(57)【要約】本発明は、チロシンキナーゼ受容体METの活性化を誘導することができ、特に組織再生を促進するHGF/SF由来のタンパク質及びその使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれK1a及びK1bと名付けられる２つのペプチドドメインを含むタンパク質であって、前記ペプチドドメインK1a及びK1bのそれぞれが、肝細胞増殖因子／分散因子のK1ペプチドドメインを含み、
前記K1ペプチドドメインは、配列番号１に対して少なくとも80％の同一性、好ましくは少なくとも90％の同一性を有する配列からなり、
前記タンパク質は、チロシンキナーゼ受容体METの活性化を誘導することができ、
ただし、前記タンパク質はHGF/SFのＮ末端ドメインを含まない、
タンパク質。
【請求項２】
前記ペプチドドメインK1a及びK1bが同一である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記ペプチドドメインK1a及びK1bのそれぞれが、配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１又は２のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項４】
前記タンパク質が、K1a及びK1bを接続するペプチドリンカーを含み、前記ペプチドリンカーが１〜50アミノ酸で、より好ましくは10〜20アミノ酸で構成される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記タンパク質が、配列番号７のアミノ酸配列、又は配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも80％の同一性、好ましくは90％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいはそれからなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
好ましくは配列番号10の核酸配列からなる、請求項１〜５のいずれか一項に定義したタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項７】
好ましくは配列番号11の核酸配列を含むか又はそれからなる、請求項６に定義した核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項８】
好ましくは酵母細胞及び細菌細胞からなる群から選択される、請求項７に定義した発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】
- 請求項１〜５のいずれか１項に定義したタンパク質、又は
- 前記タンパク質をコードする核酸分子、又は、
- 前記核酸分子を含む発現ベクター、又は
- 前記発現ベクターを含む宿主細胞
を含む組成物。
【請求項１０】
診断方法に用いるための請求項１〜５のいずれか１項に定義したタンパク質。
【請求項１１】
医用撮像に用いるための請求項１〜５のいずれか１項に定義したタンパク質。
【請求項１２】
医薬品として用いるための請求項１〜５のいずれか１項に定義したタンパク質。
【請求項１３】
細胞生存又は組織再生を促進して組織損傷の治療に用いるための請求項１〜５のいずれか１項に定義したタンパク質。
【請求項１４】
急性及び慢性肝臓病、急性及び慢性腎臓病、慢性肺疾患及び慢性皮膚創傷を含む上皮器官の疾患、ニューロン疾患及び硬化症を含む中枢神経の疾患、虚血性心疾患、末梢血管疾患、糖尿病及び末梢神経障害などの関連する合併症から選択される病変の治療に用いるための請求項１〜５のいずれか１項に定義したタンパク質。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれか１項に定義する、少なくとも２つのK1ペプチドドメインを含むタンパク質を取得する方法であって、次の工程：
- 少なくとも２つのK1ペプチドドメイン、好ましくは２つのK1ペプチドドメインを含む組換タンパク質をコードする核酸配列を発現ベクターに挿入する工程、
- 前記ベクターを宿主細胞にクローニングして、前記組換タンパク質を発現させる工程、
- 前記組換タンパク質が少なくとも２つのK1ドメインを含み、前記組換タンパク質を抽出及び精製する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞増殖因子／分散因子(HGF/SF)由来の２つのK1ドメインを含むタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞増殖因子／分散因子(HGF/SF)は、不活性前駆体として合成された後、タンパク質分解的に二本鎖(α/β)活性種に変換される複雑なドメイン構造を有する分泌90kDaタンパク質である(Nakamura, T., Structure and function of hepatocyte growth factor. Prog Growth Factor Res 3, 67-85 (1991); Holmes et al., Insights into the structure/function of hepatocyte growth factor/scatter factor from studies with individual domains. J Mol Biol 367, 395-408 (2007))。α鎖は、１つのＮ末端ドメイン(Ｎ)とクリングルドメインの４つのコピー(K1、K2、K3及びK4)とからなる。β鎖は、触媒的に不活性なセリンプロテイナーゼホモロジードメイン(SPH)である。２つの受容体結合部位がHGF/SFに同定され、それらは、α鎖のＮ末端領域に局在する高親和性部位と、β鎖に局在する低親和性部位である。
【０００３】
HGF/SFは、肝マイトジェン(肝細胞増殖因子、HGF)(Miyazawa et al., Molecular cloning and sequence analysis of cDNA for human hepatocyte growth factor. Biochem Biophys Res Commun 163, 967-973 (1989); Nakamura et al., Purification and subunit structure of hepatocyte growth factor from rat platelets. FEBS Lett 224, 311-316 (1998); Zarnegar et al., Purification and biological characterization of human hepatopoietin a, a polypeptide growth factor for hepatocytes. Cancer Res 49, 3314-3320 (1989))、及び線維芽細胞由来上皮運動因子(分散因子、SF)(Stoker et al., Scatter factor is a fibroblast-derived modulator of epithelial cell mobility. Nature 327, 239-242 (1987); Gherardi et al., Purification of scatter factor, a fibroblast-derived basic protein that modulates epithelial interactions and movement. Proc Natl Acad Sci USA 86, 5844-5848 (1989))として独立に発見された強力な増殖及び運動因子である。プロトオンコジーンによりコードされる受容体チロシンキナーゼMETは、HGF/SFに対する受容体であると後に立証された(Bottaro et al., Identification of the hepatocyte growth factor as the c-met proto-oncogene product. Science 251, 802-804 (1991))。
【０００４】
興味深いことに、一次HGF/SF転写物は、２つの選択的スプライスバリアントをコードする。第一のバリアントは未成熟翻訳停止に起因し、HGF/SFのＮドメイン及び最初のクリングルドメイン(K1)を有するNK1タンパク質を生成する。NK1タンパク質は顕著なアゴニスト活性を有しているが、完全なMET活性化の誘導にはヘパラン硫酸相互作用が必要である。構造的に、NK1タンパク質は、ヘパリン存在下で、MET二量化及び活性化の原因と推定される「頭-尾」ホモ二量体を形成する２つの球状ドメインからなる(Chirgadze et al., Crystal structure of the NK1 fragment of HGF/SF suggests a novel mode for growth factor dimerization and receptor binding. Nat Struct Biol 6, 72-79 (1999))。未成熟停止によって生じる第二のスプライスバリアントは、Ｎドメイン及び最初の２つのクリングルドメインを有するNK2タンパク質を産生する。NK2は、天然のMETアンタゴニストと考えられている。実際、NK2はMET結合能を保持するが、その立体配座特性により、METを活性化させる能力を欠いている。しかし、構造ベースの標的突然変異によって、NK1のものに近い立体配座におけるK1ドメインを再配置することで、NK2をMETアンタゴニストからアゴニストに効率的に切り替えることができる。
【０００５】
統一的かつ収束的な相互作用モデルを提案する多くの試みがなされたが、HGF/SFのMET結合機構はいまだ不明であり、論争が続いている。特に、可溶性MET細胞外ドメインと複合したNK1の結晶構造は、まだ得られていない。HGF/SFは、α鎖(Ｎ及び／又はK1ドメイン)のＮ-末端領域及びβ鎖(SPHドメイン)にそれぞれ局在する、METに対する高親和性結合部位及び低親和性結合部位を含む二価リガンドである。溶液中のMETエクトドメインへのHGF/SFの結合は、2：2化学量論の複合体を生じる(Gherardi et al., Structural basis of hepatocyte growth factor/scatter factor and met signalling. Proc Natl Acad Sci USA 103, 4046-4051 (2006))。SPHドメインはMETを明確なインターフェイスで結合する。しかし、MET上のNK1結合部位の局在はいまだ不明確であり、正確なHGF/SF-MET相互作用モデルについては議論が続いている((Holmes et al., Insights into the structure/function of hepatocyte growth factor/scatter factor from studies with individual domains. J Mol Biol 367, 395-408 (2007); Stamos et al., Crystal structure of the HGF beta-chain in complex with the sema domain of the met receptor. The EMBO Journal 23, 2325-2335 (2004); Merkulova-Rainon et al., The N-terminal domain of hepatocyte growth factor inhibits the angiogenic behavior of endothelial cells independently from binding to the c-Met-receptor. J Biol Chem 278, 37400-37408 (2003))。
