(57)【要約】本開示は、疾患の処置における使用のための、ＣＤ３εおよびＢＣＭＡに対する二特異性抗体に関する。本開示は、このような処置に対する患者の応答性を決定する方法を提供し、診断アッセイに関する。この二特異性抗体は、多発性骨髄腫疾患を患う患者の処置における使用のために、ヒトＢ細胞成熟抗原の細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３εに特異的に結合し、前記疾患が、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む前記患者の単離された体液試料において、前記二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるのＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用することによって測定される、前記ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞におけるＢＣＭＡ発現が、相対蛍光強度中央値または平均蛍光強度ＭＦＩとして決定されるベースラインを、８０またはそれ超上回ることを特徴とし得る。
2018508462.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多発性骨髄腫疾患を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢ細胞成熟抗原（さらにまた、「ＢＣＭＡ」とも称する）の細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）に特異的に結合する二特異性抗体であって、前記疾患が、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む前記患者の単離された体液試料において、前記二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用することによって測定される、前記ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞におけるＢＣＭＡ発現が、相対蛍光強度中央値または平均蛍光強度ＭＦＩとして決定されるベースラインを、８０またはそれ超上回ることを特徴とする二特異性抗体。
【請求項２】
多発性骨髄腫疾患を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記疾患が、前記患者の単離された体液試料において、標的細胞に対するＴ細胞（エフェクター細胞）の比（Ｅ：Ｔ比）が、０．３５：１またはそれより高いことを特徴とする二特異性抗体。
【請求項３】
前記Ｅ：Ｔ比が、０．３５：１〜２２：１であることを特徴とする、請求項２に記載の使用のための二特異性抗体。
【請求項４】
多発性骨髄腫疾患を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記疾患が、前記患者由来の単離された体液試料において、可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高く、前記患者試料における前記可溶性ＢＣＭＡが、前記二特異性抗体に特異的に結合することを特徴とし、前記二特異性抗体による前記患者の前記処置が、１．５倍から最大１０倍である１週間当たりの用量で行われるか、または／および用量投与間の時間間隔が、標準用量と比較して、１週間に１回投与から最大１日に１回までに短縮されることを特徴とする二特異性抗体。
【請求項５】
前記二特異性抗体による前記患者の前記処置が、標準用量と比較して、１．５倍から最大２．０倍である１週間当たりの用量で行われることを特徴とする、請求項４に記載の使用のための二特異性抗体。
【請求項６】
前記二特異性抗体による前記患者の前記処置が、用量投与間の時間間隔が前記標準用量と比較して、１週間に１回投与から最大１週間に２回まで短縮されて行われることを特徴とする、請求項４に記載の使用のための二特異性抗体。
【請求項７】
多発性骨髄腫疾患を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢＣＭＡ受容体への結合に関して可溶性ＢＣＭＡと競合するか、そして／またはＮＦ−κＢのＡＰＲＩＬ媒介性活性化を遮断する、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記疾患が、前記患者由来の単離された体液試料において、ＡＰＲＩＬの量が、１０ｎｇ／ｍＬよりも高く、最大１００ｎｇ／ｍＬであることを特徴とし、前記二特異性抗体による前記患者の前記処置が、１週間につき、１．５倍から最大２０倍の用量で行われる、または／および用量投与間の時間間隔が、標準用量と比較して、１週間に１回投与から最大１日に１回までに短縮されることを特徴とする二特異性抗体。
【請求項８】
前記二特異性抗体による前記患者の前記処置が、標準用量と比較して、１．５倍から最大３．０倍である１週間当たりの用量で行われることを特徴とする、請求項７に記載の使用のための二特異性抗体。
【請求項９】
前記二特異性抗体による前記患者の前記処置が、用量投与間の時間間隔が、前記標準用量と比較して、１週間に１回投与から最大１週間に３回までに短縮されて行われることを特徴とする、請求項７に記載の使用のための二特異性抗体。
【請求項１０】
ヒトＢＣＭＡ受容体への結合に関して可溶性ＢＣＭＡと競合する、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記抗体がＢＣＭＡへの結合に関してＡＰＲＩＬと競合し、それによって前記抗体が、ＢＣＭＡへの結合に関してＡＰＲＩＬと競合するか、そして／またはＮＦ−κＢのＡＰＲＩＬ媒介性活性化を遮断する、多発性骨髄腫疾患を患う患者の処置における使用のための二特異性抗体であり、前記疾患が、形質細胞およびＴ細胞を含む前記患者の単離された体液試料において、ＡＰＲＩＬの量が、少なくとも１００ｎｇ／ｍＬから最大１０００ｎｇ／ｍＬであることを特徴とし、前記二特異性抗体による前記患者の前記処置が、１．５倍から最大８０倍の用量により行われるか、または／および用量投与間の時間間隔が、標準用量と比較して、１週間に１回投与から最大１日に１回までに短縮されることを特徴とする二特異性抗体。
【請求項１１】
前記二特異性抗体による前記患者の前記処置が、標準用量と比較して、１．５倍から最大１０倍である１週間当たりの用量で行われることを特徴とする、請求項１０に記載の使用のための二特異性抗体。
【請求項１２】
前記二特異性抗体による前記患者の前記処置が、用量投与間の時間間隔が、前記標準用量と比較して、１週間に１回投与から最大１日に１回までに短縮されて行われることを特徴とする、請求項１０に記載の使用のための二特異性抗体。
【請求項１３】
形質細胞が関与する障害を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３に特異的に結合する二特異性抗体であって、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む前記患者の単離された体液試料において、前記二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用することによって測定される、前記ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞におけるＢＣＭＡ発現が、相対蛍光強度中央値または平均蛍光強度ＭＦＩとして決定されるベースラインを、８０またはそれ超上回る二特異性抗体。
【請求項１４】
前記二特異性抗体が、その重鎖および軽鎖ＣＤＲとして、前記抗ＢＣＭＡ抗体と同じアミノ酸配列のＣＤＲを含むことを特徴とする、請求項１から１３のいずれか一項に記載の使用のための二特異性抗体。
【請求項１５】
形質細胞が関与する障害を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記患者の単離された体液試料において、標的細胞に対するＴ細胞（エフェクター細胞）の比（Ｅ：Ｔ比）が、０．３５：１〜２２：１である二特異性抗体。
【請求項１６】
形質細胞が関与する障害を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記処置が、
ｉ）前記患者から、体液試料を単離するステップと、
ｉｉ）前記試料における可溶性ＢＣＭＡの量を測定するステップと、
ｉｉｉ）前記試料における可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い場合、また、
ｉｖ）前記患者試料における前記可溶性ＢＣＭＡが、前記二特異性抗体に特異的に結合する場合、標準用量と比較して、１．５〜１０倍もしくは１．５〜２．０倍である毎週の用量、および／または１週間に１回投与から１週間に２回もしくはさらには１週間に３回もしくは１日に１回へと短縮された用量投与間の時間間隔で、前記二特異性抗体により前記患者を処置するステップと
を連続的に含む二特異性抗体。
【請求項１７】
ヒトＢＣＭＡ受容体への結合に関して可溶性ＢＣＭＡと競合する、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記抗体が、ＢＣＭＡへの結合に関してＡＰＲＩＬと競合するか、そして／またはＮＦ−κＢのＡＰＲＩＬ媒介性活性化を遮断する、形質細胞が関与する障害を患う患者の処置における使用のための二特異性抗体であり、前記処置が、
ｉ）前記患者から、形質細胞およびＴ細胞を含む体液試料を単離するステップと、
ｉｉ）ＥＬＩＳＡ方法の使用により、前記試料におけるＡＰＲＩＬの量を測定するステップと、
ｉｉｉ）前記患者試料におけるＡＰＲＩＬの量が、１０ｎｇ／ｍＬを下回る可溶性ＡＰＲＩＬ濃度を有する患者に推奨される用量と比較して、１０ｎｇ／ｍＬよりも高く、最大１００ｎｇ／ｍＬである場合は２倍高い毎週の用量で、ＡＰＲＩＬ濃度が、１０００ｎｇ／ｍＬまで増大する場合は最大８０倍高いさらに増大された用量で前記二特異性抗体により前記患者を処置するステップ、またはより高い前記用量に達するようにそれぞれのより高頻度の処置スケジュールにより、前記二特異性抗体のいずれか２用量間のより短い期間で前記患者を処置するステップと
を連続的に含む二特異性抗体。
【請求項１８】
形質細胞が関与する障害を患う患者のＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む単離された体液試料におけるＢＣＭＡタンパク質発現を決定する方法であって、前記患者の処置における使用に意図される、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用することによって、前記ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞におけるＢＣＭＡ発現を測定するステップと、相対蛍光強度中央値または平均蛍光強度ＭＦＩが、ベースラインを、８０またはそれ超上回るか否かを決定するステップを含む方法。
【請求項１９】
単離された体液試料における細胞表面ＢＣＭＡ発現を決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する治療用二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用して、前記ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞の相対蛍光強度中央値または平均蛍光強度ＭＦＩが、ベースラインを、８０またはそれ超上回るか否かを決定するステップを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項２０】
形質細胞が関与する障害を患う患者の単離された体液試料において、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比が、０．３５：１またはそれより高いか否かを決定するための方法。
【請求項２１】
形質細胞が関与する障害を患う患者の単離された体液試料において、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比が、０．３５：１またはそれより高いか否かを決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項２２】
形質細胞が関与する障害を患う患者のＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む単離された体液試料において、前記試料における可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか否かを決定する方法。
【請求項２３】
形質細胞が関与する障害を患う患者の単離された体液試料において、前記試料における可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか否かを決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項２４】
形質細胞が関与する障害を患う患者のＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む単離された体液試料において、前記試料における可溶性ＡＰＲＩＬの量が、８０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか否かを決定する方法。
【請求項２５】
細胞表面ＢＣＭＡ発現の決定に使用するためのキットであって、１種はＣＤ１３８に、１種はＣＤ３８に、１種はＣＤ１９に、１種は、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する治療用二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値で抗ＢＣＭＡ抗体に特異的に結合する、４種の標識抗体をあらかじめ充填したバイアルまたはチューブを含むキット。
【請求項２６】
Ｅ：Ｔ比の決定に使用するためのキットであって、１種はＣＤ１３８に、１種はＣＤ３８に、１種はＣＤ１９に、１種はＣＤ３に特異的に結合する、悪性ＰＣおよびＴ細胞を検出するための４種の標識抗体をあらかじめ充填したバイアルまたはチューブを含むキット。
【請求項２７】
可溶性ＢＣＭＡの決定に使用するためのキットであって、捕捉抗体としてのポリクローナル抗ＢＣＭＡ抗体と、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する治療用二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する検出抗ＢＣＭＡ抗体とを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患の処置における使用のための、ＣＤ３εおよびＢＣＭＡに対する二特異性抗体に関する。本発明は、このような処置に対する患者の応答を決定する方法、および関連する診断アッセイを提供する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ＢＣＭＡ；ＴＲ１７＿ＨＵＭＡＮ、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ０２２２３）としてもまた公知の、ヒトＢ細胞成熟標的は、分化した形質細胞内で優先的に発現する、腫瘍壊死受容体スーパーファミリーのメンバーである［Ｌａａｂｉら、１９９２年、Ｍａｄｒｙら、１９９８年］。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞の成熟、成長、および生存に関与する、非グリコシル化ＩＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＢＣＭＡは、ＴＮＦスーパーファミリーの２つのリガンド：ＢＣＭＡに対する高アフィニティーリガンドであるＡＰＲＩＬ（増殖誘導性リガンド）と、ＢＣＭＡに対する低アフィニティーリガンドであるＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）（ＴＨＡＮＫ、ＢｌｙＳ、Ｂリンパ球刺激因子、ＴＡＬＬ−１、およびｚＴＮＦ４）とに対する受容体である。ＡＰＲＩＬとＢＡＦＦとは、構造的類似性および重複を示すが、顕著に異なる受容体結合特異性も示す。また、負の調節因子ＴＡＣＩも、ＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬの両方に結合する。ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦの、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩへの協調した結合は、転写因子ＮＦ−κＢを活性化させ、生存促進性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー（例えば、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−１、Ａ１）の発現およびアポトーシス促進性因子（例えば、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍなど）の下方調節を増大させ、こうして、アポトーシスを阻害し、生存を促進する。この作用の組合せは、Ｂ細胞の分化、増殖、生存、および抗体産生を促進する（Ｒｉｃｋｅｒｔ  ＲＣら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ（２０１１年）、２４４巻（１号）：１１５〜１３３頁において総説されている）。
【０００３】
Ｎｏｖａｋ  ＡＪら、ＢＬＯＯＤ、１０３巻（２００４年）６８９〜６９４頁は、多発性骨髄腫細胞におけるＢＣＭＡ、ＴＡＣＩおよびＢＡＦＦ−Ｒの発現、ならびに成長の機構に関する。Ｌｉら、Ｍｅｄ  Ｏｎｃｏｌ、２７巻（２０１０年）４３９〜４４５頁は、ＢＣＭＡが、形質細胞において発現されることについて言及する。Ｄｉｓｐｅｎｚｉｅｒｉら、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒｏｃ、８２巻（３号）（２００７年）３２３〜３４１頁は、骨髄腫のＭａｙｏ層別化およびリスクに適合させた治療法（Ｍａｙｏ  Ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｅｌｏｍａ  ａｎｄ  Ｒｉｓｋ−Ａｄａｐｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ）（ｍＳＭＡＲＴ）に基づく多発性骨髄腫の処置に関する。Ｓｃｈａｕｍａｎｎ  Ｄ．（学位論文、Ｂｅｒｌｉｎ、２００６年）は、ＢＣＭＡが、長寿命形質細胞の生存に必須であることが判明したこと、また、長寿命形質細胞が、自己免疫疾患におけるエフェクター細胞であることを報告する。Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９巻（２００４年）９１〜９８頁も参照されたい。ＷＯ２０１２１４３４９８は、多発性骨髄腫（ＭＭ）患者の層別化のための方法に関する。ＷＯ２００９３２０５８は、個体が、全身性エリテマトーデスＳＬＥなど、自己免疫活性に関連する状態を有する見込みの予測に関する。
【０００４】
Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｅら、Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、１５８巻、７２７〜３８頁（２０１２年）およびＷＯ２０１４０８９３３５は、ＢＣＭＡ濃度が、多発性骨髄腫（ＭＭ）患者由来の培養骨髄単核細胞の上清において、健康な対象におけるよりも高かったことを報告し、血清ＢＣＭＡレベルが、ＭＭ患者の疾患状態および全生存をモニターするためのバイオマーカーとなりうることを示唆する。
【０００５】
Ｔリンパ球のＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、ガンマ（γ）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ゼータ（ζ）、およびイータ（η）と標識されるＣＤ３の不変サブユニットと共に、細胞表面において共発現する、ＴＣＲアルファ（α）／ベータ（β）ヘテロ二量体またはＴＣＲガンマ（γ）／デルタ（δ）ヘテロ二量体からなる。ヒトＣＤ３εは、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０７７６６（ＣＤ３Ｅ＿ＨＵＭＡＮ）下に記載されている。最先端技術において記載されている抗ＣＤ３ε抗体は、ＳＰ３４（Ｙａｎｇ  ＳＪ、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８６年）、１３７巻：１０９７〜１１００頁）である。ＳＰ３４は、霊長動物ＣＤ３およびヒトＣＤ３のいずれとも反応する。ＳＰ３４は、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから入手可能である。最先端技術において記載されている、さらなる抗ＣＤ３抗体は、ＵＣＨＴ−１（ＷＯ２００００４１４７４を参照されたい）である。最先端技術において記載されている、さらなる抗ＣＤ３抗体は、ＢＣ−３（Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ＧｖＨＤについてのフェーズＩ／ＩＩ試験において使用された；Ａｎａｓｅｔｔｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、５４巻：８４４頁（１９９２年））である。
【０００６】
最近では、例えば、ＩｇＧ抗体フォーマットと単鎖ドメインとの、例えば、融合によって、多種多様な組換え二特異性抗体フォーマットが開発されている（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＲＥ、ｍＡｂｓ、４巻：２号（２０１２年）、１〜１６頁を参照されたい）。
【０００７】
ＢＣＭＡに対する抗体については、例えば、Ｇｒａｓ  Ｍ−Ｐ．ら、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ.、７巻（１９９５年）、１０９３〜１１０６頁、ＷＯ２００１２４８１１、ＷＯ２００１２４８１２、ＷＯ２０１０１０４９４９およびＷＯ２０１２１６３８０５において記載されている。ＢＣＭＡに対する抗体、ならびにリンパ腫および多発性骨髄腫の処置のためのそれらの使用については、例えば、ＷＯ２００２０６６５１６およびＷＯ２０１０１０４９４９において言及されている。ＷＯ２０１３１５４７６０は、ＢＣＭＡ認識部分と、Ｔ細胞活性化部分とを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。Ｒｙａｎ，  ＭＣら、Ｍｏｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．６巻（２００７年）３００９〜３０１８頁は、形質細胞悪性腫瘍のためのＢＣＭＡのターゲティングおよび多発性骨髄腫細胞（ＭＭ細胞）の表面におけるＢＣＭＡの発現に関する。ＣＤ３およびＢＣＭＡに対する二特異性抗体は、ＷＯ２００７１１７６００、ＷＯ２００９１３２０５８、ＷＯ２０１２０６６０５８、ＷＯ２０１２１４３４９８およびＷＯ２０１３０７２４１５、ＷＯ２０１４１２２１４３およびＷＯ２０１４１２２１４４に言及されている。ＷＯ２０１３０７２４０６およびＷＯ２０１４１４０２４８は、いくつかの図面および実施例においてＥ：Ｔ比について言及する；しかし、それぞれの殺滅アッセイ実験において、１個の標的細胞（患者試料ではない細胞系）に対して１０個のエフェクター細胞が使用されたことが報告されているだけである。したがって、このＥ：Ｔ比は、人工的であり、骨髄腫患者骨髄試料におけるいかなるＥ：Ｔ比も示されなかったか、または抗体処置に対するＥ：Ｔ比の関係に関するいかなる暗示も為されなかった。
【０００８】
ＷＯ２０１２１４３４９８は、悪性Ｂ細胞が、それらの表面にＢＣＭＡタンパク質を発現する場合の、多発性骨髄腫（ＭＭ）患者の層別化、診断または抗体に基づく多発性骨髄腫（ＭＭ）治療法の選択のための方法について言及する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１４３４９８号
【特許文献２】国際公開第２００９／３２０５８号
【特許文献３】国際公開第２０１４／０８９３３５号
【特許文献４】国際公開第２０００／０４１４７４号
【特許文献５】国際公開第２００１／２４８１１号
【特許文献６】国際公開第２００１／２４８１２号
【特許文献７】国際公開第２０１０／１０４９４９号
【特許文献８】国際公開第２０１２／１６３８０５号
【特許文献９】国際公開第２００２／０６６５１６号
【特許文献１０】国際公開第２０１３／１５４７６０号
【特許文献１１】国際公開第２００７／１１７６００号
【特許文献１２】国際公開第２００９／１３２０５８号
【特許文献１３】国際公開第２０１２／０６６０５８号
【特許文献１４】国際公開第２０１３／０７２４１５号
【特許文献１５】国際公開第２０１４／１２２１４３号
【特許文献１６】国際公開第２０１４／１２２１４４号
【特許文献１７】国際公開第２０１３／０７２４０６号
【特許文献１８】国際公開第２０１４／１４０２４８号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｒｉｃｋｅｒｔ  ＲＣら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ（２０１１年）、２４４巻（１号）：１１５〜１３３頁
【非特許文献２】Ｎｏｖａｋ  ＡＪら、ＢＬＯＯＤ、１０３巻（２００４年）６８９〜６９４頁
【非特許文献３】Ｌｉら、Ｍｅｄ  Ｏｎｃｏｌ、２７巻（２０１０年）４３９〜４４５頁
【非特許文献４】Ｄｉｓｐｅｎｚｉｅｒｉら、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒｏｃ、８２巻（３号）（２００７年）３２３〜３４１頁
【非特許文献５】Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９巻（２００４年）９１〜９８頁
【非特許文献６】Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｅら、Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、１５８巻、７２７〜３８頁（２０１２年）
【非特許文献７】Ｙａｎｇ  ＳＪ、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８６年）、１３７巻：１０９７〜１１００頁
【非特許文献８】Ａｎａｓｅｔｔｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、５４巻：８４４頁（１９９２年）
【非特許文献９】Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＲＥ、ｍＡｂｓ、４巻：２号（２０１２年）、１〜１６頁
【非特許文献１０】Ｇｒａｓ  Ｍ−Ｐ．ら、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ.、７巻（１９９５年）、１０９３〜１１０６頁
【非特許文献１１】Ｒｙａｎ，  ＭＣら、Ｍｏｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．６巻（２００７年）３００９〜３０１８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
形質細胞が関与する障害を患う患者の治療法改善の必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
Ｔ細胞二特異性抗体は、標的細胞の近くで直接Ｔ細胞を活性化することにより、例えば標的細胞を有効に殺滅するための強力な化合物である。例えば、多発性骨髄腫細胞の場合は悪性形質細胞、または全身性エリテマトーデスもしくは関節リウマチの場合は抗核抗体分泌形質細胞の表面におけるＢＣＭＡに結合するＴ細胞二特異性抗体は、用量依存的にこれらの形質細胞を殺滅することができる。本発明者らは、形質細胞の殺滅に影響する特定のパラメータを認識した。そのようなパラメータは、適切なフローサイトメトリー法によって測定されるＢＣＭＡ発現の度合い、特定の濃度の可溶性ＢＣＭＡの存在、悪性形質細胞に対するＴ細胞の比、および特定の濃度の可溶性ＢＣＭＡリガンドであるＡＰＲＩＬの存在である。本発明者らの知見は、例えば、処置担当医師（複数可）が、個々の患者に対してＢＣＭＡ−Ｔ細胞二特異性抗体による治療法を目的に合わせるための重要なガイダンスを提供し、本発明者らの知見はまた、前記パラメータを測定するための検査キットの科学的基盤も提供する。
【００１３】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢＣＭＡ（さらにまた、「ＢＣＭＡ」とも称する）の細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）に特異的に結合する二特異性抗体であって、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む前記患者の単離された体液試料において、前記二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用することによって測定される、前記ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞におけるＢＣＭＡ発現が、相対蛍光強度中央値または平均蛍光強度ＭＦＩとして決定されるベースラインを、８０またはそれ超、好ましくは１００またはそれ超、好ましくは２００またはそれ超、さらにより好ましくは３００またはそれ超上回る二特異性抗体に関する。
【００１４】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３に特異的に結合する二特異性抗体であって、前記障害が、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む前記患者の単離された体液試料において、前記二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用することによって測定される、前記ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞におけるＢＣＭＡ発現が、相対蛍光強度中央値または平均蛍光強度ＭＦＩとして決定されるベースラインを、８０またはそれ超、好ましくは１００またはそれ超、好ましくは２００またはそれ超、さらにより好ましくは３００またはそれ超上回ることを特徴とする二特異性抗体に関する。
【００１５】
好ましくは、本発明は、本発明に従う使用のための二特異性抗体であって、前記二特異性抗体および前記抗ＢＣＭＡ抗体が、ＢＣＭＡ結合に関して一価であることを特徴とする二特異性抗体に関する。好ましくは、前記抗ＢＣＭＡ抗体（前記二特異性抗体の部分）のＫｄ値は、１００ｎＭまたはそれを下回る。
【００１６】
好ましくは、本発明は、本発明に従う使用のための二特異性抗体であって、前記二特異性抗体および前記抗ＢＣＭＡ抗体が、ＢＣＭＡ結合に関して二価であることを特徴とする二特異性抗体に関する。
【００１７】
好ましくは、本発明は、本発明に従う使用のための二特異性抗体であって、前記二特異性抗体および前記抗ＢＣＭＡ抗体が、ＢＣＭＡ結合に関して三価であることを特徴とする二特異性抗体に関する。
【００１８】
好ましくは、本発明は、本発明に従う使用のための二特異性抗体であって、前記二特異性抗体が、その重鎖および軽鎖ＣＤＲとして、前記抗ＢＣＭＡ抗体と同じアミノ酸配列のＣＤＲを含むことを特徴とする二特異性抗体に関する。
【００１９】
好ましくは、本発明は、本発明に従う使用のための二特異性抗体であって、前記二特異性抗体が、その重鎖および軽鎖可変領域として、前記抗ＢＣＭＡ抗体と同じアミノ酸配列の可変領域を含むことを特徴とする二特異性抗体に関する。
【００２０】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記患者の単離された体液試料において、標的細胞に対するＴ細胞（エフェクター細胞）の比（Ｅ：Ｔ比）が、０．３５：１、好ましくは０．５：１またはそれより高い、好ましくは１：１またはそれより高い、より好ましくは５：１またはそれより高い、さらにより好ましくは１０：１またはそれより高い二特異性抗体に関する。好ましくは、Ｅ：Ｔ比は、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比、好ましくは、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋ＣＤ４５＋ＣＤ１９−ＣＤ５６＋細胞に対するＣＤ４５＋ＣＤ１９−ＣＤ５６−Ｔ細胞のＣＤ３＋細胞サブセットの比として測定される。患者が、多発性骨髄腫を患う場合、このような標的細胞は、したがって多発性骨髄腫細胞である。
【００２１】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記障害が、前記患者の単離された体液試料において、標的細胞に対するＴ細胞（エフェクター細胞）の比（Ｅ：Ｔ比）が、０．３５：１またはそれより高い、好ましくは０．５：１またはそれより高い、好ましくは１：１またはそれより高い、より好ましくは５：１またはそれより高い、好ましくは１０：１またはそれより高く、好ましくは０．３５：１〜２２：１であることを特徴とする二特異性抗体に関する。試料を有効に処置することができる患者の試料に見出されるＥ：Ｔ比は、０．３５およびそれより高いと判明した。０．３５：１〜１１：１の間のＥ：Ｔ比を有する試料をそれぞれ検査した。最大２２：１のＥ：Ｔ比も、患者試料において検出された（検査せず）。これらの知見に基づき、本発明者らは、このような試料を有するか、またはさらにより高いＥ：Ｔ値を有する試料を有する患者を、本発明に従う二特異性抗体により有効に処置することもできることを認識した。好ましくは、Ｅ：Ｔ比は、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比、好ましくは、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋ＣＤ４５＋ＣＤ１９−ＣＤ５６＋細胞に対するＣＤ４５＋ＣＤ１９−ＣＤ５６−Ｔ細胞のＣＤ３＋細胞サブセットの比として測定される。患者が、多発性骨髄腫を患う場合、このような標的細胞は、したがって多発性骨髄腫細胞である。
【００２２】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記処置が、
ｉ）前記患者から、体液試料を単離するステップと、
ｉｉ）前記試料における可溶性ＢＣＭＡの量を測定するステップと、
ｉｉｉ）前記試料における可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い場合、また、
