(57)【要約】  本発明は、抗体、並びにセロトニン経路、トリプトファン経路、及びキヌレニン経路における代謝産物、例えば、５−ヒドロキシインドール−３−酢酸（５−ＨＩＡＡ）、メラトニン（ＭＴ）、及びキヌレン酸（ＫＹＮＡ）に対する抗体を調製する方法を提供する。代謝産物に特異的な抗体（specific metabolite antibodies）は、構造的に関連する代謝産物に対する交差反応性が低く、特異的及び高反応性免疫アッセイ用に有用な剤である。本発明は、ヒト患者由来の生体サンプル中の５−ＨＩＡＡ、メラトニン、又はキヌレン酸レベルを測定する際にかかる抗体を使用する方法も提供する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−ヒドロキシインドール−３−酢酸（５−ＨＩＡＡ）に対し特異的に結合し、トリプトファン（Ｔｒｐ）、セロトニン（５−ＨＴ）、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）、キヌレニン（ＫＹＮ）、キヌレン酸（ＫＹＮＡ）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、キノリン酸（ＱＵＩＮ）、アントラニル酸（ＡＮＡ）、セロトニン−Ｏ−スルフェート、セロトニン−Ｏ−ホスフェート、及びメラトニン（ＭＴ）からなる群から選択された１種以上のメンバーに対する交差反応性が１％未満である、単離抗体又はその抗体断片。
【請求項２】
前記抗体が、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、請求項１に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項３】
前記抗体が、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項４】
前記抗体断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、又はＦ（ａｂ）’２断片である、請求項１に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項５】
前記抗体又はその抗体断片が、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号＿で寄託された１２０４−１０Ｇ６Ｆ１１Ｈ３と表記されるハイブリドーマ細胞株により産生されたものである、請求項１に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項６】
前記抗体又はその抗体断片が、動物の免疫細胞が５−ＨＩＡＡに特異的に結合する抗体又はその抗体断片を産生する条件下で、キャリアタンパク質に結合している５−ＨＩＡＡ誘導体を含む免疫原で前記動物を免疫するステップ、並びに前記動物から前記抗体又はその抗体断片を単離するステップにより産生されたものである、請求項１に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項７】
前記動物が、ヤギ、ウサギ、又はマウスである、請求項６に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項８】
前記５−ＨＩＡＡ誘導体が、５−ＨＩＡＡのベンゾオキサゾール誘導体を含む、請求項６に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項９】
メラトニン（ＭＴ）に特異的に結合し、トリプトファン（Ｔｒｐ）、セロトニン（５−ＨＴ）、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）、５−ヒドロキシインドール−３−酢酸（５−ＨＩＡＡ）、キヌレニン（ＫＹＮ）、キヌレン酸（ＫＹＮＡ）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、キノリン酸（ＱＵＩＮ）、アントラニル酸（ＡＮＡ）、セロトニン−Ｏ−スルフェート、及びセロトニン−Ｏ−ホスフェートからなる群から選択された１種以上のメンバーに対する交差反応性が１％未満である、単離抗体又はその抗体断片。
【請求項１０】
前記抗体が、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、請求項９に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項１１】
前記抗体が、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項９に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項１２】
前記抗体断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、又はＦ（ａｂ）’２断片である、請求項９に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項１３】
前記抗体又はその抗体断片が、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号＿で寄託された１２１２−６Ｃ１Ｅ２Ｆ７表記されるハイブリドーマ細胞株により産生されたものである、請求項９に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項１４】
前記抗体又はその抗体断片が、動物の免疫細胞がメラトニンに特異的に結合する抗体又はその抗体断片を産生する条件下で、キャリアタンパク質に結合しているメラトニンを含む免疫原で前記動物を免疫するステップ、並びに前記動物から前記抗体又はその抗体断片を単離するステップにより産生されたものである、請求項９に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項１５】
キヌレン酸（ＫＹＮＡ）に特異的に結合し、トリプトファン（Ｔｒｐ）、セロトニン（５−ＨＴ）、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）、５−ヒドロキシインドール−３−酢酸（５−ＨＩＡＡ）、キヌレニン（ＫＹＮ）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、キノリン酸（ＱＵＩＮ）、アントラニル酸（ＡＮＡ）、セロトニン−Ｏ−スルフェート、セロトニン−Ｏ−ホスフェート、及びメラトニンからなる群から選択された１種以上のメンバーに対する交差反応性が１％未満である、単離抗体又はその抗体断片。
【請求項１６】
前記抗体が、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、請求項１５に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項１７】
前記抗体が、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１５に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項１８】
前記抗体断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、又はＦ（ａｂ）’２断片である、請求項１５に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項１９】
前記抗体又はその抗体断片が、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号＿で寄託された１１９４−６Ｈ５Ｂ１１Ａ７と表記されるハイブリドーマ細胞株により産生されたものである、請求項１５に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項２０】
前記抗体又はその抗体断片が、動物の免疫細胞がキヌレン酸（ＫＹＮＡ）に特異的に結合する抗体又はその抗体断片を産生する条件下で、キャリアタンパク質に結合しているＫＹＮＡを含む免疫原で前記動物を免疫するステップ、並びに前記動物から前記抗体又はその抗体断片を単離するステップにより産生されたものである、請求項１５に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項２１】
検出可能な標識を有する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項２２】
固体基材上に固定化されている、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項２３】
５−ＨＩＡＡに選択的に結合するモノクローナル抗体を産生及び分泌する、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号＿で寄託された１２０４−１０Ｇ６Ｆ１１Ｈ３と表記されるハイブリドーマ細胞株。
【請求項２４】
メラトニンに選択的に結合するモノクローナル抗体を産生及び分泌する、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号＿で寄託された１２１２−６Ｃ１Ｅ２Ｆ７と表記されるハイブリドーマ細胞株。
【請求項２５】
キヌレン酸に選択的に結合するモノクローナル抗体を産生及び分泌する、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号＿で寄託された１１９４−６Ｈ５Ｂ１１Ａ７と表記されるハイブリドーマ細胞株。
【請求項２６】
免疫アッセイにより、過敏性腸症候群に罹患している疑いのある患者由来のサンプル中の５−ＨＩＡＡレベルを検出する方法であって、
（ａ）好適な条件下で、請求項１に記載の単離抗体又はその抗体断片、前記患者から得たサンプル、及び固定化した５−ＨＩＡＡを接触させて、前記単離抗体又はその抗体断片と、前記サンプル中に存在する５−ＨＩＡＡ又は前記固定化した５−ＨＩＡＡと、を含む、複合体を形成させるステップと、
（ｂ）前記固定化した５−ＨＩＡＡを含む前記複合体に結合した抗体又はその抗体断片のレベルを検出するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の抗体又はその抗体断片のレベルをもとに前記サンプル中の５−ＨＩＡＡレベルを計算するステップと、を含む、方法。
【請求項２７】
前記単離抗体又はその抗体断片、前記サンプル及び前記固定化した５−ＨＩＡＡを同時に接触させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記単離抗体又はその抗体断片、前記サンプル及び前記固定化した５−ＨＩＡＡを順に接触させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫アッセイが競合的ＥＬＩＳＡである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
免疫アッセイにより、過敏性腸症候群に罹患している疑いのある患者由来のサンプル中のメラトニンレベルを検出する方法であって、
（ａ）好適な条件下で、請求項９に記載の単離抗体又はその抗体断片、前記患者から得たサンプル、及び固定化したメラトニンを接触させて、前記単離抗体又はその抗体断片と、前記サンプル中に存在するメラトニン又は前記固定化したメラトニンと、を含む、複合体を形成させるステップと、
（ｂ）前記固定化したメラトニンを含む前記複合体に結合した抗体又はその抗体断片のレベルを検出するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の抗体又はその抗体断片のレベルをもとに前記サンプル中のメラトニンレベルを計算するステップと、を含む、方法。
【請求項３１】
前記単離抗体又はその抗体断片、前記サンプル及び前記固定化したメラトニンを同時に接触させる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記単離抗体又はその抗体断片、前記サンプル及び前記固定化したメラトニンを順に接触させる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記免疫アッセイが競合的ＥＬＩＳＡである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
免疫アッセイにより、過敏性腸症候群に罹患している疑いのある患者由来のサンプル中のキヌレン酸（ＫＹＮＡ）レベルを検出する方法であって、
（ａ）好適な条件下で、請求項１５に記載の単離抗体又はその抗体断片、前記患者から得たサンプル、及び固定化したＫＹＮＡを接触させて、前記単離抗体又はその抗体断片と、前記サンプル中に存在するＫＹＮＡ又は前記固定化したＫＹＮＡと、を含む、複合体を形成させるステップと、
（ｂ）前記固定化したＫＹＮＡを含む前記複合体に結合した抗体又はその抗体断片のレベルを検出するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の抗体又はその抗体断片のレベルをもとに前記サンプル中のＫＹＮＡレベルを計算するステップと、を含む、方法。
【請求項３５】
前記単離抗体又はその抗体断片、前記サンプル及び前記固定化したＫＹＮＡを同時に接触させる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記単離抗体又はその抗体断片、前記サンプル及び前記固定化したＫＹＮＡを順に接触させる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記免疫アッセイが競合的ＥＬＩＳＡである、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]本出願は、２０１４年１１月１９日に出願された米国仮出願特許第６２／０８２，０４７号に対する優先権を主張するものであり、全目的に関し、かかる出願内容の全体を参照により援用する。
【０００２】
[0002]あらゆる胃腸障害の中でも、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）は最も一般的なものであり、一般集団の１０〜２０％が罹患しており、消化にまつわる愁訴をもつ患者の内の５０％以上を占めている。しかしながら、複数の研究により、ＩＢＳに罹患している患者のうち実際に医療にかかっている患者はわずか約１０％〜５０％にとどまっていることが示唆されている。ＩＢＳ患者は、例えば、主に排便に関係する腹痛、下痢、便秘、あるいは下痢及び便秘、腹部膨満、ガス、並びに粘液便（excessive mucus in the stool）などの異なる症状を示す。ＩＢＳ患者の４０％超は、重度の症状を有することから、勤務時間帯での休暇取得、社会生活の短縮、性交の回避、予定の取り消し、旅行の中止、服薬、並びに更には恥をかくことを恐れての引きこもり、などを余儀なくされている。米国では、ＩＢＳの医療費は年間８０億ドルにも上ると推定されている（Ｔａｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１０９：１７３６〜１７４１（１９９５））。
【０００３】
[0003]ＩＢＳ患者は、主に腸症状によって、便秘型ＩＢＳ（ＩＢＳ−Ｃ）、下痢型ＩＢＳ（ＩＢＳ−Ｄ）、混合型ＩＢＳ（ＩＢＳ−Ｍ）、及び分類不能型ＩＢＳ（ＩＢＳ−Ｕ）の３群に分類される。現在の医療では、ＩＢＳの診断はＲｏｍｅ  ＩＩＩ診断基準及び患者により示される症状をもとに行われている。この疾患の識別に使用可能な、特異的な生物学的バイオマーカー、Ｘ線検査による所見、内視鏡検査による所見、又は生理学的バイオマーカーは存在しない。
【０００４】
[0004]過敏性腸症候群は、不均一な機能性胃腸（ＧＩ）障害である。病態形成においてストレス応答及び免疫システムが関与していることを示唆するエビデンスが増加している。ストレス、例えば、急性又は慢性ストレスは、胃腸運動、臓器感覚（visceral perception）、消化管分泌物、腸透過性、及び腸管微生物叢を含む、腸のほとんど全ての面で影響を及ぼし得る。ＩＢＳは、しばしば脳−腸軸（brain-gut axis）の疾患として記載される。セロトニン（５−ＨＴ）は、重要な神経伝達物質であり、脳−腸軸の中枢神経系（ＣＮＳ）及び腸管神経系（ＥＮＳ）におけるシグナル分子である。セロトニンは、ＣＮＳ及びＥＮＳにおいて、必須アミノ酸のトリプトファンを変換することにより生成される。身体の全セロトニンのうち約９５％が腸で見られる（Ｋｅｓｚｔｈｅｙｌｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｎｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｍｏｔｉｌ，２７（８）：１１２７〜１１３７）。トリプトファンはトリプトファンヒドロキシラーゼにより５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）に変換され、５−ＨＴＰは芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼによりセロトニンに変換される。トリプトファンは、免疫応答又はストレス応答のいずれかにより、キヌレニン経路中で酵素により代謝を受け、神経毒性代謝産物及び神経保護代謝産物を生成する（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｏｅｎｔｅｒｏｌ，２０（３９）：１４１０５〜１４１２５）。
【０００５】
[0005]ＩＢＳの正確な病態生理はまだ解明されていない。セロトニンの代謝産物であるメラトニンは、強い抗酸化作用及び抗炎症活性を有しており、腸運動を制御し得ると説明されている（Ｋｏｎｔｕｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００７，５８：３８１〜４０５；Ｓｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２０１４，２０（１０）：２４９２〜２４９８）。平滑筋の運動活性に対し阻害作用を有することも明らかである（Ｂｅｂｅｕｉｋ  ａｎｄ  Ｐａｎｇ，Ｊ  Ｐｉｎｅａｌ  Ｒｅｓ，１９９４，１６：９１〜９９）。複数の研究により、閉経後の女性ＩＢＳ−Ｃ患者の腸においてメラトニンレベルが低下していることが示されている（Ｃｈｏｊｎａｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｋｒｙｎｏｌ  Ｐｏｌ，２０１３，６４（２）：１１４〜２０）。
【０００６】
[0006]キヌレン酸（ＫＹＮＡ）は、トリプトファン経路、セロトニン経路、及びキヌレニン経路の別の代謝産物であり、ＩＢＳに関与し得る。消化されたトリプトファンのうち１％がセロトニンに変換される一方、大部分はキヌレニン経路を介して代謝を受ける。ＩＢＳ患者では粘膜中のＫＹＮＡレベルが低下することがあり、このレベルの低下が、ＩＢＳの発症を促進する機能的、神経性、代謝性、又は炎症性の変化に関与している可能性がある（Ｋｅｓｚｔｈｅｌｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｓｙｃｈｏ  Ｒｅｓ，２０１３，７４：５００１〜５０４）。腸では、ＫＹＮＡは、神経保護作用、抗酸化作用、及び抗炎症作用を有しており、腸管運動及び感覚機能において役割を有し得る。
【０００７】
[0007]現在、ＩＢＳの治療に関し、セロトニン経路を対象とした治療薬が研究されている。メラトニンによる治療はＩＢＳ−Ｃ関連性の排便痛を緩和する見込みがあり（Ｅｌｓｅｎｂｒｕｃｈ，Ｇｕｔ，２００５，５４（１０）：１３５３〜１３５４）、更には、睡眠障害を有するＩＢＳ−Ｄ患者における腹痛を改善する見込みもある（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｕｔ，２００５，５４：１４０２〜１４０７）。
【０００８】
[0008]これらの観点から、当該技術分野では、被検者の生体サンプルから、トリプトファン経路、セロトニン経路及びキヌレニン経路の代謝産物を測定する方法又は定量する方法が必要とされている。更に、脳−腸−微生物叢軸をモニターすることにより、各個体においてＩＢＳを診断する方法も必要とされている。様々な代謝経路及び異化経路が適切に機能しているかを評価するアッセイが必要とされている。本発明はこれらの及びその他の必要性を満足するものである。
【発明の概要】
【０００９】
[0009]一態様では、本明細書において、５−ヒドロキシインドール−３−酢酸（５−ＨＩＡＡ）に対し特異的に結合し、トリプトファン（Ｔｒｐ）、セロトニン（５−ＨＴ）、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）、キヌレニン（ＫＹＮ）、キヌレン酸（ＫＹＮＡ）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、キノリン酸（ＱＵＩＮ）、アントラニル酸（ＡＮＡ）、セロトニン−Ｏ−スルフェート、セロトニン−Ｏ−ホスフェート、及びメラトニン（ＭＴ）からなる群から選択された１種以上のメンバーに対する交差反応性が１％未満である、単離抗体又はその抗体断片が提供される。単離抗体又は精製抗体は、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体であり得る。いくつかの実施形態では、単離抗体又は精製抗体は、キメラ抗体又はヒト化抗体である。単離又はその精製抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、又はＦ（ａｂ）’２断片であり得る。
【００１０】
[0010]いくつかの実施形態では、抗５−ＨＩＡＡ抗体又はその抗体断片は、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号＿で寄託された１２０４−１０Ｇ６Ｆ１１Ｈ３と表記されるハイブリドーマ細胞株により産生される。
【００１１】
[0011]一実施形態では、抗体又はその抗体断片は、動物の免疫細胞が５−ＨＩＡＡに特異的に結合する抗体又はその抗体断片を産生する条件下で、キャリアタンパク質に結合している５−ＨＩＡＡ誘導体を含む免疫原で動物を免疫するステップ、並びにかかる動物からかかる抗体又はその抗体断片を単離するステップ、により産生される。動物は、ヤギ、ウサギ、又はマウスであり得る。いくつかの実施形態では、５−ＨＩＡＡ誘導体は、５−ＨＩＡＡのベンゾオキサゾール誘導体を含む。
【００１２】
[0012]別の態様では、本明細書において、メラトニン（ＭＴ）に特異的に結合し、トリプトファン（Ｔｒｐ）、セロトニン（５−ＨＴ）、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）、５−ヒドロキシインドール−３−酢酸（５−ＨＩＡＡ）、キヌレニン（ＫＹＮ）、キヌレン酸（ＫＹＮＡ）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、キノリン酸（ＱＵＩＮ）、アントラニル酸（ＡＮＡ）、セロトニン−Ｏ−スルフェート、及びセロトニン−Ｏ−ホスフェートからなる群から選択された１種以上のメンバーに対する交差反応性が１％未満である、単離抗体又はその抗体断片が提供される。単離抗体又は精製抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であり得る。いくつかの実施形態では、単離抗体又は精製抗体は、キメラ抗体又はヒト化抗体である。単離又はその精製された抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、又はＦ（ａｂ）’２断片であり得る。
【００１３】
[0013]いくつかの実施形態では、抗メラトニン抗体又はその抗メラトニン抗体断片は、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号＿で寄託された１２１２−６Ｃ１Ｅ２Ｆ７と表記されるハイブリドーマ細胞株により産生される。
【００１４】
[0014]一実施形態では、抗体又はその抗体断片は、動物の免疫細胞が、メラトニンに特異的に結合する抗体又はその抗体断片を産生する条件下で、キャリアタンパク質に結合しているメラトニンを含む免疫原で動物を免疫するステップ、並びにかかる動物からかかる抗体又はその抗体断片を単離するステップ、により産生される。動物は、ヤギ、ウサギ、又はマウスであり得る。
【００１５】
[0015]更に別の態様では、本明細書において、キヌレン酸（ＫＹＮＡ）に特異的に結合し、トリプトファン（Ｔｒｐ）、セロトニン（５−ＨＴ）、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）、５−ヒドロキシインドール−３−酢酸（５−ＨＩＡＡ）、キヌレニン（ＫＹＮ）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、キノリン酸（ＱＵＩＮ）、アントラニル酸（ＡＮＡ）、セロトニン−Ｏ−スルフェート、セロトニン−Ｏ−ホスフェート、及びメラトニン（ＭＴ）からなる群から選択された１種以上のメンバーに対する交差反応性が１％未満である、単離抗体又はその抗体断片が提供される。単離抗体又は精製抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であり得る。いくつかの実施形態では、単離抗体又は精製抗体は、キメラ抗体又はヒト化抗体である。単離又はその精製された抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、又はＦ（ａｂ）’２断片であり得る。
【００１６】
[0016]いくつかの実施形態では、抗キヌレン酸抗体又はその抗キヌレン酸抗体断片は、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号＿で寄託された１１９４−６Ｈ５Ｂ１１Ａ７と表記されるハイブリドーマ細胞株により産生される。
【００１７】
[0017]一実施形態では、抗体又はその抗体断片は、動物の免疫細胞が、キヌレン酸（ＫＹＮＡ）に特異的に結合する抗体又はその抗体断片を産生する条件下で、キャリアタンパク質に結合しているＫＹＮＡを含む免疫原で動物を免疫するステップ、並びにかかる動物からかかる抗体又はその抗体断片を単離するステップ、により産生される。動物は、ヤギ、ウサギ、又はマウスであり得る。
【００１８】
[0018]いくつかの実施形態では、本明細書に記載の単離抗体又はその単離抗体断片のいずれかは、検出可能な標識を有する。
【００１９】
[0019]いくつかの実施形態では、本明細書に記載の単離抗体又はその単離抗体断片のいずれかは、固体基材上に固定される。
【００２０】
[0020]一態様では、本明細書において、５−ＨＩＡＡに選択的に結合するモノクローナル抗体を産生及び分泌し、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号＿で寄託された１２０４−１０Ｇ６Ｆ１１Ｈ３と表記されるハイブリドーマ細胞株が提供される。
【００２１】
[0021]いくつかの態様では、本明細書において、メラトニンに選択的に結合するモノクローナル抗体を産生及び分泌し、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号＿で寄託された１２１２−６Ｃ１Ｅ２Ｆ７と表記されるハイブリドーマ細胞株が提供される。
【００２２】
[0022]一態様では、本明細書において、キヌレン酸に選択的に結合するモノクローナル抗体を産生及び分泌し、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号＿で寄託された１１９４−６Ｈ５Ｂ１１Ａ７と表記されるハイブリドーマ細胞株が提供される。
【００２３】
[0023]同様にして、本明細書において、免疫アッセイにより、過敏性腸症候群に罹患している疑いのある患者由来のサンプル中の５−ＨＩＡＡレベルを検出する方法が提供される。方法は、（ａ）好適な条件下で、上記の単離抗体又はその単離抗体断片、患者から得たサンプル、及び固定化した５−ＨＩＡＡを接触させて、単離抗体又はその単離抗体断片と、サンプル中に存在する５−ＨＩＡＡ又は固定化した５−ＨＩＡＡと、を含む、複合体を形成させるステップと、（ｂ）固定化した５−ＨＩＡＡを含む複合体に結合した抗体又はその抗体断片のレベルを検出するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の抗体又はその抗体断片のレベルをもとにサンプル中の５−ＨＩＡＡレベルを計算するステップと、を含む。
【００２４】
[0024]いくつかの実施形態では、単離抗体又はその抗体断片、サンプル及び固定化した５−ＨＩＡＡは同時に接触させる。他の実施形態では、単離抗体又はその抗体断片、サンプル及び固定化した５−ＨＩＡＡは順に接触させる。免疫アッセイは、競合的ＥＬＩＳＡなどのＥＬＩＳＡであり得る。
【００２５】
[0025]一態様では、本明細書において、免疫アッセイにより、過敏性腸症候群に罹患している疑いのある患者由来のサンプル中のメラトニンレベルを検出する方法が提供される。方法は、（ａ）好適な条件下で、上記の単離抗体又はその単離抗体断片、患者から得たサンプル、及び固定化したメラトニンを接触させて、単離抗体又はその単離抗体断片と、サンプル中に存在するメラトニン又は固定化したメラトニンと、を含む、複合体を形成させるステップと、（ｂ）固定化したメラトニンを含む複合体に結合した抗体又はその抗体断片のレベルを検出するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の抗体又はその抗体断片のレベルをもとにサンプル中のメラトニンレベルを計算するステップと、を含む。
【００２６】
[0026]いくつかの実施形態では、単離抗体又はその抗体断片、サンプル及び固定化したメラトニンは同時に接触させる。他の実施形態では、単離抗体又はその抗体断片、サンプル及び固定化したメラトニンは順に接触させる。免疫アッセイは、競合的ＥＬＩＳＡであり得る。
【００２７】
[0027]一態様では、本明細書において、免疫アッセイにより、過敏性腸症候群に罹患している疑いのある患者由来のサンプル中のキヌレン酸（ＫＹＮＡ）レベルを検出する方法が提供される。方法は、（ａ）好適な条件下で、上記の単離抗体又はその単離抗体断片、患者から得たサンプル、及び固定化したＫＹＮＡを接触させて、単離抗体又はその単離抗体断片と、サンプル中に存在するＫＹＮＡ又は固定化したＫＹＮＡと、を含む、複合体を形成させるステップと、（ｂ）固定化したＫＹＮＡを含む複合体に結合した抗体又はその抗体断片のレベルを検出するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の抗体又はその抗体断片のレベルをもとにサンプル中のＫＹＮＡレベルを計算するステップと、を含む。