【０００６】
HGF/SF及びMETは、発生と組織／臓器再生との両方において重要な生理的役割を果たす。特に、HGF/SF-METは、肝切除後の肝臓及び皮膚の再生(Huh et al., Hepatocyte growth factor/c-met signaling pathway is required for efficient liver regeneration and repair. Proc Natl Acad Sci USA 101, 4477-4482 (2004); Borowiak et al., Met provides essential signals for liver regeneration. Proc Natl Acad Sci USA 101, 10608-10613 (2004))と、皮膚創傷(Chmielowiec et al., C-met is essential for wound healing in the skin. J Cell Biol 177, 151-162 (2007))に不可欠である。さらにHGF/SFは、実験的損傷から心筋及び骨格筋を保護し(Urbanek et al., Cardiac stem cells possess growth factor-receptor systems that after activation regenerate the infarcted myocardium, improving ventricular function and long-term survival. Circ Res 97, 663-673 (2005))、運動ニューロン疾患のトランスジェニックモデル(Sun et al., Overexpression of HGF retards disease progression and prolongs life span in a transgenic mouse model of als. J Neurosci 22, 6537-6548 (2002))及び多発性硬化症の免疫学的モデル(Bai et al., Hepatocyte growth factor mediates mesenchymal stem cell-induced recovery in multiple sclerosis models. Nature neuroscience 15, 862-870 (2012))の進行を遅らせる。総合すると、これらの研究は、多くの前臨床及び最新の臨床研究により支持された概念である、再生医療におけるHGF/SFの大きな潜在力を強調する。
【０００７】
特に、組織再生、とりわけ肝切除後の肝臓再生又は糖尿病疾患に関与する損傷での組織再生を可能にするHGF/SFアゴニスト合成について多くの研究がなされている。
【０００８】
HGF/SF-MET相互作用についての現在の知見では、HGF/SF-METアゴニストの合理的設計ができないので、HGF/SHの有用性は、天然のHGF/SF、遺伝子送達法及びNK1ベースのMETアゴニストを使用して確立されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、天然のHGF/SFは、局所的に作用する組織モルフォゲンとしての役割を反映する、制限された組織拡散性を有するタンパク質である(Birchmeier et al., Met, metastasis, mobility and more. Nat Rev Mol Cell Biol 4, 915-925 (2003); Ross et al., Protein Engineered Variants of Hepatocyte Growth Factor/Scatter Factor Promote Proliferation of Primary Human Hepatocytes and in Rodent Liver. Gastroenterology 142, 897-906 (2012))。実際、局所又は全身投与後、HGF/SFは、細胞外マトリクスに存在するヘパラン硫酸により固定化されて、より遠隔の組織におけるMET受容体への拡散は著しく減少する(Roos et al., Induction of liver growth in normal mice by infusion of hepatocyte growth factor/scatter factor. The American Journal of Physiology 268, G380-386 (1995); Hartmann et al., Engineered mutants of HGF/SF with reduced binding to heparan sulphate proteoglycans, decreased clearance and enhanced activity in vivo. Curr Biol 8, 125-134 (1998))。さらに、天然のHGF/SHは、その複雑なマルチドメインの構造により、生産が困難で非常に割高でもある。
【００１０】
HGF/SFをコードする裸のDNAの筋肉内注射を含めた遺伝子送達法は、タンパク質療法としての天然のHGF/SFの使用にかかる複数の問題に取り組むものである(例えば、HGF/SFタンパク質の生産コスト)。現在、糖尿病性末梢神経障害の患者と筋萎縮性側索硬化症の患者とにおいて、HGF/SF DNAを用いた臨床試験が実施されている。この試験の結果は興味が持たれているが、現在の遺伝子送達法には、遺伝子産物の安定的治療レベルの達成と、制限された拡散のため特定の組織領域及び臓器に対する相対的利用能の点において限界がある。例えば、かかる遺伝子送達法は、プラスミド送達システム(特許出願 WO 2009/093880, WO 2009/125986 及び WO 2013/065913)又はアデノウイルスをベースにした送達システム(Yang et al., Improvement of heart function in postinfarct heart failure swine models after hepatocyte growth factor gene transfer: comparison of low-, medium- and high-doses groups. Mol Biol Rep 37, 2075-2081 (2010))に基づいている。
【００１１】
現在入手可能なNK1ベースのMETアゴニスト、例えば1K1(すなわちNK1ミュータント)は強いアゴニスト活性を有し、HGF/SFよりも有利な点がある(Lietha et al., Crystal structures of NK1-heparin complexes reveal the basis for NK1 activity and enable engineering of potent agonists of the MET receptor. The EMBO journal 20, 5543-5555 (2001) and patent US 7,179,786)。天然のHGF/SFと異なり、このNK1ミュータントは異種発現系での効率的生産が可能であり、また生理学的緩衝溶液中で安定であるので、投与量及び血漿濃度を完全に制御して投与できる。しかし、NK1の潜在的な限界は、組織拡散を回避するヘパラン硫酸に対する強力な残余親和性である。
【００１２】
このことから、改善された安定性、改善された貯蔵寿命、最適なバイオアベイラビリティーを備え、且つ安価な生産と容易な投与が可能である強力なMETアゴニストに対するニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の目的の１つは、チロシンキナーゼ受容体METの活性化を誘導できるタンパク質の提供である。
また、本発明の別の目的は、かかるタンパク質を含む組成物の提供である。
さらに、本発明の別の目的は、特に診断と治療応用における、かかるタンパク質の使用に関する。
【００１４】
本発明は、それぞれK1a及びK1bと名付けられる２つのペプチドドメインを含むタンパク質であって、該ペプチドドメインK1a及びK1bのそれぞれが、肝細胞増殖因子／分散因子(HGF/SF)のK1ペプチドドメイン(クリングル1)を含み、
該K1ペプチドドメインは、配列番号１に対して少なくとも80％の同一性、好ましくは少なくとも90％の同一性を有する配列からなり、
該タンパク質は、チロシンキナーゼ受容体METの活性化を誘導できる、
タンパク質に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、K1ドメインが強力なMETアゴニストの基礎単位を構成し、かつ強力なMETアゴニスト活性を有するK1二量体を作り出すことが可能であるという、本発明者らによる予期せぬ二方面からの観察に基づく。
【００１６】
本発明において、用語「K1a」及び「K1b」はすべて、HGF/SFのK1ドメインを含むペプチド配列をいう。
【００１７】
本発明のタンパク質は、２つのK1ドメインがアミノ酸鎖により互いに共有結合している、HGF/SFのK1ドメインの共有結合性二量体である。本発明のタンパク質は、用語「K1K1」で表される。
【００１８】
特に本発明は、それぞれK1a及びK1bと名付けられる２つのペプチドドメインを含むタンパク質であって、該ペプチドドメインK1a及びK1bのそれぞれが、肝細胞増殖因子／分散因子(HGF/SF)のK1ペプチドドメイン(クリングル1)を含み、
該K1ペプチドドメインは、配列番号１に対して少なくとも80％の同一性、好ましくは少なくとも90％同一性を有する配列からなり、
該タンパク質は、チロシンキナーゼ受容体METの活性化を誘導することができ、
ただし、該タンパク質はHGF/SFのＮ末端ドメインを含まない、
タンパク質に関する。
【００１９】
本発明のタンパク質は、多くの技術的及び金銭的な面で有利である。
最も重要な技術的利点は、本発明のタンパク質が強力なMETアゴニスト活性を有する点である。よって、このタンパク質は、さまざまなインビトロ及びインビボアッセイにおいて、MET受容体を活性化することができ、且つ／又は、MET活性化に関連するいかなる表現型も誘導することができる。
【００２０】
次を実行できる場合、タンパク質はMETアゴニスト活性を有する：
- MET受容体に結合し、
- METリン酸化と、細胞における下流のシグナル伝達とを活性化し、及び
- 生存、増殖、形態形成及び／又は移動などの少なくとも１つの細胞表現型を誘導する。
【００２１】
これらの基準の確認は、タンパク質-タンパク質相互作用試験(SPR(表面プラズモン共鳴)、AlphaScreen、プルダウン技術又はゲルろ過クロマトグラフィーなど)、リン酸化試験(ウエスタンブロット法、ELISA又はAlphaScreenなど)、及び表現型試験(分散、MTTアッセイ又はMatrigel(商標)誘導性形態形成など)を用いて示すことができる。
【００２２】
例えば、細胞におけるMET活性化及び下流のシグナル伝達は、ウエスタンブロット法によりインビトロで分析し、ホモジニアス時間分解蛍光法(HTRF)により定量化できる。インビボの場合には、局所血管新生の分析及びFas誘発性劇症肝炎からのマウスの保護が可能である。
【００２３】
