(57)【要約】Ａｘｌタンパク質と特異的に結合し、ＡｘｌとＡｘｌリガンドＧａｓ６との相互作用を阻害する抗体について記載する。また、抗Ａｘｌ抗体の作製方法及び使用方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のいずれかから得られる抗体が結合するエピトープと結合する抗体：
Ａ）ハイブリドーマＵＴ−１０Ｃ９−Ｂ９；または
Ｂ）ハイブリドーマＷＲ−１０Ｇ５−Ｅ５。
【請求項２】
ＡｘｌとそのリガンドＧａｓ６との結合を阻害する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
Ａｘｌ発現の下方調節、Ａｘｌ受容体のシグナル伝達阻害、及び／または腫瘍成長の阻害をもたらす、請求項１または２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４】
Ａｘｌを結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体であって、
Ａ）配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３と、場合により配列番号６及び配列番号５から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のＶＨ  ＣＤＲとを含む抗体ＶＨドメイン；ならびに／もしくは
配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のＶＬ  ＣＤＲを含む抗体ＶＬドメイン；または
Ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３と、場合により配列番号２４及び配列番号２３から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のＶＨ  ＣＤＲとを含む抗体ＶＨドメイン；ならびに／もしくは
配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のＶＬ  ＣＤＲを含む抗体ＶＬドメインを含む、前記抗体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体であって、
配列番号５、配列番号６及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲを含んでいる抗体ＶＨドメインを含み、１０Ｃ９のＶＨドメイン（配列番号３）及び１０Ｃ９のＶＬドメイン（配列番号４）を含んでいる抗体のＡｘｌ結合ドメインと、Ａｘｌへの結合を競合する抗体；または
配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲを含んでいる抗体ＶＨドメインを含み、１０Ｇ５のＶＨドメイン（配列番号２１）及び１０Ｇ５のＶＬドメイン（配列番号２２）を含んでいる抗体のＡｘｌ結合ドメインと、Ａｘｌへの結合を競合する抗体のいずれかである、前記抗体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体であって、
Ａ）１０Ｃ９のＶＨドメイン（配列番号３）；または
Ｂ）１０Ｇ５のＶＨドメイン（配列番号２１）のいずれかを含む、前記抗体。
【請求項７】
請求項６に記載の抗体であって、
Ａ）１０Ｃ９のＶＬドメイン（配列番号４）；または
Ｂ）１０Ｇ５のＶＬドメイン（配列番号２２）のいずれかを含む、前記抗体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体の変異体であって、該変異体が、１つ以上のフレームワーク領域内及び／または１つ以上のＣＤＲ内に１つ以上のアミノ酸配列改変を含む、前記変異体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体であって、該抗体が、
（ｉ）抗体の重鎖定常領域及び／もしくは抗体の軽鎖定常領域のすべてもしくは部分；
（ｉｉ）全抗体；または
（ｉｉｉ）抗原結合性抗体断片を含む、前記抗体。
【請求項１０】
前記全抗体が、ＩｇＧ抗体であり、前記抗原結合性抗体断片が、単一ドメイン抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦＶ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ミニボディ、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、直列型ｓｃＦｖ、ＴａｎｄＡｂ、バイボディ、トリボディ、カッパ（ラムダ）ボディ、ＢｉＴＥ、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＳＩＰ、ＳＭＩＰまたはＤＡＲＴである、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体がヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２】
前記ＡｘｌがヒトＡｘｌである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１３】
６ｘ１０−１０Ｍ以下のＫＤでＡｘｌを結合する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１４】
８ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１以上のｋｏｎでＡｘｌを結合する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１５】
霊長類のＡｘｌを特異的に結合する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体であって、
（ｉ）１０−３Ｍ超のＫＤでマウスＡｘｌを結合する；
（ｉｉ）１０−３Ｍ超のＫＤでヒトＭｅｒを結合する；及び／または
（ｉｉｉ）１０−３Ｍ超のＫＤでヒトＴｙｒｏ３を結合する、前記抗体。
【請求項１７】
ＡｘｌのＧａｓ６への結合を阻害する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１８】
Ａｘｌ受容体の発現を下方調節する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１９】
Ａｘｌ受容体の内在化の速度を増加させる、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２０】
前記抗体が、Ａｘｌ受容体の下流シグナル伝達を阻害する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２１】
細胞死率を増加させる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２２】
腫瘍成長を阻害する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２３】
検出可能標識、酵素または毒素と、場合によりペプチジル結合またはリンカーを介して複合体化された、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２４】
以下のいずれかから得られる抗体：
Ａ）ハイブリドーマＵＴ−１０Ｃ９−Ｂ９；または
Ｂ）ハイブリドーマＷＲ−１０Ｇ５−Ｅ５。
【請求項２５】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗体の、抗体または抗体のＶＨもしくはＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項２６】
請求項２５に記載の核酸で形質転換された宿主細胞。
【請求項２７】
抗体または抗体のＶＨもしくはＶＬドメインの作製方法であって、前記抗体または抗体のＶＨもしくはＶＬドメインの作製条件下で、請求項２６に記載の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
【請求項２８】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗体、またはその免疫複合体を、薬学的に許容される賦形剤とともに含む組成物。
【請求項２９】
免疫チェックポイントモジュレーター及び／またはＡｘｌ以外の標的に特異的な抗腫瘍抗体を更に含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
治療方法に使用される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗体、または請求項２３に記載の組成物。
【請求項３１】
増殖性疾患の治療方法に使用される、請求項３０に記載の抗体または組成物。
【請求項３２】
前記増殖性疾患が癌である、請求項３１に記載の抗体または組成物。
【請求項３３】
前記癌が転移癌である、請求項３２に記載の抗体または組成物。
【請求項３４】
Ａｘｌの過剰発現を特徴とする疾患または障害を治療するための医薬品の製造における、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗体、または請求項２８もしくは請求項２９のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項３５】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の抗体、及び前記メンバーと転移癌細胞との結合を特定できる１種以上の試薬を含む診断キット。
【請求項３６】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗体、または請求項２８もしくは請求項２９のいずれか１項に記載の組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、Ａｘｌタンパク質と特異的に結合する抗体に関する。また、抗Ａｘｌ抗体の作製方法及び使用方法も開示する。
【背景技術】
【０００２】
Ａｘｌは、ビタミンＫ依存性リガンドＧａｓ６（ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｒｅｓｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ６、増殖停止特異的６）を共有するＴＡＭ（Ｔｙｒｏ３−Ａｘｌ−Ｍｅｒ）受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のメンバーである。ＴＡＭファミリーＲＴＫは、細胞生存性、増殖、自食、遊走、血管新生、血小板凝集及びナチュラルキラー細胞分化を含む多様な範囲の細胞応答を調節する。Ａｘｌは、多くの胚組織に発現し、間葉及び神経の発生に関与すると考えられており、成体組織での発現が主に平滑筋細胞に限定される（ＭＧＩ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ；ｗｗｗ．ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｊａｘ．ｏｒｇ）。Ａｘｌ活性化は、Ａｋｔ、ＭＡＰキナーゼ、ＮＦ−κＢ、ＳＴＡＴ及びその他を含む、いくつかのシグナル伝達経路と連係している。Ａｘｌは、慢性骨髄性白血病患者由来の形質転換遺伝子として最初に同定されて以降、各種の高度悪性癌との関連性、及び予後不良との相関性が示されてきた。
【０００３】
広範囲にわたる固形腫瘍及び骨髄性白血病に、Ａｘｌ受容体の過剰発現が認められている（Ｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ａｄｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１００：３５，２００８；Ｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ．１４：１０７３，２０１０）。
【０００４】
Ａｘｌの発現は、悪性進行と相関性があり、膵臓癌（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ．１１７：７３４，２０１１）、前立腺癌（Ｐａｃｃｅｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．３２：６９８，２０１３）、肺癌（Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ．２０１２；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．４４：８５２，２０１２）、乳癌（Ｇｊｅｒｄｒｕｍ，Ｐｒｏｃ  ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７：１１２４，２０１０）、大腸癌（Ｙｕｅｎ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，８：ｅ５４２１１，２０１３）及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（Ｂｅｎ−Ｂａｔａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  １２２：２４４３，２０１３）を含む、いくつかの悪性疾患において患者の全生存期間を低下させる独立予測因子である。
【０００５】
腫瘍関連のマクロファージ（Ｌｏｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ．１１５：２２６４，２０１０）または自己分泌機構（Ｇｊｅｒｄｒｕｍ，Ｐｒｏｃ  ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７：１１２４，２０１０）によって分泌されるタンパク質リガンド（Ｇａｓ６）によって、Ａｘｌシグナル伝達が活性化されると、受容体の二量化、自己リン酸化、及び下流シグナル伝達が、例えばＰＩ３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）−ＡＫＴ経路、特にＡＫＴ経路及びマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路（Ｋｏｒｓｈｕｎｏｖ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．１２２：３６１，２０１２）経由などで誘発される。また、他のチロシンキナーゼ受容体、例えば上皮成長因子（ＥＧＦＲ）とのヘテロ二量体化も発生することが報告されている（Ｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ．１４：１０７３，２０１０；Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ６：ｒａ６６，２０１３）。
【０００６】
腫瘍細胞内でのＡｘｌの異常活性化は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの標的療法に対する薬剤耐性の獲得と広範囲にわたり関連している（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．４４：８５２，２０１２；Ｂｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９：２７９，２０１３）。Ａｘｌ標的薬は腫瘍形成、転移を阻止するとともに、トリプルネガティブ乳癌、ホルモン耐性前立腺癌及び肺腺癌を含む、いくつかの実験的癌モデルにおいてＥＭＴ／ＣＳＣの形質を転換させることにより薬剤耐性（例えばエルロチニブに対する）を克服している（Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７０：１５４４，２０１０；Ｇｊｅｒｄｒｕｍ，Ｐｒｏｃ  ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７：１１２４，２０１０；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．４４：８５２，２０１２；Ｐａｃｃｅｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．３２：６９８，２０１３）。
【０００７】
Ａｘｌ及び抗Ａｘｌ抗体に関する他の出願としては、ＥＰ２２６７４５４Ａ２［Ａｘｌの測定による癌細胞浸潤性の診断及び予防―Ｍａｘ  Ｐｌａｎｃｋ］；ＷＯ２００９０６３９６５［抗Ａｘｌ―Ｃｈｕｇａｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ］；ＷＯ２０１１１５９９８０Ａ１［抗Ａｘｌ−Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ］、ＷＯ２０１１０１４４５７Ａ１［Ａｘｌ及びＶＥＧＦアンタゴニスト併用療法−Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ］；ＷＯ２０１２−１７５６９１Ａ１［抗Ａｘｌ  ２０Ｇ７−Ｄ９−ＩＮＳＥＲＭ］、ＷＯ２０１２−１７５６９２Ａ１［抗Ａｘｌ  ３Ｅ３Ｅ８−ＩＮＳＥＲＭ］；ＷＯ２００９／０６２６９０Ａ１［抗Ａｘｌ−Ｕ３  Ｐｈａｒｍａ］及びＷＯ２０１０／１３０７５１Ａ１［ヒト化抗Ａｘｌ−Ｕ３  Ｐｈａｒｍａ］が挙げられる。
【０００８】
Ａｘｌが腫瘍形成に果たす役割を考慮すると、Ａｘｌとの特異的な結合に有利な特性をもつ抗体の更なる同定が望まれる。本開示はこのような抗体に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＭＡｂ  １０Ｃ９及び１０Ｇ５と、組み換えヒト（ｒｈ）Ａｘｌ、ｒｈＭｅｒ及びｒｈＴｙｒｏ３との相互作用を示す結合性分析から得たセンサーグラムの重ね合わせプロット。ブランクの表面シグナル減算後の曲線を示す。
【図２】リガンド（ＭＡｂ  １０Ｃ９、ＭＡｂ  １０Ｇ５及びｒｍＧａｓ６）と、ｒｈＡｘｌ、組み換えマウス（ｒｍ）Ａｘｌ及びｒｈＴｙｒｏ３をコーティングしたセンサーチップＣＭ５との相互作用を示すＢｉａｃｏｒｅ分析。ブランクの表面シグナル減算後の曲線を示す。
【図３】リガンド（ＭＡｂ  １０Ｃ９及び１０Ｇ５）と、組み換えヒトＡｘｌ（ｒｈＡｘｌ及びカニクイザル由来Ａｘｌ抗原（ｃｙｎｏ―Ａｘｌ）をコーティングしたセンサーチップＣＭ５との相互作用を示すＢｉａｃｏｒｅ分析。ブランクの表面シグナル減算後の曲線を示す。
【図４】ＭＡｂ  １０Ｃ９及び１０Ｇ５と、Ｂｉａｃｏｒｅセンサーチップ表面に固定化されたｒｈＡｘｌとの相互作用の速度論的分析。異なる抗体濃度（１０Ｃ９は１．３〜６６６．７ｎＭ、１０Ｇ５は０．３〜１６６．７ｎＭ）でのセンサーグラムの重ね合わせプロットを示す。正確な速度論的分析は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア、及び１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルによるカーブフィッティングを使用して実施した。２５℃での抗原結合の親和性定数（速度論及び定常状態）ならびに算出された半減期を以下の表１に示す。
【表１】
2018506961.tif 000002
表１
【図５】Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００を使用した、ＭＡｂ  １０Ｃ９または１０Ｇ５（第１のサンプル）と、抗Ａｘｌ  ＭＡｂ  ＭＡＢ１５４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗体１０Ｃ９及び１０Ｇ５、ｒｈＧａｓ６及びｒｍＧａｓ６（第２のサンプル）との間の競合性分析。異なる第２のサンプルを使用したときのセンサーグラムの重ね合わせプロットを示す。第１のサンプル（１０Ｃ９または１０Ｇ５）及び第２のサンプルの注入開始点を矢印で示す。
【図６】３次元（３Ｄ）器官型の腫瘍腫瘤の発現に対する抗Ａｘｌ抗体の効果。高悪性度ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を対照ＩｇＧ（中上段パネルに示す）または抗Ａｘｌ  ＭＡｂ（下段パネル）のいずれかで処置すると同時に細胞外マトリックスの存在下で増殖させ、このような３Ｄ器官型モデルを作成した。陽性対照として、Ａｘｌ発現をノックダウンしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を示す。
【図７】樹立した３Ｄ器官型の腫瘍腫瘤に対する抗Ａｘｌ抗体１０Ｃ９及び１０Ｇ５の効果。ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の発現後９日の星形３Ｄ器官型腫瘤を、対照ＩｇＧまたは抗Ａｘｌ抗体１０Ｃ９及び１０Ｇ５のいずれかで７２時間処置した。画像は明視野を使用して取得した。画像の矢印はアポトーシスにより分解している星形細胞を示す。
【図８】いずれかの抗体またはマルチキナーゼ阻害剤フォレチニブによる、Ａｘｌ受容体発現に対する治療効果を示すウェスタンブロット解析。高悪性度ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、抗体（無関係なＩｇＧ対照及び抗Ａｘｌ  ＭＡｂ  １０Ｃ９、１０Ｇ５及びＭＡｂ＃３）またはフォレチニブで２４時間処理した後、ＳＤＳ−ＰＡＡゲルにロードした。負荷対照としてアクチンタンパク質のレベルを使用した。
【図９】マウスモノクローナル抗体１０Ｃ９及び１０Ｇ５の存在下での、Ｇａｓ６媒介性Ａｘｌシグナル伝達の阻害を示すウェスタンブロット解析。Ｓｅｒ４７３でのＡｋｔのリン酸化を、Ａｘｌ活性に代わる読み取り値として使用した。Ｍは分子量マーカーである。抗ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、または負荷対照としての抗ＧＡＰＤＨ（グリセリンアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）を用いて、免疫ブロット法により全細胞可溶化物を精査した。
【図１０】抗Ａｘｌモノクローナル抗体１０Ｃ９及び１０Ｇ５由来のＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列。重鎖及び軽鎖のＣＤＲ領域に下線が引かれている。１０Ｃ９  ＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１にある推定Ｎ−グリコシル化部位を太字で示す。ＶＨドメインの１位のグルタミン（Ｑ）がグルタミン酸（Ｅ）と置換された場合の１０Ｇ５のＶＨ変異体の配列も含まれている。この変異体を「１０Ｇ５［Ｑ１Ｅ］」と称する。
【図１１】抗Ａｘｌマウス抗体１０Ｃ９、それに相当するキメラ（マウス可変／ヒト定常）抗体（ｃ１０Ｃ９）及び抗体１０Ｇ５のキメラ変異体（ｃ１０Ｇ５）の、Ａｘｌ陽性細胞に対する用量依存的結合性。濃度の異なるマウス及びキメラ抗体の、トリプルネガティブ乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対する結合性をフローサイトメトリーで試験した。結合したマウス及びキメラ抗体を、マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１：５００希釈）、またはヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１：３００希釈）（いずれもＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ製）それぞれに特異的なＡＰＣ複合体ロバＦ（ａｂ’）２断片を用いて検出した。細胞染色は、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。ＭＦＩは幾何平均蛍光強度である。
【図１２】キメラ抗体ｃ１０Ｃ９及びｃ１０Ｇ５、ならびにその相当するマウス抗体と、組み換えヒト（ｒｈ）Ａｘｌとの相互作用を示すＢｉａｃｏｒｅ結合性分析から得たセンサーグラムの重ね合わせプロット。ブランクの表面シグナル減算後の曲線を示す。
【図１３】キメラ抗体ｃ１０Ｃ９及びｃ１０Ｇ５と、Ｂｉａｃｏｒｅセンサーチップ表面に固定化されたｒｈＡｘｌとの相互作用の速度論的分析。異なる抗体濃度（ｃ１０Ｃ９は１．３〜６６６．７ｎＭ、ｃ１０Ｇ５は０．３〜１６６．７ｎＭ）でのセンサーグラムの重ね合わせプロットを示す。正確な速度論的分析は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア、及び１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルによるカーブフィッティングを使用して実施した。２５℃での抗原結合の親和性定数（速度論及び定常状態）ならびに算出された半減期を以下の表２に示す。
【表２】
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表２
【図１４】キメラ抗体１０Ｇ５によるＡ５４９異種移植腫瘍成長の阻害。平均腫瘍サイズが１００ｍｍ３に達した時点で、週２回、２０ｍｇ／ｋｇの抗体の腹腔内投与を開始した。ビヒクル（滅菌ＰＢＳ）またはキメラ１０Ｇ５による処置群での腫瘍成長曲線を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。統計分析は双方向ＡＮＯＶＡを使用して実施した。＊＊はＰ＜０．０１である。
【図１５】キメラ抗体１０Ｇ５によるＭｖ４−１１異種移植腫瘍成長の阻害。平均腫瘍サイズが２００ｍｍ３に達した時点で、週２回、３０ｍｇ／ｋｇの抗体の腹腔内投与を開始した。ビヒクル（滅菌ＰＢＳ）またはキメラ１０Ｇ５による処置群での腫瘍成長曲線を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。統計分析は双方向ＡＮＯＶＡを使用して実施した。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１である。
【図１６】実施例１６からのデータ。抗体Ｇｌｙｍａｘ−ｃ１０Ｇ５は、ｃ１０Ｇ５と比較して、Ａ５４９腫瘍の成長を有意に減衰させた（Ｐ＜０．０００１、双方向ＡＮＯＶＡにより決定）。キメラ１０Ｇ５のｗｔ型と非フコシル化型の活性に有意差が見られたことは、腫瘍成長の阻害における抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の重要性を示す。
【図１７】実施例１７からのデータ。ＦＶ１抗体は、対照と比較して、Ａ５４９腫瘍の成長を有意に減衰させた（Ｐ＜０．０５１、双方向ＡＮＯＶＡにより決定）。２週間の処置後、約２５％の阻害が観察された。
【図１８】実施例１８からのデータ。ＦＶ２抗体は、抗ＥＧＦＲ治療抗体セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）の抗腫瘍効果と類似した適度な抗腫瘍活性を示した。両方の抗体を併用すると、アイソタイプ対照で処置した動物と比較して、有意な腫瘍成長の遅延が得られた（Ｐ＜０．０００１；双方向ＡＮＯＶＡにより決定）。ＦＶ２またはＥｒｂｉｔｕｘのいずれか単独による処置群と比較した場合にも、併用効果が有意であった（Ｐ＜０．０５；双方向ＡＮＯＶＡにより決定）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、Ａｘｌタンパク質と結合する抗体を提供し、ＡｘｌとそのリガンドＧａｓ６との結合を阻害する。この抗体はまた、好ましくはＡｘｌ発現の下方調節、Ａｘｌ受容体のシグナル伝達阻害、及び／または腫瘍成長の阻害をもたらす。
【００１１】
Ａｘｌを結合し、ＡｘｌとそのリガンドＧａｓ６との結合を阻害するこのような抗体のうち、２つの具体例を本明細書で開示する。本明細書では、これらの抗体を「１０Ｃ９」（本明細書に記載されているように、ハイブリドーマＵＴ−１０Ｃ９−Ｂ９から得られる）及び「１０Ｇ５」（本明細書に記載されているように、ハイブリドーマＷＲ−１０Ｇ５−Ｅ５から得られる）と称する。
【００１２】
したがって、本発明は、本明細書に記載されているように、ハイブリドーマＵＴ−１０Ｃ９−Ｂ９から得られる１０Ｃ９抗体が結合するエピトープと結合する抗体を提供する。また、本明細書に記載されているように、ハイブリドーマＷＲ−１０Ｇ５−Ｅ５から得られる１０Ｇ５抗体が結合するエピトープと結合する抗体も提供する。
【００１３】
好ましくは、この抗体はＡｘｌとそのリガンドＧａｓ６との結合を阻害する。更により好ましくは、この抗体はまた、Ａｘｌ発現の下方調節、Ａｘｌ受容体のシグナル伝達阻害、及び／または腫瘍成長の阻害をもたらす。
【００１４】
配列
以下の配列を本明細書で開示する（全配列については、後述する「配列」の項を参照のこと）。
2018506961.tif 000004
2018506961.tif 000005
【００１５】
１０Ｃ９抗体
一態様では、本発明は、Ａｘｌを結合し、１０Ｃ９のＶＨドメイン（配列番号３）及び／または１０Ｃ９のＶＬドメイン（配列番号４）で構成される単離された抗体を提供する。好ましくは、これに結合されるＡｘｌはヒトＡｘｌである。
【００１６】
一態様では、本発明は、Ａｘｌを結合し、１０Ｇ５のＶＨドメイン（配列番号２１）及び／または１０Ｇ５のＶＬドメイン（配列番号２２）で構成される単離された抗体を提供する。好ましくは、これに結合されるＡｘｌはヒトＡｘｌである。非好適な代替的態様では、本発明は、Ａｘｌを結合し、１０Ｇ５［Ｑ１Ｅ］ＶＨドメイン（配列番号４５）及び／または１０Ｇ５のＶＬドメイン（配列番号２２）で構成される単離された抗体を提供する。好ましくは、これに結合されるＡｘｌはヒトＡｘｌである。
【００１７】
通常、ＶＨドメインはＶＬドメインと対になり、抗体抗原結合部位を形成するが、以下で詳述するように、ＶＨドメインを単独で用いて抗原と結合させてもよい。好ましい一実施形態では、１０Ｃ９のＶＨドメイン（配列番号３）を１０Ｃ９のＶＬドメイン（配列番号４）と対にすることで、１０Ｃ９のＶＨドメイン及びＶＬドメイン両方を含む抗体抗原結合部位を形成する。
【００１８】
他の実施形態では、１０Ｃ９のＶＨは１０Ｃ９のＶＬ以外のＶＬドメインと対である。軽鎖の無差別性（ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ）は従来技術で確立されている。例えば、いくつかの実施形態では、１０Ｃ９のＶＨドメイン（配列番号３）は１０Ｇ５のＶＬドメイン（配列番号２２）と対である。
【００１９】
１０Ｃ９のＶＨまたはＶＬドメインから１つ以上のＣＤＲを得ることができ、それを適したフレームワークに組み込むことができる。これについては、以下で詳述する。１０Ｃ９のＶＨ  ＣＤＲ１、２及び３をそれぞれ配列番号５、６及び７で示す。１０Ｃ９のＶＬ  ＣＤＲ１、２及び３をそれぞれ配列番号８、９及び１０で示す。
【００２０】
本発明の一態様では、Ａｘｌを結合し、以下で構成される抗体を提供する：
１０Ｃ９のＶＨドメイン（配列番号３）、及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３と、場合により配列番号６及び配列番号５から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のＶＨ  ＣＤＲとを含むＶＨドメインからなる群から選択される抗体ＶＨドメイン；ならびに／または
１０Ｃ９のＶＬドメイン（配列番号４）、及び配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のＶＬ  ＣＤＲを含むＶＬドメインからなる群から選択される抗体ＶＬドメイン。
【００２１】
例えば、抗体は、配列番号５、配列番号６及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲを含んでいる抗体ＶＨドメインを含んでもよい。更に抗体は、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲを含んでいる抗体ＶＬドメインを含んでもよい。
【００２２】
いくつかの実施形態では、抗体は、（ｉ）配列番号５、配列番号６及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲを含んでいる抗体ＶＨドメイン、（ｉｉ）配列番号８、配列番号９及び配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲを含んでいる抗体ＶＬドメインで構成される。
【００２３】
この抗体は１０Ｃ９のＶＨドメイン（配列番号３）を含み、場合により１０Ｃ９のＶＬドメイン（配列番号４）を更に含んでもよい。
【００２４】
好ましくは、抗体は、１０Ｃ９のＶＨドメイン（配列番号３）及び１０Ｃ９のＶＬドメイン（配列番号４）を含んでいる抗体のＡｘｌ結合ドメインと、ヒトＡｘｌへの結合を競合する。
【００２５】
好ましくは、抗体は、本明細書に記載されているように、ハイブリドーマＵＴ−１０Ｃ９−Ｂ９から得られる抗体が結合するエピトープと結合する。
【００２６】
好ましくは、この抗体はＡｘｌとそのリガンドＧａｓ６との結合を阻害する。更により好ましくは、この抗体はまた、Ａｘｌ発現の下方調節、Ａｘｌ受容体のシグナル伝達阻害、及び／または腫瘍成長の阻害をもたらす。
【００２７】
本発明の更に別の態様によれば、本明細書で指定する配列であり、Ａｘｌに対する抗体として用いることができ、配列改変または突然変異及びスクリーニングといった方法によって得ることができる、ＶＨ及びＶＬドメインの変異体が提供される。このような方法もまた、本発明によって提供される。
【００２８】
本明細書で具体的に開示されている配列であるＶＨ及びＶＬドメインのいずれかの可変ドメインのアミノ酸配列変異体を、記載されているように本発明に従って用いることができる。個々の変異体には、１つ以上のアミノ酸配列改変（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／または挿入）、おそらく約２０未満の改変、約１５未満の改変、約１０未満の改変または約５未満の改変（すなわち、４、３、２または１）が含まれ得る。改変は、１つ以上のフレームワーク領域及び／または１つ以上のＣＤＲ内に施すことができる。
【００２９】
本発明による抗体は、抗原と結合し、かつ本明細書で開示される抗体ＶＨ及び／またはＶＬドメイン、本明細書で開示されるＶＨ  ＣＤＲ３、またはこれらのいずれかの変異体を含む任意の抗体と、抗原への結合を競合するものであればよい。抗体間の競合は、例えば、ＥＬＩＳＡ法を使用して、及び／または、一方の抗体に対して特異的なレポーター分子を標識化し、他方の無標識抗体（複数可）の存在下で検出できるようにして、同じエピトープまたは重複するエピトープと結合する抗体の同定を可能にすることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで容易に分析することができる。
【００３０】
したがって、本発明は、本明細書で具体的に開示される、いかなる抗体の変異体も含み、該変異体は、１つ以上のフレームワーク領域内及び／または１つ以上のＣＤＲ内に１つ以上のアミノ酸配列改変を含む。例えば、変異体抗体は、いずれか１つのＣＤＲ内に４以下の配列改変、例えば、いずれか１つのＣＤＲ（例えばＶＨドメインのＣＤＲ３）内に３以下、２以下、１以下の配列改変を含み得る。変異体抗体は、１０Ｃ９のＶＨドメイン（配列番号３）及び１０Ｃ９のＶＬドメイン（配列番号４）を含んでいる抗体のＡｘｌ結合ドメインと、Ａｘｌ（例えば、ヒトＡｘｌ）への結合を競合し得る。
【００３１】
したがって、本発明の更なる態様は、ヒトＡｘｌへの結合を１０Ｃ９と競合するヒト抗体抗原結合部位を含んでいる抗体を提供する。
【００３２】
一態様では、本発明は、本明細書に記載されているように、ハイブリドーマＵＴ−１０Ｃ９−Ｂ９から得られる抗体を提供する。
【００３３】
Ａｘｌへの結合を１０Ｃ９と競合し得る、Ａｘｌに対する抗体を得るための種々の方法が当技術分野で提供されている。
【００３４】
更なる態様では、本発明は、抗原を結合できる１つ以上の抗体を得る方法を提供し、該方法には、本発明による抗体のライブラリと前記抗原とを接触させること、及び前記抗原と結合できるライブラリの１つ以上の抗体メンバーを選択することを含む。
【００３５】
このライブラリをバクテリオファージ粒子の表面に提示することができる。各粒子は、その表面に提示される抗体ＶＨ可変ドメインをコードする核酸、また存在する場合には提示されたＶＬドメインもコードする場合がある核酸を含んでいる。
【００３６】
抗原を結合でき、バクテリオファージ粒子に提示される抗体を選別した後、前記選別された抗体を提示するバクテリオファージ粒子から核酸を取得することができる。前記選別された抗体を提示するバクテリオファージ粒子から得た核酸配列を有する核酸からの発現により、このような核酸を後続の抗体または抗体ＶＨ可変ドメイン（場合により抗体ＶＬ可変ドメイン）の作製に使用することができる。
【００３７】
前記選別された抗体の抗体ＶＨ可変ドメインのアミノ酸配列を有する抗体ＶＨ可変ドメインを単離形態で提供することも、このようなＶＨドメインを含んでいる抗体を提供することもできる。
【００３８】
Ａｘｌとの結合能、またＡｘｌへの結合を１０Ｃ９と競合する能力を更に試験することができる。
【００３９】
あるいは、目的とする抗体が結合するＡｘｌ上のエピトープと結合する抗体（例えば、１０Ｃ９または１０Ｇ５抗体のＡｘｌへの結合を阻止するもの）をスクリーニングするため、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されているような通常のクロスブロッキングアッセイを実施することができる。
【００４０】
本発明による抗体は、１０Ｃ９の親和性によりＡｘｌを結合することができる。
【００４１】
本発明の抗体は、マウス、ラット、サル、非ヒト霊長類及び／またはヒトのＡｘｌと結合することができる。好ましくは、抗体はヒト及びサルのＡｘｌと結合する。いくつかの実施形態では、抗体は霊長類のＡｘｌを特異的に結合する。例えば、抗体は、ヒト及びサルのＡｘｌを特異的に結合することができる。一実施形態では、抗体はヒトのＡｘｌのみを特異的に結合する。
【００４２】
抗体は、キメラ化、ヒト化、またはＣＤＲ移植した抗Ａｘｌ抗体でもよい。例えば、抗体はヒト／マウスキメラ抗体でもよい。
【００４３】
異なる抗体の結合親和性及び中和力価を適切な条件下で比較することができる。
【００４４】
抗体配列に加えて、本発明による抗体は例えばペプチドまたはポリペプチドを形成する他のアミノ酸、例えばフォールドドメイン、または抗原を結合する能力に加えて他の機能的な特徴を分子に付与できるアミノ酸を含んでもよい。
【００４５】
本発明の抗体は、検出可能な標識を保持することも、または毒素（例えば細胞毒）、酵素もしくは有機部分に（例えばペプチジル結合またはリンカーを介して）複合体化することもできる。
【００４６】
当業者は、タンパク質に分子を化学的に複合体化する数多くの方法を認識している。本発明の一実施形態では、検出可能な蛍光標識、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）と、またはレポーター酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と抗体を複合体化することができる。
【００４７】
好ましい実施形態では、抗体は細胞毒性薬と複合体化して、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する。抗体が医薬用途を目的とする場合、抗体と薬を連結する結合は、循環（例えば、循環血液）中は安定であるが、複合体が細胞内に隔離された後は不安定であることが好ましい。したがって、免疫複合体として複合体化された抗体を、例えば癌の治療方法に用いることができる。
【００４８】
更なる態様では、本発明は本発明による抗体、ＶＨドメイン及び／またはＶＬドメインをコードする配列を含む単離した核酸と、本発明の抗体、ＶＨドメイン及び／またはＶＬドメインの調製方法とを提供し、該方法には、前記抗体、ＶＨドメイン及び／またはＶＬドメインの産生をもたらす条件下で前記核酸を発現させ、それを回収する方法を含む。
【００４９】
本発明による抗体は、ヒトまたは動物の身体の治療方法または診断方法、例えば前記患者に本発明の抗体または複合体、もしくはその薬物−複合体を有効量で投与することを含む、ヒト患者での疾患または障害の治療方法（予防治療を含み得る）に使用することができる。本発明による治療が可能な病状は、本明細書に別記するものを含む。
【００５０】
