(57)【要約】核酸配列を細胞母集団からの反応生成物に取り込む方法を含めた、細胞ベース分析方法であって、核酸配列を各細胞の反応生成物に個別に、又は少数の細胞群に個別に取り込む方法について記載する。さらに、少なくとも２種類の試薬を別個に各細胞又は各細胞群に送給するのを可能にするマトリクス型マイクロ流体装置、並びにこの方法及び装置に有用なプライマーの組合せについて記載する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
母集団からの細胞を少なくとも２つの異なる試薬に曝す方法であって、各細胞が、個別に、又は２つ若しくはそれ以上の細胞群毎にこれら試薬に曝す、該方法において、
(a)   母集団からの細胞をマイクロ流体装置における複数個の捕獲部位に分配し、複数個の捕獲部位それぞれが１つ又はそれ以上の細胞を有するようにするステップと、
(b)   １つ又はそれ以上の第１試薬を各捕獲部位に供給するステップと、
(c)   前記第１試薬とは異なり及び／又は前記第１試薬とは別個に供給する、１つ又はそれ以上の第２試薬を各捕獲部位に供給するステップと、
(d)   前記反応生成物が捕獲部位情報の項目をコード化する反応を行わせるステップと、
(e)   前記反応生成物を回収するステップと、並びに
(f)   前記反応生成物を解析するステップであって、このような解析が、特定捕獲部位における単一細胞又は細胞群に由来するものとして特定反応生成物の同定を可能にするステップと、
を備える、方法。
【請求項２】
核酸配列を細胞母集団からの反応生成物内に取り込む方法であって、核酸配列が、各細胞の反応生成物に個別に、又は１０００にも達するまでの細胞群毎の反応生成物内に取り込まれる、該方法において、
(a)   母集団からの細胞をマイクロ流体装置における複数個の捕獲部位に分配し、複数個の捕獲部位それぞれが１つ又はそれ以上の細胞を有するようにするステップと、
(b)   １つ又はそれ以上の第１試薬を各捕獲部位に供給するステップと、
(c)   前記第１試薬とは異なり及び／又は前記第１試薬とは別個に供給する、１つ又はそれ以上の第２試薬を各捕獲部位に供給するステップと、
(d)   核酸配列が各細胞又は細胞群の反応生成物内に個別に取り込まれる反応を行わせるステップと、
(e)   前記反応生成物を回収するステップと、並びに
(f)   前記反応生成物を解析するステップであって、このような解析が、特定捕獲部位における単一細胞又は細胞群に由来するものとして特定反応生成物の同定を可能にするステップと、
を備える、方法。
【請求項３】
核酸配列を細胞母集団の核酸内に取り込む方法であって、核酸配列が、各細胞の核酸に個別に、又は１０００にも達するまでの細胞群毎の核酸内に取り込まれる、該方法において、
(a)   母集団からの細胞をマイクロ流体装置における複数個の捕獲部位に分配し、複数個の捕獲部位それぞれが１つ又はそれ以上の細胞を有するようにするステップと、
(b)   １つ又はそれ以上の第１試薬を各捕獲部位に供給するステップと、
(c)   前記第１試薬とは異なり及び／又は前記第１試薬とは別個に供給する、１つ又はそれ以上の第２試薬を各捕獲部位に供給するステップと、
(d)   核酸配列が各細胞又は細胞群の核酸内に個別に取り込まれる反応を行わせて、反応生成物を産生するステップと、
(e)   前記反応生成物を回収するステップと、並びに
(f)   前記反応生成物を解析するステップであって、このような解析が、特定捕獲部位における単一細胞又は細胞群に由来するものとして特定反応生成物の同定を可能にするステップと、
を備える、方法。
【請求項４】
請求項１〜３のうちいずれか一項記載の方法において、前記分配は、複数個の捕獲部位それぞれが多くて単一の細胞しか有しないよう行う、方法。
【請求項５】
請求項１〜４のうちいずれか一項記載の方法において、前記反応は、ヌクレオチドのバーコードを前記反応生成物内に取り込むものである、方法。
【請求項６】
請求項５記載の方法において、前記バーコードは、捕獲部位情報の項目をコード化するものである、方法。
【請求項７】
請求項１〜６のうちいずれか一項記載の方法において、前記反応は、核酸配列が取り込まれる分子を一意的に同定するような核酸配列（ＵＭＩ）を取り込むものである、方法。
【請求項８】
請求項３記載の方法において、前記反応は、ＲＮＡの逆転写を含む、方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法において、前記第１試薬は、ポリ-ｄＴ配列及び前記ポリ-ｄＴ配列の第１バーコード５′を有する逆転写（ＲＴ）プライマーを含んでいる、方法。
【請求項１０】
請求項９記載の方法において、前記ＲＴプライマーは、さらに第１ＵＭＩを含んでいる、方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法において、前記第１ＵＭＩは、前記ポリ-ｄＴ配列の５′である、方法。
【請求項１２】
請求項９〜１１のうちいずれか一項記載の方法において、前記ＲＴプライマーは、さらに、第１リンカーを含んでいる、方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法において、前記第１リンカーは、前記ＲＴプライマーの５′末端にある、方法。
【請求項１４】
請求項９〜１３のうちいずれか一項記載の方法において、前記ＲＴプライマーは、さらに、ポリ-ｄＴ配列のアンカー配列３′を含んでいる、方法。
【請求項１５】
請求項８〜１４のうちいずれか一項記載の方法において、前記反応は、さらにｃＤＮＡを産生する第２ストランド合成を含む、方法。
【請求項１６】
請求項８〜１５のうちいずれか一項記載の方法において、前記第２試薬は、ポリ-リボＧ配列を有する５′オリゴヌクレオチドを含んでいる、方法。
【請求項１７】
請求項１５記載の方法において、前記５′オリゴヌクレオチドは、前記ポリ-リボＧ配列の第２バーコード５′を含んでいる、方法。
【請求項１８】
請求項１５又は１７記載の方法において、前記５′オリゴヌクレオチドは、さらに第２ＵＭＩを含んでいる、方法。
【請求項１９】
請求項１８記載の方法において、前記第２ＵＭＩはポリ-リボＧ配列の５′である、方法。
【請求項２０】
請求項１５〜１９のうちいずれか一項記載の方法において、前記５′オリゴヌクレオチドは、さらに第２リンカーを含んでいる、方法。
【請求項２１】
請求項２０記載の方法において、前記第２リンカーは、５′オリゴヌクレオチドの５′末端にある、方法。
【請求項２２】
請求項２１記載の方法において、ｃＤＮＡを産生するステップであって、一方のストランドが、リンカー間にバーコードが配置される、５′-第２リンカー-ＲＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１リンカー-３′の構造を有する、該ｃＤＮＡ産生ステップを備える、方法。
【請求項２３】
請求項２２記載の方法において、前記第１バーコードは、前記第１リンカーに隣接して配置される、方法。
【請求項２４】
請求項２３記載の方法において、前記第２バーコードは、前記第２リンカーに隣接して配置される、方法。
【請求項２５】
請求項２３記載の方法において、ｃＤＮＡの前記一方のストランドは、３′-第２リンカー-ＲＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１バーコード-第１リンカー-５′の構造を有する、方法。
【請求項２６】
請求項２５記載の方法において、ｃＤＮＡの前記一方のストランドは、３′-第２リンカー-第２バーコード-ＲＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１バーコード-第１リンカー-５′の構造を有する、方法。
【請求項２７】
請求項２５記載の方法において、ｃＤＮＡの前記一方のストランドは、
３′-第２リンカー-ＲＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１ＵＭＩ-第１バーコード-第１リンカー-５′、及び
３′-第２リンカー-ＲＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１バーコード-第１ＵＭＩ-第１リンカー-５′
よりなるグループから選択される構造を有する、方法。
【請求項２８】
請求項２７記載の方法において、ｃＤＮＡの前記一方のストランドは、
３′-第２リンカー-第２バーコード-第２ＵＭＩ-ポリｄＣ-ＲＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１ＵＭＩ-第１バーコード-第１リンカー-５′；
３′-第２リンカー-第２バーコード-第２ＵＭＩ-ポリｄＣ-ＲＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１バーコード-第１ＵＭＩ-第１リンカー-５′；
３′-第２リンカー-第２ＵＭＩ-第２バーコード-ＲＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１ＵＭＩ-第１バーコード-第１リンカー-５′；又は
３′-第２リンカー-第２ＵＭＩ-第２バーコード-ＲＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１バーコード-第１ＵＭＩ-第１リンカー-５′
よりなるグループから選択される構造を有する、方法。
【請求項２９】
請求項３記載の方法において、前記反応は、ＤＮＡの増幅を含む、方法。
【請求項３０】
請求項２９記載の方法において、前記第１及び／又は第２の試薬は、それぞれ第１及び／又は第２の増幅プライマーを含み、前記第１及び／又は第２の増幅プライマーは、それぞれ第１又は第２のバーコード、すなわち、プライマー配列の５′を有する、方法。
【請求項３１】
請求項３０記載の方法において、前記第１及び／又は第２の増幅プライマーは、さらに、それぞれ第１又は第２のＵＭＩを含んでいる、方法。
【請求項３２】
請求項３１記載の方法において、前記第１及び／又は第２のＵＭＩは、プライマー配列の５′である、方法。
【請求項３３】
請求項３０〜３２のうちいずれか一項記載の方法において、前記第１及び／又は第２の増幅プライマーは、さらに、第１又は第２のリンカーを含んでいる、方法。
【請求項３４】
請求項３３記載の方法において、前記第１又は第２のリンカーは、前記増幅プライマーの５′末端にある、方法。
【請求項３５】
請求項３４記載の方法において、一方のストランドが、リンカー間にバーコードを持つ５′-第２リンカー-細胞ＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１リンカー-３′の構造を有するアンプリコンを産生するステップを備える、方法。
【請求項３６】
請求項３５記載の方法において、一方のストランドは、３′-第２リンカー-細胞ＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１バーコード-第１リンカー-５′の構造を有する、方法。
【請求項３７】
請求項２５記載の方法において、前記一方のストランドは、３′-第２リンカー-第２バーコード-細胞ＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１バーコード-第１リンカー-５′の構造を有する、方法。
【請求項３８】
請求項２５記載の方法において、前記一方のストランドは、
３′-第２リンカー-細胞ＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１ＵＭＩ-第１バーコード-第１リンカー-５′；及び
３′-第２リンカー-細胞ＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１バーコード-第１ＵＭＩ-第１リンカー-５′
よりなるグループから選択される構造を有する、方法。
【請求項３９】
請求項２７記載の方法において、前記一方のストランドは、
３′-第２リンカー-第２バーコード-第２ＵＭＩ-細胞ＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１ＵＭＩ-第１バーコード-第１リンカー-５′；
３′-第２リンカー-第２バーコード-第２ＵＭＩ-細胞ＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１バーコード-第１ＵＭＩ-第１リンカー-５′；
３′-第２リンカー-第２ＵＭＩ-第２バーコード-細胞ＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１ＵＭＩ-第１バーコード-第１リンカー-５′；及び
３′-第２リンカー-第２ＵＭＩ-第２バーコード-細胞ＤＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１バーコード-第１ＵＭＩ-第１リンカー-５′
よりなるグループから選択される構造を有する、方法。
【請求項４０】
請求項１〜３９記載の方法において、前記マイクロ流体装置は、マトリクス型マイクロ流体装置であって、
Ｒ行及びＣ列のマトリクス状に配列された捕獲部位であり、Ｒ及びＣは１より大きい整数であり、細胞を前記捕獲部位に分配した後には互いに流体的に隔絶することができる、該捕獲部位と、
第１試薬を特定の行における捕獲部位に送給するＲ個の入力ラインのセットと、
第２試薬を特定の列における捕獲部位に送給し、第１試薬の送給とは別個に送給するＣ個の入力ラインのセットと、
を備え、反応後には、個別の行及び列からの反応生成物のプールとして前記マイクロ流体装置から反応生成物を回収する、該マトリクス型マイクロ流体装置を有する、方法。
【請求項４１】
請求項４０記載の方法において、ＲＴプライマーを一方の入力ラインセット経由で捕獲部位に送給し、また５′オリゴヌクレオチドを他方の入力ラインセット経由で捕獲部位に送給する、方法。
【請求項４２】
請求項４０記載の方法において、第１増幅プライマーを一方の入力ラインセット経由で捕獲部位に送給し、また第２増幅プライマーを他方の入力ラインセット経由で捕獲部位に送給する、方法。
【請求項４３】
請求項１〜４２のうちいずれか一項記載の方法において、すべての方法ステップはマイクロ流体装置内で実施する、方法。
【請求項４４】
請求項１〜４３のうちいずれか一項記載の方法において、前記反応生成物は、第１及び第２リンカーをアニーリングするリンカープライマーを用いて予増幅され、リンカープライマーは、同一又は互いに異なるものとする、方法。
【請求項４５】
請求項４４記載の方法において、前記予増幅は、前記マイクロ流体装置内で実施する、方法。
【請求項４６】
請求項１〜４５のうちいずれか一項記載の方法において、前記反応生成物は、タグメンテーション反応を受ける、方法。
【請求項４７】
請求項１〜４６のうちいずれか一項記載の方法において、前記反応は、１つ又はそれ以上のＤＮＡシークエンシングプライマー結合部位を前記反応生成物に取り込む、方法。
【請求項４８】
請求項１〜４７のうちいずれか一項記載の方法において、前記反応生成物は、ＤＮＡシークエンシングを受ける、方法。
【請求項４９】
請求項４８記載の方法において、ＤＮＡシークエンシングから得られた配列は、１つ又は２つのバーコードに基づいて、特定捕獲部位に由来するものとして同定する、方法。
【請求項５０】
請求項４０〜４９のうちいずれか一項記載の方法において、送出されたプールは、請求項４４〜４９のステップのうち１つ又はそれ以上のステップを個別に受ける、方法。
【請求項５１】
請求項４０〜４９のうちいずれか一項記載の方法において、送出されたプールは、１つの反応混合物として組み合わされ、前記反応混合物は、請求項４４〜４９のステップのうち１つ又はそれ以上のステップを受ける、方法。
【請求項５２】
