(57)【要約】  本発明は、新規なインスリンアナログ、特に天然型インスリンに比べて増加したインビトロ効力を有するインスリンアナログ、それをコードする核酸、前記核酸を含む発現ベクター、前記発現ベクターが導入された形質転換体、前記形質転換体からインスリンアナログを製造する方法、前記インスリンアナログを有効成分として含む糖尿病治療用薬学的組成物、及び前記インスリンアナログまたは前記薬学的組成物を用いて糖尿病を治療する方法に関する。【選択図】  図１
2018526001.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表される配列番号３のＡ鎖と下記一般式（２）で表される配列番号４のＢ鎖を含むインスリンアナログペプチド：
一般式（１）
【化１】
2018526001.tif 000012
前記一般式（１）において、
Ｘａａ１が、アラニン、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ２が、アラニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Ｘａａ３が、アラニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Ｘａａ４が、アラニン、チロシン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ５が、アラニン、ロイシン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ６が、アラニン、チロシン、セリン、グルタミン酸、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Ｘａａ７が、アスパラギン、グリシン、ヒスチジンまたはアラニンである。
一般式（２）
【化２】
2018526001.tif 000013
前記一般式（２）において、
Ｘａａ８が、チロシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在であり、
Ｘａａ９が、フェニルアラニンであるか、不在であり、
Ｘａａ１０が、トレオニンであるか、不在であり、
Ｘａａ１１が、プロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在である
（ここで、配列番号１のＡ鎖及び配列番号２のＢ鎖を含むペプチドは除く）。
【請求項２】
前記配列番号４のＢ鎖において、Ｘａａ８がチロシンであり、Ｘａａ９が不在であり、Ｘａａ１０がトレオニンである、請求項１に記載のインスリンアナログペプチド。
【請求項３】
前記配列番号４のＢ鎖において、Ｘａａ８がチロシンであり、Ｘａａ９がフェニルアラニンであり、Ｘａａ１０が不在である、請求項１に記載のインスリンアナログペプチド。
【請求項４】
前記配列番号３のＡ鎖において、Ｘａａ１がグリシンであり、Ｘａａ２がグルタミンであり、Ｘａａ３がセリンであり、Ｘａａ４がグルタミン酸であり、Ｘａａ５がロイシンであり、Ｘａａ６がチロシンであり、Ｘａａ７がアスパラギンであり、
前記配列番号４のＢ鎖において、Ｘａａ８がチロシンであり、Ｘａａ９がフェニルアラニンであり、Ｘａａ１０がトレオニンであり、Ｘａａ１１がプロリンである、請求項１に記載のインスリンアナログペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドが、配列番号１６で記載されるアミノ酸配列を含むものである、請求項４に記載のインスリンアナログペプチド。
【請求項６】
前記配列番号３のＡ鎖において、Ｘａａ１がグリシンであり、Ｘａａ２がグルタミンであり、Ｘａａ３がセリンであり、Ｘａａ４がアスパラギンであり、Ｘａａ５がロイシンであり、Ｘａａ６がチロシンであり、Ｘａａ７がアスパラギンであり、
前記配列番号４のＢ鎖において、Ｘａａ８がチロシンであり、Ｘａａ９がフェニルアラニンであり、Ｘａａ１０がトレオニンであり、Ｘａａ１１がプロリンである、請求項１に記載のインスリンアナログペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドが、配列番号１８で記載されるアミノ酸配列を含むものである、請求項６に記載のインスリンアナログペプチド。
【請求項８】
前記配列番号３のＡ鎖において、Ｘａａ１がグリシンであり、Ｘａａ２がグルタミンであり、Ｘａａ３がセリンであり、Ｘａａ４がグルタミン酸であり、Ｘａａ５がロイシンであり、Ｘａａ６がチロシンであり、Ｘａａ７がアスパラギンであり、
前記配列番号４のＢ鎖において、Ｘａａ８がチロシンであり、Ｘａａ９が不在であり、Ｘａａ１０がトレオニンであり、Ｘａａ１１がプロリンである、請求項１に記載のインスリンアナログペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドが、配列番号２０で記載されるアミノ酸配列を含むものである、請求項８に記載のインスリンアナログペプチド。
【請求項１０】
前記配列番号３のＡ鎖において、Ｘａａ１がグリシンであり、Ｘａａ２がグルタミンであり、Ｘａａ３がセリンであり、Ｘａａ４がアラニンであり、Ｘａａ５がロイシンであり、Ｘａａ６がチロシンであり、Ｘａａ７がアスパラギンであり、
前記配列番号４のＢ鎖において、Ｘａａ８がグルタミン酸であり、Ｘａａ９が不在であり、Ｘａａ１０がトレオニンであり、Ｘａａ１１がプロリンである、請求項１に記載のインスリンアナログペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチドが、配列番号２２で記載されるアミノ酸配列を含むものである、請求項１０に記載のインスリンアナログペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のインスリンアナログペプチドをコードする、核酸。
【請求項１３】
前記核酸が、配列番号１５、１７、１９及び２１からなる群から選択される塩基配列を有するものである、請求項１２に記載の核酸。
【請求項１４】
請求項１２に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組換え発現ベクターで形質転換された、形質転換体。
【請求項１６】
前記形質転換体が、大腸菌である、請求項１５に記載の形質転換体。
【請求項１７】
下記段階を含む請求項１に記載のインスリンアナログペプチドを製造する方法：
ａ）請求項１に記載のインスリンアナログペプチドをコードする核酸を含む組換え発現ベクターを製造する段階；
ｂ）前記組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を収得する段階；
ｃ）前記形質転換体を培養してインスリンアナログペプチドを発現させる段階；及び
ｄ）発現されたインスリンアナログペプチドを分離及び精製する段階。
【請求項１８】
前記核酸が、配列番号１５、１７、１９及び２１からなる群から選択される塩基配列を有するものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記宿主細胞が、大腸菌である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記分離及び精製が、
ｄ‐１）培養液から形質転換体細胞を収穫して破砕する段階；
ｄ‐２）破砕された細胞溶解物から前記発現されたインスリンアナログペプチドを回収してリフォールディングする段階；
ｄ‐３）リフォールディングされたインスリンアナログペプチドを陽イオン交換クロマトグラフィーで精製する段階；
ｄ‐４）精製されたインスリンアナログペプチドをトリプシン及びカルボキシぺプチダーゼＢで処理する段階；及び
ｄ‐５）処理されたインスリンアナログペプチドを陽イオン交換クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーで順次的に精製する段階を含むものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
有効成分として請求項１〜１１のいずれか一項に記載のインスリンアナログペプチドと、薬剤学的に許容可能な担体を含む、糖尿病治療用薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なインスリンアナログ、特に天然型インスリンに比べてインビトロ（in
vitro）効力が増加したインスリンアナログ及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリンは、人体の膵臓から分泌される血糖調節ホルモンとして、血液内の余剰ブドウ糖を細胞に移し、細胞にエネルギー源を供給する一方、血糖を正常レベルに維持させてくれる役割をする。しかし、糖尿病患者の場合、このようなインスリンが不足したり、インスリン抵抗性及びベータ細胞の機能消失によりインスリンが正常な機能を実行できない。そのため、糖尿病患者は、血液内のブドウ糖をエネルギー源として利用できず、血中のブドウ糖レベルが高い高血糖症状を示し、最終的に尿に糖を排出するようになり、これは、さまざまな合併症の原因となっている。したがって、インスリンの生成に異常があったり（Type I）、インスリン耐性に起因する（Type II）糖尿病患者はインスリン治療が必要であり、インスリン投与により血糖を正常レベルに調節することができる。
【０００３】
