(57)【要約】  所定の嗅覚受容体の過剰出現に起因して知覚が増強された遺伝子改変脊椎動物が提供される。脊椎動物を、その１次構造がACATAACTTTTTAATGAGTCT（配列番号１）と少なくとも９０％相同である配列の、少なくとも４つの連続した反復を含むＤＮＡを導入することによって遺伝子改変する。当該ＤＮＡにより、近くの嗅覚受容体コード配列が、当該ＤＮＡを欠く対応する脊椎動物と比較して、単一遺伝子選択的に過剰出現するようになる。【選択図】図１
2018530997.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変非ヒト脊椎動物を作出する方法であって、
導入遺伝子骨格；
２つの完全な２本鎖Ｂ−ＤＮＡターンを有し、５’ACATAACTTTTTAATGAGTCT３’（配列番号１）と少なくとも９０％相同であるＤＮＡ配列の、少なくとも３つの連続した反復；
前記少なくとも３つの連続した反復の下流に配置された転写開始部位（ＴＳＳ）；
前記転写開始部位の下流に配置された、所定の嗅覚受容体をコードする嗅覚受容体コード配列、
を含むベクターを使用して非ヒト脊椎動物のゲノムにＤＮＡを挿入するステップを含み、
挿入するステップの後に、非ヒト脊椎動物において多数の嗅覚ニューロン（ＯＳＮ）を含む主嗅上皮（ＭＯＥ）が発生し、ＯＳＮの１０％〜９５％が、前記所定の嗅覚受容体を発現する、
前記方法。
【請求項２】
嗅覚受容体コード配列が、Ｍ７１嗅覚受容体コード配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
非ヒト脊椎動物がマウスである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
嗅覚受容体コード配列が、Ｍ７１嗅覚受容体コード配列である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
非ヒト脊椎動物がラットである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
非ヒト脊椎動物がイヌである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡ配列が、配列番号１と少なくとも９５％相同である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＤＮＡ配列が配列番号１である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも４つの連続した反復が存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
導入遺伝子骨格が、Ｍ７１嗅覚受容体（ＯＲ）導入遺伝子骨格である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
脊椎動物を遺伝子改変するためのベクターであって、
Ｍ７１嗅覚受容体（ＯＲ）導入遺伝子骨格；
５’ACATAACTTTTTAATGAGTCT３’（配列番号１）と少なくとも９０％相同であるＤＮＡ配列の、少なくとも３つの連続した反復；
前記少なくとも３つの連続した反復の下流に配置された転写開始部位（ＴＳＳ）；
前記転写開始部位の下流に配置された、所定の嗅覚受容体をコードする嗅覚受容体コード配列、
を含み、
前記脊椎動物において、前記所定の嗅覚受容体の１０％〜７０％を発現する嗅上皮が発生する、
前記ベクター。
【請求項１２】
少なくとも４つの連続した反復が存在する、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
嗅覚受容体導入遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）から１０ｋｂ以内の近傍にＤＮＡが挿入された生殖細胞及び体細胞を含む遺伝子改変非ヒト脊椎動物であって、前記挿入により、前記脊椎動物において、挿入を欠く対応する脊椎動物と比較して、前記嗅覚受容体導入遺伝子に対応する所定の嗅覚受容体が過剰出現するようになり、前記ＤＮＡは、２つの完全なｄｓ  Ｂ−ＤＮＡターンを有し、その１次構造はACATAACTTTTTAATGAGTCT（配列番号１）と少なくとも９０％相同であるＤＮＡ配列の、少なくとも３つの連続した反復を含むものである、前記遺伝子改変非ヒト脊椎動物。
【請求項１４】
マウスである、請求項１３に記載の非ヒト脊椎動物。
【請求項１５】
ラットである、請求項１３に記載の非ヒト脊椎動物。
【請求項１６】
イヌである、請求項１３に記載の非ヒト脊椎動物。
【請求項１７】
所定の嗅覚受容体が、少なくとも４倍過剰出現する、請求項１３に記載の非ヒト脊椎動物。
【請求項１８】
所定の嗅覚受容体が、少なくとも１０倍過剰出現する、請求項１３に記載の非ヒト脊椎動物。
【請求項１９】
ＤＮＡ配列が、配列番号１と少なくとも９５％相同である、請求項１３に記載の非ヒト脊椎動物。
【請求項２０】
ＤＮＡ配列が配列番号１である、請求項１３に記載の非ヒト脊椎動物。
【請求項２１】
１０以下の連続した反復が存在する、請求項１３に記載の非ヒト脊椎動物。
【請求項２２】
脊椎動物の嗅上皮の１０％〜７０％が、所定の嗅覚受容体を発現する、請求項１３に記載の非ヒト脊椎動物。
【請求項２３】
嗅覚リガンドに対するハイスループットなスクリーニングの方法であって、
候補嗅覚リガンドを嗅覚ニューロン又はバイオセンサーの絨毛に曝露するステップであって、前記バイオセンサーは、ニューロンを有する複数の細胞を嗅上皮内に含み、前記嗅上皮内のニューロンの１％超が、５’ACATAACTTTTTAATGAGTCT３’と少なくとも９０％相同であるＤＮＡ配列の少なくとも３つの反復を有する単一遺伝子選択エンハンサーヌクレオチド配列によって嗅覚受容体（ＯＲ）を発現しており、前記少なくとも３つの反復は、所定の嗅覚受容体から１０ｋｂ以内に配置されているステップ；
前記嗅覚ニューロン又は前記絨毛を、ＧＤＰ、ｃＡＭＰ、及び／又はＡＴＰの発現変化についてモニタリングするステップであって、増大は、前記候補嗅覚リガンドの前記所定の嗅覚受容体への上首尾の結合に相当するステップ、
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]本出願は、その全体が本明細書に援用される米国特許出願第６２／２００，３１２号（２０１５年８月３日出願）及び同第６２／３１２，０６８号（２０１６年３月２３日出願）の優先権を主張するものであり、また、その仮出願ではない。
【０００２】
連邦政府により資金提供を受けた研究又は開発についての記載
[0002]本発明は、国立衛生研究所による助成番号ＧＭ０８８１１４−０１Ａ１及び国立マイノリティ健康格差研究所による助成番号ＭＤ００７５９９を受けて、政府支援によりなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表の参照
[0003]本出願は、その全体が本明細書に援用される、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔ」という表題の電子文書（５ｋｂ、２０１６年８月３日作成）として提供される、以下に列挙されている「配列表」を参照する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
[0004]本明細書に開示の主題は、遺伝子改変生物の生成に関し、具体的には、嗅覚受容体の出現が増大し、同時に嗅覚が増強した遺伝子改変生物に関する。現在、匂い検出の課題に関してヒトを補助するために、イヌ、ミツバチ、及びラットなどの動物が利用されているが、それらの使用には、長期間の訓練が必要になるので、費用がかかる。特定の嗅覚受容体の出現が増大した遺伝子操作生物により、訓練プロセスが相当に短縮され、動物に基づく匂い検出の課題が進歩する。特定の嗅覚受容体の出現が増大した遺伝子操作生物により、特定の嗅覚受容体を活性化する匂いの研究者による分析能が増大する。
【０００５】
[0005]揮発性化学物質は、鼻腔の内側に位置する感覚上皮内に配列した数百万の嗅覚ニューロン（ＯＳＮ）によって検出される。主嗅上皮（ＭＯＥ）は、十分に理解されていない単一遺伝子選択機構によって嗅覚受容体（ＯＲ）を発現し、その機構により、任意のＯＲ遺伝子の１つの対立遺伝子のみが、所与のニューロンにおける特異的発現のために選択される。一般には、ＭＯＥ内のＯＳＮの総数の約０．１％が同じＯＲを発現し、それらの軸索が、脳におけるシナプス活性の最初の中継点である嗅球内のホモタイプ糸球体に集束する。したがって、全てのＯＲが同等の低い出現で発現することにより、嗅覚ニューロンシートは匂い分子の広範な非特異的検出器になっている。
【０００６】
[0006]揮発性化学物質（匂い）を同定するために、鼻における数百万の嗅覚ニューロン（ＯＳＮ）が使用される。齧歯類及びイヌは、約１０００種の個々の嗅覚受容体（ＯＲ）遺伝子を有し、それら遺伝子のタンパク質は、特定の匂いに結合し得る；およそ１０，０００ニューロンが個々のＯＲ遺伝子に関連する。したがって、各ＯＲは、同等かつ低い出現（０．１％）で存在し、それにより、嗅覚ニューロンシートは匂い分子の広範な非特異的検出器になっている。
【０００７】
[0007]ｉｎ  ｖｉｔｒｏで異種細胞において発現するＯＲの匂いプロファイリングにおける成功は限られている。この限定の一部は、ＯＲタンパク質を原形質膜に輸送できないことに起因する。さらに、嗅覚系の生物学的性質を考慮すると、多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏで特徴付けられたＯＲ対立遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｖｏの状況では機能的でない可能性がある。それにもかかわらず、主要な欠点は、液相（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）中に提示される匂いが、それらの粘膜環境（ｉｎ  ｖｉｖｏ）において気相中でＯＲに提示される匂いとどのように対応するかを迅速に対照させる能力である。トランスジェニックマウス及び遺伝子ターゲティングマウス由来の樹状瘤のｅｘ  ｖｉｖｏにおけるパッチングであっても、匂いは気相送達されない。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＯＲ遺伝子の選択及びＯＲコーディングのどちらの試験も、所与のＯＲ出現が低いこと、すなわち、平均で、野生型マウスにおける総ニューロン集団の約０．１％のみであることにより妨害される。任意のＯＲの匂いプロファイリングのための迅速なｉｎ  ｖｉｖｏ手法は、ブレークスルーであり、研究者がｉｎ  ｖｉｔｒｏ応答、ｅｘ  ｖｉｖｏ応答、及びｉｎ  ｖｉｖｏ応答の相互関係を示すことを可能にするものである。残念ながら、適切なｉｎ  ｖｉｖｏ手法は知られていない。
