(57)【要約】  本発明は、同族受容体に関する改変されたアフィニティを有する新規デザイナー骨形成タンパク質、該タンパク質をコードする核酸、および該タンパク質を用いる方法に関する。より好ましくは、新規デザイナー骨形成タンパク質はデザイナーＢＭＰであり、そして同族ＢＭＰ受容体に関する改変されたアフィニティを有する。デザイナーＢＭＰは、改変された生物学的特性を示し、そして潜在的に有用な新規療法剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、デザイナーＢＭＰタンパク質。
【請求項２】
デザイナーＢＭＰタンパク質のＩ型、ＩＩＡ型、またはＩＩＢ型結合ドメイン内ではない、少なくとも１つの突然変異をさらに含む、請求項１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【請求項３】
少なくとも１つの突然変異が、１０より多い突然変異ではない、請求項２のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【請求項４】
対応する野生型ＢＭＰの結合プロファイルとは異なる結合プロファイルを有する、請求項１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【請求項５】
デザイナーＢＭＰタンパク質の結合プロファイルが、以下：約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ２受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ３受容体への結合；約１ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ６受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＡ受容体への結合；約０．５ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＢ受容体への結合；および約３．５ｎＭより大きくないＫＤでのＢＭＰＲＩＩＡ受容体への結合の少なくとも１つを含む、請求項４のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【請求項６】
請求項１のデザイナーＢＭＰタンパク質をコードする核酸。
【請求項７】
請求項６の核酸を含む発現ベクターを細胞内に導入する工程を含む、デザイナーＢＭＰタンパク質を産生する方法。
【請求項８】
請求項１記載のデザイナーＢＭＰタンパク質と、患者を接触させる工程を含む、患者を治療する方法。
【請求項９】
患者を治療する工程が、骨喪失に関連する骨疾患を治療する工程を含み、そして患者とデザイナーＢＭＰを接触させる工程が、骨疾患を治療するために有効な用量のデザイナーＢＭＰを患者に投与する工程を含む、請求項８の方法。
【請求項１０】
患者を治療する工程が、線維症の治療を含み、そして患者とデザイナーＢＭＰを接触させる工程が、線維症を治療するために有効な用量のデザイナーＢＭＰを患者に投与する工程を含む、請求項８の方法。
【請求項１１】
配列番号１に比較して、以下の突然変異：Ｖ３３Ｉ、Ｐ３６Ｅ、Ｈ３９Ａ、Ｈ４４Ｅ、Ｐ４８Ａ、Ａ５２Ｎ、Ｄ５３Ｓ、Ｈ５４Ｙ、Ｌ５５Ｍ、Ｓ５７Ａ、Ｎ６８Ｈ、Ｓ６９Ｆ、Ｖ７０Ｉ、Ｓ７２Ｐ、Ｋ７３Ｅ、Ｋ７３の後のＴ挿入、Ｉ７４Ｖ、Ａ７７Ｐ、Ｖ８０Ａ、Ｓ８５Ｎ、Ｍ８９Ｖ、Ｌ９２Ｆ、Ｅ９４Ｄ、Ｎ９５Ｓ、Ｅ９６Ｓ、Ｋ９７Ｎ、Ｖ９９Ｉを含む、デザイナーＢＭＰタンパク質。
【請求項１２】
デザイナーＢＭＰタンパク質のＩ型、ＩＩＡ型、またはＩＩＢ型結合ドメイン内ではない、少なくとも１つの突然変異をさらに含む、請求項１１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【請求項１３】
配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【請求項１４】
対応する野生型ＢＭＰの結合プロファイルとは異なる結合プロファイルを有する、請求項１１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【請求項１５】
デザイナーＢＭＰタンパク質の結合プロファイルが、以下：約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ２受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ３受容体への結合；約１ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ６受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＡ受容体への結合；約０．５ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＢ受容体への結合；および約３．５ｎＭより大きくないＫＤでのＢＭＰＲＩＩＡ受容体への結合の少なくとも１つを含む、請求項１４のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に関するクロスリファレンス
本出願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２０のもとに、Ｂｅｒａｓｉらによって２０１５年１月５日に出願された米国特許出願第１４／５８９，４６８号の一部継続出願であり、そして該出願に優先権を請求し、該出願は２０１１年８月１７日出願の米国特許出願第１３／２１１，７５５号、現米国特許８，９５２，１３１に優先権を請求し、次に、該特許は３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）のもとに、２０１０年８月２０日出願の米国仮特許出願第６１／３７５，６３６号に優先権を請求する。前述の出願は各々、その全体が、そしてすべての目的のために、本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、そしてその全体が本明細書に援用される、配列表を含有する。２０１５年４月３日に生成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、７３６２１７４００１と名付けられ、そしてサイズは１７，３９５バイトである。
【０００３】
発明の分野
本出願は、骨形成タンパク質、改善された骨形成タンパク質を作製する方法、および骨形成タンパク質で患者を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
システイン・ノット・サイトカイン・スーパーファミリーはサブファミリーに分かれ、これには、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）タンパク質、糖タンパク質ホルモン、血小板由来増殖因子様（ＰＤＧＦ様）タンパク質、神経増殖因子（ＮＧＦ）、および神経芽腫における異常な示差スクリーニング選択遺伝子（ＤＡＮ）ファミリー（例えばケルベロス）が含まれる。次に、ＴＧＦβスーパーファミリーは、およそ４３のメンバーを含み、３つのサブファミリー：ＴＧＦβ、アクチビンおよび骨形成／増殖分化因子タンパク質（ＢＭＰ／ＧＤＦ）に細分される。
【０００５】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーは、古典的システイン・ノット・トポロジーを含有する。すなわち、システイン・ノットは、６つのシステイン残基の異常な配置の結果である。ノットは、システイン１−４、システイン２−５の間の結合からなり、そして介在する配列が環を形成し、これを通じて、システイン３−６の間にジスルフィド結合が出来る。これらのタンパク質の活性型は、ホモ二量体またはヘテロ二量体である。各場合で、単量体トポロジーは、システイン・ノットによって安定化され、そしてさらなるシステインは、さらなる鎖間結合に寄与し、そして／または別のタンパク質単位との二量体化を仲介する。Ｋｉｎｇｓｌｅｙ，  １９９４，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ８：１３３−１４６；  Ｌａｎｄｅｒら，  ２００１，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：８６０−９２１を参照されたい。
【０００６】
ＢＭＰ／ＧＤＦは、ＴＧＦ−βタンパク質スーパーファミリーの最も多くのメンバーである。ＢＭＰ／ＧＤＦサブファミリーには、限定されるわけではないが、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３（オステオゲニン）、ＢＭＰ３ｂ（ＧＤＦ−１０）、ＢＭＰ４（ＢＭＰ２ｂ）、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７（骨形成タンパク質−１またはＯＰ１）、ＢＭＰ８（ＯＰ２）、ＢＭＰ８Ｂ（ＯＰ３）、ＢＭＰ９（ＧＤＦ２）、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１（ＧＤＦ１１）、ＢＭＰ１２（ＧＤＦ７）、ＢＭＰ１３（ＧＤＦ６、ＣＤＭＰ２）、ＢＭＰ１５（ＧＤＦ９）、ＢＭＰ１６、ＧＤＦ１、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５（ＣＤＭＰ１；ＭＰ５２）、およびＧＤＦ８（ミオスタチン）が含まれる。ＢＭＰはときに、骨形成タンパク質（ＯＰ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）、または軟骨由来形態形成タンパク質（ＣＤＭＰ）と称される。ＢＭＰはまた、他の動物種にも存在する。さらに、ヒト集団の異なるメンバー間で、ＢＭＰ配列のいくつかのアレル変動がある。
【０００７】
ＢＭＰは、天然には、長いプロドメイン、１またはそれより多い切断部位、および成熟ドメインを含む、プロタンパク質として発現される。次いで、このプロタンパク質は、細胞機構によってプロセシングされて、二量体成熟ＢＭＰ分子を生じる。プロドメインは、ＢＭＰの正しいフォールディングおよびプロセシングを補助すると考えられる。さらに、すべてではないがいくつかのＢＭＰにおいて、プロドメインは、成熟ドメインと非共有的に結合して、そしてシャペロンならびに阻害剤として作用しうる（例えばＴｈｉｅｓら，  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  １８：２５１−９（２００１））。
【０００８】
ＢＭＰシグナル伝達は、ＢＭＰ二量体が２つのＩ型および２つのＩＩ型セリン／スレオニンキナーゼ受容体に結合した際に開始される。Ｉ型受容体には、限定されるわけではないが、ＡＬＫ−１（アクチビン受容体様キナーゼ（Ａｃｔｉｖｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｋｉｎａｓｅ）１）、ＡＬＫ−２（ＡｃｔＲｌａまたはＡｃｔＲＩとも称される）、ＡＬＫ−３（ＢＭＰＲＩａとも称される）、およびＡＬＫ−６（ＢＭＰＲＩｂとも称される）が含まれる。ＩＩ型受容体には、限定されるわけではないが、ＡｃｔＲＩＩａ（ＡｃｔＲＩＩとも称される）、ＡｃｔＲＩＩｂ、およびＢＭＰＲＩＩが含まれる。ヒトゲノムは、受容体セリン／スレオニンキナーゼファミリーの１２のメンバーを含有し、これには７つのＩ型および５つのＩＩ型受容体が含まれ、これらすべてがＴＧＦ−βシグナル伝達に関与する（その開示が本明細書に援用されるＭａｎｎｉｎｇら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：１９１２−３４（２００２））。したがって、１２の受容体および４３のスーパーファミリーメンバーがあり、少なくともいくつかのＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーが同じ受容体（単数または複数）に結合すると示唆される。ＢＭＰ結合後、ＩＩ型受容体は、Ｉ型受容体をリン酸化し、Ｉ型受容体は、転写因子のＳｍａｄファミリーのメンバーをリン酸化し、そしてＳｍａｄは核に転位置して、そしていくつかの遺伝子の発現を活性化する。
【０００９】
ＢＭＰは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの最も多くのメンバーの中にあり、そして胚パターン形成および組織特定、ならびに生体組織において、他の場所の中でも、神経系および骨格系における、創傷治癒および修復プロセス促進などの、多様な細胞および発生プロセスセットを制御する。実際、ＢＭＰは、最初に、骨および軟骨形成を誘導する能力によって単離された：ＢＭＰシグナル伝達は、骨折および関連組織傷害に際して誘導可能であり、骨再生および修復を導く。発生および正常創傷治癒における役割を考慮すると、ＢＭＰは、骨格系、神経系、およびＢＭＰ受容体が発現される他の組織の再生および修復に非常に有望である。天然タンパク質に比較して、受容体に関して改善されたアフィニティおよび／または改善された生物学的活性を持つＢＭＰであれば、さらにより有望であろう。本発明者らは、以前、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて、ＢＭＰ受容体への改変された結合および増加した活性を持つデザイナーＢＭＰを記載してきている。現在知られるデザイナーＢＭＰ（ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ＢＭＰ）の分野は比較的小さいままであるが、新規のデザイナーＢＭＰの開発に関して、技術分野において継続する必要性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｋｉｎｇｓｌｅｙ，  １９９４，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ８：１３３−１４６
【非特許文献２】Ｌａｎｄｅｒら，  ２００１，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：８６０−９２１
【非特許文献３】Ｔｈｉｅｓら，  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  １８：２５１−９（２００１）
【非特許文献４】Ｍａｎｎｉｎｇら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：１９１２−３４（２００２）
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、多様な側面において、ＢＭＰ２、４、６および７に基づく新規デザイナーＢＭＰ、これらのデザイナーＢＭＰに関する組成物および方法、ならびに該デザイナーＢＭＰを作製しそして用いる方法を提供することによって、この必要性に取り組む。１つの側面において、本発明は、多様な態様において、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、デザイナーＢＭＰに関する。該デザイナーＢＭＰは、場合によって、Ｉ型、ＩＩＡ型、またはＩＩＢ型結合ドメイン内ではない、１またはそれより多い突然変異を含み；多様に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多いこうした突然変異があることも可能である。あるいはまたはさらに、デザイナーＢＭＰは、野生型ＢＭＰとは異なる受容体結合プロファイルを示し、こうした結合プロファイルには、以下：約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ２受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ３受容体への結合；約１ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ６受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＡ受容体への結合；約０．５ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＢ受容体への結合；および約３．５ｎＭより大きくないＫＤでのＢＭＰＲＩＩＡ受容体への結合の１つ、いくつかまたはすべてが含まれる。
【００１２】
別の側面において、本発明は、配列番号１に比較して、以下の突然変異：Ｖ３３Ｉ、Ｐ３６Ｅ、Ｈ３９Ａ、Ｈ４４Ｅ、Ｐ４８Ａ、Ａ５２Ｎ、Ｄ５３Ｓ、Ｈ５４Ｙ、Ｌ５５Ｍ、Ｓ５７Ａ、Ｎ６８Ｈ、Ｓ６９Ｆ、Ｖ７０Ｉ、Ｓ７２Ｐ、Ｋ７３Ｅ、Ｋ７３の後のＴ挿入、Ｉ７４Ｖ、Ａ７７Ｐ、Ｖ８０Ａ、Ｓ８５Ｎ、Ｍ８９Ｖ、Ｌ９２Ｆ、Ｅ９４Ｄ、Ｎ９５Ｓ、Ｅ９６Ｓ、Ｋ９７Ｎ、Ｖ９９Ｉを含む、デザイナーＢＭＰに関する。いくつかの態様において、該デザイナーＢＭＰは、場合によって、Ｉ型、ＩＩＡ型、またはＩＩＢ型結合ドメイン内ではない、１またはそれより多い突然変異を含み；多様に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多いこうした突然変異があることも可能である。あるいはまたはさらに、デザイナーＢＭＰは、野生型ＢＭＰとは異なる受容体結合プロファイルを示し、こうした結合プロファイルには、以下：約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ２受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ３受容体への結合；約１ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ６受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＡ受容体への結合；約０．５ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＢ受容体への結合；および約３．５ｎＭより大きくないＫＤでのＢＭＰＲＩＩＡ受容体への結合の１つ、いくつかまたはすべてが含まれる。デザイナーＢＭＰは、いくつかの場合、配列番号８を含むアミノ酸配列を有してもよいが、他の場合、デザイナーＢＭＰは、配列番号８に比較して、以下の突然変異：Ｅ８４Ｋ、Ｎ８６Ｒ、Ａ８７Ｐ、Ｉ８８Ｍ、Ｖ９０Ｍ、Ｆ９３Ｙ、Ｓ９６Ｇ、Ｓ９７Ｑ、Ｖ９９Ｉ、Ｌ１０１Ｋ、Ｎ１０３Ｄ、Ｙ１０４Ｉ、Ｄ１０６Ｎ、Ｖ１０８Ｉ、Ｇ１１１Ｅ、Ｒ１１５Ｓを含む。
【００１３】
別の側面において、本発明は、配列番号１に比較して、以下の突然変異：Ｖ３３Ｉ、Ｐ３６Ｅ、Ｈ３９Ａ、Ｈ４４Ｅ、Ｐ４８Ａ、Ａ５２Ｎ、Ｄ５３Ｓ、Ｈ５４Ｙ、Ｌ５５Ｍ、Ｓ５７Ａ、Ｎ６８Ｈ、Ｓ６９Ｆ、Ｖ７０Ｉ、Ｓ７２Ｐ、Ｋ７３Ｅ、Ｋ７３の後のＴ挿入、Ｉ７４Ｖ、Ａ７７Ｐ、Ｖ８０Ａ、Ｅ８３Ｋ、Ｓ８５Ｒ、Ａ８６Ｐ、Ｉ８７Ｍ、Ｌ９２Ｙ、Ｅ９４Ｄ、Ｎ９５Ｇ、Ｅ９６Ｑ、Ｋ９７Ｎ、Ｖ９８Ｉ、Ｖ９９Ｉ、Ｌ１００Ｋ、Ｎ１０２Ｄ、Ｙ１０３Ｉ、Ｄ１０５Ｎ、Ｖ１０７Ｉ、Ｇ１１０Ｅ、Ｒ１１４Ｓを含む、デザイナーＢＭＰに関する。いくつかの態様において、該デザイナーＢＭＰは、場合によって、Ｉ型、ＩＩＡ型、またはＩＩＢ型結合ドメイン内ではない、１またはそれより多い突然変異を含み；多様に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多いこうした突然変異があることも可能である。あるいはまたはさらに、デザイナーＢＭＰは、野生型ＢＭＰとは異なる受容体結合プロファイルを示し、こうした結合プロファイルには、以下：約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ２受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ３受容体への結合；約１ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ６受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＡ受容体への結合；約０．５ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＢ受容体への結合；および約３．５ｎＭより大きくないＫＤでのＢＭＰＲＩＩＡ受容体への結合の１つ、いくつかまたはすべてが含まれる。デザイナーＢＭＰは、いくつかの場合、配列番号９を含むアミノ酸配列を有してもよい。
【００１４】
さらに別の側面において、本発明は、配列番号２に比較して、以下の突然変異：Ｖ３５Ｉ、Ｐ３８Ｋ、Ｑ４１Ａ、Ｈ４６Ｄ、Ｄ４８Ｅ、Ｐ５０Ｓ、Ａ５４Ｎ、Ｄ５５Ａ、Ｌ５７Ｍ、Ｓ５９Ａ、Ｎ７０Ｈ、Ｓ７１Ｌ、Ｖ７２Ｐ、Ｓ７４Ｐ、Ｓ７５Ｅ、Ｓ７５の後のＹ挿入、Ｉ７６Ｖ、Ａ７９Ｐ、Ｖ８２Ａ、Ｓ８７Ｎ、Ｍ９１Ｖ、Ｌ９４Ｆ、Ｅ９６Ｄ、Ｙ９７Ｎ、Ｄ９８Ｓ、Ｋ９９Ｎ、Ｖ１０１Ｉを含む、デザイナーＢＭＰに関する。いくつかの態様において、該デザイナーＢＭＰは、場合によって、Ｉ型、ＩＩＡ型、またはＩＩＢ型結合ドメイン内ではない、１またはそれより多い突然変異を含み；多様に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多いこうした突然変異があることも可能である。あるいはまたはさらに、デザイナーＢＭＰは、野生型ＢＭＰとは異なる受容体結合プロファイルを示し、こうした結合プロファイルには、以下：約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ２受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ３受容体への結合；約１ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ６受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＡ受容体への結合；約０．５ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＢ受容体への結合；および約３．５ｎＭより大きくないＫＤでのＢＭＰＲＩＩＡ受容体への結合の１つ、いくつかまたはすべてが含まれる。デザイナーＢＭＰは、いくつかの場合、配列番号１０を含むアミノ酸配列を有してもよい。他の場合、デザイナーＢＭＰは、配列番号１０に比較してＫ３８Ｒの突然変異を含んでもよく、そして／または配列番号１２のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００１５】
