(57)【要約】  本発明は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のための医薬組成物又は動物用組成物に関する。前記組成物は、適切な医薬担体中、エチレフリン及びジルチアゼムから選択される少なくとも1種の化合物を含有することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
適当な医薬担体中に、エチレフリン及びジルチアゼムから選択される少なくとも1種の化合物を含むことを特徴とする、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のための医薬組成物又は動物用組成物。
【請求項２】
前記インフルエンザウイルスが、H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7及びH7N9亜型等のA型ウイルスから選択されることを特徴とする、請求項1に記載の使用のための医薬組成物又は動物用組成物。
【請求項３】
吸入投与を意図した剤形であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の使用のための医薬組成物又は動物用組成物。
【請求項４】
ジルチアゼムとエチレフリンの組合せを含むことを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物又は動物用組成物。
【請求項５】
別の抗ウイルス剤を更に含むことを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物又は動物用組成物。
【請求項６】
前記抗ウイルス剤が、インフルエンザウイルスに対する阻害活性を有することを特徴とする、請求項5に記載の使用のための医薬組成物又は動物用組成物。
【請求項７】
前記抗ウイルス剤が、オセルタミビル、ザナミビル、ペラミビル、アマンタジン、リマンタジン、リバビリン及びアルビドールから選択されることを特徴とする、請求項6に記載の使用のための医薬組成物又は動物用組成物。
【請求項８】
前記抗ウイルス剤がモネンシンであることを特徴とする、請求項5に記載の使用のための医薬組成物又は動物用組成物。
【請求項９】
少なくとも1種の抗菌剤を更に含むことを特徴とする、請求項1から8のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物又は動物用組成物。
【請求項１０】
インフルエンザウイルスによる感染症を予防及び/又は治療するための、同時、個別又は逐次的使用のための、エチレフリン及びジルチアゼムから選択される少なくとも1種の化合物並びに少なくとも1種の抗ウイルス剤及び/又は少なくとも1種の抗菌剤を含む組合せ製品。
【請求項１１】
適当な医薬担体中に、エチレフリン及びジルチアゼムから選択される少なくとも1種の化合物又は両方の組合せと組み合わせて、少なくとも1種の抗ウイルス剤を含む医薬組成物又は動物用組成物。
【請求項１２】
前記抗ウイルス剤が、インフルエンザウイルスに対する阻害活性を有する、請求項11に記載の医薬組成物又は動物用組成物。
【請求項１３】
前記抗ウイルス剤がオセルタミビルである、請求項12に記載の医薬組成物又は動物用組成物。
【請求項１４】
前記抗ウイルス剤がモネンシンである、請求項11に記載の医薬組成物又は動物用組成物。
【請求項１５】
吸入投与を意図した剤形であることを特徴とする、請求項11から14のいずれか一項に記載の医薬組成物又は動物用組成物。
【請求項１６】
適当な医薬担体中に、ジルチアゼムとエチレフリンの組合せを含む医薬組成物又は動物用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト及び動物におけるインフルエンザウイルスに関連したウイルス感染の治療における使用のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザの原因となるウイルスは、インフルエンザウイルスであり、これは3つの型:A、B、及びC型に分類される。該ウイルスの表面にあるのは、感染した生体の細胞への感染において重要な役割を果たす2種の糖タンパク質:赤血球凝集素(HA)及びノイラミニダーゼ(NA)である。A型インフルエンザウイルスには、その表面にある糖タンパク質HA及びNAの性質によって様々な亜型が存在する:16種類のHA及び9種類のNAが、動物界、特に移住性の海鳥の間で蔓延しているウイルスに確認されている。したがって、インフルエンザウイルスは、その表面上のタンパク質の種類によって定義されうる。
【０００３】
ヒトの間で数十年間蔓延しているウイルスは、H1N1、H2N2、及びH3N2亜型であり、鳥ウイルスであるH5N1、H7N7、H7N9、H5N2、及びH9N2の偶発的な種間伝播、特に動物からヒトへの伝播を伴う。ブタ、鳥、及びヒト由来の新型パンデミックH1N1インフルエンザウイルス(ブタ、鳥、及びヒトの再集合体ウイルス)の最近の出現によって実証された通り、A型インフルエンザウイルスは、公衆衛生にとって深刻な脅威である。ヒト集団におけるインフルエンザのパンデミックは、特に、新型の表面糖タンパク質(HA及びNA)を持つウイルスの出現に相当する抗原シフトの結果生じる。こうしたシフトは、動物ウイルス、特に鳥ウイルスのヒトへの直接感染を可能にする。この鳥ウイルスの事例は、2003年からアジアで発生した高病原性鳥H5N1のエピデミック、又は2003年にオランダで発生したH7N7インフルエンザ及び2013年に東南アジアで発生したH7N9のエピデミックである。抗原シフトは、例えば、ブタが宿主の中間的な役割を果たす、鳥、ブタ、及びヒトのウイルス間における遺伝子再編成の結果生じる。この遺伝子再編成は、特に2009年のH1N1パンデミックの原因であった。更に、特に遺伝的浮動(表面糖タンパク質における変異の発生)の結果生じる季節性インフルエンザのエピデミックは、特にヒト集団、とりわけ乳幼児(very young)、高齢者、免疫抑制者、及び心肺疾患のある者において、罹患率及び死亡率を上昇させる主な原因である。
【０００４】
予防接種は、なおもインフルエンザ予防の要である。しかし、新型ウイルスが出現した際、新型ワクチンを開発し提供するためには、6〜9カ月間を必要とし、治療及び/又は予防のため、抗ウイルス薬の使用を考慮する必要がある。一般的な抗ウイルス剤は、アマンタジン等のM2チャネル阻害剤、並びにザナミビル及びオセルタミビル等のノイラミニダーゼ阻害剤である。
【０００５】
これらの薬物の使用は、特にパンデミックH1N1ウイルスでみられる、繰り返される耐性の出現によって制限される。更に、新たに出現するウイルスが、すでにこれらの分子に耐性を持つ可能性は否定できない。最終的に、これらの分子の大半は、全身投与が不可能であり、このことは重篤な感染症の事象では問題となる。
【０００６】
したがって、より有効で広い作用スペクトルを有する新型抗ウイルス性化合物を開発又は同定することは、不可欠であると思われる。広いスペクトルを有する新型の治療用分子を開発するための解決法は、細胞経路に作用する分子、及びウイルスがその複製サイクルを実行するために標的とする因子を同定することである。Josset他(PLoS One、2010)の論文で提示されたこの戦略は、特許出願FR2953410に提示されている分子のような、予想外の抗ウイルス活性を有する最初の一連の分子の同定を可能にした。
