(57)【要約】  試料中のｃｆＮＡが核酸精製ステップに供されない、試料中のｃｆＤＮＡなどのｃｆＮＡのインサイチュ増幅（ＩＳＡ）のための方法が提供される。開示される方法は、試料中に存在する分析可能なｃｆＮＡのプールを作製するために使用され得る。この分析可能なプールは、試料中の核酸を特性決定するための種々の分析技法と共に使用され得る。診断の方法、治療介入を決定する方法、及び対象の監視の方法も提供される。
2018530347.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルフリー核酸（ｃｆＮＡ）のインサイチュ増幅の方法であって、
ａ．  複数のｃｆＮＡを含有する液体試料を準備するステップと、
ｂ．  前記試料に少なくとも１つの処理ステップを行うステップと、
ｃ．  酵素混合物を使用し、前記試料中の前記ｃｆＮＡの少なくとも一部分の５’末端または３’末端のうちの少なくとも１つに外因性核酸配列を付加することで、前記試料中の前記ｃｆＮＡの少なくとも一部分を修飾ｃｆＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＮＡプールを創出するステップであって、前記外因性核酸配列が、プライマーに結合することが可能なプライマー部位を含有する、ステップと、
ｄ．  前記増幅可能なｃｆＮＡプールを増幅して、分析可能なｃｆＮＡのプールを生成するステップと、を含み、
前記試料中の前記ｃｆＮＡが、核酸精製ステップに供されない、方法。
【請求項２】
前記ｃｆＮＡがｃｆＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｃｆＮＡがｃｆＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｃｆＲＮＡが、ステップ（ｃ）の前に二本鎖ＤＮＡに変換される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素混合物が、ＤＮアーゼ活性を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記試料中の前記ｃｆＮＡの少なくとも一部分が、ひとつにライゲーションされる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記試料中の前記ｃｆＮＡが、５０ｂｐ〜２，０００ｂｐ、１００ｂｐ〜１，０００ｂｐ、５０ｂｐ〜６００ｂｐ、１００ｂｐ〜５００ｂｐ、１００ｂｐ〜４００ｂｐ、１００ｂｐ〜３００ｂｐ、１００ｂｐ〜２００ｂｐ、２００ｂｐ〜３００ｂｐ、３００ｂｐ〜４００ｂｐ、４００ｂｐ〜５００ｂｐまたは５００ｂｐ〜６００ｂｐの断片サイズ分布を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、単一の反応槽内で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記プライマー部位が、ユニバーサルプライマー部位である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記外因性核酸配列が、前記ｃｆＮＡの５’末端、前記ｃｆＮＡの３’末端、または前記ｃｆＮＡの少なくとも一部分の５’末端と３’末端との両方に付加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料中の前記ｃｆＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％少なくとも８０、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％が、前記外因性核酸配列を含有するように修飾される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素混合物が、
ａ．  ３’−５’エキソヌクレアーゼ活性ありまたはなしの５’−３’ポリメラーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡリガーゼ、
ｂ．  ３’−５’エキソヌクレアーゼ活性ありまたはなしの５’−３’ポリメラーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、及びＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ、
ｃ．  ３’−５’エキソヌクレアーゼ活性ありまたはなしの５’−３’ポリメラーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ、及びウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、または、
ｄ．  ３’−５’エキソヌクレアーゼ活性ありまたはなしの５’−３’ポリメラーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、及び一本鎖ＤＮＡ核酸ニッキング酵素
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記酵素混合物が、
ａ．  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４  ＤＮＡリガーゼ、
ｂ．  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片及びＴ４  ＤＮＡリガーゼ、
ｃ．  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、及びＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、
ｄ．  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、
ｅ．  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、及びウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ、または、
ｆ．  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ、及びＮｂ．ＢｂｖＣ１
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料が、ステップ（ｃ）で順次加熱プログラムに供される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記順次加熱プログラムが、第１の所定期間にわたる１６℃のステップ、第２の所定期間にわたる２４℃のステップ、第３の所定期間にわたる３７℃のステップ、及び第４の所定期間にわたる７５℃のステップを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記外因性核酸配列が、前記プライマー部位の少なくとも一方の側に隣接している縮重核酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記外因性核酸配列が、前記プライマー部位のいずれかの側に隣接している縮重核酸配列を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記外因性核酸配列が、初期複製ステップ中に前記ｃｆＮＡに組み込まれる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記外因性核酸配列が、配列番号１及び２の配列を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記酵素混合物が、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性ありまたはなしの５’−３’ポリメラーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡリガーゼを含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記酵素混合物が、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４  ＤＮＡリガーゼを含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記外因性核酸配列が、二本鎖逆方向反復及び一本鎖ループを含むオリゴヌクレオチドであり、前記試料中の前記ｃｆＮＡの少なくとも一部分が、前記ｃｆＮＡの５’末端、前記ｃｆＮＡの３’末端、または前記ｃｆＮＡの５’末端と３’末端との両方に平滑末端を有するように調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記外因性核酸配列の各鎖が、前記試料中の前記ｃｆＮＡの少なくとも一部分で、前記ｃｆＮＡの５’末端、前記ｃｆＮＡの３’末端、または前記ｃｆＮＡの５’末端と３’末端との両方において、前記ｃｆＮＡの各鎖にライゲーションされる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記一本鎖ループが、ステップ（ｄ）の前に切断される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記外因性核酸配列が、配列番号１０の配列を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記酵素混合物が、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性ありまたはなしの５’−３’ポリメラーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ、及びウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼを含む、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記酵素混合物が、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、及びウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼを含む、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記外因性核酸配列が、二本鎖逆方向反復及び一本鎖ループを含むオリゴヌクレオチドであり、前記試料中の前記ｃｆＮＡの少なくとも一部分が、前記ｃｆＮＡの５’末端上の３’末端のうちの少なくとも１つにテール配列を有するように調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記外因性核酸配列の各鎖が、前記試料中の前記ｃｆＮＡの少なくとも一部分で、前記ｃｆＮＡの５’末端、前記ｃｆＮＡの３’末端、または前記ｃｆＮＡの５’末端と３’末端との両方において、前記ｃｆＮＡの各鎖にライゲーションされる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記一本鎖ループが、ステップ（ｄ）の前に切断される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記外因性核酸配列が、配列番号９または配列番号７の配列を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記酵素混合物が、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性ありまたはなしの５’−３’ポリメラーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ、及びウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼを含む、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記酵素混合物が、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、及びウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼを含む、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記外因性核酸配列が、二本鎖逆方向反復及び一本鎖ループを含むオリゴヌクレオチドであり、前記試料中の前記ｃｆＮＡの少なくとも一部分が、前記ｃｆＮＡの５’末端、前記ｃｆＮＡの３’末端、または前記ｃｆＮＡの５’末端と３’末端との両方に平滑末端を有するように調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記外因性核酸配列の１つの鎖が、前記試料中の前記ｃｆＮＡの少なくとも一部分で、前記ｃｆＮＡの５’末端、前記ｃｆＮＡの３’末端、または前記ｃｆＮＡの５’末端と３’末端との両方において、前記ｃｆＮＡの１つの鎖にライゲーションされる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記外因性核酸配列が、配列番号５の配列を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記酵素混合物が、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性ありまたはなしの５’−３’ポリメラーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ、一本鎖ＤＮＡ核酸ニッキング酵素、及び場合により複製ブロック活性化活性を含む、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記酵素混合物が、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｎｂ．ＢｂｖＣ１、及び場合によりウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼを含む、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記外因性核酸配列が、二本鎖逆方向反復、一本鎖ループを含むオリゴヌクレオチドであり、複製ブロックを含有し、前記試料中の前記ｃｆＮＡの少なくとも一部分が、前記ｃｆＮＡの５’末端、前記ｃｆＮＡの３’末端、または前記ｃｆＮＡの５’末端と３’末端との両方に平滑末端を有するように調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記複製ブロックが、複製ブロック活性化活性の作用を受けるまで不活性である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記外因性核酸配列の１つの鎖が、前記試料中の前記ｃｆＮＡの少なくとも一部分で、前記ｃｆＮＡの５’末端、前記ｃｆＮＡの３’末端、または前記ｃｆＮＡの５’末端と３’末端との両方において、前記ｃｆＮＡの１つの鎖にライゲーションされる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記外因性核酸配列が、配列番号５の配列を有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記酵素混合物が、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性ありまたはなしの５’−３’ポリメラーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ、一本鎖ＤＮＡ核酸ニッキング酵素、及び複製ブロック活性化活性を含む、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記酵素混合物が、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｎｂ．ＢｂｖＣ１、及びウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼを含む、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記少なくとも１つの処理ステップが、前記液体試料を希釈すること、前記液体試料を加熱すること、前記液体試料中の前記ｃｆＮＡを断片化すること、または前述のものの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
前記少なくとも１つの処理ステップが、前記液体試料を希釈すること、前記液体試料を加熱すること、または前述のものの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
前記加熱ステップが、前記ｃｆＮＡの断片化をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
前記液体試料中の前記ｃｆＮＡが、前記加熱ステップ後に５０ｂｐ〜６００ｂｐ、１００ｂｐ〜５００ｂｐ、１００ｂｐ〜４００ｂｐ、１００ｂｐ〜３００ｂｐ、１００ｂｐ〜２００ｂｐ、２００ｂｐ〜３００ｂｐ、３００ｂｐ〜４００ｂｐ、４００ｂｐ〜５００ｂｐ、または５００ｂｐ〜６００ｂｐの断片サイズ分布を有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項４９】
前記液体試料が、血清試料、血漿試料、尿試料、唾液試料、または脳脊髄液試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記液体試料の容量が１００μＬ未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
前記液体試料の容量が１０μＬ〜５０μＬである、請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
前記修飾ｃｆＮＡが、前記試料中に存在する元々のｃｆＮＡ配列の一部分、またはその相補体、及び外因性核酸配列を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５３】
ｃｆＮＡを分析する方法であって、
ａ．  請求項１に記載の方法によって生成される分析可能なｃｆＮＡのプールを準備するステップと、
ｂ．  前記分析可能なｃｆＮＡのプールを分析して、前記分析可能なｃｆＮＡ分子のプール中のｃｆＮＡの特性を決定するステップと、を含む、方法。
【請求項５４】
前記特性が、染色体異常、単一ヌクレオチド多型、遺伝子変異、点変異、欠失、挿入、メチル化パターン、及びコピー数変動からなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
疾患を患っているか、もしくはそのリスクがある対象を診断する方法であって、
ａ．  請求項１に記載の方法によって生成される分析可能なｃｆＮＡのプールを準備するステップと、
ｂ．  前記分析可能なｃｆＮＡのプールを分析して、前記分析可能なｃｆＮＡ分子のプール中の、前記疾患に関連しているｃｆＮＡの特性を決定するステップと、
ｃ．  前記特性の存在に基づいて、前記対象が前記疾患を患っているか、もしくはそのリスクがあると決定するステップ、または、前記特性の非存在に基づいて、前記対象が前記疾患を患っていないか、もしくはそのリスクがないと決定するステップと、を含む、方法。
【請求項５６】
前記特性が、染色体異常、単一ヌクレオチド多型、遺伝子変異、点変異、欠失、挿入、メチル化パターン、及びコピー数変動からなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
疾患を患う対象のための治療介入を決定する方法であって、
ａ．  請求項１に記載の方法によって生成される分析可能なｃｆＮＡのプールを準備するステップと、
ｂ．  前記分析可能なｃｆＮＡのプールを分析して、前記分析可能なｃｆＮＡ分子のプール中の、前記疾患に関連しているｃｆＮＡの特性を決定するステップと、
ｃ．  決定された前記特性に基づいて、前記治療介入を決定するステップと、を含む、方法。
【請求項５８】
前記特性が、染色体異常、単一ヌクレオチド多型、遺伝子変異、点変異、欠失、挿入、メチル化パターン、及びコピー数変動からなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
対象を監視する方法であって、
ａ．  請求項１に記載の方法によって、前記対象から分析可能なｃｆＮＡのプールを準備するステップと、
ｂ．  前記分析可能なｃｆＮＡ分子のプールを分析して、前記分析可能なｃｆＮＡ分子のプール中の、疾患に関連しているｃｆＮＡの特性を決定するステップと、
ｃ．  決定された前記特性に基づいて、前記対象が治療を必要としているかを決定するステップと、を含む、方法。
【請求項６０】
前記特性が、染色体異常、単一ヌクレオチド多型、遺伝子変異、点変異、欠失、挿入、メチル化パターン、及びコピー数変動からなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
疾患の診断を受け、かつ前記疾患の治療のための治療レジメンを用いた治療を受けている対象の治療を監視するための方法であって、
ａ．  請求項１に記載の方法によって、前記対象から分析可能なｃｆＮＡのプールを準備するステップと、
ｂ．  前記分析可能なｃｆＮＡのプールを分析して、前記分析可能なｃｆＮＡのプール中の、疾患に関連しているｃｆＮＡの特性を決定するステップと、
ｃ．  決定された前記特性が前記治療レジメンと適合性があるかを決定するステップと、
ｄ．  決定された前記特性が、前記治療レジメンが禁忌であるもしくは推奨されないことを示す場合は、前記治療レジメンを変更するステップ、または、決定された前記特性が、前記治療レジメンが引き続き推奨されることを示す場合は、前記治療レジメンを継続するステップと、
ｅ．  場合により、ステップａ）〜ｄ）を所望の時間間隔で繰り返すステップと、を含む、方法。
【請求項６２】
前記特性が、染色体異常、単一ヌクレオチド多型、遺伝子変異、点変異、欠失、挿入、メチル化パターン、及びコピー数変動からなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
試料中のセルフリー核酸（ｃｆＮＡ）の元々の濃度を決定するための方法であって、
ａ．  請求項１に記載の方法によって増幅可能なｃｆＮＡプールを準備するステップと、
ｂ．  前記増幅可能なｃｆＮＡプールを増幅して、増幅されたｃｆＮＡ分子のプールを生成するステップと、
ｃ．  ｃｆＮＡの前記増幅されたプール中のｃｆＮＡの濃度を決定するステップと、
ｄ．  決定されたｃｆＮＡの濃度を標準曲線と比較して、前記試料中のｃｆＮＡの元々の濃度を決定するステップと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年８月１２日出願（現在審査中）の米国仮特許出願第６２／２０４，２６８号の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
本年は１６０万件の癌の新規症例が診断され、５０万を超える癌による死がもたらされると推定されている。これは１日当たり約１，６００人と言い換えられ、米国における死の４件中１件を占めることになる。固形腫瘍生検の遺伝子検査の大きな進歩により、癌の標的化及び治療の方法が変化し、生存率の改善につながっている。
【０００３】
現在、一般に原発腫瘍のものである組織生検は、標的療法が開始する前に、単一の時間点における癌の分子プロファイルを決定するために使用されている。しかしながら、固形腫瘍の試料採取には、いくつかの欠点及び制限がある。第１に、固形腫瘍の試料採取は侵襲的手技であり、多くの事例において患者へのリスクを示す。第２に、いくつかの場合、固形腫瘍の試料採取は選択肢にないか、あるいは腫瘍の位置及び／またはサイズが原因で実現困難である。第３に、固形腫瘍の試料採取は、空間的には生検される領域に限定され、そして時間的には生検の時点での腫瘍の状態に限定されるため、腫瘍の不均一性が十分に対処されない場合がある。腫瘍ゲノムは、淘汰圧下で著しく不安定であり、クローン増殖しやすい。したがって、癌のゲノム特性は、空間的にも時間的にも変化し、本質的に静的ではない。第４に、治療法の決断を下すために固形腫瘍の試料採取から関連性のある情報を特定するには、数日から数週間、またはさらには数か月かかる場合があり、この情報の治療用途での使用は複雑なものとなっている。第５に、固形腫瘍の試料採取は実行にかかるコストが高く、そのため、その用途は多くの場合で限定されている。最後に、固形腫瘍の試料採取は、分析に必要な時間、分析のコスト、及び分析のために試料を得ることの侵襲的性質といったいくつかの要素が原因で、癌治療の長期的監視には実用的でない。したがって、腫瘍組織のゲノム特性決定は、癌の治療及び管理において依然として主要な課題である。
【０００４】
血液生検（別称、液体生検）、特に循環細胞フリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のものは、腫瘍中に存在する特異的遺伝子変異の特定のための非侵襲的方法として発展中である。そのような方法は、既知の癌治療により治療可能である変異を特定するため、また治療のための標的療法を開発するために研究されている。血液中のｃｆＤＮＡを単離し、数量化し、分析するための先進技術は、染色体異常、遺伝子変異、メチル化パターンの差、及びコピー数多型など、循環における癌特異的な異常の特定につながっている。これらの異常は、固形腫瘍組織の異常に酷似していることが見出された。
【０００５】
ｃｆＤＮＡ分析を利用した血液生検は、固形腫瘍の試料採取における欠点の解決策を提示する。血液生検は低侵襲性であり、日常的な来院の間に分析用試料を日常的に収集することが可能である。加えて、血液生検は、広範な腫瘍ＤＮＡの試料採取を可能にし、固形腫瘍の試料採取で見られる不均一性の不足を克服する。また、血液生検では、診断情報が医療提供者に迅速に返される。最後に、血液生検は、その低侵襲性の性質及び迅速な結果のため、最もコスト効果の高い様式でリアルタイムの腫瘍ゲノム進化を長期的に監視するのに理想的である。
【０００６】
循環ｃｆＤＮＡベースの検査は、治療有効性を確実にし、薬物抵抗性、転移、及び再発を監視し、リアルタイムで患者個人に合わせた治療介入を個別化する能力を臨床医に与える。治療法の決断を誘導するための循環ｃｆＤＮＡの腫瘍ゲノム配列決定の使用は、臨床成績を大きく改善させるであろう。したがって、癌の診断及び治療の個人的管理におけるｃｆＤＮＡの臨床的有用性は、現在の治療モデルを著しく変化させ、全体的な癌生存率を増加させ、新世代の癌管理の標準治療となる能力を有する。
【０００７】
しかしながら、ｃｆＤＮＡの分析にもいくつかの欠点がある。そのような制限としては、高い試料容量の必要性、ｃｆＤＮＡの低い収率、異なるサイズのｃｆＤＮＡ断片の差次的な回収、及び再現性の不足が挙げられるが、これらに限定されない。前述の内容は、ｃｆＤＮＡベースの検査を診療所において日常的に適用することに対する主要な障害である。
【０００８】
現在、ｃｆＤＮＡの抽出及び単離にはいくつかの方法が用いられているものの、試料からのｃｆＤＮＡ出発物質の抽出が不完全であること、及びこのプロセス中の物質損失が大きいことが原因で、ｃｆＤＮＡ単離の効率及び収率は極めて低い。さらに、規格化が不十分であるため、数量化は不定である。
【０００９】
ｃｆＤＮＡの分析及び臨床的ツールとしてのｃｆＤＮＡの使用は、最適ではない。本開示は、試料からｃｆＤＮＡを濃縮するための優れた方法を提供することによって、ｃｆＤＮＡ分析における問題の新規かつ発明的な解決策を提示する。かかる方法は、必要な試料の投入容量が低く、後の分析に使用するための高い回収率の核酸物質をもたらす。したがって、本開示の方法は、試料から直接的にｃｆＤＮＡを濃縮することを可能にする。開示される方法は、次世代配列決定（ＮＧＳ）及びｑＰＣＲを含むがこれらに限定されない広範囲のゲノムプラットフォームにおけるマイクロリットル容量（血液−液滴容量）の試料を用いた複数の分析を可能にする。本開示の方法により、臨床医は、１０マイクロリットルほどの少ない試料容量（例えば、指を刺すことによるもの）で作業することが可能になる。本開示の方法は、関与する遺伝子変異のより完全な特性決定、臨床判断の迅速化、標的療法の特定、ならびに時間効率及びコスト効率の両方が高い様式である様式における適格な患者のための実験的臨床治験の特定を含むがこれらに限定されない、いくつかの利点を可能にする。したがって、本開示の方法を利用することにより、ｃｆＤＮＡ分析の潜在性が十分に実現され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】ＣＧＤ法を使用して２０μＬの血漿から生成されたｃｆＤＮＡのアガロースゲル電気泳動を示す。ｃｆＤＮＡは、臭化エチジウムを使用して可視化した。レーン１〜４は、癌と診断された対象または癌を有する疑いのある対象からの凍結した臨床血漿試料であり、レーン５は、健常な対象からの新鮮な血漿に試料４の血漿を加えたものであった。レーン６〜８は、健常な対象からの凍結した血漿試料であり、レーン９〜１０は、健常な対象からの新鮮な血漿試料であった。
【図１Ｂ】ＣＧＤ法を使用して１０μＬの尿から生成されたｃｆＤＮＡのアガロースゲル電気泳動を示す。ｃｆＤＮＡは、臭化エチジウムを使用して可視化した。レーン１〜６は、健常な対象からの新鮮な尿試料であり、レーン７は、比較のための血漿試料であった。
【図２】ＣＧＤ法及びＱＩＡａｍｐキットを使用して、それぞれ２０μＬ及び２００μＬの血漿から調製されたｃｆＤＮＡに対する、ＴａｑＭａｎ定量的リアルタイムＰＣＲを使用して作成されたＫＲＡＳの増幅プロットを示す。
【図３Ａ】ＣＧＤ法及びＱＩＡａｍｐキットを使用して、それぞれ２０μＬ及び２００μＬの血漿から調製されたｃｆＤＮＡに対する、ＴａｑＭａｎ定量的リアルタイムＰＣＲを使用して作成されたＢＲＡＦの増幅プロットを示す。
【図３Ｂ】ＣＧＤ法及びＱＩＡａｍｐキットを使用して、それぞれ２０μＬ及び２００μＬの血漿から調製されたｃｆＤＮＡに対する、ＴａｑＭａｎ定量的リアルタイムＰＣＲを使用して作成されたＰＩＫ３ＣＡの増幅プロットを示す。
【図３Ｃ】ＣＧＤ法及びＱＩＡａｍｐキットを使用して、それぞれ２０μＬ及び２００μＬの血漿から調製されたｃｆＤＮＡに対する、ＴａｑＭａｎ定量的リアルタイムＰＣＲを使用して作成されたＮＲＡＳの増幅プロットを示す。
【図４】防腐剤あり及びなしで市販の唾液試料採取キットを使用して収集された２０μＬの唾液からＣＧＤ法を使用して調製されたｃｆＤＮＡのアガロースゲル電気泳動（２％）を示す。ｃｆＤＮＡは、臭化エチジウムを使用して可視化した。レーン１及び２は、防腐剤を含む市販の試料採取キットを用いて得た唾液試料の結果を示し、レーン３は陰性対照であり（唾液試料は存在しない）、一方で、レーン４及び５は、防腐剤を含まない市販の試料採取キットを用いて得た唾液試料の結果を示し、レーン６は陰性対照である（唾液試料は存在しない）。
【図５】ＣＧＤ法を使用して２０μＬの血漿及び脳脊髄液ならびに１０μＬの尿から生成されたｃｆＤＮＡのアガロースゲル電気泳動（２％）を示す。ｃｆＤＮＡは、臭化エチジウムを使用して可視化した。試料の割り当ては次の通りである（括弧内はｃｆＤＮＡ濃度である）：レーン１  ＣＳＦ（８．５）、レーン２  尿（５．１）、レーン３  血漿（２２）、レーン４  血漿（５９）、レーン５  血漿（３６．４）、レーン６  陰性対照、レーン７  尿（５２．２）、レーン８  尿（１１．２）、レーン９  尿（８９．６）、及びレーン１０  尿（３０）。
【図６】血漿、ＣＳＦ、及び尿試料からＣＧＤ法によって調製されたｃｆＤＮＡのサイズ分布及び定量化を決定するためにＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用した、図５の試料１〜５の分析を示す。
【図７】ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、及びＫＲＡＳ遺伝子に関して、治療前及び治療後の卵巣癌患者のＣＧＤ法で得られた結果と組織生検で得られた結果との比較を示す。
【図８Ａ】肺癌と診断された対象におけるｃｆＤＮＡ変異の定量を示す。治療中により低い循環ｃｆＤＮＡの変異負荷、及び５０日間の安定状態（ｓｔａｂｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）後の変異負荷の上昇。治療の開始は、黒矢印黒矢印によって示されている。変異負荷は、患者毎に検出された体細胞変異の数（グラフ右側の縦軸）として表されている。青色の点線は、ＰＥＴ／ＣＴが行われた時間を示す。時間点は、ｃｆＤＮＡ分析が実施された時間を示す。
【図８Ｂ】１１−３０−１５における安定状態及び２０１６年３月における進行状態（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）を示し、図ＸＡのｃｆＤＮＡ分析の結果を確定する、対象のＰＥＴ／ＣＴ画像法を示す。
【図９Ａ】膵周囲リンパ節腺癌と診断された対象におけるｃｆＤＮＡ変異の定量を示す。治療中に循環ｃｆＤＮＡの変異負荷が減少し、安定状態を示している。安定状態は、タンパク質バイオマーカー、ＰＥＴ／ＣＴ画像法（右の写真）、及び臨床成績と一致していた。変異負荷は、患者毎に検出された体細胞変異の数（グラフ右側の縦軸）として表されている。青色の点線は、ＰＥＴ／ＣＴが行われた時間を示す。時間点は、ｃｆＤＮＡ分析が実施された時間を示す。
【図９Ｂ】治療後の安定状態を示し、図ＸＡのｃｆＤＮＡ分析の結果を画定する、対象のＰＥＴ／ＣＴ画像法を示す。
【図１０】−２０℃（レーン１〜５）及び４℃（レーン６〜１０）で保管した試薬を使用してＣＧＤ法により調製し、２％ゲルでのアガロースゲル電気泳動に供し、臭化エチジウム（分子量ラダー１ｋｂ）を使用して可視化した、分析可能なｃｆＤＮＡプールを示す。
【図１１】０、０．００１、０．００５、０．０１、０．０２５、０．０５、０．１、０．２５、０．５、及び１ｎｇ／μＬの濃度における精製ＤＮＡを用い、ＣＧＤ法を使用して生成した標準曲線を示す。
【図１２】ＣＧＤ法を使用して２０μＬの血漿中のｃｆＲＮＡから作製されたｃＤＮＡの増幅プロットを示す。
【発明の概要】
【００１１】
本概要は、以下の「発明を実施するための形態」にさらに記載される選ばれた概念を簡易化した形態で紹介するために提供される。本概要は、特許請求の主題の主要または必須な特徴を特定することを意図するものではなく、特許請求の主題の範囲を限定するよう使用されることを意図するものでもない。特許請求の主題の他の特徴、詳細、有用性、及び利点は、添付の図面に例示され添付の「特許請求の範囲」に定義される態様を含め、以下の「発明を実施するための形態」の文言から明らかになるであろう。
