(57)【要約】  本発明はインスリン及び/そのアナログ（insulin analog）と免疫グロブリンFc領域とを連結して、生体内持続性及び安定性が向上されたインスリン及び/またはそのアナログ結合体及びその利用に関する。本発明のインスリン及び/またはそのアナログ結合体は生体内でインスリンと同様の活性を示し、血中半減期が著しく増加されたインスリン及び/またはそのアナログの持続型剤型であって、インスリン治療の欠点である低血糖を誘導しない画期的なインスリン及び/またはそのアナログ結合体を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式（１）を有する持続型結合体：
Ｘ-Ｌａ-Ｆ１：Ｙ-Ｌａ-Ｆ２        （１）
前記式において、
Xが、野生型インスリンＡ鎖またはそのアナログであり、
Lが、リンカーであり、
ａが、０または自然数であり、ただし、ａが２以上の場合にそれぞれのＬは互いに独立的であり、
：は化学結合であり、
Ｙが、野生型インスリンＢ鎖またはそのアナログであり、
Ｆ１とＦ２が、免疫グロブリン不変領域を含み、ＦｃＲｎ結合部位を有する。
【請求項２】
Ｆ１とＦ２の免疫グロブリン不変領域が、免疫グロブリンＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメインからなる群から選択される１つ〜４つのドメインからなる、請求項１に記載の結合体。
【請求項３】
免疫グロブリン不変領域が、ヒンジ領域をさらに含む、請求項２に記載の結合体。
【請求項４】
免疫グロブリン不変領域が、ＩｇＧであることを特徴とする、請求項２に記載の結合体。
【請求項５】
Ｆ１がＩｇＧ１のヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含み、ＣＨ３領域の２４番目のアミノ酸であるセリン（Ｓｅｒ）をヒスチジン（Ｈｉｓ）に、７５番目のアミノ酸であるフェニルアラニン（Ｐｈｅ）をアラニン（Ａｌａ）に置換したことが特徴であり、Ｆ２がＩｇＧ１のヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含み、ＣＨ３領域の９番目のアミノ酸であるチロシン（Ｔｙｒ）をトレオニン（Ｔｈｒ）に、５４番目のアミノ酸であるトレオニン（Ｔｈｒ）をフェニルアラニン（Ｐｈｅ）に置換したことを特徴とする、請求項１に記載の結合体。
【請求項６】
Ｆ１とＦ２が、天然型ではないアミノ酸に置換された免疫グロブリン領域であり、Ｆ２とＦ１が、互いに異なる組み合わせに置換されたアミノ酸になれることを特徴とする、請求項１に記載の結合体。
【請求項７】
Ｌであるリンカーが、ペプチドまたはポリエチレングリコール（polyethylene glycol）を含むことを特徴とする、請求項１に記載の結合体。
【請求項８】
Ｆ１とＦ２の化学結合が、ジスルフィド結合（disulfide bond）であることを特徴とする、請求項１に記載の結合体。 
【請求項９】
インスリンアナログのＢ鎖が、インスリンＢ鎖の８番目のアミノ酸、１０番目のアミノ酸、１２番目のアミノ酸、１６番目のアミノ酸、２３番目のアミノ酸、２４番目のアミノ酸、２５番目のアミノ酸、２６番目のアミノ酸、２７番目のアミノ酸、２８番目のアミノ酸、２９番目のアミノ酸、３０番目のアミノ酸からなる群から選択される一つまたはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたことを特徴とする、請求項１に記載の結合体。
【請求項１０】
インスリンアナログのＡ鎖が、インスリンＡ鎖の１番目のアミノ酸、２番目のアミノ酸、５番目のアミノ酸、１４番目のアミノ酸、１９番目のアミノ酸及び２１番目のアミノ酸からなる群から選択される一つまたはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたことを特徴とする、請求項１に記載の結合体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の結合体を含む、糖尿病の予防または治療用薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリン及び/またはそのアナログと生体内半減期を増加させることができる、生体適合性物質が相互共有結合により連結されており、生体内持続性及び安定性が向上されたインスリン及び/またはそのアナログ結合体及びその利用に関する。より具体的に、本発明は生体内で持続性特性が付与され、インスリン治療の副作用及び投与利便性を向上させた画期的なインスリン及び/またはそのアナログ結合体及びその製造方法に関する。また、本発明はインスリン及び/またはインスリンアナログと生体内半減期を増加させることができる、生体適合性物質相互共有結合により連結された結合体を提供する。
【背景技術】
【０００２】
インスリンは人体の膵臓から分泌される血糖調節ホルモンであって、血液内の余剰 ブドウ糖を細胞に伝達して細胞にエネルギー源を供給する一方、血糖を正常レベルに維持させる役割をする。しかし、糖尿患者の場合、このようなインスリンが不足したり、インスリン抵抗性及びベータ細胞の機能消失によりインスリンが正常な機能を行うことができなくて血液内のブドウ糖をエネルギー源に利用できず、血中ブドウ糖レベルが高い高血糖症状を現し、結局は小便を通して糖を排出することになり、様々な合併症と連携される。従って、インスリン生成に異常があったり（Type I）、インスリン耐性による（Type II）糖尿患者にはインスリン治療が必須であり、インスリン投与により正常レベルに血糖を調節することができる。
このような治療のためのインスリン製剤として、天然インスリンだけではなく、ヒトインスリンを変形させて作用時間などを改善したインスリンアナログなどが開発されている。
遺伝子組換え技術による最初のヒトインスリンアナログは、イーライリリー社（Eli lilly）のインスリンリスプロ（Lispro）であって、Ｂ鎖カルボキシ末端２番目のリシン残基と３番目のプロリン残基の順序を変えてインスリン二量体及び六量体の形成を防いで注射投与時に血糖降下活性が良い単量体インスリンの量を増やしたインスリンアナログである。ノボノルディスク社（Novo Nordisk）のインスリンアスパート（aspart）は、Ｂ鎖２８番目のプロリン残基をアスパラギン酸残基に置換して、電荷の反発力（repulsion）を増加させて、インスリン六量体の形成を防いで超速効性活性を示すように作られたアナログである。サノフィ・アベンティス社のインスリングルリジン（Glulisine）は、Ｂ鎖３番目のアスパラギン（asparagine）残基をリシン（Lysine）残基に置換し、Ｂ鎖２９番目のリシン（Lysine）残基をグルタミン酸（glutamic acid）残基に置換して早い血糖降下効果を示すように作られたアナログである。
【０００３】