【０００７】
本発明の文脈では、いくつかの分子が選択され、ウイルス感染の細胞試験及びin vivoマウスモデルにおいて評価された。特定の分子は、H1N1亜型のA型インフルエンザ株だけでなく、H3N2亜型の株に対しても抗ウイルス効果を有していた。該選択された化合物は、初め、ウイルス感染とは全く異なる病状の治療における有効成分とされていた。予想外に、今や、これらの化合物の特定のものは、特にA型インフルエンザウイルスの様々な亜型に対する抗ウイルス活性を有することが示された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許出願FR2953410
【特許文献２】EP0728751
【特許文献３】EP0561861
【特許文献４】EP0450705
【特許文献５】EP0355395
【特許文献６】特許出願WO87/07508
【特許文献７】特許出願WO2011/126071
【特許文献８】CN102657621
【特許文献９】WO02/094238
【特許文献１０】US4,605,552
【特許文献１１】特許出願EP0162320
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Josset他PLoS One、2010
【非特許文献２】Terrier他Virol J、2011
【非特許文献３】Terrier他J Gen Virol、2013
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、エチレフリン及びジルチアゼムから選択される少なくとも1種の化合物を含む、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のための医薬組成物又は動物用組成物（veterinary compositions）に関する。
【００１１】
これらの医薬組成物又は動物用組成物は、有利には、少なくとも1種の他の抗ウイルス剤及び/又は抗菌剤を更に含んでもよい。これらの組成物は、ヒト又は動物の治療、特にインフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における同時、個別、又は逐次的使用のための組合せ製品の形態であってよい。
【００１２】
更に、本発明は、少なくとも1種の抗ウイルス剤を、ジルチアゼム及びエチレフリンから選択される少なくとも1種の化合物又は両方の組合せとの組合せで含む医薬組成物又は動物用組成物に関する。
【００１３】
本発明の好ましい態様によると、これらの医薬組成物又は動物用組成物は、吸入投与を意図した特定の剤形である。
【００１４】
更に、本発明は、適当な医薬担体中、ジルチアゼムとエチレフリンの組合せを含む医薬組成物又は動物用組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】実験プロトコルを示す図である。
【図１Ｂ】H1N1 pdm09ウイルスに感染したA549細胞における、抗ウイルス活性が公知の化合物(リバビリン、モネンシン)の抗ウイルス効果に関するin vitro評価を示す図である。実線は、該化合物濃度(μM)の関数として正規化したウイルス産生率(百分率)を示す。点線は、該化合物濃度(μM)の関数として正規化した細胞生存率(百分率)を示す。
【図１Ｃ】H1N1 pdm09ウイルスに感染したA549細胞における、化合物であるラナトシドCの抗ウイルス効果に関するin vitro評価を示す図である。実線は、該化合物濃度(μM)の関数として正規化したウイルス産生率(百分率)を示す。点線は、該化合物濃度(μM)の関数として正規化した細胞生存率(百分率)を示す。
【図１Ｄ】H1N1 pdm09ウイルスに感染したA549細胞における、化合物であるジルチアゼム及びエチレフリンの抗ウイルス効果に関するin vitro評価を示す図である。実線は、該化合物濃度(μM)の関数として正規化したウイルス産生率(百分率)を示す。点線は、該化合物濃度(μM)の関数として正規化した細胞生存率(百分率)を示す。
【図２】H3N2ウイルスに感染したA549細胞における、エチレフリンの抗ウイルス効果に関するin vitro評価を示す図である。実線(丸点)は、エチレフリン濃度(μM)の関数として正規化したウイルス産生率(百分率)を示す。点線(四角点)は、エチレフリン濃度(μM)の関数として正規化した細胞生存率(百分率)を示す。
【図３】H1N1 pdm09ウイルスに感染したA549細胞において、エチレフリン(A)又はジルチアゼム(B)とオセルタミビルとを組み合わせた場合の抗ウイルス効果に関するin vitro評価を示す図である。該グラフは、各条件において正規化したウイルス産生率(百分率)を示す。
【図４】次の分子の毒性に関するin vivo評価を示す図である:オセルタミビル、モネンシン、ジルチアゼム、エチレフリン、及びイソキシカム。「生理食塩水」対照は、PBSで処置したマウスの体重を示す。曲線は、様々なマウス群における経時的な体重変化を示す(体重増加/減少を百分率で表示)。
【図５Ａ】H1N1感染前のマウスに、化合物であるオセルタミビル、モネンシン、ジルチアゼム、エチレフリン、及びイソキシカムを投与した場合の抗ウイルス効果に関するin vivo評価:実験プロトコルを示す図である。
【図５Ｂ】H1N1感染前のマウスに、化合物であるオセルタミビル、モネンシン、ジルチアゼム、エチレフリン、及びイソキシカムを投与した場合の抗ウイルス効果に関するin vivo評価:感染後14日目までの経時的な生存率を示す図である。
【図５Ｃ】H1N1感染前のマウスに、化合物であるオセルタミビル、モネンシン、ジルチアゼム、エチレフリン、及びイソキシカムを投与した場合の抗ウイルス効果に関するin vivo評価:経時的に観察された体重減少を示す図である。
【図５Ｄ】H1N1感染前のマウスに、化合物であるオセルタミビル、モネンシン、ジルチアゼム、エチレフリン、及びイソキシカムを投与した場合の抗ウイルス効果に関するin vivo評価:感染後5日目の感染したマウスの肺で測定したウイルス力価を示す図である。
【図６Ａ】H1N1感染24時間後のマウスに、化合物であるオセルタミビル及びジルチアゼムを投与した場合の抗ウイルス効果に関するin vivo評価。実験プロトコルを示す図である。
【図６Ｂ】H1N1感染24時間後のマウスに、化合物であるオセルタミビル及びジルチアゼムを投与した場合の抗ウイルス効果に関するin vivo評価を示す図である。H1N1感染24時間後のマウスへの、PBSのみ「生理食塩水」でin vivo処置後の経時的な生存率。
【図６Ｃ】H1N1感染24時間後のマウスに、化合物であるオセルタミビル及びジルチアゼムを投与した場合の抗ウイルス効果に関するin vivo評価を示す図である。H1N1感染24時間後のマウスへの、オセルタミビルでin vivo処置後の経時的な生存率。
