(57)【要約】本明細書は、異種抗原（腫瘍関連抗原を含む）に融合された切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列の融合タンパク質を含む、生きた弱毒化組み換え型リステリア株を含む組成物の使用を含めた組成物を開示しており、ここで組成物はさらに、抗体またはその断片を含むか、またはそれと同時投与される。また、生きた弱毒化組み換え型リステリア菌株を含む組成物を、腫瘍の治療、腫瘍に対する保護、および／または腫瘍に対する免疫応答の誘発に使用するために、特に、治療、それに対する保護および／またはそれに対する免疫応答の誘発によって被験者における生存率が増大する場合に、抗体またはその断片と共に使用することを含む併用療法が開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物であって、前記核酸分子が融合ポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドが異種抗原またはその断片に融合された切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含み、前記組成物がさらに抗体またはその機能的断片を含む、組成物。
【請求項２】
前記抗体またはその機能的断片がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ´）２断片、Ｆｖ断片、単鎖抗体（ＳＣＡ）、またはその任意の組み合わせを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗体またはその機能的断片がＴ細胞受容体共刺激分子を含む前記異種抗原またはその部分、共刺激分子に結合する抗原提示細胞受容体、または前記ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーに結合される、請求項１〜２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの前記メンバーが、グルココルチコイド誘発ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４受容体）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７受容体）およびＴＮＦＲ２５から成る群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記共刺激分子に結合する抗原提示細胞受容体がＣＤ８０受容体、ＣＤ８６受容体およびＣＤ４０受容体から成る群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
第一のオープンリーディングフレームを含む前記核酸分子が前記リステリアゲノムに組み込まれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
第一のオープンリーディングフレームを含む前記核酸分子が前記組み換え型リステリア株内のプラスミド内にある、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
抗生物質選択がない時に前記プラスミドが前記組み換え型リステリア株内で安定して維持される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記プラスミドが前記組み換え型リステリアに抗生物質抵抗性を与えない、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記異種抗原が腫瘍関連抗原である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記腫瘍関連抗原が前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原またはキメラｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組み換え型リステリア株が弱毒化されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記弱毒化リステリアが内因性遺伝子内に突然変異、欠失、分裂、不活性化、置換、または切断を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記内因性遺伝子がＡｃｔＡ病毒性遺伝子、ｐｒｆＡ病毒性遺伝子、ｄａｌ遺伝子遺伝子、ｉｎｌＢ遺伝子、ｄａｔ遺伝子またはその組み合わせを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記内因性遺伝子がｐｒｆＡ遺伝子である、請求項１３〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記内因性遺伝子が前記ｄａｌ／ｄａｔおよびＡｃｔＡ遺伝子である、請求項１３〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
第１のオープンリーディングフレームを含む前記核酸が、第２のオープンリーディングフレームをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記第２のオープンリーディングフレームがＤ１３３Ｖ突然変異を含むｐｒｆＡタンパク質をコードし、また前記ｐｒｆＡタンパク質が前記ｐｒｆＡ遺伝子内の前記突然変異、欠失、分裂、不活性化、置換、または切断を補完する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記第２のオープンリーディングフレームが代謝酵素をコードし、また前記代謝酵素が前記ｄａｌおよびｄａｔ遺伝子内の前記突然変異、欠失、分裂、不活性化、置換、または切断を補完する、請求項１〜１４、１６または１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記第２のオープンリーディングフレームによってコードされた前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
アジュバントをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記アジュバントが、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、またはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記リステリア株がリステリア・モノサイトゲネスである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
被験者における抗腫瘍Ｔ細胞応答の増強を誘発する方法であって、前記方法が有効量の核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子が融合ポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、また前記融合ポリペプチドが異種抗原またはその断片に融合された切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含み、また前記方法がさらに抗体またはその断片を含む有効量の組成物を前記被験者に投与する工程を含み、また前記投与が前記被験者における前記抗腫瘍Ｔ細胞応答を増強する、方法。
【請求項２５】
前記抗体またはその機能的断片が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ  断片、Ｆ（ａｂ´）２断片、Ｆｖ断片、単鎖抗体（ＳＣＡ）、またはその任意の組み合わせを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体またはその機能的断片が、Ｔ細胞受容体共刺激分子を含む異種抗原またはその部分、共刺激分子を結合する抗原提示細胞受容体、または前記ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーに結合される、請求項２４〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの前記メンバーが、グルココルチコイド誘発ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４受容体）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７受容体）およびＴＮＦＲ２５から成る群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記共刺激分子を結合する抗原提示細胞受容体がＣＤ８０受容体、ＣＤ８６受容体およびＣＤ４０受容体から成る群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
第一のオープンリーディングフレームを含む前記核酸分子が前記リステリアゲノムに統合される、請求項２４〜２８に記載の方法。
【請求項３０】
第一のオープンリーディングフレームを含む前記核酸分子が前記組み換え型リステリアワクチン株内のプラスミド内にある、請求項２４〜２８に記載の方法。
【請求項３１】
抗生物質選択がない時に前記プラスミドが前記組み換え型リステリア株内で安定して維持される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記プラスミドが前記組み換え型リステリアに抗生物質抵抗性を与えない、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記異種抗原が腫瘍関連抗原である、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記腫瘍関連抗原が前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原またはＨｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記組み換え型リステリア株が弱毒化されている、請求項２４〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記弱毒化リステリアが内因性遺伝子内に突然変異、欠失、分裂、不活性化、置換、または切断を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記内因性遺伝子がＡｃｔＡ病毒性遺伝子、ｐｒｆＡ病毒性遺伝子、ｄａｌ遺伝子遺伝子、ｉｎｌＢ遺伝子、ｄａｔ遺伝子またはその組み合わせを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記内因性遺伝子がｐｒｆＡ遺伝子である、請求項３６〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記内因性遺伝子が前記ｄａｌ／ｄａｔおよびＡｃｔＡ遺伝子である、請求項３６〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４０】
第１のオープンリーディングフレームを含む前記核酸が、第２のオープンリーディングフレームをさらに含む、請求項２４〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記第２のオープンリーディングフレームがＤ１３３Ｖ突然変異を含むｐｒｆＡタンパク質をコードし、また前記ｐｒｆＡタンパク質が前記ｐｒｆＡ遺伝子内の前記突然変異、欠失、分裂、不活性化、置換、または切断を補完する、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記第２のオープンリーディングフレームが代謝酵素をコードし、また前記代謝酵素が前記ｄａｌおよびｄａｔ遺伝子内の前記突然変異、欠失、分裂、不活性化、置換、または切断を補完する、請求項２４〜３７、または３９〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４３】
前記第２のオープンリーディングフレームによってコードされた前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
アジュバントをさらに含む、請求項２４〜４３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４５】
前記アジュバントが、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、またはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記リステリア株がリステリア・モノサイトゲネスである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４７】
抗体またはその断片を含む前記組成物が、前記組み換え型弱毒化リステリア株を含む前記組成物の投与の前に、それと同時に、またはその後で投与される、請求項２４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗腫瘍Ｔ細胞応答がインターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）産生細胞のレベルを増加することを含む、請求項２４〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗腫瘍Ｔ細胞応答がＴエフェクター細胞による腫瘍浸潤の増加を含む、請求項２４〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記Ｔエフェクター細胞がＣＤ４５＋ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｆｏｘ３Ｐ−Ｔ細胞である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗腫瘍Ｔ細胞応答が脾臓および腫瘍微小環境内での調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の頻度の減少を含む、請求項２４〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗腫瘍Ｔ細胞応答が、脾臓および腫瘍微小環境内での骨髄系由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の頻度の減少を含む、請求項２４〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記方法が前記被験者における抗原特異的Ｔ細胞の増加を含む、請求項２４〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記方法が被験者における腫瘍またはガンの治療を含む、請求項２４〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記方法がガンまたは腫瘍を罹患した被験者の生存期間を延長することを含む、請求項２４〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記腫瘍が乳房腫瘍、頭頸部腫瘍、子宮頸腫瘍、前立腺腫瘍である、請求項５５〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ガンが乳ガン、頭頸部ガン、子宮頸ガン、前立腺ガン、肛門ガン、食道ガン、肺ガン、メラノーマ、骨肉腫、または卵巣ガンである、請求項５５〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、異種抗原（腫瘍関連抗原を含む）に融合された切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列の融合タンパク質を含む、生きた弱毒化組み換え型リステリア株を含む組成物の使用を含めた組成物を開示しており、ここで組成物はさらに、抗体またはその断片を含むか、またはそれと同時投与される。また、生きた弱毒化組み換え型リステリア菌株を含む組成物を、腫瘍の治療、腫瘍に対する保護、および／または腫瘍に対する免疫応答の誘発に使用するために、特に、治療、それに対する保護および／またはそれに対する免疫応答の誘発によって被験者における生存率が増大する場合に、抗体またはその断片と共に使用することを含む併用療法が開示されている。
【背景技術】
【０００２】
リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）は、リステリア症の原因となるグラム陽性の通性細胞内病原体である。宿主細胞に侵入すると、Ｌｍは、血管膜を溶解し、細胞質の中に入ることを可能にして、そこで複製してアクチン重合化タンパク質（ＡｃｔＡ）の移動度に基づいて隣接する細胞に拡散する孔形成タンパク質、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）の生成を通してファゴリソソームから脱出しうる。細胞質内では、Ｌｍ−分泌タンパク質はプロテアソームによって分解され、そして小胞体内のＭＨＣクラスＩ分子と関連するペプチドへと処理される。この特有の特徴により、これは大変魅力的なガンワクチンベクターとされ、この中で腫瘍抗原は腫瘍に特異的な細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を活性化するためにＭＨＣクラスＩ分子を提示されうる。
【０００３】
さらに、いったん貪食されると、その後ＬｍはＬｍ特異的ＣＤ４−Ｔ細胞応答の活性化用のＭＨＣクラスＩＩ上に提供されたファゴリソソーム区画およびペプチド内で処理されうる。あるいは、Ｌｍは、ファゴソームを逃れてサイトゾルに入ることがあり、そこで核オリゴマー形成ドメイン様受容体によるペプチドグリカンの認識、およびＤＮＡセンサー（ＡＩＭ２）によるＬｍ  ＤＮＡが、炎症カスケードを活性化する。この炎症性応答とＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩ経路への抗原の効率的な送達との組み合わせは、Ｌｍを腫瘍の治療、腫瘍に対する保護、および腫瘍に対する免疫応答の誘発における強力なワクチンベクターとしている。
【０００４】
ところが、腫瘍細胞は免疫抑制微小環境を誘発することがよくあり、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）など、免疫抑制の免疫細胞母集団の発生を助ける。腫瘍による免疫調節の複雑さを理解することは、免疫療法の発展にとって重要である。抗腫瘍免疫応答を高め、「免疫チェックポイント」を克服するための様々な戦略が開発中である。さらに、組み合わせ免疫療法の投与はより有効かつ持続的な応答を提供しうる。
【０００５】
例えば、腫瘍媒介性免疫抑制のいくつかの機構のうちの１つは、腫瘍によるＴ細胞共阻害分子の発現である。それらのリガンドに結合すると、これらの分子は末梢内および腫瘍微小環境内のエフェクターリンパ球を抑制することができる。
【０００６】
現在のところ、腫瘍の成長およびガンを除去することができる腫瘍標的化方法のための効果的な併用療法を提供する必要性が依然としてある。本発明はこの必要性に、リステリアベースのワクチンと、記憶Ｔ細胞およびエフェクターＴ細胞の増殖を増強または促進して、Ｔ細胞または抗原提示細胞上の共刺激受容体を活性化しうる抗体またはその断片の追加を含めた各種の両方との組み合わせを提供することにより対処する。共刺激は、リステリアベースのワクチンの投与に起因する抗原提示に加えて、特定の腫瘍またはガンに対する効果的な抗腫瘍免疫応答の発生にとって重大である場合があると考えられる。
【０００７】
標的化免疫調節療法は、例えば、４−１ＢＢ、ＯＸ４０およびＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘発ＴＮＦ受容体関連）を含め、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーを標的にした作動薬抗体を使用することによるなど、主に共刺激受容体の活性化に焦点が当てられている。ＧＩＴＲの調節は、抗腫瘍およびワクチンの両方の場面での潜在性が示されてきた。作動薬抗体の別の標的は、Ｔ細胞活性化のための共刺激シグナル分子である。共刺激シグナル分子を標的化することは、Ｔ細胞の活性化の増強およびより強力な免疫応答の促進につながりうる。共刺激はまた、チェックポイント抑制からの抑制的影響の防止に役立ち、抗原特異的Ｔ細胞増殖を増大しうる。残念ながら、こうした作動薬抗体の使用は毒性の問題につながりうる。したがって、作動薬抗体と考慮されているリステリアベースの免疫療法的組成物との任意の組み合わせの安全かつ有効な投与量を確立することが抗腫瘍免疫療法の開発において不可欠である。
【０００８】
よって、リステリアベースの免疫療法的組成物と任意の免疫療法作動薬抗体との組み合わせを投与するための投与量およびスケジュールを最適化する必要性が残っている。本発明はまた、この必要性に、腫瘍発生に応答してリステリアベースのワクチンと作動薬抗体との組み合わせを提供することにより対処している。
【０００９】
ガンを含むある一定の疾患の複雑な性質を考えると、その治療において組み合わせられたアプローチの必要性が存在する。以下の本発明を実施するための形態に示されるように、これらの併用療法は免疫療法の全体的な抗腫瘍有効性を改善しうる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一態様では、本開示は核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物に関連し、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、ここで前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含み、前記組成物はさらに抗体またはその断片を含む。別の態様では、抗体またはその断片は作動薬抗体またはその断片である。別の態様では、抗体またはその断片は、Ｔ細胞受容体共刺激分子を含む抗原またはその部分、共刺激分子を結合する抗原提示細胞受容体またはＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーに結合される。
【００１１】
別の態様では、本開示は核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物に関連し、前記核酸分子は、異種抗原またはその断片に融合された切断リステリオリシンＯタンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、前記組成物はさらに抗体またはその断片を含む。別の態様では、抗体またはその断片は作動薬抗体またはその断片である。別の態様では、抗体またはその断片は、Ｔ細胞受容体共刺激分子を含む抗原またはその部分、共刺激分子を結合する抗原提示細胞受容体またはＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーに結合される。関連する別の態様では、リステリア株内に含まれる核酸分子は、切断ＬＬＯタンパク質をコードする。関連する別の態様では、リステリア株内に含まれる核酸分子は、切断ＬＬＯタンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列をコードする。
【００１２】
関連する態様では、本発明は被験者における抗腫瘍Ｔ細胞応答の増強を誘発する方法に関連し、前記方法は、組み換え型リステリア株を含む有効量の免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記リステリア株は核酸分子を含み、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、ここで前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断リステリオリシンＯタンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含み、ここで方法はさらに、抗ＴＮＦ受容体抗体またはその断片を含む有効量の組成物を前記被験者に投与する工程を含む。
【００１３】
関連する別の態様では、本開示は、核酸分子を含む組み換え型リステリア株の使用を含めた、被験者における抗腫瘍Ｔ細胞応答の増強を誘発する方法に関連し、前記核酸分子は、切断ＬＬＯタンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列をコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、ここで方法はさらに、抗ＴＮＦ受容体抗体またはその断片を含む有効量の組成物を前記被験者に投与する工程を含む。
【００１４】
関連する別の態様では、本開示は被験者における抗原特異的Ｔ細胞を増大する方法に関連し、前記方法は、核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む有効量の免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、ここで前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断リステリオリシンＯタンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含み、ここで方法はさらに、抗ＴＮＦ受容体抗体またはその断片を含む有効量の組成物を前記被験者に投与する工程を含む。
【００１５】
関連する別の態様では、本開示は、核酸分子を含む組み換え型リステリア株の使用を含めた、被験者におけるＴ細胞応答を増大させる方法に関連し、前記核酸分子は、切断ＬＬＯタンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列をコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、ここで方法はさらに、抗ＴＮＦ受容体抗体またはその断片を含む有効量の組成物を前記被験者に投与する工程を含む。
【００１６】
関連する別の態様では、本開示は被験者における腫瘍またはガンを治療する方法に関連し、前記方法は、核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む有効量の免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、ここで前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断リステリオリシンＯタンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含み、ここで方法はさらに、抗ＴＮＦ受容体抗体またはその断片を含む有効量の組成物を前記被験者に投与する工程を含む。
【００１７】
関連する別の態様では、被験者における腫瘍またはガンを治療するための本発明の方法は、核酸分子を含む組み換え型リステリア株の使用を含み、前記核酸分子は、切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列をコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、ここで方法はさらに、抗ＴＮＦ受容体抗体またはその断片を含む有効量の組成物を前記被験者に投与する工程を含む。
【００１８】
関連する別の態様では、本発明は被験者における生存率を増大させる方法に関連し、前記方法は、核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む有効量の免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、ここで前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断リステリオリシンＯタンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含み、ここで方法はさらに、抗ＴＮＦ受容体抗体またはその断片を含む有効量の組成物を前記被験者に投与する工程を含む。関連する別の態様では、被験者における生存率を増大させるための本発明の方法は、核酸分子を含む組み換え型リステリア株の使用を含み、前記核酸分子は、切断ＬＬＯタンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列をコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、ここで方法はさらに、抗ＴＮＦ受容体抗体またはその断片を含む有効量の組成物を前記被験者に投与する工程を含む。
【００１９】
以下の発明を実施するための形態、実施例、および図面から本発明の他の特徴および利点が明らかとなる。しかしながら、詳細な説明から当業者には本発明の趣旨および範囲内での様々な変更および修正が明らかとなるので、この詳細な説明および具体的な実施例は本発明の好ましい実施形態を示す一方で、単に例示としてのみ与えられることを理解するべきである。
【００２０】
本発明に関する主題は、本明細書の結論部分に特定的に指摘され、かつ明瞭に主張されている。しかしながら、本発明の構成および運用方法の両方については、その目的、特徴、および利点とともに、添付図面とともに読んだとき、以下の発明を実施するための形態を参照することによって最も良好に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（ＡＤＸＳ１１A）は異なる発現系を使用してＥ７を発現および分泌する。Ｌｍ−Ｅ７を、Ｌ．モノサイトゲネスゲノム（図１Ａ）のｏｒｆＺドメインの中へと遺伝子カセットを導入することによって生成した。ｈｌｙプロモーターは、ＨＰＶ−１６  Ｅ７が後に続くＬＬＯのｈｌｙシグナル配列および最初の５つのアミノ酸（ＡＡ）の発現を駆動する。（図１Ｂ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を、ｐｒｆＡ−株ＸＦＬ−７をプラスミドｐＧＧ−５５で形質転換することによって生成した。ｐＧＧ−５５は、ＬＬＯ−Ｅ７の非溶血性の融合の発現を駆動するｈｌｙプロモーターを有する。ｐＧＧ−５５は、ｐｒｆＡ遺伝子も含有し、インビボでＸＦＬ−７によってプラスミドの保持を選択する。
【図２】Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７はＥ７を分泌する。Ｌｍ−Ｇａｇ（レーン１）、Ｌｍ−Ｅ７（レーン２）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（レーン３）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（レーン４）、ＸＦＬ−７（レーン５）、および１０４０３Ｓ（レーン６）を、ルリア−ベルターニ培地中、３７℃で一晩増殖させた。６００ｎｍの吸光度においてＯＤによって決定された同等数の細菌をペレット化し、そして各々の上清１８ｍＬをＴＣＡ沈殿させた。Ｅ７発現をウエスタンブロットによって解析した。ブロットを抗Ｅ７  ｍＡｂでプローブし、それに続いてＨＲＰ結合抗マウス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でプローブし、次いでこれをＥＣＬ検出試薬を使用して発色させた。
【図３】ＬＬＯ−Ｅ７融合の腫瘍免疫療法有効性。腫瘍接種の７、１４、２１、２８、および５６日後におけるマウス内の腫瘍サイズがミリメートルで示される。無処置マウス：白丸、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７：黒丸、Ｌｍ−Ｅ７：正方形、Ｌｍ−Ｇａｇ：白ひし形、そしてＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰ：黒三角。
【図４】Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７−免疫化マウスからの脾細胞はＴＣ−１細胞に曝露されたとき増殖する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、または対照ｒＬｍ株を用いて免疫を与え、かつブーストした。脾細胞を、ブーストの６日後に採取し、そして示される比で照射したＴＣ−１細胞と共に培養皿に蒔いた。細胞を３Ｈチミジンでパルスラベルし、採取した。ｃｐｍは、（実験的ｃｐｍ）−（非ＴＣ−１対照）と定義された。
【図５】（図５Ａ）Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７がＥ７を分泌することを実証するウエスタンブロット。レーン１：Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、レーン２：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７A、レーン３：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７−２．５．３、レーン４：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７−２．５．４．（図５Ｂ）Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（長方形）、Ｌｍ−Ｅ７（楕円）、およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（×）を投与したマウス、ならびに無処置マウス（非ワクチン接種、黒三角形）内の腫瘍サイズ。
【図６Ａ１】（図６Ａ）４つのＬＭワクチンを作り出すために使用されるプラスミドインサートの概略表示。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７インサートは、使用されるすべてのリステリア遺伝子を含有する。これは、ｈｌｙプロモーター、ｈｌｙ遺伝子の最初の１．３ｋｂ（タンパク質ＬＬＯをコードする）、およびＨＰＶ−１６  Ｅ７遺伝子を含有する。ｈｌｙの最初の１．３ｋｂは、シグナル配列（ｓｓ）およびＰＥＳＴ領域を含む。Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、ｈｌｙプロモーター、シグナル配列、ならびにＰＥＳＴおよびＥ７配列を含むが、残りの切断ＬＬＯ遺伝子は除外する。Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７はＰＥＳＴ領域を除外するが、ｈｌｙプロモーター、シグナル配列、Ｅ７、および切断ＬＬＯの残りを含有する。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、ｈｌｙプロモーター、シグナル配列、およびＥ７のみを有する。（図６Ｂ）上のパネル：リステリア構築体は、腫瘍退行を誘発するＰＥＳＴ領域を含有する。下のパネル：２つの別個の実験での腫瘍チャレンジ後２８日目における平均腫瘍サイズ。（図６Ｃ）脾臓内にＥ７特異的なリンパ球のより高いパーセンテージを誘発するＰＥＳＴ領域を含有するリステリア構築体。３つの実験からのデータの平均およびＳＥが図示される。
【図６Ａ２】同上
【図６Ｂ】同上
【図６Ｃ】同上
【図７Ａ】（図７Ａ）ＴＣ−１腫瘍細胞を投与し、これに続いてＬｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、もしくはＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７を投与した、またはワクチンを投与しなかった（無処置）マウスでの、脾臓内でのＥ７特異的なＩＦＮ−ガンマ−分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導、および腫瘍に浸透する数。（図７Ｂ）図７Ａに記述したマウスの脾臓および腫瘍でのＥ７特異的ＣＤ８＋細胞の誘導および浸透。
【図７Ｂ】同上
【図８Ａ】腫瘍の中のＥ７特異的リンパ球のより高いパーセンテージを誘発するＰＥＳＴ領域を含有するリステリア構築体。（図８Ａ）１つの実験からの代表的データ。（図８Ｂ）３つのすべての実験からのデータの平均およびＳＥ。
【図８Ｂ】同上
【図９】実施例６で提示された治療で患者において観察された有効性を示す、コホート１および２からのデータ。
【図１０Ａ】（図１０Ａ）ｋｌｋ３統合およびＡｃｔＡ欠失の後でのＬｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３の染色体領域の概略図を示す。（図１０Ｂ）ｋｌｋ３遺伝子がＬｍｄｄおよびＬｍｄｄＡ染色体に統合されている。ｋｌｋ３特異的プライマーを使用した、それぞれの構築体からの染色体ＤＮＡ調製物からのＰＣＲでは、ｋｌｋ３遺伝子に対応する７１４  ｂｐの帯域が増幅され、野生型タンパク質の分泌シグナル配列が欠失している。
【図１０Ｂ】同上
【図１１Ａ】（図１１Ａ）ｐＡＤＶ１３４プラスミドのマップである。（図１１Ｂ）ＬｍｄｄＡ−１３４培養上清からのタンパク質を沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＬＬＯ−Ｅ７タンパク質が抗Ｅ７モノクローナル抗体を使用したウエスタンブロットにより検出された。抗原発現カセットは、ｈｌｙプロモーター、切断ＬＬＯのためのＯＲＦおよびヒトＰＳＡ遺伝子（ｋｌｋ３）から構成される。（図１１Ｃ）ｐＡＤＶ１４２プラスミドのマップである。（図１１Ｄ）抗ＰＳＡおよび抗ＬＬＯ抗体を使用してＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の発現を示したウエスタンブロットである。
【図１１Ｂ】同上
【図１１Ｃ】同上
【図１１Ｄ】同上
【図１２Ａ】（図１２Ａ）選択圧のある場合とない場合とで培養した場合の、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのインビトロでのプラスミド安定性を示す（Ｄ−アラニン）。株および培養条件が先にリストされ、ＣＦＵ決定に使用されたプレートが後でリストされている。（図１２Ｂ）インビボでのＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの除去、およびこの間の潜在的なプラスミド損失を評価したものである。細菌は静脈内に注入され、示された時点で脾臓から隔離された。ＣＦＵは、ＢＨＩおよびＢＨＩ＋Ｄ−アラニンの各プレート上で決定された。
【図１２Ｂ】同上
【図１３Ａ】（図１３Ａ）１０８のＣＦＵをＣ５７ＢＬ／６マウスに投与した後での、株ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのインビボでの除去を示す。ＣＦＵの数は、ＢＨＩ／ｓｔｒプレート上でのプレーティングにより決定された。この方法での検出限界は１００  ＣＦＵであった。（図１３Ｂ）１０４０３Ｓ、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡおよびＸＦＬ７菌株を用いたＪ７７４細胞の細胞感染アッセイ。
【図１３Ｂ】同上
【図１４Ａ】（図１４Ａ）ブースター投与後６日目における無処置およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化マウスの脾細胞内のＰＳＡ四量体特異的な細胞を示す。（図１４Ｂ）無処置およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化マウスの脾細胞内のＩＦＮ−γについての細胞内サイトカイン染色が、ＰＳＡペプチドで５ｈにわたり刺激された。異なるエフェクター／標的比での、カスパーゼをベースにしたアッセイ（図１４Ｃ）およびユーロピウムをベースにしたアッセイ（図１４Ｄ）を使用して、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化マウスおよび無処置マウスからのインビトロで刺激したエフェクターＴ細胞を含むＰＳＡペプチドでパルスしたＥＬ４細胞の特異的溶解である。ＰＳＡペプチドの存在下またはペプチドなし（図１４Ｅ）で、刺激後２４時間にわたり取得した、無処置および免疫化の脾細胞内のＩＦＮγスポット数。
【図１４Ｂ】同上
【図１４Ｃ】同上
【図１４Ｄ】同上
【図１４Ｅ】同上
【図１５Ａ】ＬｍｄｄＡ−１４２での免疫化が、Ｔｒａｍｐ−Ｃ１−ＰＳＡ（ＴＰＳＡ）腫瘍の退行の誘発。マウスは、未処置のまま（ｎ＝８）（図１５Ａ）または７日目、１４日目および２１日目にＬｍｄｄＡ−１４２（１×１０８ＣＦＵ／マウス）（ｎ＝８）（図１５Ｂ）もしくはＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（ｎ＝８）（図１５Ｃ）で腹腔内で免疫化した。腫瘍のサイズが個別の各腫瘍について測定され、および値はミリメートル単位での平均直径で表現している。それぞれの線は個別のマウスを示す。
【図１５Ｂ】同上
【図１５Ｃ】同上
【図１６Ａ】（図１６Ａ）未処置マウスおよびＬｍ対照株またはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（ＬｍｄｄＡ−１４２）のいずれかで免疫化したマウスの脾臓および浸潤性Ｔ−ＰＳＡ−２３腫瘍内のＰＳＡ−四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の分析を示す。（図１６Ｂ）未処置マウスおよびＬｍ対照株またはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのいずれかで免疫化したマウスの脾臓および浸潤性Ｔ−ＰＳＡ−２３腫瘍内での、ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋として定義されたＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の分析。
【図１６Ｂ】同上
【図１７Ａ】（図１７Ａ）ｋｌｋ３統合およびＡｃｔＡ欠失の後でのＬｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３の染色体領域の概略図を示す。（図１７Ｂ）ｋｌｋ３遺伝子がＬｍｄｄおよびＬｍｄｄＡ染色体に統合されている。ｋｌｋ３特異的プライマーを使用した各構築体からの染色体ＤＮＡ調製物からのＰＣＲでは、ｋｌｋ３遺伝子に対応する７６０  ｂｐの帯域が増幅されている。
【図１７Ｂ】同上
【図１８Ａ】（図１８Ａ）Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３がＬＬＯ−ＰＳＡタンパク質を分泌することを示す。細菌培養上清からのタンパク質を沈殿させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離させ、抗ＬＬＯおよび抗ＰＳＡ抗体を使用してウエスタンブロットにより検出したＬＬＯおよびＬＬＯ−ＰＳＡタンパク質。（図１８Ｂ）Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３により生成されたＬＬＯでは溶血活性が保持された。ヒツジ赤血球が細菌培養上清の段階希釈で培養され、溶血活性が５９０ｎｍでの吸光度により測定された。（図１８Ｃ）Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３がマクロファージ様のＪ７７４細胞内部で成長した。Ｊ７７４細胞が、ゲンタマイシン治療によって細胞外細菌を殺した後１時間にわたり、細菌と共に培養された。表示した時点で獲得したＪ７７４溶菌液の段階希釈のプレーティングにより、細胞内増殖が測定された。これらの実験でＬｍ  １０４０３Ｓが対照として使用された。
【図１８Ｂ】同上
【図１８Ｃ】同上
【図１９】Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３でのマウスの免疫化がＰＳＡ特異的な免疫応答を誘発する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスが、１×１０８ＣＦＵのＬｍｄｄ−１４３、ＬｍｄｄＡ−１４３またはＬｍｄｄＡ−１４２で１週間間隔で２回免疫化され、７日後に脾臓が収穫された。脾細胞が、モネンシンの存在下で、１  μＭのＰＳＡ６５−７４ペプチドで、５時間にわたり刺激された。細胞はＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ６２Ｌおよび細胞内ＩＦＮ−γについて染色され、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ血球計算器で分析された。
【図２０Ａ】図は、腫瘍内でのＭＤＳＣおよびＴｒｅｇの減少を示す。Ｌｍワクチン接種（ＬｍｄｄＡ−ＰＳＡおよびＬｍｄｄＡ−Ｅ７）後のＭＤＳＣ（図２０Ｂ）およびＴｒｅｇ（図２０Ａ）の数。
【図２０Ｂ】同上
【図２１Ａ】図は、リステリアワクチン接種後、ＴＰＳＡ２３腫瘍（ＰＳＡ発現腫瘍）からの単球性ＭＤＳＣがより抑制的でなくなることを実証する抑制因子アッセイデータを示す。ＰＳＡ抗原特異的なＴ細胞および非特異的に刺激されているＴ細胞でも同一の抑制減少が見られるので、ＭＤＳＣの抑制能力の変化は抗原特異的ではない。図２１Ａおよび図２１Ｂでは、ホルボールミリステートアセテートおよびイオノマイシン（ＰＭＡ／Ｉ）は非特異的な刺激を表す。図２１Ｃおよび図２１Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図２１Ａおよび図２１Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図２１Ｂおよび図２１Ｄは、プールした分裂サイクルを示す。
【図２１Ｂ】同上
【図２１Ｃ】同上
【図２１Ｄ】同上
【図２２Ａ】リステリアが脾臓の単球性ＭＤＳＣには効果がなく、またこれらは単に抗原特異的な様式で抑制的であるのにすぎないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図２２Ａおよび図２２Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図２２Ｃおよび図２２Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図２２Ａおよび図２２Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図２２Ｂおよび図２２Ｄは、プールした分裂サイクルを示す。
【図２２Ｂ】同上
【図２２Ｃ】同上
【図２２Ｄ】同上
【図２３Ａ】リステリアワクチン接種の後、腫瘍からの顆粒球性のＭＤＳＣがＴ細胞を抑制する能力の減少を有することを実証する抑制因子アッセイデータを示す。ＰＳＡ抗原特異的なＴ細胞および非特異的に刺激されているＴ細胞でも同一の抑制減少が見られるので、ＭＤＳＣの抑制能力の変化は抗原特異的ではない。図２３Ａおよび図２３Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図２３Ｃおよび図２３Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図２３Ａおよび図２３Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図２３Ｂおよび図２３Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２３Ｂ】同上
【図２３Ｃ】同上
【図２３Ｄ】同上
【図２４Ａ】リステリアが脾臓の顆粒球性ＭＤＳＣには効果がなく、またこれらは単に抗原特異的な様式でのみ抑制的であることを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図２４Ａおよび図２４Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図２４Ｃおよび図２４Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図２４Ａおよび図２４Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図２４Ｂおよび図２４Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２４Ｂ】同上
【図２４Ｃ】同上
【図２４Ｄ】同上
【図２５Ａ】腫瘍からのＴｒｅｇがまだ抑制的であることを実証する抑制因子アッセイデータを示す。この腫瘍モデルでは、非抗原特異的な様式でのＴｒｅｇの抑制能力にはわずかに減少がある。図２５Ａおよび図２５Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図２５Ｃおよび図２５Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。Ｔｒｅｇの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＴｒｅｇ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図２５Ａおよび図２５Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図２５Ｂおよび図２５Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２５Ｂ】同上
【図２５Ｃ】同上
【図２５Ｄ】同上
【図２６Ａ】脾臓のＴｒｅｇがまだ抑制的であることを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図２６Ａおよび図２６Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図２６Ｃおよび図２６Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。Ｔｒｅｇの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＴｒｅｇ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図２６Ａおよび図２６Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図２６Ｂおよび図２６Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２６Ｂ】同上
【図２６Ｃ】同上
【図２６Ｄ】同上
【図２７Ａ】それらがマウスの腫瘍で見出されたのか、または脾臓で見出されたのかに関わらず、従来のＣＤ４＋Ｔ細胞が細胞分裂には効果がないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図２７Ａおよび図２７Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図２７Ｃおよび図２７Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。Ｔｒｅｇの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＴｒｅｇ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図２７Ｃ〜図２７Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分からのデータを示す。
【図２７Ｂ】同上
【図２７Ｃ】同上
【図２７Ｄ】同上
【図２８Ａ】リステリアワクチン接種後、４Ｔ１腫瘍（Ｈｅｒ２発現腫瘍）からの単球性ＭＤＳＣが、抑制能力の減少を有することを実証する抑制因子アッセイデータを示す。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原特異的なＴ細胞および非特異的に刺激されているＴ細胞でも同一の抑制減少が見られるので、ＭＤＳＣの抑制能力の変化は抗原特異的ではない。図２８Ａおよび図２８Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図２８Ｃおよび図２８Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図２８Ａおよび図２８Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図２８Ｂおよび図２８Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２８Ｂ】同上
【図２８Ｃ】同上
【図２８Ｄ】同上
【図２９Ａ】脾臓の単球性ＭＤＳＣにはリステリア特異的な効果がないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図２９Ａおよび図２９Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図２９Ｃおよび図２９Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図２９Ａおよび図２９Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図２９Ｂおよび図２９Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２９Ｂ】同上
【図２９Ｃ】同上
【図２９Ｄ】同上
【図３０Ａ】リステリアワクチン接種後、４Ｔ１腫瘍（Ｈｅｒ２発現腫瘍）からの顆粒球性ＭＤＳＣが、抑制能力の減少を有することを実証する抑制因子アッセイデータを示す。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原特異的なＴ細胞および非特異的に刺激されているＴ細胞でも同一の抑制減少が見られるので、ＭＤＳＣの抑制能力の変化は抗原特異的ではない。図３０Ａおよび図３０Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図３０Ｃおよび図３０Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図３０Ａおよび図３０Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図３０Ｂおよび図３０Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図３０Ｂ】同上
【図３０Ｃ】同上
【図３０Ｄ】同上
【図３１Ａ】脾臓の顆粒球性ＭＤＳＣにはリステリア特異的な効果がないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図３１Ａおよび図３１Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図３１Ｃおよび図３１Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図３１Ａおよび図３１Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図３１Ｂおよび図３１Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図３１Ｂ】同上
【図３１Ｃ】同上
【図３１Ｄ】同上
【図３２Ａ】リステリアワクチン接種後、４Ｔ１腫瘍（Ｈｅｒ２発現腫瘍）からのＴｒｅｇの抑制能力の減少を有することを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図３２Ａおよび図３２Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図３２Ｃおよび図３２Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。この減少は、Ｔｒｅｇの抑制能力の変化はＨｅｒ２／ｎｅｕ特異的なレスポンダーＴ細胞と非特異的なレスポンダーＴ細胞との両方で見られるので、抗原特異的ではない。図３２Ａおよび図３２Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図３２Ｂおよび図３２Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図３２Ｂ】同上
【図３２Ｃ】同上
【図３２Ｄ】同上
【図３３Ａ】脾臓のＴｒｅｇにはリステリアに特異的な効果がないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。レスポンダーＴ細胞は、抗原特異的であるかどうかに関わらず、すべてが分裂の能力を有する。図３３Ａおよび図３３Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図３３Ｃおよび図３３Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。図３３Ａおよび図３３Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図３３Ｂおよび図３３Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図３３Ｂ】同上
【図３３Ｃ】同上
【図３３Ｄ】同上
【図３４Ａ】顆粒球性ＭＤＳＣの抑制能力がｔＬＬＯの過剰発現に起因し、融合抗原の組合せとは関係が無いことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。左側のパネル（図３４Ａおよび図３４Ｃ）は、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。右側のパネル（図３４Ｂおよび図３４Ｄ）は、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図３４Ｂ】同上
【図３４Ｃ】同上
【図３４Ｄ】同上