ヒトインスリンは、２つのポリペプチド鎖、すなわち、それぞれ２１個及び３０個のアミノ酸残基を含むＡ鎖及びＢ鎖で構成されており、これらは２つの二硫化架橋で相互連結されている。インスリンの場合、他のタンパク質やペプチドホルモンのように生体内の半減期が極めて短いため継続的な治療効果を示さず、効果を発揮するためには継続的に反復投与をしなければならないという欠点がある。このような頻繁な投与は患者にひどい苦痛と不便さを引き起こすことになるため、患者の順応性、安全性及び利便性の面で改善が求められている。
【０００４】
ここで、インスリンのようなタンパク質薬物の生体内半減期を増加させて投与回数を減らすことにより、患者の生活の質と治療的効果を高めるための様々なタンパク質の剤形化研究と化学的結合体などに対する研究が進められている。
【０００５】
インスリンは、インスリン受容体と結合して血中の糖を除去することが知られており、天然型インスリンの配列を変化させてその効力を調節することができる。インスリンのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、特定アミノ酸の削除を介してインスリンの生体内効力を調節することができ、高活性のインスリン誘導体は少ない量でも天然型インスリンと同等以上の効力を示すことができるため、治療学的に非常に望ましい形態になりうる。特に、インスリンに含まれるＡ鎖及び/またはＢ鎖のアミノ酸置換が皮下注射後のインスリン作用の薬動学的効果の面で広く研究されている。
【０００６】
このような背景下で、本発明者らは、インスリンの作用効果を高めようと鋭意努力した結果、インスリンＡ鎖及び/またはＢ鎖の特定のアミノ酸残基が変形されたインスリンアナログが、天然型インスリンに比べて著しく増加したインビトロ効力を示し、糖尿病の治療に効果的に用いられることを確認し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980
【非特許文献２】Uhlman 及び Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584, 1990
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、新規なインスリンアナログ、特に天然型インスリンに比べてインビトロ（in vitro）効力が増加したインスリンアナログを提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記インスリンアナログを有効成分として含む糖尿病治療用薬学的組成物を提供することにある。
【００１０】
本発明のもう一つの目的は、前記インスリンアナログまたはそれを有効成分として含む薬学的組成物を、これを必要とする個体に投与する段階を含む、糖尿病を治療する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するための一つの様態として、本発明は下記一般式（１）で表される配列番号３のＡ鎖と下記一般式（２）で表される配列番号４のＢ鎖を含むインスリンアナログを提供する：
一般式（１）
【化１】
2018526001.tif 000003
前記一般式（１）において、
Ｘａａ１は、アラニン、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ２は、アラニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Ｘａａ３は、アラニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Ｘａａ４は、アラニン、チロシン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ５は、アラニン、ロイシン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ６は、アラニン、チロシン、セリン、グルタミン酸、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Ｘａａ７は、アスパラギン、グリシン、ヒスチジンまたはアラニンである。
【００１２】
一般式（２）
【化２】
2018526001.tif 000004
前記一般式（２）において、
Ｘａａ８は、チロシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在であり、
Ｘａａ９は、フェニルアラニンであるか、不在であり、
Ｘａａ１０は、トレオニンであるか、不在であり、
Ｘａａ１１は、プロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在である
（ここで、配列番号１のＡ鎖及び配列番号２のＢ鎖を含むペプチドは除く）。
【００１３】
より具体的な一つの様態で、前記ペプチドは前記一般式（１）のＡ鎖を含み、前記配列番号４のＢ鎖において、Ｘａａ８はチロシンであり、Ｘａａ９は不在であり、Ｘａａ１０はトレオニンであるＢ鎖を含むことを特徴とする。
【００１４】
前記インスリンアナログは、前記一般式（１）のＡ鎖を含み、前記配列番号４のＢ鎖において、Ｘａａ８はチロシンであり、Ｘａａ９はフェニルアラニンであり、Ｘａａ１０は不在であるＢ鎖を含むことを特徴とする。
【００１５】
他の様態で、前記配列番号３のＡ鎖で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はグルタミンであり、Ｘａａ３はセリンであり、Ｘａａ４はグルタミン酸であり、Ｘａａ５はロイシンであり、Ｘａａ６はチロシンであり、Ｘａａ７はアスパラギンであり、 配列番号４のＢ鎖で、Ｘａａ８はチロシンであり、Ｘａａ９はフェニルアラニンであり、Ｘａａ１０はトレオニンであり、Ｘａａ１１はプロリンであることを特徴とする。
【００１６】
他の様態で、前記配列番号３のＡ鎖で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はグルタミンであり、Ｘａａ３はセリンであり、Ｘａａ４はアスパラギンであり、Ｘａａ５はロイシンであり、Ｘａａ６はチロシンであり、Ｘａａ７はアスパラギンであり、配列番号４のＢ鎖で、Ｘａａ８はチロシンであり、Ｘａａ９はフェニルアラニンであり、Ｘａａ１０はトレオニンであり、Ｘａａ１１はプロリンであることを特徴とする。
【００１７】
他の様態で、 前記配列番号３のＡ鎖で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はグルタミンであり、Ｘａａ３はセリンであり、Ｘａａ４はグルタミン酸であり、Ｘａａ５はロイシンであり、Ｘａａ６はチロシンであり、Ｘａａ７はアスパラギンであり、配列番号４のＢ鎖で、Ｘａａ８はチロシンであり、Ｘａａ９は不在であり、Ｘａａ１０はトレオニンであり、Ｘａａ１１はプロリンであることを特徴とする。
【００１８】
他の様態で、 前記配列番号３のＡ鎖で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はグルタミンであり、Ｘａａ３はセリンであり、Ｘａａ４はアラニンであり、Ｘａａ５はロイシンであり、Ｘａａ６はチロシンであり、Ｘａａ７はアスパラギンであり、配列番号４のＢ鎖で、Ｘａａ８はグルタミン酸であり、Ｘａａ９は不在であり、Ｘａａ１０はトレオニンであり、Ｘａａ１１はプロリンであることを特徴とする。
【００１９】
他の様態で、
本発明に係るインスリンアナログは、配列番号３のＡ鎖でＸａａ４がグルタミン酸であり、配列番号４のＢ鎖でＸａａ９がフェニルアラニンであるか；
配列番号３のＡ鎖でＸａａ４がアスパラギンであり、配列番号４のＢ鎖でＸａａ９がフェニルアラニンであるか、
配列番号３のＡ鎖でＸａａ４がグルタミン酸であり、配列番号４のＢ鎖でＸａａ９が不在であるか、
配列番号３のＡ鎖でＸａａ４がアラニンであり、配列番号４のＢ鎖でＸａａ８がグルタミン酸であり、Ｘａａ９が不在であることを特徴とするが、これに限定されない。
【００２０】
別の様態では、本発明に係るインスリンアナログは、配列番号１６、１８、２０または２２で記載されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【００２１】
別の様態として、本発明は、前記インスリンアナログをコードする核酸を提供する。
【００２２】
一実施様態として、本発明に係る核酸は、配列番号１５、１７、１９及び２１からなる群から選択される塩基配列を含むことを特徴とする。
【００２３】
別の様態として、本発明は、前記核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。
【００２４】
別の様態として、本発明は、前記組換え発現ベクターで形質転換された形質転換体を提供する。
【００２５】
別の様態として、本発明は、下記段階を含む前記インスリンアナログを製造する方法を提供する：
ａ）前記インスリンアナログペプチドをコードする核酸を含む組換え発現ベクターを製造する段階；
ｂ）前記組換え発現ベクターを宿主細胞に形質転換して形質転換体を収得する段階；
ｃ）前記形質転換体を培養して、インスリンアナログペプチドを発現させる段階；
ｄ）発現されたインスリンアナログペプチドを分離及び精製する段階。
【００２６】
別の様態として、本発明は、有効成分として前記インスリンアナログと、薬学的に許容可能な担体を含む糖尿病治療用薬学的組成物を提供する。
【００２７】
以下では、本発明をさらに詳細に説明する。
【００２８】
一方、本願で開示されるそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの別の説明及び実施形態にも適用されうる。つまり、本願で開示された多様な要素のすべての組み合わせが本発明の範囲に属する。また、下記記述される具体的な叙述によって、本発明の範囲が制限されるとはいえない。