【図６Ｄ】H1N1感染24時間後のマウスに、化合物であるオセルタミビル及びジルチアゼムを投与した場合の抗ウイルス効果に関するin vivo評価を示す図である。H1N1感染24時間後のマウスへの、ジルチアゼムでin vivo処置後の経時的な生存率。
【図７Ａ】H1N1 pdm09ウイルスに感染したA549細胞において、ジルチアゼムと他の抗ウイルス剤とを組み合わせた場合の抗ウイルス効果に関するin vitro評価を示す図である。感染後の細胞処理プロトコル。
【図７Ｂ】H1N1 pdm09ウイルスに感染したA549細胞において、ジルチアゼムと他の抗ウイルス剤を組み合わせた場合の抗ウイルス効果に関するin vitro評価。ジルチアゼムとオセルタミビルの組合せに対して得られた結果を示す図である。
【図７Ｃ】H1N1 pdm09ウイルスに感染したA549細胞において、ジルチアゼムと他の抗ウイルス剤を組み合わせた場合の抗ウイルス効果に関するin vitro評価。ジルチアゼムとモネンシンの組合せに対して得られた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、適当な医薬担体中、エチレフリン、ジルチアゼム、及びそれらの誘導体から選択される少なくとも1種の化合物を含むことを特徴とする、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のための医薬組成物又は動物用組成物に関する。
【００１７】
これらの化合物は、ヒト又は動物において、インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性に無関係の他の治療応用に用いられることが公知である。これらの化合物が、予想外に、A型インフルエンザウイルスの様々な亜型に対する抗ウイルス活性を有することは、今や実証されている。
【００１８】
ジルチアゼムは、一般的に、狭心症、高血圧、心筋虚血、及び頻脈の治療のために用いられる。ジルチアゼムは強力な血管拡張剤である。
【００１９】
いくつかの特許出願に、ジルチアゼム(EP0728751、EP0561861)及びジルチアゼム誘導体(EP0450705、EP0355395)を製造する方法が記載されている。
【００２０】
この分子は、ベンゾチアゼピンファミリーのメンバーであり、次の化学構造式:
【００２１】
【化１】
2018508587.tif 000002
【００２２】
を有する。
【００２３】
ジルチアゼムは、心筋の筋線維及び血管の平滑筋線維への膜貫通カルシウムの侵入を遅延させることによって作用し、これによって収縮性タンパク質に達する細胞内カルシウム濃度を低下させる。したがって、ジルチアゼムは、心臓の仕事量を減少させ、心拍数を抑える。
【００２４】
特許出願WO87/07508には、細胞へのカルシウム流入を阻害する、ジルチアゼム等の治療用化合物と、サイトメガロウイルスに関連するウイルス感染及びヘルペスに関連するウイルス感染を治療するための他の抗ウイルス剤とを組み合わせて使用することが記載されている。
【００２５】
特許出願WO2011/126071には、細胞へのカルシウム流入を阻害する、ジルチアゼム等の治療用化合物を、ウイルス感染、特にインフルエンザウイルスに関連したものを治療するために使用することが記載されている。より具体的には、該出願によって、ジルチアゼムが、ウイルスとカルシウムチャネルの間の相互作用を阻害し、これによって細胞へのウイルスの侵入を阻止しうることが示されている。
【００２６】
これに反して、本発明では、ジルチアゼムが、標的細胞における遺伝子発現を強く調節し、これによってウイルス感染に不利である全般的な細胞状態を引き起こすことで、包括的に標的細胞に作用することが示されている。実際に、また実施例の序論で更に詳細に提示される通り、選択した分子は、感染状態に特徴的なものとは正反対の細胞の遺伝子発現プロファイルに関連している。更に、WO2011/126071では、本出願に提案されている濃度の100倍を超えるジルチアゼム濃度が提案されている。
【００２７】
従来、ヒトに用いられるジルチアゼムの量は、ジルチアゼムが錠剤の形態である場合、典型的な投与計画において、好ましくは200〜300mg/日の間である。
【００２８】
ジルチアゼムは、注射液用散剤(CN102657621)又は吸入用製剤(WO02/094238、US4,605,552)等、様々な剤形で利用可能である。
【００２９】
本発明の文脈では、「ジルチアゼム」という用語は、その全ての形態、特に塩の形態のジルチアゼムを意味し、「ジルチアゼム誘導体」という用語は、上記の式(1)由来の全ての分子を意味し、これらは同じ生物学的活性、特に同じ抗ウイルス活性を有する。前記抗ウイルス活性は、標的細胞の一定数の遺伝子の発現に作用することで、ウイルス感染に不利である全般的な細胞状態を引き起こすことによって得られる。
【００３０】
エチレフリンは、強心薬と記載されており、一般的に、抗降圧剤として、特に内分泌系又は代謝由来の神経性及び心血管性起立性低血圧の治療に用いられる。その使用は、特に特許出願EP0162320に記載されている。
【００３１】
エチレフリンは、α-1及びβ-アドレナリン受容体における直接的な交感神経刺激作用を介し、その陽性変力作用によって、心拍出量、心拍血液量、及び静脈還流を増加し、中心静脈圧及び動脈圧を上昇させる。更に、これは静脈緊張を上昇させ、循環血液量の増加に繋がる。
【００３２】
これは、3-ヒドロキシ-フェニルエタノールアミン系の交感神経刺激アミンであり、化学構造式:
【００３３】
【化２】
2018508587.tif 000003
【００３４】
を有する。
【００３５】
従来、ヒトに用いられる量は、好ましくは約30mg/日であり、通常、3用量で投与する。
【００３６】
エチレフリンは、注射液用溶液、経口液用溶液、及び錠剤の形態等、様々な剤形で利用可能である。
【００３７】
更に、他のβ-アドレナリン受容体アゴニストの吸入による投与様式が記載されている。
【００３８】
本発明の文脈では、「エチレフリン」という用語は、その全ての形態、特に塩の形態のエチレフリンを意味し、「エチレフリン誘導体」という用語は、上記の式(2)由来の全ての分子を意味し、これらは同じ生物学的活性、特に同じ抗ウイルス活性を有する。前記抗ウイルス活性は、標的細胞の一定数の遺伝子の発現に作用することで、ウイルス感染に不利である全般的な細胞状態を引き起こすことによって得られる。
【００３９】
本発明によると、インフルエンザウイルスは、ヒト又は動物を宿主とするA型ウイルスである。「インフルエンザウイルス(flu virus)」及び「インフルエンザウイルス(influenza virus)」という用語は、本出願中、互換的に用いられ、同じウイルスを意味する。
【００４０】
「インフルエンザウイルスによる感染症」という表現は、少なくとも1種の公知のインフルエンザウイルスの存在によって生じる感染症であり、る。前記ウイルスは、該組成物を投与する個体若しくは動物に感染している、又は個体若しくは動物に感染可能であると理解されるべきである。
【００４１】
本発明によると、「適当な医薬担体」という用語は、本発明による薬学的に許容される担体又は添加物、すなわち、個体又は動物への投与に著しい有害効果が伴わない、当業者に周知の担体又は添加物を意味する。
