球、赤血球、またはがん細胞である、請求項１又は２に記載のインビトロ使用。
【請求項４】
超音波系デバイスがトランスデューサーを有して成る、請求項１〜３のいずれかに記載のインビトロ使用。
【請求項５】
表在性体液が、脳脊髄液、血液、尿、胸膜液、滑液、および心膜液から成る群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載のインビトロ使用。
【請求項６】
ウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患が、髄膜炎である、請求項１〜５のいずれかに記載のインビトロ使用。
【請求項７】
被検者の表在性体液における循環細胞の検知および定量化を行うためのインビトロ方法であって、
ａ）被検者の表在性体液から分離させた液体サンプルの超音波デバイスを得るため該液体サンプルと接触状態となるように超音波系デバイスを設ける工程；
ｂ）体液内の細胞および該細胞の濃度に関する情報を供するデータ処理システムによって、工程ａ）で得られた超音波データを分析する工程；および
ｃ）工程ｂ）で得られた情報を個人内の循環細胞の存在および量と相関させる工程
を含み、
超音波系デバイスを、１０〜１００ＭＨｚの範囲の中心周波数、２５〜１０００ｎｓのパルス継続時間、および１５〜１５０μｍの波長で作動させる、方法。
【請求項８】
超音波系デバイスにより発せられる信号を、２０ＭＨｚの中心周波数、および／または５００ｎｓのパルス継続時間、および／または７５μｍの波長で作動させる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
循環細胞が白血球、赤血球、またはがん細胞である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
超音波系デバイスがトランスデューサーを有して成る、請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
工程ａ）で得られた超音波データが、（ｉ）Ａ−ラインデータの集合および／または（ｉｉ）２ＤデータのＢ−モードタイプまたは３ＤデータのＣ−モードタイプの形態である、請求項７〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
データ処理システムがアルゴリズムを有して成る、請求項７〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
細胞に関する情報が細胞サイズ、細胞濃度、および／または細胞生存能力である、請求項７〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
表在性体液が、脳脊髄液、血液、尿、胸膜液、滑液、および心膜液から成る群から選択される、請求項７〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
被検者内のウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患の診断のため、またはウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患を患っている可能性がある被検者を特定するためのインビトロ方法であって、
ａ）請求項７〜１４のいずれかに記載の方法により被検者の表在性体液中の循環細胞の定量化を行う工程、および
ｂ）前記循環細胞の量を被検者内のウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患の存在と相関させる工程
を含み、
基準値よりも高い循環細胞の量が、ウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患を示し、または被検者がウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患を患っている可能性があることを示す、方法。
【請求項１６】
ウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患を患う被検者に実施した治療の効果を監視するためのインビトロ方法であって、
ａ）請求項７〜１４のいずれかに記載の方法により治療前と治療後に被検者の表在性体液中の循環細胞の定量化を行う工程、および
ｂ）前記循環細胞の量を前記被検者に実施した治療の効果と相関させる工程
を含み、
治療前の循環細胞の量よりも少ない治療後の被検者内の循環細胞の量は、治療が効果的であることを示す、方法。
【請求項１７】
ウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患が、髄膜炎である、請求項１５又は１６に記載のインビトロ方法。
【請求項１８】
被検者の表在性体液における循環細胞の検出および定量化を行うため、被検者内のウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患の診断のため、ウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患を患っている可能性がある被検者を特定するため、またはウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患を患う被検者に実施した治療の効果を監視するための超音波系デバイスの非侵襲的な使用であって、
超音波系デバイスが、１０〜５０ＭＨｚの範囲の中心周波数、５０〜１０００ｎｓのパルス継続時間、および３０〜１５０μｍの波長で作動する、非侵襲的な使用。
【請求項１９】
超音波系デバイスにより発せられる信号が、２０ＭＨｚの中心周波数、および／または５００ｎｓのパルス継続時間、および／または７５μｍの波長で作動する、請求項１８に記載の非侵襲的な使用。
【請求項２０】
循環細胞が白血球、赤血球、またはがん細胞である、請求項１８又は１９に記載の非侵襲的な使用。
【請求項２１】
表在性体液が、脳脊髄液、血液、尿、胸膜液、滑液、および心膜液から成る群から選択される、請求項１８〜２０のいずれかに記載の非侵襲的な使用。
【請求項２２】
ウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患が、髄膜炎である、請求項１８〜２１のいずれかに記載の非侵襲的な使用。
【請求項２３】
表在性体液における循環細胞の検知および定量化を行うための非侵襲的な方法であって、
ａ）被検者の皮膚の下方にある表在性体液の超音波データを得るため該皮膚に超音波系デバイスを設ける工程；
ｂ）体液内の細胞および該細胞の濃度に関する情報を供するデータ処理システムによって、工程ａ）で得られた超音波データを分析する工程；および
ｃ）工程ｂ）で得られた情報を被検者内の循環細胞の存在および量と相関させる工程
を含み、
超音波系デバイスを、１０〜５０ＭＨｚの範囲の中心周波数、５０〜１０００ｎｓのパルス継続時間、および３０〜１５０μｍの波長で作動させる、方法。
【請求項２４】
超音波系デバイスにより発せられる信号を、２０ＭＨｚの中心周波数、および／または５００ｎｓのパルス継続時間、および／または７５μｍの波長で作動させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
循環細胞が白血球、赤血球、またはがん細胞である、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
超音波系デバイスがトランスデューサーを有して成る、請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
工程ａ）で得られた超音波データが、（ｉ）Ａ−ラインデータの集合および／または（ｉｉ）２ＤデータのＢ−モードタイプまたは３ＤデータのＣ−モードタイプの形態である、請求項２３〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
データ処理システムがアルゴリズムを有して成る、請求項２３〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
細胞に関する情報が細胞サイズ、細胞濃度、および／または細胞生存能力である、請求項２３〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
表在性体液が、脳脊髄液、血液、尿、胸膜液、滑液、および心膜液から成る群から選択される、請求項２３〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
被検者内のウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患の診断のため、またはウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患を患っている可能性がある被検者を特定するための方法であって、
ａ）請求項２３〜３０のいずれかに記載の方法により被検者の表在性体液中の循環細胞の定量化を行う工程、および
ｂ）前記循環細胞の量を被検者内のウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患の存在と相関させる工程
を含み、