本発明による抗体は、例えば、抗体が結合する細胞の存在または位置を決定するためのイメージング方法に使用することができる。
【００５１】
更なる態様では、本発明は、本発明による抗体及び１つ以上の試薬を含んでいる、抗体の抗原への結合を判定する診断キットを提供する。
【００５２】
本発明の更なる態様は、本明細書で開示される抗体ＶＨ可変ドメイン（配列番号３）及び／またはＶＬ可変ドメイン（配列番号４）をコードする核酸、通常は単離した核酸を提供する。いくつかの実施形態では、ＶＨをコードする核酸は、配列番号１に指定された配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬをコードする核酸は、配列番号２に指定された配列を有する。
【００５３】
本発明の別の態様は、本明細書で開示されるＶＨ  ＣＤＲまたはＶＬ  ＣＤＲの配列、特に配列番号５、６、及び７から選択されるＶＨ  ＣＤＲまたは配列番号８、９または１０から選択されるＶＬ  ＣＤＲ、最も好ましくは１０Ｃ９  ＣＤＲ３（配列番号７）をコードする核酸、通常は単離した核酸を提供する。
【００５４】
更なる態様は、本発明の核酸で形質転換された宿主細胞を提供する。
【００５５】
更に別の態様は、抗体ＶＨ可変ドメインの作製方法を提供し、該方法にはコード核酸から発現を生じさせることを含む。このような方法には、前記抗体ＶＨ可変ドメインの作製条件下で、宿主細胞を培養することを含んでもよい。
【００５６】
ＶＬ可変ドメインならびにＶＨ及び／またはＶＬドメインを含んでいる抗体の類似した作製方法を本発明の更なる態様として提供する。
【００５７】
作製方法には、産物の単離及び／または精製工程を含み得る。
【００５８】
作製方法は、少なくとも１つの添加成分、例えば薬学的に許容される賦形剤を含む組成物に産物を製剤化することを含み得る。
【００５９】
本発明の上記及びその他の態様について、以下で更に詳細に述べる。
【００６０】
１０Ｇ５抗体
一態様では、本発明は、Ａｘｌを結合し、１０Ｇ５のＶＨドメイン（配列番号２１）及び／または１０Ｇ５のＶＬドメイン（配列番号２２）で構成される単離された抗体を提供する。好ましくは、これに結合されるＡｘｌはヒトＡｘｌである。非好適な代替的態様では、本発明は、Ａｘｌを結合し、１０Ｇ５［Ｑ１Ｅ］ＶＨドメイン（配列番号４５）及び／または１０Ｇ５のＶＬドメイン（配列番号２２）で構成される単離された抗体を提供する。好ましくは、これに結合されるＡｘｌはヒトＡｘｌである。
【００６１】
好ましい実施形態では、１０Ｇ５のＶＨドメイン（配列番号２１）は１０Ｇ５のＶＬドメイン（配列番号２２）と対になることで、１０Ｇ５のＶＨドメイン及びＶＬドメイン両方を含む抗体抗原結合部位を形成する。他の実施形態では、１０Ｇ５のＶＨは１０Ｇ５のＶＬ以外のＶＬドメインと対である。軽鎖の無差別性は従来技術で確立されている。例えば、実施形態によっては、１０Ｇ５のＶＨドメイン（配列番号２１）は１０Ｃ９のＶＬドメイン（配列番号４）と対である。非好適な代替的態様では、１０Ｇ５［Ｑ１Ｅ］ＶＨドメイン（配列番号４５）は１０Ｇ５のＶＬドメイン（配列番号２２）と対になることで、１０Ｇ５のＶＨドメイン及びＶＬドメイン両方を含む抗体抗原結合部位を形成する。他の実施形態では、１０Ｇ５のＶＨは１０Ｇ５のＶＬ以外のＶＬドメインと対である。軽鎖の無差別性は従来技術で確立されている。例えば、実施形態によっては、１０Ｇ５［Ｑ１Ｅ］のＶＨドメイン（配列番号４５）は１０Ｃ９のＶＬドメイン（配列番号４）と対である。
【００６２】
１０Ｇ５のＶＨまたはＶＬドメインから１つ以上のＣＤＲを得ることができ、それを適したフレームワークに組み込むことができる。これについては、以下で詳述する。１０Ｇ５のＶＨ  ＣＤＲ１、２及び３をそれぞれ配列番号２３、２４及び２５に示す。１０Ｇ５のＶＬ  ＣＤＲ１、２及び３をそれぞれ配列番号２６、２７及び２８に示す。
【００６３】
本発明の一態様では、Ａｘｌを結合し、以下で構成される抗体を提供する：
１０Ｇ５のＶＨドメイン（配列番号２１）、１０Ｇ５［Ｑ１Ｅ］ＶＨドメイン（配列番号４５）、及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３と、場合により配列番号２４及び配列番号２３から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲとを含むＶＨドメインからなる群から選択される抗体ＶＨドメイン；ならびに／または
１０Ｇ５のＶＬドメイン（配列番号２２）、及び配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のＶＬ  ＣＤＲを含むＶＬドメインからなる群から選択される抗体ＶＬドメイン。
【００６４】
例えば、抗体は、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲを含んでいる抗体ＶＨドメインを含んでもよい。更に抗体は、配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲを含んでいる抗体ＶＬドメインを含んでもよい。
【００６５】
いくつかの実施形態では、抗体は、（ｉ）配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲを含んでいる抗体ＶＨドメイン、（ｉｉ）配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲを含んでいる抗体ＶＬドメインで構成される。
【００６６】
抗体は、１０Ｇ５のＶＨドメイン（配列番号２１）を含み、場合により１０Ｇ５のＶＬドメイン（配列番号２２）を更に含んでもよい。非好適な代替的実施形態では、抗体は１０Ｇ５［Ｑ１Ｅ］ＶＨドメイン（配列番号４５）を含み、場合により１０Ｇ５のＶＬドメイン（配列番号２２）を更に含んでもよい。
【００６７】
好ましくは、抗体は、１０Ｇ５のＶＨドメイン（配列番号２１）及び１０Ｇ５のＶＬドメイン（配列番号２２）を含んでいる抗体のＡｘｌ結合ドメインと、ヒトＡｘｌへの結合を競合する。
【００６８】
好ましくは、抗体は、本明細書に記載されているように、ハイブリドーマＷＲ−１０Ｇ５−Ｅ５から得られる抗体が結合するエピトープと結合する。
【００６９】
好ましくは、この抗体はＡｘｌとそのリガンドＧａｓ６との結合を阻害する。更により好ましくは、この抗体はまた、Ａｘｌ発現の下方調節、Ａｘｌ受容体のシグナル伝達阻害、及び／または腫瘍成長の阻害をもたらす。
【００７０】
本発明の更に別の態様によれば、本明細書で指定する配列であり、Ａｘｌに対する抗体として用いることができ、配列改変または突然変異及びスクリーニングといった方法によって得ることができる、ＶＨ及びＶＬドメインの変異体が提供される。このような方法もまた、本発明によって提供される。
【００７１】
本明細書で具体的に開示されている配列であるＶＨ及びＶＬドメインのいずれかの可変ドメインのアミノ酸配列変異体を、記載されているように本発明に従って用いることができる。個々の変異体には、１つ以上のアミノ酸配列改変（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／または挿入）、おそらく約２０未満の改変、約１５未満の改変、約１０未満の改変または約５未満の改変（すなわち、４、３、２または１）が含まれ得る。改変は、１つ以上のフレームワーク領域及び／または１つ以上のＣＤＲ内に施すことができる。
【００７２】
本発明による抗体は、抗原と結合し、かつ本明細書で開示される抗体ＶＨ及び／またはＶＬドメイン、本明細書で開示されるＶＨ  ＣＤＲ３、またはこれらのいずれかの変異体を含む任意の抗体と、抗原との結合を競合するものであればよい。抗体間の競合は、例えば、ＥＬＩＳＡ法を使用して、及び／または、一方の抗体に対して特異的なレポーター分子を標識化し、他方の無標識抗体（複数可）の存在下で検出できるようにして、同じエピトープまたは重複するエピトープと結合する抗体の同定を可能にすることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで容易に分析することができる。
【００７３】
あるいは、目的とする抗体が結合するＡｘｌ上のエピトープと結合する抗体（例えば、１０Ｃ９または１０Ｇ５抗体のＡｘｌへの結合を阻止するもの）をスクリーニングするため、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されているような通常のクロスブロッキングアッセイを実施することができる。
【００７４】
したがって、本発明は、本明細書で具体的に開示されるいかなる抗体の変異体も含み、該変異体は、１つ以上のフレームワーク領域内及び／または１つ以上のＣＤＲ内に１つ以上のアミノ酸配列改変を含む。例えば、変異体抗体は、いずれか１つのＣＤＲ内に４以下の配列改変、例えば、いずれか１つのＣＤＲ（例えばＶＨドメインのＣＤＲ３）内に３以下、２以下、１以下の配列改変を含み得る。変異体抗体は、１０Ｇ５のＶＨドメイン（配列番号２１）及び１０Ｇ５のＶＬドメイン（配列番号２２）を含んでいる抗体のＡｘｌ結合ドメインと、Ａｘｌ（例えば、ヒトＡｘｌ）への結合を競合し得る。
【００７５】
したがって、本発明の更なる態様は、ヒトＡｘｌへの結合を１０Ｇ５と競合するヒト抗体抗原結合部位を含んでいる抗体を提供する。
【００７６】
一態様では、本発明は、本明細書に記載されているように、ハイブリドーマＷＲ−１０Ｇ５−Ｅ５から得られる抗体を提供する。
【００７７】
Ａｘｌへの結合を１０Ｇ５と競合し得る、Ａｘｌに対する抗体を得るための種々の方法が当技術分野で提供されている。
【００７８】
更なる態様では、本発明は、抗原と結合できる１つ以上の抗体を得る方法を提供し、該方法には、本発明による抗体のライブラリと前記抗原とを接触させること、及び前記抗原と結合できるライブラリの１つ以上の抗体メンバーを選択する方法を含む。
【００７９】
このライブラリをバクテリオファージ粒子の表面に提示することができる。各粒子は、その表面に提示される抗体ＶＨ可変ドメインをコードする核酸、また存在する場合には提示されたＶＬドメインもコードする場合がある核酸を含んでいる。
【００８０】
抗原を結合でき、バクテリオファージ粒子に提示される抗体を選別した後、前記選別された抗体を提示するバクテリオファージ粒子から核酸を取得することができる。前記選別された抗体を提示するバクテリオファージ粒子から得た核酸配列を有する核酸からの発現により、このような核酸を後続の抗体または抗体ＶＨ可変ドメイン（場合により抗体ＶＬ可変ドメイン）の作製に使用することができる。
【００８１】
前記選別された抗体の抗体ＶＨ可変ドメインのアミノ酸配列を有する抗体ＶＨ可変ドメインを単離形態で提供することも、このようなＶＨドメインを含んでいる抗体を提供することもできる。
【００８２】
Ａｘｌとの結合能、またＡｘｌへの結合を１０Ｇ５と競合する能力を更に試験することができる。
【００８３】
本発明による抗体は、１０Ｇ５の親和性によりＡｘｌを結合することができる。
【００８４】
本発明の抗体は、マウス、ラット、サル、非ヒト霊長類及び／またはヒトＡｘｌと結合することができる。好ましくは、抗体はヒト及びサルのＡｘｌと結合する。いくつかの実施形態では、抗体は霊長類のＡｘｌを特異的に結合する。例えば、抗体は、ヒト及びサルのＡｘｌを特異的に結合することができる。一実施形態では、抗体はヒトのＡｘｌのみを特異的に結合する。
【００８５】
抗体は、キメラ化、ヒト化、またはＣＤＲ移植した抗Ａｘｌ抗体でもよい。例えば、抗体はヒト／マウスキメラ抗体でもよい。
【００８６】
異なる抗体の結合親和性及び中和力価を適切な条件下で比較することができる。
【００８７】
抗体配列に加えて、本発明による抗体は例えばペプチドまたはポリペプチドを形成する他のアミノ酸、例えばフォールドドメイン、または抗原を結合する能力に加えて他の機能的な特徴を分子に付与できるアミノ酸を含んでもよい。
【００８８】
本発明の抗体は、検出可能な標識を保持することも、または毒素（例えば細胞毒）、酵素もしくは有機部分に（例えばペプチジル結合またはリンカーを介して）複合体化することもできる。
【００８９】
当業者は、タンパク質に分子を化学的に複合体化する数多くの方法を認識している。本発明の一実施形態では、検出可能な蛍光標識、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）と、またはレポーター酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と抗体を複合体化することができる。
【００９０】
好ましい実施形態では、抗体は細胞毒性薬と複合体化して、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成する。抗体が医薬用途を目的とする場合、抗体と薬を連結する結合は、循環（例えば、循環血液）中は安定であるが、複合体が細胞内に隔離された後は不安定であることが好ましい。したがって、免疫複合体として複合体化された抗体を、例えば癌の治療方法に用いることができる。
【００９１】
更なる態様では、本発明は本発明による抗体、ＶＨドメイン及び／またはＶＬドメインをコードする配列を含む単離した核酸と、本発明の抗体、ＶＨドメイン及び／またはＶＬドメインの調製方法とを提供し、該方法には、前記抗体、ＶＨドメイン及び／またはＶＬドメインの産生をもたらす条件下で前記核酸を発現させ、それを回収する方法を含む。
【００９２】
本発明による抗体は、ヒトまたは動物の身体の治療方法または診断方法、例えば前記患者に本発明の抗体または複合体、もしくはその薬物−複合体を有効量で投与することを含む、ヒト患者での疾患または障害の治療方法（予防治療を含み得る）に使用することができる。本発明による治療が可能な病状は、本明細書に別記するものを含む。
【００９３】
本発明による抗体は、例えば、抗体が結合する細胞の存在または位置を決定するためのイメージング方法に使用することができる。
【００９４】
更なる態様では、本発明は、本発明による抗体及び１つ以上の試薬を含んでいる、抗体の抗原への結合を判定する診断キットを提供する。
【００９５】
本発明の更なる態様は、本明細書で開示される抗体ＶＨ可変ドメイン（配列番号２１）、抗体ＶＨ可変ドメイン（配列番号４５）及び／またはＶＬ可変ドメイン（配列番号２２）をコードする核酸、通常は単離した核酸を提供する。いくつかの実施形態では、ＶＨをコードする核酸は、配列番号１９に指定された配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬをコードする核酸は、配列番号２０に指定された配列を有する。
【００９６】
本発明の別の態様は、本明細書で開示されるＶＨ  ＣＤＲまたはＶＬ  ＣＤＲの配列、特に配列番号２３、２４、及び２５から選択されるＶＨ  ＣＤＲまたは配列番号２６、２７または２８から選択されるＶＬ  ＣＤＲ、最も好ましくは１０Ｇ５  ＣＤＲ３（配列番号２５）をコードする核酸、通常は単離した核酸を提供する。
【００９７】
更なる態様は、本発明の核酸で形質転換された宿主細胞を提供する。
【００９８】
更に別の態様は、抗体ＶＨ可変ドメインの作製方法を提供し、該方法にはコード核酸から発現を生じさせることを含む。このような方法には、前記抗体ＶＨ可変ドメインの作製条件下で、宿主細胞を培養することを含んでもよい。
【００９９】
ＶＬ可変ドメインならびにＶＨ及び／またはＶＬドメインを含んでいる抗体の類似した作製方法を本発明の更なる態様として提供する。
【０１００】
作製方法には、産物の単離及び／または精製工程を含み得る。
【０１０１】
作製方法は、少なくとも１つの添加成分、例えば薬学的に許容される賦形剤を含む組成物に産物を製剤化することを含み得る。
【０１０２】
本発明の上記及びその他の態様について、以下で更に詳細に述べる。
【０１０３】
１０Ｃ９抗体の特性
Ａｘｌに対する高親和性
本明細書に記載する１０Ｃ９抗体は、高親和性でヒトＡｘｌと結合する。実施例５及び１３に記載されているように、マウス１０Ｃ９抗体が０．１８ｎＭのＫＤを有することを特定すると同時に、キメラ型が０．１０ｎＭのＫＤを有することを特定した。
【０１０４】
したがって、本明細書に記載する１０Ｃ９抗体及びその変異体は、高親和性でＡｘｌを結合し、好ましくはヒトＡｘｌを高親和性で結合する。いくつかの実施形態では、抗体はＡｘｌ（すなわちヒトＡｘｌ）と、１０−６Ｍ以下、例えば５ｘ１０−７Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、５ｘ１０−８Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、５ｘ１０−９Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、５ｘ１０−１０Ｍ以下、２ｘ１０−１０Ｍ以下、１．１ｘ１０−１０Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、５ｘ１０−１１Ｍ以下、１０−１１Ｍ以下、５ｘ１０−１２Ｍ以下、６ｘ１０−１２Ｍ以下、１０−１２Ｍ以下、５ｘ１０−１３Ｍ以下、１０−１３Ｍ以下、５ｘ１０−１４Ｍ以下、１０−１４Ｍ以下、５ｘ１０−１５Ｍ以下または１０−１５Ｍ以下のＫＤで結合する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、抗体はＡｘｌ（すなわちヒトＡｘｌ）と、１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ〜１０−１４Ｍ、または１０−１４Ｍ〜１０−１６ＭのＫＤで結合する。
【０１０６】
ＫＤは、実施例５または実施例１３で述べた方法で測定して算出することができる。
【０１０７】
本明細書に記載する１０Ｃ９抗体は、非常に速い会合速度（ｋｏｎ）を有することを特徴とする。具体的には、実施例５で、マウス１０Ｃ９抗体がｋｏｎ＝１．６１ｘ１０６Ｍ−１ｓ−１の非常に速い会合速度を有することを特定すると同時に、実施例１３で、キメラ１０Ｃ９抗体がそれよりも速いｋｏｎ＝２．１６ｘ１０６Ｍ−１ｓ−１の会合速度を有することを特定した。
【０１０８】
したがって、本明細書に記載する抗体は、好ましくはヒトＡｘｌを速い会合速度で結合する。いくつかの実施形態では、抗体はＡｘｌ（すなわちヒトＡｘｌ）と、１０４Ｍ−１ｓ−１以上、例えば５ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１以上、１０５Ｍ−１ｓ−１以上、５ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１以上、１０６Ｍ−１ｓ−１以上、１．５ｘ１０６Ｍ−１ｓ−１以上、２ｘ１０６Ｍ−１ｓ−１以上、５ｘ１０６Ｍ−１ｓ−１以上、１０７Ｍ−１ｓ−１以上、２ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１以上、５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１以上、１０８Ｍ−１ｓ−１以上、５ｘ１０８Ｍ−１ｓ−１以上、または１０９Ｍ−１ｓ−１以上のｋｏｎで結合する。
【０１０９】
１０Ｇ５抗体の特性
Ａｘｌに対する高親和性
本明細書に記載する１０Ｇ５抗体は、高親和性でヒトＡｘｌと結合する。実施例５及び１３に記載されているように、マウス１０Ｇ５抗体が０．５３ｎＭのＫＤを有することを特定すると同時に、キメラ型が０．１０ｎＭのＫＤを有することを特定した。
【０１１０】
したがって、本明細書に記載する１０Ｇ５抗体及びその変異体は、高親和性でＡｘｌを結合し、好ましくはヒトＡｘｌを高親和性で結合する。いくつかの実施形態では、抗体はＡｘｌ（すなわちヒトＡｘｌ）と、１０−６Ｍ以下、例えば５ｘ１０−７Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、５ｘ１０−８Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、５ｘ１０−９Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、６ｘ１０−１０Ｍ以下、５ｘ１０−１０Ｍ以下、１．１ｘ１０−１０Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、５ｘ１０−１１Ｍ以下、１０−１１Ｍ以下、５ｘ１０−１２Ｍ以下、６ｘ１０−１２Ｍ以下、１０−１２Ｍ以下、５ｘ１０−１３Ｍ以下、１０−１３Ｍ以下、５ｘ１０−１４Ｍ以下、１０−１４Ｍ以下、５ｘ１０−１５Ｍ以下または１０−１５Ｍ以下のＫＤで結合する。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、抗体はＡｘｌ（すなわちヒトＡｘｌ）と、１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ〜１０−１４Ｍ、または１０−１４Ｍ〜１０−１６ＭのＫＤで結合する。
【０１１２】
ＫＤは、実施例５または実施例１３で述べた方法で測定して算出することができる。
【０１１３】
本明細書に記載する１０Ｇ５抗体は、非常に速い会合速度（ｋｏｎ）を有することを特徴とする。具体的には、実施例５で、マウス１０Ｇ５抗体がｋｏｎ＝０．８３ｘ１０６Ｍ−１ｓ−１の非常に速い会合速度を有することを特定すると同時に、実施例１３で、キメラ１０Ｇ５抗体がそれよりも速いｋｏｎ＝１．６４ｘ１０６Ｍ−１ｓ−１の会合速度を有することを特定した。
【０１１４】
したがって、本明細書に記載する抗体は、好ましくはヒトＡｘｌを速い会合速度で結合する。いくつかの実施形態では、抗体はＡｘｌ（すなわちヒトＡｘｌ）と、１０４Ｍ−１ｓ−１以上、例えば５ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１以上、１０５Ｍ−１ｓ−１以上、５ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１以上、１０６Ｍ−１ｓ−１以上、１．５ｘ１０６Ｍ−１ｓ−１以上、２ｘ１０６Ｍ−１ｓ−１以上、５ｘ１０６Ｍ−１ｓ−１以上、１０７Ｍ−１ｓ−１以上、２ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１以上、５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１以上、１０８Ｍ−１ｓ−１以上、５ｘ１０８Ｍ−１ｓ−１以上、または１０９Ｍ−１ｓ−１以上のｋｏｎで結合する。
【０１１５】
１０Ｃ９及び１０Ｇ５抗体両方の特性
特異的結合性
一般に用語「特異的」及び「特異的に結合する」は、抗体がその特異的結合パートナー（複数可）以外の分子にいかなる有意な結合も示さない状況を指すときに使用することができる。例えば、ヒトＡｘｌを「特異的に結合する」抗体は、マウスＡｘｌに対していかなる有意な結合も示さない。
【０１１６】
この用語はまた、例えばいくつかの抗原がもつ特定のエピトープに対して抗体が特異的である場合にも適用できる。この場合、エピトープを「特異的に結合する」抗体は、認識されたエピトープをもつ種々の抗原すべてと結合することが可能である。
【０１１７】
通常、特異性は、例えば抗原パネルを用いたＥＬＩＳＡ法などの結合アッセイによって決定することができる。
【０１１８】
本明細書に記載する１０Ｃ９及び１０Ｇ５抗体は、高特異的にヒトＡｘｌと結合する。すなわち、１０Ｃ９及び１０Ｇ５抗体は、ヒトＡｘｌを「特異的に結合する」。このことを実施例で実証する。示される内容は以下の通りである：
（１）実施例２で、１０Ｃ９及び１０Ｇ５は、ヒトＴＡＭ受容体チロシンキナーゼファミリーの他のメンバーであるｈＭｅｒ及びｈＴｙｒｏ３由来の組み換え抗原と有意な結合性を示さない；
（２）実施例３で、１０Ｃ９及び１０Ｇ５は、ヒトＡｘｌと強く結合するが、マウスＡｘｌとの結合性は示さない（これはマウスＡｘｌリガンドであるマウスＧａｓ６が、マウスとヒト両方のＡｘｌと強く結合するとともに、ヒトＴｙｒｏ３とも（より弱く）結合することとは対照的である）；
（３）実施例４で、１０Ｃ９及び１０Ｇ５は、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）Ａｘｌと強く結合する。
【０１１９】
このように、本明細書に記載する抗体は、霊長類Ａｘｌを特異的に結合することが好ましい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する抗体は、ヒト及びサル（例えばＭａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のＡｘｌを特異的に結合する。一実施形態では、抗体はヒトＡｘｌに限り特異的に結合する。
【０１２０】
本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載する抗体は、ヒトＴｙｒｏ３及び／またはヒトＭｅｒに有意な結合を示さない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する抗体は、マウスＡｘｌと有意な結合性を示さない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する抗体は、ヒトＴｙｒｏ３、ヒトＭｅｒまたはマウスＡｘｌのいずれにも有意な結合性を示さない。
【０１２１】
抗体が抗原に「有意な結合性を示さない」かどうかは、例えば、実施例２及び３に記載されている技術を使用して当業者が容易に特定できる。いくつかの実施形態では、抗体が１０−３Ｍ超、例えば１０−２Ｍ超、１０−１Ｍ超または１Ｍ超のＫＤで抗原を結合する場合、抗体は特定の抗原に「有意な結合性を示さない」ものと見なす。ＫＤは、実施例５で述べた方法で測定して算出することができる。
【０１２２】
Ａｘｌ／Ｇａｓ６結合の阻害
本明細書に記載する１０Ｃ９及び１０Ｇ５抗体は、ＡｘｌとそのリガンドＧａｓ６との結合を阻害する。
【０１２３】
図５は、実施例６に記載されている競合結合アッセイの結果を示す。結果は、固定化ｒｈＡｘｌが１０Ｃ９で飽和されると、それ以降に追加された１０Ｃ９、または１０Ｇ５、ｒｈＧａｓ６（ｒｈＡｘｌのリガンドとして既知）もしくはｒｍＧａｓ６のいずれもが結合できないことを示している。これは、１０Ｃ９、１０Ｇ５及びＧａｓ６が結合するＡｘｌ分子の領域が互いに隣接していることを示す。対照的に、１０Ｃ９の結合は、ＭＡＢ１５４抗Ａｘｌ抗体の結合をまったく阻害しなかった。これは、１０Ｃ９とＭＡＢ１５４がＡｘｌ分子の別々の部分と結合することを意味する。
【０１２４】
したがって、好ましい実施形態では、本明細書に記載する抗体は、ＡｘｌのＧａｓ６への（例えば、ｒｈＡｘｌのｒｈＧａｓ６への）結合を阻害する。すなわち、好ましくは、本明細書に記載する抗体は、ヒトＡｘｌへの結合をヒトＧａｓ６と競合する。最も好ましくは、Ａｘｌ／Ｇａｓ６結合が阻害される結果、抗体で飽和したＡｘｌサンプルにＧａｓ６の有意な結合がまったく観察できない（例えば、それまで抗体に露出されなかったＡｘｌサンプルに対して観察される結合が１％以下）。Ｇａｓ６結合の阻害は、実施例６に記載されている競合結合アッセイを使用して評価することができる。
【０１２５】
Ａｘｌ受容体発現の阻害
本発明の抗体は、Ａｘｌの発現に有意な減少を生じさせる。
【０１２６】
図８は、実施例９に記載されているウェスタンブロットアッセイの結果を示す。この実施例では、ＭＢＡ−ＭＤ−２３１細胞を、一連の抗体のいずれかとともに一晩インキュベートした後、Ａｘｌ発現について試験した。結果は、１０Ｃ９とともにインキュベートすると、細胞内に存在するＡｘｌ受容体タンパク質の量に有意な減少が生じることを示している。これは、１０Ｃ９抗体の結合がＡｘｌ受容体の発現を下方調節することを意味する。
【０１２７】
したがって、好ましい実施形態では、本発明の抗体はＡｘｌ受容体の発現を下方調節する。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、Ａｘｌ受容体の発現を、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をしたサンプルで観察されるレベルの８０％未満に減少させる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、Ａｘｌ受容体の発現を、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をしたサンプルで観察されるレベルの７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満または１０％未満に減少させる。Ａｘｌ受容体発現のレベルは、実施例９に記載されているアッセイを使用して評価することができる。また当技術分野では、ウェスタンブロット上のバンドを正確に定量化するための方法が数多く知られており、例えば、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３；５５（３）：２１７−２２６を参照のこと。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、Ａｘｌ受容体発現の下方調節は迅速に発生する。例えば、いくつかの実施形態では、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をしたサンプルで観察されるレベルの８０％未満へのＡｘｌ受容体発現の減少が、サンプルを抗体と接触させてから１２時間以内、例えばサンプルを抗体と接触させてから１２時間以内、６時間以内、３時間以内、または１時間以内で観察される。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、抗体は、Ａｘｌ受容体発現の持続的な下方調節を生じさせる。例えば、いくつかの実施形態では、抗体と接触させたサンプルのＡｘｌ受容体発現のレベルを、サンプルを抗体と接触させて以降、少なくとも６時間、例えば少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間または少なくとも９６時間の間、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をしたサンプルで観察されるレベルの５０％未満に維持する。
【０１３１】
理論に束縛されるものではないが、Ａｘｌ発現に観察された下方調節は、抗体／Ａｘｌ受容体の複合体が内在化して、細胞によって分解されるためであると考えられる。抗体の内在化は、抗体または抗体と連結された分子を標的細胞に到達させることが望ましい用途において極めて有利である。例えば、標的が癌細胞である場合、抗体は細胞毒性薬と連結されている。
【０１３２】
したがって、好ましい実施形態では、本発明の抗体は、Ａｘｌ受容体の内在化の速度を増加させる。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、Ａｘｌ受容体の内在化の速度を、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をしたサンプルで観察されるレベルの少なくとも１１０％に増加させる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、Ａｘｌ受容体の内在化の速度を、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をしたサンプルで観察されるレベルの少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％に増加させる。
【０１３４】
Ａｘｌ受容体の内在化のレベルは、当技術分野で既知のいずれか１つの受容体内在化アッセイを使用して評価することができる。例えば、Ｋｏｅｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２５９，２００４，ｐｐ２４９−２７３に記載されている方法である。
【０１３５】
Ａｘｌ受容体シグナル伝達の阻害
本発明の抗体が（１）Ａｘｌ受容体の天然リガンド（例えばＧａｓ６）との結合を阻害する、また（２）Ａｘｌ受容体の発現を下方調節するという観察と一貫して、本発明の抗体はＡｘｌ受容体のリガンドによって誘発される下流のシグナル伝達を阻害する。この観察結果を図９に示している。この図から、１０Ｃ９抗体の存在が、ＡｘｌリガンドＧａｓ６添加時にＡｋｔのＳｅｒｉｎｅ  ４７３がリン酸化される程度を有意に減少させることがわかる。
【０１３６】
したがって、好ましい実施形態では、本発明の抗体はＡｘｌ活性を阻害する。阻害される活性は、構成的Ａｘｌ活性であり得る。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、Ａｘｌの下流のシグナル伝達、例えばＳｅｒｉｎｅ  ４７３でのＡｋｔのリン酸化を阻害する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体と接触させたサンプルのＳｅｒｉｎｅ  ４７３でのＡｋｔのリン酸化は、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をしたサンプルで観察されるレベルの８０％未満である。いくつかの実施形態では、本発明の抗体と接触させたサンプルのＳｅｒｉｎｅ  ４７３でのＡｋｔのリン酸化は、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をしたサンプルで観察されるレベルの７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満または１０％未満である。Ｓｅｒｉｎｅ  ４７３でのＡｋｔのリン酸化のレベルは、実施例１０に記載されているアッセイを使用して評価することができる。また当技術分野では、ウェスタンブロット上のバンドを正確に定量化するための方法が数多く知られており、例えば、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３；５５（３）：２１７−２２６を参照のこと。
【０１３８】
Ａｘｌ受容体のシグナル伝達を阻害することによって、本発明の抗体はまた、Ａｘｌ受容体のシグナル伝達が担う範囲の作用に影響を及ぼすことが期待される。
【０１３９】
例えば、Ａｘｌ受容体のシグナル伝達がＧａｓ６依存性の細胞増殖を刺激して細胞死を阻害し、その結果、腫瘍成長を助けることが知られている。また、Ａｘｌ受容体のシグナル伝達は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を刺激して、その結果、腫瘍転移を促進することも知られている。
【０１４０】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、例えばアポトーシスによる細胞死を促進する。好ましくは、細胞は、例えば循環腫瘍細胞または転移細胞などの腫瘍細胞である。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、細胞死率を、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をしたサンプルで観察されるレベルの少なくとも１１０％に増加させる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、細胞死率を、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をしたサンプルで観察されるレベルの少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％に増加させる。細胞死率は、例えば、ＢｒｄＵ取り込みアッセイ、ＭＴＴ、［３Ｈ］−チミジンの取り込み（例えば、ＴｏｐＣｏｕｎｔアッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ））、細胞生存率アッセイ（例えば、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ））、ＤＮＡ断片化アッセイ、カスパーゼ活性化アッセイ、トリプタンブルー染色による排除、クロマチンの形態分析などにより測定することができる。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、Ａｘｌの下流シグナル伝達を阻害する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、Ｇａｓ６依存性の細胞増殖を阻害する。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、腫瘍関連マクロファージからの炎症性サイトカインの発現を阻害する。
【０１４３】
腫瘍成長の阻害
腫瘍成長におけるＡｘｌ及びＥＭＴ経路の役割と一貫して、本発明の抗体は、血液学的腫瘍と非血液学的腫瘍両方の成長速度を低下させる。このことを、実施例１４及び１５に記載されている方法によって得た、図１４及び１５に示すデータによって実証している。
【０１４４】
したがって、好ましい実施形態では、本発明の抗体は、例えば腫瘍間質の機能を調節することによって、腫瘍成長及び／または転移を阻害する。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、対照腫瘍と比較して少なくとも１０％腫瘍成長を阻害する。すなわち、抗体で治療した腫瘍の容積は、対照腫瘍の容積の９０％以下である。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、対照腫瘍と比較して少なくとも２０％、例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％腫瘍成長を阻害する。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、実施例１４に記載されているように、腫瘍成長に対する抗体の効果を分析する。いくつかの実施形態では、実施例１５に記載されているように、腫瘍成長に対する抗体の効果を分析する。
【０１４７】
定義
抗体
この用語は、天然であるか、または部分合成もしくは全体合成から産生されたかを問わず、免疫グロブリンを意味する。この用語はまた、抗体抗原−結合ドメインを含んでいる、いかなるポリペプチドまたはタンパク質にも適用される。抗体抗原−結合ドメインを含む抗体断片には、全抗体（例えばカノニカル配置でＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＬ及びＣＬドメインを含んでいるＩｇＧ抗体）、または標的抗原に対する結合活性を保持している全抗体の断片を包含する。このような断片としては、Ｆｖ（可変断片）、Ｆａｂ（抗体結合性の断片）及びＦ（ａｂ’）２断片、ならびに一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）、ｄｓＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、直列型ｓｃＦｖ、ＴａｎｄＡｂ、バイボディ、トリボディ、カッパ（ラムダ）ボディ、ＢｉＴＥ、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＳＩＰ、ＳＭＩＰまたはＤＡＲＴが挙げられる。更に、抗体及びその断片は、例えばＥＰ２３９４００Ａに記載されているヒト化抗体であってよい。例えば、モノクローナル及びポリクローナル抗体、組み換え抗体、抗体のタンパク質分解性断片及び組み換え断片（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ）、単一ドメイン抗体（ＶＨＨ、ｓｄＡｂ、ナノボディ、ＩｇＮＡＲ、ＶＮＡＲ）、ならびに抗体に無関係なタンパク質であり、これらは、限定されないが、以下のような抗体様特異的結合（抗体模倣体）を有するように操作されている。
【０１４８】
名称                    ベース：
アドネクチン／モノボディ  ヒトフィブロネクチン（１０Ｆｎ３）ＩＩＩ型の第１０ドメイン、１０ｋＤａ
アフィボディ              プロテインＡ、Ｚドメイン、６ｋＤａ
アフィリン                ヒトγ−クリスタリン／ヒトユビキチン（１０〜２０ｋＤａ）
アフィチン                Ｓａｃ７ｄ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来）、７ｋＤａ
アンチカリン              リポカリン、２０ｋＤａ
アビマー                  種々の細胞膜受容体のドメイン、９〜１８ｋＤａ
ＤＡＲＰｉｎ              アンキリンリピートモチーフ、１４ｋＤａ
Ｅｖｉｂｏｄｙ            細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）、１５ｋＤａ
