(57)【要約】本発明は、リソソーム酵素補充療法の結果として発生する、中和抗体のような中和因子を含む、リソソーム酵素の細胞取り込みを防止する因子について体液または組織をスクリーニングするための細胞ベースの方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のリソソーム酵素（ＬＥ）特異的中和因子を検出するための方法であって、
（ａ）体液試料を、検出部分と共役するリソソーム酵素と接触させて、前記体液試料中のＬＥ特異的中和因子を検出するステップであって、前記ＬＥ特異的中和因子及びリソソーム酵素検出部分が複合体を形成する、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記ＬＥ特異的因子／リソソーム酵素複合体を、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）を含む細胞と接触させるステップと、
（ｃ）前記細胞の内部または前記細胞の表面上において前記検出部分で標識された前記リソソーム酵素の存在を判定することにより、前記体液試料からＬＥ特異的中和因子の存在を判定するステップと、を含む、方法。
【請求項２】
前記体液試料が、対象からのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象が、酵素補充療法を受けている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
対象中のリソソーム酵素（ＬＥ）特異的中和因子の存在を判定するための方法であって、
（ａ）前記対象からの体液試料を、検出部分と共役するリソソーム酵素と接触させて、前記体液試料中のＬＥ特異的中和因子を検出するステップであって、前記ＬＥ特異的中和因子及びリソソーム酵素検出部分が複合体を形成する、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記ＬＥ特異的中和因子／リソソーム酵素複合体を、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）を含む細胞と接触させるステップと、
（ｃ）前記細胞の内部または前記細胞の表面上において前記検出部分で標識された前記リソソーム酵素を検出することにより、前記体液試料からＬＥ特異的中和因子の存在を判定するステップであって、少量の検出可能なＬＥ−検出部分共役体が、前記試料中のＬＥ特異的中和因子の存在を示す、ステップと、を含む、方法。
【請求項５】
前記体液及びリソソーム酵素−検出部分共役体を、細胞との接触前に、同じ溶液中で共に接触させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
対象中のリソソーム酵素（ＬＥ）特異的中和因子によるリソソーム酵素活性の阻害パーセントを判定するための方法であって、
（ａ）前記対象からの体液試料を、ＬＥ共役磁気ビーズと接触させるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記ＬＥ特異的中和因子／ＬＥビーズを、検出部分と共役する前記リソソーム酵素を含む組成物と接触させて、ＬＥ特異的中和因子を検出するステップと、
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせを、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）を含む細胞と接触させるステップと、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の組み合わせからＬＥ特異的中和因子の存在を判定し、捕捉されたＬＥ特異的中和因子のレベルを、既知量のＬＥ特異的中和抗体を有する対照試料と比較して、前記体液試料中の中和因子によるＬＥ活性の阻害パーセントを判定するステップと、を含む、方法。
【請求項７】
前記体液試料中のＬＥ特異的中和因子のレベルが、前記細胞の内部または前記細胞の表面上において前記検出部分で標識された前記リソソーム酵素の存在を判定することにより判定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
対照と比較して前記体液試料の存在下での検出の低減したレベルが、前記体液試料がＬＥ取り込みを阻害する中和因子を含有することを示す、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記体液、リソソーム酵素−ビーズ共役体、及びリソソーム酵素−検出部分共役体を、細胞との接触前に、同じ溶液中で共に接触させる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記体液、リソソーム酵素−ビーズ共役体、及びリソソーム酵素−検出部分共役体を、細胞との接触前に、少なくとも約６時間にわたり共に接触させる、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記リソソーム酵素−検出部分共役体のモル濃度が、前記リソソーム酵素−ビーズ共役体のモル濃度とほぼ同じであるかまたはこれより低い、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記リソソーム酵素−ビーズ共役体及びリソソーム酵素−検出部分共役体が、ほぼ等モル比で使用される、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出が、フローサイトメトリーによる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料を、前記ＬＥ−検出部分共役体と、少なくとも約６時間にわたり接触させる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料を、少なくとも６時間にわたり約４℃で放置する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料を、前記細胞と、約３時間にわたり接触させる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記試料を、少なくとも３時間にわたり約３７℃で放置する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記検出限界が、約５００ｎｇ／ｍＬ未満である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記検出限界が、約１００ｎｇ／ｍＬ未満である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出限界が、約１．７ｎｇ／ｍＬ〜約８．５ｎｇ／ｍＬである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
対象中のＬＥ特異的抗体を、ヒト、カニクイザル、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ラット、及びマウスからなる群から選択される種から検出することができる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記種が、ヒトである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記体液が、血清である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記リソソーム酵素が、Ｎ−アセチルガラクトサミン６−スルファターゼ（ｒｈＧＡＬＮＳ）、Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、及び酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）からなる群から選択される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記リソソーム酵素が、Ｎ−アセチルガラクトサミン６−スルファターゼ（ｒｈＧＡＬＮＳ）である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記検出限界が、約４５μｇ／ｍＬ以下である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記検出部分が、フルオロフォアである、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記中和因子が、中和抗体である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記中和因子が、中和抗体であり、前記検出部分が、フルオロフォアである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
第１の洗浄ステップが、ステップ（ａ）後に行われ、第２の洗浄ステップが、ステップ（ｂ）後に行われる、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
請求項５のステップ（ｃ）後に行われる洗浄ステップを任意で含む、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、本明細書に参照により組み込まれる、２０１５年１１月６日に出願された、米国仮出願第６２／２５２，１８１号の優先権利益を主張する。
【０００２】
本発明は、酵素補充療法の一部として投与されたリソソーム酵素の細胞取り込みを中和する因子について体液または組織をスクリーニングするための細胞ベースの方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ムコ多糖症（ＭＰＳ）（Ｋｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔｅｒｎａｔ  Ｐｅｄｉａｔｒ．９：４０−４８（１９９４）、Ｓｔａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ＆  Ｄｉｓｅａｓｅ  １：１６５−１７６（１９９４）を含む、リソソーム蓄積症は、酵素または酵素の組み合わせの欠損により引き起こされる。これらのリソソーム蓄積症は、多くの場合、未分解のグリコサミノグリカン、または「蓄積物質」のリソソーム内蓄積、グリコサミノグリカンの過剰な尿中排泄、進行性の精神及び身体機能低下、ならびに早死により特徴付けられる。患者は、通常はリソソーム蓄積障害の目に見える臨床的特性なく生まれるが、進行性臨床的病変を発症する。各タイプの蓄積障害は、特徴的な臓器病変度及び悪化率と共に特異的なリソソーム酵素欠損を有する。Ｍｕｅｎｚｅｒ、Ａｄｖ．Ｐｅｄｉａｔｒｉ．３３：２６９−３０２（１９８６）を参照されたい。多数のリソソーム酵素が同定され、それらの関連疾患と相関付けられている。欠損酵素が同定されれば、治療は、補充酵素を患者の罹患組織に効率的に送達するという単独の課題に整理することができる。
【０００４】
一部の患者は、小児期及び成人期初期の間に疾患関連合併症で死亡する。リソソーム蓄積症を治療する１つの方法は、静脈内酵素補充療法（ＥＲＴ）（Ｋａｋｋｉｓ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  １１（５）：６７５−８５（２００２））による。ＥＲＴは、単一の投与部位からほとんどの組織まで酵素を運搬するのに血管系を利用する。酵素は、広く分布された後、細胞中に取り込まれなければならない。細胞中への取り込みの基礎は、リソソーム酵素の独自の特性において見られ、リソソーム酵素は、末端マンノース残基の第６位でリン酸により定義される別々のクラスの糖タンパク質を構成する。マンノース６−リン酸は、高い親和性及び特異性で、ほとんどの細胞の表面上で見られる受容体により結合される（Ｍｕｎｉｅｒ−Ｌｅｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２４（１）：１３３−６（１９９６）、Ｍａｒｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９９（６）：１９０７−１６（１９８４））。カチオン非依存性マンノース６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）は、血液から組織への酵素の取り込みを誘導した後、リソソームへの細胞内経路決定に影響を与える。リソソーム送達のための別の関連メカニズムは、取り込みを促進するのに同じＣＩ−ＭＰＲ分子の異なる結合領域を利用するグリコシル化非依存性リソソーム標的化ペプチド（ＧＩＬＴ）を伴う。例えば、本明細書に参照により組み込まれる、米国特許第８，８５９，４９８号及び米国特許第８，５６３，６９１号を参照されたい。
【０００５】
酵素補充療法（ＥＲＴ）の実施の潜在的な副作用は、複数回の療法を受ける患者における酵素特異的抗体または他の中和因子の発達である。これらの酵素特異的抗体または他の因子は、臨床的有効性における潜在的な有害事象及び変化、薬物動態プロファイルにおける変化、酵素活性の中和、受容体介在性酵素取り込みへの干渉、ならびに自己タンパク質に対する寛容の破綻を促進し得る。
例えば、エロスルファーゼアルファを含む、様々なリソソーム蓄積障害の治療のための多数のＥＲＴは、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）部分を含有し、内在化及びリソソームへの輸送についてＣＩ−Ｍ６ＰＲ膜貫通受容体に依存する。生物学的療法は、免疫応答を引き出し、薬物製品に結合すること及び、いくつかの場合では、標的細胞上に結合する受容体に干渉することができる抗薬物抗体の発生をもたらし得る。さらに、これらの抗体は、有効性に悪影響を及ぼし得る［Ｂｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．９（２００３）４５０−４５３、Ｄｅｓｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１３（２０１２）３０７−３３５、Ｂａｎｕｇａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｄ．１３（２０１１）７２９−７３６］。臨床試験は、エロスルファーゼアルファで治療されたすべての個体が、薬物特異的総抗体（ＴＡｂ）を発達させたことを示した。薬物特異的抗体のサブセットは、ＣＩ−Ｍ６ＰＲ結合に干渉することができるエロスルファーゼアルファ特異的中和抗体（ＮＡｂｓ）であってよく、その陽性は、ＥＬＩＳＡベースのインビトロアッセイ（ＣＩ−Ｍ６ＰＲ結合アッセイ）を使用して明らかとなった。エロスルファーゼアルファ特異的抗体発達は、臨床試験において治療個体の中で普遍的に見られたが、ＴＡｂ力価またはＮＡｂ陽性とｕＫＳレベルの物理的向上または低下の規模との間の関係は検出されなかった［Ｓｃｈｗｅｉｇｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．３７（２０１５）１０１２−１０２１．ｅ６］。
抗酵素中和因子の発達を正確に測定する信頼できるアッセイは、ＥＲＴを受ける患者における治療レジメンの評価を可能にし、患者療法のより効率的な設計を促進するであろう（Ｍｉｒｅ−Ｓｌｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８９：１−１６（２００４））。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第８，８５９，４９８号明細書
【特許文献２】米国特許第８，５６３，６９１号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔｅｒｎａｔ  Ｐｅｄｉａｔｒ．９：４０−４８（１９９４）
【非特許文献２】Ｓｔａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ＆  Ｄｉｓｅａｓｅ  １：１６５−１７６（１９９４）
【非特許文献３】Ｍｕｅｎｚｅｒ、Ａｄｖ．Ｐｅｄｉａｔｒｉ．３３：２６９−３０２（１９８６）
【非特許文献４】Ｋａｋｋｉｓ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  １１（５）：６７５−８５（２００２）
【非特許文献５】Ｍｕｎｉｅｒ−Ｌｅｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２４（１）：１３３−６（１９９６）
【非特許文献６】Ｍａｒｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９９（６）：１９０７−１６（１９８４）
【非特許文献７】Ｂｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．９（２００３）４５０−４５３
【非特許文献８】Ｄｅｓｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１３（２０１２）３０７−３３５
【非特許文献９】Ｂａｎｕｇａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｄ．１３（２０１１）７２９−７３６
【非特許文献１０】Ｓｃｈｗｅｉｇｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．３７（２０１５）１０１２−１０２１．ｅ６
【非特許文献１１】Ｍｉｒｅ−Ｓｌｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８９：１−１６（２００４）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、リソソーム蓄積障害のための、酵素補充療法を含む、タンパク質治療薬に関連して発達する、抗体のような、中和因子の測定のための特異的な細胞ベースの選択的アッセイの開発に基づく。本開示は、細胞取り込みを阻害することができるＮＡｂの同定及び力価測定のための新規の細胞ベースのフローサイトメトリー方法（機能的ＮＡｂアッセイ）について記載し、この測定が、以前の研究において測定されたような、受容体結合の阻害の測定よりも臨床的に有意義となり得るかを判定する。
【０００９】
本発明の１つの態様は、（ａ）対象からの体液試料を、検出部分と共役するリソソーム酵素と接触させて、体液試料中のＬＥ特異的中和因子を検出するステップであって、ＬＥ特異的中和因子及びリソソーム酵素検出部分が複合体を形成する、ステップと、（ｂ）ステップ（ａ）からのＬＥ特異的因子／リソソーム酵素検出部分複合体を、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）を含む細胞と接触させるステップと、（ｃ）細胞の内部または細胞の表面上において検出部分で標識されたリソソーム酵素の存在を判定することにより、体液試料中のＬＥ特異的中和因子の存在を判定するステップと、を含む、対象（例えば、ヒト）中のリソソーム酵素（ＬＥ）特異的中和因子を検出するための方法である。
【００１０】
（ａ）対象からの体液試料を、検出部分と共役するリソソーム酵素と接触させて、体液試料中のＬＥ特異的中和因子を検出するステップであって、ＬＥ特異的中和因子及びリソソーム酵素検出部分が複合体を形成する、ステップと、（ｂ）ステップ（ａ）からのＬＥ特異的中和因子／リソソーム酵素検出部分複合体を、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）を含む細胞と接触させるステップと、（ｃ）細胞の内部または細胞の表面上において検出部分で標識されたリソソーム酵素の存在を判定することにより、体液試料からのＬＥ特異的中和因子の存在を判定するステップであって、少量の検出可能ＬＥ−検出部分が、試料中のＬＥ特異的中和因子の存在を示す、ステップと、を含む、対象中のリソソーム酵素（ＬＥ）特異的中和因子の存在を判定するための方法も提供される。
【００１１】
様々な実施形態では、体液試料及びリソソーム酵素−検出部分は、細胞との接触前に、同じ溶液中で共に接触させる。
【００１２】
様々な実施形態では、体液試料、リソソーム酵素−検出部分、及び細胞は、例えば、接触が同時に開始する、同じ溶液中で共に接触させる。
【００１３】
本開示は、（ａ）対象からの体液試料を、ＬＥ共役磁気ビーズと接触させるステップと、（ｂ）ステップ（ａ）からの体液試料／ＬＥビーズ組み合わせを、検出部分と共役するリソソーム酵素を含む組成物と接触させて、体液試料中のＬＥ特異的中和因子を検出するステップと、（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせを、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）を含む細胞と接触させるステップと、（ｄ）（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の組み合わせからの体液試料中のＬＥ特異的中和因子の存在を判定し、ＬＥ特異的中和因子のレベルを、既知量のＬＥ特異的中和抗体を有する対照試料と比較して、体液試料中の中和因子によるＬＥ活性の阻害パーセントを判定するステップと、を含む、対象中のリソソーム酵素（ＬＥ）特異的中和因子によるリソソーム酵素活性の阻害パーセントを判定するための方法も提供する。
【００１４】
様々な実施形態では、体液試料中のＬＥ特異的中和因子のレベルは、細胞の内部または細胞の表面上において検出部分で標識されたリソソーム酵素の存在を判定することにより判定される。
【００１５】
様々な実施形態では、対照と比較して体液試料の存在下での検出の低減したレベルは、体液試料がＬＥ取り込みを阻害する中和因子を含有することを示す。
【００１６】
様々な実施形態では、体液試料、リソソーム酵素−ビーズ共役体、及びリソソーム酵素−検出部分共役体は、細胞との接触前に、同じ溶液中で共に接触させる。
【００１７】
様々な実施形態では、体液試料、リソソーム酵素−ビーズ共役体、リソソーム酵素−検出部分共役体、及び細胞はすべて、例えば、接触が同時に開始する、同じ溶液中で共に接触させる。
【００１８】
様々な実施形態では、体液試料及びリソソーム酵素−検出部分共役体は、細胞との接触前に、少なくとも約６時間にわたり共に接触させる。
【００１９】
様々な実施形態では、体液試料、リソソーム酵素−ビーズ共役体、及びリソソーム酵素−検出部分共役体は、細胞との接触前に、少なくとも約６時間にわたり共に接触させる。様々な実施形態では、接触は、少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、または１２時間にわたり行われる。
【００２０】
様々な実施形態では、体液試料は、ＬＥ−検出部分共役体と、少なくとも約６時間にわたり接触させる。様々な実施形態では、接触は、少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、または１２時間とすることができる。様々な実施形態では、体液試料及びＬＥ−検出部分は、少なくとも約６時間にわたり約４℃で接触させる。
【００２１】