【０００８】
[0008]上記の考察は、ただ単に一般的な背景情報を提供するものであり、特許請求された主題の範囲を決定する補助として使用されるものではない。
【発明の概要】
【０００９】
発明の簡単な説明
[0009]所定の嗅覚受容体の過剰発現に起因して知覚が増強された遺伝子改変脊椎動物が提供される。脊椎動物を、その１次構造がACATAACTTTTTAATGAGTCT（配列番号１）と少なくとも９０％相同である配列の、少なくとも４つの連続した反復を含むＤＮＡを導入することによって遺伝子改変する。当該ＤＮＡにより、近くの嗅覚受容体コード配列が、当該ＤＮＡを欠く対応する脊椎動物と比較して、単一遺伝子選択的に過剰出現するようになる。
【００１０】
[0010]第１の実施形態では、遺伝子改変非ヒト脊椎動物を作出する方法が提供される。当該方法は、ベクターを使用して非ヒト脊椎動物のゲノムにＤＮＡを挿入するステップを含む。ベクターは、Ｍ７１嗅覚受容体（ＯＲ）導入遺伝子骨格；５’ACATAACTTTTTAATGAGTCT３’（配列番号１）と少なくとも９０％相同である、２つの完全なｄｓ  Ｂ−ＤＮＡターンを有するＤＮＡ配列の、少なくとも３つの連続した反復；少なくとも３つの連続した反復の下流に配置された転写開始部位（ＴＳＳ）；転写開始部位の下流に配置された、所定の嗅覚受容体をコードする嗅覚受容体コード配列を含み、挿入するステップの後に、非ヒト脊椎動物において多数の嗅覚ニューロン（ＯＳＮ）を含む主嗅上皮（ＭＯＥ）が発生し、ＯＳＮの１０％〜９５％が、所定の嗅覚受容体を発現する。
【００１１】
[0011]第２の実施形態では、脊椎動物を遺伝子改変するためのベクターが提供される。ベクターは、Ｍ７１嗅覚受容体（ＯＲ）導入遺伝子骨格；５’ACATAACTTTTTAATGAGTCT３’（配列番号１）と少なくとも９０％相同であるＤＮＡ配列の、少なくとも３つの連続した反復；少なくとも３つの連続した反復の下流に配置された転写開始部位（ＴＳＳ）；転写開始部位の下流に配置された、所定の嗅覚受容体をコードする嗅覚受容体コード配列を含み、脊椎動物において、前記所定の嗅覚受容体の１０％〜７０％を発現する嗅上皮が発生する。
【００１２】
[0012]第３の実施形態では、遺伝子改変非ヒト脊椎動物が提供される。脊椎動物は、嗅覚受容体導入遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）から１０ｋｂ以内の近傍にＤＮＡが挿入された生殖細胞及び体細胞を含み、当該挿入により、脊椎動物において、挿入を欠く対応する脊椎動物と比較して、嗅覚受容体導入遺伝子に対応する所定の嗅覚受容体が過剰出現するようになり、当該ＤＮＡは、２つの完全な２本鎖Ｂ−ＤＮＡターンを有し、その１次構造はACATAACTTTTTAATGAGTCT（配列番号１）と少なくとも９０％相同であるＤＮＡ配列の、少なくとも３つの連続した反復を含む。
【００１３】
[0013]第４の実施形態では、嗅覚リガンドに対するハイスループットなスクリーニングの方法が提供される。当該方法は、候補嗅覚リガンドを嗅覚ニューロン又はバイオセンサーの絨毛に曝露するステップであって、バイオセンサーは、ニューロンを有する複数の細胞を嗅上皮内に含み、嗅上皮内のニューロンの１％超が、５’ACATAACTTTTTAATGAGTCT３’と少なくとも９０％相同であるＤＮＡ配列の少なくとも３つの反復を有する単一遺伝子選択エンハンサーヌクレオチド配列によって嗅覚受容体（ＯＲ）を発現しており、少なくとも３つの反復は、所定の嗅覚受容体から１０ｋｂ以内に配置されているステップ、及び、嗅覚ニューロン又は絨毛を、ＧＤＰ、ｃＡＭＰ、及び／又はＡＴＰの発現変化についてモニタリングするステップであって、増大は、候補嗅覚リガンドの所定の嗅覚受容体への上首尾の結合に相当するステップを含む。
【００１４】
[0014]本発明の簡単な説明は、単に、１以上の例示的な実施形態により、本明細書に開示の主題の簡単な概要を提供するものであり、特許請求の範囲を解釈するため、又は、添付の特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を定義もしくは限定するための指針として機能するものではない。この簡単な説明は、以下の詳細な説明でさらに説明されている簡易化された形式での概念の例示的な選択を導入するために提供される。この簡単な説明は、特許請求された主題の重要な特徴又は本質的な特徴を同定するものではなく、特許請求された主題の範囲の決定の補助として使用されるものでもない。特許請求された主題は、背景技術において記載されている不都合のいずれか又は全てを解決する実行に限定されない。
【００１５】
図面の簡単な説明
[0015]本発明の特徴を理解することができる様式、発明を実施するための形態が、ある特定の実施形態を参照することによってなされるように、その一部が添付の図面に例示されている。しかし、図面は、単に本発明のある特定の実施形態を例示するものであり、したがって、本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではなく、本発明の範囲は他の同等に有効な実施形態を包含することに留意するべきである。図面は、必ずしも一定の縮尺ではなく、一般に、本発明のある特定の実施形態の特徴を例示することに重点が置かれている。図面では、種々の表示全体を通して、同様の数字が同様の部分を示すように使用されている。したがって、本発明をさらに理解するために、以下の詳細な説明を参照し、以下の図面と併せて読むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】[0016]図１は、開示のＤＮＡ配列を使用した導入遺伝子の設計を示す。
【図２Ａ】[0017]図２Ａは、アセトフェノン（ＡＣＰ）について、４・Ｍ７１Ｃα系統を用いた、Ｍ７１バイオセンサーのｉｎ  ｖｉｖｏ糸球体イメージングの匂い応答プロファイルを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、４−メチルアセトフェノン（４ＭＡＣＰ）について、４・Ｍ７１Ｃα系統を用いた、Ｍ７１バイオセンサーのｉｎ  ｖｉｖｏ糸球体イメージングの匂い応答プロファイルを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、２，４−ジメチルアセトフェノン（２４ｄＭＡＣＰ）について、４・Ｍ７１Ｃα系統を用いた、Ｍ７１バイオセンサーのｉｎ  ｖｉｖｏ糸球体イメージングの匂い応答プロファイルを示す。
【図３Ａ】[0018]図３Ａは、２，４−ジメチルアセトフェノン（２４ｄＭＡＣＰ）を用いた、４・Ｍ７１Ｃαホモ系統に対する行動回避アッセイの結果を示すグラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、２，４−ジメチルアセトフェノン（２４ｄＭＡＣＰ）を用いた、５・Ｍ７１Ｃα系統に対する行動回避アッセイの結果を示すグラフである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、（−）−カルボンを用いた、５・ＯＲ１Ａ１Ｃβ系統に対する行動回避アッセイの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
[0019]本開示は、マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの特定の嗅覚受容体の発現を、ＯＲ遺伝子の選択における決定因子であることが公知のホメオドメイン結合部位配列TAATGAを包含する特定の２１ｂｐ配列を多量体化し、それをＭ７１嗅覚受容体（ＯＲ）導入遺伝子骨格に付加することによって制御する方法に関する（Ｒｏｔｈｍａｎら、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｏｄｏｒａｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  Ｍ７１；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２８、５３５−５４６、２００５参照）。２１ｂｐ配列は、２本鎖Ｂ−ＤＮＡの２つの完全なターンが反映されるように（平均でターン当たり１０．５ｂｐ）選択されたことに留意されたい。当該方法は、特定のマウス又はヒトＯＲコード配列を発現する嗅覚ニューロン（ＯＳＮ）の総数を、さまざまなトランスジェニック動物において再現性よく劇的に増加させるものである。任意の嗅覚受容体又はＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）（ヒト、マウス、又は任意の種に由来するもの）を、導入遺伝子骨格内にシャトルできるように遺伝子導入ベクターを設計した。重要なことは、ＯＲの過剰出現を伴うトランスジェニックマウスは、概念実証試験により、匂いの検出行動課題において同類の匂いに対する感受性の増大を示すことである。このようにして、翻訳潜在力の大きいマウスの鼻における遺伝子発現を遺伝的に操作することによって、バイオセンサーをもたらす多用途プラットフォームが創出されている。当該プラットフォームにより、互いに独立して試験することができない３つのプロセスである、遺伝子選択、軸索同一性、及び匂いのコーディングを、ｉｎ  ｖｉｖｏで同時に試験する研究が可能になる。
【００１８】