さらに別の側面において、本発明は、配列番号２に比較して、以下の突然変異：Ｖ３５Ｉ、Ｐ３８Ｋ、Ｑ４１Ａ、Ｈ４６Ｄ、Ｄ４８Ｅ、Ｐ５０Ｓ、Ａ５４Ｎ、Ｄ５５Ａ、Ｌ５７Ｍ、Ｓ５９Ａ、Ｎ７０Ｈ、Ｓ７１Ｌ、Ｖ７１Ｍ、Ｓ７４Ｐ、Ｓ７５Ｅ、Ｓ７５の後のＹ挿入、Ｉ７６Ｖ、Ａ７９Ｐ、Ｖ８２Ａ、Ｅ８５Ｋ、Ｓ８７Ｒ、Ａ８８Ｐ、Ｉ８９Ｍ、Ｌ９４Ｙ、Ｅ９６Ｄ、Ｙ９７Ｇ、Ｄ９８Ｑ、Ｋ９９Ｎ、Ｖ１００Ｉ、Ｖ１０１０Ｉ、Ｌ１０２Ｋ、Ｎ１０４Ｄ、Ｙ１０５Ｉ、Ｅ１０７Ｎ、Ｖ１０９Ｉ、Ｇ１１２Ｅ、Ｒ１１６Ｓを含む、デザイナーＢＭＰに関する。いくつかの態様において、該デザイナーＢＭＰは、場合によって、Ｉ型、ＩＩＡ型、またはＩＩＢ型結合ドメイン内ではない、１またはそれより多い突然変異を含み；多様に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多いこうした突然変異があることも可能である。あるいはまたはさらに、デザイナーＢＭＰは、野生型ＢＭＰとは異なる受容体結合プロファイルを示し、こうした結合プロファイルには、以下：約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ２受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ３受容体への結合；約１ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ６受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＡ受容体への結合；約０．５ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＢ受容体への結合；および約３．５ｎＭより大きくないＫＤでのＢＭＰＲＩＩＡ受容体への結合の１つ、いくつかまたはすべてが含まれる。デザイナーＢＭＰは、いくつかの場合、配列番号１１を含むアミノ酸配列を有してもよい。
【００１６】
さらに別の側面において、本発明は、配列番号２に比較して、以下の突然変異：Ｖ３５Ｉ、Ｐ３８Ｒ、Ｑ４１Ａ、Ｈ４６Ｄ、Ｄ４８Ｅ、Ｐ５０Ｓ、Ａ５４Ｎ、Ｄ５５Ａ、Ｌ５７Ｍ、Ｓ５９Ａ、Ｎ７０Ｈ、Ｓ７１Ｌ、Ｖ７２Ｍ、Ｓ７４Ｐ、Ｓ７５Ｅ、Ｓ７５の後のＹ挿入、Ｉ７６Ｖ、Ａ７９Ｐ、Ｖ８２Ａ、Ｅ８５Ｋ、Ｓ８７Ｒ、Ａ８８Ｐ、Ｉ８９Ｍ、Ｌ９４Ｙ、Ｅ９６Ｄ、Ｙ９７Ｇ、Ｄ９８Ｑ、Ｋ９９Ｎ、Ｖ１００Ｉ、Ｖ１０１Ｉ、Ｌ１０２Ｋ、Ｎ１０４Ｄ、Ｙ１０５Ｉ、Ｅ１０７Ｎ、Ｖ１０９Ｉ、Ｇ１１２Ｅ、Ｒ１１６Ｓを含む、デザイナーＢＭＰに関する。いくつかの態様において、該デザイナーＢＭＰは、場合によって、Ｉ型、ＩＩＡ型、またはＩＩＢ型結合ドメイン内ではない、１またはそれより多い突然変異を含み；多様に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多いこうした突然変異があることも可能である。あるいはまたはさらに、デザイナーＢＭＰは、野生型ＢＭＰとは異なる受容体結合プロファイルを示し、こうした結合プロファイルには、以下：約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ２受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ３受容体への結合；約１ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ６受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＡ受容体への結合；約０．５ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＢ受容体への結合；および約３．５ｎＭより大きくないＫＤでのＢＭＰＲＩＩＡ受容体への結合の１つ、いくつかまたはすべてが含まれる。デザイナーＢＭＰは、場合によって、配列番号１３を含むアミノ酸配列を有する。
【００１７】
さらに別の側面において、本発明は、配列番号２に比較して、以下の突然変異：Ｖ３５Ｉ、Ｐ３８Ｅ、Ｑ４１Ａ、Ｈ４６Ｅ、Ｄ４８Ｅ、Ｐ５０Ａ、Ａ５４Ｎ、Ｄ５５Ｓ、Ｈ５６Ｙ、Ｌ５７Ｍ、Ｓ５９Ａ、Ｎ７０Ｈ、Ｓ７１Ｆ、Ｖ７２Ｉ、Ｎ７３の後のＰ挿入、Ｓ７４Ｅ、Ｓ７５Ｔ、Ｉ７６Ｖ、Ａ７９Ｐ、Ｖ８２Ａ、Ｓ８７Ｎ、Ｍ９１Ｖ、Ｌ９４Ｆ、Ｅ９６Ｄ、Ｙ９７Ｓ、Ｄ９８Ｓ、Ｋ９９Ｎ、Ｖ１０１Ｉを含む、デザイナーＢＭＰに関する。いくつかの態様において、該デザイナーＢＭＰは、場合によって、Ｉ型、ＩＩＡ型、またはＩＩＢ型結合ドメイン内ではない、１またはそれより多い突然変異を含み；多様に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多いこうした突然変異があることも可能である。あるいはまたはさらに、デザイナーＢＭＰは、野生型ＢＭＰとは異なる受容体結合プロファイルを示し、こうした結合プロファイルには、以下：約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ２受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ３受容体への結合；約１ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ６受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＡ受容体への結合；約０．５ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＢ受容体への結合；および約３．５ｎＭより大きくないＫＤでのＢＭＰＲＩＩＡ受容体への結合の１つ、いくつかまたはすべてが含まれる。デザイナーＢＭＰは、配列番号１４を含むアミノ酸配列を有してもよい。
【００１８】
さらに別の側面において、本発明は、配列番号２に比較して、以下の突然変異：Ｖ３５Ｉ、Ｐ３８Ｅ、Ｑ４１Ａ、Ｈ４６Ｅ、Ｄ４８Ｅ、Ｐ５０Ａ、Ａ５４Ｎ、Ｄ５５Ｓ、Ｈ５６Ｙ、Ｌ５７Ｍ、Ｓ５９Ａ、Ｎ７０Ｈ、Ｓ７１Ｆ、Ｖ７２Ｉ、Ｎ７３の後のＰ挿入、Ｓ７４Ｅ、Ｓ７５Ｔ、Ｉ７６Ｖ、Ａ７９Ｐ、Ｖ８２Ａ、Ｅ８５Ｋ、Ｓ８７Ｒ、Ａ８８Ｐ、Ｉ８９Ｍ、Ｌ９４Ｙ、Ｅ９６Ｄ、Ｙ９７Ｇ、Ｄ９８Ｑ、Ｋ９９Ｎ、Ｖ１００Ｉ、Ｖ１０１Ｉ、Ｌ１０２Ｋ、Ｎ１０４Ｄ、Ｙ１０５Ｉ、Ｅ１０７Ｎ、Ｖ１０９Ｉ、Ｇ１１２Ｅ、Ｒ１１６Ｓを含む、デザイナーＢＭＰに関する。いくつかの態様において、該デザイナーＢＭＰは、場合によって、Ｉ型、ＩＩＡ型、またはＩＩＢ型結合ドメイン内ではない、１またはそれより多い突然変異を含み；多様に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多いこうした突然変異があることも可能である。あるいはまたはさらに、デザイナーＢＭＰは、野生型ＢＭＰとは異なる受容体結合プロファイルを示し、こうした結合プロファイルには、以下：約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ２受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ３受容体への結合；約１ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ６受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＡ受容体への結合；約０．５ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＢ受容体への結合；および約３．５ｎＭより大きくないＫＤでのＢＭＰＲＩＩＡ受容体への結合の１つ、いくつかまたはすべてが含まれる。デザイナーＢＭＰは、配列番号１５を含むアミノ酸配列を有してもよい。
【００１９】
本発明には、上述のタイプのデザイナーＢＭＰタンパク質を産生する方法がさらに含まれる。該方法には、一般的に、タンパク質をコードする核酸を宿主細胞内に導入し、該タンパク質を産生する条件下で細胞を培養し、そして該タンパク質を精製する工程が含まれる。
【００２０】
多様な側面において、本発明は、配列番号８〜１５からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするか、または具体的に、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、および／または配列番号１５をコードする核酸に関する。核酸は、任意の適切な発現ベクター内に取り込まれてもよく、続いて以下に論じるように、発現および採取のために細胞内に導入されてもよい。
【００２１】
本発明にはまた、治療の必要がある患者において、骨喪失に関連する骨疾患を治療する方法も含まれる。１つの側面において、該方法には、上述のようなデザイナーＢＭＰタンパク質の療法的有効量を投与し、それによって、患者において骨疾患を治療する工程が含まれる。多様な態様において、デザイナーＢＭＰタンパク質には、配列番号８〜１５からなる群より選択される、または具体的に、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、および／または配列番号１５のアミノ酸配列が含まれる。
【００２２】
本発明には、治療の必要がある患者において、線維症を治療する方法が含まれる。１つの側面において、本発明は、上述のようなデザイナーＢＭＰタンパク質の療法的有効量を投与し、それによって、線維症を治療する工程を含む方法に関する。多様な態様において、デザイナーＢＭＰタンパク質には、配列番号８〜１５からなる群より選択される、または具体的に、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、および／または配列番号１５のアミノ酸配列が含まれる。
【００２３】
さらに、本発明には、組織において骨形成を誘導する方法が含まれる。この側面において、該方法は、上述のようなデザイナーＢＭＰタンパク質と組織を接触させ、それによって前記組織において、骨形成を誘導する工程を含む。多様な態様において、デザイナーＢＭＰタンパク質は、配列番号８〜１５からなる群より選択される、または具体的に、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、および／または配列番号１５のアミノ酸配列である。
【００２４】
最後に、本発明の１つの側面は、上述のようなデザイナーＢＭＰを含む、患者を治療するためのキットに関する。多様な態様において、デザイナーＢＭＰタンパク質には、配列番号８〜１５からなる群より選択される、または具体的に、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、および／または配列番号１５のアミノ酸配列が含まれる。本発明のキットには、場合によって、またはさらに、デザイナーＢＭＰを希釈し、それによってデザイナーＢＭＰ溶液を生成するための液体、ならびに／あるいはデザイナーＢＭＰ溶液とともに使用するための医学的装置または移植材料が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
本発明を例示する目的のため、図において、本発明の特定の態様を示す。しかし、本発明は図に示す態様の正確な配置および手段に限定されない。
【図１】図１は、多様な野生型およびデザイナーＢＭＰアミノ酸配列の整列を示し、そしてＩ型およびＩＩ型受容体相互作用に潜在的に関与するこれらのタンパク質の領域を示す（ボックス内にあることによって）ダイアグラムである。図１は、野生型ＢＭＰ２（配列番号１）、ＢＭＰ４（配列番号２）、ＢＭＰ５（配列番号３）、ＢＭＰ６（配列番号４）、ＢＭＰ７（配列番号５）、ＢＭＰ８（配列番号６）およびＢＭＰ９（配列番号７）のアミノ酸配列整列を示す。
【図２】図２は、２つのＩ型および２つのＩＩ型ＢＭＰ受容体への野生型ＢＭＰ２ホモ二量体結合を示す構造モデルの例示である。
【図３】パネルＡおよびＢを含む図３は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）（図３Ａ）および大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）細胞（図３Ｂ）において産生されるヒトＢＭＰ２のヒスチジン・ドアストップの位（Ｈ５４）を示す構造モデルのダイアグラムである。
【図４】パネルＡおよびＢを含む図４は、グリカン・テザーおよび潜在的なヒスチジン（Ｈｉｓ）・ドアストップの位置を例示するダイアグラムである。図４Ａは、すべて、ＣＨＯ産生ＢＭＰ２における、グリカン・テザー（Ｎ５６のＮ連結グリカン）および非ドアストップ配向のヒスチジン５４、ならびにグリカン・テザーとＲ１６の相互作用を示す。図４Ｂは、ＢＭＰ６におけるグリカン・テザー（Ｎ８０のＮ連結グリカン）およびＨ７８の非ドアストップ立体配置のヒスチジン、ならびにＢＭＰ２におけるＲ１６に対応するＲ３９を示す。
【図５】パネルＡ〜Ｄを含む図５は、ＢＭＰおよびデザイナーＢＭＰの精製のためのプロセスにおける多様な工程を示す。図５Ａは、硫酸セルファインカラムを用いたＢＭＰの勾配溶出を示すクロマトグラムを示す。図５Ｂは、硫酸セルファインカラム工程由来の分画の試料を含有するクーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（左側に非還元および右側に還元）ゲルの画像である。図５Ｃは、調製用逆相精製工程由来のプロファイルを示すクロマトグラムを示す。図５Ｄは、調製用逆相精製工程によって得た分画の試料を含有するＢＭＰのクーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（左側に非還元および右側に還元）ゲルの画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、本明細書において、「デザイナーＢＭＰ」、「デザイナー骨形成タンパク質」および「デザイナータンパク質（ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」と称される、「デザイナー」骨形成タンパク質に関する。本発明のデザイナーＢＭＰは、野生型非修飾ＢＭＰ、例えば限定されるわけではないが、ＢＭＰ２（配列番号１）、ＢＭＰ４（配列番号２）、ＢＭＰ５（配列番号３）、ＢＭＰ６（配列番号４）、ＢＭＰ７（配列番号５）、ＢＭＰ８（配列番号６）、およびＢＭＰ９（配列番号７）のアミノ酸配列に対応してもよい。特定の態様において、デザイナーＢＭＰは、対応する野生型ＢＭＰに比較した際に、Ｉ型および／またはＩＩ型ＢＭＰ受容体への改変された結合を示す。さらなる態様において、デザイナーＢＭＰは、対応するＢＭＰに比較した際、改変された半減期、免疫原性、または任意の薬物動態学的／薬力学的（ＰＫ／ＰＤ）パラメータを有するよう修飾されていてもよい。
【００２７】
定義
本明細書に別に定義しない限り、本発明と関連して用いられる科学的および技術的用語は、一般の当業者に一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、背景によって別に必要とされない限り、単一の用語には複数が含まれるものとし、そして複数の用語には単数が含まれるものとする。一般的に、本明細書に記載するような細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションは、当該技術分野において周知であり、そして一般的に用いられるものである。
【００２８】
本発明の方法および技術は、一般的に、別に示さない限り、当該技術分野に周知の方法にしたがって、そして本明細書全体で引用され、そして論じられる多様な一般的およびより特異的な参考文献に記載されるように、実行される。こうした参考文献には、例えば、本明細書に援用される、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（２００１）、Ａｕｓｕｂｅｌら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ニューヨーク州（２００２）、ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９９０）が含まれる。酵素反応および精製技術は、製造者の明細にしたがって、当該技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書に記載するように、行われる。本明細書に記載する、分析化学、合成有機化学、ならびに医学的および薬学的化学と関連して用いる命名法、ならびに実験室的方法および技術は、周知のものであり、そして当該技術分野において一般的に用いられる。化学合成、化学分析、薬学的調製、配合、および送達、ならびに患者の治療のために、標準的な技術が用いられる。
【００２９】
本明細書において、以下の用語の各々は、このセクションにおいて、これに関連した意味を有する。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において、冠詞の文法的対象の１または１より多く（すなわち少なくとも１つ）を指すよう用いられる。例えば、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１より多い要素を意味する。
【００３０】
本出願において、「または」の使用は、別に言及しない限り、「および／または」を意味する。
本明細書において、ポリペプチド配列を描くためには、慣用的表記を用いる：ポリペプチド配列の左側の端はアミノ末端であり；ポリペプチド配列の右側の端はカルボキシル末端である。本明細書において、２０の慣用的なアミノ酸およびその略語は、慣用的用法にしたがう。本明細書に援用される、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版，  Ｅ．  Ｓ．  ＧｏｌｕｂおよびＤ．  Ｒ．  Ｇｒｅｎ監修，  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  マサチューセッツ州サンダーランド（１９９１））を参照されたい。本明細書において、アミノ酸は、以下に示すように、そのフルネームによって、それに対応する３文字コードによって、またはそれに対応する１文字コードによって示される。
【００３１】
【化１】
2018506992.tif 000002
【００３２】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば電荷または疎水性）を持つ側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させないであろう。２またはそれより多いアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、配列同一性パーセントまたは類似性の度合いを上方に調節して、置換の保存的性質に関して補正することも可能である。この調節を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４３：３０７−３１（１９９４）を参照されたい。
【００３３】
類似の化学的特性を持つ側鎖を有するアミノ酸の群の例には、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに７）イオウ含有側鎖：システインおよびメチオニンが含まれる。好ましい保存的アミノ酸置換群は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００３４】
あるいは、本明細書に援用される、Ｇｏｎｎｅｔら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５（１９９２）に開示される、保存的置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて、負でない値を有する任意の変化である。
【００３５】
好ましいアミノ酸置換は：（１）タンパク質分解に対する感受性を減少させ、（２）酸化に対する感受性を減少させ、（３）タンパク質複合体形成に関する結合アフィニティを改変し、そして（４）こうした類似体に他の物理化学的または機能的特性を与えるかまたはこうした特性を修飾するものである。置換、欠失、および／または挿入を含む類似体には、明記するペプチド配列以外の配列の多様な変異タンパク質が含まれてもよい。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（好ましくは保存的アミノ酸置換）を、明記する配列において（好ましくは分子間接触を形成するドメイン（単数または複数）の外、例えばＣＤＲあるいはＩ型またはＩＩ型受容体結合部位の外のポリペプチド部分において）、行ってもよい。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造特性を実質的に変化させてはならない（例えば、置換アミノ酸は、親配列中に存在するらせんを破壊する傾向があってはならず、また親配列を特徴付ける二次構造の他のタイプを妨害してはならない）。当該技術分野に認識されるポリペプチド二次および三次構造の例は、各々、本明細書に援用される、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ監修，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ニューヨーク（１９８４））；  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  （Ｃ．  ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ．  Ｔｏｏｚｅ監修，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  ニューヨーク州ニューヨーク（１９９１））；ならびにＴｈｏｒｎｔｏｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５（１９９１）に記載される。
【００３６】
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、および「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡおよびＲＮＡ中の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも称される）を指し、そして任意の鎖の２またはそれより多いヌクレオチドを意味する。ポリヌクレオチドは、キメラ混合物、あるいはその誘導体または修飾型、一本鎖または二本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドを、塩基部分、糖部分、またはリン酸主鎖で修飾して、例えば分子の安定性、そのハイブリダイゼーションパラメータ等を改善してもよい。ヌクレオチド配列は、典型的には、遺伝情報を所持し、これには、タンパク質および酵素を作製するために細胞機構によって用いられる情報が含まれる。これらの用語には、二本鎖または一本鎖ゲノムおよびｃＤＮＡ、ＲＮＡ、任意の合成および遺伝子操作ポリヌクレオチド、ならびにセンスおよびアンチセンスポリヌクレオチドの両方が含まれる。これにはまた、修飾塩基を含有する核酸、例えばチオウラシル、チオグアニン、およびフルオロウラシル、あるいは炭水化物または脂質を含有する核酸も含まれる。