様々な実施形態では、体液試料、リソソーム酵素−ビーズ共役体、及びリソソーム酵素−検出部分は、細胞と、約３時間にわたり接触させる。様々な実施形態では、体液試料及びリソソーム酵素−検出部分は、細胞と、約３時間にわたり接触させる。様々な実施形態では、試料は、細胞と、少なくとも３時間にわたり約３７℃で接触させる。様々な実施形態では、細胞との接触は、約３、４、５、または６時間とすることができる。様々な実施形態では、細胞との接触は、約３、３．２５、３．５、３．７５、または４時間にわたる。
【００２２】
様々な実施形態では、リソソーム酵素−検出部分共役体のモル濃度は、リソソーム酵素−ビーズ共役体のモル濃度とほぼ同じであるかまたはこれより低い。様々な実施形態では、リソソーム酵素−ビーズ共役体及びリソソーム酵素−検出部分共役体は、ほぼ等モル比で使用される。
【００２３】
様々な実施形態では、検出は、フローサイトメトリーによる。
【００２４】
様々な実施形態では、細胞は、ＣＩ−ＭＰＲを天然にまたは組換えで発現させる細胞である。様々な実施形態では、細胞は、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞、マクロファージ、ＨｅｐＧ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む、Ｔ細胞である。
【００２５】
様々な実施形態では、検出限界は、約５００ｎｇ／ｍＬ未満、または約１００ｎｇ／ｍＬ未満である。様々な実施形態では、検出限界は、約４５μｇ／ｍＬ以下である。
【００２６】
様々な実施形態では、検出限界は、約１．７ｎｇ／ｍＬ〜約８．５ｎｇ／ｍＬである。
【００２７】
様々な実施形態では、対象中のＬＥ特異的中和因子は、ヒト、カニクイザル、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ラット、及びマウスからなる群から選択される種から検出することができる。様々な実施形態では、種は、ヒトである。様々な実施形態では、ＬＥ特異的中和因子は、中和抗体であり、種は、ヒトである。
【００２８】
様々な実施形態では、体液は、血液、尿、脳脊髄液、血漿、及び血清からなる群から選択される。様々な実施形態では、体液は、血清である。様々な実施形態では、体液試料は、治療用酵素の毎週または隔週投与の直前に回収される。
【００２９】
様々な実施形態では、リソソーム酵素は、Ｎ−アセチルガラクトサミン６−スルファターゼ（ｒｈＧＡＬＮＳ）、Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、及び酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）からなる群から選択される。
【００３０】
様々な実施形態では、酵素は、マンノース６リン酸を通して、またはＩＧＦ−ＩＩ  ＧＩＬＴタグを通して、ＣＩ−ＭＰＲにより取り込まれる。
【００３１】
様々な実施形態では、中和因子は、中和抗体、マンノース６リン酸、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−ＩＩペプチド、ＩＧＦ−ＩＩペプチドアナログ、及び可溶性ＣＩ−ＭＰＲからなる群から選択される。様々な実施形態では、中和因子は、中和抗体である。
【００３２】
様々な実施形態では、中和因子は、中和抗体であり、検出部分は、フルオロフォアである。
【００３３】
様々な実施形態では、検出部分は、フルオロフォアである。方法における使用について考慮される例となるフルオロフォアとしては、これらに限定されないが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、フィコエリトリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＥＣＤ、ＦＩＴＣ、ＦｌｕｏｒＸ（登録商標）、Ｃａｓｃａｄｅ（登録商標）Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）４５０、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６０５ＮＣ、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６２５ＮＣ、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６５０ＮＣ、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６６０、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）７１０、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ（商標）（ＢＶ）フルオロフォアＢＶ４２１、ＢＶ５１０、ＢＶ５７０、ＢＶ６０５、ＢＶ６５０、ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）Ｖ４５０、ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）Ｖ５００、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ローダミン、シアニン、フィコシアニン、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ｏ−フタルデヒド、フルオレサミン、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８、ＰＥ−ＡＰＣ、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰｅｒＣＰ、ＰＥ−ＴＲ、ローダミングリーン、及びロドールグリーン、ならびにこれらのタンデム色素が挙げられる。
【００３４】
様々な実施形態では、第１の洗浄ステップは、ステップ（ａ）後に行われ、第２の洗浄ステップは、ステップ（ｂ）後に行われる。様々な実施形態では、方法は、ステップ（ｃ）後に行われる洗浄ステップを任意で含む。
【００３５】
本明細書において記載されている方法を使用して患者からの試料中のＬＥ中和因子のレベルを測定すること、ならびにＥＲＴの有効性に干渉する中和因子が検出される場合、次に患者に免疫抑制療法を実施すること、及び／または酵素補充療法中に投与される酵素の量を低減することを含む、リソソーム蓄積症を有し、酵素補充療法を受けている患者を治療するための方法も考慮される。
【００３６】
例えば、本明細書では、（ａ）対象からの体液試料を、検出部分と共役するリソソーム酵素と接触させて、体液試料中のＬＥ特異的中和因子を検出することであって、ＬＥ特異的中和因子及びリソソーム酵素検出部分が複合体を形成する、検出することと、（ｂ）ステップ（ａ）からのＬＥ特異的因子／リソソーム酵素検出部分複合体を、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）を含む細胞と接触させることと、（ｃ）細胞の内部または細胞の表面上において検出部分で標識されたリソソーム酵素の存在を判定することにより、体液試料中のＬＥ特異的中和因子の存在を判定することと、（ｄ）ＬＥ特異的中和因子が酵素補充療法の有効性に干渉するかを判定することと、（ｅ）ＬＥ特異的中和因子が酵素補充療法の有効性に干渉する場合に療法レジメンを変更し、任意で対象に免疫抑制薬がさらに投与される、及び／または対象のための酵素補充療法の用量が低減されることと、を含む、リソソーム蓄積症を有し、酵素補充療法を受けている対象を治療するための方法が提供される。
【００３７】
本明細書では、（ａ）対象からの体液試料を、検出部分と共役するリソソーム酵素と接触させて、体液試料中のＬＥ特異的中和因子を検出することであって、ＬＥ特異的中和因子及びリソソーム酵素検出部分が複合体を形成する、検出することと、（ｂ）ステップ（ａ）からのＬＥ特異的中和因子／リソソーム酵素検出部分複合体を、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）を含む細胞と接触させることと、（ｃ）細胞の内部または細胞の表面上において検出部分で標識されたリソソーム酵素を検出することにより、体液試料からＬＥ特異的中和因子の存在を判定することと、（ｄ）ＬＥ特異的中和因子が酵素補充療法の有効性に干渉するかを判定することと、（ｅ）ＬＥ特異的中和因子が酵素補充療法の有効性に干渉する場合に療法レジメンを変更し、任意で対象に免疫抑制薬がさらに投与される、及び／または対象のための酵素補充療法の用量が低減されることと、を含む、リソソーム蓄積症を有し、酵素補充療法を受けている対象を治療するための方法も提供される。
【００３８】
本明細書では、（ａ）対象からの体液試料を、検出部分と共役するリソソーム酵素と接触させて、体液試料中のＬＥ特異的中和因子を検出することであって、ＬＥ特異的中和因子及びリソソーム酵素検出部分が複合体を形成する、検出することと、（ｂ）ステップ（ａ）からのＬＥ特異的中和因子／リソソーム酵素複合体を、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）を含む細胞と接触させることと、（ｃ）細胞の内部または細胞の表面上において検出部分で標識されたリソソーム酵素を検出することにより、体液試料からＬＥ特異的中和因子の存在を判定することと、（ｄ）ＬＥ特異的中和因子が酵素補充療法の有効性に干渉するかを判定することと、（ｅ）ＬＥ特異的中和因子が酵素補充療法の有効性に干渉する場合に療法レジメンを変更し、任意で対象に免疫抑制薬がさらに投与される、及び／または対象のための酵素補充療法の用量が低減されることと、を含む、リソソーム蓄積症を有し、酵素補充療法を受けている対象を治療するための方法も考慮される。
【００３９】
本明細書において考慮されている免疫抑制薬としては、これらに限定されないが、シクロスポリンＡ、ラパマイシン、及びＦＫ５０６のようなカルシニューリン阻害薬、ならびにこれらに限定されないが、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、チオグアニン、シタラビン、メトトレキサート、マイコフェノール酸、または６−（１，３−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−６−メトキシ−７−メチル−３−オキシ−５−イソベンゾフラニル）−４−メチル−４−ヘキサン酸、等、シクロホスファミド、及びクロラムブシルを含む、抗増殖薬が挙げられる。酵素補充療法を受けている対象に対して免疫抑制療法を実施する方法は、例えば、米国特許第７，４８５，３１４号及び第９，０４４，４７３号において開示されている。
【００４０】
本明細書において記載されている、各特性もしくは実施形態、または組み合わせは、本開示の態様のいずれかの非限定的な説明例であり、そのようなものとして、本明細書において記載されている、いずれかの他の特性もしくは実施形態、または組み合わせと組み合わせ可能であることを意味することが理解されている。例えば、特性が「１つの実施形態」、「いくつかの実施形態」、「さらなる実施形態」、「特定の例となる実施形態」、及び／または「別の実施形態」のような言葉で説明される場合、これらのタイプの実施形態の各々は、すべての可能な組み合わせを列挙する必要なく、本明細書において記載されている、いずれかの他の特性、または特性の組み合わせと組み合わされることを意図する特性の非限定的な例である。こうした特性または特性の組み合わせは、本開示の態様のいずれにも適用される。同様に、方法が、特定の特性により特徴付けられる、抗体のような、ポリペプチド結合剤を使用または同定することを説明する場合、それらの特性により特徴付けられるポリペプチド結合剤も、本開示により考慮される。範囲内に該当する値の例が開示される場合、これらの例のいずれも範囲の可能な端点として考慮され、こうした端点間のあらゆるすべての数値が考慮され、上及び下端点のあらゆるすべての組み合わせが想定される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】アッセイ手順の概略図を示す。
【図２Ａ】図２Ａ及び２Ｂは、注入されたｒｈＧＡＬＮＳ（エロスルファーゼアルファ）に対する抗体が患者血清中で検出可能であったことを示す。陽性試料（図２Ａ）は、抗ｒｈＧＡＬＮＳ総抗体（ＴＡｂ）力価（図２Ｂ）に対して比較的低いＮＡｂ力価を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ及び２Ｂは、注入されたｒｈＧＡＬＮＳ（エロスルファーゼアルファ）に対する抗体が患者血清中で検出可能であったことを示す。陽性試料（図２Ａ）は、抗ｒｈＧＡＬＮＳ総抗体（ＴＡｂ）力価（図２Ｂ）に対して比較的低いＮＡｂ力価を示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｃは、Ｍ６Ｐは、Ｊｕｒｋａｔ細胞中へのｒｈＧＡＬＮＳ取り込みの阻害に用量依存性効果を有する（図３Ａ）が、ＩＧＦ−ＩＩは、ｒｈＧＡＬＮＳ取り込みの部分的阻害のみを示す（図３Ｂ）ことを示す。可溶性ＣＩ−ＭＰＲも、ｒｈＧＡＬＮＳ取り込みを阻害する（図３Ｃ）。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｃは、Ｍ６Ｐは、Ｊｕｒｋａｔ細胞中へのｒｈＧＡＬＮＳ取り込みの阻害に用量依存性効果を有する（図３Ａ）が、ＩＧＦ−ＩＩは、ｒｈＧＡＬＮＳ取り込みの部分的阻害のみを示す（図３Ｂ）ことを示す。可溶性ＣＩ−ＭＰＲも、ｒｈＧＡＬＮＳ取り込みを阻害する（図３Ｃ）。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃは、Ｍ６Ｐは、Ｊｕｒｋａｔ細胞中へのｒｈＧＡＬＮＳ取り込みの阻害に用量依存性効果を有する（図３Ａ）が、ＩＧＦ−ＩＩは、ｒｈＧＡＬＮＳ取り込みの部分的阻害のみを示す（図３Ｂ）ことを示す。可溶性ＣＩ−ＭＰＲも、ｒｈＧＡＬＮＳ取り込みを阻害する（図３Ｃ）。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｂは、ＩＧＦ−ＩＩは、Ｊｕｒｋａｔ細胞中へのｒｈＧＡＡ−ＩＧＦ−ＩＩ取り込みの阻害に用量依存性効果を有する（図４Ａ）が、Ｍ６Ｐは、ｒｈＧＡＡ−ＩＧＦ−ＩＩ取り込みの部分的阻害のみを示す（図４Ｂ）ことを示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｂは、ＩＧＦ−ＩＩは、Ｊｕｒｋａｔ細胞中へのｒｈＧＡＡ−ＩＧＦ−ＩＩ取り込みの阻害に用量依存性効果を有する（図４Ａ）が、Ｍ６Ｐは、ｒｈＧＡＡ−ＩＧＦ−ＩＩ取り込みの部分的阻害のみを示す（図４Ｂ）ことを示す。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｅは、フローサイトメトリーにより測定されるＪｕｒｋａｔ細胞によるＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳの取り込みを示す。（図５Ａ）Ａｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ（０〜３６３．６ｎＭ）の取り込み（ＭＦＩ）を示す用量応答曲線。（図５Ｂ）ＭＦＩとＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳの濃度との間のＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロット。（図５Ｃ）処理なし、またはトリパンブルー、サイトカラシンＢ、もしくは４℃でのインキュベーションでの細胞の処理後のＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳの取り込み（ＭＦＩ）。各条件についてのエラーバー（±標準偏差）が含まれるが、ヒストグラムバーの上部と区別できない場合がある。（図５Ｄ）０．００５％〜０．４％トリパンブルーでの細胞の処理後のＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ（ＭＦＩ）及びＡｌｅｘａ４８８−抗ＣＤ３の取り込み。エラーバーは、平均±ＳＤを表す。（図５Ｅ）増加する濃度のｓＣＩ−Ｍ６ＰＲ、Ｍ６Ｐ、またはヤギ抗ＧＡＬＮＳ抗体での細胞の処理後のシグナル阻害パーセント（ＳＩ％、無処理対照に対するＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ取り込みＭＦＩ）。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｅは、フローサイトメトリーにより測定されるＪｕｒｋａｔ細胞によるＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳの取り込みを示す。（図５Ａ）Ａｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ（０〜３６３．６ｎＭ）の取り込み（ＭＦＩ）を示す用量応答曲線。（図５Ｂ）ＭＦＩとＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳの濃度との間のＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロット。（図５Ｃ）処理なし、またはトリパンブルー、サイトカラシンＢ、もしくは４℃でのインキュベーションでの細胞の処理後のＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳの取り込み（ＭＦＩ）。各条件についてのエラーバー（±標準偏差）が含まれるが、ヒストグラムバーの上部と区別できない場合がある。（図５Ｄ）０．００５％〜０．４％トリパンブルーでの細胞の処理後のＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ（ＭＦＩ）及びＡｌｅｘａ４８８−抗ＣＤ３の取り込み。エラーバーは、平均±ＳＤを表す。（図５Ｅ）増加する濃度のｓＣＩ−Ｍ６ＰＲ、Ｍ６Ｐ、またはヤギ抗ＧＡＬＮＳ抗体での細胞の処理後のシグナル阻害パーセント（ＳＩ％、無処理対照に対するＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ取り込みＭＦＩ）。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｅは、フローサイトメトリーにより測定されるＪｕｒｋａｔ細胞によるＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳの取り込みを示す。（図５Ａ）Ａｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ（０〜３６３．６ｎＭ）の取り込み（ＭＦＩ）を示す用量応答曲線。（図５Ｂ）ＭＦＩとＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳの濃度との間のＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロット。（図５Ｃ）処理なし、またはトリパンブルー、サイトカラシンＢ、もしくは４℃でのインキュベーションでの細胞の処理後のＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳの取り込み（ＭＦＩ）。各条件についてのエラーバー（±標準偏差）が含まれるが、ヒストグラムバーの上部と区別できない場合がある。（図５Ｄ）０．００５％〜０．４％トリパンブルーでの細胞の処理後のＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ（ＭＦＩ）及びＡｌｅｘａ４８８−抗ＣＤ３の取り込み。エラーバーは、平均±ＳＤを表す。（図５Ｅ）増加する濃度のｓＣＩ−Ｍ６ＰＲ、Ｍ６Ｐ、またはヤギ抗ＧＡＬＮＳ抗体での細胞の処理後のシグナル阻害パーセント（ＳＩ％、無処理対照に対するＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ取り込みＭＦＩ）。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｅは、フローサイトメトリーにより測定されるＪｕｒｋａｔ細胞によるＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳの取り込みを示す。（図５Ａ）Ａｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ（０〜３６３．６ｎＭ）の取り込み（ＭＦＩ）を示す用量応答曲線。（図５Ｂ）ＭＦＩとＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳの濃度との間のＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロット。（図５Ｃ）処理なし、またはトリパンブルー、サイトカラシンＢ、もしくは４℃でのインキュベーションでの細胞の処理後のＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳの取り込み（ＭＦＩ）。各条件についてのエラーバー（±標準偏差）が含まれるが、ヒストグラムバーの上部と区別できない場合がある。（図５Ｄ）０．００５％〜０．４％トリパンブルーでの細胞の処理後のＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ（ＭＦＩ）及びＡｌｅｘａ４８８−抗ＣＤ３の取り込み。エラーバーは、平均±ＳＤを表す。（図５Ｅ）増加する濃度のｓＣＩ−Ｍ６ＰＲ、Ｍ６Ｐ、またはヤギ抗ＧＡＬＮＳ抗体での細胞の処理後のシグナル阻害パーセント（ＳＩ％、無処理対照に対するＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ取り込みＭＦＩ）。
