(57)【要約】  本開示は、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインなどのＴＳＬＰ結合タンパク質、そのようなＴＳＬＰ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ＴＳＬＰ結合タンパク質を含んでなる医薬組成物およびキット、ならびに製造方法に関する。本発明はまた、喘息などのＴＳＬＰシグナル伝達に関連する疾患の処置における、このようなＴＳＬＰ結合タンパク質の使用に関する。
2018509153.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．配列番号９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはこれらのＣＤＲのいずれか１つもしくは総ての変異体、ここで、前記ＣＤＲ変異体は１、２または３つのアミノ酸修飾を有する；あるいは
ｂ．配列番号９の配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列
を含んでなり、５ｎＭ以下のＩＣ５０を有する、ＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項２】
ＣＤＲ１の変異体において、配列番号９の残基２８に相当する残基がＰｒｏであり、配列番号９の残基３０に相当する残基がＡｒｇであり、配列番号９の残基３１に相当する残基がＡｓｎであり、配列番号９の残基３２に相当する残基がＴｒｐであり、かつ、配列番号９の残基３４に相当する残基がＡｓｐであり；ＣＤＲ２の変異体において、配列番号９の残基５０に相当する残基がＧｌｙであり、配列番号９の残基５３に相当する残基がＨｉｓであり、かつ、配列番号９の残基５５に相当する残基がＧｌｎであり；かつ、ＣＤＲ３の変異体において、配列番号９の残基９１に相当する残基がＩｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＰｈｅであり、配列番号９の残基９２に相当する残基がＧｌｙまたはＡｌａであり、配列番号９の残基９３に相当する残基がＧｌｕ、Ｐｈｅ、ＡｓｐまたはＳｅｒであり、かつ、配列番号９の残基９４に相当する残基がＡｓｐである、請求項１に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項３】
ＣＤＲ２の変異体において、配列番号９の残基４６に相当する残基がＬｅｕである、請求項２に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項４】
ＣＤＲ３が配列Ｘ１ＧｌｎＸ２Ｘ３Ｘ４ＡｓｐＰｒｏＸ５Ｔｈｒからなり、配列中、Ｘ１はＬｙｓ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、ＭｅｔまたはＩｌｅを表し、Ｘ２はＶａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＰｈｅを表し、Ｘ３はＧｌｙまたはＡｌａを表し、Ｘ４はＧｌｕ、Ｐｈｅ、ＡｓｐまたはＳｅｒを表し、かつ、Ｘ５はＶａｌまたはＴｈｒを表す、請求項２または３に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項５】
ヒトおよびカニクイザルＴＳＬＰを用いたＩＣ５０に５倍以下の差を示し、かつ、配列番号９の残基９１に相当する残基がＩｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌである、請求項２または３に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項６】
ＣＤＲ３が配列Ｘ１ＧｌｎＸ２Ｘ３Ｘ４ＡｓｐＰｒｏＸ５Ｔｈｒからなり、配列中、Ｘ１はＬｙｓ、Ｔｒｐ、ＶａｌまたはＭｅｔを表し、Ｘ２はＶａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅを表し、Ｘ３はＧｌｙまたはＡｌａを表し、Ｘ４はＧｌｕ、Ｐｈｅ、ＡｓｐまたはＳｅｒを表し、かつ、Ｘ５はＶａｌまたはＴｈｒを表す、請求項５に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項７】
配列番号９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでなる、請求項１に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項８】
ＣＤＲ１が配列番号１として定義される配列からなり、ＣＤＲ２が配列番号４として定義される配列からなり、かつ、ＣＤＲ３が配列番号７として定義される配列からなる、請求項７に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項９】
ＣＤＲ１が配列番号１として定義される配列からなり、ＣＤＲ２が配列番号５として定義される配列からなり、かつ、ＣＤＲ３が配列番号７として定義される配列からなる、請求項７に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項１０】
全長ヒトＴＳＬＰと２ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で結合する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項１１】
全長ヒトＴＳＬＰとの結合をめぐって配列番号９の単一可変ドメインと競合する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項１２】
ＩＬ−７と有意な結合を示さない、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項１３】
単一可変ドメインである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項１４】
前記単一可変ドメインがＶκ単一可変ドメインである、請求項１３に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項１５】
前記Ｖκ単一可変ドメインが、ＲＴで終わるＣ末端を有する、請求項１４に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項１６】
前記Ｖκ単一可変ドメインがＲで終わらないＣ末端を有する、請求項１４に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項１７】
配列番号９の残基２７に相当する残基がＡｒｇであり、配列番号９の残基２９に相当する残基がＩｌｅであり、配列番号９の残基８９に相当する残基がＶａｌであり、かつ、配列番号９の残基９６に相当する残基がＶａｌである、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項１８】
配列番号９の残基４９に相当する残基がＴｒｐである、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項１９】
配列番号９の残基３６に相当する残基がＴｙｒであり、配列番号９の残基３８に相当する残基がＧｌｎであり、配列番号９の残基４４に相当する残基がＰｒｏであり、配列番号９の残基６７に相当する残基がＳｅｒであり、配列番号９の残基８７に相当する残基がＴｙｒであり、配列番号９の残基９８に相当する残基がＰｈｅであり、配列番号９の残基１００に相当する残基がＧｌｎである、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項２０】
配列番号９のアミノ酸配列からなる、ＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に定義されるＴＳＬＰ結合タンパク質をコードする、単離された核酸。
【請求項２２】
配列番号１０または配列番号１１からなる、請求項２１に記載の単離された核酸分子。
【請求項２３】
請求項２１または２２に定義される核酸分子を含んでなる、ベクター。
【請求項２４】
請求項２１もしくは２２に定義される核酸または請求項２３に定義されるベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項２５】
請求項１〜２０のいずれか一項に定義されるＴＳＬＰ結合タンパク質を製造する方法であって、請求項２４に定義される宿主細胞を前記核酸またはベクターの発現に好適な条件下で維持し、それにより、ＴＳＬＰ結合タンパク質が生産されることを含んでなる、方法。
【請求項２６】
薬剤として使用するための、請求項１〜２０のいずれか一項に定義されるＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項２７】
ＴＳＬＰシグナル伝達に関連する疾患の治療に使用するための、請求項１〜２０のいずれか一項に定義されるＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項２８】
ＴＳＬＰシグナル伝達に関連する疾患の処置のための薬剤の製造における、請求項１〜２０のいずれか一項に定義されるＴＳＬＰ結合タンパク質の使用。
【請求項２９】
必要とするヒト患者においてＴＳＬＰシグナル伝達に関連する疾患を処置する方法であって、請求項１〜２０のいずれか一項に定義されるＴＳＬＰ結合タンパク質を前記ヒト患者に投与することを含んでなる、方法。
【請求項３０】
前記ＴＳＬＰシグナル伝達に関連する疾患が、喘息、特発性肺線維症、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、ネザートン症候群、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、食物アレルギー、アレルギー性下痢、好酸球性胃腸炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）、アレルギー性真菌性副鼻腔炎、癌、関節リウマチ、ＣＯＰＤ、全身性硬化症、ケロイド、潰瘍性大腸炎、慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳ）、鼻ポリープ、慢性好酸球性肺炎、好酸球性気管支炎、小児脂肪便症、チャーグ−ストラウス症候群、好酸球性筋痛症候群、好酸球増多症候群、多発血管炎性好酸球性肉芽腫症および炎症性腸疾患からなる群から選択される、請求項２７に記載の使用のためのＴＳＬＰ結合タンパク質、または請求項２８に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質の使用、または請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＴＳＬＰシグナル伝達に関連する疾患が、喘息、特発性肺線維症、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、ネザートン症候群、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、食物アレルギー、アレルギー性下痢、好酸球性胃腸炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）、アレルギー性真菌性副鼻腔炎、癌、関節リウマチ、ＣＯＰＤ、全身性硬化症、ケロイド、潰瘍性大腸炎、慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳ）および鼻ポリープからなる群から選択される、請求項３０に記載の使用のためのＴＳＬＰ結合タンパク質、または請求項３０に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質の使用、または請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＴＳＬＰシグナル伝達に関連する疾患が喘息である、請求項３１に記載の使用のためのＴＳＬＰ結合タンパク質、または請求項３１に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質の使用、または請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載にＴＳＬＰ結合タンパク質を含んでなり、１種類以上の薬学上許容可能な賦形剤および／または担体を含んでいてもよい、医薬組成物。
【請求項３４】
請求項１〜２０のいずれか一項に定義されるＴＳＬＰ結合タンパク質と、前記ＴＳＬＰ結合タンパク質を吸入するためのデバイスとを含んでなる、キット。
【請求項３５】
全長ヒトＴＳＬＰの以下の残基：Ｔｙｒ１５、Ｌｙｓ３１、Ｓｅｒ３２、Ｔｈｒ３３、Ｐｈｅ３５、Ａｓｎ３６、Ａｓｎ３７、Ｓｅｒ４０、Ｃｙｓ４１、Ｓｅｒ４２、Ｓｅｒ１１４、Ｇｌｎ１１５、Ｇｌｎ１１７、Ｇｌｙ１１８、Ａｒｇ１２１、Ａｒｇ１２２、Ａｒｇ１２５、Ｐｒｏ１２６、Ｌｅｕ１２８およびＬｙｓ１２９を含んでなるエピトープと結合する、ＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項３６】
エピトープが、以下の残基：Ｓｅｒ２０、Ｉｌｅ２４、Ｇｌｕ３４、Ｔｈｒ３８、Ｖａｌ３９、Ａｓｎ４３、Ｈｉｓ４６、Ａｓｎ１２４およびＬｅｕ１２７をさらに含んでなる、請求項３５に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項３７】
抗体である、請求項３５または３６に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項３８】
単一可変ドメインである、請求項３５または３６に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項３９】
Ｖκドメインである、請求項３８に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【請求項４０】
ＩＬ−７と有意な結合を示さない、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインなどのＴＳＬＰ結合タンパク質、そのようなＴＳＬＰ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ＴＳＬＰ結合タンパク質を含んでなる医薬組成物およびキット、ならびに製造方法に関する。本発明はまた、喘息などのＴＳＬＰシグナル伝達に関連する疾患の処置における、このようなＴＳＬＰ結合タンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
全長胸腺間質リンホポエチン（ＴＳＬＰ）は、当初、Ｂ細胞前駆体の増殖を誘導し得る、マウス胸腺間質細胞由来の上清中の因子として同定された(Friend, et al., Exp Hematol. 22(3):321, 1994)。マウスタンパク質は後に同定され(Sims. et al., J Exp Med. 2000 Sep 4;192(5):671-80)、そのすぐ後、２００１年に２つの別のグループによりヒトＴＳＬＰが同定された(Quentmeier, et al., Leukemia. 2001 Aug;15(8):1286-92, Reche, et al.. J Immunol. 2001 Jul 1;167(1):336-43)。
【０００３】
全長ＴＳＬＰは、ＩＬ−７ＲαとユニークなＴＳＬＰＲ鎖（ＣＲＦＬ２）からなるヘテロ二量体受容体複合体である機能的ＴＳＬＰ受容体（ＴＳＬＰＲ）を介してシグナル伝達兼転写活性化因子(Signal Transducer and Activator of Transcription)（ＳＴＡＴ５）のリン酸化を誘導する単鎖４α−ヘリカルバンドルサイトカインである(Park et al, JEM 192(5):659-682 (2002)。加えて、ヒト細胞では選択的転写開始部位から発現されるショートアイソフォーム型のＴＳＬＰ（ｓｆＴＳＬＰ）が発現されると思われるが、これはＳＴＡＴ５を活性化するとは思われず、全長ＴＳＬＰとは異なる働きを果たす可能性がある(Bjerkan et al., Mucosal immunology 8(1) 49-56 (2015))。
【０００４】
ＴＳＬＰは、皮膚、消化管、および肺の障壁表面を裏打ちしている上皮細胞および間質細胞により最も多く生産されるが、アレルギー性疾患に関与する他の細胞種（例えば、樹状細胞、肥満細胞、平滑筋細胞）によっても生産される。生産は、プロテアーゼアレルゲン(Kouzaki et al, J Immunol. 183(2):1427-34 (2009))、ウイルス、細菌、炎症性メディエーター、煙草の煙および環境粒子(Bleck et al, J Clin Immunol 28(2):147-156 (2008))を含むいくつかの因子に曝された際に誘導される。
【０００５】
ＴＳＬＰは、広範な細胞種（例えば、樹状細胞、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、好酸球、好塩基球、肥満細胞および２型自然リンパ球（ＩＬＣ２）(Mjosberg et al, Immunity 37(4):649-59 (2012))で炎症、および特に、２型炎症（サイトカインＩＬ−５、ＩＬ−１３およびＩＬ−４の生産を特徴とする）を誘導する働きをする。２型炎症は、喘息、ならびにアトピー性皮膚炎およびネザートン症候群などの他のアレルギー性疾患の特徴である。ＴＳＬＰは、動物において線維芽細胞の蓄積およびコラーゲンの沈着を誘導することが分かっており、線維性疾患の増進における付加的な役割が証明されている。
【０００６】
アレルギー性疾患の発症および持続におけるＴＳＬＰの重要な役割は、前臨床動物モデルデータにより裏づけられる。ＴＳＬＰシグナル伝達を欠損するマウスは、喘息の発症に耐性があり(Zhou et al, Nat Immunol 6(10): 1047-1053 (2005))、抗体によるＴＳＬＰまたはその受容体の中和は、マウスまたは霊長類喘息または鼻炎モデルにおいて効果的である。例えば、霊長類喘息モデル（ブタ回虫(Ascaris suum)抗原に自然に感作しているカニクイザル）においてＴＳＬＰを抗ＴＳＬＰＲ  ｍＡｂで遮断すると、好酸球増多症の気道抵抗およびＩＬ−１３レベルが低下した(Cheng et al, Journal of Allergy and Clinical Immunology 132(2):455-462 (2013))。
【０００７】
ＴＳＬＰは、喘息患者の肺の上皮および固有層において、高用量の吸入コルチコステロイドを摂取している患者であっても、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方で過剰発現される(Ying et al. J Immunol. 181(4):2790-2798 (2008); Shikotra et al. J Allergy Clin Immunol. 129(1):104-111 (2012); Kaur et al. Chest. 142(1):76-85 (2012))。喘息におけるＴＳＬＰの重要性を強く裏づけるデータは、軽度喘息患者でのアレルゲン投与試験における抗ＴＳＬＰモノクローナル抗体（ＡＭＧ−１５７／ＭＥＤＩ９９２９）の有効性から来ている(Gavreau et al, N Engl J Med. 370(22):2102-2110 (2014)。ＡＭＧ−１５７による６週間または１２週間の処置後（１か月に１回の投与）、ＦＥＶ１、ならびに血液および痰の好酸球総数、およびＦｅＮＯレベルの変化によって測定される初期および後期応答に有意な効果が視られた。
【０００８】
喘息は、世界で推定３億人を侵している一般的な慢性疾患であり、症状は、疾患の重篤度に応じ、気管支拡張薬（例えば、β２−アドレナリン受容体作用薬）および吸入または経口コルチコステロイドを用いて、多くの患者で制御可能である。しかしながら、多数の中等度および重症の喘息患者は症候性が持続し、制御が不十分で、生活の質に影響を及ぼし、多大な医療負担となっている。特に、重症喘息を有する多くの患者は、高用量のステロイドにも不応であるか、または十分に応答ない場合がある。
【０００９】
オマリズマブ（ゾレア(Xolair)（商標））は、ヒト化ＩｇＧ１  ｍＡｂ標的間可溶性ＩｇＥであり、皮膚試験陽性であるかまたは通年の空中アレルゲンにｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応性があり、その症状が吸入コルチコステロイドで十分に制御されない、中等度〜重度の持続性喘息を有する成人および青年（１２歳以上）の処置に承認されている。現行療法の補助として使用される場合、それは増悪を軽減することが証明されている(Busse et al Curr Med Res Opin. 2007 Oct;23(10):2379-86)。しかしながら、オマリズマブは総ての喘息患者に好適であるわけではなく、その使用は、血清ＩｇＥ  ３０〜７００ＩＵ／ｍｌなどの特に定義された基準を満たす患者に限定される。
【００１０】
よって、既存の標準療法では制御されない患者のために、単独療法であるか、または付加療法として使用され得る新規な喘息治療の多大な必要がある。
【発明の概要】
【００１１】
１つの実施態様では、本発明は、配列番号９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはこれらのＣＤＲのいずれか１つもしくは総ての変異体（ここで、前記ＣＤＲ変異体は、１、２または３個のアミノ酸修飾を有する）；または配列番号９の配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配を含んでなる、ＴＳＬＰ結合タンパク質を提供する。
【００１２】
ＣＤＲ変異体は、少なくとも１個のアミノ酸で修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾はアミノ酸配列の化学的変更または部分的変更であり得、その修飾は変異体に非修飾配列の生物学的特徴を保持させる。ＣＤＲアミノ酸配列の部分的変更は、１以上のアミノ酸の欠失もしくは置換、または１以上のアミノ酸の付加もしくは挿入、またはそれらの組合せによるものであり得る。ＣＤＲ変異体は、そのアミノ酸配列に１、２または３個のアミノ酸の置換、付加または欠失を任意の組合せで含み得る。
【００１３】
典型的には、修飾は、置換または例えば以下の表１に示されるような保存的置換である。１つの実施態様では、ＣＤＲは、３個までのアミノ酸、例えば、１または２個のアミノ酸、例えば、１個のアミノ酸の置換で修飾される。ある実施態様では、３つのＣＤＲのそれぞれが他の２つのＣＤＲとは独立に、２、１または０個のアミノ酸残基で修飾される。
【００１４】
【表１】
2018509153.tif 000003
【００１５】
特定のＣＤＲ１変異体では、配列番号９の残基２８に相当する残基はＰｒｏであり、配列番号９の残基３０に相当する残基はＡｒｇであり、配列番号９の残基３１に相当する残基はＡｓｎであり、配列番号９の残基３２に相当する残基はＴｒｐであり、かつ、配列番号９の残基３４に相当する残基はＡｓｐである。特定のＣＤＲ２変異体では、配列番号９の残基５０に相当する残基はＧｌｙであり、配列番号９の残基５３に相当する残基はＨｉｓであり、かつ、配列番号９の残基５５に相当する残基はＧｌｎである。より特定のＣＤＲ２変異体では、以上に特定された残基に加え、配列番号９の残基４６に相当する残基はＬｅｕである。特定のＣＤＲ３変異体では、配列番号９の残基９１に相当する残基はＩｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＰｈｅであり、配列番号９の残基９２に相当する残基はＧｌｙまたはＡｌａであり、配列番号９の残基９３に相当する残基はＧｌｕ、Ｐｈｅ、ＡｓｐまたはＳｅｒであり、かつ、配列番号９の残基９４に相当する残基はＡｓｐである。より特定のＣＤＲ３変異体では、配列番号９の残基９１に相当する残基はＩｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌである。
【００１６】
１つの実施態様では、ＣＤＲ３は配列Ｘ１ＧｌｎＸ２Ｘ３Ｘ４ＡｓｐＰｒｏＸ５Ｔｈｒからなり、配列中、Ｘ１はＬｙｓ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、ＭｅｔまたはＩｌｅを表し、Ｘ２はＶａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＰｈｅを表し、Ｘ３はＧｌｙまたはＡｌａを表し、Ｘ４はＧｌｕ、Ｐｈｅ、ＡｓｐまたはＳｅｒを表し、かつ、Ｘ５はＶａｌまたはＴｈｒを表す。より詳しくは、配列Ｘ１ＧｌｎＸ２Ｘ３Ｘ４ＡｓｐＰｒｏＸ５Ｔｈｒからなり、配列中、Ｘ１はＬｙｓ、Ｔｒｐ、ＶａｌまたはＭｅｔを表し、Ｘ２はＶａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅを表し、Ｘ３はＧｌｙまたはＡｌａを表し、Ｘ４はＧｌｕ、Ｐｈｅ、ＡｓｐまたはＳｅｒを表し、かつ、Ｘ５はＶａｌまたはＴｈｒを表す。
【００１７】
より特定の実施態様では、ＴＳＬＰ結合タンパク質は、配列番号９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでなる。
【００１８】
以上の実施態様において、ＣＤＲは、任意のナンバリング規則、例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭおよびＣｏｎｔａｃｔ規則により定義することができる。あるいは、ＣＤＲは、最小結合単位（Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭおよびＣｏｎｔａｃｔ定義によりＣＤＲの一部を形成する残基）であり得る。各方法により定義される配列番号９に関するＣＤＲ領域を表２に示す。熟練の読者は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のそれぞれは異なるナンバリング規則によって定義可能であること、または２つ以上のＣＤＲが同じナンバリング規則によって定義可能であることを理解するであろう。
