(57)【要約】  本発明は、エネルギー発生発酵経路を含む遺伝子操作細菌及びこれに関連した方法に関する。特に、本発明は、非天然基質に作用し、多種多様な産物及び中間体を産生する、ホスフェートブチリルトランスフェラーゼ（Ｐｔｂ）及びブチレートキナーゼ（Ｂｕｋ）（Ｐｔｂ−Ｂｕｋ）を含む細菌を提供する。特定の実施形態では、本発明は、ガス状基質から産物を産生することができるＣ１固定微生物へのＰｔｂ−Ｂｕｋの導入に関する。【選択図】図１
2018530342.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外因性ホスフェートブチリルトランスフェラーゼ（Ｐｔｂ）及び外因性ブチレートキナーゼ（Ｂｕｋ）（Ｐｔｂ−Ｂｕｋ）を含む遺伝子操作細菌であって、前記Ｐｔｂ−Ｂｕｋが非天然基質に作用し、非天然産物を産生する、細菌。
【請求項２】
前記Ｐｔｂ−Ｂｕｋがブタノイル−ＣｏＡ及び／またはブタノイルホスフェート以外の基質に作用する、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
前記Ｐｔｂ−Ｂｕｋがブタノイルホスフェートまたはブチレート以外の産物を産生する、請求項１に記載の細菌。
【請求項４】
前記細菌がブタノールを産生しない、請求項１に記載の細菌。
【請求項５】
前記細菌が酸、アルケン、ケトン、アルデヒド、アルコール、またはジオールのうちの１つ以上を産生する、請求項１に記載の細菌。
【請求項６】
前記細菌がアセトンもしくはその前駆体、イソプロパノールもしくはその前駆体、イソブチレンもしくはその前駆体、３−ヒドロキシブチレートもしくはその前駆体、１，３−ブタンジオールもしくはその前駆体、２−ヒドロキシイソブチレートもしくはその前駆体、アジピン酸もしくはその前駆体、１，３−ヘキサンジオールもしくはその前駆体、３−メチル−２−ブタノールもしくはその前駆体、２−ブテン−１−オールもしくはその前駆体、イソバレレートもしくはその前駆体、またはイソアミルアルコールもしくはその前駆体のうちの１つ以上を産生する、請求項１に記載の細菌。
【請求項７】
前記Ｐｔｂ−Ｂｕｋがアセトアセチル−ＣｏＡをアセトアセテートに（ステップ２）、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシイソバレレートに（ステップ８）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチレートに（ステップ１４）、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを２−ヒドロキシイソブチレートに（ステップ２０）、クロトニル−ＣｏＡをクロトネートに（ステップ２８）、アセトブチリル−ＣｏＡをアセトブチレートに（ステップ３３）、またはイソバレリル−ＣｏＡをイソバレレートに（ステップ４４）変換する、請求項１に記載の細菌。
【請求項８】
前記細菌が１−プロパノール、１−ヘキサノール、及び１−オクタノールのうちの１つ以上を産生する、請求項１に記載の細菌。
【請求項９】
前記細菌がＣ１固定細菌である、請求項１に記載の細菌。
【請求項１０】
前記細菌がクロストリジウム・オートエタノゲナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、クロストリジウム・ユングダリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、クロストリジウム・ラグスダレイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ベイジェリンクキイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）、クロストリジウム・サッカロブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ジオリス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｏｌｉｓ）、クロストリジウム・クルイベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、クロストリジウム・パステリアニウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｒｉａｎｉｕｍ）、クロストリジウム・ノビイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｏｖｙｉ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・セルロボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、クレブシエラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、及びメチロバクテリウム・エクストルクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）からなる群から選択される親細菌に由来する、請求項１に記載の細菌。
【請求項１１】
前記細菌が外因性または内因性アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＡＯＲ）をさらに含む、請求項１に記載の細菌。
【請求項１２】
前記細菌がホスホトランスアセチラーゼ（Ｐｔａ）及びアセテートキナーゼ（Ａｃｋ）における破壊的変異をさらに含む、請求項１に記載の細菌。
【請求項１３】
前記細菌がチオエステラーゼにおける破壊的変異をさらに含む、請求項１に記載の細菌。
【請求項１４】
アセトンまたはその前駆体の産生のための、
（ａ）アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ１）、アセトアセチル−ＣｏＡをアセトアセテートに変換する酵素（ステップ２）、及びアセトアセテートをアセトンに変換する酵素（ステップ３）であって、アセトアセチル−ＣｏＡをアセトアセテートに変換する前記酵素（ステップ２）がＰｔｂ−Ｂｕｋである、酵素、または
（ｂ）アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ１）、アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ１３）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチレートに変換する酵素（ステップ１４）、３−ヒドロキシブチレートをアセトアセテートに変換する酵素（ステップ１５）、及びアセトアセテートをアセトンに変換する酵素（ステップ３）であって、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチレートに変換する前記酵素（ステップ１４）がＰｔｂ−Ｂｕｋである、酵素を含む、遺伝子操作細菌。
【請求項１５】
前記細菌がアセトンまたはその前駆体を産生する、請求項１４に記載の細菌。
【請求項１６】
前記細菌が第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼにおける破壊的変異をさらに含む、請求項１４に記載の細菌。
【請求項１７】
イソプロパノールまたはその前駆体の産生のための、
（ａ）アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ１）、アセトアセチル−ＣｏＡをアセトアセテートに変換する酵素（ステップ２）、アセトアセテートをアセトンに変換する酵素（ステップ３）、及びアセトンをイソプロパノールに変換する酵素（ステップ４）であって、アセトアセチル−ＣｏＡをアセトアセテートに変換する前記酵素（ステップ２）がＰｔｂ−Ｂｕｋである、酵素、または
（ｂ）アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ１）、アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ１３）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチレートに変換する酵素（ステップ１４）、３−ヒドロキシブチレートをアセトアセテートに変換する酵素（ステップ１５）、アセトアセテートをアセトンに変換する酵素（ステップ３）、及びアセトンをイソプロパノールに変換する酵素（ステップ４）であって、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチレートに変換する前記酵素（ステップ１４）がＰｔｂ−Ｂｕｋである、酵素を含む、遺伝子操作細菌。
【請求項１８】
前記細菌がイソプロパノールまたはその前駆体を産生する、請求項１７に記載の細菌。
【請求項１９】
イソブチレンまたはその前駆体の産生のための、
（ａ）アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ１）、アセトアセチル−ＣｏＡをアセトアセテートに変換する酵素（ステップ２）、アセトアセテートをアセトンに変換する酵素（ステップ３）、アセトンを３−ヒドロキシイソバレレートに変換する酵素（ステップ５）、及び３−ヒドロキシイソバレレートをイソブチレンに変換する酵素（ステップ６）であって、アセトアセチル−ＣｏＡをアセトアセテートに変換する前記酵素（ステップ２）がＰｔｂ−Ｂｕｋである、酵素、または
（ｂ）アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ１）、アセトアセチル−ＣｏＡをアセトアセテートに変換する酵素（ステップ２）、アセトアセテートをアセトンに変換する酵素（ステップ３）、アセトンを３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ７）、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシイソバレレートに変換する酵素（ステップ８）、及び３−ヒドロキシイソバレレートをイソブチレンに変換する酵素（ステップ６）であって、アセトアセチル−ＣｏＡをアセトアセテートに変換する前記酵素（ステップ２）及び／もしくは３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシイソバレレートに変換する前記酵素（ステップ８）がＰｔｂ−Ｂｕｋである、酵素を含む、遺伝子操作細菌。
【請求項２０】
前記細菌がイソブチレンまたはその前駆体を産生する、請求項１９に記載の細菌。
【請求項２１】
３−ヒドロキシブチレートまたはその前駆体の産生のための、
（ａ）アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ１）、アセトアセチル−ＣｏＡをアセトアセテートに変換する酵素（ステップ２）、及びアセトアセテートを３−ヒドロキシブチレートに変換する酵素（ステップ１５）であって、アセトアセチル−ＣｏＡをアセトアセテートに変換する前記酵素（ステップ２）がＰｔｂ−Ｂｕｋである、酵素、
（ｂ）アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ１）、アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ１３）、及び３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチレートに変換する酵素（ステップ１４）であって、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチレートに変換する前記酵素（ステップ１４）がＰｔｂ−Ｂｕｋである、酵素、または
（ｃ）アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ１）、アセトアセチル−ＣｏＡをアセトアセテートに変換する酵素（ステップ２）、及びアセトアセテートを３−ヒドロキシブチレートに変換する酵素（ステップ１５）であって、アセトアセチル−ＣｏＡをアセトアセテートに変換する前記酵素（ステップ２）がチオエステラーゼである、酵素を含む、遺伝子操作細菌。
【請求項２２】
前記細菌が３−ヒドロキシブチレートまたはその前駆体を産生する、請求項２１に記載の細菌。
【請求項２３】
１，３−ブタンジオールまたはその前駆体の産生のための、
（ａ）アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ１）、アセトアセチル−ＣｏＡをアセトアセテートに変換する酵素（ステップ２）、アセトアセテートを３−ヒドロキシブチレートに変換する酵素（ステップ１５）、３−ヒドロキシブチレートを３−ヒドロキシブチリルアルデヒドに変換する酵素（ステップ１６）、及び３−ヒドロキシブチリルアルデヒドを１，３−ブタンジオールに変換する酵素（ステップ１７）であって、アセトアセチル−ＣｏＡをアセトアセテートに変換する前記酵素（ステップ２）がＰｔｂ−Ｂｕｋである、酵素、
（ｂ）アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ１）、アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ１３）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチレートに変換する酵素（ステップ１４）、３−ヒドロキシブチレートを３−ヒドロキシブチリルアルデヒドに変換する酵素（ステップ１６）、及び３−ヒドロキシブチリルアルデヒドを１，３−ブタンジオールに変換する酵素（ステップ１７）であって、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチレートに変換する前記酵素（ステップ１４）がＰｔｂ−Ｂｕｋである、酵素、または
（ｃ）アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ１）、アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ１３）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリルアルデヒドに変換する酵素（ステップ１８）、及び３−ヒドロキシブチリルアルデヒドを１，３−ブタンジオールに変換する酵素（ステップ１７）を含む、遺伝子操作細菌。
【請求項２４】
前記細菌が１，３−ブタンジオールまたはその前駆体を産生する、請求項２３に記載の細菌。
【請求項２５】
２−ヒドロキシイソブチレートまたはその前駆体の産生のための、
（ａ）アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ１）、アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ１３）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ１９）、及び２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを２−ヒドロキシイソブチレートに変換する酵素（ステップ２０）であって、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを２−ヒドロキシイソブチレートに変換する前記酵素（ステップ２０）がＰｔｂ−Ｂｕｋである、酵素を含む、遺伝子操作細菌。
【請求項２６】
前記細菌が２−ヒドロキシイソブチレートまたはその前駆体を産生する、請求項２５に記載の細菌。
【請求項２７】
アジピン酸またはその前駆体の産生のための、
（ａ）アセチル−ＣｏＡをスクシニル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ２１）、スクシニル−ＣｏＡを３−オキソ−アジピル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ２２）、３−オキソ−アジピル−ＣｏＡを３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ２３）、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ２４）、２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡをアジピル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ２５）、及びアジピル−ＣｏＡをアジピン酸に変換する酵素（ステップ２６）であって、アジピル−ＣｏＡをアジピン酸に変換する前記酵素（ステップ２６）がＰｔｂ−Ｂｕｋである、酵素、または
（ｂ）アセチル−ＣｏＡを３−オキソ−アジピル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ２２）、３−オキソ−アジピル−ＣｏＡを３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ２３）、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ２４）、２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡをアジピル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ２５）、及びアジピル−ＣｏＡをアジピン酸に変換する酵素（ステップ２６）であって、アジピル−ＣｏＡをアジピン酸に変換する前記酵素（ステップ２６）がＰｔｂ−Ｂｕｋである、酵素を含む、遺伝子操作細菌。
【請求項２８】
前記細菌がアジピン酸またはその前駆体を産生する、請求項２７に記載の細菌。
【請求項２９】
３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからの１，３−ヘキサンジオールまたはその前駆体の産生のための、
（ａ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡをクロトニル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ２７）、クロトニル−ＣｏＡをブチリル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ３１）、ブチリル−ＣｏＡをアセトブチリル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ３２）、アセトブチリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ３６）、３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡを３−ヒドロキシヘキサノエートに変換する酵素（ステップ３７）、３−ヒドロキシヘキサノエートを１，３−ヘキサアルデヒドに変換する酵素（ステップ３８）、及び１，３−ヘキサアルデヒドを１，３−ヘキサンジオールに変換する酵素（ステップ３９）を含む、遺伝子操作細菌。
【請求項３０】
前記細菌が１，３−ヘキサンジオールまたはその前駆体を産生する、請求項２９に記載の細菌。
【請求項３１】
３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからの３−メチル−２−ブタノールまたはその前駆体の産生のための、
（ａ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡをクロトニル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ２７）、クロトニル−ＣｏＡをブチリル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ３１）、ブチリル−ＣｏＡをアセトブチリル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ３２）、アセトブチリル−ＣｏＡをアセトブチレートに変換する酵素（ステップ３３）、アセトブチレートをアセチルアセトンに変換する酵素（ステップ３４）、及びアセチルアセトンを３−メチル−２−ブタノールに変換する酵素（ステップ３５）であって、アセトブチリル−ＣｏＡをアセトブチレートに変換する前記酵素（ステップ３３）がＰｔｂ−Ｂｕｋである、酵素を含む、遺伝子操作細菌。
【請求項３２】
前記細菌が３−メチル−２−ブタノールまたはその前駆体を産生する、請求項３１に記載の細菌。
【請求項３３】
３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからの２−ブテン−１−オールまたはその前駆体の産生のための、
（ａ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡをクロトニル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ２７）、クロトニル−ＣｏＡをクロトネートに変換する酵素（ステップ２８）、クロトネートをクロトンアルデヒドに変換する酵素（ステップ２９）、及びクロトンアルデヒドを２−ブテン−１−オールに変換する酵素（ステップ３０）であって、クロトニル−ＣｏＡをクロトネートに変換する前記酵素（ステップ２８）がＰｔｂ−Ｂｕｋである、酵素を含む、遺伝子操作細菌。
【請求項３４】
前記細菌が３−メチル−２−ブタノールまたはその前駆体を産生する、請求項３３に記載の細菌。
【請求項３５】
イソバレレートまたはその前駆体の産生のための、
（ａ）アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ１）、アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ４０）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルコニル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ４１）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルコニル−ＣｏＡを２−メチルクロトニル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ４２）、２−メチルクロトニル−ＣｏＡをイソバレリル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ４３）、及びイソバレリル−ＣｏＡをイソバレレートに変換する酵素（ステップ４４）であって、イソバレリル−ＣｏＡをイソバレレートに変換する前記酵素（ステップ４４）がＰｔｂ−Ｂｕｋである、酵素を含む、遺伝子操作細菌。
【請求項３６】
前記細菌がイソバレレートまたはその前駆体を産生する、請求項３５に記載の細菌。
【請求項３７】
イソアミルアルコールまたはその前駆体の産生のための、
（ａ）アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ１）、アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ４０）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルコニル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ４１）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルコニル−ＣｏＡを２−メチルクロトニル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ４２）、２−メチルクロトニル−ＣｏＡをイソバレリル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ４３）、イソバレリル−ＣｏＡをイソバレレートに変換する酵素（ステップ４４）、イソバレレートをイソバレルアルデヒドに変換する酵素（ステップ４５）、及びイソバレルアルデヒドをイソアミルアルコールに変換する酵素（ステップ４６）であって、イソバレリル−ＣｏＡをイソバレレートに変換する前記酵素（ステップ４４）がＰｔｂ−Ｂｕｋである、酵素、または
（ｂ）アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ１）、アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ４０）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルコニル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ４１）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルコニル−ＣｏＡを２−メチルクロトニル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ４２）、２−メチルクロトニル−ＣｏＡをイソバレリル−ＣｏＡに変換する酵素（ステップ４３）、イソバレリル−ＣｏＡをイソバレルアルデヒドに変換する酵素（ステップ４５）、及びイソバレルアルデヒドをイソアミルアルコールに変換する酵素（ステップ４６）を含む、遺伝子操作細菌。
【請求項３８】
前記細菌がイソアミルアルコールまたはその前駆体を産生する、請求項３７に記載の細菌。
【請求項３９】
前記細菌がＣ１固定細菌である、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項４０】
前記細菌がクロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ、エシェリキア・コリ、サッカロマイセス・セレビシエ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンクキイ、クロストリジウム・サッカロブチリカム、クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・ジオリス、クロストリジウム・クルイベリ、クロストリジウム・パステリアニウム、クロストリジウム・ノビイ、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・サーモセラム、クロストリジウム・セルロリチカム、クロストリジウム・セルロボランス、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス、ラクトコッカス・ラクチス、バチルス・サブチリス、バチルス・リケニフォルミス、ザイモモナス・モビリス、クレブシエラ・オキシトカ、クレブシエラ・ニューモニア、コリネバクテリウム・グルタミカム、トリコデルマ・リーゼイ、カプリアビダス・ネカトール、シュードモナス・プチダ、ラクトバチルス・プランタラム、及びメチロバクテリウム・エクストルクエンスからなる群から選択される親細菌に由来する、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項４１】
請求項１〜４０のいずれか一項に記載の細菌を基質の存在下で培養することを含む産物の産生方法であって、これにより前記細菌が前記産物を産生する、方法。
【請求項４２】
前記細菌がアセトンもしくはその前駆体、イソプロパノールもしくはその前駆体、イソブチレンもしくはその前駆体、３−ヒドロキシブチレートもしくはその前駆体、１，３−ブタンジオールもしくはその前駆体、２−ヒドロキシイソブチレートもしくはその前駆体、アジピン酸もしくはその前駆体、１，３−ヘキサンジオールもしくはその前駆体、３−メチル−２−ブタノールもしくはその前駆体、２−ブテン−１−オールもしくはその前駆体、イソバレレートもしくはその前駆体、またはイソアミルアルコールもしくはその前駆体のうちの１つ以上を産生する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記Ｐｔｂ−Ｂｕｋがアセトアセチル−ＣｏＡをアセトアセテートに（ステップ２）、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシイソバレレートに（ステップ８）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチレートに（ステップ１４）、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを２−ヒドロキシイソブチレートに（ステップ２０）、クロトニル−ＣｏＡをクロトネートに（ステップ２８）、アセトブチリル−ＣｏＡをアセトアセテートに（ステップ３３）、またはイソバレリル−ＣｏＡをイソバレレートに（ステップ４４）変換する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記基質がＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記ガス状基質が合成ガスである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記ガス状基質が産業廃ガスである、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１０月１３日出願の米国仮特許出願第６２／２４０，８５０号の利益を主張し、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【０００２】
発酵及び代謝工学における最近の進歩と共に、様々な産物への発酵ルートが確認及び開発されている（Ｃｌｏｍｂｕｒｇ、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、８６：４１９−４３４、２０１０、Ｐｅｒａｌｔａ−Ｙａｈｙａ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ、５：１４７−１６２、２０１０、Ｃｈｏ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ、ｐｉｉ：Ｓ０７３４−９７５０（１４）００１８１−５、２０１４）。しかしながら、これらの発酵ルートのすべてはエネルギー（ＡＴＰ）多消費または、良くてもエネルギー（ＡＴＰ）ニュートラルであり、これはエネルギー制限システムにおける産物収率を制限し、産物産生を微生物増殖から切り離す。本発明は、酸、アルケン、アルデヒド、アルコール、及びジオールを含む、様々な産物への新規発酵ルート及び経路を提供することによりこれらの制限を克服する、エネルギー（ＡＴＰ）発生経路を提供する。これらの経路は微生物増殖と直接共役し、高い産物収率を提供する。
【０００３】
特に、本発明は、Ｐｔｂ−Ｂｕｋを伴う発酵経路に関する。ホスフェートブチリルトランスフェラーゼ（Ｐｔｂ）（ＥＣ２．３．１．１９）は、ＣｏＡ及びブタノイルホスフェートを形成するブタノイル−ＣｏＡ及びホスフェートの反応を天然に触媒する。ブチレートキナーゼ（Ｂｕｋ）（ＥＣ２．７．２．７）は、ブチレート（ブタノエート）及びＡＴＰを形成するブタノイルホスフェート及びＡＤＰの反応を天然に触媒する。したがって、これらの酵素は共に（Ｐｔｂ−Ｂｕｋ）、ブタノイル−ＣｏＡのブチレートへの変換を天然に触媒し、基質レベルのリン酸化（ホスホリレーション）（ＳＬＰ）を通して１つのＡＴＰを発生させる。
【０００４】
本発明者らは、Ｐｔｂが無差別的であり、様々なアシル−ＣｏＡ及びエノイル−ＣｏＡを基質として受け入れることができ、Ｐｔｂ−Ｂｕｋが、同時に基質レベルのリン酸化を通してＡＴＰを発生させながら、多数のアシル−ＣｏＡ及びエノイル−ＣｏＡを、それぞれ、それらの対応する酸またはアルケネートに変換するのに使用され得ることを発見した。
【０００５】
さらに、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＡＯＲ）及びアルコールデヒドロゲナーゼとの組み合わせにおいて、Ｐｔｂ−Ｂｕｋ系を通して形成された酸は、それらのそれぞれのアルデヒド、アルコール、またはジオールにさらに変換することができる。ＡＯＲ（ＥＣ１．２．７．５）は、アルデヒド及び酸化フェレドキシンを形成する酸及び還元フェレドキシン（これは、例えば、ＣＯまたは水素の酸化から発生させることができる）の反応を触媒する。アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１及びＥＣ１．１．１．２）は、アルデヒド及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈをアルコール及びＮＡＤ（Ｐ）に変換することができる。
【０００６】
Ｐｔｂ−Ｂｕｋ及び／またはＡＯＲの非相同種への導入は、したがって、高収率での酸、アルケン、ケトン、アルデヒド、アルコール、及びジオールのような、天然及び非天然産物の発酵への新規代替ルートを提供し、よって現在の最新技術の制限を克服する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、外因性ホスフェートブチリルトランスフェラーゼ（Ｐｔｂ）及び外因性ブチレートキナーゼ（Ｂｕｋ）（Ｐｔｂ−Ｂｕｋ）を含む遺伝子操作細菌を提供する。一般的には、Ｐｔｂ−Ｂｕｋは、非天然基質、例えば、ブタノイル−ＣｏＡ及び／またはブタノイルホスフェート以外の基質に作用し、非天然産物、例えば、ブタノイルホスフェートまたはブチレート以外の産物を産生する。特定の実施形態では、Ｐｔｂ−Ｂｕｋは、アセトアセチル−ＣｏＡをアセトアセテートに、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシイソバレレートに、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチレートに、または２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを２−ヒドロキシイソブチレートに変換する。
【０００８】
細菌は、酸、アルケン、ケトン、アルデヒド、アルコール、またはジオールのうちの１つ以上を産生してもよい。より具体的には、細菌は、アセトンもしくはその前駆体、イソプロパノールもしくはその前駆体、イソブチレンもしくはその前駆体、３−ヒドロキシブチレートもしくはその前駆体、１，３−ブタンジオールもしくはその前駆体、２−ヒドロキシイソブチレートもしくはその前駆体、アジピン酸もしくはその前駆体、１，３−ヘキサンジオールもしくはその前駆体、３−メチル−２−ブタノールもしくはその前駆体、２−ブテン−１−オールもしくはその前駆体、イソバレレートもしくはその前駆体、またはイソアミルアルコールもしくはその前駆体のうちの１つ以上を産生してもよい。細菌は、典型的にはブタノールを産生しない。
【０００９】
細菌は、ホスホトランスアセチラーゼ（Ｐｔａ）及びアセテートキナーゼ（Ａｃｋ）における破壊的変異をさらに含んでもよい。細菌は、チオエステラーゼにおける破壊的変異をさらに含んでもよい。別の実施形態では、本発明は、外因性Ｐｔｂ−Ｂｕｋ及び外因性または内因性アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼを含む遺伝子操作細菌を提供する。
【００１０】
本発明は、前述の実施形態のいずれかの細菌を基質の存在下で培養することを含む産物の産生方法をさらに提供する。産物は、例えば、アセトンもしくはその前駆体、イソプロパノールもしくはその前駆体、イソブチレンもしくはその前駆体、３−ヒドロキシブチレートもしくはその前駆体、１，３−ブタンジオールもしくはその前駆体、２−ヒドロキシイソブチレートもしくはその前駆体、アジピン酸もしくはその前駆体、１，３−ヘキサンジオールもしくはその前駆体、３−メチル−２−ブタノールもしくはその前駆体、２−ブテン−１−オールもしくはその前駆体、イソバレレートもしくはその前駆体、またはイソアミルアルコールもしくはその前駆体であってもよい。典型的には、基質は、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２の１つ以上を含むガス状基質である。１つの実施形態では、ガス状基質は合成ガスである。別の実施形態では、ガス状基質は産業廃ガスである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１はアセチル−ＣｏＡからのアセトン、イソプロパノール、イソブチレン、３−ヒドロキシブチレート、１，３−ブタンジオール、及び２−ヒドロキシイソブチレートを含む、様々な産物の産生についての代謝経路の図である。アセチル−ＣｏＡは、炭水化物（例えば、糖）基質またはガス状基質のような、いずれかの適切な基質から発生し得る。本発明では、アセチル−ＣｏＡは、多くの場合ガス状基質から発生する。太矢印は、Ｐｔｂ−Ｂｕｋにより触媒され得るステップを示す。
【図２】図２はＰｔｂ−Ｂｕｋにより天然に触媒された反応、すなわちブタノイル−ＣｏＡのブチレートへの変換及び１つのＡＴＰの発生を示す図である。
【図３】図３はＣｏＡトランスフェラーゼ、チオエステラーゼ、及びＰｔｂ−Ｂｕｋの活性を比較する図である。
【図４】図４は外因性遺伝子を含むプラスミドで修飾されたＥ・コリＢＬ２１（Ｄ３）における平均アセトン産生を示すグラフである。このデータは、Ｅ・コリにおいてインビボでアセトアセチル−ＣｏＡをアセトアセテートに変換するＰｔｂ−Ｂｕｋの能力を示す。
【図５】図５は（チオラーゼ、Ｐｔｂ−Ｂｕｋ、及びアセトアセテートデカルボキシラーゼを発現させる）ｐＡＣＹＣ−ｐｔｂ−ｂｕｋ及びｐＣＯＬＡ−ｔｈｌＡ−ａｄｃプラスミドの両方を保持するＥ・コリＢＬ２１（ＤＥ３）の導入の効果を示すグラフである。
【図６】図６はＰｔｂ−Ｂｕｋによる（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの産生及びＡＴＰの発生において産生された還元当量を再生利用しながら、アセトン産生のためにＰｔｂ−Ｂｕｋを使用するように設計された経路の図である。
【図７】図７はＣ・オートエタノゲナムにおける１，３−ブタンジオールの産生におけるアルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＡＯＲ）、フェレドキシン、及びＡｄｈの役割を示す図である。より一般的には、ＡＯＲは、酸のアルデヒドへの変換を触媒するのに使用してもよく、Ａｄｈは、アルデヒドのアルコール／ジオールへの変換を触媒するのに使用してもよい。
【図８】図８は（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート及び２−ヒドロキシイソブチレートの産生のためのＰｔｂ−Ｂｕｋの立体特異性を示す図である。図８における「天然」という用語は天然チオエステラーゼを指す。
【図９】図９は代替経路１を使用する３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡ及び３−ヒドロキシイソバレレートのＰｔｂ−Ｂｕｋ変換を通したイソブテンの産生を示す図である。
【図１０】図１０は代替経路２を使用する３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡ及び３−ヒドロキシイソバレレートのＰｔｂ−Ｂｕｋ変換を通したイソブテンの産生を示す図である。
【図１１】図１１は３−ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ｂｌｄ）を通した１，３−ブタンジオールの産生を示す図である。
【図１２】図１２は対照に対してＰｔｂ−Ｂｕｋ系を使用するＣ・オートエタノゲナムにおけるイソプロパノール産生を示すグラフである。○ｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ａｄｃ、●ｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｐｔｂ−ｂｕｋ−ａｄｃ。
【図１３Ａ】異なる濃度のインデューサーＩＰＴＧ（０、５０、１００μＭ）を有するＥ・コリにおけるモジュラープラスミドでの３−ヒドロキシブチレート、アセテート、エタノール、及びアセトンの産生を示すグラフである。図１３Ａ：ｐＡＣＹＣ−ｐｔｂ−ｂｕｋ、ｐＣＯＬＡ−ｔｈｌＡ−ａｄｃ、ｐＣＤＦ−ｐｈａＢ。
【図１３Ｂ】異なる濃度のインデューサーＩＰＴＧ（０、５０、１００μＭ）を有するＥ・コリにおけるモジュラープラスミドでの３−ヒドロキシブチレート、アセテート、エタノール、及びアセトンの産生を示すグラフである。図１３Ｂ：ｐＡＣＹＣ−ｐｔｂ−ｂｕｋ、ｐＣＯＬＡ−ｔｈｌＡ−ａｄｃ、ｐＣＤＦ−ｐｈａＢ−ｂｄｈ１。
【図１３Ｃ】異なる濃度のインデューサーＩＰＴＧ（０、５０、１００μＭ）を有するＥ・コリにおけるモジュラープラスミドでの３−ヒドロキシブチレート、アセテート、エタノール、及びアセトンの産生を示すグラフである。図１３Ｃ：ｐＣＯＬＡ−ｔｈｌＡ−ａｄｃ、ｐＣＤＦ−ｐｈａＢ−ｂｄｈ１。
【図１３Ｄ】異なる濃度のインデューサーＩＰＴＧ（０、５０、１００μＭ）を有するＥ・コリにおけるモジュラープラスミドでの３−ヒドロキシブチレート、アセテート、エタノール、及びアセトンの産生を示すグラフである。図１３Ｄ：ｐＣＯＬＡ−ｔｈｌＡ−ａｄｃ。
【図１３Ｅ】異なる濃度のインデューサーＩＰＴＧ（０、５０、１００μＭ）を有するＥ・コリにおけるモジュラープラスミドでの３−ヒドロキシブチレート、アセテート、エタノール、及びアセトンの産生を示すグラフである。図１３Ｅ：ｐＣＤＦ−ｐｈａＢ−ｂｄｈ１。
【図１３Ｆ】異なる濃度のインデューサーＩＰＴＧ（０、５０、１００μＭ）を有するＥ・コリにおけるモジュラープラスミドでの３−ヒドロキシブチレート、アセテート、エタノール、及びアセトンの産生を示すグラフである。図１３Ｆ：ｐＣＤＦ−ｐｈａＢ。
【図１４】図１４はプラスミドｐＭＴＬ８２２５−ｂｕｄＡ：：ｔｈｌＡ−ｐｈａＢのプラスミドマップである。
【図１５】図１５は野生型（Ｗ）と比較した４つのクローン（１、４、７、９）についてのＣ・オートエタノゲナムにおけるアセトラクテートシンターゼ（ｂｕｄＡ）遺伝子のチオラーゼ（ｔｈｌＡ）及び３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｐｈａＢ）遺伝子での置換のＰＣＲ検証のゲル画像である。すべてのクローンは、野生型と比較してより大きなＰＣＲフラグメントサイズによりわかるとおり、陽性である。
【図１６】図１６はバッチ発酵Ｃ・オートエタノゲナムｂｕｄＡ：：ｔｈｌＡｐｈａＢ株の発酵プロファイルを示し、ガスからの３−ヒドロキシブチレート及び１，３−ブタンジオール形成について実証するグラフである。
【図１７Ａ】図１７Ａはチオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ｂｌｄ）、及びブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼを通した１，３−ＢＤＯの産生を示すグラフである。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは増殖に対するｂｌｄ発現の影響を示すグラフである。
【図１８Ａ】図１８ＡはＣ・オートエタノゲナムｐＭＴＬ８３１５−Ｐｆｄｘ−ｈｂｄ１−ｔｈｌＡにおけるガス状基質からの３−ヒドロキシブチレート及び１，３−ブタンジオールの形成を示すグラフである。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは同じ培養におけるアセテートのエタノールへの還元を示すグラフである。
【図１９】図１９は連続培養（記載がある場合、培地は所定の希釈率Ｄで連続的に補充された）におけるガス状基質からの３−ヒドロキシブチレート及び１，３−ブタンジオールの形成を示すＣ・オートエタノゲナムｐＭＴＬ８３１５−Ｐｆｄｘ−ｈｂｄ１−ｔｈｌＡ株についての発酵プロファイルを示すグラフである。
【図２０Ａ】図２０Ａは野生型（ＷＴ）と比較したプラスミドｐＭＴＬ８２２５６−ｐｔｂ−ｂｕｋからのＰｔｂ−Ｂｕｋ系を発現させるＣ・オートエタノゲナムにおける様々なアシル−ＣｏＡ（アセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、及び２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ）に対する増加したＣｏＡ加水分解活性を示すグラフである。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは野生型（ＷＴ）と比較したプラスミドｐＭＴＬ８２２５６−ｐｔｂ−ｂｕｋからのＰｔｂ−Ｂｕｋ系を発現させるＣ・オートエタノゲナムにおける様々なアシル−ＣｏＡ（アセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、及び２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ）に対する増加したＣｏＡ加水分解活性を示すグラフである。