請求項４０〜５１のうちいずれか一項記載の方法において、前記マイクロ流体装置は、細胞を、及び／又は可視化標識を採用するとき細胞若しくは反応生成物に関連する信号を可視化できるよう、少なくとも一方の表面が十分透明なものとする、方法。
【請求項５３】
請求項５２記載の方法において、さらに、反応が行われる前に細胞が占有する捕獲部位を撮像するステップを備える、方法。
【請求項５４】
請求項１〜５３のうちいずれか一項記載の方法において、前記反応は、全トランスクリプトーム増幅（WTA）、全ゲノム増幅（WGA）、タンパク質近傍ライゲーション、ミクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）予増幅、ＲＮＡ又はＤＮＡの標的特異性増幅、を含む、方法。
【請求項５５】
請求項１〜５４のうちいずれか一項記載の方法において、前記マイクロ流体装置は、少なくとも７５０個の捕獲部位を有する、方法。
【請求項５６】
マトリクス型マイクロ流体装置であって、
Ｒ行及びＣ列のマトリクス状に配列された複数個の捕獲部位であって、Ｒ及びＣは１より大きい整数であり、各捕獲部位は、１個又はそれ以上の細胞を捕獲する捕獲形体を有し、細胞を前記捕獲部位に分配した後には互いに流体的に隔絶され得る、該捕獲部位と、
第１試薬を特定の行における捕獲部位に送給するよう構成されたＲ個の入力ラインのセットと、及び
第２試薬を特定の列における捕獲部位に送給するよう構成され、第１試薬の送給とは別個に送給するＣ個の入力ラインのセットと、
を備える、装置。
【請求項５７】
請求項５６記載の装置において、前記捕獲形体は、多くても単一の細胞を捕獲するよう構成されている、装置。
【請求項５８】
請求項５６又は５７記載の装置において、マイクロ流体装置は、細胞を、及び／又は可視化標識を採用するとき細胞又は反応生成物に関連する信号を可視化できるよう、少なくとも一方の表面が十分透明である、装置。
【請求項５９】
請求項５６〜５８のうちいずれか一項記載の装置において、各捕獲部位は、互いに流体的に隔絶することができる４個のチャンバを有し、これらチャンバのうち１つのチャンバは前記捕獲形体を有する、装置。
【請求項６０】
請求項５６〜５９のうちいずれか一項記載のマイクロ流体装置を動作させる方法において、
(a)   細胞母集団からの細胞を前記捕獲部位に分配して、複数個の捕獲部位が１つ又はそれ以上の細胞を有するようにするステップと、
(b)   分配後、前記捕獲部位を互いに流体的に隔絶するステップと、
(c)   １つ又はそれ以上の第１試薬を前記Ｒ個の第１入力ライン経由で流体的に隔絶された各捕獲部位に供給するステップと、
(d)    １つ又はそれ以上の第２試薬を前記Ｃ個の第２入力ライン経由で流体的に隔絶された各捕獲部位に供給し、前記第２試薬は前記第１試薬とは異なるものであるステップと、
(e)   反応を行わせるステップと、
を備える、方法。
【請求項６１】
請求項６０記載の方法において、複数個の捕獲部位は、多くとも単一の細胞を有する、方法。
【請求項６２】
請求項６０又は６１記載の方法において、さらに、各行からの反応生成物プールとして、又は各列からの反応生成物プールとして前記反応生成物を回収するステップを備える、方法。
【請求項６３】
請求項６０〜６２のうちいずれか一項記載の方法において、前記回収ステップは、前記Ｒ個の第１入力ライン又は前記Ｃ個の第２入力ラインに回収試薬を供給するステップを含む、方法。
【請求項６４】
ＲＮＡからｃＤＮＡを産生するのに使用するプライマー組合せにおいて、
(a)    アンカー配列、アンカー配列のポリ-ｄＴ配列５′、ポリ-ｄＴ配列の第１バーコード５′、及び第１バーコード配列の第１リンカー５′を含む逆転写（ＲＴ）プライマー、並びに
(b)    ポリ-リボＧ配列、ポリ-リボＧ配列の第２バーコード５′、及び第２バーコードの第２リンカー５′を含む５′オリゴヌクレオチド
を備える、プライマー組合せ。
【請求項６５】
請求項６４記載のプライマー組合せにおいて、前記プライマーのうち一方又は双方はＵＭＩを含む、プライマー組合せ。
【請求項６６】
ＤＮＡを増幅するのに使用するためのプライマー組合せであって、適切なテンプレートＤＮＡの存在の下にアンプリコン産生を促すことができる第１及び第２の増幅プライマーを含み、各増幅プライマーは、
プライマー配列、
プライマー配列の５′であるバーコードであって、各プライマーのバーコードが互いに異なる、該バーコード、及び
バーコードの５′であるリンカー
を含み、
一方又は双方のプライマーは、さらに、プライマー配列の５′及びリンカーの３′であるＵＭＩを含む、プライマー組合せ。
【請求項６７】
請求項６４〜６６のうちいずれか一項記載のプライマー組合せにおいて、さらに、リンカーをアニーリングする１つ又はそれ以上のリンカープライマーを含む、プライマー組合せ。
【請求項６８】
請求項６４〜６７のうちいずれか一項記載のプライマー組合せにおいて、５′リンカープライマー及びこれと異なる３′リンカープライマーを含む、プライマー組合せ。
【請求項６９】
請求項６８記載のプライマー組合せにおいて、３′リンカープライマー若しくはその相補体のための部分特異性を有するプライマー、及び／又は５′リンカープライマー若しくはその相補体のための部分特異性を有するプライマーを含み、前記プライマーは、さらに、ブリッジシークエンシングにおけるクラスター生成に有用なフローセル配列を含む、プライマー組合せ。
【請求項７０】
ＲＮＡからｃＤＮＡを産生する方法において、請求項６４又は６５のプライマー組合せを第１ストランド合成に採用する、方法。
【請求項７１】
ＤＮＡを増幅する方法において、アンプリコンを産生するための請求項６６記載のプライマー組合せにテンプレートＤＮＡを接触させるステップを備える、方法。
【請求項７２】
ｃＤＮＡ又は請求項７０若しくは７１のアンプリコンをそれぞれ予増幅する方法において、前記ｃＤＮＡ又はアンプリコンを請求項６７及び６８のリンカープライマーで予増幅するステップを備える、方法。
【請求項７３】
ｃＤＮＡ又は請求項７０〜７２のうちいずれか一項記載の方法で産生されるアンプリコンのブリッジシークエンシングにおけるクラスターを生成する方法において、請求項６９のプライマーを用いて、クラスターを生成するステップを備える、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載の本発明は、概して、単一細胞又は少数の細胞群における解析の分野に関する。とくに、本発明は、独立的に添加される少なくとも２つの試薬で個別の反応を行い、細胞又は細胞群（又はそれらの成分）を多重化し、随意的に、これに続く他の解析を行うための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
１つの研究において、相当多くの単一細胞における転写を定量化することに生命科学の関心がある。現在では、フリューダイム社（Fluidigm Corporation）が、Ｃ１ＴＭシステム「集積流体回路（integrated fluidic circuit）」(ＩＦＣＴＭ)のマイクロ流体装置により１回につき９６個の単一細胞から転写することの研究を可能にする。
【０００３】
ｍＲＮＡ転写産物レベルの解析用に（一般的であるが、ｍＲＮＡシークエンシングに限定されない）単一細胞からｃＤＮＡを調製するのに使用される市販のソースから現在利用可能な化学構造は、各単一細胞用のアドレス指定可能な出口ウェルが存在しない限り、フリューダイムＩＦＣＴＭに使用することができない。各細胞からのｃＤＮＡをプールとして互いに組み合わせるとき、市販のキットを使用して単一細胞からの転写産物を同定する容易な方法はなく、各個別の単一細胞ｃＤＮＡサンプルを出力するのに十分なウェルが存在しないので、第２世代キャリヤで９６個より多い数の単一細胞用に開発されたフリューダイムＩＦＣＴＭが必要である。
【０００４】
ｃＤＮＡをシークエンシング（配列決定）する場合、例えば、ブリッジシークエンシング（クラスター生成）及びイルミナ（Illumina）社（カリフォルニア州サンディエゴ）により商品化されたシークエンシング方法を用いてシークエンシングする場合、９６細胞ＩＦＣＴＭからの細胞のｃＤＮＡに対して、シークエンシング中にフローセルクラスター化及びサンプル同定のための制御された断片化を可能にする、個別の市販のタグメンテーション反応剤を必要とするという他の問題がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、都合のよい単一細胞トランスクリプトーム増幅及び各細胞から特異性転写産物の同定を容易にし、またその上に様々な他の用途を持つ、ＩＦＣにおける高処理能力捕獲アーキテクチャ並びに随伴化学構造を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
様々な態様において、本明細書で考慮する本発明としては、必ずしも限定しないが以下の実施形態のうち任意な１つ又はそれ以上がある。
【０００７】
実施形態１：
母集団からの細胞を少なくとも２つの異なる試薬に曝す方法であって、各細胞が、個別に、又は２つ若しくはそれ以上の細胞群毎にこれら試薬に曝す、該方法において、
(a)   母集団からの細胞をマイクロ流体装置における複数個の捕獲部位に分配し、複数個の捕獲部位それぞれが１つ又はそれ以上の細胞を有するようにするステップと、
(b)   １つ又はそれ以上の第１試薬を各捕獲部位に供給するステップと、
(c)   前記第１試薬とは異なり及び／又は前記第１試薬とは別個に供給する、１つ又はそれ以上の第２試薬を各捕獲部位に供給するステップと、
(d)   前記反応生成物が捕獲部位情報の項目をコード化する反応を行わせるステップと、
(e)   前記反応生成物を回収するステップと、並びに
(f)   前記反応生成物を解析するステップであって、このような解析が、特定捕獲部位における単一細胞又は細胞群に由来するものとして特定反応生成物の同定を可能にするステップと、
を備える、方法。
【０００８】
実施形態２：
核酸配列を細胞母集団からの反応生成物内に取り込む方法であって、核酸配列が、各細胞の反応生成物に個別に、又は１０００にも達するまでの細胞群毎の反応生成物内に取り込まれる、該方法において、
(a)   母集団からの細胞をマイクロ流体装置における複数個の捕獲部位に分配し、複数個の捕獲部位それぞれが１つ又はそれ以上の細胞を有するようにするステップと、
(b)   １つ又はそれ以上の第１試薬を各捕獲部位に供給するステップと、
(c)   前記第１試薬とは異なり及び／又は前記第１試薬とは別個に供給する、１つ又はそれ以上の第２試薬を各捕獲部位に供給するステップと、
(d)   核酸配列が各細胞又は細胞群の反応生成物内に個別に取り込まれる反応を行わせるステップと、
(e)   前記反応生成物を回収するステップと、並びに
(f)   前記反応生成物を解析するステップであって、このような解析が、特定捕獲部位における単一細胞又は細胞群に由来するものとして特定反応生成物の同定を可能にするステップと、
を備える、方法。
【０００９】
実施形態３：
核酸配列を細胞母集団の核酸内に取り込む方法であって、核酸配列が、各細胞の核酸に個別に、又は１０００にも達するまでの細胞群毎の核酸内に取り込まれる、該方法において、
(a)   母集団からの細胞をマイクロ流体装置における複数個の捕獲部位に分配し、複数個の捕獲部位それぞれが１つ又はそれ以上の細胞を有するようにするステップと、
(b)   １つ又はそれ以上の第１試薬を各捕獲部位に供給するステップと、
(c)   前記第１試薬とは異なり及び／又は前記第１試薬とは別個に供給する、１つ又はそれ以上の第２試薬を各捕獲部位に供給するステップと、
(d)   核酸配列が各細胞又は細胞群の核酸内に個別に取り込まれる反応を行わせて、反応生成物を産生するステップと、
(e)   前記反応生成物を回収するステップと、並びに
(f)   前記反応生成物を解析するステップであって、このような解析が、特定捕獲部位における単一細胞又は細胞群に由来するものとして特定反応生成物の同定を可能にするステップと、
を備える、方法。
【００１０】
実施形態４：
上述の実施形態１〜３のうちいずれか１つに記載の方法において、前記分配は、複数個の捕獲部位それぞれが多くて単一の細胞しか有しないよう行う、方法。
【００１１】
実施形態５：
上述の実施形態１〜４のうちいずれか１つに記載の方法において、前記反応は、ヌクレオチドのバーコードを前記反応生成物内に取り込むものである、方法。
【００１２】
実施形態６：
上述の実施形態５に記載の方法において、前記バーコードは、捕獲部位情報の項目をコード化するものである、方法。
【００１３】
実施形態７：
上述の実施形態１〜６のうちいずれか１つに記載の方法において、前記反応は、核酸配列が取り込まれる分子を一意的に同定するような核酸配列を取り込むものである、方法。
【００１４】
実施形態８：
実施形態３記載の方法において、前記反応は、ＲＮＡの逆転写を含む方法。
【００１５】
実施形態９：
実施形態８記載の方法において、前記第１試薬は、ポリ-ｄＴ配列及び前記ポリ-ｄＴ配列の第１バーコード５′を有する逆転写（ＲＴ）プライマーを含んでいる、方法。
【００１６】
実施形態１０：
実施形態９記載の方法において、前記ＲＴプライマーは、さらに第１ＵＭＩを含んでいる、方法。
【００１７】
実施形態１１：
実施形態１０記載の方法において、前記第１ＵＭＩは、前記ポリ-ｄＴ配列の５′である、方法。
【００１８】
実施形態１２：
実施形態９〜１１のうちいずれか１つに記載の方法において、前記ＲＴプライマーは、さらに、第１リンカーを含んでいる、方法。
【００１９】
実施形態１３：
実施形態１２記載の方法において、前記第１リンカーは、前記ＲＴプライマーの５′末端にある、方法。
【００２０】
実施形態１４：
実施形態９〜１３のうちいずれか１つに記載の方法において、前記ＲＴプライマーは、さらに、ポリ-ｄＴ配列のアンカー配列３′を含んでいる、方法。
【００２１】
実施形態１５：
実施形態９〜１４のうちいずれか１つに記載の方法において、前記反応は、さらにｃＤＮＡを産生する第２ストランド合成を含む、方法。
【００２２】
実施形態１６：
実施形態８〜１５のうちいずれか１つに記載の方法において、前記第２試薬は、ポリ-リボＧ配列を有する５′オリゴヌクレオチドを含んでいる、方法。
【００２３】
実施形態１７：
実施形態１５記載の方法において、前記５′オリゴヌクレオチドは、前記ポリ-リボＧ配列の第２バーコード５′を含んでいる、方法。
【００２４】
実施形態１８：
実施形態１５又は１７記載の方法において、前記５′オリゴヌクレオチドは、さらに第２ＵＭＩを含んでいる、方法。
【００２５】
実施形態１９：
実施形態１８記載の方法において、前記第２ＵＭＩはポリ-リボＧ配列の５′である、方法。
【００２６】
実施形態２０：
実施形態１５〜１９のうちいずれか１つに記載の方法において、前記５′オリゴヌクレオチドは、さらに第２リンカーを含んでいる、方法。
【００２７】
実施形態２１：
実施形態２０記載の方法において、前記第２リンカーは、５′オリゴヌクレオチドの５′末端にある、方法。
【００２８】
実施形態２２：
実施形態２１記載の方法において、ｃＤＮＡを産生するステップであって、一方のストランドが、リンカー間にバーコードが配置される、５′-第２リンカー-ＲＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１リンカー-３′の構造を有する、該ｃＤＮＡ産生ステップを備える、方法。
【００２９】
実施形態２３：
実施形態２２記載の方法において、前記第１バーコードは、前記第１リンカーに隣接して配置される、方法。
【００３０】
実施形態２４：
実施形態２３記載の方法において、前記第２バーコードは、前記第２リンカーに隣接して配置される、方法。
【００３１】
実施形態２５：
実施形態２３記載の方法において、ｃＤＮＡの前記一方のストランドは、３′-第２リンカー-ＲＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１バーコード-第１リンカー-５′の構造を有する、方法。