【図３５Ａ】単球性ＭＤＳＣの抑制能力もｔＬＬＯの過剰発現に起因し、融合抗原の組合せとは関係が無いことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。左側のパネル（図３５Ａおよび図３５Ｃ）は、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。右側のパネル（図３５Ｂおよび図３５Ｄ）は、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図３５Ｂ】同上
【図３５Ｃ】同上
【図３５Ｄ】同上
【図３６Ａ】Ｌｍワクチン接種の後、脾臓から精製された顆粒球性のＭＤＳＣがその抗原特異的なレスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力を保持することを実証する抑制因子アッセイデータを示す（図３６Ａおよび図３６Ｂ）。しかしながら、非特異的な刺激後、活性化したＴ細胞（ＰＭＡ／イオノマイシンを用いて）は、依然として分裂の能力を有している（図３６Ｃおよび図３６Ｄ）。左側のパネルは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。右側のパネルは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図３６Ｂ】同上
【図３６Ｃ】同上
【図３６Ｄ】同上
【図３７Ａ】Ｌｍワクチン接種の後、脾臓から精製された単球性のＭＤＳＣがその抗原特異的なレスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力を保持することを実証する抑制因子アッセイデータを示す（図３７Ａおよび図３７Ｂ）。しかしながら、非特異的な活性化（ＰＭＡ／イオノマイシンによって刺激された）後、Ｔ細胞は、依然として分裂の能力を有している（図３７Ｃおよび図３７Ｄ）。左側のパネルは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。右側のパネルは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図３７Ｂ】同上
【図３７Ｃ】同上
【図３７Ｄ】同上
【図３８Ａ】レスポンダー細胞が抗原特異的（図３８Ａおよび図３８Ｂ）に活性化されるか、または非特異的（図３８Ｃおよび図３８Ｄ）に活性化されるかに関わらず、Ｌｍで処置した群のいずれかの腫瘍から精製したＴｒｅｇのレスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力がわずかに減退したことを実証するための抑制因子アッセイデータを示す。左側のパネルは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。右側のパネルは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図３８Ｂ】同上
【図３８Ｃ】同上
【図３８Ｄ】同上
【図３９Ａ】脾臓から精製したＴｒｅｇがまだ抗原特異的（図３９Ａ〜図３９Ｂ）、および非特異的（図３９Ｃおよび図３９Ｄ）の両方で活性化したレスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力を有することを実証する抑制因子アッセイデータを示す。
【図３９Ｂ】同上
【図３９Ｃ】同上
【図３９Ｄ】同上
【図４０Ａ】レスポンダー細胞が抗原特異的に活性化した（図４０Ａおよび図４０Ｂ）か、または非特異的に活性化した（図４０Ｃおよび図４０Ｄ）かに関わらず、腫瘍Ｔｃｏｎ細胞がＴ細胞の分裂を抑制する能力を有しないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。
【図４０Ｂ】同上
【図４０Ｃ】同上
【図４０Ｄ】同上
【図４１Ａ】レスポンダー細胞が抗原特異的に活性化した（図４１Ａおよび図４１Ｂ）か、または非特異的に活性化した（図４１Ｃおよび図４１Ｄ）かに関わらず、脾臓Ｔｃｏｎ細胞がＴ細胞の分裂を抑制する能力を有しないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。
【図４１Ｂ】同上
【図４１Ｃ】同上
【図４１Ｄ】同上
【図４２Ａ】（図４２Ａ）  リステリアベースのワクチン（ＡＤＸＳ１１A、すなわちＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７）と抗ＯＸ４０抗体の組み合わせの投与を受けるマウスの治療スケジュールの概略図であり、ここで腫瘍増殖およびマウスの生存率が実験全体を通してモニタリングされた。（図４２Ａ）リステリアベースのワクチン（ＡＤＸＳ１１A、すなわちＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７）と抗ＧＩＴＲ抗体の組み合わせの投与を受けるマウスの治療スケジュールの概略図であり、ここで実験全体を通して腫瘍増殖およびマウスの生存率をモニターした。０日目のマウスで（図４２Ａ）および（図４２Ｂ）について、７×１０５のＴＣ−１腫瘍細胞が注射され、腫瘍形成が開始された。ワクチン接種は１０日目に開始された。対照には、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯおよびリステリア株ＸＦＬ７が含まれる。（図４２Ａ）は、抗ＯＸ４０抗体が実験期間全体を通して週に２回投与されたことを示す。（図４２Ｂ）は、抗ＧＩＴＲ抗体が週に２回、合計３回分の投与量が投与されたことを示す。（図４２Ｃ）は、処置なし（ＮＴ）を含めて、１２の投与レジメンを特定している。
【図４２Ｂ】同上
【図４２Ｃ】同上
【図４３】ＴＣ−１腫瘍がＣ５７ＢＬ／６マウスの腹側の皮下（ｓ．ｃ．）に移植された。腫瘍体積が約０．０６  ｃｍ３に達した時、２回分の投与量のＬｍベースのＥ７特異的腫瘍ワクチン（１ｘ１０８  コロニー形成単位／マウス）が７日間隔で腹腔内（ｉ．ｐ．）投与された。ＧＩＴＲ（５ｍｇ／Ｋｇ  ｂ．ｗｔ．、合計４回分の投与量）およびＯＸ４０（１ｍｇ／Ｋｇ  ｂ．ｗｔ．、実験全体を通して）抗体が、ワクチンと共に開始して週に２回腹腔内に注射された。腫瘍サイズが週に２回測定された。腫瘍増殖（図４３Ａ）および生存率（図４３Ｂ）を示す。Ｎ＝５／群。結果は、代表的な一実験からの平均±ＳＥで示されている。実験は２回繰り返された。＊ｐ≧E、＊＊ｐ≧A、＊＊＊＊ｐ≧０．０００１。
【図４４】ＴＣ−１腫瘍がＣ５７ＢＬ／６マウスの腹側の皮下（ｓ．ｃ．）に移植された。腫瘍体積が約０．０６  ｃｍ３に達した時、２回分の投与量のＬｍベースのＥ７特異的腫瘍ワクチン（１ｘ１０８  コロニー形成単位／マウス）が７日間隔で腹腔内（ｉ．ｐ．）投与された。ＯＸ４０（１ｍｇ／Ｋｇ  ｂ．ｗｔ．、実験全体を通して）抗体が、ワクチンと共に開始して週に２回腹腔内に注射された。腫瘍サイズが週に２回測定された。腫瘍増殖（図４４Ａ）および生存率（図４４Ｂ）を示す。Ｎ＝５／群。結果は、代表的な一実験からの平均±ＳＥで示されている。実験は２回繰り返された。＊ｐ≧E、＊＊ｐ≧A、＊＊＊＊ｐ≧０．０００１。
【図４５】抗ＧＩＴＲ  Ａｂとリステリアベースのワクチン療法の組み合わせについてのワクチン投与研究の概略図である。
【図４６Ａ】図４６Ａは、異なる療法群による腫瘍浸潤性ＣＤ４＋  Ｔ細胞の数を示す棒グラフである。図４６Ｂは、異なる療法群による腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋）細胞の数を示す棒グラフである。
【図４６Ｂ】同上
【図４７Ａ】図４７Ａは、異なる療法群による腫瘍浸潤性トータル非Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−）細胞の数を示す棒グラフである。図４７Ｂは、異なる療法群による腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇ  ＦｏｘＰ３＋のＣＤ４＋細胞に対する比率を示す棒グラフである。
【図４７Ｂ】同上
【図４８Ａ】図４８Ａは、異なる療法群による腫瘍浸潤性ＣＤ８＋  Ｔ細胞の数を示す棒グラフである。図４８Ｂは、異なる療法群による腫瘍浸潤性Ｅ７特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞（抗原特異的）の数を示す棒グラフである。
【図４８Ｂ】同上
【図４９Ａ】図４９Ａは、異なる療法群によるＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ細胞の比を示す棒グラフである。図４９Ｂは、異なる療法群によるＥ７＋ＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ細胞の比を示す棒グラフである。
【図４９Ｂ】同上
【図５０Ａ】図５０Ａは、異なる療法群による腫瘍浸潤性骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の数を示す棒グラフである。図５０Ｂは、異なる療法群による腫瘍浸潤性ＣＤ８／ＭＤＳＣの比を示す棒グラフである。図５０Ｃは、異なる療法群による抗原  特異的腫瘍浸潤性Ｅ７−ＣＤ８／ＭＤＳＣの比を示す棒グラフである。
【図５０Ｂ】同上
【図５０Ｃ】同上
【図５１】抗ＯＸ４０  Ａｂとリステリアベースのワクチン療法の組み合わせのためのワクチン投与研究の概略図である。
【図５２Ａ】図５２Ａは、異なる療法群による腫瘍浸潤性ＣＤ４＋  Ｔ細胞の数を示す棒グラフである。図５２Ｂは、異なる療法群による腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋）細胞の数を示す棒グラフである。
【図５２Ｂ】同上
【図５３Ａ】図５３Ａは、異なる療法群による腫瘍浸潤性トータル非Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−）細胞の数を示す棒グラフである。図５３Ｂは、異なる療法群による腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇ  ＦｏｘＰ３＋のＣＤ４＋細胞に対する比率を示す棒グラフである。
【図５３Ｂ】同上
【図５４Ａ】図５４Ａは、異なる療法群による腫瘍浸潤性ＣＤ８＋  Ｔ細胞の数を示す棒グラフである。図５４Ｂは、異なる療法群による腫瘍浸潤性Ｅ７特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞（抗原  特異的）の数を示す棒グラフである。
【図５４Ｂ】同上
【図５５Ａ】図５５Ａは、異なる療法群によるＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ細胞の比を示す棒グラフである。図５５Ｂは、異なる療法群によるＥ７＋ＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ細胞の比を示す棒グラフである。
【図５５Ｂ】同上
【図５６Ａ】図５６Ａは、異なる療法群による腫瘍浸潤性骨髄由来免疫抑制細胞抑制細胞（ＭＤＳＣ）の数を示す棒グラフである。図５６Ｂは、異なる療法群による腫瘍浸潤性ＣＤ８／ＭＤＳＣの比を示す棒グラフである。図５６Ｃは、異なる療法群による抗原  特異的腫瘍浸潤性Ｅ７−ＣＤ８／ＭＤＳＣの比を示す棒グラフである。
【図５６Ｂ】同上
【図５６Ｃ】同上
【図５７Ａ】ＡＤＸＳ３１−１６４の構築。（図５７Ａ）構造性のリステリアｐ６０プロモーターの制御下で、ＬｍｄｄＡ株内の染色体のｄａｌ−ｄａｔ欠失の相補のために、バシラスサチリスｄａｌ遺伝子を寄生するｐＡｄｖ１６４のプラスミドのマップ。これは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの３つの断片：ＥＣ１（ａａ  ４０−１７０）、ＥＣ２（ａａ  ３５９−５１８）およびＩＣＩ（ａａ  ６７９−８０８）の直接融合によって構造化された、切断ＬＬＯ（１−４４１）のキメラ型ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子への融合も含有する。（図５７Ｂ）抗ＬＬＯ抗体でブロットしたＴＣＡ沈殿した細胞培養上清のウエスタンブロット解析によって、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８）およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（ＡＤＸＳ３１−１６４）内でｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌が検出された。〜１０４  ＫＤの差を示す帯はｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２に対応する。内因性のＬＬＯは、５８  ＫＤ帯として検出される。リステリア対照はＣｈＨｅｒ２発現を欠いている。
【図５７Ｂ】同上
【図５８Ａ】ＡＤＸＳ３１−１６４の免疫原性特性（図５８Ａ）ＮＴ−２細胞を刺激薬として使用し、かつ３Ｔ３／ｎｅｕ細胞を標的として使用して、免疫化マウスからの脾細胞内でＨＥＲ２／ｎｅｕリステリアベースのワクチンによって引き出された細胞毒性Ｔ細胞応答を試験した。Ｌｍ−対照は、すべてのやり方で同一であるが、無関連の抗原（ＨＰＶ１６−Ｅ７）が発現される、ＬｍｄｄＡバックグラウンドに基づく。（図５８Ｂ）脾細胞によって免疫化ＦＶＢ／Ｎマウスから細胞培地の中へと分泌されたＩＦＮ−・が、ＮＴ−２細胞によって処置されたマイトマイシンＣを用いたインビトロの刺激の２４時間後、ＥＬＩＳＡによって測定された。（図５８Ｃ）インビトロでのタンパク質の異なる領域からのペプチドを用いたインキュベーションに応答する、キメラワクチンを用いて免疫化したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスからの脾細胞によるＩＦＮ−・分泌。図の凡例にリスト表示したように、組み換え型ＣｈＨｅｒ２タンパク質が正の対照として使用され、無関連ペプチドまたはペプチドを含まない群が負の対照を構成要素とした。コインキュベーションの７２時間後に採取した細胞培養上清を使用するＥＬＩＳＡアッセイによって、ＩＦＮ−γ分泌が検出された。各々のデータ点は、３倍のデータ＋／−標準誤差の平均であった。＊Ｐ値＜０A。
【図５８Ｂ】同上
【図５８Ｃ】同上
【図５９】リステリア−ＣｈＨｅｒ２／ｎｅｕワクチンのための腫瘍防止研究Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスに各々組み換え型リステリア−ＣｈＨｅｒ２または対照リステリアワクチンを６回注射した。生後６週で免疫化を開始し、２１週目まで３週ごとに継続した。腫瘍の外観を毎週観察して、腫瘍を有しないマウスのパーセンテージで表現した。＊ｐ＜E、グループ当たりＮ＝９。
【図６０】脾臓中のＴｒｅｇの％で示したＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化の効果。ＦＶＢ／Ｎマウスに１×１０６ＮＴ−２細胞を用いて皮下で接種し、各々のワクチンを用いて一週間間隔で３回免疫化した。第２の免疫化の７日後、脾臓を採取した。免疫細胞の分離後、Ｔｒｅｇの検出のために、抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦｏｘＰ３抗体によってこれらを染色した。代表的な実験からのＴｒｅｇのドットプロットは、異なる治療群の間での全ＣＤ３＋またはＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するパーセンテージとして表されるＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度を示す。
【図６１Ａ】ＮＴ−２腫瘍内の腫瘍浸潤Ｔｒｅｇの％で示したＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化の効果。ＦＶＢ／Ｎマウスに１×１０６ＮＴ−２細胞を用いて皮下で接種し、各々のワクチンを用いて一週間間隔で３回免疫化した。第２の免疫化の７日後に腫瘍を採取した。免疫細胞の分離後、Ｔｒｅｇの検出のために、抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦｏｘＰ３抗体によってこれらを染色した。（図６１Ａ）代表的な実験からのＴｒｅｇのドットプロット。図６１Ｂ。異なる投与群にわたって全ＣＤ３＋またはＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（左のパネル）、および腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比（右のパネル）に対するパーセンテージとして表される、ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度。データは、２つの独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示される。
【図６１Ｂ】同上
【図６２Ａ】ＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種は乳ガン細胞株の脳内での増殖を遅延することができる。Ｂａｌｂ／ｃマウスにＡＤＸＳ３１−１６４または対照リステリアワクチンを用いて３回免疫化した。ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞（５，０００）を麻酔をかけたマウスの頭蓋内に注射した。（図６２Ａ）示された日にＸｅｎｏｇｅｎ  Ｘ−１００  ＣＣＤカメラを使用してマウスのエクスビボ撮像を遂行した。（図６２Ｂ）ピクセルの輝度は、１秒当たり表面積１平方ｃｍ当たりの光子数としてグラフ表示され、平均放射輝度として提示される。（図６２Ｃ）ウエスタンブロットによって、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体を使用して、ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞、４Ｔ１−Ｌｕｃ、およびＮＴ−２細胞株によるＨＥＲ２／ｎｅｕの発現が検出された。Ｊ７７４．Ａ２細胞、マウスのマクロファージ様細胞株を負の対照として使用した。
【図６２Ｂ】同上
【図６２Ｃ】同上
【図６３】予め確立されたＦＶＢ／Ｎ  ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＮＴ−２腫瘍マウスモデルのための治療スケジュールを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
図示の単純化および明瞭化のために図に示される要素は必ずしも実寸に比例していないことを理解されたい。例えば、一部の要素の寸法は、明瞭化のために他の要素に対して相対的に誇張されている場合がある。さらに、適切と考えられる場合には、参照番号は対応するかまたは類似する要素を示す図の間で繰り返される場合がある。
【００２３】
以下の発明を実施するための形態では、本発明の完全な理解を提供するために多数の具体的な詳細が示される。しかしながら、本開示はこれらの具体的な詳細を含まずに実施されうることが当業者には理解されるであろう。他の事例では、本開示を不明瞭にしないために周知の方法、手順、および構成成分は詳細には記述されていない。
【００２４】
一態様では、核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物が開示されており、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、ここで前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含み、また組成物はさらに抗体またはその断片を含む。
【００２５】
一実施形態では、本明細書で開示されている抗体またはその断片は作動薬抗体である。別の実施形態では、抗体またはその断片は抗ＴＮＦ受容体抗体である。別の実施形態では、抗体またはその断片は作動薬抗ＴＮＦ受容体抗体である。
【００２６】
別の実施形態では、本明細書では核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物が開示されており、核酸分子は切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列をコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、ここで組成物はさらに作動薬抗ＴＮＦ受容体抗体またはその断片を含む。さらなる実施形態では、リステリア株内に含まれる核酸分子は、融合ポリペプチドをコードしない。
【００２７】
別の実施形態では、作動薬抗体またはその断片、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物が本明細書で開示されており、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、ここで前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。
【００２８】
別の実施形態では、本明細書では、作動薬抗ＴＮＦ受容体抗体またはその断片、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物が開示されており、核酸分子は切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列コードする第一のオープンリーディングフレームを含む。さらなる実施形態では、リステリア株内に含まれる核酸分子は、融合ポリペプチドをコードしない。
【００２９】
一実施形態では、作動薬抗体またはその断片は、Ｔ細胞受容体共刺激分子を含む異種抗原またはその部分に結合される。よって、別の実施形態では、Ｔ細胞受容体共刺激分子を結合する、作動薬抗体またはその断片、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物が本明細書で開示されており、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、ここで前記融合ポリペプチドは、切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。
【００３０】
なお別の実施形態では、本明細書では、Ｔ細胞受容体共刺激分子を結合する、作動薬抗体またはその断片、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物が開示されており、核酸分子は切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列コードする第一のオープンリーディングフレームを含む。さらなる実施形態では、リステリア株内に含まれる核酸分子は、融合ポリペプチドをコードしない。
【００３１】
別の実施形態では、開示された作動薬抗体またはその断片は、共刺激分子を結合する抗原提示細胞受容体を含む抗原またはその部分に結合される。よって、別の実施形態では、抗原提示細胞受容体共刺激分子を結合する作動薬抗体またはその断片、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物が開示されており、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、ここで前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合される切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は、共刺激分子を結合する抗原提示細胞受容体、作動薬抗体またはその断片、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含み、核酸分子は切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列コードする第一のオープンリーディングフレームを含む。さらなる実施形態では、リステリア株内に含まれる核酸分子は、融合ポリペプチドをコードしない。
【００３２】
別の実施形態では、作動薬抗体またはその断片は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバーを含む抗原またはその部分に結合される。よって、別の実施形態では、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーを結合する、作動薬抗体またはその断片、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物が開示されており、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、ここで前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合される切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーを結合する作動薬抗体またはその断片、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含み、核酸分子は切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列コードする第一のオープンリーディングフレームを含む。さらなる実施形態では、リステリア株内に含まれる核酸分子は、融合ポリペプチドをコードしない。
【００３３】
一態様では、被験者において抗腫瘍Ｔ細胞応答の増強を誘発するための方法が開示されており、方法は、核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む有効量の免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、ここで前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含み、ここで方法はさらに、抗体またはその断片を含む有効量の組成物を前記被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、抗腫瘍Ｔ細胞応答の増強を誘発するための方法の一部としての組み換え型リステリア株の投与は切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列コードする第一のオープンリーディングフレームを含む核酸分子を含む。さらなる実施形態では、第一のオープンリーディングフレームは、融合ポリペプチドをコードしない。
【００３４】
別の態様では、被験者において腫瘍媒介の免疫抑制を阻害する方法が開示されており、方法は、核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む有効量の免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、ここで前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含み、ここで方法はさらに、抗体またはその断片を含む有効量の組成物を前記被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、被験者において腫瘍媒介の免疫抑制を阻害するための方法の一部としての組み換え型リステリア株の投与は切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列コードする第一のオープンリーディングフレームを含む核酸分子を含む。さらなる実施形態では、第一のオープンリーディングフレームは、融合ポリペプチドをコードしない。
【００３５】
別の態様では、被験者の脾臓および腫瘍においてＴエフェクター細胞のせいｇｙＴ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増大する方法が開示されており、方法は、核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、ここで前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含み、ここで方法はさらに、抗体またはその断片を含む有効量の組成物を前記被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、被験者の脾臓および腫瘍においてＴエフェクター細胞の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増大する方法の一部としての組み換え型リステリア株の投与は切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列コードする第一のオープンリーディングフレームを含む核酸分子を含む。さらなる実施形態では、第一のオープンリーディングフレームは、融合ポリペプチドをコードしない。
【００３６】
別の態様では、被験者において抗原特異的Ｔ細胞を増加させる方法が開示されており、方法は、核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、ここで前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含み、ここで方法はさらに、抗体またはその断片を含む有効量の組成物を前記被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、被験者においてＴ細胞を増加するための方法の一部としての組み換え型リステリア株の投与は切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列コードする第一のオープンリーディングフレームを含む核酸分子を含む。さらなる実施形態では、第一のオープンリーディングフレームは、融合ポリペプチドをコードしない。
【００３７】
別の態様では、腫瘍を有するかまたはガンに罹患している被験者の生存時間を延長する方法が開示されており、方法は、核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、ここで前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含み、ここで方法はさらに、抗体またはその断片を含む有効量の組成物を前記被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、腫瘍を有するかまたはガンに罹患している被験者の生存時間を延長する方法の一部としての組み換え型リステリア株の投与は切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列コードする第一のオープンリーディングフレームを含む核酸分子を含む。さらなる実施形態では、第一のオープンリーディングフレームは、融合ポリペプチドをコードしない。
【００３８】
別の態様では、被験者における腫瘍またはガンを治療する方法が開示されており、方法は、核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、ここで前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含み、ここで方法はさらに、抗体またはその断片を含む有効量の組成物を前記被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、被験者における腫瘍またはガンを治療する方法の一部としての組み換え型リステリア株の投与は切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列コードする第一のオープンリーディングフレームを含む核酸分子を含む。さらなる実施形態では、第一のオープンリーディングフレームは、融合ポリペプチドをコードしない。
【００３９】
組み換え型リステリア株
一実施形態では、本発明の組み換え型リステリア株は核酸分子を含み、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された異種抗原またはその断片に融合された切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本発明の組み換え型リステリア株は核酸分子を含み、核酸分子は切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列コードする第一のオープンリーディングフレームを含む。一実施形態では、組み換え型リステリア株は、弱毒化されている。
【００４０】
別の実施形態では、切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列は、異種抗原またはその断片に融合されない。
【００４１】
一実施形態では、切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質はＰＥＳＴ配列を含む。別の実施形態では、切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質は推定上のＰＥＳＴ配列を含む。一実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質はＰＥＳＴを含むアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は推定上のＰＥＳＴを含むアミノ酸配列を含む。
【００４２】
一実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸（ＡＡ）配列は切断ＬＬＯ配列を含む。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列はＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫ（配列番号：１）である。別の実施形態では、リステリアから他のＬＭ  ＰＥＳＴ  ＡＡ配列への抗原の融合は、抗原の免疫原性も強化する。
【００４３】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＮ末端ＬＬＯタンパク質断片は配列番号：３を含む。別の実施形態では、断片はＬＬＯシグナルペプチドを含む。別の実施形態では、断片は配列番号：４を含む。別の実施形態では、断片は配列番号：４からほぼ構成される。別の実施形態では、断片は配列番号：４から本質的に構成される。別の実施形態では、断片は配列番号：４に対応する。別の実施形態では、断片は配列番号：４と相同である。別の実施形態では、断片は配列番号：４の断片と相同である。いくつかの実施例で使用されるΔＬＬＯは、システイン４８４を含有する活性化ドメインを含むアミノ末端からの８８個の残基が切断されたので、４１６  ＡＡ長さ（シグナル配列を含まない）であった。活性化ドメインを有しない、そして特にシステイン４８４を有しない任意のΔＬＬＯは本発明の方法および組成物のために好適であることが当業者には明らかであろう。別の実施形態では、ＰＥＳＴ  ＡＡ配列、配列番号：１を含む、異種抗原の任意のΔＬＬＯへの融合は、媒介される細胞、および抗原の抗腫瘍免疫性を強化する。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００４４】
「ＰＥＳＴ配列含有ペプチド」という用語は、ＰＥＳＴ配列ペプチドまたはそのＬＬＯタンパク質もしくはＡｃｔＡタンパク質のペプチド断片を包含する場合があることを当業者は理解するであろう。ＰＥＳＴ配列ペプチドは、当該技術分野で既知であり、また米国特許第７，６３５，４７９号、および米国特許公開整理番号第２０１４／０１８６３８７号に記述され、これらの両方はその全体を本明細書組み込まれる。
【００４５】
別の実施形態では、原核生物のＰＥＳＴ配列は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対してＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ（ＴＢＳ  ２１：２６７−２７１，１９９６）によって記述されたものなどの方法を用いてルーチン的に同定することができる。あるいは、この方法に基づいて他の原核生物由来のＰＥＳＴアミノ酸配列を同定することもできる。ＰＥＳＴアミノ酸配列が期待される他の原核生物には、他のリステリア種を含むが、これに限定されない。例えば、Ｌ．モノサイトゲネスタンパク質ＡｃｔＡは４つのかかる配列を含有する。これらは、ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ（配列番号：５）、ＫＡＳＶＴＤＴＳＥＧＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫ（配列番号：６）、ＫＮＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号：７）、およびＲＧＧＩＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号：８）である。また、ストレプトコッカス株由来のストレプトリジンＯもＰＥＳＴ配列を含有する。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスストレプトリジンＯはアミノ酸３５〜５１にＰＥＳＴ配列ＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号：９）を含み、ストレプトコッカス・エクイシミリスストレプトリジンＯはアミノ酸３８〜５４にＰＥＳＴ様配列ＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号：１０）を含む。さらに、ＰＥＳＴ配列を抗原性タンパク質の中に埋め込むことができると考えられる。したがって、本発明においては、ＰＥＳＴ配列融合に関する場合、「融合」とは、抗原性タンパク質が抗原の一端にリンクするかまたは抗原の中に埋め込まれるかのいずれかで抗原とＰＥＳＴアミノ酸配列との両方を含むことを意味する。その他の実施形態では、ＰＥＳＴ配列またはＰＥＳＴ含有ポリペプチドは、融合タンパク質の一部でもなく、ポリペプチドが異種抗原を含むこともない。
【００４６】
別の実施形態では、構築体または核酸分子は、ＰＥＳＴ配列含有ポリペプチドまたはＰＥＳＴ配列ペプチドをコードする核酸配列を用いてエピソーム性ベクターまたはプラスミドベクターから発現される。別の実施形態では、抗生物質選択が無い状態で、プラスミドは組み換え型リステリア株内で安定して維持される。別の実施形態では、プラスミドは組み換え型リステリア上に抗生物質抵抗性を与えない。別の実施形態では、断片は機能的断片である。別の実施形態では、断片は免疫原性断片である。
【００４７】
本発明のワクチンを構築するために利用されるＬＬＯタンパク質は、別の実施形態では、以下の配列を有する：
【００４８】
【化１】
2018501244.tif 000002
この配列に対応するプロタンパク質の最初の２５個のＡＡはシグナル配列であり、細菌によって分泌されるときにＬＬＯから分割される。したがって、この実施形態では、全長の活性ＬＬＯタンパク質は５０４残基長である。別の実施形態では、上記のＬＬＯ断片は本発明のワクチンに組み込まれるＬＬＯ断片の供給源として使用される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００４９】
別の実施形態では、本発明の組成物および方法で利用されるＬＬＯタンパク質のＮ末端断片は、以下の配列を有する：
【００５０】
【化２】
2018501244.tif 000003
【００５１】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は本明細書で利用されるＡＡ２０〜４４２のＬＬＯタンパク質にほぼ対応する。
【００５２】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、以下の配列を有する：
【００５３】
【化３】
2018501244.tif 000004
【化４】
2018501244.tif 000005
【００５４】
別の実施形態では、「Ｎ末端ＬＬＯ断片」、「切断ＬＬＯ」、「ΔＬＬＯ」またはそれらの文法的に同等な用語は、本明細書では互換的に使用され、非溶血性であるＬＬＯの断片を意味する。別の実施形態では、これらの用語は推定ＰＥＳＴ配列を含むＬＬＯ断片を指す。
【００５５】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、活性化ドメインの欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、システイン４８４を含む領域の欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態では、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，７７１，７０２号に詳細に述べられるように、ＬＬＯは、コレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）の欠失または突然変異によって非溶血性にされる。
【００５６】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は野生型ＬＬＯタンパク質の最初の４４１  ＡＡを含む。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は野生型ＬＬＯの最初の４２０  ＡＡを含む。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は野生型ＬＬＯタンパク質の非溶血性の形態である。
【００５７】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜４００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜４２５から構成される。
【００５８】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は上記のＡＡ範囲のうちの１つに対応する相同ＬＬＯタンパク質の残基を含有する。別の実施形態では、残基番号は上記に列挙した残基番号と必ずしも正確に対応する必要はなく、例えば、相同ＬＬＯタンパク質が本明細書で利用されるＬＬＯタンパク質に対して挿入または欠失を有する場合、残基番号を適宜調節することができる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は当該技術分野で既知の任意の他のＬＬＯ断片である。
【００５９】
別の実施形態では、相同ＬＬＯは、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が７０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同ＬＬＯは、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が７２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が７５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が７８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が８０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が８２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が８３％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が８５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が８７％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が８８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が９０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が９２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が９３％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が９５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が９６％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が９７％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が９８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が９９％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＬＬＯ配列に対する同一性が１００％であることを指す。
【００６０】
別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１１に示される配列を含む。
【００６１】
【化５】
2018501244.tif 000006
この配列に対応するプロタンパク質の最初の２９個のＡＡはシグナル配列であり、細菌によって分泌されるときにＡｃｔＡタンパク質から分割される。一実施形態では、ＡｃｔＡポリペプチドまたはペプチドは、シグナル配列、上記の配列番号：１１のＡＡ  １〜２９を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡポリペプチドまたはペプチドは、シグナル配列、上記の配列番号：１１のＡＡ  １〜２９を含まない。
【００６２】
一実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質はＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片を含む。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質はＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片である。一実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１２に示される配列を含む。
【００６３】
【化６】
2018501244.tif 000007
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は配列番号：１２に示される配列を含む。
【００６４】
別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１３に示される配列を含む。
【化７】
2018501244.tif 000008
【００６５】
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は当該技術分野で既知の任意の他のＡｃｔＡ断片である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００６６】
別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質をコードする組み換え型ヌクレオチドは、配列番号：１４に示される配列を含む。
【００６７】
【化８】
2018501244.tif 000009
【化９】
2018501244.tif 000010
別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは配列番号：１４に示される配列を有する。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする任意の他の配列を含む。
【００６８】
別の実施形態では、「切断ＡｃｔＡ」または「ΔａｃｔＡ」はＰＥＳＴドメインを含むＡｃｔＡの断片を指す。別の実施形態では、これらの用語はＰＥＳＴ配列を含むＡｃｔＡ断片を指す。
【００６９】
別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、原核生物に由来する別のＰＥＳＴ  ＡＡ配列である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、当該技術分野で既知の任意の他のＰＥＳＴ配列である。
【００７０】
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はＡｃｔＡタンパク質のおよそ最初の１００  ＡＡから構成される。
【００７１】
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜７５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜１００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜１２５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜１５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜１７５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２２５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２７５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜３００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜３２５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜３３８から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜３５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜３７５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜４００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜４５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜５００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜５５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜６００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜６３９から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜１００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜１２５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜１５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜１７５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜２００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜２２５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜２５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜２７５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜３００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜３２５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜３３８から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜３５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜３７５から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜４００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜４５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜５００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜５５０から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜６００から構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜６０４から構成される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００７２】
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は上記のＡＡ範囲のうちの１つに対応する相同ＡｃｔＡタンパク質の残基を含有する。別の実施形態では、残基番号は上記に列挙した残基番号と必ずしも正確に対応する必要はなく、例えば、相同ＡｃｔＡタンパク質が本明細書で利用されるＡｃｔＡタンパク質に対して挿入または欠失を有する場合、残基番号を適宜調節することができる。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は当該技術分野で既知の任意の他のＡｃｔＡ断片である。
【００７３】
別の実施形態では、相同ＡｃｔＡは、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が７０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同ＡｃｔＡは、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が７２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同ＡｃｔＡは、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が７５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同ＡｃｔＡは、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が７８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が８０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が８２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が８３％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が８５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が８７％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が８８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が９０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：１１のうちの１つに対する同一性が９２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が９３％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が９５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が９６％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が９７％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が９８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が９９％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、本明細書で開示されているＡｃｔＡ配列に対する同一性が１００％であることを指す。
【００７４】
本明細書で使用される「相同性」という用語は、本明細書で開示された任意の核酸配列を参照するとき、対応する未変性核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセンテージを同様に示すことが当業者には理解されるであろう。
【００７５】
一実施形態では、当該技術分野において適切に記述される方法によって、相同性は配列アライメントに対してコンピューターアルゴリズムによって決定される。例えば、核酸配列相同性のコンピューターアルゴリズム解析は入手可能な任意の数のソフトウェアパッケージの利用を含む場合があり、これらは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＤＯＭＡＩＮ、ＢＥＡＵＴＹ（ＢＬＡＳＴ増強アラインメントユーティリティ）、ＧＥＮＰＥＰＴ、およびＴＲＥＭＢＬパッケージなどである。
【００７６】