【００４２】
特に、本発明の組成物は、A型インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療に使用される。好都合にも、本発明の組成物は、A型インフルエンザウイルスの様々な亜型に対する広い作用スペクトルを有する。
【００４３】
一実施形態において、本発明の組成物は、主にヒト及び動物に蔓延しているA型ウイルスによる感染症の予防及び治療に使用される。
【００４４】
その表面上にある糖タンパク質HA及びNAの性質によってA型インフルエンザウイルスには様々な亜型が存在する。特定の態様によると、該インフルエンザウイルスは、H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H7N9、H5N2、及びH9N2亜型から選択されるA型ウイルスである。
【００４５】
したがって、本発明は、ヒトにおけるインフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療、すなわち、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のための医薬組成物に関する。
【００４６】
更に、本発明は、動物、特にブタ、ウマ、及び家禽等の家畜におけるインフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療に関する。より具体的には、本発明は、家禽、より具体的には、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、及び七面鳥におけるインフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療に関する。更に、本発明は、他の動物、例えば、ウマ、ネコ、イヌ、及びネコ科の動物等におけるインフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療に関する。本態様によると、これによって、本発明は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のための動物用組成物に関する。
【００４７】
本発明による組成物は、特にインフルエンザウイルスによる感染症の予防に使用するよう意図されている。
【００４８】
「予防」という用語は、ヒト又は動物の生体において少なくとも1種のインフルエンザウイルスによる感染症が発症する可能性を抑制する、又は少なくとも低下させることを指す。本発明による少なくとも1種の組成物を投与することによって、前記生体のヒト又は動物の細胞は、前記ウイルスによる感染に対してより耐性になり、前記ウイルスによる感染の可能性が低下する。
【００４９】
更に、本発明による組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の治療に使用するよう意図されていてもよい。
【００５０】
「治療」という用語は、ヒト又は動物の生体において少なくとも1種のインフルエンザによる感染に抵抗することを指す。本発明による少なくとも1種の組成物を投与することによって、生体におけるウイルス感染レベルは漸減し、その後完全に消失する。更に、「治療」という用語は、ウイルス感染に伴う症状(発熱、倦怠等)を軽減することを指す。
【００５１】
本発明の第1の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、有効量のジルチアゼム又はその誘導体を含む。
【００５２】
本発明の第2の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、有効量のエチレフリン又はその誘導体を含む。
【００５３】
本発明の第3の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、1種又は複数のインフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、ジルチアゼムとエチレフリン又はそれらの誘導体の組合せを含む。
【００５４】
この組合せは、各化合物を同量(質量比50/50の組成物)又は90%ジルチアゼム及び10%エチレフリン、80%ジルチアゼム及び20%エチレフリン、70%ジルチアゼム及び30%エチレフリン、60%ジルチアゼム及び40%エチレフリン、40%ジルチアゼム及び60%エチレフリン、30%ジルチアゼム及び70%エチレフリン、20%ジルチアゼム及び80%エチレフリン、若しくは更には10%ジルチアゼム及び90%エチレフリン等、各化合物を不等量のいずれかで含む。
【００５５】
本発明の特定の態様によると、上記の使用のための該医薬組成物又は動物用組成物は、別の抗ウイルス剤を更に含むことを特徴とする。
【００５６】
実際に、ジルチアゼム及びエチレフリン又はその混合物を、それのみで又は他の少なくとも1種の活性薬剤と組み合わせて治療に用いることができる。これらは、該化合物又はインフルエンザウイルスによる感染症の治療に抗ウイルス剤として用いられることが公知である他の活性薬剤の活性を増強するための化合物であってよい。
【００５７】
特に、該抗ウイルス剤は、インフルエンザウイルスに対する直接的な阻害活性を有する、すなわち、感染した生体における少なくとも1種のインフルエンザウイルスの複製を阻害又は侵入若しくは増殖を予防する。
【００５８】
このような活性薬剤は、当業者に周知であり、市販されているか、Vidal社から出版されている薬物データベース(Le Dictionnaire Vidal)のような参考資料に記載されている。
【００５９】
本発明の第1の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、ジルチアゼム及び1種の抗ウイルス剤を含む。
【００６０】
本発明の第2の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、エチレフリン及び1種の抗ウイルス剤を含む。
【００６１】
本発明の第3の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、ジルチアゼムとエチレフリンの組合せ及び1種の抗ウイルス剤を含む。
【００６２】
特に、この抗ウイルス剤は、該ウイルスに対する直接的な阻害作用を有する、オセルタミビル(タミフルとも呼ぶ)、ザナミビル、ペラミビル、アマンタジン、リマンタジン、リバビリン、及びアルビドール等の抗ウイルス剤から選択される。
【００６３】
この抗ウイルス剤は、細胞に対して活性のある、ウイルス感染に不利である全般的な細胞状態を引き起こす、モネンシン、ミドドリン、デスグリミドドリン、リルメニジン、ハルモール、ハルモール二量体、及びブリンゾラミド等の薬剤から選択されてもよい。
【００６４】
本発明の好ましい態様によると、この抗ウイルス剤は、細胞外培地においてカルシウムキレート作用を有する分子であるモネンシンである。
【００６５】
この抗ウイルス剤は、
-  ウイルスポリメラーゼ阻害剤(例えば、T705);
-  核タンパク質阻害剤(nucleoprotein inhibitors);
-  赤血球凝集素阻害剤;
