(57)【要約】  本開示は、ＦｃＲｎに特異的な抗体融合タンパク質、抗体融合タンパク質を含む製剤、治療における各々の使用、前記抗体を発現させ、任意選択により調合するためのプロセス、抗体をコードするＤＮＡ、及び前記ＤＮＡを含む宿主に関する。
2018516555.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
直接又はリンカーを介してｓｃＦＶに連結されたＦａｂフラグメントを含む抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質であって、前記ＦａｂフラグメントはＦｃＲｎに結合し、前記ｓｃＦＶは血清担体タンパク質に結合する、上記抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質。
【請求項２】
直接又はリンカーを介してｓｃＦＶに連結されたＦａｂフラグメントを含む抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質であって、前記Ｆａｂフラグメントは重鎖及び軽鎖を含み、前記重鎖の可変領域は３つのＣＤＲを含み、ここでＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号２に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号３に示す配列を有し、さらに前記軽鎖の可変領域は３つのＣＤＲを含み、ここでＣＤＲ  Ｌ１は配列番号４に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号５又は配列番号７に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号６に示す配列を有する、上記抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質。
【請求項３】
前記Ｆａｂフラグメントの前記重鎖が、配列番号９に示す配列を含み、前記Ｆａｂフラグメントの前記軽鎖が、配列番号８に示す配列を含む、請求項２に記載の抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質。
【請求項４】
前記Ｆａｂフラグメントの前記重鎖が、配列番号１４に示す配列を含み、前記Ｆａｂフラグメントの前記軽鎖が、配列番号１０に示す配列を含む、請求項２又は３に記載の抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質。
【請求項５】
前記ｓｃＦＶが、アルブミンと結合する、請求項１から４までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質。
【請求項６】
前記ｓｃＦＶが、ヒト血清アルブミンと結合する、請求項５に記載の抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質。
【請求項７】
前記ｓｃＦＶの前記重鎖及び軽鎖可変ドメインが、配列番号３０に示すもののような任意の適切なリンカーによって連結される、請求項１から６までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質。
【請求項８】
前記ｓｃＦＶが、直接又はリンカーを介して、前記Ｆａｂフラグメントの前記重鎖又は前記軽鎖のＣ末端に連結されている、請求項１から７までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質。
【請求項９】
前記ｓｃＦＶが、配列番号３３に示す配列を有するリンカーを介して、前記Ｆａｂフラグメントの前記重鎖の前記Ｃ末端に連結されている、請求項１から８までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ｓｃＦＶが、３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメインを含み、ここでＣＤＲ  Ｈ１は配列番号８５に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号８６に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号８７に示す配列を有し、さらに３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインを含み、ここでＣＤＲ  Ｌ１は配列番号８８に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８９に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９０に示す配列を有する、請求項１から９までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質。
【請求項１１】
前記ｓｃＦＶが、ジスルフィド安定化ｓｃＦＶ（ｄｓｓｃＦＶ）である、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質。
【請求項１２】
前記ｄｓｓｃＦＶが、配列番号１５に示す配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１６に示す配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項１１に記載の抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質。
【請求項１３】
配列番号１２に示す配列を含む重鎖、及び配列番号１０に示す配列を含む軽鎖を有する、請求項１２に記載の抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質。
【請求項１４】
重鎖を含むヒトＦｃＲｎに結合する、抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質であって、重鎖は配列番号１２に示す配列に少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列を含み、軽鎖は配列番号１０に示す配列に少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列を含む、上記抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質。
【請求項１５】
抗体Ｆａｂフラグメントが、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号１に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号２に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ３については配列番号３に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号４に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号５又は配列番号７に示す配列、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号５に示す配列を有する、請求項１４に記載の抗ＦｃＲｎ融合タンパク質。
【請求項１６】
請求項１から１５までのいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質の重鎖及び／又は軽鎖（単数若しくは複数）をコードする、単離されたＤＮＡ配列。
【請求項１７】
請求項１６に記載の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む、クローニングベクター又は発現ベクター。
【請求項１８】
配列番号１１に示す配列及び配列番号１３に示す配列を含む、請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載の、１つ又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１９の宿主細胞を培養するステップと、抗体融合タンパク質を単離するステップとを含む、ヒトＦｃＲｎに結合特異性を有する抗体融合タンパク質を生成するためのプロセス。
【請求項２１】
請求項１から１５までのいずれか一項に記載の抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質を、１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体と組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項２２】
他の有効成分を含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
治療において用いるための、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、又は請求項２１若しくは２２に記載の組成物。
【請求項２４】
重症筋無力症、尋常性天疱瘡、視神経脊髄炎、ギランバレー症候群、狼瘡、特発性血小板減少性紫斑病、及び血栓性血小板減少性紫斑病などの自己免疫疾患の処置において用いるための、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、又は請求項２１若しくは２２に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項１から１５までのいずれか一項に記載の抗体若しくはその結合フラグメント、又は請求項２１若しくは２２に記載の組成物の治療有効量を投与することを含む、患者を処置する方法。
【請求項２６】
処置が、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、視神経脊髄炎、ギランバレー症候群、狼瘡、特発性血小板減少性紫斑病、及び血栓性血小板減少性紫斑病などの自己免疫疾患のためである、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ＦｃＲｎに特異的な抗体、抗体を含む製剤、治療における各々の使用、前記抗体を発現させ、任意選択により調合するためのプロセス、抗体をコードするＤＮＡ、及び前記ＤＮＡを含む宿主に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＦｃＲｎは、膜タンパク質ＦｃＲｎのα鎖及びβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）の非共有結合性の複合体である。成年哺乳動物では、ＦｃＲｎは、ＩｇＧアイソタイプの抗体に結合し、回収する受容体として作用することによって、血清抗体レベルを維持する上で重要な役割を果たす。ＩｇＧ分子は内皮細胞により貪食され、ＦｃＲｎに結合すると、リサイクルされ、循環中などに経細胞輸送される。対照的に、ＦｃＲｎに結合しないＩｇＧ分子は細胞に侵入し、リソソーム経路に標的化され、そこで分解される。Ｈｉｓ４３５がアラニンに変異しているバリアントＩｇＧ１はＦｃＲｎ結合の選択的喪失をもたらし、血清半減期の大幅な低下をまねく（Ｆｉｒａｎら、２００１年、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１３巻、９９３頁）。
【０００３】
ＦｃＲｎは、少なくとも部分的に自己抗体によって引き起こされる、ある種の自己免疫障害に対する潜在的な治療標的であると仮定されている。このようなある種の障害に対する現在の処置には、血漿交換法が含まれる。血漿交換法はときに、疾患の長期マネージメントのために免疫抑制治療と一緒に用いられる。血漿の交換は、有害な自己抗体の除去に対する最も迅速な短期間の解決策を提供する。しかし、プレドニゾン、シクロホスファミド、シクロスポリン、ミコフェノール酸モフェチル、リツキシマブ、又はこれらの混合物などの薬物療法を用いることによって、免疫系による自己抗体の生成を抑制するのが望ましいこともある。
【０００４】
血漿交換法で処置することができる疾患の例には、ギランバレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、グッドパスチャー症候群、過粘稠血症候群、クリオグロブリン血症、パラプロテイン血症、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重症筋無力症、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）／溶血性尿毒症症候群、ウェゲナー肉芽腫症、ランバート−イートン症候群、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ又はＡＰＬＳ）、顕微鏡的多発性血管炎、移植腎における再発性の巣状及び分節性糸球体硬化症、ＨＥＬＬＰ症候群、ＰＡＮＤＡＳ症候群、レフサム病、ベーチェット症候群、ＨＩＶ関連神経障害、乳児及び新生児におけるグレーブス病、尋常性天疱瘡、多発性硬化症、横紋筋融解症、並びに同種免疫疾患が含まれる。
【０００５】
血漿交換法は、救急などにおいて重篤な副作用を低減するために、治療薬を含むＦｃを除去するためのレスキュー治療法として、ときに用いられる。
【０００６】
血漿交換法はある医学的状態では役に立つが、治療法に付随する潜在的な危険性及び合併症が存在する。かなり大型の静脈内カテーテルの挿入は、出血、肺穿刺（カテーテルの挿入部位によって）をまねくことがあり、カテーテルがあまりに長期間残されると、感染症及び／又は静脈に対する損傷をまねき得、手順を繰り返す機会が制限される。
【０００７】
手順には、手順に付随するさらなる合併症があり、例えば、患者の血液が、身体の外で血漿交換装置を通過する場合、血液には凝固する傾向がある。この傾向を下げるために、一般的な一プロトコールでは、血液が回路を通って流れる間、クエン酸塩を注入する。クエン酸塩は血中のカルシウムに結合するが、カルシウムは血液を凝固するのに不可欠である。クエン酸塩は血液が凝固するのを防ぐのに非常に有効であるが、クエン酸塩を用いると生命を脅かすほどの低カルシウムレベルをまねき得る。これは、クボステク徴候又はトルソー徴候を用いて検出することができる。この合併症を防ぐには、患者が血漿交換法を受けている間、カルシウムを静脈内注入し、その上、経口によるカルシウム補充をやはり与えてもよい。
【０００８】
手順の他の合併症には、血圧低下、輸血反応又は輸血感染症（ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ−ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）の危険のある血液製剤に対する潜在的な曝露、患者の免疫系の抑制、並びに針穿刺からくる出血及び血腫が含まれる。
【０００９】
加えて、血漿交換法を提供する施設は限られており、手順は非常に高価である。
【００１０】
血漿交換法に対する代替に静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）があるが、これは１０００人を超える供血者の血漿から抽出したポリクローナルＩｇＧをプールしたものを含む血液製剤である。この治療法は静脈内投与され、その領域に２週間から３か月継続する。
【００１１】
ＩＶＩＧ処置の合併症には、頭痛、皮膚炎、ＨＩＶ又は肝炎など、治療生成物の汚染からくるウイルス感染、肺浮腫、アレルギー応答、急性腎不全、静脈血栓症、及び無菌性髄膜炎が含まれる。
【００１２】
よって、侵襲性が低く、患者を医薬上の合併症にあまりさらさない、自己免疫障害に対する治療法に、重大で未だ対処されていない必要性が存在する。
【００１３】
よって、侵襲性が低く、患者を医薬上の合併症にあまりさらさない、免疫学的障害及び／又は自己免疫障害に対する治療法に、重大で未だ対処されていない必要性が存在する。
【００１４】
したがって、ＩｇＧのＦｃＲｎへの結合をブロック又は低減する薬剤は、このような自己免疫疾患及び炎症性疾患の処置又は防止において有用であり得る。抗ＦｃＲｎ抗体は、以前にＷＯ２００９／１３１７０２、ＷＯ２００７／０８７２８９、ＷＯ２００６／１１８７７２、ＷＯ２０１４／０１９７２７、及びＷＯ２０１４／２０４２８０に記載されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、直接又はリンカーを介してｓｃＦＶに連結されたＦａｂフラグメント（Ｆａｂ断片）を含む抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質であって、ＦａｂフラグメントはＦｃＲｎに結合し、ｓｃＦＶは、アルブミンなどの血清担体タンパク質に結合する、抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質を提供する。一例において、ｓｃＦｖは、ジスルフィド安定化されたｓｃＦｖ（ｄｓｓｃＦｖ）である。
【００１６】
よって、一態様において、直接又はリンカーを介してｓｃＦＶに連結されたＦａｂフラグメントを含む抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質であって、Ｆａｂフラグメントは重鎖及び軽鎖を含み、重鎖の可変領域は３つのＣＤＲを含み、ここでＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号２に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号３に示す配列を有し、さらに軽鎖の可変領域は３つのＣＤＲを含み、ここでＣＤＲ  Ｌ１は配列番号４に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号５又は配列番号７に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号６に示す配列を有する、抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質を提供する。
【００１７】
特に、ｓｃＦＶ又はｄｓｓｃＦｖが、アルブミンと結合し、３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメインを含み、ここでＣＤＲ  Ｈ１は配列番号８５に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号８６に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号８７に示す配列を有し、さらに３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインを含み、ここでＣＤＲ  Ｌ１は配列番号８８に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８９又は配列番号７に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９０に示す配列を有する、抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質を提供する。
【００１８】
特に、ｓｃＦＶが、ジスルフィド安定化された抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質を提供し、前記融合タンパク質は、配列番号１２に示す配列を有する重鎖及び配列番号１０に示す配列を有する軽鎖を含む。
【００１９】
本開示の抗体は、ＩｇＧのＦｃＲｎへの結合をブロックし、循環抗体の半減期の低減を含めたＦｃＲｎの１つ又は複数の生物学的機能の低減において有用であると考えられている。これは、患者が、自己抗体などの抗体をより速やかに一掃するのを可能にするという点で、有益であり得る。したがって、本開示の抗体は、ＩｇＧのＦｃＲｎへの結合を低減する。
【００２０】
本発明の抗体が、例えば、ｐＨ７及びｐＨ７．４の両方で、比較可能で高い結合親和性で、ヒトＦｃＲｎに結合することができることが重要である。したがって、抗体がエンドソーム内でもＦｃＲｎに引き続き結合することができ、それによりＦｃＲｎのＩｇＧへの結合のブロックを最大にするのが有利である。
【００２１】
一実施形態において、本開示の抗体及び結合フラグメント（結合断片）は、ヒトＩｇＧのヒトＦｃＲｎへの結合をブロックする。
【００２２】
一実施形態において、本開示の抗体及び結合フラグメントは、β２ミクログロブリンに結合しない。
【００２３】
一実施形態において、本開示の抗体及び結合フラグメントは、ヒトβ２ミクログロブリンに結合しない。
【００２４】
一例において、本開示の抗体及び結合フラグメントは、循環アルブミンレベルを、５０％を超えて低下させず、好ましくはわずか２５％しか低下させない。
【００２５】
一例において、本開示の抗体及び結合フラグメントは、循環アルブミンレベルを低下させない。
【００２６】
本開示は、例えば、ＤＮＡがベクター中に組み入れられる、本明細書に記載する抗体又はフラグメントをコードする、ＤＮＡなどのポリヌクレオチドにも拡張する。
【００２７】
前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞も提供する。
【００２８】
抗体又はフラグメントを発現させる方法を本明細書に提供し、抗体又はフラグメントをＰＥＧなどのポリマーにコンジュゲートする方法も本明細書に提供する。
【００２９】
本開示は、前記抗体及びフラグメントを含む医薬組成物にも関する。
【００３０】
一実施形態において、本明細書に記載する治療有効量の抗体、フラグメント、又は組成物を投与するステップを含む、処置の方法を提供する。
【００３１】
本開示は、処置において、特に免疫学的障害及び／又は自己免疫障害の処置において用いるための、本開示による抗体、フラグメント、又は組成物にも拡張する。
【００３２】
よって、本開示は、ＩｇＧを異化するための身体の自然のメカニズムを加速することによって実現される、病原性ＩｇＧを除去するための、抗体、そのフラグメント、及び方法を提供する。
【００３３】
本質的に、本開示による抗体及びフラグメントは、身体においてＩｇＧをリサイクルする系をブロックする。
【００３４】
本発明の治療法は、血漿交換法が、患者にとって有利である、治療法又はＩＶＩｇ治療である、ある種の疾患に対する置換又は補充を提供する可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８は、ＭＤＣＫ  ＩＩクローン７細胞においてＩｇＧのリサイクルを阻害することを示す図である。
【図２】ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスの血清中のヒトＩＶＩｇの濃度に対する１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８の効果を示す図である。
【図３】ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける、血清アルブミン濃度に対する１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８の効果を示す図である。
【図４】正常マウスにおける、１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８の薬物動態を示す図である。
【図５】ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける、１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８の薬物動態を示す図である。
【図６】親Ｆａｂ及び等価なＦａｂ−Ｆｖと比較した１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８（Ｆａｂ−ｓｃＦｖ）の熱安定性を示す図である。
【図７】本開示のＦａｂ−ｓｃＦｖ及びＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖフラグメントフォーマットを示す図である。
【図８】本開示による抗体配列を示す図である。
【図９Ａ】抗体１６３８．ｇ４９のヒト化を示す図である。
【図９Ｂ】抗体１６３８．ｇ４９のヒト化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本明細書で用いるＦｃＲｎは、胎児性Ｆｃ受容体としても知られ、そのアミノ酸配列はＰ５５８９９という番号でＵｎｉＰｒｏｔに存在し、その細胞外ドメインは図８（配列番号２１）に示されるヒトＩｇＧ受容体アルファ鎖と、そのアミノ酸配列はＰ６１７６９の番号という番号でＵｎｉＰｒｏｔに存在するヒトβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）との非共有結合性の複合体を指す（本明細書ではシグナルペプチドあり（配列番号２３）、シグナルペプチドなし（配列番号２４）を提供する）。
【００３７】
本明細書で用いる抗体分子は、抗体融合タンパク質を含む抗体又はその結合フラグメント（結合断片）を指す。
【００３８】
本明細書で用いる「抗体」という用語は、概ね、無傷な（全）抗体に関し、すなわち２本の重鎖及び２本の軽鎖のエレメントを含む。抗体は、例えば、ＷＯ２００７／０２４７１５に開示するＤＶＤ−Ｉｇ分子、又はＷＯ２０１１／０３０１０７に記載される、いわゆる（ＦａｂＦｖ）２Ｆｃにより、さらなる付加的な結合ドメインを含むことができる。よって、本明細書で用いる抗体は、２価、３価、又は４価の全長抗体を含む。
【００３９】