ｉｖ）前記患者試料における前記可溶性ＢＣＭＡが、前記二特異性抗体に特異的に結合する場合、より高い用量でおよび／またはより高頻度の処置スケジュールで、前記二特異性抗体により前記患者を処置するステップと
を連続的に含む二特異性抗体に関する。
【００２３】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記障害が、前記患者由来の単離された体液試料において、可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高く、前記患者試料における前記可溶性ＢＣＭＡが、前記二特異性抗体に特異的に結合することを特徴とし、前記二特異性抗体による前記患者の前記処置が、１．５倍から最大１０倍である１週間当たりの用量で行われるか、または／および用量投与間の時間間隔が、標準用量と比較して、１週間に１回投与から最大１日に１回までに短縮されることを特徴とする二特異性抗体に関する。好ましくは、前記二特異性抗体による前記患者の前記処置は、標準用量と比較して、１．５倍から最大２．０倍の１週間当たりの用量で行われる。好ましくは、前記二特異性抗体による前記患者の前記処置は、用量投与間の時間間隔が前記標準用量と比較して、１週間に１回投与から最大１週間に２回まで短縮されて行われる。
【００２４】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記処置が、
ｉ）前記患者から、体液試料を単離するステップと、
ｉｉ）前記試料における可溶性ＢＣＭＡの量を測定するステップと、
ｉｉｉ）前記試料における可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い場合、また、
ｉｖ）前記患者試料における前記可溶性ＢＣＭＡが、前記二特異性抗体に特異的に結合する場合、第１の用量に関してより高い用量で、または前記二特異性抗体の第１の用量および第２の用量の間のより短い期間もしくは前記二特異性抗体の第１の用量および第３の用量の間のより短い期間による、より高頻度の処置スケジュールで、前記二特異性抗体により前記患者を処置するステップと
を連続的に含む二特異性抗体に関する。
【００２５】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢＣＭＡ受容体への結合に関して可溶性ＢＣＭＡと競合し、そして／またはＮＦ−κＢのＡＰＲＩＬ媒介性活性化を遮断する、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記処置が、
ｉ）前記患者から、形質細胞およびＴ細胞を含む体液試料を単離するステップと、
ｉｉ）前記試料におけるＡＰＲＩＬの量を測定するステップと、
ｉｉｉ）前記患者試料におけるＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬを超える場合、より高い用量でおよび／またはより高頻度の処置スケジュールで、前記二特異性抗体により前記患者を処置するステップと
を連続的に含む二特異性抗体に関する。
【００２６】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢＣＭＡ受容体への結合に関して可溶性ＢＣＭＡと競合し、そして／またはＮＦ−κＢのＡＰＲＩＬ媒介性活性化を遮断する、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記障害が、前記患者由来の単離された体液試料において、ＡＰＲＩＬの量が、１０ｎｇ／ｍＬよりも高く、最大１００ｎｇ／ｍＬであることを特徴とし、前記二特異性抗体による前記患者の前記処置が、１週間につき、１．５倍から最大２０倍の用量で行われるか、または／および用量投与間の時間間隔が、標準用量と比較して、１週間に１回投与から最大１日に１回までに短縮されることを特徴とする二特異性抗体に関する。好ましくは、前記二特異性抗体による前記患者の前記処置は、標準用量と比較して、１．５倍から最大３．０倍の１週間当たりの用量で行われる。好ましくは、前記二特異性抗体による前記患者の前記処置は、用量投与間の時間間隔が、前記標準用量と比較して、１週間に１回投与から最大１週間に３回までに短縮されて行われる。
【００２７】
本発明は、ヒトＢＣＭＡ受容体への結合に関して可溶性ＢＣＭＡと競合する、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記抗体が、ＢＣＭＡへの結合に関してＡＰＲＩＬと競合し、それによって、前記抗体が、ＢＣＭＡへの結合に関してＡＰＲＩＬと競合するし、そして／またはＮＦ−κＢのＡＰＲＩＬ媒介性活性化を遮断する、形質細胞が関与する障害を患う患者の処置における使用のための二特異性抗体であって、前記処置が、
ｉ）前記患者から、形質細胞およびＴ細胞を含む体液試料を単離するステップと、
ｉｉ）前記試料におけるＡＰＲＩＬの量を測定するステップと、
ｉｉｉ）前記患者試料におけるＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬを超える場合、１００ｎｇ／ｍＬを下回る可溶性ＡＰＲＩＬ濃度を有する患者に推奨される用量と比較して、１００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬ濃度においては２倍高い用量で、ＡＰＲＩＬ濃度が、１０００ｎｇ／ｍＬまで増大する場合は最大８０倍高いさらに増大された用量で、前記二特異性抗体により前記患者を処置するステップ、またはより高い前記用量に達するようにそれぞれのより高頻度の処置スケジュールにより、前記二特異性抗体のいずれか２用量間のより短い期間で前記患者を処置するステップと
を連続的に含む二特異性抗体に関する。
【００２８】
本発明は、ヒトＢＣＭＡ受容体への結合に関して可溶性ＢＣＭＡと競合する、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記抗体が、ＢＣＭＡへの結合に関してＡＰＲＩＬと競合し、それによって、前記抗体が、ＢＣＭＡへの結合に関してＡＰＲＩＬと競合するし、そして／またはＮＦ−κＢのＡＰＲＩＬ媒介性活性化を遮断する、形質細胞が関与する障害を患う患者の処置における使用のための二特異性抗体であって、前記障害が、形質細胞およびＴ細胞を含む前記患者の単離された体液試料において、ＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬを超えることを特徴とし、１００ｎｇ／ｍＬを下回る可溶性ＡＰＲＩＬ濃度を有する患者に推奨される用量と比較して、１００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬ濃度においては２倍高い用量で、ＡＰＲＩＬ濃度が、１０００ｎｇ／ｍＬまで増大する場合は最大８０倍高いさらに増大された用量で、前記二特異性抗体により前記患者を処置すること、またはより高い前記用量に達するようにそれぞれのより高頻度の処置スケジュールにより、前記二特異性抗体のいずれか２用量間のより短い期間で前記患者を処置することを特徴とする二特異性抗体に関する。
【００２９】
ＡＰＲＩＬの量は、好ましくは、ＥＬＩＳＡ方法の使用によって測定される。
【００３０】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者の、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む単離された体液試料におけるＢＣＭＡタンパク質発現を決定する方法であって、
前記患者の処置における使用に意図される、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用することによって、前記ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞におけるＢＣＭＡ発現を測定するステップと、フローサイトメトリーによって、相対蛍光強度中央値または平均蛍光強度ＭＦＩが、ベースラインを、８０またはそれ超、好ましくは１００またはそれ超、好ましくは２００またはそれ超、さらにより好ましくは３００またはそれ超上回るか否かを決定するステップと
を含む方法に関する。
【００３１】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者を処置する方法であって、
前記患者の処置における使用に意図される、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用することによって、前記患者由来のＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む単離された体液試料を、前記ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞におけるＢＣＭＡ発現に関して分析するステップと、相対蛍光強度中央値または平均蛍光強度ＭＦＩが、ベースラインを、８０またはそれ超、好ましくは１００またはそれ超、好ましくは２００またはそれ超、さらにより好ましくは３００またはそれ超上回る場合、前記二特異性抗体により前記患者を処置するステップと
を含む方法に関する。
【００３２】
好ましくは、本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者にとって最も有効な処置計画を選択することであって、前記患者の単離された体液試料が、ベースラインを、８０またはそれ超、好ましくは１００またはそれ超、好ましくは２００またはそれ超、さらにより好ましくは３００またはそれ超上回るＢＣＭＡのＭＦＩを示すことに関する。
【００３３】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者が、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体による処置に応答する見込みを予測するための方法であって、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む前記患者の単離された体液試料における、前記二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用することによって測定される、相対蛍光強度中央値または平均蛍光強度ＭＦＩとして決定されるベースラインを、８０またはそれ超、好ましくは１００またはそれ超、好ましくは２００またはそれ超、さらにより好ましくは３００またはそれ超上回る、細胞表面ＢＣＭＡ発現が、前記処置に応答する患者の見込みを予測する方法に関する。
【００３４】
本発明は、単離された体液試料における細胞表面ＢＣＭＡ発現を決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する治療用二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用して、前記ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞の相対蛍光強度中央値または平均蛍光強度ＭＦＩが、ベースラインを、８０またはそれ超、好ましくは１００またはそれ超、好ましくは２００またはそれ超、さらにより好ましくは３００またはそれ超上回るか否かを決定するステップを含む方法に関する。
【００３５】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者の処置に最も有効な処置計画を選択するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、前記患者に関して、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する治療用二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用することによって測定される、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む単離された体液試料における細胞表面ＢＣＭＡ発現が、相対蛍光強度中央値または平均蛍光強度ＭＦＩとして決定されるベースラインを、１００またはそれ超、好ましくは２００またはそれ超、さらにより好ましくは３００上回り、処置計画が、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する治療用二特異性抗体の使用を伴う方法に関する。
【００３６】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者を処置するための治療法を選択するための方法であって、
ｉ）ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する治療用二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用することによって測定される、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む単離された体液試料における細胞表面ＢＣＭＡ発現が、相対蛍光強度中央値もしくは平均蛍光強度ＭＦＩとして決定されるベースラインを、１００もしくはそれ超、好ましくは２００もしくはそれ超、さらにより好ましくは３００もしくはそれ超上回る場合、前記治療用抗体により前記患者を処置するステップ、または
ｉｉ）ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する治療用二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用することによって測定される、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む単離された体液試料における細胞表面ＢＣＭＡ発現が、相対蛍光強度中央値もしくは平均蛍光強度ＭＦＩとして決定されるベースラインを、１００未満、好ましくは５０未満、なお好ましくは１０未満しか上回らない場合、前記治療用抗体により前記患者を処置しないステップ
を含む方法に関する。
【００３７】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者の単離された体液試料において、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比が、０．３５：１、好ましくは０．５：１またはそれより高い、好ましくは１：１またはそれより高い、より好ましくは５：１またはそれより高い、さらにより好ましくは１０：１またはそれより高いか否かを決定するための方法に関する。
【００３８】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者を処置する方法であって、前記患者の単離された体液試料において、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比が、０．３５：１、好ましくは０．５：１またはそれより高い、好ましくは１：１またはそれより高い、より好ましくは５：１またはそれより高い、さらにより好ましくは１０：１またはそれより高いか否かを分析するステップを含む方法に関する。
【００３９】
好ましくは、本発明は、０．３５：１、好ましくは０．５：１またはそれより高い、好ましくは１：１またはそれより高い、より好ましくは５：１またはそれより高い、さらにより好ましくは１０：１またはそれより高い、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比を示す、患者にとって最も有効な処置計画を選択することに関する。
【００４０】
好ましくは、本発明は、患者にとって最も有効な処置計画を選択することであって、
ｉ）前記患者の体液試料において、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比が、０．３５：１、好ましくは０．５：１またはそれより高い、好ましくは１：１またはそれより高い、より好ましくは５：１またはそれより高い、さらにより好ましくは１０：１またはそれより高い場合、単独療法においてＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する治療用二特異性抗体により前記患者を処置し、
ｉｉ）前記患者の単離された体液試料において、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比が、０．５：１よりも低い、好ましくは０．２５：１よりも低い場合、Ｔ細胞増殖性療法またはＴ細胞化学誘引物質療法と組み合わせて、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する治療用二特異性抗体により前記患者を処置することに関する。
【００４１】
本発明は、前記患者の単離された体液試料において、処置に応答する患者の見込みを予測する、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比が、０．３５：１、好ましくは０．５：１またはそれより高い、好ましくは１：１またはそれより高い、より好ましくは５：１またはそれより高い、さらにより好ましくは１０：１またはそれより高いか否かを測定することにより、形質細胞が関与する障害を患う患者が、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体による処置に応答する見込みを予測するための方法に関する。
【００４２】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者の単離された体液試料において、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比が、０．５：１またはそれより高い、好ましくは１：１またはそれより高い、より好ましくは５：１またはそれより高い、さらにより好ましくは１０：１またはそれより高いか否かを決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【００４３】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者の処置に最も有効な処置計画を選択するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、前記患者の単離された体液試料において、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比が、０．３５：１、好ましくは０．５：１またはそれより高い、好ましくは１：１またはそれより高い、より好ましくは５：１またはそれより高い、さらにより好ましくは１０：１またはそれより高いと決定され、処置計画が、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する治療用二特異性抗体の使用を伴う方法に関する。
【００４４】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者のために、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体による治療法を選択するための方法であって、
ｉ）前記患者の単離された体液試料において、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比が、０．３５：１、好ましくは０．５：１もしくはそれより高い、好ましくは１：１もしくはそれより高い、より好ましくは５：１もしくはそれより高い、さらにより好ましくは１０：１もしくはそれより高い場合、前記治療用抗体により前記患者を処置するステップ、または
ｉｉ）前記患者の単離された体液試料において、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比が、０．３５：１よりも低い、好ましくは０．５：１、好ましくは０．２５：１よりも低い場合、Ｔ細胞増殖性療法もしくはＴ細胞化学誘引物質療法と組み合わせて、ＢＣＭＡおよびＣＤ３に特異的に結合する二特異性抗体により前記患者を処置するステップ
を含む方法に関する。
【００４５】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者のＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む単離された体液試料において、前記試料における可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、さらにより好ましくは２５０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか否かを決定する方法に関する。
【００４６】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者を処置する方法であって、前記体液試料における可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、さらにより好ましくは２５０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか否かを決定するステップを含む方法に関する。
【００４７】
好ましくは、本発明は、ベースラインを、８０またはそれ超、好ましくは１００またはそれ超、好ましくは２００またはそれ超、さらにより好ましくは３００またはそれ超上回るＢＣＭＡのＭＦＩを示す、患者にとって最も有効な処置計画の選択することに関する。本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者が、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体による処置に応答する見込みを予測するための方法であって、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、さらにより好ましくは２５０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、前記体液試料における可溶性ＢＣＭＡの量が、処置に応答する患者の見込みを予測する方法に関する。
【００４８】
本発明は、単離された体液試料において、前記試料における可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、さらにより好ましくは２５０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか否かを決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【００４９】
好ましくは、本発明は、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、さらにより好ましくは２５０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い可溶性ＢＣＭＡの量を示す、患者にとって最も有効な処置計画を選択することに関する。
【００５０】
本発明は、前記試料における可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、さらにより好ましくは２５０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか否かを決定することにより、形質細胞が関与する障害を患う患者の処置に最も有効な処置計画を選択するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、処置計画が、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体の使用を伴う方法に関する。
【００５１】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者を処置するための治療法を選択するための方法であって、治療法が、
ｉ）前記試料における可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬよりも低い場合、前記治療用抗体により前記患者を処置するステップ、または
ｉｉ）前記試料における可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬもしくはそれより高く、
前記患者試料における前記可溶性ＢＣＭＡが、前記二特異性抗体に結合しない場合、前記治療用抗体により前記患者を処置するステップ、または
ｉｉｉ）前記試料における可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬもしくはそれより高い、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬもしくはそれより高い、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬもしくはそれより高い、さらにより好ましくは２５０ｎｇ／ｍＬもしくはそれより高く、
前記患者試料における前記可溶性ＢＣＭＡが、前記二特異性抗体に特異的に結合する場合、より高い用量で、および／もしくはより高頻度の処置スケジュールで、前記二特異性抗体により前記患者を処置するステップ
を含む方法に関する。
【００５２】
好ましくは、本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者を処置するための治療法を選択するための方法であって、治療法が、
ｉ）前記試料における可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬよりも低い場合、前記治療用抗体により前記患者を処置するステップ、あるいは
ｉｉ）前記試料における可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高く、
前記患者試料における前記可溶性ＢＣＭＡが、前記二特異性抗体に結合しない場合、前記治療用抗体により前記患者を処置するステップ、あるいは
ｉｉｉ）前記試料における可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、さらにより好ましくは２５０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高く、前記患者試料における前記可溶性ＢＣＭＡが、前記二特異性抗体に特異的に結合する場合、第１の用量に関してより高い用量で、または前記二特異性抗体の第１の用量および第２の用量の間のより短い期間もしくは前記二特異性抗体の第１の用量および第３の用量の間のより短い期間による、より高頻度の処置スケジュールで、前記二特異性抗体により前記患者を処置するステップ
を含む方法に関する。
【００５３】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者のＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む単離された体液試料において、前記試料における可溶性ＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか否かを決定する方法に関する。
【００５４】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者であって、前記患者の単離された体液試料において、可溶性ＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いと診断された患者を、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体により処置する方法に関する。
【００５５】
好ましくは、本発明は、１００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い可溶性ＡＰＲＩＬの量を示す、患者にとって最も有効な処置計画を選択することに関する。
【００５６】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者が、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体による処置に応答する見込みを予測するための方法であって、１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い前記試料における可溶性ＡＰＲＩＬの量が、処置に応答する患者の見込みを予測する方法に関する。
【００５７】
本発明は、単離された体液試料において、前記試料における可溶性ＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか否かを決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【００５８】
本発明は、前記試料における可溶性ＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか否かを決定することにより、形質細胞が関与する障害を患う患者の処置に最も有効な処置計画を選択するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、処置計画が、ＡＰＲＩＬ競合的二特異性抗体またはＡＰＲＩＬ非競合的二特異性抗体の使用を伴う方法に関する。
【００５９】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者を処置するための治療法を選択するための方法であって、治療法が、
ｉ）前記試料における可溶性ＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬもしくはそれを下回る、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬもしくはそれを下回る場合、前記治療用抗体により前記患者を処置するステップ、または
ｉｉ）前記試料における可溶性ＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬもしくはそれより高い、好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬもしくはそれより高い場合、ＡＰＲＩＬ非競合的二特異性抗体により前記患者を処置するステップ、または
ｉｉｉ）前記試料における可溶性ＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬよりも高い、好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬもしくはそれより高い場合、より高い用量で、および／もしくはより高頻度の処置スケジュールで、前記二特異性抗体により前記患者を処置するステップ
を含む方法に関する。
【００６０】
好ましくは、本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者を処置するための治療法を選択するための方法であって、治療法が、
ｉ）前記試料における可溶性ＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬもしくはそれを下回る、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬもしくはそれを下回る場合、前記治療用抗体により前記患者を処置するステップ、または
ｉｉ）前記試料における可溶性ＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬもしくはそれより高い、好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬもしくはそれより高い場合、ＢＣＭＡリガンド競合的二特異性抗体により前記患者を処置するステップ、または
ｉｉｉ）前記患者試料におけるＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬを超える場合、１００ｎｇ／ｍＬを下回る可溶性ＡＰＲＩＬ濃度を有する患者に推奨される用量と比較して、１００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬ濃度においては２倍高い用量で、ＡＰＲＩＬ濃度が、１０００ｎｇ／ｍＬまで増大する場合は最大８０倍高いさらに増大された用量で、前記二特異性抗体により前記患者を処置するステップ、もしくはより高い前記用量に達するようにそれぞれのより高頻度の処置スケジュールにより、前記二特異性抗体のいずれか２用量間のより短い期間で前記患者を処置するステップ
を含む方法に関する。
【００６１】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う患者にとって最も有効な処置計画を決定するための方法に関する。
【００６２】
本発明は、形質細胞が関与する障害を患う新たな患者のための処置計画を決定するための方法であって、
少なくとも１種の調査方法を利用して、前記新たな患者のＢＣＭＡ関連の形質細胞状態を提供するステップと、
１種の方法の少なくとも結果を利用して、少なくとも１種の同様の表現を有する同じ障害を患う以前の患者に関して以前の処置計画を検索するステップと、
少なくとも１種の以前の処置計画における情報に基づき新たな患者の処置を改善する仕方を決定するために、以前の患者に関して以前の処置計画を審査するステップと
を含む方法に関する。
【００６３】
本発明は、患者における形質細胞が関与する障害を診断および処置するための方法であって、前記患者の単離された体液試料において、本発明に従うＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞におけるＢＣＭＡ発現を分析するステップであって、前記ＢＣＭＡ発現が、相対蛍光強度中央値または平均蛍光強度ＭＦＩとして決定されるベースラインを、８０またはそれ超、好ましくは１００またはそれ超、好ましくは２００またはそれ超、さらにより好ましくは３００またはそれ超上回る場合、患者が、前記疾患を有すると診断されるステップと、本発明に従う二特異性抗体による処置を、診断された患者に施すステップとを含む方法に関する。
【００６４】
本発明は、患者における形質細胞が関与する障害を診断および処置するための方法であって、単離された体液試料において、標的細胞に対するＴ細胞（エフェクター細胞）の比（Ｅ：Ｔ比）を分析するステップであって、前記比が、０．３５：１、好ましくは０．３５：１、好ましくは０．５：１またはそれより高い場合、患者が、前記疾患と診断されるステップと、本発明に従う二特異性抗体による処置を、診断された患者に施すステップとを含む方法に関する。
【００６５】