基準値よりも高い循環細胞の量が、ウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患を示し、被検者がウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患を患っている可能性があることを示す、方法。
【請求項３２】
ウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患を患う被検者に実施した治療の効果を監視するための方法であって、
ａ）請求項２３〜３０のいずれかに記載の方法により治療前と治療後に被検者の表在性体液中の循環細胞の定量化を行う工程、および
ｂ）前記循環細胞の検出を前記被検者に実施した治療の効果と相関させる工程
を含み、
治療前の循環細胞の量よりも少ない治療後の被検者内の循環細胞の量は、治療が効果的であることを示す、方法。
【請求項３３】
ウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患が、髄膜炎である、請求項３１又は３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高周波系デバイスを用いて表在性体液における循環細胞を測定するための方法に関する。当該方法は、個人のサンプルの抽出を要することなく個人の体液における循環細胞を検出するため、診断ツールとして有益とするため、およびウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患を患う個人に実施した治療の効果を監視するために使用され得る。特に、当該方法は、脳脊髄液における循環細胞の検出を通じて髄膜感染症および／または髄膜炎症の診断に有益である。
【背景技術】
【０００２】
特許出願ＲＵ２０９３８３３は神経超音波学（neurosonography）を通じた乳幼児の脳および脊髄の病変を予測するための方法を開示する。神経超音波学の実施のために、少なくとも超音波センサが乳児の脊柱または泉門内の欠陥骨内に設けられる。このセンサは３．５、５．０、７．５ＭＨｚのうちの１つの周波数にて作動する。特に、ＲＵ２０９３８３３に記載されている方法は、脳脊髄液をスキャン（または検査;scan）すること、およびタンパク質レベルを測定することを含む。タンパク質レベルが増加すると、脳脊髄液の粘性が変化する。この脳脊髄液の変化により、脳脊髄液におけるタンパク質レベルを検出可能となる。ＣＳＦ内のタンパク質含有量が０．８ｇ／Ｌよりも多いと、病変を髄膜炎または脳炎と示す。当該方法は、感染症または炎症の表示として増加したタンパク質レベルに起因したＣＳＦの密度／粘度変化に基づく。これは、髄膜炎に対する低感度の脳脊髄液（ＣＳＦ）パラメータとなっている。従って、当該方法は、正確な測定値を得るため身体へのいくつかの侵襲的な処置を要する。
【０００３】
特許出願ＲＵ２０９３８３３は、細菌による幼い子どもの化膿した髄膜炎の進行を予測するための方法を開示する。特に、この方法では、疾患の第１週目の間に撮られる患者の神経超音波画像のパラメータを解析する。神経損傷（neurologic injury）を予測するためエコー輝度（echogenicity）および脳のエコーを生じる構造（echogenic structure）を得るために、当該超音波画像は脳半球（hemisphere）間の割れ目（fissure）で撮られる。当該方法は、後の段階で疾患で生じる構造的変化を評価することで化膿した髄膜炎を予測する。そのため、当該方法では、ＣＳＦが未だ化膿していない際における早期の髄膜感染症の診断、および患者の治療に対する反応を追跡するために最も多く使用されるパラメータである、正確なＣＳＦ細胞変化を可能とすることができない。
【０００４】
国際特許出願ＷＯ２００６０５５４４９は、懸濁液中の様々な粒子または細胞の特性の超音波測定のためのシステムおよび方法を指す。これらの特性は、例えば、粒子の速度、濃度および／または大きさである。これらの特性を測定するために、アコースティック（または音響;acoustic）エネルギーが焦点（または局所または限局;focal）ゾーンに導入され、狭帯域の質問（または調べる）信号（narrow band interrogating signals）が使用される。アコースティックエネルギーは、流体または懸濁液の動きまたはストリーミング（または流れ;streaming）を生じさせ得る。アコースティックストリーミングにより、他のいかなる源を必要とすることなく速度のドップラー効果測定が可能となり得る。又、この特許出願は、懸濁液の濃度、粒径および粘度を特徴付けるための超音波後方散乱の使用を開示する。また、この超音波後方散乱時間領域信号は、高速フーリエ変換（“ＦＦＴ”）アルゴリズムによって粒子懸濁液に関する情報を供する形の高分解能（または解像度；resolution）狭帯域パワースペクトルに変換され得る。この特許は、少なくとも１０サイクルの超音波単一周波数のトーンバースト（tone burst）を指向する方法を規定する。そのような長い信号により、バックグラウンド信号または基準信号に対する後方散乱信号の正規化／特徴付けに対する濃度測定を行う個々の細胞を分解するシステムの能力が低下する。この正規化は、各患者の皮膚の異なる減衰（または減弱;attenuation）がインビトロ（または体外でまたは試験管内で;in vitro）または他の患者から得られた以前の参照を無効にするため、各患者についてインビボ（または体内でまたは生体内で;in vivo）では実用的ではない。
【０００５】
国際特許出願ＷＯ２００９０５２４８１は、光コヒーレンストモグラフィー（または光干渉断層撮影;optical coherence tomography）による細胞検出システムを開示する。特に、この発明の目的は、光磁気ドプラ断層撮影（ＭＭＯＤＴ，magneto-motive optical Doppler tomography）、光干渉断層撮影（ＯＣＴ，Optical Coherence Tomography）、または超音波を使用して血流を画像化することである。これらの方法のうちの少なくとも１つは患者の体内に向けられ、血漿（blood plasma）中に懸濁された赤血球は、後方散乱された超音波エネルギーをいくつかの既知の方法で処理して流れの存在および流速の推定値を決定する電気信号に変換するレシーバー／トランスデューサーに向かって超音波エネルギーを戻すように散在する。しかしながら、この方法では、後方散乱信号のシフトに敏感であるために高濃度の赤血球が必要である。このような高濃度の細胞では、５〜１０ＭＨｚの範囲の超音波周波数が一般的に必要とされる。
【０００６】
したがって、上記の欠点の１つ以上に悩まされない方法およびプロセスを有することが望ましい。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は使用される方法の概略図である。
【図２】図２は、フックスローゼンタール血球計で測定したＷＢＣ濃度に関連する超音波後方散乱係数を示す。破線は、ＷＢＣ濃度（９７％）と比較したときのデータの後方散乱変動を決定係数Ｒ２によって測定されるように説明する線形近似を示す。この図は、１〜３ヶ月の乳児および新生児にそれぞれ設定された髄膜炎診断閾値１０細胞／μＬおよび２０細胞／μＬ前後のＷＢＣ濃度を確実に区別するための高周波超音波の能力を示す。インビボでの検証において、診断感度を維持するために泉門の減衰に対抗するようにシステムを調整する必要がある。
【図３】図３は、血球計で測定したＷＢＣ濃度０，１２および１００細胞／μＬでのＣＳＦサンプルの２Ｄ超音波画像を示す。より多くの散乱体（細胞）が増加したＷＢＣ濃度の画像において観察される。０細胞／μＬでは散乱体（細胞）は観察されず、個々の散乱体は１００細胞／μＬまで観察することができる。
【図４】図４は、ＣＳＦ空間における細胞検出の図式的説明を示す。第１群の信号は泉門層から反射され、第２群の後方散乱は細胞が体液中に存在する場合に得られ、第３群の信号は流体−脳インターフェースから反射される。全ての組織層に直交するため、この最後の信号群はトランスデューサーの最適なアラインメントを示すために使用することができる。
【図５】図５は、異なる地点で超音波エネルギーを焦点合わせするために使用することができるトランスデューサーレイを示す。
【図６】図６は、流体と接触している単一要素トランスデューサーを示す図である。（左図）トランスデューサーは焦点領域で最大のアコースティックエネルギーを供給する。トランスデューサーの感度は焦点領域で最も良い。異なる領域の液体をサンプリングするために、トランスデューサーのアコースティックビームは、複数の要素が使用される場合、機械的に変位され得る、または電子的に変位され得る。（中間図）流体に加えられるアコースティック圧力（またはアコースティック放射力）は、パターン、すなわち流れに従う流体の変位を意味する。（右図）粒子が流体に閉じ込められている場合、粒子の位置がトランスデューサーの視野内にある限り、粒子は流れに閉じ込められる。エネルギーおよびパルス繰り返し周波数が高いほど、流れ内に閉じ込められる際に流速および粒子速度が高くなる。
【図７】図７は、粒子の後方散乱信号は散乱物体によってトランスデューサーに反射された信号であることを示す。放射された信号の波長が散乱直径に近いほど、後方散乱された信号は高くなる。右側図に示されるように、エネルギーの一部が粒子によって反射され、一部が媒体によって減衰されるので、放出された信号はより低いエネルギーで流体中の伝播を維持する。