抗体の結合フラグメント（結合断片）には、単鎖抗体（すなわち、全長の重鎖及び軽鎖）、Ｆａｂ、修飾されているＦａｂ、Ｆａｂ’、修飾されているＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、２価、３価、又は４価の抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリボディ、トリアボディ、テトラボディ、及び上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが含まれる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２３巻（９）、１１２６〜１１３６頁；Ａｄａｉｒ及びＬａｗｓｏｎ、２００５年、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ、２巻（３）、２０９〜２１７頁を参照されたい）。これらの抗体フラグメントを創出及び製造するための方法は当技術分野ではよく知られている（例えば、Ｖｅｒｍａら、１９９８年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６巻、１６５〜１８１頁を参照されたい）。Ｆａｂ−Ｆｖフォーマットは、ＷＯ２００９／０４０５６２に最初に開示され、そのジスルフィド安定化されたバージョンであるＦａｂ−ｄｓＦｖは、ＷＯ２０１０／０３５０１２に最初に開示された。本発明で用いるための他の抗体フラグメントには、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０、及びＷＯ２００５／００３１７１に記載されているＦａｂ及びＦａｂ’フラグメントが含まれる。多価抗体は、二特異的など、多重の特異性を含むことができ、又は単一特異性でもよい（例えば、ＷＯ９２／２２５８３及びＷＯ０５／１１３６０５を参照されたい）。後者のこのような一例は、ＷＯ９２／２２５８３に記載されているＴｒｉ−Ｆａｂ（又はＴＦＭ）である。
【００４０】
例えばＷＯ２０１３／０６８５７１の例４において、及び本実施例において記載されるように、また本明細書中の図７に示すように、抗体フラグメントはまた、Ｆａｂ−ｓｃＦｖフラグメント及びＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖフラグメントを含む。このようなフラグメントは、本明細書中で「抗体融合タンパク質」と称される。
【００４１】
一例において、本発明は、直接又はリンカーを介してｄｓｓｃＦｖに連結されたＦａｂフラグメントを含む抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質であって、ＦａｂフラグメントはＦｃＲｎに結合し、ｄｓｓｃＦＶは、アルブミンなどの血清担体タンパク質に結合する、抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質を提供する。したがって、本発明の抗体融合タンパク質は、ＦｃＲｎに対して一価である。Ｆａｂフラグメントは、任意の適切な抗ＦｃＲｎ抗体分子に由来するものであってもよく、ｄｓｓｃＦｖは、任意の適切なアルブミン結合抗体分子に由来するものであってもよいことが理解されよう。
【００４２】
よって、一態様において、直接又はリンカーを介してｓｃＦｖに連結されたＦａｂフラグメントを含む抗ＦｃＲｎ  Ｆａｂ−ｓｃＦｖ若しくはＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ抗体フラグメント又は抗体融合タンパク質であって、Ｆａｂフラグメントは重鎖及び軽鎖を含み、重鎖の可変領域は３つのＣＤＲを含み、ここでＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号２に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号３に示す配列を有し、さらに軽鎖の可変領域は３つのＣＤＲを含み、ここでＣＤＲ  Ｌ１は配列番号４に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号５又は配列番号７に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号６に示す配列を有する、抗ＦｃＲｎ  Ｆａｂ−ｓｃＦＶ若しくはＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ抗体フラグメント又は抗体融合タンパク質を提供する。
【００４３】
本明細書で用いるための典型的なＦａｂ分子は重鎖及び軽鎖の対を含み、ここで重鎖は、可変領域ＶＨ及び定常ドメインＣＨ１を含み、鎖間システインで終結する場合があり、軽鎖は、可変領域ＶＬ及び定常ドメインＣＬを含む。
【００４４】
１つ又は複数の（例えば、１、２、３、又は４つの）アミノ酸置換、付加、及び又は欠失を、抗体がＦｃＲｎに対して結合する能力を大幅に変更せずに、本発明により提供されるＣＤＲ又は他の配列（例えば、可変ドメイン）に行うことができることが理解されよう。任意のアミノ酸置換、付加、及び／又は欠失の効果は、例えば、本明細書、特に実施例に記載する、ＦｃＲｎ結合／ブロックを決定するための方法を用いることによって、当業者であれば容易に試験することができる。
【００４５】
一例において、１つ又は複数の（例えば、１、２、３、又は４つの）アミノ酸置換、付加、及び／又は欠失は、本発明により提供される抗体又はフラグメントにおいて用いられるフレームワーク領域に対して行うことができ、この場合、ＦｃＲｎへの結合親和性は保持又は増大される。
【００４６】
抗体可変ドメインにおける残基は、Ｋａｂａｔらにより考案されたシステムに従って慣習的にナンバリングされる。このシステムは、Ｋａｂａｔら、１９８７年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、ＵＳＡ（以降「Ｋａｂａｔら（上述）」）に記載されている。別段の指摘がなければ、本明細書ではこのナンバリングシステムを用いる。
【００４７】
Ｋａｂａｔ残基の呼称は、アミノ酸残基の直鎖のナンバリングと必ずしも直接的に対応するわけではない。実際の直鎖状アミノ酸配列は、基本的な可変ドメイン構造のフレームワークであっても、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）であっても、構成成分の短縮又は構成成分中への挿入に相当する、厳密なＫａｂａｔナンバリングにおけるよりも少数の、又は付加的なアミノ酸を含み得る。残基の正しいＫａｂａｔナンバリングは、抗体の配列における相同性の残基を、「標準の」Ｋａｂａｔナンバリングした配列とアラインメントすることにより、所与の抗体ごとに決定することができる。
【００４８】
重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って、残基３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）、及び残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）に位置する。しかし、Ｃｈｏｔｈｉａによると（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．及びＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６巻、９０１〜９１７頁（１９８７年））、ＣＤＲ−Ｈ１に等価なループは残基２６から残基３２まで伸長する。よって、別段の指摘がなければ、本明細書で用いる「ＣＤＲ−Ｈ１」は、ＫａｂａｔナンバリングシステムとＣｈｏｔｈｉａのトポロジーのループ定義との組合せによって記載される通り、残基２６から３５を指すものとされる。
【００４９】
軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って、残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）、及び残基８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）に位置する。
【００５０】
本開示の抗体及びフラグメントは、ＦｃＲｎをブロックし、それによってＩｇＧのリサイクルにおける機能を妨げ得る。本明細書で用いるブロックは、受容体の閉塞など、物理的なブロックを指すが、立体配置の変化などを引き起こす、エピトープに抗体又はフラグメントが結合する場合も含み、これは受容体に対して天然のリガンドがもはや結合しないことを意味する。本発明の抗体分子はＦｃＲｎに結合し、それによりＩｇＧ定常領域に対するＦｃＲｎの結合を低減又は防止（例えば、阻害）する。一実施形態において、抗体又はそのフラグメントは、ＩｇＧに関して競合的にＦｃＲｎに結合する。
【００５１】
一例において、本発明の抗体融合タンパク質は、ヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合の競合的インヒビターとして機能する。一例において、抗体融合タンパク質は、ＦｃＲｎ上のＩｇＧ結合部位に結合する。一例において、抗体融合タンパク質は、ＩｇＧ結合部位をブロックする。一例において、抗体融合タンパク質は、β２Ｍに結合しない。
【００５２】
本開示において用いるための抗体は、当技術分野では知られている任意の適切な方法を用いて得ることができる。融合タンパク質、ポリペプチドを（組換えで又は天然に）発現する細胞（例えば、線維芽細胞）を含むＦｃＲｎポリペプチド／タンパク質を用いて、単独で、又はβ２Ｍと組み合わせて、ＦｃＲｎを特異的に認識する抗体を生成することができる。ポリペプチドは、「成熟した」ポリペプチド若しくはその生物学的に活性なフラグメント、又はそれらの誘導体であってよい。ヒトタンパク質は、Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔにおいてＰ５５８９９の番号で登録されている。ヒトＦｃＲｎアルファ鎖の細胞外ドメインを、配列番号２１に示す。成熟ヒトβ２Ｍの配列を、配列番号２４に示す。
【００５３】
一実施形態において、抗原は、ＦｃＲｎが細胞において内部移行する動的なプロセシングが殆ど、又は全くないように、細胞の表面上にＦｃＲｎを提示するように操作されているＦｃＲｎの変異型であり、例えば、ＦｃＲｎアルファ鎖の細胞質内のテイルにおいて変異を作成することにより、これを実現することができ、この場合、Ｏｂｅｒら、２００１年、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３巻、１５５１〜１５５９頁に記載されている通り、ジ−ロイシンがジ−アラニンに変異している。
【００５４】
宿主を免疫化するのに用いるためのポリペプチドは、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から、当技術分野ではよく知られているプロセスによって調製してもよく、又は天然の生物学的供給源から回収してもよい。本開示では、「ポリペプチド」の用語には、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質が含まれる。これらは、別段の指摘がなければ、交換可能に用いられる。ＦｃＲｎポリペプチドは、ある場合には、例えば、親和性タグ又は類似物に融合している融合タンパク質などの大型タンパク質の一部であってもよい。
【００５５】
ＦｃＲｎポリペプチドに対して産生された抗体を得てもよく、この場合、ポリペプチドを動物、好ましくは非ヒト動物に、よく知られている、ルーチンのプロトコールを用いて投与することにより、動物を免疫化することが必要であり、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（編集）、４巻、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８６年）を参照されたい。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダ、又はブタなどの多くの温血動物を免疫化してもよい。しかし、マウス、ウサギ、ブタ、及びラットが、全般的に最も適切である。
【００５６】
モノクローナル抗体を、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５〜４９７頁）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４巻、７２頁）、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、７７〜９６頁、Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８５年）など、当技術分野では知られている任意の方法により調製してもよい。
【００５７】
本発明において用いるための抗体は、Ｂａｂｃｏｏｋ、Ｊ．ら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３巻（１５）、７８４３〜７８４８ｌ頁；ＷＯ９２／０２５５１、ＷＯ２００４／０５１２６８、及び国際特許出願第ＷＯ２００４／１０６３７７号によって記載されている方法などにより、特異的な抗体を生成するために選択された単一のリンパ球から産生された免疫グロブリン可変領域のｃＤＮＡをクローニング及び発現させることにより、単一リンパ球抗体方法を用いてやはり産生してもよい。
【００５８】
抗体に対するスクリーニングは、ヒトＦｃＲｎへの結合を測定するアッセイ、及び／又は受容体に対するＩｇＧ結合をブロックする能力を測定するアッセイを用いて行うことができる。結合アッセイの一例は、特にヒトＦｃＲｎ及びヒトＦｃの融合タンパク質を用いたＥＬＩＳＡであり、ヒトＦｃＲｎ及びヒトＦｃをプレート上に固定化し、融合タンパク質に結合している抗ＦｃＲｎ抗体を検出するための二次抗体を用いる。適切なアンタゴニストアッセイ及びブロッキングアッセイの例を、本明細書の以下に記載する。
【００５９】
本明細書で用いる特異的は、それに対して抗体が特異的である抗原のみを認識する抗体、又はそれに対して抗体が非特異的である抗原への結合に比べて、それに対して抗体が特異的である抗原に対して著しく高い結合親和性、例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０倍高い結合親和性を有する抗体を指すものとされる。結合親和性は、本明細書以下に記載するＢＩＡｃｏｒｅなどの技術により測定してもよい。一例において、本発明の抗体は、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）に結合しない。一例において、本発明の抗体は、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）のＦｃＲｎに結合する。一例において、本発明の抗体分子は、ラット又はマウスのＦｃＲｎに結合しない。
【００６０】
本開示によるある種の抗体分子のアミノ酸配列及びポリペプチド配列を提供し、これらは本発明の一態様を形成する。
【００６１】
一実施形態において、本開示による抗体又は結合フラグメントは完全ヒトであり、例えば、ファージライブラリー又は同様のものから調製される。
【００６２】
一実施形態において、本開示による抗体又はフラグメントはヒト化されている。
【００６３】
ヒト化抗体（ＣＤＲグラフト化抗体を含む）は、非ヒト種からの１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する抗体分子である（例えば、ＵＳ５，５８５，０８９；ＷＯ９１／０９９６７を参照されたい）。ＣＤＲ全体よりもむしろＣＤＲの特異性決定残基のみを移動させる必要があり得ることが理解されよう（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら、２００５年、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６巻、２５〜３４頁を参照されたい）。ヒト化抗体は、ＣＤＲが由来する非ヒト種に由来する１つ又は複数のフレームワーク残基を、任意選択によりさらに含むことができる。後者はしばしばドナー残基と呼ばれる。
【００６４】
よって、一実施形態において、本明細書で用いる「ヒト化抗体分子」という用語は、重鎖及び／又は軽鎖が、ＣＤＲが由来する非ヒト種に由来する１つ又は複数のフレームワーク残基（ドナー残基）を任意選択によりさらに含む、アクセプタ抗体（例えば、ヒト抗体）の重鎖及び／又は軽鎖可変領域フレームワークにグラフト化されているドナー抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体などの非ヒト抗体）から１つ又は複数のＣＤＲ（所望により、１つ又は複数の修飾されているＣＤＲを含む）を含む抗体分子を指す。概説には、Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６巻、５３５〜５３９頁、１９９８年を参照されたい。一実施形態において、ＣＤＲ全体を移動させるよりもむしろ、本明細書上記に記載するいずれか１つのＣＤＲから１つ又は複数の特異性決定残基のみを、ヒト抗体フレームワークに移動させる（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら、２００５年、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６巻、２５〜３４頁を参照されたい）。一実施形態において、本明細書上記に記載する１つ又は複数のＣＤＲから、特異性決定残基のみを、ヒト抗体フレームワークに移動させる。別の一実施形態において、本明細書上記に記載する各ＣＤＲから、特異性決定残基のみを、ヒト抗体フレームワークに移動させる。
【００６５】
ＣＤＲ又は特異性決定残基をグラフト化する場合、マウス、霊長動物、及びヒトのフレームワーク領域を含めた、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／タイプに関して、任意の好適なアクセプタ可変領域フレームワーク配列を用いることができる。
【００６６】
適切には、本発明によるヒト化抗体は、ヒトアクセプタフレームワーク領域、及び本明細書に特に提供する１つ又は複数のＣＤＲを含む可変ドメインを有する。よって、一実施形態において、可変ドメインがヒトアクセプタフレームワーク領域及び非ヒトドナーＣＤＲを含む、ヒトＦｃＲｎに結合するブロッキングヒト化抗体を提供する。
【００６７】
本発明において用いることができるヒトフレームワークの例には、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ、及びＰＯＭ（Ｋａｂａｔら、上述）がある。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭは重鎖に用いることができ、ＲＥＩは軽鎖に用いることができ、ＥＵ、ＬＡＹ、及びＰＯＭは重鎖及び軽鎖の両方に用いることができる。或いは、ヒト生殖系列配列を用いてもよく、ヒト生殖系列配列はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／で入手できる。
【００６８】
本発明のヒト化抗体では、アクセプタ重鎖及び軽鎖は必ずしも同じ抗体に由来する必要はなく、所望により、異なる鎖に由来するフレームワーク領域を有する複合性の鎖を含むことができる。
【００６９】
本発明のヒト化抗体の重鎖に対するこのような適切なフレームワーク領域の１つは、ＪＨ３とともにヒト亜群ＶＨ３配列ＩＧＨＶ３〜７に由来し、一例において、抗体の重鎖可変ドメインは、配列番号２０に示す配列を含む。
【００７０】
本発明のヒト化抗体の軽鎖に適する適切なフレームワーク領域は、ＪＫ４とともにヒト亜群ＶＫ１配列ＩＧＫＶ１〜２７配列に由来し、一例において、抗体分子の軽鎖可変ドメインは、配列番号１９に示す配列を含む。
【００７１】
本発明のヒト化抗体において、フレームワーク領域は、アクセプタ抗体の配列と正確に同じ配列を有する必要はない。例えば、稀な残基は、アクセプタ鎖のクラス又はタイプに対してより頻繁に生じる残基に変化してもよい。或いは、アクセプタフレームワーク領域における選択された残基は、これらがドナー抗体における同じ位置に見出される残基に対応するように変化してもよい（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻、３２３〜３２４頁を参照されたい）。このような変化は、ドナー抗体の親和性を回復するのに必要な最小に維持しなければならない。変化する必要があり得る、アクセプタフレームワーク領域における残基を選択するためのプロトコールは、ＷＯ９１／０９９６７に記載されている。
【００７２】
よって、一実施形態において、フレームワークにおける１、２、３、４、又は５つの残基が、代替のアミノ酸残基で置き換えられている。
【００７３】
したがって、一例において、重鎖の可変ドメインの少なくとも各々の４８位及び７８位（Ｋａｂａｔナンバリング）の残基がドナー残基であるヒト化抗体を提供し、例えば、配列番号９に示す配列を参照されたい。
【００７４】
一実施形態において、重鎖可変ドメインの残基４８が、バリンなどの代替のアミノ酸で置き換えられている。
【００７５】
一実施形態において、重鎖可変ドメインの残基７８が、ロイシンなどの代替のアミノ酸で置き換えられている。
【００７６】
一実施形態において、本開示によるヒト化重鎖可変領域における残基４８はバリンであり、残基７８はロイシンである。
【００７７】
したがって、一例において、軽鎖の可変ドメインの少なくとも各々の７０位及び７１位（Ｋａｂａｔナンバリング）の残基がドナー残基であるヒト化抗体を提供し、例えば、配列番号８に示す配列を参照されたい。
【００７８】
一実施形態において、軽鎖可変ドメインの残基７０が、アスパラギン酸などの代替のアミノ酸で置き換えられている。
【００７９】
一実施形態において、軽鎖可変ドメインの残基７１が、フェニルアラニンなどの代替のアミノ酸で置き換えられている。
【００８０】
一実施形態において、本開示によるヒト化軽鎖可変領域における残基７０はアスパラギン酸であり、残基７１はフェニルアラニンである。
【００８１】
一実施形態において、本開示は、本明細書に開示する配列に８０％、例えば、ＣＤＲを除いて、可変ドメイン配列、ＣＤＲ配列、又は可変ドメイン配列など関連の配列の一部又は全体にわたって８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％類似又は同一である抗体配列を提供する。一実施形態において、関連の配列は配列番号８又は９である。一実施形態において、関連の配列は配列番号１０又は１２又は１４である。
【００８２】
一実施形態において、本発明は、重鎖を含むヒトＦｃＲｎに結合する抗体分子を提供し、重鎖の可変ドメインは、本明細書の配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性又は類似性を有する配列、例えば、配列番号９に示す配列を含む。
【００８３】
一実施形態において、本発明は、軽鎖を含むヒトＦｃＲｎに結合する抗体分子を提供し、軽鎖の可変ドメインは、配列番号８に示す配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００８４】
一実施形態において、本発明は、ヒトＦｃＲｎに結合する抗体分子を提供し、抗体は、本明細書に示す配列、例えば、配列番号９に示す配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％類似又は同一である重鎖可変ドメインを有するが、抗体分子は、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号１に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号２に示す配列、及びＣＤＲ−Ｈ３については配列番号３に示す配列を有する。
【００８５】
一実施形態において、本発明は、ヒトＦｃＲｎに結合する抗体分子を提供し、抗体は、本明細書に示す配列、例えば、配列番号８における配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％類似又は同一である軽鎖可変ドメインを有するが、抗体分子は、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号４に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号５又は配列番号７に示す配列、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号６に示す配列を有する。
【００８６】
一実施形態において、本発明は、ヒトＦｃＲｎに結合する抗体分子を提供し、抗体は、本明細書に示す配列、例えば、配列番号１２に示す配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％類似又は同一である重鎖、及び本明細書に示す配列、例えば、配列番号１０に示す配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％類似又は同一である軽鎖を有する。
【００８７】
本発明の一実施形態において、本発明は、ヒトＦｃＲｎと結合する抗体分子を提供し、抗体は、本明細書に示す配列、例えば配列番号１２に示す配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％類似又は同一である重鎖及び本明細書に示す配列、例えば配列番号１０に示す配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％類似又は同一である軽鎖を有するが、抗体分子のＦａｂポーションは、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号１に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号２に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ３については配列番号３に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号４に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号５又は配列番号７に示す配列、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号６に示す配列を有する。
【００８８】