【００３２】
実施形態２６：
実施形態２５記載の方法において、ｃＤＮＡの前記一方のストランドは、３′-第２リンカー-第２バーコード-ＲＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１バーコード-第１リンカー-５′の構造を有する、方法。
【００３３】
実施形態２７：
実施形態２５記載の方法において、ｃＤＮＡの前記一方のストランドは、
３′-第２リンカー-ＲＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１ＵＭＩ-第１バーコード-第１リンカー-５′、及び
３′-第２リンカー-ＲＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１バーコード-第１ＵＭＩ-第１リンカー-５′
よりなるグループから選択される構造を有する、方法。
【００３４】
実施形態２８：
実施形態２７記載の方法において、ｃＤＮＡの前記一方のストランドは、
３′-第２リンカー-第２バーコード-第２ＵＭＩ-ポリｄＣ-ＲＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１ＵＭＩ-第１バーコード-第１リンカー-５′；
３′-第２リンカー-第２バーコード-第２ＵＭＩ-ポリｄＣ-ＲＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１バーコード-第１ＵＭＩ-第１リンカー-５′；
３′-第２リンカー-第２ＵＭＩ-第２バーコード-ＲＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１ＵＭＩ-第１バーコード-第１リンカー-５′；又は
３′-第２リンカー-第２ＵＭＩ-第２バーコード-ＲＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１バーコード-第１ＵＭＩ-第１リンカー-５′
よりなるグループから選択される構造を有する、方法。
【００３５】
実施形態２９：
実施形態３記載の方法において、前記反応は、ＤＮＡの増幅を含む、方法。
【００３６】
実施形態３０：
実施形態２９記載の方法において、前記第１及び／又は第２の試薬は、それぞれ第１及び／又は第２の増幅プライマーを含み、前記第１及び／又は第２の増幅プライマーは、それぞれ第１又は第２のバーコード、すなわち、プライマー配列の５′を有する、方法。
【００３７】
実施形態３１：
実施形態３０記載の方法において、前記第１及び／又は第２の増幅プライマーは、さらに、それぞれ第１又は第２のＵＭＩを含んでいる、方法。
【００３８】
実施形態３２：
実施形態３１記載の方法において、前記第１及び／又は第２のＵＭＩは、プライマー配列の５′である、方法。
【００３９】
実施形態３３：
実施形態３０〜３２のうちいずれか１つに記載の方法において、前記第１及び／又は第２の増幅プライマーは、さらに、第１又は第２のリンカーを含んでいる、方法。
【００４０】
実施形態３４：
実施形態３３記載の方法において、前記第１又は第２のリンカーは、前記増幅プライマーの５′末端にある、方法。
【００４１】
実施形態３５：
実施形態３４記載の方法において、一方のストランドが、リンカー間にバーコードを持つ５′-第２リンカー-細胞ＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１リンカー-３′の構造を有するアンプリコンを産生するステップを備える、方法。
【００４２】
実施形態３６：
実施形態３５記載の方法において、一方のストランドは、３′-第２リンカー-細胞ＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１バーコード-第１リンカー-５′の構造を有する、方法。
【００４３】
実施形態３７：
実施形態２５記載の方法において、前記一方のストランドは、３′-第２リンカー-第２バーコード-細胞ＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１バーコード-第１リンカー-５′の構造を有する、方法。
【００４４】
実施形態３８：
実施形態２５記載の方法において、前記一方のストランドは、
３′-第２リンカー-細胞ＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１ＵＭＩ-第１バーコード-第１リンカー-５′；及び
３′-第２リンカー-細胞ＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１バーコード-第１ＵＭＩ-第１リンカー-５′
よりなるグループから選択される構造を有する、方法。
【００４５】
実施形態３９：
請求項２７記載の方法において、前記一方のストランドは、
３′-第２リンカー-第２バーコード-第２ＵＭＩ-細胞ＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１ＵＭＩ-第１バーコード-第１リンカー-５′；
３′-第２リンカー-第２バーコード-第２ＵＭＩ-細胞ＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１バーコード-第１ＵＭＩ-第１リンカー-５′；
３′-第２リンカー-第２ＵＭＩ-第２バーコード-細胞ＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１ＵＭＩ-第１バーコード-第１リンカー-５′；及び
３′-第２リンカー-第２ＵＭＩ-第２バーコード-細胞ＤＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１バーコード-第１ＵＭＩ-第１リンカー-５′
よりなるグループから選択される構造を有する、方法。
【００４６】
実施形態４０：
実施形態１〜３９記載の方法において、前記マイクロ流体装置は、マトリクス型マイクロ流体装置であって、
Ｒ行及びＣ列のマトリクス状に配列された捕獲部位であり、Ｒ及びＣは１より大きい整数であり、細胞を前記捕獲部位に分配した後には互いに流体的に隔絶することができる、該捕獲部位と、
第１試薬を特定の行における捕獲部位に送給するＲ個の入力ラインのセットと、
第２試薬を特定の列における捕獲部位に送給し、第１試薬の送給とは別個に送給するＣ個の入力ラインのセットと、
を備え、反応後には、個別の行及び列からの反応生成物のプールとして前記マイクロ流体装置から反応生成物を回収する、該マトリクス型マイクロ流体装置を有する、方法。
【００４７】
実施形態４１：
実施形態４０記載の方法において、ＲＴプライマーを一方の入力ラインセット経由で捕獲部位に送給し、また５′オリゴヌクレオチドを他方の入力ラインセット経由で捕獲部位に送給する、方法。
【００４８】
実施形態４２：
実施形態４０記載の方法において、第１増幅プライマーを一方の入力ラインセット経由で捕獲部位に送給し、また第２増幅プライマーを他方の入力ラインセット経由で捕獲部位に送給する、方法。
【００４９】
実施形態４３：
実施形態１〜４２のうちいずれか１つに記載の方法において、すべての方法ステップはマイクロ流体装置内で実施する、方法。
【００５０】
実施形態４４：
実施形態１〜４３のうちいずれか１つに記載の方法において、前記反応生成物は、第１及び第２リンカーをアニーリングするリンカープライマーを用いて予増幅され、リンカープライマーは、同一又は互いに異なるものとする、方法。
【００５１】
実施形態４５：
実施形態４４記載の方法において、前記予増幅は、前記マイクロ流体装置内で実施する、方法。
【００５２】
実施形態４６：
実施形態１〜４５のうちいずれか１つに記載の方法において、前記反応生成物は、タグメンテーション反応を受ける、方法。
【００５３】
実施形態４７：
実施形態１〜４６のうちいずれか１つに記載の方法において、前記反応は、１つ又はそれ以上のＤＮＡシークエンシングプライマー結合部位を前記反応生成物に取り込む、方法。
【００５４】
実施形態４８：
実施形態１〜４７のうちいずれか１つに記載の方法において、前記反応生成物は、ＤＮＡシークエンシングを受ける、方法。
【００５５】
実施形態４９：
実施形態４８記載の方法において、ＤＮＡシークエンシングから得られた配列は、１つ又は２つのバーコードに基づいて、特定捕獲部位に由来するものとして同定する、方法。
【００５６】
実施形態５０：
実施形態４０〜４９のうちいずれか１つに記載の方法において、送出されたプールは、実施形態４４〜４９のステップのうち１つ又はそれ以上のステップを個別に受ける、方法。
【００５７】
実施形態５１：
実施形態４０〜４９のうちいずれか一項記載の方法において、送出されたプールは、１つの反応混合物として組み合わされ、前記反応混合物は、実施形態４４〜４９のステップのうち１つ又はそれ以上のステップを受ける、方法。
【００５８】
実施形態５２：
実施形態４０〜５１のうちいずれか一項記載の方法において、前記マイクロ流体装置は、細胞を、及び／又は可視化標識を採用するとき細胞若しくは反応生成物に関連する信号を可視化できるよう、少なくとも一方の表面が十分透明なものとする、方法。
【００５９】
実施形態５３：
実施形態５２記載の方法において、さらに、反応が行われる前に細胞が占有する捕獲部位を撮像するステップを備える、方法。
【００６０】
実施形態５４：
実施形態１〜５３のうちいずれか１つに記載の方法において、前記反応は、全トランスクリプトーム増幅（WTA）、全ゲノム増幅（WGA）、タンパク質近傍ライゲーション、ミクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）予増幅、ＲＮＡ又はＤＮＡの標的特異性増幅、を含む、方法。
【００６１】
実施形態５５：
実施形態１〜５４のうちいずれか１つに記載の方法において、前記マイクロ流体装置は、少なくとも７５０個の捕獲部位を有する、方法。
【００６２】
実施形態５６：
マトリクス型マイクロ流体装置であって、
Ｒ行及びＣ列のマトリクス状に配列された複数個の捕獲部位であって、Ｒ及びＣは１より大きい整数であり、各捕獲部位は、１個又はそれ以上の細胞を捕獲する捕獲形体を有し、細胞を前記捕獲部位に分配した後には互いに流体的に隔絶され得る、該捕獲部位と、
第１試薬を特定の行における捕獲部位に送給するよう構成されたＲ個の入力ラインのセットと、及び
第２試薬を特定の列における捕獲部位に送給するよう構成され、第１試薬の送給とは別個に送給するＣ個の入力ラインのセットと、
を備える、装置。
【００６３】
実施形態５７：
実施形態５６記載の装置において、前記捕獲形体は、多くても単一の細胞を捕獲するよう構成されている、装置。
【００６４】
実施形態５８：
実施形態５６又は５７記載の装置において、マイクロ流体装置は、細胞を、及び／又は可視化標識を採用するとき細胞又は反応生成物に関連する信号を可視化できるよう、少なくとも一方の表面が十分透明である、装置。
【００６５】
実施形態５９：
実施形態５６〜５８のうちいずれか１つに記載の装置において、各捕獲部位は、互いに流体的に隔絶することができる４個のチャンバを有し、これらチャンバのうち１つのチャンバは前記捕獲形体を有する、装置。
【００６６】
実施形態６０：
実施形態５６〜５９のうちいずれか１つに記載のマイクロ流体装置を動作させる方法において、
(a)   細胞母集団からの細胞を前記捕獲部位に分配して、複数個の捕獲部位が１つ又はそれ以上の細胞を有するようにするステップと、
(b)   分配後、前記捕獲部位を互いに流体的に隔絶するステップと、
(c)   １つ又はそれ以上の第１試薬を前記Ｒ個の第１入力ライン経由で流体的に隔絶された各捕獲部位に供給するステップと、
(d)    １つ又はそれ以上の第２試薬を前記Ｃ個の第２入力ライン経由で流体的に隔絶された各捕獲部位に供給し、前記第２試薬は前記第１試薬とは異なるものであるステップと、
(e)   反応を行わせるステップと、
を備える、方法。
【００６７】
実施形態６１：
実施形態６０記載の方法において、複数個の捕獲部位は、多くとも単一の細胞を有する、方法。
【００６８】
実施形態６２：
実施形態６０又は６１記載の方法において、さらに、各行からの反応生成物プールとして、又は各列からの反応生成物プールとして前記反応生成物を回収するステップを備える、方法。
【００６９】
実施形態６３：
実施形態６０〜６２のうちいずれか１つに記載の方法において、前記回収ステップは、前記Ｒ個の第１入力ライン又は前記Ｃ個の第２入力ラインに回収試薬を供給するステップを含む、方法。
【００７０】
実施形態６４：
ＲＮＡからｃＤＮＡを産生するのに使用するプライマー組合せにおいて、
(a)    アンカー配列、アンカー配列のポリ-ｄＴ配列５′、ポリ-ｄＴ配列の第１バーコード５′、及び第１バーコード配列の第１リンカー５′を含む逆転写（ＲＴ）プライマー、並びに
(b)    ポリ-リボＧ配列、ポリ-リボＧ配列の第２バーコード５′、及び第２バーコードの第２リンカー５′を含む５′オリゴヌクレオチド
を備える、プライマー組合せ。
【００７１】
実施形態６５：
実施形態６４記載のプライマー組合せにおいて、前記プライマーのうち一方又は双方はＵＭＩを含む、プライマー組合せ。
【００７２】
実施形態６６：
ＤＮＡを増幅するのに使用するためのプライマー組合せであって、適切なテンプレートＤＮＡの存在の下にアンプリコン産生を促すことができる第１及び第２の増幅プライマーを含み、各増幅プライマーは、
プライマー配列、
プライマー配列の５′であるバーコードであって、各プライマーのバーコードが互いに異なる、該バーコード、及び
バーコードの５′であるリンカー
を含み、
一方又は双方のプライマーは、さらに、プライマー配列の５′及びリンカーの３′であるＵＭＩを含む、プライマー組合せ。
【００７３】
実施形態６７：
実施形態６４〜６６のうちいずれか１つに記載のプライマー組合せにおいて、さらに、リンカーをアニーリングする１つ又はそれ以上のリンカープライマーを含む、プライマー組合せ。
【００７４】
実施形態６８：
実施形態６４〜６７のうちいずれか１つに記載のプライマー組合せにおいて、５′リンカープライマー及びこれと異なる３′リンカープライマーを含む、プライマー組合せ。
【００７５】
実施形態６９：
実施形態６８記載のプライマー組合せにおいて、３′リンカープライマー若しくはその相補体のための部分特異性を有するプライマー、及び／又は５′リンカープライマー若しくはその相補体のための部分特異性を有するプライマーを含み、前記プライマーは、さらに、ブリッジシークエンシングにおけるクラスター生成に有用なフローセル配列を含む、プライマー組合せ。
【００７６】
実施形態７０：
ＲＮＡからｃＤＮＡを産生する方法において、実施形態６４又は６５のプライマー組合せを第１ストランド合成に採用する、方法。
【００７７】
実施形態７１：
ＤＮＡを増幅する方法において、アンプリコンを産生するための実施形態６６記載のプライマー組合せにテンプレートＤＮＡを接触させるステップを備える、方法。
【００７８】
実施形態７２：
ｃＤＮＡ又は実施形態７０若しくは７１のアンプリコンをそれぞれ予増幅する方法において、前記ｃＤＮＡ又はアンプリコンを実施形態６７及び６８のリンカープライマーで予増幅するステップを備える、方法。
【００７９】
実施形態７３：
ｃＤＮＡ又は実施形態７０〜７２のうちいずれか１つに記載の方法で産生されるアンプリコンのブリッジシークエンシングにおけるクラスターを生成する方法において、実施形態６９のプライマーを用いて、クラスターを生成するステップを備える、方法。
【００８０】