-  ノイラミニダーゼ阻害剤;
-  NS1、M1、M2、Pb1-F2、NEPタンパク質阻害剤
から選択されてもよい。
【００６６】
この抗ウイルス剤は、
-  組換えシアリダーゼ(例えば、DAS181);
-  NFKB阻害剤;
-  HSP90阻害剤;及び
-  細胞プロテインキナーゼMek、Erk、又はPKCの阻害剤
から選択されてもよい。
【００６７】
この抗ウイルス剤は、抗ウイルス作用を有するために必要な量で使用されると理解される。この量は「有効」と定められた量であり、この割合は当業者によって容易に決定される。
【００６８】
本発明の別の好ましい態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、ジルチアゼムをオセルタミビルとの組合せで含む。
【００６９】
特定の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、ジルチアゼムをザナミビルとの組合せで含む。
【００７０】
特定の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、ジルチアゼムをペラミビルとの組合せで含む。
【００７１】
特定の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、ジルチアゼムをアマンタジンとの組合せで含む。
【００７２】
特定の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、ジルチアゼムをリマンタジンとの組合せで含む。
【００７３】
特定の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、ジルチアゼムをリバビリンとの組合せで含む。
【００７４】
特定の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、ジルチアゼムをアルビドールとの組合せで含む。
【００７５】
本発明の別の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、ジルチアゼム及びモネンシンを含む。
【００７６】
本発明の別の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、ジルチアゼム、モネンシン、及びオセルタミビルを含む。
【００７７】
本発明の別の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、ジルチアゼム、モネンシン、及びザナミビルを含む。
【００７８】
本発明の別の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、ジルチアゼム、モネンシン、及びペラミビルを含む。
【００７９】
本発明の別の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、ジルチアゼム、モネンシン、及びアマンタジンを含む。
【００８０】
本発明の別の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、ジルチアゼム、モネンシン、及びリマンタジンを含む。
【００８１】
本発明の別の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、ジルチアゼム、モネンシン、及びリバビリンを含む。
【００８２】
本発明の別の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、ジルチアゼム、モネンシン、及びアルビドールを含む。
【００８３】
本発明の第2の好ましい態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、エチレフリンをオセルタミビルとの組合せで含む。
【００８４】
特定の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、エチレフリンをザナミビルとの組合せで含む。
【００８５】
特定の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、エチレフリンをペラミビルとの組合せで含む。
【００８６】
特定の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、エチレフリンをアマンタジンとの組合せで含む。
【００８７】
特定の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、エチレフリンをリマンタジンとの組合せで含む。
【００８８】
特定の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、エチレフリンをリバビリンとの組合せで含む。
【００８９】
特定の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、エチレフリンをアルビドールとの組合せで含む。
【００９０】
本発明の別の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、エチレフリン及びモネンシンを含む。
【００９１】
本発明の第3の好ましい態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、ジルチアゼムとエチレフリンの組合せを、オセルタミビルとの組合せで含む。
【００９２】
本発明に従って使用するための医薬組成物又は動物用組成物は、少なくとも1種の抗菌剤を含んでもよい。このような薬剤は、特に、インフルエンザウイルスによる感染症の合併症で古典的にみられる細菌重複感染の予防を目的とする抗生剤である。
【００９３】
本発明の第1の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、ジルチアゼムを少なくとも1種の抗菌剤との組合せで含む。
【００９４】
本発明の第2の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、エチレフリンを少なくとも1種の抗菌剤との組合せで含む。
【００９５】
本発明の第3の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、ジルチアゼムとエチレフリンの組合せを、少なくとも1種の抗菌剤との組合せで含む。
【００９６】
本発明の第4の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、ジルチアゼムとエチレフリンの組合せを、1種の抗ウイルス剤、特にオセルタミビル及び少なくとも1種の抗菌剤との組合せで含む。
【００９７】
本発明の第5の態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のため、ジルチアゼムとモネンシンの組合せを、上記の組合せのうちの1つ等の抗ウイルス剤及び少なくとも1種の抗菌剤との組合せで含む。
【００９８】
組合せ製品