しかし、インスリンの場合、他のタンパク質及びペプチドホルモンと同様に体内半減期が極めて短くて治療学的な効果を持続的に現すことが難しいため、効果を現すためには持続的に反復投与するしかないという欠点がある。また、ほとんど注射剤の形で患者に投与されるが、インスリンの血中濃度を維持するためには、頻繁に注射することになるが、これは患者に多大な苦痛を引き起こすことになる。したがって、インスリンの生体内半減期を増加させて投与回数を減らすことによって、治療学的効果を高めて患者の生活の質を上げるための多様なタンパク質剤形化研究と化学的結合体など（脂肪酸結合体、ポリエチレン重合体結合体）に対する研究が行われてきた。
このようなインスリン製剤の投与上の問題点を克服するための様々な試みの一つとして、インスリン薬物の生体膜透過度を増加させて口腔または鼻腔を通じた吸引によりインスリン薬物を体内に伝達しようとする試みがあった。ファイザー社の吸入型糖尿病インスリン治療剤「エクスベラ（Exubera）」は、注射投与の不便さを改善した画期的な吸入型速効性インスリン製剤であり、注射型インスリン製剤に類似した血糖降下の効果を現して注目されていたが、肺がん発病のリスクなどの安全性の問題及び売り上げ不振のため市場から撤収された。また、ノボノルディスク社、リリー社などの様々の製薬会社で吸入型インスリン開発に着手したが中断したことがある。
このような吸入型投与方法は簡単であり、患者自らも痛みなしに投与することができるため、既存の注射投与より確実に好まれているが、注射剤に比べて薬物の体内伝達効率が低く、薬物の体内活性を要求される条件で維持することはまだ難しい。また、微生物及び病原菌による汚染、安全性及び耐久性などの吸入型投与に適切な組成物を用意するのに難しい。そして吸入型製品を肺に伝達すると浮腫、細胞損傷及び組織に炎症のような副作用を誘発する可能性があるため肺吸収メカニズムに関する研究がもっと必要であり、現在の吸収メカニズム、吸収率及び範囲を予測する能力は初期段階である。
【０００４】
しかし、依然として多数の研究者及び製薬社はインスリン製剤の呼吸器伝達が可能であるとし、続いて開発努力をしており、現在、エクスベラの欠点を克服したマンカインド（mannkind）社の吸入型インスリン製剤であるアフレッザ（Afrezza）がＦＤＡ承認を待機中である。
それ以外にも、投与利便性を向上させて効果的な治療に十分なレベルの生物学的に利用可能性のあるインスリン製剤の投与方法の開発は過去数年間、進行されており、現在、経口、鼻腔及び経皮吸収などの投与経路に対して臨床試験進行中である（非特許文献１）。
一方、インスリン製剤薬物の血中安定性を増加させ、血中薬物の濃度を長い間高いレベルで維持させて薬効の極大化及び投与利便性を向上させようとする努力が続けられてきた。このようなインスリン薬物の持続型製剤は、インスリンの安定性を高めると同時に薬物自体の力価が十分に高く維持されて、患者に低血糖反応を誘発しないようにするべきである。
【０００５】
現在、市販の持続型インスリン製剤としては、サノフィ-アベンティス社（sanofi-aventis）のインスリングラルギン（insulin glargine、lantus）とノボノルディスク社（Novo Nordisk）のインスリンデテミル（insulin detemir、levemir）がある。サノフィ-アベンティス社のインスリングラルギンは最初の持続型インスリンであって、Ａ鎖の２１番目のアスパラギンをグリシンに置換し、Ｂ鎖に２つのアルギニン残基を付加して酸性ｐＨで可溶性の性質を有し、生体内のｐＨでは低い可溶性を示して、皮下投与時にインスリンの沈殿を誘導してゆっくり吸収されるよう製造された。インスリングラルギンの持続時間は約２０〜２２時間で、速効性（５〜８時間）及び超速効性（３〜５時間）インスリンに比べて作用時間が長く、インスリン濃度のピークがないため低血糖が発生されないという利点を有する。ノボノルディスク社のインスリンデテミルは、最も最近に開発された持続型インスリン製剤であって、Ｂ鎖の３０番目のトレオニン残基を除去してＢ鎖の２９番目のリシン残基をアシル化させることにより、人体投与時にアルブミンと結合できるように作製して持続型の特性を付与した（非特許文献２）。また、持続時間はインスリングラルギンより若干短い１８〜２２時間で、１日１回または２回剤形で開発された。これら持続性インスリンは血中インスリン濃度のピークがないため、基底インスリンに適する。しかし、このような持続型インスリンは半減期が十分に長くないため毎日１回または２回投与しなければならないという不便さが依然として存在し、長期間投与するべき糖尿病の患者の場合、投与頻度を画期的に下げて患者の利便性を増加させることができる製剤が極めて必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際特許公開第９７/３４６３１号
【特許文献２】国際特許公開第９６/３２４７８号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】E.-S. Khafagy et al. , Advanced Drug Delivery Reviews ; 59, (2007) 1521-1546
【非特許文献２】Allison J. et al, DM. 148-162, 2010
【非特許文献３】H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979
【非特許文献４】Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980; Uhlman  and Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584, 1990
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、血中持続性向上により投与の利便性を増大させるための持続型インスリン製剤を開発しようと 鋭意努力した結果、インスリン及びそのアナログに半減期を増加させることができる免疫グロブリン不変領域にインスリンＡ鎖（A chain）とＢ鎖（B chain）がそれぞれ連結されたＡ鎖結合体とＢ鎖結合体が結合されて形成された新しい形態の結合体であるインスリンまたはそのアナログ結合体を製造した。このような結合体は、精製時、Ｃ-ペプチド（C-peptide）除去の過程を必要としないため収率を高めることができ、半減期を画期的に増加させると期待される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一つの目的は、インスリンの体内半減期の延長及び血糖降下効力を維持する、インスリンアナログ及び半減期を延長させることができる生体適合性物質がペプチド結合により結合された、インスリン及び/またはそのアナログ結合体を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、インスリン及び/またはそのアナログ及びその半減期を延長させることができる生体適合性物質がペプチド結合により結合された、インスリンまたはそのアナログ結合体を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、インスリン及び/またはそのアナログ結合体である下記化学式（１）を有する、持続型結合体を提供することにある。