【００３７】
ヌクレオチド配列との関連で、用語「実質的に同一」は、本明細書において、第一および第二のヌクレオチド配列が、共通の機能活性を有するポリペプチドをコードするか、あるいは共通の構造ポリペプチドドメインまたは共通の機能ポリペプチド活性をコードするように、第二の核酸配列中の整列ヌクレオチドに同一である、十分なまたは最小の数のヌクレオチドを含有する第一の核酸を指す。例えば、参照配列に対して、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列である。
【００３８】
「デザイナーＢＭＰ核酸」および文法的同等物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）によって、本明細書において、デザイナーＢＭＰをコードする核酸を意味する。
用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書において、交換可能に用いられる。これらの用語は、ペプチド結合を通じてともに連結されたアミノ酸の連続鎖を指す。該用語には、別個の単位として機能する１またはそれより多いタンパク質が含まれる。単一のポリペプチドが、別個の機能単位であり、そして別個の機能単位を形成するために、他のポリペプチドとの永続的または一時的な物理的関係を必要としない場合、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、交換可能に使用可能である。別個の機能単位が、互いに物理的に関係する多数のポリペプチドで構成される場合、用語「タンパク質」は、本明細書において、物理的にカップリングし、そして別個の単位としてともに機能する多数のポリペプチドを指す。本発明にしたがって発現されるタンパク質は、タンパク質療法剤であってもよい。タンパク質療法剤は、作用する体の領域、または中間物を通じて遠隔的に作用する体の領域に、生物学的影響を有するタンパク質である。タンパク質療法剤の例を、以下により詳細に論じる。
【００３９】
「デザイナーＢＭＰ」は、本明細書において、突然変異を伴わない対応する野生型ＢＭＰに比較して、少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含むＢＭＰタンパク質であって、Ｉ型および／またはＩＩ型受容体に関して、対応する野生型ＢＭＰの結合に比較して、少なくともＩ型受容体および／または少なくとも１つのＩＩ型受容体に関する検出可能に改変された結合を有する、前記タンパク質を指す。
【００４０】
「対応する野生型タンパク質」によって、いかなる突然変異導入よりも前のデザイナーＢＭＰの野生型バージョンを意味する。例えば、デザイナーＢＭＰがデザイナーＢＭＰ２である場合、対応する野生型ＢＭＰは野生型ＢＭＰ２である。したがって、１つの態様において、デザイナーＢＭＰの設計は、野生型ＢＭＰ配列で始まり、突然変異（例えばアミノ酸置換、欠失および／または挿入）が野生型配列に導入されてもよいが、そうである必要はない。したがって、デザイナーＢＭＰは、野生型ＢＭＰに対応可能であり、そして突然変異の位置は、例えば、対応する野生型または「参照」ＢＭＰ配列のアミノ酸配列に比較して、そして／またはそれに対して言及されてもよい。
【００４１】
本発明のタンパク質には、本明細書記載のポリペプチドの断片、誘導体、類似体、または変異体、およびその任意の組み合わせが含まれる。本発明のタンパク質に言及した際、用語「断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」、「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」、「誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）」および「類似体（ａｎａｌｏｇ）」には、由来したタンパク質の機能的特性の少なくともいくつかを保持する任意のタンパク質が含まれる。
【００４２】
用語「断片」によって、本明細書において、ポリペプチドを指し、そして所定のポリペプチドにユニークであるかまたは特徴的である、該ポリペプチドの任意の別個の部分と定義される。本明細書において、該用語はまた、全長ポリペプチドの活性の少なくともある割合を保持する、所定のポリペプチドの任意の別個の部分も指す。特定の態様において、保持される活性の割合は、全長ポリペプチドの少なくとも１０％である。特定の態様において、保持される活性の割合は、全長ポリペプチドの活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％である。特定の態様において、保持される活性の割合は、全長ポリペプチドの活性の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。特定の態様において、保持される活性の割合は、全長ポリペプチドの活性の１００％またはそれより多くである。あるいはまたはさらに、本明細書において、該用語は、全長ポリペプチドで見られる、少なくとも確立された配列要素を含む、所定のポリペプチドの任意の部分も指す。いくつかの態様において、配列要素は、全長ポリペプチドの少なくとも約４〜５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれより多いアミノ酸に渡る。本発明のタンパク質の断片には、タンパク質分解的断片、ならびに欠失断片が含まれる。
【００４３】
本発明のタンパク質の変異体には、上述のような断片、そしてまたアミノ酸置換、欠失、または挿入によって改変されたアミノ酸配列を含むポリペプチドも含まれる。変異体は、天然存在であっても、または非天然存在であってもよい。非天然存在変異体は、当該技術分野に知られる突然変異誘発技術を用いて産生可能である。変異体タンパク質は、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を含んでもよい。
【００４４】
本発明のタンパク質には、官能側鎖の反応によって化学的に誘導体化された１またはそれより多い残基を有するタンパク質が含まれる。本発明のタンパク質としてやはり含まれるのは、２０の標準アミノ酸の１またはそれより多い天然存在アミノ酸誘導体を含有するポリペプチドである。例えば、４−ヒドロキシプロリンがプロリンに対して置換されていてもよく；５−ヒドロキシリジンがリジンに対して置換されていてもよく；３−メチルヒスチジンがヒスチジンに対して置換されていてもよく；ホモセリンがセリンに対して置換されていてもよく；そしてオルニチンがリジンに対して置換されていてもよい。
【００４５】
「組換え発現ポリペプチド」および「組換えポリペプチド」は、本明細書において、そのポリペプチドを発現するように操作されている宿主細胞から発現されたポリペプチドを指す。特定の態様において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。特定の態様において、この操作は、１またはそれより多い遺伝子修飾を含んでもよい。例えば、宿主細胞は、発現しようとするポリペプチドをコードする１またはそれより多い異種遺伝子の導入によって、遺伝子操作されていてもよい。異種組換え発現ポリペプチドは、宿主細胞において通常発現されるポリペプチドと同一であってもまたは類似であってもよい。異種組換え発現ポリペプチドはまた、宿主細胞に対して外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）であってもよく、例えば宿主細胞で通常発現されるポリペプチドに対して異種であってもよい。特定の態様において、異種組換え発現ポリペプチドはキメラである。例えば、ポリペプチドの一部は、宿主細胞において通常発現されるポリペプチドと同一であるかまたは類似であるアミノ酸配列を含有し、一方、他の部分は宿主細胞に対して外来であるアミノ酸配列を含有してもよい。さらにまたはあるいは、ポリペプチドは、どちらも宿主細胞において通常発現される２またはそれより多い異なるポリペプチド由来のアミノ酸配列を含有してもよい。さらに、ポリペプチドは、宿主細胞に対してどちらも外来である２またはそれより多いポリペプチド由来のアミノ酸配列を含有してもよい。いくつかの態様において、宿主細胞は、１またはそれより多い内因性遺伝子の活性化または上方制御によって遺伝的に修飾される。
【００４６】
配列間の相同性または配列同一性（該用語は本明細書において交換可能に用いられる）の計算は、以下のように行われる。２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するため、最適比較目的のために配列を整列させる（例えば、最適整列のために、第一および第二のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入してもよく、そして比較目的のために、非相同配列を無視してもよい）。典型的な態様において、比較目的のために整列させる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％または６０％、あるいは少なくとも７０％、８０％、９０％または１００％である。次いで、対応するアミノ酸位またはヌクレオチド位でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列の位が第二の配列の対応する位で同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合、分子はその位で同一である（本明細書において、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と同等である）。
【００４７】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の同一性パーセントを決定するため、最適比較目的のために配列を整列させる（例えば第二のアミノ酸または核酸配列との最適整列のために、第一のアミノ酸または核酸配列の配列中にギャップを導入してもよい）。２つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一の位の数の関数である（すなわち、％相同性＝同一の位の数／位の総数ｘ１００）。数学的アルゴリズムを用いて、２つの配列間の相同性パーセントの決定を達成してもよい。２つの配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの限定されない例は、Ｋａｒｌｉｎら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９０：５８７３−７（１９９３）におけるように修飾される、Ｋａｒｌｉｎら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８７：２２６４−８（１９９０）のアルゴリズムである。こうしたアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０（１９９０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに取り込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実行可能である。
【００４８】
ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実行可能である。比較目的のためにギャップ形成整列を得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：３３８９−４０２（１９９７）に記載されるように、ギャップ形成ＢＬＡＳＴを利用してもよい。ＢＬＡＳＴおよびギャップ形成ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用してもよい。
【００４９】
２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適な整列のために導入される必要がある、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一の位の数の関数である。
【００５０】
２つの配列間の配列比較および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成可能である。１つの態様において、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）に取り込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８：４４３−５３（１９７０））を用い、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ加重、および１、２、３、４、５、または６の長さ加重を用いて、決定する。さらに別の態様において、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントを、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（ｇｃｇ．ｃｏｍで、インターネット上で入手可能）を用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスギャップ、および４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ加重、および１、２、３、４、５、または６の長さ加重を用いて、決定する。パラメータの１つの典型的なセット（および別に明記しない限り使用すべきであるもの）は、１２のギャップペナルティ、４のギャップ伸長ペナルティ、および５のフレームシフトギャップペナルティを伴う、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２スコアリングマトリックスである。
【００５１】
２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に取り込まれているＥ．  ＭｙｅｒｓおよびＷ．  Ｍｉｌｌｅｒ（Ｍｙｅｒｓら，  Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ  ４：１１−７（１９８８））のアルゴリズムを用い、ＰＡＭ１２０加重残基表、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを用いて、決定可能である。
【００５２】
本明細書において、「使用説明書（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｌ  ｍａｔｅｒｉａｌ）」には、本明細書に言及する多様な疾患または障害に影響を及ぼすか、これらを軽減するかまたは治療するためのキットにおいて、本発明の化合物、組み合わせおよび／または組成物の有用性を伝えるために使用可能な、刊行物、録音、図表、または任意の他の表現媒体が含まれる。場合によって、またはあるいは、使用説明書は、本明細書の別の箇所に開示するようなものを含めて、細胞、組織、または哺乳動物における疾患または障害を軽減する１またはそれより多い方法を記載しうる。
【００５３】
キットの使用説明書は、例えば、本発明の化合物および／または組成物を含有する容器に添付されてもよいし、あるいは化合物および／または組成物を含有する容器とともに輸送されてもよい。あるいは、使用説明書は、受領者が使用説明書および化合物を協調させて使用する意図で、容器とは別個に輸送されてもよい。
【００５４】
記載する場合を除いて、用語「患者」または「被験体」は、交換可能に用いられ、そして哺乳動物、例えばヒト患者および非ヒト霊長類、ならびに獣医学的被験体、例えばウサギ、ラット、およびマウス、ならびに他の動物を指す。好ましくは、患者はヒトを指す。
【００５５】
「有効量」または「療法的に有効な量」は、本明細書において交換可能に用いられ、組織または哺乳動物、好ましくはヒトに投与した際、該化合物の非存在下で検出される反応に比較して、検出可能な療法的反応を仲介する量である。限定されるわけではないが、線維症の阻害および／または減少、骨量または骨密度の増加等の療法的反応は、例えば本明細書に開示するような方法を含む、多数の当該技術分野に認識される方法によって容易に評価可能である。
【００５６】
当業者は、本明細書の投与される化合物または組成物の有効量が多様であり、そして治療される疾患または状態、疾患の病期、治療される哺乳動物の年齢および健康状態および身体状態、疾患の重症度、投与される特定の化合物等の多くの要因に基づいて、容易に決定可能であることを理解するであろう。
【００５７】
本明細書において、「治療する」は、患者が疾患の症状（例えば骨密度減少、骨折、線維症等）を経験する頻度を減少させることを意味する。該用語には、疾患の症状、合併症、または生化学的指標の開始を防止するかまたは遅延させ、疾患、状態、または障害の症状を軽減するか、またはそのさらなる発展を抑止するかもしくは阻害するための、本発明の化合物または剤の投与が含まれる。治療は予防的（疾患の開始を防止するかまたは遅延させる、あるいはその臨床的または亜臨床的症状の徴候を防止する）、あるいは疾患の徴候後の症状の療法的抑制または軽減であってもよい。
【００５８】
句「特異的に結合する」によって、本明細書において、特定の分子を認識して、そしてこれに結合するが、試料中の他の分子を実質的に認識せずまたはこれらに結合しない化合物、例えばタンパク質、核酸、抗体等を意味する。例えば、ＢＭＰタンパク質、抗体またはペプチド阻害剤は、試料中の同族受容体（例えばＢＭＰ  Ｉ型またはＩＩ型受容体、その同族抗原に結合する抗体等）を認識し、そして結合するが、試料中の他の分子を実質的に認識せずまたはこれらに結合しない。したがって、指定されたアッセイ条件下で、明記される結合部分（例えばＢＭＰまたはその受容体結合断片）は、特定のターゲット分子に優先的に結合し、そして試験試料中に存在する他の構成要素に、有意な量では結合しない。多様なアッセイ形式を用いて、関心対象の分子に特異的に結合する抗体を選択することも可能である。ＢＭＰ受容体と特異的に反応するＢＭＰを同定するために使用可能な多くのアッセイの中には、例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ、免疫沈降、ＢＩＡｃｏｒｅ、ＦＡＣＳ、Ｏｃｔｅｔ、およびウェスタンブロット分析がある。典型的には、特異的または選択的反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍、より好ましくはバックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも５倍高く、そしてより典型的にはバックグラウンドより１０倍より高く、さらにより具体的には、平衡解離定数（ＫＤ）が≦１００μＭ、より好ましくは≦１０μＭ、さらにより好ましくは≦１μＭ、さらにより好ましくは≦１００ｎＭそして最も好ましくは≦１０ｎＭの場合、ＢＭＰは、ＢＭＰ受容体に「特異的に結合する」と言われる。
【００５９】
用語「ＫＤ」は、特定のリガンド−受容体相互作用の平衡解離定数を指す。
「結合アフィニティ」は、一般的に、分子（例えばＢＭＰリガンド）およびその結合パートナー（例えばＢＭＰ  Ｉ型またはＩＩ型受容体）の結合部位間の非共有相互作用の力の合計を指す。別に示さない限り、本明細書において、「結合アフィニティ」は、結合対（例えばＢＭＰおよびその同族受容体）メンバー間の１：１相互作用を反映する、生得的な結合アフィニティを指す。分子ＸのそのパートナーＹに対するアフィニティは、一般的に、解離定数（Ｋｄ）によって表されうる。
【００６０】
本明細書に記載するものを含めて、当該技術分野に知られる一般的な方法によって、アフィニティを測定することも可能である。低アフィニティＢＭＰは、一般的に、受容体により緩慢に結合し、そして容易に解離する傾向があり、一方、高アフィニティＢＭＰは、一般に、受容体により迅速に結合し、そしてより長く結合したままである傾向がある。結合アフィニティを測定する多様な方法が当該技術分野に知られ、このうちいずれを本発明の目的のために用いてもよい。特定の例示的態様を、本明細書の別の箇所に記載する。
【００６１】
用語「ｋｏｎ」は、本明細書において、単位：Ｍ−１秒−１で測定される、順方向、または複合体形成反応の、会合またはオン速度定数、または特異的反応速度を指すよう意図される。
【００６２】
用語「ｋｏｆｆ」は、本明細書において、単位：秒−１で測定される、抗体／抗原複合体からの抗体の解離に関する、解離またはオフ速度定数、または特異的反応速度を指すよう意図される。
【００６３】
用語「Ｋｄ」は、本明細書において、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を指すよう意図される。これは、式：
ｋｏｆｆ／ｋｏｎ＝Ｋｄ
によって計算される。
【００６４】
用語「改変された結合」は、本明細書において、デザイナーＢＭＰが、対応する野生型ＢＭＰの同じＩ型および／またはＩＩ型受容体に対する結合と比較した際、少なくともＩ型受容体および／またはＩＩ型受容体に関する、異なる結合特異性を含むことを意味する。デザイナーＢＭＰは、その受容体に対する野生型ＢＭＰの結合に比較して、受容体とより高いまたはより低いアフィニティで結合してもよい。例えば、野生型ＢＭＰが特定の結合アフィニティで特定のＩ型受容体に結合する場合、対応するデザイナーＢＭＰは、野生型ＢＭＰに比較してより高いまたはより低いアフィニティで受容体に結合する。デザイナーＢＭＰが、野生型ＢＭＰが検出可能に結合しない受容体に特異的に結合してもよいし、そしてデザイナーＢＭＰが、野生型が結合する受容体にもはや検出可能に結合しない場合は逆であってもよい。したがって、改変された結合は、対応する野生型ＢＭＰによるその受容体の結合と比較した、デザイナーＢＭＰによるＩ型またはＩＩ型受容体の結合におけるいかなる検出可能な変化も含む。デザイナーＢＭＰのＫｄが、同じＢＭＰ受容体に関する対応する野生型ＢＭＰのＫｄより高いまたは低いように、デザイナーＢＭＰが、対応する野生型ＢＭＰのｋｏｎ値に比較して、より高いまたはより低いｋｏｎ値を有してもよいし、そして／またはデザイナーＢＭＰが、対応する野生型ＢＭＰへのｋｏｆｆ値に比較して、より高いまたはより低いｋｏｆｆ値を有してもよい。したがって、デザイナーＢＭＰおよび対応する野生型ＢＭＰの間の結合特性および／またはアフィニティ値のいかなる相違も、本明細書において、用語「改変された結合」に含まれる。