【図５Ｅ】図５Ａ〜５Ｅは、フローサイトメトリーにより測定されるＪｕｒｋａｔ細胞によるＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳの取り込みを示す。（図５Ａ）Ａｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ（０〜３６３．６ｎＭ）の取り込み（ＭＦＩ）を示す用量応答曲線。（図５Ｂ）ＭＦＩとＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳの濃度との間のＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロット。（図５Ｃ）処理なし、またはトリパンブルー、サイトカラシンＢ、もしくは４℃でのインキュベーションでの細胞の処理後のＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳの取り込み（ＭＦＩ）。各条件についてのエラーバー（±標準偏差）が含まれるが、ヒストグラムバーの上部と区別できない場合がある。（図５Ｄ）０．００５％〜０．４％トリパンブルーでの細胞の処理後のＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ（ＭＦＩ）及びＡｌｅｘａ４８８−抗ＣＤ３の取り込み。エラーバーは、平均±ＳＤを表す。（図５Ｅ）増加する濃度のｓＣＩ−Ｍ６ＰＲ、Ｍ６Ｐ、またはヤギ抗ＧＡＬＮＳ抗体での細胞の処理後のシグナル阻害パーセント（ＳＩ％、無処理対照に対するＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ取り込みＭＦＩ）。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｃは、阻害抗体の検出に最適なＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ濃度の判定を示す。（図６Ａ）指示された濃度のＡｂＰＣ（抗ｒｈＧＡＬＮＳ）と予め混合された変動する濃度のＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ（０．１５６〜２．５μｇ／ｍＬ）で処理されたＪｕｒｋａｔ細胞。（図６Ｂ）試験された最大濃度のＡｂＰＣ（１００μｇ／ｍｌ）からのＭＦＩに対する相対ＭＦＩ倍率変化として表される（図６Ａ）からのデータ。（図６Ｃ）異なる血清希釈物（１：２．５〜１：２０）の存在下、指示された濃度のＡｂＰＣでのＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ取り込み。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｃは、阻害抗体の検出に最適なＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ濃度の判定を示す。（図６Ａ）指示された濃度のＡｂＰＣ（抗ｒｈＧＡＬＮＳ）と予め混合された変動する濃度のＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ（０．１５６〜２．５μｇ／ｍＬ）で処理されたＪｕｒｋａｔ細胞。（図６Ｂ）試験された最大濃度のＡｂＰＣ（１００μｇ／ｍｌ）からのＭＦＩに対する相対ＭＦＩ倍率変化として表される（図６Ａ）からのデータ。（図６Ｃ）異なる血清希釈物（１：２．５〜１：２０）の存在下、指示された濃度のＡｂＰＣでのＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ取り込み。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｃは、阻害抗体の検出に最適なＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ濃度の判定を示す。（図６Ａ）指示された濃度のＡｂＰＣ（抗ｒｈＧＡＬＮＳ）と予め混合された変動する濃度のＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ（０．１５６〜２．５μｇ／ｍＬ）で処理されたＪｕｒｋａｔ細胞。（図６Ｂ）試験された最大濃度のＡｂＰＣ（１００μｇ／ｍｌ）からのＭＦＩに対する相対ＭＦＩ倍率変化として表される（図６Ａ）からのデータ。（図６Ｃ）異なる血清希釈物（１：２．５〜１：２０）の存在下、指示された濃度のＡｂＰＣでのＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ取り込み。
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｃは、アッセイ感度及び実施例品質管理データを示す。個別のＳＩ％は、ＮＰＳ（図７Ａ）においてまたはモルキオＡ症候群を有する個体からのプール血清（図７Ｂ）においてアッセイ感度を確認する６つの独立したバリデーションランからの、２０μｇ／ｍＬで開始する、１：３段階希釈を意味する。（Ａ）における１４．０２％または（Ｂ）における１９．６％のアッセイスクリーニングカットポイント（ＳＣＰ）は、段階希釈がカットポイントを超えた場所を示すことが示されている。（図７Ｃ）代表的なフローサイトメトリーヒストグラム、ならびにＮＱＣ（０μｇ／ｍＬ）、ＬＱＣ（３μｇ／ｍＬ）、及びＨＱＣ（２０μｇ／ｍＬ）試料についてのＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ  ＭＦＩ。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｃは、アッセイ感度及び実施例品質管理データを示す。個別のＳＩ％は、ＮＰＳ（図７Ａ）においてまたはモルキオＡ症候群を有する個体からのプール血清（図７Ｂ）においてアッセイ感度を確認する６つの独立したバリデーションランからの、２０μｇ／ｍＬで開始する、１：３段階希釈を意味する。（Ａ）における１４．０２％または（Ｂ）における１９．６％のアッセイスクリーニングカットポイント（ＳＣＰ）は、段階希釈がカットポイントを超えた場所を示すことが示されている。（図７Ｃ）代表的なフローサイトメトリーヒストグラム、ならびにＮＱＣ（０μｇ／ｍＬ）、ＬＱＣ（３μｇ／ｍＬ）、及びＨＱＣ（２０μｇ／ｍＬ）試料についてのＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ  ＭＦＩ。
【図７Ｃ】図７Ａ〜７Ｃは、アッセイ感度及び実施例品質管理データを示す。個別のＳＩ％は、ＮＰＳ（図７Ａ）においてまたはモルキオＡ症候群を有する個体からのプール血清（図７Ｂ）においてアッセイ感度を確認する６つの独立したバリデーションランからの、２０μｇ／ｍＬで開始する、１：３段階希釈を意味する。（Ａ）における１４．０２％または（Ｂ）における１９．６％のアッセイスクリーニングカットポイント（ＳＣＰ）は、段階希釈がカットポイントを超えた場所を示すことが示されている。（図７Ｃ）代表的なフローサイトメトリーヒストグラム、ならびにＮＱＣ（０μｇ／ｍＬ）、ＬＱＣ（３μｇ／ｍＬ）、及びＨＱＣ（２０μｇ／ｍＬ）試料についてのＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ  ＭＦＩ。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｂは、抗エロスルファーゼアルファ抗体の検出に対するマトリックスの干渉を表す。３μｇ／ｍｌの抗ｒｈＧＡＬＮＳ（ＬＱＣ）が添加された、男性５つ及び女性５つの健康な個別の血清試料、ならびに４つの脂肪血症及び４つの溶血血清試料、または無添加の対照からのＳＩ％データ。（図８Ｂ）３μｇ／ｍＬのＡｂＰＣ（ＬＱＣ）が添加された、モルキオＡ症候群を有する男性５人及び女性５人の個体からの薬物未投与の血清試料、または無添加の対照。（図８Ａ）における１４．０２％または（図８Ｂ）における１９．６％のアッセイスクリーニングカットポイントは、試料がカットポイントを超えた場所を示す線として示される。バーは、２日かけて２つの独立した実験において試験された試料の平均（±標準偏差）を表す。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｂは、抗エロスルファーゼアルファ抗体の検出に対するマトリックスの干渉を表す。３μｇ／ｍｌの抗ｒｈＧＡＬＮＳ（ＬＱＣ）が添加された、男性５つ及び女性５つの健康な個別の血清試料、ならびに４つの脂肪血症及び４つの溶血血清試料、または無添加の対照からのＳＩ％データ。（図８Ｂ）３μｇ／ｍＬのＡｂＰＣ（ＬＱＣ）が添加された、モルキオＡ症候群を有する男性５人及び女性５人の個体からの薬物未投与の血清試料、または無添加の対照。（図８Ａ）における１４．０２％または（図８Ｂ）における１９．６％のアッセイスクリーニングカットポイントは、試料がカットポイントを超えた場所を示す線として示される。バーは、２日かけて２つの独立した実験において試験された試料の平均（±標準偏差）を表す。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｄは、ＭＯＲ−００４試験においてエロスルファーゼアルファで治療された個体におけるＮＡｂアッセイ一致性及び力価を示す。（図９Ａ）プラセボ、エロスルファーゼアルファ２．０ｍｇ／ｋｇＱＯＷ、またはエロスルファーゼアルファ２．０ｍｇ／ｋｇＱＷで治療された個体からの試料におけるインビトロＣＩ−Ｍ６ＰＲ結合アッセイ及び細胞ベース機能的ＮＡｂアッセイで検出されるＮＡｂ陽性間の一致性。（図９Ｂ）プラセボ、エロスルファーゼアルファ２．０ｍｇ／ｋｇＱＯＷ、またはエロスルファーゼアルファ２．０ｍｇ／ｋｇＱＷで治療された個体からの試料における２４週にかかる（細胞ベース機能的ＮＡｂアッセイからの）平均ＴＡｂ及びＮＡｂ力価。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｄは、ＭＯＲ−００４試験においてエロスルファーゼアルファで治療された個体におけるＮＡｂアッセイ一致性及び力価を示す。（図９Ａ）プラセボ、エロスルファーゼアルファ２．０ｍｇ／ｋｇＱＯＷ、またはエロスルファーゼアルファ２．０ｍｇ／ｋｇＱＷで治療された個体からの試料におけるインビトロＣＩ−Ｍ６ＰＲ結合アッセイ及び細胞ベース機能的ＮＡｂアッセイで検出されるＮＡｂ陽性間の一致性。（図９Ｂ）プラセボ、エロスルファーゼアルファ２．０ｍｇ／ｋｇＱＯＷ、またはエロスルファーゼアルファ２．０ｍｇ／ｋｇＱＷで治療された個体からの試料における２４週にかかる（細胞ベース機能的ＮＡｂアッセイからの）平均ＴＡｂ及びＮＡｂ力価。
【図１０−１】図１０は、試験週によるＮＡｂアッセイ結果の一致性を示す表である。配位子受容体結合ＮＡｂ及び細胞ベース取り込みＮＡｂアッセイ陽性（＋）及び陰性（−）値は、丸括弧中の割合と共に示される。
【図１０−２】図１０は、試験週によるＮＡｂアッセイ結果の一致性を示す表である。配位子受容体結合ＮＡｂ及び細胞ベース取り込みＮＡｂアッセイ陽性（＋）及び陰性（−）値は、丸括弧中の割合と共に示される。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｂは、ＭＯＲ−００４試験においてエロスルファーゼアルファ２．０ｍｇ／ｋｇＱＯＷまたはＱＷが投与されている個体についての有効性及びＮＡｂ力価を示す。（図１１Ａ）ＱＯＷ（左）及びＱＷ（右）投与コホートにおけるＮＡｂ力価に対してプロットされたベースラインから２４週目までの６ＭＷＴ距離の変化。（図１１Ｂ）ＱＯＷ（上）及びＱＷ（下）投与コホートにおけるＮＡｂ力価に対してプロットされたｕＫＳレベルにおけるベースラインから２４週目までの割合変化。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｂは、ＭＯＲ−００４試験においてエロスルファーゼアルファ２．０ｍｇ／ｋｇＱＯＷまたはＱＷが投与されている個体についての有効性及びＮＡｂ力価を示す。（図１１Ａ）ＱＯＷ（左）及びＱＷ（右）投与コホートにおけるＮＡｂ力価に対してプロットされたベースラインから２４週目までの６ＭＷＴ距離の変化。（図１１Ｂ）ＱＯＷ（上）及びＱＷ（下）投与コホートにおけるＮＡｂ力価に対してプロットされたｕＫＳレベルにおけるベースラインから２４週目までの割合変化。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｂは、ＭＯＲ−００４試験における個体におけるエロスルファーゼアルファ半減期及びクリアランスとのＮＡｂ力価相関を示す。（図１２Ａ）２２週目のエロスルファーゼアルファの血清半減期（ｔ１／２、分）が、２．０ｍｇ／ｋｇＱＯＷ（上パネル）及びＱＷ（下パネル）投与群における２４週目ＮＡｂ力価（ｌｏｇスケール）に対してプロットされる。（図１２Ｂ）２２週目の血清からのエロスルファーゼアルファクリアランス（ＣＬ、ｍＬ／分／ｋｇ）が、２．０ｍｇ／ｋｇＱＯＷ（上）及びＱＷ（下）投与群における２４週目ＮＡｂ力価（ｌｏｇスケール）に対してプロットされる。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｂは、ＭＯＲ−００４試験における個体におけるエロスルファーゼアルファ半減期及びクリアランスとのＮＡｂ力価相関を示す。（図１２Ａ）２２週目のエロスルファーゼアルファの血清半減期（ｔ１／２、分）が、２．０ｍｇ／ｋｇＱＯＷ（上パネル）及びＱＷ（下パネル）投与群における２４週目ＮＡｂ力価（ｌｏｇスケール）に対してプロットされる。（図１２Ｂ）２２週目の血清からのエロスルファーゼアルファクリアランス（ＣＬ、ｍＬ／分／ｋｇ）が、２．０ｍｇ／ｋｇＱＯＷ（上）及びＱＷ（下）投与群における２４週目ＮＡｂ力価（ｌｏｇスケール）に対してプロットされる。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明は、酵素補充療法の結果として発生する患者体液及び組織からのリソソーム酵素に特異的な、抗体のような、中和因子を検出する高感度で特異的な細胞ベースアッセイの開発に基づく。
【００４３】
特に定義されていない限り、本明細書において使用されているすべての技術及び科学用語は、本発明が属する当該技術分野における当業者により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。以下の参考文献は、当業者に、本発明において使用されている用語の多くの一般的な定義を提供する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（２ｄ  ｅｄ．１９９４）、ＴＨＥ  ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．、１９８８）、ＴＨＥ  ＧＬＯＳＳＡＲＹ  ＯＦ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ、５ＴＨ  ＥＤ．、Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）、及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ、ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１）。
【００４４】
本明細書において引用されている各刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照により、その全体において、本開示と矛盾しない程度に組み込まれる。
【００４５】
ここで、本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されている、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、特に文脈が明らかに示さない限り、複数形の参照物を含むことが留意される。
【００４６】
本明細書において使用されている、以下の用語は、特に指定されていない限り、それらに帰する意味を有する。
【００４７】
「誘導体」という用語は、本発明の抗体物質及びポリペプチドと関連して使用される場合、これらに限定されないが、ヒトタンパク質では通常は起こらない、ユビキチン化、治療または診断薬との共役、（例えば、放射性核種または様々な酵素での）標識化、ＰＥＧ化（ポリエチレングリコールでの誘導体化）のような共有ポリマー結合、及びオルニチンのようなアミノ酸の化学合成による挿入または置換を含む技術により化学修飾されたポリペプチドを指す。誘導体は、本発明の非誘導体化分子の結合特性を保持する。
【００４８】
本明細書において使用されている「検出可能部分」、「検出部分」、または「標識」という用語は、これらに限定されないが、分光学、光化学、生化学、免疫化学、化学、または他の物理学的手段を含む手段により検出可能な組成物を指す。例えば、有用な検出可能部分または標識としては、ルテニウム（Ｒｕ）ベース触媒、ユーロピウム、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光色素、高電子密度試薬、（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されているような）酵素、ビオチン−ストレプトアビジン、ジオキシゲニン、抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なハプテン及びタンパク質、ならびに標的に対して相補的な配列を有する核酸分子が挙げられる。蛍光標識またはフルオロフォアとしては、これらに限定されないが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、フィコエリトリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＥＣＤ、ＦＩＴＣ、ＦｌｕｏｒＸ（登録商標）、Ｃａｓｃａｄｅ（登録商標）Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）４５０、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６０５ＮＣ、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６２５ＮＣ、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６５０ＮＣ、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６６０、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）７１０、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ（商標）（ＢＶ）フルオロフォアＢＶ４２１、ＢＶ５１０、ＢＶ５７０、ＢＶ６０５、ＢＶ６５０、ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）Ｖ４５０、ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）Ｖ５００、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ローダミン、シアニン、フィコシアニン、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ｏ−フタルデヒド、フルオレサミン、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８、ＰＥ−ＡＰＣ、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰｅｒＣＰ、ＰＥ−ＴＲ、ローダミングリーン、及びロドールグリーン、ならびにこれらのタンデム色素が挙げられる。
【００４９】
検出可能部分または標識は、多くの場合、試料中の結合した検出可能部分または標識の量を定量化するのに使用することができる、放射性、発色、発光、または蛍光シグナルのような、測定可能なシグナルを発生させる。
【００５０】
本明細書において使用されている「捕捉部分」という用語は、固体担体に付着または連結した別の組成物により特異的に結合させることができる組成物を指す。上記検出部分の多くは、結合事象を伴う限り、捕捉部分としても使用することができる。例えば、有用な捕捉部分としては、特異的及び選択的配位子が利用可能な親和性標識（例えば、ビオチンとアビジン、グルタチオンとＧＳＴ）、抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なハプテン及びタンパク質（例えば、ｃ−Ｍｙｃ）、標的に対して相補的な配列を有する核酸分子、ならびに特異的及び選択的配位子が利用可能なペプチド（例えば、ヒスチジンタグとＮｉ）が挙げられる。クロマトグラフィー樹脂への結合特性に影響を及ぼす分子も想定される。固体担体は、例えば、フィルター、プレート、メンブレン、クロマトグラフィー樹脂、またはビーズとすることができる。
【００５１】
「同一」または「同一性」パーセントという用語は、２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈において、配列比較アルゴリズムを使用して、または視覚的検査により測定されるように、最大の一致について比較及び整列した場合、同じである、または特定の割合の同じヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。
【００５２】
本明細書において使用されている「多様体」という用語は、元のポリペプチドコードドメインに対してコード領域中に少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含有するポリペプチド配列を指す。多様体は、天然に存在するポリペプチドの生物活性を保持する。例えば、本発明の方法において使用されるリソソーム酵素は、天然に存在する酵素であってよく、または天然に存在する酵素からの１つ以上のアミノ酸変化を含んでよいが、酵素の生物活性を保持すると考えられている。同様に、本発明の方法において使用されるリソソーム酵素受容体は、天然に存在する受容体の多様体または断片であってよいが、その配位子への結合を保持する。
【００５３】
本明細書において使用されている「検出可能リソソーム酵素」という用語は、検出することができるリソソーム酵素を指し、例えば、リソソーム酵素試薬は、その本来的なリソソーム酵素特異的抗体への結合に加えて、直接標識される。
【００５４】
本明細書において使用されている「検出限界」もしくは「ＬＯＤ」または「感度」という用語は、一般的には、検出することができるが、必ずしも正確な値として定量化されない、体液（例えば、血清）試料中の最低分析物濃度を指す。例えば、ＬＯＤは、プールされたナイーブなマトリックス＋カットポイント因子の測定された平均応答より大きなシグナルを一貫して発生させる分析物濃度として定義してよい。
【００５５】
本明細書において使用されている「カットポイント因子」または「閾値」という用語は、ナイーブなプールされた対照マトリックス（例えば、血清）からのシグナルに対して数学的に正規化され、陽性とみなされるために試料から必要な最小シグナルを定義するのに使用される値を指す。カットポイント因子は、治療用リソソーム酵素に予め曝露されていない個体からの試料のセットから信頼区間に基づき判定してよい（Ｓｈａｎｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ａｎａｌ  ４８（２００８）１２６７−１２８１）。例えば、１．６４５に個別の試料にわたる標準偏差をかけて計算された、９５％信頼区間は、約５％の偽陽性率をもたらすであろう。
【００５６】
本明細書において使用されている「干渉」という用語は、一般的には、標的分析物の正確な検出及び測定を妨げる体液（例えば、血清）試料中の物質の存在を指す。本明細書において使用されている、干渉とは、一般的には、濃度応答関係に対する遊離薬物の効果またはマトリックス（例えば、血清）の効果を指す。例えば、マトリックスからの干渉は、潜在的な干渉を含まない試料に対する相対正確度として評価し、相対正確度７５〜１２５％の範囲を目標としてよい。
【００５７】
本明細書において使用されている「精度」という用語は、一般的には、分析者及び日数の間でのシグナルのばらつきを指す。例えば、精度は、変動係数、値の範囲として、またはＡＮＯＶＡ統計を使用して評価してよい。
【００５８】
本明細書において使用されている「試薬安定性」という用語は、一般的には、試薬の調製堅牢性及び保存安定性を指す。例えば、試薬安定性は、調製されたばかりの試薬に対して７５〜１２５％以内の正確度で値を測定することを依然として可能にする条件により確認してよい。