【００２９】
本発明は、新規なインスリン、特に天然型インスリンに比べてインビトロ効力が増加したインスリンアナログに関する。
【００３０】
本発明で用語、「インスリンアナログ（insulin analog）」とは、天然型インスリンの一部のアミノ酸を付加、欠失または置換の形態に変形させたアナログを意味する。特に、前記変形を介して天然型に比べてインビトロ効力が増加した様々なアナログを含む。
【００３１】
天然型インスリンは、膵臓から分泌されるホルモンとして、一般的に細胞内グルコースの吸収を促進し、脂肪の分解を抑制して体内の血糖を調節する役割をする。インスリンは血糖の調節機能がないプロインスリン（proinsulin）前駆体の形態でプロセッシングを経て、血糖調節機能を有するインスリンになる。インスリンは、２つのポリペプチド鎖、すなわち、それぞれ２１個及び３０個のアミノ酸残基を含むＡ鎖及びＢ鎖から構成されており、これらは２つの二硫化架橋で相互連結されている。天然型インスリンのＡ鎖及びＢ鎖は、それぞれ下記配列番号１及び２で表されるアミノ酸配列を含む。
【００３２】
Ａ鎖：
Ｇｌｙ‐Ｉｌｅ‐Ｖａｌ‐Ｇｌｕ‐Ｇｌｎ‐Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ‐Ｔｈｒ‐Ｓｅｒ‐Ｉｌｅ‐Ｃｙｓ‐Ｓｅｒ‐Ｌｅｕ‐Ｔｙｒ‐Ｇｌｎ‐Ｌｅｕ‐Ｇｌｕ‐Ａｓｎ‐Ｔｙｒ‐Ｃｙｓ‐Ａｓｎ（配列番号１)
Ｂ鎖：
Ｐｈｅ‐Ｖａｌ‐Ａｓｎ‐Ｇｌｎ‐Ｈｉｓ‐Ｌｅｕ‐Ｃｙｓ‐Ｇｌｙ‐Ｓｅｒ‐Ｈｉｓ‐Ｌｅｕ‐Ｖａｌ‐Ｇｌｕ‐Ａｌａ‐Ｌｅｕ‐Ｔｙｒ‐Ｌｅｕ‐Ｖａｌ‐Ｃｙｓ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｐｈｅ‐Ｔｙｒ‐Ｔｈｒ‐Ｐｒｏ‐Ｌｙｓ‐Ｔｈｒ（配列番号２)
【００３３】
本発明に係るインスリンは、遺伝子組換え技術で作られたインスリンアナログであるが、本発明はこれに限定されるものではなく、天然型インスリンに比べてインビトロ効力が増加したすべてのインスリンを含む。好ましくは、逆方向インスリン（inverted insulin）、インスリン変異体（variant）、インスリン断片（fragment）などを含み、これらは遺伝子組換え法だけでなく、固相（solid phase）方法でも製造することができ、これに制限されるものではない。
【００３４】
本発明に係るインスリンアナログは、インスリンと同様な生体内の血糖調節機能を有するペプチドであって、このようなペプチドはインスリンアゴニスト（insulin agonist）、インスリン誘導体（insulin derivative）、インスリン断片（insulin fragment）、インスリン変異体（insulin variant）などをすべて含む。
【００３５】
本発明で用語、「インスリンアゴニスト」は、インスリンの構造に関係なく、インスリンの生体内受容体に結合してインスリンと同様な生物学的活性を示す物質を意味する。
【００３６】
本発明で用語、「インスリン誘導体」は、天然型インスリンのＡ鎖及びＢ鎖のアミノ酸配列のそれぞれに対して相同性を示し、アミノ酸残基の一部のグループが、化学的に置換（例えば、α‐メチル化、α‐ヒドロキシル化）、削除（例えば、脱アミン化）または修飾（例えば、Ｎ‐メチル化）された形態であってもよく、体内で血糖を調節する機能を有するペプチドを意味してもよい。また、「インスリン誘導体」は、天然型インスリンとアミノ酸配列に相同性がなくても、インスリン受容体と結合して体内で血糖を調節しうるペプチドミミック（mimic）及び低分子あるいは高分子化合物が含まれてもよい。
【００３７】
本発明で用語、「インスリン断片」は、インスリンに１つ以上のアミノ酸が追加または削除された形態を意味し、追加されたアミノ酸は天然に存在しないアミノ酸（例えば、Ｄ型アミノ酸）であってもよく、このようなインスリン断片は体内で血糖を調節する機能を有する。
【００３８】
本発明で用語、「インスリン変異体」は、インスリンとアミノ酸配列が一つ以上の異なるペプチドであって、体内で血糖を調節する機能を有する。
【００３９】
本発明のインスリンアゴニスト、誘導体、断片及び変異体でそれぞれ用いられた製造方法は、独立して用いられてもよく、組み合わせも可能である。例えば、アミノ酸配列が一つ以上異なり、アミノ末端のアミノ酸残基に脱アミノ化（deamination）が導入されたもので、体内で血糖を調節する機能を有するペプチドも、本発明の範囲に含まれる。
【００４０】
本発明に係るインスリンアナログは、天然型インスリンのＡ鎖及びＢ鎖のアミノ酸配列（配列番号１及び２）でアミノ酸の置換、付加、欠失または翻訳後の変形（例えば、メチル化、アシル化、ユビキチン化、分子内共有結合）が導入され、天然型に比べて増加したインビトロ効力を有する任意のペプチドを包括する。前記アミノ酸の置換または付加の際には、ヒトタンパク質で通常に観察される２０個のアミノ酸だけでなく、非定型または非自然的発生アミノ酸を用いてもよい。非定型アミノ酸の商業的な出処には、Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣｈｅｍＰｅｐ及びＧｅｎｚｙｍｅｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが含まれてもよい。このようなアミノ酸が含まれたペプチドと典型的なペプチド配列は、商業化されたペプチド合成会社、例えば、米国のＡｍｅｒｉｃａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂａｃｈｅｍや韓国のＡｎｙｇｅｎを通じて合成及び購入可能である。
【００４１】
具体的に、本発明に係るインスリンアナログは、前記のような天然型インスリンのＡ鎖及びＢ鎖で特定アミノ酸残基の変形または欠失を含むもので、好ましくは、天然型インスリンのＡ鎖の特定アミノ酸残基が変形されて、Ｂ鎖の特定アミノ酸残基が変形されて/されたり、欠失されたものであってもよい。
【００４２】
好ましくは、本発明のインスリンアナログは、天然型インスリンのインビトロ効力を増加させるために、配列番号１で表されるＡ鎖アミノ酸配列の１４番目のアミノ酸であるチロシンをグルタミン酸、アスパラギンまたはアラニンに置換したり、配列番号２で表されるＢ鎖アミノ酸配列の１６番目のアミノ酸配列であるチロシンをグルタミン酸に置換して/したり、２５番目のアミノ酸であるフェニルアラニンを欠失させたり、両方を含んでもよい。
【００４３】
さらに好ましくは、本発明に係るインスリンアナログは、下記一般式（１）で表される配列番号３のＡ鎖と下記一般式（２）で表される配列番号４のＢ鎖を含む新規なペプチドであってもよい：
一般式（１）
【化３】
2018526001.tif 000005
前記一般式（１）において、
Ｘａａ１は、アラニン、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ２は、アラニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Ｘａａ３は、アラニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Ｘａａ４は、アラニン、チロシン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ５は、アラニン、ロイシン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ６は、アラニン、チロシン、セリン、グルタミン酸、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Ｘａａ７は、アスパラギン、グリシン、ヒスチジンまたはアラニンである。
【００４４】
一般式（２）
【化４】
2018526001.tif 000006
前記一般式（２）において、
Ｘａａ８は、チロシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在であり、
Ｘａａ９は、フェニルアラニンであるか、不在であり、
Ｘａａ１０は、トレオニンであるか、不在であり、
Ｘａａ１１は、プロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在である。
【００４５】
ここで、配列番号１のＡ鎖及び配列番号２のＢ鎖を含むペプチドは除いてもよい。
【００４６】
より具体的な一つの様態では、
前記一般式（１）において、
Ｘａａ１は、グリシンであり、
Ｘａａ２は、グルタミンであり、
Ｘａａ３は、セリンであり、
Ｘａａ４は、アラニン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ５は、ロイシンであり、
Ｘａａ６は、チロシンであり、
Ｘａａ７は、アスパラギンであり、
前記一般式（２）において、
Ｘａａ８は、チロシンまたはグルタミン酸であり、
Ｘａａ９は、フェニルアラニンであるか、不在であり、
Ｘａａ１０は、トレオニンであり、
Ｘａａ１１は、プロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在であるインスリンアナログペプチドであってもよいが、これに制限されない。
【００４７】
より具体的な一つの様態では、
前記一般式（１）において、
Ｘａａ１は、グリシンであり、
Ｘａａ２は、グルタミンであり、
Ｘａａ３は、セリンであり、