本発明は、患者における形質細胞が関与する障害を診断および処置するための方法であって、患者の単離された体液試料において、本発明に従う可溶性ＢＣＭＡの量を分析するステップであって、前記可溶性ＢＣＭＡが、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高く、前記患者試料における前記可溶性ＢＣＭＡが、前記二特異性抗体に特異的に結合する場合、患者が、前記疾患と診断されるステップと、本発明に従う二特異性抗体による処置を、より高い用量で、および／またはより高頻度の処置スケジュールで、診断された患者に施すステップとを含む方法に関する。
【００６６】
本発明は、患者における形質細胞が関与する障害を診断および処置するための方法であって、患者の単離された体液試料において、本発明に従う可溶性ＢＣＭＡの量を分析するステップであって、前記可溶性ＢＣＭＡが、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高く、前記患者試料における前記可溶性ＢＣＭＡが、前記二特異性抗体に特異的に結合する場合、患者が、前記疾患と診断されるステップと、本発明に従う二特異性抗体による処置を、診断された患者に施すステップであって、第１の用量に関してより高い用量で、または前記二特異性抗体の第１の用量および第２の用量の間のより短い期間もしくは前記二特異性抗体の第１の用量および第３の用量の間のより短い期間による、より高頻度の処置スケジュールで行われるステップとを含む方法に関する。
【００６７】
本発明は、患者における形質細胞が関与する障害を診断および処置するための方法であって、患者の単離された体液試料において、本発明に従うＡＰＲＩＬの量を分析するステップであって、ＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬを超える場合、患者が、前記疾患と診断されるステップと、本発明に従う二特異性抗体による処置を、診断された患者に施すステップであって、より高い用量で、および／またはより高頻度の処置スケジュールで、ヒトＢＣＭＡ受容体への結合に関して可溶性ＢＣＭＡと競合するか、および／またはＮＦ−κＢのＡＰＲＩＬ媒介性活性化を遮断する前記二特異性抗体により行われるステップとを含む方法に関する。
【００６８】
本発明は、患者における形質細胞が関与する障害を診断および処置するための方法であって、形質細胞およびＴ細胞を含む患者の単離された体液試料において、本発明に従うＡＰＲＩＬの量を分析するステップであって、ＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬを超える場合、患者が、前記疾患と診断されるステップと、本発明に従う二特異性抗体による処置を、診断された患者に施すステップであって、１００ｎｇ／ｍＬを下回る可溶性ＡＰＲＩＬ濃度を有する患者に推奨される用量と比較して、１００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬ濃度においては２倍高い用量で、ＡＰＲＩＬ濃度が、１０００ｎｇ／ｍＬまで増大する場合は最大８０倍高いさらに増大された用量で、ヒトＢＣＭＡ受容体への結合に関してＡＰＲＩＬと競合するか、および／もしくはＮＦ−κＢのＡＰＲＩＬ媒介性活性化を遮断する前記二特異性抗体により行われるステップ、またはより高い前記用量に達するようにそれぞれのより高頻度の処置スケジュールにより、前記二特異性抗体のいずれか２用量間のより短い期間で前記患者を処置するステップとを含む方法に関する。
【００６９】
好ましくは、疾患（障害）は、多発性骨髄腫、全身性エリテマトーデスおよび関節リウマチからなる群から選択される。
【００７０】
好ましくは、結合価（valence）は、診断用抗体と治療用抗体との間で同様のものとなるべきである（例えば、ＢＣＭＡ決定のための一価抗体は、ｓｃＦＶに基づくＢｉＴＥ分子など、悪性細胞における腫瘍標的への一価結合によるＢＣＭＡ抗体療法のための患者層別化に使用されるべきである）。ＢＣＭＡ抗体療法のＢＣＭＡ結合剤と同じものである、ＢＣＭＡ決定のためのＢＣＭＡ抗体を使用することがさらにより好ましい。
【００７１】
好ましくは、アフィニティーセットアップ表面プラズモン共鳴アッセイにおいて濃度５００ｎＭまたはそれより低いヒトＢＣＭＡ  Ｆｃ融合体の存在下、２５ｎＭの抗体濃度で測定される、前記二特異性抗体のヒトＢＣＭＡに対するアフィニティーは、２００ｎＭまたはそれより低い。
【００７２】
好ましくは、リダイレクトＴ細胞殺滅ＬＤＨ放出アッセイにおいて、１０：１のＥ：Ｔ比におけるヒトＰＢＣＭおよびＨ９２９細胞の存在下で、１００ｎＭおよびそれを下回る濃度で２４時間使用される場合、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０６８）を殺滅する前記二特異性抗体の効力（ＥＣ５０）は、２ｎＭまたはそれを下回るものと測定される。
【００７３】
好ましくは、アフィニティーセットアップ表面プラズモン共鳴アッセイにおいて、ヒトＩｇＧ１型の抗体において測定される、ヒトＢＣＭＡに対する前記ＢＣＭＡ結合部分のアフィニティーは、５００ｎＭまたはそれを下回る濃度のヒトＢＣＭＡ  Ｆｃ融合体の存在下における２５ｎＭの抗体濃度において、２００ｎＭまたはそれを下回る。
【００７４】
好ましくは、本発明に従う抗体はさらに、カニクイザルＢＣＭＡにも特異的に結合することを特徴とする。
【００７５】
ＩｇＧ１サブクラスの定常重領域ＣＨ２／ＣＨ３を含む本発明に従う二特異性抗体は、ＦｃＲおよびＣ１ｑへの結合を回避し、ＡＤＣＣ／ＣＤＣを最小化するように、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ２３９Ｇ（Ｋａｂａｔに従う番号付け）を含むことを特徴とすることが好ましい。利点は、本発明のこのような抗体が、Ｔ細胞をリダイレクションし／活性化させる強力な機構により、その腫瘍細胞殺滅の有効性を純粋に媒介することである。補体系およびＦｃガンマＲを発現するエフェクター細胞に対する効果などのさらなる作用機構は、回避され、副作用の危険性は、低下する。
【００７６】
本発明に従う抗体は、１ｍｇ／ｋｇ体重（ＢＷ）の用量で、週２回または週１回、静脈内（ｉ．ｖ．）または皮下（ｓ．ｃ．）または腹腔内（ｉ．ｐ．）投与され、好ましくは０．５ｍｇ／ｋｇ  ＢＷで、週２回または週１回、ｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与され、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ  ＢＷで、週２回または週１回、ｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与され、好ましくは０．０５ｍｇ／ｋｇ  ＢＷで、週２回または週１回、ｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与され、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ  ＢＷで、週２回または週１回、ｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与され、好ましくは５μｇ／ｋｇ  ＢＷで、週２回または週１回、ｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与される、多発性骨髄腫異種移植モデル（例えば、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞またはＲＰＭＩ８２２６細胞またはＵ２６６Ｂ１細胞またはＬ−３６３細胞による異種移植）において、７０％を超え、好ましくは８５％を超え、好ましくは１００％に近い腫瘍成長の阻害を示すことにより特徴付けられることが好ましい。
【００７７】
本発明に従う抗体は、マウス、好ましくは、カニクイザルにおける消失半減期であって、２４時間より長い、好ましくは、３日間またはそれより長い消失半減期により特徴付けられることが好ましく、半減期は、異種移植モデルにおける、週２回または１回の投与で有効である用量について測定されることが好ましい。
【００７８】
腫瘍細胞上の標的およびＣＤ３に結合し、分子フォーマット（ｓｃＦｖ）２を有する二特異性抗体は、消失半減期が、１〜４時間と非常に短い。（ｓｃＦｖ）２二特異性ＣＤ１９×ＣＤ３抗体ブリナツモマブを用いた臨床試験では、この化合物は、患者が携行するポンプを介して、数週間および数カ月間にわたり投与しなければならなかった（Ｔｏｐｐら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２０１１年、２９巻（１８号）：２４９３〜８頁）。週２回または週１回のｉｖまたはｓｃ投与と比較して、ポンプを介して投与される処置は、患者にとってはるかに不都合であり、また、はるかに危険でもある（例えば、ポンプの不具合、カテーテルに関する問題）。
【００７９】
本発明に従う抗体は、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−９０６８（商標））への結合についてのＥＣ５０値であって、５００ｎＭまたはそれを下回る、好ましくは、３５０ｎＭおよびそれを下回るＥＣ５０値、好ましくは１００ｎＭおよびそれを下回るＥＣ５０値を示すことを特徴とすることが好ましい。
【００８０】
本発明に従う抗体は、ヒトＴ細胞の存在下における、ＮＣＩ−Ｈ９２９腫瘍細胞のリダイレクトされた殺滅を、１ｎＭ未満、好ましくは、０．５ｎＭ、好ましくは、０．１ｎＭおよびそれを下回るＥＣ５０で誘導するその能力により特徴付けられることが好ましい。
【００８１】
本発明に従う二特異性抗体は、ヒトＴ細胞の存在下において、多発性骨髄腫患者の原発性骨髄腫細胞の、リダイレクトされた殺滅を誘導するその能力により特徴付けられることが好ましい。
【００８２】
本発明のさらなる実施形態は、診断用抗ＢＣＭＡ抗体、ならびに本発明に従うＢＣＭＡおよびＣＤ３に対する治療用二特異性抗体を含むキットである。
【００８３】
本発明のさらなる実施形態は、抗ＢＣＭＡ抗体が、前記二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有し、相対蛍光強度中央値または平均蛍光強度ＭＦＩとして決定されるベースラインを、８０またはそれ超、好ましくは１００またはそれ超、好ましくは２００またはそれ超、さらにより好ましくは３００またはそれ超上回ることを特徴とする、抗ＢＣＭＡ抗体、ならびにＢＣＭＡおよびＣＤ３に対する二特異性抗体、ならびに使用説明書、特に、本発明の方法を行う仕方についての説明書を含むキットである。好ましくは、前記抗ＢＣＭＡ抗体、ならびにＢＣＭＡおよびＣＤ３に対する前記二特異性抗体は、両方とも、一価、二価または三価であり、好ましくは、同じＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬ配列を有する。
【００８４】
キットは、少なくとも１個の容器と、容器に貼ったまたは添えたラベルまたはパッケージとを含む。適した容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどを含む。容器は、ガラスまたはプラスチックなど、様々な材料で形成されていてよい。容器は、治療剤を抽出するための無菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。ラベルまたはパッケージは、組成物が、ＭＭ、ＳＬＥ、ＲＡまたは形質細胞が関与する別の障害の処置に使用されることを示すことができる。
【００８５】
その上、キットは、注射用の静菌的な水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液など、薬学的に許容される緩衝液を含む第２の容器をさらに含むことができる。キットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針およびシリンジを含む、商業的なおよび使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含むことができる。
【００８６】
好ましくは、キットは、次のものを含む；
１）細胞表面ＢＣＭＡ発現の決定用：悪性ＰＣにおけるＢＣＭＡを決定するための、標識抗体（好ましくは４種の抗体；そのうち１種はＣＤ１３８に、１種はＣＤ３８に、１種はＣＤ１９に、１種はＢＣＭＡに特異的に結合する（本発明に従う特性を有する））があらかじめ充填されたバイアルまたはチューブ；アイソタイプ対照抗体の入ったチューブ；
２）Ｅ：Ｔ比の決定用：悪性ＰＣおよびＴ細胞を検出するための、標識抗体があらかじめ充填されたバイアルまたはチューブ（好ましくは、４種の抗体；そのうち１種はＣＤ１３８に、１種はＣＤ３８に、１種はＣＤ１９に、１種はＣＤ３に特異的に結合する）；アイソタイプ対照抗体の入ったチューブ；
３）可溶性ＢＣＭＡの決定用：マイクロタイタープレート、捕捉抗体（ポリクローナルＢＣＭＡ抗体）、ビオチンコンジュゲート検出抗体（ＢＣＭＡに特異的に結合（本発明に従う特性を有する））、質量較正された標準、ストレプトアビジン−ＨＲＰまたはストレプトアビジン−ＡＬＰ、詳細なプロトコール、ＰＢＳ、洗浄緩衝液  −  ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．２〜７．４、試薬希釈剤１  −  ＰＢＳ中の１％のＢＳＡ５、基質溶液  −  着色試薬Ａ（Ｈ２Ｏ２）および着色試薬Ｂ（テトラメチルベンジジン）の１：１混合物、停止溶液  −  ２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を含むＥＬＩＳＡキット；
４）可溶性ＡＰＲＩＬの決定用：マイクロタイタープレート、捕捉抗体（抗ヒトＡＰＲＩＬ抗体）、ビオチンコンジュゲート検出抗体（抗ヒトＡＰＲＩＬ抗体）、質量較正された標準、ストレプトアビジン−ＨＲＰまたはストレプトアビジン−ＡＬＰ、詳細なプロトコール、ＰＢＳ、洗浄緩衝液  −  ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．２〜７．４、試薬希釈剤１  −  ＰＢＳ中の１％のＢＳＡ５、基質溶液  −  着色試薬Ａ（Ｈ２Ｏ２）および着色試薬Ｂ（テトラメチルベンジジン）の１：１混合物、停止溶液  −  ２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を含むＥＬＩＳＡキット。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】フローサイトメトリーによって検出され、相対平均蛍光強度または蛍光強度中央値によって定義される、患者悪性形質細胞におけるＢＣＭＡ発現。フローサイトメトリーによって検出される、患者骨髄腫細胞における（Ａ）中〜高ＢＣＭＡ発現、（Ｂ）中程度ＢＣＭＡ発現および（Ｃ）低ＢＣＭＡ発現の代表的なＦＡＣＳヒストグラムプロット（ＭＦＩ）。陰性対照（Ｔ細胞においてゲーティングした、ＡＰＣコンジュゲートＢＣＭＡ−１抗体）と比較して、患者骨髄腫細胞における陽性ＢＣＭＡ発現に対応する、ｘ軸上の右への明らかなシフトが見られる。相対ＭＦＩ値に基づき、骨髄腫患者は、自身の悪性形質細胞においてＢＣＭＡを発現するが、ＢＣＭＡ発現は、低発現（相対ＭＦＩ値＜１０３）から中程度発現（１０３〜０．３×１０４）から中〜高発現（０．３×１０４〜１０４）へと変動する（実施例１．１を参照）。
【図２】ＢＣＭＡ−ＴＣＢの殺滅効力は、標的細胞の表面におけるＢＣＭＡ発現によって影響される：ＢＣＭＡｈｉ発現Ｈ９２９対ＢＣＭＡｍｅｄ／ｌｏ発現Ｕ２６６骨髄腫細胞。一対一の比較において実行したところ、ＢＣＭＡ−２−ＴＣＢは、１１５ｐＭのＥＣ５０および６０％の最大殺滅で、ＢＣＭＡｈｉ発現Ｈ９２９骨髄腫細胞の殺滅を誘導した一方、同じＢＣＭＡ−ＴＣＢ抗体は、ＢＣＭＡｍｅｄ／ｌｏ発現Ｕ２６６骨髄腫標的細胞を、３７０ｐＭのＥＣ５０および１８％の最大殺滅で殺滅することしかできなかった（実施例１．３を参照）。
【図２．１】ＢＣＭＡ発現骨髄腫細胞系（ＢＣＭＡｈｉ発現Ｈ９２９、ＢＣＭＡｍｉｄ／ｌｏ発現Ｌ３６３およびＢＣＭＡｌｏ発現ＲＰＭＩ−８２２６  ＭＭ細胞）の殺滅を誘導するＢＣＭＡ−１−ＴＣＢの効力を検査し、比較した。一対一の比較において実行したところ、ＢＣＭＡ−１−ＴＣＢは、（Ａ）８．４９ｐＭのＥＣ５０および８２．８％の最大殺滅で、ＢＣＭＡｈｉ発現Ｈ９２９骨髄腫細胞の殺滅を誘導した一方、同じＢＣＭＡ−１−ＴＣＢ抗体は、（Ｂ）１２．６ｐＭのＥＣ５０および６７．１％の最大殺滅で、ＢＣＭＡｍｅｄ／ｌｏ発現Ｌ３６３骨髄腫標的細胞を、または（Ｃ）２２９．３ｐＭのＥＣ５０および２８．１％の最大殺滅で、ＢＣＭＡｌｏ発現ＲＰＭＩ−８２２６を殺滅することしかできなかった（実施例１．３）。
【図３】フローサイトメトリーによって検出され、相対平均蛍光強度または蛍光強度中央値によって定義される、ヒト骨髄腫細胞系におけるＢＣＭＡ発現。
【図４】ホスホフローサイトメトリーによって検出される、ＡＰＲＩＬ誘導性ＮＦ−κＢ活性化におけるＡＰＲＩＬ競合ＢＣＭＡ−ＴＣＢ抗体の効果。（Ａ）Ｈ９２９細胞におけるＡＰＲＩＬ（１０００ｎｇ／ｍＬ）媒介性ＮＦ−κＢ活性化におけるＡＰＲＩＬ競合Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢの効果。ホスホフローサイトメトリーによる細胞内リン酸化ＮＦ−κＢの検出（実施例４．２．１を参照）。
【図５】比色ＬＤＨ放出アッセイによって検出される、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞のＴ細胞リダイレクト殺滅を誘導するＡＰＲＩＬ競合ＢＣＭＡ−ＴＣＢ抗体における可溶性ＡＰＲＩＬの影響。外因性可溶性ＡＰＲＩＬの非存在下および１００ｎｇ／ｍＬまたは１０００ｎｇ／ｍＬの外因性可溶性ＡＰＲＩＬの存在下における、ＡＰＲＩＬ遮断／競合Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢ。Ｅ：Ｔ比は、１０のＰＢＭＣ：１のＨ９２９細胞として使用した；ＬＤＨ放出の測定前に、細胞を２４時間インキュベートした。ＡＰＲＩＬ遮断／競合Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢは、外因性ＡＰＲＩＬの非存在下において、低ピコモル効力（ＥＣ５０ＡＰＲＩＬ０＝５．８ｐＭ）でＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫の濃度依存的殺滅を誘導した。１００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬを培養物に添加した場合、このようなリガンドの濃度は、ＥＣ５０の２．４倍増大（ＥＣ５０ＡＰＲＩＬ１００＝１４．２ｐＭ）により示される通り、Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢによって媒介される殺滅効力に最小にしか影響しなかった。しかし、１０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬを培養物に添加した場合、８４．３倍のＥＣ５０の増大によって反映される通り（ＥＣ５０ＡＰＲＩＬ１０００＝４８８．９ｐＭ）、Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢによって媒介される殺滅効力は、大幅に低減された（実施例４．２．２を参照）。
【図６】フローサイトメトリーによって検出される、Ｔ細胞活性化を誘導するＡＰＲＩＬ競合ＢＣＭＡ−ＴＣＢ抗体における可溶性ＡＰＲＩＬの影響。４８時間のインキュベーション後の、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞における初期活性化マーカーＣＤ６９（Ｂ、Ｄ）および後期活性化マーカーＣＤ２５（Ａ、Ｃ）の発現レベル（２つの独立した実験の代表的な結果）。ＡＰＲＩＬ競合／遮断Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢ抗体は、ＢＣＭＡ陽性標的細胞の存在下、外因性可溶性ＡＰＲＩＬの非存在下において、濃度依存的かつ特異的な様式で、ＣＤ６９およびＣＤ２５活性化マーカーの上方調節を誘導した（四角）。１００ｎｇ／ｍＬの可溶性ＡＰＲＩＬを培養物に添加した場合、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞における活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の両方に対して、濃度応答曲線の右へのわずかなシフトが観察された。１０００ｎｇ／ｍＬの可溶性ＡＰＲＩＬを培養物に添加した場合、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方におけるＴ細胞活性化の明らかな低減が見られた。ヒトＰＢＭＣをＤＰ４７−ＴＣＢ対照抗体で処置した場合、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は観察されず、ＴＣＢ抗体が、ＢＣＭＡ陽性標的細胞に結合しない場合、Ｔ細胞におけるＣＤ３への結合にもかかわらず、Ｔ細胞活性化が起こらないことを示唆する（データ図示せず）。この結果は、特に、ＢＣＭＡ−ＴＣＢが、ＡＰＲＩＬと競合する場合、高レベルの可溶性ＡＰＲＩＬが、腫瘍標的およびＴ細胞への結合に際しＴ細胞活性化を誘導するＢＣＭＡ−ＴＣＢ抗体の効力を低減することを明らかに示唆する（実施例４．３を参照）。
【図７】自家骨髄浸潤Ｔ細胞により患者骨髄悪性形質細胞の殺滅を誘導するＢＣＭＡ−ＴＣＢの効力におけるＢＣＭＡ発現およびＥ：Ｔ比の影響。ＢＣＭＡ−１−ＴＣＢは、わずか２４時間のインキュベーション後には既に、患者Ｃ１（Ａ）および患者Ｃ８（Ｂ）の両方に由来する悪性形質細胞の濃度依存的かつ特異的な殺滅を誘導した。しかし、骨髄腫細胞の殺滅は、患者Ｃ１骨髄試料において、患者Ｃ８骨髄試料よりも顕著であった。この結果は、不利な０．５：のＥ：Ｔ比および骨髄腫細胞におけるより弱いＢＣＭＡ発現（すなわち、相対ＭＦＩ値１４８９）を有する患者Ｃ８骨髄試料よりも、患者Ｃ１骨髄試料におけるより有利な１１：１のＥ：Ｔ比およびＢＣＭＡ発現（すなわち、相対ＭＦＩ値２６３６）に起因しうる。この結果は、患者骨髄におけるＥ：Ｔ比の測定と組み合わせた、悪性形質細胞におけるＢＣＭＡ発現の測定が、骨髄腫患者が、ＢＣＭＡ−ＴＣＢ処置に応答しうるかより正確に予測することができることを示唆する。
【発明を実施するための形態】
【００８８】
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、形質細胞が関与する障害、特に、多発性骨髄腫、全身性エリテマトーデスおよび／または関節リウマチを、いくつかのサブタイプに分類（分割）することができることを認識した。このようなサブタイプを次に示す：
【００８９】
１．単離された体液試料においてＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む患者であって、前記二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分であるＫｄ値の０．７０〜１．３倍のＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用することによって測定される、前記ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞におけるＢＣＭＡ発現が、相対蛍光強度中央値または平均蛍光強度ＭＦＩとして決定されるベースラインを、８０またはそれ超、１００またはそれ超、好ましくは２００またはそれ超、さらにより好ましくは３００またはそれ超上回ることによって特徴付けられる患者。
【００９０】
２．単離された体液試料において、単離された体液試料における標的細胞に対するＴ細胞（エフェクター細胞）の比（Ｅ：Ｔ比）が、０．３５：１またはそれより高い、好ましくは０．５：１またはそれより高い患者。
【００９１】
３．単離された体液試料における可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い患者。
【００９２】
４．単離された体液試料におけるＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬを超える患者。
【００９３】
４．単離された体液においてＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む患者であって、前記二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用することによって測定される、前記ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞におけるＢＣＭＡ発現が、相対蛍光強度中央値または平均蛍光強度ＭＦＩとして決定されるベースラインを、８０またはそれ超、好ましくは１００またはそれ超、好ましくは２００またはそれ超、さらにより好ましくは３００またはそれ超上回ることによって特徴付けられる患者であり、前記単離された体液試料において、試料の標的細胞に対するＴ細胞（エフェクター細胞）の比（Ｅ：Ｔ比）が、０．３５：１、好ましくは０．５：１またはそれより高い患者。
【００９４】
ＢＣＭＡ受容体は、骨髄腫患者の骨髄において豊富なそのリガンドであるＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦに結合することにより、正常および悪性形質細胞（すなわち、骨髄腫細胞）の生存にとって重大な役割を果し、骨髄腫細胞におけるＢＣＭＡ発現は、ｍＲＮＡレベルおよび表面タンパク質レベルの両方で、多くのグループによって検出された（O’Connorら、J  Exp  Med、２００４年、１９９巻（１号）：９１〜８頁；Novakら、Blood、２００４年、１０３巻（２号）：６８９〜９４頁；Ryanら、Mol  Cancer  Ther、２００７年、６巻（１１号）：３００９〜１８頁；Quinnら、Blood、２０１１年、１１７巻（３号）：８９０頁；Carpenterら、Blood、２０１３年、１９巻（８号）：２０４８〜６０頁；Frigyesiら、Blood、２０１４年、１２３巻（９号）：１３３６〜４０頁；Claudioら、Blood、２００２年、１００巻（６号）：２１７５〜８６頁；Taiら、Cancer  Res、２００６年、１２３巻（２０号）：３１２８〜３８頁；Moreauxら、Blood、２００４年、１０３巻（８号）：３１４８〜５７頁；Juら、Clin  Biochem、２００９年、４２巻（４〜５号）：３８７〜９９頁；Moreauxら、Eur  J  Haematol、２００９年、８３巻（２号）：１１９〜２９頁）。したがって、骨髄腫患者において、ＢＣＭＡは、患者の悪性形質細胞において発現される。しかし、本発明者らは、骨髄腫患者が、細胞表面においてＢＣＭＡを発現するが、ただしこれは、フローサイトメトリーによる最適測定によって検出される通り、中／高〜中程度〜低に及ぶ異なる発現レベルであることを観察し、本発明者らは、患者層別化のためのＢＣＭＡ発現の検出のための最適に満たない技法または方法の使用（例えば、ヒトＢＣＭＡへの低アフィニティー結合を有するＢＣＭＡ抗体の使用）は、骨髄腫患者の悪性形質細胞における低発現のＢＣＭＡを検出することができず、このような場合、そのような骨髄腫患者が、応答できるのに、ＢＣＭＡ抗体療法に応答しないであろうと臨床医に誤った情報を伝えてしまうことを認識した。
【００９５】
Ｔ細胞二特異性（ＴＣＢ）抗体は、細胞殺滅において非常に高い濃度／腫瘍細胞受容体占有度依存的効力を有し（例えば、ピコモル未満の範囲または低ピコモル範囲の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞殺滅アッセイにおけるＥＣ５０；Dreierら、Int  J  Cancer、２００２年）、Ｔ細胞二特異性抗体（ＴＣＢ）は、従来の単一特異性抗体よりもはるかに低い用量で与えられる。例えば、ブリナツモマブ（ＣＤ１９×ＣＤ３）は、急性リンパ球性白血病の処置のために５〜１５μｇ／ｍ２／日（すなわち、わずか０．０３５〜０．１０５ｍｇ／ｍ２／週）または非ホジキンリンパ腫の処置のために６０μｇ／ｍ２／日の持続的静脈内用量で与えられ、これらの用量における血清濃度は、０．５〜４ｎｇ／ｍＬの範囲内である（Klingerら、Blood、２０１２年；Toppら、J  Clin  Oncol、２０１１年；Goebelerら、Ann  Oncol、２０１１年）。低い用量のＴＣＢは、患者において高い有効性を発揮することができるため、本発明に従う抗体のために、臨床設定において皮下投与が可能であり好まれる（好ましくは、０．２５〜２．５ｍｇ／ｍ２／週の用量範囲内で）ことが想定される。このような低い濃度／用量／受容体占有度であっても、ＴＣＢは、相当な有害事象を引き起こす場合がある（Klingerら、Blood、２０１２年）。したがって、腫瘍細胞占有度／カバレッジを制御することが重大な意味を持つ。したがって、ＴＣＢによる処置のための用量は、患者分類のための有効な方法に基づいて選ぶべきである。
【００９６】
したがって、患者骨髄腫細胞におけるＢＣＭＡ発現のための最適な決定方法が必要とされる。このようなＢＣＭＡ発現のための最適な決定方法は、決定に適切なＢＣＭＡ抗体によるフローサイトメトリーを使用して行うことができる。例えば、本発明に従って、患者層別化のための骨髄腫細胞におけるＢＣＭＡ決定に使用するために、ＢＣＭＡ抗体療法として、ヒトＢＣＭＡに対する同様のアフィニティー範囲（例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される）を有するＢＣＭＡ抗体が、検出のために使用される。抗体結合価が、検出のためのＢＣＭＡ抗体およびＢＣＭＡ抗体療法の間で同じとなることがさらに好まれる（例えば、ｓｃＦＶに基づくＢｉＴＥ分子の場合など、悪性細胞における腫瘍標的への一価結合を有するＢＣＭＡ抗体療法のための患者層別化のために、ＢＣＭＡ検出のための一価抗体を使用するべきである）。アビディティー範囲（ＳＰＲによって測定される）が、検出のためのＢＣＭＡ抗体およびＢＣＭＡ抗体療法の間で同様のものであることがさらに好まれる。ＢＣＭＡ抗体療法のＢＣＭＡ結合剤と同じものである、決定のためのＢＣＭＡ抗体を使用することがさらに好まれる。
【００９７】
本明細書で使用される「標的」という用語は、ＢＣＭＡまたはＣＤ３のいずれかを意味する。「第１の標的および第２の標的」という用語は、第１の標的としてのＣＤ３、および第２の標的としてのＢＣＭＡを意味するか、または、第１の標的としてのＢＣＭＡ、および第２の標的としてのＣＤ３を意味する。
【００９８】
本明細書で使用される「ＢＣＭＡ」という用語は、分化した形質細胞内で優先的に発現する、腫瘍壊死受容体スーパーファミリーのメンバーである、ＢＣＭＡとしてもまた公知の、ヒトＢ細胞成熟標的（ＴＮＦＲＳＦ１７であるＴＲ１７＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ０２２２３））に関する。ＢＣＭＡの細胞外ドメインは、ＵｎｉＰｒｏｔに従い、アミノ酸１〜５４（または５〜５１）からなる。本明細書で使用される「ＢＣＭＡに対する抗体、抗ＢＣＭＡ抗体」という用語は、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体に関する。
【００９９】
本明細書で使用される「ＣＤ３εまたはＣＤ３」という用語は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０７７６６（ＣＤ３Ｅ＿ＨＵＭＡＮ）下に記載されているヒトＣＤ３εに関する。「ＣＤ３に対する抗体、抗ＣＤ３抗体」という用語は、ＣＤ３εに結合する抗体に関する。抗体は、配列番号３、４および５の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨと、配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬとを含むことが好ましい。抗体は、配列番号１（ＶＨ）および配列番号２（ＶＬ）の可変ドメインを含むことが好ましい。本明細書で使用される「ＣＤ３に対する抗体、抗ＣＤ３抗体」という用語は、ＣＤ３εに特異的に結合する抗体に関する。
【０１００】
「ＣＤ３またはＢＣＭＡにあるいはＣＤ３εまたはＢＣＭＡに特異的に結合すること」とは、抗体が、ＣＤ３またはＢＣＭＡのターゲティングにおいて、治療剤として有用であるように、ヒトＣＤ３εまたはヒトＢＣＭＡ（標的）の細胞外ドメインに、十分なアフィニティーで結合することが可能な抗体を指す。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または抗ＢＣＭＡ抗体が、無関係なＣＤ３以外またはＢＣＭＡ以外のタンパク質に結合する程度は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、またはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により測定される通り、抗体の、ＣＤ３またはＢＣＭＡへの結合の、約１０分の１、好ましくは、１００分の１未満である。ＣＤ３またはＢＣＭＡに結合する抗体の解離定数（Ｋｄ）は、１０−８Ｍまたはそれ未満、好ましくは、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、好ましくは、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍであることが好ましい。抗ＣＤ３および／または抗ＢＣＭＡ抗体は、異なる種に由来するＣＤ３および／またはＢＣＭＡの間、好ましくは、ヒトおよびカニクイザルの間で保存されているＣＤ３および／またはＢＣＭＡのエピトープに結合することが好ましい。「ＣＤ３およびＢＣＭＡに特異的に結合する二特異性抗体」または「本発明に従う抗体」とは、両方の標的への結合についてのそれぞれの規定を指す。ＢＣＭＡ（またはＢＣＭＡおよびＣＤ３）に特異的に結合する抗体は、他のヒト抗原に結合しない。したがって、ＥＬＩＳＡでは、このような無関係な標的についてのＯＤ値は、特殊なアッセイの検出限界のＯＤ値と等しいかもしくはそれ未満、好ましくは、０．３ｎｇ／ｍＬ超、またはＢＣＭＡをプレートに結合させていないか、もしくはＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトしていない対照試料のＯＤ値と等しいかもしくはそれ未満である。
【０１０１】
本明細書で使用される「ＣＤ３εまたはＣＤ３結合部分」という用語は、ＣＤ３に特異的に結合する抗体のＦａｂ断片に含まれる、ＶＨおよびＣＨ１からなる抗体重鎖ならびにＶＬおよびＣＬからなる抗体軽鎖の組合せに関する。
【０１０２】
本明細書で使用される「ＢＣＭＡ結合部分」という用語は、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体のＦａｂ断片に含まれる、ＶＨおよびＣＨ１からなる抗体重鎖ならびにＶＬおよびＣＬからなる抗体軽鎖の組合せに関する。
【０１０３】