【００２８】
[0028]いくつかの実施形態では、単離抗体又はその抗体断片、サンプル及び固定化したキヌレン酸は同時に接触させる。他の実施形態では、単離抗体又はその抗体断片、サンプル及び固定化したキヌレン酸は順に接触させる。免疫アッセイは、競合的ＥＬＩＳＡであり得る。
【００２９】
[0029]本出願は、全目的に関し、国際公開ＷＯ２０１４／１８８３７７号及び同第ＷＯ２０１４／１８８３７８号の全体を参照により援用する。
【００３０】
[0030]これらの及びその他の態様、利点、及び実施形態は、以下の発明の詳細な説明及び図面をご覧いただくことにより明確になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
[0031]
【図１】セロトニン経路、トリプトファン経路、及びキヌレニン経路の代謝産物を示す。代謝産物としては、トリプトファン（Ｔｒｐ、１２２）、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ、１２５）、セロトニン（５−ＨＴ、１０１）、メラトニン（ＭＴ、１２０）、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ又は５ＨＩＡＡ、１１５）、キヌレニン（ＫＹＮ、１３１）、キヌレン酸（ＫＹＮＡ、１３５）、アントラニル酸（ＡＮＡ、１４０）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ、１４６）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ、１４９）、キノリン酸（ＱＵＩＮ；１６０）、及びキサンツレン酸（ＸＡ、１４８）が挙げられる。
【図２】本明細書に記載の競合的ＥＬＩＳＡの代表例を示す。
【図３Ａ】本明細書に記載の抗体を生成するのに使用される免疫原性複合物を示す。免疫原としては、５−ＨＩＡＡ（図３Ａ）、メラトニン（図３Ｂ）、及びキヌレン酸（図３Ｃ）のベンゾオキサゾール誘導体をハプテンとするものが挙げられる。ハプテンは、ＰＥＧリンカーなどのリンカーを介しキャリアタンパク質に結合させた。
【図３Ｂ】本明細書に記載の抗体を生成するのに使用される免疫原性複合物を示す。免疫原としては、５−ＨＩＡＡ（図３Ａ）、メラトニン（図３Ｂ）、及びキヌレン酸（図３Ｃ）のベンゾオキサゾール誘導体をハプテンとするものが挙げられる。ハプテンは、ＰＥＧリンカーなどのリンカーを介しキャリアタンパク質に結合させた。
【図３Ｃ】本明細書に記載の抗体を生成するのに使用される免疫原性複合物を示す。免疫原としては、５−ＨＩＡＡ（図３Ａ）、メラトニン（図３Ｂ）、及びキヌレン酸（図３Ｃ）のベンゾオキサゾール誘導体をハプテンとするものが挙げられる。ハプテンは、ＰＥＧリンカーなどのリンカーを介しキャリアタンパク質に結合させた。
【図３Ｄ】本明細書に記載の抗体を生成するのに使用される免疫原性複合物を示す。セロトニン誘導体（５ＨＴ−ｄ）、及び５−ヒドロキシインドール酢酸誘導体（５−ＨＩＡＡ−ｄ）を含む、代謝産物誘導体の分離を示すＨＰＬＣクロマトグラムを提供する。
【図４Ａ】免疫原性複合物を使用した抗体産生の概略図を提供する。モノクローナル抗体の産生及びポリクローナル抗体の産生に使用できる免疫原性複合物を示す。
【図４Ｂ】免疫原性複合物を使用した抗体産生の概略図を提供する。設計した抗原によるマウスの免疫化、ハイブリドーマクローンの生成、並びに記載の抗原に特異的なモノクローナル抗体の単離を含む、モノクローナル抗体の産生プロセスを示す。
【図５Ａ】５−ＨＩＡＡ誘導体合成により作成する化学反応スキームを提供する。ＰＥＧリンカーと結合させた、５−ＨＩＡＡのベンゾオキサゾール誘導体を示す。
【図５Ｂ】５−ＨＩＡＡ誘導体合成により作成する化学反応スキームを提供する。ＰＥＧリンカーを介しビオチンと結合させた、５−ＨＩＡＡのベンゾオキサゾール誘導体を示す。
【図６Ａ】ハイブリドーマクローン１０Ｇ６Ｆ１１Ｈ３により産生されたマウスモノクローナル抗体の反応性を示す。抗体は、５−ＨＩＡＡに対し特異的に結合する（免疫反応性である）。５−ＨＩＡＡに対する、未希釈の抗体及び１：２００希釈のモノクローナル抗体の結合の類似性を示す。
【図６Ｂ】ハイブリドーマクローン１０Ｇ６Ｆ１１Ｈ３により産生されたマウスモノクローナル抗体の反応性を示す。抗体は、５−ＨＩＡＡに対し特異的に結合する（免疫反応性である）。未固定化の５−ＨＩＡＡと、固定化した５−ＨＩＡＡとの競合アッセイにより得られたデータを示す。ウェルに未結合の５−ＨＩＡＡを全く加えなかった場合（０ｎｇ／ｍＬ）には、未結合の５−ＨＩＡＡを１００ｎｇ／ｍＬ存在させた場合と比較して高ＯＤが検出された。高ＯＤは、固定化した５−ＨＩＡＡへの抗体の結合が高レベルであったことに相当する。低ＯＤは、本アッセイにおいて、固定化した５−ＨＩＡＡへの抗体の結合が低レベルであったこと、並びに未固定化の５−ＨＩＡＡへの抗体の結合が高レベルであったことに相当する。
【図６Ｃ】ハイブリドーマクローン１０Ｇ６Ｆ１１Ｈ３により産生されたマウスモノクローナル抗体の反応性を示す。抗体は、５−ＨＩＡＡに対し特異的に結合する（免疫反応性である）。未結合の５−ＨＩＡＡの濃度を様々に変えた、各種希釈濃度でのモノクローナル抗体の滴定を示す。
【図６Ｄ】ハイブリドーマクローン１０Ｇ６Ｆ１１Ｈ３により産生されたマウスモノクローナル抗体の反応性を示す。抗体は、５−ＨＩＡＡに対し特異的に結合する（免疫反応性である）。抗５−ＨＩＡＡモノクローナル抗体がセロトニンに対する交差反応性を有さず、かつ抗５ＨＴモノクローナル抗体が５−ＨＩＡＡに対する交差反応性を有しないことを示す。
【図７Ａ】ハイブリドーマクローン１０Ｇ６Ｆ１１Ｈ３由来のモノクローナル抗体が、５−ＨＩＡＡに対する特異性を有し、ただしトリプトファン代謝産物、セロトニン代謝産物、又はキヌレニン代謝産物に対する特異性は有しないことを示す。抗体が、４−ヒドロキシキノリン、３−ヒドロキシ−ＤＬ−キヌレニン、及びメラトニンに対する交差反応性を有しないことを示す。
【図７Ｂ】ハイブリドーマクローン１０Ｇ６Ｆ１１Ｈ３由来のモノクローナル抗体が、５−ＨＩＡＡに対する特異性を有し、ただしトリプトファン代謝産物、セロトニン代謝産物、又はキヌレニン代謝産物に対する特異性は有しないことを示す。セロトニン（５−ＨＴ）、５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン、及びＮ−アセチル−５−ヒドロキシトリプタミンに対し交差反応性を有しないことを示す。ハイブリドーマクローン１０Ｇ６Ｆ１１Ｈ３から生成されたモノクローナル抗体は、抗５ＨＩＡＡであり、ＩｇＧ１κ抗体である。
【図８】抗５−ＨＩＡＡのモノクローナル抗体の標準曲線を示す。希釈倍率は５倍とし、濃度は０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲とした。
【図９】ウサギ＃１６４０１、＃１６４０２、及び＃１６４０３の採血前及び採血１〜９時（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、及びＢ９）の抗血清中の抗メラトニンポリクローナル抗体を示す。ウサギを、本明細書に記載のメラトニン免疫原性複合物で免疫した。ウサギ＃１６４０１は最も高い抗メラトニン抗体力価を示した。
【図１０Ａ】アフィニティ精製した抗メラトニンウサギポリクローナル抗体の、競合的ＥＬＩＳＡにおける反応性を示す。アッセイでは、メラトニン（２５μｇ／ｍＬ）をウェルの表面上に固定化した。未結合の（固定化されていない、又は未結合の）メラトニン及びアフィニティ精製した抗メラトニンウサギポリクローナル抗体を各ウェルに添加した。添加した未結合のメラトニン量は、０．００ｍＭ（グラフの右側）から８．００ｍＭ（グラフの左側）の範囲とした。ＯＤ測定値により、固定化したメラトニンに結合した抗体の量が表される。同様の競合アッセイにおいて、メラトニンに構造的に類似している、他の競合する（結合していない（free）、固定化していない（not immobilized）、又は未結合の（unbound）））化合物を抗体及び固定化したメラトニンとインキュベートした。
【図１０Ｂ】アフィニティ精製した抗メラトニンウサギポリクローナル抗体の、競合的ＥＬＩＳＡにおける反応性を示す。アッセイでは、メラトニン（２５μｇ／ｍＬ）をウェルの表面上に固定化した。未結合の（固定化されていない、又は未結合の）メラトニン及びアフィニティ精製した抗メラトニンウサギポリクローナル抗体を各ウェルに添加した。添加した未結合のメラトニン量は、０．００ｍＭ（グラフの右側）から８．００ｍＭ（グラフの左側）の範囲とした。ＯＤ測定値により、固定化したメラトニンに結合した抗体の量が表される。同様の競合アッセイにおいて、メラトニンに構造的に類似している、他の競合する（結合していない（free）、固定化していない（not immobilized）、又は未結合の（unbound）））化合物を抗体及び固定化したメラトニンとインキュベートした。図１０Ｂは、アフィニティ精製したウサギ抗体は、セロトニン（Ser）、トリプトファン（Ｔｒｙｐ）、又は５−ＨＩＡＡに対し交差反応性を有しないことを示す。
【図１１】メラトニンに対するモノクローナル抗体の特異性を示す。グラフは、４種類のハイブリドーマクローン（６Ｃ１Ｅ２Ｆ７、６Ｃ２Ｈ４Ｃ８、７Ｃ７Ｆ１Ｇ２、及び７Ｃ８Ａ１Ｄ２）由来の抗体がメラトニンに対し特異的に結合し、セロトニン、トリプトファン、及び５−ＨＩＡＡに対する交差反応性は見られないことを示す。ハイブリドーマクローン６Ｃ１Ｅ２Ｆ７から生成されたモノクローナル抗体は、抗メラトニンＩｇＧ３κ抗体である。
【図１２】ハイブリドーマクローン６Ｃ１Ｅ２Ｆ７由来のモノクローナル抗メラトニン抗体の標準曲線を提供する。
【図１３Ａ】キヌレン酸（ＫＹＮＡ）に対するウサギポリクローナル抗体の反応性を示す。本明細書で記載のＫＹＮＡ免疫原性複合物で免疫したウサギの抗血清は、ＫＹＮＡに特異的に結合する抗体を含むことを示す。図１３Ａは、未結合のＫＹＮＡが、固定したＫＹＮＡと抗体の結合について競合する、競合的ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。このアッセイでは、未結合のＫＹＮＡの量は、０μｇ／ｍＬ（右側）〜５００μｇ／ｍＬ（左側）の範囲とした。ＯＤ測定値により、固定化したＫＹＮＡに結合した抗体の量が表される。未結合のＫＹＮＡを添加しない場合（０．００μｇ／ｍＬ）、抗ＫＹＮＡ抗体は固定化したＫＹＮＡ抗原に対し結合し、これは高ＯＤ値により表された。未結合のＫＹＮＡ抗原を添加した場合、固定化した抗原に結合する抗体は減少し、これは低ＯＤ値により表された。
【図１３Ｂ】キヌレン酸（ＫＹＮＡ）に対するウサギポリクローナル抗体の反応性を示す。同様の競合アッセイの結果を示す。このアッセイでは、抗体の量は、同様に１：２５０の希釈率から１：２５００の希釈率までの範囲とした。
【図１４Ａ】キヌレン酸（ＫＹＮＡ）に対するマウスモノクローナル抗体の反応性を示す。ハイブリドーマクローン４Ｂ１１Ｈ９Ａ２及び６Ｈ５Ｂ１１Ａ７由来の抗体がＫＹＮＡに特異的に結合し、３−ＯＨ−ＤＬ−キヌレニン、セロトニン、トリプトファン、Ｎ−アセチル−５−ヒドロキシ−トリプタミン、及び５−Ｏｈ−キノリンに対しては交差反応性を有しないことが示される。競合的ＥＬＩＳＡでは、ＫＹＮＡと構造的に類似する化合物は、抗体のＫＹＮＡに対する結合に干渉しなかった。
【図１４Ｂ】キヌレン酸（ＫＹＮＡ）に対するマウスモノクローナル抗体の反応性を示す。未希釈及び希釈した抗ＫＹＮＡマウスモノクローナル抗体のＫＹＮＡに対する結合を示す。ハイブリドーマクローン６Ｈ５Ｂ１１Ａ７から生成されたモノクローナル抗体は、抗ＫＹＮＡであり、ＩｇＧ１κ抗体である。
【図１５Ａ】ハイブリドーマクローン６Ｈ５Ｂ１１Ａ７により産生されたマウスモノクローナル抗体がキヌレン酸に特異的に結合することを示す。図１５Ａに示すとおり、未結合のＫＹＮＡ抗原は、本明細書において提供される競合的ＥＬＩＳＡにおける抗体の結合に関し、固定化したＫＹＮＡ抗原と競合する。未結合のＫＹＮＡの量が増加すると、固定化した抗原に結合する抗体は減少し、ＯＤ値が低下する。
【図１５Ｂ】ハイブリドーマクローン６Ｈ５Ｂ１１Ａ７により産生されたマウスモノクローナル抗体がキヌレン酸に特異的に結合することを示す。図１５Ｂは、抗ＫＹＮＡマウスモノクローナル抗体の標準曲線を示す。
【図１６Ａ】本明細書で開示される競合的ＥＬＩＳＡの代表的な実施形態により得られる結果を示す。ＴＭＢ基質を用いた呈色反応を示す。
【図１６Ｂ】本明細書で開示される競合的ＥＬＩＳＡの代表的な実施形態により得られる結果を示す。発光基質を用いた検出反応を示す。発光基質を使用するアッセイでは、ＴＭＢ基質によるアッセイよりも感度が高くなった。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
Ｉ．定義
[0047]本明細書で使用するとき、用語「ａ」、「ａｎ」又は「ｔｈｅ」は、各要素を単数のみで含む態様だけではなく、各要素を１つ以上で含む態様も含む。例えば、「ポリアミン化合物及び賦形剤（a polyamine compound and an excipient）」を含む実施体は、ある種の態様では、少なくとも２つのポリアミン化合物、少なくとも２つの賦形剤、又はその両方を含むものとして理解されるべきである。
【００３３】
[0048]用語「抗原」は、抗体に特異的に結合し得る、なんらかの分子、化合物、組成物、又は粒子を指す。抗原は、抗体と反応する１つ以上のエピトープを有しているものの、これは抗体の産生を誘導するのに必須ではない。
【００３４】
[0049]用語「抗体」は、特定の抗原と免疫学的に反応する免疫グロブリン分子を指し、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を含む。この用語は、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）及びヘテロ複合物抗体（heteroconjugate antibodies）（例えば、二重特異性抗体）などの、遺伝子工学により設計された形態も含む。用語「抗体」は、例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及びｄｉ−ｓｃＦｖといった、抗原結合能を有する断片などの、抗原を結合する抗体の形態も含む（例えば、Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ１９９８）。この用語は、二価又は二重特異性分子、二重特異性抗体、三重特異性抗体（triabodies）、及び四重特異性抗体（tetrabodies）を更に含む。二価及び二重特異性分子は、例えば、Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．に報告されている（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１９９７；６：７８１〜９，ａｎｄ  Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９６；５６：３０５５〜６１を参照されたい）。様々な抗体断片が、インタクトな抗体の消化産物という観点で定義される一方、当業者は、化学的に、又は組み換えＤＮＡ法を利用することにより断片をデノボ合成可能であることも理解されるであろう。したがって、本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、完全な抗体の改変（the modification of whole antibodies）又は組み換えＤＮＡ法のいずれかにより産生された抗体断片を含む。
【００３５】
[0050]抗体は、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子の断片により実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドから構成され得る。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、定常領域のκ、λ、α、γ、δ、ε及びμ遺伝子、並びに数々の免疫グロブリン可変領域の遺伝子が挙げられる。軽鎖はκ鎖及びλ鎖のいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、又はεとして分類され、この重鎖により、免疫グロブリンの区分ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥがそれぞれ定義される。「抗体」は、結合タンパク質として機能し、抗体を産生する動物の免疫グロブリンをコードしている遺伝子のフレームワーク領域のアミノ酸配列、又はかかる領域に由来するアミノ酸配列を含むものとして構造的に定義される。
【００３６】
[0051]典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造ユニットは四量体を構成することが知られている。各四量体は、同一な２対のポリペプチド鎖から構成され、各対は、一本の「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び一本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識に関係する、約１００〜１１０個以上のアミノ酸からなる可変領域を特徴づける。用語「軽鎖可変部（ＶＬ）」及び「重鎖可変部（ＶＨ）」が、それぞれこれらの軽鎖及び重鎖を指す。
【００３７】
[0052]抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が連結して（直接的に又はペプチドリンカーを介し）連続的なポリペプチドを形成している一本鎖Ｆｖ抗体（ｓＦｖ又はｓｃＦｖ）などの一本鎖抗体（一本のポリペプチド鎖として存在する抗体）を含む、ＶＨ−ＶＬ二量体を含み得る。一本鎖Ｆｖ抗体は、共有結合したＶＨ−ＶＬであり、ＶＨ−ＶＬは、直接的に結合される、又はペプチドをコードしているリンカーにより結合されるＶＨコード配列及びＶＬ−コード配列を含む核酸により発現され得る（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９〜５８８３，１９８８）。ＶＨ及びＶＬは、互いに単一のポリペプチド鎖として結合しており、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは非共有結合的に結合する。あるいは、抗体は別の断片であり得る。その他の断片を、例えば、組み換え法により、可溶性タンパク質又はディスプレイ法により得られた断片として生成することもできる。抗体は、２抗体（diantibodies）及びミニ抗体も含み得る。本発明の抗体は、ラクダ科動物由来の抗体などの重鎖二量体も含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、抗体は二量体である。他の実施形態では、抗体は、活性なアイソタイプを有する単量体の形態であってもよい。いくつかの実施形態では、抗体は、抗原を架橋可能な多価の形態であり、例えば、３価又は４価の形態である。
【００３８】
[0053]用語「抗体断片」又は「抗原結合断片」は、免疫グロブリン分子の、標的に結合する可変領域、すなわち、抗原認識ドメイン又は抗原結合領域の、少なくとも一部を指す。一部の免疫グロブリンの定常領域は含まれ得る。抗体断片の例としては、線状抗体（linear antibodies）、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ断片、超可変領域又は（ro）相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＶＬ（軽鎖可変領域）、ＶＨ（重鎖可変領域）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、抗体断片から形成された多重特異性抗体、及びこれらの任意の組み合わせ、あるいは標的抗原に結合し得る免疫グロブリンペプチドのその他の部分、が挙げられるがこれらに限定されない。当業者により認識されるとおり、例えば、ペプシンなどの抗体による、インタクトな抗体の消化；又はデノボ合成、などの様々な方法により、抗体断片を得ることができる。抗体断片は、多くの場合、化学的に、又は組み換えＤＮＡ法を利用することによりデノボ合成される。
【００３９】
[0054]用語「ポリクローナル抗体」は、異なるＢ細胞系により分泌され、同じ抗原上の複数のエピトープを認識する抗体群に含まれる抗体を指す。
【００４０】
[0055]用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体群から得られた抗体を指し、すなわち、抗体群を構成する各抗体は、天然に生じる可能性がある、微量に存在し得る変異以外は同一である。モノクローナル抗体は高特異性であり、単一の抗原部位又はエピトープを対象とする。更に、異なる決定基又はエピトープを対象とする異なる抗体を典型的に含む、ポリクローナル抗体配合物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。本発明により使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）において最初に報告されているハイブリドーマ法により製造でき、あるいは米国特許第４，８１６，５６７号に報告されているものなどの組み換えＤＮＡ法により製造され得る。いくつかの場合では、モノクローナル抗体は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２〜５５４（１９９０）に報告される方法を使用して作製されたファージライブラリによっても単離され得る。
【００４１】
[0056]用語「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）を、異なる又は別のクラスの定常領域、エフェクター機能及び／若しくは種、キメラ抗体に新しい特性を付与する完全に異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬剤などに結合されるよう、定常領域又はこれらの部分が、変更、置き換え、又は交換されている；あるいは（ｂ）可変領域又はその一部が、異なる若しくは代替的な抗原特異性を有する可変領域若しくはその一部により、又は別の種若しくは別の抗体クラス若しくはサブクラスに由来する対応する配列により、変更、置き換え、又は交換されている、免疫グロブリン分子を指す。
【００４２】
[0057]用語「ヒト化抗体」は、抗原結合ループ、すなわち、ＶＨ領域及びＶＬ領域により構成される相補性決定領域（ＣＤＲ）が、ヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を指す。典型的には、ヒト化抗体は、本明細書に記載の非ヒト化抗体と同じ結合特異性を有する。抗体をヒト化する技術は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、Ｖｅｒｈｏｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４（１９８８）並びにＷｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３４９：２９３（１９９１）に報告されている。
【００４３】
[0058]抗原又はハプテンに言及するとき、抗体に対する句「特異的（又は選択的）に結合する」、又は「特異的（又は選択的）に免疫反応性である」は、多くの場合、抗原又はハプテンの不均一な集団中の、並びに細胞混合物、細胞溶解物、又は生体サンプル、例えば、血液、血漿、又は血清などのその他の生物サンプル（biologics）中の抗原又はハプテンの存在を決定づける（determinative）結合反応を指す。したがって、指定の免疫アッセイ条件下では、特異的な抗体が、特定の抗原又はハプテンに結合する（バックグラウンドの少なくとも２倍、典型的には、バックグラウンドの１０〜１００倍）。このような条件下での、抗原に対する特異的結合は、特定の抗原又はハプテンについて特異的に選択される抗体を必要とする。例えば、ポリクローナル抗体は、抗原に対し特異的に免疫反応性でありながら、他のタンパク質に対してはかかる反応性を示さないポリクローナル抗体のみを得るべく、選択され得る。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を取り除くことにより達成され得る。様々なフォーマットの免疫アッセイを使用して、特定のタンパク質に対し特異的な免疫反応性を有する抗体を選択することができる。例えば、通常、タンパク質に対し特異的な免疫反応性を有する抗体の選択には、ＥＬＩＳＡ免疫アッセイが使用される（例えば、特異的な免疫反応性を決定するのに使用できる免疫アッセイのフォーマット及び条件の説明についてはＨａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＹのＭａｎｕａｌ（１９９８）を参照されたい）。
【００４４】
[0059]特異的な結合は、例えば、対象と類似の対照分子（例えば、未標識の過剰量の対象）との競合アッセイを用いるものなどといった、例えば、当該技術分野において既知の方法により、測定され得る。標的抗原に特異的に結合する抗体の、抗原に対するＫｄは、少なくとも約１０−４Ｍ、あるいは少なくとも約１０−５Ｍ、あるいは少なくとも約１０−６Ｍ、あるいは少なくとも約１０−７Ｍ、あるいは少なくとも約１０−８Ｍ、あるいは少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１２Ｍ以上であり得る。一実施形態では、用語「特異的に結合する」は、抗体が、他の構造的に類似しているハプテン又は化合物に実質的に結合せずに特定のハプテンに結合する、結合を指す。このような実施形態では、非特異的な結合の程度は、例えば、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）分析、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）、又は放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）により測定されたときに、バックグラウンドと同程度、又はバックグラウンド以下であり、典型的には、約１０％未満、好ましくは約５％未満、及びより好ましくは約１％未満である。
【００４５】
[0060]用語「交差反応性」は、対象とする精製抗体に対する、指定の（第１の）抗原及び第２の抗原の相対的な結合（relative binding）を指し、指定の又は第１の抗原は、対象とする抗体の産生に使用されるものである。Ｃ５０第２は、第２の抗原に、第１の抗原と、対象とする抗体との間の反応を５０％阻害させるのに必要とされる濃度である。同様にして、Ｃ５０第１は、第１の抗原に、第１の抗原と、抗体との間の反応を５０％阻害させるのに必要とされる濃度である（自己阻害）。次に、抗原バリアントについての相対的な平衡結合定数、Ｃ５０第１／Ｃ５０第２は、交差反応性の尺度となる（Ｂｅｎｊａｍｉｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｄｕｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９６，９（３）：５０８〜５１５）。換言すると、化合物Ｘに対し産生された抗体に交差反応性が存在すると、特異的な化合物Ｘに関し、［（ａ／ｂ）ｘ１００］となり、式中、ａは、抗体に結合した化合物Ｙのうち５０％を置き換えるのに必要とされる化合物Ｘであり；ｂは、抗体に結合した化合物Ｘのうち５０％を置き換えるのに必要とされる化合物Ｙの量である。抗体についての用語「交差反応性」は、異なる抗原上の類似する又は類似しないエピトープについての抗体の相互作用も指す場合がある。「交差反応性」は、当業者に既知の、例えば、競合的ＥＬＩＳＡ、例えば、直接的競合的ＥＬＩＳＡ又は間接的競合的ＥＬＩＳＡなどといった標準アッセイを使用して測定できる。
【００４６】
[0061]本明細書で使用するとき、用語「単離」又は「精製」抗体は、通常、又は天然にはその抗体に付随する成分を実質的に又は本質的に含まない抗体を指す。純度及び均質性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高性能液体クロマトグラフィなどの化学的分析法を用いて決定される。環境由来の夾雑成分は、抗体又はその断片の使用に干渉する成分であり、このような成分としては、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性若しくは非タンパク質性の溶質などを挙げることができる。ある種の実施形態では、単離抗体は、ローリー法により決定されたときにポリペプチドの９５重量％超、好ましくは９９重量％超が精製されており、あるいはクマシーブルー染色又は銀染色を用いる還元又は非還元条件下でのＳＤＳ−ｐａｇｅでは均質となるように精製される。単離抗体としては、組み換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕの抗体が挙げられる。いくつかの場合では、単離抗体は、少なくとも１回の精製ステップにより調製される。
【００４７】
[0062]用語「ハイブリドーマ細胞株」又は「ハイブリドーマクローン」は、モノクローナル抗体の産生に使用されるハイブリッド細胞株を指す。いくつかの場合では、ハイブリドーマ細胞は、マウス脾臓由来の抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させたものであり、マウスには予め特定の抗原が投与されている。
【００４８】
[0063]用語「ハプテン」は、動物において免疫反応を誘起させ得る小分子を指し、ハプテンは、キャリア分子（例えば、キャリアタンパク質）に連結又は結合させると免疫原又は免疫原性複合物を形成する。ハプテン−キャリアタンパク質複合体は、免疫原性であり（免疫応答を誘起させ得る）、かつハプテン単独（未結合のハプテン）には免疫原性はない。キャリアタンパク質の非限定例としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ若しくはブタサイログロブリン、破傷風トキソイド、ゼラチン、又は大豆トリプシンインヒビターなどが挙げられる。
【００４９】
[0064]用語「免疫原」は、動物において免疫応答による産生を刺激する物質、化合物、ペプチド、又は組成物を指す。
【００５０】