【００６５】
用語「表面プラズモン共鳴」は、本明細書において、例えばＢＩＡｃｏｒｅ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、スウェーデン・ウプサラ、およびニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の改変を検出することにより、リアルタイム生物特異的相互作用の分析を可能にする、光学現象を指す。さらなる説明に関しては、例えば、Ｊｏｈｎｓｓｏｎら，  Ａｎｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｌｉｎ．  ５１：  １９−２６（１９９３）；  Ｊｏｈｎｓｓｏｎら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：  ６２０−６２７（１９９１）；  Ｊｏｈｎｓｓｏｎら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．  ８：  １２５−１３１（１９９５）；およびＪｏｈｎｎｓｏｎら，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９８：  ２６８−２７７（１９９１）を参照されたい。
【００６６】
本明細書において、「実質的に純粋」は、対象の種が、存在する主な種であり（すなわち組成物中の任意の他の個々の種よりもモル基準でより豊富であり）、そして好ましくは実質的に純粋な分画は、対象の種（例えばデザイナーＢＭＰ）が、存在するすべての巨大分子種の少なくとも約５０パーセント（モル基準で）を構成する組成物であることを意味する。一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての巨大分子種の約８０パーセントより多く、より好ましくは約８５％、９０％、９５％、および９９％を含むであろう。最も好ましくは、対象の種は、本質的に均質に精製されており（慣用的な検出法によって、混入種が組成物中で検出不能である）、組成物は、本質的に、単一の巨大分子種からなる。
【００６７】
説明
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）
上述のように、ＢＭＰはＴＧＦ−βタンパク質スーパーファミリーのメンバーであり、これらはすべて６つの保存されるシステイン残基によって特徴付けられる（Ｌａｎｄｅｒら，  （２００１）  Ｎａｔｕｒｅ，  ４０９：８６０−９２１）。ＢＭＰ／ＧＤＦサブファミリーには、限定されるわけではないが、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３（オステオゲニン）（例えば米国特許第６，１７７，４０６号を参照されたい）、ＢＭＰ３ｂ（ＧＤＦ−１０）（例えば米国特許第６，２０４，０４７号を参照されたい）、ＢＭＰ４（ＢＭＰ２ｂ）（例えば米国特許第６，２４５，８８９号を参照されたい）、ＢＭＰ５（例えば米国特許第５，５４３，３９４号を参照されたい）、ＢＭＰ６（例えば米国特許第６，６１３，７４４号を参照されたい）、ＢＭＰ７（骨形成タンパク質−１またはＯＰ１）（例えば米国特許第５，１４１，９０５号を参照されたい）、ＢＭＰ８（ＯＰ２）（例えば米国特許第５，６８８，６７８号を参照されたい）、ＢＭＰ８Ｂ（ＯＰ３）（例えば米国特許第５，８５４，０７１号を参照されたい）、ＢＭＰ９（ＧＤＦ２）（例えば米国特許第６，２８７，８１６号を参照されたい）、ＢＭＰ１０（例えば米国特許第５，７０３，０４３号を参照されたい）、ＢＭＰ１１（ＧＤＦ１１）（例えば米国特許第６，４３７，１１１号を参照されたい）、ＢＭＰ１２（ＧＤＦ７）（例えば米国特許第６，０２７，９１９号を参照されたい）、ＢＭＰ１３（ＧＤＦ６、ＣＤＭＰ２）（例えば米国特許第６，０２７，９１９号を参照されたい）、ＢＭＰ１５（ＧＤＦ９）（例えば米国特許第６，０３４，２２９号を参照されたい）、ＢＭＰ１６（例えば米国特許第６，３３１，６１２号を参照されたい）、ＧＤＦ１（例えば米国出願第２００４／００３９１６２号を参照されたい）、ＧＤＦ３（例えば米国特許第６，０２５，４７５号を参照されたい）、ＧＤＦ５（ＣＤＭＰ１；  ＭＰ５２）（例えば米国特許第５，９９４，０９４号を参照されたい）、およびＧＤＦ８（ミオスタチン）（例えば米国特許第５，８２７，７３３号を参照されたい）が含まれる。
【００６８】
ＢＭＰは、Ｉ型受容体：ＡＬＫ−Ｉ、ＡＬＫ−２（ＡｃｔＲｌａまたはＡｃｔＲＩとも称される）、ＡＬＫ−３（ＢＭＰＲＩａとも称される）、およびＡＬＫ−６（ＢＭＰＲＩｂとも称される）；ならびにＩＩ型受容体：ＡｃｔＲＩＩａ（ＡｃｔＲＩＩとも称される）、ＡｃｔＲＩＩｂ、およびＢＭＰＲＩＩを含む、その同族受容体に特異的に結合する。ＢＭＰ−受容体結合相互作用は、徹底的に研究されてきており、そして各Ｉ型および／またはＩＩ型受容体に関する各野生型ＢＭＰの結合特異性は、当該技術分野に一般的に知られ、そして表１に示される。例えば、Ｎｉｃｋｅｌら，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  ２０：３６７−７７（２００９）；  Ｈｅｉｎｅｃｋｅら，  ＢＭＣ  Ｂｉｏｌ  ７：５９（２００９）を参照されたい。
【００６９】
【表１】
2018506992.tif 000003
【００７０】
改善された骨形成活性を持つデザイナー骨形成タンパク質
本発明は、各ＢＭＰ二量体が４つのＢＭＰ受容体：２つのＩ型受容体および２つのＩＩ型受容体に結合するという理解に部分的に基づく。各受容体に関する各ＢＭＰの特異性は、表１で上に示すように、当該技術分野に知られる。また、各受容体に関するＢＭＰの結合を仲介する、多様なＢＭＰの受容体結合領域がマッピングされており、そしてこれを表２に示す。例えば、野生型ＢＭＰ２およびＢＭＰ４が、Ｉ型ＢＭＰ受容体Ａｌｋ−３およびＡＬＫ−６に高アフィニティで結合し、そしてＩＩ型ＢＭＰ受容体により低いアフィニティで結合することがよく確立されている。他方で、野生型ＢＭＰ６およびＢＭＰ７は、ＩＩ型受容体ＡｃｔｒＩＩＡ、ＡｃｔｒＩＩＢ、およびＢＭＰＲＩＩに高アフィニティで結合するが、ＩＩ型に結合するよりも低いアフィニティでＩ型受容体に結合することが知られる。およそ１２の受容体との相互作用を通じた、およそ４３のＴＧＦβスーパーファミリーメンバーのシグナル伝達からの異なる細胞反応は、各リガンドが、異なるアフィニティで結合する受容体の特定のレパートリーを利用するためであると考えられる。Ｉ型およびＩＩ型結合ドメインを表２に示す。
【００７１】
【表２】
2018506992.tif 000004
【００７２】
デザイナーＢＭＰの受容体結合を改変するための合理的アミノ酸置換
野生型ＢＭＰ２が、Ｉ型受容体に関して比較的高いアフィニティを示し、一方、野生型ＢＭＰ６が、ＩＩ型受容体に関して高いアフィニティを示すことが、当該技術分野において周知である。当該技術分野において、野生型ＢＭＰ２およびＢＭＰ６のヘテロ二量体が、Ｉ型およびＩＩ型受容体両方に比較的高いアフィニティで結合し、各ＢＭＰが各受容体に関してより高いアフィニティ結合部位を提供しているようであることが、当該技術分野にさらに知られる。以下の表３を参照されたい。ＢＭＰ２／６ヘテロ二量体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ骨形成アッセイの両方において、ＢＭＰ２またはＢＭＰ６単独あるいはホモ二量体よりもより活性であることが知られる。表３は、Ｉ型およびＩＩ型受容体へのＢＭＰ２およびＢＭＰ６結合アフィニティの例を示す。
【００７３】
【表３】
2018506992.tif 000005
【００７４】
したがって、（限定されるわけではないが）ＢＭＰヘテロ二量体の結合を模倣し、そして好ましくは改善する結合を含む、Ｉ型および／またはＩＩ型受容体への改善された結合を伴うデザイナーＢＭＰを提供することが本発明の目的である。図１および表２に示すように、各ＢＭＰは、受容体結合に寄与する３つの結合部位を含む。Ｎ末端からＣ末端に、各ＢＭＰは、ＩＩ型受容体結合部位Ａ、Ｉ型受容体結合部位、および第二のＩＩ型受容体結合部位Ｂを含む。野生型ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、およびＢＭＰ９の例示的な整列を図１に例示するが、当業者は、ＴＧＦβスーパーファミリーメンバー間の多様なアミノ酸の相対的な位置を提供する、周知の整列があることを認識するであろう。こうした整列は、とりわけ、国際公報第ＷＯ  ２００９／０８６１３１号（例えば、図１５〜１７、図３１Ａ）、第ＷＯ  ２００８／０５１５２６号（図９〜１２）、第ＷＯ  ２００５／１１８６３６号（図６）、第ＷＯ  ２００５／１１８６３５号、第ＷＯ  ２００５／１１３５８５号（図３）、第ＷＯ  ２００１／９２２９８号（図６Ａ〜６Ｃ）、Ｋｉｒｓｃｈら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １９  ：３３１４−３３２４（２０００）（図１）、米国特許出願公報第２００７／０２９３４２５号（図６）、Ｇｒｏｐｐｅら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２０  ：６３６−６４２（２００２）、Ｎｉｃｋｅｌら，  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．  Ａｍ．  ８３：７−１４（２００１）、およびＷｅｂｅｒら，  ＢＭＣ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌ．  ７  ：６（２００７）に提供される。したがって、多様なＴＧＦβスーパーファミリーメンバーのアミノ酸配列整列を含む、当該技術分野に周知の、ならびに本明細書に提供する開示のタンパク質配列整列アルゴリズムおよびツールを用いて、別のＢＭＰ／ＧＤＦタンパク質中の任意の位のアミノ酸に対する１つのＢＭＰ／ＧＤＦタンパク質中の対応するアミノ酸を決定することも可能である。１つの態様において、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８およびＢＭＰ−９における対応するアミノ酸残基を示す（例えば図１を参照されたい）。
【００７５】
本発明記載のデザイナーＢＭＰには、一般的に、Ｉ型結合ドメインおよび／またはＩＩ型結合ドメイン中の突然変異が含まれ、該突然変異が、Ｉ型またはＩＩ型ＢＭＰ受容体への改変された結合を与える。いくつかの態様において、デザイナーＢＭＰは、Ｉ型結合ドメイン、ならびに第一（結合ドメインＡ）および／または第二（結合ドメインＢ）のＩＩ型結合ドメインの両方に、１またはそれより多い突然変異を含む。他の態様において、デザイナーＢＭＰはＩＩ型結合ドメイン両方に、１またはそれより多い突然変異を含む。他の態様において、デザイナーＢＭＰは、第一のＩＩ型結合ドメイン、第二のＩＩ型結合ドメイン、およびＩ型結合ドメインに、１またはそれより多い突然変異を含む。いくつかの態様において、デザイナーＢＭＰは、Ｉ型結合ドメインに１またはそれより多い突然変異を含む。
【００７６】
上述の突然変異は、好ましい態様において、キメラデザイナーＢＭＰを生成する、異なるＴＧＦβスーパーファミリーメンバーの対応するドメイン間の１またはそれより多い「スワップ」によって生成される。例えば、Ｂｅｒａｓｉらにおいて、多様なデザイナーＢＭＰを生成するために、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−６間のスワップが用いられている。本開示において、Ｂｅｒａｓｉらの解説を拡張して、ＢＭＰ−２、４、６および７間のスワップを含めたが、当業者は、これらおよび他のＴＧＦβスーパーファミリーメンバー間で、他のスワップが可能であることを認識するであろう。
【００７７】
限定されない例として、ＢＭＰ−ＧＥ２７（配列番号８）には、ＢＭＰ７のＩ型ならびにＩＩ型ＡおよびＢドメインのＢＭＰ−２へのスワップが含まれ、ＢＭＰ−２／７キメラを生じる。同様に、ＢＭＰ−ＧＥ４６（配列番号１０）およびＢＭＰ−ＧＥ４７（配列番号１４）には、ＢＭＰ−４への（それぞれ）ＢＭＰ  ６および７のＩ型ならびにＩＩ型ＡおよびＢドメインのスワップが含まれる。
【００７８】
上述の突然変異戦略に加えて、本発明者らは、アクチビン−ＡのＣ末端領域のデザイナーＢＭＰへの別個のスワップが、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体に非常に高いアフィニティを持つデザイナーＢＭＰを生じ、生じる分子がＮｏｇｇｉｎと機能的に異ならず、高濃度のＮｏｇｇｉｎの存在下であってさえＢＭＰ受容体に結合することを発見した（そしてＢｅｒａｓｉらが開示した）。したがって、本発明には、特定の態様において、１またはそれより多いＣ末端突然変異および／または「スワップ」を取り込むｄＢＭＰ、例えばＢＭＰ−ＧＥ２７−ＮＲ（配列番号９）、ＢＭＰ−ＧＥ４６−ＮＲ（配列番号１１）、ＢＭＰ−ＧＥＲ４６−ＮＲ（配列番号１３）またはＢＭＰ−ＧＥ４７−ＮＲ（配列番号１５）が含まれる。
【００７９】
いくつかの態様において、突然変異は、Ｉ型受容体への結合を改善する。他の態様において、突然変異は、ＩＩ型受容体への結合を改善する。他の態様において、突然変異は、Ｉ型またはＩＩ型受容体への結合を減少させる。いくつかの態様において、突然変異は、以下により詳細に示すような、グリカン・テザーを生成するかまたは破壊する。いくつかの態様において、突然変異は、以下により詳細に示すような、Ｈｉｓドアストップを生成するかまたは破壊する。
【００８０】
ＢＭＰは当該技術分野において非常によく特徴付けられ、そして理解されているため、本明細書に提供する開示が提供されたならば、作製可能であり、デザイナーＢＭＰの活性にさらなる影響を及ぼさないありうる突然変異の位置が理解されるであろう。したがって、本発明のデザイナーＢＭＰは、変異体ＢＭＰの受容体結合アフィニティに影響を及ぼさない、さらなる挿入、欠失、または置換を含有する点で、対応する野生型またはデザイナーＢＭＰとは異なる変異体ＢＭＰを含む。いくつかの限定されない態様において、当業者は、システイン・ノット形成に関与するシステインおよび受容体相互作用に関与するアミノ酸は突然変異されるべきではなく、または保存的置換で変化されるべきではなく、一方、他のアミノ酸は、デザイナーＢＭＰの生物学的活性に不都合に影響を及ぼすことなく、より自由に置換、挿入または欠失させうることを理解するであろう。
【００８１】
別に言及しない限り、デザインまたは修飾ＢＭＰのすべての位置番号付けは、成熟天然ＢＭＰの配列に基づくことに注目すべきである。デザイナーＢＭＰは、変異のあらかじめ決定された性質によって特徴付けられ、これは、デザイナーＢＭＰをＢＭＰ配列の天然存在アレルまたは種間変異とは異なるものにする特徴である。デザイナーＢＭＰの変異体は、以下に記載するような適切なアッセイを用いて決定した際、１またはそれより多い細胞タイプにおいて、対応する野生型の活性またはデザイナーＢＭＰ活性の少なくとも５０％の活性を保持しなければならない。野生型活性の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％を保持する変異体がより好ましく、そして野生型よりもより活性である変異体が特に好ましい。デザイナーＢＭＰは、Ｎ末端、Ｃ末端、または内部に、挿入、欠失、および／または置換を含有してもよい。好ましい態様において、デザインまたは修飾ＢＭＰは、最も類似であるヒトＢＭＰ配列とは異なる少なくとも１残基を有し、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くの異なる残基を有することがより好ましい。
【００８２】
本発明のデザイナーＢＭＰは、対応する野生型ＢＭＰタンパク質配列と、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を維持する。
【００８３】
本発明のデザイナーＢＭＰは、対応する野生型ＢＭＰタンパク質配列のＣ末端領域の保存されるシステインドメインと、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を維持することも可能である。
【００８４】
デザイナーＢＭＰは、さらなるタンパク質特性、例えば安定性または免疫原性を改善するか、あるいは翻訳後修飾、例えばＰＥＧ化またはグリコシル化を可能にするかまたは妨げる、さらなる修飾、例えば突然変異を含有してもよい。限定されるわけではないが、１またはそれより多い側鎖または末端の合成誘導体化、グリコシル化、ＰＥＧ化、循環並べ替え、環状化、タンパク質またはタンパク質ドメインへの融合、およびペプチドタグまたは標識の付加を含む、翻訳と同時のまたは翻訳後修飾に、デザイナーＢＭＰを供してもよい。
【００８５】
遺伝暗号の縮重のため、デザイナーＢＭＰのアミノ酸配列を変化させない方式で、１またはそれより多くのコドンの配列を単純に修飾することによって、非常に多数の核酸が作製され、そのすべてが本発明のデザイナーＢＭＰをコードすることも可能である。本発明のデザイナーＢＭＰは、ＷＯ２００８／０５１５２６またはＷＯ２００９／０８６１３１に示すこれらの配列を含まない。
【００８６】
上述のように、ＢＭＰは、天然には、長いプロドメイン、１またはそれより多い切断部位、および成熟ドメインを含むプロタンパク質として発現される。次いで、このプロタンパク質は、細胞機構によってプロセシングされて、二量体成熟ＢＭＰ分子を生じる。好ましい態様において、本発明のデザイナーＢＭＰは、類似の方式で産生される。プロドメインは、ＢＭＰの正しいフォールディングおよびプロセシングを補助すると考えられる。さらに、すべてではないがいくつかのＢＭＰにおいて、プロドメインは、成熟ドメインに非共有的に結合する可能性もあり、そしてシャペロン、ならびに阻害剤として働く可能性もある（例えば、Ｔｈｉｅｓら（２００１）  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，  １８：２５１−２５９）。好ましくは、本発明の修飾ＢＭＰをこの型で産生し、そして／または療法的に投与する。あるいは、限定されるわけではないが、天然ドメインを直接産生するかまたは封入体から再フォールディングするか、あるいは全長の損なわれていないプロタンパク質を含む、他の型で、ＢＭＰを産生してもよい。本発明のデザイナーＢＭＰは、これらのおよび他の型で有用であろう。
【００８７】
特定の態様において、本発明のデザイナーＢＭＰは、主鎖ＢＭＰ、すなわちデザイナーＢＭＰが対応する野生型ＢＭＰを含む。特定の態様において、この主鎖ＢＭＰは、野生型ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、またはＢＭＰ９主鎖であってもよい。
【００８８】
本発明のいくつかの態様において、デザイナーＢＭＰは、Ｉ型結合ドメインおよび／またはＩＩ型結合ドメイン中に少なくとも１つの突然変異を含み、この突然変異が、該突然変異を含まない対応する野生型ＢＭＰの結合と比較して、Ｉ型またはＩＩ型ＢＭＰ受容体への改変された結合を与える。いくつかの態様において、デザイナーＢＭＰは、Ｉ型結合ドメインにおいて少なくとも１つの突然変異、そしてＩＩ型結合ドメインにおいて少なくとも１つの突然変異の両方を含む。他の態様において、デザイナーＢＭＰは、ＩＩ型結合ドメインＡおよびＩＩ型結合ドメインＢ内に少なくとも１つの突然変異を含む。他の態様において、デザイナーＢＭＰは、ＩＩ型結合ドメインＡ、ＩＩ型結合ドメインＢ、およびＩ型結合ドメインに、少なくとも１つの突然変異を含む。
【００８９】
特定の態様において、突然変異は、アミノ酸または核酸置換、欠失および／または挿入を含んでもよい。好ましい態様において、突然変異は、アミノ酸置換を含む。
いくつかの態様において、主鎖ＢＭＰは野生型ＢＭＰであり、そして突然変異は、表４〜６に列挙する１またはそれより多い突然変異である。デザイナーＢＭＰは、これらの表中に列挙する突然変異の任意の組み合わせおよび任意の数を含有してもよい。
【００９０】
いくつかの態様において、主鎖ＢＭＰは野生型ＢＭＰであり、そして突然変異は、表４〜６に列挙する１またはそれより多い突然変異である。デザイナーＢＭＰは、これらの表中または本明細書の他の箇所に列挙する突然変異の並べ替えおよび任意のものおよびすべてを含有してもよい。
【００９１】
【表４】
2018506992.tif 000006
【００９２】
【表５】
2018506992.tif 000007
【００９３】
【表６】
2018506992.tif 000008
【００９４】
いくつかの態様において、突然変異はＩ型受容体への結合を改善する。他の態様において、突然変異はＩＩ型受容体への結合を改善する。他の態様において、突然変異は、Ｉ型またはＩＩ型受容体への結合を減少させる。
【００９５】
上記の表４〜６は、本発明の突然変異例の限定されない編集を提供し、ここで、突然変異の位を、対応する野生型ＢＭＰアミノ酸配列に比較して提供する。したがって、いくつかの態様において、デザイナーＢＭＰは、突然変異の以下の好ましい組み合わせを含む：
デザイナーＢＭＰの例示的なアミノ酸配列を、以下の表７に示す。表７は、デザインされた分子の名称および配列を示す。
【００９６】
【表７】
2018506992.tif 000009
【００９７】
上記に列挙するデザイナーＢＭＰは、本発明の態様を含むが、本発明はいかなる点でも、いかなる特定の分子にも限定されない。その代わり、本発明は、ＩＩ型受容体結合ドメインＡ内の少なくとも１つの突然変異を含む、改変された受容体結合を含む、任意のデザイナーＢＭＰを含み、さらにより好ましくは、デザイナーＢＭＰは、Ｉ型受容体結合ドメイン内に少なくとも１つのさらなる突然変異を含み、最も好ましくは、デザイナーＢＭＰは、ＩＩ型受容体結合ドメインＢ内にさらに別の少なくとも１つのさらなる突然変異を含む。
【００９８】
他の態様において、本発明のデザイナーＢＭＰは、上述の配列の１つに少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または同一であるアミノ酸配列を含む。別の態様において、デザイナーＢＭＰは、配列番号８〜１５の配列に少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または同一であるアミノ酸配列を含む。
