(57)【要約】  エクソソーム又は他のマイクロベシクルを生物学的標的に送達する方法であって、該方法は、（１）血液を提供し、（２）提供された血液から血漿を分離し、及び（３）そこから、エクソソームを含む溶液を分離し、（４）エクソソームをカプセル化し、及び（５）エクソソームを送達する工程を含んでなる。カプセル化工程は、水ビーズ法、アルギネートビーズ法、スプレー乾燥ビーズ形成、又はプレーティングによって行われる。生物学的標的は、ヒト又は動物の心臓、骨／関節、創傷又は皮膚である。エクソソームをカプセル化する方法、カプセル化したエクソソームを使用する方法、カプセル化したエクソソームを含む組成物、及びカプセル化したエクソソーム自体も開示される。【選択図】    図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロベシクルをカプセル化する方法であって、（１）血液を提供し、（２）提供された血液から血漿を分離し、（３）そこから、マイクロベシクルを有する溶液を分離し、及び（４）マイクロベシクルをカプセル化する工程を含んでなる方法。
【請求項２】
提供される血液が、ヒト、豚又は牛から集められるものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血液から分離する血漿の液体体積が１０〜４０％である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
マイクロベシクルがエクソソームである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
分離した血漿からエクソソームの溶液を分離する工程を、濾過を介して行い、これによって、エクソソームの溶液をフィルターによって保持する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
濾過を、３０〜１００ｋダルトンフィルターによって行う請求項５に記載の方法。
【請求項７】
フィルターが５０〜８０ｋダルトンフィルターである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
分離した血漿からエクソソームの溶液を分離する工程を、遠心分離を介して行う請求項４に記載の方法。
【請求項９】
血漿から抽出するエクソソームの液体体積が０．５〜４０％である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
血漿から抽出するエクソソームの液体体積が２０〜３０％である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
エクソソーム溶液を１００〜１．０％で希釈する請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
エクソソーム溶液を１５〜５％で希釈する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
エクソソームをカプセル化する工程を水ビーズ送達によって行う請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
エクソソームをカプセル化する工程をアルギネートビーズ送達によって行う請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
エクソソームをカプセル化する工程をスプレー乾燥ビーズ形成によって行う請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
エクソソームをカプセル化する工程をプレーティング送達によって行う請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
さらに、カプセル化したエクソソームを基礎物質と組み合わせる工程を含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
基礎物質がバイオマトリックスゲルである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
カプセル化したエクソソーム及び基礎物質の組み合わせを、所定の物質でコーティングする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