「ＢＣＭＡおよびＣＤ３に特異的に結合する二特異性抗体、またはＢＣＭＡおよびＣＤ３に対するＴＣＢもしくは抗体」という用語は、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体に関する。このような抗体は、例えば、ＷＯ２０１３０７２４０６、ＷＯ２０１３０７２４１５およびＷＯ２０１４１４０２４８に言及されている単鎖抗体のように、ＢＣＭＡについて一価であっても、または例えば、ＷＯ２０１４１２２１４３、ＷＯ２０１４１２２１４４に開示されているように、二価もしくは三価であってもよい。ＷＯ２０１３０７２４０６およびＷＯ２０１４１４０２４８は、いくつかの図面および実施例においてＥ：Ｔ比について言及する；しかし、それぞれの殺滅アッセイ実験において、１個の標的細胞（患者試料ではない細胞系）につき１０個のエフェクター細胞が使用されたことしか報告されていない。したがって、このＥ：Ｔ比は人工的であり、骨髄腫患者骨髄試料におけるいかなるＥ：Ｔ比も示されなかったか、または抗体処置に対するＥ：Ｔ比の関係に関するいかなる暗示も為されなかった。好ましくは、二特異性抗体は、ＣＤ３結合部分のＣＤＲとして、配列番号２〜４および６〜８のＣＤＲ、好ましくは、配列番号１および５のＶＬおよびＶＨドメインを含む。好ましくは、二特異性抗体は、ＢＣＭＡ結合部分のＣＤＲとして、表１に列挙されているＣＤＲまたは好ましくはＶＨおよびＶＬドメインを含む。好ましくは、二特異性抗体は、ＢＣＭＡ結合部分のＣＤＲとして、配列番号１０〜１２および１４〜１６のＣＤＲまたは好ましくは、配列番号９および１３のＶＬおよびＶＨドメインを含む。好ましくは、二特異性抗体は、ＢＣＭＡ結合部分のＣＤＲとして、配列番号１８〜２０および２２〜２４のＣＤＲまたは好ましくは、配列番号１７および２１のＶＬおよびＶＨドメインを含む。抗体Ｊ６Ｍ０は、ＷＯ２０１２１６３８０５に記載されている。Ｊ６Ｍ０を含むＴＣＢは、ＣＤ３結合部分のＣＤＲとして、配列番号２〜４および６〜８のＣＤＲ、好ましくは、配列番号１および５のＶＬおよびＶＨドメインを含む。
【０１０４】
「ＡＰＲＩＬ非競合的二特異性抗体」という用語は、前記抗体の結合が、ＡＰＲＩＬなしでのヒトＢＣＭＡへの前記抗体の結合と比較して、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定される２０％を超えて、１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＰＲＩＬによって低減されないことを特徴とする二特異性抗体に関する。「ＡＰＲＩＬ非競合的抗ＢＣＭＡ抗体」という用語は、前記抗体の結合が、ＡＰＲＩＬなしでのヒトＢＣＭＡへの前記抗体の結合と比較して、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定される２０％を超えて、１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＰＲＩＬによって低減されないことを特徴とする抗ＢＣＭＡ抗体に関する。このような抗体は、ＷＯ２０１４１２２１４３、ＷＯ２０１４１２２１４４、ＥＰ１４１７９７０５およびＥＰ１４１９４１５１に記載されている。
【０１０５】
【表１】
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【０１０６】
「治療用抗体」という用語は、多発性骨髄腫を患う患者における悪性形質細胞の枯渇において機能する、ＢＣＭＡおよびＣＤ３に特異的に結合する二特異性抗体を指す。治療用抗体は、特に、Ｔ細胞活性化、続いてパーフォリンおよびグランザイムＢが関与するＴ細胞媒介性アポトーシスを誘導することにより、細胞傷害性効果または細胞溶解を媒介する。
【０１０７】
本発明に従う治療用抗体は、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−９０６８（商標））への結合についてのＥＣ５０値であって、５００ｎＭまたはそれを下回る、好ましくは、３５０ｎＭおよびそれを下回るＥＣ５０値、好ましくは１００ｎＭおよびそれを下回るＥＣ５０値を示すことを特徴とすることが好ましい。
【０１０８】
本発明に従う治療用抗体は、Ｕ２６６（ＡＴＣＣ（登録商標）  ＴＩＢ−１９６（商標））細胞に結合するその能力により特徴付けられることが好ましい。
【０１０９】
好ましい一実施形態では、本発明に従う治療用抗体は、ヒトＴ細胞に結合するその能力により特徴付けられる。
【０１１０】
本発明に従う治療用抗体は、ＨＥＫ細胞上で一過性に発現させたカニクイザルＢＣＭＡに結合するその能力により特徴付けられることが好ましい。
【０１１１】
好ましい実施形態では、本発明に従う治療用抗体は、ＢＣＭＡを発現する腫瘍細胞の存在下において、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を誘導するその能力により特徴付けられる。
【０１１２】
本発明に従う治療用抗体は、ヒトＴ細胞の存在下における、ＮＣＩ−Ｈ９２９腫瘍細胞のリダイレクトされた殺滅を、１ｎＭ未満、好ましくは、０．５ｎＭ、好ましくは、０．１ｎＭおよびこれを下回るＥＣ５０で誘導するその能力により特徴付けられることが好ましい。
【０１１３】
「診断用抗体」という用語は、ＢＣＭＡの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体を指す。本発明に従って、前記診断用抗体は、細胞表面ＢＣＭＡ発現が決定される場合、患者の処置のための使用に意図される治療用二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体である。好ましくは、この抗体は、前記治療用二特異性抗体のＢＣＭＡ結合部分に由来し、好ましくは、前記治療用抗体の前記ＢＣＭＡ結合部分と同じＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬドメインを含む。本発明に従って、前記診断用抗体は、ＭＦＩが決定される場合、好ましくは、標識された抗体である。本発明に従って、前記診断用抗体は、可溶性ＢＣＭＡが決定される場合、ＥＬＩＳＡに有用な抗体である。
【０１１４】
「標識された抗体」という用語は、検出可能な標識を取り付けた抗体を指す。好ましくは、分析のためにＦＡＣＳが使用される場合、検出可能な標識は、フルオロフォアである。他の分析方法に関して、他のあらゆる公知の標識を使用することもできる（例えば、HarlowおよびLane編（Antibodies:  A  Laboratory  Manual（１９８８年）Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、N.Y.）を参照）。好まれるフルオロフォアの例は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＰｅｒＣＰ、タンデムコンジュゲート（例えば、ＰＥ−シアニン、ＰｅｒＣＰ−シアニン）、ローダミン（テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ＴＲＩＴＣ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびフィコビリンタンパク質である。
【０１１５】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、モノクローナル抗体を指す。抗体は、「軽鎖」（ＬＣ）および「重鎖」（ＨＣ）の２つの対（本明細書では、このような軽鎖（ＬＣ）／重鎖対を、ＬＣ／ＨＣと略記する）からなる。このような抗体の軽鎖および重鎖は、いくつかのドメインからなるポリペプチドである。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＨＣＶＲまたはＶＨと略記する）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３（抗体クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧ）、任意選択で重鎖定常ドメインＣＨ４（抗体クラス：ＩｇＥおよびＩｇＭ）を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメインＶＬおよび軽鎖定常ドメインＣＬを含む。可変ドメインＶＨおよびＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられる超可変領域であって、フレームワーク領域（ＦＲ）と名付けられる、より保存的な領域を散在させた、超可変領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端から、カルボキシ末端へと、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で並べられる、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。重鎖および軽鎖の「定常ドメイン」は、抗体の、標的への結合に直接は関与しないが、多様なエフェクター機能を呈示する。
【０１１６】
本明細書で使用される「抗体の軽鎖」とは、Ｎ末端からＣ末端の方向で、ＶＬ−ＣＬと略記される、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含むポリペプチドである。本明細書で使用される「抗体の重鎖」とは、Ｎ末端からＣ末端の方向で、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）を含むポリペプチドである。
【０１１７】
「抗体」という用語は、例えば、それらの特徴的な特性が保持されている限りにおいて、マウス抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および遺伝子操作抗体（変異体または突然変異体の抗体）を含む。とりわけ、組換えヒト抗体またはヒト化抗体としての、ヒト抗体またはヒト化抗体が、とりわけ、好ましい。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一のアミノ酸組成を有する抗体分子の調製物を指す。
【０１１８】
本明細書で使用される「二特異性抗体」および「本発明に従う抗体」という用語は、重鎖および軽鎖の２つの対（ＨＣ／ＬＣ）のうちの一方が、ＢＣＭＡに特異的に結合しており、他の一方が、ＣＤ３に、または好ましくは、ＣＤ３およびＢＣＭＡに特異的に結合している抗体を指す。本出願中で使用される「〜価の」という用語は、抗体分子内の、明記された数の結合性部位の存在を示す。本発明に従う二価抗体は、一方が、ＣＤ３のための、他方が、ＢＣＭＡのための、２つの結合性部位を有する。それ自体、「三価」という用語は、本発明に従う抗体内の３つの結合性部位であって、２つの結合性部位が、ＢＣＭＡのためであり、１つの結合性部位が、ＣＤ３のためである、結合性部位の存在を示す。
【０１１９】
ギリシャ文字：α、δ、ε、γ、およびμで示される、５種類の哺乳動物抗体重鎖が存在する（Ｊａｎｅｗａｙ  ＣＡ，Ｊｒら（２００１年）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、５版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）。存在する重鎖の種類は、抗体のクラスを規定し、これらの鎖は、それぞれ、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体、およびＩｇＭ抗体において見出される（Ｒｈｏａｄｅｓ  ＲＡ、Ｐｆｌａｎｚｅｒ  ＲＧ（２００２年）、Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、４版、Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ）。別個の重鎖は、サイズおよび組成が異なり、αおよびγが、約４５０アミノ酸を含有するのに対し、μおよびεは、約５５０アミノ酸を有する。各重鎖は、２つの領域である、定常領域および可変領域を有する。定常領域は、同じアイソタイプの全ての抗体では、同一であるが、異なるアイソタイプの抗体では異なる。重鎖γ、α、およびδは、３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３（一列の）と、可撓性を付加するためのヒンジ領域とから構成される定常領域を有し（Ｗｏｏｆ  Ｊ、Ｂｕｒｔｏｎ  Ｄ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、４巻（２００４年）、８９〜９９頁）、重鎖μおよびεは、４つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４から構成される定常領域を有する（Ｊａｎｅｗａｙ  ＣＡ，Ｊｒら（２００１年）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、５版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）。重鎖の可変領域は、異なるＢ細胞により産生される抗体内では異なるが、単一のＢ細胞またはＢ細胞クローンにより産生される全ての抗体では同じである。各重鎖の可変領域は、約１１０アミノ酸の長さであり、単一の抗体ドメインから構成される。
【０１２０】
哺乳動物では、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）と呼ばれる、２種類の軽鎖が存在する。軽鎖は、２つの連続ドメイン：１つの定常ドメインＣＬと、１つの可変ドメインＶＬとを有する。軽鎖のおおよその長さは、２１１〜２１７アミノ酸である。軽鎖は、カッパ（κ）軽鎖であることが好ましく、定常ドメインＣＬは、カッパ（Ｋ）軽鎖（定常ドメインＣＫ）に由来することが好ましい。本発明に従う抗体の重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインは、ヒトドメインであることが好ましい。
【０１２１】
本発明に従う「抗体」は、任意のクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、好ましくは、ＩｇＧまたはＩｇＥ）、またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２、好ましくは、ＩｇＧ１）の抗体であることが可能であり、これによって、本発明に従う二特異性二価抗体が由来する両方の抗体は、同じサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４など、好ましくは、ＩｇＧ１）、好ましくは、同じアロタイプ（例えば、白色人種）のＦｃパートを有する。
【０１２２】
本明細書で使用される「抗体のＦａｂ断片」とは、抗原に結合する抗体の断片である。抗体のＦａｂ断片は、２つのドメイン対からなる。野生型抗体では、抗体のＦａｂ断片は、重鎖（ＣＨ１、およびＶＨ）および軽鎖（ＣＬおよびＶＬ）の各々の１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインから構成される。野生型抗体では、かつ、本発明に従えば、Ｆａｂ断片の重鎖および軽鎖のドメイン対のドメインは、化学的に一緒に連結されてはおらず、したがって、ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）ではない。
【０１２３】
「抗体のＦｃパート」とは、当業者に周知であり、パパインによる抗体の切断に基づき規定される用語である。本発明に従う抗体は、Ｆｃパートとして、好ましくは、ヒト由来のＦｃパート、好ましくは、ヒト定常領域の他の全てのパートも含有する。抗体のＦｃパートは、補体の活性化、Ｃ１ｑへの結合、Ｃ３の活性化、およびＦｃ受容体への結合に直接関与する。抗体の、補体系に対する影響は、ある特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃパート内の、規定された結合性部位により引き起こされる。このような結合性部位は、最先端技術において公知であり、例えば、Ｌｕｋａｓ，ＴＪ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ.、１２７巻（１９８１年）、２５５５〜２５６０頁；Ｂｒｕｎｈｏｕｓｅ，Ｒ．、およびＣｅｂｒａ，Ｊ．Ｊ．、ＭｏＩ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６巻（１９７９年）、９０７〜９１７頁；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２８８巻（１９８０年）、３３８〜３４４頁；Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．ら、ＭｏＩ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３７巻（２０００年）、９９５〜１００４頁；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６４巻（２０００年）、４１７８〜４１８４頁；Ｈｅｚａｒｅｈ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７５巻（２００１年）、１２１６１〜１２１６８頁；Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、８６巻（１９９５年）、３１９〜３２４頁；ならびにＥＰ０３０７４３４により記載されている。このような結合性部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、およびＰ３２９（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け（下記を参照されたい））である。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３の抗体が通例、補体の活性化、Ｃ１ｑへの結合、Ｃ３の活性化を示すのに対し、ＩｇＧ４は、補体系を活性化させず、Ｃ１ｑに結合せず、Ｃ３を活性化させない。Ｆｃパートは、ヒトＦｃパートであることが好ましい。Ｆｃパートは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃパートであることが好ましい。本発明に従う抗体は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃパート内に、Ｐｒｏ３２９の、グリシンもしくはアルギニンによるアミノ酸置換、ならびに／または置換Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ、好ましくは、Ｐｒｏ３２９のグリシンによる置換、ならびに置換Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含むことが好ましい。
【０１２４】
本発明に従う抗体は、Ｆｃパートとして、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＦｃ変異体であって、位置Ｐｒｏ３２９におけるアミノ酸置換と、少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換とを含み、残基が、ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従い、番号付けされ、前記抗体が、野生型ＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体と比較して、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩに対するアフィニティーの低減を呈示し、前記抗体により誘導されるＡＤＣＣが、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体により誘導されるＡＤＣＣの少なくとも２０％まで低減されるＦｃ変異体を含むことが好ましい。具体的な実施形態では、本発明に従う抗体内の野生型ヒトＦｃ領域のＰｒｏ３２９を、グリシンもしくはアルギニン、またはＦｃのプロリン３２９と、ＦｃγＲＩＩＩのトリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｅ）残基Ｔｒｐ８７およびＴｉｐ１１０との間で形成される、Ｆｃ／Ｆｃγ受容体界面内のプロリンサンドイッチ（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４０６巻、２６７〜２７３頁（２０００年７月２０日））を破壊するのに十分な程度に大型のアミノ酸残基で置換する。本発明のさらなる態様では、Ｆｃ変異体内の、少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、またはＰ３３１Ｓであり、さらに別の実施形態では、前記少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ（ロイシン２３４が、アラニンにより置換されていることを示す）およびＬ２３５Ａ、またはヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域のＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅである。このようなＦｃ変異体については、ＷＯ２０１２１３０８３１において、詳細に記載されている。Ｆｃ部分を含む本発明に従う抗体の利点は、Ｆｃ部分なしのＴＣＢと比較して、消失半減期が、約１２日までまたはそれよりさらにそれ超まで延長され、週１回または２回の投与の機会をもたらすことである。
【０１２５】
「キメラ抗体」という用語は、１つの供給源または種に由来する可変領域、すなわち、結合性領域と、異なる供給源または種に由来する定常領域の少なくとも一部とを含む抗体であって、通例、組換えＤＮＡ技法により調製される抗体を指す。マウス可変領域と、ヒト定常領域とを含むキメラ抗体が好ましい。本発明により包含される、「キメラ抗体」の他の好ましい形態は、本発明に従う特性であって、とりわけ、Ｃ１ｑへの結合および／またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合に関する特性を作出するように、定常領域を、元の抗体の定常領域から修飾するか、または変化させた形態である。このようなキメラ抗体はまた、「クラススイッチ抗体」とも称する。キメラ抗体とは、免疫グロブリンの可変領域をコードするＤＮＡセグメントと免疫グロブリンの定常領域をコードするＤＮＡセグメントとを含む、発現した免疫グロブリン遺伝子の産物である。キメラ抗体を作製するための方法は、当技術分野で周知の従来の組換えＤＮＡおよび遺伝子トランスフェクション技法を伴う。例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻（１９８４年）、６８５１〜６８５５頁；米国特許第５，２０２，２３８号、および同第５，２０４，２４４号を参照されたい。
【０１２６】
「ヒト化抗体」という用語は、フレームワークまたは「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンのＣＤＲと比較して特異性が異なる、免疫グロブリンのＣＤＲを含むように修飾された抗体を指す。好ましい実施形態では、マウスＣＤＲを、ヒト抗体のフレームワーク領域へとグラフトして、「ヒト化抗体」を調製する。例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻（１９８８年）、３２３〜３２７頁；およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４巻（１９８５年）、２６８〜２７０頁を参照されたい。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体について上で言及した標的を認識する配列を表すＣＤＲに対応する。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、本発明に従う特性であって、とりわけ、Ｃ１ｑへの結合および／またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合に関する特性を作出するように、定常領域を、元の抗体の定常領域から、さらに修飾するか、または変化させた形態である。
【０１２７】
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。最先端技術では、ヒト抗体が周知である（ｖａｎ  Ｄｉｊｋ，Ｍ．Ａ．およびｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、５巻（２００１年）、３６８〜３７４頁）。ヒト抗体はまた、免疫化すると、内因性免疫グロブリン産生の非存在下において、ヒト抗体の完全なレパートリーまたはセレクションを産生することが可能な、トランスジェニック動物（例えば、マウス）によって作製することもできる。ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子アレイの、このような生殖細胞系列突然変異マウスへの移入は、標的による感作時における、ヒト抗体の産生を結果としてもたらす（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻（１９９３年）、２５５１〜２５５５頁；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻（１９９３年）、２５５〜２５８頁；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ら、Ｙｅａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ.、７巻（１９９３年）、３３〜４０頁を参照されたい）。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．およびＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ.、２２７巻（１９９２年）、３８１〜３８８頁；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ.、２２２巻（１９９１年）、５８１〜５９７頁）で作製することもできる。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらによる技法はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製にも利用可能である（Coleら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５年）；およびＢｏｅｒｎｅｒ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻（１９９１年）、８６〜９５頁）。本発明に従うキメラ抗体およびヒト化抗体について既に言及した通り、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語はまた、本発明に従う特性であって、とりわけ、Ｃ１ｑへの結合および／またはＦｃＲへの結合に関する特性を作出するように、例えば、「クラススイッチング」、すなわち、Ｆｃパートの変化または突然変異（例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ４への突然変異、および／またはＩｇＧ１／ＩｇＧ４突然変異）により、定常領域において修飾される抗体も含む。
【０１２８】
本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、ＮＳＯ細胞もしくはＣＨＯ細胞などの宿主細胞、またはヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、あるいは宿主細胞へとトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現させた抗体など、組換え手段により調製するか、発現させるか、創出するか、または単離した、全てのヒト抗体を含むことを意図する。このような組換えヒト抗体は、可変領域および定常領域を、再配列された形態で有する。本発明に従う組換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける体細胞超変異に供されている。こうして、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨおよびＶＬ配列に由来し、これらと類縁であるが、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内で、天然には存在しえない配列である。
【０１２９】
本明細書で使用される「可変ドメイン」（軽鎖（ＶＬ）の可変ドメイン、重鎖（ＶＨ）の可変領域）は、抗体の、標的への結合に直接関与する、軽鎖および重鎖の対の各々を示す。可変ヒト軽鎖および重鎖のドメインは、同じ一般的構造を有し、各ドメインは、その配列が、広く保存され、３つの「超可変領域」（または相補性決定領域、ＣＤＲ）により接続されている、４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域は、βシートコンフォメーションを取り、ＣＤＲは、βシート構造を接続するループを形成しうる。各鎖内のＣＤＲは、フレームワーク領域により、それらの三次元構造に保たれ、他の鎖に由来するＣＤＲと一緒に、標的結合性部位を形成する。抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明に従う抗体の結合特異性／アフィニティーにおいて、特に重要な役割を果たし、したがって、本発明のさらなる目的を提供する。
【０１３０】
本明細書で使用される場合の「超可変領域」または「抗体の標的結合性領域」という用語は、標的への結合の一因となる、抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」領域または「ＦＲ」領域とは、本明細書で規定される超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖および重鎖は、Ｎ末端からＣ末端へと、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。各鎖上のＣＤＲは、このようなフレームワークアミノ酸により隔てられている。とりわけ、重鎖のＣＤＲ３は、標的への結合に最も寄与する領域である。ＣＤＲ領域およびＦＲ領域は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１年）による標準的な規定に従い、決定する。
【０１３１】
「エピトープ」という用語は、抗体への特異的結合が可能な、任意のポリペプチド決定基を含む。ある特定の実施形態では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなど、化学的に活性な表面分子の群を含み、ある特定の実施形態では、特異的な三次元構造特徴および／または特異的な電荷特徴を有しうる。エピトープとは、抗体が結合する、標的の領域である。
【０１３２】
本明細書で使用される「発現」とは、核酸をｍＲＮＡへと転写するプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡ（転写物ともまた称する）を、その後、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質へと翻訳するプロセスを指す。転写物と、コードされたポリペプチドとを、遺伝子産物と総称する。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡに由来する場合、真核細胞内の発現は、ｍＲＮＡのスプライシングを含みうる。
【０１３３】
本発明に従う二特異性抗体は、組換え手段により作製することが好ましい。このような方法は、最先端技術において広く公知であり、原核細胞内および真核細胞内のタンパク質の発現であって、その後における抗体ポリペプチドの単離と、通例、薬学的に許容される純度までの精製とを伴う発現を含む。タンパク質を発現させるためには、標準的な方法により、軽鎖および重鎖またはこれらの断片をコードする核酸を、発現ベクターへと挿入する。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、またはＥ．ｃｏｌｉ細胞のような適切な原核または真核宿主細胞内で実施し、抗体は、細胞（上清または溶解の後における細胞）から回収する。二特異性抗体は、全細胞で、細胞溶解物中、または部分的に精製もしくは実質的に純粋形態で存在しうる。精製は、アルカリ／ＳＤＳ処理、カラムクロマトグラフィー、および当技術分野で周知の他の技法を含む標準的な技法により、他の細胞構成要素または他の夾雑物、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質、を消失させるために実施する。Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７年）を参照されたい。
【０１３４】
ＣＤ１９×ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性（ＴＣＢ）抗体ブリナツモマブについては、再発性／不応性の急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を伴う患者において、最大８０％の奏効率が示されている。ＡＬＬと同様、多発性骨髄腫および他の形質細胞疾患にも、依然として高い医療的必要が存在する。今日利用可能な全ての処置にも拘らず、初回の診断の５年後に、多発性骨髄腫患者のうちの約６０％が、既に死亡している。多発性骨髄腫を伴う患者のための有効な処置が、依然として必要とされている。
【０１３５】
「形質細胞が関与する障害」という用語は、その対応する産物である、モノクローナル免疫グロブリンタンパク質（Ｍ−タンパク質）の血清／血漿レベルの増大を伴う疾患を指す。Ｍ−タンパク質は、重鎖および軽鎖の両方、または１種類の鎖のみからなることができる。形質細胞障害はまた、多発性骨髄腫またはＢＣＭＡを発現する他のＢ細胞障害である。多発性骨髄腫は、骨髄コンパートメントにおける異常形質細胞の単クローン性の拡大および蓄積によって特徴付けられるＢ細胞悪性腫瘍である。多発性骨髄腫また、同じＩｇＧ遺伝子再配列および体細胞超変異を伴う、循環クローン性Ｂ細胞も伴う。多発性骨髄腫は、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）と呼ばれる、無症状性の前悪性状態であって、骨髄形質細胞の低レベルおよび単クローン性タンパク質により特徴付けられる状態から起こる。多発性骨髄腫細胞（ＭＭ細胞）は、低速で増殖する。多発性骨髄腫は、複数の構造的染色体変化（例えば、不均衡型転座）の進行性の発生から生じる。多発性骨髄腫は、悪性形質細胞と、骨髄微小環境（例えば、正常な骨髄間質細胞）との交互的な相互作用を伴う。活動性の多発性骨髄腫の臨床徴候は、単クローン性の抗体スパイク、形質細胞の過密な骨髄、溶解性骨病変、および破骨細胞の過剰刺激から生じる骨破壊（ＤｉｍｏｐｕｌｏｓおよびＴｅｒｐｏｓ、Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ、２０１０年、２１巻、増刊７号：ｖｉｉ１４３〜１５０頁）を含む。形質細胞を伴う別のＢ細胞障害、すなわち、ＢＣＭＡを発現する別のＢ細胞障害は、ループスとしてもまた公知の、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である。ＳＬＥとは、体内の任意のパートに影響を及ぼす可能性があり、免疫系が身体自身の細胞および組織を攻撃することにより表され、その結果として、慢性炎症および組織損傷がもたらされる、全身性の自己免疫疾患である。ＳＬＥは、抗体−免疫複合体が、さらなる免疫応答を誘起し、これを引き起こす、ＩＩＩ型過敏反応である（ＩｎａｋｉおよびＬｅｅ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ、２０１０年；６巻：３２６〜３３７頁）。