【図８】図８の左図は、異なる大きさの細胞の後方散乱スペクトルが、細胞直径が増加するにつれてエネルギーが増加することを示す。より大きな帯域の実行（エクスビボ適用又は生体外適用；ex-vivo application）では、周波数の最大値も、より小さいセルについてはより高い周波数に向かって変位される。図８の右図は、より高いタンパク質濃度によって媒体の減衰が増加するにつれて、後方散乱スペクトルはより低い周波数にシフトしバンド幅が広がることを示す。
【図９】図９は、各パルス放出では、アコースティック圧は粒子および媒体特性、並びにパルスのエネルギーおよび繰り返し周波数に依存する速度で粒子を変位させることを示す。後方散乱信号速度は、例えば連続した捕捉（図の右側）を相関させることによって追跡することができ、かつ損なわれた信号対ノイズ条件における技術の検出感度を改善するために使用することができる。
【図１０】図１０は、細胞感度を高めるためのコーディングシステムの概略図を示す。（上図）送信では、電気インパルスは全体的により高いエネルギーでより大きなシーケンスにコード化される。このシーケンスは、このエネルギーをシステムに入力される機械信号に変換するトランスデューサーを励起する。（下図）受信モードでは、信号は０ｄＢに近いＳＮＲにあり得るが、シーケンスが検出される場合にピークを出力するデコーダによって符号化パターンを認識する（畳み込みを解く（deconvolved）、相関を失わせる（decorrelated））ことが可能である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
いくつかの疾患の早期診断を達成するためのキーは、低濃度範囲（１〜１０００細胞／μＬ）での細胞濃度のインビボ（または体内でまたは生体内で;in vivo）の効率的な測定値を得るための個々の細胞の検出である。実施例に示されているように、本明細書に開示される方法は、高周波超音波および短期間のアコースティックパルス列（pulse trains）を用いて非常に低濃度で細胞を検出することによって、上記の欠点の解決策を供する。
【０００９】
従って、一態様では、本発明は、表在性体液における（または表在性体液内のまたは表在体液内のまたは表面体液の;in superficial body fluids）循環細胞（circulating cells）の検知および定量化を行うための非侵襲的な方法（non-invasive method）に関する。当該本発明の第１方法は、
ａ）被検者（または被験者；subject）の皮膚の下方にある表在性体液の超音波データを得るため該皮膚に超音波系デバイスを設ける工程；
ｂ）体液内の細胞および該細胞の濃度に関する情報を供するデータ処理システムによって、工程ａ）で得られた超音波データを分析する工程；および
ｃ）工程ｂ）で得られた情報を被検者内の循環細胞の存在および量と相関させる工程
を含み、
超音波系デバイスを、１０〜５０ＭＨｚの範囲の中心周波数、５０〜１０００ｎｓのパルス継続時間、および３０〜１５０μｍの波長で作動させる、方法である。
【００１０】
本発明の内容において、「非侵襲的」という用語は、個人における皮膚がサンプルを抽出するために破壊されないプロセスを指す。したがって、更に非侵襲的である本発明の第１の方法は同時に無痛である、すなわち物理的な痛みを引き起こさないプロセスである。
【００１１】
本発明の第１の方法は、表在性体液中の循環細胞を検出するのに有益である。人体中の体液を流れる細胞は「循環細胞」とされ、本発明の方法によって検出することができる。特定の実施形態では、循環細胞は、白血球、赤血球または癌細胞である。
【００１２】
用語「表在性体液」は、言及した範囲（１０〜５０ＭＨｚ）の高周波超音波が皮膚に到達するように皮膚に十分に近接して流れる人体の体液を指す。当該表在性体液は、５０ｍｍよりも深くない、好ましくは２０ｍｍよりも深くない体液を含み得る。特定の実施形態では、表在性体液は、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、尿、胸膜液、滑液および心膜液からなる群から選択される。
【００１３】
本発明の方法は、腰椎穿刺を行う必要なく脳脊髄液における乳児の循環細胞を測定するのに特に有用である。当業者に知られているように、泉門は小児の頭部の軟部であり、当該頭部の軟部により、出生時に頭蓋骨の骨プレートが屈曲することを可能にし、子供の頭部が産道を通過することを可能にする。頭蓋骨の骨の骨化により、大泉門（または前泉門；anterior fontanelle）泉門が９〜２４か月までにわたり閉口される。これにより、泉門が閉じられる前に、脳を囲むＣＳＦにアクセス可能であり、医師は本発明の方法を用いて循環細胞を測定することが可能になり、その濃度により髄膜炎または脳炎等の中枢神経系における感染または炎症を表すことが可能となる。
【００１４】
本発明の第１の方法の更なる利点は、表在性体液の循環細胞が検出または測定されるのみでなく、例えば大きさ、変動性、濃度等の細胞の他の特性を評価し、かつ病気の指標となる表在性体液中のタンパク質濃度に関する情報を供することが可能である粘度などの表在性体液の特性を評価することが可能であるということである。
【００１５】
本発明の第１の方法の第１工程である工程ａ）は、皮膚の下方にある表在性体液の超音波データを得るため超音波系デバイスを被検者の皮膚上に設けることを含む。
【００１６】
任意の超音波系デバイスが本発明を実施するために使用することができる。限定されるものではないが当該デバイスの例としては、ＴａｂｅｒｎａＰｒｏ−Ｍｅｄｉｃｕｍ社のポータブル皮膚科学超音波デバイス（ＤＵＢ皮膚スキャナ３３または３３ＭＨｚ）（システム型、プローブ型およびラップトップ型）、ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ社の臨床前イメージングデバイス（Ｖｅｖｏ２１００およびＶｅｖｏ７７０）（米国特許第７２５５６７８号）、およびアークスキャン社の眼用プローブ（米国特許出願２０１３２３７８２６号）が挙げられる。
【００１７】
特定の実施形態では、本発明の方法での超音波系デバイスはトランスデューサーを有して成る。当業者により理解されるように、トランスデューサーは、ある形態のエネルギーを別の形態のエネルギーに変換するデバイスである。すなわち超音波トランスデューサーは、圧力のような物理量の変化を電気信号に変換し、同様に電気信号のような物理量の変化を圧力に変換するデバイスである。
【００１８】
ゲルは、通常トランスデューサーと皮膚との間のより良いアコースティックインピーダンス整合のためにトランスデューサーと皮膚との間に設けられ、それによって信号の送受信中の信号損失が低減される。最適な信号を得るための超音波の焦点はターゲット領域内にある必要がある。一般に、この焦点は、プローブ表面から１〜３０ｍｍ、好ましくは２０ｍｍの間であり得る。
【００１９】
トランスデューサーは、単一の集束（または焦点；focused）素子、例えば共振平滑圧電セラミック結晶および凹型集束レンズを含み得る。他のトランスデューサー、例えば、集束を生成するための成形圧電素子を有するトランスデューサーが使用され得る。送信信号および受信感度を最大にするために、短いパルスを得るためあまり鋭くない共鳴が使用され得る。トランスデューサーは、異なる直径（典型的には４〜１０ｍｍ）と焦点距離（典型的には５〜１５ｍｍ）を有し得る。任意の直径および焦点長さを有する任意の他の適当なトランスデューサーを使用することができる。皮膚と音響的に接触している単一のトランスデューサーは、質問信号（interrogating signal）を発射し、後方散乱信号を受信することができる。
【００２０】
一組のトランスデューサーまたはアレイを使用することもできる。この場合、幾何学的に合焦された要素、（各トランスデューサーの放射に対して適切な遅延を設定することによる）電子焦点化（またはフォーカルライゼーション；focalization）、（得られた信号を後処理することによる）合成焦点化、またはそれらの一部または全部の組み合わせを使用することで、単一の焦点が得られ得る。表在性体液中に十分に大きな超音波圧力信号を発生させることができる任意の他のタイプのトランスデューサーが使用されてよい。
【００２１】
特定の実施形態では、超音波系デバイスまたはトランスデューサーによって放出される信号は、２０ＭＨｚの中心周波数、５００ｎｓのパルス継続時間、および７５μｍの波長で作動する。
【００２２】
アコースティックパルスがトランスデューサーによって皮膚を通じて放出されると、体液中の細胞および組織層界面からの反射信号または超音波データが、トランスデューサーによって受信され、記録される（これらの信号をインターフェース信号および散乱と呼ぶ）
【００２３】
