(57)【要約】本発明は、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３の機能または活性を模倣するマイクロＲＮＡ模倣化合物を提供する。本発明のマイクロＲＮＡ模倣化合物は、成熟ｍｉＲ−９６配列、成熟ｍｉＲ−１８２配列または成熟ｍｉＲ−１８３配列を含む約（２２）〜約（２６）リボヌクレオチドの第１の鎖；および第１の鎖に実質的に相補的であり、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する配列を含む約（２０）〜約（２４）リボヌクレオチドの第２の鎖を含み、第１の鎖は第２の鎖と比較して３’ヌクレオチドオーバーハングを有する。加えて本発明は、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３の１つまたは複数をコードするポリヌクレオチド（複数可）を含む発現ベクターを提供する。
2018509912.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
成熟ｍｉＲ−９６配列、成熟ｍｉＲ−１８２配列または成熟ｍｉＲ−１８３配列を含む約２２〜約２６リボヌクレオチドの第１の鎖；および
前記第１の鎖に実質的に相補的であり、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する配列を含む約２０〜約２６リボヌクレオチドの第２の鎖
を含む、マイクロＲＮＡ模倣化合物。
【請求項２】
前記第１の鎖が、１つまたは複数の２’フルオロヌクレオチドを有する、請求項１に記載のマイクロＲＮＡ模倣化合物。
【請求項３】
前記第１の鎖が、修飾されたヌクレオチドを有さない、請求項１に記載のマイクロＲＮＡ模倣化合物。
【請求項４】
前記第２の鎖における前記少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドである、請求項１から３のいずれか一項に記載のマイクロＲＮＡ模倣化合物。
【請求項５】
前記第２の鎖が、前記第１の鎖に完全には相補的でない、請求項１から４のいずれか一項に記載のマイクロＲＮＡ模倣化合物。
【請求項６】
前記第２の鎖が、前記第１の鎖と比較して１つ、２つまたは３つのミスマッチを有する、請求項５に記載のマイクロＲＮＡ模倣化合物。
【請求項７】
前記第２の鎖が、その３’または５’末端でコレステロール分子に連結されている、請求項１から６のいずれか一項に記載のマイクロＲＮＡ模倣化合物。
【請求項８】
前記コレステロール分子が、少なくとも６炭素リンカーを通じて前記第２の鎖に連結されている、請求項７に記載のマイクロＲＮＡ模倣化合物。
【請求項９】
前記第１の鎖が、５’末端モノホスフェートを有する、請求項１から８のいずれか一項に記載のマイクロＲＮＡ模倣化合物。
【請求項１０】
前記第１の鎖または前記第２の鎖が、他方の鎖と比較して３’ヌクレオチドオーバーハングを有する、請求項１から９のいずれか一項に記載のマイクロＲＮＡ模倣化合物。
【請求項１１】
前記３’オーバーハングを含む前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合によって連結されている、請求項１から１０のいずれか一項に記載のマイクロＲＮＡ模倣化合物。
【請求項１２】
前記３’ヌクレオチドオーバーハングが、２つのリボヌクレオチドを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のマイクロＲＮＡ模倣化合物。
【請求項１３】
前記第１の鎖が、成熟ｍｉＲ−９６配列を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のマイクロＲＮＡ模倣化合物。
【請求項１４】
前記第１の鎖が、配列番号１０の配列を含む、請求項１３に記載のマイクロＲＮＡ模倣化合物。
【請求項１５】
前記第２の鎖が、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３からなる群より選択される配列を含む、請求項１３または１４に記載のマイクロＲＮＡ模倣化合物。
【請求項１６】
前記第１の鎖が、配列番号１０および２６〜２９からなる群より選択される配列を含み、前記第２の鎖が、配列番号１１〜１４および３０〜３４からなる群より選択される配列を含む、請求項１３に記載のマイクロＲＮＡ模倣化合物。
【請求項１７】
前記第１の鎖が、成熟ｍｉＲ−１８２配列を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のマイクロＲＮＡ模倣化合物。
【請求項１８】
前記第１の鎖が、配列番号１５の配列を含む、請求項１７に記載のマイクロＲＮＡ模倣化合物。
【請求項１９】
前記第２の鎖が、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８からなる群より選択される配列を含む、請求項１７または１８に記載のマイクロＲＮＡ模倣化合物。
【請求項２０】
前記第１の鎖が、配列番号１５および３５〜３８からなる群より選択される配列を含み、前記第２の鎖が、配列番号１６〜１９および３９〜４３からなる群より選択される配列を含む、請求項１７に記載のマイクロＲＮＡ模倣化合物。
【請求項２１】
前記第１の鎖が、成熟ｍｉＲ−１８３配列を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のマイクロＲＮＡ模倣化合物。
【請求項２２】
前記第１の鎖が、配列番号２０の配列を含む、請求項２１に記載のマイクロＲＮＡ模倣化合物。
【請求項２３】
前記第２の鎖が、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４からなる群より選択される配列を含む、請求項２１または２２に記載のマイクロＲＮＡ模倣化合物。
【請求項２４】
前記第１の鎖が、配列番号２０および４４〜４７からなる群より選択される配列を含み、前記第２の鎖が、配列番号２１〜２５および４８〜５２からなる群より選択される配列を含む、請求項２１に記載のマイクロＲＮＡ模倣化合物。
【請求項２５】
請求項１から２４のいずれか一項に記載のマイクロＲＮＡ模倣化合物または薬学的に許容されるその塩の治療有効量および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１に記載の少なくとも２つのマイクロＲＮＡ模倣化合物の治療有効量を含む医薬組成物であって、第１のマイクロＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖は成熟ｍｉＲ−９６配列を含み、第２のマイクロＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖は成熟ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３配列を含む、医薬組成物。
【請求項２７】
前記第２のマイクロＲＮＡ模倣化合物の前記第１の鎖が、成熟ｍｉＲ−１８２配列を含む、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
第３のマイクロＲＮＡ模倣化合物をさらに含み、前記第３のマイクロＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖が成熟ｍｉＲ−１８３配列を含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記第１のマイクロＲＮＡ模倣化合物、前記第２のマイクロＲＮＡ模倣化合物および前記第３のマイクロＲＮＡ模倣化合物が、等モル濃度で存在する、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
眼科的状態の処置または予防を必要とする被験体において眼科的状態を処置するまたは予防する方法であって、前記被験体にｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３の少なくとも１つのアゴニストの治療有効量を投与することを含み、前記アゴニストが、成熟ｍｉＲ−９６配列、成熟ｍｉＲ−１８２配列または成熟ｍｉＲ−１８３配列を含む第１の鎖および前記第１の鎖に実質的に相補的である配列を含む第２の鎖を含む二本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記鎖の少なくとも１本が、１つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含む、方法。
【請求項３１】
前記治療有効量が、前記被験体において視力を維持または改善するために十分な量である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記治療有効量が、前記被験体において光受容体細胞の損傷および／または死を低下させるまたは予防するために十分な量である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の鎖が、約２２〜約２６ヌクレオチドの長さであり、前記第２の鎖が、約２０〜約２６ヌクレオチドの長さである、請求項３０から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１の鎖が、１つまたは複数の２’フルオロヌクレオチドを有する、請求項３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記第２の鎖が、１つまたは複数の２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドを有する、請求項３０から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記第２の鎖が、前記第１の鎖と比較して１つ、２つまたは３つのミスマッチを有する、請求項３０から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１の鎖または前記第２の鎖が、他方の鎖と比較して３’ヌクレオチドオーバーハングを有する、請求項３０から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記３’オーバーハングを含む前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合によって連結されている、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記３’ヌクレオチドオーバーハングが、２つのリボヌクレオチドを含む、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第２の鎖が、その３’または５’末端でコレステロール分子に連結されている、請求項３０から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記コレステロール分子が、少なくとも６炭素リンカーを通じて前記第２の鎖に連結されている、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記アゴニストが、ｍｉＲ−９６アゴニストであり、前記二本鎖オリゴヌクレオチドの前記第１の鎖が、成熟ｍｉＲ−９６配列を含む、請求項３０から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１の鎖が、配列番号１０および２６〜２９からなる群より選択される配列を含み、前記第２の鎖が、配列番号１１〜１４および３０〜３４からなる群より選択される配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記アゴニストが、ｍｉＲ−１８２アゴニストであり、前記二本鎖オリゴヌクレオチドの前記第１の鎖が、成熟ｍｉＲ−１８２配列を含む、請求項３０から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１の鎖が、配列番号１５および３５〜３８からなる群より選択される配列を含み、前記第２の鎖が、配列番号１６〜１９および３９〜４３からなる群より選択される配列を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記アゴニストが、ｍｉＲ−１８３アゴニストであり、前記二本鎖オリゴヌクレオチドの前記第１の鎖が、成熟ｍｉＲ−１８３配列を含む、請求項３０から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記第１の鎖が、配列番号２０および４４〜４７からなる群より選択される配列を含み、前記第２の鎖が、配列番号２１〜２５および４８〜５２からなる群より選択される配列を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記被験体にｍｉＲ−１８２アゴニストを投与することをさらに含み、前記ｍｉＲ−１８２アゴニストが成熟ｍｉＲ−１８２配列を含む第１の鎖および前記第１の鎖に実質的に相補的である配列を含む第２の鎖を含む二本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記鎖の少なくとも１本が１つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
前記被験体にｍｉＲ−１８３アゴニストを投与することをさらに含み、前記ｍｉＲ−１８３アゴニストが成熟ｍｉＲ−１８３配列を含む第１の鎖および前記第１の鎖に実質的に相補的である配列を含む第２の鎖を含む二本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記鎖の少なくとも１本が１つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項４２または４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ｍｉＲ−９６アゴニスト、前記ｍｉＲ−１８２アゴニストおよび前記ｍｉＲ−１８３アゴニストが、別々の組成物中で前記被験体に投与される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ｍｉＲ−９６アゴニスト、前記ｍｉＲ−１８２アゴニストおよび前記ｍｉＲ−１８３アゴニストが、同じ組成物中で前記被験体に投与される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記ｍｉＲ−９６アゴニスト、前記ｍｉＲ−１８２アゴニストおよび前記ｍｉＲ−１８３アゴニストが、等モル濃度で前記組成物中に存在する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記少なくとも１つのアゴニストが、前記被験体の眼に投与される、請求項３０から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記眼への投与が、硝子体内、眼周囲、腔内、結膜下または経強膜投与を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記被験体が、網膜色素変性症を有する、請求項３０から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記被験体が、夜盲症の徴候を有する、請求項３０から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記被験体が、網膜剥離、網膜変性、黄斑変性症およびシュタルガルト病からなる群より選択される眼科的状態を有する、請求項３０から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記治療有効量が、前記被験体の光受容体細胞中の１つまたは複数の光伝達遺伝子の発現を増加させるために十分な量である、請求項３０から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記１つまたは複数の光伝達遺伝子が、リカバリン（Ｒｅｖｒｎ）、ＮＲＬ、アレスチン（Ｓａｇ）、ロドプシン（Ｒｈｏ）、トランスデューシン（Ｇｎａｔ２）およびホスデューシン（ＰＤＣ）から選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
被験体にｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３の少なくとも１つのアゴニストの治療有効量を投与することを含む、耳の障害の処置または予防を必要とする前記被験体において耳の障害を処置するまたは予防する方法であって、前記アゴニストが成熟ｍｉＲ−９６配列、成熟ｍｉＲ−１８２配列または成熟ｍｉＲ−１８３配列を含む第１の鎖および前記第１の鎖に実質的に相補的である配列を含む第２の鎖を含む二本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記鎖の少なくとも１本が１つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含む、方法。
【請求項６１】
前記耳の障害が、難聴、耳鳴り、メニエール病および耳の感染症からなる群より選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
哺乳動物細胞における発現のための、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項６３】
ウイルス発現ベクターである、請求項６２に記載の発現ベクター。
【請求項６４】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項６３に記載の発現ベクター。
【請求項６５】
前記アデノ随伴ウイルスベクターが、自己相補的アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項６３に記載の発現ベクター。
【請求項６６】
前記アデノ随伴ウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群より選択される、請求項６４または６５に記載の発現ベクター。
【請求項６７】
配列番号５３〜５５からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項６２に記載の発現ベクター。
【請求項６８】
被験体にｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３をコードする発現ベクターの有効量を投与することを含む、眼科的状態または耳の状態の処置または予防を必要とする前記被験体において、眼科的状態または耳の状態を処置するまたは予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１５年３月１６日に出願された米国仮出願第６２／１３３，５９０号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）への優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３の機能または活性を模倣するマイクロＲＮＡ模倣化合物を提供する。本発明は、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３の１つまたは複数をコードするポリヌクレオチド（複数可）を含む発現ベクターも提供する。本発明は、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／もしくはｍｉＲ−１８３模倣化合物またはｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／もしくはｍｉＲ−１８３をコードする発現ベクターを含む組成物ならびにマイクロＲＮＡ模倣化合物またはそれをコードする発現ベクターを使用して眼科的および耳の状態を処置する方法をさらに提供する。
【背景技術】
【０００３】