【００１２】
第１の態様において、本開示は、試料中の無細胞核酸（ｃｆＮＡ）を核酸精製ステップに供することなく試料中のｃｆＮＡのインサイチュ増幅（ＩＳＡ）を行う方法であって、ｉ）複数のｃｆＮＡ分子を含有する液体試料を準備するステップと、ｉｉ）試料に少なくとも１つの処理ステップを行うステップと、ｉｉｉ）試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＮＡプールを創出するステップと、ｉｖ）増幅可能なｃｆＮＡプールを増幅して、分析可能なｃｆＮＡ分子のプールを生成するステップと、を含む、方法を提供する。
【００１３】
第２の態様において、本開示は、試料中のｃｆＮＡを核酸精製ステップに供することなく試料中のｃｆＮＡのＩＳＡを行う方法であって、ｉ）複数のｃｆＮＡ分子を含有する液体試料を準備するステップと、ｉｉ）試料に少なくとも１つの処理ステップを行うステップと、ｉｉｉ）試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分の３’末端に外因性核酸配列を付加することにより、試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＮＡプールを創出するステップと、ｖ）増幅可能なｃｆＮＡプールを増幅して、分析可能なｃｆＮＡ分子のプールを生成するステップと、を含む、方法を提供する。
【００１４】
第３の態様において、本開示は、試料中のｃｆＮＡを核酸精製ステップに供することなく試料中のｃｆＮＡのＩＳＡを行う方法であって、ｉ）複数のｃｆＮＡ分子を含有する液体試料を準備するステップと、ｉｉ）試料に少なくとも１つの処理ステップを行うステップと、ｉｉｉ）試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分の５’末端に外因性核酸配列を付加することにより、試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＮＡプールを創出するステップと、ｖ）増幅可能なｃｆＮＡプールを増幅して、分析可能なｃｆＮＡ分子のプールを生成するステップと、を含む、方法を提供する。
【００１５】
第４の態様において、本開示は、試料中のｃｆＮＡを核酸精製ステップに供することなく試料中のｃｆＮＡのＩＳＡを行う方法であって、ｉ）複数のｃｆＮＡ分子を含有する液体試料を準備するステップと、ｉｉ）試料に少なくとも１つの処理ステップを行うステップと、ｉｉｉ）試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分の３’末端と５’末端との両方に外因性核酸配列を付加することにより、試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＮＡプールを創出するステップと、ｖ）増幅可能なｃｆＮＡプールを増幅して、分析可能なｃｆＮＡ分子のプールを生成するステップと、を含む、方法を提供する。
【００１６】
第５の態様において、本開示は、試料を核酸精製ステップに供することなく試料中のｃｆＤＮＡのＩＳＡを行う方法であって、ｉ）複数のｃｆＤＮＡ分子を含有する液体試料を準備するステップと、ｉｉ）試料に少なくとも１つの処理ステップを行うステップと、ｉｉｉ）試料中のｃｆＤＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＤＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＤＮＡプールを創出するステップと、ｉｖ）増幅可能なｃｆＤＮＡプールを増幅して、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを生成するステップと、を含む、方法を提供する。
【００１７】
第６の態様において、本開示は、試料を核酸精製ステップに供することなく試料中のｃｆＤＮＡのＩＳＡを行う方法であって、ｉ）複数のｃｆＤＮＡ分子を含有する液体試料を準備するステップと、ｉｉ）試料に少なくとも１つの処理ステップを行うステップと、ｉｉｉ）試料中のｃｆＤＮＡ分子の少なくとも一部分の３’末端に外因性核酸配列を付加することにより、試料中のｃｆＤＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＤＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＤＮＡプールを創出するステップと、ｖ）増幅可能なｃｆＤＮＡプールを増幅して、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを生成するステップと、を含む、方法を提供する。
【００１８】
第７の態様において、本開示は、試料を核酸精製ステップに供することなく試料中のｃｆＤＮＡのＩＳＡを行う方法であって、ｉ）複数のｃｆＤＮＡ分子を含有する液体試料を準備するステップと、ｉｉ）試料に少なくとも１つの処理ステップを行うステップと、ｉｉｉ）試料中のｃｆＤＮＡ分子の少なくとも一部分の５’末端に外因性核酸配列を付加することにより、試料中のｃｆＤＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＤＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＤＮＡプールを創出するステップと、ｖ）増幅可能なｃｆＤＮＡプールを増幅して、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを生成するステップと、を含む、方法を提供する。
【００１９】
第８の態様において、本開示は、試料を核酸精製ステップに供することなく試料中のｃｆＤＮＡのＩＳＡを行う方法であって、ｉ）複数のｃｆＤＮＡ分子を含有する液体試料を準備するステップと、ｉｉ）試料に少なくとも１つの処理ステップを行うステップと、ｉｉｉ）試料中のｃｆＤＮＡ分子の少なくとも一部分の３’末端と５’末端との両方に外因性核酸配列を付加することにより、試料中のｃｆＤＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＤＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＤＮＡプールを創出するステップと、ｖ）増幅可能なｃｆＤＮＡプールを増幅して、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを生成するステップと、を含む、方法を提供する。
【００２０】
第９の態様において、本開示は、試料を核酸精製ステップに供することなく試料中のｃｆＲＮＡのＩＳＡを行う方法であって、ｉ）複数のｃｆＲＮＡ分子を含有する液体試料を準備するステップと、ｉｉ）試料に少なくとも１つの処理ステップを行うステップと、ｉｉｉ）試料中のｃｆＲＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＲＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＲＮＡプールを創出するステップと、ｉｖ）増幅可能なｃｆＲＮＡプールを増幅して、分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプールを生成するステップと、を含む、方法を提供する。
【００２１】
第１０の態様において、本開示は、試料を核酸精製ステップに供することなく試料中のｃｆＲＮＡのＩＳＡを行う方法であって、ｉ）複数のｃｆＲＮＡ分子を含有する液体試料を準備するステップと、ｉｉ）試料に少なくとも１つの処理ステップを行うステップと、ｉｉｉ）試料中のｃｆＲＮＡ分子の少なくとも一部分の３’末端に外因性核酸配列を付加することにより、試料中のｃｆＲＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＲＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＲＮＡプールを創出するステップと、ｖ）増幅可能なｃｆＲＮＡプールを増幅して、分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプールを生成するステップと、を含む、方法を提供する。
【００２２】
第１１の態様において、本開示は、試料を核酸精製ステップに供することなく試料中のｃｆＲＮＡのＩＳＡを行う方法であって、ｉ）複数のｃｆＲＮＡ分子を含有する液体試料を準備するステップと、ｉｉ）試料に少なくとも１つの処理ステップを行うステップと、ｉｉｉ）試料中のｃｆＲＮＡ分子の少なくとも一部分の５’末端に外因性核酸配列を付加することにより、試料中のｃｆＲＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＲＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＲＮＡプールを創出するステップと、ｖ）増幅可能なｃｆＲＮＡプールを増幅して、分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプールを生成するステップと、を含む、方法を提供する。
【００２３】
第１２の態様において、本開示は、試料を核酸精製ステップに供することなく試料中のｃｆＲＮＡのＩＳＡを行う方法であって、ｉ）複数のｃｆＲＮＡ分子を含有する液体試料を準備するステップと、ｉｉ）試料に少なくとも１つの処理ステップを行うステップと、ｉｉｉ）試料中のｃｆＲＮＡ分子の少なくとも一部分の３’末端と５’末端との両方に外因性核酸配列を付加することにより、試料中のｃｆＲＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＲＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＲＮＡプールを創出するステップと、ｖ）増幅可能なｃｆＲＮＡプールを増幅して、分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプールを生成するステップと、を含む、方法を提供する。
【００２４】
上述の第１〜第１２の態様のそれぞれの特定の実施形態において、液体試料は、対象から得られる任意の液体試料である。特定の実施形態において、液体試料は、血液試料、血清試料、血漿試料、唾液試料、脳脊髄液試料、または尿試料である。特定の実施形態において、液体試料は、処理される。例えば、血液試料は、血漿または血清試料を生成するために処理され得る。
【００２５】
上述の第１〜第１２の態様のそれぞれの特定の実施形態において、試料容量は、約１ｍｌ未満、約０．５ｍｌ未満、約０．１ｍｌ未満、約０．０５ｍｌ未満、または約０．０２５ｍｌ未満（しかし全事例において０．０１０ｍｌ超）であり得る。特定の実施形態において、試料容量は、約１０〜約１５０マイクロリットルである。特定の実施形態において、試料容量は、約１０〜約１００マイクロリットルである。特定の実施形態において、試料容量は、約１０〜約７５マイクロリットルである。特定の実施形態において、試料容量は、約１０〜約５０マイクロリットルである。特定の実施形態において、試料容量は、約１０〜約２５マイクロリットルである。
【００２６】
上述の第１〜第１２の態様のそれぞれの特定の実施形態において、本明細書に記載される範囲内の試料容量が、対象から直接得られる場合がある（すなわち、２５マイクロリットルの血液の試料が、指穿刺によって対象から得られる場合がある）。上述の第１〜第４の態様のそれぞれにおいて、本明細書に記載される範囲内の試料容量は、対象から得られるより大きな容量の試料から得られてもよい（すなわち、５ｍｌの血液の試料が対象から得られてもよく、この５ｍｌの試料から５０マイクロリットルの試料が採取され、試料容量として使用されてもよい）。
【００２７】
上述の第１〜第１２の態様のそれぞれの特定の実施形態において、ｃｆＮＡ、ｃｆＤＮＡ、及び／またはｃｆＲＮＡの３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端との両方に付加される外因性核酸配列は、二本鎖核酸配列である。上述の第１〜第１２の態様のそれぞれの特定の実施形態において、ｃｆＮＡ、ｃｆＤＮＡ、及び／またはｃｆＲＮＡの３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端との両方に付加される外因性核酸配列は、パリンドローム配列を含有する一本鎖核酸配列である。前述の内容の特定の実施形態において、ｃｆＮＡ、ｃｆＤＮＡ、及び／またはｃｆＲＮＡは、二本鎖である。
【００２８】
上述の第１〜第４の態様のそれぞれの特定の実施形態において、ｃｆＮＡは、任意の核酸であり得る。特定の実施形態において、ｃｆＮＡはｃｆＤＮＡである。特定の実施形態において、ｃｆＮＡは二本鎖ｃｆＤＮＡである。特定の実施形態において、ｃｆＮＡは一本鎖ｃｆＤＮＡである。特定の実施形態において、ｃｆＮＡは無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）である。特定の実施形態において、ｃｆＮＡは二本鎖ｃｆＲＮＡである。特定の実施形態において、ｃｆＮＡは一本鎖ｃｆＲＮＡである。
【００２９】
第１〜第１２の態様の特定の実施形態において、試料は、ｃｆＤＮＡとｃｆＲＮＡとの両方を含有してもよく、ｃｆＤＮＡ及びｃｆＲＮＡのそれぞれが増幅されて、ｃｆＤＮＡ分子及びｃｆＲＮＡ分子の両方の分析可能なプールが生成される。第１〜第１２の態様の特定の実施形態において、試料は、ｃｆＤＮＡとｃｆＲＮＡとの両方を含有してもよく、ｃｆＤＮＡのみが増幅されて、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールが生成される。第１〜第１２の態様の特定の実施形態において、試料は、ｃｆＤＮＡとｃｆＲＮＡとの両方を含有してもよく、ｃｆＲＮＡのみが増幅されて、分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプールが生成される。前述の内容において、ｃｆＤＮＡは、二本鎖であってもよく、かつ／または、ｃｆＲＮＡは、二本鎖であってもよい。
【００３０】
上述の第１〜第１２の態様のそれぞれの特定の実施形態において、処理ステップは、希釈、緩衝液もしくは緩衝液系の添加、試料の加熱、試料中のｃｆＮＡ（ｃｆＤＮＡ及び／またはｃｆＲＮＡを含む）の少なくとも一部分の断片化、または前述のものの組み合わせであり得る。
【００３１】
上述の第１〜第１２の態様のそれぞれの特定の実施形態において、試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＮＡプールを創出するステップは、試料中のｃｆＮＡ（ｃｆＤＮＡ及び／またはｃｆＲＮＡを含む）の少なくとも一部分の末端修復、試料中のｃｆＮＡ（ｃｆＤＮＡ及び／またはｃｆＲＮＡを含む）の少なくとも一部分の平滑末端ｃｆＮＡへの変換、試料中のｃｆＮＡ（ｃｆＤＮＡ及び／またはｃｆＲＮＡを含む）の少なくとも一部分のＡテーリング、ライゲーション、または前述のものの組み合わせを伴う。
【００３２】
上述の第１〜第１２の態様のそれぞれの特定の実施形態において、試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＮＡプールを創出するステップは、
ｉ）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性ありまたはなしの５’−３’ポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼ、及びｉｉ）リガーゼ、
ｉ）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性ありまたはなしの５’−３’ポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼ、ｉｉ）リガーゼ、及びｉｉｉ）ポリヌクレオチドキナーゼ、
ｉ）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性ありまたはなしの５’−３’ポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼ、ｉｉ）リガーゼ、ｉｉｉ）ポリヌクレオチドキナーゼ、及びｉｖ）複製ブロック活性化活性、
ｉ）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性ありまたはなしの５’−３’ポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼ、ｉｉ）リガーゼ、ｉｉｉ）ポリヌクレオチドキナーゼ、ｉｖ）複製ブロック活性化活性、及びｖ）核酸ニッキング酵素活性、
ｉ）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性ありまたはなしの５’−３’ポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼ、ｉｉ）リガーゼ、ｉｉｉ）ポリヌクレオチドキナーゼ、ｉｖ）複製ブロック活性化活性、ｖ）核酸ニッキング酵素活性、及びｖｉ）核酸結合タンパク質
を含む、酵素混合物の使用を伴う。
【００３３】
上述の第５〜第８の態様のそれぞれの特定の実施形態において、ｃｆＤＮＡは、二本鎖ｃｆＤＮＡであっても一本鎖ｃｆＤＮＡであってもよい。第５〜第８の態様の特定の実施形態において、ｃｆＤＮＡは二本鎖ｃｆＤＮＡである。上述の第５〜第８の態様の特定の実施形態において、試料は、ｃｆＲＮＡ（一本鎖または二本鎖のいずれか）をさらに含有してもよい。第５〜第８の態様の特定の実施形態において、試料は、ｃｆＤＮＡとｃｆＲＮＡとの両方を含有してもよく、ｃｆＤＮＡのみが増幅されて、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールが生成される。第５〜第８の態様の特定の実施形態において、試料は、ｃｆＤＮＡとｃｆＲＮＡとの両方を含有してもよく、ｃｆＤＮＡ及びｃｆＲＮＡのそれぞれが増幅されて、分析可能なｃｆＤＮＡ分子及びｃｆＲＮＡ分子のプールが生成される。
【００３４】
上述の第９〜第１２の態様のそれぞれの特定の実施形態において、ｃｆＲＮＡは、二本鎖ｃｆＲＮＡであっても一本鎖ｃｆＲＮＡであってもよい。第９〜第１２の態様の特定の実施形態において、ｃｆＲＮＡは二本鎖ｃｆＲＮＡである。上述の第９〜第１２の態様の特定の実施形態において、試料は、ｃｆＤＮＡ（一本鎖または二本鎖のいずれか）をさらに含有してもよい。第９〜第１２の態様の特定の実施形態において、試料は、ｃｆＲＮＡとｃｆＤＮＡとの両方を含有してもよく、ｃｆＲＮＡのみが増幅されて、分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプールが生成される。第９〜第１２の態様の特定の実施形態において、試料は、ｃｆＲＮＡとｃｆＤＮＡとの両方を含有してもよく、ｃｆＲＮＡ及びｃｆＤＮＡのそれぞれが増幅されて、分析可能なｃｆＲＮＡ分子及びｃｆＤＮＡ分子のプールが生成される。
【００３５】
上述の第１〜第１２の態様のそれぞれの特定の実施形態において、試料中に存在するｃｆＮＡの少なくとも５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上が修飾ｃｆＮＡに変換されて、増幅可能なｃｆＮＡプールが創出される。第５〜第８の態様にあるように、ｃｆＮＡがｃｆＤＮＡ（二本鎖ｃｆＤＮＡを含む）であるとき、試料中に存在するｃｆＤＮＡの少なくとも５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上が修飾ｃｆＤＮＡに変換されて、増幅可能なｃｆＤＮＡプールが創出される。第９〜第１２の態様にあるように、ｃｆＮＡがｃｆＲＮＡ（二本鎖ｃｆＲＮＡを含む）であるとき、試料中に存在するｃｆＲＮＡの少なくとも５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上が修飾ｃｆＲＮＡに変換されて、増幅可能なｃｆＲＮＡプールが創出される。
【００３６】
第１３の態様において、本開示は、試料中のｃｆＮＡを核酸精製ステップに供することなく分析のための試料中のｃｆＮＡを調製する方法であって、ｉ）複数のｃｆＮＡ分子を含有する液体試料を準備するステップと、ｉｉ）試料に少なくとも１つの処理ステップを行うステップと、ｉｉｉ）試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＮＡプールを創出するステップと、を含む、方法を提供する。
【００３７】
第１４の態様において、本開示は、試料中のｃｆＮＡを核酸精製ステップに供することなく分析のための試料中のｃｆＮＡを調製する方法であって、ｉ）複数のｃｆＮＡ分子を含有する液体試料を準備するステップと、ｉｉ）試料に少なくとも１つの処理ステップを行うステップと、ｉｉｉ）試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分の３’末端に外因性核酸配列を付加することにより、試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＮＡプールを創出するステップと、を含む、方法を提供する。
【００３８】
第１５の態様において、本開示は、試料中のｃｆＮＡを核酸精製ステップに供することなく分析のための試料中のｃｆＮＡを調製する方法であって、ｉ）複数のｃｆＮＡ分子を含有する液体試料を準備するステップと、ｉｉ）試料に少なくとも１つの処理ステップを行うステップと、ｉｉｉ）試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分の５’末端に外因性核酸配列を付加することにより、試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＮＡプールを創出するステップと、を含む、方法を提供する。
【００３９】
第１６の態様において、本開示は、試料中のｃｆＮＡを核酸精製ステップに供することなく分析のための試料中のｃｆＮＡを調製する方法であって、ｉ）複数のｃｆＮＡ分子を含有する液体試料を準備するステップと、ｉｉ）試料に少なくとも１つの処理ステップを行うステップと、ｉｉｉ）試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分の３’末端と５’末端との両方に外因性核酸配列を付加することにより、試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＮＡプールを創出するステップと、を含む、方法を提供する。
【００４０】
第１７の態様において、本開示は、試料中のｃｆＤＮＡを核酸精製ステップに供することなく分析のための試料中のｃｆＤＮＡを調製する方法であって、ｉ）複数のｃｆＤＮＡ分子を含有する液体試料を準備するステップと、ｉｉ）試料に少なくとも１つの処理ステップを行うステップと、ｉｉｉ）試料中のｃｆＤＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＤＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＤＮＡプールを創出するステップと、を含む、方法を提供する。
【００４１】
第１８の態様において、本開示は、試料中のｃｆＤＮＡを核酸精製ステップに供することなく分析のための試料中のｃｆＤＮＡを調製する方法であって、ｉ）複数のｃｆＤＮＡ分子を含有する液体試料を準備するステップと、ｉｉ）試料に少なくとも１つの処理ステップを行うステップと、ｉｉｉ）試料中のｃｆＤＮＡ分子の少なくとも一部分の３’末端に外因性核酸配列を付加することにより、試料中のｃｆＤＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＤＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＤＮＡプールを創出するステップと、を含む、方法を提供する。
【００４２】
第１９の態様において、本開示は、試料中のｃｆＤＮＡを核酸精製ステップに供することなく分析のための試料中のｃｆＤＮＡを調製する方法であって、ｉ）複数のｃｆＤＮＡ分子を含有する液体試料を準備するステップと、ｉｉ）試料に少なくとも１つの処理ステップを行うステップと、ｉｉｉ）試料中のｃｆＤＮＡ分子の少なくとも一部分の５’末端に外因性核酸配列を付加することにより、試料中のｃｆＤＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＤＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＤＮＡプールを創出するステップと、を含む、方法を提供する。
【００４３】
第２０の態様において、本開示は、試料中のｃｆＤＮＡを核酸精製ステップに供することなく分析のための試料中のｃｆＤＮＡを調製する方法であって、ｉ）複数のｃｆＤＮＡ分子を含有する液体試料を準備するステップと、ｉｉ）試料に少なくとも１つの処理ステップを行うステップと、ｉｉｉ）試料中のｃｆＤＮＡ分子の少なくとも一部分の３’末端と５’末端との両方に外因性核酸配列を付加することにより、試料中のｃｆＤＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＤＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＤＮＡプールを創出するステップと、ｖ）増幅可能なｃｆＤＮＡプールを増幅して、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを生成するステップと、を含む、方法を提供する。
【００４４】
第２１の態様において、本開示は、試料中のｃｆＲＮＡを核酸精製ステップに供することなく分析のための試料中のｃｆＲＮＡを調製する方法であって、ｉ）複数のｃｆＲＮＡ分子を含有する液体試料を準備するステップと、ｉｉ）試料に少なくとも１つの処理ステップを行うステップと、ｉｉｉ）試料中のｃｆＲＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＲＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＲＮＡプールを創出するステップと、を含む、方法を提供する。
【００４５】
第２２の態様において、本開示は、試料中のｃｆＲＮＡを核酸精製ステップに供することなく分析のための試料中のｃｆＲＮＡを調製する方法であって、ｉ）複数のｃｆＲＮＡ分子を含有する液体試料を準備するステップと、ｉｉ）試料に少なくとも１つの処理ステップを行うステップと、ｉｉｉ）試料中のｃｆＲＮＡ分子の少なくとも一部分の３’末端に外因性核酸配列を付加することにより、試料中のｃｆＲＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＲＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＲＮＡプールを創出するステップと、を含む、方法を提供する。
【００４６】
第２３の態様において、本開示は、試料中のｃｆＲＮＡを核酸精製ステップに供することなく分析のための試料中のｃｆＲＮＡを調製する方法であって、ｉ）複数のｃｆＲＮＡ分子を含有する液体試料を準備するステップと、ｉｉ）試料に少なくとも１つの処理ステップを行うステップと、ｉｉｉ）試料中のｃｆＲＮＡ分子の少なくとも一部分の５’末端に外因性核酸配列を付加することにより、試料中のｃｆＲＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＲＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＲＮＡプールを創出するステップと、を含む、方法を提供する。
【００４７】
第２４の態様において、本開示は、試料中のｃｆＲＮＡを核酸精製ステップに供することなく分析のための試料中のｃｆＲＮＡを調製する方法であって、ｉ）複数のｃｆＲＮＡ分子を含有する液体試料を準備するステップと、ｉｉ）試料に少なくとも１つの処理ステップを行うステップと、ｉｉｉ）試料中のｃｆＲＮＡ分子の少なくとも一部分の３’末端と５’末端との両方に外因性核酸配列を付加することにより、試料中のｃｆＲＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＲＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＲＮＡプールを創出するステップと、を含む、方法を提供する。
【００４８】
上述の第１３〜第２４の態様のそれぞれの特定の実施形態において、液体試料は、第１〜第１２の態様に関して記載した通りである。
【００４９】
上述の第１３〜第２４の態様のそれぞれの特定の実施形態において、試料容量は、第１〜第１２の態様に関して記載した通りである。
【００５０】
上述の第１３〜第２４の態様のそれぞれの特定の実施形態において、処理ステップは、第１〜第１２の態様に関して記載した通りであり得る。
【００５１】
上述の第１３〜第２４の態様のそれぞれの特定の実施形態において、試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＮＡプールを創出するステップは、第１〜第１２の態様に関して記載した通りのプロセスを伴う。
【００５２】
上述の第１３〜第２４の態様のそれぞれの特定の実施形態において、試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＮＡプールを創出するステップは、第１〜第１２の態様に関して記載した通りの酵素混合物の使用を伴う。
【００５３】
上述の第１３〜第２４の態様のそれぞれの特定の実施形態において、ｃｆＮＡ、ｃｆＤＮＡ、及び／またはｃｆＲＮＡの３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端との両方に付加される外因性核酸配列は、第１〜第１２の態様に関して記載した通りである。
【００５４】
上述の第１３〜第２４の態様のそれぞれの特定の実施形態において、ｃｆＮＡは、任意の核酸であり得る。特定の実施形態において、ｃｆＮＡはｃｆＤＮＡである。特定の実施形態において、ｃｆＮＡは二本鎖ｃｆＤＮＡである。特定の実施形態において、ｃｆＮＡは一本鎖ｃｆＤＮＡである。特定の実施形態において、ｃｆＮＡは無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）である。特定の実施形態において、ｃｆＮＡは二本鎖ｃｆＲＮＡである。特定の実施形態において、ｃｆＮＡは一本鎖ｃｆＲＮＡである。
【００５５】
第１３〜第２４の態様の特定の実施形態において、試料は、ｃｆＤＮＡとｃｆＲＮＡとの両方を含有してもよく、ｃｆＤＮＡ及びｃｆＲＮＡのそれぞれが修飾されて、ｃｆＤＮＡ分子及びｃｆＲＮＡ分子の両方の増幅可能なプールが生成される。第１３〜第２４の態様の特定の実施形態において、試料は、ｃｆＤＮＡとｃｆＲＮＡとの両方を含有してもよく、ｃｆＤＮＡのみが修飾されて、増幅可能なｃｆＤＮＡ分子のプールが生成される。第１３〜第２４の態様の特定の実施形態において、試料は、ｃｆＤＮＡとｃｆＲＮＡとの両方を含有してもよく、ｃｆＲＮＡのみが修飾されて、増幅可能なｃｆＲＮＡ分子のプールが生成される。前述の内容において、ｃｆＤＮＡは、二本鎖であってもよく、かつ／または、ｃｆＲＮＡは、二本鎖であってもよい。
【００５６】
上述の第１７〜第２０の態様のそれぞれの特定の実施形態において、ｃｆＤＮＡは、二本鎖ｃｆＤＮＡであっても一本鎖ｃｆＤＮＡであってもよい。第１７〜第２０の態様の特定の実施形態において、ｃｆＤＮＡは二本鎖ｃｆＤＮＡである。上述の第１７〜第２０の態様の特定の実施形態において、試料は、ｃｆＲＮＡ（一本鎖または二本鎖のいずれか）をさらに含有してもよい。第１７〜第２０の態様の特定の実施形態において、試料は、ｃｆＤＮＡとｃｆＲＮＡとの両方を含有してもよく、ｃｆＤＮＡのみが修飾されて、増幅可能なｃｆＤＮＡ分子のプールが生成される。第１７〜第２０の態様の特定の実施形態において、試料は、ｃｆＤＮＡとｃｆＲＮＡとの両方を含有してもよく、ｃｆＤＮＡ及びｃｆＲＮＡのそれぞれが修飾されて、増幅可能なｃｆＤＮＡ分子及びｃｆＲＮＡ分子のプールが生成される。
【００５７】
上述の第２１〜第２４の態様のそれぞれの特定の実施形態において、ｃｆＲＮＡは、二本鎖ｃｆＲＮＡであっても一本鎖ｃｆＲＮＡであってもよい。第２１〜第２４の態様の特定の実施形態において、ｃｆＲＮＡは二本鎖ｃｆＲＮＡである。上述の第２１〜第２４の態様の特定の実施形態において、試料は、ｃｆＤＮＡ（一本鎖または二本鎖のいずれか）をさらに含有してもよい。第２１〜第２４の態様の特定の実施形態において、試料は、ｃｆＲＮＡとｃｆＤＮＡとの両方を含有してもよく、ｃｆＲＮＡのみが修飾されて、増幅可能なｃｆＲＮＡ分子のプールが生成される。第２１〜第２４の態様の特定の実施形態において、試料は、ｃｆＲＮＡとｃｆＤＮＡとの両方を含有してもよく、ｃｆＲＮＡ及びｃｆＤＮＡのそれぞれが修飾されて、増幅可能なｃｆＲＮＡ分子及びｃｆＤＮＡ分子のプールが生成される。
【００５８】
上述の第２１〜第２４の態様のそれぞれの特定の実施形態において、試料中に存在するｃｆＮＡの少なくとも５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上が修飾ｃｆＮＡに変換されて、増幅可能なｃｆＮＡプールが創出される。第１７〜第２０の態様にあるように、ｃｆＮＡがｃｆＤＮＡ（二本鎖ｃｆＤＮＡを含む）であるとき、試料中に存在するｃｆＤＮＡの少なくとも５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上が修飾ｃｆＤＮＡに変換されて、増幅可能なｃｆＤＮＡプールが創出される。第２１〜第２４の態様にあるように、ｃｆＮＡがｃｆＲＮＡ（二本鎖ｃｆＲＮＡを含む）であるとき、試料中に存在するｃｆＲＮＡの少なくとも５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上が修飾ｃｆＲＮＡに変換されて、増幅可能なｃｆＲＮＡプールが創出される。
【００５９】
第２５の態様において、本開示は、ｃｆＮＡを分析する方法であって、ｉ）第１〜第４の態様などの本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＮＡ分子のプール中のｃｆＮＡ分子の特性を決定するステップと、を含む、方法を提供する。
【００６０】
第２６の態様において、本開示は、ｃｆＤＮＡを分析する方法であって、ｉ）第５〜第８の態様などの本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプール中のｃｆＤＮＡ分子の特性を決定するステップと、を含む、方法を提供する。