別の実施形態では、「相同性」は本明細書に開示された配列から選択された配列との同一性が６８％より大きいことを指す。別の実施形態では、「相同性」は本明細書に開示された配列から選択された配列との同一性が７０％より大きいことを指す。別の実施形態では、「相同性」は本明細書に開示された配列から選択された配列との同一性が７２％より大きいことを指す。別の実施形態では、同一性は７５％より大きい。別の実施形態では、同一性は７８％より大きい。別の実施形態では、同一性は８０％より大きい。別の実施形態では、同一性は８２％より大きい。別の実施形態では、同一性は８３％より大きい。別の実施形態では、同一性は８５％より大きい。別の実施形態では、同一性は８７％より大きい。別の実施形態では、同一性は８８％より大きい。別の実施形態では、同一性は９０％より大きい。別の実施形態では、同一性は９２％より大きい。別の実施形態では、同一性は９３％より大きい。別の実施形態では、同一性は９５％より大きい。別の実施形態では、同一性は９６％より大きい。別の実施形態では、同一性は９７％より大きい。別の実施形態では、同一性は９８％より大きい。別の実施形態では、同一性は９９％より大きい。別の実施形態では、同一性は１００％である。
【００７７】
別の実施形態では、相同性は、候補配列ハイブリダイゼーションの決定を介し決定され、その方法は当業者によりよく記述されている（例えば、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”  Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．  Ｊ．，  Ｅｄｓ．（１９８５）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．；  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎ．Ｙを参照）。例えば、ハイブリダイゼーションの方法は、ネイティブカスパーゼペプチドをコードするＤＮＡの補体に対して中程度からストリンジェントな条件下で実行される場合がある。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、１０〜２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍＬの変性断片化サケ精子ＤＮＡを含む溶液中４２℃にて一晩のインキュベーションである。
【００７８】
一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は、抗生物質耐性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は抗生物質耐性遺伝子をコードする核酸を含むプラスミドを含む。
【００７９】
一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリアは、ファゴリソソームを避ける能力を有する。
【００８０】
一実施形態では、異種抗原または抗原性ポリペプチドは、リステリア染色体のＬＬＯとフレーム内に組み込まれる。別の実施形態では、統合核酸分子は、ＡｃｔＡを持つフレーム内のＡｃｔＡ遺伝子座へと統合される。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードする染色体の核酸は、抗原をコードする核酸分子によって置き換えられる。
【００８１】
一実施形態では、異種抗原は腫瘍関連抗原である。別の実施形態では、腫瘍関連抗原は天然起源の腫瘍関連抗原である。別の実施形態では、腫瘍関連抗原は合成腫瘍関連抗原である。別の実施形態では、腫瘍関連抗原はキメラ腫瘍関連抗原である。
【００８２】
一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリアは、核酸分子を含む。別の実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、異種抗原またはその断片を含む組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む。別の実施形態では、組み換え型ポリペプチドは、切断ＬＬＯタンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質または異種抗原に融合したＰＥＳＴ配列ペプチドをさらに含む。別の実施形態では、切断ＬＬＯタンパク質はＮ末端ＬＬＯまたはその断片である。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡタンパク質はＮ末端ＡｃｔＡタンパク質またはその断片である。
【００８３】
別の実施形態では、本明細書で開示されている核酸分子は、切断ＬＬＯタンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴ配列ペプチドを含む組み換え型ポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、ここで切断ＬＬＯタンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴ配列ペプチドは異種抗原に融合されない。別の実施形態では、第一のオープンリーディングフレームは、Ｎ末端ＬＬＯまたはその断片を含む切断ＬＬＯタンパク質をコードする。別の実施形態では、第一のオープンリーディングフレームは、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質またはその断片を含む切断ＡｃｔＡタンパク質をコードする。別の実施形態では、第一のオープンリーディングフレームは、本質的にＮ末端ＬＬＯまたはその断片から成る切断ＬＬＯタンパク質をコードする。別の実施形態では、第一のオープンリーディングフレームは、本質的にＮ末端ＡｃｔＡタンパク質またはその断片から成る切断ＡｃｔＡタンパク質をコードする。別の実施形態では、第一のオープンリーディングフレームは、Ｎ末端ＬＬＯまたはその断片から成る切断ＬＬＯタンパク質をコードする。別の実施形態では、第一のオープンリーディングフレームは、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質またはその断片からなる切断ＡｃｔＡタンパク質をコードする。
【００８４】
一実施形態では、「抗原」、「抗原断片」、「抗原部分」、「異種タンパク質」、「異種抗原」、「異種タンパク質抗原」、「タンパク質抗原」、「抗原」、「抗原性ポリペプチド」、またはそれらの文法的に等価な用語は、本明細書では互換的に使用され、また被験者の細胞内に存在するＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子上で処理または提示され、宿主内に存在する時、または別の実施形態では、宿主によって検出される時に免疫応答の開始につながる、本明細書で説明したポリペプチド、ペプチドまたは組み換え型ペプチドを指すことが意味される。一実施形態では、抗原は宿主に対して異質でありうる。別の実施形態では、抗原は、宿主内に存在するが、免疫寛容のために宿主はこれに対する免疫応答を引き出さない場合がある。
【００８５】
一実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含む。別の実施形態では、代謝酵素は、組み換え型リステリア株の染色体を欠いている内因性遺伝子を相補する。別の実施形態では、第２のオープンリーディングフレームによってコードされる代謝酵素はアラニンラセマーゼ酵素（Ｄａｌ）である。別の実施形態では、第２のオープンリーディングフレームによってコードされる代謝酵素はＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素（Ｄａｔ）である。別の実施形態では、本明細書に開示されたリステリア株は内因性ｄａｌ／ｄａｔ遺伝子内の突然変異を含む。別の実施形態では、リステリアはｄａｌ／ｄａｔ遺伝子を欠いている。別の実施形態では、ｄａｌ／ｄａｔ遺伝子は、リステリア染色体内で欠失される。別の実施形態では、ｄａｌ／ｄａｔ遺伝子は、リステリア染色体内で切断される。
【００８６】
別の実施形態では、本開示の方法および組成物の核酸分子は、プロモーター／調節性配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、本開示の方法および組成物の第１のオープンリーディングフレームは、プロモーター／調節性配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、本開示の方法および組成物の第２のオープンリーディングフレームは、プロモーター／調節性配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、オープンリーディングフレームの各々はプロモーター／調節配列に動作可能にリンクする。
【００８７】
別の実施形態では、「代謝酵素」は、宿主細菌によって要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌によって要求される栄養素の合成のために要求される酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌によって利用される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌の増殖の保持のために要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この酵素は栄養素の合成のために要求される。
【００８８】
別の実施形態では、組み換え型リステリアは、弱毒化栄養要求性株である。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、米国特許第８，１１４，４１４号に記述されるＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７株であり、この特許はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８９】
一実施形態では、弱毒化株は、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）である。別の実施形態では、弱毒化株は、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）ΔａｃｔＡ（ＬｍｄｄＡ）である。ＬｍｄｄＡは、リステリア株に基づき、これは病毒性遺伝子ａｃｔＡの欠失に起因して弱毒化され、かつインビボおよびインビトロでの望ましい異種抗原または切断ＬＬＯ発現のためにｄａｌ遺伝子の相補によってプラスミドを保持する。
【００９０】
別の実施形態では、弱毒化株はＬｍΔａｃｔＡである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍΔｒｆＡである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍΔＰｌｃＢである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍΔＰｌｃＡである。別の実施形態では、株は上述の株のいずれかの二重変異体または三重変異体である。別の実施形態では、この株は、リステリアベースのワクチンの先天的な特性である強いアジュバント効果を発揮する。別の実施形態では、この株はＥＧＤリステリアバックボーンから作られる。別の実施形態では、本発明で使用される株は非溶血性ＬＬＯを発現するリステリア株である。
【００９１】
別の実施形態では、リステリア株は、栄養要求性突然変異体である。別の実施形態では、リステリア株はビタミン合成遺伝子をコードする遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はパントテン酸シンターゼをコードする遺伝子が欠損している。
【００９２】
一実施形態では、Ｄ−アラニンを欠損したリステリアのＡＡ株の生成は、例えば、欠失突然変異生成、挿入突然変異生成、およびフレームシフト突然変異の発生の結果として生じる突然変異生成、タンパク質の中途終始を生じる突然変異、または遺伝子発現に影響を与える調節性配列の突然変異を含む、当業者には周知の数多くの方法で達成されうる。別の実施形態では、組み換え型ＤＮＡ技法を使用して、または変異原性化学薬品もしくは放射、およびそれに続く突然変異体の選択を使用する従来の突然変異生成技術を使用して突然変異生成を達成することができる。別の実施形態では、栄養要求性表現型の復帰をともなう可能性が低いため、欠失変異体が好ましい。別の実施形態では、本明細書に提示されるプロトコルに従って生成されるＤ−アラニンの変異体は、単純な実験室の培養アッセイでＤ−アラニンの非存在下で成長する能力を試験される場合がある。別の実施形態では、この化合物の非存在下で成長することができない変異体がさらなる研究のために選択される。
【００９３】
別の実施形態では、本明細書に開示されるとおり、リステリアの突然変異生成のための標的として上述のＤ−アラニンに関連する遺伝子に加えて、代謝酵素の合成に関与する他の遺伝子が使用されてもよい。
【００９４】
別の実施形態では、代謝酵素は、組み換え型細菌株の染色体の残りのものに欠けている内在性代謝遺伝子を相補する。一実施形態では、内在性代謝遺伝子は、染色体内で突然変異する。別の実施形態では、内在性代謝遺伝子は染色体から欠失される。別の実施形態では、代謝酵素はアミノ酸代謝酵素である。別の実施形態では、代謝酵素は組み換え型リステリア株内で細胞壁合成のために使用されるアミノ酸の形成を触媒する。別の実施形態では、代謝酵素はアラニンラセマーゼ酵素である。別の実施形態では、代謝酵素はＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。
【００９５】
一実施形態では、栄養要求性リステリア株は、栄養要求性リステリア株の栄養要求性を相補する代謝酵素を含むエピソームの発現ベクターを含む。別の実施形態では、構成物はエピソームの様式でリステリア株内に含有される。別の実施形態では、外来抗原は組み換え型リステリア株が抱えるベクターから発現される。別の実施形態では、エピソームの発現ベクターは抗生物質耐性マーカーを欠いている。一実施形態では、本明細書に開示された方法および組成物の抗原はＰＥＳＴ配列を含むポリペプチドに融合される。
【００９６】
別の実施形態では、リステリア株はアミノ酸（ＡＡ）代謝酵素が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はＤグルタミン酸シンターゼ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はｄａｌ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はｄｇａ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株は、ジアミノピメリン酸ＣｙｓＫの合成に関与する遺伝子が欠損している。別の実施形態では、遺伝子はビタミンＢ１２に依存しないメチオニンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｐＡである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｐＢである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｐＥである。別の実施形態では、遺伝子はａｓｎＢである。別の実施形態では、遺伝子はｇｌｔＤである。別の実施形態では、遺伝子はｇｌｔＢである。別の実施形態では、遺伝子はｌｅｕＡである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｇＧである。別の実施形態では、遺伝子はｔｈｒＣである。別の実施形態では、リステリア株は上述の遺伝子のうちの１つ以上が欠損している。
【００９７】
別の実施形態では、リステリア株はシンターゼ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、遺伝子は、ＡＡ合成遺伝子である。別の実施形態では、遺伝子は、ｆｏｌＰである。別の実施形態では、遺伝子はジヒドロウリジンシンターゼファミリータンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＤである。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＦである。別の実施形態では、遺伝子はホスホエノールピルビン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｈｉｓＦである。別の実施形態では、遺伝子はｈｉｓＨである。別の実施形態では、遺伝子はｆｌｉＩである。別の実施形態では、遺伝子はリボソームの大型サブユニットシュードウリジンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＤである。別の実施形態では、遺伝子は二機能性ＧＭＰシンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はｃｏｂＳである。別の実施形態では、遺伝子はｃｏｂＢである。別の実施形態では、遺伝子はｃｂｉＤである。別の実施形態では、遺伝子はウロポルフィリン−ＩＩＩＣ−メチルトランスフェラーゼ／ウロポルフィリノゲン−ＩＩＩシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｃｏｂＱである。別の実施形態では、遺伝子はｕｐｐＳである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｕＢである。別の実施形態では、遺伝子はｄｘｓである。別の実施形態では、遺伝子はｍｖａＳである。別の実施形態では、遺伝子はｄａｐＡである。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＧである。別の実施形態では、遺伝子はｆｏｌＣである。別の実施形態では、遺伝子は、クエン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｇＪである。別の実施形態では、遺伝子は３−デオキシ−７−ホスホヘプツロン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はインドール−３−グリセロール−リン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はアントラニル酸シンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼ構成成分である。別の実施形態では、遺伝子はｍｅｎＢである。別の実施形態では、遺伝子はメナキノン特異的イソコリスミ酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼＩまたはＩＩである。別の実施形態では、遺伝子はホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミドシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｃａｒＢである。別の実施形態では、遺伝子はｃａｒＡである。別の実施形態では、遺伝子はｔｈｙＡである。別の実施形態では、遺伝子はｍｇｓＡである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＢである。別の実施形態では、遺伝子はｈｅｐＢである。別の実施形態では、遺伝子はｒｌｕＢである。別の実施形態では、遺伝子はｉｌｖＢである。別の実施形態では、遺伝子はｉｌｖＮである。別の実施形態では、遺伝子はａｌｓＳである。別の実施形態では、遺伝子はｆａｂＦである。別の実施形態では、遺伝子はｆａｂＨである。別の実施形態では、遺伝子はシュードウリジンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｐｙｒＧである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｕＡである。別の実施形態では、遺伝子はｐａｂＢである。別の実施形態では、遺伝子はａｔｐシンターゼ遺伝子（例えば、ａｔｐＣ、ａｔｐＤ−２、ａｐｔＧ、ａｔｐＡ−２、等々）である。
【００９８】
別の実施形態では、遺伝子はｐｈｏＰである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＡである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＣである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＤである。別の実施形態では、遺伝子はｐｌｃＢである。
【００９９】
別の実施形態では、リステリア株はペプチド輸送体が欠損している。別の実施形態では、遺伝子はＡＢＣ輸送体／ＡＴＰ結合／パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はオリゴペプチドＡＢＣ輸送体／オリゴペプチド結合タンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はオリゴペプチドＡＢＣ輸送体／パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子は亜鉛ＡＢＣ輸送体／亜鉛結合タンパク質である。別の実施形態では、遺伝子は糖ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はリン酸輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＺＩＰ亜鉛輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＥｍｒＢ／ＱａｃＡファミリーの薬剤耐性輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は硫酸塩輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はプロトン依存性オリゴペプチド輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマグネシウム輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は蟻酸塩／亜硝酸塩輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はスペルミジン／プトレシンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＮａ／Ｐｉ共輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は糖リン酸輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はグルタミンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はメジャーファシリテイターファミリー輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はグリシンベタイン／Ｌ−プロリンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はモリブデンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はテイコ酸ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はコバルトＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はアンモニウム輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はアミノ酸ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は細胞分裂ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマンガンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は鉄化合物ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマルトース／マルトデキストリンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＢｃｒ／ＣｆｌＡファミリーの薬剤耐性輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は上記のタンパク質のうちの１つのサブユニットである。
【０１００】
一実施形態では、組み換え型リステリアに到達するために、リステリアを形質転換するために使用される核酸分子が本明細書に開示されている。別の実施形態では、リステリアを形質転換するために使用される本明細書に開示された核酸は病毒性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、核酸分子はリステリアゲノムの中へと組み込まれ、非機能性病毒性遺伝子を担持する。別の実施形態では、病毒性遺伝子は組み換え型リステリア内で突然変異する。さらに別の実施形態では、核酸分子はリステリアゲノム内に存在する内因性の遺伝子を不活性化するために使用される。さらに別の実施形態では、病毒性遺伝子は、ａｃｔＡ遺伝子、ｉｎｌＡ遺伝子ならびにｉｎｌＢ遺伝子、ｉｎｌＣ遺伝子、ｉｎｌＪ遺伝子、ｐｌｂＣ遺伝子、ｂｓｈ遺伝子、またはｐｒｆＡ遺伝子である。病毒性遺伝子は、組み換え型リステリアの病毒性と関連付けられる当該技術分野で既知の任意の遺伝子とすることができることが当業者によって理解されるべきである。
【０１０１】
一実施形態では、リステリア株は、１つ以上の内因性遺伝子での突然変異を含む。別の実施形態では、リステリア株は、ｄａｌ突然変異、ｄａｔ突然変異、ｉｎｌＡ突然変異、ｉｎｌＢ突然変異、ｉｎｌＣ突然変異、ｉｎｌＪ突然変異、ｐｒｆＡ突然変異、ＡｃｔＡ突然変異、ｄａｌ／ｄａｔ突然変異、ｐｒｆＡ突然変異、ｐｌｃＢ欠失突然変異体、またはｐｌｃＡおよびｐｌｃＢまたはＡｃｔＡおよびｉｎｌＢまたはｄａｌおよびｄａｔの両方での二重変異体、またはｄａｌ／ｄａｔおよびＡｃｔＡでの三重変異体である。別の実施形態では、本明細書で開示されているリステリアは、これらの遺伝子のうちどれか１つの突然変異またはこれらの遺伝子の組み合わせを含む。別の実施形態では、本明細書に開示されたリステリアは、遺伝子のそれぞれ１つずつを欠いている。別の実施形態では、本明細書に開示されたリステリアは、ａｃｔＡ、ｐｒｆＡ、およびｄａｌ／ｄａｔ遺伝子を含む本明細書に開示されたいずれかの遺伝子のうちの少なくとも１個かつ最高１０個を欠いている。
【０１０２】
別の実施形態では、ｄａｌおよびｄａｔ突然変異を含むリステリア株は、リステリア株内のプラスミドに存在する核酸配列内で第二のオープンリーディングフレームによってコードされる代謝酵素によって補完される。別の実施形態では、ｐｒｆＡ突然変異を含むリステリア株は、Ｄ１３３Ｖアミノ酸突然変異を含む突然変異ｐｒｆＡタンパク質によって補完される。別の実施形態では、突然変異Ｄ１３３Ｖ  ｐｒｆＡタンパク質は、リステリア株内のプラスミド内に存在する核酸配列で第二のオープンリーディングフレームによってコードされる。
【０１０３】
一実施形態では、弱毒化生リステリアは、組み換え型リステリアである。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ゲノムインターナリンＣ（ｉｎｌＣ）遺伝子内での突然変異を含む。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ゲノムａｃｔＡ遺伝子およびゲノムインターナリンＣ遺伝子内の突然変異を含む。一実施形態では、リステリアの隣接するＴ細胞への転座は、プロセス中に関与するａｃｔＡ遺伝子および／またはｉｎｌＣ遺伝子の欠失によって阻害され、これはプロセスに関与するので、それによって、免疫原性の増加およびワクチンバックボーンとしての有用性によって結果として予想外に高いレベルの弱毒化が得られる。
【０１０４】
一実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子などが、リステリア株の染色体で欠けている。別の実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子などが、リステリア株の染色体および何らかのエピソームの遺伝要素で欠けている。別の実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子などが、病毒性株のゲノムで欠けている。一実施形態では、病毒性遺伝子は、染色体内で突然変異する。別の実施形態では、病毒性遺伝子は染色体から欠失される。
【０１０５】
一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は弱毒化されている。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ａｃｔＡ病毒性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ｐｒｆＡ病毒性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、組み換え型リステリアはｉｎｌＢ遺伝子を欠いている。別の実施形態では、組み換え型リステリアはａｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子の両方を欠いている。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ａｃｔＡ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ｉｎｌＢ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ＡｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ＡｃｔＡおよびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ＡｃｔＡ、ｉｎｌＢおよびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ＡｃｔＡ、ｉｎｌＢおよびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ＡｃｔＡ、ｉｎｌＢおよびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は以下の遺伝子：ａｃｔＡ、ｄａｌ、ｄａｔ、ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣ、ｐｒｆＡ、ｐｌｃＡ、ｐｌｃＢのうちの任意の単一遺伝子または遺伝子の組み合わせの不活性化突然変異を含む。
【０１０６】
「突然変異」という用語およびその文法的な同等物は、配列（核酸またはアミノ酸配列）に対する任意のタイプの突然変異または修飾を含み、これには欠失、切断、不活性化、妨害、置き換え、または転座を含むことを当業者は理解するであろう。突然変異のこれらのタイプは当該技術分野でよく知られている。
【０１０７】
一実施形態では、本明細書に開示された代謝酵素または相補する遺伝子をコードするプラスミドを含む栄養要求性細菌（栄養要求性リステリアなど）を選択するために、形質転換した栄養要求性細菌をアミノ酸代謝遺伝子または相補遺伝子の発現を選択する培地上で成長させる。別の実施形態では、Ｄ−グルタミン酸合成のための栄養要求性の細菌は、Ｄ−グルタミン酸合成のための遺伝子を含むプラスミドを用いて形質転換され、また栄養要求性細菌はＤ−グルタミン酸無しで増殖することになり、一方でＤ−グルタミン酸合成のためにプラスミドを用いて形質転換されていない栄養要求性細菌、またはタンパク質をコードするプラスミドを発現していない栄養要求性細菌は、増殖しないことになる。別の実施形態では、Ｄ−アラニン合成のための栄養要求性の細菌は、プラスミドがＤ−アラニン合成のためのアミノ酸代謝酵素をコードする孤立核酸を含む場合、本発明のプラスミドを形質転換し、かつ発現するときＤ−アラニン無しで増殖することになる。必要な増殖因子、サプリメント、アミノ酸、ビタミン、抗生物質、およびこれに類するものを含んでいる、または欠いている適切な培地を作成するためのかかる方法は当該技術分野で既知であり、また市販されている（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ）。
【０１０８】
別の実施形態では、相補プラスミドを含む栄養要求性細菌が一旦選択されると、この細菌は適切な培地上で選択的な圧力の存在の中で繁殖する。かかる繁殖は、栄養要求性因子を有しない培地内での細菌の増殖を含む。栄養要求性細菌内でのアミノ酸代謝酵素を発現するプラスミドの存在は、細菌とともにプラスミドの複製を確保し、したがって継続的にプラスミドが規制する細菌を選択する。本開示および本明細書の方法を備えるとき、プラスミドを含む栄養要求性細菌が増殖する培地の体積を調節することによって、当業者は、組み換え型リステリア株の生産を容易にスケールアップすることができる。
【０１０９】
別の実施形態では、他の栄養要求性株および相補系が本開示の使用に適合されることを当業者は理解するであろう。
【０１１０】
一実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原は、相互に直接融合している。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原をコードする遺伝子は相互に直接融合している。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原はリンカーペプチドを介して動作可能に付着している。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原は異種ペプチドを介して付着している。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片は異種抗原へのＮ末端である。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片は単独で、すなわち融合されていない形態で発現および使用される。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片は、融合タンパク質のＮ最末端部分である。別の実施形態では、切断ＬＬＯはＮ末端ＬＬＯに到達するＣ末端において切断される。別の実施形態では、切断ＬＬＯは非溶血性ＬＬＯである。
【０１１１】
本明細書で開示したとおり、顆粒球性のＭＤＳＣの抑制能力に予期されなかった変化があり、これは融合抗原のパートナリングとは無関係なｔＬＬＯの過剰発現に起因する（実施例１９を参照）。
【０１１２】
一実施形態では、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片および異種抗原は、相互に直接融合している。別の実施形態では、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片および異種抗原をコードする遺伝子は相互に直接融合している。別の実施形態では、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片および異種抗原はリンカーペプチドを介して動作可能に付着している。別の実施形態では、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片および異種抗原は異種ペプチドを介して付着している。別の実施形態では、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片は異種抗原へのＮ末端である。別の実施形態では、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片は単独で、すなわち融合されていない形態で発現および使用される。別の実施形態では、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片は、融合タンパク質のＮ最末端部分である。別の実施形態では、切断ＡｃｔＡはＮ末端Ａｃｔに到達するＣ末端において切断される。
【０１１３】
別の実施形態では、本明細書で開示された組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドをコードするプラスミドを含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型核酸は、本明細書に開示された組み換え型リステリア株のプラスミド中にある。別の実施形態では、プラスミドは、組み換え型リステリア株の染色体の中へと統合されないエピソーム性プラスミドである。別の実施形態では、プラスミドはリステリア株の染色体の中へと組み込まれる組み込みプラスミドである。別の実施形態では、プラスミドはマルチコピープラスミドである。
【０１１４】
一実施形態では、本明細書で開示される組成物および方法の組み換え型リステリア株は腫瘍細胞によって発現される異種抗原性ポリペプチドを発現する。一実施形態では、腫瘍関連抗原は前立腺特異抗原（ＰＳＡ）である。別の実施形態では、腫瘍関連抗原はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原である。なお別の実施形態では、腫瘍関連抗原は、米国特出願公開第第ＵＳ２０１１／０１４２７９号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記述されているキメラＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原である。なお別の実施形態では、腫瘍関連抗原は血管形成抗原である。
【０１１５】
一実施形態では、本明細書に開示された組成物および方法の組み換え型リステリア株は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）をコードする第１または第２の核酸分子を含み、これは一実施形態では、前立腺腫瘍によって高度に発現される前立腺ガンのマーカーである。一実施形態では、ＰＳＡは前立腺上皮細胞によって分泌されるカリクレインセリンプロテアーゼ（ＫＬＫ３）であり、これは一実施形態では、前立腺ガンのマーカーとして広く使用される。本明細書で使用されるＰＳＡおよびｋｌｋ３という用語は互換性があり、すべて同一の意味および質を有する。
【０１１６】
一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は、腫瘍関連抗原をコードする核酸分子を含む。一実施形態では、腫瘍関連抗原はＫＬＫ３ポリペプチドまたはその断片を含む。一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は、ＫＬＫ３タンパク質をコードする核酸分子を含む。
【０１１７】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：
【０１１８】
【化１０】
2018501244.tif 000011
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：１５の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：１５の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：１５の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：１５の断片である。各々の可能性は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【０１１９】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：
【０１２０】
【化１１】
2018501244.tif 000012
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：１６の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：１６の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：１６の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：１６の断片である。各々の可能性は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【０１２１】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：
【化１２】
2018501244.tif 000013
【化１３】
2018501244.tif 000014
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：１７の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：１７の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：１７の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：１７の断片である。各々の可能性は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【０１２２】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つヌクレオチド分子でコードされる。
【化１４】
2018501244.tif 000015
【化１５】
2018501244.tif 000016
【化１６】
2018501244.tif 000017
【化１７】
2018501244.tif 000018
【化１８】
2018501244.tif 000019
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号：１８の残基４０１．．４４６、１６８８．．１８４７、３４７７．．３７６３、３９０７．．４０４３、および５４１３．．５５６８によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：１８の相同体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：１８の変異体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：１８の異性体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：１８の断片によってコードされる。各々の可能性は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【０１２３】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：
【化１９】
2018501244.tif 000020
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：１９の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：１９の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：１９の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：１９の断片である。各々の可能性は本明細書で開示した別個の実施形態を表す。
【０１２４】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つヌクレオチド分子でコードされる。
【化２０】
2018501244.tif 000021
【化２１】
2018501244.tif 000022
【化２２】
2018501244.tif 000023
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２０の残基４２〜７５８によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２０の相同体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２０の変異体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２０の異性体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２０の断片によってコードされる。
【０１２５】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：        ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＫ  （配列番号：２１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１０２５２２１）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２１の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２１の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質の配列は配列番号：２１を含む。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２１の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２１の断片である。各々の可能性は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【０１２６】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つヌクレオチド分子でコードされる。
【化２３】
2018501244.tif 000024
【化２４】
2018501244.tif 000025
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２２の残基４２〜７５８によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２２の相同体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２２の変異体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２２の異性体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２２の断片によってコードされる。各々の可能性は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【０１２７】
別の実施形態では、ＫＬＫ３ペプチドの供給源であるＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：
【化２５】
2018501244.tif 000026
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２３の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２３の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２３の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２３の断片である。
【０１２８】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つヌクレオチド分子でコードされる。
【化２６】
2018501244.tif 000027
【化２７】
2018501244.tif 000028
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２４の残基４２〜７５８によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２４の相同体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２４の変異体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２４の異性体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２４の断片によってコードされる。各々の可能性は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【０１２９】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：
【化２８】
2018501244.tif 000029
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２５の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２５の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２５の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２５の断片である。各々の可能性は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【０１３０】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つヌクレオチド分子でコードされる。
【化２９】
2018501244.tif 000030
【化３０】
2018501244.tif 000031
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２６の残基４２〜７５８によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２６の相同体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２６の変異体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２６の異性体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２６の断片によってコードされる。各々の可能性は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【０１３１】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：
【化３１】
2018501244.tif 000032
【化３２】
2018501244.tif 000033
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２７の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２７の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２７の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２７の断片である。
【０１３２】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つヌクレオチド分子でコードされる。
【化３３】
2018501244.tif 000034
【化３４】
2018501244.tif 000035
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２８の残基４２〜８２７によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２８の相同体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２８の変異体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２８の異性体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２８の断片によってコードされる。
【０１３３】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：
【化３５】
2018501244.tif 000036
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２９の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２９の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２９の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質の配列は配列番号：２９を含む。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：２９の断片である。
【０１３４】
別の実施形態では、ｋｌｋ３タンパク質は次の配列を持つヌクレオチド分子でコードされる。
【化３６】
2018501244.tif 000037
【化３７】
2018501244.tif 000038
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３０の残基４７〜８３２によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３０の相同体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３０の変異体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３０の異性体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３０の断片によってコードされる。
【０１３５】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：
【化３８】
2018501244.tif 000039
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３１の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３１の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３１の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３１の断片である。
【０１３６】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：
【化３９】
2018501244.tif 000040
【化４０】
2018501244.tif 000041
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３２の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３２の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３２の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質の配列は配列番号：３２を含む。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３２の断片である。
【０１３７】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：
【化４１】
2018501244.tif 000042
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３３の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３３の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質の配列は配列番号：３３を含む。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３３の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３３の断片である。
【０１３８】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：
【化４２】
2018501244.tif 000043
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３４の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３４の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３４の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３４の断片である。