次に、トランスデューサーは、工程ｂ）で処理される超音波データを受信する。特定の実施形態では、工程ａ）で得られる超音波データは、（ｉ）Ａ−ラインデータの集合および／または（ｉｉ）２ＤデータのＢ−モードタイプまたは３ＤデータのＣ−モードタイプの形態である。Ａラインデータは、一次元で得られた超音波データを指し、トランスデューサーの位置を固定したままにする。ＢモードおよびＣモードは、（移動システムにおける）角度およびトランスデューサーの位置の関数としてそれぞれ得られる２Ｄまたは３Ｄデータ表示を指す。２Ｄおよび３Ｄデータは、単一の要素トランスデューサーを移動することによって、または固定型または移動型トランスデューサーレイ（線形または２Ｄアレイ）を使用することで得ることができる。
【００２４】
第２工程である工程ｂ）では、本発明の第１の方法は、細胞および／または流体特性に関する情報を供するデータ処理システムによって、工程ａ）で得られた超音波データを分析する工程を含む。
【００２５】
本発明において、「データ処理システム」は、超音波データを分析し、密度または粘度などの細胞の流体バルク特性と細胞のタイプおよび濃度情報を供する電子機器およびアルゴリズムの組み合わせを意味する。特定の実施形態では、データ処理システムはアルゴリズムを含む。
【００２６】
本発明の内容において、「分析する」、「処理する」、「算出する」、「計算する」、「決定する」、「導出する」などの用語は同等であり、コンピュータシステムのレジスタおよび／またはメモリ内の電子量等の物理的量として表されるデータを、コンピュータシステムのメモリ、レジスタまたは他の情報記憶、伝送または表示サービス内で物理量として同様に表される他のデータに操作および／または変換する、プロセッサ、コンピュータ若しくはコンピュータシステム、または同様の電子若しくはハードウェア算出デバイスの動作および／または処理を指す。
【００２７】
本明細書で示されるプロセスおよびディスプレイは、本質的には任意の特定のコンピュータ、測定デバイス、電子デバイスまたは他の装置に関係しない。様々なこれらのシステムの望ましい構造は以下の説明から明らかになるであろう。さらに、本発明の実施形態は、任意の特定のプログラミング言語、機械コードなどを参照して記載されていない。本明細書に記載の本発明の教示を実施するために、様々なプログラミング言語、数学的ツール、電子測定ツール、機械コードなどを使用できることは理解されよう。本発明の実施形態は、ハードディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、“ディスクオンキー”、メモリスティック、または実行時に本発明の実施形態を実行する命令が保存された、または効果に対応するファイルまたはデータが保存された他のメモリユニットなどの媒体または物品に含めることができる。
【００２８】
トランスデューサーによって放出された波は、波が中断されている媒体とアコースティックインピーダンスコントラスト（acoustic impedance contrast）を有する物体から後方散乱される。このアコースティックコントラストは、例えば、体液の密度若しくは圧縮率またはその両方と、粒子の密度または圧縮率との差異に起因する可能性がある。これらの差異は、密度と圧縮率との積の平方根に反比例する、粒子または流体の密度と音波速度との積である、アコースティックインピーダンス間に差異を生じさせる可能性がある。これらの物体（トランスデューサー）によって後方散乱される信号は、流体および物体の相対的なアコースティックインピーダンス、これらの物体の大きさおよび形状にさえ依存する。
【００２９】
散乱されるアコースティック（または音響;acoustic）エネルギーの波長が弱散乱（非共鳴）粒子のサイズよりも大きい場合の長波長限界では、すなわち、λ＞２Π（またはπ）ａである場合（λは波長を表し、ａは粒子半径を表す）、後方散乱されたエネルギーはレイリー散乱に起因し得、粒子の圧縮性と密度と流体懸濁媒体の圧縮性と密度との間のコントラスト、および粒子の体積に依存し得る。例えば、２０ＭＨｚの超音波周波数では、アコースティック波長は７５μｍである。１０μｍ以下の細胞または他の粒子につき、比２Πａ／λは小さく（ａ／λが＜１／１０で＜１）、後方散乱効果はレイリーレジーム内である。より高い周波数および／またはより大きな粒子については、後方散乱パワーは後方散乱データの振幅の解釈を複雑にする他の粒子特性の関数となり得る。
【００３０】
本発明の方法は、例えば、懸濁される媒体とアコースティックコントラストを有する任意の粒子種の濃度測定を可能にし得る。測定は、測定される流体と接触せずに使用されてもよい。さらに、本発明の実施形態によって生成され得る後方散乱スペクトルは、粒子の性質に関する情報を供し得る。例えば、細胞と周波数との応答の差は、２つ以上のタイプまたはサイズの細胞の存在を示唆している可能性がある。粒子の移動または速度はＥｃｋａｒｔストリーミングによって生成されてよく、当該ストリーミングは、超音波による流体の開放体積での運動生成または単なる「ストリーミング」である。このストリーミングによって押し出された粒子の運動エコーは、データ処理内の細胞からの小さなエコーの検出を改善するために使用され得る。
【００３１】
また、超音波系デバイスは、トランスデューサーにより体液に投影される信号を生成する信号発生器（質問信号とも呼ばれる）を有して成り得る。当該信号は、例えば、選択された中心周波数で等しい長さの一連のパルスまたはトーンバーストを含み得る。上述したように、特定の実施形態では、トランスデューサーによって投影される信号発生器は、２０ＭＨｚの中心周波数、５００ｎｓのパルス、および７５μｍの波長で作動する。
【００３２】
パルス間の期間（本明細書では「ギャップ」とも呼ばれる）では、質問信号をオフにすることができる。信号が焦点ゾーンから戻ることができるのはこの間隔であり、例えば、超音波信号を含むパルス間の間隔の間に戻り信号を受信することができる。例えば、焦点ゾーンはトランスデューサーから約７ｍｍであり、ゾーンおよび後方への双方向移動距離は１４ｍｍであり、信号の前縁（または前方エッジ；leading edge）は９．３マイクロ秒（１４ｍｍ／１５００ｍ／秒）後にトランスデューサーに戻ることができる。戻った後方散乱信号は放出されたパルスの間に入り、信号がオフになる。細胞によって後方散乱されたパルスの数は、焦点領域に存在する細胞の数の情報を運ぶ。受け取ったパルスのエネルギーは、細胞の性質だけでなく皮膚の減衰にも依存する。信号処理は両方の効果を分離することができる。
【００３３】
超音波データがデータ処理システムによって分析されると、細胞に関する情報および／または体液中の細胞の濃度に関する情報が得られる。特定の実施形態において、得られる細胞特性は、細胞サイズ、細胞濃度および／または細胞生存率である。
【００３４】
最後に、第３の工程であるステップｃ）において、本発明の第１の方法は、工程ｂ）で得られた情報を、疾患または病原性細胞の存在を示す個人における循環細胞の存在および量と相関させる工程を含む。工程ｂ）で得られた情報と循環細胞の存在および量との間の相関関係は、例えば、スキャンされた体積によって受容した個々の超音波エコーの数を分割することによって実施され得る。
【００３５】
本発明の内容において、「病原性細胞」とは、免疫反応を引き起こすのに人間の体液中にて十分な濃度があり、かつ個人にて疾患を引き起こし得る細胞をいう。
【００３６】
当業者には理解されるように、工程ｂ）で得られた情報は、検出された循環細胞由来のエコーの形態である。より多くの循環細胞が体液中に存在するほど、より多くのエコーが検出される。必要であれば、より正確な測定値を得るために細胞エコー検出を改善するいくつかの方法がある。これらの方法の例は、限定されるものではないが、信号振幅（信号振幅スイープ（または掃引；sweep））の増大、細胞の速度の測定、および励起信号のコード化されたシーケンスの使用である。
【００３７】
■信号振幅スイープ：組織の減衰は局所的にも被検者間でも異なる。組織の減衰が大きいと、焦点中心から離れた細胞からのエコーが受信されないことがあり得る。その結果、真の濃度が過小評価される可能性がある。この効果は、２Ｄおよび３Ｄ走査によって克服することが可能である。２Ｄおよび３Ｄ走査では、十分な細胞が焦点体積を横切って細胞濃度の統計的に確かな測定値となることを確実にするためにより大きな容積がサンプリングされる。あるいは、トランスデューサーで組織を介して受信される細胞エコーの最大エネルギーは、各患者の皮膚減衰を評価するためにエクスビボ（または生体外で；ex-vivo）で得られた細胞エコーの最大エネルギーに関連づけることができる。この患者依存係数は、実施例１に記載の方法で得られるエクスビボ（または生体外で；ex-vivo）カウント（または数；counts）を補正するために使用することができる。
【００３８】
■細胞速度：細胞速度は、自然の体液流れ、超音波信号の放射力、または内部構造を変位させる（またはずらすまたは置き換える；displace）組織上のユーザーの示唆する圧力のいずれかによってもたらされ得る。
【００３９】
低い信号対ノイズ比（ＳＮＲ）では、伝播しないノイズとの区別を可能にするため、単一の細胞速度によって単一の細胞後方散乱の検出能力が向上する。例えば連続するデータ収集間の相関によって懸濁液における単一細胞の速度を測定することにより、所与の時間における細胞の最大変位を知ることができる。したがって、検出能力または感度は、（図９に示すように）セル速度範囲の制御または許可によって改善することができる。
【００４０】
■励起信号のコード化されたシーケンスによる感度の改善