本発明は、ヒト又は動物におけるインフルエンザウイルスによる感染症を予防及び/又は治療するための同時、個別、又は逐次的使用のための、エチレフリン及びジルチアゼムから選択される少なくとも1種の化合物並びに少なくとも1種の抗ウイルス剤及び/又は抗菌剤を含む組合せ製品にも関する。
【００９９】
一実施形態によると、前記組合せ製品は、ジルチアゼム及びオセルタミビル又はモネンシン等、少なくとも1種の抗ウイルス剤を含む。
【０１００】
別の実施形態によると、前記組合せ製品は、エチレフリン及びオセルタミビル又はモネンシン等の少なくとも1種の抗ウイルス剤を含む。
【０１０１】
別の実施形態によると、前記組合せ製品は、ジルチアゼムとエチレフリンの組合せ及びオセルタミビル又はモネンシン等の少なくとも1種の抗ウイルス剤を含む。
【０１０２】
別の実施形態によると、前記組合せ製品は、ジルチアゼム及び少なくとも1種の抗菌剤を含む。
【０１０３】
別の実施形態によると、前記組合せ製品は、エチレフリン及び少なくとも1種の抗菌剤を含む。
【０１０４】
別の実施形態によると、前記組合せ製品は、ジルチアゼムとエチレフリンの組合せ及び少なくとも1種の抗菌剤を含む。
【０１０５】
別の実施形態によると、前記組合せ製品は、ジルチアゼム、少なくとも1種の抗ウイルス剤、及び少なくとも1種の抗菌剤を含む。
【０１０６】
別の実施形態によると、前記組合せ製品は、エチレフリン、少なくとも1種の抗ウイルス剤、及び少なくとも1種の抗菌剤を含む。
【０１０７】
別の実施形態によると、前記組合せ製品は、ジルチアゼムとエチレフリンの組合せ、少なくとも1種の抗ウイルス剤、及び少なくとも1種の抗菌剤を含む。
【０１０８】
特にインフルエンザウイルスに対して阻害作用を有する抗ウイルス剤は、当業者に周知であり、特に次の薬剤:
-  オセルタミビル、ザナミビル、ペラミビル、アマンタジン、リマンタジン、リバビリン、及びアルビドール;
-  ミドドリン、デスグリミドドリン、リルメニジン、ハルモール、ハルモール二量体、ブリンゾラミド、及びモネンシン;
-  ウイルスポリメラーゼ阻害剤(例えば、T705);
-  核タンパク質阻害剤;
-  赤血球凝集素阻害剤;
-  ノイラミニダーゼ阻害剤;
-  NS1、M1、M2、NEP、Pb1-F2タンパク質阻害剤;
-  組換えシアリダーゼ(例えば、DAS181);
-  NFKB阻害剤;
-  HSP90阻害剤;及び
-  細胞プロテインキナーゼMek、Erk、又はPKCの阻害剤
から選択される。
【０１０９】
更に、本発明は、インフルエンザウイルスによる感染症を予防及び/又は治療するための同時、個別、又は逐次的使用のための、エチレフリン及びジルチアゼムから選択される少なくとも1種の化合物並びに少なくとも1種の他の抗ウイルス剤及び/又は抗菌剤を含む組合せ製品に関する。
【０１１０】
更に、本発明は、ヒトにおけるインフルエンザウイルス(influenza viruses (flu viruses))による感染症の予防及び/又は治療のための療法に関し、ここで、患者には、エチレフリン及びジルチアゼムから選択される化合物又は両方の混合物を有効量で投与し、任意選択で別の抗ウイルス性化合物及び/又は抗菌性化合物と組み合わせて投与する。
【０１１１】
更に、本発明は、動物におけるインフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療のための療法に関し、ここで、動物には、エチレフリン及びジルチアゼムから選択される化合物を有効量で投与し、任意選択で別の抗ウイルス性化合物及び/又は抗菌性化合物と組み合わせて投与する。有利には、該動物は、例えば、ブタ、ウマ、若しくはニワトリ等の家畜又はペット(イヌ、ネコ等)である。
【０１１２】
医薬組成物又は動物用組成物の製剤
本発明の好ましい態様によると、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のための該医薬組成物又は動物用組成物は、吸入投与を意図した剤形であることを特徴とする。
【０１１３】
「吸入」という用語は、気道による吸収を意味する。これは、特に、ガス、微小液滴、又は懸濁液中の粉末の形態で、特定物質の治療用化合物を吸収する方法である。
【０１１４】
医薬組成物又は動物用組成物の吸入、すなわち、経鼻及び/又は経口経路による投与は、当業者に周知である。
【０１１５】
吸入投与は2種類に区別されうる:
-  該組成物が粉末の形態である場合は通気投与、及び
-  該組成物が、エアロゾル(懸濁液)の形態又は加圧溶液の形態、例えば、水溶液である場合は噴霧投与。この場合、該医薬組成物又は動物用組成物を投与するため、ネブライザー又は噴霧器の使用が推奨される。
【０１１６】
したがって、ここで検討される剤形は、散剤、液滴の水性懸濁液、又は加圧溶液から選択される。
【０１１７】
医薬組成物又は動物用組成物
更に、本発明は、適当な医薬担体中、少なくとも1種の抗ウイルス剤を、エチレフリン及びジルチアゼムから選択される少なくとも1種の化合物又は両方の組合せとの組合せで含む医薬組成物又は動物用組成物に関する。
【０１１８】
好ましい態様によると、該抗ウイルス剤は、当業者に周知であり、インフルエンザを予防又は治療するために従来使用され、特に、インフルエンザウイルスに対する直接的な阻害作用を有する、すなわち、感染した生体における少なくとも1種のインフルエンザウイルスの複製を阻害又は侵入若しくは増殖を予防する抗ウイルス剤から選択される。
【０１１９】
該抗ウイルス剤は、特に、オセルタミビル、ザナミビル、ペラミビル、アマンタジン、リマンタジン、リバビリン、及びアルビドールから選択される。
【０１２０】
この抗ウイルス剤は、細胞に対して活性がある、ウイルス感染に不利である全般的な細胞状態を引き起こす、ミドドリン、デスグリミドドリン、リルメニジン、ハルモール、ハルモール二量体、ブリンゾラミド、及びモネンシン等の薬剤から選択されてもよい。
【０１２１】
この抗ウイルス剤は:
-  ウイルスポリメラーゼ阻害剤(例えば、T705);
-  核タンパク質阻害剤;
-  赤血球凝集素阻害剤;
-  ノイラミニダーゼ阻害剤;
-  NS1、M1、M2、NEP、Pb1-F2タンパク質阻害剤
から選択されてもよい。
【０１２２】
この抗ウイルス剤は:
-  組換えシアリダーゼ(例えば、DAS181);
-  NFKB阻害剤;
-  HSP90阻害剤;及び
-  細胞プロテインキナーゼMek、Erk、又はPKCの阻害剤
から選択されてもよい。
【０１２３】
好ましい態様によると、該抗ウイルス剤はオセルタミビルである。別の好ましい態様によると、該抗ウイルス剤はモネンシンである。
【０１２４】
したがって、本発明は、具体的に:
-  適当な医薬担体中、少なくとも1種の抗ウイルス剤とジルチアゼムを含む医薬組成物又は動物用組成物;並びに
-  適当な医薬担体中、少なくとも1種の抗ウイルス剤とエチレフリンを含む医薬組成物又は動物用組成物;並びに
-  適当な医薬担体中、少なくとも1種の抗ウイルス剤とエチレフリン及びジルチアゼムを含む医薬組成物又は動物用組成物
に関する。
【０１２５】
この抗ウイルス剤は、好ましくは、本出願に列挙された抗ウイルス剤から選択され、特に、オセルタミビル又はモネンシンである。
【０１２６】