本発明又は本特許出願ファイルは、少なくとも１つの色付き図面を含む。カラー図面を有する本発明又は本特許出願刊行物のコピーは申請及び必要料金支払いの際に特許庁によって得られる。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１Ａは、例示的マトリクス型マイクロ流体装置を概略的に示す。図１Ｂは、Ｒ個の異なるバーコードをＲの異なる第１入力ラインから捕獲サイトに送給することを示す。図１Ｃは、Ｃ個の異なるバーコードをＣの異なる第１入力ラインから捕獲サイトに送給することを示す。図１Ｄは、反応させた後の反応生成物を各カラムにつきプールして回収できることを示し、この回収は、例えば、回収流体をＣ個の第２入力ラインに供給して、これら第２入力ラインの一方の端部における出口から反応生成物を押し出すことによって行う。
【図２】図１に概略的に示す例示的マトリクス型マイクロ流体装置の写真である。
【図３】マトリクス型マイクロ流体装置における単一細胞を捕獲するのに適した例示的捕獲形体の顕微鏡写真、並びに捕獲した細胞からの反応生成物に行及び列毎にバーコードを付加する方法の例示的フローチャートを示す。
【図４Ａ】徐々により小型にされる一連の例示的な捕獲形体を示し、これら一連の捕獲形体は、マイクロ流体装置あたりより多くの細胞を解析するのを容易にする。
【図４Ｂ】行及び列における捕獲形体の配列、並びに細胞を捕獲形体に分配するためのチャンネルを示す。
【図４Ｃ】小型にされていく捕獲形体の顕微鏡写真を示す。
【図４Ｄ】２種類の異なる捕獲部位設計における細胞占有率データを表し、表の上部パネルは、小型にされていく捕獲形体の結果を示し、表の下部パネルは、上部溝及び下部溝に関して異なる高さ比を持つ例示的な溝捕獲形体の結果を示す。表の第１列は細胞のない捕獲形体の数を表し、第２列は単に１個の細胞がある捕獲形体の数を表す。
【図４Ｅ】２種類の異なる捕獲部位設計を有するＩＦＣの概略図であって、一方は寸法が減少していく部位設計であり、もう一方は上部溝及び下部溝の高さ比が異なる部位設計を示す。
【図５】細胞を捕獲形体に分配するためのチャンネルを含む例示的なダブル溝捕獲形体の概略図である。このジオメトリ（構成配置）によれば、単位面積あたりの捕獲部位をより多くすることができる。
【図６】Ａは例示的なダブル溝捕獲形体における主流路及びバイパスフローにおける流れ抵抗を示し、Ｂはそれを概略図として示し、Ｃ及びＤはそれを顕微鏡写真で示す。
【図７】Ａは例示的なダブル溝捕獲形体におけるバイパス蠕動ポンピング作動を概略図として示し、Ｂはそれを顕微鏡写真で示す。
【図８】図８Ａは、例示的なダブル溝捕獲装置における主フロー出力の閉鎖を概略図として示す。図８Ｂは、例示的なダブル溝捕獲装置における主フロー出力の閉鎖を顕微鏡写真で示す。図８Ｃは、ダブル溝捕獲形体設計に関する細胞占有率データを表し、表の第１列は細胞のない捕獲形体の数を表し、第２列は単に１個の細胞がある捕獲形体の数を表す。
【図９】それぞれが試薬を利用できる４チャンバを有する例示的な単位捕獲部位を示す。捕獲形体は４個のチャンバ各個に配置する。使用にあたり、第１試薬を捕獲部位内に底部から頂部に向けて（紫色矢印）装填することができ、第２試薬を捕獲部位内に左から右に向けて（緑色矢印）装填することができる。
【図１０】単一細胞トランスクリプトーム同定（メッセンジャー[ポリ-Ａ]ＲＮＡに対する）スキーム及び実施例２で説明した転写産物の３′末端計数を示す。
【図１１】図１０の単一細胞トランスクリプトーム同定スキームを実施するのに適した例示的な捕獲部位である。ワークフローを顕微鏡写真の上方に示し、顕微鏡写真には４個のバルブ（ａ〜ｅ）によって分離された４個のチャンバ、並びに捕獲部位（１〜７）を流れる流体フローを示す。
【図１２】図１０と同一の単一細胞トランスクリプトーム同定スキームを、捕獲部位の４チャンバ提案レイアウトの右側に示す。
【図１３】核酸の組合せバーコード化の例示的スキーム（BC1+2=異なる２つのバーコード；Univ1及びUniv2=互いに同一又は異なることができるユニバーサルプライマー結合部位）を示す。
【図１４】組合せバーコード化後に末端対シークエンシング（配列決定）を行う、ＲＮＡの標的特異性増幅の例示的なススキームを示す。
【図１５】ライゲーション（核酸連結）による核酸の組合せバーコード化の例示的スキーム（BC1+2=異なる２つのバーコード；Univ1及びUniv2=互いに同一又は異なることができるユニバーサルプライマー結合部位）を示す。
【図１６】タンパク質近傍のライゲーション（ＰＬＡ：protein proximity ligation）又は伸長に組合せバーコード化を使用する例示的スキーム（PEA; BC1+2=異なる２つのバーコード；Univ1及びUniv2=互いに同一又は異なることができるユニバーサルプライマー結合部位）を示す。
【図１７】バーコードを導入するようトランスポゼースのような酵素を使用する組合せバーコード化の例示的スキーム（BC1+2=異なる２つのバーコード；Univ1及びUniv2=互いに同一又は異なることができるユニバーサルプライマー結合部位）を示す。
【図１８】マトリクス型マイクロ流体装置で配列をバーコード化し、その後シークエンシング及び行列バーコードを用いる「多重分離（demultilexing）」を行い、特定シークエンシング読取りを特定捕獲部位に帰属付けするシークエンシング研究からの例示的データを示す。
【図１９】マトリクス型マイクロ流体装置で配列をバーコード化し、その後シークエンシング及び行列バーコードを用いる「多重分離（demultilexing）」を行い、特定シークエンシング読取りを特定捕獲部位に帰属付けするシークエンシング研究からの例示的データを示す。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
本明細書では、転写産物の各分子追跡解析に細胞特異性バーコードを使用して細胞を互いに多重分離することができる多くの単一細胞（又は少数の細胞）からｃＤＮＡをプールするポストＩＦＣＴＭを可能にするHT ＩＦＣＴＭにおける衛生的なバーコード化方策を記載する。この方策は、増幅による単純なバーコード富化（エンリッチメント）を容易にするよう策定することができ、これにより、被照会物質の大部分が、特定細胞に帰属付けできないｃＤＮＡ物質ではなく、むしろバーコード化されて、特異シークエンス（配列）データの生成をもたらす。
【００８３】
単一細胞に対する他のバーコード化ｃＤＮＡ富化方策は、特注トランスポゾン及びビオチン・ストレプアビジン・プルダウンを含み、富化ワークフローの複雑さを増大させるとともに、同時にこのタイプの清浄化の性質に起因してシークエンシング（配列決定）に利用可能な物質量を潜在的に減らすことになる。増幅ベースのバーコード富化方策は、１回につき１個の細胞ではなく多数の細胞に対して単一タグメンテーション反応を可能にし、プルダウン又は余分な清浄化ステップがなく、また特注トランスポゾンを生成する必要がない。
【００８４】
さらに本明細書では、慎重に捕獲又は隔離された単一細胞（又は細胞群）を、細胞内高分子解析を容易にする任意な多段階生化学的プロセスと組み合わせて処理することができるＩＦＣＴＭアーキテクチャを記載する。このようなプロセスとしては、限定しないが、ＤＮＡシークエンシング用全ゲノム増幅（ＷＧＡ）、特異タンパク質を定量化するための多重タンパク質近傍リゲーション検定、多重ミクロＲＮＡ予増幅、ＲＮＡ転写産物又はＤＮＡ配列（例えば、ＳＮＰのような遺伝子型決定多型マーカー、又はコピー数変異のような解析における他の遺伝的変異）の標的特異増幅、標的シークエンシング、又はそれらの任意な組合せがある。新規なＩＦＣＴＭアーキテクチャを使用することの他に、ＩＦＣＴＭ関連制御スクリプトに対する簡単な変更により、単一細胞転写産物のリアルタイム検出が可能になり、このことは、例えば、統合化した温度及び空気圧制御を全単位細胞の光学的検出との連携で可能にするコントローラと組み合わせて使用することができる。この組合せによれば、表現型を遺伝子発現解析にリンクさせるとともに、長時間にわたる望ましくないオフインスツルメントの撮像ステップを排除する能力を提供する。このアーキテクチャによれば、さらに、任意な所望条件の下で慎重に捕獲／隔離された細胞又は細胞群を培養するのに活用することができ、この条件は、例えば、特定受容体（リセプタ）に対する作動薬（アゴニスト）又は拮抗薬（アンタゴニスト）のような成分を添加することによってオンチップで変更することができる。
【００８５】
定義
特許請求の範囲及び明細書中に使用する用語は、他に明記しない限り以下のように定義される。これら用語は、とくに明確にするために定義するが、すべての定義は、当業者がどのようにこれら用語を理解するかに一貫している。
【００８６】
本明細書に使用される用語「マイクロ流体装置（microfluidic device）」は、少なくとも１つの寸法が１ミリメートル未満のチャンバ及び／又はチャンネルを有する任意なデバイスを意味する。若干の実施形態において、マイクロ流体装置は、流体フローチャンネル（又はライン）及びこの流体フローチャンネルにおけるフローを制御又は調節するよう機能する個別の制御チャンネル（又はライン）を有する。
【００８７】
用語「核酸（nucleic acids）」は、ＤＮＡ又はＲＮＡの任意な形式を含み、例えば、ゲノムＤＮＡ；ｍＲＮＡのＤＮＡ表現であって、通常はメッセージＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の逆転写又は増幅によって得られる相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）；合成又は増幅によって産生されるＤＮＡ分子；及びｍＲＮＡがある。
【００８８】
用語核酸（nucleic acids）は、二本鎖（ダブルストランド）又は三本鎖（トリプルストランド）の核酸並びに一本鎖（シングルストランド）分子を包含する。二本鎖又は三本鎖の核酸において、核酸のストランド（らせん構造）は同一範囲にわたり延在する必要はない（すなわち、二本鎖核酸は、両方のストランドが全体長さに沿って二本鎖である必要はない）。
【００８９】
用語核酸は、さらに、その任意な化学修飾を包含し、例えばメチル化及び／又はキャッピングによる化学修飾をも包含する。核酸の修飾には、付加的電荷、分極率、水素結合、静電相互作用、及び個別の核酸塩基又は核酸全体に対する機能性を取り込む化学基の付加がある。このような修飾には、２′位糖修飾、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、シトシン環外アミンにおける修飾、5-ブロモ-ウラシル、骨格修飾、同種塩基のイソシチジン、イソグアニジン等のような異型塩基対合組合せがあり得る。
【００９０】
より具体的には、若干の実施形態において、核酸としては、ポリデオキシリボヌクレオチド（２-デオキシ-Ｄ-リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ-リボースを含む）、並びにプリン塩基若しくはピリミジン塩基のＮ-若しくはＣ-グリコシドである任意な他のタイプの核酸、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸(PNA)）及びポリモルホリノ（オレゴン州コーバリスのアンチウイルス社から市販されている）ポリマー、及びポリマーがＤＮＡ及びＲＮＡで見られるような塩基対合（ペアリング）及び塩基積合（スタッキング）を可能にする形態で核酸塩基を含む場合における他の合成配列特異性核酸ポリマーがある。用語核酸は、さらに、米国特許第６，７９４，４９９号、同第６，６７０，４６１号、同第６，２６２，４９０号、及び同第６，７７０，７４８号の特許文献に記載されている結合核酸（ＬＮＡｓ）も包含し、ＬＮＡｓに関するこれら特許文献は参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする。
【００９１】
核酸は、生物学的起源から、例えば、核酸を産生する任意の種から単離することによって固相介在化学合成のような完全に化学的合成プロセスにより、又はＤＮＡ複製、ＰＣＲ逆転写のような分子生物学ツールによる核酸操作を含むプロセスにより、又はそれらプロセスの組合せにより抽出することができる。
【００９２】
本明細書に使用する用語「テンプレート（template）」は、相補核酸分子を合成するポリメラーゼ用のテンプレートとして作用する核酸分子に言及する。
【００９３】
用語「テンプレート核酸（template nucleic acids）」は、「標的核酸」を包含する総称である。
【００９４】
本明細書に使用する用語「標的核酸（target nucleic acids）」は、本明細書に記載した方法で検出されるべき特定核酸に言及するものである。したがって、例えば、単一ヌクレオチド多型性（ＳＰＮ）の増幅は標的特異性増幅の例であり、一方、全ゲノム増幅はゲノムにおけるすべてのテンプレート核酸の増幅を目的とする増幅の例である。
【００９５】
本明細書に使用される用語「標的ヌクレオチド配列（target nucleotide sequence）」は、標的核酸のヌクレオチド配列を含む分子、例えば、標的核酸の増幅によって得られる増幅産物、又はＲＮＡ標的核酸の逆転写の際に産生されるｃＤＮＡに言及する。
【００９６】
本明細書に使用する用語「相補[的]（complementary）」は、２つのヌクレオチド間の精密な対合能力、すなわち、核酸における所定位置におけるヌクレオチドが他の核酸のヌクレオチドと水素結合できる場合、これら２つの核酸はその位置で互いに相補的であると見なされる。２つの一本鎖核酸分子間の相補性は、ヌクレオチドの幾つかのみが結合するような「部分的」の場合があり、又は全体的相補性が一本鎖分子間に存在するとき完全であり得る。核酸ストランド間の相補性の度合いは、核酸ストランド間の交雑（ハイブリダイゼーション）の効率及び強度に大きな効果を持つ。第１ヌクレオチド配列は、第１ヌクレオチド配列が第２ヌクレオチド配列に相補的である場合、第２配列の「相補体（complement）」であると言える。第１ヌクレオチド配列は、第１ヌクレオチド配列が第２ヌクレオチド配列の逆である配列に相補的である場合、第２配列の「逆相補体（reverse complement）」であると言える。
【００９７】
「特異性交雑（specific hybridization）」は、規定厳密条件下において、交雑混成物に存在する他のヌクレオチド配列に対してはほぼ結合することなく、核酸が標的ヌクレオチド配列に結合することに言及する。当業者であれば、交雑条件の厳密度を弛めることにより配列不一致は許容できることを認識するであろう。
【００９８】
特別な実施形態において、交雑は厳密な交雑条件の下で実施する。語句「厳密交雑条件（stringent hybridization conditions）」は、概して、規定イオン強度及びｐＨにおける特定配列の融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃〜約２０℃又は２５℃の範囲内の温度に言及する。本明細書に使用するＴｍは、二本鎖核酸分子の母集団が一本鎖ストランドに半解離する温度である。核酸のＴｍを計算する方法は従来既知である（例えば、以下の非特許文献である、Berger and Kimmel (1987) METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL.152: GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, San Diego: Academic Press, Inc. and Sambrook et al. (1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ND ED., VOLS. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratoryを参照されたく、これら非特許文献双方は、参照により本明細書に組み入れられるものとする）。標準的基準に示されているように、Ｔｍの簡単な見積値は、核酸が１ＭのＮａＣｌ水溶液に存在するとき等式Ｔｍ＝８１.５＋０.４１（％Ｇ＋Ｃ）によって計算することができる（例えば、非特許文献であるAnderson and Young, Quantitative Filter Hybridization in NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (1985)参照）。交雑物の融解温度（ひいては厳密交雑の条件）は、様々な因子、例えば、プライマー又はプローブの長さ及び性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）及び標的核酸の性質（溶液内に存在する又は固定化された等のＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）、並びに塩及び他の成分（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールの有無）の濃度、によって影響を受ける。これら因子の効果はよく知られており、また従来標準的基準に詳述されている。多くの配列の特異性交雑を得るのに適した例示的な厳密条件は、少なくとも約６０℃の温度及びｐＨ７における約０.２モルの塩濃度である。