別の技術的な利点は、本発明のタンパク質を、投与量及び／又は血漿濃度を完全に制御して投与できることである。
【００２４】
加えて、天然のHGF/SFの大きな欠点の一つは、細胞外マトリクスにおいてヘパラン硫酸に強く結合するという事実である。これは、より離れた部位への分子の拡散を厳しく制限する。一方、本発明のタンパク質は、高親和性ヘパラン硫酸部位を欠損している。
【００２５】
よって、本発明のタンパク質は、HGF/SFとは逆に、細胞外マトリクスのヘパラン硫酸鎖により固定化されない。したがって、患者に注射されたとき、本発明のタンパク質は、注入領域から離れた組織にあるMET受容体に向かって拡散できるが、天然のHGF/SFは拡散できない。このことは、マウスによるインビボでの実験で立証されている。他方、クリングルドメインにおける低親和性ヘパリン部位の存在は、ヘパリン-セファロース・アフィニティクロマトグラフィーを介して効率的な精製を可能にする。
【００２６】
いくつかの金銭的な利点は、本発明のタンパク質が、大量で安価な生産が容易にできる点である。実際、かかるタンパク質は、細菌又は酵母などの発現系として使用される宿主細胞で組み換え生産できる。
【００２７】
一実施形態において、本発明は、それぞれK1a及びK1bと名付けられる、70〜100アミノ酸の２つのペプチドドメインを含むタンパク質であって、該ペプチドドメインK1a及びK1bのそれぞれが、肝細胞増殖因子／分散因子(HGF/SF)のK1ペプチドドメイン(クリングル1)を含み、
該K1ペプチドドメインは配列番号１に対して少なくとも80％の同一性、好ましくは少なくとも90％の同一性を有する配列からなり、
該タンパク質は、チロシンキナーゼ受容体METの活性化を誘導できる、
タンパク質に関する。
【００２８】
一実施形態で、本発明は、それぞれK1a及びK1bと名付けられる、70〜100アミノ酸の２つのペプチドドメインを含むタンパク質であって、該ペプチドドメインK1a及びK1bのそれぞれが、肝細胞増殖因子／分散因子(HGF/SF)のK1ペプチドドメイン(クリングル1)を含み、
該K1ペプチドドメインは配列番号２に対して少なくとも80％の同一性、好ましくは少なくとも90％の同一性を有する配列からなり、
該タンパク質は、チロシンキナーゼ受容体METの活性化を誘導できる、
タンパク質に関する。
【００２９】
一実施形態で、本発明は、それぞれK1a及びK1bと名付けられる２つのペプチドを含むタンパク質であって、ペプチドドメインK1a及びK1bのそれぞれが、配列番号１に対して少なくとも80％の同一性、好ましくは少なくとも90％の同一性を有する70〜100アミノ酸の配列を含むか又はそれからなり、
該タンパク質は、チロシンキナーゼ受容体METの活性化を誘導できる、
タンパク質に関する。
【００３０】
一実施形態で、本発明は、ペプチドドメインK1a及びK1bのそれぞれのサイズが少なくとも70アミノ酸、好ましくは少なくとも74アミノ酸、より好ましくは79アミノ酸である、上で定義したタンパク質に関する。
【００３１】
特に、K1a及び／又はK1bのサイズは70〜100アミノ酸である。かかるK1ペプチドドメインは70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100アミノ酸からなり得る。
【００３２】
一実施形態で、本発明は、ペプチドドメイK1a及びK1bが同一である、上で定義したタンパク質に関する。
一実施形態で、本発明は、ペプチドドメイK1a及びK1bが互いに異なる、上で定義したタンパク質に関する。
一実施形態で、本発明は、ペプチドドメインK1a及びK1bのそれぞれが配列番号１のアミノ酸配列からなる、上で定義したタンパク質に関する。
一実施形態で、本発明は、ペプチドドメインK1a及びK1bのそれぞれが配列番号２のアミノ酸配列からなる、上で定義したタンパク質に関する。
【００３３】
一実施形態で、本発明は、ペプチドドメインK1a及びK1bのそれぞれが、配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなる、上で定義したタンパク質に関する。
【００３４】
一実施形態で、本発明は、ペプチドドメインK1a及び／又はK1bが、配列番号１に対してアミノ酸の少なくとも１つの付加、欠失又は置換を含み、
K1a及びK1bのK1ペプチドドメインが、配列番号１に対して少なくとも80％の同一性を有する配列からなる、上で定義したタンパク質に関する。
【００３５】
一実施形態で、本発明は、ペプチドドメインK1a及び／又はK1bが、配列番号１に対して５位のアミノ酸Ｋ及び／又は７位のアミノ酸Ｒの少なくとも１つに置換を含み、
K1a及びK1bのK1ペプチドドメインは、配列番号１に対して少なくとも80％の同一性を有する配列からなる、上で定義したタンパク質に関する。
【００３６】
一実施形態で、本発明は、ペプチドドメインK1a及び／又はK1bが、配列番号１に対してK5E及びR7Eから選択される少なくとも１つの置換を含み、
K1a及びK1bのK1ペプチドドメインは、配列番号１に対して少なくとも80％の同一性を有する配列からなる、上で定義したタンパク質に関する。
【００３７】
一実施形態で、本発明は、ペプチドドメインK1a及びK1bのそれぞれが、配列番号１に対してK5E及びR7Eの置換を含み、
それぞれのK1ペプチドドメインは、配列番号１に対して少なくとも80％の同一性を有する配列からなる、上で定義したタンパク質に関する。
【００３８】
配列番号１は、配列番号12で表されるHGF/SFの128位のアミノ酸から206位のアミノ酸までの領域である、ヒトK1ドメインの配列に対応する。
配列番号１は79アミノ酸のサイズを有し、２つのシステインで挟まれている。
【００３９】
配列番号２は、５アミノ酸が欠損した、ヒトK1ドメインのバリアントに対応する。
【００４０】
【表１】
2018508197.tif 000002
【００４１】
配列番号２で表されるヒトK1ドメインのバリアントは、５つの連続したアミノ酸(SFLPS)の欠失により、配列番号１で表されるヒトK1ドメインとは異なる。
【００４２】
K1a及びK1bは、配列番号１のアミノ酸配列、又は、配列番号１に対して少なくとも80％、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列からなり得る。
【００４３】
本発明で定義する２つのペプチド配列間の「パーセンテージ同一性」は、比較ウインドウを通して、適切に整列させた２つの配列の比較により決定される。したがって、比較ウインドウ中のアミノ酸配列は、２つの配列の間での最適なアライメントの取得のために、基準配列(これは付加又は欠失を含まない)に対して付加又は欠失(例えば「gaps」)を含んでもよい。
【００４４】
パーセンテージ同一性は、比較される２つの配列においてアミノ酸残基が同一である位置の数を決定し、この数を比較ウインドウ中の位置の総数で割り、その結果に100を掛けて、２つのアミノ酸配列の互いのパーセンテージ同一性を得ることによって算出される。
【００４５】
パーセンテージ同一性は、全体のアミノ酸配列に対して、又は選択されたドメインに対して、好ましくは全体のアミノ酸配列に対して決定されてもよい。局所アライメントには、Smith-Watermanアルゴリズムが特に有効である(Smith T F, Waterman M S (1981) J. Mol. Biol. 147(1); 195-7)。
【００４６】
一実施形態で、本発明は、ペプチドドメインK1a及びK1bのそれぞれが、配列番号３及び配列番号４からなる群から選択される核酸配列によりコードされる、上で定義したタンパク質に関する。
【００４７】
配列番号３は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする核酸配列に対応する。
配列番号４は、配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列に対応する。
【００４８】
【表２】
2018508197.tif 000003
【００４９】
一実施形態で、本発明は、かかるタンパク質がK1a及びK1bを接続するペプチドリンカーを含む、上で定義したタンパク質に関する。
【００５０】
本発明は、それぞれK1a及びK1bと名付けられ、互いにペプチドリンカーで接続された２つのペプチドドメインからなるタンパク質であって、
該ペプチドドメインK1a及びK1bのそれぞれが、肝細胞増殖因子／分散因子(HGF/SF)のK1ペプチドドメイン(クリングル1)を含み、
該K1ペプチドドメインは、配列番号１に対して少なくとも80％の同一性、好ましくは少なくとも90％の同一性を有する配列からなり、
該タンパク質はチロシンキナーゼ受容体METの活性化を誘導できる、
タンパク質に関する。
【００５１】
一実施形態で、本発明は、ペプチドリンカーが1〜50アミノ酸、好ましくは10〜20アミノ酸で構成される、上で定義したタンパク質に関する。
【００５２】
特に、リンカーのサイズは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49又は50アミノ酸である。
一実施形態で、リンカーのサイズは４アミノ酸である。
【００５３】
一実施形態で、本発明は、かかるペプチドリンカーが配列番号５のアミノ酸配列(SEVE)を含むか又はそれからなる、上で定義したタンパク質に関する。
配列番号５のペプチドリンカーは、配列番号６の核酸配列(TCAGAAGTTGAA)によりコードされ得る。
【００５４】
一実施形態で、本発明は配列番号７のアミノ酸配列、又は配列番号７に対して少なくとも80％の同一性、好ましくは90％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいはそれからなるタンパク質に関する。
【００５５】
一実施形態で、本発明は配列番号８のアミノ酸配列、又は配列番号８に対して少なくとも80％の同一性、好ましくは90％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいはそれからなるタンパク質に関する。
【００５６】
【表３】
2018508197.tif 000004
【００５７】
配列番号７は、Ｎ端末からＣ端末までにおいて、配列番号１、配列番号６及び配列番号１により構成される。
配列番号８は、Ｎ端末からＣ端末までにおいて、配列番号２、配列番号６及び配列番号２により構成される。
【００５８】
一実施形態で、本発明のタンパク質は、そのＮ末端及び／又はＣ末端の端においてポリヒスチジンタグなどの切断可能タグを含む。かかるポリヒスチジンタグは、タグ付きタンパク質のアフィニティ精製を可能にするために使用できる。
【００５９】
一実施形態で、本発明は、配列番号９のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるタンパク質に関する。
【００６０】
【表４】
2018508197.tif 000005
【００６１】
【表５】
2018508197.tif 000006
【００６２】
配列番号13は、ヒスチジンタグのないK1K1タンパク質に対応する。
配列番号14は、SEVEリンカーが、柔軟なリンカーとしての17アミノ酸の配列(GGGGSLVPRGSGGGGS、配列番号17)により置換されている、本発明のK1K1タンパク質に対応する。この伸長リンカーは、トロンビンのための切断部位(LVPRGS、配列番号18)を含み、２つのK1ドメインに分離することが可能になる。
配列番号15は、SEVEリンカーが、構造的制約が全くないGSリンカー(GSGGS、配列番号19)により置換されている、本発明のK1K1タンパク質に対応する。
【００６３】