フィノマー                Ｆｙｎ、ＳＨ３ドメイン、７ｋＤａ
クニッツドメインペプチド  種々のプロテアーゼ阻害剤、６ｋＤａ
【０１４９】
抗体は、抗体の重鎖定常領域及び／または抗体の軽鎖定常領域のすべてまたは部分を含み得る。
【０１５０】
モノクローナル抗体やその他の抗体を用い、組み換えＤＮＡ技術の技法を利用して、元の抗体の特異性を保持する遺伝子操作された抗体またはキメラ分子を作製することが可能である。このような技術には、抗体の免疫ブロブリン可変領域、すなわち相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡ断片と、異なる免疫グロブリンの免疫ブロブリン定常領域、すなわち定常領域にフレームワーク領域を加えた領域をコードする遺伝子とのライゲーションを伴う場合がある。例えば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ  ２１８８６３８ＡまたはＥＰ−Ａ−２３９４００を参照のこと。抗体を産生するハイブリドーマまたはその他細胞に、遺伝子突然変異またはその他の改変を施すことができる。この改変は、産生される抗体の結合特異性を変更するものであっても、変更しないものであってもよい。
【０１５１】
抗体がいくつかの方法で改変できる場合、用語「抗体分子」は、要求される特異性をもつ抗体由来の抗原−結合ドメインを有する、いかなるポリペプチドまたはその他の分子も含むと解釈されるものとする。したがって、この用語は、天然または全合成もしくは部分合成を問わず、免疫グロブリン結合ドメインを含んでいる何らかのポリペプチドを含む、抗体断片及び誘導体にも適用される。したがって、別のポリペプチドと融合された、免疫グロブリン結合ドメインまたは等価物を含むキメラ分子も包含される。キメラ抗体のクローニング及び発現については、ＥＰ−Ａ−０１２０６９４及びＥＰ−Ａ−０１２５０２３に記載されている。
【０１５２】
これには、全抗体の断片が抗原の結合機能を実行できることが示されている。結合性断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６（１９８９））；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの連結されたＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｖｉｉ）ＶＨドメインとＶＬドメインとがペプチドリンカーにより連結され、２つのドメインが会合されて抗原結合部位が形成されている一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３，１９８８）；（ｖｉｉｉ）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）ならびに（ｉｘ）「ダイアボディ」、すなわち遺伝子融合により構築された多価断片または多重特異性断片である（ＷＯ９４／１３８０４；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，６４４４−６４４８，１９９３）である。Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはダイアボディ分子は、ＶＨドメインとＶＬドメインとを連結するジスルフィド結合の組み込みにより安定化することができる（Ｙ．Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４，１２３９−１２４５，１９９６）。ＣＨ３ドメインと連結されたｓｃＦｖを含むミニボディもまた作製することができる（Ｓ．Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，３０５５−３０６１，１９９６）。
【０１５３】
抗体は、二重特異性であっても、多重特異性であってもよい。二重特異性抗体を使用する場合、この抗体は、さまざまな方法（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４，４４６−４４９（１９９３））で製造できる従来的な二重特異性抗体（例えば、化学的に調製されたものまたはハイブリッドハイブリドーマから調製されたもの）であっても、上述の二重特異性抗体断片のいずれかであってもよい。ダイアボディ及びｓｃＦｖは、可変ドメインのみを使用してＦｃ領域なしで構築でき、例えば抗体エフェクター機能による副作用、またはマウス起源の抗体を使用する場合にはヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応による副作用を低減する可能性をもつ。
【０１５４】
二重特異性ダイアボディは、二重特異性全抗体と対照的に、細菌（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）内に容易に構築して発現させることができるため、特に有用であり得る。適切な結合特異性のダイアボディ（及び抗体断片などの多数の他のポリペプチド）は、ファージディスプレイ（ＷＯ９４／１３８０４）を使用して抗体ライブラリから容易に選択することができる。ダイアボディの１本のアームを、例えばＡｘｌに対する特異性を有する定常なものにしたい場合は、他方のアームが可変性となり適切な特異性の抗体が選択されるライブラリを作製することができる二重特異性全抗体は、「ノブイントゥホール」操作（Ｊ．Ｂ．Ｂ．Ｒｉｄｇｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，９，６１６−６２１，１９９６）によって作製することができる。
【０１５５】
サンプル
本明細書で使用される場合、「サンプル」は単一細胞であっても、細胞集団であってもよい。細胞（複数可）は、通常の健康な細胞（複数可）であっても、腫瘍細胞、例えば循環癌細胞であってもよい。
【０１５６】
サンプルは、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏであり得る。例えば、サンプルはｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍腫瘤であっても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞集団であってもよい。
【０１５７】
抗原結合ドメイン
これは、抗原の一部または全体を認識して、それと特異的に結合し、それに相補的である領域を含む抗体分子の一部を意味する。抗原が大きい場合、抗体は、エピトープと呼ばれる、その抗原の特定の部分のみと結合し得る。抗原結合ドメインは、１つ以上の抗体可変ドメイン（例えば、ＶＨドメインからなる、いわゆるＦｄ抗体断片）によって構成され得る。好ましくは、抗原結合ドメインは抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１５８】
特異性タンパク質
ヒトＡｘｌ
本明細書で使用される場合、「ヒトＡｘｌ」とは、受容体チロシンキナーゼのヒトＴＡＭファミリーのＡｘｌメンバーを指す。ヒトＡｘｌには以下のアイソフォームが存在する：
2018506961.tif 000006
【０１５９】
いくつかの実施形態では、ヒトＡｘｌポリペプチドは、上記のアイソフォーム「Ａ」に相当する。いくつかの実施形態では、ヒトＡｘｌポリペプチドは、上記のアイソフォーム「Ｂ」に相当する。いくつかの実施形態では、ヒトＡｘｌポリペプチドは、上記のアイソフォーム「Ｃ」に相当する。
【０１６０】
マウスＡｘｌ
本明細書で使用される場合、「マウスＡｘｌ」とは、受容体チロシンキナーゼのマウスＴＡＭファミリーのＡｘｌメンバーを指す。マウスＡｘｌには以下のアイソフォームが存在する：
2018506961.tif 000007
【０１６１】
いくつかの実施形態では、マウスＡｘｌポリペプチドは、上記のアイソフォーム「Ａ」に相当する。いくつかの実施形態では、マウスＡｘｌポリペプチドは、上記のアイソフォーム「Ｂ」に相当する。いくつかの実施形態では、マウスＡｘｌポリペプチドは、上記のアイソフォーム「Ｃ」に相当する。
【０１６２】
ヒトＴｙｒｏ３
本明細書で使用される場合、「ヒトＴｙｒｏ３」とは、受容体チロシンキナーゼのヒトＴＡＭファミリーのＴｙｒｏ３メンバーを指す。いくつかの実施形態では、ヒトＴｙｒｏ３ポリペプチドは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００６２８４．２、ＧＩ：２７５９７０７８、登録更新日：２０１４年１１月２８日１２：３０ＡＭ（配列番号３９）に相当する。一実施形態では、ヒトＴｙｒｏ３ポリペプチドをコードする核酸は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００６２９３．３、ＧＩ：２９５８４２１８３、登録更新日：２０１４年１１月２８日１２：３０ＡＭに相当する。
【０１６３】
ヒトＭｅｒ
本明細書で使用される場合、「ヒトＭｅｒ」とは、受容体チロシンキナーゼのヒトＴＡＭファミリーのＭｅｒメンバーを指す。いくつかの実施形態では、ヒトＭｅｒポリペプチドは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００６３３４．２、ＧＩ：６６９３２９１８、登録更新日：２０１４年９月６日０４：０３ＡＭ（配列番号４０）に相当する。一実施形態では、ヒトＭｅｒポリペプチドをコードする核酸は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００６３４３、バージョン番号ＮＭ＿００６３４３．２  ＧＩ：６６９３２９１７、登録更新日：２０１４年９月６日０４：０３ＡＭに相当する。
【０１６４】
ヒトＡｋｔ３
本明細書で使用される場合、「ヒトＡｋｔ３」とは、セリン／スレオニンプロテインキナーゼのヒトＡＫＴサブファミリーのＡｋｔ３メンバーを指す。ヒトＡｋｔ３には以下のアイソフォームが存在する：
2018506961.tif 000008
【０１６５】
いくつかの実施形態では、ヒトＡｋｔポリペプチドは、上記のアイソフォーム「Ａ」に相当する。いくつかの実施形態では、ヒトＡｋｔポリペプチドは、上記のアイソフォーム「Ｂ」に相当する。いくつかの実施形態では、ヒトＡｋｔポリペプチドは、上記のアイソフォーム「Ｃ」に相当する。
【０１６６】
ヒトＧａｓ６
本明細書で使用される場合、「ヒトＧａｓ６」（増殖停止特異的６）とは、受容体チロシンキナーゼのＴＡＭファミリーのリガンドを指す。いくつかの実施形態では、ヒトＧａｓ６ポリペプチドは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０００８１１．１、ＧＩ：４５５７６１７、登録更新日：２０１４年９月６日０２：４４ＡＭ（配列番号４２）に相当する。一実施形態では、ヒトＧａｓ６ポリペプチドをコードする核酸は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００８２０．３、ＧＩ：６７３０３８８７７、登録更新日：２０１４年９月６日０２：４４ＡＭに相当する。
【０１６７】
ＢＳＡ
本明細書で使用される場合、「ＢＳＡ」とはウシ血清アルブミンを指す。いくつかの実施形態では、ＢＳＡは「Ａ９６４７−ウシ血清アルブミン」（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に相当する。いくつかの実施形態では、ＢＳＡは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ７６８４７、バージョン番号ＣＡＡ７６８４７．１  ＧＩ３３３６８４２、登録更新日：２０１１年１月７日０２：３０ＰＭに相当する。
【０１６８】
Ｃｏｍｐｒｉｓｅ（を含む）
この用語は一般に、「ｉｎｃｌｕｄｅ（を含む）」、すなわち１つ以上の特徴または成分の存在を許容する意味で使用される。
【０１６９】
単離された
この用語は、本発明の抗体またはこのような抗体をコードする核酸が、一般に本発明に従っている状態を指す。抗体及び核酸は、それらが自然に会合する物質、例えば、その天然の環境中で、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで実施される組み換えＤＮＡ技術によって調製される場合には、その調製環境（例えば、細胞培養）中で共存する他のポリペプチドまたは核酸などの物質を含まないか、または実質的に含まない。抗体及び核酸は希釈剤またはアジュバントとともに製剤化できるが、その場合でも実用目的のため単離でき、例えば、その抗体を、イムノアッセイに使用されるマイクロタイタープレートのコーティングに使用する場合には、通常ゼラチンまたは他の担体と混合し、あるいは診断または療法に使用する場合には、薬学的に許容される担体または希釈剤と混合する。抗体は、天然または異種起源の真核細胞系（例えば、ＣＨＯまたはＮＳ０（ＥＣＡＣＣ  ８５１１０５０３）細胞）によってグリコシル化される場合もあれば、（例えば、原核細胞での発現により産生される場合には）非グリコシル化形態の場合もある。
【０１７０】
実質的に指定された
「実質的に指定された」とは、本発明の関連するＣＤＲまたはＶＨもしくはＶＬドメインが、本明細書で指定した配列を有する特定の領域と同一または極めて類似していることを意味する。「極めて類似」とは、ＣＤＲ及び／またはＶＨもしくはＶＬドメイン内に、１〜５、好ましくは１〜４、例えば１〜３または１もしくは２、または３もしくは４つのアミノ酸置換が施され得ることを意味する。
【０１７１】
ＣＤＲを支持するフレームワーク
本発明のＣＤＲを保持する構造は一般に、再構成された免疫グロブリン遺伝子によりコードされる天然に存在するＶＨ及びＶＬ抗体可変ドメインのＣＤＲに対応する位置にＣＤＲが配置されている、抗体重鎖もしくは軽鎖配列またはその実質的部分である。免疫グロブリン可変ドメインの構造及び位置は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．１９８７及びその改訂版（現在は、インターネット上で利用可能（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕまたは検索エンジンを使用して「Ｋａｂａｔ」を検索））を参照して特定することができる。
【０１７２】
本発明で使用される可変ドメインは、何らかの生殖細胞株または再構成されたマウスもしくはヒトの可変ドメインから得てもよく、またはマウスもしくはヒトの既知の可変ドメインのコンセンサス配列に基づいた合成可変ドメインであってもよい。本発明のＣＤＲ配列（例えばＣＤＲ３）は、組み換えＤＮＡ技術を使用して、ＣＤＲ（例えばＣＤＲ３）が欠失した可変ドメインのレパートリーに導入することができる。
【０１７３】
例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０：７７９−７８３）が、抗体可変ドメインのレパートリーの作製方法を記載している。この方法では、抗体可変ドメイン領域の５末端に設定された、または５末端と隣接するコンセンサスプライマーを、ヒトＶＨ遺伝子の第３フレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーとともに使用することで、ＣＤＲ３が欠失したＶＨ可変ドメインのレパートリーを提供する。Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．は更に、このレパートリーを特定の抗体のＣＤＲ３と、どのように組み合わせることができるかについても記載している。類似した技術を使用して、本発明のＣＤＲ３由来の配列を、ＣＤＲ３を欠失したＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーと一緒にシャッフルし、シャッフルした完全なＶＨまたはＶＬドメインを同族のＶＬまたはＶＨドメインと組み合わせることにより、本発明の抗体を得ることができる。更に、レパートリーをＷＯ９２／０１０４７のファージディスプレイシステムのような適切な宿主系に提示することにより、適切な抗体を選択することができる。レパートリーは、１０４を上回る個々の抗体、例えば１０６〜１０８または１０１０の抗体由来のものからなり得る。
【０１７４】
類似したシャッフリング技術または組み合わせ技術はまた、Ｓｔｅｍｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３７０：３８９−３９１）によっても開示されており、それには、β−ラクタマーゼ遺伝子と関連するＤＮＡシャッフリング技術が示されているが、この方法を抗体の産生に使用できると述べている。
【０１７５】
更に別の方法では、１つ以上の選択されたＶＨ及び／またはＶＬ遺伝子のランダム突然変異誘発を利用して、完全な可変ドメイン内に突然変異を引き起こすことにより、本発明のＣＤＲ由来の配列を保持する新規のＶＨまたはＶＬ領域を作製する。このような技術は、Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ（１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０）に記載されており、ここではエラープローンＰＣＲ法が使用されている。
【０１７６】
もう一つの方法として、ＶＨまたはＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域に突然変異誘発を誘導する方法も使用できる。このような技術は、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：３８０９−３８１３）及びＳｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−５６７）によって開示されている。
【０１７７】
上記の技術はすべて当業者に公知であり、それ自体は本発明に属さない。当業者は、このような技術を使用することで、当技術分野での通常の方法論を用いて本発明の抗体を得ることができるであろう。
【０１７８】
エピトープ特異的抗体
本発明の更なる態様はＡｘｌエピトープに特異的な抗体を得る方法を提供する。この方法は、本明細書に指定されたＶＨドメインのアミノ酸配列における１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入により、ＶＨドメインのアミノ酸変異体であるＶＨドメインを提供することと、場合により、このようにして提供されるＶＨドメインを１つ以上のＶＬドメインと組み合わせることと、ＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬの組み合わせまたは複数の組み合わせを試験して、Ａｘｌに特異的な抗体分子または抗体抗原結合ドメインを同定することとを含む。前記ＶＬドメインは、実質的に本明細書に指定されたアミノ酸配列を有し得る。
【０１７９】
目的とする抗体が結合するＡｘｌ上のエピトープと結合する抗体（例えば、１０Ｃ９または１０Ｇ５抗体のＡｘｌへの結合を阻止するもの）をスクリーニングするため、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されているような通常のクロスブロッキングアッセイを実施することができる。
【０１８０】
本明細書に開示されるＶＬドメインの１つ以上の配列変異体を１つ以上のＶＨドメインと組み合わせる類似の方法を用いてもよい。
【０１８１】
本発明の更なる態様では、Ａｘｌに特異的な抗体を調製する方法を提供する。該方法は、
（ａ）ＣＤＲ３が置換されているか、またはＣＤＲ３コード領域が欠失しているＶＨドメインをコードする核酸の出発レパートリーを提供することと；
（ｂ）前記レパートリーを、ＶＨ  ＣＤＲ３について本明細書に実質的に指定されたアミノ酸配列をコードするドナー核酸と組み合わせることにより、前記ドナー核酸をレパートリー内のＣＤＲ３領域に挿入し、それによってＶＨドメインをコードする核酸の産物レパートリーを提供することと；
（ｃ）前記産物レパートリーの核酸を発現させることと；
（ｄ）Ａｘｌに特異的な抗体を選択することと；
（ｅ）前記抗体またはそれをコードする核酸を回収することと、を含む。
【０１８２】
この場合も、ＣＤＲ３が置換されているか、またはＣＤＲ３コード領域が欠失しているＶＬドメインをコードする核酸のレパートリーと本発明のＶＬ  ＣＤＲ３を組み合わせる類似の方法を使用してもよい。
【０１８３】
同様に、１つ以上、または３つすべてのＣＤＲをＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーに移植した後、それをスクリーニングし、Ａｘｌに特異的な単一のまたは複数の抗体を検出してもよい。
【０１８４】
免疫グロブリンの可変ドメインの実質的な部分は、少なくとも３つのＣＤＲ領域に加え、それらを介在するフレームワーク領域を含む。好ましくは、この部分はまた、１番目及び４番目のフレームワーク領域のいずれかまたは両方の少なくとも約５０％を含み、この５０％は、１番目のフレームワーク領域のＣ末端５０％、及び４番目のフレームワーク領域のＮ末端５０％である。可変ドメインの実質的な部分のＮ末端またはＣ末端に位置するその他の残基は、天然に存在する可変ドメイン領域には通常会合しないものであってもよい。例えば、組み換えＤＮＡ技術によって作製される本発明の抗体の構築物は、クローニングまたは他の操作工程を容易にするために導入されるリンカーによってコードされるＮまたはＣ末端残基の導入をもたらす場合がある。他の操作工程は、以下により詳細に述べるように免疫グロブリン重鎖、他の可変ドメイン（例えばダイアボディの産生における）またはタンパク質標識を含む更なるタンパク質配列に、本発明の可変ドメインを連結するためにリンカーを導入することを含む。
【０１８５】
本発明の好ましい態様では、ＶＨ及びＶＬドメインの対を含んでいる抗体が好ましいが、ＶＨまたはＶＬドメイン配列のいずれかによる単一結合ドメインは、本発明の更なる態様を構成する。単一免疫グロブリンドメイン、特にＶＨドメインは、特異的に標的抗原に結合できることが知られている。
【０１８６】
いずれかの単一結合ドメインの場合、これらドメインを用いて、Ａｘｌに結合できる２ドメイン抗体を形成可能な相補的ドメインをスクリーニングすることができる。
【０１８７】
スクリーニングは、例えば、ＷＯ９２／０１０４７に開示されている、いわゆる階層的二重コンビナトリアルアプローチを使用したファージディスプレイスクリーニング法によって実現することができる。このアプローチでは、Ｈ鎖またはＬ鎖のいずれかのクローンを含む個別のコロニーを用いて他方の鎖（ＬまたはＨ）をコードするクローンの完全なライブラリを感染させ、得られた二本鎖抗体を先の参考文献に記載されているようなファージディスプレイ法に従って選択する。この技術は、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．の同書にも開示されている。
【０１８８】
本発明の抗体は、抗体定常領域またはその一部を更に含んでもよい。例えば、本発明の抗体は、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメイン（または、そのいずれかの組み合わせ）を含んでもよい。ＶＬドメインは、そのＣ末端で、ヒトＣκまたはＣλ鎖、好ましくはＣκ鎖を含む抗体軽鎖定常領域に結合することができる。同様に、ＶＨドメインによる抗体は、そのＣ末端で、任意の抗体アイソタイプ、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及びＩｇＭ、ならびにアイソタイプサブクラスのいずれかに由来する免疫グロブリン重鎖のすべてまたは一部に結合することができる。ＷＯ９９／５８５７２に開示されているΔｎａｂ及びΔｎａｃなどのＦｃ領域を使用してもよい。
【０１８９】
キメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植抗体
本明細書で使用される場合、「キメラ」抗体または「ヒト化」抗体または「ＣＤＲ移植」抗体は、非マウス、好ましくはヒト抗体由来の１種以上のタンパク質またはペプチドと組み合わせた、本明細書に記載する抗Ａｘｌ抗体のいずれかの組み合わせまたはそれに由来する何らかのＣＤＲを含む。
【０１９０】
キメラ抗体またはヒト化抗体は、ＣＤＲが本明細書に記載する１つ以上の抗Ａｘｌ抗体に由来し、抗体の少なくとも一部または残部が１つ以上のヒト抗体から由来するものを含む。したがって、実質的にヒトに免疫原性がない、フレームワーク、ＣＬ（例えばＣκまたはＣλ）、ＣＨドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ヒンジ領域が抗体のヒト部分に含まれていてもよい。
【０１９１】
ヒト抗体由来の抗体領域は、ヒト抗体と１００％の同一性を有する必要はない。好ましい実施形態では、免疫原性を無視できるように、マウスのアミノ酸残基は可能な限りほとんど維持されないが、ＣＤＲによって形成される抗原結合部位を支持しつつ、同時に抗体のヒト化を最大化するため、マウス残基は必要に応じて保持され得る。このような変更または変異は、非修飾抗体と比べて、ヒトまたは他の種の免疫原性を場合により、及び好ましくは保持または低減する。
【０１９２】
尚、ヒト化抗体は、非ヒト動物、すなわち機能的に再編成されたヒト免疫グロブリン（例えば、重鎖及び／または軽鎖）遺伝子を発現できる原核細胞または真核細胞によって産生することができる。更に、抗体が単鎖抗体であるとき、抗体は本来のヒト抗体に存在しないリンカーペプチドを含むことができる。例えば、ｓｃＦｖは、重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とを接続するリンカーペプチド、例えば２〜約２０のグリシンまたは他のアミノ酸残基（好ましくはグリシン及びセリン残基（例えば、Ｇｌｙ４ＳｅｒまたはＧｌｙ２Ｓｅｒリピート））を含み得る。このようなリンカーペプチドは、ヒトに非免疫原性であると考えられる。いくつかの実施形態では、リンカーは少なくとも１２アミノ酸長である。
【０１９３】
抗体のヒト化は、例えば、個々のヒトフレームワークのプールにインフレーム融合された非ヒト標的モノクローナル抗体の６つすべてのＣＤＲを含むコンビナトリアルライブラリを合成することにより実施することができる。すべての既知の重鎖及び軽鎖ヒト生殖細胞系配列を表す遺伝子を収容するヒトフレームワークライブラリを利用することができる。得られたコンビナトリアルライブラリを更にスクリーニングして、目的とする抗原との結合を検出することができる。このアプローチは、親抗体に対する結合活性を維持するという観点から、完全なヒトフレームワークの最も好ましい組み合わせの選択が可能である。その後、ヒト化抗体を様々な技術によって更に最適化することができる。
【０１９４】
完全長抗体分子の場合、免疫グロブリン遺伝子をハイブリドーマ細胞株のゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡから得ることができる。その抗体の重鎖及び軽鎖を哺乳動物のベクター系にクローニングする。アセンブリは、当技術分野で既知の方法を使用したシーケンシングによって確認する。抗体構築物は、他のヒトまたは哺乳動物の宿主細胞系で発現させることができる。この構築物を更に、目的とする発現抗体の一過性トランスフェクションアッセイ及びウェスタンブロット解析によって検証することができる。迅速なアッセイ方法を使用して、最大の生産性を有する安定な細胞系を単離してスクリーニングすることができる。
【０１９５】
ヒト化抗体、断片及び領域の定常（Ｃ）領域をコードするヒト遺伝子は、既知の方法によるヒト胎児肝臓のライブラリに由来し得る。ヒトＣ領域遺伝子は、ヒト免疫グロブリンを発現して産生するものを含む、いかなるヒト細胞にも由来し得る。ヒトのＣＨ領域は、γ、μ、α、δ、ε、及びそのサブクラス（例えばＧ１、Ｇ２、Ｇ３及びＧ４）を含むヒト重鎖の既知のクラスまたはアイソタイプのいずれかに由来し得る。重鎖アイソタイプは抗体の種々のエフェクター機能の原因となるため、望ましいエフェクター機能、例えば補体結合または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を基準としてＣＨドメインを選択する。好ましくは、ＣＨドメインはガンマ１（ＩｇＧ１）に由来する。
【０１９６】
ヒトのＣＬ領域は、ヒトＬ鎖アイソタイプ、カッパまたはラムダのいずれか、好ましくはカッパに由来し得る。
【０１９７】
ヒト免疫グロブリンＣ領域をコードする遺伝子は、標準クローニング技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７−１９９３））によってヒト細胞から得られる。ヒトＣ領域遺伝子は、２種類の軽鎖、５つのクラスの重鎖、及びそのサブクラスを表す遺伝子を含んでいる既知のクローンから容易に得ることができる。
【０１９８】
キメラ抗体断片、例えばＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２は、適切に短縮されたキメラ重鎖遺伝子を設計することによって調製することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片の重鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、短縮された分子を得るために、重鎖のＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列に続いて、翻訳終止コドンを含み得る。
【０１９９】
非ヒト抗体またはヒト抗体の遺伝子操作方法またはヒト化方法を使用することができ、これらの方法は当技術分野において周知である。一般に、ヒト化抗体または遺伝子操作抗体は、非ヒト起源、例えば、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類またはその他哺乳動物由来の１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらのヒトアミノ酸残基は「移入」残基と称されることが多く、通常は既知のヒト配列の「移入」可変ドメイン、定常ドメインまたはその他のドメインから得られる。既知のヒトＩｇ配列は、例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｐｕｂｌｉｃ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｐｅｄｒｏ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｍｇｅｎ．ｕｎｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ＳＤ／ＩＴ／ＩＴ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｗｈｆｒｅｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＣＨ０５／ｋｕｂｙ０５．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｌｉｂｒａｒｙ．ｔｈｉｎｋｑｕｅｓｔ．ｏｒｇ／１２４２９／Ｉｍｍｕｎｅ／Ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｈｈｍｉ．ｏｒｇ／ｇｒａｎｔｓ／ｌｅｃｔｕｒｅｓ／１９９６／ｖｌａｂ／；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍｒｃ７／ｍｉｋｅｉｍａｇｅｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／；ｍｃｂ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＢｉｏＬｉｎｋｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ．ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌｉｎｋ．ｃｏｍ／；ｐａｔｈｂｏｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｈｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｈｃｌ／；ｗｗｗ．ｐｅｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐａ／３４０９１３／３４０９１３．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ａｗｉｃ／ｐｕｂｓ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／；ｗｗｗ．ｍ．ｅｈｉｍｅ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／．ａｂｏｕｔ．ｙａｓｕｈｉｔｏ／Ｅｌｉｓａ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ／ｔａｂｌｅ．ａｓｐ；ｗｗｗ．ｉｃｎｅｔ．ｕｋ／ａｘｐ／ｆａｃｓ／ｄａｖｉｅｓ／ｌｉｎｋｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｆｃｃｌ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｓａｃ−ｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅｓ＿ｇｅｏ．ｈｔｍｌ；ａｘｉｍｔ１．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／．ａｂｏｕｔ．ｒｅｋ／ＡＥＰＳｔａｒｔ．ｈｔｍｌ；ｂａｓｅｒｖ．ｕｃｉ．ｋｕｎ．ｎＩ／．ａｂｏｕｔ．ｊｒａａｔｓ／ｌｉｎｋｓ１．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｒｅｃａｂ．ｕｎｉ−ｈｄ．ｄｅ／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｖｕ．ｅｄｕ／；ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｐｕｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／Ｖ＿ｍｉｃｅ．ｈｔｍｌ；ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４／；ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍａｒｔｉｎ／ａｂｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋ／；ａｂｇｅｎ．ｃｖｍ．ｔａｍｕ．ｅｄｕ／ｌａｂ／ｗｗｗａｂｇｅｎ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／．ａｂｏｕｔ．ｈｏｎｅｇｇｅｒ／ＡＨＯｓｅｍｉｎａｒ／ＳｌｉｄｅＯＩ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｕｂｃｇ０７ｓ／；ｗｗｗ．ｎｉｍｒ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ＣＣ／ｃｃａｅｗｇ／ｃｃａｅｗｇ．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍｒｃ７／ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔａｔ＿ａｉｍ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉ．ｍｉｓｓｏｕｒｉ．ｅｄｕ／ｓｍｉｔｈｇｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｉｏｃ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｆｍｏｌｉｎａ／Ｗｅｂ−ｐａｇｅｓ／Ｐｅｐｔ／ｓｐｏｔｔｅｃｈ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｊｅｒｉｎｉ．ｄｅ／ｆｒ＿ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｐａｔｅｎｔｓ．ｉｂｍ．ｃｏｎ／ｉｂｍ．ｈｔｍｌ、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ（１９８３）に開示されており、それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２００】
当技術分野で既知のように、このような移入された配列を使用して、免疫原性を低減すること、または結合性、親和性、結合速度、解離速度、結合活性、特異性、半減期または他のいずれかの適切な特性を低減、増強もしくは調節することができる。一般に、可変領域及び定常領域の非ヒト配列はヒトまたは他のアミノ酸と置換されるが、非ヒトまたはヒトＣＤＲ配列は一部またはすべてが維持される。
【０２０１】
また場合により、抗原に対する高親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持したまま、抗体をヒト化することもできる。この目的を達成するために、場合により、親配列及びヒト化配列の３次元モデルを使用して、親配列及び種々の概念的ヒト化産物を分析する過程を経て、ヒト化抗体を調製することができる。３次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者に熟知されている。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な３次元コンフォメーション構造を図示して表示するコンピュータプログラムが提供されている。この表示を精査することで、候補免疫グロブリン配列の機能において残基に見込まれる役割の分析、すなわち候補免疫グロブリンの抗原結合能に影響する残基の分析が可能になる。このように、ＦＲ残基をコンセンサス配列及び移入配列から選択して組み合わせることにより、望ましい抗体特性、例えば標的抗原（複数可）に対する親和性の増加などが実現される。
【０２０２】
一般にＣＤＲ残基は、抗原結合の作用に直接的かつ最も実質的に関与している。抗体のヒト化または遺伝子操作は、既知のいずれかの方法を使用して実施することができる。例えば、以下に限定されないが、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２  １９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８）），Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７），Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）、米国特許第５，７２３，３２３号、同第５，９７６，８６２号、同第５，８２４，５１４号、同第５，８１７，４８３号、同第５，８１４，４７６号、同第５，７６３，１９２号、同第５，７２３，３２３号、同第５，７６６，８８６号、同第５，７１４，３５２号、同第６，２０４，０２３号、同第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，２２５，５３９号；同第４，８１６，５６７号、ＰＣＴ／：ＵＳ９８／１６２８０、ＵＳ９６／１８９７８、ＵＳ９１／０９６３０、ＵＳ９１／０５９３９、ＵＳ９４／０１２３４、ＧＢ８９／０１３３４、ＧＢ９１／０１１３４、ＧＢ９２／０１７５５；ＷＯ９０／１４４４３、ＷＯ９０／１４４２４、ＷＯ９０／１４４３０、ＥＰ２２９２４６に記載されているものである。
【０２０３】
ヒト化抗体のヒト定常領域は、いかなるクラスまたはアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤなど）でもあり得、カッパまたはラムダ軽鎖を含み得る。一実施形態では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ重鎖または定義済み断片、例えば、ＩｇＧサブクラスであるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のうち、少なくとも１つを含む。
【０２０４】
標識抗体
本発明の抗体は、検出可能または機能的標識で標識してもよい。検出可能標識には、［１３１Ｉ］または［９９Ｔｃ］などの放射性標識を含み、放射性免疫複合体の技術分野で既知の従来の化学的方法を用いて、これら標識を本発明の抗体に結合させることができる。標識はまた、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素標識を含む。更に標識は、特異的同族の検出可能部分、例えば、標識されたアビジンまたはストレプトアビジンへの結合により検出できるビオチンなどの化学成分を含む。好ましくは、標識は蛍光標識、例えばＦＩＴＣを含む。