さらに、上記工程を行う際の温度を、界面活性剤にさらすことを制限することによって制御する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ａ．血液から分離される血漿の液体積が１０〜４０％であり、
ｂ．マイクロベシクルがエクソソームであり、
ｃ．分離した血漿からエクソソームの溶液を分離する工程を、濾過又は遠心分離によって行い、
ｄ．血漿から抽出するエクソソームの液体体積が０．５〜４０％であり、
ｅ．エクソソーム溶液を１５〜５％で希釈し、
ｆ．エクソソームをカプセル化する工程を、水ビーズ送達、スプレー乾燥ビーズ形成、又はプレーティング送達によって行う
請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
ａ．カプセル化したエクソソーム、及び
ｂ．キャリヤー
を含んでなるカプセル化したエクソソームを含む組成物。
【請求項２３】
カプセル化したエクソソームが、血小板エクソソーム物質を含むコア、及びカプセル化材料を含んでなるものである請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
カプセル化材料が、コアと接触しかつ包囲する疎水性粒子の少なくとも１つの層である請求項２３に記載の成物。
【請求項２５】
ａ．カプセル化したエクソソームが、血小板エクソソーム物質を含むコア、及びカプセル化材料を含んでなるものであり、
ｂ．エクソソームが血漿から分離され、
ｃ．カプセル化材料が、コアと接触しかつ包囲する疎水性粒子の少なくとも１つの層であり、水ビーズ送達、アルギネートビーズ送達、スプレー乾燥ビーズ形成又はプレーティング送達によって形成され、及び
ｄ．キャリヤーがバイオマトリックスゲルである
請求項２２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、バイオテクノロジーシステム、装置、組成物及び方法に関する。詳しくは、本発明は、心臓病、皮膚病、外科、傷ケア、及び全ての回復ヘルスケアの用途において使用されるヒト再生医学及び医療に関する。最も詳しくは、本発明は、カプセル化したエクソソーム、エクソソームをカプセル化する装置、エクソソームをカプセル化する方法、及びカプセル化したエクソソームを上記の分野で使用する方法に関する。本発明のシステム、装置、組成物及び方法は、獣医学及び化粧品組成物及び方法を含む他の分野（ただし、これらに限定されない）においても有用であると考えらえる。
【背景技術】
【０００２】
再生医学的治療及び方法は、心臓病、皮膚病、手術、傷ケア、及び他の医療及び外科の分野において、病気及び他の状態を治療することに関して大いなる可能性を有している。これらの方法は、血液及び他の幹細胞を含むヒト又は動物の各種の細胞からの物質を利用する。エクソソームは、血液を含む多くの体液中に存在する小ベシクル（脂質二重膜によって封入された液からなる細胞内の小型構造体）である（図１参照）。エクソソームは、代表的には、直径３０〜１００ｎｍを有する。エクソソームは、リボ核酸（ＲＮＡ）、タンパク質、脂質及び各種の代謝物を含有する。エクソソームは、凝固作用、細胞内シグナル伝達、及び老廃物管理において役割を果たしていることが明らかである。エクソソームは、潜在的に、病気の経過予想、薬物療法のために、又はバイオマーカーとして使用されると考えられている。
【０００３】
血小板エクソソームは、血小板（直径約２〜３μｍの哺乳類血液細胞）が各種の手段で物理的に破壊された際に存在する。図２を参照して、血小板は、出血を止めるように機能することがよく知られている（凝血作用及び止血）。しかし、血小板は、組織再生、コラーゲン基質形成、骨密度、血管新生、除痛、炎症最小化、及びヒト又は他の動物における総合的な治癒を増大させるため、一般的に、組織の治癒において広範な役割を果たすと考えられる。本発明は、傷害された組織を再生、補修又は回復させるために及び他の生物学的、医療、化粧、又は消毒を目的として、カプセル化したベシクル、特に、カプセル化したエクソソーム、最も詳しくは、カプセル化した血小板エクソソームを使用することを含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
この分野において存在する技術は、重大な制限及び欠点を有すると考えられる。
【０００５】
この出願のどこかで述べる全ての米国特許及び特許出願、及び他の公開されたドキュメントを、参照して、ここに含める。
