(57)【要約】  本明細書では、アテローム性動脈硬化を診断または予防するために、アテローム性構造物の存在を検出する方法を提供する。特に、化合物が被験体の血管の内皮壁内に形成された高リスクプラーク、アテローム、マクロファージおよびその他のアテローム性構造物を標的とするため、静脈内に注入されたメチレンブルーは優れた指示薬として作用するということが見出された。化合物は、プラークまたはアテローム中でのみ取り込まれて、正常または健康な血管間質組織中では取り込まれない特有の結合プロファイルを提供するため、メチレンブルーは、イメージング目的のための良好なプラーク対バックグラウンド比を維持する。これにより、医療提供者は患者の生体内アテローム性動脈硬化の発生状況を、確実性高く、かつローコストで判定できるようになる。本開示方法によれば、イメージング試薬としてメチレンブルーを使用することで、被験体の血管内にあるプラークの蓄積、プラークの病理生物学、およびその他のアテローム性構造物の高解像度マッピングが可能となる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者のアテローム性動脈硬化を診断するための方法であって、
（ａ）メチレンブルー溶液を、前記患者に対して静脈内投与する投与工程であって、前記溶液が前記患者の任意のアテロームを標的とする溶液であり、
（ｂ）前記患者の前記任意のアテロームの存在を検出するために、イメージを取得する取得工程、を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記溶液が、０．１〜５ｍｇ／ｋｇの濃度でメチレンブルーを含む
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶液が、０．２〜２ｍｇ／ｋｇの濃度でメチレンブルーを含む
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記溶液が、０．５〜１．５ｍｇ／ｋｇの濃度でメチレンブルーを含む
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記溶液が、リン酸緩衝生理食塩水を含む
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記溶液を前記患者へ投与後、遅延時間を待った後に前記取得工程を行う
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記溶液が、前記遅延時間後に前記患者の血管における前記正常な内皮壁と結合しない
ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記遅延時間が、約１８時間〜約３３時間である
ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記溶液が、前記アテローム内のマクロファージ細胞を標的とする
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶液が、前記アテローム内のアポトーシス細胞を標的とする
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記取得工程が、生体内イメージング法を使用することを含む
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記取得工程が、非侵襲性イメージング法を使用することを含む
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記取得工程が、血管造影イメージングモダリティを使用することを含み、
前記溶液が、造影剤として作用する
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記血管造影イメージングモダリティが、Ｘ線画像法である
ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記血管造影イメージングモダリティが、磁気共鳴イメージング法である
ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記取得工程が、断層イメージングモダリティを使用することを含む
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記断層イメージングモダリティが、コンピュータ断層撮影法である
ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記断層イメージングモダリティが、ポジトロン放射断層撮影法である
ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記断層イメージングモダリティが、単一光子放射断層撮影法である
ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記断層イメージングモダリティが、光干渉断層撮影法である
ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記断層イメージングモダリティが、近赤外蛍光光干渉断層撮影法である
ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記取得工程が、近赤外線分光法を使用することを含む
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記取得工程が、蛍光顕微鏡法を使用することを含む
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記取得工程が、共焦点顕微鏡法を使用することを含む
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記取得工程が、高解像度落射蛍光顕微鏡法を使用することを含む
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記取得工程が、多波長蛍光反射イメージングを使用することを含む
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記取得工程が、近赤外蛍光イメージングを使用することを含む
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記取得工程が、光音響イメージングを使用することを含む
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記取得工程が、侵襲性イメージング法を使用することを含む
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記取得工程が、血管内イメージングを使用することを含む
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記取得工程が、蛍光イメージングを使用することを含む
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記取得工程が、蛍光分光法を使用することを含む
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記取得工程が、近赤外蛍光プローブを使用することを含む
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
第二のイメージングモダリティを使用して、第二のイメージを取得する第２取得工程をさらに含む
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記第二のイメージングモダリティが、血管内超音波イメージングである
ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記イメージおよび前記第二のイメージを相互相関させることをさらに含む
ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
前記患者における前記任意のアテロームの存在が、前記溶液の優れた作用で示されている
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記患者における前記任意のアテロームの存在が、特に前記アテロームが位置する領域において蛍光発光で示されている
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記蛍光発光が、約６５０ｎｍ〜約７２０ｎｍである
ことを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
アテローム性動脈硬化を有していることが疑われ、検出可能量のメチレンブルーが投与された患者のイメージを取得する取得工程を含む
ことを特徴とするイメージング方法。
【請求項４１】
前記検出可能量のメチレンブルーが、静脈内投与された
ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記検出可能量のメチレンブルーが投与された後、遅延時間待った後に前記取得工程が行われる
ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記メチレンブルーが、前記遅延時間後に前記患者の血管における前記正常な内皮壁と結合しない
ことを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記遅延時間が、約１８時間〜約３３時間である
ことを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記メチレンブルーが、前記アテローム内のマクロファージ細胞を標的とする
ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記メチレンブルーが、前記アテローム内のアポトーシス細胞を標的とする
ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
前記取得工程が、生体内イメージング法を使用することを含む
ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
前記取得工程が、非侵襲性イメージング法を使用することを含む
ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
前記取得工程が、血管造影イメージングモダリティを使用することを含み、
前記溶液が造影剤として作用する
ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
前記血管造影イメージングモダリティが、Ｘ線画像法である
ことを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記血管造影イメージングモダリティが、磁気共鳴イメージング法である
ことを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記取得工程が、断層イメージングモダリティを使用することを含む
ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項５３】
前記断層イメージングモダリティが、コンピュータ断層撮影法である
ことを特徴とする請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記断層イメージングモダリティが、ポジトロン放射断層撮影法である
ことを特徴とする請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記断層イメージングモダリティが、単一光子放射断層撮影法である
ことを特徴とする請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記断層イメージングモダリティが、光干渉断層撮影法である
ことを特徴とする請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記断層イメージングモダリティが、近赤外蛍光光干渉断層撮影法である
ことを特徴とする請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
前記取得工程が、近赤外線分光法を使用することを含む
ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項５９】
前記取得工程が、蛍光顕微鏡法を使用することを含む
ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項６０】
前記取得工程が、共焦点顕微鏡法を使用することを含む
ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項６１】
前記取得工程が、高解像度落射蛍光顕微鏡法を使用することを含む
ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項６２】
前記取得工程が、多波長蛍光反射イメージングを使用することを含む
ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項６３】
前記取得工程が、近赤外蛍光イメージングを使用することを含む
ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項６４】
前記取得工程が、光音響イメージングを使用することを含む
ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項６５】
前記取得工程が、侵襲性イメージング法を使用することを含む
ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項６６】
前記取得工程が、血管内イメージングを使用することを含む
ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項６７】
前記取得工程が、蛍光イメージングを使用することを含む
ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項６８】
前記取得工程が、蛍光分光法を使用することを含む
ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項６９】
前記取得工程が、近赤外蛍光プローブを使用することを含む
ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項７０】
第二のイメージングモダリティを使用して、第二のイメージを取得する第２取得工程をさらに含む
ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項７１】
前記第二のイメージングモダリティが、血管内超音波イメージングである
ことを特徴とする請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記イメージおよび前記第二のイメージを相互相関させることをさらに含む
ことを特徴とする請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記患者における前記任意のアテロームの存在が、メチレンブルーの優れた作用で示されている
ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項７４】
前記患者における前記任意のアテロームの存在が、特に前記アテロームが位置する領域において蛍光発光で示されている
ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項７５】
前記蛍光発光が、約６５０ｎｍ〜約７２０ｎｍである
ことを特徴とする請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
患者のアテローム性動脈硬化を検出するための診断方法にて使用する、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の化合物であって、前記式（Ｉ）、前記式（ＩＩ）、前記式（ＩＩＩ）、前記式（ＩＶ）の化合物が、次の通りである。
【化１】
2018508578.tif 000016
【化２】
2018508578.tif 000017
【化３】
2018508578.tif 000018
【化４】
2018508578.tif 000019
【請求項７７】
前記診断方法が、
（ａ）前記患者に、検出可能量の前記化合物を投与する投与工程であって、前記化合物は前記患者の任意のアテロームを標的とし、
（ｂ）前記患者の前記任意のアテロームの存在を検出するために、イメージを取得する取得工程と、
を含む
ことを特徴とする請求項７６に記載の化合物。
【請求項７８】
前記取得工程が、血管造影、Ｘ線画像法、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴法（ＭＲ）、ポジトロン放出型断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影法、近赤外線分光法（ＮＩＲＳ）、蛍光分光法、蛍光顕微鏡法（ＦＭ）、共焦点顕微鏡法、高解像度落射蛍光顕微鏡法、多波長蛍光反射イメージング（ＦＲＩ）、近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）イメージング、光干渉断層法（ＯＣＴ）、ＮＩＲＦ−ＯＣＴ、光音響または音響光学イメージング、超音波イメージング、および血管内イメージングのうちの少なくとも１つを使用することを含む
ことを特徴とする請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
患者のアテローム性動脈硬化を診断するための方法であって、
（ａ）検出可能量の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の化合物：
【化５】
2018508578.tif 000020
【化６】
2018508578.tif 000021
【化７】
2018508578.tif 000022
【化８】
2018508578.tif 000023
を含む溶液を、前記患者に対して静脈内投与する投与工程であって、前記化合物は、前記患者の任意のアテロームを標的としており、