Ｘ-Ｌａ-Ｆ１：Ｙ-Ｌａ-Ｆ２        （１）
前記式において、
ＸはインスリンＡ鎖またはインスリンアナログのＡ鎖であり、
Ｌはリンカーであり、
ａは０または自然数であり、ただし、ａが２以上の場合はそれぞれのＬは互いに独立的であり、
：は化学結合であり、
ＹはインスリンＢ鎖またはインスリンアナログのＢ鎖であり、
Ｆ１とＦ２は免疫グロブリン不変領域を含み、ＦｃＲｎ結合部位を有する。
本発明のもう一つの目的は、前記インスリン及び/またはそのアナログ結合体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、及び前記ベクターを含む形質転換体を提供することにある。
【００１０】
本発明のもう一つの目的は、インスリン及び/またはそのアナログのＡ鎖結合体とＢ鎖結合体がそれぞれコードされた後二重結合された、インスリン及び/またはインスリンアナログ結合体を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、インスリン及び/またはそのアナログのＡ鎖とＢ鎖にそれぞれ結合されている生体適合性物質の変異により、Ａ鎖結合体とＢ鎖結合体の二重結合の形成が増進された、インスリンまたはインスリンアナログ結合体を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記インスリン及び/またはそのアナログ結合体を含む、糖尿病の予防または治療用組成物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記インスリン及び/またはそのアナログ結合体を、これを必要とする個体に投与する段階を含む、糖尿病の治療方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、インスリン及び/またはそのアナログのＡ鎖結合体とＢ鎖結合体がそれぞれコードされた後二重結合された、インスリン及び/またはインスリンアナログ結合体を製造する方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、インスリン及び/またはそのアナログのＡ鎖結合体とＢ鎖結合体がそれぞれコードされた後二重結合された、インスリン及び/またはインスリンアナログ結合体を製造する方法を提供することにあって、リフォールディング（refolding）過程後Ｃ-ペプチドの除去が欠けていた製造方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のインスリン及び/またはそのアナログ結合体は生体内で安定的な血糖降下効果を維持し、血中半減期が著しく増加してインスリンの投与利便性及び副作用を改善する効果がある。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明を実施するための一つの様態は、インスリンの体内半減期延長及び血糖降下効力を維持する、インスリン及び/またはそのアナログ及び半減期を延長しうる生体適合性物質がペプチド結合により結合された、インスリン及び/またはそのアナログ結合体、またはその製造方法を提供する。
一つの具体例として、前記インスリン及び/またはそのアナログ結合体は下記化学式（１）を有する持続型結合体である。
Ｘ-Ｌａ-Ｆ１：Ｙ-Ｌａ-Ｆ２        （１）
前記式において、
Ｘは野生型インスリンＡ鎖またはそのアナログであり、
Ｌはリンカーであり、
ａは０または自然数であり、ただし、ａが２以上の場合にそれぞれのＬは互いに独立的であり、
：は化学結合であり、
Ｙは野生型インスリンＢ鎖またはそのアナログであり、
Ｆ１とＦ２は免疫グロブリン不変領域を含み、ＦｃＲｎ結合部位を有する。
一つの具体例として、前記生体適合性物質は免疫グロブリンFc領域であることを特徴とする。
【００１３】
また一つの具体例として、前記インスリンまたはそのアナログ結合体は、前記インスリンアナログの各鎖（chain）が免疫グロブリンＦｃ領域の各断片に連結された、インスリンまたはそのアナログ結合体であることを特徴とする。
インスリンまたはそのアナログの各鎖と免疫グロブリンＦｃ領域の各断片との連結は、遺伝子レベルで連結することができ、ＰＥＧ（Polyethylene glycol）のような高分子重合体によるものであってもよい。
本発明のもう一つの様態として、インスリンまたはそのアナログ及びその半減期を延長させることができる生体適合性物質がペプチド結合により結合された、インスリンまたはそのアナログ結合体、またはその製造方法を提供する。
本発明のもう一つの様態として、前記インスリン及び/またはそのアナログ結合体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むべクター、及び前記ベクターを含む形質転換体を提供する。
【００１４】
本発明のもう一つの様態として、前記インスリン及び/またはそのアナログ結合体は、Ａ鎖結合体とＢ鎖結合体がそれぞれコードされた後、Ａ鎖結合体とＢ鎖結合体が互いに結合されて形成されたインスリン及び/またはインスリンアナログ結合体であることを特徴とする。
本発明のもう一つの様態として、前記インスリン及び/またはそのアナログ結合体を形成する生体適合性物質である免疫グロブリンＦｃ領域は変異により二重結合が増進された生体適合性物質であることを特徴とする。
本発明のもう一つの様態として、前記インスリン及び/またはそのアナログ結合体を含む、糖尿病の予防または治療用組成物を提供する。
また一つの具体例として、前記組成物は（i）インスリンに比べて血糖降下効果改善；（ii）インスリンに比べて血中持続性増加；（iii）生体内活性維持；及び（IV）インスリンに比べて副作用である低血糖効果減少の中でいずれか一つ以上を有することを特徴とする。
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は一つの具体例としてインスリン及び/またはそのアナログ結合体を提供する。