配列番号16は、K10E、R12E、K93E及びR95Eの変異が導入された、本発明のK1K1タンパク質に対応する。K10E及びR12Eの変異は、第一のクリングルドメインの部分であり、K93E及びR95Eは第二のクリングルドメインの部分である。標的のK10、R12、K93及びR95残基は、ヘパリンと相互作用するK１ドメインの正に荷電したパッチの部分である。この構造では、ヘパリンに対する親和性が低下していると予想されたので、ニッケル・アフィニティクロマトグラフィーによる精製を可能にするために、ヘキサヒスチジンタグがＣ末端に付加される。
【００６４】
特に、本発明は、次を含むか又はそれからなるタンパク質に関する：
- 配列番号９、配列番号13、配列番号14、配列番号15及び配列番号16から選択されるアミノ酸配列、又は
- 配列番号９、配列番号13、配列番号14、配列番号15及び配列番号16から選択される配列に対して少なくとも80％の同一性、好ましくは90%の同一性を有するアミノ酸配列。
【００６５】
特に、本発明のタンパク質は、配列番号９、配列番号13、配列番号14、配列番号15及び配列番号16から選択される１つの配列に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【００６６】
特に、本発明は、配列番号９、配列番号13、配列番号14、配列番号15及び配列番号16から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるタンパク質に関する。
【００６７】
一実施形態で、本発明は、かかるタンパク質が合成タンパク質又は組換タンパク質である、上で定義したタンパク質に関する。
【００６８】
本発明において、「合成タンパク質」は、液相又は固相合成法などの古典的な有機化学の方法を使用して合成されたタンパク質である。
本発明において、「組換タンパク質」は、遺伝子工学から生じるタンパク質である。遺伝的構築物は、組換タンパク質を得るために古典的な分子生物学的技術を使用して、ベクターに挿入されてもよいし、細菌又は酵母などの宿主細胞に発現されてもよい。
【００６９】
一実施形態で、本発明は、チロシンキナーゼ受容体METの活性化がヘパラン硫酸に依存しない、上で定義したタンパク質に関する。
【００７０】
インビボ条件下で、HGF/SFは細胞外マトリクスに存在するヘパラン硫酸鎖で固定化され、著しく減少した拡散及び／又は組織分布をもたらす。本発明のタンパク質は、高親和性ヘパラン硫酸結合部位(Ｎドメイン)を欠損しているので、遠隔の組織におけるMET受容体への拡散が可能である。
【００７１】
一実施形態で、本発明は、かかるタンパク質がKD≦200 nM、好ましくは≦100 nM、より好ましくは≦10 nMの解離定数でチロシンキナーゼ受容体METに結合可能である、上で定義したタンパク質に関する。
特に、かかるタンパク質は、KD≦200 nM、≦150 nM、≦100 nM、≦90 nM、≦80 nM、≦70 nM、≦60 nM、≦50 nM、≦40 nM、≦30 nM、≦10 nM、又は≦5 nMの解離定数でチロシンキナーゼ受容体METに結合可能である。
【００７２】
別の態様で、本発明はまた、上に定義する、少なくとも２つのK１ペプチドドメインを含むタンパク質を取得する方法であって、次の工程：
- 少なくとも２つのK１ペプチドドメイン、好ましくは２つのK１ペプチドドメインを含む組換タンパク質をコードする核酸配列を発現ベクターに挿入する工程、
- かかるベクターを宿主細胞にクローニングして、かかる組換タンパク質を発現させる工程、
- かかる組換タンパク質が少なくとも２つのK1ドメインを含み、かかる組換タンパク質を抽出及び精製する工程
を含む方法に関する。
【００７３】
別の態様で、本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸分子に関し、かかる核酸は、好ましくは配列番号10の核酸配列からなる。
【００７４】
【表６】
2018508197.tif 000007
【００７５】
配列番号10の核酸配列は、配列番号９のアミノ酸配列をコードする。
【００７６】
別の態様で、本発明は、上で定義した核酸分子を含む発現ベクターに関し、かかるベクターは、好ましくは配列番号11の核酸配列を含むか又はそれからなる。
【００７７】
【表７Ａ】
2018508197.tif 000008
【００７８】
【表７Ｂ】
2018508197.tif 000009
【００７９】
【表７Ｃ】
2018508197.tif 000010
【００８０】
【表７Ｄ】
2018508197.tif 000011
【００８１】
別の態様で、本発明は、上に定義した発現ベクターを含む宿主細胞に関し、かかる宿主細胞は、好ましくは酵母細胞及び細菌細胞からなる群から選択される。
【００８２】
別の態様で、本発明はまた、次を含む組成物に関する：
- 上に定義したタンパク質、又は
- かかるタンパク質をコードする核酸分子、又は
- かかる核酸分子を含む発現ベクター、又は
- かかる発現ベクターを含む宿主細胞。
【００８３】
別の態様で、本発明はまた、インビボ診断方法に用いる、上に定義したタンパク質に関する。
本発明のタンパク質は、そのMETに結合する能力により、診断方法のための、特にHGF/SF及びMET分子の発現に関与する病変の診断方法のための有用なツールになる。
【００８４】
一実施形態で、本発明は、癌、急性及び慢性肝臓病、急性及び慢性腎臓病、慢性肺疾患及び慢性皮膚創傷を含む上皮器官の疾患、ニューロン疾患及び硬化症を含む中枢神経の疾患、虚血性心疾患、末梢血管疾患、糖尿病及び末梢神経障害などの関連する合併症から選択される病変の診断方法に用いるための、上に定義したタンパク質に関する。
【００８５】
一実施形態で、本発明は、癌、急性及び慢性肝臓病、急性及び慢性腎臓病、慢性肺疾患及び慢性皮膚創傷を含む上皮器官の疾患、ニューロン疾患及び硬化症を含む中枢神経の疾患、虚血性心疾患、末梢血管疾患、糖尿病及び末梢神経障害などの関連する合併症から選択される病変のインビボ診断方法に用いるための、上に定義したタンパク質に関する。
【００８６】
一実施形態で、本発明は、かかる癌がチロシンキナーゼ受容体METを発現する腫瘍である、インビボ診断方法に用いるための、上に定義したタンパク質に関する。
別の態様で、本発明は、医用撮像に用いるための、上に定義したタンパク質に関する。
別の態様で、本発明は、インビボ撮像に用いるための、上に定義したタンパク質に関する。
【００８７】
一実施形態で、本発明は、かかるタンパク質により薬物及び／又は造影剤の検出及び／又は追跡を可能にする、医用撮像に用いるための、上に定義したタンパク質に関する。
特に、本発明のタンパク質は、画像誘導手術に使用できる。現在、術前及び術中の画像化は、手術器具の入念な位置決め及び特定組織の除去において、外科医師の支援に利用されている。蛍光(IR/NIR)プローブは、術中の生体画像化に使用できる。
別の態様で、本発明は、インビトロ診断ツールとしての、上に定義したタンパク質の使用に関する。
【００８８】
一実施形態で、本発明は、病変のインビトロ診断のための、上に定義したタンパク質の使用に関し、かかる病変は、癌、急性及び慢性肝臓病、急性及び慢性腎臓病、慢性肺疾患及び慢性皮膚創傷を含む上皮器官の疾患、ニューロン疾患及び硬化症を含む中枢神経の疾患、虚血性心疾患、末梢血管疾患、糖尿病及び末梢神経障害などの関連する合併症から選択される。
【００８９】
一実施形態で、本発明は、かかる癌がチロシンキナーゼ受容体METを発現する腫瘍である、病変のインビトロ診断のための、上に定義したタンパク質の使用に関する。
別の態様で、本発明は、インビトロ又はエクスビボ撮像のための本発明のタンパク質の使用に関する。
【００９０】
診断方法及び医用画像では、タンパク質は、投薬(例えば生検を用いる)により又は画像(PETスキャン又はIRMなどの技術で入手したもの)により、生体試料において検出及び定量できる。
実際、本発明のタンパク質は、マーカーで標識することができ、MET受容体の検出、局在化及び定量化を可能にする。
例えば、タンパク質は、放射線医薬品トレーサ又は蛍光トレーサで標識できる。
【００９１】
かかる放射線医薬品トレーサとしては、カルシウム47、炭素11、炭素14、クロム51、コバルト57、コバルト58、エルビウム169、フッ素18、ガリウム67、ガリウム68、水素3、インジウム111、ヨウ素123、ヨウ素125、ヨウ素131、鉄59、クリプトン81m、窒素13、酸素15、リン32、ラジウム223、ルビジウム82、サマリウム153、セレン75、ナトリウム22、ナトリウム24、ストロンチウム89、テクネチウム99m、タリウム201、キセノン133、イットリウム90が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
かかる蛍光トレーサとしては、蛍光色素(ローダミン誘導体、クリマン誘導体、フルオレセイン誘導体など)、又は蛍光タンパク質(GFP(緑色)、YFP(黄色)、RFP(赤色)、又はフィトクロムに基づく近赤外蛍光タンパク質(iRFP)が挙げられるが、これらに限定されない。
特に、赤外(IR)色素及び近赤外(NIR)色素、並びに蛍光タンパク質は、高い浸透性と低い自己蛍光により、インビボ撮像に好ましいトレーサである。
【００９３】
別の態様で、本発明は、上で定義したタンパク質を患者に投与する工程を含む、病変のインビボ診断方法に関し、かかる病変は、癌、急性及び慢性肝臓病、急性及び慢性腎臓病、慢性肺疾患及び慢性皮膚創傷を含む上皮器官の疾患、ニューロン疾患及び硬化症を含む中枢神経の疾患、虚血性心疾患、末梢血管疾患、糖尿病及び末梢神経障害などの関連する合併症から選択される。
【００９４】
別の態様で、本発明は、上に定義したタンパク質を患者に投与する工程を含む、医用撮像の方法に関する。
一実施形態で、本発明はまた、かかるタンパク質により、チロシンキナーゼ受容体METの検出が可能である、医用撮像の方法に関する。
一実施形態で、本発明は、かかるタンパク質により、抗体のプレターゲティングが可能である、医用撮像の方法に関する。
実際、本発明のタンパク質は、トレーサの特定のエピトープを認識する抗体への結合が可能である。
【００９５】
別の態様で、本発明はまた、次を含む医薬組成物に関する：
- 上に定義したタンパク質、又は
- 該タンパク質をコードする核酸分子、又は
- 該核酸分子を含む発現ベクター、又は
- 該発現ベクターを含む宿主細胞、及び
医薬的に許容可能な賦形剤。
【００９６】
別の態様で、本発明はまた、医薬品として用いるための、上に定義したタンパク質に関する。
一実施形態で、本発明は、細胞生存又は組織再生を促進することによる組織損傷の治療に用いるための、上に定義したタンパク質に関する。
【００９７】
一実施形態で、本発明は、急性及び慢性肝臓病、急性及び慢性腎臓病、慢性肺疾患及び慢性皮膚創傷を含む上皮器官の疾患、ニューロン疾患及び硬化症を含む中枢神経の疾患、虚血性心疾患、末梢血管疾患、糖尿病及び末梢神経障害などの関連する合併症から選択される病変の治療に用いるための、上に定義したタンパク質に関する。
【００９８】
一実施形態で、本発明は、かかるタンパク質が約1 mg/kg〜1,000 mg/kg、好ましくは約10 mg/kg〜約100 mg/kgの用量で投与可能である、組織損傷の治療に用いるための又は上に定義した病変の治療に用いるための、上に定義したタンパク質に関する。
【００９９】
一実施形態で、本発明は、かかるタンパク質が1 mg〜1,000 mg、特に10 mg〜1,000 mg、特に100 mg〜1,000 mgの単位用量で経口又は静脈内経路により投与可能となり得る形態で用いられる、組織損傷の治療に用いるための又は上に定義した病変の治療に用いるための、上に定義したタンパク質に関する。
