(57)【要約】  本発明は、液体の全血サンプル又はそれに由来するサンプル中の、例えばＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞など、１つ以上のサブクラスの目的の血液細胞（ＢＣｏＩ）を迅速に評価するための新規な方法；その細胞の細胞数を測定する方法；ＣＤ４／ＣＤ８比を決定する方法；サンプル中のその受容体の量を測定する方法；並びにその評価を行う垂直フローアッセイ装置に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体の全血サンプル又はそれに由来するサンプル中の、１つ以上のサブクラスの目的の血液細胞（ＢＣｏＩ）を評価する評価方法であって、
前記サブクラスの各々が、前記サブクラスの目的の血液細胞の第１細胞表面マーカー（Ｍ１）を有し、
さらに前記サンプルが、前記第１細胞表面マーカー（Ｍ１）の少なくとも１つを非特異的マーカーとして有する阻害血液細胞（ＤＢＣ）、及び／又は、前記第１細胞表面マーカー（Ｍ１）のいずれかの遊離の非細胞表面結合型を少なくとも1つ含んでもよい、下記工程を含む方法：
（１）前記サンプルから、任意の阻害血液細胞（ＤＢＣ）を除去する工程；
（２）工程（１）で得られたサンプルから、各々の前記第１細胞表面マーカー（Ｍ１）の任意の遊離の非細胞表面結合型を除去する工程；及び、
（３）工程（２）で得られたサンプル中の、前記第１細胞表面マーカー（Ｍ１）を有する各々の前記サブクラスのＢＣｏＩを評価する工程。
【請求項２】
評価方法が垂直フローアッセイ法である、請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
工程（１）において前記ＤＢＣを濾過により除去する、請求項１又は２に記載の評価方法。
【請求項４】
前記ＤＢＣが凝集し、該凝集物が工程（１）において適用されたフィルタで保持される、請求項３に記載の評価方法。
【請求項５】
前記ＤＢＣが、前記ＢＣｏＩに結合しない免疫グロブリン分子によって凝集する、請求項４に記載の評価方法。
【請求項６】
前記ＤＢＣが、前記ＢＣｏＩの表面上に存在しない第２細胞表面マーカー（Ｍ２）に結合する免疫グロブリン分子によって凝集する、請求項５に記載の評価方法。
【請求項７】
前記ＤＢＣに結合する免疫グロブリンが、固体粒子の表面、特にポリマー粒子の表面に結合する遊離抗体、高分子抗体又は抗体から選択される、請求項５又は６に記載の評価方法。
【請求項８】
工程（２）において、前記第１細胞表面マーカー（Ｍ１）の前記非細胞表面結合型に対して透過性であるが前記ＢＣｏＩを保持するフィルタを適用することによって、前記第１細胞表面マーカー（Ｍ１）の前記非細胞表面結合型を濾過により除去する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項９】
前記工程（３）の評価が、前記第１細胞表面マーカー（Ｍ１）と反応する免疫グロブリン分子によって実施される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項１０】
前記免疫グロブリン分子が標識されている、請求項９に記載の評価方法。
【請求項１１】
前記標識が、酵素、蛍光若しくは着色分子マーカー又は蛍光若しくは着色粒子から選択される、請求項１０に記載の評価方法。
【請求項１２】
前記ＢＣｏＩがリンパ球のサブクラスから選択され、特にＴリンパ球であり、前記ＤＢＣが単球である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項１３】
前記第１細胞表面マーカー（Ｍ１）がＴリンパ球マーカー（Ｍ１ａ）、特にＣＤ４細胞表面受容体分子である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項１４】
評価される前記１つ以上のサブクラスの目的の血液細胞（ＢＣｏＩ）がＣＤ４＋細胞を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項１５】
前記第１細胞表面マーカー（Ｍ１ａ）がＣＤ４であり、且つ、前記第１のサブクラスの細胞がＴヘルパー細胞である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項１６】
前記方法が、さらに、前記第１細胞表面マーカー（Ｍ１ａ）とは異なる細胞表面マーカー（Ｍ１ｂ）を有する第２のサブクラスのＢＣｏＩの評価を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項１７】
前記細胞表面マーカー（Ｍ１ｂ）が、Ｍ１ａとは異なるＴリンパ球マーカー、特に表面マーカーＣＤ８であり、且つ、前記第２のサブクラスのＢＣｏＩがＣＤ８＋細胞を含む、請求項１６に記載の評価方法。
【請求項１８】
前記細胞表面マーカー（Ｍ１ｂ）がＣＤ８であり、且つ、前記第２のサブクラスの細胞が細胞傷害性Ｔ細胞である、請求項１７に記載の評価方法。
【請求項１９】
前記第２細胞表面マーカー（Ｍ１ｂ）を有する前記第２のサブクラスのＢＣｏＩの評価が、特に同じサンプル中の、第１細胞表面マーカー（Ｍ１ａ）を有する前記第１のサブクラスのＢＣｏＩの評価と共に工程（３）で実施される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項２０】
前記マーカー（Ｍ１ｂ）を有する前記第２のサブクラスのＢＣｏＩの評価が独立して実施される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の評価方法であって、下記工程を含む評価方法：
（４）必要に応じて、評価を阻害するおそれのある任意の巨大分子不純物を、前記サンプルから除去する工程；
（５）前記第２細胞表面マーカー（Ｍ１ｂ）の任意の遊離の非細胞表面結合型を、（場合により、工程（４）で得られる）前記サンプルから除去する工程；及び、
（６）前記細胞表面マーカー（Ｍ１ｂ）を有する前記サブクラスのＢＣｏＩを、工程（５）で得られるサンプル中で評価する工程。
【請求項２２】
工程（５）において、前記細胞表面マーカー（Ｍ１ｂ）の前記非細胞表面結合型に対して透過性であるが、（Ｍ１ｂ）を有する前記サブクラスのＢＣｏＩを保持するフィルタを適用することによって、前記第２細胞表面マーカー（Ｍ１ｂ）の前記非細胞表面結合型を濾過により除去する、請求項２１に記載の評価方法。
【請求項２３】
前記工程（６）の評価が、前記細胞表面マーカー（Ｍ１ｂ）と反応する免疫グロブリン分子を用いて実施される、請求項２２に記載の評価方法。
【請求項２４】
前記免疫グロブリン分子が標識されている、請求項２３に記載の評価方法。
【請求項２５】
前記標識が、酵素、蛍光若しくは着色分子マーカー又は蛍光若しくは着色粒子から選択される、請求項２４に記載の評価方法。
【請求項２６】
前記ＤＢＣがＣＤ１４＋単球である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項２７】
工程（１）におけるＤＢＣの凝集が、免疫グロブリンを含む第１の液体を添加することによって実施され、前記液体はサンプル中に含まれる赤血球を溶解することができる、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項２８】
実施形態１〜２７のいずれか一項に記載の評価方法であって、以下の工程を含む評価方法：
（１ａ）前記サンプル又は前記サンプルのアリコートを、前記特定のサブグループの細胞とは異なるが、前記ＣＤ４受容体を有する他の細胞の表面で他の構造と結合する抗体を含む第１の液体と混合し、前記細胞の特定のサブグループ内の細胞のサイズよりも著しく大きいサイズを有する粒子、凝集体又は粒子若しくは細胞のクラスターを形成する工程；
（１ｂ）形成された前記粒子、凝集体又は粒子若しくは細胞のクラスターを、サイズ排除フィルタで構成された第１のフィルタを用いて濾過する工程；及び、
（２）前記サンプル中の前記特定のサブグループの細胞を保持するが、溶液中のＣＤ４受容体分子をフィルタを通して通過させる第２のフィルタに、残りの混合物を通す工程；続いて、任意の洗浄工程；
（３ａ）続いて、酵素又は着色された若しくは蛍光性の粒子で構成された標識で標識され、前記ＣＤ４受容体に特異的に反応する抗体を含む液体に、前記第２のフィルタを曝露する工程；続いて、任意の洗浄工程；
（３ｂ）続いて任意に、前記酵素に基質を添加して、着色された若しくは蛍光性の基質を生成する工程；及び、
（３ｃ）前記第２のフィルタ上の色又は蛍光の強度を測定し、前記特定のサブグループの細胞の表面上の前記ＣＤ４受容体のクラスの濃度に、前記強度を相関させる工程。
【請求項２９】
評価前（すなわち、工程（１）（１ａ）及び（４）が実施される前）の前記血液サンプルに対して、（選択的な）好ましくは低張な、赤血球の溶解が行われる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項３０】
ＣＤ４＋細胞グループの細胞数を評価する、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項３１】
ＣＤ４＋細胞グループの細胞数と、ＣＤ４＋細胞とは異なる少なくとも１つのさらなる細胞グループ、特にＣＤ８＋細胞グループの細胞数、特にＣＤ４／ＣＤ８比を評価する、請求項３０に記載の評価方法。
【請求項３２】
ＣＤ４＋細胞の表面上に位置するＣＤ４受容体の量の評価と、必要に応じて、全血サンプル又は血液由来サンプル中のＣＤ８＋細胞の表面上に位置するＣＤ８受容体の量の評価を行う方法であって、
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の評価方法を実施する工程；ＣＤ４＋細胞グループの評価のために得られたシグナルを、細胞結合ＣＤ４＋受容体の量と相関させる工程；及び、必要に応じて、ＣＤ８＋細胞グループの評価のために得られたシグナルを、細胞結合ＣＤ８＋受容体の量と相関させる工程を含む評価方法。
【請求項３３】
前記方法において適用される前記免疫グロブリン分子が、モノクローナル又はポリクローナル、特に非げっ歯類である非ヒトの抗体などの抗体である、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項３４】
（Ｍ１ａ）及び／又は（Ｍ１ｂ）（特にＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋細胞）への結合に適用された免疫グロブリンが、平均粒径が３０〜５００ｎｍの範囲である着色ラテックス粒子に共有結合している、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載の評価方法を実施するための垂直フローアッセイ装置であって、
少なくとも１つの（１０個の液体用）円形サンプル供給開口部（１０２）と、上部カバーシート（１０１）に固定された下部吸着層（１０５）とを備えた上部カバーシート（１０１）；
前記少なくとも１つの円形開口部（１０２）に取り外し可能に挿入された第１の円形フィルタ（１０６）；及び、
前記上部カバーシート（１０１）と前記下部吸着層（１０５）との間に固定された第２のフィルタ（１０４）を備え、
前記少なくとも１つの供給開口部（１０２）と、その中に挿入された円形フィルタ（１０６）とが、前記吸着層（１０５）から分離している装置。
【請求項３６】
前記第１の円形フィルタ（１０６）が、凝集した血液細胞を保持する開口部又は細孔を備え、非凝集血球、特にＣＤ４＋細胞及び場合によりＣＤ８＋細胞に対して透過性である、請求項３５に記載の装置。
【請求項３７】
前記第１の円形フィルタ（１０６）が、１８〜５０μｍ、好ましくは２２〜４０μｍ、より好ましくは２５〜３３μｍの範囲のグリッドサイズを有するネットフィルタである、請求項３６に記載の装置。
【請求項３８】
前記第２のフィルタ（１０４）が、非凝集血液細胞を保持する開口部又は細孔を有し、前記液体サンプルに可溶な成分に対して透過性である、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３９】
前記第２のフィルタ（１０４）が、１〜１０μｍ、好ましくは３〜９μｍ、より好ましくは５〜８μｍの範囲の細孔サイズを有する、請求項３８に記載の装置。
【請求項４０】
前記第１の円形フィルタ（１０６）がキャリアリング（１０８）を介して接着テープ（１０７）に固定され、前記リング（１０８）が前記サンプル供給開口部（１０２）の直径よりわずかに小さい外径と、所定のサンプル容量の定量的な取り込みに十分な独立した円形空間を設定するために選択された内径とを有する、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４１】
前記テープ（１０７）が前記上部カバーシート（１０１）の上側に取外し可能に接着している、請求項４０に記載の装置。
【請求項４２】
前記少なくとも１つの円形開口部（１０２）の中に取り外し可能に挿入された前記第１の円形フィルタ（１０６）が、前記上部カバーシート（１０１）から前記テープ（１０７）を除去することにより装置から取り外される、請求項３５〜４１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４３】
前記吸着層が、垂直フローアッセイの間に、前記サンプル供給開口部（１０２）に添加されたサンプル、試薬及び洗浄溶液の任意の液体成分の吸着に十分に高い吸着能力を有する、請求項３５〜４２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４４】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載の評価方法を実施するための請求項３５〜４３のいずれか一項に記載の装置の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体の全血サンプル又はそれに由来するサンプル中の、例えばＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞など、１つ以上のサブクラスの目的の血液細胞（ＢＣｏＩ）を迅速に評価するための新規な方法；その細胞の細胞数を測定する方法；ＣＤ４／ＣＤ８比を決定する方法；サンプル中のその受容体の量を測定する方法；並びにその評価を行う垂直フローアッセイ装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
全血とは、標準的な献血又は血液サンプリング由来のヒト血液に使用される用語である。その血液は、典型的には、採取の工程中に抗凝固剤と混合されるが、一般的には未処理である。全血には、血漿、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）及び白血球（ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ）及び血小板が含まれる。研究分析用の血液サンプルの凝固を防ぐために添加する抗凝固剤として、ヘパリン、クエン酸塩及びＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）が一般的に使用される。
【０００３】
ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、ヒト免疫系の必須要素である白血球である。それらはしばしばＣＤ４細胞、Ｔヘルパー細胞又はＴ４細胞と呼ばれるリンパ球の亜集団である。主要な役割の１つがＣＤ８キラー細胞を含む他のタイプの免疫細胞にシグナルを送ることであることから、それらはヘルパー細胞と呼ばれている。ＣＤ４細胞はシグナルを送り、そしてＣＤ８細胞は感染性粒子を破壊する。例えば、未治療のＨＩＶ感染又は移植前の免疫抑制後にＣＤ４細胞が枯渇した場合、そうでなければ戦うことができた広範囲な感染に対して生体は無防備になる。
【０００４】