【００９９】
さらに別の態様において、デザイナーＢＭＰは、配列番号８〜１５のいずれか１つに示すようなアミノ酸配列を含む。別の態様において、デザイナーＢＭＰのアミノ酸配列は、配列番号８〜１５の配列の１つからなる。
【０１００】
さらに、１つの態様において、デザイナーＢＭＰは、配列番号８〜１５の配列の１つに少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１０１】
本発明のデザイナーＢＭＰは、上述の配列の任意の１つの断片を含むことも可能である。１つの態様において、デザイナーＢＭＰ断片は、配列番号８〜１５のいずれか１つの配列由来の、少なくとも中断されない２０、２２、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４１、４３、４４、４５、４７、５０、５３、５４、５６、５８、６０、６２、６６、６８、７０、７１、７４、７７、８０、８３、８５、８８、９０、９１、９３、９５、９７、９９、１００、１０２、１０５、１０８、１１０、１１２、１１５、１１７、１１９、１２０、１２１、１２２、または１２５アミノ酸配列の断片を含むことも可能である。
【０１０２】
ＢＭＰがしばしば、タンパク質のアミノおよび／またはカルボキシル末端に関して不均一であることが周知である。すなわち、本発明は、デザイナーＢＭＰのＣおよびまたはＮ末端から、少なくとも１０アミノ酸残基、好ましくは９アミノ酸残基、さらにより好ましくは８アミノ酸残基、さらにより好ましくは７アミノ酸残基、好ましくは６アミノ酸残基、さらにより好ましくは５アミノ酸残基、好ましくは４アミノ酸残基、より好ましくは３アミノ酸残基、さらにより好ましくは２アミノ酸残基、そして最も好ましくは１アミノ酸残基の欠失を含む、アミノおよび／またはカルボキシル末端でのアミノ酸欠失／一部切除を含む、デザイナーＢＭＰを含む。
【０１０３】
別の態様において、本発明は、配列番号８〜１５の配列の任意の１つのアミノ酸配列を含み、そして該タンパク質のアミノおよび／またはカルボキシル末端からの欠失／一部切除をさらに含む、デザイナーＢＭＰタンパク質を含む。別の態様において、本発明は、配列番号８〜１５の任意の配列のアミノ酸配列を含むＢＭＰタンパク質に由来するデザイナーＢＭＰタンパク質であって、デザイナーＢＭＰタンパク質アミノ酸配列のＣおよびまたはＮ末端から、少なくとも１０アミノ酸残基、好ましくは９アミノ酸残基、さらにより好ましくは８アミノ酸残基、さらにより好ましくは７アミノ酸残基、好ましくは６アミノ酸残基、さらにより好ましくは５アミノ酸残基、好ましくは４アミノ酸残基、より好ましくは３アミノ酸残基、さらにより好ましくは２アミノ酸残基、そして最も好ましくは１アミノ酸残基の欠失を含む、アミノおよび／またはカルボキシル末端でのアミノ酸欠失／一部切除を含む、前記デザイナーＢＭＰタンパク質を含む。
【０１０４】
グリコシル化によって仲介される改変された受容体アフィニティを持つＢＭＰの構造設計
本発明者らは、以前、Ｂｅｒａｓｉらにおいて説明するように、大腸菌で産生され、グリコシル化されていないＢＭＰ２ホモ二量体（本明細書において、「大腸菌ＢＭＰ２」と称される）が、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞で産生されたグリコシル化ＢＭＰ２（本明細書において、「ＣＨＯ  ＢＭＰ２」と称される）よりも活性が低いことを発見した。本発明者らはまた、大腸菌で産生したＢＭＰ６ホモ二量体が、哺乳動物細胞培養で産生されたＢＭＰ６ホモ二量体に比較して、本質的に非機能性であることもまた発見した。これらの知見は、Ｉ型受容体結合領域において、大腸菌ＢＭＰ２およびＣＨＯ  ＢＭＰ２の結晶構造間に重大な変異が存在することを示す。
【０１０５】
本発明者らはまた、哺乳動物（例えばＣＨＯ）細胞で産生した野生型ＢＭＰ２において、Ｄ５３が受容体界面の方を向き、一方、Ｈ５４は受容体と反対側を向くこともまた以前に発見した（そしてＢｅｒａｓｉらに開示した）。これは大腸菌産生ＢＭＰ２とは対照的であり、こちらはＤ５３残基が受容体界面とは反対側を向き、そしてＨ５４残基が受容体に向かって並び、図３に例示するようにプロリン残基に対してスタックし、見かけ上、「ドアストップ」として作用する。Ｂｅｒａｓｉらはさらに、完全にグリコシル化されてそして活性であるＣＨＯ産生ＢＭＰ６がまた、やって来る受容体に向かうヒスチジン残基、すなわちヒスチジン「ドアストップ」も含むことを最初に立証した。
【０１０６】
いかなる特定の理論によって束縛されることも望ましくないが、Ｂｅｒａｓｉらに示すように、本発明者らの発見は、「ドアストップ」残基を受容体界面に背を向けるように動かすと、ＢＭＰリガンドおよびその受容体間の結合増加を仲介しうることを最初に示唆した。データはさらに、ドアストップ残基が、それ自体突然変異されてドアストップが除去されるか、または他の残基が突然変異されてドアストップ残基の位置をシフトさせることも可能であることを立証した。Ｂｅｒａｓｉらに開示されるデータはさらに、他の残基を突然変異させて「グリカン・テザー」を提供し、これが次に、グリカンの束縛がドアストップ残基を再配向するように、グリカンを配向させうることも立証した。
【０１０７】
本発明は、Ｂｅｒａｓｉらの結果の上に、いくつかの態様において、グリカン・テザーに影響を及ぼし、そして／またはヒスチジン・ドアストップ構造を除去して、それによって、改変された受容体結合をデザイナーＢＭＰに提供する、少なくとも１つのアミノ酸突然変異を取り込むことによって産生されたデザイナーＢＭＰを含む。
【０１０８】
要約すると、いくつかの態様において、本発明のデザイナーＢＭＰは、改変されたＩ型および／またはＩＩ型受容体結合を与える、ＢＭＰのＩ型および／またはＩＩ型結合ドメインにおける少なくとも１つの突然変異を含んでもよい。１つの態様において、ＢＭＰ配列を操作して、操作されたまたは「デザイナー」ＢＭＰの受容体結合および／または骨形成活性を改変し、そして改善するために、ＢＭＰの受容体アフィニティを改変する。１つの態様において、この操作は、Ｉ型およびＩＩ型受容体結合に関与する残基を同定し、そしてこれらをとりわけ、デザイナーＢＭＰが由来する親ＢＭＰよりも、Ｉ型およびＩＩ型受容体の両方により高いアフィニティを示す、デザイナーＢＭＰ分子を生成するために置換する工程を伴う。
【０１０９】
他の態様において、本発明のデザイナーＢＭＰは、新規のアルギニン「グリカン・テザー」を生成するか、または現存するものを破壊して、Ｉ型受容体結合ドメインを再成形する突然変異を含む。すなわち、ＢＭＰ２のＲ１６と同等である、最初のシステインから２残基Ｃ末端の位置にあるアルギニンへの突然変異は、グリカン鎖をＢＭＰ表面上に「束縛（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）」するようであり、そしてその結果、突然変異を欠く野生型ＢＭＰに比較して、プレらせんループ領域のコンホメーションを改変する。他の態様において、本発明のデザイナーＢＭＰは、ＢＭＰとのさらなる結合からＩ型受容体をブロックする、「ドアストップ」残基を改変するか生成するかまたは破壊する（無効にする）少なくとも１つの突然変異を含むことも可能である。すなわち、デザイナーＢＭＰ中のＨ５４、またはデザイナーＢＭＰとＩ型受容体の相互作用を妨害するかまたは増加させる方式で配向している、その対応する同等の残基の突然変異である。
【０１１０】
いくつかの態様において、アミノ酸突然変異は、アルギニン「グリカン・テザー」の生成およびまたは対応する野生型ＢＭＰ中にそうでなければ存在するテザーの無効化を仲介するように、デザイナーＢＭＰのコンホメーションに影響を及ぼす。いくつかの態様において、突然変異は、対応する野生型ＢＭＰにおいて、ドアストップ・コンホメーションが、それぞれ、存在しないかまたは活性である場合、デザイナーＢＭＰにおいて、ヒスチジン・ドアストップ・コンホメーションを生成するかまたは除去／無効化する、改変されたコンホメーションを仲介する。
【０１１１】
したがって、当業者は、本明細書およびＢｅｒａｓｉらに提供する解説を与えられたならば、限定されるわけではないが、本明細書に例示する方法を含む、タンパク質の構造分析のために当該技術分野に知られる任意の方法を用いて、ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーにおけるアルギニン「グリカン・テザー」および／またはヒスチジン「ドアストップ」の存在または非存在を評価することも可能であることを認識するであろう。「ドアストップ」残基の存在がひとたび同定されたらならば、ヒスチジンを受容体結合界面から背を向けて再配向する少なくとも１つの突然変異を分子に導入することも可能である。あるいは、存在する場合、ヒスチジン「ドアストップ」の阻害効果を減少させるかまたはより好ましくは除去するように、「グリカン・テザー」を生成するかまたは増進させる突然変異を導入してもよい。
【０１１２】
１つの態様において、ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーがＢＭＰ２である場合、ヒスチジン・ドアストップを除去する突然変異は、Ｈ５４に対する別のアミノ酸の置換である。いくつかの態様において、Ｈ５４をアラニン、グリシン、セリン、またはスレオニンで置換する。
【０１１３】
本発明は、ＢＭＰ２に関するこうした「ドアストップ」除去突然変異を開示するが、当業者は、当該技術分野の知識に基づいて、他のＴＧＦβスーパーファミリーメンバーに関して対応する突然変異をどのように同定するかを理解し、そして「ドアストップ」を欠く、すなわち結合界面に向くかまたは界面に突き出ることによって、受容体結合にそうでなければ干渉するであろう残基を除去するかまたは再配向する突然変異体を容易に産生するであろう。限定されるわけではないが、本明細書に開示するものなど、タンパク質の構造分析のための当該技術分野に認識される任意の方法を用いて、タンパク質コンホメーションに対する突然変異の影響を決定することも可能である。あるいは、ドアストップを除去して、そしてＩ型受容体へのリガンド結合を増加させうる突然変異を、当該技術分野で利用可能なコンピュータモデリング法を用いて、インシリコで同定することも可能である。したがって、本発明は、そうでなければ受容体界面に存在するであろうヒスチジン「ドアストップ」残基を欠くような、Ｉ型受容体との改善された結合を有するＴＧＦβスーパーファミリーメンバーの設計を含む。
【０１１４】
本発明はさらに、当業者に、アルギニン・グリカン・テザーを生成するかまたは破壊するであろう、他のＴＧＦβファミリーメンバーに関する突然変異をどのように同定するかの理解を提供する。アルギニン・グリカン・テザーを欠くタンパク質にテザーを付加する突然変異が本発明によって意図される。したがって、本発明は、Ｉ型受容体結合ドメインのコンホメーションを改変するアルギニン・グリカン・テザーを含有するような、Ｉ型受容体との改善された結合を有するＴＧＦβスーパーファミリーメンバーの設計を含む。
【０１１５】
いくつかの態様において、それによってグリカン・テザーの必要性を除去するヒスチジン・ドアストップの除去は、生物学的活性を維持しながら、グリコシル化を伴わずに産生可能であるデザイナーＢＭＰを提供する。例えば、哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化活性を有するかまたはグリコシル化活性が存在しない細胞、例えば細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または粘菌細胞において、デザイナーＢＭＰを産生してもよい。特定の態様において、デザイナーＢＭＰを大腸菌で産生し、そして生物学的活性を維持することも可能である。
【０１１６】
したがって、いくつかの態様において、本発明は、哺乳動物細胞によって産生されるものとは異なる、改変されたグリカンが産生されるように、グリコシル化を欠くかまたは改変されたグリコシル化を含むかいずれかである細胞において産生可能であるＢＭＰを設計しそして産生するための方法を提供する。すなわち、本発明は、そうでなければ受容体結合を損なうかまた阻害するであろうドアストップ残基を除去する突然変異を導入するための方法を含む。当業者は、本発明の解説を提供されたならば、受容体−リガンド界面を侵害するドアストップ残基を突然変異させて、残基を完全に除去するか、または残基が界面に背を向けて配向されるように他の突然変異を導入してもよいことを理解するであろう。こうした他の突然変異には、限定されるわけではないが、グリカンのコンホメーションを改変し、そしてそれによってドアストップ残基が結合界面に背を向けて配向するように、リガンドのコンホメーションを改変するグリカン・テザーを提供するものが含まれる。
【０１１７】
デザイナーＢＭＰをコードする核酸
本発明にはまた、本明細書記載のデザイナーＢＭＰをコードする核酸も含まれる。本明細書記載のデザイナーＢＭＰをコードする核酸を、当該技術分野に知られる広範囲の方法内の１またはそれより多い任意の適切な手段によって、調製することも可能である。
【０１１８】
１つの態様において、デザイナーＢＭＰをコードする核酸を、総遺伝子合成によって、あるいは野生型または修飾ＢＭＰをコードする核酸の部位特異的突然変異誘発によって、調製する。テンプレート指示連結、再帰ＰＣＲ、カセット突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発または当該技術分野に周知の他の技術を含む方法が、利用可能である（例えば、Ｓｔｒｉｚｈｏｖら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：１５０１２−１５０１７（１９９６）；  ＰｒｏｄｒｏｍｏｕおよびＰｅｒｌ，  Ｐｒｏｔ．  Ｅｎｇ．  ５：８２７−８２９（１９９２）；  ＪａｙａｒａｍａｎおよびＰｕｃｃｉｎｉ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２：３９２−３９８（１９９２）；ならびにＣｈａｌｍｅｒｓら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３０：２４９−２５２（２００１）を参照されたい）。
【０１１９】
したがって、本発明の態様は、本発明のデザイナーＢＭＰをコードする核酸分子を含むことも可能である。特定の態様において、本発明は、配列番号８〜１５のアミノ酸配列の１つをコードする核酸分子を提供する。
【０１２０】
他の態様において、核酸分子は、配列番号８〜１５のアミノ酸配列の１つに少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を含む、デザイナーＢＭＰタンパク質をコードする。
【０１２１】
デザイナーＢＭＰを産生する方法
ＢＭＰは、天然に、長いプロドメイン、１またはそれより多い切断部位、および成熟ドメインを含むプロタンパク質として発現される。次いで、このプロタンパク質は、細胞機構によってプロセシングされて、典型的には二量体成熟ＢＭＰ分子が生じる。いくつかの態様において、デザイナーＢＭＰは、類似の方式で産生される。プロドメインは、ＢＭＰのフォールディングおよびプロセシングにおいて役割を果たすと考えられる。さらに、いくつかのＢＭＰにおいて、プロドメインは、成熟タンパク質に非共有的に結合し、そして可溶性エンハンサー、シャペロン、または阻害剤として作用しうる。いくつかの態様において、ＢＭＰは、封入体から直接産生されるか、または再フォールディングされる、成熟ドメインとして産生されうる。他の態様において、ＢＭＰは、化学合成または任意の他の既知のタンパク質産生法を通じて、産生される。
【０１２２】
例えば、いくつかの場合、デザイナーＢＭＰをコードする核酸は、総遺伝子合成によって、あるいは野生型、デザイナー、または変異体ＢＭＰをコードする核酸の部位特異的突然変異誘発によって調製される。方法には、テンプレート指示連結、ＰＣＲ、カセット突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、制限酵素消化および連結、または当該技術分野に周知の他の技術が含まれる（例えばＰｒｏｄｒｏｍｏｕら，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ５：８２７−９（１９９２）；  Ｊａｙａｒａｍａｎら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２：３９２−８（１９９２）；  Ｃｈａｌｍｅｒｓら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３０：２４９−５２（２００１）；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ中，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（２００１）を参照されたい）。
【０１２３】
いくつかの態様において、デザイナーＢＭＰをコードする遺伝子を含む発現ベクターを調製する。多様な宿主細胞に関する、多くのタイプの適切な発現ベクターおよび適切な制御配列が当該技術分野に知られる。発現ベクターは、転写および翻訳制御配列を含有してもよく、これには限定されるわけではないが、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写ターミネーターシグナル、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーまたはアクチベーター配列が含まれる。いくつかの態様において、制御配列には、プロモーターならびに転写開始および停止配列が含まれる。さらに、発現ベクターは、さらなる要素、例えば２つの複製系を含んで、２つの生物において維持されることを可能にしてもよい。発現ベクターは、染色体外ベクターまたは宿主細胞ゲノム内に取り込まれるベクターであってもよい。いくつかの態様において、発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに相同な少なくとも１つの配列を含有し、ゲノム内への組込みを促進する。組込みベクターのための構築物は、当該技術分野に周知である。いくつかの態様において、発現ベクターは、安定に形質転換された宿主細胞の選択を可能にする、選択可能マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子は、当該技術分野に周知であり、そして用いる宿主細胞で多様であろう。
【０１２４】
発現ベクターには、宿主細胞からのデザイナーＢＭＰの分泌を提供する、分泌リーダー配列またはシグナルペプチド配列が含まれてもよい。適切な分泌リーダー配列およびシグナルペプチドが当該技術分野に知られる。
【０１２５】
デザイナーＢＭＰをコードする核酸を、単独で、またはデザイナーＢＭＰが核酸から発現されるように発現ベクターと組み合わせて、宿主細胞内に導入してもよい。導入法は、大部分、宿主細胞タイプによって決まる。トランスフェクション／形質転換の例示的な方法には、ＣａＰＯ４沈殿、リポソーム融合、エレクトロポレーション、ウイルス感染、デキストラン仲介トランスフェクション、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、直接マイクロインジェクションおよび当該技術分野に知られる他の方法が含まれる。デザイナーＢＭＰをコードする核酸は、宿主細胞ゲノム内に安定に組み込まれてもよいし、あるいは一過性または安定に細胞質に存在してもよい。
【０１２６】
デザイナーＢＭＰを発現するために適した宿主細胞には、野生型または天然ＢＭＰを発現するために適した任意の細胞が含まれ、限定されるわけではないが、酵母、細菌、古細菌、真菌、昆虫、および動物細胞が含まれる。いくつかの態様において、宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または大腸菌である。いくつかの態様において、宿主細胞は哺乳動物細胞、例えば２９３（例えば２９３−Ｔおよび２９３−ＥＢＮＡ）、ＢＨＫ、ＣＨＯ（例えばＣＨＯＫ１およびＤＧ４４）、ＣＯＳ、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、またはＣ２Ｃ１２細胞である。他の適切な細胞は、ＡＴＣＣカタログ中に見出されうる。デザイナーＢＭＰは、より複雑な生物中で産生されてもよく、こうした生物には、限定されるわけではないが、植物および動物が含まれる。１つの態様において、細胞をさらに遺伝子操作して、すなわちデザイナーＢＭＰ核酸を含む発現ベクター以外の外因性核酸を含有するようにしてもよい。
【０１２７】
いくつかの態様において、デザイナーＢＭＰは、デザイナーＢＭＰの発現を誘導するかまたは引き起こすために適切な条件下で、デザイナーＢＭＰをコードする核酸を含有する発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養することによって産生される。デザイナーＢＭＰ発現に適した条件は、天然または野生型ＢＭＰを発現するために適していることが知られるものと同じ条件である。これらの条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択で多様であり、そしてルーチンの実験を通じて当業者によって容易に確認されうる。
【０１２８】
いくつかの態様において、発現後に、デザイナーＢＭＰを精製するかまたは単離してもよい。標準的な精製法には、電気泳動、分子、免疫学的、ならびにイオン交換、疎水性、アフィニティ、および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィを含むクロマトグラフィ技術、ならびにクロマトフォーカシングが含まれる。適切な精製技術における一般的なガイダンスは、Ｓｃｏｐｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  ＮＹ，  第３版（１９９４）中に見出されうる。必要な精製の度合いは、望ましい使用に応じて多様であり、そしていくつかの場合、精製はまったく必要でないであろう。
【０１２９】
細菌細胞からの精製は、封入体中のＢＭＰの発現、およびＣＨＡＰＳ／高塩系における再フォールディングの続く工程を生じるであろう。哺乳動物細胞からの精製は、硫酸セルファインおよび逆相クロマトグラフィカラムを通じた、２工程精製を伴うであろう。
【０１３０】