[0065]本明細書で使用するとき、「リンカー」又は「スペーサー」は、ハプテンを、本明細書に開示される別の分子又は部分に結合（例えば、共有結合による）させ得るなんらかの分子である。リンカーとしては、直鎖又は分岐鎖炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、ペプチドリンカー、ポリエーテルリンカー、及び短鎖親水性分子が挙げられるがこれらに限定されない。代表的なリンカーとしては、ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−、及び５−アミノ−３−オキソペンタノイルが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｐｏｗｅｌｌ，ＯＨから入手可能である。これらのリンカーは、場合により、アミド結合、スルフヒドリル結合、又はヘテロ官能性の結合を有する。
【００５１】
[0066]用語「標識」又は「検出可能な標識」は、分光学的手法、光化学的手法、生化学的な手法、免疫化学的な手法、化学的な手法、又は他の物理的な手法により検出可能な組成物である。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、蛍光染料、電子密度の高い試薬（electron-dense reagents）、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般に使用されるものなど）、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はペプチド及びタンパク質（例えば、放射性標識をペプチドに組み込むことにより検出可能なものにすることができるペプチド及びタンパク質）が挙げられる。検出可能な標識は、蛍光標識、発光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、又は酵素標識であり得るがこれらに限定されない。
【００５２】
[0067]用語「固体基材」又は「固体支持体」は、固体材料、膜、アレイ、チップ、及びビーズなどを指す。固体基材表面は、基材と同じ材料から構成され得る。表面は、例えば、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖、シリカ若しくはシリカベース材料、炭素、金属、無機ガラス、膜、又は上記の基材材料のうちの任意のものなどの任意選択的な様々な材料から構成され得る。
【００５３】
[0068]用語「免疫アッセイ」は、抗体、免疫グロブリン、又はそれらの断片を利用して被検成分（小分子、化合物、ペプチド、ポリペプチドド、生体分子、抗体、代謝産物など）の有無又は濃度（レベル又は量）を検出又は測定するアッセイを指す。
【００５４】
[0069]用語「被検体」、「患者」、及び「個体」は互換可能に使用され、記載のない限り、ヒト及び非ヒト霊長類、並びにウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ブタ、及び他の哺乳動物種などと行った哺乳動物を指す。
【００５５】
[0070]「サンプル（sample）」という用語には、個体から得られた任意の生物試料が含まれる。使用に適したサンプルとしては、全血、血漿、血清、唾液、尿、大便、涙液、他の任意の体液、組織サンプル（例えば、生検）、及びそれらの細胞抽出物（例えば、赤血球細胞抽出物）などが挙げられるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、サンプルは血清サンプル又は血漿サンプルである。血清、唾液、及び尿などのサンプルの使用が当業界では知られている（例えば、Ｈａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．，１１：２６７〜８６（１９９７）を参照されたい）。当業者であれば、血清サンプルなどのサンプルは、本明細書に開示される方法を実施する前に希釈され得ることを認識されるであろう。
【００５６】
[0071]本明細書で使用するとき、「アシル」としては、本明細書で定義されるとおりのアルカノイル基、アロイル基、ヘテロシクリル基、又はヘテロアロイル基が挙げられる。代表的なアシル基としては、アセチル基、ベンゾイル基、及びニコチノイル基などが挙げられる。
【００５７】
[0072]本明細書で使用するとき、「アルカノイル」としては、アルキル基が本明細書で定義されるとおりのものであるアルキル−Ｃ（Ｏ）−基が挙げられる。代表的なアルカノイル基としては、アセチル基及びエタノイル基などが挙げられる。
【００５８】
[0073]本明細書で使用するとき、「アルケニル」としては、炭素−炭素二重結合又は三重結合を少なくとも１つ含み２〜約１５個の炭素原子からなる直鎖又は分岐鎖脂肪族炭化水素基が挙げられる。好ましいアルケニル基は、炭素原子を２〜約１２個有する。より好ましいアルケニル基は、炭素原子を２〜約６個含む。一態様では、炭素−炭素二重結合を含む炭化水素基が好ましい。第２の態様では、炭素−炭素三重結合を含む炭化水素基が好ましい（すなわち、アルキニル）。本明細書で使用するとき、「低級アルケニル」としては、炭素原子を２〜約６個含むアルケニルが挙げられる。代表的なアルケニル基としては、ビニル、アリル、ｎ−ブテニル、２−ブテニル、３−メチルブテニル、ｎ−ペンテニル、ヘプテニル、オクテニル、デセニル、プロピニル、２−ブチニル、３−メチルブチニル、ｎ−ペンチニル、及びヘプチニルなどが挙げられる。
【００５９】
[0074]アルケニル基は、非置換であってよく、あるいは場合により置換されてよい。場合により置換されるとき、アルケニル基の１つ以上（例えば、１〜４個、１〜２個、又は１個）の水素原子は、独立して、フルオロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、チオ、及びアルキルチオからなる群から選択された部分で置換され得る。
【００６０】
[0075]本明細書で使用するとき、「アルケニレン」としては、炭素−炭素二重結合又は三重結合を少なくとも１つ含む直鎖又は分岐鎖二価炭化水素鎖が挙げられる。好ましいアルケニレン基は、鎖中に炭素原子を２〜約１２個含み、より好ましいアルケニル基は、鎖中に炭素原子を２〜６個含む。一態様では、炭素−炭素二重結合を含む炭化水素基が好ましい。第２の態様では、炭素−炭素三重結合を含む炭化水素基が好ましい。代表的なアルケニレン基としては、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ−、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２−、エチニレン、プロピニレン、及びｎ−ブチニレンなどが挙げられる。
【００６１】
[0076]本明細書で使用するとき、「アルコキシ」としては、アルキル基が本明細書で定義されるとおりのものであるアルキル−Ｏ−基が挙げられる。代表的なアルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ヘプトキシなどが挙げられる。
【００６２】
[0077]アルコキシ基は、非置換であってよく、あるいは場合により置換されてよい。場合により置換されるとき、アルコキシ基の１つ以上（例えば、１〜４個、１〜２個、又は１個）の水素原子は、独立して、フルオロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、チオ、及びアルキルチオからなる群から選択された部分で置換され得る。
【００６３】
[0078]本明細書で使用するとき、「アルコキシアルキル」としては、アルキル及びアルキレンが本明細書で定義されるとおりのものであるアルキル−Ｏ−アルキレン基が挙げられる。代表的なアルコキシアルキル基としては、メトキシエチル、エトキシメチル、ｎ−ブトキシメチル、及びシクロペンチルメチルオキシエチルが挙げられる。
【００６４】
[0079]本明細書で使用するとき、「アルコキシカルボニル」としては、エステル基；すなわち、アルキル基が本明細書で定義されるとおりのものであるアルキル−Ｏ−ＣＯ−基が挙げられる。代表的なアルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、及びｔ−ブチルオキシカルボニルなどが挙げられる。
【００６５】
[0080]本明細書で使用するとき、「アルコキシカルボニルアルキル」としては、アルキル及びアルキレンが本明細書で定義されるとおりのものであるアルキル−Ｏ−ＣＯ−アルキレン基が挙げられる。代表的なアルコキシカルボニルアルキルとしては、メトキシカルボニルメチル、エトキシカルボニルメチル、メトキシカルボニルエチルなどが挙げられる。
【００６６】
[0081]本明細書で使用するとき、「アルキル」としては、鎖中に炭素原子を約１個〜約２０個有する直鎖又は分岐鎖であり得る脂肪族炭化水素基が挙げられる。好ましいアルキル基は、鎖中に炭素原子を１〜約１２個有する。より好ましいアルキル基は、鎖中に炭素原子を１〜約６個有する。本明細書で使用するとき、「分岐鎖」としては、直鎖アルキル鎖にメチル、エチル、又はプロピルが結合したものなどの、１つ以上の低級アルキル基が挙げられる。本明細書で使用するとき、「低級アルキル」としては、鎖中に炭素原子を１〜約６個、好ましくは５又は６個含むものが挙げられ、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。代表的なアルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、及び３−ペンチルが挙げられる。
【００６７】
[0082]アルキル基は、非置換であってよく、あるいは場合により置換されてよい。場合により置換されるとき、アルキル基の１つ以上（例えば、１〜４個、１〜２個、又は１個）の水素原子は、独立して、フルオロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、チオ、及びアルキルチオからなる群から選択された部分で置換され得る。
【００６８】
[0083]本明細書で使用するとき、「アルキレン」としては、１〜約６個の炭素原子からなる二価の直鎖又は分岐鎖炭化水素鎖が挙げられる。好ましいアルキレン基は、炭素原子を１個〜約４個有する低級アルキレン基である。代表的なアルキレン基としては、メチレン、及びエチレンなどが挙げられる。
【００６９】
[0084]本明細書で使用するとき、「アルキルチオ」としては、アルキル基が本明細書で定義されるとおりのものであるアルキル−Ｓ基が挙げられる。好ましいアルキルチオ基は、アルキル基が低級アルキルであるものである。代表的なアルキルチオ基としては、メチルチオ、エチルチオ、イソプロピルチオ、及びヘプチルチオなどが挙げられる。
【００７０】
[0085]本明細書で使用するとき、「アルキルチオアルキル」としては、アルキルチオ及びアルキレンが本明細書で定義されるとおりのものであるアルキルチオ−アルキレン基が挙げられる。代表的なアルキルチオアルキル基としては、メチルチオメチル、エチルチオプロピル、イソプロピルチオエチルなどが挙げられる。
【００７１】
[0086]本明細書で使用するとき、「アミド」としては、式Ｙ１Ｙ２Ｎ−Ｃ（Ｏ）−の基が挙げられ、式中、Ｙ１及びＹ２は、独立して、水素、アルキル、又はアルケニルであり；又はＹ１及びＹ２は、Ｙ１及びＹ２が結合している窒素とともに４〜７員のアザヘテロシクリル基（例えば、ピペリジニル）を形成する。代表的なアミド基としては、一級アミド（Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｏ）−）、メチルアミド、ジメチルアミド、及びジエチルアミドなどが挙げられる。好ましくは、「アミド」は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’基であり、式中、Ｒ及びＲ’は、独立して、Ｈ及びアルキルからなる群から選択されるメンバーである。より好ましくは、Ｒ及びＲ’のうち少なくとも１つはＨである。
【００７２】
[0087]本明細書で使用するとき、「アミドアルキル」としては、アミド及びアルキレンが本明細書で定義されるとおりのものであるアミド−アルキレン基が挙げられる。代表的なアミドアルキル基としては、アミドメチル、アミドエチレン、ジメチルアミドメチルなどが挙げられる。
【００７３】
[0088]本明細書で使用するとき、「アミノ」としては、式Ｙ１Ｙ２Ｎ−の基が挙げられ、式中、Ｙ１及びＹ２は、独立して、水素、アシル、又はアルキルであり；又はＹ１及びＹ２は、Ｙ１及びＹ２が結合している窒素とともに４〜７員のアザヘテロシクリル基（例えば、ピペリジニル）を形成する。場合により、Ｙ１及びＹ２が、独立して、水素又はアルキルであるとき、窒素に置換基を追加して、第四級アンモニウムイオンとすることもできる。代表的なアミノ基としては、一次アミノ（Ｈ２Ｎ−）、メチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノなどが挙げられる。好ましくは、「アミノ」は、ＮＲＲ’基であり、式中、Ｒ及びＲ’は、独立して、Ｈ及びアルキルからなる群から選択されるメンバーである。好ましくは、Ｒ及びＲ’のうち少なくとも１つはＨである。
【００７４】
[0089]本明細書で使用するとき、「アミノアルキル」としては、アミノ及びアルキレンが本明細書で定義されるとおりのものであるアミノ−アルキレン基が挙げられる。代表的なアミノアルキル基としては、アミノメチル、アミノエチル、及びジメチルアミノメチルなどが挙げられる。
【００７５】
[0090]本明細書で使用するとき、「アロイル」としては、アリールが本明細書で定義されるとおりのものであるアリール−ＣＯ−基が挙げられる。代表的なアロイルとしては、ベンゾイル、ナフト−１−オイル及びナフト−２−オイルが挙げられる。
【００７６】
[0091]本明細書で使用するとき、「アリール」としては、６〜約１４個、好ましくは６〜約１０個の炭素原子からなる芳香族単環式又は多環式が挙げられる。代表的なアリール基としては、フェニル及びナフチルが挙げられる。
【００７７】
[0092]本明細書で使用するとき、「芳香環」としては、酸素、硫黄、セレニウム、及び窒素かなる群から選択されるヘテロ原子を０〜４個含み得る５〜１２員の芳香族単環式又は縮合多環式部分が挙げられる。代表的な芳香環としては、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジン、ナフタレン、ベンゾチアゾリン（benzathiazoline）、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、インドール、ベンゾインドール、及びキノリンなどが挙げられる。芳香族基は、１つ以上の部分が、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、ハロアルキル、シアノ、スルホナト、アミノスルホニル、アリール、スルホニル、アミノカルボニル、カルボキシ、アシルアミノ、アルキルスルホニル、アミノ、及び置換又は非置換置換基により置換され得る。
【００７８】
[0093]本明細書で使用するとき、「生体分子」としては、生物システムに使用する天然分子又は合成分子が挙げられる。好ましい生体分子としては、タンパク質、ペプチド、酵素基質、ホルモン、抗体、抗原、ハプテン、アビジン、ストレプトアビジン、炭水化物、炭水化物誘導体、オリゴ糖、多糖、及び核酸が挙げられる。より好ましい生体分子としては、タンパク質、ペプチド、アビジン、ストレプトアビジン、又はビオチンが挙げられる。
【００７９】
[0094]本明細書で使用するとき、「カルボキシ」及び「カルボキシル」としては、ＨＯＣ（Ｏ）−基（すなわち、カルボン酸）又はそれらの塩が挙げられる。
【００８０】
[0095]本明細書で使用するとき、「カルボキシアルキル」としては、ＨＯＣ（Ｏ）−アルキレン基が挙げられ、式中、アルキレンは本明細書で定義される。代表的なカルボキシアルキルとしては、カルボキシメチル（すなわち、ＨＯＣ（Ｏ）ＣＨ２−）及びカルボキシエチル（すなわち、ＨＯＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−）が挙げられる。
【００８１】
[0096]本明細書で使用するとき、「シクロアルキル」としては、約３〜約１０個、好ましくは約５〜約１０個の炭素原子からなる非芳香族単環式又は多環式が挙げられる。より好ましいシクロアルキル環は、環原子を５又は６個含む。シクロアルキル基は、場合により、少なくとも１つのｓｐ２混成炭素を含む（例えば、環は、環内又は環外オレフィンを組み込む）。代表的な単環式シクロアルキル基としては、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、及びシクロヘプチルなどが挙げられる。代表的な多環式シクロアルキルとしては、１−デカリン、ノルボルニル、アダマンチルなどが挙げられる。
【００８２】
[0097]本明細書で使用するとき、「シクロアルキレン」としては、炭素原子を約４〜約８個有する二価シクロアルキルが挙げられる。好ましいシクロアルケニル基としては、１，２−、１，３−、又は１，４−ｃｉｓ−又はｔｒａｎｓ−シクロヘキシレンが挙げられる。
【００８３】
[0098]本明細書で使用されるとき、「ハロ」又は「ハロゲン」としては、フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨードが挙げられる。
【００８４】
[0099]本明細書で使用するとき、「ヘテロ原子」としては、炭素又は水素以外の原子が挙げられる。代表的なヘテロ原子としては、Ｏ、Ｓ、及びＮが挙げられる。ヘテロ原子の窒素原子又は硫黄原子は、場合により、対応するＮ−酸化物、Ｓ−酸化物（スルホキシド）、又はＳ，Ｓ−二酸化物（スルホン）へと酸化される。好ましい態様では、ヘテロ原子は、アルキレン炭素原子（例えば、−Ｃ１〜Ｃ９アルキレン−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ９アルキレン−）に対して少なくとも２つの結合を有する。いくつかの実施形態では、ヘテロ原子は、アシル基、アルキル基、アリール基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、又はヘテロアリール基（例えば、−Ｎ（Ｍｅ）−；−Ｎ（Ａｃ）−）により更に置換される。
【００８５】
[0100]本明細書で使用するとき、「ヒドロキシアルキル」としては、１つ以上のヒドロキシ基で置換された、本明細書で定義されるとおりのアルキル基が挙げられる。好ましいヒドロキシアルキルは、低級アルキルを含有する。代表的なヒドロキシアルキル基としては、ヒドロキシメチル及び２−ヒドロキシエチルが挙げられる。
【００８６】
[0101]「結合基」、すなわち、Ｌは、代謝産物誘導体に、キャリアタンパク質、ビオチン、又はストレプトアビジンなどの生体分子を結合する原子を含む。Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）も参照されたい。一実施形態では、Ｌは、タンパク質の付加反応前の結合基前駆体を表し、Ｒ１１は、本発明の化合物と、タンパク質又はビオチンとの間に得られる付加を表す（すなわち、Ｒ１１は、生体分子に結合させた結合基間に得られる付加である）。好ましい反応性官能部分としては、ホスホラミダイト基、活性化エステル（例えば、ＮＨＳエステル）、チオシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、及びヨードアセトアミドが挙げられる。Ｌは、環に共有結合した末端アミノ基、末端カルボン酸基、又は末端スルフヒドリル基を含み得る。ある例では、末端アミノ基、末端カルボン酸基、又は末端スルフヒドリル基が示され、−Ｌ−ＮＨ２、又は−Ｌ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ又は−Ｌ−ＳＨとして表される。
【００８７】
[0102]本明細書で使用するとき、「オキソ」としては、式＞Ｃ＝Ｏ（すなわち、カルボニル基−Ｃ（Ｏ）−）の基が挙げられる。
【００８８】
[0103]本明細書で使用するとき、「スルホナト」としては、好ましくは、Ｈ＋、Ｎａ＋、又はＫ＋などのカチオンにより釣り合いをとる−ＳＯ３−基が挙げられる。
【００８９】
[0104]本明細書で使用するとき、「スルホナトアルキル」としては、スルホナト及びアルキレンが本明細書で定義されるとおりのものであるスルホナト−アルキレン基が挙げられる。より好ましい実施形態としては、炭素原子を２〜６個有するアルキレン基が挙げられ、最も好ましい実施形態としては、炭素原子を２、３、又は４個有するアルキレン基が挙げられる。代表的なスルホナトアルキルとしては、スルホナトメチル、３−スルホナトプロピル、４−スルホナトブチル、５−スルホナトペンチル、及び６−スルホナトヘキシルなどが挙げられる。
【００９０】
ＩＩ．発明を実施するための形態
[0105]ある種の態様では、本開示は、例えば、ヒト被検体などの被検体より得られたサンプル中の、トリプトファン経路、セロトニン経路、及びキヌレニン経路の代謝産物のレベル、量、又は濃度を測定するための、免疫アッセイなどのアッセイを提供する。例えば、図１を参照すると、本明細書では、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）を有する疑いのある、又はかかる疾患を有する被検体より得られた生体サンプル、例えば、血液、血漿、又は血清中の５−ＨＩＡＡ（５−ヒドロキシインドール−３−酢酸）１１５、メラトニン、及びキヌレン酸の量を測定又は定量する組成物及び方法が提供される。本明細書では、抗体、例えば、トリプトファン経路、セロトニン経路及びキヌレニン経路の特定の代謝産物に対し免疫反応性である、ポリクローナル及びモノクローナル抗体が提供される。そのようなものとして、組成物及び方法を、ＩＢＳ、あるいはカルチノイド症候群、抑うつ、高血圧、自閉症、アルツハイマー症、及び片頭痛などの、トリプトファン経路、セロトニン経路、及びキヌレニン経路に関与するその他の病態の診断又は予後診断の補助に使用できる。
【００９１】
[0106]構造的に類似する代謝産物を検出又は測定する従来法は存在しておらず、あるいは感度、特異性、及び再現性に欠く。概して、従来法では、構造的に類似する化合物を識別することができない。いくつかの方法では、特定の代謝産物のレベルを測定するのに必要とされるサンプル用量は約５００μＬである。同様にして、いくつかの場合では、方法の実施前に、サンプルに対し、抽出、凍結乾燥、及び／又は再構成などの加工を行う必要がある。
【００９２】
[0107]当業者であれば、セロトニン及び５−ＨＩＡＡは酸素と反応しやすく、非常に不安定であることを認識されているであろう。これらの化合物は、４℃にて、解凍からおよそ７時間で分解を開始する。５−ヒドロキシインドールは不安定性であることから、酸化による分解を防止するために添加物を使用する場合でさえも、アッセイの測定値の信頼性が低くなる恐れがある。
【００９３】
Ａ．トリプトファン経路及びセロトニン経路の代謝産物−５−ＨＩＡＡハプテン
[0108]一態様では、本発明は、代謝産物誘導体及びそれらの複合物、抗体産生方法、並びにセロトニン代謝産物に対する抗体を提供する。ある種の態様では、５−ＨＴ及び５−ＨＩＡＡなどの代謝産物は酸素に対する反応性が高く、ひいては不安定であることから、誘導体化は好ましい。血漿中セロトニンレベルは、約０．６〜１７９ｎｍｏｌ／Ｌの範囲であり得る。穏和な条件下での５−ＨＴ及び５−ＨＩＡＡの化学的誘導体により、化合物を安定化する。したがって、一態様では、本発明は、セロトニン代謝産物の安定なベンゾオキサゾール誘導体を提供する。安定なベンゾオキサゾール誘導体は、その蛍光のため、高感度でＨＰＬＣにより検出され得る（図３Ｄ）。この誘導体を、キャリアタンパク質などの生体分子と結合させ、アジュバントと組み合わせて免疫応答を刺激できる。誘導体は、ペプチドなどの他の生体分子に結合させることもできる。
【００９４】
[0109]本発明は、セロトニン（５−ＨＴ）及び５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）の安定な誘導体を提供する。一態様では、本発明は、式Ｉの化合物を提供する：
【化１】
2018501202.tif 000003
［式中、Ｒは、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アミノアルキル、アミドアルキル、カルボキシアルキル、置換カルボキシアルキルからなる群から選択されるメンバーであり；並びに
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、それぞれ独立して、水素、アルキル、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アロイル、アルカノイル、アミド、置換アミド、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、スルホナト、アルコキシアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、スルホナトアルキル、Ｌ、及びＲ１１Ｂからなる群から選択されるメンバーであり；
Ｌはリンカーであり；
Ｒ１１は、化合物と生体分子との間に得られる付加であり；
Ｂは生体分子である］。
【００９５】
[0110]一態様では、Ｒは、アミノアルキル、カルボキシアルキル、及び置換カルボキシアルキルからなる群から選択されるメンバーである。別の態様では、Ｒは、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、及び−ＣＨ２ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ２Ｈからなる群から選択されるメンバーである。
【００９６】
[0111]Ｌは、キャリアタンパク質又はビオチンなどの生体分子に付加させるための連結基を表す。いくつかの実施形態では、Ｌは、ポリエチレングリコール又はＰＥＧを含む。例えば、Ｌは、環に共有結合した末端アミノ基、末端カルボン酸基、又は末端スルフヒドリル基を含み得る。ある例では、末端アミノ基、末端カルボン酸基、又は末端スルフヒドリル基が示され、−Ｌ−ＮＨ２、又は−Ｌ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ又は−Ｌ−ＳＨとして表される。
【００９７】
[0112]Ｒ１１は、本発明の化合物と、キャリアタンパク質、ペプチド、又はビオチンなどの生体分子との間に得られる付加を表す（すなわち、Ｒ１１は、生体分子に結合した連結基を構成する）。
【００９８】
[0113]Ｌは、直接結合、又は共有結合からなる群から選択されたメンバーであり、共有結合は、直鎖又は分岐鎖、環式又は複素環式、飽和又は不飽和であり、Ｃ、Ｎ、Ｐ、Ｏ、及びＳからなる群から選択された原子を１〜６０個有し、Ｌは、価数を満足するよう追加の水素原子を有してよく、結合は、エーテル結合、チオエーテル結合、アミン結合、エステル結合、カルバメート結合、尿素結合、チオ尿素結合、オキシ結合、又はアミド結合のいずれかの組み合わせ；あるいは一重結合、二重結合、三重結合、又は芳香族炭素−炭素結合；あるいは、リン−酸素結合、リン−硫黄結合、窒素−窒素結合、窒素−酸素結合、又は窒素−白金結合；あるいは、芳香族又は複素芳香族結合、を含有する。ある種の態様では、Ｌは、末端アミノ基、末端カルボン酸基、又は末端スルフヒドリル基を含む。
【００９９】
[0114]ある種の態様では、Ｌは、式：
−Ｘ１−Ｙ１−Ｘ２−である
［式中、Ｘ１は、二価基、直接結合、酸素、場合により置換窒素、及び硫黄からなる群から選択されるメンバーであり；Ｙ１は、直接結合、及び場合によりヘテロ原子を中に含む（interrupted）Ｃ１〜Ｃ１０アルキレンからなる群から選択されるメンバーであり；Ｘ２は、二価基、直接結合、酸素、場合により置換窒素、及び硫黄からなる群から選択されるメンバーである］。
【０１００】
[0115]好ましくは、Ｘ１及びＸ２の二価基は、それぞれ独立して、直接結合、場合により置換アルキレン、場合により置換アルキレンオキシカルボニル、場合により置換アルキレンカルバモイル、場合により置換アルキレンスルホニル、アリーレンスルホニル、場合により置換アリーレンオキシカルボニル、場合により置換アリーレンカルバモイル、場合により置換チオカルボニル、場合により置換スルホニル、及び場合により置換スルフィニルからなる群から選択される。
【０１０１】
[0116]ある種の好ましい態様では、Ｌは、−（ＣＨ２）ｎ−であり、式中、ｒは１〜１０の整数であり、好ましくはｎは、１〜４、又は１、２、３、４、若しくは５など、１〜５の整数である。
【０１０２】
[0117]更に、ベンゾオキサゾール誘導体は、免疫原性複合物の作製に使用できる。例えば、一態様では、本発明の複合物は、対象とする代謝産物に特異的な免疫原による応答の立ち上げに使用できる。ある例では、ベンゾオキサゾール誘導体及びリンカーアーム（ｎは約１〜２０である）を使用して、キャリアタンパク質をアミノ（又はスルフヒドリル）末端に付加できる。いくつかの実施形態では、リンカーアームはＰＥＧである。リンカーアームとしては、次のリンカー：ＰＥＧ１、ＰＥＧ２、ＰＥＧ３、ＰＥＧ４、ＰＥＧ５、ＰＥＧ６、ＰＥＧ７、ＰＥＧ８、ＰＥＧ９、ＰＥＧ１０、ＰＥＧ１１、ＰＥＧ１２、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ１４、ＰＥＧ１５、ＰＥＧ１６、ＰＥＧ１７、ＰＥＧ１８、ＰＥＧ１９、又はＰＥＧ２０を挙げることができる。いくつかの実施形態では、本明細書において５−ＨＩＡＡ誘導体ハプテンが記載される。
【０１０３】
[0118]このように作製した抗体の親和性及び特異性を試験するため、ビオチン化ハプテンを作製できる。ある例では、ベンゾオキサゾール誘導体及びリンカーアーム（ｎは約１〜２０である）を使用して、ビオチン分子をアミノ（又はスルフヒドリル）末端に付加できる。いくつかの実施形態では、リンカーアームはＰＥＧである。リンカーアームとしては、次のリンカー：ＰＥＧ１、ＰＥＧ２、ＰＥＧ３、ＰＥＧ４、ＰＥＧ５、ＰＥＧ６、ＰＥＧ７、ＰＥＧ８、ＰＥＧ９、ＰＥＧ１０、ＰＥＧ１１、ＰＥＧ１２、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ１４、ＰＥＧ１５、ＰＥＧ１６、ＰＥＧ１７、ＰＥＧ１８、ＰＥＧ１９、又はＰＥＧ２０を挙げることができる。いくつかの実施形態では、ビオチン分子は、ハプテンを固体基材又は支持体に固定化するのに使用できる異なる分子で置き換えられる。
【０１０４】
[0119]いくつかの実施形態では、ベンゾオキサゾール誘導体は、オキサゾロ−インドール−ＰＥＧ−ビオチン−エステル又はオキサゾロ−インドール−ＰＥＧ−ビオチン酸である。
【０１０５】