血液細胞はしばしば細胞表面受容体（膜受容体、しばしば膜貫通受容体の形態である）を含む。これらの分子は、細胞と外界の間の相互作用に関与する特殊な内在性膜タンパク質である。細胞外シグナル伝達分子（通常、ホルモン、神経伝達物質、サイトカイン、成長因子又は細胞認識分子）が受容体に結合し、細胞の機能変化を引き起こす。この過程はシグナル伝達と呼ばれ、その結合は膜の細胞内側の化学変化を開始させる。このようにして、受容体は細胞相互作用及びシグナル伝達においてユニークでかつ重要な役割を果たす。多くの膜貫通型受容体は、集合的に作用する２つ以上のタンパク質サブユニットから構成され、リガンドが結合するか、脱落するか又はそれらの「活性化」サイクルの別の段階で解離する。（Ｗｉｋｉｐｅｄｉａの引用  ２０１４年７月２４日）。
【０００５】
ＣＤ４（クラスター分類４）と呼ばれる受容体は、Ｔヘルパー細胞、単球、マクロファージ及び樹状細胞などの免疫細胞の表面に見出される糖タンパク質である。ＣＤ４受容体は１９７０年代後半に発見され、１９８４年にＣＤ４と命名される前にはｌｅｕ−３やＴ４（それに反応するＯＫＴ４モノクローナル抗体後）として元々知られていた。ヒトにおいて、ＣＤ４タンパクはＣＤ４遺伝子によってコードされている。（非特許文献１及び非特許文献２）
【０００６】
ＨＩＶ感染は、ＣＤ４を発現するＴ細胞の数を段階的に減少させる。医療従事者は、「ＣＤ４数」を参考にして、ＨＩＶ感染中に治療をいつ開始するか、又は疾患中の投薬をどのようにコントロールするかを決定する。正常な血液の値は、通常、血液マイクロリットル（μＬ）（又は立方ミリメートル、ｍｍ３）あたりの細胞数として表され、ＣＤ４細胞の正常値は５００〜１２００細胞／ｍｍ３である。ＣＤ４数は、ＣＤ４を発現するＴ細胞の数を測定する。ＣＤ４数は、例えば、ウイルスＤＮＡの存在やＨＩＶに対する特異的な抗体の存在を確認するような直接的なＨＩＶ検査ではないが、それらは患者の免疫系を評価するために使用される。ヨーロッパではＣＤ４数が３５０細胞／μＬに達すると患者はしばしば治療を受けるが、米国では、通常、約５００細胞／μＬに達すると患者はしばしば治療を受ける。２００細胞／μＬ未満のヒトは、ＡＩＤＳに定義される疾患に罹患するリスクが高い。最新の国立衛生研究所（ＮＩＨ）のガイドラインでは、ＣＤ４数にかかわらず、ＨＩＶ陽性者の治療を推奨している。また、医療従事者は、治療の有効性を判定するためにＣＤ４検査を参考にする。
【０００７】
Ｔヘルパー細胞のみが細胞表面と細胞質のＣＤ４受容体を有するわけではない。非特許文献３は、すべての単球がＣＤ４陽性であると報告した。全血液中の単球の数は一般的に多い。したがって、Ｔヘルパー細胞に関連するＣＤ４受容体の数を測定する方法は、ＣＤ４受容体を有する単球を選別する工程又は方法の一部を包含する必要がある。
【０００８】
ＣＤ４を有する他の血液細胞（マクロファージなど）は低量で含まれており、本明細書中では血液中で無視できる割合である。
【０００９】
フローサイトメトリーは、細胞を同定し、計数するための強力なツールである。フローサイトメーターは、レーザービームを通る流れを通過する個々の細胞を検出し、計数する。多数の細胞を調べることにより、フローサイトメトリーは、Ｂ細胞を特徴付ける表面免疫グロブリン、ＣＤ３として知られているＴ細胞受容体関連分子、及び主要なＴ細胞サブセットを区別するＣＤ４とＣＤ８の共受容体タンパクなどの異なる分子を有する細胞の割合について定量的データを与えることができる。混合集団内の個々の細胞は、蛍光色素で標識された特異的抗体、又は、例えば、特異的抗体後、標識された抗イムノグロブリン抗体でタグ付けされる。そして、標識された細胞の懸濁混合物は、隙間を通って強制的に押し出され、間隔をあけて単独で細胞を含む細かい液体の流れが生じる。各細胞がレーザービームを通過すると、レーザー光が散乱し、細胞に結合した色素分子は励起されて蛍光を発する。感度光電子増倍管は、細胞の大きさや粒度に関する情報を与える散乱光と、標識された抗体の結合、すなわち各細胞による細胞表面タンパクの発現に関する情報を与える蛍光発光の両方を検出する。それぞれが異なる蛍光色素に結合した２つ以上の抗体が使用される場合、データは２次元散布図又は等高線図の形で表示され、１つの色素標識抗体の蛍光を第２の蛍光標識抗体の蛍光に対してプロットし、その結果、１つの抗体で標識する細胞の集団は、第２の抗体とのその反応性に基づいてさらに細分することができる。
【００１０】
典型的には、前記フローサイトメトリー技術を用いて、研究室でＣＤ４数が測定される。高価な最新の設備が必要とされるだけでなく、高度に訓練された人員、無菌水の供給及び試薬用の低温流通用貯蔵庫が一般的に必要であり、一元化された場所で試験を実施する必要がある。また、試験と得られる結果の間のタイミングの遅れは、重大な「患者のフォローアップの低下」につながり、救命処置を受けるために戻されることがないことが多い。
【００１１】
さらに、ＨＩＶの影響を最も受けた国の基準外の研究所や診療所の多くは、ＣＤ４数のモニターを定期的にすることができず、地方では検査へのアクセスが困難又は不可能になる可能性がある。
【００１２】
患者の近くでの検査を促進し、非常に高度で複雑なフローサイトメーターの機器を備えた一元化された研究所の必要性を減らすために、米国のＡｌｅｒｅ社は、いわゆるＰＩＭＡシステムを開発した（非特許文献４参照）。その点について、以下が述べられている。ＰＩＭＡ試験のために、各参加者は、ＰＩＭＡ  ＣＤ４カートリッジに、ランセットフィンガースティックによって指先から直接採取された１〜２滴の血液を提供した。十分な毛細血管血流に達するために、１．８ｍｍの穿刺深さのブレードタイプランセット（Ｓａｒｓｔｅｄｔ社）を使用した。そのＰＩＭＡカートリッジは、２５μＬの容器に血液を採取した。この初期容量のうち、５μＬの血液をＰＩＭＡカートリッジ中に吸引し、さらに細胞量の分析に使用した。カートリッジをキャップし、すぐにＰＩＭＡ分析装置に挿入して試験を実施した。分析工程中、血液は、カートリッジに含まれている凍結乾燥した蛍光標識抗体（抗ＣＤ３及び抗ＣＤ４）と自動的に混合され、検出チャンバーに移され、そこでは血液１ｍＬあたりのＣＤ４細胞の数を算出するために、標識細胞の画像が撮影される。
【００１３】
ＰＩＭＡシステムは、患者の近くでの検査のための良い進歩であったが、依然としてＰＩＭＡシステムは、生産に費用がかかる複雑なカセットを含む精巧な装置に基づいている。
【００１４】
イムノアッセイはもう一つの特に有用な評価形態であり、サンプルを分析し、その中の特定の成分を検出するために抗体−抗原反応の特異性、強度及び多様性を利用する。例えば非特許文献５に記載されている広範囲のイムノアッセイ技術が、利用可能である。また特定の抗原に対する抗体を検出するための広範囲な方法も知られている。例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）やラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）は、研究室で日常的に使用されている。また、アレイやハイスループットスクリーニング法も使用される。これらの方法は、一般的に、実験技法において高いレベルの技能を必要とする。熟練を必要とせず実施が迅速であるため、特定の抗原に対する抗体の検出及び／又は治療の時点における特定の抗原の検出に適した様々な方法も開発されている。特に、ウイルス感染を含む多数の感染を評価するための、ラテラルフロー、ディップスティック及びキャピラリチューブキットが開発されている。
【００１５】
ＣＤ４細胞を検出する１つの方法において、ＣＤ４＋Ｔリンパ球に結合するために抗ＣＤ４抗体を被覆したダイナビーズが使用される。抗ＣＤ１４抗体を被覆したビーズを用いて、ＣＤ１４とＣＤ４を発現する単球は新鮮な血液サンプルから除去される。公知文献である非特許文献６を参照のこと。その後、単離されたＣＤ４  Ｔリンパ球を溶解し、アクリジンオレンジで染色し、染色された核を蛍光顕微鏡で計数する。
【００１６】
「ＴＲＡｘ  ＣＤ４」試験キットは、非特許文献７に記載されている。このキットは、全血液サンプル中の全ＣＤ４を測定する方法に基づいたＥＬＩＳＡである。使用される抗体は、細胞結合性のＣＤ４と可溶性のＣＤ４を区別できない（非特許文献８参照）。
【００１７】
特許文献１には、ＣＤ４抗原を測定するためのイムノクロマトグラフィー装置が記載されている。しかしながら、この文献には、被験者由来のサンプル中で細胞質ドメインが欠損する細胞結合性のＣＤ４と可溶性のＣＤ４を区別できる捕捉試薬が開示されていない。さらに、特許文献１に記載されている装置は、試験ストリップ上に連続的な捕捉領域を飽和することによってＣＤ４を捕捉し、その後、サンプル中のＣＤ４細胞の濃度の視覚的指標を提供するための一連の番号を付した捕捉領域上のサンプルの流れに依存する。
【００１８】
例示的な実施形態では、この方法は、被験者からの血液サンプル中の細胞質（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ）ドメイン及び細胞外（外在性）ドメインを含むＴ細胞関連ＣＤ４レベル又はＣＤ４  Ｔ細胞レベルを評価するために使用される方法であって、以下の工程を含む：
（ｉ）必要に応じて、サンプルをＣＤ４  Ｔ細胞を溶解又は膜透過処理できる試薬と接触させる工程；
（ｉｉ）サンプルをＣＤ４の細胞質ドメインに結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させる工程；及び、
（ｉｉｉ）サンプル中の結合したＣＤ４のレベル又は存在を直接又は間接的に評価する工程。
【００１９】
Ａｎｄｅｒｓｏｎらによる特許文献２は、細胞質（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ）ドメイン及び細胞外（外在性）ドメインを含むＴ細胞関連ＣＤ４レベル又はＣＤ４  Ｔ細胞レベルを被験者から評価するラテラルフロー法を記載する。前記方法は、以下の工程を含む：
ａ）試験サンプルをイムノクロマトグラフィー装置のサンプル部分に適用する工程であって、
該サンプル部分は該装置の捕捉部分に操作可能に結合し、
試験サンプルの成分は、該サンプル部分から、ＣＤ４の細胞質ドメインに結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを含む該捕捉部分まで流動し、
抗体又はそのフラグメントに結合する細胞質ドメインを含まない可溶性ＣＤ４ではなく、細胞質ドメインを含むＣＤ４のみが捕捉されたＣＤ４を形成する工程；
ｂ）検出マーカーを含むか検出マーカーを含む第３の若しくは後続の結合物質に結合でき、細胞質又は細胞外ドメインを含むＣＤ４と結合する第２の結合物質と、該捕捉部分を接触させる工程；及び、
ｃ）必要に応じて、第２の結合物質を、検出マーカーを含む第３の若しくは後続の結合物質と接触させて、検出マーカーの存在を評価する工程。
【００２０】
この技術によって、英国のオメガ・ダイアグノスティックス（Ｏｍｅｇａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＵＫ）が製造する市販品である「ＶＩＳＩＴＥＣＴ（商標）ＣＤ４」が開発された。この装置は、細胞表面上に露出したＣＤ４受容体の一部及び細胞のＣＤ４受容体の細胞内部分の両方を含むＣＤ４を測定するための、ディスポーザブルの、患者に近い試験装置である。このようにして、血漿中に存在しているが白血球には結合していないＣＤ４受容体の可溶性部分の共測定が回避される。さらに、単球の磁気分離は、試験装置の不可欠な部分である。この試験は使いやすく、試験を行うためには指を穿刺した血液サンプルのみが必要である。それは精巧な実験装置が利用できない場所での試験に適した試験装置である。しかし、それは時間のかかる４０分間の試験であり、１７分後に別々の液体試薬を手動で添加する必要があり、これは試験の工程においてオペレータが誘発する障害を発生する。さらに、磁気分離装置を内蔵した複雑な製造物と、分離工程を処理するための磁性粒子を必要とする。
【００２１】
ラテラルフロー技術では、試薬及びサンプルの流れは、通常は濾過装置である装置の表面に平行であり、用いる試薬は、しばしば乾燥形態であり、フィルタに接続されているか、フィルタ内に設置又は固定されている。多くの分析対象の定性的、半定量的及び定量的測定のために、このような試験装置が大量に作られてきた。非特許文献９は、「Ｌａｔｅｒａｌ  ｆｌｏｗ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ｉｔｓ  ｓｔｒｅｎｇｔｈｓ，ｗｅａｋｎｅｓｓｅｓ，ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｒｅａｔｓ（ラテラルフローイムノアッセイ：その強み、弱点、チャンス及び脅威）」と題するレビューを提供する。
【００２２】
一般的に、ラテラルフロー技術の代替技術は、垂直フロー技術であろう。サンプル及び試薬が濾過装置に垂直に通され、場合によってはフィルタに固定された特異的な結合物質を有する対応する製品が作られている。ＨＩＶウイルスに対する抗体の検査が実施されている。例えば、非特許文献１０に記載のように、フィルタ装置中で固定された抗原又は抗原フラグメントを使用した、Ｍｅｄｍｉｒａ社（カナダ）によるものである。
【００２３】
ＮｙｃｏＣａｒｄ  ＣＲＰ検査は、細菌性又はウイルス性の感染の原因を示すための２分間のポイント・オブ・ケア（Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ）検査である。非特許文献１１に記載のように、ＮｙｃｏＣａｒｄ  ＣＲＰは、感染による発症後に急速に増加する急性期タンパクであるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を測定する。その垂直フローアッセイは、５μＬのサンプル容量、２分間の評価時間、全血、血清又は血漿のサンプル材料、全血サンプルの測定範囲：８〜２００ｍｇ／Ｌ、血清及び血漿サンプルの測定範囲：５〜１２０ｍｇ／Ｌによって特徴付けられている。サンプルのクロスオーバーはなく、ニトロセルロース濾過膜にＣＲＰに対する抗体を固定した使い捨ての検査装置を採用し、抗ＣＲＰ抗体に結合した金コロイド粒子を使用する。サンプルの接触のリスクは低く、膜表面上の色の簡単な反射測定値は、検査されたサンプル中のＣＲＰ濃度と相関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】国際公開第２００６／１１５８６６号
【特許文献２】米国特許第８，４０９，８１８号明細書
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Ｉｓｏｂｅ  Ｍ，Ｈｕｅｂｎｅｒ  Ｋ，Ｍａｄｄｏｎ  ＰＪ，Ｌｉｔｔｍａｎ  ＤＲ，Ａｘｅｌ  Ｒ，Ｃｒｏｃｅ  ＣＭ（Ｊｕｎｅ  １９８６）“Ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔ４  ｉｓ  ｌｏｃａｔｅｄ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １２”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３（１２）：４３９９−４４０２
【非特許文献２】Ａｎｓａｒｉ−Ｌａｒｉ  ＭＡ，Ｍｕｚｎｙ  ＤＭ，Ｌｕ  Ｊ，Ｌｕ  Ｆ，Ｌｉｌｌｅｙ  ＣＥ，Ｓｐａｎｏｓ  Ｓ，Ｍａｌｌｅｙ  Ｔ，Ｇｉｂｂｓ  ＲＡ（Ａｐｒｉｌ  １９９６）“Ａ  ｇｅｎｅ−ｒｉｃｈ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ＣＤ４  ａｎｄ  ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅｓ  ａｔ  ｈｕｍａｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １２ｐ１３”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６（４）：３１４-２６