Ｘａａ４は、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ５は、ロイシンであり、
Ｘａａ６は、チロシンであり、
Ｘａａ７は、アスパラギンであり、
前記一般式（２）において、
Ｘａａ８は、チロシンであり、
Ｘａａ９は、フェニルアラニンであるか、不在であり、
Ｘａａ１０は、トレオニンであり、
Ｘａａ１１は、プロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在であるインスリンアナログペプチドであってもよいが、これに制限されない。
【００４８】
より具体的な一つの様態で、前記ペプチドは、前記一般式（１）のＡ鎖を含み、前記配列番号４のＢ鎖でＸａａ８がチロシンであり、Ｘａａ９は不在であり、Ｘａａ１０がトレオニンであり、Ｘａａ１１は、プロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在であるＢ鎖を含むものであってもよいが、これに制限されない。
【００４９】
前記インスリンアナログは、前記一般式（１）のＡ鎖を含み、前記配列番号４のＢ鎖でＸａａ８がチロシンであり、Ｘａａ９はフェニルアラニンであり、Ｘａａ１０が不在であり、Ｘａａ１１はプロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在であるＢ鎖を含むものであってもよいが、これらに制限されない。
【００５０】
前記インスリンアナログは、前記配列番号３のＡ鎖でＸａａ１がグリシンであり、Ｘａａ２がグルタミンであり、Ｘａａ３がセリンであり、Ｘａａ４がグルタミン酸であり、Ｘａａ５がロイシンであり、Ｘａａ６がチロシンであり、Ｘａａ７がアスパラギンであり、配列番号４のＢ鎖でＸａａ８がチロシンであり、Ｘａａ９がフェニルアラニンであり、Ｘａａ１０がトレオニンであり、Ｘａａ１１はプロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在であってもよいが、これに制限されない。
【００５１】
前記インスリンアナログは、前記配列番号３のＡ鎖でＸａａ１がグリシンであり、Ｘａａ２がグルタミンであり、Ｘａａ３がセリンであり、Ｘａａ４がアスパラギンであり、Ｘａａ５がロイシンであり、Ｘａａ６がチロシンであり、Ｘａａ７がアスパラギンであり、配列番号４のＢ鎖でＸａａ８がチロシンであり、Ｘａａ９がフェニルアラニンであり、Ｘａａ１０はトレオニンであり、Ｘａａ１１はプロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在であってもよいが、これに制限されない。
【００５２】
他の様態で、前記配列番号３のＡ鎖でＸａａ１がグリシンであり、Ｘａａ２がグルタミンであり、Ｘａａ３がセリンであり、Ｘａａ４がグルタミン酸であり、Ｘａａ５がロイシンであり、Ｘａａ６がチロシンであり、Ｘａａ７がアスパラギンであり、配列番号４のＢ鎖でＸａａ８がチロシンであり、Ｘａａ９が不在であり、Ｘａａ１０がトレオニンであり、Ｘａａ１１はプロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在であってもよいが、これに制限されない。
【００５３】
他の様態で、前記配列番号３のＡ鎖でＸａａ１がグリシンであり、Ｘａａ２がグルタミンであり、Ｘａａ３がセリンであり、Ｘａａ４がアラニンであり、Ｘａａ５がロイシンであり、Ｘａａ６がチロシンであり、Ｘａａ７がアスパラギンであり、配列番号４のＢ鎖でＸａａ８がグルタミン酸であり、Ｘａａ９が不在であり、Ｘａａ１０がトレオニンであり、Ｘａａ１１はプロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在であってもよいが、これに制限されない。
【００５４】
好ましい一実施形態によれば、本発明に係るインスリンアナログは下記を含む。
【００５５】
ｉ）インスリンアナログ１：配列番号３で表されるＡ鎖アミノ酸配列の１４番目アミノ酸がグルタミン酸であり、配列番号４で表されるＢ鎖アミノ酸配列の２５番目アミノ酸がフェニルアラニンであるペプチドであって、配列番号１６で記載されるアミノ酸配列を有し、これは配列番号１５で記載される塩基配列を有する核酸からコードされる。
【００５６】
ｉｉ）インスリンアナログ２：配列番号３で表されるＡ鎖アミノ酸配列の１４番目アミノ酸がアスパラギンであり、配列番号４で表されるＢ鎖アミノ酸配列の２５番目アミノ酸がフェニルアラニンであるペプチドであって、配列番号１８で記載されるアミノ酸配列を有し、これは配列番号１７で記載される塩基配列を有する核酸からコードされる。
【００５７】
ｉｉｉ）インスリンアナログ３：配列番号３で表されるＡ鎖アミノ酸配列の１４番目アミノ酸がグルタミン酸であり、配列番号４で表されるＢ鎖アミノ酸配列の２５番目アミノ酸が欠失したペプチドであって、配列番号２０で記載されるアミノ酸配列を有し、これは配列番号１９で記載される塩基配列を有する核酸からコードされる。
【００５８】
ｉｖ）インスリンアナログ４：配列番号３で表されるＡ鎖アミノ酸配列の１４番目アミノ酸がアラニンであり、配列番号４で表されるＢ鎖アミノ酸配列の１６番目アミノ酸配列がグルタミン酸であり、２５番目アミノ酸が欠失されたペプチドであって、配列番号２２で記載されるアミノ酸配列を有し、これは配列番号２１で記載される塩基配列を有する核酸からコードされる。
【００５９】
本明細書でインスリンアナログに関連して使用される用語 、「インビトロ効果」は、インスリンアナログのグルコース吸収能（glucose uptake）を意味するもので、本発明では、脂肪細胞に分化させたマウス由来の３Ｔ３ Ｌ１細胞を対象にグルコース吸収能のＥＣ５０を測定した結果で表される。
【００６０】
発明の好ましい実施例で、前記方法に基づいて、本発明に係るインスリンアナログ１〜３のインビトロ効力を測定した結果、天然型インスリンに比べてインスリンアナログ１は２３８．４％、インスリンアナログ２は２４１．７％、インスリンアナログ３は７０５％のグルコース吸収能を示し、本発明に係るインスリンアナログは、天然型インスリンに比べて２〜７倍に大幅に増加したインビトロ効力を示すことを確認した（表１）。
【００６１】
もう一つの様態として、本発明は、前記インスリンアナログをコードする核酸を提供する。
【００６２】
本発明で用語、「核酸」は、一本鎖または二本鎖の形態で存在するデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）であり、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びこれから転写されるＲＮＡを含む意味を有し、核酸分子で基本的な構成単位であるヌクレオチドは自然のヌクレオチドだけでなく、糖または塩基部位が変形された類似体（analogue）も含む（非特許文献１及び２）。本発明の核酸は、標準分子生物学の技術を用いて分離または製造しうる。例えば、適切なプライマー配列を用いて、天然型インスリン遺伝子配列（NM_000207.2、NCBI）からＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を介して増幅することができ、自動化されたＤＮＡ合成器を用いる標準合成技術を用いて製造しうる。
【００６３】
本発明の核酸は、好ましくは、配列番号１５、１７、１９及び２１で記載される塩基配列を含む。本発明は、配列番号１５、１７、１９及び２１で記載される塩基配列だけでなく、前記配列と７０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性、さらに好ましくは９５％以上の相同性、最も好ましくは９８％以上の相同性を示す配列であって、実質的に核酸がコードしたペプチドがインスリンの生体内受容体に結合してインスリンと同様な生物学的活性を示すものをすべて含む。
【００６４】
本発明で用語、「相同性（homology）」は、天然型（wild type）タンパク質のアミノ酸配列またはそれをコードする塩基配列との類似度を示すためのものであって、本発明のアミノ酸配列または塩基配列と前記のようなパーセント以上の同一配列を有する配列を含む。このような相同性は２つの配列を肉眼で比較して決定してもよいが、比較対象となる配列を並べて相同性の程度を分析してくれる生物情報アルゴリズム（bioinformatic algorithm）を用いて決定してもよい。前記二つのアミノ酸配列間の相同性はパーセントで示してもよい。有用な自動化されたアルゴリズムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Genetics Computer Group、Madison、W、USA）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡとＴＦＡＳＴＡコンピュータソフトウェアモジュールで利用可能である。前記モジュールの自動化された配列アルゴリズムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆ＷｕｎｓｃｈとＰｅａｒｓｏｎ＆ＬｉｐｍａｎとＳｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ配列の配列アルゴリズムを含む。他の有用な配列に対するアルゴリズムと相同性の決定は、ＦＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＰＳＩＢＬＡＳＴとＣＬＵＳＴＡＬ Ｗを含むソフトウェアで自動化されている。
【００６５】