（ｂ）前記患者の前記任意のアテロームの存在を検出するために、イメージを取得する取得工程と、を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項８０】
前記取得工程が、血管造影、Ｘ線画像法、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴法（ＭＲ）、ポジトロン放出型断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影法、近赤外線分光法（ＮＩＲＳ）、蛍光分光法、蛍光顕微鏡法（ＦＭ）、共焦点顕微鏡法、高解像度落射蛍光顕微鏡法、多波長蛍光反射イメージング（ＦＲＩ）、近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）イメージング、光干渉断層法（ＯＣＴ）、ＮＩＲＦ−ＯＣＴ、光音響または音響光学イメージング、超音波イメージング、および血管内イメージングのうちの少なくとも１つを使用することを含む
ことを特徴とする請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
患者のアテローム性動脈硬化を診断するための方法であって、
（ａ）アテローム性プラークを標的とする指示薬として、メチレンブルー（ＭＢ）を前記患者の血流に注入する注入工程と、
（ｂ）前記患者の血流が実質的にメチレンブルーを含まなくなるまで、半減期間の数値の間、待機する待機工程と、
（ｃ）前記患者の血管系のうちの少なくとも一部分を、アテローム性プラークと結合したＭＢを検出するように設定されたイメージングモダリティを使用してイメージングするイメージング工程と、を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項８２】
前記半減期の数値が、約３〜約５．５である
ことを特徴とする請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記イメージングモダリティが、血管造影、Ｘ線画像法、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴法（ＭＲ）、ポジトロン放出型断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影法、近赤外線分光法（ＮＩＲＳ）、蛍光分光法、蛍光顕微鏡法（ＦＭ）、共焦点顕微鏡法、高解像度落射蛍光顕微鏡法、多波長蛍光反射イメージング（ＦＲＩ）、近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）イメージング、光干渉断層法（ＯＣＴ）、ＮＩＲＦ−ＯＣＴ、光音響または音響光学イメージング、超音波イメージング、および血管内イメージングのうちの少なくとも１つである
ことを特徴とする請求項８１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年３月６日出願の米国出願第６２／１２９２４３号からの優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
該当なし。
【背景技術】
【０００３】
本開示は、アテローム性動脈硬化の特徴的な構造物または分子指標を、標的イメージングして検出する方法に関する。特に、静脈内に注入されたメチレンブルーまたはその誘導体を、被験体の血管系のアテロームまたは関連構造物を標的とするイメージング試薬として使用してよい。
【０００４】
アテローム性動脈硬化は、アテローム性プラークもしくはアテロームの発生を伴う血管または慢性炎症性病変であり、血管壁内で、マクロファージおよび脂質から作られる。この患者の動静脈における病変部の蓄積は、心筋梗塞または脳卒中などの臨床事象をもたらし得る。発症中のアテローム性動脈硬化を有する患者の静脈または動脈におけるアテロームは、主としてマクロファージおよび脂質により形成される。アテローム中のマクロファージまたは白血球は、典型的には、酸化した低比重リポタンパク質（ＬＤＬｓ）を取り込む。アテローム性動脈硬化に関連し、このように診断に使用される特性または構造物としては、内皮組織およびアテローム性プラークの透過性、プラークにおけるアテローム形成または新生血管の形成、プラーク新血管新生、脂質またはプラークのアポトーシス、プラーク内出血、プラーク破裂、炎症、脂質の多い血液プール、線維性被膜の欠如、血漿タンパク質の滲出、細胞外マトリックスの欠如、アルブミン、α−グロブリン、微細血管成長、狭窄または内腔制限、ならびに内膜中膜肥厚が挙げられる。
【０００５】
イメージング試薬はこの増大した透過性によって炎症の部位で蓄積することができるので、内皮透過性は多くの場合、標的とされる。血管系における正常な内皮壁は、ギャップまたは透過性のない密着結合を有する。ギャップを含むこの増大した透過性を有する異常な内皮ライニング、または内膜は、炎症性細胞および脂質を溢出させ、さらにはプラークの蓄積を引き起こす。さらに、アテローム性病変の低酸素症は、微細血管または血管壁内血管を引き起こし、組織的でない血管新生、または新血管新生を介した血管の正常状態範囲外の拡がりを被る。
【０００６】
全血管内腔をイメージングするが血管壁はイメージングしない血管造影は、アテローム性動脈硬化の診断を示唆するとして伝統的に用いられてきた。新血管新生、微細血管成長、内皮透過性、およびその他の領域は、血管造影を使用する種々の標的試薬で示されてもよい。磁気共鳴（ＭＲ）血管造影は、頚動脈プラークマクロファージの蓄積を示すために、頸動脈および大動脈にて使用されてもよい。しかし、ガドリニウム造影剤を使用したＭＲ血管造影図は、例えば冠状動脈または静脈など、患者のより小さな血管におけるアテロームまたはプラークを示すには不適切である。この不適切さは、血管系におけるガドリニウム剤のＭＲイメージングから得られる解像度および詳細度に対する制限によるものである。
【０００７】
血管壁の最も内側にある２つの層の内膜中膜肥厚は、超音波検査を使用して測定してよい。これは、血管外または血管内超音波（ＩＶＵＳ）法を使用して測定してもよい。しかしながら、アテローム性動脈硬化の指標としての内膜中膜肥厚の有用性は、異議が唱えられている。その上、血管反応系が複雑であるため、内膜中膜肥厚の変化は、時間の経過とともに、アテローム性動脈硬化の発生とは関連がなくなることもある。さらに、アテローム性プラークおよび動静脈の正常な肥厚の間の識別は、特に、現行のイメージング法を基準とすると非常に困難である。現行のイメージングは、特定患者の血管系のベースラインイメージを取得することを基準にしており、次いで、静脈もしくは動脈の有意な膨張または肥厚があったかどうかを判定するために、その基準イメージと後者のイメージを比較する。この肥厚は、アテローム性プラークの蓄積またはアテローム性動脈硬化に応答する免疫系に起因する可能性がある。モニタリングされる患者のイメージが肥厚を示した後、患者は手術または血管内プローブを含む更なる侵襲性イメージングモダリティを行ってもよい。したがって、アテローム性動脈硬化を診断するための現行の手法には課題が存在する。そのため、アテローム性動脈硬化の診断は、内膜中膜肥厚測定値単独に基づいて必ずしも信頼性が得られるとは限らず、アテローム性動脈硬化診断の信頼性があると思われる場合にも、時々不正確である。加えて、その他の構造的イメージングモダリティのように、ＩＶＵＳからは血管壁内プラークの生態についての情報が得られない。
【０００８】
同様に、Ｘ線、ＭＲ、およびコンピュータ断層撮影（ＣＴ）血管造影は、単一のイメージング評価では、アテローム性動脈硬化由来のアテロームまたは動脈肥厚の信頼性のある識別には不適切である。これは、示された正常な構造物と異常な構造物とを識別できないことに加え、イメージングされた血管における血液のバックグラウンドノイズにも起因するものである。
【０００９】
インドシアニングリーン（ＩＣＧ）は、アテローム性動脈硬化のイメージングにて使用されてもよい。例えば、ＩＣＧイメージングは、アテロームの組織学的タイプを予測するのに有用であってもよい。アテローム内で見られるＩＣＧの標準化された取り込み値（ＳＵＶ）は、可能性がある部位で、いかに新血管新生が侵攻性であるかを予測することが分かってきた。ＩＣＧイメージングは、血流中におけるＩＣＧの短い６分の半減期のために、患者に対する静脈内投与の前後において幾分か直ちに実施される。その一方で、同じ場所で見られるアテロームおよびプラークは、変更可能なＩＣＧの取り込みまたは結合を有してもよい。さらに、そこではＩＣＧはアテロームおよびマクロファージと結合するのに良好な感度を有するように見え、さらに大きなプラークまたは内皮透過性が高い場所では、ＩＣＧが、間質ギャップに蓄積、あるいはプラーク内出血中へも漏出する場合もある。したがって、ＩＣＧの結合プロファイルおよび蓄積パターンは、アテローム性構造物の領域をいっそう強調表示しつつ、異なったまたはさらに精度の良い結合プロファイルを示し、短い半減期または循環時間を伴う初回通過効果をあまり受けないアテローム動脈硬化イメージング試薬を有することが望ましい場合もある。
【００１０】
前述から、特に症状が発生する前に、またはアテローム性動脈硬化疾患の進行が開始する前に、アテローム性動脈硬化を早期検出するための患者のアテロームを検出する代替的な方法が必要とされていると理解できる。より具体的には、標的イメージング試薬がアテローム性構造物中では蓄積し、内皮、間質組織または血管壁中では非特異的ではないことを意味する、良好なプラーク対バックグラウンド比を提供し得るイメージング試薬が必要とされている。