本発明の一実施形態において、本発明は、ヒトＦｃＲｎと結合する抗体分子を提供し、抗体は、本明細書に示す配列、例えば配列番号１２に示す配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％類似又は同一である重鎖及び本明細書に示す配列、例えば配列番号１０に示す配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％類似又は同一である軽鎖を有するが、抗体分子のｄｓｓｃＦｖポーションは、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号８５に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号８６に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ３については配列番号８７に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号８８に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号８９に示す配列、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号９０に示す配列を有する。
【００８９】
本発明の一実施形態において、本発明は、ヒトＦｃＲｎと結合する抗体分子を提供し、抗体は、本明細書に示す配列、例えば配列番号１２に示す配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％類似又は同一である重鎖及び本明細書に示す配列、例えば配列番号１０に示す配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％類似又は同一である軽鎖を有するが、抗体分子のＦａｂポーションは、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号１に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号２に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ３については配列番号３に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号４に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号５又は配列番号７に示す配列、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号６に示す配列を有し、抗体分子のｄｓｓｃＦｖポーションは、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号８５に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号８６に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ３については配列番号８７に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号８８に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号８９に示す配列、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号９０に示す配列を有する。
【００９０】
本明細書で用いる「同一性」は、アラインした配列における任意の特定の位置で、アミノ酸残基が、配列間で同一であることを指摘する。本明細書で用いる「類似性」は、アラインした配列における任意の特定の位置で、アミノ酸残基が、配列間で類似のタイプであることを指摘する。例えば、ロイシンは、イソロイシン又はバリンに対して置換することができる。相互にしばしば置換することができる他のアミノ酸には、それだけには限定されないが、以下が含まれる：
−  フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）、
−  リシン、アルギニン、及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）、
−  アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）、
−  アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）、並びに
−  システイン及びメチオニン（含硫側鎖を有するアミノ酸）。同一性及び類似性の度合いは、容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編集、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  １、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編集、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．編集、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１年、ＮＣＢＩから入手できるＢＬＡＳＴ（商標）ソフトウエア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜４１０頁；Ｇｉｓｈ，Ｗ．及びＳｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．、１９９３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．、３巻：２６６〜２７２頁、Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら、１９９６年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２６６巻：１３１〜１４１頁；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９〜３４０２頁；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．及びＭａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．、１９９７年、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、７巻：６４９〜６５６頁）。
【００９１】
本発明の抗体融合タンパク質のＦａｂ−フラグメント成分は、任意の適切な抗ＦｃＲｎ抗体又は抗体フラグメントに由来し得るか、又はそれから構築され得ることが理解されよう。
【００９２】
一例において、本開示の抗体分子は、例えば、軽鎖及び重鎖についてそれぞれ配列番号２６及び２８に示す配列を含む、抗体Ｆａｂフラグメントを含む。
【００９３】
一例において、本開示の抗体分子は、例えば、軽鎖及び重鎖についてそれぞれ配列番号９２及び９４に示す配列を含む、抗体Ｆａｂフラグメントを含む。
【００９４】
一例において、本開示の抗体分子は、例えば、軽鎖及び重鎖についてそれぞれ配列番号１０及び配列番号１４に示される配列を含む抗体Ｆａｂフラグメントを含む。一例において、分子の抗体Ｆａｂフラグメントポーションは、配列番号１０に示す配列を含む軽鎖及び配列番号１４に示す配列を含む重鎖を有する。
【００９５】
本発明のＦａｂフラグメントは、直接又はリンカーを介してｓｃＦｖに連結されている。一例において、ｓｃＦｖは、ジスルフィド安定化されている。通常、ｓｃＦｖは、ジスルフィド安定化されている。Ｆａｂフラグメントへの連結は、化学的コンジュゲーションであり得るが、翻訳融合物、即ちそれぞれの配列が発現ベクターによって配列中でコードされる遺伝子融合物であることが最も好ましい。したがって、リンカーは通常、本明細書に記載するアミノ酸リンカーである。
【００９６】
通常、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖは、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗体融合タンパク質の半減期を延長させるために血清担体タンパク質に結合する。このような様式で半減期を延長させることは、ＦｃＲｎ結合とは無関係であり、好適であり得る。
【００９７】
「血清担体タンパク質」は本明細書で用いる場合、ｓｃＦｖが結合し得る任意の適切な血漿担体タンパク質を指し、一例において、血清担体タンパク質は、チロキシン結合タンパク質、トランスサイレチン、α１−酸性糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノゲン及びアルブミン、又はそれらの任意のフラグメントから選択される。
【００９８】
通常、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖは、アルブミン、好ましくはヒト血清アルブミンに結合する。
【００９９】
任意の適切なアルブミン結合ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖは、本発明の抗体融合タンパク質に組み入れられ得る。適切なアルブミン結合ドメインは、当技術分野においてこれまでに記載されている。
【０１００】
「単鎖可変フラグメント」又は「ｓｃＦｖ」は本明細書で用いる場合、ＶＨ可変ドメインとＶＬ可変ドメインとの間のペプチドリンカーによって安定化される単鎖可変フラグメントを指す。
【０１０１】
「ジスルフィド安定化された単鎖可変フラグメント」又は「ｄｓｓｃＦｖ」は本明細書で用いる場合、ＶＨドメインとＶＬ可変ドメインとの間のペプチドリンカーによって安定化され、またＶＨとＶＬとの間にドメイン間ジスルフィド結合を含む単鎖可変フラグメントを指す。
【０１０２】
一実施形態において、ｄｓｓｃＦｖの可変ドメインＶＨとＶＬとの間のジスルフィド結合は、以下に列挙する残基の２つの間に存在する（文脈が他の場合を示さない限りは、Ｋａｂａｔナンバリングが、以下のリストで用いられる）。Ｋａｂａｔナンバリングについて言及する際はいつも、関連参考文献は、Ｋａｂａｔら、１９８７年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、ＵＳＡである。
【０１０３】
一実施形態において、ジスルフィド結合は、
・ＶＨ３７＋ＶＬ９５Ｃ（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６、７８１〜７８８頁  Ｚｈｕら（１９９７年）を参照されたい）；
・ＶＨ４４＋ＶＬ１００（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３  ５４５１〜５４５９頁  Ｒｅｉｔｅｒら（１９９４年）；又はＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  第２６９巻  第２８号  １８３２７〜１８３３１頁  Ｒｅｉｔｅｒら（１９９４年）；又はＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第１０巻  第１２号  １４５３〜１４５９頁  Ｒａｊａｇｏｐａｌら（１９９７年）を参照されたい）；
・ＶＨ４４＋ＶＬ１０５（例えば、Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８、８２５〜８３１頁  Ｌｕｏら（１９９５年）を参照されたい）；
・ＶＨ４５＋ＶＬ８７（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６、７８１〜７８８頁  Ｚｈｕら（１９９７年）を参照されたい）；
・ＶＨ５５＋ＶＬ１０１（例えば、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３７７  １３５〜１３９頁  Ｙｏｕｎｇら（１９９５年）を参照されたい）；
・ＶＨ１００＋ＶＬ５０（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９  １３６２〜１３６７頁  Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら（１９９０年）を参照されたい）；
・ＶＨ１００ｂ＋ＶＬ４９；
・ＶＨ９８＋ＶＬ４６（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６、７８１〜７８８  Ｚｈｕら（１９９７年）を参照されたい）；
・ＶＨ１０１＋ＶＬ４６；
・ＶＨ１０５＋ＶＬ４３（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  第９０巻  ７５３８〜７５４２頁  Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら（１９９３年）；又はＰｒｏｔｅｉｎｓ  １９、３５〜４７頁  Ｊｕｎｇら（１９９４年）を参照されたい）；
・ＶＨ１０６＋ＶＬ５７（例えば、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３７７  １３５〜１３９頁  Ｙｏｕｎｇら（１９９５年）を参照されたい）及び分子中に位置する可変領域対においてそこに相当する位置（単数又は複数）からなる群から選択される位置に存在する。
【０１０４】
一実施形態において、ジスルフィド結合は、位置ＶＨ４４と位置ＶＬ１００との間に形成される。
【０１０５】
上記に列挙するアミノ酸対は、ジスルフィド結合が形成され得るように、システインによる置換に通じる位置に存在する。システインは、公知の技法によって、これらの所望の位置へ操作することができる。したがって、一実施形態において、本開示に従う操作されたシステインは、システイン残基で置換された所定のアミノ酸位置にある天然に存在する残基を指す。
【０１０６】
操作されたシステイン残基の導入は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して実施することができる。これらの方法として、ＰＣＲエクステンションオーバーラップ突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発又はカセット突然変異誘発が挙げられるが、これらに限定されない（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ、ＮＹ、１９８９年；Ａｕｓｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ＆  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ、１９９３年を参照されたい）。部位特異的突然変異誘発キットは、市販されており、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）である。カセット突然変異誘発は、Ｗｅｌｌｓら、１９８５年、Ｇｅｎｅ、３４：３１５〜３２３頁に基づいて実施することができる。或いは、突然変異体は、重複オリゴヌクレオチドのアニーリング、ライゲーション及びＰＣＲ増幅及びクローニングによって、全遺伝子合成により作製することができる。
【０１０７】
したがって、一実施形態において、ｄｓｓｃＦｖの可変ドメインＶＨ及び可変ドメインＶＬは、２つのシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結されてもよく、システイン残基の対の位置は、ＶＨ３７及びＶＬ９５、ＶＨ４４及びＶＬ１００、ＶＨ４４及びＶＬ１０５、ＶＨ４５及びＶＬ８７、ＶＨ１００及びＶＬ５０、ＶＨ１００ｂ及びＶＬ４９、ＶＨ９８及びＶＬ４６、ＶＨ１０１及びＶＬ４６、ＶＨ１０５及びＶＬ４３並びにＶＨ１０６及びＶＬ５７を含むか、又はそれらからなる群から選択される。
【０１０８】
一実施形態において、ｄｓｓｃＦｖの可変ドメインＶＨ及び可変ドメインＶＬは、ＣＤＲの外側にある２つのシステイン残基（一方がＶＨ中にあり、且つ一方がＶＬ中にある）間のジスルフィド結合によって連結されてもよく、システイン残基の対の位置は、ＶＨ３７及びＶＬ９５、ＶＨ４４及びＶＬ１００、ＶＨ４４及びＶＬ１０５、ＶＨ４５及びＶＬ８７、ＶＨ１００及びＶＬ５０、ＶＨ９８及びＶＬ４６、ＶＨ１０５及びＶＬ４３並びにＶＨ１０６及びＶＬ５７からなる群から選択される。
【０１０９】
一実施形態において、ｄｓｓｃＦｖの可変ドメインＶＨ及び可変ドメインＶＬは、２つの操作されたシステイン残基（一方が位置ＶＨ４４にあり、且つ他方がＶＬ１００にある）間のジスルフィド結合によって連結される。
【０１１０】
一実施形態において、ｄｓｓｃＦｖの可変ドメインＶＨ及び可変ドメインＶＬは、２つの操作されたシステイン残基（一方が位置ＶＨ４４にあり、且つ他方がＶＬ１００にある）間のジスルフィド結合によって連結される。
【０１１１】
一例において、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖは、３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメインを含み、ここでＣＤＲ  Ｈ１は配列番号８５に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号８６に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号８７に示す配列を有し、さらに３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインを含み、ここでＣＤＲ  Ｌ１は配列番号８８に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８９に示す配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９０に示す配列を有する。
【０１１２】
一例において、本発明のｄｓｓｃＦｖのＶＨドメインは、配列番号１５に示す配列を有し、本発明のｄｓｓｃＦｖのＶＬドメインは、配列番号１６に示す配列を有する。
【０１１３】
本発明のｓｃＦｖ及びｄｓｓｃＦｖにおけるＶＨ並びにＶＬ、通常、重−軽（ＨＬ）配向性で、適切なリンカーを介して互いに連結され、それらの例は以下で本明細書に提供されている。本発明の抗体融合タンパク質において、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖは、直接又はリンカーを介してＦａｂフラグメントのＣ末端に連結されている。
【０１１４】
一実施形態において、ｄｓｓｃＦｖの重鎖可変ドメインが、Ｆａｂフラグメントの重鎖のＣ末端に結合されるか、又はｄｓｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインが、Ｆａｂフラグメントの重鎖のＣ末端に結合される。
【０１１５】
一実施形態において、ｄｓｓｃＦｖの重鎖可変ドメインが、Ｆａｂフラグメントの軽鎖のＣ末端に結合されるか、又はｄｓｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインが、Ｆａｂフラグメントの軽鎖のＣ末端に結合される。
【０１１６】
一実施形態において、ｄｓｓｃＦｖのＶＨドメインは、リンカーを介してＦａｂフラグメントのＣＨ１のＣ末端に結合される。一実施形態において、ｄｓｓｃＦｖのＶＨドメインは、ＣＬのＣ末端に結合される。
【０１１７】
一実施形態において、リンカーは、任意の適切なリンカー、例えば、ＣＨ１又はＣＬのＣ末端ポーションをｄｓｓｃＦｖのＶＨに結合するのに適したペプチドである。
【０１１８】
一実施形態において、本明細書で用いるためのペプチドリンカーは、５０個のアミノ酸長又はそれ未満、例えば２０個のアミノ酸又はそれ未満、例えば１９個、１０個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個又は１個のアミノ酸である。
【０１１９】
一実施形態において、リンカーは、Ｇ４Ｓ（即ち、ＧＧＧＧＳ  配列番号２９）の反復単位、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０）又はＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３１）などのその１個、２個、３個、４個又は５個の単位に基づく。一実施形態において、本開示の構築物で用いるリンカーは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号３２）を有する。さらに、このようなリンカーを使用して、ｓｃＦＶ又はｄｓｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬと結合させてもよい。一実施形態において、リンカーは、本明細書に示される配列から選択される。一実施形態において、ＶＨ及びＶＬは、配列番号３０に示す配列を有するリンカーによって連結される。一実施形態において、ＦａｂのＣＨ１のＣ末端と、ｄｓｓｃＦｖのＶＨのＮ末端との間のリンカーは、配列ＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号３３）を有する。
【０１２０】
【表１】
2018516555.tif 000003
【０１２１】
【表２−１】
2018516555.tif 000004
【表２−２】
2018516555.tif 000005
【０１２２】
（Ｓ）は、配列４５〜４９において任意選択的である。
【０１２３】
硬質リンカーの例として、ペプチド配列ＧＡＰＡＰＡＡＰＡＰＡ（配列番号８３）、ＰＰＰＰ（配列番号８４）及びＰＰＰが挙げられる。
【０１２４】
一実施形態において、本発明のＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖフラグメント又は融合タンパク質は、配列番号１２に示す配列を含むか、又はそれからなる重鎖及び配列番号１０に示す配列を含むか、又はそれからなる軽鎖を含む。
【０１２５】
ＣＡ１７０＿０１６３８ｇ４９及び１６３８．ｇ４９は、本明細書において交換可能に用いられ、いくつかの異なるフォーマットにおいて用いることができる、抗体可変領域の特異的な対を指すのに用いられる。これらの可変領域は、配列番号９に示す重鎖配列ｇＨ３３、及び配列番号８に示す軽鎖配列ｇＬ７である。
【０１２６】
ＣＡ１７０＿０１６３８ｇ２８及び１６３８．ｇ２８は、本明細書において交換可能に用いられ、いくつかの異なるフォーマットにおいて用いることができる、抗体可変領域の特異的な対を指すのに用いられる。これらの可変領域は、配列番号２７に示す重鎖配列、及び配列番号２５に示す軽鎖配列である。
【０１２７】
一実施形態において、Ｆａｂ抗体重鎖はＣＨ１ドメインを含み、抗体軽鎖はカッパ又はラムダいずれかのＣＬドメインを含む。
【０１２８】
一実施形態において、Ｆａｂ成分の軽鎖は、配列番号１０に示す配列を有し、Ｆａｂ成分の重鎖は、配列番号１４に示す配列を有する。
【０１２９】
一実施形態において、Ｆａｂ成分の軽鎖は配列番号２６に示す配列を有し、Ｆａｂ成分の重鎖は配列番号２８に示す配列を有する。
【０１３０】
一実施形態において、Ｆａｂ成分の軽鎖は配列番号９２に示す配列を有し、Ｆａｂ成分の重鎖は配列番号９４に示す配列を有する。
【０１３１】
抗体又はフラグメントなどの生物学的分子は、酸性及び／又は塩基性の官能基を含み、それによって分子に正味の正又は負の電荷を与える。全体的に「観察される」電荷の量は、実体の絶対的なアミノ酸配列、３Ｄ構造において荷電している基の局所環境、及び分子の環境条件に依存する。等電点（ｐＩ）は、特定の分子又は溶媒が接近できるその表面が正味の電荷を保有しないｐＨである。一例において、本発明のＦｃＲｎ抗体及びフラグメントを、好適な等電点を有するように操作してもよい。これにより、より頑強な性質、特に適切な溶解性及び／若しくは安定性のプロファイル、並びに／又は改善された精製の特徴を有する抗体及び／若しくはフラグメントがもたらされ得る。
【０１３２】
よって、一態様において、本発明は、初めに同定された抗体の等電点と異なる等電点を有するように操作した、ヒト化ＦｃＲｎ抗体を提供する。抗体は、例えば、酸性アミノ酸残基を、１つ又は複数の塩基性アミノ酸残基で置き換えるなど、アミノ酸残基を置き換えることにより操作してもよい。或いは、塩基性アミノ酸残基を導入してもよく、又は酸性アミノ酸残基を除去してもよい。或いは、分子が、容認できないほど高いｐＩ値を有する場合は、必要に応じて、酸性残基を導入してｐＩを下げてもよい。ｐＩを操作する場合、抗体又はフラグメントの所望の活性を保持するよう注意を払わなければならないことが重要である。よって、一実施形態において、操作した抗体又はフラグメントは、「非修飾の」抗体又はフラグメントと同じ又は実質的に同じ活性を有する。
【０１３３】
＊＊ＥｘＰＡＳＹ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ、及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｕｔ−ａｒｌｅｓ．ｕｐ．ｕｎｉｖ−ｍｒｓ．ｆｒ／ｗ３ｂｂ／ｄ＿ａｂｉｍ／ｃｏｍｐｏ−ｐ．ｈｔｍｌなどのプログラムを用いて、抗体又はフラグメントの等電点を予想してもよい。或いは、又は加えて、任意の適切な標準の実験技術を用いてｐＩを測定することができる。
【０１３４】
本発明の抗体分子は、特にナノモル範囲の、高い結合親和性を有するのが適切である。親和性は、本明細書の実施例に記載する、ＢＩＡｃｏｒｅを含めた当技術分野では知られている任意の適切な方法を用いて、単離された天然若しくは組換えのＦｃＲｎ、又は適切な融合タンパク質／ポリペプチドを用いて測定してもよい。一例において、親和性を、本明細書の実施例に記載する組換えヒトＦｃＲｎ細胞外ドメイン（配列番号２１）を用いて測定する。一例において、親和性を、ヒトβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）（配列番号２４）と会合している、組換えヒトＦｃＲｎアルファ鎖細胞外ドメイン（配列番号２１）を用いて測定する。本発明の抗体分子が、単離されたヒトＦｃＲｎに対して約１ｎＭ以下の結合親和性を有するのが適切である。一実施形態において、本発明の抗体分子は、約５００ｐＭ以下の結合親和性を有する（すなわち、より高い親和性）。一実施形態において、本発明の抗体分子は、約２５０ｐＭ以下の結合親和性を有する。一実施形態において、本発明の抗体分子は、約２００ｐＭ以下の結合親和性を有する。一実施形態において、本発明の抗体分子は、約１６０ｐＭ以下の結合親和性を有する。
【０１３５】
一実施形態において、本発明の抗体分子は、ヒトＦｃＲｎに、ｐＨ６以下のｐＨ（特にｐＨ６）及びｐＨ７．４以上のｐＨ（特にｐＨ７．４）の両方で、匹敵する結合親和性で結合することができる。したがって、抗体が、エンドソーム内でもＦｃＲｎに結合し続けることができ、それによってＦｃＲｎのＩｇＧへの結合のブロックが最大になるのが有利である。