【０１３９】
別の実施形態では、ｋｌｋ３タンパク質は、次の配列を持つヌクレオチド分子によってコードされる：  
【化４３】
2018501244.tif 000044
【化４４】
2018501244.tif 000045
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３５の残基６７〜１０８８によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３５の相同体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３５の変異体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３５の異性体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３５の断片によってコードされる。
【０１４０】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：
【０１４１】
【化４５】
2018501244.tif 000046
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３６の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３６の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質の配列は配列番号：３６を含む。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３６の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３６の断片である。
【０１４２】
別の実施形態では、ＫＬＫ３ペプチドの供給源であるＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：
【０１４３】
【化４６】
2018501244.tif 000047
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３７の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３７の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３７の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３７の断片である。
【０１４４】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次の配列を持つ：
【０１４５】
【化４７】
2018501244.tif 000048
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３８の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３８の変異体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３８の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は配列番号：３８の断片である。
【０１４６】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次のＧｅｎＢａｎｋ受入番号のうちの１つに示される配列によってコードされる：ＢＣ００５３０７、ＡＪ３１０９３８、ＡＪ３１０９３７、ＡＦ３３５４７８、ＡＦ３３５４７７、Ｍ２７２７４、およびＭ２６６６３。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は上記ＧｅｎＢａｎｋ受入番号のうちの１つに示される配列によってコードされる。
【０１４７】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次のＧｅｎＢａｎｋ受入番号のうちの１つに示される配列によってコードされる：ＮＭ＿００１０３００５０、ＮＭ＿００１０３００４９、ＮＭ＿００１０３００４８、ＮＭ＿００１０３００４７、ＮＭ＿００１６４８、ＡＪ４５９７８２、ＡＪ５１２３４６、またはＡＪ４５９７８４。各々の可能性は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。一つの実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列がＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲ（配列番号：３９）を欠いている、本明細書に記述された配列のいずれかの変異体によってコードされる。
【０１４８】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次のＧｅｎＢａｎｋ受入番号のうちの１つに示される配列を含む：Ｘ１３９４３、Ｘ１３９４２、Ｘ１３９４０、Ｘ１３９４１、およびＸ１３９４４。
【０１４９】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は当該技術分野で既知の任意の他のＫＬＫ３タンパク質である。
【０１５０】
別の実施形態では、ＫＬＫ３ペプチドは当該技術分野で既知の任意の他のＫＬＫ３ペプチドである。別の実施形態では、ＫＬＫ３ペプチドは当該技術分野で既知の任意の他のＫＬＫ３ペプチドの断片である。ＫＬＫ３ペプチドの各タイプは本明細書に開示される方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【０１５１】
「ＫＬＫ３ペプチド」とは、別の実施形態では、全長ＫＬＫ３タンパク質を指す。別の実施形態では、この用語はＫＬＫ３タンパク質の断片を指す。別の実施形態では、この用語は、ＫＬＫ３シグナルペプチドを欠くＫＬＫ３タンパク質の断片を指す。別の実施形態では、この用語は、ＫＬＫ３シグナルペプチドを除いてＫＬＫ３配列全体を含むＫＬＫ３タンパク質を指す。「ＫＬＫ３シグナル配列」とは、別の実施形態では、本質的にＫＬＫ３タンパク質上に見られる任意のシグナル配列を指す。別の実施形態では、本明細書に開示された方法および組成物のＫＬＫ３タンパク質はいずれのシグナル配列も含まない。各々の可能性は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【０１５２】
別の実施形態では、本明細書に開示された方法および組成物で使用するためのＫＬＫ３ペプチダーゼの供給源であるカリクレイン関連ペプチダーゼ３（ＫＬＫ３タンパク質）は、ＰＳＡタンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はＰ−３０抗原タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はガンマセミノプロテインタンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はカリクレイン３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はセメノゲラーゼタンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はセミニンタンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は当該技術分野で既知のＫＬＫ３タンパク質の任意の他のタイプである。各々の可能性は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【０１５３】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はスプライス変異体１  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はスプライス変異体２  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はスプライス変異体３  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は転写変異体１  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は転写変異体２  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は転写変異体３  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は転写変異体４  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は転写変異体５  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は転写変異体６  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はスプライス変異体ＲＰ５  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は当該技術分野で既知の任意の他のスプライス変異体ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は当該技術分野で既知の任意の他の転写変異体ＫＬＫ３タンパク質である。各々の可能性は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【０１５４】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は成熟ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はプロＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、リーダー配列は、本明細書に開示された方法および組成物の成熟ＫＬＫ３タンパク質から除去されている。各々の可能性は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【０１５５】
別の実施形態では、本明細書に開示された方法および組成物のＫＬＫ３ペプチドの供給源であるＫＬＫ３タンパク質は、ヒトＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は霊長類ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は当該技術分野で既知の任意の他の種のＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、上記ＫＬＫ３タンパク質の１つは、「ＫＬＫ３タンパク質」と当技術分野では呼ばれる。
【０１５６】
一実施形態では、本明細書に開示されたＰＳＡタンパク質に融合された切断ＬＬＯを含む組み換え型ポリペプチドは、次の配列によりコードされる：
【０１５７】
【化４８】
2018501244.tif 000049
【化４９】
2018501244.tif 000050
別の実施形態では、融合タンパク質は配列番号：９１の相同体によってコードされる。別の実施形態では、融合タンパク質は配列番号：９１の変異体によってコードされる。別の実施形態では、融合タンパク質は配列番号：９１の異性体によってコードされる。一実施形態では、融合タンパク質内の「ｃｔｃｇａｇ」配列は、腫瘍抗原をプラスミド内の切断ＬＬＯに結合するために使用されるＸｈｏ  Ｉ制限部位を表す。
【０１５８】
別の実施形態では、本明細書に開示されたＰＳＡタンパク質に融合された切断ＬＬＯを含む組み換え型ポリペプチドは、次の配列を含む：
【０１５９】
【化５０】
2018501244.tif 000051
別の実施形態では、ｔＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質は配列番号：９２の相同体である。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質は配列番号：９２の変異体である。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質は配列番号：９２の異性体である。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質は配列番号：９２の断片である。
【０１６０】
一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は、腫瘍関連抗原をコードする核酸分子を含むが、ここで抗原はＨＰＶ−Ｅ７タンパク質を含む。一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は、ＨＰＶ−Ｅ７タンパク質をコードする核酸分子を含む。
【０１６１】
一実施形態では、Ｅ７タンパク質全体またはその断片のいずれかが、ＬＬＯタンパク質またはその切断部またはペプチド、ＡｃｔＡタンパク質またはその切断部またはペプチド、またはＰＥＳＴ様配列を含むペプチドに融合され、本発明の組成物および方法の組み換え型ポリペプチドまたはペプチドを生成する。別の実施形態では、（全体でまたは断片の供与源としてのいずれかで）利用されるＥ７タンパク質の配列は、
【０１６２】
【化５１】
2018501244.tif 000052
別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：４０の相同体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：４０の変異体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：４０の異性体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：４０の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：４０の相同体の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：４０の変異体の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：４０の異性体の断片である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１６３】
別の実施形態では、Ｅ７タンパク質の配列は、
【０１６４】
【化５２】
2018501244.tif 000053
別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：４１の相同体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：４１の変異体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：４１の異性体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：４１の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：４１の相同体の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：４１の変異体の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：４１の異性体の断片である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１６５】
別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は以下のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つに示される配列を有する：Ｍ２４２１５、ＮＣ＿００４５００、Ｖ０１１１６、Ｘ６２８４３、またはＭ１４１１９。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の相同体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の変異体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の異性体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の相同体の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の変異体の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の異性体の断片である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１６６】
一実施形態では、ＨＰＶ抗原はＨＰＶ１６である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−１８である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８から選択される。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−３１である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−３５である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−３９である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−４５である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−５１である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−５２である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−５８である。別の実施形態では、ＨＰＶは高リスクＨＰＶタイプである。別の実施形態では、ＨＰＶは粘膜ＨＰＶタイプである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１６７】
一実施形態では、ＨＰＶ  Ｅ６はＨＰＶ−１６由来である。別の実施形態では、ＨＰＶ  Ｅ７はＨＰＶ−１６由来である。別の実施形態では、ＨＰＶ−Ｅ６はＨＰＶ−１８由来である。別の実施形態では、ＨＰＶ−Ｅ７はＨＰＶ−１８由来である。別の実施形態では、ＨＰＶ  Ｅ６抗原は、本発明の組成物または方法のＥ７抗原の代わりにまたはＥ７抗原に加えて、ＨＰＶ媒介性疾患、障害、または症状を治療もしくは軽快するために利用される。別の実施形態では、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７は、ＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７の代わりにまたはこれと組み合せて利用される。かかる実施形態では、組み換え型リステリアはＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７を染色体から、ならびにＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７をプラスミドから発現してもよく、またはその反対であってもよい。別の実施形態では、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７抗原ならびにＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７抗原は、本明細書に開示された組み換え型リステリア内に存在するプラスミドから発現される。別の実施形態では、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７抗原ならびにＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７抗原は、本明細書に開示された組み換え型リステリアの染色体から発現される。別の実施形態では、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７抗原ならびにＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７抗原は上記の実施形態の任意の組み合せで発現され、これには各々のＨＰＶ株由来の各々のＥ６およびＥ７抗原がプラスミドまたは染色体のいずれかから発現されるものを含む。
【０１６８】
別の実施形態では、Ｅ７タンパク質全体またはその断片のいずれかは、ＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列含有ペプチドに融合され、本明細書で開示された組み換え型ポリペプチドを生成する。一実施形態では、利用されるＥ７タンパク質（全体または断片の供給源としてのいずれか）は配列番号：９３に記載されたアミノ酸配列を含む。
【０１６９】
【化５３】
2018501244.tif 000054
別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：９３の相同体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：９３の変異体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：９３の異性体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：９３の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：９３の相同体の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：９３の変異体の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：９３の異性体の断片である。
【０１７０】
別の実施形態では、Ｅ７タンパク質に融合される切断ＬＬＯのアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列を含む：
【０１７１】
【化５４】
2018501244.tif 000055
【化５５】
2018501244.tif 000056
別の実施形態では、ｔＬＬＯ−Ｅ７の融合タンパク質は配列番号：９４の相同体である。別の実施形態では、タンパク質は配列番号：９４の変異体である。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−Ｅ７融合タンパク質は配列番号：９４の異性体である。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−Ｅ７融合タンパク質は配列番号：９４の断片である。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−Ｅ７の融合タンパク質は配列番号：９４の相同体の断片である。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−Ｅ７融合タンパク質は配列番号：９４の変異体である。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−Ｅ７融合タンパク質は配列番号：９４の異性体である。
【０１７２】
一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は、腫瘍関連抗原をコードする核酸分子を含むが、ここで腫瘍関連抗原はＨｅｒ−２／ｎｅｕペプチドを含む。一実施形態では、腫瘍関連抗原はＨｅｒ−２／ｎｅｕ抗原を含む。一実施形態では、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕペプチドはキメラＨｅｒ−２／ｎｅｕ抗原（ｃＨｅｒ−２）を含む。
【０１７３】
一実施形態では、弱毒化栄養要求性リステリア株は、リステリアワクチンベクターに基づき、これは病毒性遺伝子ＡｃｔＡの欠失に起因して弱毒化され、かつインビボおよびインビトロでのＨＥＲ２／ｎｅｕ発現のためにｄａｌ遺伝子の相補によってプラスミドを保持する。一実施形態では、リステリア株はリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）の最初の４４１のアミノ酸を融合したキメラ型Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質を発現および分泌する。別の実施形態では、リステリアは、ｄａｌ、ｄａｔおよびＡｃｔＡ内因性遺伝子内に突然変異を有するｄａｌ／ｄａｔ／ＡｃｔＡリステリアである。別の実施形態では、突然変異は、突然変異遺伝子の欠失、切断または不活性化である。別の実施形態では、リステリア株は、耐性を破壊する能力を有する強くかつ抗原特異的な抗腫瘍応答をトランスジェニック動物内のＨＥＲ２／ｎｅｕに対して行使する。別の実施形態では、免疫化したマウスの脾臓からより迅速に除去されるので、ｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ株は高度に弱毒化され、以前のリステリアワクチン世代より良好な安全性プロファイルを有する。別の実施形態では、トランスジェニック動物で、このワクチンの抗生剤耐性でかつより病毒性のバージョンであるＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２よりも長い腫瘍発症の遅延を、リステリア株はもたらす（米国公開番号２０１１／０１４２７９１参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、リステリア株は、腫瘍内の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の著しい減少を生じる。別の実施形態では、ＬｍｄｄＡワクチンで処理した腫瘍内のＴｒｅｇのより低い頻度は、腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の増加をもたらし、ＬｍｄｄＡワクチンを用いた免疫化後により好ましい腫瘍の微小環境を得ることができることを示唆する。一実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２キメラタンパク質に融合したまたはその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドを提供する。一実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２キメラタンパク質に融合したまたはその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片から構成される組み換え型ポリペプチドを提供する。その実施形態では、異種抗原はＨｅｒ−２キメラタンパク質またはその断片である。
【０１７４】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＨＥＲ２キメラタンパク質はヒトＨＥＲ２キメラタンパク質である。別の実施形態では、Ｈｅｒ−２タンパク質はマウスのＨｅｒ−２キメラタンパク質である。別の実施形態では、Ｈｅｒ−２タンパク質はラットのＨｅｒ−２キメラタンパク質である。別の実施形態では、Ｈｅｒ−２タンパク質は霊長類のＨｅｒ−２キメラタンパク質である。別の実施形態では、Ｈｅｒ−２タンパク質は当該技術分野で既知のヒトもしくは任意の他の動物種のＨｅｒ−２キメラタンパク質またはその組み合わせである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１７５】
別の実施形態では、Ｈｅｒ−２タンパク質は、「ＨＥＲ２／ｎｅｕ」、「Ｅｒｂｂ２」、「ｖ−ｅｒｂ−ｂ２」、「ｃ−ｅｒｂ−ｂ２」、「ｎｅｕ」、または「ｃＮｅｕ」と称されるタンパク質である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１７６】
一実施形態では、Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質は、ガン遺伝子のＭＨＣクラスＩエピトープのクラスターを示すＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原の２つの細胞外および１つの細胞内の断片を寄生し、一方別の実施形態では、キメラタンパク質は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原の３つのＨ２Ｄｑおよび少なくとも１７のマッピングしたヒトＭＨＣクラスＩエピトープ（断片ＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１）を寄生する（図４５参照）。別の実施形態では、キメラタンパク質は少なくとも１３のマッピングしたヒトＭＨＣクラスＩエピトープ（断片ＥＣ２およびＩＣ１）を寄生する。別の実施形態では、キメラタンパク質は少なくとも１４のマッピングしたヒトＭＨＣクラスＩエピトープ（断片ＥＣ１およびＩＣ１）を寄生する。別の実施形態では、キメラタンパク質は少なくとも９のマッピングしたヒトＭＨＣクラスＩエピトープ（断片ＥＣ１およびＩＣ２）を寄生する。別の実施形態では、Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質は非溶血性リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）に融合する。別の実施形態では、Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質はリステリア−モノサイトゲネスリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質の最初の４４１のアミノ酸に融合し、リステリア・モノサイトゲネス弱毒化栄養要求性株ＬｍｄｄＡによって発現および分泌される。別の実施形態では、キメラ型ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原／ＬＬＯ融合タンパク質を発現する本明細書に開示された弱毒化栄養要求性株からの融合タンパク質ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌は、インビトロで８時間増殖した後ＴＣＡ沈殿させた細胞培養上清内のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２のものと同等である（図４５Ｂ参照）。
【０１７７】
一実施形態では、無処置の動物、または無関連のリステリアワクチンを注射したマウスではＣＴＬ活性は検出されなかった（図４６Ａ）。一方で別の実施形態では、本明細書に開示された弱毒化栄養要求性株は、野生型ＦＶＢ／Ｎマウスからの脾細胞によるＩＦＮ−γの分泌を刺激することができる（図４６Ｂ）。
【０１７８】
別の実施形態では、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕキメラタンパク質は、配列番号：９５に示される以下の核酸配列によってコードされる。
【０１７９】
【化５６】
2018501244.tif 000057
【化５７】
2018501244.tif 000058
【０１８０】
別の実施形態では、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質は以下の配列を持つ。
【０１８１】
【化５８】
2018501244.tif 000059
【化５９】
2018501244.tif 000060
【０１８２】
一実施形態では、本明細書に開示された方法および組成物のＨＥＲ２キメラタンパク質またはその断片はそのシグナル配列を含まない。別の実施形態では、シグナル配列の高い疎水性により、シグナル配列の削除はＨＥＲ２断片がリステリア内で順調に発現できるようにする。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１８３】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＨＥＲ２キメラタンパク質の断片はその膜貫通領域（ＴＭ）を含まない。一実施形態では、ＴＭの高い疎水性により、ＴＭの削除はＨｅｒ−２断片がリステリア内で順調に発現できるようにする。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１８４】
一実施形態では、ＬｍｄｄＡ１６４は、ｃＨｅｒ２に融合されたｔＬＬＯをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸配列を含み、ここで、前記核酸配列は配列番号：９７を含む。
【化６０】
2018501244.tif 000061
【化６１】
2018501244.tif 000062
【化６２】
2018501244.tif 000063
、ここで、大文字の配列はｃＨｅｒ２をコードし、小文字の配列はｔＬＬＯをコードし、下線付きの「ｃｔｃｇａｇ」配列は、腫瘍抗原をプラスミド内の切断ＬＬＯに結合するために使用されるＸｈｏ  Ｉ制限部位を表す。別の実施形態では、プラスミドｐＡｄｖ１６８は配列番号：９７を含む。一実施形態では、切断ＬＬＯ−ｃＨｅｒ２融合は配列番号：９７の相同体である。別の実施形態では、切断ＬＬＯ−ｃＨｅｒ２融合は配列番号：９７の変異体である。別の実施形態では、切断ＬＬＯ−ｃＨｅｒ２融合は配列番号：９７の異性体である。
【０１８５】
一実施形態では、ｃＨｅｒ２に融合されたｔＬＬＯを含む組み換え型タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：９８を含む。
【化６３】
2018501244.tif 000064
【化６４】
2018501244.tif 000065
一実施形態では、切断ＬＬＯ−ｃＨｅｒ２融合は配列番号：９８の相同体である。別の実施形態では、切断ＬＬＯ−ｃＨｅｒ２融合は配列番号：９８の変異体である。別の実施形態では、切断ＬＬＯ−ｃＨｅｒ２融合は配列番号：９８の異性体である。
【０１８６】
小さい断片リステリアベースのワクチンまたはトラスツズマブ（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原の細胞外領域に位置するエピトープに対するモノクローナル抗体）によってこれらの腫瘍が標的化されたとき、ガン遺伝子タンパク質Ｈｅｒ２／ｎｅｕ内での点突然変異またはアミノ酸欠失が耐性腫瘍細胞の処置を媒介することが報告されている。一実施形態では、ガン遺伝子のＭＨＣクラスＩエピトープのクラスターを示すＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原の２つの細胞外断片および１つの細胞内断片を寄生するキメラ型Ｈｅｒ２／ｎｅｕベースの組成物が開示されている。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原の３個のＨ２Ｄｑおよび少なくとも１７個のマッピングしたヒトのＭＨＣクラスＩエピトープを寄生する、このキメラタンパク質は、リステリア・モノサイトゲネスリステリオリシンＯタンパク質の最初の４４１のアミノ酸に融合し、リステリア・モノサイトゲネス弱毒化株ＬｍｄｄＡによって発現および分泌した。
【０１８７】
別の実施形態では、対象抗原はＫＬＫ９ポリペプチドである。
【０１８８】
別の実施形態では、腫瘍関連抗原はＨＰＶ−Ｅ７である。別の実施形態では、抗原はＨＰＶ−Ｅ６である。別の実施形態では、抗原はＨｅｒ−２である。別の実施形態では、抗原はＮＹ−ＥＳＯ−１である。別の実施形態では、抗原はテロメラーゼである。別の実施形態では、抗原はＳＣＣＥである。別の実施形態では、抗原はＷＴ−１である。別の実施形態では、抗原はＨＩＶ−１Ｇａｇである。別の実施形態では、抗原はプロテイナーゼ３である。別の実施形態では、抗原はチロシナーゼ関連タンパク質２である。別の実施形態では、抗原はＰＳＡ（前立腺特異抗原）である。別の実施形態では、抗原はＥ７、Ｅ６、Ｈｅｒ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼ、ＳＣＣＥ、ＷＴ−１、ＨＩＶ−１Ｇａｇ、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）から選択される。別の実施形態では、抗原は腫瘍関連抗原である。別の実施形態では、抗原は感染性疾病抗原である。
【０１８９】
別の実施形態では、腫瘍関連抗原は血管形成抗原である。別の実施形態では、血管形成抗原は活性化した周皮細胞と腫瘍血管形成血管系内の周皮細胞との両方の上で発現され、これは別の実施形態では、インビボでの新血管形成と関連付けられる。別の実施形態では、血管形成抗原はＨＭＷ−ＭＡＡである。別の実施形態では、血管形成抗原は当該技術分野で既知のものであり、国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／１０２１４０号で開示され、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９０】
別の実施形態では、抗原は、菌類病原体、細菌、寄生虫、蠕虫、またはウイルスに由来する。別の実施形態では、抗原は、破傷風トキソイド、インフルエンザウイルスからの血球凝集素分子、ジフテリアトキソイド、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質、ＩｇＡプロテアーゼ、インシュリンペプチドＢ、粉状そうか病菌抗原、ビブリオ症菌抗原、サルモネラ抗原、肺炎球菌抗原、呼吸器合胞体ウイルス抗原、インフルエンザ菌外膜タンパク質、ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ、髄膜炎菌ピリン、淋菌ピリン、メラノーマ−関連抗原（ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ）、タイプＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−３３、−３５、または−４５からのヒトパピローマウイルス抗原Ｅ１およびＥ２、腫瘍抗原ＣＥＡ、突然変異したまたはしていないｒａｓタンパク質、突然変異したまたはしていないｐ５３タンパク質、Ｍｕｃ１、メソテリン、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、またはｐＳＡから選択される。
【０１９１】
他の実施形態では、抗原は以下の疾患のうちの１つと関連付けられる。コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、麻疹、髄膜炎、おたふく風邪、百日咳、天然痘、肺炎球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、結核、腸チフス、水痘帯状疱疹、百日咳、黄熱病、アジソン病由来のイムノゲンおよび抗原、アレルギー、アナフィラキシー、ブルートン症候群、固形および血液由来の腫瘍を含むガン、湿疹、橋本甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、後天性免疫不全症候群、腎臓、心臓、すい臓、肺、骨、および肝臓などの移植拒否反応、グレーブス病、多内分泌自己免疫疾患、肝炎、顕微鏡的多発性動脈炎、結節性多発動脈炎、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変症、悪性貧血、セリアック病、抗体媒介性腎炎、糸球体腎炎、リウマチ性疾患、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、血清反応陰性脊椎関節症、鼻炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、硬化性胆管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、疱疹状皮膚炎、乾癬、白斑、多発性硬化症、脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、ランバート・イートン筋無力症候群、強膜、上強膜、ブドウ膜炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、じんましん、乳児一過性低ガンマグロブリン血症、骨髄腫、Ｘ連鎖高Ｉｇｍ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、アミロイド症、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、マラリアのスポロゾイト周囲タンパク、微生物抗原、ウイルス抗原、自己抗原、およびリステリア症。各々の抗原は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【０１９２】
別の実施形態では、本明細書に開示された異種抗原は腫瘍関連抗原であり、これは、一実施形態では、ＭＡＧＥ（メラノーマ関連抗原Ｅ）タンパク質、例えば、ＭＡＧＥ  １、ＭＡＧＥ  ２、ＭＡＧＥ  ３、ＭＡＧＥ  ４、チロシナーゼ；突然変異ｒａｓタンパク質；突然変異ｐ５３タンパク質；進行ガンと関連付けられたｐ９７メラノーマ抗原、ｒａｓペプチドもしくはｐ５３ペプチド；子宮頸ガンと関連付けられたＨＰＶ１６／１８抗原、乳ガンと関連付けられたＫＬＨ抗原、大腸ガンと関連付けられたＣＥＡ（ガン胎児抗原）、ｇｐ１００、メラノーマと関連付けられたＭＡＲＴ１抗原、または前立腺ガンと関連付けられたＰＳＡ抗原といった腫瘍抗原のうちの１つである。別の実施形態では、本明細書に開示された組成物および方法のための抗原はメラノーマ−関連抗原であり、これは、一実施形態では、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ、またはこれらの組み合わせである。別の実施形態では、腫瘍関連抗原は血管形成抗原である。
【０１９３】
一実施形態では、抗原は米国特出願公開第２０１１／０１４２７９１号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記述されるキメラＨｅｒ２抗原である。
【０１９４】
別の実施形態では、異種抗原は感染性疾患抗原である。一実施形態では、抗原は自己抗原（ａｕｔｏ  ａｎｔｉｇｅｎ）または自己抗原（ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｇｅｎ）である。
【０１９５】
別の実施形態では、異種抗原は、真菌病原体、細菌、寄生生物、蠕虫、またはウイルスに由来する。他の実施形態では、抗原は、破傷風トキソイド、インフルエンザウイルスからの血球凝集素分子、ジフテリアトキソイド、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質、ＩｇＡプロテアーゼ、インシュリンペプチドＢ、粉状そうか病菌抗原、ビブリオ症菌抗原、サルモネラ抗原、肺炎球菌抗原、吸器合胞体ウイルス抗原、インフルエンザ菌外膜タンパク質、ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ、髄膜炎菌ピリン、淋菌ピリン、タイプＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−３３、−３５、または−４５ヒトパピローマウイルスからのヒトパピローマウイルス抗原Ｅ１およびＥ２、またはこれらの組み合せから選択される。
【０１９６】
本明細書に開示されるように、方法および組成物の別の実施形態では、「核酸」または「ヌクレオチド」という用語は少なくとも２つの塩基−糖−リン酸塩の組み合せのストリングを指す。一実施形態では、この用語はＤＮＡおよびＲＮＡを含む。一実施形態では、「ヌクレオチド」は核酸高分子の単量体単位を指す。一実施形態では、ＲＮＡは、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびリボザイムの形態をとる。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの使用が記述される（Ｃａｕｄｙ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌ  １６：２４９１−９６およびそこに引用された参考文献）。ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、線状ＤＮＡ、もしくは染色体ＤＮＡの形態、またはこれらの群の誘導体であってもよい。さらに、ＤＮＡおよびＲＮＡのこれらの形態は、１本鎖、２本鎖、３本鎖、または４本鎖であってもよい。別の実施形態では、この用語は他の種類のバックボーンであるが同一の塩基を含有する人工核酸も含む。一実施形態では、この人工核酸はＰＮＡ（ペプチド核酸）である。ＰＮＡはペプチドバックボーンおよびヌクレオチド塩基を含有し、一実施形態では、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子に結合することができる。別の実施形態では、このヌクレオチドはオキセタン修飾される。別の実施形態では、ヌクレオチドは１つ以上のホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合で置き換えることによって修飾される。別の実施形態では、人工核酸は当該技術分野で既知の未変性の核酸のリン酸バックボーンの任意の他の変異体を含有する。ホスホロチオエート核酸およびＰＮＡの使用は、当業者に既知であり、また例えば、Ｎｅｉｌｓｅｎ  ＰＥ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９：３５３−５７、およびＲａｚ  ＮＫ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２９７：１０７５−８４に記述される。核酸の生産および使用は、当業者には既知であり、また例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，（２００１），Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  ｅｄｓ．およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ（２００３）Ｐｕｒｃｈｉｏ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｃ．  Ｆａｒｅｅｄに記述される。各々の核酸誘導体は、本明細書に開示される別個の実施形態を表す。
【０１９７】
一実施形態では、「オリゴヌクレオチド」という用語は「核酸」という用語と互換的であり、また原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも挙げられる場合があるがこれに限定されない分子を指す場合がある。この用語は既知のＤＮＡおよびＲＮＡの塩基類似体のいずれかを含む配列も指す。
【０１９８】
別の実施形態では、本明細書に開示された構築体または核酸分子は相同的組み換えを使用してリステリア染色体の中へと組み込まれる。相同的組み換えのための技法は当該技術分野で周知であり、また例えば以下の文献に記述されている。Ｂａｌｏｇｌｕ  Ｓ、Ｂｏｙｌｅ  ＳＭ、ｅｔ  ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｔｏ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｅｉｔｈｅｒ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｐａｒｔｉａｌ  ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ  ｏｒ  Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｌ７／Ｌ１２  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００５，  １０９（１−２）：１１−７）；およびＪｉａｎｇ  ＬＬ，  Ｓｏｎｇ  ＨＨ，  ｅｔ  ａｌ．，  （Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｔｒａｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｓｉｎ  （Ｓｈａｎｇｈａｉ）  ２００５，  ３７（１）：１９−２４）。別の実施形態では、相同的組み換えを米国特許第６，８５５，３２０号に記述されるように実施した。この場合、Ｅ７を発現する組み換え型Ｌｍ株は、ｈｌｙプロモーターの制御下で、また遺伝子産物の分泌を確保するためにｈｌｙシグナル配列を含めることによって、Ｅ７遺伝子の染色体組み込みによって作成され、Ｌｍ−ＡＺ／Ｅ７と称される組み換え型を得る。別の実施形態では、温度感受性プラスミドは、組み換え型を選択するために使用される。各々の技法は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１９９】
別の実施形態では、構築体または核酸分子はトランスポゾン挿入を使用してリステリア染色体の中へと組み込まれる。トランスポゾン挿入の技法は当該技術分野で周知であり、とりわけ以下のＳｕｎらの文献  ＤＰ−Ｌ９６７の構造における（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９０，  ５８：  ３７７０−３７７８）に記載されている。トランスポゾン突然変異生成は、別の実施形態では、安定したゲノム挿入変異体を形成することができるという有利点を有するが、外来性遺伝子が挿入されるゲノム内の位置が未知であるという不利点を有する。
【０２００】
別の実施形態では、構築体または核酸分子は、ファージ組み込み部位を使用してリステリアの染色体の中へと組み込まれる（Ｌａｕｅｒ  Ｐ，Ｃｈｏｗ  ＭＹ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈａｇｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２００２；１８４（１５）：４１７７−８６）。この方法のある特定の実施形態では、異種遺伝子を、ゲノム内の任意の適切な部位であってもよい、対応する付着部位（例えば、ｃｏｍＫまたはａｒｇ  ｔＲＮＡ遺伝子の３‘端）の中へとインサートするために、バクテリオファージ（例えば、Ｕ１５３またはＰＳＡリステリオファージ）のインテグラーゼ遺伝子および付着部位が使用される。別の実施形態では、内因性のプロファージは構築体または異種遺伝子組込の前に利用された付着部位から回復した。別の実施形態では、この方法は結果として単一コピー組み込み体をもたらす。別の実施形態では、本発明は、臨床用途のためのファージベースの染色体組み込みシステムをさらに含み、ここでｄ−アラニン・ラセマーゼを含むがこれに限定されない必須酵素のための栄養要求性である宿主株を使用することができ、例えば、Ｌｍｄａｌ（−）ｄａｔ（−）である。別の実施形態では、「ファージキュアリング工程」を避けるためにＰＳＡに基づくファージ組み込み系を使用する。別の実施形態では、これは組み込まれた遺伝子を維持するために抗生物質による継続的な選択を必要とする。したがって、別の実施形態では、本発明は、抗生物質を用いた選択を必要としないファージベースの染色体組み込み系の確立を可能にする。代わりに、栄養要求性宿主株を相補することができる。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２０１】
本明細書で開示される方法および組成物の一実施形態では、「組み換え部位」または「部位特異的な組み換え部位」という用語は、組み換え部位に隣接する核酸区分の交換または切除を媒介するリコンビナーゼによって（いくつかの事例では、関連するタンパク質とともに）識別される核酸分子内の塩基の配列を指す。リコンビナーゼおよび関連するタンパク質は「組み換え型タンパク質」と総称される（例えば、Ｌａｎｄｙ，Ａ．，（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）３：６９９−７０７；１９９３）を参照のこと）。
【０２０２】
「ファージ発現ベクター」または「ファージミド」とは、本明細書で開示されるような方法および組成物の核酸配列をインビトロまたはインビボで、任意の細胞（原核生物細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳類の細胞を含む）内で構造的にまたは誘導的に発現する目的の任意のファージベースの組み換え型発現系を指す。ファージ発現ベクターは、典型的には、細菌細胞内で再生すること、および適切な条件下でファージ粒子を生成することの両方を可能にすることができる。この用語は線形または円形の発現系を含み、またエピソームのまま、または宿主細胞ゲノムの中へと組込まれた両方のファージベースの発現ベクターを包含する。
【０２０３】
一実施形態では、本明細書で使用される場合、「動作可能にリンクした」という用語は、転写および翻訳調節性核酸が、任意のコード配列に対して転写が開始されるような様式で位置することを意味する。一般的にこれは、プロモーターおよび転写開始配列または始動配列がコ−ド化領域に５’に位置されることを意味することになる。
【０２０４】
一実施形態では、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、潜在的にタンパク質をコードする可能性がある塩基の配列を含有する生命体のゲノムの部分である。別の実施形態では、ＯＲＦの開始端および停止端はｍＲＮＡの端部と同等でないが、通常のｍＲＮＡ中に含まれる。一実施形態では、ＯＲＦは、遺伝子の開始コード配列（開始コドン）と停止コドン配列（終止コドン）との間に位置する。したがって、一実施形態では、内因性のポリペプチドとともにオープンリーディングフレームとして動作可能にゲノムの中へと組込まれる核酸分子は、内因性のポリペプチドと同一のオープンリーディングフレーム内でゲノムの中へと組込まれた核酸分子である。
【０２０５】
一実施形態では、本発明はリンカー配列を含む融合ポリペプチドを提供する。一実施形態では、「リンカー配列」は２つの異種ポリペプチドまたはその断片もしくはドメインを結合するアミノ酸配列を指す。一般的に、本明細書で使用される場合、リンカーは融合ポリペプチドを形成するためにポリペプチドを共有的にリンクするアミノ酸配列である。リンカーは、典型的には、オープンリーディングフレームおよび表示タンパク質によってコードされたアミノ酸配列を含む融合タンパク質を作り出すために、表示ベクターからのレポーター遺伝子の除去後の残りの組み換え型信号から翻訳されたアミノ酸を含む。当業者によって理解されるように、リンカーはグリシンおよび他の小さい中性アミノ酸などの追加的なアミノ酸を含むことができる。
【０２０６】
一実施形態では、「内因性」は、ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｗｅｂ．ｎｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｏｍｄ？ｗｉｔｈｉｎ参照生命体内で発生もしくは創出された、または参照生命体の中で生じたものから発生してきた物品を意味する。別の実施形態では、内因性は、天然であることを指す。
【０２０７】
別の実施形態では、「安定して維持される」とは、選択（例えば、抗生物質選択）無しで検出可能な損失を伴わずに、核酸分子またはプラスミドを１０世代の間、維持することを指す。別の実施形態では、期間は１５世代である。別の実施形態では、期間は２０世代である。別の実施形態では、期間は２５世代である。別の実施形態では、期間は３０世代である。別の実施形態では、期間は４０世代である。別の実施形態では、期間は５０世代である。別の実施形態では、期間は６０世代である。別の実施形態では、期間は８０世代である。別の実施形態では、期間は１００世代である。別の実施形態では、期間は１５０世代である。別の実施形態では、期間は２００世代である。別の実施形態では、期間は３００世代である。別の実施形態では、期間は５００世代である。別の実施形態では、期間は世代を超えるものである。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロで（例えば、培養液内で）安定して維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビボで安定して維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロおよびインビトロの両方で安定して維持される。
【０２０８】
別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物の組み換え型リステリア株は、リステリアゲノムにオープンリーディングフレームとして内因性ＡｃｔＡ配列とともに動作可能に組み込まれる核酸分子を含む。別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物の組み換え型リステリア株は、ＡｃｔＡまたは切断ＡｃｔＡに融合される抗原を含む融合タンパク質をコードする核酸分子を含むエピソーム性の発現ベクターを含む。一実施形態では、抗原の発現および分泌は、ａｃｔＡプロモーターおよびＡｃｔＡシグナル配列制御下にあり、またこれはＡｃｔＡ（切断ＡｃｔＡまたはｔＡｃｔＡ）の１〜２３３アミノ酸への融合として発現される。別の実施形態では、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，６５５，２３８号に記述されるように、切断ＡｃｔＡは野生型ＡｃｔＡタンパク質の最初の３９０のアミノ酸から成る。別の実施形態では、米国特許公開番号第２０１４／０１８６３８７号に記述されるように、切断ＡｃｔＡは、ＡｃｔＡ−Ｎ１００またはその修正版（ＡｃｔＡ−Ｎ１００＊と称される）であり、この中でＰＥＳＴモチーフを欠失しており、非保存的なＱＤＮＫＲ置換を含有する。