もう一つの様態として、本発明は、前記インスリンアナログをコードする核酸を含む組換えベクターを提供する。本発明に係る組換えベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築されてもよく、原核細胞または真核細胞を宿主細胞にして構築されてもよい。
【００６６】
本発明で用語、「ベクター」とは、適当な宿主細胞で目的タンパク質を発現できる組換えベクターであって、核酸挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須の調節要素を含む核酸構造物（construct）を意味する。本発明は、インスリンアナログをコードする核酸を含む組換えベクターを製造することができるが、前記組換えベクターを宿主細胞に形質転換（transformation）または形質感染（transfection）させることで、本発明のインスリンアナログを収得してもよい。
【００６７】
本発明でインスリンアナログをコードする核酸は、プロモーターに作動可能に連結される。本発明で用語、「作動可能に連結された（operatively linked）」は、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、リボソーム結合部位、転写終結配列など）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これにより前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び/または解読を調節することになる。
【００６８】
本発明で用語、「プロモーター」は、ポリメラーゼに対する結合部位を含み、プロモーター下流遺伝子のｍＲＮＡへの転写開始活性を有するコーディング領域の上位（upstream）の非解読された核酸配列、すなわち、ポリメラーゼが結合して遺伝子の転写を開始するようにするＤＮＡ領域をいい、ｍＲＮＡ転写開始部位の５’部位に位置する。
【００６９】
例えば、本発明のベクターが組換えベクターであり、原核細胞を宿主とする場合に、転写を進行させうる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、 ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボゾーム結合部位及び転写/解読終結配列を含むことが一般的である。
【００７０】
また、本発明に用いられてもよいベクターは、当業界でよく用いるプラスミド（例えば、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８/９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４ 、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ、ｐＰＩＣＺαシリーズ、ｐＵＣ１９など）、ファージ（例えば、λｇｔ４・λＢ、λ-Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１及びＭ１３など）またはウイルス（例えば、ＳＶ４０など）を操作して製作されうる。
【００７１】
一方、本発明のベクターが組換えベクターであり、真核細胞を宿主とする場合に、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクチンウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター及びＨＳＶのｔｋプロモーター）が用いられてもよく、転写終結配列としてポリアデニル化配列（例えば、ウシ成長ホルモンターミネーター及びＳＶ４０由来ポリアデニル化配列）を一般的に有する。
【００７２】
また、本発明の組換えベクターは、選択マーカーとして当業界で通常的に用いられる抗生物質耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子が用いられてもよい。
【００７３】
本発明の組換えベクターは、回収される目的タンパク質、すなわち、単鎖インスリンアナログ、プロインスリンまたはインスリンアナログの精製を容易にするために、必要に応じて他の配列をさらに含んでもよい。前記さらに含まれてもよい配列は、タンパク質精製用タグ配列であってもよく、例えば、グルタチオンＳ‐トランスフェラーゼ（Pharmacia、USA）、マルトース結合タンパク質（NEB、USA）、ＦＬＡＧ（IBI、USA）及び６つのヒスチジン（hexahistidine）などがあるが、前記例によって目的タンパク質の精製のために必要な配列の種類が制限されるものではない。
【００７４】
前記のようなタグ配列を含む組換えベクターによって発現された融合タンパク質は、アフィニティー・クロマトグラフィーによって精製されてもよい。例えば、グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼが融合した場合には、この酵素の基質であるグルタチオンを用いてもよく、６つのヒスチジンタグが用いられた場合には、Ｎｉ‐ＮＴＡカラムを用いて、必要な目的のタンパク質を容易に回収してもよい。
【００７５】
もう一つの様態として、本発明は、前記インスリンアナログをコードする核酸を含む組換えベクターで形質転換された形質転換体を提供する。
【００７６】
本発明で用語、「形質転換（transformation）」とは、ＤＮＡを宿主細胞内に導入してＤＮＡが染色体の因子として、または染色体統合完成によって複製可能になることで、外部のＤＮＡを細胞内に導入して人為的に遺伝的な変化を起こす現象を意味する。
【００７７】
本発明の形質転換方法は、任意の形質転換方法が用いられてもよく、当業界の通常の方法によって容易に行ってもよい。一般的に、形質転換の方法は、ＣａＣｌ２沈殿法、ＣａＣｌ２沈殿法にＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）と呼ばれる還元物質を用いることで、効率を高めたＨａｎａｈａｎ方法、電気穿孔法（electroporation）、リン酸カルシウム沈殿法、原形質融合法、シリコンカーバイド繊維を用いた攪拌法、アグロバクテリア媒介形質転換法、ＰＥＧを用いた形質転換法、デキストラン硫酸、リポフェクタミン及び乾燥/抑制媒介された形質転換法などがある。
【００７８】
本発明に係るインスリンアナログをコードする核酸を含む組換えベクターを形質転換させるための方法は、前記例に限定されず、当業界で通常に用いられる形質転換または形質感染方法が制限なく用いられてもよい。
【００７９】
目的核酸であるインスリンアナログをコードする核酸を含む組換えベクターを宿主細胞内に導入することにより、本発明の形質転換体（transformant）を獲得してもよい。
【００８０】
本発明に適した宿主は、本発明の核酸を発現するようにする限り、特に制限されない。本発明に用いられてもよい宿主の特定の例としては、大腸菌（E. coli）のようなエシェリキア（Escherichia）属細菌；バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）のようなバチルス（Bacillus）属細菌；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）のようなシュードモナス（Pseudomonas）属細菌；ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、 シゾサッカロミセス・ポンベ （Schizosaccharomyces pombe）のような酵母；スポドプテラ・フルギペルダ（ＳＦ９）のような昆虫細胞；と及びＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＳＣなどのような動物細胞がある。好ましくは、宿主細胞に大腸菌を用いる。
【００８１】
発明の好ましい実施例では、本発明に係るインスリンアナログ１〜４をそれぞれコードする核酸配列をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）で増幅した後、そこから増幅された遺伝子断片をｐＥＴ２２ｂベクター（Novagen）にクローニングした。インスリンアナログを細胞内封入体形態で発現させるためにｐＥＴ２２ｂベクターを制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで処理して、信号配列を除去し、インスリンアナログのＰＣＲ増幅産物を同じ制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理して分離された個々のＤＮＡをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて、ｐＥＴ２２ｂクローニングベクターに挿入した。前記結果として得られた発現ベクターを、それぞれｐＥＴ２２ｂ‐インスリンアナログ１〜４と命名した。
【００８２】
前記発現ベクターｐＥＴ２２ｂ‐インスリンアナログ１〜４は、Ｔ７プロモーターの調節下にそれぞれ配列番号１６、１８、２０及び２２のアミノ酸配列を暗号化し、宿主細胞内でそれぞれのインスリンアナログペプチドを封入体の形態で発現させた。
【００８３】
配列番号１６、１８、２０及び２２のインスリンアナログをコードする核酸を含む組換えベクターｐＥＴ２２ｂ‐インスリンアナログ１〜４をそれぞれ大腸菌に形質転換させて、これらを封入体形態で発現する形質転換体を収得した。