【００９９】
用語「オリゴヌクレオチド（oligonucleotide）」は、比較的短い、概して、２００ヌクレオチドよりも短い、より具体的には、１００ヌクレオチドよりも短い、最も具体的には５０ヌクレオチドよりも短い、核酸に言及するのに使用する。一般的には、オリゴヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡ分子である。
【０１００】
用語「プライマー（primer）」は、核酸と交雑（「アニーリング（annealing）」とも称される）でき、適切な条件（すなわち、４つの異なる三リン酸ヌクレオシド、及びＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素のような重合剤の存在）の下で、適切な緩衝液及び適当な温度での、ヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）重合化の開始部位として作用するオリゴヌクレオチドに言及するものである。用語「プライマー部位」又は「プライマー結合部位」は、プライマーが交雑する標的核酸のセグメントに言及する。
【０１０１】
プライマーは、プライマー又はプライマーの一部が核酸内でヌクレオチド配列に交雑する場合、他の核酸とアニーリングすると言える。プライマーが特定ヌクレオチド配列と交雑するという記述は、プライマーがそのヌクレオチド配列と完全に又は排他的に交雑することを意味するものであるとは意図しない。
【０１０２】
用語「プライマー対（primer pair）」は、増幅すべきＤＮＡ配列の５′末端の相補体と交雑する５′「上流プライマー」又は「順プライマー」、及び増幅すべきＤＮＡ配列の３′末端と交雑する３′「下流プライマー」又は「逆プライマー」を含む１組のプライマーセットに言及するものである。当業者には理解されるように、「上流」及び「下流」又は「順」及び「逆」は、限定することを意図するものではなく、特定実施形態における例示的な向きを示すものである。
【０１０３】
プライマー又はプローブは、標的核酸配列に対して完全に相補的であり得る、又は完全には相補的でないものであり得る。若干の実施形態において、プライマーは、少なくとも７ヌクレオチドの配列にわたり、より一般的には１０〜３０ヌクレオチドの範囲内における配列にわたり、またしばしば１４〜２５ヌクレオチドの範囲内における配列にわたり、標的核酸配列の相補体に対する少なくとも６５％同一性を有する、またよりしばしば少なくとも７５％同一性、少なくとも８５％同一性、少なくとも９０％同一性、又は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９５％の同一性を有する。当然のことながら、若干の塩基（例えば、プライマーの３′塩基）は、概して標的核酸配列の対応塩基に対して望ましくは完全相補性である。プライマー及びプローブは、一般的に厳密交雑条件の下で標的配列とアニーリングする。
【０１０４】
本明細書に使用する用語「ヌクレオチドバーコード（nucleotide barcode）」及び「バーコード（barcode）」は、バーコード化されたプライマー又はオリゴヌクレオチドが逆転写で使用されるときに産生されたｃＤＮＡに関する情報、又は１つ以上のバーコード化されたプライマーが増幅反応で使用されるときに産生された単位複製配列に関する情報をコード化する特異ヌクレオチド配列に言及するものである。図１６及び１７に示すように、バーコードは、ライゲーション（核酸連結）のような他の手段により、又はトランスポゼースを介在させてヌクレオチド配列に付加することもできる。
【０１０５】
幾つかの実施形態において、バーコードは、「捕獲部位情報の項目（an item of capture site information）」をコード化する。例えば、マトリクス型マイクロ流体装置で行われる反応のため、バーコードは捕獲部位の行又は列をコード化することができる。２つのバーコード、すなわち、バーコードが導入される行をコード化するバーコード、及びバーコードが導入される列をコード化するバーコードは、バーコードによって同定される行列の交差部に存在する特異捕獲部位を規定することができる。
【０１０６】
本明細書で使用される「ＵＭＩ」は一意的分子指標（unique molecular index）の頭字語であり、「分子指標」とも称される。ＵＭＩは、各指標（又はバーコード）が指標配列を有する指標群における１つであり、その指標配列はその指標群における他の指標のいずれとも異なる。この「一意性（uniqueness）」を得る１つの方法は一連のヌクレオチドのストリングを使用することである。例えば、このストリングの長さが１０塩基である場合、１００万個より多い一意的配列が存在し、２０塩基長さである場合、１０１２個の一意的配列が存在する。これについては、以下の特許文献、すなわち、Hug and Schulernz, “Measurement of the Number of Molecules of a Single mRNA Species in a Complex mRNA Preparation,” J. Theor. Biol. (2003) 221, 615-624 and Hollas and Schuler, “A Stochastic Approach to Count RNA Molecules Using DNA Sequencing Methods” in Algorithms in Bioinformatics (2003):  Third International Workshop, WABI 2003, Budapest, Hungary, September 15-20, 2003, Series title:  Lecture Notes in Computer Science Volume 2812, pp 55-62 (eds. Benson and Page)を参照されたい。
【０１０７】
「リンカー（linker）」は、核酸である又は核酸を含むことができるが、必ずしもそうでなくともよい。ヌクレオチドリンカーは、増幅すべきヌクレオチド配列のいずれかの端部に付加することができ、これによりヌクレオチドリンカーに対するプライマー特異性を使用する無作為増幅を容易にし、これらヌクレオチドリンカーは、同一又は異なるものとすることができる。
【０１０８】
本明細書に使用する「アンカー配列（anchor sequence）」は、標的配列にロックするよう作用するオリゴヌクレオチドにおける配列に言及するものであり、一般的に同一ヌクレオチド塩基の伸長が後続する。通常、オリゴヌクレオチドの３′末端で生ずるがこの位置に限定されない。アンカー配列は、しばしばヌクレオチドの伸長を排除するランダムヌクレオチドよりなる。例えば、プライマー（又はオリゴヌクレオチド）におけるポリ-ｄＴ伸長に追随する例示的なアンカー配列は、塩基Ａ、Ｇ、及び／又はＣのうちのいずれか若しくはすべてを含む部分であって、Ｔは含まない第１位置又は部分からなる。第２位置又は部分は、プライマー又はオリゴヌクレオチドの末端に任意な組合せの塩基又は塩基（Ａ,Ｇ,Ｔ,Ｃ）のすべてを含むことができる。
【０１０９】
用語「隣接の／する（adjacent）」は、核酸における２つのヌクレオチド配列に言及するのに使用するとき、１〜約５０個、より具体的には１〜約２０個、より一層具体的には１〜約１０個の範囲内における個数のヌクレオチド分だけ隔たるヌクレオチド配列、又は互いに突き合わさる（０個のヌクレオチド分だけ隔たる）配列に言及し得る。
【０１１０】
プライマーの一部分につき使用される用語「標的特異性（target-specific）」ヌクレオチド配列は、適正なアニーリング条件の下で標的核酸又は標的ヌクレオチド配列に対して特異的にアニーリングすることができる配列に言及する。プライマーの部分は、標的ではなくヌクレオチド配列に対して同一感度の「特異性」を示すことができる。
【０１１１】
本発明が教示する増幅は、少なくとも１つの標的核酸の少なくとも一部分が、一般的にはテンプレート依存で複製される任意の手段を包含し、限定するものではないが、線形的又は指数関数的のいずれかで核酸配列を増幅する広範囲にわたる技術を含む。増幅ステップを実施する例示的手段としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：ligase chain reaction）、リガーゼ検出反応（ＬＤＲ：ligase detection reaction）、Ｑ-レプリカーゼ増幅が後続するライゲーション、ＰＣＲ、プライマー伸長、ストランド置換増幅（ＳＤＡ：strand displacement amplification）、超分岐ストランド置換増幅、多重置換増幅（ＭＤＡ）、核酸ストランドに基づく増幅（NASBA：nucleic acid strand-based amplification）、２段階多重化増幅、ローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）、及び、例えば限定しないが、OLA/PCR、PCR/OLA、LDR/PCR、PCR/PCR/LDR、PCR/LDR、LCR/PCR、PCR/LCR（複合連鎖反応--ＣＣＲとしても知られている）の多重式及びそれらの組合せを含むもの等がある。このような技術に関する記述は、とりわけ以下の非特許文献及び特許文献に記載されている。すなわち、Ausbel et al.; PCR Primer: A Laboratory Manual, Diffenbach, Ed., Cold Spring Harbor Press (1995); The Electronic Protocol Book, Chang Bioscience (2002); Msuih et al., J. Clin. Micro. 34:501-07 (1996); The Nucleic Acid Protocols Handbook, R. Rapley, ed., Humana Press, Totowa, N.J. (2002); Abramson et al., Curr Opin Biotechnol. 1993 Feb.;4(1):41-7, U.S. Pat. No. 6,027,998; U.S. Pat. No. 6,605,451, Barany et al., PCT Publication No. WO 97/31256; Wenz et al., PCT Publication No. WO 01/92579; Day et al., Genomics, 29(1): 152-162 (1995), Ehrlich et al., Science 252:1643-50 (1991); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990); Favis et al., Nature Biotechnology 18:561-64 (2000); and Rabenau et al., Infection 28:97-102 (2000); Belgrader, Barany, and Lubin, Development of a Multiplex Ligation Detection Reaction DNA Typing Assay, Sixth International Symposium on Human Identification, 1995 (available on the world wide web at: promega.com/geneticidproc/ussymp6proc/blegrad.html- ); LCR Kit Instruction Manual, Cat. #200520, Rev. #050002, Stratagene, 2002; Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:188-93 (1991); Bi and Sambrook, Nucl. Acids Res. 25:2924-2951 (1997); Zirvi et al., Nucl. Acid Res. 27:e40i-viii (1999); Dean et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:5261-66 (2002); Barany and Gelfand, Gene 109:1-11 (1991); Walker et al., Nucl. Acid Res. 20:1691-96 (1992); Polstra et al., BMC Inf. Dis. 2:18- (2002); Lage et al., Genome Res. 2003 Feb.;13(2):294-307, and Landegren et al., Science 241:1077-80 (1988), Demidov, V., Expert Rev Mol Diagn. 2002 Nov.;2(6):542-8., Cook et al., J Microbiol Methods. 2003 May;53(2):165-74, Schweitzer et al., Curr Opin Biotechnol. 2001 Feb.;12(1):21-7, U.S. Pat. No. 5,830,711, U.S. Pat. No. 6,027,889, U.S. Pat. No. 5,686,243, PCT Publication No. WO0056927A3, and PCT Publication No. WO9803673A1を参照されたい。
【０１１２】
幾つかの実施形態において、増幅は、少なくとも１つのプライマーを少なくとも１つの標的核酸における相補的又はほぼ相補的な配列でアニーリングする；ポリメラーゼを用いてテンプレート依存でヌクレオチドにおける少なくとも１つのストランドを合成する、及び新たに形成した核酸複製を変性させてストランドを分離する；という逐次的手順の少なくとも１回のサイクルを含む。増幅は、熱サイクルを含むことができる、又は等温的に実施することができる。
【０１１３】
「全トランスクリプトーム増幅」(WTA: Whole transcriptome amplification）は、そこから準備された細胞からのＲＮＡ母集団である増幅生成物を産生することを目的とする任意の増幅方法である。例示的なＷＴＡ方法には、無作為増幅を容易にする何れかの末端におけるｃＤＮＡ担持リンカー産生を含む。多くの実施形態において、ＷＴＡは、メッセンジャー（ポリＡ）ＲＮＡ（これは「RNAseq」とも称される）を解析するのに実施される。