マイクロＲＮＡは、遺伝子発現の転写後リプレッサーとして作用する小さい、内在性、非コードＲＮＡである。マイクロＲＮＡは発生中および成体の網膜において固有の発現プロファイルを有し、網膜の正常な発生および機能に関与している（Ｒｙａｎら、Ｍｏｌ  Ｖｉｓ１２巻：１１７５〜１１８４頁、２００６年；Ｘｕら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２巻（３４号）：２５０５３〜２５０６６頁、２００７年）。ｍｉＲＮＡは、網膜変性マウスモデルの網膜において調節不全にされており、網膜変性へのそれらの関与の可能性を示唆している（Ｌｏｓｃｈｅｒら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  ８巻（１１号）：Ｒ２４８、２００７年；Ｌｏｓｃｈｅｒら、Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  ８７巻（６号）：５２９〜５３４頁  ２００８年）。ダイサー、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩエンドヌクレアーゼの条件的不活性化は、サイトゾルにおけるｍｉＲＮＡ成熟のために必要であり、マウス網膜では網膜分化の変化および眼杯のパターン形成、細胞死の増加および網膜神経節細胞の軸索の組織崩壊を生じ（ＰｉｎｔｅｒおよびＨｉｎｄｇｅｓ、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ５巻（４号）：ｅ１００２１、２０１０年；ＤａｖｉｓおよびＡｓｈｅｒｙ−Ｐａｄａｎ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３８巻（１号）：１２７〜１３８頁、２０１１年；ＧｅｏｒｇｉおよびＲｅｈ、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３０巻（１１号）：４０４８〜４０６１頁、２０１０年）、ｍｉＲＮＡは、哺乳動物の網膜の正常な発生および機能のために重要であることを示唆している。しかし網膜における個々のｍｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ機能は未だほとんど不明である。
マイクロＲＮＡ−１８３／９６／１８２クラスターは、網膜および他の感覚器官において発現される。ｍｉＲ−１８３／９６／１８２クラスターのノックアウトマウスモデルは、発生中のクラスターの不活性化が光受容体の早期発症で進行性のシナプス欠損ならびに進行性網膜変性を生じることを示した（Ｌｕｍａｙａｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、１１０巻（６号）：Ｅ５０７〜１６頁、２０１３年）。一方、ｍｉＲ−１８３／９６／１８２クラスター中の３つ全てのｍｉＲＮＡの活性が低下しているトランスジェニック抗ｍｉＲＮＡ「スポンジ」マウスモデルは、明るい光が誘発する網膜変性の増加を示した；しかし網膜の組織学的欠陥も機能的欠陥も通常の照明条件下では観察されなかった（Ｚｈｕら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２８６巻（３６号）：３１７４９〜６０頁、２０１１年）。したがって成体網膜におけるｍｉＲ−１８３／９６／１８２クラスターの役割は不明確なままである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｒｙａｎら、Ｍｏｌ  Ｖｉｓ１２巻：１１７５〜１１８４頁、２００６年
【非特許文献２】Ｘｕら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２巻（３４号）：２５０５３〜２５０６６頁、２００７年
【非特許文献３】Ｌｏｓｃｈｅｒら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  ８巻（１１号）：Ｒ２４８、２００７年
【非特許文献４】Ｌｏｓｃｈｅｒら、Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  ８７巻（６号）：５２９〜５３４頁  ２００８年
【非特許文献５】ＰｉｎｔｅｒおよびＨｉｎｄｇｅｓ、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ５巻（４号）：ｅ１００２１、２０１０年
【非特許文献６】ＤａｖｉｓおよびＡｓｈｅｒｙ−Ｐａｄａｎ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３８巻（１号）、１２７〜１３８頁、２０１１年
【非特許文献７】ＧｅｏｒｇｉおよびＲｅｈ、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３０巻（１１号）：４０４８〜４０６１頁、２０１０年
【非特許文献７】Ｌｕｍａｙａｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、１１０巻（６号）：Ｅ５０７〜１６頁、２０１３年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
多数の研究が抗ｍｉＲと呼ばれる一本鎖ｍｉＲＮＡ阻害剤を使用した治療有効性を示す一方で、ｍｉＲＮＡの機能を回復させるまたは増加させるための努力は遅れていた（ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊら、Ｃｉｒ  Ｒｅｓ、１１０巻：４９６〜５０７頁、２０１２年）。現在ｍｉＲＮＡ機能は、ウイルスの過剰発現によって、または合成二本鎖ｍｉＲＮＡを使用することによってのいずれかで増加させ得る。ｉｎ  ｖｉｖｏでのその活性を回復させるために所与のｍｉＲＮＡの発現を駆動するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の使用は、肝細胞癌および肺癌のマウスモデル（ＫａｓｉｎｓｋｉおよびＳｌａｃｋ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、７２巻：５５７６〜５５８７頁、２０１２年；Ｋｏｔａら、Ｃｅｌｌ、１３７巻：１００５〜１０１７頁、２００９年）ならびに球脊髄性筋萎縮症（Ｍｉｙａｚａｋｉら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．、１８巻（７号）：１１３６〜４１頁、２０１２年）において有効であることが示されている。ｍｉＲＮＡレベルを増加させるための合成オリゴヌクレオチドに基づく手法の使用は、まだ十分に調査されていない。本発明は、眼および耳の機能を回復させるためにｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３の活性を模倣する合成オリゴヌクレオチドおよびウイルスで発現させたポリヌクレオチドを提供する。
【０００６】
本発明は、マイクロＲＮＡの機能または活性、具体的にはｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３の機能または活性を模倣するマイクロＲＮＡ模倣化合物を提供する。一部の実施形態では、本発明のマイクロＲＮＡ模倣化合物は、合成オリゴヌクレオチドを含む。他の実施形態では、本発明は、眼または耳の機能障害を処置するための哺乳動物細胞における発現のためにｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３の１つまたは複数をコードするポリヌクレオチド（複数可）を含む発現ベクターを提供する。
【０００７】
ある特定の実施形態では、本発明のマイクロＲＮＡ模倣化合物は、第１の鎖および第２の鎖を含む合成オリゴヌクレオチドを含み、２本の鎖は完全にまたは部分的に相補的である二本鎖領域を形成する。種々の実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖またはアンチセンス鎖は成熟ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３の配列を含み、第２の鎖またはセンス鎖は第１の鎖に実質的に相補的であり、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する配列を含む。
【０００８】
本発明のマイクロＲＮＡ模倣化合物は、成熟、天然に存在するｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３マイクロＲＮＡの機能または活性を模倣し、アンチセンス鎖のヌクレアーゼ消化への抵抗性の増強、アンチセンス鎖をｍｉＲＮＡ誘発サイレンシング複合体（ｍｉＲＩＳＣ）に負荷する能力の改善、および／またはセンス鎖の急速な分解を示す。
【０００９】
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖は、約１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８ヌクレオチドの長さであり、成熟ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３の配列を含み、第２の鎖は約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７ヌクレオチドの長さであり、第１の鎖に実質的に相補的である配列を含み、第２の鎖は少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、第１の鎖は約２２〜約２６ヌクレオチドの長さであり、第２の鎖は約２０〜約２４ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、第１の鎖は約２２〜約２６ヌクレオチドの長さであり、第２の鎖は約２０〜約２６ヌクレオチドの長さである。
【００１０】
一部の実施形態では、本発明のマイクロＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖の配列は、成熟ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３配列と約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、これらの間の値を含んで、同一である。他の実施形態では、第１の鎖の配列は、成熟ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３配列と完全に（１００％）同一である。一部の実施形態では、第１の鎖は、第２の鎖と比較して３’ヌクレオチドオーバーハングを含んでよい。他の実施形態では、第２の鎖は、第１の鎖と比較して３’ヌクレオチドオーバーハングを含んでよい。第１のまたは第２の鎖上の３’オーバーハングは、約１、２、３または４ヌクレオチドを含んでよい。ある特定の実施形態では、３’オーバーハングは約１または２ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、第１のおよび第２の鎖は、同じ数のヌクレオチドを含有する、すなわちいずれの鎖上にもオーバーハングがない。一部の実施形態では、オーバーハングは、第１のまたは第２の鎖の５’末端に存在してよい。
【００１１】
一実施形態では、第２の鎖の配列は、第１の鎖の配列に完全に（１００％）相補的である。別の実施形態では、第２の鎖の配列は、第１の鎖に約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％、これらの間の値を含んで、相補的など実質的に相補的である。さらに別の実施形態では、第２の鎖の配列は、第１の鎖と比較して約１つ、２つ、３つ、４つまたは５つミスマッチを含有してよい。
【００１２】
一部の実施形態では、第１の鎖および／または第２の鎖は、１つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含んでよい。一部の実施形態では、成熟ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３配列を含む第１の鎖は、１つまたは複数の２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドなどの１つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含有する。ある特定の実施形態では、第１の鎖は、少なくとも１つの２’−フルオロヌクレオチドを含有する。一部の実施形態では、第１の鎖の配列に実質的に相補的である配列を含む第２の鎖は、２’−フルオロまたは２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドなどの少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、第２の鎖中の少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドである。
【００１３】
一部の実施形態では、本発明は、成熟ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３配列を含む約２２〜約２６リボヌクレオチドの第１の鎖；および第１の鎖に実質的に相補的であり、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する配列を含む約２０〜約２４リボヌクレオチドの第２の鎖を含むマイクロＲＮＡ模倣化合物であって、第１の鎖が第２の鎖と比較して３’ヌクレオチドオーバーハングを有するマイクロＲＮＡ模倣化合物を提供する。一部の他の実施形態では、本発明は、成熟ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３配列を含む約２２〜約２６リボヌクレオチドの第１の鎖；および第１の鎖に実質的に相補的であり、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する配列を含む約２０〜約２６リボヌクレオチドの第２の鎖を含むマイクロＲＮＡ模倣化合物であって、第１のまたは第２の鎖が３’ヌクレオチドオーバーハングを有するマイクロＲＮＡ模倣化合物を提供する。
【００１４】
本発明は、眼科的または耳の障害の処置のための治療剤としての使用のための哺乳動物細胞における発現のために配置されたｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターをさらに提供する。例えば、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３をコードする配列は、眼または耳の細胞における発現のために適切なプロモーターに近接して配置されており、プロモーターとコード配列とは末端逆位配列によって隣接されている。次いで配列は、ある特定の実施形態では、ヒト細胞において複製できるベクター配列にさらに挿入される。ポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドであってよい。
【００１５】
ある特定の実施形態では、ベクターは、ウイルス発現ベクターである。ある特定の実施形態では、ウイルス発現ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルス発現ベクターは、自己相補的アデノ随伴ウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９などのＡＡＶの単一の血清型に基づく。実質的に単一の血清型に基づく改変ＡＡＶベクターは当技術分野において公知であり、例えばＡＡＶ８様であり、ＡＡＶ８と９３％アミノ酸同一性を共有する血清型ｒｈ．７４が使用できる（例えば本明細書によって参照により組み込まれるＭａｒｔｉｎら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２９６巻：Ｃ４７６〜Ｃ４８８頁、２００９年を参照されたい）。あるいは、アデノ随伴ウイルスベクターは、ＡＡＶの複数の血清型に基づくキメラアデノ随伴ウイルスベクターである。
【００１６】
本発明によって提供される発現ベクターは、本発明のいずれかの方法での使用のための機能性ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３をコードする任意の配列を含んでよい。ある特定の実施形態では、発現ベクターは、配列番号５３〜５５からなる群より選択される核酸配列を含む。
【００１７】
本発明は、本発明のｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３をコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は、細菌細胞または哺乳動物細胞である。細胞は、ポリヌクレオチドが治療介入として送達される細胞であってよい。あるいは、細胞は、眼科的または耳の障害の処置のための医薬組成物の調製のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用される細胞であってよい。
【００１８】
一部の実施形態では、本発明は、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３模倣化合物の少なくとも１つまたはその薬学的に許容される塩および薬学的に許容される担体もしくは賦形剤を含む組成物を提供する。一部の他の実施形態では、本発明は、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３の少なくとも１つをコードする発現ベクターならびに薬学的に許容される担体または賦形剤を含む組成物を提供する。
【００１９】
本発明は、網膜変性または網膜色素変性症などの眼科的状態を処置するまたは予防する方法であって、それを必要とする被験体に本明細書に記載のｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３模倣化合物の少なくとも１つを投与することを含む、方法をさらに提供する。本発明は、それを必要とする被験体に本明細書に記載のｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３模倣化合物の少なくとも１つを投与することを含む、それを必要とする被験体において視力を改善するまたは回復させるための方法も包含する。
【００２０】
本発明は、網膜変性または網膜色素変性症などの眼科的状態を処置するまたは予防する方法であって、それを必要とする被験体にｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３の少なくとも１つをコードする発現ベクターを投与することを含む、方法をさらに提供する。本発明は、それを必要とする被験体にｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３の少なくとも１つをコードする発現ベクターを投与することを含む、それを必要とする被験体において視力を改善するまたは回復させるための方法も包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用するマウス網膜におけるｍｉＲＮＡ模倣物およびＲｈｏ  ｓｉＲＮＡの定量を示す。示されている値は、ｐｍｏｌオリゴ／ｇ網膜組織であり、網膜４つ（マイクロＲＮＡ）または網膜２つ（ｓｉＲＮＡ）を示している。図１ＡはｍｉＲ−１８３模倣物の量を示し、図１ＢはｍｉＲ−９６模倣物の量を示し、図１ＣはｍｉＲ−１８２模倣物の量を示し、図１ＤはＲｈｏ  ｓｉＲＮＡの量を示している。
【００２２】
【図２】図２は、Ｒｈｏ  ｓｉＲＮＡのマウス網膜への機能的送達およびＲｈｏ  ｍＲＮＡの下方制御を示す。実線は検出されたロドプシンｓｉＲＮＡの量（ｎｍｏｌ／ｇ網膜組織）を示し、点線は、未処置の眼（時間０）と比較して網膜において検出されたロドプシンｍＲＮＡの割合を示している。
【００２３】
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、Ｒ−Ｒｅｔ細胞におけるｍｉＲＮＡ模倣物の受動的トランスフェクションの効果を示す。図３Ａは、１０μＭ  ｍｉＲ−２０６模倣物でトランスフェクトされたＲ−Ｒｅｔ細胞のトランスフェクション７２時間後を示しており、図３Ｂは未処置Ｒ−Ｒｅｔ細胞を示している。
【００２４】
【図４】図４は、ｍｉＲ−２０６模倣物でトランスフェクトされたＲ−Ｒｅｔ細胞のアデニル酸キナーゼアッセイの結果を示す。
【００２５】
【図５】図５は、種々の濃度のコレステロールとコンジュゲートしたＲｈｏ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＲ−Ｒｅｔ細胞におけるＲｈｏ  ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析を示す。
【００２６】
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、１μＭオリゴヌクレオチドへの曝露後の光伝達経路に関与する遺伝子のｍＲＮＡ発現プロファイルのリアルタイムＰＣＲ分析を示す。図６Ａは、１μＭオリゴヌクレオチドへの曝露後に上方制御された遺伝子を示している。図６Ｂは、１μＭオリゴヌクレオチドへの曝露後に下方制御された遺伝子を示している。