【００６１】
第２７の態様において、本開示は、ｃｆＲＮＡを分析する方法であって、ｉ）第９〜第１２の態様などの本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプール中のｃｆＲＮＡ分子の特性を決定するステップと、を含む、方法を提供する。
【００６２】
第２５の態様の特定の実施形態において、分析可能なプールは、第４の態様の第１、第２、第３の方法によって生成される。第２６の態様の特定の実施形態において、分析可能なプールは、第５、第６、第７、または第８の態様の方法によって生成される。第２７の態様の特定の実施形態において、分析可能なプールは、第９、第１０、第１１、または第１２の態様の方法によって生成される。
【００６３】
上述の第２５〜第２７の態様のそれぞれにおいて、分析ステップは、核酸分子の分析に使用するのに好適な任意の技法を伴い得る。好適な技法としては、限定されないが、次世代配列決定（ＮＧＳ）、ならびに、リアルタイム定量的ＰＣＲ、ブロッカーＰＣＲ、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、クランピングＰＣＲ、ＩＣＥ−ＣＯＬＤ  ＰＣＲ、ｃａｓｔＰＣＲ、ＡＲＭＳ  ＰＣＲ、ＢＥＡＭｉｎｇなどだがこれらに限定されない、ＰＣＲベースの技術が挙げられる。本開示の方法によって生成された分析可能なｃｆＮＡ分子（ｃｆＤＮＡ及びｃｆＲＮＡを含む）のプールは、分析可能なｃｆＮＡプールの調製中に核酸分子の精製を必要とすることなく、これら及び他の分析技法で使用するのに十分な分量及び質のｃｆＮＡ分子をもたらす。
【００６４】
上述の第２５〜第２７の態様のそれぞれにおいて、決定される特性は、ｃｆＮＡ分子（ｃｆＤＮＡ及びｃｆＲＮＡを含む）の任意の特性であり得る。２つ以上の特性が同時に分析されてもよい。代表的な特性としては、染色体異常、単一ヌクレオチド多型、遺伝子変異（限定されないが、例えば点変異、欠失、及び挿入）、メチル化パターン、及びコピー数多型が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、この特性は、疾患に関連する。
【００６５】
第２８の態様において、本開示は、疾患を患っているか、もしくはそのリスクがあるものとして対象を診断する方法であって、ｉ）第１〜第４の態様などの本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＮＡ分子のプール中の、疾患に関連しているｃｆＮＡ分子の特性を決定するステップと、ｉｉｉ）この特性の存在に基づいて、対象が疾患を患っている、かつ／もしくはそのリスクがあると決定するステップ、または、この特性の非存在に基づいて、対象が疾患を患っていない、かつ／もしくはそのリスクがないと決定するステップと、を含む、方法を提供する。
【００６６】
第２９の態様において、本開示は、疾患を患っているか、もしくはそのリスクがあるものとして対象を診断する方法であって、ｉ）第５〜第８の態様などの本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプール中の、疾患に関連しているｃｆＤＮＡ分子の特性を決定するステップと、ｉｉｉ）この特性の存在に基づいて、対象が疾患を患っている、かつ／もしくはそのリスクがあると決定するステップ、または、この特性の非存在に基づいて、対象が疾患を患っていない、かつ／もしくはそのリスクがないと決定するステップと、を含む、方法を提供する。
【００６７】
第３０の態様において、本開示は、疾患を患っているか、もしくはそのリスクがあるものとして対象を診断する方法であって、ｉ）第９〜第１２の態様などの本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプール中の、疾患に関連しているｃｆＲＮＡ分子の特性を決定するステップと、ｉｉｉ）この特性の存在に基づいて、対象が疾患を患っている、かつ／もしくはそのリスクがあると決定するステップ、または、この特性の非存在に基づいて、対象が疾患を患っていない、かつ／もしくはそのリスクがないと決定するステップと、を含む、方法を提供する。
【００６８】
第２８の態様の特定の実施形態において、分析可能なプールは、第４の態様の第１、第２、第３の方法によって生成される。第２９の態様の特定の実施形態において、分析可能なプールは、第５、第６、第７、または第８の態様の方法によって生成される。第３０の態様の特定の実施形態において、分析可能なプールは、第９、第１０、第１１、または第１２の態様の方法によって生成される。
【００６９】
上述の第２８〜第３０の態様のそれぞれにおいて、分析ステップは、核酸分子の分析に使用するのに好適な任意の技法を伴い得る。好適な技法としては、限定されないが、次世代配列決定（ＮＧＳ）、ならびに、リアルタイム定量的ＰＣＲ、ブロッカーＰＣＲ、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、クランピングＰＣＲ、ＩＣＥ−ＣＯＬＤ  ＰＣＲ、ｃａｓｔＰＣＲ、ＡＲＭＳ  ＰＣＲ、ＢＥＡＭｉｎｇなどだがこれらに限定されない、ＰＣＲベースの技術が挙げられる。本開示の方法によって生成された分析可能なｃｆＮＡ分子（ｃｆＤＮＡ及びｃｆＲＮＡを含む）のプールは、分析可能なｃｆＮＡプールの調製中に核酸分子の精製を必要とすることなく、これら及び他の分析技法で使用するのに十分な分量及び質のｃｆＮＡ分子をもたらす。
【００７０】
上述の第２８〜第３０の態様のそれぞれにおいて、決定される特性は、ｃｆＮＡ分子（ｃｆＤＮＡ及びｃｆＲＮＡを含む）の任意の特性であり得る。２つ以上の特性が同時に分析されてもよい。代表的な特性としては、染色体異常、単一ヌクレオチド多型、遺伝子変異（限定されないが、例えば点変異、欠失、及び挿入）、メチル化パターン、及びコピー数多型が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、この特性は、疾患に関連する。
【００７１】
第３１の態様において、本開示は、疾患を患う対象のための治療介入を決定する方法であって、ｉ）第１〜第４の態様などの本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＮＡ分子のプール中の、疾患に関連しているｃｆＮＡ分子の特性を決定するステップと、ｉｉｉ）決定された特性に基づいて、治療介入を決定するステップと、を含む、方法を提供する。
【００７２】
第３２の態様において、本開示は、疾患を患う対象のための治療介入を決定する方法であって、ｉ）第５〜第８の態様などの本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプール中の、疾患に関連しているｃｆＤＮＡ分子の特性を決定するステップと、ｉｉｉ）決定された特性に基づいて、治療介入を決定するステップと、を含む、方法を提供する。
【００７３】
第３３の態様において、本開示は、疾患を患う対象のための治療介入を決定する方法であって、ｉ）第９〜第１２の態様などの本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプール中の、疾患に関連しているｃｆＲＮＡ分子の特性を決定するステップと、ｉｉｉ）決定された特性に基づいて、治療介入を決定するステップと、を含む、方法を提供する。
【００７４】
第３１の態様の特定の実施形態において、分析可能なプールは、第４の態様の第１、第２、第３の方法によって生成される。第３２の態様の特定の実施形態において、分析可能なプールは、第５、第６、第７、または第８の態様の方法によって生成される。第３３の態様の特定の実施形態において、分析可能なプールは、第９、第１０、第１１、または第１２の態様の方法によって生成される。
【００７５】
上述の第３１〜第３３の態様のそれぞれにおいて、分析ステップは、核酸分子の分析に使用するのに好適な任意の技法を伴い得る。好適な技法としては、限定されないが、次世代配列決定（ＮＧＳ）、ならびに、リアルタイム定量的ＰＣＲ、ブロッカーＰＣＲ、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、クランピングＰＣＲ、ＩＣＥ−ＣＯＬＤ  ＰＣＲ、ｃａｓｔＰＣＲ、ＡＲＭＳ  ＰＣＲ、ＢＥＡＭｉｎｇなどだがこれらに限定されない、ＰＣＲベースの技術が挙げられる。本開示の方法によって生成された分析可能なｃｆＮＡ分子（ｃｆＤＮＡ及びｃｆＲＮＡを含む）のプールは、分析可能なｃｆＮＡプールの調製中に核酸分子の精製を必要とすることなく、これら及び他の分析技法で使用するのに十分な分量及び質のｃｆＮＡ分子をもたらす。
【００７６】
上述の第３１〜第３３の態様のそれぞれにおいて、決定される特性は、ｃｆＮＡ分子（ｃｆＤＮＡ及びｃｆＲＮＡを含む）の任意の特性であり得る。２つ以上の特性が同時に分析されてもよい。代表的な特性としては、染色体異常、単一ヌクレオチド多型、遺伝子変異（限定されないが、例えば点変異、欠失、及び挿入）、メチル化パターン、及びコピー数多型が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、この特性は、疾患に関連する。
【００７７】
第３４の態様において、本開示は、疾患の診断を受け、かつ疾患の治療のための治療レジメンを用いた治療を受けている対象の治療を監視するための方法であって、ｉ）第１〜第４の態様などの本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＮＡ分子のプール中の、疾患に関連しているｃｆＮＡ分子の特性を決定するステップと、ｉｉｉ）決定された特性が現在の治療処置レジメンと適合性があるかを決定するステップと、ｉｖ）決定された特性が、治療レジメンが禁忌であるもしくは推奨されないことを示す場合は、治療レジメンを変更するステップ、または、決定された特性が、治療レジメンが引き続き推奨されることを示す場合は、治療レジメンを継続するステップと、ｖｉ）場合により、ステップｉ）〜ｉｖ）を繰り返して、所望の時間間隔で治療介入を監視するステップと、を含む、方法を提供する。
【００７８】
第３５の態様において、本開示は、疾患の診断を受け、かつ疾患の治療のための治療レジメンを用いた治療を受けている対象の治療を監視するための方法であって、ｉ）第５〜第８の態様などの本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプール中の、疾患に関連しているｃｆＤＮＡ分子の特性を決定するステップと、ｉｉｉ）決定された特性が現在の治療処置レジメンと適合性があるかを決定するステップと、ｉｖ）決定された特性が、治療レジメンが禁忌であるもしくは推奨されないことを示す場合は、治療レジメンを変更するステップ、または、決定された特性が、治療レジメンが引き続き推奨されることを示す場合は、治療レジメンを継続するステップと、ｖｉ）場合により、ステップｉ）〜ｉｖ）を繰り返して、所望の時間間隔で治療介入を監視するステップと、を含む、方法を提供する。
【００７９】
第３６の態様において、本開示は、疾患の診断を受け、かつ疾患の治療のための治療レジメンを用いた治療を受けている対象の治療を監視するための方法であって、ｉ）第９〜第１２の態様などの本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプール中の、疾患に関連しているｃｆＲＮＡ分子の特性を決定するステップと、ｉｉｉ）決定された特性が現在の治療処置レジメンと適合性があるかを決定するステップと、ｉｖ）決定された特性が、治療レジメンが禁忌であるもしくは推奨されないことを示す場合は、治療レジメンを変更するステップ、または、決定された特性が、治療レジメンが引き続き推奨されることを示す場合は、治療レジメンを継続するステップと、ｖｉ）場合により、ステップｉ）〜ｉｖ）を繰り返して、所望の時間間隔で治療介入を監視するステップと、を含む、方法を提供する。
【００８０】
第３４の態様の特定の実施形態において、分析可能なプールは、第４の態様の第１、第２、第３の方法によって生成される。第３５の態様の特定の実施形態において、分析可能なプールは、第５、第６、第７、または第８の態様の方法によって生成される。第３６の態様の特定の実施形態において、分析可能なプールは、第９、第１０、第１１、または第１２の態様の方法によって生成される。
【００８１】
上述の第３４〜第３６の態様のそれぞれにおいて、分析ステップは、核酸分子の分析に使用するのに好適な任意の技法を伴い得る。好適な技法としては、限定されないが、次世代配列決定（ＮＧＳ）、ならびに、リアルタイム定量的ＰＣＲ、ブロッカーＰＣＲ、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、クランピングＰＣＲ、ＩＣＥ−ＣＯＬＤ  ＰＣＲ、ｃａｓｔＰＣＲ、ＡＲＭＳ  ＰＣＲ、ＢＥＡＭｉｎｇなどだがこれらに限定されない、ＰＣＲベースの技術が挙げられる。本開示の方法によって生成された分析可能なｃｆＮＡ分子（ｃｆＤＮＡ及びｃｆＲＮＡを含む）のプールは、分析可能なｃｆＮＡプールの調製中に核酸分子の精製を必要とすることなく、これら及び他の分析技法で使用するのに十分な分量及び質のｃｆＮＡ分子をもたらす。
【００８２】
上述の第３４〜第３６の態様のそれぞれにおいて、決定される特性は、ｃｆＮＡ分子（ｃｆＤＮＡ及びｃｆＲＮＡを含む）の任意の特性であり得る。２つ以上の特性が同時に分析されてもよい。代表的な特性としては、染色体異常、単一ヌクレオチド多型、遺伝子変異（限定されないが、例えば点変異、欠失、及び挿入）、メチル化パターン、及びコピー数多型が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、この特性は、疾患に関連する。
【００８３】
第３７の態様において、本開示は、対象を監視する方法であって、ｉ）第１〜第４の態様などの本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＮＡ分子のプール中の、疾患に関連しているｃｆＮＡ分子の特性を決定するステップと、ｉｉｉ）決定された特性に基づいて、対象が治療を必要としているかを決定するステップと、を含む、方法を提供する。
【００８４】
第３８の態様において、本開示は、対象を監視する方法であって、ｉ）第５〜第８の態様などの本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプール中の、疾患に関連しているｃｆＤＮＡ分子の特性を決定するステップと、ｉｉｉ）決定された特性に基づいて、対象が治療を必要としているかを決定するステップと、を含む、方法を提供する。
【００８５】
第３９の態様において、本開示は、対象を監視する方法であって、ｉ）第９〜第１２の態様などの本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプール中の、疾患に関連しているｃｆＲＮＡ分子の特性を決定するステップと、ｉｉｉ）決定された特性に基づいて、対象が治療を必要としているかを決定するステップと、を含む、方法を提供する。
【００８６】
第３７の態様の特定の実施形態において、分析可能なプールは、第４の態様の第１、第２、第３の方法によって生成される。第３８の態様の特定の実施形態において、分析可能なプールは、第５、第６、第７、または第８の態様の方法によって生成される。第３９の態様の特定の実施形態において、分析可能なプールは、第９、第１０、第１１、または第１２の態様の方法によって生成される。
【００８７】
上述の第３７〜第３９の態様のそれぞれにおいて、分析ステップは、核酸分子の分析に使用するのに好適な任意の技法を伴い得る。好適な技法としては、限定されないが、次世代配列決定（ＮＧＳ）、ならびに、リアルタイム定量的ＰＣＲ、ブロッカーＰＣＲ、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、クランピングＰＣＲ、ＩＣＥ−ＣＯＬＤ  ＰＣＲ、ｃａｓｔＰＣＲ、ＡＲＭＳ  ＰＣＲ、ＢＥＡＭｉｎｇなどだがこれらに限定されない、ＰＣＲベースの技術が挙げられる。本開示の方法によって生成された分析可能なｃｆＮＡ分子（ｃｆＤＮＡ及びｃｆＲＮＡを含む）のプールは、分析可能なｃｆＮＡプールの調製中に核酸分子の精製を必要とすることなく、これら及び他の分析技法で使用するのに十分な分量及び質のｃｆＮＡ分子をもたらす。
【００８８】
上述の第３７〜第３９の態様のそれぞれにおいて、決定される特性は、ｃｆＮＡ分子（ｃｆＤＮＡ及びｃｆＲＮＡを含む）の任意の特性であり得る。２つ以上の特性が同時に分析されてもよい。代表的な特性としては、染色体異常、単一ヌクレオチド多型、遺伝子変異（限定されないが、例えば点変異、欠失、及び挿入）、メチル化パターン、及びコピー数多型が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、この特性は、疾患に関連する。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
以下の説明において、本発明の理解をより深めるために多数の具体的詳細が記載される。しかしながら、開示される実施形態がこれらの具体的詳細のうちの１つ以上を用いずに実施され得ることは当業者に明らかであろう。他の事例では、本発明を不明瞭にすることを避けるために、周知の特徴及び当業者に周知の手技は記載されていない。
【００９０】
定義
本明細書で使用される場合、「増幅可能な核酸プール」という用語は、核酸分子の増幅が可能になるように元々の状態から改変されている核酸のプールを指す。特定の実施形態において、増幅可能な核酸プールは、試料中に存在する核酸分子の少なくとも一部分の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端との両方に外因性核酸配列を付加することによって創出される。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「増幅可能な核酸プール」及び「増幅可能なｃｆＮＡプール」という用語は、試料中に存在する、少なくとも１つの外因性核酸配列を含有するように修飾されている複数の核酸を指し、この外因性核酸配列は、外因性配列が結合している核酸分子を増幅するための反応において使用される。特定の実施形態において、核酸は、１つまたは２つの外因性配列を含有し得る。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「増幅可能なｃｆＤＮＡプール」という用語は、試料中に存在する、少なくとも１つの外因性核酸配列を含有するように修飾されている複数のｃｆＤＮＡを指し、この外因性核酸配列は、外因性配列が結合しているｃｆＤＮＡ分子を増幅するための反応において使用される。特定の実施形態において、ｃｆＤＮＡは、１つまたは２つの外因性配列を含有し得る。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「増幅可能なｃｆＲＮＡプール」という用語は、試料中に存在する、少なくとも１つの外因性核酸配列を含有するように修飾されている複数のｃｆＲＮＡを指し、この外因性核酸配列は、外因性配列が結合しているｃｆＲＮＡ分子を増幅するための反応において使用される。特定の実施形態において、ｃｆＲＮＡは、１つまたは２つの外因性配列を含有し得る。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「外因性核酸配列」という用語は、試料中に存在する、ｃｆＮＡ、ｃｆＤＮＡ、及び／またはｃｆＲＮＡを含む、核酸分子内に存在しない配列を意味する。特定の実施形態において、外因性核酸配列は、ヒトゲノムでは生じない配列である。特定の実施形態において、外因性核酸配列は、プライマーに結合することが可能なプライマー部位を含有する。特定の実施形態において、プライマー部位は、ユニバーサルプライマー部位である。特定の実施形態において、外因性核酸配列は、複製ブロックを含有する。
【００９５】
本明細書で使用される場合、「無細胞核酸」または「ｃｆＮＡ」という用語は、血流、脳脊髄液、唾液、または尿を含むがこれらに限定されない体液中などの細胞外に見出される核酸のセグメントを意味する。ｃｆＮＡは、対象（例えば、対象の細胞）を起源としてもよいし、対象以外の源（例えば、ウイルス感染）を起源としてもよい。
【００９６】
本明細書で使用される場合、「無細胞ＤＮＡ」または「ｃｆＤＮＡ」という用語は、血流、脳脊髄液、唾液、または尿を含むがこれらに限定されない体液中などの細胞外に見出されるＤＮＡのセグメントを意味する。ｃｆＤＮＡは、対象（例えば、対象の細胞）を起源としてもよいし、対象以外の源（例えば、ウイルス感染）を起源としてもよい。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「無細胞ＲＮＡ」または「ｃｆＲＮＡ」という用語は、血流、脳脊髄液、唾液、または尿を含むがこれらに限定されない体液中などの細胞外に見出されるＲＮＡのセグメントを意味する。「無細胞ＲＮＡ」または「ｃｆＲＮＡ」という用語には、ＲＮＡのセグメントのセグメントから生成されたＤＮＡ（例えば、二本鎖ｃＤＮＡなど）も含まれる。ｃｆＲＮＡは、対象（例えば、対象の細胞）を起源としてもよいし、対象以外の源（例えば、ウイルス感染）を起源としてもよい。
【００９８】
本明細書で使用される場合、試料または試料中の核酸（ｃｆＮＡ、ｃｆＤＮＡ、及び／またはｃｆＲＮＡを含む）を説明するために使用されるときの「試料を核酸精製ステップに供することなく」、「精製ステップに供されていない」、「未精製」、または「精製に供されない」などの用語（ならびに同様の用語）は、その試料／核酸が、試料中の核酸（ｃｆＮＡ、ｃｆＤＮＡ、及び／またはｃｆＲＮＡを含む）を特異的に単離または精製するためのステップに供されていないことを意味する。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「特異的に単離する」という用語は、試料中の核酸（ｃｆＮＡ、ｃｆＤＮＡ、及び／またはｃｆＲＮＡを含む）を核酸の配列特異的特性に基づいて（例えば、プローブの使用などによって）試料から分離することを可能にするステップまたは一連のステップを意味する。本明細書で使用される場合、試料中の核酸（ｃｆＮＡ、ｃｆＤＮＡ、及び／またはｃｆＲＮＡを含む）に関する「精製する」という用語は、試料中の核酸（ｃｆＮＡ、ｃｆＤＮＡ、及び／またはｃｆＲＮＡを含む）を核酸の結合特性に基づいて試料から分離することを可能にするステップまたは一連のステップ（例えば、配列特異的な様式以外の様式で核酸に結合する核酸結合試薬とのインキュベーション）を意味する。したがって、試料の性質がどのようなものであれ、試料は、試料から核酸を取り除くため、または核酸以外の試料の成分の全てもしくは本質的に全てを試料から取り除くために、ｉ）試料中に存在し得る何らかの核酸（ｃｆＮＡ、ｃｆＤＮＡ、及び／またはｃｆＲＮＡを含む）を特異的に単離するステップ（複数可）に供されることも、またはｉｉ）核酸を単離するための、試料中の核酸（ｃｆＮＡ、ｃｆＤＮＡ、及び／またはｃｆＲＮＡを含む）と核酸結合試薬との相互作用を伴うステップに供されることもない。特定の事例では、核酸を含有する試料は処理されてもよく（例えば、血液試料は、血清または血漿試料を生成するために遠心処理または他の手段によって処理されてもよい）、この処理は、特定の成分（例えばタンパク質、細胞、または他の成分）を取り除き、かつ／または試料中の核酸の濃度を増加させてもよい。そのような処理は、試料中の核酸（ｃｆＮＡ、ｃｆＤＮＡ、及び／またはｃｆＲＮＡを含む）を「特異的に単離する」または「精製する」ものとはみなされないが、これは、核酸分子が依然として試料のさらなる成分と共に存在し、この処理が試料中の核酸分子を特異的に対象としないためである。一実施形態において、「特異的に単離する」及び「精製する」という用語は、試料の遠心処理を含まない。別の実施形態では、ｃｆＮＡ（ｃｆＤＮＡ及び／またはｃｆＲＮＡを含む）の濃度を増加させる処理ステップは、試料の少なくとも１つの他の成分の濃度も増加する場合、試料中のｃｆＮＡ（ｃｆＤＮＡ及び／またはｃｆＲＮＡを含む）を「特異的に単離する」または「精製する」ものとはみなされない。
【０１００】
本明細書で使用される場合、反応（例えば核酸の増幅）を説明するために使用されるときの「インサイチュ」という用語は、その反応が、試料をさらに操作する必要なしに試料中で起こることを意味する。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、「およそ」、「大体」、「ほぼ」、または「の領域内」を意味する。「約」という用語が数値範囲と併せて使用されるとき、この用語は、記載される数値の上下に両境界を広げることにより、その範囲を修飾する。概して、本明細書において「約」という用語は、規定値を１パーセント〜２０パーセント上または下の（より高いまたはより低い）差異だけ上回る数値及び下回る数値を修飾するように使用され、特定の実施形態では、本明細書において「約」という用語は、規定値を１パーセント〜５パーセント上または下の（より高いまたはより低い）差異だけ上回る数値及び下回る数値を修飾するように使用される。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「動物」、「対象」、及び「患者」という用語は、本明細書で使用される場合、哺乳動物、動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ、ブタなど）、及びヒトを含むがこれらに限定されない、動物界の全てのメンバーを含む。特定の実施形態では、対象はヒトである。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、「試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分の５’末端及び／または３’末端に外因性核酸配列を付加する」という用語または同様の用語は、試料中に存在するｃｆＮＡの配列への外因性核酸配列の組み込み、またはｃｆＮＡの配列の少なくとも一部分の相補体である配列への外因性核酸配列の組み込みを指す。そのような組み込みは、ｃｆＮＡ配列への外因性核酸配列のアニーリング及び（外因性核酸配列によりプライミングされてもよい）ｃｆＮＡ配列の後の複製によって達成することができる。そのような組み込みは、ｃｆＮＡの少なくとも１つの鎖への外因性核酸配列の少なくとも１つの鎖のライゲーションによって達成されてもよい。いずれにしても、ｃｆＮＡの少なくとも５’末端及びまたは３’末端が外因性核酸配列を含有する、本明細書では修飾ｃｆＮＡと称される場合もあるｃｆＮＡ（またはｃｆＮＡの相補体）が生成される。
【０１０４】
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、文脈が別段明らかに指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「核酸分子（ａ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」への言及は、１つの核酸分子、２つ以上の核酸分子、またはそのような核酸分子の混合物を指し、「アッセイ（ａｎ  ａｓｓａｙ）」への言及は、当業者に知られる複数の同等なステップ及び方法への言及を含むなどということである。
【０１０５】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の各介在値、及びその規定範囲内のあらゆる他の規定値または介在値が、本発明に包含されることを理解されたい。規定範囲が上限及び下限を含む場合、含まれるこれらの限界のいずれかを除外する範囲も本発明に含まれる。
【０１０６】
明示的な規定がない限り、本明細書で使用される用語は、当業者により理解されている平易かつ通常の意味を有するよう意図される。上記の定義は、読者の本発明の理解を助けることを意図するが、明確な記載がない限り、かかる用語の意味を変えること、または別様に限定することを意図するものではない。本明細書で言及される全ての公開文献は、公開文献に記載され、かつ本明細書に記載される発明に関連して使用され得る、系統的表現及び方法論を説明し開示する目的で、参照により援用される。
【０１０７】
導入
体内の核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）のほとんどは細胞内に位置しているが、相当量の細胞外核酸が血流中に循環していることも見受けられる。Ｍａｎｄｅｌ及びＭｅｔａｉｓにより１９４８年に初めて血液中のｃｆＤＮＡが発見されてから、ｃｆＤＮＡは、疾患または病態（例えば癌）を有する患者と健常な個体とを２つの方法で識別することが、研究者らにより見出されている。その２つの方法とは、第１に、疾患または病態を有する患者の血液中のｃｆＤＮＡ濃度の上昇によるもの、そして第２に、疾患または病態を有する患者のｃｆＤＮＡにおける腫瘍特異的変質の存在によるものである。腫瘍特異的ｃｆＤＮＡは、血液癌、結腸直腸癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、肺癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、及び子宮頸癌などだがこれらに限定されない、広範な癌に対応する血液中で見出されている。これは、ｃｆＤＮＡが全ての癌の特質であり、癌の診断、疾患進行の監視、治療介入の特定、及び治療応答の監視に使用することのできる、病理学的プロセスを反映することを示唆する。ｃｆＤＮＡは、新たに合成された核酸の「能動的」放出、ならびに「受動的」機序によって、ネクローシス性及び／またはアポトーシス性の細胞死の最終産物として血流に進入すると考えられている。
【０１０８】
健常な対象の場合、循環ｃｆＤＮＡの平均濃度は血漿１ｍＬ当たり１０〜３０ｎｇであり、癌患者の値は、血漿１ｍＬ当たり１００ｎｇを超える。複数の方法を使用した、腫瘍によりもたらされたｃｆＤＮＡの推定値は、０．０１〜９０％である（Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂａｃｈ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １１３７：１９０−１９６）。ほとんどのｃｆＤＮＡ断片は１５０〜２００塩基対の長さであり、循環中の可変的な半減期は、１５分間から数時間まで及ぶ。血流中のｃｆＤＮＡの量は、腫瘍進行、腫瘍位置、腫瘍の代謝回転、腫瘍サイズ、ならびに血液及びリンパ循環によるｃｆＤＮＡのクリアランス、分解、及びフィルタリングなどだがこれらに限定されない、種々の要素に影響される。最も一般的な公開されているｃｆＤＮＡの抽出方法は、市販のスピンカラム抽出キットである。他に報告されている抽出方法としては、磁気ビーズ、フェノール／クロロホルム抽出、及びアルカリ塩添加（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｓａｌｔｉｎｇ）が挙げられる。ｃｆＤＮＡ抽出の効率は、変異（複数可）を検出する能力に直接影響し得、この検出能力は、アッセイ感度に直接影響する。
【０１０９】
循環ｃｆＤＮＡベースの非侵襲的方法を使用すると、特定の癌の分子特性決定に従い、癌患者の適切な治療のために特異的及び予測的バイオマーカーを検出し、監視することができる。例えば、ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、または配列決定を使用することにより、標的療法の前、その間、及びその後の癌患者のｃｆＤＮＡから、ＫＲＡＳ及びＥＦＧＲ変異の状態を得ることができる（Ｂｉｄａｒｄ  ＦＣ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．３２（１−２）：１７９−１８８）。次世代配列決定（ＮＧＳ）によるｃｆＤＮＡの全エクソーム配列決定は、腫瘍進行の分子的状態に関する大域的で完全かつリアルタイムな実態を提供することができる（Ｄｉａｚ  ＬＡ  Ｊｒ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ４（１０）：１８５６−１８５７）。最も重要なことには、超深度ｃｆＤＮＡ変異プロファイリングから腫瘍量を定量的に推定することができる（Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．６（２２４）：２２４ｒａ２４）。腫瘍ゲノムのメチル化の状態をｃｆＤＮＡ断片中で検出することもできる（Ｍｏｒｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３（３６）：９３５１−９３５８）。全体として、血液生検を用いた患者中心の分子診断学の発展は、患者ケアに多くの利益を提示する。
【０１１０】
精密医療の時代において、患者はますます、腫瘍の位置または組織学的特徴ではなく、患者特有の腫瘍の遺伝的構造に基づいて治療されることが予想されている。しかしながら、癌ゲノムは、療法の適用などの淘汰圧下で不安定であり、変化しやすい。したがって、遺伝子学的に個別化された癌治療は、臨床成績の改善のための腫瘍ゲノムの連続的監視を必要とする。その実行は、現在の技法では臨床的に実用的でない。原発腫瘍に典型的な遺伝子変異及びエピジェネティック変異が癌患者の循環ｃｆＤＮＡ中で検出され得るという所見は、血液中のｃｆＤＮＡの少なくとも一部が腫瘍由来であることを示唆する。したがって、末梢血のｃｆＤＮＡ分析は、非侵襲的方式における長期的な腫瘍監視の無比の機会を提示する。
【０１１１】
以上、固形腫瘍の試料採取に固有の欠点を詳解した。
【０１１２】
対照的に、血液生検、特にｃｆＤＮＡ分析は、癌の精密管理のための利用しやすく低侵襲性かつ長期的な解決策を提示する。ｃｆＤＮＡを用いる臨床検査は、本質的に特異的であり、高感度であり、腫瘍内及び腫瘍間の両方の不均一性をリアルタイムで捉えることができる（Ｄａｗｓｏｎ  ＳＪ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６８：１１９９−１２０９）。周期的な「血液生検」分析による低頻度の変異の検出により、病変が画像法で検出するのに十分大きくなる前の腫瘍進行を監視することができる（Ｄｉａｚ  ＬＡ  Ｊｒ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｎａｔｕｒｅ  ４８６（７４０４）：５３７−５４０）。また、単一変異を超える分析は、効果的な治療法の決断のために腫瘍不均一性を捉えることが保証され得る（Ｓｅｑｕｉｓｔ  ＬＶ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２３（７５）：７５ｒａ２６）。血液生検は組織生検ほど空間的に限定されず、体内における癌発生の間中に生じる変異の大域的なスペクトルを提示し得る。それにもかかわらず、サンガー配列決定などの従来の分析方法の感度は、低頻度のバリアントを検出するには不十分である。この点で、先進的なＮＧＳ技術は、高感度を有する複数の変異のハイスループット分析のコスト効果の高い代替手段を提供し得る。加えて、大部分が正常な集団からの腫瘍特異的ｃｆＤＮＡの単一分子増幅及び／または選択的濃縮という特徴を有するＰＣＲベースのプラットフォームは、前例のないアッセイ感度を実証している。