[0120]ある種の態様では、図１に示すとおりのセロトニン経路の化合物、又は式Ｉの化合物を、当該技術分野で知られる複合物形成反応を使用してキャリア分子と反応させることができる。例えば、活性化エステル（ＮＨＳエステル）を、第一級アミンと反応させて、安定なアミド結合を形成できる。マレイミド及びチオールを一緒に反応させると、チオエーテルを形成できる。ハロゲン化アルキルをアミン及びチオールと反応させると、それぞれアルキルアミン及びチオエーテルを形成する。本明細書では、タンパク質と複合物を形成し得る反応部分を提供する誘導体を利用できる。当該技術分野で知られるとおり、遊離アミノ基、遊離カルボン酸基、又は遊離スルフヒドリル基を含む部分は、タンパク質の複合物形成に有用な反応基を提供する。例えば、遊離アミノ基を、グルタルアルデヒド架橋により、又はカルボジイミド架橋により、タンパク質の利用可能なカルボキシ部分と結合させることができる。同様にして、遊離スルフヒドリル基を有するハプテンを、例えば、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）を使用するタンパク質のマレイミド活性化によりタンパク質に結合させたあと、スルフヒドリル基を結合させることができる。
【０１０６】
[0121]アミン含有代謝産物に付加させるためのカルボン酸基を有するキャリアタンパク質を結合させるとき、最初に、活性剤を使用して、このカルボン酸を反応性のより高い形態、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル又は無水混合物形態に変換することができる。アミン含有代謝産物を、得られる活性化酸により処理して、アミド結合を形成させる。当業者であれば、あるいは、代謝産物上にＮＨＳエステルがあってよく、キャリアタンパク質上にアミンがあってよいことを認識されるであろう。
【０１０７】
[0122]誘導体化による代謝産物の安定化プロセスにより、免疫原性複合物に対する抗体を生成できる。手持ちの抗体を用いてＥＬＩＳＡなどの免疫アッセイを実施でき、この場合の抗体は、対象とする代謝産物に対し特異性が高い。
【０１０８】
[0123]図１に示されるとおり、セロトニン経路において対象とされる代謝産物は、例えば、セロトニン（５−ＨＴ）１０１、５−ヒドロキシインドールアセトアルデヒド１０５、及び５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）１１５である。一態様では、本発明は、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）１１５に特異的に結合する単離又は精製抗体又はそれらの抗原結合断片を提供し、抗体の、図１のトリプトファン１２２、５−ヒドロキシトリプトファン１２５、セロトニン１０１、メラトニン１２０、キヌレニン１３１、キヌレン酸１３５、アントラニル酸１４０、３−ヒドロキシキヌレニン１４６、３−ヒドロキシアントラニル酸１４９、キノリン酸１６０、及びキサンツレン酸１４８からなる群から選択される１つ以上の代謝産物に対する交差反応性は、１％未満、例えば、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、又は０％である。
【０１０９】
[0124]一態様では、本発明は、代謝産物複合物に対する単離又は精製抗体を提供する。最初に、代謝産物又はそれらの安定な誘導体を調製できる。次に、ＢＳＡなどのキャリアタンパク質を誘導体と結合させる。代謝産物又はそれらの安定な誘導体に対する抗体は、例えば、ウサギ、マウス、ヒツジ、ニワトリ、ヤギなどの哺乳動物にかかる複合物を投与することにより製造されたものとした。その後、ビオチン化ハプテンを使用して、前述のように製造された抗体の反応性、結合活性、特異性、及び／又は感度を試験できる。
【０１１０】
[0125]他の態様では、本発明は、セロトニン代謝産物に特異的に結合する抗体、例えば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の製造方法を提供する。方法は、（ａ）それぞれキャリアタンパク質と結合させた、セロトニン（５−ＨＴ）、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）、及び５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）からなる群から選択された誘導体を含む免疫原を準備するステップと、（ｂ）動物の免疫システムが抗体を作製するような条件下で動物に免疫原を免疫するステップと、（ｃ）動物から抗体を回収するステップと、を含む。
【０１１１】
[0126]一態様では、本発明の複合物を使用して、血清又は細胞培養上清から、本明細書において提供される方法により生成された抗体を回収又は単離できる。例えば、一態様では、５−ＨＩＡＡ化合物、それらの複合物、又はそれらの誘導体を使用して、免疫したヤギ、ウサギ、又はマウスなどの免疫動物の血清から抗体を回収することができる。抗体は、血清、腹水、細胞培養上清、又は培地などから、対象とする抗体を選択的に富化させる、あるいは特異的に単離することにより精製され得る。例えば、抗原特異的なアフィニティ法又は免疫グロブリンクラス特異的なアフィニティ法などのアフィニティ法を使用して、対象とする抗体を単離できる。ビオチン化５−ＨＩＡＡ化合物を使用して、哺乳動物（ウサギ、マウス、又はヤギ）から対応する抗体を回収できる。
【０１１２】
[0127]いくつかの態様では、本発明は、２０１５年１１月１７日にアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ（登録商標））にＡＴＣＣ受託番号＿で寄託された１２０４−１０Ｇ６Ｆ１１Ｈ３と表記されるハイブリドーマ細胞株により産生され、５−ＨＩＡＡに対し免疫反応性である、単離又は精製モノクローナル抗体を提供する。かかる抗体は、図１のトリプトファン１２２、５−ヒドロキシトリプトファン１２５、セロトニン１０１、メラトニン１２０、キヌレニン１３１、キヌレン酸１３５、アントラニル酸１４０、３−ヒドロキシキヌレニン１４６、３−ヒドロキシアントラニル酸１４９、キノリン酸１６０、及びキサンツレン酸１４８といった、トリプトファン経路、セロトニン経路、及びキヌレニン経路の、構造的に類似しているその他の代謝産物又は化合物に対し、交差反応性を実質的に有しない。
【０１１３】
Ｂ．トリプトファン及びセロトニン経路代謝産物−メラトニンハプテン
[0128]本明細書において、安定なメラトニンハプテン、それらの変異体、又はそれらの誘導体を、キャリアタンパク質などの生体分子と結合させ、アジュバントと組み合わせて免疫応答を刺激できる。
【０１１４】
[0129]別の態様では、本発明は、トリプトファン経路における代謝産物に対する抗体を製造するための抗原を提供する。ある種の例では、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）におけるセロトニン機能の変則性は、セロトニン代謝産物、すなわち、メラトニン１２０の代謝における変動に起因する（図１）。
【０１１５】
[0130]本発明は、抗体、及びメラトニン（ＭＴ）に対する抗体を製造する方法を提供する。
【０１１６】
[0131]一態様では、本発明は、式ＩＩの構造を有するメラトニンの誘導体を提供する：
【化２】
2018501202.tif 000004
Ｒは、水素、アルキル、アロイル、アルカノイル、アミド、置換アミド、Ｌ、及びＲ１１Ｂからなる群から選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、それぞれ独立して、水素、アルキル、ハロ、カルボキシル、ヒドロキシ、アルコキシ、アロイル、アルカノイル、アミド、置換アミド、アルコキシカルボニル、スルホナト、アルコキシアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、スルホナトアルキル、Ｌ及びＲ１１Ｂからなる群から選択されるメンバーであり；
Ｌはリンカーであり；
Ｒ１１は、化合物と生体分子との間に得られる付加であり；
Ｂは生体分子である。
【０１１７】
[0132]別の態様では、当業者に知られる、抗体の製造を目的とした複合物形成反応により、式ＩＩの化合物をキャリアタンパク質に結合させることができる。活性化エステル（ＮＨＳエステル）を、第一級アミンと反応させて、安定なアミド結合を形成できる。マレイミド及びチオールを一緒に反応させると、チオエーテルを形成できる。ハロゲン化アルキルをアミン及びチオールと反応させると、それぞれアルキルアミン及びチオエーテルを形成する。本明細書では、タンパク質と複合物を形成し得る反応部分を提供する誘導体を利用できる。当該技術分野で知られるとおり、遊離アミノ基、遊離カルボン酸基、又は遊離スルフヒドリル基を含む部分は、タンパク質の複合物形成に有用な反応基を提供する。例えば、遊離アミノ基を、グルタルアルデヒド架橋により、又はカルボジイミド架橋により、タンパク質の利用可能なカルボキシ部分と結合させることができる。同様にして、遊離スルフヒドリル基を有するハプテンを、例えば、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）を使用したタンパク質のマレイミド活性化によりタンパク質に結合させたあと、スルフヒドリル基を結合させることができる。
【０１１８】
[0133]複合物形成についての代表的なスキームは以下のとおりであり、式中、ｎは０〜２０（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０）の整数である：
【化３】
2018501202.tif 000005
【０１１９】
[0134]哺乳動物により生成された抗体は、本発明の複合物を使用して血清から回収され得る。例えば、一態様では、式ＩＩの化合物は式ＩＩｂの構造を有する：
【化４】
2018501202.tif 000006
【０１２０】
[0135]本発明は、安定なメラトニン誘導体（derivatives melatonin）、及び抗体の製造方法も提供する。本方法は、
（ａ）メラトニン（ＭＴ）の誘導体を含む免疫原を準備するステップと、
（ｂ）動物の免疫システムが抗体を作製するような条件下で動物に免疫原を免疫するステップと、
（ｃ）動物から抗体を回収するステップと、を含む。
【０１２１】
[0136]別の態様では、本発明は、メラトニン（ＭＴ）に特異的に結合し、トリプトファン（Ｔｒｐ）、セロトニン（５−ＨＴ）、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）、５−ヒドロキシインドール−３−酢酸（５−ＨＩＡＡ）、キヌレニン（ＫＹＮ）、キヌレン酸（ＫＹＮＡ）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、キノリン酸（ＱＵＩＮ）、アントラニル酸（ＡＮＡ）、セロトニン−Ｏ−スルフェート、及びセロトニン−Ｏ−ホスフェートからなる群から選択された１種以上のメンバーに対する交差反応性が１％未満である、単離抗体又は抗原結合断片が提供される。
【０１２２】
[0137]ある種の他の態様では、本発明は、ヒトなどの哺乳動物由来の体液サンプル又は組織サンプル中のメラトニンをアッセイする方法を提供する。方法は、サンプルを、本明細書に記載の抗体と組み合わせるステップと、その後、抗体がサンプル中のメラトニンに特異的に結合するかを決定するステップと、を含む。例えば、これらの方法において、サンプル由来のメラトニンに対し特異的な抗体結合があった場合、サンプル中にメラトニンが存在することを意味する。
【０１２３】
[0138]ある例では、本発明の抗体は、代謝産物のレベル及び濃度を検出する酵素標識を利用できる酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ、例えば、競合的ＥＬＩＳＡ）又はＣＥＥＲなどの免疫アッセイに使用される。
【０１２４】
[0139]Ｌは、キャリアタンパク質又はビオチンなどの生体分子に付加させるための連結基を表す。いくつかの実施形態では、Ｌは、ポリエチレングリコール又はＰＥＧを含む。例えば、Ｌは、環に共有結合した末端アミノ基、末端カルボン酸基、又は末端スルフヒドリル基を含み得る。ある例では、末端アミノ基、末端カルボン酸基、又は末端スルフヒドリル基が示され、−Ｌ−ＮＨ２、又は−Ｌ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ又は−Ｌ−ＳＨとして表される。
【０１２５】
[0140]Ｒ１１は、本発明の化合物と、キャリアタンパク質、ペプチド、又はビオチンなどの生体分子との間に得られる付加を表す（すなわち、Ｒ１１は、生体分子に結合した連結基を構成する）。
【０１２６】
[0141]Ｌは、直接結合、又は共有結合からなる群から選択されたメンバーであり、共有結合は、直鎖又は分岐鎖、環式又は複素環式、飽和又は不飽和であり、Ｃ、Ｎ、Ｐ、Ｏ、及びＳからなる群から選択された原子を１〜６０個有し、Ｌは、価数を満足するよう追加の水素原子を有してよく、結合は、エーテル結合、チオエーテル結合、アミン結合、エステル結合、カルバメート結合、尿素結合、チオ尿素結合、オキシ結合、又はアミド結合のいずれかの組み合わせ；あるいは一重結合、二重結合、三重結合、又は芳香族炭素−炭素結合；あるいは、リン−酸素結合、リン−硫黄結合、窒素−窒素結合、窒素−酸素結合、又は窒素−白金結合；あるいは、芳香族又は複素芳香族結合、を含有する。ある種の態様では、Ｌは、末端アミノ基、末端カルボン酸基、又は末端スルフヒドリル基を含む。
【０１２７】
[0142]ある種の態様では、Ｌは、式：
−Ｘ１−Ｙ１−Ｘ２−
［式中、Ｘ１は、二価基、直接結合、酸素、場合により置換窒素、及び硫黄からなる群から選択されるメンバーであり；Ｙ１は、直接結合、及び場合によりヘテロ原子を中に含む（interrupted）Ｃ１〜Ｃ１０アルキレンからなる群から選択されるメンバーであり；Ｘ２は、二価基、直接結合、酸素、場合により置換窒素、及び硫黄からなる群から選択されるメンバーである］。
【０１２８】
[0143]好ましくは、Ｘ１及びＸ２の二価基は、それぞれ独立して、直接結合、場合により置換アルキレン、場合により置換アルキレンオキシカルボニル、場合により置換アルキレンカルバモイル、場合により置換アルキレンスルホニル、アリーレンスルホニル、場合により置換アリーレンオキシカルボニル、場合により置換アリーレンカルバモイル、場合により置換チオカルボニル、場合により置換スルホニル、及び場合により置換スルフィニルからなる群から選択される。
【０１２９】
[0144]ある種の好ましい態様では、Ｌは、−（ＣＨ２）ｎ−であり、式中、ｒは１〜１０の整数であり、好ましくはｎは、１〜４、又は１、２、３、４、若しくは５など、１〜５の整数である。
【０１３０】
[0145]ある例では、メラトニンハプテン、それらのバリアント、又はそれらの誘導体と、リンカーアームＬ（ｎは約１〜２０である）とを使用して、キャリアタンパク質をアミノ（又はスルフヒドリル）末端に付加できる。いくつかの実施形態では、リンカーアームはＰＥＧである。リンカーアームとしては、次のリンカー：ＰＥＧ１、ＰＥＧ２、ＰＥＧ３、ＰＥＧ４、ＰＥＧ５、ＰＥＧ６、ＰＥＧ７、ＰＥＧ８、ＰＥＧ９、ＰＥＧ１０、ＰＥＧ１１、ＰＥＧ１２、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ１４、ＰＥＧ１５、ＰＥＧ１６、ＰＥＧ１７、ＰＥＧ１８、ＰＥＧ１９、又はＰＥＧ２０を挙げることができる。一実施形態では、キャリアタンパク質、例えば、ＢＳＡ、ＲＳＡ、ＭＳＡ、ＫＬＨ、ＯＶＡなどに複合又は結合させた安定なメラトニンハプテンが免疫原を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書においてメラトニンハプテンが記載される。ハプテンは、他の生体分子に結合させることもできる。例えば、前述のように製造された抗体の親和性及び特異性を試験するに当たり、ハプテンは、ビオチニル化ハプテン、例えば、ビオチニル化メラトニンを作製するべく、ビオチンに結合させた複合物であってよく、あるいはビオチンに結合させてもよい。
【０１３１】
[0146]別の態様では、当業者に知られる、抗体の製造を目的とした複合物形成反応により、メラトニン化合物、それらのバリアント、又はそれらの誘導体をキャリアタンパク質に結合させることができる。例えば、活性化エステル（ＮＨＳエステル）を、第一級アミンと反応させて、安定なアミド結合を形成できる。マレイミド及びチオールを一緒に反応させると、チオエーテルを形成できる。ハロゲン化アルキルをアミン及びチオールと反応させると、それぞれアルキルアミン及びチオエーテルを形成する。本明細書では、タンパク質と複合物を形成し得る反応部分を提供する誘導体を利用できる。当該技術分野で知られるとおり、遊離アミノ基、遊離カルボン酸基、又は遊離スルフヒドリル基を含む部分は、タンパク質の複合物形成に有用な反応基を提供する。例えば、遊離アミノ基を、グルタルアルデヒド架橋により、又はカルボジイミド架橋により、タンパク質の利用可能なカルボキシ部分と結合させることができる。同様にして、遊離スルフヒドリル基を有するハプテンを、例えば、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）を使用したタンパク質のマレイミド活性化によりタンパク質に結合させたあと、スルフヒドリル基を結合させることができる。
【０１３２】
[0147]アミン含有代謝産物に付加させるためのカルボン酸基を有するキャリアタンパク質を結合させるとき、活性剤を使用して、このカルボン酸を反応性のより高い形態、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル又は無水混合物形態に最初に変換することができる。アミン含有代謝産物を、得られる活性化酸により処理して、アミド結合を形成させる。当業者であれば、あるいは、代謝産物上にＮＨＳエステルがあってよく、キャリアタンパク質上にアミンがあってよいことを認識されるであろう。
【０１３３】
[0148]本開示は、メラトニン（セロトニン代謝産物）に特異的に結合する抗体（例えば、抗体、それらの抗体断片、及びそれらの抗原結合断片）の製造方法も提供する。方法は、（ａ）キャリアタンパク質と結合させたメラトニンハプテンを含む免疫原を準備するステップと、（ｂ）動物の免疫システムが抗体を作製するような条件下で動物に免疫原を免疫するステップと、（ｃ）動物からメラトニンに特異的に結合した抗体を回収するステップと、を含む。動物は、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラット、又はマウスなどであり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。他の実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体である。メラトニンハプテンは、化学的に合成でき、あるいは当業者に知られる何らかの方法により製造され得る。
【０１３４】
[0149]一実施形態では、本明細書に開示される方法により製造され、メラトニンに対し特異的に結合する、単離又は精製された抗体又はそれらの抗原結合断片の、トリプトファン経路、セロトニン経路、及びキヌレニン経路の構造的に類似している化合物との交差反応性は１％未満であり、例えば、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％又は０％である。いくつかの例では、抗メラトニン抗体又はそれらの断片は、メラトニンと構造的に類似している、図１のトリプトファン１２２、５−ヒドロキシトリプトファン１２５、セロトニン１０１、５−ヒドロキシインドール酢酸１１５、キヌレニン１３１、キヌレン酸１３５、アントラニル酸１４０、３−ヒドロキシキヌレニン１４６、３−ヒドロキシアントラニル酸１４９、キノリン酸１６０、及びキサンツレン酸１４８などといった、トリプトファン経路、セロトニン経路、及びキヌレニン経路の代謝産物又は化合物に対し、交差反応性を実質的に示さない。本明細書において、メラトニンに対し特異的に免疫反応性であるポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を提供する。
【０１３５】
[0150]一態様では、哺乳動物から精製された抗体又はそれらの抗原結合断片は、本発明の複合物を使用して、血清から回収又は分離され得る。いくつかの場合では、哺乳動物からの抗メラトニン抗体の回収には、他の生体分子又は化合物に結合させたビオチン化メラトニン又はメラトニンを使用できる。精製方法についての詳細な説明を以下に開示する。
【０１３６】
[0151]いくつかの態様では、本発明は、２０１５年１１月１７日にアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ（登録商標））にＡＴＣＣ受託番号＿で寄託された１２１２−６Ｃ１Ｅ２Ｆ７と表記されるハイブリドーマ細胞株により産生され、メラトニンに対し免疫反応性である、単離又は精製モノクローナル抗体を提供する。
【０１３７】
Ｃ．キヌレニン経路代謝産物−キヌレン酸ハプテン
[0152]キヌレニン経路代謝産物は、内臓痛の機序において機能し、ＩＢＳにおける低レベルの免疫活性に関連する。食物由来のトリプトファンのうち、セロトニンに変換されるのはわずか１％であり、９５％超はキヌレニンに代謝される。ＩＢＳ患者では、キヌレニンレベル及び「キヌレニン：トリプトファン比」の両方は顕著に上昇している。典型的には、ＩＢＳ患者は、キヌレン酸（ＫＹＮＡ）濃度の低下、並びにアントラニル酸（ＡＮＡ）及び３−ヒドロキシアンスラニル酸濃度の上昇を示す。キヌレニン経路を介するトリプトファン代謝は、ＩＢＳ−Ｄ患者では阻害される。本発明は、ＩＢＳ患者のステータスを決定するに当たり、診断上重要である、トリプトファン経路及びキヌレニン経路の代謝産物のレベルを決定する免疫アッセイを提供する。
【０１３８】
[0153]本明細書において、キャリアタンパク質などの生体分子と結合させて免疫応答を刺激するアジュバントと組み合わせることのできるハプテン、すなわち、安定なキヌレン酸（ＫＹＮＡ）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、キノリン酸、及びアントラニル酸が提供される。ハプテンは、他の生体分子に結合させることもできる。一実施形態では、キャリアタンパク質に複合又は結合させた安定なキヌレン酸（ＫＹＮＡ）ハプテンが免疫原を産生する。いくつかの場合では、本明細書においてＫＹＮＡハプテンが記載される。
【０１３９】
[0154]本開示は、キヌレン酸（ＫＹＮＡ）、これらのバリアント、又はこれらの誘導体などといった、指定のキヌレニン経路代謝産物に特異的に結合する抗体の製造方法も提供する。本方法は、（ａ）キャリアタンパク質に結合させた、キヌレニン（Ｋ）、キヌレン酸（ＫＹＮＡ）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、キノリン酸、アンスラニル酸、それらのバリアント、又はそれらの誘導体からなる群から選択されたハプテンを含む、免疫原を準備するステップと、（ｂ）動物の免疫システムが抗体を作製するような条件下で動物に免疫原を免疫するステップと、（ｃ）動物から抗体を回収するステップと、を含む。動物は、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラット、又はマウスなどであり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。他の実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体である。
【０１４０】
[0155]一実施形態では、本明細書に開示される方法により製造され、ＫＹＮＡに対し特異的に結合する、単離又は精製された抗体の、トリプトファン経路、セロトニン経路、及びキヌレニン経路の構造的に類似している化合物との交差反応性は１％未満であり、例えば、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％又は０％である。いくつかの例では、抗ＫＹＮＡ抗体は、ＫＹＮＡと構造的に類似している、図１のトリプトファン１２２、５−ヒドロキシトリプトファン１２５、セロトニン１０１、メラトニン１２０、５−ヒドロキシインドール酢酸１１５、キヌレニン１３１、アントラニル酸１４０、３−ヒドロキシキヌレニン１４６、３−ヒドロキシアントラニル酸１４９、キノリン酸１６０、及びキサンツレン酸１４８といった、トリプトファン経路、セロトニン経路、及びキヌレニン経路の代謝産物又は化合物に対し、交差反応性を実質的に示さない。
【０１４１】
[0156]更に態様では、本発明は、式ＩＩＩの化合物を提供する：
【化５】
2018501202.tif 000007
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、それぞれ独立して、水素、アルキル、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アロイル、アルカノイル、アミド、置換アミド、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、スルホナト、アルコキシアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、スルホナトアルキルＬ及びＲ１１Ｂからなる群から選択されるメンバーであり；Ｌはリンカーであり；Ｒ１１は、化合物と生体分子との間に得られる付加であり；Ｂは生体分子である。式ＩＩＩの化合物は、キヌレン酸１３５に特異的な抗体の作製に有用である。
【０１４２】
[0157]別の態様では、当業者に知られる、抗体の製造を目的とした複合物形成反応により、式ＩＩＩの化合物をキャリアタンパク質に結合させることができる。例えば、活性化エステル（ＮＨＳエステル）を、第一級アミンと反応させて、安定なアミド結合を形成できる。マレイミド及びチオールを一緒に反応させると、チオエーテルを形成できる。ハロゲン化アルキルをアミン及びチオールと反応させると、それぞれアルキルアミン及びチオエーテルを形成する。本明細書では、タンパク質と複合物を形成し得る反応部分を提供する誘導体を利用できる。当該技術分野で知られるとおり、遊離アミノ基、遊離カルボン酸基、又は遊離スルフヒドリル基を含む部分は、タンパク質の複合物形成に有用な反応基を提供する。例えば、遊離アミノ基を、グルタルアルデヒド架橋により、又はカルボジイミド架橋により、タンパク質の利用可能なカルボキシ部分と結合させることができる。同様にして、遊離スルフヒドリル基を有するハプテンを、例えば、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）を使用したタンパク質のマレイミド活性化によりタンパク質に結合させたあと、スルフヒドリル基を結合させることができる。
【０１４３】
[0158]複合物形成についての代表的なスキームは以下のとおりであり、式中、Ｌは末端ＳＨを含む：
【化６】
2018501202.tif 000008
【０１４４】
[0159]キャリアタンパク質と結合させることのできるキヌレン酸ハプテンの代表的な実施形態。得られた免疫原を使用して、キヌレン酸に対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を生成できる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のモノクローナル抗体は、以下の化学構造を含むキヌレン酸免疫原を使用して生成される。他の実施形態では、本明細書に記載のポリクローナル抗体は、以下の化学構造を含むキヌレン酸免疫原から生成される。
【化７】
2018501202.tif 000009
【０１４５】
[0160]リンカーアーム（式中、ｎは約１〜２０である）を使用して、チオ複合物形成を介しキャリアタンパク質を付加できる。
【０１４６】
[0161]Ｌは、キャリアタンパク質又はビオチンなどの生体分子に付加させるための連結基を表す。いくつかの実施形態では、Ｌは、ポリエチレングリコール又はＰＥＧを含む。例えば、Ｌは、環に共有結合した末端アミノ基、末端カルボン酸基、又は末端スルフヒドリル基を含み得る。ある例では、末端アミノ基、末端カルボン酸基、又は末端スルフヒドリル基が示され、−Ｌ−ＮＨ２、又は−Ｌ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ又は−Ｌ−ＳＨとして表される。
【０１４７】
[0162]Ｒ１１は、本発明の化合物と、キャリアタンパク質、ペプチド、又はビオチンなどの生体分子との間に得られる付加を表す（すなわち、Ｒ１１は、生体分子に結合した連結基を構成する）。
【０１４８】
[0163]Ｌは、直接結合、又は共有結合からなる群から選択されたメンバーであり、共有結合は、直鎖又は分岐鎖、環式又は複素環式、飽和又は不飽和であり、Ｃ、Ｎ、Ｐ、Ｏ、及びＳからなる群から選択された原子を１〜６０個有し、Ｌは、価数を満足するよう追加の水素原子を有してよく、結合は、エーテル結合、チオエーテル結合、アミン結合、エステル結合、カルバメート結合、尿素結合、チオ尿素結合、オキシ結合、又はアミド結合のいずれかの組み合わせ；あるいは一重結合、二重結合、三重結合、又は芳香族炭素−炭素結合；あるいは、リン−酸素結合、リン−硫黄結合、窒素−窒素結合、窒素−酸素結合、又は窒素−白金結合；あるいは、芳香族又は複素芳香族結合、を含有する。ある種の態様では、Ｌは、末端アミノ基、末端カルボン酸基、又は末端スルフヒドリル基を含む。
【０１４９】
[0164]ある種の態様では、Ｌは、式：
−Ｘ１−Ｙ１−Ｘ２−
［式中、Ｘ１は、二価基、直接結合、酸素、場合により置換窒素、及び硫黄からなる群から選択されるメンバーであり；Ｙ１は、直接結合、及び場合によりヘテロ原子を中に含む（interrupted）Ｃ１〜Ｃ１０アルキレンからなる群から選択されるメンバーであり；Ｘ２は、二価基、直接結合、酸素、場合により置換窒素、及び硫黄からなる群から選択されるメンバーである］。
【０１５０】
[0165]好ましくは、Ｘ１及びＸ２の二価基は、それぞれ独立して、直接結合、場合により置換アルキレン、場合により置換アルキレンオキシカルボニル、場合により置換アルキレンカルバモイル、場合により置換アルキレンスルホニル、アリーレンスルホニル、場合により置換アリーレンオキシカルボニル、場合により置換アリーレンカルバモイル、場合により置換チオカルボニル、場合により置換スルホニル、及び場合により置換スルフィニルからなる群から選択される。
【０１５１】
[0166]ある種の好ましい態様では、Ｌは、−（ＣＨ２）ｎ−であり、式中、ｒは１〜１０の整数であり、好ましくはｎは、１〜４、又は１、２、３、４、若しくは５など、１〜５の整数である。
【０１５２】
[0167]哺乳動物により生成された抗体は、本発明の複合物を使用して血清から回収され得る。例えば、一態様では、式ＩＩＩｃの化合物は、式ＩＩＩの構造を有する：
【化８】
2018501202.tif 000010
