(57)【要約】  本開示は、ビタミン又は関連する薬剤（例えば葉酸）に連結した生分解性ポリマー（例えばデキストラン等の多糖類）から形成された粒状物に基づく製剤を含む、薬理学的に活性な試薬のための製剤を提供する。パクリタキセルの投与のために、疎水性の薬学的に活性な薬剤（例えば抗癌薬物、例えばパクリタキセル）が、多糖類−ビタミン共役体にカプセル化されている。活性薬剤は、粒子の表面上ではなく、粒状物のコア部分にある。前記活性薬剤を含む粒状物及び組成物を製造及び使用するための方法も開示される。特に、癌の診断及び治療の方法が提供される。
2018530606.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の多糖類−ビタミン共役体と、
前記複数の多糖類−ビタミン共役体に被包された活性薬剤と、
を含み、
前記複数の多糖類−ビタミン共役体のそれぞれは、多糖類分子と、前記多糖類分子に連結基を介した共有結合により共役したビタミン又は類似体若しくは誘導体の１以上の分子と、を含み、
前記活性薬剤は、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体の分子に非共有結合により結合されている、粒状物。
【請求項２】
前記粒状物の表面が実質的に親水性である、請求項１に記載の粒状物。
【請求項３】
前記活性薬剤が、前記粒状物のコア部分に入っている、請求項１に記載の粒状物。
【請求項４】
前記多糖類分子が、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体の１以上の分子のそれぞれに連結体分子を介して共役されており、
前記連結体分子は、前記多糖類分子の１以上の官能基又は官能化多糖類分子に対して反応性の第１の化学基と、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体の１以上の分子のそれぞれの１以上の官能基又はそれらの官能化分子に対して反応性の第２の化学基と、を含む、請求項１に記載の粒状物。
【請求項５】
前記多糖類−ビタミン共役体が、第１のビタミン又はその類似体若しくは誘導体と、前記第１のビタミン又はその類似体若しくは誘導体とは異なる第２のビタミン又はその類似体若しくは誘導体と、を含み、
前記第１のビタミン又はその類似体若しくは誘導体と、前記第２のビタミン又はその類似体若しくは誘導体とは、それぞれ、前記多糖類に前記多糖類の異なる位置で共有結合により連結されている、請求項１に記載の粒状物。
【請求項６】
前記ビタミンが、葉酸塩、コール酸、ニコチンアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルニコチンアミド、ビオチン、又はサリチル酸ナトリウムである、請求項１に記載の粒状物。
【請求項７】
前記多糖類が、水及び有機溶媒に可溶な多糖類である、請求項１に記載の粒状物。
【請求項８】
前記多糖類が、デキストラン若しくはその誘導体、セルロース若しくはその誘導体、カルボキシメチルセルロース、又はヒアルロン酸若しくはその誘導体である、請求項５に記載の粒状物。
【請求項９】
前記多糖類が、スクシニル化、カルボキシメチル化、及び／又は環式無水物による修飾がなされている、請求項１に記載の粒状物。
【請求項１０】
前記ビタミン又は類似体若しくは誘導体の１以上の分子が疎水性である、請求項１に記載の粒状物。
【請求項１１】
前記活性薬剤が疎水性である、請求項１に記載の粒状物。
【請求項１２】
前記活性薬剤が抗腫瘍薬である、請求項１に記載の粒状物。
【請求項１３】
前記活性薬剤が、タキサン化合物若しくはその類似体又はカンプトテシン化合物若しくはその類似体である、請求項１に記載の粒状物。
【請求項１４】
前記粒状物の平均直径が約２０ｎｍ〜約１０００ｎｍである、請求項１に記載の粒状物。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の粒状物と、薬学的に許容される担体又は添加剤と、を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、錠剤、カプセル、粉末、又は液体として製剤化されている、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
適切な溶媒又は薬学的に許容される注入用賦形剤を更に含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
溶液、エマルジョン、懸濁液、又はコロイドとして製剤化されている、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
約０．２μｍの平均細孔径の膜に通すことによって滅菌されている、請求項１７又は１８に記載の組成物。
【請求項２０】
局所的、腸内／胃腸内、腸管外、硬膜外、大脳内、脳室内、皮内、皮下内、経鼻、経口、静脈内、動脈内、筋肉内、骨髄内、硝子体内、嚢内、経皮的、又は経粘膜的な経路を介して対象に投与されるように構成されている、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の粒状物又は組成物。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の有効量の粒状物又は組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象を治療する方法。
【請求項２２】
前記活性薬剤が抗腫瘍薬である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記活性薬剤が、タキサン化合物若しくはその類似体又はカンプトテシン化合物若しくはその類似体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記活性薬剤を前記粒状物に被包することが、所与の量の前記活性薬剤に対する対象の応答性を変化させることは実質的にない、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記活性薬剤が、細胞毒性薬であり、前記対象の応答性が、前記細胞毒性薬の細胞毒性によって測定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の粒状物に被包されていない前記活性薬剤を投与することと比較して、前記活性薬剤に対する前記対象の耐用量を増加させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記対象が、癌又は腫瘍性の疾患又は症状を有している、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記癌が、非小細胞性肺癌又は乳癌細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
有効量の前記粒状物又は組成物を前記対象に投与することで、前記対象における腫瘍細胞の増殖を減少させる、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の有効量の粒状物又は組成物を細胞に送達することを含む、細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項３１】
前記細胞が癌細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞が、非小細胞性肺癌細胞又は乳癌細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
有効量の放射線で、それを必要とする対象を治療することと、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の有効量の粒状物又は組成物で、前記対象を治療することと、を含む、対象における腫瘍増殖を減少させる方法。
【請求項３４】
有効量の化学療法薬で、それを必要とする対象を治療することと、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の有効量の粒状物又は組成物で、前記対象を治療することと、を含む、対象における腫瘍増殖を減少させる方法。
【請求項３５】
有効量の生物学的に活性な治療薬で、それを必要とする対象を治療することと、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の有効量の粒状物又は組成物で、前記対象を治療することと、を含む、対象における腫瘍増殖を減少させる方法。
【請求項３６】
前記活性薬剤が、治療薬又は診断薬である、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の粒状物、組成物、又は方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年９月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／２３３１１２号に対する優先権を主張し、その内容全体が参照により援用される。
【０００２】
本開示は、一般に、抗癌治療薬を含む、薬理学的に活性な試薬のための化合物、薬物組成物、製剤、及び送達システム（ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ）に関する。いくつかの態様では、本開示は、修飾多糖類、治療試薬、及びナノキャリアを含む組成物に関する。いくつかの態様では、本開示は、化合物、薬物組成物、及び製剤を製造する方法、並びに、例えば癌治療においてそれらを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン等の臨床的に使用される抗癌薬物のほとんどが、難水溶性を有している。しばしば、これらの薬物は、患者に、例えば非経口的に直接投与することができない。例えば、パクリタキセル並びにその誘導体及び類似体の多くが、血管内投与に適合するほとんどの生理学的に許容される水性溶媒への溶解度が非常に低い。従って、医薬品添加剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）としての界面活性剤が、有効化合物のインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）送達を容易にするためにしばしば必要である。例えば、「Ｔａｘｏｔｅｒｅ」（登録商標）（サノフィ−アベンティス）は、エタノール及びクエン酸と共に、医薬品添加剤としてのポリソルベート８０を有するドセタキセルの製剤である。パクリタキセル製剤「Ｔａｘｏｌ」（登録商標）（ブリストル−マイヤーズ  スクイブ）は、ポリオキシエチル化ヒマシ油である「Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ」（登録商標）ＥＬを用いて製剤化されている。この製剤は、５０％（ｖ／ｖ）アルコールの他に８８倍過剰の「Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ」（登録商標）ＥＬを含有しており、これが重大な副作用を誘発する可能性がある。パクリタキセル製剤の急性及び一般的な臨床副作用は深刻であり、呼吸困難、低血圧症、血管性浮腫、全身性蕁麻疹、及び最も顕著なアナフィラキシー様反応が挙げられ、致命的な転帰となるおそれがある。更に、「Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ」（登録商標）ＥＬの高い濃度は、「可塑剤」、即ち、使い捨て可能な輸液バッグ及びチューブセットの製造に使用される化学物質を輸液剤中に漏出し易くする。これらの化学物質に曝される患者の長期的リスクは不明である。従って、これらの薬物製剤中の医薬品添加剤は、アレルギー、腎毒性、神経、及び心毒性等の重篤な副作用を引き起こす可能性があり、状況次第では、ジフェンヒドラミン、Ｈ２−拮抗薬、更にはコルチコステロイドによる前投薬が義務づけられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、危険を伴う副作用を緩和し、従来の用量療法と高用量化学療法の両方でより均一な薬物供給を提供するために、抗癌薬物の代替できる薬物組成物及び製剤が必要とされている。本開示は、この必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
１つの態様では、本開示は、複数の多糖類−ビタミン共役体と、複数の多糖類−ビタミン共役体に被包された活性薬剤と、を含む粒状物を提供し、ここで、複数の多糖類−ビタミン共役体のそれぞれは、多糖類分子と、該多糖類分子に連結基を介して共有結合により共役したビタミン又は類似体若しくは誘導体の１以上の分子と、を含み、活性薬剤は、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体の分子に非共有結合により結合されている。
【０００６】
任意に、粒状物の表面は、実質的に親水性である。
【０００７】
任意に、活性薬剤は、粒状物のコア部分にある。
【０００８】
任意に、多糖類分子は、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体の１以上の分子のそれぞれに連結体分子を介して共役されており、該連結体分子は、該多糖類分子の１以上の官能基又は官能化多糖類分子に対して反応性の第１の化学基と、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体の１つ以上の分子のそれぞれの１以上の官能基又はそれらの官能化分子に対して反応性の第２の化学基とを含む。
【０００９】
任意に、多糖類−ビタミン共役体は、第１のビタミン又はその類似体若しくは誘導体と、第１のビタミン又はその類似体若しくは誘導体とは異なる第２のビタミン又はその類似体若しくは誘導体とを含み、ここで、第１のビタミン又はその類似体若しくは誘導体と、第２のビタミン又はその類似体若しくは誘導体とは、それぞれ、多糖類に該多糖類の異なる位置で共有結合により連結されている。
【００１０】
任意に、ビタミンは、葉酸塩、コール酸、ニコチンアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルニコチンアミド、ビオチン、又はサリチル酸ナトリウムである。
【００１１】
任意に、多糖類は、水及び有機溶媒に可溶な多糖類である。
【００１２】
任意に、多糖類は、デキストラン若しくはその誘導体、セルロース若しくはその誘導体、カルボキシメチルセルロース、又はヒアルロン酸若しくはその誘導体である。
【００１３】
任意に、多糖類は、スクシニル化、カルボキシメチル化及び／又は環式無水物による修飾がなされている。
【００１４】
任意に、ビタミン又は類似体若しくは誘導体の１以上の分子は、疎水性である。
【００１５】
任意に、活性薬剤は疎水性である。
【００１６】
任意に、活性薬剤は抗腫瘍薬である。
【００１７】
任意に、活性薬剤は、タキサン化合物若しくはその類似体又はカンプトテシン化合物若しくはその類似体である。
【００１８】
任意に、粒状物の平均直径は、約２０ｎｍ〜約１０００ｎｍである。
【００１９】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される粒状物と、薬学的に許容される担体又は医薬品添加剤と、を含む医薬組成物を提供する。
【００２０】
任意に、組成物は、錠剤、カプセル、粉末、又は液体として製剤化されている。
【００２１】
任意に、医薬組成物は、適切な溶媒又は薬学的に許容される注入用賦形剤（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｖｅｈｉｃｌｅ）を更に含む。
【００２２】
任意に、医薬組成物は、溶液、エマルジョン、懸濁液、又はコロイドとして製剤化されている。
【００２３】
任意に、医薬組成物は、約０．２μｍの平均細孔径の膜に通すことによって滅菌されている。
【００２４】
任意に、本明細書に記載される粒状物又は組成物は、局所的、腸内／胃腸内、腸管外、硬膜外、大脳内、脳室内、皮内、皮下内、経鼻、経口、静脈内、動脈内、筋肉内、骨髄内、硝子体内、嚢内、経皮的、又は経粘膜的な経路を介して対象に投与されるように構成されている。
【００２５】
別の態様では、本開示は、対象を治療する方法であって、本明細書に記載される有効量の粒状物又は組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【００２６】
任意に、活性薬剤は抗腫瘍薬である。
【００２７】
任意に、活性薬剤は、タキサン化合物若しくはその類似体又はカンプトテシン化合物若しくはその類似体である。
【００２８】
任意に、活性薬剤を粒状物に被包することが、所与の量の活性薬剤に対する対象の応答性を変化させることは実質的にない。
【００２９】
任意に、活性薬剤は細胞毒性薬であり、対象の応答性は、該細胞毒性薬の細胞毒性によって測定される。
【００３０】
任意に、この方法は、粒状物に被包されていない活性薬剤を投与することと比較して、活性薬剤に対する対象の耐用量を増加させる。
【００３１】
任意に、対象は、癌又は腫瘍性の疾患又は症状を有している。
【００３２】
任意に、癌は、非小細胞性肺癌又は乳癌細胞である。
【００３３】
任意に、本明細書に記載される有効量の粒状物又は組成物を対象に投与することで、対象における腫瘍細胞の増殖を減少させる。
【００３４】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される有効量の粒状物又は組成物を細胞に送達することを含む、細胞の増殖を阻害する方法を提供する。
【００３５】
任意に、細胞は癌細胞である。
【００３６】
任意に、細胞は、非小細胞性肺癌細胞又は乳癌細胞である。
【００３７】
別の態様では、本発明は、有効量の放射線で、それを必要とする対象を治療することと、本明細書に記載される有効量の粒状物又は組成物で対象を治療することと、を含む、対象における腫瘍増殖を減少させる方法を提供する。
【００３８】
別の態様では、本発明は、有効量の化学療法薬で、それを必要とする対象を治療することと、本明細書に記載される有効量の粒状物又は組成物で対象を治療することと、を含む、対象における腫瘍増殖を減少させる方法を提供する。
【００３９】
別の態様では、本発明は、有効量の生物学的に活性な治療薬で、それを必要とする対象を治療することと、本明細書に記載される有効量の粒状物又は組成物で対象を治療することと、を含む、対象における腫瘍増殖を減少させる方法を提供する。
【００４０】
任意に、活性薬剤は、治療薬又は診断薬である。
【００４１】