【０１３６】
一実施形態において、本発明の抗体分子は、ｐＨ６及びｐＨ７．４で測定した場合、２００ｐＭ若しくはそれ未満又は１６０ｐＭ若しくはそれ未満の結合親和性で、ヒトＦｃＲｎと結合することが可能である。一実施形態において、本発明の抗体は、ｐＨ６及びｐＨ７．４で測定した場合、１３０ｐＭ以下の結合親和性でヒトＦｃＲｎに結合することができる。一実施形態において、本発明の抗体は、ｐＨ６で測定した場合、１６０ｐＭ以下の結合親和性で、及びｐＨ７．４で測定した場合、５０ｐＭ以下の結合親和性でヒトＦｃＲｎに結合することができる。
【０１３７】
本発明の抗体又は結合フラグメントの親和性、及び結合剤（例えば、抗体）が結合を阻害する度合いは、当業者によって、従来の技術、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら（Ａｎｎ．ＫＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、５１巻：６６０〜６７２頁（１９４９年））によって記載されている技術を用いて、又はＢＩＡｃｏｒｅなどのシステムを用いた表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によって決定することができる。表面プラズモン共鳴法では、標的分子は固相上に固定化され、フローセルに沿って流れる移動相中のリガンドに曝露される。固定化された標的に対してリガンドの結合が生じる場合、局所的な屈折率が変化し、ＳＰＲ角度の変化をまねき、反射された光線の強度における変化を検出することにより、ＳＰＲ角度の変化をリアルタイムでモニタリングすることができる。ＳＰＲシグナルの変化の速度を分析して、結合反応の会合及び解離の相に対する見かけの速度定数を得ることができる。これらの値の比率により、見かけの平衡定数（親和性）を得る（例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５３巻：２５６０〜６５頁（１９９３年）を参照されたい）。
【０１３８】
本発明において、試験抗体分子の親和性は、以下の通りＳＰＲを用いて決定するのが典型的である。試験抗体分子を固相上で捕獲し、ヒトβ２Ｍとの非共有結合性の複合体におけるヒトＦｃＲｎアルファ鎖細胞外ドメインを、移動相中、捕獲した抗体上に流し、ヒトＦｃＲｎに対する試験抗体分子の親和性を決定する。試験抗体分子を、固相チップ表面上で、任意の好適な方法を用いて、例えば、抗Ｆｃ又は抗Ｆａｂ’特異的捕獲剤を用いて捕獲してもよい。一例において、ｐＨ６で親和性を決定する。一例において、ｐＨ７．４で親和性を決定する。
【０１３９】
本発明が提供する抗体の親和性は、当技術分野では知られている任意の適切な方法を用いて変更してもよいことを理解されよう。したがって、本発明は、ＦｃＲｎに対する改善された親和性を有する、本発明の抗体分子のバリアントにも関する。このようなバリアントは、ＣＤＲの変異を含めたいくつかの親和性成熟のプロトコール（Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５４巻、３９２〜４０３頁、１９９５年）、チェインシャフリング（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻、７７９〜７８３頁、１９９２年）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異誘発株の使用（Ｌｏｗら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５０巻、３５９〜３６８頁、１９９６年）、ＤＮＡシャフリング（Ｐａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８巻、７２４〜７３３頁、１９９７年）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５６巻、７７〜８８頁、１９９６年）、及びセクシュアル（ｓｅｘｕａｌ）ＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３９１巻、２８８〜２９１頁、１９９８年）により得ることができる。Ｖａｕｇｈａｎら（上述）は、これら親和性成熟の方法を論じている。
【０１４０】
一実施形態において、本発明の抗体分子はヒトＦｃＲｎ活性をブロックする。抗体がＦｃＲｎをブロックする能力を決定するのに適するアッセイを、本明細書の実施例に記載する。抗体分子がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩｇＧリサイクルをブロックする能力を決定するのに適するアッセイを、本明細書以下に記載する。
【０１４１】
所望により、本発明において用いるための抗体分子を、１つ又は複数のエフェクター分子（単数又は複数）にコンジュゲートしてもよい。エフェクター分子は、単一のエフェクター分子、又は本発明の抗体に付着することができる単一の部分を形成するように連結されている、２つ以上のこのような分子を含むことができることが理解されよう。エフェクター分子に連結している抗体フラグメントを得るのが望ましい場合、この抗体フラグメントは、抗体フラグメントがエフェクター分子に対して直接又はカップリング剤によってのいずれかで連結される、標準の化学的手順又は組換えＤＮＡ手順により調製することができる。このようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートするための技術は、当技術分野ではよく知られている（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、第２版、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編集、１９８７年、６２３〜５３頁；Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、６２巻：１１９〜５８頁、及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋら、１９９９年、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、８３巻、６７〜１２３頁を参照されたい）。特定の化学的手順には、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６、及びＷＯ０３／０３１５８に記載されているものが含まれる。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、連結は、ＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５などに記載されている、組換えＤＮＡ手順を用いて実現してもよい。
【０１４２】
本明細書で用いるエフェクター分子という用語には、例えば、抗悪性腫瘍性の薬剤、薬物、毒素、生物学的に活性なタンパク質、例えば、酵素、他の抗体又は抗体フラグメント、合成又は天然に存在するポリマー、核酸及びそのフラグメント、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びこれらのフラグメント、放射性核種、特に、放射性ヨウ化物、放射性同位元素、キレート化された金属、ナノ粒子、及びレポーター群、例えば、蛍光化合物、又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光光度法によって検出することができる化合物が含まれる。
【０１４３】
エフェクター分子の例には、細胞にとって有害である（例えば、死滅させる）任意の薬剤を含めた細胞毒素又は細胞毒性薬剤が含まれ得る。例として、コンブレスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、メイタンシノイド、スポンジスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）、ヘミアステルリン（ｈｅｍｉａｓｔｅｒｌｉｎ）、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにこれらの類似体又はホモログが含まれる。
【０１４４】
エフェクター分子には、それだけには限定されないが、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアミシン、又はデュオカルマイシン）、並びに有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）も含まれる。
【０１４５】
他のエフェクター分子には、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリホルニウム２５２、イリジウム１９２及びタングステン１８８／レニウム１８８などのキレート化された放射性核種、又はそれだけには限定されないが、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩインヒビター、タキソイド、及びスラミンなどの薬物が含まれ得る。他のエフェクター分子には、タンパク質、ペプチド、及び酵素が含まれる。対象の酵素には、それだけには限定されないが、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが含まれる。対象のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドには、それだけには限定されないが、免疫グロブリン；毒素、例えば、アブリン、リシン（ｒｉｃｉｎ）Ａ、シュードモナス外毒素、又はジフテリア毒素；タンパク質、例えば、インスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、又は組織プラスミノゲンアクチベータ、抗血栓剤（ａ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、又は抗血管形成薬剤、例えば、アンジオスタチン若しくはエンドスタチン；又は生物学的応答調節剤、例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、又は他の成長因子及び免疫グロブリンが含まれる。
【０１４６】
他のエフェクター分子には、診断などにおいて有用な、検出可能な物質が含まれ得る。検出可能な物質の例として、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性核種、ポジトロン放出性金属（ポジトロン放出断層撮影において用いるための）、及び非放射性の常磁性金属イオンが含まれる。全般的に、診断として用いるための抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンには、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素には、セイヨウワサビのベルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ、適切な補欠分子族には、ストレプトアビジン、アビジン、及びビオチンが含まれ、適切な蛍光材料には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、及びフィコエリスリンが含まれ、適切な発光材料にはルミノールが含まれ、適切な生物発光材料には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが含まれ、適切な放射性核種には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、及び９９Ｔｃが含まれる。
【０１４７】
別の一例において、エフェクター分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗体の半減期を増大し得、且つ／又は抗体の免疫原性を低減し得、且つ／又は上皮のバリアを横切った免疫系への抗体の送達を増強し得る。このタイプの適切なエフェクター分子の例には、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質、又はアルブミン結合化合物、例えば、ＷＯ０５／１１７９８４に記載されているものが含まれる。
【０１４８】
一実施形態において、ＦｃＲｎと無関係であるエフェクター分子が提供する半減期が有利である。
【０１４９】
エフェクター分子がポリマーである場合、エフェクター分子は全般的に、合成の、又は天然に存在するポリマー、例えば、任意選択により置換されている直鎖若しくは分枝鎖のポリアルキレン、ポリアルキレン、ポリアルケニレン、若しくはポリオキシアルキレンポリマー、又は分枝若しくは非分枝の多糖、例えば、ホモ多糖若しくはヘテロ多糖であってよい。
【０１５０】
上記に言及した合成ポリマー上に存在し得る具体的な、任意選択の置換基には、ヒドロキシ、メチル、又はメトキシ基の１つ又は複数が含まれる。
【０１５１】
合成ポリマーの具体的な例には、任意選択により置換されている直鎖又は分枝鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）、又はこれらの誘導体、特に任意選択により置換されているポリ（エチレングリコール）、例えば、メトキシポリ（エチレングリコール）、又はその誘導体が含まれる。
【０１５２】
具体的な天然に存在するポリマーには、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン、又はこれらの誘導体が含まれる。
【０１５３】
一実施形態において、ポリマーは、アルブミン又はそのフラグメント、例えば、ヒト血清アルブミン又はそのフラグメントである。
【０１５４】
本明細書で用いる「誘導体」には、反応性の誘導体、例えば、チオール選択性反応性基、例えばマレイミドなどが含まれるものとされる。反応性基は、直接、又はリンカーセグメントを介してポリマーに連結していてもよい。このような基の残基は、ある場合には、抗体フラグメントとポリマーとの間の連結基として生成物の一部を形成することが理解されよう。
【０１５５】
ポリマーのサイズは、所望により変動することができるが、全般的に、平均分子量範囲５００Ｄａから５００００Ｄａ、例えば、５０００から４００００Ｄａ、例えば、２００００から４００００Ｄａである。ポリマーのサイズは、特に、腫瘍などある種の組織に局在する能力、又は循環半減期を延長する能力など、生成物の意図する使用に基づいて選択することができる（再考には、Ｃｈａｐｍａｎ、２００２年、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４巻、５３１〜５４５頁を参照されたい）。よって、例えば、腫瘍の処置において用いるために、生成物が循環を離れ、組織に浸透することを意図する場合などは、分子量およそ５０００Ｄａを有するなど、低分子量のポリマーを用いるのが有利であり得る。生成物が循環にとどまる適用には、２００００Ｄａから４００００Ｄａの範囲の分子量を有するなど、より高分子量のポリマーを用いるのが有利であり得る。
【０１５６】
適切なポリマーには、ポリ（エチレングリコール）又は特に、メトキシポリ（エチレングリコール）、又はこれらの誘導体などの、特に約１５０００Ｄａから約４００００Ｄａの範囲の分子量を有するポリアルキレンポリマーが含まれる。
【０１５７】
一例において、本発明において用いるための抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に付着している。特定の一例において、抗体は抗体フラグメントであり、ＰＥＧ分子は、抗体フラグメントに位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端のアミノ酸官能基、例えば、任意の遊離のアミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル、又はカルボキシル基を介して付着していてもよい。このようなアミノ酸は、抗体フラグメントにおいて天然に存在してもよく、又は組換えＤＮＡ方法を用いてフラグメント中に操作してもよい（例えば、ＵＳ５，２１９，９９６；ＵＳ５，６６７，４２５；ＷＯ９８／２５９７１、ＷＯ２００８／０３８０２４を参照されたい）。一例において、本発明の抗体分子は修飾されているＦａｂフラグメントであり、修飾は、エフェクター分子の付着を可能にするための、その重鎖のＣ末端終端に対する１つ又は複数のアミノ酸の付加である。さらなるアミノ酸が、それに対してエフェクター分子が付着し得る１つ又は複数のシステイン残基を含む修飾されているヒンジ領域を形成するのが適切である。多重の部位を用いて２つ以上のＰＥＧ分子を付着することができる。
【０１５８】
ＰＥＧ分子が、抗体フラグメントに位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合性に連結しているのが適切である。修飾されている抗体フラグメントに付着している各ポリマー分子は、フラグメントに位置するシステイン残基のイオウ原子に共有結合性に連結していてもよい。共有結合性の連結は、一般的にジスルフィド結合であり、又は特にイオウ−炭素結合である。チオール基を付着点として用いる場合、マレイミド及びシステイン誘導体などのチオール選択的誘導体など、好適に活性化されたエフェクター分子を用いてもよい。活性化されたポリマーを、上記に記載するポリマー修飾されている抗体フラグメントの調製における出発材料として用いてもよい。活性化されたポリマーは、α−ハロカルボン酸又はエステル、例えば、ヨードアセトアミド、イミド、例えば、マレイミド、ビニルスルホン、又はジスルフィドなど、チオール反応性基を含む任意のポリマーであってよい。このような出発材料は、市場から得てもよく（例えば、Ｎｅｋｔａｒ、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ、ＵＳＡから）、又は市販の出発材料から慣例的な化学的手順を用いて調製してもよい。特定のＰＥＧ分子には、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒ；Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ；及びＳｕｎＢｉｏから入手可能）、並びにＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）が含まれる。
【０１５９】
一実施形態において、抗体は、修飾されているＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、又はｄｉＦａｂであり、ｄｉＦａｂは、ＰＥＧ化されている、すなわち、例えば、ＥＰ０９４８５４４又はＥＰ１０９００３７に開示されている方法に従って、それに共有結合性に付着しているＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を有する［「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、１９９２年、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ（編集）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、１９９７、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編集）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、並びに「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、１９９８年、Ｍ．Ａｓｌａｍ及びＡ．Ｄｅｎｔ、Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｃｈａｐｍａｎ、Ａ．、２００２年、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００２年、５４巻：５３１〜５４５頁も参照されたい］。一例において、ＰＥＧは、ヒンジ領域においてシステインに付着している。一例において、ＰＥＧが修飾するＦａｂフラグメントは、修飾されているヒンジ領域において単一のチオール基に共有結合性に連結しているマレイミド基を有する。リシン残基が、マレイミド基に、及びリシン残基上の各アミン基に、共有結合性に付着していてもよく、分子量およそ２０，０００Ｄａを有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーに付着していてもよい。Ｆａｂフラグメントに付着しているＰＥＧの合計分子量は、したがって、およそ４０，０００Ｄａであってよい。
【０１６０】
特定のＰＥＧ分子には、ＰＥＧ２ＭＡＬ４０Ｋ（Ｎｅｋｔａｒ、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）としても知られる、Ｎ，Ｎ’−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）ＭＷ２００００）が修飾しているリシンの２−［３−（Ｎ−マレイミド）プロピオンアミド］エチルアミドが含まれる。
【０１６１】
ＰＥＧリンカーの代替の供給源には、ＧＬ２−４００ＭＡ３（構造中、ｍが５未満である）及びＧＬ２−４００ＭＡ（ｍが２であり、ｎがおよそ４５０である）を供給するＮＯＦが含まれる。
【化１】
2018516555.tif 000006
【０１６２】
すなわち、各ＰＥＧは約２０，０００Ｄａである。
【０１６３】
よって、一実施形態において、ＰＥＧは、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＭＡ３として知られている、Ｍｗ４０，０００の、２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−｛［３−（６−マレイミド−１−オキソヘキシル）アミノ］プロピルオキシ｝ヘキサン（２アーム分枝ＰＥＧ、−ＣＨ２）３ＮＨＣＯ（ＣＨ２）５−ＭＡＬである。
【０１６４】
以下のタイプのさらなる代替のＰＥＧエフェクター分子が、Ｄｒ  Ｒｅｄｄｙ、ＮＯＦ、及びＪｅｎｋｅｍから入手可能である：
【化２】
2018516555.tif 000007
【０１６５】
一実施形態において、抗体又はフラグメントは、デンプン分子にコンジュゲートして、例えば、半減期を延長する。デンプンをタンパク質にコンジュゲートする方法は、参照により本明細書に援用されるＵＳ８，０１７，７３９に記載される通りである。
【０１６６】
一実施形態において、抗ＦｃＲｎ結合分子（すなわち、抗体又はその結合フラグメント）を提供し、抗ＦｃＲｎ結合分子は：
−  血漿ＩｇＧ濃度の５０〜８０％の低減、例えば、７０％の低減を引き起こし、
−  血漿アルブミン濃度の低減は２５％若しくは２０％以下であり、且つ／又は
−  血漿ＩｇＧ低濃度の長期間の維持を実現するための反復投薬の可能性がある。
【０１６７】
本発明は、本発明の抗体分子の、重鎖及び／又は軽鎖（単数又は複数）をコードする単離されたＤＮＡ配列も提供する。ＤＮＡ配列が、本発明の抗体分子の重鎖又は軽鎖をコードするのが適切である。本発明のＤＮＡ配列は、例えば、化学的プロセシング、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はこれらの任意の組合せにより生成される合成ＤＮＡを含むことができる。
【０１６８】
本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列は、当業者にはよく知られている方法によって得ることができる。例えば、抗体の重鎖及び軽鎖を一部又は全てコードするＤＮＡ配列を、決定されたＤＮＡ配列から、又は対応するアミノ酸配列に基づいて、所望により合成することができる。
【０１６９】
アクセプタフレームワーク配列をコードするＤＮＡは、当業者には広く入手可能であり、これらの知られているアミノ酸配列に基づいて容易に合成することができる。
【０１７０】
分子生物学の標準的技術を用いて、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を調製することができる。所望のＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成技術を用いて、完全に、又は部分的に合成することができる。部位特異的変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を、適宜用いてもよい。
【０１７１】
適切なＤＮＡ配列の例を、本明細書に提供する。
【０１７２】
したがって、一例において、本発明は、配列番号１３に示す配列を含む、本発明の抗体Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖの重鎖をコードする単離されたＤＮＡ配列を提供する。配列番号１１に示す配列を含む、本発明の抗体Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖの軽鎖をコードする単離されたＤＮＡ配列も提供する。
【０１７３】
本発明は、本発明の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニングベクター又は発現ベクターにも関する。したがって、本発明の抗体をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む、クローニングベクター又は発現ベクターを提供する。クローニングベクター又は発現ベクターが、本発明の抗体分子の軽鎖及び重鎖をそれぞれコードする２つのＤＮＡ配列、並びに適切なシグナル配列を含むのが適切である。一例において、ベクターは、重鎖と軽鎖との間に遺伝子間配列を含む（ＷＯ０３／０４８２０８を参照されたい）。
【０１７４】
それによりベクターを構築することができる一般的方法、トランスフェクション方法、及び培養方法は、当業者にはよく知られている。この点に関して、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１９９９年、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編集）、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、及びＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ製作のｔｈｅ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｍａｎｕａｌを参照されたい。