【０２０５】
有機部分
本発明の修飾抗体及び抗原結合性断片は、抗体と直接的または間接的に共有結合される１つ以上の有機部分を含むことができる。本明細書に記載する抗体または抗原結合性断片に結合される各有機部分は、独立して親水性ポリマー基、脂肪酸基または脂肪酸エステル基であり得る。本明細書で使用される場合、用語「脂肪酸」は、モノカルボン酸及びジカルボン酸を包含する。「親水性ポリマー基」は、本明細書でこの用語が使用される場合、オクタンよりも水に溶解しやすい有機ポリマーを指す。例えば、ポリリジンは、オクタンよりも水に溶解しやすい。したがって、ポリリジンの共有結合により修飾された抗体は本開示に包含される。本明細書に記載する抗体の修飾に適した親水性ポリマーは、直鎖状でも分枝鎖状でもよく、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、ＰＰＧなどのポリアルカングリコール、炭水化物（例えば、デキストラン、セルロース、オリゴ糖、多糖類など）、親水性アミノ酸のポリマー（例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリアスパルテートなど）、ポリアルカン酸化物（例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドなど）及びポリビニルピロリドンが挙げられる。好ましくは、本明細書に記載する抗体を修飾する親水性ポリマーは、独立した分子実体として約８００〜約１５０，０００ダルトンの分子量を有する。例えば、ＰＥＧ５０００及びＰＥＧ２０，０００を使用することができ、この添字がポリマー平均分子量（ダルトン）である。親水性ポリマー基は、１〜約６個のアルキル基、脂肪酸基、または脂肪酸エステル基と置換され得る。脂肪酸基または脂肪酸エステル基と置換される親水性ポリマーは、適切な方法を用いて調製することができる。例えば、アミン基を含むポリマーを、脂肪酸または脂肪酸エステルのカルボキシレートと結合することができ、脂肪酸または脂肪酸エステルの活性化カルボキシレート（例えば、Ｎ，Ｎ−カルボニルジイミダゾールで活性化されたもの）をポリマーのヒドロキシル基と結合することができる。
【０２０６】
本発明に記載される抗体の修飾に適した脂肪酸及び脂肪酸エステルは、飽和されていても、または１つ以上の不飽和単位を含有していてもよい。本発明に記載される抗体の修飾に適した脂肪酸としては、例えば、ｎ−ドデカン酸（Ｃ１２、ラウリン酸）、ｎ−テトラデカン酸（Ｃ１４、ミリスチン酸）、ｎ−オクタデカン酸（Ｃ１８、ステアリン酸）、ｎ−エイコサン酸（Ｃ２０、アラキジン酸）、ｎ−ドコサン酸（Ｃ２２、ベヘン酸）、ｎ−トリアコンタン酸（Ｃ３０）、ｎ−テトラコンタン酸（Ｃ４０）、ｃｉｓ−δ  ９−オクタデカン酸（Ｃ１８、オレイン酸）、全ｃｉｓ−δ  ５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸（Ｃ２０、アラキドン酸）、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などが挙げられる。好適な脂肪酸エステルとしては、直鎖または分枝鎖の低級アルキル基を含んでいるジカルボン酸のモノエステルが挙げられる。低級アルキル基は、１〜約１２個、好ましくは１〜約６個の炭素原子を含むことができる。
【０２０７】
修飾ヒト抗体及び抗原結合性断片は、好適な方法を使用して、例えば１つ以上の修飾剤との反応によって調製することができる。「修飾剤」は、本明細書でこの用語が使用される場合、活性基を含む好適な有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）を指す。「活性基」とは、適切な条件下で第２の化学基と反応でき、その反応により修飾剤と第２の化学基との間に共有結合が形成される化学的部分または官能基である。例えば、アミン反応性活性基としては、トシレート、メシレート、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）などの求電子性基が挙げられる。チオールと反応することができる活性基としては、例えば、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロイル（ａｃｒｙｌｏｌｙｌ）、ピリジルジスルフィド、５−チオール−２−ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ−チオール）などが挙げられる。アルデヒド官能基は、アミンまたはヒドラジド含有分子と結合することができ、アジド基は、三価リン基と反応して、ホスホロアミダートまたはホスホロイミド結合を形成することができる。活性基を分子に導入する好適な方法は、当技術分野で既知である（例えば、Ｈｅｒｎａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９６）を参照）。活性基は、有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）と、直接またはリンカー部分、例えば、二価のＣ１−Ｃ１２基（この基は、１個以上の炭素原子が酸素、窒素、またはイオウなどのヘテロ原子と置換され得る）を介して結合することができる。好適なリンカー部分としては、例えば、テトラエチレングリコール、−（ＣＨ２）３−、−ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ−、−（ＣＨ２）２−ＮＨ−、及び−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ−ＮＨ−が挙げられる。リンカー部分を含む修飾剤は、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下で、モノ−Ｂｏｃ−アルキルジアミン（例えば、モノ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン、モノ−Ｂｏｃ−ジアミノへキサン）を脂肪酸と反応させ、遊離アミンと脂肪酸カルボキシレートとの間のアミド結合を形成することにより生成することができる。Ｂｏｃ保護基をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）処理により生成物から除去して一級アミンを露出させ、これを記載されているように別のカルボキシレートと結合すること、または無水マレイン酸と反応させ、得られた生成物を環化して脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を生成することができる。（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９２／１６２２１を参照のこと）。
【０２０８】
本発明の修飾抗体は、ヒト抗体または抗原結合断片を修飾剤と反応させることにより作製することができる。例えば、アミン反応性修飾剤、例えば、ＰＥＧのＮＨＳエステルを用いることによって、有機部分を非部位特異的方法で抗体と結合させることができる。抗体または抗原結合断片のジスルフィド結合（例えば鎖内ジスルフィド結合）を還元することによって、修飾ヒト抗体または抗原結合断片を調製することもできる。このとき、還元された抗体または抗原結合断片をチオール反応性修飾剤と反応させて、本明細書に記載される修飾抗体を作製することができる。本明細書に記載される抗体の特異的部位と結合する、有機部分を含んだ修飾ヒト抗体及び抗原結合断片は、好適な方法、例えば、タンパク質分解の逆反応（Ｆｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，３：１４７−１５３（１９９２）；Ｗｅｒｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，５：４１１−４１７（１９９４）；Ｋｕｍａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．６（１０）：２２３３−２２４１（１９９７）；Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２４（１）：５９−６８（１９９６）；Ｃａｐｅｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，５６（４）：４５６−４６３（１９９７））、及びＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９６）に記載の方法などを使用して調製することができる。
【０２０９】
免疫複合体
本発明はまた、１種以上の細胞毒性剤、例えば化学療法剤もしくは化学療法薬、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌性の酵素活性毒素、真菌、植物もしくは動物起源、またはそれらの断片）または放射性同位体と複合体化された、本明細書の抗Ａｘｌ抗体を含んでいる免疫複合体を提供する。
【０２１０】
一実施形態では、免疫複合体は、抗体が１種以上の薬物と複合体化された、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）であり、例えば薬物としては、以下に限定されないが、メイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号、及び欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂ１を参照）；アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチン薬部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５，６３５，４８３号及び第５，７８０，５８８号及び第７，４９８，２９８号を参照）；ドラスタチン；カリケアマイシンまたはその誘導体その（米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号及び同第５，８７７，２９６号；Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２（１９９３）；及びＬｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２５−２９２８（１９９８）を参照）；アントラサイクリン、例えばダウノマイシンまたはドキソルビシン（Ｋｒａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｒｎ．１３：４７７−５２３（２００６）；Ｊｅｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｒｎ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １６：３５８−３６２（２００６）；Ｔｏｒｇｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｒｎ．１６：７１７−７２１（２００５）；Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：８２９−８３４（２０００）；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｒｎ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２：１５２９−１５３２（２００２）；Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｒｎ．４５：４３３６−４３４３（２００２）；及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照）；メトトレキサート；ビンデシン；タキサン、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセル；トリコテセン及びＣＣ１０６５が挙げられる。
【０２１１】
別の実施形態では、免疫複合体は、酵素活性毒素またはその断片と複合体化された、本明細書に記載される抗体を含み、酵素活性毒素としては、以下に限定されないが、ジフテリア毒素Ａ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（Ｐ  ＡＰＩ、Ｐ  ＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンが挙げられる。
【０２１２】
別の実施形態では、免疫複合体は、放射性原子と複合体化されて放射性免疫複合体を形成する、本明細書に記載される抗体を含む。本発明の放射性免疫複合体の作製に種々の放射性同位体を利用できる。例としては、［２１１Ａｔ］、［１３１Ｉ］、［１２５Ｉ］、［９０Ｙ］、［１８６Ｒｅ］、［１８８Ｒｅ］、［１５３Ｓｍ］、［２１２Ｂｉ］、［３２Ｐ］、［２１２Ｐｂ］及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。放射性免疫複合体を検出に使用する場合、免疫複合体には、シンチグラフィー検査用の放射性原子、例えば［９９Ｔｃ］または［１２３Ｉ］、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（別名、磁気共鳴イメージング、ＭＲＩ）用のスピン標識、例えば同じくヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄を含んでよい。
【０２１３】
抗体と細胞毒性剤との複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジプイミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７））に記載のように調製することができる。炭素−１４で標識した１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレン・トリアミンペンタ酢酸（ＭＸＤＴＰＡ）は、抗体と放射性ヌクレオチドを複合体化するキレート剤の典型例である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。本発明のリンカーは、細胞の細胞毒性薬の放出が容易である「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用することができる。
【０２１４】
本明細書の免疫複合体またはＡＤＣは、限定されないが、例えばＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳｌＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ及びスルホ−ＳＭＰＢ）ならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むがこれに限定されない（例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，Ｕ．Ｓ．Ａから）市販されている架橋試薬を用いて調製された、このような複合体を明示的に企図する。
【０２１５】
グリコシル化変異体
ある特定の実施形態では、本明細書で提供する抗体を改変して、抗体がグリコシル化される範囲が増減されている。１つ以上のグリコシル化部位が生成または削除されるようにアミノ酸配列を改変することにより、抗体に対するグリコシル化部位の付加または除去を好都合に達成することができる。
【０２１６】
抗体がＦｃ領域を含む場合、Ｆｃ領域と結合する炭水化物を変更することができる。哺乳動物細胞によって産生される本来の抗体は通常、一般にＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合で結合している、分枝状の二分岐オリゴ糖を含む。Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６−３２（１９９７）を参照のこと。オリゴ糖は種々の炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」にあるＧｌｃＮＡｃに結合しているフコースを含み得る。いくつかの実施形態では、特定の特性が改善された抗体変異体を作製するために、本発明の抗体のオリゴ糖に修飾を施すことができる。
【０２１７】
一実施形態では、Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）結合するフコースがない炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、このような抗体ではフコースの量を１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％または２０％〜４０％にすることができる。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載のように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により測定される、Ａｓｎ２９７に結合した糖鎖構造（例えば、複合型、混合型、及び高マンノース構造）すべての合計と比較した、Ａｓｎ２９７にある糖鎖内のフコースの平均量を算出することにより決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域のおよそ２９７の位置（Ｆｃ領域残基のＥｕ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指す。ただし、Ａｓｎ２９７はまた、抗体の軽微な配列変異により、位置２９７のおよそ±３アミノ酸上流または下流、すなわち位置２９４と３００との間に位置する場合もある。このようなフコシル化変異体は、ＡＤＣＣ機能を改善し得る。例えば、米国特許公開ＵＳ２００３／０１５７１０８（Ｐｒｅｓｔａ、Ｌ．）；ＵＳ２００４／００９３６２１（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｌｗ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照のこと。「非フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異体に関連した刊行物の例としては、以下が挙げられる：ＵＳ２００３／０１５７１；ＷＯ２０００／６１７３９；ＷＯ２００１／２９２４６；ＵＳ２００３／０１１５６１４；ＵＳ２００２／０１６４３２８；ＵＳ２００４／００９３６２１；ＵＳ２００４／０１３２１４０；ＵＳ２００４／０１１０７０４；ＵＳ２００４／０１１０２８２；ＵＳ２００４／０１０９８６５；ＷＯ２００３／０８５１１９；ＷＯ２００３／０８４５７０；ＷＯ２００５／０３５５８６；ＷＯ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；ＷＯ２００２／０３１１４０；Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）。
【０２１８】
非フコシル化抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）；米国特許ＵＳ２００３／０１５７１０８  Ａ１，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；及びＷＯ２００４／０５６３１２  Ａ１，Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）；及びＷＯ２００３／０８５１０７）を参照）が挙げられる。
【０２１９】
更に、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されているバイセクティングオリゴ糖をもつ抗体変異体を提供する。このような抗体変異体は、フコシル化を減少させ得る、及び／またはＡＤＣＣ機能を改善し得る。このような抗体変異体の例は、例えばＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ  Ｍａｉｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）；米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）；及びＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。Ｆｅ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体もまた提供される。このような抗体変異体はＣＤＣ機能を改善し得る。このような抗体変異体は、例えばＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）；ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；及びＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０２２０】
Ｆｃ領域変異体
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸改変を導入し、それによってＦｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域の変異体は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域の配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃ領域）を含み得る。
【０２２１】
ある特定の実施形態では、本発明は、すべてではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を企図しており、これはｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体結合及びＡＤＣＣなど）は不要または有害であるような用途に望ましい候補となる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞毒性アッセイを実施すると、ＣＤＣ活性及び／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体がＦｃγ結合を欠失している（それゆえ、ＡＤＣＣ活性の欠失が見込まれる）が、ＦｃＲｎ結合能は保持していることを確認することができる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介する初代細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現については、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４ページ、表３に要約されている。目的とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例が、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７０５９−７０６３（１９８６）を参照）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１４９９−１５０２（１９８５）；５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）；及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、または加えて、目的とする分子のＡＤＣＣ活性を、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているように、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば動物モデルにおいて評価することができる。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施して、抗体がＣ１ｑを結合できず、その結果、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を欠失していることを確認することができる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−２７４３（２００４）を参照）。また��ＦｃＲｎ結合及びｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス／半減期のＦｃ測定を、当技術分野で既知の方法を使用して実施することができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）を参照）。
【０２２２】
エフェクター機能が減少した抗体には、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうち、１つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ変異体としては、アミノ酸２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７位のうち、２つ以上に置換を有するＦｃ変異体が挙げられ、これには、残基２６５及び２９７がアラニンに置換された、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０２２３】
ＦｃＲへの結合を改善または減少させた特定の抗体変異体が記載されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；ＷＯ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照）。
【０２２４】
ある特定の実施形態では、抗体変異体は、ＡＤＣＣ活性を改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８位及び／または３３３位（残基のＥＵ番号付け）に置換を有するＦｃ領域を含む。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載されているように、Ｃ１ｑ結合及び／またはＣＤＣ活性が変化（すなわち改善または減少）するようにＦｃ領域が改変される。
【０２２６】
半減期が増加し、胎児への母体ＩｇＧの移送を担う新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善した抗体（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））が、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１つ以上の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体には、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４または４３４の１つ以上の置換、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換を有するものが含まれる（米国特許第７，３７１，８２６号）。その他のＦｃ領域変異体の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及びＷＯ９４／２９３５１も参照のこと。
【０２２７】
システイン操作抗体変異体
ある特定の実施形態では、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基と置換されているシステイン操作抗体、例えば「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。
【０２２８】
特定の実施形態では、残基の置換は、抗体の接触可能な部位で生じる。この残基をシステインと置換すると、接触可能な抗体部位に反応性チオール基が配置されるため、これを利用して、例えば薬物部分またはリンカー−薬物部分などの他の部分と抗体を複合体化し、本明細書で更に記載されるような免疫複合体を作製することができる。ある特定の実施形態では、以下のいずれか１つ以上の残基をシステインと置換することができる：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作抗体は、例えば米国特許第７，５２１，５４１号に記載のように生成することができる。
【０２２９】
診断方法及び治療方法
本発明の抗体は、ヒトまたは動物対象、好ましくはヒトの診断方法または治療方法に使用されるように設計される。
【０２３０】
したがって、本発明の更なる態様は、提供される抗体を１種以上の試薬、例えばＦＩＴＣなどの検出可能な標識と複合体化して投与することを含む、診断方法を提供する。提供される抗体を使用して、迅速性と信頼性のある、生検組織由来癌細胞の検査を開発することができる。例えば、体液、例えば血液またはリンパ中に循環している循環腫瘍細胞などの転移性癌細胞を発見し得る検査に本抗体を使用することができる。目的とする他の癌として、乳癌、肺癌、胃癌、頭頸部癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮内膜癌及び前立腺癌、ならびにリンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ＮＨＬ）及び白血病（特に急性骨髄性白血病、ＡＭＬ）が挙げられる。
【０２３１】
本発明の更なる態様は、提供される抗体の投与を含む治療方法、このような抗体を含む医薬組成物、治療方法に使用される本明細書に記載される抗体、本明細書に記載される特定の臨床的徴候の治療方法に使用される本明細書に記載される抗体、及び投与用医薬品の製造へのこのような抗体の使用、例えば、抗体を薬学的に許容される賦形剤とともに本抗体を製剤化することを含む医薬品または医薬組成物の製造方法での使用を提供する。
【０２３２】
臨床的徴候
ヒトＡｘｌに対して高特異性を有する抗体を使用することで、臨床的利点が得られる臨床的徴候には、Ａｘｌが過剰発現している病状、またはＡｘｌ拮抗作用が臨床的利点をもたらす病状のいずれをも含む。このような徴候としては、免疫不全、心臓血管疾患、血栓症、糖尿病、免疫チェックポイント障害、線維性障害（線維症）または増殖性疾患、例えば癌、特に転移性癌が挙げられる。更に、Ａｘｌは上皮起源の多くの癌に関与することが知られている。
【０２３３】
目的とする線維性障害としては、斜視（ｓｔｒａｂｍｉｓｕｓ）、強皮症、ケロイド、腎性全身性線維症、肺線維症、特発性肺胞線維症（ＩＰＦ）、嚢胞性線維症（ＣＦ）、全身性硬化症、心臓線維症、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、それ以外の種類の肝線維症、原発性胆汁性胆管炎、腎線維症、癌及びアテローム性動脈硬化症が挙げられる。これらの疾患では、組織内での線維症の慢性的発現が、罹患した臓器の構造を著しく変化させ、それに続く臓器能不全を引き起こす。このような臓器の持続的消耗過程の結果、線維症を伴う疾患の多くは、進行性の病状であることが多く、長期的な予後不良を有する（Ｒｏｃｋｅｙ，Ｄ．Ｃ．，Ｂｅｌｌ，Ｐ．Ｄ．ａｎｄ  Ｈｉｌｌ，Ｊ．Ａ．（２０１５），Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．３７２，ｐｐ．１１３８−１１４９を参照）。
【０２３４】
目的とする免疫チェックポイント傷害としては、慢性ウイルス感染症、黒色腫、大腸癌、乳癌、卵巣癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、前立腺癌、腎細胞癌、膵臓癌、食道癌、膀胱癌、骨髄腫、腎臓癌、膀胱癌、脳腫瘍及びリンパ腫が挙げられる。
【０２３５】
目的とする癌としては、白血病（例えば、限定されないが、急性白血病、急性リンパ性白血病）、急性骨髄性白血病（例えば、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤芽球性白血病及び骨髄異形成症候群）、慢性白血病（例えば、限定されないが、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ性白血病、有毛細胞白血病）；真性多血症；リンパ腫（例えば、限定されないが、ホジキン病、非ホジキン病）；多発性骨髄腫（例えば、限定されないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞性白血病、孤立性形質細胞腫及び髄外性形質細胞腫）；ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症症；意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症；良性単クローングロブリン血症；重鎖病；骨及び結合組織肉腫（例えば、限定されないが、骨腫瘍、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟組織肉腫、血管肉腫（血管内皮腫）、線維肉腫、カポシ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、転移性癌、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫）；脳腫瘍（例えば、限定されないが、神経膠腫、膠芽腫、星状細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣細胞腫、乏突起神経膠腫、非グリア腫瘍、聴神経腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫及び原発性脳リンパ腫）；乳癌（例えば、限定されないが、腺癌、小葉（小細胞）癌、乳管内癌、髄様乳癌、粘液性乳癌、管状乳癌、乳頭状乳癌、原発性癌、ページェット病及び炎症性乳癌）；副腎癌（例えば、限定されないが、クロム親和性細胞腫及び副腎皮質癌）；甲状腺癌（例えば、限定されないが、乳頭状または濾胞性甲状腺癌、甲状腺髄様悪性腫瘍、甲状腺髄様癌及び甲状腺未分化癌）；ＧＩＳＴ−消化管間質腫瘍；膵臓癌（例えば、限定されないが、インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍及びカルチノイドまたは膵島細胞腫瘍）；下垂体癌（例えば、限定されないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、先端巨大症及び尿崩症）；眼の癌（例えば、限定ないが、眼内黒色腫（例えば、虹彩黒色腫、脈絡膜悪性黒色腫及び毛様体黒色腫）及び網膜芽細胞腫）；膣癌（例えば、扁平上皮癌、腺癌及び黒色腫）；外陰癌（例えば、扁平上皮癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫及びページェット病）；子宮頸癌（例えば、限定されないが、扁平上皮癌及び腺癌）；子宮癌（例えば、限定されないが、子宮内膜癌及び子宮肉腫）；卵巣癌（例えば、限定されないが、卵巣上皮癌、境界腫瘍、胚細胞腫瘍及び間質腫瘍）；食道癌（例えば、限定されないが、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、いぼ状癌及び燕麦細胞（小細胞）癌）；胃癌（例えば、限定されないが、腺癌、菌状（ポリープ状）、潰瘍性、表在拡大型、びまん性拡大型、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫及び癌肉腫）；結腸癌；直腸癌；肝臓癌（例えば、限定されないが、肝細胞癌及び肝芽細胞腫）、胆嚢癌（例えば、腺癌）；胆管癌（例えば、限定されないが、乳頭状、結節状及びびまん性）；肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、扁平上皮癌（類表皮癌）、腺癌、大細胞癌及び小細胞肺癌（ＳＣＬＣ））；精巣癌（例えば、限定されないが、生殖細胞腫瘍、精上皮腫、未分化、古典的（定型）、精母細胞性、非精上皮腫性、胎生期癌、奇形癌、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍））、前立腺癌（例えば、限定されないが、腺癌、平滑筋肉腫及び横紋筋肉腫）；生殖器癌（例えば、陰茎癌）；口腔癌（例えば、限定されないが、扁平上皮癌）；基底癌；唾液腺癌（例えば、限定されないが、腺癌、粘表皮癌及び腺様嚢胞癌）；咽頭癌（例えば、限定されないが、扁平上皮癌及びいぼ状癌）；皮膚癌（例えば、限定されないが、基底細胞癌、扁平上皮癌及び黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫）；腎臓癌（例えば、限定されないが、腎細胞癌、腎明細胞癌、腺癌、腎細胞腫、線維肉腫、移行上皮癌（腎盂及び／または尿管））；ウィルムス腫瘍；膀胱癌（例えば、限定されないが、移行上皮癌；扁平上皮癌、腺癌、癌肉腫）が挙げられる。加えて、癌には、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽細胞腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支原性癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌及び乳頭腺癌が挙げられる。好ましくは、癌は乳癌、黒色腫、前立腺癌、卵巣癌、大腸癌、肺癌または神経膠腫癌から選択される。より好ましくは、癌は転移性乳癌または肺癌である。循環腫瘍細胞の標的化及び治療を想定する。
【０２３６】
転移癌の治療は、原発腫瘍の位置に応じて異なる。乳癌が例えば肺まで拡大した場合であっても、依然それは乳癌であり、癌が現在、肺にあるという事実によってではなく、乳房内を起源とする転移癌により治療が決定される。約５パーセントの確率で、転移癌が発見されても、原発腫瘍を特定できない場合がある。そのような転移癌の治療は、その起源ではなくその箇所に従って行う。転移癌は起源腫瘍（既知である場合）の組織によって命名される。例えば、脳に拡大した乳癌は脳転移乳癌と呼ばれる。
【０２３７】
本発明による抗Ａｘｌ治療を利用すると、Ａｘｌが過剰発現する病状、またはＡｘｌ拮抗作用により臨床的利点が得られる病状を有する患者に明らかな利点をもたらすことができる。治療は、注射（例えば静脈内）によってまたは局所送達方法によって行うことができる。提供される抗体は、標的組織への医薬組成物の送達を誘導するために使用することも、または例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）またはその他の転移細胞を標的とするため全身的に使用することもできる。
【０２３８】
本発明の更なる態様では、対象の癌幹細胞を阻害する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載される抗体（または、その複合体）に対象を接触させることを含む。このような方法に使用される抗体及び複合体も想定される。
【０２３９】
ＥＧＦＲの拮抗作用
本発明はまた、本明細書に開示されるいずれかの有効量の抗Ａｘｌ抗体を個体に投与し、構成的Ａｘｌを阻害することを含む、構成的Ａｘｌ活性の阻害方法を提供する。
【０２４０】
一態様では、本発明は、ＥＧＦＲ活性化突然変異またはＥＧＦＲ遺伝子増幅と関連する癌に罹患している対象の治療方法であって、該対象はＥＧＦＲアンタゴニストによる治療に耐性を発現しており、該治療方法には、対象がＡｘｌ発現、Ａｘｌ活性化突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を有するかどうかを特定することと、Ａｘｌ活性化突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を有する該対象に、ＥＧＦＲアンタゴニスト及び本明細書に記載されるいずれかの抗Ａｘｌ抗体を投与することを含む方法を提供する。
【０２４１】