【００２７】
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、３μＭオリゴヌクレオチドへの曝露後の光伝達経路に関与する遺伝子のｍＲＮＡ発現プロファイルのリアルタイムＰＣＲ分析を示す。図７Ａは、３μＭオリゴヌクレオチドへの曝露後に上方制御された遺伝子を示している。図７Ｂは、３μＭオリゴヌクレオチドへの曝露後に下方制御された遺伝子を示している。
【００２８】
【図８】図８は、図６〜７に示す処置のｌｏｇ２変換平均倍率変化値のヒートマップを示す。
【００２９】
【図９】図９は、網膜色素変性症のマウスモデルにおける視力低下へのプールしたマイクロＲＮＡ模倣物およびＲｈｏ  ｓｉＲＮＡの効果を示す。
【００３０】
【図１０】図１０は、網膜色素変性症のマウスモデルにおける視力低下へのプールしたマイクロＲＮＡ模倣物およびＲｈｏ  ｓｉＲＮＡの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、小さい、約１８〜約２５ヌクレオチドの長さの非タンパク質コードＲＮＡであり、個々のｍｉＲＮＡ遺伝子に、タンパク質をコードする遺伝子のイントロンにまたは複数の密接に関連するｍｉＲＮＡをしばしばコードするポリシストロン転写物に由来する。Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０１巻（５６３１号）：３３６〜３３８頁、２００３年）による総説を参照されたい。ｍｉＲＮＡは、その分解を促進することによってまたは翻訳を阻害することによって標的ｍＲＮＡのリプレッサーとして作用する。
【００３２】
ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ、Ｑｉら、（２００６年）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３巻：４１１〜４１９頁を参照されたい）によって転写され、最初の転写物から生じ、一次ｍｉＲＮＡ転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）と称され、一般に数千塩基長である。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、核においてＲＮａｓｅドローシャによって約７０〜約１００ヌクレオチドヘアピン形前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）にプロセシングされる。細胞質への輸送に続いてヘアピンｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、二本鎖ｍｉＲＮＡを産生するようにダイサーによってさらにプロセシングされる。次いで成熟ｍｉＲＮＡ鎖は、それが塩基対相補性によってその標的ｍＲＮＡと会合するＲＮＡ誘発サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる。ｍｉＲＮＡ塩基がｍＲＮＡ標的に完全に対合する比較的まれな場合では、それはｍＲＮＡ分解を促進する。より一般的にはｍｉＲＮＡは標的ｍＲＮＡと不完全なヘテロ二重鎖を形成し、いずれかのｍＲＮＡ安定性に影響を与えるまたはｍＲＮＡ翻訳を阻害する。
【００３３】
マイクロＲＮＡ−１８３／９６／１８２クラスターは、網膜および他の感覚器官において発現される。このクラスターは、マウスでは第６染色体に、ヒトでは第７染色体に、ラットでは第４染色体に位置する。マウス、ヒトおよびラットでの成熟ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３についての配列は下に示されている。
マウスにおける成熟ｍｉＲ−９６配列（配列番号１）
ＵＵＵＧＧＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡＵＵＵＵＵＧＣＵ
ヒトにおける成熟ｍｉＲ−９６配列（配列番号２）
ＵＵＵＧＧＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡＵＵＵＵＵＧＣＵ
ラットにおける成熟ｍｉＲ−９６配列（配列番号３）
ＵＵＵＧＧＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡＵＵＵＵＵＧＣＵ
マウスにおける成熟ｍｉＲ−１８２配列（配列番号４）
ＵＵＵＧＧＣＡＡＵＧＧＵＡＧＡＡＣＵＣＡＣＡＣＣＧ
ヒトにおける成熟ｍｉＲ−１８２配列（配列番号５）
ＵＵＵＧＧＣＡＡＵＧＧＵＡＧＡＡＣＵＣＡＣＡＣＵ
ラットにおける成熟ｍｉＲ−１８２配列（配列番号６）
ＵＵＵＧＧＣＡＡＵＧＧＵＡＧＡＡＣＵＣＡＣＡＣＣＧ
マウスにおける成熟ｍｉＲ−１８３配列（配列番号７）
ＵＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵＣＡＣＵ
ヒトにおける成熟ｍｉＲ−１８３配列（配列番号８）
ＵＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵＣＡＣＵ
ラットにおける成熟ｍｉＲ−１８３配列（配列番号９）
ＵＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵＣＡＣＵ
【００３４】
マウスにおけるマイクロＲＮＡ−１８３／９６／１８２クラスターのノックアウトは、早期発症および進行性の光受容体のシナプス欠損ならびに進行性網膜変性を生じた（Ｌｕｍａｙａｇら、（２０１３年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、１１０巻（６号））Ｅ５０７〜Ｅ５１６頁）。マイクロＲＮＡ−１８３／９６／１８２クラスターは網膜の発生において役割を演じていることが示されているが；成体においてマイクロＲＮＡ−１８３／９６／１８２クラスターの活性を回復させることまたは補うことが網膜障害を好転または予防できるかどうかはまだ明白でない。
【００３５】
本発明は、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３の活性を模倣するマイクロＲＮＡ模倣化合物の投与が網膜色素変性症のマウスモデルにおいて網膜細胞における光伝達遺伝子の発現を制御し、光受容体細胞の死を予防または低下させ、視力喪失を予防または低下させるという発見に一部基づく。したがって本発明は、眼科的状態を処置するまたは予防するためのマイクロＲＮＡ模倣化合物、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３をコードする発現ベクター、その組成物およびその方法を提供する。本発明は、他の感覚器官、例えば耳の疾患または障害を処置する、改善するまたは予防するためのｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３模倣化合物ならびにｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３をコードする発現ベクターの使用も意図する。
【００３６】
本発明によるマイクロＲＮＡ模倣化合物は、第１の鎖および第２の鎖を含み、第１の鎖は成熟ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３配列を含み、第２の鎖は第１の鎖に実質的に相補的であり、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する配列を含み、マイクロＲＮＡ模倣化合物はｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３マイクロＲＮＡの活性を模倣する。本明細書で使用される場合、「マイクロＲＮＡアゴニスト」という用語は、合成マイクロＲＮＡ模倣化合物またはｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／もしくはｍｉＲ−１８３をコードする発現ベクターを指す。本開示全体を通して「第１の鎖」という用語は、「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」という用語と互換的に使用される場合があり、「第２の鎖」という用語は、「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」という用語と互換的に使用される場合がある。
【００３７】
合成マイクロＲＮＡ模倣化合物
一実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖は、約２０〜約２８ヌクレオチドを含み、第２の鎖は約１８〜約２６ヌクレオチドを含む。種々の実施形態では、第１の鎖は、約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８ヌクレオチドを含んでよく、第２の鎖は約２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチドを含んでよい。ある特定の実施形態では、第１の鎖は成熟ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３の配列を含む約２２〜約２６ヌクレオチドを含み、第２の鎖は第１の鎖に完全にまたは実質的に相補的である配列を含む約２０〜約２４ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、第１の鎖は成熟ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３の配列を含む約２２〜約２６ヌクレオチドを含み、第２の鎖は第１の鎖に完全にまたは実質的に相補的である配列を含む約２０〜約２６ヌクレオチドを含む。
【００３８】
マイクロＲＮＡ模倣化合物の第１のおよび第２の鎖を形成するヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドおよびこれらの組合せを含んでよい。ある特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖および第２の鎖は、リボヌクレオチドおよび／または修飾されたリボヌクレオチドを含む。「修飾されたヌクレオチド」という用語は、核酸塩基および／または糖部分が修飾されていないヌクレオチドと比較して修飾されているヌクレオチドを意味する。
【００３９】
ある特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣化合物は、その配列が成熟ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３配列の全体または一部と同一である「ｍｉＲＮＡ領域」を含む第１の鎖またはアンチセンス鎖、およびその配列がｍｉＲＮＡ領域の配列に約７０％〜約１００％の間で相補的である「相補的領域」を有する第２の鎖またセンス鎖を有する。「ｍｉＲＮＡ領域」という用語は、成熟、天然に存在するｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３配列の配列全体に、少なくとも約７５、８０、８５、９０、９５または１００％、その間の全ての整数を含んで、同一であるｍｉＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖上の領域を指す。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ領域は、マウス、ヒトまたはラットｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３配列などの成熟、天然に存在するｍｉＲＮＡの配列と約または少なくとも約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一である。例えば一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ領域は、マウス、ヒトまたはラットｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３配列などの成熟、天然に存在するｍｉＲＮＡの配列と約または少なくとも約９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９または１００％同一である。あるいは、ｍｉＲＮＡ領域は、配列アライメントアルゴリズムおよび当技術分野において周知の方法によって比較した場合に成熟、天然に存在するｍｉＲＮＡと共通である１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個またはそれ超のヌクレオチド位置を含んでよい。第１の鎖のｍｉＲＮＡ領域の配列が成熟、天然に存在するｍｉＲＮＡの配列と比較してヌクレオチドの修飾を含んでよいことが理解される。例えば、成熟、天然に存在するｍｉＲＮＡ配列が特定の位置にシチジンヌクレオチドを含む場合、模倣化合物の第１の鎖のｍｉＲＮＡ領域は２’−フルオロシチジンなどの修飾されたシチジンヌクレオチドを対応する位置に含んでよく、成熟、天然に存在するｍｉＲＮＡ配列が特定の位置にウリジンヌクレオチドを含む場合、模倣化合物の第１の鎖のｍｉＲＮＡ領域は２’−フルオロ−ウリジン、２’−Ｏ−メチル−ウリジン、５−フルオロウラシルまたは４−チオウラシルなどの修飾されたウリジンヌクレオチドを対応する位置に含んでよい。第１の鎖のｍｉＲＮＡ領域の配列がそのような修飾されたヌクレオチドを含んでいたとしても、修飾されるヌクレオチドが成熟、天然に存在するｍｉＲＮＡ配列中に存在するヌクレオチドと同じ塩基対合能力を有する限り、配列は成熟、天然に存在するｍｉＲＮＡ配列の配列と同一であると依然として見なされる。一部の実施形態では、第１の鎖は、５’末端残基の修飾を含む場合がある。例えば第１の鎖は、５’末端モノホスフェートを有する場合がある。
【００４０】
「相補的領域」という用語は、第１の鎖上のｍｉＲＮＡ領域の配列に少なくとも約７０％相補的であるｍｉＲＮＡ模倣化合物の第２の鎖上の領域を指す。例えば相補的領域は、ｍｉＲＮＡ領域の配列に、少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％、これらの間の全ての値を含んで、相補的である。ある特定の実施形態では、第２の鎖の相補的領域の約１８、１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチドは、第１の鎖に相補的であってよい。一部の実施形態では、第２の鎖の相補的領域は、第１の鎖のｍｉＲＮＡ領域と比較して約１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのミスマッチを含む。すなわち第１の鎖のｍｉＲＮＡ領域と第２の鎖の相補的領域との間の１、２、３、４または５ヌクレオチドまでは、相補的でない場合がある。一実施形態では、ミスマッチは連続しており、バルジを創出する場合がある。別の実施形態では、ミスマッチは連続的でなく、相補的領域全体に分布していてよい。さらに別の実施形態では、１つ、２つ、３つ、または４つまでのミスマッチは、連続していてバルジを創出する場合があり、残りのミスマッチは相補的領域全体に分布している場合がある。
【００４１】
一部の実施形態では、模倣化合物の第１のおよび／または第２の鎖は、鎖の５’または３’末端にオーバーハングを含んでよい。ある特定の実施形態では、第１の鎖は、第２の鎖と比較して３’オーバーハング、すなわち二重鎖領域を超えて伸長する一本鎖領域を含む。一部の実施形態では、第２の鎖は、第１の鎖と比較して３’オーバーハングを含む。第１のまたは第２の鎖の３’オーバーハングは、約１ヌクレオチド〜約４ヌクレオチドまでの範囲であってよい。ある特定の実施形態では、第１のまたは第２の鎖の３’オーバーハングは、１または２ヌクレオチドを含んでよい。一部の実施形態では、３’オーバーハングを含むヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合によって連結される。３’オーバーハングを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドまたはこれらの組合せを含んでよい。ある特定の実施形態では、第１のまたは第２の鎖中の３’オーバーハングは、２つのリボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、第１のまたは第２の鎖中の３’オーバーハングは、２つの修飾されたリボヌクレオチドを含む。さらに他の実施形態では、第１のまたは第２の鎖中の３’オーバーハングは、１つのリボヌクレオチドおよび１つの修飾されたリボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、オーバーハングは、第１のまたは第２の鎖の５’末端に存在してよい。５’オーバーハングは、約１〜４ヌクレオチドを含んでよい。３’オーバーハングと同様に５’オーバーハングは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドまたはこれらの組合せを含んでよい。一部の実施形態では、５’オーバーハングを含むヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合によって連結されている場合がある。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ模倣化合物は、ヘアピン、すなわち５’および３’末端を有し、一本鎖がそれ自体の上に折り返す場合に一方の末端がオーバーハングを生成できる一本鎖ポリヌクレオチドであってよい。これらの実施形態では、一本鎖は、リンカー領域によって分離されてよいｍｉＲＮＡ領域および相補的領域を含む。そのような一本鎖ｍｉＲＮＡ模倣化合物は、より広い範囲の長さ、例えば約５５〜約１００ヌクレオチドを有してよい。一本鎖ｍｉＲＮＡ模倣化合物は、リンカー領域に実質的に対応する不対ループを含有してよい。
【００４２】
マイクロＲＮＡ模倣化合物の第１のまたはアンチセンス鎖が成熟、天然に存在するマイクロＲＮＡの配列全体またはその一部を含んでよく、成熟ｍｉＲＮＡ配列の一部ではない、追加的なヌクレオチドを含んでよいことが上の記載から理解される。例えば、ｍｉＲ−９６の活性を模倣する本発明による模倣化合物の第１の鎖は、配列番号１、２もしくは３の配列全体または、配列番号１、２もしくは３の約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１もしくは２２ヌクレオチドなどの部分配列および成熟ｍｉＲ−９６配列の一部ではない約４〜６までの追加的なヌクレオチドを含んでよい。成熟、天然に存在するマイクロＲＮＡの全体または部分配列および約４〜６までの追加的なヌクレオチドを含む模倣化合物が、マイクロＲＮＡの活性または機能を模倣する能力を依然として維持することも理解される。成熟、天然に存在するマイクロＲＮＡの配列を含む第１の鎖の配列が成熟、天然に存在するマイクロＲＮＡ中に存在するヌクレオチドに対応する修飾されたヌクレオチドを含んでよいことも理解される。
【００４３】
一実施形態では、本発明は、成熟ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３配列を含む約２２〜約２６リボヌクレオチドの第１の鎖；および第１の鎖に実質的に相補的であり、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する配列を含む約２０〜約２４リボヌクレオチドの第２の鎖を含むマイクロＲＮＡ模倣化合物であって、第１の鎖が第２の鎖と比較して３’ヌクレオチドオーバーハングを有するマイクロＲＮＡ模倣化合物を提供する。一部の実施形態では、本発明は、成熟ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３配列を含む約２２〜約２６リボヌクレオチドの第１の鎖；および第１の鎖に実質的に相補的であり、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する配列を含む約２０〜約２６リボヌクレオチドの第２の鎖を含むマイクロＲＮＡ模倣化合物であって、第２の鎖が第２の鎖と比較して３’ヌクレオチドオーバーハングを有するマイクロＲＮＡ模倣化合物を提供する。「実質的に相補的」という用語は、第２の鎖の配列が、第１の鎖の配列に少なくとも約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％、これらの間の値を含んで、相補的である、または第２の鎖の配列が、第１の鎖の配列と比較して約１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つまでのミスマッチを含有することを意味する。