[0020]所与のＯＲを発現するニューロン集団を上方制御するために、赤色蛍光タンパク質で標識された同じＯＲをマウス嗅上皮の１０〜７０％が発現する、トランスジェニックマウスを生成する方法。任意のＯＲコード領域の上流に位置する強力な調整可能なエンハンサーを含む、Ｍ７１（マウスＯＲ）導入遺伝子骨格を使用して、発現系を開発した。調整可能なエンハンサーは、特定の２１ｍｅｒ配列（以後、×２１と称する）：５’ACATAACTTTTTAATGAGTCT３’（配列番号１）の反復から成る。この配列は、単一遺伝子選択事象と相関するTAATGA配列を含有する。通常、１つのＯＳＮは１つのＯＲのみを発現する。所与のＯＳＮによりＯＲが「選択」されると、そのＯＳＮによって別のＯＲが選択されることはない。開示の方法を使用すると、所与のＯＳＮ系により目的の所定のＯＲがより高い確率で選択されるようになる。
【００１９】
[0021]マウスＭ７１  ＯＲ及びヒトＯＲ１Ａ１  ＯＲを発現するバイオセンサーが、分子レベル及び機能レベルで検証されている。開示の方法を使用しない場合、主嗅上皮内の嗅覚ニューロンの総数の約０．１％が同じ嗅覚受容体（ＯＲ）を単一に発現し、それらの軸索が嗅球内のホモタイプ糸球体に集束する。原理証明試験では、マウスＯＲ（Ｍ７１）の発現は、１００，０００〜２００，０００個のＯＳＮまで４５倍（約１〜２％）に増大し、ヒトＯＲ（ＯＲ１Ａ１）は１．３百万個のＯＳＮまで５００倍に（約１３％）増大し、一方で、嗅覚系の生物学的性質は保存されていた。生存動物ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングによって示される通り、トランスジェニック動物では、それら特定のＯＲによって認識される既知の匂いに対する脳活性が増強されている。トランスジェニック動物は、行動匂い回避アッセイにおいてそれらの同類の匂いに対する感受性の増大を示すので、重要なことは、匂いの検出の改善は高次皮質領域に翻訳されると思われることである。
【００２０】
[0022]ＯＲコード配列の下流に、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、その後ろに赤色蛍光タンパク質（ｔａｕＣｈｅｒｒｙ）のコード配列を挿入する。これにより、バイシストロン性翻訳が可能になり、そのようにして、目的のＯＲとｔａｕ−Ｃｈｅｒｒｙを同時発現させることにより、過剰出現したＯＲをｉｎ  ｖｉｖｏにおいて蛍光顕微鏡を使用して可視化することが可能になる。１つの実施形態では、可視化が所望されない場合は蛍光タンパク質は省略される。
【００２１】
詳細な結果
[0023]ＯＲ遺伝子は、哺乳動物において最も大きな多重遺伝子ファミリーを形成し、マウスでは約１２００種のメンバーが存在し、ヒトではえ約３５０種のメンバーが存在する。主嗅上皮（ＭＯＥ）は、十分に理解されていない単一遺伝子選択機構によってＯＲを発現し、その機構により、任意の嗅覚受容体遺伝子の対立遺伝子の１つのみが選択されて、所与のニューロンにおいて特異的に発現される。同一のＯＲを発現するＯＳＮに由来する軸索は、嗅球（ＯＢ）内の約１８００の糸球体のうちの２つに集束する。嗅覚受容体コード配列（ＯＲ  ＣＤＳ）は、遺伝子選択の維持において役割を果たしている。ＯＲがこの維持をなすことができない場合は、第２のＯＲ対立遺伝子を、機能性について試験する。したがって、ＯＲ  ＣＤＳの欠失により、軸索の特定の糸球体への収斂が妨げられ、ＯＢ内の種々の糸球体に投射される他のＯＲ遺伝子を発現するＯＳＮが選択される。さらに、ＯＲタンパク質は、軸索誘導の促進、軸索同一性、及びそれらのＯＲを発現するように選択されたニューロンの安定化に必要である。最後に、ＯＲタンパク質は、嗅毛にターゲティングされる必要があり、そこで、匂いシグナル伝達に機能する。本明細書で使用される場合、嗅覚受容体コード配列（ＯＲ  ＣＤＳ）という用語は、個々の嗅覚受容体の成長を促進するＤＮＡの配列を表す。
【００２２】
[0024]Ｍ７１  ＯＲミニ遺伝子の場合では、７．５ｋｂのＤＮＡ断片により、遺伝子がターゲティングされたＭ７１遺伝子座の機能性が正確に再現され、内在性遺伝子の発現パターンと類似した発現パターンがもたらされる。２つの高度に保存された配列が同定された：（１）単一の候補Ｏ／Ｅ結合部位及び（２）この１６１ｂｐ領域内の、２つの候補Ｌｈｘ２ホメオドメイン（ＨＤ）結合部位。ＨＤ配列は、任意のＯＲ遺伝子が発現する確率を調節するために非常に望ましいと考えられる。
【００２３】
[0025]マウスＨ（ＭＯＲ２８クラスターを活性化する相同性領域）及びＰ（Ｐ３最小プロモーターに対して高い相同性を有する配列）などの、ＯＲ遺伝子の選択に強力に影響を及ぼすことが知られている配列のさらなる分析により、エレメントは、互いに極めて近傍にある３つのＨＤ結合部位のセット、及び関連するＯ／Ｅ部位を示し、ＨＤ部位のうちの１つは、それらの間で同じ１３ｍｅｒのAACTTTTTAATGA（配列番号２）を共有する。Ｐエレメントに由来するこの１３ｍｅｒ配列を含有する１９ｍｅｒ（配列番号１０、図１参照）を９倍に多量体化し（９×１９）、ＭＯＲ２３導入遺伝子骨格の上流に位置付けたところ、細胞数の一貫性のない増加が観察された。
【００２４】
[0026]開示のエンハンサーは、「Ｈエレメント」に由来する１３ｍｅｒ配列を包含する、多量体化した２１ｂｐのＨＤを使用して、２重らせんの２つの完全なターンを提供するように設計されており、それにより、Ｍ７１導入遺伝子骨格の背景において、任意の嗅覚受容体タンパク質の抜本的かつ信頼できる発現の増加がもたらされる。開示の方法は、ＯＲ遺伝子の選択、軸索同一性、及び匂いのコーディングを、その完全なｉｎ  ｖｉｖｏ環境において研究者が同時に試験することを初めて可能にするものである。
【００２５】
[0027]導入遺伝子
[0028]多量体化した２１ｍｅｒのＨエレメント（１０．５ｂｐごとにＤＮＡターン、それにより、最大の協同性が可能になる）の効果を、Ｍ７１導入遺伝子から発現される任意のＯＲ  ＣＤＳの選択の確率に対して試験した。４８５ｂｐのＭ７１プロモーターを転写開始部位（ＴＳＳ）の上流に含むＭ７１導入遺伝子骨格（図１）を使用して、任意の数の２１ｍｅｒの反復を、−４８５位のＮｈｅＩ部位にシャトルすることができるように、遺伝子導入ベクターのモジュラーバージョンを創出した。遺伝子導入ベクターのモジュラーバージョンは、Ｒｏｔｈｍａｎ（Ｔｈｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｏｄｏｒａｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  Ｍ７１；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２８、５３５−５４６、２００５）により開示されたＭ７１  ７．５ｋｂミニ遺伝子の改変形態であり、Ｍ７１  ＯＲ  ＣＤＳを、選択されたＯＲ  ＣＤＳで置き換えたものである。導入遺伝子骨格とは、Ｍ７１  ＯＲ  ＣＤＳのない、開示のミニ遺伝子を表す。
【００２６】
[0029]目的の任意のＯＲ  ＣＤＳを、所望によりＩＲＥＳ−ｔａｕＣｈｅｒｒｙカセットなどの標識を後ろに続けて、ＡｓｃＩ部位にクローニングすることができる。配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）により、バイシストロン性翻訳、及び嗅覚ニューロンの形態の可視化を可能にするｔａｕＣｈｅｒｒｙの同時発現が可能になる。
【００２７】
[0030]図１は、導入遺伝子の設計を具体的に示す。Ｍ７１  ＯＲゲノム骨格を使用して遺伝子導入ベクターを創出した。任意の数のＨ＿２１ｍｅｒ（×２１）の反復をＴＳＳの上流のＮｈｅＩ部位にシャトルすることができ、任意のＯＲ  ＣＤＳをＡｓｃＩ部位にクローニングすることができる。ＩＲＥＳ−ｔａｕＣｈｅｒｒｙカセット（ＰａｃＩ）を、ＯＲ  ＣＤＳの後に続ける。配列内リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）により、バイシストロン性翻訳、及び嗅覚形態の可視化を可能にするｍＣｈｅｒｒｙの同時発現が可能になる。ＰｍｅＩ（黒色）で消化したＤＮＡの前核注射によって、トランスジェニック動物を生成した。１つの実施形態では、所定のＯＲ  ＣＤＳから１０ｋｂ以内に反復を配置する。別の実施形態では、所定のＯＲ  ＣＤＳから少なくとも５００ｂｐであるが所定のＯＲ  ＣＤＳから１０ｋｂ未満のところに反復を配置する。１つの実施形態では、ＯＲ  ＣＤＳの上流に反復を配置する。別の実施形態では、ＯＲ  ＣＤＳの下流に反復を配置する。
【００２８】
[0031]２１ｍｅｒの多量体形成の効果
[0032]２１ｍｅｒ配列の０、１、２、３、又は４多量体を含有する種々のＭ７１トランスジェニック系統の最初の分析を実施した（表１）。
【００２９】
【表１】
2018530997.tif 000003
【００３０】
[0033]このデータは、４×２１未満の多量体を含有する生殖系列動物で、クローニングされたＯＲの発現を示すものは５０％未満であり、それらの中にロバストな発現体は存在しないことを示している。これに反して、４×２１  Ｍ７１系統では、生殖系列動物の１００％（３／３）でロバストな発現を生じた。２種の４×２１−Ｍ７１系統（４・Ｍ７１Ｃα及びβ）を飼育してさらに分析した。さらに、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって導入遺伝子挿入のコピー数を評価してＯＲの発現率についての影響を決定したところ、発現レベルとコピー数との間に相関は見いだされなかった。ヘミ接合性４・Ｍ７１Ｃαは約１５コピーを含有し、一方、ヘミ接合性４・Ｍ７１Ｃβでは約２４コピーを示した。興味深いことに、９種の０・Ｍ７１Ｃ創始体は、５〜３２の導入遺伝子の挿入を含有したが、ロバストなＯＲ発現を示さなかった。特定の理論に縛られることを望むものではないが、４×２１エンハンサーは、ゲノム内にランダムに挿入されると、クロマチン環境を調節し、したがって、ＯＲ発現を促進さることができると考えられる。
【００３１】
[0034]４・Ｍ７１Ｃα系統における単一遺伝子発現