【０１００】
別の態様で、本発明は、インビボ、エクスビボ又はインビトロ条件下で血管新生を促進する、上に定義したタンパク質の使用に関する。
本発明のタンパク質は、その強力なMETアゴニスト活性により、METとHGF/SFとの相互作用の機構を理解するために使用できる。
別の態様で、本発明は、インビトロ研究用ツールとしての、上に定義したタンパク質の使用に関する。
別の態様で、本発明は、かかるタンパク質が、少なくとも２つのK1ドメインによりチロシンキナーゼ受容体METと複合化された、上に定義したタンパク質とチロシンキナーゼ受容体METとの間の分子複合体に関する。
【０１０１】
本発明を以下の図及び実施例により分かり易く説明する。いずれの場合でも、以下の実施例が発明の範囲を限定することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】大腸菌においてK1K1の発現に使用されるプラスミド。HGF/SFのK1ドメイン(aa 128-206)の２つのコピーは、(縦一列に)頭-尾配向で配置され、lacプロモータの制御下で発現する。
【図２】大腸菌BL21培養物の封入体からのK1K1タンパク質のHisTRap精製。(a)溶出プロファイル。HisTrapに結合した主要なタンパク質ピークに対応するフラクション(黒のバー)(6、7、8、9及び10)を還元条件下でSDS-PAGEにより分析し、結果を(b)に示す。
【図３】K1K1タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー。His-Trapカラムからの主要なピークに対応するフラクション(図２)をプールして濃縮し、アリコートをSuperdexカラムに装填した(a)。３つのピークにわたるフラクションを、非還元条件下(b)又は還元条件下(c)でSDS-PAGEにより分析した。ピーク2とピーク3の両方は、主としてK1K1タンパク質を含む(ピーク2は二量体の二量体を含み、ピーク3は予期された二量体を含む)。非還元ゲルは、封入体からのK1K1タンパク質の前洗浄HisTrap精製を示す。
【図４】K1K1タンパク質の陽イオン交換クロマトグラフ。His-Trapカラムからの主要なピークに対応するフラクション(図２)をプールして濃縮し、アリコートを1mlのResource-Sカラムに装填した(a)。NaCl勾配で溶出したフラクションだけでなく非結合材(ピーク1)も、MDCKコロニー分散アッセイで生物活性について試験した。すべての活性はピーク2で回復した。
【図５】K1K1刺激に対するMETシグナル伝達分析。HeLa細胞を100 pM及び500 pMのHGF/SF(HGF)、1 nM、10 nM及び100 nMのK1K1、並びに1 nM、10 nM、100 nMのNK1で処理した。次に、細胞溶解物を特異的な全MET、Akt及びERK、又はリン酸化MET、リン酸化Akt及びリン酸化ERKのウエスタンブロット法により分析した。Ctrl: DMEM 0.1% FCS(ウシ胎児血清)。
【図６】ALPHAscreen(登録商標) MET-Fc-K1K1及びERK/Akt活性化。(a)Alphascreen MET-Fc-K1K1。K1K1を組換MET-Fcタンパク質に結合させる交差力価測定アッセイを、384ウェルのマイクロタイタープレートで実施した。最終濃度は、K1K1が0〜300 nM、MET-Fcが0〜10 nM、ストレプトアビジンで被覆したドナービーズ及びプロテインＡ結合アクセプタービーズが10μg/mLであった。(b)定量的ALPHAアッセイによるAkt及びERKのリン酸化。細胞をプレートに播種し、異なるアゴニスト(HGF/SF、NK1、K1K1及びK1B(ビオチン化K1))で刺激した後、同じ96ウェル培養プレートで溶解した。ALPHAScreen(登録商標) SureFire(登録商標) Ultra(商標)のアクセプタービーズ及びドナービーズを添加して、２時間インキュベートした。放射信号強度を、EnSpire(登録商標)マルチモードプレートリーダ(PerkinElmer)を標準アルファ設定にして測定した。
【図７】K1K1刺激に対するMETシグナル伝達分析。HeLa細胞を100 pMのHGF/SF(HGF)、100 nMのK1K1又は100 nMのNK1で１分、５分、10分又は20分間処理した。次に、細胞溶解物を特異的な全MET、Akt及びERK、又はリン酸化MET、リン酸化Akt及びリン酸化ERKのウエスタンブロット法により分析した。
【図８】K1K1タンパク質の生物活性。K1K1タンパク質(HisTrapプール)のMDCKコロニー分散活性を試験し、精製組換え完全長HGF/SF及びNK1と比較した。データは、5回(HGF/SF)、7回(K1K1)及び7回(NK1)の実験のそれぞれからの平均±標準偏差である。
【図９】K1K1タンパク質により誘導される細胞表現型(細胞分散アッセイ)。MDCK単離細胞島を、100 pMのHGF/SF、100 nMのNK1及び100 nMのK1K1が添加された培養培地中にインキュベートした。次に、細胞を染色して、顕微鏡下(100倍)で観察した。
【図１０】K1K1タンパク質により誘導される細胞表現型(Matrigel(商標)形態形成アッセイ)。MDCK細胞をMatrigel(商標)のマトリゲルの層に播種して、100 pMのHGF/SF、100 nMのNK1、及び100 nMのK1K1で処理した。次に、細胞を、培養１日後(a)及び培養２日後(b)に顕微鏡下(40倍又は100倍)で観察した。
【図１１】細胞表現型(MTTアッセイ)。MDCK細胞を、アニソマイシン(0.7μM)添加又は無添加の培地中に、500 pMのHGF/SF(HGF)、100 nMのK1K1及び100 nMのNK1の存在下で一晩(15時間)培養した。次に、MTTアッセイを実施して、細胞生存を評価した。結果を未処理対照のパーセンテージで表す。ANOVA試験をP値<0.05を統計的有意と考えて実施して、３つの平均を比較した。ANOVA試験を全ての平均の比較に実施し、P値<0.001は統計的有意差を示すと考えられた。
【図１２】K1K1刺激のMETシグナル伝達分析。(A)HeLa細胞を500 pMのHGF/SF (HGF)、1 nMのK1K1、1 nMのバリアント1、1 nMのバリアント2、1 nMのバリアント3、1 nM及び100 nMのNK1で処理した。(B)HeLa細胞を10 pM、100 pM及び500 pMのHGF/SF(HGF)、100 pM、500 pM及び1000 pMのバリアント1、及び100pM、500pM及び1000pMのK1K1で処理した。次に、細胞溶解物を特異的な全MET、Akt及びERK、又はリン酸化MET、リン酸化Akt及びリン酸化ERKのウエスタンブロット法により分析した。Ctrl: K1単量体。
【図１３】定量的ALPHAアッセイによるAkt及びERKのリン酸化。細胞をプレートに播種し、異なるアゴニスト(HGF/SF、NK1、K1K1並びにバリアント１、2及び3)の濃度を増加して10分間刺激し、同じ96ウェル培養プレート中に溶解した。ALPHAScreen(登録商標) SureFire(登録商標)反応混合物を添加し、製造業者のプロトコール(TGRES500及びTGRA4S500)に則って２時間インキュベートした。放射信号強度を、EnSpire(登録商標)マルチモードプレートリーダ(PerkinElmer)を標準アルファ設定にして測定した。
【図１４】K1K1タンパク質により誘導される細胞表現型(細胞分散アッセイ)。MDCK単離細胞島を、500 pMのHGF/SF、1 nM、10 nM及び100 nMのK1K1、10 nMのK1K1バリアント1、2及び3、及び100 nMのK1単量体を用いて培養培地中にインキュベートした。次に、細胞を染色して顕微鏡下(100倍)で観察した。Ctrl: DMEM 10% FCS 。
【図１５Ａ】K1K1タンパク質により誘導される細胞表現型(Matrigel(商標)形態形成アッセイ)。MDCK細胞をMatrigel(商標)のマトリゲルの層に播種し、1 nMのHGF/SF、100 nMのNK1、100 nMのK1K1、バリアント1、2又は3、及び100 nMのK1単量体で処理した。次に、細胞を、培養１日後(A)、２日後(B)及び３日後(C)に顕微鏡下(40倍)で観察した。Ctrl: DMEM 10% FCS。
【図１５Ｂ】K1K1タンパク質により誘導される細胞表現型(Matrigel(商標)形態形成アッセイ)。MDCK細胞をMatrigel(商標)のマトリゲルの層に播種し、1 nMのHGF/SF、100 nMのNK1、100 nMのK1K1、バリアント1、2又は3、及び100 nMのK1単量体で処理した。次に、細胞を、培養１日後(A)、２日後(B)及び３日後(C)に顕微鏡下(40倍)で観察した。Ctrl: DMEM 10% FCS。
【図１５Ｃ】K1K1タンパク質により誘導される細胞表現型(Matrigel(商標)形態形成アッセイ)。MDCK細胞をMatrigel(商標)のマトリゲルの層に播種し、1 nMのHGF/SF、100 nMのNK1、100 nMのK1K1、バリアント1、2又は3、及び100 nMのK1単量体で処理した。次に、細胞を、培養１日後(A)、２日後(B)及び３日後(C)に顕微鏡下(40倍)で観察した。Ctrl: DMEM 10% FCS。
【図１６】K1K1タンパク質により誘導される細胞表現型(Matrigel(商標) 3D形態形成アッセイ)。MDCK細胞をタイプ1コラーゲンMatrigel(商標)に播種し、1 nMのHGF/SF (HGF)、100 nMのK1K1、100 nMのK1K1バリアント1及び100 nMのK1単量体を含む培養培地を、かかる層に添加した。細胞を固定して染色し、顕微鏡下(100倍)で観察した。Ctrl: DMEM 10% FCS。
【図１７】K1K1バリアント1(タグ無し)によるインビボMET活性化。マウスに5μgのK1単量体又は5μgのK1K1バリアント1を注射した(IV)。10分後に肝臓を取り出し、急速冷凍して破砕した。細胞溶解物中のMET、Akt及びERKのリン酸化状態をウエスタンブロット法で分析した。
【図１８】K1K1及びK1K1バリアント1(タグ無し)の結晶構造及び分子整列。1.8Åの分解能でのK1K1バリアント1(タグ無し)の結晶構造。MET受容体の結合の原因として知られた残基は、図(A)中に点在している。K1K1(A)及びK1K1バリアント1(タグ無し)(B)の構造的アライメント。0.819Åの算出されたRMSD値は、図(B)の右下隅に示されている。
【図１９】大腸菌BL21培養物の封入体からのK1K1タンパク質のHisTRap精製。溶菌液(大腸菌、BL21)の還元SDS-PAGE、及び精製の異なるステージでのK1K1タンパク質。(A)レーンM：分子量マーカー、レーン1：超音波処理後の不溶性粗物質、レーン2：超音波処理後の可溶性粗物質、レーン3：２MのL-アルギニンにおける72時間の可溶化後のK1K1、レーン4：アフィニティクロマトグラフィー精製後のK1K1(HisTrap FF 5ml)、レーン5：サイズ排除クロマトグラフィー後のK1K1。(B)ncIBs封入体から抽出されたK1K1(H6)タンパク質のHisTrapクロマトグラフィー。(C)ncIBs封入体から抽出されたK1K1(H6)タンパク質のSuperdex75クロマトグラフィー。
【図２０】大腸菌BL21培養物の封入体からのK1K1バリアント1(タグ無し)のアフィニティクロマトグラフィー精製(HiTrapTMヘパリンHPカラム)。主要なタンパク質のピークに対応するフラクションを一緒にプールし、分取ゲル濾過クロマトグラフィーに適切な体積に濃縮した。