【非特許文献３】Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９０  Ｄｅｃ  ３１；１３５（１−２）：５９−６９，Ｆｉｌｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ
【非特許文献４】“Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＩＭＡ  Ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−Ｃａｒｅ  ＣＤ４  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ｉｎ  ＶＣＴ  Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｉｎ  Ｚｉｍｂａｂｗｅ”ｂｙ  Ｓｅｋｅｓａｉ  Ｍｔａｐｕｒｉ−Ｚｉｎｙｏｗｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｊ  Ａｃｑｕｉｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃ  Ｓｙｎｄｒ  ２０１０；５５：１-７
【非特許文献５】“Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，２００１
【非特許文献６】“Ｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ−１  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ＩｇＧ４  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ：ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＩＬ−１０”ｂｙ  Ｓａｔｏｇｕｉｎａ  ＪＳ，Ｗｅｙａｎｄ  Ｅ，  Ｌａｒｂｉ  Ｊ，Ｈｏｅｒａｕｆ  Ａ，ｉｎ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００５）１７４：４７１８−４７２６
【非特許文献７】Ｐａｘｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２（１）：１０４−１１４，１９９５
【非特許文献８】Ｌｙａｍｕｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９５：１０３−１１２，１９９６
【非特許文献９】Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ（２００９）３９３：５６９-５８２，Ｇｅｅｒｔｒｕｉｄａ  Ａ．Ｐｏｓｔｈｕｍａ−Ｔｒｕｍｐｉｅ  ＆  Ｊａｋｏｂ  Ｋｏｒｆ  ＆  Ａａｒｔ  ｖａｎ  Ａｍｅｒｏｎｇｅｎ
【非特許文献１０】Ｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｙ  ２００８，ｐ．１５８８−１５９５，Ｖｏｌ．４６，Ｎｏ．５“Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔｅｓｔｓ  Ｔｈａｔ  Ａｒｅ  Ｌｉｃｅｎｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ”
【非特許文献１１】“Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅａｒ−ｐａｔｉｅｎｔ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｓｅｄ  ｉｎ  ｄａｉｌｙ  ｒｏｕｔｉｎｅ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｐｌｏｔｓ”ｂｙ  Ｄａｈｌｅｒ−Ｅｒｉｋｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９９７  ｖｏｌ．４３  ｎｏ．１１  ２０６４−２０７５
【発明の概要】
【００２６】
全血サンプル中の、例えばＴ細胞関連ＣＤ４受容体など、診断又は治療を目的とする血液細胞のサブクラスに特異的な細胞表面受容体を評価するための簡単、迅速、低コストの方法及び装置が必要とされる。
【００２７】
上記の問題は、特許請求の範囲に定義され、以下でより詳細に説明される方法及び装置によって驚くべきことに解決された。
【００２８】
本発明は、非常に驚くべきことに、特定の血液細胞の評価のために、迅速な垂直フロー原理を適用することを可能にした。具体的には、フィルタに固定された特異的結合物質を使用することなく適用できる。本発明は、垂直フローイムノアッセイでは良く知られているフィルタの表面に発生した色の比色測定を使用するが、フィルタ内で抗体を固定するは必要ない。
【００２９】
本発明は、１つの実施形態において、全血サンプル又は全血由来のサンプル中の細胞の「特定クラス」又は「特定グループ」（目的の血液細胞（ＢＣｏＩ）とも呼ばれる）に結合した受容体の特定クラスの受容体分子の量の評価を行う方法に関する。典型的には、受容体分子の前記クラスはＣＤ４受容体のクラスであり、典型的には、前記受容体分子を有する細胞のクラス（本明細書ではサブクラス、サブセット又は亜集団ともいう）は、Ｔリンパ球である。
【００３０】
本発明の評価方法は、「第１の工程」で、前記サンプル又は前記サンプルのアリコートを、細胞の前記特定グループ（又はクラス）とは異なるが、前記受容体を有する「他の細胞」の表面で他の構造物と結合する抗体を含む「第１の液体」と混合し（前記「他の細胞」は、阻害血液細胞（ＤＢＣ）とも呼ばれる）、細胞の前記特定グループ内の細胞のサイズよりも著しく大きいサイズを有する粒子、凝集体又は粒子若しくは細胞のクラスターを形成することを特徴とする。
【００３１】
本発明の１つの実施形態において、前記「第１の液体」中の前記抗体は、単球上に非常に豊富にあるＣＤ１４に対して特異的な親和性を有する（そして単球もＣＤ４受容体を有する。そうでなければ評価を阻害することになる）。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、さらに前記「他の細胞」のクラスターを形成する前記「他の細胞」に対する抗体を有する前記「第１の液体」を特徴とするか、或いはその抗体は、細胞の「前記特定グループ」における細胞のサイズよりも著しく大きいサイズの粒子、凝集体又は粒子若しくは細胞のクラスターを容易に形成する粒子、ポリマー若しくは他の大きな分子に重合若しくは固定される。
【００３３】
本発明の１つの実施形態において、前記「第１の液体」の抗体は受容体ＣＤ１４に対する特異的親和性を有する。したがって、細胞の前記「特定グループ」における細胞のサイズよりも有意に大きいサイズの前記サンプルの単球を含む粒子、凝集体又は粒子若しくは細胞のクラスターの形成を可能にする。
【００３４】
好ましくは、前記「第１の液体」は、サンプルの赤血球を迅速に溶解させるために、イオン強度が低く、分析されるサンプルと混合された後に前記低イオン強度を維持するのに十分に大きい体積を有する。
【００３５】
白血球の溶解を伴わない赤血球の低張溶解は、Ｃｕｎｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１４，６，１３７７−１３８３に“Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ  ｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ（ヒト赤血球の低張溶解の動態学）”と題して記載されている。赤血球の溶解は、全血サンプルの垂直フローイムノアッセイにおいて非常に一般的である。
【００３６】
本発明の方法の「第２の工程」は、細胞の「特定グループ」をフィルタを介して分析できるようにする第１のフィルタを用いて、分析される細胞の「特定グループ」よりも有意に大きいサイズを有する前記粒子、クラスター又は凝集体を濾過する濾過工程である。
【００３７】
本発明の１つの実施形態では、ＣＤ１４受容体に対する特異的反応性を有する抗体と反応することによって形成したクラスターを有する、サンプルの単球を含むＣＤ１４受容体を含む細胞（任意に抗体がポリマーに結合しているか、又は粒子に固定されている）は、Ｔ細胞（及びＣＤ４受容体を有するＴ細胞）を通過させるフィルタを用いて除去される。前記「第１のフィルタ」は、分析する細胞の「特定グループ」の通過を可能にする孔径を有さなければならない。本発明の１つの実施形態では、細胞の前記「特異的グループ」はＴリンパ球によって構成されているため、前記実施形態では、前記「第１のフィルタ」は、Ｔリンパ球がフィルタを通過することを可能にする孔径を有さなければならない。
【００３８】
細胞の非特異的結合性が低く、細孔分布がかなり狭いフィルタ材料が好ましい。ナイロンウェブフィルタは細孔径が明確に定義されており、非特異的な結合性がかなり低いため、非常に良い選択肢である。Ｔリンパ球は、３０μＭのフィルタを容易に通過するが、単球の凝集体、特に大きな粒子に凝集した場合（例えば直径１．０μｍ〜５０μｍ）、抗ＣＤ１４受容体抗体を有する粒子はこのようなフィルタに止められる。
【００３９】
非限定的には、前記「第１のフィルタ」は、ガラス、ガラス繊維、ポリプロピレン、ポリエチレン、フルオロポリマー、セルロース、ニトロセルロース、ポリアミド及びこれらの混合物からなるものであってもよい。一般的に、タンパク質及び細胞の非特異的結合に対してはブロッキング処理が好ましい。Ｔリンパ球が、全血サンプル又は血液由来サンプル中の細胞の前記特定グループである場合、１８〜５０μｍのフィルタ孔径が適切であるが、好ましい孔径は２２〜４０μｍであり、より好ましくは２５〜３３ｎｍの孔径である。
【００４０】
次の工程（「第３の工程」）において、本発明の方法は、前記サンプル中の細胞の前記「特定グループ」を保持する「第２のフィルタ」に残りの混合物を通すが、溶液中の受容体分子をフィルタを通して通過させることを含む。したがって、この「第２のフィルタ」の孔径は、第１のフィルタの孔径よりも小さい。
【００４１】
非限定的には、前記「第２のフィルタ」は、ガラス、ガラス繊維、ポリプロピレン、ポリエチレン、フルオロポリマー、セルロース、ナイロン、ニトロセルロース、ポリアミド及びこれらの混合物からなる。一般的に、タンパク質及び細胞の非特異的結合に対するブロッキング処理が好ましい。前記細胞の「特定グループ」がＴリンパ球である場合、Ｔ細胞を捕捉するための前記膜の適切な孔径は、平均孔径が１〜１０μｍ、好ましくは３〜９μｍ、さらに好ましくは５〜８μｍの膜であり、膜に低張性溶液を通過させた後にサンプル材料からより小さい粒状材料を得ることができる。細胞の前記「特定グループ」が他の細胞によって構成されている場合、他の孔径が好ましい。
【００４２】
そして、前記「第２のフィルタ」は、必要に応じて、洗浄緩衝液又は洗浄溶液で洗浄できる。
【００４３】
本発明の１つの実施形態では、細胞の前記「特定グループ」は、しばしばＣＤ４＋Ｔ細胞と呼ばれるＴリンパ球を含むリンパ球によって構成される。
【００４４】
本発明の方法の次の段階（「第４工程」）において、前記「第２のフィルタ」は、前記受容体に特異的に反応する標識された抗体を含む液体に曝露される。前記標識は酵素又は着色された若しくは蛍光性の粒子で構成され、必要に応じて、洗浄工程が続く。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、少なくとも１つの円形の液体サンプル供給開口部（１０２）を備えた上部カバーシート（１０１）と、前記上部カバーシート（１０１）に固定された下部吸着層（１０５）を備えた垂直フローアッセイ装置；前記少なくとも１つの円形の開口部（１０２）に取り外し可能に挿入された第１の円形フィルタ（１０６）；前記上部カバーシート（１０１）と前記下部吸着層（１０５）との間に固定され、前記少なくとも１つの供給開口部（１０２）とそれに挿入された前記円形フィルタ（１０６）を前記吸着層（１０５）から分離する第２のフィルタ（１０４）、を示す。
【図２】図２は、上部の回転可能な枠エレメント（１）、下部枠エレメント（２）、サンプル供給開口部（３）及び読取り開口部（４）を備えた本発明の垂直フローアッセイ装置の実施形態の別の変形例の斜視図を示す。
【図３】図３は、カード（１０）に設けられた対応する開口部（１０ａ）に挿入可能な図２の装置を示す。
【図４】図４は、図２のアッセイ装置の断面を示す。
【図５】図５は、本発明のアッセイ装置の別の実施形態の上面図であり、サンプルが供給される２対の供給開口部と読み取り開口部（３，４及び３’，４’）を備える。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
［発明の詳細な説明］
Ａ．一般的な定義
本発明の評価方法において使用される「全血」サンプルは、哺乳動物、特にヒト由来のサンプルである。任意の「全血サンプル」を使用することができる。前記サンプルは、「そのまま」、すなわち血液ドナーから採取されたまま前処理なしに直接使用することができ、又は評価前に前処理することもできる。したがって、例えば、本明細書中における全血とは、全血の非処理サンプル、抗凝固剤がサンプルに添加されたサンプル、又は、例えば緩衝液若しくは他の液体が添加された全血由来のサンプルを意味する。適切なサンプルの例は、ＥＤＴＡ血液、クエン酸塩血液、ヘパリン血などの天然未処理全血及び前処理全血である。最初に得られた試料は、希釈によってさらに処理できる。評価を妨害する可能性のある成分を除去するための全血の分画は、通常必要ではない。希釈は、成分、例えば分析対象の濃度を調整するために、適当な緩衝液などの適切なサンプル液と元のサンプルを混合することによって実施できる。また、そのサンプルは例えば赤血球の選択的溶血などの溶血によって前処理されてもよい。そのように処理されたサンプルとしては、哺乳動物の体内から収集又は単離された元の全血サンプルに「由来する」サンプルが例示される。
【００４７】
本発明に従って評価される「分析対象」は、細胞マーカー、特に細胞表面マーカー、より詳細にはＣＤ４又はＣＤ８である。
【００４８】
「ＣＤ４」（クラスター分類４）は、Ｔヘルパー細胞、単球、マクロファージ、及び樹状細胞などの免疫細胞の表面に見出される糖タンパクである。それは１９７０年代後半に発見され、１９８４年にＣＤ４と命名される前はもともとｌｅｕ−３とＴ４として知られていた。
【００４９】
「ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞」は、ヒト免疫系の必須部分である白血球である。それらはしばしばＣＤ４細胞、Ｔヘルパー細胞又はＴ４細胞と呼ばれる。それらはヘルパー細胞と呼ばれる。その理由は、その主な役割の１つが、感染性粒子を破壊するＣＤ８キラー細胞を含む他のタイプの免疫細胞にシグナルを送ることだからである。例えば、未治療のＨＩＶ感染時、又は移植前の免疫抑制後に、ＣＤ４細胞が枯渇した場合、その身体は、そうでなければ戦うことができたかもしれない広範囲の感染に対して脆弱になる。
【００５０】
「ＣＤ８」（クラスター分類８）は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の共受容体として働く膜貫通糖タンパクである。ＴＣＲと同様に、ＣＤ８は主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合するが、クラスＩ  ＭＨＣタンパクに特異的である。そのタンパクの２つのアイソフォーム、アルファ及びベータがあり、それぞれ異なる遺伝子によってコードされている。ＣＤ８共受容体は、主に細胞傷害性Ｔ細胞の表面上に発現するが、ナチュラルキラー細胞、皮質胸腺細胞、及び樹状細胞にも見出すことができる。