一態様では、本発明は、ＥＧＦＲ活性化突然変異またはＥＧＦＲ遺伝子増幅と関連する癌に罹患している対象の治療方法であって、（ｉ）ＥＧＦＲアンタゴニストによる治療を受けている対象をモニタリングし、対象がＡｘｌ発現、Ａｘｌ活性化突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を発現しているかどうかを特定することと、（ｉｉ）対象がＡｘｌ活性化突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を発現している場合に、ＥＧＦＲアンタゴニストに加えて、本明細書に記載される抗Ａｘｌ抗体のいずれかを含むように対象の治療計画を変更することを含む方法を提供する。
【０２４２】
一態様では、本発明は、ＥＧＦＲ活性化突然変異またはＥＧＦＲ遺伝子増幅と関連する癌に罹患している対象の治療方法であって、（ｉ）ＥＧＦＲアンタゴニストによる治療を受けている対象をモニタリングし、対象が阻害剤に対する耐性を発現しているかどうかを特定することと、（ｉｉ）対象を検査して、対象がＡｘｌ発現、Ａｘｌ活性化突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を有しているかどうかを特定することと、（ｉｉｉ）対象がＡｘｌ活性化突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を有している場合に、ＥＧＦＲアンタゴニストに加えて、本明細書に記載される抗Ａｘｌ抗体のいずれかを含むように対象の治療計画を変更することを含む方法を提供する。
【０２４３】
一態様では、本発明は、ＥＧＦＲアンタゴニストの評価方法であって、（ｉ）ＥＧＦＲアンタゴニストによる治療を受けている集団をモニタリングし、治療薬に対する耐性を発現している対象を同定することと、（ｉｉ）耐性のある対象を検査して、各対象がＡｘｌ発現、Ａｘｌ活性化突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を有しているかどうかを特定することと、（ｉｉｉ）対象がＡｘｌ発現、Ａｘｌ活性化突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を有している場合に、ＥＧＦＲアンタゴニストに加えて、本明細書に記載される抗Ａｘｌ抗体のいずれかを含むように対象の治療計画を変更することを含む方法を提供する。
【０２４４】
一態様では、本発明は、癌細胞のＥＧＦＲリン酸化を低減する方法であって、前記癌細胞はＥＧＦＲアンタゴニストに対する耐性を獲得し、また前記癌細胞は、Ａｘｌ活性化突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を含んでおり、該方法は、本明細書に記載されるいずれかの抗Ａｘｌ抗体及びＥＧＦＲアンタゴニストと、細胞を接触させる工程を含む方法を提供する。
【０２４５】
一態様では、本発明は、癌細胞のＰＢＫ媒介性シグナル伝達を低減する方法であって、前記癌細胞はＥＧＦＲアンタゴニストに対する耐性を獲得し、また前記癌細胞はＡｘｌ発現、Ａｘｌ活性化突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を含んでおり、該方法は、本明細書に記載されるいずれかの抗Ａｘｌ抗体及びＥＧＦＲアンタゴニストと、細胞を接触させる工程を含む方法を提供する。
【０２４６】
一態様では、本発明は、癌細胞のＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達を低減する方法であって、前記癌細胞はＥＧＦＲアンタゴニストに対する耐性を獲得し、また前記癌細胞はＡｘｌ発現、Ａｘｌ活性化突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を含んでおり、該方法が、本明細書に記載されるいずれかの抗Ａｘｌ抗体及びＥＧＦＲアンタゴニストと、細胞を接触させることを含む方法を提供する。
【０２４７】
一態様では、本発明は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する癌細胞の感受性を回復する方法であって、前記癌細胞はＥＧＦＲアンタゴニストに対する耐性を獲得し、また前記癌細胞はＡｘｌ発現、Ａｘｌ活性化突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を含んでおり、該方法は、本明細書に記載されるいずれかの抗Ａｘｌ抗体及びＥＧＦＲアンタゴニストと、細胞を接触させることを含む方法を提供する。
【０２４８】
一態様では、本発明は、癌細胞の成長または増殖を低減する方法であって、前記癌細胞はＥＧＦＲアンタゴニストに対する耐性を獲得し、また前記癌細胞はＡｘｌ発現、Ａｘｌ活性化突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を含んでおり、該方法は、本明細書に記載されるいずれかの抗Ａｘｌ抗体及びＥＧＦＲアンタゴニストと、細胞を接触させる工程を含む方法を提供する。
【０２４９】
一態様では、本発明は、癌細胞のアポトーシスを増加させる方法であって、前記癌細胞はＥＧＦＲアンタゴニストに対する耐性を獲得し、また前記癌細胞はＡｘｌ発現、Ａｘｌ活性化突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を含んでおり、該方法は、本明細書に記載されるいずれかの抗Ａｘｌ抗体及びＥＧＦＲアンタゴニストと、細胞を接触させる工程を含む方法を提供する。
【０２５０】
一態様では、本発明は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する癌細胞の耐性を低減する方法であって、前記癌細胞はＥＧＦＲアンタゴニストに対する耐性を獲得し、また前記癌細胞はＡｘｌ活性化突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を含んでおり、該方法は、本明細書に記載されるいずれかの抗Ａｘｌ抗体及びＥＧＦＲアンタゴニストと、細胞を接触させる工程を含む方法を提供する。
【０２５１】
一態様では、本発明は、ＥＧＦＲアンタゴニスト耐性を獲得した癌細胞の治療方法であって、前記癌細胞は、Ａｘｌ活性化突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を含んでおり、該方法は、本明細書に記載されるいずれかの抗Ａｘｌ抗体及びＥＧＦＲアンタゴニストと、細胞を接触させることを含む方法を提供する。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、癌細胞はＥＧＦＲ誘導性の癌である。いくつかの実施形態では、癌細胞はＥＧＦＲ活性化突然変異を含む。いくつかの実施形態では、癌細胞はＥＧＦＲ遺伝子増幅を含む。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ遺伝子増幅は少なくとも２倍である。いくつかの実施形態では、Ａｘｌ増幅は少なくとも２倍である。いくつかの実施形態では、癌細胞は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する耐性の増加と関連するＥＧＦＲ遺伝子突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する耐性の増加と関連するＥＧＦＲ遺伝子突然変異は、ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ突然変異である。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、小分子治療薬、核酸治療薬またはタンパク質治療薬である。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、抗体、アンチセンス分子または小分子キナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、ゲフィチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ、パニツムマブからなる群から選択されるＥＧＦＲキナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、セツキシマブ、パニツムマブからなる群から選択される抗ＥＧＦＲ抗体である。いくつかの実施形態では、核酸治療薬は、ｓｉＲＮＡ分子である。
【０２５４】
一態様では、本発明は、ＥＧＦＲアンタゴニスト及び本明細書に記載されるいずれかの抗Ａｘｌ抗体による治療候補である対象を同定する方法であって、前記対象はＥＧＦＲアンタゴニストによる治療を受けたことがあり、前記ＥＧＦＲアンタゴニストに対する耐性を獲得した癌に罹患しており、前記対象由来の癌細胞において、Ａｘｌ発現、Ａｘｌ活性化突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅を検出することを含む方法を提供する。
【０２５５】
一態様では、本発明は、ＥＧＦＲアンタゴニストによる治療を受けており、前記ＥＧＦＲアンタゴニストに対する耐性を獲得するリスクのある対象を同定する方法であって、前記対象由来の癌細胞において、Ａｘｌ発現、Ａｘｌ活性化突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅の存在を検出することを含み、前記Ａｘｌ発現、Ａｘｌ活性化突然変異またはＡｘｌ遺伝子増幅の存在が、前記耐性を獲得するリスクの指標となる方法を提供する。
【０２５６】
一態様では、本発明は、ＥＧＦＲアンタゴニストによる治療に耐性である癌に罹患した対象を治療する方法であって、ＥＧＦＲアンタゴニスト及び本明細書に記載されるいずれかの抗Ａｘｌ抗体を対象に投与することを含む方法を提供する。
【０２５７】
一態様では、本発明は、ＥＧＦＲ活性化突然変異またはＥＧＦＲ遺伝子増幅に関連する癌に罹患している対象の治療方法であって、該対象は、ＥＧＦＲアンタゴニストによる治療に耐性を発現しており、該方法は、対象がＡｘｌ発現、例えば、Ａｘｌのレベルの上昇及び／または活性の上昇を有するかどうかを特定することと、Ａｘｌ発現、例えば、Ａｘｌ活性の上昇を有する対象に、ＥＧＦＲアンタゴニスト及び本明細書に記載されるいずれかの抗Ａｘｌ抗体を投与することを含む方法を提供する。
【０２５８】
一態様では、本発明は、ＥＧＦＲ活性化突然変異またはＥＧＦＲ遺伝子増幅と関連する癌に罹患している対象の治療方法であって、（ｉ）ＥＧＦＲアンタゴニストによる治療を受けている対象をモニタリングし、対象がＡｘｌ発現、例えば、Ａｘｌレベルの上昇及び／またはＡｘｌ活性の上昇を示すかどうかを特定することと、（ｉｉ）対象がＡｘｌ発現、例えば、Ａｘｌレベルの上昇及び／または活性の上昇を発現している場合に、ＥＧＦＲアンタゴニストに加えて、本明細書に記載される抗Ａｘｌ抗体のいずれかを含むように対象の治療計画を変更することを含む方法を提供する。
【０２５９】
一態様では、本発明は、ＥＧＦＲ活性化突然変異またはＥＧＦＲ遺伝子増幅と関連する癌に罹患している対象の治療方法であって、（ｉ）ＥＧＦＲアンタゴニストによる治療を受けている対象をモニタリングし、対象が阻害剤に対する耐性を発現しているかどうかを特定することと、（ｉｉ）対象を検査して、対象がＡｘｌ発現、例えばＡｘｌレベルの上昇及び／または活性の上昇を有しているかどうかを特定することと、（ｉｉｉ）対象がＡｘｌレベルの上昇及び／または活性の上昇を有している場合に、ＥＧＦＲアンタゴニストに加えて、本明細書に記載される抗Ａｘｌ抗体のいずれかを含むように対象の治療計画を変更することを含む方法を提供する。
【０２６０】
別の態様では、本発明は、（ｉ）ＥＧＦＲアンタゴニストに対する癌細胞の感受性を回復し、（ｉｉ）ＥＧＦＲアンタゴニストに対する癌細胞の耐性を低減し、及び／または（ｉｉｉ）ＥＧＦＲアンタゴニスト及び本明細書に記載されるいずれかの抗Ａｘｌ抗体と、細胞を接触させることにより、ＥＧＦＲアンタゴニスト耐性を獲得した癌細胞を治療する方法を提供する。
【０２６１】
例示した実施形態では、癌細胞は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する耐性を獲得しており、例えば、Ａｘｌ遺伝子の突然変異活性、Ａｘｌ遺伝子増幅、またはＧａｓ６媒介性Ａｘｌ活性化に伴うＡｘｌ活性及び／または発現レベルの上昇を含む。本明細書に開示される方法は、癌細胞の感受性の回復、耐性の低減、及び／または獲得した耐性の治療に使用することができる。
【０２６２】
別の態様では、本発明は、ＥＧＦＲアンタゴニスト及び本明細書に記載されるいずれかの抗Ａｘｌ抗体と、細胞を接触させることにより、癌細胞の成長及び／または増殖を低減する、または癌細胞のアポトーシスを増加させる方法を提供する。例示した実施形態では、癌細胞は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する耐性を獲得しており、例えば、Ａｘｌ遺伝子の突然変異活性、Ａｘｌ遺伝子増幅、またはＧａｓ６媒介性Ａｘｌ活性化に伴うＡｘｌ活性及び／または発現の上昇を含む。
【０２６３】
医薬組成物
本発明の抗体は通常、抗体に加えて少なくとも１つの成分を含み得る医薬組成物の形態で投与される。
【０２６４】
したがって、本発明による医薬組成物及び本発明に従って使用される医薬組成物は、活性成分に加えて、当業者に周知の薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または他の材料を含んでよい。このような材料は、非毒性でなければならず、活性成分の有効性を妨げてはならない。担体または他の材料の厳密な性質は、投与経路によって異なり、投与経路は経口であっても、注射（例えば静脈内）によるものでもよい。本医薬組成物は、ヒト用医薬品及び動物用医薬品に使用されるヒト用または動物用のものであり得る。
【０２６５】
本明細書に記載する種々の異なる形態の医薬組成物に適した、このような賦形剤の例は、"Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ”，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９９４），Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａ  Ｗａｄｅ  ａｎｄ  ＰＪ  Ｗｅｌｌｅｒにて参照することができる。
【０２６６】
治療用途に許容される担体または希釈剤は、医薬分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄｉｔ．１９８５）に記載されている。好適な担体の例としては、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトールなどが挙げられる。好適な希釈剤の例としては、エタノール、グリセロール、水及び緩衝生理食塩水が挙げられる。
【０２６７】
薬剤担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図された投与経路及び標準的な薬務を考慮して選択することができる。医薬組成物には、担体、賦形剤、または希釈剤として、またはそれに加えて、任意の好適な結合剤（複数可）、滑沢剤（複数可）、懸濁化剤（複数可）、コーティング剤（複数可）、可溶化剤（複数可）、緩衝剤（複数可）、着香剤（複数可）、界面活性剤（複数可）、粘稠剤（複数可）、防腐剤（複数可）（抗酸化剤を含む）など、意図するレシピエントの血液と等張性のある製剤を提供する目的で含まれる物質を含んでよい。
【０２６８】
好適な結合剤の例としては、デンプン、ゼラチン、天然糖（例えば、グルコース、無水ラクトース、易流動性ラクトース、ベータ−ラクトース、とうもろこし甘味剤）、天然ガム及び合成ガム（例えば、アカシア、トラガカント、またはアルギン酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロースならびにポリエチレングリコールが挙げられる。
【０２６９】
好適な滑沢剤の例としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。医薬組成物には、防腐剤、安定剤、色素及び着香剤さえも存在してよい。防腐剤の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。抗酸化剤及び沈殿防止剤も使用することができる。
【０２７０】
医薬組成物には、経口投与、局所（経皮、頬側、舌下）投与、直腸投与または非経口（皮下、皮内、筋肉内、及び静脈内を含む）投与、経鼻投与、経肺投与（例えば、吸入）に適したものが含まれる。製剤は、必要な場合、利便上、個々の用量単位で提供されてもよく、薬学分野で周知の方法のいずれかにより調製することができる。どの方法にも、活性化合物を液体担体もしくは微粉固体担体または両方と結合させた後、生成物を必要に応じて望ましい製剤に成形する工程が含まれる。担体が固体である場合の経口投与に適した医薬組成物は、単位用量製剤、例えば、それぞれ所定量の活性薬剤を含有する大丸薬、カプセル剤または錠剤として提供されることが最も好ましい。錠剤は、場合により１つ以上の補助成分とともに、圧縮または成形することにより作製することができる。圧縮錠剤は、場合により結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、潤滑剤、界面活性剤または分散剤と混合された易流動性形態、例えば粉末または顆粒の活性薬剤を、適した機械で圧縮することにより調製することができる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤とともに活性薬剤を成形することにより作製することができる。錠剤は、場合によりコーティングされていてもよく、コーティングしていない場合には、場合により刻み目を付けてもよい。カプセル剤は、活性薬剤を単独で、または１種以上の補助成分との混合物としてカプセルシェルに充填した後、通常の方法で密封することにより調製することができる。カシェ剤はカプセル剤と同様に、活性薬剤が何らかの補助成分（複数可）とともにライスペーパー製の包材中に封入されている。活性薬剤はまた、分散性粒剤として製剤化することもでき、例えば、これは投与前に水中で懸濁化しても、食品にふりかけてもよい。この粒剤を例えばサシェに包装することができる。担体が液体である場合の経口投与に適した製剤は、水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液、または水中油型液体エマルジョンとして提供されてもよい。
【０２７１】
経口投与のための製剤には、徐放剤形、例えば、活性薬剤が適切な放出制御マトリックス内に製剤化されているか、または好適な放出制御フィルムでコーティングされている錠剤を含む。このような製剤は特に予防用途に好都合であり得る。
【０２７２】
担体が固体である場合の直腸投与に適した医薬組成物は、単位用量坐剤として提供されることが最も好ましい。好適な担体には、当技術分野で一般に用いられるカカオバター及びその他の材料を含む。坐剤は、軟化または溶解された担体（複数可）と活性薬剤を混合した後、成形型内で冷却して成形することにより、好都合に形成することができる。
【０２７３】
非経口投与に適した医薬組成物は、水性または油性ビヒクル中の活性薬剤の無菌溶液または懸濁液を含む。
【０２７４】
注射用製剤は、ボーラス注射または連続注入に適したものであってよい。このような製剤は、単位用量または複数用量容器で提供し、製剤の投入後、使用時に必要となるまで密封されていると便利である。あるいは、活性薬剤を粉末形態にし、好適なビヒクル、例えば滅菌パイロジェンフリー水を用いて使用前に作製してもよい。
【０２７５】
活性化合物はまた、長時間作用性のデポー製剤として調製してもよく、これを例えば皮下または筋肉内に、筋肉内注射によってまたは埋め込みによって投与してもよい。デポー調製物は、例えば、好適なポリマー材料もしくは疎水性材料またはイオン交換樹脂を含んでもよい。このような長時間作用性製剤は、特に予防用途に好都合である。
【０２７６】
口腔経由の肺投与に適した製剤は、活性化合物を含有し、望ましくは直径が０．５〜７ミクロンの範囲である粒子状物質をレシピエントの気管支樹に送達するように提供される。一つの可能性として、このような製剤は、吸入装置での使用に適した貫通可能なカプセル、例えばゼラチン内での提供、あるいは活性薬剤と、好適な液体またはガス状の噴射剤、ならびに場合により界面活性剤及び／もしくは固体希釈剤などの他の成分を含む、自動噴霧製剤としての提供に好都合である微粉砕粉末の形態である。好適な液体噴射剤としてはプロパン及びクロロフルオロカーボンが挙げられ、好適なガス状噴射剤としては二酸化炭素が挙げられる。また自動噴霧製剤は、活性薬剤を溶液または懸濁液の液滴形態で投薬する場合に用いることができる。
【０２７７】
このような自動噴霧製剤は、当技術分野で既知のものと同様に、既定の手順によって調製することができる。自動噴霧製剤は、好適には、望ましい噴霧特性を有する手動操作可能な、または自動的に機能するバルブを備えた容器で提示される。また有利には、バルブはその作動ごとに一定の量（例えば、２５〜１００マイクロリットル）を送達する計量型のものである。
【０２７８】
更に別の可能性として、活性薬剤は、加速気流または超音波撹拌を用いて吸入用の微細な霧状液滴を発生させるアトマイザーまたはネブライザーで使用するために溶液または懸濁液の形態であってもよい。
【０２７９】
経鼻投与に適した製剤としては、一般に上記の肺投与用のものと類似した製剤が挙げられる。このような製剤は、投与されるときに鼻腔内に定着できるように、望ましくは１０〜２００ミクロン範囲の粒径を有する必要があり、これは、必要に応じて好適な粒径の粉末を使用するかまたは適切なバルブを選択することによって実現できる。他の好適な製剤としては、鼻の近くに保持した容器から鼻腔への急速吸入により投与するための２０〜５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗粉末、及び水性または油性溶液または懸濁液中に０．２〜５％ｗ／ｖの活性薬剤を含む点鼻液が挙げられる。
【０２８０】
薬学的に許容される担体は、当業者に周知であり、それらの担体としては、０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍリン酸緩衝液、または０．８％生理食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、このような薬学的に許容される担体は、水性または非水性の溶液、懸濁液、及びエマルジョンであってもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体としては、生理食塩水及び緩衝化媒体を含めた、水、アルコール／水溶液、エマルジョン、または懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、または不揮発性油が挙げられる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどの防腐剤及びその他の添加剤が存在してもよい。
【０２８１】
局所製剤に適した製剤は、例えば、ゲル剤、クリーム剤、または軟膏剤として提供することができる。このような調製物は、例えば、傷もしくは潰瘍の表面に直接広げるか、または治療すべき箇所及び部分一面に適用できる包帯、ガーゼ、メッシュなどの好適な支持体に付けて、傷または潰瘍に塗布することができる。
【０２８２】
治療すべき部位、例えば、傷または潰瘍に直接噴霧するかまたはふりかけることができる、液体または粉末製剤も提供することができる。あるいは、包帯、ガーゼ、メッシュなどの担体に、製剤を噴霧またはふりかけた後、治療すべき部位に適用することができる。
【０２８３】
本発明の更なる態様によれば、上記の医薬組成物または動物用組成物を調製するための方法であって、活性化合物（複数可）を、例えば混合によって、担体と結合させる工程を含む方法が提供される。一般に該製剤は、活性薬剤を、液体担体もしくは微粉固体担体、またはその両方と均一にかつ十分に結合させ、その後、必要な場合には生成物を成形することによって調製される。本発明は、薬剤を、薬学的または獣医学的に許容される担体またはビヒクルと結合させることを含む、医薬組成物の調製方法にまで及ぶ。
【０２８４】
投与
本発明の医薬組成物は、経口、経直腸、経鼻、気管支内、局所（頬側、舌下を含む）、膣もしくは非経口（皮下、筋肉内、静脈内、動脈内及び皮内を含む）、腹腔内、または髄腔内投与への適合が可能である。好ましくは、製剤は静脈内または皮下投与される製剤である。
【０２８５】
製剤は、好都合には、単位剤形で、すなわち、単位用量、または単位用量の複数単位もしくは分割単位を含有する個別部分の形態で提示することができる。例として、製剤は錠剤及び徐放性カプセル剤の形態をとることができ、製薬分野で周知の任意の方法によって調製することができる。
【０２８６】
本発明における経口投与用製剤は、それぞれ所定の量の活性薬剤を含有するカプセル剤、ゲルーレ（ｇｅｌｌｕｌｅｓ）、ドロップ剤、カシェ剤、丸薬もしくは錠剤などの別個の単位として；粉末もしくは顆粒として；水性液体もしくは非水性液体中の活性薬剤の溶液、エマルジョン、もしくは懸濁液として；または水中油型液体エマルジョンもしくは油中水型液体エマルジョンとして；または大丸薬などとして提供することができる。好ましくは、これらの組成物は、１用量当たり１〜２５０ｍｇ、より好ましくは１０〜１００ｍｇの活性成分を含有する。
【０２８７】
経口投与用組成物（例えば、錠剤及びカプセル剤）に関して、用語「許容される担体」は、ビヒクル、例えば一般的な賦形剤、例えば結合剤、例えばシロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、スクロース及びデンプン；充填剤及び担体、例えば、トウモロコシデンプン、ゼラチン、ラクトース、スクロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウム及びアルギン酸；ならびに滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム及び他の金属ステアリン酸塩、ステアリン酸グリセロール、ステアリン酸、シリコーン流体、タルク、蝋、油、及びコロイド状シリカを含む。ペパーミント、冬緑油、サクランボ香料などの着香剤も使用することができる。剤形を容易に識別できるように、着色剤を添加することが望ましい場合もある。錠剤は、当技術分野で周知の方法によってコーティングすることもできる。
【０２８８】
錠剤は、場合により１種以上の補助成分とともに、圧縮または成形することにより製造することができる。圧縮錠剤は、場合により結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、防腐剤、界面活性剤または分散剤と混合された易流動性形態、例えば粉末または顆粒の活性薬剤を、適した機械で圧縮することにより、調製することができる。成形錠剤は、湿った粉末化合物と不活性液体希釈剤との混合物を好適な機械で成形することにより製造することができる。錠剤は、場合によりコーティングすることも、刻み目をつけることもでき、活性薬剤をゆっくりまたは制御して放出させるように製剤化することもできる。
【０２８９】
経口投与に適した他の製剤としては、矯味基剤、通常はスクロース及びアカシア、またはトラガカントに活性薬剤を含むトローチ剤；不活性基剤、例えば、ゼラチン及びグリセリンまたはスクロース及びアカシアに活性薬剤を含むパステル剤；好適な液体担体に活性薬剤を含む洗口液が挙げられる。
【０２９０】
他の投与形態は、静脈内、動脈内、髄腔内、皮下、皮内、腹腔内または筋肉内に注射でき、無菌のまたは滅菌可能な溶液から調製される溶液またはエマルジョンを含む。注射形態は通常、１用量当たり１０〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜２５０ｍｇの活性成分を含有する。
【０２９１】
本発明の医薬組成物はまた、坐剤、膣坐剤、懸濁液、エマルジョン、ローション剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、噴霧剤、溶液または粉剤の形態であってもよい。
【０２９２】
経皮投与の代替的な手段は、皮膚パッチの使用によるものである。例えば、ポリエチレングリコールまたは液体パラフィンの水性エマルジョンからなるクリーム剤に活性成分を組み込むことができる。活性成分はまた、必要とされ得る程度の安定剤及び防腐剤を加えた、白蝋または白色軟質パラフィン基剤からなる軟膏に１〜１０重量％の濃度で組み込むことができる。
【０２９３】
別の製剤手法により、経口または坐剤経路に適した製剤を提供することができる。投与経路は、有効性を最大化する、または副作用を最小化するために、治療薬の物理化学的特性によって、疾患ごとに特別に配慮して決定することができる。
【０２９４】
更に別の投与様式は、留置装置のプレコーティングまたはそれ以外の組み込みを用いるものであり、そのために適切な実験によって抗体の最適量を決定する。
【０２９５】
本発明のいくつかの好ましい実施形態の抗体分子は、単一遺伝子性断片（例えばＦａｂまたはｓｃＦｖ）である。このような抗体断片は、半減期が比較的短いという特徴を有することができる。
【０２９６】
投与量
当業者は、過度の実験をすることなく、対象に投与する、本組成物の適切な用量を容易に決定することができる。通常は、医師が個々の患者に最も適する実際の投与量を決定するものであり、投与量は、用いる特定の薬剤の活性、その薬剤の代謝安定性及び作用の長さ、年齢、体重、全身の健康、性別、食事、投与様式及び投与時間、排泄率、併用薬物、特定の病状の重症度、ならびに個別の実行中の療法を含めた様々な因子に応じて異なると予想される。
【０２９７】
本発明に従って、提供される組成物を個々の患者に投与することができる。投与は「治療的有効量」内であることが好ましく、この量は患者に利点をもたらすのに十分な量である。このような利点は、少なくとも１つの症状が少なくとも寛解することであってよい。実際に投与される量、ならびに投与速度及び時間経過は、治療される内容の性質及び重症度に依存する。治療薬の処方（例えば、投与量の決定など）は、一般診療医及びその他の医師の担当範囲内である。抗体の適切な用量は当技術分野で周知である（Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ  Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４７：６５９−６６４；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ４：９１５−９２２を参照）。
【０２９８】
正確な用量は、抗体が診断用または治療用いずれであるか、治療すべき領域の大きさと位置、抗体（例えば全抗体、抗体断片またはダイアボディ）の明確な性質、及び抗体と結合する検出可能標識または他の分子の性質を含めた多数の因子に応じて異なると予想される。通常の抗体用量を静脈内にボーラス投与することができる。他の投与様式としては、数時間にわたる静脈注入により、同程度の総蓄積用量を達成することが挙げられる。これは成人患者の単独治療での用量であり、幼児及び乳児の場合には、それに比例して調整でき、また他の形態の抗体の場合、分子量に比例して調整することができる。治療は、医師の裁量で毎日、週２回、毎週または毎月の間隔で繰り返すことができる。
【０２９９】
本明細書で開示される投与量は、平均的症例の例示である。言うまでもなく、この投与量範囲よりも高いまたは低い方が功を奏する個々の事例もあり得るが、このような量も本発明の範囲内である。
【０３００】
本発明に従って、Ａｘｌを阻害する有効量の薬剤を投与することができる。言うまでもなく、この投与量は薬剤の投与種類に応じて更に変更される。例えば、緊急治療時に「有効量」を達成するためには、非経口投与が好ましい。５％デキストロースの水または正常生理食塩水中の化合物、または好適な賦形剤を含む類似の製剤の静脈内注射が最も効果的であるが、筋肉内ボーラス注射も有用である。通常、非経口用量は０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくはキナーゼの阻害または標的受容体の飽和に有効な血漿中濃度に薬物濃度を維持するように０．１〜２０ｍｇ／ｋｇである。薬剤は、毎日１〜４回、約０．４〜約４００ｍｇ／ｋｇ／日の総１日用量を達成するレベルで投与することができる。治療的に有効である正確な活性薬剤量、及びこのような薬剤が最適に投与される経路は、薬剤の血中濃度を、治療的効果を得るために必要な濃度と比較することにより、当業者によって容易に決定される。
【０３０１】
本発明の薬剤はまた、薬物濃度が本明細書に開示される治療的指標のうちの１つ以上を達成するのに十分であるような方法で患者に経口投与することもできる。通常、薬剤を含有する医薬組成物は、患者の病状と合致するように約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇの経口用量で投与される。好ましくは、経口用量は約０．５〜約２０ｍｇ／ｋｇである。
【０３０２】
本発明の薬剤を数種のバイオアッセイのいずれかで試験して、所与の薬理効果を得るために必要な濃度を決定することができる。
【０３０３】
併用療法
本発明の抗Ａｘｌ抗体は単独で投与することも、他の治療薬と組み合わせて、治療すべき病状に応じて同時にまたは逐次的に投与することもできる。例えば、本発明の抗体またはその複合体を、抗癌単剤療法として、または下記のような他の癌治療薬との併用療法に使用することができる。他の治療薬には、好適な用量の鎮痛薬、例えば非ステロイド性抗炎症薬（例えばアスピリン、イブプロフェンまたはケトプロフェン）もしくはオピエート（例えばモルヒネ）、または制吐剤の投与を含むことができる。
【０３０４】
併用療法での使用に適した薬剤
これには、アルキル化剤（例えば、ブスルファンなどのスルホン酸アルキル）；ナイトロジェンマスタード（例えばクロラムブシル、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メルファラン及びウラムスチン）、エチレンイミン誘導体（例えばチオテパ）；ニトロソウレア（例えばカルムスチン、ロムスチン及びストレプトゾシン）、トリアゼン（例えばダカルバジン）、プロカルバジン及びテモゾールアミド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ）；白金化合物、例えばシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン及びピコプラチン、オンナプラチン（ｏｎｎａｐｌａｔｉｎ）、テトラプラチン、スプリオプラチン（ｓｐｒｉｏｐｌａｔｉｎ）、イプロプラチン、クロロ（ジエチレンジアミノ）−白金（ＩＩ）クロリド、ジクロロ（エチレンジアミノ）−白金（ＩＩ）、ジアミノ（２−エチルマロナト）白金（ＩＩ）、（１，２−ジアミノシクロヘキサン）マロナト白金（ＩＩ）、（４−カルボキシフタロ）−（１，２−ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）、（１，２−ジアミノシクロヘキサン）−（イソシトラト）白金（ＩＩ）及び（１，２−ジアミノシクロヘキサン）−ｃｉｓ−（ピルバト）白金（ＩＩ）；抗葉酸剤（例えばメトトレキサート、ペメトレキセド（ｐｅｒｍｅｔｒｅｘｅｄ）、ラルチトレキセド、及びトリメトレキサート）を含む代謝拮抗薬；ピリミジン類似体（例えばアザシチジン、カペシタビン、シタラビン、エダトレキサート、フロクスウリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン及びトロキサシタビン）；プリン類似体（例えばクラドリビン、クロロデオキシアデノシン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、ペントスタチン、チオグアニン）；抗腫瘍抗生物質（例えばブレオマイシン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ポルフィロマイシン）、及びアントラサイクリン（例えばダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びバルルビシン）を含む天然生成物；有糸分裂阻害薬（例えばビンカアルカロイド、ビンブラスチン、ビンベシル（ｖｉｎｖｅｓｉｒ）、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン）；
酵素（例えばＬ−アスパラギナーゼ及びＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ）；微小管ポリマー安定剤（例えばタキサン類のパクリタキセル及びドセタキセル）；トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えばカンプトテシン、イリノテカン及びトポテカン）；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えばポドフィロトキシン、アムサクリン、エトポシド、テニポシド、ロソキサントロン及びアクチノマイシン）；アンドロゲン（例えばフルオキシメステロン及びテストラクトン）を含むホルモン及びホルモンアンタゴニスト、抗アンドロゲン薬（例えばビカルタミド、シプロテロン、フルタミド及びニルタミド）；コルチコステロイド（例えばデキサメタゾン及びプレドニゾン）；アロマターゼ阻害剤（例えばアミノグルテチミド、アナストロゾール、エキセメスタン、ホルメスタン及びレトロゾール）；エストロゲン（例えばジエチルスチルベストロール）；抗エストロゲン薬（例えばフルベストラント、ラロキシフェン、タモキシフェン及びトレミフェン）；黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト及びアンタゴニスト（例えばアバレリクス、ブセレリン、ゴセレリン、リュープロリド、ヒストレリン、デスロレリン（ｄｅｓｏｒｅｌｉｎ）、酢酸ナファレリン及びトリプトレリン）；プロゲスチン（例えば酢酸メドロキシプロゲステロン及び酢酸メゲストロール）及び甲状腺ホルモン（例えばレボチロキシン及びリオチロニン）；ＰＫＢ経路阻害剤（例えばペリホシン、エンザスタウリン塩酸塩及びトリシリビン）；ＰＩ３Ｋ阻害剤（例えばセマフォア（ｓｅｍａｐｈｏｒｅ）及びＳＦ１１２６）；ｍＴＯＲ阻害剤（例えばラパマイシン及び類似体）；ＣＤＫ阻害剤（例えばセリシクリブ、アルボシジブ及び７−ヒドロキシスタウロスポリン）；ＣＯＸ−２阻害剤（例えばセレコキシブ）；ＨＤＡＣ阻害剤（例えばトリコスタチンＡ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸及びクラミドシン）；ＤＮＡメチラーゼ阻害剤（例えばテモゾロミド）；ならびにその他の薬剤（例えばアルトレタミン、三酸化ヒ素、サリドマイド、レナリドミド、硝酸ガリウム、レバミゾール、ミトタン、ヒドロキシウレア、オクトレオチド、プロカルバジン、スラミン、光線力学的化合物（例えばメトキサレン及びポルフィマーナトリウム）、及びプロテアソーム阻害剤（例えばボルテゾミブ））が挙げられる。
【０３０５】
分子標的療法剤チロシンキナーゼ阻害剤としては以下が挙げられる：機能性治療剤（例えば遺伝子療法剤）；アンチセンス療法剤；チロシンキナーゼ阻害剤（例えばエルロチニブ塩酸塩、ゲフィチニブ、メシル酸イマチニブ及びセマクサニブ）；ＲＡＦ阻害剤（例えばソラフェニブ）；レチノイド及びレキシノイドなどの遺伝子発現モジュレーター（例えばアダパレン、ベキサロテン、ｔｒａｎｓ−レチノイン酸、９−ｃｉｓ−レチノイン酸及びＮ−（４−ヒドロキシフェニル）レチンアミド）；モノクローナル抗体（例えばアレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、イブリツモマブチウキセタン、リツキシマブ、トラスツズマブ）を含む表現型特異的療法剤；免疫毒素（例えばエムタンシン）、放射性免疫複合体（例えばＩ−トシツモマブ（ｔｏｓｉｔｕｍｏｂａｂ））、ならびに癌ワクチン。
【０３０６】
生物学的療法剤としては、インターフェロン（例えばインターフェロン−［アルファ］２ａ及びインターフェロン−［アルファ］２ｂ）、及びインターロイキン（例えばアルデスロイキン、デニロイキンディフティトックス及びオプレルベキン）が挙げられる。Ａｘｌ阻害剤としては、１−（６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［６，７］シクロヘプタ［１，２−ｃ］ピリダジン−３−イル）−Ｎ３−（（７−（Ｓ）−ピロリジン−１−イル）−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−２−イル）−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３，５−ジアミン（ＢＧＢ３２４／Ｒ４２８）、ＣＨ５４５１０９８  （Ｒｏｃｈｅ）、ならびにＰＣＴ／ＵＳ０７／０８９１７７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２１２７５及びＰＣＴ／ＥＰ２０１１／００４４５１に記載のＡｘｌ阻害剤が挙げられ、各文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０３０７】