上記の2種、3種、又は4種の活性化合物の全ての組合せは、本発明による医薬組成物又は動物用組成物であると理解される。
【０１２７】
更に別の態様によると、本発明による医薬組成物又は動物用組成物は、適当な医薬担体中、ジルチアゼムとエチレフリンの組合せを含む。
【０１２８】
上記のように、任意のジルチアゼムとエチレフリンの組合せは、各化合物を同量(質量比50/50の組成物)又は90%ジルチアゼム及び10%エチレフリン、80%ジルチアゼム及び20%エチレフリン、70%ジルチアゼム及び30%エチレフリン、60%ジルチアゼム及び40%エチレフリン、40%ジルチアゼム及び60%エチレフリン、30%ジルチアゼム及び70%エチレフリン、20%ジルチアゼム及び80%エチレフリン、若しくは更には10%ジルチアゼム及び90%エチレフリン等、各化合物を不等量のいずれかで含む。
【０１２９】
本説明中、記載された全ての化合物は、該医薬組成物又は動物用組成物中に有効量で、すなわち、期待される抗ウイルス効果を生じる量で存在すると理解される。該有効量は、当業者によって容易に決定されうる。
【０１３０】
本発明の医薬組成物又は動物用組成物は、経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、経眼、局所、又は直腸投与に適しており、ここで、該活性化合物は、従来の医薬品添加物と混合した単回単位剤形で、動物又はヒトに投与してよい。
【０１３１】
適当な単回単位剤形として、錠剤、ゼラチンカプセル剤、散剤、顆粒剤、及び経口溶液又は経口懸濁液等の経口形態、舌下及び口腔内剤形、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内、又は眼内剤形、並びに直腸剤形が挙げられる。
【０１３２】
固形組成物を錠剤形態として調製する場合、主要な活性化合物は、ゼラチン、デンプン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アラビアゴム等の適当な医薬担体と混合する。該錠剤は、ショ糖又は他の適当な物質でコーティングすることができ、或いは、持続性又は遅効性活性を有するように、かつ所定量の有効成分を持続的に放出するように処理することができる。
【０１３３】
ゼラチンカプセルの製剤は、該活性化合物を希釈剤と混合し、得られた混合物を軟ゼラチンカプセル又は硬ゼラチンカプセルの中にそそぎ入れることで得られる。
【０１３４】
シロップ形態又はエリキシル形態の製剤は、該活性化合物を香料及び適当な着色剤に加え、甘味料、防腐剤と共に含有してよい。
【０１３５】
水分散性散剤又は水分散性顆粒剤は、該活性化合物を風味矯正剤(flavor correctors)又は甘味料に加え、分散体若しくは湿潤剤又は懸濁剤と混合して含有してよい。
【０１３６】
本発明の好ましい態様によると、該医薬組成物又は動物用組成物は、気道の粘膜を介した投与、すなわち、吸入投与等の局所投与を意図した剤形である。
【実施例】
【０１３７】
序論
培養細胞を用いたin vitroにおける、インフルエンザ感染中の細胞のトランスクリプトーム応答に関する研究によって、感染中に利用された及び/又は迂回されたシグナル伝達経路が明らかとなった。これによって、様々なヒト及び鳥インフルエンザウイルスによる感染症に特異的なin vitro「トランスクリプトームシグネチャー」の特性を明らかにすることが可能となった(Josset他PLoS One、2010;Terrier他Virol J、2011;Terrier他J Gen Virol、2013)。
【０１３８】
この同じ戦略を、パンデミックH1N1ウイルス(pdm09)による感染症のin vivoシグネチャーの特性を明らかにするため、患者9名の鼻腔洗浄液から得たin vivo細胞サンプルに適用した。これらのトランスクリプトームシグネチャーは、Affymetrix Fluidics Station 450を用い、様々なバイオインフォマティクス解析ツールによって得た。Connectivity Map(Broad Institute、MIT)等の公共データベースにおける「in silico」スクリーニング後、特に、エチレフリン、ジルチアゼム、モネンシン、ラナトシドC、及びイソキシカムを含む、34種の分子を選択した。これらの分子は、A549ヒト肺上皮細胞株におけるin vitro感染細胞モデルにて、次に感染性マウスモデルにおけるin vivoにて、その抗ウイルス活性を評価した。
【０１３９】
(実施例1)
H1N1に感染したA549細胞における選択された様々な化合物の抗ウイルス効果のin vitro評価
詳細な培養及び感染プロトコル:
【０１４０】
A.ヒトA549細胞の培養液
A549(肺癌)細胞を、5%CO2を含有する飽和水蒸気雰囲気下、37℃のインキュベーター内で、10%(v/v)ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、100U/mLペニシリン、及び100μg/mLストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、BioWhittaker社)で維持する。コンフルエントに達した時点で、該細胞を、トリプシン-EDTAで処理することで支持体から剥離し、新鮮培地15mLを加えた培養フラスコに再播種した。感染工程の3日前、0.75・106細胞を、25cm2(T25)フラスコ中、感染中に70〜80%コンフルエントとなるように10%ウシ胎児血清を加えた培地に分散する。
【０１４１】
B.代表的なインフルエンザウイルスによる細胞の感染
該細胞を、DMEM、2mM L-グルタミン、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、及び0.5μg/mLトリプシン中、感染多重度(MOI)0.1で様々なインフルエンザウイルスに感染させる。
【０１４２】
使用するウイルスは、ヒトA型インフルエンザウイルスのH1N1(A/Pdm/09)及びH3N2(A/Moscow/10/99)株である。
【０１４３】
C.前処理及び処理
該分子は、70〜80%コンフルエントに達したA549細胞で試験した。該細胞を、様々な濃度の分子と共に6時間インキュベートし、次に様々なウイルスに1時間感染させ、同濃度の分子の存在下に戻した。
【０１４４】
D.測定
細胞毒性試験及びウイルス定量試験は、5%CO2下、37℃で48時間のインキュベーション後に実施する。様々な分子の細胞毒性は、生存率試験(MTSアッセイ、Promega社)による非感染細胞のプレートにおける各試験で決定する。本試験は、基質(MTSテトラゾリウム)を生成物(ホルマザン)に変換する、細胞の代謝活性を測定することに基づく。この生成物は、培地に可溶であり、490nmで測定されるその吸光度は、生細胞数を比例的に反映する。各ウェルの吸光度の対照細胞(該分子で処理していない)を含有するウェルの平均吸光度に対する比を算出し、細胞生存率(相対細胞生存率)の指標として図表に示す。
【０１４５】
ウイルス産生に対する効果は、MDCK細胞で行われた感染力価(TCID50/mL、50%感染量)の決定によって推測される。該力価は、Reed-Muench法に従って算出される。各条件における感染力価の比率は、対照条件において測定した感染力価の関数として表示した。