【発明の概要】
【００１１】
全くの予想外で、本開示において、メチレンブルー（ＭＢ）が、被験体において、当業者が理解または予想するよりも、実質的にさらに頑健な標的化または結合プロファイルを有することを見出したのである。したがって、本開示は、ＭＢまたは関連誘導体を使用したアテローム性構造物のイメージング方法を提供することにより、前述の必要性を提起する。アテローム性動脈硬化の進行状況またはリスクが、平面または断層イメージングモダリティなどの種々の医用イメージング技術を使用して診断され得るように、ＭＢまたは関連誘導体はアテローム性構造物中に蓄積し得る。ＭＢは、血管造影、Ｘ線画像法、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴法（ＭＲ）、ポジトロン放出型断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影法、近赤外線分光法（ＮＩＲＳ）、蛍光分光法、蛍光顕微鏡法（ＦＭ）、共焦点顕微鏡法、高解像度落射蛍光顕微鏡法、多波長蛍光反射イメージング（ＦＲＩ）、近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）イメージング、光干渉断層法（ＯＣＴ）、ＮＩＲＦ−ＯＣＴ、光音響または音響光学イメージング、超音波イメージング、血管内イメージング、およびこれらのいずれかの組み合わせなどのイメージングモダリティ用アテローム性動脈硬化標的試薬として機能し得る。
【００１２】
本開示は、アテローム性動脈硬化を診断するための標的イメージング試薬としてＭＢを使用する方法を提供する。ＭＢは、アテローム性動脈硬化の標的化、分子的、または生物学的イメージングのための診断用イメージング試薬として認識されていたことはない。本開示で示されたデータは、これが、ＭＢの結合または取り込みパターンを検出するために、種々のイメージングモダリティを使用することが可能であることを示唆している。これにより、アテローム性動脈硬化症、および場合により、人のアテローム性血管病における高リスクプラークを検出するための完全に新規な方法が可能になる。
【００１３】
インドシアニングリーン（ＩＣＧ）とは対照的に、ＭＢは、内皮透過性もしくはプラーク内出血における漏出または蓄積の影響を受けにくい場合もある。静脈内投与の直後に、ＩＣＧは、血漿タンパク質に迅速に結合する。さらに、ＩＣＧは、１５０秒〜約１８０秒の半減期を有し、毎分１８％〜２４％の速度で肝臓により独占的に除去される。
【００１４】
ＭＢが漏出の影響を受けにくいことは、非常に異なったＭＢの結合プロファイル、および血液プールが十分にクリアで、十分なＭＢの取り込みが発生することを、ＭＢをイメージングする前の遅延時間が確保するという事実に起因し得る。ＭＢは、さらに、複雑な薬物動態を示す。静脈内投与後、ＭＢの還元は多相であり、より深い区画中に拡散して分布し、緩徐な終末消失速度を含む。投与後４時間〜２４時間の間の尿中排泄率の減少、ならびに０．００２２分の推測される終末相は、約５時間〜６．５時間でＭＢの半減期を示す。あるいは、放射性ヨウ素化ＭＢ溶液中では、トレーサーの測定により報告されているように、半減期は約４．５時間であってもよい。加えて、ＭＢはＩＣＧよりも低い両親媒性であり、不要なアテローム性構造物と結合する可能性を低くする。最後に、ＭＢは、部分的な共存のみのＩＣＧとは異なった、断続的な結合パターンを示す。
【００１５】
一態様では、本開示は、近赤外蛍光イメージング試薬としてＭＢを使用するための方法を提供する。
【００１６】
別の態様では、本開示は、患者のアテローム性動脈硬化を診断するための方法を提供する。方法は、患者に対してメチレンブルー溶液を静脈内投与することを含む。溶液は、患者の任意のアテロームを標的とする。すると、イメージは患者の任意のアテロームの存在を検出するようになる。
【００１７】
さらに別の態様では、本開示は、アテローム性動脈硬化を有していることが疑われ、検出可能量のメチレンブルーが投与された患者のイメージを取得すること含むイメージング方法を提供する。
【００１８】
さらに別の態様では、本開示は、患者のアテローム性動脈硬化を検出するための診断方法にて使用する以下の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の化合物を提供する。式（Ｉ）の化合物は、次の通りである。
【００１９】
【化１】
2018508578.tif 000003
【００２０】
式（ＩＩ）の化合物は、次の通りである。
【００２１】
【化２】
2018508578.tif 000004
【００２２】
式（ＩＩＩ）の化合物は、次の通りである。
【００２３】
【化３】
2018508578.tif 000005
【００２４】
式（ＩＶ）の化合物は、次の通りである。
【化４】
2018508578.tif 000006
【００２５】
さらに別の態様では、本開示は、患者のアテローム性動脈硬化を検出するための方法を提供する。このバージョンの方法では、検出可能量の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の化合物を、患者に投与する。
【００２６】
検出可能量の式（Ｉ）は、以下の通りである。
【００２７】
【化５】
2018508578.tif 000007
【００２８】
検出可能量の式（ＩＩ）は、以下の通りである。
【００２９】
【化６】
2018508578.tif 000008
【００３０】
検出可能量の式（ＩＩＩ）は、以下の通りである。
【００３１】
【化７】
2018508578.tif 000009
【００３２】
検出可能量の式（ＩＩＩ）は、以下の通りである。
【化８】
2018508578.tif 000010
【００３３】
化合物は、患者の任意のアテロームを標的とする。次に、イメージは、患者の静脈、動脈、または他所の内側にある任意のアテロームの有無を検出する。イメージ取得のステップは、血管造影、Ｘ線画像法、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴法（ＭＲ）、ポジトロン放出型断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影法、近赤外線分光法（ＮＩＲＳ）、蛍光分光法、蛍光顕微鏡法（ＦＭ）、共焦点顕微鏡法、高解像度落射蛍光顕微鏡法、多波長蛍光反射イメージング（ＦＲＩ）、近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）イメージング、光干渉断層撮影法（ＯＣＴ）、ＮＩＲＦ−ＯＣＴ、光音響または音響光学イメージング、超音波イメージング、血管内イメージング、およびこれらのいずれかの組み合わせなどのイメージング法を使用して実施可能である。
【００３４】
さらに別の態様では、本開示は、患者のアテローム性動脈硬化を診断するための方法を提供する。方法は、アテローム性プラークを標的とする指示薬として、メチレンブルーを患者の血流に注入することを含む。次いで、方法は、患者の血流が実質的にメチレンブルーを含まなくなるまで、半減期間の数値の間、待機することを含む。次に、患者の血管系のうちの少なくとも一部分が、アテローム性プラークと結合したメチレンブルーを検出するように設定されたイメージングモダリティを使用してイメージングされる。
【００３５】
本発明のこれらおよびその他の特徴、態様および利点は、以下の詳細な説明、図面および添付の特許請求の範囲を考察することで、さらに理解が深まる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】本開示に従う経時的な、血流中におけるメチレンブルー蛍光強度の例示的測定値のグラフを示す。
【図１Ｂ】本開示に従う経時的に測定されたメチレンブルー蛍光強度の例示的グラフを示す。
【図２】本開示に従うメチレンブルーにおける吸収スペクトルを示す。
【図３Ａ】本開示に従う白色光源を用いた多波長蛍光反射イメージングを使用した大動脈の一対の生体外イメージを示す。ここでは、メチレンブルーは左側イメージには存在するが、右側イメージには存在しない。
【図３Ｂ】本開示に従う４７０ｎｍ光源を用いた多波長蛍光反射イメージングを使用した図３Ａの大動脈の一対の生体外イメージを示す。ここでは、メチレンブルーは左側イメージには存在するが、右側イメージには存在しない。
【図３Ｃ】本開示に従うＣｙ５  ６３０ｎｍ光源を用いた多波長蛍光反射イメージングを使用した図３Ａの大動脈の一対の生体外イメージを示す。ここでは、メチレンブルーは左側イメージには存在するが、右側イメージには存在しない。
【図３Ｄ】本開示に従うＣｙ７  ７４０ｎｍ光源を用いた多波長蛍光反射イメージングを使用した図３Ａの大動脈の一対の生体外イメージを示す。ここでは、メチレンブルーは左側イメージには存在するが、右側イメージには存在しない。
【図４Ａ】本開示に従うメチレンブルー濃度に応じた図３Ａの大動脈におけるメチレンブルー蛍光強度のグラフを示す。
【図４Ｂ】本開示に従うメチレンブルーを用いたおよび用いない図３Ａの大動脈において計算された標的対バックグラウンド比の範囲を比較する図表を示す。
【図５Ａ】本開示に従うメチレンブルー投与後の、被験体の腹部大動脈の生体外イメージを示す。
【図５Ｂ】本開示に従う白色光源を用いた高解像度落射蛍光顕微鏡法を使用した、図５Ａの大動脈の生体外イメージを示す。