１つの態様では、本明細書に開示されるのは、シェル−コア構造を有する粒状物（例えばマイクロ粒子）であって、該粒状物は、多糖類−ビタミン共役体を含むシェルと、該シェルに取り込まれた活性薬剤を含むコアとを含み、該多糖類−ビタミン共役体は、多糖類に共有結合により連結したビタミン又はその類似体若しくは誘導体の１以上の分子を含み、ここで、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体の１以上の分子は、コアと多糖類との間に位置する。
【００４２】
１つの実施形態では、多糖類は、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体の１以上の分子のそれぞれに連結体分子を介して共役されており、該連結体分子は、該多糖類の１以上の官能基に対して反応性の第１の化学基と、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体の１以上の分子のそれぞれの１以上の官能基に対して反応性の第２の化学基と、を含む。
【００４３】
１つの実施形態では、多糖類−ビタミン共役体は、第１のビタミン又はその類似体若しくは誘導体と、第１のビタミン又はその類似体若しくは誘導体とは異なる第２のビタミン又はその類似体若しくは誘導体と、を含み、ここで、第１のビタミン又はその類似体若しくは誘導体と、第２のビタミン又はその類似体若しくは誘導体とは、それぞれ、多糖類に該多糖類の異なる位置で共有結合により連結されている。
【００４４】
１つの実施形態では、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体の１以上の分子は、本開示の粒状物（例えばマイクロ粒子）のシェルの内面に配置されていてもよい。本明細書に記載される実施形態のいずれにおいても、ビタミンは、葉酸塩、ニコチンアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルニコチンアミド、ビオチン、又はサリチル酸ナトリウムであり得る。別の実施形態では、ビタミンは、修飾されていてもよい。本明細書に開示される実施形態のいずれにおいても、ビタミンは、アミノ化によって修飾されていてよい。
【００４５】
１つの実施形態では、多糖類は、有機溶媒に可溶な多糖類である。
【００４６】
１つの態様では、多糖類は、本開示の粒状物（例えばマイクロ粒子）中でのデキストラン若しくはその誘導体、セルロース若しくはその誘導体、カルボキシメチルセルロース、又はヒアルロン酸若しくはその誘導体であり得る。別の態様では、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体の１以上の分子は、本明細書に開示される実施形態のいずれにおいても、連結基を介して多糖類に共有結合により連結されていてよい。連結基は、ジスルフィド結合、エステル結合、γ−グルタミル−ε−リジン結合、及び／又はジアゾ結合であってもよく、あるいはそれらを含んでいてもよい。更に別の実施形態では、多糖類は、スクシニル化、カルボキシメチル化、及び／又は環式無水物による修飾がなされていてもよい。
【００４７】
本明細書に開示される実施形態のいずれにおいても、好ましくは、活性薬剤は、疎水性である。１つの態様では、活性薬剤は、抗腫瘍薬、例えば抗癌薬物であり得る。別の態様では、活性薬剤は、パクリタキセル若しくはその誘導体、ドセタキセル若しくはその誘導体、又はドキソルビシン若しくはその誘導体であり得る。更に別の態様では、活性薬剤は、多糖類−ビタミン共役体に共有結合により連結されていない。
【００４８】
本明細書に開示される実施形態のいずれにおいても、本開示の粒状物は、マイクロ粒子であり得る。本明細書に開示される実施形態のいずれにおいても、本開示の粒状物は、ナノ粒子であり得る。ある特定の態様では、粒状物の平均直径は、約２０ｎｍ〜約１０００ｎｍ、例えば、２０ｎｍ〜１００ｎｍ、１００ｎｍ〜２００ｎｍ、１００ｎｍ〜４００ｎｍ、又は４００ｎｍ〜１０００ｎｍであり得る。ある特定の態様では、粒状物の平均直径は、約２０ｎｍ〜約２００ｎｍの間であり得る。特定の他の態様では、粒状物の平均直径は、約２０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約１５０ｎｍ、又は約１５０ｎｍ〜約２００ｎｍであり得る。
【００４９】
本明細書に更に開示されるのは、シェル−コア構造を有する粒状物（例えばマイクロ粒子）を含む組成物であって、該粒状物は、多糖類−ビタミン共役体を含むシェルと、該シェルに取り込まれた活性薬剤を含むコアと、を含み、該多糖類−ビタミン共役体は、多糖類に共有結合により連結したビタミン又はその類似体若しくは誘導体の１以上の分子を含み、ここで、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体の１以上の分子は、コアと多糖類との間に位置する。
【００５０】
ある特定の実施形態では、多糖類は、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体の１以上の分子のそれぞれに連結体分子を介して共役されており、該連結体分子は、該多糖類の１以上の官能基に対して反応性の第１の化学基と、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体の１以上の分子のそれぞれの１以上の官能基に対して反応性の第２の化学基と、を含む。
【００５１】
ある特定の実施形態では、多糖類−ビタミン共役体は、第１のビタミン又はその類似体若しくは誘導体と、第１のビタミン又はその類似体若しくは誘導体とは異なる第２のビタミン又はその類似体若しくは誘導体と、を含み、ここで、第１のビタミン又はその類似体若しくは誘導体と、第２のビタミン又はその類似体若しくは誘導体とは、それぞれ、多糖類に該多糖類の異なる位置で共有結合により連結されている。
【００５２】
ある特定の実施形態では、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体の１以上の分子は、シェルの内面に配置されていてもよい。ある特定の実施形態では、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体の１以上の分子は、シェルの外面に配置されていない。ある特定の他の実施形態では、ビタミンは、葉酸塩、ニコチンアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルニコチンアミド、ビオチン、又はサリチル酸ナトリウムであり得る。ある特定の態様では、ビタミンは、修飾されていてもよい。本明細書に開示される実施形態のいずれにおいても、ビタミンは、アミノ化によって修飾されていてよい。
【００５３】
ある特定の実施形態では、多糖類は、有機溶媒に可溶な多糖類である。
【００５４】
本明細書に開示される実施形態のいずれにおいても、組成物の多糖類は、デキストラン若しくはその誘導体、セルロース若しくはその誘導体、カルボキシメチルセルロース、又はヒアルロン酸若しくはその誘導体であり得る。１つの態様では、本明細書に開示される組成物のビタミン又はその類似体若しくは誘導体の１つ以上の分子は、連結基を介して多糖類に共有結合により連結されていてよく、該連結基は、ジスルフィド結合、エステル結合、γ−グルタミル−ε−リジン結合及び／又はジアゾ結合を含んでいてもよい。１つの実施形態では、多糖類は、スクシニル化、カルボキシメチル化及び／又は環式無水物による修飾がなされていてもよい。
【００５５】
本明細書に開示される組成物の実施形態のいずれにおいても、活性薬剤は、疎水性であり得る。１つの態様では、活性薬剤は、抗腫瘍薬、例えば抗癌薬物であり得る。別の態様では、活性薬剤は、パクリタキセル若しくはその誘導体、ドセタキセル若しくはその誘導体、又はドキソルビシン若しくはその誘導体であり得る。更に別の態様では、活性薬剤は、多糖類−ビタミン共役体に共有結合により連結されていない。
【００５６】
本明細書に開示される実施形態のいずれにおいても、本開示の粒状物は、マイクロ粒子であり得る。本明細書に開示される組成物の実施形態のいずれにおいても、粒状物は、ナノ粒子であり得る。ある特定の態様では、粒状物の平均直径は、約２０ｎｍ〜約１０００ｎｍ、例えば、２０ｎｍ〜１００ｎｍ、１００ｎｍ〜２００ｎｍ、１００ｎｍ〜４００ｎｍ、又は４００ｎｍ〜１０００ｎｍであり得る。ある特定の態様では、粒状物の平均直径は、約２０ｎｍ〜約２００ｎｍの間であり得る。特定の他の態様では、粒状物の平均直径は、約２０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約１５０ｎｍ、又は約１５０ｎｍ〜約２００ｎｍであり得る。
【００５７】
本明細書に開示される実施形態のいずれにおいても、組成物は、薬学的に許容される担体又は医薬品添加剤を更に含んでいてよい。１つの態様では、組成物は、錠剤、カプセル、粉末、又は液体として製剤化されていてもよい。別の態様では、組成物は、適切な溶媒又は薬学的に許容される注入用賦形剤を更に含んでいてもよい。特定の実施形態では、組成物は、溶液、エマルジョン、懸濁液、又はコロイドとして製剤化されていてもよい。ある特定の態様では、組成物は、約０．２μｍの平均細孔径の膜に通すことによって滅菌されていてもよいし、又は他の滅菌プロセスによって滅菌されていてもよい。ある特定の態様では、粒状物（例えばマイクロ粒子）又は組成物は、濾過、放射線、加熱、若しくはエチレンオキシド処理、又はそれらを任意の適切な順序で任意に組み合わせることによって滅菌されていてもよい。好ましい実施形態では、膜の通過及び他の滅菌プロセスは、粒状物の粒径を実質的に変化させない。他の好ましい実施形態では、滅菌法は、粒径を約２００ｎｍ未満に保つ。
【００５８】
本明細書に開示される実施形態のいずれにおいても、組成物は、凍結保護物質を更に含んでいてよい。特定の実施形態では、凍結保護物質は、糖であり得る。ある特定の実施形態では、糖は、スクロース又はトレハロースであり得る。
【００５９】
本明細書に開示される実施形態のいずれにおいても、組成物は、凍結乾燥に供してよい。１つの態様では、粒状物（例えばマイクロ粒子）の平均直径は、凍結乾燥中又は凍結乾燥後に実質的に変化せず、且つ粒状物は、凍結乾燥工程中、凍結乾燥後、又は再構成後に凝集しない。１つの実施形態では、粒状物（例えば、マイクロ粒子）の平均直径は、凍結乾燥工程中、凍結乾燥後、又は再構成後に約２００ｎｍ未満であり、且つ粒状物は、凍結乾燥工程中、凍結乾燥後、又は再構成後に凝集しない。他の好ましい実施形態では、凍結乾燥工程は、粒状物のサイズを約２００ｎｍ未満に保つ。本明細書に開示される実施形態のいずれにおいても、組成物は、薬学的に許容される担体又は医薬品添加剤への該組成物のその後の再懸濁又は溶解のために容器中で凍結乾燥粉末又は凍結乾燥ケーキ（ｌｙｏ−ｃａｋｅ）として製剤化することができる。
【００６０】
前述の実施形態のいずれにおいても、本開示の粒状物（例えばマイクロ粒子）又は組成物は、局所的、腸内／胃腸内、腸管外、硬膜外、大脳内、脳室内、皮内、皮下内、経鼻、経口、静脈内、動脈内、筋肉内、骨髄内、硝子体内、嚢内、経皮的、又は経粘膜的な経路を介して対象に投与されるように構成されることができる。
【００６１】
前述の実施形態のいずれかの粒状物（例えばマイクロ粒子）を含む組成物を調製する方法も開示される。１つの態様では、この方法は、多糖類に共有結合により連結したビタミン又はその類似体若しくは誘導体の１以上の分子を含む多糖類−ビタミン共役体を準備することと、多糖類−ビタミン共役体と活性薬剤とを適切な溶媒中で組み合わせるか、又は多糖類−ビタミン共役体の溶液と活性薬剤の溶液とを組み合わせることと、多糖類−ビタミン共役体と活性薬剤との混合物を高せん断ホモジナイザーに供して多糖類−ビタミン共役体と活性薬剤とを含む粒状物（例えばマイクロ粒子）を含む組成物を形成することとを含み、ここで、活性薬剤は、多糖類−ビタミン共役体によって形成されたシェルに取り込まれており、且つビタミン又はその類似体若しくは誘導体の１以上の分子は、活性薬剤と多糖類との間に位置する。
【００６２】
特定の態様では、多糖類−ビタミン共役体と活性薬剤との混合物は、約１０，０００〜約３０，０００ｐｓｉ（ポンド／平方インチ）の範囲の圧力下で高せん断ホモジナイザーに供することができる。ある特定の実施形態では、多糖類−ビタミン共役体の溶液と活性薬剤の溶液とは混和性である。本明細書に開示される実施形態のいずれにおいても、多糖類−ビタミン共役体の溶液と活性薬剤の溶液とを組み合わせることで、エマルジョン、例えばマイクロエマルジョンを得ることができる。
【００６３】
本明細書に開示される方法の実施形態のいずれにおいても、該方法は、ダイアフィルトレーション、濾過、溶媒蒸発、若しくは遠心分離、又はそれらの任意の組合せによって、粒状物（例えばマイクロ粒子）を任意の適切な順序で単離することを更に含むことができる。前述の実施形態のいずれにおいても、該方法は、共溶媒の添加、続いてダイアフィルトレーションによって粒状物（例えばマイクロ粒子）を単離することを更に含むことができる。ある特定の態様では、共溶媒は、脱イオン水であってもよい。前述の実施形態のいずれにおいても、該方法は、精製工程及び／又は滅菌工程を更に含むことができる。ある特定の態様では、精製工程及び／又は滅菌工程は、粒状物を適切な溶媒で洗浄すること、及び／又は０．２μｍの平均細孔径の膜に通して粒状物を濾過することを含むことができる。前述の実施形態のいずれにおいても、該方法は、凍結保護物質の存在下での乾燥工程及び／又は凍結乾燥工程を更に含むことができる。特定の実施形態では、凍結乾燥工程は、粒状物を実質的に凝集させないか、又は粒状物の平均直径を実質的に変化させない。１つの実施形態では、粒状物の平均直径は、約２００ｎｍ未満であり、且つ凍結乾燥工程中、凍結乾燥後、又は再構成後に約２００ｎｍ未満のままである。本明細書に開示される実施形態のいずれにおいても、凍結乾燥工程後の組成物は、凍結乾燥ケーキ又は凍結乾燥粉末として製剤化することができる。
【００６４】
本明細書に更に開示されるのは、該方法の前述の実施形態のいずれかの生成物である。
【００６５】
本開示は、本明細書に開示される実施形態のいずれかの有効量の粒状物（例えばマイクロ粒子）又は組成物を対象に投与することを含む、対象を治療する方法も提供する。１つの態様では、粒状物又は組成物中に含まれる活性薬剤は、抗腫瘍薬であり得る。特定の実施形態では、活性薬剤は、パクリタキセル若しくはその誘導体、ドセタキセル若しくはその誘導体、又はドキソルビシン若しくはその誘導体であり得る。ある特定の態様では、活性薬剤を粒状物に取り込むことが、所与の量の活性薬剤に対する対象の応答性を変化させることは実質的にない。他の態様では、活性薬剤は、細胞毒性薬であり、対象の応答性は、該細胞毒性薬の細胞毒性によって測定することができる。他の態様では、対象を治療するこの方法は、本開示の粒状物に取り込まれていない活性薬剤を投与することと比較して、活性薬剤に対する対象の耐用量を増加させる。
【００６６】
本明細書に開示される方法の実施形態のいずれにおいても、対象は、癌又は腫瘍性の疾患若しくは症状、又は腫瘍症候群を有し得る。特定の実施形態では、癌は非小細胞性肺癌又は乳癌細胞であり得る。ある特定の態様では、有効量の粒状物（マイクロ粒子）又は組成物を対象に投与することで、対象における腫瘍細胞の増殖を減少させることができる。
【００６７】
本開示は、本明細書に開示される実施形態のいずれかの有効量の粒状物（例えばマイクロ粒子）又は組成物を細胞に送達することを含む、細胞の増殖を阻害する方法も提供する。１つの実施形態では、細胞は、癌細胞であり得る。１つの態様では、細胞は、非小細胞性肺癌細胞又は乳癌細胞であり得る。
【００６８】
本開示は、有効量の放射線と本明細書に開示される実施形態のいずれかの粒状物（例えばマイクロ粒子）又は組成物との組合せで対象を治療することを含む、対象における腫瘍増殖を減少させる方法を更に提供する。それに、対象における腫瘍増殖を減少させる方法であって、有効量の放射線で、それを必要とする対象を治療することと、有効量の本明細書に開示される実施形態のいずれかの粒状物又は組成物で対象を治療することと、を含む方法も提供される。
【００６９】
ある特定の他の態様では、本明細書に提供されるのは、有効量の化学療法薬と本明細書に開示される実施形態のいずれかの粒状物（例えばマイクロ粒子）又は組成物との組合せで対象を治療することを含む、対象における腫瘍増殖を減少させる方法である。それに、対象における腫瘍増殖を減少させる方法であって、有効量の化学療法薬で、それを必要とする対象を治療することと、本明細書に開示される実施形態のいずれかの有効量のマイクロ粒子又は組成物で対象を治療することと、を含む方法も提供される。
【００７０】
更に別の態様では、有効量の生物学的に活性な治療薬と本明細書に開示される実施形態のいずれかの粒状物（例えばマイクロ粒子）又は組成物との組合せで対象を治療することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を減少させる方法が開示される。それに、対象における腫瘍増殖を減少させる方法であって、有効量の生物学的に活性な治療薬で、それを必要とする対象を治療することと、本明細書に開示される実施形態のいずれかの有効量のマイクロ粒子又は組成物で対象を治療することと、を含む方法も提供される。
【００７１】
本明細書に開示される粒状物、組成物、工程、生成物、又は方法の実施形態のいずれにおいても、粒状物に取り込まれた活性薬剤は、治療薬又は診断薬であり得る。
【００７２】
以下の図面は、開示される様々な実施形態による例示目的のための単なる例であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１Ａ】本開示のある特定の実施形態による製剤の調製を示す図であって、スクシニル化１，６デキストランの合成を概略的に示す図である。
【図１Ｂ】本開示のある特定の実施形態による製剤の調製を示す図であって、スクシニル化１，３デキストランの合成を概略的に示す図である。
【図１Ｃ】本開示のある特定の実施形態による製剤の調製を示す図であって、アミノ葉酸の合成を概略的に示す図である。
【図１Ｄ】本開示のある特定の実施形態による製剤の調製を示す図であって、図１Ｂ及び図１Ｃの生成物を連結してデキストラン−葉酸共役体を形成する反応を概略的に示す図である。
【図２】本開示のいくつかの実施形態による、マイクロ粒子を含む製剤を調製するための被包過程を例示するフローチャートを示す図である。
【図３】本開示の特定の実施形態による、凍結乾燥ケーキを含有するバイアルを示す図である。
【図４Ａ】本開示のある特定の実施形態による製剤についての、体重減少に基づくｉｎ  ｖｉｖｏ毒性評価を示す図である。
【図４Ｂ】異種移植モデルにおいてヒト非小細胞性肺癌細胞を使用した、本開示のある特定の実施形態による製剤の抗腫瘍活性を示す図である。
【図５Ａ】本開示のある特定の実施形態による製剤の調製を示す図であって、スクシニル化デキストランの合成を概略的に示す図である。
【図５Ｂ】本開示のある特定の実施形態による製剤の調製を示す図であって、葉酸−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２の合成を概略的に示す図である。