【０１１３】
ｃｆＤＮＡによって癌関連遺伝子変異を評価することにより、観察される変異のスペクトルが同じ悪性組織内の異なる生検切片間で異なり得る腫瘍の直接試料採取に固有の位置的なバイアスを避けることもできる。血流へのＤＮＡ放出の精確な機序は不確かなままであるが、アポトーシス、ネクローシス、及び腫瘍細胞からの能動的放出の組み合わせから生じると考えられている。そのような情報価値のあるｃｆＤＮＡバイオマーカーは、ほとんど全ての癌タイプにおいて、早期検出、診断、予後、疾患及び療法の監視を改善させる見込みを示している（Ｇｏｒｍａｌｌｙ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．６３５（２−３）：１０５−１１７、Ｔｏｎｇ  ＹＫ，ｅｔ  ａｌ．，２００６  Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ３６３（１−２）：１８７−１９６、Ｇａｕｔｓｃｈｉ  Ｏ，ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２（２０）：４１５７−４１６４、Ｘｕｅ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．，２００６  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０７５：１５４−１６４、Ｋｈａｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，２００４  Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １１０（６）：８９１−８９５）。
【０１１４】
【表１】
2018530347.tif 000003
【０１１５】
健常な個体と比較してより高いレベルの血漿ｃｆＤＮＡが癌患者で一貫して検出されているものの、研究間及び方法論間で相当な差異がある。こうした差異は、研究コホート、分析前の試料調製、及びｃｆＤＮＡを単離し数量化するために使用される方法の差に起因し得る（Ｘｕｅ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０７５：１５４−１６４、Ｂｏｄｄｙ  ＪＬ，ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１（４）：１３９４−１３９９、Ｗｕ  ＴＬ，ｅｔ  ａｌ．２００２，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ３２１（１−２）：７７−８７、Ｃｈｉｕ  ＲＷ，ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４７（９）：１６０７−１６１３）。循環ｃｆＤＮＡは、血漿中でのその低い濃度、不均一なサイズ分布、及び断片化された性質のために、抽出が困難な分析物である。結果として、ｃｆＤＮＡの単離は、高い投入容量の必要性、コスト、及び労働集約のために困難である。ｃｆＤＮＡの抽出、精製、または数量化のための既存の標準的プロトコルはない。多くの研究所が市販の抽出キットを用いる一方で、他の研究所は独自の単離方法を開発している。最もポピュラーな市販キットは、ＱＩＡａｍｐ循環核酸キット（Ｑｉａｇｅｎ）であり、このキットでは、シリカ膜が、好ましくは、ｃｆＤＮＡの小断片にスピンカラム形式で結合し、さらなるゲノム分析のためにｃｆＤＮＡを精製するための迅速かつ容易な方法が提供される。しかしながら、結合、洗浄、及び溶出などのステップにおける損失が不可避であるため、現在の方法論によるｃｆＤＮＡの回収効率は極めて低く、大容量の出発物質（＞１０ｍＬの血液）の必要性につながっている。さらに、このようなシリカ膜結合技法は、様々なサイズのｃｆＤＮＡ断片を効率的に回収せず、下流分析にさらにバイアスをかける。
【０１１６】
液体生検分野における最新の研究は、対象の腫瘍特異的ｃｆＤＮＡを選択的に濃縮または増幅する新規技術に焦点を当てている。しかしながら、上記で詳解したように、現在の技法によって単離されたｃｆＤＮＡは、試料中に元々存在したｃｆＤＮＡの一部にしか相当しないため、出発物質は不完全なままである。したがって、濃縮及び検出技術の感度が下流でいかに高かろうと、これらの技法は、上流の試料調製中に既に失われたｃｆＤＮＡを補うことはできない。さらに、先行技術の技法は、様々なサイズのｃｆＤＮＡ断片の回収に一貫性がない。
【０１１７】
したがって、当該技術分野では、同じ試料中の無細胞核酸から腫瘍特異的変異プロファイルを正確に数量化し、かつ検出するための、より高分子量（ネクローシス死）及びより低分子量（アポトーシス死）のｃｆＮＡ種（ｃｆＤＮＡ及び／またはｃｆＲＮＡを含む）の両方を効率的に回収することのできる、目的にかなった試料調製方法が不足している。本開示はそのような方法を提供し、ｃｆＤＮＡ分析の分析感度及び特異性の改善を可能にする。
【０１１８】
増幅の方法
本開示は、ｃｆＮＡベースの液体生検の患者ケアへの適用を含む液体生検の臨床適用における少なくとも３つの主要な未解決の課題、すなわちｉ）投入試料容量、ｉｉ）分析用のｃｆＮＡの産出分量、及びｉｉｉ）分析用の産出ｃｆＮＡの質に対する解決策を提示する。本開示は、分析のための試料中のｃｆＮＡ（ｃｆＤＮＡ及び／またはｃｆＲＮＡを含む）を、該試料を核酸精製ステップに供することなく調製する方法を提供する。そのような方法において、必要とされる試料容量は先行技術の方法よりも低く（好適な血漿試料を生成するために１０〜５０マイクロリットルほどの低さの全血が必要とされる）、核酸精製ステップが必要とされないことから汚染のリスクが減少し、核酸精製が必要とされないことから試料中のｃｆＮＡの全スペクトルの回収が増加する。本開示はまた、ｃｆＮＡの使用のための方法、例えば、試料中のｃｆＮＡ（ｃｆＤＮＡ及び／またはｃｆＲＮＡを含む）を分析する方法であって、ｃｆＮＡが本開示の方法を使用して調製される（すなわち、試料が核酸精製ステップに供されていない）方法を提供する。
【０１１９】
本開示の方法によって調製された核酸は、増幅及び分析の前にｃｆＮＡを精製または回収する必要性が排除されるため、試料中のｃｆＮＡの優れた利用をもたらす。本開示は、試料中のｃｆＮＡのインサイチュ増幅をもたらし、単一の反応（すなわち、単一の試験管またはマルチウェルプレートの単一のウェル）で行うことができる。さらに、本開示の方法によって調製されたｃｆＮＡは、先行技術の方法によって調製されたｃｆＮＡよりも質が高く、優れた下流分析が可能である。なおもさらに、本開示の方法は、小容量の出発試料のみを必要とする。１０〜５０マイクロリットルほどの低さの容量を使用することができる（液滴容量）。例えば、本開示は、１０マイクロリットルの尿及び１０〜２０マイクロリットルの血漿（およそ５０マイクロリットルの全血から得ることができる）からのｃｆＮＡの増幅及び／または分析を示す。したがって、本開示の方法は、次世代液体生検、ポイントオブケア、及びナノまたは小型化マイクロ流体「ラブオンチップ」診断デバイスに好適である。加えて、本開示の方法を使用すると、より広範なｃｆＮＡ分子（例えば、小型及び大型両方のｃｆＮＡ断片の広域分布）を分析することができる。例えば、本開示の方法は、核酸断片サイズに関するバイアスを示さない。
【０１２０】
ｃｆＮＡのＩＳＡ方法及び増幅用ｃｆＮＡの調製方法
本開示の方法は、試料を核酸精製ステップに供する必要のない、液体試料中のｃｆＮＡのインサイチュ増幅を利用する。したがって、核酸精製ステップの必要なしに、液体試料（例えば、尿、ＣＳＦ、唾液、血漿、または血清）からインサイチュで直接ｃｆＮＡを増幅することができる（例えば、ｃｆＮＡは、特異的に単離または精製されない）。この特徴は、調製ステップ中の試料中のｃｆＮＡの損失を少なくとも部分的に排除し、試料中のｃｆＮＡの完全再現の利点が後の分析のために利用可能である。本明細書に記載の方法において、試料容量は先行技術と比較して著しく低下する。
【０１２１】
加えて、本開示の方法は、質が高く種々の下流分析技法で使用することのできる分析可能なｃｆＮＡのプールを提供する。本開示の方法によって作製された分析可能なｃｆＮＡのプールを分析するためには、本開示の方法と併せて、任意の既知の分析技法が使用され得る。好適な技法としては、限定されないが、次世代配列決定（ＮＧＳ）、ならびに、リアルタイム定量的ＰＣＲ、ブロッカーＰＣＲ、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、クランピングＰＣＲ、ＩＣＥ−ＣＯＬＤ  ＰＣＲ、ｃａｓｔＰＣＲ、ＡＲＭＳ  ＰＣＲ、ＢＥＡＭｉｎｇなどだがこれらに限定されない、ＰＣＲベースの技術が挙げられる。これまで、これらの技法で使用するためには高度に精製されたｃｆＮＡが必要であると考えられていた。
【０１２２】
本開示は、増幅可能な核酸プールを生成するための、試料中の核酸（例えば、ｃｆＤＮＡを含む）のインサイチュ増幅の方法を提供する。増幅可能な核酸プールは、本明細書に記載されるように、分析可能な核酸プールを生成するために増幅することができ、後の分析に使用することができる。さらに、本開示は、増幅のための試料中の核酸（例えば、ｃｆＤＮＡを含む）を調製する方法を提供する。記載される方法は、試料を核酸精製ステップに供することなく実施される（例えば、ｃｆＮＡは、特異的に単離または精製されない）。さらに、特定の実施形態において、本方法は、１０〜５０マイクロリットルの試料容量を用いて行われる。本方法の特定の実施形態が、以下に提供される。なおもさらに、特定の実施形態において、記載される反応は全て、単一の反応槽内で実施される。
【０１２３】
核酸分子は、任意の核酸であり得る。特定の実施形態において、核酸はｃｆＤＮＡである。特定の実施形態において、核酸は二本鎖ｃｆＤＮＡである。特定の実施形態において、核酸は二本鎖ｃｆＲＮＡである。
【０１２４】
以下の記載は、本明細書に記載の方法の実施形態及び態様のそれぞれに言及する。以下の詳解は、簡潔さのために代表的なｃｆＮＡとしてｃｆＤＮＡに言及し得るが、本開示の方法は任意の種類のｃｆＮＡに適用可能であり、ｃｆＤＮＡに限定されるべきではない。
【０１２５】
本開示の方法は、試料中のｃｆＮＡのＩＳＡの方法であって、１）ｃｆＮＡ（ｃｆＤＮＡ及び／またはＲＮＡを含む）を含有する液体試料を準備することと、２）試料を処理ステップに供することと、３）試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分の５’末端及び／または３’末端に外因性核酸配列を付加することにより、試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＮＡプールを創出することと、４）増幅可能なｃｆＮＡプールを増幅して、分析可能なｃｆＮＡのプールを創出することと、を含む、方法を提供する。
【０１２６】
本明細書で詳解されるように、ｃｆＮＡは、ｃｆＤＮＡ（例えば二本鎖ｃｆＤＮＡ）であってもよい。したがって、本開示は、試料中のｃｆＤＮＡのＩＳＡの方法であって、１）ｃｆＤＮＡを含有する液体試料を準備することと、２）試料を処理ステップに供することと、３）試料中のｃｆＤＮＡ分子の少なくとも一部分の５’末端及び／または３’末端に外因性核酸配列を付加することにより、試料中のｃｆＤＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＤＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＤＮＡプールを創出することと、４）増幅可能なｃｆＤＮＡプールを増幅して、分析可能なｃｆＤＮＡのプールを創出することと、を含む、方法を提供する。
【０１２７】
本明細書で詳解されるように、ｃｆＮＡは、ｃｆＲＮＡであってもよい。したがって、本開示は、試料中のｃｆＲＮＡのＩＳＡの方法であって、１）ｃｆＲＮＡを含有する液体試料を準備することと、２）試料を処理ステップに供することと、３）試料中のｃｆＲＮＡ分子の少なくとも一部分の５’末端及び／または３’末端に外因性核酸配列を付加することにより、試料中のｃｆＲＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＲＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＲＮＡプールを創出することと、４）増幅可能なｃｆＲＮＡプールを増幅して、分析可能なｃｆＲＮＡのプールを創出することと、を含む、方法を提供する。
【０１２８】
本開示は、試料中のｃｆＮＡを核酸精製ステップに供することなく分析のための試料中のｃｆＮＡを調製する方法であって、ｉ）複数のｃｆＮＡ分子を含有する液体試料を準備するステップと、ｉｉ）試料に少なくとも１つの処理ステップを行うステップと、ｉｉｉ）試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＮＡプールを創出するステップと、を含む、方法を提供する。
【０１２９】
本明細書で詳解されるように、ｃｆＮＡは、ｃｆＤＮＡ（例えば二本鎖ｃｆＤＮＡ）であってもよい。したがって、本開示は、試料中のｃｆＮＡを核酸精製ステップに供することなく分析のための試料中のｃｆＮＡを調製する方法であって、１）ｃｆＤＮＡを含有する液体試料を準備するステップと、２）試料を処理ステップに供するステップと、３）試料中のｃｆＤＮＡ分子の少なくとも一部分の５’末端及び／または３’末端に外因性核酸配列を付加することにより、試料中のｃｆＤＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＤＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＤＮＡプールを創出するステップと、を含む、方法を提供する。
【０１３０】
本明細書で詳解されるように、ｃｆＮＡは、ｃｆＲＮＡであってもよい。したがって、本開示は、試料中のｃｆＮＡを核酸精製ステップに供することなく分析のための試料中のｃｆＮＡを調製する方法であって、１）ｃｆＲＮＡを含有する液体試料を準備するステップと、２）試料を処理ステップに供するステップと、３）試料中のｃｆＲＮＡ分子の少なくとも一部分の５’末端及び／または３’末端に外因性核酸配列を付加することにより、試料中のｃｆＲＮＡ分子の少なくとも一部分を修飾ｃｆＲＮＡに変換して、増幅可能なｃｆＲＮＡプールを創出するステップと、４）増幅可能なｃｆＲＮＡプールを増幅して、分析可能なｃｆＲＮＡのプールを創出するステップと、を含む、方法を提供する。
【０１３１】
本開示の方法は、上記の「発明の概要」の節に記載した第１〜第１２及び第１３〜第２４の態様の方法を具体的に含む。以下の記載は、ＩＳＡの方法と、分析用のｃｆＮＡを調製するための方法との両方に適用される。
【０１３２】
特定の実施形態において、試料中のｃｆＮＡ（ｃｆＤＮＡ及び／またはｃｆＲＮＡを含む）の少なくとも一部分は、ｃｆＮＡの５’末端または３’末端のいずれかに１つの外因性核酸配列を含有する。特定の実施形態において、試料中のｃｆＮＡ（ｃｆＤＮＡ及び／またはｃｆＲＮＡを含む）の少なくとも一部分は、２つの外因性核酸配列（５’末端に１つ及び３’末端に１つ）を含有する。複数の外因性核酸配列が存在するとき、外因性核酸配列は、同じであってもよく、または互いと異なっていてもよい。特定の実施形態において、外因性核酸配列は、試料中に存在するｃｆＮＡ（ｃｆＤＮＡ及び／またはｃｆＲＮＡを含む）分子の少なくとも一部分の３’末端と５’末端との両方に付加される。
【０１３３】
複数のｃｆＮＡ分子（例えば、ｃｆＤＮＡ及び／またはｃｆＲＮＡ）を含有する液体試料が準備される。液体試料は、対象から得られる任意の液体試料であり得る。特定の実施形態において、液体試料は、血液試料、血清試料、血漿試料、唾液試料、ＣＳＦ試料、唾液試料、または尿試料である。液体試料は、所望の場合は処理されてもよい。例えば、血液試料は、細胞を取り除き、血漿／血清画分を準備するために処理されてもよい。液体試料は、いかなる処理も行わずに直接使用されてもよい。液体試料の性質が、処理ステップが必要であるかを少なくとも部分的に決定する。一実施形態における液体試料は、全細胞または細胞断片を含有しない。処理ステップは、細胞、細胞断片など、不要な物質を試料から排除するために使用され得る。試料の性質がどのようなものであれ、試料中のｃｆＮＡは、特異的に単離または精製されない。特定の実施形態において、液体試料は、ヒト対象などの対象からのものである。特定の実施形態において、液体試料は、癌、細菌感染、またはウイルス感染などの疾患または病態を有する疑いのある、ヒト対象を含む対象からのものである。特定の実施形態において、液体試料は、疾患または病態のための治療を受けている、ヒト対象を含む対象からのものである。いくつかの実施形態では、液体試料は、対象が疾患または病態のための治療を受けている間（治療が開始される前、治療中、及び／または治療が休止した後を含む）、ヒト対象を含む対象から経時的に連続して採取される。
【０１３４】
一実施形態において、液体試料の容量は、１ｍｌ未満である。別の実施形態では、液体試料の容量は、０．５ｍｌ未満である。別の実施形態では、液体試料の容量は、０．１ｍｌ未満である。別の実施形態では、液体試料の容量は、０．０５ｍｌ未満である。特定の実施形態において、液体試料の容量は、１０〜１０００マイクロリットルである。特定の実施形態において、液体試料の容量は、１０〜７５０μＬである。特定の実施形態において、液体試料の容量は、１０〜５００μＬである。特定の実施形態において、液体試料の容量は、１０〜２５０μＬである。特定の実施形態において、液体試料の容量は、１０〜１００μＬである。特定の実施形態において、液体試料の容量は、１０〜５０μＬである。試料の性質が、必要な試料容量を少なくとも部分的に決定し得る。
【０１３５】
一実施形態において、処理ステップは、試料を希釈することである。したがって、ｃｆＮＡを含有する試料は、場合により希釈されてもよい。特定の実施形態において、試料は、本明細書に記載されるさらなる反応と適合性のある溶液で希釈される。特定の実施形態において、試料は、増幅許容溶液で希釈される。「増幅許容溶液」とは、試料中の修飾ｃｆＤＮＡ分子の増幅のために使用される核酸増幅反応と適合性のある溶液であり、試料中のｃｆＮＡを分解しないものである。使用することのできる代表的な溶液は当該技術分野で知られており、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ＰＣＲ増幅緩衝液、ヌクレアーゼ不含水、及びトリス系緩衝液を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、試料は希釈されない。血漿または血清試料が使用される特定の実施形態では、試料は、増幅許容溶液などで１〜２０倍、１〜１０倍、または１〜５倍希釈される。特定の実施形態において、溶液は、ＰＢＳである。特定の実施形態において、溶液は、１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡである。特定の実施形態において、溶液は、ヌクレアーゼ不含水である。特定の実施形態において、血漿及び血清試料が希釈される。特定の実施形態において、尿試料は希釈されない。増幅許容溶液は、試料中のｃｆＮＡの分解を防止する作用物質を含有してもよい。特定の実施形態において、増幅許容溶液は、試料中のｃｆＮＡの分解を防止する作用物質を含有しない。
【０１３６】
一実施形態において、処理ステップは、試料を加熱することである。したがって、ｃｆＮＡを含有する試料は、場合により加熱されてもよい。加熱は、タンパク質の変性、ｃｆＮＡ複合体の解離、試料中のヌクレアーゼ（例えば、ＤＮアーゼ及び／またはＲＮアーゼ）の不活性化、及び試料中のｃｆＤＮＡの断片化に少なくとも部分的に役立つ。加熱ステップは様々であり得る。一実施形態において、試料は、７０℃〜１２０℃、８０℃〜１１０℃、または９０℃〜１００℃の温度で加熱される。試料は、１〜２０分間、１〜１０分間、または１〜５分間加熱されてもよい。特定の実施形態では、試料は、９５℃で４分間加熱される。
【０１３７】
一実施形態において、処理ステップは、試料中のｃｆＮＡを断片化することである。本明細書で詳解されるように、様々な源由来のｃｆＮＡは、異なる断片サイズ分布を有し得る。本明細書に記載の方法で使用されるとき、特定の実施形態において、ｃｆＮＡは、５０ｂｐ〜２，０００ｂｐの断片サイズ分布を有することが好ましい。特定の実施形態において、ｃｆＮＡは、１００ｂｐ〜１，０００ｂｐの断片サイズ分布を有する。特定の実施形態において、ｃｆＮＡは、５０ｂｐ〜６００ｂｐの断片サイズ分布を有する。特定の実施形態において、ｃｆＮＡは、５０ｂｐ〜５００ｂｐの断片サイズ分布を有する。特定の実施形態において、ｃｆＮＡは、１００ｂｐ〜５００ｂｐの断片サイズ分布を有する。特定の実施形態において、ｃｆＮＡは、１００ｂｐ〜４００ｂｐの断片サイズ分布を有する。特定の実施形態において、ｃｆＮＡは、１００ｂｐ〜３００ｂｐの断片サイズ分布を有する。特定の実施形態において、ｃｆＮＡは、１００ｂｐ〜２００ｂｐの断片サイズ分布を有する。特定の実施形態において、ｃｆＮＡは、２００ｂｐ〜３００ｂｐ、３００ｂｐ〜４００ｂｐ、４００ｂｐ〜５００ｂｐ、または５００ｂｐ〜６００ｂｐの断片サイズ分布を有する。特定の実施形態において、ｃｆＮＡの主要な部分は、１００ｂｐ〜２，０００ｂｐ、または上記に詳解した範囲のいずれかの断片サイズ分布を有する。ここで「主要な部分」とは、試料中のｃｆＮＡの少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれ以上を意味する。したがって、ｃｆＮＡを含有する試料は、場合により断片化されてもよい。特定の実施形態において、断片化ステップの後、ｃｆＮＡは、５０ｂｐ〜６００ｂｐ、１００ｂｐ〜５００ｂｐ、１００ｂｐ〜４００ｂｐ、１００ｂｐ〜３００ｂｐ、１００ｂｐ〜２００ｂｐ、２００ｂｐ〜３００ｂｐ、３００ｂｐ〜４００ｂｐ、４００ｂｐ〜５００ｂｐ、または５００ｂｐ〜６００ｂｐの断片サイズ分布を有する。断片化ステップは、当該技術分野で知られるいずれの方法を使用して達成されてもよい。上記で詳解したように、一実施形態において、断片化は、試料を加熱することによって達成され得る。ｃｆＮＡを断片化するために加熱が使用される場合、二価カチオン（例えば、マグネシウム）が試料に付加されてもよい。一実施形態において、断片化は、音波せん断（ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｓｈｅａｒｉｎｇ）、超音波処理、及び流体力学的せん断などだがこれらに限定されない物理的手段によって達成される。
【０１３８】
一実施形態において、処理ステップは、希釈及び加熱である。一実施形態において、処理ステップは、希釈及び断片化である。一実施形態において、処理ステップは、加熱及び断片化である。一実施形態において、処理ステップは、希釈、加熱、及び断片化である。
【０１３９】
特定の実施形態において、試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分が、試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分の５’末端に外因性核酸配列を付加することによって修飾ｃｆＮＡに変換されて、増幅可能なｃｆＮＡプールが創出される。特定の実施形態において、増幅可能なｃｆＮＡプールを創出するための、試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分の３’末端に外因性核酸配列を付加することによる、修飾ｃｆＮＡへの試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分。特定の実施形態において、増幅可能なｃｆＮＡプールを創出するための、試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分の５末端と３’末端との両方に外因性核酸配列を付加することによる、修飾ｃｆＮＡへの試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分。
【０１４０】
試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分に外因性核酸配列を付加するためには、外因性核酸配列に効率的に連結することのできるｃｆＮＡ（「最適化ｃｆＮＡ」と称される）を生成するようにｃｆＮＡを処置してもよい。試料中のｃｆＮＡは、特に５’末端及び／または３’末端において均一でない。したがって、特定の実施形態において、試料中のｃｆＮＡの少なくとも一部分は、外因性核酸配列（複数可）の付加前に最適化ｃｆＤＮＡに形質転換される。最適化ｃｆＮＡは、付加される外因性核酸配列（複数可）の性質に部分的に依存し得るいくつかの方法によって調製することができる。特定の実施形態において、試料中のｃｆＮＡは、試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分に外因性核酸配列を付加する前に、本明細書で詳解されるように断片化される。
【０１４１】
一実施形態において、ｃｆＮＡは、平滑末端を有するｃｆＮＡを生成するように末端修復される。このような末端修復により、あらゆる５’及び／または３’オーバーハングが、好適なポリメラーゼを使用することで充填される。ポリメラーゼが、５’−３’ポリメラーゼ活性に加えて、３’−５’エキソヌクレアーゼ／プルーフリーディング活性を有することが好ましいが、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は必要ではない。例えば、ｃｆＤＮＡ  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼのために、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片またはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが使用され得る。外因性核酸配列は、試料中のｃｆＮＡの少なくとも一部分の３’末端及び５’末端の一方または両方にライゲーションによって直接付加されてもよい。
【０１４２】
別の実施形態では、試料中のｃｆＮＡは、ｃｆＮＡの一方または両方の末端に（ポリメラーゼにより創出された単一のアデニンまたはポリ−アデノシン配列であり得る）３’オーバーハングを作製するように（例えば、ポリメラーゼを使用して）末端修復される。外因性核酸配列は、３’オーバーハングとハイブリダイズするための相補性配列を有するように設計されており、その後、試料中のｃｆＤＮＡ分子の少なくとも一部分の３’末端及び５’末端の一方または両方にライゲーションされる。
【０１４３】
別の実施形態では、ｃｆＮＡの３’末端の一方または両方が、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を使用して修飾されて、ホモポリマーテール（例えば、ポリ−アデニン配列）が創出され、これが、相補的ヌクレオチド配列（例えば、ポリ−チミン）を有する外因性核酸配列の付加を可能にする。一本鎖ニックを封止するためにＤＮＡリガーゼを使用してもよい。
【０１４４】
前述のもののいずれにおいても、５’リン酸にヌクレオチドキナーゼ活性（例えばＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ）が付加されてもよい。
【０１４５】
前述の反応を達成するために、種々の酵素混合物が使用され得る。特定の実施形態において、酵素混合物は、次の成分：
１）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性ありまたはなしの５’−３’ポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼ、及びｉｉ）リガーゼ、
２）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性ありまたはなしの５’−３’ポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼ、ｉｉ）リガーゼ、及びｉｉｉ）ポリヌクレオチドキナーゼ、
３）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性ありまたはなしの５’−３’ポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼ、ｉｉ）リガーゼ、ｉｉｉ）ポリヌクレオチドキナーゼ、及びｉｖ）複製ブロック活性化活性、
４）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性ありまたはなしの５’−３’ポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼ、ｉｉ）リガーゼ、ｉｉｉ）ポリヌクレオチドキナーゼ、ｉｖ）複製ブロック活性化活性、及びｖ）核酸ニッキング酵素活性、
５）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性ありまたはなしの５’−３’ポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼ、ｉｉ）リガーゼ、ｉｉｉ）ポリヌクレオチドキナーゼ、ｉｖ）複製ブロック活性化活性、ｖ）核酸ニッキング酵素活性、及びｖｉ）核酸結合タンパク質
を含み得る。
【０１４６】
特定の実施形態において、酵素混合物は、次の成分：
１）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性ありまたはなしの５’−３’ポリメラーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、及びｉｉ）ＤＮＡリガーゼ、
２）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性ありまたはなしの５’−３’ポリメラーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ｉｉ）ＤＮＡリガーゼ、及びｉｉｉ）ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ、
３）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性ありまたはなしの５’−３’ポリメラーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ｉｉ）ＤＮＡリガーゼ、ｉｉｉ）ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ、及びｉｖ）ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性、
４）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性ありまたはなしの５’−３’ポリメラーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ｉｉ）ＤＮＡリガーゼ、ｉｉｉ）ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ、ｉｖ）ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ核酸ニッキング酵素活性、
５）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性ありまたはなしの５’−３’ポリメラーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ｉｉ）ＤＮＡリガーゼ、ｉｉｉ）ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ、ｉｖ）ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性、ｖ）一本鎖ＤＮＡ核酸ニッキング酵素活性、及びｖｉ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質
を含み得る。
【０１４７】
特定の実施形態において、酵素混合物は、次の成分：
１）Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、及びｉｉ）Ｔ４  ＤＮＡリガーゼまたはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、及びｉｉ）Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、
２）Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、ｉｉ）Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、及びｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、
３）Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、ｉｉ）Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、及びｉｖ）Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、
４）Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、ｉｉ）Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ｉｖ）Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、及びｖ）ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ、または、
５）Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、ｉｉ）Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ｉｖ）Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、ｖ）ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ及びＮｂ．ＢｂｖＣ１