【０００６】
本発明は、カプセル化したエクソソーム又は他の小ベシクル（以下、「ベシクル」又は「マイクロベシクル」）、カプセル化装置、エクソソーム又は他のベシクルをカプセル化する方法、及び効果的、安全、実用的、信頼できる、及び効率的であり、しかも従来の技術を凌駕する改善を構成すると考えられるカプセル化したエクソソーム又は小ベシクルを使用する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の態様では、本発明は、エクソソーム又は他のベシクルをカプセル化する方法であって、（１）血液を集め、（２）集めた血液から血漿を分離し、（３）そこから、エクソソームを含む溶液を分離し、及び（４）エクソソーム又は他のベシクルをカプセル化する工程を含んでなる方法に係る。
【０００８】
第２の態様では、第１の工程で集める血液が、ヒトから集められるものである。
【０００９】
第３の態様では、第１の工程で集める血液が、豚、牛、羊等からなる群から集められるものである。
【００１０】
第４の態様では、第１の工程で集めた血液から集める血漿の液体体積が、０．５〜５０％、好ましくは３〜４５％、最も好ましくは１０〜４０％である。
【００１１】
第５の態様では、第１の態様における分離した血漿からエクソソーム又は他のベシクルを分離する工程を、濾過又は遠心分離を介して行う。
【００１２】
第６の態様では、第５の態様の濾過工程を、３０〜１００ｋダルトンフィルター、好ましくは５０〜１００ｋダルトンフィルター、最も好ましくは５０〜８０ｋダルトンフィルターによって行い、ここで、フィルターによって保持される物質は、所望のエクソソームを含有する。
【００１３】
第７の態様では、第１の態様における血漿から抽出するエクソソームの液体体積が、０．５〜４０％、好ましく１５〜３５％、最も好ましくは２０〜３０％である。
【００１４】
第８の態様では、第１の態様に由来のエクソソーム溶液を、好ましくは１００〜１．０％、好ましくは２５〜２．５％、最も好ましくは１５〜５％に希釈する。
【００１５】
第９の態様では、第１の態様のエクソソームをカプセル化する工程が、水ビーズ送達を含む。
【００１６】
第１０の態様では、第１の態様のエクソソームをカプセル化する工程が、アルギネートビーズ送達を含む。
【００１７】
第１１の態様では、第１の態様のエクソソームをカプセル化する工程が、スプレー乾燥ビーズ形成を含む。
【００１８】
第１２の態様では、第１の態様のエクソソームをカプセル化する工程が、プレーティング送達を含む。
【００１９】
第１３の態様では、第１の態様が、さらに、カプセル化したエクソソームを生物学的標的に送達する工程を含む。
【００２０】
第１４の態様では、第１３の態様における送達工程が、心臓、骨又は関節、創傷、及び皮膚、又は他の臓器又は組織からなる群から選ばれる標的に送達することを含む。
【００２１】
第１５の態様では、本発明は、上述の工程を実施する際の温度を、界面活性剤にさらすことを制限することによって制御する工程を含む。
【００２２】
第１６の態様では、本発明は、（１）カプセル化したエクソソームを提供する工程及び（２）カプセル化したエクソソームを、身体、組織又は臓器の標的領域に送達する工程を含む治療方法を提供する。
【００２３】
第１７の態様では、本発明は、（１）血液を集め、（２）集めた血液から血漿を分離し、（３）そこから、エクソソームを含む溶液を分離し、及び（４）エクソソームをカプセル化する工程を含んでなる方法によって製造されたカプセル化したエクソソームを提供する。
【００２４】
第１８の態様では、本発明は、（１）血小板エクソソーム物質を含むコアと、（２）カプセル化材料とを含むカプセル化したエクソソーム又は他のベシクルを提供する。
【００２５】
本発明は、予測を超える結果を生ずるように新規な様式で組み合わせた新規な要素を含むものであると考えられる。
【００２６】
本発明の態様、特徴、利点、利益及び目的は、下記の記載、特許請求の範囲及び図面を参照することによって、当業者には、明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ベシクル及びエクソソームを含む細胞を一般的に示す図である。
【図２】血液成分及び血小板を一般的に示す図である。
【図３】カプセル化したエクソソームの調製に係る発明の好適な具体例を示すチャートである。
【図４】カプセル化の水ビーズ法の具体例を示すフローチャートである。