【図２１】K1K1バリアント1(タグ無し)のサイズ排除クロマトグラフィー。HiTrapTM HPカラムからの主要なピークに対応するフラクション(図20)をプールして濃縮し、アリコートをSuperdexカラムに装填した。
【実施例】
【０１０３】
実施例１．K1K1及びK1K1バリアント1(タグ無し)の生産
原核生物発現プラスミド(pET45b(+)-K1K1)を、HGF/SFのK1ドメイン(aa 128-206)の２つのタンデム反復を含むDNAフラグメントをサブクローニングして構築した(図１)。短いリンカーは、第１と第２のK1ドメインとを接続する。構築物を、HGF/SF-K1K1(K1K1と略称)と称する。該原核生物発現プラスミドをBL21(DE3)細胞にトランスフェクトした。
【０１０４】
形質転換が成功した後、タンパク質産生が開始され、この期間に細菌細胞を、低濃度のIPTG(0.4 mM)の誘導後から24時間、18℃で増殖させた。抽出を非常に穏やかに実施した後、K1K1(又はそのバリアント)を含む封入体を高濃度のL-アルギニンを含む緩衝液中に再懸濁させ、４℃で72時間インキュベートして、タンパク質を可溶化して抽出した。次に、抽出されたタンパク質を、アフィニティクロマトグラフィーと、それに続くゲル濾過クロマトグラフィー工程により精製した。
【０１０５】
図２に、非定型的な封入体に富み、且つ25℃にて0.4 mMのIPTGでBL21細胞を一晩かけて誘導した後に２MのL-アルギニンにより可溶化/再生されたフラクションのHis-Trapカラムに対する典型的な溶出プロファイルを示した。主要なピークを0.2 M以下のイミダゾールで溶出し(図2a)、K1K1タンパク質を主に含む(図2b)。
【０１０６】
K1K1タンパク質は均一ではない。Superdex75でのHisTrapプールのサイズ排除クロマトグラフィーは、３つのピークを示す(図3a)。ピーク1は、HisTrapプールにおいて容易に分解されて通常は存在しない小規模な高分子量汚染物質を表す。ピーク2及び3は常に観察され、両方ともK1K1タンパク質を含む。ピーク3は、Superdex75において予期した溶出量、及びSDS-PAGEにおいて予期した見かけの質量を伴うタンパク質を含む。ピーク2は「二量体の二量体」、すなわち、主要なK1K1ピークから分離でき、且つ非還元条件下のSDS-PAGEではゆっくり泳動するが(図3b)、還元ゲルにおいて主要なK1K1タンパク質と区別できない(図3c)２つのK1K1分子を含む(補足的結果を図19に示す)。
【０１０７】
K1K1タンパク質のHisTrapプールの不均一性は、陽イオン交換クロマトグラフで確認された(図４)。陽イオン交換カラムにより３つのピークに分離され、そのうちの主要なピーク(ピーク2)は強力な生物活性を有する。ピーク1とピーク3は生物学的に不活性である。
【０１０８】
ポリヒスチジンタグを欠く別のK1K1バリアントを、ヘパリン-セファロースのアフィニティクロマトグラフィーカラムを使用するアフィニティクロマトグラフィーを介して精製した。図20に、L-アルギニンで可溶化後のK1K1バリアント1(タグ無し)の典型的なHisTrap(商標)ヘパリン溶出プロファイルを示した。主要なピークは、ゲル濾過クロマトグラムに示されるように、高純度K1K1バリアント1(タグ無し)を含む(図21)。
【０１０９】
ヘパリンアフィニティクロマトグラフィーとその後のゲル濾過に基づくプロトコールは、Hisタグの存在に依存しない。ヘパリンは、適切に折り畳まれたタンパク質の精製を可能にするが、ニッケルカラムは特異性/弁別性が劣る。このプロトコールは、すべてのバリアントに使用可能である。
【０１１０】
実施例２．K1K1は強力なMETアゴニストである
K1K1の結合能力を、組換MET-IgG1キメラを使用する交差力価測定ALPHAScreen(登録商標)アッセイで測定し(図6A)、K1K1とMETとの結合を示す。HGF/SF、K1K1、K1B(ビオチン化単量体K1ドメイン)又は組換NK1とインキュベーションしたHeLa細胞におけるMET活性化及び下流のシグナル伝達を、ウエスタンブロット法(図５)又はALPHAscreenの定量的アプローチ(図6B)により分析した。典型的には、HGF/SFはpM濃度まで、最大のERK及びAkt活性化を誘発した。興味深いことに、K1K1は、ERK及びAktのリン酸化レベルを、低いnMの範囲まで誘発できたので、NK1タンパク質と同様のアゴニスト活性を示した。さらに、K1K1は100 nMで強力なMETリン酸化を誘導した。
【０１１１】
また、ウエスタンブロット法を用いて、MET及び下流のシグナル伝達活性化動態(0〜20分間)を測定した(図７)。典型的には、HGF/SFは、5分から10分の間に最大のMET自己リン酸化を誘導し、続いて約10分から20分ごろに最大のAkt及びERKのリン酸化を誘導した。比較すると、METリン酸化は、K1K1及びNK1では最初の１分間以内に非常に速やかに進行し、そして低減した。このことから、最大のERK及びAkt活性化は早い時期に、つまり僅か３分から７分後に観察された。
【０１１２】
実施例３．K1K1は細胞分散、形態形成及び生存表現型を促進する
K1K1タンパク質の生物活性に関する最初の研究は、MDCKコロニー分散アッセイを用いて行われ、図８に要約されている。７つの異なる発現実験からのHisTrapプールの活性を、天然の完全長HGF/SF、及び広範囲に特性化されたHGF/SFのフラグメントであって、より有用なベンチマークであるNK1のそれらと比較した。K1K1の活性は、モル基準でHGF/SFのそれよりも〜３倍低い。
【０１１３】
18〜24時間のHGF/SF(100 pM)存在下で、MDCK細胞は、間葉様表現型及び分散性を得た。この際立った表現型は、NK1タンパク質及びK1K1によっても誘導された(図９)。
【０１１４】
さらなる細胞アッセイを、基底細胞外マトリクスの模倣として管腔基底細胞様マトリクス(Matrigel(商標))を用いて行った。この条件下で無処理の場合、MDCK細胞は、24時間以内に自発的にMatrigel(商標)上に密な球状クラスターを形成する。これに対して、HGF/SFで刺激すると、MDCK細胞は、分岐した連結構造に自己組織化する。とりわけ、NK1及びK1K1は、かかる構造の形成を広範囲にわたって促進した(図10)。
【０１１５】
アポトーシスストレス後の細胞の生存を促進するアゴニストの能力を試験した。この表現型は、血清除去、紫外線照射、虚血又は一部の化学物質により誘導される死に対して多くの細胞型を保護するHGF/SFの特徴である。MDCK細胞に、DNA及びタンパク質合成の阻害剤であってアポトーシスを誘導するアニソマイシンを用いてストレスを与えた。アニソマイシン処理は、16時間後に90%以下の細胞死を誘導したが、HGF/SFで前処理した場合は僅か10%以下の細胞死の誘導であった(図11)。K1K1及びNK1での前処理により25％以下の細胞死となることから、これらも有意な程度に細胞を保護する。
【０１１６】
実施例４．別のK1K1構築物からの相補的結果
HGF/SF、K1K1(6xHisタグ)、K1K1バリアント1(タグ無し)、K1K1バリアント2(長いリンカー)、K1K1バリアント3(GSリンカー)又は組換NK1とインキュベーションしたHeLa細胞におけるMET活性化及び下流のシグナル伝達を、ウエスタンブロット法(図12)及びALPHAScreen(登録商標)定量化アプローチ(図13)で分析した。典型的に、HGF/SFはpM濃度まで、最大のERK及びAkt活性化を誘発した。興味深いことに、K1K1及びそのバリアントは、ERK及びAktのリン酸化レベルを100 pMの範囲まで誘発できたので、NK1よりも少なくとも10倍強力なアゴニスト活性を示した。さらに、K1K1及びそのバリアントは、100 pMで開始する強力なMETリン酸化を誘導した。
【０１１７】
24時間のGF/SF存在下に、MDCK細胞は、間葉様表現型及び分散性を得た(図14)。この際立った表現型は、K1K1及びバリアント1、2及び3によっても誘導された。K1単量体は影響を与えない。
【０１１８】
さらなる細胞アッセイを、基底細胞外マトリクスの模倣として管腔基底細胞様マトリクス(Matrigel(商標))を用いて行った。この条件下で無処理の場合、MDCK細胞は、24時間以内に自発的にMatrigel(商標)上に密な球状クラスターを形成する。これに対して、HGF/SFで刺激すると、MDCK細胞は、分岐した連結構造に自己組織化する。とりわけ、K1K1及びそのバリアントは、かかる構造の形成を広範囲にわたって促進した(図15)。
【０１１９】
同様に、コラーゲン/Matrigel(商標)マトリクスに培養された場合、MDKC細胞は、分岐構造に自己組織化した。これらの3D構造の侵襲性及び分岐は、HGFにより強力に促進された。明らかに、K1K１及びバリアント1は、壮大な3D形態形成を促進した(図16)。
【０１２０】
最後に、K1単量体又はK1K1バリアント1を静脈注射し、MET受容体が強く発現していることが知られた臓器である肝臓におけるMET及び下流経路の活性化を調べた。肝臓を10分後に取り出して、MET、ERK及びAktのリン酸化状態をウエスタンブロット法で分析した(図17)。K1K1バリアント1の注射により、肝臓での強いAkt及びERK活性化に関連する明らかなMETリン酸化が誘導された。これに対して、コントロールのK1では、検出可能なシグナルを生じなかった。
【０１２１】
実施例５．K1K1バリアント1(タグ無し)の3D構造
K1K1とK1K1バリアント1(タグ無し)との両方の結晶構造をＸ線結晶学により、それぞれ1.4及び1.8Å(オングストローム)の分解能で明らかにした。これらの構造は非常に興味深く、重要な事実を示す：両方のケースにおいて、K1K1分子は、外部に露出した広がった立体配座をとり、両側に２つのMET結合部位をとる(図18、パネルA)。このことは、活性化シグナル伝達複合体を形成する正しい配向で２つの受容体を結合可能な分子の生成の有用性を確認する。K1K1及びK1K1バリアント1の3D構造の整列から、これらは１Åよりも小さいRMSD値(原子配置の根平均二乗偏差)でほぼ同一である(図18、パネルB)。
【０１２２】
方法
ベクター構築
原核生物発現プラスミド(pET45b(+)-K1K1)を、頭-尾(N-terからC-terまで)配向でK1ドメインの２つのコピーを含むDNAフラグメントをサブクローニングして構築した。K1K1をコードするcDNA配列を、酵母P.パストリスでのK1K1の発現のために生産された別の発現プラスミド(pPIC9K-K1K1)からPCRにより増幅した。発現ベクター(pET45b(+)-K1K1)を組み立てるために、それぞれが予めPCR技術で増幅されている２つのヒトSGF/SFクリングル1ドメインの融合によって、K1K1 cDNAを予め生成した。K1K1のＮ末端単量体を増幅させるために、次のプライマーのセットを使用した：フォワードプライマーP1(5'-ATCATCCCATGGCCATTAGAAACTGCATCATTGGTAAAGGACG-3')(配列番号22)及びリバースプライマーP3(5'-TTCAACTTCTGAACACTGAGGA-3')(配列番号20)。Ｃ末端単量体については、次のプライマーのセットを使用した：フォワードプライマーP4((5'-CAGAAGTTGAATGCATCATTGGTGAAGGA-3')(配列番号21)及びリバースプライマーP2 (5'-ACAGCGGCCGCTCATCAA-3')(配列番号23)。Ｎ末端とＣ末端の融合を可能にするために、K1 cDNAのフォワードプライマーP3とリバースプライマーP4の両方ともHpy188I制限部位を有する。
【０１２３】
