(57)【要約】第２高調波発生（ＳＨＧ）は、標的分子に付着した第２高調波活性標識を使用してタンパク質および他の生物学的標的における結合相互作用およびコンホメーション変化の検出を可能にする表面選択的検出技法として構成されうる非線形光学プロセスである。第２高調波発生（ＳＨＧ）および関連した表面選択的非線形光学技法を使用してタンパク質構造およびダイナミクスを決定するための方法、デバイス、およびシステムが開示されている。
2018516358.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中のタンパク質構造を決定するための方法であって、
（ａ）第１のセットの実験条件下で表面にタンパク質分子を繋ぎ止めるステップであって、前記タンパク質分子は、１つまたは複数の既知の位置において１種または複数の非線形活性標識で標識される、ステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）の前記繋ぎ止められたタンパク質分子を少なくとも１つの基本周波数の励起光で照射するステップであって、前記励起光は、少なくとも１つの光源によって提供される、ステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記照射の結果として前記１種または複数の非線形活性標識によって生成される光の第１の物理的性質を検出するステップと；
（ｄ）少なくとも第２のセットの実験条件下で表面に前記タンパク質分子を繋ぎ止めるステップと；
（ｅ）ステップ（ｄ）の前記繋ぎ止められたタンパク質分子を少なくとも１つの基本周波数の励起光で照射するステップと；
（ｆ）ステップ（ｅ）の前記照射の結果として前記１種または複数の非線形活性標識によって生成される光の少なくとも第２の物理的性質を検出するステップと；
（ｇ）ステップ（ｆ）で検出された前記光の前記少なくとも第２の物理的性質を、ステップ（ｃ）で検出された前記光の前記第１の物理的性質と比較して、前記繋ぎ止められたタンパク質分子中の前記１種または複数の非線形活性標識の相対的配向を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記１種または複数の非線形活性標識の前記相対的配向のデータを、前記タンパク質分子の構造モデルに包括的にフィッティングするステップをさらに含み、前記構造モデルは、前記タンパク質分子内の前記１種または複数の非線形活性標識の既知の位置に基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも２種の異なる非線形活性標識−タンパク質コンジュゲートについてステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップをさらに含み、前記非線形活性標識は、前記タンパク質分子上の少なくとも２つの異なる部位に付着されている、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも２種の異なる非線形活性標識−タンパク質コンジュゲートがそれぞれ、単一部位システインを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記非線形活性標識が、非線形活性非天然アミノ酸である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
光の前記少なくとも第２の物理的性質が、光の前記第１の物理的性質と異なる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
光の前記第１の物理的性質および前記少なくとも第２の物理的性質が、同じ偏光を有するが、異なる規模または強度のものである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
光の前記第１の物理的性質および前記少なくとも第２の物理的性質が、異なる偏光を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記非線形活性非天然アミノ酸が、アラダン、またはナフタレンの誘導体である、請求項５から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質のＸ線結晶学的データを前記タンパク質分子の前記構造モデルに組み込むステップをさらに含む、請求項２から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記タンパク質分子が、２つまたはそれ超の既知の位置で標識される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質分子が、３つまたはそれ超の既知の位置で標識される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｄ）から（ｆ）が、少なくとも第３のセットの実験条件について繰り返される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｄ）から（ｆ）が、少なくとも第４のセットの実験条件について繰り返される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のセットの実験条件が、第１の電場強度の第１の電場を前記繋ぎ止められたタンパク質分子に印加することを含み、前記少なくとも第２のセットの実験条件が、少なくとも第２の電場強度の少なくとも第２の電場を前記繋ぎ止められたタンパク質分子に印加することを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の電場および前記少なくとも第２の電場が、直流（ＤＣ）場である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の電場および前記少なくとも第２の電場が、交流（ＡＣ）場である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の電場が、直流（ＤＣ）場であり、前記少なくとも第２の電場が、交流（ＡＣ）場である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の電場が、交流（ＡＣ）場であり、前記少なくとも第２の電場が、直流（ＤＣ）場である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の電場および前記少なくとも第２の電場が、前記表面上に製作された電極のアレイを使用して印加される、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記電極のアレイが、図９に例示した環状アレイである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１のセットの実験条件が、Ｎ末端に付着したＨｉｓ−タグを使用して前記タンパク質分子を繋ぎ止めることを含み、前記少なくとも第２のセットの実験条件が、Ｃ末端に付着したＨｉｓ−タグを使用して前記タンパク質分子を繋ぎ止めることを含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１のセットの実験条件が、２×Ｈｉｓ、４×Ｈｉｓ、６×Ｈｉｓ、８×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、１２×Ｈｉｓ、および１４×Ｈｉｓからなる群より選択される第１のＨｉｓ−タグを使用して前記タンパク質分子を繋ぎ止めることを含み、前記少なくとも第２のセットの実験条件が、前記第１のＨｉｓ−タグと長さが異なる少なくとも第２のＨｉｓ−タグを使用して前記タンパク質分子を繋ぎ止めることを含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１のセットの実験条件が、第１のアッセイ緩衝液を使用して前記タンパク質分子を繋ぎ止めることを含み、前記少なくとも第２のセットの実験条件が、前記第１のアッセイ緩衝液と異なる少なくとも第２のアッセイ緩衝液を使用して前記タンパク質分子を繋ぎ止めることを含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１のアッセイ緩衝液と前記少なくとも第２のアッセイ緩衝液との間の差異が、イオン強度、ｐＨ、界面活性剤濃度、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）濃度、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）濃度、ポリエチレングリコール濃度、およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１のセットの実験条件と前記少なくとも第２のセットの実験条件との間の差異が、前記繋ぎ止められたタンパク質分子を、前記タンパク質分子に結合し、前記タンパク質分子においてコンホメーション変化を誘導することが分かっている少なくとも第１のリガンドと接触させることを含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記１種または複数の既知の位置に位置した前記１種または複数の非線形活性標識が同じである、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記１種または複数の既知の位置に位置した前記１種または複数の非線形活性標識が異なる、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記１種または複数の非線形活性標識が、第２高調波（ＳＨ）活性標識である、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記１種または複数の非線形活性標識が、和周波（ＳＦ）活性標識である、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記１種または複数の非線形活性標識が、差周波（ＤＦ）活性標識である、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記照射するステップが、少なくとも１つの基本周波数の励起光の偏光を調整することを含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（ｃ）および（ｅ）の前記検出するステップが、検出器に到達する前記１種または複数の非線形活性標識によって生成される前記光の偏光を調整することを含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
光の前記第１の物理的性質および前記少なくとも第２の物理的性質が、強度または偏光である、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
繋ぎ止められたタンパク質に付着した非線形活性標識の絶対配向を決定するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの基本周波数の励起光で照射する結果として非線形活性表面によって生成される光の物理的性質を検出するステップであって、検出は、前記励起光の２つの異なる偏光状態を使用して実施される、ステップと；
（ｂ）非標識表面上に配向様式で繋ぎ止められた非線形活性標識タンパク質によって生成される光の物理的性質を検出するステップであって、前記光は、前記少なくとも１つの基本周波数の励起光で照射する結果として生成され、検出は、前記励起光の２つの異なる偏光状態を使用して実施される、ステップと；
（ｃ）非線形活性標識表面上に配向様式で繋ぎ止められた非線形活性標識タンパク質によって生成される光の物理的性質を検出するステップであって、前記光は、前記少なくとも１つの基本周波数の励起光で照射する結果として生成され、検出は、前記励起光の前記２つの異なる偏光状態を使用して実施される、ステップと；
（ｄ）ステップ（ａ）における前記光の前記物理的性質、ステップ（ｂ）で検出された前記光の前記物理的性質、およびステップ（ｃ）で検出された前記光の前記物理的性質を比較することによって、前記繋ぎ止められたタンパク質に付着した前記非線形活性標識の絶対配向を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項３６】
前記励起光が、それが前記表面から全反射される方式で、前記表面に向けられる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記励起光の第１の偏光状態が、その入射面に対してｐ偏光を含み、前記励起光の第２の偏光状態が、その入射面に対してｓ偏光を含む、請求項３５から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
２つを超える異なる偏光状態の励起光を使用して、ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）で生成された前記光の物理的性質を検出するステップをさらに含む、請求項３５から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記非線形活性標識表面が、カルボキシル化非線形活性標識のアミノシラン官能化ガラス基板表面への共有結合性カルボジイミドカップリングを使用して調製される、請求項３５から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記非線形活性標識表面が、支持脂質二重層を含み、前記支持脂質二重層が、非線形活性標識が共有結合的にカップリングされるアミンまたはチオール含有脂質をさらに含む、請求項３５から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記非線形活性標識タンパク質が、前記タンパク質のＣ末端のアミノシラン官能化ガラス基板表面への共有結合性カルボジイミドカップリングを使用して前記非標識表面または前記非線形活性標識表面上に配向様式で繋ぎ止められる、請求項３５から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記非線形活性標識タンパク質が、支持脂質二重層を含む非標識表面または非線形活性標識表面上に配向様式で繋ぎ止められ、前記非線形活性標識タンパク質が、前記支持脂質二重層中に挿入され、または前記支持脂質二重層中に挿入されたアンカー分子に付着される、請求項３５から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記非線形活性標識が、第２高調波（ＳＨ）活性標識である、請求項３５から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記非線形活性標識が、和周波（ＳＦ）活性標識である、請求項３５から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記非線形活性標識が、差周波（ＤＦ）活性標識である、請求項３５から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
（ａ）複数の別個の領域をさらに含む第１の表面を含む基板であって、各別個の領域は、支持脂質二重層および電極のパターン形成されたアレイをさらに含む、基板；ならびに
（ｂ）各別個の領域が単一ウェル内に含有されるように、前記基板の前記第１の表面に結合し、またはそれと一体化したウェル形成コンポーネント
を備える、デバイス。
【請求項４７】
複数の支持脂質二重層が、非線形活性標識タンパク質をさらに含む、請求項４６に記載のデバイス。
【請求項４８】
前記複数の支持脂質二重層が、それぞれについて同じである非線形活性タンパク質をさらに含む、請求項４６に記載のデバイス。
【請求項４９】
前記複数の支持脂質二重層が、支持脂質二重層の２つまたはそれ超のサブセットをさらに含み、支持脂質二重層の各サブセットが、異なる非線形活性タンパク質を含む、請求項４７に記載のデバイス。
【請求項５０】
前記基板が、ガラス、石英ガラス、ポリマー、またはこれらの任意の組合せからなる群より選択される光学的に透明な材料から製作される、請求項４６から４９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５１】
前記電極のパターン形成されたアレイが、前記支持脂質二重層を囲繞する前記基板表面上にパターン形成された２つまたはそれ超の電極のアレイを含む、請求項４６から５０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５２】
前記電極のパターン形成されたアレイが、ウェル形成ユニットの各ウェルの壁上にパターン形成された２つまたはそれ超の電極のアレイを含む、請求項４６から５０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５３】
前記電極のパターン形成されたアレイが、各ウェルを密閉する蓋上にパターン形成された少なくとも１つの電極を含む、請求項４６から５１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５４】
ウェル形成ユニットが９６ウェルを含む、請求項４６から５３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５５】
ウェル形成ユニットが、３８４ウェルを含む、請求項４６から５３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５６】
ウェル形成ユニットが、１，５３６ウェルを含む、請求項４６から５３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５７】
前記基板の第２の表面と一体化され、励起光を、それが前記第１の表面から全反射されるように前記基板の前記第１の表面に送達するように構成されたプリズムのアレイをさらに備える、請求項４６から５６のいずれか一項に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
この出願は、２０１５年４月２日に出願された米国仮出願第６２／１４２，３１４号の利益を主張し、２０１５年４月１６日に出願された米国仮出願第６２／１４８，６４９号の利益も主張する（これら出願の両方は、その全体が参考として本明細書に援用される）。
【背景技術】
【０００２】
第２高調波発生（ＳＨＧ）は、標的分子に付着した第２高調波活性標識を使用してタンパク質および他の生物学的標的における結合相互作用およびコンホメーション変化の検出を可能にする表面選択的検出技法として構成されうる非線形光学プロセスである（例えば、米国特許第６，９５３，６９４号および同第８，４９７，０７３号を参照）。これまで、これらの方法は、様々な系におけるリガンド誘導コンホメーション変化を検出するため、およびリガンドが結合すると誘導するコンホメーションのタイプによってリガンドを区別するために適用されてきた（Ｓａｌａｆｓｋｙ，  Ｊ．  Ｓ．（２００１年）、「’ＳＨＧ−ｌａｂｅｌｓ’  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂｙ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３４２巻、４８５〜４９１頁；Ｓａｌａｆｓｋｙ，  Ｊ．  Ｓ．（２００３年）、「Ｓｅｃｏｎｄ−Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  Ｐｒｏｂｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３８１巻、７０５〜７０９頁；Ｓａｌａｆｓｋｙ，  Ｊ．  Ｓ．（２００６年）、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｎｇｅ  ｂｙ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ−Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ、１２５巻；Ｍｏｒｅｅ，  Ｂ．ら（２０１５年）、「Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  α−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ａｎｄ  Ｒｅｕｃｅ  Ｉｔｓ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｊ．  ｂｏｉｌ．  Ｃｈｅｍ．、２９０巻（４６号）；２７５８２〜２７５９３頁；Ｍｏｒｅｅら（２０１５年）、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｎｇｅｓ  ａｒｅ  Ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｓｉｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｙ  Ｓｅｃｏｎｄ−Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」、Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．、１０９巻：８０６〜８１５頁）。例には、タンパク質に結合してそれぞれ不活性および活性コンホメーションを誘導するイマチニブおよびダサチニブなどのＩ型対ＩＩ型キナーゼ阻害剤を区別することが含まれる。
ＳＨＧおよび関連技法の和周波発生（ＳＦＧ）は、界面における色素分子の配向を研究するために過去において使用されてきた（Ｈｅｉｎｚ  Ｔ．ら、（１９８３年）、「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ  Ａｄｓｏｒｂａｔｅｓ  ｂｙ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ−Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」、Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ａ、２８巻（３号）：１８８３〜１８８５頁；Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎａ（Ｓｔｅｇｅｍａｎ，  Ｈ．  Ｐ．  ａ．  Ｇ．編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、３５３〜４１６頁におけるＨｅｉｎｚ，  Ｔ（１９９１年）、「Ｓｅｃｏｎｄ−Ｏｒｄｅｒ  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｔ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ」）。これらの測定では、標識された界面の非線形感受性（χ（２））のコンポーネントは、偏光を使用して決定される。次いで、界面における色素分子についての分子配向分布の詳細を、χ（２）についての実験的に決定された値、および界面の面内の色素分子の配向度に関する仮定、分子座標系（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｒａｍｅ  ｏｆ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）における色素分子の超分極率（ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｂｉｌｉｔｙ）（α（２））のコンポーネントの相対的規模などを使用して推測することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第６，９５３，６９４号明細書