いくつかの態様において、デザイナーＢＭＰは、共有的または非共有的に修飾されてもよい。タンパク質のターゲティングされるアミノ酸残基を、選択される側鎖または末端残基と反応可能である有機誘導体化剤と反応させることによって、共有修飾をタンパク質に導入してもよい。限定されるわけではないが、視覚的検査、構造分析、配列分析、および分子シミュレーションを含む多様な基準を用いて、修飾のために最適な部位を選択してもよい。
【０１３１】
いくつかの態様において、デザイナーＢＭＰを少なくとも１つの元素、同位体、または化学的化合物で標識してもよい。標識は、同位体標識、例えば放射性同位体または重同位体であってもよい。いくつかの態様において、標識は、免疫標識、例えば抗体または抗原であってもよい。いくつかの態様において、標識は着色または蛍光標識、例えばフルオレセインであってもよい。いくつかの態様において、標識はビオチン、タグ（例えばＦＬＡＧ、Ｍｙｃ、Ｈｉｓ）であってもよい。
【０１３２】
デザイナーＢＭＰを二官能性剤で誘導体化して、タンパク質に結合する抗体またはタンパク質を精製する際に使用するか、あるいはスクリーニングアッセイにおいて結合を検出するため、支持マトリックスまたは表面に、デザイナーＢＭＰを架橋させてもよい。一般的に用いられる架橋剤には、限定されるわけではないが、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドが含まれる。他の修飾には、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基への、それぞれグルタミニルおよびアスパラギニル残基の脱アミド化、プラリン（ｐｒａｌｉｎｅ）およびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のアミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，  サンフランシスコ，  ｐｐ．  ７９−８６（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、および任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。こうした誘導体化は、可溶性、吸収、血液脳関門を渡る輸送、血清半減期等を改善しうる。デザイナーＢＭＰの修飾は、あるいは、タンパク質の任意のありうる望ましくない副作用を除去するかまたは減弱させることも可能である。こうした効果を仲介可能な部分は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  第１６版，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  ペンシルバニア州イーストン（１９８０）に開示される。
【０１３３】
デザイナーＢＭＰの共有修飾の別のタイプは、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号または第４，１７９，３３７号に示される方式での、多様な非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンの１つへのタンパク質の連結を含む。多様なカップリング化学反応を用いて、当該技術分野に周知であるように、ＰＥＧ付着を達成してもよい。
【０１３４】
別の態様において、デザイナーＢＭＰは、限定されるわけではないが、米国特許第５，７３３，７５７号、および米国特許公報第ＵＳ  ２００９／００９８１３０号に記載されるＣｏｖＸ−ボディなどの、ＣｏｖＸ−ボディ抗体へのＣｏｖＸ−ボディを通じたタンパク質連結を含む。こうしたＣｏｖＸ−ボディは、限定されるわけではないが、安定性改善および血清半減期延長を含む、改善された特性を示すことも可能である。
【０１３５】
デザイナーＢＭＰの受容体結合活性をアッセイする方法
野生型ＢＭＰの活性を評価するために用いる任意の方法を用いて、デザイナーＢＭＰの受容体結合活性を評価することも可能である。
【０１３６】
受容体結合アッセイによって、１またはそれより多いＢＭＰ受容体に関するデザイナーＢＭＰのアフィニティを決定してもよい。例えば、ＡＬＫ−２、ＡＬＫ−３、ＡＬＫ−６、ＡｃｔＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩｂ、またはＢＭＰＲＩＩに関するアフィニティを決定してもよい。適切な結合アッセイには、限定されるわけではないが、ＥＬＩＳＡ、蛍光異方性および強度、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｐｅａｒｃｅら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：８１−８９（１９９９））、ＤＥＬＦＩＡアッセイ、およびＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒより商業的に入手可能；  Ｂｏｓｓｅ  Ｒ．，  Ｉｌｌｙ  Ｃ，  およびＣｈｅｌｓｋｙ  Ｄ（２００２））が含まれる。
【０１３７】
いくつかの態様において、Ｂｉａｃｏｒｅまたは表面プラズモン共鳴アッセイを用いる、例えば、ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ５：５７２−５７７（２００１）を参照されたい。Ｂｉａｃｏｒｅ実験は、以前、ＴＧＦ−βアイソフォームのその受容体に対する結合を特徴付けるために用いられてきた（Ｄｅ  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７６：  ２９６３２−２９６４３（２００１）；  Ｄｅ  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３２８：  １１７３−１１８３）（２００３）。
【０１３８】
他の態様において、プレートに基づく直接結合アッセイを用いて、１またはそれより多いＢＭＰ受容体に対する１またはそれより多い修飾ＢＭＰのアフィニティを決定する。この方法は、抗ＢＭＰモノクローナル抗体を用いてＢＭＰが捕捉され、そして次いで、ＢＭＰ受容体−Ｆｃ融合タンパク質を用いて検出される、修飾サンドイッチＥＬＩＳＡである。
【０１３９】
他の態様において、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭアッセイ（Ｂｏｓｓｅ  Ｒ．ら，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭ，  ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｔｅ  Ｒｅｆ  ＃４０６９，  ｈｔｔｐ：／／ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ．ｃｏｍ／  Ｎｏｔｅｓ／Ｓ４０６９−０８０２．ｐｄｆ（２００２））を用いて、受容体および阻害剤結合を特徴付けることも可能である。蛍光アッセイもまた用いて、受容体および阻害剤結合を特徴付けるとも可能である。例えば、ＢＭＰ２またはＢＭＰ２受容体または阻害剤のいずれかを、蛍光色素（適切な色素の例に関しては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓカタログを参照されたい）で標識してもよい。さらに、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を用いて、受容体結合アフィニティを決定してもよい。例えば、ＢＭＰ受容体−Ｆｃ融合をプロテインＡコーティングＳＰＡビーズまたたはフラッシュプレートに結合させ、そしてＳ３５標識ＢＭＰで処理してもよく；結合事象は光の産生を生じる。
【０１４０】
特定の態様において、ヒトＩｇＧ−Ｆｃへの受容体細胞外ドメイン融合体を用いることによって、特定のＢＭＰ突然変異体のＩ型またはＩＩ型受容体へのＫＤを決定することも可能である。抗ヒト−ＩｇＧ−Ｆｃセンサーを用いて、Ｏｃｔｅｔセンサーに受容体を結合させてもよく、そしてＢＭＰは、ＫｏｎおよびＫｏｆｆ速度を決定する溶液中の受容体細胞外ドメインに結合可能である。Ｏｃｔｅｔ系は、専売ＢｉｏＬａｙｅｒインフェロメトリー（ＢＬＩ）を利用して、生体分子相互作用のリアルタイム標識不含分析を可能にし、そしてアフィニティ、動力学および濃度に関する情報を提供する。タンパク質がＯｃｔｅｔセンサーに結合すると、センサーを通過した光は、分光光度計で測定可能な波長シフトを有する。分析物がセンサーに結合した際、および結合を失った際のシフト率を測定する。
【０１４１】
デザイナーＢＭＰの骨形成活性をアッセイする方法
野生型ＢＭＰの活性を評価するために用いる任意の方法を用いて、デザイナーＢＭＰの骨形成活性を評価することも可能である。
【０１４２】
ＢＭＰは、いくつかのタイプの細胞の増殖および分化を促進する。例えば、アルカリホスファターゼの発光受容体、あるいはアルシアンブルーまたはＰＮＰＰなどの熱量測定試薬を用いて、分化を監視することも可能である（Ａｓａｈｉｎａら（１９９６）  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ，  ２２２：３８−４７；  Ｉｎａｄａら（１９９６）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｖｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．．  ２２２：３１７−３２２；  Ｊｏｒｔｉｋｋａら（１９９８）  Ｌｉｆｅ  ＳｃＬ  ６２：２３５９−２３６８；  Ｃｈｅｎｇら（２００３）  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ９５Ａ：１５４４−１５５２）。
【０１４３】
ラット肢芽軟骨分化アッセイを用いて、初代細胞における活性を監視することもまた可能である。代替態様において、受容体遺伝子またはキナーゼアッセイを用いてもよい。ＢＭＰは、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化するため、ＳＴＡＴ反応性レポーター、例えばＧＦＰまたはルシフェラーゼを含有するＢＭＰ反応性細胞株を用いてもよい（Ｋｕｓａｎａｇｉら（２０００）  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ．，  １１：５５５−５６５）。例えば、細胞に基づくアッセイを用いて、腎臓細胞中のＢＭＰ活性を決定してもよい；例えばＷａｎｇおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ（２００４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７９：２３２００−２３２０６を参照されたい。
【０１４４】
すべて、Ｉｓａａｃｓら，  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ２４：１４６９−１４７７（２０１０）に記載される、アルカリホスファターゼ、ＢＲＥ−ルシフェラーゼ、またはアリザリンレッドミネラル化などの細胞に基づくアッセイにおいて、骨形成活性を測定してもよい。
【０１４５】
また、骨形成活性を、ラット異所性骨アッセイまたは哺乳動物骨増殖モデルを通じて、ｉｎ  ｖｉｖｏで測定してもよい。いくつかの態様において、骨形成活性を非ヒト霊長類モデルにおいて測定する。これらのモデルは、Ｉｓａａｃｓら，  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ２４：１４６９−１４７７（２０１０）に記載される。
【０１４６】
骨量および品質を評価するための方法が当該技術分野に知られ、そしてこれには、限定されるわけではないが、Ｘ線回折；  ＤＸＡ；  ＤＥＱＣＴ；  ｐＱＣＴ、化学分析、密度分画、組織測光法、組織形態計測、および組織化学分析、例えば、Ｌａｎｅら，  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．  Ｒｅｓ．  １８：２１０５−２１１５（２００３）に記載されるようなものが含まれる。皮質骨密度を決定するための１つのアッセイは、マイクロＣＴアッセイである。ｐＱＣＴ測定後、例えば、大腿に対するＳｃａｎｃｏ  ｍＣＴ４０（Ｓｃａｎｃｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＡＧ）を用いて、マイクロＣＴ評価を行ってもよい。
【０１４７】
骨増殖／密度／強度を評価するための、任意の既知のまたは後に開発されるｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ法を用いて、本発明のデザイナーＢＭＰの骨形成活性を評価してもよい。
【０１４８】
薬学的組成物
本発明のデザイナーＢＭＰを、薬学的組成物の一部として、投与の必要がある哺乳動物、好ましくはヒトに投与するために配合してもよい。任意の適切な手段によって、例えば非経口的、経口的または局所で、組成物を投与してもよい。デザインＢＭＰが、注射によって、望ましい組織部位に局所投与される場合、あるいは全身性に、例えば静脈内、皮下、筋内、眼窩内、眼部、脳室内、頭蓋内、関節内、脊髄内、大槽内、腹腔内、頬側、直腸、膣、鼻内またはエアロゾル投与によって投与される場合、組成物は好ましくは、水溶液を含む。溶液は好ましくは、生理学的に許容されうるものであり、哺乳動物へのその投与が、哺乳動物の通常の電解質および液体体積バランスに不都合に影響を及ぼさないものである。したがって、水溶液は，例えば通常の生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ、０．１５Ｍ）、ｐＨ７〜７．４を含んでもよい。
【０１４９】
経口または非経口全身投与に有用な溶液は、例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ａ．監修，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．，  １９９０、その開示は本明細書に援用される）に記載される、薬学業に周知の任意の方法によって調製可能である。配合物には、例えば、ポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール、植物起源の油、水素付加ナフタレン等が含まれてもよい。直接投与のための配合物には、特に、グリセロールおよび他の高粘度組成物が含まれてもよい。
【０１５０】
例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン、リン酸三カルシウム、ポリブチレート、ポリラクチド、ポリグリコリドおよびラクチド／グリコチドコポリマーを含む、生体適合性、好ましくは生体吸収性ポリマーは、ｉｎ  ｖｉｖｏでデザイナーＢＭＰの放出を調節するために有用な賦形剤でありうる。本発明のＢＭＰのための他の潜在的に有用な非経口送達系には、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能注入系、およびリポソームが含まれうる。吸入投与のための配合物は、賦形剤として、例えばラクトースを含有してもよく、あるいは例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココレートもしくはデオキシコレートを含有する水溶液、または点鼻剤の形の投与用の油溶液または鼻内に適用されるジェルとしてであってもよい。
【０１５１】
あるいは、本発明のデザイナーＢＭＰを経口投与してもよい。例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（上記）に記載されるものなどの標準的実施にしたがって、デザイナーＢＭＰの液体配合物を調製してもよい。こうした液体配合物を、次いで、投与のため、飲料または別の栄養補助食品に添加してもよい。また、これらの液体配合物のエアロゾルを用いて、経口投与を達成してもよい。あるいは、当該技術分野に認識される乳化剤を用いて調製した固体配合物を、経口投与に適した錠剤、カプセルまたはロゼンジに作製してもよい。
【０１５２】
場合によって、デザイナーＢＭＰを、望ましい組織によるタンパク質の取り込みを増進させるための手段を含む組成物中に配合してもよい。例えば、テトラサイクリンおよびジホスホネート（ビスホスホネート）は、哺乳動物において全身に提供された場合、特に骨リモデリングゾーンで、骨ミネラルに結合することが知られる。したがって、こうした構成要素を用いて、本発明のデザイナーＢＭＰの骨組織への送達を増進させることも可能である。あるいは、望ましいターゲット組織と特異的に関連するアクセス可能な物質、例えば細胞表面抗原に特異的に結合する抗体またはその部分もまた用いてもよい。望ましい場合、こうした特異的ターゲティング分子を、例えば化学的架橋によって、または例えば酸不安定性結合、例えばＡｓｐ−Ｐｒｏ連結を生成するための標準的な遺伝子操作技術を用いることによって、本発明のデザイナーＢＭＰに共有結合させてもよい。例えば米国特許第５，０９１，５１３号の解説にしたがって、有用なターゲティング分子を設計することも可能である。
【０１５３】
限定なしにポリマーマトリックスを含むキャリアーマトリックスと組み合わせた際、デザイナーＢＭＰのいくつかがｉｎ  ｖｉｖｏで最高レベルの活性を示しうることもまた意図される。例えば、その開示が本明細書に援用される米国特許第５，２６６，６８３号を参照されたい。現在好ましいキャリアーマトリックスは、異種性、同種性または自己である。しかし、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ酪酸、その誘導体およびコポリマーを含む合成材料もまた、適切なキャリアーマトリックスを生成するために使用可能である。好ましい合成および天然由来マトリックス材料、その調製、本発明のデザイナーＢＭＰとともにこれらを配合するための方法、および投与法は当該技術分野に周知であり、そしてしたがって本明細書で詳細には論じない。例えば米国特許第５，２６６，６８３号を参照されたい。
【０１５４】
特定の態様において、デザイナーＢＭＰを、単独で、または組織形態形成に有益な効果を有することが知られる別の物質と組み合わせて、必要がある哺乳動物に投与してもよい。こうした物質（本明細書において、補因子）の例には、組織修復および再生を促進し、そして／または炎症または線維症を阻害する物質が含まれる。骨粗鬆症個体における骨組織増殖を刺激するために有用な補因子の例には、例えば、限定されるわけではないが、ビタミンＤ３、カルシトニン、プロスタグランジン、副甲状腺ホルモン、デキサメタゾン、エストロゲンおよびＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩが含まれる。神経組織修復および再生に有用な補因子には、神経増殖因子が含まれてもよい。他の有用な補因子には、症状軽減補因子が含まれ、消毒剤、抗生物質、抗ウイルスおよび抗真菌剤、鎮痛剤および麻酔剤が含まれる。
【０１５５】
デザイナーＢＭＰを、好ましくは、薬学的に許容されうる非毒性賦形剤およびキャリアーと混合することによって、薬学的組成物に配合する。上述のように、こうした組成物は、全身、例えば非経口投与のために、特に液体溶液または懸濁物の形で；経口投与のために、特に錠剤またはカプセルの形で；あるいは鼻内投与のために、特に粉末、点鼻剤またはエアロゾルの形で調製されていてもよい。組織表面への接着が望ましい場合、組成物は、例えば、その開示が本明細書に援用されるＰＣＴ  ＵＳ９１／０９２７５に開示されるようなフィブリノーゲン−トロンビン分散剤または他の生物接着剤を含んでもよい。次いで、組成物を望ましい組織表面に塗布するか、スプレーするか、または別の方式で適用してもよい。
【０１５６】
投与した際、本発明の薬学的組成物は、典型的には発熱物質不含の生理学的に許容されうる形で送達される。さらに、組成物は、望ましくは、骨軟骨または組織損傷部位への送達のために、粘性の形で被包されるかまたは注射されていてもよい。局所投与は、創傷治癒および組織修復のために適切であってもよい。好ましくは、骨および／または軟骨形成のため、組成物には、骨および／または軟骨損傷の部位にＢＭＰタンパク質を送達可能であり、骨および軟骨の発展のための構造を提供し、そして最適には体内に吸収されることが可能なマトリックスが含まれる。こうしたマトリックスは、現在、他の移植医学適用のために現在使用される材料で形成されてもよい。
【０１５７】
マトリックス材料の選択は、生体適合性、生体分解性、機械的特性、美容的外見および界面特性に基づく。デザイナーＢＭＰ組成物の特定の適用は、適切な配合物を定義するであろう。組成物の潜在的なマトリックスは、生体分解性であり、そして化学的に定義された硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物であってもよい。他の潜在的な材料は、生体分解性で、そして生物学的によく定義された、例えば骨または皮膚コラーゲンである。さらなるマトリックスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリックス構成要素で構成される。他の潜在的なマトリックスは、非生体分解性で、そして化学的に定義された、例えば焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸、または他のセラミクスである。マトリックスは、上述のタイプの材料、例えばポリ乳酸およびヒドロキシアパタイトまたはコラーゲンおよびリン酸三カルシウムのいずれの組み合わせで構成されてもよい。バイオセラミクスの組成を改変して、例えばカルシウム−アルミン酸−リン酸にして、そして孔サイズ、粒子サイズ、粒子形状、および生体分解性を改変するようにプロセシングしてもよい。
【０１５８】
投薬措置は、主治医によって、デザイナーＢＭＰタンパク質の作用を修飾する多様な要因を考慮して、決定されるであろう。これらの要因には、限定なしに、形成されることが望ましい骨重量、骨損傷部位、損傷を受けた骨の状態、創傷のサイズ、損傷を受けた組織のタイプ、患者の年齢、性別、および食餌、任意の感染の重症度、投与時間および他の臨床的要因が含まれる。投薬量は、再構成において用いられるマトリックスのタイプによって多様でありうる。また、他の既知の増殖因子、例えばＩＧＦ  Ｉ（インスリン様増殖因子Ｉ）を、最終組成物に添加して投薬量に影響を及ぼしてもよい。骨増殖および／または修復の定期的評価によって、進行を監視してもよい。骨増殖または修復を評価する１つの方法は、多くの当該技術分野に知られる方法の中でも、Ｘ線画像化および／またはＣＴスキャンによるものがある。
【０１５９】