【００５９】
本明細書において使用されている「試料安定性」という用語は、一般的には、回収された試料が経験すると予想される取扱い条件に対する生体液または組織試料中での分析物の安定性を指す。試料安定性は、回収されたばかりの試料に対して７５〜１２５％以内の正確度で値を測定することを依然として可能にする条件として測定してよい。例えば、試料安定性は、−２０℃及び−８０℃で典型的な保存期間に等しい時間にかけて、室温（ＲＴ）もしくは４℃で典型的な試料調製及び分析ラン時間に等しい時間にかけて、−２０℃、４℃、及びＲＴで典型的な輸送期間に等しい時間にかけて、または経験され得る凍結解凍サイクルを通して評価してよい。
【００６０】
本明細書において使用されている「堅牢性」という用語は、一般的には、方法パラメータにおける小さな変動により影響されないままであるアッセイの能力を指し、正常ラン条件中のアッセイの信頼性を示す。例えば、堅牢性は、ノミナル条件に対して７５〜１２５％以内の正確度でシグナルを依然として発生させる試薬濃度、試薬体積、またはインキュベーション時間の変化パーセントとして評価することができる。
【００６１】
「阻害パーセント」という用語は、細胞中へのリソソーム酵素取り込みを阻害またはリソソーム酵素活性を阻害するリソソーム酵素特異的抗体の能力を指す。本明細書における方法は、患者試料中に存在する抗体の阻害パーセントを検出することができる。様々な実施形態では、阻害パーセントは、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはこれらの端点間の、及びこれらの端点を含むいずれかの範囲で検出可能である。
【００６２】
本明細書において使用されている「特異性」という用語は、一般的には、細胞取り込みに影響を及ぼす因子またはＥＲＴに生理化学的に関連したタンパク質を検出するアッセイの能力を指す。例えば、特異性は、特異的分析物との比例検出応答を指してよいが、リソソーム酵素に特異的でない抗体試料からの応答は、ＬＯＤを下回るはずである。比例応答は、０．９８以上の相関係数Ｒ値に対して評価してよい。
【００６３】
「中和因子」という用語は、リソソーム酵素の細胞取り込みを防止する因子を指し、対象における酵素補充療法の結果として発生し得る。例となる中和因子としては、中和抗体、遊離マンノース−６−リン酸、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−ＩＩペプチド、ＩＧＦ−ＩＩペプチド類似体、または可溶性ＣＩ−ＭＰＲが挙げられる。
【００６４】
「特異的に結合する」、「標的特異的な」、標的「に特異的な」、または標的抗原と「免疫反応性」である抗体とは、類似の抗原より大きな親和性で標的抗原を結合する抗体または抗体物質を指す。本開示の１つの態様では、標的結合ポリペプチド、またはその断片、多様体、もしくは誘導体は、他の、すなわち、非ヒトの、種の標的に対するその結合親和性と比較して、ヒト標的に対してより大きな親和性で結合するが、標的のオーソログを認識及び結合する結合ポリペプチドは、提供される範囲内に含まれる。
【００６５】
例えば、その同種抗原「に特異的な」抗体またはその断片は、抗体の可変領域が、検出可能な選好性で対象のポリペプチドを認識及び結合する（すなわち、対象のポリペプチドを同じファミリーの他の既知のポリペプチドから、ファミリーメンバー間の考えられる局所的配列同一性、相同性、または類似性の存在にかかわらず、結合親和性における測定可能な相違によって、区別することができる）ことを示す。特異的抗体は、抗体の可変領域外、及び特に、分子の定常領域中の配列との相互作用を通して、他のタンパク質（例えば、Ｓ・アウレウスタンパク質ＡまたはＥＬＩＳＡ技術における他の抗体）とも相互作用し得ることが理解されるであろう。本開示の方法における使用のための抗体の結合特異性を判定するスクリーニングアッセイは、当該技術分野において周知であり、日常的に実施されている。こうしたアッセイの包括的な議論については、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８８）、Ｃｈａｐｔｅｒ  ６を参照されたい。
【００６６】
本明細書において使用されている「マトリックス」という用語は、一般的には、抗体が測定される生物学的バックグラウンドを指す。マトリックスの例としては、例えば、体液及び組織が挙げられる。
【００６７】
本明細書において使用されている「体液」という用語は、対象、例えば、ヒトから得られる流体を指す。例えば、体液は、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、または尿であってよい。血液は、細胞を除去した分画（すなわち、血漿）または細胞及び凝固因子を除去した分画（すなわち、血清）であってよい。
【００６８】
本明細書において使用されている「組織」という用語は、対象、例えば、ヒトから得られる組織を指す。例えば、組織は、生検試料、外科的に除去された組織、または死後採集物であってよい。例えば、組織は、抗体を組織から単離するために均質化及び抽出してよい。
【００６９】
本明細書において使用されている「ナイーブ（未投与）」という用語は、治療薬には予め曝露されていないが、内因性レベルの因子には曝露されている場合がある、個体、例えば、ヒトを指す。
【００７０】
「リソソーム蓄積症」とは、天然高分子を代謝するのに必要な１つ以上のリソソーム酵素の欠損から引き起こされるあらゆる疾患を指す。これらの疾患は、典型的には、リソソームにおける未分解の分子の蓄積をもたらし、（貯蔵小胞とも称される）貯蔵顆粒の数の増加をもたらす。これらの疾患については、以下により詳細に記載する。
【００７１】
「酵素補充療法」とは、リソソーム蓄積障害を有する対象において欠損している、または欠陥のある酵素の組換え型が、欠損酵素を補うために投与される、治療の方法を指す。
【００７２】
「対象」とは、本発明の方法を使用して治療されるあらゆる動物を含むことを意味する。好ましくは、対象は、限定なしに、ヒトならびに、チンパンジーならびに他の類人猿及びサル種のような非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、及びウマのような家畜、イヌ及びネコのような飼育哺乳類、マウス、ラット、及びモルモットのような齧歯類を含む実験動物、等を含む、哺乳類対象である。用語は、特定の年齢または性別を示さない。よって、成体及び新生対象、ならびに胎児は、雌雄にかかわらず、「対象」という用語内に含まれる。
【００７３】
「治療的に有効」とは、本明細書では、本明細書において記載されている治療方法の結果として発生するあらゆる治療的利益を示すことを意図する。例えば、こうした効果は、対象のリソソーム障害において欠損している酵素の、適切な対象組織中に現れる有益な効果とすることができ、こうした有益な生理学的効果は、酵素補充療法の非存在下で測定される生理学的パラメータと比較される。こうした治療効果は、対象の疾患の１つ以上の臨床または準臨床的症状のいくらかの低減または消失であってよい。例えば、（貯蔵顆粒とも称される）貯蔵小胞の数の低減、またはその消失は、治療された対象に治療的利益を提供するであろう。治療的利益を評価するための方法は、当該技術分野において知られており、例えば、米国特許第９，０８９，５６６号を参照されたい。
【００７４】
多様体
特定の実施形態では、リソソーム酵素（ＬＥ）またはＬＥ受容体類似体及び多様体を調製してよく、リソソーム酵素及びそれらの受容体が使用され得る多様な用途において有用である。ＬＥまたはＬＥ断片は、全長酵素、または全長酵素の生物活性（すなわち、酵素活性）の少なくともいくらかを保持する、そのいずれかの多様体、断片、もしくは修飾を含む。ＬＥ受容体またはＬＥ結合断片は、全長受容体、受容体の細胞外部分、または全長ＬＥ受容体の生物活性（すなわち、ＬＥ結合活性）の少なくともいくらかを保持する、そのいずれかの多様体、断片、もしくは修飾を含む。
【００７５】
全長ＬＥは、天然源から単離、または組換え技術を使用して調製することができる。ＬＥ断片は、組換え技術を使用して調製することができる。ＬＥ受容体は、天然源から単離（例えば、ウシ胎児血清から精製）、または組換え技術を使用して調製することができる。例えば、組換え全長ＬＥ受容体もしくはＬＥ受容体の細胞外部分、またはＬＥ結合活性を保持するその多様体もしくは多様体、断片、もしくは修飾を生成する一般戦略は、ＰＣＲによりＬＥ受容体ｃＤＮＡから対象のコード領域を増幅し、ｃＤＮＡを哺乳類発現ベクターにクローニングし、哺乳類発現ベクターを哺乳類細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）またはＧ．７．１細胞に形質移入し、ウシ胎児血清中に存在する細胞からもたらされたＬＥ受容体を単離する手順を使用してＬＥ受容体を精製することである。ＬＥ受容体またはその多様体は、ヒトまたは他の哺乳類源からとすることができる。
【００７６】
ＬＥまたはＬＥ受容体のアミノ酸配列多様体は、例えば、置換、挿入、または欠失多様体とすることができる。欠失多様体は、機能及び／または免疫原性活性に必須ではない、天然ＬＥまたはＬＥ受容体の１つ以上の残基を欠く。挿入変異体は、典型的には、ポリペプチドにおける非末端点での物質の付加を伴う。これは、免疫反応性エピトープまたは単純に単一の残基の挿入を含んでよい。末端付加とは、ＬＥまたはＬＥ受容体のＮまたはＣ末端のいずれかでのアミノ酸配列の付加である。末端付加は、ＬＥまたはＬＥ受容体の生物物理学的特徴を向上、または精製を簡略化するのに使用することができる。ペプチド付加物としては、例えば、限定のためではなく、ＨＩＳ（例えば、６または１２）、ＴＡＴ、ＦＬＡＧ（商標）、ＨＡ、ｃ−Ｍｙｃ、ＶＳＶ−Ｇ、Ｖ５、Ｓ−ペプチド、及びＨＳＶが挙げられる。タンパク質付加物としては、例えば、限定のためではなく、ＧＦＰ、ＭＢＰ、及びＧＳＴが挙げられる。
【００７７】
置換多様体は、典型的には、天然に存在するＬＥまたはＬＥ受容体の１つのアミノ酸を、１つ以上の部位で別のものに交換し、他の機能または特性の喪失なしに、タンパク質分解性開裂に対する安定性のような、ＬＥまたはＬＥ受容体の１つ以上の特性を調節するように設計してよい。この種類の置換は、好ましくは保存的であり、すなわち、１つのアミノ酸が、同様の形状及び負荷のもので置換される。
【００７８】
多様体は、天然に存在するＬＥまたはＬＥ受容体と実質的に相同または実質的に同一であってよい。２つの核酸またはポリペプチドの文脈において、実質的に相同とは、一般的には、当該技術分野において周知の配列比較アルゴリズムを使用して、または視覚的検査により測定されるように、最大の一致について比較及び整列した場合、少なくとも４０％、６０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。
【００７９】
カチオン非依存性マンノース６リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）とは、Ｔ細胞、筋細胞、及びマクロファージを含む、多様な細胞タイプ上で天然に発現するリソソーム酵素受容体である。ＣＩ−ＭＰＲを天然に発現させる、または発現させるように操作された細胞は、本方法における使用について考慮される。方法における使用のための例となる細胞としては、これらに限定されないが、ＨｅＬａ、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＣＦ−７、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅｐＧ２、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、及びマクロファージが挙げられる。ＣＩ−ＭＰＲを組換えで発現させるように修飾された細胞または細胞表面上のそのリソソーム酵素結合断片も、方法における使用について考慮される。組換えタンパク質発現に有用な哺乳類宿主細胞株の例としては、これらに限定されないが、ＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（２９３または懸濁培養における成長のためにサブクローニングされた２９３細胞）（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９、１９７７）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１、１９８０）、サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸部癌腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）、ヒト肝臓細胞（ＨＢ  ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））、ＭＲＣ５細胞、ならびにＦＳ４細胞が挙げられる。
【００８０】
組換えタンパク質発現の方法は、当該技術分野において周知である。ヒトＣＩ−ＭＰＲ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｊ０３５２８）及び他の種からのＣＩ−ＭＰＲについてのヌクレオチド配列は、当該技術分野において知られており、国立バイオテクノロジー情報センター及び米国国立医学図書館により管理されているもののような、公開されているゲノムデータベースを通してアクセス可能である。細胞中にＣＩ−ＭＰＲを組換えで発現させるために、当業者であれば、ＣＩ−ＭＰＲヌクレオチド配列を、適切な宿主細胞中での発現のための組換え発現ベクターに挿入するであろう。
【００８１】
宿主細胞は、ＣＩ−ＭＰＲまたはその断片の発現またはクローニングベクターで形質転換または形質移入され、細胞表面上での発現を得るために、プロモーターを誘導、形質転換体を選択、または所望の配列をコード化する遺伝子を増幅するために必要に応じて修飾された従来の栄養培地において培養される。
【００８２】
標識（検出可能及び捕捉部分）
いくつかの実施形態では、アッセイ試薬は、その検出を促進するように標識される。標識または検出可能部分は、分光学、光化学、生化学、免疫化学、化学、または他の物理学的手段により検出可能な組成物である。例えば、抗体は、放射性同位体、（ビオチン、アビジン、等のような）親和性標識、（ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、等のような）酵素標識、（ＦＩＴＣもしくはローダミン、等のような）蛍光標識、または（ユーロピウム、バナジウム、等のような）発光もしくは生物発光標識、常磁性原子、（基質と組み合わされたＲｕベース標識、等のような）電気化学発光標識、等の使用を通して検出可能に標識することができる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、アッセイ試薬は、その捕捉または検出を促進するように標識される。捕捉部分は、固体担体に付着または連結した別の組成物により特異的に結合させることができる組成物である。アッセイ試薬、例えば、リソソーム酵素は、特異的及び選択的配位子が利用可能な（ビオチン、アビジン、等のような）親和性標識、抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なハプテン及びタンパク質、ならびに標的に対して相補的な配列を有する核酸分子の使用を通して標識することができる。こうした標識を達成するための手順は、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５（１９７０）、Ｂａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８（１９７９）、Ｅｎｇｖａｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９（１９７２）、Ｇｏｄｉｎｇ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５（１９７６）において記載されている。固体担体は、フィルター、プレート、メンブレン、またはビーズ、等とすることができる。
【００８４】
本発明における使用に適した標識の例としては、これらに限定されないが、放射性標識（例えば、３２Ｐ）、フルオロフォア（例えば、フルオレセイン）、高電子密度試薬、（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されているような）酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、及び、例えば、放射性標識をハプテンもしくはペプチド中に組み込むことにより、検出可能にする、またはハプテンもしくはペプチドと特異的に反応性の抗体を検出するために使用することができるタンパク質が挙げられる。ナノタグ、分子質量ビーズ、磁性剤、蛍光色素を含有するナノもしくはマイクロビーズ、量子ドット、量子ビーズ、蛍光タンパク質、蛍光標識を有するデンドリマー、マイクロトランスポンダー、電子ドナー分子もしくは分子構造、または光反射粒子も考慮される。
【００８５】
例えば、本発明での使用について考慮される標識としては、これらに限定されないが、蛍光色素（例えば、上記のようなＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ色素、フルオレセインイソチオシアネート、Ｔｅｘａｓレッド、ローダミン、等）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及び他のＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されるもの）、ビオチン、及び金コロイド、色ガラス、またはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス、等）のような比色標識、ならびに発光または化学発光標識（例えば、ユーロピウム（Ｅｕ）、ＭＳＤ  Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ）が挙げられる。
【００８６】
蛍光標識またはフルオロフォアとしては、これらに限定されないが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、フィコエリトリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＥＣＤ、ＦＩＴＣ、ＦｌｕｏｒＸ（登録商標）、Ｃａｓｃａｄｅ（登録商標）Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）４５０、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６０５ＮＣ、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６２５ＮＣ、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６５０ＮＣ、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６６０、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）７１０、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ（商標）（ＢＶ）フルオロフォアＢＶ４２１、ＢＶ５１０、ＢＶ５７０、ＢＶ６０５、ＢＶ６５０、ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）Ｖ４５０、ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）Ｖ５００、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ローダミン、シアニン、フィコシアニン、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ｏ−フタルデヒド、フルオレサミン、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８、ＰＥ−ＡＰＣ、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰｅｒＣＰ、ＰＥ−ＴＲ、ローダミングリーン、及びロドールグリーン、ならびにこれらのタンデム色素が挙げられる。
【００８７】
標識は、アッセイの所望の成分と直接または間接的に共役させてよい。好ましくは、１つの実施形態における標識は、本発明に従った活性薬剤の共役のためのイソシアネートまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル試薬を使用してバイオポリマーに共有結合させる。本発明の１つの態様では、本発明の二官能性イソシアネート試薬を使用し、標識をバイオポリマーと共役させ、活性薬剤が付着していない標識バイオポリマー共役体を形成することができる。標識バイオポリマー共役体は、本発明に従った標識された共役体の合成のための中間体として使用してよく、またはバイオポリマー共役体を検出するのに使用してよい。上述の通り、幅広い多様な標識を使用することができ、標識の選択は、必要な感度、アッセイの所望の成分との共役の容易さ、安定性要件、利用可能な器具類、及び廃棄規定に依存している。非放射性標識は、多くの場合、間接的な手段により付着させる。一般的には、配位子分子（例えば、ビオチン）は、分子に共有結合させる。配位子は次に、別の分子（例えば、ストレプトアビジン）分子に結合し、これは本来的に検出可能であるか、検出可能酵素、蛍光化合物、もしくは化学発光化合物のような、シグナルシステムに、またはフィルター、プレート、メンブレン、もしくはビーズのような、固体担体、等に共有結合されるかのいずれかである。
【００８８】
本発明の方法において有用な化合物は、例えば、酵素またはフルオロフォアとの共役により、シグナル発生化合物と直接共役させることもできる。標識としての使用に適した酵素としては、これらに限定されないが、ヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、エステラーゼ、及びグリコシダーゼ、またはオキシドターゼ、特にペルオキシダーゼが挙げられる。標識としての使用に適した蛍光化合物、すなわち、フルオロフォアとしては、上記のものが挙げられる。適切なフルオロフォアのさらなる例としては、これらに限定されないが、エオシン、ＴＲＩＴＣ−アミン、キニーネ、フルオレセインＷ、アクリジンイエロー、リサミンローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、Ｂスルホニルクロリドエリスロセイン、ルテニウム（トリス、ビピリジニウム）、ユーロピウム、ニコチンアミド、アデニンジヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド、等が挙げられる。標識としての使用に適した化学発光化合物としては、これらに限定されないが、ユーロピウム（Ｅｕ）、サマリウム（Ｓｍ）、ルシフェリン、及び２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えば、ルミノールが挙げられる。標識としての使用に適した電気化学発光化合物としては、これらに限定されないが、ＭＳＤ  ＴＡＧ、ＭＳＤ  Ｓｕｌｆｏ−ＴＡＧ、ＢＶ−ＴＡＧ、及びＢＶ−ＴＡＧ  Ｐｌｕｓが挙げられる。本発明の方法において使用することができる様々な標識またはシグナル生成システムの概要については、米国特許第４，３９１，９０４号を参照されたい。