【００１９】
【表２】
2018509153.tif 000004
【００２０】
以上の結合タンパク質の特定の実施態様では、総てのＣＤＲがＫａｂａｔナンバリング規則に従って定義され、従って、ＣＤＲ１は、配列番号１として定義される配列またはその変異体からなり、ＣＤＲ２は、配列番号４として定義される配列またはその変異体からなり、かつ、ＣＤＲ３は、配列番号７として定義される配列またはその変異体からなる（許容されるバリエーションは上記で概説）。より特定の実施態様では、総てのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリング規則に従って定義され、従って、ＣＤＲ１は、配列番号１として定義される配列からなり、ＣＤＲ２は、配列番号４として定義される配列からなり、かつ、ＣＤＲ３は、配列番号７として定義される配列からなる。
【００２１】
別の実施態様では、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔナンバリング規則に従って定義され、従って、ＣＤＲ１は、配列番号１として定義される配列またはその変異体からなり、かつ、ＣＤＲ３は、配列番号７として定義される配列またはその変異体からなり、かつ、ＣＤＲ２は、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングシステムに従って定義され、従って、それは配列番号５で定義される配列またはその変異体からなる。より特定の実施態様では、ＣＤＲ１は、配列番号１として定義される配列からなり、ＣＤＲ３は、配列番号７として定義される配列からなり、かつ、ＣＤＲ２は、配列番号５で定義される配列からなる。
【００２２】
より特定の実施態様では、ＴＳＬＰ結合タンパク質は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでなり、
（ｉ）ＣＤＲ１は、配列番号９に示される通りであるか、またはＩｌｅ２９のＶａｌでの置換およびＬｅｕ３３のＭｅｔ、Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＰｈｅでの置換から選択される１以上の置換を有するこの配列の変異体であり、
（ｉｉ）ＣＤＲ２は、配列番号９に示される通りであるか、またはＡｌａ５１がＴｈｒで置換されたこの配列の変異体であり、かつ、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、配列番号９に示される通りであるか、またはＶａｌ８９のＧｌｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＰｈｅまたはＬｅｕでの置換；Ｇｌｎ９０のＡｓｎまたはＨｉｓでの置換；Ｉｌｅ９１のＶａｌまたはＰｈｅでの置換；Ｇｌｙ９３のＡｌａでの置換；Ｇｌｕ９３のＳｅｒでの置換；Ａｓｐ９４のＧｌｕでの置換；Ｖａｌ９６のＰｒｏ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、ＴｒｐまたはＰｈｅでの置換から選択される１以上の置換を有するこの配列の変異体である。
【００２３】
本発明の文脈において、用語「での置換」は、例えば「Ｉｌｅ２９のＶａｌでの置換」という句で、最初に記載された残基（この場合、Ｉｌｅ２９）の、次に記載された残基（この場合、Ｖａｌ）での置換を意味する。
【００２４】
以上の結合タンパク質の特定の実施態様では、ＴＳＬＰ結合タンパク質は、５ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。例えば、本発明は、配列番号９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３またはこれらのＣＤＲのいずれか１つもしくは総ての変異体、ここで、前記ＣＤＲ変異体は１、２、または３個のアミノ酸修飾を有する；または配列番号９の配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでなり；５ｎＭ以下のＩＣ５０を有するＴＳＬＰ結合タンパク質を提供する。
【００２５】
ＩＣ５０は、当技術分野で公知の方法により、例えば、実施例１に記載の受容体結合アッセイもしくは実施例２に記載の細胞アッセイで、または実施例５に記載のヒト全血アッセイでＴＳＬＰにより誘導されるＴＡＲＣ（ＣＣＬ１７）の阻害によって測定することができる。１つの実施態様では、ＩＣ５０は、実施例２に記載の細胞アッセイにより測定される。当業者は、異なる試験から計算されたＩＣ５０の個々の値には変動があることを認識するであろう。１つの実施態様では、ＩＣ５０値は、少なくとも３回の試験から計算された平均である。別の実施態様では、ＩＣ５０値は、少なくとも３回の試験から計算された幾何平均である。
【００２６】
以上の結合タンパク質の特定の実施態様では、ＴＳＬＰ結合タンパク質は、全長ヒトＴＳＬＰと２ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で結合する。１つの実施態様では、ＫＤ値は、少なくとも３回の試験から計算された平均である。
【００２７】
以上の結合タンパク質の特定の実施態様では、ＴＳＬＰ結合タンパク質は、ＩＬ−７と有意な結合を示さない（１つの実施態様では、結合しない）。結合親和性は、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））、または動態法（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）分析）によって決定することができる。
【００２８】
以上の結合タンパク質の特定の実施態様では、ＴＳＬＰ結合タンパク質は、全長ヒトＴＳＬＰとの結合をめぐって配列番号９の単一可変ドメインと競合する。
【００２９】
以上の結合タンパク質のいずれか１つの実施態様では、ＴＳＬＰ結合タンパク質は、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインである。特定の実施態様では、単一可変ドメインはＶＬドメインである。特定の実施態様では、ＶＬドメインはＶκドメインである。
【００３０】
ＴＳＬＰ結合タンパク質がＶκドメインである１つの実施態様では、配列番号９の残基２７に相当する残基はＡｒｇであり、配列番号９の残基２９に相当する残基はＩｌｅであり、配列番号９の残基８９に相当する残基はＶａｌであり、かつ、配列番号９の残基９６に相当する残基はＶａｌである。１つの実施態様では、配列番号９の残基４９に相当する残基はＴｒｐである。１つの実施態様では、配列番号９の残基３６に相当する残基はＴｙｒであり、配列番号９の残基３８に相当する残基はＧｌｎであり、配列番号９の残基４４に相当する残基はＰｒｏであり、配列番号９の残基６７に相当する残基はＳｅｒであり、配列番号９の残基８７に相当する残基はＴｙｒであり、配列番号９の残基９８に相当する残基はＰｈｅであり、かつ、配列番号９の残基１００に相当する残基はＧｌｎである。
【００３１】
より特定の実施態様では、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインは、配列番号９として定義される配列、または１０個までのアミノ酸の付加、欠失もしくは置換（ただし、これらの付加、欠失、もしくは置換は、配列番号９の残基２８、３０、３１、３２、３４、５０、５３、５５、９１、９２、９３および９４に相当する位置にない）を有することで異なる配列番号９の変異体からなる。より詳しくは、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインは、配列番号９として定義される配列、または１０個までのアミノ酸の付加、欠失もしくは置換（ただし、これらの付加、欠失、もしくは置換は、配列番号９の２７、２８、２９、３０、３１、３２、３４、５０、５３、５５、８９、９１、９２、９３、９４および９６に相当する位置にない）を有することで異なる配列番号９の変異体からなる。いっそうより詳しくは、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインは、配列番号９として定義される配列、または１０個までのアミノ酸の付加、欠失もしくは置換（ただし、これらの付加、欠失、もしくは置換は、配列番号９の残基２７、２８、２９、３０、３１、３２、３４、４６、４９、５０、５３、５５、８９、９１、９２、９３、９４および９６に相当する位置にない）を有することで異なる配列番号９の変異体からなる。より詳しくは、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインは、配列番号９として定義される配列、または１０個までのアミノ酸の付加、欠失もしくは置換（ただし、これらの付加、欠失、もしくは置換は、配列番号９の残基２７、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３６、３８、４４、４６、４９、５０、５３、５５、８７、８９、９１、９２、９３、９４、９６、９８および１００に相当する位置にない）を有することで異なる配列番号９の変異体からなる。より詳しくは、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインは、配列番号９として定義される配列、または１０個までのアミノ酸の付加、欠失もしくは置換（ただし、これらの付加、欠失、もしくは置換は、配列番号９の残基２７、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３６、３８、４４、４６、４９、５０、５３、５５、６７、８７、８９、９１、９２、９３、９４、９６、９８および１００に相当する位置にない）を有することで異なる配列番号９の変異体からなる。上記の抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインのいっそうより特定の実施態様では、ＣＤＲは上記の実施態様のいずれかに記載の通りに定義される。
【００３２】
当業者には、配列番号９の変異体は１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸の置換、付加または欠失を任意の組合せで含み得ることは認識されるであろう。一般に、修飾は置換である。１つの実施態様では、配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸の置換により修飾される。より特定の実施態様では、修飾は、保存的置換（あるアミノ酸残基の、表２の同じ群の別の残基での置換）である。
【００３３】
別の実施態様では、ＴＳＬＰ結合タンパク質（抗ＴＳＬＰ単一可変ドメイン）は、配列番号９として定義される配列、または配列番号９の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列からなる。より特定の実施態様では、配列番号９との同一性パーセンテージは、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９以上である。
【００３４】
クエリアミノ酸配列とサブジェクトアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、ペアワイズＢＬＡＳＴＰアラインメントが実施された後にサブジェクトアミノ酸配列がクエリアミノ酸配列と１００％のクエリカバー率を有する場合にＢＬＡＳＴＰアルゴリズムにより計算される、パーセンテージとして表される同一性値である。このようなクエリアミノ酸配列とサブジェクトアミノ酸配列の間のペアワイズＢＬＡＳＴＰアラインメントは、National Center for Biotechnology Instituteのウェブサイトで利用可能なデフォルト設定のＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用い、低複雑性領域のフィルターをオフにして実施される。
【００３５】
同一性パーセンテージは、クエリ配列の全長にわたって決定してもよい。あるいは、同一性パーセンテージは、固定された／そのままの特定の残基を除外してもよい。１つの実施態様では、配列番号９の２８、３０、３１、３２、３４、４９、５０、５３、５５、９１、９２、９３および９４番に相当する残基は固定されている。より特定の実施態様では、配列番号９の２７、２８、２９、３０、３１、３２、３４、５０、５３、５５、８９、９１、９２、９３および９６番に相当する残基は固定されている。いっそうより詳しくは、配列番号９の２７、２８、２９、３０、３１、３２、３４、４６、４９、５０、５３、５５、８９、９１、９２、９３、９４および９６番に相当する残基は固定されている。いっそうより詳しくは、配列番号９の２７、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３６、３８、４４、４６、４９、５０、５３、５５、８７、８９、９１、９２、９３、９４、９６、９８および１００番に相当する残基は固定されている。より詳しくは、配列番号９の２７、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３６、３８、４４、４６、４９、５０、５３、５５、６７、８７、８９、９１、９２、９３、９４、９６、９８および１００番に相当する残基は固定されている。１つの実施態様では、固定された位置を除外する配列番号９との同一性パーセンテージは、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９以上である。
【００３６】
別の実施態様では、同一性パーセンテージは、ＣＤＲ（上記実施態様のいずれかに記載の通りに定義され得る）および配列番号９の４９番に相当する残基を除外してもよい。より詳しくは、同一性パーセンテージは、ＣＤＲ（上記実施態様のいずれかに記載の通りに定義され得る）および配列番号９の３６、３８、４４、４６、４９、８７、９８および１００番に相当する残基を除外してもよい。いっそうより詳しくは、同一性パーセンテージは、ＣＤＲ（上記実施態様のいずれかに記載の通りに定義され得る）および配列番号９の３６、３８、４４、４６、４９、６７、８７、９８および１００番に相当する残基を除外してもよい。１つの実施態様では、固定された位置を除外する配列番号９との同一性パーセンテージは、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９以上である。
【００３７】
１つの実施態様では、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインは、配列番号９として定義されるアミノ酸配列からなる。
【００３８】
１つの実施態様では、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインは、配列番号１２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる。より特定の実施態様では、アミノ酸配列は、ＲＴで終わるＣ末端を有する。別の実施態様では、アミノ酸配列は、Ｒで終わらないＣ末端を有する。
【００３９】
１つの実施態様では、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインは、配列番号１２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
【００４０】
１つの実施態様では、上記の抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインを含んでなるポリペプチドが提供される。
【００４１】
別の態様では、本発明は、特定のエピトープと結合するＴＳＬＰ結合タンパク質を提供する。１つの実施態様では、特定のＴＳＬＰ結合タンパク質に対するエピトープ残基は、Ｑｔ−ＰＩＳＡ  ｖ２．０．１ソフトウエア（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ、ＣｏｍｐｌｅｘｅｓおよびＡｓｓｅｍｂｌｉｅｓ；ＫｒｉｓｓｉｎｅｌおよびＨｅｎｒｉｃｋ（２００７）を用い、ＴＳＬＰ結合タンパク質との結合時に露出表面積の２０％以上が埋もれるようになる、全長ヒトＴＳＬＰ上の残基であるとして同定され得る。よって、エピトープ残基は、全長ヒトＴＳＬＰの以下の残基：Ｔｙｒ１５、Ｌｙｓ３１、Ｓｅｒ３２、Ｔｈｒ３３、Ｐｈｅ３５、Ａｓｎ３６、Ａｓｎ３７、Ｓｅｒ４０、Ｃｙｓ４１、Ｓｅｒ４２、Ｓｅｒ１１４、Ｇｌｎ１１５、Ｇｌｎ１１７、Ｇｌｙ１１８、Ａｒｇ１２１、Ａｒｇ１２２、Ａｒｇ１２５、Ｐｒｏ１２６、Ｌｅｕ１２８およびＬｙｓ１２９を含んでなり得る。別の実施態様では、特定のＴＳＬＰ結合タンパク質に対するエピトープ残基は、Ｑｔ−ＰＩＳＡ  ｖ２．０．１ソフトウエア（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ、ＣｏｍｐｌｅｘｅｓおよびＡｓｓｅｍｂｌｉｅｓ；ＫｒｉｓｓｉｎｅｌおよびＨｅｎｒｉｃｋ（２００７）を用い、ＴＳＬＰ結合との結合時に埋入表面積％に増加を示す、全長ヒトＴＳＬＰ上の残基であるとして同定され得る。よって、すでに同定されている残基に加え、エピトープ残基は、全長ヒトＴＳＬＰの以下の残基：Ｓｅｒ２０、Ｉｌｅ２４、Ｇｌｕ３４、Ｔｈｒ３８、Ｖａｌ３９、Ａｓｎ４３、Ｈｉｓ４６、Ａｓｎ１２４およびＬｅｕ１２７を含んでなり得る。
【００４２】
１つの実施態様では、上記のエピトープと結合するＴＳＬＰ結合タンパク質は、抗体である。より詳しくは、上記エピトープと結合するＴＳＬＰ結合タンパク質は、単一可変ドメインである。より特定の実施態様では、単一可変ドメインはＶＬドメインである。より詳しくは、ＶＬドメインはＶκドメインである。１つの実施態様では、上記のエピトープと結合する単一可変ドメインは、非天然型である。
【００４３】
特定の実施態様では、上記のエピトープと結合するＴＳＬＰ結合タンパク質は、ＩＬ−７と有意な結合を示さない（１つの実施態様では、結合しない）。結合親和性は、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））、または動態法（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）分析）によって決定することができる。
【００４４】
１つの実施態様では、本発明は、以下のＣＤＲ：配列番号９由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはこれらのＣＤＲのいずれか１つもしくは総ての変異体を含んでなり、ＴＳＬＰと２ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で結合するか、またはＴＳＬＰとの結合をめぐって配列番号９の単一可変ドメインと競合する、ＴＳＬＰ結合タンパク質を提供する。疑念を避けるため、ＴＳＬＰとの結合をめぐって配列番号９の単一可変ドメインと競合するＴＳＬＰ結合タンパク質もまた、配列番号９由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはこれらのＣＤＲのいずれか１つもしくは総ての変異体を有さなければならない。競合試験に使用されるＴＳＬＰは、１つの実施態様では、全長ヒトＴＳＬＰである。
【００４５】
より特定の実施態様では、本発明は、以下のＣＤＲ：配列番号９由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはこれらのＣＤＲのいずれか１つもしくは総ての変異体を含んでなり、ＴＳＬＰと２ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で結合し、かつ、およびＴＳＬＰとの結合をめぐって配列番号９の単一可変ドメインと競合する、ＴＳＬＰ結合タンパク質を提供する。
【００４６】
別の実施態様では、本発明は、
（ｉ）配列番号１のＣＤＲ１、またはＩｌｅ２９がＶａｌで置換され；Ｌｅｕ３３がＭｅｔ、Ｖａｌ、ＩｌｅもしくはＰｈｅで置換された配列番号１の変異体、
（ｉｉ）配列番号４のＣＤＲ２、またはＡｌａ５１がＴｈｒで置換された配列番号４の変異体、および
（ｉｉｉ）配列番号７のＣＤＲ３、またはＶａｌ８９はＧｌｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＰｈｅもしくはＬｅｕで置換され；Ｇｌｎ９０がＡｓｎもしくはＨｉｓで置換され；Ｉｌｅ９１はＰｈｅもしくはＶａｌで置換され；Ｇｌｕ９３がＳｅｒで置換され；Ｖａｌ９６がＰｒｏ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、ＴｒｐもしくはＰｈｅで置換された配列番号７の変異体
を含んでなり；かつ
ＴＳＬＰと２ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で結合することができ、かつ／またはＴＳＬＰとの結合をめぐって配列番号９の単一可変ドメインと競合するＴＳＬＰ結合タンパク質を提供する。
【００４７】
別の実施態様では、本発明は、１０個までのアミノ酸の置換、欠失または付加を任意の組合せで有する配列番号９のアミノ酸配列を含んでなり、ＴＳＬＰと２ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で結合し、かつ／またはＴＳＬＰとの結合をめぐって配列番号９の単一可変ドメインと競合する抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインを提供する。
【００４８】
さらに別の実施態様では、本発明は、本開示の抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインを含んでなり、ＴＳＬＰと結合する単離されたポリペプチドを提供する。
【００４９】
別の実施態様では、本発明は、本開示のＴＳＬＰ結合タンパク質、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメイン、またはポリペプチドをコードする核酸を、それを含んでなるベクターおよび宿主細胞、ならびにそれを作製するための方法とともに提供する。
【００５０】
さらに別の実施態様では、本発明は、本開示のＴＳＬＰ結合タンパク質、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメイン、またはポリペプチドを含んでなる医薬組成物を提供する。このようなポリペプチドまたは医薬組成物は、ＴＳＬＰシグナル伝達に関連する疾患の処置において使用可能である。
【００５１】
さらに別の実施態様では、本発明は、本開示のＴＳＬＰ結合タンパク質、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメイン、またはポリペプチドと、前記本開示のＴＳＬＰ結合タンパク質、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインまたはポリペプチドを吸入するためのデバイスとを含んでなるキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、抗ＴＳＬＰ  ｄＡｂの作製、最適化および特性決定を示すフローチャートである。
【図２】図２は、ｄＡｂｂの、既存のヒト抗Ｖκ（ＨＡＶＫ）抗体への結合を示すグラフである：ＤＯＭ−３０ｈ−４４０−８７、ＤＯＭ−３０ｈ−４４０−８８、ＤＯＭ−３０ｈ−４４０−９０およびＤＯＭ−３０ｈ−４４０−９１（Ｃ末端に−Ｒまたは＋Ｔ修飾を有するＶｋ  ｄＡｂ）は、ＤＴ０２−Ｋ−０４４−０８５（非修飾天然Ｃ末端）に比べて、既存のＨＡＶＫ抗体への結合が低下した。
【図３】図３は、ＤＯＭ−３０ｈ−４４０−８１／８６は組換えヒトＴＳＬＰ（１ｎｇ／ｍｌ）および天然ヒトＴＳＬＰ（ヒト肺線維芽細胞由来の上清）の、ＴＳＬＰ受容体複合体への結合を阻害したことを示すグラフである（ＴＳＬＰ受容体結合アッセイ（ＲＢＡ））。
【図４】図４は、ＤＯＭ−３０ｈ−４４０−８１／８６（−Ｒ  Ｃ末端）に対する既存の抗体を含有する健康ヒトドナー血清サンプルの頻度を、ＤＴ０２−Ｋ−０４４−０８５（非修飾天然Ｃ末端）と比較して示すグラフである。
【図５】図５は、１５０ＬスケールでのＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６の製造のための発酵プロセスを示すフローチャートである。
【図６】図６は、明澄化発酵培養液からのＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６の精製のための下流精製プロセスを示す。
【図７】図７は、ＴＳＬＰ−ＤＯＭ−３０ｈ−４４０−８１／８６（黒いリボン）のＸ線構造の、文献の複合体であるＴＳＬＰ／ＩＬ７Ｒα／ＴＳＬＰＲ複合体（ＰＤＢ：４ＮＮ７、より薄いグレーの影）との重ね合わせ。
【図８】図８は、ＴＳＬＰの個々の残基に関するＴＳＬＰ−ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６複合体形成時に埋もれる表面積率％を示す。
【図９】図９は、ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６の個々の残基に関するＴＳＬＰ−ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６複合体形成時に埋もれる表面積率％を示す。
【発明の具体的説明】
【００５３】
本開示は、ＴＳＬＰ結合タンパク質、特に、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメイン（抗ＴＳＬＰドメイン抗体またはｄＡｂ）に関する。本開示のＴＳＬＰ結合タンパク質を喘息および本明細書に記載の他の疾患の治療または予防のために理想的な候補とする重要な特徴／特性を以下に記載する。
【００５４】