癌細胞に対して作用することを目的としたこれらの薬剤に加え、抗癌療法には、保護剤または補助剤の使用が含まれ、例えば、細胞保護剤（例えばアミフォスチン及びデクスラゾキサン）；ホスホネート（例えばパミドロネート、ゾレドロン酸）；及び刺激因子（例えばエポエチン、ダルベポエチン（ｄａｒｂｅｏｐｅｔｉｎ）、フィルグラスチム、ＰＥＧ−フィルグラスチム及びサルグラモスチム）が挙げられる。
【０３０８】
例えば、カルボプラチン／パクリタキセル、カペシタビン／ドセタキセル、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒａｕｒａｃｉｌ）／レバミゾール、フルオロウラシル／ロイコボリン、メトトレキサート／ロイコボリン及びトラスツズマブ／パクリタキセル）の組み合わせ単独、またはカルボプラチンなどとの更なる併用など、多くの併用化学療法計画が当技術分野で既知である。
【０３０９】
本明細書に開示された抗Ａｘｌ抗体と併用される、特に好ましいクラスの薬剤は、免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）、例えば免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ））である。
【０３１０】
腫瘍は、免疫系の抑制性経路である免疫チェックポイントを悪用して免疫耐性を誘発し得る。したがって、Ｔ細胞刺激性及び抑制性受容体、ならびに樹状細胞刺激性受容体を含む、免疫チェックポイントを遮断または調節し、それによって癌の免疫耐性を低減または克服する抗体の使用は、癌研究の重要な手段である。
【０３１１】
免疫チェックポイントを調節する抗体の使用により調節され得るＴ細胞刺激性受容体としては、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＴＷＥＡＫＲ、ＨＶＥＭ及びＴＩＭ−１が挙げられる。免疫チェックポイントを調節する抗体の使用により調節され得るＴ細胞抑制性受容体としては、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３及びＴＩＧＩＴが挙げられる。免疫チェックポイントを調節する抗体の使用により調節され得る樹状細胞刺激性受容体としては、ＣＤ４０及び４−１ＢＢが挙げられる。
【０３１２】
本明細書に開示される抗Ａｘｌ抗体との併用に適したＩＣＭには、免疫チェックポイントを調節または阻害する抗体を含み、その多くが当技術分野で既知である。特に好適な免疫チェックポイントを調節する抗体としては、以下が挙げられる：
ＣＴＬＡ−４標的抗体、例えばイピリムマブ及びトレメリムマブ。
ＰＤ−１標的抗体、例えばペムブロリズマブ、ミボルマブ（Ｍｉｖｏｌｕｍａｂ）及びＡＭＰ−５１４／ＭＥＤＩ０６８０。
ＢＤ−Ｌ１標的抗体、例えばＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ及びＢＭＳ−９３６５５９。
４−１ＢＢ標的抗体、例えばウレルマブ及びＰＦ−０５０８２５６６。
ＯＸ−４０標的抗体、例えばＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ６３８３（ｒＯＸ４０Ｌ）及びＭＯＸＲ０９１６。
ＧＩＴＲ標的抗体、例えばＴＲＸ５１８。
ＣＤ２７標的抗体、例えばＣＤＸ−１１２７。
ＣＤ４０標的抗体、例えばＣＰ−８７０，８９３。
ＬＡＧ３標的抗体、例えばＢＭＳ−９８６０１６。
【０３１３】
本発明の抗ＡＸＬ抗体とＩＣＭ抗体を併用する場合、使用するＩＣＭ抗体のすべてが抑制性受容体を標的とすることも、抑制性受容体を標的とするＩＣＭ抗体と刺激性受容体を標的とするＩＣＭ抗体との組み合わせを使用することもできる。
【０３１４】
したがって本開示は、本明細書に記載するように、治療（例えば癌などの増殖性疾患）に使用されるＡｘｌ結合抗体を提供するものであり、ここでの治療は１種以上の免疫チェックポイント調節抗体を更に含む。同様に、増殖性疾患（例えば癌）の治療用医薬品の製造に、本明細書に記載されるＡｘｌ結合抗体を提供するものであり、ここでの治療は１種以上の免疫チェックポイント調節抗体を更に含む。抗体は、イピリムマブ、トレメリムマブ、ペムブロリズマブ、ミボルマブ、ＡＭＰ−５１４／ＭＥＤＩ０６８０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＢＭＳ−９３６５５９、ウレルマブ、ＰＦ−０５０８２５６６、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ６３８３（ｒＯＸ４０Ｌ）、ＭＯＸＲ０９１６、ＴＲＸ５１８、ＣＤＸ−１１２７、ＣＰ−８７０，８９３及びＢＭＳ−９８６０１６から選択することができる。癌は肺癌、黒色腫、乳癌、卵巣癌または癌腫から選択され得る。
【０３１５】
本発明の化合物は、１種以上の免疫チェックポイント調節抗体の前に、１種以上の免疫チェックポイント調節抗体と同時に、または１種以上の免疫チェックポイント調節抗体の後に投与することができる。
【０３１６】
本発明の抗Ａｘｌ抗体との併用に特に好ましい、別のクラスの薬剤はＡｘｌ以外の標的に特異的な抗腫瘍抗体である。本発明の抗Ａｘｌ抗体との併用に適した、このような抗体を以下の表に示す：
2018506961.tif 000009
2018506961.tif 000010
【０３１７】
本明細書全体にわたって、本明細書に記載される方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで実施されることが好ましい。方法はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで実施することもできる。
【０３１８】
本発明は、本明細書で提供される抗体をＡｘｌと結合させること、または結合を可能にすること含む方法を提供する。前述のように、このような結合はｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば抗体の投与後）、または抗体をコードする核酸で行われる場合もあれば、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏ、例えばＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット解析、免疫細胞化学、免疫組織化学、免疫沈降またはアフィニティクロマトグラフィーで行われる場合もある。
【０３１９】
Ａｘｌ受容体と結合する抗体の量を測定することができる。診断を目的とする試験用サンプル中の抗原量と関連した定量化が可能である。
【０３２０】
サンプル中の抗体の反応性は、任意の適切な手段によって特定することができる。実現可能な手段の一つが放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）である。放射性標識抗原を非標識抗原（試験用サンプル）と混合して、抗体と結合させる。結合した抗原を結合していない抗原から物理的に分離し、抗体と結合した放射性抗原の量を測定する。試験用サンプル中に存在する抗原が増えるほど、抗体と結合する放射性抗原は少なくなる。レポーター分子と結合された抗原または類似体を使用した、非放射性抗原による競合的結合アッセイを用いることもできる。レポーター分子は、分光吸収特性または発光特性を有する蛍光色素、蛍光体またはレーザー色素であってよい。好適な蛍光色素としては、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン及びＴｅｘａｓ  Ｒｅｄが挙げられる。好適な発色性色素としては、ジアミノベンジジンが挙げられる。
【０３２１】
それ以外のレポーターとして、着色された、磁性または常磁性のラテックスビーズ、及び検出可能なシグナルの視覚的観察、電気的検出もしくはそれ以外の記録を直接的または間接的に可能にする生物学的または化学的に活性のある薬剤などの巨大分子コロイド状粒子または微粒子材料がある。これらの分子は、例えば、発色もしくは変色、または電気的特性の変化を起こす反応を触媒する酵素であってもよい。それらは分子的に励起可能なため、エネルギー状態間の電子遷移により、特有のスペクトル吸収または放射が得られる。レポーター分子には、バイオセンサーとともに用いられる化学物質が含まれていてもよい。ビオチン／アジビンまたはビオチン／ストレプトアビジン及びアルカリホスファターゼ検出系を使用することができる。
【０３２２】
個々の抗体−レポーター複合体によって生成されるシグナルを利用して、（標準及び試験）サンプル中の関連する抗体結合の定量化可能な絶対的または相対的データを導き出すことができる。
【０３２３】
本発明はまた、競合アッセイ法での抗原レベルの測定における上記の抗体の使用、すなわち、本発明によって提供される抗体を競合アッセイ法で使用することにより、サンプル中の抗原のレベルを測定する方法も提供する。この方法では、結合抗原を未結合抗原から物理的に分離する必要がない場合がある。結合時に物理的または光学的変化が生じるように、抗体にレポーター分子を結合することは、実現可能な手段の一つである。このレポーター分子は、検出可能な、また好ましくは測定可能なシグナルを直接的にまたは間接的に生じさせることができる。レポーター分子の結合は、直接的もしくは間接的、共有結合的（例えばペプチド結合による）、または非共有結合的であってよい。ペプチド結合による結合は、抗体及びレポーター分子をコードする融合遺伝子の組み換え発現の結果によるものであり得る。
【０３２４】
本発明はまた、例えばバイオセンサーシステムにおいて、本発明による抗体を使用することにより抗原レベルを直接測定することを提供する。
【０３２５】
結合の測定様式は本発明の特徴ではなく、当業者は自身の選択及び一般知識に従って好適な様式を選択することができる。
【０３２６】
本発明は更に、抗原と結合し、かつ本明細書に実質的に指定されたアミノ酸を有するＣＤＲを含む抗体可変ドメイン（ＶＨもしくはＶＬのいずれか、または両方）、または本明細書に実質的に指定されたアミノ酸配列を有する可変ドメインを含むいかなる抗体とも、Ａｘｌへの結合を競合する抗体にまで及ぶ。抗体間の競合は、例えば、一方の結合メンバーに特異的なレポーター分子をタグ付けし、他方のタグ無し結合メンバー（複数可）の存在下で検出できるようにして、同じエピトープもしくは重複するエピトープを結合する抗体の同定を可能にすることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで容易に分析することができる。競合は、例えば、ＥＬＩＳＡ法またはフローサイトメトリーを使用して特定することができる。あるいは、競合抗体は、実施例６に記載するように、Ｂｉａｃｏｒｅ装置を使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって同定することができる。
【０３２７】
別の方法では、目的とする抗体が結合するＡｘｌ上のエピトープと結合する抗体（例えば、１０Ｃ９または１０Ｇ５抗体のＡｘｌへの結合を阻止するもの）をスクリーニングするため、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されているような通常のクロスブロッキングアッセイを実施することができる。
【０３２８】
競合試験には、抗原のペプチド断片、特に目的とするエピトープを含むペプチドを用いることができる。エピトープ配列に加え、１つ以上のアミノ酸をいずれかの末端に有するペプチドを使用することができる。このようなペプチドは、特異的配列から「本質的になる」と称することができる。本発明による抗体は、抗原に対する結合が、所与の配列を有する、またはそれを含むペプチドによって阻害されるようなものでもあってよい。そのための試験に、一方の配列に加え、１つ以上のアミノ酸を有するペプチドを使用することができる。
【０３２９】
特定のペプチドを結合する抗体を、例えば、ペプチド（複数可）を用いたパニングにより、ファージディスプレイライブラリから単離することができる。
【０３３０】
本発明は更に、本発明の抗体をコードする単離された核酸を提供する。核酸にはＤＮＡ及びＲＮＡを含む。好適な態様では、本発明は、上記に定義した本発明のＣＤＲ、ＶＨまたはＶＬドメインをコードする核酸を提供する。
【０３３１】
本発明はまた、上記の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写カセットまたは発現カセットの形態である構築物も提供する。
【０３３２】
本発明はまた、上記の１種以上の構築物を含む、組み換え宿主細胞も提供する。提供されるＣＤＲ、ＶＨもしくはＶＬドメイン、または抗体のいずれをコードする核酸も、コード核酸からの発現方法を含む、コード産物の産生方法と同様に、それ自体で本発明の一態様を形成する。発現は、その核酸を含む組み換え宿主細胞を適切な条件下で培養することにより、利便に実現され得る。発現による産生後、ＶＨもしくはＶＬドメイン、または抗体を当技術分野で既知の任意の好適な技術を使用して単離及び／または精製することができる。
【０３３３】
本発明による抗体、ＶＨ及び／またはＶＬドメイン、ならびにコード核酸分子及びベクターは、例えば天然の環境から、実質的に純粋もしくは均一な形態で、あるいは核酸の場合には、必要とされる機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の核酸も遺伝子源も含まずに、もしくは実質的に含まずに、単離及び／または精製して提供することができる。本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでよく、また全体的にまたは部分的に合成されてもよい。本明細書に記載するヌクレオチド配列への言及は、指定された配列を有するＤＮＡ分子を包含し、かつ文脈において特に指示がない限り、ＴがＵで置換されている指定された配列を有するＲＮＡ分子を包含する。
【０３３４】
種々の異なる宿主細胞においてポリペプチドをクローニング及び発現する系は周知である。好適な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、酵母、バキュロウイルス及び昆虫細胞系が挙げられる。当技術分野で、異種ポリペプチドの発現に利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＮＳ０及びＳＰ２／０マウス黒色腫細胞、ＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞、ヒト細胞株ＨＥＫ−２９３及びＰＥＲ．Ｃ６ならびに他多数が挙げられる。一般的な好ましい細菌宿主はＥ．ｃｏｌｉである。
【０３３５】
Ｅ．ｃｏｌｉのような原核細胞における抗体及び抗体断片の発現は、当技術分野において十分に確立されている。概説については、例えばＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５４５−５５１（１９９１）を参照のこと。培養物中での真核細胞の発現もまた、抗体の作製のための１つの選択肢として当業者は利用可能である。概説については、例えば、Ｒｅｆ，Ｍ．Ｅ．（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：５７３−５７６；Ｔｒｉｌｌ  Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ６：５５３−５６０を参照のこと。
【０３３６】
必要に応じて、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び他の配列を含めた、適切な調節配列を含んでいる好適なベクターを選択または構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス、例えば、ファージもしくはファージミドであってよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２には、例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞中へのＤＮＡの導入及び遺伝子発現における核酸の操作、ならびにタンパク質解析のための既知の技術及びプロトコルが数多く詳細に記載されている。
【０３３７】
したがって、本発明の更に別の態様は、本明細書に開示される核酸を含む宿主細胞を提供する。なお更なる態様は、このような核酸の宿主細胞への導入を含む方法を提供する。この導入には、任意の利用可能な技術を使用することができる。真核細胞の場合、好適な技術には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性のトランスフェクション、及びレトロウイルスまたは他のウイルス、例えば、ワクシニア、もしくは昆虫細胞の場合、バキュロウイルスを使用する形質導入が含まれ得る。菌体の場合、好適な技術には、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション及びバクテリオファージを使用したトランスフェクションが含まれ得る。
【０３３８】
導入に続いて、例えば、遺伝子発現のための条件下で宿主細胞を培養することにより、核酸からの発現を引き起こすか、または可能にすることができる。
【０３３９】
一実施形態では、本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば染色体）中に組み込まれる。標準的な技術に従って、このゲノムとの組み換えを促進する配列を含めることによって、組み込みを促進することができる。
【０３４０】
本発明はまた、上記の抗体またはポリペプチドを発現させるために、発現系で上記構築物を使用することを含む方法も提供する。
【０３４１】
ここで以下の実験を参照し、本発明の態様及び実施形態を例示目的として説明する。
【０３４２】
本明細書のあらゆる箇所で引用された文献はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３４３】
発明の陳述−１０Ｃ９抗体
以下の段落は、本発明の具体的に想定される多数の実施形態及び組み合わせを記載する。
【０３４４】
１．Ａｘｌを結合する抗体であって、
１０Ｃ９のＶＨドメイン（配列番号３）、及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３と、場合により配列番号６及び配列番号５から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のＶＨ  ＣＤＲとを含むＶＨドメインからなる群から選択される抗体ＶＨドメイン；ならびに／または
１０Ｃ９のＶＬドメイン（配列番号４）、及び配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のＶＬ  ＣＤＲを含むＶＬドメインからなる群から選択される抗体ＶＬドメインを含む抗体。
【０３４５】
２．配列番号５、配列番号６及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲを含んでいる抗体ＶＨドメインを含む、段落１による抗体であって、１０Ｃ９のＶＨドメイン（配列番号３）及び１０Ｃ９のＶＬドメイン（配列番号４）を含んでいる抗体のＡｘｌ結合ドメインと、ヒトＡｘｌへの結合を競合する抗体。
【０３４６】
３．１０Ｃ９のＶＨドメイン（配列番号３）を含んでいる段落１または段落２による抗体。
【０３４７】
４．１０Ｃ９のＶＬドメイン（配列番号４）を含んでいる段落３による抗体。
【０３４８】
５．段落１〜４のいずれか１項による抗体の変異体であって、１つ以上のフレームワーク領域内及び／または１つ以上のＣＤＲ内に１つ以上のアミノ酸配列改変を含む変異体。
【０３４９】
６．抗体の親和性と抗原結合部位の親和性が同一条件下で特定されるとき、１０Ｃ９のＶＨドメイン（配列番号３）及び１０Ｃ９のＶＬドメイン（配列番号４）によって形成されるＡｘｌ抗原結合部位の親和性と等しいか、またはそれを上回る親和性でＡｘｌを結合する段落１〜５のいずれか１項による抗体。
【０３５０】
７．ｓｃＦｖ抗体分子を含む、段落１〜６のいずれか１項による抗体。
【０３５１】
８．抗体の定常領域を含む、段落１〜６のいずれか１項による抗体。
【０３５２】
９．全抗体を含む、段落８による抗体。
【０３５３】
１０．抗原結合能に加えて、更に機能的特徴を備えている付加アミノ酸を含む、段落１〜９のいずれか１項による抗体。
【０３５４】
１１．２ｘ１０−１０Ｍ以下のＫＤでＡｘｌを結合する、段落１〜１０のいずれか１項による抗体。
【０３５５】
１２．１．５ｘ１０６Ｍ−１ｓ−１以上のｋｏｎでＡｘｌを結合する、段落１〜１１のいずれか１項による抗体。
【０３５６】
１３．ＡｘｌがヒトＡｘｌである、段落１〜１２のいずれか１項による抗体。
【０３５７】
１４．霊長類のＡｘｌを特異的に結合する、段階１〜１３のいずれか１項による抗体。
【０３５８】
１５．（ｉ）１０−３Ｍ超のＫＤでマウスＡｘｌを結合する；
（ｉｉ）１０−３Ｍ超のＫＤでヒトＭｅｒを結合する；及び／または
（ｉｉｉ）１０−３Ｍ超のＫＤでヒトＴｙｒｏ３を結合する、段階１〜１４のいずれか１項による抗体。
【０３５９】
１６．ＡｘｌのＧａｓ６への結合を阻害する、段落１〜１５のいずれか１項による抗体。
【０３６０】
１７．Ａｘｌ受容体の発現を下方調節する、段落１〜１６のいずれか１項による抗体。
【０３６１】
１８．Ａｘｌ受容体の発現を、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をしたサンプルで観察されるレベルの５０％未満に減少させる、段落１７による抗体。
【０３６２】
１９．Ａｘｌ受容体発現の下方調節が、サンプルと抗体との接触後１２時間以内に観察される、段落１７または１８のいずれか１項による抗体。
【０３６３】
２０．Ａｘｌ受容体発現の下方調節が、サンプルと抗体との接触後、少なくとも２４時間持続する、段落１７〜１９のいずれか１項による抗体。
【０３６４】
２１．Ａｘｌ受容体の内在化の速度を増加させる、段落１〜２０のいずれか１項による抗体。
【０３６５】
２２．Ａｘｌ活性を阻害する、段落１〜２１のいずれか１項による抗体。
【０３６６】
２３．前記抗体が、Ａｘｌ受容体の下流シグナル伝達を阻害する、段落２２による抗体。
【０３６７】
２４．本発明の抗体と接触させたサンプルのＳｅｒｉｎｅ  ４７３でのＡｋｔのリン酸化を、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をしたサンプルで観察されるレベルの５０％未満に減少させる、段落２２または２３のいずれか１項による抗体。
【０３６８】
２５．細胞死率を増加させる、段落１〜２４のいずれか１項による抗体。
【０３６９】
２６．腫瘍成長を阻害する、段落１〜２５のいずれか１項による抗体。
【０３７０】
２７．検出可能標識、酵素または毒素と、場合によりペプチジル結合またはリンカーを介して複合体化された、段落１〜２６のいずれか１項による抗体。
【０３７１】
２８．前記毒素がＭＭＡＥ及びＭＭＡＦからなる群から選択される、段落２７による抗体。
【０３７２】
２９．前記検出可能標識がＦＩＴＣである、段落２７による抗体。
【０３７３】
３０．ハイブリドーマＵＴ−１０Ｃ９−Ｂ９から得られる１０Ｃ９抗体が結合するエピトープと結合する、段落１〜２９のいずれか１項による抗体。
【０３７４】
３１．ハイブリドーマＵＴ−１０Ｃ９−Ｂ９から得られる１０Ｃ９抗体が結合するエピトープと結合する抗体。
【０３７５】
３２．ＡｘｌとそのリガンドＧａｓ６との結合を阻害する、段落３１による抗体。
【０３７６】
３３．Ａｘｌ発現の下方調節、Ａｘｌ受容体のシグナル伝達阻害、及び／または腫瘍成長の阻害をもたらす、段落３１または３２のいずれか１項による抗体。
【０３７７】
３４．ハイブリドーマＵＴ−１０Ｃ９−Ｂ９から得られる１０Ｃ９抗体。
【０３７８】
３５．段落１〜２６のいずれか１項による抗体の、抗体または抗体のＶＨもしくはＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【０３７９】
３６．段落３５による核酸で形質転換された宿主細胞。
【０３８０】
３７．抗体または抗体のＶＨもしくはＶＬドメインの作製方法であって、前記抗体または抗体のＶＨもしくはＶＬドメインの作製条件下で、段落３６による宿主細胞を培養することを含む方法。
【０３８１】
３８．前記抗体または抗体のＶＨもしくはＶＬ可変ドメインを単離及び／または精製することを更に含む、段落３７による方法。
【０３８２】
３９．前記抗体または抗体のＶＨもしくはＶＬ可変ドメインを、少なくとも１種の追加成分を含む組成物に製剤化することを更に含む、段落３７または段落３８による方法。
【０３８３】
４０．Ａｘｌを結合する抗体を得る方法であって、
１０Ｃ９のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号３）における１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入により、それぞれが１０Ｃ９のＶＨドメインのアミノ酸配列変異体である１つ以上のＶＨドメインを提供し、場合により、このようにして提供される１つ以上のＶＨドメインのアミノ酸配列変異体を１つ以上のＶＬドメインと組み合わせ、１つ以上のＶＨ／ＶＬの組み合わせを提供することと；及び／または
１０Ｃ９のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号４）における１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入により、１０Ｃ９のＶＬドメインのアミノ酸配列変異体であるＶＬドメインを提供し、このようにして提供される１つ以上のＶＬドメインのアミノ酸配列変異体を１つ以上のＶＨドメインと組み合わせ、１つ以上のＶＨ／ＶＬドメインの組み合わせを提供することと；
ならびにＶＨドメインのアミノ酸配列変異体またはＶＨ／ＶＬの組み合わせもしくは複数の組み合わせを試験して、Ａｘｌを結合する抗体を同定することと、を含む方法。
【０３８４】
４１．Ａｘｌを結合する抗体を得る方法であって、
ＣＤＲ３が置換されているか、もしくはＣＤＲ３コード領域が欠失している１つ以上のＶＨドメインをコードする出発核酸を提供し、前記出発核酸を、配列番号７であるＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードするドナー核酸と組み合わせることにより、前記ドナー核酸を出発核酸内のＣＤＲ３領域に挿入し、それによってＶＨドメインをコードする核酸産物を提供すること；または
ＣＤＲ３が置換されているか、もしくはＣＤＲ３コード領域が欠失している１つ以上のＶＬドメインをコードする出発核酸を提供し、前記出発核酸を、配列番号１０であるＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードするドナー核酸と組み合わせることにより、前記ドナー核酸を出発核酸内のＣＤＲ３領域に挿入し、それによってＶＬドメインをコードする核酸産物を提供することと；
ＶＨドメインをコードする前記核酸産物の核酸を発現させ、場合により、このようにして提供されるＶＨドメインを１つ以上のＶＬドメインと組み合わせてＶＨ／ＶＬの組み合わせを提供すること、及び／もしくはＶＬドメインをコードする前記核酸産物の核酸を発現させ、このようにして提供されるＶＬドメインを１つ以上のＶＨドメインと組み合わせてＶＨ／ＶＬの組み合わせを提供することと；
Ａｘｌを結合するＶＨドメインもしくはＶＨ／ＶＬの組み合わせを含む抗体を選択することと；
ならびに、Ａｘｌを結合する前記抗体及び／もしくはＡｘｌを結合する抗体をコードする核酸を回収することと、を含む方法。
【０３８５】
４２．Ａｘｌを結合する抗体がＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む抗体断片である、段落４１または段落４１による方法。
【０３８６】
４３．前記抗体断片がｓｃＦｖ抗体分子である、段落４２による方法。
【０３８７】
４４．前記抗体断片がＦａｂ抗体分子である、段落４２による方法。
【０３８８】
４５．全抗体に抗体断片のＶＨドメイン及び／またはＶＬドメインを提供することを更に含む、段落４３または段落４４による方法。
【０３８９】
４６．Ａｘｌを結合する抗体またはＡｘｌを結合する抗体の抗体ＶＨもしくはＶＬ可変ドメインを、少なくとも１種の追加成分を含む組成物に製剤化することを更に含む、段落３７〜４５のいずれか１項による方法。
【０３９０】
４７．Ａｘｌを結合する抗体をＡｘｌまたはＡｘｌの断片に結合することを更に含む、段落３７〜４６のいずれか１項による方法。
【０３９１】
４８．段落１〜２９のいずれか１項によるＡｘｌを結合する抗体をＡｘｌまたはＡｘｌの断片に結合することを含む方法。
【０３９２】
４９．前記結合がｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じる、段落４７または段落４８による方法。
【０３９３】
５０．抗体がＡｘｌまたはＡｘｌの断片に結合する量を特定することを含む、段落４７〜４９のいずれか１項による方法。
【０３９４】
５１．Ａｘｌの過剰発現を特徴とする疾患または障害を治療する医薬品の製造における、前記抗体の使用を更に含む、段落３７〜４６のいずれか１項による方法。
【０３９５】
５２．段落１〜２６のいずれか１項による抗体、またはその免疫複合体を、薬学的に許容される賦形剤とともに含む組成物。
【０３９６】
５３．免疫チェックポイントモジュレーター及び／またはＡｘｌ以外の標的に特異的な抗腫瘍抗体を更に含む、段落５２による組成物。
【０３９７】
５４．前記免疫チェックポイントモジュレーターが、イピリムマブ、トレメリムマブ、ペムブロリズマブ、ミボルマブ、ＡＭＰ−５１４／ＭＥＤＩ０６８０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＢＭＳ−９３６５５９、ウレルマブ、ＰＦ−０５０８２５６６、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ６３８３（ｒＯＸ４０Ｌ）、ＭＯＸＲ０９１６、ＴＲＸ５１８、ＣＤＸ−１１２７、ＣＰ−８７０、８９３またはＢＭＳ−９８６０１６などの抗体である、段落５３による組成物。
【０３９８】
５５．Ａｘｌ以外の標的に特異的な前記抗腫瘍抗体が、リツキシマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、アレムツズマブ、ＩＧＮ１０１、アデカツムマブ、ラベツズマブ、ｈｕＡ３３、ペムツモマブ、オレゴボマブ、ＣＣ４９（ミンレツモマブ）、ｃＧ２５０、Ｊ５９１、ＭＯｖ１８、ＭＯＲＡｂ−００３（ファルレツズマブ）、３Ｆ８、ｃｈ１４．１８、ＫＷ−２８７１、ｈｕ３Ｓ１９３、ＩｇＮ３１１、ベバシズマブ、ＩＭ−２Ｃ６、ＣＤＰ７９１、エタラシズマブ、ボロシキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ８０６、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ＭＭ−１２１、ＡＭＧ  １０２、ＭＥＴＭＡＢ、ＳＣＨ  ９００１０５、ＡＶＥ１６４２、ＩＭＣ−Ａ１２、ＭＫ−０６４６、Ｒ１５０７、ＣＰ  ７５１８７１、ＫＢ００４、ＩＩＩＡ４、マパツムマブ（ＨＧＳ−ＥＴＲ１）、ＨＧＳ−ＥＴＲ２、ＣＳ−１００８、デノスマブ、シブロツズマブ、Ｆ１９、８１Ｃ６からなる群から選択される、段落５３による組成物。
【０３９９】
５６．治療方法に使用される、段落１〜２９のいずれか１項による抗体、または段落５２〜５５のいずれか１項による組成物。
【０４００】
５７．増殖性疾患の治療方法に使用される、段落５６による抗体または組成物。
【０４０１】
５８．前記増殖性疾患が癌である、段落５７による抗体または組成物。
【０４０２】
５９．前記癌が転移癌である、段落５８による抗体または組成物。
【０４０３】
６０．Ａｘｌの過剰発現を特徴とする疾患または障害を治療するための医薬品の製造における、段落１〜２９のいずれか１項による抗体、または段落５２〜５５のいずれか１項による組成物の使用。
【０４０４】
６１．Ａｘｌの過剰発現を特徴とする疾患または障害の治療方法であって、段落１〜２９のいずれか１項による抗体、または段落５２〜５５のいずれか１項による組成物を、疾患もしくは障害を有する患者、または疾患もしくは障害を発現するリスクのある患者に投与することを含む方法。
【０４０５】
６２．段落５６〜５９のいずれか１項による抗体、または請求項６１の方法であって、段落１〜２９のいずれか１項による抗体、または段落５２〜５５のいずれか１項による組成物を、免疫チェックポイントモジュレーター及び／またはＡｘｌ以外の標的に特異的な抗腫瘍抗体と組み合わせて投与することを含む治療方法。
【０４０６】
６３．前記抗体が転移癌細胞を標的とする医薬組成物の送達を誘導する、段落６１による方法。
【０４０７】
６４．Ａｘｌの過剰発現を特徴とする疾患または障害を検出するための診断薬の製造における、段落１〜２９のいずれか１項による抗体、及び前記抗体と転移癌細胞の結合を特定できる１種以上の試薬の使用。
【０４０８】
６５．Ａｘｌの過剰発現を特徴とする疾患または障害の診断方法であって、段落１〜２９のいずれか１項による抗体、または段落５２〜５５のいずれか１項による組成物、及び前記抗体と転移癌細胞との結合を特定できる１種以上の試薬を、疾患もしくは障害を有する患者、または疾患もしくは障害を発現するリスクのある患者に投与することを含む方法。
【０４０９】
６６．段落１〜２９のいずれか１項による抗体、及び前記メンバーと転移癌細胞との結合を特定できる１種以上の試薬を含む診断キット。
【０４１０】
６７．段落１〜２９のいずれか１項による抗体、または段落５２〜５５のいずれか１項による組成物を含むキット。
【０４１１】
６８．薬学的に許容される賦形剤とともに、有効量の段落１〜２９による抗体を活性成分として含む医薬組成物。
【０４１２】
発明の陳述−１０Ｇ５抗体
以下の段落は、本発明の具体的に想定される多数の実施形態及び組み合わせを記載する。
【０４１３】
１ａ．Ａｘｌを結合する抗体であって、
１０Ｇ５のＶＨドメイン（配列番号２１）、及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３と、場合により配列番号２４及び配列番号２３から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のＶＨ  ＣＤＲとを含むＶＨドメインからなる群から選択される抗体ＶＨドメイン；ならびに／または
１０Ｇ５のＶＬドメイン（配列番号２２）、及び配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のＶＬ  ＣＤＲを含むＶＬドメインからなる群から選択される抗体ＶＬドメインを含む抗体。
【０４１４】
１ｂ．Ａｘｌを結合する抗体であって、
１０Ｇ５（Ｑ１Ｅ）のＶＨドメイン（配列番号４５）、及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３と、場合により配列番号２４及び配列番号２３から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のＶＨ  ＣＤＲとを含むＶＨドメインからなる群から選択される抗体ＶＨドメイン；ならびに／または１０Ｇ５のＶＬドメイン（配列番号２２）、及び配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のＶＬ  ＣＤＲを含むＶＬドメインからなる群から選択される抗体ＶＬドメインを含む抗体。
【０４１５】
２ａ．段落１ａまたは１ｂによる抗体であって、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲを含んでいる抗体ＶＨドメインを含み、１０Ｇ５のＶＨドメイン（配列番号２１）及び１０Ｇ５のＶＬドメイン（配列番号２２）を含んでいる抗体のＡｘｌ結合ドメインと、Ａｘｌへの結合を競合する抗体。
【０４１６】
３ａ．１０Ｇ５のＶＨドメイン（配列番号２１）を含んでいる段落１ａまたは段落２ａによる抗体。
【０４１７】
３ｂ．１０Ｇ５（Ｑ１Ｅ）のＶＨドメイン（配列番号４５）を含んでいる段落１ｂまたは段落２ａによる抗体。
【０４１８】
４ａ．１０Ｇ５のＶＬドメイン（配列番号２２）を含んでいる段落３ａによる抗体。
【０４１９】
５ａ．段落１ａ〜４ａのいずれか１項による抗体の変異体であって、１つ以上のフレームワーク領域内及び／または１つ以上のＣＤＲ内に１つ以上のアミノ酸配列改変を含む変異体。
【０４２０】
６ａ．抗体の親和性と抗原結合部位の親和性が同一条件下で特定されるとき、１０Ｇ５のＶＨドメイン（配列番号２１）及び１０Ｇ５のＶＬドメイン（配列番号２２）によって形成されるＡｘｌ抗原結合部位の親和性と等しいか、またはそれを上回る親和性でＡｘｌと結合する段落１ａ〜５ａのいずれか１項による抗体。
【０４２１】
７ａ．ｓｃＦｖ抗体分子を含む、段落１ａ〜６ａのいずれか１項による抗体。
【０４２２】
ａ８．抗体定常領域を含む、段落１ａ〜６ａのいずれか１項による抗体。
【０４２３】
９ａ．全抗体を含む、段落８ａによる抗体。
【０４２４】
１０ａ．抗原結合能に加えて、更に機能的特徴を備えている付加アミノ酸を含む、段落１ａ〜９ａのいずれか１項による抗体。
【０４２５】
１１ａ．６ｘ１０−１０Ｍ以下のＫＤでＡｘｌを結合する、段落１ａ〜１０ａのいずれか１項による抗体。
【０４２６】
１２ａ．８ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１以上のｋｏｎでＡｘｌを結合する、段落１ａ〜１１ａのいずれか１項による抗体。
【０４２７】
１３ａ．ＡｘｌがヒトＡｘｌである、段落１ａ〜１２ａのいずれか１項による抗体。
【０４２８】
１４ａ．霊長類のＡｘｌを特異的に結合する、段落１ａ〜１３ａのいずれか１項による抗体。
【０４２９】
１５ａ．（ｉ）１０−３Ｍ超のＫＤでマウスＡｘｌを結合する；
（ｉｉ）１０−３Ｍ超のＫＤでヒトＭｅｒを結合する；及び／または
（ｉｉｉ）１０−３Ｍ超のＫＤでヒトＴｙｒｏ３を結合する、段落１ａ〜１４ａのいずれか１項による抗体。
【０４３０】
１６ａ．ＡｘｌのＧａｓ６への結合を阻害する、段落１ａ〜１５ａのいずれか１項による抗体。
【０４３１】
１７ａ．Ａｘｌ受容体の発現を下方調節する、段落１ａ〜１６ａのいずれか１項による抗体。
【０４３２】
１８ａ．Ａｘｌ受容体の発現を、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をしたサンプルで観察されるレベルの５０％未満に減少させる、段落１７ａによる抗体。
【０４３３】
１９ａ．Ａｘｌ受容体発現の下方調節が、サンプルと抗体との接触後１２時間以内に観察される、段落１７ａまたは１８ａのいずれか１項による抗体。
【０４３４】
２０ａ．Ａｘｌ受容体発現の下方調節が、サンプルと抗体との接触後、少なくとも２４時間持続する、段落１７ａ〜１９ａのいずれか１項による抗体。
【０４３５】
２１ａ．Ａｘｌ受容体の内在化の速度を増加させる、段落１ａ〜２０ａのいずれか１項による抗体。
【０４３６】
２２ａ．Ａｘｌ活性を阻害する、段落１ａ〜２１ａのいずれか１項による抗体。
【０４３７】
２３ａ．前記抗体が、Ａｘｌ受容体の下流シグナル伝達を阻害する、段落２２ａによる抗体。
【０４３８】
２４ａ．本発明の抗体と接触させたサンプルのＳｅｒｉｎｅ  ４７３でのＡｋｔのリン酸化を、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をしたサンプルで観察されるレベルの５０％未満に減少させる、段落２２ａまたは２３ａのいずれか１項による抗体。
【０４３９】
２５ａ．細胞死率を増加させる、段落１ａ〜２４ａのいずれか１項による抗体。
【０４４０】
２６ａ．腫瘍成長を阻害する、段落１ａ〜２５ａのいずれか１項による抗体。
【０４４１】
２７ａ．検出可能標識、酵素または毒素と、場合によりペプチジル結合またはリンカーを介して複合体化された、段落１ａ〜２６ａのいずれか１項による抗体。
【０４４２】
２８ａ．前記毒素がＭＭＡＥ及びＭＭＡＦからなる群から選択される、段落２７ａによる抗体。
【０４４３】
２９ａ．前記検出可能標識がＦＩＴＣである、段落２７ａによる抗体。
【０４４４】
３０ａ．ハイブリドーマＷＲ−１０Ｇ５−Ｅ５から得られる１０Ｇ５抗体が結合するエピトープと結合する、段落１ａ〜２９ａのいずれか１項による抗体。
【０４４５】