[0035]４・Ｍ７１Ｃα系統では、Ｍ７１  ＯＲを発現するＯＳＮの増加により、ＯＢ当たり１つの外側糸球体及び１つの内側糸球体への標識された軸索の集束がもたらされる。驚くべきことに、これらの糸球体は、典型的な糸球体よりも有意に大きく（３００μｍ）、これにより、嗅覚の分野における長期にわたる問い：匂い応答の際の単一の糸球体への軸索からの入力の増大の効果とは？に答える独特の機会がもたらされた。４・Ｍ７１Ｃα系統におけるＭ７１  ＯＲの選択増大の、「内在性」Ｍ７１  ＯＲの発現レベルに対する効果と、軸索誘導及び同一性に対する効果とを対比するために、この系統を、Ｍ７１遺伝子座に遺伝子がターゲティングされたＭ７１−ＩＲＥＳ−ｔａｕＧＦＰマウス（Ｍ７１Ｇ、１２９系）と交配させた。Ｍ７１Ｇについてホモ接合性であるか（Ｍ７１Ｇ  −／−、以後、野生型と称する）、あるいはＭ７１Ｇについてホモ接合性であり、かつＭ７１−ＩＲＥＳｔａｕＣｈｅｒｒｙ導入遺伝子についてヘミ接合性又はホモ接合性である（４・Ｍ７１Ｃα  −／０又は−／−；Ｍ７１Ｇ  −／−、以後、４・Ｍ７１Ｃαヘミ又はホモと称する）新しいマウス系統を確立した。これらの４・Ｍ７１Ｃαヘミ動物のＭＯＥの冠状凍結切片を使用して、Ｍ７１  ４×２１導入遺伝子を発現するｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞が合計４７５４個、及びＧＦＰ陽性細胞が２２１個計数され、ＭＯＥにおいて緑色マーカーを同時発現する赤色細胞は存在せず、これにより、この４×２１  Ｍ７１導入遺伝子が１遺伝子発現を維持していたことが示唆される。さらに、これらの動物のＯＢの共焦点イメージングにより、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性軸索が、内在性ＧＦＰ陽性軸索と同じアイソタイプのＭ７１糸球体に同時収斂することが明らかになり、これにより、Ｍ７１導入遺伝子を発現するＯＳＮが、内在性Ｍ７１  ＯＳＮと同じ軸索同一性を有することが示される。軸索同一性は、ＯＳＮに発現する最も豊富なＯＲと厳密に相関しており、したがって、４・Ｍ７１Ｃα  ＯＳＮが他のＯＲに富んでいる可能性は低い。さらに、Ｍ７１  ＲＮＡ転写物はＭ７１Ｇ軸索に集束するので、４・Ｍ７１Ｃα  ＯＳＮにおいてそのレベルが上昇する可能性は低い；これは、以前の、９×１９導入遺伝子に由来するＭＯＲ２３を発現するＯＳＮの軸索が、内在性遺伝子座に由来するＭＯＲ２３を発現するＯＳＮの軸索と同じ糸球体に同時収斂するという知見、及び、ＯＲレベルのわずかな変化が、軸索同一性に劇的な影響を及ぼす知見と一致する。
【００３２】
[0036]糸球体活性のｉｎ  ｖｉｖｏシナプトフルオリン（ＳｐＨ）イメージング
[0037]Ｍ７１  ＯＲは嗅球において背側に発現するので、Ｍ７１導入遺伝子骨格を使用してクローニングされたＯＲはその軸索を、背側に位置する糸球体に集束し、それにより光学イメージングに利用可能なものになる。したがって、光学イメージングを使用して、ＯＢにおける導入遺伝子Ｍ７１投射を機能的に特徴付けた。それらの機能的性質を調査するために、遺伝子によりコードされた活性レポーターＳｐＨを、全ての成熟ＯＳＮにおいて発現するマウスのＯＢからの、匂いにより惹起される活性をイメージングした。４・Ｍ７１Ｃαについてヘミ接合性であるか又はホモ接合性であり（遺伝子がターゲティングされたＭ７１−ＧＦＰを外交配した）、ＳｐＨについてヘテロ接合性であるマウスから同時記録を得、赤色Ｍ７１糸球体を同定した。遺伝子がターゲティングされたマウスにおける遺伝的に定義されたＭ７１  ＯＳＮのｅｘ  ｖｉｖｏ分析から、７種の異なるＭ７１選択的リガンドを使用した：これらのリガンドのうちの３種：アセトフェノン（ＡＣＰ）、４−メチルアセトフェノン（４ＭＡＣＰ）、及び２，４−ジメチルアセトフェノン（２４ｄＭＡＣＰ）で、０％〜１５％で変動する種々の匂い希釈度で送達された際に、ＳｐＨイメージングによる応答が生じた。匂い前取得（３秒）、匂い時取得（４秒）、及び匂い後取得（４秒）を有する１４秒の試験期間にわたり、各化合物について、匂い濃度あたりの蛍光の最大変化［（ｄＦ／Ｆ）ｍａｘ］を算出した。ヘミ４・Ｍ７１Ｃα動物及びホモ４・Ｍ７１Ｃα動物の全てのイメージングされた糸球体に完全に含有される標準化された５０μｍのウインドウを用いて、全ての糸球体についてｄＦ／Ｆ値を算出した（図２Ａ、図２Ｂ、及び図２Ｃ：各データポイントは、イメージングした４〜１６個の糸球体の平均（ｄＦ／Ｆ）ｍａｘを表す）。△はヘミ接合性動物からの応答を示し、○はホモ接合性動物を示し、＊は、動物に同じ匂い濃度を提示した時の、ヘミ接合性応答よりも有意に高いホモ接合性応答を示す。イメージングされた全てのマウスはｏｍｐ−ＳｐＨについてヘテロ接合性である。
【００３３】
[0038]Ｍ７１リガンドは、ヘミ接合性４・Ｍ７１Ｃα動物において、同じ有効性を示すが、見かけの親和性は異なる。ヘミ接合性動物では、平均最高（ｄＦ／Ｆ）ｍａｘは、ＡＣＰについては３．４９％であり（ｎ＝６、１．７７μＭ）、４ＭＡＣＰについては４．４８％であり（ｎ＝９、０．６９μＭ）、２４ｄＭＡＣＰについては４．１５％である（ｎ＝７、０．６６μＭ）。これらの結果は、３種の化合物全てにより、Ｍ７１  ＯＲ活性化に関して同様の有効性［化合物によって得られる最大応答、すなわち、平均（ｄＦ／Ｆ）ｍａｘ］がもたらされることを示している（ヘミ動物間の最高（ｄＦ／Ｆ）ｍａｘ値を比較する１元配置ＡＮＯＶＡは、有意差を示さなかった）。しかしながら、４ＭＡＣＰ及び２４ｄＭＡＣＰは、より低い濃度でＭ７１糸球体の活性化を開始するので、これら２つの化合物に対するＭ７１  ＯＲの見かけの親和性は、ＡＣＰに対するものよりも有意に高い（図２）。例えば、同じ濃度（すなわち、約０．７０μＭ）で送達した場合、ＡＣＰの有効性は０．７３％である（ｎ＝４）。これは、４ＭＡＣＰの有効性（４．４８％、ｎ＝９、スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０００１）及び２４ｄＭＡＣＰの有効性（４．１５％、ｎ＝７、スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０００１）よりも有意に低い。したがって、ヘミ動物では、４ＭＡＣＰ及び２４ｄＭＡＣＰについて、ＡＣＰ応答と比較して低い濃度で同様の匂い有効性が観察される。
【００３４】
[0039]Ｍ７１を発現するＯＳＮの数が倍増すると、高親和性リガンド及び低親和性リガンドの有効性も変化する。ホモ接合性動物では、ＡＣＰの最高有効性は４．５７％であり（ｎ＝１４、２．６６μＭ）、４ＭＡＣＰでは３．８２％であり（ｎ＝１６、０．６９μＭ）、２４ｄＭＡＣＰでは４．９２％である（ｎ＝７、０．４６μＭ）。ヘミ接合性動物とホモ接合性動物を比較した場合、４ＭＡＣＰについて用量応答は有意には異ならなかった。しかしながら、２４ｄＭＡＣＰについては、０．４４μＭで有効性の有意な増大が観察され（２．９２％（ｎ＝４）対４．９２％（ｎ＝７）、スチューデントのｔ検定、ｐ＝０．００７５）、これにより、Ｍ７１の発現を選択するＯＳＮの数の倍増により、このリガンドがこの特定の濃度で存在する場合の有効性が変化することが示唆される。さらに、平均有効性（全ての濃度及び匂いの）は、ホモ接合性動物では２４ｄＭＡＣＰと４ＭＡＣＰの間で有意に異なるが（４．９２％対３．８３％、スチューデントのｔ検定、ｐ＝０．０２７２）、それにもかかわらず、２４ｄＭＡＣＰと４ＭＡＣＰは、ヘミ接合性動物では実際に同じ用量応答を示す（図２Ａ〜２Ｃ）。Ｍ７１  ＯＲを発現するニューロンの数の倍増により、２４ｄＭＡＣＰの有効性が変化するため、経験的に、２４ｄＭＡＣＰがより親和性の高いリガンドであると同定される。
【００３５】
[0040]興味深いことに、ホモ接合性動物では、ＡＣＰを０．７１μＭで送達した場合、有効性は３．００％（ｎ＝６）であり、ヘミ接合性動物における同濃度での応答（０．７３％、ｎ＝４）よりも有意に高く（スチューデントのｔ検定、ｐ＝０．０１８９）、これは、このリガンドについての見かけの親和性の変化を反映するものである。さらに、送達した最高ＡＣＰ濃度（すなわち、２．６６μＭ）でも、ホモ接合性応答がヘテロ接合性応答よりも有意に高い（４．５７％、ｎ＝１４対３．４６％、ｎ＝９）。
【００３６】
[0041]Ｍ７１を発現するＯＳＮの定義された数を考慮すると、所与の匂いのある特定の濃度で、糸球体応答は飽和に達する。しかしながら、この飽和応答は、１つのＯＲ型を発現するＯＳＮの特定のサブセットによって決定されるものではない。データから、Ｍ７１を発現するニューロンの数の倍増により、特定の濃度における糸球体の有効性が増大し得る。
【００３７】
[0042]ｅｘ  ｖｉｖｏ対ｉｎ  ｖｉｖｏのリガンドプロファイリング
[0043]概念実証実験では、９９％純粋な匂い分子を含有する匂い飽和器バイアルのヘッドスペースから、送達前に空気（Ｎ２）で流動希釈して、麻酔した動物に匂いを送達する。したがって、動物の鼻に到達した蒸気モル濃度（μＭ）は、匂い分子間で劇的に異なり得る匂い分子飽和蒸気圧（Ｐｓ）によって決定される。例えば、ＡＣＰの１５％空気希釈（Ｐｓ＝０．３２６０ｍｍＨｇ、２５℃）では２．６６μＭの空気中濃度が生じ、一方、４ＭＡＣＰ及び２４ｄＭＡＣＰ（それぞれＰｓ＝０．０８４９及び０．０８１１）は、それぞれ０．６９μＭ及び０．６６μＭで送達される。液相中に送達されたときの樹状瘤のｅｘ  ｖｉｖｏパッチクランプによってＭ７１応答を引き出したもの（ベンズアルデヒド、エチルマルトール、２アミノアセトフェノン、ＡＣＰ、４−メトキシアセトフェノン、４ＭＡＣＰ、及び２４ｄＭＡＣＰ）又は引き出さなかったもの（安息香酸メチル及びメントン）の７種の異なる匂いを分析することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏ応答を先のｅｘ  ｖｉｖｏデータと比較した。糸球体活性は、ＡＣＰ、４ＭＡＣＰ、及び２４ｄＭＡＣＰでのみ観察された。これらの所見には２つの理由がある：（１）匂いが十分高い濃度で送達されないこと、及び／又は（２）匂いがＯＳＮ内に十分高い活性化を生じさせることができないこと。ｉｎ  ｖｉｖｏで応答を引き出すことを可能にするために必要な最小Ｐｓは０．０８１１ｍｍＨｇ（２４ｄＭＡＣＰのＰｓ）であることが見いだされた。４−メトキシアセトフェノン（ｅｘ  ｖｉｖｏにおける高応答体）は、我々の手では糸球体活性化を示さず、Ｐｓ＝０．０１３３（＜０．０８１１）ｍｍＨｇであり、ベンズアルデヒド（ｅｘ  ｖｉｖｏにおける低応答体）も、糸球体活性化を示さず、試験した全ての匂いの中で最高のＰｓを有した（２５℃で１．０１００ｍｍＨｇ）。したがって、ＳｐＨイメージングの設定では、最小Ｐｓ要件が満たされた場合、最小電流振幅（ｐＡ）Ｍ７１応答（ｅｘ  ｖｉｖｏ）が匂いに対して使用されて、糸球体を活性化することが示唆される。