を含み得る。
【０１４８】
前述のもののいずれかは、一本鎖結合タンパク質（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ一本鎖結合タンパク質など）をさらに含んでもよい。
【０１４９】
特定の実施形態において、酵素混合物は、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ、及びＮｂ．ＢｂｖＣ１を含む。特定の実施形態において、酵素混合物は、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片及びＴ４  ＤＮＡリガーゼを含む。
【０１５０】
本明細書に開示される方法で使用することのできる様々な酵素の濃度は、様々であり得る。一実施形態において、酵素は、次の濃度範囲、すなわちＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ２〜１５Ｕ、クレノウ断片２〜２０Ｕ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ１００〜１，０００Ｕ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ５〜２０Ｕ、Ｎｂ．ＢｂｖＣ１  ５〜２０Ｕ、及びウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ１〜６Ｕで使用され、Ｅ．ｃｏｌｉ一本鎖結合タンパク質は、５０〜５００ｎｇで存在し得る。
【０１５１】
当該技術分野で知られているように、種々の緩衝液／反応溶液が本開示の方法で使用され得る。一実施形態において、反応溶液は、２０〜７５ｍＭの酢酸カリウム、１０〜１００ｍＭのトリス−アセテート（２５℃においてｐＨ７．９）、１〜３０ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１〜２０ｍＭのＤＴＴ、５〜１００μＭのｄＮＴＰ、０．５〜２ｍＭのＡＴＰ、及び１００〜４００ｕｇ／ｍＬのＢＳＡを含む。別の実施形態では、反応溶液は、２０〜７５ｍＭのＮａＣｌ、１０〜１００ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．０〜８．０）、１〜３０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１〜２０ｍＭのＤＴＴ、５〜１００μＭのｄＮＴＰ、及び０．５〜２ｍＭのＡＴＰを含む。
【０１５２】
特定の実施形態において、酵素混合物は、反応を開始し完了させるために、順次加熱プログラム（例えばサーマルサイクラーの使用によるもの）に供される。一実施形態において、順次加熱プログラムは、所定期間の２つの加熱ステップ、所定期間の３つの加熱ステップ、所定期間の４つの加熱ステップ、または所定期間の５つの加熱ステップからなる。個々の加熱ステップの期間は、独立して様々であってよく、１〜４０分間、例えば５〜３０分間、１０〜２５分間、１〜５分間、２０分間、または５分間持続してもよい。順次加熱プログラムは、試料の温度を変更することによって、酵素混合物中の特定の酵素を所定の時間に優先的に活性にさせるのに役立つ。ここで優先的に活性とは、酵素混合物中の酵素のうちの１つ以上が、酵素混合物中の少なくとも１つの他の酵素よりも高い活性を示すことを意味する。この様式において、増幅可能なｃｆＮＡプールの生成に必要とされる様々な反応を、少なくとも部分的な程度まで順序付けることができる。順次加熱プログラムは、最適なｃｆＮＡの形成を可能にする、ポリメラーゼ活性（例えばＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ及び／またはクレノウ断片）が優先的に活性である温度で始まり、次に、ｃｆＮＡへの外因性核酸配列（複数可）のライゲーションを可能にする、リガーゼが優先的に活性である温度が続く。他の加熱ステップが含まれてもよい。例えば、外因性核酸配列の切断を可能にする温度ステップが含まれてもよい。さらなる例として、酵素混合物中の酵素の全てまたは一部を不活性化する温度ステップが含まれてもよい。
【０１５３】
順次加熱プログラムの例示的な温度範囲には、１２℃〜２０℃、２０℃〜３０℃、３０℃〜４０℃、及び６０℃〜９０℃が含まれる。特定の実施形態では、順次加熱プログラムの温度範囲は、１４℃〜１８℃及び２２℃〜２６℃；１４℃〜１８℃、２２℃〜２６℃、及び７０℃〜８０℃；または１４℃〜１８℃、２２℃〜２６℃、３５℃〜３９℃、及び７０℃〜８０℃である。各温度範囲は、次の温度範囲に進行する前に所定期間にわたって維持され得る。
【０１５４】
本開示の方法で使用され得る代表的な順次加熱プログラムは、ｉ）１６℃で２０分間、ｉｉ）２４℃で２０分間、ｉｉｉ）３７℃で２０分間、ｉｖ）７５℃で５分間（不活性化）、及びｖ）４℃（保持；このステップは、即時的なＰＣＲ増幅が所望される場合は任意である）である。このプロセスの結果は、修飾ｃｆＤＮＡ分子の５’末端及び３’末端の一方または両方にプライマー部位を有する、増幅可能なｃｆＤＮＡ分子のプールである。この反応の結果が、増幅可能なｃｆＤＮＡ分子のプールである。
【０１５５】
前述の内容において、全ての酵素反応は、ｃｆＮＡ精製の必要なしに元々の試料中で行われ（ｃｆＮＡは特異的に単離または精製されない）、成分を取り除いたり、生成物もしくは基質を取り除いたり、または別様にステップ間で反応を「クリーンアップ」したりする必要なしに、単一の反応槽内で行われる。
【０１５６】
前述の内容の結果が、分析可能なｃｆＮＡ分子のプールを創出するために使用され得る増幅可能なｃｆＮＡ分子のプールの創出である。
【０１５７】
外因性核酸配列は、増幅可能なｃｆＮＡのプールの増幅に使用される、プライマーに結合することが可能なプライマー部位を含有する。「プライマーに結合することが可能な」という用語は、特異的プライマーの配列に相補的である配列を有するプライマー部位、ならびに特異的プライマーの配列と同一の配列を有するプライマー部位（この場合、プライマーに相補的な配列は、本明細書で詳解される初期複製ステップ中に生成される）を含むよう意図される。特定の実施形態において、外因性核酸配列は、特異的プライマーに相補的なプライマー部位または特異的プライマーと同一の配列を含有し、これは、初回のＤＮＡ合成の後にプライマー部位を創出する。特定の実施形態において、プライマー部位は、ユニバーサルプライマー部位である。したがって、ユニバーサルプライマー部位は、試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端との両方に付加される。３’末端に付加されたプライマー部位は、３’プライマー部位と称され、５’末端に付加されたプライマー部位は、５’プライマー部位と称される。一実施形態において、３’プライマー部位のそれぞれは、修飾された各ｃｆＮＡ分子で同一であり、５’プライマー部位のそれぞれは、修飾された各ｃｆＮＡ分子で同一であり、３’プライマー部位及び５’プライマー部位は、互いと明確に異なる（すなわち、明確に異なるプライマーに配列特異的な様式で結合することが可能である）。したがって、増幅可能なｃｆＮＡプールを増幅するために単一のプライマー対を使用し、複数のプライミング部位に合わせて増幅条件を最適化することの複雑性を排除することにより、増幅の条件を簡易化することができる。一実施形態において、３’プライマー部位及び５’プライマー部位のそれぞれは、修飾された各ｃｆＮＡ分子で同一であり、３’プライマー部位及び５’プライマー部位のそれぞれは、配列特異的な様式で同じプライマーに結合することが可能である。増幅可能なｃｆＮＡプールを増幅するために単一のプライマーを使用し、複数のプライミング部位に合わせて増幅条件を最適化することの複雑性を排除することにより、増幅の条件をさらに簡易化してもよい。特定の実施形態において、３’プライマー結合部位及び／または５’プライマー結合部位は、ヒトゲノムでは見出されない配列である。特定の実施形態において、３’プライマー部位及び／または５’プライマー部位は、実質的に同じ増幅条件下でそれぞれのプライマーが３’結合部位及び／または５’結合部位に結合するように設計される。特定の実施形態において、３’プライマー部位及び／または５’プライマー部位は、互いの１℃〜２℃以内または互いの２℃〜４℃以内である融解温度及び／またはアニーリング温度でそれぞれのプライマーが３’結合部位及び／または５’結合部位に結合するように設計される。
【０１５８】
一実施形態において、外因性核酸配列は、以下に示される配列を有し、Ｎ６−１０及びＮ３−６は、任意の核酸配列を表す。各部位のそれぞれのプライマーも提供する。
アダプター１：５’−（Ｎ６−１０）ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ（Ｎ３−６）−３’（配列番号１）
アダプター２：５’−（Ｎ６−１０）ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（Ｎ３−６）−３’（配列番号２）
５’プライマー：５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ−３’−（配列番号３）
３’プライマー：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’−（配列番号４）
【０１５９】
別の実施形態では、外因性核酸配列は、以下に示される配列を有する。各部位のそれぞれのプライマーも提供する。
アダプター：
５’−ＯＨ−ＴＧＴＧＴＴＧＧＧＴＧＴＧＧＵＵＵＵＵＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＣＣＣＴＣＡＧＣＡＣＣ
ＡＣＣＡＣＡＣＣＣＡＡＣＡＣＡ−３’（配列番号５）
プライマー：５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＣＣＣＴＣＡＧＣＡＣＣＡＣ−３’（配列番号６）
【０１６０】
別の実施形態では、外因性核酸配列は、以下に示される配列を有する。各部位のそれぞれのプライマーも提供する。
アダプター：
５’−ＴＧＴＧＴＴＧＧＧＴＧＴＧＧＵＵＵＵＵＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＣＣＣＴＣＡＧＣＡＣＣＡＣ
ＣＡＣＡＣＣＣＡＡＣＡＣＡ（Ｎ）ｎ−３’（配列番号７）（式中、Ｎは任意のヌクレオチドであり得、ｎは、０〜１０の整数である。特定の実施形態において、Ｎはアデニンであり、ｎは、１〜５であるか、またはｎは１である（例えば配列番号９）。特定の実施形態において、ｎは０である（例えば配列番号１０））
５’−ＴＧＴＧＴＴＧＧＧＴＧＴＧＧＵＵＵＵＵＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＣＣＣＴＣＡＧＣＡＣＣＡＣ
ＣＡＣＡＣＣＣＡＡＣＡＣＡＡ−３’（配列番号９）
５’−ＴＧＴＧＴＴＧＧＧＴＧＴＧＧＵＵＵＵＵＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＣＣＣＴＣＡＧＣＡＣＣＡＣ
ＣＡＣＡＣＣＣＡＡＣＡＣＡ（配列番号１０）
プライマー：５’−ＴＧＡＧＴＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＡＧＴＣＧＡＧＧＴＧ（配列番号８）
【０１６１】
特定の実施形態において、外因性核酸は、複製ブロックを含有する。本明細書で使用される場合、「複製ブロック」という用語は、ＤＮＡポリメラーゼが複製ブロックを超えて相補的な核酸鎖を創出しないようにＤＮＡポリメラーゼの作用を妨害または停止する核酸配列を指す。特定の実施形態において、複製ブロックの核酸配列は、不活性形態にあり、反応混合物の成分（例えば酵素混合物の成分）によって活性形態に変換される。上記の外因性核酸配列の特定の実施形態において、複製ブロックは、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼの作用を受けない限り複製ブロックとして不活性である、ポリ−Ｕ配列によって表される。
【０１６２】
上記に提供した配列は本質的に例示的であり、他の外因性核酸配列が提供されてもよい。本明細書に開示される方法において、外因性核酸配列は、０．１〜５μＭで使用することができ、プライマーは、５０〜１０００ｎＭで使用することができる。
【０１６３】
試料中のｃｆＮＡの少なくとも一部分の５’末端及び／または３’末端に付加される外因性核酸配列は、種々の形態で準備され得る。一実施形態において、外因性核酸配列は、ステム−ループ構造を形成し、一本鎖ループ部分を含む配列である。
【０１６４】
特定の実施形態において、試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％が、５’末端及び／または３’末端の一方または両方に外因性核酸配列を含有するように修飾される。特定の実施形態において、試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％が、５’末端と３’末端との両方に外因性核酸配列を含有するように修飾される。
【０１６５】
以下、試料中のｃｆＮＡの５’末端、３’末端、及び／または５’末端と３’末端との両方に外因性核酸配列を付加するためのいくつかの例示的な手法を記載する。特定の実施形態において、外因性核酸配列は、外因性核酸配列によってプライミングまたは開始されてもよいｃｆＮＡの初期複製によって、ｃｆＮＡの５’末端及び／または３’末端に付加される。特定の実施形態において、外因性核酸配列の少なくとも１つの鎖が、ｃｆＮＡの５’末端及び／または３’末端において、ｃｆＮＡの少なくとも１つの鎖にライゲーションされる。特定の実施形態において、外因性核酸配列の少なくとも１つの鎖が、ｃｆＮＡの５’末端及び／または３’末端において、ｃｆＮＡの少なくとも１つの鎖にライゲーションされ、外因性核酸配列の少なくとも一部分は、ｃｆＮＡによってプライミングまたは開始されてもよい初期複製によって複製される。本明細書に記載される実施形態において、試料中のｃｆＮＡのうちの１つ以上は、より大きなｃｆＮＡ断片を形成するようにひとつにライゲーションされてもよい。
【０１６６】
一実施形態において、本開示の方法は、ユニバーサル５’末端プライマー部位を保有する縮重オリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングすることによる、試料中に存在するｃｆＮＡ（例えばｃｆＤＮＡを含む）の初期複製を利用する。アニーリングされたプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長され、これが次に、プライマーのアニーリング及び伸長の別のサイクルのための新しい鋳型の機能を果たし得る。結果として、試料中のｃｆＮＡ（例えばｃｆＤＮＡを含む）は、プライマー部位を含有する（この場合、初期複製によるｃｆＮＡへの組み込みによる）外因性核酸配列の付加によって修飾され、増幅可能なｃｆＮＡ（例えばｃｆＤＮＡを含む）プールを生成する分析前の指数関数的増幅に好適である。したがって、外因性核酸配列は、外因性核酸配列が初期複製をプライミングする際、初期複製によって５’末端及び／または３’末端に付加される。一実施形態において、全ての酵素反応は、物質（核酸を含む）の移動またはｃｆＮＡの精製の必要なしに、元々の試料中で行われる（例えば、ｃｆＮＡは、特異的に単離または精製されない）。特定の実施形態において、試料中のｃｆＮＡ断片は、縮重プライマーがｃｆＮＡ配列に結合する前または後のいずれかに、より長いｃｆＮＡ断片を生成するようにライゲーションを受ける場合がある。そのような実施形態に好適な酵素混合物としては、ＤＮＡポリメラーゼＩ及びＴ４  ＤＮＡリガーゼを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる酵素混合物が挙げられるが、これに限定されない。
【０１６７】
別の実施形態では、本開示の方法は、分子クローニングの概念を適用して、試料中のｃｆＮＡ（例えばｃｆＤＮＡを含む）の少なくとも一部分に５’末端及び３’末端の一方または両方で配列特異的な外因性核酸配列を酵素的に付加し、ＰＣＲ増幅のためのプライマー部位（複数可）を作製する。一実施形態において、全ての酵素反応は、物質（核酸を含む）の移動またはｃｆＮＡの精製の必要なしに、元々の試料中かつ単一の反応槽内で行われる（例えば、ｃｆＮＡは、特異的に単離または精製されない）。
【０１６８】
分子クローニング手法の一実施形態において、外因性核酸配列は、ステム−ループ構造を形成し、一本鎖ループ部分を含む配列であり、外因性核酸配列の各鎖は、修飾ｃｆＮＡが外因性核酸配列とｃｆＮＡ配列との間で、核酸鎖にギャップ、ニック、または切断を有しないように、試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分の５’末端及び／または３’末端でｃｆＮＡの各鎖にライゲーションされる。この手法の一実施形態では、外因性核酸配列は、ｃｆＮＡに直接ライゲーションされる。ｃｆＮＡは、本明細書で詳解される平滑末端、ならびに５’末端及び／または３’末端でｃｆＮＡの各鎖に直接ライゲーションされた外因性核酸配列を有するように調製されてもよい。そのような実施形態において、外因性核酸配列のループ部分は、酵素（例えば、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼの使用などによって、切断される（または開かれる）場合がある。そのような実施形態に好適な酵素混合物としては、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、ｉｉ）Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ｉｖ）Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、及びｖ）ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（場合によりＮｂ．ＢｂｖＣ１を含有するもの）を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる酵素混合物が挙げられるが、これに限定されない。そのような実施形態に好適な好適な外因性核酸配列としては、配列番号８のプライマーを有する配列番号１０の配列が挙げられるが、これに限定されない。
【０１６９】
ｃｆＮＡは、単一のヌクレオチド（例えば単一のアデニン残基）または複数のヌクレオチド（例えばポリ−アデニンテール）などのテール配列（例えば３’オーバーハング）を有するように調製されてもよく、特定の実施形態において、テールは、ｃｆＮＡの５’末端及び／または３’末端の一方または両方に位置する。特定の実施形態において、テールは、単一のアデニンまたはポリ−アデニンテール（例えば２〜１０ヌクレオチド長）である。そのような実施形態において、外因性核酸配列のループ部分は、酵素（例えば、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼの使用などによって、切断される（または開かれる）場合がある。そのような実施形態に好適な酵素混合物としては、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、ｉｉ）Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ｉｖ）Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、及びｖ）ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（場合によりＮｂ．ＢｂｖＣ１を含有するもの）を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる酵素混合物が挙げられるが、これに限定されない。そのような実施形態に好適な好適な外因性核酸配列としては、配列番号８のプライマーと併せた配列番号７の配列（例えば、配列番号９）が挙げられるが、これに限定されない。
【０１７０】
分子クローニング手法の別の実施形態では、外因性核酸配列は、ステム−ループ構造を形成し、プライマー部位の相補体を含む一本鎖ループ部分を含む配列であり、外因性核酸配列の１つの鎖は、修飾ｃｆＮＡが、ｃｆＮＡ配列の末端３’ＯＨ残基と外因性核酸配列の５’ＯＨとの間で、ｃｆＮＡの５’末端及び／または３’末端における核酸鎖にギャップ、ニック、または切断を含有しないように、試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分の５’末端及び／または３’末端でｃｆＮＡの１つの鎖にライゲーションされる。この実施形態において、本開示の方法は、外因性核酸配列を複製し、プライマー結合部位を創出する、ｃｆＮＡの遊離３’ＯＨで開始されるニックトランスレーション機序による外因性核酸配列の初期複製を利用する。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによって５’リン酸基が付加されてもよく、これは、外因性核酸配列に元々存在した３’ＯＨをリン酸に置き換える。そのような実施形態に好適な酵素混合物としては、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、及びＮｂ．ＢｂｖＣ１（場合によりウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼを含有するもの）を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる酵素混合物が挙げられるが、これに限定されない。そのような実施形態に好適な好適な外因性核酸配列としては、配列番号６のプライマーと併せた配列番号５の配列が挙げられるが、これに限定されない。
【０１７１】
分子クローニング手法の別の実施形態では、外因性核酸配列は、ステム−ループ構造を形成し、複製ブロック及びプライマー部位の相補体を含む一本鎖ループ部分を含む配列であり、外因性核酸配列の１つの鎖は、修飾ｃｆＮＡが、ｃｆＮＡ配列の末端３’ＯＨ残基と外因性核酸配列の５’ＯＨとの間で、ｃｆＮＡの５’末端及び／または３’末端における核酸鎖にギャップ、ニック、または切断を含有しないように、試料中のｃｆＮＡ分子の少なくとも一部分の５’末端及び／または３’末端でｃｆＮＡの１つの鎖にライゲーションされる。この実施形態において、本開示の方法は、外因性核酸配列を複製ブロックまで複製する、ｃｆＮＡの遊離３’ＯＨで開始されるニックトランスレーション機序による外因性核酸配列の初期複製を利用する。ＤＮＡポリメラーゼを使用し、創出された５’オーバーハングを充填して、プライマー結合部位を創出することができる。特定の実施形態において、パリンドローム配列の一部分は、後のＰＣＲ増幅プロセス中のヘアピン構造の形成を防止するために修飾ｃｆＮＡから取り除かれた元々の外因性核酸配列のものである。そのような反応は、一本鎖ニッキング酵素（例えばＮｂＢｂｖ１）及びウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼを使用して実施され得る。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによって５’リン酸基が付加されてもよく、これは、外因性核酸配列に元々存在した３’ＯＨをリン酸に置き換える。そのような実施形態に好適な酵素混合物としては、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ、及びＮｂ．ＢｂｖＣ１を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる酵素混合物が挙げられるが、これに限定されない。そのような実施形態に好適な好適な外因性核酸配列としては、配列番号６のプライマーと併せた配列番号５の配列が挙げられるが、これに限定されない。
【０１７２】
分子クローニング手法の特定の実施形態において、パリンドローム配列の一部分は、後のＰＣＲ増幅プロセス中のヘアピン構造の形成を防止するために修飾ｃｆＮＡから取り除かれた元々の外因性核酸配列（二本鎖ステム部分を形成するもの）のものである。そのような反応は、一本鎖ニッキング酵素（例えばＮｂＢｂｖ１）及びウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼを使用して実施され得る。分子クローニング手法の特定の実施形態において、パリンドローム配列の一部分は取り除かれない。
【０１７３】
次に、増幅可能なｃｆＮＡプールを任意の既知の技法によって増幅して、下流分析のために十分な分量のｃｆＮＡを生成することができる。この増幅反応の生成物は、分析可能なｃｆＮＡのプールと称される。一実施形態において、増幅可能なｃｆＮＡプールは、３’プライマー結合部位及び／または５’プライマー結合部位に対する配列特異的プライマーを使用したＰＣＲに供される。一実施形態において、３’結合部位と５’結合部位との両方、及びそれらそれぞれのプライマーが、増幅に使用される。一実施形態において、３’プライマー結合部位または５’プライマー結合部位のうちの一方のみ、及びそれぞれのプライマーが、増幅に使用される。いかなるＰＣＲ増幅プロトコルまたは技法を使用して、増幅可能なｃｆＤＮＡプールを増幅してもよい。
【０１７４】
ＰＣＲ増幅は、分析可能なｃｆＮＡのプール中のｃｆＮＡの所望の収率をもたらすために、所望の増幅サイクル数にわたって実施することができる。特定の実施形態では、１０〜３０サイクルの増幅が実施される。特定の実施形態では、１２〜２８サイクルの増幅が実施される。特定の実施形態では、１５〜２５サイクルの増幅が実施される。特定の実施形態では、１７〜２３サイクルの増幅が実施される。特定の実施形態では、１８サイクルの増幅が実施される。特定の実施形態では、２５サイクルの増幅が実施される。
【０１７５】
ＰＣＲ増幅反応のサイクリング条件は、当該技術分野で知られている通りであり得、概して、鋳型の変性、プライマーのアニーリング、及びプライマーの伸長のためのステップを含む。最初のステップは、標的ＤＮＡを１５秒〜４分間９４℃以上に加熱することにより、標的ＤＮＡを変性させる。この変性プロセスにおいて、ＤＮＡの鎖が互いから分離し、熱安定性ポリメラーゼによる複製に必要な一本鎖ＤＮＡ鋳型が生成される。サイクルの次のステップでは、温度をおよそ４０〜６５℃に低下させる。この温度において、オリゴヌクレオチドプライマーは、変性した標的ＤＮＡと安定な会合を形成し（アニール）、ポリメラーゼのためのプライマーとして機能することができ、新しい鋳型が合成される。このステップは、概して、１〜７分間にわたり６５〜７４℃の範囲で行われる。次のサイクルは、変性のために９４℃に戻すことから始まる。ＰＣＲ増幅の特定の条件は、当該技術分野で知られているように変更され、それでも本開示の方法で有用であり得る。
【０１７６】
一実施形態において、次のＰＣＲ増幅条件：ｉ）９５℃で３分間にわたる初期変性、ｉｉ）続いて、２５サイクルの、９４℃で１５秒間にわたる変性、及び６５℃で５分間にわたるアニーリング／伸長が使用される。
【０１７７】
別の実施形態では、次のＰＣＲ増幅条件：ｉ）９５℃で３分間にわたる初期変性、ｉｉ）続いて、１８サイクルの、９４℃で１５秒間にわたる変性、及び６５℃で５分間にわたるアニーリング／伸長が使用される。
【０１７８】
この増幅反応の結果は、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールである。
【０１７９】
例示的な手順
本明細書に記載の方法を実施するための例示的な手順は、本明細書における「方法」の節及び「実施例」に提供する。
【０１８０】
分析可能なｃｆＤＮＡのプールの分析
本明細書における方法によって生成された分析可能なｃｆＤＮＡのプールは、当該技術分野で知られるいずれの方法によって分析されてもよい。さらに、いかなる量のｃｆＮＡが分析に使用されてもよい。
【０１８１】
一実施形態において、分析の方法は、次世代配列決定（ＮＧＳ）である。ＮＧＳが使用される場合、分析可能なプールからのｃｆＮＡの量は様々であり得る。特定の実施形態において、分析可能なプール中で１ｎｇ〜５０ｎｇのｃｆＮＡが、ＮＧＳ分析のために使用される。特定の実施形態において、分析可能なプール中で１ｎｇ〜１０ｎｇ、例えば１ｎｇ〜２ｎｇ、２ｎｇ〜５ｎｇ、５ｎｇ〜７ｎｇ、または７ｎｇ〜１０ｎｇのｃｆＮＡが、ＮＧＳ分析のために使用される。特定の実施形態において、分析可能なプール中で１０ｎｇ〜２５ｎｇ、例えば１３ｎｇ〜２７ｎｇ、１６ｎｇ〜２４ｎｇ、または１９ｎｇ〜２１ｎｇのｃｆＮＡが、ＮＧＳ分析のために使用される。
【０１８２】
別の実施形態では、分析の方法はＮＧＳであり、ｃｆＮＡ試料（例えば、上記で指定された量のもの）は、単一の分析可能なｃｆＮＡのプールから採取される。分析可能なｃｆＮＡのプールからのｃｆＮＡは、単一の試料採取で採取されても、複数の試料採取で採取されてもよい。
【０１８３】
別の実施形態では、分析の方法はＮＧＳであり、ｃｆＮＡ試料、例えば上記で指定された量のものは、同じ試料から調製された複数の分析可能なｃｆＮＡのプールから採取される。任意の数、例えば２〜１０個の分析可能なｃｆＮＡのプールを試料採取することができる。分析可能なｃｆＮＡのプールからのｃｆＮＡは、任意の分析可能なｃｆＮＡのプールから、単一の試料採取で採取されても、複数の試料採取で採取されてもよい。同じ試料から調製された、さらなる複数の分析可能なｃｆＮＡのプールを、試料採取の前に組み合わせてもよい。任意の数、例えば２〜１０個の分析可能なｃｆＮＡのプールを組み合わせる（すなわちプーリングする）ことができる。組み合わされた分析可能なｃｆＮＡのプールからのｃｆＮＡは、組み合わされた分析可能なｃｆＮＡのプールから、単一の試料採取で採取されても、複数の試料採取で採取されてもよい。
【０１８４】
使用の方法
本開示は、増幅可能なｃｆＮＡのプール及び分析可能なｃｆＮＡのプールを使用する方法も提供する。
【０１８５】
本開示は、試料中のｃｆＮＡ（ｃｆＤＮＡを含むがこれに限定されない）を分析する方法を提供する。本方法の特定の実施形態が、以下に提供される。
【０１８６】
一実施形態において、本開示は、無細胞核酸を分析する方法であって、ｉ）本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＮＡ分子のプール中のｃｆＮＡ分子の特性を決定するステップと、を含む、方法を提供する。
【０１８７】
この分析の方法において、ｃｆＮＡは、ｃｆＮＡであり得る。特定の実施形態において、核酸はｃｆＤＮＡである。特定の実施形態において、核酸は、二本鎖ｃｆＤＮＡである。特定の実施形態において、ｃｆＮＡは、ｃｆＲＮＡか、またはかかるｃｆＲＮＡに由来し、かつかかるｃｆＲＮＡを代表するＤＮＡである。
【０１８８】
したがって、別の実施形態において、本開示は、ｃｆＤＮＡを分析する方法であって、ｉ）本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプール中のｃｆＤＮＡ分子の特性を決定するステップと、を含む、方法を提供する。
【０１８９】
別の実施形態において、本開示は、ｃｆＲＮＡを分析する方法であって、ｉ）本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプール中のｃｆＤＮＡ分子の特性を決定するステップと、を含む、方法を提供する。特定の実施形態において、ｃｆＲＮＡは、ｃｆＲＮＡを代表するＤＮＡに変換され、分析可能なプールは、ｃｆＲＮＡを代表するＤＮＡを含む。
【０１９０】
分析可能なプールは、当該技術分野で知られるいずれの技法によって分析されてもよい。好適な技法としては、限定されないが、次世代配列決定（ＮＧＳ）、ならびに、リアルタイム定量的ＰＣＲ、ブロッカーＰＣＲ、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、クランピングＰＣＲ、ＩＣＥ−ＣＯＬＤ  ＰＣＲ、ｃａｓｔＰＣＲ、ＡＲＭＳ  ＰＣＲ、ＢＥＡＭｉｎｇなどだがこれらに限定されない、ＰＣＲベースの技術が挙げられる。本開示の方法により生成された分析可能なプールは、これら及び他の分析技法で使用するのに十分な分量及び質のｃｆＮＡをもたらす。
【０１９１】
特定の実施形態において、分析可能なプールは、分析可能なプール中の１つ以上のｃｆＮＡ（ｃｆＤＮＡを含む）の少なくとも１つの特性を決定するために分析される。決定される特性は、ｃｆＮＡの任意の特性であり得る。２つ以上の特性が同時に分析されてもよい。代表的な特性としては、限定されないが、染色体異常、単一ヌクレオチド多型、遺伝子変異（限定されないが、例えば点変異、欠失、及び挿入）、メチル化パターン、及びコピー数多型が挙げられ、加えて、この特性は、作用物質（限定されないが、例えばウイルス、細菌、または真菌）の存在であってもよい。一実施形態において、この特性は、疾患に関連する。一実施形態において、この特性は、試料の提供者が疾患を患っているかを決定するために使用される。別の実施形態では、この特性は、試料の提供者が疾患を発症するリスクがあるかを決定するために使用される。別の実施形態では、この特性は、試料の提供者における作用物質（限定されないが、例えばウイルス、細菌、または真菌）の存在を決定するために使用される。別の実施形態では、この特性は、対象のための治療または療法の過程を決定するために使用される。別の実施形態では、この特性は、治療または療法の現在の過程が効果的であるかを決定するために使用される。
【０１９２】
特定の特性についてｃｆＮＡ（例えばｃｆＤＮＡを含む）を分析する能力は、診断的な意味と、疾患を治療するための治療介入の決定との両方で有益である。本明細書で詳解されるように、本開示の方法は、ｃｆＮＡの精製を必要としない、少ない試料容量のｃｆＮＡ（例えばｃｆＤＮＡを含む）の分析を可能にする。したがって、本開示の方法の患者ケアへの適用形態は、大きく拡大する。
【０１９３】
本開示は、疾患を患っているか、もしくはそのリスクがあるものとして対象を診断する方法を提供する。
【０１９４】
一実施形態において、本方法は、ｉ）本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＮＡ分子のプール中の、疾患に関連しているｃｆＮＡ分子の特性を決定するステップと、ｉｉｉ）この特性の存在に基づいて、対象が疾患を患っている、かつ／もしくはそのリスクがあると決定するステップ、または、この特性の非存在に基づいて、対象が疾患を患っていない、かつ／もしくはそのリスクがないと決定するステップと、を含む。
【０１９５】
別の実施形態では、本方法は、ｉ）本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプール中の、疾患に関連しているｃｆＤＮＡ分子の特性を決定するステップと、ｉｉｉ）この特性の存在に基づいて、対象が疾患を患っている、かつ／もしくはそのリスクがあると決定するステップ、または、この特性の非存在に基づいて、対象が疾患を患っていない、かつ／もしくはそのリスクがないと決定するステップと、を含む。