次のプライマー対において、フォワードプライマーP1(5'-ATCATCCCATGGCCATTAGAAACTGCATCATTGGTAAAGGACG-3')(配列番号22)及びリバースプライマーP2(5'-ACAGCGGCCGCTCATCAA-3')(配列番号23)は、それぞれNcoI部位及びNotI部位を有し、発現ベクターへのK1K1 cDNAの挿入を可能にする。PCR条件は、94℃で15秒間、54℃で30秒間、68℃で60秒間の28サイクルで構成され、かつDNS増幅に使用された酵素はPatinum(登録商標) Pfx DNAポリメラーゼ(Invitrogen)であった。PCR増幅されたDNAフラグメントを、臭化エチジウム(EB)を含む1.5％アガロースゲルで分離し、(長波長の)UV光照射下で可視化した。バンドを、Zymoclean(商標) Gel DNA Recoveryキット(Zymogen)を用いてアガロースゲルから回収して精製し、NcoI(New England Biolabs)及びNotI(New England Biolabs)を用いて消化した。pET45b(+)プラスミドをNcoI及びNotIで制限し、脱リン酸化して1％アガロースゲルから単離した。消化産物を、DNA Clean & Concentrator(商標)キット(Zymogen)を用いてアガロースゲルから回収して精製し、続いてK1K1 cDNAを、Quick ligaseキット(New England Biolabs)を用いてオープンベクターに挿入させた。ライゲーション生成物で大腸菌MACH1細胞(New England Biolabs)を形質転換させ、細菌を、アンビシリン含有LB寒天平板上にて一晩増殖させた。単一コロニーを、T7ユニバーサル・フォワードプライマー(5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3')(配列番号24)アニーリングと、リバースプライマーとしてのプライマーP2(配列番号23)とを用いるPCRによりスクリーニングした。K1K1構築物におけるクリングルドメインの正しい配向の確認及び人為的変異の不存在を、両方の鎖での全ての構築物の配列決定で確認した。
【０１２４】
大腸菌発現
K1K1タンパク質及びそのバリアントは、合計で６つのジスルフィド結合(それぞれのクリングルドメインに３つ)を含む。大腸菌におけるジスルフィドリッチタンパク質の生産は重大な課題であり、大多数の場合、かかるタンパク質は、封入体と呼ばれる大きな凝集体で蓄積する。典型的な封入体は直径が0.5μm-1.3μmであり、細菌の細胞質の内側又はペリプラスムに見出される。封入体は、主に標的タンパク質(50％から90％まで)からなる一方で、別の細胞質タンパク質及び別の細胞構成成分がほぼ常に封入体に付随する。しかし、特に低い温度で培養するときには、封入体は、正しく折り畳まれた標的タンパク質も含み得る。この「非古典的な」封入体は、非変性条件下で効果的に抽出される、標的タンパク質の正しく折り畳まれた前駆体に富む。
【０１２５】
この後者の戦略を、正しく折り畳まれ、且つ生理的に活性なK1K1の発現のために採用した。手短に言えば、プラスミドpET45b(+)-K1K1を使用して、大腸菌のDH5α株(増殖用)及びBL21株(発現用)を形質転換した。BL21細胞を0.5〜0.6のOD600に到達するまで、アンピシリンを含むLB培地において37℃で培養され、この到達点において0.4 mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を用いて発現を誘導した。誘導後、振とうインキュベータ(250rpm)内で18℃にて24時間、細胞を増殖させた。細胞を5,000gで30分間、４℃で遠心分離して採取し、PBSに再懸濁して、超音波処理(40秒間隔で、20秒を10サイクル)により溶解した。別法では、リゾチームを使用して37℃で１時間、細胞を溶解し、続いて凍結融解又はEmulsyflexを用いる機械的溶解の数サイクルで溶解した。超音波処理又はリゾチーム処理後、細胞溶解物を5,000gで30分間、４℃で遠心分離し、0.4%(v/v)トリトンX-100を含むPBSで再懸濁し、穏やかに撹拌しながら室温で１時間、インキュベートして非特異吸着タンパク質を除去した。再度、溶解物を5,000gで30分間、４℃で遠心分離し、ペレットを、0.025%(v/v)フェノキシポリエトキシエタノール(NP40)を含むPBSで再懸濁し、４℃で１時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートして非特異吸着タンパク質を除去し、続いて新たに遠心分離をした。最後に、ペレットを氷冷PBSで数回洗浄して微量の洗剤を除去した。L-アルギニンを用いたK1K1タンパク質の可溶化及び再生のために、ほぼ純粋な封入体からなる得られたペレットを、２MのL-アルギニンを含むPBSに再懸濁し、250 rpmの振とう速度で37℃にて一晩インキュベートした。
【０１２６】
アフィニティクロマトグラフィー
２MのL-アルギニンでの一晩のインキュベーションと、さらなる遠心分離工程(5,000gで30分間、４℃)の後に得られた上清を、0.22μmのフィルターで濾過して、2 ml/分で500 mMのNaC1に調整されたPBSで平衡化された、1 mlのHisTrap粗FF親和性カラムに装填した。ベースラインがゼロに戻るまでカラムを洗浄し、結合タンパク質を、500 mMのNaClに調整されたPBS中のイミダゾール(0-500 mM)の勾配(130 ml)で溶出した。タンパク質含有フラクションを、SDS-PAGE、Superdex 75 10/30 (GE Healthcare)カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーにより、また生物活性について、MDCKコロニー分散アッセイを用いて分析した(Stoker, M. et al., Scatter factor is a fibroblast-derived modulator of epithelial cell mobility. Nature 327, 239-242 (1987))。
【０１２７】
別法では、２MのL-アルギニンでの72時間のインキュベーションと、さらなる遠心分離工程(15,000gで30分間、４℃)の後に得られた上清を、100倍にして希釈してローディングバッファー(25 mM Tris pH 7.4、500 mM NaCl)に入れ、0.22μmのフィルターで濾過した。この方法で準備した試料を、1.5 ml/分の流速で一晩中、カラム(5 ml HisTrapTM-FF)に装填した。カラムを、記録されたUVトレースが平坦で低い吸光度ベースラインを示すまで洗浄した。次に、結合した物質を、10カラム容積の50％緩衝液B(25 mM Tris、pH 7.4、500 mM NaCl 1 Mのイミダゾール)を用いる段階勾配溶出により5 ml／分で溶出し、１つの工程で100％緩衝液Bに到達し、これを別の10カラム容積において維持した。UV吸光を289 nmでモニターし、5 mlのフラクションを全溶出の手順にて回収した。
【０１２８】
ゲル濾過クロマトグラフィー
HiLoadTM 16/60 SuperdexTM 75を、カラム緩衝液(25 mMのTris、500 mMのNaCl、pH7.4)で平衡化した。アフィニティクロマトグラフィー工程からの濃縮されたフラクションを、5 mlのループを使用するカラムに装填した。クロマトグラフランを0.5 ml/分の流量で行い、5 mlのフラクションを全溶出の手順にて回収した。予期したピークに対応するフラクションを回収して、合わせてプールし、分析及び必要に応じて−80℃で瞬間冷凍した。
【０１２９】
陽イオン交換クロマトグラフ
封入体からの可溶性バリアント1タンパク質及びHis-Trapカラムからのフラクションを含むタンパク質(K1K1、バリアント2及びバリアント3)をプールし、４℃で24時間、50 mM MES、150 mM NaCl(pH6.0)に対して透析した。試料を遠心分離し、0.22μmのフィルターで濾過して、流速0.5 ml/分で50 mM MES、150 mM NaCl(pH6.0)で平衡化された1 mlのResource-Sカラム(GE Healthcare)に装填した。結合したタンパク質を、NaCl勾配(0.25〜100 M)で溶出した。フラクションを回収し、SDS-PAGE及びMDCKコロニー分散アッセイで分析した。
【０１３０】
METシグナル伝達経路及び用量応答(ウエスタンブロット法)
HeLa細胞を、500 pMのHGF/SF、1 nMのK1K1、1 nMのK1K1バリアント1、2及び3、又は1 nMもしくは100 nMのNK1を用いて10分間処理した。次に、細胞溶解物を、特異的な全MET、Akt及びERK、又はリン酸化MET、リン酸化Akt及びリン酸化ERKのウエスタンブロット法により分析した。細胞をスクレイピングにより回収して、新たに添加されたプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤(Sigma)を補充した溶解用緩衝液(20 mM HEPES pH7.4, 142 mMのKCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 5%グリセロール、1% NP40、0.1% SDS)を用いて氷上で溶解した。溶解物を遠心分離(20,000g x 15分)により取り除き、タンパク質濃度を測定した(BCA protein assay Kit, Pierce(登録商標), Thermo scientific, IL, USA)。同じタンパク質量の細胞抽出物を古典的なSDS-PAGE又はNuPAGE(4-12％又は10％ビス-トリスプレキャストゲル)(Life technologies)のいずれかで分離し、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜(Merck Millipore)に電気的に転写した。膜を、示された一次抗体によってプローブし、続いて適切なHRP結合二次抗体を用いてインキュベーションした。タンパク質-抗体複合体を、SuperSignal(登録商標) West Dura Extended Duration Substrate X-rayフィルム(CL-Xposure(商標)フィルム、Thermo scientific)による化学発光で可視化した。
【０１３１】
用量応答について、HeLa細胞を、10 pM、100 pM及び500 pMのHGF/SF (HGF)、100 pM、500 pM及び1000 pMのK1K1バリアント1、並びに100 pM、500 pM及び1000 pMのK1K1を用いて10分間処理した。
【０１３２】
動力学(ウエスタンブロット法)