信号対ノイズ比（ＳＮＲ）が損なわれ、信号の電力が増加することができない状況では、例えば安全性の問題のために、符号化された励起シーケンスを使用してＳＮＲを高めることができる。一方では、単一のパルスの代わりに複数のパルスが生成されるので、信号エネルギーの量はより大きい。信号がより長い時間にわたって送信されるので、電力は維持されるが、空間分解能は低下する。空間分解能の損失を回復するために、パルスシーケンスは、励起シーケンスのための固有の信号パターンを生成するマッチフィルタ（またはコーダ）で畳み込まれる（convolved）。これがシステムに送信される信号である。受信モードでは、信号は逆重畳（deconvolved）または復号（decoded）される。他のソース、すなわちノイズから発生した受信信号に対しては、信号パターンが認識されないので、デコーダは低い信号値を出力する。反対に、符号化された信号が受信されると、信号は復号され、高い狭い（相関）ピークが生成される。ＳＮＲがゼロに近いシミュレーションでさえ、このストラテジは単一セルからの後方散乱をうまく解決することを示している（図１０参照）。
【００４１】
本明細書の冒頭で説明したように、本発明の方法は、診断ツールとして有用であり、ウィルス、原生動物、真菌および／または細菌性の疾患（またはウィルス性、原生動物性、真菌性および／または細菌性の疾患；viral, protozoal, fungal and/or bacterial disease）を患っている被検者に実施された治療の効果を監視する（またはモニタリングする；monitoring）ために有用である。したがって、本発明は、ウィルス、原生動物、真菌および／または細菌の疾患および感染に対する炎症反応を診断するための本発明の方法の使用に関する。
【００４２】
従って、第２の態様では、本発明は、被検者内のウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患の診断のため、またはウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患を患っている可能性がある被検者を特定するための方法に関する。
当該本発明の第２の方法は、
ａ）本発明の第１の方法に従った方法により被検者の表在性体液中の循環細胞の定量化を行う工程、および
ｂ）前記循環細胞の量を被検者内のウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患の存在と相関させる工程
を含み、
基準値よりも高い循環細胞の量が、ウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患を示し、または被検者がウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患を患っている可能性があることを示す、方法である。
【００４３】
参照値は、診断されるべき種々の疾患のための技術水準において広く知られており、本発明を実施するために当業者に利用可能である。
【００４４】
当業者が理解するように、本発明の第１の方法について開示された全ての特定の実施形態は、本発明の第２の方法に適用することができる。
【００４５】
本発明の内容において、「ウィルス性疾患」とはウィルスによって引き起こされる疾患を指し、「原生動物性疾患」は原生動物によって引き起こされる疾患を指し、「真菌性疾患」は真菌によって引き起こされる疾患を指し、および「細菌性疾患」とは、細菌によって引き起こされる疾患を指す。
【００４６】
原生動物は、ある人間から別の人間に伝染することができる単細胞生物である。人間の腸内に生存している原生動物は、感染した人が触れた食物を共有したり、人と人との直接の接触等を通じた糞口ルートを介して、ある人間から他の人間に伝染され得る。血液中に生息する原生動物は、蚊のような第３の供給源を介して伝達され得る。ヒトに感染する原因となる原生動物には、肉質虫類（またはサルコディナ；sarcodina）（アメーバ）、鞭毛虫類（mastigophora (flagellates)）、繊毛虫類（ciliophora (ciliates)）、胞子虫類（sporozoa）の４つの主要なグループがある。本発明の方法で診断され得る原生動物性疾患の非限定的な例は、アメーバ症（amoebiasis）（例えば、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica））、ジアルジア症（giardiasis）（例えば、ランブル鞭毛虫症（Giardia lamblia））、アフリカ睡眠病（african sleeping sickness）（例えば、トリパノソーマ・ブルーセイ（Trypanosoma brucei））、リーシュマニア症（leishmaniasis）（例えば、大型リーシュマニア（Leishmania. major）、小児リーシュマニア（Leishmania. infantum）、ブラジル・リーシュマニア（Leishmania. braziliensis)）、トキソプラズマ症（toxoplasmosis）（例えば、トキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）、マラリア（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Plamodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（Plamodium vivax）、卵型マラリア原虫（Plamodium ovale）、四日熱マラリア原虫（Plamodium malariae））
、バベシア症（babesiosis）（例えば、バベシアミクロチ（Babesia microti）、バベシアダンカニ（Babesia duncani）多型バベシア（Babesia divergens）、およびバベシアベナトルム（Babesia venatorum）、トリコモナス症（Trichomonas）（膣トリコモナス（Trichomonas vaginalis）である。
【００４７】
真菌性疾患は真菌症と呼ばれ、ヒトに影響を及ぼすものは体組織への浸透レベルに基づいてグループに分けることができる。皮下真菌は皮下、結合および骨組織を含むように皮膚の下に浸透する。全身または深部の真菌症は、内臓器官に感染し、身体全体に広く拡がる。真菌疾患の非限定的な例には、アスペルギルス真菌によって引き起こされるアスペルギルス症、クリプトコッカス・ネオフォルマンスおよびＣ．ガティイによって引き起こされるクリプトコッカス髄膜炎およびクリプトコッカス肺炎などのクリプトコッカス感染症、ヒストプラスマ・カプスラツムによって引き起こされるヒストプラスマ症などが挙げられる。
【００４８】
本発明の第２の方法により診断することができる細菌性疾患の例として、（結核菌、髄膜炎菌、肺炎連鎖球菌、Ｂ型インフルエンザ菌、リステリア菌、または大腸菌）により引き起こされる髄膜炎、脳炎、肺炎、結核などが挙げられる。
【００４９】
ウィルス性疾患の例としては、髄膜炎、水痘、インフルエンザ、ヘルペス、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ／ＡＩＤＳ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、感染性単核球症、流行性耳下腺炎、はしか、風疹および帯状疱疹が挙げられる。
【００５０】
特定の実施形態において、ウィルス、原生動物、真菌および／または細菌性の疾患は髄膜炎である。
【００５１】
従って、本発明の方法は、被検者における髄膜炎の診断のため、または髄膜炎を患っている可能性がある被検者を特定するための方法であって、
ａ）本発明の第１の方法により被検者の表在性体液中の循環細胞の定量化を行う工程、および
ｂ）前記循環細胞の量を髄膜炎の診断と相関させる工程
を含み、
基準値よりも高い循環細胞の量が髄膜炎を示し、または被検者が髄膜炎を患っている可能性があることを示す、方法に関する。
【００５２】
基準値は当該技術分野で広く知られており、当業者が知っているように患者の年齢に依存する。血液脳関門（ＢＢＢ）は年齢とともに浸透しにくくなるため、髄膜炎における脳脊髄液（ＣＳＦ）の白血球（ＷＢＣ）濃度の診断レベルは、３０〜９０日の患者の＞９ＷＢＣ／μＬおよび９０日を上回る患者の＞５ＷＢＣ／μＬよりも２９日を下回る患者ではより高い値である＞２０ＷＢＣ／μＬとなっている（Ａｒｍｙらによる２００３年のＡｍＦａｍＰｈｙｓｉｃｉａｎ；６８：１１０３〜１１０８頁；Ｅｄｗａｒｄｓらによる２０１３年、編集者Ｄ、ＴｏｒｃｈｉａＭＭの１カ月齢以上の小児における急性細菌性髄膜炎の臨床的特徴および診断、２０１３年まで；１〜１９頁）。
【００５３】
更に、本発明の方法の冒頭で説明したように、ＣＳＦ内の乳児の循環細胞の測定が泉門を通じて実施され得るため、本発明の方法は脊髄穿刺を行う必要なく当該乳児の循環細胞を測定するのに特に有用である。別の特定の実施形態では、循環細胞はＷＢＣであり、および／または表在性体液はＣＳＦである。
【００５４】
第３の態様では、本発明の方法は、ウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患を患う被検者に実施した治療の効果を監視するための方法に関する。
本発明の第３の方法は、
ａ）本発明の第１の方法に従った方法による治療前と治療後に被検者の表在性体液中の循環細胞の定量化を行う工程、および