【図２１Ａ】図２１ＡはＣ・オートエタノゲナムＬＺ１５６０またはＬＺ１５６１において見られる活性と比較した不活性化チオエステラーゼ（ＣＴ２６４０＝チオエステラーゼ１、ＣＴ１５２４＝チオエステラーゼ２、ＣＴ１７８０＝チオエステラーゼ３）を有するＣ・オートエタノゲナム株の低減したアセチル−ＣｏＡ加水分解活性を示すグラフである。
【図２１Ｂ】図２１ＢはＣ・オートエタノゲナムＬＺ１５６０またはＬＺ１５６１において見られる活性と比較した不活性化チオエステラーゼ（ＣＴ２６４０＝チオエステラーゼ１、ＣＴ１５２４＝チオエステラーゼ２、ＣＴ１７８０＝チオエステラーゼ３）を有するＣ・オートエタノゲナム株の低減したアセチル−ＣｏＡ加水分解活性を示すグラフである。
【図２２】図２２は野生型Ｃ・オートエタノゲナムと比較した破壊されたチオエステラーゼ３を有するＣ・オートエタノゲナム株（ＣＡＥＴＨＧ＿１７８０）における増加した特異的イソプロパノール産生を示すグラフである。
【図２３Ａ】Ｃ・オートエタノゲナム野生型及び野生型Ｃ・オートエタノゲナムと比較した破壊されたチオエステラーゼ３を有する株（ＣＡＥＴＨＧ＿１７８０）の増殖（図２３Ａ）ならびにイソプロパノール（図２３Ｂ）、アセテート（図２３Ｃ）、及びエタノール（図２３Ｄ）産生プロファイルを示すグラフである。
【図２３Ｂ】Ｃ・オートエタノゲナム野生型及び野生型Ｃ・オートエタノゲナムと比較した破壊されたチオエステラーゼ３を有する株（ＣＡＥＴＨＧ＿１７８０）の増殖（図２３Ａ）ならびにイソプロパノール（図２３Ｂ）、アセテート（図２３Ｃ）、及びエタノール（図２３Ｄ）産生プロファイルを示すグラフである。
【図２３Ｃ】Ｃ・オートエタノゲナム野生型及び野生型Ｃ・オートエタノゲナムと比較した破壊されたチオエステラーゼ３を有する株（ＣＡＥＴＨＧ＿１７８０）の増殖（図２３Ａ）ならびにイソプロパノール（図２３Ｂ）、アセテート（図２３Ｃ）、及びエタノール（図２３Ｄ）産生プロファイルを示すグラフである。
【図２３Ｄ】Ｃ・オートエタノゲナム野生型及び野生型Ｃ・オートエタノゲナムと比較した破壊されたチオエステラーゼ３を有する株（ＣＡＥＴＨＧ＿１７８０）の増殖（図２３Ａ）ならびにイソプロパノール（図２３Ｂ）、アセテート（図２３Ｃ）、及びエタノール（図２３Ｄ）産生プロファイルを示すグラフである。
【図２４】図２４はｐＭＴＬ８２２５−ｐｔａ−ａｃｋ：：ｐｔｂ−ｂｕｋのプラスミドマップである。
【図２５】図２５はｐｔｂ及びｂｕｋ遺伝子ならびにｅｒｍＢカセットで置換されたｐｔａ及びａｃｋ遺伝子の置換を示すゲル画像である。
【図２６】図２６はアルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ遺伝子ａｏｒ１の過剰発現による３−ヒドロキシブチレートの１，３−ＢＤＯへの増加した変換を示すグラフである。
【図２７】図２７は対照（ＢＬ２１株）と比較したチオエステラーゼＴｅｓＢ、Ｐｔａ−Ａｃｋ、及びＰｔｂ−Ｂｕｋ系の、アセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、及び２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡのＣｏＡ加水分解に対する活性を示すグラフである。Ｐｔｂ−Ｂｕｋは最も高い活性を示し、Ｐｔａ−Ａｃｋは活性を示さない。
【図２８Ａ】（Ｓ）特異的（Ｈｂｄ）（図２８Ａ）または（Ｒ）特異的３−ヒドロキシブチレート（ＰｈａＢ）（図２８Ｂ）デヒドロゲナーゼとの組み合わせにおけるＰｔｂ−Ｂｕｋを通した３−ヒドロキシブチレートの産生を示すグラフである。
【図２８Ｂ】（Ｓ）特異的（Ｈｂｄ）（図２８Ａ）または（Ｒ）特異的３−ヒドロキシブチレート（ＰｈａＢ）（図２８Ｂ）デヒドロゲナーゼとの組み合わせにおけるＰｔｂ−Ｂｕｋを通した３−ヒドロキシブチレートの産生を示すグラフである。
【図２９Ａ】２−ヒドロキシイソブチレート（２−ＨＩＢ）及び２−ヒドロキシブチレート（２−ＨＢ）のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ検出を示すグラフである。図２９Ａ：１ｍＭ  ２−ＨＩＢ標準。
【図２９Ｂ】２−ヒドロキシイソブチレート（２−ＨＩＢ）及び２−ヒドロキシブチレート（２−ＨＢ）のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ検出を示すグラフである。図２９Ｂ：１ｍＭ  ２−ＨＢ標準。
【図２９Ｃ】２−ヒドロキシイソブチレート（２−ＨＩＢ）及び２−ヒドロキシブチレート（２−ＨＢ）のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ検出を示すグラフである。図２９Ｃ：０．５ｍＭ  ２−ＨＢ及び２−ＨＩＢ標準。
【図２９Ｄ】２−ヒドロキシイソブチレート（２−ＨＩＢ）及び２−ヒドロキシブチレート（２−ＨＢ）のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ検出を示すグラフである。図２９Ｄ：ガスからの２−ＨＩＢ及び２−ＨＢ産生を示すＣ・オートエタノゲナム試料の複製。
【図３０】図３０は２−ヒドロキシイソ酪酸（８．９１分）産生のＧＣ−ＭＳ確認を示す図のセットである。第１のパネル：Ｃ・オートエタノゲナム＋ｐＭＴＬ８３１５５−ｔｈｌＡ−ｈｂｄ−Ｐｗｌ−ｍｅａＢｈｃｍＡ−ｈｃｍＢ＋ｐＭＴＬ８２２５６−ｔｅｓＢ。第２のパネル：Ｃ・オートエタノゲナム＋ｐＭＴＬ８３１５５−ｔｈｌＡ−ｈｂｄ−Ｐｗｌ−ｍｅａＢｈｃｍＡ−ｈｃｍＢ＋ｐＭＴＬ８２２５６−ｐｔｂ−ｂｕｋ（スペクトル）。第３のパネル：Ｅ・コリ＋ｐＭＴＬ８３１５５−ｔｈｌＡ−ｈｂｄ−Ｐｗｌ−ｍｅａＢｈｃｍＡ−ｈｃｍＢ＋ｐＭＴＬ８２２５６−ｔｅｓＢ。第４のパネル：Ｅ・コリ＋ｐＭＴＬ８３１５５−ｔｈｌＡ−ｈｂｄ−Ｐｗｌ−ｍｅａＢｈｃｍＡ−ｈｃｍＢ＋ｐＭＴＬ８２２５６−ｐｔｂ−ｂｕｋ。
【図３１】図３１はＥ・コリ、３０℃のＣ・オートエタノゲナムＬＺ１５６１、及び３７℃のＣ・オートエタノゲナムＬＺ１５６１における２−ＨＩＢＡ経路（ｐｔａ−ａｃｋプロモーター及びそれぞれウッド−ユングダール（Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ）オペロンプロモーターからのｔｈｌＡ、ｈｂａ、ｍｅａＢｈｃｍＡ、ｈｃｍＢ）の遺伝子の発現を示すリアルタイムＰＣＲの図のセットである。
【図３２】図３２はＰｔｂ−Ｂｕｋ、ＡＯＲ、及びＡｄｈを含む微生物における様々な産物の産生を示す図である。
【図３３】図３３はＰｔｂ−Ｂｕｋ多様体を特徴付けるＰｔｂ−Ｂｕｋ系との共役ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）を示す図である。
【図３４】図３４はアジピン酸を含む、様々な産物の産生についての代謝経路の図である。太矢印は、Ｐｔｂ−Ｂｕｋにより触媒され得るステップを示す。
【図３５】図３５は１，３−ヘキサンジオール、２−メチル−２−ブタノール、及び２−ブテン−１−オールを含む、様々な産物の産生についての代謝経路の図である。太矢印は、Ｐｔｂ−Ｂｕｋにより触媒され得るステップを示す。
【図３６】図３６はイソバレレート及びイソアミルアルコールを含む、様々な産物の産生についての代謝経路の図である。太矢印は、Ｐｔｂ−Ｂｕｋにより触媒され得るステップを示す。
【図３７】図３７は様々な増殖点でプラスミドｐＭＴＬ８２２５６−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢを含有するＣ・オートエタノゲナムにおける３−ＨＢ産生のグラフである。
【図３８Ａ】図３８Ａは株Ｃ・オートエタノゲナムｐｔｂ−ａｃｋ：：ｐｔｂ−ｂｕｋ＋ｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｐｔｂ−ｂｕｋ−ａｄｃの増殖ならびにエタノール及び２，３−ブタンジオール産生プロファイルを示すグラフである。
【図３８Ｂ】図３８Ｂは株Ｃ・オートエタノゲナムｐｔｂ−ａｃｋ：：ｐｔｂ−ｂｕｋ＋ｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｐｔｂ−ｂｕｋ−ａｄｃのイソプロパノール及び３−ＨＢ産生プロファイルを示すグラフである。
【図３９】図３９は既知の鎖伸長経路（Ｈｂｄ、Ｃｒｔ、Ｂｃｄ−ＥｔｆＡＢ、Ｔｈｌ）をＰｔｂ−Ｂｕｋ＋ＡＯＲ／Ａｄｃ−Ａｄｈと組み合わせることを通して様々なＣ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４アルコール、ケトン、エノール、またはジオールを産生するための経路スキームの図である。
【図４０】図４０は様々な増殖点でプラスミドｐＭＴＬ８３１５９−ｐｈａＢ−ｔｈｌＡで形質転換されたＣ・オートエタノゲナムによる３−ＨＢ及び１，３−ＢＤＯの産生を示すグラフである。
【図４１】図４１は様々な増殖点でｂｕｄＡノックアウト及びｐＭＴＬ−ＨＢＤ−ＴｈｌＡを含むＣ・オートエタノゲナムによる３−ＨＢ及び１，３−ＢＤＯの産生を示すグラフである。
【図４２Ａ】図４２ＡはＣ・オートエタノゲナムｐＭＴＬ８３１５９−ｐｈａＢ−ｔｈｌＡ＋ｐＭＴＬ８２２５６発酵における３−ＨＢの産生を示すグラフである。
【図４２Ｂ】図４２ＢはＣ・オートエタノゲナムｐＭＴＬ８３１５９−ｐｈａＢ−ｔｈｌＡ＋ｐＭＴＬ８２２５６−ｂｕｋ−ｐｔｂ発酵における３−ＨＢの産生を示すグラフである。
【図４３】図４３はＰｔｂ−Ｂｕｋ発現プラスミドｐＭＴＬ８２２５６−ｂｕｋ−ｐｔｂあり及びなしでプラスミドｐＭＴＬ８３１５６−ｐｈａＢ−ｔｈｌＡを発現させるチオエステラーゼノックアウト（ΔＣＡＥＴＨＧ＿１５２４）を有するＣ・オートエタノゲナム株における３−ＨＢの産生を示すグラフである。
【図４４】図４４はＡＯＲ過剰発現プラスミドｐＭＴＬ８３１５９−ａｏｒ１（＋ａｏｒ１）あり及びなしでプラスミドｐＭＴＬ８２２５６−ｈｂｄ−ｔｈｌＡ（２ｐｆ）を発現させるＣ・オートエタノゲナム株におけるエタノール及び１，３−ＢＤＯ産生を示す示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
図１及び３４〜３６の代謝経路
図１及び３４〜３６は、基質からのアセトン、イソプロパノール、イソブチレン、３−ヒドロキシブチレート（Ｒ及びＳ異性体）、１，３−ブタンジオール、２−ヒドロキシイソブチレート、アジピン酸、１，３−ヘキサンジオール、２−メチル−２−ブタノール、２−ブテン−１−オール、イソバレレート、及びイソアミルアルコールを含む、様々な酸、アルケン、ケトン、アルデヒド、アルコール、及びジオール産物の産生のための代謝経路の図である。太矢印は、Ｐｔｂ−Ｂｕｋにより触媒され得るステップを示す。例となる酵素はステップの各々について提供され、酵素経路は図１及び３４〜３６において詳記されている。しかしながら、追加の適切な酵素が当業者に知られている場合がある。
【００１３】
ステップ１は、アセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの変換を示す。このステップは、チオラーゼ（すなわち、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ）（ＥＣ２．３．１．９）により触媒してもよい。チオラーゼは、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）からのＴｈｌＡ（ＷＰ＿０１０９６６１５７．１）（配列番号１）、カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）からのＰｈａＡ（ＷＰ＿０１３９５６４５２．１）（配列番号２）、カプリアビダス・ネカトールからのＢｋｔＢ（ＷＰ＿０１１６１５０８９．１）（配列番号３）、またはエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）からのＡｔｏＢ（ＮＰ＿４１６７２８．１）（配列番号４）であってもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、クロストリジウム・ユングダリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、及びクロストリジウム・ラグスダレイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ）は、このステップについて知られている天然活性を有しない。エシェリキア・コリは、このステップについての天然活性を有する。
【００１４】
ステップ２は、アセトアセチル−ＣｏＡのアセトアセテートへの変換を示す。このステップは、ＣｏＡトランスフェラーゼ（すなわち、アセチル−ＣｏＡ：アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ）（ＥＣ２．８．３．９）により触媒してもよい。ＣｏＡトランスフェラーゼは、例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）からの、ＣｔｆＡＢ、サブユニットＣｔｆＡ及びＣｔｆＢを含むヘテロ二量体（ＣｔｆＡ、ＷＰ＿０１２０５９９９６．１）（配列番号５）（ＣｔｆＢ、ＷＰ＿０１２０５９９９７．１）（配列番号６）であってもよい。このステップはまた、チオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．２０）により触媒してもよい。チオエステラーゼは、例えば、エシェリキア・コリからのＴｅｓＢ（ＮＰ＿４１４９８６．１）（配列番号７）であってもよい。このステップはまた、例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナムまたはクロストリジウム・ユングダリイからの、推定チオエステラーゼにより触媒してもよい。特に、クロストリジウム・オートエタノゲナムにおいて３つの推定チオエステラーゼ、（１）「チオエステラーゼ１」（ＡＧＹ７４９４７．１、パルミトイル−ＣｏＡヒドロラーゼとしてアノテートされている、配列番号８）、（２）「チオエステラーゼ２」（ＡＧＹ７５７４７．１、４−ヒドロキシベンゾイル−ＣｏＡチオエステラーゼとしてアノテートされている、配列番号９）、及び（３）「チオエステラーゼ３」（ＡＧＹ７５９９９．１、推定チオエステラーゼとしてアノテートされている、配列番号１０）が同定されている。クロストリジウム・ユングダリイにおいても３つの推定チオエステラーゼ、（１）「チオエステラーゼ１」（ＡＤＫ１５６９５．１、推定アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ１としてアノテートされている、配列番号１１）、（２）「チオエステラーゼ２」（ＡＤＫ１６６５５．１、推定チオエステラーゼとしてアノテートされている、配列番号１２）、及び（３）「チオエステラーゼ３」（ＡＤＫ１６９５９．１、推定チオエステラーゼとしてアノテートされている、配列番号１３）が同定されている。このステップはまた、ホスフェートブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）＋ブチレートキナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）により触媒してもよい。ホスフェートブチリルトランスフェラーゼ及びブチレートキナーゼの例となる供給源は、本出願において他で記載されている。クロストリジウム・オートエタノゲナムからのチオエステラーゼのような、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイ（またはエシェリキア・コリ）における天然酵素は、このステップを触媒し、いくらかの量の下流産物の産生をもたらし得る。しかしながら、外因性酵素の導入または内因性酵素の過剰発現は、所望のレベルで下流産物を産生するのに必要となり得る。また、特定の実施形態では、破壊的変異は、導入されたＰｔｂ−Ｂｕｋとの競合を低減するか、または排除するために、内因性チオエステラーゼのような内因性酵素に導入され得る。
【００１５】
ステップ３は、アセトアセテートのアセトンへの変換を示す。このステップは、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．４）により触媒してもよい。アセトアセテートデカルボキシラーゼは、例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキイからのＡｄｃ（ＷＰ＿０１２０５９９９８．１）（配列番号１４）であってもよい。このステップはまた、α−ケトイソバレレートデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７４）により触媒してもよい。α−ケトイソイソバレレートデカルボキシラーゼは、例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）からのＫｉｖＤ（配列番号１５）であってもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについて知られている天然活性を有しない。また、エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。まれに、アセトアセテートのアセトンへの変換は自発的に起こり得る。しかしながら、自発的変換は、非常に非効率的であり、所望のレベルでの下流産物の産生をもたらす可能性が低い。
【００１６】
ステップ４は、アセトンのイソプロパノールへの変換を示す。このステップは、第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２）により触媒してもよい。第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼは、例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナムからのＳｅｃＡｄｈ（ＡＧＹ７４７８２．１）（配列番号１６）、クロストリジウム・ユングダリイからのＳｅｃＡｄｈ（ＡＤＫ１５５４４．１）（配列番号１７）、クロストリジウム・ラグスダレイからのＳｅｃＡｄｈ（ＷＰ＿０１３２３９１３４．１）（配列番号１８）、またはクロストリジウム・ベイジェリンキイからのＳｅｃＡｄｈ（ＷＰ＿０２６８８９０４６．１）（配列番号１９）であってもよい。このステップはまた、サーモアナエロバクター・ブロキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｋｉｉ）からのＳｅｃＡｄｈ（３ＦＳＲ＿Ａ）（配列番号２０）のような、第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．８０）により触媒してもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについての天然活性を有する（Ｋｏｐｋｅ、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、８０：３３９４−３４０３、２０１４）。しかしながら、エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイにおいてこの酵素をノックダウンまたはノックアウトすることは、イソプロパノールではなくアセトンの産生及び蓄積をもたらす（ＷＯ２０１５／０８５０１５）。
【００１７】
ステップ５は、アセトンの３−ヒドロキシイソバレレートへの変換を示す。このステップは、ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）からのヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）（ＥＣ２．３．３．１０）（配列番号２１）のような、ヒドロキシイソバレレートシンターゼにより触媒してもよい（ＵＳ２０１２／０１１０００１）。ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼは、活性を向上させるように操作してもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについて知られている天然活性を有しない。エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。
【００１８】
ステップ６は、３−ヒドロキシイソバレレートのイソブチレン（イソブテン）への変換を示す。このステップは、ヒドロキシイソバレレートホスホリラーゼ／デカルボキシラーゼにより触媒してもよい。このステップはまた、メバロネートジホスフェートデカルボキシラーゼ（ヒドロキシイソバレレートデカルボキシラーゼ）（ＥＣ４．１．１．３３）により触媒してもよい。メバロネートジホスフェートデカルボキシラーゼは、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＭｄｄ（ＣＡＡ９６３２４．１）（配列番号２２）またはピクロフィラス・トリダス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｔｏｒｒｉｄｕｓ）からのＭｄｄ（ＷＰ＿０１１１７８１５７．１）（配列番号２３）であってもよい（ＵＳ２０１１／０１６５６４４、ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、９３：１３７７−１３８７、２０１２）。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについて知られている天然活性を有しない。エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。
【００１９】
ステップ７は、アセトンの３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡへの変換を示す。このステップは、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡシンターゼにより触媒してもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについて知られている天然活性を有しない。エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。
【００２０】
ステップ８は、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡの３−ヒドロキシイソバレレートへの変換を示す。このステップは、ＣｏＡトランスフェラーゼ（すなわち、アセチル−ＣｏＡ：アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ）（ＥＣ２．８．３．９）により触媒してもよい。ＣｏＡトランスフェラーゼは、例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）からの、ＣｔｆＡＢ、サブユニットＣｔｆＡ及びＣｔｆＢを含むヘテロ二量体（ＣｔｆＡ、ＷＰ＿０１２０５９９９６．１）（配列番号５）（ＣｔｆＢ、ＷＰ＿０１２０５９９９７．１）（配列番号６）であってもよい。このステップはまた、チオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．２０）により触媒してもよい。チオエステラーゼは、例えば、エシェリキア・コリからのＴｅｓＢ（ＮＰ＿４１４９８６．１）（配列番号７）であってもよい。このステップはまた、例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナムまたはクロストリジウム・ユングダリイからの、推定チオエステラーゼにより触媒してもよい。特に、クロストリジウム・オートエタノゲナムにおいて３つの推定チオエステラーゼ、（１）「チオエステラーゼ１」（ＡＧＹ７４９４７．１、パルミトイル−ＣｏＡヒドロラーゼとしてアノテートされている、配列番号８）、（２）「チオエステラーゼ２」（ＡＧＹ７５７４７．１、４−ヒドロキシベンゾイル−ＣｏＡチオエステラーゼとしてアノテートされている、配列番号９）、及び（３）「チオエステラーゼ３」（ＡＧＹ７５９９９．１、推定チオエステラーゼとしてアノテートされている、配列番号１０）が同定されている。クロストリジウム・ユングダリイにおいても３つの推定チオエステラーゼ、（１）「チオエステラーゼ１」（ＡＤＫ１５６９５．１、推定アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ１としてアノテートされている、配列番号１１）、（２）「チオエステラーゼ２」（ＡＤＫ１６６５５．１、推定チオエステラーゼとしてアノテートされている、配列番号１２）、及び（３）「チオエステラーゼ３」（ＡＤＫ１６９５９．１、推定チオエステラーゼとしてアノテートされている、配列番号１３）が同定されている。このステップはまた、ホスフェートブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）＋ブチレートキナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）により触媒してもよい。ホスフェートブチリルトランスフェラーゼ及びブチレートキナーゼの例となる供給源は、本出願において他で記載されている。クロストリジウム・オートエタノゲナムからのチオエステラーゼのような、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイ（またはエシェリキア・コリ）における天然酵素は、このステップを触媒し、いくらかの量の下流産物の産生をもたらし得る。しかしながら、外因性酵素の導入または内因性酵素の過剰発現は、所望のレベルで下流産物を産生するのに必要となり得る。また、特定の実施形態では、破壊的変異は、導入されたＰｔｂ−Ｂｕｋとの競合を低減するか、または排除するために、内因性チオエステラーゼのような内因性酵素に導入され得る。
【００２１】
ステップ９は、アセチル−ＣｏＡの３−メチル−２−オキソペンタノエートへの変換を示す。このステップは、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイ（ならびにエシェリキア・コリ）を含む、多くの細菌中に天然に存在する、イソロイシン生合成経路に関与する多数の酵素反応を包含する。アセチル−ＣｏＡの３−メチル−２−オキソペンタノエートへの変換に関与する酵素としては、シトラマレートシンターゼ（ＥＣ２．３．１．１８２）、３−イソプロピルマレートデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．３５）、３−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．８５）、アセトラクテートシンターゼ（ＥＣ２．２．１．６）、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＥＣ１．１．１．８６）、及び／またはジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．９）が挙げられ得る。シトラマレートシンターゼは、例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナムからのＣｉｍＡ（ＡＧＹ７６９５８．１）（配列番号２４）またはメタノカルドコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）からのＣｉｍＡ（ＮＰ＿２４８３９５．１）（配列番号２５）であってもよい。３−イソプロピルマレートデヒドラターゼは、例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナムからのＬｅｕＣＤ（ＷＰ＿０２３１６２９５５．１、ＬｅｕＣ、ＡＧＹ７７２０４、ＬｅｕＤ）（それぞれ、配列番号２６及び２７）またはエシェリキア・コリからのＬｅｕＣＤ（ＮＰ＿４１４６１４．１、ＬｅｕＣ、ＮＰ＿４１４６１３．１、ＬｅｕＤ）（それぞれ、配列番号２８及び２９）であってもよい。３−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼは、例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナムからのＬｅｕＢ（ＷＰ＿０２３１６２９５７．１）（配列番号３０）またはエシェリキア・コリからのＬｅｕＢ（ＮＰ＿４１４６１５．４）（配列番号３１）であってもよい。アセトラクテートシンターゼは、例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナムからのＩｌｖＢＮ（ＡＧＹ７４３５９．１、ＩｌｖＢ、ＡＧＹ７４６３５．１、ＩｌｖＢ、ＡＧＹ７４３６０．１、ＩｌｖＮ）（それぞれ、配列番号３２、３３、及び３４）またはエシェリキア・コリからのＩｌｖＢＮ（ＮＰ＿４１８１２７．１、ＩｌｖＢ、ＮＰ＿４１８２１６．１、ＩｌｖＮ）（それぞれ、配列番号３５及び３６）であってもよい。ケトール酸レダクトイソメラーゼは、例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナムからのＩｌｖＣ（ＷＰ＿０１３２３８６９３．１）（配列番号３７）またはエシェリキア・コリからのＩｌｖＣ（ＮＰ＿４１８２２２．１）（配列番号３８）であってもよい。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼは、例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナムからのＩｌｖＤ（ＷＰ＿０１３２３８６９４．１）（配列番号３９）またはエシェリキア・コリからのＩｌｖＤ（ＹＰ＿０２６２４８．１）（配列番号４０）であってもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについての天然活性を有する。
【００２２】
ステップ１０は、３−メチル−２−オキソペンタノエートの２−メチルブタノイル−ＣｏＡへの変換を示す。このステップは、ケトイソバレレートオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．２．７．７）により触媒してもよい。ケトイソバレレートオキシドレダクターゼは、例えば、メタノサーモバクター・サームオートトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）からのＶｏｒＡＢＣＤ（ＷＰ＿０１０８７６３４４．１、ＶｏｒＡ、ＷＰ＿０１０８７６３４３．１、ＶｏｒＢ、ＷＰ＿０１０８７６３４２．１、ＶｏｒＣ、ＷＰ＿０１０８７６３４１．１、ＶｏｒＤ）（それぞれ、配列番号４１〜４４）またはパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）からのＶｏｒＡＢＣＤ（ＷＰ＿０１１０１２１０６．１、ＶｏｒＡ、ＷＰ＿０１１０１２１０５．１、ＶｏｒＢ、ＷＰ＿０１１０１２１０８．１、ＶｏｒＣ、ＷＰ＿０１１０１２１０７．１、ＶｏｒＤ）（それぞれ、配列番号４５〜４８）であってもよい。ＶｏｒＡＢＣＤは、４サブユニット酵素である。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについて知られている天然活性を有しない。エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。
【００２３】
ステップ１１は、２−メチルブタノイル−ＣｏＡの２−メチルクロトニル−ＣｏＡへの変換を示す。このステップは、２−メチルブタノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．３．９９．１２）により触媒してもよい。２−メチルブタノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、例えば、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）からのＡｃｄＨ（ＡＡＤ４４１９６．１もしくはＢＡＢ６９１６０．１）（配列番号４９）またはストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）からのＡｃｄＨ（ＡＡＤ４４１９５．１）（配列番号５０）であってもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについて知られている天然活性を有しない。エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。
【００２４】
ステップ１２は、２−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡへの変換を示す。このステップは、クロトナーゼ／３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５５）により触媒してもよい。クロトナーゼ／３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼは、例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキイからのＣｒｔ（ＡＢＲ３４２０２．１）（配列番号５１）、クロストリジウム・アセトブチリカムからのＣｒｔ（ＮＰ＿３４９３１８．１）（配列番号５２）、またはミクソコッカス・キサンタス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓ）からのＬｉｕＣ（ＷＰ＿０１１５５３７７０．１）であってもよい。このステップはまた、クロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ−レダクターゼ（ＥＣ１．３．１．８６）により触媒してもよい。クロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ−レダクターゼは、例えば、トレポネマ・デンチコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）からのＣｃｒ（ＮＰ＿９７１２１１．１）（配列番号５３）であってもよい。このステップはまた、クロトニル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．３．１．４４）により触媒してもよい。クロトニル−ＣｏＡレダクターゼは、例えば、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）からのＴｅｒ（ＡＡＷ６６８５３．１）（配列番号５４）であってもよい。このステップはまた、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１１６）により触媒してもよい。この３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡデヒドラターゼは、例えば、メタロスフェラ・セデュラ（Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａ）からのＭｓｅｄ＿２００１（ＷＰ＿０１２０２１９２８．１）であってもよい。このステップはまた、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼにより触媒してもよい。このエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（４．２．１．１７）は、例えば、バチルス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）からのＹｎｇＦ（ＷＰ＿０００７８７３７１．１）であってもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについて知られている天然活性を有しない。エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。
【００２５】
ステップ１３は、アセトアセチル−ＣｏＡの３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの変換を示す。このステップは、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）により触媒してもよい。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキイからのＨｂｄ（ＷＰ＿０１１９６７６７５．１）（配列番号５５）、クロストリジウム・アセトブチリカムからのＨｂｄ（ＮＰ＿３４９３１４．１）（配列番号５６）、またはクロストリジウム・クルイベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）からのＨｂｄ１（ＷＰ＿０１１９８９０２７．１）（配列番号５７）であってもよい。このステップはまた、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ４．２．１．３６）により触媒してもよい。アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼは、例えば、カプリアビダス・ネカトールからのＰｈａＢ（ＷＰ＿０１０８１０１３１．１）（配列番号５８）であってもよい。このステップはまた、アセトアセチル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１１９）により触媒してもよい。留意点として、ＰｈａＢはＲ特異的であり、ＨｂｄはＳ特異的である。また、クロストリジウム・クルイベリからのＨｂｄ１はＮＡＤＰＨ依存的であり、クロストリジウム・アセトブチリカム及びクロストリジウム・ベイジェリンキイからのＨｂｄはＮＡＤＨ依存的である。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについて知られている天然活性を有しない。エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。
【００２６】
ステップ１４は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの３−ヒドロキシブチレートへの変換を示す。このステップは、チオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．２０）により触媒してもよい。チオエステラーゼは、例えば、エシェリキア・コリからのＴｅｓＢ（ＮＰ＿４１４９８６．１）（配列番号７）であってもよい。このステップはまた、例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナムまたはクロストリジウム・ユングダリイからの、推定チオエステラーゼにより触媒してもよい。特に、クロストリジウム・オートエタノゲナムにおいて３つの推定チオエステラーゼ、（１）「チオエステラーゼ１」（ＡＧＹ７４９４７．１、パルミトイル−ＣｏＡヒドロラーゼとしてアノテートされている、配列番号８）、（２）「チオエステラーゼ２」（ＡＧＹ７５７４７．１、４−ヒドロキシベンゾイル−ＣｏＡチオエステラーゼとしてアノテートされている、配列番号９）、及び（３）「チオエステラーゼ３」（ＡＧＹ７５９９９．１、推定チオエステラーゼとしてアノテートされている、配列番号１０）が同定されている。クロストリジウム・ユングダリイにおいても３つの推定チオエステラーゼ、（１）「チオエステラーゼ１」（ＡＤＫ１５６９５．１、推定アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ１としてアノテートされている、配列番号１１）、（２）「チオエステラーゼ２」（ＡＤＫ１６６５５．１、推定チオエステラーゼとしてアノテートされている、配列番号１２）、及び（３）「チオエステラーゼ３」（ＡＤＫ１６９５９．１、推定チオエステラーゼとしてアノテートされている、配列番号１３）が同定されている。このステップはまた、ホスフェートブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）＋ブチレートキナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）により触媒してもよい。ホスフェートブチリルトランスフェラーゼ及びブチレートキナーゼの例となる供給源は、本出願において他で記載されている。クロストリジウム・オートエタノゲナムからのチオエステラーゼのような、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイ（またはエシェリキア・コリ）における天然酵素は、このステップを触媒し、いくらかの量の下流産物の産生をもたらし得る。しかしながら、外因性酵素の導入または内因性酵素の過剰発現は、所望のレベルで下流産物を産生するのに必要となり得る。また、特定の実施形態では、破壊的変異は、導入されたＰｔｂ−Ｂｕｋとの競合を低減するか、または排除するために、内因性チオエステラーゼのような内因性酵素に導入され得る。
【００２７】
ステップ１５は、３−ヒドロキシブチレートのアセトアセテートへの変換を示す。このステップは、３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３０）により触媒してもよい。３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼは、例えば、ラルストニア・ピケッティイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ）からのＢｄｈ１（ＢＡＥ７２６８４．１）（配列番号６０）またはラルストニア・ピケッティイからのＢｄｈ２（ＢＡＥ７２６８５．１）（配列番号６１）であってもよい。逆反応、アセトアセテートの３−ヒドロキシブチレートへの変換は、異なる３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３０）により触媒してもよい。例えば、アセトアセテートの３−ヒドロキシブチレートへの変換は、クロストリジウム・オートエタノゲナムからのＢｄｈ（ＡＧＹ７５９６２）（配列番号６２）により触媒してもよい。クロストリジウム・ユングダリイ及びクロストリジウム・ラグスダレイは、おそらく同様の活性を有する酵素を有する。エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。
【００２８】
ステップ１６は、３−ヒドロキシブチレートの３−ヒドロキシブチリルアルデヒドへの変換を示す。このステップは、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）により触媒してもよい。アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＡＯＲ）は、例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナムからのＡＯＲ（ＷＰ＿０１３２３８６６５．１、ＷＰ＿０１３２３８６７５．１）（それぞれ、配列番号６３及び６４）またはクロストリジウム・ユングダリイからのＡＯＲ（ＡＤＫ１５０７３．１、ＡＤＫ１５０８３．１）（それぞれ、配列番号６５及び６６）であってもよい。さらなる実施形態では、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼは、例えば、その配列が公表されている、下記の供給源のいずれかであってもよく、またはこれに由来してもよい。
【００２９】
【表１】
2018530342.tif 000003
2018530342.tif 000004
2018530342.tif 000005
2018530342.tif 000006
2018530342.tif 000007
2018530342.tif 000008
2018530342.tif 000009
2018530342.tif 000010