【図５Ｃ】本開示に従う増強されたメチレンブルーを用いて高解像度落射蛍光顕微鏡法を使用した、図５Ａの大動脈の生体外イメージを示す。
【図５Ｄ】本開示に従う図５Ｂおよび図５Ｃを統合したイメージを示す。
【図６Ａ】本開示に従う白色で強調表示されるメチレンブルー、および灰色で表されるフルオレセインイソチオシアネートを用いた被験体の大動脈の蛍光顕微鏡法断面イメージを示す。
【図６Ｂ】本開示に従う白色で強調表示されるメチレンブルー、および灰色で表されるフルオレセインイソチオシアネートを用いた被験体の大動脈の蛍光顕微鏡法断面イメージの別の例を示す。
【図７Ａ】本開示に従う白色で強調表示されるメチレンブルーを投与した、静脈血栓を含む被験体の血管の蛍光顕微鏡法軸方向イメージを示す。
【図７Ｂ】本開示に従う強調表示される自家蛍光を用いた図７Ａの蛍光顕微鏡法軸方向イメージを示す。
【図７Ｃ】本開示に従う図７Ａおよび図７Ｂを統合したイメージを示す。
【図８Ａ】本開示に従う白色で強調表示されるメチレンブルー、および灰色で表されるフルオレセインイソチオシアネートを用いた被験体の大動脈の蛍光顕微鏡法断面イメージを示す。
【図８Ｂ】本開示に従うＲＡＭ１１マクロファージマーカーで染色された図８Ａにおける大動脈の免疫組織化学的断面イメージを示す。
【図８Ｃ】本開示に従うオイルレッド０染色で処理された図８Ａにおける大動脈の組織学的断面イメージを示す。
【図９Ａ】本開示に従う断面の端周辺で見られる自家蛍光から分離するしずく状構造物において蛍光しているメチレンブルーを用いた、被験体の大動脈の蛍光顕微鏡法断面イメージを示す。
【図９Ｂ】本開示に従うＲＡＭ１１マクロファージマーカーで染色された図９Ａにおける大動脈の免疫組織化学的断面イメージを示す。
【図９Ｃ】本開示に従うモバットペンタクローム染色で処理された図９Ａの大動脈の組織学的断面イメージを示す。
【図９Ｄ】本開示に従うへマトキシリン・エオジンで染色された図９Ａの大動脈の組織学的断面イメージを示す。
【図１０】本開示に従う大動脈造影（一番上）、血管内超音波（上から２番目）、および生体外での多波長蛍光反射イメージングを含む複数のイメージング手段を使用した、フルオレセインイソチオシアネートおよびメチレンブルーが注入された大動脈のイメージを示す。
【図１１】本開示に従う図１０の血管内超音波ロングビューイメージ（上から２番目）において垂直白色点線で示された場所で切り取った、大動脈の代表的な蛍光顕微鏡法断面イメージを示す。
【図１２】本開示に従うへマトキシリン・エオジンを用いた組織学的染色で染色された図１１の組織学的大動脈断面イメージを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本開示は、メチレンブルー（ＭＢ）（または関連誘導体）が、マクロファージおよびアテローム内などのアテローム性構造物の領域で蓄積するという新たに発見された証拠に基づいたアテローム性動脈硬化の検出方法を提供する。本発見に基づいて、本開示は、ＭＢおよび関連誘導体の新規な使用、およびＭＢおよび関連誘導体を使用したイメージングの新規な医療適用、すなわち、生検を必要とせずにアテローム性動脈硬化を診断するためのアテロームイメージングを提案する。ＭＢおよび関連誘導体を使用した医用イメージングは、アテローム性動脈硬化の発生または治療後の進行をモニタリングするのにも使用することができる。ＭＢおよび関連誘導体を使用した医用イメージングは、外科的切除後の再発／残存アテローム性動脈硬化の診断に対しても有用である。
【００３８】
本開示に従う方法は、アテローム性構造物の領域で蓄積するというＭＢまたは関連誘導体の新たに発見された性質を利用する。本発明の方法は、ＭＢの存在によって示されるような患者の体の部位（例えば、静脈または動脈）にて、アテローム性構造物の存在（ある場合）および場所を判定する。その方法は、検出可能量のＭＢを含む医薬組成物を患者に投与するステップを含む。「検出可能量」とは、投与される化合物の量が、医用イメージング技術を使用して、アテローム性構造物中の化合物の蓄積を検出可能とするのに十分な量を意味する。「患者」とは、哺乳類、好ましくは人、最も好ましくはアテローム性動脈硬化の発生が疑われる人である。あるいは、患者はアテローム性動脈硬化の症状がない人であってもよく、なおも除外判定または任意のアテローム性動脈硬化発生初期段階をモニタリングするようにする。本開示において使用されるＭＢとしては、全ての関連誘導体および以下に説明される種々の式の化合物が挙げられる。
【００３９】
理論に束縛されるものではないが、ＭＢは、ＭＢが投与された患者の血管系におけるアテローム性構造物内のアポトーシス、ネクローシス、または死細胞を標的とし得ると考えられている。このアテローム性プラークの脂質、マクロファージ、または任意の他の部位のアポトーシスは、アテローム性動脈硬化の発生と関係している。ＭＢは、アテロームのアポトーシス／ネクローシス指標試薬として機能する。ＭＢは、当初、１８８６年にミトコンドリアを標的とする神経イメージング試薬として使用するのに注入されていた。ＭＢは、細胞間ミトコンドリアの膜内在性チャネルを標的としてもよい。ＭＢは、細胞がアポトーシスである場合、細胞の境界をただ単に横断し得る。さらに、生育可能な細胞または生細胞は、染色されていない細胞を残して、ＭＢを還元する。対照的に、生育不可能な細胞または死細胞は、ＭＢで染色されたままになり、したがって、蛍光、光学的、および可視光アプローチを介して検出される。また、ＭＢは、分子標的を有してもよい。最終的に、ＭＢは、場合により、多核または破骨細胞状であり得る巨細胞を示す大きなしずく状構造物を含む特有の結合パターンを有する。
【００４０】
高リスクプラークのマーカーであるマクロファージにおけるＭＢの細胞内取り込みのため、ＭＢは、アテローム性動脈硬化診断用イメージング試薬として有用である。本開示は、ＲＡＭ１１マクロファージマーカーを使用した免疫組織化学的イメージングと相互相関がある場合、実施例実験においてこのＭＢの取り込みを確認する。
【００４１】
アテローム性構造物中に蓄積した化合物ＭＢの生体内検出は、既知または利用可能な任意の平面または断層医用イメージング技術によって達成される。ＭＢは、血管造影、Ｘ線画像法、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴法（ＭＲ）、ポジトロン放出型断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影法、近赤外線分光法（ＮＩＲＳ）、蛍光分光法、蛍光顕微鏡法（ＦＭ）、共焦点顕微鏡法、高解像度落射蛍光顕微鏡法、多波長蛍光反射イメージング（ＦＲＩ）、近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）イメージング、光干渉断層法（ＯＣＴ）、ＮＩＲＦ−ＯＣＴ、光音響または音響光学イメージング、超音波イメージング、血管内イメージング、およびこれらのいずれかの組み合わせなどのイメージングモダリティ用アテローム性動脈硬化標的試薬として機能する。
【００４２】
メチレンブルー（ＭＢ）は、ベーシックブルー９、メチルチオニニウムクロリド、Ｓｗｉｓｓ  ｂｌｕｅ、ＣｈｒｏｍｏｓｍｏｎおよびＵｒｏｌｅｎｅ  ｂｌｕｅとしても知られ、分子式Ｃ１６Ｈ１８ＣＩＮ３Ｓを有する。ＭＢは、組織学にて使用する染色または色素として知られているが、血管造影もしくはアテロームの検出にて使用されたり、または使用が示唆されたりしたことはない。ＭＢは、生物物理的システムにおける光プローブとして、ナノ多孔性材料におけるインターカレータとして、およびフォトエレクトロクロミックイメージングにおける酸化還元メディエータとして使用されている。医療用途においては、ＭＢは、グアニル酸シクラーゼを阻害し、低濃度のメトヘモグロビンに対し、およびシアン化物中毒のための治療薬として用いられている。ＭＢは、グロビン血症（ｇｌｏｂｉｎｅｍｉａ）治療のための薬剤としても、ＦＤＡにより承認されている。
【００４３】
以下の式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物は、患者のアテローム性動脈硬化関心領域を標的とするためのイメージング試薬として使用してもよい。
【００４４】
【化９】
2018508578.tif 000011
【００４５】
上述の式（Ｉ）の化合物は、［７−（ジメチルアミノ）フェノチアジン−３−イリデン］−ジメチルアザニウムクロリド（ＣＡＳ番号６１−７３−４、７０６０−８２−４）、Ｎ−［７−（ジメチルアミノ）−３Ｈ−フェノチアジン−３−イリデン］−Ｎ−メチルメタンアミニウムクロリド、またはメチレンブルー（ＭＢ）としてもまた知られている。ＭＢは３１９．８５ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。
【００４６】
【化１０】
2018508578.tif 000012
【００４７】
上述の式（ＩＩ）の化合物は、７−（ジメチルアミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３Ｈ−フェノチアジン−３−イミニウムクロリド（ＣＡＳ番号１５２０７１−３２−４）、３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン−５−イウムクロリド、メチレンブルー（ＭＢ）、またはベーシックブルー９としてもまた知られており、３１９．８５ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ＭＢは、類似した構造体を有するチアジン色素の部類のフェノチアジンである。