【図５Ｃ】本開示のある特定の実施形態による製剤の調製を示す図であって、図５Ａ及び図５Ｂの生成物を連結してデキストラン−コハク酸と葉酸−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２との共役体を形成する共役反応を概略的に示す図である。
【図６】エチレンジアミンによるコール酸の修飾を概略的に示す図である。
【図７】デキストラン−コハク酸−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−コール酸の合成を概略的に示す図である。
【図８】エチレンジアミンによるレチノイン酸の修飾を概略的に示す図である。
【図９】デキストラン−コハク酸−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−レチノイン酸の合成を概略的に示す図である。
【図１０】デキストラン−葉酸−コール酸共役体の合成を概略的に示す図である。
【図１１】エチレンジアミンによるトコフェロールコハク酸の修飾を概略的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
詳細な説明
特許請求される主題の１以上の実施形態の詳細な説明を、特許請求される主題の原理を例示する添付の図面と一緒に以下に提供する。特許請求される主題は、そのような実施形態に関連して説明されるが、任意の実施形態に限定されない。特許請求される主題は、様々な形態で実施することができ、多数の代替物、修正物、及び均等物を包含すると理解されたい。それ故、本明細書に開示される具体的な詳細は、限定するものとして解釈されるべきではなく、特許請求の範囲の基礎として、及び特許請求される主題を事実上任意の適切な詳細なシステム、構造、又は手法で用いることを当業者に教示するための代表的な基礎として解釈されるべきである。本明細書に提供されるこれらの詳細は、例示の目的のためであり、特許請求される主題は、これらの具体的な詳細の一部又は全部を伴わずに、特許請求の範囲に従って実施することができる。特許請求される主題の範囲から逸脱することなく、他の実施形態を使用することができ、構造の変更を行うことができると理解されたい。分かりやすくする意味で、特許請求される主題に関連する技術分野において知られている技術資料は、特許請求される主題が不必要に不明瞭にならないように詳細には記載していない。
【００７５】
他に定義されない限り、本明細書で使用される技術分野、表記、並びに他の技術用語及び科学用語又は専門用語の全ての用語は、特許請求される主題が関係する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有していることが意図される。場合によっては、一般的に理解される意味の用語は、明確にするために及び／又はすぐに参照できるように本明細書で定義され、そのような定義を本明細書に含めることが、当該技術分野において一般的に理解されているものと実質的な相違を表していると必ずしも解釈されるべきではない。
【００７６】
本出願及び参考文献及び添付書類で言及される、特許文書、科学論文、及びデータベースを含む全ての刊行物は、あたかも個々の刊行物が個別に参照により援用されているのと同程度に、あらゆる目的のためにその全体が参照により援用される。本明細書に記載される定義が、参照により本明細書に援用される特許、出願、公開出願、及び他の刊行物に記載される定義と相容れないか、さもなければ矛盾している場合、本明細書に記載される定義が、参照により本明細書に援用される定義よりも優先される。
【００７７】
提供される実施形態の実施は、特に明記しない限り、有機化学、ポリマー化学、及び技術（特に、多糖類化学及び技術）、分子生物学、細胞生物学、及び生化学の従来の技術及び説明を使用することになり、これらは、当業者がその実施をすることができる技能の範囲内である。そのような技術には、多糖類の合成及び／又は修飾、並びに粒状物、ナノ粒子を含むマイクロ粒子の調製が含まれる。適切な技術の具体的な実例は、本明細書の実施例を参照することにより得ることができる。しかしながら、他の同等の従来の手順も当然のことながら使用することができる。そのような従来の技術及び説明は、標準的な実験室用マニュアル、例えばＳｔａｒｃｈ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｗｈｉｓｔｌｅｒ，ＢｅＭｉｌｌｅｒ，  ａｎｄ  Ｐａｓｃｈａｌｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８４及びＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．ＩＶ，  Ｅｄ．Ｗｈｉｓｔｌｅｒ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９６４に見出すことができ、これらのいずれも、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に援用される。米国特許第５９７７３４８号明細書、米国特許出願第２０１３０１４９３８５号明細書及び米国特許第６６８９３３８号明細書も、多糖類の合成及び／若しくは修飾、又は粒状物（例えばマイクロ粒子）の調製の方法を開示している。これらの３つの特許公報はすべて、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に援用される。
【００７８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明確に別途示されない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「ある（ａ）」又は「ある（ａｎ）」は、「少なくとも１つ」又は「１つ以上」を意味する。従って、「糖」への言及は、１以上の種類の糖を指すことができ、「方法」への言及には、本明細書に開示される、及び／又は当業者に知られている等価な工程及び方法等への言及が含まれる。
【００７９】
この開示を通じて、特許請求される主題の様々な態様が、範囲形式で提示される。範囲形式の記載は、単に便宜上及び簡潔さのためのものであり、特許請求される主題の範囲に対して柔軟性を欠いた限定として解釈されるべきではないと理解されたい。従って、ある範囲の記載は、その範囲内の全ての可能な部分範囲の他に個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、ある範囲の値が与えられている場合、その範囲の上限値と下限値との間に介在する各値と、その規定範囲における任意の他の規定値又は介在値とは、特許請求される主題内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、独立して、より小さい範囲に含まれていてもよく、規定範囲における任意の具体的に除外された限界値を条件として、特許請求される主題内に包含されていてもよい。規定された範囲に、限界値の１つ又は両方が含まれる場合、それらの含まれる限界値のいずれか一方又は両方を除外した範囲も、特許請求される主題に含まれる。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【００８０】
本明細書で使用される「約」という用語は、この技術分野の当業者に既知のそれぞれの値に対する通常の誤差範囲を指す。本明細書における値又はパラメーターの「約」への言及は、その値又はパラメーター自体に向けられた実施形態を含む（及び記載する）。
【００８１】
本明細書中で使用される場合、「個体」は、ヒト及び他の哺乳動物を含む任意の生物体であり得る。本明細書で使用される「対象」は、提供される組成物、方法、キット、デバイス、及びシステムを投与又は適用することができる生物体であり得る。１つの実施形態では、対象は、哺乳動物又は細胞、組織、臓器若しくは哺乳動物の一部であり得る。哺乳動物には、ヒト、並びに家畜、スポーツ動物、げっ歯類、及びペットを含む非ヒト動物が含まれるが、これらに限定されない。本開示のある特定の態様では、生物学的サンプル又は材料は、入手及び使用することができ、生きた源若しくはウイルス源若しくは他の巨大分子源、及び生体分子源から得られる任意のサンプル又は材料を指すことができ、且つ核酸若しくはタンパク質若しくは他の巨大分子が得られる対象の任意の細胞型又は組織を含む。生物学的サンプルは、生物学的供給源から直接得られるサンプル又は処理されたサンプルであってもよい。例えば、増幅され単離された核酸が、生物学的サンプルの構成要素となる。生物学的サンプルには、体液、例えば動物及び植物由来の血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿、及び汗、組織及び器官サンプル、並びにそれらより誘導された処理サンプルが含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「組成物」は、２以上の生成物又は化合物の任意の混合物であり得る。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性、又はそれらの任意の組合せであり得る。
【００８３】
「難水溶性」又は「疎水性」という用語は、周囲温度及び周囲圧力下で並びに約ｐＨ７で約３０ｍｇ／ｍｌ未満、約１０ｍｇ／ｍＬ未満、又は約１ｍｇ／ｍＬ未満の水溶性を指すことができる。例えば、これは、「やや難溶性」、「わずかに可溶性」、「ごくわずかに可溶性」、「実質的に不溶性」、及び「不溶性」という用語を一般的に使用することによって特徴づけられるビタミン、多糖類−ビタミン共役体及び／又は治療薬であり、これらは全て本明細書で互換的に使用される。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「生物学的活性」は、化合物若しくは組成物のｉｎ  ｖｉｖｏ活性、又は化合物、組成物、若しくは他の混合物のｉｎ  ｖｉｖｏ投与に起因する生理学的反応を含むことができる。従って、生物学的活性は、そのような化合物、組成物及び混合物の治療効果及び薬剤活性を含むことができる。生物学的活性は、そのような活性を試験又は使用するように設計されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ系で観察することができる。
【００８５】
「結合」という用語は、分子が互いに非常に近接している安定した会合をもたらす２つの分子間の吸引相互作用を指すことができる。分子結合は、以下の種類に分類することができる：非共有、可逆的共有、及び不可逆共有による結合。分子結合に関与することができる分子には、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、及び医薬化合物等の有機小分子が含まれる。他の分子と安定した複合体を形成するタンパク質は、しばしば受容体（レセプター）と呼ばれる一方で、それらの結合パートナーは、リガンドと呼ばれる。
【００８６】
ビタミン又はビタミン部分は、本明細書で使用される場合、ビタミン及び関連する薬剤、その誘導体、及びその類似体を指すことができ、これらは全て、文脈に応じて、ビタミンの所望の機能若しくは活性を所有又は実質的に保持する。同様に、多糖類又は多糖類部分は、多糖類、その誘導体、その類似体、及び文脈に応じて、多糖類の所望の機能若しくは活性を所有又は実質的に保持する他の関連する薬剤を指すことができる。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「連結体分子」という用語は、多糖類の１以上の官能基に対して反応性の第１の化学基と、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体の１以上の官能基に対して反応性の第２の化学基と、を有する分子を指す。任意に、連結体分子は、第１の化学基と第２の化学基との間に少なくとも１つの原子を更に含む。任意に、連結体分子は、第１の化学基と第２の化学基との間にスペーサーを更に含む。
【００８８】
化学療法は、癌の制御及び治癒に対する主要なアプローチの１つであった。従来の癌化学療法の多くの場合において、癌細胞の死滅の線形増加を得るために、指数関数的に投与される細胞毒性薬の量を増加させることがしばしば必要である。バイスタンダー、健康な細胞の非特異的細胞毒性の望ましくない増加は、しばしば患者の全体的な症状を悪化させる。多くの場合において、細胞毒素のより少ない用量を繰り返し送達することがしばしば必要であり、これは、必然的に薬剤耐性細胞がほんのわずかに生き残ることにつながる。更に、細胞毒性薬物による癌細胞以外の細胞に対する非選択的作用が、依然として大きな問題である。
【００８９】
活性薬剤を被包する粒状物
１つの態様では、本開示は、複数の多糖類−ビタミン共役体と、複数の多糖類−ビタミン共役体に被包された活性薬剤と、を含む粒状物を提供する。いくつかの実施形態では、複数の多糖類−ビタミン共役体のそれぞれは、多糖類分子と、該多糖類分子に連結基を介して共有結合により共役したビタミン又は類似体若しくは誘導体の１以上の分子と、を含む。活性薬剤は、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体の分子に非共有結合により結合されている。
【００９０】
いくつかの実施形態では、粒状物の表面は、実質的に親水性である。例えば、粒状物は、実質的に親水性の多糖類分子を有する表面を含むことができるのに対して、活性薬剤は、粒状物の内部に被包されており、即ち、活性薬剤は、粒状物の表面に露出しておらず、表面のすぐ下に埋め込まれている。いくつかの例では、多糖類−ビタミン共役体は、自己集合過程中に該共役体に非共有結合により結合した活性薬剤と共に、自己集合して粒状物になる。いくつかの共役体では、多糖類部分は、親水性であり、ビタミン部分は、疎水性であり、かつ多糖類−ビタミン共役体は、両親媒性分子であり、これらが自己集合して粒状物になる。自己集合過程は、粒状物のコア部分と体液等の外部水性環境との間の安定化界面としての実質的に親水性の表面により、水−共役体界面自由エネルギーを最小にする。実質的に親水性の表面のすぐ下では、共役体分子が、例えば、共役体の疎水性部分間の疎水性相互作用を介して一緒に集合する。任意に、粒状物のコア部分における共役体分子は、ランダムな様式で、即ち、二層構造等の任意の明確な構造的特徴を欠くように配置される。従って、活性薬剤は、粒状物のコア部分全体にわたってランダムに被包することができる。例えば、本開示のいくつかの粒状物では、活性薬剤は、必ずしも粒状物の内部コアの内部に分離していない。従って、本開示におけるコア−シェル構造への言及は、一般的には、実質的に親水性の表面を有する粒状物構造と、活性薬剤が任意の様式で被包されたコア部分と、を指す。本粒状物は、活性薬剤の驚くほど大きな担持容量（例えば、最大約３０％ｗ／ｗ又はそれより高い担持容量）を有することが見出された。いくつかの粒状物では、該粒状物のコア部分は、実質的に均質な構造を有し、即ち、活性薬剤、疎水性部分及び親水性部分の単独又は別個の下位部分への明確な分離が欠如している。結果として、顕著な担持容量を、本粒状物において達成することができる。
【００９１】
粒状物は、様々な適切なサイズにすることができる。いくつかの実施形態では、粒状物は、２０ｎｍ〜１０００ｎｍ、例えば２０ｎｍ〜１００ｎｍ、１００ｎｍ〜２００ｎｍ、１００ｎｍ〜４００ｎｍ、又は４００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲の平均直径を有する。任意に、粒状物は、マイクロ粒子である。任意に、粒状物は、ナノ粒子である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、粒状物は、約１０％ｗ／ｗ〜約３０％ｗ／ｗの担持容量、例えば、約１５％ｗ／ｗ〜約３０％、約２０％ｗ／ｗ〜約３０％ｗ／ｗ、又は約２５％ｗ／ｗ〜約３０％ｗ／ｗの担持容量を有する。
【００９３】
任意に、活性薬剤は、疎水性薬物である。任意に、疎水性活性薬剤は、共役体分子の疎水性部分（例えばビタミン部分）と非共有結合により結合されている。いくつかの粒状物では、疎水性部分と任意の関連する活性薬剤とは、粒状物全体にわたってランダム又は実質的に均質に分布されている。
【００９４】
ある特定の態様では、「腫瘍特異的抗原」に対するモノクローナル抗体等の標的薬剤を、単独で又は他のストラテジーと組み合わせて、例えば、本明細書に開示される粒状物（例えばマイクロ粒子）又は組成物を使用したものを、癌細胞に送達される細胞毒性薬の用量を増加させるために使用することができる。しかしながら、多くの場合、単独で使用すると、「腫瘍特異的抗原」に対するモノクローナル抗体は、効果的な癌細胞死滅のために抗体に結合した十分な細胞毒性薬を依然として送達することができない。
【００９５】
２００５年に、ＦＤＡは、進行転移性乳癌のためのヒトアルブミン結合パクリタキセル製剤（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））を承認した。この製剤は、パクリタキセルの臨床用量を増加させ、以前の製剤と比較して副作用を減少させ、患者の生存率を増加させる。市販のパクリタキセル製剤及び関連する臨床試験を、表１にまとめる。いくつかの態様では、生分解性ポリマーを使用して、例えば寄付された血液由来のウイルスによるヒトアルブミンの汚染のリスクを減少させることができる。
【００９６】
表１：市販のタキサン製剤及び臨床試験の概要
【表１】
2018530606.tif 000003
【００９７】
表１における製剤のいずれも、タキサンを送達するための賦形剤として多糖類を使用していない。米国特許出願公開第２００７／０２１３３９３号明細書では、脂質又はＰＬＧＡによって製剤化されたマイクロエマルジョン中に分散したパクリタキセルを取り込むためにヒアルロン酸が多糖ヒドロゲルとして使用されている。ポリマーのパクリタキセル粒状物（例えばナノ粒子）の調製が、当該分野で公知の方法、例えば、Ｆｅｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１９８９により記載される界面析出法によって、具体的にはＦｏｎｓｅｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．２００２により記載されるパクリタキセル−ＰＬＧＡナノ粒子の調製のために行われ得る。
【００９８】
特開２０１０１２６５３３号公報では、デキストランは、パクリタキセルと化学的に連結してパクリタキセルの溶解度を増加させる。葉酸（ＦＡ）は、共役体の表面に物理的に吸収され、抗癌治療の標的効果を増加させる。しかしながら、化学的に共役したパクリタキセルは、それが骨格から放出されるまでは活性でないことが実験により示されている。更に、ラセミ化を薬物修飾反応中に回避することは困難である。別の欠点は、標的リガンドである葉酸が、該リガンドを保持するほど物理的吸収が強くないために溶出しやすいことである。