【００４４】
ある特定の実施形態では、本発明によるｍｉＲ−９６模倣化合物は、配列番号１、２、または３の配列を含む約２２〜約２６ヌクレオチドの第１の鎖、および第１の鎖に実質的に相補的であり、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する約２０〜約２４ヌクレオチドの第２の鎖を含み、第１の鎖は第２の鎖と比較して３’ヌクレオチドオーバーハングを有する。一部の実施形態では、第２の鎖は約２０〜約２６ヌクレオチドを含んでよく、第１の鎖と比較して３’または５’ヌクレオチドオーバーハングを含んでよい。本開示全体を通して、列挙する語「配列番号Ｘ、ＹまたはＺの配列」は、天然に存在するヌクレオチドが対応する修飾されたヌクレオチドで置き換えられている全ての配列を包含する。例えば語は、アデノシンが修飾されたアデノシンで置き換えられている；ウリジンが修飾されたウリジン、チミジンもしくは修飾されたチミジンで置き換えられている；グアノシンが修飾されたグアノシンで置き換えられている；またはシチジンが修飾されたシチジンで置き換えられている配列を包含する。
【００４５】
ある特定の実施形態では、本発明によるｍｉＲ−９６模倣化合物は、配列：
５’−ｒＵｒＵｆＵｒＧｒＧｆＣｒＡｆＣｆＵｒＡｒＧｆＣｒＡｆＣｒＡｆＵｆＵｆＵｆＵｆＵｒＧｆＣｆＵｓｒＵｓｒＵ−３’（配列番号１０）を含む第１の鎖および約８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％、これらの間の全ての値を含んで、相補的などの第１の鎖に実質的に相補的である第２の鎖を含む。一実施形態では、ｍｉＲ−９６模倣化合物の第２の鎖は、配列：
５’−ｍＡｍＧｍＣｒＡｒＡｒＡｒＡｍＵｍＵｒＧｒＡｒＧｍＣｍＵｒＡｒＧｍＵｒＧｍＣｒＧｒＡｒＡｒＡ−３’（配列番号１１）を含む。別の実施形態では、ｍｉＲ−９６模倣化合物の第２の鎖は、配列：５’−ｍＡｍＧｍＣｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡｍＵｒＧｍＵｒＧｍＣｍＵｒＡｒＧｍＵｒＧｍＣｍＣｒＡｒＡｒＡ−３’（配列番号１２）を含む。本明細書で使用される場合、塩基表示（例えばＡ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）に先行する「ｍ」は２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドを、塩基表示に先行する「ｒ」は修飾されていないリボヌクレオチド（すなわち、２’−ＯＨ）を、塩基表示に先行する「ｆ」は２’−フルオロヌクレオチドを、そして「ｓ」はホスホロチオエート結合を示す。他に示す場合を除いて、アンチセンスおよびセンス鎖中のヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって連結されている。一部の実施形態では、本発明によるｍｉＲ−９６模倣化合物は、配列番号１０および２６〜２９から選択される配列を含む第１の鎖を含む。一部の実施形態では、本発明によるｍｉＲ−９６模倣化合物は、配列番号１１〜１４および３０〜３４から選択される配列を含む第２の鎖を含む。
【００４６】
ある特定の実施形態では、本発明によるｍｉＲ−９６模倣化合物は、配列番号１、２、３または１０の配列を含む約２２〜約２６リボヌクレオチドの第１の鎖、および第１の鎖に実質的に相補的であり、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する配列を含む約２０〜約２４リボヌクレオチドの第２の鎖を含み、第１の鎖は第２の鎖と比較して３’ヌクレオチドオーバーハングを有する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−９６模倣化合物の第２の鎖は、配列番号１１または１２の配列を含む。一部の実施形態では、本発明によるｍｉＲ−９６模倣化合物は、配列番号１、２、３または１０の配列を含む約２２〜約２６リボヌクレオチドの第１の鎖、および第１の鎖に実質的に相補的であり、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する配列を含む約２０〜約２６リボヌクレオチドの第２の鎖を含み、第２の鎖は第１の鎖と比較して３’または５’ヌクレオチドオーバーハングを有する。
【００４７】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−９６模倣化合物は、配列番号１０の配列を含む約２０〜約２６ヌクレオチドの第１の鎖、および配列番号１１の配列を含む約２０〜約２４ヌクレオチドの第２の鎖を含み、第１の鎖は第２の鎖と比較して３’オーバーハングを有する。別の実施形態では、ｍｉＲ−９６模倣化合物は、配列番号１０の配列を含む約２０〜約２６ヌクレオチドの第１の鎖、および配列番号１２の配列を含む約２０〜約２４ヌクレオチドの第２の鎖を含み、第１の鎖は第２の鎖と比較して３’オーバーハングを有する。さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−９６模倣化合物は、配列番号１０の配列を含む約２０〜約２６ヌクレオチドの第１の鎖、および配列番号１３（５’−ｍＡ．ｍＧ．ｍＣ．ｒＡ．ｒＡ．ｒＡ．ｒＡ．ｍＵ．ｍＵ．ｒＧ．ｒＡ．ｒＧ．ｍＣ．ｍＵ．ｒＡ．ｒＧ．ｍＵ．ｒＧ．ｍＣ．ｒＧ．ｒＡ．ｒＡ．ｒＡ．ｃｈｏｌ６−３’）の配列を含む約２０〜約２４ヌクレオチドの第２の鎖を含み、第１の鎖は第２の鎖と比較して３’オーバーハングを有する。一部の実施形態では、ｍｉＲ−９６模倣化合物の第２の鎖は、約２０〜約２４ヌクレオチドであり、配列番号１４（５’−ｍＡ．ｍＧ．ｍＣ．ｒＡ．ｒＡ．ｒＡ．ｒＡ．ｍＵ．ｍＵ．ｒＧ．ｒＡ．ｒＧ．ｍＣ．ｍＵ．ｒＡ．ｒＧ．ｍＵ．ｒＧ．ｍＣ．ｒＧ．ｒＡ．ｒＡ．ｒＡｓ．ｃｈｏｌ６−３’）の配列を含む。本実施形態では、第２の鎖のオリゴヌクレオチド配列は、ホスホロチオエート結合を介してコレステロール（担体分子）に付着されている。
【００４８】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−９６模倣化合物は、２５、２６、２７または２８ヌクレオチド長以下であり、配列番号１、２、３または１０の配列を含む第１の鎖を含む。一部の他の実施形態では、ｍｉＲ−９６模倣化合物は、２６、２７または２８ヌクレオチド長以下であり、配列番号１、２または３の配列を含む第１の鎖を含み、５’から３’方向で３（Ｕ）位、６（Ｃ）位、８（Ｃ）位、９（Ｕ）位、１２（Ｃ）位、１４（Ｃ）位、１６（Ｕ）位、１７（Ｕ）位、１８（Ｕ）位、１９（Ｕ）位、２０（Ｕ）位、２２（Ｃ）位および／または２３（Ｕ）位のヌクレオチドは、配列番号１、２また３と比較して修飾されている。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−９６模倣化合物は、配列番号１、２、３または１０の配列を有する第１の鎖、ならびに第２の鎖の３’末端からヌクレオチド４位、１３位および／または１６位を除いて第１の鎖に相補的である第２の鎖を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲ−９６模倣化合物の第２の鎖は、配列番号１、２、３または１０の配列に相補的であり、５’から３’方向で１（Ａ）、２（Ｇ）、３（Ｃ）、８（Ｕ）、９（Ｕ）、１３（Ｃ）、１４（Ｕ）、１７（Ｕ）および１９（Ｃ）からなる群より選択される１つまたは複数の位置に修飾されたヌクレオチドを含む。
【００４９】
ある特定の実施形態では、本発明によるｍｉＲ−１８２模倣化合物は、配列番号４、５または６の配列を含む約２２〜約２６ヌクレオチドの第１の鎖、および第１の鎖に実質的に相補的であり、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する第２の鎖を含み、第１の鎖は、第２の鎖と比較して３’ヌクレオチドオーバーハングを有する。一部の実施形態では、第２の鎖は、約２０〜約２６ヌクレオチドを含み得、第１の鎖と比較して３’または５’ヌクレオチドオーバーハングを含み得る。ある特定の実施形態では、本発明によるｍｉＲ−１８２模倣化合物は、配列：５’−ｒＵｒＵｆＵｒＧｒＧｆＣｒＡｒＡｆＵｒＧｒＧｆＵｒＡｒＧｒＡｒＡｆＣｆＵｆＣｒＡｆＣｒＡｆＣｆＵｓｒＵｓｒＵ−３’（配列番号１５）を含む第１の鎖、および約８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％、これらの間の全ての値を含んで、相補的などの第１の鎖に実質的に相補的である第２の鎖を含む。一実施形態では、ｍｉＲ−１８２模倣化合物の第２の鎖は、配列：５’−ｍＡｍＧｍＵｒＧｍＵｒＧｒＡｒＧｒＡｍＵｍＣｒＡｒＡｍＣｍＣｒＡｍＵｍＵｒＧｍＣｒＧｒＡｒＡｒＡ−３’（配列番号１６）を含む。別の実施形態では、ｍｉＲ−１８２模倣化合物の第２の鎖は、配列：５’−ｍＡｍＧｍＵｒＧｍＵｒＧｒＡｒＧｍＵｍＵｍＣｍＵｒＡｍＣｍＣｒＡｍＵｍＵｒＧｍＣｍＣｒＡｒＡｒＡ−３’（配列番号１７）を含む。一部の実施形態では、本発明によるｍｉＲ−１８２模倣化合物は、配列番号１５および３５〜３８から選択される配列を含む第１の鎖を含む。一部の実施形態では、本発明によるｍｉＲ−１８２模倣化合物は、配列番号１６〜１９および３９〜４３から選択される配列を含む第２の鎖を含む。
【００５０】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−１８２模倣化合物は、配列番号４、５、６または１５の配列を含む約２２〜約２６リボヌクレオチドの第１の鎖、および第１の鎖に実質的に相補的であり、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する配列を含む約２０〜約２４リボヌクレオチドの第２の鎖を含み、第１の鎖は第２の鎖と比較して３’ヌクレオチドオーバーハングを有する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−１８２模倣化合物の第２の鎖は、配列番号１６または１７の配列を含む。一部の実施形態では、本発明によるｍｉＲ−１８２模倣化合物は、配列番号４、５、６または１５の配列を含む約２２〜約２６リボヌクレオチドの第１の鎖、および第１の鎖に実質的に相補的であり、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する配列を含む約２０〜約２６リボヌクレオチドの第２の鎖を含み、第２の鎖は第１の鎖と比較して３’または５’ヌクレオチドオーバーハングを有する。
【００５１】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−１８２模倣化合物は、配列番号１５の配列を含む約２２〜約２６ヌクレオチドの第１の鎖、および配列番号１６の配列を含む約２０〜約２４ヌクレオチドの第２の鎖を含み、第１の鎖は第２の鎖と比較して３’オーバーハングを有する。別の実施形態では、ｍｉＲ−１８２模倣化合物は、配列番号１５の配列を含む約２２〜約２６ヌクレオチドの第１の鎖、および配列番号１７の配列を含む約２０〜約２４ヌクレオチドの第２の鎖を含み、第１の鎖は第２の鎖と比較して３’オーバーハングを有する。さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−１８２模倣化合物は、配列番号１５の配列を含む約２２〜約２６ヌクレオチドの第１の鎖、および配列番号１８（５’−ｍＡ．ｍＧ．ｍＵ．ｒＧ．ｍＵ．ｒＧ．ｒＡ．ｒＧ．ｒＡ．ｍＵ．ｍＣ．ｒＡ．ｒＡ．ｍＣ．ｍＣ．ｒＡ．ｍＵ．ｍＵ．ｒＧ．ｍＣ．ｒＧ．ｒＡ．ｒＡ．ｒＡ．ｃｈｏｌ６−３’）の配列を含む約２０〜約２４ヌクレオチドの第２の鎖を含み、第１の鎖は第２の鎖と比較して３’オーバーハングを有する。一部の実施形態では、ｍｉＲ−１８２模倣化合物の第２の鎖は、約２０〜約２４ヌクレオチドであり、配列番号１９（５’−ｍＡ．ｍＧ．ｍＵ．ｒＧ．ｍＵ．ｒＧ．ｒＡ．ｒＧ．ｒＡ．ｍＵ．ｍＣ．ｒＡ．ｒＡ．ｍＣ．ｍＣ．ｒＡ．ｍＵ．ｍＵ．ｒＧ．ｍＣ．ｒＧ．ｒＡ．ｒＡ．ｒＡｓ．ｃｈｏｌ６−３’）の配列を含む。本実施形態では、第２の鎖のオリゴヌクレオチド配列は、ホスホロチオエート結合を介してコレステロール（担体分子）に付着されている。
【００５２】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−１８２模倣化合物は、２６、２７または２８ヌクレオチド長以下であり、配列番号４、５、６または１５の配列を含む第１の鎖を含む。一部の他の実施形態では、ｍｉＲ−１８２模倣化合物は、２７または２８ヌクレオチド長以下であり、配列番号４、５また６の配列を含む第１の鎖を含み、５’から３’方向で３（Ｕ）位、６（Ｃ）位、９（Ｕ）位、１２（Ｕ）位、１７（Ｃ）位、１８（Ｕ）位、１９（Ｃ）位、２１（Ｃ）位、２３（Ｃ）位および／または２４（Ｕ）位のヌクレオチドは、配列番号４、５また６と比較して修飾されている。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−１８２模倣化合物は、配列番号４、５、６または１５の配列を有する第１の鎖、ならびに第２の鎖の３’末端からヌクレオチド４位、１３位および／または１６位を除いて第１の鎖に相補的である第２の鎖を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲ−１８２模倣化合物の第２の鎖は、配列番号４、５、６または１５の配列に相補的であり、５’から３’方向で１（Ａ）、２（Ｇ）、３（Ｕ）、５（Ｕ）、１０（Ｕ）、１１（Ｃ）、１４（Ｃ）、１５（Ｃ）、１７（Ｕ）、１８（Ｕ）および２０（Ｃ）からなる群より選択される１つまたは複数の位置に修飾されたヌクレオチドを含む。
【００５３】
ある特定の実施形態では、本発明によるｍｉＲ−１８３模倣化合物は、配列番号７、８または９の配列を含む約２２〜約２６ヌクレオチドの第１の鎖、および第１の鎖に実質的に相補的であり、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する第２の鎖を含み、第１の鎖は、第２の鎖と比較して３’ヌクレオチドオーバーハングを有する。一部の実施形態では、第２の鎖は、約２０〜約２６ヌクレオチドを含み得、第１の鎖と比較して３’または５’ヌクレオチドオーバーハングを含み得る。ある特定の実施形態では、本発明によるｍｉＲ−１８３模倣化合物は、配列：５’−ｒＵｒＡｆＵｒＧｒＧｆＣｒＡｆＣｆＵｒＧｒＧｆＵｒＡｒＧｒＡｒＡｆＵｆＵｆＣｒＡｆＣｆＵｓｒＵｓｒＵ−３’（配列番号２０）を含む第１の鎖、および約８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％、これらの間の全ての値を含んで、相補的などの第１の鎖に実質的に相補的である第２の鎖を含む。一実施形態では、ｍｉＲ−１８３模倣化合物の第２の鎖は、配列：５’−ｍＡｍＧｍＵｒＧｒＡｒＡｒＡｍＵｍＣｒＡｒＡｍＣｍＣｒＡｒＧｍＵｒＧｍＣｒＧｒＡｍＵｒＡ−３’（配列番号２１）を含む。別の実施形態では、ｍｉＲ−１８３模倣化合物の第２の鎖は、配列：５’−ｍＡｍＧｍＵｒＧｒＡｒＡｍＵｍＵｍＣｍＵｒＡｍＣｍＣｒＡｒＧｍＵｒＧｍＣｍＣｒＡｍＵｒＡ−３’（配列番号２２）を含む。一部の実施形態では、本発明によるｍｉＲ−１８３模倣化合物は、配列番号２０および４４〜４７から選択される配列を含む第１の鎖を含む。一部の実施形態では、本発明によるｍｉＲ−１８３模倣化合物は、配列番号２１〜２５および４８〜５２から選択される配列を含む第２の鎖を含む。
【００５４】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−１８３模倣化合物は、配列番号７、８、９または２０の配列を含む約２２〜約２６リボヌクレオチドの第１の鎖、および第１の鎖に実質的に相補的であり、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する配列を含む約２０〜約２４リボヌクレオチドの第２の鎖を含み、第１の鎖は第２の鎖と比較して３’ヌクレオチドオーバーハングを有する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−１８３模倣化合物の第２の鎖は、配列番号２１または２２の配列を含む。一部の実施形態では、本発明によるｍｉＲ−１８３模倣化合物は、配列番号７、８、９または２０の配列を含む約２２〜約２６リボヌクレオチドの第１の鎖、および第１の鎖に実質的に相補的であり、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する配列を含む約２０〜約２６リボヌクレオチドの第２の鎖を含み、第２の鎖は第１の鎖と比較して３’または５’ヌクレオチドオーバーハングを有する。
【００５５】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−１８３模倣化合物は、配列番号２０の配列を含む約２２〜約２６ヌクレオチドの第１の鎖、および配列番号２１の配列を含む約１８〜約２２ヌクレオチドの第２の鎖を含み、第１の鎖は第２の鎖と比較して３’オーバーハングを有する。別の実施形態では、ｍｉＲ−１８３模倣化合物は、配列番号２０の配列を含む約２２〜約２６ヌクレオチドの第１の鎖、および配列番号２２の配列を含む約１８〜約２２ヌクレオチドの第２の鎖を含み、第１の鎖は第２の鎖と比較して３’オーバーハングを有する。さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−１８３模倣化合物は、配列番号２０の配列を含む約２２〜約２６ヌクレオチドの第１の鎖、および配列番号２３（５’−ｍＡｍＧｍＵｒＧｒＡｒＡｒＡｍＵｍＣｒＡｒＡｍＣｍＣｒＡｒＧｍＵｒＧｍＣｒＧｒＡｍＵｒＡ．ｃｈｏｌ６−３’）または配列番号２４（５’−ｍＡｍＧｍＵｒＧｒＡｒＡｍＵｍＵｍＣｍＵｒＡｍＣｍＣｒＡｒＧｍＵｒＧｍＣｍＣｒＡｍＵｒＡ．ｃｈｏｌ６−３’）の配列を含む約１８〜約２２ヌクレオチドの第２の鎖を含み、第１の鎖は第２の鎖と比較して３’オーバーハングを有する。一実施形態では、ｍｉＲ−１８３模倣化合物の第２の鎖は、配列番号２５（５’−ｍＡｍＧｍＵｒＧｒＡｒＡｒＡｍＵｍＣｒＡｒＡｍＣｍＣｒＡｒＧｍＵｒＧｍＣｒＧｒＡｍＵｒＡｓ．ｃｈｏｌ６−３’）の配列を含む。本実施形態では、第２の鎖のオリゴヌクレオチド配列は、ホスホロチオエート結合を介してコレステロール（担体分子）に付着されている。
【００５６】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−１８３模倣化合物は、２５、２６、２７または２８ヌクレオチド長以下であり、配列番号７、８、９または２０の配列を含む第１の鎖を含む。一部の他の実施形態では、ｍｉＲ−１８３模倣化合物は、２５、２６、２７または２８ヌクレオチド長以下であり、配列番号７、８また９の配列を含む第１の鎖を含み、５’から３’方向で３（Ｕ）位、６（Ｃ）位、８（Ｃ）位、９（Ｕ）位、１２（Ｕ）位、１７（Ｕ）位、１８（Ｕ）位、１９（Ｃ）位、２１（Ｃ）位および／または２２（Ｕ）位のヌクレオチドは、配列番号７、８また９と比較して修飾されている。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−１８３模倣化合物は、配列番号７、８、９または２０の配列を有する第１の鎖、ならびに第２の鎖の３’末端からヌクレオチド４位、１３位および／または１６位を除いて第１の鎖に相補的である第２の鎖を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲ−１８３模倣化合物の第２の鎖は、配列番号７、８、９または２０の配列に相補的であり、５’から３’方向で１（Ａ）、２（Ｇ）、３（Ｕ）、７（Ｕ）、８（Ｕ）、９（Ｃ）、１０（Ｕ）、１２（Ｃ）、１３（Ｃ）、１６（Ｕ）、１８（Ｃ）、１９（Ｃ）および２１（Ｕ）からなる群より選択される１つまたは複数の位置に修飾されたヌクレオチドを含む。
【００５７】
本明細書に開示されている具体的なマイクロＲＮＡ模倣化合物は、下の表１に要約されている。しかし本発明は、これらの具体的な模倣化合物に限定されず、本明細書全体を通して提供される指針に基づいて調製され得る他の模倣化合物も本発明によって包含される。
【表１−１】
2018509912.tif 000003
【表１−２】
2018509912.tif 000004
【００５８】