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のそれぞれは水素である。
【０１５３】
[0168]本明細書において、安定なＫＹＮＡハプテン、それらの変異体、又はそれらの誘導体を、キャリアタンパク質などの生体分子と結合させ、アジュバントと結合させて免疫応答を刺激できる。ある例では、ＫＹＮＡハプテン、それらのバリアント、又はそれらの誘導体と、リンカーアーム（ｎは約１〜２０である）とを使用して、キャリアタンパク質をアミノ（又はスルフヒドリル）末端に付加できる。いくつかの実施形態では、リンカーアームはＰＥＧである。リンカーアームとしては、次のリンカー：ＰＥＧ１、ＰＥＧ２、ＰＥＧ３、ＰＥＧ４、ＰＥＧ５、ＰＥＧ６、ＰＥＧ７、ＰＥＧ８、ＰＥＧ９、ＰＥＧ１０、ＰＥＧ１１、ＰＥＧ１２、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ１４、ＰＥＧ１５、ＰＥＧ１６、ＰＥＧ１７、ＰＥＧ１８、ＰＥＧ１９、又はＰＥＧ２０を挙げることができる。一実施形態では、キャリアタンパク質、例えば、ＢＳＡ、ＲＳＡ、ＭＳＡ、ＫＬＨ、ＯＶＡなどに複合又は結合させた安定なＫＹＮＡハプテンが免疫原を提供する。ハプテンは、他の生体分子に結合させることもできる。例えば、前述のように製造された抗体の親和性及び特異性を試験するに当たり、ハプテンは、ビオチニル化ＫＹＮＡ、例えば、ビオチニル化ハプテンを作製するべく、ビオチンに結合させた複合物であってよく、あるいはビオチンに結合させてもよい。
【０１５４】
[0169]別の態様では、本発明は、キヌレン酸に特異的に結合する単離若しくは精製抗体又はそれらの抗原結合断片が提供され、抗体は、図１のトリプトファン１２２、５−ヒドロキシトリプトファン１２５、セロトニン１０１、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）１１５、キヌレニン１３１、アントラニル酸１４０、３−ヒドロキシキヌレニン１４６、３−ヒドロキシアントラニル酸１４９、キノリン酸１６０、キサンツレン酸１４８、及びメラトニン１２０からなる群から選択された１種以上のメンバーに対する交差反応性が１％未満である。
【０１５５】
[0170]いくつかの態様では、本発明は、２０１５年１１月１７日にアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ（登録商標））にＡＴＣＣ受託番号＿で寄託された１１９４−６Ｈ５Ｂ１１Ａ７と表記されるハイブリドーマ細胞株により産生され、ＫＹＮＡに対し免疫反応性である、単離又は精製モノクローナル抗体を提供する。かかる抗体は、トリプトファン経路、セロトニン経路、及びキヌレニン経路の構造的に類似しているその他の代謝産物又は化合物に対し、実質的に交差反応性を有しない。
【０１５６】
Ｄ．免疫アッセイにより、生体サンプル中の代謝産物を検出するステップ
[0171]いくつかの態様では、本開示は、ヒト被検体などの被検体由来の生体サンプル中のメラトニンレベルを検出、測定又は定量するアッセイ方法及びキットを提供する。いくつかの実施形態では、ヒト被検体は、健常な被検体と比べてメラトニン、５−ＨＩＡＡ、及び／又はキヌレン酸が高レベル又は低レベルであることに関連付けられる状態を有する。いくつかの例では、状態は、次のサブタイプ：便秘型ＩＢＳ（ＩＢＳ−Ｃ）、下痢型ＩＢＳ（ＩＢＳ−Ｄ）、混合型ＩＢＳ（ＩＢＳ−Ｍ）、及び分類不能型ＩＢＳ（ＩＢＳ−Ｕ）のうちのいずれかを含む過敏性腸症候群である。方法は、抗５−ＨＩＡＡ抗体、ビオチン化５−ＨＩＡＡ、抗キヌレン酸抗体、ビオチン化キヌレン酸、抗メラトニン抗体、ビオチン化メラトニン、及びこれらの任意の組み合わせを使用することを包含し得る。
【０１５７】
[0172]いくつかの態様では、本発明は、哺乳動物、例えば、ヒト由来の、体液サンプル又は組織サンプルなどといった生体サンプル中の、セロトニン代謝産物の有無、又はレベルを、アッセイ、測定、又は検出する方法を提供する。いくつかの実施形態では、セロトニン代謝産物は、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）である。いくつかの例では、本方法は、ヒト被検体から得られた生体サンプル中の５−ＨＩＡＡ量又は濃度を測定又は定量することを含む。方法は、抗体と、サンプル中に存在する場合の５−ＨＩＡＡと、が複合体を形成する条件下で、５−ＨＩＡＡに特異的に結合する抗体と、サンプルとを組み合わせるステップを含み得る。抗体は、本明細書に記載の抗−５ＨＩＡＡ抗体のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、サンプルと、抗５ＨＩＡＡ抗体とは、固定化した５−ＨＩＡＡ誘導体とも組み合わせられる。固定化した５−ＨＩＡＡ誘導体は、ストレプトアビジンコートしたマルチウェルプレートなどのストレプトアビジンコートした固体基材に付加された、又は結合した、本明細書に記載のビオチン化５−ＨＩＡＡであってよい。いくつかの実施形態では、サンプル、抗５ＨＩＡＡ抗体、及び固定化した５−ＨＩＡＡ誘導体を同時に接触させ、又は一緒に加える。いくつかの場合では、サンプル及び抗５−ＨＩＡＡ抗体を、予め選択された時間にわたり一緒にインキュベートしたあと、固定化した５−ＨＩＡＡ又はビオチン化５−ＨＩＡＡとインキュベートする。他の場合では、固定化した又はビオチン化５−ＨＩＡＡ誘導体を、予め選択された時間にわたり抗５−ＨＩＡＡ抗体とインキュベートしたあと、サンプルとインキュベートする。更に他の場合では、サンプル、抗５ＨＩＡＡ抗体、及び固定化した５ＨＩＡＡを、任意の順番で連続的に接触させる。サンプル中の５−ＨＩＡＡレベルは、固定化した５−ＨＩＡＡ誘導体に結合した抗５−ＨＩＡＡ抗体のレベルを測定し、サンプル中の５−ＨＩＡＡの相当レベルを計算することにより決定できる。換言すると、固定化した５−ＨＩＡＡ誘導体と複合体を形成した抗５ＨＩＡＡ抗体のレベルは直接測定でき、次いでサンプル中の５−ＨＩＡＡレベルを間接的に定量できる。いくつかの場合では、サンプル中の５−ＨＩＡＡは、固定化した５−ＨＩＡＡ誘導体に結合した抗５−ＨＩＡＡ抗体のレベルに対し反比例する。
【０１５８】
[0173]他の態様では、本発明は、哺乳動物、例えば、ヒト被検体由来の体液サンプル又は組織サンプルなどといった生体サンプル中のメラトニンなどのセロトニン代謝産物の有無又はレベルをアッセイする方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、メラトニンに特異的に結合する抗体と、サンプル中に存在する場合のメラトニンとが複合体を形成する条件下で、被検体から得られたサンプルを、かかる抗体と組み合わせるステップを含む。抗体は、本明細書に開示される任意の抗メラトニン抗体であり得る。いくつかの実施形態では、サンプル及び抗メラトニン抗体は、固定化したメラトニンとも組み合わせられる。固定化したメラトニンは、ストレプトアビジンコートしたマルチウェルプレートなどのストレプトアビジンコートした固体基材に付加又は結合させた、本明細書に記載のビオチン化メラトニンであり得る。いくつかの実施形態では、サンプル、抗−抗体（anti-antibody）、及び固定化したメラトニンを同時に接触させ、又は一緒に加える。いくつかの場合では、サンプル及び抗メラトニン抗体を事前に設定した時間にわたり共にインキュベートしたあと、固定化したメラトニン又はビオチン化メラトニンとインキュベートする。他の場合では、固定化したメラトニン又はビオチン化メラトニンを事前に設定した時間にわたり抗メラトニン抗体とインキュベートしたあと、サンプルとインキュベートする。更に他の場合では、サンプル、抗メラトニン抗体及び固定化したメラトニンを任意の順番で接触させる。サンプル中のメラトニンレベルは、固定化したメラトニンに結合した抗メラトニン抗体のレベルを測定し、サンプル中の相当するメラトニンレベルを計算することにより決定できる。例えば、固定化したメラトニンと複合体を形成した抗メラトニン抗体のレベルは直接測定でき、次いでサンプル中のメラトニンレベルを間接的に定量できる。いくつかの場合では、サンプル中のメラトニンは、固定化したメラトニンに結合した抗メラトニン抗体のレベルに対し反比例する。
【０１５９】
[0174]他の態様では、本発明は、哺乳動物、例えば、ヒト被検体由来の体液サンプル又は組織サンプルなどといった生体サンプル中のキヌレン酸（ＫＹＮＡ）などのキヌレニン代謝産物の有無又はレベルをアッセイする方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、ＫＹＮＡに特異的に結合する抗体と、サンプル中に存在する場合のメラトニンとが複合体を形成する条件下で、被検体から得られたサンプルを、かかる抗体と組み合わせるステップを含む。抗体は、本明細書に開示される任意の抗ＫＹＮＡ抗体であってよい。いくつかの実施形態では、サンプル及び抗ＫＹＮＡ抗体も、固定化したＫＹＮＡと組み合わせる。固定化したＫＹＮＡは、ストレプトアビジンコートしたマルチウェルプレートなどのストレプトアビジンコートした固体基材に付加された、又は結合した、本明細書に記載のビオチン化ＫＹＮＡであってよい。いくつかの実施形態では、サンプル、抗−抗体（anti-antibody）、及び固定化したＫＹＮＡを同時に接触させ、又は一緒に加える。いくつかの場合では、サンプル及び抗ＫＹＮＡ抗体を事前に設定した時間にわたり共にインキュベートしたあと、固定化したＫＹＮＡ又はビオチン化ＫＹＮＡとインキュベートする。他の場合では、固定化したＫＹＮＡ又はビオチン化ＫＹＮＡを事前に設定した時間にわたり抗ＫＹＮＡ抗体とインキュベートしたあと、サンプルとインキュベートする。更に他の場合では、サンプル、抗ＫＹＮＡ抗体、及び固定化したＫＹＮＡを、任意の順番で連続的に接触させる。サンプル中のＫＹＮＡレベルは、固定化したＫＹＮＡに結合した抗ＫＹＮＡ抗体のレベルを測定し、サンプル中の相当するＫＹＮＡレベルを計算することにより決定できる。いくつかの実施形態では、固定化したＫＹＮＡと複合体を形成した抗ＫＹＮＡ抗体のレベルは直接測定でき、次いでサンプル中のＫＹＮＡレベルを間接的に定量できる。いくつかの場合では、サンプル中のＫＹＮＡは、固定化したＫＹＮＡに結合した抗ＫＹＮＡ抗体のレベルに対し反比例する。
【０１６０】
[0175]いくつかの実施形態では、サンプルは、全血サンプル、血漿サンプル、又は血清サンプルである。このようなサンプルは、ヒト被検体などの被検体から単離でき、又は得ることができる。いくつかの場合では、被検体はＩＢＳであるとして診断を受けている。他の場合では、被検体はＩＢＳであるいう診断を受けていない。いくつかの例では、被検体はＩＢＳであると疑われている。他の例では、被検体は、ＩＢＳの症状のうちの１つ以上を経験しており、又は呈している。いくつかの実施形態では、アッセイ方法において使用するサンプルは、希釈サンプルである。サンプルは、未加工のサンプルであってよい。いくつかの例では、本方法に使用するサンプルの用量は、約１００μＬ未満であり、例えば、約９９μＬ、９０μＬ、８５μＬ、８０μＬ、７５μＬ、７０μＬ、６５μＬ、６０μＬ、５５μＬ、５０μＬ、４５μＬ、４０μＬ、３５μＬ、３０μＬ、２５μＬ、２０μＬ、１５μＬ、１０μＬ、又は５μＬ未満である。サンプル用量を、約５０μＬ未満、例えば、約５０μＬ、４５μＬ、４０μＬ、３５μＬ、３０μＬ、２５μＬ、２０μＬ、１５μＬ、１０μＬ、５μＬ未満にすることもできる。
【０１６１】
[0176]いくつかの実施形態では、アッセイ方法を実施するのに当たり、所要時間は２４時間未満であり、例えば、２３時間、２２時間、２１時間、２０時間、１９時間、１８時間、１７時間、１６時間、１５時間、１４時間、１３時間、１２時間、１１時間、１０時間、９時間、８時間、７時間、６時間、５時間、４時間、３時間、２時間、１時間、又は３０分未満である。
【０１６２】
[0177]ある種の態様では、結合した抗代謝産物抗体のレベル、又は代謝産物のレベルを測定するステップは、免疫アッセイを用いて実施される。免疫アッセイは、体液中の代謝産物をモニターするための、信頼性が高く、容易（facile）な方法を提供する。本発明は、トリプトファン代謝産物、セロトニン代謝産物、キヌレニン代謝産物のうちの１種以上の検出及び定量にあたって特異性及び感度が高く信頼性の高い免疫アッセイを提供する。いくつかの実施形態では、免疫アッセイは、例えば、競合的ＥＬＩＳＡなどの酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）であり、又は例えば、ＣＥＥＲ（商標）などの近接免疫アッセイである。
【０１６３】
[0178]いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体を、形成された抗原−抗体複合物を測定するのに使用できる検出可能な任意の標識又は部分に結合させることができる。いくつかの場合では、抗体は、発色団、金コロイド、有色ラテックス、フルオロフォアなどの読み取り可能なシグナルに直接結合させる。他の場合では、抗体を、酵素、ペプチド、又は他の生体分子と結合させる。
【０１６４】
[0179]一態様では、本発明は、抗体−抗原反応が実施されるアッセイ方法を提供する。ＥＬＩＳＡの一実施形態では、被検体から得られたサンプル中に存在する５−ＨＩＡＡ、メラトニン、又はＫＹＮＡなどの抗原又は代謝産物を、アッセイする代謝産物に特異的な、酵素標識した抗体、例えば、ペルオキシダーゼ標識した抗体と反応させて、抗原−抗体複合体を形成させる。このようにして形成した抗体−抗体複合体を検出基質と反応させて、酵素、例えばペルオキシダーゼ又はホスファターゼの活性を測定する。いくつかの実施形態では、代謝産物に特異的な抗体は、代謝産物に特異的な抗体を認識した酵素標識された抗体でも、代謝産物に特異的な抗体を認識した酵素標識された二次抗体でもない。検出基質は、酵素の活性を測定する目的で、二次抗体の酵素標識と反応させるために使用できる。酵素標識した抗体は、アルカリフォスファターゼ−、β−ガラクトシダーゼ−、又はＨＲＰ−標識した抗体であり得る。
【０１６５】
[0180]当業者により認識されている任意の検出基質を使用できる。例えば、化学発光反応に関しては、基質は、ルミノール、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ（登録商標）、ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、及びＤｙｎａＬｉｇｈｔ（商標）化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）であってよい。比色分析に際し、４−クロロ−１−ナフトール、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）、ＯＰＤ、ＯＮＰＧ、又はＴＭＢなどの基質を使用できる。蛍光反応には、４−メチルウンベリフェリルホスフェート二ナトリウム塩（ＭＵＰ）、ＱｕａｎｔａＢｌｕ（商標）蛍光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、及びＡｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ  Ｒｅａｇｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）などの基質を使用できる。代謝産物の有無、濃度及び又はレベルは、例えば、分光計又は他の検出装置を使用して測定され得る。
【０１６６】
[0181]他のＥＬＩＳＡ実施形態では、代謝産物又はそれらの誘導体を固定化できる。本発明の抗体は、固定化した代謝産物に結合させて、抗原−抗体複合体を形成させるよう使用できる。代謝産物を含むサンプルを使用して、抗原−抗体結合を完了させることができる。したがって、複合物は、酵素標識を有する他の抗体（二次抗体）により検出され得る。次に、この酵素標識を検出試薬又は基質と反応させたあと、モニターする。他の場合では、本発明の抗体を、検出可能な部分又は標識と複合物形成させて、二次抗体は使用せずに反応及び／又は検出することができる。
【０１６７】
[0182]本明細書に記載のいずれかの代謝産物を検出するアッセイ方法は、当該技術分野で既知のなんらかの免疫アッセイを含み得る。いくつかの態様では、アッセイは液相で実施される。他の実施形態では、アッセイは、固相又は固体支持体で実施され、例えば、９６ウェルマイクロタイタープレートなどのビーズ又はマイクロプレート上で実施される。これらの方法で有用な免疫アッセイの非限定例には、ラジオイムノアッセイ、マイクロアレイアッセイ、蛍光偏光免疫測定法、ＦＲＥＴを含む免疫アッセイ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、又はＣＥＥＲ（商標）がある。
【０１６８】
[0183]ハプテン検出に有用であるものとして当該技術分野で既知の任意のＥＬＩＳＡをインスタントアッセイに利用できる。ハプテン用のＥＬＩＳＡは、概して競合フォーマットを利用する。競合フォーマットでは、サンプル中のハプテン（代謝産物）が、抗ハプテン抗体結合部位に対し標識ハプテン（例えば、ビオチン−ハプテン又は酵素−ハプテン複合物）と競合し、サンプル中にハプテンが多量に存在するとき、標識ハプテンの結合は少なくなる。したがって、これらの競合アッセイでは、サンプル中のハプテンの量が多くなると、固相に結合する抗体は少なくなり、結果として検出可能なシグナルが減少する。このような競合アッセイでは、標識ハプテンと共にサンプルを加えて抗体結合部位に対し直接的に競合させることが可能、又はサンプル及び標識ハプテンを順に加えて、サンプルハプテンが結合していない部位に標識ハプテンを単純に結合させることが可能である。いくつかの実施形態では、ＥＬＩＳＡは直接競合的ＥＬＩＳＡ、又は間接競合的ＥＬＩＳＡである。
【０１６９】
[0184]一実施形態では、本明細書で産生される抗体は固相に直接的に又は間接的に結合し、間接的に結合する場合、固相は抗−抗体でコートされており（例えば、ウサギＩｇＧ抗体に結合するヤギ抗体（抗ウサギＩｇＧヤギ）、抗体は抗−抗体と結合する。抗−抗体は二次抗体としても知られる。これらのアッセイでは、サンプル及び標識ハプテンを固相に加え、コーティングされた固相上に抗体結合部位と競合させる。洗浄後、固相に結合した標識ハプテンの量の尺度となるシグナルが発生する。
【０１７０】
[0185]本明細書では、上記のアッセイ方法を実施するためのキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、例えば、抗５−ＨＩＡＡモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、及び場合によりビオチン化５−ＨＩＡＡ誘導体などといった、５−ＨＩＡＡに特異的に結合する抗体を含む。抗５−ＨＩＡＡモノクローナル抗体は、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号＿で寄託された１２０４−１０Ｇ６Ｆ１１Ｈ３と表記されるハイブリドーマクローンにより産生され得る。
【０１７１】
[0186]他の実施形態では、キットは、メラトニンに特異的に結合する抗体、例えば、抗メラトニンモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、及び場合によりビオチン化メラトニンを含む。モノクローナル抗体は、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号＿で寄託された１２１２−６Ｃ１Ｅ２Ｆ７と表記されるハイブリドーマクローンにより産生され得る。
【０１７２】
[0187]更に他の実施形態では、キットは、キヌレン酸に特異的に結合する抗体、例えば、抗キヌレン酸モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、及び場合によりビオチン化キヌレン酸を含む。モノクローナル抗体は、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号＿で寄託された１１９４−６Ｈ５Ｂ１１Ａ７と表記されるハイブリドーマクローンにより産生され得る。
【０１７３】
[0188]いくつかの例では、キットは、本明細書に記載のアッセイ法を実施するための取扱説明書も含む。キットは、５−ＨＩＡＡ標準対照、メラトニン標準対照、又はキヌレン酸標準対照などの代謝産物の標準対照も含む。いくつかの実施形態では、標準対照代謝産物は、対照とする代謝産物を、予め選択された濃度又は濃度既知で含む。
【０１７４】
Ｅ．ポリクローナル抗体
[0189]本明細書において提供されるポリクローナル抗体は、主要な抗体アイソタイプ：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭなどの、なんらかのアイソタイプであってよい。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、又はＩｇＡ２抗体として分類され得る。いくつかの例では、抗体は、カッパ（κ）軽鎖又はラムダ（λ）軽鎖を有する。
【０１７５】
[0190]ポリクローナル抗体は、本発明の抗原及びアジュバントを複数回皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射することにより、動物の内部で好ましくは産生される。対象とする抗原を、二官能性の剤又は誘導剤（derivatizing agent）により免疫される動物種において免疫原性であるキャリアタンパク質と結合させることは有用であり得る。二官能性の剤又は誘導剤の非限定例としては、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基による結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基による結合）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、及びＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲ１は異なるアルキル基である）が挙げられる。
【０１７６】
[0191]動物は、例えば、１００μｇ（ウサギの場合）又は５μｇ（マウスの場合）の抗原又は複合物と、３倍のフロイントの完全アジュバントとを組み合わせて、この溶液を複数箇所の皮内に注入することにより本発明の抗原、あるいはそれらの免疫原性複合物又は誘導体に対し免疫される。一ヶ月後、動物は、フロイントの不完全アジュバントにもともと含まれる量の約１／５〜１／１０量の複合物を複数箇所に皮下注射することにより追加免疫される。７日〜１４日後、この動物から採血し、抗体力価について血清をアッセイする。動物は、典型的には、力価がプラトーに達するまで追加免疫される。好ましくは、動物は、異なる免疫原性抗原と結合させた同じ抗原により追加免疫され、及び／又は異なる架橋剤も使用され得る。ある例では、ミョウバンなどの凝集剤を使用して、免疫応答を増強させることができる。ポリクローナル抗体の産生方法についての詳細な説明は、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）に見られる。
【０１７７】
Ｆ．モノクローナル抗体
[0192]本明細書において提供されるモノクローナル抗体は、主要な抗体アイソタイプ：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭなどの、なんらかのアイソタイプであってよい。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、又はＩｇＡ２抗体として分類され得る。いくつかの例では、抗体は、カッパ（κ）軽鎖又はラムダ（λ）軽鎖を有する。いくつかの実施形態では、抗５−ＨＩＡＡモノクローナル抗体、又は２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号＿で寄託された１２０４−１０Ｇ６Ｆ１１Ｈ３と表記されるハイブリドーマクローンにより産生されるモノクローナル抗体は、ＩｇＧ１κ抗体である。他の実施形態では、抗メラトニンモノクローナル抗体、又は２０１５年１１月１２日にＡＴＣＣ受託番号＿で寄託された１２１２−６Ｃ１Ｅ２Ｆ７と表記されるハイブリドーマクローンにより産生されるモノクローナル抗体は、ＩｇＧ３κ抗体である。更に他の実施形態では、抗ＫＹＮＡモノクローナル抗体、又は２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号＿で寄託された１１９４−６Ｈ５Ｂ１１Ａ７と表記されるハイブリドーマクローンにより産生されるモノクローナル抗体は、ＩｇＧ１κ抗体である。
【０１７８】
[0193]モノクローナル抗体は、概して、実質的に均質な抗体群から得られ、すなわち、抗体群を構成する各抗体は、天然に生じる変異がわずかに存在する可能性があるものの、それ以外は同一である。したがって、修飾語句「モノクローナル」は、その抗体が異なる抗体の混合物ではないという特性を意味する。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により報告されているハイブリドーマ法を使用して、あるいは当該技術分野で既知のなんらかの組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）を使用して作製され得る。
【０１７９】
[0194]ハイブリドーマ法では、マウス又は他の適切な宿主動物（例えば、ハムスター）を上記のとおりに免疫して、免疫に使用する対象となるポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生する又は産生し得る、リンパ細胞を刺激する。あるいは、リンパ細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫される。次に、ポリエチレングリコールなどの適した融合剤を使用して、前述の免疫化したリンパ細胞を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（例えばＧｏｄｉｎｇ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．５９〜１０３（１９８６）を参照されたい）。このようにして調製したハイブリドーマ細胞を、好ましくは未融合の親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する物質を１種以上含む好適な培養培地に播種し、増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が、酵素のヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）を欠損している場合、ハイブリドーマ細胞用の培養培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠損細胞の増殖を阻止するヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含むことになる。
【０１８０】
[0195]好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生を支持するものであり、及び／又はＨＡＴ培地などの培地に感受性のものである。ヒトモノクローナル抗体の産生に好ましいこのような骨髄腫細胞株の例としては、ＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍から誘導されたものなどのマウス骨髄腫細胞株（Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能）、ＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手可能）、並びにヒト骨髄腫又はマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；及びＢｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．５１〜６３（１９８７）を参照されたい）が挙げられる。
【０１８１】
[0196]ハイブリドーマ細胞を増殖させている培養培地を、対象としているポリペプチドに対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイすることもできる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法により、あるいはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイにより決定され得る。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ｔｈｅ  Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）を使用して決定され得る。
【０１８２】
[0197]望ましい特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を特定したあと、限界希釈法によりクローンをサブクローニングし、標準法により増殖させることができる（例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．５９〜１０３（１９８６）を参照されたい）。この目的に好適な培養培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭ培地又はＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。更に、ハイブリドーマ細胞を、動物において腹水腫瘍としてｉｎ  ｖｉｖｏ増殖させることもできる。サブクローニングにより分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティクロマトグラフィなどといった一般的な抗体精製法により、培養培地、腹水、又は血清から分離することができる。
【０１８３】