【０１７５】
本発明の抗体分子をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む、１つ又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。したがって、本発明は、以下を含む、本発明による抗体分子を発現させるための宿主細胞も提供し：
ｉ）前記抗体の重鎖をコードするＤＮＡ配列、及び
ｉｉ）前記抗体の軽鎖をコードするＤＮＡ配列
この場合、１つ又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターにおけるＤＮＡ配列を提供する。
【０１７６】
任意の適切な宿主細胞／ベクター系を、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を発現させるのに用いることができる。大腸菌などの細菌の、及び他の微生物系を用いてもよく（特に、抗体フラグメントを発現させるために）、又は哺乳動物などの真核生物の、宿主細胞の発現系も用いてもよい（特に、全長抗体を発現させるために）。適切な哺乳動物の宿主細胞には、ＣＨＯ、ミエローマ、又はハイブリドーマ細胞が含まれる。
【０１７７】
本発明で用いるためのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）の適切なタイプには、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含めた、ＣＨＯ及びＣＨＯ−Ｋ１細胞、例えば、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、及びＤＨＦＲ選択マーカーと用いてもよいＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞、又はグルタミン合成酵素選択マーカーと用いてもよいＣＨＯＫ１−ＳＶ細胞が含まれ得る。抗体を発現させるのに用いる他の細胞型には、リンパ球細胞系、例えば、ＮＳＯミエローマ細胞及びＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞が含まれ得る。
【０１７８】
本発明は、本発明のベクター又はベクター（複数）を含む宿主細胞を、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからタンパク質の発現をもたらすのに適する条件下で培養するステップと、抗体分子を単離するステップとを含む、本発明による抗体分子を生成するためのプロセスも提供する。
【０１７９】
抗体分子は、重鎖及び軽鎖の両方を含み、細胞系は、２つのベクター、即ち軽鎖ポリペプチドをコードする第１のベクター及び重鎖ポリペプチドをコードする第２のベクターでトランスフェクトされ得る。或いは、軽鎖及び重鎖のポリペプチドをコードする配列を含む、単一のベクターを用いてもよい。
【０１８０】
本開示による抗体及びフラグメントは、宿主細胞から良好なレベルで発現される。よって、抗体及び／又はフラグメントの性質は、商業上の加工を促進する。
【０１８１】
よって、宿主細胞を培養し、抗体又はそのフラグメントを発現させ、後者を単離し、任意選択によりそれを精製して単離された抗体又はフラグメントを提供するためのプロセスを提供する。一実施形態において、プロセスは、エフェクター分子を、単離された抗体又はフラグメントにコンジュゲートする、例えば、特に本明細書に記載するＰＥＧポリマーをコンジュゲートするステップをさらに含む。
【０１８２】
一実施形態において、不純物がカラムに保持され、抗体が溶出されるように、非結合性の様式で陰イオン交換クロマトグラフィーを行うステップを含む、抗体（特に本発明による抗体又はフラグメント）を精製するためのプロセスを提供する。
【０１８３】
一実施形態において、精製は、ＦｃＲｎカラムでの親和性による捕捉を使用する。
【０１８４】
一実施形態において、精製は、アルブミン融合又はコンジュゲート分子を精製するための、シバクロンブルー又は同様品を使用する。プロセスにおいて用いるのに適するイオン交換樹脂には、Ｑ．ＦＦ樹脂（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅにより供給される）が含まれる。ステップは、例えば、ｐＨ約８で行ってもよい。
【０１８５】
プロセスは、例えば、ｐＨ約４から５、例えば、４．５で行われる陽イオン交換クロマトグラフィーを使用する、開始の捕捉ステップをさらに含むことができる。陽イオン交換クロマトグラフィーは、例えば、ＣａｐｔｏＳ樹脂又はＳＰセファロースＦＦ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅにより供給される）などの樹脂を使用してもよい。次いで、抗体又はフラグメントを、例えば、濃度２００ｍＭの塩化ナトリウムなどのイオン性塩溶液を用いて、樹脂から溶出することができる。
【０１８６】
よって、クロマトグラフのステップ又はステップ（複数）は、適宜、１つ又は複数の洗浄ステップを含むことができる。
【０１８７】
精製プロセスは、透析ろ過のステップなど、１つ又は複数のろ過ステップも含むことができる。
【０１８８】
よって、一実施形態において、外毒素及び／又は宿主細胞のタンパク質又はＤＮＡから実質的に精製されている、特にこれらがない、又は実質的にない、精製された抗ＦｃＲｎ抗体又はフラグメント、例えば、ヒト化抗体又はフラグメント、特に本発明による抗体又はフラグメントを提供する。
【０１８９】
上述で用いられる精製されている形態は、少なくとも純度９０％、例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９重量％又はそれを超えて純粋であることを指すものとされる。
【０１９０】
外毒素が実質的にないことは、一般的に、外毒素含量が抗体生成物１ｍｇあたり１ＥＵ以下、例えば、生成物１ｍｇあたり０．５又は０．１ＥＵであることを指すものとされる。
【０１９１】
宿主細胞のタンパク質又はＤＮＡが実質的にないことは、一般的に、抗体生成物１ｍｇあたり宿主細胞のタンパク質及び／又はＤＮＡ含量が４００μｇ以下、例えば、適宜、１ｍｇあたり１００μｇ以下、特に１ｍｇあたり２０μｇであることを指すものとされる。
【０１９２】
本発明の抗体分子は、診断において、例えば、ＦｃＲｎに関与する疾患状態のｉｎ  ｖｉｖｏの診断及び画像化において用いてもよい。
【０１９３】
本発明の抗体は病理学的状態の処置及び／又は予防において有用であるため、本発明は、本発明の抗体分子を、１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体と組み合わせて含む、医薬又は診断用組成物も提供する。したがって、本発明の抗体分子の、医薬を製造するための使用を提供する。組成物は、薬学的に許容される担体を通常含む、無菌の医薬組成物の一部として通常供給される。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことができる。
【０１９４】
本発明は、本発明の抗体分子を、１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体とともに加え、及び混合するステップを含む、医薬又は診断用組成物を調製するためのプロセスも提供する。
【０１９５】
抗体分子は、医薬若しくは診断用組成物における唯一の有効成分であってもよく、又はステロイド若しくは他の薬物分子、特にその半減期がＦｃＲｎの結合と無関係である薬物分子など、他の抗体成分又は非抗体成分を含めた他の有効成分を伴ってもよい。
【０１９６】
医薬組成物は、治療有効量の本発明の抗体を含むのが適切である。本明細書で用いる「治療有効量」という用語は、標的の疾患又は状態を、処置、軽減、若しくは防止するのに、又は検出可能な治療若しくは予防効果を表すのに必要とされる治療剤の量を指す。任意の抗体分子に対して、治療有効量は、細胞培養アッセイにおいて、又は動物モデル、通常、齧歯動物、ウサギ、イヌ、ブタ、若しくは霊長動物においてのいずれかで、最初に推定することができる。動物モデルを用いて、好適な濃度範囲及び投与経路を決定してもよい。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおける投与に有用な用量及び経路を決定することができる。
【０１９７】
ヒト対象に対する正確な治療有効量は、疾患状態の重症度、対象の全体的な健康、対象の年齢、体重、及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物併用（単数又は複数）、反応の感受性、並びに治療に対する認容性／応答に依存する。この量は、ルーチンの実験によって決定することができ、医師の判断の範囲内にある。一般的に、治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇから５００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇから２００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００ｍｇ／ｋｇである。
【０１９８】
医薬組成物は、１用量あたり、予め決定された量の本発明の有効薬剤を含む単位剤形において提示すると便利であり得る。
【０１９９】
本開示による抗体の治療用量は、ｉｎ  ｖｉｖｏで明らかな毒性学的効果を示さない。
【０２００】
本発明による抗体又はフラグメントの一実施形態において、単一用量は、循環ＩｇＧレベルにおける最高７０％の低減をもたらし得る。本発明による抗体又はフラグメントの一例において、単一用量は、循環ＩｇＧレベルにおける最高８０％の低減をもたらし得る。本発明による抗体又はフラグメントの一例において、単一用量は、循環ＩｇＧレベルにおける８０％を超える低減をもたらし得る。
【０２０１】
循環ＩｇＧにおける最大の治療的な低減は、関連の治療用量を投与して約１週間後に観察され得る。ＩｇＧのレベルは、さらなる治療用量を送達しなければ、投薬後数週にわたって回復し得る。本明細書で用いる回復は、最初の投薬を開始する前に観察されたレベルと同様のレベルに戻るレベルを指す。
【０２０２】
ｉｎ  ｖｉｖｏのＩｇＧレベルが、本開示による抗体又はフラグメントの逐次用量の投与によって、好適に低レベルに維持され得るのが有利である。
【０２０３】
組成物は、患者に個々に投与してもよく、又は他の薬剤、薬物、若しくはホルモンと併用して（例えば、同時に、逐次的に、若しくは別々に）投与してもよい。
【０２０４】
本明細書で用いる薬剤は、投与したときに生理学的効果のある実体を指す。
【０２０５】
本明細書で用いる薬物は、治療用量で好適な生理学的効果のある化学的実体を指す。
【０２０６】
一実施形態において、本開示による抗体又はフラグメントを、免疫抑制治療、例えば、ステロイド、特にプレドニゾンとともに使用する。
【０２０７】
一実施形態において、本開示による抗体又はフラグメントを、リツキシマブ又は他のＢ細胞治療とともに使用する。
【０２０８】
一実施形態において、本開示による抗体又はフラグメントを、任意のＢ細胞若しくはＴ細胞変調剤、又は免疫調節薬とともに使用する。例として、メトトレキサート、ミコフェノレート（ｍｉｃｒｏｐｈｅｎｙｏｌａｔｅ）、及びアザチオプリンが含まれる。
【０２０９】
本発明の抗体分子を投与する用量は、処置しようとする状態の性質、存在する炎症の程度、及び抗体分子を予防的に用いるか、又は既存の状態を処置するのに用いるかに依存する。
【０２１０】
投薬の頻度は、抗体の半減期、その標的が媒介する性質、その効果の持続時間、及び抗薬物抗体の存在に依存する。抗体の半減期が短い（数時間）、若しくは活性が限られている場合、且つ／又は小体積の薬物を送達するのが望ましい場合（例えば、皮下注射に対して）、１日あたり１回以上の頻度など、頻繁に投薬する必要があり得る。或いは、抗体の半減期が長い場合、活性の持続時間が長い場合、又は大体積を投薬することができる（例えば、注入により）場合、投薬はまれであってよく、１日１回、又は数日、数週、若しくは数か月毎であってよい。一実施形態において、投薬間に十分な時間を与えて、抗薬物抗体のレベルを低下させる。
【０２１１】
本明細書で用いる半減期は、血清／血漿中など、循環中の分子の持続時間を指すものとされる。
【０２１２】
本明細書で用いる薬力学は、本開示による分子の、プロファイル、特に生物学的作用の持続時間を指す。
【０２１３】
薬学的に許容される担体は、それ自体、組成物を投与する個体に有害な抗体の生成を誘発してはならず、毒性であってはならない。適切な担体は、大型で、ゆっくりと代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体のアミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び不活性なウイルス粒子であってよい。
【０２１４】
鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、及び硫酸塩、又は有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、及び安息香酸塩など、薬学的に許容される塩を用いることができる。
【０２１５】
治療用組成物中の薬学的に許容される担体は、水、食塩水、グリセリン、及びエタノールなどの液体をさらに含むことができる。加えて、補助的な物質、例えば、湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝化剤がこのような組成物中に存在してもよい。このような担体により、医薬組成物は、患者が摂取するための、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、及び懸濁剤として調合できるようになる。
【０２１６】
投与に適する形態には、例えば、ボーラス注射又は持続的注入などによる注射又は注入による、非経口投与に適する形態が含まれる。生成物が注射又は注入用である場合、生成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁剤、溶液剤、又は乳剤の形態をとることができ、懸濁化剤、保存剤、安定化剤、及び／又は分散剤などの製剤用薬剤を含むことができる。或いは、抗体分子は、使用前に好適な無菌の液体と再構成するために乾燥形態であってもよい。
【０２１７】
調合後は、本発明の組成物を、対象に直接投与してもよい。処置しようとする対象は動物でもよい。しかし、１つ又は複数の実施形態において、組成物は、ヒト対象への投与に適応される。適切には、本開示による製剤において、最終製剤のｐＨは、抗体又はフラグメントの等電点の値に同様ではなく、例えば、タンパク質のｐＩが８〜９又はそれを超える範囲である場合、ｐＨ７の製剤が好適であり得る。理論によって拘泥しようとするものではないが、これは最終的に、溶液中に抗体又はフラグメントが残存するなど、安定性が改善された最終製剤を提供し得ると考えられる。
【０２１８】
一例において、ｐＨが４．０から７．０の範囲である医薬組成物は、本開示による抗体分子を１から２００ｍｇ／ｍＬ、バッファーを１から１００ｍＭ、界面活性剤を０．００１から１％、ａ）安定化剤を１０から５００ｍＭ、ｂ）安定化剤を１０から５００ｍＭ及び等張化剤を５から５００ｍＭ、又はｃ）等張化剤を５から５００ｍＭ含む。
【０２１９】
本発明の医薬組成物は、それだけには限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮膚（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照されたい）、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、膣内、又は直腸の経路を含めた任意の数々の経路によって投与することができる。皮下噴射器も、本発明の医薬組成物を投与するのに用いることができる。典型的に、治療用組成物は、液体の液剤又は懸濁剤いずれかとして、注射可能として調製することができる。注射前に液体のビヒクル中の液剤、又は懸濁剤に適する固体形態も調製することができる。
【０２２０】
組成物の直接的な送達は、一般的に、皮下、腹腔内、静脈内、若しくは筋肉内の注射により、又は組織の間質腔に対する送達により遂行する。組成物を、病変中に投与することもできる。用量処置は、単一用用量スケジュールでも、又は複数の用量スケジュールでもよい。
【０２２１】
組成物中の有効成分は抗体分子であることが理解されよう。抗体分子はそれ自体、消化管において分解を受けやすい。よって、組成物を、消化管を用いた経路によって投与しようとする場合、組成物は、抗体を分解から保護するが、消化管から吸収された後は抗体を放出する薬剤を含む必要がある。
【０２２２】
薬学的に許容される担体の徹底的な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．、１９９１年）において得ることができる。
【０２２３】
一実施形態において、製剤を、吸入を含めた局所投与用の製剤として提供する。
【０２２４】
適切な吸入可能な調製物には、吸入可能な粉末、プロペラントガスを含む計量用エアロゾル、又はプロペラントガスのない吸入可能な溶液が含まれる。有効物質を含む本開示による吸入可能な粉末は、上記に言及した有効物質のみからなってもよく、又は上記に言及した有効物質の生理学的に許容される賦形剤との混合物からなってもよい。
【０２２５】
これら吸入可能な粉末には、単糖（例えば、グルコール若しくはアラビノース）、二糖（例えば、ラクトース、ショ糖、マルトース）、オリゴ糖及び多糖（例えば、デキストラン）、多価アルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）、又はこれらの相互の混合物が含まれ得る。適切には単糖又は二糖が用いられ、ラクトース又はグルコースは、特定には、ただしそれに限定されないが、それらの水和物の形態で用いられる。
【０２２６】
肺に堆積させるための粒子には、１〜９ミクロン、例えば、１から５μｍなど、１０ミクロン未満の粒径が必要とされる。有効成分（例えば、抗体又はフラグメント）の粒径が最重要である。
【０２２７】
吸入可能なエアロゾルを調製するために用いることができるプロペラントガスは当技術分野では知られている。適切なプロペラントガスは、ｎ−プロパン、ｎ−ブタン、又はイソブタンなどの炭化水素、並びに、メタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン、又はシクロブタンの塩素化及び／又はフッ素化された誘導体などのハロ炭化水素の間から選択される。上記に言及したプロペラントガスは、単独で、又はこれらの混合物において用いることができる。
【０２２８】
特に適切なプロペラントガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ、及びＴＧ２２７の間から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上記に言及したハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）、並びにこれらの混合物が特に適切である。
【０２２９】
プロペラントガス含有の吸入可能なエアロゾルは、共溶媒、安定化剤、表面活性剤（界面活性剤）抗酸化剤、滑沢剤、及びｐＨを調整するための手段など、他の成分も含むことができる。これらの成分は全て、当技術分野では知られている。
【０２３０】
本発明によるプロペラントガス含有の吸入可能なエアロゾルは、最高５重量％の有効物質を含むことができる。本発明によるエアロゾルは、例えば、０．００２から５重量％、０．０１から３重量％、０．０１５から２重量％、０．１から２重量％、０．５から２重量％、又は０．５から１重量％の有効成分を含む。
【０２３１】
或いは、肺に対する局所投与は、例えば、コンプレッサ（例えば、Ｐａｒｉ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｖａ．が製造したＰａｒｉ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒ）コンプレッサに接続されているＰａｒｉ  ＬＣ−Ｊｅｔ  Ｐｌｕｓ（Ｒ）ネブライザー）に接続されているネブライザーなどの装置を用いて、液体の液剤又は懸濁剤製剤の投与によってもよい。
【０２３２】
本発明の抗体は、溶媒中に分散させて、例えば、液剤又は懸濁剤の形態において送達することができる。本発明の抗体は、好適な生理学的溶液、例えば、食塩水、又は他の薬理学的に許容される溶媒若しくは緩衝溶液中に懸濁することができる。当技術分野において知られている緩衝溶液の例は、ｐＨ約４．０から５．０を実現するように、水１ｍｌあたりエデト酸二ナトリウムを０．０５ｍｇから０．１５ｍｇ、ＮａＣｌを８．０ｍｇから９．０ｍｇ、ポリソルベートを０．１５ｍｇから０．２５ｍｇ、無水クエン酸を０．２５ｍｇから０．３０ｍｇ、及びクエン酸ナトリウムを０．４５から０．５５ｍｇ含むことができる。凍結乾燥抗体などの懸濁剤を用いてもよい。
【０２３３】
治療用懸濁剤又は液剤の製剤は、１つ又は複数の賦形剤も含むことができる。賦形剤は、当技術分野ではよく知られており、バッファー（例えば、クエン酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、及び重炭酸バッファー）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、及びグリセリンを含む。液剤又は懸濁剤は、リポソーム又は生分解性の微粒子中に封入することができる。製剤は、一般的に、無菌製造プロセスを使用して、実質的に無菌の形態において提供する。
【０２３４】
これには、当業者にはなじみのある方法による、製剤に用いる緩衝溶媒／溶液のろ過による生成及び滅菌、無菌緩衝溶媒溶液中の抗体の無菌懸濁、及び製剤の無菌容器中への分配が含まれ得る。
【０２３５】
本開示による霧化可能な（ｎｅｂｕｌｉｚａｂｌｅ）製剤を、例えば、ホイルエンベロープ中に包装した単一の用量単位（例えば、密封されたプラスチックコンテナ又はバイアル）として提供してもよい。各バイアルは、溶媒／溶液バッファー２ｍＬなどの体積中に単位用量を含む。
【０２３６】
本明細書に開示する抗体は、霧化による送達に適し得る。
【０２３７】
本発明の抗体は、遺伝子治療の使用により投与してもよいことが、やはり想定される。これを実現するために、好適なＤＮＡ成分の制御下で抗体分子の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ配列を、抗体鎖がＤＮＡ配列から発現され、インサイチューで構築されるように、患者中に導入する。
【０２３８】
本発明は、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳症、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、ＡＮＣＡ−関連血管炎、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索神経障害（Axonal & nal neuropathies）、バロー病、ベーチェット病、類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ−ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素病、先天性心伝導障害、コクサッキー心筋炎（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ）、ＣＲＥＳＴ病、本態性混合型寒冷グロブリン血症、脱髄性ニューロパチー、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デヴィック病（視神経脊髄炎）、拡張型心筋症、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸性血管中心性線維症、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エバンス症候群、線維化肺胞炎、巨細胞動脈炎（側頭動脈炎）、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発性血管炎を有する肉芽腫症（ＧＰＡ）、ウェゲナーを参照されたい、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本脳症、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン症、特発性低補体血性尿細管間質性腎炎（Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｈｙｐｏｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｍｉｃ  ｔｕｂｕｌｏｉｎｔｅｓｔｉｔｉａｌ  ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４−関連疾患、ＩｇＧ４−関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク、炎症性大動脈瘤、炎症性偽腫瘍、封入体筋炎、インスリン依存性糖尿病（１型）、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病、川崎症候群、キュットナー腫瘍（Ｋｕｔｔｎｅｒ’ｓ  ｔｕｍｏｕｒ）、ランバート−イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、全身性ループス（ＳＬＥ）、ライム病、慢性縦隔線維症、メニエール病、顕微鏡的多発性血管炎、ミクリッツ症候群、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ−ハーベルマン病、多巣性線維硬化症（Ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｆｉｂｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、多発性硬化症、重症筋無力症、筋肉炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック病）、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、オーモンド病（後腹膜線維症）、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（Ａ群溶連菌関連小児自己免疫神経精神疾患）、傍腫瘍性小脳変性症、異常タンパク性多発ニューロパチー（Ｐａｒａｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉｃ  ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｅｓ）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー−ロンベルグ症候群、パーソネージ−ターナー症候群、扁平部炎（末梢性ブドウ膜炎）、尋常性天疱瘡、大動脈周囲炎、動脈周囲炎、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎（Ｐｅｒｉｖｅｎｏｕｓ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ型多腺性自己免疫症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開術後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維化症（オーモンド病）、リウマチ熱、関節リウマチ、リーデル甲状腺腫、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣自己免疫（Ｓｐｅｒｍ  ＆  ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ）、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ−ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、小水疱水疱性皮膚疾患（Ｖｅｓｉｃｕｌｏｂｕｌｌｏｕｓ  ｄｅｒｍａｔｏｓｉｓ）、白斑、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、温式特発性溶血性貧血（Ｗａｒｍ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃ  ａｎａｅｍｉａ）、及びウェゲナー肉芽腫症（現在、多発性血管炎を有する肉芽腫症（ＧＰＡ）と呼ばれる）など、自己免疫疾患のコントロールにおいて用いるための抗体分子（又はそれを含む組成物）も提供する。