【００９９】
１つの態様では、本明細書に開示されるのは、パクリタキセル送達のための、多糖類−ビタミン共役体に基づく粒状物の形態の製剤である。１つの実施形態では、デキストランが葉酸と共役され、デキストラン−葉酸共役体とパクリタキセル分子とが集合して粒状物になる。疎水性薬物であるパクリタキセルは、粒状物のコア部分に被包されている。ある特定の態様では、薬物をより良好に被包し、形成された粒状物を安定化させるために、ビタミン（例えば葉酸）を修飾して疎水性を増加させることができる。ある特定の態様では、形成された粒状物における葉酸部分の大部分が、粒状物の外面ではなく、粒状物の内部に位置する。更に他の態様では、形成された粒状物における全ての葉酸部分が、粒状物の内部に位置する。更に他の態様では、形成された粒状物の葉酸部分のいずれも、粒状物の外面に位置しない。いくつかの実施形態では、活性薬剤は、粒状物の表面に露出しておらず、表面のすぐ下に埋め込まれている。いくつかの実施形態では、活性薬剤は、粒状物のコア部分全体にわたってランダムに被包されており、例えば、活性薬剤は、粒状物の内部コアの内部に分離していない。
【０１００】
１つの態様では、本明細書に開示されるのは、パクリタキセル送達のための、多糖類−ビタミン共役体に基づくコア−シェル粒状物の形態の製剤である。１つの実施形態では、デキストランが葉酸と共役され、デキストラン−葉酸共役体が、粒状物のシェル／表面を形成する。疎水性薬物であるパクリタキセルは、粒子に取り込まれている。ある特定の態様では、薬物をより良好に被包し、形成されたナノ粒子を安定化させるために、ビタミン（例えば葉酸）及び／又は多糖類を修飾して疎水性を増加させることができる。ある特定の態様では、形成されたコア−シェルナノ粒子における葉酸部分の大部分が、ナノ粒子の外面ではなく、薬物とデキストラン部分との間のナノ粒子の内部に位置する。更に他の態様では、形成されたコア−シェルナノ粒子における全ての葉酸部分が、薬物とデキストラン部分との間のナノ粒子の内部に位置する。
【０１０１】
ある特定の態様では、本明細書に開示される粒状物（例えばマイクロ粒子）及び組成物の調製は、ラセミ化をもたらす化学反応を含む薬物の化学修飾を伴わない。好ましい実施形態では、製剤化のための複雑な精製手順を回避することができる。好ましい実施形態では、製剤化工程に関与するヒトタンパク質等の生物学的物質が存在しないため、製造コストを大幅に減少させることができる。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、治療薬を被包する粒状物に加えて、本開示の組成物は、以下：共溶媒溶液、リポソーム、ミセル、液晶、ナノ結晶、エマルジョン、マイクロスフェア、ナノスフェア、ナノカプセル、ポリマー若しくはポリマー担体、界面活性剤、懸濁化剤、錯化剤、例えばシクロデキストリン又は吸着分子、例えばアルブミン（例えばＢＳＡ）、表面活性粒子、及びキレート剤のうちの少なくとも１つを更に含んでいてもよい。
【０１０３】
１．ビタミン及び関連する薬剤
本開示のある特定の態様では、細胞増殖に必須の分子、例えば、ビタミン及び関連する薬剤を、粒状物（例えばマイクロ粒子）及び組成物の調製に使用することができる。本開示の粒状物（例えばマイクロ粒子）及び組成物に含まれ得るビタミン及び関連する薬剤のリストは、確立された参照ガイド、例えばＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（即ち、Ｕ．Ｓ．Ｐ．−Ｎ．Ｆ．Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）又は改訂を含む欧州指令９０／４９６／ＥＥＣに見出すことができ、これらは、参照により本明細書に援用される。
【０１０４】
本開示の粒状物（例えばマイクロ粒子）及び組成物に含まれ得るビタミン及び関連する実体、例えば、ビタミン類似体、ビタミン誘導体、及び修飾ビタミンには、ビタミンＡ（及びビタミンＡ前駆体）、チアミン（ビタミンＢ１）、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ナイアシン（ビタミンＢ３）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、葉酸、コバラミン（ビタミンＢ１２）、パントテン酸（ビタミンＢ５）、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビオチン、ビタミンＫ、他のＢ複合ビタミン、例えばコリン及びイノシトール等のＢ複合関連化合物、並びにルテイン、リコピン、ゼアキサンチン、及びアスタキサンチン等のカロチノイドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０５】
ビタミンの誘導体及び類似体は、本開示の範囲内であることが理解されよう。本明細書で検討される類似体には、類似体がビタミン受容体に対していくらかの結合活性を有するという条件で、天然物スクリーニング等のスクリーニングプロセスによって化学的に合成又は同定されているような任意の供給源に由来する保護基及び塩及びその複合体の追加的な除去を含む、ビタミン分子の環構造、官能基、又は側鎖への修飾が含まれるが、これらに限定されない。当業者であれば、腫瘍細胞又は癌細胞上のまさにビタミン受容体以外の上方制御された受容体を標的とし得ることが理解されよう。
【０１０６】
葉酸（葉酸塩、ビタミンＭ、ビタミンＢ９、ビタミンＢｃ（又はフォラシン）、プテロイル−Ｌ−グルタミン酸、プテロイル−Ｌ−グルタミン酸、及びプテロイルモノグルタミン酸とも称される）は、水溶性ビタミンＢ９の形態である。葉酸塩は、パラアミノ安息香酸に連結した芳香族プテリジン環と１つ以上のグルタミン酸残基で構成されている。葉酸は、それ自体が生物学的に活性ではないが、その生物学的重要性は、肝臓中のジヒドロ葉酸への転換後のテトラヒドロ葉酸塩及び他の誘導体に起因する。葉酸及び葉酸塩は、多数の身体機能にとって必須である。ヒトは、葉酸を新たに合成することができない。それ故、葉酸は、１日所要量を満たすために食餌によって供給されなければならない。ヒトは、ＤＮＡを合成し、ＤＮＡを修復し、ＤＮＡをメチル化するほかに、ある特定の生物学的反応において補因子として作用するために葉酸を必要とする。それは、乳児期及び妊娠期等における迅速な細胞分裂と成長を促すという点で特に重要である。小児と成人の両方は、健康な赤血球を生成し、貧血を予防するために葉酸を必要とする。
【０１０７】
葉酸は、還元葉酸担体と呼ばれる担体タンパク質を介して、又は葉酸受容体によって促進される受容体媒介エンドサイトーシスを介して細胞に入る。葉酸受容体ＦＲ−αとＦＲ−βの２種類がある。葉酸受容体ＦＲ−αは、高い親和性（＜１ｎＭ）で葉酸に結合する３８ＫＤ  ＧＰＩアンカー型タンパク質である。受容体結合に続いて、迅速なエンドサイトーシスによりビタミンは細胞内に送達され、低ｐＨでエンドソームコンパートメント内に放出される。重要なことに、小分子、タンパク質、更にはリポソームの葉酸への共有結合による共役は、葉酸受容体に結合するビタミンの能力を阻害せず、ひいては葉酸−薬物共役体は、受容体媒介エンドサイトーシスによって容易に送達され、細胞に入ることができる。
【０１０８】
大部分の細胞は、関連のない還元葉酸担体を使用して必要な葉酸を得ることから、葉酸受容体の発現は、少数の細胞型に制限される。腎臓、脈絡叢、及び胎盤を除いて、正常組織は、低レベル又は非検出レベルの葉酸受容体を発現する。葉酸受容体の非上皮性アイソフォームであるＦＲ−βは、活性化された（休止期ではない）滑膜マクロファージ上に発現されることが報告されている。従って、葉酸受容体は、マクロファージのサブセット（即ち、活性化マクロファージ）上に発現される。ＦＲβは、活性化された単球上にも見出される。従って、本開示は、炎症又は炎症成分を有する疾患及び症状の治療のための、本明細書に開示されるマイクロ粒子又は組成物、例えば多糖類−葉酸共役体に基づくマイクロ粒子の使用にも関する。
【０１０９】
葉酸受容体は、卵巣癌、乳癌、肺癌、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、及び骨髄造血細胞の癌を含むヒト癌細胞の大部分で有意に過剰発現される。一般に、ＦＲ−αは、卵巣悪性腫瘍等の上皮由来の悪性組織で上方制御される一方で、ＦＲ−βは、非上皮由来の悪性組織で過剰発現される。ビタミンの保持及び取込みに関与する正常組織ではＦＲが検出されていたが、これらの組織は、保護された部位にあり、一般的には、葉酸塩共役体の血液媒介性送達の後には接近できない。脈絡叢、腸管刷子縁頂端膜表面、及び腎臓の近位尿細管に発現がある。後者の場合、受容体は、排泄された葉酸塩を捕捉するように機能すると考えられ、従って、その場合、大きな分子量の葉酸塩複合体に接近することができない。
【０１１０】
本開示のある特定の態様では、多糖類−ビタミン共役体、例えば、葉酸ベースの治療用製剤に基づく粒状物及び組成物は、低分子量の化学療法薬、治療用抗体、タンパク毒素、放射性画像診断剤、放射線治療薬、ＭＲＩ造影剤、取り込まれた薬物を有するリポソーム、遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、及び免疫療法薬の送達のために使用することができる。特に、多糖類−ビタミン共役体（デキストラン−葉酸共役体を含む）に基づく粒状物は、細胞、例えば、上掲の癌細胞、治療薬、又は診断薬を送達するために使用することができる。好ましい実施形態では、多糖類−ビタミン共役体に基づく粒状物は、実質的に親水性の表面を有し、活性薬剤（例えば治療薬又は診断薬）は、粒状物のコア部分に被包されている。いくつかの実施形態では、活性薬剤は、粒状物の表面に露出しておらず、表面のすぐ下に埋め込まれている。いくつかの実施形態では、活性薬剤は、粒状物のコア部分全体にわたってランダムに被包されており、例えば、活性薬剤は、粒状物の内部コアの内部に分離していない。
【０１１１】
本開示のある特定の態様では、多糖類−ビタミン共役体、例えば、葉酸ベースの治療用製剤に基づく粒状物（例えばマイクロ粒子）及び組成物は、低分子量の化学療法薬、治療用抗体、タンパク毒素、放射性画像診断剤、放射線治療薬、ＭＲＩ造影剤、取り込まれた薬物を有するリポソーム、遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、及び免疫療法薬の送達のために使用することができる。特に、多糖類−ビタミン共役体（デキストラン−葉酸共役体を含む）に基づく粒状物（例えばマイクロ粒子）は、細胞、例えば、上掲の癌細胞、治療薬、又は診断薬を送達するために使用することができる。好ましい実施形態では、多糖類−ビタミン共役体に基づく粒状物（例えばマイクロ粒子）は、シェル−コア構造を有し、シェルは、多糖類−ビタミン共役体を含み、且つコアは、シェルに取り込まれた上掲の治療薬又は診断薬を含む。ある特定の態様では、多糖類−ビタミン共役体は、多糖類に共有結合により連結したビタミン又はその誘導体の分子を含み、該ビタミン又はその誘導体の分子は、コアと多糖類との間に位置する。
【０１１２】
本明細書に開示される実施形態のいずれにおいても、ビタミンは、葉酸塩、ニコチンアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルニコチンアミド、ビオチン、サリチル酸ナトリウム、又はそれらの任意の組合せであり得る。例えば、多糖類−葉酸塩共役体と多糖類−ニコチンアミド共役体とを混合して、本開示の粒状物を形成することができる。ある特定の実施形態では、１以上の疎水性若しくは脂溶性ビタミン及び／又は関連する薬剤を、粒状物（例えばマイクロ粒子）に使用することができる。
【０１１３】
ビタミンは、本開示に従って修飾することもできる。例えば、葉酸は、アミノ化によって、例えば図１Ｃに示す反応によって修飾することができる。ある特定の態様では、薬物をより良好に取り込んで、形成された粒状物（例えばナノ粒子）を安定化させるために、ビタミン及び多糖類を修飾して疎水性を増加させることができる。
【０１１４】
２．多糖類を含むポリマー
ある特定の実施形態では、本開示の多糖類は、ヒアルロン酸及びその誘導体を含むことができる。好ましい実施形態では、本開示の多糖類は、デキストラン及びその誘導体を含むことができる。ある特定の実施形態では、多糖類は、シクロデキストリン又は環状オリゴ糖であり得る。
【０１１５】
更に別の実施形態では、本開示の多糖類は、セルロース及びその誘導体（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、酢酸コハク酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、キトサン及びその誘導体、β−グルカン、アラビノキシラン、カラギーナン、ペクチン、グリコーゲン、フコイダン、コンドロチン、ペントサン、ケラタン、アルギン酸塩、若しくはシクロデキストリン、又はそれらのエステル、硫酸塩を含む塩、及び誘導体を含むことができる。本明細書に開示される２以上の多糖類の組合せを混合し、１以上の種類のビタミン又は関連する薬剤との共役体を形成し、本開示の粒状物（例えばマイクロ粒子）を形成することができる。更に、本明細書に開示される２以上の多糖類のモノマー間で形成されるコポリマーも、本開示の粒状物（例えばマイクロ粒子）及び組成物の調製における使用に企図される。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、本開示の多糖類は、有機溶媒に可溶な多糖類である。多糖類を有機溶媒に可溶とすることによって、ビタミンとの共役反応を効率的に行うことができる。適切な有機溶媒の例には、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、シュウ酸等が含まれる。任意に、多糖類は、炭素、酸素、及び水素原子のみを有する多糖類である。任意に、多糖類は、デキストラン又はその誘導体である。
【０１１７】
ある特定の態様では、高分子量のポリマー複合体を使用して、本開示の粒状物（例えばマイクロ粒子）及び／又は組成物における使用のために、ビタミン又は関連する薬剤を共役してポリマー−ビタミン共役体を形成することができる。例えば、多糖類−ビタミン共役体は、送達される薬剤又は活性物質を取り込む粒状物を形成することができる。好ましい実施形態では、多糖類−ビタミン共役体に基づく粒状物は、実質的に親水性の表面を有し、活性薬剤（例えば治療薬又は診断薬）は、粒状物のコア部分に被包されている。いくつかの実施形態では、活性薬剤は、粒状物の表面に露出しておらず、表面のすぐ下に埋め込まれている。いくつかの実施形態では、活性薬剤は、粒状物のコア部分全体にわたってランダムに被包されており、例えば、活性薬剤は、粒状物の内部コアの内部に分離していない。任意に、多糖類−ビタミン共役体は、送達される薬剤又は活性物質を取り込んで、マイクロ粒子のシェルを形成することができる。いくつかの実施形態では、多数のビタミン分子が連結している生体適合性ポリマー骨格がシェルを形成し、薬物がコアを形成するが、該薬物は、ポリマー骨格又はビタミン部分に共有結合により連結されていない。そのような配置は、薬物送達の効率を高め、薬物の生物学的活性を保持することができる。
【０１１８】
ある特定の他の態様では、粒状物（例えばマイクロ粒子）は、多糖以外のポリマーを含むことができる。例えば、ＰＣＴ／ＡＵ００／００４０６は、葉酸塩ポリマー複合体及びその使用を開示しており、米国特許第５４４９７２０号明細書は、ＶＢ１２−ポリマー複合体及びその使用を開示しており、これらのいずれの明細書も、その内容全体が参照により本明細書に援用される。ビタミンでコーティングされた粒状物（例えばナノ粒子）も、ＰＣＴ／ＡＵ００／００４０５及び欧州特許第０５３１４９７号明細書に開示されており、これらのいずれの明細書も、その内容全体が参照により本明細書に援用される。粒状物（例えばマイクロ粒子及びナノ粒子）の形成に適したポリマーには、とりわけ、ポリ乳酸、ポリ（ラクチド／コグリコリド）、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバレレート、ポリ（ヒドロキシブチレート／バレレート）、エチルセルロース、デキストラン、多糖類、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリ（ε−カプロラクトン）並びにそれらの様々な組合せ及びコポリマーが含まれる。ある特定の態様では、粒状物（例えばナノ粒子）は、共役したビタミン部分を有するポリマーから溶媒蒸発又は液中乾燥によって形成される。
【０１１９】
ある特定の他の態様では、共役したビタミン部分を有するポリマーから界面析出／重合によって粒状物（例えばマイクロ粒子）又はマイクロスフェアを形成することができる。ある特定の態様では、ポリマーには、とりわけ、リジン塩酸塩とｐ−フタロイルジクロリドとの反応によってか、あるいはアクリロイル化マルトデキストリン又はアクリロイル化ヒドロキシエチルデンプンとペルオキソ二硫酸アンモニウム及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンとの反応によって形成されるポリマーが含まれる。ポリマー相分離による粒状物（例えばマイクロ粒子）又はマイクロスフェアの形成に適したポリマーには、コポリ（塩化ビニル：ビニルアルコール：酢酸ビニル）、セルロース系ポリマー、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビニル、天然及び合成ゴム、ポリアクリレート、ポリスチレン等が含まれる。そのような粒状物（例えばマイクロ粒子）又はマイクロスフェアを合成する方法は、米国特許第４１６６８００号明細書に完全に記載されており、その開示は、あらゆる目的のために参照により援用される。粒状物（例えばマイクロ粒子）又はマイクロスフェアの形成に適した他のポリマーには、とりわけ、ポリアニオン、例えばアラビアゴム、アルギン酸塩、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、ポリスチレンスルホン酸、ポリビニルスルホン酸、ポリ−Ｄ−グルクロン酸、ポリピルビン酸、カラギーナン、硫酸ヘパリン、ポリリン酸塩と、ポリカチオン、例えばポリリジン、ポリリシン、ゼラチン、架橋ゼラチン、デンプン、架橋アルブミン、ポリアクリルアミドとの混合物、並びに粒状物（例えばマイクロ粒子）及び／又はマイクロスフェア調製の当業者に公知の他のものが含まれる。いかなる理論にも束縛されることなく、ポリアミノ酸のホモポリマー、例えばポリ（Ｌ−グルタミン酸）、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリアミノ酸のコポリマー、コラーゲン、アルブミン、フィブリン、又はゼラチンを含むポリペプチドも、例えば成分として、粒状物（例えばマイクロ粒子）に含まれ得る。本開示により有用なポリマーには、潜在的に生分解性を持つポリマー、例えばデキストラン及びその誘導体、並びにアミノ酸ポリマー、例えばポリリジン及びポリグルタミン酸が含まれる。ある特定の実施形態では、葉酸及び治療薬と一緒にポリマー（多糖類等）を使用する利点は、ポリマーのサイズに基づき腎臓に対する標的を回避又は低減できることである。