[0198]モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、従来手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離し、配列決定することができる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として機能する。かかるＤＮＡが単離されたならば、発現ベクター内に挿入したあと、元々は抗体を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞などの宿主細胞に導入して、組み換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を誘導する。例えば、Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６〜２６２（１９９３）；ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．，１３０：１５１〜１８８（１９９２）を参照されたい。このＤＮＡ配列は、例えば、重鎖及び軽鎖定常ドメインをコードしているマウス配列を相同なヒト配列で置き換えることにより改変することもできる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；並びにＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４）を参照されたい）、あるいは免疫グロブリンをコードしている配列の全て又は一部を免疫グロブリン以外のポリペプチドをコードしている配列と共有結合させることにより改変することもできる。
【０１８４】
[0199]更なる実施形態では、モノクローナル抗体又はそれらの抗体断片は、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２〜５５４（１９９０）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４〜６２８（１９９１）；並びにＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１〜５９７（１９９１）に報告される技法を使用して作製された抗体ファージライブラリによっても分離され得る。ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇによる高親和性（nM range）ヒトモノクローナル抗体の産生は、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９〜７８３（１９９２）に報告されている。非常に大規模なファージライブラリを構築する際にストラテジーとして使用されるコンビナトリアルな感染及びｉｎ  ｖｉｖｏでの組み換えは、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：２２６５〜２２６６（１９９３）に報告されている。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体の生成にあたって、従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に替える実現可能な方法である。
【０１８５】
Ｇ．抗体断片
[0200]抗体断片の産生にあたって様々な技法が開発されている。従来、これらの断片は、改変していない（intact）抗体を消化することにより生成されていた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈ．，２４：１０７〜１１７（１９９２）；ａｎｄ  Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照のこと）。しかしながら、現在では、これらの断片は、組み換え宿主細胞を使用して直接的に産生できるようになっている。例えば、抗体断片は、上掲の抗体ファージライブラリから単離され得る。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片であれば、大腸菌細胞から直接回収し、化学的に連結させて、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成させることもできる（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６３〜１６７（１９９２）を参照されたい）。他のアプローチでは、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組み換え宿主細胞培養物から直接単離できる。抗体断片を産生する際の他の技法も当業者には明らかであろう。他の実施形態では、選択される抗体は一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。例えば、国際出願ＰＣＴ第９３／１６１８５号；並びに米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号を参照されたい。抗体断片は、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載のものなどの直線状の抗体であってもよい。このような直線状の抗体断片は、単一特異性又は二重特異性なものであり得る。
【０１８６】
Ｈ．二重特異性抗体
[0201]二重特異性抗体は、少なくとも異なる２つのエピトープに対し結合特異性を有する抗体である。代表的な二重特異性抗体は、対象とする同じポリペプチドの異なる２つのエピトープに結合し得る。他の二重特異性抗体は、対象となるポリペプチドの結合部位を、１つ以上の追加の抗原に対する結合部位（複数可）と組み合わせ得る。二重特異性抗体は、完全長の抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製できる。
【０１８７】
[0202]二重特異性抗体の作製方法は当該技術分野で既知である。従来の完全長の二重特異性抗体の産生は、２種の免疫グロブリン重鎖−軽鎖対を同時発現させることをベースとしたものであり、ここで、２種の鎖は異なる特異性を有する（例えば、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７〜５３９（１９８３）を参照されたい）。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の組み合わせはランダムであることから、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０種の異なる抗体分子の混合物を産生する可能性があり、このうちのわずか１種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常、アフィニティクロマトグラフィによって実施される。同様の手順は、国際出願ＰＣＴ第９３／０８８２９号、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５〜３６５９（１９９１）に報告されている。
【０１８８】
[0203]別種のアプローチでは、望ましい結合特異性（抗体−抗原結合部位）を備えた抗体可変領域を免疫グロブリン定常領域の配列に融合させる。好ましくは、融合は、少なくともヒンジ部、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含む、免疫グロブリン重鎖定常領域に対するものである。融合体のうちの少なくとも１つに存在し、軽鎖の結合に必要とされる領域を含む、第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することは好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、及び所望される場合の免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡは、別個の発現ベクターに挿入され、適した宿主生物に同時導入される。これにより、各実施形態において、構造に使用される３つのポリペプチドド鎖の割合が不均一なときに、３つのポリペプチド断片の相互的な部分（mutual proportions）の調節が非常に柔軟なものになり、最適な収率が提供される。しかしながら、少なくとも２つのポリペプチド鎖を等比で発現させることで結果として高収率になる場合、又は比になんら有意性がない場合に、２本又は３本全てのポリペプチドド鎖を発現ベクターに挿入することは可能である。
【０１８９】
[0204]このアプローチに関し、好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、１本の腕が第１の結合特異性ハイブリッド免疫グロブリン重鎖で構成されており、他の腕は、ハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性をもたらす）で構成されている。この非対称的な構造により、二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することから、分離の仕方が容易になり、所望の二重特異性化合物を望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することが容易となる。例えば、国際出願ＰＣＴ第９４／０４６９０号及びＳｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
【０１９０】
[0205]米国特許第５，７３１，１６８号に記載の他のアプローチによると、組み換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大化するよう、抗体分子対間の接触面を組み換えることができる。好ましい接触面は、抗体の定常領域のＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の接触面の小さなアミノ酸側鎖のうち１つ以上を、より大きな側鎖で置き換える（例えば、チロシン又はトリプトファン）。大型のアミノ酸側鎖を、より小型の側鎖（例えば、アラニン又はスレオニン）に置き換えることにより、大型の側鎖（複数可）と同一又は類似した大きさの相補的な「キャビティ（caviries）」が、第２の抗体分子の接触面上に形成される。これにより、ホモ二量体などの他の望ましくない副生成物の収率よりもヘテロ二量体の収率を向上させるメカニズムが提供される。
【０１９１】
[0206]二重特異性抗体としては、架橋された抗体又は「ヘテロ複合物」抗体が挙げられる。例えば、ヘテロ複合物の抗体のうち片方は、アビジンに結合でき、他方はビオチンに結合できる。ヘテロ複合物抗体は、なんらかの従来の架橋方法を使用して作製できる。好適な架橋剤及び技法は当該技術分野で知られており、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０１９２】
[0207]また、抗体断片から二重特異性抗体を生成するに当たって好適な技法は、当該技術分野で既知である。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を利用して調製できる。ある例では、二重特異性抗体は、改変していない抗体をタンパク質を分解するように分裂させてＦ（ａｂ’）２断片を生成する手順により生成できる（例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元され、ビシナルジチオールが安定化され、分子間でのジスルフィド結合の形成が防止される。生成されたＦａｂ’断片を、次にチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうちの１つを、次にＦａｂ’−リオールに再変換し、メルカプトエチルアミンにより還元し、当モル量のその他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成させる。
【０１９３】
[0208]いくつかの実施形態では、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は大腸菌から直接回収され、化学結合を受けて二重特異性抗体を形成する。例えば、完全長ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子は、Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７〜２２５（１９９２）に記載の方法により産生され得る。各Ｆａｂ’断片は、大腸菌から別々に分泌され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接化学結合を受けて、二重特異性抗体を形成する。
【０１９４】
[0209]組み換え細胞培養物から二重特異性抗体断片を直接作製及び単離する様々な技法が報告されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを利用して産生されている。例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１５４７〜１５５３（１９９２）を参照されたい。Ｆｏｓタンパク質及びＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合により、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結させた。抗体のホモ二量体をヒンジ領域で還元してモノマーを生じさせたあと、再度酸化して抗体ヘテロ二量体を形成させた。この方法は、抗体ホモ二量体の産生にも利用可能である。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４〜６４４８（１９９３）に記載される「二重特異性抗体」の技法は、二重特異性抗体断片を作製するに当たっての代替的なメカニズムを提供した。断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）に結合した重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、それは非常に短いので同じ鎖上の２つの領域間で対を形成させることができない。したがって、ある断片のＶＨ領域及びＶＬ領域は、他の断片の相補的なＶＬ及びＶＨドメインと対を形成せざるを得ず、これによって抗原結合部位が２つ形成されることになる。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用して二重特異性抗体の断片を作成する際の他のストラテジーは、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）に記載されている。
【０１９５】
Ｉ．抗体精製
[0210]抗体は、当業者に既知の手法により精製できる。精製法としては、特に、選択的沈殿、液体クロマトグラフィ、ＨＰＬＣ、電気泳動、等電点電気泳動、ゲル電気泳動、透析、及び様々なアフィニティ法が挙げられる。選択的沈殿は、硫酸アンモニウム、エタノール（Cohn precipitation）、ポリエチレングリコール、又は当該技術分野で利用可能なその他のものを使用し得る。液体クロマトグラフィの媒体としては、特に、イオン交換培地ＤＥＡＥ、ポリアスパルテート）、ヒドロキシルアパタイト、サイズ排除（例えば、架橋アガロース、アクリルアミド、デキストランなどをベースとしたもの）、疎水性マトリックス（例えば、ブルーセファロース）が挙げられる。アフィニティ法は、典型的には、免疫グロブリンＦｃ領域と相互作用するタンパク質に依存する。スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureas）由来のタンパク質Ａは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖をベースとして抗体を精製するのに使用できる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１〜１３（１９８３））。Ｃ群及びＧ群のストレプトコッカス由来のプロテインＧ（Protein G）は、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に有用である（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Peptostreptococcus magnus）の細胞壁タンパク質であり、ｋ軽鎖相互作用（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ／ＣｌｏｎＴｅｃｈ．Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ．）により免疫グロブリン（Ｉｇ）に結合するプロテインＬ（Protein L）は、Ｉｇのサブクラス、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩｇＹのアフィニティ精製に有用である。これらのタンパク質の組み換え型は、市販されてもいる。ヒスチジンタグを含有するよう構成されたファージディスプレイ抗体などのように、抗体が金属結合残基を含有する場合、金属アフィニティクロマトグラフィを使用できる。
【０１９６】
[0211]十分な量の特異的細胞群が利用可能である場合、細胞を使用して抗原アフィニティマトリックスを作製して、抗体を精製するアフィニティ法を提供することもできる。アフィニティリガンドが結合するこのマトリックスはほとんどの場合アガロースであるものの、他のマトリックスも利用可能である。細孔の調整された（controlled pore）ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスにより、アガロースゲルを使用した場合よりも流速を上げ、プロセス時間を短縮することができる。抗体がＣＨ３領域を含む場合、精製にはＢａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ；Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が有用であり得る。回収する抗体によっては、タンパク質精製用の、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカによるクロマトグラフィ、ヘパリンセファロースによるクロマトグラフィ（商標）、アニオン又はカチオン交換樹脂によるクロマトグラフィ（ポリアスパラギン酸カラムなど）、クロマト分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などといった他の技法も使用することができる。
【０１９７】
[0212]組み換え法を使用する場合、抗体は、単離宿主細胞内で産生され、宿主細胞の細胞膜周辺腔で産生され、あるいは宿主細胞から培地に直接分泌される。抗体が細胞内で産生される場合、粒子状のデブリが、例えば遠心分離又は限外濾過により最初に除去される。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈ．，１０：１６３〜１６７（１９９２）では、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離する手法が報告されている。簡潔に述べると、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で、細胞ペーストを約３０分間解凍する。細胞デブリは遠心分離により除去できる。抗体が培地に分離される場合、このような発現系の上清は、概して市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｕｎｉｔを使用して濃縮される。前述の工程のいずれかにおいて、タンパク質分解を阻害するためにＰＭＳＦなどのプロテアーゼインヒビターを含めることもでき、偶発的な汚染菌の増殖を予防するために抗生物質を含めることもできる。
【０１９８】
[0213]いずれかの予備精製工程（複数可）後、対象とする抗体と、汚染菌とを含む混合物に対し、ｐＨ約２．５〜４．５の溶出液を使用して、低ｐＨでの疎水性相互作用クロマトグラフィを、好ましくは低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で実施する。
【０１９９】
[0214]当業者であれば、サンプル中の対象とする1種以上の分析物に特異的な抗体と類似した機能を有する結合分子、例えば、結合分子又は結合パートナーを本発明の方法及び組成物に使用できることも認識されるであろう。好適な抗体様分子の例としては、ドメイン抗体、ユニボディ（unibodies）、ナノボディ（nanobodies）、シャーク抗原反応プロテイン（shark antigen reactive protein）、アビマー（avimer）、アドネクチン（adnectin）、アンチカルム（anticalms）、アフィニティリガンド、フィロマー（phylomers）、アプタマー、アフィボディ（affibodies）、及びトリネクチン（trinectins）などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２００】
Ｊ．単離した抗体の反応性の評価方法
[0215]抗体の産生及び選択は何とおりかの方法で実施することができる。対象とする代謝産物に対応する抗原を合成し、精製したものを、例えば、マウス若しくはウサギ又は他の哺乳動物に注射して、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を産生させる。当業者であれば、抗体の産生には、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）に記載のものなどの多くの手法を利用可能であることを認識されるであろう。当業者であれば、遺伝子情報をもとに様々な手法により、抗体を模倣する（例えば、機能性結合領域を保持している）結合断片又はＦａｂ断片を作成することもできる。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９５）；ａｎｄ  Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４９：３９１４〜３９２０（１９９２）を参照されたい。
【０２０１】
[0216]これらの方法により産生させた抗体に対し、次に、対象とする精製抗原（本明細書に記載のものなどのビオチン化ハプテン）との親和性及び特異性について初回のスクリーニングを行い、選択して、必要に応じ、結合させないことが望ましい他の抗原に対する抗体親和性及び特異性について結果を比較することができる。スクリーニング法は、精製抗原をマイクロタイタープレートの別々のウェルに固定化することを包含する。プレートにはストレプトアビジンを固定化することができる。固定化後、候補となる抗体又は抗体群を含む溶液をそれぞれのマイクロタイターウェルに入れて約３０分から２時間インキュベートする。次に、マイクロタイターウェルを洗浄し、このウェルに、標識した二次抗体（例えば、産生させる抗体がマウス抗体である場合には、アルカリフォスファターゼを結合させた抗マウス抗体）を入れ、約３０分間インキュベートしたあと、洗浄する。各ウェルに基質を入れると、ビオチン化抗原などの固定化した抗原に対する抗体が存在する場合には呈色反応が生じる。
【０２０２】
[0217]このようにして特定した抗体を、次に親和性及び特異性について更に分析できる。標的代謝産物用の免疫アッセイの開発において、精製された標的代謝産物は、選択した抗体を用いる免疫アッセイの感度及び特異性を判断する基準として機能する。結合親和性は抗体によって異なり得るものであるため、例えば、ある種の抗体を組み合わせた場合に、それらは互いに立体障害をもたらし得るため、抗体のアッセイ性能は、抗体の単独での親和性及び特異性よりも重要な尺度になり得る。
【０２０３】
[0218]当業者であれば、抗体又は結合断片の産生、並びに対象とする様々な代謝産物に対する親和性及び特異性についてのスクリーニング及び選択には、様々なアプローチを用いることができるものの、これらのアプローチは本発明の範囲を変更しないことを認識されるであろう。
【０２０４】
ＩＩＩ．使用方法
[0219]本発明は、本明細書に記載の代謝産物の有無又は濃度（量又はレベル）を利用して、被検体における過敏性腸症候群（ＩＢＳ）の診断を確定するための方法を提供する。方法は、患者から得られた血液、血漿、又は血清中の１種以上の代謝産物を、本明細書に記載のアッセイ方法により測定するステップを含み得る。
【０２０５】
[0220]本発明は、患者が、治療、例えば、ＩＢＳの治療に反応するかを決定する方法も提供する。方法は、患者の血液、血漿、又は血清中の１種以上の代謝産物を、本明細書に記載のアッセイ方法により測定するステップを含み得る。いくつかの実施形態では、治療の有効性は、治療の実施前又は実施後のＩＢＳ患者由来の生体サンプル中の５−ＨＩＡＡ、メラトニン、及び／又はキヌレン酸レベルをもとに予測される。方法は、ＩＢＳ患者が治療に対し臨床的に反応性を有していたかを決定するのに有用である。
【０２０６】
[0221]ある種の他の態様では、本発明は、事前にＩＢＳであるとの診断を受けている患者を評価する、又はＩＢＳ患者の予後を診断する方法を提供する。方法は、患者の血液、血漿、又は血清中の１種以上の代謝産物を、本明細書に記載のアッセイ方法により測定するステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、第１の時点で、ＩＢＳ患者由来の生体サンプル中の５−ＨＩＡＡ、メラトニン、及び／又はキヌレン酸レベルを測定するステップと、第２の時点で、当該患者由来の生体サンプル中の５−ＨＩＡＡ、メラトニン、及び／又はキヌレン酸レベルを測定するステップと、これらつ２つの時点のレベル間の変化又は差を計算するステップと、を含む。方法は、統計的アルゴリズムを使用して、患者のＩＢＳの重症度が、以前（例えば、ＩＢＳの初期診断）と比較して低減しているか、増悪しているかについての尤度を予測するステップも包含し得る。いくつかの場合では、統計的アルゴリズムを使用して、患者のＩＢＳサブタイプを予測することもできる。
【０２０７】
[0222]以下の実施例は例示のために提供するものであり、本発明の特許請求の範囲を制限するためのものではない。
【０２０８】
経路の代謝産物についての間接的競合的ＥＬＩＳＡアッセイ
[0223]本実施例は、本明細書において提供される、トリプトファン経路、セロトニン経路、及びキヌレニン経路における代謝産物（図１）などといった代謝産物に特異的に結合する単離抗体の使用を記載する。本例は、サンプル中、例えば、患者の血清中の特定の代謝産物の正確で効率的な検出、測定、及び定量のため、これらの抗体を競合的ＥＬＩＳＡアッセイ（図２）に使用可能であることも示す。抗体は、交差反応性を全く検出されない（あるいは実質的に交差反応性でない）。競合的ＥＬＩＳＡは、代謝産物濃度の正確で定量的な測定を提供する。
【０２０９】
[0224]競合的ＥＬＩＳＡは、免疫原性の複合物（例えば、抗原）として機能する合成代謝産物類似体（ハプテン）に対し産生させた新規抗体をベースとするものである。類似体は、リンカーが小分子を突出し、ハプテンに対する特異的な免疫応答を誘起するよう特異的に設計した。
【０２１０】
ビオチン化ハプテン
[0225]各経路の代謝産物又はそれらの誘導体に対しビオチン化ハプテンを産生させた。リンカーアームをキャリアタンパク質に結合させる代わりに、かかるリンカーをビオチンに結合させた。例えば、５−ＨＩＡＡのビオチン化ベンゾオキサゾール誘導体を化学合成して、誘導体のフェニル末端にはリンカーアームを、リンカーの他の末端にはビオチンを含有させた。
【０２１１】
競合的ＥＬＩＳＡ
[0226]図２は、患者の血清中の、経路代謝産物を検出するのに使用した、競合的ＥＬＩＳＡの代表的な実施形態を提供する。アッセイプレートは、ストレプトアビジンプレートを、対象とするビオチン化ハプテン（例えば、ビオチン化５−ＨＩＡＡ、メラトニン又はキヌレン酸）でコーティングすることにより作製した。患者の血清又は血清の希釈液を、対象とする代謝産物（ハプテン）に対する抗体（例えば、抗５−ＨＩＡＡ抗体）と混合したあと、プレートに移した。このプレートを室温で１時間インキュベートした。抗体を血清中のビオチン化ハプテン又は代謝産物と結合させるに当たり十分な時間を提供するインキュベート条件を選択した。プレートを、例えば、ＰＢＳ緩衝液などの洗浄緩衝液で複数回洗浄した。抗ウサギヤギ抗体−ＨＲＰ複合物又は抗マウスヤギ抗体−ＨＲＰ複合物などの二次抗体を加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを、緩衝液で複数回洗浄した。検出反応、例えば、呈色反応、蛍光反応、化学発光反応、又は発光反応のため、基質液を加えた。停止液を加え、基質反応を停止させた。次に、分光光度計で、適切な波長にてプレートを読み取り、検出反応をモニターした。ビオチン化ハプテンに結合した抗体の測定濃度をベースとして、対象とする代謝産物の濃度を計算できる。この種類のアッセイでは、サンプル中の代謝産物の量と、結合した抗体の測定レベルとは逆相関となる。
【０２１２】
５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）に特異的に結合する抗体の産生
[0227]本実施例では、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）の安定なベンゾオキサゾール誘導体と特異的に結合する抗体の産生を記載する。誘導体としては、ＰＥＧリンカー、及びＢＳＡなどのキャリアタンパク質が挙げられる。本実施例は、これらの抗体を競合的ＥＬＩＳＡなどの免疫アッセイに使用して、例えば、患者血清などのサンプル中の代謝産物を検出できることも示す。
【０２１３】
Ａ．ＰＥＧリンカーと、キャリアタンパク質又はビオチンとを含む、５−ＨＩＡＡの安定なベンゾオキサゾール誘導体の合成
[0228]以下のスキームは、オキサドール−インドール中間体１、オキサドール−インドール中間体２、オキサドール−インドール中間体３、Ａ−５、Ａ−８、オキサゾロ−インドール−ＰＥＧ−ＳＳ−酸、オキサゾール−インドール−ＰＥＧ−ビオチン−エステル、及びオキサドール−インドール−ＰＥＧ−ビオチン−酸の合成を解説する。
【０２１４】
[0229]ステップ１−オキサゾロ−インドール中間体１：５−ヒドロキシ−１Ｈ−インドール−３−イル）−酢酸（２．０ｇ、１０．４６ｍｍｏｌ）を無水メタノール（２１ｍＬ）に溶解させ、無水トルエン（４２ｍＬ）を加えて溶液を得た。室温にて、撹拌しながら２Ｍ  ＴＭＳ−ジアゾメタンをヘキサン（５．２ｍＬ、１０．４６ｍｍｏｌ）に滴下し、ガスを発生させた。２時間かけて、更に、２Ｍ  ＴＭＳ−ジアゾメタンをヘキサン（２．６ｍＬ、５．２３ｍｍｏｌ）に２回加えた。溶媒を濃縮させて体積を１０ｍＬにし、トルエン（２０ｍＬ）を加えた。溶媒を濃縮して油を得て、ヘキサン／エチルアセテートを用いてＳｉＯ２フラッシュクロマトグラフィにより精製して、中間体１を油として得た（２．１５ｇ、９５％）。ステップ１を以下に示す。
【化９】
2018501202.tif 000011
【０２１５】