本発明のマイクロＲＮＡ模倣化合物において使用できる修飾されたヌクレオチドは、塩基修飾または置換を有するヌクレオチドを含んでよい。ＲＮＡ内の天然のまたは修飾されていない塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）（ＤＮＡはチミン（Ｔ）を有する）である。対照的に、修飾された塩基は、複素環式塩基部分とも称され、それらとして、他の合成および天然の核酸塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル誘導体および他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシンおよびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ（５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシンを含む）、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられる。
【００５９】
一部の実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣化合物は、修飾された糖部分を有するヌクレオチドを有し得る。代表的な修飾された糖としては、炭素環式または非環式糖、それらの２’位、３’位または４’位の１つまたは複数に置換基群を有する糖、および、糖の１つまたは複数の水素原子の代わりに置換基を有する糖が挙げられる。ある特定の実施形態では、糖は、２’位に置換基群を有することによって修飾されている。追加の実施形態では、糖は、３’位に置換基群を有することによって修飾されている。他の実施形態では、糖は、４’位に置換基群を有することによって修飾されている。糖がこれらの位置の１つ超に修飾を有してよいこと、またはＲＮＡ分子が１つの位置に糖修飾を有する１つまたは複数のヌクレオチドならびに異なる位置にも糖修飾を有する１つまたは複数のヌクレオチドを有してよいことも意図されている。
【００６０】
ｍｉＲＮＡ模倣化合物中に意図される糖修飾としては、これだけに限定されないが：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルから選択される置換基が挙げられ、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってよい。一部の実施形態では、これらの基は：Ｏ（ＣＨ２）ｘＯＣＨ３、Ｏ（（ＣＨ２）ｘＯ）ｙＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｘＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｘＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｘＯＮＨ２およびＯ（ＣＨ２）ｘＯＮ（（ＣＨ２）ｘＣＨ３）２から選択されてよく、ｘおよびｙは１〜１０である。
【００６１】
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ模倣化合物は、次の：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＯＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノまたは同様の置換基から選択される糖置換基を有する。一実施形態では、修飾としては、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、これは２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても公知）すなわちアルコキシアルコキシ基が挙げられる。別の修飾としては、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、２’−ＤＭＡＯＥとしても公知、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野において２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても公知）、すなわち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２が挙げられる。
【００６２】
追加的な糖置換基としては、アリル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、−Ｏ−アリル、メトキシ（−Ｏ−ＣＨ３）、アミノプロポキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）およびフルオロ（Ｆ）が挙げられる。２’位（２’−）上の糖置換基は、アラビノ（上）位置またはリボ（下）位置にあってよい。１つの２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆである。他の同様の修飾は、糖部分上の他の位置、具体的には３’末端ヌクレオシドまたは２’−５’連結オリゴヌクレオチドの糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位上に作製されてもよい。
【００６３】
ある特定の実施形態では、糖修飾は、２’−Ｏ−アルキル（例えば２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−ハロ（例えば、２’−フルオロ、２’−クロロ、２’−ブロモ）および４’チオ修飾である。例えば、一部の実施形態では、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３模倣化合物の第１の鎖は、１つまたは複数の２’フルオロヌクレオチドを含む。別の実施形態では、模倣化合物の第１の鎖は、修飾されたヌクレオチドを有さない。さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３模倣化合物の第２の鎖は、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドを含む。
【００６４】
本発明のマイクロＲＮＡ模倣化合物の第１のおよび第２の鎖は、１つまたは複数のホスホロチオエート、モルホリノまたはホスホノカルボキシレート結合などの骨格修飾も含む場合がある（本明細書によってその全体が参照により組み込まれる、例えば米国特許第６，６９３，１８７号および同第７，０６７，６４１号を参照されたい）。例えば、一部の実施形態では、３’オーバーハングを第１の鎖に含むヌクレオチドはホスホロチオエート結合によって連結されている。
【００６５】
一部の実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達および安定性を促進するためにステロイド（コレステロール）、ビタミン、脂肪酸、炭水化物もしくはグリコシド、ペプチドまたは他の小分子リガンドなどの担体分子にコンジュゲートされる。好ましくは、担体分子は、リンカーまたはスペーサー基を通じて、マイクロＲＮＡ模倣化合物の第２の鎖にその３’または５’末端で付着される。種々の実施形態では、担体分子は、コレステロール、コレステロール誘導体、コール酸またはコール酸誘導体である。本明細書によってその全体が参照により組み込まれる米国特許第７，２０２，２２７号に開示されている担体分子の使用も想定される。ある特定の実施形態では、担体分子はコレステロールであり、それは第２の鎖の３’または５’末端に少なくとも６炭素リンカーを通じて付着されている。一実施形態では、担体分子は、リンカーを通じて第２の鎖の３’末端に付着されている。種々の実施形態では、リンカーは、実質的に線形の炭化水素部分を含む。炭化水素部分は、約３個〜約１５個の炭素原子を含んでよく、エーテルまたはチオエーテル結合などの比較的非極性の基を通じてコレステロールにコンジュゲートされてよい。ある特定の実施形態では、炭化水素リンカー／スペーサーは、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１５の飽和または不飽和炭化水素鎖（例えばアルキレンまたはアルケニレン）を含む。本明細書によってその全体が参照により組み込まれる、米国付与前公開第２０１２／０１２８７６１号に記載の種々のリンカー／スペーサー基は、本発明において使用できる。
【００６６】
ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３をコードする発現ベクター
ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む発現ベクターは、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３標的の少なくとも１つの発現を制御するように成熟ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３を産生するために、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３のゲノムの状況に存在する隣接配列を含んでまたは含まずに、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３天然コード配列の十分な部分を含む。例えば十分な部分は、約２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ヌクレオチドを、その値および範囲を含んで、含み得る。一実施形態では、十分な部分は、成熟ｍｉＲの配列を少なくとも含有する。ある特定の実施形態では、十分な部分は、ｍｉＲのヘアピン配列を少なくとも含む。ある特定の実施形態では、十分な部分は、全長ｍｉＲを含む。十分な部分は、当技術分野における日常的な方法を使用して決定できる。ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３をコードする配列が、提供されるＲＮＡ配列に相補的であり、相補的ＤＮＡ鎖の場合はＵではなくＴを含むことが理解される。
【００６７】
「ベクター」によって、宿主細胞で複製できる核酸分子、例えばプラスミド、コスミドまたはバクテリオファージが意味される。一実施形態では、ベクターは、宿主細胞での核酸分子の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを有している、組換え的にまたは合成的に生成された核酸構築物である発現ベクターである。典型的には発現は、構成的または誘導性プロモーター、組織好適調節エレメント、末端逆位配列およびエンハンサーを含むある特定の調節エレメントの制御下で生じる。
【００６８】
一実施形態では、発現ベクターは、制御性ＲＮＡ送達のための特に魅力的なプラットフォームであるＡＡＶに基づくベクター系である（Ｆｒａｎｉｃｈら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １６巻、９４７〜９５６頁、２００８年およびＭｃＣａｒｔｙ、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １６巻、１６４８〜１６５６頁、２００８年）。ウイルスベクター中で送達される場合、ｍｉＲＮＡは継続的に転写され、反復投薬の必要を伴わずに標的組織での持続的な高レベル発現を可能にする。加えて、組織特異的プロモーターの使用は、ウイルスの全身性送達を用いてもこの発現を目的の特定の細胞型に限定できる。レトロウイルス送達系と比べて、ＡＡＶなどのＤＮＡウイルスは、ウイルスゲノムが主にエピソームとして存続していることから、挿入変異誘発の危険が実質的に低下している（Ｓｃｈｎｅｐｐら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７巻、３４９５〜３５０４頁、２００３年）。さらに、複数のＡＡＶ血清型が入手可能であることは、目的の多数の組織の効率的な標的化を可能にする（Ｇａｏら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９巻、１１８５４〜１１８５９頁、２００２年；ＭｃＣａｒｔｙ、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １６巻、１６４８〜１６５６頁、２００８年）。最後にＡＡＶの一般的な安全性は、このプラットフォームを使用する既に進行中の臨床試験で十分に考証されている（Ｃａｒｔｅｒ、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １６巻、５４１〜５５０頁、２００５年；Ｍａｇｕｉｒｅら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５８巻、２２４０〜２２４８頁、２００８年；およびＰａｒｋら、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  １３巻、２６５３〜２６５９頁、２００８年）。ＡＡＶベクター技術での近年の進歩としては、治療用遺伝子発現を増強する自己相補的ゲノム、および送達後の効率的な形質導入を促進する非ヒト霊長類ＡＡＶ血清型が挙げられる。それらの小さなサイズのために、制御性ＲＮＡはＡＡＶ媒介性送達に特に適している。
【００６９】
本発明によって提供される発現ベクターは、本発明のいずれかの方法における使用のために機能性ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３をコードする任意の配列を含んでよい。一部の実施形態では、発現ベクターは、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡヘアピンの配列の部分または全体をコードする核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、発現ベクターは、配列番号５３〜５５から選択される核酸配列を含む（表２）。機能性ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３をコードする核酸配列は、単一のクラスターとしてまたは２つもしくは３つの別々のクラスターとして存在してよい。
【表２】
2018509912.tif 000005
【００７０】
本発明は、眼科的および耳の疾患の処置のためにｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２もしくはｍｉＲ−１８３マイクロＲＮＡまたはこれらの任意の組合せの発現を増加させるために有用なポリヌクレオチド治療を提供する。所望の配列をコードする（例えばマイクロＲＮＡをコードする）発現ベクターは、眼科的または耳の疾患を有する被験体の細胞に送達されてよい。核酸分子は、それらが取り込まれ、有利に発現され得、それにより治療有効レベルを達成され得る形態で被験体の細胞に送達されなければならない。
【００７１】
本発明による細胞へのポリヌクレオチドの送達のための方法は、リポソーム、ポリマー、ミクロスフェア、遺伝子治療ベクターおよびネイキッドＤＮＡベクターなどの送達系を使用することを含む。
【００７２】
ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）ベクターを形質導入することは、特にそれらの高い感染効率ならびに安定な組込みおよび発現から体細胞遺伝子治療のために使用できる。例えば、核酸分子をコードするポリヌクレオチドは、レトロウイルスベクターにクローニングされてよく、発現はその内在性プロモーターから、レトロウイルスの末端反復配列から、または目的の標的細胞型に対して特異的なプロモーターから駆動されてよい。使用できる他のウイルスベクターとして、例えばワクチニアウイルス、ウシパピローマウイルスまたは、エプスタイン−バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｎ  Ｖｉｒｕｓ）などのヘルペスウイルスが挙げられる。レトロウイルスベクターは、特に十分に開発されており、臨床設定で使用されている（米国特許第５，３９９，３４６号）。ウイルスベクターは、治療適用のためにそれらが送達される細胞において好ましくは複製能力がない。しかし複製能力のあるウイルスベクターも使用されてよい。
【００７３】
本発明における使用のための好ましいウイルスベクターとしては、キメラＡＡＶベクターを含んで、ＡＡＶベクター、例えばＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、および／または９が挙げられる。複数のＡＡＶ血清型を利用できることは、目的の多数の組織の効率的な標的化を可能にする（Ｇａｏら、２００２年；ＭｃＣａｒｔｙ、２００８年；米国特許公開第２００８０７５７３７号、同第２００８００５０３４３号、同第２００７００３６７６０号、同第２００５００１４２６２号、同第２００４００５２７６４号、同第２００３０２２８２８２号、同第２００３００１３１８９号、同第２００３００３２６１３号および同第２００２００１９０５０号、それぞれ本明細書によって参照により組み込まれる）。好ましい実施形態では、本発明は、例えば、米国特許公開第２００７０１１０７２４号および同第２００４００２９１０６号ならびに米国特許第７，４６５，５８３号および同第７，１８６，６９９号（全てが本明細書によって参照により組み込まれる）に記載の自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶベクターの使用を含む。マイクロＲＮＡを発現するためのＡＡＶを調製するための例示的な方法は、Ｋｎａｂｅｌら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、１０巻（４号）：ｅ０１２４４１１頁、２０１５年およびＸｉｅら、Ｓｅｍｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ、３５巻（１号）：８１〜８８頁、２０１５年（両方が本明細書によって参照により組み込まれる）に記載されている。
【００７４】
非ウイルス手法は、眼科的または耳の疾患を有する患者の細胞への治療用核酸分子の導入のために用いられてもよい。例えば、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３マイクロＲＮＡをコードする発現ベクターは、リポフェクション、リン酸カルシウム共沈澱、電気穿孔、微量注射、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリアミントランスフェクション試薬を用いるトランスフェクション、細胞超音波処理、高速微粒子銃を使用した遺伝子衝突（ｇｅｎｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、および受容体媒介性トランスフェクションの存在下で核酸を投与することによって細胞に導入されてよい。
【００７５】
ポリヌクレオチド治療法における使用のための核酸分子発現は、任意の好適なプロモーター（例えばヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、メタロチオネイン、Ｕ１ａ１  ｓｎＲＮＡ、Ｕ１ｂ２  ｓｎＲＮＡ、ヒストンＨ２およびヒストンＨ３プロモーター）から誘導され、任意の適切な哺乳動物調節エレメントによって制御されてよい。発現は、組織特異的にまたは遍在的に発現されるプロモーターを使用して誘導されてよい。眼科的疾患の処置のために有用な組織特異的プロモーターとしては、これだけに限定されないが、ロドプシンプロモーター、カルシウム結合タンパク質５（ＣＡＢＰ５）プロモーター、および細胞性レチナールアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）プロモーターが挙げられる。所望により特定の細胞型において優先的に遺伝子発現を誘導することが公知であるエンハンサーは、核酸の発現を誘導するために使用できる。使用されるエンハンサーとしては、非限定的に、組織または細胞特異的エンハンサーとして特徴付けられているものが挙げられ得る。
【００７６】