本発明の一実施形態で、インスリン結合体またはインスリンアナログ結合体は、インスリンまたはインスリンアナログ部位（moiety）がアミノ酸または非アミノ酸リンカーを介して免疫グロブリンＦｃ切片部位（moiety）にペプチド結合で連結された、単一の鎖の連結体である。本発明の他の一実施形態で、インスリン及び/またはそのアナログ結合体はこのような連結体の二つ以上の鎖が化学的会合（chemical association）により、二量体（dimer）、三量体（trimer）などの多量体を形成したものであってもよい。ここで、化学的会合とは、共有結合、イオン結合、塩橋などの化学結合及びファンデルワールス力、疎水性相互作用など分子間の力をすべて含む概念であるが、これに制限されない。この多量体実施形態の一具体例で、前記化学的会合は一つの結合体内に存在する連結体内Ｆｃ切片部位のような結合体に属する他の連結体Ｆｃ切片部位の間に形成されるジスルフィド結合である。本発明のインスリン及び/またはそのアナログ結合体のさらに具体的な形態は、前述した二つのインスリンまたはインスリンアナログ連結体が会合した二量体が結合体を成す。ここで、前記二量体を成す各インスリンまたはインスリンアナログ連結体のインスリンまたはインスリンアナログ部位同士は互いに同一または同じであり得るが、例えば、前記二量体形態の結合体内に存在する一対のインスリン及び/またはアナログ部位がすべて野生型Ｂ鎖で同一のホモ二量体であってもよく、一つのインスリン及び/またはアナログ部位がインスリンＡ鎖のアナログであり、残りのインスリン及び/またはアナログ部位が天然型Ｂ鎖であるヘテロ二量体であってもよい。前述した特定へテロ二量体の実施形態ではインスリンＡ鎖（またはそのアナログ）部位とそれとペアを成すインスリンＢ鎖（またはそのアナログ）の間に直接的に連結してないか、ジスルフィド結合で連結されてもよい。このようなジスルフィド結合は完成された天然型インスリンＡ鎖とＢ鎖との間に存在するものと同一であるか、他のジスルフィド結合であってもよい。
本発明の他の実施形態では、インスリン製剤の持続型及び低血糖問題を解決するための方法としてインスリンアナログを使用しうる。
【００１６】
本発明の「インスリンアナログ」は、インスリンと類似の生体内血糖降下特性を有するヒトのインスリン変異体であって、野生型または天然型インスリンとＡ鎖、Ｂ鎖、そしてＣペプチドのアミノ酸配列が一つ以上異なるペプチドを意味する。
天然型インスリンアミノ酸配列は下記の通りである。
Ａ鎖：
Ｇｌｙ-Ｉｌｅ-Ｖａｌ-Ｇｌｕ-Ｇｌｎ-Ｃｙｓ-Ｃｙｓ-Ｔｈｒ-Ｓｅｒ-Ｉｌｅ-Ｃｙｓ-Ｓｅｒ-Ｌｅｕ-Ｔｙｒ-Ｇｌｎ-Ｌｅｕ-Ｇｌｕ-Ａｓｎ-Ｔｙｒ-Ｃｙｓ-Ａｓｎ（配列番号１）
Ｂ鎖：
Ｐｈｅ-Ｖａｌ-Ａｓｎ-Ｇｌｎ-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｓｅｒ-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｇｌｕ-Ａｌａ-Ｌｅｕ-Ｔｙｒ-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｇｌｕ-Ａｒｇ-Ｇｌｙ-Ｐｈｅ-Ｐｈｅ-Ｔｙｒ-Ｔｈｒ-Ｐｒｏ-Ｌｙｓ-Ｔｈｒ（配列番号２）
本発明のインスリン変異体は、インスリンとアミノ酸配列が一つ以上異なるペプチドであって、体内で血糖調節機能を有するペプチドを意味する。
本発明の「インスリンアナログ」は、Ａ鎖、Ｂ鎖、そしてＣペプチドのいずれか一つを含むペプチドを含んでもよく、Ａ鎖、Ｂ鎖、Ｃペプチド各々のアミノ酸配列は野生型配列または野生型配列に天然型であるか非天然型である一つ以上のアミノ酸が追加、置換または除去された配列のいずれも可能であるが、これに制限されない。
本発明のインスリンアナログは、天然型インスリンのＡ鎖、Ｂ鎖とそれぞれ少なくとも８０％以上アミノ酸配列に相同性を示し、アミノ酸一つの残基の一部のグループが化学的に置換（例；α‐メチル化、α‐ヒドロキシル化）、除去（例；脱アミノ化）または修飾（例；Ｎ-メチル化）された形態であってもよく、体内で血糖を調節する機能を有するペプチドをすべて含むが、これに制限されない。
本発明のインスリンアナログは、前述したインスリンと同様な生体内の血糖調節機能を有するペプチドとして、このようなペプチドはインスリンアゴニスト（agonist）、誘導体（derivatives）、断片（fragments）、変異体（variants）などを含むが、これに制限されない。
【００１７】
本発明のインスリンアゴニストは、インスリンの構造と関係なくインスリンの生体内受容体に結合してインスリンと同様な生物学的活性を示す物質を意味する。
本発明のインスリン断片は、インスリンに一つ以上アミノ酸が追加または除去された形態を意味し、追加されたアミノ酸は天然に存在しないアミノ酸（例；Ｄ型アミノ酸）も可能であり、このようなインスリン断片は体内で血糖調節機能を有する。
本発明のインスリンアゴニスト、誘導体、断片及び変異体でそれぞれ用いられた製造方法は独立的に使用してもよく、組み合わせも可能である。例えば、アミノ酸配列が一つ以上異なり、アミノ末端のアミノ酸残基が脱アミノ化（deamination）された体内で血糖調節機能を有するペプチドも含まれる。
本発明は一つの具体例として、インスリン及び/またはそのアナログに半減期を延長させることができる生体適合性物質を結合させたことを特徴とする、持続型インスリン及び/またはそのアナログ結合体を提供する。
また一つの具体例として、インスリン及び/またはそのアナログにポリエチレングリコール、脂肪酸、コレステロール、アルブミン及びその断片、アルブミン結合物質、特定アミノ酸配列の反復単位の重合体、抗体、抗体断片、ＦｃＲｎ結合物質、生体内結合組織またはその誘導体、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin）、糖類（saccharide）及び高分子重合体からなる群から選択された生体適合性物質をインスリンアナログに結合した持続型インスリン結合体を提供する。
【００１８】
本発明における用語、「生体的合成物質」とは、インスリン及び/またはそのアナログに共有結合されて結合体を形成した時、インスリン及び/またはそのアナログの生体内半減期を増加させて活性持続時間を延ばすことができる物質である。その例として、半減期の増大及び生体利用率及び持続的な活性維持が最優先の目的であるため、インスリンまたはそのアナログと結合されることができるものは、多様な生体適合性物質、例えば、ポリエチレングリコール、脂肪酸、コレステロール、アルブミン及びその断片、アルブミン結合物質、エラスチン、エラスチンの水溶性前駆体及びエラスチンタンパク質配列の一部の反復単位の重合体、特定アミノ酸配列の反復単位の重合体、抗体、抗体断片、ＦｃＲｎ結合物質、生体内結合組織、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン、糖類、高分子重合体などを制限なく含む。また、インスリン及び/またはそのアナログと生体内半減期を延長することができる生体適合性物質との連結は遺伝子組換え方法であってもよい。前記ＦｃＲｎ結合物質は免疫グロブリンＦｃ領域であってもよい。
本発明のインスリン及び/またはそのアナログは天然型インスリンに比べて低い活性を有することを特徴とする。天然型インスリンに比べて低い活性は既存の天然型インスリンの最も大きい問題点である低血糖リスクを下げることができ、その持続型剤形は低い活性を持続的に維持して低血糖リスクがなく長い時間血糖調節に有利である。
その例として、本発明で用いられたインスリン結合体及び/またはインスリンアナログ結合体は、カルボキシ末端に前記生体適合性物質または免疫グロブリンＦｃ断片がペプチド結合で結合されたことを特徴とする。
【００１９】