【０１９６】
別の実施形態では、本方法は、ｉ）本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプール中の、疾患に関連しているｃｆＲＮＡ分子の特性を決定するステップと、ｉｉｉ）この特性の存在に基づいて、対象が疾患を患っている、かつ／もしくはそのリスクがあると決定するステップ、または、この特性の非存在に基づいて、対象が疾患を患っていない、かつ／もしくはそのリスクがないと決定するステップと、を含む。特定の実施形態において、ｃｆＲＮＡは、ｃｆＲＮＡを代表するＤＮＡに変換され、分析可能なプールは、ｃｆＲＮＡを代表するＤＮＡを含む。
【０１９７】
本明細書で詳解される種々の方法を使用して、ｃｆＮＡのいくつかの特性を決定することができる。上記の方法の例示的な適用形態として、対象が進行転移性結腸癌を患っていると疑われる場合、進行転移性結腸癌に関連した特性（例えば、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、及びＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のうちの１つ以上の変異）について、分析可能なプールを分析してもよい。この特性（ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、及びＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のうちの１つ以上の変異）が分析可能なプール中に存在する場合、対象が結腸癌を患っているか、またはそのリスクがあることが決定される。
【０１９８】
本開示は、疾患を患う対象のための治療介入を決定する方法を提供する。
【０１９９】
一実施形態において、本方法は、ｉ）本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＮＡ分子のプール中の、疾患に関連しているｃｆＮＡ分子の特性を決定するステップと、ｉｉｉ）決定された特性に基づいて、治療介入を決定するステップと、を含む。
【０２００】
別の実施形態では、本方法は、ｉ）本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプール中の、疾患に関連しているｃｆＤＮＡ分子の特性を決定するステップと、ｉｉｉ）決定された特性に基づいて、治療介入を決定するステップと、を含む。
【０２０１】
別の実施形態では、本方法は、ｉ）本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプール中の、疾患に関連しているｃｆＲＮＡ分子の特性を決定するステップと、ｉｉｉ）決定された特性に基づいて、治療介入を決定するステップと、を含む。特定の実施形態において、ｃｆＲＮＡは、ｃｆＲＮＡを代表するＤＮＡに変換され、分析可能なプールは、ｃｆＲＮＡを代表するＤＮＡを含む。
【０２０２】
本明細書で詳解される種々の方法を使用して、ｃｆＮＡのいくつかの特性を決定することができる。治療介入を決定する方法の例示的な適用形態として、結腸癌の例を再び考察する。詳解したように、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、及びＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のうちの１つ以上の変異は、結腸癌を示す。しかしながら、存在する特定の異常に応じて、最も有効な治療に必要とされる治療介入は異なる。決定された特性（複数可）が、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、及びＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の変異を有しない場合は、セツキシマブ及びパニツムマブなどの抗ＥＧＦＲ抗体を用いた療法（これはＮＣＣＮ及びＡＳＣＯガイドラインによる第一選択治療の選択肢である）が適切な療法と決定され得る。しかしながら、決定された特性が、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、及びＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の変異の存在である場合は、抗ＥＧＦＲ抗体を用いた療法は推奨されず、これは、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、及びＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の変異が、抗ＥＧＦＲ抗体療法への不応性を示すためである。
【０２０３】
本開示は、疾患の診断を受け、かつ疾患の治療のための治療レジメンを用いた治療を受けている対象の治療を監視するための方法も提供する。
【０２０４】
一実施形態において、本方法は、ｉ）第１〜第４の態様などの本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＮＡ分子のプール中の、疾患に関連しているｃｆＮＡ分子の特性を決定するステップと、ｉｉｉ）決定された特性が現在の治療処置レジメンと適合性があるかを決定するステップと、ｉｖ）決定された特性が、治療レジメンが禁忌であるもしくは推奨されないことを示す場合は、治療レジメンを変更するステップ、または、決定された特性が、治療レジメンが引き続き推奨されることを示す場合は、治療レジメンを継続するステップと、ｖｉ）場合により、ステップｉ）〜ｉｖ）を繰り返して、所望の時間間隔で治療介入を監視するステップと、を含む。
【０２０５】
別の実施形態では、本方法は、ｉ）第１〜第４の態様などの本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプール中の、疾患に関連しているｃｆＤＮＡ分子の特性を決定するステップと、ｉｉｉ）決定された特性が現在の治療処置レジメンと適合性があるかを決定するステップと、ｉｖ）決定された特性が、治療レジメンが禁忌であるもしくは推奨されないことを示す場合は、治療レジメンを変更するステップ、または、決定された特性が、治療レジメンが引き続き推奨されることを示す場合は、治療レジメンを継続するステップと、ｖｉ）場合により、ステップｉ）〜ｉｖ）を繰り返して、所望の時間間隔で治療介入を監視するステップと、を含む。
【０２０６】
別の実施形態では、本方法は、ｉ）第１〜第４の態様などの本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプール中の、疾患に関連しているｃｆＲＮＡ分子の特性を決定するステップと、ｉｉｉ）決定された特性が現在の治療処置レジメンと適合性があるかを決定するステップと、ｉｖ）決定された特性が、治療レジメンが禁忌であるもしくは推奨されないことを示す場合は、治療レジメンを変更するステップ、または、決定された特性が、治療レジメンが引き続き推奨されることを示す場合は、治療レジメンを継続するステップと、ｖｉ）場合により、ステップｉ）〜ｉｖ）を繰り返して、所望の時間間隔で治療介入を監視するステップと、を含む。特定の実施形態において、ｃｆＲＮＡは、ｃｆＲＮＡを代表するＤＮＡに変換され、分析可能なプールは、ｃｆＲＮＡを代表するＤＮＡを含む。
【０２０７】
本明細書で詳解される種々の方法を使用して、ｃｆＮＡのいくつかの特性を決定することができる。本開示の方法は、試料中のｃｆＮＡの特性を決定すること、特定された特性が現在の治療処置レジメンと適合性があるかを決定すること、及び決定された特性（複数可）に基づいて治療法の決断を下すこと（例えば、決定された特性が、治療レジメンが禁忌であるもしくは推奨されないことを示す場合は、治療レジメンを変更すること、または、決定された特性が、治療レジメンが引き続き推奨されることを示す場合は、治療レジメンを継続すること）による、対象の監視を提供する。結腸癌と診断され、初回スクリーニング後に抗ＥＦＧＲ抗体治療に適格であると決定された対象を考察されたい。上記で詳解したように、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、及びＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のうちの１つ以上の変異は、抗ＥＧＦＲ抗体療法が不適切であり得ることを示す。抗ＥＧＦＲ抗体治療の継続中に決定された特性が、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、及びＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のうちの１つ以上の変異である場合は、抗ＥＧＦＲ抗体を用いた治療を停止し、新しい治療レジメンを開始する決断が下され得る。
【０２０８】
別の実施形態では、この特性は、現在の癌治療に影響し得る腫瘍細胞における薬物抵抗性の発達を示す特性であり得る。薬物抵抗性の表現型が決定されれば、治療レジメンを必要に応じて修正及び変更することができる。さらに別の実施形態では、この特性は、腫瘍のクローン進化（例えば、新しい特性の出現、またはそれまでに決定された特性の消失）を示し得る。再び、治療レジメンを必要に応じて修正及び変更することができる。さらに別の実施形態では、この特性は、腫瘍転移を示すものであり得る。そのような特性が決定された場合、所望の場合はそれにしたがって治療レジメンを改変してもよいし、新しい治療レジメンを開始してもよい。
【０２０９】
本開示は、対象を監視する方法も提供する。
【０２１０】
一実施形態において、本方法は、ｉ）第１〜第４の態様などの本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＮＡ分子のプール中の、疾患に関連しているｃｆＮＡ分子の特性を決定するステップと、ｉｉｉ）決定された特性に基づいて、対象が治療を必要としているかを決定するステップと、を含む。
【０２１１】
別の実施形態では、本方法は、ｉ）第１〜第４の態様などの本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプール中の、疾患に関連しているｃｆＤＮＡ分子の特性を決定するステップと、ｉｉｉ）決定された特性に基づいて、対象が治療を必要としているかを決定するステップと、を含む。
【０２１２】
別の実施形態では、本方法は、ｉ）第１〜第４の態様などの本明細書に記載の方法のいずれかによって、分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプールを準備するステップと、ｉｉ）分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプールを分析して、分析可能なｃｆＲＮＡ分子のプール中の、疾患に関連しているｃｆＲＮＡ分子の特性を決定するステップと、ｉｉｉ）決定された特性に基づいて、対象が治療を必要としているかを決定するステップと、を含む。特定の実施形態において、ｃｆＲＮＡは、ｃｆＲＮＡを代表するＤＮＡに変換され、分析可能なプールは、ｃｆＲＮＡを代表するＤＮＡを含む。
【０２１３】
本明細書で詳解される種々の方法を使用して、ｃｆＮＡのいくつかの特性を決定することができる。例えば、結腸癌の例を再び考察されたい。対象が現在寛解期にある場合、本開示の方法を使用して対象を監視することができる。結腸癌の再発を示す特性が決定された場合、治療介入を再開することができる。治療介入は、少なくとも部分的に、決定された特性によって誘導され得る。
【０２１４】
試料中のｃｆＮＡの数量化の方法
本開示の方法は、試料中のｃｆＮＡの元々の濃度または量の決定も可能にする。試料中のｃｆＤＮＡの量を数量化するための現在の方法は、試料からｃｆＤＮＡを精製することの難しさ（これは、試料からのｃｆＤＮＡの損失をもたらす）、及び試料中のｃｆＤＮＡの低い濃度のために、極端な可変性の影響下にある。試料中のｃｆＤＮＡの濃度を数量化する堅実かつ効率的な方法が望ましく、重要な臨床適用性を有するであろう。例えば、高レベルのｃｆＤＮＡは、移植拒絶反応、受傷後の外傷後遺症（臓器不全を含む）、虚血性脳卒中におけるリスク層別化、敗血症の重症度、及び他の病態の前兆となることが示唆されている。記載されるＣＧＤ法は、線形増幅プロセスである。したがって、既知分量のＤＮＡを投入物として（ｃｆＤＮＡを含有する試料の代わりに）使用して作成した標準曲線を参照することにより、元々の試料中のｃｆＤＮＡの濃度を数量化することが可能である。例えば、ＣＧＤ法における投入物として、ＤＮＡ、好ましくは精製されたＤＮＡを使用し（例えば、０、０．００１、０．００５、０．０１、０．０２５、０．０５、０．１、０．２５、０．５、及び１ｎｇ／μＬの連続的濃度を使用し）、標準曲線を作成するために各濃度における増幅ＤＮＡの収率を決定することで、標準曲線を確立することができる。次に、試料中のｃｆＤＮＡから得られる増幅ｃｆＤＮＡの収率が決定され、標準曲線を参照することにより、試料中のｃｆＤＮＡの元々の濃度が決定される。
【０２１５】
一実施形態において、本方法は、ｉ）本明細書に記載の方法のいずれかによって、増幅可能なｃｆＮＡプールを準備するステップと、ｉｉ）増幅可能なｃｆＮＡプールを増幅して、増幅されたｃｆＮＡ分子のプールを生成するステップと、ｉｉｉ）増幅されたｃｆＮＡのプール中のｃｆＮＡの濃度を決定するステップと、ｉｖ）決定されたｃｆＮＡの濃度を標準曲線と比較して、試料中のｃｆＮＡの濃度を決定するステップと、を含む。
【０２１６】
特定の実施形態において、標準曲線は、増幅されたｃｆＮＡのプールを調製するために使用されるものと同じ方法を使用して作成される。特定の実施形態において、標準曲線は、精製されたＤＮＡを使用して作成される。特定の実施形態において、標準曲線は、増幅されたｃｆＮＡのプールと同時に作成される。
【０２１７】
キット
本開示は、記載される方法に必要な試薬及び／または反応溶液のうちの１つ以上を含むキットも提供する。一実施形態において、本開示は、本開示の方法を実施するために必要な成分及び試薬の少なくとも一部分を含むキットを提供する。
【０２１８】
一実施形態において、本キットは、反応が実施される好適な容器または反応槽内に収容されていてもよく、少なくとも１つの外因性核酸配列（すなわち、アダプター）と、ｃｆＮＡに外因性核酸配列をライゲーションするのに好適な反応溶液と、場合により、増幅可能なｃｆＮＡのプールを生成するために反応溶液と共に使用するのに好適な酵素混合物と、を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。
【０２１９】
別の実施形態では、本キットは、反応が実施される好適な容器または反応槽内に収容されていてもよく、ｃｆＮＡに外因性核酸配列をライゲーションするのに好適な反応溶液と、増幅可能なｃｆＮＡのプールを生成するために反応溶液と共に使用するのに好適な酵素混合物と、場合により、少なくとも１つの外因性核酸配列（すなわち、アダプター）と、を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。
【０２２０】
別の実施形態では、本キットは、反応が実施される好適な容器または反応槽内に収容されていてもよく、ｃｆＮＡに外因性核酸配列をライゲーションするのに好適な反応溶液と、増幅可能なｃｆＮＡのプールを生成するために反応溶液と共に使用するのに好適な酵素混合物と、少なくとも１つの外因性核酸配列（すなわち、アダプター）と、を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。
【０２２１】
上記のキットのいずれかは、増幅可能なｃｆＮＡプールの増幅に好適な第２の反応溶液、外因性核酸配列と共に使用するための少なくとも１つのプライマー、増幅可能なｃｆＮＡプールの増幅のための第２の反応溶液と共に使用して分析可能なｃｆＮＡのプールを生成するための第２の酵素混合物、及び本方法の実施に関する指示書のうちの１つ以上をさらに含んでもよい。特定の実施形態において、上記のキットのいずれかは、列挙されたさらなる構成要素の全てを含む。
【０２２２】
一実施形態において、本キットは、−２０℃で保管されてもよい。別の実施形態では、本キットは、４℃で保管されてもよい。保管の長さは、特に−２０℃で保管されるとき、数日から数か月、数年まで及び得る。
【０２２３】
一実施形態において、本キットは、９６ウェルプレートなどのマルチウェルプレート形式で提供される。
【０２２４】
特定の実施形態において、増幅可能なｃｆＮＡのプールを生成するために反応溶液と共に使用するのに好適な酵素混合物は、次の活性：
１）５’−３’ポリメラーゼ活性及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、ならびにｉｉ）リガーゼ、
２）５’−３’ポリメラーゼ活性及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、ｉｉ）リガーゼ、ならびにｉｉｉ）ポリヌクレオチドキナーゼ、
３）５’−３’ポリメラーゼ活性及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、ｉｉ）リガーゼ、ｉｉｉ）ポリヌクレオチドキナーゼ、ならびにｉｖ）ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性、
４）５’−３’ポリメラーゼ活性及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、ｉｉ）リガーゼ、ｉｉｉ）ポリヌクレオチドキナーゼ、ｉｖ）ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性、ならびにｖ）核酸ニッキング酵素活性、
５）５’−３’ポリメラーゼ活性及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、ｉｉ）リガーゼ、ｉｉｉ）ポリヌクレオチドキナーゼ、ｉｖ）ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性、ｖ）核酸ニッキング酵素活性、ならびにｖｉ）核酸結合タンパク質
を含み得る。
【０２２５】
特定の実施形態において、増幅可能なｃｆＮＡのプールを生成するために反応溶液と共に使用するのに好適な酵素混合物は、次の成分：
１）５’−３’ポリメラーゼ活性及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ならびにｉｉ）ＤＮＡリガーゼ、
２）５’−３’ポリメラーゼ活性及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ｉｉ）リガーゼ、ならびにｉｉｉ）ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ、
３）５’−３’ポリメラーゼ活性及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ｉｉ）ＤＮＡリガーゼ、ｉｉｉ）ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ、ならびにｉｖ）ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性、
４）５’−３’ポリメラーゼ活性及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ｉｉ）ＤＮＡリガーゼ、ｉｉｉ）ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ、ｉｖ）ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性、ならびにｖ）一本鎖ＤＮＡ核酸ニッキング酵素活性、
５）５’−３’ポリメラーゼ活性及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ｉｉ）ＤＮＡリガーゼ、ｉｉｉ）ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ、ｉｖ）ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性、ｖ）一本鎖ＤＮＡ核酸ニッキング酵素活性、ならびにｖｉ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質
を含み得る。
【０２２６】
特定の実施形態において、増幅可能なｃｆＮＡのプールを生成するために反応溶液と共に使用するのに好適な酵素混合物は、次の成分：
１）Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、及びｉｉ）Ｔ４  ＤＮＡリガーゼまたはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、及びｉｉ）Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、
２）Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、ｉｉ）Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、及びｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片
３）Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、ｉｉ）Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、及びｉｖ）Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、
４）Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、ｉｉ）Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ｉｖ）Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、及びｖ）ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ、または、
５）Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、ｉｉ）Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ｉｖ）Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、ｖ）ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ及びＮｂ．ＢｂｖＣ１
を含み得る。
【０２２７】
前述のもののいずれかは、一本鎖結合タンパク質（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ一本鎖結合タンパク質など）をさらに含んでもよい。
【０２２８】
特定の実施形態において、増幅可能なｃｆＮＡのプールを生成するために反応溶液と共に使用するのに好適な酵素混合物は、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ、及びＮｂ．ＢｂｖＣ１を含む。特定の実施形態において、増幅可能なｃｆＮＡのプールを生成するために反応溶液と共に使用するのに好適な酵素混合物は、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片及びＴ４  ＤＮＡリガーゼを含む。
【０２２９】
本明細書に開示される方法で使用することのできる様々な酵素の濃度は、様々であり得る。一実施形態において、酵素は、次の濃度範囲、すなわちＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ２〜１５Ｕ、クレノウ断片２〜２０Ｕ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ１００〜１，０００Ｕ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ５〜２０Ｕ、Ｎｂ．ＢｂｖＣ１  ５〜２０Ｕ、及びウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ１〜６Ｕで使用され、Ｅ．ｃｏｌｉ一本鎖結合タンパク質は、５０〜５００ｎｇで存在し得る。
【０２３０】
特定の実施形態において、増幅可能なｃｆＮＡのプールを生成するために反応溶液と共に使用するのに好適な酵素混合物は、本明細書の実施例１２に記載される酵素混合物を含む。
【０２３１】
当該技術分野で知られているように、種々の緩衝液／反応溶液が本開示の方法で使用され得る。特定の実施形態において、反応溶液は、２０〜７５ｍＭの酢酸カリウム、１０〜１００ｍＭのトリス−アセテート（２５℃においてｐＨ７．９）、１〜３０ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１〜２０ｍＭのＤＴＴ、５〜１００μＭのｄＮＴＰ、０．５〜２ｍＭのＡＴＰ、及び１００〜４００ｕｇ／ｍＬのＢＳＡを含む。特定の実施形態において、反応溶液は、２０〜７５ｍＭのＮａＣｌ、１０〜１００ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．０〜８．０）、１〜３０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１〜２０ｍＭのＤＴＴ、５〜１００μＭのｄＮＴＰ、及び０．５〜２ｍＭのＡＴＰを含む。
【０２３２】
特定の実施形態において、酵素混合物と共に使用するための反応溶液は、本明細書の実施例１３に記載されるものである。
【０２３３】
方法
血漿ｃｆＤＮＡの調製
ＥＤＴＡを含む試験管（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に血液を採取し、２５００ｒｐｍで２０分間にわたり遠心処理した。残ったデブリ（例えば保管されていた試料中のもの）を取り除くために必要であれば、さらなる遠心処理（１０，０００ｒｐｍで１０分間）を用いてもよい。バフィーコートを慎重に避けながら、血漿をクライオバイアルに移し、さらなる分析まで−８０℃で保管した。２０μＬ及び２００μＬの血漿試料から、それぞれ、本明細書に記載のｃｆＤＮＡ濃縮及び回収技術（ＣＧＤ法と称される）ならびにＱＩＡａｍｐ循環核酸キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ、製造元の指示に従って使用）を使用して、ｃｆＤＮＡを調製した。
【０２３４】
尿からのｃｆＤＮＡの調製
別段の規定がない限り、循環ｃｆＤＮＡは、ＣＧＤ法を使用して、未処理、未希釈の尿試料１０〜２０μＬから直接調製した。
【０２３５】
ｃｆＤＮＡのＩＳＡ
本明細書に記載の実施例では、いくつかの変化形を使用して、ＣＧＤ法をｃｆＤＮＡのＩＳＡのために行った。特定の実施例は、最適化を目的とした様々なプロトコルの比較を提供し、ＣＧＤ法が行われる方法は、そのような各実施例で提供される。
【０２３６】
以下の説明は、記載されるＣＧＤ法の一般的適用を限定することを意図するものではなく、本明細書に記載の方法を実施するための例示的なプロトコルとして提供されるものである。記載される方法は、例えばＰＣＲ試験管または多層ストリップ／プレートなどの、好適な容器または反応槽内で行われる。
【０２３７】
プロトコルＡ
１．  試料（例えば、２０μＬの血漿、血清、尿、唾液、またはＣＳＦ）に、１倍ＰＢＳ（２０μＬの試料容量に対して８０μＬ）で希釈した試料を添加し、場合により試料を混合した。
２．  ステップ１の試料１０μＬに、１μＬの１０倍ＴＥ緩衝液を添加し、試料を９５℃で４分間加熱した。
４．  この試料を氷上で直ちに冷却し、試料を手短に遠心処理して内容物を固めた。
５．  ２μＬのマスターミックス（反応物中の最終濃度：ｄＮＴＰ  ４０μＭ、アダプター分子；すなわち外因性核酸配列  各２μＭ）、及び２μＬのユニバーサル緩衝液（反応物中の最終濃度：ＮａＣｌ  ５０ｍＭ、トリス−Ｃｌ（ｐＨ７．０〜８．０）２５ｍＭ、Ｍｇ２Ｃｌ  １０ｍＭ、ＤＴＴ  ２．５ｍＭ、及びＡＴＰ  １ｍＭ）を、各試料に添加した。
５’−（Ｎ６−１０）ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ（Ｎ３−６）−３’（配列番号１）
５’−（Ｎ６−１０）ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（Ｎ３−６）−３’（配列番号２）
６．  試料を十分にボルテックスし、手短に遠心処理し、９５℃で２分間加熱した。
７．  これらの試料を氷上で冷却し、遠心処理によって固め、氷上に戻した。
８．  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ（クレノウ断片）及びＴ４  ＤＮＡリガーゼを含む１μＬの酵素混合物を各試料に添加し（最終濃度：ポリメラーゼ５Ｕ及びリガーゼ１００Ｕ）、試料を十分にボルテックスし、手短に遠心処理した。
９．  試料をサーマルサイクラーに入れ、次のようにインキュベートした。
１６℃で２０分間
２４℃で２０分間
３７℃で２０分間
７５℃で５分間
４℃で保持
１０．  サーマルサイクラーから取り除いた後、試料を手短に遠心処理した。これらの試料は、−２０℃で（最長３日間にわたり）保管し、以下に記載のようにさらに処理したか、あるいは、直ちに以下に記載のように処理した。
１１．  アダプター核酸を含有する修飾ｃｆＮＡの増幅のため、ステップ１０の各試料に次の試薬を添加した。
７．５μＬの１０倍マスターミックス（反応物中の最終濃度：ｄＮＴＰ  ４０μＭ、ならびに配列番号３及び４の配列を有するプライマー５００ｎＭ）、
４７．５μＬの水（分子生物学グレード）、及び、
５μＬの高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ
５’プライマー  ５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ−３’（配列番号３）
３’プライマー：  ５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’（配列番号４）
１３．  各試料を十分にボルテックスし、手短に遠心処理し、サーマルサイクラーに入れ、次のようにインキュベートした。
９５℃で３分間の初期変性
次のように２５サイクルを行う：
９４℃で１５秒間の変性
６５℃で５分間のアニーリング／伸長
サイクリングが完了した後、試料を４℃に維持し、増幅したｃｆＮＡを本明細書に記載の分析に供したか、または本明細書に記載の分析に供するまで−２０℃で保管した。
【０２３８】
プロトコルＢ
１．  ２０μＬの試料（例えば、血漿、血清、尿、またはＣＳＦ）に、８０μＬの１倍ＰＢＳを添加し、場合により試料を混合した。
２．  ステップ１の試料１０μＬに、１μＬの１０倍ＴＥ緩衝液（１００ｍＭのトリス０ＨＣＬ（ｐＨ８．０）及び１０ｍＭのＥＤＴＡ）を添加し、試料を９５℃で４分間加熱した。
４．  この試料を氷上で直ちに冷却し、試料を手短に遠心処理して内容物を固めた。
５．  ２μＬのＣＧ１緩衝液（最終濃度：配列番号５のアダプター分子（ヌクレアーゼ不含水中）；すなわち外因性核酸配列２μＭ）、及び１μＬのＣＧ２緩衝液（最終濃度：酢酸カリウム５０ｍＭ、トリス−アセテート（ｐＨ７．９）２０ｍＭ、酢酸マグネシウム１０ｍＭ、ＤＴＴ  １ｍＭ、ＡＴＰ  １ｍＭ、ｄＮＴＰ  ４０μＭ、及びＢＳＡ  ２００μｇ／ｍｌ）を、各試料に添加した。
５’−ＯＨＴＧＴＧＴＴＧＧＧＴＧＴＧＧＵＵＵＵＵＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＣＣＣＴＣＡＧＣＡＣＣ  ＡＣＣＡＣＡＣＣＣＡＡＣＡＣＡ−３’（配列番号５）
６．  試料を十分にボルテックスし、手短に遠心処理し、９５℃で２分間加熱した。
７．  これらの試料を氷上で冷却し、遠心処理によって固め、氷上に戻した。
８．  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、Ｎｂ．ＢｂｖＣ１、及びＥ．ｃｏｌｉ一本鎖結合タンパク質を含む酵素混合物１μＬを、各試料に添加し（最終濃度：Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ５Ｕ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ８００Ｕ、クレノウ断片１２．５Ｕ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１２．５Ｕ、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ３．７５Ｕ、及び一本鎖結合タンパク質１２０ｎｇ）、試料を十分にボルテックスし、手短に遠心処理した。
９．  試料をサーマルサイクラーに入れ、次のようにインキュベートした。
１６℃で２０分間
２４℃で２０分間
３７℃で２０分間
７５℃で５分間
４℃で保持
１０．  サーマルサイクラーから取り除いた後、試料を手短に遠心処理した。これらの試料は、−２０℃で（最長３日間にわたり）保管し、以下に記載のようにさらに処理したか、あるいは、直ちに以下に記載のように処理した。
１１．  アダプター核酸を含有する修飾ｃｆＮＡの増幅のため、ステップ１０の各試料に次の試薬を添加した。
７．５μＬの１０倍マスターミックス（ｄＮＴＰ  ４０μＭ、及び配列番号６の配列を有するプライマー５００ｎＭ）、
４７．５μＬの水（分子生物学グレード）、及び、
５μＬの高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ
５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＣＣＣＴＣＡＧＣＡＣＣＡＣ−３’（配列番号６）
１３．  各試料を十分にボルテックスし、手短に遠心処理し、サーマルサイクラーに入れ、次のようにインキュベートした。
９５℃で３分間の初期変性
次のように２５サイクルを行う：
９４℃で１５秒間の変性
６５℃で５分間のアニーリング／伸長
サイクリングが完了した後、試料を４℃に維持し、増幅したｃｆＮＡを本明細書に記載の分析に供したか、または本明細書に記載の分析に供するまで−２０℃で保管した。
【０２３９】
ｃｆＲＮＡのＩＳＡ