【０１１４】
「全ゲノム増幅」(WGA: Whole genome amplification）は、そこから増幅されたゲノムである増幅生成物を産生することを目的とする任意の増幅方法である。例示的ＷＧＡ方法としては、プライマー伸長ＰＣＲ（ＰＥＰ）及び改良型ＰＥＰ（I-PEP）、変性オリゴヌクレオチドで準備されたＰＣＲ（DOP-PCR）、ライゲーション介在ＰＣＲ（ＬＭＰ）、Ｔ７に基づくＤＮＡの線形増幅（TLAD）、多重置換増幅（ＭＤＡ）がある。
【０１１５】
パラメータにつき使用される用語「ほぼ（substantially）」は、パラメータが有用な結果をもたらすのに十分であることを意味する。したがって、核酸配列に適用される「ほぼ相補的（substantially complementary）」は、概して記載された文脈で動作するのに対してほぼ相補的であることを意味する。一般的には、ほぼ相補的であることは、採用された条件の下で交雑するのにほぼ相補的であることを意味する。
【０１１６】
「試薬（reagent）」は、検体（例えば、解析されている核酸）ではなく、反応に使用される任意の媒剤に広く言及するものである。核酸増幅反応のための例示的試薬としては、限定しないが、緩衝液、金属イオン、ポリメラーゼ、逆転写酵素、プライマー、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、標識、染料、ヌクレアーゼ、等々がある。酵素反応のための試薬としては、例えば、基質、補因子、緩衝液、金属イオン、阻害剤、及び賦活剤がある。用語試薬は、細胞の成長又は挙動に影響を及ぼす任意の成分、例えば、緩衝液、培養基若しくはその成分、アゴニスト、アンタゴニスト等をも包含する。
【０１１７】
本明細書に使用する用語「標識（label）」は、検出可能及び／又は定量化可能な信号を発生するのに使用できる任意の原子又は分子に言及するものである。とくに、標識は、核酸及び／又はタンパク質に直接又は間接的に付着させることができる。プローブに付着させることができる適当な標識としては、限定しないが、放射性同位体、蛍光色素分子、発色団、質量標識、高電子密度粒子、磁気粒子、スピン標識、化学発光を生ずる分子、電気化学的活性分子、酵素、補因子、及び酵素基質がある。
【０１１８】
本明細書で使用する用語「染色剤（stain）」は、成分に結合して、その成分の検出を容易にする任意の有機又は無機の分子に言及する。
【０１１９】
本明細書で使用する用語「染料（dye）」は、３４０ｎｍ以上の波長の電磁放射を吸収する任意の有機又は無機の分子に言及する。
【０１２０】
本明細書に使用する用語「蛍光染料（fluorescent dye）」は、概して照明器具、フォトダイオード、又はレーザーのような電磁放射源の照射に基づく蛍光機序による長い波長電磁放射を放出する任意な染料に言及する。
【０１２１】
本明細書に使用する用語「変異（variation）」は、何らかの相違に言及するのに使用する。変異は個体間又は母集団間の相違に言及することができる。変異は共通又は通常の状況からの相違を包含する。したがって、「コピー数変異」又は「突然変異」は、共通又は通常のコピー数又はヌクレオチド配列からの相違に言及することができる。「発現レベル変異（expression level variation）」又は「スプライス変異（splice variant）」は、特定の細胞、組織、成長段階、条件等における共通又は通常の発現レベル又はＲＮＡ又はタンパク質とは相違する発現レベル又はＲＮＡ又はタンパク質に言及することができる。
【０１２２】
「多型マーカー(polymorphic marker)」又は「多型部位(polymorphic site)」はヌクレオチド配列分岐を生ずる遺伝子座である。例示的なマーカーは、少なくとも２つの対立遺伝子を有し、各対立遺伝子は、選択された母集団における１％より多い頻度、より一般的には１０％又は２０％より多い頻度生ずる。多型部位は１塩基対ほどの少なさであり得る。多型マーカーとしては、制限断片長多型（RFLP）、可変数縦列反復（VNTR’s）、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、単純配列反復、欠失、及びＡｌｕのような挿入因子がある。最初に同定された対立遺伝子（アレリック）形質は基準形として恣意的に割り当てられ、他の対立遺伝子形質は別の又は異型の対立遺伝子として割り当てられる。選択した母集団に最も頻繁に生起する対立遺伝子形質は、ときに野生型形質と称される。２倍体生命体は、対立遺伝子形質がホモ接合型又はヘテロ接合型であり得る。ジアレリック多型は２個の形質を有する。トリアレリック多型は３つの形質を有する。
【０１２３】
「単一ヌクレオチド多型」（ＳＮＰ）は、単一ヌクレオチドが占有する多型部位で生起し、この多型部位は対立遺伝子配列間における変異部位である。この部位は、通常、多く保存された対立遺伝子配列（例えば、母集団のうち１／１００又は１／１０００未満の構成員で変動する配列）によって先行又は後続される。ＳＮＰは通常、多型部位における１つのヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換することに起因して生ずる。塩基転換はプリンがピリミジンに入れ替わる又はその逆となる置換である。ＳＮＰは、さらに、基準対立遺伝子に対するヌクレオチド欠失又はヌクレオチド挿入から生ずることもできる。
【０１２４】
本明細書における反応、反応混合物、反応量等につき使用される用語「個別の（separate）」は、反応が他の反応から孤立して行われる反応、反応混合物、反応量等に言及する。個別の反応、反応混合物、反応量等は、必ずしもではないがエマルションであり得る液滴で実施されるもの（例えば、参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする以下の非特許文献及び特許文献を参照、すなわち、U.S. Patent No., 7,294,503, issued November 13, 2007 to Quake et al., entitled “Microfabricated crossflow devices and methods,” which is incorporated herein by reference in its entirety and specifically for its description of devices and methods for forming and analyzing droplets; U.S. Patent Publication No. 20100022414, published January 28, 2010, by Link et al., entitled “Droplet libraries,” which is incorporated herein by reference in its entirety and specifically for its description of devices and methods for forming and analyzing droplets; and U.S. Patent Publication No. 20110000560, published January 6, 2011, by Miller et al., entitled “Manipulation of Microfluidic Droplets,” which is incorporated herein by reference in its entirety and specifically for its description of devices and methods for forming and analyzing droplets.)、並びに反応、反応混合物、反応量等が、機械的バリア、例えば個別容器、マイクロタイタープレートの個別ウェル、又はマトリクス型マイクロ流体装置の個別隔室によって隔てられるものがある。
【０１２５】
本明細書に使用する用語「流体的に隔絶された（fluidically isolated）」は、マイクロ流体装置の２つ又はそれ以上の要素が互いに流体連通していない状態に言及する。
【０１２６】
用語「エラストマー（elastomer）」は、当業界で使用される一般的な意味を有する。したがって、オールコック氏らは（最新ポリマー化学、第２版）、エラストマーは概してそのガラス遷移温度と液化温度との間における温度で存在するポリマーとして記述している。エラストマー材料は、ポリマー鎖が力に応答し容易にねじれ運動を受けて主鎖の巻き戻りを可能にするとともに、力をなくすと以前の形状をとるよう主鎖が反動することに起因する弾性特性を示す。概して、エラストマーは力をくわえると変形するが、力を取り除くと元の形状に復元する。
【０１２７】
細胞に基づく解析方法
母集団からの細胞を少なくとも２種類の異なる試薬に曝す方法をここで説明し、この方法において、各細胞を又は２つ又はそれ以上の細胞群としてこれら試薬に個別に曝す。この方法は、母集団からの細胞をマイクロ流体装置内の複数個の捕獲部位に分配し、複数個の捕獲部位それぞれが１個又はそれ以上の捕獲又は隔離された細胞を有するようにするステップを含む。様々な実施形態において、捕獲部位は、２，３，４，５，６，７，８，９，１０，５０，１００，２００，３００，４００，５００，６００，７００，８００，９００，又は１０００個の細胞を有する細胞群（グループ）又はこれらの数値のうち任意な数値で規定される範囲内での細胞個数を有する細胞群を有する。幾つかの実施形態において、これら数値は、捕獲部位あたりの細胞個数の平均をとることによって規定される。
【０１２８】
１つ以上の第１試薬を各捕獲部位に供給し、また１つ以上の第２試薬を各捕獲部位に供給し、第２試薬は、第１試薬とは異なるものとする、また第１試薬とは個別に供給する。各試薬対は、例えば、捕獲部位内で互いに明確に区別される、また随意的に、捕獲形体を有するチャンバとは明確に区別される流体的に隔離可能なチャンバ対供給することができる。
【０１２９】
幾つかの実施形態において、マイクロ流体装置の少なくとも１つの表面は透明で細胞又は標識からの信号を可視化できるものとする。幾つかの実施形態において、この方法は、随意的に、反応を行う前に細胞が占拠する捕獲部位を撮像するステップを有することができる。
【０１３０】
１つ以上の試薬は、細胞成長を支援する、細胞挙動を調節する、及び／又は細胞成分（細胞表面又は細胞内部のいずれかにおける）の検出を容易にする試薬とすることができる。実際、試薬は、細胞又は細胞内容物に接触したいと思うような任意の分子又は成分とすることができる。母集団における単一細胞又は細胞群に実施することができる解析の例としては特許文献の米国特許出願公開第２０１３／０３２３７３２号に見ることができ、この特許文献は参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする。これら解析に有用な試薬は、米国特許出願公開第２０１３／０３２３７３２号に記載されている、及び／又は当業者には既知である。
【０１３１】
幾つかの実施形態において、反応は各捕獲部位で（すべての他の捕獲部位とは別個に）実施され、反応生成物は捕獲部位情報の項目をコード化する。反応生成物は、マイクロ流体装置から回収し、またその後の解析にかける。このその後の解析としては、特定捕獲部位における単一細胞又は細胞群に由来したものとして、例えば、少なくとも部分的に捕獲部位情報項目に基づいて特定反応生成物を同定することがあり得る。
【０１３２】
幾つかの実施形態において、この方法は、核酸配列を細胞母集団からの反応生成物内に取り込むステップを含み、この場合、核酸配列は、各細胞の反応生成物に個別に、又は細胞群の反応生成物に取り込まれる。様々な実施形態において、核酸配列は、２，３，４，５，６，７，８，９，１０，５０，１００，２００，３００，４００，５００，６００，７００，８００，９００，又は１０００個の細胞を有する個別の細胞群内に、又はこれらの数値のうち任意な数値で規定される範囲内での細胞個数を有する細胞群内に取り込まれる。幾つかの実施形態において、これら数値は、捕獲部位あたりの細胞個数の平均をとることによって規定される。この方法は、母集団からの細胞をマイクロ流体装置内の複数個の捕獲部位に分配し、複数個の捕獲部位それぞれが１個より多くない単一細胞を含むようにする、又は各細胞群における細胞所望数よりは多くない細胞群で細胞を解析するようにするステップを含む。幾つかの実施形態において、捕獲部位は、例えば、装置全体にわたり細胞を分配した後に、流体的に互いに隔絶可能とする。若干の実施形態において、各捕獲部位は、細胞又は細胞群を所定位置に保持する捕獲形体を有する。幾つかの実施形態において、捕獲形体はチャンバ内に存在し、このチャンバは、その捕獲部位内の他のチャンバからは流体的に隔絶できるものとする。
【０１３３】
幾つかの実施形態において、反応は、核酸配列が各細胞又は細胞群における反応生成物内に個別に取り込まれるように行う。当業者であれば、反応がｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡのような細胞内のテンプレート又は標的で行われる場合、この方法は、代表的には一方又は双方の試薬を細胞内テンプレート／標的に曝す細胞透過化又は細胞溶解ステップを含む。
【０１３４】
反応生成物は、この後回収して、特定捕獲部位における単一細胞又は細胞群に由来したものとして特定反応生成物を同定することができるやり方で解析する。この同定を達成できる１つのやり方は、バーコードを反応生成物内に取り込むことである。このようなバーコードは、捕獲部位情報項目をコード化することができる。バーコードは、実際上任意な長さを有し得るが、反応生成物がＤＮＡシークエンシングをうける場合には、より短いバーコード（例えば、長さが４〜６ヌクレオチド）が幾つかの実施形態において好適である。様々な実施形態において、適当なバーコードは、長さが２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９若しくは２０個分のヌクレオチドである、又はこれら数値によって区切られる範囲内に納まる、例えば、２〜１０若しくは３〜８個分のヌクレオチドである。
【０１３５】
この方法は、細胞からＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかの核酸を解析することに特別な用途を見出すものであるが、他の分子（タンパク質、炭水化物、脂質等）を解析することができ、またこの方法は、任意な粒子又は粒子群（例えば、細胞器官、リポソーム等）の解析に適用することができる。実際、任意なタイプの反応、一連の反応をこの方法で実施することができる。若干の実施形態において、反応は、核酸配列を細胞又は細胞群の核酸内に取り込む。これら実施形態において、反応としては、逆転写、増幅、ライゲーション（核酸連結）、又は核酸に対して実施できる任意な他の反応があり得る。例としては、全トランスクリプトーム増幅（WTA；図１０〜１２に示す例示的実施形態参照）、全ゲノム増幅（WGA；図１３に示す例示的実施形態参照）、ミクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）予増幅、ＲＮＡの標的特異性増幅（図１４に示す例示的実施形態参照）、ＤＮＡの標的特異性増幅（各プライマーのテンプレート特異性部分が標的特異性である図１３に示す例示的実施形態参照）、タンパク質近傍ライゲーション（図１６に示す例示的実施形態参照）、及び転位（図１７に示す例示的実施形態参照）がある。
【０１３６】