【００４８】
あるいは、以下の式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の化合物は、患者のアテローム性動脈硬化を診断するためのイメージング試薬として使用してもよい。
【００４９】
【化１１】
2018508578.tif 000013
【００５０】
【化１２】
2018508578.tif 000014
【００５１】
式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の化合物は、それぞれ、式（Ｉ）および（ＩＩ）のカチオン形態である。式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の化合物は、式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の正電荷を安定させるために、リン酸塩などの好適なアニオンを含む溶液中で存在し得る。式（ＩＩＩ）の化合物は、［７−（ジメチルアミノ）フェノチアジン−３−イリデン］−ジメチルアザニウム、３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン−５−イウム、またはメチレンブルー（ＭＢ）カチオンとしてもまた知られている。式（ＩＶ）の化合物は、３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェナゾチオニウムカチオン（ＣＡＳ番号８０７３０６−７１−４）、３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン−５−イウム、またはメチレンブルー（ＭＢ）カチオンとしてもまた知られている。ＭＢおよび関連誘導体は、通常、臭化物または塩化物として存在するが、例えばリン酸塩などの正電荷を安定させるための適正なアニオンを含む溶液中でも提供されてよい。
【００５２】
図２は、ＭＢの吸収スペクトルを示すが、これは、ＭＢが近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）を有することを示唆する。ＭＢの励起または吸収波長は、６００ｎｍ〜７００ｎｍの範囲で変動する。対応するＭＢの蛍光発光波長は、６５０ｎｍ〜７２０ｎｍの範囲で変動する。リン酸緩衝生理食塩水におけるＭＢのクエンチング閾値は１２．５μΜであり、量子収率は５．３％である。リン酸緩衝生理食塩水におけるＭＢの分子減衰係数は、７３，０００ｃｍ-1／Ｍである。ＭＢの特定の吸収および蛍光特性は、ＭＢのプロトン化、濃度、および異染性、ならびにＭＢ溶液のｐＨに依存する。例えば、高濃度（すなわち、３１．３ｍＭ）において、ＭＢは、クエンチングおよび溶液中における更なるモノマーからダイマーへのシフトが理由で、ＮＩＲＦを示さない場合がある。希釈水溶液において、スペクトル試験は、６６５ｎｍでの主要吸収帯がモノマーの吸収を表し得るとともに、６１０ｎｍでのショルダーがダイマーによるものであり得ることを示した。理論に束縛されるものではないが、６６５ｎｍでのＭＢモノマー吸収ピークは、Ｃ＝Ｎ結合におけるＮのｎ＝自由電子対、およびＳ＝Ｃ結合におけるＳのｎ＝自由電子対のｎ−π*遷移か、チアジン中央におけるＣ由来の電子に共鳴しているＳのπ−π*遷移のどちらかに相当すると考えられている。さらに、ショルダーにおけるダイマーの６１０ｎｍピークは、０〜１の振電遷移に相当し得る。
【００５３】
アテローム中に蓄積した化合物の生体内検出のためのＭＢを含む医薬組成物の患者に対する投与は、静脈内または動脈内にされてもよい。さらに、ＭＢの投与は、髄腔内、筋肉内、皮内、皮下、または腔内にされてもよい。イメージングの１つの非限定的な例示的方法としては、ＭＢなどの静脈内注入可能分子の使用が挙げられる。ＭＢの投与容量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇで変化する。ＭＢは、リン酸塩、水、臭素、塩素、硫酸塩、メトナール（ｍｅｔｈｏｎａｌ）またはその他の緩衝剤を含む溶液中で存在する。緩衝液は、得られたＭＢ溶液の所望のｐＨを基準にして選択される。
【００５４】
本開示の１つの例示的方法では、ＭＢが任意のアテロームに蓄積できるように、投与後に十分な時間が考慮される。したがって、この方法は、イメージングの前に意図的な遅延時間を含んでもよい。静脈内投与されたＭＢの薬物動態は、明確に立証されている。ＭＢ消失の時間的経過は、健康な人ボランティアにおいて予め測定し、５．２５時間の血液半減期が得られた（Ｐｅｔｅｒ  ＣらのＥｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（２０００年）５６刊  ２４７〜２５０頁を参照）。血流中の特定イメージング試薬の半減期に応じて、血液由来バックグラウンドイメージングを減少させるために、静脈内注入後の約３〜５．５の半減期に、血管イメージングを実施してもよい。本開示の方法の１つの例示的構成では、患者の血流中へのＭＢ投与は、イメージ取得前に約２４時間行っても良い。
【００５５】
さらに、患者の血管系におけるＭＢのイメージングは、ＭＢの第一半減期内で関心領域の初回通過イメージと共にまたはそれ無しで行ってもよい。これは、６分の半減期を有するインドシアニングリーン（ＩＣＧ）を必要とするイメージング法とは異なる。短い半減期を有するＩＣＧおよびその他のイメージング試薬は、ベースラインイメージを取得するために、静脈内投与の前後において直ちに取得される初回通過イメージを必要とする。ベースラインイメージを使用して、約３〜５．５の半減期遅延などのいくらかの遅延時間後に、例えば、血流および大動脈壁内にあるイメージング試薬のバックグラウンドノイズを取り除くために、オーバーレイイメージが取得されてもよい。
【００５６】
特にＭＢを使用する場合、イメージ取得のために投与後１８〜３０時間の間待機することで、ＭＢが患者の血液プールから十分に取り除かれ、アテロームを標的とするＭＢのイメージングを可能にする。あるいは、リンパ節をイメージングする場合など、ＭＢの蓄積は、５〜１０分以内で検出可能であってよく、その後、ＭＢの造影対ノイズ比は、一日中上昇し続けても良い。さらに、この遅延時間により、アテロームを伴うマクロファ―ジにおいてＭＢのさらなるフルオロフォアの取り込みを向上させる。
【００５７】
ＩＣＧとは異なるＭＢのイメージング技術、結合プロファイル、および細胞取り込みは、患者内の同一構造物を分析するのに両方のイメージング試薬を使用する場合、有利である。患者の血管系内でのＭＢおよびＩＣＧの同時もしくは異なる時間に取得されるイメージの相互相関またはオーバーレイは、どちらか１つよりもより有用な診断情報を提供する。あるいは、ＭＢを、ＩＣＧの他に別のフルオロフォアと混ぜ合わせてよく、２つまたはマルチチャンネル近赤外蛍光イメージング法などの多重試薬イメージングに使用されてもよい。
【００５８】
有利には、ＭＢは、共焦点顕微鏡法のためのイメージング試薬として使用してもよい。これは、約６００ｎｍ〜７００ｎｍであるＭＢの蛍光励起波長に起因する。ＭＢのより赤色の蛍光吸収範囲は、現在の共焦点顕微鏡法に搭載された光源と適合する。さらに、２軸共焦点顕微鏡法は、最近の進歩に応じた生体内イメージング法のように、同一物を微小化して、ＭＢと共に使用してもよい。
【００５９】
ＭＢは、光音響イメージングモダリティなどの非侵襲性アテローム性動脈硬化の検出にて使用されてもよい。静脈内投与されたＭＢとともにレーザーパルスを使用する、光音響または音響光学イメージングにより、患者の血管新生の生体内モニタリングが可能となる。遅延時間後におけるＭＢの細胞内取り込みが、特有の結合プロファイルを有するという本開示の新事実に従い、ＭＢは、内因性の造影対バックグラウンド比の向上をもたらす光音響イメージング試薬として使用してもよい。
【００６０】
アテローム性構造物は、静脈内造影剤としてＭＢを用いて非侵襲性磁気共鳴（ＭＲ）イメージングを使用する患者において検出される。ＭＢは、特有の結合プロファイルおよび血液プールからの十分な除去を提供するため、ＭＢは、患者のアテローム性構造物のより高解像度な詳細図を提供できる。あるいは、ＭＢが対象とする内皮組織の透過性部位に蓄積するか、または新生血管の部位および量を示すように、ＭＢは、ｂｌａｃｋ−ｂｌｏｏｄダイナミック造影増強ＭＲイメージングにて使用されてもよい。この特定部位におけるＭＢ蓄積の経時的変化は、定量的に測定される。
【００６１】