大きさ：  抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインは、モノクローナル抗体ｆ（Ａｂ’）２またはｆＡｂフラグメントよりも小さく、従って、大きな分子に比べてより多数のアンタゴニストｄＡｂ分子が肺に送達され得る（タンパク質１ｍｇ当たり）ので、吸入送達用の治療薬として利点を有する。非修飾ドメイン抗体（Ｆｃドメインを欠く）は、腎臓の濾過により全身のコンパートメントから急速に排除され、従って、全身暴露を最小にしつつ肺暴露を最大にするための吸入送達に好適であり得る。
【００５５】
親和性／効力：  本発明の１つの実施態様は、ヒトＴＳＬＰの中和を可能とするための適切に高い親和性／効力の拮抗薬を提供する。親和性／効力が十分に高くなければ、本結合タンパク質はＴＳＬＰを効果的に中和しない可能性があり、かつ／または体内でＴＳＬＰを阻害するのに必要な用量は高くなり、達成可能性または商業的実行可能性がない可能性がある。本明細書に記載のｄＡｂ分子は、供試されるアッセイにおいてヒトＴＳＬＰの中和を提供する親和性／効力を有するように選択および最適化されており、これらのｄＡｂは、ヒトで、例えば、吸入送達後の肺において、ＴＳＬＰの中和に好適である。
【００５６】
機構：  ＴＳＬＰ受容体複合体は抗原提示細胞上に存在するので、本発明の１つの態様は、ＴＳＬＰ結合タンパク質はＴＳＬＰとＴＳＬＰ受容体複合体の結合を妨げることを示す。ＩＬ−７Ｒα鎖の動員を妨げることにより、またはＴＳＬＰＲ（またはＩＬ−７Ｒα）と直接結合することにより働くＴＳＬＰ拮抗薬は、ＴＳＬＰと結合して溶液中にＴＳＬＰとの複合体として留まるＴＳＬＰ拮抗薬よりも有効に抗原として内部移行されプロセシングを受ける可能性がある。実施例１４および図７は、ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６はＴＳＬＰとＴＳＬＰ受容体複合体の結合を防ぐことを示し、ヒト全長ＴＳＬＰ上の、ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６に対するエピトープを形成する残基を同定する。このエピトープに対するパラトープを形成する残基も同定された。
【００５７】
選択性：  本明細書に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質には、ヒトＴＳＬＰと結合してそれを中和するが、関連のサイトカインＩＬ−７とは有意な結合を示さないものが含まれる。本発明の１つの態様は、ＩＬ−７は、リンパ球の増殖因子としての作用を含め、体内で別の作用を有することから、このようなＴＳＬＰ結合タンパク質を提供する。ＴＳＬＰとＩＬ−７の両方の活性を中和する拮抗薬は、ヒトにおいて、ＴＳＬＰ選択性拮抗薬とは異なる効果をもたらす可能性がある。
【００５８】
ヒトＴＳＬＰの阻害：  本明細書に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質は、組換え生産された（例えば、大腸菌またはＨＥＫ−ヒト胚腎細胞から発現された）全長ヒトＴＳＬＰおよび天然ヒトＴＳＬＰ（例えば、ヒト肺線維芽細胞を炎症性サイトカインで刺激することにより生産）と結合してそれらを中和する。例えば、ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６は、全長組換えヒトＴＳＬＰ（大腸菌（表９）またはＨＥＫ細胞（表１０）から発現）およびヒト細胞から発現された天然ヒトＴＳＬＰ（実施例７）の両方と結合してそれらを中和する。本発明の１つの実施態様では、天然ヒトＴＳＬＰはグリコシル化され得るが、大腸菌で発現された組換えヒトＴＳＬＰはグリコシル化されない。実施例９は、ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６が全長ヒトＴＳＬＰとは結合するが短いアイソフォームとは結合しないことを示す。
【００５９】
発現レベル：  多量の抗ＴＳＬＰ単一可変ドメイン拮抗薬の製造を促進するために、ｄＡｂ分子を効率的に発現させることができる。本明細書に記載のｄＡｂ分子は、大腸菌から高レベルで発現させることができる。実施例１０および図５は、ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６の製造のための発酵プロセスを記載している。
【００６０】
下流精製プロセス：  多量のＴＳＬＰ拮抗薬の製造を助けるために、本発明の１つの態様は、ｄＡｂ抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインが細胞上清から効率的に精製できることを示す。本明細書に記載のｄＡｂ分子は、タンパク質Ｌに対するそれらの高い親和性のために、アフィニティークロマトグラフィー法を用いて効率的に精製することができる。実施例１０および図６は、ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６の製造のための下流精製プロセスを記載している。
【００６１】
生物物理学的特性決定：  ヒトへの容易な投与を可能とするために、本発明の１つの実施態様は、ＴＳＬＰ結合タンパク質が高い溶解度ならびに溶液中での低レベルの凝集および／または断片化を示すことを示す。ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６により例示される抗ＴＳＬＰ  ｄＡｂ分子は、高い温度安定性、ｐＨおよび温度ストレスに対する耐性、ならびに低レベルの凝集を示した。
【００６２】
噴霧乾燥に対する安定性：  ＴＳＬＰ結合タンパク質のドライパウダー処方物の送達を助けるために、本発明の１つの態様は、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインが凍結乾燥および／または噴霧乾燥プロセスに対して安定であることを示す。温度ストレスおよび剪断ストレスに対する安定性は、高融点（Ｔｍ）を有するＴＳＬＰを選択することにより最大化することができる。特に、ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６は、とりわけ、供試したもののうち最高のＴｍを有する。
【００６３】
本発明の実施態様は、明瞭かつ一貫した明細の記載を可能とする方法を記載する。実施態様は本開示から離れずに様々に組み合わせてよい、または分離してよいことが意図され、認識されるべきである。
【００６４】
そうではないことが定義されない限り、本明細書で使用される総ての技術用語および科学用語は、当技術分野（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学）の熟練者によって共通に理解されているものと同じ意味を有する。分子的、遺伝学的および生化学的方法（一般に、引用することにより本明細書の一部とされるSambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.参照）および化学的方法には標準的な技術が使用される。
【００６５】
用語「ＴＳＬＰ結合タンパク質」は、本明細書で使用する場合、抗体およびＴＳＬＰと結合できる他のタンパク質構築物、例えばドメインを意味する。用語「抗原結合タンパク質」および「ＴＳＬＰ結合タンパク質」は、本明細書において互換的に使用される。
【００６６】
「ＴＳＬＰ」は、本明細書で使用する場合、天然または内因性哺乳動物ＴＳＬＰタンパク質および天然または内因性ＴＳＬＰタンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質（例えば、組換えタンパク質、合成タンパク質）を意味する。よって、本明細書で定義されるように、この用語には、成熟ＴＳＬＰタンパク質、多形変異体または対立遺伝子変異体およびＴＳＬＰのその他のアイソフォームならびに以上のものの修飾型および非修飾型（例えば、脂質化(lapidated)、グリコシル化）が含まれる。ヒトＴＳＬＰは、例えば、Liu et al (Annu. Rev. Immunol. 2007. 25:193−219)に記載されている。成熟ヒトＴＳＬＰ（全長ＴＳＬＰとしても知られる）は、アミノ酸１３１個（１５ＫＤ）の４α−ヘリックスバンドルサイトカインである。ヒトＴＳＬＰの他の２つのスプライス変異体が推定され、一方のスプライス変異体は同じアミノ酸１３１個の分泌型タンパク質をコードし、他方のスプライス変異体は、アミノ酸およそ６０個の末端切断型Ｃ末端アイソフォームを生じる。
【００６７】
単一可変ドメインまたはポリペプチドに関して用語「抗ＴＳＬＰ」は、ＴＳＬＰを認識してそれと結合する部分を意味する。１つの実施態様では、「抗ＴＳＬＰ」は、ヒトＴＳＬＰを特異的に認識し、かつ／またはそれと特異的に結合する。別の実施態様では、ＴＳＬＰ結合タンパク質は、ＴＳＬＰとＴＳＬＰＲ：ＩＬ−７Ｒα複合体との結合に関与する、ヒトＴＳＬＰの残基と結合する。
【００６８】
用語「抗体」は、本明細書においては最も広義で使用され、免疫グロブリン様ドメイン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ）を有する分子を意味し、モノクローナル、組換え、ポリクローナル、キメラ、ヒト、ヒト化、二重特異性抗体を含む多重特異性抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体；単一可変ドメイン（例えば、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）、抗原結合抗体フラグメント、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ＴＡＮＤＡＢＳ（商標）など、ならびに以上のいずれかの修飾型が含まれる。
【００６９】
別の抗体形式としては、抗原結合タンパク質の１以上のＣＤＲが好適な非免疫グロブリンタンパク質足場または骨格に配置された別の足場、例えば、アフィボディ、ＳｐＡ足場、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、アビマーまたはＥＧＦドメインが含まれる。
【００７０】
用語「ドメイン」は、タンパク質の残りの部分とは独立にその三次構造を保持する折り畳まされたタンパク質構造を意味する。一般に、ドメインは、タンパク質の異なる機能的特性を担い、多くの場合、タンパク質および／またはドメインの残りの部分の機能欠失を伴わずに、他のタンパク質に付加する、他のタンパク質から除去する、または他のタンパク質に移動させることができる。
【００７１】
用語「単一可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含んでなる折り畳まれたポリペプチドドメインを意味する。従って、それには、完全な抗体可変ドメイン、例えば、ＶＨ、ＶＨＨおよびＶＬ、ならびに例えば１以上のループが、抗体可変ドメインに特徴的でない配列で置換された修飾抗体可変ドメイン、あるいは末端切断されたまたはＮ末端もしくはＣ末端延長を含んでなる抗体可変ドメイン、ならびに全長ドメインの少なくとも結合活性と特異性を保持する可変ドメインの折り畳まれたフラグメントが含まれる。単一可変ドメインは、異なる可変領域またはドメインとは独立に、抗原、この場合ＴＳＬＰ、またはエピトープと結合することができる。「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、「単一可変ドメイン」と同じと考えることができる。単一可変ドメインはヒト単一可変ドメインであり得るが、齧歯類、テンジクザメおよびラクダ科動物ＶＨＨ  ｄＡｂなどの他種に由来する単一可変ドメインも含まれる。ラクダ科動物ＶＨＨは、天然に軽鎖を欠く重鎖抗体を産生する、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含む種に由来する、免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。このようなＶＨＨドメインは、当技術分野で利用可能な標準的技術に従ってヒト化可能であり、このようなドメインも「単一可変ドメイン」であると考えられる。本明細書で使用する場合、ＶＨには、ラクダ科動物ＶＨＨドメインが含まれる。特定の実施態様では、単一可変ドメインはＶＬドメインである。特定の実施態様では、ＶＬドメインはＶκドメインである。１つの実施態様では、単一可変ドメインは非天然型である。
【００７２】
抗原結合フラグメントは、非抗体タンパク質足場上に１以上のＣＤＲを配置する手段によって提供することができる。「タンパク質足場」には、本明細書で使用する場合、限定されるものではないが、免疫グロブリン（Ｉｇ）足場、例えば、ＩｇＧ足場、４鎖もしくは２鎖抗体であり得るもの、または抗体のＦｃ領域のみを含んでなり得るもの、または抗体由来の１以上の定常領域を含んでなり得、その定常領域がヒトまたは霊長類起源であり得るもの、またはヒトおよび霊長類定常領域の人工キメラであり得るものが含まれる。
【００７３】
タンパク質足場は、Ｉｇ足場、例えば、ＩｇＧ、またはＩｇＡ足場であり得る。ＩｇＧ足場は、抗体の一部または全部のドメイン（すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＨ、ＶＬ）を含んでなり得る。抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＧ４ＰＥから選択されるＩｇＧ足場を含んでなり得る。例えば、足場はＩｇＧ１であり得る。足場は、抗体のＦｃ領域かなる、もしくはそれを含んでなり得るか、またはその一部である。
【００７４】
タンパク質足場は、ＣＴＬＡ−４、リポカリン、プロテインＡのＺ−ドメイン（アフィボディ、ＳｐＡ）、Ａ−ドメイン（アビマー／Ｍａｘｉｂｏｄｙ）などのプロテインＡ由来分子；ＧｒｏＥｌおよびＧｒｏＥＳなどの熱ショックタンパク質；トランスフェリン  （トランスボディ）；アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；ペプチドアプタマー；Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）；ヒトγ−クリスタリンおよびヒトユビキチン（アフィリン）；ＰＤＺドメイン；ヒトプロテアーゼ阻害剤のサソリ毒素クニッツ型ドメイン；およびフィブロネクチン／アドネクチン；天然リガンド以外の抗原、例えばＴＳＬＰへの結合を得るためにタンパク質操作を受けたものからなる群から選択される足場の誘導体であり得る。
【００７５】
「ｄＡｂコンジュゲート」は、薬物が共有結合または非共有結合の手段により化学的にコンジュゲートされた、本明細書に開示の抗ＴＳＬＰ  ｄＡｂを含んでなる組成物を意味する。１つの実施態様では、ｄＡｂおよび薬物は共有結合される。このような共有結合はペプチド結合または修飾された側鎖を介するものなどの他の手段によるものであり得る。非共有結合は、直接的（例えば、静電気的相互作用、疎水性相互作用）であっても、または間接的（例えば、相補的結合相手（例えば、ビオチンおよびアビジン）の非共有結合による、ここでは、一方の相手が薬物に共有結合され、相補的結合相手がｄＡｂに共有結合される）であってもよい。相補的結合相手が使用される場合、結合相手のうち一方は薬物に直接または好適なリンカー部分を介して共有結合させることができ、相補的結合相手はｄＡｂに直接または好適なリンカー部分を介して共有結合させることができる。
【００７６】
本明細書で使用する場合、「ｄＡｂ融合体」は、本明細書で開示される抗ＴＳＬＰ  ｄＡｂとポリペプチド薬（ｄＡｂまたはｍＡｂであり得る）を含んでなる融合タンパク質を意味する。ｄＡｂおよびポリペプチド薬は、単一の連続ポリペプチド鎖の異なる部分（複数の部分）に存在する。
【００７７】
１つの実施態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、ヒトＴＳＬＰとカニクイザルＴＳＬＰなどの別種由来のＴＳＬＰの間で交差反応性を示す。別の実施態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、ヒトおよびサルＴＳＬＰと特異的に結合する。薬物開発には一般に、薬物がヒトで試験される前に動物系でリード薬物候補を試験する必要があるので、このような交差反応性は有用である。ヒト種とサル種に結合できる薬物を提供することで、これらの系で結果を検定し、同じ薬物を用いてデータの対照比較を行うことができる。このような薬物を提供すれば、齧歯類またはサルＴＳＬＰに対して働く薬物とヒトＴＳＬＰに対して働く別の薬物を探すために必要な煩雑さが避けられ、また、同一でない薬物を用いてヒトと動物での結果を比較する必要が避けられる。ある実施態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、ヒトＴＳＬＰおよびカニクイザルＴＳＬＰと特異的に結合する。
【００７８】
場合により、少なくともカニクイザルＴＳＬＰに対する抗原結合タンパク質結合親和性とおよびヒトＴＳＬＰに対する結合親和性は２、５、１０、５０または１００倍異なるだけである。１つの実施態様では、カニクイザルＴＳＬＰに対する結合親和性とヒトに対する結合親和性は５倍異なるだけである。別の実施態様では、カニクイザルＴＳＬＰに対する結合親和性とヒトＴＳＬＰに対する結合親和性は２倍異なるだけである。
【００７９】
親和性は、ある分子、例えば、本開示の抗原結合タンパク質と、別の分子、例えば、その標的抗原との、単一の結合部位での結合の強度である。抗原結合タンパク質の、その標的に対する結合親和性は、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））、または同態法（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）分析）によって決定することができる。例えば、実施例１に記載されるＢｉａｃｏｒｅ（商法）法を用いて結合親和性を測定することができる。
【００８０】
１つの実施態様では、抗原結合タンパク質−ＴＳＬＰ相互作用、特に、抗原結合タンパク質−ヒトＴＳＬＰ相互作用の平衡解離定数（ＫＤ）は、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下または１ｎＭ以下である。別の実施態様では、ＫＤ（ヒトＴＳＬＰに対する）は、２ｎＭ未満である。あるいは、ＫＤ（ヒトＴＳＬＰに対する）は、０．５〜２ｎＭの間であり得る。ＫＤ（ヒトＴＳＬＰに対する）は、５００ｐＭ〜１ｎＭの間であり得る。当業者は、ＫＤ数値が小さいほど結合が強いことを認識するであろう。ＫＤの逆数（すなわち、１／ＫＤ）は、単位をＭ−１とする平衡会合定数（ＫＡ）である。当業者は、ＫＡ数値が大きいほど結合が強いことを認識するであろう。
【００８１】
解離速度定数（ｋｄ）または「解離速度」は、秒当たりに減衰する抗原結合タンパク質−ＴＳＬＰ複合体、すなわち、複合体画分の安定性を表す。例えば、ｋｄ０．０１秒−１は、秒当たり１％の複合体の減衰に相当する。ある実施態様では、解離速度定数（ｋｄ）は１×１０−３秒−１以下である。ｋｄは１×１０−４秒−１〜１×１０−３秒−１の間である。
【００８２】
「会合速度定数（ｋａ）」または「結合速度」は、抗原結合タンパク質−ＴＳＬＰ複合体形成の速度を表す。ある実施態様では、会合速度定数（ヒトＴＳＬＰに対する）（ｋａ）は、１×１０５Ｍ−１秒−１より大きい。ある実施態様では、ヒトＴＳＬＰに対するｋａは４×１０５Ｍ−１秒−１〜８×１０５Ｍ−１秒−１の間である。
【００８３】
ＴＳＬＰ結合タンパク質と参照単一可変ドメイン、例えば配列番号９の間の競合は、競合ＥＬＩＳＡ、ＦＭＡＴまたはＢＩＡｃｏｒｅによって決定することができる。１つの実施態様では、競合アッセイは表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により行われる。この競合には可能性のあるいくつかの理由がある：これらの２つのタンパク質は同じもしくはオーバーラップするエピトープと結合する可能性があること、結合の立体阻害が存在する可能性があること、または第１のタンパク質の結合が、第２のタンパク質の結合を妨げるもしくは低下させる抗原の立体配座変化を誘導する可能性があること。１つの実施態様では、本開示のＴＳＬＰ結合タンパク質は、ＴＳＬＰとの結合をめぐって配列番号９の単一可変ドメインと競合する。１つの実施態様では、競合アッセイで使用されるＴＳＬＰは全長ヒトＴＳＬＰである。
【００８４】
生物活性の低下または阻害は部分的または完全であり得る。中和抗原結合タンパク質は、ＴＳＬＰの活性をＴＳＬＰ結合タンパク質の不在下でのＴＳＬＰ活性の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％だけ中和し得る。
【００８５】
用語「中和する」は、本明細書で使用する場合、ＴＳＬＰの生物活性が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の不在下でのＴＳＬＰの活性に比べて、抗原結合タンパク質の存在下で低減されることを意味する。中和はＴＳＬＰのその受容体への結合を遮断すること、ＴＳＬＰがその受容体を活性化するのを妨げること、ＴＳＬＰもしくはその受容体をダウンレギュレートすること、またはエフェクター機能に影響を与えることのうち１以上によるものであり得る。例えば、実施例１に記載されている受容体結合アッセイ（ＲＢＡ）法は、ＴＳＬＰ結合タンパク質の中和能を評価するために使用可能である。
【００８６】
「ＣＤＲ」は、抗原結合タンパク質の相補性決定領域のアミノ酸配列と定義される。これらは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である。免疫グロブリンの可変部分には３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲ（またはＣＤＲ領域）が存在する。よって、「ＣＤＲ」は、本明細書で使用する場合、３つ総ての重鎖ＣＤＲ、３つ総ての軽鎖ＣＤＲ、総ての重鎖および軽鎖ＣＤＲ、または少なくとも２つのＣＤＲを意味する。単一可変ドメインの場合、３つのＣＤＲが存在する。
【００８７】
本明細書を通じて、可変ドメイン配列および全長抗体配列のアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリング規則に従って符番される。同様に、実施例で使用される用語「ＣＤＲ」、「ＣＤＲＬ１」、「ＣＤＲＬ２」、「ＣＤＲＬ３」、「ＣＤＲＨ１」、「ＣＤＲＨ２」、「ＣＤＲＨ３」はＫａｂａｔナンバリング規則に従う。さらに詳しくは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1991)を参照。
【００８８】
上述のように、可変ドメイン配列および全長抗体配列のアミノ酸残基には別のナンバリング規則が存在する。また、ＣＤＲ配列にも、例えば、Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883に記載されているものなど、別のナンバリング規則が存在する。抗体の構造およびタンパク質折り畳みは、他の残基もＣＤＲ配列の一部と考えられ、当業者にはそのように理解されるであろうことを意味する。
【００８９】
当業者に利用可能なＣＤＲ配列に関する他のナンバリング規則には、「ＡｂＭ」（バース大学）および「Ｃｏｎｔａｃｔ」（ユニバーシティ・カレッジ・ロンドン）法が含まれる。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭおよびＣｏｎｔａｃｔ法のうち少なくとも２つを用いて最小オーバーラッピング領域を決定し、「最小結合単位」を提供することができる。以下の表３は、各ＣＤＲまたは結合単位について各ナンバリング規則を用いた１つの定義を表す。Ｋａｂａｔナンバリング法は、表１で可変ドメインアミノ酸配列を符番するために使用した。ＣＤＲ定義の一部は、使用された個々の刊行物によって異なる場合があることに留意されたい。
【００９０】
【表３】
2018509153.tif 000005
【００９１】
よって、配列番号９由来のＣＤＲのいずれか１つまたは組合せ、特に、上記の表２に示されているもの、またはそれらのＣＤＲ変異体を含んでなるＴＳＬＰ結合タンパク質が提供される。ある実施態様では、ＣＤＲＬ１は、配列番号１、２または３のいずれか１つからなる。ある実施態様では、ＣＤＲＬ２は、配列番号４、５または６のいずれか１つからなる。１つの実施態様では、ＣＤＲＬ３は、配列番号７または８のいずれか１つからなる。
【００９２】
ＣＤＲまたは最小結合単位は、ＣＤＲ変異体を形成するために少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失または付加により修飾されてもよく、前記変異体抗原結合タンパク質は実質的に、ヒトおよびカニクイザルＴＳＬＰと特異的に結合する能力など、非修飾タンパク質の生物学的特徴を保持する。
【００９３】
当業者には、これらのＣＤＲはそれぞれ単独で、または任意の順列もしくは組合せで他の任意のＣＤＲと組み合わせて修飾されてもよいことが認識されるであろう。
【００９４】
ＣＤＲ変異体は、少なくとも１つのアミノ酸で修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾は、アミノ酸配列の化学的または部分的変更（例えば、５個のアミノ酸だけによる）であってよく、その修飾はその変異体に非修飾配列の生物学的特徴を保持させる。ＣＤＲアミノ酸配列の部分的変更は、１〜数個のアミノ酸の欠失もしくは置換、または１〜数個のアミノ酸の付加もしくは挿入、またはそれらの組合せによる（例えば、５個のアミノ酸だけによる）ものであり得る。ＣＤＲ変異体は、アミノ酸配列における１、２、３、４、または５個のアミノ酸の置換、付加または欠失、任意の組合せを含み得る。
【００９５】
典型的には、修飾は、置換または例えば上記の表１に示されるような保存的置換である。１つの実施態様では、ＣＤＲは、５個までのアミノ酸、例えば、４個までのアミノ酸、例えば、３個までのアミノ酸、例えば、１または２個のアミノ酸、例えば、１個のアミノ酸の置換により修飾される。ある実施態様では、単一可変ドメインの３つのＣＤＲのそれぞれは、他の２つのＣＤＲとは独立に、２、１または０個のアミノ酸残基で修飾される。ある実施態様では、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２のみが修飾される。
【００９６】