本明細書に記載の方法を使用して、任意なタイプの細胞から核酸を、例えば、核酸の任意な自己複製、薄膜結合した生物学的実体又は任意の非複製的に薄膜結合した派生体を解析することができる。非複製的派生体は、老化細胞、末端分化型細胞、細胞キメラ、血清飢餓細胞、感染細胞、非複製的突然変異体、無核細胞、無傷核、及び固化した無傷（死滅）細胞等であり得る。本明細書に記載の方法で使用される細胞は、任意の起源、遺伝的背景、健康状態、修復状態、膜透過性、前処理、及び／又は他の特性として母集団純度を有することができる。適当な細胞は、真核性、原核性、古細菌性等あり得る、又は動物、植物、菌類、原生生物、バクテリア等々からのものであり得る。例示的実施形態において、ヒト細胞を解析する。細胞は、生物発育の任意な段階からのものとすることができ、例えば、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）の場合、胎芽細胞、胎児細胞、成熟細胞を解析することができる。若干の実施形態において、細胞は幹細胞である。細胞は、野生型；天然、化学的又はウイルス性の突然変異体；遺伝子工学的（例えば、遺伝子組み換えのような）突然変異体であり得る。加えて、細胞は、他の状態としてとくに、成長、老化、形質転換、及び／又は不死化の状態であり得る。さらに、細胞は、概して単一細胞若しくは極めて類似した細胞の小集合からのクローン母集団に由来する単一培養であり得る；親和結合、ＦＡＣＳ、薬物選択等のような任意の適当な機序によって予め分類されたものであり得る；及び／又ははっきりと区別できる細胞型の混成した又は異種的母集団であり得る。
【０１３７】
本明細書に記載の方法の１つの利点は、実際に任意な数の単一細胞を解析するのに使用できる点である。様々な実施形態において、解析される単一細胞の数は、約１０、約５０、約１００、約５００、約１０００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９,０００、約１０,０００、約１５,０００、約２０,０００、約２５,０００、約３０,０００、約３５,０００、約４０,０００、約４５,０００、約５０,０００、約７５,０００、又は約１００,０００以上とすることができる。特別な実施形態において、解析される細胞数は、上述のうち任意な２つの数値によって区切られる範囲内に納まることができる。
【０１３８】
幾つかの実施形態において、この方法は、マトリクス型マイクロ流体装置（以下にさらに説明する）で実施することができ、このマトリクス型マイクロ流体装置は、装置内の特定行を同定するバーコード、及び特定列を同定するバーコード導入を容易にし、これによりこの組合せが、特定捕獲部位及びひいては反応生成物が派生することになった特定細胞又は細胞群を一意的に同定する。この方法はこのような装置上で試験され、またうまく機能することを実証された（図１８及び１９に示す結果を参照されたい）。
【０１３９】
幾つかの実施形態において、各反応は少なくとも１つのＵＭＩを取り込み、このＵＭＩはそれが取り込まれる分子を一意的に同定する核酸配列である。このような実施形態の変更実施形態において、反応は、１つ以上のＵＭＩに加えて１つ以上のバーコードを取り込む。ＵＭＩは任意な長さとすることができ、また所定解析に必要な長さは、同定すべき一意的分子の数が増加するにつれて増加する。様々な実施形態において、適当なＵＭＩは、長さが２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９若しくは２０個分のヌクレオチドである、又はこれら数値によって区切られる、例えば、２〜１０、３〜８、４〜７若しくは５〜６個の範囲内に納まることができる。
【０１４０】
解析のために標識ＲＮＡ又はＤＮＡに対してビード及び／又は配列タグを組み合わせて使用することにより、解析に先立つ予増幅の必要性を回避することができ、またマトリクス型マイクロ流体装置を再使用可能にする。
【０１４１】
ＲＮＡ解析
幾つかの実施形態において、上述の方法はＲＮＡ解析に適用される。この場合、各捕獲部位で生ずる反応としては、ＲＮＡ逆転写、例えば、ｃＤＮＡを産生するための第２ストランド合成があり得る。
【０１４２】
例えば、単一細胞又は細胞群におけるトランスクリプトーム解析に適した特別な方法において、第１試薬は逆転写（ＲＴ）プライマーを含むことができる。例示的なＲＴプライマーを図１０に示す（「３′ＲＴプライマー」）。このＲＴプライマーは、ポリｄＴ配列の第１バーコード（「ｂｃ」）５′を含む。ポリｄＴ配列は、ｍＲＮＡのポリＡ尾部までアニーリングするのに十分な長さにすべきであり、一般的に長さが１８〜３０個分のオーダーのヌクレオチドである。このＲＴプライマーは、随意的に、やはりポリｄＴ配列の５′である第１ＵＭＩを含むものとする。図１０はＵＭＩの第１バーコード５′を示すが、当業者にはこれら要素のオーダーを逆転することができるは理解できるであろう。図１０に示すように、ＲＴプライマーは、さらに、好適にはＲＴプライマーの５′末端に第１リンカーを含むことができる。第１リンカーは無作為増幅を容易にするのに使用することができ、この場合、ＤＮＡシークエンシングは、タグメンテーション後に３′末端の富化を行う。幾つかの実施形態において、ＲＴプライマーは、さらに、ポリｄＴ配列のアンカー配列３′を有する。アンカー配列の長さ及び組成は変動することができ、また特定解析に適するアンカー配列の選択は、当業者に既知のレベル内である。代表的には、アンカー配列は長さが少なくとも２個分のヌクレオチドである。
【０１４３】
幾つかの実施形態において、第２試薬は、ポリ-リボＧ配列を持つ５′オリゴヌクレオチドを含む。このタイプの例示的なオリゴヌクレオチドを図１０に示す。このオリゴヌクレオチドは、「テンプレート切替えオリゴヌクレオチド」のための「ＴＳＯオリゴ」として認識される。この５′オリゴヌクレオチドは、ポリ-リボＧ配列の第２バーコード５′を含むことができる（例えば、図１０にポリ-リボＧ配列とリンカーとの間における２個のバーのうち一方として示される）。５′オリゴヌクレオチドは、随意的に、やはり好適にはポリ-リボＧ配列の５′である第２ＵＭＩを含むことができ、この第２ＵＭＩは、第１ＵＭＩと同一又は異なるものとすることができる（例えば、図１０にポリ-リボＧ配列とリンカーとの間における２個のバーのうち他方として示される）。図１０に示すように、５′オリゴヌクレオチドは、付加的に、好適には、５′オリゴヌクレオチドの５′末端に第２リンカーを含む。この第２リンカーは第１リンカーと同一又は異なるものとすることができ、また第１リンカーと同様に無作為増幅を容易にするのに使用することができる。
【０１４４】
特別な実施形態において、この方法は、以下に説明するようにマイクロ流体装置内で行う。この場合、ＲＴプライマーは入力ラインのうちの一方のセットを経由して捕獲部位送給することができ、また５′オリゴヌクレオチドは入力ラインのうちの他方のセットを経由して捕獲部位送給することができる。
【０１４５】
若干の実施形態において、上述した方法のうち１つの方法でこれら２つの試薬を使用することは、ｃＤＮＡを産生し、この場合、１つのストランドは、ＲＮＡ-第１リンカー-３′に由来し、リンカー間に少なくとも１つのバーコードを持つ５′-第２リンカー-ヌクレオチド配列を有する構造である。この実施形態の変更実施形態において、第１バーコードは第１リンカーに隣接する及び／又は第２バーコードは第２リンカーに隣接するよう配置される。例えば、ｃＤＮＡにおける一方のストランドは以下の構造、すなわち、
３′-第２リンカー-ＲＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１バーコード-第１リンカー-５′
の構造を有することができる。
【０１４６】
第２バーコードを含む場合、ｃＤＮＡにおける一方のストランドは以下の構造、すなわち、
３′-第２リンカー-第２バーコード-ＲＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１バーコード-第１リンカー-５′
の構造を有することができる。
【０１４７】
ＵＭＩの含有物は、例えば、
３′-第２リンカー-ＲＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１ＵＭＩ-第１バーコード-第１リンカー-５′；又は
３′-第２リンカー-ＲＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１バーコード-第１ＵＭＩ-第１リンカー-５′
の構造を産生することができる。
【０１４８】
また、第２ＵＭＩの含有物は、例えば、
３′-第２リンカー-第２バーコード-第２ＵＭＩ-ポリｄＣ-ＲＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１ＵＭＩ-第１バーコード-第１リンカー-５′；
３′-第２リンカー-第２バーコード-第２ＵＭＩ-ポリｄＣ-ＲＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１バーコード-第１ＵＭＩ-第１リンカー-５′；
３′-第２リンカー-第２ＵＭＩ-第２バーコード-ＲＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１ＵＭＩ-第１バーコード-第１リンカー-５′；又は
３′-第２リンカー-第２ＵＭＩ-第２バーコード-ＲＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１バーコード-第１ＵＭＩ-第１リンカー-５′
の構造を産生することができる。
【０１４９】
ＤＮＡ解析
当業者であれば理解できるように、ＲＮＡ解析のための上述の化学的構造はＤＮＡ解析に適用することができ、例えば、各捕獲部位で行われる反応は、ＤＮＡの増幅を含む。
【０１５０】
特別なＤＮＡ増幅の実施形態において、第１及び／又は第２の試薬は、それぞれ第１及び／又は第２の増幅プライマーを含み、この場合、第１及び／又は第２の増幅プライマーはそれぞれ第１及び／又は第２のバーコード、すなわち、プライマー配列の５′を有する。プライマー配列は、ランダムなもの又は特定標的核酸（すなわち、「標的特異性」）を増幅するよう計画されたものとすることができる。幾つかの実施形態において、第１及び／又は第２の増幅プライマーは、それぞれ付加的に第１又は第２のＵＭＩを含むことができる。いかなるＵＭＩも、好適にはプライマー配列の５′である。幾つかの実施形態において、第１及び／又は第２の増幅プライマーは、好適にはプライマー配列の５′において、それぞれ付加的に第１又は第２のリンカーを含み、無作為増幅を容易にする。バーコード及びＵＭＩのための適当な長さ及び配列に関する上述の説明は、ＤＮＡ解析の状況にも適用される。バーコード及びＵＭＩを含むプライマーに関して、それらの相対位置は厳密ではない。
【０１５１】
特別な実施形態において、ＤＮＡ増幅は以下に説明するようにマイクロ流体装置内で行う。この場合、第１増幅プライマーは入力ラインのうちの一方のセットを経由して捕獲部位送給することができ、また第２増幅プライマーは入力ラインのうちの他方のセットを経由して捕獲部位送給することができる。
【０１５２】
若干の実施形態において、上述した方法のうち１つの方法でこれら２つのこのような増幅プライマーを使用することは、アンプリコン（単位複製配列）を産生し、この場合、１つのストランドは、リンカー間にバーコードを持つ５′-第２リンカー-サンプルＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１リンカー-３′を有する構造である。例えば、アンプリコンにおける一方のストランドは以下の構造、すなわち、
３′-第２リンカー-サンプルＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１バーコード-第１リンカー-５′
の構造を有することができる。
【０１５３】
第２バーコードを含む場合、アンプリコンにおける一方のストランドは以下の構造、すなわち、
３′-第２リンカー-第２バーコード-サンプルＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１バーコード-第１リンカー-５′
の構造を有することができる。
【０１５４】
ＵＭＩの含有物は、例えば、
３′-第２リンカー-サンプルＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１ＵＭＩ-第１バーコード-第１リンカー-５′；又は
３′-第２リンカー-サンプルＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１バーコード-第１ＵＭＩ-第１リンカー-５′
の構造を産生することができる。
【０１５５】
また、第２ＵＭＩの含有物は、例えば、
３′-第２リンカー-第２バーコード-第２ＵＭＩ-サンプルＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１ＵＭＩ-第１バーコード-第１リンカー-５′；
３′-第２リンカー-第２バーコード-第２ＵＭＩ-サンプルＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１バーコード-第１ＵＭＩ-第１リンカー-５′；
３′-第２リンカー-第２ＵＭＩ-第２バーコード-サンプルＤＮＡ由来のヌクレオチド配列-第１ＵＭＩ-第１バーコード-第１リンカー-５′；又は
３′-第２リンカー-第２ＵＭＩ-第２バーコード-サンプルＤＮＡ由来のポリｄＣ-ヌクレオチド配列-第１バーコード-第１ＵＭＩ-第１リンカー-５′
の構造を産生することができる。
【０１５６】
上述の方法のいずれの場合においても、方法ステップすべては、必ずしもではないが、マイクロ流体装置内で実施することができる。
【０１５７】
これら方法のいずれも、随意的に、最も都合よいことには、ｃＤＮＡ又はＤＮＡのいずれかの末端にリンカーを付加した後に、予増幅ステップを有することができる。例えば、予増幅は、その後の特徴付け（例えば、ＤＮＡシークエンシングのような）ステップ前にｃＤＮＡ又はアンプリコンのレベルを増加するために行うことができる。予増幅は、第１及び第２のリンカーに対してアニーリングするリンカープライマーを使用して行うことができ、この場合、これらリンカープライマーは、同一又は異なるものとする（これらリンカー自体が同一又は異なるものであるかに基づいて）。予増幅は、マイクロ流体装置内で、又は反応生成物を装置から送出した後に行うことができる。
【０１５８】
幾つかの実施形態において、上述の方法のいずれもＤＮＡシークエンシングのためのテンプレートを調製するために実施することができる。幾つかの実施形態において、マイクロ流体装置内で行われる反応は、１つ以上のＤＮＡシークエンシングプライマー結合部位を反応生成物に取り込むことができる、又はこれら部位を、マイクロ流体装置からの送出後に反応生成物内に取り込むことができる。特定の実施形態において、ＤＮＡシークエンシングプライマー結合部位は、よく知られているトランスポゼースに基づくインビトロ・ショットガン方法であるタグメンテーション反応によって付加することができ、このタグメンテーション反応において、シークエンシングすべきＤＮＡは同時に断片化され、かつその後のシークエンシングを容易にする配列（シークエンス）を導入するトランスポゾン末端をタグ付けされる。
【０１５９】
したがって、幾つかの実施形態において、この方法は、ＤＮＡシークエンシング、例えば、サンガー・シークエンシング、次世代シークエンシング（例えば、ブリッジシークエンシング）、又は第３世代シークエンシングを反応生成物に受けさせるステップを有する。このような実施形態の変更実施形態において、ＤＮＡシークエンシングから得られた配列（シークエンス）は、１つ又は２つのバーコードに基づく特定捕獲部位から導き出されたものとして同定することができる。
【０１６０】