【０１４６】
E.結果
該細胞の前処理及び処理プロトコルは、図1Aに図表として示す。いくつかの濃度を試験した。該細胞を、試験する様々な分子で6時間の前処理を行い、次にH1N1 pdm09ウイルスに1時間感染させる。次に、試験する様々な分子で48時間処理を繰り返す。上記の通り、該処理の終了時に得られた測定値によって、ウイルス産生率によって決まる半数阻害濃度(IC50)を、試験する様々な濃度の関数として決定することが可能である。
【０１４７】
図1Bは、次の分子:リバビリン、モネンシン、ラナトシドC、ジルチアゼム、及びエチレフリンを用いて得られた結果を示す。予想どおり、抗ウイルス活性が公知の化合物であるリバビリン及びモネンシンは、正規化したウイルス産生率を有意に低下させる。更に驚くべきことに、ジルチアゼム及びエチレフリンも正規化したウイルス産生率を有意に低下させる。序論に記載される選択された化合物中、ラナトシドCに対し、その抗ウイルス活性を評価するための試験を行った。得られた結果からは、この化合物の抗ウイルス活性を確認することはできなかった。
【０１４８】
(実施例2)
ウイルスの亜型H3N2に感染したA549細胞におけるエチレフリンの抗ウイルス効果のin vitro評価
【０１４９】
前処理及び処理プロトコルは、図1Aに図表として示し、実験条件は、実施例1に記載のものと同じである。感染のために使用されたH3N2ウイルスは、A/Moscow/10/99(H3N2)株である。
【０１５０】
図2は、試験した最低濃度から、エチレフリンの抗ウイルス効果が大きく、0.018μMエチレフリンによってウイルス産生を完全に阻害することが可能であることを示す。
【０１５１】
(実施例3)
H1N1 pdm09ウイルスに感染したA549細胞における、オセルタミビルと組み合わせた(A)エチレフリン及び(B)ジルチアゼムの抗ウイルス効果のin vitro評価
【０１５２】
前処理及び処理プロトコルは、図1Aに図表として示し、実験条件は、実施例1に記載のものと同じである。
【０１５３】
予想どおり、オセルタミビルは、ウイルス産生率を約40%へと有意に低下させる(図3A及び図3B)。エチレフリンとオセルタミビルの組合せは、試験したエチレフリンの濃度の両方において、該化合物単独の場合よりもはるかに良い効果を示す。
【０１５４】
オセルタミビルとジルチアゼムの、0.9nMの組合せは、該化合物単独の場合よりも有効である。濃度9nMでジルチアゼムを単独使用した場合、最も良い結果が得られる。
【０１５５】
(実施例4)
マウスにおける次の分子:オセルタミビル、モネンシン、ジルチアゼム、エチレフリン、及びイソキシカムの毒性に関するin vivo評価
【０１５６】
「生理食塩水」対照は、PBSで処置した未処置のマウスを意味する。
【０１５７】
次の1日量をマウスに胃ゾンデにより強制経口投与した:
-  オセルタミビル:10mg/kg/日
-  エチレフリン:3mg/kg/日
-  ジルチアゼム:90mg/kg/日
【０１５８】
最も強力な細胞毒性を有する化合物は、オセルタミビルであり、この毒性は許容し得るものであるにもかかわらず、処置期間中のマウスの体重増加は維持される。ジルチアゼム(菱形)及びエチレフリン(星形)は、該投与量において明らかに非毒性である。
【０１５９】
(実施例5)
感染したB57BL/6マウスに対する、化合物であるオセルタミビル、モネンシン、ジルチアゼム、エチレフリン、及びイソキシカムの抗ウイルス効果のin vivo評価:(A)投与プロトコル、(B)感染後14日目までの経時的な生存率、(C)経時的に観察された体重減少、(D)肺におけるウイルス力価
【０１６０】
図5Aに図表として示されるプロトコルに従って、B57BL/6マウス(7〜8週齢)には、H1N1 pdm09ウイルス感染前(-1日目)、感染日、感染後3日目に胃ゾンデによる強制経口投与を行う。
【０１６１】
次のパラメータを経時的に評価する:
図5B:感染後14日目までの経時的な生存率;
図5C:経時的に観察された体重の減少及び増加;
図5D:感染し、処置されたマウスの肺におけるウイルス力価。
【０１６２】
エチレフリン(星形で表記)及びジルチアゼム(菱形で表記)では、感染したマウスの最高生存率、すなわち、14日目にそれぞれ70%及び90%の生存率が得られ、これは、オセルタミビル(生存率60%:丸形で表記)で得られたものよりも良好な結果である。
【０１６３】
(実施例6)
マウスをH1N1 pdm09ウイルスに感染させた24時間後、投与した化合物であるオセルタミビル及びジルチアゼムの抗ウイルス効果のin vivo評価:感染後14日目までの経時的な生存率
【０１６４】
図6Aに図表として示されるプロトコルに従って、B57BL/6マウス(7〜8週齢)には、H1N1 pdm09ウイルス感染後に胃ゾンデによる強制経口投与を行う。経時的な生存率を、処置を受けていない(図6B)、オセルタミビルで処置した(図6C)、及びジルチアゼムで処置した(図6D)感染したマウスに対して測定した。オセルタミビルで処置したマウス、及びジルチアゼムで処置したマウスの生存率は100%である。
【０１６５】
(実施例7)
H1N1 pdm09ウイルスに感染したA549細胞における、オセルタミビルと組み合わせたジルチアゼムの抗ウイルス効果のin vitro評価(図7)
【０１６６】
該感染後細胞の処理プロトコルは、図7Aに図表として示す。該細胞を、H1N1 pdm09ウイルスに1時間感染させ、次に感染6時間後から開始して48時間処理する、又は処理しない(対照測定値:Ctrl)。上記の通り、該処理の終了時に得られた測定値によって、ウイルス産生に対する処理の効果を決定することが可能である。
【０１６７】
図7B及び図7Cは、ジルチアゼムとオセルタミビル及びジルチアゼムとモネンシンの組合せから得られたそれぞれの結果を示す。
【０１６８】
感染後の処理条件下、オセルタミビル(10nM)は、対照値に対してウイルス産生率を約55%の、減少した値まで有意に低下させ、ジルチアゼム(9μM)は、対照値に対して相対ウイルス力価を有意に約20%低下させる。
【０１６９】
ジルチアゼムとオセルタミビルの組合せは、対照値に対してウイルス産生率を有意に70%低下させるため、該化合物単独の場合よりも良い効果を示す。したがって、オセルタミビルの効果は、ジルチアゼムの存在によって増強される。
【０１７０】
感染後の処理条件下、モネンシン(6μM)は、対照値に対してウイルス産生率を有意に約72%低下させるため、極めて有効である。上記のように、ジルチアゼム(9μM)は、ウイルス産生率を約20%低下させる。
【０１７１】
ジルチアゼムとモネンシンの組合せは、対照値に対してウイルス産生率を有意に82%低下させるため、該化合物単独の場合より有効である。したがって、モネンシンの効果は、ジルチアゼムの存在によって増強される。
【０１７２】
(参考文献)
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【国際調査報告】
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