特定の例では、変異体ＣＤＲにおいて、最小結合単位のアミノ酸残基は同一に保持してよいが、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａ定義の一部としてのＣＤＲを含んでなるフランキング残基は、保存的アミノ酸残基で置換されてもよい。１つの実施態様では、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインは、配列番号９由来の３つの変異体ＣＤＲを含んでなり、ＣＤＲ１は配列番号３の最小結合単位を含んでなり、ＣＤＲ２は配列番号６の最小結合単位を含んでなり、かつ、ＤＲ３は配列番号８の最小結合単位を含んでなる。
【００９７】
上記のような修飾されたＣＤＲまたは最小結合単位を含んでなるこのような抗原結合タンパク質はまた、本明細書では「機能的ＣＤＲ変異体」または「機能的結合単位変異体」とも呼ばれる。
【００９８】
１つの実施態様では、ＴＳＬＰ結合タンパク質は、配列番号９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはＴＳＬＰとの結合をめぐって配列番号９と競合誌、かつ／または（ｉｉ）ＴＳＬＰに対して２ｎＭ以下のＫＤを有する、配列番号９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３の変異体を含んでなる。
【００９９】
用語「エピトープ」は、本明細書で使用する場合、抗原結合タンパク質の特定の結合ドメインと接触させる抗原の部分を意味する。エピトープは、線状または立体配座型／不連続であり得る。立体配座型または不連続エピトープは、他の配列により分離された、すなわち、その抗原の一次に配列では連続的な配列でないアミノ酸残基を含んでなる。それらの残基はペプチド鎖の異なる領域に由来してよいが、それらは抗原の三次元構造においては近接している。多量体抗原の場合、立体配座的または不連続エピトープは、異なるペプチド鎖に由来する残基を浮くんでもよい。エピトープ内に含まれる特定の残基は、コンピューターモデリングプログラムにより、またはＸ線結晶学などの当技術分野で公知の方法を介して得られた三次元構造により決定することができる。１つの実施態様では、ＴＳＬＰ結合タンパク質のエピトープを含んでなる残基は、前記ＴＳＬＰ結合タンパク質の結合時に、より溶媒に接近しにくくなるＴＳＬＰ上の残基である。１つの実施態様では、特定のＴＳＬＰ結合タンパク質に対するエピトープ残基は、Ｑｔ−ＰＩＳＡ  ｖ２．０．１ソフトウエア（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ、ＣｏｍｐｌｅｘｅｓおよびＡｓｓｅｍｂｌｉｅｓ；ＫｒｉｓｓｉｎｅｌおよびＨｅｎｒｉｃｋ（２００７）を用い、ＴＳＬＰ結合タンパク質との結合時に露出表面積の２０％以上が埋もれる全長ヒトＴＳＬ上の残基であるとして同定され得る。別の実施態様では、特定のＴＳＬＰ結合タンパク質に対するエピトープ残基は、Ｑｔ−ＰＩＳＡ  ｖ２．０．１ソフトウエア（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ、ＣｏｍｐｌｅｘｅｓおよびＡｓｓｅｍｂｌｉｅｓ；  ＫｒｉｓｓｉｎｅｌおよびＨｅｎｒｉｃｋ（２００７）を用い、ＴＳＬＰ結合タンパク質との結合時に埋入表面積％に増加を示す全長ヒトＴＳＬＰ上の残基であるとして同定され得る。
【０１００】
ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３は、構造的に有限数の主鎖立体配座のうちの１つを示す傾向がある。ＣＤＲの特定のカノニカル構造種は、ＣＤＲの長さと、ＣＤＲとフレームワーク領域の両方において重要な位置に存在する残基（構造決定残基またはＳＤＲ）によって決定されるループパッキングの両方により定義される。Martin and Thornton (1996; J Mol Biol 263:800-815)は、「キー残基」カノニカル鋳型を定義するための自動法を作出した。クラスター分析を用いてＣＤＲセットに関するカノニカルクラスを定義し、その後、カノニカル鋳型は、埋もれた疎水性の水素結合残基、および保存されているグリシンおよびプロリンを分析することにより同定される。抗体配列のＣＤＲは、配列をキー残基鋳型と比較し、同一性または類似性行列を用いて各鋳型をスコア化することによってカノニカルクラスに割り付けることができる。
【０１０１】
本開示の範囲内のＣＤＲカノニカルの例を以下に示す。使用するアミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔである。
【０１０２】
配列番号９由来のＣＤＲＬ１（例えば、配列番号１、２または３）のカノニカルの例：Ｉｌｅ２９はＶａｌで置換され；Ｌｅｕ３３はＭｅｔ、Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＰｈｅで置換されている。
【０１０３】
配列番号９由来のＣＤＲＬ２（例えば、配列番号４、５または６）のカノニカルの例：Ａｌａ５１はＴｈｒで置換されている。
【０１０４】
配列番号９由来のＣＤＲＬ３（例えば、配列番号７または８）のカノニカルの例：Ｖａｌ８９はＧｌｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＰｈｅまたはＬｅｕで置換され；Ｇｌｎ９０はＡｓｎまたはＨｉｓで置換され；Ｉｌｅ９１はＰｈｅまたはＶａｌで置換され；Ｇｌｕ９３はＳｅｒで置換され；Ｖａｌ９６はＰｒｏ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、ＴｒｐまたはＰｈｅで置換されている。
【０１０５】
ＣＤＲにつき、結合単位につき、単一可変領域につき、およびＴＳＬＰ結合タンパク質につき複数の変異体ＣＤＲカノニカル位置が存在し得るので、ＣＤＲのカノニカル構造が、抗原結合タンパク質がＴＳＬＰと特異的に結合できるように維持されている限り、いずれの置換の組合せが本開示のＴＳＬＰ結合タンパク質に存在してもよい。
【０１０６】
上述のように、ＣＤＲの特定のカノニカル構造クラスは、ＣＤＲの長さと、ＣＤＲとフレームワーク領域の両方において重要な位置に存在する残基によって決定されるループパッキングの両方により定義される。
【０１０７】
よって、上記に挙げられるＣＤＲに加え、本開示のＴＳＬＰ結合タンパク質のカノニカル軽鎖フレームワーク残基は（Ｋａｂａｔナンバリングを使用する場合）、２番にＩｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌ；３番にＶａｌ、Ｇｌｎ、ＬｅｕまたはＧｌｕ；４番にＭｅｔまたはＬｅｕ；２３番にＣｙｓ；４６番にＬｅｕ、ＡｒｇまたはＶａｌ；４９番にＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、ＬｙｓまたはＴｒｐ；７１番にＴｙｒまたはＰｈｅ；８８番にＣｙｓ；および９８番にＰｈｅを含み得る。
【０１０８】
１つの実施態様では、軽鎖フレームワークは、以下の残基：２番にＩｌｅ、３番にＧｌｎ、４番にＭｅｔ、２３番にＣｙｓ、４６番にＬｅｕ、４９番にＴｒｐ、７１番にＰｈｅ、８８番にＣｙｓ、および９８番にＰｈｅを含んでなる。
【０１０９】
上記のフレームワーク位置のうちいずれか１つ、任意の組合せ、または総てが本開示の抗原結合タンパク質に存在してよい。単一可変領域につきおよびＴＳＬＰ結合タンパク質につき複数の変異体フレームワークカノニカル位置が存在し得るので、フレームワークのカノニカル構造が維持されている限り、いずれの置換の組合せが本開示のＴＳＬＰ結合タンパク質に存在してもよい。
【０１１０】
クエリ核酸配列とサブジェクト核酸配列の間の「同一性パーセント」は、ペアワイズＢＬＡＳＴＮアラインメントが実施された後にサブジェクト核酸配列がクエリ核酸配列と１００％のクエリカバー率を有する場合にＢＬＡＳＴＮアルゴリズムにより計算される、パーセンテージとして表される同一性値である。このようなクエリ核酸配列とサブジェクト核酸配列の間のペアワイズＢＬＡＳＴＮアラインメントは、National Center for Biotechnology Instituteのウェブサイトで利用可能なデフォルト設定のＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを用い、低複雑性領域のフィルターをオフにして実施される。重要なこととして、クエリ核酸配列は、本明細書において１以上の請求項で特定される核酸配列により記載できる。ある実施態様では、クエリアミノ酸配列は、配列番号１０または配列番号１１である。
【０１１１】
クエリアミノ酸配列とサブジェクトアミノ酸配列の間の「同一性パーセント」は上記で定義される通りである。ある実施態様では、クエリアミノ酸配列は配列番号９または配列番号１２である。
【０１１２】
クエリ配列は、サブジェクト配列と１００％同一であってよく、またはサブジェクト配列と比較した場合に同一性％が１００％未満となるような特定の整数までのアミノ酸またはヌクレオチド変化を含み得る。例えば、クエリ配列は、サブジェクト配列と少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である。このような変化は少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換（保存的置換および非保存的置換を含む）、または挿入を含み、前記変化はクエリ配列のアミノ末端位またはカルボキシ末端位で起こってもよいし、あるいはそれらの末端位と末端位の間の任意の場所に、クエリ配列のアミノ酸もしくはヌクレオチド間に個々に、またはクエリ配列内の１以上の連続する群として散在して存在してもよい。特定の実施態様では、本開示のＴＳＬＰ結合タンパク質は、配列番号９と９５、９６、９７、９８、または９９％以上同一である。
【０１１３】
同一性％は、ＣＤＲを含むクエリ配列の全長にわたって決定されてよい。あるいは、同一性％はＣＤＲを除外してもよく、例えば、ＣＤＲはサブジェクト配列と１００％同一であり、同一性％の変動はクエリ配列の残りの部分にあり、従って、ＣＤＲ配列は固定されている／そのままである。特定の実施態様では、本開示のＴＳＬＰ結合タンパク質は、配列番号９のＣＤＲと同一のＣＤＲを有し、配列番号９のフレームワークと９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一のフレームワークを有する。
【０１１４】
変異体配列は、ヒトおよびカニクイザルＴＳＬＰとの結合およびその中和、ならびにＩＬ−７結合の欠如などの非修飾タンパク質の生物学的特徴を実質的に保持する。
【０１１５】
ＶＨまたはＶＬ配列は、１０個までのアミノ酸の置換、付加または欠失を有する変異体配列であり得る。例えば、変異体配列は、例えば、配列番号９または１２と比べて、９、８、７、６、５、４、３、２または１個までのアミノ酸の置換、付加または欠失を持ち得る。１つの実施態様では、変異体配列は、例えば、配列番号９または１２と比べて、１０個までのアミノ酸の置換、例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸の置換を有する。
【０１１６】
配列変動はＣＤＲを除外してもよく、例えば、ＣＤＲはＶＨまたはＶＬ配列と同じであり、変動はＶＨまたはＶＬ配列の残りの部分にあり、ＣＤＲ配列は固定されている／そのままである。特定の実施態様では、本開示のＴＳＬＰ結合タンパク質は、配列番号９のＣＤＲと同一のＣＤＲを有し、配列番号９と比べて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸の置換、付加、または欠失を有するフレームワークを有する。
【０１１７】
典型的には、変動は、置換、または例えば、表１に示されるような保存的置換である。
【０１１８】
変異体配列は、ヒトおよびカニクイザルＴＳＬＰとの結合およびその中和、ならびにＩＬ−７結合の欠如などの非修飾タンパク質の生物学的特徴を実質的に保持する。当業者は、抗体などの抗原結合タンパク質の産生時に、使用する細胞株、および抗原結合タンパク質の特定のアミノ酸配列に応じて、翻訳後修飾が起こり得ることを認識するであろう。例えば、これには、特定のリーダー配列の切断、種々の糖部分の、グリコシル化およびリン酸化パターンでの付加、脱アミド化、酸化、ジスルフィド結合スクランブル化、異性化、Ｃ末端リシンクリッピング、およびＮ末端グルタミン環化を含み得る。本開示は、１以上の翻訳後修飾を施されたまたは受けた抗原結合タンパク質の使用を包含する。よって、本開示の「抗原結合タンパク質」または「抗体」には、本明細書に記載されるものなどの翻訳後修飾を受けた、先に定義されたようなそれぞれ「抗原結合タンパク質」または「抗体」が含まれる。
【０１１９】
脱アミド化は、主としてアスパラギン（Ｎ）をおよそ３：１の比でイソ−アスパラギン酸およびアスパラギン酸（Ｄ）に変換する酵素反応である。かなり程度は低いが、脱アミド化はグルタミン残基でも同様に起こり得る。酸化は生産および保存中に（すなわち、酸化条件の存在下で）起こり得、直接的には反応性酸素種により、または間接的には酸化ストレスの二次的副生成物との反応により誘導されるタンパク質の共有結合的修飾をもたらす。酸化は、主としてメチオニン残基で起こるが、時にはトリプトファンおよび遊離システイン残基で起こることもある。
【０１２０】
ジスルフィド結合スクランブル化は、生産および塩基性保存条件中に起こり得る。特定の状況下で、ジスルフィド結合は切断または不適切に形成されることがあり、不対システイン残基（−ＳＨ）を生じる。これらの遊離（不対）スルフヒドリル（−ＳＨ）がシャッフリングを促進し得る。
【０１２１】
異性化は一般に生産、精製、および保存（酸性ｐＨ）中に起こり、通常、化学的プロセスを介してアスパラギン酸がイソアスパラギン酸に変換される場合に起こる。
【０１２２】
重鎖および／または軽鎖のＮ末端グルタミンは、ピログルタミン酸基（ｐＧｌｕ）を形成する可能性がある。ほとんどのｐＧｌｕ形成は、生産バイオリアクター内で起こるが、処理および保存条件のｐＨおよび温度によっては非酵素的に生成されることがある。ｐＧｌｕの形成は、組換えｍＡｂの主要分解経路の１つと考えられる。
【０１２３】
Ｃ末端リシンクリッピングは、カルボキシペプチダーゼにより触媒される酵素反応であり、組換えｍＡｂで一般に見られる。このプロセスの変形として、一方または両方の重鎖からのリシンの除去が含まれる。リシンクリッピングは、生物活性に影響を及ぼすとも思われず、ｍＡｂのエフェクター機能に影響はない。
【０１２４】
ヒトには、タンパク質と結合し得る天然自己抗体が存在する。従って、自己抗体は、内因性タンパク質（ナイーブ被験体に存在する）ならびに処置のために被験体に投与されるタンパク質またはペプチドと結合し得る。治療用タンパク質結合自己抗体および薬物処置に応答して新たに形成される抗体は抗薬物抗体（ＡＤＡ）と総称される。被験体に投与された治療用タンパク質およびペプチドなどの分子に対する既存の抗体はそれらの有効性に影響を及ぼし得、処置された患者に投与反応、過敏性、臨床応答の変化、および分子の持続、排除または中和によるバイオアベイラビリティの変化をもたらし得る。免疫原性が低減された（すなわち、被験体、特に、ヒト被験体に投与した際に既存のＡＤＡとの結合能が低減された）ヒト免疫グロブリン（抗体）単一可変ドメインまたはｄＡｂを含んでなる治療用分子を提供することが有利であり得る。
【０１２５】
よって、本開示の１つの実施態様では、等価な非修飾分子に比べて既存の抗体（ＡＤＡ）との結合能が軽減された修飾ｄＡｂまたはそのような修飾ｄＡｂを含んでなるポリペプチドが提供される。結合能の低減とは、修飾分子が既存のＡＤＡと、低減された親和性または低減されたアビディティーで結合することを意味する。前記修飾ｄＡｂは、１以上のＣ末端修飾（付加、延長、欠失またはタグ）を含んでなる。
【０１２６】
１つの実施態様では、修飾ｄＡｂはＶＬ  ｄＡｂであり、配列ＶＥＩＫｐＲｑＸからなるＣ末端配列を含んでなり、配列中、
ｐおよびｑはそれぞれ０または１を表し、従って、ｐが１を表す場合、ｑは０または１であり得、ｐが０を表す場合、ｑもまた０を表す；
Ｘは、存在してもしなくてもよく、存在する場合には、１〜８個のアミノ酸残基のアミノ酸延長、例えば、単一のトレオニン延長、またはＴＶ、ＴＶＡ、ＴＶＡＡ、ＴＶＡＡＰ、ＴＶＡＡＰＳ延長を表し；
さらに、ただし、Ｘが存在しなければ、
ｐおよび／またはｑは０であり、かつ／またはＶＥＩＫｐＲｑＸで終わるｄＡｂは、前記アミノ酸置換のうちの１以上を含んでなる。
【０１２７】
ある実施態様では、ＶＬ  ｄＡｂは、Ｃ末端にアミノ酸ＲＴを含んでなる。
【０１２８】
ある実施態様では、ＶＬ  ｄＡｂは、Ｃ末端にアミノ酸Ｒを含まない。
【０１２９】
１つの実施態様では、修飾ｄＡｂは、Ｃ末端に存在するタグを含んでなり得る。このタグは、例えば、親和性タグ、例えば、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、ｈｉｓタグなどのアフィニティタグ、ＰＥＧなどの化学修飾、または抗体Ｆｃドメインなどのタンパク質ドメインなどの当技術分野で公知のいずれのタグであってもよい。
【０１３０】
Ｃ末端付加または延長またはタグは、直接融合体または分子のＣ末端とのコンジュゲートとして存在してよい。
【０１３１】
実施例１１に記載の特定のイムノアッセイは、修飾ｄＡｂはＡＤＡへの結合が低減されていることを確認するために使用できる。ＡＤＡへの結合が低減されたｄＡｂは、そのアッセイにおいて発光シグナルの低下を示す。
【０１３２】
上述のように、吸入送達が意図される場合には、小型であることが望まされる。しかしながら、他の投与様式が企図される場合、本開示の結合タンパク質および抗ＴＳＬＰ  ｄＡｂは、例えば、ＰＥＧ基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体もしくは少なくともそのトランスフェリン結合部分、抗体Ｆｃ領域の付加によって、または抗体ドメインとのコンジュゲーションによって、より大きな流体力学的サイズを有するような形式とすることができる。例えば、ポリペプチドｄＡｂ（商標）および拮抗薬は、抗体のより大きな抗原結合フラグメントまたは抗体としの形式（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ＩｇＧ、ｓｃＦｖとしての形式）とすることができる。
【０１３３】
本明細書で使用する場合、「流体力学的サイズ」は、水溶液中の分子の拡散に基づく分子（例えば、抗原結合タンパク質）の見掛けの大きさを意味する。溶液中のタンパク質の拡散または移動は、タンパク質の見掛けの大きさを導き出すように処理することができ、この場合、大きさはタンパク質粒子の「ストークス半径」または「流体力学的半径」により与えられる。タンパク質の「流体力学的サイズ」は、質量および形状（立体配座）の両方に依存し、従って、同じ分子質量を有する２つのタンパク質は、全体的な立体配座およびタンパク質の荷電に基づき、異なる流体力学的サイズを持ち得る。流体力学的サイズの増大は、腎クリアランスに関連の低下を示し、半減期（ｔ１／２）に観測される延長をもたらし得る。
【０１３４】
本開示の抗原結合タンパク質（例えば、ドメイン抗体単量体および多量体）の流体力学的サイズは、当技術分野で周知の方法を用いて決定することができる。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、抗原結合タンパク質の流体力学的サイズを決定することができる。抗原結合タンパク質の流体力学的サイズを決定するためのゲル濾過基材の例としては、周知かつ容易に入手できる架橋アガロース基材が挙げられる。
【０１３５】
抗原結合タンパク質形式の大きさ（例えば、ドメイン抗体単量体が結合しているＰＥＧ部分の大きさ）は、所望の適用によって異なり得る。例えば、抗原結合タンパク質が循環を出て末梢組織へ入ることが意図される場合、抗原結合タンパク質の流体力学的サイズは、血流からの溢出を促進するように小さく維持すればよい。あるいは、抗原結合タンパク質を体循環により長時間留まらせるためには、例えばＩｇ様タンパク質形式とすることにより、抗原結合タンパク質の大きさを増大させることができる。
【０１３６】
「半減期」（「ｔ１／２」）および「血清半減期」という句は、本開示による抗原結合タンパク質の血清（または血漿）濃度が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、例えば、抗原結合タンパク質の分解および／または天然の機構による抗原結合タンパク質のクリアランスもしくは隔離のために５０％減少するのにかかる時間を意味する。
【０１３７】
半減期の増大、または半減期の延長は、抗原結合タンパク質、抗体、小型の抗体フラグメントのｉｎ  ｖｉｖｏ適用において有用であり得る。このようなフラグメント（Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ）は一般に、身体から急速に排除される。本開示による抗原結合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏ血清半減期の延長、および結果としての身体における抗原結合タンパク質の機能活性のより長い持続時間、または滞留時間を提供するように適合または修飾することができる。好適には、このような修飾分子は、非適合分子に比べてクリアランスが低減され、かつ、平均滞留時間が延長されている。半減期の延長は治療分子の薬物動態特性および薬力学的特性を改善することができ、また患者のコンプライアンスの改善にも重要であり得る。
【０１３８】
本開示の抗原結合タンパク質は、分解および／またはクリアランスまたは隔離に耐える分子（「半減期延長部分」または「半減期延長分子」）と結合させることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで安定化させ、それらの半減期を延長することができる。好適な半減期延長戦略には、ペグ化、ポリシアリル化、ＨＥＳ化、組換えＰＥＧ  ミメティック、Ｎ−グリコシル化、Ｏ−グリコシル化、Ｆｃ融合、操作型Ｆｃ、ＩｇＧ結合、アルブミン融合、アルブミン結合、アルブミンカップリングおよびナノ粒子が含まれる。
【０１３９】
１つの実施態様では、半減期延長部分または分子は、ポリエチレングリコール部分またはＰＥＧミメティックである。別の実施態様では、抗原結合タンパク質は、ポリエチレングリコール部分（場合により、前記部分は約２０〜約５０ｋＤａの大きさ、場合により、約４０ｋＤａの直鎖または分岐ＰＥＧを有する）と連結された本開示の単一可変ドメインを含んでなる（場合により、からなる）。さらに別の実施態様では、拮抗薬は、ＰＥＧと連結されたドメイン抗体単量体からなり、前記ドメイン抗体単量体は、本開示による単一可変ドメインである。
【０１４０】
抗体のＦｃ領域と種々のＦｃ受容体（ＦｃγＲ）の間の相互作用は、抗体または抗体フラグメントの貪食作用および半減期／クリアランスに介在すると考えられている。新生児ＦｃＲｎ受容体は、抗体クリアランスと組織間トランスサイトーシスの両方に関与すると考えられる。１つの実施態様では、半減期延長部分は、抗体由来のＦｃ領域であり得る。このようなＦｃ領域は、所望の特性に応じて種々の修飾を組み込むことができる。例えば、血清半減期を延長するためにサルベージ受容体結合エピトープを抗体に組み込むことができる。
【０１４１】
ヒトＦｃＲｎｔと直接相互作用すると決定されたヒトＩｇＧ１残基には、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４およびＨｉｓ４３５が含まれる。よって、本節に記載される位置のいずれにおける置換も、血清半減期の延長および／または抗体のエフェクター特性の変更を可能とする。
【０１４２】
一般に、ｉｎ  ｖｉｖｏ血清半減期を延長するポリペプチド、すなわち、半減期延長分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて自然に生じ、（例えばヒト）から望まれない材料を除去する内在機構による分解または除去に耐えるポリペプチドである。一般に、このような分子は、それ自体長いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する天然タンパク質である。
【０１４３】
例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ血清半減期を延長するポリペプチドは、細胞外マトリックス由来タンパク質、血中に見られるタンパク質、血液脳関門もしくは神経系組織に見られるタンパク質、腎臓、肝臓、筋肉、肺、心臓、皮膚もしくは骨に局在するタンパク質、ストレスタンパク質、疾患特異的タンパク質、またはＦｃ輸送に関与するタンパク質であり得る。
【０１４４】
このようなアプローチはまた、本開示による抗原結合タンパク質、例えば、単一可変ドメインの、対象組織への標的化送達にも使用することができる。１つの実施態様では、本開示による高親和性単一可変ドメイン標的化送達が提供される。
【０１４５】
１つの実施態様では、本開示による抗原結合タンパク質、例えば、単一可変ドメインは、血清アルブミン、そのフラグメントおよび類似体に連結する、すなわち、コンジュゲートするまたは会合させることができる。
【０１４６】
別の実施態様では、本開示による単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドは、トランスフェリン、そのフラグメントおよび類似体に連結する、すなわち、コンジュゲートするまたは会合させることができる。
【０１４７】
別の実施態様では、半減期延長は、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長する抗原またはエピトープを標的化することにより達成することができる。抗原結合タンパク質の流体力学的サイズとその血清半減期は、本開示の抗原結合タンパク質を、天然分子と結合しｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長する結合ドメインとコンジュゲートするまたは会合させることにより延長することができる。
【０１４８】