以下により詳細に説明するように、マトリクス型マイクロ流体装置の特定行又は列からの反応生成物は、プールとして送出することができる。反応生成物のその後のいかなる特徴付け、例えば、ＤＮＡシークエンシングは、個別の送出されたプールで行うことができる。しかし、プール自体は、その後の特徴付けに先立って溜めておくことができるとも考えられる。この場合、マイクロ流体装置における各捕獲部位からの反応生成物は、一般的に明確に区別できるものであり、この区別は、例えば、マイクロ流体装置における各捕獲部位の行場所及び列場所をコード化する２つのバーコードを使用することによって容易に達成される。
【０１６１】
プライマー組合せ
上述したプライマー又はオリゴヌクレオチドのいずれもプライマー組合せを形成するよう組み合わせることができる。代表的には、プライマー組合せは、本明細書に記載したような方法でともに使用される２，３，４、又はそれ以上のプライマー又はオリゴヌクレオチドを含む。
【０１６２】
例えば、ＲＮＡからｃＤＮＡを産生するのに使用するためのプライマーとしては、以下のものがあり得る。
【０１６３】
(a)   アンカー配列、アンカー配列のポリ-ｄＴ配列５′、ポリ-ｄＴ配列の第１バーコード５′、及び第１バーコード配列の第１リンカー５′を含む逆転写（ＲＴ）プライマー；並びに
【０１６４】
(b)   ポリ-リボＧ配列、ポリ-リボＧ配列の第２バーコード５′、及び第２バーコードの第２リンカー５′を含む５′オリゴヌクレオチド。
【０１６５】
若干の実施形態において、これらプライマーのうち一方又は双方はＵＭＩを含むことができる。
【０１６６】
ＤＮＡを増幅するのに使用するための例示的なプライマー組合せは、第１及び第２の増幅プライマーを含むことができ、各増幅プライマーはそれぞれ、プライマー配列；プライマー配列の５′であるバーコードであって、各プライマーのバーコードが互いに異なる、該バーコード；及びバーコードの５′であるリンカーを含み、一方又は双方のプライマーは、プライマー配列の５′及びリンカーの３′であるＵＭＩを含む。
【０１６７】
これらプライマー組合せは、さらに、例えば、無作為増幅を容易にするためリンカーをアニーリングする１つ以上のリンカープライマーを含むことができる。幾つかの実施形態において、組合せは、２つのリンカープライマー、すなわち、５′リンカープライマー及びこれと異なる３′リンカープライマーを含む。上述のプライマー組合せを用いて産生されるｃＤＮＡ又はアンプリコンの予増幅を必要とする上述の幾つかの実施形態において、一方又は双方のリンカープライマーを使用してこの予増幅を実施することができる。
【０１６８】
ブリッジシークエンシングのためのＤＮＡシークエンシングテンプレートを調製するのに使用することを意図するプライマー組合せは、随意的に３′リンカープライマー若しくはその相補体のための部分特異性を有するプライマー、及び／又は５′リンカープライマー若しくはその相補体のための部分特異性を有するプライマーを含むことができ、この場合、プライマーは、ブリッジシークエンシングにおけるクラスター生成に有用なフローセル配列を付加的に含む。フローセル配列は、概してリンカー特異性部分の５′である。
【０１６９】
マトリクス型マイクロ流体装置
若干の実施形態において、上述の方法に有用なマトリクス型マイクロ流体装置は、Ｒ行及びＣ列のマトリクスに配列された捕獲部位を有し、Ｒ及びＣは１より大きい整数である。各捕獲部位は、単に１個の細胞を捕獲することができる、又は細胞を細胞群（グループ）として解析すべき場合には、各細胞群用の所望細胞数よりも多くない個数の細胞を捕獲することができる、捕獲形体を有することができる。細胞を捕獲部位に送給した後、捕獲部位は互いに流体的に隔絶することができる。装置は、さらに、特定の行における捕獲部位に第１試薬を送給するよう構成したＲ個の第１入力ラインのセット、及び特定の列における捕獲部位に第２試薬を送給するよう構成し、この送給は第１試薬の送給とは別個であるＣ個の第２入力ラインのセットを有する。このタイプの例示的な装置を図１Ａに概略的に示す。図１Ｂは、Ｒ個の互いに異なる第１入力ライン経由でＲ個の互いに異なるバーコードを捕獲部位に送給することを示す。図１Ｃは、Ｃ個の互いに異なる第２入力ライン経由でＣ個の互いに異なるバーコードを捕獲部位に送給することを示す。特別な実施形態において、すべてのバーコードは一意的である、すなわち、互いに異なるバーコードが装置に供給される。図１Ｄは、反応が行われた後に、反応生成物を各列からプールとして回収できることを示し、この回収は、例えば、回収流体をＣ個の第２入力ラインに供給して、この第２入力ラインの一方の端部における出口から反応生成物を押し出すことによって行う。（当業者であれば、反応生成物は、代案として異なる実施形態で行毎に同様にして回収することができる。）図２は、図１に概略的に描いた装置の写真を示す。
【０１７０】
若干の実施形態において、マトリクス型マイクロ流体装置は、１０００個までもの（及び１０００個を含む）個別細胞又は細胞群の解析を可能にする。細胞は、各捕獲部位で１個又はそれ以上の細胞の捕獲又は隔絶後には、無傷である、又は部分的に若しくは全体的に破壊されるものとすることができる。後者の場合、装置はこの機能性を発揮するよう構成する（図１１参照）。幾つかの実施形態において、装置は少なくとも一方の表面を透明にし、細胞数又は表現型を可視化するための撮像を可能にする（この場合、細胞又はそれらの内容物は光学的に検出可能な標識と反応しているものとする）。幾つかの実施形態において、装置は、Ｘ-Ｙ組合せバーコード付けを実施するよう構成し、これにより反応生成物は、１つ以上のプールに送出され（プールそれ自体はためられる）、その後多重的に（例えば、増幅により）解析され、これに続いて特定反応生成物に特定捕獲部位を割り当てる「多重分離（de-multiplexing）」（「demux」）を行う。このタイプのバーコード化を図１に示し、各列に送給される３′バーコードの同一セット（図１Ｂにおける「３′ＢＣ」）及び各行に送給される５′バーコードの同一セット（図１Ｃにおける「５′ＢＣ」）を示す。
【０１７１】
図３は、このような装置における単一細胞を捕獲するのに適した例示的捕獲形体の顕微鏡写真、並びに捕獲した細胞からの反応生成物に行及び列毎にバーコードを付加する方法の例示的フローチャートを示す。図４Ａは、徐々により小型にされる一連の捕獲形体を示し、これら一連の捕獲形体は、チップあたりより多くの細胞を解析するのを容易にする。図４Ｂは、行及び列における捕獲形体の配列、並びに細胞を捕獲形体に分配するためのチャンネルを示す。図４Ｃは、小型にされていく捕獲形体の顕微鏡写真を示す。
【０１７２】
図４Ｄにおける表は、２種類の異なる捕獲部位設計における細胞占有率データを表し、表の上部パネルは、小型にされていく捕獲形体の結果を示し、表の下部パネルは、上部溝及び下部溝に関して異なる高さ比を持つ溝捕獲形体の結果を示す。図４Ｄにおける表の第１列は細胞のない捕獲形体の数を表し、第２列は単に１個の細胞がある捕獲形体の数を表す。図５は、細胞を捕獲形体に分配するためのチャンネルを含むダブル溝捕獲形体の概略図を示す。このジオメトリ（構成配置）によれば、単位面積あたりの捕獲部位をより多くすることができる。図６Ａはこのような装置における主流路及びバイパスフローにおける流れ抵抗を示し、図６Ｂはそれを概略図として示し、図６Ｃ及びＤはそれを顕微鏡写真で示す。図７Ａはこのような装置におけるバイパス蠕動ポンピング作動を概略図として示し、図７Ｂはそれを顕微鏡写真で示す。図８Ａはこのような装置における主フロー出力の閉鎖を概略図として示し、図８Ｂはそれを顕微鏡写真で示す。図８Ｃにおける表はダブル溝捕獲形体設計に関する細胞占有率データを表し、表の第１列は細胞のない捕獲形体の数を表し、表の第２列は単に１個の細胞がある捕獲形体の数を表す。
【０１７３】
図９は、それぞれが試薬を利用できる４チャンバを有する単位捕獲部位を示す。捕獲形体はこれら４個のチャンバ各個に配置する。使用にあたり、第１試薬を捕獲部位内に底部から頂部に向けて（紫色矢印）装填することができ、第２試薬を捕獲部位内に左から右に向けて（緑色矢印）装填することができる。
【０１７４】
種々の実施形態において、約９７〜約１０００個の個別捕獲部位、特別には約９７〜約９０００個の個別捕獲部位、特別には約９７〜約８０００個の個別捕獲部位、またより特別には約９７〜約７５００個の個別捕獲部位を有するマイクロ流体装置を採用して本明細書に記載の方法のうち１つ以上を行う。幾つかの実施形態において、マイクロ流体装置は、１００より多い個数、２００より多い個数、３００より多い個数、４００より多い個数、５００より多い個数、６００より多い個数、７００より多い個数、８００より多い個数、９００より多い個数、又は１０００より多い個数の捕獲部位を有することができる。
【０１７５】
幾つかの実施形態において、捕獲部位は、約２ｎＬ〜５００ｎＬの範囲にわたる１個又はそれ以上の反応チャンバを有する。反応チャンバの容積が小さくなればなるほど、任意の標的核酸の有効濃度が高くなる。若干の実施形態において、反応チャンバは、約２ｎＬ〜約５０ｎＬ、好適には約２ｎＬ〜約２５ｎＬ、より好適には約４ｎＬ〜約１５ｎＬの範囲における容積である。幾つかの実施形態において、反応チャンバは、５ｎＬ、６ｎＬ、７ｎＬ、８ｎＬ、９ｎＬ、１０ｎＬ、１１ｎＬ、若しくは１２ｎＬ、又はこれら数値のいずれかによって区切られる任意の範囲内に納まる容積である。
【０１７６】
本明細書に記載の仕様に適うマイクロ流体装置、及び本明細書に記載の方法を実施するのにこの装置を採用するシステムは、本明細書のガイダンス及び２０１３年５月１２日に発行されたアンダーソン氏らの米国特許出願公開第２０１３／０３２３７２号のような本願人共有の特許公開刊行物（単一細胞解析方法及びシステムに関するそれらの記述に関して参照により本願明細書に組み入れられるものとする）に基づいて設計及び作製することができる。例えば、フリューダイム社（カリフォルニア州、南サンフランシスコ）から入手可能なＣ１ＴＭ単一細胞オートPrepシステムは、ＩＦＣＴＭにおける単一細胞からの核酸に対する多重化した遊離、溶解、及び反応の卓上オートメーションを提供する。とくに、Ｃ１ＴＭ単一細胞オートPrepアレイＴＭＩＦＣは、９６個の個別細胞の捕獲及び高度に並列化された調製を容易にするマトリクス型マイクロ流体装置である。適切に使用すると、チップ内の各捕獲部位は１個の単一細胞を捕獲する。ときには、部位はゼロ個、２個、又はそれ以上の細胞を捕獲する。しかし、Ｃ１チップの各捕獲した部位における捕獲細胞の正確な数は、顕微鏡写真で高い確かさで容易に検証され、また実証される。幾つかの実施形態において、細胞は捕獲され、またバーコード化は各個別の反応容積において行われ、バーコード化された核酸分子を産生し、これら核酸分子は、最も都合よくはＤＮＡシークエンシングによって解析され、このＤＮＡシークエンシングは、随意的に予増幅後に行うサンガー・シークエンシング、次世代シークエンシング、又は第３世代シークエンシングである。
【０１７７】
キット
本発明によるキットは、本明細書に記載の方法のうち１つ又はそれ以上を実施するのに有用な１つ以上の試薬を含むことができる。キットは、一般的には、１つ以上の個別組成としての、又は随意的に試薬の共存性を可能にする混合物としての試薬を保持する１つ以上の容器を有するパッケージを含む。キットは、さらに、ユーザーの立場から望ましい、緩衝剤、希釈剤、基準剤、又はサンプル処理、洗浄、若しくは検定評価の任意な他のステップに有用な他の物質であり得る他の材料も含むことができる。特別な実施形態において、キットは、上述した１つ若しくはそれ以上のマトリクス型マイクロ流体装置及び／又はプライマー／オリゴヌクレオチド又はそれらの組合せを含むことができる。
【０１７８】
本明細書に記載の実施例及び実施形態は単に説明目的であって、それらを考慮した様々な変更及び変化は当業者に示唆されるであろうし、本願発明の精神及び範囲内、並びに特許請求の範囲内に包含されるものと理解されたい。
【０１７９】
さらに、本明細書に引用されたすべての他の刊行物、特許及び特許出願は、あらゆる目的のため、参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする。
【実施例】
【０１８０】
実施例１：高処理能力（HT）ＩＦＣＴＭ
高処理能力（HT）IFCＴＭを添付図面に示す。HT IFCＴＭにおける１つの態様は、通常IFCＴＭと同一面積における捕獲部位の数の８倍も可能にする変更した（小型化）した捕獲形体を含むことである。
【０１８１】
HT IFCＴＭにおける他の態様は、バーコード多重化を可能にすることであり、またこのバーコード多重化は、以下に説明するような随伴化学構造と組み合わさって、Ｃ１ＴＭシステムにおける現行の単一細胞９６個限界を越えるHT IFCＴＭを可能にする。とくに、HT IFCＴＭは、２つの入力を有する各チャンバを個別にアドレス指定することができ、離散液体付加で少なくとも２つの異なるバーコードを単一細胞に個別付加するのを可能にする。
【０１８２】
実施例２：トランスクリプトーム解析するためのHT IFCＴＭ用随伴化学構造
HT IFCＴＭにおけるバーコード化及び細胞多重分離化を可能にする化学構造は、単一細胞トランスクリプトーム同定（メッセンジャー［ポリ-Ａ］ＲＮＡのための）、従来型の市販逆転写酵素（MuMLVリボヌクレアーゼＨ活量突然変異体）及び従来型Ｔａｑポリメラーゼとともに使用された転写産物の３′末端計数を可能にする修飾オリゴヌクレオチド、並びにNextera ＸＴTMキットのセットを含むことができる。このセットは以下のもののうち、１つ又はそれ以上を含むことができる（図１０を参照されたく、この図１０においては数が以下のオリゴヌクレオチド数に対応する）。
【０１８３】
1.   最低限に、２-ヌクレオチドアンカー配列、ポリ-ｄＴ配列（１８〜３０個のｄＴ）、４〜６個の間におけるヌクレオチドのチャンバ同定バーコード、単一分子同定（ＵＭＩ）用で４〜６個のヌクレオチドの随意的ランダマー、及びタグメンテーション反応後における無作為増幅及び３′末端富化（エンリッチメント）のためのリンカー配列を含む、ｍＲＮＡ転写産物の３′末端に指向するオリゴヌクレオチド（HT IFCＴＭの文脈において「行」バーコードと称されるＲＴプライマー）。
【０１８４】
2.  転写産物の５′末端からのｃＤＮＡ分子の完了及び無作為増幅のためのリンカー付加を可能にするオリゴヌクレオチドであり、このオリゴヌクレオチドは、随意的な４〜５個のヌクレオチドバーコード、並びに５′末端における増幅のためのリンカー配列とともに、単一分子同定（ＵＭＩ）用の随意的な５個のヌクレオチドランダマーを含む。
【０１８５】
3.  ｃＤＮＡの第１ストランドにおけるいずれかの末端に付加されるリンカーの予増幅を容易にするオリゴヌクレオチド。
【０１８６】
4.  フローセル配列の付加中に使用される転写産物の後続タグメンテーション反応における３′末端の富化を可能にする３′末端特異性のオリゴヌクレオチド。転写産物の５′末端を富化するよう５′リンカーに指向する随意的なオリゴヌクレオチドも使用することができる。
【０１８７】
ともに使用されるHT IFCＴＭ及びオリゴヌクレオチドは、個別細胞（送出されたプールによってバーコード化される）用にバーコード化された（行毎に）ｃＤＮＡ材料のヌクレオチドの送出を可能にし、これら個別細胞は、その後第２世代シークエンシングのプラットフォームで使用するためのプールで調製される、又は別の解析をされることができる。本明細書で示した実施形態において、HT IFCＴＭ並びに随伴化学構造は、単一チップ上で照会できる細胞数が最良の現行処理能力に比べて８倍より多く増加するとともに、同時にチップ外でのライブラリ調製反応の数を潜在的に８００個もの単一反応を単に２０個に大幅に低減する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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