【００５１】
「ＣＤ１４」（クラスター分類１４）は、ＣＤ１４としても知られているヒト遺伝子である。この遺伝子によってコードされるタンパクは、自然免疫系を構成する。ＣＤ１４は２つの形態で存在し、ひとつはグリコシルホスファチジルイノシトール尾部（ｍＣＤ１４）によって膜に固定され、もう一方は可溶性の形態（ｓＣＤ１４）で存在する。可溶性ＣＤ１４は、ｍＣＤ１４（４８ｋＤａ）の分解後に現れるか、又は細胞内小胞体（５６ｋＤａ）から直接分泌される。ＣＤ１４は、主にマクロファージ及び（１０倍少ない程度で）好中球によって発現する。それはまた、樹状細胞及び単球によっても発現する。
【００５２】
本明細書でいう「目的の血液細胞」（ＢＣｏＩ）とは、クラス若しくは集団、又はより詳細には、本発明に従って評価される全血サンプルに典型的に存在する細胞のサブクラス若しくはサブ集団に属する。この（サブ）クラス又は（サブ）集団は、特定の細胞表面マーカー又は前記マーカー若しくはマーカーのパターンに特異的な対応する抗体分子を用いて分析できるそのマーカーのパターンに基づく試験環境（全血サンプル）において、互いに区別される。
【００５３】
細胞の「サブクラス」、「サブセット」又は「サブ集団」は、機能的及び抗原的に関連する血液細胞のグループをいう。その例は、（ＣＤ４＋）Ｔヘルパー細胞又は（ＣＤ８＋）細胞傷害性Ｔ細胞である。
【００５４】
血液細胞の「クラス」又は「集団」の例は、Ｔリンパ球及びＢリンパ球である。
【００５５】
本明細書において「区別可能」とは、特定のマーカーが前記特定のＢＣｏＩに「特異的」であること、すなわち他の身体細胞では検出不可能であることを意味する；或いは「サブクラス特異的」であり、したがって、解析される血液サンプルの別の細胞集団において検出されない；或いは、同様に全血サンプル中に存在するが、非常に低い割合で存在する他の血液細胞上でも検出可能であるため「非特異的」であり、評価結果に悪影響を及ぼさない。又は評価結果を偽らない。又はＢＣｏＩの評価が行われる前にサンプルから除去される。
【００５６】
このように本明細書中では、細胞のクラス、集団、サブクラス又は部分母集団「に特異的」という文言は、特に記載がなければ広義に理解されるべきである。
【００５７】
「評価する」又は「評価」とは、サンプル中に存在する分析対象の量又は濃度の絶対値を得る、及び、指標、比、パーセンテージ、視覚又はサンプル中の分析対象のレベルを示す他の値を得るという意味で、定量的及び定性的測定の両方を含むことを意図する。評価は、直接的又は間接的であり、実際に検出された化学種は当然に分析対象自体である必要はなく、例えばその誘導体が分析対象であってもよい。
【００５８】
本発明の分析方法の「正確さ」とは、サンプル中の分析対象の濃度を正確に測定する方法の能力であり、より信頼性の高い基準方法によって測定された濃度と比較される。
【００５９】
本発明の分析方法の「精度」とは、サンプル中の分析対象の濃度を繰り返し測定した場合の結果の変動である。
【００６０】
本発明による評価の「ロバスト性」とは、分析対象の濃度測定の結果の値に影響を与えることなく、妨害物質及び評価条件の変動に耐える方法の能力である。
【００６１】
本明細書で使用される「不活性タンパク」とは、本発明の評価方法を妨害しないすべての起源のタンパク質（例えば、ヒト又は非ヒト哺乳動物、微生物）である；特に、それは、本発明の評価方法で用いられる分析される分析対象及び／又は抗体に対する検出可能な親和性を実質的に有さないか又は全く有さない。
【００６２】
「粒子サイズ」という用語は、本明細書に特に記載がない限り「平均粒子サイズ」として定義される。好ましくは、本発明の粒子、特にナノ粒子及びそれに抗体がカップリングすることによってそれから誘導される免疫粒子は、狭い、特に「実質的に単峰性」又は「単峰性」の粒度分布を特徴とする。粒子サイズの測定は、例えばＭａｌｖｅｒｎ  Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ装置で粒度分布測定を適用することによって、それ自体公知の方法で行うことができる。典型的には、０．１Ｍ  ＮａＯＨ中で測定を行うことができる。本明細書に記載の平均粒子サイズ値は、多少異なる場合があるが、Ｄ（０．５）又はＤ（４．３）値のいずれかであり、それでもなお示されたパラメータ範囲にある。Ｄ（０．５）は、分布の５０％の粒子サイズ（μｍ）がより小さく、粒度分布の５０％がより大きいことを示す。Ｄ（４，３）は体積平均直径を表す。平均粒子サイズは、例えば透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって、顕微鏡的に測定することもできる。
【００６３】
「抗体」は、これには限定されないが、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む、任意のクラスの「免疫グロブリン分子」（ＩｇＡ、Ｄ、ＥＧ、Ｍ、Ｗ、Ｙなど）及び任意のアイソタイプに関する。前記用語は、特に、特定の抗原に結合できる機能的な（すなわち、抗原に結合する能力を有する）モノクローナル又はポリクローナル抗体（Ａｂ）又はフラグメント抗体（ｆＡｂ）をいう。該Ａｂ及びｆＡｂは、化学的に又は酵素的に産生された分子から選択されるか、或いは原核若しくは真核微生物又は細胞株によって非組換え又は組換えにより生産されるか、或いは哺乳動物、好ましくは非ヒト哺乳動物種などの高等生物、又は非哺乳動物種、好ましくは鳥類若しくは植物によって生産される。前記ｆＡｂは、一価抗体（１つの重鎖及び１つの軽鎖からなる）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２（又はＦａｂ２）、Ｆａｂ３、ｓｃＦｖ、ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ），テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、タンダブ（ｔａｎｄａｂ）；並びにＶＨ及びＶＬドメインのなどの単一抗体ドメイン、及びそのフラグメントからなる群から選択される。その多価フラグメントは、特にＣＤ４若しくはＣＤ８などの同じ抗原の異なる又は好ましくは同じ抗原決定基に結合することができる。
【００６４】
本明細書で使用される「標識抗体」という用語は、抗体（好ましくは、それぞれの抗原に結合した後）の同定を提供する標識が組み込まれた、上記で定義した抗体分子をいう。特にその標識は、例えば、放射性標識されたアミノ酸が取り込んだ、又は標識されたアビジンによって検出され得るビオチン部分のポリペプチド（例えば、蛍光マーカー又は光学的若しくは比色測定法によって検出できる酵素活性を含むストレプトアビジン）に結合した「検出可能なマーカー」である。抗体の標識として以下が例示できるが、これには限定されない：
−放射性同位元素又は放射性核種（例えば、３Ｈ，１４Ｃ，３５Ｓ，９０Ｙ，９９Ｔｃ，１１１Ｉｎ，１２５Ｉ，１３１Ｉ，１７７Ｌｕ，１６６Ｈｏ，又は１５３Ｓｍ）；
−蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）；
−酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；
−化学発光マーカー；
−ビオチニル基；
−二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）；並びに、
−ポリマー粒子（例えば、着色ナノ粒子）；
−金属粒子（金ナノ粒子など）；
−磁性物質、例えばガドリニウムキレート；及び、
−オリゴヌクレオチド
【００６５】
用語「エピトープ」又は「抗原決定基」には、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体に特異的に結合できる任意のポリペプチド決定基が含まれる。特定の実施形態では、エピトープ決定基には、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニルなどの化学的に活性化している分子の表面基が含まれ、特定の実施形態では、特定の三次元構造特性及び／又は比電荷特性を有し得る。エピトープは、抗体によって結合した抗原の領域である。特定の実施形態では、タンパク質及び／又は高分子の複合混合物中でその標的抗原を少なくとも優先的又は排他的に認識する場合、抗体は抗原に「特異的に」結合すると言われる。
【００６６】
細胞の「表面上に存在する」とは、前記分子（細胞表面マーカーなど）が、細胞表面に結合するか、又は細胞膜を不可欠な部分として細胞膜を越えて細胞外空間に延び、場合によっては細胞内空間（すなわち、細胞質）にも広がることを意味する。
【００６７】
結合物（抗体など）と標的（特に抗原、例えばＣＤ４又はＣＤ８）との結合を含む反応に関して「特異的」とは、分析されるサンプル中に存在し得る異なる標的（特に抗原）との交差反応性を示さずに、前記特定の目的とする標的を特別に認識して結合する結合物の能力を定義する。
【００６８】
「溶血した」又は「溶血」とは、全血サンプルに含まれる赤血球（ＲＢＣ）が、本発明による分析評価の間に、好ましくは本発明による分析評価の前に、溶血性細胞破壊を受けることを定義する。特に記載のない限り、特に白血球の溶解を伴わない赤血球の低張溶解をいう（例えば「ヒト赤血球の低張溶解の動態学」と題し、ＣｕｎｈａらによってＡｎａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１４，６，１３７７−１３８３に記載されている）。
【００６９】
「凝集」（“Ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ”及び“ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ”）（「凝集する」（“ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｅ”及び“ａｇｇｒｅｇａｔｅ”））は、本明細書では同義語として使用される。これらの用語は粒子の凝集を説明する。抗原が対応する抗体（イソアグルチニンとも呼ばれる）と混合されると凝集が起こる。抗体、補体又はレクチンなどの他の分子の存在下における赤血球などの細胞の凝集である。その抗体又は他の分子は、複数の粒子を結合し、それらに結合し、大きな複合体を作る。
【００７０】
本発明による「垂直フローアッセイ」又は「垂直フローイムノアッセイ」は、アッセイ装置を通る流体の垂直流を特徴とする。そのアッセイ装置は、例えば、選択透過性（サイズ排除）又は液体の様々な吸着特性に関して、同一又は好ましくは異なる官能性の多重性（すなわち、少なくとも２つ以上、特に３つ）の互いに積み重なる層を含む。その機能層は、グリッド、フィルタ膜及び吸着層から選択できる。
【００７１】
「吸着層」は、分析されるサンプルの液相（その中に溶解又は懸濁した成分を含む）、評価方法の間に添加される洗浄液、装置に加えられる液体試薬媒体の液相（液相中の必要な試薬の溶液又は分散液）、及び、前記試薬媒体の未反応成分を、物理的に吸着する能力を有する適切な天然又は合成材料を含む。前記吸着層の大きさ（容積）は、吸着される液体の全容量及び吸着材料の吸着能力に依存し、好ましくは、吸着される液体の容量を超えるべきである。
【００７２】
特に明記しない限り、用語「上部」は、分析されるサンプル（例えば、任意に前処理された血液サンプルなど）が添加されて装置に入る、その装置の側面をいう。
【００７３】
特に明記しない限り、用語「内部」は、周辺環境と直接接触していないか、又は実質的に接触していない装置の部分をいう。
【００７４】
装置の「第１の構造」は、「サンプル添加構造」と呼ぶこともできる。
【００７５】
装置の「第２の構造」は、「試薬添加構造」、「読み出し構造」又は「読み込み構造」と呼ぶこともできる。
【００７６】
装置の「第１開口部」は、「サンプル添加開口部」又は「サンプル供給開口部」と呼ぶこともできる。前記開口部において、必要に応じて前処理された血液サンプルが添加され、第１のフィルタ層内で洗浄され、そして前記サンプル中に場合により形成された細胞凝集体が前記フィルタに保持される。
【００７７】
装置の「第２開口部」は、「試薬添加開口部」、「読取り開口部」又は「読み出し開口部」と呼ぶこともできる。分析対象に特異的な試薬（例えば、評価されるべき細胞又は細胞表面マーカーなど）の添加の際に形成される検出可能なシグナルを検出し、前記開口部から読み出すことができる。
【００７８】
「マルチプレックス」検出とは、同じサンプル中、好ましくは同じアッセイ装置内の同じスポット又は異なるスポットにおける異なる分析対象（抗原など）の同時検出に関する。
【００７９】
多重化は、アッセイ装置上の１つ以上の所定の位置及び／又はパターンで同じサンプルをスポットすることによって容易に達成される。可視化を容易にするために、多重化は、例えば様々な色のナノ粒子に結合した識別可能な標識を持つ分析対象のプローブ（例えば、抗体）と結合させることもできる。様々なスポットが様々な分析対象に適用される場合、特定の抗原の存在は、対応する標識（色）シグナルの出現によって容易に検出可能である。１つの単一スポットが適用される場合、２つ以上の異なる抗原がサンプル中に存在する場合には混合標識（色）が現れ、その混合標識（色）の構成は、例えば、分光学的などの適切な方法で分析する必要がある。
【００８０】
Ｂ．好適な実施形態
Ｂ１．本発明は、以下の特定の実施形態に関する：
１．液体の全血サンプル又はそれに由来するサンプル中の１つ以上のサブクラスの目的の血液細胞（ＢＣｏＩ）を評価する評価方法であって、
各サブクラスは、好ましくは識別可能な、前記サブクラスの目的の血液細胞の第１細胞表面マーカー（又は細胞表面の受容体分子）（Ｍ１）を有し、異なるサブクラスの細胞のマーカー（Ｍ１）は互いに異なり（すなわち、抗原的に異なり、したがって区別可能である）、
前記サンプルが、阻害血液細胞（ＤＢＣ）、すなわち前記第１細胞表面マーカー（Ｍ１）の少なくとも１つを非特異的マーカーとして有し、したがって前記マーカー（Ｍ１）の少なくとも１つを有する前記サブクラスのＢＣｏＩの評価を妨害する細胞をさらに含んでもよく（又は含むことが疑われ）、及び／又は、
前記サンプルが、少なくとも1つの遊離の（例えば溶解した）非細胞表面結合型、例えば好ましくは各々の前記第１細胞表面マーカー（Ｍ１）の少なくとも１つの（例えば溶解した）細胞外フラグメントなどをさらに含んでもよい（又は含むことが疑われる）、下記工程を含む方法：
（１）前記サンプルから、前記第１細胞表面マーカー（Ｍ１）の少なくとも１つを有する任意の阻害血液細胞（ＤＢＣ）を除去する工程；
（２）工程（１）で得られたサンプルから、各々の前記第１細胞表面マーカー（Ｍ１）の任意の遊離の非細胞表面結合型を除去する工程；及び、
（３）工程（２）で得られたサンプル中の前記第１細胞表面マーカー（Ｍ１）を有する各々の前記サブクラスのＢＣｏＩを評価する工程。
【００８１】
特に前記全血サンプルは、哺乳動物、好ましくはヒト個体、例えば献血者、又は、疾患に罹患しているか、全血細胞の細胞プロファイル若しくは母集団の組成、特に前記ＢＣｏＩの１つに影響を及ぼす疾患に罹患していると疑われる患者の血液である。それは例えば、針を介した静脈採取、又は鋭利な物体で指を刺した後に採取した毛細血液から得ることができる。
【００８２】
本発明の第１の別の特定の方法は、１つの単一サブクラスのＢＣｏＩの評価を含み、工程（１）〜（３）が１回実施される。好ましくは、前記単一のサブクラスはＣＤ４＋細胞を含み、表面マーカーＭ１はＣＤ４である。ＤＢＣは、Ｍ１マーカーＣＤ４も有するＣＤ１４＋細胞を含み、特に前記ＤＢＣはＣＤ１４＋単球を含む。前記第１細胞表面マーカーＭ１の前記非細胞表面結合型はＣＤ４に由来し、すなわちその可溶性フラグメントを含む。