例えば、本開示よる抗原結合タンパク質は、抗血清アルブミン（ＳＡ）または抗新生児型Ｆｃ受容体抗体または抗体フラグメント、例えば、抗ＳＡまたは抗新生児型Ｆｃ受容体ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’もしくはｓｃＦｖ、または抗ＳＡアフィボディもしくは抗新生児型Ｆｃ受容体アフィボディもしくは抗ＳＡアビマー、または限定されるものではないが、ＣＴＬＡ−４、リポカリン、ＳｐＡ、アフィボディ、アビマー、ＧｒｏＥｌおよびフィブロネクチンからなる群から選択される足場を含んでなる抗ＳＡ結合ドメインとコンジュゲートするまたは会合させることができる。コンジュゲートとは、血清アルブミンと結合する結合ドメインなどの結合ドメインに結合された（共有結合的または非共有結合的に）本開示のポリペプチド、ｄＡｂまたは拮抗薬を含んでなる組成物を意味する。
【０１４９】
別の実施態様では、結合ドメインは、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）などのポリペプチドドメイン、またはアルブミンと結合する小分子であり得る。
【０１５０】
１つの実施態様は、本開示よる抗原結合タンパク質と抗血清アルブミンまたは抗新生児型Ｆｃ受容体抗体または抗体フラグメントとを含んでなる融合タンパク質を提供する。
【０１５１】
１つの実施態様では、本開示の単一可変ドメインは、優先的には単量体であると特定される。別の実施態様は、（実質的に）純粋な単量体を提供する。さらに別の実施態様では、単一可変ドメインは、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％純粋または１００％純粋な単量体である。単一可変ドメインが単量体であるかまたは溶液中でより高次のオリゴマーを形成するかを決定するために、それらはＳＥＣ−ＭＡＬＬＳにより分析することができる。ＳＥＣ  ＭＡＬＬＳ（多角度レーザー光散乱(multi-angle-LASER-light-scattering）を用いるサイズ排除クロマトグラフィー）は、溶液中での高分子の特性決定のための非侵襲的技術であり、当業者に知られている。簡単に述べれば、タンパク質（ダルベッコのＰＢＳバッファー中１ｍｇ／ｍＬの濃度）をサイズ排除クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫ３０００；Ｓ２００）によりそれらの流体力学的特性に従って分離する。分離の後、タンパク質の光散乱特性を、多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）検出器を用いて測定する。タンパク質が検出器を通過する際の散乱光の強度を角度の関数として測定する。この測定値を、屈折率（ＲＩ）検出器を用いて決定されるタンパク質濃度と考え合わせると、適当な式を用いて分子質量を計算できる（分析ソフトウエアＡｓｔｒａ  ｖ．５．３．４．１２の積分部分）。
【０１５２】
１つの実施態様では、本開示の単一可変ドメインは、熱的に安定である。別の実施態様では、本開示の単一可変ドメインは、１分当たり３℃の操作速度およびタンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌでＤＳＣにより測定した場合に５０℃以上のＴｍを有する。
【０１５３】
抗原結合タンパク質は、いくつかの従来の技術のいずれによって調製してもよい。例えば、抗原結合タンパク質は、それらを天然に発現する細胞から精製してもよく（例えば、抗体はそれを産生するハイブリドーマから精製することができる）、または組換え発現系で製造されてもよい。
【０１５４】
いくつかの異なる発現系および精製計画が本開示の抗原結合タンパク質を生成するために使用可能である。一般に、宿主細胞を、所望の抗原結合タンパク質をコードする組換え発現ベクターで形質転換させる。原核生物（グラム陰性菌またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌(Escherichia coli)、バチルス種、シュードモナス種、コリネバクテリウム種を含む）、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)）、真菌（例えば、アスペルギルス種）を含む真核生物、または昆虫細胞および哺乳動物起源細胞株（例えば、ＣＨＯ、Ｐｅｒｃ６、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ）を含む高等真核生物を含む、広範囲の宿主細胞が使用可能である。
【０１５５】
宿主細胞は、単離された宿主細胞であり得る。宿主細胞は通常、多細胞生物（例えば、植物または動物）の一部ではない。宿主細胞は非ヒト宿主細胞であり得る。
【０１５６】
細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主とともに使用するための適当なクローニングおよび発現ベクターおよびクローニング方法は当技術分野で公知である。
【０１５７】
これらの細胞を抗原結合タンパク質の発現を促進する条件下で培養し、従来のタンパク質精製手順によりポリペプチドを回収することができる。本明細書での使用のために企図される抗原結合タンパク質には、夾雑材料を実質的に含まない実質的に均質な抗原結合タンパク質が含まれる。
【０１５８】
当業者は、抗原結合タンパク質の製造時に、特に、使用する細胞株および抗原結合タンパク質の特定のアミノ酸配列に応じて、翻訳後修飾が起こり得ることを認識するであろう。このような翻訳後修飾は、特定のリーダー配列の切断、種々のグリコシル化パターンでの種々の糖部分の付加、脱アミド化（例えば、アスパラギンまたはグルタミン残基における）、酸化（例えば、メチオニン、トリプトファンまたは遊離システイン残基における）、ジスルフィド結合スクランブル化、異性化（例えば、アスパラギン酸残基における）、Ｃ末端リシンクリッピング（例えば、一方または両方の重鎖）、およびＮ末端グルタミン環化（例えば、重鎖および／または軽鎖における）を含み得る。本開示は、１以上の翻訳後修飾を施されたまたは受けた抗体の使用を包含する。この修飾はＣＤＲ、種々のフレームワーク領域、または定常領域に起こってよい。この修飾によりその分子の電荷に変化がもたらされ得る。
【０１５９】
本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、本明細書に記載のヒト疾患の処置に使用するための医薬組成物に組み込まれ得る。１つの実施態様では、本医薬組成物は、本明細書に開示される抗原結合タンパク質、例えば、配列番号９または１２の単一可変ドメインを、場合により、１以上の薬学上許容可能な担体および／または賦形剤と組み合わせて含んでなる。さらなる実施態様では、本医薬組成物は、本発明のＴＳＬＰ結合タンパク質、例えば、配列番号９または１２の単一可変ドメインと薬学上許容可能な担体または賦形剤を含んでなる。
【０１６０】
このような組成物は、既知かつ許容可能な薬務によって要求される薬学上許容可能な担体を含んでなる。
【０１６１】
医薬組成物は、注射または持続注入（例としては、限定されるものではないが、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内および門脈内を含む）により投与され得る。医薬組成物は、局所投与（限定されるものではないが、経皮、吸入、鼻腔内または眼内投与を含む）または経腸投与（限定されるものではないが、経口または直腸投与を含む）に好適であり得る。１つの実施態様では、本医薬組成物は吸入される。医薬組成物は、０．３μｇ〜１００ｍｇの間のＴＳＬＰ結合タンパク質、例えば、１μｇ〜３０ｍｇの間のＴＳＬＰ結合タンパク質を含んでなり得る。１つの実施態様では、本医薬組成物は、２ｍｇ〜５０ｍｇ、例えば、２ｍｇ、５ｍｇ、１５ｍｇおよび５０ｍｇを含有する。あるいは、本組成物は、１μｇ〜１５ｍｇの間、例えば、１μｇ〜１０ｍｇの間を含んでなり得る。ある実施態様では、本医薬組成物は、２５０μｇ〜５ｍｇ、例えば、５００μｇ〜２．５ｍｇの間のＴＳＬＰ結合タンパク質を含んでなる。
【０１６２】
このような医薬組成物の調製方法は当業者に周知である。他の賦形剤も投与様式および使用する特定のタンパク質に適当であれば本組成物に加えてよい。種々の賦形剤およびそれらの使用の例は、Lowe et al., Adv Protein Chem Struct Biol, 84, 41-61 (2011)に記載されている。
【０１６３】
ＴＳＬＰ結合タンパク質を投与するための有効用量および処置計画は、患者の齢、体重および健康状態ならびに処置される疾患などの因子によって異なり得る。このような因子は主治医の範囲内にある。適当な用量を選択する上での指針は、例えば、Bai et al., Clin Pharmacokinet, 51, 119-35 (2012)に見出せる。
【０１６４】
本医薬組成物は、ＴＳＬＰ結合タンパク質のパーツキットを他の薬剤、場合により使用説明書とともに含んでなり得る。好都合には、本キットは、所定の試薬を使用説明書とともに含んでなり得る。
【０１６５】
本開示のある実施態様では、ＴＳＬＰ結合タンパク質、特に、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインは、例えばドライパウダー、エアゾール、懸濁液、または溶液組成物として吸入により患者に投与するために適合された投与形に向けられる。１つの実施態様では、本開示は、ドライパウダーとして吸入により患者に投与するために適合された投与形に向けられる。さらなる実施態様では、本発明は、ネブライザーを介した吸入により患者に投与するために適合された投与形を提供する。
【０１６６】
本発明の処方物は、好適な緩衝剤の添加により緩衝させてよい。
【０１６７】
吸入により肺に送達するためのドライパウダー組成物は一般に、微粉末としてのＴＳＬＰ結合タンパク質を含んでなり、これは別の微粉末として、またはＴＳＬＰ結合タンパク質と同じ粉末粒子内に１以上の薬学上許容可能な賦形剤を伴ってもよい。ドライパウダー中に使用するのに好適な薬学上許容可能な賦形剤は当業者に公知であり、ラクトース、デンプン、マンニトール、単糖類、二糖類、および多糖類、アミノ酸または小ペプチド、塩または一価または二価陽イオンおよび脂質を含む。微粉末は、例えば、微粉砕によって、または噴霧乾燥、ＰＲＩＮＴ（商標）（Ｌｉｑｕｉｄｉａ）、または超臨界流体沈降などの直接粒子形成法によって調製することができる。一般に、微粉末は、約１〜約１０ミクロンのＤ５０値（例えば、レーザー回折を用いて測定した場合）により定義され得るタンパク質の粒子またはタンパク質含有粒子からなる。
【０１６８】
ドライパウダーは、複数の（非計量用量）の薬剤をドライパウダー形態で保存するのに好適なリザーバーを備えたリザーバードライパウダー吸入器（ＲＤＰＩ）を介して患者に投与され得る。ＲＤＰＩは一般に、リザーバーから送達位置への各薬剤用量を計量するための手段を含む。例えば、これらの計量手段は、計量カップを含んでもよく、このカップはカップがリザーバーからの薬剤で満たされる第１の位置から計量された薬剤用量が吸入のために患者に利用可能とされる第２の位置に移動される。
【０１６９】
あるいは、ドライパウダーは、多用量ドライパウダー吸入器（ＭＤＰＩ）で使用するためのカプセル（例えば、ゼラチンまたはプラスチック）、カートリッジ、またはブリスターパック内に提供されてもよい。ＭＤＰＩは、複数の規定用量（またはその一部）の薬剤を含有する（またはそうでなければ担持する）多用量パック内に薬剤が含まれる吸入器である。ドライパウダーがブリスターパックとして提供される場合、それはドライパウダー形態で薬剤を収容するための複数のブリスターを含んでなる。これらのブリスターは一般に、それらから薬剤が容易に放出される規則的様式で配置される。例えば、ブリスターは一般に、ディスク型ブリスターパック上に円形に配置されてもよく、またはブリスターは例えばストリップもしくはテープを含んでなる形態で延長されていてもよい。各カプセル、カートリッジ、またはブリスターは、例えば、１５μｇ〜１０ｍｇのＴＳＬＰ結合タンパク質を含有し得る。ＭＤＰＩの好適な例としては、限定されるものではないが、Ｄｉｓｋｕｓ（商標）（ＧＢ２２４２１３４、米国特許第６，０３２，６６６号、同第５，８６０，４１９号、同第５，８７３，３６０号、同第５，５９０，６４５号、同第６，３７８，５１９号および同第６，５３６，４２７号参照）またはＤｉｓｋｈａｌｅｒ（ＧＢ２１７８９６５、２１２９６９１および２１６９２６５、米国特許第４，７７８，０５４号、同第４，８１１，７３１号、同第５，０３５，２３７号に例示され、使用の際に計量される（例えば、Ｔｕｒｂｕｈａｌｅｒ（ＥＰ００６９７１５参照）、または米国特許第６，３２１，７４７号に記載の装置）。使用可能な単位用量デバイスの例は、Ｒｏｔａｈａｌｅｒ（ＧＢ２０６４３３６参照）である。他の好適なＭＤＩとしては、限定されるものではないが、ツインブリスターストリップデバイス、例えば、Ｅｌｌｉｐｔａ（商標）デバイス（例えば、米国特許第８，１１３，１９９号；同第８，１６１，９６８号；同第８，５１１，３０４号；同第８，５３４，２８１号および同第８，７４６，２４２号）に属するものが挙げられる。
【０１７０】
例えば、ゼラチンの吸入器または通気器で使用するための、ＴＳＬＰ結合タンパク質またはＴＳＬＰ結合タンパク質と１種類以上の賦形剤およびラクトース、マンニトールまたはデンプンなどの好適な粉末基剤との粒状処方物の吸入のための粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジが処方され得る。各カプセルまたはカートリッジは一般に、１５μｇ〜１０ｍｇのＴＳＬＰ結合タンパク質またはＴＳＬＰ結合タンパク質と１種類以上の賦形剤との粒状処方物を含有し得る。１つの実施態様では、カプセルまたはカートリッジは、２ｍｇ〜５０ｍｇの間のＴＳＬＰ結合タンパク質またはＴＳＬＰ結合タンパク質と１種類以上の賦形剤、例えば、２ｍｇ、５ｍｇ、１５ｍｇおよび５０ｍｇとの粒状処方物を含有し得る。あるいは、ＴＳＬＰ結合タンパク質またはＴＳＬＰ結合タンパク質と１種類以上の賦形剤との粒状処方物は、ラクトース、マンニトールまたはデンプンなどのさらなる粉末基剤賦形剤を用いずに提供されてもよい。
【０１７１】
開示されている局所用組成物中のＴＳＬＰ結合タンパク質の特性は、調製される処方物の厳密なタイプによって異なるが、一般に０．００１〜１００重量％の範囲内である。一般に、ほとんどのタイプの製剤では、使用される割合は、０．００５〜９０％、例えば０．０１〜８０％の範囲内である。
【０１７２】
本発明の１つの実施態様では、総一日用量およびＭＤＰＩのブリスターにより送達される計量用量は、各計量用量が１５μｇ〜１３ｍｇ、２０μｇ〜２０００μｇ、または５００μｇ〜１５００μｇのＴＳＬＰ結合タンパク質を含有するように構成される。投与は１日１回または１日数回、例えば、２、３、４または８回であってよく、各回例えば１、２または３用量が投与される。エアゾールを用いる場合の総一日用量は１００μｇ〜２０ｍｇ、または２００μｇ〜２０００μｇの範囲である。総一日用量および吸入器または通気器内のカプセルおよびカートリッジにより送達される計量用量は一般に、ＭＤＰＩで送達されるものの最大３倍である。
【０１７３】
ＴＳＬＰ結合タンパク質を含んでなる懸濁液および溶液はまたネブライザーを介して患者に投与してもよい。霧化に使用される溶媒または懸濁液薬剤は、水、生理食塩水、アルコールまたはグリコール、例えば、エタノール、イソプロピルアルコール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどまたはそれらの混合物などのいずれの薬学上許容可能な液体であってもよい。生理食塩水は、投与後に薬理活性をほとんどまたは全く示さない塩を使用する。アルカリ金属もしくはアンモニウムハロゲン塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの有機塩、またはカリウム、ナトリウムおよびアンモニウム塩などの有機塩、または有機酸、例えば、アスコルビン酸、クエン酸、酢酸、酒石酸などの両方が本目的に使用できる。
【０１７４】
他の薬学上許容可能な賦形剤を本懸濁液または溶液に加えてもよい。ＴＳＬＰ結合タンパク質は、無機酸、例えば、塩酸、硝酸、硫酸および／またはリン酸；有機酸、例えば、アスコルビン酸、クエン酸、酢酸、および酒石酸など、ＥＤＴＡまたはクエン酸およびその塩などの錯化剤；またはビタミンＥもしくはアスコルビン酸などの酸化防止剤、またはメチオニンなどのアミノ酸に基づく酸化防止剤の添加により安定化され得る。これらの無機酸は、ＴＳＬＰ結合タンパク質を安定化させるために単独または混合して使用してよい。塩化ベンザルコニウムまたは安息香酸およびその塩などの保存剤を加えてもよい。懸濁液の物理的安定性を改善するために界面活性剤を加えてもよい。これらには、レシチン、ジオクチルスルホコハク酸二ナトリウム、オレイン酸およびソルビタンエステルが含まれる。
【０１７５】
用語「個体」、「被験体」および「患者」は本明細書では互換的に使用される。１つの実施態様では、被験体は霊長類、例えば、マーモセットまたはサルなどの哺乳動物である。別の実施態様では、被験体はヒトである。
【０１７６】
本明細書に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質はまた、処置の方法において使用可能である。処置は治療的、予防的または回避的であり得る。処置は疾患の少なくとも１つの側面または症状の緩和、軽減、または回避を包含し、本明細書に記載の疾患の回避または治癒を包含する。
【０１７７】
本明細書に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質は、治療的、予防的または回避的処置のための有効量で使用される。本明細書に記載の抗原結合タンパク質の治療上有効な量は、疾患の１以上の症状の改善もしくは軽減、または疾患の回避もしくは治癒に有効な量である。
【０１７８】
本明細書に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質は、特に以下の障害のいずれか１つの処置に使用するための薬剤として使用可能である。
【０１７９】
本明細書に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質は、以下の障害のいずれか１つの処置に使用するための薬剤の製造において使用可能である。
【０１８０】
ＴＳＬＰの発現および／または機能は、いくつかの炎症性障害、主として本来アレルギー性のもの（免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）関連免疫応答を特徴とする）だけでなく非アレルギー性疾患にも関連付けられる。これらの疾患には、限定されるものではないが、喘息（重症喘息を含む）、特発性肺線維症、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎（ＡＲ）、ネザートン症候群（ＮＳ）、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、食物アレルギー、アレルギー性下痢、好酸球性胃腸炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）、アレルギー性真菌性副鼻腔炎、癌（例えば、乳癌、膵臓癌、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病）、関節リウマチ、ＣＯＰＤ、全身性硬化症、ケロイド、潰瘍性大腸炎、慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳ）、および鼻ポリープが含まれる。加えて、ＴＳＬＰは、２型サイトカインＩＬ−５、ＩＬ−１３およびＩＬ−４の産生を刺激するので、限定されるものではないが、喘息、アレルギー性鼻炎、慢性好酸球性肺炎、好酸球性気管支炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、小児脂肪便症、好酸球性胃腸炎、チャーグ−ストラウス症候群、好酸球性筋痛症候群、好酸球増多症候群、多発血管炎性好酸球性肉芽腫症、好酸球性食道炎、および炎症性腸疾患などの、これらのサイトカインが関連付けられている疾患にも関連付けられる。
【０１８１】
よって、１つの実施態様では、本発明は、ＴＳＬＰシグナル伝達に関連する処置において使用するためのＴＳＬＰ結合タンパク質を提供する。ＴＳＬＰシグナル伝達に関連する疾患の処置のための薬剤の製造における本明細書で定義されるＴＳＬＰ結合タンパク質の使用も提供される。本発明は、必要とするヒト患者においてＴＳＬＰシグナル伝達に関連する疾患を処置する方法を提供し、前記方法は、本明細書で定義されるＴＳＬＰ結合タンパク質を前記ヒト患者に投与することを含んでなる。
【０１８２】
１つの実施態様では、ＴＳＬＰシグナル伝達に関連する疾患は、喘息、特発性肺線維症、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、ネザートン症候群、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、食物アレルギー、アレルギー性下痢、好酸球性胃腸炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）、アレルギー性真菌性副鼻腔炎、癌、関節リウマチ、ＣＯＰＤ、全身性硬化症、ケロイド、潰瘍性大腸炎、慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳ）、鼻ポリープ、慢性好酸球性肺炎、好酸球性気管支炎、小児脂肪便症、チャーグ−ストラウス症候群、好酸球性筋痛症候群、好酸球増多症候群、多発血管炎性好酸球性肉芽腫症および炎症性腸疾患からなる群から選択される。より特定の実施態様では、ＴＳＬＰシグナル伝達に関連する疾患は、喘息、特発性肺線維症、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、ネザートン症候群、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、食物アレルギー、アレルギー性下痢、好酸球性胃腸炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）、アレルギー性真菌性副鼻腔炎、癌、関節リウマチ、ＣＯＰＤ、全身性硬化症、ケロイド、潰瘍性大腸炎、慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳ）および鼻ポリープからなる群から選択される。いっそうより特定の実施態様では、ＴＳＬＰシグナル伝達に関連する疾患は喘息である。
【０１８３】
喘息は、変動性かつ再発性の症状、可逆的気流閉塞および気管支痙攣を特徴とする気道の一般的な慢性炎症性疾患である。一般症状には、喘鳴音、咳、胸部圧迫感、および息切れが含まれる。喘息は、遺伝因子と環境因子の組合せにより引き起こされると思われ、主として気管支拡張薬および吸入または経口コルチコステロイドの使用により管理される。
【０１８４】
吸入コルチコステロイドには、プロピオン酸フルチカゾン、フロ酸フルチカゾン、ジプロプリオン酸ベクロメタゾン、ブデソニド、シクレソニド、フロ酸モメタゾン、トリアムシノロンおよびフルニソリドが含まれる。
【０１８５】
気管支拡張薬には、β２−アデノ受容体作用薬およびムスカリン性拮抗薬が含まれる。β２−アデノ受容体作用薬の例としては、ビランテロール、サルメテロール、サルブタモール、フォルモテロール、サルメファモール、フェノテロール、カルモテロール、エタンテロール、ナミンテロール、クレンブテロール、ピルブテロール、フレルブテロール、レプロテロール、バムブテロール、インダカテロール、テルブタリンおよびそれらの塩、例えば、サルメテロールのキシナホ酸（１−ヒドロキシ−２−ナフタレンカルボン酸）塩、サルブタモールの硫酸塩または遊離塩基、フォルモテロールのフマル酸塩、またはビランテロールのトリフェニル酢酸塩(trifenatate)が挙げられる。ムスカリン性拮抗薬の例としては、ウメクリジニウム、チオトロピウム、グリコピロレート、イプラトロピウム、およびそれらの塩、例えば、ウメクリジニウムの臭化物塩（臭化ウメクリジニウム)が挙げられる。
【０１８６】
重症喘息は、前年にＧＩＮＡ段階４〜５の喘息に関してガイドラインにより示唆される投薬による処置（高用量吸入コルチコステロイド（ＣＳ）およびＬＡＢＡまたはロイコトリエン修飾薬／テオフィリン）を必要とするか、それが「制御不能」になることを防ぐために前年の５０％以上の間全身性ＣＳを必要とする、またはこの治療にもかかわらずに「制御不能」に留まる喘息である。
【０１８７】
ＣＯＰＤは、最も多くは菌津炎に関連し、慢性気管支炎および気腫を特徴とする進行性の肺疾患である。肺機能の低下、呼吸困難、粘液の過剰生産および咳はこの疾患のホールマーク的特徴である。ＣＯＰＤは、主として気管支拡張薬およびステロイドにより薬理学的に、また、酸素両方により管理される。
【０１８８】
アトピー性皮膚炎（ＡＤ）は、皮膚病変、血清総ＩｇＥの上昇を、そして高レベルのＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３をもたらすＴｈ２過剰応答(Leung et al. Current Opinion in Immunology  15(6):634-638 (2003))を特徴とする皮膚の慢性再発性炎症性湿疹疾患を特徴とする。ＡＤの誘因は十分に理解されていないが、遺伝因子とアレルゲンとして働き得る環境因子の組合せを含む。
【０１８９】
好酸球性食道炎（ＥｏＥ）は、食道粘膜の好酸球浸潤を特徴とする慢性炎症性疾患である(Roman et al. Digestive and Liver Disease 45(11):871-878 (2013))。ＥｏＥは成人と小児の両方を侵し、食道狭窄に関連死、食品圧入、嚥下障害、体重増加不良、嘔吐および食欲不振を呈することが多い。局所様粘性コルチコステロイドまたは食品除外が選択処置となる。
【０１９０】
ネザートン症候群（ＮＳ）は、ＡＤ様病変、ならびにセリンプロテアーゼ阻害剤ＬＥＫＴＩをコードするＳＰＩＮＫ５遺伝子の突然変異から起こる他のアレルギー性病徴を特徴とする重篤な皮膚疾患である。ＴＳＬＰは、ＮＳを有する個体の皮膚に強く発現される。