一実施形態では、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３のアゴニストを発現するための発現ベクターは、アゴニストをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターおよびターミネーターを含み、発現されたアゴニストは、ｍｉＲ−９６（配列番号１、２または３）、ｍｉＲ−１８２（配列番号４、５または６）またはｍｉＲ−１８３（配列番号７、８または９）の成熟配列を含む第１の鎖および第１の鎖に実質的に相補的である第２の鎖を含む。別の実施形態では、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３のアゴニストを発現するための発現ベクターは、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターおよびターミネーターを含み、発現されたアゴニストは、成熟ｍｉＲＮＡ配列を含むヘアピンの形態でポリヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３のアゴニストを発現するための発現ベクターは、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３模倣化合物のアンチセンス鎖をコードする第１のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結した第１のプロモーターおよび第１のターミネーターならびにｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３模倣化合物のセンス鎖をコードする第２のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結した第２のプロモーターおよび第２のターミネーターを含む。「作動可能に連結した」または「転写制御下」という句は、本明細書で使用される場合、プロモーターおよびターミネーターが、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始および終了ならびにポリヌクレオチドの発現を制御するために、ポリヌクレオチドとの関連で正しい位置および方向にあることを意味する。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」とは、遺伝子の特異的な転写を開始するために必要な細胞の合成機構、または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。適切なプロモーターとしては、これだけに限定されないが、ＲＮＡ  ｐｏｌ  Ｉ、ｐｏｌ  ＩＩ、ｐｏｌ  ＩＩＩ、およびウイルスプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、およびラウス肉腫ウイルスの末端反復配列）が挙げられる。一実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。網膜細胞特異的プロモーターが特に興味深く、さらに具体的には、桿体および錐体特異的プロモーターである。これらとして、ロドプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、カルシウム結合タンパク質５（ＣＡＢＰ５）プロモーター、細胞性レチナールアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）プロモーター、光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）プロモーター、アレスチンプロモーターおよびロドプシンキナーゼプロモーターが挙げられる。本明細書で使用される場合、「ターミネーター」とは、遺伝子の特異的な転写を停止するために必要な細胞の合成機構、または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。一実施形態では、ポリアデニル化シグナル／ユニットを含む配列は、転写ターミネーターとして作用する。他の転写ターミネーターの使用も意図される。
【００７８】
ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３のアゴニストをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターは、誘導性プロモーターであってよい。誘導性プロモーターは、当技術分野で公知であり、それらとして、これだけに限定されないが、テトラサイクリンプロモーター、メタロチオネインＩＩＡプロモーター、熱ショックプロモーター、ステロイド／甲状腺ホルモン／レチノイン酸応答エレメント、アデノウイルス後期プロモーター、および誘導性マウス乳房腫瘍ウイルスＬＴＲが挙げられる。
【００７９】
処置方法
種々の実施形態では、本発明は、それを必要とする被験体において眼科的状態を処置するまたは予防する方法であって、被験体にｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２、および／またはｍｉＲ−１８３の少なくとも１つのアゴニストの治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、それを必要とする被験体において眼科的状態を処置するまたは予防する方法は、被験体に少なくとも２つのアゴニスト、例えばｍｉＲ−９６およびｍｉＲ−１８２のアゴニスト、ｍｉＲ−９６およびｍｉＲ−１８３のアゴニストまたはｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３のアゴニストの治療有効量を投与することを含む。他の実施形態では、それを必要とする被験体において眼科的状態を処置するまたは予防する方法は、被験体に３つ全てのアゴニスト、すなわちｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３のアゴニストの治療有効量を投与することを含む。一部の実施形態では、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３のアゴニストは、成熟ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３の配列を含有する第１の鎖および第１の鎖に実質的に相補的である配列を含む第２の鎖を含み、少なくとも１本の鎖が１つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチドである。本明細書に記載のいずれかのマイクロＲＮＡ模倣化合物は、それを必要とする被験体において眼科的状態を処置するまたは予防する方法において使用できる。一部の実施形態では、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３のアゴニストは、成熟ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３を産生するためにｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３天然コード配列の十分な部分をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターである。一実施形態では、発現ベクターは、組換えＡＡＶベクターである。
【００８０】
「治療有効量または用量」は、有益なまたは所望の臨床結果を生じさせるために十分な量である。例えばｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３のマイクロＲＮＡ模倣化合物の治療有効量は、視力を維持するもしくは改善するために十分である量または視力喪失を減少させるもしくは予防するために十分である量または光受容体細胞死を減少させるもしくは予防するために十分である量を含む。別の実施形態では、治療有効量は、被験体の光受容体細胞中の１つまたは複数の光伝達遺伝子の発現を増加させるために十分である量である。
【００８１】
ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３のアゴニストの１つまたは複数を投与することによって処置できる眼科的状態は、光受容体細胞の損傷および／または死によって生じる任意の状態を含む。「光受容体細胞」という用語は、桿体、錐体、神経節細胞および眼に存在する他の細胞（例えば網膜細胞）を含む。ある特定の実施形態では、光受容体細胞の損傷または死によって生じる眼科的状態としては、網膜剥離、黄斑変性症、シュタルガルト病、網膜変性、網膜色素変性症、夜盲症、網膜毒性、ブドウ膜メラノーマ、交感性眼炎および網膜症が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明により処置できる眼科的状態は、網膜変性である。一実施形態では、本発明により処置できる眼科的状態は、網膜色素変性症である。別の実施形態では、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３のアゴニストでの処置を必要とする被験体は、夜盲症の徴候を有する場合がある。
【００８２】
種々の実施形態では、被験体へのｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３の少なくとも１つのアゴニストの投与は、１つまたは複数の眼科的状態の発生および／または進行を予防するまたは遅らせ、これらの状態に関連する１つまたは複数の症状の改善をもたらす。例えば一実施形態では、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３の少なくとも１つのアゴニストの投与は、視力の改善をもたらす。別の実施形態では、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３の少なくとも１つのアゴニストの投与は、夜盲症の徴候を低下させる。さらに別の実施形態では、少なくとも２つのアゴニスト、例えばｍｉＲ−９６およびｍｉＲ−１８２のアゴニスト、ｍｉＲ−９６およびｍｉＲ−１８３のアゴニストまたはｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３のアゴニストの投与は、視力の改善をもたらす。さらに別の実施形態では、３つ全てアゴニスト、すなわちｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３のアゴニストの投与は、視力の改善をもたらす。
【００８３】
ある特定の実施形態では、本発明は、被験体にｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３の少なくとも１つのアゴニストを投与することを含む、それを必要とする被験体において視力を好転させるまたは回復させるための方法を提供する。本発明より、それを必要とする被験体へのｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３の少なくとも１つのアゴニストの全身性、局部または局所投与は、被験体の桿体、錐体、ミューラー細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞および／または神経節細胞などの種々の眼細胞でのｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２、および／またはｍｉＲ−１８３の活性の増加を生じる。
【００８４】
一実施形態では、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３の少なくとも１つのアゴニストの投与は、桿体および錐体および／もしくは他の網膜細胞などの光受容体細胞の機能を維持するもしくは改善する、視力を維持するもしくは改善する、光受容体細胞の死を低下させるもしくは予防するならびに／または視力喪失を低下させるもしくは予防する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３の少なくとも１つのアゴニストの投与は、被験体の光受容体細胞中の１つまたは複数の光伝達遺伝子の発現を維持するまたは増加させる。ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３の少なくとも１つのアゴニストの投与で上方制御される場合がある１つまたは複数の光伝達遺伝子としてはリカバリン（Ｒｅｖｒｎ）、ＮＲＬ、アレスチン（Ｓａｇ）、ロドプシン（Ｒｈｏ）、トランスデューシン（Ｇｎａｔ２）およびホスデューシン（ＰＤＣ）が挙げられる。
【００８５】
一実施形態では、被験体における視力喪失、視力および／または網膜変性は、視運動追跡（ｏｐｔｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｔｒａｃｋｉｎｇ）（ＯＫＴ）、網膜電図検査（ＥＲＧ）、平均空間頻度閾値（ｍｅａｎ  ｓｐａｔｉａｌ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（ＳＦＴ）ならびに網膜の内顆粒層および外顆粒層の厚さの測定などの検査を使用して測定される。別の実施形態では、被験体の視力は、糖尿病性網膜症の早期治療研究（「ＥＴＤＲＳ」）または加齢性眼疾患研究（「ＡＲＥＤＳ」）プロトコールなどのプロトコールを使用して決定される。一部の実施形態では、視力は、Ｆｅｒｒｉｓら、Ａｍ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  ９４巻：９１〜９６頁、１９８２年に記載の視力の測定などの改変ＥＴＤＲＳおよび／またはＡＲＥＤＳプロトコールを使用して測定される。一実施形態では、被験体の視力は、次の手順：（１）必要な顕性屈折での最高矯正視力（ＢＣＶＡ）の測定；（２）条件顕性屈折での矯正視力の測定；または（３）顕性屈折を伴わない矯正視力の測定、の１つまたは複数によって決定される。本発明の種々の態様では、それを必要とする被験体へのｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３の少なくとも１つのアゴニストの投与は、これらの眼検査の１つまたは複数でのスコアの改善をもたらす。一部の実施形態では、被験体への少なくとも２つのアゴニスト、例えばｍｉＲ−９６およびｍｉＲ−１８２のアゴニスト、ｍｉＲ−９６およびｍｉＲ−１８３のアゴニストまたはｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３のアゴニストの投与は、眼検査の１つまたは複数でのスコアの改善をもたらす。一部の他の実施形態では、被験体への３つ全てのアゴニスト、すなわちｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３のアゴニストの投与は、眼検査の１つまたは複数でのスコアの改善をもたらす。例えば一実施形態では、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３のアゴニストの少なくとも１つ、少なくとも２つまたは３つ全ての投与の際に被験体は、視力検査の標準的チャート、例えばＥＴＤＲＳチャートでの視力における３列、４列または５列より多くの改善（ｇａｉｎ）を有する。別の実施形態では、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３のアゴニストの少なくとも１つ、少なくとも２つまたは３つ全ての投与は、視力検査の標準的チャート、例えば糖尿病性網膜症の早期治療研究チャート（「ＥＴＤＲＳチャート」）の１個または複数の追加的な、一部の実施形態では、３個またはそれ超の追加的な、および一部の実施形態では、１５個またはそれ超の追加的な文字を読む被験体の能力をもたらす。
【００８６】
一部の実施形態では、本発明は、被験体にｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３の少なくとも１つのアゴニストの治療有効量を投与することを含む、それを必要とする被験体において他の感覚器官の疾患または障害を処置するまたは予防する方法を提供する。例えば、一実施形態では、本発明は、難聴、耳鳴り、メニエール病、耳感染症またはこれらの状態によって耳に生じる損傷などの耳の疾患または障害を処置するまたは予防する方法を提供する。一部の実施形態では、それを必要とする被験体において耳の障害を処置するまたは予防する方法は、被験体に少なくとも２つのアゴニスト、例えばｍｉＲ−９６およびｍｉＲ−１８２のアゴニスト、ｍｉＲ−９６およびｍｉＲ−１８３のアゴニストまたはｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３のアゴニストの治療有効量を投与することを含む。他の実施形態では、それを必要とする被験体において耳の障害を処置するまたは予防する方法は、被験体に３つ全てのアゴニスト、すなわちｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３のアゴニストの治療有効量を投与することを含む。一部の実施形態では、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３のアゴニストは、成熟ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３の配列を含有する第１の鎖および第１の鎖に実質的に相補的である配列を含む第２の鎖を含み、少なくとも１本の鎖が１つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチドである。本明細書に記載のいずれかのマイクロＲＮＡ模倣化合物は、それを必要とする被験体において耳の障害を処置するまたは予防する方法において使用できる。一部の実施形態では、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３のアゴニストは、成熟ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３を産生するためにｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３天然コード配列の十分な部分をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターである。一実施形態では、発現ベクターは、組換えＡＡＶベクターである。
【００８７】
種々の実施形態では、被験体へのｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３の少なくとも１つのアゴニストの投与は、１つまたは複数の耳の障害の発生および／または進行を予防するまたは遅らせ、これらの状態に関連する１つまたは複数の症状の改善をもたらす。例えば一実施形態では、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３の少なくとも１つのアゴニストの投与は、聴力の改善をもたらす。別の実施形態では、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｍｉＲ−１８３の少なくとも１つのアゴニストの投与は、耳の感覚細胞の機能を改善する。さらに別の実施形態では、少なくとも２つのアゴニスト、例えばｍｉＲ−９６およびｍｉＲ−１８２のアゴニスト、ｍｉＲ−９６およびｍｉＲ−１８３のアゴニストまたはｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３のアゴニストの投与は、聴力および／または耳の細胞の機能の改善をもたらす。さらに別の実施形態では、３つ全てのアゴニスト、すなわちｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３のアゴニストの投与は、聴力および／または耳の細胞の機能の改善をもたらす。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「被験体」または「患者」という用語は、限定せずに述べると、ヒトおよび他の霊長動物（例えば、チンパンジーおよび他の類人猿ならびにサル種）を含む、任意の脊椎動物、農場動物（例えば、畜牛、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマ）、愛玩用哺乳動物（例えば、イヌおよびネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、およびモルモットなどの齧歯動物）、および鳥類（例えば、愛玩用鳥類、野生鳥類、ならびにニワトリなどの闘鶏用鳥類、シチメンチョウ、および他の家禽、カモ、ガチョウなど）を指す。いくつかの実施形態では、被験体は、哺乳動物である。他の実施形態では、被験体は、ヒトである。
【００８９】
医薬組成物