【００８３】
第２の別の特定の方法は、２つの異なるサブクラスのＢＣｏＩの多重評価を含み、工程（１）〜（３）は各サブクラスの細胞に対して独立して実施される。
【００８４】
前記第２の別の特定の方法の変形例は、２つの異なるサブクラスのＢＣｏＩ（例えばＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞）の多重評価を含み、工程（１）〜（３）は第１のサブクラスのＢＣｏＩ（例えばＣＤ４＋細胞）について実施され、他の血液細胞が第２のサブクラスの細胞の評価を阻害しない場合には、少なくとも工程（２）及び（３）が前記第２のサブクラスの細胞（例えばＣＤ８＋細胞）について独立して実施される。
【００８５】
好ましくは、前記２つの異なるサブクラスはＣＤ４＋細胞（第１のサブクラス）及びＣＤ８＋細胞（第２のサブクラス）を含み、評価される表面マーカーＭ１はＣＤ４（すなわちＭ１ａ）及びＣＤ８（すなわちＭ１ｂ）である。ＤＢＣはＣＤ１４＋細胞、特に前記ＣＤ４マーカー（Ｍ１ａ）も有するＣＤ１４＋単球を含む。前記マーカーＭ１ａ及びＭ１ｂの前記非細胞表面結合型は、ＣＤ４及び／又はＣＤ８に由来し、すなわちＣＤ４及び／又はＣＤ８の可溶性の非細胞結合フラグメントを含む。
【００８６】
第３の別の特定の方法は、２つの異なるサブクラスのＢＣｏＩの多重評価を含み、工程（１）〜（３）は１回だけ実施される。
【００８７】
第４の別の特定の方法は、２つの異なるサブクラスのＢＣｏＩの多重評価を含み、工程（３）が前記サブクラスのそれぞれに対して独立して実施される間に、工程（１）及び（２）が１回だけ実施される。
【００８８】
好ましくは、上記の第２、第３及び第４の別の方法において、前記２つの異なるサブクラスは、ＣＤ４＋細胞（第１のサブクラス）及びＣＤ８＋細胞（第２のサブクラス）を含み、評価される表面マーカーＭ１はＣＤ４（すなわちＭ１ａ）及びＣＤ８（すなわちＭ１ｂ）である。ＤＢＣはＣＤ１４＋細胞、特に前記ＣＤ４マーカー（Ｍ１ａ）も有するＣＤ１４＋単球を含む。前記マーカーＭ１ａ及びＭ１ｂの前記非細胞表面結合型は、ＣＤ４及び／又はＣＤ８に由来し、すなわちＣＤ４及び／又はＣＤ８の可溶性フラグメントを含む。
【００８９】
２．垂直フローアッセイ法、特に垂直フローイムノアッセイである、実施形態１の評価方法。
【００９０】
３．前記工程（１）において、前記ＤＢＣが濾過により、特にグリッド又はネット（例えば、ナイロンネット）を介して除去される、実施形態１又は２に記載の評価方法。
【００９１】
４．前記ＤＢＣが凝集し、該凝集物が工程（１）において適用されたフィルタで保持される、実施形態３に記載の評価方法。
【００９２】
５．前記ＤＢＣが、前記ＢＣｏＩに結合しない免疫グロブリン分子によって凝集する、実施形態４に記載の方法。
【００９３】
６．前記ＤＢＣが、前記ＢＣｏＩの表面上に存在しない（したがって識別可能なマーカーとして同定され得る）第２細胞表面マーカー（Ｍ２）に結合する免疫グロブリン分子によって凝集する、特に前記第２細胞表面マーカー（Ｍ２）が前記ＤＢＣを識別可能であるか又は前記ＤＢＣに特異的であってもよい、実施形態５に記載の方法。
【００９４】
７．前記ＤＢＣに結合する免疫グロブリンが、固体粒子、特にポリマー粒子の表面に結合する遊離抗体、高分子抗体又は抗体から選択される、実施形態５又は６に記載の方法。
【００９５】
８．工程（２）において、前記第１細胞表面マーカー（Ｍ１）の前記非細胞表面結合型に対して透過性であるが、前記ＢＣｏＩを保持するフィルタを適用することによって、前記第１細胞表面マーカー（Ｍ１）の前記非細胞表面結合型を濾過により除去する、実施形態１〜７のいずれかひとつに記載の方法。
【００９６】
９．前記工程（３）の評価が、（特に）前記第１細胞表面マーカー（Ｍ１）、好ましくは前記マーカーの細胞外部分と反応する免疫グロブリン分子、好ましくはモノクローナル又はポリクローナル、げっ歯類若しくは鳥類などの非ヒトの抗体を用いて実施される、実施形態１〜８のいずれかひとつに記載の方法。
【００９７】
１０．前記免疫グロブリン分子が標識されている、実施形態９に記載の方法。
【００９８】
１１．前記標識が、酵素、蛍光若しくは着色分子マーカー又は蛍光若しくは着色粒子から選択される、実施形態１０に記載の方法。
【００９９】
１２．前記ＢＣｏＩがリンパ球のサブクラスから選択され、特にＴリンパ球であり、前記ＤＢＣが単球である、実施形態１〜１１のいずれかひとつに記載の方法。
【０１００】
１３．前記第１細胞表面マーカー（Ｍ１）がＴリンパ球マーカー（Ｍ１ａ）、特にＣＤ４細胞表面受容体分子である、実施形態１〜１２のいずれかひとつに記載の方法。
【０１０１】
１４．評価される前記１つ以上のサブクラスの目的の血液細胞（ＢＣｏＩ）がＣＤ４＋細胞を含む、実施形態１〜１３のいずれかひとつに記載の方法。
【０１０２】
１５．前記第１細胞表面マーカー（Ｍ１ａ）がＣＤ４であり、前記特定の第１のサブクラスの細胞がＴヘルパー細胞である、実施形態１〜１４のいずれかひとつに記載の方法。
【０１０３】
１６．前記方法が、第２の、好ましくは前記第１細胞表面マーカー（Ｍ１ａ）とは異なる識別可能な細胞表面マーカー（Ｍ１ｂ）を有する第２のサブクラスの血液細胞（ＢＣｏＩ）の評価も含む、実施形態１〜１５のいずれかひとつに記載の方法。
【０１０４】
１７．前記細胞表面マーカー（Ｍ１ｂ）が、（Ｍ１ａ）とは異なるＴリンパ球マーカー、特に表面マーカーＣＤ８であり、前記特定の第２のサブクラスの細胞がＣＤ８＋細胞を含む、実施形態１６に記載の方法。
【０１０５】
１８．前記表面マーカー（Ｍ１ｂ）がＣＤ８であり、前記特定の第２のサブクラスの細胞が細胞傷害性Ｔ細胞である、実施形態１７に記載の方法。
【０１０６】
１９．前記第２細胞表面マーカー（Ｍ１ｂ）を有する前記第２のサブクラスのＢＣｏＩの評価が、特に同じサンプル中の、第１細胞表面マーカー（Ｍ１ａ）を有する前記第１のサブクラスのＢＣｏＩの評価と共に工程（３）で実施される、実施形態１６〜１８のいずれかひとつに記載の方法。
【０１０７】
２０．前記マーカー（Ｍ１ｂ）を有する前記第２のサブクラスのＢＣｏＩの評価が独立して実施される、実施形態１６〜１８のいずれかひとつに記載の方法。
【０１０８】
２１．実施態様２０の方法であって、下記工程を含む方法：
（４）必要に応じて、前記評価を阻害するおそれのある任意の巨大分子不純物を、前記サンプルから除去する工程；
（５）前記第２細胞表面マーカー（Ｍ１ｂ）の任意の遊離の非細胞表面結合型を、前記サンプル（場合により、工程（４）で得られる）から除去する工程；及び、
（６）前記細胞表面マーカー（Ｍ１ｂ）を有する前記サブクラスのＢＣｏＩを、工程（５）で得られるサンプル中で評価する工程。
【０１０９】
２２．工程（５）において、前記第２細胞表面マーカー（Ｍ１ｂ）の前記非細胞表面結合型に対して透過性であるが、（Ｍ１ｂ）を有する前記サブクラスのＢＣｏＩを保持するフィルタを適用することによって、前記第２細胞表面マーカー（Ｍ１ｂ）の前記非細胞表面結合型を濾過により除去する、実施形態２１に記載の方法。
【０１１０】
２３．前記工程（６）の評価が、前記細胞表面マーカー（Ｍ１ｂ）、好ましくは前記マーカーの細胞外部分と反応する免疫グロブリン分子、好ましくはモノクローナル又はポリクローナル、げっ歯類若しくは鳥類などの非ヒトの抗体を用いて実施される、実施形態２２に記載の方法。
【０１１１】
２４．前記免疫グロブリン分子が標識されている、実施形態２３に記載の方法。
【０１１２】
２５．前記標識が、酵素、蛍光若しくは着色分子マーカー又は蛍光若しくは着色粒子から選択される、実施形態２４に記載の方法。
【０１１３】
２６．前記ＤＢＣがＣＤ１４＋単球である、実施形態１〜２５のいずれかひとつに記載の方法。
【０１１４】
２７．工程（１）におけるＤＢＣの凝集が、免疫グロブリン、好ましくはモノクローナル又はポリクローナル、げっ歯類若しくは鳥類などの非ヒトの抗体を含む第１の液体を添加することによって実施され、前記液体はサンプル中に含まれる赤血球を溶解することができる、実施形態１〜２６のいずれかひとつに記載の方法。
【０１１５】
２８．実施形態１〜２７のいずれかひとつに記載の方法であって、以下の工程を含む方法：
（１ａ）前記サンプル又は前記サンプルのアリコートを、前記特定のサブグループの細胞（特にＣＤ４＋細胞）とは異なるが、前記ＣＤ４受容体を有する他の細胞（特にＤＢＣ）の表面で他の構造と結合する抗体を含む第１の液体と混合し、細胞の前記特定のサブグループ内の細胞のサイズよりも著しく大きいサイズを有する粒子、凝集体又は粒子若しくは細胞のクラスターを形成する工程；
（１ｂ）形成された前記粒子、凝集体又は粒子若しくは細胞のクラスターを、サイズ排除フィルタで構成された第１のフィルタを用いて濾過する工程；及び、
（２）前記サンプル中の前記特定のサブグループの細胞（特にＣＤ４＋細胞）を保持するが、溶液中のＣＤ４受容体分子をフィルタを通して通過させる第２のフィルタに、残りの混合物を通す工程；続いて、任意の洗浄工程；
（３ａ）続いて、酵素又は着色された若しくは蛍光性の粒子で構成された標識で標識され、前記ＣＤ４受容体に特異的に反応する抗体を含む液体に、前記第２のフィルタを曝露する工程；続いて、任意の洗浄工程；
（３ｂ）続いて任意に、前記酵素に基質を添加して、着色された若しくは蛍光性の基質を生成する工程；及び、
（３ｃ）前記第２のフィルタ上の色又は蛍光の強度を測定し、前記特定のサブグループの細胞（特にＣＤ４＋細胞）の表面上の前記ＣＤ４受容体のクラスの濃度に、前記強度を相関させる工程。
【０１１６】
２９．評価前の前記血液サンプルに対して、（選択的な）赤血球の低張溶解［すなわち、工程（１）が実施される前の、好ましくは、白血球の溶解を伴わない赤血球の低張溶解（例えば「ヒト赤血球の低張溶解の動態学」と題し、ＣｕｎｈａらによってＡｎａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１４，６，１３７７−１３８３に記載されている）］が、実施される、実施形態１〜２８のいずれかひとつに記載の方法。
【０１１７】
３０．ＣＤ４＋細胞グループの細胞数（細胞の数／サンプルの量）を評価する、実施形態１〜２９のいずれかひとつに記載の方法。
【０１１８】
３１．ＣＤ４＋細胞グループの細胞数と、ＣＤ４＋細胞とは異なる少なくとも１つのさらなる細胞グループ、特にＣＤ８＋細胞グループの細胞数、特にＣＤ４／ＣＤ８比を評価する、実施形態３０に記載の方法。
【０１１９】
３２．ＣＤ４＋細胞の表面上に位置するＣＤ４受容体の量の評価と、必要に応じて、全血サンプル又は血液由来サンプル中のＣＤ８＋細胞の表面上に位置するＣＤ８受容体の量の評価を行う方法であって、
実施形態１〜２９のいずれかひとつに記載の方法を実施する工程；ＣＤ４＋細胞グループの評価のために得られたシグナルを、細胞結合ＣＤ４＋受容体の量と相関させる工程；及び、必要に応じて、ＣＤ８＋細胞グループの評価のために得られたシグナルを、細胞結合ＣＤ８＋受容体の量と相関させる工程を含む方法。
【０１２０】
３３．前記方法において適用される前記免疫グロブリン分子が、モノクローナル又はポリクローナル、特に鳥類など非げっ歯類の非ヒトの抗体（特に、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８及びＣＤ１４抗体）などの抗体である、実施形態１〜３２のいずれかひとつに記載の方法。
【０１２１】
３４．（Ｍ１ａ）及び／又は（Ｍ１ｂ）、特にＣＤ４＋又はＣＤ８＋細胞への結合に適用された免疫グロブリンが、平均粒径（前記免疫グロブリンによるコーティング前）が３０〜５００ｎｍの範囲である着色ラテックス粒子に共有結合している、実施形態１〜３３のいずれかひとつに記載の方法。
【０１２２】
３５．実施形態１〜３４のいずれかひとつに記載の方法を実施するための垂直フローアッセイ装置であって、以下を含む装置：
少なくとも１つの円形（好ましくは液体の）サンプル供給開口部（１０２）と、上部カバーシート（１）に固定された下部吸着層（１０５）とを備えた上部カバーシート（１０１）；
前記少なくとも１つの円形開口部（１０２）に取り外し可能に挿入された第１の円形フィルタ（１０６）；及び、
前記上部カバーシート（１０１）と前記下部吸着層（１０５）との間に固定された第２のフィルタ（１０４）。
そして、前記少なくとも１つの供給開口部（１０２）と、その中に挿入された円形フィルタ（１０６）は、前記吸着層（１０５）から分離している。
【０１２３】
３６．前記第１の円形フィルタ（１０６）がキャリアリング（１０８）を介して接着テープ（１０７）に固定され、前記リング（１０８）が前記サンプル供給開口部（１０２）の直径よりわずかに小さい外径と、所定のサンプル容量の定量的な取り込みに十分な独立した円形空間を設定するために選択された内径とを有する、実施形態３５に記載の装置。
【０１２４】
３７．前記テープ（１０７）が前記上部カバーシート（１０１）の上側に取外し可能に接着した、実施形態３６に記載の装置。
【０１２５】
３８．前記少なくとも１つの円形開口部（１０２）の中に取り外し可能に挿入された前記第１の円形フィルタ（１０６）が、前記上部カバーシート（１０１）から前記テープ（１０７）を除去することにより装置から取り外される、実施形態３５〜３７のいずれかひとつに記載の装置。
【０１２６】
３９．アッセイ装置であって、
上部枠エレメント（１）及び下部枠エレメント（２）を備え；
上部（１）及び下部枠エレメント（２）は、機能層（５，６，７）のスタックの利用に適した試験コンパートメントを構成するように組み立てられ；
該試験コンパートメントは、上部枠エレメント（１）の上部試験コンパートメント内側表面（１ａ）と下部枠エレメント（２）の下部試験コンパートメント内側表面（２ａ）を含み；
上部枠エレメント（１）は、下部枠エレメント（２）に対して可動性であり、それによりアッセイ装置の第１の構成と第２の構成が設定され；
上部枠エレメント（１）は、外部から試験コンパートメントへのアクセスを提供する第１開口部（３）と第２開口部（４）を備え；
第１開口部（３）と第２開口部（４）は、第１の構成における下部枠エレメント（２）に対する第１開口部（３）の位置が、第２の構成における下部枠エレメント（２）に対する第２開口部（４）の位置と実質的に同じであるように配置される、アッセイ装置。
【０１２７】
４０．上部枠エレメント（１）が下部枠エレメント（２）に対して回転可能であることを特徴とする、実施形態３９に記載のアッセイ装置。
【０１２８】
４１．前記機能層のスタックが上部膜層（６）と下部吸着層（７）を備え、これらは重なって配置され、且つ、実質的に上部試験コンパートメント表面（１ａ）及び下部試験コンパートメント表面（２ａ）に平行に延びていることを特徴とする、実施形態３９又は４０に記載のアッセイ装置。
【０１２９】
４２．少なくとも上部膜層（６）が下部枠エレメント（２）に固定されていることを特徴とする実施形態３９〜４１のいずれかひとつに記載のアッセイ装置。
【０１３０】
４３．上部枠エレメント（１）に移動制限器（２１）が形成されており、下部枠エレメント（２）に別の移動制限器（２２）が形成されており、該移動制限器（２１、２２）が、第１の構成に対応する第１の極限位置と第２の構成に対応する第２の極限位置との間で、下部枠エレメント（２）に対して上部枠エレメント（１）が可動性となるように設けられていることを特徴とする、実施態様３９〜４２のいずれかひとつに記載のアッセイ装置。
【０１３１】
４４．上部枠エレメント（１）がいくつかの第１開口部（３，３’）及び第２開口部（４，４’）を備え、第１開口部（３，３’）の一つ一つが第２開口部（４，４’）の一つと関連し、第１開口部（３，３’）と第２開口部（４，４’）は、第１の構成における下部枠エレメント（２）に対する第１開口部（３，３’）の位置が、第２の構成における下部枠エレメント（２）に対する第２開口部（４，４’）の位置と実質的に同じであるように配置されることを特徴とする、実施態様３９〜４３のいずれかひとつに記載のアッセイ装置。