【００３８】
[0044]２瓶識別行動課題における匂いの検出閾値
[0045]ウィスターラット新生児及び成体において実施した感受性試験は、匂いに対する最高感受性（最低閾値）が、ＭＯＥにおける最高ＯＳＮ密度と相関することを示している。４・Ｍ７１Ｃα動物における成熟ＯＳＮの総数は変化しなかった［ｑＰＣＲは、嗅覚マーカータンパク質（ｏｍｐ）のＲＮＡレベルが、４・Ｍ７１Ｃα動物と野生型動物との間で変化しないことを示す］にもかかわらず、Ｍ７１を発現するＯＳＮのニューロン出現は増大する。したがって、最もロバストなＭ７１リガンドの検出が、このＭ７１系統において増幅されるかどうかを評価することが望ましかった。匂い分子２４ｄＭＡＣＰを飲料水に添加して、胃の倦怠感を誘導することが公知の化合物である塩化リチウム（ＬｉＣｌ）の注射を伴った嫌悪刺激とする、回避課題を使用した。ホモ接合性４・Ｍ７１Ｃα動物及びそれらの野生型同腹仔を、１０−４希釈の２４ｄＭＡＣＰを含有する水に対して条件付けを行った後、動物に、ただの水か漸減濃度（１０−４、１０−６、５×１０−７、及び１０−７）の２４ｄＭＡＣＰを有する水かの選択肢を与えた。試験した動物の全てがＭ７１Ｇについてホモ接合性であり、したがって、野生型であっても機能的Ｍ７１  ＯＲを有することに留意されたい。
【００３９】
[0046]結果は、各群の動物についての匂い付けした水に対する嗜好指数（ＰＩ）として示され、これは、２４時間にわたって消費された匂い付けした水の量を、消費された液体（匂いのある水及び匂いのない水）の総量で割ったものとして算出される（図３Ａ）。５０％のＰＩは、動物による嗜好がないことを反映している。１０−４希釈の２４ｄＭＡＣＰは６４６μＭに相当し、これは、ホモ接合性動物及び野生型動物によって容易に検出することができ、それ自体では嫌悪応答を引き起こさない濃度である（ナイーブな条件付けしていないマウスに関し、１０−６の２４ｄＭＡＣＰを含有する飲料水のＰＩは、以下の通りである：野生型：６０％±７．７２（ｎ＝５）及びホモ：５９％±１．９４（ｎ＝５））。１０−４希釈物と１０−６希釈物を提示した場合には、条件付けした４・Ｍ７１Ｃαホモ動物及び野生型動物は、２４ｄＭＡＣＰに対する明らかな嫌悪を示し、これは２４ｄＭＡＣＰに対する平均ＰＩが約１０％であることに反映されている。しかしながら、２４ｄＭＡＣＰを１０−７で送達した場合、全ての動物が匂いの存在を検出することができず、平均ＰＩは野生型（ｎ＝４）について５３．４１％、及びホモ接合性動物（ｎ＝８）について６２．６７％である。これにより、これらＭ７１  ＭｏｕＳｅｎｓｏｒの感受性が変化した場合、閾値は１０−６〜１０−７であることが示唆された。実際に、野生型群のＰＩは、５×１０−７の希釈度で突然変異体のＰＩよりも有意に高く（６２．７９％対２６．１２％、スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０５）、これは、野生型は５×１０−７の匂いを検出できないが、突然変異体は依然として嫌悪行動を示し、したがって、依然として２４ｄＭＡＣＰの匂いを感じることを示唆している。重要なことは、野生型動物であっても、匂い付けした水に対して１０−４では５×１０−７よりも低いＰＩを示すことであり（１１．８４％対６２．７９％、スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０５）、これは、行動の差異が、野生型の学習欠如ではなく、突然変異体の匂いを検出する能力が増大したことの結果である可能性が最も高いことを示している。
【００４０】
[0047]５・Ｍ７１Ｃα系統と４・Ｍ７１Ｃα系統の間で、特定の匂い分子感受性を比較するために、２４ｄＭＡＣＰを用いた２瓶識別行動課題を上記の通り実施した（図３Ｂ）。要約すると、５×１０−７の希釈度で、５・Ｍ７１Ｃα群（ｎ＝９）の平均ＰＩは１９．６２％であり、これは、野生型群のＰＩ（ｎ＝８；５５．３２％）よりも有意に低い（ｐ＜０．０１）。５・Ｍ７１Ｃα系統では、匂い分子検出閾値におい、同じであるがわずかに有意な０．３ｌｏｇ減少が観察されたが、Ｍ７１を発現するそれらのＯＳＮの約１．６％有する５・Ｍ７１Ｃαヘミ動物（約２％のＭ７１発現ＯＳＮを有する４・Ｍ７１Ｃαホモ動物に類似）を使用したことに言及することが重要である。
【００４１】
[0048]ＯＳＮ数に基づいた正確な匂い閾値化は実施していないことに留意することが重要である。
[0049]Ｍ７１  ＭｏｕＳｅｎｓｏｒはモノクローナル鼻を有していない
[0050]我々の４・Ｍ７１Ｃα系統（これもＭ７１Ｇについてホモ接合性である）において、変化したＭ７１を発現するＯＳＮの百分率を評価した。ｑＰＣＲを使用して、Ｍ７１−ｍＣｈｅｒｒｙ  ＲＮＡのレベルが、ヘミ接合性４・Ｍ７１Ｃα系統ではＭ７１−ＧＦＰと比較して約１２倍（スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０１）、及び野生型系統（Ｍ７１Ｇ  −／−）ではＭ７１−ＧＦＰと比較して約４５倍（スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０１）、有意に上昇することが見いだされた。この見かけの矛盾は、遺伝子がターゲティングされたＭ７１−ＧＦＰの発現が、４・Ｍ７１Ｃαヘミ動物では野生型動物と比較して３．８９倍高い（スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０１）という事実によって説明される。これらの数字は、４・Ｍ７１Ｃα動物の発達初期では、Ｍ７１−ｍＣｈｅｒｒｙ  ＲＮＡレベルの上昇が、内在性Ｍ７１−ＧＦＰ  ＲＮＡレベルを減らすのではなくその安定化に役立ち、それにより、４・Ｍ７１Ｃα動物における内在性Ｍ７１転写物の増加が導かれることを示唆している。このモデルは、嗅覚ニューロンが軸索投射の維持に関して相互依存的であるという事実によって裏付けられる。さらに、糸球体様構造はシナプス後嗅覚ニューロンの非存在下で形成し得るため、嗅覚情報を高次皮質領域に伝えるために必要なシナプス後嗅球回路網は完全なままである。既存のＹＦＰ−ｇトランスジェニックマウス系統（シナプス後僧帽細胞の３０％が黄色に標識される）を４・Ｍ７１Ｃα系統と交配させて、僧帽細胞樹状突起を可視化した。シナプス後僧帽／房飾細胞由来の樹状突起が存在するため、Ｍ７１糸球体の僧帽細胞神経支配は正常である。
【００４２】
[0051]Ｍ７１Ｇ対立遺伝子は、ＯＳＮの約０．０３〜０．０６％において発現する（計５〜１０百万のＯＳＮのうち約３千、すなわち、平均０．１％未満）。したがって、上記の知見は、４・Ｍ７１Ｃαホモ動物（行動に使用）は、Ｍ７１  ＯＲを発現するＯＳＮを約１〜２％有することを示唆している。この点について、当該動物は、大部分のＯＲの発現を９５％低下させてそれらをＭ７１で置き換え、モノクローナル鼻を有する動物を創出することによって匂いの神経出現を変化させることにより生成された他の動物とは根本的に異なる。大部分のＯＳＮ及び糸球体はＡＣＰによって（弱く）活性化し得るという先の知見にもかかわらず、これらの動物における匂い識別及び連合学習課題の成績は損なわれる。この挙動についての１つの可能性のある説明は、広範で均一な活性化（例えば、モノクローナル鼻におけるものなど）は、複雑なフィードバック機構による側方阻害を引き起こす可能性があり（検出及び／又は知覚のレベルで）、ＡＣＰは嗅覚「ノイズ」として検出される可能性があるというものである。この点について、多くの小さな糸球体は、より少数の非常に大きな糸球体（我々の４・Ｍ７１Ｃα系統において観察される）と比較して不都合であり得、シグナル検出にはパターン化された活性化が必要であり得る。他方では、内在性ＯＲ遺伝子の出現を２０分の１に減少させることにより、ＡＣＰに対する高親和性ＯＲも同様に除去される可能性がある（例えば、Ｏｌｆｒ１４５、ｖｏｎ  ｄｅｒ  Ｗｅｉｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｇａｎｄ  ｐａｉｒｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ、２０１５）。
【００４３】
[0052]多用途プラットフォーム
[0053]「嗅覚受容体コード配列」という句は、以下の機能：（１）匂い分子の同定及び嗅覚シグナル伝達、（２）第２のＯＲの発現を遮断するための第１の選択の維持、（３）ニューロンの成熟化の促進、（４）軸索に成長能をもたらすこと、並びに（５）軸索を成長させるための軸索同一性の暗号化、を発揮するＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を表す。嗅覚受容体導入遺伝子の多数の例が当業者に公知であり、Ｍ７１及びＯＲ１Ａ１は、単に２つの例に過ぎない。開示の方法は、広範囲の嗅覚受容体導入遺伝子に適用可能である。
【００４４】
[0054]遍在するエンハンサーとしての多量体の数をさらに増加させることの、任意のクローニングされたＯＲの発現を選択するＯＳＮの数に対する効果を評価するために、２種のマウスＯＲ、Ｍ７１及びＭＯＲ１２２−２の５×２１エンハンサーを含有する系統を創出した。５・Ｍ７１Ｃについての創始体の全て（６／６）及び生殖系列動物５・Ｍ７１Ｃαの１匹で、高レベルのＭ７１発現を示し（表１）、嗅球において糸球体を形成する。さらに、５匹の５・ＭＯＲ１２２−２についての生殖系列動物全てが、高レベルのＭＯＲ１２２−２発現を示す。さらに、５・Ｍ７１Ｃαと４・Ｍ７１Ｃαとを比較すると、データは、余分の２１ｍｅｒの付加により、Ｍ７１を発現するＯＳＮの数が増加することを示している。この増加した数は、多量体形成の結果であり、ゲノム内の導入遺伝子のコピー数増加（５×２１  Ｍ７１導入遺伝子については約１６倍であるのに対し、４×２１  Ｍ７１導入遺伝子については約１５倍）の結果ではないと思われる。さらに、６．５週齢の５・Ｍ７１Ｃヘミ動物のＭＯＥの冠状凍結切片を使用して、赤色細胞の大集団の中で合計５２の緑色細胞を計数したが、その中で同時発現したものはなかった。これらのデータは、５×２１ｍｅｒの付加により、ＯＳＮにおいて単一遺伝子発現が維持されることを示している。単一遺伝子選択の現行モデルに基づけば、この選択エンハンサーは多数のニューロンにおいて依然として抑制される可能性があり、また、非ｃｈｅｒｒｙ細胞におけるサイレンシングの標的になるはずである。本開示は、役割をコードする配列又はその能力をサイレンシングするための他のゲノム配列を試験するためのモデル系を提供する。