【０２３９】
さらなる適応症には、過粘稠度症候群、クリオグロブリン血症、移植腎における再発性限局性及び分節性糸球体硬化症、ＨＥＬＬＰ症候群、レフサム病、ＨＩＶ−関連神経障害、横紋筋融解症、及び同種免疫疾患も含まれ得る。
【０２４０】
一実施形態において、本開示による抗体又はフラグメントを、癲癇又は発作の処置又は予防において用いる。
【０２４１】
一実施形態において、本開示による抗体又はフラグメントを多発性硬化症の処置又は予防において用いる。
【０２４２】
一実施形態において、本開示の抗体及びフラグメントを、以下を含む同種免疫疾患／適応症において用いる：
−  抗ＨＬＡ抗体による移植ドナー不一致
−  胎児及び新生児同種免疫性血小板減少症、ＦＮＡＩＴ（又は新生児同種免疫性血小板減少症、ＮＡＩＴＰ若しくはＮＡＩＴ若しくはＮＡＴ、又は胎児−母体同種免疫性血小板減少症、ＦＭＡＩＴＰ若しくはＦＭＡＩＴ）
【０２４３】
さらなる適応症には、Ｆｃ含有生物薬物のヒト患者からの速やかなクリアランス、及び抗ＦｃＲｎ治療の、他の治療−ＩＶＩｇ、リツキサン、血漿交換法との併用が含まれる。例えば、抗ＦｃＲｎ治療を、リツキサン治療の後に用いてもよい。加えて、抗ＦｃＲｎ治療を用いて、腫瘍を画像化する上で用いた放射標識した抗体などの造影剤（ｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を速やかに一掃してもよい。
【０２４４】
一実施形態において、本開示の抗体及びフラグメントは、以下などの神経学的障害において用いられる：
−  慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）
−  ギランバレー症候群
−  異常タンパク性多発ニューロパチー
−  視神経脊髄炎（ＮＭＯ、ＮＭＯスペクトル障害、又はＮＭＯスペクトル疾患）、及び
−  重症筋無力症。
【０２４５】
一実施形態において、本開示の抗体及びフラグメントは、以下などの皮膚科障害において用いられる：
−  類天疱瘡
−  尋常性天疱瘡
−  ＡＮＣＡ関連血管炎
−  拡張型心筋症
【０２４６】
一実施形態において、本開示の抗体及びフラグメントは、以下などの免疫学的、血液学的障害において用いられる：
−  特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）
−  血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）
−  温式特発性溶血性貧血
−  グッドパスチャー症候群
−  抗ＨＬＡ抗体による移植ドナー不一致
【０２４７】
一実施形態において、障害は、重症筋無力症、視神経脊髄炎、ＣＩＤＰ、ギランバレー症候群、異常タンパク性多発ニューロパチー、難治癲癇、ＩＴＰ／ＴＴＰ、溶血性貧血、グッドパスチャー症候群、ＡＢＯ不適合、ループス腎炎、腎血管炎、強皮症、線維化肺胞炎、拡張型心筋症、グレーブス病、１型糖尿病、自己免疫性糖尿病、天疱瘡、強皮症、ループス、ＡＮＣＡ血管炎、皮膚筋炎、シェーグレン病、及び関節リウマチから選択される。
【０２４８】
一実施形態において、障害は、多腺性自己免疫症候群１型（ＡＰＥＣＥＤ又はウイタカー症候群）、及び２型（シュミット症候群）、汎発性脱毛症、筋無力症クリーゼ、甲状腺クリーゼ、甲状腺関連眼疾患、甲状腺眼障害、自己免疫性糖尿病、自己抗体関連脳炎及び／又は脳疾患、落葉状天疱瘡、表皮水疱症、疱疹状皮膚炎、シデナム舞踏病、急性運動性軸索性神経障害（ＡＭＡＮ）、ミラー−フィッシャー症候群、多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）、眼球クローヌス、炎症性筋疾患、アイザック症候群（自己免疫性神経性筋強直）、腫瘍随伴症候群、及び辺縁系脳炎から選択される。
【０２４９】
本開示による抗体及びフラグメントは、処置又は予防において用いてもよい。
【０２５０】
本発明は、個体に、本明細書に記載する治療有効用量の抗ＦｃＲｎ抗体融合タンパク質を投与するステップを含む、個体における望ましくない抗体の濃度を低下させる方法も提供する。
【０２５１】
本発明は、自己免疫疾患など、本明細書に記載する病理学的障害を処置及び／又は予防するための医薬の製造における、本発明による抗体分子の使用をさらに提供する。
【０２５２】
したがって、本発明はまた、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳症、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、ＡＮＣＡ−関連血管炎、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索神経障害、バロー病、ベーチェット病、類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ−ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素病、先天性心伝導障害、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ病、本態性混合型寒冷グロブリン血症、脱髄性ニューロパチー、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デヴィック病（視神経脊髄炎）、拡張型心筋症、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性血管中心性線維症、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脊髄炎、エバンス症候群、線維化性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎を有する肉芽腫症（ウェゲナー肉芽腫症を参照されたい）、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本脳症、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン症、特発性低補体血症性尿細管間質性腎炎、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４−関連疾患、ＩｇＧ４−関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク、炎症性大動脈瘤、炎症性偽腫瘍、封入体筋炎、インスリン依存型糖尿病（１型）、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病、川崎症候群、キュットナー腫瘍、ランバート−イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、全身性ループス（ＳＬＥ）、ライム病、慢性縦隔線維症、メニエール病、顕微鏡的多発性血管炎、ミクリッツ症候群、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ−ハーベルマン病、多巣性線維硬化症、多発性硬化症、重症筋無力症、筋肉炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック病）、好中球減少症、眼性瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、オーモンド病（後腹膜線維症）、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（Ａ群溶連菌関連小児自己免疫神経精神疾患）、傍腫瘍性小脳変性症、異常タンパク性多発性ニューロパチー、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー−ロンベルグ症候群、パーソネージ−ターナー症候群、扁平部炎（末梢性ブドウ膜炎）、尋常性天疱瘡、大動脈周囲炎、動脈周囲炎、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発性動脈炎、Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ型多腺性自己免疫症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症（オーモンド病）、リウマチ熱、関節リウマチ、リーデル甲状腺腫、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣自己免疫、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ−ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、小水疱水疱性皮膚疾患、白斑、ワルデンストレームマクログロブリン血症、温式特発性溶血性貧血及びウェゲナー肉芽腫症（現在、多発性血管炎を有する肉芽腫症（ＧＰＡ）と呼ばれる）からなる群から選択される自己免疫性疾患のコントロールにおいて用いるための抗体分子（又はそれを含む組成物）を提供する。
【０２５３】
一実施形態において、本開示は、例えば、レポーター分子にコンジュゲートしている、診断用試薬としての抗体又はそのフラグメントの使用を含む。よって、標識されている、本開示による抗体又はフラグメントを提供する。一態様において、本開示による抗体又はフラグメントを含むカラムを提供する。
【０２５４】
よって、以下のような使用のための試薬として用いるための抗ＦｃＲｎ抗体又は結合フラグメントを提供する：
１）マトリクスにコンジュゲートしており、アフィニティーカラムとして、又は（修飾されている形態の抗ＦｃＲｎとして）沈殿剤として（例えば、Ｆｃの添加により修飾され得（若しくは全長のＩｇＧとして生成され得）、任意選択により抗Ｆｃ試薬によって沈殿される、別の分子によって認識されるドメインで修飾されている形態として）用いられる、ＦｃＲｎタンパク質（又はそのフラグメント）の精製
２）生存している、或いは固定されている（ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞、又は組織若しくは細胞切片においてｉｎ  ｖｉｖｏで）、細胞上又は細胞中の、ＦｃＲｎの検出及び／又は定量。このための使用には、抗ＦｃＲｎ処置の効果を追跡するための生物マーカーとしてのＦｃＲｎの定量が含まれ得る。この目的では、候補物質を、修飾されている形態において（例えば、全長のＩｇＧにおけるなど、Ｆｃドメインの添加により、又は遺伝子融合タンパク質若しくは化学的コンジュゲートとして、例えば、検出の目的に用いる蛍光タグの添加など、いくつかの他の部分の添加により）用いてもよい。
３）（１）及び（２）に例示した方法によって修飾される候補物質に結合することにより標識される、ＦｃＲｎ保有細胞の精製又は選別。
【０２５５】
本発明はまた、抗体分子などの試験分子がＦｃＲｎ活性をブロックする能力、特に細胞がＩｇＧをリサイクルする能力を評価するのに適するアッセイを提供する。このようなアッセイは、抗体分子又は小分子などのＦｃＲｎ活性のインヒビターを同定するのに有用であり得、それ自体としてこのようなインヒビターの生成におけるバッチ放出アッセイとしても有用であり得る。アッセイは、ＷＯ２０１４／０１９７２７において、これまでに記載された。
【０２５６】
本明細書の文脈における含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味するものとされる。
【０２５７】
技術的に好適である場合、本発明の実施形態を組み合わせてもよい。
【０２５８】
実施形態を、ある種の特徴／要素を含むものとして本明細書で説明する。本開示は、前記の特徴／要素からなり、又は前記の特徴／要素から本質的になる別の実施形態にも拡張される。
【０２５９】
特許及び出願などの技術的な参考文献が、参照により本明細書に援用される。
【０２６０】
以下の実施例において、単なる例示の目的でさらに本発明を説明するが、参照される添付の図面は以下の通りである：
図１は、１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８が、ＭＤＣＫ  ＩＩクローン７細胞においてＩｇＧのリサイクルを阻害することを示す。
図２は、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスの血清中のヒトＩＶＩｇの濃度に対する１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８の効果を示す。
図３は、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける血清アルブミン濃度に対する１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８の効果を示す。
図４は、正常マウスにおける１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８の薬物動態を示す。
図５は、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８の薬物動態を示す。
図６は、親Ｆａｂ及び等価なＦａｂ−Ｆｖと比較した１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８（Ｆａｂ−ｓｃＦｖ）の熱安定性を示す。
図７は、本開示のＦａｂ−ｓｃＦｖ及びＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖフラグメントフォーマットを示す。
図８は、本開示による抗体配列を示す。
図９Ａは、抗体１６３８．ｇ４９のヒト化を示す。
図９Ｂは、抗体１６３８．ｇ４９のヒト化を示す。
【実施例】
【０２６１】
略語
℃  温度、摂氏度。
ＡＴＲ  ＦＴＩＲ  減衰全反射法フーリエ変換赤外分光測定法
ＣＨ２  重鎖定常領域２
ｃＩＥＦ  キャピラリー等電点電気泳動
ＤＳＣ  示差走査熱量測定
Ｇ０Ｆ  フコシル化アガラクトシル２分岐グリカン（ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ａｇｌａｃｔｏｓｙｌ  ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ  ｇｌｙｃａｎ）
Ｈ鎖  重鎖
ＨＰＬＣ  高速液体クロマトグラフィー
ＩｇＧ  免疫グロブリンＧ
Ｌ鎖  軽鎖
ｎＬＣＭＳ  ナノ液体クロマトグラフィー質量分析法
ＰＢＳ  リン酸緩衝食塩水バッファー
ｐＩ  等電点
ＳＤ  標準偏差
ＳＥＣ  サイズ排除クロマトグラフィー
ＴｏＦ  飛行時間
Ｔｍ  融解温度
ＴＣＥＰ  トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン
ＴＨＰ  トリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィン
Ｔｒｉｓ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
【０２６２】
Ｂ細胞の培養及び抗体のスクリーニングのための材料を産生するために、以下の免疫化を行った：
Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを、変異ヒトＦｃＲｎ（Ｌ３２０Ａ；Ｌ３２１Ａ）（Ｏｂｅｒら、２００１年、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３巻、１５５１〜１５５９頁）及びマウスβ２Ｍを同時発現するＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞の３回注射で免疫化し、ヒトＦｃＲｎ細胞外ドメインを４回目に最終ブーストした。血清を、変異ＦｃＲｎに対するＨＥＫ−２９３細胞上の結合、及びＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８を標識したヒトｇＧの結合を妨げる能力の両方に対してモニタリングした。両方の方法とも、フローサイトメトリーにより行った。結合に対して、フィコエリスリン（ＰＥ）標識した抗マウス又はラットＦｃ特異的二次試薬を用いて、血清中ＩｇＧの結合を明らかにした。
【０２６３】
Ｚｕｂｌｅｒら（１９８５年）が記載したのと同様の方法を用いて、Ｂ細胞培養物を調製した。簡潔に述べると、１ウエルあたりおよそ５０００細胞の密度のＢ細胞を、１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｌｔｄ）、２％ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、０．１％β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、２〜５％活性化ウサギ脾細胞培養物上清、及びガンマ線照射したＥＬ−４−Ｂ５マウス胸腺腫細胞（５×１０４／ウエル）を補ったＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）２００μｌ／ウエルを含む、バーコード化した９６ウエル組織培養プレート中、５％ＣＯ２の雰囲気中、３７℃で７日間、培養した。
【０２６４】
Ｂ細胞培養上清中のＦｃＲｎ特異的抗体の存在を、均一な蛍光ベースの結合アッセイを用いて、標的抗原の源として変異ＦｃＲｎ（表面を安定化した）を一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞を用いて決定した。上清１０μｌを、バーコード化した９６ウエル組織培養プレートから、１ウエルあたりトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞を５０００個含むバーコード化した３８４ウエル黒色壁アッセイプレート中に、Ｍａｔｒｉｘ  Ｐｌａｔｅｍａｔｅリキッドハンドラーを用いて移した。ヤギ抗ラット又はマウスＩｇＧＦｃγ特異的Ｃｙ−５コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）との結合が明らかになった。プレートを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ８２００細胞検出システム上で読み取った。３８の異なる免疫化動物を代表する３８００×９６ウエル培養プレートから、９８００個の抗ヒトＦｃＲｎバインダーを同定した。これはおよそ２５億個のＢ細胞のスクリーニングを表すと推定された。
【０２６５】
一次スクリーニング後、Ａｖｉｓｏ  Ｏｎｙｘヒットピッキング（ｈｉｔ−ｐｉｃｋｉｎｇ）ロボットを用いて、陽性の上清を、バーコード化した９６ウエルのマスタープレート上に集約し、細胞培養プレート中のＢ細胞を−８０℃で凍結させた。次いで、高親和性の抗体を含み、ヒトＩｇＧのＦｃＲｎへの結合を阻害する（下記を参照されたい）ウエルを同定するために、マスタープレートをＢｉａｃｏｒｅアッセイにおいてスクリーニングした。
【０２６６】
表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を用いた生体分子の相互作用分析を、ＢＩＡｃｏｒｅＴ２００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で行った。１０ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ５バッファー中ヤギ抗ラットＩｇＧ、Ｆｃガンマ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）を、アミンカップリング化学反応により、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ＋を用いて、およそ１９５００応答単位（ＲＵ）の捕獲レベルに、ＣＭ５  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ上で固定化した。５０ｍＭホスフェート、ｐＨ６＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌを、親和性アッセイ及びブロッキングアッセイに対するランニングバッファーとして用いた。Ｂ細胞培養物上清を、２００ｍＭホスフェート、ｐＨ６＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中、１対５に希釈した。希釈したＢ細胞上清の５μｌ／分で６００秒の注射を、固定化した抗ラットＩｇＧ、Ｆｃによる捕獲に用いた。１００ｎＭのヒトＦｃＲｎを、捕獲したＢ細胞培養物上清にわたって３０μｌ／分で１８０秒注射し、引き続き３６０秒解離した。ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、３０μｌ／分で１８０秒の解離で６０秒にわたって注射した。
【０２６７】
抗体の親和定数（ＫＤ）を決定し、ＩｇＧの結合をブロックしたものを決定するために、Ｔ２００評価ソフトウエア（バージョン１．０）を用いてデータを分析した。一代替のアッセイとして、細胞ベースのヒトＩｇＧブロッキングアッセイにおいて、マスタープレートの上清もスクリーニングした。マスタープレートからＢ細胞培養物上清２５ｕｌを、９６ウエルＵ底ポリプロピレン製プレートに加えた。次いで、変異ｈＦｃＲｎをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞（２５ｕｌＰＢＳｐＨ６／１％ＦＣＳ中、１ウエルあたり５０，０００細胞）を各ウエルに加え、４℃で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ培地１５０ｕｌで２回洗浄した。次いで、細胞を、７．５ｕｇ／ｍｌのＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８又は６４９で標識したヒトＩｇＧを含むＰＢＳ／ＦＣＳ培地５０ｕｌ／ウエル中に再懸濁し、４℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞を、培地１５０ｕｌで２回洗浄し、次いで、固定液として１％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ／ＦＣＳ培地３５ｕｌ／ウエル中に再懸濁した。次いで、プレートを、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ２フローサイトメーター上で読み取った。
【０２６８】
選り抜きの対象のウエルから抗体可変領域の遺伝子を回復させるために、逆重畳積分のステップを行って、Ｂ細胞の不均一な集団を含んでいた所与のウエル中、抗原特異的なＢ細胞の同定を可能にしなければならなかった。これは、蛍光輝点方法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｆｏｃｉ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて実現した。簡潔に述べると、陽性のウエルからの免疫グロブリン分泌性Ｂ細胞を、ビオチン化ヒトＦｃＲｎ、及び最終希釈１：１２００のヤギ抗ラット又はマウスＦｃγフラグメント特異的ＦＩＴＣコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）でコーティングしたストレプトアビジンビーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と混合した。１時間、３７℃の静的なインキュベート後、抗原特異的Ｂ細胞は、Ｂ細胞を取り囲む蛍光のハロが存在したため、同定することができた。Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡を用いて同定した、これら個々のＢ細胞を、次いで、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆマイクロマニュピレータで拾い、ＰＣＲチューブ中に堆積させた。蛍光輝点が、２６８個の選択されたウエルから産生された。