【０１２０】
１つの実施形態では、ビタミン又は関連する分子をポリマーに結び付ける結合は、ジスルフィド結合、エステル結合、γ−グルタミル−ε−リジン結合、及び／又はジアゾ結合を含むことができる。好ましい実施形態では、粒状物（例えばマイクロ粒子）中の癌細胞に送達される治療薬は、それ自体ポリマーに共有結合により結合又は共役されていない。それにもかかわらず、多糖類等のポリマーは、例えば併用療法による腫瘍細胞増殖の制御のために、共有結合又は非共有結合のいずれかにより、様々な酵素、薬物、及び細胞毒性薬に連結させることができる。
【０１２１】
３．活性薬剤
好ましい実施形態では、本開示の粒状物（例えばマイクロ粒子）は、それを必要とする対象に治療薬及び／若しくは診断薬又は他の活性物質を取り込み及び／又は送達する。薬剤又は活性物質には、ホルモン、薬物、プロドラッグ、酵素、タンパク質、ペプチド、毒素、免疫原、ＤＮＡ、及び類似体、並びにＲＮＡ及び類似体を含むことができる。例えば、本開示での使用に適した薬剤には、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、モデシン、破傷風由来毒素、マイコトキシン、メリチン、α−アマニチン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、リボソーム阻害タンパク質、特に、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、ライムギ、ゲロニン、メイタンシノイドのものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２２】
治療薬又は活性物質には、細胞毒性薬、例えばアルキル化剤（例えば、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、シクロプロパン）、アントラサイクリン抗腫瘍抗生物質（例えば、ドキソルビシン、ダウノマイシン、アドリアマイシン、マイトマイシンＣ、２−（ヒドロキシメチル）アントラキノン）、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、ジクロロメタトレキサート）、シスプラチン、カルボプラチン、ならびに白金、銅、バナジウム、鉄、コバルト、金、カドミウム、亜鉛及びニッケルを含有する金属ペプチドも含まれ得る。他の薬剤には、デオキシニバレノール、チミジン、ペンタメチルメラミン、ジアンヒドロガラクチトール、５−メチル−ＴＨＦ、アングイジン、メイタンシン、ネオカルジノスタチン、クロロゾトシン、ＡＺＱ、２’−デオキシホルモマイシン、ＰＡＬＡ、バルルビシン、ｍ−ＡＭＳＡ及びミソニダゾールが含まれる。
【０１２３】
好ましい実施形態では、治療薬は、疎水性薬物、即ち、水不溶性薬物又は難水溶性薬物であり得る。「疎水性薬物」という用語は、親油性部分、例えばリポタンパク質による吸収又は極性媒質中での溶解度の減少の特徴を示す薬物、通常は治療薬を指し得る。疎水性薬物には、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、特定の抗体、イムノフィリンに作用する薬物、インターフェロン、アヘン剤、ＩＮＦ結合タンパク質、ミコフェノール酸塩、ＦＴＹ７２０、シクロスポリン（シクロスポリンＡ、シクロスポリンＢ、シクロスポリンＣ、シクロスポリンＤ、シクロスポリンＥ、シクロスポリンＦ、シクロスポリンＧ、シクロスポリンＨ、シクロスポリンＩを含む）、タクロリムス（ＦＫ５０６、「ＰＲＯＧＲＡＦ」（登録商標））、シロリムス（ラパマイシン、「ＲＡＰＡＭＵＮＥ」（登録商標））、エベロリムス（ＲＡＤ、「ＣＥＲＴＩＣＡＮ」（登録商標））、パクリタキセル等のタキサン、ディスコデルモライド、コルヒチン、ビンブラスチン、又はビンクリスチン等のビンカアルカロイド、及び前掲の薬剤のいずれかの類似体又は誘導体が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１２４】
好ましい実施形態では、難水溶性薬物は、タキサン化合物又はその類似体である。タキサン化合物の例には、パクリタキセル、ドセタキセル、７−エピパクリタキセル、ｔ−アセチルパクリタキセル、１０−デスアセチル−パクリタキセル、１０−デスアセチル−７−エピパクリタキセル、７−キシロシルパクリタキセル、１０−デスアセチル−７−グルタリルパクリタキセル、７−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシジルパクリタキセル、７−Ｌ−アラニルパクリタキセル、カバジタキセル、又はそれらの混合物が含まれる。
【０１２５】
好ましい実施形態では、難水溶性薬物は、カンプトテシン化合物である。カンプトテシン化合物の例には、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ；７−エチル−１０−［４−（１−ピペリジノ）−１−ピペリジノ］−カルボニルオキシカンプトテシン）、トポテカン（ＨＹＣＡＭＰＴＩＮ；（Ｓ）−９−Ｎ；Ｎ−ジメチルアミノエチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン）、９−アミノカンプトテシン（９−アミノ−２０（Ｓ）−カンプトテシン）、９−ニトロカンプトテシン（ルビテカンとも呼ばれる）、ルートテカン（７−（４−メチルピペラジノメチレン）−１０，１１−エチレンジオキシ−２０（Ｓ）−カンプトテシン）、エキサテカン、カレニテシン、及びホモカンプトテシンが含まれる。いくつかのカンプトテシン化合物の構造及び臨床情報は、Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｒｂｏｎｅｒｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（Ｍａｒｃｈ  ２００２）８：６４１−６６１に見出すことができる。カンプトテシン化合物の例は、米国特許第４６０４４６３号明細書、米国特許第６４０３５６９号明細書及び米国特許第５００４７５８号明細書、並びに国際公開第２００４／０１２６６１号、国際公開第２００３／１０１９９８号、国際公開第２００３／１０１９９６号、国際公開第２００３／１０１４０６号、国際公開第２００３／０９３２７４号、国際公開第２００３／０８６４７１号、国際公開第０１／７６５９７号、国際公開第０１／６４１９４号、国際公開第００／７０２７５号、国際公開第００／５３６０７号、国際公開第９９／１７８０５号、国際公開第９９／１７８０４号、国際公開第９９／０５１０３号、国際公開第９８／３５９６９号、国際公開第９７／２８１６４号、国際公開第９７／２５３３２号、国際公開第９７／１６４５４号に見出すこともでき、これらの全ての内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０１２６】
好ましい実施形態では、治療薬は、パクリタキセル、チューブリンに結合して異常な有糸分裂紡錘体を形成することによって有糸分裂（Ｍ期）を破壊する化合物、又はその類似体もしくは誘導体である。パクリタキセルは、高度に誘導体化されたジテルペノイドである（Ｗａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９３：２３２５，１９７１）。「パクリタキセル」（本明細書では、製剤、プロドラッグ、エピマー、異性体、類似体、及び誘導体、例えば「ＴＡＸＯＬ」（登録商標）、「ＴＡＸＯＴＥＲＥ」（登録商標）、ドセタキセル、パクリタキセルの１０−デアセチル類似体等を含むと理解されたい）は、当業者に公知の技術を利用して容易に調製することができ（例えば、Ｓｃｈｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：６６５−６６７，１９７９；Ｌｏｎｇ  ａｎｄ  Ｆａｉｒｃｈｉｌｄ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５４：４３５５−４３６１，１９９４；Ｒｉｎｇｅｌ  ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｊ  Ｎａｔ’ｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８３（４）：２８８−２９１，１９９１；Ｐａｚｄｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．１９（４）：３５１−３８６，１９９３；国際公開第９４／０７８８２号；国際公開第９４／０７８８１号；国際公開第９４／０７８８０号；国際公開第９４／０７８７６号；国際公開第９３／２３５５５号；国際公開第９３／１００７６号；国際公開第９４／００１５６号；国際公開第９３／２４４７６号；欧州特許第５９０２６７号明細書；国際公開第９４／２００８９号；米国特許第５２９４６３７号明細書；米国特許第５２８３２５３号明細書；米国特許第５２７９９４９号明細書；米国特許第５２７４１３７号明細書；米国特許第５２０２４４８号明細書；米国特許第５２００５３４号明細書；米国特許第５２２９５２９号明細書；米国特許第５２５４５８０号明細書；米国特許第５４１２０９２号明細書；米国特許第５３９５８５０号明細書；米国特許第５３８０７５１号明細書；米国特許第５３５０８６６号明細書；米国特許第４８５７６５３号明細書；米国特許第５２７２１７１号明細書；米国特許第５４１１９８４号明細書；米国特許第５２４８７９６号明細書；米国特許第５２４８７９６号明細書；米国特許第５４２２３６４号明細書；米国特許第５３００６３８号明細書；米国特許第５２９４６３７号明細書；米国特許第３６２８３１号明細書；米国特許第５４４００５６号明細書；米国特許第４８１４４７０号明細書；米国特許第５２７８３２４号明細書；米国特許第５３５２８０５号明細書；米国特許第５４１１９８４号明細書；米国特許第５０５９６９９号明細書；米国特許第４９４２１８４号明細書；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３５（５２）：９７０９−９７１２，１９９４；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：４２３０−４２３７，１９９２；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３４：９９２−９９８，１９９１；Ｊ．Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄ．５７（１０）：１４０４−１４１０，１９９４；Ｊ．Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄ．５７（１１）：１５８０−１５８３，１９９４；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：６５５８−６５６０，１９８８）、これらのすべての内容は、その全体が参照により本明細書に援用され、又は例えばＳｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯを含む多岐にわたる商業的供給源から得られる。
【０１２７】
４．多糖類−ビタミン−活性薬剤の組合せ
ある特定の実施形態では、異なるビタミンは、同じ種類の多糖類に共役されることができるか、又は同じビタミンは、異なる種類の多糖類に共役されることができる。他の実施形態では、ビタミンと多糖類部分の異なる組合せを有する共役体を混合して、粒状物（例えばマイクロ粒子）の調製に使用することができる。ある特定の実施形態では、異なるビタミン部分を含有する共役体が、同じ治療薬と一緒に使用される。粒状物（例えばマイクロ粒子）又はそのように生成された組成物の投与により、ビタミン受容体の上方制御された発現及び／又は活性を示す癌細胞を標的とする粒状物（例えばマイクロ粒子）を生じさせることができる一方で、同時に、粒状物（例えばマイクロ粒子）の望ましくない蓄積が、特定のビタミンによって標的化されることもある異なる器官及び組織にわたって広がる。この場合、治療薬の標的細胞への送達は、体の他の部分への治療薬の毒性を増加させることなく増強させることができる。別の実施形態では、同じビタミン部分を含有する共役体を、異なる治療薬と組み合わせて使用することができ、それにより併用療法が可能になる。例えば、増強及び／又は相乗殺傷のために、異なる薬剤を同じ癌細胞集団に標的化することができる。
【０１２８】
好ましい実施形態では、特定の多糖類−ビタミン−治療薬の組合せは、本開示の粒状物（例えばマイクロ粒子）又は組成物を使用して治療される癌の組織起源及び／又は遺伝子発現プロファイルに基づき決定することができる。本開示により恩恵を受けることができる癌の種類には、慢性白血病、乳癌、肉腫、卵巣癌、直腸癌、喉頭癌、メラノーマ、結腸癌、膀胱癌、肺癌、乳腺腺癌、消化管癌、胃癌、前立腺癌、膵臓癌、又はカポジ肉腫が含まれるが、これらに限定されない。本明細書には明示されていないが、当業者に周知の他の癌も、本開示の範囲内で想定されるものと考慮される。多糖類−ビタミン−治療薬の組合せを選択する際には、ある特定の療法に対する対象の応答性に関する情報も考慮されることができる。
【０１２９】
５．連結体分子及び連結基
いくつかの実施形態では、多糖類は、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体の１以上の分子のそれぞれに連結体分子を介して共役されており、該連結体分子は、該多糖類の１以上の官能基に対して反応性の第１の化学基と、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体の１以上の分子のそれぞれの１以上の官能基に対して反応性の第２の化学基と、を含む。多糖類−ビタミン共役体によって送達される薬物の有効性が、連結体分子を有することによって、連結体分子なしで直接共役している多糖類−ビタミン共役体によって送達される薬物の有効性と比較して、はるかに高められることを本開示において見出した。本明細書で使用される場合、官能基は、分子の本来の機能グループ（例えば、多糖類、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体）、又は官能化の結果として分子への結合を介して加えられた官能基を指し得る。例えば、コハク酸を使用して多糖類を官能化することでカルボン酸官能基を得ることができ、これは、アミン化学基を有する連結体分子と反応してアミド結合を形成することができる。
【０１３０】
任意に、連結体分子は、スペーサーを介さずに第１の化学基と第２の化学基とを含む。任意に、連結体分子は、第１の化学基、第２の化学基、及び第１の化学基と第２の化学基との間のスペーサーを含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、連結体分子は、第１の化学基、第２の化学基、及び第１の化学基と第２の化学基との間のスペーサーを含む。任意に、スペーサーは、１〜５０個の原子を含む。任意に、スペーサーは、１〜５０個の炭素原子、例えば１〜１５個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、２０〜３５個の炭素原子、又は３５〜５０個の炭素原子を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、連結体分子は、２つの官能基を有する有機分子である。２つの官能基を有する有機分子の例には、ジアミン、ジカルボン酸等が含まれるが、これらに限定されない。任意に、２つの官能基を有する有機分子は、２〜２０個の炭素原子、例えば２〜６個の炭素原子、６〜１０個の炭素原子、又は１０〜２０個の炭素原子を有する直鎖を有する。
【０１３３】
ジアミン連結体分子の例には、メチレンジアミン、エチレンジアミン、１，２−ジアミノプロパン、１，３−プロパンジアミン、Ｎ−メチル−１，３−ジアミノプロパン、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−１，３−プロパンジアミン、２，２−ジメチル−１，３−プロパンジアミン、１，３−ジアミノ−２−プロパノール、１，４−ジアミノブタン、１，５−ジアミノペンタン、１，６−ジアミノヘキサン、１，７−ジアミノヘプタン、及び１，８−ジアミノオクタンが含まれるが、これらに限定されない。ジカルボン酸連結体分子の例には、エタン二酸、プロパン二酸、ブタン二酸、リンゴ酸、酒石酸、フマル酸、ペンタン二酸、ヘキサン二酸、ヘプタン二酸、オクタン二酸、ノナン二酸、デカン二酸、１，１１−ウンデカンジカルボン酸、１，１２−ドデカンジカルボン酸、及びヘキサデカン二酸が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、連結体分子は、ポリマー鎖の第１の末端又は該末端付近に第１の化学基と、ポリマー鎖の第２の末端又は該末端付近に第２の化学基と、を有するポリマーであって、第１の末端は、第２の末端の反対側にある。連結体分子を作製するのに適したポリマーの例には、ポリエチレングリコール、ポリアミノ酸、ポリ乳酸、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、多糖類は、連結体分子と反応する前に官能化されていてもよい。任意に、多糖類は、コハク酸で官能化される。いくつかの実施形態では、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体は、連結体分子と反応する前に官能化されていてもよい。
【０１３６】
従って、いくつかの実施形態では、多糖類−ビタミン共役体は、多糖類とビタミン又はその類似体若しくは誘導体の１以上の分子のそれぞれとを共有結合により連結する連結基を含む。連結基は、連結体分子、多糖類、及びビタミン又はその類似体若しくは誘導体の間の反応生成物である。例えば、連結体分子の第１の化学基は、多糖類の官能基と反応して、連結体分子と多糖類とを連結する第１の共有結合を形成し、連結体分子の第２の化学基は、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体の官能基と反応して、連結体分子とビタミン又はその類似体若しくは誘導体とを連結する第２の共有結合を形成する。第１の共有結合及び第２の共有結合の例には、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、γ−グルタミル−ε−リジン結合、及びジアゾ結合が含まれる。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、連結基は、第１の共有結合と第２の共有結合との間にスペーサーを含む。任意に、スペーサーは１〜５０個の原子を含む。任意に、スペーサーは１〜５０個の炭素原子、例えば１〜１５個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、２０〜３５個の炭素原子、又は３５〜５０個の炭素原子を含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、第１の共有結合及び第２の共有結合の一方又は両方が生分解性結合である。生分解性結合の例には、アミドペプチダーゼ及びペプシン等の血液中の酵素によって切断されることができるアミド結合が含まれる。本開示では、第１の共有結合及び／又は第２の共有結合としてアミド結合を有する多糖類−ビタミン共役体が、温和な条件下でさえ血液中で自発的に分解することが見出された。