【００８４】
もう一つの様態として、本発明は、前記形質転換体を用いてインスリンアナログを製造する方法を提供する。
【００８５】
好ましくは、本発明に係る方法は、
ａ）インスリンアナログをコードする核酸を含む組換え発現ベクターを製造する段階；
ｂ）前記組換え発現ベクターを宿主細胞に形質転換して形質転換体を収得する段階；
ｃ）前記形質転換体を培養して、インスリンアナログを発現させる段階；及び
ｄ）発現されたインスリンアナログを分離及び精製する段階を含む、インスリンアナログの製造方法を提供する。
【００８６】
本発明で形質転換体の培養に用いられる培地は、適切な方法で宿主細胞培養の要件を満たす必要がある。宿主細胞の生長のために培地中に含まれてもよい炭素源は、製造された形質転換体の種類に応じて、当業者の判断により適宜選択されてもよく、培養時期及び量を調節するために適した培養条件を採用してもよい。
【００８７】
使用されてもよい糖源には、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油のような油及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これらの物質は、個別または混合物として使用されてもよい。
【００８８】
使用されてもよい窒素源には、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆、小麦、及び尿素または無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も、個別または混合物として使用されてもよい。
【００８９】
使用されてもよいリン源には、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム含有塩が含まれる。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有してもよい。
【００９０】
最後に、前記物質に加えて、アミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が使用されてもよい。また、培養培地に適切な前駆体が使用されてもよい。前記された原料は、培養中に培養物に適切な方法によって回分式または連続式で添加してもよい。水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような塩基性化合物またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切な方法で用いて培養物のｐＨを調節してもよい。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよい。好気状態を維持するために培養物内に酸素または酸素含有ガス（例えば、空気）を注入する。
【００９１】
本発明に係る形質転換体の培養は、通常２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃の温度で行われる。また、培養は所望のインスリンアナログの生成量が最大に得られるまで継続されるが、このような目的のために培養は、通常、１０〜１６０時間持続してもよい。
【００９２】
前述したように、宿主細胞に応じて適切な培養条件を組成すると、本発明に係る形質転換体はインスリンアナログを生産することになり、ベクターの構成及び宿主細胞の特徴に基づいて生産されたペプチド‐Ｎ‐グリコシダーゼは宿主細胞の細胞質内、原形質膜空間（periplasmic space）または細胞外に分泌されてもよい。
【００９３】
宿主細胞内または外で発現されたタンパク質は、通常の方法で精製されてもよい。精製方法の例としては、塩析（例えば、硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（例えば、アセトン、エタノールなどを用いたタンパク質画分沈殿など）、透析、ゲルろ過、イオン交換、逆相カラムクロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー及び限外ろ過などの技法を単独または組み合わせて適用してもよい。
【００９４】
本発明の形質転換体は、それに導入された組換えベクターｐＥＴ２２ｂ‐インスリンアナログ１〜３がＴ７プロモーターの調節下でインスリンアナログ１〜３を封入体形態で発現させることを特徴とする。したがって、封入体形態で発現されたインスリンアナログ１〜３を、適切な方法により、可溶性の形態に変更した後、分離、精製過程を経ることが望ましい。
【００９５】
発明の好ましい実施例では、形質転換体から封入体形態で発現されたインスリンアナログを分離及び精製するために下記段階をさらに含んでもよい。
【００９６】
ｄ‐１）培養液から形質転換体細胞を収穫して破砕する段階；
ｄ‐２）破砕された細胞溶解物から発現されたインスリンアナログペプチドを回収してリフォールディングする段階；
ｄ‐３）リフォールディングされたインスリンアナログペプチドを陽イオン交換クロマトグラフィーで精製する段階；
ｄ‐４）精製されたインスリンアナログペプチドをトリプシン及びカルボキシぺプチダーゼＢで処理する段階；
ｄ‐５）処理されたインスリンアナログペプチドを陽イオン交換クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーで順次的に精製する段階 。
【００９７】
もう一つの様態として、本発明は、前記インスリンアナログを含む糖尿病の治療用薬学的組成物を提供する。
【００９８】
本発明に係るインスリンアナログを含む薬学的組成物は、薬剤学的に許容可能な担体を含んでもよい。薬剤学的に許容される担体は、経口投与時に結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素及び香料などを用いてもよく、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤及び安定化剤などを混合して用いてもよく、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤及び保存剤などを使用してもよい。本発明の薬学的組成物の剤形は、上述したような薬剤学的に許容される担体と混合して多様に製造してもよい。例えば、経口投与の際には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、サスペンション、シロップ及びウエハーなどの形態で製造してもよく、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多数回投薬形態で製造してもよい。その他にも溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル及び徐放性製剤などで剤形化してもよい。
【００９９】
一方、製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシア、アルギン酸、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムまたは鉱物油などが用いられてもよい。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤などをさらに含んでもよい。
【０１００】
もう一つの様態として、本発明は、前記インスリンアナログまたはこれを含む薬学的組成物を、これを必要とする個体に投与する段階を含む、糖尿病の治療方法を提供する。
【０１０１】
本発明に係るインスリンアナログは、天然型インスリンに比べて著しく増加したインビトロ効力を示すため、前記インスリンアナログまたはこれを含む薬学的組成物を投与することにより、糖尿病の治療を図ることができる。
【０１０２】
本発明では、「投与」は、任意の適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記結合体の投与経路は薬物が目的の組織に到達することができる限り、いかなる一般的な経路を通じて投与されてもよい。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などになってもよいが、これらに限定されない。しかし、経口投与時のペプチドは消化されるため、経口用組成物は活性薬剤をコーティングしたり、胃での分解から保護されるように剤形化することが望ましい。好ましくは注射剤の形態で投与されてもよい。また、薬学的組成物は、有効成分が標的細胞に移動しうる任意の装置によって投与されてもよい。
【０１０３】
また、本発明の薬学的組成物は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別、体重及び疾患の重等度などのいくつかの関連因子と一緒に、有効成分である薬物の種類に応じて決定される。本発明の薬学的組成物は、生体内持続性及び力価が優れているため、本発明の薬学的組成物の投与回数及び頻度を著しく減少させることができる。
【発明の効果】
【０１０４】
本発明に係るインスリンアナログは、天然型インスリンに比べて著しく増加したインビトロ効力を示すため、少量の投与だけでも十分な治療効果が期待でき、糖尿病の治療に非常に有用に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】本発明に係るインスリンアナログの純度をタンパク質電気泳動で分析した結果であって、代表的にインスリンアナログ１の結果である。  レーン１：サイズマーカー  レーン２：インスリンアナログ１