2018530342.tif 000011
2018530342.tif 000012
2018530342.tif 000013
2018530342.tif 000014
2018530342.tif 000015
【００３０】
ＡＯＲは、アルデヒド及び酸化フェレドキシンを形成する酸及び還元フェレドキシンの反応を触媒する。アセトゲンにおいて、この反応は、共に還元フェレドキシンをもたらす酸化ＣＯ（ＣＯデヒドロゲナーゼ、ＥＣ１．２．７．４を通して）または水素（フェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼ、ＥＣ１．１２．７．２もしくは１．１２．１．４を通して）と共役することができる（Ｋｏｐｋｅ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：３２０−３２５、２０１１、Ｋｏｐｋｅ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１０７：１３０８７−１３０９２、２０１０）。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについての天然活性を有する。しかしながら、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイにおける内因性ＡＯＲの過剰発現または外因性ＡＯＲの導入は、産物収率を向上させるのに望ましい場合があり得る。あるいは、外因性ＡＯＲを、ＡＯＲを天然に含まない微生物、例えば、Ｅ・コリに導入してもよい。特に、Ｐｔｂ−Ｂｕｋ及びＡＯＲ（ならびに、任意で、Ａｄｈ）の共発現は、こうした微生物が新たな非天然産物を産生することを可能にし得る。
【００３１】
ステップ１７は、３−ヒドロキシブチリルアルデヒドの１，３−ブタンジオールへの変換を示す。このステップは、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１．または１．１．１．２．）により触媒してもよい。アルコールデヒドロゲナーゼは、アルデヒド及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈをアルコール及びＮＡＤ（Ｐ）に変換することができる。アルコールデヒドロゲナーゼは、例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナム（ＡＧＹ７６０６０．１）（配列番号６７）、クロストリジウム・ユングダリイ（ＡＤＫ１７０１９．１）（配列番号６８）、もしくはクロストリジウム・ラグスダレイからのＡｄｈ、クロストリジウム・アセトブチリカムからのＢｄｈＢ（ＮＰ＿３４９８９１．１）（配列番号６９）、クロストリジウム・ベイジェリンキイからのＢｄｈ（ＷＰ＿０４１８９７１８７．１）（配列番号７０）、クロストリジウム・ユングダリイからのＢｄｈ１（ＹＰ＿００３７８０６４８．１）（配列番号７１）、クロストリジウム・オートエタノゲナムからのＢｄｈ１（ＡＧＹ７６０６０．１）（配列番号７２）、クロストリジウム・ユングダリイからのＢｄｈ２（ＹＰ＿００３７８２１２１．１）（配列番号７３）、クロストリジウム・オートエタノゲナムからのＢｄｈ２（ＡＧＹ７４７８４．１）（配列番号７４）、クロストリジウム・アセトブチリカムからのＡｄｈＥ１（ＮＰ＿１４９３２５．１）（配列番号７５）、クロストリジウム・アセトブチリカムからのＡｄｈＥ２（ＮＰ＿１４９１９９．１）（配列番号７６）、クロストリジウム・ベイジェリンキイからのＡｄｈＥ（ＷＰ＿０４１８９３６２６．１）（配列番号７７）、クロストリジウム・オートエタノゲナムからのＡｄｈＥ１（ＷＰ＿０２３１６３３７２．１）（配列番号７８）、またはクロストリジウム・オートエタノゲナムからのＡｄｈＥ２（ＷＰ＿０２３１６３３７３．１）（配列番号７９）であってもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについての天然活性を有する。しかしながら、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイにおける内因性アルコールデヒドロゲナーゼの過剰発現または外因性アルコールデヒドロゲナーゼの導入は、産物収率を向上させるのに望ましい場合があり得る。エシェリキア・コリは、おそらくこのステップについての天然活性を有しない。
【００３２】
ステップ１８は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの３−ヒドロキシブチリルアルデヒドへの変換を示す。このステップは、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．５７）により触媒してもよい。ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼは、例えば、クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）からのＢｌｄ（ＡＡＰ４２５６３．１）（配列番号８０）であってもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについて知られている天然活性を有しない。エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。
【００３３】
ステップ１９は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡへの変換を示す。このステップは、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼ（ＥＣ５．４．９９．−）により触媒してもよい。２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼは、例えば、アクインコラ・テルチアリカルボニス（Ａｑｕｉｎｃｏｌａ  ｔｅｒｔｉａｒｉｃａｒｂｏｎｉｓ）からのＨｃｍＡＢ（ＡＦＫ７７６６８．１、大サブユニット、ＡＦＫ７７６６５．１、小サブユニット）（それぞれ、配列番号８１及び８２）またはキルピジア・ツシアエ（Ｋｙｒｐｉｄｉａ  ｔｕｓｃｉａｅ）からのＨｃｍＡＢ（ＷＰ＿０１３０７４５３０．１、大サブユニット、ＷＰ＿０１３０７４５３１．１、小サブユニット）（それぞれ、配列番号８３及び８４）であってもよい。シャペロンＭｅａＢ（ＡＦＫ７７６６７．１、アクインコラ・テルチアリカルボニス、ＷＰ＿０１３０７４５２９．１、キルピジア・ツシアエ）（それぞれ、配列番号８５及び８６）は、ＨｃｍＡＢ機能にＭｅａＢは必要ないが、ＨｃｍＡＢを再活性化することによりＨｃｍＡＢの活性を向上させることが記載されている（Ｙａｎｅｖａ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２８７：１５５０２−１５５１１、２０１２）。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについて知られている天然活性を有しない。エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。
【００３４】
ステップ２０は、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡの２−ヒドロキシイソブチレートへの変換を示す。このステップは、ホスフェートブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）＋ブチレートキナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）により触媒してもよい。ホスフェートブチリルトランスフェラーゼ及びブチレートキナーゼの例となる供給源は、本出願において他で記載されている。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについて知られている天然活性を有しない。エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。
【００３５】
ステップ２１は、アセチル−ＣｏＡのスクシニル−ＣｏＡへの変換を示す。このステップは、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイ（ならびにエシェリキア・コリ）を含む、多くの細菌中に天然に存在する、還元的ＴＣＡ経路に関与する多数の酵素反応を包含する（Ｂｒｏｗｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ、７：４０、２０１４、米国特許第９，２９７，０２６号）。アセチル−ＣｏＡのスクシニル−ＣｏＡへの変換に関与する酵素としては、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）（ＥＣ１．２．７．１）、ピルベートカルボキシラーゼ（ＰＹＣ）（ＥＣ６．４．１．１）、マリック酵素／マレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３８、ＥＣ１．１．１．４０）、ピルベートホスフェートジキナーゼ（ＰＰＤＫ）（ＥＣ２．７．９．１）、ＰＥＰカルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）（ＥＣ４．１．１．４９）、フマレートヒドラターゼ／フメラーゼ（ＥＣ４．２．１．２）、フマレートレダクターゼ（ＥＣ１．３．５．１）／スクシネートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．３．５．４）、及びスクシニル−ＣｏＡシンセターゼ（ＥＣ６．２．１．５）が挙げられ得る。ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼは、例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナム（ＡＧＹ７５１５３、ＡＧＹ７７２３２）またはエシェリキア・コリ（ＮＰ＿４１５８９６）からであってもよい。ピルベートカルボキシラーゼは、例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナム（ＡＧＹ７５８１７）からであってもよい。マリック酵素／マレートデヒドロゲナーゼは、例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナム（ＡＧＹ７６６８７）またはエシェリキア・コリ（ＮＰ＿４１６７１４、ＮＰ＿４１７７０３）からであってもよい。ピルベートホスフェートジキナーゼ（ＰＰＤＫ）は、例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナム（ＡＧＹ７６２７４、ＡＧＹ７７１１４）からであってもよい。ＰＥＰカルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）は、例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナム（ＡＧＹ７６９２８）またはエシェリキア・コリ（ＮＰ＿４１７８６２）からであってもよい。フマレートヒドラターゼ／フメラーゼは、例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナム（ＡＧＹ７６１２１、ＡＧＹ７６１２２）またはエシェリキア・コリ（ＮＰ＿４１６１２８、ＮＰ＿４１６１２９、ＮＰ＿４１８５４６）からであってもよい。フマレートレダクターゼ／スクシネートデヒドロゲナーゼは、例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナム（ＡＧＹ７４５７３、ＡＧＹ７４５７５、ＡＧＹ７５２５７、ＡＧＹ７７１６６）またはエシェリキア・コリ（ＮＰ＿４１５２４９、ＮＰ＿４１５２５０、ＮＰ＿４１５２５１、ＮＰ＿４１５２５２、ＮＰ＿４１８５７５、ＮＰ＿４１８５７６、ＮＰ＿４１８５７７、ＮＰ＿４１８５７８）からであってもよい。スクシニル−ＣｏＡシンセターゼは、例えば、エシェリキア・コリ（ＮＰ＿４１５２５６、ＮＰ＿４１５２５７）からであってもよい。
【００３６】
ステップ２２は、アセチル−ＣｏＡ及びスクシニル−ＣｏＡの３−オキソ−アジピル−ＣｏＡへの変換を示す。このステップは、β−ケトアジピル−ＣｏＡチオラーゼ（ＥＣ２．３．１．１６）により触媒してもよい。ケトイソバレレートオキシドレダクターゼは、例えば、エシェリキア・コリからのＰａａＪ（ＷＰ＿００１２０６１９０．１）であってもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについて知られている天然活性を有しない。エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。
【００３７】
ステップ２３は、３−オキソ−アジピル−ＣｏＡの３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡへの変換を示す。このステップは、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）またはアセトアセチル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１１９）により触媒してもよい。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼまたはアセトアセチル−ＣｏＡヒドラターゼは、例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキイからのＨｂｄ（ＷＰ＿０１１９６７６７５．１）（配列番号５５）、クロストリジウム・アセトブチリカムからのＨｂｄ（ＮＰ＿３４９３１４．１）（配列番号５６）、クロストリジウム・クルイベリからのＨｂｄ１（ＷＰ＿０１１９８９０２７．１）（配列番号５７）、またはカプリアビダス・ネカトールからのＰａａＨ１（ＷＰ＿０１０８１４８８２．１）であってもよい。留意点として、ＰｈａＢはＲ特異的であり、ＨｂｄはＳ特異的である。また、クロストリジウム・クルイベリからのＨｂｄ１はＮＡＤＰＨ依存的であり、クロストリジウム・アセトブチリカム及びクロストリジウム・ベイジェリンキイからのＨｂｄはＮＡＤＨ依存的である。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについて知られている天然活性を有しない。エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。
【００３８】
ステップ２４は、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡの２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡへの変換を示す。このステップは、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１７）またはエノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．３．１．３８）により触媒してもよい。エノイル−ＣｏＡヒドラターゼまたはエノイル−ＣｏＡレダクターゼは、例えば、Ｃ・アセトブチリカムからのＣｒｔ（ＮＰ＿３４９３１８．１）またはアエロモナス・カビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）からのＰｈａＪ（Ｏ３２４７２）（配列番号５２）であってもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについて知られている天然活性を有しない。エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。
【００３９】
ステップ２５は、２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡのアジピル−ＣｏＡへの変換を示す。このステップは、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．３．８．１、ＥＣ１．３．１．８６、ＥＣ１．３．１．８５、ＥＣ１．３．１．４４）により触媒してもよい。トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼは、例えば、電子フラボタンパク質ＥｔｆＡＢ（ＮＰ＿３４９３１５、ＮＰ＿３４９３１６）と複合体を形成するＣ・アセトブチリカムからのＢｃｄ（ＮＰ＿３４９３１７．１）、ストレプトマイセス・コリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｌｌｉｎｕｓ）からのＣｃｒ（ＡＡＡ９２８９０）、ロドバクター・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）からのＣｃｒ（ＹＰ＿３５４０４４．１）、トレポネマ・デンチコラからのＴｅｒ（ＮＰ＿９７１２１１．１）、またはユーグレナ・グラシリスからのＴｅｒ（ＡＹ７４１５８２．１）であってもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについて知られている天然活性を有しない。エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。
【００４０】
ステップ２６は、アジピル−ＣｏＡのアジピン酸への変換を示す。このステップは、ホスフェートブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）＋ブチレートキナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）により触媒してもよい。ホスフェートブチリルトランスフェラーゼ及びブチレートキナーゼの例となる供給源は、本出願において他で記載されている。クロストリジウム・オートエタノゲナムからのチオエステラーゼのような、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイ（またはエシェリキア・コリ）における天然酵素は、このステップを触媒し、いくらかの量の下流産物の産生をもたらし得る。しかしながら、外因性酵素の導入または内因性酵素の過剰発現は、所望のレベルで下流産物を産生するのに必要となり得る。また、特定の実施形態では、破壊的変異は、導入されたＰｔｂ−Ｂｕｋとの競合を低減するか、または排除するために、内因性チオエステラーゼのような内因性酵素に導入され得る。
【００４１】
ステップ２７は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの３−クロトニル−ＣｏＡへの変換を示す。このステップは、クロトニル−ＣｏＡヒドラターゼ（クロトナーゼ）（ＥＣ４．２．１．１７）またはクロトニル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．３．１．３８）により触媒してもよい。クロトニル−ＣｏＡヒドラターゼ（クロトナーゼ）またはクロトニル−ＣｏＡレダクターゼは、例えば、Ｃ・アセトブチリカムからのＣｒｔ（ＮＰ＿３４９３１８．１）（配列番号５２）またはアエロモナス・カビエからのＰｈａＪ（Ｏ３２４７２）であってもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについて知られている天然活性を有しない。エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。
【００４２】
ステップ２８は、クロトニル−ＣｏＡのクロトネートへの変換を示す。このステップは、ホスフェートブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）＋ブチレートキナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）により触媒してもよい。ホスフェートブチリルトランスフェラーゼ及びブチレートキナーゼの例となる供給源は、本出願において他で記載されている。クロストリジウム・オートエタノゲナムからのチオエステラーゼのような、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイ（またはエシェリキア・コリ）における天然酵素は、このステップを触媒し、いくらかの量の下流産物の産生をもたらし得る。しかしながら、外因性酵素の導入または内因性酵素の過剰発現は、所望のレベルで下流産物を産生するのに必要となり得る。また、特定の実施形態では、破壊的変異は、導入されたＰｔｂ−Ｂｕｋとの競合を低減するか、または排除するために、内因性チオエステラーゼのような内因性酵素に導入され得る。
【００４３】
ステップ２９は、クロトネートのクロトンアルデヒドへの変換を示す。このステップは、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）により触媒してもよい。アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼの例となる供給源は、本出願において他で記載されている。ＡＯＲは、アルデヒド及び酸化フェレドキシンを形成する酸及び還元フェレドキシンの反応を触媒する。アセトゲンにおいて、この反応は、共に還元フェレドキシンをもたらす酸化ＣＯ（ＣＯデヒドロゲナーゼ、ＥＣ１．２．７．４を通して）または水素（フェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼ、ＥＣ１．１２．７．２もしくは１．１２．１．４を通して）と共役することができる（Ｋｏｐｋｅ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：３２０−３２５、２０１１、Ｋｏｐｋｅ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１０７：１３０８７−１３０９２、２０１０）。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについての天然活性を有する。しかしながら、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイにおける内因性ＡＯＲの過剰発現または外因性ＡＯＲの導入は、産物収率を向上させるのに望ましい場合があり得る。パイロコッカス・フリオサスのＡＯＲは、クロトンアルデヒド及びクロトネートを変換する活性について実証されている（Ｌｏｅｓ、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８７：７０５６−７０６１、２００５）。あるいは、外因性ＡＯＲを、ＡＯＲを天然に含まない微生物、例えば、Ｅ・コリに導入してもよい。特に、Ｐｔｂ−Ｂｕｋ及びＡＯＲ（ならびに、任意で、Ａｄｈ）の共発現は、こうした微生物が新たな非天然産物を産生することを可能にし得る。
【００４４】
ステップ３０は、クロトンアルデヒドの２−ブテン−１−オールへの変換を示す。このステップは、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１．または１．１．１．２．）により触媒してもよい。アルコールデヒドロゲナーゼは、アルデヒド及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈをアルコール及びＮＡＤ（Ｐ）に変換することができる。アルコールデヒドロゲナーゼは、例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナム（ＡＧＹ７６０６０．１）（配列番号６７）、クロストリジウム・ユングダリイ（ＡＤＫ１７０１９．１）（配列番号６８）、もしくはクロストリジウム・ラグスダレイからのＡｄｈ、クロストリジウム・アセトブチリカムからのＢｄｈＢ（ＮＰ＿３４９８９１．１）（配列番号６９）、クロストリジウム・ベイジェリンキイからのＢｄｈ（ＷＰ＿０４１８９７１８７．１）（配列番号７０）、クロストリジウム・ユングダリイからのＢｄｈ１（ＹＰ＿００３７８０６４８．１）（配列番号７１）、クロストリジウム・オートエタノゲナムからのＢｄｈ１（ＡＧＹ７６０６０．１）（配列番号７２）、クロストリジウム・ユングダリイからのＢｄｈ２（ＹＰ＿００３７８２１２１．１）（配列番号７３）、クロストリジウム・オートエタノゲナムからのＢｄｈ２（ＡＧＹ７４７８４．１）（配列番号７４）、クロストリジウム・アセトブチリカムからのＡｄｈＥ１（ＮＰ＿１４９３２５．１）（配列番号７５）、クロストリジウム・アセトブチリカムからのＡｄｈＥ２（ＮＰ＿１４９１９９．１）（配列番号７６）、クロストリジウム・ベイジェリンキイからのＡｄｈＥ（ＷＰ＿０４１８９３６２６．１）（配列番号７７）、クロストリジウム・オートエタノゲナムからのＡｄｈＥ１（ＷＰ＿０２３１６３３７２．１）（配列番号７８）、またはクロストリジウム・オートエタノゲナムからのＡｄｈＥ２（ＷＰ＿０２３１６３３７３．１）（配列番号７９）であってもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについての天然活性を有する。しかしながら、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイにおける内因性アルコールデヒドロゲナーゼの過剰発現または外因性アルコールデヒドロゲナーゼの導入は、産物収率を向上させるのに望ましい場合があり得る。エシェリキア・コリは、おそらくこのステップについての天然活性を有しない。
【００４５】
ステップ３１は、クロトニル−ＣｏＡのブチリル−ＣｏＡへの変換を示す。このステップは、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼまたはトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．３．８．１、ＥＣ１．３．１．８６、ＥＣ１．３．１．８５、ＥＣ１．３．１．４４）により触媒してもよい。ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼまたはトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼは、例えば、電子フラボタンパク質ＥｔｆＡＢ（ＮＰ＿３４９３１５、ＮＰ＿３４９３１６）と複合体を形成するＣ・アセトブチリカムからのＢｃｄ（ＮＰ＿３４９３１７．１）、ストレプトマイセス・コリヌスからのＣｃｒ（ＡＡＡ９２８９０）、ロドバクター・スファエロイデスからのＣｃｒ（ＹＰ＿３５４０４４．１）、トレポネマ・デンチコラからのＴｅｒ（ＮＰ＿９７１２１１．１）、またはユーグレナ・グラシリスからのＴｅｒ（ＡＹ７４１５８２．１）であってもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについて知られている天然活性を有しない。エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。
【００４６】
ステップ３２は、ブチリル−ＣｏＡのアセトブチリル−ＣｏＡへの変換を示す。このステップは、チオラーゼまたはアシル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）により触媒してもよい。チオラーゼは、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカムからのＴｈｌＡ（ＷＰ＿０１０９６６１５７．１）（配列番号１）、クロストリジウム・クルイベリからのＴｈｌＡ１（ＥＤＫ３５６８１）、クロストリジウム・クルイベリからのＴｈｌＡ２（ＥＤＫ３５６８２）、クロストリジウム・クルイベリからのＴｈｌＡ３（ＥＤＫ３５６８３）、カプリアビダス・ネカトールからのＰｈａＡ（ＷＰ＿０１３９５６４５２．１）（配列番号２）、カプリアビダス・ネカトールからのＢｋｔＢ（ＷＰ＿０１１６１５０８９．１）（配列番号３）、またはエシェリキア・コリからのＡｔｏＢ（ＮＰ＿４１６７２８．１）（配列番号４）であってもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについて知られている天然活性を有しない。エシェリキア・コリは、このステップについての天然活性を有する。
【００４７】
ステップ３３は、アセトブチリル−ＣｏＡのアセトブチレートへの変換を示す。このステップは、ホスフェートブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）＋ブチレートキナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）により触媒してもよい。ホスフェートブチリルトランスフェラーゼ及びブチレートキナーゼの例となる供給源は、本出願において他で記載されている。クロストリジウム・オートエタノゲナムからのチオエステラーゼのような、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイ（またはエシェリキア・コリ）における天然酵素は、このステップを触媒し、いくらかの量の下流産物の産生をもたらし得る。しかしながら、外因性酵素の導入または内因性酵素の過剰発現は、所望のレベルで下流産物を産生するのに必要となり得る。また、特定の実施形態では、破壊的変異は、導入されたＰｔｂ−Ｂｕｋとの競合を低減するか、または排除するために、内因性チオエステラーゼのような内因性酵素に導入され得る。
【００４８】
ステップ３４は、アセトブチレートのアセチルアセトンへの変換を示す。このステップは、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．４）により触媒してもよい。アセトアセテートデカルボキシラーゼは、例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキイからのＡｄｃ（ＷＰ＿０１２０５９９９８．１）（配列番号１４）であってもよい。このステップはまた、α−ケトイソバレレートデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７４）により触媒してもよい。α−ケトイソイソバレレートデカルボキシラーゼは、例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）からのＫｉｖＤ（配列番号１５）であってもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについて知られている天然活性を有しない。また、エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。まれに、アセトアセテートのアセトンへの変換は自発的に起こり得る。しかしながら、自発的変換は、非常に非効率的であり、所望のレベルでの下流産物の産生をもたらす可能性が低い。
【００４９】
ステップ３５は、アセチルアセトンの３−メチル−２−ブタノールへの変換を示す。このステップは、第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２）により触媒してもよい。第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼは、例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナムからのＳｅｃＡｄｈ（ＡＧＹ７４７８２．１）（配列番号１６）、クロストリジウム・ユングダリイからのＳｅｃＡｄｈ（ＡＤＫ１５５４４．１）（配列番号１７）、クロストリジウム・ラグスダレイからのＳｅｃＡｄｈ（ＷＰ＿０１３２３９１３４．１）（配列番号１８）、またはクロストリジウム・ベイジェリンキイからのＳｅｃＡｄｈ（ＷＰ＿０２６８８９０４６．１）（配列番号１９）であってもよい。このステップはまた、サーモアナエロバクター・ブロキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｋｉｉ）からのＳｅｃＡｄｈ（３ＦＳＲ＿Ａ）（配列番号２０）のような、第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．８０）により触媒してもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについての天然活性を有する（Ｋｏｐｋｅ、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、８０：３３９４−３４０３、２０１４）。しかしながら、エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイにおいてこの酵素をノックダウンまたはノックアウトすることは、３−メチル−２−ブタノールではなくアセチルアセトンの産生及び蓄積をもたらす（ＷＯ２０１５／０８５０１５）。
【００５０】
ステップ３６は、アセトブチリル−ＣｏＡの３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡへの変換を示す。このステップは、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５７）またはアセトアセチル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１１９）により触媒してもよい。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼまたはアセトアセチル−ＣｏＡヒドラターゼは、例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキイからのＨｂｄ（ＷＰ＿０１１９６７６７５．１）（配列番号５５）、クロストリジウム・アセトブチリカムからのＨｂｄ（ＮＰ＿３４９３１４．１）（配列番号５６）、クロストリジウム・クルイベリからのＨｂｄ１（ＷＰ＿０１１９８９０２７．１）（配列番号５７）、クロストリジウム・クルイベリからのＨｂｄ２（ＥＤＫ３４８０７）、またはカプリアビダス・ネカトールからのＰａａＨ１（ＷＰ＿０１０８１４８８２．１）であってもよい。留意点として、ＰｈａＢはＲ特異的であり、ＨｂｄはＳ特異的である。また、クロストリジウム・クルイベリからのＨｂｄ１はＮＡＤＰＨ依存的であり、クロストリジウム・アセトブチリカム及びクロストリジウム・ベイジェリンキイからのＨｂｄはＮＡＤＨ依存的である。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについて知られている天然活性を有しない。エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。
【００５１】
ステップ３７は、３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡの３−ヒドロキシヘキサノエートへの変換を示す。このステップは、ホスフェートブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）＋ブチレートキナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）により触媒してもよい。ホスフェートブチリルトランスフェラーゼ及びブチレートキナーゼの例となる供給源は、本出願において他で記載されている。クロストリジウム・オートエタノゲナムからのチオエステラーゼのような、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイ（またはエシェリキア・コリ）における天然酵素は、このステップを触媒し、いくらかの量の下流産物の産生をもたらし得る。しかしながら、外因性酵素の導入または内因性酵素の過剰発現は、所望のレベルで下流産物を産生するのに必要となり得る。また、特定の実施形態では、破壊的変異は、導入されたＰｔｂ−Ｂｕｋとの競合を低減するか、または排除するために、内因性チオエステラーゼのような内因性酵素に導入され得る。
【００５２】
ステップ３８は、３−ヒドロキシヘキサノエートの１，３−ヘキサアルデヒドへの変換を示す。このステップは、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）により触媒してもよい。アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼの例となる供給源は、本出願において他で記載されている。ＡＯＲは、アルデヒド及び酸化フェレドキシンを形成する酸及び還元フェレドキシンの反応を触媒する。アセトゲンにおいて、この反応は、共に還元フェレドキシンをもたらす酸化ＣＯ（ＣＯデヒドロゲナーゼ、ＥＣ１．２．７．４を通して）または水素（フェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼ、ＥＣ１．１２．７．２もしくは１．１２．１．４を通して）と共役することができる（Ｋｏｐｋｅ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：３２０−３２５、２０１１、Ｋｏｐｋｅ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１０７：１３０８７−１３０９２、２０１０）。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについての天然活性を有する。しかしながら、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイにおける内因性ＡＯＲの過剰発現または外因性ＡＯＲの導入は、産物収率を向上させるのに望ましい場合があり得る。あるいは、外因性ＡＯＲを、ＡＯＲを天然に含まない微生物、例えば、Ｅ・コリに導入してもよい。特に、Ｐｔｂ−Ｂｕｋ及びＡＯＲ（ならびに、任意で、Ａｄｈ）の共発現は、こうした微生物が新たな非天然産物を産生することを可能にし得る。
【００５３】
ステップ３９は、１，３−ヘキサアルデヒドの１，３−ヘキサンジオールへの変換を示す。このステップは、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１．または１．１．１．２．）により触媒してもよい。アルコールデヒドロゲナーゼは、アルデヒド及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈをアルコール及びＮＡＤ（Ｐ）に変換することができる。アルコールデヒドロゲナーゼは、例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナム（ＡＧＹ７６０６０．１）（配列番号６７）、クロストリジウム・ユングダリイ（ＡＤＫ１７０１９．１）（配列番号６８）、もしくはクロストリジウム・ラグスダレイからのＡｄｈ、クロストリジウム・アセトブチリカムからのＢｄｈＢ（ＮＰ＿３４９８９１．１）（配列番号６９）、クロストリジウム・ベイジェリンキイからのＢｄｈ（ＷＰ＿０４１８９７１８７．１）（配列番号７０）、クロストリジウム・ユングダリイからのＢｄｈ１（ＹＰ＿００３７８０６４８．１）（配列番号７１）、クロストリジウム・オートエタノゲナムからのＢｄｈ１（ＡＧＹ７６０６０．１）（配列番号７２）、クロストリジウム・ユングダリイからのＢｄｈ２（ＹＰ＿００３７８２１２１．１）（配列番号７３）、クロストリジウム・オートエタノゲナムからのＢｄｈ２（ＡＧＹ７４７８４．１）（配列番号７４）、クロストリジウム・アセトブチリカムからのＡｄｈＥ１（ＮＰ＿１４９３２５．１）（配列番号７５）、クロストリジウム・アセトブチリカムからのＡｄｈＥ２（ＮＰ＿１４９１９９．１）（配列番号７６）、クロストリジウム・ベイジェリンキイからのＡｄｈＥ（ＷＰ＿０４１８９３６２６．１）（配列番号７７）、クロストリジウム・オートエタノゲナムからのＡｄｈＥ１（ＷＰ＿０２３１６３３７２．１）（配列番号７８）、またはクロストリジウム・オートエタノゲナムからのＡｄｈＥ２（ＷＰ＿０２３１６３３７３．１）（配列番号７９）であってもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについての天然活性を有する。しかしながら、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイにおける内因性アルコールデヒドロゲナーゼの過剰発現または外因性アルコールデヒドロゲナーゼの導入は、産物収率を向上させるのに望ましい場合があり得る。エシェリキア・コリは、おそらくこのステップについての天然活性を有しない。
【００５４】
ステップ４０は、アセトアセチル−ＣｏＡの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡへの変換を示す。このステップは、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）（ＥＣ２．３．３．１０）により触媒してもよい。ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼは、生物の多くの属及び界にわたって広く存在し、例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）からのＭｖａＳ（ＷＰ＿０５３０１４８６３．１）、サッカロマイセス・セレビシエからのＥＲＧ１３（ＮＰ＿０１３５８０．１）、ムス・ムスクルスからのＨＭＧＣＳ２（ＮＰ＿０３２２８２．２）、及び酵素のＥＣ２．３．３．１０グループの多くの他のメンバーが含まれる。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについて知られている天然活性を有しない。エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。
【００５５】
ステップ４１は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタノイル−ＣｏＡの３−メチルグルコニル−ＣｏＡへの変換を示す。このステップは、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５５）により触媒してもよい。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼは、例えば、ミクソコッカス・キサンタスからのＬｉｕＣ（ＷＰ＿０１１５５３７７０．１）であってもよい。このステップはまた、短鎖エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１５０）またはエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１７）により触媒してもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについて知られている天然活性を有しない。エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。
【００５６】
ステップ４２は、３−メチルグルコニル−ＣｏＡの２−メチルクロトニル−ＣｏＡへの変換を示す。このステップは、メチルクロトニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ（グルタコネート−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１２）との高い構造的類似性を有する）、例えば、ミクソコッカス・キサンタスからのａｉｂＡＢ（ＷＰ＿０１１５５４２６７．１及びＷＰ＿０１１５５４２６８．１）により触媒してもよい。このステップはまた、メチルクロトノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）、例えば、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からのＬｉｕＤＢ（ＮＰ＿２５０７０２．１及びＮＰ＿２５０７０４．１）またはアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）からのＭＣＣＡ及びＭＣＣＢ（ＮＰ＿５６３６７４．１及びＮＰ＿５６７９５０．１）により触媒してもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについて知られている天然活性を有しない。エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。