【０１３２】
４５．前記フィルタ（１０６，５）が、凝集した血液細胞、特に凝集したＣＤ１４＋単球を保持する開口部又は細孔を備え、非凝集血球、特にＣＤ４＋細胞及び任意にＣＤ８＋細胞に対して透過性である、実施形態３５〜４４のいずれかひとつに記載の装置。
【０１３３】
４６．前記フィルタ（１０６，５）が、１８〜５０μｍ、好ましくは２２〜４０μｍ、より好ましくは２５〜３３μｍの範囲のグリッドサイズを有するネットフィルタである、実施形態４５に記載の装置。
【０１３４】
４７．前記第２のフィルタ（１０４）又は膜エレメント（６）が、非凝集血液細胞を保持する開口部又は細孔を有し、前記液体サンプルに可溶な成分に対して透過性である、実施形態３５〜４６のいずれかひとつに記載の装置。
【０１３５】
４８．前記第２のフィルタ（１０４）又は膜エレメント（６）が、１〜１０μｍ、好ましくは３〜９μｍ、より好ましくは５〜８μｍの範囲の細孔サイズを有する、実施形態４７に記載の装置。
【０１３６】
４９．前記吸着層（１０５，７）が、垂直フローアッセイの間に、前記サンプル供給開口部（１０２，３，３’）に添加されたサンプル、試薬及び洗浄溶液の任意の液体成分の吸着に十分に高い吸着能力を有する、実施形態３５〜４８のいずれかひとつに記載の装置。
【０１３７】
５０．分析又は診断目的、特に医学的診断又は分析において、好ましくは実施態様１〜３４のいずれかひとつに記載の評価を実施するための実施態様３５〜４９のいずれかひとつに記載の装置の使用。
【０１３８】
Ｂ２．さらなる好適な実施形態では、本明細書の以下の実施形態において「受容体のクラス」は、特に「ＣＤ４受容体」であり、「細胞の特定グループ」は、特に「ＣＤ４＋細胞」である。
【０１３９】
Ｉ．全血サンプル又は血液由来サンプル中の特定の細胞グループの表面に位置する受容体のクラスの量を評価する方法であって、下記工程を特徴とする方法：
（ａ）前記サンプル又は前記サンプルのアリコートを、細胞の前記特定のグループとは異なるが、前記受容体を有する他の細胞の表面で他の構造物と結合する抗体を含む第１の液体と混合し、細胞の前記特定のグループ内の細胞のサイズよりも著しく大きいサイズを有する粒子、凝集体又は粒子若しくは細胞のクラスターを形成する工程；
（ｂ）形成された前記粒子、凝集体又は粒子若しくは細胞のクラスターを、サイズ排除フィルタで構成された第１のフィルタを用いて濾過する工程；及び、
（ｃ）前記サンプル中の前記細胞の特定のグループを保持するが、溶液中のＣＤ４受容体分子をフィルタを通して通過させる第２のフィルタに、残りの混合物を通す工程；続いて、任意の洗浄工程；
（ｄ）続いて、酵素又は着色された若しくは蛍光性の粒子で構成された標識で標識され、前記４受容体に特異的に反応する抗体を含む液体に、前記第２のフィルタを曝露する工程；続いて、任意の洗浄工程；
（ｅ）続いて任意に、前記酵素に基質を添加して、着色された若しくは蛍光性の基質を生成する工程；及び、
（ｆ）前記第２のフィルタ上の色又は蛍光の強度を測定し、前記細胞の特定のグループの表面上の前記受容体のクラスの濃度に、前記強度を相関させる工程。
【０１４０】
ＩＩ．全血サンプル又は血液由来サンプル中の特定の細胞グループの表面に位置する受容体のクラスの量を評価する方法であって、下記工程を特徴とする実施形態Ｉに記載の方法：
（ａ）前記サンプル又は前記サンプルのアリコートを、細胞の前記特定のグループとは異なるが、前記受容体を有する他の細胞の表面で他の構造物と結合する抗体を含む第１の液体と混合し、細胞の前記特定のグループ内の細胞のサイズよりも著しく大きいサイズを有する粒子、凝集体又は粒子若しくは細胞のクラスターを形成する工程；
（ｂ）形成された前記粒子、凝集体又は粒子若しくは細胞のクラスターを、サイズ排除フィルタで構成された第１のフィルタを用いて濾過する工程；及び、
（ｃ）前記サンプル中の前記細胞の特定のグループを保持するが、溶液中のＣＤ４受容体分子をフィルタを通して通過させる第２のフィルタに、残りの混合物を通す工程；続いて、任意の洗浄工程；
（ｄ）続いて、着色された若しくは蛍光性の粒子で構成された標識で標識され、前記受容体に特異的に反応する抗体を含む液体に、前記第２のフィルタを曝露する工程；続いて、任意の洗浄工程；及び、
（ｅ）前記第２のフィルタ上の色又は蛍光の強度を測定し、前記細胞の特定のグループの表面上の前記受容体のクラスの濃度に、前記強度を相関させる工程。
【０１４１】
ＩＩＩ．前記受容体がＣＤ４であり、前記細胞の特定グループがＴリンパ球である、実施形態Ｉ又はＩＩに記載の方法。
【０１４２】
ＩＶ．前記特定の細胞グループとは異なる他の細胞の表面上の他の構造に結合するが、前記受容体を有する抗体が、受容体ＣＤ１４と反応する抗体であることを特徴とする、実施形態Ｉ〜ＩＩＩのいずれかひとつに記載の方法。
【０１４３】
Ｖ．前記特定の細胞グループとは異なる他の細胞の表面上の他の構造に結合するが、前記受容体を有する前記抗体が、重合された抗体であるか、或いは、細胞の前記特定グループ内の細胞のサイズよりも著しく大きいサイズを有する粒子、凝集体又は粒子若しくは細胞のクラスターを容易に形成する粒子、ポリマー又は他の大きな分子上に固定化されている、実施形態Ｉ〜ＩＶのいずれかひとつに記載の方法。
【０１４４】
ＶＩ．抗体を含む前記第１の液体が、前記サンプルの赤血球を溶解できる液体である、実施形態Ｉ〜Ｖのいずれかひとつに記載の方法。
【０１４５】
ＶＩＩ．抗体を含む前記第１の液体がＣＤ１４受容体分子に特異的反応性を有する抗体を含む、実施形態Ｉ〜ＶＩのいずれかひとつに記載の方法。
【０１４６】
Ｃ．さらなる実施形態
Ｃ．１  ＣＤ４、ＣＤ８又はＣＤ１４−結合免疫グロブリン
特に断りのない限り、本明細書ではこれらの免疫グロブリンは、好ましくは、前記マーカーの１つの細胞外部分（抗原結合ドメイン）に対するものである。前記マーカーの１つのアイソフォームが存在する場合、前記免疫グロブリンは、除去されるＤＢＣ又は本発明によって評価されるＢＣｏＩの中／上に見出される個々のアイソフォーム又は全てのアイソフォームに対するものであり得る。
【０１４７】
Ｃ．１．１  ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗ヒトＣＤ４、ＣＤ８又はＣＤ１４抗体は、例えば、Ｃｈａｓｅ，Ｍ．Ｗ．，１９６７，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（免疫学および免疫化学の方法）”，ｅｄ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．ｅｔａｌ．，Ｍ．Ｗ．，ｐｐ．１９７−２０９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．Ｂｒｉｅｆｌｙの記載など、当技術分野で周知の方法によって調製できる。要約すると、適切な種（例えばウサギ、ヤギ若しくはヒツジ、又は好ましくは、鳥類、例えば雌鶏などの家禽）の動物を、適切なアジュバント、例えばフロイントの完全又は不完全アジュバント中で、精製された抗原を用いて繰り返し免疫付与する。免疫付与後、動物から採血し、ポリクローナル抗体を、例えば硫酸アンモニウム若しくは塩化アンモニウム沈殿、陰イオン交換クロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー及び／又はアフィニティークロマトグラフィーなどの方法によって精製する。
【０１４８】
非常に良好なシグナルを実現するために、高い親和性の抗体が好ましいであろう。ポリクローナル抗体は多くの異なる抗体分子を含むので、親和定数を計算することはできないが、高い親和性及び結合力は従来のポリクローナル抗体技術によって得られている。従来の方法で得られたウサギ抗体を用いたが、ヒツジ抗体でさらに良好な結果が得られた。トリ抗体を使用した場合にはさらに良好な結果が得られた。トリ抗体は、Ｌａｒｓｓｏｎ  Ａ，Ｂａａｌｏｅｗ  Ｒ−Ｍ，Ｌｉｎｄａｈｌ  Ｔ，ａｎｄ  Ｆｏｒｓｂｅｒｇ  Ｐ−Ｏ  ｉｎ  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７２：１８０７−１８１２，１９９３に記載された方法に従うことができる。ヒトと遺伝的により区別できる鳥類は、ポリクローナル哺乳動物抗体に比べて高い結合活性を有するヒトＣＤ４、ＣＤ８又はＣＤ１４に対する抗体を生産できると考えられている。
【０１４９】
ポリクローナルトリ抗体は、卵黄から通常の方法で得られる（従って、ＩｇＹと称される）。しかし、卵黄には大量の脂質が含まれており、さらに使用するには問題がある。ＩｇＹは、段階的な硫酸アンモニウム（例えば、２５〜４０％）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿を用いることによって、卵黄から単離できる。最初の精製では、Ｇａｌｌｕｓ  Ｉｍｍｕｎｏｔｃｈ社（米国、カリー）から入手可能な市販のＩｇＹ精製キットや、Ｐｉｅｒｃｅ社（米国、ロックフォード）から入手可能なＥｇｇｃｅｌｌｅｎｔ  Ｃｈｉｃｋｅｎ  ＩｇＹ精製キットを、製造業者の取扱説明書を考慮して使用することもできる。
【０１５０】
さらに、ポリクローナル抗体の結合力は、例えば、ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍ（２００６年４月）からダウンロードされた「アフィニティー精製タンパク質」の教示に従って、抗原親和性精製法を用いることによって精製された抗体の使用によりさらに増強できる。以下に、参照より組み込まれた親和性の精製（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）についてより詳細に説明する。
【０１５１】
使用された抗体の２０％が抗原親和的に精製されている場合、特に「増加した結合力」が観察される。抗体の５０％が抗原親和的に精製された場合、さらに増加が観察される。そして、７５〜１００％など、７５％を超える抗体が抗原アフィニティ精製法によって得られた場合には、さらにより多くの増加が観察される。
【０１５２】
（例えばトリ）ポリクローナル抗ヒトＣＤ４、ＣＤ８又はＣＤ１４抗体の親和性精製のために、適切なヒトＣＤ４、ＣＤ８又はＣＤ１４アフィニティーカラムを作製すべきである。精製されたヒトＣＤ４、ＣＤ８又はＣＤ１４は、標準的なプロトコールによって、抗原を支持体に共有結合的に活性化した、例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅ又はＡｆｆｉ−Ｇｅｌなどの適切な固体支持体に固定される（例えば、適切な活性化固体支持体は、Ｐｉｅｒｃｅ社（ロックフォード，米国）から入手可能である）。その後、アフィニティーカラムを前記の抗原担持樹脂から作製する。
【０１５３】
抗体のアフィニティー精製の成功は、抗体の結合部位への抗原の関連エピトープの効果的提示に依存する。抗原が小さく、複数の化学結合によって固体支持体表面に直接固定されている場合、重要なエピトープはブロックされるか又は立体障害を受け、効果的な抗体結合を阻害する場合がある。したがって、特有の官能基（例えば、ペプチドの単一末端システイン上のスルフヒドリル）を用いて抗原を固定し、数原子長のスペーサーアームに反応基が生じる活性化支持体を使用することが最もよい。より大きな抗原、特に複数の固定部位を有するものについては、抗原自体が支持マトリックスとエピトープとの間の効果的なスペーサーとして働くので、スペーサーアームの長さはそれほど重要ではなくなる。
【０１５４】
各々の抗原に対する抗体の親和性が各手順の主要部であるため、抗体のアフィニティー精製についての典型的な結合及び溶出条件に、通常、わずかな違いが存在する。抗体は生理学的条件下で抗原を厳密に認識して結合するように設計されているため、ほとんどのアフィニティー精製の手順では生理的なｐＨ及びイオン強度を模倣する結合条件を使用する。最も一般的な結合緩衝液は、ｐＨ７．２及び１．５Ｍ  ＮａＣｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及びＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）である（プレミックス緩衝液パックは、例えばＰｉｅｒｃｅ社（ロックフォード，米国）から入手可能である）。一旦、抗体が固定化された抗原に結合したら、追加の結合緩衝液を用いて結合していない物質を支持体から洗浄する。非特異的結合を最小にするために、洗浄緩衝液は、弱い相互作用を破壊するための追加の塩又は界面活性剤を含有できる。
【０１５５】
特定の精製された抗体は、緩衝液のｐＨ及び／又はイオン強度を変えることによってアフィニティー樹脂から溶出される（一般的な溶出緩衝液は、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ社（ロックフォード，米国）から入手可能である）。抗体は、一般的に、最小限の活性損失で２．５〜１１．５のｐＨ範囲に耐える弾力性のあるタンパク質であり、これは中でも最も一般的な溶出戦略である。いくつかの場合において、抗体−抗原相互作用は、ｐＨ変化によって効率的に分断されないか、又はｐＨによって損なわれ、代替的な戦略を用いることが求められる。
【０１５６】
アフィニティー精製プロトコールの例を以下に示す：
工程１：カラム（樹脂床約１ｍｌ）を洗浄し、残留タンパク質を除去した後、以下の連続する緩衝液の１０カラム容量を用いて各々を使用する：
１．  ０．２Ｍ  グリシン、ｐＨ２．８、約１０ｍｌ；
２．  ０．１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．２、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、約１０ｍｌ；
３．  上記の緩衝液を用いて２回繰り返す。次に、約５ｍｌの同じＰＢＳ緩衝液中でカラムを平衡化する。
工程２：粗製抗体調製物１０ｍｌを遠心分離して沈殿物を除去する。
工程３：ゆっくりとした流速を用いて粗製抗体調製物をカラムに適用する。
工程４：１０ｍｌの０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌでカラムを十分に洗浄する。
工程５：３ｍｌの０．１５Ｍ水酸化アンモニウム（ｐＨ１０．５±０．２）を用いて抗体を溶出する。適切なチューブに画分を集める。適切なブランク（すなわち、０．１５Ｍ水酸化アンモニウム（ｐＨ１０．５±０．２））を用いて各画分のＡ２８０を読み取る。
工程６：適切な分画をプールする。プールのＡ２８０を取得し、その抗体を室温で最大２週間成熟させる。抗体を成熟後直ぐに使用する場合は、コーティング手順に従う。直ぐに使用しない場合、その抗体は、ＮａＮ３又はＰｒｏｃｌｉｎ  ９５０などの保存剤を含むＰＢＳに対して透析し、４℃で保存する必要がある。
工程７：最後に、ＮａＮ３又はＰｒｏｃｌｉｎ  ９５０などの保存剤を含むＰＢＳでカラムを広範囲に洗浄しなければならない。
【０１５７】
Ｃ．１．２  モノクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、粒子増強アッセイにおいてモノクローナル抗体よりもしばしば好ましい。モノクローナル抗体と異なり、ポリクローナル抗体は抗原（又は分析対象）上の多くの異なるエピトープに対して実質的に反応性があり、したがって、抗原分子自体の間や、抗原と抗体が固定化された粒子との間の交差結合及びネットワークをより簡単に形成する。対照的に、モノクローナル抗体は、一般的に、１つの型のエピトープにのみ結合するので、交差結合及びネットワークを形成することがより困難になる。しかし、モノクローナル抗体は、標準化や、規定された基準に対する、特に長年の製品寿命にわたる品質管理が容易であるため、診断業界ではしばしば好適に使用される。異なるモノクローナル抗体の混合物は、特にそれらがＣＤ４、ＣＤ８又はＣＤ１４に対して高い親和性を有する多くの異なるモノクローナル抗体から構成される場合、本発明の良好な実施形態をもたらす。