ｂ）前記循環細胞の検出を前記被検者に実施した治療の効果と相関させる工程
を含み、
治療前の循環細胞の量よりも少ない治療後の被検者内の循環細胞の量は、治療が効果的であることを示す、方法である。
【００５５】
本発明の第３の態様で使用される用語および表現は、以前に定義および説明されており、本態様に適用することができる。同様に、以前の態様に関するすべての特定の実施形態は、本発明の第３の態様にも適用可能である。当業者が理解するように、治療が被検者に対してその作用を発揮するのに十分な時間をおくことが必要である。
【００５６】
更に、ＣＳＦ中の循環細胞の存在は白血病の指標となり得る。従って、本発明は、本発明の第１の方法を実施する工程、および髄膜炎について上記したような循環細胞の存在を被験体における白血病の存在と相関させる工程を含む、白血病の診断方法にも関する。
【００５７】
また、本発明は、その特定の実施形態と共に本明細書に開示された本発明の方法に対応する使用の実施形態を包含する。
【００５８】
従って、別の態様では、本発明は、被検者の表在性体液における循環細胞の検出および定量化を行うため、被検者内のウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患の診断のため、ウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患を患っている可能性がある被検者を特定するため、またはウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患を患う被検者に実施した治療の効果を監視するための超音波系デバイスの非侵襲的な使用であって、
超音波系デバイスが、１０〜５０ＭＨｚの範囲の中心周波数、５０〜１０００ｎｓのパルス継続時間、および３０〜１５０μｍの波長で作動する、非侵襲的な使用に関する。
【００５９】
特定の実施形態では、超音波系デバイスによって放射される信号は、２０ＭＨｚの中心周波数および／または５００ｎｓのパルス継続時間、および／または７５μｍの波長で作動する。
【００６０】
特定の実施形態では、循環細胞は、白血球、赤血球または癌細胞である。
【００６１】
特定の実施形態では、表在性体液は、脳脊髄液、血液、尿、胸膜液、滑液および心膜液からなる群から選択される。
【００６２】
特定の実施形態において、ウィルス、原生動物、真菌および／または細菌性の疾患は髄膜炎である。
【００６３】
他方、本発明の第１の方法の同じ測定原理は、被検者から抽出された液体試料のインビトロ（またはエクスビボ）自動分析に適用することができる。この場合、皮膚減衰の欠如の結果として、より高い周波数を使用することができ、超音波デバイスは、２５〜１０００ｎｓのパルスおよび１５〜１５０μｍの波長で１０〜１００ＭＨｚで作動することができ得る。
【００６４】
従って、第４の態様では、本発明は、被検者の表在性体液における循環細胞の検知および定量化を行うためのインビトロ（または体外でのまたは生体外での；in vitro）方法に関する。
本発明の第４の方法は、
ａ）被検者の表在性体液から分離させた液体サンプルの超音波デバイスを得るため該液体サンプルと接触状態となるように超音波系デバイスを設ける工程；
ｂ）体液内の細胞および該細胞の濃度に関する情報を供するデータ処理システムによって、工程ａ）で得られた超音波データを分析する工程；および
ｃ）工程ｂ）で得られた情報を個人内の循環細胞の存在および量と相関させる工程
を含み、
超音波系デバイスを、１０〜１００ＭＨｚの範囲の中心周波数、２５〜１０００ｎｓのパルス継続時間、および１５〜１５０μｍの波長で作動させる、方法である。
【００６５】
前記実施形態に関連するすべての開示内容および本発明の第１の方法について開示された全ての特定の実施形態は、本発明の第４の方法に適用することができる。
【００６６】
本発明の第３の方法の工程ａ）は、液体サンプルの超音波データを得るために、被検者の表在性体液から分離させた液体サンプルと接触状態となるように超音波系デバイスを設ける工程を含む。当業者であれば理解するように、超音波系デバイスと液体サンプルとの接触は、レシピエント（recipient）を含むサンプルの表面を通して実施され得る。レシピエントの減衰は超音波の分析にとって重要ではなくてよい。
【００６７】
第５の態様では、本発明は、被検者内のウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患の診断のため、ウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患を患っている可能性がある被検者を特定するためのインビトロ（または体外でのまたは生体外での；in vitro）方法に関する。
本発明の第５の方法は、
ａ）本発明の第４の方法に従った方法により被検者の表在性体液中の循環細胞の定量化を行う工程、および
ｂ）前記循環細胞の量を被検者内のウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患の存在と相関させる工程
を含み、
基準値よりも高い循環細胞の量が、ウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患を示し、または被検者がウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患を患っている可能性があることを示す、方法である。
【００６８】
本発明の第５の方法の特定の実施形態において、ウィルス、原生動物、真菌および／または細菌性の疾患は髄膜炎である。
【００６９】
最後に、第６の態様では、本発明は、ウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患を患う被検者に実施した治療の効果を監視するためのインビトロ（または体外でのまたは生体外での；in vitro）方法に関する。
本発明の第６の方法は、
ａ）本発明の第４の方法に従った方法により治療前と治療後に被検者の表在性体液中の循環細胞の定量化を行う工程、および
ｂ）前記循環細胞の量を前記被検者に実施した治療の効果と相関させる工程
を含み、
治療前の循環細胞の量よりも少ない治療後の被検者内の循環細胞の量は、治療が効果的であることを示す、方法である。
【００７０】
前記実施形態に関連するすべての開示内容および本発明の第４の方法について開示された全ての特定の実施形態は、本発明の第５の方法および第６の方法に適用することができる。
【００７１】
また、本発明は、その特定の実施形態と共に本明細書に開示された本発明の方法に対応する使用の実施形態を包含する。
【００７２】
従って、別の態様では、本発明は、被検者の表在性体液における循環細胞の検出および定量化を行うため、被検者内のウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患の診断のため、またはウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患を患っている可能性がある被検者を特定するため、またはウィルス、原生動物、真菌、および／または細菌性の疾患を患う被検者に実施した治療の効果を監視するための超音波系デバイスのインビトロ（または体外でのまたは生体外での；in vitro）使用であって、
超音波系デバイスが、１０〜１００ＭＨｚの範囲の中心周波数、２５〜１０００ｎｓのパルス継続時間、および１５〜１５０μｍの波長で作動する、超音波系デバイスのインビトロ使用に関する。
【００７３】
特定の実施形態では、超音波系デバイスによって放射される信号は、２０ＭＨｚの中心周波数および／または５００ｎｓのパルス継続時間、および／または７５μｍの波長で作動する。
【００７４】
特定の実施形態では、循環細胞は、白血球、赤血球または癌細胞である。
【００７５】
特定の実施形態では、超音波系デバイスはトランスデューサーを有して成る。
【００７６】
特定の実施形態では、表在性体液は、脳脊髄液、血液、尿、胸膜液、滑液および心膜液からなる群から選択される。
【００７７】
特定の実施形態において、ウィルス、原生動物、真菌および／または細菌性の疾患は髄膜炎である。
【００７８】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載された方法および材料と類似または同等の方法および材料は、本発明の実施において使用することができる。明細書および特許請求の範囲を通して、「含む」という単語およびその変形態様は、他の技術的特徴、追加物、構成要素、または工程を排除することを意図しない。本発明の更なる目的、利点および特徴は、明細書を検討することにより当業者に明らかになる、または本発明の実施によって習得されるであろう。下記の実施例は、例示により供されるが本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００７９】