【特許文献２】米国特許第８，４９７，０７３号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓａｌａｆｓｋｙ，Ｊ．Ｓ．  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００１年）３４２巻、４８５〜４９１頁
【非特許文献２】Ｓａｌａｆｓｋｙ，Ｊ．Ｓ．  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００３年）３８１巻、７０５〜７０９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
タンパク質および生体分子構造決定の分野は、高度に発展されているが、リアルタイムでの、かつ溶液中でのコンホメーション変化および構造の感度のよい迅速な測定のニーズが残っている。タンパク質構造およびダイナミクスについてのほとんどの情報は、主にＸ線結晶構造解析法およびＮＭＲ研究から得られているが、これらの技法は、相対的に労働および材料集約的で、遅く、またはタンパク質構造の静的なスナップショットのみをもたらす。
表面選択的非線形光学技法を使用してタンパク質構造を決定するための現在開示されている方法、デバイス、およびシステムは、これらの未充足ニーズに対処する。一部の実施形態では、ハイスループットフォーマットでのタンパク質構造の決定は、励起光を送達するのに使用される光学系に対する基板（分析される、繋ぎ止められたまたは固定化された生物学的標的を含む）の迅速な、正確な、かつ互換性の位置決めのための新規デバイス設計および機構の使用によって可能にされており、それは同時に、励起光と基板表面との間の効率的な光学的カップリングが維持されることを保証する。生体試料のハイスループット光学照合に好適な一フォーマットは、ガラス底マイクロウェルプレートである。本明細書に開示のシステムおよび方法は、ハイスループット分析システムの要件に適合する様式で、全反射によって、基板、例えば、ガラス底マイクロウェルプレート中のガラス基板にＳＨＧおよび他の非線形光学技法に要求される高強度励起光をカップリングするための機構を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書において開示されるのは、溶液中のタンパク質構造を決定するための方法であって、（ａ）第１のセットの実験条件下で表面にタンパク質分子を繋ぎ止めるステップであって、前記タンパク質分子は、１つまたは複数の既知の位置において１種または複数の非線形活性標識で標識される、ステップと；（ｂ）ステップ（ａ）の前記繋ぎ止められたタンパク質分子を少なくとも１つの基本周波数の励起光で照射するステップであって、前記励起光は、少なくとも１つの光源によって提供される、ステップと；（ｃ）ステップ（ｂ）の前記照射の結果として前記１種または複数の非線形活性標識によって生成される光の第１の物理的性質を検出するステップと；（ｄ）少なくとも第２のセットの実験条件下で表面に前記タンパク質分子を繋ぎ止めるステップと；（ｅ）ステップ（ｄ）の前記繋ぎ止められたタンパク質分子を少なくとも１つの基本周波数の励起光で照射するステップと；（ｆ）ステップ（ｅ）の前記照射の結果として前記１種または複数の非線形活性標識によって生成される光の少なくとも第２の物理的性質を検出するステップと；（ｇ）ステップ（ｆ）で検出された前記光の前記少なくとも第２の物理的性質を、ステップ（ｃ）で検出された前記光の前記第１の物理的性質と比較して、前記繋ぎ止められたタンパク質分子中の前記１種または複数の非線形活性標識の相対的配向を決定するステップとを含む方法である。
【０００７】
一部の実施形態では、前記方法は、前記１種または複数の非線形活性標識の前記相対的配向のデータを、前記タンパク質分子の構造モデルに包括的にフィッティングするステップをさらに含み、前記構造モデルは、前記タンパク質分子内の前記１種または複数の非線形活性標識の既知の位置に基づく。
【０００８】
一部の実施形態では、前記方法は、少なくとも２種の異なる非線形活性標識−タンパク質コンジュゲートについてステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップをさらに含み、前記非線形活性標識は、前記タンパク質分子上の少なくとも２つの異なる部位に付着されている。一部の実施形態では、前記少なくとも２種の異なる非線形活性標識−タンパク質コンジュゲートはそれぞれ、単一部位システインを含む。一部の実施形態では、前記非線形活性標識は、非線形活性非天然アミノ酸である。一部の実施形態では、光の前記少なくとも第２の物理的性質は、光の前記第１の物理的性質と異なる。一部の実施形態では、光の前記第１の物理的性質および前記少なくとも第２の物理的性質は、同じ偏光を有するが、異なる規模または強度のものである。一部の実施形態では、光の前記第１の物理的性質および前記少なくとも第２の物理的性質は、異なる偏光を有する。一部の実施形態では、前記非線形活性非天然アミノ酸は、アラダン、またはナフタレンの誘導体である。一部の実施形態では、前記方法は、前記タンパク質のＸ線結晶学的データを前記タンパク質分子の前記構造モデルに組み込むステップをさらに含む。一部の実施形態では、前記タンパク質分子は、２つまたはそれ超の既知の位置で標識される。一部の実施形態では、前記タンパク質分子は、３つまたはそれ超の既知の位置で標識される。
【０００９】
一部の実施形態では、ステップ（ｄ）から（ｆ）は、少なくとも第３のセットの実験条件について繰り返される。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）から（ｆ）は、少なくとも第４のセットの実験条件について繰り返される。一部の実施形態では、前記第１のセットの実験条件は、第１の電場強度の第１の電場を前記繋ぎ止められたタンパク質分子に印加することを含み、前記少なくとも第２のセットの実験条件は、少なくとも第２の電場強度の少なくとも第２の電場を前記繋ぎ止められたタンパク質分子に印加することを含む。一部の実施形態では、前記第１の電場および前記少なくとも第２の電場は、直流（ＤＣ）場である。一部の実施形態では、前記第１の電場および前記少なくとも第２の電場は、交流（ＡＣ）場である。一部の実施形態では、前記第１の電場は、直流（ＤＣ）場であり、前記少なくとも第２の電場は、交流（ＡＣ）場である。一部の実施形態では、前記第１の電場は、交流（ＡＣ）場であり、前記少なくとも第２の電場は、直流（ＤＣ）場である。一部の実施形態では、前記第１の電場および前記少なくとも第２の電場は、前記表面上に製作された電極のアレイを使用して印加される。一部の実施形態では、前記電極のアレイは、図９に例示した環状アレイである。
【００１０】
一部の実施形態では、前記第１のセットの実験条件は、Ｎ末端に付着したＨｉｓ−タグを使用して前記タンパク質分子を繋ぎ止めることを含み、前記少なくとも第２のセットの実験条件は、Ｃ末端に付着したＨｉｓ−タグを使用して前記タンパク質分子を繋ぎ止めることを含む。一部の実施形態では、前記第１のセットの実験条件は、２×Ｈｉｓ、４×Ｈｉｓ、６×Ｈｉｓ、８×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、１２×Ｈｉｓ、および１４×Ｈｉｓからなる群より選択される第１のＨｉｓ−タグを使用して前記タンパク質分子を繋ぎ止めることを含み、前記少なくとも第２のセットの実験条件は、前記第１のＨｉｓ−タグと長さが異なる少なくとも第２のＨｉｓ−タグを使用して前記タンパク質分子を繋ぎ止めることを含む。
【００１１】
一部の実施形態では、前記第１のセットの実験条件は、第１のアッセイ緩衝液を使用して前記タンパク質分子を繋ぎ止めることを含み、前記少なくとも第２のセットの実験条件は、前記第１のアッセイ緩衝液と異なる少なくとも第２のアッセイ緩衝液を使用して前記タンパク質分子を繋ぎ止めることを含む。一部の実施形態では、前記第１のアッセイ緩衝液と前記少なくとも第２のアッセイ緩衝液との間の差異は、イオン強度、ｐＨ、界面活性剤濃度、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）濃度、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）濃度、ポリエチレングリコール濃度、およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される。
【００１２】
一部の実施形態では、前記第１のセットの実験条件と前記少なくとも第２のセットの実験条件との間の差異は、前記繋ぎ止められたタンパク質分子を、前記タンパク質分子に結合し、前記タンパク質分子においてコンホメーション変化を誘導することが分かっている少なくとも第１のリガンドと接触させることを含む。
【００１３】
一部の実施形態では、前記１種または複数の既知の位置に位置した前記１種または複数の非線形活性標識は同じである。一部の実施形態では、前記１種または複数の既知の位置に位置した前記１種または複数の非線形活性標識は異なる。一部の実施形態では、前記１種または複数の非線形活性標識は、第２高調波（ＳＨ）活性標識である。一部の実施形態では、前記１種または複数の非線形活性標識は、和周波（ＳＦ）活性標識である。一部の実施形態では、前記１種または複数の非線形活性標識は、差周波（ＤＦ）活性標識である。
【００１４】
一部の実施形態では、前記照射するステップは、少なくとも１つの基本周波数の励起光の偏光を調整することを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）および（ｅ）の前記検出するステップは、検出器に到達する前記１種または複数の非線形活性標識によって生成される前記光の偏光を調整することを含む。一部の実施形態では、光の前記第１の物理的性質および前記少なくとも第２の物理的性質は、強度または偏光である。
【００１５】
また本明細書において開示されるのは、繋ぎ止められたタンパク質に付着した非線形活性標識の絶対配向を決定するための方法であって、（ａ）少なくとも１つの基本周波数の励起光で照射する結果として非線形活性表面によって生成される光の物理的性質を検出するステップであって、検出は、前記励起光の２つの異なる偏光状態を使用して実施される、ステップと；（ｂ）非標識表面上に配向様式で繋ぎ止められた非線形活性標識タンパク質によって生成される光の物理的性質を検出するステップであって、前記光は、前記少なくとも１つの基本周波数の励起光で照射する結果として生成され、検出は、前記励起光の２つの異なる偏光状態を使用して実施される、ステップと；（ｃ）非線形活性標識表面上に配向様式で繋ぎ止められた非線形活性標識タンパク質によって生成される光の物理的性質を検出するステップであって、前記光は、前記少なくとも１つの基本周波数の励起光で照射する結果として生成され、検出は、前記励起光の前記２つの異なる偏光状態を使用して実施される、ステップと；（ｄ）ステップ（ａ）における前記光の前記物理的性質、ステップ（ｂ）で検出された前記光の前記物理的性質、およびステップ（ｃ）で検出された前記光の前記物理的性質を比較することによって、前記繋ぎ止められたタンパク質に付着した前記非線形活性標識の前記絶対配向を決定するステップとを含む方法である。
【００１６】
一部の実施形態では、前記励起光は、それが前記表面から全反射される方式で、前記表面に向けられる。一部の実施形態では、前記励起光の第１の偏光状態は、その入射面に対してｐ偏光を含み、前記励起光の第２の偏光状態は、その入射面に対してｓ偏光を含む。一部の実施形態では、前記方法は、２つを超える異なる偏光状態の励起光を使用して、ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）で生成された前記光の物理的性質を検出するステップをさらに含む。
【００１７】
一部の実施形態では、前記非線形活性標識表面は、カルボキシル化非線形活性標識のアミノシラン官能化ガラス基板表面への共有結合性カルボジイミドカップリングを使用して調製される。一部の実施形態では、前記非線形活性標識表面は、支持脂質二重層を含み、前記支持脂質二重層が、非線形活性標識が共有結合的にカップリングされるアミンまたはチオール含有脂質をさらに含む。
【００１８】
一部の実施形態では、前記非線形活性標識タンパク質は、前記タンパク質のＣ末端のアミノシラン官能化ガラス基板表面への共有結合性カルボジイミドカップリングを使用して前記非標識表面または前記非線形活性標識表面上に配向様式で繋ぎ止められる。一部の実施形態では、前記非線形活性標識タンパク質は、支持脂質二重層を含む非標識表面または非線形活性標識表面上に配向様式で繋ぎ止められ、前記非線形活性標識タンパク質は、前記支持脂質二重層中に挿入され、または前記支持脂質二重層中に挿入されたアンカー分子に付着される。
【００１９】
前記非線形活性標識は、第２高調波（ＳＨ）活性標識である。前記非線形活性標識は、和周波（ＳＦ）活性標識である。前記非線形活性標識は、差周波（ＤＦ）活性標識である。
【００２０】
本明細書において開示されるのは、（ａ）複数の別個の領域をさらに含む第１の表面を含む基板であって、各別個の領域は、支持脂質二重層および電極のパターン形成されたアレイをさらに含む、基板；ならびに（ｂ）各別個の領域が単一ウェル内に含有されるように、前記基板の前記第１の表面に結合し、またはそれと一体化したウェル形成コンポーネント
を備えるデバイスである。
【００２１】
一部の実施形態では、複数の支持脂質二重層は、非線形活性標識タンパク質をさらに含む。一部の実施形態では、前記複数の支持脂質二重層は、それぞれについて同じである非線形活性タンパク質をさらに含む。一部の実施形態では、前記複数の支持脂質二重層は、支持脂質二重層の２つまたはそれ超のサブセットをさらに含み、支持脂質二重層の各サブセットは、異なる非線形活性タンパク質を含む。一部の実施形態では、前記基板は、ガラス、石英ガラス、ポリマー、またはこれらの任意の組合せからなる群より選択される光学的に透明な材料から製作される。一部の実施形態では、前記電極のパターン形成されたアレイは、前記支持脂質二重層を囲繞する前記基板表面上にパターン形成された２つまたはそれ超の電極のアレイを含む。一部の実施形態では、前記電極のパターン形成されたアレイは、ウェル形成ユニットの各ウェルの壁上にパターン形成された２つまたはそれ超の電極のアレイを含む。一部の実施形態では、前記電極のパターン形成されたアレイは、各ウェルを密閉する蓋上にパターン形成された少なくとも１つの電極を含む。一部の実施形態では、ウェル形成ユニットは９６ウェルを含む。一部の実施形態では、ウェル形成ユニットは、３８４ウェルを含む。一部の実施形態では、ウェル形成ユニットは、１，５３６ウェルを含む。一部の実施形態では、前記デバイスは、前記基板の第２の表面と一体化され、励起光を、それが前記第１の表面から全反射されるように前記基板の前記第１の表面に送達するように構成されたプリズムのアレイをさらに備える。
【００２２】
参照による組込み
本明細書で述べられるすべての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が、その全体が参照により組み込まれるように具体的かつ個々に示されているのと同じ程度に、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。本明細書における用語と組み込まれた参考文献中の用語との間で矛盾する場合は、本明細書における用語が支配する。
【００２３】
本発明の新規特徴が、添付の特許請求の範囲における独自性とともに示されている。本発明の特徴および利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用されている例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって得られることになる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】図１Ａは、蛍光のエネルギー準位図（吸収／発光プロセス）の略図を提供する。
【００２５】
【図１Ｂ】図１Ｂは、第２高調波発生のエネルギー準位図（２光子散乱プロセス）の略図を提供する。
【００２６】
【図２】図２は、リガンドの結合によって誘導されるタンパク質（非線形活性部分で標識された）におけるコンホメーション変化、およびタンパク質が付着されている光学的界面（Ｚ軸）に対する非線形活性標識の配向に対するその影響の略図を提供する。
【００２７】
【図３】図３は、実験室座標系（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｒａｍｅ  ｏｆ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）（Ｘ、Ｙ、およびＺ軸によって定義された）と分子座標系（Ｘ’、Ｙ’、およびＺ’軸によって定義された）との間の関係を例示する。一部の非線形活性分子について、超分極率テンソル（α（２））は、分子座標系中の単一コンポーネントによって支配されている、すなわち、α（２）＝α（２）Ｚ’Ｚ’Ｚ’である場合がある。
【００２８】
【図４】図４は、非線形光検出に基づいて、生物学的分子、例えば、タンパク質または他の生物学的実体の構造またはコンホメーション変化を決定するハイスループット分析システムのシステムアーキテクチャの一非限定例を例示する。
【００２９】
【図５】図５は、非線形光検出を使用して生物学的分子中の構造またはコンホメーション変化を分析するのに使用される光学セットアップの一非限定例の概略図を示す。
【００３０】
【図６】図６は、励起光が基板の上面で全反射を起こすような適切な入射角で励起光を方向付けるためのプリズムの使用を表す略図を示す。プリズムの右の２本の点線は、非線形活性種が表面に繋ぎ止められているときの反射励起光および基板表面で生成される非線形光信号の光路を示す。基板は、測定間で再位置決めするために、Ｘ−Ｙ並進ステージのアクチュエーターに任意選択で接続されている。プリズムの上面と基板の下面との間の曲線は、プリズムと基板との間の高い光学的カップリング効率を保証するのに使用される屈折率整合液の薄層（一定の拡大縮小比ではない）の存在を示す。
【００３１】
【図７】図７は、プリズムと基板の上面との間の高い光学的カップリング効率を保証するための、透明基板（この例では、マイクロウェルプレートフォーマットで構成されている）の下面に付着した、または隣接する屈折率整合エラストマー材料の層の使用を表す略図を示す。この手法の一部の実施形態では、プリズムの上面は、マイクロウェルプレートおよびプリズムを接触させるときの圧縮力を集中させ、それによってプリズムとエラストマー材料との間の空隙の形成を低減または排除するようにわずかにドーム状にされている。
【００３２】
【図８】図８は、表面選択的非線形光学技法を使用してハイスループット構造決定を実施するためのデバイスであって、基板の上面への励起光の良好な光学的カップリングをもたらすために、ガラス底マイクロプレートフォーマットにおける基板に結合され、または基板と一体化された半球状プリズムのアレイが使用されている、デバイスの一非限定例の略図を提供する。
【００３３】
【図９】図９は、支持脂質二重層を形成するのに使用される基板表面のエリアを囲繞する電極のパターン形成されたアレイを備えるデバイスの一非限定例の略図を提供する。
【００３４】
【図１０】図１０Ａ〜Ｂは、基板の上面への励起光の良好な光学的カップリングをもたらすための一体化されたプリズムアレイを有するマイクロウェルプレートを例示する。このようなデバイスは、タンパク質および他の生物学的分子のハイスループット構造決定を行うのに有用でありうる。図１０Ａ：上面不等角投影図。図１０Ｂ：底面不等角投影図。
【００３５】
【図１１】図１１Ａ〜Ｂは、図１０Ａ〜Ｂに示したマイクロウェルプレートデバイスの分解図を示す。図１１Ａ：上面不等角投影図。図１１Ｂ：底面不等角投影図。
【００３６】
【図１２】図１２は、図１０Ａ〜Ｂに例示した設計概念を使用して全反射を介して基板表面に励起光をカップリングするための入射および出射光路を例示する。
【００３７】
【図１３】図１３Ａ〜Ｂは、光学的界面に繋ぎ止められたタンパク質分子（ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ））のシステイン標識変異体について観察されるＳＨＧ信号強度のデータの例を示す。図１３Ａ：Ｎ末端Ｈｉｓ−タグによってＮｉ／ＮＴＡドープ支持脂質二重層に繋ぎ止められたシステイン標識ＤＨＦＲ変異体のデータ。図１３Ｂ：Ｃ末端Ｈｉｓ−タグによってＮｉ／ＮＴＡドープ支持脂質二重層に繋ぎ止められたシステイン標識ＤＨＦＲ変異体のデータ。
【００３８】
【図１４】図１４Ａ〜Ｂは、公知のリガンド（トリメトプリム（ＴＭＰ））を付加した後に光学的界面に繋ぎ止められたタンパク質分子（ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ））のシステイン標識変異体について観察されたＳＨＧ信号強度のパーセント変化に関するデータの例を示す。図１４Ａ：Ｎ末端Ｈｉｓ−タグによってＮｉ／ＮＴＡドープ支持脂質二重層に繋ぎ止められたシステイン標識ＤＨＦＲ変異体のデータ。図１４Ｂ：Ｃ末端Ｈｉｓ−タグによってＮｉ／ＮＴＡドープ支持脂質二重層に繋ぎ止められたシステイン標識ＤＨＦＲ変異体のデータ。
【００３９】
【００４０】
【図１５】図１５は、本明細書に開示のシステムの運転を制御するように構成されうるコンピューターシステムを例示する。
【００４１】
【図１６】図１６は、本発明の例示的実施形態に関連して使用することができるコンピューターシステムの第１の例示的アーキテクチャを例示するブロックダイヤグラムである。
【００４２】
【図１７】図１７は、複数のコンピューターシステム、複数の携帯電話および個人データアシスタント、ならびにネットワーク接続型記憶装置（ＮＡＳ）を有するネットワークの一実施形態を示すダイヤグラムである。
【００４３】