以下の説明は、ｃｆＲＮＡにＩＳＡを行う例示的な方法である。この説明は、記載されるＣＧＤ法の一般的適用を限定することを意図するものではなく、本明細書に記載の方法を実施するための例示的なプロトコルとして提供されるものである。記載される方法は、例えばＰＣＲ試験管または多層ストリップ／プレートなどの、好適な容器または反応槽内で行われる。
１．  １０μＬの希釈した血漿（１：５）を９５℃で２分間加熱して、内因性ヌクレアーゼを不活性化させ、ＤＮＡ複合体を解離させ、ｃｆＤＮＡを断片化／変性する。
２．  １μＬのＤＮアーゼＩ反応緩衝液（最終濃度：トリス−ＨＣｌ  １０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２．５ｍＭ  、ＣａＣｌ２  ０．５ｍＭ（ｐＨ７．６））及び２ユニットのＤＮアーゼＩを添加し、十分に混合し、３７℃で３０分間インキュベートする。
３．  １μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを（５ｍＭの最終濃度になるまで）添加する。
４．  ８５℃で１５分間にわたり熱で不活性化させる。
５．  逆転写及びｃＤＮＡ合成を行う（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡのＰｒｏｔｏｓｃｒｉｐｔ  ＩＩキットを使用する）。上記のＤＮアーゼＩで処置した試料１１μＬに、５倍の第１鎖合成反応緩衝液３μＬ、及びランダムプライマー１μＬを添加し、この試料を９４℃で１５分間インキュベートし、試験管を氷に移し、０．５μＬのマウスＲＮアーゼ阻害薬（２０Ｕ）及び１μＬの逆転写酵素ならびに水を添加して、最終容量を２０μＬにし、この試料を予熱済みサーマルサイクラーで次のようにインキュベートする：２５℃で１０分間、４２℃で１５分間、７０℃で１５分間、及び４℃で保持。
６．  第２鎖合成を行う（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡのＮＥＢＮｅｘｔ第２鎖合成モジュールを使用する）。反応物（２０μｌ）に、次の試薬：ヌクレアーゼ不含水４８μｌ、合成反応緩衝液８μｌ、合成酵素ミックス４μｌを添加し（全容量８０μｌ）、十分に混合し、加熱蓋を≦４０℃に設定したサーマルサイクラーにおいて１６℃で１時間インキュベートする。
７．  Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を使用して、二本鎖ｃＤＮＡを精製する。
８．  ｃｆＤＮＡのＩＳＡプロトコル（例えば、プロトコルＡまたはプロトコルＢ）のステップ５に進む。
【０２４０】
リアルタイムＰＣＲ
ｃｆＤＮＡの増幅能（Ａｍｐｌｉｆｉａｂｉｌｉｔｙ）は、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡ、及びＮＲＡＳ遺伝子（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に特異的に設計したプライマーを用い、ＴａｑＭａｎリアルタイム定量的ＰＣＲを使用して、各試料につき二連で実施した。増幅プロット及びＣｔ値は、内蔵ソフトウェア（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  １２Ｋ機器、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって作成した。ＰＣＲ反応の正確度を制御するために、各ランで適切なブランク及び陽性対照を含めた。
【０２４１】
血漿ｃｆＮＡの数量化
Ｑｕｂｉｔ  ２．０蛍光光度計をｄｓＤＮＡ  ＢＲ及びＨＳアッセイキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と一緒に使用し、ｃｆＮＡの数量化を行った。分析は、製造元の指示に従って行った。
【０２４２】
Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＮＧＳによる高深度標的化配列決定（Ｄｅｅｐ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）及びデータ分析
手短に述べると、Ｉｏｎ  ＡｍｐｌｉＳｅｑ  Ｌｉｂｒａｒｙキット２．０及びＣａｎｃｅｒ  Ｈｏｔｓｐｏｔ  Ｐａｎｅｌ  ｖ２を製造元（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の指示に従って使用し、標的化配列決定ライブラリを作製した。この試験パネルは、次の５０個の主要な癌遺伝子：ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＡＴＭ、ＢＲＡＦ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＮＡ１１、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＰＭ１、ＮＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＰＴＰＮ１１、ＲＢ１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、ＴＰ５３、及びＶＨＬにおける２，８５５個の変異を標的化するように設計されている。変異の全リストは、（ｈｔｔｐ：／／ｐａｔｈ．ｕｐｍｃ．ｅｄｕ／ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ／ｍａｐ／）で確認することができる。変異の詳細は、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ（ＣＯＳＭＩＣ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｃｏｓｍｉｃ／）から対応するＣＯＳＭＩＣ  ＩＤを用いて得ることができる。このパネルの遺伝子の参照として使用されるＤＮＡ配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｆｓｅｑ／ｒｓｇ／で確認することができる。変異の命名法は、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｖｓ．ｏｒｇ／ｍｕｔｎｏｍｅｎ／）の推奨する慣例に基づく。
【０２４３】
出発物質は、ＣＧＤ法の使用または他の方法（例えば、ＱＩＡａｍｐキット）によって調製された１〜２０ｎｇのｃｆＤＮＡからなった。各試料を５０個の遺伝子パネル全体について分析し、合計およそ２，８００個の変異を精査した。次に、ライブラリ増幅に使用したプライマーをＰｆｕ酵素によって部分的に消化し、続いて、対応するバーコード付きアダプターとのライゲーションを行い、Ａｍｐｕｒｅビーズを使用して精製した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ６リアルタイムＰＣＲ機器を使用してライブラリの質を評価した。配列決定鋳型をクローン増幅するエマルジョンＰＣＲのため、Ｉｏｎ  Ｃｈｅｆシステムで２０ピコモルの各ライブラリを分析した。分析した試料数に基づいて、チップ３１４、３１６、または３１８を使用した。１０００〜４０００倍のカバレッジ範囲を用い、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭで高深度配列決定を行った。Ｖａｒｉａｎｔ  Ｃａｌｌｅｒ  ４．０ソフトウェアにより、体細胞の高ストリンジェンシーパラメータならびに標的化及びホットスポットパイプラインを使用して、配列決定データを分析した。ＧｅｎｅＰｏｏｌ（Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｘ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）によってデータを分析することにより、特定された全てのバリアントをさらに確定した。
【実施例】
【０２４４】
実施例１−ｃｆＤＮＡ回収
ＣＧＤ法の優れた特性を実証するため、ＣＧＤ法を使用し、市販のｃｆＤＮＡ精製キット（ＱＩＡａｍｐ循環核酸キット、Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてｃｆＤＮＡを調製した。記載したように、プロトコルＡを使用し、血漿試料（２０μＬ）及び尿試料（１０μＬ）からｃｆＤＮＡを調製した。増幅可能なｃｆＤＮＡプールを、プロトコルＡに記載のＰＣＲ増幅に供した。ＱＩＡａｍｐキット（製造元の指示に従って使用）を使用し、ｃｆＤＮＡを血漿試料（２００μＬ）から調製した。１７人の癌患者の血漿試料からｃｆＤＮＡを調製した。尿試料は健常な対象のものであった。蛍光Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＢＲまたはＨＳアッセイ、ならびにＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡ、及びＮＲＡＳ遺伝子のＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲ分析により、ｃｆＤＮＡを数量化した（血漿試料のみ）。さらに、ＮＧＳ分析を適用して、血漿試料セットにおける変異を検出した（血漿試料のみ）。
【０２４５】
表１に示されるように、ＣＧＤ法は、Ｑｕｂｉｔ測定により決定した場合に、ＱＩＡａｍｐキットよりも有意に多いｃｆＤＮＡをもたらした。ＣＧＤ法を使用して観察されたｃｆＤＮＡの平均濃度は、ＱＩＡａｍｐキットを使用した０．４２ｎｇ／μＬと比較して、９２．５ｎｇ／μＬであった（ｎ＝１７、Ｐ＜０．０００１）。この回収の向上は、投入試料容量を考慮するとより顕著である。ＱＩＡａｍｐキットでの２００μＬの血漿試料と比較して、ＣＧＤ法では２０μＬの血漿試料を使用した。それでもＣＧＤ法は、低下した試料容量にもかかわらずはるかに優れた結果をもたらした。
【０２４６】
ＣＧＤ法を使用し、尿試料からもｃｆＤＮＡを回収し、Ｑｕｂｉｔ測定によって定量化した。ＣＧＤ法を使用して得られたｃｆＤＮＡの平均濃度は、４０．９ｎｇ／μＬ（Ｎ＝６）であった（４．５２ｎｇ／ｍｌ〜８０．４ｎｇ／ｍｌ．）。血漿試料については、ＣＧＤ法は、尿試料からのｃｆＤＮＡの効果的な調製を示した。この結果を表１に示す。
【表２】
2018530347.tif 000004
【０２４７】
ＣＧＤ法で得られるより高いｃｆＤＮＡの産出量は、アガロースゲル電気泳動によっても明らかになった。ＣＧＤ法により血漿及び尿試料から調製された、選択されたｃｆＤＮＡ試料をアガロースゲル電気泳動（２％）に供し、臭化エチジウムを使用して可視化した。ＣＧＤ法により調製された血漿（図１Ｂ）及び尿（図１Ｃ）から得たｃｆＤＮＡは、強いＤＮＡ強度を示した。
【０２４８】
図１Ｂにおいて、分析した試料は、７つの凍結した血漿試料及び３つの新鮮な血漿試料から抽出したｃｆＤＮＡを含んでいた。レーン１〜４は、癌と診断された対象または癌を有する疑いのある対象からの臨床血漿試料であり、レーン５は、健常な対象からの新鮮な血漿に試料４の血漿を加えたものであった。レーン６〜８は、健常な対象からの凍結した血漿試料であり、レーン９〜１０は、健常な対象からの新鮮な血漿試料であった。ＣＧＤ法を使用して調製された血漿ｃｆＤＮＡの分画は、１００〜５００ｂｐの一貫したサイズ分布を明らかにし、強力な染色を示した。
【０２４９】
図１Ｃでは、１０μＬの尿から回収したｃｆＤＮＡをアガロースゲル電気泳動（２％）に供し、臭化エチジウムを使用して可視化した。分析した試料は、６体の健常な個体からの尿試料（レーン１〜６）と、陽性対照としての血漿試料（レーン７）であった。血漿試料について見られたように、ＣＧＤ法を使用して尿試料から得たｃｆＤＮＡの分画は、ＣＧＤ法により１００〜５００ｂｐの一貫したサイズ分布を明らかにし、強力な染色を示した。
【０２５０】
上記の結果は、ＣＧＤ法が、種々の試料タイプから高分量で優秀なｃｆＤＮＡ調製物をもたらすことを実証する。さらに、ＣＧＤ法は、試験した先行技術の方法よりも優れていた。
【０２５１】
実施例２−ｃｆＤＮＡの増幅能
ＣＧＤ法及びＱＩＡａｍｐキットを使用して実施例１に記載のように血漿試料から調製したｃｆＤＮＡの増幅能を、ＴａｑＭａｎ定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により４つの癌原遺伝子（ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡ、及びＮＲＡＳ）で調べて、生成された分析可能なｃｆＤＮＡのプールの質を評価した。実施例１に記載のように血漿試料を調製し、ｑＰＣＲ分析に供した。
【０２５２】
ｑＰＣＲ技法は、増幅の進行の連続的監視を伴い、標的の数量化を可能にする。予想通り、ＣＧＤ法及びＱＩＡａｍｐキットを使用して調製されたｃｆＤＮＡからのＫＲＡＳの増幅プロットは、ＣＧＤ法及びＱＩＡａｍｐキットを使用して調製されたｃｆＤＮＡについて、それぞれ１７〜２４及び２８〜３３の範囲の閾値サイクル（Ｃｔ）値を示した（図２）。全試料においてＫＲＡＳが増幅され、血漿試料中の十分なｃｆＤＮＡの存在が示された。しかしながら、Ｃｔ値の比較は、ＣＧＤ法がＱＩＡａｍｐキットよりも少なくとも１００倍多くの分析可能なｃｆＤＮＡをもたらしたことを示す（ΔＣｔ＞７）。
【０２５３】
次に、３つの他の遺伝子、すなわちＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡ、及びＮＲＡＳで行った測定に同様の差が存在したかどうかを決定した。実施例１に記載のように血漿試料を調製した。図３Ａ〜３Ｃにはそれぞれ、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡ、及びＮＲＡＳについての結果が示されている。ＣＧＤ法を使用して調製されたｃｆＤＮＡからの増幅プロットは、ＱＩＡａｍｐキットを使用して調製されたｃｆＤＮＡと比較すると低いＣｔ値を示した。この差は、３つ全ての遺伝子間で観察された。ΔＣｔの大きさは、ＫＲＡＳのそれと一致している。
【０２５４】
これらの実験の主要な特性の概要を表２に示す。
【表３】
2018530347.tif 000005
【０２５５】
上記の結果は、ＣＧＤ法が、さらなる分析に好適な質の高い分析可能なｃｆＤＮＡのプールをもたらすことを実証する。さらに、ＣＧＤ法は、試験した先行技術の方法よりも優れていた。
【０２５６】
実施例３−次世代配列決定
次世代配列決定（ＮＧＳ）分析を使用して、ＣＧＤ法及びＱＩＡａｍｐキットから調製されたｃｆＤＮＡのさらなる評価を行った。実施例１に記載のようにｃｆＤＮＡを調製した。ＮＧＳ分析は、上述のように行った。
【０２５７】
ＣＧＤ法を使用し、またＱＩＡａｍｐキットを使用して調製された、１〜１０ｎｇのｃｆＤＮＡを、５０個の遺伝子パネル全体について分析し、合計およそ２，８００個の変異を精査した（Ｃａｎｃｅｒ  Ｈｏｔｓｐｏｔ  Ｐａｎｅｌ  ｖ２，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。この結果を表３に示す。
【表４】
2018530347.tif 000006
2018530347.tif 000007
【０２５８】
試験した１７個の試料のうち、ＱＩＡａｍｐキットにより調製されたｃｆＤＮＡを使用した８個の試料（８／１７、４７．１％）は、結果を得るにはＱＮＳ（分量不足）であり、先の実施例１のＱｕｂｉｔ及びリアルタイムＰＣＲの結果と一致した。ＣＧＤ法により調製されたｃｆＤＮＡを使用した試料は全て分析可能であった（１７／１７、１００％）。ＮＧＳ分析は、ＣＧＤ法及びＱＩＡａｍｐキットで調製されたｃｆＤＮＡを使用した、野生型（変異なし）と決定された４つの一致ケース（試料４、１０、１３、及び１５）を示した。ＮＧＳ分析は、ＣＧＤ法及びＱＩＡａｍｐキットで調製されたｃｆＤＮＡを使用した５つの不一致ケースも明らかにした。４つのケースにおいて、ＱＩＡａｍｐキットを使用して調製されたｃｆＤＮＡは、変異を明らかにしなかったが、ＣＧＤ法により調製されたｃｆＤＮＡを使用した同じ試料（試料５、７、９、及び１２）では、少なくとも１つの変異が検出された。１つのケースにおいて、ＱＩＡａｍｐキットを使用して調製されたｃｆＤＮＡは、単一の変異を明らかにし（低いカバレッジ、４６３倍）、一方で、同じ試料からＣＧＤ法により調製されたｃｆＤＮＡは、野生型の結果をもたらした（試料１４）。
【０２５９】
サイレント変異及び未確定の体細胞変異を除去した後、１７体中１１体の対象（６４．７％）が、ＣＧＤ法により調製されたｃｆＤＮＡを使用した場合にＮＧＳ分析により検出された少なくとも１つの変異を有した。これらの試料の読み深度は、１００６倍〜３５４２倍の範囲であった。対照的に、ＱＩＡａｍｐキットを使用して調製されたｃｆＤＮＡを使用したＮＧＳ分析は、１／１７のみの対象（５．９％）における変異を明らかにした。ＣＧＤ法により調製されたｃｆＤＮＡを使用したＮＧＳ分析により、ＱＩＡａｍｐキットを使用して調製されたｃｆＤＮＡを使用したＮＧＳ分析では検出されなかった１１個の試料中２３個の変異の定量が可能になった。特定された全ての変異は、置換であった。まとめると、ＮＧＳ結果は、ＣＧＤ法により抽出されたｃｆＤＮＡが、先行技術の方法と比較して優れた分析用出発物質をもたらしたことを実証した。さらに、比較すると、ＱＩＡａｍｐキットは、ｃｆＤＮＡ調製ステップにおける損失に起因する高いＱＮＳ及び偽陰性率を示した。
【０２６０】
さらなる実験において、試料可変性及びバイオマーカー検出不良の可能性に関する問題点に対処するために、添加回収実験を行った。Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓによる２つのＮＧＳ標準品を試験した：標準４は、５％で１０個の変異をカバーし、標準６は、２．５％で２０個の変異を保有し、両方ともゲノムＤＮＡフォーマットである。健常な個体に通常見出される１０〜３０ｎｇ／ｍＬのｃｆＤＮＡに関して、２つの添加濃度（５及び２０ｎｇ／ｍＬ）を使用した。表４に示されるように、ＣＧＤ法により調製された試料では、２．５％または５％のいずれにおいても６０パーセントの変異（６／１０及び１２／２０）がＮＧＳ分析によって検出され得るが、ＱＩＡａｍｐキットを使用して調製された同じ添加試料では、ＮＧＳ分析により検出可能な変異はなかった。添加研究の結果は先のＮＧＳ分析データと一致しており、ＣＧＤ法が先行技術の方法と比較して少ない血漿からより高い分量のｃｆＤＮＡをもたらしたことをさらに確定し、より多くの変異の特定につながった。
【表５】
2018530347.tif 000008
ＣＧＤ法は、液滴容量の血漿（２０μＬほどの低さ）から直接調製されたｃｆＤＮＡの先進的ゲノム分析（例えば次世代配列決定）を可能にする。ＣＧＤ法は、最小限の試料容量、最大限の収率、コスト及び所要時間の低下した合理化されたワークフローという利点と共に、広範囲の臨床遺伝子検査に適用することができる。
【０２６１】
実施例４−ＣＧＤ法を使用した唾液試料のＩＳＡ
本実施例は、ＣＧＤ法における唾液試料の使用を例示する。この実施例では、プロトコルに従ってＣＧＤ法を行った。２体の個々の対象から唾液試料を得た。唾液試料は、防腐剤ありまたはなしで、市販の試料採取キット（Ｐｕｒｅ−ＳＡＬ経口検体収集システム、Ｏａｓｉｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて得た。２０μＬの唾液試料を投入物として使用し、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを生成した。
【０２６２】
この実施例のための試料は、市販の唾液試料採取キットに存在する防腐剤あり及びなしの両方で、２体の異なる対象から採取した唾液試料であり、２０μＬの試料を各実験に使用した。プロトコルＡに記載されるように唾液試料を処理して、ｃｆＤＮＡプールの分析可能なプールを生成した。上述のＱｕｂｉｔ  ２．０蛍光光度計を使用し、増幅されたｃｆＤＮＡの全収率を数量化した。
【０２６３】
ＣＧＤ法から得られたｃｆＤＮＡを、２％のゲルでのアガロースゲル電気泳動に供し、臭化エチジウムを使用して可視化した（図４）。図４中、レーン１及び２は、防腐剤を含む市販の試料採取キットを用いて得た唾液試料の結果を示し、レーン３は陰性対照であり（唾液試料は存在しない）、一方で、レーン４及び５は、防腐剤を含まない市販の試料採取キットを用いて得た唾液試料の結果を示し、レーン６は陰性対照である（唾液試料は存在しない）。直接採取された唾液試料のｃｆＤＮＡは、ＣＧＤ法により生成された豊富なｃｆＤＮＡの存在を示す強い染色強度を示した。対照的に、防腐剤及び他の作用物質を含有する市販のキットを使用して採取された唾液試料は、染色をほとんどまたは全く示さなかった（レーン１及び２）。
【０２６４】
この実施例は、唾液試料中に存在するｃｆＤＮＡから分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを生成するためにＣＧＤ法が効率的に使用され得ることを示す。さらに、この実施例は、市販の試料採取キット中に存在する作用物質が、ＣＧＤ法によるｃｆＤＮＡの増幅を妨害し得ることを実証する。
【０２６５】
実施例５−ＣＧＤ法を使用した血漿、尿、及び脳脊髄液試料のＩＳＡ
本実施例は、ＣＧＤ法における血漿、尿、及び脳脊髄液（ＣＳＦ）試料の使用を例示する。この実施例では、プロトコルＡに従ってＣＧＤ法を行った。プロトコルＡに記載されるように試料を処理して、ｃｆＤＮＡプールの分析可能なプールを生成した。記載されるように、分析可能なｃｆＤＮＡのプールをＮＧＳ分析に供した。上述のＱｕｂｉｔ  ２．０蛍光光度計を使用し、増幅されたｃｆＤＮＡの全収率を数量化した。
【０２６６】
種々の源から凍結試料を得た。血漿及びＣＳＦ試料については、２０μＬの試料を投入物としてＣＧＤ法に使用し、一方で尿試料については、１０μＬの試料を投入物としてＣＧＤ法に使用した。
【０２６７】
ＣＧＤ法から得られたｃｆＤＮＡを、２％のゲルでのアガロースゲル電気泳動に供し、臭化エチジウムを使用して、１ｋｂラダーで可視化した（図５）。図５中、様々な試料から調製されたｃｆＤＮＡは次の通りであり、括弧内はｎｇ／μＬ単位のｃｆＤＮＡ濃度である：レーン１  ＣＳＦ（８．５）、レーン２  尿（５．１）、レーン３  血漿（２２）、レーン４  血漿（５９）、レーン５  血漿（３６．４）、レーン６  陰性対照、レーン７  尿（５２．２）、レーン８  尿（１１．２）、レーン９  尿（８９．６）、及びレーン１０  尿（３０）。全ての試料のｃｆＤＮＡが、ＣＧＤ法により生成された豊富なｃｆＤＮＡの存在を示す強い染色強度を示した。また、図５のレーン１〜６に示される試料から調製されたｃｆＤＮＡをＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにより分析して、ＣＧＤ法により調製されたｃｆＤＮＡのサイズ分布及び定量化を決定した（図６）。
【０２６８】
この実施例は、種々の試料タイプに存在するｃｆＤＮＡから分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを生成するためにＣＧＤ法が効率的に使用され得ることを示す。さらに、ＣＧＤ法を使用したｃｆＤＮＡのサイズ分布は、概して１００〜６００ｋｂの範囲内であり、これは下流分析に有益である。
【０２６９】
実施例６−ｃｆＤＮＡを使用した変異体の割合の決定
本実施例は、野生型及び変異体のｃｆＤＮＡの絶対コピー数の決定ならびに変異体の割合の計算を例示する。ＱＩＡａｍｐキット（製造元の指示に従って使用）を使用して、血漿及びＣＳＦ試料（２００μＬ）からｃｆＤＮＡを調製した。試料は、ＣＧＤ法のために直接使用した。プロトコルＡに従い、ＣＧＤ法を行った。この実施例のための試料は、対象から採取した血漿試料であった。プロトコルＡに記載されるように血漿試料を処理して、分析可能なｃｆＤＮＡプールを生成した。試料投入容量はそれぞれ、ＣＧＤ法で２０μＬ、ＣＧＤ法及びＱｉａＡｍｐキットで２００μＬであった。ｃｆＤＮＡは、陽性対照及び陰性対照と併せて、６つの血漿試料及び１つのＣＳＦ試料から調製した。ｃｆＤＮＡは、独立した研究所により、ＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して分析された。
【０２７０】
ｄｄＰＣＲは、核酸標的配列の高精度で絶対的な数量化を可能にする。サーマルサイクラーを使用した各液滴内のＰＣＲ増幅反応に続いて、離散的な容積測定的に定義された油中水型の液滴分配において封入された核酸分子を計数することにより、絶対コピー数を測定した。１つは野生型ＤＮＡに対し、もう１つは変異体ＤＮＡに対する、２つの異なる蛍光シグナルを計数する液滴リーダーで、液滴を一列に流した。変異体の割合は、変異体の割合％＝（変異体コピー数／全コピー数）×１００の式を使用して計算した。この結果を表５に示す。
【０２７１】
表５に見ることができるように、ＣＧＤ法を使用して調製されたｃｆＤＮＡは、変異体の割合の濃縮において、先行技術の方法と比較して優れていた。試験した７つの試料のうち、ＣＧＤ法は、５／７の試料（７１．４％）において変異体の割合の優れた濃縮をもたらした。
【表６】
2018530347.tif 000009
【０２７２】
実施例６−ＣＧＤ法の再現性
本実施例は、ＣＧＤ法の再現性を示す。６つの質対照試料（ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓａｍｐｌｅ）（２つの陽性対照、２つの陰性対照、及び２つの添加処理対照）を１０か月の期間にわたって分析した。陽性対照には、市販の細胞株ＳＷ４８０及びＮＣＩ−Ｈ１９７５を使用した。陰性対照には、市販の細胞株ＮＡ１２８７８及びＮＡ１９２４０を使用した。細胞株は全て、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。処理対照については、以前に試験した２つの陽性患者のＤＮＡ試料を正常血漿に添加するために使用して（最終濃度２００ｎｇ／ｍｌ）、２つの処理対照を作製した。細胞からＤＮＡを単離し、１０ｎｇのＤＮＡを投入物としてＣＧＤ法に使用した。
【０２７３】
プロトコルＡに従い、ＣＧＤ法を行った。分析可能なｃｆＤＮＡのプールを上述のようにＮＧＳ分析に供した。この結果を表６Ａに示す。表６Ａは、ＣＯＳＭＩＣ  ＩＤ番号により示される遺伝子及び変異のバリアントコールを示し、サイレント変異及び未確定の体細胞変異は除去しなかった。異なるＣＯＳＭＩＣ  ＩＤが同じ変異を表す場合がある。ＣＯＳＭＩＣ  ＩＤは、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ：  ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｃｏｓｍｉｃ／から得た。
【０２７４】
表６Ａに示されるように、ＣＧＤ法は、質対照試料を使用した全ての試験期間にわたって１００％の一致率で経時的に完全に再現可能であった。
【表７】
2018530347.tif 000010
2018530347.tif 000011
2018530347.tif 000012
【０２７５】
ＣＧＤ法を使用したアッセイ内の差異も調べた。１５個の血漿試料（健常な対象から２個、癌対象から４個、添加血漿試料から２個、４個の細胞株試料、及び３個の血清試料）を収集した。添加血漿試料は上記のように調製した。細胞株からＤＮＡを精製し、１０ｎｇのＤＮＡをＣＧＤ法への投入物として使用した。プロトコルＡに従い、ＣＧＤ法を行った。分析可能なｃｆＤＮＡのプールを上述のようにＮＧＳ分析に供した。異なる頻度の変異を有する１５個のライブラリに異なるバーコードで指標をつけ、多重化し、Ｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ  ＮＧＳアッセイを使用した同じランにおいて５回試験した。平均読み深度は＞２００倍であった。
【０２７６】
この結果を表６Ｂに示す。表６Ｂは、ＣＯＳＭＩＣ  ＩＤ番号により示される遺伝子及び変異のバリアントコールを示し、サイレント変異及び未確定の体細胞変異は除去しなかった。異なるＣＯＳＭＩＣ  ＩＤが同じ変異を表す場合がある。ＣＯＳＭＩＣ  ＩＤは、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ：  ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｃｏｓｍｉｃ／から得た。複製分析間の一致率も示されている。この結果は、各複製分析において変異コールに対する１００％の一致率を示す。変異のバリアント頻度は、高度に再現可能であった（ＣＶ％＜１０％）。
【表８】
2018530347.tif 000013
2018530347.tif 000014
2018530347.tif 000015
2018530347.tif 000016
【０２７７】
アッセイ内研究において記載した１５個の試料を使用し、２人のオペレータによる５回の異なるランで、アッセイ間再現性研究を行った。プロトコルＡに従い、ＣＧＤ法を行った。分析可能なｃｆＤＮＡのプールを上述のようにＮＧＳ分析に供した。異なる頻度の変異を有する１５個のライブラリに異なるバーコードで指標をつけ、多重化し、Ｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ  ＮＧＳアッセイを使用した５回の別々のランにおいて試験した。平均読み深度は＞２００倍である。
【０２７８】
この結果を表６Ｃに示す。表６Ｃは、ＣＯＳＭＩＣ  ＩＤ番号により示される遺伝子及び変異のバリアントコールを示し、サイレント変異及び未確定の体細胞変異は除去しなかった。異なるＣＯＳＭＩＣ  ＩＤが同じ変異を表す場合がある。ＣＯＳＭＩＣ  ＩＤは、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ：  ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｃｏｓｍｉｃ／から得た。複製分析間の一致率も示されている。アッセイ間研究と同様に、この結果は、５回全ての分析において変異コールに対する１００％の一致率を示す。変異のバリアント頻度は、高度に再現可能であった（ＣＶ％＜１０％）。
【表９】
2018530347.tif 000017
2018530347.tif 000018
2018530347.tif 000019
【０２７９】
実施例７−ＣＧＤ法の感度
この実施例は、ＣＧＤ法の感度及び検出限界（ＬＯＤ）を例示する。この実施例では、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｘ  ＮＧＳ標準品であるＴｒｕ−Ｑ  ４及びＴｒｕ−Ｑ  ７を使用した。これらの標準は、既知の変異を所定の頻度で含有する。これら２つの標準を正常なヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に４：１、３：２、２：３、及び１：４の比率で段階希釈して、異なるレベルの変異を得、ＣＧＤ法によって分析した。
【０２８０】
プロトコルＡに従い、ＣＧＤ法を行った。分析可能なｃｆＤＮＡのプールを上述のようにＮＧＳ分析に供した。Ｔｒｕ−Ｑ  ４の結果を表７Ａに示し、  Ｔｒｕ−Ｑ  ７の結果を表７Ｂに示す。これらの表は、標準中に存在する各変異を変異頻度と併せて提供し、未希釈の試料及び各段階希釈物での各変異に対するＣＧＤ法の感度（ＬＯＤ）を示す。各試料の平均読み深度は＞４０００倍であった。この結果は、最もアクショナブルな（ａｃｔｉｏｎａｂｌｅ）体細胞変異に対するＬＯＤが１％〜３％の範囲であることを示す。
【表１０】
2018530347.tif 000020
【表１１】
2018530347.tif 000021
【０２８１】
実施例８−ＣＧＤ法の特異性
本実施例は、ＣＧＤ法の特異性を例示する。１７体の健常な対象から血漿試料を得た。血漿試料を出願者の研究所にてＣＧＤ法により分析した。プロトコルＡに従い、ＣＧＤ法を行った。分析可能なｃｆＤＮＡのプールを上述のようにＮＧＳ分析に供した。第２のＣＬＩＡ認定研究所において、市販のｃｆＤＮＡ抽出キットを使用してｃｆＤＮＡを精製することにより、同じ血漿試料を分析した。Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＣＧ配列決定装置を製造元の指示に従って用い、ｃｆＤＮＡを分析した。
【０２８２】
この結果を表８に示す。表８は、ＣＯＳＭＩＣ  ＩＤ番号により示される遺伝子及び変異のバリアントコールを示し、サイレント変異及び未確定の体細胞変異は除去しなかった。異なるＣＯＳＭＩＣ  ＩＤが同じ変異を表す場合がある。ＣＯＳＭＩＣ  ＩＤは、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ：ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｃｏｓｍｉｃ／から得た。ＣＧＤ法と比較法との間の一致率も示されている。この結果は、試験特異性が遺伝子レベルで９９．９％（８４９／８５０）であり、第２のＣＬＩＡ認定研究所により行われた試験と高い一致率（１６／１７、９４％）であることを示す。
【表１２】
2018530347.tif 000022
2018530347.tif 000023
2018530347.tif 000024
【０２８３】
別の比較において、５０個の臨床血漿試料を得た（１５人の膵臓癌患者、１５人の結腸直腸癌患者、１人の消化管間質腫瘍患者、４人の肺癌患者、及びＳと記された１５個のＣＥＡ陽性血清試料）。血漿試料を出願者の研究所にてＣＧＤ法により分析した。プロトコルに従ってＣＧＤ法を行った。分析可能なｃｆＤＮＡのプールを上述のようにＮＧＳ分析に供した。上述の同じ第２のＣＬＩＡ認定研究所にて、同じ血漿試料を分析した。
【０２８４】
この結果を表９に示す。表９は、ＣＯＳＭＩＣ  ＩＤ番号により示される遺伝子及び変異のバリアントコールを示し、サイレント変異及び未確定の体細胞変異は除去しなかった。異なるＣＯＳＭＩＣ  ＩＤが同じ変異を表す場合がある。ＣＯＳＭＩＣ  ＩＤは、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ：ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｃｏｓｍｉｃ／から得た。ＣＧＤ法と比較法との間の一致率も示されている。この結果は、９６％（４８／５０）の一致率を示し、試料２及び８は不一致である。
【表１３】
2018530347.tif 000025
2018530347.tif 000026
2018530347.tif 000027
2018530347.tif 000028
2018530347.tif 000029
2018530347.tif 000030
2018530347.tif 000031
【０２８５】
これらの結果は、ＣＧＤ法が技術水準の方法に極めて好ましく匹敵することを示す。
【０２８６】
実施例９−組織生検結果とのＣＧＤ法の比較