標的化構造物におけるＭＢの標的イメージングの維持が、より良いイメージング、特に血管内イメージングを可能にする。ＭＢを使用するアテロームイメージングの１つの非限定的な例示的方法は、近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）イメージングを使用しても良い。この方法は、ＮＩＲＦカテーテルを用いて、患者の静脈内血管系からイメージを取得してもよい。ＮＩＲＦカテーテルは、励起光源として、６６５ｎｍ〜７００ｎｍの範囲の励起波長を有する連続波レーザーダイオードを使用してもよい。励起光源は、５ｎｍの半値全幅（ＦＷＨＭ）を有する狭バンドパス干渉フィルタを用いてフィルタにかけられ、残留レーザー散乱が除かれてもよい。フィルタにかけられた励起光は、ビームスプリッタを通過し、次に、マルチモードファイバを用いて案内されてもよい。また、励起光源は、ＮＩＲＦカテーテル中へと連結されてもよい。ＮＩＲＦカテーテルは、放射線不透過性（ｒａｄｉｏ−ｏｐａｑｕｅ）チップおよびハウジングを含んでもよい。ＮＩＲＦカテーテルの末端は、光を向けて焦点を当てるためのプリズムを含んでもよい。ＮＩＲＦカテーテルは、バルーン・ウェッジ・カテーテルを通して、患者の静脈または動脈中へと進めてもよい。ＮＩＲＦカテーテルは、最大電圧測定値を記録しつつ、対象とする静脈または動脈中で、手動でまたは自動的に引き戻してもよい。生体内プラーク標的対バックグラウンド比（ＴＢＲ）は、次のように計算されてもよい。
【００６２】
【数１】
2018508578.tif 000015
【００６３】
Ｖmaxは、全ての引き戻しからの最大電圧であり、Ｖbはバックグラウンド電圧である。
＜＜実施例＞＞
【００６４】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するために存在するものであり、いかなる方法によっても本発明を制限することを意図しない。
（実施例１）
【００６５】
ウサギにおけるアテローム性動脈硬化モデルを使用して、メチレンブルー（ＭＢ）のルーチン臨床タイプ静脈内投与量（１ｍｇ／ｋｇ試験済）は、ウサギのプラークにおいてＭＢを堆積することができ、近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）イメージングによって検出することができると結論付けた。
方法：
【００６６】
ニュージーランドホワイトウサギ（３〜４ｋｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｎ＝２）に、高コレステロール食（０．３％の総コレステロール、５％のピーナッツオイル；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ）を給餌し、３Ｆフォガティー塞栓除去バルーン（Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、腎動脈下腹部大動脈傷害を与えた。３Ｆバルーンは、大腿動脈を介して経皮的に挿入され、公称圧力まで拡張し、張力および反復下で引き上げた。傷害から回復後、ウサギに０．３％高コレステロール食を与え続け、その総血清コレステロール値をルーチン的に測定した（Ｈｅｍａｇｅｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。
メチレンブルー：
【００６７】
アテロームイメージング前に２４時間、リン酸緩衝生理食塩水中で１ｍｇ／ｋｇ濃度のＭＢをウサギ被験体に静脈内投与した。
生体内イメージング：
【００６８】
動脈傷害および高コレステロール食の継続から２８日で、ウサギを麻酔し、種々のイメージングモダリティを使用してイメージングした。大動脈造影（ＡＲＣＡＤＩＳ  Ｖａｒｉｃ  Ｃ−ａｒｍ  蛍光透視装置、Ｓｉｅｍｅｎｓ）が、手動のコントラストインジェクションを用いてウサギで実施された。血管造影後、血管内超音波（ＩＶＵＳ）が、カテーテル（ｉＬａｂ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施された。ＩＶＵＳカテーテルは、プラーク負荷を評価するために、予め傷害をうけた動脈領域に対して、０．５ｍｍ／秒の自動引き戻しとともに使用された。最後に、ウサギ被験体に、近赤外蛍光光干渉断層（ＮＩＲＦ−ＯＣＴ）イメージングを行った。
生体外イメージング：
【００６９】
マルチモダリティイメージングに引き続き、ウサギを安楽死させ、その大動脈を除去し、４℃にて生理食塩水中に置いた。新たに切除された大動脈を、それぞれ５３５ｎｍおよび７００ｎｍの励起波長を有するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびＭＢを用いて、多波長蛍光反射イメージング（ＦＲＩ）を使用してイメージングした。ＦＲＩシステム（Ｋｏｄａｋ  ＩｍａｇｅＳｔａｔｉｏｎ  ４０００，Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ  Ｈｅａｌｔｈ）を使用しながら、ＦＩＴＣの自家蛍光を誘起するのに使用される励起源は、４秒の照射時間で４７０ｎｍ周辺に焦点が当てられた。ＭＢの近赤外蛍光は、６４秒間の約６３０ｎｍ励起波長により誘起された。関心領域（ＲＯＩ）は、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いて手動でトレーシングされ、プラーク境界の視覚的評価法に基づいてアテロームを囲んだ。次に、アテロームトレーシングされたイメージを、ロングビューＩＶＵＳイメージと共に記載した。標的対バックグラウンド比（ＴＢＲ）は、プラーク蛍光を隣接する正常な血管で測定されたバックグラウンド蛍光で割った平均値として、各々についてのＲＯＩを計算した。
【００７０】
次に、大動脈の組織学的分析を実施した。切除された大動脈を、最適切削温度化合物（ｏｐｔｉｍａｌ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）で充填し、次に、ドライアイス上で急速凍結した。クライオスタット（Ｌｅｉｃａ  ＣＭ３０５０  Ｓ）を使用して、８μｍの大動脈切片を得た。組織切片を、へマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）、マッソントリクローム、およびオイルレッド０（ＯＲＯ）の組織学的イメージングで染色した。さらに、マクロファージ（ＲＡＭ１１；Ｄａｋｏ）について、免疫組織化学試験を実施した。
【００７１】
染色されなかった組織切片が、ＦＩＴＣおよびＭＢにおいて、多波長蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ９０ｉ）でイメージングされた。５３５ｎｍにおけるＦＩＴＣの自家蛍光発光は４８０ｎｍ源で励起され、７００ｎｍにおけるＭＢの近赤外蛍光発光は６３０ｎｍＣｙ５．５源を用いて励起された。
【００７２】
図１０〜図１２は、大動脈バルーン傷害および高コレステロール給餌から２８日後、アテロームが、血管造影、ＩＶＵＳ、および組織学的イメージングにより描写されたように明白であることを示す。
【００７３】
図１０は、大動脈造影（一番上）、ＩＶＵＳ（上から２番目）、ならびに白色光源（中央）、４８０ｎｍ源（下から２番目）、および６３０ｎｍ源（一番下）を用いた生体外での多波長ＦＲＩを含むウサギ大動脈の複数のイメージングモダリティを示す。これらのイメージは、ＭＢによるアテロームの強調を実証しており−白色光チャネルイメージ（中央）中の白矢頭およびＣｙ５．５の強調表示領域イメージ（一番下）によって示され、−すなわち、ＦＩＴＣの自家発光（下から２番目）とは異なる。これは、ＭＢがアテローム性動脈硬化診断時に提供し得る特有の標的結合プロファイルを証明する。
【００７４】
図１１は、図１０のＩＶＵＳロングビューイメージ（上から２番目）中の垂直白色点線で示された場所で切り取った、大動脈の代表的なＦＭ断面イメージを示す。このイメージは、ＭＢが近赤外蛍光（破線ボックス内）で示されるようなアテロームに標的を絞っていることを明らかにしており、これは正常な動脈壁構造がない。
【００７５】
図１２は、Ｈ＆Ｅで染色された図１１の大動脈断面の組織学的イメージを示す。このＨ＆Ｅ染色は、ＭＢの近赤外蛍光強調された部位でアテローム性プラークの存在を確認する。
【００７６】
このデータは、アテロームが、既知のまたは以前に用いられた任意の他のイメージング試薬とは異なるＭＢ特有の取り込みパターンを有することを確認する。
（実施例２）
【００７７】
メチレンブルー（ＭＢ）の結合および取り込みは、腹部大動脈のアテローム性動脈硬化のウサギモデルにおいて評価した。人血流中のＭＢ半減期は、約５〜６．５時間（Ｐｅｔｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２０００年  ５６（３）  ２４７〜５０）と記載されている。ウサギ血流中のＭＢ半減期は、高コレステロール食および高炎症プロトコールを実施したｍ４６３およびｍ４６４である２つの被験体で測定された。図１Ａは、ｍ４６３の血流中におけるＭＢ蛍光強度の経時的グラフを示す。蛍光強度は、１フェーズ指数関数的減衰を有した。半減期は、１８８分、または約３時間であることが判明した。図１Ｂは、ｍ４６４の血流中におけるＭＢ蛍光強度の経時的グラフを示す。同様に、蛍光強度は１フェーズ指数関数的減衰を有した。半減期は、４４１分、または約７．４時間であることが判明した。試験したウサギにおけるＭＢ半減期の平均は、約５．２５時間で、人において見られる範囲内に含まれる。
【００７８】
リン酸緩衝生理食塩水中で１ｍｇ／ｋｇの濃度のＭＢを、０．５ｍｇ／ｋｇのインドシアニングリーン（ＩＣＧ）溶液とともに、ウサギ被験体ｍ４６４の大動脈中に、それぞれのイメージング前２４時間および０．５時間、混注した。蛍光反射イメージング（ＦＲＩ）を実施し、ＭＢおよびＩＣＧの取り込みと分布を評価した。アテローム性領域を、ＦＲＩイメージにおける関心領域として、輪郭を描いた。ＦＲＩの結果は、大動脈のアテローム性領域においてＭＢおよびＩＣＧが共存することを示した。例えば、図３Ａ〜図３Ｄは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＭＢ、およびＩＣＧが注入された被験体ｍ４６２（一番上）、ｍ４６３（中央）およびｍ４６４（一番下）の切除された大動脈の多波長ＦＲＩイメージを示す。