本発明は、本発明によるｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３のアゴニストの１つまたは複数の治療有効量ならびに薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物も提供する。一実施形態では、本発明は、本発明によるｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／もしくはｍｉＲ−１８３の１つもしくは複数の合成マイクロＲＮＡ模倣化合物またはその薬学的に許容される塩の治療有効量ならびに薬学的に許容される担体もしくは賦形剤を含む医薬組成物を提供する。他の実施形態では、本発明は、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３をコードする１つまたは複数の発現ベクターならびに薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物であって、発現ベクターの量がｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３の治療有効量を提供する、医薬組成物を提供する。
【００９０】
「薬学的に許容される塩」という用語は、開示されているｍｉＲＮＡ模倣化合物などの化合物と、そのアニオンが、またはそのカチオンが一般にヒトでの消費のために適切であると考えられる酸または塩基とを組み合わせることによって調製される塩を指す。開示されている化合物の適切な薬学的に許容される酸付加塩としては、塩酸、臭化水素酸、フッ化水素酸、ホウ酸、フルオロホウ酸、リン酸、メタリン酸、硝酸、炭酸、スルホン酸および硫酸などの無機酸ならびに酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グリコール酸、イソチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、コハク酸、トルエンスルホン酸、酒石酸およびトリフルオロ酢酸などの有機酸由来のものが挙げられる。
【００９１】
適切な有機酸としては、例えば有機酸の脂肪族、脂環式、芳香族、芳香脂肪族（ａｒａｌｉｐｈａｔｉｃ）、複素環（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌｉｃ）、カルボン酸およびスルホン酸類が一般に挙げられる。適切な有機酸の具体的な例としては、酢酸、トリフルオロ酢酸、ギ酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、ジグルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、ステアリン酸、サリチル酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸（パモ酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トルエンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、アルギン酸（ａｌｇｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、β−ヒドロキシ酪酸、ガラクタル酸、ガラクツロン酸、アジピン酸、アルギン酸、酪酸、カンファー酸、カンファースルホン酸、シクロペンタンプロピオン酸、ドデシル硫酸、グリコヘプタン酸、グリセロリン酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、ニコチン酸、２−ナフタレンスルホン酸（２−ｎａｐｈｔｈａｌｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、シュウ酸、パルモ酸（ｐａｌｍｏａｔｅ）、ペクチン酸（ｐｅｃｔｉｎａｔｅ）、３−フェニルプロピオン酸、ピクリン酸、ピバル酸、チオシアン酸、トシル酸およびウンデカン酸が挙げられる。
【００９２】
さらに、開示されている化合物が酸性部分を有する場合、適切なそれらの薬学的に許容される塩としては、アルカリ金属塩、例えば、ナトリウムまたはカリウム塩；アルカリ土類金属塩、例えばカルシウムまたはマグネシウム塩；および適切な有機リガンドと形成された塩、例えば四級アンモニウム塩が挙げられ得る。一部の形態では、塩基性塩は、アルミニウム、アルギニン、ベンザチン、コリン、ジエチルアミン、ジオールアミン、グリシン、リシン、メグルミン、オラミン、トロメタミンおよび亜鉛塩を含む無毒性塩を形成する塩基から形成される。
【００９３】
有機塩は、トロメタミン、ジエチルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）およびプロカインなどの二級、三級または四級アミン塩から作られてよい。塩基性窒素含有基は、低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）ハロゲン化物（例えば、塩化、臭化およびヨウ化メチル、エチル、プロピルおよびブチル）、硫酸ジアルキル（例えば、硫酸ジメチル、ジエチル、ジブチルおよびジアミル）、長鎖ハロゲン化物（例えば、塩化、臭化およびヨウ化デシル、ラウリル、ミリスチルおよびステアリル）、アリールアルキルハロゲン化物（例えば、臭化ベンジルおよびフェネチル）などの薬剤で四級化されてよい。一部の形態では、酸および塩基のヘミ塩（ｈｅｍｉｓａｌｔ）も形成されてよい、例えばヘミ硫酸およびヘミカルシウム塩。ある特定の実施形態では、本模倣化合物の薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩を含む。
【００９４】
一実施形態では、医薬組成物は、ｍｉＲ−９６模倣化合物の治療有効量および薬学的に許容される担体または賦形剤を含み、模倣化合物の第１の鎖は成熟ｍｉＲ−９６配列を含み、第２の鎖は第１の鎖に実質的に相補的である。別の実施形態では、医薬組成物は、ｍｉＲ−１８２模倣化合物の治療有効量および薬学的に許容される担体または賦形剤を含み、模倣化合物の第１の鎖は成熟ｍｉＲ−１８２配列を含み、第２の鎖は第１の鎖に実質的に相補的である。さらに別の実施形態では、医薬組成物は、ｍｉＲ−１８３模倣化合物の治療有効量および薬学的に許容される担体または賦形剤を含み、模倣化合物の第１の鎖は成熟ｍｉＲ−１８３配列を含み、第２の鎖は第１の鎖に実質的に相補的である。
【００９５】
一部の実施形態では、医薬組成物は、本発明の少なくとも２つのマイクロＲＮＡ模倣化合物の治療有効量および薬学的に許容される担体または賦形剤を含み、第１のマイクロＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖は成熟ｍｉＲ−９６配列を含み、第２のマイクロＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖は成熟ｍｉＲ−１８２配列を含む。一部の他の実施形態では、医薬組成物は、本発明の少なくとも２つのマイクロＲＮＡ模倣化合物の治療有効量および薬学的に許容される担体または賦形剤を含み、第１のマイクロＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖は成熟ｍｉＲ−９６配列を含み、第２のマイクロＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖は成熟ｍｉＲ−１８３配列を含む。さらに一部の他の実施形態では、医薬組成物は、本発明の少なくとも２つのマイクロＲＮＡ模倣化合物の治療有効量および薬学的に許容される担体または賦形剤を含み、第１のマイクロＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖は成熟ｍｉＲ−１８２配列を含み、第２のマイクロＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖は成熟ｍｉＲ−１８３配列を含む。さらに一部の他の実施形態では、本発明は、本発明の３つのマイクロＲＮＡ模倣化合物の治療有効量および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物であって、第１のマイクロＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖が成熟ｍｉＲ−９６配列を含み、第２のマイクロＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖が成熟ｍｉＲ−１８２配列を含み、第３のマイクロＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖が成熟ｍｉＲ−１８３配列を含む、医薬組成物を提供する。
【００９６】
好ましくは、本発明による少なくとも２つのマイクロＲＮＡアゴニストを含む医薬組成物では、第１のおよび第２のアゴニストまたは第１の、第２のおよび第３のアゴニストは等モル濃度で存在する。約１：２、１：３、１：４、１：５、１：２：１、１：３：１、１：４：１、１：２：３、１：２：４などの他の混合比も、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３アゴニストの少なくとも２つを含む医薬組成物を調製するために想定される。
【００９７】
一部の実施形態では、本発明の１つまたは複数のマイクロＲＮＡアゴニストは、同時にだが別々の組成物中で投与されてよく、同時は短期間、例えば互いに約３０分間の内に与えられる模倣化合物を指す。一部の他の実施形態では、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３アゴニストは、別々の組成物中で異なる時期に投与されてよい。
【００９８】
本発明は、追加的な治療剤がｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３アゴニストと一緒に投与される場合がある実施形態も包含する。追加的な治療剤は、同時だが別々の製剤中でまたは逐次的に投与されてよい。他の実施形態では、追加的な治療剤は、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３アゴニストの投与前からその後の異なる時期に投与されてよい。先の投与は、例えば第２の薬剤の投与の約１週間から３０分前までの範囲内での第１の薬剤の投与を含む。先の投与は、例えば第２の薬剤の投与の約２週間から３０分前までの範囲内での第１の薬剤の投与も含む。投与後または後の投与は、例えば、第１の薬剤の投与の約１週間から３０分後までの範囲内での第２の薬剤の投与を含む。投与後または後の投与は、例えば、第１の薬剤の投与の約２週間から３０分後までの範囲内での第２の薬剤の投与も含む。臨床適用が想定される場合、医薬組成物は、意図される適用に適する形態で調製される。一般に、これは、発熱物質のほか、ヒトまたは動物に有害でありうる他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを伴う。
【００９９】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３アゴニストを含む医薬組成物は、例えば液剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、眼軟膏剤、点眼剤または眼用ゲルの形態で局所眼科適用のために製剤化されてよい。一部の他の実施形態では、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３アゴニストを含む医薬組成物は、注射を介する局部眼投与のために製剤化されてよい。注射を介してｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および／またはｍｉＲ−１８３アゴニストを投与するための経路としては、硝子体内、眼周囲、腔内、結膜下または経強膜投与が挙げられる。
【０１００】
種々の実施形態では、局所または局部眼投与のために使用される医薬組成物は、例えば緩衝液、等張化剤、防腐剤、可溶化剤（安定化剤）、ｐＨ調整剤、増粘剤およびキレート剤、薬物透過を補助する溶媒ならびに軟膏およびクリーム中の軟化剤を含む適切な眼科的添加剤を含有してよい。緩衝液は、これだけに限定されないが、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、酢酸緩衝液（例えば酢酸ナトリウム）およびアミノ酸を含む群より選択されてよい。等張化剤は、これだけに限定されないがソルビトール、グルコースおよびマンニトールなどの糖、グリセリン、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールなどの多価アルコール、ならびに塩化ナトリウムなどの塩を含む群より選択されてよい。防腐剤は、これだけに限定されないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、パラオキシ安息香酸メチルおよびパラオキシ安息香酸エチルなどのパラオキシ安息香酸アルキル、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、ソルビン酸およびその塩、チメロサールおよびクロロブタノールを含む群より選択されてよい。可溶化剤（安定化剤）は、これだけに限定されないが、シクロデキストリンおよびその誘導体、ポリ（ビニルピロリドン）などの水溶性ポリマーならびにポリソルベート８０（商品名：Ｔｗｅｅｎ８０）などの界面活性剤を含む群より選択されてよい。ｐＨ調整剤は、これだけに限定されないが、塩酸、酢酸、リン酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよび水酸化アンモニウムを含む群より選択されてよい。増粘剤は、これだけに限定されないが、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースならびにその塩を含む群より選択されてよい。キレート剤は、これだけに限定されないが、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムおよび縮合リン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含む群より選択されてよい。そのような局所製剤は、適合可能な眼用担体、例えばクリームまたは軟膏ベース、オリーブ油、ピーナッツ油、ヒマシ油、ポリオキシエチル化ヒマシ油、鉱油、石油ゼリー、ジメチルスルホキシド、アルコール（エタノールまたはオレイルアルコール）、リポソーム、シリコーン流体および米国特許第６，２５４，８６０号に教示のその混合物をさらに含有してよい。
【０１０１】
あるいは、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３アゴニストは、リポソームを介して眼に適用されてもよい。ある特定の実施形態では、送達のために使用されるリポソームは、米国付与前公開第２０１１００７６３２２号に詳しく記載されているＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）のような両性リポソームである。ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）上の表面電荷は、完全に可逆的であり、それにより、核酸の送達に特に適したものになっている。ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）は、注射によって送達することができ、安定なままであり、凝集せず、かつ、細胞膜を渡って核酸を送達する。
【０１０２】
さらに、アゴニストは、ポンプ−カテーテル系を介して涙膜に注入されてよい。本発明の別の実施形態は、持続的または選択的放出デバイス内、例えばこれだけに限定されないが、ピロカルピン（ＯＣＵＳＥＲＴ（商標））Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）において用いられるものなどの膜に含有される模倣化合物に関与する。追加的な実施形態として、模倣化合物は、眼に配置されるコンタクトレンズ内に含有、保持または付着されてよい。本発明の別の実施形態は、眼の表面に適用できるスワブまたはスポンジ内に含有される模倣化合物に関与する。本発明のさらに別の実施形態は、眼の表面に適用できる液体スプレー内に含有される模倣化合物に関与する。
【０１０３】
本発明を、限定的とみなされるべきではない、以下のさらなる例によりさらに例示する。当業者は、本開示に照らして、開示される具体的な実施形態に多くの変化を施すことができ、本発明の精神および範囲から逸脱しない限りにおいて、やはり同様または類似の結果を得うることを察知する。
【０１０４】
本開示を通じて参照される全ての特許および非特許文献は、全ての目的のために本明細書によってその全体が参照により組み込まれる。
【実施例】
【０１０５】
（実施例１：網膜におけるｍｉＲＮＡ模倣物の取り込みおよびクリアランス）
マウスｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３についてのネイキッド（コレステロールにコンジュゲートされていない）ｍｉＲＮＡ模倣物を生理食塩水中に再懸濁した。３つの二重鎖を各二重鎖３．３μｇ／μｌでプールし、１０μｇ／μｌのプールした二重鎖を得た。マウスロドプシン（ＮＭ＿１４５３８３）を標的化するネイキッドｓｉＲＮＡを陽性対照として使用し、生理食塩水中に１０μｇ／μｌの濃度で懸濁した。網膜におけるｍｉＲＮＡ模倣物の取り込みおよびクリアランスを決定するために、野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにプールしたｍｉＲＮＡ二重鎖またはロドプシンｓｉＲＮＡを眼１つ当たり１μｌ（１０μｇ）で硝子体内注射した。網膜を各時点後で単離し、ＲＮＡを単離し、サンドイッチＥＬＩＳＡによってｍｉＲＮＡレベルを測定することによって網膜の分布およびクリアランスを測定した。ｓｉＲＮＡの分布およびクリアランスについて、ＲＮＡを単離し、標的抑制をｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。
【０１０６】
研究設計：
２研究アーム：
１）  ｍｉＲ−９６／１８２／１８３模倣物のプール、合計１０μｇ（ｎ＝１４）
２）  ロドプシン標的化ｓｉＲＮＡ（ｎ＝１４）  ７時点：（マウス２匹／研究アーム／時点）
１）  未処置（ベースライン）
２）  ４時間
３）  ８時間
４）  ２４時間
５）  ４８時間
６）  ７２時間
７）  １６８時間（７日）
【０１０７】
オリゴヌクレオチド生体内分布を評価するためのｍｉＲＮＡ模倣物／ｓｉＲＮＡ定量アッセイ
サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイをＥｆｌｅｒら（「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙヌクレオチド  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｏｆｆｅｒｓ  ｇｒｅａｔｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｖｅｒ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」、オリゴヌクレオチド  １５巻（２号）、１１９〜１３１頁（２００５年））によって以前記載のとおり、組織試料中のｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２またはｒｈｏ  ｓｉＲＮＡを定量するために使用した。簡潔には、ハイブリダイゼーションアッセイのためのプローブを２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドと合成し、５’ｂＴＥＧ−ｓｕｐ−３’（捕捉プローブ）および５’−６ＦＡＭ−ｓｕｐ−３’（検出プローブ）としてタグ化した。検出は、抗蛍光ペルオキシダーゼ、Ｆａｂ断片（Ｒｏｃｈｅ）およびＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ）を使用して行った。標準曲線を４つのパラメーター（４−ＰＬ）での非線形ロジスティック回帰分析で作成した。アッセイの作業濃度範囲は、１〜５３６ｎｇ／ｍＬであった。組織試料をＭＰ  ＦａｓｔＰｒｅｐ−２４の６．０の速度設定で３ｍｏｌ／Ｌ  ＧＩＴＣ緩衝液（３ｍｏｌ／Ｌグアニジンイソチオシアネート、０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．１ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５および１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ）中で、３０秒間、２回ホモジナイズすることによって１００ｍｇ／ｍＬに調製した。組織ホモジネートを検査のために１ｍｏｌ／Ｌ  ＧＩＴＣ緩衝液（１ｍｏｌ／Ｌグアニジンイソチオシアネート、０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．１ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５および１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ）中に希釈した。