【０１３６】
本発明は、好ましくは、多発性骨髄腫の治療法に関する。本発明はまた、さらなる実施形態では、形質細胞が関与する他のＢ細胞障害の治療法に関する。ＢＣＭＡを発現する形質細胞が関与するこのような障害は、ループスとしても公知の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である。ＢＣＭＡを発現する形質細胞が関与するさらなる障害は、抗核抗体（抗ｄｓＤＮＡ抗体）の産生が関与する障害、ループス腎炎およびＲＡ、１型自己免疫肝炎である。形質細胞障害はまた、http://www.merckmanuals.comに従って分類される。
【０１３７】
【表２】
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【０１３８】
多発性骨髄腫は、多発性骨髄腫の国際ステージ分類システム（http://www.cancer.org）に従ってステージ分類することができる。このシステムは、血清ベータ−２ミクログロブリンおよび血清アルブミンレベルのみに基づいて骨髄腫を３つのステージへと分割する：
ステージＩ：血清ベータ−２ミクログロブリンが、３．５（ｍｇ／Ｌ）未満であり、アルブミンレベルが、３．５（ｇ／Ｌ）を上回る。
ステージＩＩ：ステージＩでもＩＩＩでもない、すなわち、ベータ−２ミクログロブリンレベルが、３．５〜５．５の間である（アルブミンレベルは任意）、またはアルブミンが３．５を下回るが、ベータ−２ミクログロブリンは３．５未満であるのいずれかであることを意味する。
ステージＩＩＩ：血清ベータ−２ミクログロブリンが、５．５を超える。
【０１３９】
しかし、このステージ分類システムは、患者が、ＢＣＭＡおよびＣＤ３に特異的に結合する二特異性抗体による治療法に感受性であるか否かに関する暗示をもたらさない。ＢＣＭＡが、形質細胞分化の際に選択的に誘導され、悪性形質細胞において高レベルで発現され（Ryan,  MCら、Mol.  Cancer  Ther.６巻（２００７年）３００９〜３０１８頁；Novak  AJら、Blood.２００４年１月１５日；１０３巻（２号）：６８９〜９４頁、Epub、２００３年９月２５日；Maus  MVおよびJune  CH、Clin  Cancer  Res、２０１３年；１９巻：２０４８〜６０頁）、したがって、自身のＭＭ細胞の表面においてＢＣＭＡを発現する患者は、ＢＣＭＡおよびＣＤ３に特異的に結合する二特異性抗体による治療法に感受性であろうという事実も、有効な治療法に十分ではない。本発明者らは、異なる患者のＭＭ細胞が、ＣＤ３およびＢＣＭＡに対する二特異性抗体による治療法に対して異なった感応性を有することを認識した。次の特徴のうち少なくとも１つ：
−  ＢＣＭＡ発現の測定のための診断用抗体および治療用抗体が、ある程度まで関連していること（ＭＦＩ）
−  多発性骨髄腫についてのＥ：Ｔ比
−  体液試料、特に、患者が多発性骨髄腫を患う場合は骨髄吸引物試料および患者がＳＬＥまたはＲＡを患う場合は滑液における可溶性ＢＣＭＡおよび／またはＡＰＲＩＬの量は、治療法成功に関連性がある。好ましくは、２、３または全４つの特徴が組み合わされる。好ましくは、２、３または全４つの特徴の決定が、本発明に従う処置方法、治療法選択、処置計画選択および見込みを予測することのために組み合わされる。
【０１４０】
「標準用量」という用語は、特に、多発性骨髄腫、エリテマトーデスおよび関節リウマチからなる群から選択される、それぞれの形質細胞障害の処置のためにＦＤＡに承認された毎週の用量を指す。ＦＤＡに承認された用量が、異なる週で異なる場合、「標準用量」という用語（tern）は、それぞれの週における用量を指す。
【０１４１】
「より高い用量で、および／またはより高頻度の処置スケジュールで」という用語は、ＢＣＭＡおよびＣＤ３に特異的に結合する二特異性抗体（好ましくは、ＦＤＡに承認された用量）により処置される以前の患者のために了承／承認された治療計画から始めて、用量が、１．５〜２．０倍、〜２．０倍またはさらには最大１０倍およびそれを超えて増大されること、および／または用量投与間の時間間隔が、１週間に１回投与から１週間に２回へと、またはさらには１週間に３回もしくはさらには１日に１回へと短縮されることを意味する。
【０１４２】
ＢＣＭＡ競合ＢＣＭＡ−Ｔ細胞二特異性抗体へのＡＰＲＩＬ結合が治療法に使用される場合、１００を上回り、１０００ｎｇ／ｍＬに近いＡＰＲＩＬ濃度については、最大８０倍の用量増大が好まれる（表９および図５を参照）。さらに好ましい実施形態では、用量投与間の時間間隔は、１週間に１回投与から１週間に２回またはさらには１週間に３回またはさらには１日に１回へと短縮される。好まれる治療計画は、前記患者の単離された体液試料において、可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれを下回ったか、および／またはＡＰＲＩＬ濃度が、１００ｎｇ／ｍＬよりも低かったことに基づいて選択された、患者において確立された計画である。１００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬおよび／または２．５ｎｇ／ｍＬの可溶性ＢＣＭＡを超える患者におけるＢＣＭＡおよびＣＤ３に特異的に結合する二特異性抗体の使用に好まれる治療法は、用量または用量間隔を適合させることである。これは、１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＰＲＩＬにおいて２．４倍、ただし１０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬにおいては既に８０倍になる、表９におけるＡＰＲＩＬ競合的二特異性抗体による腫瘍細胞の殺滅のＥＣ５０値によって確認される。
【０１４３】
「処置計画」という用語は、標準化された処置計画を指す。本特許出願の文脈において、これは、測定されたパラメータであるＢＣＭＡ発現（ＭＦＩ）、可溶性ＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬおよびＥ：Ｔ比に対する、用量および投薬間隔の適合に関する。与えられるガイダンスは、好ましくは次の通りである：
−  ＭＦＩが５０またはそれ未満の場合、ＴＣＢにより処置しないこと、
−  可溶性ＢＣＭＡが２．５ｎｇ／ｍＬを超える場合、用量／用量スケジュールを適合させること、
−  ＡＰＲＩＬが１００ｎｇ／ｍＬを上回る場合、または単に非競合ＢＣＭＡ−ＴＣＢを採用する場合、用量／用量スケジュールを適合させること、
−  Ｅ：Ｔが０．５：１を下回る場合、Ｔ細胞拡大／増強治療法と組み合わせること。
【０１４４】
「ベースラインを、８０またはそれ超、好ましくは１００またはそれ超、好ましくは２００またはそれ超、さらにより好ましくは３００またはそれ超上回るＭＦＩを示す患者にとって最も有効な処置計画の選択」という用語は、形質細胞が関与する障害を患う新たな患者のための処置計画を選択するための方法であって、
前記二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用することにより、前記患者のＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞におけるＢＣＭＡ発現を決定するステップと、ＭＦＩが、ベースラインを、８０またはそれ超、好ましくは１００またはそれ超上回ると判明した場合、
前記決定方法の結果を利用して、同様の（好ましくは同じ）表現を有する同じ障害を患う以前の患者を検索するステップと、
以前の処置計画における情報に基づき、新たな患者の処置を改善する仕方を決定するために、以前の患者の以前の処置計画を審査するステップと
を含む方法を指す。
【０１４５】
「ベースラインを、８０またはそれ超、好ましくは１００またはそれ超、好ましくは２００またはそれ超、さらにより好ましくは３００またはそれ超上回るＭＦＩを示す患者にとって最も有効な処置計画の選択」という用語は、好ましくは、形質細胞が関与する障害を患う新たな患者のための処置計画を選択するための方法であって、
前記二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用することにより、前記患者のＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞におけるＢＣＭＡ発現を決定するステップと、ＭＦＩが、ベースラインを、８０またはそれ超、好ましくは１００またはそれ超上回ると判明した場合、ＢＣＭＡ−Ｔ細胞二特異性抗体療法により患者を処置するが、ベースラインを、１００未満、好ましくは５０未満、なお好ましくは１０未満しか上回らないＭＦＩにおいては処置しないと考慮するステップ
を含む方法を指す。
【０１４６】
「０．３５：１、好ましくは０．５：１またはそれより高いＥ：Ｔ比を示す患者にとって最も有効な処置計画の選択」という用語は、形質細胞が関与する障害を患う新たな患者のための処置計画を選択するための方法であって、
前記患者の単離された体液試料において、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比（さらにまた、Ｅ：Ｔ比とも称する）が、０．３５：１、好ましくは０．５：１またはそれより高いか否かを決定するステップと、
前記決定方法の結果を利用して、同様の（好ましくは同じ）表現を有する同じ障害を患う以前の患者を検索するステップと、
以前の処置計画における情報に基づき、新たな患者の処置を改善する仕方を決定するために、以前の患者の以前の処置計画を審査するステップと
を含む方法を指す。
【０１４７】
「０．３５：１、好ましくは０．５：１またはそれより高いＥ：Ｔ比を示す患者にとって最も有効な処置計画の選択」という用語は、好ましくは、形質細胞が関与する障害を患う新たな患者のための処置計画を選択するための方法であって、前記患者の単離された体液試料において、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比（さらにまた、Ｅ：Ｔ比とも称する）が、０．３５：１、好ましくは０．５：１またはそれより高いか否かを決定して、比が、０．３５：１、好ましくは０．５：１を下回る場合は、Ｔ細胞増殖性またはＴ細胞化学誘引物質療法との組合せを考慮するステップを含む方法を指す。
【０１４８】
「２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い可溶性ＢＣＭＡ値を示す患者にとって最も有効な処置計画の選択」という用語は、形質細胞が関与する障害を患う新たな患者のための処置計画を選択するための方法であって、
前記患者の単離された体液試料において、可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか否かを決定するステップと、
前記決定方法の結果を利用して、同様の（好ましくは同じ）表現を有する同じ障害を患う以前の患者を検索するステップと、
以前の処置計画における情報に基づき、新たな患者の処置を改善する仕方を決定するために、以前の患者の以前の処置計画を審査するステップと
を含む方法を指す。
【０１４９】
「２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い可溶性ＢＣＭＡ値を示す患者にとって最も有効な処置計画の選択」という用語は、好ましくは、形質細胞が関与する障害を患う新たな患者のための処置計画を選択するための方法であって、前記患者の単離された体液試料において、可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか否かを決定し、続いてより高い用量で、および／またはより高頻度の処置スケジュールで切り換えることを考慮するステップを含む方法を指す。
【０１５０】
「１００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いＡＰＲＩＬ値を示す患者にとって最も有効な処置計画の選択」という用語は、形質細胞が関与する障害を患う新たな患者のための処置計画を選択するための方法であって、
前記患者の単離された体液試料において、ＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか否かを決定するステップと、
前記決定方法の結果を利用して、同様の（好ましくは同じ）表現を有する同じ障害を患う以前の患者を検索するステップと、
以前の処置計画における情報に基づき、新たな患者の処置を改善する仕方を決定するために、以前の患者の以前の処置計画を審査するステップと
を含む方法を指す。
【０１５１】
「１００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いＡＰＲＩＬ値を示す患者にとって最も有効な処置計画の選択」という用語は、好ましくは、形質細胞が関与する障害を患う新たな患者のための処置計画を選択するための方法であって、前記患者の単離された体液試料において、ＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬもしくはそれより高いか否かを決定して、続いてＢＣＭＡへの結合に関してＡＰＲＩＬと競合しないＢＣＭＡ−Ｔ細胞二特異性抗体を使用するか、またはそうでなければより高い用量で、および／もしくはより高頻度の処置スケジュールで切り換えることを考慮するステップを含む方法を指す。
【０１５２】
「患者のＢＣＭＡ関連の形質細胞状態の調査」という用語は、次のものからなる群から選択される１、２、３または全４つの方法による、前記形質細胞の調査に関する:
前記二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用することにより、前記患者のＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞におけるＢＣＭＡ発現を決定し、ＭＦＩが、ベースラインを、８０またはそれ超、好ましくは１００またはそれ超上回ると判明した場合、
前記患者の単離された体液試料において、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比（さらにまた、Ｅ：Ｔ比とも称する）が、０．３５：１、好ましくは０．５：１またはそれより高いか否かを決定すること、
前記患者の単離された体液試料において、可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか否かを決定すること、および
前記患者の単離された体液試料において、ＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか否かを決定すること。
【０１５３】
「Ｔ細胞増殖性療法」という用語は、例えば、組換えサイトカイン（例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）のＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−アルファ；インターロイキン（ＩＬ）のＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１）、共刺激性分子に対するアゴニスト抗体、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１）など、Ｔ細胞の増殖または拡大を誘導する治療的処置または生物学的処置を指し、好ましくは、Ｔ細胞の増殖または拡大は、腫瘍部位に特異的である。
【０１５４】
「Ｔ細胞化学誘引物質療法」という用語は、例えば、ケモカイン（例えば、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ１７、ＩＰ−１０）など、腫瘍部位へのＴ細胞の走化性を誘導する治療的処置または生物学的処置を指す。
【０１５５】
「体液試料」という用語は、ヒト患者の単離された体液を指す。本発明に従う好まれる体液は、骨髄吸引物、血液、血清、血漿、尿、唾液、滑液および髄液である。
【０１５６】
「骨髄吸引物」という用語は、トレフィン生検により回収された試料を指す。骨髄吸引およびトレフィン生検は通常、寛骨または後腸骨稜の背面で行われる。吸引物は、胸骨（胸の骨）から得ることもできる。骨髄吸引は、脛骨（脛の骨）で行うこともできる。多発性骨髄腫の悪性細胞のような形質細胞が関与する障害を患う患者の場合、血液および骨髄吸引物が好まれる体液試料である。多発性骨髄腫を患う患者の場合、本発明に従って、骨髄吸引物を使用することが特に好まれる。
【０１５７】
「血液試料」という用語は、細胞（すなわち、赤血球（erythrocytes  (red  blood  cells)）、白血球（leucocytes  (white  blood  cells)）、血小板（thrombocytes  (platelets)））および血漿を含む血液試料を指す。
【０１５８】
ＳＬＥまたはＲＡを患う患者の場合、血液試料および好ましくは滑液（炎症した関節周囲の流体）が、本発明に従って使用される好まれる体液試料である。
【０１５９】
ループス腎炎および１型自己免疫肝炎を患う患者の場合、血液試料が、本発明に従って使用される好まれる体液試料である。
【０１６０】
「ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞」という用語は、健康個体および多発性骨髄腫を伴う患者における形質細胞を指す。悪性形質細胞は通常、骨髄腫患者の骨髄において、正常形質細胞よりも高い頻度で見出されるため、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞は、多発性骨髄腫を伴う患者を参照する場合、この発現プロファイルの骨髄腫細胞として考慮することができる。ＣＤ３８は、形質細胞において発現される抗原である。形質細胞は、ＣＤ１３８（すなわち、シンデカン−１）を発現する骨髄における唯一の細胞であるため、このマーカーを使用して、この集団を識別および単離することができる。骨髄腫細胞の免疫表現型は、無処置および有処置患者の間で有意に異ならないため、ＣＤ１３８抗原は、両方の患者群における分析に使用することができる。好ましくは、ＣＤ１３８＋細胞が最初にゲーティングされ、続いてＣＤ３８を使用したその後の選択が行われる。「正常」形質細胞および「悪性」形質細胞（すなわち、骨髄腫細胞）の間を区別するために、ＣＤ５６およびＣＤ１９抗原は、免疫表現型分析において含めるのに有用なマーカーである。フローサイトメトリーによってＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋として識別された形質細胞の集団から、ＣＤ１９＋ＣＤ５６−による細胞の再ゲーティングは、正常形質細胞を指し、ＣＤ１９−ＣＤ５６＋によるものは、悪性形質細胞を指す（Rawstron  ACら、Report  of  the  European  Myeloma  Network  on  multiparametric  flow  cytometry  in  multiple  myeloma  and  related  disorders.、Haematologica.、２００８年；９３巻：４３１〜４３８頁およびTae-Dong  Jeongら、Korean  J  Hematol.、２０１２年１２月；４７巻（４号）：２６０〜２６６頁）。
【０１６１】
「標的細胞」という用語は、その表面においてＢＣＭＡを発現する細胞を指す。患者が、多発性骨髄腫を患っている場合、前記細胞は、多発性骨髄腫形質細胞である。患者が、ＳＬＥまたはＲＡを患っている場合、前記細胞は、抗核抗体を分泌する細胞、好ましくは抗核抗体を分泌する形質細胞である。好ましくは、標的細胞は、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞である。
【０１６２】
「エフェクター細胞」という用語は、腫瘍細胞（例えば、悪性形質細胞または骨髄腫細胞）の細胞傷害性、細胞死またはアポトーシスを誘導することができる細胞または細胞群を指し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、好ましくはＣＤ３＋Ｔ細胞を指す。
【０１６３】
「ＣＤ３＋細胞またはＣＤ３＋Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ３が陽性である細胞を指す。Ｔ細胞はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が陽性であり、ＴＣＲの表面発現によって識別することもできる。Ｔ細胞はまた、ＣＤ４５が陽性であり、ＣＤ１９およびＣＤ５６が陰性であり、したがって、ＣＤ４５の表面発現ならびにＣＤ１９（陰性）およびＣＤ５６（陰性）の陰性の決定によって識別することもできる。エフェクター細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１９７−ナイーブＴ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１９７−ＣＤ４＋ナイーブＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１９７−ＣＤ８＋ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−メモリーＴ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４＋メモリーＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ８＋メモリーＣＤ８  Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１９７＋セントラルメモリーＴ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１９７＋ＣＤ４＋セントラルメモリーＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１９７＋ＣＤ８＋セントラルメモリーＣＤ８、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１９７−エフェクターメモリーＴ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１９７−ＣＤ４＋エフェクターメモリーＣＤ４  Ｔ細胞；ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１９７−ＣＤ８＋エフェクターメモリーＣＤ８  Ｔ、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１９７−エフェクターＴ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１９７−ＣＤ４＋エフェクターＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１９７−ＣＤ８＋エフェクターＣＤ８  Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏ調節性Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＰＤ−１−非消耗（non-exhausted）Ｔ細胞およびＣＤ３＋ＰＤ−１−Ｔｉｍ−３−非消耗Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ３＋細胞として識別することもできる。
【０１６４】
「相対蛍光強度中央値または平均蛍光強度ＭＦＩとして決定されるベースライン」という用語は、本発明に従った決定のために使用されるＦＡＣＳ機器に関して定義されるベースラインに関する。ベースラインは、参照としてのＴ細胞のＭＦＩによって定義される。
【０１６５】
「可溶性ＢＣＭＡ」という用語は、患者の流体試料中に存在するＢＣＭＡを指す。好ましくは、酵素結合免疫吸着測定法が、体液試料、好ましくは血清、好ましくは血漿中のＢＣＭＡ濃度の決定のために使用される。好ましくは、アッセイは、ヒトＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ−ＲまたはＴＡＣＩと交差反応しない。
【０１６６】
「可溶性ＡＰＲＩＬの量の測定」という用語は、好ましくは、ＥＬＩＳＡ方法の使用によるものを指す。
【０１６７】
さらなる実施形態では、本発明は、自己免疫疾患の処置における使用のための、ＣＤ３εおよびＢＣＭＡに対する二特異性抗体に関する。本発明は、このような処置に対する患者の応答性を決定する方法および関連する診断アッセイを提供する。
【０１６８】
さらなる実施形態では、本発明は、多発性骨髄腫の処置における使用のための、ＣＤ３εおよびＢＣＭＡに対する二特異性抗体に関する。本発明は、このような処置に対する患者の応答性を決定する方法および関連する診断アッセイを提供する。
【０１６９】
本発明のあらゆる実施形態は、ヒトの治療法および診断の分野に関する。
【０１７０】
以下では、本発明の具体的な実施形態を列挙する：
【０１７１】
実施形態１．  形質細胞が関与する障害を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢＣＭＡ（さらにまた、「ＢＣＭＡ」とも称する）の細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）に特異的に結合する二特異性抗体であって、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む前記患者の単離された体液試料において、前記二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用することによって測定される、前記ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞におけるＢＣＭＡ発現が、相対蛍光強度中央値または平均蛍光強度ＭＦＩとして決定されるベースラインを、１００またはそれ超、好ましくは２００またはそれ超、さらにより好ましくは３００またはそれ超上回る二特異性抗体。
【０１７２】
実施形態２．  前記二特異性抗体および前記抗ＢＣＭＡ抗体が、ＢＣＭＡ結合に関して一価であることを特徴とする、実施形態１に従う使用のための二特異性抗体。
【０１７３】
実施形態３．  前記二特異性抗体および前記抗ＢＣＭＡ抗体が、ＢＣＭＡ結合に関して二価であることを特徴とする、実施形態１に従う使用のための二特異性抗体。
【０１７４】
実施形態４．  前記二特異性抗体および前記抗ＢＣＭＡ抗体が、ＢＣＭＡ結合に関して三価であることを特徴とする、実施形態１に従う使用のための二特異性抗体。
【０１７５】
実施形態５．  前記二特異性抗体が、その重鎖および軽鎖ＣＤＲとして、前記抗ＢＣＭＡ抗体と同じアミノ酸配列のＣＤＲを含むことを特徴とする、実施形態１から４のいずれか１つに従う使用のための二特異性抗体。
【０１７６】
実施形態６．  前記二特異性抗体が、その重鎖および軽鎖可変領域として、前記抗ＢＣＭＡ抗体と同じアミノ酸配列の可変領域を含むことを特徴とする、実施形態１から５のいずれか１つに従う使用のための二特異性抗体。
【０１７７】
実施形態７．  形質細胞が関与する障害を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記患者の単離された体液試料において、Ｔ細胞のエフェクター細胞に対する比（Ｅ：Ｔ比）が、０．３５：１、好ましくは０．５：１またはそれ超である二特異性抗体。
【０１７８】
実施形態８．  形質細胞が関与する障害を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記処置が、
ｉ）前記患者から、体液試料を単離するステップと、
ｉｉ）前記試料における可溶性ＢＣＭＡの量を測定するステップと、
ｉｉｉ）前記試料における可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い場合、また、
ｉｖ）前記患者試料における前記可溶性ＢＣＭＡが、前記二特異性抗体に特異的に結合する場合、第１の用量に関してより高い用量で、または前記二特異性抗体の第１の用量および第２の用量の間のより短い期間もしくは前記二特異性抗体の第１の用量および第３の用量の間のより短い期間による、より高頻度の処置スケジュールで、前記二特異性抗体により前記患者を処置するステップと
を連続的に含む二特異性抗体。
【０１７９】
実施形態９．  ヒトＢＣＭＡ受容体への結合に関して可溶性ＢＣＭＡと競合する、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記抗体が、ＢＣＭＡへの結合に関してＡＰＲＩＬと競合するか、そしい／またはＮＦ−κＢのＡＰＲＩＬ媒介性活性化を遮断する、形質細胞が関与する障害を患う患者の処置における使用のための二特異性抗体であり、前記処置が、
ｉ）前記患者から、形質細胞およびＴ細胞を含む体液試料を単離するステップと、
ｉｉ）ＥＬＩＳＡ方法の使用により、前記試料におけるＡＰＲＩＬの量を測定するステップと、
ｉｉｉ）前記患者試料におけるＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬを超える場合、１００ｎｇ／ｍＬを下回る可溶性ＡＰＲＩＬ濃度を有する患者に推奨される用量と比較して、１００ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬ濃度においては５０％〜１００％より高い用量で、１０００ｎｇ／ｍＬ  ＡＰＲＩＬ濃度を上回る場合は２倍を超えて最大８０倍高い用量で、前記二特異性抗体により前記患者を処置するステップ、またはより高い前記用量に達するようにそれぞれのより高頻度の処置スケジュールにより、前記二特異性抗体のいずれか２用量間のより短い期間で前記患者を処置するステップと
を連続的に含む二特異性抗体。
【０１８０】
実施形態１０．  形質細胞が関与する障害を患う患者のＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む単離された体液試料におけるＢＣＭＡタンパク質発現を決定する方法であって、前記患者の処置における使用に意図される、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用することによって、前記ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞におけるＢＣＭＡ発現を測定するステップと、相対蛍光強度中央値または平均蛍光強度ＭＦＩが、ベースラインを、８０またはそれ超、好ましくは１００またはそれ超、好ましくは２００またはそれ超、さらにより好ましくは３００またはそれ超上回るから否かを決定するステップとを含む方法。
【０１８１】
実施形態１１．  形質細胞が関与する障害を患う患者を処置する方法であって、前記患者の処置における使用に意図される、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用することによって、前記患者由来のＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む単離された体液試料を、前記ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞におけるＢＣＭＡ発現に関して分析するステップと、相対蛍光強度中央値または平均蛍光強度ＭＦＩが、ベースラインを、８０またはそれ超、好ましくは１００またはそれ超、好ましくは２００またはそれ超上回る、さらにより好ましくは３００またはそれ超上回る場合、前記二特異性抗体により前記患者を処置するステップとを含む方法。
【０１８２】
実施形態１２．  形質細胞が関与する障害を患う患者にとって最も有効な処置計画を選択するための方法であって、前記患者の単離された体液試料が、ベースラインを、８０またはそれ超、好ましくは１００またはそれ超、好ましくは２００またはそれ超、さらにより好ましくは３００またはそれ超上回るＢＣＭＡのＭＦＩを示す方法。
【０１８３】
実施形態１３．  形質細胞が関与する障害を患う患者が、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体による処置に応答する見込みを予測するための方法であって、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む前記患者の単離された体液試料における、前記二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用することによって測定される、相対蛍光強度中央値または平均蛍光強度ＭＦＩとして決定されるベースラインを、８０またはそれ超、好ましくは１００またはそれ超、好ましくは２００またはそれ超、さらにより好ましくは３００またはそれ超上回る細胞表面ＢＣＭＡ発現が、前記処置に応答する患者の見込みを予測する方法。
【０１８４】
実施形態１４．  単離された体液試料における細胞表面ＢＣＭＡ発現を決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する治療用二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用して、前記ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞の相対蛍光強度中央値または平均蛍光強度ＭＦＩが、ベースラインを、８０またはそれ超、好ましくは１００またはそれ超、好ましくは２００またはそれ超、さらにより好ましくは３００またはそれ超上回るか否かを決定するステップを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【０１８５】