[0230]ステップ２−オキサゾロ−インドール中間体２：オキサゾロ−インドール中間体１（１０００ｍｇ、４．８７ｍｍｏｌ）を無水ジメトキシエタン（ＤＭＥ）（９２ｍＬ）に溶解させて、溶液を得て、これを５℃に冷却した。（４−アミノメチル−ベンジル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１．２６７ｇ、５．３６ｍｍｏｌ）を加えたあと、ＭｎＯ２（４．２４ｇ、４８．７ｍｍｏｌ）を加えて、暗色の懸濁物を得て、これを室温に加温して１６時間撹拌した。反応混合物を５℃に冷却し、追加のＭｎＯ２（４６１ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温に加温し、５時間撹拌したあと、セライトパッド（１ｃｍ）により濾過した。暗色の濾液を濃縮し、ヘキサン／エチルアセテートを用いてＳｉＯ２フラッシュクロマトグラフィにより精製して、淡黄色の固体として中間体２を得た（４４２ｍｇ、２１％）。ステップ２を以下に示す。式中、Ｒ１〜Ｒ１０は、Ｘ、Ｈ、アルキル、酸基、アリールエステル、アルキルエステル又はスルホネート、及びこれらの基のなんらかの組み合わせである。
【化１０】
2018501202.tif 000012
【０２１６】
[0231]ステップ３−オキサゾロ−インドール中間体３：オキサゾロ−インドール中間体２（４４２ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（４．０ｍＬ）に懸濁したあと、室温にてチオアニソール（０．４０４ｍＬ、３．４４ｍｍｏｌ）と、次にＴＦＡ（１．９ｍＬ、２４．６ｍｍｏｌ）とを滴下し、溶液を得た。１．５時間後、反応混合物をトルエン（２０ｍＬ）で希釈して油を得て、溶媒を濃縮して緑色の懸濁物を得た。これをトルエン（２０ｍＬ）と共沸させて１０ｍＬの体積とし、懸濁物を得た。固体を濾去し、トルエンで５回洗浄して、緑色個体を得、これを真空オーブンに入れて（０．１ｍｍ  Ｈｇ）、非吸湿性の緑色固体（５５７ｍｇ，推定純度５０重量％）を得た。ステップ３を以下に示す。
【化１１】
2018501202.tif 000013
【０２１７】
[0232]ステップ４−オキサゾロ−インドール−ＰＥＧ−ＳＳ−酸：オキサゾロ−インドール−ＰＥＧ−ＳＳ−エステル（６８ｍｇ、０．０４３９ｍｍｏｌ）をジオキサン（１．４ｍＬ）に溶解させ、穏やかに加熱して溶液を得て、これを室温に冷却した。撹拌しながら１．０Ｍ  ＬｉＯＨ水溶液（０．３５１ｍＬ，０．３５１ｍｍｏｌ）を室温で滴下して溶液を得て、この溶液を室温で４時間撹拌した。溶媒を濃縮して油を得て、この油をジオキサン（１．４ｍＬ）に懸濁し、混合物を１Ｎ  ＨＣｌ（０．３５１ｍＬ、０．３５１ｍｍｏｌ）によりｐＨ１に酸性化して溶液を得た。溶媒を濃縮して残渣を得て、ＭｅＯＨ（２５ｍＬ）にほぼ溶解させた。混合物を濾過し、濾液を濃縮して油を得て、この油をＨＰＬＣ（ＣＨ３ＣＮ−Ｈ２Ｏ，０．１％  ＴＦＡ）により精製して、油として標題化合物を得た（２０ｍｇ、３０％）。
【０２１８】
[0233]オキサゾロ−インドール−ＰＥＧ−ビオチン−エステル。本ステップは、５ＨＩＡＡのオキサゾロ−インドール−ＰＥＧ−ビオチン−エステル誘導体の合成を記載する。ＰＥＧ−ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１００ｍｇ、０．１０６ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（０．３５ｍＬ）に溶解し、オキサゾロ−インドール中間体３（９５．５ｍｇ、０．２１２ｍｍｏｌ、純度９３％）、次にＤＩＥＡ（０．１４８ｍＬ、０．８５０ｍｍｏｌ）を室温で加えて溶液を得て、これを室温で２日間撹拌した。混合物を濃縮して油（２４６ｍｇ）を得て、この油をＨＰＬＣ（ＣＨ３ＣＮ−Ｈ２Ｏ、０．１％  ＴＦＡ）により精製して、油として標題化合物を得た（１２３ｍｇ、１００％）。ステップを図５Ａに示す。
【０２１９】
[0234]オキサゾロ−インドール−ＰＥＧ−ビオチン−酸。本ステップは、５ＨＩＡＡのオキサゾロ−インドール−ＰＥＧ−ビオチン−酸誘導体の合成を記載する。オキサゾロ−インドール−ＰＥＧ−ビオチン−エステル（１６０ｍｇ、０．１３８ｍｍｏｌ）をジオキサン（２．２ｍＬ）に溶解させて溶液を得た。撹拌しながら１．０Ｍ  ＬｉＯＨ水溶液（０．５５１ｍＬ、０．５５１ｍｍｏｌ）を室温で滴下して濁った溶液を得て、これを室温で６時間撹拌した。溶媒を濃縮して残渣を得て、この残渣をＨ２Ｏ（２．８ｍＬ）に溶解させて、混合物を４℃にて１Ｎ  ＨＣｌ（０．４１４ｍＬ、０．４１１ｍｍｏｌ）によりｐＨ１に酸性化して、濁った溶液を得た。溶媒を減圧下（１ｍｍ  Ｈｇ）、３０〜４０℃にて濃縮して残渣（１２０ｍｇ）を得て、この残渣をＨＰＬＣ（ＣＨ３ＣＮ−Ｈ２Ｏ、０．１％  ＴＦＡ）により精製して、油として表題化合物を得た（６１ｍｇ、５０％）。ステップを図５Ｂに示す。
【０２２０】
Ｂ．５−ＨＩＡＡのベンゾオキサゾール誘導体に対する抗体の産生
[0235]本明細書に記載の５ＨＩＡＡのベンゾオキサゾール誘導体に対するモノクローナル抗体を産生した。例えば、オキサゾロ−インドール−ＰＥＧ−ＳＳ−酸を、アミン又はチオール活性化によりキャリアタンパク質に結合させた（図３Ａ）。免疫原をマウスに注射してモノクローナル抗体を産生させ、あるいはウサギに注射して、ポリクローナル抗体を産生させた（図４Ａ及び４Ｂ）。抗体産生には、当業者に既知の、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）に記載の手法などの標準法を使用した。
【０２２１】
[0236]キャリアタンパク質の代わりに５ＨＩＡＡのベンゾオキサゾール誘導体もビオチンに結合させた（図３Ａ）。このようなビオチン化ハプテンを用いて、以下のアッセイ行い、産生された抗体の有効性及び特異性を試験した。ストレプトアビジンプレートに、対象とするビオチン化ハプテン（２μｇ／ｍｌ）を室温で１時間コーティングしたプレートを約４℃にて約２時間にわたり抗原でコーティングした。誘導体化した抗原に対し産生させたマウスモノクローナル抗体の特異性又は反応性を評価するため、ウェルに抗体を加え、室温で約１時間インキュベートした。プレートを、例えば、ＰＢＳ緩衝液などの洗浄緩衝液で複数回洗浄した。抗マウスヤギ抗体−ＨＲＰ複合物を加え、室温で約１時間インキュベートした。プレートを、緩衝液で複数回洗浄した。呈色反応用に比色基質を加えた。停止液を加えてから、プレートを約４０５ｎｍで読み取った。図６Ａは、マウスモノクローナル抗体の力価試験（titration experiment）を示す。抗体の力価は１：２００希釈では非常に高く、更に希釈できた。
【０２２２】
[0237]５−ＨＩＡＡについて本明細書に記載する競合的ＥＬＩＳＡアッセイでは、遊離の５−ＨＩＡＡは、モノクローナル抗体用のアッセイプレートに結合させたビオチン化５−ＨＩＡＡと競合する。図６Ｂは、遊離５−ＨＩＡＡ（右側から左側に向かって、０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ）の量を増加と、ビオチン化５−ＨＩＡＡに結合するモノクローナル抗体が少なくなったこと（すなわちＯＤが低くなったこと）を示す。図６Ｃは、異なる濃度の５−ＨＩＡＡ（０ｎｇ／ｍＬ〜８０ｍｇ／ｍＬ）下での、異なる希釈率の抗５ＨＩＡＡモノクローナル抗体（１：１００〜１：８００）の力価を示す。図６Ｄは、５−ＨＩＡＡ特異的モノクローナル抗体が誘導体化したセロトニン（５−ＨＴ）に対し免疫反応性でなかったことを示す。このグラフは、セロトニンに対するモノクローナル抗体は誘導体化した５−ＨＩＡＡに結合しなかったことも示す。
【０２２３】
[0238]抗体特異性についてのアッセイにより、５−ＨＩＡＡに対するモノクローナル抗体は特異的なものであり、例えば、セロトニン、メラトニン、５−ヒドロキシトリプトファン、又はトリプトファンなどの類似する化合物には結合しないことが示された。実際のところ、これらの他の化合物は、モノクローナル抗体に対して０〜０．５％未満の交差反応性を示す（図７Ａ及び７Ｂ）。図８は、免疫ベースのアッセイにおいて、５−ＨＩＡＡに対するモノクローナル抗体について作成され得る標準曲線を示す。
【０２２４】
メラトニンに特異的に結合する抗体の産生
[0239]本実施例では、メラトニンに特異的に結合する抗体の産生を記載する。本実施例では、当該抗体を、患者サンプル中のメラトニンを検出する競合的ＥＬＩＳＡなどの免疫アッセイにおいて使用できることを示す。
【０２２５】
[0240]メラトニン（５−メトキシ−Ｎ−アセチルトリプタミン）は、セロトニンから誘導される化合物である。セロトニンＮ−アセチルトランスフェラーゼは、セロトニンをＮ−アセチロセロトニンに変換し、Ｎ−アセチロセロトニンは、ヒドロキシインドール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼによりメラトニンに変換される。
【０２２６】
[0241]メラトニンは、ＩＢＳの病理発生に関与し得る（Ｋｏｎｔｕｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００７，５８：３８１〜４０５；Ｂｅｂｅｕｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｉｎｅａｌ  Ｒｅｓ，１９９４，１６：９１〜９９）。メラトニンは、強力な抗酸化活性及び抗炎症活性を示す。メラトニンは、腸運動も制御する。複数の研究により、メラトニンが平滑筋の運動活性に対し阻害作用を有し得ることが示されている。ＩＢＳは、消化管運動機能異常、内蔵過敏、心理社会的因子、自律神経機能障害、及び粘膜炎症との関連が示されている。
【０２２７】
Ａ．免疫原を含有しているメラトニンの生成
[0242]メラトニンを合成した。ＰＥＧ（ＰＥＧ１〜ＰＥＧ２０）リンカーをメラトニンに結合（複合）させた。次に、アミノ活性化又はチオール活性化により、リンカーの非結合末端にＢＳＡなどのキャリアタンパク質を結合させた（図３Ｂ）。このメラトニン抗原を使用して、メラトニンに特異的に結合するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生した。
【０２２８】
[0243]当該技術分野で知られる標準法により抗体を産生した。例えば、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，ＥＡ．「Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８に記載のものなどの方法により、モノクローナル抗体を産生した。ウサギをメラトニン抗原及びアジュバントで免疫することにより、ポリクローナル抗体を産生させた。かかるウサギにはメラトニン抗原の追加免疫を行い、免疫応答及び抗体力価を増強させた。図９は、免疫した３匹のウサギの採血前、及び第１〜第９回の採血時の抗体力価を示す。かかるグラフは、ウサギ＃１６４０１（１）がメラトニンに特異的に結合する抗体を産生したことを示す。
【０２２９】
[0244]ビオチン化メラトニン複合物も、合成により作製した。ＰＥＧ（ＰＥＧ１〜ＰＥＧ１２）リンカーをメラトニンに結合（複合）させた。次に、アミノ活性化又はチオール活性化により、リンカーの非結合末端にビオチンを結合させた。この複合物を免疫アッセイに使用して、本明細書に記載の抗メラトニン抗体の親和性及び特異性を試験した（図１０Ａ及び１０Ｂ）。
【０２３０】
Ｂ．抗メラトニン抗体アッセイ
[0245]産生させた抗メラトニン抗体の有効性及び特異性について試験するべく、以下のアッセイを用いた。ストレプトアビジンプレートに、ビオチン化メラトニンを室温で１時間コーティングしたこのプレートを洗浄し、ブロッキング緩衝液（例えば、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（商標））でブロッキングして、非特異的な結合を最小限に抑えた。ウサギ抗血清を段階希釈し（１：１００、１：１２５；１：２５０、１：５００、１：１０００）、プレートの各ウェルに移した。競合的免疫アッセイでは、競合（試験）化合物をウェルに入れて、室温で約１時間インキュベートした。いくつかの例では、試験化合物はメラトニンであり、又は例えば、セロトニン、トリプトファン、５−ＨＩＡＡなどといった構造的に類似する化合物である。いくつかのウェルには試験化合物を入れなかった。
【０２３１】
[0246]オービタルシェーカー（orbital shaking）を用いて、プレートを室温（ＲＴ）で約１時間インキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳＴ）で複数回洗浄した。抗ウサギヤギ抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合物を希釈して（１：５０００）各ウェルに入れ、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳＴ）で複数回洗浄して、過剰なＨＲＰ複合物を洗い流した。呈色基質を加えて、プレートを室温でインキュベートしてＨＲＰに反応を触媒させ、呈色させた（例えば、暗所で１５分間）。発色後、停止液（例えば、４Ｎ  ＮａＯＨ）を加えて基質反応を停止させた。プレートを約４０５ｎｍ又は検出反応に適した波長で読み取った。
【０２３２】
[0247]アッセイを行い、本明細書で記載のポリクローナル抗体の結合活性及び特異性を決定した。アッセイには、ウサギ抗体を認識する二次抗体の代わりに抗マウスヤギ抗体−ＨＲＰ複合物を用いてメラトニンに対し産生させたモノクローナル抗体を試験するべく修正を加えた。
【０２３３】
[0248]メラトニンに対する抗体が抗原特異的であるかを決定するため、メラトニン、セロトニン、トリプトファン、及び５−ＨＩＡＡなどといったなどの競合化合物をアッセイした。図１０Ａは、メラトニンの量を減少させると（８．００ｍＭから０ｍＭまで）、固定化したビオチン化メラトニンに対するポリクローナル抗体の結合増加が検出されることを示す。図１０Ｂは、競合アッセイにおいて、１ｍＭメラトニンを添加することで、ビオチン化メラトニンに対し結合する抗体の量が減少したことを示す。対照的に、セロトニン、トリプトファン、又は５−ＨＩＡＡを添加しても、固定化した抗体に結合する抗メラトニン抗体の量は変化しなかった。このデータにより、抗メラトニンポリクローナル抗体のメラトニンに対する特異性は高く、メラトニンと構造的に類似する化合物に対し交差反応性を有しないことが示される。
【０２３４】
[0249]同様の競合的ＥＬＩＳＡを実施して、異なるハイブリドーマクローン（２Ｆ１Ｄ１１Ｈ４、６Ｃ１Ｅ２Ｆ７、６Ｃ２Ｈ４Ｃ８、７Ｃ７Ｆ１Ｇ２、７Ｃ８Ａ１Ｄ２、及び７Ｆ８Ｈ９Ｇ５）由来のモノクローナル抗体の特異性を試験した。モノクローナル抗体を試験化合物（１ｍＭメラトニン、１ｍＭセロトニン、１ｍＭトリプトファン、又は１ｍＭ  ５−ＨＩＡＡ）と共にインキュベートしたあと、固定化したメラトニンでコートした各ウェルに添加した。図１１は、クローン、６Ｃ１Ｅ２Ｆ７、６Ｃ２Ｈ４Ｃ８、７Ｃ７Ｆ１Ｇ２、及び７Ｃ８Ａ１Ｄ２由来の抗体がメラトニンに特異的であり、メラトニンと構造的に類似する化合物に対し結合しなかったことを示す。
【０２３５】
[0250]標準ＥＬＩＳＡにより、抗メラトニンモノクローナル抗体の反応性を試験した。ビオチン化メラトニンをストレプトアビジンコートしたマルチウェルプレートに固定化した。プレートには、標準曲線を作製できるよう、段階希釈したモノクローナル抗体を入れた。このプレートを室温で約１時間インキュベートした。ウェルを緩衝液で複数回洗浄した。ＨＲＰ複合二次抗体（抗マウスヤギＩｇＧ）を添加し、室温で約１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で複数回洗浄した。比色検出試薬を添加した。反応を停止するため、停止剤を添加した。適切な波長でプレートを読み取った。図１２は、メラトニン（クローン６Ｃ１Ｅ２Ｆ７）に特異的に結合するモノクローナル抗体の標準曲線を示す。抗体の特異性は７．２６ｎｇ／ｍＬである。
【０２３６】
キヌレン酸（ＫＹＮＡ）に特異的に結合する抗体の産生
Ａ．ポリクローナル抗体の産生用のキヌレン酸免疫原の合成
[0251]化合物２４：６−（６−アミノヘキサンアミド）−４−ヒドロキシキノリン−２−カルボン酸。
【０２３７】
[0252]以下に化合物２４の合成スキームを示す。
【化１２】
2018501202.tif 000014
【０２３８】
[0253]ステップ１：ｂｏｃ−アミノ−ヘキサン酸（２１，２７７ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）と、ＤＩＰＥＡ（０．２１ｍｌ、１．２ｍｍｏｌ）と、ＨＡＴＵ（４５６ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）と、の混合物をＤＣＭ（５ｍｌ）及びアセトニトリル（５ｍｌ）中で３０分間撹拌した。
【０２３９】
[0254]ステップ２：化合物２２（２１８ｍｇ、１ｍｍｏｌ）の水（５ｍｌ）及びアセトニトリル（５ｍｌ）混合物にＮａＨＣＯ３（８４０ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）を添加したあと、激しく撹拌しながらステップ１の反応混合物をゆっくりと添加した。混合物を更に４時間撹拌したあと、塩ＮａＨＳＯ４で酸性化したたところ、沈殿が生じた。この固体分を濾過して中間体２３を得た。
【０２４０】
[0255]ステップ３：ステップ２の固体２３をＬｉＯＨ−Ｈ２Ｏ（４１０ｍｇ，１０ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１０ｍｌ）溶液と共に６０℃にて４時間撹拌したあと、ＮａＨＳＯ４塩溶液でｐＨ３に酸性化し、濃縮した。得られた固体分を濾過し、水で洗浄し、乾燥した。次にこれをＤＣＭ（２ｍＬ）に懸濁したあと、ＴＦＡ（２ｍｌ）を加えた。このスラリーを室温で４時間撹拌したあと、濃縮した。得られた固体分を酢酸エチル（３０ｍＬ）と５分間撹拌し、不要物を濾過し、酢酸エチルで洗浄し、乾燥して、所望の化合物２４（１２０ｍｇ）として灰色の固体分を得た。ＭＳ：３１８．０（Ｍ＋Ｈ）＋６−（６−アミノヘキサンアミド）−４−ヒドロキシキノリン−２−カルボン酸。
【０２４１】
[0256]ＫＹＮＡの免疫原性の複合物を産生するため、ＰＥＧ（ＰＥＧ１〜ＰＥＧ２０）リンカーを化学合成したＫＹＮＡハプテンに結合（複合）させ、次にＢＳＡなどのキャリアタンパク質をアミノ活性化又はチオール活性化によりリンカーの非結合末端に結合させた（図３Ｃ）。本明細書に記載のＫＹＮＡ抗原を使用して、ＫＹＮＡに特異的に結合するポリクローナル抗体を産生させた。
【０２４２】
化合物２７：４−ヒドロキシ−６−（６−（６−（５−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）ヘキサンアミド）ヘキサンアミド）キノリン−２−カルボン酸。
【化１３】
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[0257]化合物２５（３２７ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）及びＬｉＯＨ−Ｈ２Ｏ（４３０ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）をメタノール（１０ｍｌ）中で終夜撹拌したあと、注意深く６Ｎ  ＨＣｌでｐＨ７に酸性化し、濃縮してＭｅＯＨを除去した。次に、粗生成物をアセトニトリル及び水（１０ｍＬ／１０ｍＬ）で希釈し、ＮａＨＣＯ３（１．２６ｇ）を添加したあと、ビオチン−ＬＣ−ＬＣ−ＮＨＳ（８５２ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を激しく１日間撹拌し、６Ｎ  ＨＣｌで酸性化したあと、得られた固体分を濾過し、メタノール、次に水で洗浄し、乾燥して純粋な化合物２７（１４０ｍｇ）を生成した。ＭＳ：６５７．２（Ｍ＋Ｈ）＋、４−ヒドロキシ−６−（６−（６−（５−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）ヘキサンアミド）ヘキサンアミド）キノリン−２−カルボン酸。
【０２４３】
[0258]ビオチン化ＫＹＮＡ複合物も、合成により作製した。ＰＥＧ（ＰＥＧ１〜ＰＥＧ２０）リンカーをＫＹＮＡハプテンに結合（複合）させた。次に、アミノ活性化又はチオール活性化により、リンカーの非結合末端にビオチンを結合させた。この複合物を免疫アッセイに使用して、本明細書に記載の抗ＫＹＮＡ抗体の親和性及び特異性を試験した（図１３Ａ、１３Ｂ、１４Ａ、１４Ｂ、１５Ａ、１６Ａ、及び１６Ｂ）。
【０２４４】
Ｂ．モノクローナル抗体の産生用のキヌレン酸免疫原の合成
[0259]本明細書において、キヌレン酸の合成方法を提供する。
【化１４】
2018501202.tif 000016
【０２４５】
[0260]１００ｍＬの丸底フラスコで、６−ブロモ−４−ヒドロキシ−キノリン−２−カルボン酸メチルエステル（キヌレン酸メチルエステル）（５６４ｍｇ，２．０ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１２ｍＬ）に溶解させたあと、反応フラスコにＫ２ＣＯ３粉末（６９１ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ）を添加した。５分後、シリンジでベンジルブロミド（０．２８５ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ）を添加した。反応を室温で４時間継続させた。ヘキサン中２０％  ＥｔＯＡｃを使用して、反応をＴＬＣにより試験したところ、生成物への変換が完了していることが観察された。次に、反応混合物に水（１５ｍＬ）を加え、ＥｔＯＡｃ（３ｘ２０ｍＬ）で抽出した。有機層を混合して、水（２０ｍＬ）、１．０Ｎ  ＨＣｌ（２０ｍＬ）、ブライン（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させた。次に、１０〜５０％  ＥｔＯＡｃ−ヘキサンを使用して、生成物を減圧カラムクロマトグラフィ（ＶＣＣ）で精製した。純粋な生成物画分を混合して、蒸発させて、所望の生成物４−ベンジルオキシ−６−ブロモ−キノリン−２−カルボン酸メチルエステル（２８５ｍｇ）を純粋な状態の褐色固体として得、幾分不純物の混ざったものも４２０ｍｇ得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４９９ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）δ  ８．４３（ｄ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．１０（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．８３（ｄｄ、Ｊ＝９．０、２．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．７０（ｓ、１Ｈ）、７．５７〜７．５０（ｍ、２Ｈ）、７．４９〜７．３８（ｍ、３Ｈ）、５．３７（ｓ、２Ｈ）、４．０８（ｓ、３Ｈ）である。
【化１５】
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【０２４６】
[0261]２５ｍＬの丸底フラスコで、４−ベンジルオキシ−６−ブロモ−キノリン−２−カルボン酸メチルエステル（３７２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５．０ｍＬ）に溶解させ、脱気した。次に、リン酸三カリウム（４６７ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）及びテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（５７．７５ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）をフラスコに入れ、１１５℃で１６時間持続的に加熱した。完了後、揮発性成分を蒸発させ、水（５．０ｍＬ）を加え、ＥｔＯＡｃ（３×２０ｍＬ）で抽出した。混合した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させた。次に、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（０〜１００％）を使用して、減圧カラムクロマトグラフィで精製した。５０％  ＥｔＯＡｃで所望の生成物を溶出した。純粋な生成物画分を混合して、蒸発させて、４−ベンジルオキシ−６−［４−（ベンジルオキシカルボニルアミノ−メチル）−フェニル］−キノリン−２−カルボン酸メチルエステル（２５５ｍｇ、収率４８％）を淡緑黄色固体として得て、ＬＣＭＳ及びＮＭＲにより確認した。１Ｈ  ＮＭＲ（４９９ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ８．３８（ｄ、Ｊ＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．２２〜８．１１（ｍ、２Ｈ）、７．８８（ｔ、Ｊ＝６．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．７６（ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ、２Ｈ）、７．７０（ｓ、１Ｈ）、７．６５〜７．５８（ｍ、４Ｈ）、７．５８〜７．５１（ｍ、１Ｈ）、７．４９〜７．２６（ｍ、６Ｈ）、５．５５（ｓ、２Ｈ）、５．０６（ｓ、２Ｈ）、４．２７（ｄ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、２Ｈ）、３．９６（ｓ、３Ｈ）である。ＭＳ：５３３．５［Ｍ＋Ｈ］は、Ｃ３３Ｈ２８Ｎ２Ｏ５について計算した。
【化１６】
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【０２４７】
[0262]本明細書において、ビオチン化キヌレン酸の合成方法を提供する。
【０２４８】
[0263]２５０ｍＬの丸底フラスコで、４−ベンジルオキシ−６−［４−（ベンジルオキシカルボニルアミノ−メチル）−フェニル］−キノリン−２−カルボン酸メチルエステル（５３２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をメタノール（４０ｍＬ）及びＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）に溶解させた。次に、溶液を脱気し、１０％  Ｐｄ−Ｃ（８５ｍｇ）を加えた。次に、溶液にバルーンにより終夜水素添加したあと、ＬＣ−ＭＳ及びＴＬＣで分析した。反応溶液をセライトベッドで濾過し、セライト層をメタノールで洗浄した。次に、得られた透明な溶液を濃ＨＣｌで酸性化し、黄色の沈殿生成物を可視化した。次に、溶液を蒸発させて黄色固体を得た。ＬＣ  ＭＳ：３０９［Ｍ＋Ｈ］、Ｃ１８Ｈ１６Ｎ２Ｏ３について計算した。
【化１７】
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【０２４９】
[0264]本明細書において、キヌレン酸−ＰＥＧ−ジスルフィドの合成方法を提供する。
【０２５０】
[0265]４．０ｍＬの褐色のガラスバイアル内で、キヌレン酸アミンヒドロクロリド（kynurenic amine hydrochloride）（６８ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）及びＰＥＧ１２−ビオチン−ＮＨＳエステル（９４．１ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１．０ｍＬ）に懸濁し、室温で１６時間撹拌した。反応混合物中の生成物の有無をＬＣＭＳにより確認した。生成物をシリカゲルでの減圧カラムクロマトグラフィでＣＨ２Ｃｌ２−メタノール（０〜２０％）でグラジエント溶出して精製した。純粋な生成物画分を混合して、蒸発させて、淡黄色の固体を得た（４２ｍｇ）。１Ｈ  ＮＭＲ（４９９Ｍｈｚ、メタノール−ｄ４）δ  ８．４９（ｄ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．１０（ｄｄ、Ｊ＝８．８、２．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．９６（ｔ、Ｊ＝９．４Ｈｚ、２Ｈ）、７．７８〜７．６７（ｍ、２Ｈ）、７．４５（ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ、２Ｈ）、６．９７（ｓ、１Ｈ）、４．５７（ｓ、１Ｈ）、４．４７（ｄ、Ｊ＝４．３Ｈｚ、３Ｈ）、４．２９（ｄｄ、Ｊ＝７．９、４．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．０６（ｓ、３Ｈ）、３．７９（ｔ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、２Ｈ）、３．７０〜３．４５（ｍ、５４Ｈ）、３．３５（ｔ、Ｊ＝５．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．２４〜３．１２（ｍ、１Ｈ）、２．９２（ｄｄ、Ｊ＝１２．７、５．０Ｈｚ、１Ｈ）、２．６８（ｄ、Ｊ＝４．４Ｈｚ、１Ｈ）、２．５３（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．２１（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、１．７９〜１．５３（ｍ、４Ｈ）、１．４４（ｑ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）である。ＭＳ：１１３３．３［Ｍ−Ｈ］は、Ｃ５５Ｈ３３Ｎ５Ｏ１８Ｓについて計算した。
【０２５１】
[0266]メチルエステルの加水分解：上記の得られた生成物をＴＨＦ（１．５ｍＬ）に溶解させ、０．５Ｍ  ＬｉＯＨ溶液（０．４ｍＬ）を加えた。反応を室温で２時間継続したあと、１Ｎ  ＨＣｌ（０．３ｍＬ）で酸性化した。サンプルをＬＣＭＳで試験した。十分な純度（＞８５％）をもった所望の生成物が観察された。サンプルを終夜真空引きしてサンプルを十分に乾燥させた。
【０２５２】