【００５７】
ステップ４３は、メチルクロトニル−ＣｏＡのイソバレリル−ＣｏＡへの変換を示す。このステップは、オキシドレダクターゼ、亜鉛結合デヒドロゲナーゼにより触媒してもよい。このオキシドレダクターゼ、亜鉛結合デヒドロゲナーゼは、例えば、ミクソコッカス・キサンタスからのＡｉｂＣ（ＷＰ＿０１１５５４２６９．１）であってもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについて知られている天然活性を有しない。エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。
【００５８】
ステップ４４は、イソバレリル−ＣｏＡのイソバレレートへの変換を示す。このステップは、ＣｏＡトランスフェラーゼ（すなわち、アセチル−ＣｏＡ：アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ）（ＥＣ２．８．３．９）により触媒してもよい。ＣｏＡトランスフェラーゼは、例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）からの、ＣｔｆＡＢ、サブユニットＣｔｆＡ及びＣｔｆＢを含むヘテロ二量体（ＣｔｆＡ、ＷＰ＿０１２０５９９９６．１）（配列番号５）（ＣｔｆＢ、ＷＰ＿０１２０５９９９７．１）（配列番号６）であってもよい。このステップはまた、チオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．２０）により触媒してもよい。チオエステラーゼは、例えば、エシェリキア・コリからのＴｅｓＢ（ＮＰ＿４１４９８６．１）（配列番号７）であってもよい。このステップはまた、例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナムまたはクロストリジウム・ユングダリイからの、推定チオエステラーゼにより触媒してもよい。特に、クロストリジウム・オートエタノゲナムにおいて３つの推定チオエステラーゼ、（１）「チオエステラーゼ１」（ＡＧＹ７４９４７．１、パルミトイル−ＣｏＡヒドロラーゼとしてアノテートされている、配列番号８）、（２）「チオエステラーゼ２」（ＡＧＹ７５７４７．１、４−ヒドロキシベンゾイル−ＣｏＡチオエステラーゼとしてアノテートされている、配列番号９）、及び（３）「チオエステラーゼ３」（ＡＧＹ７５９９９．１、推定チオエステラーゼとしてアノテートされている、配列番号１０）が同定されている。クロストリジウム・ユングダリイにおいても３つの推定チオエステラーゼ、（１）「チオエステラーゼ１」（ＡＤＫ１５６９５．１、推定アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ１としてアノテートされている、配列番号１１）、（２）「チオエステラーゼ２」（ＡＤＫ１６６５５．１、推定チオエステラーゼとしてアノテートされている、配列番号１２）、及び（３）「チオエステラーゼ３」（ＡＤＫ１６９５９．１、推定チオエステラーゼとしてアノテートされている、配列番号１３）が同定されている。このステップはまた、ホスフェートブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）＋ブチレートキナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）により触媒してもよい。ホスフェートブチリルトランスフェラーゼ及びブチレートキナーゼの例となる供給源は、本出願において他で記載されている。クロストリジウム・オートエタノゲナムからのチオエステラーゼのような、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイ（またはエシェリキア・コリ）における天然酵素は、このステップを触媒し、いくらかの量の下流産物の産生をもたらし得る。しかしながら、外因性酵素の導入または内因性酵素の過剰発現は、所望のレベルで下流産物を産生するのに必要となり得る。また、特定の実施形態では、破壊的変異は、導入されたＰｔｂ−Ｂｕｋとの競合を低減するか、または排除するために、内因性チオエステラーゼのような内因性酵素に導入され得る。
【００５９】
ステップ４５は、イソバレレートのイソバレルアルデヒドへの変換を示す。このステップは、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）により触媒してもよい。アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＡＯＲ）は、例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナムからのＡＯＲ（ＷＰ＿０１３２３８６６５．１、ＷＰ＿０１３２３８６７５．１）（それぞれ、配列番号６３及び６４）またはクロストリジウム・ユングダリイからのＡＯＲ（ＡＤＫ１５０７３．１、ＡＤＫ１５０８３．１）（それぞれ、配列番号６５及び６６）であってもよい。アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼのさらなる例となる供給源は、本出願において他で記載されている。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについての天然活性を有する。しかしながら、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイにおける内因性ＡＯＲの過剰発現または外因性ＡＯＲの導入は、産物収率を向上させるのに望ましい場合があり得る。あるいは、外因性ＡＯＲを、ＡＯＲを天然に含まない微生物、例えば、Ｅ・コリに導入してもよい。特に、Ｐｔｂ−Ｂｕｋ及びＡＯＲ（ならびに、任意で、Ａｄｈ）の共発現は、こうした微生物が新たな非天然産物を産生することを可能にし得る。
【００６０】
ステップ４６は、イソバレルアルデヒドのイソアミルアルコールへの変換を示す。このステップは、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１．または１．１．１．２．）により触媒してもよい。アルコールデヒドロゲナーゼは、アルデヒド及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈをアルコール及びＮＡＤ（Ｐ）に変換することができる。アルコールデヒドロゲナーゼは、例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナム（ＡＧＹ７６０６０．１）（配列番号６７）、クロストリジウム・ユングダリイ（ＡＤＫ１７０１９．１）（配列番号６８）、もしくはクロストリジウム・ラグスダレイからのＡｄｈ、クロストリジウム・アセトブチリカムからのＢｄｈＢ（ＮＰ＿３４９８９１．１）（配列番号６９）、クロストリジウム・ベイジェリンキイからのＢｄｈ（ＷＰ＿０４１８９７１８７．１）（配列番号７０）、クロストリジウム・ユングダリイからのＢｄｈ１（ＹＰ＿００３７８０６４８．１）（配列番号７１）、クロストリジウム・オートエタノゲナムからのＢｄｈ１（ＡＧＹ７６０６０．１）（配列番号７２）、クロストリジウム・ユングダリイからのＢｄｈ２（ＹＰ＿００３７８２１２１．１）（配列番号７３）、クロストリジウム・オートエタノゲナムからのＢｄｈ２（ＡＧＹ７４７８４．１）（配列番号７４）、クロストリジウム・アセトブチリカムからのＡｄｈＥ１（ＮＰ＿１４９３２５．１）（配列番号７５）、クロストリジウム・アセトブチリカムからのＡｄｈＥ２（ＮＰ＿１４９１９９．１）（配列番号７６）、クロストリジウム・ベイジェリンキイからのＡｄｈＥ（ＷＰ＿０４１８９３６２６．１）（配列番号７７）、クロストリジウム・オートエタノゲナムからのＡｄｈＥ１（ＷＰ＿０２３１６３３７２．１）（配列番号７８）、またはクロストリジウム・オートエタノゲナムからのＡｄｈＥ２（ＷＰ＿０２３１６３３７３．１）（配列番号７９）であってもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、このステップについての天然活性を有する。しかしながら、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイにおける内因性アルコールデヒドロゲナーゼの過剰発現または外因性アルコールデヒドロゲナーゼの導入は、産物収率を向上させるのに望ましい場合があり得る。エシェリキア・コリは、おそらくこのステップについての天然活性を有しない。
【００６１】
ステップ４７は、イソバレリル−ＣｏＡのイソバレルアルデヒドへの変換を示す。このステップは、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．５７）により触媒してもよい。ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼは、例えば、クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）からのＢｌｄ（ＡＡＰ４２５６３．１）（配列番号８０）であってもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、おそらくこのステップについての天然活性を有しない。エシェリキア・コリは、このステップについて知られている天然活性を有しない。
【００６２】
Ｐｔｂ−Ｂｕｋの概説
本発明は、Ｐｔｂ−Ｂｕｋ酵素系を利用する新たな経路を提供する。天然では、この酵素系は、ブチレート産生クロストリジウムまたはブチリビブリオのような、様々なブチレート産生微生物において見られる。特に、ホスフェートブチリルトランスフェラーゼ（Ｐｔｂ）（ＥＣ２．３．１．１９）は、ＣｏＡ＋ブタノイルホスフェートを形成するブタノイル−ＣｏＡ＋ホスフェートの反応を天然に触媒し、ブチレートキナーゼ（Ｂｕｋ）（ＥＣ２．７．２．７）は、ブチレート（ブタノエート）及びＡＴＰを形成するブタノイルホスフェート及びＡＤＰの反応を天然に触媒する。したがって、これらの酵素は共に（Ｐｔｂ−Ｂｕｋ）、ブタノイル−ＣｏＡのブチレートへの変換を天然に触媒し、基質レベルのリン酸化を通して１つのＡＴＰを発生させる（図２）。しかしながら、本発明者らは、Ｐｔｂが無差別的であり、様々なアシル−ＣｏＡ及びエノイル−ＣｏＡを基質として受け入れることができ、Ｐｔｂ−Ｂｕｋが、同時にＡＴＰを発生させながら、多数のアシル−ＣｏＡ及びエノイル−ＣｏＡを、それぞれ、それらの対応する酸またはアルケネートに変換するのに使用され得ることを発見した。Ｐｔｂは、インビトロで、アセトアセチル−ＣｏＡを含む様々なアシル−ＣｏＡに対して活性であることが報告されている（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５６：６０７−６１３、１９９０）。アセトアセチルホスフェートがＢｕｋの基質となり得ることは以前に示されていない。Ｂｕｋが広範囲の基質を受け入れることは知られている（Ｌｉｕ、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、５３：５４５−５５２、２０００）が、活性はインビボで示されていない。
【００６３】
また、本発明者らは、外因性Ｐｔｂ−Ｂｕｋの導入が、特定の微生物に、アセトン、イソプロパノール、イソブチレン、３−ヒドロキシブチレート、１，３−ブタンジオール、及び２−ヒドロキシイソブチレートを含む、有用な産物、ならびにプロピオネート、カプロエート、及びオクトネートのような他の産物を産生することを可能にさせることを発見した。
【００６４】
Ｐｔｂ−Ｂｕｋに基づく新たな経路は、古典的なクロストリジウムのアセトン−ブタノール−エタノール（ＡＢＥ）発酵経路において見られるような、ＣｏＡトランスフェラーゼ、またはチオエステラーゼに基づく産物の産生のための既知及び既存の経路ルートに対するいくつかの大きな利点を提供する（Ｊｏｎｅｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ、５０：４８４−５２４、１９８６、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、９７：２０５−２１０、２０１３、Ｍａｙ、Ｍｅｔａｂｏｌ  Ｅｎｇ、１５：２１８−２２５、２０１３）（図３）。特に、これらの新たな経路は（１）ＣｏＡトランスフェラーゼ反応に必要な、有機酸、例えば、ブチレートまたはアセテートのような、特定の分子の存在または産生に依存しておらず、（２）チオエステラーゼまたはＣｏＡトランスフェラーゼ反応において保存されない基質レベルのリン酸化を通したＡＴＰの発生を可能にする。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの３−ヒドロキシブチレートへの変換のような、他の反応にＰｔｂ−Ｂｕｋ系を使用する場合も、同じ利点が当てはまる。よって、これらの新たな経路は、追加のエネルギーを発生させ、アセテートのような、望ましくない副産物の共産生なしに標的産物を産生することにより、はるかに高い産生力価及び速度をもたらす可能性を有する。
【００６５】
特に商業規模で、アセテートは炭素を標的産物からそらし、よって標的産物の効率及び収率に影響を及ぼすので、微生物が副産物としてアセテート（またはＣｏＡトランスフェラーゼ反応に必要な他の有機酸）を産生することは望ましくない。また、アセテートは、微生物に対して毒性であり得、及び／または汚染微生物の増殖のための基質として作用し得る。さらに、アセテートの存在は、標的産物を回収及び分離すること、ならびに標的産物の産生に有利となるように発酵条件を制御することをより困難にする。
【００６６】
基質レベルのリン酸化を通したＡＴＰ発生は、特にＡＴＰ制限システムにおいて、産物合成のための駆動力として使用することができる。特に、酢酸産生細菌は、生物の熱力学的限界で生存することが知られている（Ｓｃｈｕｃｈｍａｎｎ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１２：８０９−８２１、２０１４）。このようなものとして、アセテートの産生は微生物に、Ｐｔａ（ホスホトランスアセチラーゼ）（ＥＣ２．３．１．８）及びＡｃｋ（アセテートキナーゼ）（ＥＣ２．７．２．１）を通した基質レベルのリン酸化からＡＴＰを直接産生する選択肢を提供するので、これまで単離された酢酸産生微生物はすべてアセテートを産生することが記載されている（Ｄｒａｋｅ、Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ、Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ、３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐａｇｅｓ  ３５４−４２０、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２００６）。イオンまたはプロトン輸送系と共役している膜勾配及び電気分岐酵素、例えば、Ｒｎｆ複合体（Ｓｃｈｕｃｈｍａｎｎ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１２：８０９−８２１、２０１４）のようなメカニズムはこれらの微生物におけるＡＴＰを保存するが、直接的ＡＴＰ発生は依然としてそれらの生存にとって極めて重要である。結果として、ＡＴＰ発生を可能にしない非相同経路を導入する場合、アセテートが副産物として産生される（Ｓｃｈｉｅｌ−Ｂｅｎｇｅｌｓｄｏｒｆ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、５８６：２１９１−２１９８、２０１２）。本明細書において記載されているＰｔｂ−Ｂｕｋ経路は、しかしながら、微生物が基質レベルのリン酸化を通してＡＴＰを発生させ、したがって、アセテート産生を回避するための代替メカニズムを提供する。特に、そうでなければ必須であるだろう（Ｎａｇａｒａｊａｎ、Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ、１２：１１８、２０１３）、Ｐｔａ−Ａｃｋのような、アセテート形成酵素は、ＡＴＰ発生の代替手段としてＰｔｂ−Ｂｕｋで置換することができる。微生物はそこでＰｔｂ−Ｂｕｋを通したＡＴＰ発生に基づき得るので、このシステムは、Ｐｔｂ−Ｂｕｋを使用する新たな経路を通る最大流束を確保する駆動力を提供する。ＡＴＰの発生は、ＡＴＰを必要とする下流経路にとっても重要となり得る。例えば、アセトンからのイソブチレンの発酵産生はＡＴＰを必要とする。アセチル−ＣｏＡからイソブチレンまでの完全経路はＣｏＡトランスフェラーゼまたはチオエステラーゼを使用する場合ＡＴＰ多消費であるが、経路はＰｔｂ−Ｂｕｋを使用する場合エネルギーニュートラルである。
【００６７】
Ｐｔｂ及びＢｕｋの例となる供給源を提供する。しかしながら、Ｐｔｂ及びＢｕｋの他の適切な供給源が利用可能であり得ることは理解されるべきである。また、Ｐｔｂ及びＢｕｋは、活性を向上させるように操作してもよく、及び／またはＰｔｂ−Ｂｕｋをコード化する遺伝子は、特に宿主微生物における発現についてコドン最適化してもよい。
【００６８】
ホスフェートブチリルトランスフェラーゼは、例えば、その配列が公表されている、下記の供給源のいずれかであってもよく、またはこれに由来してもよい。
【００６９】
【表２】
2018530342.tif 000016
2018530342.tif 000017
2018530342.tif 000018
2018530342.tif 000019
2018530342.tif 000020
【００７０】
好ましい実施形態では、ホスフェートブチリルトランスフェラーゼは、クロストリジウム・アセトブチリカム（ＷＰ＿０１０９６６３５７、配列番号８７）またはクロストリジウム・ベイジェリンキイ（ＷＰ＿０２６８８６６３９、配列番号８８）（ＷＰ＿０４１８９３５００、配列番号８９）からのＰｔｂである。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、ホスフェートブチリルトランスフェラーゼを天然に含有しない。
【００７１】
ブチレートキナーゼは、例えば、その配列が公表されている、下記の供給源のいずれかであってもよく、またはこれに由来してもよい。
【００７２】
【表３】
2018530342.tif 000021
2018530342.tif 000022
2018530342.tif 000023
【００７３】
好ましい実施形態では、ブチレートキナーゼは、クロストリジウム・アセトブチリカム（ＷＰ＿０１０９６６３５６、配列番号９０）またはクロストリジウム・ベイジェリンキイ（ＷＰ＿０１１９６７５５６、配列番号９１）（ＷＰ＿０１７２０９６７７、配列番号９２）（ＷＰ＿０２６８８６６３８、配列番号９３）（ＷＰ＿０４１８９３５０２、配列番号９４）からのＢｕｋである。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、ブチレートキナーゼを天然に含有しない。
【００７４】
Ｐｔｂ−Ｂｕｋは広範囲の基質に作用することが示されているので、Ｐｔｂ−Ｂｕｋがいかなる活性及び望ましい基質も示さない場合、対象の基質に対する活性を達成するように操作することができると考えることは合理的である。戦略は（これに限定されないが）、結合ポケットが新たな基質を収容するようにまたは飽和変異導入を通して変化される結合基質を有する及び有しないＰｔｂ及びＢｕｋの利用可能な結晶構造に基づく合理的設計であり得る。活性が得られる場合、これは酵素工学の反復サイクルを通してさらに向上させることができる。これらの技術的努力は、酵素活性を試験するアッセイと組み合わされるだろう。これらのタイプの戦略は以前に効果的であると証明されている（例えば、Ｈｕａｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ、５３７：３２０−３２７、２０１６、Ｋｈｏｕｒｙ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、３２：９９−１０９、２０１４、Ｐａｃｋｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６：３７９−３９４、２０１５、Ｐｒｉｖｅｔｔ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１０９：３７９０−３７９５、２０１２参照）。
【００７５】
Ｐｔｂ−Ｂｕｋの特定のアシル−ＣｏＡ基質への基質特異性を向上させるために、公開データベースまたは（例えば、指向性進化から）発生したＰｔｂ−Ｂｕｋ変異体からのＰｔｂ−Ｂｕｋ多様体を、ハイスループットアッセイを使用してスクリーニングする、すなわちＥ・コリにおいてＰｔｂ−Ｂｕｋ酵素ペアを過剰発現させ、試験基質を添加し、生物発光アッセイでＡＴＰ産生についてスクリーニングすることができる。アッセイは、ＡＴＰ濃度をホタルルシフェラーゼ酵素生物発光と相関させる十分に確立された技法を使用することができる。このアッセイのマルチウェルプレート形式への従順性は、新たなＰｔｂ−Ｂｕｋの組み合わせにわたる基質選好性の効率的なスクリーニングを促進するだろう（図３３）。
【００７６】
基質の消耗または産物の蓄積ではなくＡＴＰ産生についてスクリーニングすることにより、アッセイはＣｏＡグループの自発的加水分解を測定することを回避する。しかしながら、文献において記載されている代替アプローチは、Ｐｔｂ−Ｂｕｋ反応のカップリング効率を推定するためにエルマン試薬（５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）またはＤＴＮＢ）を使用する確立されたアッセイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５６：６０７−６１３、１９９０）を使用して測定することができる遊離ＣｏＡを使用することである（図３３）。アシル−ＣｏＡならびに対応する遊離酸及びホスホ中間体も、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用してバリデーション段階中に測定することができる。
【００７７】
ハイスループットスクリーニングアプローチでは、タンパク質定量化に伴う労力によって反応速度データを収集するのは困難である。代わりに、Ｐｔｂ−Ｂｕｋ酵素を含有するＥ・コリ溶解物の各調製について、（単位時間当たりの発光として測定される）対象の各基質に対する活性を、陽性対照基質（ブチリル−ＣｏＡ）に対する及びアセチル−ＣｏＡ（標的アシル−ＣｏＡに対する酵素活性部位について最大の競合をもたらす可能性が高い生理的基質）に対する活性と比較することができる。
【００７８】
アッセイに天然ホスホトランスアセチラーゼ（Ｐｔａ）及び／またはアセテートキナーゼ（Ａｃｋ）活性によるバイアスがかかっていないことを確認するために、アッセイをｐｔｂ及び／またはａｃｋ遺伝子がノックアウトされたＥ・コリ株において評価することもできる。
【００７９】
アセトン及びイソプロパノールの産生
アセトン及びイソプロパノールは、８００万トンの合計市場規模及び８５〜１１０億ドルの世界市場価値を有する、重要な工業用溶媒である。加えて、アセトン及びイソプロパノールは、７０億ドルの世界市場価値を有するポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、２５０〜２９０億ドルの世界市場価値を有するイソブチレン、及び１２５０億ドルの世界市場価値を有するプロピレンを含む、貴重な下流産物の前駆体である。また、アセトンからジェット燃料までのルートが近年報告されている。現在、工業用アセトン産生は、クメン法の副産物であるので、石油化学的フェノール産生に直結している。アセトン産生の約９２体積％は、クメンからのフェノール産生の共産物である。これは環境及び市場の両方に対して顕著な影響を及ぼす。クメン法では、フェノール産生１モル当たり１モルの亜硫酸ナトリウムが蓄積し、深刻な廃棄物管理問題ならびに自然環境及び人の健康への課題を課している。フェノールに対する世界市場の需要は停滞または低下すると予想されるが、アセトンに対する需要は上昇すると予想される。ベンゼンの直接酸化からの代替フェノール産生ルートは開発中であり、もうすぐ商業化することが期待されており、これはアセトン産生の完全な排除をもたらし得る。
【００８０】
アセトンは、ほぼ１００年間、ＡＢＥ発酵におけるブタノールの副産物として、工業規模で産生されてきた。工業的ＡＢＥ発酵は２０世紀後半には低い原油価格及び高い糖コストによって衰退したが、近年復興し、ここ数年の間にいくつかの商業プラントが建設されている。複数のグループが、いくつかの学術グループによる代謝工学及び合成生物学アプローチを通した、ＡＢＥ発酵生物、特にＥ・コリ及び酵母からの対応する酵素を発現させる非相同宿主における糖からのアセトン産生についても実証している。しかしながら、バイオマスの多糖成分を放出するのに必要な予備処理に関連した低収率及び高コストは、現在の生化学的変換技術が、この物質の最大４０％を構成し得る、バイオマスのリグニン成分を利用しないので、標準的な発酵を通したアセトンの産生を非経済的にする。
【００８１】
本発明は、基質からアセトンまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する。本発明は、こうした微生物を基質の存在下で培養することにより、アセトンまたはその前駆体を産生する方法をさらに提供する。好ましい実施形態では、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイからなる群から選択される親微生物に由来する。しかしながら、微生物はまた、全く異なる微生物、例えば、エシェリキア・コリに由来してもよい。アセトンの産生のための記載されている酵素経路は、内因性酵素及び、内因性酵素活性が存在しない、または低い場合、外因性酵素を含んでもよい。
【００８２】
ステップ１、２、及び３を通したアセトン：１つの実施形態では、本発明は、ステップ１、２、及び３のための酵素を含み、これによりガス状基質のような基質からアセトンまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する。典型的には、この経路における酵素のうちの少なくとも１つは、微生物に対して外因性である。好ましい実施形態では、ステップ２はＰｔｂ−Ｂｕｋにより触媒される。ステップ１、２、及び３のための酵素の例となるタイプ及び供給源は、本出願において他で記載されている。微生物が、アセトンをイソプロパノールに変換する（ステップ４）ことができる第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼを天然に含有する親微生物（例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイ）に由来する場合、微生物は、微生物がイソプロパノールに変換することなくアセトンを産生するように、（例えば、第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼをコード化する遺伝子を破壊することにより）第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼの発現をノックダウンまたはノックアウトするように修飾してもよい（ＷＯ２０１５／０８５０１５）。
【００８３】
ステップ１、１３、１４、１５、及び３を通したアセトン：１つの実施形態では、本発明は、ステップ１、１３、１４、１５、及び３のための外因性酵素を含み、これによりガス状基質のような基質からアセトンまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する。典型的には、この経路における酵素のうちの少なくとも１つは、微生物に対して外因性である。好ましい実施形態では、ステップ１４はＰｔｂ−Ｂｕｋにより触媒される。ステップ１、１３、１４、１５、及び３のための酵素の例となるタイプ及び供給源は、本出願において他で記載されている。微生物が、アセトンをイソプロパノールに変換する（ステップ４）ことができる第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼを天然に含有する親微生物（例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイ）に由来する場合、微生物は、微生物がイソプロパノールに変換することなくアセトンを産生するように、（例えば、第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼをコード化する遺伝子を破壊することにより）第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼの発現をノックダウンまたはノックアウトするように修飾してもよい（ＷＯ２０１５／０８５０１５）。
【００８４】
１つの実施形態では、微生物は、アセトンの産生のための２つ以上の経路を含んでもよい。
【００８５】
本発明は、基質からイソプロパノールまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する。本発明は、こうした微生物を基質の存在下で培養することにより、イソプロパノールまたはその前駆体を産生する方法をさらに提供する。好ましい実施形態では、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイからなる群から選択される親微生物に由来する。しかしながら、微生物はまた、全く異なる微生物、例えば、エシェリキア・コリに由来してもよい。イソプロパノールの産生のための記載されている酵素経路は、内因性酵素及び、内因性酵素活性が存在しない、または低い場合、外因性酵素を含んでもよい。
【００８６】
ステップ１、２、３、及び４を通したイソプロパノール：１つの実施形態では、本発明は、ステップ１、２、３、及び４のための酵素を含み、これによりガス状基質のような基質からイソプロパノールまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する。典型的には、この経路における酵素のうちの少なくとも１つは、微生物に対して外因性である。好ましい実施形態では、ステップ２はＰｔｂ−Ｂｕｋにより触媒される。ステップ１、２、３、及び４のための酵素の例となるタイプ及び供給源は、本出願において他で記載されている。微生物が、アセトンをイソプロパノールに変換する（ステップ４）ことができる第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼを天然に含有する親微生物（例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイ）に由来する場合、イソプロパノールを産生するのにステップ４のための外因性酵素の導入は必要ない。しかしながら、例えば、天然第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼを過剰発現させるための、微生物の修飾は、イソプロパノールの向上した産生をもたらし得る。
【００８７】
ステップ１、１３、１４、１５、３、及び４を通したイソプロパノール：１つの実施形態では、本発明は、ステップ１、１３、１４、１５、３、及び４のための酵素を含み、これによりガス状基質のような基質からイソプロパノールまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する。典型的には、この経路における酵素のうちの少なくとも１つは、微生物に対して外因性である。好ましい実施形態では、ステップ１４はＰｔｂ−Ｂｕｋにより触媒される。ステップ１、１３、１４、１５、３、及び４のための酵素の例となるタイプ及び供給源は、本出願において他で記載されている。微生物が、アセトンをイソプロパノールに変換する（ステップ４）ことができる第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼを天然に含有する親微生物（例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイ）に由来する場合、イソプロパノールを産生するのにステップ４のための外因性酵素の導入は必要ない。しかしながら、例えば、天然第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼを過剰発現させるための、微生物の修飾は、イソプロパノールの向上した産生をもたらし得る。
【００８８】
１つの実施形態では、微生物は、イソプロパノールの産生のための２つ以上の経路を含んでもよい。
【００８９】
イソブチレンの産生
イソブチレンは、１５００万トンを超える市場規模及び２５０〜２９０億ドルの世界市場価値を有する主要な化学ビルディングブロックである。化学における及び燃料添加剤としてのその使用（１５Ｍｔ／年）を越えて、イソブチレンは、イソオクタン、ガソリン車の高性能ドロップイン燃料に変換してもよい。Ｇｌｏｂａｌ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｉｅｓは、アセトンからのイソブテン（すなわち、イソブチレン）の発酵産生についての特許を出願したが、開示されたルートのいずれもＰｔｂ−Ｂｕｋを伴わない（ＷＯ２０１０／００１０７８、ＥＰ２２９５５９３、ＷＯ２０１１／０７６６９１、ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、９３：１３７７−１３８７、２０１２）。
【００９０】
本発明は、基質からイソブチレンまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する。本発明は、こうした微生物を基質の存在下で培養することにより、イソブチレンまたはその前駆体を産生する方法をさらに提供する。好ましい実施形態では、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイからなる群から選択される親微生物に由来する。しかしながら、微生物はまた、全く異なる微生物、例えば、エシェリキア・コリに由来してもよい。イソブチレンの産生のための記載されている酵素経路は、内因性酵素及び、内因性酵素活性が存在しない、または低い場合、外因性酵素を含んでもよい。
【００９１】
図１は、イソブチレンへの２つの代替ルートを示す。第１は、ステップ１、２、３、５、及び６を通したイソブチレンの産生を伴う。第２は、ステップ１、２、３、７、８、及び６を通したイソブチレンの産生を伴う。ステップ２及び８は、Ｐｔｂ−Ｂｕｋにより触媒してもよい。したがって、各ルートはＰｔｂ−Ｂｕｋを伴ってもよい。
【００９２】
ステップ１、２、３、５、及び６を通したイソブチレン：１つの実施形態では、本発明は、ステップ１、２、３、５、及び６のための酵素を含み、これによりガス状基質のような基質からイソブチレンまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する。典型的には、この経路における酵素のうちの少なくとも１つは、微生物に対して外因性である。好ましい実施形態では、ステップ２はＰｔｂ−Ｂｕｋにより触媒される。ステップ１、２、３、５、及び６のための酵素の例となるタイプ及び供給源は、本出願において他で記載されている。微生物が、アセトンをイソプロパノールに変換する（ステップ４）ことができる第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼを天然に含有する親微生物（例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイ）に由来する場合、微生物は、アセトンのイソプロパノールへの変換を防止し、アセトンのイソブチレンへの変換を最大化するために、（例えば、第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼをコード化する遺伝子を破壊することにより）第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼの発現をノックダウンまたはノックアウトするように修飾してもよい。
【００９３】
ステップ１、２、３、７、８、及び６を通したイソブチレン：１つの実施形態では、本発明は、ステップ１、２、３、７、８、及び６のための酵素を含み、これによりガス状基質のような基質からイソブチレンまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する。典型的には、この経路における酵素のうちの少なくとも１つは、微生物に対して外因性である。好ましい実施形態では、ステップ２及び／またはステップ８はＰｔｂ−Ｂｕｋにより触媒される。ステップ１、２、３、７、８、及び６のための酵素の例となるタイプ及び供給源は、本出願において他で記載されている。微生物が、アセトンをイソプロパノールに変換する（ステップ４）ことができる第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼを天然に含有する親微生物（例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイ）に由来する場合、微生物は、アセトンのイソプロパノールへの変換を防止し、アセトンのイソブチレンへの変換を最大化するために、（例えば、第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼをコード化する遺伝子を破壊することにより）第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼの発現をノックダウンまたはノックアウトするように修飾してもよい。
【００９４】
３−ヒドロキシブチレートの産生
３−ヒドロキシブチレート（３−ＨＢ）は、βヒドロキシ酸のファミリーにおける４炭素カルボン酸である。３−ヒドロキシブチレートは、脂性肌浄化のための化粧品成分、アンチエイジングクリーム製剤のための中間体、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）のための中間体、生分解性ポリマー樹脂、及び新規バイオプラスチックのための他のポリヒドロキシ酸とのコモノマーである。また、３−ヒドロキシブチレートは、特に医療移植片のための、生体適合性及び生分解性ナノ複合体において専門用途を有する、Ｃ３／Ｃ４ケミカル、キラルビルディングブロック、及びファインケミカルのための中間体である。グルコース上で増殖させた組換えＥ・コリによる（Ｒ）−及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートの産生にもかかわらず、３−ヒドロキシブチレートの産生はガス状基質上で増殖させた微生物からは実証されていない（Ｔｓｅｎｇ、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、７５：３１３７−３１４５、２００９）。とりわけ、Ｅ・コリにおいて以前実証されたシステムは、Ｃ・オートエタノゲナムを含むアセトゲンには、アセトゲン中の天然チオエステラーゼの存在によって、そのまま転用可能ではなかった。Ｅ・コリも３−ＨＢ−ＣｏＡに作用することができるチオエステラーゼＴｅｓＢを有するが、Ｔｓｅｎｇはバックグラウンド活性が最小限（＜０．１ｇ／Ｌ）であることを示した。Ｅ・コリでは立体的に純粋な異性体の産生が報告されたが、本発明者らは驚くべきことに、異性体の混合物がＣ・オートエタノゲナムにおいて産生されたことを見出した。この理論に縛られることなく、これは天然イソメラーゼ活性の結果である可能性が高い。これは、最適化された産生のために（Ｓ）特異的３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ｈｂｄ）の組み合わせを（Ｒ）特異的Ｐｔｂ−Ｂｕｋと組み合わせることを可能にする。立体的に純粋な異性体を産生するために、この活性をノックアウトすることができる。まとめると、これは本発明は、Ｅ・コリにおける、ならびにＰｔｂ−Ｂｕｋ、（Ｒ）または（Ｓ）特異的３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのいずれかの組み合わせ、及び天然クロストリジウム・オートエタノゲナムチオエステラーゼを使用する低産生と比較して、数ｇ／Ｌの３−ＨＢを産生することを可能にする。
【００９５】
本発明は、基質から３−ヒドロキシブチレートまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する。本発明は、こうした微生物を基質の存在下で培養することにより、３−ヒドロキシブチレートまたはその前駆体を産生する方法をさらに提供する。好ましい実施形態では、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイからなる群から選択される親微生物に由来する。しかしながら、微生物はまた、全く異なる微生物、例えば、エシェリキア・コリに由来してもよい。３−ヒドロキシブチレートの産生のための記載されている酵素経路は、内因性酵素及び、内因性酵素活性が存在しない、または低い場合、外因性酵素を含んでもよい。
【００９６】
図１は、３−ヒドロキシブチレートへの２つの代替ルートを示す。第１は、ステップ１、２、及び１５を通した３−ヒドロキシブチレートの産生を伴う。第２は、ステップ１、１３、及び１４を通した３−ヒドロキシブチレートの産生を伴う。ステップ２及び１４は、Ｐｔｂ−Ｂｕｋにより触媒してもよい。したがって、各ルートはＰｔｂ−Ｂｕｋを伴ってもよい。１つの実施形態では、微生物は、Ｐｔｂ−Ｂｕｋが２つ以上のステップ（例えば、ステップ２及び１４）を触媒し得る、３−ヒドロキシブチレートの産生のための２つ以上の経路を含んでもよい。
【００９７】
ステップ１、２、及び１５を通した３−ヒドロキシブチレート：１つの実施形態では、本発明は、ステップ１、２、及び１５のための酵素を含み、これによりガス状基質のような基質から３−ヒドロキシブチレートまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する。典型的には、この経路における酵素のうちの少なくとも１つは、微生物に対して外因性である。好ましい実施形態では、ステップ２はＰｔｂ−Ｂｕｋにより触媒される。ステップ１、２、及び１５のための酵素の例となるタイプ及び供給源は、本出願において他で記載されている。
【００９８】
ステップ１、１３、及び１４を通した３−ヒドロキシブチレート：１つの実施形態では、本発明は、ステップ１、１３、及び１４のための酵素を含み、これによりガス状基質のような基質から３−ヒドロキシブチレートまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する。典型的には、この経路における酵素のうちの少なくとも１つは、微生物に対して外因性である。好ましい実施形態では、ステップ１４はＰｔｂ−Ｂｕｋにより触媒される。ステップ１、１３、及び１４のための酵素の例となるタイプ及び供給源は、本出願において他で記載されている。
【００９９】
１，３−ブタンジオールの産生
１，３−ブタンジオール（１，３−ＢＤＯ）は、一般的には食品香料のための溶媒として使用されており、特定のポリウレタン及びポリエステル樹脂において使用されるコモノマーである。より重要なことには、１，３−ブタンジオールは、１，３−ブタジエンに触媒的に変換され得る（Ｍａｋｓｈｉｎａ、Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｒｅｖ、４３：７９１７−７９５３、２０１４）。ブタジエンは、ゴム、プラスチック、潤滑剤、ラテックス、及び他の製品を製造するのに使用される。今日産生されるブタジエンの多くは、自動車タイヤにおけるゴムに使用されており、ナイロン６，６の製造において使用することができる、アジポニトリルを産生するのに使用することもできる。ブタジエンに対する世界的需要は上昇中である。２０１１年には、４００億ドルと算定される推定１０５０万トンの需要があった。
【０１００】
本発明は、基質から１，３−ブタンジオールまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する。本発明は、こうした微生物を基質の存在下で培養することにより、１，３−ブタンジオールまたはその前駆体を産生する方法をさらに提供する。好ましい実施形態では、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイからなる群から選択される親微生物に由来する。しかしながら、微生物はまた、全く異なる微生物、例えば、エシェリキア・コリに由来してもよい。１，３−ブタンジオールの産生のための記載されている酵素経路は、内因性酵素及び、内因性酵素活性が存在しない、または低い場合、外因性酵素を含んでもよい。