【０１３９】
６．共役部位及び種類
本開示の多糖類−ビタミン共役体は、任意の適切な数の共役部位を有し得る。いくつかの実施形態では、多糖類−ビタミン共役体は、１〜１０、例えば１〜５、１〜４、１〜３又は１〜２の範囲の共役部位の平均数を有する。任意に、多糖類−ビタミン共役体は、１の共役部位の平均数を有する。任意に、多糖類−ビタミン共役体は、２の共役部位の平均数を有する。共役部位の平均数は、例えば、共役反応における多糖類とビタミンとの間の比によって制御することができる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、多糖類−ビタミン共役体は、単一の種類のビタミン又はその類似体若しくは誘導体を含む。いくつかの実施形態では、多糖類−ビタミン共役体は、それぞれの共役体分子中に複数の種類のビタミン又はその類似体若しくは誘導体を含む。任意に、多糖類−ビタミン共役体は、それぞれの共役体分子中に２〜１０（例えば、２〜５、２〜４、２、４又は５）種類の異なるビタミン又はその誘導体を含む。任意に、それぞれの共役体分子は、２〜５種類の異なるビタミン又はその誘導体（例えば、葉酸、コール酸、ビタミンＡ、ビタミンＥ、又はそれらの誘導体）を含むことができる。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、粒状物は、単一の種類のビタミン又はその類似体若しくは誘導体を含む多糖類−ビタミン共役体によって形成される。いくつかの実施形態では、粒状物は、複数の種類のビタミン又はその類似体若しくは誘導体を含む多糖類−ビタミン共役体によって形成される。いくつかの実施形態では、粒状物は、多糖類−ビタミン共役体の混合物によって形成され、その一部は、それぞれの共役体分子中の単一の種類のビタミン又はその類似体若しくは誘導体を含み、その一部は、それぞれの共役体分子中の複数の種類のビタミン又はその類似体若しくは誘導体を含む。
【０１４２】
活性薬剤を被包した粒状物の調製
本開示の粒状物（例えばマイクロ粒子）を含む組成物を調製する方法は、例えば図２に示される。１つの態様では、この方法は、多糖類に共有結合により連結したビタミン又はその類似体若しくは誘導体の１以上の分子を含む多糖類−ビタミン共役体を準備することと、多糖類−ビタミン共役体と治療薬とを適切な溶媒中で組み合わせるか、又は多糖類−ビタミン共役体の溶液と治療薬の溶液とを組み合わせることと、多糖類−ビタミン共役体と治療薬との混合物を高せん断ホモジナイザーに供して多糖類−ビタミン共役体と治療薬とを含む粒状物（例えばマイクロ粒子）を形成することとを含み、ここで、治療薬は、多糖類−ビタミン共役体によって形成された粒状物に取り込まれており、且つビタミン又はその類似体若しくは誘導体の１以上の分子は、治療薬と多糖類との間に位置する。
【０１４３】
１つの実施形態では、デキストラン−葉酸共役体は、以下のように調製することができる。デキストランは、１，３−結合と１，６−結合の両方を有する。その結果、第１工程の誘導体化に利用可能な異なるヒドロキシル基が存在する。スクシニル化デキストラン（ＭＷ＝１０〜７０ＫＤａ）の合成が、以下に示され、図１Ａ（１，６デキストラン）及び図１Ｂ（１，３デキストラン）において示される。
【０１４４】
【化１】
2018530606.tif 000004
【０１４５】
１つの態様では、アミノ葉酸の合成が、以下と図１Ｃに示される。
【０１４６】
【化２】
2018530606.tif 000005
【０１４７】
多糖類とビタミンとは別個に修飾することができると理解されたい。いずれの修飾も、以下と図１Ｄに示される共役工程の前に実施することができる。ある特定の態様では、修飾又は両方の修飾のいずれかを、共役工程と同時に又は実質的に同時に実施することができる。他の実施形態では、多糖類部分の修飾及び／又はビタミン（若しくは関連する薬剤）部分の修飾は、該部分が共役した後に実施することができる。１つの実施形態では、以下の反応は、修飾されたデキストランを修飾された葉酸に連結して、デキストラン−葉酸共役体を形成する。ある特定の態様では、葉酸又はその誘導体若しくは類似体への共役は、多糖類、例えばデキストランの疎水性を増加させる。多糖類の疎水性を増加させる他のビタミン又は関連する薬剤及び他の方法も、独立して又は本明細書に記載される方法及び工程と組み合わせて使用することができると理解されたい。
【０１４８】
【化３】
2018530606.tif 000006
【０１４９】
ある特定の実施形態では、葉酸対デキストランの単位の比は、（０．５〜２）：（１．０〜２０）である。好ましい実施形態では、葉酸対デキストランの単位の比は（０．８〜１．２）：（２．０〜１０）、より好ましくは１：５である。ある特定の態様では、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）又はＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等のカルボジイミドをカップリング試薬として使用することができる。液体として、ＤＩＣは、一般的に使用されているＤＣＣより取り扱いが容易である。
【０１５０】
１つの実施形態では、薬物をデキストラン−葉酸共役体に取り込むための製剤化の方法は、抗腫瘍薬（例えば抗癌薬物）とデキストラン−葉酸共役体とを混合するために高せん断ホモジナイザーを使用して、以下のように実施することができる。好ましい実施形態では、抗腫瘍薬は、パクリタキセル、ドセタキセル、若しくはドキソルビシン、又はその誘導体若しくは類似体、又はそれらの任意の組合せであり得る。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、薬物と賦形剤との混合工程は、通常のホモジナイザーによって仕上げることができる。好ましい実施形態では、高せん断ホモジナイザーを使用して、デキストラン−葉酸共役体のコアに薬物を取り込んで、高い被包効率を有するナノスケール懸濁液を形成する。特定の態様では、多糖類−ビタミン共役体と治療薬との混合物を、約１０，０００〜約３０，０００ｐｓｉ（ポンド／平方インチ）の範囲の圧力下で高せん断ホモジナイザーに供することができる。他の態様では、約５，０００〜約１０，０００ｐｓｉ、約１０，０００〜約２０，０００ｐｓｉ、約２０，０００〜約３０，０００ｐｓｉ、約３０，０００〜約４０，０００ｐｓｉ、約４０，０００〜約５０，０００ｐｓｉ、約５０，０００〜約６０，０００ｐｓｉ、又は約６０，０００ｐｓｉ超の範囲の圧力を有する高せん断ホモジナイザーを使用することができる。
【０１５２】
１つの態様では、デキストラン−葉酸共役体を、適切な緩衝液、例えばＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）に溶解することができる。混合物は、デキストラン−葉酸共役体が完全に溶解するまで、典型的には約５〜１０分間、ホイール上で回転させることができる。１つの実施形態では、パクリタキセル等の薬物を、適切な緩衝液又は溶媒、例えば酢酸エチル／ベンジルアルコール（４：１）又はＣＨ２Ｃｌ２／エタノール（４：１）に溶解し、デキストラン−葉酸共役体水溶液に添加して、粗製製剤／エマルジョンを得る。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、多糖類−ビタミン共役体の溶液と治療薬の溶液とは混和性である。ある特定の実施形態では、多糖類−ビタミン共役体の溶液と治療薬の溶液とは、非混和性である。例えば、多糖類−ビタミン共役体の溶媒は、水性液体（例えば、水、又は溶解塩若しくは他の種、細胞若しくは生体媒質、エタノール等を含有する水）であり、治療薬の溶媒は、有機溶媒（例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、クロロホルム、テトラヒドロフラン、アセトン、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ピリジン、ジオキサン、ジメチルスルホキシド等）である。いくつかの実施形態では、多糖類−ビタミン共役体の溶液と治療薬の溶液とを組み合わせることで、エマルジョンが得られる。
【０１５４】
１つの実施形態では、エマルジョンは、水中油型エマルジョンであってもよく、該エマルジョンは、粒状物（例えばマイクロ粒子）を含有する分散した非水性相と、水を含有する連続相と、を含む。別の実施形態では、エマルジョンの非水性相は、安息香酸ベンジル、トリブチリン、トリアセチン、並びにサフラワー油及びトウモロコシ油等の油のうちの少なくとも１つを含む。ある特定の実施形態では、エマルジョンは、マイクロエマルジョンであってもよい。
【０１５５】
１つの態様では、高せん断ホモジナイザー（例えばＬＭ  ２０，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｉｎｃ．）を、３０，０００ｐｓｉで約４〜約６回、粗製エマルジョンに適用することができる。粗製エマルジョン全体を、５：１（水：エマルジョン、ｖ／ｖ）の割合で混合しながら、適切な溶媒、例えば冷ＤＩ水に注ぐことができる。ある特定の実施形態では、この方法は、ダイアフィルトレーション、濾過、溶媒蒸発、若しくは遠心分離、又はそれらの任意の組合せによって、粒状物（例えばマイクロ粒子）を単離することを更に含むことができる。例えば、エマルジョン中の溶媒は、ダイアフィルトレーションによって除去して、ポリマー１ｍＬ当たり１０ｍｇの最終濃度に達することができる。他の実施形態では、この方法は、共溶媒の添加に続いてダイアフィルトレーションによって粒状物を単離することを更に含むことができる。ある特定の態様では、共溶媒は、脱イオン水であってもよい。
【０１５６】
ある特定の態様では、このプロセスは、精製工程及び／又は滅菌工程を更に含むことができる。ある特定の態様では、精製工程及び／又は滅菌工程は、粒状物（例えばマイクロ粒子）を０．２μｍの平均細孔径の膜に通して濾過すること、及び／又は粒状物を適切な溶媒で洗浄することを含むことができる。例えば、粒径を測定することができ、凍結乾燥前に製剤を滅菌するために０．２μｍの膜を使用することができる。
【０１５７】
ある特定の態様では、この方法は、凍結保護物質、例えばスクロース又はトレハロース等の糖の存在下での乾燥工程及び／又は凍結乾燥工程を更に含むことができる。例えば、約１０重量％のスクロース等の凍結保護物質を添加して、次の凍結乾燥サイクル中に粒径を実質的に変化させないようにすることができる。特定の実施形態では、凍結乾燥工程は、粒状物（例えばマイクロ粒子）を実質的に凝集させないか、又は粒状物の平均直径を実質的に変化させない。好ましい実施形態では、粒状物（例えばマイクロ粒子）は、ナノ粒子であり得る。ある特定の態様では、粒状物の平均直径は、約２０ｎｍ〜約２００ｎｍであり得る。ある特定の別の態様では、粒状物の平均直径は、約２０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約１５０ｎｍ、又は約１５０ｎｍ〜約２００ｎｍであり得る。１つの実施形態では、粒状物の平均直径は、約２００ｎｍ未満であり、凍結乾燥中及び／又は凍結乾燥後に約２００ｎｍ未満のままである。
【０１５８】
好ましい実施形態では、製剤の長い保管寿命は、凍結乾燥法によって達成することができる。１つの態様では、凍結乾燥工程後の組成物は、凍結乾燥ケーキ又は凍結乾燥粉末として製剤化することができる。別の態様では、再構成された溶液は、懸濁液の均一性及び薬物含有量に関して、室温で３日間にわたって安定性を示した。
【０１５９】
ある特定の実施形態では、本開示の粒状物（例えばマイクロ粒子）は、治療薬を含有するナノ粒子、ナノスフェア、ナノカプセル、又はミセルであり得る。好ましい実施形態では、本開示の粒状物（例えばマイクロ粒子）において、ビタミン又は関連する薬剤部分は、粒子の外面ではなく、粒状物の内部の取り込まれた薬物と修飾多糖類との間に位置し、例えば、標的リガンドとして機能する。更に、好ましい実施形態では、生分解性多糖が使用され、アルブミン等の他の生体分子と比較して、コストが低い。例えば、多糖類の修飾とそれを他の分子に結合することとは、ヒトアルブミンよりも容易にかつ低コストで達成することができる。例えば、ポリマー精製のためにゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）法は必要ではない。更に、合成ポリマーは、市販のベンチマーク薬物において賦形剤として使用されるヒトアルブミン等の他の生物学的物質のウイルス汚染のリスクを減少させることができる。
【０１６０】
本開示の更なる利点は、他のポリマー−薬物共役体送達システムとは異なり、薬物がポリマーに物理的に取り込まれ、化学的又は共有結合による結合ではないことである。それゆえ、好ましい実施形態では、放出速度は、ポリマー又はポリマー共役体に共有結合により共役した薬物よりも速くあり得る。好ましい実施形態では、薬物のラセミ化は、薬物の効能及び／又は生物学的活性を保持するために、完全に回避することができるか、あるいは少なくとも有意に低減することができる。
【０１６１】
製剤
別の態様では、本開示は、本粒状物を有する安定な製剤を提供する。例えば、安定な製剤は、凍結乾燥した粒状物を水溶液中に再構成することによって調製することができる。再構成されたサンプルは、室温で少なくとも３日間、例えば室温で少なくとも５日間、室温で少なくとも７日間、又は室温で少なくとも１０日間安定したままである。粒状物の平均サイズは、室温で少なくとも３日間、例えば室温で少なくとも５日間、室温で少なくとも７日間、又は室温で少なくとも１０日間、再構成されたサンプル中で実質的に変化しないままである。更に、粒状物中の薬物担持容量は、室温で少なくとも３日間、例えば室温で少なくとも５日間、室温で少なくとも７日間、又は室温で少なくとも１０日間、再構成されたサンプル中で実質的に同じままである。
【０１６２】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される方法によって調製された凍結乾燥粒状物を再構成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、再構成方法は、凍結乾燥した粒状物に希釈剤を添加して、再構成された溶液を形成することを含む。任意に、希釈剤は、パイロジェンフリー水である。再構成された溶液は、皮下内注射及び静脈内注射に適している。
【０１６３】
診断、治療、及び予後に粒状物を使用する方法
本開示は、本明細書に記載される実施形態のいずれかの有効量の粒状物（マイクロ粒子）又は組成物を対象に投与することを含む、対象を治療する方法を提供する。ある特定の態様では、粒状物（マイクロ粒子）又は組成物は、局所的、腸内／胃腸内、腸管外、硬膜外、大脳内、脳室内、皮内、皮下内、経鼻、経口、静脈内、動脈内、筋肉内、骨髄内、硝子体内、嚢内、経皮的、又は経粘膜的な経路を介して対象に投与されるように構成されることができる。
【０１６４】
本開示の臨床用途は、癌又は腫瘍性の疾患又は症状に限定されないと理解されたい。それどころか、粒状物に取り込むことができる適切な薬剤、適切な投与経路、対象の適切な標的集団、及び粒状物を使用して送達される薬剤に対する対象の応答をモニターする適切な方法があるならば、任意の疾患又は症状は、本明細書に開示される粒状物（例えばマイクロ粒子）及び組成物の使用により恩恵を得ることができる。特定の例では、粒状物（例えばマイクロ粒子）及び組成物の使用により恩恵を得ることができる疾患又は症状には、ウイルス感染、例えばＨＩＶ感染若しくはＡＩＤＳ、又はＨＢＶ若しくはＨＣＶ感染、自己免疫疾患、例えば狼瘡又は関節リウマチ；神経変性疾患、例えばパーキンソン病又はアルツハイマー病が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、粒状物（例えばマイクロ粒子）の使用は、抗腫瘍薬を診断、治療及び／又は予後の目的で、それを必要とする対象に取り込み及び／又は送達するのに好ましく、ここで、抗腫瘍薬は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、天然抗癌製品、ホルモン、金属配位錯体、及びそれらの混合物からなる群から選択することができる。唯一の要件は、これらの薬剤が、本開示で使用される粒状物（例えばマイクロ粒子）によって適切に取り込まれることができ、組み合わせて使用される場合に互いに干渉しないことである。当然のことながら、本明細書及び下記に具体的に開示される多数の物質を含む単一の群又は前述の群の２以上の薬剤の投与に関しての制限はない：バッカチンＩＩＩ、ナイトロジェンマスタード（例えば、シクロホスファミド、トロホスファミド、イホスファミド及びクロラムブシル）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）及びニムスチン（ＡＣＮＵ））、エチレンイミン及びメチルメラミン（例えば、チオテパ）、葉酸アナログ（例えば、メトトレキセート）、ピリミジン類縁体（例えば、５−フルオロウラシル及びシタラビン）、プリン類縁体（例えば、メルカプトプリン及びアザチオプリン）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ニンクリスチン、及びビンデシン）、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシド及びテニポシド）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシンＡ２、マイトマイシンＣ、及びミトキサントロン）、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロール）、ゴナドトロピン放出ホルモンアナログ（例えばロイプロリド、ブセレリン、及びゴセレリン）、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン及びアミノグルテチミド）、アンドロゲン（例えば、テストロラクトン及びドロスタノロンプロピオネート）、並びに白金錯体（例えば、シスプラチン及びカルボプラチン）。
【０１６６】