【図２】本発明に係るインスリンアナログの純度を、逆相クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーで分析した結果であって、代表的にインスリンアナログ１の結果である。
【図３】本発明に係るインスリンアナログのペプチドマップ化分析結果であって、代表的にインスリンアナログ１の結果である。図３で「ＵＳＰインスリン」は、対照群として用いた天然型インスリンを意味する。
【発明を実施するための形態】
【０１０６】
以下、下記実施例により本発明をより詳細に説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。
【０１０７】
実施例１：インスリンアナログ発現ベクターの作製
天然型インスリンのＡ鎖及び/またはＢ鎖のアミノ酸を変形させたインスリンアナログを作製するために、その変形が導入されたインスリンアナログの増幅のための正方向及び逆方向プライマーペアを合成した後、プロインスリンｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。このとき、鋳型としては、プロインスリンｃＤＮＡ（SC128255、OriGene）（参照配列：ＢＣ００５２５５．１及びＡＡＨ０５２５５）がｐＥＴ２２ｂベクター（Novagen）にクローニングされたものを用い、インスリンの円滑な組換え発現のためにクローニングされたプロインスリンｃＤＮＡのＮ末端に融合パートナー（N-terminal fusion partner）としてＭｅｔ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｒｇのアミノ酸配列（配列番号２４）をコードする配列番号２３の塩基配列（ＡＴＧ ＧＣＡ ＡＣＡ ＡＣＡ ＴＣＡ ＡＣＡ ＧＣＡ ＡＣＴ ＡＣＧ ＣＧＴ）を挿入した。
【０１０８】
具体的には、本発明では、下記表１に示したようなアミノ酸配列の変形を含むインスリンアナログを合成した。
【０１０９】
【表１】
2018526001.tif 000007
【０１１０】
前記表１で、インスリンアナログ１は、配列番号１で表される天然型インスリンのＡ鎖アミノ酸配列で１４番目のアミノ酸であるチロシンのグルタミン酸への置換を含むものであり、
インスリンアナログ２は、配列番号１で表される天然型インスリンのＡ鎖アミノ酸配列で１４番目のアミノ酸であるチロシンのアスパラギンへの置換を含むものであり、
インスリンアナログ３は、配列番号１で表される天然型インスリンのＡ鎖アミノ酸配列で１４番目のアミノ酸であるチロシンのグルタミン酸への置換と配列番号２で表される天然型インスリンのＢ鎖アミノ酸配列で２５番目のアミノ酸であるフェニルアラニンの欠失を含むものである。
【０１１１】
インスリンアナログ４は、配列番号１で表される天然型インスリンのＡ鎖アミノ酸配列で１４番目のアミノ酸であるチロシンのアラニンへの置換と配列番号２で表される天然型インスリンのＢ鎖アミノ酸配列で１６番目のアミノ酸であるチロシンのグルタミン酸への置換と、２５番目のアミノ酸であるフェニルアラニンの欠失を含むものである。
【０１１２】
前記インスリンアナログ１〜３の増幅のために設計されたそれぞれの正方向及び逆方向プライマーペアを下記表２に示した。
【０１１３】
【表２】
2018526001.tif 000008
【０１１４】
前記表２で、配列番号５及び６のプライマーペアは、天然型インスリンのＡ鎖アミノ酸配列で１４番目のアミノ酸であるチロシンをグルタミン酸に置換するためのものであり、配列番号７及び８のプライマーペアは、天然型インスリンのＡ鎖アミノ酸配列で１４番目のアミノ酸であるチロシンをアスパラギンに置換するためのものであり、配列番号９及び１０のプライマーペアは、天然型インスリンのＢ鎖アミノ酸配列で２５番目のアミノ酸であるフェニルアラニンを欠失させるためのものであり、配列番号１１及び１２のプライマーペアは、天然型インスリンのＡ鎖アミノ酸配列で１４番目のアミノ酸であるチロシンをアラニンに置換するためのものであり、配列番号１３及び１４のプライマーペアは、天然型インスリンのＢ鎖アミノ酸配列で１６番目のアミノ酸であるチロシンをグルタミン酸に置換するものである。
【０１１５】
該当変形を含むインスリンアナログ増幅のためのＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ １５０ｎｇ、１００ｐＭプライマーそれぞれ１ｍｌずつ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ５ｍｌ、ｐｆｘポリメラーゼ１０単位（Invitrogen社、USA）及び１０×緩衝液を混合して反応溶液を製造し、９５℃で３０秒間の初期変性に続いて９５℃で３０秒、５５℃で３０秒及び６８℃で６分のアニーリング過程を１８回繰り返した後、最後に６８℃で５分間反応させた。これから収得したＰＣＲ増幅産物をゲル抽出キット（キアゲン、ドイツ）を用いて抽出した後、制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理して挿入切片を製造した。続いて、ｐＥＴ２２ｂベクター（Novagen、USA）を同一の制限酵素で切断し、同一のゲル抽出キットを用いて抽出した。このように用意されたベクターに前記挿入切片をＴ４リガーゼを用いて連結させて発現ベクターｐＥＴ２２ｂ‐インスリンアナログ１〜４を製造した。前記発現ベクターは、Ｔ７プロモーターの調節下でインスリンアナログ１〜４のアミノ酸配列をコードする核酸を含み、宿主内でインスリンアナログのタンパク質を封入体形態で発現させうる。
【０１１６】
これから収得された本発明に係る発現ベクターｐＥＴ２２ｂ‐インスリンアナログ１は配列番号１５で記載される塩基配列を有する核酸を含み、これは配列番号１６で記載されるアミノ酸配列を有するインスリンアナログをコードし、発現ベクターｐＥＴ２２ｂ‐インスリンアナログ２は、配列番号１７で記載される塩基配列を有する核酸を含み、これは配列番号１８で記載されるアミノ酸配列を有するインスリンアナログをコードし、発現ベクターｐＥＴ２２ｂ‐インスリンアナログ３は、配列番号１９で記載される塩基配列を有する核酸を含み、これは配列番号２０で記載されるアミノ酸配列を有するインスリンアナログをコードし、発現ベクターｐＥＴ２２ｂ‐インスリンアナログ４は、配列番号２１で記載される塩基配列を有する核酸を含み、これは配列番号２２で記載されるアミノ酸配列を有するインスリンアナログをコードする。
【０１１７】
下記表３にそれぞれのインスリンアナログ１〜４のＤＮＡ配列及びタンパク質配列を示した。
【０１１８】
【表３】
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【０１１９】
【表４】
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【０１２０】
実施例２：組換えインスリンアナログの発現
Ｔ７プロモーターの調節下で、本発明に係るインスリンアナログの組換え発現を下記のように行った。前記実施例１で製造されたそれぞれのインスリンアナログ発現ベクターに大腸菌ＢＬ２１‐ＤＥ３（E. coli B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-) gal λDE3)(Novagen, USA)を形質転換した。形質転換は、前記大腸菌ＢＬ２１‐ＤＥ３のメーカーであるＮｏｖａｇｅｎで推奨する方法に従って行われた。インスリンアナログ発現ベクターが形質転換された個々の単一コロニーをとり、５０μｇ/ｍｌのアンピシリン含有２×ＬＢ（Luria Broth、LB）培地に接種した後、３７℃で１５時間培養した。組換え菌株の培養液と３０％グリセロールを含む２ｘＬＢ培地を１：１（ｖ/ｖ）の割合で混合して、各１ｍｌずつクライオチューブ（cryo-tube）に分注して、-１４０℃で保管した。これを本発明に係るインスリンアナログの組換え生産のための細胞ストック（cell stock）として用いた。
【０１２１】
本発明に係るインスリンアナログの組換え発現のために、各細胞ストック１バイアルを溶かし、５００ｍｌの２×ＬＢ培地に接種し、３７℃で１４〜１６時間振とう培養した。ＯＤ６００の値が５．０以上を示すと培養を終了し、これを種培養液として用いた。５０Ｌ発酵器（MSJ-U2、B.E. MARUBISHI、日本）を用いて、種培養液を１７Ｌの発酵培地に接種し、初期バス（bath）発酵を開始した。培養条件を温度３７℃、空気量２０Ｌ/分（１ｖｖｍ）、及び攪拌速度５００ｒｐｍに設定し、３０％アンモニア水を使用してｐＨを６．７に維持させた。発酵の進行は、培養液内の栄養素が制限されたとき、追加の培地（feeding solution）を添加して、流加培養を行った。ＯＤ値により菌株の成長をモニタリングし、ＯＤ値が１００以上に達した場合、最終的な濃度５００μＭのＩＰＴＧ（isopropyl-beta-D-thiogalactoside）を導入した。培養はＩＰＴＧ導入後、約２３〜２５時間までさらに進行して、培養終了後、遠心分離器を使用して組換え菌株を収穫し、これを以後の使用時まで-８０℃で保管した。
【０１２２】
実施例３：組換えインスリンアナログの分離及び精製
前記実施例２で形質転換体から発現させた組換えインスリンアナログを分離、精製するために、まず不溶性封入体形態で発現されたインスリンアナログを可溶性形態に変えるため、下記のように細胞を破砕してリフォールディングを行った。
【０１２３】
＜３−１＞組換えインスリンアナログの回収及びリフォールディング