【０１０１】
特定の実施形態では、微生物は、エタノールの共産生なしに（または少量のみのエタノール、例えば、０．１〜１．０ｇ／Ｌ未満のエタノールもしくは１〜１０ｇ／Ｌ未満のエタノールの産生と共に）１，３−ブタンジオールを産生してもよい。
【０１０２】
図１は、１，３−ブタンジオールへの３つの代替ルートを示す。第１は、ステップ１、２、１５、１６、及び１７を通した１，３−ブタンジオールの産生を伴う。第２は、ステップ１、１３、１４、１６、及び１７を通した１，３−ブタンジオールの産生を伴う。第３は、ステップ１、１３、１８、及び１７を通した１，３−ブタンジオールの産生を伴う。ステップ２及び１４は、Ｐｔｂ−Ｂｕｋにより触媒してもよい。したがって、少なくとも第１及び第２のルートはＰｔｂ−Ｂｕｋを伴ってもよい。１つの実施形態では、微生物は、１，３−ブタンジオールの産生のための２つ以上の経路を含んでもよい。関連する実施形態では、Ｐｔｂ−Ｂｕｋは、２つ以上のステップ（例えば、ステップ２及び１４）を触媒してもよい。
【０１０３】
ステップ１、２、１５、１６、及び１７を通した１，３−ブタンジオール：１つの実施形態では、本発明は、ステップ１、２、１５、１６、及び１７のための酵素を含み、これによりガス状基質のような基質から１，３−ブタンジオールまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する。典型的には、この経路における酵素のうちの少なくとも１つは、微生物に対して外因性である。好ましい実施形態では、ステップ２はＰｔｂ−Ｂｕｋにより触媒される。ステップ１、２、１５、１６、及び１７のための酵素の例となるタイプ及び供給源は、本出願において他で記載されている。
【０１０４】
ステップ１、１３、１４、１６、及び１７を通した１，３−ブタンジオール：１つの実施形態では、本発明は、ステップ１、１３、１４、１６、及び１７のための酵素を含み、これによりガス状基質のような基質から１，３−ブタンジオールまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する。典型的には、この経路における酵素のうちの少なくとも１つは、微生物に対して外因性である。好ましい実施形態では、ステップ１４はＰｔｂ−Ｂｕｋにより触媒される。ステップ１、１３、１４、１６、及び１７のための酵素の例となるタイプ及び供給源は、本出願において他で記載されている。
【０１０５】
ステップ１、１３、１８、及び１７を通した１，３−ブタンジオール：１つの実施形態では、本発明は、ステップ１、１３、１８、及び１７のための酵素を含み、これによりガス状基質のような基質から１，３−ブタンジオールまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する（図１１）。典型的には、この経路における酵素のうちの少なくとも１つは、微生物に対して外因性である。ステップ１、１３、１８、及び１７のための酵素の例となるタイプ及び供給源は、本出願において他で記載されている。同様のルートは、Ｅ・コリでは実証されているが、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイのようなアセトゲンでは実証されていない（Ｋａｔａｏｋａ、Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇ、１１５：４７５−４８０、２０１３）。Ｐｔｂ−Ｂｕｋの使用は（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの産生をもたらすが、Ｐｔｂ−Ｂｕｋの使用を必要としないこのルートは、（Ｓ）−１，３−ブタンジオールの産生をもたらし得る。
【０１０６】
２−ヒドロキシイソブチレートの産生
２−ヒドロキシイソブチレート（２−ＨＩＢ）は、多くのタイプのポリマーのためのビルディングブロックとして機能し得る４炭素カルボン酸である。２−ヒドロキシイソブチレートの脱水により、または対応するアミドを通して合成することができるメタクリル酸のメチルエステルは、アクリルガラス、耐久性コーティング、及びインクの製造のためのポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）に重合される。この化合物単独で、世界市場は３００万トンを超える。他の分岐Ｃ４カルボン酸、例えば、２−ヒドロキシイソブチレートのクロロ及びアミノ誘導体、ならびにイソブチレングリコール及びその酸化物も、ポリマーにおいて及び多くの他の用途に使用される。
【０１０７】
Ｐｔｂ−Ｂｕｋ系の立体特異性は、２−ヒドロキシイソブチレートの産生に関する現在の最新技術の制限を克服することにおいて特に有用である。Ｐｔｂ−Ｂｕｋ及びチオエステラーゼの両方は無差別的であり、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡとの副活性は、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡの産生のための標的経路から資源をそらし得る（例えば、図１及び図８参照）。しかしながら、Ｐｔｂ−Ｂｕｋは立体異性体間を区別することができ、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡではなく（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに作用するだろう。対照的に、チオエステラーゼは、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ立体異性体間を区別することができない。好ましい実施形態では、３−ヒドロキシブチレートへの損失を回避し、２−ヒドロキシイソブチレート収率を最大化するために、Ｐｔｂ−Ｂｕｋとの組み合わせ（ステップ２０）において（Ｓ）特異的アセトアセチル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１１９）（ステップ１３）が選択される（図８）。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの（Ｓ）特異的形態は、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼ（ＥＣ５．４．９９．−）（ステップ１９）にとっても好ましい基質である（Ｙａｎｅｖａ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２８７：１５５０２−１５５１１、２０１２）。
【０１０８】
本発明は、基質から２−ヒドロキシイソブチレートまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する。本発明は、こうした微生物を基質の存在下で培養することにより、２−ヒドロキシイソブチレートまたはその前駆体を産生する方法をさらに提供する。好ましい実施形態では、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイからなる群から選択される親微生物に由来する。しかしながら、微生物はまた、全く異なる微生物、例えば、エシェリキア・コリに由来してもよい。２−ヒドロキシイソブチレートの産生のための記載されている酵素経路は、内因性酵素及び、内因性酵素活性が存在しない、または低い場合、外因性酵素を含んでもよい。
【０１０９】
ステップ１、１３、１９、及び２０を通した２−ヒドロキシイソブチレート：１つの実施形態では、本発明は、ステップ１、１３、１９、及び２０のための酵素を含み、これによりガス状基質のような基質から２−ヒドロキシイソブチレートまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する。典型的には、この経路における酵素のうちの少なくとも１つは、微生物に対して外因性である。好ましい実施形態では、ステップ２０はＰｔｂ−Ｂｕｋにより触媒される。ステップ１、１３、１９、及び２０のための酵素の例となるタイプ及び供給源は、本出願において他で記載されている。
【０１１０】
特定の実施形態では、本発明はまた、基質から２−ヒドロキシブチレート（２−ＨＢ）またはその前駆体を産生することができる微生物を提供する。本発明は、こうした微生物を基質の存在下で培養することにより、２−ヒドロキシブチレートまたはその前駆体を産生する方法をさらに提供する。いかなる特定の理論にも縛られることを望むことなく、本発明者らは、観察された２−ヒドロキシブチレートの産生は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイのような微生物における非特異的ムターゼ活性に起因すると考える。
【０１１１】
アジピン酸の産生
アジピン酸は最も重要なジカルボン酸であり、推定４５億ＵＳドルを超える市場を有し、年に約２５億ｋｇが産生されている。産生されたアジピン酸の６０％超はナイロンの製造のためのモノマー前駆体として使用されており、アジピン酸についての世界市場は２０１９年までに７５億ＵＳドルに達すると予想される。現在、アジピン酸は、ほぼ排他的に石油化学的に、例えば、ブタジエンのカルボニル化により産生されている。
【０１１２】
本発明は、基質からアジピン酸またはその前駆体を産生することができる微生物を提供する（図３４）。本発明は、こうした微生物を基質の存在下で培養することにより、アジピン酸またはその前駆体を産生する方法をさらに提供する。好ましい実施形態では、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイからなる群から選択される親微生物に由来する。しかしながら、微生物はまた、全く異なる微生物、例えば、エシェリキア・コリに由来してもよい。アジピン酸の産生のための記載されている酵素経路は、内因性酵素及び、内因性酵素活性が存在しない、または低い場合、外因性酵素を含んでもよい。
【０１１３】
ステップ２２、２３、２４、２５、及び２６を通したアジピン酸：１つの実施形態では、本発明は、ステップ２２、２３、２４、２５、及び２６のための酵素を含み、これによりガス状基質のような基質からアジピン酸またはその前駆体を産生することができる微生物を提供する。典型的には、この経路における酵素のうちの少なくとも１つは、微生物に対して外因性である。好ましい実施形態では、ステップ２６はＰｔｂ−Ｂｕｋにより触媒される。ステップ２２、２３、２４、２５、及び２６のための酵素の例となるタイプ及び供給源は、本出願において他で記載されている。
【０１１４】
ステップ２１、２２、２３、２４、２５、及び２６を通したアジピン酸：１つの実施形態では、本発明は、ステップ２１、２２、２３、２４、２５、及び２６のための酵素を含み、これによりガス状基質のような基質からアジピン酸またはその前駆体を産生することができる微生物を提供する。典型的には、この経路における酵素のうちの少なくとも１つは、微生物に対して外因性である。好ましい実施形態では、ステップ２６はＰｔｂ−Ｂｕｋにより触媒される。ステップ２１、２２、２３、２４、２５、及び２６のための酵素の例となるタイプ及び供給源は、本出願において他で記載されている。
【０１１５】
１つの実施形態では、微生物は、アジピン酸の産生のための２つ以上の経路を含んでもよい。
【０１１６】
１，３−ヘキサンジオールの産生
本発明は、基質から１，３−ヘキサンジオールまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する（図３５）。本発明は、こうした微生物を基質の存在下で培養することにより、１，３−ヘキサンジオールまたはその前駆体を産生する方法をさらに提供する。好ましい実施形態では、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイからなる群から選択される親微生物に由来する。しかしながら、微生物はまた、全く異なる微生物、例えば、エシェリキア・コリに由来してもよい。１，３−ヘキサンジオールの産生のための記載されている酵素経路は、内因性酵素及び、内因性酵素活性が存在しない、または低い場合、外因性酵素を含んでもよい。
【０１１７】
図３５において示されている経路は、図１において示されているように、ステップ１及び１３を通して産生され得る、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡで開始する。
【０１１８】
ステップ１、１３、２７、３１、３２、３６、３７、３８、及び３９を通した１，３−ヘキサンジオール：１つの実施形態では、本発明は、ステップ１、１３、２７、３１、３２、３６、３７、３８、及び３９のための酵素を含み、これによりガス状基質のような基質から１，３−ヘキサンジオールまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する。典型的には、この経路における酵素のうちの少なくとも１つは、微生物に対して外因性である。好ましい実施形態では、ステップ３７はＰｔｂ−Ｂｕｋにより触媒される。ステップ１、１３、２７、３１、３２、３６、３７、３８、及び３９のための酵素の例となるタイプ及び供給源は、本出願において他で記載されている。
【０１１９】
３−メチル−２−ブタノールの産生
本発明は、基質から３−メチル−２−ブタノールまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する（図３５）。本発明は、こうした微生物を基質の存在下で培養することにより、３−メチル−２−ブタノールまたはその前駆体を産生する方法をさらに提供する。好ましい実施形態では、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイからなる群から選択される親微生物に由来する。しかしながら、微生物はまた、全く異なる微生物、例えば、エシェリキア・コリに由来してもよい。３−メチル−２−ブタノールの産生のための記載されている酵素経路は、内因性酵素及び、内因性酵素活性が存在しない、または低い場合、外因性酵素を含んでもよい。
【０１２０】
図３５において示されている経路は、図１において示されているように、ステップ１及び１３を通して産生され得る、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡで開始する。
【０１２１】
ステップ１、１３、２７、３１、３２、３３、３４、及び３５を通した３−メチル−２−ブタノール：１つの実施形態では、本発明は、ステップ１、１３、２７、３１、３２、３３、３４、及び３５のための酵素を含み、これによりガス状基質のような基質から３−メチル−２−ブタノールまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する。典型的には、この経路における酵素のうちの少なくとも１つは、微生物に対して外因性である。好ましい実施形態では、ステップ３３はＰｔｂ−Ｂｕｋにより触媒される。ステップ１、１３、２７、３１、３２、３３、３４、及び３５のための酵素の例となるタイプ及び供給源は、本出願において他で記載されている。
【０１２２】
２−ブテン−１−オールの産生
本発明は、基質から２−ブテン−１−オールまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する（図３５）。本発明は、こうした微生物を基質の存在下で培養することにより、２−ブテン−１−オールまたはその前駆体を産生する方法をさらに提供する。好ましい実施形態では、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイからなる群から選択される親微生物に由来する。しかしながら、微生物はまた、全く異なる微生物、例えば、エシェリキア・コリに由来してもよい。２−ブテン−１−オールの産生のための記載されている酵素経路は、内因性酵素及び、内因性酵素活性が存在しない、または低い場合、外因性酵素を含んでもよい。
【０１２３】
図３５において示されている経路は、図１において示されているように、ステップ１及び１３を通して産生され得る、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡで開始する。
【０１２４】
ステップ１、１３、２７、２８、２９、及び３０を通した２−ブテン−１−オール：１つの実施形態では、本発明は、ステップ１、１３、２７、２８、２９、及び３０のための酵素を含み、これによりガス状基質のような基質から２−ブテン−１−オールまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する。典型的には、この経路における酵素のうちの少なくとも１つは、微生物に対して外因性である。好ましい実施形態では、ステップ２８はＰｔｂ−Ｂｕｋにより触媒される。ステップ１、１３、２７、２８、２９、及び３０のための酵素の例となるタイプ及び供給源は、本出願において他で記載されている。
【０１２５】
イソバレレートの産生
本発明は、基質からイソバレレートまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する（図３６）。本発明は、こうした微生物を基質の存在下で培養することにより、イソバレレートまたはその前駆体を産生する方法をさらに提供する。好ましい実施形態では、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイからなる群から選択される親微生物に由来する。しかしながら、微生物はまた、全く異なる微生物、例えば、エシェリキア・コリに由来してもよい。イソバレレートの産生のための記載されている酵素経路は、内因性酵素及び、内因性酵素活性が存在しない、または低い場合、外因性酵素を含んでもよい。
【０１２６】
ステップ１、４０、４１、４２、４３、及び４４を通したイソバレレート：１つの実施形態では、本発明は、ステップ１、４０、４１、４２、４３、及び４４のための酵素を含み、これによりガス状基質のような基質からイソバレレートまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する。典型的には、この経路における酵素のうちの少なくとも１つは、微生物に対して外因性である。好ましい実施形態では、ステップ４４はＰｔｂ−Ｂｕｋにより触媒される。ステップ１、４０、４１、４２、４３、及び４４のための酵素の例となるタイプ及び供給源は、本出願において他で記載されている。
【０１２７】
イソアミルアルコールの産生
本発明は、基質からイソアミルアルコールまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する（図３６）。本発明は、こうした微生物を基質の存在下で培養することにより、イソアミルアルコールまたはその前駆体を産生する方法をさらに提供する。好ましい実施形態では、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイからなる群から選択される親微生物に由来する。しかしながら、微生物はまた、全く異なる微生物、例えば、エシェリキア・コリに由来してもよい。イソアミルアルコールの産生のための記載されている酵素経路は、内因性酵素及び、内因性酵素活性が存在しない、または低い場合、外因性酵素を含んでもよい。
【０１２８】
ステップ１、４０、４１、４２、４３、４４、４５、及び４６を通したイソアミルアルコール：１つの実施形態では、本発明は、ステップ１、４０、４１、４２、４３、４４、４５、及び４６のための酵素を含み、これによりガス状基質のような基質からイソアミルアルコールまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する。典型的には、この経路における酵素のうちの少なくとも１つは、微生物に対して外因性である。好ましい実施形態では、ステップ４４はＰｔｂ−Ｂｕｋにより触媒される。ステップ１、４０、４１、４２、４３、４４、４５、及び４６のための酵素の例となるタイプ及び供給源は、本出願において他で記載されている。
【０１２９】
ステップ１、４０、４１、４２、４３、４７、及び４６を通したイソアミルアルコール：１つの実施形態では、本発明は、ステップ１、４０、４１、４２、４３、４７、及び４６のための酵素を含み、これによりガス状基質のような基質からイソアミルアルコールまたはその前駆体を産生することができる微生物を提供する。典型的には、この経路における酵素のうちの少なくとも１つは、微生物に対して外因性である。ステップ１、４０、４１、４２、４３、４７、及び４６のための酵素の例となるタイプ及び供給源は、本出願において他で記載されている。
【０１３０】
１つの実施形態では、微生物は、イソアミルアルコールの産生のための２つ以上の経路を含んでもよい。
【０１３１】
追加産物の産生
本発明は、外因性Ｐｔｂ−Ｂｕｋ及び外因性または内因性アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＡＯＲ）を含む微生物を提供する。こうした微生物は、例えば、ガス状基質から発生したアセチル−ＣｏＡから、例えば、１−プロパノール、１−ブタノール、１−ヘキサノール、及び１−オクタノールまたはこれらの前駆体を産生し得る（図３２）。本発明は、こうした微生物をガス状基質の存在下で培養することにより、１−プロパノール、１−ブタノール、１−ヘキサノール、及び１−オクタノールまたはこれらの前駆体を産生する方法をさらに提供する。クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイは、天然にＡＯＲを含む。しかしながら、ＡＯＲは、こうした微生物において、外因性Ｐｔｂ−Ｂｕｋの発現と組み合わせて過剰発現させてもよい。あるいは、外因性ＡＯＲ及び外因性Ｐｔｂ−Ｂｕｋを、エシェリキア・コリのような、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイ以外の微生物において発現させてもよい。
【０１３２】
前駆体及び中間体の産生
図１、３４、３５、及び３６において示されている経路は、前述の産物の前駆体または中間体を産生するように修飾してもよい。特に、前駆体または中間体の産生を得るために、本明細書において記載されている経路のいずれかの部分酵素経路を宿主微生物に挿入してもよい。
【０１３３】
定義及び背景
「遺伝子修飾」または「遺伝子工学」という用語は、広く微生物のゲノムまたは核酸の操作を指す。同様に、「遺伝子操作」という用語は、操作されたゲノムまたは核酸を含む微生物を指す。遺伝子修飾の方法としては、例えば、非相同遺伝子発現、遺伝子またはプロモーター挿入または欠失、核酸変異、遺伝子発現変化または不活性化、酵素工学、指向性進化、知識ベース設計、ランダム変異導入法、遺伝子シャフリング、及びコドン最適化が挙げられる。
【０１３４】
「組換え」とは、核酸、タンパク質、または微生物が、遺伝子修飾、操作、または組換えの産物であることを示す。一般的には、「組換え」という用語は、微生物の２つ以上の異なる株または種ような、複数の供給源に由来する遺伝物質を含有する、またはこれによりコード化される核酸、タンパク質、または微生物を指す。本明細書において使用されている「組換え」という用語はまた、内因性核酸またはタンパク質の変異形態を含む、変異核酸またはタンパク質を含む微生物を表すのに使用され得る。
【０１３５】
「内因性」とは、本発明の微生物が由来する野生型または親微生物中に存在または発現する核酸またはタンパク質を指す。例えば、内因性遺伝子とは、本発明の微生物が由来する野生型または親微生物中に天然に存在する遺伝子である。１つの実施形態では、内因性遺伝子の発現は、外因性プロモーターのような、外因性制御エレメントにより制御してもよい。
【０１３６】
「外因性」とは、本発明の微生物が由来する野生型または親微生物中に存在しない核酸またはタンパク質を指す。１つの実施形態では、外因性遺伝子または酵素は、非相同（すなわち、異なる）株または種に由来し、本発明の微生物中に導入または発現してもよい。別の実施形態では、外因性遺伝子または酵素は、人工的にまたは組換えで作製し、本発明の微生物中に導入または発現してもよい。外因性核酸は、本発明の微生物のゲノムに組み込まれる、または本発明の微生物における染色体外状態、例えば、プラスミド中にとどまるように改変してもよい。
【０１３７】
「酵素活性」または簡単に「活性」とは、広く、これらに限定されないが、酵素の活性、酵素の量、または反応を触媒するための酵素の利用可能性を含む、酵素活性を指す。したがって、酵素活性を「増加させること」としては、酵素の活性を増加させること、酵素の量を増加させること、または反応を触媒するための酵素の利用可能性を増加させることが挙げられる。同様に、酵素活性を「減少させること」としては、酵素の活性を減少させること、酵素の量を減少させること、または反応を触媒するための酵素の利用可能性を減少させることが挙げられる。
【０１３８】
酵素活性に関して、「基質」とは、酵素が作用する分子であり、「産物」とは、酵素の作用により産生される分子である。「天然基質」とは、したがって、野生型微生物において酵素が天然に作用する分子であり、「天然産物」とは、野生型微生物において酵素の作用により天然に産生される分子である。例えば、ブタノイル−ＣｏＡは、Ｐｔｂ及びブタノイルホスフェートの天然基質であり、Ｂｕｋの天然基質である。また、ブタノイルホスフェートはＰｔｂの天然産物であり、ブチレート（ブタノエート）はＢｕｋの天然産物である。同様に、「非天然基質」とは、野生型微生物において酵素が天然に作用しない分子であり、「非天然産物」とは、野生型微生物において酵素の作用により天然に産生されない分子である。複数の異なる基質に対して作用することができる酵素は、天然でも非天然でも、典型的には「無差別的な」酵素と称される。本発明者らは、Ｐｔｂが無差別的であり、様々なアシル−ＣｏＡ及びエノイル−ＣｏＡを基質として受け入れることができ、Ｐｔｂ−Ｂｕｋが、同時にＡＴＰを発生させながら、多数のアシル−ＣｏＡ及びエノイル−ＣｏＡを、それぞれ、それらの対応する酸またはアルケネートに変換するのに使用され得ることを発見した。よって、好ましい実施形態では、本発明のＰｔｂ−Ｂｕｋは、非天然基質（すなわち、ブタノイル−ＣｏＡ及び／またはブタノイルホスフェート以外の基質）に対して作用し、非天然産物（すなわち、ブタノイルホスフェート及び／またはブチレート（ブタノエート）以外の産物）を産生する。
【０１３９】
「ブチリル−ＣｏＡ」という用語は、本明細書において「ブタノイル−ＣｏＡ」と相互互換的に使用され得る。
【０１４０】
「エネルギー発生」等の用語は、本明細書において「エネルギー保存」等と相互互換的に使用され得る。これらの用語の両方は、文献において一般的に使用されている。
【０１４１】
「変異」とは、本発明の微生物が由来する野生型または親微生物と比較して、本発明の微生物において修飾された核酸またはタンパク質を指す。１つの実施形態では、変異は、酵素をコード化する遺伝子における欠失、挿入、または置換であってもよい。別の実施形態では、変異は、酵素における１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、または置換であってもよい。
【０１４２】
特に、「破壊的変異」とは、遺伝子または酵素の発現または活性を低減または排除（すなわち、「破壊」）する変異である。破壊的変異は、遺伝子または酵素を部分的に不活性化、完全に不活性化、または欠失し得る。破壊的変異は、ノックアウト（ＫＯ）変異であってもよい。破壊的変異は、酵素により産生される産物の生合成を低減、防止、または阻害するいずれかの変異であってもよい。破壊的変異としては、例えば、酵素をコード化する遺伝子における変異、酵素をコード化する遺伝子の発現に関与する遺伝子制御エレメントにおける変異、酵素の活性を低減もしくは阻害するタンパク質を産生する核酸の導入、または酵素の発現を阻害する核酸（例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ）もしくはタンパク質の導入が挙げられる。破壊的変異は、当該技術分野において知られているいずれかの方法を使用して導入してもよい。
【０１４３】
破壊的変異の導入は、標的産物を全くまたは実質的に産生しないか、本発明の微生物が由来する親微生物と比較して低減した量の標的産物を産生する本発明の微生物をもたらす。例えば、本発明の微生物は、標的産物を産生しないか、親微生物より少なくとも約１％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％少ない標的産物を産生する場合がある。例えば、本発明の微生物は、約０．００１、０．０１、０．１０、０．３０、０．５０、または１．０ｇ／Ｌ未満の標的産物を産生し得る。
【０１４４】
「コドン最適化」とは、特定の株または種における核酸の最適化または向上した翻訳のための、遺伝子のような、核酸の変異を指す。コドン最適化は、より速い翻訳速度またはより高い翻訳精度をもたらし得る。好ましい実施形態では、本発明の遺伝子は、クロストリジウム、特にクロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイにおける発現についてコドン最適化される。さらに好ましい実施形態では、本発明の遺伝子は、ＤＳＭＺアクセッション番号ＤＳＭ２３６９３で寄託されている、クロストリジウム・オートエタノゲナムＬＺ１５６１における発現についてコドン最適化される。
【０１４５】
「過剰発現」とは、本発明の微生物が由来する野生型または親微生物と比較した、本発明の微生物における核酸またはタンパク質の発現の増加を指す。過剰発現は、遺伝子コピー数、遺伝子転写速度、遺伝子翻訳速度、または酵素分解速度を変更することを含む、当該技術分野において知られているいずれかの手段により達成してもよい。
【０１４６】
「多様体」という用語は、その配列が、従来技術において開示または本明細書において例示されている参照核酸及びタンパク質の配列のような、参照核酸及びタンパク質の配列とは異なる核酸及びタンパク質を含む。本発明は、参照核酸またはタンパク質と実質的に同じ機能を行う多様性核酸またはタンパク質を使用して実施してもよい。例えば、多様性タンパク質は、参照タンパク質と実質的に同じ機能を行い、または実質的に同じ反応を触媒し得る。多様性遺伝子は、参照遺伝子と同じまたは実質的に同じタンパク質をコード化し得る。多様性プロモーターは、参照プロモーターと実質的に同じ、１つ以上の遺伝子の発現を促進する能力を有し得る。
【０１４７】
こうした核酸またはタンパク質は、本明細書において「機能的に同等の多様体」と称され得る。例として、核酸の機能的に同等の多様体としては、対立遺伝子多様体、遺伝子のフラグメント、変異遺伝子、遺伝子多型、等が挙げられ得る。他の微生物からの相同遺伝子も、機能的に同等の多様体の例である。これらとしては、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキイ、またはクロストリジウム・ユングダリイのような種における相同遺伝子が挙げられ、その詳細はＧｅｎｂａｎｋまたはＮＣＢＩのようなウェブサイト上で公開されている。機能的に同等の多様体としては、その配列が特定の微生物についてのコドン最適化の結果として異なる核酸も挙げられる。核酸の機能的に同等の多様体は、好ましくは、参照核酸との少なくとも約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、またはこれより大きい核酸配列同一性（相同性パーセント）を有するだろう。タンパク質の機能的に同等の多様体は、好ましくは、参照タンパク質との少なくとも約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、またはこれより大きいアミノ酸同一性（相同性パーセント）を有するだろう。多様性核酸またはタンパク質の機能的同等性は、当該技術分野において知られているいずれかの方法を使用して評価してもよい。
【０１４８】
核酸は、本発明の微生物に、当該技術分野において知られているいずれかの方法を使用して送達してもよい。例えば、核酸は、ネイキッド核酸として送達してもよく、またはリポソームのような１つ以上の物質と製剤してもよい。核酸は、必要に応じて、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはこれらの組み合わせであってもよい。制限インヒビターは、特定の実施形態において使用してもよい。追加のベクターとしては、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、コスミド、及び人工染色体が挙げられ得る。好ましい実施形態では、核酸は本発明の微生物に、プラスミドを使用して送達される。例として、（形質導入または形質移入を含む）形質転換は、電気穿孔、超音波処理、ポリエチレングリコール媒介性形質転換、化学もしくは天然能力、プロトプラスト形質転換、プロファージ誘発、または接合により達成してもよい。活性制限酵素系を有する特定の実施形態では、微生物への核酸の導入前に、核酸をメチル化する必要があり得る。
【０１４９】
さらに、核酸は、特定の核酸の発現を増加またはそうでなければ制御するために、プロモーターのような制御エレメントを含むように設計してもよい。プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであってもよい。理想的には、プロモーターは、ウッド−ユングダール経路プロモーター、フェレドキシンプロモーター、ピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼプロモーター、Ｒｎｆ複合体オペロンプロモーター、ＡＴＰシンターゼオペロンプロモーター、またはホスホトランスアセチラーゼ／アセテートキナーゼオペロンプロモーターである。
【０１５０】
「微生物」とは、微小な生物、特に細菌、古細菌、ウイルス、または真菌である。本発明の微生物は、典型的には細菌である。本明細書において使用されている「微生物」とは、「細菌」を包含するものと理解されるべきである。
【０１５１】
「親微生物」とは、本発明の微生物を発生させるのに使用される微生物である。親微生物は、天然に存在する微生物（すなわち、野生型微生物）または予め修飾された微生物（すなわち、変異または組換え微生物）であってもよい。本発明の微生物は、親微生物において発現または過剰発現しなかった１つ以上の酵素を発現または過剰発現させるように修飾してもよい。同様に、本発明の微生物は、親微生物により含有されなかった１つ以上の遺伝子を含有するように修飾してもよい。本発明の微生物はまた、親微生物において発現した１つ以上の酵素を発現させない、またはより少量で発現させるように修飾してもよい。１つの実施形態では、親微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイである。好ましい実施形態では、親微生物は、ＤＳＭＺアクセッション番号ＤＳＭ２３６９３で寄託されている、クロストリジウム・オートエタノゲナムＬＺ１５６１である。
【０１５２】
「〜に由来する」という用語は、核酸、タンパク質、または微生物が、新たな核酸、タンパク質、または微生物を産生するように、異なる（例えば、親または野生型）核酸、タンパク質、または微生物から修飾または改変されていることを示す。こうした修飾または改変としては、典型的には核酸または遺伝子の挿入、欠失、変異、または置換が挙げられる。一般的には、本発明の微生物は、親微生物に由来する。１つの実施形態では、本発明の微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイに由来する。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、ＤＳＭＺアクセッション番号ＤＳＭ２３６９３で寄託されている、クロストリジウム・オートエタノゲナムＬＺ１５６１に由来する。
【０１５３】
本発明の微生物は、機能的特徴に基づきさらに分類され得る。例えば、本発明の微生物は、Ｃ１固定性微生物、嫌気性生物、アセトゲン、エタノロゲン、カルボキシドトロフ、及び／もしくはメタノトロフであってもよく、またはこれに由来してもよい。表１は、微生物の代表一覧を提供し、それらの機能的特徴を同定する。
【０１５４】
【表４】
2018530342.tif 000024
2018530342.tif 000025
【０１５５】
「Ｃ１」とは、１炭素分子、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＨ４、またはＣＨ３ＯＨを指す。「Ｃ１オキシゲネート」とは、少なくとも１つの酸素原子も含む１炭素分子、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、またはＣＨ３ＯＨを指す。「Ｃ１炭素源」とは、本発明の微生物のための部分または単独炭素源として機能する１炭素分子を指す。例えば、Ｃ１炭素源は、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＨ４、ＣＨ３ＯＨ、またはＣＨ２Ｏ２の１つ以上を含んでもよい。好ましくは、Ｃ１炭素源は、ＣＯ及びＣＯ２の一方または両方を含む。「Ｃ１固定性微生物」とは、Ｃ１炭素源から１つ以上の産物を産生する能力を有する微生物である。典型的には、本発明の微生物はＣ１固定性細菌である。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、表１において同定されているＣ１固定性微生物に由来する。
【０１５６】
「嫌気性生物」とは、増殖に酸素を必要としない微生物である。嫌気性生物は、酸素が特定の閾値を超えて存在する場合、ネガティブな反応を示すか、死滅することすらあり得る。典型的には、本発明の微生物は嫌気性生物である。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、表１において同定されている嫌気性生物に由来する。
【０１５７】
「アセトゲン」とは、嫌気呼吸の産物としてアセテート（または酢酸）を産生する、または産生することができる微生物である。典型的には、アセトゲンとは、エネルギー保存のため、ならびにアセチル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡ由来産物、例えば、アセテートの合成のためのそれらの主要なメカニズムとしてウッド−ユングダール経路を使用する偏性嫌気性細菌である（Ｒａｇｓｄａｌｅ、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、１７８４：１８７３−１８９８、２００８）。アセトゲンは、アセチル−ＣｏＡ経路を（１）ＣＯ２からのアセチル−ＣｏＡの還元的合成のためのメカニズム、（２）最終電子受容エネルギー保存プロセス、（３）セルカーボンの合成におけるＣＯ２の固定（同化）のためのメカニズムとして使用する（Ｄｒａｋｅ、Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ、Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ、３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．３５４、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２００６）。すべての天然に存在するアセトゲンは、Ｃ１固定性、嫌気性、独立栄養性、及び非メタノトロフィックである。典型的には、本発明の微生物はアセトゲンである。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、表１において同定されているアセトゲンに由来する。
【０１５８】
「エタノロゲン」とは、エタノールを産生する、または産生することができる微生物である。典型的には、本発明の微生物はエタノロゲンである。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、表１において同定されているエタノロゲンに由来する。
【０１５９】
「独立栄養生物」とは、有機炭素の非存在下で増殖することができる微生物である。代わりに、独立栄養生物は、ＣＯ及び／またはＣＯ２のような、無機炭素源を使用する。典型的には、本発明の微生物は独立栄養生物である。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、表１において同定されている独立栄養生物に由来する。
【０１６０】
「カルボキシドトロフ」とは、炭素の単独供給源としてＣＯを利用することができる微生物である。典型的には、本発明の微生物はカルボキシドトロフである。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、表１において同定されているカルボキシドトロフに由来する。
【０１６１】
「メタノトロフ」とは、炭素及びエネルギーの単独供給源としてメタンを利用することができる微生物である。特定の実施形態では、本発明の微生物はメタノトロフに由来する。
【０１６２】
さらに広く、本発明の微生物は、表１において同定されているいずれかの属または種に由来してもよい。
【０１６３】
好ましい実施形態では、本発明の微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイ種を含むクロストリジウムのクラスターに由来する。これらの種は、Ａｂｒｉｎｉ、Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１６１：３４５−３５１、１９９４（クロストリジウム・オートエタノゲナム）、Ｔａｎｎｅｒ、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、４３：２３２−２３６、１９９３（クロストリジウム・ユングダリイ）、及びＨｕｈｎｋｅ、ＷＯ２００８／０２８０５５（クロストリジウム・ラグスダレイ）により最初に報告され、特徴分析された。
【０１６４】
これらの３つの種は多くの類似点を有する。特に、これらの種はすべて、クロストリジウム属のＣ１固定性、嫌気性、酢酸産生、エタノール産生、及びカルボキシドトロフィックなメンバーである。これらの種は、類似する遺伝子型及び表現型ならびにエネルギー保存及び発酵代謝の態様を有する。さらに、これらの種は、９９％を超えて同一であり、約２２〜３０ｍｏｌ％のＤＮＡ  Ｇ＋Ｃ含有量を有し、グラム陽性であり、類似する形態及びサイズ（０．５〜０．７×３〜５μｍの対数増殖細胞）を有し、中温性であり（３０〜３７℃で最適に増殖し）、約４〜７．５の類似するｐＨ範囲（最適ｐＨ約５．５〜６）を有し、シトクロムを欠き、Ｒｎｆ複合体を通してエネルギーを保存する、１６Ｓ  ｒＲＮＡ  ＤＮＡを有するクロストリジウムｒＲＮＡ相同性グループＩにおいてクラスター化される。また、カルボン酸のそれらの対応するアルコールへの還元が、これらの種において示されている（Ｐｅｒｅｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、１１０：１０６６−１０７７、２０１２）。重要なことに、これらの種はまた、すべてＣＯ含有ガス上で強い独立栄養的な増殖を示し、主要発酵産物としてエタノール及びアセテート（または酢酸）を産生し、特定の条件下で少量の２，３−ブタンジオール及び乳酸を産生する。
【０１６５】
しかしながら、これらの３つの種は、多数の相違点も有する。これらの種は異なる供給源、クロストリジウム・オートエタノゲナムはウサギ腸、クロストリジウム・ユングダリイは養鶏場廃棄物、クロストリジウム・ラグスダレイは淡水底質から単離された。これらの種は、様々な糖（例えば、ラムノース、アラビノース）、酸（例えば、グルコネート、シトレート）、アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン）、及び他の基質（例えば、ベタイン、ブタノール）の利用において異なる。さらに、これらの種は、特定のビタミン（例えば、チアミン、ビオチン）への栄養要求性において異なる。これらの種は、ウッド−ユングダール経路遺伝子及びタンパク質の核酸及びアミノ酸配列において相違点を有するが、これらの遺伝子及びタンパク質の一般的な構成及び数はすべての種において同じであることが見出されている（Ｋｏｐｋｅ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２２：３２０−３２５、２０１１）。
【０１６６】