具体的な一実施例として、本発明者は免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ末端にインスリン及び/またはそのアナログの、Ａ鎖（A-chain）またはＢ鎖（B-chain）を遺伝子レベルで融合して発現ベクターにクローニングした後、インスリン及び/またはそのアナログ結合体を生産することができる。
免疫グロブリンＦｃ領域は生体内で代謝される生分解性のポリペプチドであるため、薬物のキャリアーとして使用するのに安全である。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリン全体分子に比べて相対的に分子量が小さいため、結合体の製造、精製及び収率の面で有利であるだけではなく、アミノ酸配列が抗体ことに異なり高い非均質性を示すＦａｂ部分が除去されるため、物質の同質性が大幅に増加されて血中抗原性の誘発可能性も低くなる効果も期待できる。
本発明で用いられるインスリン及び/またはそのアナログは、免疫グロブリンＦｃ領域とペプチド結合で連結されて発現宿主で持続型インスリン及び/またはそのアナログ結合体に生産される。発現宿主は外部遺伝子で形質転換させてタンパク質を生産することができる大腸菌のような微生物であってもよく、酵母、昆虫細胞、動物細胞などに制限がない。
【００２０】
発現宿主を通じて生産されるインスリン及び/またはインスリンアナログのＡ鎖結合体とＢ鎖結合体は発現後のフォールディング過程でＦｃ領域が互いに二重結合されることによりＡ鎖とＢ鎖が連結され、インスリン及び/またはそのアナログ結合体が完成される。
これは、Ａ鎖結合体とＢ鎖結合体のホモ二量体ではないヘテロ二量体化を促進することにより、インスリン及び/またはそのアナログ結合体を生産することができる。
前記二重結合は ジスルフィド結合（disulfide bond）であってもよい。
本発明でＦｃ領域の変異は、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインの９番目のアミノ酸であるチロシン（Tyr）をトレオニン（Thr）に、２４番目のアミノ酸であるセリン（Ser）をヒスチジン（His）に、５４番目のアミノ酸であるトレオニン（Thr）をフェニルアラニン（Phe）に、７５番目のアミノ酸であるフェニルアラニン（Phe）をアラニン（Ala）に置換して二重結合を促進するインスリン及び/またはそのアナログ結合体を生産することができるが、前記例としたアミノ酸の置換だけではなく、二重結合を促進させることができるアミノ酸変異は制限なく含まれ、様々な組み合わせで変異が可能である。本発明の実施例では代表的な例としてＦｃ領域にＩｇＧ１を用いて生産したが、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などが制限なく含まれる。
【００２１】
本発明で、「免疫グロブリン不変領域」は、インスリン及び/またはインスリンアナログ結合体の一部分（moiety）を成す一構成であってもよいものであり、免疫グロブリンＦｃ領域を含み、また免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域、重鎖不変領域１（ＣＨ１）と軽鎖不変領域（ＣＬ１）を除外した、重鎖不変領域２（ＣＨ２）及び重鎖不変領域３（ＣＨ３）部分を意味し、重鎖不変領域にヒンジ（hinge）部分を含むこともある。
本発明の免疫グロブリン不変領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、５）一つまたは二つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（またはヒンジ領域の一部）との組み合わせ、６）重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域との二量体であってもよい。
【００２２】
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は天然型アミノ酸配列だけではなく、その配列誘導体（mutant）を含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせによって相異する配列を有することを意味する。例えば、ＩｇＧ  Ｆｃの場合、結合に重要であると知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２または３２７〜３３１番のアミノ酸残基が変形に適当な部位として利用されうる。また、ジスルフィド結合を形成することができる部位が除去されたり、天然型ＦｃでＮ-末端のいくつかのアミノ酸が除去されたり、または天然型ＦｃのＮ-末端にメチオニン残基が付加されることもあるなど多様な種類の誘導体が可能である。また、エフェクター機能をなくすために補体結合部位、例えば、Ｃ１ｑ結合部位が除去されることもあり、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（antibody dependent cell mediated cytotoxicity、ADCC）部位が除去されることもある。このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を製造する技術は特許文献１、特許文献２などに開示されている。
【００２３】
分子の活性を全体的に変形されないタンパク質及びペプチドでのアミノ酸交換は該当分野に公知となっている（非特許文献３）。もっとも通常に行う交換は、アミノ酸残基Ａｌａ/Ｓｅｒ、 Ｖａｌ/Ｉｌｅ、 Ａｓｐ/Ｇｌｕ、 Ｔｈｒ/Ｓｅｒ、 Ａｌａ/Ｇｌｙ、 Ａｌａ/Ｔｈｒ、 Ｓｅｒ/Ａｓｎ、 Ａｌａ/Ｖａｌ、 Ｓｅｒ/Ｇｌｙ、 Ｔｈｙ/Ｐｈｅ、 Ａｌａ/Ｐｒｏ、 Ｌｙｓ/Ａｒｇ、 Ａｓｐ/Ａｓｎ、 Ｌｅｕ/Ｉｌｅ、 Ｌｅｕ/Ｖａｌ、 Ａｌａ/Ｇｌｕ、 Ａｓｐ/Ｇｌｙ同士の交換である。
一方、免疫グロブリンＦｃ領域はヒトまたは牛、ヤギ、豚、マウス、ラビット、ハムスター、ラット、モルモットピックなどの動物起源であってもよく、好ましくはヒト起源である。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来またはこれらの組み合わせ（combination）またはこれらの混成（hybrid）によるＦｃ領域であってもよい。その例として、ヒト血液に最も豊富なＩｇＧまたはＩｇＭ由来であってもよく、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させるものと公知となったＩｇＧ由来であってもよい。
【００２４】
一方、本発明で組み合わせ（combination）とは、二量体または多量体を形成する時、同一起源単鎖免疫グロブリンＦｃ領域を暗号化するポリペプチドが相異する起源の単鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。つまり、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥ Ｆｃ断片からなるグループから選択された２つ以上の断片から二量体または多量体の製造が可能である。