【００８９】
検出方法及びキット
標識が蛍光標識である場合、フルオロクロムを適切な波長の光で励起させ、得られた蛍光を検出することは、これを検出し得る。蛍光は、フローサイトメトリー装置、電荷結合素子（ＣＣＤ）、または光電子増倍管、等のような電子検出器の使用により、視覚的に検出され得る。同様に、酵素標識は、酵素に適した基質を提供し、得られた反応生成物を検出することにより、検出され得る。比色標識は、単純に標識と関連した色を観察することにより、検出され得る。本発明の方法における使用に適した他の標識及び検出システムは、当業者には容易に明らかとなるであろう。こうした標識されたモジュレーター及び配位子は、疾患または健康状態の診断において使用することができる。
【００９０】
化学発光標識は、標識の基質との反応後に放出される光を観察することにより、検出され得る。電気化学発光標識は、電場における標識の基質との反応後に放出される光を観察することにより、検出され得る。
【００９１】
抗原−抗体複合体はまた、ナノ粒子誘導技術を使用して検出され得る。例えば、金ナノ粒子消光について記載する、Ａｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．７８：１１０４−６（２００６）、抗体検出におけるＳｉＯ（２）／Ａｕナノ粒子表面について記載する、Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２００５  Ｎｏｖ  ３０、及び固体基質−室温リン光免疫アッセイ（ＳＳ−ＲＴＰ−ＩＡ）における使用のためのジブロモフルオレセインを含有する二酸化ケイ素ナノ粒子について記載する、Ｌｉｅｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．３０７：３４−４０（２００５）を参照されたい。
【００９２】
キットも本発明の範囲内で考慮される。１つの実施形態では、キットは、任意で検出可能標識もしくは捕捉部分に連結した、リソソーム酵素、任意で、ビーズと共役するリソソーム酵素、及び／またはリソソーム酵素に特異的に結合する抗体標準物、及び／または既知量のリソソーム酵素を含有するリソソーム酵素標準物を含む。様々な実施形態では、キットは、ＣＩ−ＭＰＲを発現させる細胞を含む。キットの他の構成要素は、上述のような、試薬及び／または免疫アッセイを実施するための指示を任意で含んでよい。
【００９３】
分光吸収標識を使用してもよい。考えられる検出方法は、異なる光のスペクトルを吸収及び透過する異なる物質をビーズポリマー中に混合することであろう。各々の異なるタイプのビーズは、マルチスペクトル光をビーズに通し、どのスペクトルが吸収されるかを検出することにより、検出され得る。
【００９４】
リソソーム酵素及び本方法の使用
特定の実施形態では、本発明は、標的リソソーム中では低減し、欠損し、または存在しない、及び対象に投与される、生物活性を有する治療用タンパク質に対する抗体を検出するための方法を提供する。酵素治療薬としては、これらに限定されないが、アスパルチルグルコサミニダーゼ、酸性リパーゼ、システイントランスポーター、Ｌａｍｐ−２、α−ガラクトシダーゼＡ、酸性セラミダーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＡ、ＧＭ２アクチベーター欠損、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、サポシンＢ、ノイラミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼホスホトランスフェラーゼ、ホスホトランスフェラーゼγサブユニット、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチルＣｏＡ：Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン６−スルファターゼ、ヒアルロノグルコサミニダーゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼＩ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、コレステロール輸送、カテプシンＫ、β−ガラクトシダーゼＢ、α−グルコシダーゼ、及びシアル酸トランスポーターが挙げられる。様々な実施形態では、酵素は、Ｎ−アセチルガラクトサミン６−スルファターゼ、α−グルコシダーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、またはトリペプチジルペプチダーゼＩである。
【００９５】
上記のリソソーム酵素は、対応する酵素欠損を有するリソソーム蓄積症における有用な治療薬である。例となるリソソーム蓄積症としては、これらに限定されないが、リソソームタンパク質欠損が病態に寄与する、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症／ウォルマン病、シスチノーシス、ダノン病、ファブリー病、ファーバー脂肪性肉芽腫症／ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシスＩ／ＩＩ型、ゴーシェ病Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩ型ゴーシェ病、グロボイド細胞白質ジストロフィー／クラッベ病、グリコーゲン蓄積症ＩＩ／ポンペ病、ＧＭ１−ガングリオシドーシスＩ／ＩＩ／ＩＩＩ型、ＧＭ２−ガングリオシドーシスＩ型／テイ−サックス病、ＧＭ２−ガングリオシドーシスＩＩ型サンドホフ病、ＧＭ２−ガングリオシドーシス、α−マンノシドーシスＩ／ＩＩ型、α−マンノシドーシス、異染性白質ジストロフィー、ムコリピドーシスＩ型／シアリドーシスＩ／ＩＩ型ムコリピドーシスＩＩ／ＩＩＩ型Ｉ−セル病、ムコリピドーシスＩＩＩＣ型偽ハーラー多発性ジストロフィー、ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）、ムコ多糖症ＩＩ型ハンター症候群（ＭＰＳ  ＩＩ）、ムコ多糖症ＩＩＩＡ型（ＭＰＳ  ＩＩＩＡ）、ムコ多糖症ＩＩＩＢ型サンフィリポ症候群（ＭＰＳ  ＩＩＩＢ）、ムコ多糖症ＩＩＩＣ型サンフィリポ症候群（ＭＰＳ  ＩＩＩＣ）、ムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩＩＩＤ型サンフィリポ症候群（ＭＰＳ  ＩＩＩＤ）、ムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩＶＡ型モルキオ症候群（ＭＰＳ  ＩＶＡ）、ムコ多糖症ＩＶＢ型モルキオ症候群（ＭＰＳ  ＩＶＢ）、ムコ多糖症ＶＩ型（ＭＰＳ  ＶＩ）、ムコ多糖症ＶＩＩ型スライ症候群（ＭＰＳ  ＶＩＩ）、ムコ多糖症ＩＸ型（ＭＰＳ  ＩＸ）、多種スルファターゼ欠損症、ポンペ病、神経セロイドリポフスチン症、ＣＬＮ１バッテン病、神経セロイドリポフスチン症、ＣＬＮ２バッテン病、ニーマン−ピック病Ａ／Ｂ型、ニーマン−ピック病Ｃ１型、ニーマン−ピック病Ｃ２型、濃化異骨症、シンドラー病Ｉ／ＩＩ型シンドラー病、ならびにシアル酸蓄積症、異染性白質ジストロフィー、ゴーシェ、クラッベ、及びテイ−サックス病が挙げられる。様々な実施形態では、リソソーム蓄積症は、モルキオ症候群（ＭＰＳ  ＩＶＡ）、ムコ多糖症ＩＶＢ型モルキオ症候群（ＭＰＳ  ＩＶＢ）、ポンペ病、ムコ多糖症ＩＩＩＢ型サンフィリポ症候群（ＭＰＳ  ＩＩＩＢ）、またはＣＬＮ２／バッテン病である。
【００９６】
モルキオ症候群
ムコ多糖症ＩＶＡ型（モルキオ症候群、ＭＰＳ  ＩＶａ）とは、ムコ多糖蓄積症の群に属する、遺伝性、常染色体劣性疾患である。モルキオ症候群は、２つのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、ケラタン硫酸（ＫＳ）及びコンドロイチン−６−硫酸（Ｃ６Ｓ）の分解に必要なリソソーム酵素の欠損により引き起こされる。具体的には、ＭＰＳ  ＩＶＡは、酵素Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ｒｈＧＡＬＮＳ）の非存在、及びＫＳの尿中排泄により特徴付けられる。ｒｈＧＡＬＮＳの欠如は、硝子軟骨、骨格組織の主要素中でのムコ多糖の異常に多量の蓄積をもたらす。すべての患者は、全身性骨格異形成症を有する。他の症状は、患者によって重症度が異なり、とりわけ、難聴、白内障、脊椎不安定性、心臓弁膜症、及び呼吸障害を含み得る。
【００９７】
組換えヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ｒｈＧＡＬＮＳ）は、ＭＰＳ  ＩＶＡの治療のための酵素補充療法（エロスルファーゼアルファ）として開発されてきた。ｒｈＧＡＬＮＳは、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）を通してリソソーム中に内在化される。この細胞より小さい区画では、低ｐＨ（ｐＨ４〜４．５）及びタンパク質分解は、抗体及びｒｈＧＡＬＮＳの相互作用を減少または消失させるであろう。したがって、リソソーム融合前の受容体細胞表面相互作用及び内在化は、中和因子の最も可能性の高い作用部位である。
【００９８】
ポンペ病
リソソーム中の酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）酵素の不十分な活性は、ポンペ病、酸性マルターゼ欠損症（ＡＭＤ）、グリコーゲン蓄積症ＩＩ型（ＧＳＤＩＩ）、糖原病ＩＩ型、またはＧＡＡ欠損症としても知られている疾患を引き起こす。ＧＡＡは、グリコーゲンの外枝を含む、マルトース及び他の直鎖オリゴ糖におけるα−１，４結合を加水分解し、これによりリソソーム中の過剰なグリコーゲンを分解する（Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｓｃｒｉｖｅｒ、ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．（２００１）、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐ．３３８９−３４２０）。他の哺乳類リソソーム酵素と同様に、ＧＡＡは、サイトゾルにおいて合成され、ＥＲを通過し、そこでＮ−結合、高マンノース型炭水化物でグリコシル化される。ゴルジでは、高マンノース炭水化物は、リソソームタンパク質上で、これらのタンパク質をリソソームに向けるマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）の添加により、修飾される。Ｍ６Ｐ修飾タンパク質は、２つのＭ６Ｐ受容体のいずれかとの相互作用を通してリソソームに送達される。
【００９９】
減少したＧＡＡ酵素活性は、ＧＡＡをコード化する遺伝子における多様なミスセンス及びナンセンス変異によって起こる。結果として、グリコーゲンは、ポンペ病を有する患者におけるすべての細胞のリソソーム中に蓄積する。特に、グリコーゲン蓄積は、心筋及び骨格筋、肝臓、ならびに他の組織のリソソーム中で最も顕著である。蓄積したグリコーゲンは、最終的には筋機能を低下させる。ポンペ病の最も重症な形態では、心呼吸不全によって２歳の前に死亡する。米国特許第７，７８５，８５６号は、ポンペ病をＩＧＦ−ＩＩ  ＧＩＬＴタグを含む組換えＧＡＡで治療するための方法を開示する。酵素療法に干渉する中和抗体は、小児ポンペ病のための療法を受けている患者において検出されている（Ｈａｒｍａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ  Ｔｈｅｒ．２０１５  Ｓｅｐ、３７（９）：２１３０−４、Ｂａｎｕｇａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｄ．２０１１  Ａｕｇ、１３（８）：７２９−３６）。
【０１００】
ムコ多糖症ＩＩＩＢ（ＭＰＳ  ＩＩＩＢ）／サンフィリポＢ症候群
サンフィリポＢ型症候群としても知られる、ムコ多糖症ＩＩＩＢ（ＭＰＳ  ＩＩＩＢ）疾患。ＭＰＳ  ＩＩＩＢ、サンフィリポＢ症候群とは、酵素α−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）の欠損により特徴付けられる、希少な常染色体劣性遺伝子障害である。この酵素の非存在下では、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、例えば、ＧＡＧヘパラン硫酸、及び部分的に分解されたＧＡＧ分子は、体から除去することができず、様々な組織のリソソーム中に蓄積し、進行性の広範な体性機能障害を引き起こす（Ｋａｋｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ．Ｍｅｄ．３４４（３）：１８２−８、２００１）。ＧＡＧは、ニューロン及びグリア細胞のリソソーム中に蓄積し、脳外での蓄積はより少ないことが示されている。
【０１０１】
ＭＰＳ  ＩＩＩの４つの異なる形態、指定されたＭＰＳ  ＩＩＩＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤが同定されている。各々は、ＧＡＧヘパラン硫酸の分解に関与する４つの酵素のうちの１つの欠損を表す。すべての形態は、硬い顔の特徴、肝脾腫、角膜混濁、及び骨格変形を含む、様々な程度の同じ臨床症状を含む。最も注目すべきは、しかしながら、ニューロン中のヘパラン硫酸の蓄積だけでなく、初期のＧＡＧ蓄積により引き起こされるガングリオシドＧＭ２、ＧＭ３、及びＧＤ２のその後の上昇にも関係する、認知能力の重度及び進行性の低下である（Ｗａｌｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４５：１８８−９９、１９９８）。
【０１０２】
ＭＰＳ  ＩＩＩ疾患はすべて、典型的には幼児において現れる同様の症状を有する。罹患した幼児は、見たところは正常であるが、いくらかの軽度の顔面異形が認識され得る場合がある。他のムコ多糖症に典型的な硬い関節、多毛症、及び硬い髪は、通常は疾患の後期まで存在しない。初期の無症状期間後、患者は通常、発達の遅れ及び／または行動問題、続いて重度の認知症及び進行性運動疾患を引き起こす進行性知能低下を示す。発話の習得は、多くの場合で遅く不完全である。疾患は、癇癪発作、多動性、破壊性、攻撃的行動、異食症、及び睡眠障害を含む、増大する行動障害へと進行する。罹患児は正常の筋力及び可動性を有するので、行動障害は対処するのが非常に困難である。疾病の最終段階では、小児は、次第に不動及び無反応となり、多くの場合で車椅子が必要となり、嚥下困難及び発作を発現する。罹患児の寿命は、通常、１０代後半〜２０代前半を超えて延びることはない。ＭＰＳ  ＩＩＩＢを治療するための方法は、米国特許公報第２０１４／０１６１７８８号において記載されている。
【０１０３】
神経セロイドリポフスチン症（ＣＬＮ２）／バッテン病
神経セロイドリポフスチン症（ＣＬＮ２）疾患は、ＴＰＰ１遺伝子における変異により引き起こされるリソソーム酵素トリペプチジルペプチダーゼ−１（ＴＰＰ１）の欠損により特徴付けられる希少な遺伝子疾患である。ＣＬＮ２疾患は、常染色体劣性障害として遺伝する。ＴＰＰ１の非存在下では、通常は酵素により代謝されるリソソーム蓄積物質は、多くの臓器中に蓄積し、中枢神経系中での蓄積は、ＣＬＮ２疾患に典型的な神経変性症状を引き起こす。ＣＬＮ２疾患の未治療の疾患進行は、十分に特徴分析されており、疾患の自然史は、北米及び欧州における独立した患者集団からの自然史データにより示されるように、非常に一貫性があり、予測可能である。
【０１０４】
成熟天然ＴＰＰ１タンパク質は、リソソームセリンプロテアーゼであり、高度に保存されたＳｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ（ＳＥＤ）触媒三残基により特徴付けられるセドリシン（セリン−カルボキシルペプチダーゼ）ファミリーの唯一の既知の哺乳類メンバーである。酵素の主要な活性は、広範な基質特異性を有するトリペプチジルエキソペプチダーゼとしてである。その基質上での酵素の活性は、タンパク質基質のＮ末端からのトリペプチドの連続的な放出をもたらす（Ｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００５、１３８（２）：１２７−３４）。組換えヒトトリペプチジルペプチダーゼ−１（ｒｈＴＰＰ１）は、ＣＬＮ２疾患のための考えられる治療として開発されている。
【０１０５】
本明細書において記載されている方法を使用して患者からの試料中のＬＥ中和因子のレベルを測定すること、ならびにＥＲＴの有効性に干渉する中和因子が検出される場合、次に患者に免疫抑制療法を実施すること、及び／または酵素補充療法中に投与される酵素の量を低減することを含む、リソソーム蓄積症を有し、酵素補充療法を受けている患者を治療するための方法も考慮される。リソソーム蓄積症及び酵素補充療法中に投与される酵素は、本明細書において記載されているものを含む。
【０１０６】
例えば、本明細書では、（ａ）対象からの体液試料を、検出部分と共役するリソソーム酵素と接触させて、体液試料中のＬＥ特異的中和因子を検出することであって、ＬＥ特異的中和因子及びリソソーム酵素検出部分が複合体を形成する、検出することと、（ｂ）ステップ（ａ）からのＬＥ特異的因子／リソソーム酵素検出部分複合体を、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）を含む細胞と接触させることと、（ｃ）細胞の内部または細胞の表面上において検出部分で標識されたリソソーム酵素の存在を判定することにより、体液試料中のＬＥ特異的中和因子の存在を判定することと、（ｄ）ＬＥ特異的中和因子が酵素補充療法の有効性に干渉するかを判定することと、（ｅ）ＬＥ特異的中和因子が酵素補充療法の有効性に干渉する場合に療法レジメンを変更し、任意で対象に免疫抑制薬がさらに投与される、及び／または対象のための酵素補充療法の用量が低減されることと、を含む、リソソーム蓄積症を有し、酵素補充療法を受けている対象を治療するための方法が提供される。
【０１０７】
本明細書では、（ａ）対象からの体液試料を、検出部分と共役するリソソーム酵素と接触させて、体液試料中のＬＥ特異的中和因子を検出することであって、ＬＥ特異的中和因子及びリソソーム酵素検出部分が複合体を形成する、検出することと、（ｂ）ステップ（ａ）からのＬＥ特異的中和因子／リソソーム酵素検出部分複合体を、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）を含む細胞と接触させることと、（ｃ）細胞の内部または細胞の表面上において検出部分で標識されたリソソーム酵素を検出することにより、体液試料からＬＥ特異的中和因子の存在を判定することと、（ｄ）ＬＥ特異的中和因子が酵素補充療法の有効性に干渉するかを判定することと、（ｅ）ＬＥ特異的中和因子が酵素補充療法の有効性に干渉する場合に療法レジメンを変更し、任意で対象に免疫抑制薬がさらに投与される、及び／または対象のための酵素補充療法の用量が低減されることと、を含む、リソソーム蓄積症を有し、酵素補充療法を受けている対象を治療するための方法も提供される。
【０１０８】
本明細書では、（ａ）対象からの体液試料を、検出部分と共役するリソソーム酵素と接触させて、体液試料中のＬＥ特異的中和因子を検出することであって、ＬＥ特異的中和因子及びリソソーム酵素検出部分が複合体を形成する、検出することと、（ｂ）ステップ（ａ）からのＬＥ特異的中和因子／リソソーム酵素複合体を、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）を含む細胞と接触させることと、（ｃ）細胞の内部または細胞の表面上において検出部分で標識されたリソソーム酵素を検出することにより、体液試料からＬＥ特異的中和因子の存在を判定することと、（ｄ）ＬＥ特異的中和因子が酵素補充療法の有効性に干渉するかを判定することと、（ｅ）ＬＥ特異的中和因子が酵素補充療法の有効性に干渉する場合に療法レジメンを変更し、任意で対象に免疫抑制薬がさらに投与される、及び／または対象のための酵素補充療法の用量が低減されることと、を含む、リソソーム蓄積症を有し、酵素補充療法を受けている対象を治療するための方法も考慮される。
【０１０９】
中和因子は中和抗体であると考えられる。
【０１１０】
様々な実施形態では、投与される酵素の用量は、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０倍、または治療医により適切と判定されるように低減される。
【０１１１】
本明細書において考慮されている免疫抑制薬としては、これらに限定されないが、シクロスポリンＡ、ラパマイシン、ＦＫ５０６（タクロリムス）、及びシムロリムスのようなカルシニューリン阻害薬、ならびにこれらに限定されないが、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、チオグアニン、シタラビン、メトトレキサート、マイコフェノール酸、または６−（１，３−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−６−メトキシ−７−メチル−３−オキシ−５−イソベンゾフラニル）−４−メチル−４−ヘキサン酸、等、シクロホスファミド、及びクロラムブシルを含む、抗増殖薬が挙げられる。酵素補充療法を受けている対象に対して免疫抑制療法を実施する方法は、例えば、本明細書に参照により組み込まれる、米国特許第７，４８５，３１４号及び第９，０４４，４７３号において開示されている。
【０１１２】
様々な実施形態では、ヒト対象のためのシクロスポリンＡの用量は、１００〜５００ｎｇ／ｍｌの血中トラフレベルに到達するように、約１０ｍｇ／ｋｇ／日〜約１５ｍｇ／ｋｇ／日であってよい。必要なレベルは、約３５０＋／−１５０ｎｇ／ｍｌの血中トラフレベルが達成されたデノボ腎または他の移植（約８＋／−３ｍｇ／ｋｇ／日）において使用されるものと同等であってよい（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ｅｄ．５６  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏ．、Ｍｏｎｔｖａｌｅ、Ｎ．Ｊ．、ｐ２３８１）。経口タクロリムスの従来の用量は、０．２ｍｇ／ｋｇ／日である。シロリムスの従来の用量は、２ｍｇ／ｋｇ／日である。Ｔ細胞免疫抑制薬は、少なくとも約２週間、約３週間、約４週間にわたり投与され、及び約６週間以上にわたってよい。
【０１１３】
抗増殖薬が使用される場合、これは従来の用量で投与してよく、任意でＴ細胞免疫抑制薬は、一般的には少なくとも約２週間、より一般的には少なくとも約３週間、約４週間にわたり投与され、及び約６週間以上にわたってよい。例えば、アザチオプリンの標準用量は、約１〜５ｍｇ／ｋｇ／日であり、上限、約３〜５ｍｇ／ｋｇ／日が初めに使用され、レジメンの構築後は下の範囲、約１〜３ｍｇ／ｋｇ／日を投与してよい。抗増殖薬及び／またはＴ細胞免疫抑制薬は、隔週で投与してもよい。