本実施例は、組織生検とのＣＧＤ法の比較を例示する。再発経験のある乳癌患者の血漿試料（ｎ＝１３）及び卵巣癌患者（化学療法前及び後の両方）の血漿試料（ｎ＝１５）を得た。全ての対象が、比較のために入手可能な組織生検データを有した。乳癌患者では、組織生検データは、腫瘍内の２つの別々の位置から入手可能であった。卵巣癌患者では、組織生検データは、化学療法処置前及び後の両方で入手可能であり、加えて、整合した組織ゲノムＤＮＡも抽出し、分析に提供した。血漿試料から調製されたｃｆＤＮＡから得られた結果を、組織生検からの結果と比較した。
【０２８７】
プロトコルＡに従い、ＣＧＤ法を行った。得られた分析可能なｃｆＤＮＡのプールを上述のようにＮＧＳ分析に供した。
【０２８８】
再発経験のある乳癌患者に関し、ＣＧＤ法で得られた結果は、組織生検から得られた結果との強い一致を示した。全体として、ＣＧＤ法で得られた結果と組織生検で得られた結果との間には６９．２％の一致率があり、これは、当該技術分野で報告されている一致率値と一致する。この結果を表１０に示す。
【表１４】
2018530347.tif 000032
【０２８９】
卵巣癌の比較については、ＣＧＤ法で得られた結果は、化学療法処置前及び後の両方で、組織生検から得られた結果との強い一致を示した（表１１及び１２ならびに図７を参照されたい）。ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡ、及びＰＴＥＮ遺伝子に関する２つの方法の結果には、患者レベルと変異レベルとの両方で強い一致があった（表１１）。ＣＧＤ法は、組織生検と比較して、変異を有するより多くの遺伝子、及び個々の遺伝子を有するより多くの変異を検出した。最も高頻度に変異する遺伝子に関するパターンは、ＣＧＤ法と組織生検との間で一貫していた（表１２）。
【表１５】
2018530347.tif 000033
【表１６】
2018530347.tif 000034
【０２９０】
ＣＧＤ法及び組織生検の結果を治療基準に従って（例えば、化学療法処置前及び後に）比較すると、ＣＧＤ法及び組織生検の結果は、遺伝子レベルで一貫した結果を提供した（図７）。図７中、各遺伝子について提示されるデータは、左から右に、組織生検処置前、ＣＧＤ法処置前、組織生検処置後、及びＣＧＤ法処置後に対応する。
【０２９１】
これらの結果は、ＣＧＤ法と現在の技術水準の組織生検法との優秀な一致を示す。
【０２９２】
実施例１０−癌治療を受けている対象の長期的監視
本実施例では、２人の患者の治療中に血漿ｃｆＤＮＡ中の体細胞変異の長期的監視を行った。治療の過程を通じて、変異負荷の動態をプロットし、癌抗原（ＣＡ）マーカー及びＰＥＴ／ＣＴ画像法と比較した。固形腫瘍の応答評価基準（ＲＥＣＩＳＴ：Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ）を使用して画像法スキャンを評価した。
【０２９３】
この実施例では、プロトコルＡに従ってＣＧＤ法を行った。この実施例のための試料は、２体の対象から経時的に採取した血漿試料であった。上述のＱｕｂｉｔ  ２．０蛍光光度計を使用し、増幅ＤＮＡの全収率を数量化した。１〜１０ｎｇの濃度の分析可能なｃｆＤＮＡプールを使用し、供給元のプロトコルに従い、５０個の癌ドライバー遺伝子内の２８５５個のホットスポット変異を標的としたＡｍｐｌｉＳｅｑ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｈｏｔｓｐｏｔ  Ｐａｎｅｌバージョン２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、２０７個の標的遺伝子座を増幅した。その後、半導体ベースの配列決定を、Ｉｏｎ  Ｃｈｅｆ及びＩｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）でリード数を試料１つ当たり＞２００，０００に維持して行った。
【０２９４】
対象１は、転移を伴う肺癌と診断された６９歳で非喫煙の中国人女性患者であった。組織生検は上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）の感作変異を示したが、ＡＬＫ、ＲＯＳ−１、ＢＲＡＦは陰性であった（２０１５年５月１９日）。対象は、Ｔａｒｃｅｖａ（ＥＧＦ−Ｒを標的とするエルロチニブ塩酸塩；１日１００ｍｇ）及びＡｖａｓｔｉｎ（ベバシズマブ）を１か月に１回用いる療法を開始した。５か月近くの治療の後、ＣＧＤ法を使用したｃｆＤＮＡ分析によって決定した対象の癌胚抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１９−９、及びＣＡ１２５のレベルは全て著しく低下した（図ＸＡ）。ＰＥＴ／ＣＴスキャン評価はまた、腫瘍サイズ及び活性の減少と共に１０１日間維持された安定状態を示した（図ＸＢ）。しかしながら、ＣＧＤ法を使用した血漿ｃｆＤＮＡ分析は、ＴＰ５３及びＰＴＥＮ遺伝子中におよそ５０日間維持された２つの新しい体細胞変異を検出した。検出された腫瘍変異は、２０１６年３月末までに３つ、７つ、及び８つの変異へと漸進的に増加し、進行状態が示された。２０１６年３月のｃｆＤＮＡ分析は、ＥＧＦＲ、Ｅ１１４Ｋ（４．２％）、及びＥ８６８Ｇ（２．４％）の対立遺伝子頻度の低い２つのサブクローンを明らかにし、薬物による淘汰圧に際したクローン進化が暗示された。２０１６年３月３１日のＰＥＴ／ＣＴスキャンは、新しい腫瘍塊（分解能のレベルをわずかに超える；約１ｃｍ３）を特定し、ｃｆＤＮＡ分析を確定した。全体として、この事例は、ＣＧＤ法を使用してｃｆＤＮＡ分析により検出された変異が、放射線学的な進行よりも約２か月早く現れた変異負荷の増加と共に、放射線学的な安定状態と密接に関連していたことを実証する。さらに、１年に２回以上のＰＥＴ／ＣＴスキャンは推奨されないため、ＣＧＤ法は、対象の長期的評価の効果的で安全な代替手段を提示する。
【０２９５】
対象２は、原発不明の転移性膵周囲リンパ節腺癌と診断された７９歳イラン人女性患者であった。細針生検での免疫組織化学的検査はＣＫ７陽性であったが、ＣＫ２０、ＴＴＦ、Ｓ１００、及びＣＤ４５は全て、２０１５年１０月２６日時点で陰性であった。はじめに、対象にＸＥＬＯＸ療法（オキサリプラチンと合わせたカペシタビンからなる化学療法レジメン）を処した。後に免疫染色がＰＤ−Ｌ１の過剰発現も特定したため、患者を次にＸＥＬＩＲＩ（イリノテカンと合わせたカペシタビンからなる化学療法レジメン）、Ａｖａｓｔｉｎ（ベバシズマブ）、及びＯｐｄｉｖｏ（ニボルマブ）で治療した。２０１６年２月１１日のＰＥＴ／ＣＴスキャンは、＞９０％の奏効率と共に腫瘍サイズ及び活性の著しい減少を示した（図ＸＢ）。血漿ｃｆＤＮＡ分析の結果は、ＣＥＡ及びＣＡマーカー（ＣＡ１２５、ＣＡ２７−２９、ＣＡ１９−９）の減少を示し、画像法の結果と一致しており、少なくとも４１日間維持された安定状態を示した（図ＸＡ）。４つの体細胞変異がはじめに検出され（ＦＬＴ３  Ｙ５７２Ｃ  ６．５％、ＴＰ５３  Ｅ１６５Ｇ  ５．２％、ＴＰ５３  Ｙ１０４Ｃ  ４．１％、ＴＰ５３  Ｃ１３７Ｙ  ４．０％）、それから治療過程中に１個及び０個の変異まで減少した。この事例は、血液−液滴液体生検による変異分析が、療法に応答した臨床成績と強く相関したことを再び例示した。
【０２９６】
重要なことに、ＣＥＡ及びＣＡタンパク質マーカーは必ずしも癌細胞に特異的とは限らず、ＰＥＴ／ＣＴスキャンには分解能限界がある。対照的に、本明細書でＣＧＤ法によって検出される癌関連体細胞変異は悪性腫瘍に特異的であり、これらの変異を有する血漿ｃｆＤＮＡは、悪性腫瘍の存在を示すことが示された。この実施例の結果は、ＣＧＤ法を使用してｃｆＤＮＡ分析により検出される体細胞変異のレベルが、現在の標準的ケアの試験結果及び臨床成績と深く相関し、再発の最も早い兆候を提供し得ることを示す。
【０２９７】
実施例１１−ＣＧＤ法を使用した長期的監視
本実施例は、癌患者の長期的監視におけるＣＧＤ法の使用を例示する。ＣＧＤ法を使用すると、臨床医が、治療有効性、残存疾患、クローン進化、薬物抵抗性の進化、及び腫瘍再発に関するリアルタイムの長期的情報を得ることが可能になる。正確なリアルタイムの情報があれば、臨床医は、治療介入に関してより正確な決断を下すことができ、臨床医が現在の治療を改変して、最も効果的な治療をコスト効果の高い様式で提供することが可能になる。
【０２９８】
この実施例では、プロトコルＡに従ってＣＧＤ法を行った。この実施例のための試料は、対象から採取した血漿試料であった。記載されるように、分析可能なｃｆＤＮＡのプールをＮＧＳ分析に供した。
【０２９９】
表１３は、様々な癌を有する患者の分析の例示的な結果を示す（ＣＲＣは結腸直腸癌を表し、ＧＩＳＴは消化管間質腫瘍を表す）。ＣＧＤ法を使用した長期的監視の有用性は、表１３から明白である。例えば、ＣＲＣを有する対象１は、２０１５年１１月の初期検査でＮＲＡＳ及びＰＴＥＮ変異を示した。治療中、この患者を２０１５年１２月に再検査し、変異は検出されなかった。２０１５年２月にこの患者を再検査したところ、ＢＲＡＦ変異（低頻度）に対して陽性であった。別の例として、対象５（肺癌）を２０１５年１１月にはじめに検査したところ、ＴＰ５３遺伝子の変異を示した。２０１５年１２月、２０１６年１月、及び２０１６年２月のさらなる長期的検査の後、腫瘍変異パターンの変化は明白であった。この患者では、ＫＤＲ、ＥＲＢＢ４、ＶＨＬ、ＣＴＮＮｂ１、及びＲＢ１遺伝子の変異の出現が２０１６年２月に検出され、元々のＴＰ５３変異は（２０１６年２月に依然として存在していたが）頻度が減少したことが示された。リアルタイムで提供されるこのような情報を使用すると、臨床医は、患者の腫瘍プロファイルの絶えず変化する性質に対処するように治療介入を変更することができる。
【表１７】
2018530347.tif 000035
【０３００】
実施例１２−ＩＳＡ酵素混合物の最適化
本明細書で詳解されるように、ＣＧＤ法は、試料中に存在するｃｆＤＮＡから増幅可能なｃｆＮＡプールを効率的に準備するために、種々の酵素混合物を使用することができる。本実施例は、ＣＧＤ法の効率に関するいくつかの異なる酵素混合物（１〜６）の使用を例示する（効率は増幅されたｃｆＤＮＡのｎｇ／μＬ単位の収率に基づく）。酵素混合物１〜６の組成を表１４に提供する。
【０３０１】
以下の注記を例外として、プロトコルＡに従ってＣＧＤ法を行った。この実施例のための試料は、単一の対象から採取した血漿試料であり、２０μＬの試料を各実験に使用した。プロトコルＡに列挙した酵素混合物の代わりに酵素混合物１〜６をプロトコルＡのステップ８で用いたことを例外として、プロトコルＡに記載のように血漿試料を処理して、増幅可能なｃｆＤＮＡプールを生成した。増幅可能なｃｆＤＮＡプールをプロトコルＡに記載のＰＣＲ増幅に供して、分析可能なｃｆＤＮＡのプールを生成した。上述のｄｓＤＮＡ  ＢＲ及びＨＳアッセイキットと一緒にＱｕｂｉｔ  ２．０蛍光光度計を使用し、増幅ＤＮＡの全収率を数量化した。
【０３０２】
この結果を表１４に示す。全ての酵素混合物が良好な結果をもたらした。プロトコルＡの酵素混合物は、元々の試料ｃｆＤＮＡ投入物から８２．３ｎｇ／μＬの増幅ＤＮＡをもたらした。酵素ミックス１は、プロトコルＡと比較すると同様の収率の増幅ＤＮＡ（８２．２ｎｇ／μＬ）を生成したが、酵素ミックス２及びミックス６は、プロトコルＡと比較すると減少した収率の増幅ＤＮＡ（それぞれ７０．４ｎｇ／μＬ及び５８．６ｎｇ／μＬ）を生成した（しかし、これらの混合物は本明細書に記載の方法で使用するのに好適である）。酵素ミックス３、ミックス４、及びミックス５は、プロトコルＡと比較すると増加した収率の増幅ＤＮＡ（それぞれ９７．１ｎｇ／μＬ、１０５．０ｎｇ／μＬ、及び９６．４ｎｇ／μＬ）を生成した。
【０３０３】
これらの結果は、ＣＧＤ法では試料中に存在するｃｆＤＮＡから増幅可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを効率的に生成するために５’−３’ポリメラーゼ活性、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性、及びＤＮＡリガーゼ活性が必要であることを示す。ポリヌクレオチドキナーゼ活性の付加も、増幅可能なｃｆＤＮＡプールの生成の効率を増加させる。表１４に示されるように、増幅可能なｃｆＤＮＡプールの生成の効率を著しく阻害することなく、付加活性が存在する場合もある。
【表１８】
2018530347.tif 000036
【０３０４】
実施例１３−ＩＳＡ緩衝溶液の最適化
本明細書で詳解されるように、ＣＧＤ法は、試料中に存在するｃｆＤＮＡから分析可能なｃｆＮＡプールを効率的に準備するために、種々の酵素混合物を使用することができる。本実施例は、本開示の方法の効率に関するいくつかの異なる酵素混合物の使用を例示する（効率は増幅されたｃｆＤＮＡのｎｇ／μＬ単位の収率に基づく）。
【０３０５】
この実施例では、プロトコルＡで使用されるマスターミックス及びユニバーサル緩衝液を、表６に示される組み合わせのＣＧ１緩衝液またはＣＧ２緩衝液のいずれかに置き換え、増幅されたｃｆＤＮＡの全収率に対する影響を決定した。マスターミックス及び／またはユニバーサル緩衝液の代用物として使用したＣＧ１及びＣＧ２は、プロトコルＡに従って置き換えられた成分と同じ容量で添加した。
【０３０６】
マスターミックス（別称、Ｌ緩衝液）は、反応物中の最終濃度が、ｄＮＴＰ  ４０μＭならびに配列番号１及び２のアダプター分子２μＭとなるように添加した。
【０３０７】
ユニバーサル緩衝液（別称、Ｓ緩衝液）は、反応物中の最終濃度が、ＮａＣｌ  ５０ｍＭ、トリス−Ｃｌ（ｐＨ７〜８）２５ｍＭ、Ｍｇ２Ｃｌ  １０ｍＭ、ＤＴＴ  ２．５ｍＭ、及びＡＴＰ  １ｍＭとなるように添加した。
【０３０８】
ＣＧ１緩衝液は、反応物中の最終濃度が、酢酸カリウム５０ｍＭ、トリス−アセテート（ｐＨ７．９）２０ｍＭ、酢酸マグネシウム１０ｍＭ、ＤＴＴ  １ｍＭ、ＡＴＰ  １ｍＭ、ｄＮＴＰ  ４０μＭ、及びＢＳＡ  ２００μｇ／ｍｌとなるように添加した。
【０３０９】
ＣＧ２緩衝液は、反応物中の最終濃度が、配列番号５のアダプター分子２μＭ（ヌクレアーゼ不含水中）となるように添加した。
【０３１０】
以下の注記を例外として、プロトコルＡに従ってＣＧＤ法を行った。この実施例のための試料は、単一の対象から採取した血漿試料であり、２０μＬの試料を各実験に使用した。プロトコルＡに列挙したマスターミックス及び／またはユニバーサル緩衝液の代わりにＣＧ１及び／またはＣＧ２緩衝液をプロトコルＡのステップ５で用いたことを例外として、プロトコルＡに記載のように血漿試料を処理して、増幅可能なｃｆＤＮＡプールを生成した。増幅可能なｃｆＤＮＡプールをプロトコルＡに記載のＰＣＲ増幅に供して、分析可能なｃｆＤＮＡのプールを生成したが、ただし、配列番号５のアダプター分子をＣＧ２緩衝液中に使用したとき、プロトコルＡで指定したプライマーではなく、プライマー５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＣＣＣＴＣＡＧＣＡＣＣＡＣ−３’（配列番号６）を使用したことを例外とする。全ての反応において、プロトコルＡで指定した酵素混合物を使用した。
【０３１１】
上述のｄｓＤＮＡ  ＢＲ及びＨＳアッセイキットと一緒にＱｕｂｉｔ  ２．０蛍光光度計を使用し、増幅ＤＮＡの全収率を数量化した。
【０３１２】
各反応物の成分の最終濃度を以下に提供し、結果を表６に示す。
【０３１３】
試験１
ＣＧ１由来の酢酸カリウム５０ｍＭ、トリス−アセテート（ｐＨ７．９）２０ｍＭ、酢酸マグネシウム１０ｍＭ、ＤＴＴ  １ｍＭ、ＡＴＰ  １ｍＭ、ｄＮＴＰ  ４０μＭ、ＢＳＡ  ２００ｕｇ／ｍｌ、ならびにＳ緩衝液由来のＮａＣｌ  ５０ｍＭ、トリス−Ｃｌ（ｐＨ７〜８）２５ｍＭ、Ｍｇ２Ｃｌ  １０ｍＭ、ＤＴＴ  ２．５ｍＭ、及びＡＴＰ  １ｍＭ
試験２
ＣＧ２由来のアダプター２μＭ、ならびにＳ緩衝液由来のＮａＣｌ  ５０ｍＭ、トリス−Ｃｌ（ｐＨ７〜８）２５ｍＭ、Ｍｇ２Ｃｌ  １０ｍＭ、ＤＴＴ  ２．５ｍＭ、及びＡＴＰ  １ｍＭ
試験３
ＣＧ１由来の酢酸カリウム５０ｍＭ、トリス−アセテート（ｐＨ７．９）２０ｍＭ、酢酸マグネシウム１０ｍＭ、ＤＴＴ  １ｍＭ、ＡＴＰ  １ｍＭ、ｄＮＴＰ  ４０μＭ、ＢＳＡ  ２００ｕｇ／ｍｌ、ならびにＬ緩衝液由来のｄＮＴＰ  ４０μＭ及びアダプター２μＭ
試験４
Ｌ緩衝液由来のｄＮＴＰ  ４０μＭ及びＣＧ２由来のアダプター２μＭ；マスターミックス由来のアダプター分子は提供されているため、この試験では省略したことに留意されたい
試験５
ＣＧ１由来の酢酸カリウム５０ｍＭ、トリス−アセテート（ｐＨ７．９）２０ｍＭ、酢酸マグネシウム１０ｍＭ、ＤＴＴ  １ｍＭ、ＡＴＰ  １ｍＭ、ｄＮＴＰ  ４０μＭ、ＢＳＡ  ２００ｕｇ／ｍｌ、及びＣＧ２由来のアダプター２μＭ
プロトコルＡ
Ｓ緩衝液由来のＮａＣｌ  ５０ｍＭ、トリス−Ｃｌ（ｐＨ７〜８）２５ｍＭ、Ｍｇ２Ｃｌ  １０ｍＭ、ＤＴＴ  ２．５ｍＭ、及びＡＴＰ  １ｍＭ、Ｌ緩衝液由来のｄＮＴＰ  ４０μＭ及びアダプター２μＭ
【０３１４】
試験１は、陰性対照として機能した（ＣＧ１とユニバーサル緩衝液のいずれも、増幅可能なｃｆＤＮＡプールに必要な修飾ｃｆＤＮＡ分子を生成するために必要とされるアダプター分子を含有しないため）。試験２は、ｄＮＴＰの存在が、増幅可能なｃｆＤＮＡプールに必要な修飾ｃｆＤＮＡの効率的な生成に必要であることを示す。試験３は、ユニバーサル緩衝液の代わりにＣＧ１緩衝液を用いると、増幅ｃｆＤＮＡの全収率がプロトコルＡと比較して改善したことを示す。試験４は、ユニバーサル緩衝液の代わりにＣＧ２緩衝液を用いると、増幅ｃｆＤＮＡの全収率がプロトコルＡと比較して改善したことを示す。また試験５は、許容される分量の増幅ｃｆＤＮＡを生成するためにさらなる緩衝液成分が必要とされないことを示す。試験５は、マスターミックス及びユニバーサル緩衝液の両方の代わりにＣＧ１緩衝液及びＣＧ２緩衝液を用いることでも、増幅ｃｆＤＮＡの全収率が改善したことを示す。
【０３１５】
この結果を表１５に示す。これらの結果は、本開示の方法が、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを生成するために、種々の緩衝液組成を用い、かつ試験４に示されるように緩衝液成分を付加することなく行われ得ることを示す。
【表１９】
2018530347.tif 000037
【０３１６】
実施例１４−ＩＳＡ酵素混合物及び緩衝溶液の最適化
実施例１２及び１３に示されるように、ＣＧＤ法は、試料中に存在するｃｆＤＮＡから分析可能なｃｆＮＡプールを効率的に準備するために、種々の酵素混合物及び緩衝溶液を使用することができる。本実施例は、本開示の方法の効率に関する、ＣＧ１緩衝液及びＣＧ２緩衝液を使用した酵素混合物の最適化を例示する（効率は増幅されたｃｆＤＮＡのｎｇ／μＬ単位の収率に基づく）。
【０３１７】
この実施例では、プロトコルＡで使用されるマスターミックス及びユニバーサル緩衝液をＣＧ１緩衝液及びＣＧ２緩衝液に置き換え、実施例１２の酵素混合物をこの組み合わせで試験した。マスターミックス及び／またはユニバーサル緩衝液の代用物として使用したＣＧ１及びＣＧ２は、プロトコルＡに従って置き換えられた成分と同じ容量で添加した。
【０３１８】
プロトコルＡに従って、または以下の（酵素ミックス１〜４に関する）注記を例外としてプロトコルＡに従って、ＣＧＤ法を行った。この実施例のための試料は、単一の対象から採取した血漿試料であり、２０μＬの試料を各実験に使用した。プロトコルＡに列挙したマスターミックス及びユニバーサル緩衝液の代わりにＣＧ１及びＣＧ２緩衝液をプロトコルＡのステップ５で用い、プロトコルＡの酵素混合物の代わりに記載した酵素混合物１〜５をステップ８で用いたことを例外として、プロトコルＡに記載のように血漿試料を処理して、増幅可能なｃｆＤＮＡプールを生成した。増幅可能なｃｆＤＮＡプールをプロトコルＡに記載のＰＣＲ増幅に供して、分析可能なｃｆＤＮＡのプールを生成したが、ただし、プロトコルＡで指定したプライマーではなく、プライマー５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＣＣＣＴＣＡＧＣＡＣＣＡＣ−３’（配列番号６）を使用したことを例外とする。
【０３１９】
上述のｄｓＤＮＡ  ＢＲ及びＨＳアッセイキットと一緒にＱｕｂｉｔ  ２．０蛍光光度計を使用し、増幅ＤＮＡの全収率を数量化した。
【０３２０】
ＣＧ１緩衝液は、反応物中の最終濃度が、酢酸カリウム５０ｍＭ、トリス−アセテート（ｐＨ７．９）２０ｍＭ、酢酸マグネシウム１０ｍＭ、ＤＴＴ  １ｍＭ、ＡＴＰ  １ｍＭ、ｄＮＴＰ  ４０μＭ、及びＢＳＡ  ２００μｇ／ｍｌとなるように添加した。
【０３２１】
ＣＧ２緩衝液は、反応物中の最終濃度が、配列番号５のアダプター分子２μＭ（ヌクレアーゼ不含水中）となるように添加した。
【０３２２】
この結果を表１６に示す。全ての酵素混合物が良好な結果をもたらした。この実施例において、酵素ミックス２及び３は、元々の試料ｃｆＤＮＡ投入物から１４０ｎｇ／μＬの増幅ｃｆＤＮＡをもたらし、一方で、酵素ミックス１、ミックス４、及びミックス５は、元々の試料ｃｆＤＮＡ投入物から、それぞれ１２４ｎｇ／μＬ、１１２ｎｇ／μＬ、及び９９．４ｎｇ／μＬの増幅ｃｆＤＮＡをもたらした。試験した全ての酵素混合物が、本明細書に記載の方法で使用するのに好適であった。
【０３２３】
これらの結果は実施例１２と一致しており、ＣＧＤ法では試料中に存在する投入ｃｆＤＮＡから分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを効率的に生成するために５’−３’ポリメラーゼ活性、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性、及びＤＮＡリガーゼ活性が必要であることを示す。ポリヌクレオチドキナーゼ活性及びウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性の付加も、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールの生成の効率を増加させる。表１６に示されるように、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールの生成の効率を著しく阻害することなく、付加活性が存在する場合もある。
【表２０】
2018530347.tif 000038
【０３２４】
実施例１５−血漿中のｃｆＤＮＡと精製されたＤＮＡとの間のＩＳＡの効率
本実施例は、血漿試料からのｃｆＤＮＡ及び精製されたＤＮＡのＩＳＡの効率を例示する（効率は増幅されたｃｆＤＮＡまたはＤＮＡのｎｇ／μＬ単位の収率に基づく）。
【０３２５】
この実施例では、以下の（酵素ミックス１〜５に関する）注記を例外として、プロトコルＡに従ってＣＧＤ法を行った。この実施例のための試料は、単一の対象から採取した血漿試料であり、２０μＬの試料を各実験に使用した。プロトコルＡに列挙したマスターミックス及びユニバーサル緩衝液の代わりにＣＧ１及びＣＧ２緩衝液をプロトコルＡのステップ５で用い、プロトコルＡの酵素混合物の代わりに記載した酵素混合物１〜５をステップ８で用いたことを例外として、プロトコルＡに記載のように血漿試料を処理して、増幅可能なｃｆＤＮＡプールを生成した。増幅可能なｃｆＤＮＡプールをプロトコルＡに記載のＰＣＲ増幅に供して、分析可能なｃｆＤＮＡのプールを生成したが、ただし、プロトコルＡで指定したプライマーではなく、プライマー５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＣＣＣＴＣＡＧＣＡＣＣＡＣ−３’（配列番号６）を使用したことを例外とする。精製されたＤＮＡの実験では、１０ｎｇの投入ＤＮＡを等容量のＰＢＳ中で使用した。
【０３２６】
上述のｄｓＤＮＡ  ＢＲ及びＨＳアッセイキットと一緒にＱｕｂｉｔ  ２．０蛍光光度計を使用し、増幅ＤＮＡの全収率を数量化したものを、ｎｇ／μＬとして表す。
【０３２７】
この結果を表１７に示し、収率をｎｇ／μＬ単位で報告する。全ての酵素混合物が良好な結果をもたらした。この実施例では、酵素ミックス３、ミックス４、及びミックス５は、１０ｎｇの精製ＤＮＡで得られた収率以上の、元々の試料ｃｆＤＮＡ投入物からの増幅ｃｆＤＮＡの収率をもたらした。酵素ミックス１及びミックス２から得られた増幅ｃｆＤＮＡの収率ならびにプロトコルＡのものも、良好な結果を示した。試験した全ての酵素混合物が、本明細書に記載の方法で使用するのに好適であった。
【０３２８】
これらの結果は、先の実施例と一致しており、生体試料からｃｆＤＮＡを増幅することにおける本開示の方法の効率が高く、精製ＤＮＡが試料投入物として使用されるときと同じ範囲内であることを実証する。
【表２１】
2018530347.tif 000039
【０３２９】
実施例１６−ＩＳＡに使用される試薬の安定性
ＣＧＤ法を実施するために必要な試薬を含んだキット（例えば、予め充填された９６ウェルプレート）を調製するための潜在性を評価するために、ＣＧＤ法の実行に必要な様々な緩衝液及び酵素混合物を９６ウェルプレートに予め充填し、５か月間−２０℃または４℃のいずれかで５か月間保管した。加えて、マスターミックス及び酵素成分（ユニバーサル緩衝液中）を一緒または別々のいずれかで９６ウェルプレートにおいて保管することの影響も調べた。保管された試薬及び新鮮な試薬を使用した６つの試料に関する結果を比較した。
【０３３０】
この実施例では、プロトコルＡに従ってＣＧＤ法を行った。この実施例のための試料は、対象から採取した血漿試料であった。プロトコルＡに記載されるように血漿試料を処理して、ｃｆＤＮＡプールの分析可能なプールを生成した。記載されるように、分析可能なｃｆＤＮＡのプールをＮＧＳ分析に供した。上述のＱｕｂｉｔ  ２．０蛍光光度計を使用し、ｃｆＤＮＡの全収率を数量化した。
【０３３１】
この結果を表１８に示す（増幅ｃｆＤＮＡの収率はｎｇ／μＬ単位で示されている）。示されているように、ＣＧＤ法を行うために必要な試薬の−２０℃または４℃における保管は、ＣＧＤ法の性能に著しい影響を与えなかった。加えて、マスターミックス及び酵素成分を一緒に保管すること（「混合」と呼ぶ）は、それぞれを別々に保管すること（「別々」と呼ぶ）よりもいくらか効果的であった。
【表２２】
2018530347.tif 000040
【０３３２】
加えて、−２０℃及び４℃で保管した試薬を使用してＣＧＤ法により調製した分析可能なｃｆＤＮＡプールを、２％のゲルでのアガロースゲル電気泳動に供し、臭化エチジウムを使用して可視化した（図１０）。図１０中、レーン１〜１０は、１０個の試料からの結果を示し、レーン１〜５は、−２０℃で保管した試薬を使用して調製したｃｆＤＮＡからの結果を示し、レーン６〜１０は、４℃で保管した試薬を使用して調製したｃｆＤＮＡからの結果を示す。全事例において、ｃｆＤＮＡは、強い染色強度及び正常なサイズ分布を示した。この結果は、ＣＧＤ法を行う際に使用された試薬の安定性をさらに確定する。
【０３３３】
これらの結果は、集合的に、ＣＧＤ法を行う際に使用された試薬の安定性を確定し、ＣＧＤ法を行うためのキットの製造を可能にする。
【０３３４】
実施例１７−試料中のｃｆＤＮＡの数量化
本実施例は、試料中のｃｆＤＮＡ濃度の数量化を例示する。この実施例では、プロトコルＡに従ってＣＧＤ法を行った。この実施例のための試料は、対象から採取した血漿試料であった。プロトコルＡに記載されるように血漿試料を処理して、分析可能なｃｆＤＮＡのプールを生成した。精製されたＤＮＡを使用した標準曲線の作成のために、１０μＬ容量中０、０．００１、０．００５、０．０１、０．０２５、０．０５、０．１、０．２５、０．５、及び１ｎｇ／μＬの濃度における精製ＤＮＡの試料を、プロトコルＡに従ってＣＧＤ法に供する。上述のＱｕｂｉｔ  ２．０蛍光光度計を使用し、増幅されたｃｆＤＮＡまたは精製されたＤＮＡの全収率を数量化した。
【０３３５】
図１１は、０、０．００１、０．００５、０．０１、０．０２５、０．０５、０．１、０．２５、０．５、及び１ｎｇ／μＬの濃度における精製ＤＮＡをＣＧＤプロセスの投入物として１８サイクルの増幅で使用して確立された標準曲線の直線性を示す。元々のｃｆＤＮＡ試料投入物からの増幅ｃｆＤＮＡの収率（ｎｇ／μＬ単位）を決定することで、精製ＤＮＡを使用して生成された標準曲線を参照することにより、元々の試料中のｃｆＤＮＡの濃度が決定され得る。表２０は、２つの臨床試料中に元々存在したｃｆＤＮＡ濃度の定量の結果を示す。ｃｆＤＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ単位）は、ＣＧＤ法を使用して２つの臨床試料から決定した。ｃｆＤＮＡの産出収率から、試料中の元々のｃｆＤＮＡ濃度を、図１１に示される標準曲線から決定した。
【表２３】
2018530347.tif 000041
【０３３６】
この実施例は、臨床試料中の元々のｃｆＤＮＡ濃度を決定するためにＣＧＤ法が使用され得、対象におけるｃｆＤＮＡ濃度を素早くかつ正確に決定することが可能になり、種々の臨床の場におけるｃｆＤＮＡ濃度の診断的使用が可能になることを示す。
【０３３７】
実施例１８−分析のための複数の分析可能なｃｆＤＮＡのプールのプーリング
本実施例は、分析前の複数の分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールのプーリングの使用を例示する。上述のように、特定の実施例では、ＮＧＳ分析（例えば、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＮＧＳによるもの）のための配列決定ライブラリを創出するために、１〜１０μＬの分析可能なｃｆＤＮＡのプール（２０μＬの全容量から；およそ１〜２ｎｇ）を使用する。このような試料採取は、特定の事例では、ＮＧＳ配列決定アプリケーションにおける均一性の差異につながる場合がある。この実施例では、ＮＧＳのための配列決定ライブラリを創出するために使用するｃｆＤＮＡ投入物を、生成された分析可能なプールからほぼ２０ｎｇのｃｆＤＮＡに増加させた。この目的を達成するために、プロトコルＡに記載のＣＧＤ法を改変した。第１に、分析可能なｃｆＤＮＡ分子のプールを創出するために使用する増幅サイクルを２５サイクルから１８サイクルに減少させて、分析可能なプール中のｃｆＤＮＡの全体的な収率が低下するように、ＣＧＤ法を変更した。第２に、分析用のｃｆＤＮＡ投入物を単一の分析可能なｃｆＤＮＡのプールから採取するのではなく、単一の試料から複数の分析可能なプールを創出し、組み合わせ（すなわちプーリングし）、組み合わされた分析可能なｃｆＤＮＡのプールからｃｆＤＮＡ投入物を採取した。詳解したように、ＮＧＳ分析に使用したｃｆＤＮＡの量は、ほぼ２０ｎｇに増加させた。ＮＧＳ分析のために２５サイクルの増幅を使用して生成された単一の分析可能なｃｆＤＮＡのプールから取り出したｃｆＤＮＡ試料を使用することと、ＮＧＳ分析のために１８サイクルの増幅を使用して生成された４つの別々の分析可能なｃｆＤＮＡのプールを組み合わせたプールから取り出したｃｆＤＮＡ試料を使用することの対比により、ＮＧＳカバレッジ及びＮＧＳ均一性を比較した。
【０３３８】
この実施例では、プロトコルＡに従ってＣＧＤ法を行った。この実施例のための試料は、対象から採取した血漿試料であった。プロトコルＡに記載されるように血漿試料を処理して、分析可能なｃｆＤＮＡプールを生成した。記載されるように、分析可能なｃｆＤＮＡのプールをＮＧＳ分析に供した。改良したＣＧＤ法（ＣＧＤ２と表記する）では、１８サイクルの増幅を使用して分析可能なｃｆＤＮＡのプールを生成し、４つの別々の分析可能なｃｆＤＮＡのプールを組み合わせたプールからＮＧＳ分析用のｃｆＤＮＡ試料を取り出した。明確化のために付言すると、比較のＣＧＤ法（ＣＧＤ１と称される）では、２５サイクルの増幅を使用して分析可能なｃｆＤＮＡのプールを生成し、単一の分析可能なｃｆＤＮＡのプールからＮＧＳ分析用のｃｆＤＮＡ試料を取り出した。
【０３３９】
この結果を表２０に示し、ＮＧＳカバレッジ、ＮＧＳ均一性、及び組み合わされた分析可能なｃｆＤＮＡのプールを使用したＮＧＳ均一性の改善率を報告する。以下に示されるように、分析可能なｃｆＤＮＡのプールを組み合わせると、ＮＧＳ均一性が一貫して増加した。さらに、試料１４は、単一の分析可能なｃｆＤＮＡプール及び組み合わされた分析可能なｃｆＤＮＡプールの両方をＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＮＧＳによって分析したときのＣＧＤ法の再現性を示す。
【表２４】
2018530347.tif 000042
2018530347.tif 000043
【０３４０】
実施例１９−ＣＧＤ法を使用したＲＮＡのＩＳＡ
本開示の方法は、ｃｆＲＮＡのＩＳＡのために使用することもできる。ｃｆＲＮＡのＩＳＡ方法では、標準的方法論を使用して、試料中のｃｆＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換する。次にこの二本鎖ＤＮＡを、試料中のｃｆＤＮＡと同じ様式で処置する。本開示の方法を使用するための例示的なプロトコルは、方法の節に提供されている。
【０３４１】
この実施例では、プロトコルＡに従ってＣＧＤ法を行った。この実施例のための試料は、単一の対象から採取した血漿試料であった。ｃｆＲＮＡをｃＤＮＡに変換するためのさらなるＤＮアーゼＩ及び逆転写ステップを用い、プロトコルＡに記載されるように血漿試料を処理して、分析可能なｃＤＮＡプールを生成した。記載されるように、分析可能なｃＤＮＡのプールをＮＧＳ分析に供した。
【０３４２】
図１２は、ｃｆＲＮＡから生成されたｃＤＮＡのＩＳＡの成功を例示する増幅プロットを示す。ＮＧＳ配列決定は９３３，６７４のリードをマッピングし、リードの９８．９１％がオンターゲットであった。平均ベースカバレッジ深度は４．０７２であり、ベースカバレッジの均一性は５９．５６％であった。この実施例は、ＣＧＤ法のｃｆＲＮＡへの適用の成功を例示する。
【図１Ａ】
2018530347.tif 000044
【図１Ｂ】
2018530347.tif 000045
【図２】
2018530347.tif 000046
【図３Ａ】
2018530347.tif 000047
【図３Ｂ】
2018530347.tif 000048
【図３Ｃ】
2018530347.tif 000049
【図４】
2018530347.tif 000050
【図５】
2018530347.tif 000051
【図６】
2018530347.tif 000052
【図７】
2018530347.tif 000053
【図８Ａ】
2018530347.tif 000054
【図８Ｂ】
2018530347.tif 000055
【図９Ａ】
2018530347.tif 000056
【図９Ｂ】
2018530347.tif 000057
【図１０】
2018530347.tif 000058
【図１１】
2018530347.tif 000059
【図１２】
2018530347.tif 000060
【配列表】
2018530347000001.app
【国際調査報告】
2018530347.tif 000061
2018530347.tif 000062