【０１９１】
本発明のＴＳＬＰ結合タンパク質は単独でまたは他の治療薬と組み合わせて投与することができる。ＴＳＬＰ結合タンパク質および１以上の他の治療薬は、個別に、同時にまたは逐次に投与することができる。
【０１９２】
本発明のＴＳＬＰ結合タンパク質は、フロ酸フルチカゾン、プロピオン酸フルチカゾン、ブデソニド、シクレソニド、二プロピオン酸ベクロメタゾン、フロ酸モメタゾン、トリアムシノロンアセトニドおよびプレドニゾロンなどの吸入用、鼻腔内または非経口コルチコステロイドと組み合わせて投与することができる。１つの実施態様では、本発明のＴＳＬＰ結合タンパク質は、吸入用コルチコステロイドとの固定用量合剤、例えば、フロ酸フルチカゾンまたはプロピオン酸フルチカゾンとの固定用量合剤として投与することができる。
【０１９３】
本発明のＴＳＬＰ結合タンパク質は、β−２アデノ受容体作用薬および／またはムスカリン性拮抗薬などの気管支拡張薬と組み合わせて投与することができる。好適なβ−２アデノ受容体作用薬には、ビランテロール、サルメテロール、サルブタモール、フォルモテロール、サルメファモール、フェノテロール、カルモテロール、エテンテノール、ナミンテロール、クレンブテロール、ピルブテロール、フレルブテロール、レプロテロール、バムブテロール、インダカテロール、テルブタリン、およびそれらの塩が含まれる。好適なムスカリン性拮抗薬には、ウメクリジニウム、チオトロピウム、グリコピロレート、イプラトロピウム、およびそれらの塩、例えば、ウメクリジニウムの臭化物塩が含まれる。１つの実施態様では、本発明のＴＳＬＰ結合タンパク質は、β−２アデノ受容体作用薬および／またはムスカリン性拮抗薬との固定用量合剤、例えば、トリフェニル酢酸ビランテロール(vilanterol trifenatate)、臭化ウメクリジニウムまたはトリフェニル酢酸ビランテロールと臭化ウメクリジニウムの二剤合剤との固定用量合剤として投与することができる。
【０１９４】
本発明のＴＳＬＰ結合タンパク質は、１種類以上の気管支拡張薬と吸入用ステロイドの合剤とともに投与することができる。このような組合せは、フロ酸フルチカゾンとトリフェニル酢酸ビランテロール、フロ酸フルチカゾンと臭化ウメクリジニウム、プロピオン酸フルチカゾンとサルメテロール、ブデソニドとフォルモテロール、モメタゾンとフォルモテロールなどの二剤合剤、およびフロ酸フルチカゾンとトリフェニル酢酸ビランテロールと臭化ウメクリジニウムなどの三剤療法を含み得る。１つの実施態様では、本発明のＴＳＬＰ結合タンパク質は、吸入用コルチコステロイドと１種類以上の気管支拡張薬の固定用量合剤、例えば、フロ酸フルチカゾンとトリフェニル酢酸ビランテロール、またはプロピオン酸フルチカゾンとサルメテロール、またはフロ酸フルチカゾンと臭化ウメクリジニウム、またはフロ酸フルチカゾンとトリフェニル酢酸ビランテロールと臭化ウメクリジニウムとの固定用量合剤として投与することができる。
【０１９５】
本発明のＴＳＬＰ結合タンパク質は、モンテルカスト、ザフィルルカストおよびプランルカストなどの抗ロイコトリエン拮抗薬；ロフルミラストなどのＰＤＥ４阻害剤；キサンテン類；オマリズマブなどの抗ＩｇＥ抗体；メポリズマブ、ベンナリズマブおよびレスリズマブなどのＩＬ−５拮抗薬；レブリキズマブおよびトラロキヌマブなどのＩＬ−１３拮抗薬；デュピルマブなどのＩＬ−４／ＩＬ−１３拮抗薬；シルクマブなどのＩＬ−６拮抗薬、ならびにＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−３３、ＩＬ−２５およびＴＮＦ−αの拮抗薬などと組み合わせて投与することができる。
【０１９６】
本発明のＴＳＬＰ結合タンパク質は、塩酸セチリジン、レボセチリジン、デスロラチジン、ロラチジン、塩酸フェキソフェナジンまたはアゼラスチンなどの抗ヒスタミン薬と組み合わせて投与することができる。
【０１９７】
本発明のＴＳＬＰ結合タンパク質は、ピルフェニドンまたはニンテダニブまたはａｖＢ６拮抗薬、例えば、ＷＯ２０１４／１５４７２５に開示されているものと組み合わせて投与することができる。
【０１９８】
本発明の特定の実施態様として以下のものを含む。
実施態様１  以下のＣＤＲ：配列番号９由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３またはこれらのＣＤＲのいずれか１つもしくは総ての変異体を含んでなり、前記ＴＳＬＰ結合タンパク質はＴＳＬＰと２ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で結合し、かつ／またはＴＳＬＰとの結合をめぐって配列番号９の単一可変ドメインと競合する、ＴＳＬＰ結合タンパク質。
【０１９９】
実施態様２
（ｉ）配列番号１のＣＤＲ１、またはＰｒｏ２８がＡｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、ＴｈｒまたはＧｌｕで置換され；Ｉｌｅ２９がＶａｌで置換され；Ａｒｇ３０がＡｓｐ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、ＧｌｙまたはＴｈｒで置換され；Ａｓｎ３１がＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＬｙｓまたはＧｌｙで置換され；Ｔｒｐ３２がＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、ＳｅｒまたはＡｒｇで置換され；Ｌｅｕ３３がＭｅｔ、Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＰｈｅで置換され；Ａｓｐ３４がＡｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＶａｌまたはＰｈｅで置換されている配列番号１の変異体、
（ｉｉ）配列番号４のＣＤＲ２、またはＡｌａ５１がＴｈｒ、ＧｌｙまたはＶａｌで置換されている配列番号４の変異体、ならびに
（ｉｉｉ）配列番号７のＣＤＲ３、またはＶａｌ８９がＧｌｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＰｈｅまたはＬｅｕで置換され；Ｇｌｎ９０がＡｓｎまたはＨｉｓで置換され；Ｉｌｅ９１がＡｓｎ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＶａｌで置換され；Ｇｌｙ９２がＡｓｎ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、ＡｌａまたはＡｓｐで置換され；Ｇｌｕ９３がＡｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、またはＡｌａで置換され；Ａｓｐ９４がＴｙｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、ＰｒｏまたはＳｅｒで置換され；Ｖａｌ９６がＰｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、ＴｒｐまたはＰｈｅで置換されている配列番号７の変異体を含んでなり、かつ、
ＴＳＬＰと２ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で結合し、かつ／またはＴＳＬＰとの結合をめぐって配列番号９の単一可変ドメインと競合する、ＴＳＬＰ結合タンパク質。
【０２００】
実施態様３  ＣＤＲ１が配列番号１からなり；ＣＤＲ２が配列番号４からなり；かつ／またはＣＤＲ３が配列番号７からなる、実施態様１または２に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【０２０１】
実施態様４  以下の残基：２番にＩｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌ；３番にＶａｌ、Ｇｌｎ、ＬｅｕまたはＧｌｕ；４番にＭｅｔまたはＬｅｕ；２３番にＣｙｓ；３５番にＴｒｐ；３６番にＴｙｒ、ＬｅｕまたはＰｈｅ；４６番にＬｅｕ、ＡｒｇまたはＶａｌ；４９番にＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、ＬｙｓまたはＴｒｐ；７１番にＴｙｒまたはＰｈｅ；８８番にＣｙｓ；および９８番にＰｈｅを含んでなる軽鎖フレームワークを含んでなる、実施態様１〜３のいずれか一項に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【０２０２】
実施態様５  軽鎖フレームワークが以下の残基：２番にＩｌｅ、３番にＧｌｎ、４番にＭｅｔ、２３番にＣｙｓ、３５番にＴｒｐ、３６番にＴｙｒ３６、４６番にＬｅｕ、４９番にＴｒｐ、７１番にＰｈｅ、８８番にＣｙｓ、および９８番にＰｈｅを含んでなる、実施態様４のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【０２０３】
実施態様６  単一可変ドメインである、実施態様１〜５のいずれか１つのＴＳＬＰ結合タンパク質。
【０２０４】
実施態様７  前記単一可変ドメインがＶκ単一可変ドメインである、実施態様６のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【０２０５】
実施態様８  前記Ｖκ単一可変ドメインがＲＴで終わるＣ末端を有する、実施態様７に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【０２０６】
実施態様９  前記Ｖκ単一可変ドメインがＲで終わらないＣ末端を有する、実施態様７のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【０２０７】
実施態様１０  配列番号９の単一可変ドメインを含んでなる、実施態様５のＴＳＬＰ結合タンパク質。
【０２０８】
実施態様１１  １０個までのアミノ酸の置換、欠失または付加を任意の組合せで有し、ＴＳＬＰと２ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で結合し、かつ／またはＴＳＬＰとの結合をめぐって配列番号９の単一可変ドメインと競合する配列番号９のアミノ酸配列を含んでなる抗ＴＳＬＰ単一可変ドメイン。
【０２０９】
実施態様１２  前記アミノ酸の置換、欠失または付加がＣＤＲ３内に無い、実施態様１１に記載の抗ＴＳＬＰ単一可変ドメイン。
【０２１０】
実施態様１３  前記アミノ酸の置換、欠失または付加がいずれのＣＤＲ内にも無い、実施態様１２に記載の抗ＴＳＬＰ単一可変ドメイン。
【０２１１】
実施態様１４  配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメイン。
【０２１２】
実施態様１５  抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインを含んでなり、ＴＳＬＰと結合する、実施態様９〜１４のいずれか１つに記載される単離されたポリペプチド。
【０２１３】
実施態様１６  ＴＳＬＰ結合タンパク質、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインまたはポリペプチドがヒトＴＳＬＰと結合する、実施態様１〜１０のいずれか１つに記載のＴＳＬＰ結合タンパク質、実施態様１１〜１４のいずれか１つに記載の抗ＴＳＬＰ単一可変ドメイン、または実施態様１５に記載のポリペプチド。
【０２１４】
実施態様１７  ＴＳＬＰ結合タンパク質、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインまたはポリペプチドがカニクイザルＴＳＬＰとも結合する、実施態様１６に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインまたはポリペプチド。
【０２１５】
実施態様１８  ＴＳＬＰ結合タンパク質、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインまたはポリペプチドがＴＳＬＰ活性を中和する、実施態様１６に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインまたはポリペプチド。
【０２１６】
実施態様１９  ＴＳＬＰ結合タンパク質、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインまたはポリペプチドがＴＳＬＰとＴＳＬＰ受容体の結合を阻害する、実施態様１８に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインまたはポリペプチド。
【０２１７】
実施態様２０  実施態様１〜１９のいずれか１つに記載のＴＳＬＰ結合タンパク質、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメインまたはポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【０２１８】
実施態様２１  配列番号１０または配列番号１１を含んでなる、実施態様２０に記載の単離された核酸分子。
【０２１９】
実施態様２２  実施態様２０または実施態様２１に記載の核酸分子を含んでなるベクター。
【０２２０】
実施態様２３  実施態様２０もしくは２１に記載の核酸または実施態様２２に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【０２２１】
実施態様２４  実施態様１〜１０のいずれか１つに記載のＴＳＬＰ結合タンパク質、実施態様１１〜１４のいずれか１つに記載の抗ＴＳＬＰ単一可変ドメイン、または実施態様１５に記載のポリペプチドを含んでなるポリペプチドを製造する方法であって、実施態様２３に記載の宿主細胞を前記核酸またはベクターの発現に適した条件下で維持し、それにより、ＴＳＬＰ結合タンパク質または単一可変ドメインを含んでなるポリペプチドが生産されることを含んでなる、方法。
【０２２２】
実施態様２５  薬剤として使用するための、実施態様１〜１０のいずれか１つに記載のＴＳＬＰ結合タンパク質、実施態様１１〜１４のいずれか１つに記載の抗ＴＳＬＰ単一可変ドメイン、または実施態様１５に記載のポリペプチド。
【０２２３】
実施態様２６  実施態様１〜１０のいずれか１つに記載のＴＳＬＰ結合タンパク質、実施態様１１〜１４のいずれか１つに記載の抗ＴＳＬＰ単一可変ドメイン、または実施態様１５に記載のポリペプチドを含んでなる医薬組成物。
【０２２４】
実施態様２７  ＴＳＬＰシグナル伝達に関連する疾患の処置のための、実施態様１〜１０のいずれか１つに記載のＴＳＬＰ結合タンパク質、実施態様１１〜１４のいずれか１つに記載の抗ＴＳＬＰ単一可変ドメイン、実施態様１５に記載のポリペプチド、または実施態様２６に記載の医薬組成物。
【０２２５】
実施態様２８  ＴＳＬＰシグナル伝達に関連する疾患の処置のための薬剤の製造における、実施態様１〜１０のいずれか１つに記載のＴＳＬＰ結合タンパク質、実施態様１１〜１４のいずれか１つに記載の抗ＴＳＬＰ単一可変ドメイン、または実施態様１５に記載のポリペプチドの使用。
【０２２６】
実施態様２９  前記ＴＳＬＰシグナル伝達に関連する疾患が、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、ネザートン症候群、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、アレルギー性下痢、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）、アレルギー性真菌性副鼻腔炎、癌、関節リウマチ、ＣＯＰＤ、全身性硬化症、慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳ）、および鼻ポリープからなる群から選択される、実施態様２７に記載のＴＳＬＰ結合タンパク質、抗ＴＳＬＰ単一可変ドメイン、ポリペプチドもしくは医薬組成物、または実施態様２８に記載の使用。
【０２２７】
実施態様３０  必要とするヒト患者においてＴＳＬＰにより媒介される病態を処置する方法であって、実施態様１〜１０のいずれか１つに記載のＴＳＬＰ結合タンパク質、実施態様１１〜１４のいずれか１つに記載の抗ＴＳＬＰ単一可変ドメイン、または実施態様１５に記載のポリペプチドを含んでなる組成物を前記ヒト患者に投与することを含んでなる、方法。
【０２２８】
実施態様３１  実施態様１〜１０のいずれか１つに記載のＴＳＬＰ結合タンパク質、実施態様１１〜１４のいずれか１つに記載の抗ＴＳＬＰ単一可変ドメイン、または実施態様１５に記載のポリペプチドと前記ＴＳＬＰ結合タンパク質、単一可変ドメインまたはポリペプチドを吸入するためのデバイスを含んでなるキット。
【実施例】
【０２２９】
実施例１  ＴＳＬＰと結合するナイーブｄＡｂの同定
ＴＳＬＰに特異的なドメイン抗体を、標準的なファージディスプレー技術を用いて同定した。Ｄｏｍａｎｔｉｓナイーブファージライブラリーディスプレー抗体単一可変ドメインをビオチン化組換えカニクイザルＴＳＬＰに対するパンニングに使用した。ＴＳＬＰと結合するｄＡｂをｄＡｂ  ＥＬＩＳＡにより同定した。ＴＳＬＰ特異的ｄＡｂを、表面プラズモン共鳴アッセイおよび／またはＴＳＬＰ受容体結合アッセイ（ＲＢＡ）でさらに特性評価した。陽性ヒットを配列決定により同定し、これらのヒットを「ナイーブｄＡｂ」と呼称した。これらの最初のナイーブ選択では、その目的は２０〜２０００ｎＭの範囲の効力（ＲＢＡまたは細胞アッセイにより測定されるＩＣ５０）を有するｄＡｂを同定することであった。ｄＡｂ  ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６およびｄＡｂ  Ｄｏｍ３０ｈ−４４０−８７／９３、および本明細書に開示される望ましい特性を備えた他の高親和性ｄＡｂの作製に関与する、この工程と次の工程を示すフローチャートを図１に示す。
【０２３０】
ｄＡｂ  ＥＬＩＳＡスクリーニング
ヒトおよびカニクイザルＴＳＬＰ特異的ｄＡｂはＥＬＩＳＡにより同定した。簡単に述べれば、ニュートラビジンでプレーコーティングした９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）イムノプレート（Ｎｕｎｃ、デンマーク）を４℃で一晩、ビオチン化カニクイザルＴＳＬＰまたはビオチン化ヒトＴＳＬＰでコーティングした。ウェルをＰＢＳＴで洗浄した後、ＰＢＳ中２％Ｍａｒｖｅｌ（２％ＭＰＢＳ）でブロッキングした。ｄＡｂ上清を２％ＭＰＢＳ中、１：１混合物で加えた。結合したｄＡｂを、モノクローナル抗ＦＬＡＧ  Ｍ２−ペルオキシダーゼコンジュゲート抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）を用いて検出した。ペルオキシダーゼコンジュゲート抗体の検出には、比色基質（ＳｕｒｅＢｌｕｅ  １−コンポネント  ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ溶液）を用い、４５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定した。カニクイザルＴＳＬＰに対する陽性結合剤は、ＯＤ４５０がアッセイバックグラウンドの２倍である場合に同定した。
【０２３１】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ（ＴＳＬＰの第一級アミンカップリング）
ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００を用い、ｄＡｂをヒトＴＳＬＰ、カニクイザルＴＳＬＰおよびヒトＩＬ−７サイトカインとの結合動態および結合親和性に関して評価した。ヒトＴＳＬＰ、カニクイザルＴＳＬＰおよびヒトＩＬ−７を第一級アミンカップリングによりＣＭ４チップに固定化した。試験Ａｂをこれらの固定化サイトカインに、ＨＢＳ−ＥＰバッファー中１６０ｎＭ、４０ｎＭ、１０ｎＭ、２．５ｎＭ、０．６３ｎＭおよび０．１５６ｎＭで流し、結合曲線を記録した。これを同じＢＩＡｃｏｒｅ実行内で２５℃にて２反復で行った。これらの曲線はバッファー注入曲線を用いて二重参照とし、その後、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウエアに内在する１：１結合モデルに当てはめた。
【０２３２】
ＴＳＬＰ受容体結合アッセイ（ＲＢＡ）
ＴＳＬＰ中和活性を備えたｄＡｂを同定するために、可溶性ｄＡｂを、ＴＳＬＰのその受容体複合体への結合を遮断するそれらの能力に関して試験した。ヒトＴＳＬＰＲおよびＩＬ−７Ｒ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の細胞外ドメインをＥＬＩＳＡプレートにコーティングして自己会合させ、ＴＳＬＰ受容体ヘテロ二量体を形成させた。ｄＡｂを単一の濃度で、または一定の濃度範囲（例えば、３．８ｐＭ〜１μＭ）で希釈して試験し、所定の濃度（例えば１．５ｎｇ／ｍｌ）のヒトまたはカニクイザルいずれかのＴＳＬＰとともに１時間プレインキュベートした。次に、ｄＡｂ−ＴＳＬＰ複合体をマイクロウェルプレートに２時間加え、結合したＴＳＬＰの量をビオチン化ＴＳＬＰ検出抗体およびストレプトアビジン：ＨＲＰ（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを用いて４５０ｎＭで吸光度を測定）またはルテニル化ＴＳＬＰ検出抗体（ＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒを用いて電気化学的発光を測定）のいずれかを用いて定量した。４パラメーターロジスティックフィットモデルを用いてデータをプロットして効力値を得た。
【０２３３】
上清中のｄＡｂの濃度を決定するためのアッセイ
Ｃ末端ＦＬＡＧタグとともに発現されたｄＡｂを、上清においてＦＬＡＧエピトープの検出により定量した。このアッセイはＣｙ３ｂ標識ＦＬＡＧペプチドとテルビウム標識抗ＦＬＡＧ抗体の間のＨＴＲＦシグナルに頼るものである。ＦＬＡＧタグとともに発現されるｄＡｂはこの相互作用に関して競合し、ＨＴＲＦシグナルを低減することができる。
【０２３４】
Ｃ末端ＦＬＡＧタグを有する既知濃度の対照ｄＡｂを２倍ＹＴ培養培地で連続希釈した後、ＰＢＳでさらに１：１０希釈して培養培地の終濃度を下げた。７μｌの各サンプルを３８４ウェル白色ＬＶアッセイプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）のウェルに加えた。これをｄＡｂ標準曲線として用いた。
【０２３５】
未知濃度の試験ｄＡｂ（上清）を２倍ＹＴ培地で希釈し（無希釈、１：２、１：４、１：８）、次いで、ＰＢＳでさらに１：１０して培養培地の終濃度を下げた。７μｌ／ウェルの各サンプルをこのアッセイプレートに加えた。
【０２３６】
蛍光標識したＦＬＡＧペプチド（Ｈ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｃｙ３Ｂ）−ＯＨ）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を０．２ｍＭ  ＢＳＡおよび１ｍＭ  ＣＨＡＰＳバッファー中、抗Ｆｌａｇ  Ｍ２テルビウム標識抗体（Ｃｉｓｂｉｏカタログ番号６１ＦＧ２ＴＬＢ）との混合物中１μＭの（終濃度１／２０００希釈）で調製した。
【０２３７】
７μｌのＦＬＡＧペプチド／抗ＦＬＡＧ  ｍＡｂ混合物を各ウェルに加え、このプレートを１０００ｒｐｍで１分間回転させ、ウェルの底部の溶液を回収した。このプレートを暗所、室温で１０分間インキュベートした後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いてリード蛍光を読み取った。ＨＴＲＦ発光を２つの異なる波長６１５ｎｍ（ドナー）および６６５ｎｍ（アクセプター）で測定し、ウェルごとの変動を少なくした（レシオメトリック測定）。上清サンプル中のｄＡｂの濃度を、連続希釈対照ｄＡｂの標準曲線から決定した。
【０２３８】
精製ｄＡｂの濃度を決定するためのアッセイ
バッファー中の精製ｄＡｂの濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  １０００装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、２８０ｎＭでのＵＶ光の吸光度を測定することにより分光光度的に決定した。
【０２３９】
実施例２：ＴＳＬＰに対するｄＡｂの親和性を増強するための親和性成熟
ＣＤＲ領域を再多様化するために、変性突然変異誘発を用い、ＤＯＭ３０ｈ−４４０ナイーブｄＡｂに対して親和性成熟を行った。ＣＤＲの多様化は、各ＣＤＲ内の全突然変異をカバーするように設計された単一の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いて構築されたドープライブラリーを用いて行った。被多様化アミノ酸を、単一の位置に複数のアミノ酸をコードすることを可能とする縮重コドンを用いて特定した。再多様化されたｄＡｂに、漸減量のビオチン化カニクイザルＴＳＬＰ抗原（１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ）に対する５回の選択を行った。同定されたｄＡｂの例を図４に示す。
【０２４０】
【表４】
2018509153.tif 000006
2018509153.tif 000007
【０２４１】