１つの態様では、粒状物（マイクロ粒子）又は組成物中に含まれる治療薬は、抗腫瘍薬であり得る。特定の実施形態では、治療薬は、パクリタキセル若しくはその誘導体、ドセタキセル若しくはその誘導体、又はドキソルビシン若しくはその誘導体であり得る。ある特定の態様では、治療薬を粒状物（マイクロ粒子）に取り込むことが、所与の量の治療薬に対する対象の応答性を変化させることは実質的にない。他の態様では、治療薬は、細胞毒性薬であってもよく、対象の応答性は、該細胞毒性薬の細胞毒性によって測定することができる。他の態様では、対象を治療するこの方法は、本開示の粒状物（例えばマイクロ粒子）に取り込まれていない治療薬を投与することと比較して、治療薬に対する対象の耐用量を増加させる。ある特定の態様では、有効量の粒状物（例えばマイクロ粒子）又は組成物を対象に投与することで、対象における腫瘍細胞の増殖を減少させることができる。
【０１６７】
本開示は、対象における腫瘍増殖を減少させる方法であって、有効量の放射線で、それを必要とする対象を治療することと、本明細書に開示される実施形態のいずれかの有効量の粒状物（例えばマイクロ粒子）又は組成物で、対象を治療することと、を含む方法を更に提供する。ある特定の態様では、本明細書に提供されるのは、対象における腫瘍増殖を減少させる方法であって、有効量の化学療法薬で、それを必要とする対象を治療することと、本明細書に開示される実施形態のいずれかの有効量の粒状物（例えばマイクロ粒子）又は組成物で、対象を治療することと、を含む方法である。更に別の態様では、有効量の生物学的に活性な治療薬と、本明細書に開示される実施形態のいずれかの有効量の粒状物（例えばマイクロ粒子）又は組成物との組合せで、対象を治療することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を減少させる方法が開示される。
【０１６８】
本開示の方法に従って、併用治療ストラテジーの個々の治療は、治療過程中の異なる時間に別個に、任意の適切な順序で、又は分割した形態若しくは単一の組合せ形態で同時に投与することができる。例えば、有効量の放射線、化学療法薬、若しくは生物学的に活性な治療薬、又はそれらの任意の組合せによる治療は、本明細書に開示される実施形態のいずれかの有効量の粒状物（例えばマイクロ粒子）又は組成物による治療の開始に先立って、その治療の後に、又はその治療と同時に開始することができる。それ故、本開示は、同時又は交互の治療のそのようなレジームの全てを包含するものとして理解されるべきであり、「投与する」という用語は、それに応じて解釈されるべきである。
【０１６９】
本開示は、本開示の粒状物を使用して疾患又は症状を診断する方法を更に提供する。いくつかの実施形態では、疾患又は症状を診断するために有用な粒状物は、複数の多糖類−ビタミン共役体と診断用標識とを含む。いくつかの実施形態では、共役体中のビタミン又はその類似体若しくは誘導体は、体内の組織又は細胞（例えば、腫瘍又は循環血液細胞）の受容体に結合することができる標的分子である。例えば、多糖類−葉酸塩共役体は、多くの種類の腫瘍の表面上で高度に過剰発現される葉酸受容体を標的とすることができる。いくつかの実施形態では、ビタミンを、体内の組織又は細胞の受容体に結合する小分子リガンド、ペプチド、又は抗体等の標的分子を含むように誘導体化することができる。
【０１７０】
診断用標識の例には、放射性同位元素、酵素、色素、ビオチン、蛍光標識、及び化学発光標識が含まれる。いくつかの実施形態では、診断方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断方法である。任意に、この方法は、対象からサンプルを得ること（例えば、腫瘍サンプル又は血液サンプル）；サンプルを本粒状物と接触させること；サンプル中の受容体に結合していない診断用標識を除去すること；サンプル中の受容体に結合した診断用標識の量を決定することとを含む。いくつかの実施形態では、診断方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化法である。任意に、この方法は、本粒状物を対象に投与すること；対象における受容体に結合した診断用標識の存在を検出することを含む。任意に、対象における受容体に結合した診断用標識の存在は、磁気共鳴画像装置又はＸ線免疫シンチグラフィー画像装置、陽電子放射断層撮影装置等の画像装置によって検出される。
【実施例】
【０１７１】
以下の実施例は、本開示の様々な態様を更に説明及び例示することを意図しているが、本開示の範囲を、明示的にも暗黙的にも、いかなる手法、形状ま、又は形態によっても限定するものではない。
【０１７２】
実施例１：デキストラン−葉酸共役体の合成
【０１７３】
この例では、デキストラン−葉酸共役体の合成のための３つの工程がある。
【０１７４】
工程（１）：スクシニル化デキストランの合成。合成経路を図１Ａ及び図１Ｂに示す。
【０１７５】
溶媒として２０ｍｇ／ｍＬのＬｉＣｌ及び触媒として２６．１ｇ（０．３３モル）のピリジンを含有する９００ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、１８．０ｇ（０．３３ｍｏｌ  ＯＨ）のデキストラン（Ｔ−７０，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、３３．０ｇ（０．３３ｍｏｌ）の無水コハク酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）と８０℃で反応させた。反応時間は３０時間であり、ポリマーの単離を、２Ｍ冷塩酸中で沈殿させ、氷冷水で洗浄し、ＮａＨＣＯ３溶液に溶解し、アセトン中でナトリウム塩を沈殿させ、ポリマーを水に溶解し、２Ｍ塩酸中で再沈殿させ、氷冷水で洗浄し、アセトンに溶解し、最後にジエチルエーテル中で沈殿させ、安定重量まで乾燥させることによって行った。
【０１７６】
官能化デキストランの特性決定は、ＩＲ並びに１Ｈ及び１３Ｃ−ＮＭＲ技術によって実施した。置換度（ＤＳ）は、フェノールフタレインの存在下に、０．１Ｍ水酸化ナトリウムと共にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液中での修飾ポリマーの滴定によって決定した。ポリマーは、８５．０ｍｏｌ％のエステル基を含有していた（ＤＳ＝２．５５）。
【０１７７】
工程（２）：アミノ葉酸の合成。合成経路を図１Ｃに示す。
【０１７８】
葉酸（３０００ｍｇ、６．８ｍｍｏｌ）を、８５８ｍｇ（６．８ｍｍｏｌ）のＤＩＣ及び７８３ｍｇ（６．８ｍｍｏｌ）のＮＨＳが加えられた１２０ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶解した。反応を暗所で室温にて一晩放置した。次いで、１０００ｍＬのアセトン／エーテル（３：７）を、撹拌しながら添加した。黄色の沈殿物ＦＡ−ＮＨＳエステルを焼結ガラス上に集め、アセトン／エーテル（３／７）で洗浄した。乾燥されたＦＡ−ＮＨＳエステルを、合成の次の工程で直ちに使用するか、又は保管のために−２０℃で置いた。
【０１７９】
２．７８ｇ（５０ｍｍｏｌ）の乾燥ＦＡ−ＮＨＳエステルを、２０ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。６．１０ｇ（１０００ｍｍｏｌ）のエタンジアミンを、直ちに上記溶液に添加し、室温（２５℃）で１２時間、暗所で撹拌しながらインキュベートした。次いで、５０ｍＬのアセトン／エーテル（３／７）を、撹拌しながら溶液に注いだ。黄色の沈殿物を回収し、ＤＭＳＯ中で再結晶して、精製されたアミノ葉酸を得た。
【０１８０】
工程（３）：デキストラン−葉酸共役体の合成。合成経路を図１Ｄに示す。
【０１８１】
２０００ｍｇのスクシニル化デキストラン（糖単位４．９ｍｍｏｌ）を、４０ｍＬの無水ＤＭＦに溶解した。３１５．５ｍｇのＤＩＣ及び３３７．８ｍｇのＨＯＢＴを添加し、室温で一晩インキュベートした。次いで、２ｍＬのＤＭＦに溶解した４７３．８ｍｇのアミノ葉酸を添加し、更に１２時間撹拌し続けた。反応物全体をＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ３透析バッグ（ＭＷ＝３５００）に注ぎ、透析を２日間行った。溶液を凍結乾燥して黄色の固体を得た。最終生成物は、１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ−ＤＭＳＯ）：２．８（−ＣＨ２ＣＨ２−，スクシニル化デキストラン），３．２−３．６（デキストラン），４．４−５．８（デキストラン），８．６（葉酸）によって同定された。
【０１８２】
実施例２：デキストラン−葉酸共役体によるパクリタキセルの被包
【０１８３】
この例では、被包過程は、図２のフローチャートとして示すことができる。
【０１８４】
１０００ｍｇのデキストラン−葉酸共役体を、１０ｍＬの２０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）に溶解し、完全に溶解するまでホイール上で回転させた（５〜１０分間）。パクリタキセル（３００ｍｇ）を、１ｍＬの酢酸エチル／ベンジルアルコール（４：１）又はＣＨ２Ｃｌ２／エタノール（４：１）に溶解し、上記水溶液に添加して粗製製剤を得た。次いで、高せん断ホモジナイザー（ＬＶ１  Ｌｏｗ  Ｖｏｌｕｍｅ，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｉｎｃ．）を、３０Ｋ  Ｐｓｉで４〜６回、粗製エマルジョンに適用した。その後、粗製エマルジョン全体を、５：１（水：エマルジョン）の割合で混合しながら冷ＤＩ水に注いだ。最終的に、１００ｍｇ／ｍＬのポリマーの最終濃度に達するように、エマルジョン中の溶媒をダイアフィルトレーションにより最終的に除去した。粒径を測定し、凍結乾燥前に製剤を滅菌するために０．２μｍの膜を使用した。１０重量％のスクロース等の凍結保護物質を適用して、次の凍結乾燥サイクルの間ずっと粒径を維持した。
【０１８５】
実施例３：凍結乾燥ケーキの凍結乾燥工程
【０１８６】
この実施例では、凍結乾燥剤形を、その保管寿命を延ばすように製剤設計した。医薬品的に優雅な外観を呈する凍結乾燥ケーキを得るために、実施例２で製造した上記製剤を３０ｍＬの血清バイアルに入れ、凍結乾燥機（モデル：Ｖｉｒｔｉｓ  ＡｄＶａｎｔａｇｅ  Ｐｌｕｓ）に適用した。最適化サイクルは、以下のように示された。
【０１８７】
凍結及びアニーリング：−４０℃で１２０分間凍結し、温度を−２２℃に９０分間上昇させた。次いで、温度を−４０℃に低下し戻し、２時間保持した。
【０１８８】
一次乾燥プロセス：温度を−１１℃に上昇し戻し、真空下で４８．６時間保持し続けた。
【０１８９】
二次乾燥プロセス：２５℃にて真空下で７時間乾燥した。凍結乾燥ケーキの含水率は３．５％未満であり、最終生成物は、涼しくて乾燥した保管室で保管した。バイアルの代表的な画像を図３に示す。
【０１９０】
３００ｍｇのパクリタキセルを含有する凍結乾燥ケーキバイアルを、１０ｍＬのＷＦＩで３分以内に再構成して、透明な牛液を得た。粒径は、ＤＬＳによって測定して１２０±２０ｎｍであり、これは、粒状物（例えばナノ粒子）が凍結乾燥プロセス後に凝集しなかったことを示した。凍結乾燥ケーキの全ての物理化学的特性を表２に示す。
【０１９１】
表２：凍結ケーキの物理化学的特性
【表２】
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【０１９２】
加速安定性を４０℃（１００％湿度）で３０日間試験した。再構成後、効能を周囲温度で保存した物質と比較した。アッセイを９５〜１０５％に保ち、これは、極端な条件下でも凍結乾燥ケーキが少なくとも１ヶ月の保管寿命を有することを示した。
【０１９３】
実施例４：製剤のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価
【０１９４】
パクリタキセルを含有する凍結乾燥ケーキを、ヒト非小細胞性肺癌細胞の細胞毒性についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。ＷＦＩで再構成した後、異なる濃度のパクリタキセルを、「Ｇｉｂｃｏ」（登録商標）細胞培養培地と共に７２時間インキュベートした癌細胞上に置き、ＩＣ５０を細胞生存率に従って計算した。結果は、取り込まれたパクリタキセルの細胞毒性が、何ら処置を施していないパクリタキセル自体と類似していることを示した（ＩＣ５０；約１０ｎＭ）。対照的に、デキストラン−葉酸（ＦＡ）共役体は、ＩＣ５０＞０．０５ｍｇ／ｍＬで細胞毒性を示さなかった。それ故、結果は、細胞毒性の寄与が、デキストラン−ＦＡの共役体からではなく、パクリタキセルに由来することを示した。
【０１９５】
実施例５：製剤のｉｎ  ｖｉｖｏ毒性評価
【０１９６】
「Ａｂｒａｘａｎｅ」（登録商標）及び新規の製剤の毒性について、Ｃ５７／ＢＬ１６ブラックマウスで比較研究を行った。評価は体重減少に基づいており、最大用量は体重減少が１０％未満であると定義される。図４Ａによれば、「Ａｂｒａｘａｎｅ」（登録商標）の最大用量は、８０ｍｇ／ｋｇのパクリタキセル当量であった。しかしながら、新規の製剤の最大用量は、１２５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセル当量であった。結果は、デキストラン−ＦＡ共役体へのパクリタキセルの被包が、抗癌薬物の毒性を低下させ、耐性用量を増加させることができることを示した。それ故、製剤は、将来の臨床試験においてより高い用量で適用することができる。
【０１９７】
実施例６：製剤を使用した腫瘍増殖の阻害
【０１９８】
抗腫瘍活性は、ヒト非小細胞性肺癌細胞を移植した異種移植モデルで評価した。再構成された凍結乾燥ケーキ（パクリタキセル／ポリマー＝３０／１００）を、５０、７５、１００、及び１２５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセル当量で尾静脈注射によって投与した。対照群は、ＰＢＳ、デキストラン−ＦＡ共役体及び「Ａｂｒａｘａｎｅ」（登録商標）（８０ｍｇ／ｋｇのパクリタキセル当量）であった。腫瘍増殖の阻害をモニターし、その結果を図４Ｂに示した。ＰＢＳ及びデキストラン−ＦＡ共役体は、いかなる腫瘍阻害効果も有していなかった。しかしながら、７５ｍｇ／ｋｇ（パクリタキセル当量）の凍結乾燥ケーキの腫瘍成長阻害は、８０ｍｇ／ｋｇ（パクリタキセル当量）の「Ａｂｒａｘａｎｅ」（登録商標）よりも優れており、これは、５０ｍｇ／ｋｇ（パクリタキセル当量）の凍結乾燥ケーキとほぼ同じであった。
【０１９９】
このデータによれば、デキストラン−ＦＡ共役体は、非毒性であるが、取り込まれたパクリタキセルは腫瘍増殖を阻害するのを助けることができると結論付けることができる。いくつかの態様では、この製剤は、市販の製剤よりも優れている。
【０２００】
実施例７：デキストラン−葉酸共役体の合成
【０２０１】
工程１：デキストラン−コハク酸へのデキストランの修飾。合成経路を図５Ａに示す。
【０２０２】
２５０ｍＬのＲＢに、１５０ｍＬの無水ジメチルスルホキシドと共にデキストラン（４００００Ｄ、３０．０ｇ、０．５５６ｍｏｌ  −ＯＨ）を添加した。混合物を５０℃に加熱して透明な溶液を得た。無水コハク酸（５．０１ｇ、５０．０ｍｍｏｌ）及び４−（ジメチルアミノ）ピリジン（１５０ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ、２．５％の触媒担持率）を添加した。反応混合物を２４時間激しく撹拌した。得られた反応混合物を９００ｍＬの冷無水エタノールに注ぎ、白色の沈殿物を形成させた。遠心分離（４０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）によって白色の固体を回収した。得られた固体を３００ｍＬの水（ｐＨ３．２５）に溶解し、３０ｍＬの水性ＮＨ４ＨＣＯ３（０．１０Ｍ）に添加してｐＨを中性に調整した。得られた水溶液を０．２μｍのＰＶＤＦフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ  ６９００−２５０２）で濾過し、１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３と共に水に対して４日間透析した。凍結乾燥することで、１８．４ｇ（５３％）のデキストラン−（コハク酸）０．２７０が得られた。
【０２０３】
工程２：葉酸−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２を形成するための、エチレンジアミンによる葉酸の修飾。合成経路を図５Ｂに示す。
【０２０４】
２５０ｍＬのＲＢに、８０ｍＬの無水ジメチルスルホキシドと共に葉酸（３．０ｇ、６．８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を５０℃に加熱して透明な褐色の溶液を得た。２０ｍＬの乾燥ＤＭＳＯ中のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（９３０ｍｇ、４．５ｍｍｏｌ）２０ｍＬ及び２０ｍＬの乾燥ＤＭＳＯ中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（７７０ｍｇ、４．５ｍｍｏｌ）の添加を続けた。反応混合物を室温で２０時間撹拌した。暗褐色の反応混合物は、不透明に変わった。沈殿物を、遠心分離（４０００ｒｐｍ、２０℃、１０分間）によって除去した。得られた透明な暗褐色の溶液を、ジエチルエーテルとアセトンの８０／２０混合溶媒２８０ｍＬに注いだ。得られた黄褐色の沈殿物を回収し、遠心分離（４０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）によって（ジエチルエーテルとアセトンの８０／２０混合溶媒で）洗浄した。得られた黄褐色の半固体を水５０ｍＬに懸濁し、凍結乾燥して３．０８ｇの褐色の固体を得た。
【０２０５】
３．０８ｇの褐色の固体を、撹拌棒を備えた２０ｍＬのシンチレーションバイアルに１２ｍＬの乾燥ＤＭＳＯと共に添加した。この混合物に、激しく撹拌しながらエチレンジアミン（６．６３ｇ、７．４ｍＬ）を添加した。反応混合物をキャップして１８時間撹拌した。得られた反応混合物を、ジエチルエーテルとアセトンの８０／２０混合溶媒８０ｍＬに注いだ。褐色の沈殿物を回収し、遠心分離（４０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）によって（ジエチルエーテルとアセトンの８０／２０混合溶媒で）洗浄した。褐色の固体を、乾燥ＤＭＳＯ（約１０ｍＬ）から再結晶した。ＤＭＳＯ再結晶化からの褐色の固体を回収し、水３０ｍＬに懸濁し、凍結乾燥して、生成物３．０４ｇを８９％で得た。
【０２０６】
工程３：デキストラン−コハク酸と葉酸−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２との共役。合成経路を図５Ｃに示す。