【図５】カプセル化したエクソソームを生物学的標的に送達する方法の好適な具体例を示すフローチャートである。
【図６】血小板を分画する方法の好適な具体例に関するフローチャートである。
【図７】血小板を凍結乾燥する方法の好適な具体例に関するフローチャートである。
【図８】バイオマトリックスゲルを形成する方法の好適な具体例に関するフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、エクソソームを集め、精製し、カプセル化し及び送達するためのシステム、装置、方法及び組成物を含む。本発明の対象であるエクソソームは、直径約３０〜１００ｎｍである。興味深いエクソソームを、血小板に富む溶液から回収し、続いて、血小板を物理的に破壊する。傷害された組織の再生及び修復についてのエクソソームの使用効率の有意な指示が明らかにされているが、エクソソームの取り扱い及び加工、及び送達は、これまで、不明であった。
【００２９】
本発明の方法の具体例は、（１）血液を集め、（２）集めた血液から血漿を分離し、及び（３）ここから、エクソソームを含む溶液を分離し、（４）エクソソームをカプセル化し、及び（５）エクソソームを送達する工程を含む。血液を集める工程は、下記に詳述するように、ヒト又は他の動物から血液を得ることを含む。血漿を分離する工程は、いくつかの公知の手段によって行われる。第３の工程において単離したエクソソームの分画は、容易に達成され、濾過、遠心分離、又は他の手段を介して濃縮される。濾過が使用される場合、フィルターによって保持される物質は、所望のエクソソームフラクションを含有する。例示的なフィルターは、５０ｋドルトンフィルターである。３０〜１００ｋドルトンフィルターを使用することもできる。５０〜１００ｋドルトンフィルターが好ましく、５０〜８０ｋドルトンフィルターが最も好ましい。或いは、タンジェント流濾過を使用できる。例示的な収率（液体体積基準）は、各工程について、それぞれ、１０〜４０％及び２０〜３０％である。血漿の分離効率は、０．５〜５０％であり、３〜４５％が好ましく、１０〜４０％が最も好ましい。
【００３０】
エクソソーム／ベシクルの分離効率は、０．５〜４０％であり、１５〜３５％が好ましく、２０〜３０％が最も好ましい。得られたエクソソーム溶液は、蜂蜜の粘稠度を有する。方法の更なる具体例では、エクソソーム溶液を、カプセル化前に、目的の用途のために、例えば、約２０倍に希釈する。希釈率は１００〜１．０％であり、２５〜２．５％が好ましく、１５〜５％が最も好ましい。各種の源から血漿を得ることも、本発明の範囲内に含まれる。さらに、加工した血漿、例えば、脱クリオ血漿を使用することもできる。
【００３１】
エクソソーム及び有効成分であるそれらのタンパク質ペイロードは、３８℃を越える温度に対して敏感であると考えられる。故に、方法の更なる具体例は、エクソソームを維持する温度を４０〜１５０℃に制御することを含む。エクソソームの構造は、リン脂質二重膜構造であり、本発明の物質の加工及び取り扱いの間における界面活性剤の使用も注意深く制御される。無菌条件下では、エクソソームは安定であり、室温において保存する場合６か月後も活性を維持しており、このように、本発明の物質を保存する間、好ましくは、温度を制御する。
【００３２】
方法では、続いて、（４）エクソソームをカプセル化する工程、及び（５）生物学的活性の損失を最少にするとともに、いくつかの所望の粒径及び放出プロフィールを提供しつつ、カプセル化したエクソソームを、身体、臓器又は組織の所望の領域に送達する工程を含む。さらに、エクソソームの取り扱い及び送達のこれらの工程は、本発明以前では、未知であったと考えられる。この目標を達成するため、本発明は、工程（３）において、好ましくは希釈前に、工程（３）において生成したエクソソームの濃縮物又は「血小板ハニー」の原料をカプセル化及び送達する少なくとも３つの方法（Ａ、Ｂ及びＣ）を提供する。各カプセル化／送達方法において、キャリヤー物質、エクソソームの濃縮及び負荷、及び仕上がり物質の最終粒径のような各種のパラメーターが開示される。生成された最終組成物は、アクティブ荷重、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）、光学顕微鏡、熱重量分析（ＴＧＡ）、粒径分布、比重等のような方法によって特徴付けられる。他の特徴付け方法が存在すること、及びインビボ細胞増殖を促進する能力及び予め定義された棚寿命を超える前臨床性能のような特性も含まれることは本発明の範囲内である。