【図１８】図１８は、一例示的実施形態による、共有仮想アドレスメモリー空間を使用するマルチプロセッサーコンピューターシステムのブロックダイヤグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本明細書に開示のシステムおよび方法は、生体分子構造およびダイナミクス決定の分野に関する。タンパク質または他の生物学的分子に付着した第２高調波活性標識（または他の非線形活性標識、例えば、和周波活性もしくは差周波活性標識）の相対的および／または絶対配向を決定するため、ならびにそれから分子構造を決定するための方法が記載されている。さらに、分子配向または分子構造のハイスループット分析に適したデバイスおよびシステムが記載されている。本開示の一部の態様では、生物学的実体を１種または複数の試験実体と接触させることに応答した生物学的実体の配向、コンホメーション、構造、または配向、コンホメーション、もしくは構造の変化を決定するための方法およびシステムが記載されている。本明細書で使用する場合、配向、コンホメーション、構造、またはそれらの変化の決定は、非線形活性標識またはタグの平均配向に関連および／または比例する非線形光信号の測定を伴いうる。本明細書で使用する場合、「ハイスループット」は、１種もしくは複数の試験実体と任意選択で接触させられた複数の生物学的実体の分子配向、コンホメーション、構造、もしくはそれらの変化の迅速な分析を実施する能力、または大多数の試験実体と任意選択で接触させられた１種もしくは複数の生物学的実体の分子配向、コンホメーション、構造、もしくはそれらの変化の迅速な分析を実施する能力、あるいはこれらのモダリティーの任意の組合せを指す。
【００４５】
一般に、開示した方法、デバイス、およびシステムは、分子配向、コンホメーション、構造、またはそれらの変化を決定するために、第２高調波発生（ＳＨＧ）、または和周波発生（ＳＨＧ）もしくは差周波発生（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）（ＤＦＧ）の関連した非線形光学技法の使用を利用する。これらの方法では、偏光依存測定が使用されて、表面または界面で配向し、当業者に公知の方法によって過分極可能（ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｂｌｅ）部分により１つまたは複数の特異的部位で標識されたタンパク質分子（または他の生物学的分子）の非線形感受性、χ（２）のコンポーネントが決定される。χ（２）のコンポーネントは、ひいてはモデルを通じて各標識部位での分子配向分布に関係付けられる。タンパク質中の１つまたは複数の異なる部位に配置された標識を使用して、２つまたはそれ超の異なるセットの実験条件（以下に定義される）下でχ（２）の少なくとも２つの異なるコンポーネントを測定することによって、ＳＨＧまたは関連非線形光学技法を使用してタンパク質構造のモデルを開発し、その変化を検出するために標識の相対的配向についての得られる情報を使用することができる。
【００４６】
第２高調波発生を使用する配向、コンホメーション、および構造の検出
第２高調波発生は、より広く使用されている蛍光ベース技法（図１Ａ）と対照的に、同じ励起波長または周波数の２個の光子が非線形材料と相互作用し、励起光子の２倍のエネルギー、すなわち、２倍の周波数および半分の波長を有する単一光子として再放出される非線形光学プロセスである（図１Ｂ）。第２高調波発生は、反転対称性を欠く非線形材料において（すなわち、非中心対称材料において）のみ起こり、高強度励起光源を必要とする。これは、和周波発生の特別な場合であり、差周波発生などの他の非線形光学現象と関係付けられる。本開示全体にわたって、用語ＳＨＧ、ＳＦＧ、およびＤＦＧは、当業者によって理解されることになるように、互換的に使用される。
【００４７】
第２高調波発生および他の非線形光学技法は、非線形活性種の配向に対するこれらの依存性のために、表面選択的検出技法として構成されうる。例えば、非線形活性種を表面に繋ぎ止めると、分子が溶液中で自由拡散を起こすことができるとき存在しない正味の平均配向度を作り出すことができる。界面における非線形活性種の配向依存性をモデル化するのに一般に使用される式は：
χ（２）＝Ｎｓ＜α（２）＞
であり、式中、χ（２）は、非線形感受性であり、Ｎｓは、界面における単位面積当たりの非線形活性分子の総数であり、＜α（２）＞は、これらの分子の非線形超分極率（α（２））の平均配向である。ＳＨＧの強度は、非線形感受性の２乗に比例し、よって界面における配向した非線形活性種の数およびこれらの配向分布の両方に依存し、この配向分布の変化は、空間的であっても時間的であっても、ＳＨＧ強度を変化させる。
【００４８】
第２高調波発生および他の非線形光学技法は、非線形活性種が繋ぎ止められ、または固定化された光学的界面（または表面）に励起光を送達するためのモードとして全反射を使用することによってさらに表面選択的にされうる。入射励起光の全反射は、界面で「エバネッセント波」を創製し、それは、表面にごく接近している、すなわち、典型的には数十ナノメートルの程度であるエバネッセント波の空間減衰距離内にある非線形活性標識のみを選択的に励起するのに使用することができる。全反射は、表面選択的様式で蛍光を励起するのに、例えば、光学的界面に付着した蛍光ドナーを励起するのに使用することもでき、次いでそれは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）機構を介して適当なアクセプター分子にエネルギーを移動させる。本開示では、励起光の全反射によって生成されるエバネッセント波は、非線形活性標識または分子を励起するのに優先的に使用される。本明細書に記載の非線形活性プロセスにおいて非線形活性種を励起する効率は、表面に対するこれらの平均配向に強く依存する。例えば、非線形活性種の正味の平均配向が存在しない場合、ＳＨＧ信号は存在しないことになる。
【００４９】
ＳＨＧならびに他の非線形光学技法（例えば、和周波発生および差周波発生）のこの表面選択的性質は、界面に繋ぎ止められた生物学的分子における配向、コンホメーション、構造、およびそれらの変化を検出するのに活用することができる。例えば、リガンドの結合に起因する受容体分子のコンホメーション変化は、非線形活性標識または部分を使用して検出することができ、ここで標識は、コンホメーション変化が界面に対する配向の変化（図２）、よって非線形光信号の物理的性質の変化（例えば、信号強度または偏光の変化）をもたらすように受容体に付着され、またはそれと会合している。過去において、表面選択的非線形光学技法の使用は、物理および化学における用途に主に限定されていた。なぜなら、比較的少ない生体試料が本質的に非線形的に活性であるためである。最近、第２高調波活性標識（「ＳＨＧ標識」）の使用が導入され、実質的に任意の分子または粒子を高度に非線形活性にすることを可能にしている。これの第１の例は、タンパク質シトクロムｃをオキサゾール色素で標識し、第２高調波発生を用いて空気−水界面でタンパク質コンジュゲートを検出することによって実証された（Ｓａｌａｆｓｋｙ，  Ｊ．、「’ＳＨＧ−ｌａｂｅｌｓ’  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂｙ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」、Ｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｅｔｔ．、３４２巻（５〜６号）：４８５〜４９１頁（２００１年））。
【００５０】
表面選択的非線形光学技法は、コヒーレントな技法でもあり、基本および非線形光学光線がはっきりした空間的および位相関係を伴って空間を伝播する波面を有することを意味する。生物学的分子または他の生物学的実体の構造およびコンホメーションを分析するための表面選択的非線形光検出技法の使用は、ｉ）非線形活性種の配向に対する非線形信号の感度のよい直接の依存性、それによる配向およびコンホメーション変化に対する感受性の付与；（ｉｉ）非線形光信号が、非中心対称系を創製する表面でのみ生成される、すなわち、本技法は、非常に狭い「被写界深度」を本質的に有するので、蛍光ベース検出より高い信号対雑音（より低いバックグラウンド）；（ｉｉｉ）狭い「被写界深度」の結果として、本技法が、測定が遊離（すなわち、表面に繋ぎ止められていない）非線形活性種を含有するオーバーレイ溶液（ｏｖｅｒｌａｙｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）の存在下で実施されなければならないとき、例えば、結合プロセスが分離またはすすぎステップによって除去または妨害されうる場合、有用であることを含めて、他の光学手法に対していくつかの固有の利点を有する。本技法のこの態様は、バルク種の存在を必要とする平衡結合測定、または測定が規定された時間にわたって行われる動力学測定を実施するのに特に有用であり得；（ｉｖ）本技法は、２光子吸収断面が、所与の分子について１光子吸収断面より典型的にははるかに小さく、ＳＨＧ（および和周波発生または差周波発生）は、散乱を伴い、吸収を伴わないという事実に起因して、蛍光において起こるものより低い光退色および加熱効果を呈し；（ｖ）基本および非線形光学ビーム（例えば、第２高調波光）は、界面に対してはっきりした入射および出射方向を有するので、最小限の収集光学系が要求され、より高い信号対雑音が予期され；これは、蛍光ベース検出と比較して特に有利であり、その理由は、蛍光発光が等方性であり、焦点外れ面の蛍光種から生じる、検出される信号に対する大きい蛍光バックグラウンドコンポーネントも存在しうるためであり；（ｖｉ）ＳＨＧ、ＳＦＧ、またはＤＦＧから生じる信号は、分子の構造、コンホメーション、または例えば、リガンド結合の際に起こるものなどのそれらの変化を研究する瞬間的なリアルタイム手段をもたらす。この性質は、リアルタイムでその機能の一部として構造変化を起こしているタンパク質のリアルタイム「動画」を得るための開示した方法において非常に有用でありうる。
【００５１】
タンパク質構造＆ダイナミクスの決定
偏光測定：χ（２）のコンポーネントは、少なくとも１つの基本周波数の偏光励起光を使用して実験室座標系内で測定することができる。一部の光源、例えば、一部のレーザーは、実質的に偏光されている基本周波数の光を生成する。一部の実施形態では、励起光の偏光は、１種または複数の光学偏光子、波長板などを使用してさらに規定および／または調整することができる。典型的には、偏光の入射面（すなわち、励起光の伝播方向および基板または反射表面の面に垂直なベクトルによって定義される面）は、図３に例示した実験室座標系のＸ−Ｚ面となる。入射面に平行なその電場ベクトルを有する偏光は、ｐ偏光と呼ばれる。入射面に垂直なその電場ベクトルを有する偏光は、ｓ偏光と呼ばれる。一部の実施形態では、非線形活性部分の励起によって生成される検出される第２高調波光の偏光も、１種または複数の光学偏光子、波長板などを使用して規定および／または調整することができる。上記に概説したように、光学的界面（すなわち、図３中の表面平面（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｎｅ））上に配向様式で繋ぎ止められ、または固定化されたタンパク質中の１つまたは複数の異なる部位に配置された標識を使用して２つまたはそれ超の異なるセットの実験条件下でχ（２）の少なくとも２つの異なるコンポーネントを測定することによって、ＳＨＧまたは関連非線形光学技法を使用してタンパク質構造のモデルを開発し、その変化を検出するために標識の相対的配向についての得られる情報を使用することができる。
【００５２】
非線形活性部分で標識されたタンパク質：非線形活性標識のタンパク質への付着は、当業者に周知であるように、様々な技法のいずれかによって達成することができる。適当な標識付着技法の具体的な非限定的な例は、以下でより詳細に記載される。
【００５３】
一部の実施形態では、１種または複数の非線形活性標識を、同じ個々のタンパク質分子内の１つまたは複数の異なる位置に付着させることができる。一部の実施形態では、１種または複数の非線形活性標識を、同じタンパク質の異なる分子内の１つまたは複数の異なる位置（例えば、部位）に、すなわち、標識タンパク質の異なるバージョンを含むタンパク質のファミリーを創製するために付着させることができる。一部の実施形態では、タンパク質（またはタンパク質のファミリー）が標識される標識部位の数は、少なくとも１部位、少なくとも２部位、少なくとも３部位、少なくとも４部位、少なくとも５部位、少なくとも６部位、少なくとも７部位、少なくとも８部位、少なくとも９部位、少なくとも１０部位、またはそれ超でありうる。他の実施形態では、非線形活性標識を、同じタンパク質の異なる単一部位システイン変異体もしくはバリアントに付着させることができ、または非線形活性非天然アミノ酸（例えば、アラダン（Ａｌａｄａｎ）もしくは他のナフタレン誘導体）を、１つまたは複数の部位で変異体またはバリアントのファミリーに付着させることができる。このようなタンパク質は、操作し、天然に存在し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳法を使用して作製し、ｉｎ  ｖｉｖｏで発現させ、一般に、当業者に公知の様々な方法のいずれかによって創製することができる。
【００５４】
一部の実施形態では、ＳＨＧ測定は、単一非線形活性標識で標識されたタンパク質分子を使用することを含みうる。一部の実施形態では、ＳＨＧ測定は、少なくとも２種の異なる非線形活性標識、少なくとも３種の異なる非線形活性標識、少なくとも４種の異なる非線形活性標識、少なくとも５種の異なる非線形活性標識、少なくとも６種の異なる非線形活性標識、少なくとも７種の異なる非線形活性標識、少なくとも８種の異なる非線形活性標識、少なくとも９種の異なる非線形活性標識、または少なくとも１０種の異なる非線形活性標識で標識されたタンパク質分子を使用することを含みうる。
【００５５】
実験条件：本明細書で定義されるように、「実験条件」は、ＳＨＧまたは他の非線形光信号が測定される実験パラメーターの任意のセットを指し、実験条件のセット中の実験パラメーターの１つまたは複数の変化は、基礎をなす分子配向分布の変化に起因してχ（２）の測定値の変化をもたらす。言い換えれば、異なるセットの実験条件は、異なるベースラインＳＨＧ信号強度、異なる偏光依存性、同じリガンド結合事象に対する異なる応答、または上述のいずれかもしくはすべてを生じさせる。例えば、支持脂質二重層に付着されたタンパク質に電場を印加すると、分子の基礎をなす配向分布を変化させることができ、よってχ（２）の測定値を変更しうる。実験条件のセットを規定するのに使用されうる実験パラメーターの他の例としては、それらに限定されないが、緩衝液条件、例えば、ｐＨ、イオン強度、界面活性剤含有量、および濃度など、つなぎ鎖（ｔｅｔｈｅｒ）付着部位（例えば、ＮまたはＣ末端Ｈｉｓタグの使用による）などがある。具体的には、異なる、かつ独立したセットの実験条件下で測定されるχ（２）の独立した値は、実験室座標系における基礎をなす分子配向分布を得ることを可能にする（図３）。これらの異なる実験室枠測定（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｒａｍｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）を互いに関係付けることによって、分子配向分布をモデル化するのに使用されるガウス分布の幅などの配向分布の他のパラメーターとともに、タンパク質座標系中の２つまたはそれ超の異なる標識部位に配置された非線形活性標識間の角度の相対的差異を決定することができる。
【００５６】
一部の実施形態では、標識タンパク質が繋ぎ止められている表面の１種または複数の組成物の使用を、異なるセットの実験条件を規定するのに使用することができる。例えば、支持脂質二重層が標識タンパク質を繋ぎ止め、配向させるのに使用されている場合、二重層の２種またはそれ超の異なる脂質組成物（例えば、異なる静電荷密度または異なるモル脂質ドープ密度を有する）を使用して、同じタンパク質の２つまたはそれ超の異なる配向分布を創製することができる。例えば、異なる正味の電荷を持つ頭部基を有する脂質を使用することができる（例えば、両性イオン性、正に、および負に荷電した脂質頭部基）。一部の実施形態では、例えば、異なる脂質コンポーネントの数および／またはこれらの相対濃度を変更することによって支持脂質二重層の脂質組成を変更することが有利でありうる。支持脂質二重層を形成するのに使用されうる、または支持脂質二重層の主要もしくは微量コンポーネントとして挿入されうる脂質分子の例としては、これらに限定されないが、ジアシルグリセロール、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールホスフェート（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトールビホスフェート（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトールトリホスフェート（ＰＩＰ３）、セラミドホスホリルコリン（スフィンゴミエリン；ＳＰＨ）、セラミドホスホリルエタノールアミン（スフィンゴミエリン；Ｃｅｒ−ＰＥ）、セラミドホスホリルリピド（ｃｅｒａｍｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｌｉｐｉｄ）、またはこれらの任意の組合せがある。一部の実施形態では、ニッケル−ニトリロ三酢酸キレート（Ｎｉ−ＮＴＡ）部分を含む脂質分子を、Ｈｉｓタグによってタンパク質を繋ぎ止める目的に使用することができる。例えば、二重層は、様々なモル濃度で１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］（ニッケル塩）を組み込むことができる。
【００５７】
一部の実施形態では、脂質二重層の異なる脂質コンポーネントの数は、１〜１０またはそれ超の範囲となりうる。一部の実施形態では、異なる脂質コンポーネントの数は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０でありうる。一部の実施形態では、異なる脂質コンポーネントの数は、多くても１０、多くても９、多くても８、多くても７、多くても６、多くても５、多くても４、多くても３、多くても２または多くても１でありうる。
【００５８】
一部の実施形態では、脂質二重層の所与の脂質コンポーネントの相対的パーセンテージは、約０．１％〜約１００％の範囲となりうる。一部の実施形態では、所与の脂質コンポーネントの相対的パーセンテージは、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．２％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約１００％でありうる。一部の実施形態では、所与の脂質コンポーネントの相対的パーセンテージは、大きくても約１００％、大きくても約９０％、大きくても約８０％、大きくても約７０％、大きくても約６０％、大きくても約５０％、大きくても約４０％、大きくても約３０％、大きくても約２０％、大きくても約１０％、大きくても約５％、大きくても約１％、大きくても約０．５％、大きくても約０．４％、大きくても約０．３％、大きくても約０．２％または大きくても約０．１％でありうる。当業者は、脂質二重層中の所与の脂質コンポーネントの相対的パーセンテージは、この範囲内の任意の値、例えば、約１２．５％を有しうることを認識するであろう。
【００５９】
Ｈｉｓタグなどのタグがタンパク質を繋ぎ止めるのに使用される場合、異なる長さのＨｉｓ−タグ（すなわち、６×、８×、１０×、１２×など）は、異なる配向分布を生じさせることができ、したがって異なるセットの実験条件を規定するのに使用されうる。さらに、Ｎ末端対Ｃ末端Ｈｉｓ−タグは一般に、異なる配向分布を生じさせ、よって、χ（２）の異なる測定値を生じる異なるセットの実験条件を規定するのに使用することができる。
【００６０】
一部の実施形態では、Ｎｉ−ＮＴＡ部分が付着した脂質を含む支持脂質二重層に標識タンパク質を繋ぎ止めるのに使用されるＨｉｓタグの長さは、約１個のＨｉｓ残基〜約２０個のＨｉｓ残基またはそれ超の範囲となりうる。一部の実施形態では、Ｈｉｓタグの長さは、少なくとも１個のＨｉｓ残基、少なくとも２個のＨｉｓ残基、少なくとも３個のＨｉｓ残基、少なくとも４個のＨｉｓ残基、少なくとも５個のＨｉｓ残基、少なくとも６個のＨｉｓ残基、少なくとも７個のＨｉｓ残基、少なくとも８個のＨｉｓ残基、少なくとも９個のＨｉｓ残基、少なくとも１０個のＨｉｓ残基、少なくとも１１個のＨｉｓ残基、少なくとも１２個のＨｉｓ残基、少なくとも１３個のＨｉｓ残基、少なくとも１４個のＨｉｓ残基、少なくとも１５個のＨｉｓ残基、少なくとも１６個のＨｉｓ残基、少なくとも１７個のＨｉｓ残基、少なくとも１８個のＨｉｓ残基、少なくとも１９個のＨｉｓ残基または少なくとも２０個のＨｉｓ残基でありうる。一部の実施形態では、個のＨｉｓタグの長さは、多くても２０個のＨｉｓ残基、多くても１９個のＨｉｓ残基、多くても１８個のＨｉｓ残基、多くても１７個のＨｉｓ残基、多くても１６個のＨｉｓ残基、多くても１５個のＨｉｓ残基、多くても１４個のＨｉｓ残基、多くても１３個のＨｉｓ残基、多くても１２個のＨｉｓ残基、多くても１１個のＨｉｓ残基、多くても１０個のＨｉｓ残基、多くても９個のＨｉｓ残基、多くても８個のＨｉｓ残基、多くても７個のＨｉｓ残基、多くても６個のＨｉｓ残基、多くても５個のＨｉｓ残基、多くても４個のＨｉｓ残基、多くても３個のＨｉｓ残基、多くても２個のＨｉｓ残基または多くても１個のＨｉｓ残基でありうる。
【００６１】
さらに、異なる緩衝液条件、例えば、同じ緩衝液または異なる緩衝液中の異なる塩濃度なども、分子の配向分布、よってχ（２）の測定値を変化させうる。一部の実施形態では、異なるセットの実験条件を規定するのに使用される緩衝液のイオン強度は、一価の塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌなど）、二価の塩（例えば、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２など）、三価の塩（例えば、ＡｌＣｌ３）、またはこれらの任意の組合せを使用することを含みうる。一部の実施形態では、異なるセットの実験条件を規定するのに使用される緩衝液のイオン強度は、約０．０Ｍ〜約１Ｍまたはそれ超の範囲となりうる。一部の実施形態では、緩衝液のイオン強度は、少なくとも０．０Ｍ、少なくとも０．１Ｍ、少なくとも０．２Ｍ、少なくとも０．３Ｍ、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．７Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも０．９Ｍまたは少なくとも１．０Ｍでありうる。一部の実施形態では、緩衝液のイオン強度は、大きくても１．０Ｍ、大きくても０．９Ｍ、大きくても０．８Ｍ、大きくても０．７Ｍ、大きくても０．６Ｍ、大きくても０．５Ｍ、大きくても０．４Ｍ、大きくても０．３Ｍ、大きくても０．２Ｍまたは大きくても０．１Ｍでありうる。当業者は、緩衝液のイオン強度は、この範囲内の任意の値、例えば、約０．１５Ｍを有しうることを認識するであろう。
【００６２】
一部の実施形態では、界面領域と会合し、これらの濃度の関数としてタンパク質の異なる配向分布を生じさせる、緩衝液添加剤、例えば、ＰＥＧ４００、エチレングリコールなども使用することができる。