体液の組成の変化を非侵襲的に検出することに臨床的関心が存在する。非常に明確な例は脳脊髄液（ＣＳＦ）の組成の変化であり、現在では侵襲的アプローチのみが流体組成または特性の正確な情報を供している。感染の場合、主たる関心事は、外部病原体がＣＳＦ空間にアクセスしたかどうかを検出することである。そのような場合、免疫系は反応し、外部生物を殺すために感染部位に白血球（ＷＢＣ）を送る。末梢血流（peripheral blood stream）を離れる過程で、ＷＢＣは血管壁を貫通し、ＷＢＣにより血液タンパク質が感染部位に漏出可能となる。体液空間における細胞性およびタンパク質レベルの増加は、体液の密度および粘度のような体液のバルク特性を徐々に変化させる。
【００８０】
実施例１
サンプル調製
ＣＳＦ模倣（または再現；mimicking）サンプルを、０〜１００細胞／μＬの白血球（ＷＢＣ）濃度を変化させたヒト血漿の限外濾過液バージョンとして生成した。病院の体液分析ラボに届く白血球増加症患者からの血液サンプルをチューブに採取し、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）で処理した。チューブを３００ｇで１０分間遠心分離し、各ＥＤＴＡチューブからの１〜２ｍＬの血漿を用いて血漿プールを作製した。プールタンパク質を測定し、生理食塩水血清を添加して０．５ｇ／Ｌタンパク質レベルで５０ｍＬの最終血漿容積を得た。このタンパク質マトリックスは、健康な模擬ＣＳＦを構成した。各ＥＤＴＡチューブから、バフィコート（または軟膜；buffy coat）１ｍＬをパスツールピペットで取り出しウィントローブチューブに移した。次いで、１０本のウィントローブチューブを３００ｇで１０分間遠心分離した。各チューブについて、ＷＢＣ層をピペットで取り出し、タンパク質マトリックス１ｍＬで希釈した。この１ｍＬストック懸濁液から、０〜１００ＷＢＣ／μＬの範囲の濃度を得るために細胞希釈液を調製した。フックスローゼンタール血球計（Fuchs Rosenthal hemocytometer）を用いて細胞数および分化（または差異；differential）を測定した。
【００８１】
方法
単一元素トランスデューサー（米国マサチューセッツ州ウォルサムのオリンパス社製Ｖ３３２０）を用いて、細胞サンプルを超音波走査した。トランスデューサーの中心周波数は７５ＭＨｚで、４２．５ＭＨｚ〜１０１ＭＨｚの−６ｄＢ帯域幅、１２．５ｍｍの位置に位置付けられた焦点、およびＦ値が２であった。トランスデューサーはＰａｎａｍｅｔｒｉｃｓ５９００ＰＲパルサー（米国マサチューセッツ州ウォルサムのオリンパス社製）で励起されて、Ｐｉｃｏｓｃｏｐｅ６４０２Ｄオシロスコープ（英国ケンブリッジシャー州のＰｉｃｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）に接続した。焦点の中央に位置する連続したＲＦ信号を取得し、後処理のためにワークステーションに収納した。細胞サンプルをトランスデューサーと直接接触させ、トランスデューサー上にコイル状に巻いた特異的に設計されたＰＶＣ蓋内に入れた。液体媒体による減衰と細胞応答の結果として、受信されたパルスにつき４５ＭＨｚで中心にあり、波長は３３μｍであり、パルス継続時間は４５ｎｓであった。サンプルを６ｍｍの開口部（またはアパーチャー；aperture）を通じて蓋のキャビティ内外にピペットで入れた（図１）。サンプルを４℃で保存し、サンプル生成から３時間以内に測定して、細胞生存率を９０％よりも高く維持した。サンプル中のアコースティック焦点の浸漬を保証するために４５０μＬのサンプル体積を使用した。後方散乱係数を、図１に記載の方法を用いてＲＦ信号から計算し、血球計の結果と比較した。細胞からの後方散乱信号の時間および周波数応答については、この周波数範囲の細胞に用いられる値である０．５に近いポアソン係数を有するアンダーソンのモデルを用いて理論的に研究した。
【００８２】
結果
図２は、後方散乱エネルギーと全白血球数と血球計で測定した白血球数との関係を示す２つの線形傾向を示す。結果は、ＷＢＣの増加とともに後方散乱信号の線形一致を示していた（Ｒ２：０．９７）。
【００８３】
実施例２
細胞サンプル調製
上記の実施例１参照の事。
【００８４】
方法
細胞サンプルを市販の超音波システム（デンマークのハドシュンのＣｏｒｅｘＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＤｅｒｍａＳｃａｎＣＵＳＢ）を用いて超音波走査した。トランスデューサーの中心周波数は２０ＭＨｚ（パルス波長７５μｍ）で、１７．５ＭＨｚ〜２２．５ＭＨｚの−６ｄＢのバンド幅、６０μｍ（軸方向）×１５０μｍ（横方向）のシステム分解能（または解像度；resolution）、６ｍｍの位置に位置付けられた焦点、１．２１ｍｍの直線スキャン、および５ｆｐｓのフレーム率であった。
【００８５】
結果
０〜１００細胞／μＬの濃度の画像システムから２Ｄ画像を得た。図３は、０、１２および１００ＷＢＣ／μＬのサンプルに対応する３つの画像を示す。画像内に観察される個々のエコーは、システム分解能（または解像度；resolution）−粒径不一致にもかかわらず、単一の細胞に付着されていた。散乱されるアコースティックエネルギーの波長が弱散乱（非共鳴）粒子のサイズ、すなわち、λ＞２Πａより大きい長波長限界では（λは波長を表し、ａは粒子半径を表す）、後方散乱エネルギーはレイリー散乱に起因し得、粒子の圧縮性および密度と流体懸濁媒体の圧縮性および密度との間のコントラスト、および粒子の体積に依存していた。製造業者によって与えられた軸方向分解能は６０μｍであり、サンプル中のＷＢＣの半径は約６μｍであった。結果として、２πａ／λは０．６３（ａ／λ＜１／１０で＜１）となり、後方散乱効果がレイリーレジーム内にあると結論付けられた。
【００８６】
実施例３
髄膜炎の非侵襲的診断
細菌性髄膜炎（ＢＭ）は、中枢神経系に影響を及ぼし、乳児および新生児の中でも高い罹患率および死亡率を引き起こす非常に攻撃的な疾患である。途上国での死亡率は約４０〜５８％、先進国で約１０％である。この疾患の臨床的提示は、発熱が最も一般的で時には唯一の症状であることが非常に特異的である。診断には、脳脊髄を取り囲む流体である脳脊髄液（ＣＳＦ）のサンプルが必要である。現在、腰椎穿刺は、その組成特性を分析するためにＣＳＦのサンプルを得る唯一の方法である。しかし、腰椎穿刺は侵襲的な手術であり、幼児や新生児では実施が困難であり、最大４８％までの外傷を頻繁に行う。そのため、血液がサンプルを汚染し、ＣＳＦの結果が信頼できないことになる。疾患の発症率が先進国（１０００００人当たり１０例）よりも発生率が（風土病地域で）１０倍または（流行期に）１００倍である発展途上国では、サンプルを分析するための検査施設の不足のため、腰椎穿刺が行われないことが一般的である。したがって、診断は、臨床プロトコルに従う医者または医者不在時には看護師により知覚される臨床的な症候に大きく基づいている。臨床検査施設が豊富で、治療が遅れた場合に感染した患者の予後診断が不良である先進国では、髄膜症状（例えば発熱）を有する患者に医師は腰椎穿刺を行う閾値が低い。さらに、ＣＳＦ細菌の培養結果が利用可能となるまで（４８〜７２時間後）、ＣＳＦのＷＢＣ数が増加した患者（１ヵ月未満の新生児では２０細胞／μＬを超え、１〜３ヵ月の幼児では１０細胞／μＬを超える）は、ＢＭに対して経験的な抗生物質治療を直ちに受ける。安全なストラテジであるが、腰椎穿刺を受けその多くが抗生物質で治療されてＢＭの無い幼児を最大９５％とする結果をもたらしている。その結果、ＢＭの発生率が低い先進国では、このストラテジは非ＢＭ患者の医療に何らの利益ももたらさない。したがって、先進国としての資金不足のために、より良い使いやすい方法が必要と考えている。
【００８７】
本発明の方法は、泉門（図４）を介したＣＳＦ中の細胞の存在を感知するために高周波超音波を使用し、および個々の細胞を検出し、腰椎穿刺の数を厳密に必要なものに減らし髄膜炎の非侵襲的診断を助けるためのＣＳＦ細胞濃度を供するため信号処理を使用する。
【００８８】
高周波超音波メーカー：
前臨床イメージング
ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ社（カナダ）
Ａｔｙｓｍｅｄｉｃａｌ社（フランス）
皮膚科学
Ａｔｙｓｍｅｄｉｃａｌ社（フランス）
ＴＰＭ、ＴａｂｅｒｎａＰｒｏＭｅｄｉｃｕｍ社（ドイツ）
Ｃｏｒｔｅｘｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（デンマーク）
Ｓｏｎｏｓｃａｐｅ社（中国）
Ｓｏｎｏｓｉｔｅ社（米国）
Ｌｏｎｇｗｏｏｄ社（米国）
Ｅｓａｏｔｅ社（イタリア）
ＧＥヘルスケア社（米国）
【００８９】
１．アコースティックの原理（または基本；fundamental）と概念の開発
１．１サンプリング
１．１．１．体積サンプリング
超音波デバイス（またはトランスデューサー）は、液体容積の小さな領域、すなわち焦点領域で最大の圧力信号を印加する。当該デバイスが静的のままである１つの単一要素によって構成されている場合、１次元データのみが得られる。流体体積の複数の領域がサンプリングされる場合、単一の要素は機械的にまたは電子的に変位され、２次元または３次元のデータ（または画像）を得ることができる。複数の要素を使用する場合、液体容積の一部または全体をイメージングするためにアコースティックビームが電子的に導かれ得る（図５）。
【００９０】
１．１．２集束されたアコースティック放射力
トランスデューサーにより加えられるアコースティック圧力は、液体体積内に流れを誘発し得るアコースティック放射力を生成する。このような流れは、パルス繰り返し周波数（ＰＲＦ）が増加するにつれて増加し、すなわち当該周波数は圧力信号が放出される周波数であり、焦点領域において最大である（図６）。