【０２６９】
抗体可変領域の遺伝子を、単一の細胞から、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ）−ＰＣＲにより、重鎖及び軽鎖の可変領域に特異的なプライマーを用いて回収した。２ラウンドのＰＣＲを、Ａｖｉｓｏ  Ｏｎｙｘリキッドハンドリングロボット上で行い、ネステッド２°ＰＣＲにより、３’及び５’終端に制限部位を組み入れ、可変領域をマウスγ１  ＩｇＧ（ＶＨ）又はマウスカッパ（ＶＬ）哺乳動物発現ベクター中にクローニングさせた。重鎖及び軽鎖構築物を対にしたものを、Ｆｅｃｔｉｎ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＥＫ−２９３細胞中に同時トランスフェクトし、体積１ｍｌ中、４８ウエルプレートにおいて培養した。発現５〜７日後、上清を収集し、抗体をさらなるスクリーニングにかけた。
【０２７０】
ＰＣＲにより、選択した１５６のウエルから、単一のＢ細胞から重鎖及び軽鎖の同源の対を上首尾に回収した。クローニングした可変領域遺伝子のＤＮＡ配列分析により、組換え抗体の数々の独特なファミリーが同定された。発現後、一過性の上清を、ヒトＩｇＧ  ＦＡＣＳブロッキングアッセイ（上記に記載した）及びＩｇＧリサイクルアッセイの両方において調査した。いくつかの場合において、精製したマウスγ１  ＩｇＧを生成し、試験した（それに従ってデータを標識した）。
【０２７１】
リサイクルアッセイは、９６ウエルプレートの１ウエルあたり２５，０００細胞に塗抹した、ヒトＦｃＲｎ及びベータ２ミクログロブリンを過剰発現するＭＤＣＫＩＩ細胞を用いるものであった。これらを５％ＣＯ２、３７℃で終夜インキュベートした。細胞をＨＢＳＳ＋Ｃａ／Ｍｇ  ｐＨ７．２＋１％ＢＳＡで洗浄し、次いで、多様な濃度のＨＥＫ−２９３一過性上清５０μｌ又は精製した抗体と、５％ＣＯ２、３７℃で１時間インキュベートした。上清を除去し、ＨＢＳＳ＋Ｃａ／Ｍｇ  ｐＨ５．９＋１％ＢＳＡ５０μｌ中、ビオチン化ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ）５００ｎｇ／ｍｌを細胞に加え、５％ＣＯ２、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞をＨＢＳＳ＋Ｃａ／Ｍｇ  ｐＨ５．９中で３回洗浄し、ＨＢＳＳ＋Ｃａ／Ｍｇ  ｐＨ７．２  １００μｌを細胞に加え、５％ＣＯ２、３７℃で２時間インキュベートした。上清を細胞から除去し、抗ヒトＩｇＧ捕獲抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）及びストレプトアビジン−スルホタグリビール（ｒｅｖｅａｌ）抗体（ＭＳＤ）でＭＳＤアッセイを用いて合計ＩｇＧに対して分析した。阻害曲線を、非線形の回帰分析によって分析してＩＣ５０値を決定した。
【０２７２】
これらのアッセイにおける性能に基づいて、配列番号１から６に示す６個のＣＤＲを含む抗体のファミリーを選択した。抗体ＣＡ１７０＿０１６３８は、ＷＯ２０１５／０７１３３０においてこれまで記載されるように、最良の活性を有し、ヒト化に関して選択された。
【０２７３】
（例１）ヒト化方法
ラット抗体Ｖ領域からのＣＤＲを、ヒト生殖系列抗体Ｖ領域フレームワーク上にグラフト化することによって、抗体ＣＡ１７０＿０１６３８をヒト化した。抗体の活性を回復するために、ラットＶ領域からのいくつかのフレームワーク残基も、ヒト化配列に保持された。これらの残基を、Ａｄａｉｒら（１９９１年）（Ｈｕｍａｎｉｓｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ＷＯ９１／０９９６７）が概略するプロトコールを用いて選択した。ラット抗体（ドナー）Ｖ領域配列の、ヒト生殖系列（アクセプタ）Ｖ領域配列とのアラインメントを図９Ａ及びＢに、デザインしたヒト化配列とともに示す。ドナーからアクセプタ配列にグラフト化したＣＤＲはＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、１９８７年）が規定した通りであるが、ＣＤＲ−Ｈ１は例外であり、Ｃｈｏｔｈｉａ／Ｋａｂａｔの組み合わされた定義が用いられる（Ａｄａｉｒら、１９９１年、Ｈｕｍａｎｉｓｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．、ＷＯ９１／０９９６７を参照されたい）。ヒトＶ領域ＩＧＫＶ１−２７プラスＪＫ４  Ｊ−領域（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を、軽鎖ＣＤＲに対するアクセプタとして選択した。ヒトＶ領域ＩＧＨＶ３−７プラスＪＨ３  Ｊ−領域（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を、重鎖ＣＤＲに対するアクセプタとして選択した。
【０２７４】
いくつかのバリアントの重鎖及び軽鎖のＶ領域配列をコードする遺伝子をデザインし、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ  ＧｍｂＨによる自動合成の取組みによって構築した。重鎖及び軽鎖両方のＶ領域のさらなるバリアントを、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発によってＶＨ及びＶＫ遺伝子を修飾することにより創出した。これらの遺伝子をいくつかのベクター中にクローニングして、ヒト化１６３８Ｆａｂ又は１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８の、それぞれ大腸菌及び哺乳動物細胞における発現を可能にした。バリアント鎖、及びこれらの組合せを、親抗体に対するこれらの作用強度、これらの生物物理学的性質、及び下流のプロセシングに対する適合性に対して評価し、ｇＬ７軽鎖グラフト及びｇＨ３３重鎖グラフトが選択された。最終の選択されたｇＬ７及びｇＨ３３グラフト配列をそれぞれ図９Ａ及びＢ、並びに配列番号８及び９に示す。このＶ領域の対を１６３８．ｇ４９と命名した。
【０２７５】
グラフトｇＬ７における軽鎖フレームワーク残基は全てヒト生殖系列遺伝子からのものであり、残基７０及び７１（Ｋａｂａｔナンバリング）が例外であるが、残基７０及び７１ではドナー残基のヒスチジン（Ｈ７０）及びチロシン（Ｙ７１）がそれぞれ保持された。これら２つの残基の保持は、ヒト化抗体又はＦａｂの完全な効力に重要であった。ｇＬ７グラフトのＣＤＲＬ２における残基５６は、アスパラギン酸（Ｄ５６）からグルタミン酸（Ｅ５６）残基に変異し、よってｇＬ７配列から潜在的なアスパラギン酸異性体化部位が除去された。グラフトｇＨ３３における重鎖フレームワーク残基は全てヒト生殖系列遺伝子からのものであり、残基４８及び７８（Ｋａｂａｔナンバリング）が例外であるが、残基４８及び７８ではドナー残基のロイシン（Ｌ４８）及びアラニン（Ａ７８）がそれぞれ保持された。これら２つの残基の保持は、ヒト化１６３８．ｇ４９Ｆａｂ又は１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８の完全な作用強度に不可欠であった。
【０２７６】
別の、より初期のグラフトである１６３８．ｇ２８もまた生成し、１６３８．ｇ４９グラフト（Ｆ２４、Ｌ４８、Ｋ７１、Ｔ７３、Ａ７８、及びＶ９３）よりも重鎖（ｇＨ２）により多くのドナー残基を含んでいた。この抗体の軽鎖（ｇＬ２）も、１６３８．ｇ４９において用いられる配列番号７の修飾されているＣＤＲＬ２よりも、むしろ配列番号５に示す非修飾のＣＤＲＬ２を含んでいる。両セットの抗体の配列を図８に示す。
【０２７７】
大腸菌において１６３８．ｇ４９Ｆａｂを発現させるために、ヒト化重鎖及び軽鎖のＶ領域遺伝子を、ＵＣＢ発現ベクターｐＭＸＥ８１１中にクローニングしたが、ｐＭＸＥ８１１はヒトＣ−カッパ定常領域（Ｋ１ｍ３アロタイプ）、切断型ヒンジを有するヒトガンマ−１  ＣＨ１定常領域（Ｇ１ｍ１７アロタイプ）、並びに大腸菌シャペロンタンパク質ＦｋｐＡ及びＤｓｂＣをコードするＤＮＡを含んでいる。
【０２７８】
１６３８．ｇ４９可変ドメインを含むＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ融合タンパク質は、それぞれ図８の配列番号１２及び配列番号１０に示す重鎖及び軽鎖配列を用いて、本質的にＷＯ２０１３／０６８５７１の例４に記載されるように構築及び発現させた。哺乳動物細胞における１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８と称されるＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ融合タンパク質を発現させるために、ヒト化軽鎖Ｖ領域遺伝子を、ヒトＣ−カッパ定常領域（Ｋ１ｍ３アロタイプ）をコードするＤＮＡ配列に接続して、近接する１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８軽鎖遺伝子を創出した。ヒト化重鎖Ｖ領域遺伝子を、ヒトガンマ−１  ＣＨ１定常領域ドメインをコードするＤＮＡ配列に接続した。重鎖定常領域を、４×ＧＧＧＧＳリンカー及びアルブミン結合ｄｓｓｃｆｖ  ６４５  ｇＨ５  ｇＬ４をコードするＤＮＡ配列に接続して、近接する１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８重鎖遺伝子を創出した。重鎖及び軽鎖遺伝子を、哺乳動物の二重遺伝子発現ベクターｐＭＸＥ７５５中にクローニングして、１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８を創出した。
【０２７９】
（例２）１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８の調製
１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８を、安定なジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞系（ＣＨＯ  ＤＧ４４）において発現させた。選択可能マーカーとしてのＤＨＦＲに関する遺伝子及び産物をコードする遺伝子を含んでいるプラスミドベクターを用いて、製造元の指示に従って、Ｎｕｃｌｅｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、ヒポキサンチン及びチミジンを欠如している培地中で、且つＤＨＦＲ阻害剤メトトレキサートの存在下で選択した。シェーカーフラスコ段階までのミニプールの培養後、成長及び生産性を評価して、最も高い発現クローンを、流加培養シェイクフラスコプロセスにおける評価に関して選択した。培養物８Ｌを、０．３×１０６個の生細胞／ｍＬの開始密度で接種して、３６．８℃で、５％ＣＯ２雰囲気中で制御した。栄養分フィードを、３日目から１２日目まで添加して、濃度が５．８ｇ／Ｌ未満に下がった場合には、グルコースをボーラス添加として添加した。培養物を、４０００×ｇで６０分間の遠心分離、続く０．２μｍ濾過によって、１４日目に収集した。
【０２８０】
ミニプール４Ｄ４から浄化した細胞培養上清を、０．２２μｍ滅菌濾過して、下記の通りに精製した。濾過した上清を、ＰＢＳ  ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）中で平衡化させたＧａｍｍａｂｉｎｄＰｌｕｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＫ５０  Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）４５０ｍｌ上へ、１８ｍｌ／分未満でローディングした。ローディングした後、カラムをＰＢＳ  ｐＨ７．４で洗浄して、続いて０．１Ｍ  グリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．７で溶出させた。溶出後に、２８０ｎｍでの吸光度による検出を行い、溶出ピークを収集した後、２Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．５で中和した。中和した試料を、１０ｋＤａ分子量カットオフ膜を有するＶｉｖａｆｌｏｗ  ５０  Ｃａｓｅｔｔｅ（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ）を使用して濃縮した。アリコートは、ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬ；５μｍ、０．２Ｍリン酸塩、ｐＨ７．０の定組成勾配を用いて、１ｍｌ／分で展開させた７．８×３００ｍｍカラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。モノマー％は、９０％であると決定された。濃縮試料のバルクを、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で平衡化させたＸＫ５０／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用させた。カラムは、ＰＢＳ、ｐＨ７．４の定組成勾配を用いて、１０ｍｌ／分で展開させた。画分を収集して、２８０ｎｍでの吸光度による検出を伴う、ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬ；５μｍ、０．２Ｍリン酸塩、ｐＨ７．０の定組成勾配を用いて、１ｍｌ／分で展開させた７．８×３００ｍｍカラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。選択したモノマー画分をプールして、１０ｋＤａ分子量カットオフ膜を有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５濃縮器及びスイングアウトローターにおける４０００×ｇでの遠心分離を使用して、２０ｍｇ／ｍｌを上回るように濃縮した。最終試料を、濃度に関しては、Ａ２８０  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  ＵＶ−可視分光光度計（Ｃａｒｙ  ５０Ｂｉｏ）によって；モノマー％に関しては、２８０ｎｍでの吸光度による検出を伴う、ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬ；５μｍ、０．２Ｍリン酸塩、ｐＨ７．０の定組成勾配を用いて、１ｍｌ／分で展開させた７．８×３００ｍｍカラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーによって；５０ｍＡ（ゲル１枚当たり）で５３分間の４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシン  １．５ｍｍゲル（Ｎｏｖｅｘ）上での還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの実施によって、及びエンドトキシンに関しては、Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）試験カートリッジを有するＣｈａｒｌｅｓ  ＲｉｖｅｒのＥｎｄｏＳａｆｅ（登録商標）Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｔｅｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍによってアッセイした。
【０２８１】
（例３）
さらなるＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ抗体を、Ｆａｂ位置で固定される代替的な抗ＦｃＲｎ  Ｖ領域を使用して設計し、これらは、ＷＯ２０１４／０１９７２７においてこれまで記載されて、またそれぞれ軽鎖及び重鎖ドメインについて、本明細書で配列番号９２及び配列番号９４において提供される１５１９．ｇ５７  Ｖ領域であった。このＦａｂは、例１において記載するように、アルブミン結合ｄｓｓｃＦｖ  ６４５  ｇＨ５  ｇＬ４（ＨＬ配向性（ｄｓＨＬ）で）連結された。表３に示すように、これらの分子は、重鎖（ＨＣ）Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ又は軽鎖（ＬＣ）Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖのいずれかとして構築された。ＨＣ  Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖについて、ＨＣのＣＨ１領域のＣ末端は、Ｇ４Ｓベースのリンカー（１１個のアミノ酸）を介してｄｓｓｃＦｖに連結され、このＨＣは、１５１９  軽ｃＫａｐｐａ鎖（ＬＣ）と対を成し、同様に、ＬＣ  Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖについて、ＬＣのｃＫａｐｐａ領域のＣ末端は、Ｇ４Ｓベースのリンカー（１１個のアミノ酸）を介してｄｓｓｃＦｖに連結され、これは、１５１９  ＣＨ１  ＨＣ（ヒンジなし）と対を成す。１５１９  Ｆａｂヒンジなし（ｎｈ）を対照として使用した。
【０２８２】
【表３】
2018516555.tif 000008
【０２８３】
遺伝子を、ｈＣＭＶプロモーターの制御下で、専有哺乳動物発現ベクター中にクローニングして、ＣＤ  ＣＨＯ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び２ｍＭ  グルタマックスを使用して一過性発現のためにＣＨＯ−Ｓ  ＸＥ細胞系（ＵＣＢ）にトランスフェクトした。培養物を３７℃、８．０％ＣＯ２、１４０ｒｐｍで、Ｋｕｈｎｅｒシェーカー中でインキュベートして、細胞が２×１０５個の細胞／ｍｌを上回って達した場合（およそ２４時間）、Ｔ℃は、３２℃に低減された。トランスフェクションの３日後に、Ｌトランスフェクション１回につき３ｍＭ酪酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、各フラスコに無菌的に添加した。培養物を合計１４日間インキュベートした。上清は、４℃で１時間、４０００ｒｐｍで培養物を遠心分離することによって収集されて、０．２μｍフィルターに通してフィルター滅菌した。１ｍｌのＧＥ  ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び室内で産生したＦａｂ標準を使用して、プロテインＧ  ＨＰＬＣによって、発現力価を定量化した。表４に示すように、ＬＣ  Ｆａｂ−ｓｃＦｖと比較した場合、ＨＣ  Ｆａｂ−ｓｃＦｖの発現力価のおよそ１．５倍増加が観察された。
【０２８４】
【表４】
2018516555.tif 000009
【０２８５】
抗体タンパク質は、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。簡潔に述べると、上清を、ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にローディングして、続いてＰＢＳ  ｐＨ７．４で洗浄した。結合した材料を、０．１ＭグリシンｐＨ  ２．７で溶出させて、２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で中和した後、ＰＢＳ  ｐＨ７．４へバッファーを交換した。溶出したタンパク質は、２８０ｎｍでの吸光度によって定量化して、さらなる分析用に４℃で保管した。
【０２８６】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ  ＨＰＬＣ）を使用して、抗体のモノマー状態を決定した。精製したタンパク質試料（およそ２０μｇ）を、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ、１０μｍ、７．５ｍｍのＩＤ×３００ｍｍカラム（Ｔｏｓｏｈ）上にローディングして、１ｍＬ／分で０．２Ｍ  リン酸塩ｐＨ７の定組成勾配を用いて展開した。連続検出は、２８０ｎｍでの吸光度によるものであった。各タンパク質のモノマー収率を表５に示す。
【０２８７】
【表５】
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【０２８８】
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析に関して、試料は、４×Ｎｏｖｅｘ  ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ試料バッファー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び１０×ＮｕＰＡＧＥ試料還元剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又は１００ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のいずれかを、１５１９  Ｆａｂ又はＦａｂ−ｓｃＦｖの精製タンパク質およそ２μｇへ添加することによって調製し、１００℃へ３分間加熱した。試料を、１５ウエルＮｏｖｅｘ  ４〜２０％  Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上にローディングして、Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳランニングバッファー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で１１０分間、１２５Ｖの一定電圧で分離させた。Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の幅広いタンパク質標準（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を標準として使用した。ゲルは、１０％メタノール、７．５％の酢酸中のクーマシーブリリアントブルー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で１時間染色して、蒸留水の数回の変更によって脱染した。およそ４７ｋＤａの理論的分子量（ＭＷ）を有する１５１９  Ｆａｂは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でより速い移動度を有することが示されている一方で、非還元ゲル類上のＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖは、それらの各々の理論的ＭＷよりもゆっくり移動することが観察された（表６）。これは、完全に予想外ではなく、文献においてこれまでに報告されてきた観察であり、タンパク質の差次的ＳＤＳ結合及び緻密な三次構造に起因し得る。関係なく、タンパク質が還元されると、それらの各々の理論的ＭＷに近い可動性率で、全てのタンパク質は移動した（表６）。
【０２８９】
【表６】
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【０２９０】
（例４）１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８の生物物理学的特性
１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８分子は、開発及び投与の安定性のため、分子の頑強性に関してスクリーニングするための一連の生化学的及び生物物理学的分析に付した。分析には、インタクト質量及びジスルフィド配置の確認のための質量分析、熱安定性（Ｔｍ）（アンフォールディング中間点での融解温度）；実験的等電点（ＰＩ）及び電荷バリアント、空気−液体界面（製造におけるせん断応力の模倣物）での凝集安定性並びに高濃度及び粘度安定性が含まれた。１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８の特徴は、１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８のＦａｂ部分と同じ可変領域配列を含む、考え得る場合の等価なＦａｂ、ＦａｂＦｖ及びＩｇＧ４分子と比較した。
【０２９１】
質量分析
（ｉ）精製した１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８のインタクト質量及び還元質量の両方が、Ｃ８濃縮カラムチップを有するＡｇｉｌｅｎｔ  ６５１０  Ｑ−Ｔｏｆを使用した質量分析によって得られた。インタクト質量は、９８％の水（１８．２メガオーム）、２％超等級メタノール、０．３％ギ酸を用いて、試料を０．１５ｍｇ／ｍＬに希釈することによって得られた。還元質量は、まず１ｍｇ／ｍＬの試料１００μｌを、１０ｍＭ  ＴＣＥＰとともに３７℃で４５分間インキュベートした後、９８％水（１８．２メガオーム）、２％超等級メタノール、０．３％ギ酸を用いて、０．１５ｍｇ／ｍＬに希釈することによって得られた。移動相Ａは、水（１８．２メガメガオーム）中の０．１％のギ酸であり、移動相Ｂは、８０％イソプロパノール、２０％アセトニトリル、０．１％ギ酸であった。データ処理は、ＡｇｉｌｅｎｔのＭａｓｓＨｕｎｔｅｒデコンボリューションソフトウエアを使用して実行した。インタクト質量及び還元質量は、理論値と一致した（表７）。
【表７】
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【０２９２】
（ｉｉ）ジスルフィド対形成は、非還元条件下での酵素消化、続く質量分析によって確認された。消化は、６Ｍ塩酸グアニジン中で、精製した１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８（１０ｍｇ／ｍＬ）２μＬを、５０ｍＭヨードアセトアミド（ｉｏｄａｃｅｔａｍｉｄｅ）１８μＬとともに３７℃で４５分間インキュベートすること、続いて２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）ｐＨ７．５  ４０μＬ＋０．５ｍｇ／ｍＬのＬｙｓＣ（供給される懸濁バッファー中）１μＬを添加することによって実施した。この混合物を、３７℃で７０分間さらにインキュベートした後、１ｍＭ塩化カルシウム  １００μＬで希釈した。キモトリプシン（１ｍＭ塩酸中０．５ｍｇ／ｍＬで１μＬ）を添加して、反応混合物を室温で終夜インキュベートした。次に、１０％ギ酸  １６μＬの添加によって、反応をクエンチした。続いて、試料を、Ａｃｑｕｉｔｙ  ｕＰＬＣ  ａｎｄ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計を使用して２０μＬ／分及び５５℃で、９５％溶媒Ａ：５％溶媒Ｂ（１：１  ＭｅＣｎ：１−プロパノール／０．１％ギ酸）で平衡化した１×１５０ｍｍ  Ｃ１８逆相カラムに適用させた。Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＭＳデータは、溶出中、範囲７００〜４０００ｍ／ｚで１５０００の解像度で、＋ｖｅ−イオンモードで収集した。データは、Ｔｈｅｒｍｏ  ＰｅｐＦｉｎｄｅｒソフトウエアを使用して処理した。