本発明で、「ハイブリッド（hybrid）」とは、単鎖の免疫グロブリンFc領域内に２つ以上の相異する起源の免疫グロブリンＦｃ断片に該当する配列が存在することを意味する用語である。本発明の場合、色々な形態のハイブリッドが可能である。つまり、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＥ Ｆｃ及びＩｇＤ ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４からなるグループからの１つ〜４つのドメインからなるドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジを含むことができる。
一方、ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラスに分けることができ、本発明ではこれらの組み合わせまたはこれらの混成化も可能である。その例として、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラスがあり、具体的な例として、補体依存的障害（Complementdependent cytotoxicity、CDC）のようなエフェクター機能（effector function）がほとんどないＩｇＧ４のＦｃ領域であってもよいが、これに制限されない。
【００２５】
具体的に、本発明のインスリン及び/またはそのアナログ結合体の一部分（moiety）である免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１由来のＦｃ領域であってもよいが、結合体の一部分で用いられるＦｃ領域は制限なく含まれる。ヒト由来のＦｃ領域は、ヒト生体内で抗原として作用し、これに対する新しい抗体を生成するなどの好ましくない免疫反応を引き起こすことができる非-ヒト由来のＦｃ領域に比べて好ましい。
このような、本発明のインスリンまたはそのアナログ結合体はエネルギー代謝及び糖代謝のような既存のインスリンの生体内活性が維持されるだけではなく、インスリンアナログの血中半減期及びこれによる前記ペプチドの生体内効力持続効果が画期的に増加させることになるため、糖尿（Diabete）の治療に有用である。
本発明は一つの具体例として、下記化学式（１）を有する結合体を提供する。
Ｘ-Ｌａ-Ｆ１：Ｙ-Ｌａ-Ｆ２        （１）
前記式において、
ＸはインスリンのＡ鎖またはインスリンアナログのＡ鎖であり、
Ｌはリンカーであり、
ａは０または自然数であり、ただし、ａが２以上の場合にそれぞれのＬは互いに独立的であり、
：は化学結合であり、
ＹはインスリンのＢ鎖またはインスリンアナログのＢ鎖であり、
Ｆ１とＦ２は免疫グロブリン不変領域を含み、ＦｃＲｎ結合部位を有することを特徴とする。
前記結合体の化学結合（：）は、具体的には[Ｘ-Ｌａ-Ｆ１]及び[Ｙ-Ｌａ-Ｆ２]が発現後のフォールディング過程でＦ１及びＦ２、つまりＦｃ領域が互いに二重結合していてＡ鎖結合体とB鎖結合体がヘテロ二量体形態を成すものであってもよい。ここで、前記化学結合はジスルフィド結合であってもよいが、これに制限されない。
前記Ｆ１とＦ２は天然型ではないアミノ酸に置換された免疫グロブリン領域であってもよく、Ｆ２とＦ１はお互い異なる組み合わせに置換されたアミノ酸であってもよいが、これに制限されない。
【００２６】
他の具体例として、前記インスリンアナログのＢ鎖はインスリンＢ鎖の１番目のアミノ酸、２番目のアミノ酸、３番目のアミノ酸、５番目のアミノ酸、８番目のアミノ酸、１０番目のアミノ酸、１２番目のアミノ酸、１６番目のアミノ酸、２３番目のアミノ酸、２４番目のアミノ酸、２５番目のアミノ酸、２６番目のアミノ酸、２７番目のアミノ酸、２８番目のアミノ酸、２９番目のアミノ酸及び３０番目のアミノ酸からなる群から選択される一つまたはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されるか、欠失されたものであってもよい。その例として、インスリン Ｂ鎖の１番目のアミノ酸、２番目のアミノ酸、３番目のアミノ酸、５番目のアミノ酸、８番目のアミノ酸、１０番目のアミノ酸、１２番目のアミノ酸、１６番目のアミノ酸、２３番目のアミノ酸、２４番目のアミノ酸、２５番目のアミノ酸、２６番目のアミノ酸、２７番目のアミノ酸、２８番目のアミノ酸、２９番目のアミノ酸及び３０番目のアミノ酸からなる群から選択される一つまたはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものであってもよい。
また、他の具体例として、前記インスリンアナログのＡ鎖はインスリンＡ鎖の１番目のアミノ酸、２番目のアミノ酸、５番目のアミノ酸、８番目のアミノ酸、１０番目のアミノ酸、１２番目のアミノ酸、１４番目のアミノ酸、１６番目のアミノ酸、１７番目のアミノ酸、１８番目のアミノ酸、１９番目のアミノ酸及び２１番目のアミノ酸からなる群から選択される一つまたはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されるか、欠失されたものであってもよい。その例として、インスリンＡ鎖の１番目のアミノ酸、２番目のアミノ酸、５番目のアミノ酸、８番目のアミノ酸、１０番目のアミノ酸、１２番目のアミノ酸、１４番目のアミノ酸、１６番目のアミノ酸、１７番目のアミノ酸、１８番目のアミノ酸、１９番目のアミノ酸及び２１番目のアミノ酸からなる群から選択される一つまたはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されるか、欠失されたものであってもよい。
【００２７】
他の具体例として、前記インスリンアナログはＢ鎖の８番目のアミノ酸、２３番目のアミノ酸、２４番目のアミノ酸、２５番目のアミノ酸、Ａ鎖の１番目のアミノ酸、２番目のアミノ酸、１４番目のアミノ酸及び１９番目のアミノ酸からなる群から選択される一つまたはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されることを特徴とする。
他の具体例として、前記置換されたアミノ酸は、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン、イソロイシン、バリン、グルタミン、グリシン、リシン、ヒスチジン、システイン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、トレオニン、及びアスパラギン酸からなる群から選択されることを特徴とする。
他の具体例として、前記置換されたアミノ酸はＢ鎖の８番目のアミノ酸、２３番目のアミノ酸、２４番目のアミノ酸、２５番目のアミノ酸、Ａ鎖の１番目のアミノ酸、２番目のアミノ酸及び１９番目のアミノ酸からなる群から選択される一つのアミノ酸がアラニンに置換されるか、Ａ鎖の１４番目のアミノ酸がグルタミン酸またはアスパラギンに置換されたものであってもよいが、これに制限されない。
【００２８】