組成物を、ヒトまたは他の哺乳動物に、療法的に有効な量、例えば望ましい効果を誘導するために十分な期間、ターゲット組織にデザイナーＢＭＰの適切な濃度を提供する量で、非経口または経口投与のため、配合してもよい。好ましくは、本発明の組成物は、モルホゲン関連生物学的反応に関する哺乳動物の必要性、例えば組織特異的機能の維持または老化組織（例えば骨減少症骨組織）への組織特異的表現型の回復、あるいは線維症反応の阻害または逆転を軽減するかまたは緩和する。
【０１６０】
当業者に認識されるであろうように、療法組成物において記載される化合物の濃度は、投与しようとする薬剤の投薬量、使用する化合物の化学特性（例えば疎水性）、および投与経路を含む、多くの要因に応じて多様であろう。投与しようとする薬剤の好ましい投薬量はまた、疾患のタイプおよび度合い、組織喪失または欠損、特定の患者の全体の健康状態、選択される化合物の相対的な生物学的有効性、化合物の配合、配合物中の賦形剤の存在およびタイプ、ならびに投与経路などの変数に応じる可能性がある。
【０１６１】
一般的な意味で、本発明の化合物を、非経口投与のため、約０．１〜１０％  ｗ／ｖ化合物を含有する水性生理学的緩衝溶液中で提供してもよい。典型的な用量範囲は、１日あたり約１０ｎｇ／ｋｇ体重〜約１ｇ／ｋｇ体重の範囲であり；好ましい用量範囲は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１６２】
療法的使用
野生型ＢＭＰが有用である任意の徴候またはＴＧＦβスーパーファミリーメンバーが使用可能な任意の方法のために、デザイナーＢＭＰを使用することも可能である。デザイナーＢＭＰは、骨および軟骨形態形成の発生カスケードを誘導可能であり、そしてＳｍａｄシグナル伝達経路を誘導するかまたは仲介することが可能である。デザイナーＢＭＰは、より大きい骨増大および修復を誘導し、これには、限定されるわけではないが、対応する野生型ＢＭＰより多い骨量、骨剛性、および骨密度の産生が含まれる。したがって、デザイナーＢＭＰを用いて、組織において骨形成を誘導することも可能である。また、デザイナーＢＭＰを用いて、体の多様な位置で、骨および軟骨の増殖を誘導することも可能である。例えば、デザイナーＢＭＰを用いて、膝、肘、踝、および指などの関節を修復することも可能である。例えば、デザイナーＢＭＰは、関節炎または他の軟骨変性疾患を患う患者において、軟骨を再生するために有用でありうる。さらに、デザイナーＢＭＰは、傷害による軟骨中の裂傷を治療するために示される。さらに、デザイナーＢＭＰは、患者において、骨増殖を誘導するために有用である。例えば、デザイナーＢＭＰは、骨折もしくは骨破壊、骨粗鬆症を患う患者、または脊髄固定の必要がある患者を治療する際の使用に、あるいは脊髄、脊椎等の修復のために示される。
【０１６３】
別の態様において、本発明には、骨増大および／または修復の方法が含まれる。したがって、本発明は、検出可能な骨増大または修復を仲介する部位に、デザイナーＢＭＰの療法的有効量を投与する工程を含む。
【０１６４】
別の態様において、本発明には、Ｓｍａｄ発現の誘導または増加の方法が含まれる。該方法は、本発明のデザイナーＢＭＰと、Ｓｍａｄ仲介発現経路を含む細胞を接触させる工程を含む。
【０１６５】
デザイナーＢＭＰは、骨または骨軟骨とは異なる、哺乳動物中の多様な組織に関して、骨形態形成および組織形態形成の発生カスケードを誘導することが可能である。この形態形成活性には、前駆細胞の増殖および分化を誘導する能力、ならびに骨、軟骨、非ミネラル化骨格または結合組織、および他の成体組織の形成を生じる事象の進行を通じて、分化した表現型を支持し、そして維持する能力が含まれる。
【０１６６】
例えば、デザイナーＢＭＰを、代謝骨疾患において、骨量の喪失および／または増加を防止する治療のために用いてもよい。骨形成タンパク質を用いて、代謝骨疾患において、骨量の喪失および／または増加を防止する治療のための一般的な方法は、その開示が本明細書に援用される、米国特許第５，６７４，８４４号に開示される。デザイナーＢＭＰを、例えば骨破壊、骨折、および軟骨裂傷などの傷害部位で骨または軟骨を置換するかまたは修復するためにも投与してもよい。本発明のデザイナーＢＭＰを歯周組織再生のために使用してもよい。骨形成タンパク質を用いた歯周組織再生のための一般的な方法は、その開示が本明細書に援用される、米国特許第５，７３３，８７８号に開示される。
【０１６７】
デザイナーＢＭＰを肝再生のために用いてもよい。骨形成タンパク質を用いた肝再生のための一般的な方法は、その開示が本明細書に援用される、米国特許第５，８４９，６８６号に開示される。デザイナーＢＭＰを慢性腎不全の治療のために用いてもよい。骨形成タンパク質を用いた慢性腎不全の治療のための一般的な方法は、その開示が本明細書に援用される、米国特許第６，８６１，４０４号に開示される。デザイナーＢＭＰを、中枢神経系虚血または外傷後の機能回復を増進させるために用いてもよい。骨形成タンパク質を用いた、中枢神経系虚血または外傷後の機能回復を増進させるための一般的な方法は、その開示が本明細書に援用される、米国特許第６，４０７，０６０号に開示される。
【０１６８】
デザイナーＢＭＰを、樹状細胞増殖を誘導するために用いてもよい。骨形成タンパク質を用いて樹状細胞増殖を誘導するための一般的な方法は、その開示が本明細書に援用される、米国特許第６，９４９，５０５号に開示される。
【０１６９】
デザイナーＢＭＰを、神経細胞接着を誘導するために用いてもよい。骨形成タンパク質を用いて神経細胞接着を誘導するための一般的な方法は、その開示が本明細書に援用される、米国特許第６，８００，６０３号に開示される。
【０１７０】
デザイナーＢＭＰをパーキンソン病の治療および防止のために用いてもよい。骨形成タンパク質を用いたパーキンソン病の治療および防止のための一般的な方法は、その開示が本明細書に援用される、米国特許第６，５０６，７２９号に開示される。
【０１７１】
上述の多様な療法的使用のために、本発明の修飾ＢＭＰを用いて、一般的な方法を修飾することは、一般の当業者の技術範囲内である。本発明の修飾ＢＭＰの療法的適用の例示的な態様を以下にさらに記載する。
【０１７２】
デザイナーＢＭＰを用いて、疾患のまたは損傷を受けた哺乳動物組織を修復することも可能である。修復しようとする組織を好ましくは評価して、そして過剰な壊死または干渉瘢痕組織を、外科的、化学的、切除的または医学業に知られる他の方法によって、必要に応じて除去する。次いで、デザイナーＢＭＰを、無菌生体適合性組成物の一部として、組織部位に直接、外科的移植または注射のいずれかによって、提供してもよい。あるいは、修飾ＢＭＰ刺激前駆細胞を含有する無菌生体適合性組成物を、組織部位に提供してもよい。疾患または損傷を受けたかいずれかである、部位に存在する組織に、適切なマトリックスを提供して、前駆細胞の増殖および組織特異的分化を可能にする。さらに、損傷を受けたかまたは疾患の組織部位、特に、外科的手段によってさらに攻撃されている部位に、形態学的に許容性である環境を提供する。いくつかの組織に関して、修飾ＢＭＰの全身提供が十分であると想定される。
【０１７３】
デザイナーＢＭＰを用いて、傷害後の瘢痕組織形成を防止するかまたは実質的に阻害することも可能である。デザイナーＢＭＰを新規に傷害を受けた組織部位に提供する場合、その部位で組織形態形成を誘導し、非分化結合組織内で遊走線維芽細胞が凝集することを防ぎうる。デザイナーＢＭＰは、好ましくは、傷害５時間以内に、組織部位に注入される無菌薬学的調製物として提供される。
【０１７４】
例えば、部分的肝切除後、実質的に傷害を受けた肝組織のタンパク質誘導性形態形成のために、デザイナーＢＭＰを用いてもよい。この一般的なプロトコルの変形を、他の組織のために用いてもよい。一般的な方法は、組織の本質的な非再生部分を切除して、そして修飾ＢＭＰを、好ましくは可溶性薬学的調製物として、切除された組織部位に提供し、創傷を閉じ、そして後日、その部位を調べる。骨同様、肝臓も、出生後の（ｐｏｓｔ−ｆａｔａｌ）人生の間、傷害に際して再生する潜在能力を有する。
【０１７５】
別の例として、デザイナーＢＭＰはまた、象牙質形成を誘導するためにも使用可能である。今日まで、傷害に対する歯髄組織の予測不能な反応が、歯科学における基本的な臨床的問題である。標準的な歯科手術法を用いて、試料の歯の歯髄のすぐ上のエナメル質および象牙質を（ドリルによって）除去することによって、歯髄の小さな領域（例えば２ｍｍ）を外科的に曝露し、歯冠歯髄組織の部分的切断を行って、止血を誘導し、歯髄治療を適用し、そして標準的方法によって腔を密封し、そして充填する。
【０１７６】
本発明のデザイナーＢＭＰを用いて、線維症を治療してもよい。線維症は、体の多様な部分に位置してもよく、そして特定の種類のものであってもよく、例えば線維症は：腎臓において、例えば糸球体腎炎、糖尿病腎症、同種移植片拒絶、およびＨＩＶ腎症で；肝臓において、例えば肝硬変、および静脈閉塞疾患で；肺において、例えば特発性線維症（および自己免疫線維症）で；皮膚において、例えば全身性硬化症、ケロイド、瘢痕、および好酸球増多筋痛症候群で；中枢神経系において、例えば脳室内線維症で；心臓血管系において、例えば血管再狭窄で；鼻において、例えば鼻ポリープ症で；骨または骨髄において；内分泌臓器において；そして胃腸系において観察されるような線維症であってもよい。
【０１７７】
１つの態様において、ＢＭＰ７の結合特性を有するデザイナーＢＭＰ、またはその有用な修飾（半減期延長、野生型ＢＭＰ７に比較した同じまたは異なる受容体に対する結合アフィニティの増加、限定されるわけではないがＮｏｇｇｉｎなどのＢＭＰ７アンタゴニストによる阻害に対する耐性等）が、線維症を治療し、軽減しまたは逆転させるために有用でありうる。すなわち、Ｗｅｉｓｋｉｒｃｈｅｎら，  ２００９，  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉ．  １４：４９９２−５０１２に最近概説されたように、ＴＧＦβ１は、限定されるわけではないが、上皮−間葉遷移を含む、線維症増加を導くカスケードを仲介する。ＴＧＦβ１の線維症誘導効果は、ＢＭＰ７によって阻害または逆転されうる。Ｌｏｕｒｅｉｒｏら，  ２０１０，  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  Ｄｉａｌ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  ２５：１０９８−１１０８もまた参照されたい。さらに、特定の線維化状態を、ＢＭＰ４の投与によって治療するかまたは軽減させることも可能である（Ｐｅｇｏｒｉｅｒら，  ２０１０，  Ｒｅｓｐ．  Ｒｅｓ．  １１：８５を参照されたい）。したがって、本発明は、治療が必要な患者において、線維症を治療するために、受容体結合を改変し、そして潜在的に有用な療法剤を提供する、ＢＭＰ７フレームワークに基づき、そして／または本明細書の別の箇所に開示するＩ型およびＩＩ型突然変異を取り込むかいずれかのデザイナーＢＭＰを含む。
【０１７８】
線維症障害は、いくつかの原因によって誘導される可能性があり、これには：化学療法、例えばブレオマイシン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メトトレキセート、ムスチン、またはプロカルバジン治療から生じる肺線維症；偶発的または放射線療法におけるような意図的いずれかの放射線曝露、例えば放射線照射から生じる間質性肺疾患（ＩＬＤ））；環境的または産業的要因または汚染物質、例えば化学薬品、煙霧、金属、蒸気、ガス等、例えばアスベストまたは炭塵から生じるＩＬＤ；薬剤または薬剤の組み合わせ、例えば抗生物質（例えばペニシリン、スルホンアミド等）、心臓血管薬剤（例えばヒドララジン、β遮断剤等）、ＣＮＳ薬剤（フェニトイン、クロルプロマジン等）、抗炎症薬剤（例えば金塩、フェニルブタゾン等）が誘導しうるＩＬＤ；免疫反応障害、例えば皮膚線維症を伴う慢性移植片対宿主病；疾患状態、例えばＩＬＤの既知の原因である誤嚥肺炎、および寄生虫誘導性線維症；ならびにＣＮＳの貫通傷害におけるような、創傷、例えば鈍的外傷、外科切除、戦場の創傷等が含まれる。
【０１７９】
特定の態様において、Ｉ型受容体ＡＬＫ２への改善された結合を有するデザイナーＢＭＰ、例えばＢＭＰＥを用いて、ＡＬＫ２に関連する疾患を治療することも可能である。
キット
本発明には、本発明のデザイナーＢＭＰの療法的有効量を、アプリケーター、および本発明の方法を実行するためのデザイナーＢＭＰの使用を記載する使用説明書とともに含む、多様なキットが含まれる。例示的なキットを以下に記載するが、他の有用なキットの内容は、本開示を考慮して、当業者に明らかであろう。これらのキットは各々、本発明内に含まれる。
【０１８０】
本発明には、治療が必要な患者において、代謝性骨疾患における骨量喪失および／または増加を防止する治療のためのキットが含まれる。該キットには、本発明のデザイナーＢＭＰが含まれる。キットはさらに、患者にキットの構成要素を投与するための、限定されるわけではないが、シリンジ、骨セメント混合デバイス等を含むアプリケーターを含む。さらに、キットは、患者における骨量および／または骨量増加を治療するかまたは防止するためのキットの使用のための適切な情報を示す使用説明書を含む。
【０１８１】
より好ましくは、キットは、配列番号８〜１５のアミノ酸配列より選択されるアミノ酸配列を有する抗体より選択される少なくとも１つのデザイナーＢＭＰを含み、すなわちデザイナーＢＭＰは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および／または配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
【０１８２】
キットは、骨喪失および／または骨量増加を防止する治療のための任意の数のさらなる療法剤を含んでもよい。こうした剤は以前示され、そしてこれには、とりわけ、療法化合物、サイトカイン、ビタミン、ＴＧＦβスーパーファミリーの他のメンバーが含まれる。
【０１８３】
本発明はまた、骨喪失および／または骨量増加を防止するために有効な量（例えば１０ｍｇ／ｋｇより多く、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、または１５ｍｇ／ｋｇ）でデザイナーＢＭＰを含む製品（例えばｉ．ｖ．または経口投与に適応された投薬型）にも関する。特定の態様において、製品は、骨喪失および／または骨量増加を治療するかまたは防止する使用のための、デザイナーＢＭＰならびにラベルおよび／または説明書を含む単数または複数の容器を含む。
【０１８４】
本発明にはまた、治療が必要な患者における組織または臓器において、線維症を治療するかまたは防止するためのキットが含まれる。キットには、本発明のデザイナーＢＭＰが含まれる。キットはさらに、限定されるわけではないが、患者にキットの構成要素を投与するためのタンパク質を送達するためのシリンジまたはデバイス、混合デバイス等を含む、アプリケーターを含む。さらに、キットは、患者において線維症を治療するかまたは防止するためのキットの使用のための適切な情報を示す使用説明書を含む。
【０１８５】
より好ましくは、キットは、配列番号８〜１５のアミノ酸配列より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質より選択される少なくとも１つのデザイナーＢＭＰを含み、すなわちデザイナーＢＭＰは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および／または配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
【０１８６】
キットは、骨喪失を防止し、そして／または骨量を増加させ、あるいは線維症を治療するかまたは防止する治療のための、任意の数のさらなる療法剤を含んでもよい。こうした剤は以前示され、そしてこれには、とりわけ、療法化合物、サイトカイン、ビタミン、ＴＧＦβスーパーファミリーの他のメンバーが含まれる。
【０１８７】
本発明はまた、骨喪失および／または骨量増加を防止する、あるいは線維症を治療するかまたは防止するために有効な量（例えば１ｍｇ／ｋｇより多く、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、または１５ｍｇ／ｋｇ）でデザイナーＢＭＰを含む製品（例えばｉ．ｖ．または経口投与に適応された投薬型）に関する。特定の態様において、製品は、骨喪失および／または骨量増加を治療するかまたは防止する、あるいは線維症を治療するかまたは防止する使用のための、デザイナーＢＭＰならびにラベルおよび／または説明書を含む単数または複数の容器を含む。
【０１８８】
例示的な態様のリスト：
以下の限定されない態様は、本発明の多様な態様の例示である：
１．  配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、デザイナーＢＭＰタンパク質。
【０１８９】
２．  デザイナーＢＭＰタンパク質のＩ型、ＩＩＡ型、またはＩＩＢ型結合ドメイン内ではない、少なくとも１つの突然変異をさらに含む、態様１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０１９０】
３．  少なくとも１つの突然変異が、１０より多い突然変異ではない、態様２のデザイナーＢＭＰタンパク質。
４．  対応する野生型ＢＭＰの結合プロファイルとは異なる結合プロファイルを有する、態様１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０１９１】
５．  デザイナーＢＭＰタンパク質の結合プロファイルが、以下：約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ２受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ３受容体への結合；約１ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ６受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＡ受容体への結合；約０．５ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＢ受容体への結合；および約３．５ｎＭより大きくないＫＤでのＢＭＰＲＩＩＡ受容体への結合の少なくとも１つを含む、態様４のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０１９２】
６．  態様１のデザイナーＢＭＰタンパク質をコードする核酸。
７．  態様６の核酸を含む発現ベクターを細胞内に導入する工程を含む、デザイナーＢＭＰタンパク質を産生する方法。
【０１９３】
８．  態様１記載のデザイナーＢＭＰタンパク質と、患者を接触させる工程を含む、患者を治療する方法。
９．  患者を治療する工程が、骨喪失に関連する骨疾患を治療する工程を含み、そして患者とデザイナーＢＭＰを接触させる工程が、骨疾患を治療するために有効な用量のデザイナーＢＭＰを患者に投与する工程を含む、態様８の方法。
【０１９４】
１０．  患者を治療する工程が、線維症の治療を含み、そして患者とデザイナーＢＭＰを接触させる工程が、線維症を治療するために有効な用量のデザイナーＢＭＰを患者に投与する工程を含む、態様８の方法。
【０１９５】
１１．  配列番号１に比較して、以下の突然変異：Ｖ３３Ｉ、Ｐ３６Ｅ、Ｈ３９Ａ、Ｈ４４Ｅ、Ｐ４８Ａ、Ａ５２Ｎ、Ｄ５３Ｓ、Ｈ５４Ｙ、Ｌ５５Ｍ、Ｓ５７Ａ、Ｎ６８Ｈ、Ｓ６９Ｆ、Ｖ７０Ｉ、Ｓ７２Ｐ、Ｋ７３Ｅ、Ｋ７３の後のＴ挿入、Ｉ７４Ｖ、Ａ７７Ｐ、Ｖ８０Ａ、Ｓ８５Ｎ、Ｍ８９Ｖ、Ｌ９２Ｆ、Ｅ９４Ｄ、Ｎ９５Ｓ、Ｅ９６Ｓ、Ｋ９７Ｎ、Ｖ９９Ｉを含む、デザイナーＢＭＰタンパク質。
【０１９６】
１２．  デザイナーＢＭＰタンパク質のＩ型、ＩＩＡ型、またはＩＩＢ型結合ドメイン内ではない、少なくとも１つの突然変異をさらに含む、態様１１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０１９７】
１３．  配列番号８のアミノ酸配列を含む、態様１１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
１４．  対応する野生型ＢＭＰの結合プロファイルとは異なる結合プロファイルを有する、態様１１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０１９８】
１５．  デザイナーＢＭＰタンパク質の結合プロファイルが、以下：約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ２受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ３受容体への結合；約１ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ６受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＡ受容体への結合；約０．５ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＢ受容体への結合；および約３．５ｎＭより大きくないＫＤでのＢＭＰＲＩＩＡ受容体への結合の少なくとも１つを含む、態様１４のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０１９９】
１６．  態様１１のデザイナーＢＭＰタンパク質をコードする核酸。
１７．  態様１６の核酸を含む発現ベクターを細胞内に導入する工程を含む、デザイナーＢＭＰタンパク質を産生する方法。
【０２００】
１８．  態様１１記載のデザイナーＢＭＰタンパク質と、患者を接触させる工程を含む、患者を治療する方法。
１９．  患者を治療する工程が、骨喪失に関連する骨疾患を治療する工程を含み、そして患者とデザイナーＢＭＰを接触させる工程が、骨疾患を治療するために有効な用量のデザイナーＢＭＰを患者に投与する工程を含む、態様１８の方法。
【０２０１】
２０．  患者を治療する工程が、線維症の治療を含み、そして患者とデザイナーＢＭＰを接触させる工程が、線維症を治療するために有効な用量のデザイナーＢＭＰを患者に投与する工程を含む、態様１８の方法。
【０２０２】
２１．  配列番号１に比較して、以下の突然変異：Ｖ３３Ｉ、Ｐ３６Ｅ、Ｈ３９Ａ、Ｈ４４Ｅ、Ｐ４８Ａ、Ａ５２Ｎ、Ｄ５３Ｓ、Ｈ５４Ｙ、Ｌ５５Ｍ、Ｓ５７Ａ、Ｎ６８Ｈ、Ｓ６９Ｆ、Ｖ７０Ｉ、Ｓ７２Ｐ、Ｋ７３Ｅ、Ｋ７３の後のＴ挿入、Ｉ７４Ｖ、Ａ７７Ｐ、Ｖ８０Ａ、Ｅ８３Ｋ、Ｓ８５Ｒ、Ａ８６Ｐ、Ｉ８７Ｍ、Ｌ９２Ｙ、Ｅ９４Ｄ、Ｎ９５Ｇ、Ｅ９６Ｑ、Ｋ９７Ｎ、Ｖ９８Ｉ、Ｖ９９Ｉ、Ｌ１００Ｋ、Ｎ１０２Ｄ、Ｙ１０３Ｉ、Ｄ１０５Ｎ、Ｖ１０７Ｉ、Ｇ１１０Ｅ、Ｒ１１４Ｓを含む、デザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２０３】