【００９１】
１．２流体特性
１．２．１単一細胞のアコースティック後方散乱
液体体積（懸濁液）に細胞がある場合、圧力信号の一部が細胞によってトランスデューサーに反射される（図７）。単一細胞からのこれらの反射信号は、アコースティック後方散乱信号または後方散乱と呼ばれる。後方散乱エネルギーは、放出された信号の波長が細胞の大きさに近づくにつれて、すなわち放出される信号の周波数が増加するにつれて増加する。したがって、本明細書内のトランスデューサーを参照するときは常に、高周波トランスデューサーを指すことは理解されたい。細胞濃度の測定値を供するには、信号およびデータ処理も必要とされる（第２章を参照）。
【００９２】
１．２．２細胞からの後方散乱のスペクトル内容
後方散乱信号のスペクトル内容は、このような後方散乱信号を生成する細胞の特徴である。サイズおよび組成などの細胞特性は、後方散乱信号のエネルギー、周波数および帯域幅に関係する。同様に、懸濁媒体の粘度は、流体と容器の遠位壁との間の界面で反射される信号のスペクトル、ならびに後方散乱スペクトルの周波数シフトおよび帯域幅変化に関連し得る。そのような分析は、非常に低い皮膚減衰またはエクスビボ（または生体外での；ex-vivo）液体分析でのみ可能である（図８）。
【００９３】
１．２．３細胞速度
細胞の速度は、自然の流体の流れ、超音波信号の放射力、または内部構造を変位させる組織上でのユーザーの示唆する圧力のいずれかによって導かれ得る。
【００９４】
低いＳＮＲでは、伝搬しないノイズとの区別が可能であるため、単一細胞速度により単一細胞後方散乱の検出能力が向上する。例えば連続するデータ収集間の相関によって懸濁液における単一セルの速度を測定することにより、所与の時間における細胞の最大変位を知ることができる。従って、検出能力または感度は、細胞速度範囲を制御または許可することによって依然として改善することができる（図９）。
【００９５】
１．２．４励振信号の符号化シーケンスによる感度改善
ＳＮＲが損なわれ、信号の電力が増加することができない状況では、例えば、安全性の問題のために、符号化された励起シーケンスがＳＮＲを高めるために使用され得る。一方では、単一のパルスの代わりに複数のパルスが生成されるので、信号エネルギーの量はより大きい。信号がより長い時間にわたって送信されるので、電力は維持されるが、空間分解能は低下する。空間分解能の損失を回復するために、パルスシーケンスは、励起シーケンスのための固有の信号パターンを生成するマッチフィルタ（またはコーダ）で畳み込まれる。これがシステムに送信される信号である。受信モードでは、信号は逆重畳または復号される。他のソース、すなわちノイズから発生した受信信号に対しては、信号パターンが認識されないので、デコーダは低い信号値を出力する。反対に、符号化された信号が受信されると、信号は復号され、高い狭い（相関）ピークが生成される。ＳＮＲが０に近いシミュレーションでも、このストラテジは単一細胞からの後方散乱をうまく解決することを示している（図１０）。
【００９６】
１．３構造測定
１．３．１液体厚さの計算
体液が２つの組織の間に閉じ込められている場合、体液の厚みは、体液中の信号の音速と、体液を取り囲む組織の界面における反射信号の時間距離に基づいて推定することができる。
【００９７】
トランスデューサーによって受信される信号は、外部組織からの反射の第１のセット、体液中の含有量を表す第２の信号（もしあれば細胞の後方散乱）、および体液を取り囲む最も浅い組織からの反射信号の最後のセットにより構成される必要がある。
【００９８】
１．４操作上のファクター
１．４．１アライメントチェック
上記の説明を続けると、この受信された信号構造および構成が供されていないとき、これは、組織構成要素の少なくとも１つがトランスデューサーの視野にないことを意味する。トランスデューサーの位置を変えることまたは方向を変えることによって、トランスデューサーのアライメントが正しいことを示す反射信号のセットを認識することができる。この時点で、流体から生じる単一細胞後方散乱信号を単離またはゲート制御し、さらに分析することができる。流体を取り囲むより深い組織からの反射を受けないという事実は、必ずしも流体から単一細胞の後方散乱を受けることを阻むものではないことに留意されたい。
【００９９】
２．信号処理および分析
２．１目的の周波数範囲における後方散乱エネルギー分析
戻された後方散乱信号は、５〜１５ｍｍの距離に位置づけられ、数百マイクロメートルから２ｍｍまでの長さを有するアコースティック焦点のみを含むようにタイムゲートされた。焦点体積は、体液中の細胞に対する最大の感度を有する領域である。信号は高速フーリエ変換され、細胞濃度および細胞特性を計算するために１５〜３０ＭＨｚの周波数範囲のパワースペクトルが分析された。
【０１００】
２．２改善された細胞エコー検出
２．２．１相互相関
連続するＲＦ信号（またはそのエンベロープバージョン；enveloped version）は、細胞による信号線形コヒーレンスを見つけるように相互相関がある。交差相関信号をＲＦ信号のエネルギーに正規化した後、０．３〜０．９の範囲の閾値を使用して、細胞からのエコーに付随する相互相関ピークを特定する。１０分の１ミリ秒のオーダーの取得レートでは、焦点を通じて移動する細胞に対応する相互相関ピークのシフトが、細胞速度を決定するために使用される。あるいは、スペクトル後方散乱周波数ピークの位相シフトを使用することができる。線形に走査された単一素子トランスデューサーまたは線形アレイ若しくは２Ｄアレイによって２Ｄ−３Ｄ画像が得られる場合、細胞、その軌道および速度を検出するための効率的な技術として、ハフ変換をデータに適用することができる。ハフ変換（Hough transform）されたデータは、細胞検出アルゴリズムを使用して細胞数をカウントする前に、後に閾値処理され得る。
【０１０１】
２．２．２コード化された励起
受信した後方散乱信号の信号対ノイズ比を改善するために、符号化された励起技術（チャープ、ゴーリー、バーカー）が使用される。パルスは、マッチフィルタによってシーケンスまたはシーケンスの組み合わせにコード化され、ボディに送信される。受信信号はマッチフィルタの符号化されたシーケンスと一致する場合にのみ、パルス周波数帯域内に別個のスペクトルピークを生成する受信回路内のマッチフィルタの複製（またはデュプリケート；duplicate）によって畳み込みが解かれる（deconvolved）。
【０１０２】
２．３容積推定
２．３．１細胞エコー強度に基づく方法（１Ｄまたは２Ｄ）
減衰がより大きくなるほど有効サンプル体積がより小さくなるため、サンプリングされた体積の推定は、異なる減衰で以前に測定された実効焦点体積に関して、焦点領域における細胞エコーの平均強度レベルを関連付けることによって得ることができる。この目的のために、細胞エコーの強度周波数分布はビン化され（binned）、例えば１０％の確率閾値を超えて広がる強度レベルなどの分布パラメータが計算される。細胞のエコー強度レベルが大きいほど、サンプリングされる焦点体積が大きくなる。強度レベルスパンと有効サンプリングされた体積との間のこの関係は異なる減衰に対して較正することができる。あるいは、強度レベルのシフトを有効サンプリングされた体積にマッピングすることができる。細胞エコー強度レベルが低いと、減衰量が大きくなり有効サンプリング体積が小さくなる。同様に、有効サンプリングされた容積に関連した細胞エコーの強度シフトは、事前に較正することができる。
【０１０３】
２．３．２．２Ｄアレイ、線形走査された１Ｄアレイ、２Ｄ走査された単一要素
３Ｄ体積が２Ｄアレイ、線形走査された線形アレイまたは２Ｄ走査された単一要素によって得られた場合、画像ボクセルの寸法から最小の誤差で体積を推定することができる。
【０１０４】
２．４細胞の性質と生存率
細胞濃度、大きさおよび生存率は、戻された細胞後方散乱信号のスペクトルエネルギー、スペクトル帯域幅またはスペクトル勾配から決定することができる。
【０１０５】
細胞後方散乱エネルギーは、０〜１００細胞／μＬの細胞濃度に直線的に関係する。より高い濃度では、後方散乱信号の方向に散乱細胞とトランスデューサーとの間に位置付けられた細胞によって細胞後方散乱が減衰される。
【０１０６】
エコー強度を細胞の大きさに関連付けることによって３Ｄ画像が得られる場合、大きさは細胞エコー幅によって決定される。
【０１０７】
細胞生存率は、目的の周波数範囲における後方散乱エネルギー（細胞核硬度の測定値）とスペクトル勾配（散乱体の大きさの測定値）の組み合わせによって決定することができる。核の異なる構造変化を伴う細胞死の異なる方法がある。アポトーシス（または細胞の自然死；apoptosis）では、核が凝縮されて断片化され、細胞の大きさが減少し、後方散乱エネルギーが増加し、スペクトル勾配が保存される。有糸分裂停止／異変（mitotic arrest/catastrophe）では、細胞および核の大きさが増大し、後方散乱エネルギーが増加するがスペクトル勾配が減少する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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