【０２９３】
１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８分子に関する予測ジスルフィド結合は全て、観察され、正しい未変化ジスルフィド対形成を確認した。
【０２９４】
熱安定性測定（Ｔｍ）
融解温度は、ダルベッコリン酸緩衝食塩水バッファー（ＰＢＳ）ｐＨ  ７．４中でＭｉｃｒｏ−Ｃａｌ  ＶＰ−Ｃａｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して測定し、ＷＯ２０１５／０７１３３０においてこれまで記載されているＦａｂ及びＦａｂ−Ｆｖ分子と比較した。分子をＰＢＳ  ｐＨ  ７．４を使用して１ｍｇ／ｍｌに調節して、Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  ５０−Ｂｉｏ分光光度計を使用して２８０ｎｍでの吸光度を使用して、最終濃度を確認した。抗体分子及びバッファーブランクは、ロボット付属品を使用して９６ウエルプレートから試料採取した。バッファーブランクを用いた２回のスキャンは、ベースライン減算のために実施した。分析は、受動的フィードバックモードを使用して、スキャン速度１℃／分で２０℃〜１１０℃で実施し、Ｏｒｉｇｉｎ  ７．０（Ｍｉｃｒｏｃａｌ分析ソフトウエアバージョン２．０）を使用して分析した。２つのアンフォールディングドメインを観察した（図６を参照されたい）。７８．９℃で第１のアンフォールディング事象は、ｓｃＦｖドメインに相当し、８４．８℃での第２のアンフォールディング事象は、Ｆａｂドメインに相当した。ｓｃＦｖの融解温度は、相当するＦｖよりも５．５℃高いことがわかり、したがって、ｓｃＦｖは、１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８フォーマットに、より大きな安定性を付与した。分子の分子安定性を付与するＦａｂドメインの高い融解温度は、親Ｆａｂ分子に関して得られるものと同等であり、したがって、フォーマットは、Ｆａｂドメインの熱不安定性をもたらさなかった。
【０２９５】
実験的ＰＩ及び電荷バリアントの分析
実験的ｐＩは、ホールキャピラリー画像化ｃＩＥＦ  ＩＣＥ３システム（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を使用して測定した。試料は、下記：試料（ＨＰＬＣ等級の水中の１ｍｇ／ｍＬのストックから）３０μＬ、１％メチルセルロース溶液（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）３５μＬ、ｐＨ３〜１０の両性電解質（Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ）４μＬ、４．６５合成ｐＩマーカー０．５μＬ及び９．７７合成ｐＩマーカー０．５μＬ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）、８Ｍ尿素溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１２．５Ｌを混合することによって調製した。ＨＰＬＣ等級水を使用して、最終容量を１００μＬにした。混合物を短時間ボルテックスして、完全な混合を確実にし、分析の前に、１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離して、気泡を除去した。試料に１．５ｋＶで１分間、続いて３ｋＶで５分間焦点を当てて、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅソフトウエアを使用して、キャピラリーのＡ２８０画像を撮影した。得られた電気泳動図を、まずｉＣＥ３ソフトウエアを使用して分析し、ｐＩ値を割り当てた（ｐＩマーカー間の直線関係）。続いて、Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウエア（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して、較正した電気泳動図を統合した。ｐＩは、高いことがわかり、９．１１であり、親Ｆａｂ分子（９．２２）に類似していた。酸性／塩基性種のパーセンテージは低く、親Ｆａｂ分子と同等であった。
【０２９６】
気液界面での凝集傾向
１ｍｇ／ｍＬでのＰＢＳ  ｐＨ７．４中の１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８の精製試料（３×２５０μｌのアリコート）を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍｉｘｍａｔｅを使用して１．５  ｍＬのエッペンドルフ中で２５℃にて１４００ｒｐｍでボルテックスした。分光光度計（Ｖａｒｉａｎ）を使用して５９５ｎｍでの吸収を獲得することによって、ボルテックス後の様々な時点で、濁度発生に関して試料を分析した。値５９５ｎｍの平均値を時間に対してプロットした。凝集傾向は、ボルテックスの最大４８時間まで低く、親Ｆａｂに等しいことがわかった。これにより、このフォーマットが、剪断応力（限外濾過）を含む製造ステップの間で、等価なＦａｂ分子と類似した凝集安定性を示すことが示される。１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８及び親Ｆａｂはともに、等価なＩｇＧ４フォーマットと比較して、より遅い凝集速度を示した。
【０２９７】
濃度及び粘度の効果
１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８が、２００  ｍｇ／ｍＬを上回るまで濃縮することができるかどうかを決定するために、ＰＢＳ  ｐＨ７．４０中の２１．５ｍｇ／ｍＬでの精製材料４ｍＬを、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心フィルターユニットＵｌｔｒａ−４（分子量カットオフ１０ｋＤａ）を使用して３５００ｇで４５分間、２１８．６ｍｇ／ｍＬに濃縮した。濾過後、可溶性凝集体又はフラグメントの検出については、サイズ排除ＵＰＬＣ（２×Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ２００  １．７μｍ、直列に４．６ｍｍ×１５０ｍｍのカラム、０．３ｍＬ／分、定組成、０．２Ｍリン酸バッファーｐＨ７．０）によって；不溶性部粒子材料の検出については、動的散乱（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏ  ＺＳ）によって、並びに凝集及びフラグメンテーション変化については、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（４〜２０％  Ｔｒｉｓ  グリシンゲル、定電圧１２５ｍＶを使用した非還元及び還元条件）によって、試料を分析した。濃縮の結果としての凝集又はフラグメンテーションに関する証拠は見られなかった。粘度は、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＤＨＲ−１  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒを使用して、２１８．６ｍｇ／ｍＬで測定した。無限速度粘度は、ＰＢＳ  ｐＨ７．４バッファー（非最適化製剤前バッファー）中で９．９±０．４６ｃＰであることがわかり、これは、１７．１±０．９ｃＰであるその選ばれた製剤バッファー中の等価なＦａｂ分子よりも低かった。１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８が、低粘度で高濃度に濃縮することができることが実証された。
【０２９８】
概して、１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８分子は、親Ｆａｂと同等である良好な生物物理学的特徴を示した。
【０２９９】
（例５）ｈＦｃＲｎ結合に対する１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８の親和性
表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を用いた生体分子の相互作用分析を、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で行い、ヒトＦｃＲｎ細胞外ドメインに対する結合を決定した。ヒトＦｃＲｎ細胞外ドメインを、ヒトＦｃＲｎアルファ鎖細胞外ドメイン（配列番号２１）とβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）（配列番号２３）との間の非共有結合性の複合体として提供した。１０ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ５バッファー中５０μｇ／ｍｌのＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ，Ｉｎｃ．）を、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、４０００〜５０００応答単位（ＲＵ）間の捕獲レベルに、アミンカップリング化学反応によりＣＭ５Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ上に固定化した。
【０３００】
親和性アッセイ用のランニングバッファーとして、５０ｍＭホスフェート、ｐＨ６＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．０５％Ｐ２０又はＨＢＳ−Ｐ＋、ｐＨ７．４（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。抗体１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８を、ランニングバッファー中で０．２５μｇ／ｍｌに希釈して、１０μＬ／分で６０秒の注入を、固定化抗ヒトＦ（ａｂ’）２による捕捉に使用した。ヒトＦｃＲｎ細胞外ドメインを、捕獲した１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８にわたって、３０μｌ／分の３００秒に対して、２０ｎＭから１．２５ｎＭまで滴定し、引き続き６００秒解離した。表面を、ｐＨ６のランニングバッファーに対して１０μｌ／分の２×６０秒の５０ｍＭ  ＨＣｌにより、又はｐＨ７．４のランニングバッファーに対して６０秒の４０ｍＭ  ＨＣｌ及び３０秒の１０ｍＭ  ＮａＯＨにより再生した。データを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウエア（バージョン１．０）を用い、ローカルＲｍａｘとの１：１結合モデルを用いて分析した。
【０３０１】
【表８】
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したがって、ヒトＦｃＲｎに関する１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８の親和性は、ｐＨ６．０で１６０ｐＭであり、ｐＨ７．４で４６ｐＭであると決定された。
【０３０２】
（例６）機能的な細胞ベースのアッセイ
ＦｃＲｎ発現は、本来細胞内であり（Ｂｏｒｖａｋ  Ｊら、１９９８年、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０巻（９）、１２８９〜９８頁、及びＣａｕｚａ  Ｋら、２００５年、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１２４巻（１）、１３２〜１３９頁）、エンドソーム膜及びリソソーム膜と関連する。ＩｇＧのＦｃポーションは酸性のｐＨ（＜６．５）でＦｃＲｎに結合するが、中性の生理学的ｐＨ（７．４）では結合せず（Ｒｈａｇａｖａｎ  Ｍら、１９９５年）、このｐＨ依存性によりＩｇＧのリサイクルが促進される。
【０３０３】
ＦｃＲｎに結合しているＩｇＧは、一旦、ピノサイトーシスによって取り込まれ、酸性のエンドソームに侵入すると、ＦｃＲｎと一緒に細胞表面にリサイクルされるが、生理学的に中性のｐＨでＩｇＧは放出される（Ｏｂｅｒ  ＲＪら、２００４年、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７２巻、２０２１〜２０２９頁）。ＦｃＲｎに結合していない任意のＩｇＧが、リソソームの分解性経路に侵入する。
【０３０４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイを確立して、１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８が、ＦｃＲｎのＩｇＧリサイクル能力を阻害する能力を調べた。簡潔に述べると、ＭＤＣＫＩＩクローン７細胞を、ビオチン化ヒトＩｇＧと、酸性バッファー（ｐＨ５．９）中、１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８の存在下及び非存在下でインキュベートしてＦｃＲｎに結合させた。過剰の抗体を全て除去し、表面に曝露され、結合され、内部移行したＩｇＧの上清中への放出を可能にする中性ｐＨのバッファー（ｐＨ７．２）中で細胞をインキュベートした。ＦｃＲｎの阻害を、ＭＳＤアッセイを用いて追跡して、リサイクルされ、よって上清中に放出されたＩｇＧの量を検出した。
【０３０５】
図１は、１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８が、ＭＤＣＫＩＩクローン７細胞におけるＩｇＧのリサイクルを阻害することを示す。ＭＤＣＫＩＩクローン７細胞を、９６ウエルプレート中１ウエルあたり２５，０００細胞塗抹し、５％ＣＯ２、３７℃で終夜インキュベートした。翌日、細胞をＨＢＳＳ＋（Ｃａ／Ｍｇ）ｐＨ７．２＋１％ＢＳＡで一度洗浄した。細胞を、１μｇ／ｍｌ（最終濃度５００ｎｇ／ｍｌ）のビオチン化ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ）とともに、３７℃にて５％ＣＯ２で１時間インキュベートした後に、ＨＢＳＳ＋（Ｃａ／Ｍｇ）ｐＨ５．９＋１％ＢＳＡ中で３７℃にて５％ＣＯ２で１時間、１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８の存在下及び非存在下で、ともにインキュベートした。細胞を、ＨＢＳＳ＋ｐＨ５．９で洗浄し、次いで、ＨＢＳＳ＋ｐＨ７．２中、５％ＣＯ２、３７℃で２時間インキュベートした。上清を細胞から除去し、ＭＳＤアッセイを用いて合計ＩｇＧに対して分析した（抗ヒトＩｇＧ捕獲抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）及びストレプトアビジン−スルホタグ検出抗体（streptavidin-sulpho tag reveal antibody）（ＭＳＤ）を用いて）。代表的な濃度応答曲線である図１に示すように、４  １７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８は、平均ＥＣ５０値（ｎ＝５）７．２ｎＭで濃度依存的な様式でＩｇＧのリサイクルを阻害する。
【０３０６】
（例７）１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８と非ヒト霊長類ＦｃＲｎとの交差反応性
表面プラズモン共鳴技術（ＳＰＲ）を使用した生体分子相互作用分析は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施して、カニクイザルＦｃＲｎ細胞外ドメインへの結合を決定した。カニクイザルＦｃＲｎ細胞外ドメインは、カニクイザルＦｃＲｎアルファ鎖細胞外ドメイン（配列番号１７）とβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）（配列番号１８）との間の非共有結合性複合体として供給された。１０ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ５バッファー中の５０μｇ／ｍｌでのＦ（ａｂ’）２特異的なＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ，Ｉｎｃ．）を、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、アミンカップリング化学を介して、４０００〜５０００応答単位（ＲＵ）の捕捉レベルにＣＭ５  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ上で固定した。
【０３０７】
５０ｍＭリン酸塩、ｐＨ６＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．０５％Ｐ２０又はＨＢＳ−Ｐ＋、ｐＨ７．４（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、親和性分析用のランニングバッファーとして使用した。抗体１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８を、ランニングバッファー中で０．５μｇ／ｍｌに希釈して、１０μｌ／分で６０秒の注入を、固定化抗ヒトＦ（ａｂ’）２による捕捉に使用した。カニクイザルＦｃＲｎ細胞外ドメインを、捕捉した１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８にわたって２０ｎＭ〜１．２５ｎＭまで、３０μｌ／分で３００秒間滴定した後、６００ｓの解離を行った。表面は、ｐＨ６でのランニングバッファーについて２×６０秒の５０ｍＭ  ＨＣｌによって、又はｐＨ７．４でのランニングバッファーについて６０秒の４０ｍＭ  ＨＣｌ及び３０秒の１０ｍＭ  ＮａＯＨによって、１０μｌ／分で再生させた。
【０３０８】
データは、ローカルＲｍａｘを用いた１：１結合モデルを使用したＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウエア（バージョン１．０）を使用して分析した。
【０３０９】
【表９】
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したがって、カニクイザルサルＦｃＲｎに関する１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８の親和性は、ｐＨ  ６．０で１５８ｐＭであり、ｐＨ７．４で４５ｐＭであると決定された。
【０３１０】
（例８）１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８処置は、ｈＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでｈＩｇＧのクリアランスを増強する
１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８の、ヒトＩＶＩＧのクリアランスに対する効果を、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウス（Ｂ６．Ｃｇ−Ｆｃｇｒｔｔｍ１Ｄｃｒ  Ｔｇ（ＦＣＧＲＴ）３２Ｄｃｒ／ＤｃｒＪ、ＪＡＸ  Ｍｉｃｅ）において決定した。マウスに、ヒトＩｇＧ（ヒトＩｇＩ  １０％Ｇａｍｕｎｅｘ−ｃ、Ｔａｌｅｃｒｉｓ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）５００ｍｇ／ｋｇを静脈内注入した。２４時間後、動物にビヒクル対照（ＰＢＳ）又は抗ＦｃＲｎを、単一用量（１００ｍｇ／ｋｇ）として静脈内から投薬した。抗ＦｃＲｎ処置に対して−１、８、２４、４８、７２、９６、１４４、及び１９２時間に、連続的な尾端血液試料を採取した。ｈＦｃＲｎマウスにおけるヒトＩｇＧの血清レベルを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって決定した。図２に提示するデータは、１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８の１処置群当たり５〜６匹のマウス及びＰＢＳビヒクル対照について２匹のマウスでの平均値±ＳＥＭである。１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８によるｈＦｃＲｎの阻止は、ｈ１ＶＩＧの加速クリアランスをもたらし、より低濃度の総ＩｇＧが、対照マウスと比較して観察された。これらの減少したＩｇＧ濃度は、２４時間から実験の最後まで、１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８対対照マウスの全ての用量に関して、有意に異なった（ｐ＜０．０１）。有意性は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びチューキーの事後検定（ｐｏｓｔ  ｔｅｓｔ）によって測定した。
【０３１１】
マウスＩｇＧは、これらのトランスジェニックマウスに存在したヒトＦｃＲｎに結合しなかったが、内因性のマウスアルブミンは結合し、ヒトＦｃＲｎによってリサイクルされた。抗ヒトＦｃＲｎの、ヒトＦｃＲｎへの結合は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、アルブミンの、ＦｃＲｎへの結合を阻止しないが、１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８のアルブミン結合特性を考慮して、内在性マウスアルブミンのクリアランスに対する効果を評価した。データを図３に示す。血清中のアルブミン濃度はいくぶん変わりやすいため（抗ＦｃＲｎ薬の注射前、マウス３０匹の群において１６．６から５９．９ｍｇ／ｍＬ）、群の結果をより簡単に比較できるようにするため、アルブミンデータを標準化し、時間ゼロでの血清アルブミン濃度のパーセント値として図３に示した。１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８は、７２時間後に１００ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇ用量で、約２５％で最大であるアルブミン濃度に対して中程度の効果を有し、１０ｍｇ／ｋｇでは効果を示さなかった。効果は、可逆的であるようであった。
【０３１２】
（例９）１７３５ｈ５ｂ．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８処置は、マウスにおいて、ＩｇＧの薬物動態と類似の、及びＦａｂフラグメントの予測ＰＫよりも優れた薬物動態を示す。
１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８のＰＫを、正常マウスにおいて決定した。１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８の１０ｍｇ／ｋｇのＩＶボーラス用量を、１２匹の雄Ｃ５７／Ｂｌ６マウスに投与した。血漿試料を、時点１つ当たり４匹の動物から選択された間隔で採取した。１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８の血漿濃度は、１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８のプロテオタイプペプチドについてＬＣ／ＭＳ−ＭＳアッセイによって決定した。血漿薬物動態パラメーターは、非区画分析を使用して得られた。１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８が、マウスにおいて投与される典型的なヒトＩｇＧのＰＫ特性に匹敵する特性を有することが、図４のデータにより示される。分布容量は、血漿容量（３４ｍＬ／ｋｇ）に類似しており、終末相半減期（ｔ１／２）は、４．１日であり、血漿クリアランス（ＣＬ）は、１４ｍＬ／日／ｋｇである。
【０３１３】
１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８のＰＫはまた、例７に記載する研究におけるヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおいても評価した（静脈内に５００ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧを注入し、続いて１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８を投与したＢ６．Ｃｇ−Ｆｃｇｒｔｔｍ１Ｄｃｒ  Ｔｇ（ＦＣＧＲＴ）３２Ｄｃｒ／ＤｃｒＪ，ＪＡＸマウス）。連続的な尾端血液試料を、１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８処置に対して、−２４、８、２４、４８、７２、９６、１４４及び１９２時間で採取して、１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８の血清レベルを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで決定した。図５に提示するデータは、１処置群当たり５匹のマウスからの平均値±ＳＥＭであり、１７３５ｈ５．ｈＦａｂ−ｓｃＦｖ．７６８のＰＫ特性が、同等の効力及び親和性を有する全ＩｇＧ抗ＦｃＲｎ分子と少なくとも同程度良好であることを示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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