【０１５８】
また、モノクローナル抗ヒトＣＤ４、ＣＤ８又はＣＤ１４抗体は、例えば、Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｔ  ａｌ．，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５，Ｇ．Ｇａｌｆｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３，３−４６又はＲ．Ｋｅｎｎｅｔ，１９８０，“Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：ａ  ｎｅｗ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ（ハイブリドーマ：生物学的分析における新しい側面）”，ｅｄ．Ｒ．Ｋｅｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌｅｎｕｍ  ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＆  Ｌｏｎｄｏｎに記載された当分野で周知の方法により調製できる。免疫付与したマウス又はラットの脾臓細胞又は末梢血細胞を、例えばポリエチレン融合法を用いて骨髄腫細胞株と融合させる。融合後、その細胞を適当な条件下、例えば培養プレート上で増殖させ、正確に融合した細胞の選択を、例えばヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）選択法を用いて行う。抗体産生細胞株は、ＥＩＡ、ＲＩＡ又は凝集アッセイのなどの方法によって同定する。抗体産生細胞株の同定後、新しい増殖細胞株が１つの単一細胞から派生していることを保証するために、細胞を例えば限界希釈法などで繰り返しサブクローニングする。
【０１５９】
Ｃ．１．３  キメラ抗体
キメラ抗ヒトＣＤ４、ＣＤ８又はＣＤ１４抗体は、例えばＧ．Ｌ．Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，６４３−６４５に記載されている当分野で周知の方法によって得ることができる。手順は以下のように簡単に説明できる。１つの種又はその一部のモノクローナル抗体の抗原結合部位のＤＮＡを、異なる種の別の抗体の抗体フレームワークのＤＮＡに移動させる。この新しい構築物を発現ベクターにクローニングし、対応する発現系に移して抗体を産生する。
【０１６０】
Ｃ．１．４  組換え抗体
組換え抗ヒトＣＤ４、ＣＤ８又はＣＤ１４抗体は、例えばＧ．Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３４９，２９３又はＪ．Ｓ．Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５８７９に記載されている当分野で周知の方法によって、動物媒体を使用することなく得ることができる。これらの方法は以下の工程を含む：例えば、大腸菌、真菌、酵母、植物又は真核細胞などの宿主細胞への抗体又はそのフラグメントをコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ又は合成ＤＮＡ）の導入；所望の特異性及び親和性を有する抗体の選択；及び、対応する発現系における抗体又はそのフラグメントの発現。
【０１６１】
Ｃ．１．５  抗体フラグメント（ｆＡｂ）
ポリクローナル抗体のＦａｂ−及びＦ（ａｂ’）２−フラグメント、任意の種のモノクローナル抗体（キメラ抗体及び／又は組換え抗体を含む）など、上記のフラグメントは、例えば、Ａ．Ｎｉｓｓｏｎｏｆｆｅｔ  ａｌ．，１９６０，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ，８９，２３０、又は、Ｒ．Ｐ．Ｐｏｒｔｅｒ，１９５９，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，７３，１１９、又は、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ，１９８８，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（抗体−実験室マニュアル”６２６−６３１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡに記載されている当技術分野で周知の方法によって調製できる。
【０１６２】
Ｃ．１．６  ヒトＣＤ４、ＣＤ８又はＣＤ１４に対して異なる反応性の抗ヒトＣＤ４、ＣＤ８又はＣＤ１４抗体の選択
モノクローナル抗体又はそのフラグメントを結合パートナーとして使用する場合、異なる抗体の選択、特に高い反応性及び低い反応性の抗体の選択は、従来のコーティング技術によって同じ材料及びサイズのナノ粒子にモノクローナル抗体のそれぞれを別々にコーティングし、その後、ナノ粒子試薬を所定の比率、例えば１／１ｖ／ｖで、分析対象と順々に混合することによって都合よく実施できる。同じ条件下でナノ粒子試薬の較正曲線を作成後、得られた低濃度の分析対象の較正曲線の傾きが、免疫学的結合パートナーの反応性の第１の指標を与える。
【０１６３】
ポリクローナル抗体を結合パートナーとして使用する場合、高反応性及び低反応性のポリクローナル抗体の調製は、ゲルマトリックスに共有結合した抗原分析対象を有する親和性クロマトグラフィーカラムにポリクローナル抗体を導入することによる当技術分野において周知の方法に従って実施できる。溶出緩衝液の勾配を用いて、最初に反応性の低いポリクローナル抗体画分をカラムから溶出し、その後、徐々に高い反応性を有する画分を溶出する（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，“Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（獣医学の免疫及び免疫病理学）”３６，２５７−２６４，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ参照）。そして、その画分の反応性は、ＢＩＡｃｏｒｅ装置を用いるか、又はそれらを別々に同じサイズ、同じ材料のナノ粒子上にコーティングし、対応する検量線を作成することによって確認できる。
【０１６４】
抗体の選択は、ナノ粒子上にそれらをコーティングする上記の手順、その後の検出限界分析又は上記のその機能的親和性の決定により実施できる。適切であれば、本発明のナノ粒子−抗体コンジュゲートを調製するために、ヒトＣＤ４、ＣＤ８又はＣＤ１４に対するそれらの親和性／結合力に関して異なる様々な抗ヒトＣＤ４、ＣＤ８又はＣＤ１４抗体の混合物を使用してもよい。適切な混合比は、限定された一連の実験によって当業者が決定することができる。
【０１６５】
適切な抗ヒトＣＤ４、ＣＤ８又はＣＤ１４抗体は、様々な供給元からも市販されている（実験セクションも参照）。
【０１６６】
Ｃ１．７  ポリマー抗体
ポリマー性多機能抗体の調製は、当技術分野において周知である。適切な方法は、例えばＥＰ−Ａ−０９５７３６３に記載されている。
【０１６７】
Ｃ．３  ナノ粒子（ラテックス粒子）と、抗体とのそのコンジュゲート
このナノ粒子は、細胞表面マーカーＭ１の検出に適用するＤＢＣ凝集工程に適用される。
【０１６８】
本発明で使用されるナノ粒子を調製するための材料は、粒子増強光散乱アッセイをもたらし、実行するために適した任意の天然又は合成の無機、有機、非ポリマー又はポリマー材料とすることができる。その材料には、例えば、セレン、炭素、金；炭素、ケイ素又はゲルマニウムの窒化物、例えばＳｉ３Ｎ４；鉄、チタン又はケイ素の酸化物、例えばＴｉＯ２又はＳｉＯ２；及び、例えば、ポリスチレン、ポリ（塩化ビニル）、エポキシ樹脂、ポリ（塩化ビニリデン）、ポリ（α−ナフチルメタクリレート）、ポリ（ビニルナフタレン）又はそれらのコポリマー、特に、スチレンのコポリマーや、スチレン−（メタ）アクリレートコポリマーなどの共重合可能なエチレン性不飽和化合物などのポリマー材料が含まれる。例えば、米国特許第４，２１０，７２３号に記載されている、スチレンから重合された内部コアと、スチレンと共重合可能なエチレン性不飽和化合物との共重合によって形成された外殻からなるコア−シェル粒子と同様に、ポリマー材料から作られた粒子も適切である。
【０１６９】
結合に適したポリマー粒子は、Ｂａｎｇｓ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ社又はＩｎｔｅｒｆａｃｉａｌ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社、Ｍｅｒｃｋ  ＳＡ（フランス）又は他の適切な供給元から購入できる。その粒子は、多数の方法に従い抗体に結合させるために活性化できる。そのカップリング化学の詳細な教示は、例えば、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社のウェブサイトからダウンロードできるＴｅｃｈＮｏｔｅ  ２０５，Ｒｅｖ．００３、例えば、２００２年３月の“Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ（共有結合カップリング）”（参照により本明細書に組み込まれる）に見られる。例えば、その表面にカルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、ヒドラジド基又はクロロメチル基を有する粒子を用いてカップリングを達成することができる。カップリングされる分子は、これらの基と直接反応するか、又は、例えば、カルボジイミド、グルタルアルデヒド又は臭化シアンなどの適切なリンカーによって反応できる。
【０１７０】
マーカー（Ｍ１）の検出の目的のために、適切な抗Ｍ１抗体と結合したナノ粒子は、さらに、フルオロフォア又はケモフォアなどの検出可能なマーカーの付着によってさらに修飾されてもよい。対応する粒子は、市販されているか、又は、当分野で周知の適切な調製方法によって生産できる（例えば、ＣＡ  ２４９３３０９  Ａ１に記載されたシアニン色素レポーターを用いたタンパク質の部位特異的標識；ＵＳ  ４３２６００８  Ａに記載されたタンパク質を標識するためのタンパク質特異的蛍光マイクロスフェア；又は、ＵＳ  ４３２６００８  Ａに記載されたタンパク質を標識するためのタンパク質特異的蛍光マイクロスフェア）。
【０１７１】
Ｃ．４  本発明の方法の実施及びそのための装置
Ｃ．４．１  装置
適切な装置はまた、同時係属ＥＰ出願、Ｇｅｎｔｉａｎ  ＡＳによる出願番号ＥＰ１６１８０９３８．９に開示されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７２】
本発明の垂直フローアッセイを実施するための簡単な装置の非限定的な例を図１に示す。図１は、この装置の垂直断面図であり、特に、評価の実施に必要なフィルタ及び吸着材の様々な層の並びである。
【０１７３】
上側の正方形のディスク層１０１には、中央の円形開口部１０２が設けられている。その下側表面の前記正方形ディスクの下に、適当な細孔サイズを有するフィルタ１０４の円形片を前記ディスク層１０１の下側に固定するために、接着性の薄層１０３が設けられ、前記ディスクの中央開口部１０２の中心に、その中央が配置される。また、接着層１０３は、ディスク１０１の下側に、ディスク１０１とほぼ同じ大きさの四角形の吸着パッド１０５を固定する。ディスク１０１の中心孔１０２において、下側のフィルタ１０４の上に、リング１０８に取り付けられた適切なネットフィルタ１０６のディスクが中央開口部に挿入され、リング１０８の上側に固定された接着テープ１０７によってディスク１０１の上側に取り外し可能に固定される。テープ１０７には、分析するサンプルの添加と、ネットフィルタ１０６上の試薬の洗浄を可能にする中心開口部が形成される。フィルタ１０６は、サンプルの添加後に装置から取り外しでき、洗浄はテープ１０７を引っ張ることによって完了する。その後、開口部１０２を通って直接フィルタ１０４上に、洗浄緩衝液と追加の試薬を残された「開放された」装置に加えることができる。その試験結果（例えば、色反応など）は、視覚的に検査され、前記開口部１０２を介してさらに分析できる。
【０１７４】
図２，３及び４は、垂直フローアッセイ装置の別の非限定的な実施形態を示す。
【０１７５】
図２から分かるように、該アッセイ装置は、上部枠エレメント１と下部枠エレメント２とを備える。上部枠エレメント１は、図示されている場合にはサンプル供給開口部である第１開口部３と、図示されている場合には読取り開口部４である第２開口部４とを備える。上部１と下部枠エレメント２は、互いに重なっている。上部１及び下部枠エレメント２を含む組立体は、平らな円形ディスクの形状を有する。すなわち得られる組立体の半径は、ディスクの厚さより大きい。
【０１７６】
この実施形態の任意の変形例では、カード１０には、組み立てられたアッセイ装置を取り付けるのに適した孔１０ａが設けられている。特に、カード１０の孔１０ａの形状は、下部枠エレメント２の少なくとも一部との連結に適するように形成される。また、孔１０ａはノッチを含み、それは下部枠エレメント２を定位置に保持し、カード１０に対する回転の防止に適している。
【０１７７】
この実施形態の別の変形例では、説明のインプリント、例えば、アッセイ装置の使用の説明、又は、上記で説明した基準色のスポットなどのアッセイ装置を用いた測定の定量化を容易にする情報などをカード１０に設けることができる。
【０１７８】
図４については、図２のアッセイ装置の断面が記載されている。
【０１７９】
上部１及び下部枠エレメント２は、上部１ａ及び下部試験コンパートメント内側表面２ａを含み、それらは互いに向かい合って実質的に互いに平行に延びている。さらに、上部１及び下部枠エレメント２は、試験コンパートメントがそれらの間に形成されるように形成される。上部１ａ及び下部試験コンパートメント内側表面２ａは、円筒状試験コンパートメントの上面及び底面を形成する。
【０１８０】
試験コンパートメントには、上部膜層６と下部吸着層７が設けられており、それらは重なり合って配置され、上部１ａと下部試験コンパートメント内側表面２ａとに実質的に平行に広がっている。この実施形態では、試験コンパートメントは、上部膜層６及び下部吸着層７、すなわちフォームロック形態で挿入された前記層によって実質的に満たされている。さらなる実施形態では、上部膜層６は上部試験コンパートメントの内側表面１ａから離れているが、下部試験コンパートメントにはフォームロック形態で挿入されている。
【０１８１】
第２の下部試験コンパートメントの内側表面２ａには、特に、評価操作中のアッセイ装置の回転運動の間のあらゆる可動性を抑制することによって、特に、試験コンパートメント内での回転運動を完全に回避することによって、その可動性を制限し、下部吸着層７を適所に保持するのに適した突起２ｂが設けられる。本発明の他の実施形態では、突出部２ｂはさらに試験コンパートメント内に延び、上部膜層６を定位置に保持するのにも適している。他の実施形態では、下部吸着層及び／又は上部膜層は、代替的又は追加的に、例えば接着などの他の取り付け方法によって適所に保持される。
【０１８２】
さらに、この組立体はフィルタ層５を備える。図示された実施形態では、これは第１開口部３の直下の上部試験コンパートメント内側表面１ａの凹部５ａの内側に配置されている。フィルタ層５は、上部枠エレメント１に取り付けられ、特に上部枠エレメントに対するその動きを制限する。図示されたものでは、フィルタ５は、第１開口部３の試験コンパートメントに面する側が覆われるように、上部枠エレメント１に接着される。
【０１８３】