【００３３】
具体例Ａ：水ビーズ法
エクソソームをカプセル化する第１の方法は、水を含むものであり、水溶液の個々の液滴を安定化させるために、疎水性ヒュームドシリカを使用する。この方法は、米国特許第６４１３５４８号（発明の名称：液体ビーズの粒子カプセル化；ＡＶＥＫＡ，Ｉｎｃ．，米国ミネソタ州ウッドバリー）に記載されている。この特許を、参照して、ここに含める。一般に、このタイプのビーズを形成する方法は、水溶液の疎水性ヒュームドシリカのクラウドへの微粒化を含む。シリカは液滴を被覆して、小滴が集められる際、小滴を癒着から安定化させる。この方法は、パーソナルケア工業のために、ヘアケア製品としての使用に関して商業化されている。代表的には、得られるビーズは、直径３０〜１００ミクロン、８５％水溶液であり、閉止容器中、室温において、２年間以上安定である。
マイクロベシクルをカプセル化するこの方法のサブステップの特別な１具体例は、概して、体積加重平均粒径０．０５〜２５μｍを有する疎水性粒子の塊を供給し、粒子の塊に水性エクソソーム媒体の滴を供給し、及び水性エクソソーム媒体の微小滴及び疎水性粒子を穏やかに混合して、粒子のシェルによってカプセル化した、水性エクソソーム媒体の滴の安定な封入体システムを形成することを含む。
【００３４】
得られるカプル化したマイクロベシクルの１具体例は、所定の質量％（たとえば、少なくとも５％）の水を有する水性の血小板エクソソームを含むコア、及びコアを包囲する封入体を含む。カプセル化材料は、コアと接触しかつ包囲する疎水性粒子の少なくとも１つの層を含む。カプセル化したマイクロベシクルは、体積加重平均粒径を有する。例示的な粒径は０．０５〜２５μｍである。マイクロベシクルについての１形状は球形である。１具体例では、カプセル化したマイクロベシクルは、それ自体の質量を支持できる。
【００３５】
［実施例］
血小板ハニー及び不足量の物質を使用して、少量の（〜２０ｍｌ）各処方サンプルを得る。血小板ハニーは、治療用処方の範囲内で、そのままで使用される。好ましくは、希釈することによって、効率的な微粒化、溶液又は最終製品の微生物汚染を回避するための物質取り扱い、及び最終プロセスの代表である小型サンプルの生成を可能する方法のスケールダウンを可能にする。得られる物質は、生物学的に活性なバイオマトリックスゲルとしての潜在的な使用と並行して、局所的用途（創傷を含む）に適用可能である。
【００３６】
具体例Ｂ：アルギネートビーズ法
アルギネートは、真昆布オオウキモ（Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ｐｙｒｉｆｅｒａ）のような海藻から抽出される多糖類親水コロイドである。アルギン酸のナトリウム共役塩基型は水溶性であり、カルシウム、アルミニウム、又は多くの他の多価カチオンの存在下で固体ゲルを形成する。
【００３７】
［実施例］
アルギン酸ナトリウムの１〜４重量％水溶液（ここで、エクソソームが溶液の一部である）を調製し、該アルギネート溶液を、第２の塩化カルシウム溶液に滴下すると、直ちに、カルシウムイオン浴に滴下される際の滴の形状及びサイズのビーズが形成する。滴のサイズ、カルシウムイオン濃度、及び浴における時間を制御することによって、粒径及び粒子からのエクソソームの放出プロフィールの両方を制御する。各種のエクソソーム負荷及び粒径分布を有する多数のサンプルが生成される。
【００３８】
具体例Ｃ：スプレー乾燥ビーズ形成
スプレー乾燥は、溶液を微粒化するか、又は加熱チャンバーに噴霧することによって乾燥する方法である。滴は、壁に到達する以前に乾燥する。これは、カプセル化した物質を生成するための最もコスト的に効果的な方法であるが、物質の温度が３８℃以上に上昇する可能性がある。希釈及び濃縮したエクソソーム物質へのアジュバントの添加は、微粒化を可能にし、これによって、マイクロカプセル化用のこの効果的なアプローチを利用するため、風を提供する。最後に、スプレードライヤーの出口温度を最小に維持することによって、このアプローチは、増大されたエクソソームの安定性を提供すると考えられる。代表的には、このタイプの方法に関する粒径は、約１５〜７５μｍである。方法のパラメーターを注意深く制御すると、平均粒径１０μｍより小を有する粒径分布が得られる。水分含量は制御される。１例は、米国特許第８７４１３３７号に開示された方法を介する、カプセル等を有する水中に分散された希釈血小板ハニーである。