実施形態１５．  形質細胞が関与する障害を患う患者の処置に最も有効な処置計画を選択するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、前記患者に関して、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する治療用二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用することによって測定される、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む単離された体液試料における細胞表面ＢＣＭＡ発現が、相対蛍光強度中央値または平均蛍光強度ＭＦＩとして決定されるベースラインを、８０またはそれ超、好ましくは１００またはそれ超上回り、処置計画が、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する治療用二特異性抗体の使用を伴うｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【０１８６】
実施形態１６．  形質細胞が関与する障害を患う患者を処置するための治療法を選択するための方法であって、治療法が、
ｉ）ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する治療用二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用することによって測定される、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む単離された体液試料における細胞表面ＢＣＭＡ発現が、相対蛍光強度中央値もしくは平均蛍光強度ＭＦＩとして決定されるベースラインを、１００もしくはそれ超、好ましくは２００もしくはそれ超、さらにより好ましくは３００もしくはそれ超上回る場合、前記治療用抗体により前記患者を処置するステップ、または
ｉｉ）ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する治療用二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用することによって測定される、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む単離された体液試料もしくは単離された血液試料における細胞表面ＢＣＭＡ発現が、相対蛍光強度中央値もしくは平均蛍光強度ＭＦＩとして決定されるベースラインを、１００未満、好ましくは５０未満、なお好ましくは１０未満しか上回らない場合、前記治療用抗体により前記患者を処置しないステップ
を含む方法。
【０１８７】
実施形態１７．  形質細胞が関与する障害を患う患者の単離された体液試料において、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比が、０．３５：１、好ましくは０．５：１またはそれより高い、好ましくは１：１またはそれより高い、より好ましくは５：１またはそれより高い、さらにより好ましくは１０：１またはそれより高いか否かを決定するための方法。
【０１８８】
実施形態１８．  形質細胞が関与する障害を患う患者を処置する方法であって、前記患者の単離された体液試料において、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比が、０．３５：１、好ましくは０．５：１またはそれより高い、好ましくは１：１またはそれより高い、より好ましくは５：１またはそれより高い、さらにより好ましくは１０：１またはそれより高いか分析するステップを含み、前記処置が、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する治療用二特異性抗体の使用を伴う方法。
【０１８９】
実施形態１９．  単離された体液試料において、０．３５：１、好ましくは０．５：１またはそれより高い、好ましくは１：１またはそれより高い、より好ましくは５：１またはそれより高い、さらにより好ましくは１０：１またはそれより高い、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比を示す、形質細胞が関与する障害を患う患者にとって最も有効な処置計画を選択するための方法であって、前記処置計画が、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する治療用二特異性抗体の使用を伴う方法。
【０１９０】
実施形態２０．  形質細胞が関与する障害を患う患者にとって最も有効な処置計画を選択するための方法であって、
ｉ）前記患者の単離された体液試料において、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比が、０．３５：１、好ましくは０．５：１またはそれより高い、好ましくは１：１またはそれより高い、より好ましくは５：１またはそれより高い、さらにより好ましくは１０：１またはそれより高い場合、単独療法において、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する治療用二特異性抗体により前記患者を処置し、
ｉｉ）前記患者の単離された体液試料において、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比が、０．３５：１よりも低い、好ましくは０．５：１、好ましくは０．２５：１よりも低い場合、Ｔ細胞増殖性療法またはＴ細胞化学誘引物質療法と組み合わせて、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する治療用二特異性抗体により前記患者を処置する
方法。
【０１９１】
実施形態２１．  前記患者の単離された体液試料において、処置に応答する患者の見込みを予測する、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比が、０．３５：１、好ましくは０．５：１またはそれより高い、好ましくは１：１またはそれより高い、より好ましくは５：１またはそれより高い、さらにより好ましくは１０：１またはそれより高いか測定することにより、形質細胞が関与する障害を患う患者が、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体による処置に応答する見込みを予測するための方法。
【０１９２】
実施形態２２．  形質細胞が関与する障害を患う患者の単離された体液試料において、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比が、０．３５：１、好ましくは０．５：１またはそれより高い、好ましくは１：１またはそれより高い、より好ましくは５：１またはそれより高い、さらにより好ましくは１０：１またはそれより高いか否かを決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【０１９３】
実施形態２３．  形質細胞が関与する障害を患う患者の処置に最も有効な処置計画を選択するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、前記患者の単離された体液試料において、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比が、０．３５：１、好ましくは０．５：１またはそれより高い、好ましくは１：１またはそれより高い、より好ましくは５：１またはそれより高い、さらにより好ましくは１０：１またはそれより高いと決定され、処置計画が、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する治療用二特異性抗体の使用を伴うｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【０１９４】
実施形態２４．  形質細胞が関与する障害を患う患者のために、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体による治療法を選択するための方法であって、
ｉ）前記患者の単離された体液試料において、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比が、０．３５：１、好ましくは０．５：１もしくはそれより高い、好ましくは１：１もしくはそれより高い、より好ましくは５：１もしくはそれより高い、さらにより好ましくは１０：１もしくはそれより高い場合、前記治療用抗体により前記患者を処置するステップ、または
ｉｉ）前記患者の単離された体液試料において、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞に対するＣＤ３＋細胞の比が、０．３５：１よりも低い、好ましくは０．５：１、好ましくは０．２５：１よりも低い場合、Ｔ細胞増殖性療法もしくはＴ細胞化学誘引物質療法と組み合わせて、前記患者を処置するステップ
を含む方法。
【０１９５】
実施形態２５．  形質細胞が関与する障害を患う患者のＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む単離された体液試料において、前記試料における可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか、さらにより好ましくは２５０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか否かを決定する方法。
【０１９６】
実施形態２６．  形質細胞が関与する障害を患う患者を処置する方法であって、単離された体液試料における可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか、さらにより好ましくは２５０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか否かを決定するステップを含む方法。
【０１９７】
実施形態２７．  形質細胞が関与する障害を患う患者が、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体による処置に応答する見込みを予測するための方法であって、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、さらにより好ましくは２５０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い単離された体液試料における可溶性ＢＣＭＡの量が、処置に応答する患者の見込みを予測する方法。
【０１９８】
実施形態２８．  形質細胞が関与する障害を患う患者の単離された体液試料において、前記試料における可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか、さらにより好ましくは２５０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか否かを決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【０１９９】
実施形態２９．  単離された体液試料において、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、さらにより好ましくは２５０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い可溶性ＢＣＭＡの量を示す、形質細胞が関与する障害を患う患者にとって最も有効な処置を選択するための方法であって、処置が、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体の使用を伴う方法。
【０２００】
実施形態３０．  単離された体液試料における可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、さらにより好ましくは２５０ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか否かを決定することにより、形質細胞が関与する障害を患う患者の処置に最も有効な処置計画を選択するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、処置計画が、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体の使用を伴うｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【０２０１】
実施形態３１．  形質細胞が関与する障害を患う患者を処置するための治療法を選択するための方法であって、治療法が、
ｉ）前記患者の単離された体液試料において、可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬよりも低い場合、前記治療用抗体により前記患者を処置するステップ、あるいは
ｉｉ）前記試料における可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高く、
前記患者試料における前記可溶性ＢＣＭＡが、前記二特異性抗体に結合しない場合、前記治療用抗体により前記患者を処置するステップ、あるいは
ｉｉｉ）前記試料における可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高く、前記患者試料における前記可溶性ＢＣＭＡが、前記二特異性抗体に特異的に結合する場合、第１の用量に関してより高い用量で、または前記二特異性抗体の第１の用量および第２の用量の間のより短い期間もしくは前記二特異性抗体の第１の用量および第３の用量の間のより短い期間による、より高頻度の処置スケジュールで、前記二特異性抗体により前記患者を処置するステップ
を含む方法。
【０２０２】
実施形態３２．  形質細胞が関与する障害を患う患者のＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む単離された体液試料において、前記試料における可溶性ＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか、好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか否かを決定する方法。
【０２０３】
実施形態３３．  形質細胞が関与する障害を患う患者であって、前記患者の単離された体液試料において、可溶性ＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いと診断された患者を、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体により処置する方法であって、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体の使用を伴うことを特徴とする方法。
【０２０４】
実施形態３４．  単離された体液試料において、１００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い可溶性ＡＰＲＩＬの量を示す、形質細胞が関与する障害を患う患者にとって最も有効な処置計画を選択するための方法であって、前記処置計画が、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体の使用を伴うことを特徴とする方法。
【０２０５】
実施形態３５．  形質細胞が関与する障害を患う患者が、ＢＣＭＡおよびＣＤ３に特異的に結合する二特異性抗体による処置に応答する見込みを予測するための方法であって、前記患者の単離された体液試料において、１００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い可溶性ＡＰＲＩＬの量が、処置に応答する患者の見込みを予測する方法。
【０２０６】
実施形態３６．  形質細胞が関与する障害を患う患者の単離された体液試料において、前記試料における可溶性ＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか否かを決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【０２０７】
実施形態３７．  前記試料における可溶性ＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高い、好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いか否かを決定することにより、形質細胞が関与する障害を患う患者の処置に最も有効な処置計画を選択するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、処置計画が、ＡＰＲＩＬ競合的二特異性抗体またはＡＰＲＩＬ非競合的二特異性抗体の使用を伴うｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【０２０８】
実施形態３８．  形質細胞が関与する障害を患う患者を処置するための治療法を選択するための方法であって、治療法が、
ｉ）前記患者の単離された体液試料において、可溶性ＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬもしくはそれを下回る場合、ＡＰＲＩＬ競合的二特異性抗体もしくはＡＰＲＩＬ非競合的二特異性抗体により前記患者を処置するステップ、または
ｉｉ）前記試料における可溶性ＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬもしくはそれより高い場合、ＡＰＲＩＬ非競合的二特異性抗体により前記患者を処置するステップ
を含む方法。
【０２０９】
実施形態３９．  形質細胞が関与する障害を患う患者を処置する方法であって、前記患者試料におけるＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬを超える場合、１００ｎｇ／ｍＬを下回る可溶性ＡＰＲＩＬ濃度を有する患者に推奨される用量と比較して、１００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬ濃度においては２倍高い用量で、ＡＰＲＩＬ濃度が、１０００ｎｇ／ｍＬまで増大する場合は最大８０倍高いさらに増大された用量で前記二特異性抗体により前記患者を処置するか、またはより高い前記用量に達するようにそれぞれのより高頻度の処置スケジュールにより、前記二特異性抗体のいずれか２用量間のより短い期間で前記患者を処置することを特徴とする方法。
【０２１０】
実施形態４０．  形質細胞が関与する障害を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記患者試料におけるＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬを超える場合、１００ｎｇ／ｍＬを下回る可溶性ＡＰＲＩＬ濃度を有する患者に推奨される用量と比較して、１００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬ濃度においては２倍高い用量で、ＡＰＲＩＬ濃度が、１０００ｎｇ／ｍＬまで増大する場合は最大８０倍高いさらに増大された用量で、前記二特異性抗体により前記患者を処置するか、またはより高い前記用量に達するようにそれぞれのより高頻度の処置スケジュールにより、前記二特異性抗体のいずれか２用量間のより短い期間で前記患者を処置することを特徴とする二特異性抗体。
【０２１１】
実施形態４１．  形質細胞が関与する障害を患う新たな患者のための処置計画を決定するための方法であって、
少なくとも１種の調査方法を利用して、前記新たな患者のＢＣＭＡ関連の形質細胞状態を提供するステップと、
１種の方法の少なくとも結果を利用して、少なくとも１種の同様の表現を有する同じ障害を患う以前の患者のための以前の処置計画を検索するステップと、
少なくとも１種の以前の処置計画における情報に基づき、新たな患者の処置を改善する仕方を決定するために、以前の患者の以前の処置計画を審査するステップとを含み、
処置計画が、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体の使用、その用量、ならびに前記二特異性抗体の少なくとも第１の用量および第２の用量の間の期間にわたる処置スケジュールを伴う方法。
【０２１２】
実施形態４２．  細胞表面ＢＣＭＡ発現の決定に使用するためのキットであって、１種はＣＤ１３８に、１種はＣＤ３８に、１種はＣＤ１９に、１種は、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する治療用二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値で抗ＢＣＭＡ抗体に特異的に結合する、４種の標識抗体をあらかじめ充填したバイアルまたはチューブを含むキット。
【０２１３】
実施形態４３．  Ｅ：Ｔ比の決定に使用するためのキットであって、１種はＣＤ１３８に、１種はＣＤ３８に、１種はＣＤ１９に、１種はＣＤ３に特異的に結合する、悪性ＰＣおよびＴ細胞を検出するための４種の標識抗体をあらかじめ充填したバイアルまたはチューブを含むキット。
【０２１４】
実施形態４４．  可溶性ＢＣＭＡの決定に使用するためのキットであって、捕捉抗体としてのポリクローナル抗ＢＣＭＡ抗体と、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する治療用二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する検出抗ＢＣＭＡ抗体とを含むキット。
【０２１５】
実施形態４５．  実施形態４１．形質細胞が関与する障害を患う新たな患者のための処置計画を決定するための方法であって、少なくとも１種の方法を利用して、前記新たな患者のＢＣＭＡ媒介性形質細胞状態を提供するステップと、それに基づき、用量または処置スケジュールを適合させることにより、ＢＣＭＡ−Ｔ細胞二特異性抗体に、了承／承認された治療法を適合させるステップとを含む方法。
【０２１６】
実施形態４６．  多発性骨髄腫疾患を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢ細胞成熟抗原（さらにまた、「ＢＣＭＡ」とも称する）の細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）に特異的に結合する二特異性抗体であって、前記疾患が、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む前記患者の単離された体液試料において、前記二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍であるＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用することによって測定される、前記ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞におけるＢＣＭＡ発現が、相対蛍光強度中央値または平均蛍光強度ＭＦＩとして決定されるベースラインを、８０またはそれ超上回ることを特徴とする二特異性抗体。
【０２１７】
実施形態４７．  多発性骨髄腫疾患を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記疾患が、前記患者の単離された体液試料において、標的細胞に対するＴ細胞（エフェクター細胞）の比（Ｅ：Ｔ比）が、０．３５：１であることを特徴とする二特異性抗体。
【０２１８】
実施形態４８．  多発性骨髄腫疾患を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記疾患が、前記患者由来の単離された体液試料において、可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高く、前記患者試料における前記可溶性ＢＣＭＡが、前記二特異性抗体に特異的に結合することを特徴とし、前記二特異性抗体による前記患者の前記処置が、より高い用量で、および／またはより高頻度の処置スケジュールで行われることを特徴とする二特異性抗体。
【０２１９】
実施形態４９．  多発性骨髄腫疾患を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記疾患が、前記患者由来の単離された体液試料において、可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高く、前記患者試料における前記可溶性ＢＣＭＡが、前記二特異性抗体に特異的に結合することを特徴とし、前記二特異性抗体による前記患者の前記処置が、第１の用量に関してより高い用量で、または前記二特異性抗体の第１の用量および第２の用量の間のより短い期間もしくは前記二特異性抗体の第１の用量および第３の用量の間のより短い期間による、より高頻度の処置スケジュールで行われることを特徴とする二特異性抗体。
【０２２０】
実施形態５０．  多発性骨髄腫疾患を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢＣＭＡ受容体への結合に関して可溶性ＢＣＭＡと競合するか、そして／またはＮＦ−κＢのＡＰＲＩＬ媒介性活性化を遮断する、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記疾患が、前記患者由来の単離された体液試料において、ＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬを超えることを特徴とし、前記二特異性抗体による前記患者の前記処置が、より高い用量で、および／またはより高頻度の処置スケジュールで行われることを特徴とする二特異性抗体。
【０２２１】
実施形態５１．  ヒトＢＣＭＡ受容体への結合に関して可溶性ＢＣＭＡと競合する、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記抗体がＢＣＭＡへの結合に関してＡＰＲＩＬと競合し、それによって前記抗体がＢＣＭＡへの結合に関してＡＰＲＩＬと競合するか、前記抗体がＢＣＭＡへの結合に関してＡＰＲＩＬと競合し、そして／またはＮＦ−κＢのＡＰＲＩＬ媒介性活性化を遮断する、多発性骨髄腫疾患を患う患者の処置における使用のための二特異性抗体であり、前記疾患が、形質細胞およびＴ細胞を含む前記患者の単離された体液試料において、ＡＰＲＩＬの量が、１００ｎｇ／ｍＬを超えることを特徴とし、１００ｎｇ／ｍＬを下回る可溶性ＡＰＲＩＬ濃度を有する患者に推奨される用量と比較して、１００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬ濃度においては２倍高い用量で、ＡＰＲＩＬ濃度が、１０００ｎｇ／ｍＬまで増大する場合は最大８０倍高いさらに増大された用量で、前記二特異性抗体により前記患者を処置するか、またはより高い前記用量に達するようにそれぞれのより高頻度の処置スケジュールにより、前記二特異性抗体のいずれか２用量間のより短い期間で前記患者を処置することを特徴とする二特異性抗体。
【０２２２】
実施形態５２．  多発性骨髄腫疾患を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢ細胞成熟抗原（さらにまた、「ＢＣＭＡ」とも称する）の細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）に特異的に結合する二特異性抗体であって、前記疾患が、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞を含む前記患者の単離された体液試料において、前記二特異性抗体の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＫｄ値の０．７０〜１．３倍のＫｄ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を使用することによって測定される、前記ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞におけるＢＣＭＡ発現が、相対蛍光強度中央値または平均蛍光強度ＭＦＩとして決定されるベースラインを、８０またはそれ超上回ることを特徴とする二特異性抗体。
【０２２３】
実施形態５２．  多発性骨髄腫疾患を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記疾患が、前記患者の単離された体液試料において、標的細胞に対するＴ細胞（エフェクター細胞）の比（Ｅ：Ｔ比）が、０．３５：１またはそれより高いことを特徴とする二特異性抗体。
【０２２４】
実施形態５４．  Ｅ：Ｔ比が、０．３５：１〜２２：１であることを特徴とする、実施形態５２に従う使用のための二特異性抗体。
【０２２５】
実施形態５５．  多発性骨髄腫疾患を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン、およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記疾患が、前記患者由来の単離された体液試料において、可溶性ＢＣＭＡの量が、２．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより高く、前記患者試料における前記可溶性ＢＣＭＡが、前記二特異性抗体に特異的に結合することを特徴とし、前記二特異性抗体による前記患者の前記処置が、１．５倍から最大１０倍である１週間当たりの用量で行われるか、または／および用量投与間の時間間隔が、標準用量と比較して、１週間に１回投与から最大１日に１回までに短縮されることを特徴とする二特異性抗体。
【０２２６】
実施形態５６．  前記二特異性抗体による前記患者の前記処置が、標準用量と比較して、１．５倍から最大２．０倍である１週間当たりの用量で行われることを特徴とする、実施形態５５に記載の使用のための二特異性抗体。
【０２２７】
実施形態５７．  前記二特異性抗体による前記患者の前記処置が、用量投与間の時間間隔が、前記標準用量と比較して、１週間に１回投与から最大１週間に２回まで短縮されて行われることを特徴とする、実施形態５５に記載の使用のための二特異性抗体。
【０２２８】
実施形態５８．  多発性骨髄腫疾患を患う患者の処置における使用のための、ヒトＢＣＭＡ受容体への結合に関して可溶性ＢＣＭＡと競合する、および／またはＮＦ−κＢのＡＰＲＩＬ媒介性活性化を遮断する、ＢＣＭＡおよびＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、前記疾患が、前記患者由来の単離された体液試料において、ＡＰＲＩＬの量が、１０ｎｇ／ｍＬよりも高く、最大１００ｎｇ／ｍＬであることを特徴とし、前記二特異性抗体による前記患者の前記処置が、１週間につき、１．５倍から最大２０倍の用量で行われる、または／および用量投与間の時間間隔が、標準用量と比較して、１週間に１回投与から最大１日に１回までに短縮されることを特徴とする二特異性抗体。
【０２２９】
実施形態５９．  前記二特異性抗体による前記患者の前記処置が、標準用量と比較して、１．５倍から最大３．０倍である１週間当たりの用量で行われることを特徴とする、実施形態５８に記載の使用のための二特異性抗体。
【０２３０】
実施形態６０．  前記二特異性抗体による前記患者の前記処置が、用量投与間の時間間隔が、前記標準用量と比較して、１週間に１回投与から最大１週間に３回までに短縮されて行われることを特徴とする、実施形態５８に記載の使用のための二特異性抗体。
【０２３１】
材料および一般的方法
細胞培養技法
Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００年）、Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．、Ｄａｓｓｏ，Ｍ．、Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｊ．Ｂ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．、およびＹａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．（編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．において記載されている、標準的な細胞培養技法を使用する。
【０２３２】
ＰＢＭＣからの初代ヒト汎Ｔ細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により、地域の血液バンク、または健常ヒトドナーに由来する採取したての血液から得られる、富化されたリンパ球調製物（軟膜）から調製した。略述すると、血液を、滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ、Ｈ８８８９）にわたり、注意深く層化させた。４５０×ｇ、室温で３０分間遠心分離の後（ブレーキをオフに切り替える）、ＰＢＭＣを含有する相間部の上方の血漿部分を廃棄した。ＰＢＭＣを、新しい５０ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎチューブへと移し、チューブを、ＰＢＳで、５０ｍｌの総容量まで満たした。混合物を、４００×ｇ、室温で１０分間遠心分離した（ブレーキをオンに切り替える）。上清を廃棄し、ＰＢＭＣペレットを、滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（３５０×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離ステップ）。結果として得られるＰＢＭＣ集団を、自動的にカウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、アッセイ開始まで、インキュベーター内、３７℃、５％のＣＯ２、１０％のＦＣＳ、および１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で保存した。
【０２３３】
ＰＢＭＣからのＴ細胞の富化は、製造元の指示書に従い、Ｐａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ型番１３０−０９１−１５６）を使用して実施した。略述すると、細胞ペレットを、細胞１０００万個当たり４０μｌの低温緩衝液（滅菌濾過された、０．５％のＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡを伴うＰＢＳ）中で希釈し、細胞１０００万個当たり１０μｌのビオチン−抗体カクテルと共に、４℃で１０分間インキュベートした。細胞１０００万個当たり３０μｌの低温緩衝液および２０μｌの抗ビオチン磁気ビーズを添加し、混合物を、４℃でさらに１５分間インキュベートした。現行容量の１０〜２０倍容量を添加することにより、細胞を洗浄し、その後、３００×ｇで１０分間遠心分離ステップにかけた。最大１億個の細胞を、５００μｌの緩衝液中に再懸濁させた。標識されていないヒト汎Ｔ細胞の磁気による分離は、製造元の指示書に従い、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ型番１３０−０４２−４０１）を使用して実施した。結果として得られるＴ細胞集団を、自動的にカウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、アッセイ開始まで、インキュベーター内、３７℃、５％のＣＯ２、ＡＩＭ−Ｖ培地中で保存した（２４時間より長くない）。