[0267]４．０ｍＬの褐色のガラスバイアル内で、キヌレン酸アミンヒドロクロリド（kynurenic amine hydrochloride）（６８ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）及びＳＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳエステル（１１１ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１．０ｍＬ）に懸濁し、室温で１６時間撹拌した。反応混合物中の生成物の有無をＬＣＭＳにより確認した。生成物をシリカゲルでの減圧カラムクロマトグラフィでＣＨ２Ｃｌ２−メタノール（０〜１５％）でグラジエント溶出して精製した。純粋な生成物画分を混合して、蒸発させて、グミ状の固体を得た（２８ｍｇ）。１Ｈ  ＮＭＲ（４９９ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  ８．４８（ｄｄ、Ｊ＝２１．２、２．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．１３〜８．０２（ｍ、１Ｈ）、７．９３（ｄｄ、Ｊ＝１９．９、８．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．７１（ｄｄ、Ｊ＝１６．０、８．２Ｈｚ、２Ｈ）、７．４４（ｔ、Ｊ＝９．４Ｈｚ、２Ｈ）、６．９６（ｄ、Ｊ＝１６．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．５４（ｓ、３Ｈ）、４．４６（ｄ、Ｊ＝５．７Ｈｚ、２Ｈ）、４．０５（ｄ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、４Ｈ）、３．８３〜３．６６（ｍ、８Ｈ）、３．６６〜３．４７（ｍ、５０Ｈ）、３．２３（ｑ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．９２〜２．８２（ｍ、３Ｈ）、２．６７（ｓ、４Ｈ）、２．５３（ｔ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、２Ｈ）、１．３７（ｄ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、１７Ｈ）である。ＭＳ：１４９４．６［Ｍ−Ｈ］は、Ｃ７４Ｈ１０２Ｎ４Ｏ２４Ｓ２について計算した。
【０２５３】
[0268]メチルエステルの加水分解：上記の得られた生成物をＴＨＦ（１．５ｍＬ）に溶解させ、０．５Ｍ  ＬｉＯＨ溶液（０．４ｍＬ）を加えた。反応を室温で２時間継続したあと、１Ｎ  ＨＣｌ（０．３ｍＬ）で酸性化した。サンプルの一部をＬＣＭＳで試験した。十分な純度（＞８５％）をもった所望の生成物が観察された。サンプルを終夜真空引きしてサンプルを十分に乾燥させた。
【化１８】
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【０２５４】
Ｃ．キヌレン酸に対する抗体
[0269]当該技術分野で知られる標準法により抗体を産生した。例えば、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，ＥＡ．「Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８に記載のものなどの方法により、モノクローナル抗体を産生した。ウサギをメラトニン抗原及びアジュバントで免疫することにより、ポリクローナル抗体を産生させた。かかるウサギにはメラトニン抗原の追加免疫を行い、免疫応答及び抗体力価を増強させた。
【０２５５】
[0270]産生させた抗メラトニン抗体の有効性及び特異性について試験するべく、以下のアッセイを用いた。ストレプトアビジンプレートに、ビオチン化キヌレン酸を室温で１時間コーティングしたこのプレートを洗浄し、ブロッキング緩衝液（例えば、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（商標））でブロッキングして、非特異的な結合を最小限に抑えた。ウサギ抗血清を段階希釈し、プレートの各ウェルに移した。競合的免疫アッセイでは、競合（試験）化合物をウェルに入れて、室温で約１時間インキュベートした。いくつかの例では、試験化合物はメラトニンであり、又は例えば、セロトニン、トリプトファン、５−ＨＩＡＡ、及びキヌレニンなどといった構造的に類似する化合物である。いくつかのウェルには試験化合物を入れなかった。
【０２５６】
[0271]オービタルシェーカーを用いて、プレートを室温（ＲＴ）で約１時間インキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳＴ）で複数回洗浄した。抗ウサギヤギ抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合物を希釈して（１：５０００）各ウェルに入れ、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳＴ）で複数回洗浄して、過剰なＨＲＰ複合物を洗い流した。呈色基質を加えて、プレートを室温でインキュベートしてＨＲＰに反応を触媒させ、呈色させた（例えば、暗所で１５分間）。発色後、停止液（例えば、４Ｎ  ＮａＯＨ）を加えて基質反応を停止させた。プレートを約４０５〜４５０ｎｍ又は検出反応に適した波長で読み取った。
【０２５７】
[0272]図１３Ａは、ＫＹＮＡ免疫原で免疫したウサギ由来の血清中のＫＹＮＡに対するポリクローナル抗体の反応性を示す。このグラフは、ビオチン化ＫＹＮＡをマルチウェルプレートの表面上にコートした競合的ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。図１３Ｂは、アフィニティ精製した抗ＫＹＮＡウサギポリクローナル抗体の結合反応性を示す。抗体は標準法で精製した。競合的ＥＬＩＳＡでは、ポリクローナル抗体の量は１：２５０〜１：２５００に希釈し、未結合のＫＹＮＡを様々な濃度で評価した。
【０２５８】
[0273]同様の競合的ＥＬＩＳＡアッセイを行い、本明細書で記載のとおりに生成したモノクローナル抗体の特異性及び反応性を評価した。結果から、ハイブリドーマクローン４Ｂ１１Ｈ９Ａ２及び６Ｈ５Ｂ１１Ａ７由来の抗体はＫＹＮＡに特異的に結合し、３−ＯＨ−ＤＬ−キヌレニン、セロトニン、トリプトファン、ｎ−アセチル−５−ヒドロキシ−トリプタミン、及び５−ＯＨ−キノリンに対しては交差反応性を有しないことが示される（図１４Ａ）。ＫＹＮＡと構造的に類似する化合物は、抗体のＫＹＮＡに対する結合に干渉しなかった。図１４Ｂは、抗ＫＹＮＡマウスモノクローナル抗体の力価を示す。抗体は、希釈した場合でさえＫＹＮＡに対し免疫反応性を有するままであった。
【０２５９】
[0274]図１５Ａ及び１５Ｂは、ハイブリドーマクローン６Ｈ５Ｂ１１Ａ７により産生されたマウスモノクローナル抗体がキヌレン酸に特異的に結合することを示す。図１５Ａに示すとおり、未結合のＫＹＮＡ抗原は、本明細書において提供される競合的ＥＬＩＳＡにおける抗体の結合に関し、固定化したＫＹＮＡ抗原と競合する。未結合のＫＹＮＡの量が増加すると、固定化した抗原に結合する抗体は減少し、ＯＤ値が低下する。図１５Ｂは、抗ＫＹＮＡマウスモノクローナル抗体の標準曲線を示す。
【０２６０】
[0275]図１６Ａ及び１６Ｂは、本明細書で開示される競合的ＥＬＩＳＡの代表的な実施形態により得られる結果を示す。図１６Ａでは、ＴＭＢ基質を用いた呈色反応を示す。図１６Ｂでは、発光基質を用いた検出反応を示す。発光基質を用いるアッセイは、ＴＭＢ基質アッセイよりも感度が高かった。
【０２６１】
[0276]本明細書に記載の実施例及び実施形態は単に例示目的のためのものであり、その観点で以て様々な改変又は変更が当業者には示唆され、本願及び添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内で含められることは理解されたい。全ての公表文献、特許、及び特許出願は、全目的に関し、その全体が参照により援用する。
【図１】
2018501202.tif 000021
【図２】
2018501202.tif 000022
【図３Ａ】
2018501202.tif 000023
【図３Ｂ】
2018501202.tif 000024
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2018501202.tif 000026
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
2018501202.tif 000029
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年7月19日(2017.7.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−ヒドロキシインドール−３−酢酸（５−ＨＩＡＡ）に対し特異的に結合し、トリプトファン（Ｔｒｐ）、セロトニン（５−ＨＴ）、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）、キヌレニン（ＫＹＮ）、キヌレン酸（ＫＹＮＡ）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、キノリン酸（ＱＵＩＮ）、アントラニル酸（ＡＮＡ）、セロトニン−Ｏ−スルフェート、セロトニン−Ｏ−ホスフェート、及びメラトニン（ＭＴ）からなる群から選択された１種以上のメンバーに対する交差反応性が１％未満である、単離抗体又はその抗体断片。
【請求項２】
前記抗体が、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、請求項１に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項３】
前記抗体が、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項４】
前記抗体断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、又はＦ（ａｂ）’２断片である、請求項１に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項５】
前記抗体又はその抗体断片が、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７１で寄託された１２０４−１０Ｇ６Ｆ１１Ｈ３と表記されるハイブリドーマ細胞株により産生されたものである、請求項１に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項６】
前記抗体又はその抗体断片が、動物の免疫細胞が５−ＨＩＡＡに特異的に結合する抗体又はその抗体断片を産生する条件下で、キャリアタンパク質に結合している５−ＨＩＡＡ誘導体を含む免疫原で前記動物を免疫するステップ、並びに前記動物から前記抗体又はその抗体断片を単離するステップにより産生されたものである、請求項１に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項７】
前記動物が、ヤギ、ウサギ、又はマウスである、請求項６に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項８】
前記５−ＨＩＡＡ誘導体が、５−ＨＩＡＡのベンゾオキサゾール誘導体を含む、請求項６に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項９】
メラトニン（ＭＴ）に特異的に結合し、トリプトファン（Ｔｒｐ）、セロトニン（５−ＨＴ）、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）、５−ヒドロキシインドール−３−酢酸（５−ＨＩＡＡ）、キヌレニン（ＫＹＮ）、キヌレン酸（ＫＹＮＡ）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、キノリン酸（ＱＵＩＮ）、アントラニル酸（ＡＮＡ）、セロトニン−Ｏ−スルフェート、及びセロトニン−Ｏ−ホスフェートからなる群から選択された１種以上のメンバーに対する交差反応性が１％未満である、単離抗体又はその抗体断片。
【請求項１０】
前記抗体が、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、請求項９に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項１１】
前記抗体が、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項９に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項１２】
前記抗体断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、又はＦ（ａｂ）’２断片である、請求項９に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項１３】
前記抗体又はその抗体断片が、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６６９で寄託された１２１２−６Ｃ１Ｅ２Ｆ７表記されるハイブリドーマ細胞株により産生されたものである、請求項９に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項１４】
前記抗体又はその抗体断片が、動物の免疫細胞がメラトニンに特異的に結合する抗体又はその抗体断片を産生する条件下で、キャリアタンパク質に結合しているメラトニンを含む免疫原で前記動物を免疫するステップ、並びに前記動物から前記抗体又はその抗体断片を単離するステップにより産生されたものである、請求項９に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項１５】
キヌレン酸（ＫＹＮＡ）に特異的に結合し、トリプトファン（Ｔｒｐ）、セロトニン（５−ＨＴ）、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）、５−ヒドロキシインドール−３−酢酸（５−ＨＩＡＡ）、キヌレニン（ＫＹＮ）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、キノリン酸（ＱＵＩＮ）、アントラニル酸（ＡＮＡ）、セロトニン−Ｏ−スルフェート、セロトニン−Ｏ−ホスフェート、及びメラトニンからなる群から選択された１種以上のメンバーに対する交差反応性が１％未満である、単離抗体又はその抗体断片。
【請求項１６】
前記抗体が、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、請求項１５に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項１７】
前記抗体が、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１５に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項１８】
前記抗体断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、又はＦ（ａｂ）’２断片である、請求項１５に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項１９】
前記抗体又はその抗体断片が、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７０で寄託された１１９４−６Ｈ５Ｂ１１Ａ７と表記されるハイブリドーマ細胞株により産生されたものである、請求項１５に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項２０】
前記抗体又はその抗体断片が、動物の免疫細胞がキヌレン酸（ＫＹＮＡ）に特異的に結合する抗体又はその抗体断片を産生する条件下で、キャリアタンパク質に結合しているＫＹＮＡを含む免疫原で前記動物を免疫するステップ、並びに前記動物から前記抗体又はその抗体断片を単離するステップにより産生されたものである、請求項１５に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項２１】
検出可能な標識を有する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項２２】
固体基材上に固定化されている、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗体断片。
【請求項２３】
５−ＨＩＡＡに選択的に結合するモノクローナル抗体を産生及び分泌する、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７１で寄託された１２０４−１０Ｇ６Ｆ１１Ｈ３と表記されるハイブリドーマ細胞株。
【請求項２４】
メラトニンに選択的に結合するモノクローナル抗体を産生及び分泌する、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６６９で寄託された１２１２−６Ｃ１Ｅ２Ｆ７と表記されるハイブリドーマ細胞株。
【請求項２５】
キヌレン酸に選択的に結合するモノクローナル抗体を産生及び分泌する、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７０で寄託された１１９４−６Ｈ５Ｂ１１Ａ７と表記されるハイブリドーマ細胞株。
【請求項２６】
免疫アッセイにより、過敏性腸症候群に罹患している疑いのある患者由来のサンプル中の５−ＨＩＡＡレベルを検出する方法であって、
（ａ）好適な条件下で、請求項１に記載の単離抗体又はその抗体断片、前記患者から得たサンプル、及び固定化した５−ＨＩＡＡを接触させて、前記単離抗体又はその抗体断片と、前記サンプル中に存在する５−ＨＩＡＡ又は前記固定化した５−ＨＩＡＡと、を含む、複合体を形成させるステップと、
（ｂ）前記固定化した５−ＨＩＡＡを含む前記複合体に結合した抗体又はその抗体断片のレベルを検出するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の抗体又はその抗体断片のレベルをもとに前記サンプル中の５−ＨＩＡＡレベルを計算するステップと、を含む、方法。
【請求項２７】
前記単離抗体又はその抗体断片、前記サンプル及び前記固定化した５−ＨＩＡＡを同時に接触させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記単離抗体又はその抗体断片、前記サンプル及び前記固定化した５−ＨＩＡＡを順に接触させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫アッセイが競合的ＥＬＩＳＡである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
免疫アッセイにより、過敏性腸症候群に罹患している疑いのある患者由来のサンプル中のメラトニンレベルを検出する方法であって、
（ａ）好適な条件下で、請求項９に記載の単離抗体又はその抗体断片、前記患者から得たサンプル、及び固定化したメラトニンを接触させて、前記単離抗体又はその抗体断片と、前記サンプル中に存在するメラトニン又は前記固定化したメラトニンと、を含む、複合体を形成させるステップと、
（ｂ）前記固定化したメラトニンを含む前記複合体に結合した抗体又はその抗体断片のレベルを検出するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の抗体又はその抗体断片のレベルをもとに前記サンプル中のメラトニンレベルを計算するステップと、を含む、方法。
【請求項３１】
前記単離抗体又はその抗体断片、前記サンプル及び前記固定化したメラトニンを同時に接触させる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記単離抗体又はその抗体断片、前記サンプル及び前記固定化したメラトニンを順に接触させる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記免疫アッセイが競合的ＥＬＩＳＡである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
免疫アッセイにより、過敏性腸症候群に罹患している疑いのある患者由来のサンプル中のキヌレン酸（ＫＹＮＡ）レベルを検出する方法であって、
（ａ）好適な条件下で、請求項１５に記載の単離抗体又はその抗体断片、前記患者から得たサンプル、及び固定化したＫＹＮＡを接触させて、前記単離抗体又はその抗体断片と、前記サンプル中に存在するＫＹＮＡ又は前記固定化したＫＹＮＡと、を含む、複合体を形成させるステップと、
（ｂ）前記固定化したＫＹＮＡを含む前記複合体に結合した抗体又はその抗体断片のレベルを検出するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の抗体又はその抗体断片のレベルをもとに前記サンプル中のＫＹＮＡレベルを計算するステップと、を含む、方法。
【請求項３５】
前記単離抗体又はその抗体断片、前記サンプル及び前記固定化したＫＹＮＡを同時に接触させる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記単離抗体又はその抗体断片、前記サンプル及び前記固定化したＫＹＮＡを順に接触させる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記免疫アッセイが競合的ＥＬＩＳＡである、請求項３４に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
[0010]いくつかの実施形態では、抗５−ＨＩＡＡ抗体又はその抗体断片は、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７１で寄託された１２０４−１０Ｇ６Ｆ１１Ｈ３と表記されるハイブリドーマ細胞株により産生される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
[0013]いくつかの実施形態では、抗メラトニン抗体又はその抗メラトニン抗体断片は、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６６９で寄託された１２１２−６Ｃ１Ｅ２Ｆ７と表記されるハイブリドーマ細胞株により産生される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
[0016]いくつかの実施形態では、抗キヌレン酸抗体又はその抗キヌレン酸抗体断片は、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７０で寄託された１１９４−６Ｈ５Ｂ１１Ａ７と表記されるハイブリドーマ細胞株により産生される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
[0020]一態様では、本明細書において、５−ＨＩＡＡに選択的に結合するモノクローナル抗体を産生及び分泌し、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７１で寄託された１２０４−１０Ｇ６Ｆ１１Ｈ３と表記されるハイブリドーマ細胞株が提供される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
[0021]いくつかの態様では、本明細書において、メラトニンに選択的に結合するモノクローナル抗体を産生及び分泌し、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６６９で寄託された１２１２−６Ｃ１Ｅ２Ｆ７と表記されるハイブリドーマ細胞株が提供される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
[0022]一態様では、本明細書において、キヌレン酸に選択的に結合するモノクローナル抗体を産生及び分泌し、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７０で寄託された１１９４−６Ｈ５Ｂ１１Ａ７と表記されるハイブリドーマ細胞株が提供される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
[0127]いくつかの態様では、本発明は、２０１５年１１月１７日にアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ（登録商標））にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７１で寄託された１２０４−１０Ｇ６Ｆ１１Ｈ３と表記されるハイブリドーマ細胞株により産生され、５−ＨＩＡＡに対し免疫反応性である、単離又は精製モノクローナル抗体を提供する。かかる抗体は、図１のトリプトファン１２２、５−ヒドロキシトリプトファン１２５、セロトニン１０１、メラトニン１２０、キヌレニン１３１、キヌレン酸１３５、アントラニル酸１４０、３−ヒドロキシキヌレニン１４６、３−ヒドロキシアントラニル酸１４９、キノリン酸１６０、及びキサンツレン酸１４８といった、トリプトファン経路、セロトニン経路、及びキヌレニン経路の、構造的に類似しているその他の代謝産物又は化合物に対し、交差反応性を実質的に有しない。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
[0151]いくつかの態様では、本発明は、２０１５年１１月１７日にアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ（登録商標））にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６６９で寄託された１２１２−６Ｃ１Ｅ２Ｆ７と表記されるハイブリドーマ細胞株により産生され、メラトニンに対し免疫反応性である、単離又は精製モノクローナル抗体を提供する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５５】
[0170]いくつかの態様では、本発明は、２０１５年１１月１７日にアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ（登録商標））にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７０で寄託された１１９４−６Ｈ５Ｂ１１Ａ７と表記されるハイブリドーマ細胞株により産生され、ＫＹＮＡに対し免疫反応性である、単離又は精製モノクローナル抗体を提供する。かかる抗体は、トリプトファン経路、セロトニン経路、及びキヌレニン経路の構造的に類似しているその他の代謝産物又は化合物に対し、実質的に交差反応性を有しない。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７０】
[0185]本明細書では、上記のアッセイ方法を実施するためのキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、例えば、抗５−ＨＩＡＡモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、及び場合によりビオチン化５−ＨＩＡＡ誘導体などといった、５−ＨＩＡＡに特異的に結合する抗体を含む。抗５−ＨＩＡＡモノクローナル抗体は、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７１で寄託された１２０４−１０Ｇ６Ｆ１１Ｈ３と表記されるハイブリドーマクローンにより産生され得る。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７１】
[0186]他の実施形態では、キットは、メラトニンに特異的に結合する抗体、例えば、抗メラトニンモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、及び場合によりビオチン化メラトニンを含む。モノクローナル抗体は、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６６９で寄託された１２１２−６Ｃ１Ｅ２Ｆ７と表記されるハイブリドーマクローンにより産生され得る。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７２】
[0187]更に他の実施形態では、キットは、キヌレン酸に特異的に結合する抗体、例えば、抗キヌレン酸モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、及び場合によりビオチン化キヌレン酸を含む。モノクローナル抗体は、２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７０で寄託された１１９４−６Ｈ５Ｂ１１Ａ７と表記されるハイブリドーマクローンにより産生され得る。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７７】
Ｆ．モノクローナル抗体
[0192]本明細書において提供されるモノクローナル抗体は、主要な抗体アイソタイプ：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭなどの、なんらかのアイソタイプであってよい。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、又はＩｇＡ２抗体として分類され得る。いくつかの例では、抗体は、カッパ（κ）軽鎖又はラムダ（λ）軽鎖を有する。いくつかの実施形態では、抗５−ＨＩＡＡモノクローナル抗体、又は２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７１で寄託された１２０４−１０Ｇ６Ｆ１１Ｈ３と表記されるハイブリドーマクローンにより産生されるモノクローナル抗体は、ＩｇＧ１κ抗体である。他の実施形態では、抗メラトニンモノクローナル抗体、又は２０１５年１１月１２日にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６６９で寄託された１２１２−６Ｃ１Ｅ２Ｆ７と表記されるハイブリドーマクローンにより産生されるモノクローナル抗体は、ＩｇＧ３κ抗体である。更に他の実施形態では、抗ＫＹＮＡモノクローナル抗体、又は２０１５年１１月１７日にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７０で寄託された１１９４−６Ｈ５Ｂ１１Ａ７と表記されるハイブリドーマクローンにより産生されるモノクローナル抗体は、ＩｇＧ１κ抗体である。
【国際調査報告】
2018501202.tif 000051
2018501202.tif 000052
2018501202.tif 000053
2018501202.tif 000054
2018501202.tif 000055