よって、要約すると、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイの特徴の多くは、その種に特異的ではなく、むしろクロストリジウム属のＣ１固定性、嫌気性、酢酸産生、エタノール産生、及びカルボキシドトロフィックなメンバーのこのクラスターについての一般的な特徴である。しかしながら、これらの種は実際には異なるので、これらの種のうちの１つの遺伝子修飾または操作は、これらの種のうちのもう１つにおいて同一の効果を有しない場合があり得る。例えば、増殖、性能、または産物産生における相違が観察され得る。
【０１６７】
本発明の微生物はまた、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイの単離物または変異体に由来してもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナムの単離物及び変異体としては、ＪＡ１−１（ＤＳＭ１００６１）（Ａｂｒｉｎｉ、Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１６１：３４５−３５１、１９９４）、ＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）（ＷＯ２００９／０６４２００）、及びＬＺ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）が挙げられる。クロストリジウム・ユングダリイの単離物及び変異体としては、ＡＴＣＣ４９５８７（Ｔａｎｎｅｒ、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、４３：２３２−２３６、１９９３）、ＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８、ＡＴＣＣ５５３８３）、ＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ５５３８０）（ＵＳ５，５９３，８８６）、Ｃ−０１（ＡＴＣＣ５５９８８）（ＵＳ６，３６８，８１９）、Ｏ−５２（ＡＴＣＣ５５９８９）（ＵＳ６，３６８，８１９）、及びＯＴＡ−１（Ｔｉｒａｄｏ−Ａｃｅｖｅｄｏ、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ  ｆｒｏｍ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇａｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、ＰｈＤ  ｔｈｅｓｉｓ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、２０１０）が挙げられる。クロストリジウム・ラグスダレイの単離物及び変異体としては、ＰＩ１（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６２２、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７８２６）（ＷＯ２００８／０２８０５５）が挙げられる。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、しかしながら、本発明の微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイ以外の微生物である。例えば、微生物は、エシェリキア・コリ、サッカロマイセス・セレビシエ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンクキイ、クロストリジウム・サッカロブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ジオリス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｏｌｉｓ）、クロストリジウム・クルイベリ、クロストリジウム・パステリアニウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｒｉａｎｉｕｍ）、クロストリジウム・ノビイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｏｖｙｉ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、クロストリジウム・テルモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・セルロボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ラクトコッカス・ラクチス、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、クレブシエラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、カプリアビダス・ネカトール、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、及びメチロバクテリウム・エクストルクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）からなる群から選択してもよい。
【０１６９】
「基質」とは、本発明の微生物のための炭素及び／またはエネルギー源を指す。典型的には、基質はガス状であり、Ｃ１炭素源、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、及び／またはＣＨ４を含む。好ましくは、基質はＣＯまたはＣＯ＋ＣＯ２のＣ１炭素源を含む。基質は、Ｈ２、Ｎ２、または電子のような、他の非炭素成分をさらに含んでもよい。
【０１７０】
基質は、一般的には、約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍｏｌ％のＣＯのような、少なくともいくらかの量のＣＯを含む。基質は、約２０〜８０、３０〜７０、または４０〜６０ｍｏｌ％のＣＯのような、ある範囲のＣＯを含んでもよい。好ましくは、基質は、約４０〜７０ｍｏｌ％のＣＯ（例えば、製鋼工場または高炉ガス）、約２０〜３０ｍｏｌ％のＣＯ（例えば、塩基性酸素転炉ガス）、または約１５〜４５ｍｏｌ％のＣＯ（例えば、合成ガス）を含む。いくつかの実施形態では、基質は、約１〜１０または１〜２０ｍｏｌ％のＣＯのような、比較的少量のＣＯを含んでもよい。本発明の微生物は、典型的には基質中のＣＯの少なくとも一部分を産物に変換する。いくつかの実施形態では、基質はＣＯを全くまたは実質的に含まない。
【０１７１】
基質は、いくらかの量のＨ２を含んでもよい。例えば、基質は、約１、２、５、１０、１５、２０、または３０ｍｏｌ％のＨ２を含んでもよい。いくつかの実施形態では、基質は、約６０、７０、８０、または９０ｍｏｌ％のＨ２のような、比較的多量のＨ２を含んでもよい。さらなる実施形態では、基質はＨ２を全くまたは実質的に含まない。
【０１７２】
基質は、いくらかの量のＣＯ２を含んでもよい。例えば、基質は、約１〜８０または１〜３０ｍｏｌ％のＣＯ２を含んでもよい。いくつかの実施形態では、基質は、約２０、１５、１０、または５ｍｏｌ％未満のＣＯ２を含んでもよい。別の実施形態では、基質はＣＯ２を全くまたは実質的に含まない。
【０１７３】
基質は典型的にはガス状であるが、基質はまた代替形態で提供してもよい。例えば、基質は、マイクロバブル分散発生装置を使用してＣＯ含有ガスで飽和させた液体に溶解してもよい。さらなる例として、基質は固体支持体上に吸着させてもよい。
【０１７４】
基質及び／またはＣ１炭素源は、産業プロセスの副産物として、またはいくつかの他の供給源から、例えば自動車の排気ガスもしくはバイオマスのガス化から得られる廃ガスであってもよい。特定の実施形態では、産業プロセスは、鉄金属製品製造、例えば、製鋼工場製造、非鉄製品製造、石油精製プロセス、石炭ガス化、電力生産、カーボンブラック製造、アンモニア産生、メタノール産生、及びコークス製造からなる群から選択される。これらの実施形態では、基質及び／またはＣ１炭素源は、大気中に放出される前に、いずれかの便利な方法を使用して産業プロセスから捕捉してもよい。
【０１７５】
基質及び／またはＣ１炭素源は、石炭もしくは精製所残渣のガス化、バイオマスもしくはリグノセルロース材料のガス化、または天然ガスの再形成により得られる合成ガスのような、合成ガスであってもよい。別の実施形態では、合成ガスは、都市固体廃棄物または産業固体廃棄物のガス化から得てもよい。
【０１７６】
基質の組成は、反応の効率及び／またはコストに対して顕著な影響を有し得る。例えば、酸素（Ｏ２）の存在は、嫌気性発酵プロセスの効率を低減し得る。基質の組成に応じて、いかなる望ましくない不純物、例えば、毒素、望ましくない成分、もしくはダスト粒子も除去するように基質を処理、洗浄、もしくは濾過し、及び／または望ましい成分の濃度を増加させることが望ましい場合がある。
【０１７７】
本発明の微生物は、１つ以上の産物を産生するために培養してもよい。例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナムは、エタノール（ＷＯ２００７／１１７１５７）、アセテート（ＷＯ２００７／１１７１５７）、ブタノール（ＷＯ２００８／１１５０８０及びＷＯ２０１２／０５３９０５）、ブチレート（ＷＯ２００８／１１５０８０）、２，３−ブタンジオール（ＷＯ２００９／１５１３４２）、ラクテート（ＷＯ２０１１／１１２１０３）、ブテン（ＷＯ２０１２／０２４５２２）、ブタジエン（ＷＯ２０１２／０２４５２２）、メチルエチルケトン（２−ブタノン）（ＷＯ２０１２／０２４５２２及びＷＯ２０１３／１８５１２３）、エチレン（ＷＯ２０１２／０２６８３３）、アセトン（ＷＯ２０１２／１１５５２７）、イソプロパノール（ＷＯ２０１２／１１５５２７）、脂質（ＷＯ２０１３／０３６１４７）、３−ヒドロキシプロピオネート（３−ＨＰ）（ＷＯ２０１３／１８０５８１）、イソプレン（ＷＯ２０１３／１８０５８４）、脂肪酸（ＷＯ２０１３／１９１５６７）、２−ブタノール（ＷＯ２０１３／１８５１２３）、１，２−プロパンジオール（ＷＯ２０１４／０３６９１５２）、及び１−プロパノール（ＷＯ２０１４／０３６９１５２）を産生する、または産生するように操作することができる。１つ以上の標的産物に加えて、本発明の微生物は、エタノール、アセテート、及び／または２，３−ブタンジオールも産生し得る。特定の実施形態では、微生物バイオマス自体が産物とみなされ得る。
【０１７８】
「天然産物」とは、遺伝子修飾されていない微生物により産生される産物である。例えば、エタノール、アセテート、及び２，３−ブタンジオールは、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ユングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイの天然産物である。「非天然産物」とは、遺伝子修飾された微生物が由来する遺伝子修飾されていない微生物ではなく、遺伝子修飾された微生物により産生される産物である。
【０１７９】
本明細書において相互互換的に言及され得る、「中間体」及び「前駆体」という用語は、観察されたまたは標的産物の酵素経路上流における分子実体を指す。
【０１８０】
「選択性」とは、微生物により産生されるすべての発酵産物の産生に対する標的産物の産生の比を指す。本発明の微生物は、産物を特定の選択性または最小の選択性で産生するように操作してもよい。１つの実施形態では、標的産物は、本発明の微生物により産生されるすべての発酵産物の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、５０％、または７５％を占める。１つの実施形態では、標的産物は、本発明の微生物により産生されるすべての発酵産物の少なくとも１０％を占め、本発明の微生物は、少なくとも１０％の標的産物についての選択性を有する。別の実施形態では、標的産物は、本発明の微生物により産生されるすべての発酵産物の少なくとも３０％を占め、本発明の微生物は、少なくとも３０％の標的産物についての選択性を有する。
【０１８１】
「効率を増加させること」、「増加した効率」、等としては、これらに限定されないが、増殖速度、産物産生速度もしくは体積、基質消費体積当たりの産物体積、または産物選択性を増加させることが挙げられる。効率は、本発明の微生物が由来する親微生物の性能に対して測定され得る。
【０１８２】
典型的には、培養はバイオリアクターにおいて行われる。「バイオリアクター」という用語は、連続撹拌槽型反応器（ＣＳＴＲ）、固定化細胞反応器（ＩＣＲ）、トリクルベッド反応器（ＴＢＲ）、気泡塔、ガスリフト発酵槽、スタティックミキサー、または気液接触に適した他の容器もしくは他の装置のような、１つ以上の容器、塔、または配管からなる培養／発酵装置を含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、第１の増殖反応器及び第２の培養／発酵反応器を含んでもよい。基質は、これらの反応器の一方または両方に提供してもよい。本明細書において使用されている「培養」及び「発酵」という用語は、相互互換的に使用される。これらの用語は、培養／発酵プロセスの増殖段階及び産物生合成段階の両方を包含する。
【０１８３】
培養は一般的には、微生物の増殖を可能にするのに十分な栄養素、ビタミン、及び／またはミネラルを含有する水性培地において維持される。好ましくは、水性培地は、最小嫌気性微生物増殖培地のような、嫌気性微生物増殖培地である。適切な培地は、当該技術分野において周知である。
【０１８４】
培養／発酵は、望ましくは標的産物の産生に適した条件下で実施されるべきである。典型的には、培養／発酵は嫌気性条件下で行われる。考慮すべき反応条件としては、圧力（または分圧）、温度、ガス流量、液体流量、培地ｐＨ、培地酸化還元電位、撹拌速度（連続撹拌槽型反応器を使用する場合）、接種源レベル、液相中のガスが制限的にならないことを保証する最大ガス基質濃度、及び産物阻害を回避する最大産物濃度が挙げられる。特に、産物はガス制限条件下での培養により消費され得るので、基質の導入速度は、液相中のガスの濃度が制限的にならないことを保証するように制御してもよい。
【０１８５】
バイオリアクターを高圧で稼働させることは、気相から液相へのガス物質移動速度の増加を可能にする。したがって、一般的には培養／発酵を大気圧より高い圧力で行うことが好ましい。また、所定のガス変換速度は、一部分において、基質保持時間の関数であり、保持時間は必要なバイオリアクターの体積を決定するので、加圧システムの使用は、必要なバイオリアクターの体積及び、結果として、培養／発酵設備の資本コストを大幅に低減することができる。これは、ひいては、入力ガス流量で割ったバイオリアクター中の液体体積として定義される保持時間を、バイオリアクターが大気圧よりもむしろ高圧で維持される場合、低減することができることを意味する。最適な反応条件は、使用される特定の微生物に部分的に依存するだろう。しかしながら、一般的には、発酵を大気圧より高い圧力で行うことが好ましい。また、所定のガス変換速度は一部分において基質保持時間の関数であり、所望の保持時間を達成することは、ひいては必要なバイオリアクターの体積を決定するので、加圧システムの使用は、必要なバイオリアクターの体積、及び結果として発酵設備の資本コストを大幅に低減することができる。
【０１８６】
標的産物は、例えば、分別蒸留、蒸発、浸透蒸発、ガスストリッピング、相分離、及び、例えば、液液抽出を含む、抽出発酵を含む、当該技術分野において知られているいずれかの方法または方法の組み合わせを使用して、発酵ブロスから分離または精製してもよい。特定の実施形態では、標的産物は、ブロスの一部分をバイオリアクターから連続的に取り出し、微生物細胞をブロスから（便利には濾過により）分離し、１つ以上の標的産物をブロスから回収することにより、発酵ブロスから回収される。アルコール及び／またはアセトンは、例えば、蒸留により回収してもよい。酸は、例えば、活性炭上での吸着により回収してもよい。分離された微生物細胞は、好ましくはバイオリアクターに戻される。標的産物が取り出された後に残った無細胞透過物も、好ましくはバイオリアクターに戻される。バイオリアクターに戻される前に培地を補充するため、追加の栄養素（例えば、Ｂビタミン）を無細胞透過物に添加してもよい。
【実施例】
【０１８７】
下記の実施例は、本発明についてさらに例示するが、もちろん、いかなる方法でもその範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１８８】
実施例１
この実施例は、インビボでＥ・コリにおいてアセトアセチル−ＣｏＡをアセトアセテートに変換するＰｔｂ−Ｂｕｋの能力ならびにアセトン、イソプロパノール、３−ヒドロキシブチレート、及びイソブチレンの産生におけるその使用について実証する。
【０１８９】
アセトアセチル−ＣｏＡからのアセトアセテート産生のためのＰｔｂ−Ｂｕｋ系に基づく経路を、設計及び構築した。これは、ｐＤＵＥＴベクターシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して、モジュール方式で行った。１つのモジュールは、プラスミドｐＡＣＹＣ上にＣ・ベイジェリンキイＮＣＩＭＢ８０５２からのｐｔｂ−ｂｕｋ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＣ＿００９６１７、位置２３２０２７．．２３４１４７、Ｃｂｅｉ＿０２０３−２０４、ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ  ５２９１４３７−３８）を含有した。別のモジュールは、プラスミドｐＣＯＬＡ上にＣ・アセトブチリカムのチオラーゼ遺伝子ｔｈｌＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＣ＿００１９８８、位置８２０４０．．８３２１８、ＣＡ＿Ｐ００７８、ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ  １１１６０８３）及びＣ・ベイジェリンキイＮＣＩＭＢ８０５２のアセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子ａｄｃ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＣ＿００９６１７、位置４４０１９１６．．４４０２６５６、Ｃｂｅｉ＿３８３５、ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ  ５２９４９９６）を含有した。Ｐｔｂ及びｂｕｋ遺伝子を、Ｃ・ベイジェリンキイＮＣＩＭＢ８０５２のゲノムＤＮＡならびに既存のアセトンプラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ（ＷＯ２０１２／１１５５２７）からのｔｈｌＡ及びａｄｃ遺伝子から増幅させ、環状ポリメラーゼ伸長クローニング（ＣＰＥＣ）法（Ｑｕａｎ、ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ、４：ｅ６４４１、２００９）での制限独立クローニングを通してｐＤＵＥＴベクター中に存在するＴ７プロモーターの制御下でクローニングした。
【０１９０】
ｐｔｂ及びｂｕｋ遺伝子の増幅に使用されるオリゴヌクレオチド：
【０１９１】
【表５】
2018530342.tif 000026
【０１９２】
ｔｈｌＡ及びａｄｃ遺伝子の増幅に使用されるオリゴヌクレオチド：
【０１９３】
【表６】
2018530342.tif 000027
2018530342.tif 000028
【０１９４】
プラスミドｐＡＣＹＣ−ｐｔｂ−ｂｕｋ（配列番号１０５）及びｐＣＯＬＡ−ｔｈｌＡ−ａｄｃ（配列番号１０６）を構築した後、それらを個別に及び共にＥ・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換し、増殖実験を、１２ウェルプレート中の１．５ｍＬの培養物において、２８℃で、１６０ｒｐｍで環状に振盪しながら、グルコースを含むＭ９最小培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｖｏｌ  ３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）を使用して、４通り実施した（図４）。培養物を、０．１のＯＤ６００ｎｍで接種し、増殖の２時間後、異なる濃度のＩＰＴＧ（０、５０、１００μＭ）で誘発した（図５）。プレートテープストリップを使用してプレートを封止し、先端が緑の針で各ウェルに穴をあけ、微好気性条件をもたらした。誘発のさらに６４時間増殖を実施した。実験を３通り繰り返した。
【０１９５】
アセトン濃度、及びイソブチレンのような他の代謝産物の濃度を、Ｓｕｐｅｌｃｏポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０μｍ固相マイクロ抽出ファイバー、Ｒｅｓｔｅｋ  Ｒｔｘ−１（３０ｍ×０．３２μｍ×５μｍ）カラム、及び水素炎イオン化型検出器（ＦＩＤ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０ＮヘッドスペースＧＣを使用する、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析を使用して測定した。試料（４ｍｌ）を２０ｍｌヘッドスペースバイアルに移し、そこでファイバーを１０分間５０℃でインキュベート（曝露）した。試料を、インジェクターにおいて２５０℃で９分間脱着した。クロマトグラフィーは、４０℃（５分保持）及び１０℃／分で２００℃まで、続いて２２０℃で５分保持のオーブンプログラムで行った。カラム流量は１ｍｌ／分とし、水素をキャリアガスとした。ＦＩＤを２５０℃で保持し、メイクアップガスとして水素を４０ｍｌ／分、空気を４５０ｍｌ／分、及び窒素を１５ｍｌ／分とした。
【０１９６】
アセトンが（チオラーゼ、Ｐｔｂ−Ｂｕｋ、及びアセトアセテートデカルボキシラーゼを発現させる）ｐＡＣＹＣ−ｐｔｂ−ｂｕｋ及びｐＣＯＬＡ−ｔｈｌＡ−ａｄｃプラスミドの両方を有する株において産生されたことは、直ちに明らかとなった。０．１９ｇ／Ｌの平均最終アセトン産生が測定されたが、プラスミドなしの対照、培地対照、（Ｐｔｂ−Ｂｕｋを発現させる）単一プラスミド対照ｐＡＣＹＣ−ｐｔｂ−ｂｕｋ、または（チオラーゼ及びアセトアセテートデカルボキシラーゼを発現させる）ｐＣＯＬＡ−ｔｈｌＡ−ａｄｃプラスミドではアセトンは産生されなかった（信頼性検出限界未満）。（チオラーゼ、Ｐｔｂ−Ｂｕｋ、及びアセトアセテートデカルボキシラーゼを発現させる）ｐＡＣＹＣ−ｐｔｂ−ｂｕｋ及びｐＣＯＬＡ−ｔｈｌＡ−ａｄｃプラスミドの両方を有する株の誘発されていない培養物は、感知できる量のアセトンを産生しなかった。
Ｅ・コリＢＬ２１（ＤＥ３）における平均アセトン産生： 
【０１９７】
【表７】
2018530342.tif 000029
【０１９８】
この実験は、Ｐｔｂ−Ｂｕｋが、アセトアセチル−ＣｏＡのアセトアセテートへの変換を行うことができ、図１のステップ１、２、及び３を含むルートを使用して例示されている、アセトンの産生のためのＣｏＡトランスフェラーゼまたはチオエステラーゼの代わりに使用され得ることを明確に実証する。
【０１９９】
イソプロパノールを第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼの添加によりアセトンから産生することができること（Ｋｏｐｋｅ、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、８０：３３９４−３４０３、２０１４）（図１におけるステップ４）、ならびにイソブチレンをヒドロキシイソバレレートシンターゼ（図１におけるステップ５）及びデカルボキシラーゼ（図１におけるステップ６）の添加を通してアセトンから産生することができること（ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、９３：１３７７−１３８７、２０１２）は周知である。Ｐｔｂ−Ｂｕｋを通した上で実証されたアセトンルートを含む経路を、遺伝子ｔｈｌＡ、ｐｔｂ−ｂｕｋ、及びａｄｃ、ならびに図１のステップ１、２、３、及び４を含むＥ・コリにおけるＰｔｂ−Ｂｕｋ系を通したイソプロパノール産生を可能にするだろう第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０２２５９２、ｐｏｓ．６０９７１１．．６１０７６６、ＣＡＥＴＨＧ＿０５５３、ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：１７３３３９８４）で構築することができる。同様に、アセトアセチル−ＣｏＡのアセトアセテートへのＰｔｂ−Ｂｕｋ変換を通した上で実証されたアセトンルートを含む経路を、遺伝子ｔｈｌＡ、ｐｔｂ−ｂｕｋ、及びａｄｃ、ならびに図１のステップ１、２、３、５、及び６を含むＥ・コリにおけるＰｔｂ−Ｂｕｋ系を通したイソブチレン産生を可能にするだろうヒドロキシイソバレレートシンターゼ及びデカルボキシラーゼについての遺伝子で構築することができる。アセトアセテートは、３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼＢｄｈを通して３−ヒドロキシブチレートに変換することもできる。これは、図１のステップ１、２、及び１５を含む経路をもたらす遺伝子ｔｈｌＡ、ｐｔｂ−ｂｕｋ、及びｂｄｈを発現させる株における３−ヒドロキシブチレート産生のためのアセトアセチル−ＣｏＡのアセトアセテートへのＰｔｂ−Ｂｕｋ変換と組み合わせることができる。
【０２００】
実施例２
この実施例は、インビボでＣ・オートエタノゲナムにおいてアセトアセチル−ＣｏＡをアセトアセテートに変換するＰｔｂ−Ｂｕｋの能力ならびにガス状基質からのアセトン、イソプロパノール、３−ヒドロキシブチレート、及びイソブチレンの産生におけるＰｔｂ−Ｂｕｋの使用について実証する。
【０２０１】
Ｐｔｂ−Ｂｕｋ系がガス状基質からのアセトン、イソプロパノール、またはイソブチレン合成も可能にすることを実証するために、Ｃ・オートエタノゲナム、Ｃ・ユングダリイ、またはＣ・ラグスダレイのようなアセトゲンにおける発現を可能にするシャトルベクター上のクロストリジウムのプロモーターの制御下で実施例１と同じ遺伝子、ｔｈｌ＋ｐｔｂ−ｂｕｋ＋ａｄｃを含有するプラスミドを構築した。
【０２０２】
ｐＭＴＬプラスミドは、Ｅ・コリ接合を通して環状ＤＮＡをクロストリジウムに導入するためのシャトルプラスミド系である（Ｈｅａｐ、Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、７８：７９−８５、２００９）。対象の遺伝子（すなわち、ｈｂｄ、ｐｈａＢ、ｔｈｌＡ、ｐｔｂ、ｂｕｋ、及びａｏｒ１）を、ＤＮＡ制限消化後のライゲーション、及び２片以上のＤＮＡフラグメントをプラスミドに同時にクローニングする場合のゴールデンゲートＤＮＡアセンブリ技術を含む、分子生物学における一般的な技術を使用して、プラスミドのｌａｃＺ領域にクローニングした。構築されたプラスミドは、ＤＮＡ配列決定により検証される。
【０２０３】
アセトン及びイソプロパノールの産生は、ウッド−ユングダール遺伝子クラスターからのクロストリジウムのプロモーターの制御下でｔｈｌ＋ｃｔｆＡＢ＋ａｄｃをコード化するプラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ（ＷＯ２０１２／１１５５２７）を使用して、Ｃ・オートエタノゲナムにおいて以前実証された。このプラスミドでは、ＣｏＡトランスフェラーゼをコード化するｃｔｆＡＢ遺伝子を、Ｐｔｂ−Ｂｕｋ系をコード化するｐｔｂ−ｂｕｋ遺伝子で直接置換した。これは、ＣＰＥＣ法を使用して実施例１において記載されているように行った。得られたプラスミドは、ｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｐｔｂ−ｂｕｋ−ａｄｃである。
【０２０４】
ｐｔｂ−ｂｕｋの増幅及びｐＭＴＬ８３１７−ｔｈｌ−ｐｔｂ−ｂｕｋ−ａｄｃへのクローニングに使用されるオリゴヌクレオチドを下に記載する。
【０２０５】
【表８】
2018530342.tif 000030
【０２０６】
Ｃ・オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１及びＤＳＭ２３６９３（ＤＳＭ１００６１の誘導体）を、ＤＳＭＺ（Ｔｈｅ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｂｅ  ７Ｂ、３８１２４  ブラウンシュヴァイク、ドイツ）から供給した。
【０２０７】
株を、３７℃で、ｐＨ５．６のＰＥＴＣ培地において、標準的な嫌気性技術（Ｈｕｎｇａｔｅ、Ｍｅｔｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３Ｂ：１１７−１３２、１９６９、Ｗｏｌｆｅ、Ａｄｖ  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、６：１０７−１４６、１９７１）を使用して増殖させた。（グレンブルック、ニュージーランドにあるＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｓｔｅｅｌ敷地から回収された）３０ｐｓｉＣＯ含有製鋼工場ガスまたは４４％ＣＯ、３２％Ｎ２、２２％ＣＯ２、２％Ｈ２の同じ組成を有する合成ガスブレンドを、独立栄養的な増殖のための基質として使用した。固体培地には、１．２％バクトアガー（ＢＤ、フランクリンレイクス、ＮＪ  ０７４１７、米国）を添加した。
【０２０８】
構築物を合成した後、接合を通してＣ・オートエタノゲナムに形質転換した。このために、発現ベクターをまず、標準的なヒートショック形質転換を使用して、接合ドナー株Ｅ・コリＨＢ１０１＋Ｒ７０２（ＣＡ４３４）（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１１３６：８１９−８２６、１９９０）（ドナー）に導入した。ドナー細胞をＳＯＣ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｖｏｌ  ３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）において、３７℃で１時間回収した後、１００μｇ／ｍｌのスぺクチノマイシン及び２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｖｏｌ  ３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）プレートに播種した。ＬＢプレートを３７℃で一晩インキュベートした。翌日、１００μｇ／ｍｌのスぺクチノマイシン及び２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する５ｍｌのＬＢアリコートに、いくつかのドナーコロニーを接種し、３７℃で、振盪しながら約４時間、または培養物が目に見えて高密度だがまだ静止期には入っていない状態までインキュベートした。１．５ｍｌのドナー培養物を、微量遠心分離チューブにおいて、室温で、４０００ｒｐｍで２分間の遠心分離により採取し、浮遊物を廃棄した。ドナー細胞を５００μｌの無菌ＰＢＳバッファ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｖｏｌ  ３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）に穏やかに再懸濁させ、４０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ＰＢＳ浮遊物を廃棄した。ペレットを嫌気性チャンバーに導入し、２００μｌの対数期後半のＣ・オートエタノゲナム培養物（レシピエント）に穏やかに再懸濁させた。接合混合物（ドナー及びレシピエント細胞の混合物）を、ＰＥＴＣ−ＭＥＳ＋フルクトースアガープレート上に播種し、乾燥させた。スポットが目に見えて湿潤でなくなったら、プレートを圧力ジャーに導入し、合成ガスで２５〜３０ｐｓｉまで加圧し、３７℃で約２４時間インキュベートした。２４時間のインキュベーション後、接合混合物を、１０μｌ白金耳を使用して穏やかにこすり落とすことにより、プレートから取り出した。取り出した混合物を、２００〜３００μｌのＰＥＴＣ培地に懸濁させた。接合混合物の１００μｌアリコートを、１５μｇ／ｍｌのチアンフェニコールが補充されたＰＥＴＣ培地アガープレート上に播種し、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの発現を通してチアンフェニコールに対する耐性を与えるプラスミドを有する形質転換体を選択した。
【０２０９】
ｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｐｔｂ−ｂｕｋ−ａｄｃプラスミドを有するＣ・オートエタノゲナムの３つの異なるコロニーを、１５μｇ／ｍｌのチアンフェニコールを含む２ｍＬのＰＥＴＣ−ＭＥＳ培地に接種し、３７℃で、１００ｒｐｍで環状に振盪しながら、３日間独立栄養的に増殖させた。培養物を、血清ボトル中の１５μｇ／ｍｌのチアンフェニコールを含む１０ｍＬのＰＥＴＣ−ＭＥＳ培地においてＯＤ６００ｎｍ＝０．０５まで希釈し、３７℃で、１００ｒｐｍで環状に振盪しながら、５日間独立栄養的に増殖させ、バイオマス及び代謝産物を測定するために毎日サンプリングした。並行して、発現プラスミドが、アセトアセチル−ＣｏＡからのアセトアセテートの形成を触媒するｃｔｆＡＢまたはｐｔｂ−ｂｕｋ遺伝子を含まず、ウッド−ユングダールクラスタープロモーターの制御下でｔｈｌ及びａｄｃのみをコード化した対照株（ｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ａｄｃ）を調査した。代謝産物及びバイオマス蓄積をモニタリングするために、培養物を５日間サンプリングした。
【０２１０】
イソプロパノール濃度ならびにエタノール、酢酸、２，３−ブタンジオール、及び乳酸の濃度を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＬＣ上で、３５℃での屈折率（ＲＩ）検出で測定した。４００μＬを１００μＬの５−スルホサリチル酸溶液（１Ｍ硫酸中１％重量／体積）で希釈後、１４，０００ｒｐｍで３分の遠心分離により、試料を調製し、浮遊物を分析のためにガラスバイアルに移した。０．７ｍＬ／分及び６５℃で、均一濃度条件下、５ｍＭの硫酸移動相を使用する、Ａｌｌｔｅｃｈ  ＩＯＡ−２０００カラム（１５０ｍｍ×６．５ｍｍ×８μｍ）への１０μＬ注入によって、分離を実施した。
【０２１１】
いくつかの例では、ピーク分離を向上させるために、より長いＨＰＬＣ法を使用した。この方法では、イソプロパノール、エタノール、アセテート、２，３−ブタンジオール、及びまた（短い方法を使用して分離されない）３−ヒドロキシブチレート濃度を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣ上で、３５℃での屈折率（ＲＩ）検出で測定した。４００μＬを１００μＬの５−スルホサリチル酸溶液（１Ｍ硫酸中１％重量／体積）で希釈後、１４，０００ｒｐｍで３分の遠心分離により、試料を調製し、浮遊物を分析のためにガラスバイアルに移した。０．６ｍＬ／分及び３５℃で、均一濃度条件下、５ｍＭの硫酸移動相を使用する、Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ×９μｍ）への１０μＬ注入によって、分離を実施した。
【０２１２】
ｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｐｔｂ−ｂｕｋ−ａｄｃを有するＣ・オートエタノゲナムは、最大０．８０４ｇＩＰＡ／バイオマスｇを産生したが、Ｐｔｂ−Ｂｕｋを含有しないｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ａｄｃを有する対照株Ｃ・オートエタノゲナムは、ＩＰＡを産生しなかった（図１２）。
【０２１３】
この実験は、Ｐｔｂ−Ｂｕｋが、ガス状基質を使用する場合、イソプロパノール経路においてアセトアセチル−ＣｏＡのアセトアセテートへの変換を行うことができることを明確に実証する。Ｐｔｂ−Ｂｕｋは、図１のステップ１、２、３、及び４を含むルートを使用して例示されている、Ｃ・オートエタノゲナムのようなガス発酵アセトゲンにおいて、ＣｏＡトランスフェラーゼまたはチオエステラーゼの代わりに使用することができる。
【０２１４】
Ｃ・オートエタノゲナムは、アセトンをイソプロパノールに変換する天然第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼを含有する（Ｋｏｐｋｅ、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、８０：３３９４−３４０３、２０１４）。この遺伝子のノックアウトは、Ｃ・オートエタノゲナムにおけるアセトンのイソプロパノールへの変換を削除することが実証されている（ＷＯ２０１５／０８５０１５）。このノックアウトの背景では、図１のステップ１、２、及び３を含む同じ遺伝子を使用して、ガス状供給原料からＰｔｂ−Ｂｕｋ系を通して（イソプロパノールではなく）アセトンを産生することが可能となる。この株へのヒドロキシイソバレレートシンターゼ及びデカルボキシラーゼ遺伝子の付加（ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、９３：１３７７−１３８７、２０１２）は、Ｃ・オートエタノゲナムまたは図１のステップ１、２、３、５、及び６を含む同様の細菌におけるガスからのイソブチレン産生を可能にするだろう。
【０２１５】
アセトアセテートは、３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼＢｄｈを通して３−ヒドロキシブチレートに変換することもできる。３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼを、Ｃ・オートエタノゲナム（ＡＧＹ７５９６２）及びＣ・ユングダリイ（ＡＤＫ１６９２０．１）のような他のアセトゲンのゲノム中で同定した。この活性は、図１のステップ１、２、及び１５を含む経路をもたらす遺伝子ｔｈｌＡ、ｐｔｂ−ｂｕｋ（またはｃｔｆＡＢ）、及びｂｄｈを発現させる株における３−ヒドロキシブチレート産生のためのアセトアセチル−ＣｏＡのアセトアセテートへのＰｔｂ−Ｂｕｋ（またはＣｏＡトランスフェラーゼ）変換と組み合わせることができる。このルートを通した低レベルの３−ヒドロキシブチレート形成（最大２ｇ／Ｌ）は、Ｃ・オートエタノゲナムにおいて実証されている。これらのレベルは、天然には低レベルでのみ発現するＢｄｈ遺伝子を過剰発現させることにより、向上させることができる。
【０２１６】
１つの実験では、Ｃ・オートエタノゲナムを、実施例２において記載されているようなプラスミドｐＭＴＬ８２２５６−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢで形質転換した。産生は、１０日間、６つのバイオロジカルレプリケートから、実施例２において記載されているような独立栄養的な条件下でモニタリングした。１０日後の３−ＨＢの平均は１．８６±０．１４ｇ／Ｌであった。１０日目、１，３−ブタンジオールは（３−ＨＢから）０．３８±０．０５ｇ／Ｌの平均力価で産生された（図３７）。アセトンまたはイソプロパノールは形成されなかった。これは、３−ＨＢが天然酵素によってアセトアセテートを通して効率的に産生され得ることを実証する。
【０２１７】
特定の実施形態では、３−ＨＢへの炭素流出を防止し、したがってアセトン、イソプロパノール、及びイソブチレンのような産物の産生を増加させるために、Ｂｄｈのような、３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼの発現をノックアウトまたはノックダウンすることが望ましい場合がある。
【０２１８】
実施例３
この実施例は、（Ｒ）−ヒドロキシブチレート、アセトン、イソプロパノール、またはイソブチレンの産生のためのインビボでＥ・コリにおいて（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートに変換するＰｔｂ−Ｂｕｋの能力ついて実証する。
【０２１９】
（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからの（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート産生のためのＰｔｂ−Ｂｕｋ系に基づく経路を、設計及び構築した。また、３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ（Ｂｄｈ）を、（Ｒ）−３−ＨＢのアセトアセテートへの変換に利用した。ラルストニア・ピケッティイは、インビトロで３−ヒドロキシブチレートをアセトアセテートに変換することができる２つの３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼＢｄｈ１及びＢｄｈ２を有することが報告されている（Ｔａｋａｎａｓｈｉ、Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇ、１０１：５０１−５０７、２００６）。１つの経路を、Ｐｔｂ−Ｂｕｋによる（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの産生及びＡＴＰの発生において産生された還元当量を再生利用しながら、アセトン産生（図１のステップ１、１３、１４、１５、３）のためにこの酵素を活用するように設計した（図６）。
【０２２０】
経路は、ｐＤＵＥＴベクターシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して、モジュール形式で構築した。上の実施例において記載されている２つのモジュール（Ｐｔｂ−Ｂｕｋの発現のためのｐＡＣＹＣ−ｐｔｂ−ｂｕｋならびにチオラーゼ及びアセトアセテートデカルボキシラーゼの発現のためのｐＣＯＬＡ−ｔｈｌＡ−ａｄｃ）を、ベクターｐＣＤＦにおいて、カプリアビダス・ネカトールの（Ｒ）特異的３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼｐｈａＢ（ＷＰ＿０１０８１０１３１．１）単独（ｐＣＤＦ−ｐｈａＢ）及びラスルトニア・ピケツティイの３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼｂｄｈ１遺伝子（ＢＡＥ７２６８４．１）を有するもの（ｐＣＤＦ−ｐｈａＢ−ｂｄｈ１）のいずれかを含有する２つの追加のモジュールと共に使用した。ｐｈａＢ及びｂｄｈ１遺伝子の両方をＧｅｎｅＡｒｔから合成し、環状ポリメラーゼ伸長クローニング（ＣＰＥＣ）法（Ｑｕａｎ、ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ、４：ｅ６４４１、２００９）での制御独立クローニングを通して中に存在するＴ７プロモーターの制御下でクローニングした。
【０２２１】
ｂｄｈ１遺伝子の増幅に使用されるオリゴヌクレオチド：
【０２２２】
【表９】
2018530342.tif 000031
【０２２３】
ｐｈａＢ遺伝子の増幅に使用されるオリゴヌクレオチド：
【０２２４】
【表１０】
2018530342.tif 000032
【０２２５】
プラスミドｐＡＣＹＣ−ｐｔｂ−ｂｕｋ（配列番号１０５）、ｐＣＯＬＡ−ｔｈｌＡ−ａｄｃ（配列番号１０６）、ｐＣＤＦ−ｐｈａＢ（配列番号１１９）、及びｐＣＤＦ−ｐｈａＢ−ｂｄｈ１（配列番号１２０）を構築し、それらを個別に及び組み合わせてＥ・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換し、増殖実験を、１２ウェルプレート中の１．５ｍＬの培養物において、２８℃で、１６０ｒｐｍで環状に振盪しながら、グルコースを含むＭ９最小培地を使用して、４通り実施した。培養物を、０．１のＯＤ６００ｎｍで接種し、増殖の２時間後、異なる濃度のＩＰＴＧ（０、５０、１００μＭ）で誘発した。ＢｉｏＲａｄプレートテープストリップを使用してプレートを封止し、先端が緑の針で各ウェルに穴をあけ、微好気性条件をもたらした。誘発のさらに６４時間増殖を実施した。実験を３回繰り返した。代謝産物を前の実施例において記載されているように測定した。
【０２２６】