【００４５】
[0055]このプラットフォームの多用性をさらに評価するために、ＯＲ１Ａ１を５×２１  Ｍ７１導入遺伝子骨格にクローニングすることによってヒトＯＲの発現の選択確率を上昇させた。どちらの生殖系列動物（５・ＯＲ１Ａ１Ｃβ及びδ）も、ＭＯＥにおけるヒトＯＲ１Ａ１受容体のロバストな発現及びＯＢにおける安定な糸球体形成を示した。ｑＰＣＲは、４・Ｍ７１Ｃαヘミ系統におけるＭ７１  ＲＮＡレベルと比較して、５・ＯＲ１Ａ１Ｃβヘミ動物におけるＯＲ１Ａ１  ＲＮＡが約１２倍も増加したことを示している。重ねて、ｏｍｐレベルに変化はなかった。明らかに、この平衡を説明するためには、一部のＯＲの出現が減少しなければならない。４・Ｍ７１Ｃαホモ動物では、Ｍ７１  ＲＮＡレベルのほんの２−ｌｏｇの上昇が、検出可能な０．３ｌｏｇの閾値変化をもたらす。したがって、特定の理論に縛られることを望むものではないが、ニューロンにおける特定ＯＲの出現のさらなる増大は、検出閾値をさらに低減し得ると考えられる。しかしながら、細胞数と感度との間には微妙なバランスが存在するはずである。この仮説を、５・ＯＲ１Ａ１Ｃβマウスを用い、確立された２瓶行動回避課題を使用して検定した（図３Ｂ）。５・ＯＲ１Ａ１Ｃβヘミ動物（ｎ＝１２）及びそれらの野生型同腹仔（ｎ＝７）の、公知のＯＲ１Ａ１リガンドである（−）−カルボンの１０−４希釈物を含有する水に対する条件付けを実施した。４日連続して、動物に、ただの水か、漸減希釈（１０−４、１０−６、１０−７、及び１０−８）した（−）カルボンを有する水かの選択肢を与えた（図３Ｃ）。両群（野生型及びヘミ）とも、１０−４希釈の（−）−カルボンに対して明らかな嫌悪を示し（平均ＰＩ  野生型＝６．１７％及び平均ＰＩ  ヘミ＝１０．２６％）、これは、上首尾の条件付けを反映する。野生型（平均ＰＩ＝５５．５２％）及びヘミ（平均ＰＩ＝４７．８８％）のどちらも、１０−８希釈の（−）−カルボンを検出することはできなかった。しかしながら、１０−６及び１０−７では、野生型とヘミとの間で検出に明白な差異があった（１０−６：平均ＰＩ  野生型＝２７．６５％対平均ＰＩ  ヘミ＝１１．４１％、スチューデントのｔ検定ｐ＜０．０１、及び１０−７：平均ＰＩ  野生型＝５３．８８％対平均ＰＩ  ヘミ＝３０．２４％、スチューデントのｔ検定ｐ＜０．０５）。重要なことは、野生型動物であっても、匂い付けした水に対して、１０−６（６．１７％対２７．６５％、スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０１）及び１０−７（６．１７％対５３．８８％、スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０００１）よりも、１０−４において有意に低いＰＩを示し、これは、やはり、挙動の差異が、野生型の学習欠如ではなく、突然変異体の匂い検出能が増大したことの結果である可能性が最も高いことを示している（図３Ｂ）。これらの所見は、ＯＳＮの約４０％でＯＲ１Ａ１を発現することが、（−）カルボン検出閾値の２−ｌｏｇの差異に変換されることを示している。
【００４６】
[0056]結論
[0057]開示のトランスジェニックプラットフォームは、嗅覚系における単一遺伝子選択及び匂いのコーディングの機構をさらに研究するための貴重なツールである。機構的に、ＨＤ結合性モチーフは、ポリメラーゼ集合因子を誘引すること、転写開始を増強すること、又は転写伸長を安定化することによって、ＯＲ遺伝子選択の確率を調節することができる。ＨＤエレメントを互いに極めて近傍に置くことが、転写因子の強力な協同的結合に有利である可能性が最も高い。この点について、９×２１ｍｅｒの多量体化により、嗅上皮におけるＯＲのはるかに高い出現がもたらされる。このプラットフォームは、突然変異体ＯＲ配列を使用して、ＯＲ遺伝子選択の機構又は第１選択に対する負のフィードバックの機構を詳細に分析することをさらに可能にする。さらに、開示の技術を使用して、多数のマウスＯＳＮにおいてヒトＯＲを発現させることが可能なことにより、嗅覚コードを最終的に解明するためのｉｎ  ｖｉｖｏ手法に突破口をもたらす。
【００４７】
[0058]ＮｈｅＩ部位（gctagc）に、５×２１のアニーリングされたｕｌｔｒａｍｅｒを挿入する例を以下に提示する。５つの反復を含むフォワードｕｌｔｒａｍｅｒは、
ctagcACATAACTTTTTAATGAGTCTACATAACTTTTTAA TGAGTCTACATAACTTTTTAATGAGTCTACATAACTTTTTAATGAGTCTACATAACTTTTTAATGAGTCT（配列番号１１）
で示される。５つの反復を含むリバースｕｌｔｒａｍｅｒは、
ctagAGACTCATTAAAAAGTTATGTeAGACTCATTAAAAA GTTATGTAGACTCATTAAAAAGTTATGTAGACTCATTAAAAAGTTATGTg（配列番号１２）
で示される。
【００４８】
[0059]Ｍ７１プロモーター配列（４８５ｂｐ＋gctagc）は、
gctagcTCATGATGCATCATGGTGACTAGCTAACAATATGTAATAACCATCATGGCACTGAGAATGATGTTGCTGGTAGTTACTGTGGTGCCTATTGAGATGAAAATGACAATAATGATAATACATCAGTAGTAAAGGTGATAGCCATGGTCATAATGGTAATGATGATAAGGATGGGTGGGTAGTGGTGATGGATGGTTGGTGGTGGTGGTGGTGATGGTAGTGGTAGGGGGGTAATGGTGGTGGTAACGGCTCTGTTGATGCTAAATTGTTCATTGCCCCATTATATTCTAAGTTTCTGAAACTGAAAGATGACTTTTACAGATAAAAGAAGAATTAACACACTTGGGAAATAAAACATGATTCACAGAACAAGAGAAAACATGAACTAATTGTTACTTTAGAGACAACAATGGTCTCTAGAGTGACTATATCCCAGGAGATGATCCACACACACACACACATATATATAAACAGAACCCCCAATTTTT（配列番号１３）
で示される。
【００４９】
[0060]５×２１  Ｍ７１導入遺伝子プロモーターは、
gctagcACATAACTTTTTAATGAGTCTACATAACTTTTTAATGAGTCTACATAACTTTTTAATGAGTCTACATAACTTTTTAATGAGTCTACATAACTTTTTAATGAGTCTctagcTCATGATGCATCATGGTGACTAGCTAACAATATGTAATAACCATCATGGCACTGAGAATGATGTTGCTGGTAGTTACTGTGGTGCCTATTGAGATGAAAATGACAATAATGATAATACATCAGTAGTAAAGGTGATAGCCATGGTCATAATGGTAATGATGATAAGGATGGGTGGGTAGTGGTGATGGATGGTTGGTGGTGGTGGTGGTGATGGTAGTGGTAGGGGGGTAATGGTGGTGGTAACGGCTCTGTTGATGCTAAATTGTTCATTGCCCCATTATATTCTAAGTTTCTGAAACTGAAAGATGACTTTTACAGATAAAAGAAGAATTAACACACTTGGGAAATAAAACATGATTCACAGAACAAGAGAAAACATGAACTAATTGTTACTTTAGAGACAACAATGGTCTCTAGAGTGACTATATCCCAGGAGATGATCCACACACACACACACATATATATAAACAGAACCCCCAATTTTT（配列番号１４）
で示される。
【００５０】
[0061]嗅覚リガンドのハイスループットスクリーニング方法
[0062]本明細書は、匂いに直面したときの嗅覚ニューロン内のこのＯＲシグナル伝達カスケードの生化学的変化を測定するための方法も開示している。
【００５１】
[0063]匂いが嗅覚受容体（ＯＲ）に結合すると、シグナル伝達カスケードが結果として生じ、それにより、Ｇｏｌｆ  αサブユニットがＧＴＰとの結合を通じて活性化される。その後、Ｇｏｌｆ−ＧＴＰは、ＡＴＰからｃＡＭＰへの変換を触媒するアデニル酸シクラーゼＩＩＩを活性化する。この反応は、ＧＴＰが切断されてＧＤＰになり、Ｇｏｌｆ−ＧＤＰを生じることにより終結する。
【００５２】
[0064]嗅覚受容体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させることが困難であることが知られている。異種発現系が不足しているため、大部分のＯＲはオーファンのままであり、これは、それらの対応するリガンドが知られていないことを意味する。したがって、嗅覚コードはｉｎ  ｖｉｖｏで研究する必要があるが、このプロセスは、各ＯＲ遺伝子がＯＳＮの０．１％にしか発現しないために妨害され、それにより、特定のリガンドをそれらの関連したＯＲに相関づけることを困難にしている。
【００５３】
[0065]１つのグループが、シャペロン分子を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでＯＲを発現させる方法を見出したと主張している。デューク大学は、この特許技術の使用権を、小さなベルギーの会社であるＣｈｅｍＣｏｍに排他的に与えている（Ｓａｉｔｏら、Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ．１１９、６７９−６９１、２００４年１１月２４日）。したがって、香料産業におけるビッグプレーヤーの全てが、ＯＲを発現させる「次善策」を見出す必要がある。現在、香料研究者及びヒト精神物理学が、新しく合成された分子の匂いの質を経験的に検証している。この高価な方法は、製造される新しい分子で市場にたどり着くのは１年当たり１％未満であるため、効果的ではない。これは、ヒトが試験すべき候補分子の数を減らし、最終的にパイプライン費用を削減することができるハイスループットスクリーニングプラットフォームの欠如に大きく起因している。
【００５４】