【０２０９】
別の実施形態では、「機能的断片」は免疫原性断片であり、単独でまたは本明細書に開示されたワクチン組成物内で被験者に投与されるとき、免疫応答を引き出す。別の実施形態では、当業者は理解するであろうように、また本明細書にさらに開示されるように、機能的断片は生物活性を有する。
【０２１０】
別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物の組み換え型リステリア株は組み換え型リステリア・モノサイトゲネス株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・シーリゲリ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・グレイ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・イバノビ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・ムライ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・ウェルシメリ株である。別の実施形態では、リステリア株は、当該技術分野で既知の任意の他のリステリア種の組み換え型株である。
【０２１１】
別の実施形態では、本明細書に開示される組み換え型リステリア株は、動物宿主を通して継代されている。別の実施形態では、継代は株のワクチンベクターとしての有効性を最大化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の病毒性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を増加する。別の実施形態では、継代はリステリア株の病毒性を増加する。別の実施形態では、継代はリステリア株の不安定な亜系を除去する。別の実施形態では、継代はリステリア株の不安定な亜系の有病率を減少する。別の実施形態では、リステリア株は抗原含有組み換え型ペプチドをコードする遺伝子のゲノム挿入を含有する。別の実施形態では、リステリア株は抗原含有組み換え型ペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドを担持する。別の実施形態では、継代は本明細書に記述されるように実施される。別の実施形態では、当該技術分野で既知の任意の他の方法によって継代を実施する。別の実施形態では、本明細書に開示される組み換え型リステリア株は、動物宿主を通して継代されていない。
【０２１２】
別の実施形態では、本明細書で開示されている組み換え型核酸は、リステリア株内のコードしたペプチドの発現を駆動するプロモーター／調節性配列に動作可能にリンクしている。遺伝子の構造性の発現を駆動するために有用なプロモーター／調節性配列が当該技術分野で周知であり、これらとしては、例えば、リステリアのＰｈｌｙＡプロモーター、ＰＡｃｔＡプロモーター、およびｐ６０プロモーター、ストレプトコッカスｂａｃプロモーター、ストレプトマイセス・グリセウスｓｇｉＡプロモーター、およびバシルス・チューリンゲンシスｐｈａＺプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１３】
別の実施形態では、本明細書で開示したペプチドをコードする核酸の誘発性でかつ組織に特異的な発現は、ペプチドをコードする核酸を誘発性または組織特異的プロモーター／調節性配列の制御下に置くことによって遂行される。この目的のために有用な組織特異的または誘発性プロモーター／調節性配列の実施例としては、ＭＭＴＶ  ＬＴＲ誘発性プロモーター、およびＳＶ４０後期エンハンサー／プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、金属、グルココルチコイド、およびこれに類するものなどの誘発剤に応答して誘発されたプロモーターが利用される。こうして、本発明は、既知または未知のいずれかで、かつこれらに動作可能にリンクする所望のタンパク質の発現を駆動する能力を有する、任意のプロモーター／調節性配列の使用を含むことが理解されるであろう。「異種」という用語が、参照種とは異なる種に由来する核酸、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を包含することが当業者によって理解されるであろう。したがって、例えば、異種ポリペプチドを発現するリステリア株は、一実施形態では、天然ではないかもしくはリステリア株に対して内因性のリペプチドを発現することになり、または別の実施形態では、リステリア株によって通常発現されるポリペプチドを発現することになり、または別の実施形態では、リステリア株以外の供給源からのポリペプチドを発現することになる。別の実施形態では、異種という用語は同一の種の中の異なる生命体に由来するものを記述するために使用される。別の実施形態では、異種抗原はリステリアの組み換え型株によって発現され、かつ哺乳類細胞の感染に際して組み換え型株によって細胞毒性Ｔ細胞に加工および提示される。別の実施形態では、リステリア種によって発現される異種抗原は、結果として哺乳類内に自然に発現される修飾されていない抗原またはタンパク質を識別するＴ細胞応答をもたらす限り、腫瘍細胞または感染性薬剤の中で対応する修飾されていない抗原またはタンパク質に厳密に適合する必要はない。
【０２１４】
「エピソーム性の発現ベクター」という用語が、直線状または円形状であってもよく、また通常二本鎖の形態であり、その中に細菌のゲノムまたは細胞のゲノムに組み込まれるのと反対に宿主細菌の細胞質または細胞内に存在する染色体外である核酸ベクターを包含することを当業者は理解するであろう。一実施形態では、エピソーム性の発現ベクターは対象となる遺伝子を含む。別の実施形態では、エピソーム性ベクターは細菌性の細胞質の中の複数のコピー内で持続し、結果として対象となる遺伝子の増幅をもたらし、また別の実施形態では、必要なときにウイルス性トランス作用因子が供給される。別の実施形態では、本明細書ではエピソーム性の発現ベクターはプラスミドと称される場合がある。別の実施形態では、「組み込みプラスミド」はその挿入または宿主ゲノムの中に担持される対象となる遺伝子の挿入を標的化する配列を含む。別の実施形態では、挿入された対象となる遺伝子は中断されない、または細胞ＤＮＡへの組み込みからしばしば生じる調節性の制約を受けない。別の実施形態では、挿入された異種遺伝子の存在は細胞自身の重要な領域の再配列または中断につながらない。別の実施形態では、安定したトランスフェクション手順で、エピソーム性ベクターの使用は、染色体を組み込むプラスミドの使用より高いトランスフェクション効率をしばしばもたらす（Ｂｅｌｔ，Ｐ．Ｂ．Ｇ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（ＨＰＲＴ２）ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，４８６１−４８６６；Ｍａｚｄａ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｌｙｍｐｈｏ−ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０４，１４３−１５１）。一実施形態では、本明細書で開示される方法および組成物のエピソーム性の発現ベクターは、ＤＮＡ分子を細胞に送達するために採用される様々な方法のいずれかによってインビボ、エクスビボ、またはインビトロで細胞に送達される場合がある。ベクターも単独でまたは被験者の細胞への送達を強化する医薬組成物の形態で送達される場合がある。
【０２１５】
一実施形態では、「融合される」という用語は共有結合による動作可能な連鎖を指す。一実施形態では、この用語は組み換え型融合（その核酸配列またはオープンリーディングフレームの）を含む。別の実施形態では、この用語は化学的結合を含む。
【０２１６】
一実施形態では「形質転換」という用語は、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子を取り上げるために細菌細胞を改変することを指す。別の実施形態では、「形質転換」は、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子の遺伝子を発現するために細菌細胞を改変することを指す。各々の可能性は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【０２１７】
別の実施形態では、遺伝物質および／またはプラスミドを細菌の中へと導入するために結合が使用される。結合の方法は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｎｉｋｏｄｉｎｏｖｉｃ  Ｊ．ら（Ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｎｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ  ｂｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｐｌａｓｍｉｄ．２００６  Ｎｏｖ；５６（３）：２２３−７）およびＡｕｃｈｔｕｎｇ  ＪＭら（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｍｏｂｉｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００５  Ａｕｇ  ３０；１０２（３５）：１２５５４−９）に記述されている。各々の方法は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【０２１８】
一実施形態では、「弱毒化」という用語は、細菌が動物の中に疾患を生じさせる能力の減退を意味する。つまり、弱毒化されたリステリア株の病原性特徴は野生型リステリアと比較すると低下しているが、弱毒化されたリステリアは培養物中で成長および維持する能力を有する。実施例として弱毒化されたリステリアを用いたＢａｌｂ／ｃマウスの静脈内接種を使用すると、接種した動物の５０％が生存する致死量（ＬＤ５０）は、野生型リステリアのＬＤ５０より少なくとも約１０倍増加するのが好ましく、少なくとも約１００倍増加するのがより好ましく、少なくとも約１，０００倍増加するのがより好ましく、少なくとも約１０，０００倍増加するのがなおより好ましく、および少なくとも約１００，０００倍増加するのが最も好ましい。したがってリステリアの弱毒化された株は、投与された動物を殺さないものであるか、または投与された細菌の数が同じ動物を殺すのに必要な野生型の弱毒化されていない細菌の数より非常に多いときのみ動物を殺すものである。弱毒化された細菌は、その成長のために必要な栄養素がその中に存在しないために一般的な環境内では複製する能力を有しないものを意味するとも解釈されるべきである。したがって、細菌は必要な栄養素がその中で提供される制御された環境に複製が限定される。したがって、本発明の弱毒化された株は制御されていない複製の能力がないという点で、環境的に安全である。
【０２１９】
組成物
一実施形態では、本発明の組成物は免疫原性組成物である。一実施形態では、本発明の組成物はインターフェロンガンマの強い先天的な刺激を誘発し、一実施形態では、これは抗血管形成特性を有する。一実施形態では、本明細書に開示されるリステリアはインターフェロンガンマの強い先天的な刺激を誘発し、一実施形態では、これは抗血管形成特性を有する（Ｄｏｍｉｎｉｅｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００５  Ｍａｙ；５４（５）：４７７−８８．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｏｃｔ  ６、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｅａｔｔｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  Ｆｅｂ  １５；１６６（４）：２２７６−８２、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。一実施形態では、リステリアの抗血管形成特性は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって媒介される（Ｂｅａｔｔｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，  ２００１）。別の実施形態では、リステリアの抗血管形成特性は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介される。別の実施形態では、リステリアワクチン接種の結果としてのＩＦＮ−γ分泌は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔｈ１  ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＣ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはこれらの組み合せによって媒介される。
【０２２０】
別の実施形態では、本明細書で開示されている組成物の投与は１つ以上の抗血管形成タンパク質または因子の生産を誘発する。一実施形態では、抗血管形成タンパク質はＩＦＮ−γである。別の実施形態では、抗血管形成タンパク質は、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、アンジオスタチン、エンドスタチン、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ（ｓＦｌｔ）−１、または可溶性エンドグリン（ｓＥｎｇ）である。一実施形態では、本発明のリステリアは、抗血管形成因子の放出に関与し、したがって一実施形態では、抗原を被験者に導入するためのベクターとしての役割に加えて、治療的な役割を有する。各々のリステリア株およびそのタイプは、本発明の別個の実施形態を表す。
【０２２１】
本明細書に開示された方法および組成物によって誘発される免疫応答は、別の実施形態ではＴ細胞応答である。別の実施形態では、免疫応答はＴ細胞応答を含む。別の実施形態では、応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む。各々の可能性は本明細書で開示した別個の実施形態を表す。
【０２２２】
別の実施形態では、本明細書に開示される組成物の投与は、抗原特異的Ｔ細胞の数を増加させる。別の実施形態では、組成物の投与はＴ細胞上の共刺激受容体を活性化する。別の実施形態では、組成物の投与は記憶Ｔ細胞および／またはエフェクターＴ細胞の増殖を誘発する。別の実施形態では、組成物の投与はＴ細胞の増殖を増加させる。
【０２２３】
全体を通して使用される「組成物」、および「免疫原性組成物」という用語はすべて同一の意味と質を有して交換可能である。一実施形態では、組み換え型リステリア株を含み、またさらに各構成要素の同時投与または連続投与のための抗体を含む、本明細書で開示されている免疫原性組成物も、「併用療法療法」と呼ばれる。別の実施形態では、組み換え型リステリア株を含み、またさらに各構成要素の同時投与または連続投与のための抗体を含む、本明細書で開示されている免疫原性組成物も、「併用療法療法」と呼ばれる。当業者には、併用療法は追加的な構成要素、抗体、療法なども含みうることが理解される。いくつかの実施形態では、「医薬組成物」という用語は、例えば、必要な被験者に投与するなど、医薬用途に好適な組成物を指す。
【０２２４】
被験者内に強化した抗腫瘍Ｔ細胞応答を引き出すため、被験者内で腫瘍を薬物治療した免疫抑制を阻害するため、もしくは被験者の脾臓および腫瘍のＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加するため、またはこれらの任意の組み合せの目的で、本発明の組成物を本発明の方法で使用してもよい。
【０２２５】
別の実施形態では、本明細書で開示されたリステリア株を含む組成物はアジュバントをさらに含む。一実施形態では、本発明の組成物はアジュバントをさらに含む。別の実施形態では、本発明の方法および組成物で使用されるアジュバントは顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質である。別の実施形態では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦタンパク質を含む。別の実施形態では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、アジュバントはサポニンＱＳ２１である。別の実施形態では、アジュバントはサポニンＱＳ２１を含む。別の実施形態では、アジュバントは、モノホスホリルリピドＡである。別の実施形態では、アジュバントはモノホスホリルリピドＡを含む。別の実施形態では、アジュバントはＳＢＡＳ２である。別の実施形態では、アジュバントはＳＢＡＳ２を含む。別の実施形態では、アジュバントはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、アジュバントはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインである。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインを含む。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、アジュバントはクイルグリコシドであるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは細菌マイトジェンであるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは細菌毒素であるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは当該技術分野で既知の任意の他のアジュバントであるか、またはこれを含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２２６】
一実施形態では、本明細書で開示された免疫原性組成物は、核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含み、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本明細書で開示されている免疫原性組成物は、核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含み、前記核酸分子は切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列コードする第一のオープンリーディングフレームを含む。
【０２２７】
一実施形態では、本明細書で開示されている核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物は、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、ここで前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含み、前記組成物はさらに抗体またはその断片を含む。別の実施形態では、前記抗体またはその断片は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ´）２断片、Ｆｖ断片、単鎖抗体、またはその任意の組み合わせを含む。
【０２２８】
別の実施形態では、本明細書で開示されている核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物は、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、ここで前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含み、前記組成物はさらに抗体またはその断片を含む。別の実施形態では、前記抗体またはその断片は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ´）２断片、Ｆｖ断片、単鎖抗体、またはその任意の組み合わせを含む。
【０２２９】
一部の実施形態では、「抗体」という用語は、無傷の分子およびその機能的断片を意味し、また本明細書では、例えば、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー、またはＴ細胞受容体共刺激分子、または抗原提示細胞受容体を結合する共刺激分子への結合など、本明細書で説明した望ましい標的と特異的に相互作用する能力を持つＦａｂ´  Ｆ（ａｂ´）２、およびＦｖなどの「抗原結合断片」も意味する。
【０２３０】
一部の実施形態では、抗体断片は以下のいずれかを含む。（１）Ｆａｂ´。抗体分子の一価の抗原結合断片を含む断片で、抗体全体を酵素パパインで消化して、無傷の軽鎖および１つの重鎖の部分を産生することにより生成される。（２）Ｆａｂ´。抗体全体をペプシンで処理した後、還元することによって、無傷の軽鎖および重鎖を産生することで得られる抗体分子の断片であり、抗体分子１個につき２個のＦａｂ´断片が得られる。（３）（Ｆａｂ´）２。抗体全体を酵素ペプシンで処理して、その後の還元をせずに得られる抗体の断片であり、Ｆ（ａｂ´）２は、２つのジスルフィド結合によって結合した２  Ｆａｂ´断片の二量体である。（４）Ｆｖ。軽鎖の可変領域および２つの鎖として発現した重鎖の可変領域を含む遺伝学的改変断片である。（５）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）。遺伝学的に融合された単鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによってリンクされた軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝学的改変分子。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２３１】
これらの断片を作製する方法は当該技術分野で既知である。（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８を参照。参照により本明細書に組み込む）。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、抗体断片は、抗体のタンパク質加水分解、または大腸菌もしくは哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養または他のタンパク質発現系）内での断片をコードするＤＮＡの発現によって調製される場合がある。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、抗体断片は、従来の方法による抗体全体のペプシンまたはパパイン消化によって得られる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２で表される５Ｓ断片を提供するためにペプシンを用いた抗体の酵素的開裂によって、抗体断片を生成することができる。チオール還元剤、および任意選択的にジスルフィド結合の開裂の結果として得られるスルフヒドリル基の保護基を使用して、この断片をさらに開裂して３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価断片を生成することができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素的開裂は、２つの一価Ｆａｂ’断片および１つのＦｃ断片を直接的に生成する。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許  第４，０３６，９４５号および同第４，３３１，６４７号、およびその中に含有される参考文献によって記述され、これらの特許はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，７３：１１９−１２６，１９５９も参照のこと。断片が無傷の抗体によって識別される抗原に結合する限り、一価の軽重鎖断片を形成するための重鎖の分離、断片のさらなる開裂、または他の酵素的、化学的、または遺伝子学的な技法など、抗体を開裂する他の方法を使用してもよい。
【０２３４】
Ｆｖ断片はＶＨ鎖およびＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、Ｉｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６９：２６５９−６２，１９７２に記述されるように非共有結合性である場合がある。あるいは、可変鎖を分子間ジスルフィド結合によってリンクする、またはグルタルアルデヒドなどの化学薬品によって架橋することができる。Ｆｖ断片はペプチドリンカーによって接続されたＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含むことが好ましい。これらの単一鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって接続されるＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造的遺伝子は発現ベクター内へと挿入され、これはその後大腸菌などの宿主細胞の中へと導入される。組み換え型宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを用いて単一のポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを生成するための方法は、例えば、ＷｈｉｔｌｏｗおよびＦｉｌｐｕｌａによる方法、２：９７−１０５，１９９１；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９８８；Ｐａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１２７１−７７，１９９３；およびＬａｄｎｅｒらの米国特許  第４，９４６，７７８号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、に記述されている。
【０２３５】
抗体断片の別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。対象となる抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって、ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）を得ることができる。かかる遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して抗体生成細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって調製される。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｆｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２：１０６−１０，１９９１を参照のこと。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記述される抗体または断片は、抗体の「ヒト化形態」を含む場合がある。いくつかの実施形態では、「抗体のヒト化形態」という用語は、非ヒト（例えば、マウスの）抗体を指し、これは非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する免疫グロブリンのキメラ型分子、免疫グロブリン鎖、またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合部分配列など）である。ヒト化抗体は、その中でレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、非ヒト種（ドナー抗体）（所望の特異性、親和性、および容量を有するマウス、ラット、またはウサギなど）のＣＤＲからの残基によって置き換えられる、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。いくつかの事例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体は、レシピエント抗体でも移入したＣＤＲまたはフレームワーク配列でも見られない残基も含む場合がある。一般に、ヒト化抗体は少なくとも１つの、そして典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むことになり、ここでＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてはヒト免疫グロブリン共通配列のものである。最適にはヒト化抗体は、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含むことになる［Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）］。
【０２３７】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該技術分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトの供給源からその中に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば移入残基と称され、これらは典型的には移入可変ドメインから取られる。ヒト化は本質的にウィンターおよびその協力者の方法［Ｊｏｎｅｓｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］に従って、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応配列の代わりに用いることによって遂行できる。したがって、こうしたヒト化抗体はキメラ型抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、無傷のヒト可変ドメインより大幅に少ないものが非ヒト種からの対応配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は典型的にはヒト抗体であり、この中でいくつかのＣＤＲ残基および場合によってはいくつかのＦＲ残基は齧歯類の抗体の類似部位からの残基によって置換されている。
【０２３８】
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む、当該技術分野で既知の様々な技法を使用しても生産することができる［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１（１９９１）］．Ｃｏｌｅらの技法およびＢｏｅｒｎｅｒらの技法もヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）、およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６−９５（１９９１）］。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、マウスの中へと導入することによってヒトを作製することができ、この中で内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的にまたは完全に無効化されている。チャレンジに際して、ヒト抗体の生成が観察され、これは遺伝子の再配列、組立、および抗体レパートリーを含むすべてに関してヒトの中で見られるものと酷似している。この取り組みは、例えば、米国特許  第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６、および以下の科学出版物：Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，  ８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３  ６５−９３（１９９５）に記述されている。
【０２３９】
一実施形態では、抗体またはその機能的断片は、Ｔ細胞受容体共刺激分子を含む抗原またはその部分、共刺激分子を結合する抗原提示細胞受容体またはＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーに結合される。別の実施形態では、抗原またはその部分は、ＣＤ２８、ＩＣＯＳを含むＴ細胞受容体共刺激分子である。別の実施形態では、抗原またはその部分は、ＣＤ８０受容体、ＣＤ８６受容体、またはＣＤ４６受容体を含む共刺激分子を結合する抗原提示細胞受容体を含む。別の実施形態では、抗原またはその部分は、グルココルチコイド誘発ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４受容体）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７受容体）またはＴＮＦＲ２５を含む、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーを含む。
【０２４０】
一実施形態では、抗体または機能的断片は、Ｔ細胞受容体共刺激分子結合領域、共刺激分子を結合する抗原提示細胞受容体結合領域、またはＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー結合領域を含む。別の実施形態では、本明細書で開示されている抗体は、ＣＤ２８抗体、ＩＣＯＳ抗体、またはこれまで無名の共刺激受容体に対する抗体である。別の実施形態では、抗体はＣＤ８０受容体抗体、ＣＤ８６受容体抗体、またはＣＤ４６受容体抗体である。別の実施形態では、抗体は、グルココルチコイド誘発ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）抗体、ＯＸ４０（ＣＤ１３４受容体）抗体、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７受容体）抗体またはＴＮＦＲ２５抗体を含むＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー結合抗体である。抗体の形態は、モノクローナル、ポリクローナル、ヒト、または非ヒト種の動物に由来するヒト化抗体としうる。抗体は、共刺激受容体結合部位のための作動薬としての機能に特異的な一方または両方の抗体鎖の可変部分を有する、完全長または部分としうる。
【０２４１】
別の実施形態では、本明細書で開示されている抗体は、抗ＯＸ４０抗体またはその断片を結合する抗原である。別の実施形態では、抗体は抗ＧＩＴＲ抗体またはその断片を結合する抗原である。
【０２４２】
別の実施形態では、被験者におけるガンまたは感染性疾患疾患を治療する方法が開示されており、方法はエフェクターＴ細胞の個体群を入手する工程、個体群をＧＩＴＲＬ、ＧＩＴＲＬの活性断片、ＧＩＴＲＬを含む融合タンパク質、ＧＩＴＲＬの活性断片を含む融合タンパク質、作動薬の小分子、および作動薬の抗抗体から成る群から選択されるＧＩＴＲ作動薬で処理する工程を含む。別の実施形態では、被験者はガン罹患者である。
【０２４３】
別の実施形態では、組み換え型リステリア株と、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬの活性断片、ＧＩＴＲＬを含む融合タンパク質、ＧＩＴＲＬの活性断片を含む融合タンパク質、作動薬の小分子、および作動薬の抗抗体から成る群から選択されるＧＩＴＲ作動薬とを含む併用療法が開示されており、ここで前記併用療法は、腫瘍またはガンを持つ被験者の治療において使用するためである。
【０２４４】
一実施形態では、本開示は、抗ＣＤ１３４抗体、および抗ＣＤ１３４の誘導体を含めたヒトＣＤ１３４に結合する孤立結合分子を提供する。
【０２４５】
本開示の別の実施形態では、ヒトＣＤ１３４に結合する結合分子が提供されており、ここで、結合分子はヒトＣＤ１３４（ＯＸ４０  リガンド（ＯＸ４０Ｌ）を阻止せず、またここで、前記結合分子はさらにヒトＣＤ１３４発現Ｔエフェクター細胞でのヒトＯＸ４０Ｌの免疫刺激性および／または増殖性応答を妨げない。
【０２４６】
別の実施形態では、本開示は、ヒトＣＤ１３４に結合する結合分子を提供しているが、ここで、ヒトＣＤ１３４発現Ｔ細胞でのＣＤ１３４へのＯＸ４０Ｌの結合の効果は、約７０％、または約６０％、または約５０％、または約４０％、または約３０％、または約２０％、または約１０％以下を超えない程度に低減され、またここで、前記結合分子はヒトＣＤ１３４発現Ｔエフェクター細胞でのヒトＯＸ４０Ｌの免疫刺激性および／または増殖性応答を増強する。
【０２４７】
別の実施形態では、本開示はヒトＣＤ１３４に結合する結合分子が提供しているが、ここで、結合分子はヒトＣＤ１３４（ＯＸ４０  リガンド（ＯＸ４０Ｌ）を阻止せず、またここで、前記結合分子はヒトＣＤ１３４発現Ｔエフェクター細胞でのヒトＯＸ４０Ｌの免疫賦活性および／または増殖性応答を増強する。
【０２４８】
一実施形態では、本明細書に開示される疾患はガンまたは腫瘍である。一実施形態では、本発明の方法で治療されるガンは乳ガンである。別の実施形態では、このガンは子宮頸ガンである。別の実施形態では、このガンはＨｅｒ２を含有するガンである。別の実施形態では、このガンはメラノーマである。別の実施形態では、このガンは膵臓ガンである。別の実施形態では、このガンは卵巣ガンである。別の実施形態では、このガンは胃ガンである。別の実施形態では、このガンは膵臓のガンの病巣である。別の実施形態では、このガンは肺腺ガンである。別の実施形態では、このガンは肺腺ガンである。別の実施形態では、これは多形性膠芽腫である。別の実施形態では、このガンは結腸直腸腺ガンである。別の実施形態では、このガンは肺扁平上皮腺ガンである。別の実施形態では、このガンは胃腺ガンである。別の実施形態では、このガンは卵巣表面の上皮性新生物（例えば、その良性の、増殖性の、または悪性の変種）である。別の実施形態では、このガンは口腔扁平上皮ガンである。別の実施形態では、このガンは非小細胞肺ガンである。別の実施形態では、このガンは子宮内膜ガンである。別の実施形態では、このガンは膀胱ガンである。別の実施形態では、このガンは頭頸部ガンである。別の実施形態では、このガンは前立腺ガンである。別の実施形態では、このガンは口腔咽頭ガンである。別の実施形態では、このガンは肺ガンである。別の実施形態では、このガンは肛門ガンである。別の実施形態では、このガンは大腸ガンである。別の実施形態では、このガンは食道ガンである。別の実施形態では、このガンは中皮腫である。
【０２４９】
一実施形態では、本明細書で開示されている異種抗原はＨＰＶ−Ｅ７である。別の実施形態では、抗原はＨＰＶ−Ｅ６である。別の実施形態では、ＨＰＶ−Ｅ７はＨＰＶ株１６由来である。別の実施形態では、ＨＰＶ−Ｅ７はＨＰＶ株１８由来である。別の実施形態では、ＨＰＶ−Ｅ６はＨＰＶ株１６由来である。別の実施形態では、ＨＰＶ−Ｅ７はＨＰＶ株１８由来である。別の実施形態では、本明細書で開示されている異種抗原の断片も本発明に包含される。
【０２５０】
別の実施形態では、抗原はＨｅｒ２／ｎｅｕである。別の実施形態では、抗原はＮＹ−ＥＳＯ−１である。別の実施形態では、抗原はテロメラーゼ（ＴＥＲＴ）である。別の実施形態では、抗原はＳＣＣＥである。別の実施形態では、抗原はＣＥＡである。別の実施形態では、抗原はＬＭＰ−１である。別の実施形態では、抗原はｐ５３である。別の実施形態では、抗原は炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）である。別の実施形態では、抗原はＰＳＭＡである。別の実施形態では、抗原は前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）である。別の実施形態では、抗原はＨＭＷ−ＭＡＡである。別の実施形態では、抗原はＷＴ−１である。別の実施形態では、抗原はＨＩＶ−１Ｇａｇである。別の実施形態では、抗原はプロテイナーゼ３である。別の実施形態では、抗原はチロシナーゼ関連タンパク質２である。別の実施形態では、抗原はＰＳＡ（前立腺特異抗原）である。別の実施形態では、抗原は、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＰＶ−Ｅ６、Ｈｅｒ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ）、ＳＣＣＥ、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＥＧＦＲ−ＩＩＩ、サバイビン、アポトーシス反復含有のバキュロウイルス阻害剤５（ＢＩＲＣ５）、ＷＴ−１、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、ＣＥＡ、ＬＭＰ−１、ｐ５３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２、Ｍｕｃ１、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）またはこれらの組み合わせから選択される。
【０２５１】
別の実施形態では、「免疫原性断片」は、単独でまたは本明細書に開示されたワクチン組成物内で被験者に投与されるとき、免疫応答を引き出す免疫原性断片である。別の実施形態では、かかる断片は、体液性免疫応答および／または適応免疫応答を引き出すために必要なエピトープを含有する。
【０２５２】
一実施形態では、本明細書で開示されている組成物は抗体またはその機能的断片を含む。別の実施形態では、組成物は少なくとも１つの抗体またはその機能的断片を含む。別の実施形態では、組成物は２つの抗体、３つの抗体、４つの抗体、または４つを超える抗体を含みうる。別の実施形態では、本発明の組成物はＬｍ株および抗体またはその機能的断片を含む。別の実施形態では、本明細書で開示されている組成物はＬｍ株および少なくとも１つの抗体またはその機能的断片を含む。別の実施形態では、本明細書で開示されている組成物は、Ｌｍ株および２つの抗体、３つの抗体、４つの抗体、または４つを超える抗体を含む。別の実施形態では、本明細書で開示されている組成物は抗体またはその機能的断片を含む。同一のまたは異なる組成物に提示する異なる抗体は、同一の形態を有する必要はなく、例えば、１つの抗体はモノクローナル抗体であってもよく、別の抗体はＦＡｂ断片であってもよい。
【０２５３】
一実施形態では、本明細書で開示されている組成物は、特異的にＧＩＴＲまたはその部分に結合する抗体またはその機能的断片を含む。別の実施形態では、本明細書で開示されている組成物は、特異的にＯＸ４０またはその部分に結合する抗体またはその機能的断片を含む。別の実施形態では、組成物は、ＧＩＴＲまたはその部分に特異的に結合する抗体、およびＯＸ４０に特異的に結合する抗体を含む。別の実施形態では、本発明の組成物は、ＧＩＴＲに特異的に結合するＬｍ株およびその抗体または機能的断片を含む。別の実施形態では、本発明の組成物は、ＯＸ４０に特異的に結合するＬｍ株およびその抗体または機能的断片を含む。別の実施形態では、本発明の組成物は、Ｌｍ株およびＧＩＴＲまたはその部分に特異的に結合する抗体、ならびにＯＸ４０またはその部分に特異的に結合する抗体を含む。別の実施形態では、本発明の組成物は、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその機能的断片を含み、ここで、組成物は本明細書で開示されているリステリア株を含まない。別の実施形態では、本発明の組成物は、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体またはその機能的断片を含み、ここで、組成物は本明細書で開示されているリステリア株を含まない。別の実施形態では、本発明の組成物は、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその機能的断片、およびＧＩＴＲに特異的に結合する抗体を含み、ここで、組成物は本明細書で開示されているリステリア株を含まない。同一のまたは異なる組成物に提示する異なる抗体は、同一の形態を有する必要はなく、例えば、１つの抗体はモノクローナル抗体であってもよく、別の抗体はＦＡｂ断片であってもよい。各々の可能性は、本発明の異なる実施形態を表す。
【０２５４】
「抗体機能的断片」という用語は、特異的に抗原に結合する能力を有し、本発明で意図されている生物学的効果をもたらす無傷の抗体の部分を指す。抗体断片の実施例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、およびＦｖ断片、線状抗体、ｓｃＦｖ抗体、および抗体断片から形成される多選択性抗体が挙げられるがこれに限定されない。、
【０２５５】
本明細書で使用される「抗体重鎖」は、すべての抗体分子にそれらの自然発生的な配座で存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうち長い方を意味する。
【０２５６】
本明細書で使用される「抗体軽鎖」は、すべての抗体分子にそれらの自然発生的な配座で存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうち短い方を意味し、κおよびλ軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを意味する。
【０２５７】
当業者であれば、「合成抗体」という用語は、例えば、本明細書で説明したとおりバクテリオファージによる抗体発現など、組み換え型ＤＮＡ技術を使用して生成された抗体を包含することを理解するであろう。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成され、かつＤＮＡ分子が抗体タンパク質を発現する抗体、あるいは抗体を特定するアミノ酸配列を意味するようにも解釈されるべきであり、ここで、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当該技術分野で入手可能でありかつ周知の合成ＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して取得したものである。
【０２５８】
一実施形態では、抗体またはその機能的断片は抗原結合領域を含む。一実施形態では、抗原結合領域は抗体またはその抗原結合ドメインである。一実施形態では、その抗原結合ドメインはＦａｂまたはｓｃＦｖである。
【０２５９】
抗体に関して「結合する」または「特異的に結合する」という用語は、特異的な抗原を認識するが、実質的にサンプル内の他の分子を認識もしくは結合しない抗体またはその機能的断片を包含することを当業者は理解するであろう。例えば、１つの種からの抗原に特異的に結合する抗体は、１つ以上の種からその抗原にも結合する場合があるが、かかる異種間の反応性はそれ自体抗体の分類を特異的なものとして変更することはない。別の実施例では、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原の異なる対立形質にも結合する場合がある。しかしながら、かかる交差反応は、それ自体抗体の分類を特異的なものとして変更することはない。いくつかの事例では、「特異的な結合」または「特異的に結合する」という用語を、抗体、タンパク質、またはペプチドの第２の化学種との相互作用に関連して使用することができ、相互作用が化学種の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味し、例えば、抗体は、特異的なアミノ酸配列ではなく、特異的なタンパク質構造を認識および結合する。
【０２６０】
一実施形態では、本発明の組成物は、組み換え型リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）株を含む。別の実施形態では、本明細書で開示されている組成物は、本明細書で説明した通り、抗体またはその機能的断片を含む。
【０２６１】
一実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書で開示されている抗体またはその機能的断片、および本明細書で開示されている組み換え型弱毒化リステリアを含む。別の実施形態では、本明細書に開示された免疫原性組成物の各々の構成成分を、本明細書に開示された免疫原性組成物の別の構成成分の前に、別の構成成分と同時に、または別の構成成分の後に投与する。一実施形態では、同時に投与するときでさえも、Ｌｍ組成物と抗体またはその機能的断片とを２つの別個の組成物として投与する場合がある。あるいは、別の実施形態では、Ｌｍ組成物は、抗体またはその機能的断片を含む場合がある。
【０２６２】
別の実施形態では、非経口的に、癌近傍に、経粘膜的に、経皮的に、筋肉内に、静脈内に、皮内に、皮下に、腹腔内に、脳室内に、頭蓋内に、腟内に、または腫瘍内になどの当業者に既知の任意の方法によって、本明細書で開示された組成物を被験者に投与する。
【０２６３】
別の実施形態では、組成物は経口で投与され、したがってこれは経口投与に好適な形態、すなわち固形調製物または液状調製物で処方される。好適な固形の経口剤形としては、錠剤、カプセル、丸薬、顆粒、ペレット、およびこれに類するものが挙げられる。好適な液状の経口剤形としては、溶液、懸濁液、分散剤、エマルション、オイル、およびこれに類するものが挙げられる。本発明の別の実施形態では、活性成分はカプセルで処方される。この実施形態によると、本発明の組成物は活性化合物および不活性担体または希釈剤に加えて、硬いゼラチンカプセルを含む。
【０２６４】
別の実施形態では、組成物は、液状調製物の静脈内、動脈内、または筋肉内注射によって投与される。好適な液体剤形としては、溶液、懸濁液、分散剤、エマルション、オイルおよびこれに類するものが挙げられる。一実施形態では、医薬組成物は静脈内に投与され、したがって静脈内投与に好適な形態で処方される。別の実施形態では、医薬組成物は動脈内に投与され、したがって動脈内投与に好適な形態で処方される。別の実施形態では、医薬組成物は筋肉内に投与され、したがって筋肉内投与に好適な形態で処方される。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、抗体またはその機能的断片が組み換え型Ｌｍ株を含む組成物から別個に投与されるとき、抗体は、静脈内で、皮下で、または腫瘍もしくは腫瘍床の中へと直接的に注射されてもよい。一実施形態では、抗体を含む組成物は、腫瘍を外科手術的に除去した後に残された空間、例えば、前立腺腫瘍の除去後の前立腺内の空間の中へと注射される。
【０２６６】
一実施形態では、「免疫原性組成物」という用語は本明細書で開示されている組み換え型リステリア、ならびにアジュバントおよび抗体もしくはその機能的断片、またはこれらの任意の組合せを包含する場合がある。別の実施形態では、免疫原性組成物は本明細書に開示された組み換え型リステリアを含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は当該技術分野で既知のまたは本明細書に開示されたアジュバントを含む。本明細書にさらに開示されているとおり、かかる組成物の投与が免疫応答を強化する、またはＴエフェクター細胞に対する制御性Ｔ細胞の比を増加するもしくは抗腫瘍免疫応答を引き出すことも理解されるべきである。
【０２６７】
一実施形態では、本発明は、説明したリステリア菌株を含み、また抗体またはその機能的断片をさらに含む組成物の投与を含む、使用方法を提供する。別の実施形態では、使用方法は、同じまたは異なる組成物に存在しうる、かつ同じ組成物内にリステリアとして存在するか、または別個の組成物内に存在しうる、本明細書で開示されている複数の抗体の投与を含む。
【０２６８】
別の実施形態では、「医薬組成物」という用語は、リステリア株および少なくとも１つの抗体またはその機能的断片を医薬的に許容される担体または希釈剤とともに含む治療的に有効な量の活性成分（複数可）を包含する。「治療的に有効な量」という用語が、所与の病状および投与レジメンに対して治療的効果を提供する量を指すことが理解されるであろう。
【０２６９】
「投与する」という用語は被験者に本発明の組成物との接触をもたらすことを包含することを当業者は理解するであろう。一実施形態では、投与はインビトロで、すなわち、試験管内で、またはインビボで、すなわち、生命体、例えば、ヒトの細胞または組織の中で遂行することができる。一実施形態では、本発明は、本発明のリステリア株およびその組成物を被験者に投与することを包含する。
【０２７０】
本明細書で使用される時、「約」という用語は定量的な用語プラスもしくはマイナス５％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス１０％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス１５％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス２０％を意味する。「被験者」という用語は、状態もしくはその後遺症に対する療法を必要とするまたはその状態になりやすい、成人のヒト、またはヒトの子ども、ティーンエージャー、もしくは青年を含む哺乳類を包含することができ、これはイヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびマウスなどのヒト以外の哺乳類を含みうることを当業者は理解するべきである。この用語が家畜を包含してもよいことも理解されるであろう。「被験者」という用語はあらゆる点で正常な個体を除外しない。
【０２７１】
本明細書に開示された免疫原性組成物の投与に続いて、本明細書に開示された方法は末梢リンパ器官内でのＴエフェクター細胞の増殖を誘発し、腫瘍部位におけるＴエフェクター細胞の存在の強化をもたらす。別の実施形態では、本明細書に開示された方法は末梢リンパ器官におけるＴエフェクター細胞の増殖を誘発し、Ｔエフェクター細胞の末梢における存在の強化をもたらす。Ｔエフェクター細胞のかかる増殖は、Ｔｒｅｇの数に影響を与えずに、末梢内および腫瘍部位におけるＴエフェクター細胞の制御性Ｔ細胞に対する比の増加をもたらす。末梢リンパ器官としては、脾臓、パイエル板、リンパ節、アデノイド等が挙げられるが、これに限定されないことを当業者は理解するであろう。一実施形態では、Ｔｒｅｇの数に影響を与えずに、Ｔエフェクター細胞の制御性Ｔ細胞に対する比の増加が末梢で生じる。別の実施形態では、末梢、リンパ器官、および腫瘍部位で、これらの部位でのＴｒｅｇの数に影響を与えずに、Ｔエフェクター細胞の制御性Ｔ細胞に対する比の増加が生じる。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞の比の増加はＴｒｅｇの頻度を減少するが、この部位におけるＴｒｅｇの総数は減少しない。
【０２７２】
併用療法およびその使用方法
開示されている一実施形態では、被験者において強化された抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘発する方法が提供されており、方法は、核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む有効量の免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、ここで前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含み、ここで方法はさらに、抗体またはその断片を含む有効量の組成物を前記被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、抗体は作動薬抗体またはその断片を結合する抗原である。別の実施形態では、抗体は抗ＴＮＦ受容体抗体またはその断片を結合する抗原である。別の実施形態では、抗体は抗ＯＸ４０抗体またはその断片を結合する抗原である。別の実施形態では、抗体は抗ＧＩＴＲ抗体またはその断片を結合する抗原である。別の実施形態では、前記方法はさらに、前記組み換え型リステリア株を含む組成物内に含まれうるか、または別個の組成物内に含まれうる、追加的な抗体の投与を含む。
【０２７３】
別の実施形態では、被験者において強化された抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘発する方法が開示されており、方法は、核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む有効量の免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列コードする第一のオープンリーディングフレームを含み、ここで方法はさらに、抗体またはその断片を含む有効量の組成物を前記被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、抗体は作動薬抗体またはその断片を結合する抗原である。別の実施形態では、抗体は抗ＴＮＦ受容体抗体またはその断片を結合する抗原である。別の実施形態では、抗体は抗ＯＸ４０抗体またはその断片を結合する抗原である。別の実施形態では、抗体は抗ＧＩＴＲ抗体またはその断片を結合する抗原である。別の実施形態では、前記方法はさらに、前記組み換え型リステリア株を含む組成物内に含まれうるか、または別個の組成物内に含まれうる、追加的な抗体の投与を含む。
【０２７４】