【０２３４】
ＰＢＭＣからの初代ヒトナイーブＴ細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により、地域の血液バンク、または健常ヒトドナーに由来する採取したての血液から得られる、富化されたリンパ球調製物（軟膜）から調製した。ＰＢＭＣからのＴ細胞の富化は、製造元の指示書に従い、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（型番１３０−０９３−２４４）製のＮａｉｖｅ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して実施したが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の最後の単離ステップは省略した（初代ヒト汎Ｔ細胞の単離についての記載もまた参照されたい）。
【０２３５】
ＢＣＭＡ陽性ヒト骨髄腫細胞系
ＢＣＭＡ陽性ヒト骨髄腫細胞系（ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＲＰＭＩ−８２２６、Ｕ２６６Ｂ１およびＬ−３６３）を使用した。ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞（（Ｈ９２９）ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−９０６８（商標））を、１０〜２０％の熱不活化ＦＣＳを伴い、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および５０μＭのメルカプトエタノールを含有する場合もある、８０〜９０％のＲＰＭＩ  １６４０中で培養した。ＲＰＭＩ−８２２６細胞（（ＲＰＭＩ）ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５（商標））を、９０％のＲＰＭＩ  １６４０、および１０％の熱不活化ＦＣＳを含有する培地中で培養した。Ｕ２６６Ｂ１（（Ｕ２６６）ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−１９６（商標））細胞を、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、４５００ｍｇ／Ｌのグルコース、および１５００ｍｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、および１５％の熱不活化ＦＣＳを含有するように改変されたＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。Ｌ−３６３細胞系（Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）；ＤＳＭＺ受託番号ＡＣＣ  ４９）を、８５％のＲＰＭＩ  １６４０、および１５％の熱不活化ＦＣＳ中で培養した。
【実施例】
【０２３６】
（実施例１）
患者骨髄腫細胞におけるＢＣＭＡ発現の最適化された測定
（実施例１．１）
フローサイトメトリーによって検出される、患者骨髄腫細胞におけるＢＣＭＡ発現の定性的測定（蛍光強度中央値）
地域の倫理審査委員会によるガイドラインおよびヘルシンキ宣言に従い、説明同意文書の署名を得た後で、多発性骨髄腫患者から血液および骨髄吸引物を収集した。フローサイトメトリーによって、骨髄吸引物に由来する患者骨髄腫細胞の細胞表面におけるＢＣＭＡの定性的発現を測定した。表面プラズモン共鳴によって検出される１０．９±２．７ｎＭのヒトＢＣＭＡに対するアフィニティーを有する、ＡＰＣコンジュゲート二価ＢＣＭＡ−１抗体を使用して、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を決定した。
【０２３７】
患者骨髄骨髄腫細胞におけるＢＣＭＡ受容体の発現を決定するために、単離されたばかりの骨髄吸引物を使用して免疫表現型分析を行った。赤血球が溶解されＫ３−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）で抗凝集処理された全骨髄試料を免疫表現型分析に使用した。ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋ＣＤ１９−として識別された悪性形質細胞の特異的識別および免疫表現型特徴付けを目標とした、直接免疫蛍光技法およびマルチカラー染色を使用して、チューブ当たり合計２×１０６個の細胞を染色した。続いて、少なくともＣＤ１３８−ＡＰＣＣ７５０／ＣＤ３８−ＦＩＴＣ／ＣＤ５６−ＰＥ／ＣＤ１９−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ７／ＣＤ４５−Ｖ４５０／ＢＣＭＡ−ＡＰＣを含む蛍光色素コンジュゲート抗体のパネルを使用して、氷上で２０〜３０分間、遮光して骨髄細胞を染色した。使用した蛍光色素標識された抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）およびＣａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＣＡ）から購入した。免疫表現型分析においてＡＰＣコンジュゲート二価抗ヒトＢＣＭＡ−１抗体を使用した。マルチカラーフローサイトメーターおよびインストールされたソフトウェア（例えば、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを実行するＣａｎｔｏＩＩデバイスまたはＣｅｌｌＱＵＥＳＴソフトウェアを使用するＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター）を使用して、取得を行った。Ｐａｉｎｔ−Ａ−Ｇａｔｅ  ＰＲＯプログラム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をデータ分析に使用した。悪性形質細胞集団におけるゲーティングによりＢＣＭＡ発現を測定し、蛍光強度中央値を決定し、骨髄腫患者の間で比較した。ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋ＣＤ４５＋ＣＤ５６−ＣＤ１９−骨髄腫細胞においてゲーティングされるＡＰＣコンジュゲート同位体対照抗体またはＣＤ３＋Ｔ細胞（ＢＣＭＡ陰性であることが公知）においてゲーティングされるＡＰＣコンジュゲートＢＣＭＡ−１抗体の絶対ＭＦＩ値を、骨髄腫細胞においてゲーティングされるＡＰＣコンジュゲートＢＣＭＡ−１抗体の絶対ＭＦＩ値から減算することにより、骨髄腫細胞におけるＢＣＭＡ発現の相対ＭＦＩ値を計算した。図１は、フローサイトメトリーによって検出された（ＭＦＩ）、患者骨髄腫細胞における（Ａ）中〜高ＢＣＭＡ発現、（Ｂ）中程度ＢＣＭＡ発現および（Ｃ）低ＢＣＭＡ発現の代表的ＦＡＣＳヒストグラムプロットを示す。図１に示す通り、陰性対照（Ｔ細胞においてゲーティングされるＡＰＣコンジュゲートＢＣＭＡ−１抗体）と比較して、患者骨髄腫細胞における陽性ＢＣＭＡ発現に対応して、右への明らかなシフトが見られる。相対ＭＦＩ値に基づき、全骨髄腫患者が、自身の悪性形質細胞においてＢＣＭＡを発現するが、ＢＣＭＡ発現は、低発現（相対ＭＦＩ値＜１０３）から中程度発現（１０３〜０．３×１０４）から中〜高発現（０．３×１０４〜１０４）へと変動する。相対ＭＦＩ値＞１０４を有するＢＣＭＡ発現は、調査した患者骨髄試料の間で観察されなかった。表３は、患者骨髄骨髄腫細胞において発現されるＢＣＭＡの相対ＭＦＩ値を要約する。
【０２３８】
【表３】
2018508462.tif 000005
【０２３９】
（実施例１．２）
フローサイトメトリーによって検出される、患者骨髄腫細胞におけるＢＣＭＡの定量的測定（特異的抗原結合能）
フローサイトメトリーを使用して、患者骨髄腫細胞の細胞表面において、ＢＣＭＡの定量的発現、すなわち、ＢＣＭＡの特異的抗原結合能（ＳＡＢＣ）も測定した。Ｑｉｆｉｋｉｔ（Ｄａｋｏ）方法を使用して、Ｈ９２９ヒト骨髄腫細胞系と比較して、患者の骨髄骨髄腫細胞の細胞表面におけるＢＣＭＡ抗原コピー数または特異的抗原結合能を定量化した。骨髄吸引物を収集し、ＦＡＣＳ緩衝液（１００μｌ／ウェル；３５０×ｇを５分間）で細胞を洗浄し、１００万（Mio）個の細胞／ｍｌとなるように調整した。５０μｌ（＝５０万個の細胞）の細胞懸濁液を９６丸底ウェルプレートの各ウェルに移した。続いて、最終濃度２５μｇ／ｍｌ（または飽和濃度）となるようにＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．１％のＢＳＡ）に希釈した５０μｌのマウス抗ヒトＢＣＭＡ  ＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ型番３５７５０２）またはマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ型番４０１５０１）を添加し、３０分間４℃で暗所にて染色を行った。次に、１００μｌのセットアップまたは較正ビーズを別々のウェルに添加し、細胞をビーズと共にＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。Ｑｉｆｉｋｉｔに備え付けられたフルオレセインコンジュゲート抗マウス二次抗体を含有する（飽和濃度で）２５μｌのＦＡＣＳ緩衝液に、細胞およびビーズを再懸濁した。４５分間４℃で暗所にて、細胞およびビーズを染色した。細胞を１回洗浄し、全試料を１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。マルチカラーフローサイトメーターおよびインストールされたソフトウェア（例えば、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを実行するＣａｎｔｏＩＩデバイスまたはＣｅｌｌＱＵＥＳＴソフトウェアを使用するＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター）において試料を分析した。Ｐａｉｎｔ−Ａ−Ｇａｔｅ  ＰＲＯプログラム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をデータ分析に使用した。表４は、特異的抗原結合能（ＳＡＢＣ）によって測定される、患者の骨髄骨髄腫細胞における定量的ＢＣＭＡ発現を要約する。
【０２４０】
【表４】
2018508462.tif 000006
【０２４１】
（実施例１．３）
ＢＣＭＡ−ＴＣＢの殺滅効力は、標的細胞：ＢＣＭＡｈｉ発現Ｈ９２９対ＢＣＭＡｍｅｄ／ｌｏ発現Ｕ２６６  ｖｓ．ＢＣＭＡｍｅｄ／ｌｏ発現Ｌ３６３対ＢＣＭＡｌｏ発現ＲＰＭＩ−８２２６骨髄腫細胞の表面におけるＢＣＭＡ発現によって影響される
ＢＣＭＡ−ＴＣＢ抗体の効力は、骨髄腫細胞の細胞表面におけるＢＣＭＡの発現のレベルによって影響されうる。標的細胞として異なるヒト骨髄腫細胞系、すなわち、ＢＣＭＡｈｉ発現Ｈ９２９対ＢＣＭＡｍｅｄ／ｌｏ発現Ｕ２６６骨髄腫細胞を使用したリダイレクトＴ細胞細胞傷害性アッセイにおいて、ＢＣＭＡ−ＴＣＢの殺滅効力を測定した。
【０２４２】
簡潔に説明すると、ヒトＢＣＭＡｈｉ発現Ｈ９２９またはＢＣＭＡｍｅｄ／ｌｏ発現Ｕ２６６多発性骨髄腫標的細胞を細胞解離緩衝液により採取し、１０％のウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩにおいて洗浄および再懸濁した。丸底９６ウェルプレートにおいてウェル当たりおよそ３０，０００個の細胞を蒔き、所望の最終濃度のためにＴＣＢ構築物のそれぞれの希釈物を添加した（３連で）；０．１ｐＭ〜１０ｎＭの範囲のＢＣＭＡ−ＴＣＢの最終濃度。適切な比較のために、全ＴＣＢ構築物および対照を同じ容積モル濃度となるように調整した。ヒトＰＢＭＣ（エフェクター）をウェルに添加して、最終Ｅ：Ｔ比１０：１を得た。陰性対照群は、エフェクターまたは標的細胞のみによって表された。ヒト汎（pan）Ｔ細胞の活性化の陽性対照として、１μｇ／ｍｌ  ＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ型番Ｌ８９０２）を使用した。正規化のため、ＢＣＭＡｈｉ発現Ｈ９２９またはＢＣＭＡｍｅｄ／ｌｏ発現Ｕ２６６骨髄腫標的細胞の最大溶解（＝１００％）は、細胞死を誘導する最終濃度の１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と標的細胞とのインキュベーションにより決定した。最小溶解（＝０％）は、エフェクター細胞のみと共インキュベートした、すなわち、Ｔ細胞二特異性抗体全くなしの標的細胞によって表された。３７℃、５％ＣＯ２における２４時間インキュベーション後に続いて、ＬＤＨ検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）により、製造元の指示書に従い、アポトーシス性／壊死性ＢＣＭＡｈｉ発現Ｈ９２９またはＢＣＭＡｍｅｄ／ｌｏ発現Ｕ２６６骨髄腫標的細胞から上清へのＬＤＨ放出を測定した。濃度応答曲線において、ＬＤＨ放出の百分率を抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の濃度に対してプロットした。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してＥＣ５０値を測定し、最大ＬＤＨ放出の５０％をもたらすＴＣＢ抗体濃度として決定した。図２に示す通り、一対一の比較において実行したところ、ＢＣＭＡ−２−ＴＣＢは、１１５ｐＭのＥＣ５０および６０％の最大殺滅によりＢＣＭＡｈｉ発現Ｈ９２９骨髄腫細胞の殺滅を誘導した一方、同じＢＣＭＡ−ＴＣＢ抗体は、３７０ｐＭのＥＣ５０および１８％の最大殺滅によりＢＣＭＡｍｅｄ／ｌｏ発現Ｕ２６６骨髄腫標的細胞を殺滅することしかできなかった。表５は、ＢＣＭＡｈｉ発現Ｈ９２９またはＢＣＭＡｌｏ発現Ｕ２６６骨髄腫標的細胞を殺滅するＢＣＭＡ−２−ＴＣＢのＥＣ５０値および最大殺滅を要約する。
【０２４３】
同様の実験条件を使用して、ＢＣＭＡ発現骨髄腫細胞系（ＢＣＭＡｈｉ発現Ｈ９２９、ＢＣＭＡｍｉｄ／ｌｏ発現Ｌ３６３およびＢＣＭＡｌｏ発現ＲＰＭＩ−８２２６  ＭＭ細胞）の殺滅を誘導する別のＢＣＭＡ−ＴＣＢ抗体であるＢＣＭＡ−１−ＴＣＢの効力も検査した。
【０２４４】
図２．１に示す通り、一対一の比較において実行したところ、ＢＣＭＡ−１−ＴＣＢは、（Ａ）８．４９ｐＭのＥＣ５０および８２．８％の最大殺滅によりＢＣＭＡｈｉ発現Ｈ９２９骨髄腫細胞の殺滅を誘導した一方、同じＢＣＭＡ−１−ＴＣＢ抗体は、（Ｂ）１２．６ｐＭのＥＣ５０および６７．１％の最大殺滅によりＢＣＭＡｍｅｄ／ｌｏ発現Ｌ３６３骨髄腫標的細胞、または（Ｃ）２２９．３ｐＭのＥＣ５０および２８．１％の最大殺滅によりＢＣＭＡｌｏ発現ＲＰＭＩ−８２２６を殺滅することしかできなかった。表５．１は、ＢＣＭＡｈｉ発現Ｈ９２９、ＢＣＭＡｍｅｄ／ｌｏ発現Ｌ３６３またはＢＣＭＡｌｏ発現ＲＰＭＩ−８２２６骨髄腫標的細胞を殺滅するＢＣＭＡ−１−ＴＣＢのＥＣ５０値および最大殺滅を要約する。
【０２４５】
【表５】
2018508462.tif 000007
【０２４６】
【表５．１】
2018508462.tif 000008
【０２４７】
（実施例２）
骨髄腫患者骨髄吸引物におけるエフェクター細胞対腫瘍細胞（Ｅ：Ｔ）比の測定
ＢＣＭＡ抗体の効力は、骨髄腫細胞の細胞表面におけるＢＣＭＡの発現のレベルによって影響されうる。しかし、ＢＣＭＡ−ＴＣＢ抗体に関して、表面に高レベルのＢＣＭＡを発現する細胞であっても、その殺滅効力は、多発性骨髄腫患者において観察される通り有意に変動されることがあるＥ：Ｔ比によっても影響されうる。
【０２４８】
（実施例２．１）
フローサイトメトリーによる骨髄腫患者骨髄吸引物におけるＣＤ３＋Ｔ細胞対ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋骨髄腫細胞（Ｅ：Ｔ）比の決定
（実施例２．１．１）
骨髄腫患者骨髄吸引物における骨髄腫細胞の測定
骨髄腫患者における骨髄浸潤悪性形質細胞の百分率および絶対数を決定するために、単離されたばかりの骨髄吸引物を使用して免疫表現型分析を行った。赤血球を溶解しＫ３−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）で抗凝集処理された全骨髄試料を免疫表現型分析に使用した。ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋ＣＤ１９−として識別された悪性形質細胞の特異的識別および免疫表現型特徴付けを目標とした、直接免疫蛍光技法およびマルチカラー染色を使用して、チューブ当たり合計２×１０６個の細胞を染色した。続いて、少なくともＣＤ１３８−ＡＰＣＣ７５０／ＣＤ３８−ＦＩＴＣ／ＣＤ５６−ＰＥ／ＣＤ１９−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ７／ＣＤ４５−Ｖ４５０を含む蛍光色素コンジュゲート抗体のパネルを使用して、２０〜３０分間氷上で遮光して、骨髄細胞を染色した。使用した蛍光色素標識された抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）およびＣａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＣＡ）から購入した。マルチカラーフローサイトメーターおよびインストールされたソフトウェア（例えば、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを実行するＣａｎｔｏＩＩデバイスまたはＣｅｌｌＱＵＥＳＴソフトウェアを使用するＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター）を使用して取得を行った。Ｐａｉｎｔ−Ａ−Ｇａｔｅ  ＰＲＯプログラム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をデータ分析に使用した。ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋ＣＤ１９−集団におけるゲーティングにより、悪性形質細胞の百分率を決定した。悪性形質細胞の絶対数を計算するために、悪性形質細胞の百分率に、例えば、血液学分析器（Ａｄｖｉａ（登録商標）１２０  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｉｅｍｅｎｓ）により測定された骨髄吸引物試料の容量を乗じた。いくつかの実験において、Ｔｒｕｃｏｕｎｔ（商標）チューブ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  ＣＡ  ＵＳＡ）を使用して、血液中の白血球の絶対数を決定した。
【０２４９】
（実施例２．１．２）
骨髄腫患者骨髄吸引物におけるＴ細胞およびＴ細胞サブセットの測定
ＢＣＭＡ−ＴＣＢに関して、エフェクター細胞は主に、多くのＴ細胞サブセットを含むＴ細胞である。Ｔ細胞およびＴ細胞サブセットの百分率および絶対数を決定するために、単離されたばかりの骨髄吸引物を使用して、免疫表現型分析を行った。赤血球を溶解しＫ３−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）で抗凝集処理された全骨髄試料を免疫表現型分析に使用した。ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ５６−またはＣＤ３＋またはＣＤ４５＋ＣＤ１９−ＣＤ５６−として識別されうるＴ細胞の特異的識別および免疫表現型特徴付けを目標とした、直接免疫蛍光技法およびマルチカラー染色を使用して、チューブ当たり合計２×１０６個の細胞を染色した。続いて、ＣＤ１３８−ＡＰＣＣ７５０／ＣＤ３８−ＦＩＴＣ／ＣＤ５６−ＰＥ／ＣＤ１９−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ７／ＣＤ４５−Ｖ４５０を含む蛍光色素コンジュゲート抗体のパネルを使用して、２０〜３０分間氷上で遮光して、骨髄細胞を染色した。使用した蛍光色素標識された抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）およびＣａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＣＡ）から購入した。マルチカラーフローサイトメーターおよびインストールされたソフトウェア（例えば、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを実行するＣａｎｔｏＩＩデバイスまたはＣｅｌｌＱＵＥＳＴソフトウェアを使用するＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター）を使用して取得を行った。Ｐａｉｎｔ−Ａ−Ｇａｔｅ  ＰＲＯプログラム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をデータ分析に使用した。ＣＤ４５＋ＣＤ１９−ＣＤ５６−集団におけるゲーティングにより、骨髄浸潤Ｔ細胞の百分率を決定した。Ｔ細胞の絶対数を計算するために、Ｔ細胞の百分率に、骨髄吸引物試料の容量を乗じた。
【０２５０】
総Ｔ細胞またはＴ細胞サブセットを表すエフェクター細胞は、蛍光色素コンジュゲート抗体による骨髄腫患者骨髄細胞の染色によっても測定される：ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１９７−ナイーブＴ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１９７−ＣＤ４＋ナイーブＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１９７−ＣＤ８＋ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−メモリーＴ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４＋メモリーＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ８＋メモリーＣＤ８  Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１９７＋セントラルメモリーＴ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１９７＋ＣＤ４＋セントラルメモリーＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１９７＋ＣＤ８＋セントラルメモリーＣＤ８、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１９７−エフェクターメモリーＴ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１９７−ＣＤ４＋エフェクターメモリーＣＤ４  Ｔ細胞；ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１９７−ＣＤ８＋エフェクターメモリーＣＤ８  Ｔ、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１９７−エフェクターＴ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１９７−ＣＤ４＋エフェクターＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１９７−ＣＤ８＋エフェクターＣＤ８  Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏ調節性Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＰＤ−１−非消耗Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＰＤ−１−Ｔｉｍ−３−非消耗Ｔ細胞。Ｔ細胞サブセットの絶対数を計算するために、該Ｔ細胞サブセットの百分率に、骨髄吸引物試料の容量を乗じる。
【０２５１】
循環Ｔ細胞は、骨髄に浸潤し、したがって、Ｅ：Ｔ比に影響することができるため、循環Ｔ細胞の百分率および絶対数も測定する。ヘパリン処置したチューブを使用してまたはクエン酸ナトリウムを含有して、患者から血液を収集する。次に、ＣＤ３に対する蛍光色素コンジュゲート抗体で、氷上で２０分間遮光して、全血を染色する。続いて、溶解緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で赤血球を溶解し、細胞を洗浄緩衝液で２回洗浄する。マルチカラーフローサイトメーターおよびインストールされたソフトウェア（例えば、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを実行するＣａｎｔｏＩＩデバイスまたはＣｅｌｌＱＵＥＳＴソフトウェアを使用するＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター）を使用して取得を行う。Ｐａｉｎｔ−Ａ−Ｇａｔｅ  ＰＲＯプログラム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をデータ分析に使用する。ＣＤ３＋集団におけるゲーティングにより、循環Ｔ細胞の百分率を決定する。Ｔ細胞の絶対数を計算するために、Ｔ細胞の百分率に、血液試料の容量を乗じる。
【０２５２】
骨髄腫患者の骨髄吸引物において測定される浸潤骨髄腫／悪性形質細胞（すなわち、腫瘍細胞）およびＴ細胞（例えば、エフェクター細胞）の百分率により、続いてＥ：Ｔ比を決定することができる。表６に描写されている通り、Ｅ：Ｔ比（Ｔ細胞対骨髄腫細胞）は、多発性骨髄腫患者において相当に変動しうる。
【０２５３】
Ｔ細胞サブセットＣＤ４＋およびＣＤ８＋の評価も測定した。無処置骨髄吸引物培養物（２４時間またはそれ未満）から細胞懸濁液を収集し、ヒトＣＤ４およびヒトＣＤ８に対する蛍光色素コンジュゲート抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  ＣＡ）で染色した。表６．１は、多発性骨髄腫患者におけるＥ：Ｔ比（ＣＤ４＋Ｔ細胞対骨髄腫細胞）を示し、表６．２は、多発性骨髄腫患者におけるＥ：Ｔ比（ＣＤ８＋Ｔ細胞対骨髄腫細胞）を示す。
【０２５４】
細胞表面でＰＤ−１またはＴＩＭ−３を発現するＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞サブセットの百分率を測定することにより、非消耗ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞によるＥ：Ｔ比も評価した。無処置骨髄吸引物培養物から細胞懸濁液を収集し、ヒトＰＤ−１およびヒトＴＩＭ−３に対する蛍光色素コンジュゲート抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  ＣＡ）で染色した。表６．３は、多発性骨髄腫患者におけるＥ：Ｔ比（ＣＤ４＋ＰＤ−１−Ｔ細胞対骨髄腫細胞）を示し、表６．４は、多発性骨髄腫患者におけるＥ：Ｔ比（ＣＤ８＋ＰＤ−１−Ｔ細胞対骨髄腫細胞）を示す。表６．５は、多発性骨髄腫患者におけるＥ：Ｔ比（ＣＤ４＋ＴＩＭ−３−Ｔ細胞対骨髄腫細胞）を示し、表６．６は、多発性骨髄腫患者におけるＥ：Ｔ比（ＣＤ８＋ＴＩＭ−３−Ｔ細胞対骨髄腫細胞）を示す。
【０２５５】
【表６】
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【０２５６】
【表６．１】
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【０２５７】
【表６．２】
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【０２５８】
【表６．３】
2018508462.tif 000012
【０２５９】
【表６．４】
2018508462.tif 000013
【０２６０】
【表６．５】
2018508462.tif 000014
【０２６１】
【表６．６】
2018508462.tif 000015
【０２６２】
（実施例２．２）
ＢＣＭＡ−ＴＣＢの殺滅効力は、Ｈ９２９骨髄腫標的細胞の表面において検出される高ＢＣＭＡ発現にもかかわらずＥ：Ｔ比によって影響される
異なるＥ：Ｔ比および細胞表面において高対低レベルのＢＣＭＡ発現を有するヒト骨髄腫細胞系を使用して、リダイレクトＴ細胞細胞傷害性アッセイにおいてＢＣＭＡ−１−ＴＣＢの殺滅効力を測定した。
【０２６３】
（実施例２．２．１）
フローサイトメトリーによって検出される、ヒト骨髄腫細胞系におけるＢＣＭＡの定性的測定（蛍光強度中央値）
フローサイトメトリーを使用して、Ｈ９２９およびＵ２６６骨髄腫標的細胞の細胞表面におけるＢＣＭＡの定性的発現をまず測定した。簡潔に説明すると、細胞を採取し、洗浄し、生存率について計数し、９６ウェル丸底プレートに５０，０００細胞／ウェルとなるよう再懸濁し、１０μｇ／ｍｌの抗ヒトＢＣＭＡ抗体（Ａｂｃａｍ、型番ａｂ５４８３４、マウスＩｇＧ１）と共に３０分間４℃で（内部化を防止するため）インキュベートした。マウスＩｇＧ１をアイソタイプ対照として使用した（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５４１２１）。次に、細胞を遠心分離し（５分間、３５０×ｇ）、２回洗浄し、ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウス二次抗体と共に３０分間４℃でインキュベートした。インキュベーション時間の終わりに、細胞を遠心分離し（５分間、３５０×ｇ）、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを実行するＣａｎｔｏＩＩデバイスにおいて分析した。図３は、Ｈ９２９およびＵ２６６骨髄腫細胞におけるＢＣＭＡ発現を描写する。両方のヒト骨髄腫細胞系対照に関して陰性と比較して右への明らかなシフトが見られ、Ｈ９２９細胞はＢＣＭＡｈｉ発現細胞であり、Ｕ２６６はＢＣＭＡｍｅｄ／ｌｏ発現細胞である。
【０２６４】
（実施例２．２．２）
フローサイトメトリーによって検出される、ヒト骨髄腫細胞系におけるＢＣＭＡの定量的測定（特異的抗原結合能ＳＡＢＣ）
フローサイトメトリーを使用して、ヒト骨髄腫細胞系の細胞表面におけるＢＣＭＡの定量的発現、すなわち、ＢＣＭＡの特異的抗原結合能（ＳＡＢＣ）も測定した。Ｑｉｆｉｋｉｔ（Ｄａｋｏ、型番Ｋ００７８）方法を使用して、Ｈ９２９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−９０６８（商標））およびＵ２６６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−１９６（商標））ヒト骨髄腫細胞系の細胞表面におけるＢＣＭＡ抗原コピー数を定量化した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１００μｌ／ウェル；３５０×ｇ、５分間）で１回洗浄し、１００万（Mio）個の細胞／ｍｌとなるように調整した。示されている通りに、９６丸底ウェルプレートの各ウェルに５０μｌ（＝５０万個の細胞）の細胞懸濁液を移す。続いて、最終濃度２５μｇ／ｍｌ（または飽和濃度）となるようＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．１％のＢＳＡ）に希釈した５０μｌのマウス抗ヒトＢＣＭＡ  ＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ型番３５７５０２）またはマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ型番４０１５０１）を添加し、３０分間４℃で暗所にて染色を行う。次に、１００μｌのセットアップまたは較正ビーズを別々のウェルに添加し、細胞をビーズと共にＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄する。Ｑｉｆｉｋｉｔによって提供されるフルオレセインコンジュゲート抗マウス二次抗体（飽和濃度）を含有する２５μｌのＦＡＣＳ緩衝液に、細胞およびビーズを再懸濁する。４５分間４℃で暗所にて、細胞およびビーズを染色する。細胞を１回洗浄し、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に全試料を再懸濁する。マルチカラーフローサイトメーターおよびインストールされたソフトウェア（例えば、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを実行するＣａｎｔｏＩＩデバイスまたはＣｅｌｌＱＵＥＳＴソフトウェアを使用するＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター）において試料を分析する。表７に示す通り、ＢＣＭＡｍｅｄ／ｌｏ発現骨髄腫細胞として定義されたＵ２６６とは対照的に、Ｈ９２９細胞は、他の骨髄腫細胞系よりも最大５〜６倍高い最高密度でヒトＢＣＭＡを発現し、ＢＣＭＡｈｉ発現Ｈ９２９として定義された。ＢＣＭＡ定量的発現（ＳＡＢＣ）は、ＢＣＭＡ定性的発現（相対ＭＦＩ）と十分に相関した。
【０２６５】
【表７】
2018508462.tif 000016
【０２６６】
【表７．１】
2018508462.tif 000017
【０２６７】
（実施例１．３）
リダイレクトＴ細胞細胞傷害性アッセイにおけるＢＣＭＡ−ＴＣＢの効力は、Ｅ：Ｔ比によって影響される
ＢＣＭＡ−ＴＣＢ抗体の殺滅効力におけるＥ：Ｔ比の影響を検査した。簡潔に説明すると、ヒトＢＣＭＡｈｉ発現Ｈ９２９およびＢＣＭＡｍｉｄ／ｌｏ発現Ｕ２６６多発性骨髄腫標的細胞を細胞解離緩衝液により採取し、１０％のウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩにおいて洗浄および再懸濁した。丸底９６ウェルプレートにおいてウェル当たりおよそ３０，０００個の細胞を蒔き、所望の最終濃度のために構築物のそれぞれの希釈物を添加した（３連で）；０．１ｐＭ〜１００ｎＭの範囲の最終濃度。適切な比較のために、全ＴＣＢ構築物および対照を同じ容積モル濃度となるように調整した。ヒト総Ｔ細胞（エフェクター）をウェルに添加して、最終Ｅ：Ｔ比５：１を得た。１０：１、２．５：１、１：１を含む異なるＥ：Ｔ比で、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを使用した。陰性対照群は、エフェクターまたは標的細胞のみによって表された。ヒト汎Ｔ細胞の活性化の陽性対照として、１μｇ／ｍｌ  ＰＨＡ−Ｍ（Ｓｉｇｍａ型番Ｌ８９０２）を使用した。正規化のため、細胞死を誘導する最終濃度の１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と標的細胞とのインキュベーションにより、Ｈ９２９  ＭＭ標的細胞の最大溶解（＝１００％）を決定した。最小溶解（＝０％）は、エフェクター細胞のみと共インキュベートされた、すなわち、Ｔ細胞二特異性抗体全くなしの標的細胞によって表された。３７℃、５％ＣＯ２における２４時間インキュベーション後に、続いて、ＬＤＨ検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）により、製造元の指示書に従い、アポトーシス性骨髄腫標的細胞から上清へのＬＤＨ放出を測定した。濃度応答曲線において、ＬＤＨ放出の百分率をＢＣＭＡ−ＴＣＢ抗体の濃度に対してプロットした。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してＥＣ５０値を測定し、最大ＬＤＨ放出の５０％をもたらすＴＣＢ抗体濃度として決定した。表８に示す通り、ＢＣＭＡｈｉ発現Ｈ９２９細胞およびＢＣＭＡｍｉｄ／ｌｏ発現Ｕ２６６細胞を殺滅するＢＣＭＡ−１−ＴＣＢの効力は、影響された、すなわち、ＢＣＭＡ−１−ＴＣＢの殺滅効力は、Ｅ：Ｔ比が縮小するにつれて低減された。殺滅効力の低減（すなわち、ＥＣ５０値の増大）は、ＢＣＭＡｍｉｄ／ｌｏ発現Ｕ２６６細胞系においてより顕著であり、Ｅ：Ｔ比が１０：１から２．５：１および１：１へと低減された場合、ＢＣＭＡ−１−ＴＣＢ殺滅能力は失われた。