[0066]本明細書の他の箇所に記載の方法は、ヒトＯＲを含めた任意の嗅覚受容体をマウス脳において多量に発現させることができるプラットフォームを提供する。これらのトランスジェニックＯＲを発現する嗅覚ニューロンを含有する主嗅上皮は、容易に解剖し、溶解させることができる。
【００５５】
[0067]ＯＲはＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）であり、それらのリガンドによって活性化されると、ＧＴＰからＧＤＰへの変換及びＡＴＰからｃＡＭＰへの変換を伴うシグナル伝達経路を開始する。したがって、ＧＤＰ／ｃＡＭＰの増加又はＡＴＰの減少は、リガンド結合活性の指標である。
【００５６】
[0068]本開示に記載のバイオセンサーは、大多数のそれらの細胞において目的のＯＲを発現するため、特定のリガンドによる測定可能なＧＤＰ／ｃＡＭＰの増加（又はＡＴＰの減少）は、トランスジェニックＯＲの活性化を反映している。本明細書に記載の方法は、ニューロンにおける特定ＯＲの出現を増大させる任意の遺伝子プラットフォームを使用した、匂い分子（アゴニスト及びアンタゴニスト）のハイスループットスクリーニングの手段として、特定の匂い分子の活性化後のＧＤＰ／ｃＡＭＰの増加、ＡＴＰの減少の定量的測定を提供する。
【００５７】
[0069]これらの生化学的変化を定量する分子キットが市販されている。ｃＡＭＰ及びＡＴＰのレベルは、ルシフェラーゼキットなどの既存の技術によって、又はＡＴＰとクエンチャー及び／又はフルオロフォアとの直接カップリングによって測定することができる。１つの実施形態では、マイクロ流体チップを使用して活性を測定する。
【００５８】
[0070]適用
[0071]バイオセンサーを創出するための遺伝学的な手法の１つの利点は、嗅覚の増大が遺伝的に規定され、したがって、遺伝することである。例えば、ＴＮＴマウスの子孫も、増強された感覚能力を有する。さらに、トランスジェニックマウスは育種時間及び成熟化速度が速く、マウスの妊娠期間は１８〜２２日の範囲である。さらに、特定の嗅覚に関して固有の増強された知覚を有する動物は、訓練時間が劇的に短縮され、効率が増強されることが予測される。
【００５９】
[0072]開示の方法は、疾患診断、薬物防止、捜索救助、及び病原体検出を含めた多数の適用において有用である。
[0073]疾患診断において有用なバイオセンサーの例としては、ヒト唾液試料において結核（ＴＢ）を同定するバイオセンサーが挙げられる。世界的に、感染症ＴＢは死亡の主な原因であり、ＡＩＤＳに次いで第２位である。ＴＢを引き起こす細菌である結核菌は、当該細菌に独特の２種の特定の匂い（メチルニコチン酸塩及びメチル４−アニス酸塩）を生じる。これらの匂いに対するＯＲ感受性を同定し、我々のトランスジェニックプラットフォームに使用してＴＢバイオセンサーを創出することができる。
【００６０】
[0074]密売買検索のための薬物防止バイオセンサーの例としては、コカイン感受性バイオセンサーが挙げられる。捜索救助バイオセンサーの例としては、自然災害後に犠牲者を捜し出すのに役立つ警察への補助（例えば、死体捜索イヌ）をもたらすバイオセンサーが挙げられる。家畜における病原体検出のためのバイオセンサー例としては、ウシウイルスに感染した動物を同定するバイオセンサーが挙げられる。
【００６１】
[0075]材料及び方法
[0076]対象：この試験に使用したマウスは、ニューヨーク市立大学ハンターカレッジの実験動物施設において繁殖及び維持された。ハンターカレッジＩＡＣＵＣにより全ての手順が承認された。動物飼育及び手順は、「実験動物の管理と使用に関する指針」（ＮＨＨＳ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．（ＮＩＨ）８５−２３）に従った。
【００６２】
[0077]遺伝子型決定
[0078]４×２１−Ｍ７１−ＩＲＥＳ−ｔａｕＣｈｅｒｒｙ導入遺伝子の存在を、以下のプライマー：ＦＷＤ：５’CCCTGGACAACATCACAC３’（配列番号３）及びＲＥＶ：５’CCCTCCATGTGCACCTTGAAGCGCA３’（配列番号４）を用いたＰＣＲにより、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子についてのスコアリングによって評価した。ヘミ接合性４・Ｍ７１Ｃα動物とホモ接合性４・Ｍ７１Ｃα動物を区別するために、本発明者らはｑＰＣＲ法を使用した。Ｍ７１−ＩＲＥＳ−ｔａｕＧＦＰ遺伝子がターゲティングされた対立遺伝子の存在を、ＧＦＰを検出するためのプライマー：ＦＷＤ：５’CCCTGGACAACATCACAC３’（配列番号３）及びＲＥＶ：５’CGTTTACGTCGCCGTCCAGCTC３’（配列番号５）、並びに野生型  Ｍ７１対立遺伝子を検出するためのプライマー：ＦＷＤ：５’CCGCACTGGACAAAACACTGAGGAG３’（配列番号６）及びＲＥＶ：５’CTGTTTCCTGTTCAGAGTTGGGTG３’（配列番号７）を使用することによって決定し、それにより、野生型、ヘミ、及びホモ動物を区別することを可能にした。
【００６３】
[0079]嗅覚検査：匂い（シグマアルドリッチから購入）は、カスタムシールドオペレーティングテフロンソレノイド（Ｎｅｐｔｕｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を有するＡｒｄｕｉｎｏボードによって制御され、きれいな空気（Ｎ２、最大流量２Ｌｐｍ）及び匂い付けした空気（最大流量３００ＳＣＣＭ）を希釈するための２つのＭａｓｓ  Ｆｌｏｗ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（Ａｌｉｃａｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ）に接続された、特注の嗅覚計を使用して送達した。酸化を回避するための蒸気担体として窒素（Ｎ２）を使用した。匂い濃度は、２５℃において公表された蒸気圧を使用して算出される（ＵＳ  ＥＰＡ、Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｕｉｔｅ、ｖ４．０）飽和蒸気の％希釈度及び飽和蒸気モル濃度（μＭ  ｓ．ｖ．）として表される。９９％純粋な匂い分子を含有する、白色ポリプロピレンの閉鎖物及び隔壁を有する予めきれいにしたアンバーバイアル（Ｊ．Ｇ．Ｆｉｎｎｅｒａｎ）の飽和ヘッドスペースから取り出された種々の希釈度の匂い分子で匂い付けした空気と送達部位の前で混合した、流動希釈された匂いを２Ｌｐｍで送達した。嗅覚計の汚染を回避するために、匂い付けした空気はテフロン弁を通過させなかった。その代わりに、匂いは、Ｔ字形混合チャンバー（Ｎｅｐｔｕｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）中でＮ２と混合し、ａｒｄｕｉｎｏにより制御された真空系を使用して動物の鼻に送達した。異なる匂いを担持する匂い付けした流れ同士は接触させなかった。嗅覚計の出力を、トレーサーの匂いであるピネン及び光イオン化検出器（ＰＩＤ；Ａｕｒｏｒａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して較正した。
【００６４】
[0080]ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＳｐＨイメージング：マウスを、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、イソフルラン（Ｏ２中２．５％）を用いて維持し、定位頭部固定装置（ナリシゲ）を使用して固定化した。ＳｐＨ及びｍＣｈｅｒｒｙについての光学シグナルを、４倍対物レンズ（開口数０．４）を有するニコンＡＺ１００落射蛍光顕微鏡（ＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ）に接続したＡＮＤＯＲ  Ｎｅｏ  ５．５  ｓＣＭＯＳカメラを使用して記録した。ＳｐＨについては４７５ｎｍ、ｍＣｈｅｒｒｙについては５７５ｎｍの励起波長、及びＳｐＨについては５２０ｎｍ、ｍＣｈｅｒｒｙについては６３５ｎｍの放出波長を使用して、自由に呼吸している動物の嗅球を覆う細長い頭蓋骨を通って嗅球背外側の画像を得た。各イメージング試験は、匂い前取得（３秒）、匂い時取得（４秒）、及び匂い後取得（４秒）から成り、試験当たりの総取得時間は１４秒であった（弁切り換え遅延の３秒を含む）。段階的コードを使用して、嗅覚計を制御するａｒｄｕｉｎｏをＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアに組み込み、したがって、一連の画像取得全体及び流動希釈された匂い送達を顕微鏡ソフトウェアによって制御する。
【００６５】
[0081]画像加工：画像応答統計値の算出を、Ｍａｔｌａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ）で書かれたカスタムコードを使用して実施した。画像フレームを顕微鏡ＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ＡＲ  Ｓｏｆｔｗａｒｅから出力し、Ｍａｔｌａｂに入力した。フレームを空間的に帯域フィルタにかけた（Ｇａｕｓｓｉａｎ  ｋｅｒｎｅｌ；ｆｓｐｅｃｉａｌ；ｈｉｇｈ  ｐａｓｓ  ｓｉｇｍａ＝５００μｍ；ｌｏｗ  ｐａｓｓ  ｓｉｇｍａ＝１０μｍ）。画像フレームを、匂い発生の前に収集されたフレームの平均（静止Ｆ）で分割して、画像にわたる配光を補正した。糸球体活性地図（ｄＦ／Ｆ）を作成するために、分割した匂い前フレームを分割した匂い後フレームから引いた。関心領域（ＲＯＩ；半径５０μｍの円）を匂い後フレームの手動検査で選択した。各ＲＯＩ内の活性時間経過を、各フレームについてＲＯＩ内に入る全ての画素を平均することによって作成した。得られたトレースをさらなる解析のためにエクセルに出力した。
【００６６】