３１ａ．ハイブリドーマＷＲ−１０Ｇ５−Ｅ５から得られる１０Ｇ５抗体が結合するエピトープと結合する抗体。
【０４４６】
３２ａ．ＡｘｌとそのリガンドＧａｓ６との結合を阻害する、段落３１ａによる抗体。
【０４４７】
３３ａ．Ａｘｌ発現の下方調節、Ａｘｌ受容体のシグナル伝達阻害、及び／または腫瘍成長の阻害をもたらす、段落３１ａまたは３２ａのいずれか１項による抗体。
【０４４８】
３４ａ．ハイブリドーマＷＲ−１０Ｇ５−Ｅ５から得られる１０Ｇ５抗体。
【０４４９】
３５ａ．段落１ａ〜２６ａのいずれか１項による抗体の、抗体または抗体のＶＨもしくはＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【０４５０】
３６ａ．段落３５ａによる核酸で形質転換された宿主細胞。
【０４５１】
３７ａ．抗体または抗体のＶＨもしくはＶＬドメインの作製方法であって、前記抗体または抗体のＶＨもしくはＶＬドメインの作製条件下で、段落３６ａによる宿主細胞を培養することを含む方法。
【０４５２】
３８ａ．前記抗体または抗体のＶＨもしくはＶＬ可変ドメインを単離及び／または精製することを更に含む、段落３７ａによる方法。
【０４５３】
３９ａ．前記抗体または抗体のＶＨもしくはＶＬ可変ドメインを、少なくとも１種の追加成分を含む組成物に製剤化することを更に含む、段落３７ａまたは段落３８ａによる方法。
【０４５４】
４０ａ．Ａｘｌを結合する抗体を得る方法であって、
１０Ｇ５のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号３）における１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入により、それぞれが１０Ｇ５のＶＨドメインのアミノ酸配列変異体である１つ以上のＶＨドメインを提供し、場合により、このようにして提供される１つ以上のＶＨドメインのアミノ酸配列変異体を１つ以上のＶＬドメインと組み合わせ、１つ以上のＶＨ／ＶＬの組み合わせを提供することと；及び／または
１０Ｇ５のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号４）における１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入により、１０Ｇ５のＶＬドメインのアミノ酸配列変異体であるＶＬドメインを提供し、このようにして提供される１つ以上のＶＬドメインのアミノ酸配列変異体を１つ以上のＶＨドメインと組み合わせ、１つ以上のＶＨ／ＶＬドメインの組み合わせを提供することと；ならびに
ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体またはＶＨ／ＶＬの組み合わせもしくは複数の組み合わせを試験して、Ａｘｌを結合する抗体を同定することと、を含む方法。
【０４５５】
４１ａ．Ａｘｌを結合する抗体を得る方法であって、
ＣＤＲ３が置換されているか、もしくはＣＤＲ３コード領域が欠失している１つ以上のＶＨドメインをコードする出発核酸を提供し、前記出発核酸を、配列番号７であるＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードするドナー核酸と組み合わせることにより、前記ドナー核酸を出発核酸内のＣＤＲ３領域に挿入し、それによってＶＨドメインをコードする核酸産物を提供すること；または
ＣＤＲ３が置換されているか、もしくはＣＤＲ３コード領域が欠失している１つ以上のＶＬドメインをコードする出発核酸を提供し、前記出発核酸を、配列番号１０であるＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードするドナー核酸と組み合わせることにより、前記ドナー核酸を出発核酸内のＣＤＲ３領域に挿入し、それによってＶＬドメインをコードする核酸産物を提供することと；
ＶＨドメインをコードする前記核酸産物の核酸を発現させ、場合により、このようにして提供されるＶＨドメインを１つ以上のＶＬドメインと組み合わせてＶＨ／ＶＬの組み合わせを提供すること、及び／もしくはＶＬドメインをコードする前記核酸産物の核酸を発現させ、このようにして提供されるＶＬドメインを１つ以上のＶＨドメインと組み合わせてＶＨ／ＶＬの組み合わせを提供することと；
Ａｘｌを結合するＶＨドメインもしくはＶＨ／ＶＬの組み合わせを含む抗体を選択することと；
ならびに、Ａｘｌを結合する前記抗体及び／もしくはＡｘｌを結合する抗体をコードする核酸を回収することと、を含む方法。
【０４５６】
４２ａ．Ａｘｌを結合する前記抗体がＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む抗体断片である、段落４１ａまたは段落４１ａによる方法。
【０４５７】
４３ａ．前記抗体断片がｓｃＦｖ抗体分子である、段落４２ａによる方法。
【０４５８】
４４ａ．前記抗体断片がＦａｂ抗体分子である、段落４２ａによる方法。
【０４５９】
４５ａ．全抗体に抗体断片のＶＨドメイン及び／またはＶＬドメインを提供することを更に含む、段落４３ａまたは段落４４ａによる方法。
【０４６０】
４６ａ．Ａｘｌを結合する抗体またはＡｘｌを結合する抗体の抗体ＶＨもしくはＶＬ可変ドメインを、少なくとも１種の追加成分を含む組成物に製剤化することを更に含む、段落３７ａ〜４５ａのいずれか１項による方法。
【０４６１】
４７ａ．Ａｘｌを結合する抗体をＡｘｌまたはＡｘｌの断片に結合することを更に含む、段落３７ａ〜４６ａのいずれか１項による方法。
【０４６２】
４８ａ．段落１ａ〜２９ａのいずれか１項によるＡｘｌを結合する抗体をＡｘｌまたはＡｘｌの断片に結合することを含む方法。
【０４６３】
４９ａ．前記結合がｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じる、段落４７ａまたは段落４８ａによる方法。
【０４６４】
５０ａ．抗体がＡｘｌまたはＡｘｌの断片に結合する量を特定することを含む、段落４７ａ〜４９ａのいずれか１項による方法。
【０４６５】
５１ａ．Ａｘｌの過剰発現を特徴とする疾患または障害を治療する医薬品の製造における、前記抗体の使用を更に含む、段落３７ａ〜４６ａのいずれか１項による方法。
【０４６６】
５２ａ．段落１ａ〜２６ａのいずれか１項よる抗体、またはその免疫複合体を、薬学的に許容される賦形剤とともに含む組成物。
【０４６７】
５３ａ．免疫チェックポイントモジュレーター及び／またはＡｘｌ以外の標的に特異的な抗腫瘍抗体を更に含む、段落５２ａによる組成物。
【０４６８】
５４ａ．前記免疫チェックポイントモジュレーターが、イピリムマブ、トレメリムマブ、ペムブロリズマブ、ミボルマブ、ＡＭＰ−５１４／ＭＥＤＩ０６８０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＢＭＳ−９３６５５９、ウレルマブ、ＰＦ−０５０８２５６６、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ６３８３（ｒＯＸ４０Ｌ）、ＭＯＸＲ０９１６、ＴＲＸ５１８、ＣＤＸ−１１２７、ＣＰ−８７０、８９３またはＢＭＳ−９８６０１６などの抗体である、段落５３ａによる組成物。
【０４６９】
５５ａ．Ａｘｌ以外の標的に特異的な前記抗腫瘍抗体が、リツキシマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、アレムツズマブ、ＩＧＮ１０１、アデカツムマブ、ラベツズマブ、ｈｕＡ３３、ペムツモマブ、オレゴボマブ、ＣＣ４９（ミンレツモマブ）、ｃＧ２５０、Ｊ５９１、ＭＯｖ１８、ＭＯＲＡｂ−００３（ファルレツズマブ）、３Ｆ８、ｃｈ１４．１８、ＫＷ−２８７１、ｈｕ３Ｓ１９３、ＩｇＮ３１１、ベバシズマブ、ＩＭ−２Ｃ６、ＣＤＰ７９１、エタラシズマブ、ボロシキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ８０６、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ＭＭ−１２１、ＡＭＧ  １０２、ＭＥＴＭＡＢ、ＳＣＨ  ９００１０５、ＡＶＥ１６４２、ＩＭＣ−Ａ１２、ＭＫ−０６４６、Ｒ１５０７、ＣＰ  ７５１８７１、ＫＢ００４、ＩＩＩＡ４、マパツムマブ（ＨＧＳ−ＥＴＲ１）、ＨＧＳ−ＥＴＲ２、ＣＳ−１００８、デノスマブ、シブロツズマブ、Ｆ１９、８１Ｃ６からなる群から選択される、段落５３ａによる組成物。
【０４７０】
５６ａ．治療方法に使用される、段落１ａ〜２９ａのいずれか１項による抗体、または段落５２ａ〜５５ａのいずれか１項による組成物。
【０４７１】
５７ａ．増殖性疾患の治療方法に使用される、段落５６ａによる抗体または組成物。
【０４７２】
５８ａ．前記増殖性疾患が癌である、段落５７ａによる抗体または組成物。
【０４７３】
５９ａ．前記癌が転移癌である、段落５８ａによる抗体または組成物。
【０４７４】
６０ａ．Ａｘｌの過剰発現を特徴とする疾患または障害を治療するための医薬品の製造における、段落１ａ〜２９ａのいずれか１項による抗体、または段落５２ａ〜５５ａのいずれか１項による組成物の使用。
【０４７５】
６１ａ．Ａｘｌの過剰発現を特徴とする疾患または障害の治療方法であって、段落１ａ〜２９ａのいずれか１項による抗体、または段落５２ａ〜５５ａのいずれか１項による組成物を、疾患もしくは障害を有する患者、または疾患もしくは障害を発現するリスクのある患者に投与することを含む方法。
【０４７６】
６２ａ．段落５６ａ〜５９ａのいずれか１項による抗体、または請求項６１ａの方法であって、段落１ａ〜２９ａのいずれか１項による抗体、または段落５２ａ〜５５ａのいずれか１項による組成物を、免疫チェックポイントモジュレーター及び／またはＡｘｌ以外の標的に特異的な抗腫瘍抗体と組み合わせて投与することを含む治療方法。
【０４７７】
６３ａ．前記抗体が転移癌細胞を標的とする医薬組成物の送達を誘導する、段落６１ａによる方法。
【０４７８】
６４ａ．Ａｘｌの過剰発現を特徴とする疾患または障害を検出するための診断薬の製造における、段落１ａ〜２９ａのいずれか１項による抗体、及び前記抗体と転移癌細胞の結合を特定できる１種以上の試薬の使用。
【０４７９】
６５ａ．Ａｘｌの過剰発現を特徴とする疾患または障害の診断方法であって、段落１〜２９ａのいずれか１項による抗体、または段落５２ａ〜５５ａのいずれか１項による組成物、及び前記抗体と転移癌細胞との結合を特定できる１種以上の試薬を、疾患もしくは障害を有する患者、または疾患もしくは障害を発現するリスクのある患者に投与することを含む方法。
【０４８０】
６６ａ．段落１ａ〜２９ａのいずれか１項による抗体、及び前記メンバーと転移癌細胞との結合を特定できる１種以上の試薬を含む診断キット。
【０４８１】
６７ａ．段落１ａ〜２９ａのいずれか１項による抗体、または段落５２ａ〜５５ａのいずれか１項による組成物を含むキット。
【０４８２】
６８ａ．薬学的に許容される賦形剤とともに、有効量の段落１ａ〜２９ａによる抗体を活性成分として含む医薬組成物。
【実施例】
【０４８３】
実施例１：マウス抗Ａｘｌモノクローナル抗体の生成
Ｃ末端Ｍｙｃエピトープと融合させた全長ヒトＡｘｌをコードするプラスミドを用いた、免疫応答性ＮＭＲＩマウス（チャールズリバー）のＤＮＡ免疫法により、ヒトＡｘｌ受容体に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を生成した。
【０４８４】
血中にｒｈＡｘｌ特異的抗体の存在を示すマウス由来の脾臓細胞を、標準的プロトコルによるマウス骨髄腫細胞との融合に使用した。各細胞を、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地を入れたプレート（ウェル当たり１０５細胞）中で培養し、ハイブリドーマを選抜した。１２日間の選抜後、生成された１４のハイブリドーマの上清を採取して、酵素結合による免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及びフローサイトメトリーにてＡｘｌ結合を検出した。限界希釈法による２巡目のサブクローニング後に最も高い抗原結合活性を示している、３つの陽性クローンを拡大培養し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの大規模な抗体産生を行った。プロテインＧアフィニティクロマトグラフィーによって、ＭＡｂを細胞培養上清から精製した。
【０４８５】
フローサイトメトリーでＡｘｌ＋細胞に特異的な結合を示している抗体クローン１０Ｃ９及び１０Ｇ５を選抜して更に性質決定した。
【０４８６】
フローサイトメトリーのため、培養液中の付着細胞をＰＢＳで洗浄し、１分間のトリプシン（０．２５％）処理により分離し、培養皿を叩いて完全に剥離させた。組織培養用フラスコに完全培地を添加してトリプシンをクエンチした後、細胞をＰＢＳで洗浄した。洗浄工程中に、５分間２００ｇの遠心分離により細胞を収集した。０．０２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで、抗体の総濃度を希釈した。
【０４８７】
１０５個の細胞を含む２００μＬの細胞懸濁液を使用して、室温で２０分間、細胞染色を実施した。ＰＢＳ／０．０２％ＢＳＡによる２段階の洗浄後、細胞を２００μＬに再懸濁して、濃度２μｇ／ｍＬのＡＰＣ複合体化ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号７１５−１３６−１５０）とともに室温で２０分間インキュベートした。染色した細胞をＰＢＳ／０．０２％ＢＳＡで２回洗浄し、ＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ細胞分析器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析するまで、氷で保存した。
【０４８８】
実施例２：マウスモノクローナル抗体１０Ｃ９及び１０Ｇ５はヒトＴＡＭ受容体ファミリーの他のメンバーと交差反応しない
結合実験はすべて、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して２５℃で実施した。ヒトＴＡＭ受容体ファミリーのメンバーである、Ａｘｌ（ｒｈＡｘｌ−Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５４−ＡＬ）、Ｍｅｒ（ｒｈＭｅｒ−Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８９１−ＭＲ）及びＴｙｒｏ３（ｒｈＴｙｒｏ３／Ｄｔｋ−Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８５９−ＤＫ）の細胞外ドメインに対応する可溶性組み換え抗原を、ＣＭ５センサーチップの表面にアミンカップリングを利用して、それぞれ表面密度３９３．０、３０３．６及び３６４．０のレゾナンスユニット（ＲＵ）で固定化した。Ｂｉａｃｏｒｅの稼働は、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓウィザードを使用した自動モードで実施した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中に濃度１０μｇ／ｍＬのＭＡｂ  １０Ｃ９またはＭＡｂ  １０Ｇ５を含有しているサンプルを、固定化抗原を有する表面全体に流速３０μＬ／分で３分間注入（会合）した後、５分間、解離させた。
【０４８９】
図１に示した結果は、マウスモノクローナル抗体１０Ｃ９及び１０Ｇ５がヒトＡｘｌに対して特異的な結合性を示し、組み換えヒトＭｅｒ及びＴｙｒｏ３抗原には結合しなかったことを示している。
【０４９０】
実施例３：マウスモノクローナル抗体１０Ｃ９及び１０Ｇ５はマウスＡｘｌと交差反応しない
結合実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して２５℃で実施した。ヒトＡｘｌ（ｒｈＡｘｌ−Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５４−ＡＬ）、マウスＡｘｌ（ｒｍＡｘｌ−Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８５４−ＡＸ）及びヒトＴｙｒｏ３（ｒｈＴｙｒｏ３／Ｄｔｋ−Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８５９−ＤＫ）に対応する可溶性組み換え抗原を、ＣＭ５センサーチップの表面にアミンカップリングを利用して、それぞれ表面密度１，３０８．０、２，１１５．９及び１，４２９．０ＲＵで固定化した。Ｂｉａｃｏｒｅの稼働は、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓウィザードを使用した自動モードで実施した。
【０４９１】
ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中に濃度１０μｇ／ｍＬでＭＡｂ  １０Ｃ９、ＭＡｂ  １０Ｇ５、または組み換えマウス（ｒｍ）Ａｘｌ−リガンドＧａｓ６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号９８６−ＧＳ／ＣＦ）を含有しているサンプルを、固定化抗原を有する表面全体に流速３０μＬ／分で３分間注入（会合）した後、５分間、解離させた。
【０４９２】
図２に示した結果は、ＭＡｂ  １０Ｃ９及び１０Ｇ５がヒトＡｘｌと特異的に相互作用し、組み換えマウスＡｘｌ及びヒトＭｅｒ抗原には結合しなかったことを示している（それぞれ図２の上段及び中段パネル）。対照的に、対照として使用したマウスＧａｓ６は、ヒト及びマウスＡｘｌの両方と強い結合性を示し、ヒトＴｙｒｏ３とはそれより幾分弱い結合性を示した（図２、下段パネル）。
【０４９３】
実施例４：マウスモノクローナル抗体１０Ｃ９及び１０Ｇ５は非ヒト霊長類由来のＡｘｌ受容体と特異的に結合する
カニクイザル由来のＡｘｌ受容体の配列（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ；配列番号４３）をＷＯ２００９０６２６９０Ａ１から取得した。配列に基づいて、ｃｙｎｏ−Ａｘｌの組み換え細胞外ドメインをＣＨＯ細胞での一時的発現によってヒトＦｃとの融合タンパク質として生成した。組み換えｃｙｎｏ−Ａｘｌ−Ｆｃを、プロテインＡ−セファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して均一に精製した。結合実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して２５℃で実施した。ヒトＡｘｌ（ｒｈＡｘｌ−Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５４−ＡＬ）及びｃｙｎｏ−Ａｘｌに対応する可溶性組み換え抗原を、ＣＭ５センサーチップの表面にアミンカップリングを利用して、それぞれ表面密度７７５及び８８０ＲＵで固定化した。Ｂｉａｃｏｒｅの稼働は、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓウィザードを使用した自動モードで実施した。
【０４９４】
ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中に濃度１０μｇ／ｍＬでＭＡｂ  １０Ｃ９、ＭＡｂ  １０Ｇ５、またはヒトＡｘｌ特異的ＭＡｂ  ５Ｆ１１（対照）を含有しているサンプルを、固定化抗原を有する表面全体に流速３０μＬ／分で３分間注入（会合）した後、５分間、解離させた。
【０４９５】
図３に示した結果は、ＭＡｂ  １０Ｃ９及び１０Ｇ５がヒト及びカニクイザル由来両方のＡｘｌ抗原と強力かつ特異的に相互作用することを示している。対照的に、対照抗体５Ｆ１１は、ヒトＡｘｌとは強力な結合性を示したが、カニクイザル由来のＡｘｌとの交差反応性は示さなかった。
【０４９６】
実施例５：マウスモノクローナル抗体１０Ｃ９及び１０Ｇ５の親和性測定
抗Ａｘｌ抗体１０Ｃ９及び１０Ｇ５の親和性測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して表面プラズモン共鳴測定により２５℃で実施した。固体の抗原コーティング面として、密度１９０ＲＵでｒｈＡｘｌ−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５４−ＡＬ）を固定化したセンサーチップＣＭ５を使用した。
【０４９７】
速度論的測定のため、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００１−８８）中の濃度の異なる抗Ａｘｌ抗体（０．３〜６６６．７ｎＭ）を流速３０μＬ／分、注入時間３分間で注入した後、５分間、解離させた（緩衝液のみ）。各サイクル後、再生溶液（１０ｍＭのＨＣｌ、１ＭのＮａＣｌ）を３０秒間、流速５０μＬ／分で注入することにより表面を再生した。
【０４９８】
物質移動制御実験は、使用したＭＡｂ  １０Ｃ９及び１０Ｇ５の両方に有意な物質移動限界が見られないことを示した。付加的な結合反応制御実験では、１濃度のアナライト（ＭＡｂ  １０Ｃ９が７９０ｎＭ、１０Ｇ５が１６０ｎＭ）を１分、３分または２０分間注入した後、解離相が実質的に同一であったため、両方の抗体には結合反応は見られなかった。
【０４９９】
速度論的会合速度（結合速度、ｋｏｎ）及び速度論的解離速度（解離速度、ｋｏｆｆ）は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア及び１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを使用して算出した。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比で算出した。形成された抗体−抗原複合体の半減期（ｔ１／２）はｌｎ２／ｋｏｆｆ比で算出した。
【０５００】
図４に示すように、マウスＭＡｂ  １０Ｃ９及び１０Ｇ５は、それぞれＫＤ値０．１８ｎＭ及び０．５３ｎＭの、ナノモル以下範囲の高親和性を示した。
【０５０１】
実施例６：マウスモノクローナル抗体１０Ｃ９及び１０Ｇ５はＧＡＳ６のＡＸＬへの結合を阻止する
競合結合試験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＢｉｎｄｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓウィザードを使用し、２つのサンプルを数サイクル注入して実施した。第１のサンプルとして、飽和濃度のＭＡｂ  １０Ｃ９（７９０ｎＭ、すなわち１２０μｇ／ｍＬ）または１０Ｇ５（１６０ｎＭ、すなわち２４μｇ／ｍＬ）を、ｒｈＡｘｌ−Ｆｃでコーティング（アミンカップリング法を使用）されたＣＭ５センサーチップの表面全体に、流速３０μＬ／分で、３分間注入し、続いて２．５分間、安定化させた（ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液のみ）後、第２のサンプルを注入した。第２のサンプルには、組み換えヒト（ｒｈ）Ｇａｓ６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８８５−ＧＳ）、組み換えマウス（ｒｍ）Ｇａｓ６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号９８６−ＧＳ／ＣＦ）ならびに抗Ａｘｌ抗体のパネル、例えばＭＡＢ１５４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＭＡＢ１５４）、１０Ｃ９及び１０Ｇ５を使用した。濃度はすべて２５μｇ／ｍＬである。第２のサンプルを３分間注入し、続いて２．５分間、安定化（緩衝液のみ）させ、更に流速５０μＬ／分で再生溶液（１０ｍＭのＨＣｌ、１ＭのＮａＣｌ）を３０秒間注入することにより表面を再生した。
【０５０２】
図５に示した結果は、ＭＡｂ  １０Ｃ９及び１０Ｇ５はいずれも、Ａｘｌの結合を、市販の対照抗体ＭＡＢ１５４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と競合しないことを示した。他方で、抗体１０Ｃ９及び１０Ｇ５は互いの結合を阻害し、加えて、ヒト及びマウス起源の両方で、そのリガンドＧａｓ６によるＡｘｌの結合を阻害した。
【０５０３】
実施例７：３次元（３Ｄ）器官型モデルにおいて、マウスモノクローナル抗体１０Ｃ９及び１０Ｇ５は高悪性度乳癌細胞の成長を阻害する
高悪性度トリプルネガティブヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−２６（商標））を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、グルタミンならびにペニシリン及びストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物Ｆ−１２ハム培地中で、推奨条件に従って培養した。培養した細胞を、細胞表面に抗体の適切な結合が確認されるまで、懸濁液中で少なくとも１時間、３７℃で前処理した後、細胞外マトリックスに定置した。細胞培養液は毎日観察し、１日おきに交換処理を行った。抗体は濃度５０〜１００μｇ／ｍＬで使用した。位相差及びホフマン光学系両方を利用したＮＩＫＯＮ光学顕微鏡で、カバーガラス３Ｄイメージング分析（３５ｍｍディッシュ）を実施した。既に３日目にして、ＭＡｂ  １０Ｃ９またはＭＡｂ１０Ｇ５で処理された細胞と、対照の無関係なＩｇＧで処理された細胞との間に成長差が見られた。６日目で、抗体１０Ｃ９または１０Ｇ５で処理された細胞は、対照で処理された細胞と比較して、細胞外マトリックスでの成長と腫瘤の発現を有意に阻害したことが明らかになった（図６）。核染色により、ＭＡｂ  １０Ｇ５で処理された細胞は成長を阻害されたが、まだ生存していることが明らかとなった。類似の効果は抗体１０Ｃ９でも観察された。この実験は、抗Ａｘｌ抗体１０Ｃ９及び１０Ｇ５のいずれもが、器官型腫瘤の発現を阻害する見込みがあることを実証した。
【０５０４】
実施例８：抗体１０Ｃ９及び１０Ｇ５は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの３Ｄ腫瘍クローンの形態変化を誘発する
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を細胞外マトリックス上で増殖させ、高悪性度の星形形態を形成させる。次に、星形の腫瘤を、実施例７に記載されているように、対照ＩｇＧならびに抗体１０Ｃ９及び１０Ｇ５で処理した。抗体１０Ｃ９及び１０Ｇ５はいずれも、細胞死とＤＮＡ断片化に伴う星形パターンの分解を引き起こした（図７）。これらの結果は、特異的モノクローナル抗体１０Ｃ９及び１０Ｇ５を使用したＡｘｌの阻害が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの３Ｄモデルで強い抗腫瘍効果を有することを実証した。
【０５０５】
実施例９：抗体１０Ｃ９及び１０Ｇ５はＡｘｌ受容体の内在化を誘発する
異なる抗体で処理されたＭＢＡ−ＭＤ−２３１細胞でのＡｘｌ受容体タンパク質の発現を、ウェスタンブロット解析により検討した。細胞を１ウェル当たり５ｘ１０５細胞の密度で６ウェルプレートに播種し、一晩培養した後、処理を開始した。細胞をアイソタイプ対照（マウスＩｇＧ２ｂ）、濃度１００μｇ／ｍＬの抗Ａｘｌ抗体（１０Ｃ９、１０Ｇ５及びＭＡｂ＃３）、または濃度０．５μＭのマルチキナーゼ阻害剤フォレチニブ（Ｍｅｔ、Ｒｏｎ、Ａｘｌ、Ｔｉｅ−２及びＶＥＧＦＲ２を標的とする）の存在下で２０時間処理し、続いて１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離して採取し、滅菌ＰＢＳで洗浄した。遠心分離によって細胞を採取して、ＮＰ４０溶解緩衝液で再懸濁した後、３０分間、氷上でインキュベートした。細胞可溶化物を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、５分）によって清澄化し、ＢＣＡタンパク質アッセイを利用してタンパク質濃度を測定した。３５μｇの総タンパク質を含んでいる細胞可溶化物サンプルを、還元剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下で変性させ、ＮｕＰＡＧＥ１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ゲル、１．０ｍｍｘ１２ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の各ウェルに充填した。Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳランニング緩衝液を使用して、推奨条件（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）下で電気泳動を実施し、２０％メタノールを用いた転写緩衝液を使用して、ＸＣｅｌｌ  ＩＩ（商標）Ｂｌｏｔ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）用マニュアルの２種類のゲルに関する記載のようにタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。５％のスキムミルクを加えたＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）の１０ｍＬブロッキング緩衝液中で、室温にて１時間、膜をインキュベートし、続いて抗Ａｘｌ  ＭＡｂ１５４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の１：１０００希釈液を含有する５ｍＬのインキュベーション緩衝液（３％のスキムミルクを加えたＴＢＳＴ）中で、４℃で一晩インキュベートした。膜を１０ｍＬのＴＢＳＴで５分ずつ３回洗浄し、続いて５ｍＬのインキュベーション緩衝液中のヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ複合体二次抗体（１：２０００）とともに、室温で静かに転がしながら１時間インキュベートした。その後、膜を１０ｍＬのＴＢＳＴで５分間に３回、更に１０ｍＬのＴＢＳ緩衝液で２回洗浄した。膜を１ｍＬのＥＣＬ基質とともに室温で１分間インキュベートした。過剰な基質溶液を吸引し、ブロットをＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＸＲＳ＋撮像装置（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）及びＩｍａｇｅ  ｌａｂソフトウェアを使用して可視化した。負荷対照として、マウス抗アクチン抗体（１：１０，０００；Ｓｉｇｍａ）を用いた検出を同条件下で行った。
【０５０６】
図８に示した結果は、無関係なＩｇＧまたはＭＡｂ＃３のいずれかで処理された細胞と比較して、ＭＡｂ  １０Ｃ９及び１０Ｇ５で処理された細胞中のＡｘｌタンパク質が有意に低減することを示した。この結果は、ＭＡｂ  １０Ｃ９及び１０Ｇ５がＡｘｌ受容体の内在化及び細胞内分解を誘発することを示している。
【０５０７】
実施例１０：抗体１０Ｃ９及び１０Ｇ５は、リガンド誘導性のＡｘｌ下流シグナル伝達を阻害する
本実験は、ヒト子宮頸癌由来の細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−２（商標））を使用して実施した。Ｔ１７５フラスコにて、１０％のＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン及びＬグルタミンを補充したＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ）中で集密度８０％まで細胞を増殖させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）で処理して剥離し、続いて遠心分離して、新鮮な培地（ＭＥＭ／０．５％ＦＢＳ）で再懸濁した。１０％のＦＢＳを補充したＭＥＭ培地を入れたペトリ皿に細胞を播種した（１皿当たり３ｘ１０６細胞）。３７℃で３時間培養した後、細胞をＰＢＳで洗浄し、飢餓培地（ＭＥＭ／０．５％ＦＢＳ）中で一晩保存した。濃度１μｇ／ｍｌの抗Ａｘｌ抗体１０Ｃ９または１０Ｇ５とともに、細胞を１時間プレインキュベートし、続いて濃度１０μｇ／ｍＬの、Ａｘｌリガンドである組み換えマウスＧａｓ６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で２０分間刺激した。細胞可溶化物を実施例９に記載されているように調製し、抗ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、続いてヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用してウェスタンブロット解析を実施した。抗ホスホ−Ａｋｔは、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２及びＡＫＴ３を区別していないため、ブロットには「ホスホ−Ａｋｔ」の総レベルを示す。抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）による検出を、負荷対照として使用した。
【０５０８】
図９に示した結果は、Ｓｅｒ４７３上のＡｋｔの下流リン酸化を読み取り値として使用した場合に、Ａｘｌ特異的リガンドＧａｓ６が、Ｈｅｌａ細胞で強力なＡｘｌシグナル伝達を誘発することを示した。このシグナル伝達を抗体１０Ｃ９の存在下で有意に低減できた。抗体１０Ｇ５においても類似した結果が得られた。
【０５０９】
実施例１１：マウスモノクローナル抗体１０Ｃ９及び１０Ｇ５のシーケンシング
ハイブリドーマ細胞を標準条件下で増殖させた。５ｘ１０６個のハイブリドーマ細胞を使用し、標準プロトコルに従ってｍＲＮＡの単離及びｃＤＮＡ合成を行った。重鎖及び軽鎖可変領域（それぞれＶＨ及びＶＬ）をコードする遺伝子のＰＣＲ増幅のため、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ（Ｐｒｏｇｅｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号Ｆ２０１０）を使用した。ハイブリドーマ１０Ｃ９では、異なるプライマーの組み合わせを使用したＰＣＲ増幅により、ＶＨ遺伝子に対する５種類のプライマーの組み合わせを使用したＰＣＲから９配列を、ＶＬ遺伝子に対する２種類のプライマーの組み合わせを使用したＰＣＲから５配列を得た。その後の作業のため、ＩＭＧＴデータベースとのヌクレオチドアラインメントによって決定される、対応する生殖細胞系配列との最大相同性を基準としてクローンＶＨ１（Ａ７−１）及びＶκ２（Ｅ２−２）の配列を選抜した。
【０５１０】
ハイブリドーマ１０Ｇ５では、異なるプライマーの組合せを使用したＰＣＲ増幅により、ＶＨ遺伝子に対する６種類のプライマーの組み合わせを使用したＰＣＲから１２配列を、ＶＬ遺伝子に対する２種類のプライマーの組み合わせを使用したＰＣＲから５配列を得た。その後の作業のため、ＩＭＧＴデータベースとのヌクレオチドアラインメントによって決定される、対応する生殖細胞系配列との最大相同性を基準としてクローンＶＨ１（Ｂ６−４）及びＶκ１（Ｆ１−３）の配列を選抜した。
【０５１１】
抗体１０Ｃ９及び１０Ｇ５のＶＨ及びＶＬドメインの推定アミノ酸配列を図１０に示す。配列解析から、重鎖のＣＤＲ１に見込まれるＮ−グリコシル化部位の存在が明らかになった（ＣＤＲ−Ｈ１；図１０で「ＮＦＴ」のグリコシル化部位を太字で示す）。
【０５１２】
ＶＨドメインの１位のグルタミン（Ｑ）がグルタミン酸（Ｅ）と置換された場合の１０Ｇ５のＶＨ変異体の配列も図１０に含まれている。この変異体を「１０Ｇ５［Ｑ１Ｅ］」と称する。
【０５１３】
実施例１２：キメラモノクローナル抗体１０Ｃ９及び１０Ｇ５の生成及び試験
マウスハイブリドーマ１０Ｃ９及び１０Ｇ５から取得したＶＨ及びＶＬ配列を使用して、哺乳動物細胞（ＧｅｎｅＡｒｔ）の発現にコドンが最適化された合成遺伝子を生成した。これらのマウスＶＨ及びＶＬ遺伝子を、それぞれヒトＩｇＧ１重鎖及び軽鎖（Ｃ−カッパ）の定常ドメインをコードする遺伝子要素とともに、哺乳動物細胞の抗体産生に適した発現ベクターにインフレームでライゲーションした。キメラ（マウス可変／ヒト定常）ＩｇＧ１抗体の産生をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞での一時的発現によって達成した後、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを使用して精製した。
【０５１４】
フローサイトメトリーで、精製されたキメラ抗体（純度９５％超）のＡｘｌ陽性乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１との結合を分析した。比較のため、親マウスのＭＡｂ  １０Ｃ９及び１０Ｇ５を使用した。フローサイトメトリーに備え、培養液中の付着細胞をＰＢＳで洗浄し、１分間のトリプシン（０．２５％）処理により分離し、培養皿を叩いて完全に剥離させた。組織培養用フラスコに完全培地を添加してトリプシンをクエンチした後、細胞をＰＢＳで洗浄した。洗浄工程中に、５分間２００ｇの遠心分離により細胞を収集した。０．０２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで、抗体の総濃度を希釈した。１０５個の細胞を含む２００μＬの細胞懸濁液を使用して、室温で２０分間、細胞染色を実施した。ＡＰＣ複合体ロバ抗ヒトまたは抗マウスそれぞれのＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、細胞に結合した抗体を検出した。ＰＢＳ／０．０２％ＢＳＡによる２段階の洗浄後、細胞を２００μＬに再懸濁して、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析するまで氷で保存した。図１１に示した結果から、フローサイトメトリーにおいてキメラ抗体はＡｘｌ陽性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞との強い結合を示した。
【０５１５】
加えて、キメラ抗体ｃ１０Ｃ９及びｃ１０Ｇ５のＡｘｌ結合特性を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び表面密度１，３０８．０ＲＵでヒトＡｘｌ（ｒｈＡｘｌ−Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５４−ＡＬ）をコーティングしたセンサーチップＣＭ５を使用して試験した。Ｂｉａｃｏｒｅの稼働は、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓウィザードを使用した自動モードで実施した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中に濃度１０μｇ／ｍＬのキメラ抗体ｃ１０Ｃ９及びｃ１０Ｇ５またはそれに相当するマウス抗体を含有しているサンプルを、固定化抗原を有する表面全体に流速３０μＬ／分で３分間注入（会合）した後、５分間、解離させた。
【０５１６】
図１２に示す結果は、キメラ抗体ｃ１０Ｃ９及びｃ１０Ｇ５はいずれも、ハイブリドーマ１０Ｃ９及び１０Ｇ５に由来するマウス抗体の相当する結合プロファイルと極めて類似したプロファイルで、固定化されたＡｘｌと結合することを示している。
【０５１７】
実施例１３：キメラ抗体１０Ｃ９及び１０Ｇ５は親マウス抗体と同じ親和性でＡｘｌを結合する
キメラ抗Ａｘｌ抗体ｃ１０Ｃ９及びｃ１０Ｇ５の親和性測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して表面プラズモン共鳴測定により２５℃で実施した。固体の抗原コーティング面として、密度１９０ＲＵでｒｈＡｘｌ−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５４−ＡＬ）を固定化したセンサーチップＣＭ５を使用した。
【０５１８】
速度論的測定のため、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００１−８８）中の濃度の異なる抗Ａｘｌ抗体（０．３〜３３３．３ｎＭ）を流速３０μＬ／分、注入時間３分間で注入した後、５分間、解離させた（緩衝液のみ）。各サイクル後、再生溶液（１０ｍＭのＨＣｌ、１ＭのＮａＣｌ）を３０秒間、流速５０μＬ／分で注入することにより表面を再生した。
【０５１９】
物質移動制御実験は、キメラＭＡｂ  ｃ１０Ｃ９及びｃ１０Ｇ５両方に有意な物質移動限界が見られないことを示した。