【０１１４】
例えば、Ｔ細胞免疫抑制薬の初期用量は、免疫抑制のための標準用量の少なくとも約１２５％、標準用量の少なくとも約１５０％、または標準用量の２００％以上に等しい用量であってよい。他の実施形態では、用量は、より頻繁に、例えば、１日１回ではなく２回、等で投与される、従来の用量であってよい。経口タクロリムスの従来の用量は、０．２ｍｇ／ｋｇ／日である。シロリムスの従来の用量は、２ｍｇ／ｋｇ／日である。標準用量が、特定の薬物、投与の方法、すなわち、経口、静脈内、等、及び宿主に応じて変動するであろうことは、当業者により理解されるであろう。
【０１１５】
ＬＥ特異的中和因子のレベルは、免疫抑制療法の実施及び／またはＥＲＴ用量の低減後に測定され、ＬＥ特異的中和因子が検出されなくなる場合、及び／または用量がＬＥ特異的中和因子の検出前の治療用量まで再び増加される場合、免疫抑制療法は中止されるとさらに考えられる。
【０１１６】
抗体
様々な実施形態では、抗体標準物または試料抗体は、これらに限定されないが、タンパク質Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーを含む、当該技術分野における標準的な技術を使用して、溶液から精製してよい。微生物もしくは哺乳類細胞または血清から調製される抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、カチオンまたはアニオン交換クロマトグラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。親和性配位子としてのタンパク質Ａの適切性は、抗体中に存在するいずれかの免疫グロブリンＦｃドメインの種及び同位体に依存する。タンパク質Ａは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖をベースとする抗体を精製するのに使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。タンパク質Ｇは、すべてのマウスアイソタイプについて及びヒトγ３について推奨されている（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯＪ．５：１５６７−７５（１９８６））。親和性配位子が付着するマトリックスは、ほとんどの場合アガロースまたはアクリルアミドであるが、他のマトリックスが利用可能である。コントロールドポアガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成することができるものより速い流量及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。回収する抗体に応じて、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上でのクロマトグラフィー、（ポリアスパラギン酸カラムのような）アニオンまたはカチオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿のような、タンパク質精製のための他の技術も利用可能である。
【０１１７】
アッセイは、対象からの体液または組織試料中のＬＥ特異的抗体を検出するのに使用することができる。１つの実施形態では、体液は、血清である。別の実施形態では、体液は、脳脊髄液（ＣＳＦ）である。
【０１１８】
本明細書において使用されている、リソソーム酵素の細胞取り込みを中和する抗体または他の因子は、中和因子または中和抗体がＣＩ−ＭＰＲに特異的に結合またはＬＥのＣＩ−ＭＰＲとの相互作用を阻害するものである。
【０１１９】
リソソーム酵素（ＬＥ）中和抗体または中和因子を検出するアッセイ
リソソーム区画における低ｐＨ（ｐＨ４〜４．５）及びタンパク質分解は、ｒｈＧＡＬＮＳのような、抗体及びリソソーム酵素の相互作用を減少または消失させ得るので、抗ＬＥ抗体が酵素活性を直接阻害するであろう可能性は低い。しかしながら、細胞取り込みを中和する可能性は存在し、酵素療法の有効性に干渉するであろう。ここで、目標は、患者からの抗体または因子が生理学的条件下でＬＥを結合するそれらの能力を保持する、患者において酵素補充療法の一部として投与されるリソソーム酵素（ＬＥ）に対する、抗体のような、中和因子を検出するアッセイを開発することであった。
【０１２０】
ＬＥ特異的抗体に加えて、遊離マンノース−６−リン酸、ＩＧＦ２、または可溶性ＣＩＭＰＲのような他の因子が、ＬＥ取り込みに干渉し得る。これらの因子の中和能力も、スクリーニング方法において検出されるであろう。
【０１２１】
様々な実施形態では、干渉物質の除去は、ＬＥ結合活性を有する抗体の最大回収を可能にする条件下、親和性分離を通して血清マトリックスから抗体分画を単離することにより、達成することができる。１つの実施形態では、これは、タンパク質Ａ／Ｇと共役する樹脂を使用することにより達成される。代替の実施形態では、干渉物質の除去は、これらに限定されないが、タンパク質Ａ、タンパク質Ｌ、タンパク質Ａ／Ｌ、及びタンパク質Ｇ／Ｌを含む、Ｉｇドメイン結合特性を有する他のタンパク質またはタンパク質の組み合わせと共役する樹脂を使用して達成することができる。ＬＥが酵素活性を保持しながら抗体−ＬＥ複合体の形成を可能にする条件が特定される。様々な実施形態では、血清は、改変なしで使用される。
【０１２２】
ＬＥ特異的抗体を精製するための方法は、ここに参照により組み込まれる、米国特許第７，７１３，７０９号において開示されている。アッセイは、対象からの体液または組織試料中のＬＥ中和抗体または他の因子を検出するのに使用することができる。好ましい実施形態では、体液は、血清である。
【０１２３】
ＬＥでのプレインキュベーションステップは、ＣＩ−ＭＰＲを発現させる細胞への曝露前に、中和因子−ＬＥ複合体が形成されることを可能にする。
【０１２４】
様々な実施形態では、本開示は、（ａ）対象からの体液試料を、検出部分と共役するリソソーム酵素と接触させて、体液試料中のＬＥ特異的中和因子を検出することであって、ＬＥ特異的中和因子及びリソソーム酵素検出部分が複合体を形成する、検出することと、（ｂ）ステップ（ａ）からのＬＥ特異的因子／リソソーム酵素複合体を、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）を含む細胞と接触させることと、（ｃ）細胞の内部または細胞の表面上において検出部分で標識されたリソソーム酵素の存在を判定することにより、体液試料中のＬＥ特異的中和因子の存在を判定することと、を含む、対象中のリソソーム酵素（ＬＥ）特異的中和因子を検出するための方法を提供する。
【０１２５】
本開示は、（ａ）対象からの体液試料を、検出部分と共役するリソソーム酵素と接触させて、体液試料中のＬＥ特異的中和因子を検出するステップであって、ＬＥ特異的中和因子及びリソソーム酵素検出部分が複合体を形成する、ステップと、（ｂ）ステップ（ａ）からのＬＥ特異的中和因子／リソソーム酵素を、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）を含む細胞と接触させるステップと、（ｃ）細胞の内部または細胞の表面上において検出部分で標識されたリソソーム酵素を検出することにより、体液試料からＬＥ特異的中和因子の存在を判定するステップであって、少量の検出可能ＬＥ−検出部分が、試料中のＬＥ特異的中和因子の存在を示す、ステップと、を含む、対象中のリソソーム酵素（ＬＥ）特異的中和因子の存在を判定するための方法も提供する。
【０１２６】
別の態様では、本開示は、（ａ）対象からの体液試料を、ＬＥ共役磁気ビーズと接触させるステップと、（ｂ）ステップ（ａ）からの体液試料／ＬＥ−ビーズ組み合わせを、検出部分と共役するリソソーム酵素を含む組成物と接触させて、ＬＥ特異的中和因子を検出するステップと、（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせを、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）を含む細胞と接触させるステップと、（ｄ）（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の組み合わせからＬＥ特異的中和因子の存在を判定し、捕捉されたＬＥ特異的中和因子のレベルを、既知量のＬＥ特異的中和抗体を有する対照試料と比較して、体液試料中の中和因子のＬＥ活性の阻害パーセント及び／または力価を判定するステップと、を含む、対象中のリソソーム酵素（ＬＥ）特異的中和因子によるリソソーム酵素活性の阻害パーセントを判定するための方法も提供する。
【０１２７】
検出ステップ中、体液試料中のＬＥ特異的中和因子のレベルは、細胞の内部または細胞の表面上においてフルオロフォア（または他の検出部分）で標識されたリソソーム酵素の存在を判定することにより判定される。対照と比較して体液試料の存在下での検出の低減したレベルは、体液試料がＬＥ取り込みを阻害する中和因子を含有することを示す。
【０１２８】
方法中、体液試料及びリソソーム酵素−フルオロフォア共役体を、同じ溶液中で共に接触させることが考慮される。体液試料、リソソーム酵素−ビーズ共役体、及びリソソーム酵素−フルオロフォア共役体を、同じ溶液中で共に接触させることも考慮される。様々な実施形態では、試料の接触は、薬剤の細胞との接触前に行われる。１つの実施形態では、すべての成分は、同時に開始する、細胞との同じ混合物中で共に培養してよい。
【０１２９】
様々な実施形態では、体液試料及びリソソーム酵素−検出部分共役体は、細胞との接触前に、少なくとも約４〜８時間、例えば、６時間にわたり共に接触させる。様々な実施形態では、体液試料、リソソーム酵素−ビーズ共役体、及びリソソーム酵素−検出部分共役体は、細胞との接触前に、少なくとも約４〜８時間、例えば、６時間にわたり共に接触させる。様々な実施形態では、接触は、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２時間とすることができる。
【０１３０】
様々な実施形態では、体液試料は、ＬＥ−検出部分共役体と、少なくとも約６時間にわたり接触させる。様々な実施形態では、接触は、少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、または１２時間とすることができる。様々な実施形態では、接触は、約２〜８℃である。様々な実施形態では、接触は、約４℃である。様々な実施形態では、体液試料及びＬＥ−検出部分は、少なくとも約６時間にわたり約４℃で接触させる。
【０１３１】
様々な実施形態では、体液試料、リソソーム酵素−ビーズ共役体、及びリソソーム酵素−検出部分は、細胞と、約３時間にわたり接触させる。様々な実施形態では、体液試料及びリソソーム酵素−検出部分は、細胞と、約３時間にわたり接触させる。様々な実施形態では、細胞との接触は、約３、４、５、または６時間とすることができる。様々な実施形態では、細胞との接触は、約３、３．２５、３．５、３．７５、または４時間にわたる。様々な実施形態では、細胞との接触は、約３４〜３９℃である。様々な実施形態では、細胞との接触は、約３７℃である。
【０１３２】
以下の実施例は、情報を提供するものであり、限定するものとみなされるべきではない。
【実施例】
【０１３３】
実施例１
ＬＥ特異的中和因子を検出する細胞ベースアッセイの開発
ＣＩ−ＭＰＲを通したリソソーム酵素取り込みに対する、中和抗体のような、中和因子の影響を評価するために、患者において酵素補充療法として酵素が投与される場合に発達し得るリソソーム酵素の取り込みを中和する因子を検出するための細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイが開発された。
【０１３４】
アッセイは、商業的にはＶＩＭＩＺＩＭ（登録商標）（エロスルファーゼアルファ）として知られる、ｒｈＧＡＬＮＳの取り込み分析を使用して開発されたが、アッセイは、ＣＩ−ＭＰＲを通して細胞中に取り込まれるあらゆるリソソーム酵素について有用であると考えられる。
【０１３５】
ｒｈＧＡＬＮＳの細胞取り込みは、Ｊｕｒｋａｔ細胞により取り込まれるフルオロフォア共役ｒｈＧＡＬＮＳの量を判定するフローサイトメトリーを使用して測定される。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ｒｈＧＡＬＮＳをリソソームに結合及び標的化する、ＣＩ−ＭＰＲを発現させる非接着性ヒトＴ細胞株である。ｒｈＧＡＬＮＳ中和抗体（ＮＡｂ）は、試料中で、スクリーニングカットポイント（ＳＣＰ）を超える（阻害％として計算される）フルオロフォア共役ｒｈＧＡＬＮＳ取り込みの減少により検出される。
【０１３６】
ｒｈＧＡＬＮＳ  ＮＡｂアッセイは、３つのアッセイ手順からなる。スクリーニングアッセイ手順は、ＳＣＰ以上のアッセイシグナル（ｒｈＧＡＬＮＳ取り込みの阻害）に基づき、ｒｈＧＡＬＮＳ中和活性を含有する血清試料を特定する。確認手順は、抗体の除去あり及びなしでの試料のアッセイシグナルを比較することにより、スクリーニングアッセイにおいて観察された中和活性が抗体の結果であるかを判定する。ビーズと共役するｒｈＧＡＬＮＳを使用する抗体の枯渇は、ｒｈＧＡＬＮＳ取り込みを回復させると予想される。確認カットポイント（ＣＣＰ）以上の回復率の変化を有する試料は、ＮＡｂ陽性と確認される。力価アッセイ手順は、陽性試料を段階希釈し、希釈された試料が力価カットポイント（ＴＣＰ）を超える点を判定することにより、各試料中の中和抗体の相対効力を判定する。
【０１３７】
スクリーニングアッセイ：スクリーニングアッセイのために、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を、７５，０００細胞／ウェル（１００ｕＬ）で、９６ウェルプレート組織培養プレート（Ｆｉｓｈｅｒ）において、ＲＰＭＩ−１６４０完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０高グルコース、１０％ＦＢＳ、ＰＳＧ（１００Ｉ．Ｕ．／ｍＬのペニシリン、１００ＩＵ／ｍＬのストレプトマイシン、０．２９ｍｇ／ｍＬのＬ−グルタミン））中に播種し、１２時間〜一晩、３５〜３９℃でインキュベートした。患者試料及び対照試料［抗ｒｈＧＡＬＮＳ（２０μｇ／ｍＬ）、抗ｒｈＧＡＬＮＳ（３μｇ／ｍＬ）］を、細胞への添加前に、ＲＰＭＩ−１６４０無血清培地（ＲＰＭＩ−１６４０高グルコース、ＰＳＧ（１００Ｉ．Ｕ．／ｍＬのペニシリン、１００Ｉ．Ｕ．／ｍＬのストレプトマイシン、０．２９ｍｇ／ｍＬのＬ−グルタミン））に１：２．５で希釈した。
【０１３８】
確認アッセイ：確認アッセイのために、ｒｈＧＡＬＮＳ共役トシル活性化磁気ビーズを２分間磁化し、保存溶液を静かに注ぎ、ビーズを６ｍＬのカップリングバッファ［１倍ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ］に再懸濁させた。このステップをさらに３回繰り返して合計４回の洗浄を行い、ビーズをウェル当たり１００μＬでＮｕｎｃ丸底９６ウェルポリプロピレンプレートに播種した。ビーズをＤｙｎａｍａｇ  ９６  Ｓｉｄｅ  Ｓｋｉｒｔｅｄ磁石でウェルの側部まで引き、カップリングバッファをマルチチャネルピペットでウェルから除去し、Ｓｋｉｒｔｅｄ磁石も除去した。ウェル当たり１４０μＬの予め希釈された確認ＱＣ／試料を乾燥ビーズに直接添加し、プレートをプレートシェーカー上で６０分間８００ｒｐｍで振盪させた。試料は無血清ＲＰＭＩ−１６４０に１：２．５で希釈してよく、ビーズと共にウェルに添加した。プレートをシェーカーから取り出し、ビーズをＤｙｎａｍａｇ  ９６  Ｓｉｄｅ  Ｓｋｉｒｔｅｄ磁石でウェルの側部まで引いた。ウェル当たり６０μＬのすべての試料を、Ａｌｅｘａ４８８共役ｒｈＧＡＬＮＳと接触させるためにアッセイプレートに移した。
【０１３９】
Ａｌｅｘａ４８８共役ｒｈＧＡＬＮＳでの試料インキュベーション：Ａｌｅｘａ４８８共役ｒｈＧＡＬＮＳ（ストック濃度＝１ｍｇ／ｍＬ）を、ＲＰＭＩ−１６４０無血清培地で、４．８μＬのＡｌｅｘａ４８８共役ｒｈＧＡＬＮＳストックを１１９９５．２μＬのＲＰＭＩ−１６４０無血清培地に添加することにより、０．４μｇ／ｍＬの最終濃度まで希釈した。Ｃｏｓｔａｒ９６ウェル平底プレートにおいて、ウェル当たり６０μＬの０．４μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ４８８共役ｒｈＧＡＬＮＳを、ＲＰＭＩ−１６４０無血清培地中で、必要に応じてすべてのウェルに添加した。１：１希釈について、ウェル当たり６０μＬの対照を、２通りまたは４通り２セットで適切なウェルに添加した。同様に、試料の１：１希釈について、ウェル当たり６０μＬの患者スクリーニング試料を、適切なウェルに添加した。確認アッセイのための１：１希釈について、ウェル当たり６０μＬの患者確認試料を、対応するウェルに２通り添加した。プレートを覆い、ホイルに包み、一晩１４〜２０時間にわたり２〜８℃でインキュベートした。
【０１４０】
アッセイ：試料インキュベーションステップ前に、細胞プレートをＣＯ２インキュベーターから取り出し、細胞を観察して健康で生存可能であることを確認した。スクリーニングまたは確認アッセイのために調製され、ＬＥ−フルオロフォア共役体で染色された対照及び患者試料を、２〜８℃から取り出し、３５〜３９℃のＣＯ２インキュベーターに１０〜２０分間入れ、加熱した。１００μＬの試料を細胞に添加し、試料を含む細胞プレートを再度３５〜３９℃のＣＯ２インキュベーターに３〜３．５時間入れた。インキュベーションが完了した後、プレートを６分間３１０ｘｇで卓上遠心分離機において１４〜１８℃で遠心分離することにより、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、必要に応じて２〜５回繰り返した。最終洗浄後、プレートを遠心分離機から取り出し、細胞ペレットを１００μＬの生存性染料（赤色蛍光反応性色素１：１０００希釈）に再懸濁させ、生存性について試験した。生存性試験が完了すると、細胞を、６分３１０ｘｇで卓上遠心分離機において１４〜１８℃で遠心分離した。
【０１４１】
任意で、細胞は、１％パラホルムアルデヒド溶液（ＰＦＡ）中で固定される。１００μＬの１％ＰＦＡを細胞ペレットに添加し、軽くボルテックスして混合する。固定された細胞を覆い、２〜８℃で、フローサイトメトリーによる分析前に最大３日間保存する。分析前に、５０μＬのＰＢＳを各ウェルに注ぎ、各ウェル中の体積を１５０μＬにした。
【０１４２】
細胞は、最終洗浄後に１５０μＬでの再懸濁による固定なしで分析してもよい。
【０１４３】
試料回収のために、プレート試料全体をサイトメーターにより取得し、約１０，０００の所望の事象を取得した。
【０１４４】
すべての試料複製物は、ＣＶ％≦２５．０％を有していなければならない。シグナル阻害パーセント（ＳＩ％）は、［ＳＩ％＝１−試料の平均中央蛍光強度（ＭＦＩ）／対照の平均ＭＦＩ×１００］として計算される。確認アッセイデータを、試料の平均確認アッセイＭＦＩ／試料の平均スクリーニングアッセイＭＦＩとして定義される、回復率として分析した。力価を、試料が、線形回帰分析（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ）により判定される力価カットポイントを超えた補間希釈因子として計算した。他の統計は、ｔ検定を使用して計算され、対照についてｔ統計は９９％ＣＩ＝２．６６である。
【０１４５】
取り込みを中和した陽性対照ポリクロナールヤギ抗ｒｈＧＡＬＮＳ抗体は、濃度≧０．９７μｇ／ｍＬで検出可能であった。アッセイ精度、選択性、薬物耐性、及び特異性を判定し、カットポイントを計算して陽性試料を評価するための基準を設定した。
【０１４６】
確認カットポイント：固定ＣＣＰを確立し、陽性と確認された試料を特定するのに使用した。６ランについての回復率値を、ボックスプロット分析を使用するＪＭＰ統計ソフトウェア（バージョン１１．０）において正規性について評価した。データセットから最小数の外れ値を除去後、６ランの各々についての回復率値の分析は、すべてのランが正規分布したことを判定した（ｐ値≧０．０５、付録３）。プールされた分散を次に使用し、データ（表４）の正規分布モデルの９９パーセンタイルに基づく固定確認カットポイントを計算し、１．２４の回復率ＣＣＰを得た。よって、陽性とスクリーニングされ、確認アッセイにおいて回復率≧１．２４を有する試料は、試料試験中に陽性と確認されたとみなされる。
【０１４７】
スクリーニング及び力価カットポイント：ＪＭＰソフトウェアを使用し、バリデーション中に回収されたナイーブな個別の血清スクリーニングアッセイデータの分布の正規性を分析した。試料ＳＩ％データ分布を、正規性について分析した。外れ値は、各ランについての正規分布を達成するのに必要な最小数を除去することにより、保存的に除外した。プールされた分散を次に使用し、データの正規分布モデルの９５パーセンタイルに基づくスクリーニングカットポイント及び９９．９パーセンタイルに基づく力価カットポイントを計算し、それぞれ、１４．０２％及び２５．７６％のＳＩ％スクリーニングカットポイント及び力価カットポイントを得た。よって、スクリーニングアッセイにおいてＳＩ％≧１４．０２％を有する試料は、試料試験中に陽性とみなされる。
【０１４８】
薬物耐性（ｒｈＧＡＬＮＳ薬物干渉）：薬物耐性を、３μｇ／ｍＬ（低陽性、ＬＰ）または２０μｇ／ｍＬ（高陽性、ＨＰ）の陽性対照抗ｒｈＧＡＬＮＳ抗体が添加された正常ヒトプール血清（ＮＨＰＳ）を使用して評価した。上記のような陽性対照濃度を含有する試料に、０μｇ／ｍＬのｒｈＧＡＬＮＳまたは７つの濃度のｒｈＧＡＬＮＳ薬物（２．００μｇ／ｍＬ、０．６７μｇ／ｍＬ、０．２２μｇ／ｍＬ、０．０７４μｇ／ｍＬ、０．０２５μｇ／ｍＬ、０．００８μｇ／ｍＬ、及び０．００２７μｇ／ｍＬ）のうちの１つのいずれかを投与した。すべての試料を、スクリーニング方法に従って、単一のプレート上で、一人の分析者によりアッセイした。低及び高ＰＣ添加試料が陽性とスクリーニングされたｒｈＧＡＬＮＳの最高ニート濃度は、２．００μｇ／ｍＬであり、試験された最高濃度であった。ＮＨＰＳ及び２．０μｇ／ｍＬでの低陽性添加試料のＳＩ％における増加は、Ａｌｅｘａ４８８共役ｒｈＧＡＬＮＳ薬物で標識されていないものの競合取り込み阻害を示し得る。これらのデータは、アッセイが、Ａｌｅｘａ４８８共役ｒｈＧＡＬＮＳ薬物の取り込みに干渉する前の、最大０．２２μｇ／ｍＬのｒｈＧＡＬＮＳ薬物を許容することができることを示す。毎週または隔週投与の直前に試料を回収することにより、薬物干渉を最小化することが推奨されている。
【０１４９】
ｒｈＧＡＬＮＳ  ＮＡｂアッセイをバリデートし、臨床試験内での実施のために準備した。ＳＩ％結果≧１４．０２をもたらす臨床試料は、仮陽性とみなされ、確認試験を必要とする。確認試験において、試料は、３０ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＡＬＮＳ共役トシル活性化Ｄｙｎａｂｅａｄｓで免疫枯渇させる。回復率≧１．２４のＣＣＰを有する試料は、ｒｈＧＡＬＮＳ特異的中和抗体の存在について陽性と報告される。陽性試料は、２５．７６％のＳＩ％力価カットポイントを使用して抗ｒｈＧＡＬＮＳ中和抗体のレベルを判定する力価アッセイを使用して試験される。