他の具体例として、前記Ｌはペプチド、ポリエチレングリコール、脂肪酸、サッカライド（saccharide）、高分子重合体、低分子化合物、ヌクレオチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする。
他の具体例として、前記ＸとＦ１、ＹとＦ２は共有化学結合、非共有化学結合またはこれらの組み合わせでＬにより互いに結合されることを特徴とする。
他の具体例として、前記Ｆは ＩｇＧ Ｆｃ領域であることを特徴とする。
本発明のもう一つの様態は、前記インスリンまたはそのアナログをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び前記発現ベクターを含む形質転換体である。
前記インスリン及び/またはそのアナログに対しては前記で説明した通りである。
前記ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の形で存在するデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）であり、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びこれから転写されるＲＮＡを含むことを意味し、基本構成単位であるヌクレオチドは自然のヌクレオチドだけではなく、糖または塩基部位が変形された類似体（analogue）も含む（非特許文献４）。本発明のポリヌクレオチドは標準分子生物学技術を用いて、分離または製造することができる。
本発明に係る組換えベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築されてもよく、原核細胞または真核細胞を宿主細胞に用いるためのベクターとして構築されてもよい。
【００２９】
本発明における用語、「ベクター」とは、適当な宿主細胞で目的タンパク質を発現することができる組換えベクターであって、核酸挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須の調節要素を含む核酸構造物（construct）を意味する。本発明はインスリンまたはそのアナログをコードする核酸を含む組換えベクターを製造することができるが、前記組換えベクターを宿主細胞に形質転換（transformation）または形質感染（transfection）させることにより、本発明のインスリン及び/またはそのアナログを得ることができる。
本発明のインスリン及び/またはそのアナログをコードする核酸は、プロモーターに作動可能に連結される。本発明における用語、「作動可能に連結された（operatively linked）」は、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列、リボソーム結合部位、転写終結配列など）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これにより前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び/または解読を調節することになる。
本発明における用語、「プロモーター」は、ポリメラーゼに対する結合部位を含み、プロモーター下位遺伝子のｍＲＮＡへの転写開始活性を有する、コード領域の上位（upstream）の非解読された核酸配列、すなわち、ポリメラーゼが結合して遺伝子の転写を開始するようにするＤＮＡ領域を言い、ｍＲＮＡ転写開始部位の５′-部位に位置する。
例えば、本発明のベクターが組換えベクターであり、原核細胞を宿主とする場合に、転写を進行させることができる強力なプロモーター（例：ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、 ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター、及びＴ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合部位及び転写/解読終結配列を含むことが一般的である。
【００３０】
また、本発明で用いられるベクターは、当業界でよく使用されているプラスミド（例：ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８/９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４ 、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ、ｐＰＩＣＺαシリーズ、ｐＵＣ１９等）、ファージ（例：λｇｔ４・λＢ、λ-Charon、λΔｚ１及びＭ１３など）またはウイルス（例：ＳＶ４０など）を操作して製作されてもよいが、これらに限定されない。
一方、本発明のベクターが組換えベクターであり、真核細胞を宿主とする場合に、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例：メタルチオニンプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター及びＨＳＶのｔｋプロモーター）を用いることができ、転写終結配列としてポリアデニル化配列（例：ウシ成長ホルモンターミネーター及びＳＶ４０由来ポリアデニル化配列）を一般的に有する。
【００３１】
また、本発明の組換えベクターは選択マーカーとして当業界で通常に用いられている抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を使用することができる。
本発明の組換えベクターは、回収される目的タンパク質、すなわち、インスリン及び/またはそのアナログを容易に精製するために、必要に応じて他の配列をさらに含んでもよい。前記さらに含んでもよい配列は、タンパク質精製用のタグ配列であってもよく、例えば、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（Pharmacia、USA）、マルトース結合タンパク質（NEB、USA）、ＦＬＡＧ（IBI、USA）及び６つのヒスチジン（hexahistidine）などがあるが、前記例によって目的タンパク質の精製に必要な配列の種類が制限されるものではない。
前記のようなタグ配列を含む組換えベクターによって発現された融合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーによって精製されることができる。例えば、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼが融合された場合には、この酵素の基質であるグルタチオンを利用することができ、６つのヒスチジンタグが使用された場合には、Ｎｉ-ＮＴＡカラムを用いて、希望の目的タンパク質を容易に回収することができる。
【００３２】
前記インスリン及び/またはそのアナログをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを用いて、前記ベクターが形質転換された形質転換体を構築することができる。