【００６３】
一部の実施形態では、ＳＨＧ偏光測定に使用される異なるセットの実験条件の数は、サンプリングされる独立した分子配向分布の数および行われうる独立した偏光測定の数を増やし、それによって、角度測定およびそれから導出されるタンパク質構造モデルの精度を増大させるために増やすことができる。一部の実施形態では、使用される異なるセットの実験条件の数は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０または少なくとも１００でありうる。
【００６４】
χ（２）の測定およびタンパク質構造との関係：異なる基礎をなす配向分布に起因してχ（２）の測定値の異なるセットをもたらす実験条件の各セットは、ＳＨＧによって決定される角度θの独立した測定を可能にする。２つまたはそれ超のこのような測定を組み合わせることによって、複数のコンホメーション状態の平衡状態で存在するタンパク質の構造を含めて、タンパク質構造のより正確な決定を行うことができる。χ（２）のコンポーネントの測定およびθの値の決定は、当業者に公知の標準的な分子モデル化技法の使用、および一部の実施形態では、適切な単純化仮定の選択によって構造モデルを開発するのに使用することができる。分析を単純化し、タンパク質構造モデルを開発するのに行うことができる仮定の一非限定例は、タンパク質表面上の異なる部位における２つまたはそれ超の標識の配向は、実験室座標系において（すなわち、表面平面に垂直の軸に対して）実験条件によって変動するが、これらの間の相対的配向、すなわち、タンパク質座標系内の角度は、異なる実験条件下で一定のままであるということである。実際には、この仮定の下で、タンパク質の機能およびコンホメーションランドスケープを乱さない方式で表面上のタンパク質の配向分布を変更する。各実験条件は、異なる偏光で測定されるＳＨＧ強度を分子配向分布に関係付ける少なくとも１つの独立した式を生じさせる。適切な制御、例えば、リガンド誘導コンホメーション変化、リガンド競合実験、リガンド結合の動態、用量−応答測定などを各実験条件で実行させて、タンパク質が依然として機能的であり、よって天然様であることを保証することができる。例えば、タンパク質中の標識または過分極可能部分の配向分布の他のパラメーターとともに、平均角度の測定値を、当業者に公知の方法による新規のまたは統合的な構造モデル構築における制約として使用することができる。一部の実施形態では、例えば、タンパク質のアポＸ線結晶構造（ａｐｏ  Ｘ−ｒａｙ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）をモデルに含め、ＳＨＧ測定によって提供される構造データと重ね合わせて、モデルの精度を改善することができる。
【００６５】
ＳＨＧ構造データの分析を単純化する目的のための開示した方法の一部の実施形態において行うことができる仮定の非限定的な例としては、（ｉ）α（２）の単一コンポーネント（例えば、αｚｚｚ（２））が標識の超分極率を支配すること；（ｉｉ）標識の超分極率は、実験条件の変化とともに変化しないこと；（ｉｉｉ）タンパク質内の２つまたはそれ超の標識の位置（すなわち、標識が付着されているアミノ酸残基の正体）が分かっていること；（ｉｖ）繋ぎ止められたまたは固定化されたタンパク質分子の配向は、Ｘ−Ｙ面内で等方性である（すなわち、タンパク質分子は、基板表面の面上または支持脂質二重層の面内でランダムに配向されている）こと；（ｖ）２つまたはそれ超の標識の配向の変化は、タンパク質コンホメーションもしくはタンパク質アンフォールディングの本質的な変化に起因しないこと；（ｖｉ）各標識部位における標識の配向分布は、デルタ関数を構成すること（すなわち、標識部位における配向角度の広がりがないこと）、またはこれらの任意のこのような組合せがある。一部の実施形態では、ＳＨＧ構造データを、タンパク質結晶学的研究、ＮＭＲ研究、ＵＶ−Ｖｉｓおよび蛍光分光学的研究、円偏光二色性研究、架橋実験、小角Ｘ線散乱研究などからの構造データと重ね合わせ、または組み合わせることができる。
【００６６】
一部の実施形態では、非線形活性標識のタンパク質分子への付着は、標準的な共有結合性コンジュゲーション化学を使用して、例えば、アミン基、カルボキシル基、チオール基などと反応性である非線形活性部分を使用して実施することができる。一部の実施形態では、任意選択で、標識タンパク質の質量分光分析を実施して、タンパク質内の標識アミノ酸残基の位置を厳密に同定することが望ましい場合がある。
【００６７】
好適な実施形態では、標識の付着部位は、当業者に周知であるように、遺伝子操作および部位特異的変異誘発技法によって決定される（例えば、Ｅｄｅｌｈｅｉｔら（２００９年）、「Ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔｗｏ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｍｕｔａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ」、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻：６１頁を参照）。この手法を使用して、例えば、アミンまたはチオール基を含むアミノ酸残基を、非線形活性タグで標識する前に、タンパク質内の正確な位置に配置することができる。次いで変異タンパク質を、当業者に公知の様々なアッセイのいずれかを使用して、例えば、タンパク質の既知のリガンドを使用する結合アッセイを実施して、天然様機能性について試験することができる。
【００６８】
さらに好適な実施形態では、遺伝子操作技法を、当業者に公知の様々な技法のいずれかを使用してタンパク質内の特異的部位に非線形活性非天然アミノ酸を組み込むのに使用することができる。例えば、Ｃｏｈｅｎら（２００２年）、「Ｐｒｏｂｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９６巻：１７００〜１７０３頁、および米国特許第９，１８２，４０６号を参照。
【００６９】
開示した方法の一例では、タンパク質は、単一の部位特異的に操作されたシステイン残基において、超分極率を有し、ひいては応答の単一の支配的エレメントα（２）＝α（２）ｚ’ｚ’ｚ’を有するＳＨＧ活性標識で標識される。標識タンパク質は、脂質頭部基に付着したＮｉ−ＮＴＡ部分を含む支持脂質二重層膜にＨｉｓタグを介して付着される。ベースラインＳＨＧ信号は、このように生成され、χ（２）のゼロになることのないコンポーネント（Ｓａｌａｆｓｋｙ，  Ｊ．  Ｓ．（２００１年）、「’ＳＨＧ−ｌａｂｅｌｓ’  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂｙ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３４２巻、４８５〜４９１頁；Ｓａｌａｆｓｋｙ，  Ｊ．  Ｓ．（２００３年）、「Ｓｅｃｏｎｄ−Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  Ｐｒｏｂｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３８１巻、７０５〜７０９頁；Ｓａｌａｆｓｋｙ，  Ｊ．  Ｓ．（２００６年）、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｎｇｅ  ｂｙ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ−Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ、１２５巻）が、当業者に周知であるように与えられる：
【数１】
2018516358.tif 000003
【００７０】
式中、ＮｓおよびαＺ’Ｚ’Ｚ’（２）は、それぞれ、表面密度および分子超分極率である。次いでχ（２）のコンポーネントを、２つの異なる偏光依存測定（ＩｚｚｚおよびＩｚｘｘ、または同等にＩｐｐｐおよびＩｐｓｓ）から決定することができる。この場合、χｚｚｚ（２）は、ｐ偏光基本励起光を使用してｐ偏光ＳＨＧ信号を測定することによって決定することができる。例えば、８００ｎｍの基本励起光が使用される場合（例えば、Ｔｉ：サファイアモードロックレーザーから）、第２高調波信号は、４００ｎｍで検出される。一般に、ｐ偏光励起およびｐ偏光ＳＨＧ検出下で観察されるＳＨＧ信号強度であるＩｐｐｐは、非線形感受性のいくつかのコンポーネントによって支配される。しかし、この測定においてχｚｚｚ（２）のみを単離するための簡易化された手法は、シリカプリズムを使用して全反射ジオメトリにおける入射の臨界角でＳＨＧ信号を測定することによって達成される。全反射（ＴＩＲ）ジオメトリでは、測定されるＳＨＧ強度は、プリズムおよび表面に繋ぎ止められたタンパク質が浸される緩衝液の屈折率によって決定される。なぜなら、χ（２）の軸外テンソルコンポーネントが消失し、測定されるＩｐｐｐ  ＳＨＧ信号強度を決定するχｚｚｚ（２）のみを残すためである（基本／ＳＨＧビームの偏光を参照して）。同様に、χｚｘｘ（２）は、ｓ偏光基本光を使用してＩｐｓｓを測定し、ｐ偏光ＳＨＧ光強度を測定することによって決定することができる。Ｎｓおよびαｚ’ｚ’ｚ’が未知である場合では、異なる偏光組合せの下で測定される強度の比を使用してこれらのパラメーターを排除し、θの三角関数である配向分布自体の比のみを残すことができ、ここでθは、分子枠内のｚ軸と面法線との間の平均角度として定義される。配向分布が狭いとき、θは、直接的に決定することができる。２つまたはそれ超の異なる部位で（例えば、２つまたはそれ超の異なる単一部位システイン変異体内で、これらのシステイン部位において）標識されたタンパク質を使用して異なる偏光下でＳＨＧ強度の測定を繰り返すことによって（例えば、ＩｚｚｚおよびＩｚｘｘ）、例えば、構造決定における制約として使用されうる各標識部位の異なるθを得ることができる。各測定は、好ましくは、タンパク質内の既知の位置で部位特異的に付着した（例えば、部位特異的システイン変異誘発を介して共有結合的に付着した）標識を有する標識タンパク質を必要とする。やはり実験条件を変更して標識の２つまたはそれ超の異なる部位とともに表面平面に対して異なって配向したタンパク質を生成することによって、独立した測定を行って、配向分布を記述する複数のパラメーターを決定し、それによってタンパク質構造決定について重要な制約をもたらすことができる。本発明の重要なステップは、χ（２）の異なる値またはχ（２）コンポーネントの比（例えば、χｚｚｚ（２）／χｚｘｘ（２））をもたらす２つまたはそれ超の異なる実験条件下で２つまたはそれ超の異なる部位で標識されたタンパク質（好ましくは別個のタンパク質−標識コンジュゲートにおける）の測定を行うことである。２つまたはそれ超の異なる実験条件下で、２つまたはそれ超の異なる部位で標識された同じタンパク質についてχ（２）の値を測定することによって、θ（実験室枠内）のより正確な測定を得、これらの間の、すなわち、タンパク質枠内の差異を、タンパク質の構造に関係付けることができる。
【００７１】
例えば、それぞれが表面上で異なる実験条件下で異なって配向されている、１つの部位でそれぞれ標識された２つのタンパク質を用いて（部位１および部位２）、合計８つの独立した強度測定について、２つの偏光依存ＳＨＧ強度を以下に示すように獲得することができる４つの別個の測定値を有することができる：
配向１：部位１で標識されたタンパク質  −  Ｉｚｚｚ、Ｉｚｘｘを測定する
部位２で標識されたタンパク質  −  Ｉｚｚｚ、Ｉｚｘｘを測定する
配向２：部位１で標識されたタンパク質  −  Ｉｚｚｚ、Ｉｚｘｘを測定する
部位２で標識されたタンパク質  −  Ｉｚｚｚ、Ｉｚｘｘを測定する
【００７２】
ＩｚｚｚおよびＩｚｘｘの測定された強度を比率で表し（ｒａｔｉｏｉｎｇ）、適切なフレネル係数を使用することによって、ＳＨＧ活性標識の超分極率および数密度を、当業者に周知の方法を使用して排除することができる。タンパク質は、多くの潜在的な標識付着部位を有する巨大分子であるので、異なる方式で異なる部位を標識し、タンパク質を配向させると、偏光依存強度（例えば、ＩｚｚｚおよびＩｚｘｘ）の１つを超える独立した比を得る好都合な方式が提供され、それによって（１）中の式の括弧内の配向分布項を複数のモデルパラメーターにフィットすることが可能になる。
【００７３】
例えば、２つの異なるシステイン部位で標識された２つの別個のタンパク質コンジュゲートについて異なるタンパク質配向分布を生じさせる３つまたはそれ超の異なるセットの実験条件を使用する場合、分子配向分布のパラメーターを決定するのに使用されうる（２×３）−１＝５の強度比を得る。実験室枠内の異なるθを使用して、タンパク質枠内の２つの標識部位間の分子内角度差を計算する、すなわち、タンパク質枠内の構造情報を得ることができる。これは、タンパク質は、それがＣ末端対Ｎ末端でＨｉｓ−タグを介して表面に繋ぎ止められているとき、実験室枠内で異なって配向されることになるが（異なるθおよび配向分布をもたらす）、タンパク質座標系内の標識間の関係は、一定のままであるはずであるためである。したがって、タンパク質が表面に異なる配向分布で繋ぎ止められているとき、追加の独立した測定は、タンパク質座標系内の角度間測定値をより正確に決定することを可能にする。実際には、各セットの実験条件は、表面上のタンパク質を再配向させることになり、その結果、ｚ軸上に投影された標識超分極率（ｌａｂｅｌ  ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｂｉｌｉｔｙ）の実験室枠角度の複数の独立した測定を得ることができる。各独立した測定を使用して、タンパク質座標系内の構造の決定における追加の制約をもたらすことができる。実際には、２つのシステイン部位間の平均角度差は、実験条件にわたって一定のままであるはずであり、平均角度以外の追加のモデルパラメーター、例えば、配向分布の幅（例えば、平均角度を中心としたガウス分布の半値全幅（ＦＷＨＭ））などへの配向分布のフィッティングを可能にする。この手法を使用して、リガンド結合タンパク質の構造を、異なる標識部位についてχ（２）の値の２つまたはそれ超の独立した測定を行い、非結合（アポ）Ｘ線結晶構造座標とともにＳＨＧによって決定されるこれらの角度制約を使用して、リガンド結合複合体のＸ線結晶構造決定を必要とすることなく、原子分解能で最良のリガンド結合構造を決定することによって迅速に決定することができる。このようなリガンドは、低分子、低分子断片、ペプチド、タンパク質、抗体、オリゴヌクレオチド、および一般に、当業者に公知の任意のリガンドでありうる。
【００７４】
複数のコンホメーション  −  平衡状態配向分布：タンパク質が複数のコンホメーション状態の平衡状態で存在する場合、タンパク質は、各標識部位においてマルチモーダル（または多状態）配向分布によって記述されることになる。分布が、異なる重み、平均角度（θ）、および分布幅（Δ）を有するガウス分布の和で構成される場合、タンパク質のコンホメーションランドスケープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ）の完全な記述は、これらのパラメーターのそれぞれの決定に依存することになる。例えば、標識部位１におけるタンパク質の局所的構造が３つのコンホメーションを採用する場合、これらの仮定の下で、局所的な配向分布は、決定される３×３パラメーター、または各コンホメーションの振幅、平均角度、および幅を記述する９つの未知のものによって記述することができる。標識部位２は、２つのみの局所的コンホメーションを採用する場合があり、その場合では、６つのパラメーターによって同様に記述することができる。超分極率の単一の支配的テンソルコンポーネント、表面平面内の等方対称性（方位対称（ａｚｉｍｕｔｈａｌ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ））、および臨界角での励起を伴う実験ジオメトリについて、χ（２）の２つの独立したコンポーネントを各実験条件について決定することができ（例えば、χｚｚｚ（２）およびχｘｚｘ（２）またはχｚｘｘ（２））；これらの値のＮ−１個の独立した比を使用してＮｓおよびαｚ’ｚ’ｚ’を排除することができる。したがって、上述の仮定の下で２つの標識変異体を伴う実験について、最低限で１６の独立した測定（χ（２）のコンポーネントの）が行われるべきであり（χ（２）値の１５個の独立した比を生じる）、それを、配向分布をフィットするのに使用することができる。この手法は、超分極率の単一の支配的テンソルコンポーネントは、標識部位によって規模または位相が変動しないことを仮定する。追加の独立した測定、本発明の一態様を、タグ部位（例えば、ＣおよびＮ末端）、タグ長さ（例えば、６×、８×、１０×、および１２×Ｈｉｓタグ）、緩衝液条件（例えば、異なる塩濃度）など、または一般に、表面上のタンパク質の配向を変更し、よってχ（２）の測定値に影響を与える任意の実験条件を変更することによって得ることができる。次いでこれらの独立した測定のすべてを、例えば、包括的フィッティング法（ｇｌｏｂａｌ  ｆｉｔｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）において使用して、これらの２つの部位におけるタンパク質座標系内の溶液ベースコンホメーションランドスケープ（すなわち、多状態配向分布）を決定することができる。一部の実施形態では、タンパク質のＸ線結晶構造座標を、モデル構築におけるさらなる制約として任意選択で使用してもよい。
【００７５】
絶対的極性配向決定：実験室枠内の標識の傾斜角配向を決定することができるが、この傾斜角は、それぞれ表面に向かう、および表面から離れる方向を示す２つの円錐で縮重している。本発明は、単純な実験を使用して、標識の絶対方向、すなわち、表面平面に対して標識が指す方向を得るための新規方法も開示する。この実験では、所与の偏光状態下のＳＨＧ信号が、ｉ）非標識表面に付着した標識タンパク質；ｉｉ）標識表面に付着した非標識タンパク質、およびｉｉｉ）標識表面に付着した標識タンパク質を使用して測定される。標識表面は、当業者に公知の様々な方式で、例えば、カルボキシル化非線形活性標識のアミノシラン官能化ガラス基板表面への共有結合性カルボジイミドカップリングによって調製することができる。代わりに、支持脂質二重層（ＳＬＢ）を用いて、アミンまたはチオール（例えば、リシンまたはシステイン残基側鎖に対応する）を介してタンパク質に付着する同じ非線形活性標識を、様々なモルパーセンテージのアミンまたはチオール含有脂質をドープされた二重層に共有結合的にカップリングすることができる。次いでこの表面は、独自のＳＨＧ信号をもたらし、それは、標識がタンパク質標識のものと同じであるので、タンパク質から生成されるＳＨＧ信号と同相である。支持二重層に付着した標識は、表面へのその既知の方向性カップリングおよびその化学構造によって既知の極性配向を有する。タンパク質上の標識の絶対極性配向（したがって潜在的に、タンパク質全体の極性配向）を決定する実験は、以下の通り遂行することができる。第１に、タンパク質の非存在下での標識表面のＳＨＧ信号が測定される（ＩＬ）。第２に、非標識表面に付着した標識タンパク質のＳＨＧ信号が測定される（ＩＰ）。第３に、表面のＳＨＧ信号が、標識タンパク質が標識表面に付着しているとき測定される（ＩＴＯＴ）。異なるＳＨＧ信号間の関係は、以下の通りである：
ＩＴＯＴ＝ＩＬ＋ＩＰ＋ｓｑｒｔ（ＩＬχＩＰ）χｃｏｓ（θ）
【００７６】
式中、ｃｏｓ（θ）は、第３の測定（ＩＴＯＴ）におけるタンパク質分子に付着した標識と表面との間の位相関係（絶対極性配向が表面に向かうかまたは表面から離れるかで符号が反転する）を記述する。ＩＴＯＴ、ＩＬ、およびＩＰを別個に測定し、測定信号強度を比較することによって、タンパク質上の各標識の絶対極性配向を決定することができる。一部の場合では、例えば、ＩＬ＋ＩＰがおおよそ同等の規模のものであるとき、ＩＴＯＴがそのままでＩＬより小さい場合、破壊的な干渉がタンパク質標識と表面標識との間で起こっており、したがって、標識は、反対の極性配向に配向していると直ちに決定することができ、ＩＴＯＴがそのままでＩＬより大きい場合、建設的な干渉が起こっており、標識は、同じ極性方向に配向している。ＩＬ＋ＩＰの規模は、例えば、色素について支持二重層上の付着部位の密度、または表面に付着されるタンパク質の密度を調整することによって変更することができる。
【００７７】
一部の実施形態では、支持脂質二重層上の付着部位の密度は、アミン基もしくはチオール基（または標準的なコンジュゲーション化学が利用可能である任意の他の官能基）を含む二重層の脂質コンポーネントのパーセンテージを変更することによって変更することができる。一部の実施形態では、アミンまたはチオール基を含む脂質コンポーネントのパーセンテージは、約０パーセント〜約１００パーセントの範囲でありうる。一部の実施形態では、アミンまたはチオール基を含む脂質コンポーネントのパーセンテージは、少なくとも０パーセント、少なくとも１０パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも４０パーセント、少なくとも５０パーセント、少なくとも６０パーセント、少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセントまたは少なくとも１００パーセントでありうる。一部の実施形態では、アミンまたはチオール基を含む脂質コンポーネントのパーセンテージは、大きくても１００パーセント、大きくても９０パーセント、大きくても８０パーセント、大きくても７０パーセント、大きくても６０パーセント、大きくても５０パーセント、大きくても４０パーセント、大きくても３０パーセント、大きくても２０パーセントまたは大きくても１０パーセントでありうる。当業者は、アミンまたはチオール基を含む脂質コンポーネントのパーセンテージは、この範囲内の任意の値、例えば、約１２パーセントを有しうることを認識するであろう。
【００７８】
一部の実施形態では、表面に付着される非線形活性標識タンパク質の密度は、支持脂質二重層とともにインキュベートされる溶液中の標識タンパク質の濃度を変更することによって変更することができる。例えば、Ｈｉｓタグ付き標識タンパク質の濃度は、Ｎｉ−ＮＴＡ部分をさらに含む脂質コンポーネントを含む支持脂質二重層とともにインキュベートされる溶液中で変更されうる。一部の実施形態では、溶液中の標識タンパク質の濃度は、約１ｎＭ〜約１００μＭの範囲となりうる。好適な実施形態では、溶液中の標識タンパク質の濃度は、約１００ｎＭ〜約５μＭの範囲となりうる。一部の実施形態では、溶液中の標識タンパク質の濃度は、少なくとも１ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも１０μＭまたは少なくとも１００μＭでありうる。一部の実施形態では、溶液中の標識タンパク質の濃度は、大きくても１００μＭ、大きくても１０μＭ、大きくても１μＭ、大きくても１００ｎＭ、大きくても１０ｎＭまたは大きくても１ｎＭでありうる。当業者は、溶液中の標識タンパク質の濃度は、この範囲内の任意の値、例えば、約１２μＭを有しうることを認識するであろう。
【００７９】