【００３９】
具体例Ｄ：プレーティング法
プレーティングは、粉末粒子状態を維持する間、多量の液体を吸収できる多孔性の特殊な物質を使用するカプセル化及び送達システムである。この技術の１つの利点は、例えば、室温又は他の制御された温度において実施されることである。このような技術は、乾燥状態等の食品、栄養補助測品、医薬用液体のカプセル化及び送達について一般的であるが、これまでは、エクソソームのカプセル化については知られていなかった。この具体例では、本発明の方法は、マイクロカプセル化を最適化するために、単糖、加工デンプン、マルトデキストリン、多孔性シリカ、炭酸カルシウム等のキャリヤー物質を使用する。方法は、負荷及び効力を最大にするように変更可能である。これらの物質、及び先の実施例における物質は、棚寿命及び／又は送達速度を有効なものとするためにコーティングされてもよい。
【００４０】
［実施例Ａ］
希釈していない「血小板ハニー」２ｃｃを取り、Ｈｕｒｂｅｒ  Ｚｅｏｆｒｅｅ（登録商標）５１６２シリカ１ｇに含侵させた。これは、ＦｌａｃｋＴｅｋ  Ｓｐｅｅｄｍｉｘｅｒ（商標名）ＤＡＣ１５０を２０００ｒｐｍ及び２０秒間で使用し、希釈していない「血小板ハニー」が十分にシリカに含侵されるまで繰り返し操作することによって達成される。物質の温度を測定し、混合の間、３５℃以下に維持する。
【００４１】
［実施例Ｂ］
希釈した「血小板ハニー」２ｃｃを取り、Ｈｕｒｂｅｒ  Ｚｅｏｆｒｅｅ（登録商標）５１６２シリカ１ｇに含侵させた。これは、ＦｌａｃｋＴｅｋ  Ｓｐｅｅｄｍｉｘｅｒ（商標名）ＤＡＣ１５０を２０００ｒｐｍ及び２０秒間で使用し、希釈した「血小板ハニー」が十分にシリカに含侵されるまで繰り返し操作することによって達成される。物質の温度を測定し、混合の間、３５℃以下に維持する。
【００４２】
本発明は、血小板エクソソームを経済的に分離する方法も提供する。本発明のエクソソームは、ヒト血液から集められる。適切なエクソソームについて集められ及び分離された豚又は牛の血漿からも同様の結果が得られると考えられる。抽出の方法は、同様であるが、これらの源からの多量の血液の利用は、ヒト血漿では容易に達成できないスケーラビリティーを提供する。
【００４３】
図３は、要約すると、本発明のカプセル化したエクソソームを形成する方法（１０）の具体例を示す。初めに、血液を集める（１１）。次に、血液から血漿を分離する（１２）。液体体積収率は１０〜４０％である。ついで、好ましくは、血小板の物理的崩壊及び続くフィルター、最も好ましくは５０ｋドルトンフィルターを介する分離によって、血漿からエクソソームを分離する（１３）。この工程において、液体体積収率は約２０〜３０％である。単離されたエクソソームのサイズは、約３０〜１００ｎｍである。次に、エクソソームをカプセル化する（１４）。カプセル化（１４）は、図４のフローチャートにおいて示す水ビーズ法（２０）によって達成される。これは、所定のプロフィールの疎水性粒子を提供することを含む（２１）。エクソソームの溶液も提供される（２２）。最後に、エクソソーム及び粒子を混合する（２３）。
【００４４】
図５は、治療又は他の目的のため、カプセル化したエクソソームを標的に送達する方法を示す。初めに、カプセル化したエクソソームは、図１において示し、上述した方法（１０）によって提供される。次に、カプセル化したエクソソームを、標的に送達する（３１）。
【００４５】
この技術は、臨床、化粧品及び獣医学用用途について有用であると考えられる。詳しくは、これらの物質は、動物／ペット、ヒトへの適用について、化粧品分野、創傷被覆の用途における局所的適用、及び損傷した心臓又は他の組織への直接注入に有用である。さらに、精製したナノベシクル／エクソソームフラクションは、繊維筋性、骨原性、軟骨形成、脂肪生成、又は他の再生用のバイオマトリックスゲルとして使用される。このように、技術プラットフォームは、大腸／婦人科の手術（瘻孔、非治癒性びらん、骨盤内臓器脱）、ＥＮＴ法（放射線骨壊死）、形成外科／創傷治癒（傷跡の制限、迅速な治癒、非治癒性創傷）、整形外科的処置（偽関節、無血性壊死）用の生分解性メッシュと複合化される。これらの各用途は、異なった送達関係を呈する。同様に、創傷適用及び直接注入適用は、数日以上６か月以下の、一様のゆっくりとした送達を必要とする。
【００４６】
図８を参照すると、本発明は、さらに、バイオマトリックスゲルを調製する方法を提供する。方法の１具体例は、次のとおりである。