【０１５０】
共焦点イメージング：Ａｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳの内在化及びリソソームへの輸送を、セクション２．３において記載されている機能的ＮＡｂアッセイからの細胞を、５０ｎＭのＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で、３７℃で１時間インキュベートすることにより、共焦点顕微鏡により確認した。細胞を次に無血清ＲＰＭＩ−１６４０で洗浄し、Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｍｏｕｎｔａｎｔ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で封入し、封止し、Ｌｅｉｃａ  ＳＰ８共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して可視化した。４倍ズームを備える６３倍Ｐｌａｎ−Ａｐｏ対物レンズ及びＬＡＳＸソフトウェア（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、共焦点Ｚスタックを取得した。Ｚスタックを、Ｖｏｌｏｃｉｔｙソフトウェアバージョン６．３（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して３Ｄレンダリング及びエクスポートした。
【０１５１】
血清からのヒト抗ｒｈＧＡＬＮＳ抗体の検出
アッセイの原理は、内在化フルオロフォア標識薬物を測定することである。この例では、陽性ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８シグナルの存在は、患者試料内の中和抗体の非存在を示し、よって、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識薬物の細胞中への内在化を可能にする。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８シグナルの非存在は、患者試料内の中和抗体または他の中和因子の存在を示し、よって、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識薬物の内在化を阻害する。
【０１５２】
患者試料中のｒｈＧＡＬＮＳ  ＮＡｂの量を判定する上記スクリーニング及び確認アッセイを実施した後、細胞表面上でＣＩ−ＭＰＲを発現させるＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞が、３７℃での４時間のインキュベーション後の約５μｇ／ｍＬのＫ取り込みで、Ａｌｅｘａ４８８標識ｒｈＧＡＬＮＳを内在化したことを判定した。トリパンブルー消光、細胞のＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳでの３７℃ではなく４℃でのインキュベーション、または細胞のサイトカラシンＤでの処理での実験は、フローサイトメーターにより測定されたＭＦＩシグナルが、細胞表面に結合したＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳではなく、内在化Ａｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳからもたらされたことを示した。
【０１５３】
バリデートされた細胞取り込みＮＡｂアッセイ及びインビトロ受容体結合ＮＡｂアッセイからのアッセイパラメータの比較を行った。フェーズ３試験からの〜８００の対象試料の再試験は、両方のアッセイからの試料結果の８９％が、すべての時点及び治療群にわたりＮＡｂ発生について一致していることを示した。
【０１５４】
ｒｈＧＡＬＮＳ（エロスルファーゼアルファ）治療の２４週試験からの試料を、ＮＡｂについて、ベースラインならびに２、４、８、１２、１６、２０、及び２４週目で評価した。ｒｈＧＡＬＮＳを、２．０ｍｇ／ｋｇ体重で、２つの投与コホート、毎週及び隔週（ＱＯＷ）で注入した。陽性試料（図２Ａ）は、抗ｒｈＧＡＬＮＳ総抗体（ＴＡｂ）力価［毎週群では２４週平均１６７，７３７（レンジ０〜１．７７×１０６）及びＱＯＷ群では１９０，９０１（レンジ８１０〜１．７７×１０６）］（図２Ｂ）に対して、比較的低いＮＡｂ力価［毎週群では２４週平均５２（レンジ０〜１，０９８）及びＱＯＷ群では１３０（レンジ０〜１，６５９）］を示す。
【０１５５】
これらの結果は、この細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイが、ｒｈＧＡＬＮＳに対する、中和抗体、または他の因子を検出し、このプラットフォームが、受容体介在性内在化が起こる他の酵素補充療法酵素に対する中和抗体及び他の中和因子の検出に適用可能であることを示す。
【０１５６】
実施例２
細胞中へのリソソーム酵素取り込みを阻害する中和因子の検出
アッセイにおいてＣＩ−ＭＰＲに結合してｒｈＧＡＬＮＳの取り込みを阻害する他の因子の能力も測定した。ｒｈＧＡＬＮＳは、タンパク質上のマンノース６リン酸を通してＣＩ−ＭＰＲに結合する。遊離Ｍ６Ｐ、ＩＧＦ−ＩＩ、及び可溶性ＣＩ−ＭＰＲのような他の考えられる中和因子を、アッセイにおいて、中和抗体の代わりにインキュベートした。アッセイの結果は、Ｍ６Ｐの存在下での細胞の培養が、Ｊｕｒｋａｔ細胞中へのｒｈＧＡＬＮＳ取り込みの阻害に用量依存性効果を有し、０．５ＭのＭ６Ｐが約３２％のｒｈＧＡＬＮＳ取り込みの阻害を示し、５ＭのＭ６Ｐが約９６％の阻害を示すことを示した（図３Ａ）。対照的に、ＩＧＦ−ＩＩは、ｒｈＧＡＬＮＳ取り込みの部分的阻害のみを示す（図３Ｂ）。ウシ血清から単離された、可溶性ＣＩ−ＭＰＲも、濃度依存的にＪｕｒｋａｔ細胞上の細胞ＣＩ−ＭＰＲへの結合について競合することにより、ｒｈＧＡＬＮＳの取り込みを機能的に阻害した（図３Ｃ）。
【０１５７】
これらの結果は、マンノース−６−リン酸誘導性のＬＥの細胞取り込みを、方法において、過剰な可溶性マンノース−６−リン酸により、及び可溶性受容体（ｓＣＩ−ＭＰＲ）により、特異的に阻害することができることを示す。
【０１５８】
アッセイを、マンノース−６リン酸ではないＣＩ−ＭＰＲ配位子についてもバリデートした。ＣＩ−ＭＰＲ発現ＪｕｒｋａｔまたはＨｅｐＧ２細胞の能力を、ＣＩ−ＭＰＲへの結合を促進する、ＩＧＦ−ＩＩタグを含む標識ＧＡＡを取り込むそれらの能力について、フローサイトメトリーにより分析した。Ｊｕｒｋａｔ及びＨｅｐＧ２細胞の両方は、細胞内蛍光シグナルにより判定されるように、ＧＡＡ−ＩＧＦＩＩを内在化することができた。この取り込みは、非標識ＧＡＡ及び抗ＩＧＦＩＩ抗体により阻害された。
【０１５９】
アッセイの結果は、ＩＧＦ−ＩＩの存在下での細胞の培養が、Ｊｕｒｋａｔ細胞中へのｒｈＧＡＡ−ＩＧＦ−ＩＩ取り込みの阻害に用量依存性効果を有し、０．６Ｍの過剰ＩＧＦ−ＩＩが約５８％のｒｈＧＡＬＮＳ取り込みの阻害を示し、５０Ｍの過剰ＩＧＦ−ＩＩが約９５％の阻害を示すことを示した（図４Ａ）。対照的に、Ｍ６Ｐは、ｒｈＧＡＡ−ＩＧＦ−ＩＩ取り込みの部分的阻害のみを示した（図４Ｂ）。
【０１６０】
これらの結果は、グリコシル化非依存性リソソーム標的化を、方法において、過剰ＩＧＦ−ＩＩにより特異的に阻害することができることを示す。
【０１６１】
実施例３
追加の機能的ＮＡｂアッセイ開発
追加の分析において、フローサイトメトリーゲーティング戦略は、ＭＦＩ分析をＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ取り込みの測定について単一の生きたＪｕｒｋａｔ細胞に制限した。インビトロでのＪｕｒｋａｔ細胞による最適なｒｈＧＡＬＮＳ取り込み条件を評価するために、Ａｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ用量応答曲線を生成した（０〜３６３．６ｎＭまたは０〜４０μｇ／ｍｌ）。ＭＦＩにおける用量依存性の増加は、Ａｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳでインキュベートされたＪｕｒｋａｔ細胞において観察され、未処理細胞のバックグラウンドは、４３．７±４．７のＭＦＩで検出された（Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロット線形回帰分析によるＫ取り込み＝４６．３ｎＭ、図５Ａ及びＢ）。
【０１６２】
Ａｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳでの細胞のインキュベーション後に検出されたＭＦＩシグナルが内在化された薬物または細胞表面に結合した薬物からもたらされたかを判定するために、一連の実験を行い、これにより、２０％のプールヒト血清の存在下でＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ（０．４μｇ／ｍＬ）でインキュベートされた細胞に、４℃での放置、トリパンブルーでの消光、またはサイトカラシンＢで処理のいずれかを行った。４℃でインキュベートされた細胞は、薬物の取り込みではなく結合を可能にし、細胞を同じ長さの時間３７℃でインキュベートした場合（図５Ｃ）の４４２５±９８．６のＭＦＩと比較して、９２．９±１．５０のＭＦＩをもたらし、ＭＦＩは主にＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳの内在化を測定したことを示した。次に、Ａｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳでのインキュベーション後の細胞は、生存細胞には不透過性であり、Ａｌｅｘａ４８８蛍光を消光する［Ｓａｈｌｉｎ、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６０（１９８３）１１５−１２４］トリパンブルーで処理され、Ａｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳが細胞表面に結合した場合、ＭＦＩシグナルを低減させることが予想された。トリパンブルーがＪｕｒｋａｔ細胞の表面上においてＡｌｅｘａ４８８を消光したことを確認するための対照として、細胞を、Ｔ細胞の細胞表面上で発現したＣＤ３を結合するＡｌｅｘａ４８８共役マウスモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ  ＳＰ３４−２）で標識した［Ｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（１９９２）２９９５−３０００］。増加する濃度のトリパンブルーは、Ａｌｅｘａ４８８標識抗ＣＤ３で処理された細胞の蛍光を低減した（図５Ｄ）。しかしながら、０．４％までのトリパンブルーの濃度は、Ａｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ  ＭＦＩ値に影響を及ぼさず、Ａｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ処理細胞から放出されたＭＦＩシグナルのほぼすべてが細胞内の薬物内在化の結果であったことを示した（図５Ｃ及びＤ）。薬物内在化がエンドサイトーシスの結果であったかを判定するために、細胞を、Ａｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳでのインキュベーション前に１時間、サイトカラシンＢで予め処理した。Ａｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ処理細胞から放出されたＭＦＩシグナルは、３７４μＭのサイトカラシンＢの存在下で７７７±４．２ＭＦＩまで低減した（図５Ｃ）。
【０１６３】
ＣＩ−Ｍ６ＰＲを通したＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳの取り込みメカニズムを確認するために、細胞を、ＣＩ−Ｍ６ＰＲ結合部位について競合するように過剰な可溶性ＣＩ−Ｍ６ＰＲ（ｓＣＩ−Ｍ６ＰＲ）もしくはＭ６Ｐ、またはｒｈＧＡＬＮＳ結合を中和するように親和性精製ヤギ抗ｒｈＧＡＬＮＳポリクロナール抗体の存在下で、Ａｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳでインキュベートした。増加する濃度のｓＣＩ−Ｍ６ＰＲ、Ｍ６Ｐ、及び抗ｒｈＧＡＬＮＳ抗体は、用量依存的に、Ａｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ取り込みを抑制した（ｓＣＩ−Ｍ６ＰＲについてＩＣ５０［μＭ］＝０．０８５、Ｍ６Ｐについて４５２．９、及び抗ｒｈＧＡＬＮＳについて０．０２７、図５Ｅ）。Ｍ６ＰについてのＩＣ５０  値は、おそらくＭ６Ｐ結合部位を含有するｒｈＧＡＬＮＳ及び追加のタンパク質に対する複数のＭ６Ｐ部分との競合によって、ｓＣＩ−Ｍ６ＰＲまたは抗ｒｈＧＡＬＮＳのものより高かった。さらに、Ａｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ処理細胞の共焦点イメージングは、Ａｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳがリソソームと共局在化したことを明らかにし、標識ｒｈＧＡＬＮＳが効率的に内在化及びリソソームに輸送されることを確認した。集合的に、これらのデータは、Ａｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳの内在化が、ＣＩ−Ｍ６ＰＲへのＭ６Ｐ介在性受容体結合、これに続くエンドサイトーシス及びリソソームへの輸送を通して起こることを示す。
【０１６４】
阻害抗体の検出に最適なＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ濃度及び血清希釈の判定  一連の用量応答曲線を生成し、２０％プールヒト血清の存在下での約１μｇ／ｍＬの親和性精製ヤギ抗ｒｈＧＡＬＮＳポリクロナール抗体陽性対照（ＡｂＰＣ）の検出を提供するであろう最適な薬物用量を判定した。Ａｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳを、細胞培地に、０．０４６〜１００μｇ／ｍＬの範囲内の増加する濃度のＡｂＰＣの存在下、０．１５６μｇ／ｍＬ〜２．５０μｇ／ｍＬの最終濃度で添加した。ＡｂＰＣは、用量依存的にＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳの取り込みに干渉した（図６Ａ）。これらのデータを次に、試験されたＡｂＰＣの最大濃度（１００μｇ／ｍＬ、図６Ｂ）に対する相対倍率変化として変換及びプロットし、ＡｂＰＣについて約１μｇ／ｍＬの感度を提供するであろうＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳの用量を判定した。０．３１３μｇ／ｍＬの濃度のＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳは、最高のシグナル対ノイズ比をもたらし、９２％のほぼ最大のＳＩは、１１．１μｇ／ｍＬのＡｂＰＣの存在下で観察された。共に、これらのデータは、後述のアッセイ感度分析を含む、さらなるアッセイ開発のための、０．４μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳの選択をもたらした。
【０１６５】
ＮＡｂの検出に対する血清成分からの干渉（マトリックス干渉）の潜在的な効果を特徴分析するために、０．０４６〜１００μｇ／ｍＬの範囲内の濃度でＡｂＰＣが添加されたＮＰＳ試料を、無血清培地に２．５、５、１０、及び２０倍に希釈し、０．４μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳと１：１で混合した。（Ａｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳとの混合後の２０％プールヒト血清に等しい）１：２．５の希釈は、＜１μｇ／ｍＬでのＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ取り込みの阻害を示し、他の希釈に対して最も低いＡｂＰＣ濃度で取り込みを阻害した（図６Ｃ）。１：２０希釈は、ＡｂＰＣによる阻害（図６Ｃ）の非存在下でも、Ａｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳの検出を低減し、これは低いＮＰＳ濃度が、このアッセイにおいて薬物取り込みを非依存的に低減することができることを示した。したがって、最適感度を提供するのに、１：２．５の最小必要希釈（ＭＲＤ）が選択された。
【０１６６】
細胞取り込みＮＡｂアッセイのためのアッセイカットポイント  段階的臨床試験戦略を採用し、（総抗エロスルファーゼ抗体、ＴＡｂとも称される）抗エロスルファーゼ抗体の結合について陽性と確認されたＮＡｂ試料をスクリーニング、確認、及び力価測定した［Ｍｉｒｅ−Ｓｌｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８９（２００４）１−１６］。ＮＡｂアッセイ陽性／陰性カットポイントを定義するために、血清を、モルキオＡ症候群を有する薬物未投与の個体から回収し（ｎ＝４８）、２人の分析者により２日かけて行われる６つの別々の実験において２通り分析した。アッセイ開発時、血清は、モルキオＡ症候群を有する個体からは入手不可能であり、よって、モルキオＡ症候群を有さない健康なドナーからのプール血清が使用された。各ランについての試料ＳＩ％分布を、Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ検定（ＪＭＰソフトウェア、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ）を使用して正規性について分析した。ボックスプロット分析（ＪＭＰ）を使用して特定された外れ値を、各ランについての正規分布を達成するのに必要な最小数を除去することにより、保存的に除外した［Ｓｈａｎｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．４８（２００８）１２６７−１２８１］。このアプローチによって、総スクリーニングデータセットからの２つの外れ値（０．６９％）の除外後、正規分布が確立された。プールされた分散を次に使用し、９５パーセンタイルに基づくスクリーニングカットポイント（ＳＣＰ）を計算し、偽陰性応答を回避し、１４．０２％ＳＩのＳＣＰを得た。よって、スクリーニングステップにおいて対照血清と比較してシグナルが≧１４．０２％低減した個別の血清試料は、試料試験中に反応性（潜在的に陽性）とみなした。
【０１６７】
反応性（潜在的に陽性）とスクリーニングされた試料について、確認ステップは、真陽性試料と予想されるであろう、ｒｈＧＡＬＮＳ特異的抗体の枯渇により、試料シグナルが増加したかを評価した。薬物共役ビーズを使用し、細胞ベースアッセイにおける再試験前に、血清からｒｈＧＡＬＮＳ特異的抗体を枯渇させた。確認カットポイント（ＣＣＰ）を、上記の同じ薬物未投与血清試料を枯渇させ、各々を同じプレート上で試験されたその対応する非枯渇試料と比較することにより確立した。固定ＣＣＰ（免疫枯渇試料シグナル／非枯渇試料シグナルの回復率）を、各ランからの結果を正規性及び外れ値についてまず評価することにより判定した。正規性の欠如は、Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ検定（ｐ≦０．０５）に基づき、６つのランのうちの２つにおいて観察されたが、データセットからの最小数の外れ値（ｎ＝４［データセットの１．４１％］）の除去は、すべてのランについて正規分布をもたらした（ｐ≧０．０５）。プールされた分散を次に使用し、データの正規分布モデルの９９パーセンタイルに基づく固定ＣＣＰを計算し、１．２４の回復率ＣＣＰを得た。よって、スクリーニングステップにおいて反応性であり、確認ステップにおいて回復率≧１．２４を有した試料は、試料試験中に陽性とみなした。
【０１６８】
ＮＡｂ陽性試料を、その後、相対ＮＡｂレベルを判定する力価実験において３倍段階希釈した（１：２．５、１：７．５、１：２２．５、等）。２５．７６％ＳＩの力価カットポイント（ＴＣＰ）を、スクリーニングステップについて記載された正規分布データモデルの９９．９パーセンタイルに基づき計算した。力価値を外挿するために、陽性試料の少なくとも１つの希釈は、ＴＣＰを下回らなければならなかった。
【０１６９】
モルキオＡ症候群を有する薬物未投与個体からの試料が臨床試験から入手可能になると、アッセイバリデーション中に確立されたスクリーニング及び確認カットポイントは、モルキオＡ症候群を有する６０人の薬物未投与個体から回収され、４人の分析者により４か月かけて試験された１１５のベースライン及びプラセボ試料からの生のＭＦＩデータを使用して検証された。モルキオＡ症候群を有さないドナーについて上で記載されたものと同様の統計的アプローチを使用して、標的治療集団カットポイントは、非罹患個体から誘導された元の細胞取り込みＮＡｂアッセイカットポイントと同等であった（表１）。一致性評価の目的で、抗エロスルファーゼアルファＮＡｂを検出するのに以前使用されたＥＬＩＳＡベースのＣＩ−Ｍ６ＰＲ結合アッセイのカットポイント［Ｓｃｈｗｅｉｇｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．３７（２０１５）１０１２−１０２１．ｅ６］も、１１５のベースライン及びプラセボ試料において確認された（表１）。モルキオＡ個体からのカットポイントを使用するＮＡｂアッセイ一致性は９０％であり、バリデートされたアッセイにおける非罹患個体で確立されたカットポイントの使用を支持した。
【表１】
2018538008.tif 000002
【０１７０】
感度及び精度  生物療法により誘発された中和抗体の検出のために、業界ガイドラインは、≦１μｇ／ｍＬ陽性対照抗体のアッセイ感度を推奨する［Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２１（２００７）１−１８］。アッセイにおいて検出することができる抗体の最低濃度（すなわち、感度または検出限界［ＬＯＤ］）を判定するために、ＡｂＰＣを２０μｇ／ｍＬでＮＰＳに添加し、３倍段階希釈し、８点系列を生成した（ｎ＝１８）。各希釈系列について、値は、少なくとも２つの希釈≧ＳＣＰ及び少なくとも１つの希釈＜ＳＣＰからのＳＩ％シグナルでスクリーニングカットポイントを超え、ＡｂＰＣの平均ニート濃度は、線形回帰分析及びＭＲＤの補正を使用するＳＣＰでの補間濃度から計算した。アッセイの感度及びＬＯＤは、０．９７μｇ／ｍｌであると判定された（図７Ａ）。
【０１７１】
試験試料が入手可能になると、方法の感度を、エロスルファーゼアルファでの治療前に、モルキオＡ症候群を有する個体からの血清を使用して確認した。単一の分析者により３日かけてアッセイされた６つの希釈曲線から、０．３０μｇ／ｍＬの平均値、ＮＰＳを使用するアッセイバリデーション中に得られた０．９７μｇ／ｍＬの値（図７Ａ）と同様の値を、モルキオＡを有する個体からの試料のＳＣＰ（図７Ｂ）で補間した。