一部の実施形態では、表面上の非線形活性標識タンパク質の密度は、約１０２分子／ｃｍ２〜約１０１４分子／ｃｍ２の範囲にわたって当業者に公知の様々な技法のいずれかを使用して変更することができる。一部の実施形態では、表面上の非線形活性標識タンパク質の密度は、少なくとも１０２分子／ｃｍ２、少なくとも１０３分子／ｃｍ２、少なくとも１０４分子／ｃｍ２、少なくとも１０５分子／ｃｍ２、少なくとも１０６分子／ｃｍ２、少なくとも１０７分子／ｃｍ２、少なくとも１０８分子／ｃｍ２、少なくとも１０９分子／ｃｍ２、少なくとも１０１０分子／ｃｍ２、少なくとも１０１１分子／ｃｍ２、少なくとも１０１２分子／ｃｍ２、少なくとも１０１３分子／ｃｍ２または少なくとも１０１４分子／ｃｍ２でありうる。一部の実施形態では、表面上の非線形活性標識タンパク質の密度は、多くても１０１４分子／ｃｍ２、多くても１０１３分子／ｃｍ２、多くても１０１２分子／ｃｍ２、多くても１０１１分子／ｃｍ２、多くても１０１０分子／ｃｍ２、多くても１０９分子／ｃｍ２、多くても１０８分子／ｃｍ２、多くても１０７分子／ｃｍ２、多くても１０６分子／ｃｍ２、多くても１０５分子／ｃｍ２、多くても１０４分子／ｃｍ２、多くても１０３分子／ｃｍ２または多くても１０２分子／ｃｍ２でありうる。当業者は、表面上の非線形活性標識タンパク質の密度は、この範囲内の任意の値、例えば、約４．０×１０１２分子／ｃｍ２を有しうることを認識するであろう。
【００８０】
バックグラウンド信号減算：バックグラウンドＳＨＧ信号が、例えば、基板−緩衝液界面に起因して存在する場合、これは、様々な方式で「減算する」ことができる。例えば、タンパク質上の標識からのＳＨＧ信号とバックグラウンドに起因するＳＨＧ信号との間の位相差は、Ｒｅｉｄｅｒ，  Ｇ．ら（１９９９年）、「Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  Ａｒｔｉｆａｃｔｓ  ｉｎ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｂ−Ｌａｓｅｒｓ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓ、６８巻、３４３〜３４７頁に記載されているものなどの干渉法実験で測定することができる。次いでタンパク質単独に起因するＳＨＧ信号を決定することができる。
【００８１】
電場配向、強度、および特性：電場を印加して、界面において実験室枠内の生体分子の配向を操作することができる。電場方向は、表面を横切る、表面に垂直、または一般に、表面平面に対して任意の角度におけるものでありうる。一実施形態では、１つの電極は、脂質二重層膜、または基板、例えば、ガラス基材にタンパク質を付着させるための他の表面化学の下に配置される。対電極（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）は、基板の表面平面の上、例えば、試料ウェルの液体の上部に配置される。別の実施形態では、２つまたはそれ超の電極が、基板の表面平面内に配置され、電場方向は、基板−膜界面に平行である。
【００８２】
別の実施形態では、電極のアレイを、図９に例示したように、繋ぎ止められ、または固定化されたタンパク質試料の周囲に配置することができる。例えば、電極の環状アレイを、それぞれ互いに約１０度離して間隔をあけて、ガラス基板表面上の膜界面に平行に配置することができる。互いに１８０度離れている電極の対に印加される電圧は、電場の方位角方向を随意に、かつ迅速な様式で変更することを可能にする。例えば、電場の方位角方向を、１秒または数分の１秒で円全体の周囲で掃引することができる。
【００８３】
電極は、当業者に公知の様々な技法のいずれかを使用して基板表面上にパターン形成することができる。例としては、これらに限定されないが、スクリーン印刷、フォトリソグラフィーパターン形成、スパッタコーティング、化学蒸着法、またはこれらの任意の組合せがある。
【００８４】
電極は、当業者に周知であるように、様々な材料のいずれかから製作されうる。適当な電極材料の例としては、これらに限定されないが、銀、金、白金、銅、アルミニウム、グラファイト、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）、半導体材料、伝導性ポリマー、またはこれらの任意の組合せがある。
【００８５】
一部の実施形態では、１つまたは複数の電極の表面を不動態化して、例えば、水性緩衝液と接触している電極表面の腐食を最小限にし、かつ／またはタンパク質もしくは他の生物学的なコンポーネントの汚染もしくはそれとの干渉を防止し、かつ／または試料中の電流フローを防止することが望ましい場合がある。当業者に公知の様々な不動態化技法のいずれも、使用することができ、一般に、電極を製作するのに使用される材料の選択に依存することになる。例えば、ガラス基板上のインジウムスズ酸化物電極を、３０ｎｍのＳｉＯ２層の成長または堆積によって不動態化することができる。金属または半導体電極は、多くの場合、空気に曝露されると不活性な「天然酸化物」層を発達させ、それは、不動態化層として機能を果たしうる。この不活性表面層は通常、白金について単層（１〜３Å）、ケイ素について約１５Åの厚さを伴った酸化物または窒化物であり、空気に長く曝露された後、アルミニウムについて５０Åの厚さに近くなりうる。
【００８６】
電場は、ＤＣまたはＡＣ、すなわち、時不変または時変のものでありうる。後者の場合では、これは、任意の周波数の正弦波を採り得、またはこれは、多くの周波数コンポーネントから構成される複合波（例えば、階段関数、鋸歯状パターンなど）であり得、電場は、正もしくは負の値間で振動することができ、またはすべて正もしくはすべて負に留まることができる。非周期的またはパルス電場も、一部の実施形態では、印加することができる。ＳＨＧ信号は、試料に電場を印加する前、間、または後に読み取ることができる。
【００８７】
一部の実施形態では、電場強度は、約ゼロ〜約１０６Ｖ／ｃｍ、またはそれ超の範囲でありうる。一部の実施形態では、電場強度は、少なくともゼロ、少なくとも１０Ｖ／ｃｍ、少なくとも１０２Ｖ／ｃｍ、少なくとも１０３Ｖ／ｃｍ、少なくとも１０４Ｖ／ｃｍ、少なくとも１０５Ｖ／ｃｍ、または少なくとも１０６Ｖ／ｃｍでありうる。一部の実施形態では、電場強度は、多くても１０６Ｖ／ｃｍ、多くても１０５Ｖ／ｃｍ、多くても１０４Ｖ／ｃｍ、多くても１０３Ｖ／ｃｍ、多くても１０２Ｖ／ｃｍ、多くても１０Ｖ／ｃｍでありうる。当業者は、電場強度が、この範囲内の任意の値、例えば、約５００Ｖ／ｃｍを有しうることを認識するであろう。
【００８８】
一部の実施形態では、電場が変化する周波数は、約０Ｈｚ〜約１０５Ｈｚの範囲でありうる。一部の実施形態では、電場が変化する周波数は、少なくとも０Ｈｚ、少なくとも１０Ｈｚ、少なくとも１０２Ｈｚ、少なくとも１０３Ｈｚ、少なくとも１０４Ｈｚ、または少なくとも１０５Ｈｚでありうる。一部の実施形態では、電場が変化する周波数は、多くても１０５Ｈｚ、多くても１０４Ｈｚ、多くても１０３Ｈｚ、多くても１０２Ｈｚ、または多くても１０Ｈｚでありうる。当業者は、電場が変化する周波数が、この範囲内の任意の値、例えば、約１２５Ｈｚを有しうることを認識するであろう。
【００８９】
電場は、タンパク質分子の配向、よってベースライン信号またはＳＨＧ偏光依存性を操作するのに使用することができる。一部の実施形態では、基板の表面平面（すなわち、ＸＹ面）内の配向等方性が印加電場の非存在下で起こり、電場が印加されるとき保存される場合、非線形感受性（χ（２））の２つまたは３つのみの独立したゼロになることのないコンポーネントが存在することになる。配向異方性が電場を印加する前、間、または後に表面平面内で存在する他の実施形態では、χ（２）の２つまたは３つを超える独立したゼロになることのないコンポーネントが存在することになり、偏光基本および第２高調波光の異なる組合せを用いた追加の独立したＳＨＧ測定を可能にする。配向異方性が表面平面（例えば、標識タンパク質が付着される脂質生体膜）で存在する一部の実施形態では、χ（２）の複数の独立した測定を異なる方位角で行うことができる。例えば、電場が表面に平行に印加され、これが、面内等方性から面内異方性へのタンパク質分子の配向分布の変化を引き起こす場合、追加の独立した光学的測定を、印加電場の方向に対して多くの方位角方向で行って、分子配向分布を決定することができる。
【００９０】
電極が一体化された光学マルチウェルプレート：以下でより詳細に論じられるように、一部の実施形態では、本明細書に記載のＳＨＧ測定は、マイクロウェルプレートフォーマットを使用して優先的に実施される。一部の実施形態では、３８４ウェルプレート（または他のマイクロウェルプレートもしくはマルチチャンバーフォーマット）を使用して、電極を、ウェルを密閉するのに使用される蓋の一部として、ウェルの壁の内部の、およびこれらに隣接する基板表面上で、ウェル内の基板表面（これはガラスでありうる）上の他の場所で、または試料に電場を生じさせるための電圧の印加およびＳＨＧ信号の光学読取りの両方を可能にする任意の場所でパターン形成することができる。
【００９１】
半球状プリズムを有する光学マルチウェルプレート：一部の実施形態では、特に、分子の異方性配向分布が表面で存在する場合では、異方性軸に対して異なる方位角方向で試料を光学的にプローブすることが有用となる。光軸に対して試料を回転する代替として、光軸を固定された試料に対して回転することができる。これを達成するために、各ウェルの底部または各ウェル付近に配置された半球状プリズムを使用して、ウェルに対して任意の角度でプリズムに入射する入射光を、分子を含有する界面領域に向けることができる。一部の実施形態では、半球状プリズムは、図８に例示したように、ガラス底マルチウェルプレート内の基板に結合され、またはそれと一体化される。半球状プリズムは、マルチウェルプレートと光学的接触を作り、それによって最小限の損失で光学ビームの透過を可能にする。一部の実施形態では、光学マルチウェルプレートは、３８４ウェルガラス底プレートまたは他のガラス底マイクロウェルプレートフォーマット（すなわち、当業者に周知である標準的なマイクロウェルプレートフォーマット）を含むことになる。
【００９２】
一部の実施形態では、ウェルの底部を形成するガラス基板に結合され、またはそれと一体化した半球状プリズムのアレイを備えるマイクロウェルプレートデバイスは、各ウェル内のガラス基板の上面に電極のパターン形成されたアレイをさらに備えることができ、その結果、偏光ＳＨＧ測定を、異なる電場強度の電場を印加しながら行うことができる。
【００９３】
コンホメーション変化の測定：一実施形態では、リガンド誘導コンホメーション変化が、タンパク質内の１つまたは複数の標識部位で測定される。一実施形態では、単一部位システイン残基が使用される。偏光基本および非線形光の組合せが使用されて、リガンドを付加する前および後のχ（２）のコンポーネントが決定される。例えば、生体分子が表面上で等方的に配向しており、分子超分極率が単一のテンソルエレメント（例えば、αｚ’ｚ’ｚ’、または同等に一部の文献ではβｚ’ｚ’ｚ’）によって支配されている場合、χ（２）の４回の独立した測定：生体分子をリガンドと接触させる前に２回および後に２回：（例えば、χｚｚｚおよびχｘｚｘまたはχｚｘｘ）を行うことができる。コンホメーション変化の前および後の配向分布を、３つの調整可能なパラメーター（θ１、θ２、およびσ）であって、θ１は、コンホメーション変化前の平均実験室枠配向であり、θ２は、コンホメーション変化後の平均実験室枠配向であり、σは、θ１およびθ２の両方の周囲のガウス分布（Ｇａｕｓｓｉａｎ）の配向幅である、すなわち、モデル仮定の一非限定例では、配向角度分布の幅は、コンホメーション変化後に同じままである、パラメーターを含有するとしてモデル化する場合、χ（２）の４つのコンポーネント（χ１ｚｚｚ、χ１ｚｘｘ、χ２ｚｚｚ、χ２ｚｘｘ）の３つの独立した比：例えば、χ１ｚｚｚ／χ１ｚｘｘ、χ２ｚｚｚ／χ２ｚｘｘ、χ１ｚｚｚ／χ２ｚｚｚ（式中、上付き文字１および２は、それぞれ、リガンド誘導変化の前および後のコンホメーションを示す）を決定することによって、これらの３つのパラメーターを決定することができる。このような測定および式１から決定される平均角度（θ１およびθ２）を使用して、コンホメーション変化に起因するタンパク質座標系内の標識部位における標識配向の角度変化を決定することができる。このプロセスは、異なる単一部位システイン変異体を使用して、任意の数の標識部位について繰り返すことができ、局所的または包括的なリガンド結合構造のモデルを決定することができる。一部の実施形態では、モデルは、Ｘ線結晶構造座標または他の構造的制約（例えば、ＮＭＲデータ、小角Ｘ線散乱データ、もしくは当業者に公知の任意の他の測定からの）を任意選択で組み込む。
【００９４】
ハイスループットシステムおよび方法
第２高調波発生または関連非線形光検出技法の使用に基づいて、生物学的実体中のコンホメーションの構造のハイスループット分析を実装するためのシステムおよび方法が、本明細書に開示されている。本明細書で使用する場合、「ハイスループット」は、ＮＭＲまたはＸ線結晶構造解析法などの伝統的技法を使用して実施される構造測定と比較して使用される相対的な用語である。以下でより詳細に記載されるように、本明細書に開示のＳＨＧベース方法およびシステムは、これらの慣例的な技法より少なくとも１桁速い速度で構造決定を実施することができる。
【００９５】
一態様では、本開示は、１種または複数の生物学的実体中のコンホメーションまたはコンホメーション変化をハイスループット検出するための方法であって、（ｉ）１種または複数の標的生物学的実体、例えば、タンパク質分子を、非線形活性標識またはタグで標識するステップと、（ｉｉ）光学的界面をさらに含む平面基板表面の１つまたは複数の別個の領域で１種または複数の標識された標的生物学的実体を繋ぎ止め、または固定化するステップと、（ｉｉｉ）外部光源に対して基板の位置を変更することによって各別個の領域を励起光に逐次曝露するステップと、（ｉｖ）各別個の領域から、それが励起光に曝露される際に放出される非線形光信号を収集するステップと、（ｖ）前記非線形光信号を処理して、１種または複数の生物学的実体のそれぞれの配向、コンホメーション、またはコンホメーション変化を決定するステップとを含む方法を提供する。別の態様では、方法は、（ｖｉ）励起光への第１の曝露の後に、１種または複数の生物学的実体のそれぞれを１種または複数の試験実体と接触させるステップと、（ｖｉｉ）各別個の領域を励起光に１回または複数回引き続いて再曝露するステップと、（ｖｉｉｉ）各別個の領域から、それが励起光に曝露される際に非線形光信号を収集するステップと、（ｉｘ）前記非線形光信号を処理して、配向またはコンホメーションの変化が、前記１種または複数の試験実体と接触させた結果として１種または複数の生物学的実体中で起こったか否かを決定するステップとをさらに含む。本方法の一態様では、非線形光信号は、１種または複数の生物学的実体を１種または複数の試験実体と接触させた後に１回だけ検出され（すなわち、エンドポイントアッセイモード）、次いで使用されてコンホメーション変化が起こったか否かが決定される。別の態様では、非線形光信号は、１種または複数の生物学的実体を１種または複数の試験実体と接触させた後に、繰り返して、かつ規定された時間間隔で収集され（すなわち、動態モード）、次いで使用されて１種または複数の生物学的実体中のコンホメーション変化の動態が決定される。本方法の好適な態様では、基板の各別個の領域は、支持脂質二重層構造を含み、生物学的実体は、脂質二重層に繋ぎ止め、またはその中に包埋することによって各別個の領域内に固定化される。本方法の別の好適な態様では、励起光は、全反射によって基板表面、すなわち、光学的界面に送達され、基板表面の別個の領域から放出される非線形光信号は、反射励起光と同じ光軸に沿って収集される。
【００９６】
非線形光検出を使用してタンパク質構造またはコンホメーション変化のハイスループット分析を実装するために、本明細書に記載のシステムは、（ｉ）少なくとも１つの励起光線を光学的界面に送達するための少なくとも１つの適当な励起光源および光学系、（ｉｉ）光学的界面を含む互換性の基板であって、１種または複数の生物学的実体が基板の別個の領域に繋ぎ止められ、または固定化された、基板、（ｉｉｉ）少なくとも１つの励起光源に対して基板を位置決めするための高精度並進ステージ、ならびに（ｉｖ）基板の別個の領域のそれぞれを励起光で照射する結果として生成される非線形光信号を収集し、前記非線形信号を検出器に送達するための光学系、ならびに（ｖ）検出器から受け取った非線形光信号データを分析し、基板に固定化された１種または複数の生物学的実体のコンホメーションまたはコンホメーション変化を決定するためのプロセッサーを含めた、いくつかのコンポーネント（図４に概略的に例示した）を必要とする。一部の態様では、本明細書に開示のシステムおよび方法は、（ｖｉ）基板の別個の領域のそれぞれに試験実体を送達するためのプログラム可能な流体分注システムの使用、および（ｖｉｉ）光学系とのインターフェースで基板を自動位置決めし、取り替えるためのプレート−ハンドリングロボティクスの使用をさらに含む。
【００９７】
本明細書に開示の方法およびシステムは、複数の試験実体と接触した単一生物学的実体の分析、もしくは単一試験実体と接触した複数の生物学的実体の分析、またはこれらの任意の組合せのために構成することができる。１種または複数の生物学的実体を複数の試験実体と接触させるとき、接触させるステップは、逐次、すなわち、固定化された生物学的実体の単一試験実体への指定時間にわたる曝露、その後の試験実体溶液を除去し、次の試験実体を導入する前に固定化された生物学的実体を再生するための任意選択のすすぎステップによって実施してもよく、または接触させるステップは、並行して、すなわち、同じ固定化された生物学的実体を含む複数の別個の領域を有し、複数の別個の領域のそれぞれにおける生物学的実体を異なる試験実体に曝露することによって実施してもよい。本明細書に開示の方法およびシステムは、少なくとも１の生物学的実体、少なくとも２の生物学的実体、少なくとも４の生物学的実体、少なくとも６の生物学的実体、少なくとも８の生物学的実体、少なくとも１０の生物学的実体、少なくとも１５の生物学的実体または少なくとも２０の生物学的実体におけるコンホメーション変化の分析を実施するように構成されうる。一部の態様では、本明細書に開示の方法およびシステムは、多くても２０の生物学的実体、多くても１５の生物学的実体、多くても１０の生物学的実体、多くても８の生物学的実体、多くても６の生物学的実体、多くても４の生物学的実体、多くても２の生物学的実体または多くても１の生物学的実体におけるコンホメーション変化の分析を実施するように構成されうる。同様に、本明細書に開示の方法およびシステムは、１つまたは複数の生物学的実体の、少なくとも１の試験エンティテ、少なくとも５の試験実体、少なくとも１０の試験実体、少なくとも５０の試験実体、少なくとも１００の試験実体、少なくとも５００の試験実体、少なくとも１，０００の試験実体、少なくとも５，０００の試験実体、少なくとも１０，０００の試験実体または少なくとも１００，０００の試験実体に対する曝露時のコンホメーション変化の分析を実施するように構成されうる。一部の態様では、本明細書に開示の方法およびシステムは、１つまたは複数の生物学的試験実体の、多くても１００，０００の試験実体、多くても１０，０００の試験実体、多くても５，０００の試験実体、多くても１，０００の試験実体、多くても５００の試験実体、多くても１００の試験実体、多くても５０の試験実体、多くても１０の試験実体、多くても５の試験実体または多くても１の試験実体に対する曝露時のコンホメーション変化の分析を実施するように構成されうる。
【００９８】
生物学的実体および試験実体
本明細書で使用する場合、語句「生物学的実体」は、これらに限定されないが、細胞、タンパク質、ペプチド、受容体、酵素、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、生物学的分子、オリゴヌクレオチド、溶媒、低分子、合成分子、炭水化物、またはこれらの任意の組合せを含む。同様に、語句「試験実体」も、これらに限定されないが、細胞、タンパク質、ペプチド、受容体、酵素、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、生物学的分子、オリゴヌクレオチド、溶媒、低分子、合成分子、炭水化物、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の態様では、生物学的実体は、薬物標的またはそのポーションを含み得、一方、試験実体は、薬物候補またはそのポーションを含みうる。
【００９９】
非線形活性標識および標識技法
上述したように、ほとんどの生物学的分子は、本質的に非線形活性でない。例外としては、コラーゲン、ほとんどの構造または耐荷重組織において見つかる構造タンパク質がある。ＳＨＧ顕微鏡観察は、コラーゲン含有構造、例えば、角膜の研究において広範に使用されている。他の生物学的分子または実体は、タグまたは標識などの非線形活性部分を導入することによって非線形活性にされなければならない。本発明で使用するための標識は、得られるシステムをより非線形光学活性にするために、分子、粒子、または相（例えば、脂質二重層）に共有結合的または非共有結合的に結合されうる非線形活性部分、タグ、分子、または粒子を指す。標識は、分子、粒子、または相（例えば、脂質二重層）が非線形活性でない場合においてシステムを非線形活性にするのに、または既に非線形活性であるシステムを用いて、追加の特徴付けパラメーターをシステムに加えるのに使用することができる。外因性標識を、分子、粒子、または他の生物学的実体に予め付着させ、任意の非結合または未反応標識を、本明細書に記載の方法で使用する前に標識実体から分離することができる。本明細書に開示の方法の具体的な態様では、非線形活性部分は、基板表面の別個の領域内で標的分子または生物学的実体を固定化する前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで標的分子または生物学的実体に付着される。生物学的分子または他の生物学的実体を非線形活性標識で標識すると、表面選択的非線形光学技法を使用して、標識生物学的分子または実体と別の分子または実体（すなわち、試験実体）との間の相互作用を、相互作用が生物学的分子または実体の配向またはコンホメーションを変化させる場合において検出する直接光学手段が可能になる。
【０１００】
本明細書に記載の方法およびシステムの代替の態様では、少なくとも２つの区別可能な非線形活性標識が使用される。次いで、付着された２つまたはそれ超の区別可能な標識の配向が、発しているコヒーレントな非線形光線のはっきりした方向を助長するように選択される。２つまたはそれ超の区別可能な標識は、光学的界面に対して１つまたは複数の偏光方向で入射する１つまたは複数の周波数の複数の基本光線が使用され、少なくとも２つの非線形光線の発出が得られるアッセイにおいて使用することができる。一部の実施形態では、使用される区別可能な非線形活性標識の数は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０でありうる。