ＤＯＭ３０ｈ−４４０−３５  ｄＡｂに対し、選択中に標的抗原（ビオチン化ＴＳＬＰ）と１：１の相互作用を可能とし、かつ、固有の親和性に基づいて改良型のｄＡｂクローンの選択を可能とするファージミド系を用いてさらなる親和性成熟を行った。２回目の親和性成熟は、ＮＮＫウォーキングおよび誤りがちな突然変異誘発の２つの突然変異誘発アプローチを用いて行った。ＮＮＫウォーキングは、標的残基に対する全突然変異をカバーするように設計された単一の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いて構築されたＮＮＫライブラリーを用いたＣＤＲ領域の再多様化をもたらす。誤りがちな突然変異誘発は、ｄＡｂ当たり４．５〜９のアミノ酸変異という中等度の突然変異率で全ｄＡｂ配列に対して多様化を行い、これはフレームワーク領域とＣＤＲ領域の療法を含んだ。ＮＮＫファージミドライブラリーと誤りがちなライブラリーの両方に、（個々にまたは他のライブラリーとのプールとして）１０ｎＭ、１ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭのビオチン化カニクイザルＴＳＬＰに対して４回の選択（それぞれ１、２、３、４回）を行った。ｄＡｂの配列を決定し、ＴＳＬＰ受容体結合アッセイ（ＲＢＡ）（実施例１の方法論）によりスクリーニングし、かつ／または細胞系アッセイ（以下の方法論）で試験した。精製ｄＡｂの親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（以下の方法論）により決定した。
【０２４２】
細胞アッセイ（ＳＷ７５６細胞におけるＴＳＬＰにより誘導されるｐＳＴＡＴ５の阻害）
膣癌細胞株ＳＷ７５６（ＡＴＣＣ）において、ＴＳＬＰにより刺激される、シグナル伝達兼転写活性化因子５のリン酸化を阻害する効力を決定するために親和性成熟したｄＡｂを評価した。これらの細胞は、ｍＲＮＡ分析により判定されるように内因性ＴＳＬＰ受容体を発現し、ＳＴＡＴ５リン酸化により証明されるようにＴＳＬＰに応答することが示された。要するに、ＳＷ７５６細胞を９６ウェルプレートに２５，０００細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２中で一晩インキュベートして接着させた。ＥＣ７５濃度１ｎｇ／ｍｌのヒトまたはカニクイザルＴＳＬＰを０．０５〜１０００ｎＭの範囲の濃度のｄＡｂとともに１時間プレインキュベートした。ＴＳＬＰ／ｄＡｂ複合体をこれらの細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ２中で３０分間インキュベートした後、細胞を溶解させた。ＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００を用い、製造者のプロトコール（Ｋ１５１６３Ｄ−３）に従ってＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）によりｐＳＴＡＴ５を定量するために溶解液を分析した。４パラメーターロジスティックフィットモデルを用いてデータをプロットして効力値を得た。
【０２４３】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ（ビオチン化ＴＳＬＰ）
ｄＡｂの、ビオチン化ヒトＴＳＬＰおよびビオチン化カニクイザルＴＳＬＰに関する結合動態および結合親和性を評価した。これはＢＩＡＣＯＲＥ（商標）４０００を用いて測定した。ビオチン化ヒトＴＳＬＰおよびビオチン化カニクイザルＴＳＬＰを、ＳＡ−ビオチンカップリングによりＳＡチップに固定化した。試験ｄＡｂをこれらの固定化サイトカインにＨＢＳ−ＥＰバッファー中１０００ｎＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭおよび０ｎＭで流し、結合曲線を記録した。これを２５℃にて同じＢＩＡｃｏｒｅ実行内で行った。これらの曲線はバッファー注入曲線を用いて二重参照とし、その後、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）４０００評価ソフトウエアに内在する１：１結合モデルに当てはめた。
【０２４４】
親和性成熟スクリーニングの目的は、５ｎＭ未満の効力（ＲＢＡまたは細胞アッセイにより測定されるＩＣ５０）を有し、かつ、カニクイザルＴＳＬＰと良好な交差反応性（好ましくは、ヒトＴＳＬＰとカニクイザルＴＳＬＰの間でＩＣ５０に５倍未満の違い）を保持していたｄＡｂを同定することである。表５にＲＢＡまたは細胞アッセイにおいて５ｎＭ未満の効力（ＩＣ５０）を有していたクローンを列挙する。
【０２４５】
【表５】
2018509153.tif 000008
【０２４６】
実施例３：ＩＣ５０＜５ｎＭのクローンに関する「コンセンサス」ＣＤＲＬ３の同定
表６は、表５に列挙された各クローンに関するＣＤＲ３の配列（Ｋａｂａｔナンバリング規則に従う）を示す。
【０２４７】
【表６】
2018509153.tif 000009
【０２４８】
クローン間にはＣＤＲＬ３の配列の変動がある。ヒトＴＳＬＰを用いた受容体結合アッセイおよび／またはヒトＴＳＬＰを用いた細胞アッセイで５ｎＭ以下のＩＣ５０を有する総てのクローン由来の配列ＣＤＲＬ３のコンセンサス配列を同定することが可能である：Ｘ１ＧｌｎＸ２Ｘ３Ｘ４ＡｓｐＰｒｏＸ５Ｔｈｒ、配列中、Ｘ１はＬｙｓ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、ＭｅｔまたはＩｌｅを表し、Ｘ２はＶａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＰｈｅを表し、Ｘ３はＧｌｙまたはＡｌａを表し、Ｘ４はＧｌｕ、Ｐｈｅ、ＡｓｐまたはＳｅｒを表し、かつ、Ｘ５はＶａｌまたはＴｈｒを表す。
【０２４９】
加えて、ヒトおよびカニクイザルＴＳＬＰを用いる細胞アッセイにおいてＩＣ５０に５倍以下の差がある必要があれば、コンセンサス配列は、Ｘ１ＧｌｎＸ２Ｘ３Ｘ４ＡｓｐＰｒｏＸ５Ｔｈｒとなり、配列中、Ｘ１はＬｙｓ、Ｔｒｐ、ＶａｌまたはＭｅｔを表し、Ｘ２はＶａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅを表し、Ｘ３はＧｌｙまたはＡｌａを表し、Ｘ４はＧｌｕ、Ｐｈｅ、ＡｓｐまたはＳｅｒを表し、かつ、Ｘ５はＶａｌまたはＴｈｒを表す。
【０２５０】
実施例４：親和性成熟したｄＡｂのＣ末端修飾は既存のヒト抗Ｖκ（ＨＡＶＫ）抗体との結合を低減する
ＤＯＭ３０ｈ−４４０−５５およびＤＯＭ３０ｈ−４４０−５７は、親和性成熟後に、ヒトおよびカニクイザルＴＳＬＰに対する効力が改善されたと特定されたｄＡｂの例である。ＤＯＭ３０ｈ−４４０−５５の場合、このｄＡｂはまた、より高い温度安定性（Ｔｍ）も有することが示された。表７に詳細に示されるように、既存のＨＡＶＫ抗体との結合を低減するためのＣ末端修飾および他のフレームワーク突然変異をこれらのｄＡｂに対して行った。Ｄｏｍ３０ｈ−４４０−８７、Ｄｏｍ３０ｈ−４４０−８８、Ｄｏｍ３０ｈ−４４０−９０およびＤｏｍ３０ｈ−４４０−９１を、既存のＨＡＶＫ抗体との結合に対するＣ末端修飾の影響を決定するためのアッセイで試験した。
【０２５１】
既存のＨＡＶＫ抗体との結合に関するアッセイ
抗ＴＳＬＰ  ｄＡｂのＶｋ  ｄＡｂフレームワークに対するＣ末端修飾がＶｋフレームワークと結合する既存のヒト抗Ｖκ（ＨＡＶＫ）抗体との結合を低減し得るかどうかを調べるためのアッセイ（確認アッセイ）を開発するために、修飾型のＣ末端（ＤＴ０２−Ｋ−０４４−０８５  ｄＡｂ−ＷＯ２０１３０１４２０８に配列番号１０５として公開されるアミノ酸配列）を持たないＶκ  ｄＡｂを使用した。１０名の既知のＨＡＶＫ陽性ヒトドナー由来の血清サンプルをこのアッセイに使用した。
【０２５２】
マイクロタイターアッセイプレートにて、ＨＡＶＫ陽性ヒト血清サンプルを含有するサンプルおよび試験材料（例えば、ＤＴ０２−Ｋ−０４４−０８５  ｄＡｂ対照または修飾型ｄＡｂｓ）を室温で１時間プレインキュベートした後、アッセイ希釈剤（ＰＢＳ中１％カゼイン）中、ビオチン化ＤＴ０２−Ｋ  ０４４−０８５とルテニル化（「スルホタグ」（商標））ＤＴ０２−Ｋ−０４４−０８５  ｄＡｂの均質混合物に、終濃度が５％ＨＡＶＫ陽性ヒト血清、１０μｇ／ｍＬ試験材料（例えば、ＤＴ０２−Ｋ−０４４−０８５  ｄＡｂまたは修飾型ｄＡｂ）、０．２μｇ／ｍＬビオチン化ＤＴ０２−Ｋ−０４４−０８５および０．１μｇ／ｍＬルテニル化（「スルホタグ」（商標））ＤＴ０２−Ｋ−０４４−０８５  ｄＡｂとなるように加える。この混合物を室温で１時間インキュベートした後、アッセイサンプルをＭＳＤ（商標）ストレプトアビジンプレート（室温にて１〜２時間、ＰＢＳ（１％）中、１５０μＬ／ウェルカゼインで予めブロッキングし、洗浄せずにブロッキング剤を除去した）に移す。ＭＳＤ（商標）プレートを暗所、室温で１時間インキュベートした後、３回洗浄し、１５０μＬ／ウェルのリードバッファーを加え、プレートをＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒで読み取る。
【０２５３】
このアッセイにおける発光シグナルは、ＤＴ０２−Ｋ−０４４−０８５  ｄＡｂのビオチン化分子およびルテニル化分子がサンプル中に存在する抗体により架橋された際に生成する。遊離型の非標識ＤＴ０２−Ｋ−０４４−０８５  ｄＡｂは、このアッセイにおいてＨＡＶＫ結合をめぐって競合し、シグナル強度の低下（高いシグナル阻害率％）。このアッセイは、修飾型のＶｋ抗ＴＳＬＰ  ｄＡｂがＡＤＡ結合をめぐってＤＴ０２−Ｋ−０４４−０８５  ｄＡｂと競合し得るかどうかを決定するために使用した。結果を図２にシグナル阻害率％として示す。シグナル阻害率％が低いほど、ＨＡＶＫ抗体に結合できた修飾型ｄＡｂは少ない。この確認アッセイを用い、Ｃ末端に−Ｒまたは＋Ｔいずれかの修飾を有するｄＡｂがＤＴ０２−Ｋ−０４４−０８５  ｄＡｂに比べて既存のＨＡＶＫ抗体との結合を低減したと判定された。
【０２５４】
【表７】
2018509153.tif 000010
【０２５５】
修飾ｄＡｂのアミノ酸配列の配列識別子は以下のとおりである：
配列番号９：  Ｄｏｍ３０ｈ−４４０−８１／８６
配列番号１２：  Ｄｏｍ３０ｈ−４４０−８７／９３
配列番号３３：  Ｄｏｍ３０ｈ−４４０−８８／９２
配列番号３４：  Ｄｏｍ３０ｈ−４４０−８９／９４
配列番号３５：  Ｄｏｍ３０ｈ−４４０−９０／９５
配列番号３６：  Ｄｏｍ３０ｈ−４４０−９１／９６
【０２５６】
実施例５：ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６のさらなる特性決定
元のＣ末端を得るための［−Ｒ］および［＋Ｔ］の両Ｃ末端修飾は、ｄＡｂと既存のＨＡＶＫ抗体の結合の低減に等しく有効であることが示された。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける［＋Ｔ］Ｃ末端残基のクリッピングの理論的リスクを考慮した。よって、ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６（−Ｒ）およびＤＯＭ３０ｈ−４４０−８７／９３（−Ｒ）を、２回目の親和性成熟から高い効力、カニクイザルＴＳＬＰとの交差反応性および小規模での許容可能な収率の組合せに基づいて選択した。２つのうちＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６を、より高い温度安定性（Ｔｍ）のために選好した。
【０２５７】
ヒトおよびカニクイザルＴＳＬＰに対するＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６の親和性は、従前に記載されているようにビオチン化ＴＳＬＰを用いるＳＰＲにより決定した。データの例を表８に示す。
【０２５８】
【表８】
2018509153.tif 000011
【０２５９】
ＲＢＡにおけるＴＳＬＰの阻害に関する効力およびＳＷ７５６細胞におけるＴＳＬＰにより誘導されるｐＳＴＡＴ５の阻害に関する効力を従前に記載されているように決定した（表９）。ヒト全血におけるヒトＴＳＬＰにより誘導されるＴＡＲＣ（ＣＣＬ１７）の阻害に関するＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６の効力もまた決定した。データの例を表９に示す。
【０２６０】
ヒト全血におけるＴＳＬＰにより誘導されるＴＡＲＣ（ＣＣＬ１７）の阻害
ナトリウムヘパリン（１０００ＩＵ／１００ｍｌ）中、健康なボランティアドナー（英国人体組織法(UK Human Tissue Act)に準拠した適切なコンセントを伴う）由来の血液をＧＳＫスティーブニッジ献血ユニットから入手した。ｄＡｂを一定の濃度範囲（例えば、０．０４ｎＭ〜１００ｎＭ）に希釈した後、室温で１時間、ＥＣ７５濃度の組換えヒトＴＳＬＰ（１ｎｇ／ｍｌ）とともにプレインキュベートした。各ドナーからの血液をＴＳＬＰ：ｄＡｂ複合体に加え、３７℃および５％ＣＯ２でさらに４８時間インキュベートした。次に、血漿を回収し、ＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒを用いた製造者のプロトコール（Ｋ１５１ＢＧＣ−４）に記載されるようなＭＳＤによるＴＡＲＣレベルの分析のために、−８０℃で冷凍した。４パラメーターロジスティックフィットモデルを用いてデータをプロットして効力値を得た。
【０２６１】
【表９】
2018509153.tif 000012
【０２６２】
実施例６：ＨＥＫ細胞から発現されたグリコシル化組換えヒトＴＳＬＰの阻害に関するＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６の効力
細胞アッセイ（ＳＷ７５６細胞におけるＴＳＬＰにより誘導されるｐＳＴＡＴ５の阻害）、または全血アッセイ（ヒト全血におけるＴＳＬＰにより誘導されるＴＡＲＣ（ＣＣＬ１７）の阻害）を用い、ヒト胚腎（ＨＥＫ）細胞から発現されたヒトＴＳＬＰを阻害するＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６の効力を決定した。
【０２６３】
【表１０】
2018509153.tif 000013
【０２６４】
実施例７  ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６は天然ヒトＴＳＬＰを阻害する
炎症性サイトカイン（１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１βおよび１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦα）で４８時間刺激されたヒト肺線維芽細胞由来の上清を天然ヒトＴＳＬＰの供給源として使用した。天然ヒトＴＳＬＰをＲＢＡアッセイで効力を決定するために使用した。これらの実験では、天然ＴＳＬＰはより低いアッセイシグナルを示したが、ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６は天然ＴＳＬＰを用量依存的に阻害したと判定された。データの例を図３に示す。
【０２６５】
同様に、炎症性サイトカイン（４８時間、１ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦαおよび１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４）で刺激されたヒト肺線維芽細胞由来の上清を天然ＴＳＬＰ（およそ２ｎｇ／ｍｌ）の供給源として使用した。細胞アッセイ（ＳＷ７５６細胞におけるＳＬＰにより誘導されるｐＳＴＡＴ５の阻害）を用い、ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６は、天然ＴＳＬＰにより誘導されるＳＴＡＴ５のリン酸化を０．８６ｎＭの幾何平均ＩＣ５０（＋／−ＳＤ）（０．５１〜１．４５ｎＭ）で阻害した。
【０２６６】
実施例８  ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６は、ＴＳＬＰ、ＩＬ−３３およびＩＬ−２５の混合物で刺激されたヒトＰＢＭＣからのＩＬ−５生産を阻害した
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６とともに１時間プレインキュベートした後、各１０ｎｇ／ｍｌのヒトＴＳＬＰ、ヒトＩＬ−２５およびヒトＩＬ−３３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で刺激した。細胞を９６時間、３７℃、５％ＣＯ２中でインキュベートし、上清を回収した。ＩＬ−５をビーズに基づくアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を用いて測定した。ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６は、ＴＳＬＰ、ＩＬ−３３およびＩＬ−２５の混合物で刺激されたヒトＰＢＭＣからのＩＬ−５生産を幾何平均ＩＣ５０（＋／−ＳＤ）１２９ｎＭ＋／−９１ｎＭ（６ドナーの平均）で阻害した。
【０２６７】
実施例９：ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６はＴＳＬＰのショートアイソフォームには結合しない
短鎖型ＴＳＬＰ（ｓｆＴＳＬＰ−成熟全長ＴＳＬＰの残基６９〜１３１を含んでなる合成ビオチン化６３アミノ酸ペプチド）または全長ＴＳＬＰ：ｈｉｓに対するＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６の結合をＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ標識不含相互作用分析装置を用いて決定した。ウサギ抗ＴＳＬＰポリクローナル抗体（ｐＡｂ）（Ａｂｃａｍカタログ番号ａｂ４７９４３）を、両形態のＴＳＬＰとの結合に関する陽性対照として使用した。ストレプトアビジンおよび抗ヒスチジン（ｈｉｓ）センサーチップをＩｇＧ不含ＰＢＳバッファー中でプレインキュベートした。別に、ビオチン化ｓｆＴＳＬＰおよび全長ＴＳＬＰ：ｈｉｓをＩｇＧ不含ＰＢＳバッファーで１０μｇ／ｍＬに希釈した。次に、これらのストレプトアビジンセンサーチップをビオチン化ｓｆＴＳＬＰに浸漬し、抗ｈｉｓセンサーチップを全長ＴＳＬＰ：ｈｉｓに浸漬した。ビオチン化ｓｆ  ＴＳＬＰおよび全長ＴＳＬＰ：ｈｉｓを含まないブランクセンサーもまた、ＩｇＧ不含ＰＢＳバッファー中に浸漬することにより調製した。次に、センサーを５００または１０００ｎＭ濃度のＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６またはポリクローナル抗体溶液に浸漬し、結合応答を測定した。また、バッファーもブランク対照として使用した。結合閾値は０．１応答単位に設定し、試験を２５℃で行った。
【０２６８】
供試条件下、ポリクローナル抗体（ａｂ４７９４３）は全長ＴＳＬＰおよびｓｆＴＳＬＰの両方に結合した。ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６は全長ＴＳＬＰタンパク質に結合したが、ｓｆＴＳＬＰには結合しなかった。ｐＡｂとブランクセンサーの非特異的結合がいくらか見られたが、これは１０００ｎＭというすっと高い濃度を用いた場合のみであった。
【０２６９】
【表１１】
2018509153.tif 000014
【０２７０】
実施例１０  抗ＴＳＬＰ  ｄＡｂの発展性の評価
Ｄｏｍ３０ｈ４４０−８１／８６を産生する大腸菌細胞株はより優れた力価とプロセスロバストネスを示し、例えば、５０Ｌ発酵プロセスで＞２ｇ／Ｌの力価を示した（ｎ＝５）。ロバストネスは増殖、プロセス制御および力価に関して実証された。プラスミド安定性は５０Ｌスケールで評価し、＞９５％収率の生成物発現プラスミドを示した。所望の生成物品質で、およそ７０％の全プロセス回収率が達成された。１５０ＬスケールでのＤｏｍ３０ｈ４４０−８１／８６の製造および精製のためのプロセスが開発された。図５は発酵プロセスを示し、図６は下流精製プロセスを示す。このプロセスを実施したところ、６４．５％の全生成物回収率が達成された。生成物はＢｉａｃｏｒｅにおいて結合を示し（実施例１に記載の方法論を使用）、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣ）で判定したところ９８．４％単量体であることが示され、ＲＰ−ＨＰＬＣにより＞９３％純度の主要ピークを有した。ＤＯＭ３０ｈ４４０−８１／８６は、広い範囲のｐＨおよびイオン強度条件で試験したところ、極めて良好な生物物理学特徴を示した。溶解度は、ネイキッドバッファー中では少なくとも４０ｍｇ／ｍｌまで、ｐＨ２．５〜９．０のＮａＣｌおよび０．０および２．０Ｍの間の範囲のＮａＣｌ濃度を含有するバッファー中では１０ｍｇ／ｍｌまで達成された。極端なｐＨ、すなわち、ｐＨ２．５および９．０でのみ、若干の凝集が特記された。低ｐＨ（ｐＨ４．５以下）でのみ、若干の立体配座的変化が特記された。生物物理学スクリーニングを受けたＤＯＭ３０ｈ４４０−８１／８６サンプルは、標準的な示差走査熱量測定（ＤＳＣ）技術により測定される極めて良好な温度安定性（５３．８〜６７．２℃の間の範囲のＴｍ）を示した。
【０２７１】
処方物研究では、ＤＯＭ３０ｈ４４０−８１／８６は噴霧乾燥または凍結乾燥生成物として処方可能であることが示された。これらの処方物に、安定性試験の一部として種々の条件下（温度および時間）で評価を行った。種々の条件下で３か月の保存後に、噴霧乾燥処方物または凍結乾燥処方物のいずれにおいても克服できない物理的または化学的分解または酸化は見られなかった。
【０２７２】
一例としての噴霧乾燥処方物は、図６の下流精製プロセスの生成物から調製され得る（２０ｍＭリン酸塩中、４５〜５５ｍｇ／ｍｌ  Ｄｏｍ３０ｈ４４０−８１−８６）。９．５〜１１．５ｇのトレハロース二水和物および６．４〜７．７ｇのＬ−ロイシンを水に溶かした後、１０００ｇのＴＳＬＰ結合タンパク質溶液を加え、水でさらに希釈して５％の溶液濃度とし、その後、入口温度１２５℃および出口温度７０℃、乾燥ガス流３０ｋｇ／時および霧化ガス流５ｋｇ／時でＧＥＡ  Ｎｉｒｏ  ＳＤ  Ｍｉｃｒｏを用いて噴霧乾燥し、以下の粉末を提供した：
【０２７３】
【表１２】
2018509153.tif 000015
【０２７４】
一例としてのブレンドを噴霧乾燥粉末から、好適な量の噴霧乾燥粉末およびＤＰＰＣ／ラクトース担体を秤量して意図されるブレンド強度および量とする、例えば、３０ｇの噴霧乾燥粉末および２０ｇのＤＰＰＣ／ラクトースを容器に加えることにより調製され得る。最後に、これらの２成分をＴｕｒｂｕｌａ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて４６分−１で６０分間ブレンドした。
【０２７５】
【表１３】
2018509153.tif 000016
【０２７６】
実施例１１  健康なドナー血清中のＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）の頻度
特異的イムノアッセイを用いて、健康なドナー血清中のＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）の頻度を決定した。
【０２７７】
抗薬物抗体に対するｄＡｂの結合を決定するための特異的イムノアッセイ
１．マイクロタイターアッセイプレートにて、アッセイ希釈剤（ＰＢＳ中１％カゼイン）中５％血清サンプルを、アッセイ希釈剤（ＰＢＳ中１％カゼイン）中、０．１μｇ／ｍＬビオチン化試験材料（例えば、ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６）と０．２μｇ／ｍＬのルテニル化（「スルホタグ」（商標））試験材料（例えば、ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６）を含有する均質混合物とともにインキュベートする。
２．ＭＳＤ（商標）ストレプトアビジンプレートを、室温（ＲＴ）にて１時間、振盪しながら、１５０μｌのブロッキングバッファー（ＰＢＳ中1％カゼイン）でブロッキングする。洗浄せずにブロッキング剤を除去する。
３．サンプル（５０μｌ）をアッセイプレートからＭＳＤ（商標）ストレプトアビジンプレートに移し、室温で１時間インキュベートする。
４．１時間のインキュベーションの後、次いで、ＭＳＤプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、リードバッファー（１５０μＬ／ウェル）を加え、プレートを、ＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒを用いて読み取る。
５．このアッセイにおける発光シグナルは、試験材料、例えば、ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６のビオチン化分子とルテニル化分子が、血清サンプル中に存在する抗体により架橋された際に生成する。
６．陽性率パーセンテージは、アッセイカットポイントを上回るサンプルの％として決定した。アッセイカットポイントは、アウトライアーを除いた後に［集団の平均発光＋１．６５４×標準偏差］として定義した。
【０２７８】
データの例を図４に示す。ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６の陽性シグナル（アッセイカットポイントを上回る）を与える健康被験体からの血清の頻度は、ＤＴ０２−Ｋ−０４４−０８５の１１％に比べて、６．７％であった。
【０２７９】
実施例１２：ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６の吸入
１個体の雄および１個体の雌カニクイザルに、ビヒクル（ラクトース中１％ｗ／ｗジルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ））中２０％の名義的濃度で処方した粉末乾燥組成物（ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６（６１．０７％）、リン酸バッファー塩（３．９４％）、トレハロース（３０％ｗ／ｗ）、ロイシン（５％ｗ／ｗ））を、毎日１時間のフェースマスク吸入により、０、８８０、２２７２または７０４６ｍｇ／ｋｇ／日の総推定用量で１４日間投与した。血漿サンプルを１日目と１４日目の投与直後と１時間の吸入時間の終了から０．５、１、２、５、８、１２および２３時間後に採取した。気管支肺胞洗浄(Bronchoalveolar lavage)（ＢＡＬ）サンプルは、剖検時におよそ１０ｍｌの等張生理食塩水で１回の洗浄により動物から採取した。５μｌの各血漿サンプル（脱イオン水で２．５倍希釈）および５０μｌの各ＢＡＬサンプルの尿素を、市販のＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍアッセイを用いて分析した。ＢＡＬサンプル中に含有される上皮肺液(epithelial lung fluid)（ＥＬＦ）の容量は、１４日目に動物当たりの血漿および最終ＢＡＬサンプル中の平均内在尿素を測定することにより評価し、ＥＬＦ希釈率を求めた。５０μｌの各血漿／ＢＡＬサンプル（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（登録商標）Ｔ２０で５倍希釈）はまた、次のようにＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６濃度についても分析した。