【０１７２】
アッセイ精度は、同じプレート上（アッセイ内）またはプレート間（アッセイ間）での同じ試料の反復測定値の近さを表す。ＱＣ濃度を選択して、アッセイ精度を評価し、高及び低濃度のＮＡｂの存在下でのアッセイ性能をモニタリングした。２０μｇ／ｍＬ及び３μｇ／ｍＬでＮＰＳに添加されたＡｂＰＣを、段階希釈された場合のＡｂＰＣ性能に基づき、それぞれ、高品質管理［ＨＱＣ］及び低品質管理［ＬＱＣ］濃度として選択した（図７Ａ）。アッセイ精度を評価するために、ＡｂＰＣを、２０μｇ／ｍＬ（ＨＱＣ及び力価品質管理［ＴＱＣ］濃度）、３μｇ／ｍＬ（ＬＱＣ濃度）で添加、または無添加（陰性品質管理［ＮＱＣ］濃度）とし、アッセイ内及びアッセイ間分散係数（ＣＶ）を評価した。これらのＱＣ試料の各々についての生のヒストグラムデータの一例を図７Ｃに表す。アッセイ内及びアッセイ間精度は、確認されたＨＱＣ試料について０．６０％及び０．６５％ＣＶ、ＬＱＣについて１２．０２％及び１７．６２％ＣＶ、ＮＱＣについて１４．８８％及び１６．５０％ＣＶ、ならびにＬＱＣについて１２．４１％及び２８．０４％ＣＶであった（表２）。バッチ内ｎ値は、各プレート上で試験されたＱＣ数の相違及び機器の不具合によるいくつかの試料の除外によって、ＱＣ間でわずかに変動する。ＴＱＣ試料の力価測定は、１８中１４の結果が２８．５４の中央補間希釈の±１つの３倍希釈以内であったことを示した。
【表２】
2018538008.tif 000003
【０１７３】
特異性及び選択性  取り込みアッセイにおいてＮＡｂによるｒｈＧＡＬＮＳ中和の特異性を評価するために、ＮＰＳ及びＮＰＳ＋ＬＱＣ  ＡｂＰＣの両方に、非特異的ヤギＩｇＧ陰性対照を３μｇ／ｍＬの濃度で添加することにより、試料を調製した。非特異的ヤギＩｇＧ抗体のみが添加されたＮＰＳは、スクリーニング及び確認アッセイにおいて陰性と試験された。ＮＰＳ＋ＬＱＣ  ＡｂＰＣは、非特異的ヤギＩｇＧ抗体あり及びなし両方で、陽性とスクリーニング及び確認され（表３）、アッセイが抗ｒｈＧＡＬＮＳ抗体に特異的であることを示した。
【表３】
2018538008.tif 000004
【０１７４】
このアッセイにおける抗ｒｈＧＡＬＮＳの検出に対する血清成分の効果を評価するために、１０人（男性５人／女性５人）の個別のドナーからの血清ならびに（モルキオＡ症候群を有さない）薬物未投与で健康な個体からの４つの脂肪血及び４つの溶血血清を、スクリーニングアッセイを使用して試験した。これらの試料の各々に、０μｇ／ｍＬ（ＮＱＣ濃度）または３μｇ／ｍＬ（ＬＱＣ濃度）のＡｂＰＣを添加し、アッセイ選択性を評価した。ＬＱＣが添加されたすべての正常血清試料（１０／１０）は、スクリーニングステップにおいて潜在的に陽性／反応性であった（図８Ａ）。ＬＱＣ濃度のＡｂＰＣが添加された４つの溶血試料のうち、４つ中１つ（２５％）が陽性とスクリーニングされ、より低いレベルの抗ｒｈＧＡＬＮＳの検出において血清脂質からの干渉があり得ることを示した。反対に、ＬＱＣが添加された溶血試料のすべては、陽性／反応性とスクリーニングされ、溶血が抗ｒｈＧＡＬＮＳの検出に干渉しないことを示した。
【０１７５】
アッセイ選択性を、臨床試験からの薬物未投与ベースライン試料において確認した。選択性は、１０の個別の試料において、各試料のアリコート中でＡｂＰＣをＬＱＣ濃度まで添加することにより行った。これらの添加ベースライン試料、及び対応する無添加血清を、単一のプレート上で共にアッセイした。健康または標的治療集団ベースＳＣＰのいずれかを使用して、マトリックス干渉は観察されなかった。標的集団由来ＳＣＰを使用して、すべての１０の無添加試料（１００％）が陰性とスクリーニングされ、ＬＱＣ  ＡｂＰＣを含有するすべての１０の試料（１００％）が陽性とスクリーニングされた（図８Ｂ）。
【０１７６】
薬物耐性  循環レベルの薬物からの干渉に対するアッセイの感受性を、０〜２μｇ／ｍＬの非標識ｒｈＧＡＬＮＳの存在下でのＬＱＣもしくはＨＱＣ濃度のＡｂＰＣ添加または無添加ＮＰＳを使用して評価した。予想通り、ＬＱＣ及びＨＱＣ  ＡｂＰＣは、非標識ｒｈＧＡＬＮＳの非存在下で陽性とスクリーニングされた（表４）。低濃度の非標識ｒｈＧＡＬＮＳ（≦０．０７４μｇ／ｍＬ）がＬＱＣまたはＨＱＣ  ＡｂＰＣに添加された場合、ＳＩ％は非標識ｒｈＧＡＬＮＳの非存在下で測定されたものと同等であり（表４）、わずかな相違は本来的なアッセイばらつきによる可能性が高かった。
【表４】
2018538008.tif 000005
【０１７７】
すべてのＬＱＣ及びＨＱＣ  ＡｂＰＣ添加試料は、２μｇ／ｍＬの非標識ｒｈＧＡＬＮＳの存在下で陽性とスクリーニングされた。しかしながら、濃度≧０．２２μｇ／ｍＬの非標識ｒｈＧＡＬＮＳは、ＡｂＰＣを含まないＮＰＳ中でのＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ取り込みを低減させた。これらのデータは、非標識ｒｈＧＡＬＮＳが、Ａｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳの取り込みを阻害したことを示し、アッセイが、患者血清を通して導入される最大０．２２μｇ／ｍＬのｒｈＧＡＬＮＳを許容することができることを示す。ＮＡｂ試料はモルキオＡ症候群を有する個体から投与直前に回収されたので、エロスルファーゼアルファが完全に除去されていた場合［Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．（２０１４）］、エロスルファーゼアルファが試料中に、アッセイに干渉するのに十分な濃度で存在するであろう可能性は低い。
【０１７８】
ＮＡｂ力価及び臨床結果  機能的ＮＡｂアッセイを、モルキオＡ症候群を有するエロスルファーゼアルファ治療個体中のＮＡｂを検出するための、以前報告されたＥＬＩＳＡベースＣＩ−Ｍ６ＰＲ結合アッセイ［Ｓｃｈｗｅｉｇｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．、前掲］と比較するために、臨床試験からの血清試料を細胞ベースアッセイで再分析した。陽性／陰性と確認された結果を得るのに、血清試料回収時点の大部分（８４２／８４７［９９％］）について、十分な血清−試料体積が利用可能であった。全体的な一致性は、受容体結合アッセイ及び細胞ベースアッセイにおいてＮＡｂ陽性の間で高かった（８９％）。さらに、一致性は、２４週の治療期間にかけて一貫していた（図９Ａ）。各試験訪問週でのアッセイ間の一致性を図１０に表す。
【０１７９】
以前報告されたＣＩ−Ｍ６ＰＲ結合アッセイ［Ｓｃｈｗｅｉｇｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．、前掲］を使用して検出されたＴＡｂ力価を、機能的ＮＡｂアッセイで検出されたＮＡｂアッセイ力価展開の時間経過と比較した（図９Ｂ）。ＴＡｂ及びＮＡｂの両方の力価は、ＱＯＷ及びＱＷ治療群の両方において、治療の最初の８週間で急速に増加した後、８週目から２４週目までプラトー化した（図９Ｂ）。薬物投与の頻度は、２４週目でＴＡｂ及びＮＡｂ力価に対して最小の効果を有したが、ＱＷ治療群は、治療の初期４週においてＴＡｂ及びＮＡｂの両方のより高い力価を有するようであった。ＱＯＷ及びＱＷ治療群の両方における対象は、２４週にかけて異なるＮＡｂ力価経過を展開した。力価は、初期展開後に比較的一定に保持される、もしくは徐々に低下するか、または間欠的パターンを示すかのいずれかであった。
【０１８０】
実施例４
２４週目でのＮＡｂ力価及び有効性応答
臨床試験における主要な有効性尺度は、持久力の尺度を提供する、６ＭＷＴでの歩行距離であった。ケラタン硫酸、ｒｈＧＡＬＮＳ基質も、個体の尿（ｕＫＳ）中で測定し、エロスルファーゼアルファでの治療の薬物動態学的効果を追跡した。機能的ＮＡｂアッセイで検出されたＮＡｂ力価を、６ＭＷＴ距離におけるベースラインから２４週目までの変化、及びベースラインからのｕＫＳにおける割合変化に対してプロットした。毎週または隔週投与された個体において、ＮＡｂ力価と６ＭＷＴ（図１１Ａ）またはＮＡｂ力価とｕＫＳ（図１１Ｂ）との間で関連は観察されなかった。これらのデータは、ＮＡｂ力価が、２４週の治療期間中、エロスルファーゼアルファ有効性に対して悪影響を有さなかったことを示す。
【０１８１】
エロスルファーゼアルファ薬物動態に対するＮＡｂ力価の効果：ＮＡｂと薬物動態との間の関連をさらに調査するために、機能的ＮＡｂアッセイからのＮＡｂ力価を、静脈内投与後の薬物の全身クリアランス（ＣＬ）及び消失半減期（ｔ１／２）と比較した。増加したＮＡｂ力価は、ＱＯＷ及びＱＷコホートの両方において延長したｔ１／２と関連付けられた（図１２Ａ）。両方のコホートは、増加したＮＡｂ力価と減少したＣＬとの間の相関への傾向も示した（図１２Ｂ）。共にこれらの結果は、ＮＡｂが、血漿からのエロスルファーゼアルファのクリアランスを遅らせ得ることを示す。
【０１８２】
要約
以前使用されたＣＩ−Ｍ６ＰＲ結合アッセイと比較して、この細胞ベースアッセイの形式は、エロスルファーゼアルファの細胞取り込みへの干渉を測定する。このアッセイ形式は、ＮＡｂ−薬物複合体の生きたヒト細胞上における機能的ＣＩ−Ｍ６ＰＲとの相互作用による、インサイチュ環境とのより大きな生理学的関連性を示すことが予想された。対照的に、以前報告されたインビトロＣＩ−Ｍ６ＰＲ結合アッセイは、ビオチン標識ｒｈＧＡＬＮＳのＥＬＩＳＡプレート上に固定されたウシ由来ＣＩ−Ｍ６ＰＲとの相互作用を測定する［Ｓｃｈｗｅｉｇｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．、前掲］。機能的ＮＡｂアッセイには、ヒトＴ細胞リンパ腫Ｊｕｒｋａｔ細胞が、一次ヒトＴ細胞上でも発現する、ＣＩ−Ｍ６ＰＲのそれらの天然発現のために選択された［Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３（２００８）４１６５−４１７６、Ｍｏｔｙｋａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  １０３（２０００）４９１−５００］。
【０１８３】
本試験におけるいくつかの実験は、このアッセイ形式のインビボ関連性を支持する。サイトカラシンＢ、トリパンブルー、及び４℃での細胞のインキュベーションでの実験は、ほぼすべてのＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ蛍光シグナルが、内在化薬物（すなわち、細胞表面に結合していない薬物）から得られたことを示す。Ａｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ及びＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ、リソソーム特異的ｐＨ感受性色素でインキュベートされた細胞の共焦点イメージングは、薬物がアッセイの時間枠内でリソソームに輸送されたことを示した。ｓＣＩ−Ｍ６ＰＲまたはＭ６Ｐとの競合がＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ取り込みを完全に阻害したので、ＣＩ−Ｍ６ＰＲによる内在化は、Ｊｕｒｋａｔ細胞内へのＡｌｅｘａ４８８−ｒｈＧＡＬＮＳ移行の単独のメカニズムであるようである。ほとんどのＥＲＴはＣＩ−Ｍ６ＰＲを通してリソソームに輸送されるので、このアッセイプラットフォームは、ＥＲＴに対するＮＡｂ及び他の中和因子の試験における広範な用途のための潜在能力を有する。
【０１８４】
ＭＯＲ−００４フェーズ３臨床試験においてエロスルファーゼアルファを２．０ｍｇ／ｋｇＱＯＷまたはＱＷで静脈内投与されたモルキオＡ症候群を有する個体から回収された血清試料は、インビトロＣＩ−Ｍ６ＰＲ結合ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、力価なしで、中和因子について陽性または陰性として以前評価された［Ｓｃｈｗｅｉｇｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．、前掲］。ここで提示されているこのインビトロアッセイ形式と細胞ベース形式との間の相違にかかわらず、結果は高度に一致し、両方のアッセイにおいて＞８９％で陽性または陰性のいずれかと試験した。アッセイ間で異なった試料の小部分の予備分析は、不一致試料の≧９０％の結果が、ＳＣＰ、ＣＣＰ、または両方の３０％以内であったことを示した。したがって、不一致データの少なくともいくつかは、相対的に低い陽性を有する試料の試験に関連した分析ばらつきに起因し得る。
【０１８５】
有効性に対するＮＡｂの潜在的な影響の分析を、陽性ＮＡｂ結果を有する試験訪問の割合を使用して行った。以前の結果［Ｓｃｈｗｅｉｇｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．、前掲］を確認して、ＮＡｂを結合する受容体について個体が陽性と試験された回数と６ＭＷＴ距離におけるベースラインから２４週目までの有効性応答の変化または薬物動態マーカーｕＫＳの変化との間で関連は見出されなかった。新たな細胞ベースアッセイから誘導されたＮＡｂ力価も、ベースラインから２４週目までの６ＭＷＴまたはｕＫＳにおける変化により測定された、いずれの投与群における有効性結果とも相関付けられなかった。ＴＡｂ力価ではなく、ＮＡｂ陽性が、エロスルファーゼアルファの毎週投与を受けている個体において、血清からのＣＬの減少した速度及び延長したｔ１／２と関連付けられたことは、以前報告されている［Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．、前掲］。この試験では、増加したＮＡｂ力価も、より低いＮＡｂ力価と比較して、減少した血漿クリアランス速度及び増加したｔ１／２と相関したことが見出された。しかしながら、より高いＮＡｂ力価は、ベースラインから２４週目までのｕＫＳレベルの変化により測定されたように、より堅牢性が低い薬物動態学的効果とは関連付けられなかった。
【０１８６】
ＮＡｂ力価がエロスルファーゼアルファ有効性との相関を有さなかったという発見は、ＥＲＴ免疫原性と薬物活性との間の関係についての一連の研究の登場に寄与する［Ｂａｎｕｇａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｄ．１３（２０１１）７２９−７３６、Ｂｅｎｉｃｈｏｕ、ｅｔ  ａｌ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．９６（２００９）４−１２、Ｂｒａｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｏｒｐｈａｎｅｔ  Ｊ．Ｒａｒｅ  Ｄｉｓ．８（２０１３）５１、Ｊａｍｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｏｃｈｒａｎｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｓｙｓｔ．Ｒｅｖ．９（２０１３）ＣＤ００９３５４］。このトピックについての刊行物のほとんどは、アルグルコシダーゼアルファでの治療後の幼児期発症ポンペ病を有する患者の免疫原性についての試験からのものである。ポンペ病を有する患者は、彼らが免疫学的に検出可能なレベルの酸性α−グルコシダーゼタンパク質を発現させるかに応じて、交差反応性免疫学的物質（ＣＲＩＭ）について陽性または陰性のいずれかとして分類され得る。陰性ＣＲＩＭ反応は、より高い抗体力価及びより悪い治療結果と相関することが報告されている［Ｋｉｓｈｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．９９（２０１０）２６−３３］が、１１人の患者の１つの最近の試験は、抗薬物抗体力価とＣＲＩＭ反応との間の相関を示さなかった［ｖａｎ  Ｇｅｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＢＭＣ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  １４（２０１３）１８］。イデュルスルファーゼで治療されたＭＰＳ  ＩＩ（ハンター症候群）を有する患者の別の試験は、ナンセンスまたはフレームシフト変異を有するものが、イデュルスルファーゼに対する抗体を発達させる可能性がより高かったが、抗体陽性が、６ＭＷＴ距離、予測努力性肺活量パーセント、または肝及び脾体積の向上との関連を有さなかったことを見出した［Ｂａｒｂｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．１１０（２０１３）３０３−３１０］。モルキオＡ症候群を有する個体のＣＲＩＭ反応は、本試験では評価されなかったが、抗体陽性、抗体タイプ（総抗体対中和）、または抗体力価と有効性結果と間のいかなる関係の欠如も、エロスルファーゼアルファが、抗体応答の存在下で治療活性を維持することを示す。対象はまた、エロスルファーゼアルファの反復投与に対して免疫寛容を発達させ得る。実際に、長期延長試験に参加する対象について、ＮＡｂ陽性を有する患者の割合は、３６週目の８５．９％から１２０週目の６６．０％まで減少した（Ｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｆｒｏｍ  ＭＯＲ−００５、ａ  Ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｓｔｕｄｙ、Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．、ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ）。
【０１８７】
ＣＩ−Ｍ６ＰＲを通したエロスルファーゼアルファ取り込みを中和する抗体は、効果的な量のエロスルファーゼアルファが標的組織に到達するのを防止するのに十分な濃度では存在しない場合がある。薬物の取り込みを阻害するＮＡｂは、我々の細胞ベースＮＡｂアッセイにおいて測定可能であるが、この量のＮＡｂは、エロスルファーゼアルファ用量に対しては有意でない場合がある。この細胞ベースアッセイは、理想的には観察された臨床効果の前に、最も低い可能なＮＡｂ濃度を検出するように設計された。注目すべきことには、エロスルファーゼアルファの血漿Ｃｍａｘ（２２週後、２．０ｍｇ／ｋｇＱＷ群について４．０μｇ／ｍＬ及び２．０ｍｇ／ｋｇＱＯＷ群について２．６μｇ／ｍＬ）は、アッセイにおいて使用された濃度（０．４μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ４８８標識エロスルファーゼアルファ）よりはるかに高い［Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．５３（２０１４）１１３７−１１４７］。アッセイ陽性対照抗体の力価及び親和性は、試験対照における抗体応答と同等でない場合があるが、低く安定な力価（１２週目で平均力価＝１１８±２７１）は、ＮＡｂがエロスルファーゼアルファ有効性に影響を及ぼすのに十分な量では存在しない場合があるという仮説を支持する。また、エロスルファーゼアルファは、細胞中に急速に取り込まれ、それぞれ、２２週後、２．０ｍｇ／ｋｇＱＯＷまたは２．０ｍｇ／ｋｇＱＷ群について１９または３６分の半減期（ｔ１／２）で血漿から除去される［Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．５３（２０１４）１１３７−１１４７］。さらなる調査が必要であるが、有効性に対する中和抗体効果の欠如への１つの態様は、血漿からの薬物の急速なクリアランスが、中和抗体−エロスルファーゼアルファ複合体形成の速度を減少させることであり得る。多発性硬化症の治療のためのインターフェロン−βのような、ＮＡｂが有効性に影響を及ぼすことが示されている他の生物療法について、より高濃度の薬物の投与は、ＮＡｂを克服し、有効性を回復することが示されている［Ｍｉｌｌｏｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｕｌｔ．Ｓｃｌｅｒ．１５（２００９）９７７−９８３］。
【０１８８】
ＮＡｂと有効性との間の相関の欠如についての別の考えられる説明は、エロスルファーゼアルファが、ＣＩ−Ｍ６ＰＲに非依存的に、Ｆｃ受容体発現細胞によるＮＡｂのＦｃ部分の結合を通して、ＮＡｂ−薬物複合体として取り込まれ得ることである。モルキオＡ症候群における、単球及びマクロファージのような、Ｆｃ受容体発現細胞の役割は、あまり理解されていないが、これらの細胞はＧＡＧのクリアランスまたは制御に関与することが可能である［Ｄｖｏｒａｋ−Ｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５（２０１０）ｅ１２１９４］。ＮＡｂ複合体を通したエロスルファーゼアルファの取り込みは、これらの細胞タイプ内でのＧＡＧクリアランスをもたらし、またはそうでなければ蓄積したＧＡＧにより以前損なわれたこれらの細胞の機能を向上させ得る。モルキオＡ症候群におけるＦｃ受容体発現細胞の役割のさらなる調査は、この可能性に光を当てるであろう。
【０１８９】
上記説明例において記載されているような本発明における多数の変更及び変形は、当業者には発生が予想されている。結果として、本発明には、添付の特許請求の範囲において見られるような限定のみが課されるべきである。
【図１】
2018538008.tif 000006
【図２Ａ】
2018538008.tif 000007
【図２Ｂ】
2018538008.tif 000008
【図３Ａ】
2018538008.tif 000009
【図３Ｂ】
2018538008.tif 000010
【図３Ｃ】
2018538008.tif 000011
【図４Ａ】
2018538008.tif 000012
【図４Ｂ】
2018538008.tif 000013
【図５Ａ】
2018538008.tif 000014
【図５Ｂ】
2018538008.tif 000015
【図５Ｃ】
2018538008.tif 000016
【図５Ｄ】
2018538008.tif 000017
【図５Ｅ】
2018538008.tif 000018
【図６Ａ】
2018538008.tif 000019
【図６Ｂ】
2018538008.tif 000020
【図６Ｃ】
2018538008.tif 000021
【図７Ａ】
2018538008.tif 000022
【図７Ｂ】
2018538008.tif 000023
【図７Ｃ】
2018538008.tif 000024
【図８Ａ】
2018538008.tif 000025
【図８Ｂ】
2018538008.tif 000026
【図９Ａ】
2018538008.tif 000027
【図９Ｂ】
2018538008.tif 000028
【図１０−１】
2018538008.tif 000029
【図１０−２】
2018538008.tif 000030
【図１１Ａ】
2018538008.tif 000031
【図１１Ｂ】
2018538008.tif 000032
【図１２Ａ】
2018538008.tif 000033
【図１２Ｂ】
2018538008.tif 000034
【国際調査報告】
2018538008.tif 000035
2018538008.tif 000036
2018538008.tif 000037