【０１０１】
非線形活性タグまたは標識の例としては、これらに限定されないが、表１に列挙した化合物、およびこれらの誘導体がある。
【表１】
2018516358.tif 000004
【０１０２】
種が非線形活性でありうるか否かの評価において、以下の特性が非線形活性の潜在性を示しうる：大きい差異の双極子モーメント（分子の基底状態と励起状態との間の双極子モーメントの差異）、蛍光における大きいストークスシフト、または芳香族もしくは共役結合特徴。このような種のさらなる評価において、実験者は、当業者に公知の単純な技法を使用して、例えば、非線形活性種が分布している空気−水界面からのＳＨＧの検出によって非線形活性を確認することができる。適当な非線形活性種が手元に、実験のために選択されると、種を、本明細書に開示の表面選択的非線形光学方法およびシステムにおいて使用するために、生物学的分子または実体に必要に応じてコンジュゲートすることができる。
【０１０３】
以下の参考文献およびその中の参考文献は、合成色素および多くの他の分子から標識生物学的実体を創製するのに利用可能な技法を記述する：Ｇｒｅｇ  Ｔ．  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９６年。
【０１０４】
開示した方法およびシステムの具体的な態様では、金属ナノ粒子およびそれらのアセンブリーが修飾されて、生物学的非線形活性標識が創製される。以下の参考文献は、金属ナノ粒子およびアセンブリーの修飾を記述する：Ｊ．Ｐ．  ＮｏｖａｋおよびＤ．  Ｌ．  Ｆｅｌｄｈｅｉｍ、「Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌｅｎｅ−Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｓｉｌｖｅｒ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｒｒａｙｓ」、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１２２巻：３９７９〜３９８０頁（２０００年）；Ｊ．Ｐ．  Ｎｏｖａｋら、「Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ  Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｒｒａｙｓ」、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１２２巻：１２０２９〜１２０３０頁（２０００年）；Ｖａｎｃｅ，  Ｆ．Ｗ．、Ｌｅｍｏｎ，  Ｂ．  Ｉ．、およびＨｕｐｐ，  Ｊ．  Ｔ．、「Ｅｎｏｒｍｏｕｓ  Ｈｙｐｅｒ−Ｒａｙｌｅｉｇｈ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｆｒｏｍ  Ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ」、Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂ、１０２巻：１００９１〜９３頁（１９９９年）。
【０１０５】
本明細書に開示の方法およびシステムのさらに別の態様では、システムの非線形活性は、非線形類似体の分子ビーコンへの導入、すなわち、フルオロフォアおよびクエンチャーの代わりに非線形活性標識（またはそのモジュレーター）を組み込むように修飾された分子ビーコンプローブによっても操作することができる。分子ビーコンのこれらの非線形光学類似体は、分子ビーコン類似体（ＭＢ類似体またはＭＢＡ）と本明細書で呼ばれる。記載した方法およびシステムにおいて使用されるＭＢ類似体は、当業者に公知の手順によって合成することができる。
【０１０６】
検出される生物相互作用のタイプ
タンパク質および他の生物学的分子の配向または構造の決定に加えて、本明細書に開示の方法およびシステムは、使用される生物学的実体、試験実体、および非線形活性標識技法の選択に応じて、生物学的実体同士間、または生物学的実体と試験実体との間の様々な相互作用の検出を提供する。一態様では、本開示は、結合事象、例えば、受容体中で誘導される得られるコンホメーション変化によって示される、リガンドの受容体への結合の定性的検出を提供する。別の態様では、本開示は、結合事象、例えば、異なる濃度のリガンド分子を使用して反復測定を実施し、観察される最大コンホメーション変化のパーセント変化を使用して用量−応答曲線を生成することによって、リガンドの受容体への結合の定量分析を提供する。同様に、本開示の他の態様は、酵素−阻害剤相互作用、抗体−抗原相互作用、生物学的巨大分子の複合体の形成、または受容体のアロステリックモジュレーターとの相互作用を定性的または定量的に測定するための方法を提供することができる。
【０１０７】
他の具体的な実施形態では、ＭＢ類似体を、溶液相ハイブリダイゼーションアッセイと同じように過剰のプローブからプローブ−標的ハイブリッドを分離しなければならないということなく、かつ標的オリゴヌクレオチドを標識する必要なく、相補的核酸標的の存在を検出することができるハイブリダイゼーションプローブとして、本明細書に開示の方法に従って使用することができる。ＭＢ類似体プローブは、生細胞内のＲＮＡを検出するため、バイオリアクターから引き出した試料アリコートにおける特定の核酸の合成を監視するため、およびセルフレポーティングオリゴヌクレオチド（ｓｅｌｆ−ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）アレイを構築するためにも使用することができる。これらは、ＤＮＡ中の単一ヌクレオチドバリエーションの同定、および界面検出のために表面に固定化された病原体または細胞の検出のためにホモジニアス１ウェルアッセイを実施するのに使用することができる。
【０１０８】
生物学的実体同士間、または生物学的実体と試験実体との間の相互作用（例えば、結合反応、コンホメーション変化など）は、現在開示されている方法によって、以下の測定可能な非線形信号パラメーターに相関させることができる：（ｉ）非線形光の強度、（ｉｉ）非線形光の波長またはスペクトル、（ｉｉｉ）非線形光の偏光、（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）の時間経過、ならびに／またはｖｉ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）の１つもしくは複数の組合せ。
【０１０９】
レーザー光源および励起光学系
図５は、第２高調波光が、試料界面（または光学的界面）を含む基板の表面から入射基本励起光を反射させることによって生成される、本明細書に開示の方法およびシステムの一態様を例示する。一部の実施形態では、基板は、適切な角度でレーザー光を送達して基板表面において全反射を誘導するのに使用されるプリズムに光学的にカップリングされている（図６）。一部の実施形態では、光学的カップリングは、屈折率整合液の薄膜を使用することによってもたらされる。レーザーは、試料界面で第２高調波光を生成するのに必要な基本光を提供する。典型的にはこれは、波長調整可能な、または調整可能でない、市販のピコ秒またはフェムト秒レーザー（例えば、Ｔｉ：サファイアフェムト秒レーザーまたはファイバーレーザーシステム）となる。基本周波数（ｗ）の光がレーザーから出て行き、その偏光が、例えば、光の周波数および強度に適切な半波長板（例えば、Ｍｅｌｌｅｓ  Ｇｒｉｏｔ、Ｏｒｉｅｌ、またはＮｅｗｐｏｒｔ  Ｃｏｒｐ．から入手可能な）を使用して選択される。次いでビームは、基本光を通過させるが、非線形光（例えば、第２高調波光）を遮断するように設計された高調波分離器（ｈａｒｍｏｎｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｏｒ）を通過する。このフィルターは、第２高調波ビームのレーザーキャビティー内への後方反射を防止するのに使用され、この後方反射は、レージング特性における障害を引き起こしうる。次いで、鏡およびレンズの組合せが、最終の鏡からの反射の前にビームを操縦するおよび形作るのに使用され、最終の鏡は、プリズムを介してビームを、基板表面上の特定の場所において、かつ特定の角度θで衝突するように誘導し、その結果、ビームは、基板表面で全反射を起こす。光路中の鏡の１つを、検流計制御鏡スキャナー、回転多面鏡スキャナー、ブラッグ回折器、音響光学偏向器、または鏡の位置の制御を可能にする当技術分野で公知の他の手段を使用して、必要に応じて走査することができる。光学的界面および非線形活性試料表面を含む基板を、ｘ−ｙ並進ステージ（コンピューター制御）に取り付けて、第２高調波ビームを生成するための基板表面上の特定の場所を選択することができる。現在記載されている方法およびシステムの一部の態様では、全反射のために入射の角度をわずかに変更し、それによって照射中の励起光スポットの位置を実質的に変更することなく、基板表面の別個の領域から放出される非線形光信号を最大にするために、１つの鏡を走査または回転することが望ましい。一部の態様では、異なる基本周波数を有する２つ（またはそれ超の）レーザーを、非線形活性試料が固定化されている光学的界面で和周波または差周波光を生成するのに使用することができる。
【０１１０】
基板フォーマット、光学的界面、および全反射
上述した通り、本開示のシステムおよび方法は、基板の上面に１種または複数の生物学的実体を繋ぎ止め、または固定化するための平面基板を利用し、上の基板表面は、非線形光信号を励起するのに使用される光学的界面（または試料界面）をさらに含む。基板は、基本および第２高調波光線に対して透明であり、励起光が適切な角度で入射するとき、基板／試料界面で全反射を支持するガラス、シリカ、石英ガラス、プラスチック、または任意の他の固形材料でありうる。本発明の一部の態様では、生物学的実体が含有されている別個の領域は、一次元または二次元アレイとして構成されており、疎水性コーティングまたは薄い金属層によって互いに分離されている。他の態様では、別個の領域は、基板表面内にへこみを含みうる。さらに他の態様では、別個の領域は、基板がマイクロウェルプレート（またはマイクロプレート）の底部を形成し、各個々の別個の領域がマイクロウェルプレート内の１つのウェルの底部を形成するように、ウェル形成コンポーネントによって互いに分離することができる。本開示の一態様では、ウェル形成コンポーネントは、基板の上面を９６の別個のウェルに分離する。別の態様では、ウェル形成コンポーネントは、基板の上面を３８４のウェルに分離する。さらに別の態様では、ウェル形成コンポーネントは、基板の上面を１，５３６のウェルに分離する。これらの態様のすべてにおいて、基板は、平面アレイ、へこみのあるアレイ、またはマイクロウェルプレートフォーマットのいずれで構成されていても、ハイスループットシステムの他の光学および機械コンポーネントとインターフェースする使い捨てのまたは消費できるデバイスまたはカートリッジを含みうる。
【０１１１】
本明細書に開示の方法およびシステムは、基板表面が分割される別個の領域またはウェルの数を、分離が別個の領域またはウェル間でどのように維持されるかに関係なく、指定することをさらに含む。基板上により大きい数の別個の領域またはウェルを有することは、方法またはシステムの試料分析スループットを増大させる観点から有利でありうる。本開示の一態様では、基板１枚当たりの別個の領域またはウェルの数は、１０から１，６００の間である。別の態様では、別個の領域またはウェルの数は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１，０００、少なくとも１，２５０、少なくとも１，５００または少なくとも１，６００である。開示の方法およびシステムのなお別の態様では、別個の領域またはウェルの数は、多くても１，６００、多くても１，５００、多くても１，０００、多くても７５０、多くても５００、多くても４００、多くても３００、多くても２００、多くても１００、多くても５０、多くても２０または多くても１０である。好適な態様では、別個の領域またはウェルの数は、９６である。別の好適な態様では、別個の領域またはウェルの数は、３８４である。さらに別の好適な態様では、別個の領域またはウェルの数は、１，５３６である。当業者は、別個の領域またはウェルの数は、これらの値のいずれかによって境界とされる任意の範囲内（例えば、約１２〜約１，４００）に入りうることを認識するであろう。
【０１１２】
本明細書に開示の方法およびシステムは、基板表面が分割される別個の領域またはウェルの表面積を、分離が別個の領域またはウェル間でどのように維持されるかに関係なく、指定することも含む。より大きい面積の別個の領域またはウェルを有すると、一部の場合では、付随する生物学的実体のアクセスの容易さおよび操作を促進することができ、一方、より小さい面積の別個の領域またはウェルを有することは、アッセイ試薬体積要件を低減し、方法またはシステムの試料分析スループットを増大させる観点から有利でありうる。本開示の一態様では、別個の領域またはウェルの表面積は、１ｍｍ２から１００ｍｍ２の間である。別の態様では、別個の領域またはウェルの表面積は、少なくとも１ｍｍ２、少なくとも２．５ｍｍ２、少なくとも５ｍｍ２、少なくとも１０ｍｍ２、少なくとも２０ｍｍ２、少なくとも３０ｍｍ２、少なくとも４０ｍｍ２、少なくとも５０ｍｍ２、少なくとも７５ｍｍ２または少なくとも１００ｍｍ２である。開示の方法およびシステムのなお別の一態様では、別個の領域またはウェルの表面積は、大きくても１００ｍｍ２、大きくても７５ｍｍ２、大きくても５０ｍｍ２、大きくても４０ｍｍ２、大きくても３０ｍｍ２、大きくても２０ｍｍ２、大きくても１０ｍｍ２、大きくても５ｍｍ２、大きくても２．５ｍｍ２または大きくても１ｍｍ２である。好ましい態様では、別個の領域またはウェルの表面積は、約３５ｍｍ２である。別の好ましい態様では、別個の領域またはウェルの表面積は、約８．６ｍｍ２である。当業者は、別個の領域またはウェルの表面積は、別個の領域またはウェルの数は、これらの値のいずれかによって境界とされる任意の範囲内（例えば、約２ｍｍ２〜約９５ｍｍ２）に入りうることを認識するであろう。
【０１１３】
基板表面の別個の領域は、励起光源に対して基板を再位置決めすることによって逐次励起光に曝露される（励起光で照射される）。入射励起光の全反射は、試料界面で「エバネッセント波」を創製し、それは、非線形活性標識を励起し、第２高調波光（または一部の態様では、和周波もしくは差周波光）を生成する。エバネッセント波の強度、したがって生成される非線形光信号の強度は、励起光線の入射角に依存するので、励起ビームの光軸に対する基板面の正確な配向およびビームの基板への効率的な光学的カップリングは、別個の領域のアレイにわたって最適なＳＨＧ信号を達成するのに極めて重要である。本開示の一部の態様では、全反射は、基板表面からの励起光の単一反射によって達成される。他の態様では、基板は、励起光が、導波路に沿って伝搬する際に複数の全反射を起こすような導波路として構成することができる。さらに他の態様では、基板は、エバネッセント場がナノ加工構造によって創製されるゼロモード導波路として構成することができる。
【０１１４】
図５および６に例示したものなどの光学セットアップ中の励起光線と基板との間の効率的な光学的カップリングは、典型的には、屈折率整合液、例えば、鉱油、鉱油および水素化テルフェニルの混合物、ペルフルオロカーボン流体、グリセリン、グリセロール、または１．５付近の屈折率を有する同様の流体などの使用によって達成され、屈折率整合液は、プリズムと基板の下面との間に吸い上げられる。屈折率整合液の静的な無気泡膜は、基板の高速再位置決め中に破壊される可能性があるので、本明細書に開示のシステムおよび方法は、ハイスループットシステムにおいて励起ビームの基板への効率的な光学的カップリングを創製するための代替手法を含む。
【０１１５】
図７は、屈折率整合エラストマー材料の薄層が屈折率整合液の代わりに使用されて、プリズムと基板との間の効率的な光学的カップリングを維持する、本開示のハイスループットシステムの別の態様を例示する。この場合、基板は、やはりマイクロウェルプレートフォーマット（例えば、ガラス底マイクロプレートフォーマット）でパッケージされるが、屈折率整合エラストマー材料の薄層は、基板の下面に付着または隣接しており、その結果、プリズムの上面と接触して配置されるとき、エラストマーは、プリズムと基板との間のギャップを満たし、効率的な光学的カップリングをもたらす。使用されうるエラストマー材料の例は、これに限定されないが、約１．４の屈折率を有するシリコーンがある。本開示の一態様では、エラストマー材料の屈折率は、約１．３５〜約１．６の間である。別の態様では、屈折率は、約１．６もしくはそれ未満、約１．５５もしくはそれ未満、約１．５もしくはそれ未満、約１．４５もしくはそれ未満、約１．４もしくはそれ未満または約１．３５もしくはそれ未満である。なお別の態様では、屈折率は、少なくとも約１．３５、少なくとも約１．４、少なくとも約１．４５、少なくとも約１．５、少なくとも約１．５５または少なくとも約１．６である。当業者は、エラストマー材料の屈折率は、これらの値のいずれかによって境界とされる任意の範囲内（例えば、約１．４〜約１．６）に入りうることを認識するであろう。本手法の一態様では、エラストマー材料の層の厚さは、約０．１ｍｍから２ｍｍの間である。別の態様では、エラストマー材料の層の厚さは、少なくとも０．１ｍｍ、少なくとも０．２ｍｍ、少なくとも０．４ｍｍ、少なくとも０．６ｍｍ、少なくとも０．８ｍｍ、少なくとも１．０ｍｍ、少なくとも１．２ｍｍ、少なくとも１．４ｍｍ、少なくとも１．６ｍｍ、少なくとも１．８ｍｍまたは少なくとも２．０ｍｍである。このアプローチの別の態様では、エラストマー材料の層の厚さは、大きくても２．０ｍｍ、大きくても１．８ｍｍ、大きくても１．６ｍｍ、大きくても１．４ｍｍ、大きくても１．２ｍｍ、大きくても１．０ｍｍ、大きくても０．８ｍｍ、大きくても０．６ｍｍ、大きくても０．４ｍｍ、大きくても０．２ｍｍまたは大きくても０．１ｍｍである。当業者は、エラストマー材料の層の厚さは、これらの値のいずれかによって境界とされる任意の範囲内（例えば、約０．１ｍｍ〜約１．５ｍｍ）に入りうることを認識するであろう。本手法の別の態様では、プリズムの上面は、圧縮力を集中させ、基板、エラストマー層、およびプリズム表面の間のより良好な接触をもたらすために、部分的に円筒形の隆線を有し、またはドーム状になっている（図７）。本手法はまた、基板を位置決めするための並進の第３の軸の使用を必要とする場合があり、すなわち、励起ステップと検出ステップとの間で、基板（マイクロウェルプレート）は、分析される次の別個の領域の場所に基板を再位置決めする前に、エラストマー層とプリズムとの間の接触を排除するためにわずかに上昇される。
【０１１６】
図１０Ａ〜Ｂおよび図１１Ａ〜Ｂは、プリズムまたは格子のアレイが、基板（マイクロウェルプレートフォーマットでパッケージされた）の下面と一体化され、固定プリズムと取り替えるのに使用され、それによって屈折率整合液またはエラストマー層の必要性を完全に排除する、本開示のハイスループットシステムの好適な態様を例示する。プリズム（または格子）のアレイは、入射励起光が「入口プリズム」（「入口格子」）によって、試料界面からの励起光線の全反射を可能にする入射の角度で、入口プリズム（入口格子）に隣接するが直上にない別個の領域またはウェルに向けられる方式で（図１２を参照）、かつ反射した励起ビーム、および照射された別個の領域で生成される非線形光信号が、照合下の別個の領域からやはりずれている（隣接するが直下にない）「出口プリズム」（「出口格子」）によって収集されるように、基板の上面上の別個の領域またはウェルのアレイと整列されており、ここで、各別個の領域の入口プリズムおよび出口プリズム（入口格子および出口格子）は、アレイの固有ではない異なるエレメントである。
【０１１７】
一般に、Ｍ行×Ｎ列の個々のフィーチャーを含む別個の領域のアレイについて、対応するプリズムまたは格子アレイは、Ｍ＋２行×Ｎ列またはＮ＋２列×Ｍ行の個々のプリズムまたは格子を有することになる。一部の実施形態では、Ｍは、少なくとも２、少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５または少なくとも５０行の値を有しうる。一部の実施形態では、Ｍは、多くても５０、多くても４５、多くても４０、多くても３５、多くても３０、多くても２５、多くても２０、多くても１８、多くても１６、多くても１４、多くても１２、多くても１０、多くても８、多くても６、多くても４または多くても２行の値を有しうる。同様に、一部の実施形態では、Ｎは、少なくとも２、少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５または少なくとも５０列の値を有しうる。一部の実施形態では、Ｎは、多くても５０、多くても４５、多くても４０、多くても３５、多くても３０、多くても２５、多くても２０、多くても１８、多くても１６、多くても１４、多くても１２、多くても１０、多くても８、多くても６、多くても４または多くても２列の値を有しうる。当業者に明らかとなるように、ＭおよびＮは、同じ値を有しても異なる値を有してもよく、上記に指定した範囲内の任意の値、例えば、Ｍ＝１５およびＮ＝４５を有しうる。
【０１１８】
プリズムまたは格子アレイ層の厚さを含めた個々のプリズムまたは格子のジオメトリおよび寸法は、励起光線に対する基板（マイクロウェルプレート）の位置とは独立に、入射光が基板の選択された別個の領域で全反射を起こし、選択された別個の領域で生成される非線形光信号が高い光学的カップリング効率で収集されるのを保証するように最適化される。プリズムまたは格子アレイは、当業者に公知の様々な技法によって製作することができ、例えば、好適な態様では、これらは、低複屈折材料、例えば、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）もしくは環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、アクリル、ポリエステル、または同様のポリマーなどを滑らかに流すことによって射出成形されうる。一部の態様では、プリズムまたは格子アレイは、別個のコンポーネントとして製作し、引き続いて基板の下面と一体化することができる。他の態様では、プリズムまたは格子アレイは、基板自体の不可欠なフィーチャーとして製作されうる。
【０１１９】
固定化化学
本明細書に開示するように、上述したフォーマットのいずれかにおける基板は、指定された別個の領域内に生物学的実体を固定化するためにさらに構成される。生物学的分子または細胞の固定化は、当業者に公知の様々な技法によって、例えば、アミン官能基でガラスまたは石英ガラス表面を官能化するためにアミノプロピルシラン化学を使用し、その後、目的の生物学的分子と直接的に、または中間スペーサーもしくはリンカー分子を介してアミン反応性コンジュゲーション化学を使用して共有結合性カップリングすることによって達成されうる。非特異的吸着も、例えば、ＢＳＡの分子層を表面に最初に付着させ、次いでそれをＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネートで活性化することによって、ＢＳＡ−ＮＨＳ（ＢＳＡ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を使用して、直接的または間接的に使用することができる。ＢＳＡ上の活性化リシン、アスパルテート、またはグルタメート残基は、タンパク質上の表面アミンと反応する。