【０５２０】
速度論的会合速度（結合速度、ｋｏｎ）及び速度論的解離速度（解離速度、ｋｏｆｆ）は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア及び１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを使用して算出した。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比で算出した。形成された抗体−抗原複合体の半減期（ｔ１／２）はｌｎ２／ｋｏｆｆ比で算出した。
【０５２１】
図１３に示すように、キメラＭＡｂ  ｃ１０Ｃ９及びｃ１０Ｇ５はいずれも、親マウス抗体の親和性を若干上回る（実施例５を参照）、ＫＤ値０．１０ｎＭのナノモル以下範囲の高親和性を示した。
【０５２２】
実施例１４：キメラ抗体１０Ｇ５は、ヒト非小細胞肺癌のマウスモデルにおいて腫瘍成長を阻害する
抗Ａｘｌキメラ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性を評価するために、本発明者らは、ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のマウス異種移植モデルを使用した。ヒトＮＳＣＬＣ  Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−１８５）Ａ５４９細胞を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、０．４５％のＤ−（＋）−グルコース、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補充したＤＭＥＭ培地中で、単層培養としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させた。ヌードマウスの側腹部に、無血清培地／マトリゲル（１：１）で再懸濁した５ｘ１０６のＡ５４９細胞を皮下（ｓ．ｃ．）注入した。腫瘍サイズが１００ｍｍ３に達したら（図１４の０日目）、動物をランダム化して、４週間、週２回の腹腔内（ｉ．ｐ．）注入により、２０ｍｇ／ｋｇのビヒクル（滅菌ＰＢＳ）または抗Ａｘｌキメラ抗体１０Ｇ５のいずれかで処置した。
【０５２３】
図１４に示すように、キメラ抗体１０Ｇ５は、対照と比較して、Ａ５４９腫瘍の成長を有意に減衰させた（Ｐ＜０．０１、双方向ＡＮＯＶＡにより決定）。４週間の処置後、約４０％の阻害が観察された。
【０５２４】
実施例１５：キメラ抗体１０Ｇ５は、ヒト急性骨髄性白血病のマウス異種移植モデルにおいて腫瘍成長を阻害する
抗Ａｘｌキメラ抗体の血液癌モデルでの抗腫瘍活性を評価するために、本発明者らは、ヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）のマウス異種移植モデルを使用した。ヒトＡＭＬ  Ｍｖ４−１１細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−９５９１）細胞を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＩＭＤＭ培地の懸濁液中で増殖させた。ヌードマウスの側腹部に、無血清ＩＭＤＭ培地とマトリゲル（１：１）との混合物で再懸濁した５ｘ１０６のＭｖ４−１１細胞をｓ．ｃ．注入した。腫瘍サイズが２００ｍｍ３に達したら（図１５の０日目）、動物をランダム化して、４週間、週２回のｉ．ｐ．注入により、３０ｍｇ／ｋｇのビヒクル（滅菌ＰＢＳ）または抗Ａｘｌキメラ抗体１０Ｇ５のいずれかで処置した。
【０５２５】
図１５に示すように、キメラ抗体１０Ｇ５は、対照と比較して、Ｍｖ４−１１腫瘍の成長を極めて有意に減衰させた（Ｐ＜０．０００１、双方向ＡＮＯＶＡにより決定）。３週間の処置後、約７５％の阻害が観察された。
【０５２６】
実施例１６：非フコシル化グリコシル化操作したＣ１０Ｇ５（ＧＬＹＭＡＸ）は、ヒト非小細胞肺癌のマウスモデルにおいてＣ１０Ｇ５と比較して増強された抗腫瘍効果を示す
抗Ａｘｌ裸抗体は、標定受容体に特異的なシグナル伝達経路を阻害すること、ならびに／またはそのエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び／もしくは抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）による腫瘍細胞の殺傷のいずれによっても腫瘍成長を防止することができる。コアがフコシル化されていない抗体は、抗体依存性の細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の有意な増強及び抗腫瘍活性作用の増加を示す。
【０５２７】
キメラ抗体ｃ１０Ｇ５の２つの変異体（ｗｔ及び非フコシル化）の抗腫瘍効果を比較するために、本発明者らは、ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のマウス異種移植モデルを使用した。ヒトＮＳＣＬＣ  Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−１８５）Ａ５４９細胞を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、０．４５％のＤ−（＋）−グルコース、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補充したＤＭＥＭ培地中で、単層培養としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させた。ＳＣＩＤマウスの側腹部に、無血清培地／マトリゲル（１：１）で再懸濁した５ｘ１０６のＡ５４９細胞を皮下（ｓ．ｃ．）注入した。腫瘍サイズが１３０ｍｍ３に達したら（図１５の０日目）、動物をランダム化して、４週間、週２回の腹腔内（ｉ．ｐ．）注入により、３０ｍｇ／ｋｇの抗Ａｘｌ  ｃ１０Ｇ５またはＧｌｙｍａｘ−ｃ１０Ｇ５のいずれかで処置した。
【０５２８】
図１６に示すように、抗体Ｇｌｙｍａｘ−ｃ１０Ｇ５は、ｃ１０Ｇ５と比較して、Ａ５４９腫瘍の成長を有意に減衰させた（Ｐ＜０．０００１、双方向ＡＮＯＶＡにより決定）。キメラ１０Ｇ５のｗｔ型と非フコシル化型の活性に有意差が見られたことは、腫瘍成長の阻害における抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の重要性を示す。
【０５２９】
実施例１７：フレームワーク変異体１（ＦＶ１）は、ヒト非小細胞肺癌のマウスモデルにおいて腫瘍成長を阻害する
ＦＶ１は、ＣＤＲを有し、１０Ｇ５との結合特異性を有するが、Ｖドメインのフレームワーク領域に複数の置換を有する抗体である。抗Ａｘｌ  ＦＶ１のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性を評価するために、本発明者らは、ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のマウス異種移植モデルを使用した。ヒトＮＳＣＬＣ  Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−１８５）Ａ５４９細胞を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、０．４５％のＤ−（＋）−グルコース、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補充したＤＭＥＭ培地中で、単層培養としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させた。ＳＣＩＤマウスの側腹部に、無血清培地／マトリゲル（１：１）で再懸濁した５ｘ１０６のＡ５４９細胞を皮下（ｓ．ｃ．）注入した。腫瘍サイズが１００ｍｍ３に達したら（図１６の１８日目）、動物をランダム化して、２週間、週２回の腹腔内（ｉ．ｐ．）注入により、３０ｍｇ／ｋｇのビヒクル（ＳＹＮＡＧＩＳ）または抗Ａｘｌ  ＦＶ１のいずれかで処置した。図１７に示すように、抗体ＦＶ１は、対照と比較して、Ａ５４９腫瘍の成長を有意に減衰させた（Ｐ＜０．０５１、双方向ＡＮＯＶＡにより決定）。２週間の処置後、約２５％の阻害が観察された。
【０５３０】
実施例１８：グリコシル化操作されたＦＶ２（ＦＶ２−ＧＬＹＭＡＸＸ）は、ヒト非小細胞肺癌のマウスモデルの腫瘍成長に対する抗ＥＧＦＲ治療薬の効果を増強する
ＦＶ２−ＧＬＹＭＡＸＸは、ＣＤＲを有し、１０Ｇ５との結合特異性を有するが、Ｖドメインのフレームワーク領域に複数の置換を有する抗体である。抗ＦＶ２−ＧＬＹＭＡＸＸのｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性を評価するために、本発明者らは、ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のマウス異種移植モデルを使用した。ヒトＮＳＣＬＣ  Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−１８５）Ａ５４９細胞を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、０．４５％のＤ−（＋）−グルコース、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補充したＤＭＥＭ培地中で、単層培養としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させた。ヌードマウスの側腹部に、無血清培地／マトリゲル（１：１）で再懸濁した５ｘ１０６のＡ５４９細胞を皮下（ｓ．ｃ．）注入した。腫瘍サイズが１００ｍｍ３に達したら（図１８の０日目）、動物をランダム化して、ビヒクル（ＳＹＮＡＧＩＳ）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（２０ｍｇ／ｋｇ）またはＦＶ２−ＧＬＹＭＡＸＸ（１５または３０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを単独でもしくは組み合わせて処置した。抗体は、３週間、週２回の腹腔内（ｉ．ｐ．）注入により投与した。
【０５３１】
図１８に示すように、ＦＶ２−ＧＬＹＭＡＸＸは、抗ＥＧＦＲ治療抗体セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）の抗腫瘍効果と酷似した適度な抗腫瘍活性を示した。しかしながら、いずれの抗体も単剤として使用した場合、アイソタイプ対照抗体（Ｓｙｎａｇｉｓ）で処置したマウスコホートと比較して統計学的に有意な効果は観察されなかった。両方の抗体を併用すると、アイソタイプ対照で処置した動物と比較して、有意な腫瘍成長の遅延が得られた（Ｐ＜０．０００１；双方向ＡＮＯＶＡにより決定）。ＦＶ２−ＧＬＹＭＡＸＸ抗体またはＥｒｂｉｔｕｘのいずれか単独による処置群と比較した場合にも、効果が有意であった（Ｐ＜０．０５；双方向ＡＮＯＶＡにより決定）。
【０５３２】
配列
配列番号１［１０Ｃ９  ＶＨドメイン（ｎｔ）］
ＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＡＣＴＴＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＧＣＴＡＣＴＡＴＡＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＴＧＧＡＴＴＴＡＴＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＴＧＡＴＴＣＴＡＡＡＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＧＧＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＣＡＡＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＡＡＧＧＡＡＴＧＧＴＡＡＣＴＡＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧＡＣＣＧＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣ
配列番号２［１０Ｃ９  ＶＬドメイン（ｎｔ）］
ＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＣＣＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＴＣＡＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＴＣＡＧＴＡＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＡＧＴＡＡＧＡＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＴＡＧＣＡＡＴＧＧＣＡＡＣＡＣＴＴＡＣＴＴＡＴＡＴＴＧＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡＡＣＴＣＣＴＧＡＴＡＴＡＴＣＧＧＡＴＧＴＣＣＡＡＣＣＴＴＧＣＣＴＣＡＧＧＡＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＡＧＧＡＡＣＴＧＣＴＴＴＣＡＣＡＣＴＧＡＧＡＡＴＣＡＧＴＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＴＧＧＧＴＡＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＴＧＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣＴＴＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＧＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＡＴＣＣ
配列番号３［１０Ｃ９  ＶＨドメイン（ａａ）］
ＱＶＱＬＱＱＰＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＴＳＤＹＮＦＴＲＹＹＩＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＷＩＹＰＧＴＧＤＳＫＹＮＥＫＦＫＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＱＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＮＧＮＹＷＹＦＤＶＷＧＡＧＴＡＶＴＶＳＳ
配列番号４［１０Ｃ９  ＶＬドメイン（ａａ）］
ＤＩＶＭＴＱＡＡＰＳＧＰＶＴＰＧＥＳＶＳＩＳＣＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＹＷＦＬＱＲＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲＭＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＡＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＩＹＹＣＭＱＨＲＥＹＰＦＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号５［１０Ｃ９重鎖ＣＤＲ１］
ＤＹＮＦＴＲＹＹＩＨ
配列番号６［１０Ｃ９重鎖ＣＤＲ２］
ＷＩＹＰＧＴＧＤＳＫＹＮＥＫＦＫＧ
配列番号７［１０Ｃ９重鎖ＣＤＲ３］
ＮＧＮＹＷＹＦＤＶ
配列番号８［１０Ｃ９軽鎖ＣＤＲ１］
ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＹ
配列番号９［１０Ｃ９軽鎖ＣＤＲ２］
ＲＭＳＮＬＡＳ
配列番号１０［１０Ｃ９軽鎖ＣＤＲ３］
ＭＱＨＲＥＹＰＦＴ
配列番号１１［１０Ｃ９重鎖ＦＲ１］
ＱＶＱＬＱＱＰＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＴＳ
配列番号１２［１０Ｃ９重鎖ＦＲ２］
ＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧ
配列番号１３［１０Ｃ９重鎖ＦＲ３］
ＲＡＴＬＴＡＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＱＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲ
配列番号１４［１０Ｃ９重鎖ＦＲ４］
ＷＧＡＧＴＡＶＴＶＳＳ
配列番号１５［１０Ｃ９軽鎖ＦＲ１］
ＤＩＶＭＴＱＡＡＰＳＧＰＶＴＰＧＥＳＶＳＩＳＣ
配列番号１６［１０Ｃ９軽鎖ＦＲ２］
ＷＦＬＱＲＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹ
配列番号１７［１０Ｃ９軽鎖ＦＲ３］
ＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＡＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＩＹＹＣ
配列番号１８［１０Ｃ９軽鎖ＦＲ４］
ＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１９［１０Ｇ５  ＶＨドメイン（ｎｔ）］
ＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＧＴＴＴＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＴＡＴＡＴＡＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＣＡＡＧＧＡＴＴＴＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＴＧＡＴＡＡＴＡＣＴＴＡＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡＡＧＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＴＡＣＡＴＡＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＡＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＴＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣ
配列番号２０［１０Ｇ５  ＶＬドメイン（ｎｔ）］
ＧＡＴＧＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣＣＴＧＴＣＡＧＴＣＴＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＣＡＧＡＴＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＴＧＴＧＣＡＣＡＧＴＡＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＣＴＡＴＴＴＡＣＡＴＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＧＡＧＴＴＴＣＣＡＡＣＣＧＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＧＣＴＣＡＡＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＣＴＧＴＴＣＴＣＡＡＧＧＴＡＣＡＣＡＴＧＴＴＣＣＴＣＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＧＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＡＴＣＣ
配列番号２１［１０Ｇ５  ＶＨドメイン（ａａ）］
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＤＦＹＩＮＷＶＲＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＡＲＩＦＰＧＧＤＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＥＥＳＳＳＴＡＹＩＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＲＧＬＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＩＳＶＴＶＳＳ
配列番号２２［１０Ｇ５  ＶＬドメイン（ａａ）］
ＤＶＬＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＩＰＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＲＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＧＴＨＶＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号２３［１０Ｇ５重鎖ＣＤＲ１］
ＧＹＳＦＴＤＦＹＩＮ
配列番号２４［１０Ｇ５重鎖ＣＤＲ２］
ＲＩＦＰＧＧＤＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧ
配列番号２５［１０Ｇ５重鎖ＣＤＲ３］
ＲＧＬＹＹＡＭＤＹ
配列番号２６［１０Ｇ５軽鎖ＣＤＲ１］
ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＩＰＹＬＨ
配列番号２７［１０Ｇ５軽鎖ＣＤＲ２］
ＲＶＳＮＲＦＳ
配列番号２８［１０Ｇ５軽鎖ＣＤＲ３］
ＳＱＧＴＨＶＰＰＴ
配列番号２９［１０Ｇ５重鎖ＦＲ１］
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳ
配列番号３０［１０Ｇ５重鎖ＦＲ２］
ＷＶＲＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＡ
配列番号３１［１０Ｇ５重鎖ＦＲ３］
ＫＡＴＬＴＡＥＥＳＳＳＴＡＹＩＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲ
配列番号３２［１０Ｇ５重鎖ＦＲ４］
ＷＧＱＧＩＳＶＴＶＳＳ
配列番号３３［１０Ｇ５軽鎖ＦＲ１］
ＤＶＬＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣ
配列番号３４［１０Ｇ５軽鎖ＦＲ２］
ＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹ
配列番号３５［１０Ｇ５軽鎖ＦＲ３］
ＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣ
配列番号３６［１０Ｇ５軽鎖ＦＲ４］
ＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号３７［ヒトＡｘｌ］
ＭＧＩＱＡＧＥＰＤＰＰＥＥＰＬＴＳＱＡＳＶＰＰＨＱＬＲＬＧＳＬＨＰＨＴＰＹＨＩＲＶＡＣＴＳＳＱＧＰＳＳＷＴＨＷＬＰＶＥＴＰＥＧＶＰＬＧＰＰＥＮＩＳＡＴＲＮＧＳＱＡＦＶＨＷＱＥＰＲＡＰＬＱＧＴＬＬＧＹＲＬＡＹＱＧＱＤＴＰＥＶＬＭＤＩＧＬＲＱＥＶＴＬＥＬＱＧＤＧＳＶＳＮＬＴＶＣＶＡＡＹＴＡＡＧＤＧＰＷＳＬＰＶＰＬＥＡＷＲＰＧＱＡＱＰＶＨＱＬＶＫＥＰＳＴＰＡＦＳＷＰＷＷＹＶＬＬＧＡＶＶＡＡＡＣＶＬＩＬＡＬＦＬＶＨＲＲＫＫＥＴＲＹＧＥＶＦＥＰＴＶＥＲＧＥＬＶＶＲＹＲＶＲＫＳＹＳＲＲＴＴＥＡＴＬＮＳＬＧＩＳＥＥＬＫＥＫＬＲＤＶＭＶＤＲＨＫＶＡＬＧＫＴＬＧＥＧＥＦＧＡＶＭＥＧＱＬＮＱＤＤＳＩＬＫＶＡＶＫＴＭＫＩＡＩＣＴＲＳＥＬＥＤＦＬＳＥＡＶＣＭＫＥＦＤＨＰＮＶＭＲＬＩＧＶＣＦＱＧＳＥＲＥＳＦＰＡＰＶＶＩＬＰＦＭＫＨＧＤＬＨＳＦＬＬＹＳＲＬＧＤＱＰＶＹＬＰＴＱＭＬＶＫＦＭＡＤＩＡＳＧＭＥＹＬＳＴＫＲＦＩＨＲＤＬＡＡＲＮＣＭＬＮＥＮＭＳＶＣＶＡＤＦＧＬＳＫＫＩＹＮＧＤＹＹＲＱＧＲＩＡＫＭＰＶＫＷＩＡＩＥＳＬＡＤＲＶＹＴＳＫＳＤＶＷＳＦＧＶＴＭＷＥＩＡＴＲＧＱＴＰＹＰＧＶＥＮＳＥＩＹＤＹＬＲＱＧＮＲＬＫＱＰＡＤＣＬＤＧＬＹＡＬＭＳＲＣＷＥＬＮＰＱＤＲＰＳＦＴＥＬＲＥＤＬＥＮＴＬＫＡＬＰＰＡＱＥＰＤＥＩＬＹＶＮＭＤＥＧＧＧＹＰＥＰＰＧＡＡＧＧＡＤＰＰＴＱＰＤＰＫＤＳＣＳＣＬＴＡＡＥＶＨＰＡＧＲＹＶＬＣＰＳＴＴＰＳＰＡＱＰＡＤＲＧＳＰＡＡＰＧＱＥＤＧＡ
配列番号３８［マウスＡｘｌ］
ＭＧＲＶＰＬＡＷＷＬＡＬＣＣＷＧＣＡＡＨＫＤＴＱＴＥＡＧＳＰＦＶＧＮＰＧＮＩＴＧＡＲＧＬＴＧＴＬＲＣＥＬＱＶＱＧＥＰＰＥＶＶＷＬＲＤＧＱＩＬＥＬＡＤＮＴＱＴＱＶＰＬＧＥＤＷＱＤＥＷＫＶＶＳＱＬＲＩＳＡＬＱＬＳＤＡＧＥＹＱＣＭＶＨＬＥＧＲＴＦＶＳＱＰＧＦＶＧＬＥＧＬＰＹＦＬＥＥＰＥＤＫＡＶＰＡＮＴＰＦＮＬＳＣＱＡＱＧＰＰＥＰＶＴＬＬＷＬＱＤＡＶＰＬＡＰＶＴＧＨＳＳＱＨＳＬＱＴＰＧＬＮＫＴＳＳＦＳＣＥＡＨＮＡＫＧＶＴＴＳＲＴＡＴＩＴＶＬＰＱＲＰＨＨＬＨＶＶＳＲＱＰＴＥＬＥＶＡＷＴＰＧＬＳＧＩＹＰＬＴＨＣＮＬＱＡＶＬＳＤＤＧＶＧＩＷＬＧＫＳＤＰＰＥＤＰＬＴＬＱＶＳＶＰＰＨＱＬＲＬＥＫＬＬＰＨＴＰＹＨＩＲＩＳＣＳＳＳＱＧＰＳＰＷＴＨＷＬＰＶＥＴＴＥＧＶＰＬＧＰＰＥＮＶＳＡＭＲＮＧＳＱＶＬＶＲＷＱＥＰＲＶＰＬＱＧＴＬＬＧＹＲＬＡＹＲＧＱＤＴＰＥＶＬＭＤＩＧＬＴＲＥＶＴＬＥＬＲＧＤＲＰＶＡＮＬＴＶＳＶＴＡＹＴＳＡＧＤＧＰＷＳＬＰＶＰＬＥＰＷＲＰＶＳＥＰＰＰＲＡＦＳＷＰＷＷＹＶＬＬＧＡＬＶＡＡＡＣＶＬＩＬＡＬＦＬＶＨＲＲＫＫＥＴＲＹＧＥＶＦＥＰＴＶＥＲＧＥＬＶＶＲＹＲＶＲＫＳＹＳＲＲＴＴＥＡＴＬＮＳＬＧＩＳＥＥＬＫＥＫＬＲＤＶＭＶＤＲＨＫＶＡＬＧＫＴＬＧＥＧＥＦＧＡＶＭＥＧＱＬＮＱＤＤＳＩＬＫＶＡＶＫＴＭＫＩＡＩＣＴＲＳＥＬＥＤＦＬＳＥＡＶＣＭＫＥＦＤＨＰＮＶＭＲＬＩＧＶＣＦＱＧＳＤＲＥＧＦＰＥＰＶＶＩＬＰＦＭＫＨＧＤＬＨＳＦＬＬＹＳＲＬＧＤＱＰＶＦＬＰＴＱＭＬＶＫＦＭＡＤＩＡＳＧＭＥＹＬＳＴＫＲＦＩＨＲＤＬＡＡＲＮＣＭＬＮＥＮＭＳＶＣＶＡＤＦＧＬＳＫＫＩＹＮＧＤＹＹＲＱＧＲＩＡＫＭＰＶＫＷＩＡＩＥＳＬＡＤＲＶＹＴＳＫＳＤＶＷＳＦＧＶＴＭＷＥＩＡＴＲＧＱＴＰＹＰＧＶＥＮＳＥＩＹＤＹＬＲＱＧＮＲＬＫＱＰＶＤＣＬＤＧＬＹＡＬＭＳＲＣＷＥＬＮＰＲＤＲＰＳＦＡＥＬＲＥＤＬＥＮＴＬＫＡＬＰＰＡＱＥＰＤＥＩＬＹＶＮＭＤＥＧＧＳＨＬＥＰＲＧＡＡＧＧＡＤＰＰＴＱＰＤＰＫＤＳＣＳＣＬＴＡＡＤＶＨＳＡＧＲＹＶＬＣＰＳＴＡＰＧＰＴＬＳＡＤＲＧＣＰＡＰＰＧＱＥＤＧＡ
配列番号３９［ヒトＴｙｒｏ３］
ＭＡＬＲＲＳＭＧＲＰＧＬＰＰＬＰＬＰＰＰＰＲＬＧＬＬＬＡＡＬＡＳＬＬＬＰＥＳＡＡＡＧＬＫＬＭＧＡＰＶＫＬＴＶＳＱＧＱＰＶＫＬＮＣＳＶＥＧＭＥＥＰＤＩＱＷＶＫＤＧＡＶＶＱＮＬＤＱＬＹＩＰＶＳＥＱＨＷＩＧＦＬＳＬＫＳＶＥＲＳＤＡＧＲＹＷＣＱＶＥＤＧＧＥＴＥＩＳＱＰＶＷＬＴＶＥＧＶＰＦＦＴＶＥＰＫＤＬＡＶＰＰＮＡＰＦＱＬＳＣＥＡＶＧＰＰＥＰＶＴＩＶＷＷＲＧＴＴＫＩＧＧＰＡＰＳＰＳＶＬＮＶＴＧＶＴＱＳＴＭＦＳＣＥＡＨＮＬＫＧＬＡＳＳＲＴＡＴＶＨＬＱＡＬＰＡＡＰＦＮＩＴＶＴＫＬＳＳＳＮＡＳＶＡＷＭＰＧＡＤＧＲＡＬＬＱＳＣＴＶＱＶＴＱＡＰＧＧＷＥＶＬＡＶＶＶＰＶＰＰＦＴＣＬＬＲＤＬＶＰＡＴＮＹＳＬＲＶＲＣＡＮＡＬＧＰＳＰＹＡＤＷＶＰＦＱＴＫＧＬＡＰＡＳＡＰＱＮＬＨＡＩＲＴＤＳＧＬＩＬＥＷＥＥＶＩＰＥＡＰＬＥＧＰＬＧＰＹＫＬＳＷＶＱＤＮＧＴＱＤＥＬＴＶＥＧＴＲＡＮＬＴＧＷＤＰＱＫＤＬＩＶＲＶＣＶＳＮＡＶＧＣＧＰＷＳＱＰＬＶＶＳＳＨＤＲＡＧＱＱＧＰＰＨＳＲＴＳＷＶＰＶＶＬＧＶＬＴＡＬＶＴＡＡＡＬＡＬＩＬＬＲＫＲＲＫＥＴＲＦＧＱＡＦＤＳＶＭＡＲＧＥＰＡＶＨＦＲＡＡＲＳＦＮＲＥＲＰＥＲＩＥＡＴＬＤＳＬＧＩＳＤＥＬＫＥＫＬＥＤＶＬＩＰＥＱＱＦＴＬＧＲＭＬＧＫＧＥＦＧＳＶＲＥＡＱＬＫＱＥＤＧＳＦＶＫＶＡＶＫＭＬＫＡＤＩＩＡＳＳＤＩＥＥＦＬＲＥＡＡＣＭＫＥＦＤＨＰＨＶＡＫＬＶＧＶＳＬＲＳＲＡＫＧＲＬＰＩＰＭＶＩＬＰＦＭＫＨＧＤＬＨＡＦＬＬＡＳＲＩＧＥＮＰＦＮＬＰＬＱＴＬＩＲＦＭＶＤＩＡＣＧＭＥＹＬＳＳＲＮＦＩＨＲＤＬＡＡＲＮＣＭＬＡＥＤＭＴＶＣＶＡＤＦＧＬＳＲＫＩＹＳＧＤＹＹＲＱＧＣＡＳＫＬＰＶＫＷＬＡＬＥＳＬＡＤＮＬＹＴＶＱＳＤＶＷＡＦＧＶＴＭＷＥＩＭＴＲＧＱＴＰＹＡＧＩＥＮＡＥＩＹＮＹＬＩＧＧＮＲＬＫＱＰＰＥＣＭＥＤＶＹＤＬＭＹＱＣＷＳＡＤＰＫＱＲＰＳＦＴＣＬＲＭＥＬＥＮＩＬＧＱＬＳＶＬＳＡＳＱＤＰＬＹＩＮＩＥＲＡＥＥＰＴＡＧＧＳＬＥＬＰＧＲＤＱＰＹＳＧＡＧＤＧＳＧＭＧＡＶＧＧＴＰＳＤＣＲＹＩＬＴＰＧＧＬＡＥＱＰＧＱＡＥＨＱＰＥＳＰＬＮＥＴＱＲＬＬＬＬＱＱＧＬＬＰＨＳＳＣ
配列番号４０［ヒトＭｅｒ］
ＭＧＰＡＰＬＰＬＬＬＧＬＦＬＰＡＬＷＲＲＡＩＴＥＡＲＥＥＡＫＰＹＰＬＦＰＧＰＦＰＧＳＬＱＴＤＨＴＰＬＬＳＬＰＨＡＳＧＹＱＰＡＬＭＦＳＰＴＱＰＧＲＰＨＴＧＮＶＡＩＰＱＶＴＳＶＥＳＫＰＬＰＰＬＡＦＫＨＴＶＧＨＩＩＬＳＥＨＫＧＶＫＦＮＣＳＩＳＶＰＮＩＹＱＤＴＴＩＳＷＷＫＤＧＫＥＬＬＧＡＨＨＡＩＴＱＦＹＰＤＤＥＶＴＡＩＩＡＳＦＳＩＴＳＶＱＲＳＤＮＧＳＹＩＣＫＭＫＩＮＮＥＥＩＶＳＤＰＩＹＩＥＶＱＧＬＰＨＦＴＫＱＰＥＳＭＮＶＴＲＮＴＡＦＮＬＴＣＱＡＶＧＰＰＥＰＶＮＩＦＷＶＱＮＳＳＲＶＮＥＱＰＥＫＳＰＳＶＬＴＶＰＧＬＴＥＭＡＶＦＳＣＥＡＨＮＤＫＧＬＴＶＳＫＧＶＱＩＮＩＫＡＩＰＳＰＰＴＥＶＳＩＲＮＳＴＡＨＳＩＬＩＳＷＶＰＧＦＤＧＹＳＰＦＲＮＣＳＩＱＶＫＥＡＤＰＬＳＮＧＳＶＭＩＦＮＴＳＡＬＰＨＬＹＱＩＫＱＬＱＡＬＡＮＹＳＩＧＶＳＣＭＮＥＩＧＷＳＡＶＳＰＷＩＬＡＳＴＴＥＧＡＰＳＶＡＰＬＮＶＴＶＦＬＮＥＳＳＤＮＶＤＩＲＷＭＫＰＰＴＫＱＱＤＧＥＬＶＧＹＲＩＳＨＶＷＱＳＡＧＩＳＫＥＬＬＥＥＶＧＱＮＧＳＲＡＲＩＳＶＱＶＨＮＡＴＣＴＶＲＩＡＡＶＴＲＧＧＶＧＰＦＳＤＰＶＫＩＦＩＰＡＨＧＷＶＤＹＡＰＳＳＴＰＡＰＧＮＡＤＰＶＬＩＩＦＧＣＦＣＧＦＩＬＩＧＬＩＬＹＩＳＬＡＩＲＫＲＶＱＥＴＫＦＧＮＡＦＴＥＥＤＳＥＬＶＶＮＹＩＡＫＫＳＦＣＲＲＡＩＥＬＴＬＨＳＬＧＶＳＥＥＬＱＮＫＬＥＤＶＶＩＤＲＮＬＬＩＬＧＫＩＬＧＥＧＥＦＧＳＶＭＥＧＮＬＫＱＥＤＧＴＳＬＫＶＡＶＫＴＭＫＬＤＮＳＳＱＲＥＩＥＥＦＬＳＥＡＡＣＭＫＤＦＳＨＰＮＶＩＲＬＬＧＶＣＩＥＭＳＳＱＧＩＰＫＰＭＶＩＬＰＦＭＫＹＧＤＬＨＴＹＬＬＹＳＲＬＥＴＧＰＫＨＩＰＬＱＴＬＬＫＦＭＶＤＩＡＬＧＭＥＹＬＳＮＲＮＦＬＨＲＤＬＡＡＲＮＣＭＬＲＤＤＭＴＶＣＶＡＤＦＧＬＳＫＫＩＹＳＧＤＹＹＲＱＧＲＩＡＫＭＰＶＫＷＩＡＩＥＳＬＡＤＲＶＹＴＳＫＳＤＶＷＡＦＧＶＴＭＷＥＩＡＴＲＧＭＴＰＹＰＧＶＱＮＨＥＭＹＤＹＬＬＨＧＨＲＬＫＱＰＥＤＣＬＤＥＬＹＥＩＭＹＳＣＷＲＴＤＰＬＤＲＰＴＦＳＶＬＲＬＱＬＥＫＬＬＥＳＬＰＤＶＲＮＱＡＤＶＩＹＶＮＴＱＬＬＥＳＳＥＧＬＡＱＧＳＴＬＡＰＬＤＬＮＩＤＰＤＳＩＩＡＳＣＴＰＲＡＡＩＳＶＶＴＡＥＶＨＤＳＫＰＨＥＧＲＹＩＬＮＧＧＳＥＥＷＥＤＬＴＳＡＰＳＡＡＶＴＡＥＫＮＳＶＬＰＧＥＲＬＶＲＮＧＶＳＷＳＨＳＳＭＬＰＬＧＳＳＬＰＤＥＬＬＦＡＤＤＳＳＥＧＳＥＶＬＭ
配列番号４１［ヒトＡｋｔ３］
ＭＳＤＶＴＩＶＫＥＧＷＶＱＫＲＧＥＹＩＫＮＷＲＰＲＹＦＬＬＫＴＤＧＳＦＩＧＹＫＥＫＰＱＤＶＤＬＰＹＰＬＮＮＦＳＶＡＫＣＱＬＭＫＴＥＲＰＫＰＮＴＦＩＩＲＣＬＱＷＴＴＶＩＥＲＴＦＨＶＤＴＰＥＥＲＥＥＷＴＥＡＩＱＡＶＡＤＲＬＱＲＱＥＥＥＲＭＮＣＳＰＴＳＱＩＤＮＩＧＥＥＥＭＤＡＳＴＴＨＨＫＲＫＴＭＮＤＦＤＹＬＫＬＬＧＫＧＴＦＧＫＶＩＬＶＲＥＫＡＳＧＫＹＹＡＭＫＩＬＫＫＥＶＩＩＡＫＤＥＶＡＨＴＬＴＥＳＲＶＬＫＮＴＲＨＰＦＬＴＳＬＫＹＳＦＱＴＫＤＲＬＣＦＶＭＥＹＶＮＧＧＥＬＦＦＨＬＳＲＥＲＶＦＳＥＤＲＴＲＦＹＧＡＥＩＶＳＡＬＤＹＬＨＳＧＫＩＶＹＲＤＬＫＬＥＮＬＭＬＤＫＤＧＨＩＫＩＴＤＦＧＬＣＫＥＧＩＴＤＡＡＴＭＫＴＦＣＧＴＰＥＹＬＡＰＥＶＬＥＤＮＤＹＧＲＡＶＤＷＷＧＬＧＶＶＭＹＥＭＭＣＧＲＬＰＦＹＮＱＤＨＥＫＬＦＥＬＩＬＭＥＤＩＫＦＰＲＴＬＳＳＤＡＫＳＬＬＳＧＬＬＩＫＤＰＮＫＲＬＧＧＧＰＤＤＡＫＥＩＭＲＨＳＦＦＳＧＶＮＷＱＤＶＹＤＫＫＬＶＰＰＦＫＰＱＶＴＳＥＴＤＴＲＹＦＤＥＥＦＴＡＱＴＩＴＩＴＰＰＥＫＣＱＱＳＤＣＧＭＬＧＮＷＫＫ
配列番号４２［ヒトＧａｓ６］
ＭＡＰＳＬＳＰＧＰＡＡＬＲＲＡＰＱＬＬＬＬＬＬＡＡＥＣＡＬＡＡＬＬＰＡＲＥＡＴＱＦＬＲＰＲＱＲＲＡＦＱＶＦＥＥＡＫＱＧＨＬＥＲＥＣＶＥＥＬＣＳＲＥＥＡＲＥＶＦＥＮＤＰＥＴＤＹＦＹＰＲＹＬＤＣＩＮＫＹＧＳＰＹＴＫＮＳＧＦＡＴＣＶＱＮＬＰＤＱＣＴＰＮＰＣＤＲＫＧＴＱＡＣＱＤＬＭＧＮＦＦＣＬＣＫＡＧＷＧＧＲＬＣＤＫＤＶＮＥＣＳＱＥＮＧＧＣＬＱＩＣＨＮＫＰＧＳＦＨＣＳＣＨＳＧＦＥＬＳＳＤＧＲＴＣＱＤＩＤＥＣＡＤＳＥＡＣＧＥＡＲＣＫＮＬＰＧＳＹＳＣＬＣＤＥＧＦＡＹＳＳＱＥＫＡＣＲＤＶＤＥＣＬＱＧＲＣＥＱＶＣＶＮＳＰＧＳＹＴＣＨＣＤＧＲＧＧＬＫＬＳＱＤＭＤＴＣＥＤＩＬＰＣＶＰＦＳＶＡＫＳＶＫＳＬＹＬＧＲＭＦＳＧＴＰＶＩＲＬＲＦＫＲＬＱＰＴＲＬＶＡＥＦＤＦＲＴＦＤＰＥＧＩＬＬＦＡＧＧＨＱＤＳＴＷＩＶＬＡＬＲＡＧＲＬＥＬＱＬＲＹＮＧＶＧＲＶＴＳＳＧＰＶＩＮＨＧＭＷＱＴＩＳＶＥＥＬＡＲＮＬＶＩＫＶＮＲＤＡＶＭＫＩＡＶＡＧＤＬＦＱＰＥＲＧＬＹＨＬＮＬＴＶ
ＧＧＩＰＦＨＥＫＤＬＶＱＰＩＮＰＲＬＤＧＣＭＲＳＷＮＷＬＮＧＥＤＴＴＩＱＥＴＶＫＶＮＴＲＭＱＣＦＳＶＴＥＲＧＳＦＹＰＧＳＧＦＡＦＹＳＬＤＹＭＲＴＰＬＤＶＧＴＥＳＴＷＥＶＥＶＶＡＨＩＲＰＡＡＤＴＧＶＬＦＡＬＷＡＰＤＬＲＡＶＰＬＳＶＡＬＶＤＹＨＳＴＫＫＬＫＫＱＬＶＶＬＡＶＥＨＴＡＬＡＬＭＥＩＫＶＣＤＧＱＥＨＶＶＴＶＳＬＲＤＧＥＡＴＬＥＶＤＧＴＲＧＱＳＥＶＳＡＡＱＬＱＥＲＬＡＶＬＥＲＨＬＲＳＰＶＬＴＦＡＧＧＬＰＤＶＰＶＴＳＡＰＶＴＡＦＹＲＧＣＭＴＬＥＶＮＲＲＬＬＤＬＤＥＡＡＹＫＨＳＤＩＴＡＨＳＣＰＰＶＥＰＡＡＡ
配列番号４３［Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ由来Ａｘｌ；本明細書での別称「Ｃｙｎｏ  Ａｘｌ」］
ＭＡＷＲＣＰＲＭＧＲＶＰＬＡＷＣＬＡＬＣＧＷＶＣＭＡＰＲＧＴＱＡＥＥＳＰＦＶＧＮＰＧＮＩＴＧＡＲＧＬＴＧＴＬＲＣＱＬＱＶＱＧＥＰＰＥＶＨＷＬＲＤＧＱＩＬＥＬＡＤＳＴＱＴＱＶＰＬＧＥＤＥＱＤＤＷＩＶＶＳＱＬＲＩＡＳＬＱＬＳＤＡＧＱＹＱＣＬＶＦＬＧＨＱＮＦＶＳＱＰＧＹＶＧＬＥＧＬＰＹＦＬＥＥＰＥＤＲＴＶＡＡＮＴＰＦＮＬＳＣＱＡＱＧＰＰＥＰＶＤＬＬＷＬＱＤＡＶＰＬＡＴＡＰＧＨＧＰＱＲＮＬＨＶＰＧＬＮＫＴＳＳＦＳＣＥＡＨＮＡＫＧＶＴＴＳＲＴＡＴＩＴＶＬＰＱＱＰＲＮＬＨＬＶＳＲＱＰＴＥＬＥＶＡＷＴＰＧＬＳＧＩＹＰＬＴＨＣＴＬＱＡＶＬＳＤＤＧＭＧＩＱＡＧＥＰＤＰＰＥＥＰＬＴＬＱＡＳＶＰＰＨＱＬＲＬＧＳＬＨＰＨＴＰＹＨＩＲＶＡＣＴＳＳＱＧＰＳＳＷＴＨＷＬＰＶＥＴＰＥＧＶＰＬＧＰＰＥＮＩＳＡＴＲＮＧＳＱＡＦＶＨＷＱＥＰＲＡＰＬＱＧＴＬＬＧＹＲＬＡＹＱＧＱＤＴＰＥＶＬＭＤＩＧＬＲＱＥＶＴＬＥＬＱＧＤＧＳＶＳＮＬＴＶＣＶＡＡＹＴＡＡＧＤＧＰＷＳＬＰＶＰＬＥＡＷＲＰＧＱＡＱＰＶＨＱＬＶＫＥＴＳＡＰＡＦＳＷＰＷＷＹＩＬＬＧＡＶＶＡＡＡＣＶＬＩＬＡＬＦＬＶＨＲＲＫＫＥＴＲＹＧＥＶＦＥＰＴＶＥＲＧＥＬＶＶＲＹＲＶＲＫＳＹＳＲＲＴＴＥＡＴＬＮＳＬＧＩＳＥＥＬＫＥＫＬＲＤＶＭＶＤＲＨＫＶＡＬＧＫＴＬＧＥＧＥＦＧＡＶＭＥＧＱＬＮＱＤＤＳＩＬＫＶＡＶＫＴＭＫＩＡＩＣＴＲＳＥＬＥＤＦＬＳＥＡＶＣＭＫＥＦＤＨＰＮＶＭＲＬＩＧＶＣＦＱＧＳＥＲＥＳＦＰＡＰＶＶＩＬＰＦＭＫＨＧＤＬＨＳＦＬＬＹＳＲＬＧＤＱＰＶＹＬＰＴＱＭＬＶＫＦＭＡＤＩＡＳＧＭＥＹＬＳＴＫＲＦＩＨＲＤＬＡＡＲＮＣＭＬＮＥＮＭＳＶＣＶＡＤＦＧＬＳＫＫＩＹＮＧＤＹＹＲＱＧＲＩＡＫＭＰＶＫＷＩＡＩＥＳＬＡＤＲＶＹＴＳＫＳＤＶＷＳＦＧＶＴＭＷＥＩＡＴＲＧＱＴＰＹＰＧＶＥＮＳＥＩＹＤＹＬＲＱＧＮＲＬＫＱＰＡＤＣＬＤＧＬＹＡＬＭＳＲＣＷＥＬＮＰＱＤＲＰＳＦＴＥＬＲＥＤＬＥＮＴＬＫＡＬＰＰＡＱＥＰＤＥＩＬＹＶＮＭＤＥＧＧＧＹＰＥＰＰＧＡＡＧＧＡＤＰＰＴＱＬＤＰＫＤＳＣＳＣＬＴＳＡＥＶＨＰＡＧＲＹＶＬＣＰＳＴＡＰＳＰＡＱＰＡＤＲＧＳＰＡＡＰＧＱＥＤＧＡ
配列番号４４［リンカー］
ＧＧＧＧＳ
配列番号４５［１０Ｇ５（Ｑ１Ｅ）ＶＨドメイン（ａａ）］
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＤＦＹＩＮＷＶＲＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＡＲＩＦＰＧＧＤＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＥＥＳＳＳＴＡＹＩＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＲＧＬＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＩＳＶＴＶＳＳ
【０５３３】
生物寄託
本開示は２種類のハイブリドーマ細胞株に関する。「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」に従って、２つのハイブリドーマ細胞株を寄託した。詳細を以下に示す。
【０５３４】
ＵＴ−１０Ｃ９−Ｂ９
受託機関→Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）
Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ
Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ
Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ
ＳＰ４  ＯＪＧ
Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ
寄託日→２０１５年１２月１６日
アクセッション番号→１５１２１６０１
特徴→ハイブリドーマ−Ｂリンパ球；種−Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）；形態−リンパ芽球；免疫原−ヒトＡｘｌ細胞外ドメイン；免疫細胞供与体−ＮＭＲＩマウス；無限分裂パートナーＸ６３．Ａｇ８．６５３；産物のＩｇクラス／サブクラス−ＩｇＧ２ｂ
【０５３５】
ＷＲ−１０Ｇ５−Ｅ５
受託機関→Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）
Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ
Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ
Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ
ＳＰ４  ＯＪＧ
Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ
寄託日→２０１５年１２月１６日
アクセッション番号→１５１２１６０２
特徴→ハイブリドーマ−Ｂリンパ球；種−Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）；形態−リンパ芽球；免疫原−ヒトＡｘｌ細胞外ドメイン；免疫細胞供与体−ＮＭＲＩマウス；無限分裂パートナーＸ６３．Ａｇ８．６５３；産物のＩｇクラス／サブクラス−ＩｇＧ１
【図１】
2018506961.tif 000011
【図２】
2018506961.tif 000012
【図３】
2018506961.tif 000013
【図４】
2018506961.tif 000014
【図５】
2018506961.tif 000015
【図６】
2018506961.tif 000016
【図７】
2018506961.tif 000017
【図８】
2018506961.tif 000018
【図９】
2018506961.tif 000019
【図１０】
2018506961.tif 000020
【図１１】
2018506961.tif 000021
【図１２】
2018506961.tif 000022
【図１３】
2018506961.tif 000023
【図１４】
2018506961.tif 000024
【図１５】
2018506961.tif 000025
【図１６】
2018506961.tif 000026
【図１７】
2018506961.tif 000027
【図１８】
2018506961.tif 000028
【配列表】
2018506961000001.app
【国際調査報告】
2018506961.tif 000029
2018506961.tif 000030
2018506961.tif 000031
2018506961.tif 000032
2018506961.tif 000033
2018506961.tif 000034
2018506961.tif 000035