本発明における用語、「形質転換（transformation）」とは、ＤＮＡを宿主細胞内に導入してＤＮＡが染色体の因子として、または染色体統合完成によって複製可能になるものとして、外部のＤＮＡを細胞内に導入して、人為的に遺伝的な変化を引き起こす現象を意味する。
本発明の形質転換方法は、任意の形質転換方法が使用されてもよく、当業界の通常の方法に従って容易に行ってもよい。一般的に形質転換の方法は、ＣaＣｌ２沈殿法、ＣaＣｌ２沈殿法にＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）と呼ばれる還元物質を使用することにより効率を高めたＨａｎａｈａｎ方法、電気穿孔法（electroporation）、リン酸カルシウム沈殿法、原形質融合法、シリコンカーバイド繊維を用いた攪拌法、アグロバクテリウム媒介形質転換法、ＰＥＧを用いた形質転換法、デキストラン硫酸、リポフェクタミン及び乾燥/抑制媒介された形質転換法などがある。
【００３３】
本発明に係るインスリン及び/またはそのアナログをコードする核酸を含む組換えベクターを形質転換させるための方法は、前記例示に限定されず、当業界で通常に使用されている形質転換または形質感染方法が制限なく使用されてもよい。
目的核酸であるインスリン及び/またはそのアナログをコードする核酸を含む組換えベクターを宿主細胞内に導入することにより、本発明の形質転換体（transformant）を獲得することができる。
本発明に適した宿主は、本発明の核酸を発現することができる限り、特に制限されない。本発明に使用されてもよい宿主の特定の例としては、大腸菌（E. coli）のようなエシェリキア（Escherichia）属細菌；バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）のようなバチルス（Bacillus）属細菌； シュードモナス・プチダ （Pseudomonas putida）のようなシュードモナス（Pseudomonas）属細菌；ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）のような酵母；スポドプテラ・フルギペルダ（ＳＦ９）のような昆虫細胞；及びＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＳＣなどの動物細胞があるが、これに限定されない。
本発明は、もう一つの具体例として、本発明の前記インスリン及び/またはそのアナログ結合体を含む糖尿病治療用薬学的組成物を提供する。
前記組成物は、下記特徴のいずれかを有する：（i）インスリンに比べて血糖降下効果の改善; （ii）インスリンに比べて血中持続性の増加：（iii）生体内活性を維持; （iv）インスリンに比べて副作用である低血糖効果の減少。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれら実施例により制限されるもので解釈されない。
【００３５】
実施例１．天然型インスリンのＡ鎖及びＢ鎖連結体遺伝子合成
天然型インスリンのＡ鎖及びＢ鎖それぞれに免疫グロブリンＦｃ領域を遺伝子レベルで融合して発現ベクターにそれぞれ挿入した。
具体的に、下記のように天然型インスリンのＡ鎖とＢ鎖がそれぞれ含まれた連結体を合成した（表１）。Ａ鎖に結合する免疫グロブリンＦｃ領域は具体的にＣＨ３領域の２４番のアミノ酸であるセリン（Ser）をヒスチジン（His）に、７５番のアミノ酸であるフェニルアラニン（Phe）をアラニン（Ala）に置換された免疫グロブリンFc領域を用い、Ｂ鎖に結合する免疫グロブリンFc領域は具体的にＣＨ３領域の９番のアミノ酸であるチロシン（Tyr）をトレオニン（Thr）に、５４番のアミノ酸であるトレオニン（Thr）をフェニルアラニン（Phe）に置換された免疫グロブリン領域を用いて合成した。
【００３６】
【表１】
2018508504.tif 000002
2018508504.tif 000003
【００３７】
実施例２．ポリシストロニック発現される天然型インスリン連結体の製造
前記実施例１で合成後、発現ベクターにそれぞれ挿入されたＡ鎖-ＩｇＧ１Ｆｃ連結体とＢ鎖-ＩｇＧ１Ｆｃ連結体を一つのベクターで発現させるために制限酵素を用いてＡ鎖-ＩｇＧ１Ｆｃ連結体があるベクターにＢ鎖-ＩｇＧ１Ｆｃ連結体ＤＮＡ断片を挿入した。ポリシストロニック発現システムを構築するために、発現ベクターであるｐＥＴ２２ｂベクターに前記二つの連結体遺伝子が挿入されるように発現ベクターを構築した。Ａ鎖-ＩｇＧ１Ｆｃが挿入されたベクターにＡ鎖-ＩｇＧ１Ｆｃ連結体を切らず、多重クローニング部位（Multi cloning site）に存在する ＳａｌＩと ＸｈｏＩ制限酵素切断部位を切った後、Ｂ鎖-ＩｇＧ１Ｆｃ連結体ＤＮＡ断片を挿入した。その時、ポリシストロニック発現のため、Ｂ鎖-ＩｇＧ１Ｆｃ前にリボソーム結合部位を共に挿入することによって一つのプロモーターに二つのリボソーム結合部位が含まれたメッセンジャーＲＮＡが形成され、二つのリボソーム結合部位を通じてＡ鎖-ＩｇＧ１Ｆｃ連結体とＢ鎖-ＩｇＧ１Ｆｃ連結体がそれぞれ発現されるようにした。
【００３８】
【表２】
2018508504.tif 000004
【００３９】
前記ポリシストロニック発現ベクターを宿主細胞で発現させると一つのベクターに一つの長いｍＲＮＡが形成され、二つのリボソーム結合部位を通じて二つのタンパク質であるインスリンのＡ鎖-ＩｇＧ１Ｆｃ連結体及びＢ鎖-ＩｇＧ１Ｆｃ連結体がそれぞれ発現されるようになる。この時発現される連結体は互いに二重結合をすることになるが、ＩｇＧ１ ＣＨ３の変異された部分同士が結合されるようにして、Ａ鎖-ＩｇＧ１Ｆｃ連結体とＢ鎖-ＩｇＧ１Ｆｃ連結体がヘテロ二量体を形成するインスリン結合体を製造することができる。このようなインスリン結合体は発現時にリフォールディング過程後、既存インスリン結合体などのＣペプチドの除去段階が要らないため、収率を高めることができる。
このような本発明のインスリン及び/またはそのアナログ結合体は、生体内で安定的な血糖降下効果を維持し、血中半減期が著しく増加する血中持続性の向上でインスリン製剤の投与利便性及び副作用を減少させることができるインスリン製剤の有効成分として用いられることになる。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形で実施されることがあることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものとして理解しなければならない。本発明の範囲は、前記の詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【配列表】
2018508504000001.app
【国際調査報告】
2018508504.tif 000005
2018508504.tif 000006
2018508504.tif 000007
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