プラスミドｐＡＣＹＣ−ｐｔｂ−ｂｕｋ、ｐＣＯＬＡ−ｔｈｌＡ−ａｄｃ、及びｐＣＤＦ−ｐｈａＢの組み合わせを含有する培養物は、非常に少量のみの副産物と共に、（インデューサーのレベルに応じて）１．６５〜２．４ｇ／Ｌの（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートを産生し（図１３Ａ〜Ｆ）、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリレートに変換し、増殖を支えるＰｔｂ−Ｂｕｋ系の効率について実証した（図１３Ａ〜Ｆ）。（プラスミドｐＡＣＹＣ−ｐｔｂ−ｂｕｋ、ｐＣＯＬＡ−ｔｈｌＡ−ａｄｃ、及びｐＣＤＦ−ｐｈａＢ−ｂｄｈ１の組み合わせを含有する）ｂｄｈ１も発現させた培養物では、少量のみの（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリレートが培地中に見られ、（インデューサーのレベルに応じて）０．８９〜１．１６ｇ／Ｌのアセトンが見られ、ｂｄｈ１遺伝子が、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートをアセトアセテートに及びさらにアセトンに変換することにおいて効率的であることを示した。Ｐｔｂ−Ｂｕｋを含まないすべてのプラスミドの組み合わせでは、３−ヒドロキシブチレートまたはアセトンは見られなかった（図１３Ａ〜Ｆ）。これらの培養物では、アセテートレベルは顕著に高かった。
【０２２７】
この実験は、Ｐｔｂ−Ｂｕｋが（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート−ＣｏＡの３−ヒドロキシブチレートへの変換を行うことができること、及びまた（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの産生において産生された還元当量を再生利用することにより、Ｂｄｈ１がインビボで３−ヒドロキシブチレートをさらにアセトアセテートに変換することができることを明確に実証する。実験は、Ｐｔｂ−Ｂｕｋが増殖を支えることができ、したがってアセテート産生が不要となることも強調する。（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート形成の産生を、図１のステップ１、１３、及び１４を含む株において例示した。アセトンの産生を、図１のステップ１、１３、１４、１５、及び３を含むルートを通して例示した。
【０２２８】
イソプロパノールを第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼの添加によりアセトンから産生することができること（図１におけるステップ４）（Ｋｏｐｋｅ、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、８０：３３９４−３４０３、２０１４）、ならびにイソブチレンをヒドロキシイソバレレートシンターゼ（図１におけるステップ５）及びデカルボキシラーゼ（図１におけるステップ６）の添加を通してアセトンから産生することができること（ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、９３：１３７７−１３８７、２０１２）は周知である。Ｐｔｂ−Ｂｕｋを通した上で実証されたアセトンルートを含む経路は、遺伝子ｔｈｌＡ、ｐｔｂ−ｂｕｋ、及びａｄｃ、ならびにＥ・コリにおけるＰｔｂ−Ｂｕｋ系を通したイソプロパノール産生（図１のステップ１、１３、１４、１５、３、及び４）を可能にするだろう第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＣ＿０２２５９２、ｐｏｓ．６０９７１１．．６１０７６６、ＣＡＥＴＨＧ＿０５５３、ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：１７３３３９８４）で構築することができる。同様に、Ｐｔｂ−Ｂｕｋを通した上で実証されたアセトンルートを含む経路は、遺伝子ｔｈｌＡ、ｐｔｂ−ｂｕｋ、及びａｄｃ、ならびにＥ・コリにおけるＰｔｂ−Ｂｕｋ系を通したイソブチレン産生（図１のステップ１、１３、１４、１５、３、５、及び６）を可能にするだろうヒドロキシイソバレレートシンターゼ及びデカルボキシラーゼについての遺伝子で構築することができる。
【０２２９】
実施例４
この実施例は、Ｃ・オートエタノゲナムにおける（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート及び１，３−ブタンジオールの産生について実証する。これは、２，３−ブタンジオールの非存在下での１，３−ブタンジオールの産生についても実証する。
【０２３０】
２，３−ブタンジオール産生のための天然経路が不活性化され、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ形成のための遺伝子で置換された、Ｃ・オートエタノゲナムの株を構築した。これは、Ｃ・オートエタノゲナムのゲノム上のアセトラクテートデカルボキシラーゼ遺伝子（ｂｕｄＡ）をチオエステラーゼ（Ｃ・アセトブチリカムのｔｈｌＡ、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＣ＿００１９８８、位置８２０４０．．８３２１８、ＣＡ＿Ｐ００７８、ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ  １１１６０８３）及び（Ｒ）特異的３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ（カプリアビダス・ネカトールのｐｈａＢ、ＧｅｎＢａｎｋ  ＷＰ＿０１０８１０１３１．１）についての遺伝子で置換し、Ｃ・オートエタノゲナムｂｕｄＡ：：ｔｈｌＡｐｈａＢ株をもたらすことにより達成した。
【０２３１】
ｂｕｄＡ遺伝子をｔｈｌＡ及びｐｈａＢで置換するために、プラスミド、ｐＭＴＬ８２２５−ｂｕｄＡ：：ｔｈｌＡ−ｐｈａＢ（図１４）と、ｔｅｔ３ｎ０テトラサイクリン誘導性プロモーター下のＥ・コリ毒素遺伝子ｍａｚＦ（対抗選択のため）、ｂｕｄＡ遺伝子の約１ｋｂ上流相同性アーム、ｔｈｌＡ、ｐｈａＢ、ｌｏｘＰ部位に隣接するｅｒｍＢカセット、及びｂｕｄＡ遺伝子の約１ｋｂ下流相同性アームとを、プラスミドｐＭＴＬ−ｔｅｔ３ｎｏ上でアセンブリした。
【０２３２】
ｂｕｄＡの約１ｋｂ上流及び下流相同性アームを、プライマーＳＮ０１／ＳＮ０２及びＳＮ０７／ＳＮ０８でＣ・オートエタノゲナムからＰＣＲ増幅させた。ｔｈｌＡ及びｐｈａＢ遺伝子を、プライマーＳＮ０３／ＳＮ０４ｍｏｄを使用して、カプリアビダス・ネカトールのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。ｌｏｘＰ部位に隣接するｅｒｍＢカセットを、プライマーＳＮ０５ｍｏｄ／ＳＮ０６を使用してＰＣＲ増幅させた。Ｆｓｅｌ及びＰｍｅｌに隣接するｔｅｔ３ｎｏプロモーターを、制限酵素Ｆｓｅｌ及びＰｍｅｌで合成及び処理し、洗浄した。ＰＣＲ産物及び消化ベクターを、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＧｅｎｅＡｒｔ  Ｓｅａｍｌｅｓｓクローニングキットを使用してアセンブリし、挿入フラグメント中に変異を含まないプラスミドｐＭＴＬ８２２５−ｂｕｄＡ：：ｔｈｌＡ−ｐｈａＢ（配列番号１２１）を使用し、前の実施例において記載されているように接合によりＣ・オートエタノゲナムを形質転換した。
【０２３３】
トリメトプリム及びクラリスロマイシンでの接合及び選択後、９つのコロニーを、ＰＥＴＣ−ＭＥＳアガープレート上、クラリスロマイシン及びアンヒドロテトラサイクリンで２回ストリークし、ｍａｚＦ遺伝子の発現を誘導した。クラリスロマイシン及びアンヒドロテトラサイクリンからのコロニーは、ｂｕｄＡ遺伝子がｔｈｌＡ及びｐｈａＢ遺伝子ならびにｅｒｍＢカセットで置換されているべきある。これは、相同性アーム及びＫＡＰＡポリメラーゼに隣接するプライマーＯｇ３１ｆ／Ｏｇ３２ｒを使用して、ＰＣＲにより検証した（図１５）。
【０２３４】
約３．３ｋｂのバンドは野生型株から増幅されるが、約５．７ｋｂのバンドはコロニー１、４、７、及び９から増幅され、ｂｕｄＡ遺伝子のｔｈｌＡ、ｐｈａＢ、及びｅｒｍＢカセットでの置換を示した。上の事象は、すべての４つのクローンのＰＣＲ産物を配列決定することにより、さらに確認された。得られた修飾によって、ｔｈｌＡ及びｐｈａＢ遺伝子の発現は、ｂｕｄＡ遺伝子のプロモーター上流により駆動される。
【０２３５】
【表１１】
2018530342.tif 000033
【０２３６】
Ｃ・オートエタノゲナムｂｕｄＡ：：ｔｈｌＡ−ｐｈａＢ株での発酵を実施した。培養物を、３７℃で、連続的にバイオリアクターに供給される合成ガス（５０％ＣＯ、１８％ＣＯ２、２％Ｈ２、及び３０％Ｎ２）下で増殖させた。ガス流は、初期は５０ｍｌ／分に設定し、撹拌を２００ｒｐｍから５００ｒｐｍまで増加させながら、実験経過にわたって４００ｍｌ／分まで増加させた。発酵を５日間近く実施した。代謝産物を上の実施例において記載されているように測定した。
【０２３７】
１，３−ブタンジオール及び、２−ヒドロキシイソ酪酸のような、他の代謝産物の濃度を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＣＰ−ＳＩＬ  ５ＣＢ−ＭＳ（５０ｍ×０．２５μｍ×０．２５μｍ）カラム、オートサンプラー、及び水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０Ｎ  ＧＣを使用する、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析を使用して測定した。４００μＬの試料を４００μＬのアセトニトリルで希釈後、１４，０００ｒｐｍで３分の遠心分離により試料を調製し、浮遊物をガラスバイアルに移し、試料をＴｈｅｒｍｏ  ＳｐｅｅｄＶａｃにおいて乾燥させた。乾燥後、試料を次に４００μＬのＮ，Ｏ−ビストリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）及びピリジン（３：１比）の溶液に懸濁させ、封止されたガラスバイアルにおいて６０分間６０℃で加熱した。試料を、１μＬ注入、３０対１の分割比、及び２５０℃の入口温度を使用して、分析のためにオートサンプラーに移した。クロマトグラフィーは、７０℃（保持なし）、１１０℃まで３℃／分の勾配、２３０℃まで１５℃／分の勾配後、３１０℃まで４０℃／分の最終勾配、及び３分保持のオーブンプログラムで行った。カラム流量は１．８ｍｌ／分とし、ヘリウムをキャリアガスとした。ＦＩＤを３２０℃で保持し、メイクアップガスとして水素を４０ｍｌ／分、空気を４００ｍｌ／分、及びヘリウムを２０ｍｌ／分とした。
【０２３８】
驚くべきことに、最大１．５５ｇ／Ｌの３−ヒドロキシブチレートが、ｔｈｌＡ及びｐｈａＢを発現させるＣ・オートエタノゲナムｂｕｄＡ：：ｔｈｌＡ−ｐｈａＢ株においてガスから産生された（図１６）。天然チオエステラーゼは、形成された３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチレートに変換し得る。ゲノム配列中、３つの推定チオエステラーゼが同定された。
【０２３９】
さらにより驚くべきことに、３−ヒドロキシブチレート形成と共に、最大１５０ｍｇ／Ｌの１，３−ブタンジオール形成もあったことも見出された（図１６）。これは天然アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＡＯＲ）及びアルコールデヒドロゲナーゼ活性によるものであり得る。２つのＡＯＲ遺伝子及びいくつかのアルコールデヒドロゲナーゼが、Ｃ・オートエタノゲナムのゲノム中に存在する（Ｍｏｃｋ、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１９７：２９６５−２９８０、２０１５）。３−ヒドロキシブチレートのこの還元は、還元フェレドキシンにより駆動され、よって、還元フェレドキシンをもたらすＣＯ酸化と直接共役させることができる（ＣＯ＋Ｆｄｏｘ→ＣＯ２＋Ｆｄｒｅｄ）（図７）。
【０２４０】
１，３−ＢＤＯ産生は、クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカムからのブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼＢｌｄ（ＡＡＰ４２５６３．１）（配列番号８０）を使用する代替ルートを通してガスからも実証された。ｂｌｄ遺伝子を合成し、同じチオラーゼ（Ｃ・アセトブチリカムのｔｈｌＡ）及び（Ｒ）特異的３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ（カプリアビダス・ネカトールのｐｈａＢ）と共にプラスミドｐＭＴＬ８３１５−Ｐｆｄｘ−ｔｈｌＡ−ｐｈａＢ−ｂｌｄ（配列番号１３２）にクローニングした。Ｂｌｄ及びｐｈａＢ遺伝子を、下の表中のプライマーを通して上のプラスミドから増幅し、既存のプラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ（ＷＯ２０１２／１１５５２７）にクローニングした。
【０２４１】
【表１２】
2018530342.tif 000034
【０２４２】
得られた構築物を、上述のとおりＣ・オートエタノゲナムに形質転換し、増殖実験を、５０ｍＬのＰＥＴＣ培地を含み、（グレンブルック、ニュージーランドにあるＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｓｔｅｅｌ敷地から回収された）ＣＯ含有製鋼工場ガスまたは４４％ＣＯ、３２％Ｎ２、２２％ＣＯ２、２％Ｈ２の同じ組成を有する合成ガスブレンドで３０ｐｓｉに加圧された血清ボトルにおいて行った。
【０２４３】
１，３−ＢＤＯ産生は、このルートを通してガスから実証された（図１７Ａ）が、産生は、ＡＯＲルートを通るより少なく（最大６７ｍｇ／Ｌの１，３−ＢＤＯ）、ＡＯＲルートとは対照的に、増殖は、Ｃ・オートエタノゲナム野生型と比較してｂｌｄ遺伝子を発現させる場合に影響を受けた（図１７Ｂ）。
【０２４４】
別の実験では、実施例２において記載されているようなプラスミドｐＭＴＬ８３１５９−ｐｈａＢ−ｔｈｌＡで形質転換されたＣ・オートエタノゲナムは、実施例２において記載されているような独立栄養的な条件下でのボトル実験において、それぞれ、０．３３及び０．４６ｇ／Ｌの３−ＨＢ及び１，３−ＢＤＯを産生した（図４０）。
【０２４５】
実施例５
この実施例は、Ｃ・オートエタノゲナムにおける（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレート及び１，３−ブタンジオールの産生について実証する。
【０２４６】
フェレドキシンプロモーター（Ｃ・オートエタノゲナムから単離されたＰｆｄｘ、配列番号１３８）またはピルベート−フェレドキシンオキシドレダクターゼプロモーター（Ｃ・オートエタノゲナムから単離されたＰｐｆｏｒ、配列番号１３９）のいずれかの下でチオラーゼ（Ｃ・アセトブチリカムからのｔｈｌＡ、配列番号１３６）及び（Ｓ）特異的３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ（Ｃ・クルイベリからのｈｂｄ１、配列番号１３７）を発現させるプラスミドを構築した。プラスミドを次のとおり構築した。Ｐ−ｈｂｄ１−ｒｂｓ２−ｔｈｌＡを組み立て、制御酵素消化後のライゲーション、重複伸長ポリメラーゼ連鎖反応、シームレスクローニング（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及びＧｅｎｅＡｒｔ  Ｔｙｐｅ  ＩＩｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む、分子クローニングにおける通常の方法により、ｐＭＴＬ８３１５１ベクター（Ｈｅａｐ、Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｍｅｔｈ、７８：７９−８５、２００９）にクローニングした。オペロンＰ−ｈｂｄ１−ｒｂｓ２−ｔｈｌＡを、プラスミドの多重クローニング領域において見られる制御部位ＮｏｔＩとＸｈｏＩとの間にクローニングした。Ｐは、インタクトなリボソーム結合部位（ｒｂｓ）を含有する構成的プロモーターである。ｒｂｓ２（配列番号１４０）は、ｔｈｌＡを発現させるためのリボソーム結合部位である。ステップワイズ法は、下に挙げられているプライマーでの既存のテンプレートからのＰ、ｈｂｄ１、及びｔｈｌＡの増幅であった。
【０２４７】
【表１３】
2018530342.tif 000035
【０２４８】
ポリメラーゼ連鎖反応を、Ｋａｐａ  Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して次のとおり行った。アニール温度を５６℃、伸長を１分間に設定する。ＰＣＲ反応を３０サイクル繰り返す。その後、ＰＣＲ産物を、ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して脱塩した。
【０２４９】
ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ  ＮｏｔＩ及びＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ  ＸｈｏＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、提供されているプロトコルに従ってＮｏｔＩ／ＸｈｏＩ二重消化、続いてＦａｓｔＡＰ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び提供されているプロトコルを使用して、アルカリホスファターゼでの処理を実施することにより、ｐＭＴＬ８３１５１プラスミド骨格を調製した。消化された骨格を次に、ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で脱塩した。
【０２５０】
ＰＣＲ産物及びプラスミド骨格のアセンブリを、ＧｅｎｅＡｒｔ  Ｔｙｐｅ  ＩＩｓ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施した。得られたプラスミドを次に、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、Ｅ・コリプラスミド発現宿主から単離した。
【０２５１】
オペロンからなるアセンブリされたプラスミドｐＭＴＬ８３１５−Ｐｆｄｘ−ｈｂｄ１−ｔｈｌＡ及びｐＭＴＬ８３１５−Ｐｐｆｏｒ−ｈｂｄ１−ｔｈｌＡを導入するには、プラスミドをまず、化学的形質転換によりＥ・コリＣＡ４３４株に導入した。その後、形質転換ＣＡ４３４株を、固体ＬＢアガー培地上で、Ｃ・オートエタノゲナム産生宿主と混合すること、ならびに嫌気性環境中、実施例２において記載されているような一酸化炭素及び水素からなる混合物での圧力下でのインキュベーションにより、接合を行った。Ｃ・オートエタノゲナムを、接合後、嫌気性条件下、適切な抗生物質及びトリメスロプリムを含有する固体培地上での継続的な増殖により選択し、残ったＥ・コリＣＡ４３４株を除去した。
【０２５２】
オペロンＰ−ｈｂｄ１−ｒｂｓ２−ｔｈｌＡからなる導入されたｐＭＴＬ８３１５−Ｐｆｄｘ−ｈｂｄ１−ｔｈｌＡまたはｐＭＴＬ８３１５−Ｐｐｆｏｒ−ｈｂｄ１−ｔｈｌＡプラスミドを有するＣ・オートエタノゲナム株を、ゴムセプタム及びキャップで密封され、（グレンブルック、ニュージーランドにあるＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｓｔｅｅｌ敷地から回収された）ＣＯ含有製鋼工場ガスまたは４４％ＣＯ、３２％Ｎ２、２２％ＣＯ２、２％Ｈ２の同じ組成を有する合成ガスブレンドで３０ｐｓｉに加圧された２５０ｍＬショットボトル中の１０ｍＬのＰＥＴＣ培地において増殖させた。代謝産物を前の実施例において記載されているように測定した。
【０２５３】
驚くべきことに、ｔｈｌＡ及びｈｂｄ１を発現させるＣ・オートエタノゲナム培養物においてガスから産生された３−ヒドロキシブチレートがあった（図１８Ａ）。天然チオエステラーゼは、形成された３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチレートに変換し得る。ゲノム配列中、３つの推定チオエステラーゼが同定された。ｐＭＴＬ８３１５−Ｐｆｄｘ−ｈｂｄ１−ｔｈｌＡを有する株において、最大２．５５ｇ／Ｌの３−ヒドロキシブチレートが見られた（図１８Ａ）。
【０２５４】
さらにより驚くべきことに、３−ヒドロキシブチレートが時間と共に１，３−ブタンジオールに変換され、増殖の終わりに、プラスミドｐＭＴＬ８３１５−Ｐｆｄｘ−ｈｂｄ１−ｔｈｌＡを有する株において最大１．１ｇ／Ｌの１，３−ブタンジオールが産生されたことも見出された（図１８Ａ）。これは天然アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＡＯＲ）及びアルコールデヒドロゲナーゼ活性によるものであり得る。２つのＡＯＲ遺伝子及びいくつかのアルコールデヒドロゲナーゼが、Ｃ・オートエタノゲナムのゲノム中に存在する（Ｍｏｃｋ、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１９７：２９６５−２９８０、２０１５）。３−ヒドロキシブチレートのこの還元（及びアセテートのエタノールへの還元、図１８Ｂ）は、還元フェレドキシンにより駆動され、よって、還元フェレドキシンをもたらすＣＯ酸化と直接共役させることができる（ＣＯ＋Ｆｄｏｘ→ＣＯ２＋Ｆｄｒｅｄ）（図７）。
【０２５５】
プラスミドｐＭＴＬ８３１５−Ｐｆｄｘ−ｈｂｄ１−ｔｈｌＡを有するＣ・オートエタノゲナムの同じ株も、連続発酵において試験した。発酵は前の実施例において記載されているように実施したが、培養は、新鮮な培地との希釈率を２日目に約０．０５及び次に３日目に１．０まで増加させながら、連続的に行った。最大７ｇ／Ｌの高い３−ヒドロキシブチレート産生が、０．５ｇ／Ｌの１，３−ＢＤＯ産生と共に観察された。
【０２５６】
（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレート及び１，３−ブタンジオールの産生を向上させ、別の形態のブタンジオール（２，３−ブタンジオール）の合成を回避するために、プラスミドｐＭＴＬ−ＨＢＤ−ＴｈｌＡを、アセトラクテートデカルボキシラーゼ遺伝子ＢｕｄＡが欠失した不活性化２，３−ブタンジオール経路を有する株に導入した（Ｕ．Ｓ．９，２９７，０２６）。このｂｕｄＡノックアウトは、２，３−ＢＤＯへの主要経路を削除し、３−ＨＢ及び１，３−ＢＤＯ産生についての特異性を増加させた。ｐＭＴＬ−ＨＢＤ−ＴｈｌＡをｂｕｄＡ欠失株において発現させた場合、３−ＨＢ及び１，３−ＢＤＯの両方について合計１５％のＣ−ｍｏｌが達成された（図４１）。
【０２５７】
【表１４】
2018530342.tif 000036
2018530342.tif 000037
【０２５８】
比較として、同じプラスミド、ｂｕｄＡノックアウトを含まないｐＭＴＬ８３１５９−ｈｂｄ−ｔｈｌＡを発現させる株では、定常状態での３−ＨＢ及び１，３−ＢＤＯの産生についての合計特異性はわずか６．９％であった。
【０２５９】
【表１５】
2018530342.tif 000038
【０２６０】
実施例６
この実施例は、Ｐｔｂ−Ｂｕｋ系がＣ・オートエタノゲナムにおいて、アセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、及び２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを含む多様なアシル−ＣｏＡに対して効率的であることを実証する。
【０２６１】
Ｐｔｂ−Ｂｕｋ系を、Ｃ・オートエタノゲナムにおいてプラスミドから発現させ、その活性をＣｏＡ加水分解アッセイを使用して測定した。このために、Ｃ・ベイジェリンキイＮＣＩＭＢ８０５２からのｐｔｂ−ｂｕｋ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＣ＿００９６１７、位置２３２０２７．．２３４１４７、Ｃｂｅｉ＿０２０３−２０４、ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ  ５２９１４３７−３８）を、Ｃ・ベイジェリンキイＮＣＩＭＢ８０５２のゲノムＤＮＡから増幅させ、ピルベート−フェレドキシンオキシドレダクターゼプロモーター（Ｃ・オートエタノゲナムから単離されたＰｐｆｏｒ、配列番号１３９）の制御下、実施例５において記載されているように、制限酵素消化後のライゲーション、重複伸長ポリメラーゼ連鎖反応、シームレスクローニング（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及びＧｅｎｅＡｒｔ  Ｔｙｐｅ  ＩＩｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む、分子クローニングにおける通常の方法により、ｐＭＴＬ８２２５１ベクター（Ｈｅａｐ、Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈ、７８：７９−８５、２００９）にクローニングした。オリゴヌクレオチドを下に記載する。
【０２６２】
【表１６】
2018530342.tif 000039
【０２６３】
得られたプラスミドｐＭＴＬ８２２５６−ｐｔｂ−ｂｕｋ（配列番号１５３）を、前の実施例において記載されているように、Ｃ・オートエタノゲナムに導入した。
【０２６４】
アシル−ＣｏＡ加水分解アッセイを次のとおり行った。Ｃ・オートエタノゲナム細胞を、ＯＤ２（対数期後半）で、遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、１分間、４℃）により採取した。細胞を５００μｌの溶解バッファ（リン酸カリウムバッファ、ｐＨ８）に再懸濁させた。細胞を、凍結解凍サイクル（任意）、振幅２０、氷上での音波処理６×３０秒を使用して、溶解した。試料を、１０分間、１４，０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離し、可溶性タンパク質を含む浮遊物を除去した。タンパク質濃度を、例えば、ブラッドフォードアッセイで測定した。
【０２６５】
アッセイ混合物は、４８４μｌのリン酸カリウムバッファｐＨ８．０、１μｌのＤＴＮＢ（０．１ｍＭの最終濃度）、１０μｌの細胞溶解物、及び５μｌのＣｏＡ（５００μＭの最終濃度）を含有した。タンパク質を除くすべての成分を、石英キュベット（１ｃｍの読取長を有する１ｍｌキュベット）において混合した。細胞溶解物を添加し、分光光度計において４０５ｎｍ、３０℃で３分間、反応を観測することにより、アッセイを開始した。溶解物を含まない対照については、アシル−ＣｏＡの自己分解を測定した。
【０２６６】
活性を決定するために、曲線の線形部分（通常は最初の３０秒）の勾配を計算した。タンパク質量を正規化し、勾配をタンパク質量で割った。減衰係数（１４，１５０Ｍ−１ｃｍ−１）を使用し、特異的活性Ｍ／ｓ／ｍｇを計算した。陰性対照の活性を引いた。
【０２６７】
アッセイを、アセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ（３−ＨＢ−ＣｏＡ）及び２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ（２−ＨＩＢ−ＣｏＡ）のラセミ混合物で行った。潜在的な基質制限による３−ＨＢ−ＣｏＡ及び２−ＨＩＢ−ＣｏＡの人工的に低い加水分解速度の可能性を、アシル−ＣｏＡの異なる濃度、５００μＭ及び２００μＭを使用してＣ・オートエタノゲナム溶解物についての加水分解アッセイを繰り返すことにより示した。
【０２６８】
アッセイの結果は、アセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、及び２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを含む多様なアシル−ＣｏＡ上でＰｔｂ−Ｂｕｋ系を発現させるプラスミドｐＭＴＬ８２２５６−ｐｔｂ−ｂｕｋを有するＣ・オートエタノゲナムの溶解物における顕著に増加したＣｏＡ加水分解を示す（図２０Ａ〜Ｂ）。とりわけ、Ｃ・オートエタノゲナム野生型により加水分解されない２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡのようなアシル−ＣｏＡについてのＣｏＡ加水分解もある。アセトアセチル−ＣｏＡ及び３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡでは、いくらかの天然ＣｏＡ加水分解活性が観察された。
【０２６９】
実施例７
この実施例は、同定された天然チオエステラーゼ遺伝子の破壊が、アセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、または２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡのような利用可能なアシル−ＣｏＡのプールを増加させることにより、Ｐｔｂ−Ｂｕｋ及びＣｏＡトランスフェラーゼ系の効率を向上させることを実証する。
【０２７０】
アシル−ＣｏＡのそれらの各々の酸への変換中にエネルギーがＡＴＰの形態で保存されるＰｔｂ−Ｂｕｋ系とは対照的に、ＣｏＡが単純に加水分解される場合エネルギーは保存されない。
【０２７１】
ヒドロラーゼアッセイでは、Ｃ・オートエタノゲナムにおいてアセトアセチル−ＣｏＡ及び３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡについて天然加水分解活性があることが見出された。
【０２７２】
アセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ（３−ＨＩＢ−ＣｏＡ）及び２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ（２−ＨＩＢ−ＣｏＡ）のラセミ混合物でのアシル−ＣｏＡ加水分解アッセイを、前の実施例において記載されているように行った。アッセイの結果は、２−ＨＩＢ−ＣｏＡではなく、アセトアセチル−ＣｏＡ及び３−ＨＢ−ＣｏＡの開裂を示し、Ｃ・オートエタノゲナムにおいて天然活性が存在することを確認する（図１１）。
【０２７３】
Ｃ・オートエタノゲナムのゲノムの分析は、アセトアセチル−ＣｏＡまたは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡチオエステル結合の開裂の原因となり得る３つの推定ＣｏＡチオエステラーゼ（チオエステル−ヒドロラーゼ）の同定をもたらした。これらは、Ｃ・ユングダリイのような他のアセトゲン中にも存在する。
【０２７４】
【表１７】
2018530342.tif 000040
【０２７５】
これらの３つの推定ＣｏＡチオエステラーゼの不活性化は、より高い産物力価をもたらし、Ｐｔｂ−Ｂｕｋ系の効率を向上させる。３つの推定チオエステラーゼを、ＣｌｏｓＴｒｏｎ技術を使用して不活性化した。簡潔に、ＩＩ型Ｌｔｒの標的化ドメインを、ＣｌｏｓＴｒｏｎウェブサイトを使用してリプログラミングし、再標的化ＣｌｏｓＴｒｏｎプラスミドをＤＮＡ２．０から配列した。ＣｌｏｓＴｒｏｎノックアウトベクター、チオエステラーゼ１（ＣＡＥＴＨＧ＿０７１８）を標的化するｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２−Ｃａｕ−２６４０−５７１ｓ、チオエステラーゼ２（ＣＡＥＴＨＧ＿１５２４）を標的化するｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２−ＰＢｏｒ３７８２−１６６ｓ、及びチオエステラーゼ３（ＣＡＥＴＨＧ＿１７８０）を標的化するｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２−ＰＢｏｒ４０３９−１９９ｓを、接合を使用してＣ・オートエタノゲナムに導入した。
【０２７６】
組み込みのための選択は、５μｇ／ｍｌのクラリスロマイシンで補充されたＰＥＴＣを選択することにより行い、ＩＩ型イントロンの組み込みによる不活性化の成功は、挿入部位にわたるＰＣＲにより確認した。
【０２７７】
野生型Ｃ・オートエタノゲナム及び不活性化された推定遺伝子の１つを有するＣ・オートエタノゲナムの各々の両方のアセトアセチル−ＣｏＡに対するＣｏＡヒドロラーゼ活性を、上述のアッセイを使用して測定した。不活性化推定チオエステラーゼを有するすべての３つの株は、アセトアセチル−ＣｏＡ及び３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに対してより低い加水分解活性を示したことが示された（図２１Ａ〜Ｂ）。
【０２７８】
減少したＣｏＡヒドロラーゼ活性、及びよってアセトアセチル−ＣｏＡの増加したプールが、アセトアセチル−ＣｏＡ由来産物の産生にとって有益であることを実証するために、ｔｈｌ＋ｃｔｆＡＢ＋ａｄｃをコード化するイソプロパノールプラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ（ＷＯ２０１２／１１５５２７）を、Ｃ・オートエタノゲナム野生型株及び不活性化チオエステラーゼ１を有する株に導入した。増殖実験を、１Ｌショットボトル中の４０ｍｌのＰＥＴＣ培地において、テクニカルレプリケートで、Ｃｏガスで、３７℃で、１１０ｒｐｍで振盪しながら実施した。合成ガス（５０％ＣＯ、１８％ＣＯ２、２％Ｈ２、及び３０％Ｎ２）を、単独のエネルギー及び炭素源として使用した。ヘッドスペースを１回交換し、２１ｐｓｉ（１．５バール）に、３７℃で、合成ガス（５０％ＣＯ、１８％ＣＯ２、２％Ｈ２、及び３０％Ｎ２）下でガス化した。ＯＤ及び分析のための試料を１日２回採取した。
【０２７９】
不活性化チオエステラーゼ３ＣＡＥＴＨＧ＿１７８０を有する株は、野生型より顕著に高いレベルのイソプロパノールを産生した（図２２及び図２３Ａ〜Ｄ）。
【０２８０】
同様に、Ｃ・オートエタノゲナムにおけるチオエステラーゼのノックアウトは、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡのプールを増加させ、Ｐｔｂ−Ｂｕｋによる３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡのより効率的な利用を可能にし、アセトン、イソプロパノール、イソブチレン、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート、１，３−ブタンジオール、及び／または２−ヒドロキシイソ酪酸のより高い産生をもたらすだろう。実施例５のプラスミドｐＭＴＬ８３１５−Ｐｆｄｘ−ｈｂｄ１−ｔｈｌＡを、阻害されたチオエステラーゼ２、ＣＡＥＴＨＧ＿１５２４を有するＣ・オートエタノゲナム株に導入した場合、３−ヒドロキシブチレート合成は（このプラスミドをＣ・オートエタノゲナム野生型株において発現させる場合に見られた最大２．５５ｇ／Ｌの３−ヒドロキシブチレートと比較して）無効化された。この株において３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡについての競合活性は存在しない。
【０２８１】
これらの結果は、チオエステラーゼ活性を低減することにより、Ｐｔｂ−Ｂｕｋ系及び産物合成により多くのＣｏＡプールが利用可能となることを実証する。
【０２８２】
また、３−ＨＢ及び１，３−ＢＤＯの産生は、ｐｔｂ−ｂｕｋの過剰発現により増加させることができる。対照実験では、実施例２において記載されているようなＣ・オートエタノゲナムが、実施例４からのプラスミドｐＭＴＬ８３１５９−ｐｈａＢ−ｔｈｌＡ及びｐＭＴＬ８２２５６（Ｈｅａｐ、Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、７８：７９−８５、２００９）で形質転換されたが、後者はバックグラウンド対照として使用される空のプラスミドであり、こうした株の発酵は１０日目に１．６８ｇ／Ｌで最も高い力価での３−ＨＢの産生をもたらした（図４２Ａ）。空のプラスミドｐＭＴＬ８２２５６の代わりに、ｐＭＴＬ８２２５６−ｂｕｋ−ｐｔｂを、Ｃ・オートエタノゲナムにおいてｐＭＴＬ８３１５９−ｐｈａＢ−ｔｈｌＡと共発現させた場合、発酵は、早期４日目に４．７６ｇ／Ｌで３−ＨＢのより高い力価をもたらした（図４２Ｂ）。
【０２８３】
天然チオエステラーゼの欠失は、（Ｒ）−３−ＨＢ−ＣｏＡについての選好性を有する、ｐｔｂ−ｂｕｋ系の効率を向上させる。ゲノム中のチオエステラーゼ遺伝子の遺伝子座を欠失させ、相同組換えとして知られている一般的な分子生物学技術を通してｂｕｋ−ｐｔｂＤＮＡフラグメントで置換した。ｂｕｋ−ｐｔｂによるチオエステラーゼ遺伝子の置換は、ＰＣＲ、その後のアガロースゲル電気泳動及びＤＮＡ配列決定により確認した。
【０２８４】
ボトル実験では、ｐＭＴＬ８３１５６−ｐｈａＢ−ｔｈｌＡを、上述されているチオエステラーゼ欠失変異体においてｐｔｂ−ｂｕｋなしで発現させた場合、産生された３−ＨＢの平均最大力価は、修飾されていないＣ・オートエタノゲナム株を使用して得られた力価と同様に、０．５０±０．０５ｇ／Ｌであった。ｐＭＴＬ８２２５６−ｂｕｋ−ｐｔｂを、チオエステラーゼノックアウト株においてｐＭＴＬ８３１５６−ｐｈａＢ−ｔｈｌＡプラスミドと共発現させた場合、３−ＨＢの産生は１．２９±０．１０ｇ／Ｌまで増加した（図４３）。
【０２８５】
実施例８
この実施例は、Ｐｔｂ−ｂｕｋ系を有するアセトゲンＣ・オートエタノゲナムにおいてアセテート産生系を削除することが可能であることを実証する。
【０２８６】
アセテートの産生が、Ｐｔａ（ホスホトランスアセチラーゼ）及びＡｃｋ（ホスホトランスアセチラーゼ−アセテートキナーゼ）を通して基質レベルのリン酸化からＡＴＰを直接発生させる選択肢を有する微生物を提供するので、すべての酢酸産生微生物はアセテートを産生することが記載されている（Ｄｒａｋｅ、Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ、Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ、３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐａｇｅｓ  ３５４−４２０、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２００６）。Ｐｔａ−Ａｃｋのような天然アセテート形成酵素は、したがって、アセトゲンにおいて必須であると考えられる（Ｎａｇａｒａｊａｎ、Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ、１２：１１８、２０１３）。Ｐｔｂ−Ｂｕｋはエネルギー発生のための代替手段を提供するので、天然Ｐｔａ−Ａｃｋ系をＰｔｂ−Ｂｕｋで置換することが可能となる。
【０２８７】
Ｃ・オートエタノゲナムにおけるｐｔａ及びａｃｋ遺伝子は、１つのオペロン中にある。ｐｔａ及びａｃｋ遺伝子をｐｔｂ及びｂｕｋ遺伝子で置換するために、プラスミド、ｐＭＴＬ８２２５−ｐｔａ−ａｃｋ：：ｐｔｂ−ｂｕｋ（図２４）を、テトラサイクリン誘発性プロモーター下にあるｍａｚＦ対抗選択マーカー、約１ｋｂ上流相同性アーム、ｐｔｂ、ｂｕｋ、ｌｏｘＰ部位に隣接するｅｒｍＢカセット、及び約１ｋｂ下流相同性アームとアセンブリした（配列番号１６０）。
【０２８８】
ｂｕｄＡの約１ｋｂ上流及び下流相同性アームを、プライマーＳＮ２２ｆ／ＳＮ２３ｒ及びＳＮ２８ｆ／ＳＮ２９ｒでＣ・オートエタノゲナムからＰＣＲ増幅させた。Ｐｔｂ及びｂｕｋ遺伝子を、プライマーＳＮ２４ｆ／ＳＮ２５ｒを使用してｐＩＰＡ＿１６プラスミドからＰＣＲ増幅させた。ｌｏｘＰ部位を有するｅｒｍＢカセットを、プライマーＳＮ２６ｆ／ＳＮ２７ｒを使用してＰＣＲ増幅させた。プラスミド骨格を、プライマーＳＮ３０ｆ／ＳＮ３１ｒでＰＣＲ増幅させた。ＫＡＰＡポリメラーゼをすべてのＰＣＲ増幅に使用した。ＰＣＲ産物を、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＧｅｎｅＡｒｔ  Ｓｅａｍｌｅｓｓクローニングキットを使用してアセンブリし、挿入フラグメント中に変異を含まないプラスミドを、前述のとおり接合によりＣ・オートエタノゲナムを形質転換するのに使用した。
【０２８９】
トリメトプリム及びクラリスロマイシンでの接合及び選択後、７つのコロニーを、ＰＥＴＣ−ＭＥＳアガープレート上、クラリスロマイシン及びアンヒドロテトラサイクリンで２回ストリークし、ｍａｚＦ遺伝子の発現を誘導した。クラリスロマイシン及びアンヒドロテトラサイクリンからのコロニーは、ｐｔａ及びａｃｋ遺伝子がｐｔｂ及びｂｕｋ遺伝子ならびにｅｒｍＢカセットで置換されているべきである。これは、相同性アーム及びＫＡＰＡポリメラーゼに隣接するプライマーＯｇ２９ｆ／Ｏｇ３０ｒを使用して、ＰＣＲにより検証した（図２５）。約４．６ｋｂのバンドは野生型株から増幅されるが、約５．７ｋｂのバンドはコロニー１及び４〜７から増幅され、ｐｔａ及びａｃｋ遺伝子のｐｔｂ及びｂｕｋ遺伝子ならびにｅｒｍＢカセットでの置換を示した。上の事象は、クローン４〜７からのＰＣＲ産物を配列決定することにより、さらに確認された。
【０２９０】
得られた修飾によって、ｐｔｂ及びｂｕｋ遺伝子の発現は、ｐｔａ遺伝子のプロモーター上流により駆動される。
【０２９１】
【表１８】
2018530342.tif 000041
2018530342.tif 000042
【０２９２】
ｐｔａ−ａｃｋオペロンがｐｔｂ−ｂｕｋオペロンにより置換された、得られたＣ・オートエタノゲナム株ｐｔａ−ａｃｋ：：ｐｔｂ−ｂｕｋを、実施例２からのイソプロパノール産生プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ａｄｃで上述のとおり形質転換した。増殖実験を独立栄養的な条件下で実施し、最終代謝産物について分析した。アセテート産生は観察されなかったが、イソプロパノール（最大０．３５５ｇ／Ｌ）及び３−ＨＢ（最大０．２９ｇ／Ｌ）はエタノール及び２，３−ブタンジオールと共に依然として産生された（図３９Ａ及び３９Ｂ）。これは、Ｐｔｂ−Ｂｕｋ系を使用して、ガス状基質ＣＯ及び／またはＣＯ２ならびにＨ２から、アセテート産生なしにイソプロパノール及び３−ＨＢを産生することが可能であることを実証する。
【０２９３】
イソプロパノールではなくアセトンが標的産物である場合、第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（配列番号１７）は、上で及び詳しくはＷＯ２０１５／０８５０１５において記載されている方法を使用して、このＣ・オートエタノゲナム株ｐｔａ−ａｃｋ：：ｐｔｂ−ｂｕｋでさらにノックアウトすることができる。プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ａｄｃをこの株に導入することは、アセテートの共産生なしでのイソプロパノールについて上で記載されているものと同様のレベルでのアセトンの産生をもたらす。エタノール、２，３−ブタンジオール、及び３−ＨＢは、さらなる産物であり得る。
【０２９４】
さらなるノックアウトにより、これらの産物を排除することも可能であり、例えば、アセトラクテートデカルボキシラーゼ遺伝子ＢｕｄＡのノックアウトは、２，３−ブタンジオールを産生することができない株をもたらす（Ｕ．Ｓ．９，２９７，０２６）。３−ＨＢ産生は、３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ遺伝子Ｂｄｈ（配列番号６２）の欠失により、低減または削除され得る。
【０２９５】
実施例９
この実施例は、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ遺伝子ａｏｒ１の過剰発現による３−ヒドロキシブチレートの１，３−ＢＤＯへの変換の向上について実証する。
【０２９６】
ｐＭＴＬ８２２５１プラスミド骨格をＣ・オートエタノゲナムａｏｒ１遺伝子の過剰発現に使用した。異なる複製起点及び抗生物質マーカーを有するが、ｈｂｄ１及びｔｈｌＡを含有した実施例５において使用されたプラスミドと共発現することができたので、ｐＭＴＬ８２２５１プラスミドが選択された。プラスミド骨格の調製及びアセンブリ反応を、上に挙げられている手順に従って実施し、まずＣ・オートエタノゲナムフェレドキシンプロモーターをプラスミドｐＭＴＬ８２２５１に導入することによりプラスミドｐＭＴＬ８２２５６を発生させた後、ａｏｒ１遺伝子を付加してプラスミドｐＭＴＬ８２２５６−ａｏｒ１を形成した。次のプライマーを使用した。