一実施形態では、本明細書で説明したリステリア株を含む任意の組成物を、本明細書で開示した方法で使用されうる。一実施形態では、リステリア株および抗体またはその断片、例えば、本明細書で説明した通り、抗体結合ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー、またはＴ細胞受容体共刺激分子に結合される抗体または共刺激分子を結合する抗原提示細胞受容体に結合する抗体を含む、任意の組成物が本発明の方法で使用されうる。一実施形態では、本明細書で説明した抗体またはその機能的断片を含む任意の組成物を、本明細書で開示した方法で使用されうる。リステリア株を含む組成物で、抗体を含むものと含まないものを上記に詳細に説明してきた。抗体を含む組成物についても上記に詳細に説明してきた。一部の実施形態では、本発明の方法において、抗体またはその断片、例えば、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーに結合される抗体、またはＴ細胞受容体共刺激分子に結合される抗体または共刺激分子を結合する抗原提示細胞受容体に結合する抗体を含む組成物は、リステリア株を含む組成物の投与の前に、それと同時に、またはその後に投与されうる。
【０２７５】
一実施形態では、腫瘍の退行を達成するために、初回の治療過程にすぐ引き続いて、または数日、数週間、もしくは数か月の間隔の後、本明細書で開示された組成物の繰返し投与（投薬）を行ってもよい。別の実施形態では、腫瘍増殖の抑制を達成するために、第１の処置の過程にすぐ引き続いて、または数日、数週間、または数か月の間隔の後、繰返し投与を行ってもよい。撮像技法、血清腫瘍マーカーの解析、生検、または腫瘍に伴う症状の存在、不在、または寛解などの診断方法を含む当該技術分野で既知の任意の技法によって評価を決定してもよい。
【０２７６】
一実施形態では、本明細書には、異種抗原を発現する腫瘍の予防、治療およびそれに対するワクチン接種のための、および異種抗原の準優占エピトープに対する免疫応答を誘発しつつ、腫瘍のエスケープ変異を防止するための方法および組成物が開示されている。
【０２７７】
一実施形態では、異種抗原を発現する腫瘍の予防、治療およびそれに対するワクチン接種のための方法および組成物は、切断リステリオリシン（ｔＬＬＯ）タンパク質の使用を含む。別の実施形態では、本明細書で開示した方法および組成物は、ＬＬＯを過剰発現する組み換え型リステリア過剰発現ｔＬＬＯを含む。別の実施形態では、ｔＬＬＯはリステリア内のプラスミドから発現される。
【０２７８】
別の実施形態では、被験者内における腫瘍増殖またはガンを予防または治療するための方法が本明細書に提供され、この方法は本明細書で説明した通り、抗体またはその機能的断片と、核酸分子を含む組み換え型リステリア株とを含む免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含み、核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、被験者内での腫瘍増殖またはガンを予防または治療するための方法が本明細書に提供され、この方法は本明細書で説明した通りの抗体またはその機能的断片と、核酸分子を含む組み換え型リステリア株とを含む免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含み、核酸分子は、切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列をコードする第１のオープンリーディングフレームを含む。
【０２７９】
一実施形態では、「治療する」という用語は疾患を治癒することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患を防止することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患の発生率を減少することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患の症状を軽快することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは患者のパフォーマンスのない生存率または全体的な生存率が増加することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患の進行を安定させることを指す。別の実施形態では、「治療する」とは寛解を誘発することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患の進行を減速することを指す。別の実施形態では、「減少する」、「抑制する」、および「阻害する」という用語は、より少なくすることまたは減らすことを指す。
【０２８０】
一実施形態では、被験者の脾臓および腫瘍微小環境内で、Ｔエフェクター細胞の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加する方法が本明細書に提供され、方法は本明細書に開示された免疫原性組成物を投与することを含む。別の実施形態では、被験者内の脾臓および腫瘍微小環境内のＴエフェクター細胞の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加することは、被験者内のより著明な抗腫瘍応答を可能にする。
【０２８１】
別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞を含む。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞である。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、制御性Ｔ細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞である。
【０２８２】
一実施形態では、本発明は、腫瘍またはガンを治療する、腫瘍またはガンから保護する、および腫瘍またはガンに対する免疫応答を誘発する方法を提供し、これには本明細書に提供される免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。
【０２８３】
一実施形態では、本発明はヒト被験者内の腫瘍またはガンを予防または治療する方法を提供し、これには被験者に本明細書に開示された免疫原性組成物の株を投与する工程を含み、この組み換え型リステリア株はＬＬＯタンパク質のＮ末端断片および腫瘍関連抗原を含む組み換え型ポリペプチドを含み、それによってこの組み換え型リステリア株が腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘発し、これによってヒト被験者内の腫瘍またはガンを治療する。別の実施形態では、免疫応答はＴ細胞応答である。別の実施形態では、Ｔ細胞応答はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、Ｔ細胞応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、Ｔ細胞応答はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、本発明は腫瘍またはガンから被験者を保護する方法を提供し、これには本明細書で開示される免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本発明は被験者内の腫瘍の退行を誘発する方法を提供し、これには本明細書に開示された免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本明細書は腫瘍またはガンの発生または再発を減少させる方法を開示し、これには本明細書に開示された免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本明細書は被験者内の腫瘍の形成を抑制する方法を開示し、これには本明細書に開示された免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本明細書は被験者内のガンの寛解を誘発する方法を開示し、これには本明細書に開示された免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。一実施形態では、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸分子はリステリアゲノムに組み込まれる。別の実施形態では、核酸分子は組み換え型リステリアワクチン株内のプラスミドの中にある。
【０２８４】
一実施形態では、方法は組み換え型リステリアを追加的な療法とともに同時投与する工程を含む。別の実施形態では、追加的な療法は外科手術、化学療法、免疫療法、放射線療法、抗体ベースの免疫療法、またはこれらの組み合わせである。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与より追加的療法を先に行う。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与に続いて追加的療法を行う。別の実施形態では、追加的療法は抗体療法である。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞に対する調節性Ｔ細胞の比を増加し、より強力な抗腫瘍免疫応答を生成するために、組み換え型リステリアは漸増用量で投与される。細胞の免疫応答を強化するために、腫瘍を有する被験者にＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、および当該技術分野で既知の他のサイトカインを含むがこれに限定されないサイトカインを提供することによって、抗腫瘍免疫応答をさらに強化することができることが当業者によって理解されるであろう。これらのうちのいくつかは米国特許第６，９９１，７８５号に記載されており、この特許は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２８５】
一実施形態では、本明細書に開示された方法は、本明細書に提供される免疫原性組成物を前記被験者内で抗腫瘍免疫応答を強化する抗体またはその機能的断片と同時投与する工程をさらに含む。
【０２８６】
一実施形態では、本明細書に開示された方法は、本明細書に開示された免疫原性組成物をインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）経路阻害剤と同時投与する工程をさらに含む。本発明で使用するためのＩＤＯ経路阻害剤としては、１−メチルトリプトファン（１ＭＴ）、１−メチルトリプトファン（１ＭＴ）、ネクロスタチン−１、ピリドキサールイソニコチノイルヒドラゾン、エブセレン、５−メチルインドール−３−カルボキサルデヒド、ＣＡＹ１０５８１、抗ＩＤＯ抗体、または小分子ＩＤＯ阻害剤が挙げられるがこれに限定されない当該技術分野で既知の任意のＩＤＯ経路阻害剤を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組成物および方法は、化学療法または放射線療法レジメンと併せて、その前に、またはそれに続いても使用される。別の実施形態では、ＩＤＯ阻害は化学療法剤の効率を強化する。
【０２８７】
別の実施形態では、ガンに罹患しているかまたは腫瘍を有する被験者の生存率を増加させる方法が本明細書に提供され、この方法は本明細書で説明した通り  抗体またはその機能的断片と、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株とを含む免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含み、核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。
【０２８８】
別の実施形態では、ガンに罹患しているかまたは腫瘍を有する被験者の抗原特異的Ｔ細胞を増加させる方法が本明細書に提供され、この方法は本明細書で説明した通りの抗体またはその機能的断片と、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株とを含む免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含み、核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ガンに罹患しているかまたは腫瘍を有する被験者のＴ細胞を増加させる方法が本明細書に提供され、この方法は本明細書で説明した通りの抗体またはその機能的断片と、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株とを含む免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含み、核酸分子は、切断リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列をコードする第１のオープンリーディングフレームを含む。
【０２８９】
別の実施形態では、本発明の方法は、本明細書で開示した通り、組み換え型リステリア株または抗体またはその機能的断片を用いて被験者をブーストする工程をさらに含む。別の実施形態では、ブースター接種で使用される組み換え型リステリア株は初期の「プライミング」接種で使用される株と同一である。別の実施形態では、ブースター株はプライミング株とは異なる。別の実施形態では、ブースター接種で使用される抗体は、初期の「プライミング」接種で使用されるものと同一の抗原を結合する。別の実施形態では、ブースター抗体はプライミング抗体とは異なる。別の実施形態では、プライミング接種とブースティング接種とで同一の用量が使用される。別の実施形態では、ブースターではより大きい用量が使用される。別の実施形態では、ブースターではより小さい用量が使用される。別の実施形態では、本発明の方法は被験者にブースターワクチン接種を実施する工程をさらに含む。一実施形態では、ブースターワクチン接種は単一のプライミングワクチン接種に続いて行われる。別の実施形態では、プライミングワクチン接種の後に単一のブースターワクチン接種を実施する。別の実施形態では、プライミングワクチン接種の後、２回のブースターワクチン接種を実施する。別の実施形態では、プライミングワクチン接種の後、３回のブースターワクチン接種を実施する。一実施形態では、プライム株とブースト株との間の期間は、当業者によって実験的に決定される。別の実施形態では、プライム株とブースト株との間の期間は１週間であり、別の実施形態では、これは２週間であり、別の実施形態では、これは３週間であり、別の実施形態では、これは４週間であり、別の実施形態では、これは５週間であり、別の実施形態では、これは６〜８週間であり、さらに別の実施形態では、ブースト株をプライム株の８〜１０週間後に投与する。  
【０２９０】
別の実施形態では、本発明の方法は、本明細書で開示される弱毒化リステリア株を含む免疫原性組成物を用いて被験者をブーストすることをさらに含む。別の実施形態では、本発明の方法は本明細書に開示される弱毒化リステリア株を含む免疫原性組成物のブースター用量を投与する工程を含む。別の実施形態では、ブースター用量は前記免疫原性組成物の代替形態である。別の実施形態では、本発明の方法は被験者にブースター免疫原性組成物を投与する工程をさらに含む。一実施形態では、ブースター用量は前記免疫原性組成物の単一のプライミング用量の後に続く。別の実施形態では、プライミング用量の後に単一のブースター用量を投与する。別の実施形態では、プライミング用量の後に２回のブースター用量を投与する。別の実施形態では、プライミング用量の後に３回のブースター投与量を投与する。一実施形態では、本明細書に開示された弱毒化リステリアを含む免疫原性組成物のプライム用量とブースト用量との間の期間は当業者によって実験的に決定される。別の実施形態では、この用量は当業者によって実験的に決定される。別の実施形態では、プライム用量とブースト用量との間の期間は１週間であり、別の実施形態では、これは２週間であり、別の実施形態では、これは３週間であり、別の実施形態では、これは４週間であり、別の実施形態では、これは５週間であり、別の実施形態では、これは６〜８週間であり、さらに別の実施形態では、ブースト用量を免疫原性組成物のプライム用量の８〜１０週間後に投与する。
【０２９１】
異種「プライムブースト」戦略は免疫応答および多数の病原体に対する保護を強化するために効果的であった。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１７０：２９−３８（１９９９）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２３９−５０（２００２）；Ｇｏｎｚａｌｏ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒａｉｎ  ２０：１２２６−３１（２００２）；Ｔａｎｇｈｅ，Ａ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：３０４１−７（２００１）。プライム注射とブースト注射において異なる形態で抗原を提供すると、抗原に対する免疫応答を最大化するように思われる。ＤＮＡ株プライミングの後にアジュバント中のタンパク質を用いたブースティング、または抗原をコードするＤＮＡのウイルスベクター送達が続くのが、抗原特異的抗体およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答のそれぞれの改善の最も効果的なやり方であるように思われる。Ｓｈｉｖｅｒ  Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：３３１−５（２００２）；Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒａｉｎ  ２０：１０３９−４５（２００２）；Ｂｉｌｌａｕｔ−Ｍｕｌｏｔ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒａｉｎ  １９：９５−１０２（２０００）；Ｓｉｎ，Ｊ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１８：７７１−９（１９９９）。サルのワクチン接種の研究からの最近のデータは、サルにＨＩＶ  ｇａｇ  ＤＮＡをプライムでワクチン接種し、ＨＩＶ  ｇａｇを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ５−ｇａｇ）を用いたブーストを後に続けた場合、ＣＲＬ１００５ポロクサマー（１２ｋＤａ、５％  ＰＯＥ）をＨＩＶ  ｇａｇ抗原をコードするＤＮＡに加えることがＴ細胞応答を強化することを示唆している。ＤＮＡ／ポロクサマーのプライムの後にＡｄ５−ｇａｇブーストを続けることに対する細胞免疫応答は、ＤＮＡ（ポロクサマーを用いない）プライムの後に続くＡｄ５−ｇａｇブーストで、またはＡｄ５−ｇａｇのみで誘発される応答より大きい。Ｓｈｉｖｅｒ、Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：３３１−５（２００２）。米国特許出願  公開第ＵＳ２００２／０１６５１７２Ａ１号は、免疫応答が生成されるような、抗原の免疫原性の部分をコードするベクター構築体と抗原の免疫原性の部分を含むタンパク質との同時投与を記述している。このドキュメントは、Ｂ型肝炎抗原およびＨＩＶ抗原に限られる。さらに、米国特許  第６，５D３２号は対象となるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同時投与によって核酸ワクチン接種の免疫応答を強化する方法を対象としている。この特許によると、同時投与は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同一の免疫応答の間の投与を意味し、相互の間が０〜１０日間または３〜７日間であるのが好ましい。この特許によって意図される抗原としては、数ある中でも、肝炎（すべての形態）、ＨＳＶ、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＲＳＶ、ＶＺＶ、ＨＰＶ、ポリオ、インフルエンザ、寄生虫（例えば、プラスモジウム属からの）、および病原性細菌（結核菌、ライ菌、クラミジア、シゲラ、ライム病ボレリア、腸内毒素原性大腸菌、サルモネラ・ティフォサ、ピロリ菌、コレラ菌、百日咳菌等々が挙げられるがこれ���限定されない）が挙げられる。すべての上記の参考文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２９２】
一実施形態では、本発明の治療プロトコルは治療的である。別の実施形態では、プロトコルは予防的である。別の実施形態では、当業者であれば理解するであろうように、本発明の組成物は、家族性遺伝のためまたはこれらのタイプの病気にかかりやすくなる他の状況のために、乳ガンまたは他のタイプの腫瘍などのガンのリスクがある人々を保護するために使用される。別の実施形態では、ワクチンは、外科手術による腫瘍増殖の減量術、従来の化学療法、または放射線治療の後のガン免疫療法として使用される。かかる治療に続いて、本発明のワクチンを投与し、これによってワクチンの腫瘍抗原に対するＣＴＬ応答が残りの転移を破壊し、ガンからの寛解を長持ちさせる。別の実施形態では、本発明のワクチンは、以前に定着した腫瘍の成長に作用し、既存の腫瘍細胞を死滅させるために使用される。
【０２９３】
一部の実施形態では、「含む」という用語またはその文法的な形態は、製薬業界で周知の通り、示された活性薬剤（本発明のＬｍ菌株など）を含むと共に、抗体またはその機能的断片、および医薬的に許容される担体、賦形剤、軟化薬、安定剤などその他の活性薬剤を含むことを意味する。一部の実施形態では、「本質的に〜から成る」という用語は、唯一の活性成分が示された活性成分である組成物を意味するが、製剤の安定、保存などのためであって、指示された活性成分の治療的効果には直接的に関与しないその他の化合物も含まれることがある。一部の実施形態では、「本質的に〜から成る」という用語は、指示された活性成分の機序とは別個の機序によって治療的効果を発揮する構成要素を意味することがある。一部の実施形態では、「本質的に〜から成る」という用語は、治療的効果を発揮し、かつ指示された活性成分のとは別個の化合物クラスに属する構成要素を意味することがある。一部の実施形態では、「本質的に〜から成る」という用語は、治療的効果を発揮し、かつ例えば、異なる作用機序によって作用することにより、指示された活性成分とは別個の構成要素を意味することがある。一部の実施形態では、「本質的に〜から成る」という用語は、活性成分の放出を促進する構成要素を意味することがある。一部の実施形態では、「から成る」という用語は、活性成分および医薬的に許容される担体または賦形剤を含む組成物を意味する。
【０２９４】
本明細書で使用される時、単数形（「１つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」）は複数形の参照を含むが、その文脈によってそうでないことが明らかに示される場合はその限りではない。例えば、「１つの化合物」または「少なくとも１つの化合物」は、これらの混合物を含む複数の化合物を含む場合がある。
【０２９５】
本出願全体を通して、本発明の様々な実施形態が範囲の形式で提示される場合がある。範囲の形式の記述は、単に利便性および簡潔性の目的に過ぎず、本発明の範囲の一定不動の制限として解釈するべきではないことを理解するべきである。したがって、範囲の記述はすべての可能性のある部分的範囲ならびにその範囲内の個別の数値を具体的に開示したものと考えるべきである。例えば、１〜６などのような範囲の記述は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６、等々などの具体的に開示された部分的範囲、ならびにこの範囲内の個別の数、例えば、１、２、３、４、５、および６を有すると考えるべきである。これは、範囲の幅広さに関わらず適用される。
【０２９６】
本明細書に数値的範囲が示されるときはいつも、示される範囲内のあらゆる引用された数値（分数または整数）を含むことを意味する。第１に示す数と第２に示す数と「の間の範囲」という句、および第１に示す数「から」第２に示す数「までの範囲」という句は、本明細書で互換的に使用され、第１に示す数および第２に示す数ならびにそれらの間のすべての分数および整数を含むことを意味する。
【０２９７】
本明細書で使用される時「方法」という用語は、化学技術、薬学技術、生物学技術、生化学技術、および医術の実践者に既知であるか、または既知の様式、手段、技法、および手順からこれらの施術者によって容易に開発される様式、手段、技法、および手順を含むがこれに限定されない、所与の課題を遂行するための様式、手段、技法、および手順を指す。
【０２９８】
以下の実施例では、本発明の完全な理解を提供するために多数の具体的な詳細が示される。しかしながら、本発明はこれらの具体的な詳細を含まずに実施されてもよいことが当業者によって理解されるであろう。他の事例では、本発明を不明瞭にしないために周知の方法、手順、および構成成分は詳細には記述されていない。
【実施例】
【０２９９】
材料および実験方法（実施例１〜２）
【０３００】
細胞株
Ｃ５７ＢＬ／６同系ＴＣ−１腫瘍をＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７で不死化し、ｃ−Ｈａ−ｒａｓガン遺伝子で形質転換した。Ｔ．Ｃ．Ｗｕ（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、米国メリーランド州Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）によって提供されたＴＣ−１は、ＨＰＶ−１６  Ｅ６  および  Ｅ７で低いレベルを発現する腫瘍形成性の高い肺上皮細胞であり、またｃ−Ｈａ−ｒａｓガン遺伝子で形質転換される。ＴＣ−１を、ＲＰＭＩ  １６４０、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００μＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０マイクロモル（ｍｃＭ）の２−ＭＥ、４００マイクログラム（ｍｃｇ）／ｍＬのＧ４１８、および１０％のナショナルコレクションタイプ培養液−１０９培地中、３７°で、１０％のＣＯ２を用いて成長させた。Ｃ３は、ＨＰＶ  １６の完全ゲノムで不死化し、ｐＥＪ−ｒａｓで形質転換されたＣ５７ＢＬ／６マウスからのマウスの胎芽細胞である。ＥＬ−４／Ｅ７は、Ｅ７を用いてレトロウイルスによって形質導入した胸腺腫ＥＬ−４である。
【０３０１】
Ｌ．モノサイトゲネス株および増殖  
使用されたリステリア株は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（エピソーム発現系内のｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子、図１Ａ）、Ｌｍ−Ｅ７（ＡＤＸＳ１１Aとも呼ばれる）（リステリアゲノムへと組込まれる単一コピーＥ７遺伝子カセット）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（「ＤＰ−Ｌ２０２８」、エピソーム発現系内のｈｌｙ−ＮＰ融合遺伝子）、およびＬｍ−Ｇａｇ（「ＺＹ−１８」、染色体へと組込まれる単一コピーＨＩＶ−１Ｇａｇ遺伝子カセット）であった。Ｅ７を、
【化６５】
2018501244.tif 000066
を使用してＰＣＲによって増幅し、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）へと連結させた。ｐＣＲ２．１をＸｈｏＩ／ＳｐｅＩによって消化してＥ７を切り離してｐＧＧ−５５へと連結した。このｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子および多能性の転写因子ｐｒｆＡをマルチコピーシャトルプラスミド（Ｗｉｒｔｈ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６５：８３１，１９８６）であるｐＡＭ４０１へとクローニングし、ｐＧＧ−５５を生成した。ｈｌｙプロモーターはｈｌｙ遺伝子産物の初めの４４１  ＡＡの発現を駆動し（溶血性Ｃ末端を欠いている、以下では「ΔＬＬＯ」と呼ばれ、配列番号：３に示す配列を有する）、これはＸｈｏＩ部位によってＥ７遺伝子に結合され、ＬＬＯ−Ｅ７として転写され、分泌されたｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子を得る。リステリアのｐｒｆＡ陰性株、ＸＦＬ−７（ペンシルバニア大学のＤｒ．Ｈａｏ  Ｓｈｅｎによって提供された）のｐＧＧ−５５を用いた形質転換が、インビボでのプラスミドの保持に対して選択された（図１Ａ〜図１Ｂ）。ｈｌｙプロモーターおよび遺伝子断片は、
【化６６】
2018501244.tif 000067
を用いて作成した。ｐｒｆＡ遺伝子は、
【化６７】
2018501244.tif 000068
を用いてＰＣＲ増幅した。Ｌｍ−Ｅ７は、ｈｌｙプロモーターと、Ｅ７の発現および分泌を駆動するシグナル配列とを含有する発現カセットを、ＬＭゲノムのｏｒｆＺドメインへと導入することによって生成した。Ｅ７を
【化６８】
2018501244.tif 000069
を使用してＰＣＲ増幅した。次いでＥ７をｐＺＹ−２１シャトルベクターへと連結させた。ＬＭ株１０４０３Ｓを、結果として得られるプラスミドｐＺＹ−２１−Ｅ７を用いて形質転換したが、このプラスミドはＬＭゲノムのｏｒｆＸ、Ｙ、Ｚドメインに対応する１．６ｋｂ配列の中央に挿入された発現カセットを含む。相同性ドメインは、相同的組み換えによるＥ７遺伝子カセットのｏｒｆＺドメインへの挿入を可能にする。クローンを、Ｅ７遺伝子カセットのｏｒｆＺドメインへの組込みについてスクリーニングした。細菌をブレインハートインフュージョン培地中で、クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）を用いて（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰ）、または用いないで（Ｌｍ−Ｅ７およびＺＹ−１８）、成長させた。細菌は、アリコートで−８０℃にて凍結させた。ウエスタンブロット法によって発現を検証した（図２）。
【０３０２】
ウエスタンブロット法
リステリア株をルリア−ベルターニ培地内で３７℃にて増殖させ、６００ｎｍで測定された同一の光学濃度にて採取した。上清をＴＣＡ沈殿させ、０．１ＮのＮａＯＨを補充した１×サンプルバッファー中で再懸濁した。同一量の各々の細胞ペレットまたは各々のＴＣＡ沈殿させた上清を、４〜２０％のトリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮＯＶＥＸ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）上に負荷した。ゲルを二フッ化ポリビニリデンに移し、抗Ｅ７モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）でプローブし、次いでＨＲＰ−結合抗マウス二次Ａｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、英国Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ）でインキュベートし、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ検出試薬で顕色し、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に露光させた。
【０３０３】
腫瘍増殖の測定
１日おきに表面の最短径及び最長径にキャリパーをわたして腫瘍を測定した。これら２つの測定値の平均を平均腫瘍径としてミリメートルの単位で様々な時点に対してプロットした。腫瘍径が２０ｍｍに達したとき、マウスを犠牲にした。各々の時点に対する腫瘍の測定値は、生きているマウスに対してのみ示されている。
【０３０４】
定着した腫瘍増殖に対するリステリア組み換え型の効果
生後６〜８週目のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）が２×１０５ＴＣ−１細胞を左脇腹の皮下に投与された。腫瘍接種の一週間後、腫瘍は直径４〜５ｍｍの触知可能なサイズに達した。次いで８匹のマウスの群が、７日目および１４日目に、０．１ＬＤ５０腹腔内で、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１０７ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１０６ＣＦＵ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（１０７ＣＦＵ）、またはＬｍ−Ｇａｇ（５×１０５ＣＦＵ）で処置された。
【０３０５】
５１Ｃｒリリースアッセイ
生後６〜８週間のＣ５７ＢＬ／６マウスが、０．１ＬＤ５０Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ、またはＬｍ−Ｇａｇで腹腔内免疫化された。免疫化の１０日後、脾臓を採取した。フィーダー細胞として照射されたＴＣ−１細胞（１A、脾細胞：ＴＣ−１）を用いて、脾細胞を培養液内に定着させ、インビトロで５日間刺激し、次いで以下の標的を使用して標準的５１Ｃｒリリースアッセイに使用した。ＥＬ−４、ＥＬ−４／Ｅ７、またはＥ７  Ｈ−２ｂペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）でパルスしたＥＬ−４。各３回実施したＥ：Ｔ細胞比は、８０：１、４０：１、２０：１、１０：１、５：１、および２．５：１であった。３７℃で４時間のインキュベーション後、細胞をペレット化し、５０μｌの上清を各々のウェルから取り出した。Ｗａｌｌａｃ  １４５０シンチレーションカウンター（米国メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を用いてサンプルをアッセイした。パーセント特異的溶解は、［（一分当たりの実験計数（ｃｐｍ）−自然発生ｃｐｍ）／（合計ｃｐｍ−自然発生ｃｐｍ）］×１００として決定された。
【０３０６】
ＴＣ−１特異的増殖
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを０．１ＬＤ５０を用いて免疫化し、２０日後に１ＬＤ５０のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ、またはＬｍ−Ｇａｇを用いて腹腔内注射によってブーストした。ブースティングの６日後、免疫化マウスおよび無処置マウスから脾臓を採取した。脾細胞を５×１０５／ウェルで、平底９６−ウェルプレート内に、２．５×１０４、１．２５×１０４、６×１０３、または３×１０３の照射ＴＣ−１細胞／ウェルをＥ７  Ａｇ源として用いて、またはＴＣ−１細胞なし、もしくは１０μｇ／ｍＬのＣｏｎ  Ａありで、培養液内に定着させた。４５時間後に０．５μＣｉ［３Ｈ］チミジン／ウェルを用いて細胞をパルスした。プレートはＴｏｍｔｅｃハーベスター９６（米国コネチカット州Ｏｒａｎｇｅ）を使用して１８時間後に採取され、Ｗａｌｌａｃ  １４５０シンチレーションカウンターを用いて増殖が評価された。ｃｐｍの変化は、実験的ｃｐｍ−Ａｇを含まないｃｐｍとして計算された。
【０３０７】
フローサイトメトリー解析
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、０．１  ＬＤ５０  Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＬｍ−Ｅ７を用いて静脈内（ｉ．ｖ．）免疫化し、３０日後にブーストした。ＣＤ８（５３−６．７、ＰＥ結合）、ＣＤ６２リガンド（ＣＤ６２Ｌ、ＭＥＬ−１４、ＡＰＣ結合）、およびＥ７  Ｈ−２Ｄｂ四量体に対する３色フローサイトメトリーを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメーターとＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国カリフォルニア州Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、）を使用して実施した。ブーストの５日後に採取した脾細胞を、Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）または対照（ＨＩＶ−Ｇａｇ）ペプチドを負荷したＨ−２Ｄｂ四量体を用いて、室温（ｒｔ）で染色した。四量体は１／２００に希釈して使用され、これらの四量体は、Ｄｒ．Ｌａｒｒｙ  Ｒ．Ｐｅａｓｅ（Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ、米国ミネソタ州Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）およびＮＩＡＩＤ  Ｔｅｔｒａｍｅｒ  Ｃｏｒｅ  ＦａｃｉｌｉｔｙおよびＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈならびに標準試薬プログラムによって提供された。Ｔｅｔｒａｍｅｒ＋、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞が解析された。
【０３０８】
Ｂ１６Ｆ０−Ｏｖａ実験
２４匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに５×１０５のＢ１６Ｆ０−Ｏｖａ細胞を接種した。３日目、１０日目、および１７日目に、０．１ＬＤ５０Ｌｍ−ＯＶＡ（１０６ｃｆｕ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＯＶＡ（１０８ｃｆｕ）を用いて８匹のマウスの群を免疫化し、８匹のマウスは処置しないままにした。
【０３０９】
統計
腫瘍径の比較のために、各々の群に対する腫瘍サイズの平均およびＳＤが決定され、スチューデントのｔ−検定によって統計的有意性が決定された。ｐ≦Eが有意と見なされた。
［実施例１］  ＬＬＯ−抗原融合が抗腫瘍免疫性を誘発
【０３１０】
結果
Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７がＴＣ−１増殖に影響を与える能力に関して比較された。皮下腫瘍がＣ５７ＢＬ／６マウスの左の脇腹に定着した。７日後、腫瘍は触診可能なサイズ（４〜５ｍｍ）に達した。７日目および１４日目に、０．１ＬＤ５０ｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、または対照としてのＬｍ−ＧａｇおよびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰをマウスにワクチン接種した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、定着したＴＣ−１腫瘍の７５％の完全な退行を誘発し、一方でこの群の中の他の２匹のマウスでは腫瘍増殖が制御された（図３）。対照的に、Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−Ｇａｇを用いた免疫化は、腫瘍退行を誘発しなかった。この実験は複数回繰返され、常に非常に類似した結果であった。加えて、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７に対しては異なる免疫化プロトコル下でも類似の結果が達成された。別の実験では、単一の免疫化で、マウスの定着した５ｍｍのＴＣ−１腫瘍を治癒することができた。
【０３１１】
他の実験では、２つの他のＥ７を発現する腫瘍細胞株：Ｃ３およびＥＬ−４／Ｅ７で類似の結果が得られた。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を用いたワクチン接種の有効性を確認するために、腫瘍を除去した動物にＴＣ−１またはＥＬ−４／Ｅ７腫瘍細胞をそれぞれ６０日目または４０日目に再負荷した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を用いて免疫化した動物は実験終了まで腫瘍がないままであった（ＴＣ−１の場合１２４日目、ＥＬ−４／Ｅ７に対しては５４日目）。
【０３１２】
したがってΔＬＬＯとの融合タンパク質としての抗原の発現は抗原の免疫原性を強化する。
［実施例２］  ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７治療がＴＣ−１特異的脾細胞増殖を引き出す
【０３１３】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を有するＬｍ−Ｅ７によるＴ細胞の誘導を測定するために、ＴＣ−１特異的増殖性の応答、抗原特異的免疫能の測定が免疫化したマウスで実施された。脾細胞においてＥ７の供給源として照射したＴＣ−１細胞に曝露したとき、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で免疫化したマウスからの脾細胞を増殖した。ＴＣ−１比は２０：１、４０：１、８０：１、および１６０：１である（図４）。反対に、Ｌｍ−Ｅ７およびｒＬｍ対照免疫化マウスからの脾細胞はバックグラウンドレベルの増殖しか示さなかった。
［実施例３］  ＡｃｔＡ−Ｅ７およびＰＥＳＴ−Ｅ７融合が抗腫瘍免疫性を与える
【０３１４】
材料および方法
【０３１５】
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７の構築
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７は、ａｃｔＡタンパク質の切断版に融合されるＥ７タンパク質を発現するプラスミドを含むＬＭの組み換え型株である。Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７は、ｐＤＰ−２０２８を修飾することにより構成されるプラスミドベクターｐＤＤ−１をリステリアに導入することにより生成された。ｐＤＤ−１は、ＡｃｔＡ−Ｅ７の発現および分泌を駆動する３１０  ｂｐのｈｌｙプロモーターおよびｈｌｙシグナル配列（ｓｓ）のコピーを発現する発現カセットと、４つのＰＥＳＴ配列（配列番号：１４）を含む１１７０  ｂｐのＡｃｔＡ遺伝子（切断ＡｃｔＡポリペプチドは分子の最初の３９０のＡＡから成る、配列番号：１２）と、３００  ｂｐのＨＰＶ  Ｅ７遺伝子と、１０１９  ｂｐのｐｒｆＡ遺伝子（病毒性遺伝子の発現を制御）と、形質転換細菌クローンの選択のためのＣＡＴ遺伝子（クロラムフェニコール  耐性遺伝子）とを含む（Ｓｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）、Ａｒｃｈ．  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ．、１３０：９２−９７）。
【０３１６】
ｈｌｙプロモーター（ｐＨｌｙ）および遺伝子断片は、ｐＧＧ５５（実施例１）から、
【化６９】
2018501244.tif 000070
を使用してＰＣＲ増幅された。ＡｃｔＡ遺伝子は、Ｌｍ  １０４０３Ｓ野生型ゲノムから
【化７０】
2018501244.tif 000071
を使用してＰＣＲ増幅された。Ｅ７遺伝子は、ｐＧＧ５５（ｐＬＬＯ−Ｅ７）から、
【化７１】
2018501244.tif 000072
を使用してＰＣＲ増幅された。ｐｒｆＡ遺伝子は、Ｌｍ  １０４０３Ｓ野生型ゲノムから、
【化７２】
2018501244.tif 000073
を使用してＰＣＲ増幅された。ｈｌｙプロモーター−ＡｃｔＡ遺伝子融合（ｐＨｌｙ−ａｃｔＡ）は、精製したｐＨｌｙ  ＤＮＡおよび精製したＡｃｔＡ  ＤＮＡから、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号：５９）および下流ＡｃｔＡプライマー（配列番号：６２）を使用してＰＣＲ生成および増幅された。
【０３１７】
ｐｒｆＡ遺伝子（Ｅ７−ｐｒｆＡ）に融合されたＥ７遺伝子は、精製したＥ７  ＤＮＡおよび精製したｐｒｆＡ  ＤＮＡから、上流Ｅ７プライマー（配列番号：６３）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号：６６）を使用してＰＣＲ生成および増幅された。
【０３１８】
Ｅ７−ｐｒｆＡ融合生成物に融合されたｐＨｌｙ−ａｃｔＡ融合生成物は、精製した融合ｐＨｌｙ−ａｃｔＡ  ＤＮＡ生成物および精製した融合Ｅ７−ｐｒｆＡ  ＤＮＡ生成物から、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号：５９）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号：６６）を使用してＰＣＲ生成および増幅され、ｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）に連結された。コンピテント大腸菌（ＴＯＰ１０’Ｆ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）は、ｐＣＲＩＩ−ＡｃｔＡＥ７で形質転換された。溶解および分離の後、プラスミドは、ＢａｍＨＩ（期待される断片サイズ７７０  ｂｐおよび６４００  ｂｐ（またはインサートがベクター：２５００  ｂｐおよび４１００  ｂｐに反転された時））およびＢｓｔＸＩ（期待される断片サイズ２８００  ｂｐおよび３９００  ｂｐ）を使用した制限分析によってスクリーニングされ、また上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号：５９）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号：６６）を使用したＰＣＲ分析を用いてスクリーニングされた。
【０３１９】
ｐＨｌｙ−ＡｃｔＡ−Ｅ７−ｐｒｆＡ  ＤＮＡインサートはＸｂａ  ＩおよびＳａｌ  Ｉを用いた二重消化によってｐＣＲＩＩから切り離され、またこれもＸｂａ  Ｉ  および  Ｓａｌ  Ｉを用いて消化されたｐＤＰ−２０２８へと連結された。ＴＯＰ１０’Ｆ構成要素大腸菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）を発現系ｐＡｃｔＡＥ７で形質転換した後、クロラムフェニコール耐性クローンが、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号：５９）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号：６６）を使用してＰＣＲ分析によってスクリーニングされた。。ｐＡｃｔＡＥ７を含むクローンがブレインハートインフュージョン培地（クロラムフェニコール（２０  ｍｃｇ（マイクログラム）／ｍｌ（ミリリットル）、Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈ．を使用）内で培養され、ｐＡｃｔＡＥ７がミディプレップＤＮＡ精製システムキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）を使用して細菌細胞から分離された。ペニシリン処置したリステリア（株ＸＦＬ−７）のｐｒｆＡ陰性株は発現系ｐＡｃｔＡＥ７を用いて形質転換され（Ｉｋｏｎｏｍｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８０：  ２２０９−２２１８）、クローンはプラスミドの保持のためにインビボで選択された。クローンをクロラムフェニコール（２０ｍｃｇ／ｍＬ）入りのブレインハートインフュージョン中で３７℃にて増殖させた。細菌をアリコートで−８０℃にて凍結した。
【０３２０】
抗原発現のイムノブロット検証
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７がＡｃｔＡ−Ｅ７を分泌する（約６４ｋＤ）ことを検証するために、リステリア株をルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地中で３７℃にて増殖させた。トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いて培養上清からタンパク質を沈殿させ、０．１Ｎの水酸化ナトリウムを用いて１×サンプルバッファー中に再懸濁した。同一の量の各々のＴＣＡ沈殿した上清を４％〜２０％のトリスグリシンドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（ＮＯＶＥＸ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）に負荷した。ゲルを二フッ化ポリビニリデン膜に導入し、１：２５００抗Ｅ７モノクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）でプローブし、次いで１：５０００西洋ワサビペルオキシダーゼ共役抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、英国、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ）でプローブした。ブロットはＡｍｅｒｓｈａｍ強化化学発光検出試薬を用いて発色させ、オートラジオグラフィーフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に曝露した（図５Ａ）。
【０３２１】
Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−Ｅ７ｅｐｉの構築（図６Ａ）
Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、それがプロモーターおよびｈｌｙ遺伝子のＰＥＳＴ配列のみ、特にＬＬＯの最初の５０個のＡＡを含有すること以外はＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と同一である。Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７を構築するために、ＳＯＥ（重複延長による遺伝子スプライシング）ＰＣＲ技法を使用して、ｈｌｙプロモーターおよびＰＥＳＴ領域を全長のＥ７遺伝子に融合した。Ｅ７遺伝子およびｈｌｙ−ＰＥＳＴ遺伝子断片をＬＬＯの最初の４４１個のＡＡを含有するプラスミドｐＧＧ−５５から増幅し、従来のＰＣＲ技法によって一緒にスプライシングした。最終的なプラスミドｐＶＳ１６．５を作り出すために、ｈｌｙ−ＰＥＳＴ−Ｅ７断片およびｐｒｆＡ遺伝子を、インビトロでの選択のためのクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むプラスミドｐＡＭ４０１へとサブクローンし、得られたプラスミドを使用してＸＦＬ−７を形質転換した。
【０３２２】
Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７は、それがＰＥＳＴ配列を欠いていること以外は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と同一である組み換え型リステリア株である。これは、ＰＥＳＴ含有領域（ｂｐ３３３−３８７）をｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子から除去するために設計されたプライマーを使用してエピソーム発現系を構築した以外は、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７について本質的に記載されたように作成された。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、ＰＥＳＴ領域またはＬＬＯなしでＥ７を分泌する組み換え型株である。この株を形質転換するのに用いるプラスミドは、ｈｌｙプロモーターの遺伝子断片、およびＥ７遺伝子に融合したシグナル配列を含有する。この構築体は、染色体の中へと組み込まれたＥ７遺伝子の単一コピーを発現する本来のＬｍ−Ｅ７とは異なる。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、発現されたＥ７抗原の形態を除いて、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７と完全に同系である。
【０３２３】
結果
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７対Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７によって誘発した抗腫瘍免疫性を比較するために、２×１０５ＴＣ−１腫瘍細胞をマウス内に皮下移植し、触知可能サイズ（おおよそ５ミリメートル［ｍｍ］）まで増殖させた。７日目および１４日目に、マウスをＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（５×１０８ＣＦＵ）（十字）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１０８ＣＦＵ）（四角）、またはＬｍ−Ｅ７（１０６ＣＦＵ）（丸）いずれかの１つのＬＤ５０でマウスを腹腔内で免疫化した。２６日目までに、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７でのすべての動物は腫瘍がなく、そのままであったが、一方ですべての無処置の動物（三角）およびＬｍ−Ｅ７で免疫化した動物は大きい腫瘍を成長させた（図５Ｂ）。したがって、ＡｃｔＡ−Ｅ７融合でのワクチン接種は腫瘍退行を生じさせる。
【０３２４】
加えて、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−Ｅ７ｅｐｉを、Ｅ７発現腫瘍の退行を生じさせるそれらの能力について比較した。ｓ．ｃ．  ＴＣ−１腫瘍は４０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの左脇腹に定着した。腫瘍が４〜５ｍｍに達した後、マウスを８匹のマウスの５つの群に分けた。各々の群を４つの組み換え型ＬＭワクチンのうちの１つで処置し、１つの群は未処置のまま放置した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、それぞれ５／８および３／８の事例では定着した腫瘍の退行を誘発した。いずれの時点においても、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７またはＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で処置したマウスの平均腫瘍サイズの間に統計的な差はなかった。しかしながら、ＰＥＳＴ配列、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−Ｅ７ｅｐｉを含まないＥ７を発現したワクチンは、１つを除いて全てのマウスで腫瘍退行を生じなかった（図６Ｂ、上のパネル）。これは２つの実験の代表であり、２８日目における平均腫瘍サイズの統計的に有意な差がＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７で処置した腫瘍とＬｍ−Ｅ７ｅｐｉまたはＬｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７で処置した腫瘍との間で観察された（Ｐ＜０A、スチューデントのｔ検定；図６Ｂ、下のパネル）。加えて、四量体陽性脾細胞のパーセンテージの増大は、ＰＥＳＴ含有ワクチンをワクチン接種したマウスの脾臓における３つの実験にわたって再現性が見られた（図６Ｃ）。したがって、ＰＥＳＴ−Ｅ７融合を用いたワクチン接種は腫瘍退行を生じさせる。
［実施例４］  ＬＬＯ、ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ様配列へのＥ７の融合はＥ７特異的な免疫性を強化し、腫瘍浸潤Ｅ７特異的ＣＤ８＋細胞を発生させる
【０３２５】
材料および実験方法
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１００ｍｃｌ（マイクロリットル）の２×１０５ＴＣ−１腫瘍細胞に加えて４００ｍｃｌのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ）を含む５００ｍｃｌのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）を１２匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの左脇腹に皮下移植した（ｎ＝３）。マウスを７日目、１４日目、および２１日目に腹腔内免疫し、脾臓および腫瘍を２８日目に採取した。腫瘍ＭＡＴＲＩＧＥＬをマウスから取り出し、氷上で、２ミリリットル（ｍＬ）のＲＰ  １０培地を含有する試験管内で４℃にて一晩インキュベートした。腫瘍を鉗子を用いて細かく切り刻み、２ｍｍのブロックに切断し、３ｍＬの酵素混合物（ＰＢＳ中の０．２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＰ、１ｍｇ／ｍＬのＤＮＡｓｅ−１）とともに３７℃で１時間インキュベートした。組織懸濁液を、ナイロンメッシュを通して濾過し、四量体およびＩＦＮ−γ染色のために、ＰＢＳ中の５％胎児ウシ血清＋E％のＮａＮ３で洗浄した。
【０３２６】