【００７９】
図３Ａは、白色光源を用いた一対の生体外多波長ＦＲＩイメージを示し、左イメージではＭＢが存在し、右イメージではＭＢが存在しない。左イメージで存在するＭＢは、イメージング前の２４時間、１ｍｇ／ｋｇリン酸緩衝生理食塩水中で、被験体に静脈内投与された。図３Ｂは、５３５ｎｍでＦＩＴＣの自家蛍光が見られ得るように、４７０ｎｍ励起光源下で見られる図３Ａの大動脈の一対の生体外イメージを示す。図３Ｃは、７００ｎｍ周辺で近赤外蛍光のＭＢが見られ得るように、Ｃｙ５  ６３０ｎｍ励起光源下で見られる図３Ａの大動脈の一対の生体外イメージを示す。図３Ｃは、さらに、１５μΜ、３μΜ、１．５μΜおよび０．３μΜにおける、ＭＢのＦＲＩ標準スケール強度を示す。最後に、図３Ｄは、７９０ｎｍ周辺でＩＣＧ蛍光が見られ得るように、Ｃｙ７  ７４０ｎｍ励起光源下で見られる図３Ａの大動脈の一対の生体外イメージを示す。ＩＣＧはイメージングが行われる前の３０分、０．５ｍｇ／ｋｇ溶液中で、被験体に静脈内投与された。
【００８０】
図４Ａは、μΜのＭＢ濃度に応じた図３Ａの大動脈におけるＭＢ蛍光強度のグラフを示す。図４Ｂは、ＭＢを用いたおよび用いない図３Ａの大動脈における標的対バックグラウンド比（ＴＢＲ）の範囲を比較する図表を示す。ＴＢＲは、蛍光を、隣接する正常な大動脈のバックグラウンド蛍光で割った平均値として計算された。図４Ｂの比較は、イメージング前の２４時間、ＭＢが投与された被験体の大動脈イメージングの方が、ＭＢがない場合よりも高いＴＢＲを有することを示す。これにより、ＭＢの標的化プロファイルは当業者が予想するよりも実質的にさらに頑健であることを確信する。このより高いシグナル対ノイズ比は、既知または使用されている任意の他のイメージング試薬と比較して、アテロームまたはその他のアテローム性構造物中でＭＢフルオロフォアをさらに取り込むことを示唆している。
【００８１】
ＦＲＩを介して見られるＭＢおよびＩＣＧの共存は、高解像度落射蛍光顕微鏡法を使用して、ＦＲＩの結果で輪郭を描いた関心領域由来の新鮮凍結組織断面もまた確認した。ＭＢの取り込みは、６０％超の狭窄を有する顕微鏡的病変およびアテローム性病変の両方において局在化することが判明した。さらに、切片評価を蛍光核染色で対比染色した場合、ＭＢの結合は細胞取り込みを伴った。例えば、図５Ａは、ＭＢ投与後に高コレステロール食および高炎症プロトコールを与えた被験体の切除された腹部大動脈イメージを示す。図５Ａ〜図５Ｄで見られるように、イメージング実施前の２４時間、被験体ウサギ（Ｒｂ）ｍ５３９ではＭＢが投与され、リン酸緩衝生理食塩水中に１ｍｇ／ｋｇのＭＢ溶液を含んだ。図５Ｂは、白色光源を用いた高解像度落射蛍光顕微鏡法を使用した、図５Ａの大動脈の生体外イメージを示す。図５Ｃは、増強されたＭＢを用いた高解像度落射蛍光顕微鏡法を使用した、図５Ａの大動脈の生体外イメージを示す。図５Ｄは、図５Ｂおよび図５Ｃを統合したイメージを示す。
【００８２】
蛍光顕微鏡法（ＦＭ）が、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびＣｙ５チャネルにおいてｍ４６４の大動脈横断面で実施された。図６Ａは、ＭＢおよびＦＩＴＣを用いた被験体ｍ４６４の大動脈のＦＭ断面イメージ（１０ｘＳｔｉｔｃｈ  ｏｎ  ９０ｉ）を示す。白色領域は、Ｃｙ５．５源下のＭＢ近赤外蛍光を表す。灰色領域は、ＦＩＴＣの自家蛍光を表す。ＭＢおよびＦＩＴＣ領域間にはほとんどオーバーラップはなく、アテローム性構造物における特有のＭＢ取り込みおよび結合プロファイルは、その他のイメージング試薬によって標的とされないことを証明している。図６Ｂは、ＭＢおよびＦＩＴＣを用いた被験体ｍ４６４の大動脈のＦＭ断面イメージ（１０ｘＳｔｉｔｃｈ  ｏｎ  ９０ｉ）の別の例を示す。また、ＭＢ結合領域およびＦＩＴＣ自家蛍光の間の違いは、任意のその他のものとは異なるアテローム標的試薬としてのＭＢの有用性を示す。さらに、図６Ａおよび図６ＢにおけるＭＢのＴＢＲは、ＭＢの標的化プロファイルが頑健であることを示す。さらに別の実施例では、図９Ａは、高炎症プロトコールに従い動脈傷害を受けた後の２８日間、高コレステロール食を給餌した後の被験体ｍ５３９の大動脈ＦＭ断面イメージを示す。ＦＭイメージは、大動脈壁周辺の自家蛍光、および内側大動脈壁に沿って異なった白色斑点またはしずく状で、自家蛍光からは分離されたＭＢの近赤外蛍光を示す。
【００８３】
さらに、図７Ａ〜図７Ｃは、高炎症プロトコールに従い血管傷害を受けた後の静脈血栓を含む、被験体血管のＦＭ軸方向イメージを示す。被験体へは、イメージング前の２４時間、リン酸緩衝生理食塩水中１ｍｇ／ｋｇ濃度のＭＢを注入した。図７Ａは、ＭＢのみが強調表示されるようにフィルタを利用して取得した静脈血栓を含むＦＭ軸方向イメージを示す。図７Ｂは、他のイメージング試薬の自家蛍光のみが強調表示されるように適用したフィルタを用いた図７Ａの同ＦＭ軸方向イメージを示す。最後に、図７Ｃは、図７Ａおよび図７Ｂを統合したイメージを示し、ここでＭＢは白色で強調表示され、他のイメージング試薬の自家蛍光はより暗い色合いで表されている。図７Ｃにおけるボックス領域は、血管中の静脈血栓を示す。図７Ｃの隅にある静脈血栓部位の拡大は、自家蛍光では見られない特別なＭＢ取り込み領域を示す。図７Ａ〜図７ＣのＦＭイメージは、血管壁周辺の自家蛍光、ならびに内側血管壁に沿っておよび静脈血栓において異なった白色斑点またはしずく状であり、自家蛍光からは分離されたＭＢの近赤外蛍光を示す。これもまた、ＭＢが血管イメージング用の特有の結合パターンを提供する証拠である。
【００８４】
被験体の大動脈におけるＭＢの結合もまた、従来の組織学的染色を使用して、評価された。ＭＢの取り込みを評価するためにイメージングされた蛍光組織断面は、さらに、へマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色で処理された。断面の組織学的イメージングは、ＭＢ結合領域が、アテローム性病変の表在性領域に限られないことを示した。特に、ＭＢの結合は、病変の全深さを透過する特別な領域で見られた。さらに小さい細胞領域でも、ＭＢの取り込みがあることが判明した。例えば、図９Ｄは、Ｈ＆Ｅを用いて染色された図９Ａの大動脈の組織学的断面イメージを示す。さらに、図９Ｃは、モバットペンタクローム染色で処理された図９Ａの大動脈の組織学的断面イメージを示す。
【００８５】
最後に、断面は免疫組織化学的染色技術を使用してイメージングされた。既知のマクロファージマーカーである免疫組織化学的染色ＲＡＭ１１を使用して、ＭＢ結合イメージと相互相関させた。ＭＢ取り込み領域は、ＲＡＭ１１染色においてマクロファージ陽性である領域を伴うことが判明した。これらの領域は、特定の場所とは限らなかった。例えば、ＭＢおよびＲＡＭ１１が均一に共存する一領域は、内弾性板の内腔側、ならびに他領域のアテロームの近くに位置していた。図９Ｂは、ＲＡＭ１１マクロファージマーカーで染色された図９Ａにおける大動脈の免疫組織化学的断面イメージを示す。
【００８６】
このＭＢおよびＲＡＭ１１間の共存の別の例として、図８Ａ〜図８Ｃは、ＦＭ、組織学的イメージング、免疫組織化学的イメージングを含む種々のイメージングモダリティを使用した被験体の同様な大動脈断面イメージを示す。図８Ａは、内側大動脈壁に沿った異なった白色斑点またはしずく状のＭＢの近赤外蛍光を用いて、正常な大動脈壁構造に沿った灰色で表されるＦＩＴＣの自家蛍光から分離した、被験体大動脈のＦＭ断面イメージを示す。図８Ｂは、ＲＡＭ１１マクロファージマーカーで染色された図８Ａにおける大動脈の免疫組織化学的断面イメージを示す。図８Ｃは、オイルレッド０（ＯＲＯ）染色で処理された図８Ａの大動脈の組織学的断面イメージを示す。
＜結論＞
【００８７】
上記では、ＭＢがアテローム性動脈硬化を診断するための有用な標的イメージング試薬になる可能性を有していることが示された。さらに、ＭＢは、アテローム性動脈硬化診断における一般的な診断的課題の解決を手助けする。ＭＢを用いたアテロームイメージングは、既報されていない新規なタイプのアテローム性動脈硬化イメージングを示す。髄膜腫におけるＭＢ結合の正確なメカニズムは分かっていないが、ＭＢはアテローム内のアポトーシス細胞と結合する。この結合が、イメージング試薬として知られているＩＣＧおよび他のものとは異なる特有なものである。ＭＢは、大きな、しずく状の特徴的な形の構造を示す。さらに、ＭＢは膜内在性チャネルを透過する。
【００８８】
本発明を特定の実施形態について説明したが、当業者であれば、本発明が記載された実施形態以外の実施形態で実施することができ、これらは具体的説明のために提示され限定されないことが、当業者には理解されよう。したがって、添付した請求項の範囲は本明細書に含まれる詳細な実施形態に限定されるべきではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ−８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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