１．ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｈ（登録商標）Ｔ２０（ＰＢＳ）（４μｇ／ｍｌ）中３５μｌビオチン化ヒトＴＳＬＰを９６ウェルスモールスポットストレプトアビジンプレート（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）の各ウェルに適用した。これらのプレートを封止し、振盪しながら３７℃でおよそ１時間インキュベートした。
２．これらのプレートを３００μｌの洗浄バッファー（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．５）で５回洗浄した。
３．２００μｌのブロッキングバッファー（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（登録商標）Ｔ２０（Ｔｈｅｒｍｏ、製品番号３７５１６）＋５％ＮＨＰ血漿）を各ウェルに加えた。これらのプレートを封止し、振盪しながら３７℃でおよそ１時間インキュベートした。
４．これらのプレートを３００μｌの洗浄バッファー（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．５）で５回洗浄した。
５．３５μｌのサンプル（または較正標品）を加えた。これらのプレートを封止し、振盪しながら３７℃でおよそ２時間インキュベートした。
６．これらのプレートを３００μｌの洗浄バッファー（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．５）で５回洗浄した。
７．３５μｌのリポータータグ溶液（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（登録商標）Ｔ２０（Ｔｈｅｒｍｏ、製品番号３７５１６）中１：５０希釈のＨＢＲ−９（Ｔｈｅｒｍｏ、パート番号３ＫＣ５６４）中、０．５μｇ／ｍｌルテニウム標識抗ＶＫａｐｐａ  ｍＡｂ）を各ウェルに加えた。これらのプレートを封止し、振盪しながら３７℃でおよそ１時間インキュベートした。
８．これらのプレートを３００μｌ洗浄バッファー（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．５）で５回洗浄した。
９．１５０μｌの現像基質（界面活性剤を含有する０．８７倍ＭＳＤリードバッファーＴ（ＭＳＤ、カタログ番号Ｒ９２ＴＣ−１）を各ウェルに加えた。１．５〜２分後、電気的発光を、プレートリーダーを用いて測定した。
【０２８０】
血漿サンプルは血漿較正直線に対して分析し、ＢＡＬサンプルはＢＡＬ較正直線に対して分析した。ＥＬＦ希釈倍率を用いて、ＢＡＬサンプル内に含有されるＥＬＦ中のＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６濃度を計算した。雄および雌群の重要な血漿薬物動態パラメーターを表１２および１３に示し、上皮粘液(epithelial lining fluid)中のＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６の濃度を表１４にまとめる。
【０２８１】
【表１４】
2018509153.tif 000017
【０２８２】
【表１５】
2018509153.tif 000018
【０２８３】
【表１６】
2018509153.tif 000019
【０２８４】
ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６は、ビヒクル対照動物から回収された血漿およびＢＡＬサンプルのいずれにおいても定量できなかった。ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６投与動物では、ＥＬＦ中のＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６の濃度は一般に用量増加とともに上昇する。全身暴露は一般に１日目よりも１４日目で低かった。サンプルサイズが小さいため（ｎ＝１／性別／群）、性別間の全身暴露または用量間の比例性の違いを結論付けることが難しい。
【０２８５】
実施例１３：ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６はＴＳＬＰ、ＩＬ−３３およびＩＬ−２５の混合物で刺激したヒト鼻ポリープ細胞からのＩＬ−５および／またはＩＬ−１３産生を阻害する
鼻ポリープ組織（英国人体組織法に準拠した適切なコンセントを伴う）を裁断して断片とし、これらを１２５μｇ／ｍｌ内毒素不含コラゲナーゼ（Ｌｉｂｅｒａｓｅ  ＴＭ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎａｏｓｔｉｃｓ）および２５μｇ／ｍｌＤＮアーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で３７℃にて１時間、振盪ながら消化し、単細胞懸濁液を得た。細胞をＡＩＭ  Ｖ無血清培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２回洗浄した後、ＡＩＭ  Ｖ培地に４×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させた。ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６を最終必要濃度の４倍となるように希釈し、５０ｕｌ／ウェルを平底９６ウェルプレートに加えた。次に、各４０ｎｇ／ｍｌのＴＳＬＰ、ＩＬ−２５およびＩＬ−３３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する５０μＬのＡＩＭ  Ｖ培地を、各サイトカインの終濃度が１０ｎｇ／ｍｌとなるように加え、その後、１００μｌの細胞懸濁液（４×１０５細胞／ウェル）を加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で９６時間インキュベートし、その後、上清を回収し、ＩＬ−５およびＩＬ−１３を、Ｌｕｍｉｎｅｘマルチプレックスアッセイを用いて測定した。
【０２８６】
鼻腔組織アッセイにおいて見られた刺激応答は変動が大きく、ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６は相応に、供試ドナー組織によってＬ−５および／またはＩＬ−１３の無阻害、部分的阻害および完全阻害の範囲の、異なる程度の有効性を示した。
【０２８７】
実施例１４：ヒトＴＳＬＰと複合体を形成したＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６の結晶構造
この複合体は、２４．６ｍｇの精製組換え再折りたたみヒトＴＳＬＰ（大腸菌由来）と２０ｍｇの組換えＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６（ｈＴＳＬＰとＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６のモル比０．９１）を混合した後、５ｋ分子量カットオフ膜を備えた遠心分離濃縮デバイス（ＶｉｖａＳｐｉｎ  ２０  Ｓａｒｏｒｉｏｕｓ：カタログ番号ＶＳ２０１２）を用いて約２ｍｌに濃縮することにより作製した。次に、この複合体を非複合体形成材料から、０．５Ｍアルギニンを含有するＰＢＳのランニングバッファーで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ７５サイズ排除カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １７−１１８０−０１）を用いて精製した。分離された複合体を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０を用いて再び濃縮した後、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌの最終バッファー中へ透析した。最終収量は５７．７８ｍｇ／ｍＬで５３μｌのタンパク質であった（２８０ｎｍでの吸光度により測定）。複合体成分をタンパク質インタクト質量分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによりバリデートした。
【０２８８】
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０、１５０ｍＭ  ＮａＣ中、３３．４ｍｇ／ｍｌのヒトＴＳＬＰ−ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６精製複合体を、ウェル：タンパク質溶液１：１比からなるシッティングドロップ中、沈澱剤として２０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ  ３３５０および０．０２Ｍリン酸Ｎａ  Ｋを用いて共結晶させた。結晶を、２０％ＰＥＧ２００およびパラトンを含むウェル溶液からなる凍結保護剤を用いて凍結保護した後、液体窒素中でフラッシュ凍結させた。単結晶からのデータはＥｕｒｏｐｅｏｎ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（グルノーブル）で採取し、ＡＵＴＯＰＲＯＣ(Vonrhein, C., et al. (2011) Acta Cryst. D67, 293-302.)内のＸＤＳ(Kabsch, W. (2010) XDS. Acta Cryst. D66, 125-132.)およびＡＩＭＬＥＳＳ(Evans, P.R., et al. (2013) Acta Cryst. D69, 1204-1214)を用いて１．８４Åまで処理した。ＡＳＵにおける４つの複合体を含有する分子置換法は、ＰＨＥＮＩＸ(Adams PD, (2010) Acta Cryst. D66, 213-221)内のＰＨＡＳＥＲ(J. Appl. Cryst. (2007). 40, 658-674)を用いて決定した。反復手動モデル構築はＣＯＯＴ(Emsley, P., et al. (2004)Acta Cryst., D60, 2126-2132)を用いて行い、ＰＨＥＮＩＸを用いて精密化した。ヒトＴＳＬＰ−ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６相互作用界面は十分に定義され、ＡＳＵ内の４つ総ての複合体において一致していた。
【０２８９】
ｈＴＳＬＰ−ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６複合体の構造は、ラットＴＳＬＰ／ＩＬＲａ／ＴＳＬＰ受容体複合体の構造に重ね合わせることができる（図８）。これは、ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６がＴＳＬＰとＴＳＬＰＲの間の相互作用に直接干渉することを示す。上述のように、ＩＬ−７Ｒα鎖の動員を妨げることにより、またはＴＳＬＰＲ（またはＩＬ−７Ｒα）と直接結合することにより作用するＴＳＬＰ拮抗薬は、ＴＳＬＰと結合しＴＳＬＰとの複合体として溶液中に留まるＴＳＬＰ拮抗薬よりもより効果的に内部移行され抗原として処理され得ることから、このことは極めて望ましい。
【０２９０】
ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６のエピトープは、ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６と結合した際に溶媒に接近不能となる、ヒトＴＳＬＰ上の残基を同定することにより、より正確に定義することができる。よって、抗ＴＳＬＰ  ｄＡｂ／ヒトＴＳＬＰ共結晶構造はＱｔ−ＰＩＳＡ  ｖ２．０．１（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ、Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ；Krissinel and Henrick (2007) を用いて分析し、ヒトＴＳＬＰの各残基について埋入表面積（ＢＳＡ）を計算した。図８は、ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６との結合時に埋もれる、ＴＳＬＰの各残基の％露出表面積を示す。ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６との結合時に埋もれるヒトＴＳＬＰ上の残基はエピトープを表す。これに基づけば、ヒトＴＳＬＰ上の、ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６に対するエピトープには、以下の残基：Ｔｙｒ１５、Ｓｅｒ２０、Ｉｌｅ２４、Ｌｙｓ３１、Ｓｅｒ３２、Ｔｈｒ３３、Ｇｌｕ３４、Ｐｈｅ３５、Ａｓｎ３６、Ａｓｎ３７、Ｔｈｒ３８、Ｖａｌ３９、Ｓｅｒ４０、Ｃｙｓ４１、Ｓｅｒ４２、Ａｓｎ４３、Ｈｉｓ４６、Ｓｅｒ１１４、Ｇｌｎ１１５、Ｇｌｎ１１７、Ｇｌｙ１１８、Ａｒｇ１２１、Ａｒｇ１２２、Ａｓｎ１２４、Ａｒｇ１２５、Ｐｒｏ１２６、Ｌｅｕ１２７、Ｌｅｕ１２８およびＬｙｓ１２９が含まれる。
【０２９１】
抗体またはそのフラグメントの、エピトープと結合する部分は、パラトープと呼ばれる。ＣＤＲは、広義には、パラトープの重要領域であると認知されているが、他の残基もまた重要であり得る。よって、ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６のパラトープは、ヒトＴＳＬＰとの結合時に溶媒に接近不能となる、ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６上の残基を同定することにより同定された（ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６のエピトープを同定するために使用されたものと同じ技術を使用）。図９は、ヒト全長ＴＳＬＰとの結合時に埋もれるＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６の各残基の％露出表面積を示す。これに基づけば、ＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６のパラトープには、以下の残基：Ａｒｇ２７、Ｐｒｏ２８、Ｉｌｅ２９、Ａｒｇ３０、Ａｓｎ３１、Ｔｒｐ３２、Ａｓｐ３４、Ｔｙｒ３６、Ｇｌｎ３８、Ｐｒｏ４４、Ｌｅｕ４６、Ｔｒｐ４９、Ｇｌｙ５０、Ｈｉｓ５３、Ｇｌｎ５５、Ｔｙｒ８７、Ｖａｌ８９、Ｉｌｅ９１、Ｇｌｙ９２、Ｇｌｕ９３、Ａｓｐ９４、Ｖａｌ９６、Ｐｈｅ９８およびＧｌｎ１００が含まれる。驚くことではないが、これらの残基のうち３分の２はＣＤＲ領域（Ｋａｂａｔナンバリング法により定義）内にある、すなわち、ＣＤＲＬ１のＡｒｇ２７、Ｐｒｏ２８、Ｉｌｅ２９、Ａｒｇ３０、Ａｓｎ３１、Ｔｒｐ３２およびＡｓｐ３４、ＣＤＲＬ２のＧｌｙ５０、Ｈｉｓ５３およびＧｌｎ５５、およびＶａｌ８９、ＣＤＲＬ３のＩｌｅ９１、Ｇｌｙ９２、Ｇｌｕ９３、Ａｓｐ９４およびＶａｌ９６。また、ＣＤＲＬ２がＣｏｎｔａｃｔナンバリングシステムに従って定義されるでき場合には、Ｌｅｕ４６およびＴｒｐ４９もＣＤＲ残基と見なされることに留意されたい。
【０２９２】
Ｖｋ／Ｊｋ生殖細胞系に対してＤＯＭ３０ｈ−４４０−８１／８６のタンパク質マルチプル配列アラインメントを行った。フレームワーク残基Ｔｙｒ３６、Ｇｌｎ３８、Ｐｒｏ４４、Ｌｅｕ４６（Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングシステムが使用される場合にはＣＤＲ残基と見なされる）、Ｔｙｒ８７、Ｐｈｅ９８およびＧｌｎ１００は、機能的ヒトＶｋおよびＪｋ遺伝子では６０％以上の同一性で保存されている。このレベルの保存は、これらの残基が構造的役割を持つことを示唆する。しかしながら、機能的ヒトＶｋおよびＪｋ遺伝子には他の残基も見られるという事実は、バリエーションが許容され得ることを示唆する。対照的に、Ｔｒｐ４９（Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングシステムが使用される場合にＣＤＲ残基と見なされる）は、比較される遺伝子の中でもユニークであり、これが保存される必要があり得ることを示唆する。
【０２９３】
エピトープとパラトープの間の相互作用は、ＣＣＧ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ）ＭＯＥ  ｖ２０１４．０９（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）を用いて定義した。ｄＡｂまたはＴＳＬＰの７Å内のタンパク質残基が選択され、次いで、「リガンド相互作用」ツールをデフォルトパラメーターとともに用いて、水分子、またはこれらの残基と相互作用すると思われた相互作用分子由来の残基を同定した。このツールが小分子リガンド相互作用を定義するよう設計されているために、タンパク質残基というよりも、選択された各残基の「リガンド相互作用」が個々に計算されたということに留意されたい。ＭＯＥにより定義された相互作用は鎖内相互作用を消去し、かつ、２鎖間の架橋を形成したものを除く総ての水相互作用を消去するように編集された。残りの相互作用残基を以下に示す。
【０２９４】
エピトープ
抗ＴＳＬＰ  ｄＡｂ残基との直接的相互作用のみ：Ｌｙｓ３１、Ｐｈｅ３５、Ａｒｇ１２１、Ａｒｇ１２２
抗ＴＳＬＰ  ｄＡｂ残基との直接的相互作用および水を介した間接的相互作用：Ｓｅｒ３２、Ｔｈｒ３３、Ａｓｎ３７
水を介した間接的相互作用のみ：Ｔｙｒ１５、Ａｓｎ３６、Ｓｅｒ４０、Ｃｙｓ４１、Ｓｅｒ４２、Ｌｅｕ１２８
【０２９５】
パラトープ
ＴＳＬＰ残基との直接的相互作用のみ：Ｔｒｐ３２、Ｉｌｅ９１
ＴＳＬＰ残基との直接的相互作用および水を介した間接的相互作用：Ａｒｇ３０、Ａｓｎ３１、Ａｓｐ３４、Ｇｌｕ９３、Ａｓｐ９４
水を介した間接的相互作用のみ：Ｐｒｏ２８、Ｔｙｒ３６、Ｇｌｎ３８、Ｐｒｏ４４、Ｌｅｕ４６、Ｇｌｙ５０、Ｈｉｓ５３、Ｇｌｎ５５、Ｓｅｒ６７、Ｇｌｙ９２
【０２９６】
エピトープ内の相互作用残基は総て、ＤＯＭ−３０ｈ−４４０−８１／８６と結合した際に、より溶媒に接近しにくくなる残基である。Ｓｅｒ６７は、ＴＳＬＰと結合した際に、より溶媒に接近しにくくならなかったが水を介してＴＳＬＰと相互作用する、ＤＯＭ−３０ｈ−４４０−８１／８６上の残基である。Ｓｅｒ６７は、他のいくつかのフレームワーク残基と同様に、機能的ヒトＶｋおよびＪｋ遺伝子間で６０％より大きい同一性で保存されており、この残基は構造的役割を持ち得ることを示唆する。
【０２９７】
配列表
配列番号1
Dom30h-440-81/86, Dom30h-440-53, Dom30h-440-54, Dom30h-440-55, Dom30h-440-56, Dom30h-440-57, Dom30h-440-58, Dom30h-440-60, Dom30h-440-63, Dom30h-440-64およびDom30h-440-65のCDRL1 (Kabat, ChothiaおよびAbM CDR定義)
RASRPIRNWLD
【０２９８】
配列番号2
Dom30h-440-81/86のCDRL1(Contact CDR定義)
RNWLDWY
【０２９９】
配列番号3
Dom30h-440-81/86のCDRL1(最小結合単位)
RNWLD
【０３００】
配列番号4
Dom30h-440-81/86, Dom30h-440-53, Dom30h-440-54, Dom30h-440-55, Dom30h-440-56, Dom30h-440-57, Dom30h-440-58, Dom30h-440-60, Dom30h-440-63, Dom30h-440-64およびDom30h-440-65のCDRL2(Kabat, Chothia, AbM CDR定義)
GASHLQS
【０３０１】
配列番号5
Dom30h-440-81/86のCDRL2(Contact CDR定義)
LLIWGASHLQ
【０３０２】
配列番号6
Dom30h-440-81/86のCDRL2(最小結合単位)
GASHLQ
【０３０３】
配列番号7
Dom30h-440-81/86およびDom30h-440-55のCDRL3(Kabat, Chothia, AbM CDR定義)
VQIGEDPVT
【０３０４】
配列番号8
Dom30h-440-81/86のCDRL3(Contact CDRおよび最小結合単位定義)
VQIGEDPV
【０３０５】
配列番号9
Dom30h-440-81/86アミノ酸配列
【化１】
2018509153.tif 000020
【０３０６】
配列番号10
非コドン最適化DNA配列(Dom30h-440-81)
【化２】
2018509153.tif 000021
【０３０７】
配列番号11
コドン最適化DNA配列(Dom30h-440-86)
【化３】
2018509153.tif 000022
【０３０８】
配列番号12
Dom30h-440-87/93 アミノ酸配列
【化４】
2018509153.tif 000023
【０３０９】
配列番号13
非コドン最適化DNA配列(Dom30h-440-87)
【化５】
2018509153.tif 000024
【０３１０】
配列番号14
コドン最適化DNA配列(Dom30h-440-93)
【化６】
2018509153.tif 000025
【０３１１】
配列番号15
Dom30h-440-53のCDRL3(Kabat定義)
LQVGEDPVT
【０３１２】
配列番号16
Dom30h-440-54のCDRL3(Kabat定義) 
WQLAFDPTT
【０３１３】
配列番号17
Dom30h-440-56およびDom30h-440-65のCDRL3(Kabat定義)
MQIGEDPVT
【０３１４】
配列番号18
Dom30h-440-57のCDRL3(Kabat定義)
MQIGDDPVT
【０３１５】
配列番号19
Dom30h-440-58のCDRL3(Kabat定義) 
LQIADDPVT
【０３１６】
配列番号20
Dom30h-440-60のCDRL3(Kabat定義) 
IQFGEDPVT
【０３１７】
配列番号21
Dom30h-440-63のCDRL3(Kabat定義) 
MQIGSDPVT
【０３１８】
配列番号22
Dom30h-440-64のCDRL3 (Kabat定義) 
LQIGEDPVT
【０３１９】
配列番号23
Dom30h-440-53アミノ酸配列
【化７】
2018509153.tif 000026
【０３２０】
配列番号24
Dom30h-440-54アミノ酸配列
【化８】
2018509153.tif 000027
【０３２１】
配列番号25
Dom30h-440-55アミノ酸配列
【化９】
2018509153.tif 000028
【０３２２】
配列番号26
Dom30h-440-56アミノ酸配列
【化１０】
2018509153.tif 000029
【０３２３】
配列番号27
Dom30h-440-57アミノ酸配列
【化１１】
2018509153.tif 000030
【０３２４】
配列番号28
Dom30h-440-58アミノ酸配列
【化１２】
2018509153.tif 000031
【０３２５】
配列番号29
Dom30h-440-60アミノ酸配列
【化１３】
2018509153.tif 000032
【０３２６】
配列番号30
Dom30h-440-63アミノ酸配列
【化１４】
2018509153.tif 000033
【０３２７】
配列番号31
Dom30h-440-64アミノ酸配列
【化１５】
2018509153.tif 000034
【０３２８】
配列番号32
Dom30h-440-65アミノ酸配列
【化１６】
2018509153.tif 000035
【０３２９】
配列番号33
Dom30h-440-88/92アミノ酸配列
【化１７】
2018509153.tif 000036
【０３３０】
配列番号34
Dom30h-440-89/94アミノ酸配列
【化１８】
2018509153.tif 000037
【０３３１】
配列番号35
Dom30h-440-90/95アミノ酸配列
【化１９】
2018509153.tif 000038
【０３３２】
配列番号36
Dom30h-440-91/96アミノ酸配列
【化２０】
2018509153.tif 000039
【図１】
2018509153.tif 000040
【図２】
2018509153.tif 000041
【図３】
2018509153.tif 000042
【図４】
2018509153.tif 000043
【図５】
2018509153.tif 000044
【図６】
2018509153.tif 000045
【図７】
2018509153.tif 000046
【図８−１】
2018509153.tif 000047
【図８−２】
2018509153.tif 000048
【図９−１】
2018509153.tif 000049
【図９−２】
2018509153.tif 000050
【配列表】
2018509153000001.app
【国際調査報告】
2018509153.tif 000051
2018509153.tif 000052
2018509153.tif 000053
2018509153.tif 000054
2018509153.tif 000055
2018509153.tif 000056