脾細胞および腫瘍細胞を１０７細胞／ｍＬのブレフェルジンＡの存在下で、１マイクロモル（ｍｃｍ）のＥ７ペプチドと共に５時間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、５０ｍｃｌの抗マウスＦｃ受容体上清（２．４  Ｇ２）中、４℃で１時間または一晩インキュベートした。細胞を表面分子ＣＤ８およびＣＤ６２Ｌについて染色し、浸透させ、浸透キットＧｏｌｇｉ−ｓｔｏｐ（登録商標）またはＧｏｌｇｉ−Ｐｌｕｇ（登録商標）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を使用して固定し、ＩＦＮ−γに対して染色した。５００，０００事象を２レーザーフローサイトメーター、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを使用して獲得し、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ）を使用して分析した。活性化（ＣＤ６２Ｌｌｏｗ）ＣＤ８＋Ｔ細胞内のＩＦＮ−γ分泌細胞のパーセンテージを計算した。
【０３２７】
四量体染色のために、Ｈ−２Ｄｂ四量体にフィコエリスリン（ＰＥ）結合Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、配列番号：６７）を負荷し、室温で１時間染色し、抗アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合ＭＥＬ−１４（ＣＤ６２Ｌ）およびＦＩＴＣ−結合ＣＤ８・で４℃にて３０分間染色した。脾臓および腫瘍内の四量体＋ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞を比較して細胞を解析した。
【０３２８】
結果
抗原特異的免疫性を強化するＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７の能力を解析するために、マウスにＴＣ−１腫瘍細胞を移植し、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０７ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１×１０６ＣＦＵ）、またはＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（２×１０８ＣＦＵ）のいずれかで免疫化するか、あるいは未処置とした（無処置）。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７群からのマウスの腫瘍は、Ｌｍ−Ｅ７または無処置マウスにおけるよりも、より高いパーセンテージのＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞（図７Ａ）および四量体特異的なＣＤ８＋細胞（図７Ｂ）を含有した。
【０３２９】
別の実験では、腫瘍を持つマウスにＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、またはＬｍ−Ｅ７ｅｐｉを投与し、腫瘍の中のＥ７特異的リンパ球のレベルを測定した。０．１ＬＤ５０の４つのワクチンを用いて、７日目および１４日目にマウスを処置した。腫瘍を２１日目に採取し、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８に対する抗体を用いて、およびＥ７／Ｄｂ四量体を用いて染色した。腫瘍内の四量体陽性リンパ球のパーセンテージの増大が、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７を用いてワクチン接種したマウスで見られた（図８Ａ）。この結果は３つの実験にわたって再現性があった（図８Ｂ）。
【０３３０】
したがって、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７、およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導および腫瘍退行において各々有効である。
［実施例５］  ＬＬＯおよびＡｃｔＡの融合はＥ６／Ｅ７トランスジェニックマウスにおける自己由来（自発性）腫瘍を低減
【０３３１】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７ワクチンの、Ｅ６／Ｅ７トランスジェニックマウスにおける自己由来腫瘍に対する影響を判断するために、生後６〜８週のマウスを１×１０８  Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７または２．５×１０８  Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７で毎月１回、８か月にわたり免疫化した。マウスは最後の免疫化の後２０日で犠牲にされ、甲状腺が摘出され秤量された。この実験は２度実施された（表１）。
【表１−１】
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【０３３２】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７処置マウスと未処置マウスの間、ならびにＬｍ−ＬＬＯ−ＡｃｔＡ処置マウスと未処置マウスの間の甲状腺秤量の差は、両方の実験において有意（それぞれｐ＜０Aおよびｐ＜E）であったが、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ処置マウス（無関係の抗原対照）と未処置マウスの間の差は有意でなく（スチューデントのｔ−検定）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７が自発性腫瘍増殖を制御したことが示されている。よって、本発明のワクチンは新しいＥ７発現腫瘍の形成を防止する。
【０３３３】
上記実施例における所見を要約すると、ＬＬＯ抗原およびＡｃｔＡ抗原の融合は、（ａ）腫瘍浸潤性抗原特異的Ｔ細胞を誘発する腫瘍特異的免疫応答を誘発するとともに、腫瘍退行を誘発して、正常な腫瘍および特に侵襲性の強い腫瘍の両方の腫瘍増殖を制御し、（ｂ）自己抗原に対する耐性を克服し、（ｃ）自発性腫瘍増殖を防止する。これらの所見は、多様な異なる抗原、ＰＥＳＴ様配列、および腫瘍タイプで首尾よく実施されたことによる証拠として、多数の抗原、ＰＥＳＴ様配列、および腫瘍タイプに一般化される。
［実施例６］  Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチンは安全であり子宮頸ガン患者の臨床指標を改善する
【０３３４】
材料および実験方法
【０３３５】
選択基準。治験のすべての患者は「進行、進行性または再発性子宮頸ガン」と診断され、登録時の評価で全員がＩＶＢ疾患を有する段階であることが示された。すべての患者は、カンジジン、おたふく風邪、破傷風、またはツベルクリン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）から選択される３つのメモリー抗原を含むアネルギーパネルに対して陽性の免疫応答を示し、妊娠中でもＨＩＶ陽性でもなく、４週以内に治験薬を服用しておらず、ステロイドを受けていなかった。
【０３３６】
プロトコル：  患者は、２回のワクチン接種を３週間間隔で、入院患者への通常の生理食塩水２５０  ｍｌに入れた３０分の静脈内（ＩＶ）注入として受けた。５日後、患者は単回のＩＶアンピシリンを投与され、さらに１０日間の経口アンピシリンを処方された上で退院した。全般的な健康状態を判断するために、食欲、日常的作業を完了する能力、安らかな睡眠など、全般的な生命力および生活の質の尺度であるカルノフスキーパフォーマンス指標が使用された。さらに、安全性および全体的な健康状態の指標：アルカリホスファターゼ、ビリルビン（直接および総の両方）、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（ｇｇｔ）、コレステロール、収縮期、拡張期、および心拍数、疾患の進行を評価するための米国東海岸がん臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）基準（カルノフスキーなどの生活の質の指標）、ヘマトクリット、ヘモグロビン、血小板レベル；リンパ球レベル、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、およびＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）が決定された。患者は２回目の投与の後、３週および３か月で追跡され、、その時点で、患者の固形腫瘍治療効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ）のスコアが決定され、スキャンが実施されて腫瘍サイズが決定され、治験終了時の免疫学的分析用に血液標本が採取されたが、これにはＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞母集団の評価が含まれた。
【０３３７】
リステリア株：Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の生成は実施例１に説明されている。
【０３３８】
結果
治験の前に、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の静脈内（静脈内）対腹腔内の投与の抗腫瘍有効性を判断するための前臨床実験が実施された。１×１０４のＴＣ−１細胞を含む腫瘍が皮下に確立された。７日目および１４日目に、マウスは１０８のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７腹腔内投与、あるいは１０８、１０７、１０６、または１０５の投与量でのＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７静脈内投与のいずれかで免疫化された。３５日目に、両方の経路で１０８のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を受けた５／８のマウス、または１０７のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７静脈内投与、および１０６のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７静脈内投与を受けた４／８のマウスが治癒した。それに対して、１０７未満の投与量、または一部のケースで１０８のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７腹腔内投与でさえも、腫瘍増殖の制御に効果がなかった。よって、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の静脈内投与は、腹腔内投与よりも効果的である。
【０３３９】
治験
進行、進行性、または再発性の子宮頸ガン患者におけるＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチンの安全性および有効性を評価するために、段階Ｉ／ＩＩの治験が実施された。それぞれ５人の患者がコホート１〜２に割り当てられ、それぞれ１×１０９または３．３×１０９  ＣＦＵを受けた。さらに５人の患者がそれぞれコホート３〜４に割り当てられ、それぞれ１×１０１０または３．３１×１０１０  ＣＦＵを受ける予定である。
【０３４０】
安全性データ
第一のコホート
第一のコホートの患者全員が、注入の開始後１〜２時間内に軽度から中程度の発熱および悪寒の発症を報告した。一部の患者は、吐き気を伴う、または伴わない嘔吐があった。１例を除いて（後述）、パラセタモールなどの非ステロイド系薬剤の単回投与が、これらの症状を寛解させるのに十分であった。発熱と呼応して、その時間経過に合わせて、幾分かの一時的な心血管系の効果が観察された。その他の有害効果は報告されなかった。
【０３４１】
子宮頸ガンのこの後期段階では、１年生存率は一般的に患者の１０〜１５％であり、腫瘍療法はこれまで全く効果がなかった。実際に、患者２は、非常に侵襲性の強い疾患を伴う若年の患者であり、治験完了後まもなく亡くなった。
【０３４２】
定量的血液培養が投与後２日目、３日目、および５日目に評価された。このコホートで評価可能な５人の患者のうち、４人はどの時点でも血清リステリアが見られず、１人では２日目に非常に少量（３５  ＣＦＵ）の循環するリステリアが観察されたが、３日目または５日目には検出可能なリステリアはなかった。
【０３４３】
患者５は初期ワクチン接種に反応し、投与後４８時間に軽度の発熱があり、抗炎症剤で治療を受けた。１例で発熱が中程度の重篤度（どの時点でも３８．４  °Ｃを超えない）まで上昇したが、その後その患者には単回のアンピシリンが与えられ、これによって発熱が解消した。抗生物質投与中、この患者は軽度のじんましんを発症し、これは抗生物質投与後に解消した。血液培養はすべて無菌であり、心血管データはその他の患者で観察された範囲内にあり、血清化学値は正常で、この患者にはリステリア疾患がないことが示された。さらに、アネルギーパネルは、１／３メモリー抗原に対する強い反応を示し、機能性免疫の存在を示した（他の患者と類似）。患者５はその後、ブーストを受けた後にはその他全ての患者と類似した反応を示した。
【０３４４】
第二のコホートおよび全般的安全性の観察  
【０３４５】
有効性  −  第一のコホート  
以下の有効性指標は、治験を終了した第一のコホートの３人の患者で観察された：（図９）。
【０３４６】
患者１はそれぞれ２０ｍｍの２個の腫瘍がある状態で治験に登録したが、これらの腫瘍は治験期間にわたり１８  ｍｍおよび１４ｍｍに縮小し、ワクチンの治療的有効性を示した。さらに、患者１の治験登録時のカルノフスキーパフォーマンス指標は７０であったが、投与後には９０に上昇した。安全性審査パネルの会合で、Ｓｉｎｉｓａ  Ｒａｄｕｌｏｖｉｃ（腫瘍学および放射線学研究所腫瘍学部門長（セルビア国ベオグラード市））は、治験実施団体の代表者である、当団体のコンサルタントを務めるＭｉｃｈａｅｌ  Ｋｕｒｍａｎ（独立系腫瘍専門医）Ｍｅｒｃｋのために第ＩＩＩ相Ｇａｒｄａｓｉｌ治験を、Ｇｌａｘｏ  ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅのためにＣｅｒｖａｒｉｘ治験を実施したＫｅｖｉｎ  Ａｕｌｔ（エモリー大学の学術的婦人科腫瘍医）、およびＴａｔｅ  Ｔｈｉｇｐｅｎ（ＮＣＩの婦人科腫瘍学グループ創始者兼ミシシッピ大学婦人科腫瘍学教授）各氏に結果を発表した。Ｒａｄｕｌｏｖｉｃ博士の意見では、患者１はワクチンの治療によって臨床的利益を示した。
【０３４７】
亡くなる前の患者２の反応は混在しており、１／２の腫瘍が縮小していた。
【０３４８】
患者３は腫瘍随伴性疾患（患者の全体的な衰弱状態によってガンに対して二次的なその他の続発症が生まれる付帯現象）のある状態で登録したが、これには血小板数の９３６×１０９／ｍｌへの上昇が含まれた。最初の投与の後、この数値はほぼ正常なレベルである４０５×１０９／ｍｌに減少した。
【０３４９】
患者４はそれぞれ２０ｍｍの２個の腫瘍がある状態で治験に登録したが、これらの腫瘍は治験期間にわたり１８ｍｍおよび１４ｍｍに縮小し、ワクチンの治療的有効性を示した。患者４は１．６  Ｋｇの体重増加を示し、また１回目と２回目の投与の間でおよそ１０％のヘモグロビン数増加を示した。
【０３５０】
有効性  −  第二のコホートおよび一般的観察
最低投与量のコホートでは、２人の患者で腫瘍の縮小が見られた。この効果のタイミングは、免疫応答の経時的発生に従っていたという点で免疫学的応答で観察された内容と一致していた。これまでに腫瘍細胞量が評価された第二のコホートの２人の患者のうち１人は、ワクチン接種後の時点で劇的な腫瘍細胞量の減少を示した。治験開始時、この患者には１３ｍｍ、１３ｍｍ、および１４ｍｍの３個の腫瘍があった。２回のワクチン投与後、２個の腫瘍は９．４ｍｍおよび１２ｍｍに縮小し、３個目の腫瘍はもはや検出できなかった。
【０３５１】
２つのコホートの腫瘍細胞量を図１３Ｂに示す。要約すると、比較的低いＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の投与でさえも、プライミング注入および単回ブーストを含む治療レジメンでの投与では、データが収集された６人の患者のうち３人で客観的反応が達成された。
【０３５２】
考察
子宮頸ガンのこの後期段階では、１年生存率は一般的に患者の１０〜１５％であり、腫瘍療法はこれまで全く効果がなかった。いかなる治療も、段階ＩＶＢ子宮頸ガンの進行阻止に効果的であるとは示されなかった。この段階での子宮頸ガンの治療の困難さにもかかわらず、２／６の患者において抗腫瘍効果が観察された。さらに、その他の有効性指標が、本明細書で上述した通り治験を終了した患者で観察された。
【０３５３】
よって、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７はヒト被験者において安全であり、比較的低い投与量を投与した時でさえも、子宮頸ガン患者の臨床的指標を向上させる。投与量およびブースターワクチン接種の回数が増加された時に、および／または抗生物質が少量の投与量で、または注入後のより後ほどの時点で投与される時に、さらに肯定的結果が観察される可能性が高い。治験前研究は、一桁台の倍率での投与量の増大は奏効率に劇的な変化（例えば、０％の奏効率５０〜１００％の完全寛解率）を起こしうることを示している。また、追加的なブースター投与によって、得られる免疫応答がさらに増強される可能性が非常に高い。さらに、観察された治療的免疫応答の肯定的効果は、免疫系は引き続きガンを攻撃することから、さらなる時間経過にわたり継続する可能性がある。
［実施例７］  弱毒化リステリア菌株−ＬｍｄｄΔＡｃｔＡの構築、およびＬｍｄｄおよびＬｍｄｄＡ菌株内のｈｌｙ遺伝子へのフレーム内のヒトｋｌｋ３遺伝子の挿入。
【０３５４】
材料および方法
ｔＬＬＯに融合されたＰＳＡを分泌する組み換え型Ｌｍ（Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ）が開発されたが、この株は前立腺ガンについてマウスモデルにおける腫瘍の退行に関連した強力なＰＳＡ特異的な免疫応答を誘発し、ここでｔＬＬＯ−ＰＳＡの発現は、ｐＧＧ５５（表２）に基づき、プラスミドに由来し、これはベクターに抗生物質抵抗性を与える。我々は、最近、ｐＡｄｖ１４２プラスミドに基づき、ＰＳＡワクチン用の新株を開発したが、これは、抗生物質抵抗性マーカーを持たず、ＬｍｄｄＡ−１４２（表３）と呼ぶ。この新株は、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡよりも１０倍弱毒化される。さらに、ＬｍｄｄＡ−１４２は、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡよりも、わずかに高い免疫原性があり、またＰＳＡを発現する腫瘍の退行において著しく大きな効果がある。
【表２−１】
2018501244.tif 000075
【表２−２】
2018501244.tif 000076
【０３５５】
プラスミドｐＡｄｖ１４２（６５２３  ｂｐ）の配列は次のとおりであった：
【０３５６】
【化７３】
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【化７４】
2018501244.tif 000078
【化７５】
2018501244.tif 000079
【化７６】
2018501244.tif 000080
【化７７】
2018501244.tif 000081
【化７８】
2018501244.tif 000082
【化７９】
2018501244.tif 000083
このプラスミドは、２−２０−０８にＧｅｎｅｗｉｚ施設にて大腸菌株から配列決定された。
【０３５７】
Ｌｍｄａｌ  ｄａｔ（Ｌｍｄｄ）株は、病毒性因子、ＡｃｔＡの不可逆的な欠失によって弱毒化された。ａｃｔＡのＬｍｄａｌｄａｔ（Ｌｍｄｄ）バックグラウンド内でのインフレーム欠失は、下流遺伝子発現上のあらゆる極性効果を避けるように構造化された。Ｌｍｄａｌ  ｄａｔΔａｃｔＡは、ＡｃｔＡの５９１アミノ酸の欠失によるＮ末端における最初の１９アミノ酸およびＣ末端の２８アミノ酸残基を含有する。
【０３５８】
ＡｃｔＡ欠失突然変異体は、ＡｃｔＡの上流部分（６５７  ｂｐ−ｏｌｉｇｏ’ｓ  Ａｄｖ  ２７１／２７２）および下流部分（６２５  ｂｐ−  ｏｌｉｇｏ’ｓ  Ａｄｖ  ２７３／２７４）に対応する染色体領域を増幅して、ＰＣＲによって結合することにより生成された。この増幅に使用されるプライマーの配列は表１の通りである。ＡｃｔＡの上流および顆粒のＤＮＡ領域が、ｐＮＥＢ１９３内でＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ制限部位でクローン化され、またこのプラスミドから、ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩがさらに、温度感受性プラスミドｐＫＳＶ７内でクローン化され、その結果としてΔＡｃｔＡ／ｐＫＳＶ７（ｐＡｄｖ１２０）が得られた。
【表１−２】
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【０３５９】
その染色体位置からの遺伝子の欠失は、ＡｃｔＡ欠失領域に外部的に結合されるプライマーを使用して確認されたが、これは図１０（ＡおよびＢ）に
【化８０】
2018501244.tif 000085
として示されている。ＰＣＲ解析をＬｍｄｄおよびＬｍｄｄΔＡｃｔＡから分離された染色体ＤＮＡ上で実施した。Ｌｍ−ｄｄ染色体のＤＮＡ内のプライマー対１／２および３／４の２つの異なるセットで増幅した後のＤＮＡ断片のサイズは、３．０Ｋｂおよび３．４Ｋｂとなると予想された。一方で、ＬｍｄｄΔＡｃｔＡについて、プライマーの対１／２および３／４を使用するＰＣＲの予想されるサイズは、１．２Ｋｂおよび１．６Ｋｂである。したがって、図１０（ＡおよびＢ）のＰＣＲ解析はａｃｔＡの１．８ｋｂ領域は、ＬｍｄｄΔａｃｔＡ株内では除去されていることを確認する。ＤＮＡ配列決定を、ＬｍｄｄａｃｔＡ株内の領域を含有するΔａｃｔＡの欠失を確認するためにＰＣＲ産物上でも実施した。
［実施例８］  Ｌｍベクターによる抗原送達のための抗生物質独立的エピソーム発現系の構築。
【０３６０】
Ｌｍベクター（ｐＡｄｖ１４２）による抗原送達のための抗生物質独立的なエピソーム発現系は、次世代の抗生物質を含まないプラスミドｐＴＶ３である（Ｖｅｒｃｈら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ、２００４．  ７２（１１）：６４１８−２５、参照により本明細書に組み込まれる）。病毒性遺伝子転写活性化剤ｐｒｆＡ用の遺伝子は、リステリア株Ｌｍｄｄは、染色体内にｐｒｆＡ遺伝子の複製を含むため、ｐＴＶ３から除去された。さらに、ＮｈｅＩ／ＰａｃＩ制限部位でのｐ６０−リステリアｄａｌ用のカセットは、ｐ６０−枯草菌ｄａｌにより置換され、その結果としてプラスミドｐＡｄｖ１３４が得られた（図１１Ａ）。リステリアとバシラスｄａｌ遺伝子の類似性は〜３０％であり、プラスミドとＬｍｄｄ染色体内のｄａｌ遺伝子の残りの断片との間での組み換えの可能性が実質的に除外される。プラスミドｐＡｄｖ１３４は、抗原発現カセットｔＬＬＯ−Ｅ７を含んでいた。ＬｍｄｄＡ株は、ｐＡｄｖ１３４プラスミドで形質転換し、選択したクローンからのＬＬＯ−Ｅ７タンパク質の発現がウエスタンブロットによって確認された（図１１Ｂ）。１０４０３Ｓ野生型株に由来するＬｍｄｄ系は、Ｌｍｄｄストレプトマイシン耐性を除き、抗生物質抵抗性マーカーを欠失している。
【０３６１】
さらに、ｐＡｄｖ１３４がＸｈｏＩ／ＸｍａＩでクローンヒトＰＳＡ、ｋｌｋ３に制限され、その結果プラスミド、ｐＡｄｖ１４２が得られた。新しいプラスミド、ｐＡｄｖ１４２（図１１Ｃ、表２）は、リステリアｐ６０プロモーターの制御下でバシラスｄａｌ（Ｂ−Ｄａｌ）を含む。シャトルプラスミド、ｐＡｄｖ１４２は、外因性Ｄ−アラニンの不在下で、大腸菌ａｌａ  ｄｒｘ  ＭＢ２１５９とリステリア・モノサイトゲネス株Ｌｍｄｄの両方の増殖を補完した。プラスミドｐＡｄｖ１４２内の抗原発現カセットは、ｈｌｙプロモータープロモーターおよびＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質から構成される（図１１Ｃ）。
【０３６２】
プラスミドｐＡｄｖ１４２は、リステリア背景株ＬｍｄｄＡｃｔＡ株に形質転換され、その結果としてＬｍ−ｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡが得られた。株Ｌｍ−ｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡによるＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の発現および分泌は、抗ＬＬＯおよび抗ＰＳＡ抗体を使用したウエスタンブロットにより確認された（図１１Ｄ）。インビボでの２継代後に株Ｌｍ−ｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡによるＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の安定した発現および分泌があった。
［実施例９］  株ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのインビトロおよびインビボでの安定性
【０３６３】
プラスミドのインビトロでの安定性が、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡリステリア株を選択圧の存在下または不在下で８日間にわたり培養することにより検査された。株ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのための選択圧は、Ｄ−アラニンである。したがって、株ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、Ｂｒａｉｎ−Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）およびＢＨＩ＋  １００  μｇ／ｍｌ  Ｄ−アラニンで継代培養された。ＣＦＵが、選択的（ＢＨＩ）および非選択的（ＢＨＩ＋Ｄ−アラニン）培地でのプレーティング後に毎日決定された。非選択的培地（ＢＨＩ＋Ｄ−アラニン）にプレーティングされた後で、プラスミドの損失が結果的により高いＣＦＵにつながることが予想された。図１２Ａに示すとおり、選択的および非選択的な培地でのＣＦＵ数には差異がなかった。これは、実験が終了した少なくとも５０世代までのあいだ、プラスミドｐＡｄｖ１４２が安定していたことを示唆する。
【０３６４】
インビボでのプラスミド維持が、５×１０７ＣＦＵのＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡをＣ５７ＢＬ／６  マウスに静脈内注入することにより決定された。生存可能な細菌がＰＢＳ中で均質化された脾臓から２４  ｈおよび４８時間の時点で分離された。各試料についてのＣＦＵが、ＢＨＩプレートおよびＢＨＩ  ＋  １００ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−アラニンについて各時点で決定された。選択的および非選択的の培地への脾細胞のプレーティングの後、コロニーは２４時間後に回収された。この株はかなり高く弱毒化されているため、細菌負荷はインビボで２４時間でクリアされた。選択的および非選択的なプレートで有意なＣＦＵの差異は検出されず、これは分離されたすべての細菌内での組み換え型プラスミドの安定した存在を示している（図１２Ｂ）。
［実施例１０］  株ＬｍｄｄＡ−１４２（ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ）のインビボでの継代培養、病毒性およびクリアランス
【０３６５】
ＬｍｄｄＡ−１４２は、エピソーム的に発現されたｔＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質を分泌する組み換え型リステリア株である。安全な投与量を決定するために、マウスが様々な投与量でのＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化され、毒性効果が決定された。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、最小限の毒性効果しかもたらさなかった（データ非表示）。結果は、１０８ ＣＦＵのＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの投与量が、マウスによって十分な耐容性を示すことを示唆するものであった。病毒性研究は、株ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは高度に弱毒化されたことを示す。
【０３６６】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに安全な投与量１０８ＣＦＵを腹腔内投与した後での、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのインビボでのクリアランスが決定された。２日後、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化したマウスの肝臓および脾臓内には、検出可能なコロニーはなかった。この株は高度に弱毒化されているため、インビボで４８時間の時点で完全にクリアされた（図１３Ａ）。
【０３６７】
ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの弱毒化が、株ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのマクロファージに感染して細胞内で成長する能力を決定するために、細胞感染アッセイが実施された。マウスのマクロファージ様の細胞株（Ｊ７７４Ａ．１など）がリステリア構築体によってインビトロで感染され、細胞内増殖が定量化された。正の対照株の野生型リステリア株１０４０３Ｓは細胞内で成長し、およびｐｒｆＡ変異体である負の対照ＸＦＬ７は、ファゴリソソームを逃れることができず、Ｊ７７４細胞内で成長しない。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの細胞質内での増殖は、この株の細胞から細胞へと蔓延する能力の損失のため、１０４０３Ｓよりも遅かった（図１３Ｂ）。結果は、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、マクロファージに感染する能力を持ち、細胞質内で成長することを示す。
［実施例１１］  Ｃ５７ＢＬ／６  マウスにおける株−ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの免疫原性
【０３６８】
Ｃ５７ＢＬ／６  マウス内で構築体ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡにより誘発されたＰＳＡ特異的な免疫応答がＰＳＡ四量体染色を使用して決定された。マウスは、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで１週間間隔で２回免疫化され、ブースト後６日目に脾細胞がＰＳＡ四量体について染色された。ＰＳＡ特異的な四量体での脾細胞の染色によって、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、ＰＳＡ四量体＋ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞の２３％の誘発が示された（図１４Ａ）。ＰＳＡペプチドでの５時間にわたる刺激後に、ＰＳＡ特異的なＴ細胞のＩＦＮ−γを分泌する機能性能力が、細胞内サイトカイン染色を使用して検査された。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ群でＰＳＡペプチドで刺激したＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｌｏｗＩＦＮ−γを分泌する細胞で、無処置マウスと比較して２００倍の増加があり（図１４Ｂ）、これは、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株は非常に免疫原性が高く、また脾臓内のＰＳＡに対して高いレベルの機能的に活性のＰＳＡ  ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を初期刺激することを示している。
【０３６９】
マウスをＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化した後でＰＳＡに対して生成された細胞毒性Ｔ細胞の機能性活性を決定するために、ＰＳＡ特異的なＣＴＬの持つインビトロアッセイでＨ−２ＤｂペプチドによりパルスしたＥＬ４細胞を溶解する能力を試験した。ＦＡＣＳベースのカスパーゼアッセイ（図１４Ｃ）およびユーロピウム放出（図１４Ｄ）が、細胞溶解を測定するために使用された。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化したマウスの脾細胞は、標的抗原としてＰＳＡペプチドを示す細胞について高い細胞溶解活性を持つＣＴＬを含んでいた。
【０３７０】
抗原で２４  ｈ刺激した後、エフェクターＴ細胞の持つＩＦＮ−γを分泌する機能性能力を決定するためにＥＬＩＳｐｏｔが実施された。ＥＬＩＳｐｏｔを使用して、特異的ペプチドで刺激したＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化したマウスからの脾細胞内で、無処置マウスの脾細胞と比較した時に、ＩＦＮ−γのスポット数に２０倍の増加があったことが観察された（図１４Ｅ）。
［実施例１２］  ＬｍｄｄＡ−１４２菌株による免疫化は、ＰＳＡを発現する腫瘍の退行およびＰＳＡ特異的なＣＴＬによる腫瘍の浸潤を誘発する。
【０３７１】
構築体ＬｍｄｄＡ−１４２  （ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ）の治療上の有効性が、ＰＳＡを発現する前立腺腺ガン細胞株の改変を使用して決定された（Ｔｒａｍｐ−Ｃ１−ＰＳＡ（ＴＰＳＡ）；Ｓｈａｈａｂｉら、２００８）。マウスに２×１０６のＴＰＳＡ細胞を皮下移植した。腫瘍接種後６日目に、腫瘍が４〜６ｍｍの触知可能なサイズに達した時、マウスは１週間間隔で３回、１０８ＣＦＵのＬｍｄｄＡ−１４２、１０７ＣＦＵのＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（正の対照）免疫化されたか、または未処置のままとした。無処置マウスは腫瘍を徐々に成長させた（図１５Ａ）。ＬｍｄｄＡ−１４２で免疫化したマウスは、すべて３５日目まで腫瘍がなく、８匹のうち３匹のマウスが腫瘍を徐々に成長させたが、無処置マウスと比較してずっと遅い速度で成長した（図１５Ｂ）。８匹のうち５匹のマウスが７０日目まで腫瘍のないままであった。予想されたとおり、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡワクチン接種したマウスは、無処置の対照よりも腫瘍が少なく、腫瘍の成長は対照よりもさらに遅かった（図１５Ｃ）。したがって、構築体ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、ＴＰＳＡ細胞株によって確定された腫瘍の６０％を退行させることができ、また他のマウスでは腫瘍の増殖を遅らせた。治癒したマウスは腫瘍のないままであったが、６８日目にＴＰＳＡ腫瘍で再チャレンジした。
【０３７２】
ＬｍｄｄＡ−１４２によるマウスの免疫化は、増殖を制御でき、また無処置群（図１５Ａ）で無かったのと比較して、６０％を越える実験動物（図１５Ｂ）でＰＳＡを発現するよう改変された、確定されたＴｒａｍｐ−Ｃ１腫瘍の７日目の退行を誘発できる。ＬｍｄｄＡ−１４２は、高度に弱毒化されたベクター（ＬｍｄｄＡ）およびプラスミドｐＡｄｖ１４２（表２）を使用して構築された。
【０３７３】
さらに、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ構築体によって生成されたＰＳＡ特異的なＣＤ８リンパ球の持つ腫瘍を浸潤する能力が、調査された。マウスには腫瘍およびマトリゲルの混合物が皮下移植された後、未変性または対照（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７）リステリアで、またはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで、７日間隔で２回の免疫化がなされた。腫瘍は、２１日目に切除され、ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ  ＰＳＡ四量体＋と、ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋の母集団で、腫瘍における制御性Ｔ細胞の浸潤性について分析された。
【０３７４】
無処置マウスおよびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７対照免疫化マウスの両方に存在したＰＳＡに特異的な、非常に少数のＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ  ＰＳＡ四量体＋腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）が観察された。ところが、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化したマウスでは、ＰＳＡ特異的なＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ  ＰＳＡ四量体＋  ＴＩＬの割合に１０〜３０倍の増加があった（図７Ａ）。興味深いことに、脾臓内のＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ  ＰＳＡ四量体＋細胞の母集団は、腫瘍内よりも７．５倍少なかった（図１６Ａ）。
【０３７５】
さらに、未処置マウスおよびリステリア免疫化マウスの腫瘍内でのＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）の存在が確認された。興味深いことに、リステリアでの免疫化によって、結果として、腫瘍内のＣＤ４＋  ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋  Ｔ−ｒｅｇｓの数がかなり減少したが、脾臓内では減少しなかった（図１６Ｂ）。ところが、構築体ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、無処置およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７免疫化群と比較した時に、腫瘍内でのＣＤ４＋  ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋  Ｔ−ｒｅｇｓの頻度の減少に強力な影響を及ぼした（図１６Ｂ）。
【０３７６】
よって、ＬｍｄｄＡ−１４２ワクチンは、腫瘍部位を浸潤することができるＰＳＡ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発できる（図１６Ａ）。興味深いことに、ＬｍｄｄＡ−１４２での免疫化は、腫瘍内での制御性Ｔ細胞数の減少に関連し（図１６Ｂ）、おそらく、効率的な抗腫瘍ＣＴＬ活性について、より好ましい環境が創出される。
［実施例１３］  Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３は、ＰＳＡ融合にもかかわらず、機能性ＬＬＯを分泌する。
【０３７７】
Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３は、完全長ヒトｋｌｋ３遺伝子を含み、これはＰＳＡタンパク質をコードし、相同組換えにより染色体内のｈｌｙ遺伝子の下流にインフレームで挿入される。これらの構築体は、ｐＫＳＶ７プラスミド（ＳｍｉｔｈおよびＹｏｕｎｇｍａｎ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．  １９９２；７４（７−８）ｐ７０５−７１１）を使用して相同組換えにより作成されるが、これは温度感受性レプリコンを有し、ｈｌｙ−ｋｌｋ３−ｍｐｌ組み換えカセットを保有する。第２の組み換え事象後のプラスミド切除のため、統合選択に使用される抗生物質抵抗性マーカーは失われる。さらに、ＡｃｔＡ遺伝子は、ＬｍｄｄＡ−１４３株内で除去される（図１７Ａ）。ｈｌｙとインフレームのｋｌｋ３の染色体への挿入が、ＰＣＲにより確認され（図１７Ｂ）、両方の構築体で配列決定がなされた（データ非表示）。
【０３７８】
これらの染色体構築体の一つの重要な面は、ＬＬＯ−ＰＳＡが生成されても、リステリアがファゴソーム、サイトゾル浸潤およびＬ．モノサイトゲネスによって生成された効率的な免疫から逃れるために必要とされるＬＬＯの機能が完全には消滅しないことである。Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３培養上清からの分泌タンパク質のウエスタンブロットにより、ＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質に対応する〜８１  ｋＤａ帯域および予想されたＬＬＯのサイズである〜６０  ｋＤａ帯域（図１８Ａ）が明らかにされるが、これは染色体内の融合遺伝子にもかかわらず、ＬＬＯがＬ．モノサイトゲネスによってＬＬＯ−ＰＳＡ融合から切断されたか、またはなおも単一のタンパク質から生成されたかのいずれかであることを示す。Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３によるＬＬＯ分泌により、野生型Ｌ．モノサイトゲネス１０４０３Ｓと比較して、５０％の溶血活性が保持された（図１８Ｂ）。これらの結果と一致して、Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３のどちらも、マクロファージ様のＪ７７４細胞株内で、細胞内での複製ができた（図１８Ｃ）。
［実施例１４］  Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３のどちらもＰＳＡ抗原に対する細胞媒介性の免疫応答を誘発する。
【０３７９】
Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３のどちらも、ＬＬＯに融合されたＰＳＡを分泌できることを示した後、これらの菌株がＰＳＡ特異的な免疫応答をインビボで誘発できるかどうかを調査した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスが、未処置のままか、またはＬｍｄｄ−１４３、ＬｍｄｄＡ−１４３またはＬｍｄｄＡ−１４２で２回免疫化された。ＰＳＡ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答が、ＰＳＡ６５−７４ペプチドおよびＩＦＮ−γについての細胞内染色により脾細胞を刺激することで測定された。図１９に示すとおり、染色体およびプラスミドをベースにしたベクターにより誘発された免疫応答は同様であった。
【０３８０】
材料および方法（実施例１５〜１９）
【０３８１】
ＭＤＳＣおよびＴｒｅｇ機能  
腫瘍がマウスに、腫瘍モデルに依存して脇腹または生理学的部位に移植された。次いで７日後に、マウスはワクチン接種され、初期ワクチン接種日は使用する腫瘍モデルに依存する。次いでワクチンが与えられた一週間後に、マウスはブースターワクチンを投与された。
【０３８２】
次いでブーストの１週間、または浸潤性腫瘍モデルの場合はブーストの３〜４日後にマウスは犠牲にされ、腫瘍および脾臓が採取された。腫瘍を採取する５日前に、レスポンダーＴ細胞の目的で使用するために、腫瘍を持っていないマウスはワクチン接種された。標準的な方法を使用して脾細胞が準備された。
【０３８３】
簡潔に述べると、腫瘍および脾臓の両方の単細胞懸濁液が調製された。脾臓を手作業で潰し、赤血球を溶解した。腫瘍を細かく刻み、コラゲナーゼ／デオキシリボヌクレアーゼを用いてインキュベートした。代替的に、ＧＥＮＴＬＥＭＡＣＳ（商標）解離器を腫瘍解離キットとともに使用した。
【０３８４】
ＭＤＳＣまたはＴｒｅｇは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉキットおよびカラム、またはａｕｔｏＭＡＣｓセパレーターを使用して腫瘍および脾臓から精製された。次いで細胞を計数した。
【０３８５】
単細胞懸濁液を調製し、赤血球を溶解した。次いでＣＦＳＥを用いてレスポンダーＴ細胞にラベルを付けた。
【０３８６】
ウェル当たり１×１０５のＴ細胞密度にて、９６ウェルプレート内に、レスポンダーＴ細胞（すべての分裂サイクルうの段階からの）対ＭＤＳＣまたはＴｒｅｇの比が２：１となるように細胞を一緒にプレーティングした。次いで、適切なペプチド（ＰＳＡまたはＣＡ９）を用いて、または非特異的にＰＭＡ／イオノマイシンを用いてレスポンダーＴ細胞を刺激した。３７℃にて２日間、５％のＣＯ２を用いて、細胞を遮光下でインキュベートした。２日後、細胞をＦＡＣＳのために染色し、ＦＡＣＳマシンで解析した。
【０３８７】
Ｔ細胞応答の解析
ＥＬＩＳＡによるサイトカイン解析のために、脾細胞を採取して、ウェル当たり１５０万細胞にて４８ウェルプレートに培地、ＳＥＡ、またはｃｏｎＡ（正の対照として）の存在中にプレーティングした。７２時間の間のインキュベーションの後、上清を採取して、ＥＬＩＳＡ（ＢＤ）を用いてサイトカインレベルを解析した。抗原特異的なＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔのために、脾細胞を採取して、プレート当たり３０万および１５万細胞にてＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔプレート内に、培地、特異的なＣＴＬペプチド、無関連ペプチド、特異的なヘルパーペプチド、またはｃｏｎＡ（正の対照として）の存在中にプレーティングした。２０時間のインキュベーション後、ＥＬＩＳｐｏｔｓ（ＢＤ）を実施し、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃ．Ｔ．Ｌ．）によってスポットを計数した。１００万脾細胞当たりのスポットの数をグラフにした。
【０３８８】
Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、  Ｚ１を使用して脾細胞を計数した。ｇａｇ−ＣＴＬ、ｇａｇ−ｈｅｌｐｅｒ、培地、無関連抗原、およびｃｏｎ  Ａ（正の対照）を用いた再刺激後のＣＤ８＋  Ｔ細胞を生産するＩＦＮ−γの頻度が、標準的なＩＦＮ−γベースのＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して決定された。
【０３８９】
簡潔に述べると、５ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ  Ｒ４０−Ａ２と、最適な希釈で使用される多クローン性のウサギの抗ＩＦＮ−γ（親切にもＰｈｉｌｌｉｐ  Ｓｃｏｔｔ博士、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、米国ペンシルバニア州Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａによって提供された）とを使用してＩＦＮ−γを検出した。ＩＦＮ−γのレベルは、マウスのｒＩＦＮ−γ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を使用した標準曲線との比較によって計算された。プレートはペルオキシダーゼ−共役ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ａｂ（ＩＦＮ−γ）を使用して開発された。次いでプレートを４０５ｎｍで読み取った。アッセイに対する検出の下限値は３０ｐｇ／ｍＬである。
［実施例１５］  リステリアワクチン処置後の抑制細胞機能
【０３９０】
０日目に腫瘍をマウスに移植した。７日目にマウスにＬｍｄｄａ−Ｅ７またはＬｍｄｄＡ−ＰＳＡを用いてワクチン接種した。１４日目に腫瘍を採取して、ワクチン接種した群および無処置群に対する浸潤性ＭＤＳＣおよびＴｒｅｇの数およびパーセンテージを測定した。リステリア処置したマウスの腫瘍で、ＭＤＳＣとＴｒｅｇとの両方のパーセンテージ、およびＭＤＳＣの絶対数の減少が見出されたが、脾臓または排出リンパ節（ＴＬＤＮ）では同じ効果は観察されなかった（図２０）。
【０３９１】
腫瘍内でＭＤＳＣおよびＴｒｅｇ（両者とも脾臓および腫瘍のＭＤＳＣおよびＴｒｅｇ）の存在中でのＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡおよびＬｍ−ＬＬＯ−ＣＡ９、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｈｅｒ２（図２１〜２３）を用いた免疫化の効果を解明するために、上記の実験での腫瘍を持つマウスから分離された脾細胞および抽出された腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）を、プールし、ＣＤ３およびＣＤ８のために染色した。各々のカラムは特定の細胞分裂段階におけるＴ細胞集団の％を表し、特定の処置群（無処置、ペプチド−ＣＡ９またはＰＳＡ処置、ＭＤＳＣ／Ｔｒｅｇなし、およびＭＤＳＣ＋ＰＭＡ／イオノマイシンなし）の下で下位群にグループ分けした（図２１〜２３参照）。
【０３９２】
提示するＴｒｅｇおよびＭＤＳＣのパーセンテージについて腫瘍を持つマウスからの血液を解析した。Ｌｍワクチン接種後のマウスの血液ではＭＤＳＣとＴｒｅｇとの両方の減少があった。
［実施例１６］  脾臓以外のＴＰＳＡ２３腫瘍からのＭＤＳＣは、リステリアワクチン接種後に抑制性が低下する。
【０３９３】
非特異的に活性化した無処置マウスの細胞および特異的に活性化した細胞（ＰＳＡ、ＣＡ９、ＰＭＡ／イオノマイシン）を有するＴＰＳＡ２３腫瘍から分離された単球性および顆粒球性のＭＤＳＣを使用して抑制因子アッセイを実行した。結果は、Ｌｍワクチン接種した群からの腫瘍から分離されたＭＤＳＣは、無処置マウスの腫瘍からのＭＤＳＣと比較して活性化したＴ細胞の分裂を抑制する能力が減退していることを実証した。（図２１および図２３のＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡおよびＬｍ−ＬＬＯで処置した群を参照、図中右側のパネルは右側のパネルからのプールした細胞分裂データを表す）。加えて、ＭＤＳＣが存在せずかつ細胞が刺激されていない／活性化している、未処置マウスからのＴレスポンダー細胞は、その親状態（休止状態）のままであるのに対して（図２１および図２３）、ＰＭＡまたはイオノマイシンで刺激されたＴ細胞は複製しているのが観察された（図２１および図２３）。さらに、Ｇｒ＋Ｌｙ６Ｇ＋およびＧｒｄｉｍＬｙ６Ｇ−ＭＤＳＣの両方とも、リステリアワクチンを用いた処置後、抑制がより低くなることが観察された。これは、ＰＳＡ特異的なＴ細胞および非特異的な（ＰＭＡ／イオノマイシンで刺激した）Ｔ細胞の両方の分割を抑制するこれらの能力を減少するために適用される。
【０３９４】
さらに、非特異的に活性化した無処置マウスの細胞を用いてＴＰＳＡ２３腫瘍から分離されたＭＤＳＣを使用して実施した抑制因子アッセイは、Ｌｍワクチン接種した群からの腫瘍から分離されたＭＤＳＣが、無処置マウスの腫瘍からのＭＤＳＣと比較して、活性化したＴ細胞の分裂を抑制する能力が減退していることを実証した（図２１および図２３参照）。
【０３９５】
加えて、すぐ上で考察した図２１および図２７に関する観察は、脾臓のＭＤＳＣを使用したときには観察されなかった。後者では、無処置群からの脾細胞／Ｔ細胞、リステリアで処置した群（ＰＳＡ、ＣＡ９）、およびＰＭＡ／イオノマイシンで刺激した群（正の対照）のすべてが同じレベルの複製を実証した（図２２および図２４）。したがって、これらの結果はリステリア媒介性の腫瘍内の抑制因子細胞の阻害が抗原特異的なおよび非特異的な様式で作用するのに対して、これらは抗原特異的な様式でのみ抑制的なので、リステリアは脾臓の顆粒球性のＭＤＳＣには何も効果を有しないことを示す。
［実施例１７］  腫瘍調節性Ｔ細胞の抑制の減少
【０３９６】
リステリア処置後ＴＰＳＡ２３腫瘍から分離されたＴｒｅｇを使用して、抑制因子アッセイを実施した。リステリアを用いた処置後、腫瘍からのＴｒｅｇの抑制能力の減少が観察されたが（図２５）、しかしながら脾臓のＴｒｅｇはそれでも抑制的なままであることが見出された（図２６）。
【０３９７】
対照として、ＭＤＳＣまたはＴｒｅｇの代わりに従来のＣＤ４＋Ｔ細胞が使用され、細胞分裂には効果を有しないことが見出された（図２７）。
［実施例１８］  ４Ｔ１腫瘍からのＭＤＳＣおよびＴｒｅｇ（ただし脾臓ではない）は、リステリアワクチン接種後、より抑制が低下する。
【０３９８】
４Ｔ１腫瘍を使用して上記と同様に同一の実験を実施したところ、同一の観察を得た。すなわち、リステリアワクチン接種後、ＭＤＳＣは抑制がより少なくなる（図２８および図３０）、リステリアは脾臓の単球性ＭＤＳＣには特異的な効果を有しない（図２９および図３１）、リステリアワクチン接種の後、４Ｔ１腫瘍からのＴｒｅｇの抑制能力の減少がある（図３２）、およびリステリアが脾臓のＴｒｅｇの抑制能力に効果を有しない（図３３）。
【０３９９】
最後にリステリアが脾臓のＴｒｅｇの抑制能力には効果を有しないことが観察された。
［実施例１９］  顆粒球性および単球性ＭＤＳＣの抑制能力の変化は、ｔＬＬＯの過剰発現に起因する。
【０４００】
ＬＬＯプラスミドは、ＴＡＡまたは無関連抗原のいずれかを用いたリステリアワクチンと類似の結果を示す（図３４）。これは、顆粒球性のＭＤＳＣの抑制能力の変化がｔＬＬＯの過剰発現に起因し、融合抗原のパートナリングとは無関係であることを意味する。空のプラスミド構築体単独でもＭＤＳＣの抑制能力の変化を導くが、プラスミド上に切断ＬＬＯを含有するワクチンのいずれかとは正確に同一のレベルではない。３つの独立した実験の平均は、空のプラスミドとｔＬＬＯを有する他のプラスミドと（腫瘍抗原を有するものと有しないものと）の間の抑制の差異が有意であることを示す。抗原特異的な刺激されたレスポンダーＴ細胞が使用されるか、または抗原に非特異的な刺激されたレスポンダーＴ細胞が使用されるかという事実に関わらず、ＭＤＳＣ抑制能力の減少は同一である。
【０４０１】
顆粒球性のＭＤＳＣと同様に、３つの独立した実験の平均は、腫瘍から精製した単球性ＭＤＳＣのＬｍが空のプラスミドワクチンを用いたワクチン接種後の抑制能力の観察された差異が、他のワクチン構築体と比較して有意であることを示す（図３５）。
【０４０２】
上記の観察と同様に、脾臓から精製した顆粒球性のＭＤＳＣは、Ｌｍワクチン接種後もそれらの抗原特異的なレスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力を保持する（図３６）。しかしながら非特異的な刺激後、活性化したＴ細胞（ＰＭＡ／イオノマイシンを有する）はまだ分裂する能力を有している。これらの結果のいずれもＬＬＯのみまたは空のプラスミドワクチンの使用によって変更されず、これはＬｍベースのワクチンが脾臓の顆粒球性のＭＤＳＣには影響しないことを示す（図３５）。
【０４０３】
同様に、脾臓から精製した単球性のＭＤＳＣは、Ｌｍワクチン接種後もそれらの抗原特異的なレスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力を保持する。しかしながら、非特異的な活性化（ＰＭＡ／イオノマイシンによって刺激された）後、Ｔ細胞は、まだ分裂の能力を有している。これらの結果のいずれもＬＬＯのみまたは空のプラスミドワクチンの使用によって変更されず、これはＬｍワクチンが脾臓の単球性のＭＤＳＣには影響しないことを示す（図３７）。
【０４０４】
レスポンダー細胞が抗原特異的に活性化されるか、または非特異的に活性化されるかに関わらず、Ｌｍで処置した群のいずれかの腫瘍から精製したＴｒｅｇは、レスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力がわずかに減退している。特に、非特異的に活性化したレスポンダーＴ細胞については、それでも空のプラスミドを有するワクチンがＬＬＯをプラスミドに含有するすべてのワクチンと同じ結果を示す。この実験を他のものと平均化すると、差異が有意でないことを示す（図３８）。
【０４０５】
脾臓から精製したＴｒｅｇは、抗原特異的なおよび非特異的な活性化したレスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力をまだ有する。脾臓のＴｒｅｇの抑制能力にはＬｍ処置の効果はない（図３９）。
【０４０６】
Ｔｃｏｎ細胞は、レスポンダー細胞が抗原特異的に活性化したか、または非特異的に活性化したかに関わらず、Ｔ細胞の分裂を抑制する能力を有しない。これはこれらの細胞が非抑制的であるという事実と一致している。Ｌｍはこれらの細胞には効果を有さず、細胞が腫瘍から精製されても、またはマウスの脾臓から精製されても違いはなかった（図４０〜図４１）。
［実施例２０］  リステリアベースのワクチンと抗ＯＸ４０または抗ＧＩＴＲ  Ａｂｓの組み合わせを投与したマウスにおける生存の増加
【０４０７】
材料および方法
【０４０８】
動物、細胞株、ワクチン、および他の試薬
生後６〜８週間のメスのＣ５７ＢＬ６マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、病原体の無い条件下に保った。マウスは、ＧＲＵ動物実験委員会によって承認されたプロトコルの下でＮＩＨガイドラインに従い飼育された。ヒトパピローマウイルス株１６（ＨＰＶ１６）初期タンパク質６および７（Ｅ６およびＥ７）ならびに活性化ｒａｓガン遺伝子の、初代Ｃ５７ＢＬ／６マウス肺上皮細胞への共トランスフェクションによって派生させたＴＣ−１細胞をＡＴＣＣ（米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から取得し、細胞を、１０％のＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシン（各々１００Ｕ／ｍＬ）、ならびにＬ−グルタミン（２ｍＭ）を補足したＲＰＭＩ  １６４０内で、３７℃にて５％ＣＯ２を用いて成長させた。ヒトパピローマウイルス−１６（ＨＰＶ−１６）Ｅ７（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯおよびＸＦＬ７）を含むものと含まない、Ａｄｖａｘｉｓ  Ｉｎｃ．により提供されたリステリアワクチンベクターが、実施例１で上述した通り、また「詳細な説明」で上記に開示されている通りに生成された。