２２．  デザイナーＢＭＰタンパク質のＩ型、ＩＩＡ型、またはＩＩＢ型結合ドメイン内ではない、少なくとも１つの突然変異をさらに含む、態様２１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２０４】
２３．  配列番号９のアミノ酸配列を含む、態様２１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
２４．  対応する野生型ＢＭＰの結合プロファイルとは異なる結合プロファイルを有する、態様２１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２０５】
２５．  デザイナーＢＭＰタンパク質の結合プロファイルが、以下：約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ２受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ３受容体への結合；約１ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ６受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＡ受容体への結合；約０．５ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＢ受容体への結合；および約３．５ｎＭより大きくないＫＤでのＢＭＰＲＩＩＡ受容体への結合の少なくとも１つを含む、態様２４のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２０６】
２６．  態様２１のデザイナーＢＭＰタンパク質をコードする核酸。
２７．  態様２６の核酸を含む発現ベクターを細胞内に導入する工程を含む、デザイナーＢＭＰタンパク質を産生する方法。
【０２０７】
２８．  態様２１記載のデザイナーＢＭＰタンパク質と、患者を接触させる工程を含む、患者を治療する方法。
２９．  患者を治療する工程が、骨喪失に関連する骨疾患を治療する工程を含み、そして患者とデザイナーＢＭＰを接触させる工程が、骨疾患を治療するために有効な用量のデザイナーＢＭＰを患者に投与する工程を含む、態様２８の方法。
【０２０８】
３０．  患者を治療する工程が、線維症の治療を含み、そして患者とデザイナーＢＭＰを接触させる工程が、線維症を治療するために有効な用量のデザイナーＢＭＰを患者に投与する工程を含む、態様２８の方法。
【０２０９】
３１．  配列番号２に比較して、以下の突然変異：Ｖ３５Ｉ、Ｐ３８Ｋ、Ｑ４１Ａ、Ｈ４６Ｄ、Ｄ４８Ｅ、Ｐ５０Ｓ、Ａ５４Ｎ、Ｄ５５Ａ、Ｌ５７Ｍ、Ｓ５９Ａ、Ｎ７０Ｈ、Ｓ７１Ｌ、Ｖ７２Ｐ、Ｓ７４Ｐ、Ｓ７５Ｅ、Ｓ７５の後のＹ挿入、Ｉ７６Ｖ、Ａ７９Ｐ、Ｖ８２Ａ、Ｓ８７Ｎ、Ｍ９１Ｖ、Ｌ９４Ｆ、Ｅ９６Ｄ、Ｙ９７Ｎ、Ｄ９８Ｓ、Ｋ９９Ｎ、Ｖ１０１Ｉを含む、デザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２１０】
３２．  デザイナーＢＭＰタンパク質のＩ型、ＩＩＡ型、またはＩＩＢ型結合ドメイン内ではない、少なくとも１つの突然変異をさらに含む、態様３１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２１１】
３３．  配列番号１０または１２のアミノ酸配列を含む、態様３１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
３４．  対応する野生型ＢＭＰの結合プロファイルとは異なる結合プロファイルを有する、態様３１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２１２】
３５．  デザイナーＢＭＰタンパク質の結合プロファイルが、以下：約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ２受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ３受容体への結合；約１ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ６受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＡ受容体への結合；約０．５ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＢ受容体への結合；および約３．５ｎＭより大きくないＫＤでのＢＭＰＲＩＩＡ受容体への結合の少なくとも１つを含む、態様３４のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２１３】
３６．  態様３１のデザイナーＢＭＰタンパク質をコードする核酸。
３７．  態様３６の核酸を含む発現ベクターを細胞内に導入する工程を含む、デザイナーＢＭＰタンパク質を産生する方法。
【０２１４】
３８．  態様３１記載のデザイナーＢＭＰタンパク質と、患者を接触させる工程を含む、患者を治療する方法。
３９．  患者を治療する工程が、骨喪失に関連する骨疾患を治療する工程を含み、そして患者とデザイナーＢＭＰを接触させる工程が、骨疾患を治療するために有効な用量のデザイナーＢＭＰを患者に投与する工程を含む、態様３８の方法。
【０２１５】
４０．  患者を治療する工程が、線維症の治療を含み、そして患者とデザイナーＢＭＰを接触させる工程が、線維症を治療するために有効な用量のデザイナーＢＭＰを患者に投与する工程を含む、態様３８の方法。
【０２１６】
４１．  配列番号２に比較して、以下の突然変異：Ｖ３５Ｉ、Ｐ３８Ｋ、Ｑ４１Ａ、Ｈ４６Ｄ、Ｄ４８Ｅ、Ｐ５０Ｓ、Ａ５４Ｎ、Ｄ５５Ａ、Ｌ５７Ｍ、Ｓ５９Ａ、Ｎ７０Ｈ、Ｓ７１Ｌ、Ｖ７１Ｍ、Ｓ７４Ｐ、Ｓ７５Ｅ、Ｓ７５の後のＹ挿入、Ｉ７６Ｖ、Ａ７９Ｐ、Ｖ８２Ａ、Ｅ８５Ｋ、Ｓ８７Ｒ、Ａ８８Ｐ、Ｉ８９Ｍ、Ｌ９４Ｙ、Ｅ９６Ｄ、Ｙ９７Ｇ、Ｄ９８Ｑ、Ｋ９９Ｎ、Ｖ１００Ｉ、Ｖ１０１０Ｉ、Ｌ１０２Ｋ、Ｎ１０４Ｄ、Ｙ１０５Ｉ、Ｅ１０７Ｎ、Ｖ１０９Ｉ、Ｇ１１２Ｅ、Ｒ１１６Ｓを含む、デザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２１７】
４２．  デザイナーＢＭＰタンパク質のＩ型、ＩＩＡ型、またはＩＩＢ型結合ドメイン内ではない、少なくとも１つの突然変異をさらに含む、態様４１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２１８】
４３．  配列番号１１のアミノ酸配列を含む、態様４１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
４４．  対応する野生型ＢＭＰの結合プロファイルとは異なる結合プロファイルを有する、態様４１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２１９】
４５．  デザイナーＢＭＰタンパク質の結合プロファイルが、以下：約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ２受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ３受容体への結合；約１ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ６受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＡ受容体への結合；約０．５ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＢ受容体への結合；および約３．５ｎＭより大きくないＫＤでのＢＭＰＲＩＩＡ受容体への結合の少なくとも１つを含む、態様４４のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２２０】
４６．  態様４１のデザイナーＢＭＰタンパク質をコードする核酸。
４７．  態様４６の核酸を含む発現ベクターを細胞内に導入する工程を含む、デザイナーＢＭＰタンパク質を産生する方法。
【０２２１】
４８．  態様４１記載のデザイナーＢＭＰタンパク質と、患者を接触させる工程を含む、患者を治療する方法。
４９．  患者を治療する工程が、骨喪失に関連する骨疾患を治療する工程を含み、そして患者とデザイナーＢＭＰを接触させる工程が、骨疾患を治療するために有効な用量のデザイナーＢＭＰを患者に投与する工程を含む、態様４８の方法。
【０２２２】
５０．  患者を治療する工程が、線維症の治療を含み、そして患者とデザイナーＢＭＰを接触させる工程が、線維症を治療するために有効な用量のデザイナーＢＭＰを患者に投与する工程を含む、態様４８の方法。
【０２２３】
５１．  配列番号２に比較して、以下の突然変異：Ｖ３５Ｉ、Ｐ３８Ｒ、Ｑ４１Ａ、Ｈ４６Ｄ、Ｄ４８Ｅ、Ｐ５０Ｓ、Ａ５４Ｎ、Ｄ５５Ａ、Ｌ５７Ｍ、Ｓ５９Ａ、Ｎ７０Ｈ、Ｓ７１Ｌ、Ｖ７２Ｍ、Ｓ７４Ｐ、Ｓ７５Ｅ、Ｓ７５の後のＹ挿入、Ｉ７６Ｖ、Ａ７９Ｐ、Ｖ８２Ａ、Ｅ８５Ｋ、Ｓ８７Ｒ、Ａ８８Ｐ、Ｉ８９Ｍ、Ｌ９４Ｙ、Ｅ９６Ｄ、Ｙ９７Ｇ、Ｄ９８Ｑ、Ｋ９９Ｎ、Ｖ１００Ｉ、Ｖ１０１Ｉ、Ｌ１０２Ｋ、Ｎ１０４Ｄ、Ｙ１０５Ｉ、Ｅ１０７Ｎ、Ｖ１０９Ｉ、Ｇ１１２Ｅ、Ｒ１１６Ｓを含む、デザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２２４】
５２．  デザイナーＢＭＰタンパク質のＩ型、ＩＩＡ型、またはＩＩＢ型結合ドメイン内ではない、少なくとも１つの突然変異をさらに含む、態様５１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２２５】
５３．  配列番号１３のアミノ酸配列を含む、態様５１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
５４．  対応する野生型ＢＭＰの結合プロファイルとは異なる結合プロファイルを有する、態様５１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２２６】
５５．  デザイナーＢＭＰタンパク質の結合プロファイルが、以下：約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ２受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ３受容体への結合；約１ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ６受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＡ受容体への結合；約０．５ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＢ受容体への結合；および約３．５ｎＭより大きくないＫＤでのＢＭＰＲＩＩＡ受容体への結合の少なくとも１つを含む、態様５４のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２２７】
５６．  態様５１のデザイナーＢＭＰタンパク質をコードする核酸。
５７．  態様５６の核酸を含む発現ベクターを細胞内に導入する工程を含む、デザイナーＢＭＰタンパク質を産生する方法。
【０２２８】
５８．  態様５１記載のデザイナーＢＭＰタンパク質と、患者を接触させる工程を含む、患者を治療する方法。
５９．  患者を治療する工程が、骨喪失に関連する骨疾患を治療する工程を含み、そして患者とデザイナーＢＭＰを接触させる工程が、骨疾患を治療するために有効な用量のデザイナーＢＭＰを患者に投与する工程を含む、態様５８の方法。
【０２２９】
６０．  患者を治療する工程が、線維症の治療を含み、そして患者とデザイナーＢＭＰを接触させる工程が、線維症を治療するために有効な用量のデザイナーＢＭＰを患者に投与する工程を含む、態様５８の方法。
【０２３０】
６１．  配列番号２に比較して、以下の突然変異：Ｖ３５Ｉ、Ｐ３８Ｒ、Ｑ４１Ａ、Ｈ４６Ｄ、Ｄ４８Ｅ、Ｐ５０Ｓ、Ａ５４Ｎ、Ｄ５５Ａ、Ｌ５７Ｍ、Ｓ５９Ａ、Ｎ７０Ｈ、Ｓ７１Ｌ、Ｖ７２Ｍ、Ｓ７４Ｐ、Ｓ７５Ｅ、Ｓ７５の後のＹ挿入、Ｉ７６Ｖ、Ａ７９Ｐ、Ｖ８２Ａ、Ｅ８５Ｋ、Ｓ８７Ｒ、Ａ８８Ｐ、Ｉ８９Ｍ、Ｌ９４Ｙ、Ｅ９６Ｄ、Ｙ９７Ｇ、Ｄ９８Ｑ、Ｋ９９Ｎ、Ｖ１００Ｉ、Ｖ１０１Ｉ、Ｌ１０２Ｋ、Ｎ１０４Ｄ、Ｙ１０５Ｉ、Ｅ１０７Ｎ、Ｖ１０９Ｉ、Ｇ１１２Ｅ、Ｒ１１６Ｓを含む、デザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２３１】
６２．  デザイナーＢＭＰタンパク質のＩ型、ＩＩＡ型、またはＩＩＢ型結合ドメイン内ではない、少なくとも１つの突然変異をさらに含む、態様６１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２３２】
６３．  配列番号１４のアミノ酸配列を含む、態様６１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
６４．  対応する野生型ＢＭＰの結合プロファイルとは異なる結合プロファイルを有する、態様６１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２３３】
６５．  デザイナーＢＭＰタンパク質の結合プロファイルが、以下：約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ２受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ３受容体への結合；約１ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ６受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＡ受容体への結合；約０．５ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＢ受容体への結合；および約３．５ｎＭより大きくないＫＤでのＢＭＰＲＩＩＡ受容体への結合の少なくとも１つを含む、態様６４のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２３４】
６６．  態様６１のデザイナーＢＭＰタンパク質をコードする核酸。
６７．  態様６６の核酸を含む発現ベクターを細胞内に導入する工程を含む、デザイナーＢＭＰタンパク質を産生する方法。
【０２３５】
６８．  態様６１記載のデザイナーＢＭＰタンパク質と、患者を接触させる工程を含む、患者を治療する方法。
６９．  患者を治療する工程が、骨喪失に関連する骨疾患を治療する工程を含み、そして患者とデザイナーＢＭＰを接触させる工程が、骨疾患を治療するために有効な用量のデザイナーＢＭＰを患者に投与する工程を含む、態様６８の方法。
【０２３６】
７０．  患者を治療する工程が、線維症の治療を含み、そして患者とデザイナーＢＭＰを接触させる工程が、線維症を治療するために有効な用量のデザイナーＢＭＰを患者に投与する工程を含む、態様６８の方法。
【０２３７】
７１．  配列番号２に比較して、以下の突然変異：Ｖ３５Ｉ、Ｐ３８Ｒ、Ｑ４１Ａ、Ｈ４６Ｄ、Ｄ４８Ｅ、Ｐ５０Ｓ、Ａ５４Ｎ、Ｄ５５Ａ、Ｌ５７Ｍ、Ｓ５９Ａ、Ｎ７０Ｈ、Ｓ７１Ｌ、Ｖ７２Ｍ、Ｓ７４Ｐ、Ｓ７５Ｅ、Ｓ７５の後のＹ挿入、Ｉ７６Ｖ、Ａ７９Ｐ、Ｖ８２Ａ、Ｅ８５Ｋ、Ｓ８７Ｒ、Ａ８８Ｐ、Ｉ８９Ｍ、Ｌ９４Ｙ、Ｅ９６Ｄ、Ｙ９７Ｇ、Ｄ９８Ｑ、Ｋ９９Ｎ、Ｖ１００Ｉ、Ｖ１０１Ｉ、Ｌ１０２Ｋ、Ｎ１０４Ｄ、Ｙ１０５Ｉ、Ｅ１０７Ｎ、Ｖ１０９Ｉ、Ｇ１１２Ｅ、Ｒ１１６Ｓを含む、デザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２３８】
７２．  デザイナーＢＭＰタンパク質のＩ型、ＩＩＡ型、またはＩＩＢ型結合ドメイン内ではない、少なくとも１つの突然変異をさらに含む、態様５１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２３９】
７３．  配列番号１３のアミノ酸配列を含む、態様５１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
７４．  対応する野生型ＢＭＰの結合プロファイルとは異なる結合プロファイルを有する、態様５１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２４０】
７５．  デザイナーＢＭＰタンパク質の結合プロファイルが、以下：約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ２受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ３受容体への結合；約１ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ６受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＡ受容体への結合；約０．５ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＢ受容体への結合；および約３．５ｎＭより大きくないＫＤでのＢＭＰＲＩＩＡ受容体への結合の少なくとも１つを含む、態様５４のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２４１】
７６．  態様５１のデザイナーＢＭＰタンパク質をコードする核酸。
７７．  態様５６の核酸を含む発現ベクターを細胞内に導入する工程を含む、デザイナーＢＭＰタンパク質を産生する方法。
【０２４２】
７８．  態様５１記載のデザイナーＢＭＰタンパク質と、患者を接触させる工程を含む、患者を治療する方法。
７９．  患者を治療する工程が、骨喪失に関連する骨疾患を治療する工程を含み、そして患者とデザイナーＢＭＰを接触させる工程が、骨疾患を治療するために有効な用量のデザイナーＢＭＰを患者に投与する工程を含む、態様５８の方法。
【０２４３】
８０．  患者を治療する工程が、線維症の治療を含み、そして患者とデザイナーＢＭＰを接触させる工程が、線維症を治療するために有効な用量のデザイナーＢＭＰを患者に投与する工程を含む、態様５８の方法。
【０２４４】
８１．  配列番号２に比較して、以下の突然変異：Ｖ３５Ｉ、Ｐ３８Ｅ、Ｑ４１Ａ、Ｈ４６Ｅ、Ｄ４８Ｅ、Ｐ５０Ａ、Ａ５４Ｎ、Ｄ５５Ｓ、Ｈ５６Ｙ、Ｌ５７Ｍ、Ｓ５９Ａ、Ｎ７０Ｈ、Ｓ７１Ｆ、Ｖ７２Ｉ、Ｎ７３の後のＰ挿入、Ｓ７４Ｅ、Ｓ７５Ｔ、Ｉ７６Ｖ、Ａ７９Ｐ、Ｖ８２Ａ、Ｅ８５Ｋ、Ｓ８７Ｒ、Ａ８８Ｐ、Ｉ８９Ｍ、Ｌ９４Ｙ、Ｅ９６Ｄ、Ｙ９７Ｇ、Ｄ９８Ｑ、Ｋ９９Ｎ、Ｖ１００Ｉ、Ｖ１０１Ｉ、Ｌ１０２Ｋ、Ｎ１０４Ｄ、Ｙ１０５Ｉ、Ｅ１０７Ｎ、Ｖ１０９Ｉ、Ｇ１１２Ｅ、Ｒ１１６Ｓを含む、デザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２４５】
８２．  デザイナーＢＭＰタンパク質のＩ型、ＩＩＡ型、またはＩＩＢ型結合ドメイン内ではない、少なくとも１つの突然変異をさらに含む、態様８１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２４６】
８３．  配列番号１５のアミノ酸配列を含む、態様８１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
８４．  対応する野生型ＢＭＰの結合プロファイルとは異なる結合プロファイルを有する、態様８１のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２４７】
８５．  デザイナーＢＭＰタンパク質の結合プロファイルが、以下：約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ２受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ３受容体への結合；約１ｎＭより大きくないＫＤでのＡＬＫ６受容体への結合；約２ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＡ受容体への結合；約０．５ｎＭより大きくないＫＤでのＡｃｔＲＩＩＢ受容体への結合；および約３．５ｎＭより大きくないＫＤでのＢＭＰＲＩＩＡ受容体への結合の少なくとも１つを含む、態様８４のデザイナーＢＭＰタンパク質。
【０２４８】
８６．  態様８１のデザイナーＢＭＰタンパク質をコードする核酸。
８７．  態様８６の核酸を含む発現ベクターを細胞内に導入する工程を含む、デザイナーＢＭＰタンパク質を産生する方法。
【０２４９】
８８．  態様８１記載のデザイナーＢＭＰタンパク質と、患者を接触させる工程を含む、患者を治療する方法。
８９．  患者を治療する工程が、骨喪失に関連する骨疾患を治療する工程を含み、そして患者とデザイナーＢＭＰを接触させる工程が、骨疾患を治療するために有効な用量のデザイナーＢＭＰを患者に投与する工程を含む、態様８８の方法。
【０２５０】
９０．  患者を治療する工程が、線維症の治療を含み、そして患者とデザイナーＢＭＰを接触させる工程が、線維症を治療するために有効な用量のデザイナーＢＭＰを患者に投与する工程を含む、態様８８の方法。
【０２５１】
結論
本明細書に引用する各々およびすべての特許、特許出願、および刊行物の開示は、その全体が本明細書に援用される。
【０２５２】
本発明は、特定の態様に言及しながら開示されているが、本発明の他の態様および変動が、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、当業者によって考案されうることが明らかである。付随する請求項は、こうした態様および同等の変動のすべてを含むよう構築されていることが意図される。
【図１】
2018506992.tif 000010
【図２】
2018506992.tif 000011
【図３】
2018506992.tif 000012
【図４】
2018506992.tif 000013
【図５】
2018506992.tif 000014
【国際調査報告】
2018506992.tif 000015
2018506992.tif 000016
2018506992.tif 000017
2018506992.tif 000018
2018506992.tif 000019