HeLa細胞を、100 pMのHGF、100 nMのK1K1及び100 nMのNK1を用いて１分、５分、10分又は20分間処理した。次に、細胞溶解物を、特異的な全MET、Akt及びERK、又はリン酸化MET、リン酸化Akt及びリン酸化ERKでウエスタンブロット法により分析した。細胞をスクレイピングで回収して、新たに添加されたプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤(Sigma)を補充した溶解用緩衝液(20 mM HEPES pH7.4, 142 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 5%グリセロール, 1% NP40及び0.1% SDS)を用いて氷上で溶解した。溶解物を遠心分離(20,000 g x 15分)により取り除き、タンパク質濃度を測定した(BCA protein assay Kit, Pierce(登録商標), Thermo scientific, IL, USA)。同じタンパク質量細胞抽出物を、古典的なSDS-PAGE又はNuPAGE(4-12％又は10％ビス-トリスプレキャストゲル)(Life technologies)のいずれかで分離し、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜(Merck Millipore)に電気的に転写した。膜を、示された一次抗体によってプローブし、続いて適切なHRP抱合二次抗体を用いてインキュベーションした。タンパク質-抗体複合体を、X線フイルム(CL-Xposure(商標)フィルム, Thermo scientific)を使用して、SuperSignal(登録商標) West Dura Extended Duration Substrate (Thermo scientific)による化学発光で可視化した。
【０１３３】
MDCK分散
MDCKの単離細胞島は100 pMのHGF/SF、100 nMのK1K1、100 nMのNK1を用いて培養培地で18-24時間インキュベートし。別法では、MDCKの単離細胞島を500 pMのHGF/SF、10 nMのK1K1、バリアント1、2又は3並びに100 nMのK1単量体を用いて培養培地で24時間インキュベートした。次に細胞を染色して顕微鏡下(100倍)で観察した。
【０１３４】
細胞を低密度(12ウェルプレート上に2,000細胞/ウェル)で播種し、コンパクトなコロニーを形成した。処理後、コロニー分散を確認した場合、細胞を固定し、製造業者の指示書に則ってHemacolor(登録商標)染色(Merck, Darmstadt, Germany)により染色した。代表的な画像を、100倍率の位相差顕微鏡(Nikon Eclipse TS100, Tokyo, Japan)を使用して取得した。
【０１３５】
MDCK形態形成
MDCK細胞を、増殖因子低減Matrigel(商標)(BD Biosciences)の層に播種し(24ウェルプレートに100,000細胞/ウェル)、100 pMのHGF/SF、100 nMのK1K1及び100 nMのNK1を用いて18〜24時間処理し、位相差顕微鏡で観察した。代表的な画像を、40倍及び100倍率(Nikon Eclipse TS100)で取得した。
【０１３６】
別法では、MDCK細胞を、15ウェルIbidi(登録商標)マイクロスライド血管新生(2,500細胞/ウェル)中の、増殖因子低減Matrigel(商標)(BD Biosciences)の10μL層上に播種し、50μLの1 nM HGF/SF, 100 nMのK1K1、バリアント1、2又は3及び100 nMのK1単量体で処理し、細胞を24時間、48時間及び72時間経過時に位相差顕微鏡(40倍)で観察した。代表的な画像を40倍率(Nikon Eclipse TS100)で取得した。
【０１３７】
MDCKの3D形態形成
細胞を、1 nMのHGF/SF (HGF)、100 nMのNK1、100 nMのK1K1、バリアント1及び100 nMのK1単量体を含む培養培地によりカバーした24ウェルプレート中のタイプ1コラーゲンMatrigel(商標)の厚い層に播種した。細胞を固定して、エバンスブルー(0.01％)を用いて染色した後、位相差顕微鏡(Nikon Eclipse TS100)及び共焦点(Leica LSM 880)顕微鏡(Ex405nm/Em630)で観察した。代表的な画像を40倍又は100倍率で取得し、Z-stackに3D再構築された。
【０１３８】
MDCK生存
細胞を、アニソマイシン(0.7μM)添加又は無添加の0.1％FBS含有培地で、500 pMのHGF/SF、100 nMのK1K1及び100 nMのNK1の存在下で一晩培養した。次に、MTTアッセイを実施して細胞生存を評価した。結果を、未処理対照のパーセンテージで表した。
【０１３９】
細胞をPBSで洗浄して死細胞の除去した後、3-(4、5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2、5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物を含む培地(MTT、Invitrogen)で１時間インキュベートした。PBSによる洗浄工程後に、ホルマザン結晶をイソプロパノール中の0.04 MのHClで完全に可溶化し、混合した。それぞれの条件下で、60μlのホルマザン溶液をトリプリケートで96ウェルプレートに加えた。次に、試験波長及び標準波長として、それぞれ550 nm及び620 nmでの吸光度をマルチプレート分光光度計で測定した。吸光度は細胞数に相関する。
【０１４０】
交差力価測定アッセイ
K1K1を組換MET-Fcタンパク質に結合させる交差力価測定アッセイを、384ウェルのマイクロタイタープレートで実施した(OptiPlate(商標)-384, PerkinElmer(C), CA, USA、50μLの最終反応容積)。最終濃度は、K1K1が0〜300 nM、MET-Fcが0〜10 nM、ストレプトアビジンで被覆したドナービーズ及びプロテインＡ結合アクセプタービーズが10μg/mLであった。すべてのタンパク質溶液とビーズ懸濁液との調製に使用した緩衝液は、PBS、5 mM HEPES pH 7.4、0.1% BSAであった。プレートを暗箱内で23℃にて60分間インキュベートした。放射信号強度を、EnSpire(登録商標)マルチモードプレートリーダ(PerkinElmer)を標準アルファ設定にして測定した。
【０１４１】
ALPHAScreen(登録商標) SureFire(登録商標) Ultra(商標)の方法によるAkt及びERKのリン酸化アッセイ
アッセイを、ALPHAScreen(登録商標)SureFire(登録商標)Ultra(商標) (PerkinElmer(C), CA, USA)に記載されている製造業者のプロトコールに則って実施した。手短に言えば、細胞をプレートに播いて、異なるアゴニスト(HGF/SF、NK1、K1K1及びK1B(ビオチン化K1))を用いて７分間刺激し、同じ96ウェル培養プレート中で溶解した。溶解物(10μL)を、リン酸化Art(ALSU-PAKT-B500、Ser473)及びERK(ALSU-PERK-A500、Thr202/Tyr204)の検出のために384-ウェルマイクロプレートに移した。ALPHAScreen(登録商標)SureFire(登録商標)Ultra(商標)のアクセプタービーズ及びドナービーズを添加して２時間インキュベートした。放射信号強度を、EnSpire(登録商標)マルチモードプレートリーダ(PerkinElmer)を標準アルファ設定にして測定した。
【０１４２】
ALPHAScreen SureFire(登録商標)の方法によるAkt及びERKのリン酸化アッセイ
アッセイを、ALPHAScreen(登録商標)SureFire(登録商標)のERK(TGRES500)及びAkt (TGRA4S500) (PerkinElmer(C), CA, USA)に記載されている製造業者のプロトコールに則って実施した。手短に言えば、細胞をプレートに播いて、異なるアゴニスト(HGF/SF、NK1、K1K1、バリアント1、2又は3、及びK1(ビオチン化K1))を用いて10分間刺激し、同じ96ウェル培養プレート中で溶解した。溶解物(5μL)を、リン酸化Art(Ser473)とERK(Thr202/Tyr204)の検出のために384-ウェルマイクロプレートに移した。ALPHAScreen(登録商標) SureFire(登録商標)のアクセプタービーズとドナービーズとの混合物を、製造業者の定める手順で添加して２時間インキュベートした。放射信号強度を、EnSpire(登録商標)マルチモードプレートリーダ(PerkinElmer)を標準アルファ設定にして測定した。
【０１４３】
インビトロでのMETシグナル伝達活性化
肝臓でのMET活性化の可視化のために、体重19〜21 gのFVBマウス(n=2)(Charles River)を用いた。イソフルランを用いた麻酔(Aerrane, Baxter, USA)の後、PBS中の5μgのK1単量体又はK1K1バリアント1をマウスに静脈注射した。10分後、マウスを犠牲にして、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を補充したPBSで肝臓を潅流した。肝臓を抽出して、MET、ERK及びAktの活性化をウエスタンブロット法で分析した。
【０１４４】
Fas誘発性劇症肝炎
この実験には、体重19〜21 gのFVBマウスを用いた。イソフルランを用いた麻酔の後、K1K1バリアント1(タグ無し)、HGF/SF、NK1などの異なるアゴニストと混合した抗Fas抗体(Clone Jo-2, CD95, Pharmingen,BD Biosciences)を、マウスに125 ng/g体重で静脈注射した。最初の注射から90分後、マウスに、それぞれのアゴニストで２回目の注射をした。さらに３時間後、マウスを犠牲にして、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を補充したPBSで肝臓を潅流した。
【０１４５】
並行して、肝臓でのMET活性化の可視化のために、マウスに10分間、それぞれのアゴニストの静脈注射をした。
【０１４６】
組織学的分析のため、肝臓組織を回収し、4％パラホルムアルデヒドで一晩固定し、イソペンタン中で急速冷凍し、液体窒素中に浸漬して、OCT(Tissue-Tek(登録商標)、VWR、PA、USA)に包埋した。冷凍した肝臓切片(5μm)を、一般的な形態に対するヘマトキシリン及びエオシン(HE)で染色した。アポトーシスに対するTUNEL染色も、製造業者(Apoptag(登録商標) Fluorescein Direct In Situ kit, Merck Millipore, Billerica, MA, USA)の指示書に則って、肝臓切片に実施した。分子分析のために、取り出した肝臓組織を液体窒素中で直ちに冷凍した。肝臓を、新たに添加したプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を補充した溶解用緩衝液中で破砕した。
【０１４７】
インビボでの「創傷治癒」実験プロトコール
動物モデルは豚(研究用の３頭の豚)である。
順応は、７日間の環境順応期間及び25日間のフォローアップ期間を含む。
臨床観察及び計量は４週間中、週１回行う。
【０１４８】
創傷治癒モデル：
- 四角い皮膚-表皮創傷(2x2 cm)を動物の両側に負わせる。
- 各動物が自己の証人である。
○ 第１の側＝製剤で処理
○ 第２の側＝負の対照、プラセボで処理
- 処理：２つの濃度(1 nM及び50 nM)でのK1K1 TL(タグ無し)の２つの製剤
○ ４週間中に週２回
【０１４９】
臨床観察と計量：
次のパラメータ検討後の創傷治癒アセスメント：
- 創口閉鎖-形態計測学的検討(創傷の写真)
- 組織生検(HES及びMTG)-血管新生-肉芽組織
- D7、D14、D35における上皮形成
- 安楽死。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０（ａ）】
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【図１０（ｂ）】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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