【０４０９】
Ｌｍ−ＬＬＯ、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＸＦＬ７を、１×１０８ＣＦＵ／マウスの用量で腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＧＩＴＲおよびＯＸ４０抗体はＡｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ  ／  Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅから入手され、投与量５０  μｇ／マウス（抗ＯＸ４０Ａｂ）および２５０  μｇ／マウス（抗ＧＩＴＲ  Ａｂ）で静脈内（ｉ．ｖ．）として注入されたが、図４２Ａおよび図４２Ｂに示す通りである。
【０４１０】
腫瘍移植および治療
後述するとおり腫瘍の成長および生存を解析することを目的とした治療的実験を実施した。簡潔に述べると、０日目に７０，０００個のＴＣ−１腫瘍細胞／マウスをマウスの右の脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）移植した。１０日目に（腫瘍サイズの直径が約４〜５ｍｍ）、適切な群からの動物（群当たり１０匹のマウス）が、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯおよびＸＦＬ７（抗ＧＩＴＲ  Ａｂまたは抗ＯＸ４０  Ａｂを含むものと含まないもの）を腹腔内注入されたか、または未処置（ＮＴ）とした。（図４２Ｃ）抗ＯＸ４０  Ａｂを受けたマウスは、実験期間全体にわたりワクチンおよび抗ＯＸ４０  Ａｂで週２回の処置を受けた（図４２、１０日目、１３日目、１７日目、２０日目など）。抗ＧＩＴＲ  Ａｂを受けたマウスは週２回合計３回の投与を受けた（図４２Ｂ、１０日目、１３日目および１７日目）。他の群のマウスは未処置のままとした。
【０４１１】
結果
図４３Ａ〜Ｂは、リステリアベースのワクチンＡＤＸＳ１１A単独での投与は、処置マウスの生存期間を未処置のマウスまたは対照処置マウスの少なくとも２倍延長させたが、ＡＤＸＳ１１Aによる処置および抗ＧＩＴＲ  Ａｂｓの投与の組み合わせは、生存期間を延長させただけでなく、母集団内の生存率も増加させたことを示している。増加率はほぼ４０％であった。ＡＤＸＳ１１Aと抗ＧＩＴＲ  Ａｂｓの組み合わせは、処置したマウスの６０％で確立された腫瘍の完全な退行をもたらした（図４３Ａ）。興味深いことに、抗ＧＩＴＲ抗体も、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯのみを受けたマウスと比較して、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ／抗ＧＩＴＲで処置したマウスの生存期間を延長させた（図４３Ｂ）。
【０４１２】
図４４Ａ〜Ｂは、リステリアベースのワクチンＡＤＸＳ１１A単独での投与は、処置マウスの生存期間を未処置のマウスまたは対照処置マウスの少なくとも２倍延長させるが、ＡＤＸＳ１１Aによる処置および抗ＧＩＴＲ  Ａｂｓの投与の組み合わせは、生存期間を延長させただけでなく、母集団内の生存率も増加させた（図４４Ｂ）。増加率はほぼ２０％であった。そのため、ＡＤＸＳ１１Aと抗ＯＸ４０  Ａｂｓの組み合わせは、処置したマウスの４０％で確立された腫瘍の完全な退行につながった（図４４Ａ）。
【０４１３】
これらの結果は、抗ＯＸ４０および抗ＧＩＴＲ抗体の使用がリステリアベースのワクチンの治療的な可能性を増強したことを示す。
［実施例２１］  共刺激分子ＧＩＴＲおよびＯＸ４０に対して作動薬抗体を使用することはリステリアベースの免疫療法の抗腫瘍有効性を著しく増強
【０４１４】
作動薬抗体、抗ＯＸ４０および抗ＧＩＴＲがリステリアベースのワクチンの治療的可能性を増強したことを示す実施例２０で提示された結果を受けて、この増強された生存についての免疫応答が分析された。
【０４１５】
材料および方法
【０４１６】
動物、細胞株、ワクチン、および他の試薬
生後６〜８週間のメスのＣ５７ＢＬ６マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、病原体のない条件下に保った。マウスは、ＧＲＵ動物実験委員会によって承認されたプロトコルの下でＮＩＨに従い飼育された。ヒトパピローマウイルス株１６（ＨＰＶ１６）初期タンパク質６および７（Ｅ６およびＥ７）ならびに活性化ｒａｓガン遺伝子の、初代Ｃ５７ＢＬ／６マウス肺上皮細胞への共トランスフェクションによって派生させたＴＣ−１細胞をＡＴＣＣ（米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から取得し、細胞を、１０％のＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシン（各々１００Ｕ／ｍＬ）、ならびにＬ−グルタミン（２ｍＭ）を補足したＲＰＭＩ  １６４０内で、３７℃にて５％ＣＯ２を用いて成長させた。Ａｄｖａｘｉｓ  Ｉｎｃ．により提供されたリステリアワクチンベクターは、ヒトパピローマウイルス−１６（ＨＰＶ−１６）Ｅ７（Ｌｍ  ［ＸＦＬ７］、Ｌｍ−ＬＬＯ  ［ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ］、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７  ［ＡＤＸＳ１１A］）を含むものと含まないものが、実施例１で上述した通り、詳細な説明で上記に開示されている通りに生成された。リステリアベースの療法を表３に対照と共に示す。
【表３】
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【０４１７】
Ｌｍ、ＬＭ−ＬＬＯおよびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７が、腹腔内（ｉ．ｖ．）に１×１０８ＣＦＵ／マウスの投与量で、Ｄ１３日目から開始して７日ごとに注入された（図４５および図５１Ａ）。ＧＩＴＲおよびＯＸ４０抗体はＡｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ  ／  Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅから入手され、静脈内（ｉ．ｖ．）に注入されたが、図４５および図５１に示す通りである。
【０４１８】
腫瘍移植および治療
後述するとおり腫瘍の成長および免疫応答を解析した治療的実験を実施した。簡潔に述べると、０日目に７０，０００個のＴＣ−１腫瘍細胞／マウスをマウスの右の脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）移植した。１３日目に（腫瘍サイズの直径が約４〜５ｍｍ）、適切な群からの動物（群当たり５匹のマウス）が、Ｌｍ、ＬＭ−ＬＬＯまたはＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（抗ＧＩＴＲ  Ａｂ（図４５、表４）または抗ＯＸ４０  Ａｂ（図５１、表５）を含むものと含まないもの）を腹腔内注入されたか、または未処置（ＮＴ）とした。抗ＯＸ４０  Ａｂを受けたマウスは、ワクチンおよび抗ＯＸ４０  Ａｂで合計４回の１ｍｇ／Ｋｇマウス重量（ｍｐｋ）の投与を１３日目（Ｄ１３）に開始して３〜４日間隔で受けた（図５１）。抗ＧＩＴＲ  Ａｂを受けたマウスは、ワクチンおよび抗ＧＩＴＲ  Ａｂで合計４回の５ｍｇ／Ｋｇ  マウス重量（ｍｐｋ）の投与を１３日目（Ｄ１３）に開始して３〜４日間隔で受けた（図４５）。別の群のマウスは、作動薬抗体では未処置のままとした（ＰＢＳ行、図４２Ｃで説明）。
【０４１９】
一部のマウスについて、デジタルキャリパーを使用して３〜４日ごとに腫瘍を測定し、式Ｖ＝（Ｗ２×Ｌ）／２（式中、Ｖは体積、Ｌは長さ（長直径）、またＷは幅（短直径））を使用して腫瘍体積を計算する。これらの実験では、マウスが瀕死になったとき、腫瘍が潰瘍形成したとき、または腫瘍体積が１．５ｃｍ３に達したとき、マウスは犠牲にされる。
【０４２０】
全体で８つの試験群があった。２６日目（Ｄ２６）にすべての動物を屠殺し、脾臓および腫瘍が収穫され、総浸潤ＣＤ４、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋）、非Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−）、ＣＤ８＋、ＣＤ８＋Ｅ７＋、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、ＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ、ＣＤ８＋Ｅ７＋／Ｔｒｅｇ、ＣＤ８＋／ＭＤＳＣ、ＣＤ８＋Ｅ７＋／ＭＤＳＣについてスクリーニングされた。
【０４２１】
抗原特異的細胞免疫応答（ＡＳＩＲ）、Ｔｒｅｇ、末梢および腫瘍でのＭＤＳＣの分析    
【０４２２】
製造業者（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）によって示唆されているように、ＥＬＩＳＰＯＴの解析を使用して、処置マウスおよび対照マウス由来のＥ７再刺激（１０μｇ／ｍＬ）脾細胞培養物内のＩＦＮγ産生を検出した。スポットを解析するためにＣＴＬ  Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．、米国オハイオ州Ｓｈａｋｅｒ  Ｈｅｉｇｈｔｓ）が使用される。無関連なペプチド（ｈｇｐ  １００２５−３３−ＫＶＰＲＮＱＤＷＬ−Ｃｅｌｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国テネシー州Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ）再刺激脾細胞からのスポットの数が、Ｅ７再刺激培養物から差し引かれる。さらに、腫瘍内のＡＳＩＲが、抗原特異的腫瘍浸潤性ＣＤ８＋  Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｅ７＋細胞）の数として図４８Ｂおよび５４Ｂで示されている。
【０４２３】
製造業者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、米国カリフォルニア州Ａｕｂｕｒｎ）によって示唆されているように、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ解離器および固形腫瘍均質化プロトコルを使用して腫瘍サンプルを加工した。腫瘍浸潤ＣＤ８＋、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋（Ｔｒｅｇ）およびＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋（ＭＤＳＣ）細胞の数は、フローサイトメトリーアッセイを使用してＣＤ４５＋造血細胞集団の中で解析された。同一のフローサイトメトリーアッセイを使用して、腫瘍を持っている処置したマウスおよび対照マウスの脾臓のＴｒｅｇ細胞およびＭＤＳＣのレベルが評価された。
【０４２４】
統計的解析
すべての統計パラメータは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して計算された。群間の統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙの事後多重比較検定を用いた一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）によって判定された（Ｐ＜Eが統計的有意であると考えられた）。
【０４２５】
結果
【０４２６】
ＧＩＴＲ作動薬抗体との組み合わせ
浸潤性ＣＤ４＋  Ｔ細胞の合計数は併用療法の後で増加した。図４６Ａは、ＧＩＴＲ作動薬抗体との組み合わせでのＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の投与は、単一療法のみと比較しても、総腫瘍浸潤性ＣＤ４＋  Ｔ細胞を著しく増加させたことを示している。重要なことに、ＧＩＴＲ作動薬抗体との組み合わせでのＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の投与によるＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋）の合計数に有意な効果はない（図４６Ｂ）。
【０４２７】
非Ｔｒｅｇ  ＣＤ４＋  Ｔ細胞の合計数は併用療法の後で増加した。図４７Ａは、ＧＩＴＲ作動薬抗体との組み合わせでのＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の投与によって、非Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−）ＣＤ４＋  Ｔ細胞の合計数が著しく増大したことを示す。興味深いことに、リステリアベースのワクチンの投与それ自体も、合計ＣＤ４におけるＦｏｘＰ３細胞の全体的なパーセント値を著しく低減し、ＦＩＴＲ作動薬抗体との組み合わせでは、ＰＢＳまたは作動薬群単独と比較して低減度はさらに著しく高い（図４７Ｂ）
【０４２８】
併用療法でもまた、結果的に合計ＣＤ８＋  Ｔ細胞の腫瘍浸潤が増加した。抗ＧＩＴＲ作動薬抗体（Ａｂ）と組み合わせたＬＭ−ＬＬＯおよびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の投与は、腫瘍浸潤性ＣＤ８＋  Ｔ細胞を著しく増加させることが観察された。（図４８Ａ）興味深いことに、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、抗ＧＩＴＲ  Ａｂと併用することで、腫瘍浸潤性抗原特異的ＣＤ８＋Ｅ７＋Ｔ細胞を増加させることが観察された。（図  ４８Ｂ）
【０４２９】
併用療法療法は、腫瘍におけるＣＤ８／Ｔｒｅｇ比を増大させた。腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比は、ＰＢＳまたは抗体群単独と比較して、組み合わせＧＩＴＲ  Ａｂ群で著しく増大することが分かった。（図４９Ａ）Ｅ７−ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７および抗ＧＩＴＲの組み合わせ群では、有意ではない増加が観察された。（図  ４９Ｂ）
【０４３０】
作動薬ＧＩＴＲ抗体によるＭＤＳＣの誘発。ＧＩＴＲに対する作動薬Ａｂは、ＰＢＳ群と比較してＭＤＳＣを著しく誘発することが観察された。（図５０Ａ）さらに、ＣＤ８／ＭＤＳＣ比は、抗ＧＩＴＲ  ＡｂとＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の組み合わせにより著しく増大した。（図５０Ｂ）興味深いことに、Ｅ７＋ＣＤ８＋／ＭＤＳＣ比は、抗ＧＩＴＲ  ＡｂとＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の組み合わせにより著しく増大した。（図  ５０Ｃ）
【０４３１】
ＯＸ４０作動薬抗体との組み合わせ
興味深いことに、ＯＸ４０作動薬Ａｂそれ自体も、ＰＢＳ群と比較して合計ＣＤ４＋Ｔ細胞を著しく増加させた。リステリアベースのＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７とＯＸ４０作動薬Ａｂの組み合わせは、ＰＢＳ群と比較して総腫瘍浸潤性ＣＤ４＋Ｔ細胞のみを著しく増加させたが、単独療法のみと比較しては増加していなかった。（図５２Ａ）ＯＸ４０  Ａｂ誘発Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋）は、リステリアベースのＬＭ−ＬＬＯおよびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７との組み合わせで著しく減少した。（図５２Ｂ）
【０４３２】
総腫瘍浸潤性非Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−）の数および合計ＣＤ４＋  Ｔ細胞に占めるＴｒｅｇの比率が分析された。リステリアベースのＥ７ワクチンとＯＸ４０作動薬  Ａｂの組み合わせは、非Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−） Ｔ細胞の合計数を著しく増加させた。（図５３Ａ）リステリアベースのワクチンそれ自体は、合計ＣＤ４内のＦｏｘＰ３細胞の全体的な比率を著しく低下させ、ＯＸ４０作動薬Ａｂとの組み合わせでは、どの群と比較しても低下はさらに著しく高くなった。（図５３Ｂ）
【０４３３】
ＣＤ８＋  Ｔ細胞および抗原特異的ＣＤ８＋Ｅ７＋細胞の合計数は併用療法の後で増加した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と抗ＯＸ４０  Ａｂの組み合わせは、ＰＢＳ群と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞の合計数の著しい増加につながった。（図５４Ａ）さらに、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、抗ＯＸ４０作動薬  Ａｂの投与と組み合わせた時に、腫瘍浸潤性抗原特異的ＣＤ８＋Ｅ７＋Ｔ細胞を著しく増加することが観察された。（図５４Ｂ）
【０４３４】
ＣＤ８／ＴｒｅｇおよびＥ７ＣＤ８／Ｔｒｅｇの比は、併用療法の後で改善された。腫瘍におけるＣＤ８／Ｔｒｅｇ比は、その他のどの群と比較しても、抗ＯＸ４０作動薬ＡｂおよびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の組み合わせ群で著しく改善されることが分かった。（図５５Ａ）腫瘍におけるＥ７ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比は、その他のどの群と比較しても、抗ＯＸ４０作動薬ＡｂおよびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の組み合わせ群で著しく改善されることが分かった。（図５５Ｂ）
【０４３５】
併用療法後のＭＤＳＣの誘発。作動薬ＯＸ４０  Ａｂは、ＭＤＳＣを非有意に増加させること、およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７との組み合わせでこの免疫抑制ＭＤＳＣを著しく減少させることが観察された。（図５６Ａ）ＣＤ８／ＭＤＳＣ比は、抗ＯＸ４０  ＡｂとＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の組み合わせで著しく増大した。（図５６Ｂ）また、Ｅ７＋ＣＤ８＋／ＭＤＳＣ比は、抗ＯＸ４０  ＡｂとＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の組み合わせで著しく増大した。（図５６Ｃ）
【０４３６】
結論  
本明細書で提示した結果は、共刺激性ＧＩＴＲおよびＯＸ４０経路の阻害と、リステリアベースのＥ７ワクチンの組み合わせの抗腫瘍および免疫応答性を示す。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７腫瘍ワクチンの存在下でのＧＩＴＲまたはＯＸ４０経路の共刺激は、抗腫瘍活性の増強および生存の増加（実施例２０）を示した。抗ＧＩＴＲまたは抗ＯＸ４０とペプチドベースのＥ７ワクチンの組み合わせは、合計および抗原特異的ＣＤ８を著しく増加させたが、ＴｒｅｇまたはＭＤＳＣ母集団に対しては何の効果もなかった。むしろ、これらの作動薬抗体による療法それ自体が、またはＴＣ１腫瘍モデルにおけるペプチドベースのＥ７ワクチンとの組み合わせで、腫瘍内の免疫抑制細胞を増加させることがわかった。
【０４３７】
リステリアベースのワクチンは、免疫抑制細胞を減少させ、ＴｒｅｇおよびＭＤＳＣを誘発することが周知である。リステリアベースのワクチンの存在下でのＧＩＴＲまたはＯＸ４０経路の共刺激は、ＭＤＳＣ個体群に対するＣＤ８  Ｔ細胞の比を増加させ、ＣＤ８および抗原特異的ＣＤ８を増加させ、よって抗腫瘍活性および生存の改善と相関するエフェクター細胞／免疫抑制細胞の比を全般的に増強させる。
【０４３８】
材料および方法（実施例２２〜２７）
オリゴヌクレオチドはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）によって合成され、またＤＮＡ配列決定はＧｅｎｅｗｉｚ  Ｉｎｃ（米国ニュージャージー州Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ）によって行われた。フローサイトメトリー試薬はＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＢＤ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）から購入した。細胞培養培地、補助剤および他のすべての試薬は、示されない限りＳｉｇｍａ（米国ミズーリ州Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓｅ）から入手した。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＨＬＡ−Ａ２ペプチドはＥＺｂｉｏｌａｂｓ（米国インディアナ州Ｗｅｓｔｆｉｅｌｄ）によって合成された。完全なＲＰＭＩ  １６４０（Ｃ−ＲＰＭＩ）培地は、２ｍＭグルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、および１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｈｅｐｅｓ（２５ｍＭ）を含有した。多クローン性の抗ＬＬＯ抗体が前述されており、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体はＳｉｇｍａから購入した。
【０４３９】
マウスおよび細胞株
すべての動物実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａまたはＲｕｔｇｅｒｓ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおいてＩＡＣＵＣによって認可されたプロトコルに従って実施した。ＦＶＢ／ＮマウスはＪａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国メーン州Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ）から購入した。ラットＨｅｒ２／ｎｅｕ腫瘍性タンパク質を過剰発現するＦＶＢ／Ｎ  Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａの実験動物コア施設で収容および飼育された。ＮＴ−２腫瘍細胞株は高いレベルのラットＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質を発現し、これはこれらのマウスの自然発生的な乳腺腫瘍に由来し、前述したように増殖した。ＤＨＦＲ−Ｇ８（３Ｔ３／ｎｅｕ）細胞はＡＴＣＣから得られ、ＡＴＣＣの推奨に従って増殖した。ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞株は、Ｊｏｈｎ  Ｏｈｌｆｅｓｔ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、米国ミネソタ州）からの寛大な供与物であり、また完全なＣ−ＲＰＭＩ培地中で増殖した。生物発光の作業は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（米国ペンシルバニア州Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）のＳｍａｌｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＳＡＩＦ）によるガイダンスに従って実行された。
【０４４０】
リステリア構築体および抗原発現
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ−ｐＧＥＭ７Ｚは、親切にもＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのＭａｒｋ  Ｇｒｅｅｎｅ博士によって供与され、これはｐＧＥＭ７Ｚプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）へとクローニングされた全長のヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ（ｈＨｅｒ２）遺伝子を含んでいた。このプラスミドは、ＰＣＲによってｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および表６に示されるオリゴを使用して、ｈＨｅｒ−２／ｎｅｕの３つの区分、すなわちＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１を増幅するためのテンプレートとして使用された。
【表６−１】
2018501244.tif 000087
【表６−２】
2018501244.tif 000088
【０４４１】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕキメラ構築体はＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲ法およびテンプレートとしての各々の別個のｈＨｅｒ−２／ｎｅｕ区分による直接融合によって生成された。プライマーを表７に示す。
【表７】
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【０４４２】
異なる区分のヒトＨｅｒ２領域の増幅のためのプライマーの配列
【０４４３】
ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ制限酵素を使用してｐＡｄｖ１３８から切り離され、Ｌｍｄｄシャトルベクター、ｐＡｄｖ１３４で、ＬＬＯの切断非溶血性断片を用いてインフレームでクローニングされた。インサート、ＬＬＯ、およびｈｌｙプロモーターの配列はＤＮＡシークエンシング解析によって確認された。このプラスミドは電子コンピテントＡｃｔＡ、ｄａｌ、ｄａｔ突然変異体リステリア・モノサイトゲネス株、ＬｍｄｄＡへと電気穿孔され、ストレプトマイシン（２５０μｇ／ｍＬ）を含有するブレインハートインフージョン（ＢＨＩ）寒天培養基プレート上で陽性クローンが選択された。いくつかの実験では、ｈＨｅｒ２／ｎｅｕ（Ｌｍ−ｈＨｅｒ２）断片を発現する類似のリステリア株が比較の目的で使用された。すべての研究で、無関連リステリア構築体（Ｌｍ対照）が、免疫系でリステリアの抗原と無関係な効果を説明するために含まれる。Ｌｍ対照は、ＡＤＸＳ３１−１６４（ＬｍｄｄＡ−ＣｈＨｅｒ２）と同一のリステリアプラットフォームに基づくが、ＨＰＶ１６−Ｅ７またはＮＹ−ＥＳＯ−１などの異なる抗原を発現した。融合タンパク質のリステリアからの発現および分泌が試験された。各々の構築体はインビボで２回継代された。
【０４４４】
細胞毒性アッセイ
３〜５匹のＦＶＢ／Ｎマウスの群が、１×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２、ＡＤＸＳ３１−１６４、Ｌｍ−ｈＨｅｒ２  ＩＣＩ、またはＬｍ対照（無関連抗原を発現する）を用いて一週間間隔で３回免疫化されるか、または無処置のままとされた。ＮＴ−２細胞をインビトロで増殖させ、トリプシンで取り出し、マイトマイシンＣ（血清を含まないＣ−ＲＰＭＩ媒体中２５０μｇ／ｍＬ）で３７℃にて４５分間処置した。５回洗浄した後、これらを免疫化した動物または無処置の動物から採取した脾細胞を用いて１：５の比（刺激薬：レスポンダー）で５日間、３７℃および５％ＣＯ２で共インキュベートした。標的として３Ｔ３／ｎｅｕ（ＤＨＦＲ−Ｇ８）細胞のラベルが付いているユーロピウムを使用して、前述した方法により、標準的な細胞毒性アッセイを実施した。４時間のインキュベーションの後、分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｖｉｃｔｏｒ２）を５９０ｎｍにて使用して、死滅した標的細胞から放出されたユーロピウムを測定した。特異的な溶解のパーセントが（実験群での溶解−自然発生的溶解）／（最大溶解−自然発生的溶解）として定義された。
【０４４５】
免疫化マウスからの脾細胞によるインターフェロン−γ分泌
３〜５匹のＦＶＢ／ＮまたはＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスの群が、１×１０８ＣＦＵのＡＤＸＳ３１−１６４、陰性リステリア対照（無関連抗原を発現する）を用いて一週間間隔で３回免疫化されるか、または無処置のままとされた。最後の免疫化の一週間後、ＦＶＢ／Ｎマウスからの脾細胞が分離され、５×１０６細胞／ウェルにて２４ウェルプレートでマイトマイシンＣで処置したＮＴ−２細胞の存在下でＣ−ＲＰＭＩ培地中で共培養された。ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスからの脾細胞は、１μＭのＨＬＡ−Ａ２特異的なペプチドまたは１μｇ／ｍＬの組み換え型Ｈｉｓタグ付きＣｈＨｅｒ２タンパク質（大腸菌内で生産され、ニッケルベースのアフィニティークロマトグラフィーシステムによって精製された）の存在下でインキュベートされた。上清からのサンプルが２４時間または７２時間後に得られ、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の存在について、製造業者の推奨に従ってマウスＩＦＮ−γ酵素にリンクした免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを使用して試験した。
【０４４６】
Ｈｅｒ２トランスジェニック動物での腫瘍研究
生後６週間のＦＶＢ／ＮラットＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウス（９〜１４／群）に５×１０８ＣＦＵのＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２、ＡＤＸＳ３１−１６４、またはＬｍ対照を６回免疫化した。これらを、自然発生的な乳腺腫瘍の出現について週に２回観察し、これらは最高５２週間まで電子カリパスを使用して測定された。平均直径が１ｃｍ２のサイズに達したとき、エスケープした腫瘍を切り離し、ＲＮＡｌａｔｅｒ内で−２０℃にて保存した。これらの腫瘍のエスケープ上のＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質内の突然変異の効果を決定するために、ゲノムＤＮＡ分離キットを使用してゲノムＤＮＡを抽出し、配列決定した。
【０４４７】
脾臓および腫瘍内の調節性Ｔ細胞へのＡＤＸＳ３１−１６４の効果
マウスに１×１０６ＮＴ−２細胞を皮下（ｓ．ｃ．）で移植した。７日目、１４日目、および２１日目に、これらに１×１０８ＣＦＵのＡＤＸＳ３１−１６４、ＬｍｄｄＡ対照で免疫化、または無処置のままにした。２８日目に腫瘍および脾臓を抽出し、ＦＡＣＳ解析によってＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの存在について試験した。簡潔に述べると、Ｃ−ＲＰＭＩ培地中で２枚のガラススライドの間で脾臓を均質化することによって脾細胞を分離した。滅菌したカミソリの刃を使用して腫瘍を細かく刻み、ＰＢＳ中にＤＮａｓｅ（１２Ｕ／ｍＬ）およびコラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍＬ）を含有するバッファーを用いて消化した。室温にて撹拌しながら６０分間インキュベーションした後で、細胞を激しいピペッティングによって分離した。赤血球をＲＢＣ溶解バッファーによって溶解し、続いて１０％ＦＢＳを含有する完全なＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて数回洗浄した。ナイロンメッシュを通した濾過の後、腫瘍細胞および脾細胞をＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳ／ＰＢＳ）中で再懸濁し、抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ２５−ＡＰＣ抗体を用いて染色し、続いて抗Ｆｏｘｐ３−ＰＥを用いて透過処理および染色した。４色ＦＡＣＳキャリバー（ＢＤ）を使用してフローサイトメトリー解析を実施し、ｃｅｌｌ  ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ）を使用してデータを解析した。
【０４４８】
統計的解析
生存データに対して対数順位χ二乗検定を使用し、ＣＴＬおよびＥＬＩＳＡアッセイに対してスチューデントのｔ検定を使用し、これらを３回行った。これらの解析では、E未満（＊印をつけた）のｐ値は統計的に有意であると考えられる。Ｐｒｉｓｍソフトウェア、Ｖ．４．０ａ（２００６）またはＳＰＳＳソフトウェア、Ｖ．１５．０（２００６）のいずれかを用いてすべての統計的な解析が行われた。別段の記載がない限り、すべてのＦＶＢ／ＮラットＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック研究のために、群あたり８〜１４匹のマウスを使用し、すべての野生型ＦＶＢ／Ｎ研究のために、群あたり少なくとも８匹のマウスを使用した。Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスモデルの長期腫瘍研究を除いて、すべての研究を少なくとも１回は繰り返した。
［実施例２１］  Ｈｅｒ−２断片に融合されたＬＬＯ断片を分泌するＬ．モノサイトゲネス株の発生：ＡＤＸＳ３１−１６４の構築
【０４４９】
キメラＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子（ＣｈＨｅｒ２）の構築については以下の通りであった。簡潔に述べると、ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、ＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲ法によって、Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の２つの細胞外断片（ａａ４０〜１７０およびａａ３５９〜４３３）と１つの細胞内断片（ａａ６７８〜８０８）との直接融合によって生成された。キメラタンパク質は、タンパク質の既知のヒトＭＨＣクラスＩエピトープのほとんどを有する。ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、プラスミド、ｐＡｄｖ１３８（これは構築体Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２に使用される）から切り離され、ＬｍｄｄＡシャトルプラスミドへとクローニングされ、結果としてプラスミドｐＡｄｖ１６４が得られる（図５７Ａ）。これらの２つのプラスミドバックボーンの間には２つの大きい違いがある。１）組み換え型細菌のインビトロでの選択のためにｐＡｄｖ１３８はクロラムフェニコール耐性マーカー（ｃａｔ）を使用しているが、ｐＡｄｖ１６４はバシラスサチリスからのＤ−アラニン・ラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）を寄生し、これはｄａｌ−ｄａｔ遺伝子を欠いているＬｍｄｄＡ株内でインビトロでの選択のためおよびインビボでのプラスミド保持のために代謝相補経路を使用する。このワクチンプラットフォームは、ＦＤＡによる改変リステリアワクチン株の抗生物質抵抗性についての憂慮に対処するために設計および開発された。２）ｐＡｄｖ１３８とは異なり、これはインビボでのＬｍｄｄ株の相補に必要ないので、プラスミド（以下の配列および図５７Ａを参照）中でｐＡｄｖ１６４はｐｒｆＡ遺伝子のコピーを寄生しない。ＬｍｄｄＡワクチン株も、ａｃｔＡ遺伝子（リステリア細胞内移動、および細胞から細胞への拡散を担当する）を欠いているので、このバックボーンに由来する組み換え型ワクチン株は、その親株であるＬｍｄｄに由来するものより病毒性が１００倍少ない。ＬｍｄｄＡベースのワクチンは、免疫化マウスの脾臓からのＬｍｄｄベースのワクチンよりもずっと速く（４８時間未満の間に）除去される。この株からの融合タンパク質ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌は、インビトロで８時間増殖したＴＣＡ沈殿した細胞培養上清の中のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２のもの（図５７Ｂ）と同等であり、ウエスタンブロット解析を使用して約１０４ＫＤの帯域として抗ＬＬＯ抗体によって検出される。負の対照としてｔＬＬＯのみを発現するリステリアバックボーン株が使用される。
【０４５０】
ｐＡｄｖ１６４配列（７０７５塩基対）（図５７Ａおよび５７Ｂを参照）：
【０４５１】
【化８１】
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【化８２】
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【化８３】
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【化８４】
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【化８５】
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【化８６】
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［実施例２２］  ＡＤＸＳ３１−１６４は、ＬＭ−ＬＬＯ−ＣｈＨＥＲ２と同じく免疫原性である
【０４５２】
抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的な細胞毒性Ｔ細胞を発生するうえでのＡＤＸＳ３１−１６４の免疫原性の特性が、標準的なＣＴＬアッセイでＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２ワクチンのものと比較された。両方のワクチンは、３Ｔ３／ｎｅｕ標的細胞によって発現されるＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原に対して強いが同等の細胞毒性Ｔ細胞応答を引き出す。したがって、ＬＬＯに対してＨｅｒ２に融合された細胞内断片のみを発現するリステリアを用いて免疫化されたマウスは、より多くのＭＨＣクラスＩエピトープを含有するキメラより低い溶解活性を示す。無処置の動物、または無関連リステリアワクチンを注射したマウスではＣＴＬ活性は検出されなかった（図５８Ａ）。ＡＤＸＳ３１−１６４は、野生型ＦＶＢ／Ｎマウスからの脾細胞によってＩＦＮ−γの分泌を刺激することもできる（図５８Ｂ）。これはマイトマイシンＣで処理されたＮＴ−２細胞と共培養されたこれらの細胞の培養上清の中で検出され、これらは高いレベルのＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原を発現する（図５８Ｃ）。
【０４５３】
ヒトＭＨＣクラスＩエピトープのＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化後の適切な処置および提示は、ＨＬＡ−Ａ２マウスで試験された。免疫化したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックからの脾細胞は、マッピングしたＨＬＡ−Ａ２で制限されたエピトープに対応するペプチドと７２時間の間共インキュベートされ、このペプチドはＨＥＲ２／ｎｅｕ分子の細胞外（ＨＬＹＱＧＣＱＶＶ配列番号：８８もしくはＫＩＦＧＳＬＡＦＬ配列番号：８９）、または細胞内（ＲＬＬＱＥＴＥＬＶ配列番号：９０）領域に位置する（図５８Ｃ）。組み換え型ＣｈＨｅｒ２タンパク質は、正の対照、および無関連ペプチド、または負の対照としてペプチドなしで使用された。この実験からのデータは、ＡＤＸＳ３１−１６４が抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的な免疫応答を標的化した抗原の異なるドメインに位置するヒトエピトープへと引き出すことができることを示す。
［実施例２３］  ＡＤＸＳ３１−１６４は、自然発生的な乳腺腫瘍の発症の防止には、ＬＭ−ＬＬＯ−ＣｈＨＥＲ２より有効である
【０４５４】
ＡＤＸＳ３１−１６４の抗腫瘍効果が、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２とＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック動物において比較され、この動物は生後２０〜２５週間で繁殖の遅い自然発生的な乳腺腫瘍を発生した。無関連リステリア対照ワクチンを用いて免疫化されたすべての動物は、２１〜２５週の間に乳房の腫瘍を発生し、３３週の前に犠牲にされた。対照的に、リステリア−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ組み換え型ワクチンは、乳腺腫瘍の形成の著しい遅延を生じた。４５週には、５０％を超えるＡＤＸＳ３１−１６４をワクチン接種したマウス（９匹のうち５匹）は、まだ腫瘍がなく、これはＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２を用いて免疫化したマウスの２５％と比較される。５２週には、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いて免疫化した８匹のうち２匹のマウスは、まだ腫瘍を有しないままであったが、一方で他の実験的な群からのマウスはすべて、すでにこれらの疾患に屈服していた（図５９）。これらの結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４はより弱毒化しているにもかかわらず、Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック動物の自然発生的な乳腺腫瘍の発症の防止ではＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２より有効であることを示す。
［実施例２４］  ＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化の際のＨＥＲ２／ＮＥＵ遺伝子での突然変異
【０４５５】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕのＭＨＣクラスＩエピトープ内の突然変異は、小さい分量のワクチンまたはトラスツズマブ（ハーセプチン）（Ｈｅｒ２／ｎｅｕの細胞外ドメインでエピトープを標的化するモノクローナル抗体）を用いた免疫化の際にエスケープした腫瘍を担当すると考えられてきた。これを評価するために、トランスジェニック動物内のエスケープした腫瘍からゲノム材料が抽出され、キメラワクチンまたは対照ワクチンを用いて免疫化した腫瘍内のｎｅｕ遺伝子の対応する断片を配列決定した。いかなるワクチン接種した腫瘍サンプルのＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子の中にも突然変異が観察されなかったことは、代替的なエスケープ機構を示唆する（データ示さず）。
［実施例２５］  ＡＤＸＳ３１−１６４は、腫瘍内の制御性Ｔ細胞の著しい減少を生じる
【０４５６】
脾臓および腫瘍内での制御性Ｔ細胞の頻度に対するＡＤＸＳ３１−１６４の効果を解明するために、マウスにＮＴ−２腫瘍細胞を移植した。３回の免疫化の後、脾細胞および腫瘍内のリンパ球が分離され、Ｔｒｅｇのために染色した。これらは、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋細胞と定義されたが、別個に解析したとき、ＦｏｘＰ３マーカーまたはＣＤ２５マーカーのいずれかを用いて同等の結果が得られた。この結果は、無関連リステリアワクチンまたは無処置の動物と比較して、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化は、脾臓内のＴｒｅｇの頻度については効果を有しないことを示した（図６０）。対照的に、リステリアワクチンを用いた免疫化は、腫瘍内のＴｒｅｇの存在に少なからぬ影響を生じた（図６１Ａ）。処理されていない腫瘍ではすべてのＣＤ３＋Ｔ細胞の平均で１９．０％がＴｒｅｇであったが、この頻度は無関連ワクチンについては４．２％に減少し、ＡＤＸＳ３１−１６４ついては３．４％と腫瘍内のＴｒｅｇの頻度が５分の１に減少した（図６１Ｂ）。いずれかのＬｍｄｄＡワクチンで処置したマウスでの腫瘍内のＴｒｅｇの頻度の減少は、腫瘍のサイズの差異には貢献しなかった。代表的実験では、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いて免疫化したマウスからの腫瘍（平均直径（ｍｍ）±ＳＤ：６．７１±０．４３、ｎ＝５）は、未処置マウス（８．６９±０．９８、ｎ＝５、ｐ＜A）、または無関連ワクチン（８．４１±１．４７、ｎ＝５、ｐ＝D）で処置されたマウスからの腫瘍より著しくより小さかったが、一方で後者のこれら２つの群の比較は腫瘍サイズでは統計的な有意さを示さなかった（ｐ＝０．７３）。ＬｍｄｄＡワクチンで処置した腫瘍内のＴｒｅｇのより低い頻度は、腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の増加をもたらし、ＬｍｄｄＡワクチンを用いた免疫化後により好ましい腫瘍の微小環境を得ることができることを示唆する。しかしながら、標的抗原ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＡＤＸＳ３１−１６４）を発現するワクチンのみが腫瘍増殖を減少することができ、Ｔｒｅｇの減少は腫瘍内で抗原特異的な応答が存在するときのみ効果を有することを示す。
［実施例２６］  ＡＤＸＳ３１−１６４を用いた末梢の免疫化は転移性乳ガン細胞株の脳内での増殖を遅延することができる
【０４５７】
ＡＤＸＳ３１−１６４または無関連Ｌｍ対照ワクチンを用いてマウスに腹腔内で免疫化し、次いでルシフェラーゼおよび低いレベルのＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するＥＭＴ６−Ｌｕｃ腫瘍細胞を５．０００頭蓋内に移植した（図６２Ａ）。麻酔をかけたマウスのエクスビボでの撮像によって接種後の異なる時点で腫瘍をモニターした。腫瘍接種後８日目に、すべての対照動物で腫瘍が検出されたが、ＡＤＸＳ３１−１６４群のマウスではいかなる検出可能な腫瘍を示すものもなかった（図６２Ａおよび図６２Ｂ）。ＡＤＸＳ３１−１６４はこれらの腫瘍の発症を明らかに遅延することができ、腫瘍接種後１１日目には負の対照群のマウスはすべてその腫瘍によって死んだが、ＡＤＸＳ３１−１６４群のマウスはすべてまだ生存しており、腫瘍増殖の小さい兆候を示すのみであった。これらの結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４の末梢投与を用いて得られた免疫応答が中枢神経系に到達することができる可能性があり、かつＬｍｄｄＡベースのワクチンがＣＮＳ腫瘍の治療のための使用の可能性を有する場合があることを強く示唆する。
［実施例２７］  Ｌｍベースのｈｅｒ２／ｎｅｕワクチン、ＧＩＴＲ作動薬抗体およびチェックポイント阻害剤の３つの組み合わせの治療的有効性および免疫調整効果、ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性ＢＣマウスモデルにおけるＰＤ−１  Ａｂ実験デザイン  マウス腫瘍モデル：ラットＨｅｒ−２／ＦＶＢ／ＮマウスモデルおよびＦＶＢ／Ｎ  Ｈｅｒ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウスモデルといった２つのマウス腫瘍モデルが使用された。
【０４５８】
抗体：抗ＰＤ１（ＲＭＰ−１４クローン、ラットＩｇＧ２ａ）および抗ＧＩＴＲ（ＤＴＡ−１クローン）。両方の抗体が週２回、腹腔内に注入された。抗ＰＤ−１  Ａｂは、１ｍｇ／Ｋｇ  ｂ．ｗｔ．の投与量で実験期間全体で投与された。作動薬ＧＩＴＲ  Ａｂについては、合計４回の投与が５ｍｇ／Ｋｇ  ｂ．ｗｔ．の投与量で投与された。
【０４５９】
ラットＨｅｒ−２／ＦＶＢ／Ｎマウスモデルでの実験：ラットおよびヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質は相同性が高いため、ＬｍベースのＨｅｒ−２／ｎｅｕワクチンとＧＩＴＲ作動薬および抗ＰＤ−１  Ａｂの組み合わせの治療的抗腫瘍効果を試験するために、ラットＨｅｒ−２／ＦＶＢ／Ｎマウスモデルが使用された。腫瘍は、メスＦＶＢ／Ｎマウス（生後８〜１０週、５／群）の右わき腹に高レベルのラットｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質を発現する１×１０６のＮＴ−２腫瘍細胞を注入することにより、皮下移植された。腫瘍体積が約０．５  ｃｍ３に達した後、マウスは無作為に１６群に分けられ（表８）、高く弱毒化されたＬｍベースのワクチンベクター（腹腔内；１〜５×１０８のコロニー形成単位、インビボ毒性アッセイによって決定）によって、ＬＬＯおよびｈｅｒ２／ｎｅｕ（Ｌｍ、Ｌｍ−ＬＬＯおよびＡＤＸＳ３１−１６４）、抗ＰＤ１  Ａｂ、および作動薬  抗ＧＩＴＲ  Ａｂを伴うものと伴わないものとで処置した。ワクチンの１回目の投与後、２回のブーストを７日間隔で投与した。
【表８】
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【０４６０】
作動薬ＧＩＴＲ  Ａｂは、ワクチンと同じ日に開始して、合計４回投与された。ＰＤ１は、早期活性化およびＴ細胞の消耗の両方において役割を果たすため、ワクチン後の抗ＰＤ−１の投与はＴ細胞の消耗を再活性化しうる。したがって、抗ＰＤ１  Ａｂは、抗原特異的応答がさらに増強されるかどうか判断するために、２回目のワクチン接種の３日後に注入される。対照群では、マウスはＰＢＳを受ける。腫瘍増殖および生存が測定される。デジタルキャリパーを使用して腫瘍を週に２回測定し、式Ｖ＝（Ｗ２＊Ｌ）／２（式中、Ｖは体積、Ｌは長さ（長直径）、またＷは幅（短直径））を使用して腫瘍体積を計算した。マウスは、瀕死の状態になった時、または腫瘍体積が１．５  ｃｍ３に達した場合に犠牲にした。全般的な治療スケジュールを図６３に示す。実験は２回繰り返された。
【０４６１】
ＦＶＢ／Ｎ  Ｈｅｒ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウスモデルでの実験：ＮＴ−２細胞株を使用した移植可能な腫瘍マウスモデルは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗原に対する耐性がほとんどない急成長中の腫瘍モデルである。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗原に対する耐性がワクチンの免疫療法的有効性の弱化に著しい役割を果たす可能性のあるより難度の高い腫瘍モデルは、ラットＨｅｒ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウスモデルである。このモデルでは、マウスは生後２０〜２５週の間で自発性かつ成長の遅い乳腺腫瘍を発生する。よって、このマウス株を使用することにより、Ｌｍベースのｈｅｒ２／ｎｅｕワクチンがＨｅｒ−２／ｎｅｕ自己抗原に対する耐性を克服できるかどうかを試験することができる。これらのマウスの繁殖ペアはＡｄｖａｘｉｓ，  Ｉｎｃ．によって提供されたものである。
【０４６２】
マウスは、表８に示すとおり１６群に分けられた。マウスは、６週目から３週間間隔で、合計６回の投与量（１〜５×１０８コロニー形成単位）で免疫化される。上述の成長の早いモデルと比較して、このモデルではワクチンによるさらなる免疫化が可能であるが、その理由は、これが予防モデルであり自己由来腫瘍は約２０週まで生じ始めないためである。作動薬ＧＩＴＲ  Ａｂは、ワクチンと同じ日に開始して、合計６回の投与が毎回のワクチンと共になされた。抗ＰＤ１  Ａｂを用いた治療は、最後のワクチン接種から３〜４日後に開始され、実験期間全体にわたり継続した。マウスは、自己由来乳腺腫瘍の発生および増殖について最長５２週にわたり週２回観察された。自発性腫瘍形成は上部および下部のマウス乳腺の触診によって検出され、これによって直径１〜２ｍｍ程度の腫瘍が特定される。全般的な治療スケジュールを図５に示す。
【０４６３】
免疫応答および調整の研究：さらに、腫瘍増殖および生存に対する効果の原因である免疫調整の詳細な機序が、腫瘍、脾臓、および腫瘍排出リンパ節（ＴＤＬＮ）で調査されている。これらの実験について、マウスは群に分けられ（４マウス／群）、  上記と類似した治療がなされ、２回目の免疫化の６日後および３回目の免疫化の１週間後に犠牲にされた。腫瘍、脾臓、ＴＤＬＮが収穫され、その後のアッセイが実施された。
【０４６４】
本発明のある特定の特徴が本明細書に例示され記述されてきたが、今では当業者には数多くの修正、置換、変更、および均等物が生じるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の趣旨に含まれるかかるすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ１】
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【図６Ａ２】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３６Ｄ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３７Ｄ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図３９Ｄ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４０Ｄ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４１Ｄ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５０Ｃ】
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【図５１】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５４Ａ】
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【図５４Ｂ】
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【図５５Ａ】
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【図５５Ｂ】
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【図５６Ａ】
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【図５６Ｂ】
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【図５６Ｃ】
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【図５７Ａ】
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【図５７Ｂ】
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【図５８Ａ】
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【図５８Ｂ】
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【図５８Ｃ】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１Ａ】
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【図６１Ｂ】
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【図６２Ａ】
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【図６２Ｂ】
2018501244.tif 000262
【図６２Ｃ】
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【図６３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2018501244.tif 000265
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2018501244.tif 000267
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