【０２９７】
【表１９】
2018530342.tif 000043
【０２９８】
得られたプラスミドｐＭＴＬ８２２５６−ａｏｒ１をＥ・コリＣＡ４３４株に形質転換した後、以前のＣ・オートエタノゲナム１，３−ＢＤＯ産生宿主上で接合を行った。よって、得られたＣ・オートエタノゲナム株は、２つのプラスミドを有し、異なる複製起点及び選択マーカー下で、１つはｈｂｄ１及びｔｈｌＡを、もう１つはａｏｒ１を過剰発現させるものであった。１，３−ＢＤＯの産生を、上の手順に従って特徴分析及び定量化した。
【０２９９】
結果は、１，３−ＢＤＯ産生がａｏｒ１を過剰発現させることにより向上され得ることを明確に示す。同様に、他のアルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ遺伝子は、Ｃ・オートエタノゲナムにおいて発現し、３−ヒドロキシブチレートの１，３−ブタンジオールへの変換を促進することができた。
【０３００】
１，３−ＢＤＯ産生を向上させるために、ＡＯＲを過剰発現させ、３−ＨＢの３−ＨＢ−アルデヒドへの変換を向上させた。これを行うために、ｐＭＴＬ８２２５６−ｈｂｄ−ｔｈｌＡ及びｐＭＴＬ８３１５９−ａｏｒ１をＣ・オートエタノゲナムにおいて共発現させた。ｐＭＴＬ８２２５６−ｈｂｄ−ｔｈｌＡを単独で有した株と比較して、ａｏｒ１共発現株は、より多くのエタノール及び１，３−ＢＤＯを産生した（図４４）。
【０３０１】
実施例１０
この実施例は、望ましくない副産物の産生なしでの２−ヒドロキシイソ酪酸の産生を可能にするＰｔｂ−Ｂｕｋの立体特異性について実証する。
【０３０２】
２−ヒドロキシイソ酪酸は、Ｅ・コリ及びＣ・オートエタノゲナムにおいて、アセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換するチオラーゼ及び３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡへの変換のための２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼ酵素、ならびにＣｏＡを加水分解し、２−ヒドロキシイソ酪酸を形成することができる酵素の導入により、産生することができる。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、（Ｒ）または（Ｓ）特異的のいずれか、ならびに図１のステップ１、１３、１９、及び２０に従って２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを２−ヒドロキシブチレートに変換する酵素であり得る。この最後のステップは、チオエステラーゼまたはＰｔｂ−Ｂｕｋ系のいずれかを通して行うことができる。
【０３０３】
３つの潜在的な候補遺伝子、Ｅ・コリのチオエステラーゼＩＩ型ＴｅｓＢ、Ｃ・オートエタノゲナムのホスフェートアセチルトランスフェラーゼ／アセテートキナーゼペア、及びＣ・ベイジェリンキイのブチリルトランスフェラーゼ／ブチレートキナーゼペアを、上述の方法及び下のプライマーを通してＥ・コリｐＤＵＥＴ  Ｔ７発現ベクターにクローニングした。
【０３０４】
【表２０】
2018530342.tif 000044
【０３０５】
得られたプラスミド、ｐＤＵＥＴ−ｐｔａ−ａｃｋ（配列番号１８５）、ｐＤＵＥＴ−ｐｔｂ−ｂｕｋ（配列番号１８６）、ｐＤＵＥＴ−ｔｅｓＢ（配列番号１８７）を、発現のためにＥ・コリＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した後、アセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、及び２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡに対するそれらの活性についてアッセイした。結果を図２７に示す。Ｅ・コリＢＬ２１は、すべての３つの基質に対して少ないが測定可能な量の活性を有する。Ｐｔａ−Ａｃｋは、バックグラウンドを上回る活性をもたらさなかったが、チオエステラーゼＴｅｓＢ及びＰｔｂ−Ｂｕｋの両方は、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを含む、すべての３つの基質に対して高い活性を示した。
【０３０６】
チオエステラーゼＴｅｓＢ及びＰｔｂ−Ｂｕｋの両方の活性は、分岐２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡよりも、線状アセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡについて高かった。これは、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡでの経路の早期終了をもたらし、特に活性が２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼ酵素に対する活性より高いので、経路において問題を引き起こす。
【０３０７】
しかしながら、チオエステラーゼとは対照的にＰｔｂ−Ｂｕｋは、立体異性体間を区別することができ、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡではなく（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡのみに（選好的に）作用するだろう。これは、Ｐｔｂ−Ｂｕｋ系をＥ・コリにおいてｐＤｕｅｔ系中のＴｈｌＡ及び（Ｓ）特異的Ｈｂｄ（図２８Ａ）または（Ｒ）特異的ｐｈａＢ（図２８Ｂ）のいずれかと発現させることにより、実証された。構築物は、実施例１及び３において記載されているように構築した。増殖実験は、感知できる量の３−ヒドロキシブチレートが、Ｐｔｂ−Ｂｕｋを（Ｒ）特異的ｐｈａＢではなく（Ｓ）特異的Ｈｂｄとの組み合わせで発現させた場合のみ形成されたことを確認した。
【０３０８】
したがって、（Ｓ）特異的３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ及びＰｔｂ−Ｂｕｋを通したルートは、Ｐｔｂ−Ｂｕｋ系が（チオエステラーゼとは異なり）（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに対して活性ではないが、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡが２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼの好ましい異性体でもあるので、顕著な利点を提供する（Ｙａｎｅｖａ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２８７：１５５０２−１５５１１、２０１２）。産生された２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡは次にＰｔｂ−Ｂｕｋを通して使用し、２−ヒドロキシイソ酪酸を産生することができ、（チオエステラーゼとは異なり）２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ加水分解は追加のエネルギーを提供する（図８）。
【０３０９】
モジュラー構築物を、経路の性能を比較するために設計した。遺伝子ｍｅａＢ、ｈｃｍＡ、及びｈｃｍＢの前にウッド−ユングダールプロモーターを含有する遺伝子カセットを、コドン最適化及び合成した（配列番号１８８）。ｈｃｍＡ及びｈｃｍＢは、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼ及びｍｅａＢ、アクインコラ・テルチアリカルボニスからのシャペロンをコード化し、構築物において、ｈｃｍＡ及びｍｅａＢ遺伝子を、記載のとおり１つのタンパク質として共に融合させた（Ｙａｎｅｖａ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２８７：１５５０２−１５５１１、２０１２）（配列番号１８９）。遺伝子カセットを、それぞれ、プラスミドｐＭＴＬ８３１５５−ｔｈｌＡ−ｈｂｄ−Ｐｗｌ−ｍｅａＢｈｃｍＡ−ｈｃｍＢ（配列番号１９１）及びｐＭＴＬ８３１５５−ｔｈｌＡ−ｐｈａＢ−Ｐｗｌ−ｍｅａＢｈｃｍＡ−ｈｃｍＢ（配列番号１９２）を形成するための制限酵素ＫｐｎＩ及びＮｃｏＩを使用して、チオラーゼ（Ｃ・アセトブチリカムからのｔｈｌＡ、配列番号１３６）及び（Ｓ）特異的３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ（Ｃ・アセトブチリカムからのｈｂｄ、配列番号１９０）（ｐＭＴＬ８３１５５−ｔｈｌＡ−ｈｂｄ）または（Ｒ）特異的３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ（Ｒ・ユートロファからのｐｈａＢ）（ｐＭＴＬ８３１５５−ｔｈｌＡ−ｐｈａＢ）を含有するプラスミドのいずれかにクローニングした。Ｅ・コリＴｏｐ−１０におけるコドン最適化２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼカセットのサブクローニングは、クローニング初期のいくらかの混乱後にのみ成功し、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼカセットは低温（２８℃）でのみプラスミドにクローニングすることができたことが見出された。
【０３１０】
ベクターｐＭＴＬ８３１５５−ｔｈｌＡ−ｈｂｄ及びｐＭＴＬ８３１５５−ｔｈｌＡ−ｐｈａＢは、まずＣ・オートエタノゲナムのホスフェートアセチルトランスフェラーゼのプロモーター領域（配列番号１９３）を増幅させ、ＮｏｔＩ及びＮｄｅＩ制限部位を使用してベクターｐＭＴＬ８３１５１（ＦＪ７９７６４７．１、Ｈｅａｐ、Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈ、７８：７９−８５、２００９）にクローニングした後、二重ライゲーション反応において遺伝子ｔｈｌＡ及びｈｂｄまたはそれぞれＮｄｅＩ及びＫｐｎＩを通してｐｈａＢを導入することにより作製した。
【０３１１】
また、ｐｔｂ−ｂｕｋまたはｔｅｓＢを発現させるための適合性プラスミドモジュールを構築した。このためには、各々の遺伝子をゲノムＤＮＡから増幅し、実施例９において記載されているプラスミドｐＭＴＬ８２２５６に導入した後、ｐｔｂ−ｂｕｋまたはｐｈａＢのいずれかを、ＮｄｅＩ及びＮｃｏＩならびにＳｅａｍｌｅｓｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して導入し、プラスミドｐＭＴＬ８２２５６−ｐｔｂ−ｂｕｋ（配列番号１９４）及びｐＭＴＬ８２２５６−ｔｅｓＢ（配列番号１９５）を形成した。
【０３１２】
プラスミドｐＭＴＬ８３１５５−ｔｈｌＡ−ｈｂｄ−Ｐｗｌ−ｍｅａＢｈｃｍＡ−ｈｃｍＢ、ｐＭＴＬ８３１５５−ｔｈｌＡ−ｐｈａＢ−Ｐｗｌ−ｍｅａＢｈｃｍＡ−ｈｃｍＢ、ｐＭＴＬ８２２５６−ｐｔｂ−ｂｕｋ、及びｐＭＴＬ８２２５６−ｔｅｓＢを、（すべてのステップについて２８℃で）Ｅ・コリＴｏｐ−１０、及びＣ・オートエタノゲナムに、前の実施例において記載されているような形質転換により、次のような組み合わせ、ｐＭＴＬ８３１５５−ｔｈｌＡ−ｈｂｄ−Ｐｗｌ−ｍｅａＢｈｃｍＡ−ｈｃｍＢ＋ｐＭＴＬ８２２５６−ｐｔｂ−ｂｕｋ、ｐＭＴＬ８３１５５−ｔｈｌＡ−ｈｂｄ−Ｐｗｌ−ｍｅａＢｈｃｍＡ−ｈｃｍＢ＋ｐＭＴＬ８２２５６−ｔｅｓＢ、ｐＭＴＬ８３１５５−ｔｈｌＡ−ｐｈａＢ−Ｐｗｌ−ｍｅａＢｈｃｍＡ−ｈｃｍＢ＋ｐＭＴＬ８２２５６−ｐｔｂ−ｂｕｋ、及びｐＭＴＬ８３１５５−ｔｈｌＡ−ｐｈａＢ−Ｐｗｌ−ｍｅａＢｈｃｍＡ−ｈｃｍＢ＋ｐＭＴＬ８２２５６−ｔｅｓＢで導入した。
【０３１３】
増殖実験を、Ｅ・コリで、ＬＢ培地において、３０℃で４日間、ならびにＣ・オートエタノゲナムで、ＰＥＴＣ培地において、（グレンブルック、ニュージーランドにあるＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｓｔｅｅｌ敷地から回収された）３０ｐｓｉＣＯ含有製鋼工場ガスで、３０℃及び３７℃で６日間実施した。代謝産物を上述のとおり測定した。ＧＣ−ＭＳによる測定に加えて、２−ヒドロキシイソ酪酸産生は、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）及び１Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法も使用して確認した。
【０３１４】
液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）データを、ＡＢＳｃｉｅｘ  ４０００  ＱＴＲＡＰ質量分析計（ＡＢＳｃｉｅｘ、コンコード、カナダ）と共役させたＤｉｏｎｅｘ  ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００液体クロマトグラフィーシステム（Ｄｉｏｎｅｘ、カリフォルニア、米国）上で取得した。液体クロマトグラフィーシステムをＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェア（Ｄｉｏｎｅｘ）により制御し、クロマトグラフ分離を、プレカラムＳｅｃｕｒｉｔｙ  Ｇｕａｒｄ  Ｇｅｍｉｎｉ−ＮＸ  Ｃ１８  ４ｍｍ×２ｍｍＩ．Ｄ．カートリッジを備えたＧｅｍｉｎｉ−ＮＸ  Ｃ１８  １５０ｍｍ×２ｍｍ  Ｉ．Ｄ．、３μｍ１１０Å粒子カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、アシャッフェンブルク、ドイツ）上に１０μＬを注入することにより達成した。カラムオーブン温度は、取得中は常に５５℃で制御及び維持し、移動相は次のとおり、氷酢酸（溶離液Ａ）及びアセトニトリル（溶離液Ｂ）でｐＨ４．９５（±０．０５）に調節された７．５ｍＭ水性トリブチルアミンとした。移動相流量は、勾配プロファイル全体を通して３００μＬ／分で維持し、分割なしで質量分析計に直接導入した。質量分析計は、Ａｎａｌｙｓｔ１．５．２ソフトウェア（ＡＢＳｃｉｅｘ）により制御し、負イオン化モードで作動させるＴｕｒｂｏＶエレクトロスプレー源を備えた。下記の予め最適化された（及びしたがって一般的な）パラメータを使用し、指定の多重反応モニタリング（ＭＲＭ）データ取得した。イオンスプレー電圧は−４５００Ｖであり、ネブライザー（ＧＳ１）、補助（ＧＳ２）、カーテン（ＣＵＲ）、及び衝突（ＣＡＤ）ガスは、それぞれ、６０、６０、２０、及び中（任意単位）であり、Ｎ３０００ＤＲ窒素発生装置（Ｐｅａｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ、米国）を通して発生させた。補助ガス温度は３５０℃に維持した。入口電位（ＥＰ）は−１０ボルトとした。この方法は、２−ヒドロキシイソ酪酸を検出及び分離することもできる。
【０３１５】
４００ＭＨｚの場の強さでの１Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法。４００μＬの試料を、内部標準（ｐＨ７）としてＤ２Ｏで調製され、トリメチルシリルプロピオン酸（ＴＭＳＰ）を含有する４００μＬの２０ｍＭリン酸バッファで希釈することにより、試料を調製した。試料を次にガラスＮＭＲチューブ（５ｍｍ×８インチ）に移し、３０°励起パルス、１５秒緩和遅延、及び２７℃の温度での６４走査での水抑制のための予備飽和を使用して１Ｈ  ＮＭＲにより分析した。取得後、スペクトルは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＶｎｍｒＪソフトウェアを使用して変換、平坦化、及び統合した。ＴＭＳＰの既知の濃度を、１．３６ｐｐｍ（一重項）での共鳴を使用する２−ヒドロキシイソ酪酸の定量化に使用した。
【０３１６】
従属栄養的に増殖するＥ・コリ及び独立栄養的に増殖するＣ・オートエタノゲナムの両方において、２−ヒドロキシイソ酪酸は、構築物ｐＭＴＬ８３１５５−ｔｈｌＡ−ｈｂｄ−Ｐｗｌ−ｍｅａＢｈｃｍＡ−ｈｃｍＢ＋ｐＭＴＬ８２２５６−ｔｅｓＢ（Ｃ・オートエタノゲナムにおいてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法で１．５ｍｇ／Ｌ及びＧＣ−ＭＳで８ｍｇ／Ｌ、Ｅ・コリにおいてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法で０．５ｍｇ／Ｌ及びＧＣ−ＭＳで２ｍｇ／Ｌ）ならびにｐＭＴＬ８３１５５−ｔｈｌＡ−ｐｈａＢ−Ｐｗｌ−ｍｅａＢｈｃｍＡ−ｈｃｍＢ＋ｐＭＴＬ８２２５６−ｐｔｂ−ｂｕｋ（Ｃ・オートエタノゲナムにおいてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法で１５ｍｇ／Ｌ及びＧＣ−ＭＳで７５ｍｇ／Ｌ、Ｅ・コリにおいてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法で１．１ｍｇ／Ｌ及びＧＣ−ＭＳで８．５ｍｇ／Ｌ）中では検出できたが、対照を含むすべての他の構築物中では検出できなかった。これまで最も高い産生は、チオラーゼ、（Ｓ）特異的（Ｓ）特異的３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡムターゼ、及びＰｔｂ−Ｂｕｋ系での最適経路を有する、プラスミドｐＭＴＬ８３１５５−ｔｈｌＡ−ｈｂｄ−Ｐｗｌ−ｍｅａＢｈｃｍＡ−ｈｃｍＢ＋ｐＭＴＬ８２２５６−ｐｔｂ−ｂｕｋ（すべての他のルートより１０倍高い）を有する株において起こった（図２９Ａ〜Ｄ）。驚くべきことに、２−ヒドロキシブチレート（２−ＨＢ）の産生（Ｃ・オートエタノゲナムにおいてＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより最大６４ｍｇ／Ｌ及びＧＣ−ＭＳにより５０ｍｇ／Ｌ、Ｅ・コリにおいてＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより１２ｍｇ／Ｌ及びＧＣ−ＭＳにより９．５ｍｇ／Ｌ）も、この株において見られ、非特異的ムターゼ活性を示した（図３０）。これは、ｔｅｓＢ株においても見れらたが、やはり著しく低いレベルであった（Ｃ・オートエタノゲナムにおいてＬＣ−ＭＳ−ＭＳで１８ｍｇ／Ｌ及びＧＣ−ＭＳで９ｍｇ／Ｌ）。２−ヒドロキシイソ酪酸の産生もＮＭＲにより確認した。
【０３１７】
また、ｑＲＴ−ＰＣＲも実施し、遺伝子ｔｈｌＡ、ｈｂｄ、ｍｅａＢｈｃｍＡ、及びｈｃｍＢの発現を確認した（図３１）。
【０３１８】
ＲＴ−ＰＣＲグラフは、ｔｈｌＡ遺伝子産物が、Ｐｐｔａ−ａｃｋプロモーターで、（オペロンにおける第２の遺伝子で予想されるような）ｈｂｄよりわずかに高いレベルまで発現すること、及びｈｍｃＢがｍｅａＢｈｃｍＡよりわずかに低い発現レベルを示すことを示す。また３０℃のＣ・オートエタノゲナムでは、３７℃より、及び３０℃のＥ・コリより低い発現が見られる。具体的なサイクル数については下を参照されたい。
【０３１９】
【表２１】
2018530342.tif 000045
【０３２０】
（Ｓ）−３−ヒドロキシ酪酸の（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸に対する比を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣ上、２１０ｎｍでのＵＶ検出で測定した。試料を、１４，０００ｒｐｍで３分間の遠心分離、続いて２００μＬの浮遊物を乾燥までの蒸発により、調製した。ペレットを次に、１００％イソプロパノールに再懸濁させ、加熱下で１時間音波処理した。遠心分離を繰り返し、浮遊物を分析のためにＨＰＬＣバイアルに移した。１．５ｍＬ／分及び４０℃で、均一濃度条件下、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する９５−５ヘキサン−イソプロパノール移動相を使用する、ＴＣＩ  Ｃｈｉｒａｌ  ＭＢ−Ｓカラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ×３μｍ）への５μＬ注入によって、分離を達成した。
【０３２１】
３−ＨＢ産生の立体特異的分析が行われた。驚くべきことに、Ｃ・オートエタノゲナムにおいて、異性体の混合物が産生されたことが見出された。酵素Ｈｂｄ及びＰｈａＢは、立体特異的であることが記載されており、ＰｈａＢはＲ特異的であり、ＨｂｄはＳ特異的であり、Ｅ・コリにおいてこれらの酵素が発現する場合、立体的に純粋な産生物が観察された（Ｔｓｅｎｇ、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、７５：３１３７−３１４５、２００９）。
【０３２２】
下記の表は、Ｃ・オートエタノゲナムにおいて３つの異なるルートを通して産生される平衡での３−ＨＢの（Ｒ）及び（Ｓ）形態の分布を示す。これらのデータは、Ｃ・オートエタノゲナムにおけるイソメラーゼの存在を示す。
【０３２３】
【表２２】
2018530342.tif 000046
【０３２４】
天然イソメラーゼのノックアウトは、３−ＨＢの（Ｒ）及び（Ｓ）形態の相互変換を防止し得る。あるいは、イソメラーゼの発現または過剰発現は、新たなｐｔｂ−ｂｕｋルートを有効化し得る。例えば、Ｈｂｄを使用して（Ｓ）−３−ＨＢを発生させることができ、イソメラーゼは（Ｓ）−３−ＨＢを（Ｒ）−３−ＨＢに変換することができ、ｐｔｂ−ｂｕｋは（Ｒ）−３−ＨＢに作用して対象の産物を産生することができる。
【０３２５】
実施例１１
この実施例は、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡ及び３−ヒドロキシイソバレレートのＰｔｂ−Ｂｕｋ変換を通したイソブチレンの産生について実証する。
【０３２６】
イソブチレンの産生のための異なるルート、例えば、ヒドロキシイソバレレートシンターゼ及びデカルボキシラーゼを通したアセトンのイソブチレンへの変換が記載されている（ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、９３：１３７７−１３８７、２０１２）。しかしながら、ヒドロキシイソバレレートデカルボキシラーゼステップは、ＡＴＰを必要とするステップであり、この酵素の反応速度は理想的でない場合がある。Ｐｔｂ−Ｂｕｋ系を使用するイソブチレンへの２つの代替ルートが、インビトロでＰｔｂ−Ｂｕｋ系にとって実用的な基質であることが示されている３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡによって同定されている（Ｌｉｕ、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、５３：５４５−５５２、２０００）。
【０３２７】
代替経路１は、アセトンを３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡに変換するシンターゼからなる（図９）。
【０３２８】
代替経路２は、Ｅ・コリまたはＣ・オートエタノゲナムのような細菌に共通するイソロイシン生合成の既知の中間体３−メチル−２−オキソペンタノエートを通って進行する（図１０）。
【０３２９】
実施例１２
この実施例は、Ｐｔｂ−Ｂｕｋ多様体の特徴分析方法について説明する。
【０３３０】
Ｐｔｂ−Ｂｕｋの基質無差別性を前提として、変化するアミノ酸配列のＰｔｂ−Ｂｕｋ系は所定の基質について変化する選好性を有する可能性が高い。望ましい基質（例えば、アセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ、アセチル−ＣｏＡ、及び／またはブチリル−ＣｏＡ）を好むＰｔｂ−Ｂｕｋ系を同定するには、ハイスループットスクリーニングが望ましい。こうしたスクリーニングは、ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をＰｔｂ−Ｂｕｋ系と共役させることにより、達成することができる（図３３）。ＬｕｃはＤ−ルシフェリンと反応し、オキシルシフェリン、二酸化炭素、及び光を発生させる。マグネシウム及び分子酸素に加えて、Ｌｕｃは反応を進めるのにＡＴＰを必要とする。ＡＴＰは、適切なアシル−ＣｏＡまたはエノイル−ＣｏＡ基質が提供される場合、Ｐｔｂ−Ｂｕｋにより発生する産物である。したがって、Ｐｔｂ−Ｂｕｋ反応速度及び選好性は、Ｐｔｂ−Ｂｕｋ、Ｌｕｃ、ｄ−ルシフェリン、マグネシウム、分子酸素、ホスフェート、ＡＤＰ、及びアシル−ＣｏＡまたはエノイル−ＣｏＡを含有する反応により発生した光の量を定量化することにより、変化する基質について比較することができる。
【０３３１】
実施例１３
この実施例は、ゲノムスケールモデリングを使用し、Ｐｔｂ−Ｂｕｋを使用して高い非天然産物選択性を達成することができることを実証する。さらに、これはＰｔｂ−Ｂｕｋの使用が、細胞増殖の産物産生との共役を可能にし、安定かつ高収率の発酵株の構築を可能し得ることを示す。
【０３３２】
Ｍａｒｃｅｌｌｉｎ、Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍ、１８：３０２０−３０２８、２００６により記載されているものと同様のＣ・オートエタノゲナムのゲノムスケール代謝モデルを利用した。追加の代謝反応を組み込み、各々が非天然産物形成についての異なる遺伝子修飾微生物を表す、このモデルの多様体を作製した。各非天然産物経路について、チオエステラーゼ、アセテート−ＣｏＡトランスフェラーゼ、またはＰｔｂ−Ｂｕｋ反応のいずれかを組み込む、３つのモデルバージョンを作製した。
【０３３３】
Ｇｕｒｏｂｉバージョン６．０．４（Ｇｕｒｏｂｉ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．）をソルバーとして、ＭＡＴＬＡＢ  Ｒ２０１４ａ（Ｔｈｅ  Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．）中のＣＯＢＲＡ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  ｖ２．０からのスクリプトを使用する、流束均衡分析（ＦＢＡ）を使用して、最大選択性を計算した。交換反応は、炭素及びエネルギーの供給源としてＣＯを含む化学的に定義された最小増殖培地を表すことに制限された。進化的アルゴリズムを使用して、標的非天然化学物質産生を増殖と共役させる最大１０の遺伝子ノックアウトを組み込む株設計の存在を検索した。
【０３３４】
ＦＢＡは、Ｐｔｂ−ＢｕｋまたはＣｏＡトランスフェラーゼを使用する経路が、基質レベルのリン酸化を通したＡＴＰ利得によって最も高い産物選択性を提供することを予測する。結果を表２に示す。しかしながら、ゲノムスケールモデル及びＦＢＡ分析の１つの制限は、酵素反応速度が捕捉されないことであることに留意すべきである。ＣｏＡトランスフェラーゼ反応は、機能性のために一定のベースレベルのアセテートを必要とし、したがって実際には、ＣｏＡトランスフェラーゼを使用する最大選択性は、存在する必要があるベースレベルのアセテートによって１００％未満となるだろう。
【０３３５】
【表２３】
2018530342.tif 000047
【０３３６】
表３．産物及び候補酵素のセットについてのＣ・オートエタノゲナムにおける最大限可能な非天然産物選択性を示す流束均衡分析（ＦＢＡ）。
【０３３７】
細胞増殖のために標的非天然化学物質が産生されなければならない株を構築することが望ましい。ＦＢＡは、ほとんどの例において、チオエステラーゼまたはＣｏＡトランスフェラーゼを使用する場合、標的化学物質産生を増殖と共役させることが困難であり、代わりに、天然産物アセテート及びエタノールが好まれるだろうと予測する。しかしながら、Ｐｔｂ−Ｂｕｋを使用する場合、しばしばホスホトランスアセチラーゼ−アセテートキナーゼ反応の破壊を組み込む、多くの増殖共役化学物質産生株設計が存在する。表３は、各株の増殖共役能力をまとめる。
【０３３８】
【表２４】
2018530342.tif 000048
【０３３９】
表３．代謝ネットワークを最大１０の遺伝子ノックアウトで再構成する場合、ＣＯ上での増殖中、非天然化学物質産生をＣ・オートエタノゲナムにおける増殖と共役させる可能性。
【０３４０】
Ｐｔｂ−Ｂｕｋ及びＣｏＡトランスフェラーゼの両方が高い選択性を支えることができるが、流束均衡分析は、ほとんどの例において、Ｐｔｂ−Ｂｕｋのみが、非天然化学物質産生を増殖と共役させる安定で高収率の発酵株の構築を可能にするだろうと予測する。
【０３４１】
実施例１４
この実施例は、ガス状供給原料からのＰｔｂ−Ｂｕｋを通したアジピン酸の産生について実証する。
【０３４２】
Ｐｔｂ−Ｂｕｋを利用する経路によるＥ・コリにおける糖からのアジピン酸の産生が記載されている（Ｙｕ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、１１１：２５８０−２５８６、２０１４）。しかしながら産生は、μｇ／Ｌ範囲で、低かった。いかなる特定の理論にも縛られることを望むことなく、本発明者らは、これは還元力及び余剰ＡＴＰの形態での駆動力不足の関数である可能性が高いと考える。ＣＯ及びＨ２のような還元ガス状基質ならびにＣ・オートエタノゲナムのような酢酸産生細菌を使用して、この現在の制限を克服することができる。ＣＯ及びＨ２酸化は、より多くの酸化糖上で従属栄養的に増殖するＥ・コリとは対照的に、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼまたはアセトアセチル−ＣｏＡヒドラターゼによる３−オキソ−アジピル−ＣｏＡの３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡへの、及びエノイル−ＣｏＡヒドロラーゼまたはエノイル−ＣｏＡレダクターゼによる２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡのアジピル−ＣｏＡへの還元のための十分な駆動力を提供する（図３４、ステップ２３及び２５）。酢酸産生細菌は、生物のエネルギー限界で生存し、したがってＡＴＰ発生反応は、Ｐｔｂ−Ｂｕｋ系のように強い駆動力を有し、解糖から余剰ＡＴＰを発生させる糖上で従属栄養的に増殖するＥ・コリとは対照的に、アジピル−ＣｏＡのアジピン酸への十分な変換を確保する（図３４、ステップ２６）。
【０３４３】
Ｃ・オートエタノゲナムにおいてガスからアジピン酸を産生するには、Ｅ・コリからのスクシニル−ＣｏＡシンセターゼ（ＮＰ＿４１５２５６、ＮＰ＿４１５２５７）、Ｅ・コリからのケトイソイソバレレートオキシドレダクターゼＰａａＪ（ＷＰ＿００１２０６１９０．１）、クロストリジウム・ベイジェリンキイからの３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＨｂｄ（ＷＰ＿０１１９６７６７５．１）、Ｃ・アセトブチリカムからのトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼＣｒｔ（ＮＰ＿３４９３１８．１）、Ｃ・アセトブチリカムからのトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼＢｃｄ（ＮＰ＿３４９３１７．１）、及び電子フラボタンパク質ＥｔｆＡＢ（ＮＰ＿３４９３１５、ＮＰ＿３４９３１６）をコード化する遺伝子を、発現プラスミド上でクローニングした後、前の実施例からのＣ・オートエタノゲナム株ｐｔａ−ａｃｋ：：ｐｔｂ−ｂｕｋまたはＣＡＥＴＨＧ＿１５２４：：ｐｔｂ−ｂｕｋにおいて上述のとおり形質転換する。アジピン酸は、図３４において示されているステップに従って産生される。
【０３４４】
実施例１５
この実施例は、Ｐｔｂ−Ｂｕｋ及びＡＯＲを通した２−ブテン−１−オール、３−メチル−２−ブタノール、１，３−ヘキサンジオール（ＨＤＯ）を含む様々な産物の産生について実証する。
【０３４５】
実施例６において実証されているように、Ｐｔｂ−Ｂｕｋは非常に無差別的であり、基質として広範囲のＣｏＡに作用し、または基質として様々な非天然ＣｏＡを使用するように操作することができる。同様に、ＡＯＲ酵素は、広範囲の基質に作用することが示されている。共にこれらの２つの酵素は、広範囲のＣｏＡを、それらの酸を通してアルデヒドに変換することができ、これはその後、多種多様なものが天然に存在する、アルコールデヒドロゲナーゼを通してアルコール、ケトン、またはエノールにさらに変換することができる。標準的な条件下、ＡＯＲを通した酸のフェレドキシンでのアルデヒドへの還元は、エネルギー吸収性であり（Ｔｈａｕｅｒ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  Ｒｅｖ、４１：１００−１８０、１９７７）、そのようなものとして実現可能ではないが、驚くべきことに、低ｐＨで、ＣＯまたはＨ２を基質として働くＣ・オートエタノゲナムのようなカルボキシドトロフィックなアセトゲン中に存在する（Ｍｏｃｋ、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１９７：２９６５−２９８０、２０１５）。アセトゲンと連携する１つの一般的な制限は、それらがＡＴＰ制限的であり、生物の熱力学的限界で生存することであり（Ｓｃｈｕｃｈｍａｎｎ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１２：８０９−８２１、２０１４）、これはこの酸還元をＣｏＡからのＰｔｂ−Ｂｕｋ系を通した酸のＡＴＰ関連形成と共役させることにより克服することができる。
【０３４６】
Ｐｔｂ−Ｂｕｋ系及びＡＯＲ系は、いくつかの異なる産物について上の例において実証されているが、さらなる産物、例えば、２−ブテン−１−オール、３−メチル−２−ブタノール、１，３−ヘキサンジオール（ＨＤＯ）の産生まで伸長することができる。２−ブテン−１−オールは、クロトニル−ＣｏＡから、Ｐｔｂ−Ｂｕｋ、ＡＯＲ、及びアルコールデヒドロゲナーゼを通して産生することができる（図３５）。１，３−ヘキサンジオールは、３−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡから、Ｐｔｂ−Ｂｕｋ、ＡＯＲ、及びアルコールデヒドロゲナーゼを通して産生することができる（図３５）。Ｐｔｂ−Ｂｕｋ、Ａｄｃ、及びアルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、天然第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼ）を組み合わせることにより、３−メチル−２−ブタノールをアセトブチリル−ＣｏＡから形成することができる。
【０３４７】
これらの前駆体、クトロニル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ、またはアセトブチリル−ＣｏＡのすべては、例えば、クロストリジウム・クルイベリ（Ｂａｒｋｅｒ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、３１：３７３−３８１、１９４５、Ｓｅｅｄｏｒｆ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１０５：２１２８−２１３３、２００８）及び他のクロストリジウムの、既知の発酵経路を通した前の実施例において記載されているアセチル−ＣｏＡ、アセトアセチル−ＣｏＡ、及び３−ＨＢ−ＣｏＡの還元及び伸長により形成することができる。関与酵素としては、クロトニル−ＣｏＡヒドラターゼ（クロトナーゼ）またはクロトニル−ＣｏＡレダクターゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼまたはトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、チオラーゼまたはアシル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、及び３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼまたはアセトアセチル−ＣｏＡヒドラターゼが挙げられる（図３５）。Ｃ・クルイベリまたは他のクロストリジウムからの各遺伝子を、発現プラスミド（Ｕ．Ｓ．２０１１／０２３６９４１）上でクローニングした後、２−ブテン−１−オール、３−メチル−２−ブタノール、１，３−ヘキサンジオール（ＨＤＯ）の産生のための前の実施例からのＣ・オートエタノゲナム株ｐｔａ−ａｃｋ：：ｐｔｂ−ｂｕｋまたはＣＡＥＴＨＧ＿１５２４：：ｐｔｂ−ｂｕｋにおいて上述のとおり形質転換する。２−ブテン−１−オール、３−メチル−２−ブタノール、及び１，３−ヘキサンジオール（ＨＤＯ）は、さらなる下流産物のための前駆体であり得る。
【０３４８】
これらは単なるいくつかの例であり、この経路を、同じ酵素または、より長い鎖長について特異性を有するその操作多様体を使用してさらに伸長し、様々なＣ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４アルコール、ケトン、エノール、またはジオールを産生することができることが明白であるべきである（図３９）。他で記載されているように、チオラーゼステップにおけるアセチル−ＣｏＡとは異なるプライマーまたはエクステンダーユニットを使用することにより、異なるタイプの分子も得ることができる（Ｃｈｅｏｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、３４：５５６−５６１、２０１６）。
【０３４９】
本明細書において引用されている、刊行物、特許出願、及び特許を含む、すべての参考文献は、各参考文献が、参照により組み込まれていると個別かつ具体的に示され、その全体が本明細書において記載されているのと同程度に、ここで参照により組み込まれる。本明細書における従来技術の参照は、従来技術がいかなる国においても本発明分野における共通の一般知識の一部を形成するという認識としては解釈されず、されるべきではない。
【０３５０】
本発明について記載する文脈における（特に下記特許請求の範囲の文脈における）「ａ」及び「ａｎ」ならびに「ｔｈｅ」という用語、ならびに同様の指示物の使用は、本明細書において特に指示または文脈による明らかな矛盾がない限り、単数形及び複数形の両方を包含すると解釈されるものである。「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、特に指示がない限り、非限定的な用語（すなわち、「これらに限定されないが、〜を含む」を意味するもの）として解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、本明細書おいて特に指示がない限り、範囲内に該当する各々別々の値を個別に指す簡単な方法として機能することを意図し、各々別々の値は、本明細書において個別に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書において記載されているすべての方法は、本明細書において特に指示または文脈による明らかな矛盾がない限り、いずれかの適切な順序で行うことができる。本明細書において提供されているいずれか及びすべての例、または例示的な言葉（例えば、「〜のような」）の使用は、単に、本発明をより良く例示することを意図し、特に主張がない限り、本発明の範囲に制限を課さない。本明細書における言葉は、特許請求の範囲に含まれない要素も本発明の実施には必須であること示すものとは解釈されるべきではない。
【０３５１】
本発明の好ましい実施形態は、本明細書において記載されている。これらの好ましい実施形態の変形は、前述の説明を読めば当業者には明らかとなり得る。本発明者らは、当業者が必要に応じてこうした変形を使用することを予想しており、本発明者らは、本発明が本明細書において具体的に記載されているものとは別の方法で実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用法により認められているように、添付の特許請求の範囲において挙げられている本題のすべての変更及び同等物を含む。さらに、そのすべての可能な変形における上述の要素のいずれの組み合わせも、本明細書において特に指示または文脈による明らかな矛盾がない限り、本発明により包含される。
【図１】
2018530342.tif 000049
【図２】
2018530342.tif 000050
【図３】
2018530342.tif 000051
【図４】
2018530342.tif 000052
【図５】
2018530342.tif 000053
【図６】
2018530342.tif 000054
【図７】
2018530342.tif 000055
【図８】
2018530342.tif 000056
【図９】
2018530342.tif 000057
【図１０】
2018530342.tif 000058
【図１１】
2018530342.tif 000059
【図１２】
2018530342.tif 000060
【図１３Ａ】
2018530342.tif 000061
【図１３Ｂ】
2018530342.tif 000062
【図１３Ｃ】
2018530342.tif 000063
【図１３Ｄ】
2018530342.tif 000064
【図１３Ｅ】
2018530342.tif 000065
【図１３Ｆ】
2018530342.tif 000066
【図１４】
2018530342.tif 000067
【図１５】
2018530342.tif 000068
【図１６】
2018530342.tif 000069
【図１７Ａ】
2018530342.tif 000070
【図１７Ｂ】
2018530342.tif 000071
【図１８Ａ】
2018530342.tif 000072
【図１８Ｂ】
2018530342.tif 000073
【図１９】
2018530342.tif 000074
【図２０Ａ】
2018530342.tif 000075
【図２０Ｂ】
2018530342.tif 000076
【図２１Ａ】
2018530342.tif 000077
【図２１Ｂ】
2018530342.tif 000078
【図２２】
2018530342.tif 000079
【図２３Ａ】
2018530342.tif 000080
【図２３Ｂ】
2018530342.tif 000081
【図２３Ｃ】
2018530342.tif 000082
【図２３Ｄ】
2018530342.tif 000083
【図２４】
2018530342.tif 000084
【図２５】
2018530342.tif 000085
【図２６】
2018530342.tif 000086
【図２７】
2018530342.tif 000087
【図２８Ａ】
2018530342.tif 000088
【図２８Ｂ】
2018530342.tif 000089
【図２９Ａ】
2018530342.tif 000090
【図２９Ｂ】
2018530342.tif 000091
【図２９Ｃ】
2018530342.tif 000092
【図２９Ｄ】
2018530342.tif 000093
【図３０】
2018530342.tif 000094
【図３１】
2018530342.tif 000095
【図３２】
2018530342.tif 000096
【図３３】
2018530342.tif 000097
【図３４】
2018530342.tif 000098
【図３５】
2018530342.tif 000099
【図３６】
2018530342.tif 000100
【図３７】
2018530342.tif 000101
【図３８Ａ】
2018530342.tif 000102
【図３８Ｂ】
2018530342.tif 000103
【図３９】
2018530342.tif 000104
【図４０】
2018530342.tif 000105
【図４１】
2018530342.tif 000106
【図４２Ａ】
2018530342.tif 000107
【図４２Ｂ】
2018530342.tif 000108
【図４３】
2018530342.tif 000109
【図４４】
2018530342.tif 000110
【配列表】
2018530342000001.app
【国際調査報告】
2018530342.tif 000111
2018530342.tif 000112
2018530342.tif 000113
2018530342.tif 000114
2018530342.tif 000115
2018530342.tif 000116
2018530342.tif 000117