【０１２０】
本開示の好適な態様では、生物学的分子は、「支持脂質二重層」に繋ぎ止め、またはその中に包埋することによって表面上に固定化することができ、後者は、疎水性および静電相互作用によってケイ素またはガラス表面に閉じ込められた脂質二重層の小さいパッチを含み、二重層は、水性緩衝液の薄層上で基板表面の上に「浮いている」。支持リン脂質二重層はまた、例えば、Ｓａｌａｆｓｋｙら、「Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎａｒ  Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｂｉｌａｙｅｒｓ：  Ａ  Ｓｔｕｄｙ  ｗｉｔｈ  Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５巻（４７号）：１４７７３〜１４７８１頁（１９９６年）；Ｇｅｎｎｉｓ，  Ｒ．、Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９８９年；Ｋａｌｂら、「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｐｌａｎａｒ  Ｂｉｌａｙｅｒｓ  ｂｙ  Ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｔｏ  Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ」、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ．、１１０３巻：３０７〜３１６頁（１９９２年）；およびＢｒｉａｎら、「Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｐｌａｎａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ」、ＰＮＡＳ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、８１巻（１９号）：６１５９〜６１６３頁（１９８４年）に記載されているように、膜タンパク質または他の膜関連コンポーネントを含んで、またはこれらを含まずに調製することができる。これらの文献の関連した部分は、参照により本明細書に組み込まれている。支持リン脂質二重層は、当技術分野で周知であり、これらの製作に利用可能な多数の技法が存在する。基板表面または光学的界面上にタンパク質または他の生物学的実体を固定化するために支持脂質二重層を使用する潜在的な利点としては、（ｉ）典型的には、細胞膜または細胞の他の膜コンポーネントにまたがり、二次および三次構造の安定化のために二重層の疎水性コアとの相互作用を必要とするタンパク質の膜タンパク質構造の保存、（ｉｉ）二重層内のタンパク質コンポーネント同士間の相互作用を研究するための２次元横方向および回転拡散機動性の保存、ならびに（ｉｉｉ）研究下のタンパク質のタイプ（すなわち、膜または可溶性タンパク質）、どのように二重層膜が基板表面上で形成されるか、およびどのようにタンパク質が二重層に繋ぎ止められるか（可溶性タンパク質の場合において）などの因子に応じた分子配向の保存がある。支持二重層は、繋ぎ止められた、または包埋されたタンパク質を含んで、またはこれらを含まずに、典型的には、空気に曝露されたときのこれらの破壊を防止するために水溶液中に浸されるべきである。
【０１２１】
可溶性タンパク質および他の生物学的実体は、いくつかの異なるアンカー分子、リンカー、および／または付着化学を使用して配向様式で支持脂質二重層に繋ぎ止め、または付着させることができる。本明細書で使用する場合、「アンカー分子」は、脂質二重層中に包埋される分子であり、付着部分がコンジュゲートされる脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、または他の脂質もしくは非脂質分子を含みうる。
【０１２２】
リンカー分子は、繋ぎ止められているタンパク質または他の生物学的実体の付着点と、脂質二重層の面内に包埋されるアンカー分子上の付着点との間の空間的な（「垂直の」）分離をもたらすのに使用される分子である。適当なリンカー分子の例としては、これらに限定されないが、オメガ−アミノ脂肪酸、ポリエチレングリコールなどがある。
【０１２３】
付着部分（「親和性タグ」とも呼ばれる）は、２つの生物学的実体間で共有結合性または非共有結合性結合をもたらす特定の化学構造または結合パートナーである。本明細書に開示の方法で使用するのに適している付着部分または親和性タグの例としては、ビオチンおよびアビジン（またはビオチンおよびストレプトアビジン）、ならびにＨｉｓ−タグ／Ｎｉ−ＮＴＡ結合パートナーがある。
【０１２４】
高親和性、非共有結合性ビオチン−ストレプトアビジン相互作用は、タンパク質または他の生物学的実体をコンジュゲートまたは固定化するのに生物学的アッセイ技法において広く使用されている。タンパク質をビオチン化すると、それ自体表面（例えば、ガラススライドもしくはビーズ）に接着され、または別の分子にコンジュゲートされる（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン−ビオチンブリッジもしくはリンカーの使用によって）多価アビジンまたはストレプトアビジン分子による捕捉が可能になる。ビオチン部分は、ビオチン化が典型的にはタンパク質機能を妨害しないほどに十分小さい。ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジンとの結合相互作用の高親和性（１０〜１４Ｍから１０〜１５ＭのＫｄ）および高特異性は、複合試料であってもそれからの目的のビオチン化タンパク質の捕捉を可能にする。極めて強い結合相互作用に起因して、厳しい条件が、ストレプトアビジン被覆表面からビオチン化タンパク質を溶出するのに必要とされ（典型的には、ｐＨ１．５で６ＭグアニジンＨＣｌ）、それは、目的のタンパク質を変性させることになることが多い。約１０〜８Ｍの低下したビオチン結合親和性を有するアビジンまたはストレプトアビジンの単量体形態を使用すると、ビオチン化タンパク質を、必要であれば、過剰の遊離ビオチンとともに溶出することが可能になりうる。本明細書に開示の方法では、ビオチン部分を含む脂質分子を、ビオチン化タンパク質および／または他のビオチン化生物学的実体を二重層に、ビオチン−アビジン−ビオチン（またはビオチン−ストレプトアビジン−ビオチン）ブリッジを介して固定化し、または繋ぎ止める目的で支持脂質二重層中に組み込むことができる。
【０１２５】
タンパク質および他の生物学的実体のビオチン化は、直接カップリングによって、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン（ＮＨＳ−ビオチン）を使用するタンパク質の表面上の一級アミンのコンジュゲーションによって実施することができる。代わりに、組換えタンパク質が、好都合なことには、ＡｖｉＴａｇペプチド配列（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）が遺伝子操作およびタンパク質発現技法の使用によってタンパク質中に組み込まれる、ＡｖｉＴａｇ手法を使用してビオチン化される。ＡｖｉＴａｇ配列の存在は、ＢｉｒＡ酵素を用いた処置によってタンパク質のビオチン化を可能にする。
【０１２６】
Ｈｉｓタグ化学は、組換えタンパク質および他の生体分子を精製するための別の広く使用されているツールである。この手法では、例えば、６〜９個の一続きのヒスチジン残基を指定するＤＮＡ配列を、そのＮまたはＣ末端に融合された６×Ｈｉｓまたはポリ−Ｈｉｓタグを含む組換えタンパク質の産生に使用されるベクター中に組み込むことができる。次いでＨｉｓタグ付きタンパク質を、一続きのヒスチジン残基が、特定の緩衝液条件下でニッケル、コバルト、および銅を含めたいくつかのタイプの固定化された金属イオンに結合するという事実の結果として精製および検出することができる。アガロースビーズまたは磁性粒子などの支持体をキレート化基で誘導体化して所望の金属イオンを固定化することができ、次いでこれらは、目的のＨｉｓタグ付き生体分子の結合および精製のためのリガンドとして機能する。
【０１２７】
Ｈｉｓ−タグリガンドを創製するのに最も一般に使用されるキレーターは、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）およびイミノ二酢酸（ＩＤＡ）である。ＮＴＡまたはＩＤＡコンジュゲート支持体が調製されると、これらは、所望の二価金属（例えば、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｕ、またはＦｅ）を「ロード」することができる。例えば、金属としてニッケルを使用するとき、得られる親和性支持体は通常、Ｎｉ−キレート、Ｎｉ−ＩＤＡ、またはＮｉ−ＮＴＡ支持体と呼ばれる。Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質の親和性精製は、タンパク質生物学研究における金属キレート支持体の最も一般的な用途である。ＮＴＡキレート化化学によって固定化されたニッケルまたはコバルト金属は、本願にとって最適なシステムである。本明細書に開示の方法では、Ｎｉ−ＮＴＡ基（または他のキレート化金属イオン）を含む脂質分子を、Ｈｉｓタグ付きタンパク質および他のＨｉｓタグ付き生物学的実体を二重層に固定化し、または繋ぎ止める目的で支持脂質二重層中に組み込むことができる。一部の実施形態では、支持脂質二重層は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを含み得、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］（ニッケル塩）も様々な濃度で含有しうる。
【０１２８】
ポリ−Ｈｉｓタグは、中性付近の緩衝液条件（生理学的ｐＨおよびイオン強度）においてキレート化金属イオンに最良に結合する。典型的な結合／洗浄緩衝液は、１０〜２５ｍＭイミダゾールを含有するＴｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）ｐＨ７．２からなる。低濃度のイミダゾールは、ヒスチジンクラスターを有する内因性タンパク質の非特異的結合を防止するのに役立つ。キレート化金属イオン支持体からの捕捉されたＨｉｓタグ付きタンパク質の溶出および回収は、望まれる場合、典型的には、高濃度のイミダゾール（少なくとも２００ｍＭ）、低ｐＨ（例えば、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５）、または過剰の強いキレーター（例えば、ＥＤＴＡ）を使用して達成される。免疫グロブリンは、これらのＦｃ領域内に複数のヒスチジンを有することが公知であり、キレート化金属イオン支持体に結合することができ、したがって、厳格な結合条件（例えば、適切な濃度のイミダゾールを使用する）が、免疫グロブリンが目的のＨｉｓタグ付きタンパク質と比較して高い相対存在量で試料中に存在する場合、高レベルのバックグラウンド結合を回避するのに必要である。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのアルブミンも複数のヒスチジンを有し、より豊富なＨｉｓタグ付きタンパク質の非存在下、または結合／洗浄緩衝液中のイミダゾールの使用下で、キレート化金属イオン支持体への高レベルのバックグラウンド結合を生じうる。
【０１２９】
収集光学系および検出器
図５は、基板の別個の領域の逐次照射の際に生成される非線形光信号を検出するのに使用される収集光学系および検出器をさらに例示する。表面選択的な非線形光学技法は、コヒーレントな技法であり、基本および非線形光学光線は、はっきりした空間的および位相関係を伴って空間を伝播する波面を有することを意味するので、最小限の収集光学系が要求される。放出される非線形光信号は、プリズム（または上述したマイクロプレートデバイスの一体化したプリズムもしくは格子アレイ）によって収集され、二色性リフレクターおよび鏡を介して検出器に向けられる。追加の光学的コンポーネント、例えば、レンズ、光学バンドパスフィルター、鏡などが、検出器に到達する前にビームをさらに形作る、操縦する、および／またはフィルタリングするのに任意選択で使用される。これらに限定されないが、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管、ＣＭＯＳセンサー、またはＣＣＤデバイスを含めた様々な異なる光検出器を使用することができる。
【０１３０】
Ｘ−Ｙ並進ステージ
図４に例示したように、本明細書に開示のハイスループットシステムの実装は、励起光線に関して基板（上述したフォーマットのいずれかにおける）を再位置決めするために高精度Ｘ−Ｙ（または一部の場合では、Ｘ−Ｙ−Ｚ）並進ステージを理想的には利用する。適当な並進ステージは、いくつかの供給業者、例えば、Ｐａｒｋｅｒ  Ｈａｎｎｉｆｉｎから市販されている。精密並進ステージシステムは、典型的には、これらに限定されないが、リニアアクチュエーター、光学式エンコーダー、サーボおよび／もしくはステッパーモーター、ならびにモーターコントローラー、または駆動ユニットを含むいくつかのコンポーネントの組合せを含む。光検出および／または液体分注のステップの繰り返しを散在させるとき、非線形光信号の正確な測定を保証するために、高い精度および再現性のステージ移動が本明細書に開示のシステムおよび方法に要求される。また、励起光の焦点のサイズ［直径または一辺が２０〜２００ミクロン］は、基板上の別個の領域のサイズより実質的に小さいので、本開示の一部の態様では、反復測定を行うとき所与の別個の領域内でわずかに異なる位置に戻すか、または単回測定の過程にわたり、別個の領域の一部にわたって励起ビームを徐々に走査し、それによって長い曝露または先の曝露の光退色効果に関する潜在的な懸念を排除することが望ましい場合もある。
【０１３１】
したがって、本明細書に開示の方法およびシステムは、並進ステージが励起光線に関して基板を位置決めすることができる精度を指定することをさらに含む。本開示の一態様では、並進ステージの精度は、約１μｍから約１０μｍの間である。他の態様では、並進ステージの精度は、約１０μｍもしくはそれ未満、約９μｍもしくはそれ未満、約８μｍもしくはそれ未満、約７μｍもしくはそれ未満、約６μｍもしくはそれ未満、約５μｍもしくはそれ未満、約４μｍもしくはそれ未満、約３μｍもしくはそれ未満、約２μｍもしくはそれ未満、または約１μｍもしくはそれ未満である。当業者は、並進ステージの精度は、これらの値のいずれかによって境界とされる任意の範囲内（例えば、約１．５μｍ〜約７．５μｍ）に入りうることを認識するであろう。
【０１３２】
流体分注システム
図４に例示したように、本明細書に開示のハイスループットシステムの一部の実施形態は、基板表面に固定化された生物学的または標的実体を試験実体（または試験化合物）と接触させるのに使用するための自動化された、プログラム可能な流体分注（または液体分注）システムをさらに備え、後者は、典型的には、小有機溶媒コンポーネント、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加した、または添加しない水性緩衝液を含む溶液で分注される。適当な自動化された、プログラム可能な流体分注システムは、いくつかの供給業者、例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｔｅｃａｎ、Ｖｅｌｏｃｉｔｙ１１、および多くのその他から市販されている。本明細書に開示のシステムおよび方法の好適な態様では、流体分注システムは、プログラム可能な体積の液体（例えば、約１マイクロリットル〜数ミリリットルの範囲）を基板上の複数のウェルまたは場所に同時送達するために、多チャネル分注ヘッド、例えば、４チャネル、８チャネル、１６チャネル、９６チャネル、または３８４チャネル分注ヘッドをさらに備える。
【０１３３】
プレートハンドリングロボティクス
本明細書に開示のハイスループットシステムの他の態様では、システムは、光学的励起および検出光学系に関して基板（上述したフォーマットのいずれかにおける）を自動交換および位置決めするため、または光学機器と流体分注システムとの間で基板を任意選択で移動させるためのマイクロプレート−ハンドリング（またはプレート−ハンドリング）ロボットシステム（図４）をさらに備える。適当な自動化された、プログラム可能なマイクロプレート−ハンドリングロボットシステムは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｅｍｅｒ、Ｔｅｃａｎ、Ｖｅｌｏｃｉｔｙ１１、および多くのその他を含めたいくつかの供給業者から市販されている。本明細書に開示のシステムおよび方法の好適な態様では、自動化されたマイクロプレートハンドリングロボットシステムは、固定化された生物学的実体および／または試験化合物のアリコートを含むマイクロウェルプレートの収集物を、冷蔵貯蔵ユニットへ移動させ、そしてそこから移動させるように構成されている。
【０１３４】
プロセッサー／コントローラーおよび制約ベーススケジューリングアルゴリズム
本開示の別の態様では、開示したハイスループットシステムは、記載した様々なサブシステム（励起光学系および検出光学系、Ｘ−Ｙ（またはＸ−Ｙ−Ｚ）並進ステージ、流体分注システム、ならびにプレートハンドリングロボティクス）を制御し、ハイスループットコンフォメーション分析の実施に関与する異なる操作ステップを同期させるシステムソフトウェアを実行させるように構成されたプロセッサー（またはコントローラー、またはコンピューターシステム）（図４）をさらに備える。データ取得プロセス、すなわち、コンホメーション変化に関連した非線形光信号に対応する検出器からの出力電子信号の収集を取り扱うことに加えて、プロセッサーまたはコントローラーはまた、典型的には、データを記憶し、データ処理を実施し、機能（配向またはコンホメーションの変化が試験された生物学的実体、または生物学的および試験実体の組合せについて起こったか否かの決定を含む）を表示し、オペレーターによる双方向制御のためにグラフィカルユーザーインターフェースを操作するように構成されている。プロセッサーまたはコントローラーは、他のプロセッサーとネットワーク形成し、または遠隔地の他の機器およびコンピューターと通信するためにインターネットに接続することもできる。
【０１３５】
プロセッサー／コントローラーの典型的な入力パラメーターとして、セットアップパラメーター、例えば、分析されるマイクロウェルプレートの総数；プレート１枚当たりのウェルの数；励起および検出ステップが基板の各別個の領域またはマイクロプレートのウェルについて実施される回数（例えば、エンドポイントアッセイまたは動態アッセイモードを指定するため）；動態データが各別個の領域またはウェルについて収集されるべき全時間経過；各別個の領域またはウェルに送達される試験化合物溶液の順序、タイミング、および体積；非線形光信号を収集および積分するための滞留時間；出力データファイルの名称；ならびに当業者に公知のいくつかのシステムセットアップおよび制御パラメーターのいずれかなどを挙げることができる。
【０１３６】
本開示の好適な態様では、プロセッサーまたはコントローラーは、制約ベーススケジューリングアルゴリズムを実行することによってシステムスループット最適化を実施するようにさらに構成されている。このアルゴリズムは、上述したシステムセットアップパラメーターを利用して、互いに隣接していても隣接していなくてもよい別個の領域またはウェルについて散在した励起／検出および液体分注ステップの最適なシーケンスを決定し、その結果、１時間当たりに分析される生物学的実体および／または試験実体の数の観点からのシステムの全体的スループットが最大化される。システム操作ステップの最適化は、ハイスループット分析を達成する重要な側面である。開示した方法およびシステムの一部の態様では、分析システムの平均スループットは、１時間当たりに試験される約１０試験実体〜１時間当たりに試験される約１，０００試験実体の範囲でありうる。一部の態様では、分析システムの平均スループットは、１時間当たりに試験される少なくとも１０試験実体、１時間当たりに試験される少なくとも２５試験実体、１時間当たりに試験される少なくとも５０試験実体、１時間当たりに試験される少なくとも７５試験実体、１時間当たりに試験される少なくとも１００試験実体、１時間当たりに試験される少なくとも２００試験実体、１時間当たりに試験される少なくとも４００試験実体、１時間当たりに試験される少なくとも６００試験実体、１時間当たりに試験される少なくとも８００試験実体、または１時間当たりに試験される少なくとも１，０００試験実体でありうる。他の態様では、分析システムの平均スループットは、１時間当たりに試験される多くても１，０００試験実体、１時間当たりに試験される多くても８００試験実体、１時間当たりに試験される多くても６００試験実体、１時間当たりに試験される多くても４００試験実体、１時間当たりに試験される多くても２００試験実体、１時間当たりに試験される多くても１００試験実体、１時間当たりに試験される多くても７５試験実体、１時間当たりに試験される多くても５０試験実体、１時間当たりに試験される多くても２５試験実体、または１時間当たりに試験される多くても１０試験実体でありうる。
【０１３７】
コンピューターシステムおよびネットワーク
様々な実施形態では、本発明の方法およびシステムは、コンピューターシステムにインストールされたソフトウェアプログラムおよびそれらの使用をさらに含みうる。したがって、上述したように、様々なサブシステムのコンピューター制御、ならびにデータ分析および表示を含めたハイスループットコンフォメーション分析の実施に関与する異なる操作ステップの同期化は、本発明の範囲内である。
【０１３８】
図１５に例示したコンピューターシステム５００は、媒体５１１、および／または固定媒体５１２を有するサーバー５０９に任意選択で接続されうるネットワークポート５０５からの命令を読むことができる論理装置として理解されうる。図１５に示したものなどのシステムは、ＣＰＵ  ５０１、ディスクドライブ５０３、任意選択の入力デバイス、例えば、キーボード５１５および／またはマウス５１６など、ならびに任意選択のモニター５０７を含みうる。データ通信は、ローカルまたは遠隔地におけるサーバーへの示された通信媒体によって達成することができる。通信媒体は、データを送信および／または受信する任意の手段を含みうる。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、無線接続、またはインターネット接続でありうる。このような接続は、ワールドワイドウェブによる通信を提供することができる。本開示に関連するデータは、図１５に例示したように、関係者５２２による受信および／または点検のためにこのようなネットワークまたは接続によって送信されうることが想定されている。