具体的に、細胞ペレット１００ｇ（wet weight）を１Ｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ ９．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）、０．２Ｍ ＮａＣｌ及び０．５％トリトンＸ-１００）に再浮遊した後、微細溶液化（microfluidizer）プロセッサーＭ-１１０ＥＨ（AC Technology Corp. Model M1475C）を用いて１５，０００ｐｓｉの圧力を加えて細胞を破砕した。破砕された細胞溶解物を７，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離して上澄液を捨て、３Ｌの洗浄緩衝液（０．５％トリトンＸ-１００及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、０．２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再浮遊した。７，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離してペレットを蒸留水に再浮遊した後、同様の方法で遠心分離した。このことからペレットをとり、４００ｍｌの緩衝液（１Ｍ グリシン、３．７８ｇ システイン-ＨＣｌ、ｐＨ １０．６）に再浮遊した後、常温で１時間攪拌した。再浮遊された遺伝子組換えインスリンアナログを回収するために、４００ｍｌの８Ｍ尿素を追加した後、４０℃で１時間撹拌した。可溶化された組換えインスリンアナログのリフォールディング（refolding）のために７，０００ｒｐｍで４℃で３０分間遠心分離した後、上澄液を取り、ここで７．２Ｌの蒸留水を連動ポンプ（peristaltic pump）を用いて、１０００ｍｌ/時間の流速で添加し、４℃で１６時間攪拌した。
【０１２４】
＜３−２＞陽イオン交換クロマトグラフィー精製
４５％エタノールを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．０）で平衡化された陽イオン交換カラム（Source S、GE Healthcare社）に、前記実施例＜３−１＞でリフォールディングが終結した試料をローディングして結合させた。続いて塩化カリウム０．５Ｍと４５％エタノールを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．０）を用いて濃度が０％→１００％になるように１０ｘカラム容量の線形濃度勾配でインスリンアナログのタンパク質をカラムから溶出した。
【０１２５】
＜３−３＞トリプシン及びカルボペプチダーゼＢの処理
前記実施例＜３−２＞で脱塩カラム（Desalting column）で溶出された試料から塩を除去し、緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ ８．０）に交換した。得られた試料のタンパク質の量の１０００モル比に該当するトリプシン（trypsin）と２０００モル比に該当するカルボペプチダーゼ（carboxypeptidase）Ｂを添加した後、１６℃で１６時間攪拌した。１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．０）を用いてｐＨを３．５に下げて反応を終結した。
【０１２６】
＜３−４＞ 陽イオン交換クロマトグラフィー精製
前記実施例＜３−３＞で反応が終結した試料を４５％エタノールを含む20ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．０）で平衡化された陽イオン交換カラム（Source S、GE Healthcare社）に再びローディングして結合させた。続いて塩化カリウム０．５Ｍと４５％エタノールを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．０）を用いて濃度が０％→１００％になるように１０ｘカラム容量の線形濃度勾配でインスリンアナログのタンパク質をカラムから溶出した。
【０１２７】
＜３−５＞陰イオン交換クロマトグラフィー精製
前記実施例＜３−４＞で脱塩カラムで溶出された試料から塩を除去し、緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ７．５）に交換した。これから収得された試料で純粋なインスリンアナログを分離するために、１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化された陰イオン交換カラム（Source Q、GE Healthcare社）にローディングして結合させた。続いて、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて濃度が０％→１００％になるように１０ｘカラム容量の線形濃度勾配でインスリンアナログのタンパク質をカラムから溶出した。
【０１２８】
精製されたインスリンアナログの純度は、タンパク質電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）と、逆相及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析し、前記結果をそれぞれ図１及び２に示した。また、アミノ酸の変形は、ペプチドマップ化（mapping）と各ピークの分子量分析を通じて確認し、これは図３に示した。
【０１２９】
その結果、それぞれのインスリンアナログが目的とすることにより、アミノ酸配列が変形されたことが確認できた。
【０１３０】
実施例４：天然型インスリンとインスリンアナログのインビトロ効力の比較
前記実施例３で分離、精製されたインスリンアナログのインビトロ効力を測定するために、脂肪細胞に分化させたマウス由来の３Ｔ３‐Ｌ１細胞株を用いたグルコース吸収能（glucose uptake、または脂質合成能）試験を実施した。３Ｔ３‐Ｌ１細胞株（ATCC、CL-173）を１０％ＮＢＣＳ（新生仔牛血清）を含むＤＭＥＭ（Dulbeco's Modified Eagle's Medium、Gibco、Cat.No、12430）培地を用いて、週２〜３回継代培養し維持した。３Ｔ３‐Ｌ１細胞株を分化用培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）に懸濁した後、４８ウェルプレートにウェル当たり５×１０４細胞となるように接種した後、３７℃で４８時間培養した。脂肪細胞への分化のために分化用培地に１μｇ/ｍｌのヒトインスリン（Sigma, Cat. No. I9278）、０．５ｍＭ ＩＢＭＸ（3-isobutyl-1-methylxanthine, Sigma, Cat. No.I5879）、１μＭデキサメタゾン（Dexamethasone、Sigma, Cat. No. D4902）を混合し、既存の培地を除去した後、ウェル当たり２５０μｌずつ添加した。４８時間後、分化用培地に１μｇ/ｍｌのヒトインスリンのみを添加した培地に再度交換した。以後、４８時間ごとに１μｇ/ｍｌのヒトインスリンを添加した分化用培地に交換しながら７〜９日間、脂肪細胞への分化が誘導されることを確認した。
【０１３１】
グルコース吸収能試験のために、脂肪細胞への分化が終結された細胞を無血清ＤＭＥＭ培地で１回水洗した後、２５０μｌずつ入れ、４時間血清枯渇を誘導した。
【０１３２】
ヒトインスリンとインスリンアナログを５μＭから０．００５ｎＭまで無血清ＤＭＥＭ培地で１０倍に順次希釈して準備した。用意されたインスリン試料を細胞にそれぞれ２５０μｌずつ添加した後、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２培養器で培養した。培養が終わった培地のグルコース残量を測定するために、２００μｌの培地を取って、Ｄ‐ＰＢＳでそれぞれ５倍希釈した後、ＧＯＰＯＤ分析（GOPOD Assay Kit、Megazyme、Megazyme, Cat. No. K-GLUC）を行った。グルコース標準溶液の吸光度を基準に培地の残りのグルコース濃度を換算し、インスリンアナログのグルコース吸収能のＥＣ５０をそれぞれ算出し、下記表４に示した。
【０１３３】
【表５】
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【０１３４】
表４に示したように、天然型ヒトインスリンと比べて、本発明に係るインスリンアナログ１は２３８．４％、インスリンアナログ２は２４１．７％、及びインスリンアナログ３は７０５％の増加されたグルコース吸収能が観察された。
【０１３５】
前記の結果から、本発明に係るインスリンアナログのインビトロ効力が天然型インスリンと比較して２〜７倍に大幅に増加することが確認され、これは前記インスリンアナログが、実際の生体内で血中半減期が大幅に増加して安定的なインスリン製剤として提供されることができ、糖尿病治療薬として効果的に用いられることを示唆する。
【０１３６】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施できることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解するべきである。本発明の範囲は、前記の詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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