【０２６８】
１）Ｅ：Ｔ比は、多発性骨髄腫患者の間で相当に変動しうる、また２）ＢＣＭＡ−ＴＣＢの殺滅効力は、Ｅ：Ｔ比によって影響されうるという結果に基づき、高いＥ：Ｔ比を有する骨髄腫患者は、ＢＣＭＡ−ＴＣＢ治療法に応答する機会がより多く、低いＥ：Ｔ比を有する患者は、ＢＣＭＡ−ＴＣＢ治療法に応答する機会がより少ない可能性があることから、ＢＣＭＡ−ＴＣＢによる処置前のＥ：Ｔ比の測定を含む患者層別化方法が必要とされる。
【０２６９】
【表８】
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【０２７０】
（実施例３）
ＥＬＩＳＡに基づく方法による骨髄腫患者血清／血漿および骨髄吸引物における可溶性ＢＣＭＡの検出
健康個体と比較して、無処置多発性骨髄腫患者の血清において、高レベルの可溶性ＢＣＭＡが見出される可能性があり、可溶性レベルは、一部の患者では１２０ｎｇ／ｍＬまで上昇する（Sanchezら、Brit  J  Haematol、２０１２年）。Ｔ細胞二特異性抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞に基づくアッセイにおいてフェムトモルからピコモルの有効性を有する非常に強力な分子であるため、効果的な臨床用量は、患者に非常に低い用量で与えられることが予想され（Bargouら、Science、２００８年；３２１巻（５８９１号）；９７４〜７頁）、よって、骨髄腫患者におけるこのような可溶性ＢＣＭＡは、ＢＣＭＡ−ＴＣＢ抗体に結合して、それが骨髄腫細胞の細胞表面におけるＢＣＭＡに結合するのを妨げることにより、ＢＣＭＡ−ＴＣＢ抗体の効力に影響を与えることができ、そのためリダイレクトＴ細胞の悪性形質細胞殺滅が妨げられる。
【０２７１】
（実施例３．１）
骨髄腫患者血清／血漿および骨髄吸引物における可溶性ＢＣＭＡの測定
地域の倫理審査委員会によるガイドラインおよびヘルシンキ宣言に従い、説明同意文書の署名を得た後で、多発性骨髄腫患者から末梢血および骨髄吸引物を収集する。Ｃｏｒｖａｃ（商標）血清分離器チューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）から遠心分離によって血清を単離し、使用まで−８０℃で保存する。ヘパリン処置したチューブ内に骨髄吸引物または血液を収集し、遠心分離し、上清を収集し、使用まで−８０℃で保存する。いくつかの実験において、可溶性ＢＣＭＡ測定のためのアッセイに先立ち、患者骨髄吸引物を最大４８時間培養する。ＢＣＭＡ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ１９３Ｅ）によって、血清、血漿および上清試料を分析する。血清／血漿／骨髄試料を１：５０に希釈し、製造元のプロトコールに従い、ＢＣＭＡ  ＥＬＩＳＡアッセイを行った。４５０ｎｍに設定したプレートリーダーを使用して、ＥＬＩＳＡプレートを分析する。値は、各検体につき３連の試料の平均を表す。注目すべきことに、この特異的ＢＣＭＡ  ＥＬＩＳＡキットは、組換えヒトＡＰＲＩＬもしくはＢＡＦＦ、組換えヒトＴＡＣＩ／Ｆｃまたは組換えマウスＢＣＭＡ／ＦｃもしくはマウスＢＣＭＡと交差反応しない。マウスモノクローナル抗ヒトＢＣＭＡ抗体（カタログ番号ＷＨ００００６０８Ｍ１；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）またはＢＣＭＡ  ＥＬＩＳＡにおいて提供されるポリクローナル捕捉抗体を使用して、ＢＣＭＡ抗原標準または骨髄腫患者由来の血清／血漿／骨髄（１：５０希釈）をインキュベートする。続いて、ＢＣＭＡ  ＥＬＩＳＡプロトコールに従って試料をアッセイする。表８．１は、培養下の（およそ４８時間）無処置骨髄腫患者骨髄吸引物の上清において測定される可溶性ＢＣＭＡのレベルを要約する。
【０２７２】
【表８．１】
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【０２７３】
（実施例３．２）
ＢＣＭＡ−ＴＣＢ抗体が、骨髄腫患者血清／血漿および骨髄吸引物における可溶性ＢＣＭＡに結合するか否かに関する検証
捕捉抗体として使用されるヒトＢＣＭＡ  ＥＣＤに対するポリクローナルＢＣＭＡ抗体および検出抗体としてＢＣＭＡ−ＴＣＢ二特異性抗体のＢＣＭＡ結合剤を表すＢＣＭＡ抗体による捕捉サンドイッチＥＬＩＳＡ方法を使用して、以前に収集し−８０℃で保存した、可溶性ＢＣＭＡを含有する骨髄腫患者血清／血漿および骨髄吸引物上清試料を、ＢＣＭＡ−ＴＣＢ抗体への結合に関して検査する。簡潔に説明すると、ポリクローナル捕捉ＢＣＭＡ抗体を、炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ９．６）における１〜１０μｇ／ｍＬの濃度でＰＶＣマイクロタイタープレートに固定化する。次に、プレートを接着性プラスチックで覆い、一晩４℃でインキュベートする。続いてコーティング溶液を除去し、ウェルを２００μｌのＰＢＳで満たすことにより、プレートを２回洗浄する。シンクの上でプレートを振ることにより、溶液または洗浄液を除去する。ペーパータオルの上でプレートを軽く叩くことにより、残っている液滴を除去する。次に、ウェル当たり２００μｌのブロッキング緩衝液である５％脱脂粉乳／ＰＢＳを添加することにより、コーティングされたウェルに残っているタンパク質結合部位をブロッキングする。続いてプレートを接着性プラスチックで覆い、少なくとも１〜２時間室温でまたは一晩４℃でインキュベートする。可溶性ＢＣＭＡ含有骨髄腫患者血清／血漿および骨髄吸引物上清試料由来の１００μｌの適切に希釈された試料を各ウェルに２連で添加する。標準およびブランクを各プレートで実行する。次に、マイクロプレートを９０分間３７℃でインキュベートする。次に、試料を除去し、２００μｌのＰＢＳでウェルを満たすことにより、プレートを２回洗浄する。ＢＣＭＡ−ＴＣＢ二特異性抗体のＢＣＭＡ結合剤を表すＢＣＭＡ抗体からなる、１００μｌの希釈したビオチンコンジュゲート検出抗体を各ウェルに添加する。次に、プレートを接着性プラスチックで覆い、２時間室温でインキュベートする。プレートをＰＢＳで４回洗浄する。洗浄後に、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）にコンジュゲートされた１００μｌのストレプトアビジンをウェルに添加する。ＨＲＰまたはＡＬＰコンジュゲートされたストレプトアビジンは、使用直前に最適濃度となるようブロッキング緩衝液に希釈する。次に、プレートを接着性プラスチックで覆い、１〜２時間室温でインキュベートする。続いてプレートをＰＢＳで４回洗浄する。ＡＬＰ基質としてｐＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニル−リン酸）を使用し、ウェルに添加し、室温で１５〜３０分間インキュベートする。続いて、等容量の０．７５Ｍ  ＮａＯＨを添加することにより反応を停止する。次に、プレートリーダーを使用して、４０５ｎｍでプレートを測定する。ＨＲＰ基質に対しては、過酸化水素を使用し、４５０ｎｍで最適密度を読み取る。次に、濃度をｘ軸（対数目盛り）対吸光度をＹ軸（線形）にした系列希釈から作成されるデータの標準曲線を用意する。
【０２７４】
（実施例４）
骨髄腫患者血清／血漿および骨髄における可溶性ＡＰＲＩＬまたはＢＡＦＦの検出
多発性骨髄腫など、ある特定の造血器悪性腫瘍において、循環ＢＣＭＡリガンドＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦのレベルは上昇されうる（Moreauxら、２００４年；Blood、１０３巻（８号）：３１４８〜３１５７頁）。よって、本発明者らは、血清／血漿中の高レベルのリガンドが、腫瘍細胞におけるＢＣＭＡ受容体へのＢＣＭＡ−ＴＣＢ抗体の結合に干渉しうることを認識する。健康なドナーと比較して、多発性骨髄腫患者血液における循環ＡＰＲＩＬ（ＢＣＭＡに対する高アフィニティーリガンド）のレベルは、約１００ｎｇ／ｍＬ（約１０ｎｇ／ｍＬに対して）である。ＢＡＦＦ（ＢＣＭＡに対する低アフィニティーリガンド）に関しては、レベルは、健康なドナーの約３ｎｇ／ｍＬと比較して、１〜１０００ｎｇ／ｍＬに増減しうる。腫瘍細胞近く、すなわち、多発性骨髄腫患者の骨髄微小環境において（骨髄は、ＡＰＲＩＬが構成的に豊富な臓器である）、ＡＰＲＩＬ／ＢＡＦＦ濃度は、血清において測定されるレベルよりもはるかに高くなりうる。より重要なことに、ＡＰＲＩＬは、骨髄微小環境において構成的に発現され、悪性骨髄腫細胞に対する重要な生存因子であり、また、骨髄の骨髄系前駆体細胞によって主に産生および分泌される（Matthesら、Blood、２０１１年；１１８巻（７号）：１８３８〜１８４４頁）。よって、最大１０００ｎｇ／ｍＬまたはそれよりもさらに高いより大きな度合いのものであることが予想される、骨髄腫患者の骨髄におけるＡＰＲＩＬの濃度は、この文脈において強い関連性がある。全身性エリテマトーデスなど、ある特定の自己免疫疾患において、約８５ｎｇ／ｍＬによる循環ＡＰＲＩＬのレベルも上昇される（Koyamaら、２００５年；Ann  Rheum  Dis、６４巻：１０６５〜１０６７頁）。
【０２７５】
特に、強力な分子であるためにＢＣＭＡ−ＴＣＢ抗体の臨床効果的濃度が低いと予想される場合、ＢＣＭＡ受容体への結合に関して可溶性ＡＰＲＩＬ（高アフィニティーを有するＢＣＭＡリガンド）と競合するＢＣＭＡ−ＴＣＢ抗体に関して、高レベルの可溶性ＡＰＲＩＬは、その効力に影響を与えうる。よって、多発性骨髄腫患者血液／血清／血漿または骨髄吸引物試料における可溶性ＡＰＲＩＬを測定する必要がある。
【０２７６】
（実施例４．１）
ＥＬＩＳＡに基づく方法により骨髄腫患者の血清／血漿または骨髄吸引物において様々なレベルの可溶性ＡＰＲＩＬを測定することができる
地域の倫理審査委員会によるガイドラインおよびヘルシンキ宣言に従い、説明同意文書の署名を得た後で、多発性骨髄腫患者から末梢血および骨髄吸引物を収集する。Ｃｏｒｖａｃ（商標）血清分離器チューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）から遠心分離によって血清を単離し、使用まで−８０℃で保存する。ヘパリン処置したチューブに骨髄吸引物および血液を収集し、遠心分離し、上清を収集し、使用まで−８０℃で保存する。いくつかの実験において、可溶性ＡＰＲＩＬ測定のアッセイに先立ち、患者骨髄吸引物を最大４８時間培養する。ＡＰＲＩＬ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ８８４Ｂ）によって、血清、血漿および骨髄上清試料を分析する。血清試料を１：５０に希釈し、製造元のプロトコールに従い、ＡＰＲＩＬ  ＥＬＩＳＡアッセイを行う。４５０ｎｍに設定したプレートリーダーを使用して、ＥＬＩＳＡプレートを分析する。値は、各検体につき２回連または３連の試料の平均を表す。ＡＰＲＩＬ  ＥＬＩＳＡキットに提供される捕捉抗体を使用して、ＡＰＲＩＬ抗原標準または骨髄腫患者由来の血清／血漿もしくは骨髄吸引物上清（１：５０希釈）をインキュベートする。次に、ＡＰＲＩＬ  ＥＬＩＳＡプロトコールに従って試料をアッセイする。
【０２７７】
（実施例４．２）
可溶性ＡＰＲＩＬは、ＢＣＭＡ陽性骨髄腫標的細胞を殺滅するＡＰＲＩＬ競合／遮断ＢＣＭＡ−ＴＣＢ抗体の効力に影響する
ＡＰＲＩＬ遮断／競合ＢＣＭＡ−ＴＣＢ抗体の殺滅効力が、可溶性ＡＰＲＩＬによって影響されるか検証するために、多発性骨髄腫患者に見られる上昇濃度の可溶性ＡＰＲＩＬ（すなわち、１００ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬ）の存在下において、細胞におけるＢＣＭＡへの抗原結合部分の結合を介した構築物の架橋によりＢＣＭＡ陽性骨髄腫標的細胞のＴ細胞媒介性殺滅を誘導するその潜在力に関してＡＰＲＩＬ遮断／競合ＢＣＭＡ−ＴＣＢ抗体を分析した。ＡＰＲＩＬは、ＢＡＦＦが受容体に結合するよりも最大１０００倍高いアフィニティーでヒトＢＣＭＡに結合するため、高濃度の可溶性ＡＰＲＩＬは、この文脈において、可溶性ＢＡＦＦの場合よりも関連性がある。特に、治療薬が患者に非常に低い用量で与えられる場合、高レベルの可溶性ＡＰＲＩＬは、ＴＣＢ抗体の有効性に影響する可能性が最も高い（Bargouら、Science、２００８年；３２１巻（５８９１号）；９７４〜７頁）。よって、次の実験を行った。
【０２７８】
（実施例４．２．１）
ＡＰＲＩＬ遮断／競合Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢ抗体は、細胞内リン酸化ＮＦ−κＢによって検出されるＡＰＲＩＬ依存的ＮＦ−κＢ活性化を遮断する（フローサイトメトリー）
ＢＣＭＡ結合剤としてのＡＰＲＩＬ／ＢＡＦＦ競合Ｊ６Ｍ０により作製されたＢＣＭＡ−ＴＣＢ二特異性抗体であるＪ６Ｍ０−ＴＣＢ（Tai  YTら、Blood、２０１４年、１２３巻（２９号）：３１２８〜２８頁）の殺滅効力における可溶性ＡＰＲＩＬの効果は、リダイレクトＴ細胞殺滅アッセイにおいて検査するように計画したが、その前に、実験を実行して、Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢが実際に、ＡＰＲＩＬを遮断しこれと競合することを確認した。Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢを検査したところ、ＡＰＲＩＬ依存的ＮＦ−κＢ活性化を遮断した。Lafargeら、BMC  Molecular  Biol、２００７年；８巻：６４頁に記載されている通り、フローサイトメトリーによって細胞内リン酸化ＮＦ−κＢの検出を測定した。ホスホフローサイトメトリー法は、感度が不十分で面倒なステップを含有するＥＬＩＳＡに基づく発光アッセイによるＮＦ−κＢ活性化の検出の代替法である（PerezおよびNolan．、Nat  Biotechnol、２００２年；２０巻（２号）：１５５〜６２頁）。ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞へのＪ６Ｍ０−ＴＣＢの結合が、ＢＣＭＡ受容体の下流の公知の核内因子シグナリング経路であるＡＰＲＩＬ依存的ＮＦ−κＢ活性化を遮断するか査定した。簡潔に説明すると、細胞インキュベーター内で２４時間３７℃にて、ＦＣＳなしのＲＰＭＩ１６４０においてＨ９２９細胞を飢餓させた。飢餓時間の終わりに、細胞を採取し、計数し、ＶｉＣｅｌｌを使用して細胞生存率を評価した。ＢＳＡ含有ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において１ｍｌ当たり１×１０６個の細胞となるように、生細胞を調整した。丸底９６ウェルプレートにおけるウェルごとに１００μｌのこの細胞懸濁液をさらにアリコート分割し、飽和濃度４００ｎＭ（７７μｇ／ｍｌ）の２５μｌのＪ６Ｍ０−ＴＣＢ抗体またはアイソタイプ対照抗体と共に２０分間３７℃でインキュベートし、続いて１００ｎｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬ組換えマウスΔ−ＡＰＲＩＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ）の直接インキュベーションをさらに１５分間３７℃で行った。陰性対照として、細胞を無処置のまま放置した、または対応するＩｇＧアイソタイプ対照抗体４００ｎＭ（７７μｇ／ｍｌ）と共に合計４５分間３７℃でインキュベートした。陽性対照として、細胞を１００ｎｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬ組換えマウスΔ−ＡＰＲＩＬ単独（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ）と共に１５分間３７℃でインキュベートした。刺激の終わりに、細胞を遠心分離し（３６０×ｇ、４分間）、あらかじめ加温したＣｙｔｏｆｉｘ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５４６５５）において細胞ペレットを直ちに固定し、３７℃で１０分間インキュベートした。次に、細胞を遠心分離し、上清を除去し、ボルテックスによって細胞ペレットを破壊した。続いて氷冷Ｐｈｏｓｆｌｏｗ  Ｐｅｒｍ緩衝液ＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５８０５０）において細胞を３０分間氷上で透過処理した。次に細胞を遠心分離し、上清を除去し、ボルテックスによって細胞ペレットを破壊した。細胞を１００μＬのＰｈｏｓｆｌｏｗ  Ｐｅｒｍ緩衝液ＩＩＩに再懸濁し、透過処理した細胞を抗ＮＦ−κＢ  ｐ６５（ｐＳ５２９）抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５８４２��）またはアイソタイプ対照抗体（マウスＩｇＧ２ｂ、κ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ型番５５５０５８）で６０分間室温にて遮光して染色した。染色期間の後に、フローサイトメトリー分析に先立ちＰＢＳ＋ＰＢＳ中の０．１％のＢＳＡ＋０．１％のＢＳＡで細胞を洗浄した。上述の通りに処置したＨ９２９細胞から得た相対蛍光強度中央値を測定した。アイソタイプ対照の存在下におけるΔ−ＡＰＲＩＬの結合により得た蛍光強度中央値（ＭＦＩ）シグナルを１に設定した；他のシグナルをこれに対して正規化した。図４に描写されている通り、Ｈ９２９細胞において、１０００ｎｇ／ｍＬ  ＡＰＲＩＬ媒介性ＮＦ−κＢ活性化におけるＡＰＲＩＬ競合ＢＣＭＡ結合性アーム（arm）を有するＪ６Ｍ０−ＴＣＢ抗体の効果を検査した。Ｈ９２９細胞への可溶性ＡＰＲＩＬの添加は、ＮＦ−κＢ活性化を誘導した。ＡＰＲＩＬ競合ＢＣＭＡ結合性アームＪ６Ｍ０−ＴＣＢにＨ９２９細胞を曝露すると、ホスホフローサイトメトリーによって測定されるＮＦ−κＢ活性化シグナルの少なくとも７９．３％減少が見られた。Ｊ６Ｍ０抗ＢＣＭＡ抗体（ＷＯ２０１２１６３８０５）は、ＡＰＲＩＬ誘導性ＮＦ−κＢ活性化を遮断することが報告された。本結果は、Ｊ６Ｍ０が、ＢＣＭＡへの結合に関してＡＰＲＩＬと競合する抗ＢＣＭＡ抗体であり、これが、ＡＰＲＩＬ下流シグナリングを遮断することを確認する。
【０２７９】
（実施例４．２．２）
高レベルの可溶性ＡＰＲＩＬは、ＢＣＭＡ発現Ｈ９２９骨髄腫細胞を殺滅するＡＰＲＩＬ競合ＢＣＭＡ−ＴＣＢ抗体の効力に影響する（比色ＬＤＨ放出アッセイ）
次に、ＢＣＭＡ結合剤としてのＡＰＲＩＬ／ＢＡＦＦ競合Ｊ６Ｍ０により作製されたＢＣＭＡ−ＴＣＢ二特異性抗体であるＪ６Ｍ０−ＴＣＢ（Tai  YTら、Blood、２０１４年、１２３巻（２９号）：３１２８〜２８頁）の殺滅効力における可溶性ＡＰＲＩＬの効果をリダイレクトＴ細胞殺滅アッセイにおいて検査した。簡潔に説明すると、ヒトＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９多発性骨髄腫標的細胞を細胞解離緩衝液により採取し、１０％のウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩにおいて洗浄および再懸濁した。丸底９６ウェルプレートにおいてウェル当たりおよそ３０，０００個の細胞を蒔き、所望の最終濃度のためにＴＣＢ構築物のそれぞれの希釈物を添加した（３連で）；最終濃度１００ｎｇ／ｍＬまたは１０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬの存在または非存在下における、０．１ｐＭ〜１０ｎＭの範囲のＪ６Ｍ０−ＴＣＢ抗体の最終濃度。適切な比較のために、全ＴＣＢ構築物および対照を同じ容積モル濃度となるように調整した。ヒトＰＢＭＣ（エフェクター）をウェルに添加して、最終Ｅ：Ｔ比１０：１を得た。陰性対照群は、エフェクターまたは標的細胞のみによって表された。ヒト汎Ｔ細胞の活性化の陽性対照として、１μｇ／ｍＬ  ＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ型番Ｌ８９０２）を使用した。正規化のため、細胞死を誘導する最終濃度の１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と標的細胞とのインキュベーションにより、Ｈ９２９  ＭＭ標的細胞の最大溶解（＝１００％）を決定した。最小溶解（＝０％）は、エフェクター細胞のみと共インキュベートした、すなわち、Ｔ細胞二特異性抗体全くなしの標的細胞によって表された。３７℃、５％ＣＯ２における２４時間インキュベーション後に、続いてＬＤＨ検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）により、製造元の指示書に従い、アポトーシス性／壊死性Ｈ９２９骨髄腫標的細胞から上清へのＬＤＨ放出を測定した。濃度応答曲線において、ＬＤＨ放出の百分率をＪ６Ｍ０−ＴＣＢ抗体の濃度に対してプロットした。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してＥＣ５０値を測定し、最大ＬＤＨ放出の５０％をもたらすＴＣＢ抗体濃度として決定した。図５に示す通り、Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢ抗体は、外因性可溶性ＡＰＲＩＬの存在または非存在下において、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞の殺滅を誘導した。図５に描写されている通り、ＡＰＲＩＬ遮断／競合Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢは、外因性ＡＰＲＩＬの非存在下において、低ピコモル効力（ＥＣ５０ＡＰＲＩＬ０＝５．８ｐＭ）でＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫の濃度依存的殺滅を誘導した。１００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬを培養物に添加した場合、このようなリガンド濃度は、ＥＣ５０の２．４倍増大により示される通り（ＥＣ５０ＡＰＲＩＬ１００＝１４．２ｐＭ）、Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢによって媒介される殺滅効力に最小にしか影響を与えなかった。しかし、１０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬを培養物に添加した場合、８４．３倍のＥＣ５０の増大によって反映される通り（ＥＣ５０ＡＰＲＩＬ１０００＝４８８．９ｐＭ）、Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢによって媒介される殺滅効力は、大幅に低減された。表９は、外因性ＡＰＲＩＬの非存在および存在下におけるＡＰＲＩＬ遮断／競合Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢのＥＣ５０値を要約する。
【０２８０】
結果は、ＡＰＲＩＬ遮断／競合ＢＣＭＡ−ＴＣＢ抗体が、多発性骨髄腫患者の骨髄微小環境または血液中に存在する可能性が高い高濃度の可溶性ＡＰＲＩＬによって影響されうることを示唆する。これらの観察を臨床状況へと置きか換えることは、骨髄または血液中に高レベルのＡＰＲＩＬを有する患者におけるＪ６Ｍ０−ＴＣＢなど、ＢＣＭＡ−ＴＣＢの所定の低治療用量において、骨髄腫細胞は殺滅されず、高レベルの可溶性ＡＰＲＩＬを有する患者における抗腫瘍効果が失われる可能性が高いことを意味する。
【０２８１】
【表９】
2018508462.tif 000020
【０２８２】
（実施例４．３）
可溶性ＡＰＲＩＬは、Ｔ細胞活性化を誘導するＡＰＲＩＬ競合／遮断ＢＣＭＡ−ＴＣＢ抗体の効力に影響する
フローサイトメトリーによって、Ｔ細胞活性化を誘導するＡＰＲＩＬ競合／遮断Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢの効力における可溶性ＡＰＲＩＬの効果も検査した。ヒトＢＣＭＡ発現ＭＭ細胞の存在または非存在において、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞における初期活性化マーカーＣＤ６９または後期活性化マーカーＣＤ２５の表面発現を評価することにより、Ｔ細胞活性化を測定した。簡潔に説明すると、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９細胞を細胞解離緩衝液により採取し、計数し、生存率をチェックした。改変ＲＰＭＩ−１６４０培地において１ｍｌ当たり０．３×１０６個の（生）細胞となるように細胞を調整し、ウェル当たり１００μｌのこの細胞懸濁液をピペットで吸って丸底９６ウェルプレートに入れた（示されている通り）。５０μｌの（希釈した）ＡＰＲＩＬ競合／遮断Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢ抗体を細胞含有ウェルに添加して、最終濃度０．３ｐＭ〜３０ｎＭを得た。健康なドナーの採取したての血液からヒトＰＢＭＣエフェクター細胞を単離し、改変ＲＰＭＩ−１６４０培地において１ｍｌ当たり６×１０６個の（生）細胞となるように調整した。アッセイプレートのウェル当たり５０μｌのこの細胞懸濁液を添加して、ＰＢＭＣ対骨髄腫腫瘍細胞の最終Ｅ：Ｔ比１０：１を得た。ＡＰＲＩＬ競合／遮断Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢ抗体が、ヒトＢＣＭＡを発現する標的細胞の存在下において、特異的にＴ細胞を活性化することができたか分析するために、３ｎＭのＪ６Ｍ０−ＴＣＢ抗体と共にＰＢＭＣを含有したが、標的細胞を含有しないウェルを含めた。３７℃、５％ＣＯ２における１５〜２８時間（ＣＤ６９）または２４〜４８時間（ＣＤ２５）のインキュベーション後に、細胞を遠心分離し（５分間、３５０×ｇ）、０．１％のＢＳＡを含有する１５０μｌ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄した。ＣＤ４（マウスＩｇＧｌ、Ｋ；クローンＲＰＡ−Ｔ４）、ＣＤ８（マウスＩｇＧｌ、Ｋ；クローンＨＩＴ８ａ；ＢＤ型番５５５６３５）、ＣＤ６９（マウスＩｇＧｌ；クローンＬ７８；ＢＤ型番３４０５６０）およびＣＤ２５（マウスＩｇＧｌ、Ｋ；クローンＭ−Ａ２５１；ＢＤ型番５５５４３４）の表面染色を、供給元の示唆に従い、４℃で３０分間行った。０．１％のＢＳＡを含有する１５０μｌ／ウェルのＰＢＳで細胞を２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの固定緩衝液（ＢＤ型番５５４６５５）を使用して１５分間４℃で固定した。遠心分離後に、０．１％のＢＳＡを有する２００μｌ／ウェルのＰＢＳに試料を再懸濁し、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ装置（ソフトウェアＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ）を使用して分析した。図６は、４８時間のインキュベーション後の、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞における初期活性化マーカーＣＤ６９（Ｂ、Ｄ）および後期活性化マーカーＣＤ２５（Ａ、Ｃ）の発現レベルを描写する（２つの独立した実験の代表的な結果）。ＡＰＲＩＬ競合／遮断Ｊ６Ｍ０−ＴＣＢ抗体は、ＢＣＭＡ陽性標的細胞の存在下、外因性可溶性ＡＰＲＩＬの非存在下において、濃度依存的かつ特異的な様式で、ＣＤ６９およびＣＤ２５活性化マーカーの上方調節を誘導した（四角）。１００ｎｇ／ｍＬの可溶性ＡＰＲＩＬを培養物に添加した場合、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞における活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の両方に関して、濃度応答曲線の右へのわずかなシフトが観察された。１０００ｎｇ／ｍＬの可溶性ＡＰＲＩＬを培養物に添加した場合、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方におけるＴ細胞活性化の明らかな低減が見られた。ＤＰ４７−ＴＣＢ対照抗体でヒトＰＢＭＣを処置した場合、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は観察されず、Ｔ細胞におけるＣＤ３への結合にもかかわらず、ＴＣＢ抗体がＢＣＭＡ陽性標的細胞に結合しない場合、Ｔ細胞活性化が起こらないことを示唆する（データ図示せず）。結果は、特に、ＢＣＭＡ−ＴＣＢがＡＰＲＩＬと競合する場合、高レベルの可溶性ＡＰＲＩＬが、腫瘍標的およびＴ細胞への結合後にＴ細胞活性化を誘導するＢＣＭＡ−ＴＣＢ抗体の効力を低減することを明らかに示唆する。
【０２８３】
（実施例５）
骨髄腫患者悪性形質細胞を殺滅するＢＣＭＡ−１−ＴＣＢ抗体の効力は、より大きいＥ：Ｔ比および悪性形質細胞におけるより大きいＢＣＭＡ発現（相対ＭＦＩ）を有する患者骨髄試料においてより顕著である
地域の倫理審査委員会によるガイドラインおよびヘルシンキ宣言に従い、説明同意文書の署名を得た後で、多発性骨髄腫患者から骨髄吸引物を収集する。骨髄浸潤自家Ｔ細胞による骨髄浸潤悪性形質細胞のリダイレクトＴ細胞殺滅を誘導するＢＣＭＡ−１−ＴＣＢ抗体の効力を評価するために、骨髄腫患者から全骨髄試料を収集し、全骨髄試料にＢＣＭＡ−１−ＴＣＢ抗体を直接スパイクした。簡潔に説明すると、２００μｌの全骨髄試料を９６ディープウェルプレートに移した。無菌ＰＢＳにおいてＢＣＭＡ−１−ＴＣＢ抗体および対照抗体希釈物を調製し、０．０３ｐＭ〜３０ｎＭの範囲の最終濃度のために、この調製物をそれぞれのウェルに添加した。全骨髄−抗体懸濁液を穏やかな振とうにより混合し、続いてパラフィンフィルムで密封して、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。インキュベーション期間後に、細胞懸濁液試料をＫ３−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）により赤血球溶解し、免疫表現型分析のために細胞試料を調製した。ＣＤ１３８−ＡＰＣＣ７５０／ＣＤ３８−ＦＩＴＣ／ＣＤ５−ＢＶ５１０／ＣＤ５６−ＰＥ／ＣＤ１９−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ７／ＣＤ４５−Ｖ４５０／ＢＣＭＡ−ＡＰＣ／アネキシン−Ｖ−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５を含む抗体パネルに基づき調製した２０μｌの対応するＦＡＣＳ抗体溶液を９６−Ｕ字底プレートに添加した。蛍光色素標識された抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）およびＣａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＣＡ）から購入し、自家製のＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＢＣＭＡ抗体を使用した。次に、試料を１５分間、暗所で室温にてインキュベートし、マルチレーザーフローサイトメーターを使用して取得および分析を行った。悪性形質細胞集団ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋ＣＤ４５＋ＣＤ１９−ＣＤ５６＋においてゲーティングされるアネキシン−Ｖ陽性発現を評価することにより、骨髄腫細胞死を決定した。次に、ＢＣＭＡ−１−ＴＣＢ二特異性抗体の各濃度における骨髄腫細胞死の百分率を決定した。図７に描写される通り、わずか２４時間のインキュベーション後には既に、ＢＣＭＡ−１−ＴＣＢは、患者Ｃ１（Ａ）および患者Ｃ８（Ｂ）の両方に由来する悪性形質細胞の濃度依存的かつ特異的殺滅を誘導した。しかし、骨髄腫細胞の殺滅は、患者Ｃ１骨髄試料において、患者Ｃ８骨髄試料よりも顕著であった。これは、患者Ｃ１骨髄試料における、不利な０．５：１のＥ：Ｔ比および骨髄腫細胞におけるより弱いＢＣＭＡ発現（すなわち、相対ＭＦＩ値１４８９）を有する患者Ｃ８骨髄試料よりも有利な１１：１のＥ：Ｔ比およびＢＣＭＡ発現（すなわち、相対ＭＦＩ値２６３６）に起因しうる。結果は、患者骨髄におけるＥ：Ｔ比の測定と組み合わせた、悪性形質細胞におけるＢＣＭＡ発現の測定が、骨髄腫患者がＢＣＭＡ−ＴＣＢ処置に応答できるかについてより正確に予測しうることを示唆する。
【０２８４】
（実施例６）
ＢＣＭＡ−１−ＴＣＢに対する患者骨髄試料の応答性に関する患者生物学的パラメータ（骨髄腫細胞におけるＢＣＭＡ相対発現、Ｅ：Ｔ比、可溶性ＡＰＲＩＬおよび可溶性ＢＣＭＡ）
中程度の相対ＭＦＩ（１０００〜５０００の範囲）を有する試料は、薬物に７１．４％（５／７）応答し、低ＢＣＭＡ発現（相対ＭＦＩ＜１０００）を有する試料は、薬物に３３．３％（１／３）応答する。有利なＥ：Ｔ比（Ｅ：Ｔ＞１）を有する患者試料は、薬物に６６．７％（４／６）応答する。不利なＥ：Ｔ比＜１を有する患者試料は、薬物に６０％（３／５）応答する。少なくとも２種の生物学的パラメータの組合せを評価した。骨髄腫細胞における有利なＢＣＭＡ発現および有利なＥ：Ｔ比の両方が、薬物応答予測に使用された場合、７５％（３／４）の相関が見出された。
【０２８５】
【表１０】
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【図１】
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【図２】
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【図２．１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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