【０１３９】
図１６は、本発明の例示的な実施形態に関連して使用することができるコンピューターシステム１００の第１の例示的なアーキテクチャを例示するブロックダイヤグラムである。図１６に表したように、例示的なコンピューターシステムは、命令を処理するためのプロセッサー１０２を含みうる。プロセッサーの非限定的な例としては、Ｉｎｔｅｌ  Ｘｅｏｎ（商標）プロセッサー、ＡＭＤ  Ｏｐｔｅｒｏｎ（商標）プロセッサー、Ｓａｍｓｕｎｇ  ３２−ビットＲＩＳＣ  ＡＲＭ１１７６ＪＺ（Ｆ）−Ｓ  ｖ１．０（商標）プロセッサー、ＡＲＭ  Ｃｏｒｔｅｘ−Ａ８  Ｓａｍｓｕｎｇ  Ｓ５ＰＣ１００（商標）プロセッサー、ＡＲＭ  Ｃｏｒｔｅｘ−Ａ８  Ａｐｐｌｅ  Ａ４（商標）プロセッサー、Ｍａｒｖｅｌｌ  ＰＸＡ９３０（商標）プロセッサー、または機能的に等価なプロセッサーがある。実行の複数のスレッドを並列処理のために使用することができる。一部の実施形態では、複数のプロセッサーまたは複数のコアを有するプロセッサーも、単一コンピューターシステム内であっても、クラスター内であっても、または複数のコンピューター、携帯電話、および／もしくは個人データアシスタントデバイスを含むネットワーク上のシステムにわたって分布していても、使用することができる。
【０１４０】
図１６に例示したように、高速キャッシュ１０４を、プロセッサー１０２に接続し、またはその中に組み込んで、プロセッサー１０２によって最近使用されてきた、または頻繁に使用されている命令またはデータのための高速メモリーをもたらすことができる。プロセッサー１０２は、プロセッサーバス１０８によってノースブリッジ１０６に接続される。ノースブリッジ１０６は、メモリーバス１１２によってランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）１１０に接続され、プロセッサー１０２によるＲＡＭ１１０へのアクセスを管理する。ノースブリッジ１０６は、チップセットバス１１６によってサウスブリッジ１１４にも接続される。サウスブリッジ１１４は次に、ペリフェラルバス１１８に接続される。ペリフェラルバスは、例えば、ＰＣＩ、ＰＣＩ−Ｘ、ＰＣＩ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、または他のペリフェラルバスでありうる。ノースブリッジおよびサウスブリッジは、プロセッサーチップセットと呼ばれることが多く、プロセッサー、ＲＡＭ、およびペリフェラルバス１１８上のペリフェラルコンポーネントの間のデータ転送を管理する。一部の代替アーキテクチャでは、ノースブリッジの機能性を、別個のノースブリッジチップを使用する代わりにプロセッサー内に組み込むことができる。
【０１４１】
一部の実施形態では、システム１００は、ペリフェラルバス１１８に取り付けられたアクセラレーターカード１２２を含みうる。アクセラレーターは、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）またはある特定の処理を加速するための他のハードウェアを含みうる。例えば、アクセラレーターは、適合性のあるデータ再構築のために、または拡張されたセット処理において使用される代数式を評価するのに使用することができる。
【０１４２】
ソフトウェアおよびデータは、外部記憶装置１２４に記憶され、プロセッサーが使用するためにＲＡＭ  １１０および／またはキャッシュ１０４にロードされうる。システム１００は、システムリソースを管理するためのオペレーティングシステムを含み、オペレーティングシステムの非限定的な例としては、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（商標）、ＭａｃＯＳ（商標）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ  ＯＳ（商標）、ｉＯＳ（商標）、および他の機能的に等価なオペレーティングシステム、ならびに本発明の例示的な実施形態に従ってデータ記憶および最適化を管理するためにオペレーティングシステムの上層で実行するアプリケーションソフトウェアがある。
【０１４３】
本実施例では、システム１００は、ネットワーク接続型記憶装置（ＮＡＳ）などの外部記憶装置、および分散並列処理に使用されうる他のコンピューターシステムへのネットワークインターフェースを提供するための、ペリフェラルバスに接続されたネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）１２０および１２１も含む。
【０１４４】
図１７は、複数のコンピューターシステム２０２ａおよび２０２ｂ、複数の携帯電話および個人データアシスタント２０２ｃ、ならびにネットワーク接続型記憶装置（ＮＡＳ）２０４ａおよび２０４ｂを有するネットワーク２００を示すダイヤグラムである。例示的な実施形態では、システム２０２ａ、２０２ｂ、および２０２ｃは、データ記憶を管理し、ネットワーク接続型記憶装置（ＮＡＳ）２０４ａおよび２０４ｂに記憶されたデータのデータアクセスを最適にすることができる。数学的モデルをデータに使用し、コンピューターシステム２０２ａおよび２０２ｂ、ならびに携帯電話および個人データアシスタントシステム２０２ｃにわたって分散並列処理を使用して評価することができる。コンピューターシステム２０２ａおよび２０２ｂ、ならびに携帯電話および個人データアシスタントシステム２０２ｃは、ネットワーク接続型記憶装置（ＮＡＳ）２０４ａおよび２０４ｂに記憶されたデータの適合性のあるデータ再構築のための並列処理も提供することができる。図１７は、一例のみを例示しており、多種多様な他のコンピューターアーキテクチャおよびシステムを本発明の様々な実施形態と併せて使用することができる。例えば、ブレードサーバーを使用して並列処理を提供することができる。プロセッサーブレードは、バックプレーンによって接続されて並列処理を提供しうる。記憶装置は、バックプレーンに、または別個のネットワークインターフェースを通じたネットワーク接続型記憶装置（ＮＡＳ）として接続することもできる。
【０１４５】
一部の例示的な実施形態では、プロセッサーは、別個のメモリー空間を維持し、ネットワークインターフェース、バックプレーン、または他のプロセッサーによる並列処理のための他のコネクタを通じてデータを送信することができる。他の実施形態では、プロセッサーの一部またはすべては、共有仮想アドレスメモリー空間を使用することができる。
【０１４６】
図１８は、例示的な実施形態に従って共有仮想アドレスメモリー空間を使用するマルチプロセッサーコンピューターシステムのブロックダイヤグラムである。システムは、共有メモリーサブシステム３０４にアクセスすることができる複数のプロセッサー３０２ａ〜ｆを含む。システムは、メモリーサブシステム３０４内に複数のプログラム可能なハードウェアメモリーアルゴリズムプロセッサー（ＭＡＰ）３０６ａ〜ｆを組み込む。各ＭＡＰ  ３０６ａ〜ｆは、メモリー３０８ａ〜ｆおよび１つまたは複数のフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）３１０ａ〜ｆを備えうる。ＭＡＰは、構成可能な機能単位を提供し、特定のアルゴリズムまたはアルゴリズムの部分が、それぞれのプロセッサーと密接に連携して処理するためにＦＰＧＡ  ３１０ａ〜ｆに提供されうる。例えば、ＭＡＰを使用して、データモデルに関する代数式を評価し、例示的実施形態において適合性のあるデータ再構築を実施することができる。本実施例では、各ＭＡＰは、これらの目的のために、プロセッサーのすべてによって包括的にアクセス可能である。一構成では、各ＭＡＰは、直接メモリーアクセス（ＤＭＡ）を使用して関連メモリー３０８ａ〜ｆにアクセスすることができ、それぞれのマイクロプロセッサー３０２ａ〜ｆとは独立に、かつ非同期的にタスクを実行することを可能にする。この構成では、ＭＡＰは、アルゴリズムのパイプライン化および並列実行のために別のＭＡＰに直接結果を送ることができる。
【０１４７】
上記コンピューターアーキテクチャおよびシステムは、例であるだけであり、汎用プロセッサー、コプロセッサー、ＦＰＧＡおよび他のプログラマブルロジックデバイス、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、ならびに他の処理およびロジックエレメントの任意の組合せを使用するシステムを含めて、多種多様な他のコンピューター、携帯電話、ならびに個人データアシスタントアーキテクチャおよびシステムを、例示的実施形態に関連して使用することができる。一部の実施形態では、コンピューターシステムのすべてまたは一部を、ソフトウェアまたはハードウェアで実装することができる。ランダムアクセスメモリー、ハードドライブ、フラッシュメモリー、テープドライブ、ディスクアレイ、ネットワーク接続型記憶装置（ＮＡＳ）、ならびに他のローカルまたは分散型データ記憶デバイスおよびシステムを含めて、任意の様々なデータ記憶媒体を例示的実施形態に関連して使用することができる。
【０１４８】
例示的な実施形態では、コンピューターシステムは、上記または他のコンピューターアーキテクチャおよびシステムのいずれかで実行するソフトウェアモジュールを使用して実装されうる。他の実施形態では、システムの機能は、ファームウェア、図１８に参照されているフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）などのプログラマブルロジックデバイス、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、または他の処理およびロジックエレメントで部分的または完全に実装されうる。例えば、セットプロセッサーアンドオプティマイザー（Ｓｅｔ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ）は、図１６に例示したアクセラレーターカード１２２などのハードウェアアクセラレーターカードを使用して、ハードウェアアクセラレーションで実装することができる。
【実施例】
【０１４９】
実施例１−ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）変異体の構造パラメーターの決定
ガラス製品および超音波処理脂質調製：開始する前にピラニア洗浄（２０分）ですべてのガラス製品を浄化する。使用上の注意  −  ピラニア洗浄は、特に有機物と接触しているとき、高度に発熱性であり、爆発しやすい。最初にＨ２Ｏ２を量り分け、次いで酢酸を添加することによって換気フード内でＰｙｒｅｘ（商標）などの耐熱ガラス製品中で溶液を調製する。クロロホルム（ＣＨＣｌ３）で真空瓶をすすぐ。可能な限り空気への曝露を回避するように注意しながら、ＤＯＰＣ脂質とＤＧＳ  ＮＴＡ−Ｎｉの所望のモル比を決定する。脂質ミックスを含む真空瓶をＲｏｔｏｖａｐ蒸発器上に配置する。乾燥するまで蒸発させ（約３０秒）、次いでＮ２ガスを蒸発した調製物上に１０分間ブローして残留するＣＨＣｌ３を除去する。ｄｉＨ２Ｏ  ２ｍＬ中に脂質混合物を再懸濁する。濁った懸濁液が形成するまで活発にボルテックスする（約５分）。懸濁液を４ｍＬポリスチレン試験管に移す。溶液が透明になるまで脂質混合物を氷上で超音波処理する。これは、超音波処理器を２５％の出力に設定して約６０〜９０秒を要するはずである。
【０１５０】
超音波処理した脂質溶液を微小遠心管に移し、１７，０００×Ｇで４℃にて３０分間遠心分離する。上清を清潔な微小遠心管に移し、仕上げた脂質プレップを４℃で貯蔵する。これらは約１カ月間安定である。
【０１５１】
スライド調製およびタンパク質ローディング：ＤＯＰＣ／ＤＧＳ  ＮＴＡ（Ｎｉ）脂質を適用する直前に、顕微鏡スライドをピラニア洗浄で２０分間浄化する。スライド染色容器内でｄｉＨ２Ｏを用いて３回すすぐ。圧縮窒素でスライドを乾燥させる。粘着性ガスケットをピラニア浄化済みスライドに付着させることによってＳＨＧウェルをアセンブルする（すなわち、１０〜２０μｌの体積を含有するスライド１枚当たり１６ウェル）。アセンブリージグを使用してガスケットを整列させ、スライドをジグ内に慎重に据え、しっかりとプレスする。ＤＯＰＣ／ＤＧＳ  ＮＴＡ（Ｎｉ）脂質プレップをＰＢＳまたはＴＢＳ緩衝液で１：１に希釈する。１００ｍＭ  ＮａＣｌが、ガラススライドのハイドロスタティックチャージ（ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｃ  ｃｈａｒｇｅ）を低減し、支持脂質二重層（ＳＬＢ）が形成するのを可能にするのに要求される。希釈したＤＯＰＣ／ＤＧＳ  ＮＴＡ（Ｎｉ）脂質１０〜２０μＬをスライドのウェルにピペットで移し、室温で５分間インキュベートする。緩衝液浴（ＰＢＳまたはＴＢＳ）にスライドを浸し、いかなる時もウェルに空気を導入しないように注意しながら２００μＬピペッターで撹拌することによってウェルを洗浄する。浴中の緩衝液の全体積を新鮮な緩衝液と交換し、洗浄ステップをさらに２回繰り返す。１：１体積の１００ｍＭ  ＮｉＣｌ２溶液をすべてのウェルに添加し、室温で１０分間インキュベートする。緩衝液浴（ＰＢＳまたはＴＢＳ）にスライドを浸し、２００μＬピペッターで撹拌することによってウェルを洗浄する。浴中の緩衝液の全体積を新鮮な緩衝液と交換し、洗浄ステップをさらに２回繰り返す。必要であれば、ウェル中の緩衝液を適切なタンパク質ローディングバッファーに交換し、目的の標的タンパク質をウェル上にロードする。室温で３０〜９０分間インキュベートし、その後アッセイ緩衝液でウェルを完全にすすいだ後、実験を開始する。
【０１５２】
小単層ベシクル（ＳＵＶ）を上述したように超音波処理によって調製し、ピラニア洗浄済みフィッシャースライド上に適用してＳＬＢ表面を作製する。ＮｉＣｌ２を１０分間添加し、ウェルを標識緩衝液で洗浄した。
【０１５３】
標識タンパク質を上述したように調製したＳＬＢ表面上に３μＭ（マイクロモル濃度）で４５分間ロードし、その後洗浄する。イミダゾールもしくはＥＤＴＡが添加され、またはタンパク質が一方もしくは両方の存在下でＳＬＢ表面とともにインキュベートされる場合、ＳＨＧ信号は、ベースラインレベルに降下し、表面への付着がタンパク質のＨｉｓ−タグを介して特異的に起こることを示す。
【０１５４】
Ｎ末端またはＣ末端８×Ｈｉｓタグを有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉタンパク質ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の変異体を、当技術分野で公知の方法を使用して創製した（Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ，  Ｐ．ら（２００２年）、「Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ：  Ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  ｏｆ  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、９９巻（２１号）：１３４８１〜６頁；Ｇｏｏｄｅｙ，  Ｎ．（２００８年）、「Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｅｍｅｒｇｅ  ｖｉａ  ａ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｒｏｕｔｅ」、Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．、４巻（８号）：４７４〜８２頁；Ａｎｔｉｋａｉｎｅｎ，  Ｎ．（２００５年）、「Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４４巻（５１号）：１６８３５〜４３頁）。第１の場合では、両方の天然システインが除去されたシステイン最少化変異体を作製した（Ｃ８５ＡおよびＣ１５２Ａ）。次いで、２つの単一の異なる残基（例えば、Ｍ１６Ｃ、Ｎ２３Ｃ、Ｑ６５Ｃ、Ｖ１３６Ｃ、Ｄ１４２Ｃ、Ａ１９Ｃなど）をシステインに変異させ、すなわち、２つの単一部位変異体コンストラクトをこのシステイン最少化バックグラウンドにおいて創製した：変異体１および変異体２。変異の部位を選択するために、タンパク質の表面上の様々な残基をシステインに変異させ、ＳＨＧプローブによって標識される能力について試験した。第２の場合では、野生型タンパク質を標識し、プローブのＣ１５２への付着を質量分析によって確認した。野生型または組換えタンパク質を２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中に精製した。タンパク質を、製造業者の指示に従ってマレイミド色素を使用して標識し、例えば、タンパク質を、２０：１の色素：タンパク質標識比（最終ＤＭＳＯ濃度は５％であった）でおよそ５０μＭにて２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＴＣＥＰ、および１０％グリセロール中でインキュベートした。タンパク質を４℃で一晩撹拌し、次いで２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＴＣＥＰ中にゲル精製した。次いで標識および精製タンパク質を、Ｈｉｓ−タグを介してＳＬＢ表面に繋ぎ止めた。
【０１５５】
ＳＨＧ信号の偏光依存測定を、当業者に公知の方法を使用して２つの異なる変異体のχ（２）の独立したゼロになることのないコンポーネントを決定するのに使用した。例えば、最も単純な光学ジオメトリにおいて、かつ方位角等方性および超分極率テンソルの単一支配的コンポーネントを仮定して、χ（２）の２つの独立したゼロになることのないコンポーネント（χｚｚｚおよびχｘｚｘまたはχｚｘｘ）を決定する。これらを次に、変異体のそれぞれのθ（すなわち、θ１およびθ２）に関する配向分布を最良に決定するのに使用した。
【０１５６】
例えば、Ｃ末端でＨｉｓ−タグを介して脂質二重層に繋ぎ止められた単一部位システインにおいて標識されたＶ１３６Ｃ、Ｑ６５Ｃ、およびＮ２３Ｃについて、面法線（ｚ軸）に対する色素超分極率の平均角度は、配向においてデルタ関数（単一角度および配向分布中の幅なし）を仮定して、以下の通りであった：
Ｖ１３６Ｃ    ３５．３°
Ｑ６５Ｃ    ４７．５°
Ｎ２３Ｃ    ３８．５°
【０１５７】
図１３Ａ〜Ｂは、Ｎ末端またはＣ末端でＨｉｓタグによってタグ付けされ、繋ぎ止められた様々なＳＨＧ標識単一部位システイン変異体のＩｚｚｚ測定を示す。直ちに明白であったように、標識タンパク質の絶対信号規模（ベースライン信号）は、Ｎ末端およびＣ末端でタグ付けされ、繋ぎ止められたタンパク質について標識部位ごとに変動した（それぞれ図１３Ａおよび図１３Ｂ）。
【０１５８】
リガンドを付加すると、正または負に、ＳＨＧベースライン信号レベルの変化（ＳＨＧ  ％変化）を引き起こした。それは、タンパク質アンサンブルにわたる標識の再配向から、言い換えれば、リガンド結合の結果としての標識配向分布の変化から生じる。図１４Ａおよび１４Ｂは、ＤＨＦＲを結合させることが当業者に周知である１μＭ（マイクロモル濃度）ＴＭＰリガンドがベースライン信号（ＩＺＺＺ）の示差的な変化を生じさせた実験の結果を示す。図１４Ａおよび１４Ｂにおいて分かるように、ＳＨＧ信号変化の方向および規模は、一般的なタグ付けおよび繋ぎ止め（例えば、Ｎ末端またはＣ末端タグ付け）について、かつＮおよびＣ末端タグ付き変異体の結果にわたって部位ごとに変動した。例えば、図１４Ａにおいて見られるように、ＴＭＰを付加すると、Ｎ末端でそのＨｉｓタグを介して付着され、配向しているタンパク質変異体のベースライン信号がおおよそ７０％低下するが、Ｃ末端でＨｉｓタグを介して付着され、配向している変異体についてはおよそ９０％低下する。
【０１５９】
同様の測定をＩｚｘｘについて繰り返すことができ、２つの偏光依存強度の比を使用することによって、狭い配向分布を仮定して、タンパク質コンストラクトの関数（例えば、ＮまたはＣ末端タグ）として各システイン部位における標識の平均角度を決定することができる。
実施例２（預言的）
実施例１の実験を３つまたはそれ超の異なるＨｉｓ−タグ長さを含むように拡張することができ、それは、異なる配向分布が観察されることになる。これにより、独立した偏光測定の数が４８に増加し、角度測定およびタンパク質構造モデルの精度が増大する。
【０１６０】
実施例３（預言的）
実施例２の実験を、様々な塩濃度（例えば、０、５０ｍＭ、２００ｍＭ、および３００ｍＭ  ＮａＣｌ）の４種の異なる緩衝液を含むように拡張することができ、それは、異なる配向分布を生じさせる。これにより、独立した偏光測定の数が３８４に増加し、角度測定およびタンパク質構造モデルの精度が増大する。
【０１６１】
実施例４（預言的）
実施例３の実験を、異なる濃度の、緩衝液に添加される分子（すなわち、添加剤）（例えば、ＰＥＧ４００（１０μＭ、２０μＭ、４０μＭ、および８０μＭ  マイクロモル濃度  ＰＥＧ４００））を含むように拡張することができ、この分子は、界面領域と会合し、異なる配向分布を生じさせる。これにより、独立した配向分布および偏光測定の数が増加し、よって角度測定およびタンパク質構造モデルの精度が増大する。
【０１６２】
実施例５（預言的）
実施例４の実験を、当業者に公知の方法によって支持脂質二重層を横切って印加される横行電場を含むように拡張することができる。４種の異なる電場強度（ゼロ、低、中、および高）を印加する。金属片を３８４ウェルガラス底プレートウェル（約３ｍｍの直径）中の二重層領域にわたってパターン形成し、約１Ｖ／ｃｍ〜１Ｅ４  Ｖ／ｃｍの電場強度に対応する、０．１〜１００Ｖの範囲の電圧をこれらの片に印加する。印加される電場は、当業者に公知であるように電気泳動および電気浸透機構を介してタンパク質集団の配向分布を変更し、異なる規模の印加電場は、タンパク質の異なる配向集団をもたらし、独立した偏光測定を可能にする。これにより、角度測定およびタンパク質構造モデルの精度が増大する。
【０１６３】
（実施例６）
実施例５の実験を、それぞれ異なる単一システイン部位で標識された、ＤＨＦＲの１０の異なる変異体を含むように拡張することができる。これにより、独立した偏光測定の数、ならびに角度測定およびタンパク質構造モデルの精度が増大する。
【０１６４】
本発明の好適な実施形態を本明細書に示し、記載してきたが、このような実施形態は、単なる例として提供されていることが当業者に明白となるであろう。多数のバリエーション、変更、および置換が、本発明から逸脱することなく現在では当業者に見出されるであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態の様々な代替案を、本発明を実施するのに使用することができることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物は、それによって包含されることが意図されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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