１．血小板成分の単離（エクソソーム及び／又は約３０〜５０ｋＤカットオフを介する）に続いて、この成分を、後述のプロトコルにおいて設定した濃度範囲のトレハロースとともに、コラーゲン溶液に混合する。
２．ついで、ＮａＯＨの添加を介して、この溶液を中和して、生理的ｐＨとする。最終体積を記録する。
３．完全に凍結するまで、液体窒素で、溶液を直ちにフレッシュ凍結する。
４．溶液を、直ちに、−８０℃において、少なくとも２４時間保存する。
５．ついで、全ての水分が除去されるまで、これを凍結乾燥する。粉末状物質が形成される。
６．粉末を−８０℃で保存できる。
７．工程２において記録した体積での添加によって、粉末を、水又は細胞培養培地中に再懸濁化できる。
８．ついで、ゲル化のため、この物質を３７℃において保存する。
９．３０分後、生成物は完全にゲル化している。
【００４７】
好ましくは、上記工程の各々を、不完全なゲル化を防止するため、氷中のサンプルを使用して行う。
【００４８】
図６を参照すると、本発明は、血小板を分画する方法を提供する。この方法の１具体例は、下記の工程を含む。
１．全血を集める。
２．少なくとも１５００ｒｐｍ、少なくとも１５分間、全血を遠心分離する（或いは、全血を４℃で保存して、ＲＢＣを少なくとも４時間沈殿させる）。
３．血小板欠乏血漿（上澄みの約２／３）を除去し、上澄みの残りの１／３を単離する。
４．血小板リッチ血漿を、液体窒素中でフラッシュ凍結し、−８０℃において少なくとも２４時間保存する。
５．血小板リッチ血漿を、水浴中、２５〜３７℃の間の温度において解凍させ、好ましくは、凍結−解凍サイクルを繰り返す。
６．解凍したＰＬを、５００ｇで１０分間遠心分離する。
７．上澄みを集め、ペレットを廃棄する。
８．意図的にブランクを捨てる。
９．上澄みを、７０μｍフィルターを通過させ、集める。
１０．先の工程の収集物を、４０μｍフィルターを通過させる。
１１．先の工程の収集物を、０．２μｍフィルターを通して濾過する。
１２．通過画分を集め、３０又は５０ｋＤカットオフを介して血小板の分画を行う。ここでは、これらの値を超えるものすべてを集め、それ以下のものを廃棄する。
１３．遠心分離を介して３０又は５０ｋＤカットオフを行う。この工程では、遠心分離機の設定は、フィルターに応じて変動する。所望の生成物の体積が、初期インプット体積よりも少なくとも５倍少なくなった時点で遠心分離を停止する。
１４．単離物は蜂蜜様の粘稠度を有しており、これを、（ａ）長期間の保存のため−８０℃で直接凍結する、（ｂ）使用のため、４℃で保存する、又は（ｃ）微粒子化のため凍結乾燥する。
【００４９】
図７を参照すると、本発明は、さらに、血小板を凍結乾燥する方法を提供する。方法の１具体例は、次のとおりである。
１．上記工程１２の前に、工程１３の内容物を、トレハロースの５〜６０％溶液と混合し、
２．上記工程１３、
３．工程１３からの単離物を、液体窒素中でフラッシュ凍結し、−８０℃において少なくとも２４時間保存し、
４．内容物を一夜凍結乾燥し、及び
５．凍結乾燥した物質を−８０℃で保存する。
【００５０】
エクソソームに関連して、システム、組成物及び方法を、ここに記載したが、技術を他のベシクルに適用することも本発明の範囲内である。
【００５１】
当業者が本発明及びそれを製造及び使用する様式及び方法を理解することができるように、上記具体例を選択し、記載し及び説明した。記載及び添付図面は、例示的なものであり、徹底的な又は限定されたものではないと解釈されなければならない。本発明は、開示された正確な形式に限定されるものではない。本願は、合理的に予測可能な本発明の具体例の全てを開示することを試みるものではあるが、等価物として残る予測できない想像上の変形も存在するであろう。特許請求の範囲によって限定されるように本発明の範囲に属するが、ここに開示した具体例以外の具体例も存在することは、当業者によって理解されなければならない。もしあれば、請求項が特定の機能を発揮する手段又は工程として表わされている場合には、このような請求項は、明細書に記載の対応する構造、物質、又は作用及びその等価物（構造的等価物及び等価の構造の両方、物質的等価物及び等価の物質の両方、及び作用的等価物及び等価の作用の両方を含む）を包含すると解釈されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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