[0082]嗅覚行動試験：２瓶識別試験を先に記載の通に実施した。マウスを、飲料水中の漸減濃度の単一の匂いを検出する能力について試験するので、この識別アッセイも検出閾値試験とみなされる。８週齢のマウスを個別に収容し、アッセイ開始前２日間、食物は自由に与えたが、サッカリン−フタル酸溶液（２．１×１０−２Ｍのサッカリンナトリウム及び１０−３Ｍのフタル酸、ｐＨ６．５）について１日２回、１時間に制限した。これにより、マウスが条件付けの間に溶液を飲み始めることが確実になる。３日目（条件付け日）に、マウスを、匂い付けした１０−４希釈の水を伴うサッカリンナトリウムフタル酸（ＳＳＰＡ）溶液に１０分にわたって曝露する。直後に、マウスに塩化リチウム（０．６Ｍの溶液を体重１ｇ当たり１５μｌ）を腹腔内注射して嫌悪倦怠感及び嗜眠状態を誘導する。２時間後、マウスを収容ケージに戻し、飲料水の２つの瓶を利用できるようにする；マウスに、匂いの１０−４希釈物を含有するＳＳＰＡ溶液か匂い付けしていないＳＳＰＡ溶液かの選択肢を与える。次の３日間、２４時間ごとに瓶の位置を逆転させ、また、匂い付けした溶液の濃度を、それぞれ１０−６、１０−７、及び０．５×１０−６に低下させる。毎日、両方の瓶を秤量して消費された液体の量を決定する。各匂い濃度での２４時間の試験期間ごとに各マウスについて、嗜好指数を、消費された匂い付けした溶液の量を消費された水溶液の総量で割ったものとして算出した。スチューデントのｔ検定を実施して、統計的有意性を検定し、両側分布及び２標本不等分散を仮定した。値は、平均±ＳＥＭであり、対数尺度でプロットされている。ＬｉＣｌ注射後に条件付けされなかったと思われる（つまり、２４ｄＭＡＣＰについてのＰＩが１０−４において２０％超である）動物（野生型及びホモ）は我々の分析から排除した（すなわち、野生型４匹及びホモ２匹）。
【００６７】
[0083]ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡの合成：４・Ｍ７１Ｃαヘミ動物を屠殺し、嗅上皮組織を氷とドライアイスの混合物上で解剖した。液体Ｎ２中で組織をスナップ凍結させ、−８０℃で保存した。ＲＮＡを、ＲＮＥＡＳＹ（登録商標）Ｍｉｎｉカラム（キアゲン、カタログ番号７４１０４）を製造者のプロトコールに従って使用して、ＤＮａｓｅ消化を伴って単離した。組織を、β−メルカプトエタノール１０μＬを含有する、キットにより提供された溶解緩衝液中で、乳鉢及び乳棒でホモジナイズした。単離されたＲＮＡ試料中の濃度を、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計を使用して測定した。２６０／２８０比が１．８〜２．１のＲＮＡ試料のみを、さらなる処理の考慮に入れた。ＲＮＡ抽出後、追加的なＤＮａｓｅ消化を、ＴＵＲＢＯ  ＤＮＡ−ＦＲＥＥ（商標）ＤＮａｓｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｒｅｍｏｖａｌ（ライフテクノロジーズ、カタログ番号ＡＭ１９０７）キットを用いて実施し、全てのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を試料から除去した。第１鎖ｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ用ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ  ファーストストランド合成システム（ライフテクノロジーズ、カタログ番号１８０８０−０５１）を使用して合成した。第１鎖ｃＤＮＡを１：５に希釈して、総体積を１００μｌにした。生成したｃＤＮＡのゲノム汚染を、エクソン内でＨｉｐｋＩＩ遺伝子の小さなイントロンの上にまたがる２つのプライマー：ＦＷＤ：５’TGTGAGGCAATTGACATGTGG３’（配列番号８）及びＲＥＶ：５’TACGGTGAGTCTGTGTCAC３’（配列番号９）を用いた定期的なＰＣＲで確認した。
【００６８】
[0084]定量的リアルタイムＰＣＲ：ｑＰＣＲを、最新のＭｉｎｉｍｕｍ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ（ＭＩＱＥ）ガイドライン（８）に従い、加水分解プローブセットを使用して実施した。６．５週齢の同腹仔（４・Ｍ７１Ｃαヘミ及び野生型、ｎ＝３）由来の嗅覚上皮組織からＲＮＡを単離した。プライマー／加水分解プローブセットの増幅効率を、２倍のｃＤＮＡ（Ｇａｐｄｈ、Ｐｇｋ１、Ｔｆｒｃ、Ｒｎ１８Ｓ、Ｏｍｐについて）又はプラスミドＤＮＡ（ｍＣｈｅｒｒｙ、ＧＦＰについて）希釈系列を使用した検量線の作成に基づいて算出した。ＰＣＲ効率を、検量線の傾きを使用して次式：ＰＣＲ  Ｅ＝１０−１／傾き−１に従って算出した。直線ダイナミックレンジは４つの希釈度であり、Ｔａｑｍａｎ  ＩＤ、検量線の傾き、ＰＣＲ効率、ｒ２値、及び全てのアンプリコン分析についての直線ダイナミックレンジが、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １６、１１１５−１１２５（２０１６）に要約されている。ｑＰＣＲ反応混合物（１０μｌ）は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現マスターミックス（アプライドバイオシステムズ）５μｌ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（アプライドバイオシステムズ）及びプライマーミックス０．５μｌ、脱イオン水２．５μｌ、及びｃＤＮＡ２μｌを含有するものであった。ｑＰＣＲ反応を、１２．５μｌのＩｍｐａｃｔ  ３８４  Ｔｉｐｓを有するＭａｔｒｉｘ電動マルチチャンネルピペット（サーモサイエンティフィック、米国ニューハンプシャー州ハドソン、カタログ番号７４２１）を使用して手動で設定し、ＴｈｅｒｍａＳｅａｌ光学カバー（Ｅｘｃｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州ビクタービル、カタログ番号ＴＳＳ−ＲＴＱ−１００））で覆った白色３８４ウェルプレート（Ｅ＆Ｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州サンタクララ、カタログ番号４８６３８４）にて反応を行った。ロシュ  ライトサイクラー４８０にて以下のサイクル条件を使用して反応を行った：９５℃で１０秒の最初の変性ステップ、その後、９５℃で１０秒、６０℃で３０秒、及び７２℃で１分の増幅ステップを４５サイクル、並びに４０℃で１０秒の最終的な冷却ステップ。鋳型なしの対照（ＮＴＣ）についてのＣｑ値は全ての加水分解プローブセットについて＞３０であった。各加水分解プローブセットについて、ｑＰＣＲレベルを、変動係数（ＣＶ）によって示される通り野生型動物と４・Ｍ７１Ｃαヘミ動物との間で安定に発現した４種の異なる参照遺伝子、Ｇａｐｄｈ、Ｐｇｋ１、Ｔｆｒｃ、及びＲｎ１８Ｓ（（９）に基づいて選択した）に対して正規化した。ＣＶは、標準偏差の平均に対する比と定義され、平均が互いに極端に異なるとしても、１つのデータシリーズから別のデータシリーズの変動の程度を比較するための有用な統計値である。ＣＶが２５％未満の参照遺伝子を、野生型と４・Ｍ７１Ｃαヘミとの間で安定に発現したとみなした。ＣＶは以下の通りであった：Ｇａｐｄｈ：２３．９５％；Ｐｇｋ１：２１．６５％；Ｔｆｒｃ：１８．５２％；及びＲｎ１８Ｓ：２４．６１％。比較Ｃｔ法又は２−ｄ��Ｃｔ法を使用して、各試料について遺伝子ごとの正規化された相対的な定量（ＮＲＱ）値、及びＲＮＡ発現レベルの倍率差異を算出した。
【００６９】
[0085]僧帽細胞標識：雄ＹＦＰ−ｇマウス（０１４１３０系、ジャクソン研究所）を雌ヘミ接合性４・Ｍ７１Ｃα（Ｍ７１Ｇ  −／−）マウスと交配して、複合突然変異マウスを生成した。ＹＦＰとｍＣｈｅｒｒｙの両方について陽性であった雄の子孫を８〜１２週齢時に安楽死させ、嗅球組織を組織学的イメージングのために処理した。画像をＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡（カール・ツァイス）で、対物レンズ、Ｆｌｕａｒ、１０倍Ｎ．Ａ．０．５、及びＰｌａｎＮｅｏｆｌｕａｒ  ４０倍、Ｎ．Ａ．１．３を使用して収集した。
【００７０】
[0086]免疫組織化学的検査：雄ヘミ接合性４・Ｍ７１Ｃα（Ｍ７１Ｇ  −／−）、８〜１２週齢に、１×ＰＢＳ、その後、４％ＰＦＡを経心的に灌流した。嗅球を解剖し、ゼラチンに包埋し、凍結保護のために２％ＰＦＡ＋５０％スクロース中で終夜、後固定した。嗅球を、５０μｍの冠状にクリオスタットで切片作製し、免疫蛍光染色のために処理した。１次抗体：ＴＨ（１：２５００、Ｎｏｖｕｓ）、５Ｔ４（１：２５０、Ｒ＆Ｄシステムズ）、カルレチニン（１：２５００、ミリポア）、カルビンジン（１：２０００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、及びＣＣＫ（１：１０００、シグマ）、４℃で２日間。全ての切片を、その後、Ｃｙ５を含有する２次抗体（１：６００、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と室温で４時間インキュベートした。ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡（カール・ツァイス）で、対物レンズ、Ｆｌｕａｒ、１０倍Ｎ．Ａ．０．５、及びＰｌａｎＮｅｏｆｌｕａｒ  ４０倍、Ｎ．Ａ．１．３を使用して画像を収集した。
【００７１】
[0087]本明細書では、最良の形態を含め、本発明を開示するため、並びに、あらゆる当業者が、任意のデバイス又はシステムの作成及び使用を含め、本発明を実施すること、及び任意の組み入れられた方法を実施することが可能になるように、例を使用している。本発明の特許を受けられる範囲は、特許請求の範囲によって定義され、当業者に想起される他の例も含み得る。そのような他の例は、特許請求の範囲の文字通りの用語と異ならない構造要素を有する場合、又は、特許請求の範囲の文字通りの用語からの差異が微弱な等価の構造要素を含む場合、特許請求の範囲の範囲内であるものとする。
【図１】
2018530997.tif 000004
【図２Ａ】
2018530997.tif 000005
【図２Ｂ】
2018530997.tif 000006
【図２Ｃ】
2018530997.tif 000007
【図３Ａ】
2018530997.tif 000008
【図３Ｂ】
2018530997.tif 000009
【図３Ｃ】
2018530997.tif 000010
【配列表】
2018530997000001.app
【国際調査報告】
2018530997.tif 000011
2018530997.tif 000012