【０１０８】
マウスロドプシンの定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応分析
ｉｎ  ｖｉｖｏリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析のために、ＲＮＡを網膜組織からＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で抽出し、次いで各試料から全ＲＮＡ  １００ｎｇを製造者の仕様書に従ってＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でｃＤＮＡを生成するために使用した。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイを用いて遺伝子発現を測定した。遺伝子発現をＧＡＰＤＨなどのハウスキーピング遺伝子に対して正規化し、対照群の平均と比較した相対的な発現量として算出した。
【０１０９】
ｍｉＲＮＡ模倣物プールで処置した動物について、生体内分布分析のために各動物から網膜２つをプールした。Ｒｈｏ  ｓｉＲＮＡで処置した動物について、生体内分布のために動物１匹当たり網膜１つを使用し、もう１つの網膜を標的ノックダウンを定量するためのＲＮＡ単離のために使用した。
【０１１０】
３つ全てのｍｉＲＮＡ模倣物およびＲｈｏ  ｓｉＲＮＡを１回の硝子体内注射の後に網膜に分布させた。各ｍｉＲＮＡ模倣物の量は、網膜において検出されたｓｉＲＮＡの量のおよそ３分の１であり、ｓｉＲＮＡは合計濃度１０μｇで投薬された一方で、ｍｉＲＮＡ模倣物プールは各ｍｉＲＮＡ模倣物３．３μｇ（合計オリゴ１０μｇ）を含有した事実と一致している。３つ全てのｍｉＲＮＡ模倣物が用量後４時間および８時間で検出され、８時間後に急速に除去された（図１）。Ｒｈｏ  ｓｉＲＮＡは、注射後４時間および８時間で検出され、２４時間までに除去された。
【０１１１】
Ｒｈｏ（ロドプシン）ｓｉＲＮＡは、注射後７２時間で標的遺伝子の６０％サイレンシングをもたらし、サイレンシングは注射後７日で約５０％残存していた（図２）。ロドプシンは網膜において光受容体中に発現される。したがって本データは、ｓｉＲＮＡ二重鎖が光受容体に機能的に分布していることを実証している。２４時間後にはｓｉＲＮＡ自体は網膜で検出できないが、サイレンシングは注射後約１週間保持される。
【０１１２】
（実施例２：ラット網膜細胞系でのマイクロＲＮＡ模倣物（ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３）の投与）
本研究のためのコレステロールとコンジュゲートしたｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３の模倣物ならびにラットロドプシンｓｉＲＮＡ模倣物を使用した。
【０１１３】
【表３】
2018509912.tif 000006
【０１１４】
３つそれぞれのマイクロＲＮＡのコレステロールとコンジュゲートした模倣物をＬｏｎｚａ（Ｒ−ＲＥＴ−５０８）から購入したラット網膜細胞に投与した。新生仔期（Ｐ３またはＰ４）のスプラーグドーリーラットから単離されたＬｏｎｚａのラット網膜細胞系は網膜に通常見られる７つの細胞型（桿体、錐体、ミューラー細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞および神経節細胞）を含む。これは混合細胞集団であるが、ラット網膜における細胞型の割合についてのデータは、桿体が主な細胞型であり、桿体がｍｉＲ−１８３クラスターが通常最も高く発現されている細胞型でもあることを示している。他の網膜ニューロン細胞型に関してｍｉＲＮＡ模倣物の効果を研究することにより、単離された単一の細胞型と比較してさらに関連がある、状況依存的な生物学を提供できた。加えて、この混合細胞系は、後のｉｎ  ｖｉｖｏ研究で同定される遺伝子発現変化についてのより直接的な比較を提供できた。ラットのＰ３／Ｐ４新生仔段階ではｍｉＲ−１８３／９６／１８２クラスター中のマイクロＲＮＡは、比較的低く発現され（成体網膜において約１％のレベル）それにより低バックグラウンドおよび外因的に添加された模倣物に対するより強いシグネチャをもたらす。
【０１１５】
培養中のラット網膜細胞（Ｒ−Ｒｅｔ細胞）をコレステロールとコンジュゲートしたマイクロＲＮＡ模倣物で受動的にトランスフェクトし、種々のパラメーター：ｍｉＲＮＡ模倣物の毒性、Ｒｈｏ  ｓｉＲＮＡを使用するＲｈｏ  ｍＲＮＡの下方制御、Ｒ−Ｒｅｔ細胞の最適プレーティング密度、Ｒ−Ｒｅｔ細胞を培養するための最長期間およびリアルタイムＰＣＲを使用する光伝達経路に関与する遺伝子の発現プロファイリングを決定した。
【０１１６】
研究設計：
Ａ．Ｒ−Ｒｅｔ細胞によって耐容されるコレステロールとコンジュゲートしたｍｉＲＮＡ模倣物の最高用量を決定し、１０μＭを投与する最高用量とする。
Ｂ．コレステロールとコンジュゲートしたｓｉＲＮＡプールを使用してＲｈｏノックダウンを測定することによって機能的取り込みを評価する
Ｃ．少なくとも８００ｎｇの総ＲＮＡ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォームでのマイクロアレイプロファイリングのための必要最少量）をもたらすＲ−Ｒｅｔ細胞の最適プレーティング密度を決定する
Ｄ．細胞を培養できる最長時間を決定する
Ｅ．光伝達経路に機能的に関与する遺伝子の選択についてリアルタイムＰＣＲを実行する
エンドポイント：
Ａ．毒性／生存率アッセイおよび視覚的評価
Ｂ．ＲｈｏのｑＰＣＲ
Ｃ．ＵＶ／可視ＲＮＡ定量
Ｄ．ｍｉＲＮＡ  ｑＰＣＲ
Ｅ．Ｒｈｏ、Ｓａｇ、Ａｒｒ３、Ｒｃｖｒｎ、Ｎｒｌ、Ｐｄｃ、Ｇｎａｔ１、Ｇｎａｔ２、Ｏｐｎ１ｍｗのｑＰＣＲ
【０１１７】
Ｒ−Ｒｅｔ細胞をコレステロールとコンジュゲートしたｍｉＲ−２０６模倣物で受動的にトランスフェクトし、細胞をトランスフェクション後７２時間で観察した。コレステロールとコンジュゲートしたｍｉＲＮＡ模倣物の１０μＭ用量は、トランスフェクション後７２時間および培養開始後１週間に細胞の分化を生じると考えられた（図３）。ｍｉＲＮＡ模倣物のＲ−Ｒｅｔ細胞への毒性は、アデニル酸キナーゼアッセイを使用して測定した。毒性は、無血清培地中で経時的に減少することが見出され（図４）、１０μＭ  ｍｉＲＮＡ模倣物での細胞の処置は、毒性ではないことが見出された。
【０１１８】
Ｒ−Ｒｅｔ細胞を種々の濃度のコレステロールとコンジュゲートしたＲｈｏ  ｓｉＲＮＡまたは非標的化対照（ＮＴＣ）ｓｉＲＮＡで受動的にトランスフェクトした。ＲＮＡを単離し、Ｒｈｏ  ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析を実施した。図５は、１、５、および１０μＭのコレステロールとコンジュゲートしたＲｈｏ  ｓｉＲＮＡプールが同等のＲｈｏノックダウンを産生したことを示している。
【０１１９】
ＲＮＡを一週間培養したＲ−Ｒｅｔ細胞から単離し、収量をＵＶ／可視分光光度計を使用して決定した（表４）。
【表４】
2018509912.tif 000007
【０１２０】
細胞を培養できる最長期間を決定するために、Ｒ−Ｒｅｔ細胞をポリ−Ｌ−リシン上にプレーティングした。細胞を最初の４日間は５％血清培地中で培養し、次いで培地を無血清培地に交換した場合、細胞は、少なくとも２週間培養物中で生存した。
【０１２１】
Ｒ−Ｒｅｔ細胞を種々の濃度のプールしたまたは個々のｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−９６およびｍｉＲ−１８２模倣物ならびにＲｈｏ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ＲＮＡをトランスフェクション後７２時間に単離し、光伝達経路に関与する遺伝子のｍＲＮＡ発現プロファイルを決定するためにリアルタイムＰＣＲ分析を実施した。図６および７は、ＰＣＲアッセイの範囲内で発現される遺伝子の相対的な発現レベルを示している。差異のＰ値は、未処置群と比較する多重比較についてのニューマン−コイルス検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡによって算出した。図８は、図７に示す処置のｌｏｇ２変換平均倍率変化値のヒートマップを示す。
【表５】
2018509912.tif 000008
【０１２２】
表６は、ｍｉＲ−１８３クラスターノックアウトマウスで選択した遺伝子の発現データと、コレステロールとコンジュゲートしたｍｉＲ−１８３クラスターｍｉＲＮＡ模倣物で処置したラット網膜細胞でのものとの比較を示す。
【表６】
2018509912.tif 000009
【０１２３】
（実施例３：網膜でのマイクロＲＮＡ模倣物（ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８３）の直接および下流標的の同定）
培養中のＲ−Ｒｅｔ細胞を個々のもしくはプールしたコレステロールとコンジュゲートしたマイクロＲＮＡ模倣物（ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２）またはコレステロールとコンジュゲートしたＲｈｏ  ｓｉＲＮＡで受動的にトランスフェクトする。トランスフェクション後の種々の時点でＲＮＡを単離し、マイクロアレイプロファイリングに供し、有意に制御された転写物を同定する。
【０１２４】
（実施例４：マイクロＲＮＡ模倣物の投与は視力喪失および網膜変性を予防する）
マイクロＲＮＡ模倣化合物（ｍｉＲ−９６およびｍｉＲ−１８２のマイクロＲＮＡ模倣物のプールならびに対照二重鎖）の、網膜色素変性症のマウスモデルにおける視力喪失および網膜変性への効果を検討した。Ｒｈｏ  ｓｉＲＮＡを陽性対照として使用した。
【０１２５】
ｒｄ１０／ｒｄ１０マウスは、網膜変性を誘導するために１２時間の明／暗周期に移動されるＰ３１まで暗所飼育した。Ｐ３１に試験薬剤（マイクロＲＮＡプールまたはＲｈｏ  ｓｉＲＮＡ）を１０μｇ（Ｒｈｏ  ｓｉＲＮＡ）または２μｇおよび１０μｇ（ｍｉＲ−９６およびｍｉＲ−１８２のマイクロＲＮＡプールならびに対照二重鎖）の濃度で両側硝子体内（ＩＶＴ）注射を介して投与した。対照群はＰ３１にビヒクルの両側投与を受けたｒｄ１０／ｒｄ１０マウス、またはフェニル−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン（ＰＢＮ）の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与をＰ２９からＰ３５まで毎日受けた動物を含んだ。視運動追跡（ＯＫＴ）および網膜電図検査（ＥＲＧ）による視力喪失の評価のために、未処置Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスの追加的な対照群を含めた。視力喪失は、視力測定（Ｐ３８およびＰ４５）およびＥＲＧ（Ｐ３９およびＰ４６）の両方によって評価した。マウスが仮想環境で提示される視覚刺激を識別できる平均空間頻度閾値（ＳＦＴ）を決定することによって視力を評価した。
【０１２６】
Ｐ４５でＯＫＴによって決定されたとおり、１０μｇのプールした模倣物（ｍｉＲ−９６およびｍｉＲ−１８２模倣物ならびに対照二重鎖）およびＰＢＮの両方のｒｄ１０／ｒｄ１０マウスへの投与は、統計的に有意な視力の維持をもたらした。
【０１２７】
実験設計
ｒｄ１０／ｒｄ１０マウス
・Ｐ１〜Ｐ３０：動物は誕生から暗所飼育
・Ｐ２９〜Ｐ３５：毎日のＰＢＮの腹腔内投与（アーム５）
・Ｐ３１：動物を通常の周期性の光（ｃｙｃｌｉｃ  ｌｉｇｈｔ）に移して飼育（日中約２００ルクス）
・Ｐ３１：ビヒクルまたは試験薬剤の両側硝子体内投薬（アーム１〜４）
・Ｐ３８：空間頻度閾値を定量するためのＯＫＴ分析
・Ｐ４５：空間頻度閾値を定量するためのＯＫＴ分析
動物
系統：ｒｄ１０／ｒｄ１０マウス
性別：オス／メス
年齢範囲：新生仔
体重範囲：ｎ／ａ
供給者：室内育種
研究動物数：４８
予備動物数０
指標動物数：０
試験化合物およびビヒクル
【表７】
2018509912.tif 000010
研究アーム
【表８】
2018509912.tif 000011
【０１２８】
動物飼育
全ての動物を標準的な動物管理条件下で換気されたシェルフ内で大きなケージで３〜５匹の群で飼育した。ｒｄ１０／ｒｄ１０の妊娠中の雌を、粘液栓を観察して暗所で飼育した。新生仔は、出生後１日目から出生後３０日目まで完全な暗闇の中で母親と共に飼育した。出生後３１日目に動物を１２時間の明（＜５００ルクス）に続く１２時間の暗からなる通常の周期的光条件下で維持するために移した。
【０１２９】
製剤調製および保存
試験薬剤を１０μｇ／μｌのアリコートとして供給し、注射用にした。アーム２について試験薬剤（プールした模倣物）を２μｇ／μｌの最終濃度となるように０．９％ＮａＣｌ中に１：５で希釈した。合計体積１μｌを全ての硝子体内注射に送達した。アリコートは使用まで−２０℃で保存した。初回の解凍後、残りの全ての材料は４℃で保存し、再凍結しなかった。ＰＢＮを使用直前に０．９％ＮａＣｌ（Ｃａｔ＃Ｓ４０４１、Ｔｅｋｎｏｖａ）中の１５ｍｇ／ｍｌ溶液として調製した。ＰＢＮをセクション３．２に示したとおり動物の体重に応じて１００ｍｇ／ｋｇの用量、総体積７５〜１５０μｌで毎日送達した。
【０１３０】
腹腔内（ＩＰ）投与
鎮静剤および陽性対照試験薬剤（ＰＢＮ）を８ｍｍ  ３１ゲージ針（ＢＤ＃３２８４３８）を装着した０．３ｃｃインスリンシリンジを利用するＩＰ注射に関する標準的技法によって合計体積≦１５０μｌで送達した。
【０１３１】
硝子体内投与
動物をケタミン（８５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１４ｍｇ／ｋｇ）を利用するＵ−１００シリンジを使用してケタミン／キシラジンで麻酔した。次いで瞳孔をＣｙｃｌｏｇｙｌおよびＡｋ−Ｄｉｌａｔｅの局所投与で散大させた。鎮静および散大に続いて、眼１つ当たり１μｌの合計体積をＨａｍｉｌｔｏｎシリンジおよび３３ゲージ針を使用して毛様体輪において硝子体に注射した。
【０１３２】
視運動追跡（ＯＫＴ）
全ての視運動追跡実験は、げっ歯類での使用のために設計したＯｐｔｏｍｏｔｒｙ（Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．）を使用して実施する。この非侵襲性評価では、マウスを遮光ボックス内に置いた４つのＬＣＤスクリーンによって囲まれたプラットフォームに入れる。次いで視覚刺激をＬＣＤスクリーンを介してマウスに提示し、盲検の観察者は、箱の上部に備え付けられたデジタルカムコーダーからの視運動追跡反射を可視化し、スコア化する。空間頻度閾値の測定のためにマウスを空間頻度０．０３４〜０．５１４サイクル／度の範囲で検査した。Ｏｐｔｏｍｏｔｒｙデバイスは、盲検の観察者からの入力を受け入れるために専有のアルゴリズムを用い、動物が正しいまたは正しくない追跡反射を示したかどうかに基づいて検査刺激を自動的に調整する。
【０１３３】
組織回収
ケタミン／キシラジンでの鎮静後、動物を致死用量のペントバルビタールで安楽死させた。全ての動物の右目を炎にあてた針で表面を焼き、眼の上部を画定し、眼球除去し、Ｚ−ｆｉｘ（亜鉛緩衝中性ホルマリン）中で固定し、Ｈ＆Ｅ組織学のために処理した。全ての動物の左目から網膜を個々に単離し、直ちに液体Ｎ２中で急速凍結し、２ｍＬスクリューキャップポリプロピレンチューブ中、−７０℃で個々にさらなる処理まで保存した。
【０１３４】
データおよび統計解析
任意の変化が統計的に有意であるかどうかを決定するために、閾値ｐ＜０．０５で、ｔ検定（ＯＫＴおよびＥＲＧ）または一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）算出（網膜の厚さ）を実施するために、Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｉｎｃ．）を使用して統計的有意性を決定した。
【０１３５】
図９は、網膜色素変性症のマウスモデルでの視力低下への試験薬剤の効果を示している。視力は、マウスが視覚刺激を識別できた平均ＳＦＴによって評価した。視力はＰ３８およびＰ４５の両方で、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ対照マウスと比較してｒｄ１０マウスの全ての群において低かった。Ｐ３８で視力は、ビヒクルで処置した群およびプールした模倣物を受けた両方の群について同等であった。１０μｇのＲｈｏ  ｓｉＲＮＡを受けた群は、Ｐ３８で、ビヒクルで処置した群と比較して統計的に有意に視力が低かった（ｐ＝０．０１８５、対応のないｔ検定）、一方ＰＢＮで処置した陽性対照群は、ビヒクルと比較して統計的に有意に高い視力測定値を示した（ｐ＝０．０２２４、対応のないｔ検定）。Ｐ４５で、プールした模倣物を受けた２群について、プールした模倣物の１０μｇ群とビヒクルとの間に統計的有意差を有して、視力喪失に用量依存的好転が存在する（ｐ＝０．０２５８、対応のないｔ検定）。ＰＢＮで処置した動物もＰ４５でビヒクルと比較して統計的に有意に良好な視力を示している（ｐ＝０．０４１６、対応のないｔ検定）。１０μｇ  Ｒｈｏ  ｓｉＲＮＡ群についての視力は、年齢適合ビヒクル群よりもはるかに低いままであったが、差異は統計的に有意でなかった。
【０１３６】
図１０は、網膜色素変性症のマウスモデルでの視力減退への試験薬剤の効果を示している。視力低下は、Ｐ３８からＰ４５で全ての群にわたって生じた。ビヒクルで処置した動物は、Ｐ３８からＰ４５で視力の４８％低下を示している。２つの時点にわたる視力の最も大きな減退は、１０μｇ  Ｒｈｏ  ｓｉＲＮＡ試験薬剤（５９％）を受けている群について生じた。１０μｇのプールした模倣物を受けている群は、２つの時点にわたる視力のほとんど無視できる程度の喪失であった（１１％）。視力低下は、プールした模倣物の２μｇ群およびＰＢＮ群の両方について、ビヒクルと比較してあまり劇的でなかった（それぞれ３５％および３９％）。
【０１３７】
検討した両方の出生後時点で、ＯＫＴによって評価した視力喪失は、光に曝露したｒｄ１０／ｒｄ１０マウスでは対照Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスおよび光への曝露前のｒｄ１０／ｒｄ１０マウスの両方と比較して統計的に有意に低かった。ビヒクルで処置した群は、１０μｇ  Ｒｈｏ  ｓｉＲＮＡ処置群を除く全ての群よりもそのＳＦＴが低かった。１０μｇのプールした模倣物（ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２および対照二重鎖）の両側硝子体内投与は、Ｐ４５でのＳＦＴ測定値における統計的に有意な維持およびＰ３８からＰ４５でのＳＦＴにおける全ての群の内で最も低い百分率低下によって実証されるとおり、視力に対する正の効果を実証している（図９および１０）。ＰＢＮ陽性対照処置群もＰ４５でビヒクル対照群と比較して統計的に有意に高いＳＦＴを保持しているが、Ｐ３８からＰ４５でのＳＦＴにおける喪失は、プールした模倣物の１０μｇ群よりもＰＢＮ群において大きかった。プールした模倣物の２μｇ処置群は、Ｐ４５でビヒクル対照群よりも高いＳＦＴを有したが、差異は統計的に有意でなかった。１０μｇ  Ｒｈｏ  ｓｉＲＮＡを受けた群は、Ｐ３８およびＰ４５の両方でＳＦＴ測定値において最も大きな喪失を有し、２つの時点間でＳＦＴにおける最も大きな百分率減退も有した。データに基づいて１０μｇのプールした模倣物の両側硝子体内投与は、ＯＫＴによって測定した視力に統計的に有意な差異を有して後の時点での視力喪失を好転させる。
【図１】
2018509912.tif 000012
【図２】
2018509912.tif 000013
【図３】
2018509912.tif 000014
【図４】
2018509912.tif 000015
【図５】
2018509912.tif 000016
【図６】
2018509912.tif 000017
【図７】
2018509912.tif 000018
【図８】
2018509912.tif 000019
【図９】
2018509912.tif 000020
【図１０】
2018509912.tif 000021
【配列表】
2018509912000001.app
【国際調査報告】
2018509912.tif 000022
2018509912.tif 000023
2018509912.tif 000024