【０２０７】
撹拌棒を備えた２０ｍＬのシンチレーションバイアルに、１０ｍＬの無水ジメチルスルホキシドと共にデキストラン−（コハク酸）０．２７０（供給源ＺＹＴ−ＷＷ−Ｉ−３９、１．０ｇ、５．３ｍｍｏｌのグルコース部分、１．４２コハク酸部分）を添加した。混合物を５０℃に加熱して透明な溶液を得た。５ｍＬの乾燥ＤＭＳＯ中のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（５４．６ｍｇ、０．２６７ｍｍｏｌ、５％当量のグルコース部分）及びＮ−ヒドロキシルスクシンイミド（３０．７ｍｇ、０．２６７ｍｍｏｌ、１．０５当量）の添加を続けた。反応混合物を室温で２０時間撹拌した。反応混合物に、５ｍＬの乾燥ＤＭＳＯと共に葉酸−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２（供給源ＺＹＴ−ＷＷ−Ｉ−４５、１５５ｍｇ、０．２６７ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物を室温で更に２４時間撹拌した。反応混合物を８０ｍＬの冷無水エタノールに注ぎ、淡黄色の沈殿物を形成させた。淡黄色の固体を遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０℃、２０分間）によって回収した。得られた固体を水３０ｍＬに溶解した。得られた水溶液を５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３と共に水で２日間透析し、５分間超音波処理し、０．２μｍのＰＶＤＦフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ  ６９００−２５０２）で濾過し、次いで６ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３と共に水に対して更に１日間透析した。得られた透明な溶液はｐＨ７．０であり、更に１０ｍＭ  ＨＯＡｃと共に水で２日間透析した。褐色の固体が透析管内部に形成し、この褐色の固体を遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０℃、２０分間）によって回収した。得られた褐色のペーストを水５０ｍＬに懸濁し、凍結乾燥して１．１３ｇの最終生成物をデキストラン−（コハク酸）０．２２（コハク酸−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−葉酸）０．０５として淡褐色の固体（収率９８％）として得た。ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルは、葉酸部分が、葉酸モル識別係数に基づいて３．８ｍｏｌ％であることを示した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、葉酸部分が、積分に基づいて約３モル％であることを示した。
【０２０８】
実施例８：エチレンジアミンによるコール酸の修飾
【０２０９】
合成経路を図６に示す。撹拌棒を備えた２０ｍＬのシンチレーションバイアルに、１０ｍＬの無水ジメチルスルホキシドと共にコール酸（３．０ｇ、７．３４ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加した。混合物を５０℃に加熱して透明な溶液を得た。１０ｍＬの乾燥ＤＭＳＯ中のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．５ｍｇ、７．７１ｍｍｏｌ、１．０５当量）及びＮ−ヒドロキシルスクシンイミド（８９０ｍｇ、７．７ｍｍｏｌ、１．０５当量）の添加を続けた。反応混合物を室温で２０時間撹拌した。反応混合物にエチレンジアミン（６．６３ｇ、７．４ｍＬ）を添加した。得られた反応混合物を室温で更に２４時間撹拌した。反応混合物をエタノールと水の８０／２０混合溶媒８０ｍＬに注いだ。得られた白色の沈殿物を回収し、遠心分離（４０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）によって（エタノールと水の８０／２０混合溶媒で）洗浄した。粗製固体生成物を水５０ｍＬに懸濁し、凍結乾燥して３．３ｇの白色の固体（収率１００％）を得た。
【０２１０】
実施例９：デキストラン−コハク酸−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−コール酸の合成
【０２１１】
合成経路を図７に示す。撹拌棒を備えた２０ｍＬのシンチレーションバイアルに、１０ｍＬの無水ジメチルスルホキシドと共にデキストラン（コハク酸）０．２７０（１．０ｇ、５．３ｍｍｏｌグルコース部分、１．４２コハク酸部分）を添加した。混合物を５０℃に加熱して透明な溶液を得た。５ｍＬの乾燥ＤＭＳＯ中のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（５４．６ｍｇ、０．２６７ｍｍｏｌ、５％当量のグルコース部分）及びＮ−ヒドロキシルスクシンイミド（３０．７ｍｇ、０．２６７ｍｍｏｌ、１．０５当量）の添加を続けた。反応混合物を室温で２０時間撹拌した。反応混合物に、５ｍＬの乾燥ＤＭＳＯと共にコール酸ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２（１２０ｍｇ、０．２６７ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物を室温で更に２４時間撹拌した。反応混合物を８０ｍＬの冷無水エタノールに注ぎ、オフホワイトの沈殿物を形成させた。固体を遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０℃、２０分間）によって回収し、水３０ｍＬに再溶解した。得られた水溶液を５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３と共に水で２日間透析し、５分間超音波処理し、０．２μｍのＰＶＤＦフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ  ６９００−２５０２）で濾過し、次いで６ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３と共に水に対して更に１日間透析した。得られた透明な溶液を更に水で透析し、凍結乾燥して０．８４ｇ（収率７６％）の最終生成物をデキストラン−（コハク酸）０．２２（コハク酸−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−コール酸）０．０５のオフホワイトの固体として得た。
【０２１２】
実施例１０：エチレンジアミンによるレチノイン酸の修飾
【０２１３】
合成経路を図８に示す。撹拌棒を備えた２０ｍＬのシンチレーションバイアルに、１０ｍＬの無水ジメチルスルホキシドと共にレチノイン酸（１．５ｇ、５．０ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加した。混合物を５０℃に加熱して淡黄色の溶液を得た。１０ｍＬの乾燥ＤＭＳＯ中のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．０８ｍｇ、５．２４ｍｍｏｌ、１．０５当量）及びＮ−ヒドロキシルスクシンイミド（６０３ｍｇ、５．２４ｍｍｏｌ、１．０５当量）の添加を続けた。反応混合物を室温で２０時間撹拌した。反応混合物にエチレンジアミン（３．３ｇ、３．７ｍＬ）を添加した。得られた反応混合物を室温で更に２４時間撹拌した。反応混合物をエタノールと水の８０／２０混合溶媒８０ｍＬに注いだ。得られた白色の沈殿物を回収し、遠心分離（４０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）によって（エタノールと水の８０／２０混合溶媒で）洗浄した。粗製固体生成物を水５０ｍＬに懸濁し、凍結乾燥して１．５５ｇの淡黄色の固体（収率９１％）を得た。
【０２１４】
実施例１１：デキストラン−コハク酸−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−レチノイン酸の合成
【０２１５】
合成経路を図９に示す。撹拌棒を備えた２０ｍＬのシンチレーションバイアルに、１０ｍＬの無水ジメチルスルホキシドと共にデキストラン（コハク酸）０．２７０（１．０ｇ、５．３ｍｍｏｌグルコース部分、１．４２コハク酸部分）を添加した。混合物を５０℃に加熱して透明な溶液を得た。５ｍＬの乾燥ＤＭＳＯ中のＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、５４．６ｍｇ、０．２６７ｍｍｏｌ、５％当量のグルコース部分）及びＮ−ヒドロキシルスクシンイミド（３０．７ｍｇ、０．２６７ｍｍｏｌ、１．０５当量）の添加を続けた。反応混合物を室温で２０時間撹拌した。反応混合物に、５ｍＬの乾燥ＤＭＳＯと共にレチノイン酸−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２（９１．５ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物を室温で更に２４時間撹拌した。反応混合物を８０ｍＬの冷無水エタノールに注ぎ、淡黄色の沈殿物を形成させた。固体を遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０℃、２０分間）によって回収し、水３０ｍＬに再溶解した。得られた水溶液を５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３と共に水で再び２日間透析し、５分間超音波処理し、０．２μｍのＰＶＤＦフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ  ６９００−２５０２）で濾過し、次いで６ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３と共に水に対して更に１日間透析した。得られた透明な溶液を更に水で透析し、凍結乾燥して０．８４ｇ（収率７６％）の最終生成物をデキストラン−（コハク酸）０．２２（コハク酸−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−レチノイン酸）０．０５として淡黄色の固体として白色の固体として得た。
【０２１６】
実施例１２：デキストラン−葉酸−コール酸共役体の合成
【０２１７】
合成経路を図１０に示す。撹拌棒を備えた２００ｍＬのＲＢフラスコに、１５ｍＬの無水ジメチルスルホキシドと共にデキストラン−（コハク酸）０．２７０（１．０ｇ、５．３ｍｍｏｌのグルコース部分、１．４２コハク酸部分）を添加した。混合物を５０℃に加熱して透明な溶液を得た。５ｍＬの乾燥ＤＭＳＯ中のＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１１０ｍｇ、０．５３４ｍｍｏｌ、１０％当量のグルコース部分）及びＮ−ヒドロキシルスクシンイミド（６１ｍｇ、０．５３４ｍｍｏｌ）の添加を続けた。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。５ｍＬの乾燥ＤＭＳＯ中の葉酸−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２（４６５ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）の溶液と５ｍＬの乾燥ＤＭＳＯ中のコール酸−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２（１２０ｍｇ、０．２６７ｍｍｏｌ）の溶液とを調製し、混合した。ＤＭＳＯ溶液の得られた混合物を、室温で激しく撹拌しながら反応混合物に添加し、更に２４時間撹拌し続けた。反応混合物を８０ｍＬの冷無水エタノールに注ぎ、淡黄色の沈殿物を形成させた。淡黄色の固体を遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０℃、２０分間）によって回収した。得られた固体を水３０ｍＬに溶解した。得られた水溶液を５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３と共に水に対して２日間透析し、５分間超音波処理し、０．２μｍのＰＶＤＦフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ  ６９００−２５０２）で濾過し、次いで６ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３と共に水に対してさらに１日間透析した。得られた透明な溶液を水で２日間透析し、凍結乾燥して約１０ｇ（収率７４％）の淡褐色の固体をデキストラン−（コハク酸）０．１７（コハク酸−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−葉酸）０．０５（コハク酸−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−コール酸）０．０５として得た。
【０２１８】
実施例１３：エチレンジアミンによるトコフェロールコハク酸の修飾
【０２１９】
合成経路を図１１に示す。撹拌棒を備えた２０ｍＬのシンチレーションバイアルに、１０ｍＬの無水ジメチルスルホキシドと共にトコフェロールコハク酸（３．０ｇ、５．６５ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加した。混合物を５０℃に加熱して透明な溶液を得た。１０ｍＬの乾燥ＤＭＳＯ中のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．２２ｇ、５．９３ｍｍｏｌ、１．０５当量）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（６８２ｍｇ、５．９３ｍｍｏｌ、１．０５当量）の添加を続けた。反応混合物を室温で２０時間撹拌した。反応混合物にエチレンジアミン（６．６３ｇ、７．４ｍＬ）を添加した。得られた反応混合物を室温でさらに２４時間撹拌した。反応混合物をエタノールと水の８０／２０混合溶媒８０ｍＬに注いだ。得られた白色の沈殿物を回収し、遠心分離（４０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）によって（エタノールと水の８０／２０混合溶媒で）洗浄した。粗製固体生成物を水５０ｍＬに懸濁し、凍結乾燥して２．９４ｇの白色の固体（収率６０％）を得た。
【０２２０】
実施例１４：水混和性溶媒によるデキストラン−葉酸共役体でのパクリタキセルの被包
【０２２１】
４２０ｍｇのデキストラン−葉酸共役体を水７０ｍＬに溶解し、完全に溶解するまで（５〜１０分間）撹拌した。パクリタキセル（１００ｍｇ）をエタノール３．５ｍＬに溶解し、８０００ｐｓｉで２分間ローター／ステーターによって混合しながら上記水溶液に添加してプレミックスを形成させた。次いで、高せん断ホモジナイザー（Ｍ１１０Ｐ，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｉｎｃ．）を２９Ｋ  Ｐｓｉで粗製エマルジョンに１〜５回適用した。その後、室温にて減圧下で粗製エマルジョンからエタノールを蒸発させた。粒径を測定し、凍結乾燥前に製剤を滅菌するために０．２２μｍの膜を使用した。１０重量％のスクロース等の凍結保護物質を適用して、次の凍結乾燥サイクルの間ずっと粒径を維持した。
【０２２２】
実施例１５：水混和性溶媒によるデキストラン−コール酸、デキストラン−レチノイン酸、又はデキストラン−葉酸−コール酸の共役体でのパクリタキセルの被包
【０２２３】
４２０ｍｇのポリマーを水７０ｍＬに溶解し、完全に溶解するまで（５〜１０分間）撹拌した。パクリタキセル（１００ｍｇ）をエタノール３．５ｍＬに溶解し、８０００ｐｓｉで２分間ローター／ステーターによって混合しながら上記水溶液に添加してプレミックスを形成させた。次いで、高せん断ホモジナイザー（ＬＭ２０，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｉｎｃ．）を２９Ｋ  Ｐｓｉで粗製エマルジョンに１〜５回適用した。その後、室温にて減圧下で粗製エマルジョンからエタノールを蒸発させた。粒径を１００〜２００ｎｍの間で制御し、凍結乾燥前に製剤を滅菌するために０．２２μｍの膜を使用した。１０重量％のスクロース等の凍結保護物質を適用して、次の凍結乾燥サイクルの間ずっと粒径を維持した。
【０２２４】
実施例１６：再構成された粒状物溶液の安定性
【０２２５】
実施例２で調製したデキストラン−葉酸共役体と被包パクリタキセルとを有する凍結乾燥した粒状物サンプルを、無菌のパイロジェンフリー水溶液で再構成した。再構成したサンプルを室温（２３℃〜３５℃）で１０日間保持した。再構成したサンプルを、クロマトグラフィーを使用して、それぞれ１日目、７日目、及び１０日目に分析した。薬物濃度及び純度は、１日目のものと比較して、７日目及び１０日目では同じままである。１日目、７日目、及び１０日目の粒径も分析し、同じ範囲に留まることが示された。
【０２２６】
全ての見出しは、読み手の便宜上のためにあり、特に指定がない限り、見出しに続くテキストの意味を限定するために使用されるべきではない。
【０２２７】
上記の刊行物又は文書の引用は、それらのいずれかが関連する先行技術であることを認めるものではなく、またこれらの刊行物又は文書の内容又は日付に関して認めるものではない。
【０２２８】
本開示の様々な実施形態について上記で説明してきたが、それらは単なる例示として提示されたものであり、限定するものではないことを理解されたい。同様に、様々な図表は、本開示に含めることができる特徴及び機能の理解を助けるためになされた本開示の例示的な構造上又は他の構成を示すことができる。本開示は、例示された実施例の構造又は構成に限定されず、様々な代替的な構造及び構成を使用して実行することができる。更に、本開示は、様々な例示的な実施形態及び実施形態に関して上記で記載しているが、個々の実施形態の１以上において説明される様々な特徴及び機能は、それらが記載されている特定の実施形態への適用性に限定されないことを理解されたい。むしろ、そのような実施形態が記載されているか否かにかかわらず、またそのような特徴が記載された実施形態の一部として提示されているか否かにかかわらず、それらは単独で、又はいくつかの組合せにおいて、本開示の他の実施形態の１つ以上に適用することができる。従って、本開示の外延及び範囲は、上記の例示的な実施形態のいずれによっても制限されるべきではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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