この実施形態では、上部枠エレメント１の第２開口部４は、主に読取り開口部４として機能し、その第２開口部は、上部枠エレメント１を通って試験コンパートメントまで、上部膜層６の遮るものがない光景について、外部からの直接の視覚的なアクセスを提供する。また、第２開口部は、前記膜層６の表面上に保持された分析対象（特定の血液細胞など）を有する膜層上に試薬溶液及び洗浄溶液を添加するためにも使用される。
【０１８４】
この実施形態では、下部吸着層７は、上部膜６によって保持されない低分子物質及び液体を吸着するための吸着材料を有する。上部膜層６は分析対象、特に、前記細胞、又は好ましくは細胞表面上に分析対象を有することが疑われる血液細胞を保持する半透膜を備える。さらに、フィルタ層５は、非凝集血液細胞及びサンプルのより小さい成分に対して透過性の半透膜又は好ましくはグリッドを備え、同時に、上部膜の表面上の分析検出反応が最終的に行われる前に除去されるべき血液細胞のより大きな凝集体を保持する。
【０１８５】
上部１と下部枠エレメント２の組立体は、上部枠エレメント１が下部枠エレメント２の一部を占める連結構造を備える。上部枠エレメント１と下部枠エレメント２の連結部分の丸い形状のため、上部１と下部枠エレメント２は互いに回転可能であり、回転角は２つの枠エレメント１，２の互いの位置を決める。下部枠エレメント２の連結部分には、ラッチ１２が設けられる。それは、上部１と下部枠エレメント２の組立体を所定位置にしっかりと保持するのに適し、枠エレメント１、２の互いに対する自由運動のための回転度のみを実質的に残している。
【０１８６】
さらに、図３に示すように、下部枠エレメント２の一部には、カード１０の孔１０ａと連結するラッチ１３が設けられている。
【０１８７】
ラッチ１２，１３は、当業者が理解するように、様々な方法で形成することができる。さらに、下部枠エレメントのラッチ１２に対応する上部枠エレメント１に、対応する溝が形成される。下部枠エレメント２との連結動作を容易にするために、同様の構造をカード１０に形成してもよい。
【０１８８】
図５には、アッセイ装置の別の非限定的な実施形態の上面図が示されている。アッセイ装置の構成は、図２〜４を参照した上述の構造に類似している。
【０１８９】
単純化のために、下部枠エレメント２は、回転停止部２２を除いて、図５には示されていない。上部枠エレメント１には、第１の構成及び第２の構成においてそれぞれ、下部枠エレメント２の回転停止部２２とかみ合う２つの回転ストッパ２１が設けられている。ここでは、アッセイ装置の第１の構成が示されており、第２の構成には、上部枠エレメント１を下部枠エレメント２に対して反時計回りに、回転止め２１，２２によって規定される第２の極大の回転角度に向けて回転させることによって、達することができる。
【０１９０】
上部枠エレメント１には、第１開口部３，３’と第２開口部４，４’の第１の対である３，４と第２の対である３’，４’ が形成されており、第１開口部３，３’には、隆起部３ａ，３ａ’がそれぞれの周囲に設けられている。また、上部枠エレメント１の下側の第１開口部３，３’を横切って延びるフィルタ層５，５’は、第１開口部３，３’の内側に網掛けで示されている。一対の開口部３，４，３’，４’は、第２の構成（回転後）において、下部枠エレメントに対する第２開口部４，４’の位置が、回転停止部２２によって、第１の構成における第１開口部３，３’の位置と実質的に同じとなるように配置されている。
【０１９１】
さらに、ラベル１１は上部枠エレメント１の上面に配置され、説明インプリント１１ｂはアッセイ装置の使用者が見ることができる。また、第２開口部４，４’の周囲のラベル１１には円周のインプリント４ａ、４ａ’が設けられている。円周インプリント４ａ、４ａ’の異なる網掛けは、例えば、各々の第２開口部４，４’を相互に容易に区別することを助ける、又は、評価の比色分析値の解釈のための基準色を与える、色彩の相違を示す。
【０１９２】
Ｃ．４．２  本発明の評価方法の実施
Ｃ．４．２．１  ＣＤ４の評価
この実施形態は、ＣＤ４＋リンパ球、特にＴヘルパー細胞上のＣＤ４受容体の評価について述べる。
【０１９３】
本発明の前記実施形態では、標識抗体はＣＤ４受容体に対して反応性であり、前記標識は酵素又は着色粒子若しくは蛍光粒子で構成される。酵素が標識として使用される場合、好ましい実施形態は、着色物質を形成する物質、好ましくは沈殿する着色物質、好ましくは沈殿する着色物質を前記フィルタにその後曝露することを特徴とする。
【０１９４】
本発明の方法で生成された色又は蛍光と、受容体分子の前記クラスの濃度との相関関係については、以下のように行うことができる：結合した着色粒子の量が、試験されるサンプル中に存在する前記特定の受容体分子の量に関係するため、前記特定の受容体分子の量と測定される色との間には直接的関係がある。そしてこの色は、事前評価、事前較正及び／又は所定の色彩図と比較して視覚的に検出可能であるか、或いは、自由に入手可能なマークされたもの若しくは本発明のために開発されたものにおいて、電子的色検出器を用いた色量の測定によって検出可能である。
【０１９５】
使用される測定装置は、使用する着色物質又は免疫粒子、それらのカラースキーム及び必要な検出範囲に対して容易に較正及び調整される。検出器の較正では、既知の量の分析対象が使用され、バックグラウンド対シグナルの良好な比を与え、正確な計算された読み出し値をユーザに提供できる。
【０１９６】
有色物質又は蛍光物質の代わりに酵素（ペルオキシダーゼ酵素又はアルカリホスファターゼを含むがこれに限定されない）が使用される場合、前記酵素用の発色又は蛍光発生物質が使用される。２つ以上の波長における反射率の測定による、フィルタ上に堆積した異なる色を持つ２つの成分の測定は、当業者に周知である。既にそれは、Ｆｒａｎｋ  ＦｒａｎｔｚｅｎらによるＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１２  ２３９０-２３９６（１９９７）の記事「Ｇｌｙｃｏｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｆｉｌｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｄｏｃｔｏｒｓ’  ｏｆｆｉｃｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｂｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ（医師のためのボロン酸親和性の原理に基づくグリコヘモグロビンフィルタアッセイ」；Ｅｒｌｉｎｇ  ＳｕｎｄｒｅｈａｇｅｎとＦｒａｎｋ  ＦｒａｎｔｚｅｎによるＵＳ５，７０２，９５２；及び、ＳｕｎｄｒｅｈａｇｅｎとＦｒａｎｔｚｅｎによるＵＳ５，５０６，１４４に記載されている。Ｆｒａｎｔｚｅｎらは、６２０ｎｍと４７０ｎｍにおける反射率（％Ｒ）を測定する特別な反射率計を使用した。これらの波長における測定を用いて青色のボロン酸コンジュゲート及び赤色ヘモグロビン（Ｈｂ）をそれぞれ定量した。この装置は、記録された反射率データを線形化するために、Ｋｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋ変換（Ｋｕｂｅｌｋａ  Ｐ．Ｎｅｗ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｏｐｔｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｎｓｅｌｙ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｊ  Ｏｐｔ  Ｓｏｃ  Ａｍ  １９４８；３８：４４８-５７）を自動的に行った。「Ｐｏｒｔａｂｌｅ  ｒａｐｉｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｅｓｔ  ｒｅａｄｅｒ」はＥＰ  ２８１２６７５に記載されており、「Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｓｅｎｓｏｒ  ｏｎ  ｍｏｂｉｌｅ  ｐｈｏｎｅ」は、ＵＳ２００６／０２７９７３２に記載されている。今日では、携帯電話のカメラ機能は、診断医学におけるフィルタベースの試験装置の反射測定用に一般的に使用されている。
【０１９７】
このシステムは、ＳｕｎｄｒｅｈａｇｅｎとＢｒｅｍｎｅｓによるＥＰ  ０９５３８４９（Ｂ１）にも記載されている。今日では、多くの企業が、反射光の強度及び波長からサンプルの濃度を計算する較正ソフトウェアを備えた、診断装置の検査スポットからの反射光の強度及び波長を測定するための反射走査装置又はデジタルカメラ画像処理ソフトウェアを提供している。Ｓｋａｎｎｅｘ  ＡＳ（オスロ、ノルウェー）のＳｃａｎｓｍａｒｔシステムは、このアプリケーションの自動化された専用システムの一例であり、ノルウェーの顧客に、垂直フロー試験の反射測定スポット強度測定用に販売されている。また、デジタルカメラを備えた標準的な「スマートフォン」を使用して、得られた色シグナルのデジタル画像を得ることができる。通常、デジタル画像はその後、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（商品名）の電子プログラムにアップロードされる。この方法は、結果のグラフィック表示を可能にする。また、この方法では、バックグランドが最も低い場合と、シグナルが最も強い場合とを比較して測定することができる。シグナルの標準化及び較正は、測定される分析対象の既知の強度及び濃度を有する参照スポットを使用することにより行うことができる。
【０１９８】
酵素的カラーシステムの作成を使用する場合、キネティック測定を使用することができる。またその測定は「ビデオ」モードを使用して行うことができる。
【０１９９】
ソフトウェアＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  １３とプログラム「Ｅｙｅｄｒｏｐｐｅｒ  ｔｏｏｌ」を使用して、ＨＳＬ、赤、緑、青、その他のカラースキームを決定し、アップロードされた画像の色を決定する。ＨＳＬ（色相、彩度、明度）スキームは、装置に依存しないで色を表現する方法を提供する。特に有益なのものは、インターネット上のｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈａｎｄｐｒｉｎｔ．ｃｏｍ／ＬＳ／ＣＶＳ／ｃｏｌｏｒ．ｈｔｍｌ（２０１５年５月）である。
【０２００】
本発明の特定の実施形態では、参照色スポットは、固定化された抗体を有する膜に近接近して配置又は固定される。或いは、選択的にアッセイ膜のホルダーの分子又はそのフラグメントに敢えて結合する。本発明の評価の測定の一部として、これらの参照スポットも同様に測定される。前記参照スポットの測定は、装置間や他のハードウェアとの差異を補うために使用する測定装置のソフトウェアによって、評価の全体的な精度を高めることができる。
【０２０１】
これらの参照スポットは、分析測定におけるそれぞれの色のカラースケールを規定できる。機器、例えば携帯電話のカメラは、測定する表面の画像又は一連の画像と、装置の参照スポットを撮影する。様々なソフトウェアプログラムが、測定されたピクセルを数値に変換し、様々な数値システムでカラールーム（ｃｏｌｏｕｒ  ｒｏｏｍ）を定義することができる。非常に一般的なのは、ＲＧＢ（レッド・グリーン・ブルー）カラールーム（ｃｏｌｏｕｒ  ｒｏｏｍ）である。ＲＧＢカラーモデルは、幅広い色を再現するために、赤、緑、青の光を様々な方法で一緒に加える加色法モデルである。そのモデルの名前は、赤、緑、青の３つの加色する原色の頭文字に由来する。（ウィキペディア、２０１６年７月１６日）
【０２０２】
ＨＳＬとＨＳＶは、ＲＧＢカラーモデルのポイントの最も一般的な２つの円柱座標表示である。２つの表示は、直交（キューブ）表示よりも直観的で知覚的に関連するように、ＲＧＢの形状を再配置する。１９７０年代にコンピュータグラフィックスアプリケーション向けに開発されたＨＳＬとＨＳＶは、現代のカラーピッカー、画像編集ソフトウェア、画像解析及びコンピュータビジョンではあまり一般的ではない。
【０２０３】
現在、カラースポットを測定及び分析してカラールーム（ｃｏｌｏｕｒ  ｒｏｏｍ）に数値を与えるために使用されている非常に現代的で自由なソフトウェアパッケージは、ＧＩＭＰである。ＧＩＭＰ／ｇｉｍｐ／（ＧＮＵ  Ｉｍａｇｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ）は、画像の修正や編集、自由形式の描画、サイズ変更、トリミング、写真モンタージュ、異なる画像フォーマット間の変換、及び、さらに特殊なタスクに使用されるフリーでオープンソースのラスターグラフィックエディタである。すべての態様が説明されているｗｗｗ．ｇｉｍｐ．ｏｒｇを参照。
【０２０４】
結果は、容量単位当たりのＣＤ４リンパ球とＣＤ８リンパ球の数、及び／又は、２つの数の比として報告される。
【０２０５】
ＣＤ４の評価は、図１に示す簡単な装置を用いて以下のように実施できる：
１．全血サンプルを、白血球を溶解しないが、サンプルに含まれる赤血球の低張溶解に適合する希釈緩衝液と混合した。また、希釈緩衝液はＣＤ１４単球を凝集させるのに適した形態の抗ＣＤ１４抗体を含む。
２．短いインキュベーション時間の後、前記混合物のアリコート（分注物）を図１の装置の開口部１０２に移し、すぐに前記開口部に挿入された粗い（ナイロンメッシュ）フィルタ１０６中に吸引し、凝集したＣＤ１４細胞を保持しながら、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞を通過させる。
３．その後、洗浄溶液を濾過装置の開口部１０２に移し、ナイロンメッシュフィルタ１０６及び１０６の下に位置するフィルタ１０４中に吸引した。
４．その後、ナイロンメッシュフィルタ１０６を装置から取り外した。
５．その後、検出可能なマーカー（酵素、色粒子など）を有する抗ヒトＣＤ４受容体抗体の溶液を濾過装置の開口部１０２に移し、フィルタ１０４中に吸引した。その溶液をフィルタ１０４中に吸引した後、抗体コンジュゲートをフィルタ１０４上に保持された細胞に結合させた。
６．その後、洗浄液を濾過装置の孔１０２に移し、フィルタ１０４中に吸引した。
７．その後、マーカーとして酵素を用いた場合、対応する基質を濾過装置の孔１０２に移し、フィルタ１０４中に吸引した。
８．その後、規定時間（例えば、５分後）に、例えば、Ｓｋａｎｎｅｘ  ＡＳ（ノルウェー）が提供するソフトウェアを備えたＳｋａｎＳｍａｒｔ  ＣＥリーダーを用いて反射測定法により発色を測定した。
９．読み取り値を、同一の実験で分析したＣＤ４＋リンパ球を既知の含有量で含む較正サンプルによって作成し、ソフトウェアに保存した検量線と比較し、ＣＤ４＋リンパ球の含有量を算出した。
【０２０６】
ＣＤ４の評価は、図２、図３及び図４に示すより高度な装置を用いて以下のように実施できる：
１．白血球を溶解しないが、サンプルに含まれる赤血球の低張溶解に適合した希釈緩衝液と全血サンプルを混合した。また、希釈緩衝液はＣＤ１４単球を凝集させるのに適した形態の抗ＣＤ１４抗体を含む。
２．短いインキュベーション時間の後、前記混合物のアリコート（分注物）を図４の装置の開口部３に移し、すぐに開口部３の下に位置する粗い（ナイロンメッシュ）フィルタ５中に吸引し、凝集したＣＤ１４細胞を保持しながら、次のフィルタ層６の表面上に保持されるＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞を通過させる。
３．その後、濾過装置の開口部３に洗浄液を移し、ナイロンメッシュフィルタ５及びフィルタ６中に吸引した。
４．その後、開口部４がフィルタ６に対して開口部３の前の位置、すなわち前記ＣＤ４＋ヘルパー細胞がフィルタ上に吸着されるフィルタ部分に正確に来るように、装置の上部枠エレメント１をねじる（回転角度約１８０°）ことによって、ナイロンメッシュフィルタ５を除去した。
５．その後、検出可能なマーカー（酵素など）を有する抗ヒトＣＤ４受容体抗体の溶液を、濾過装置の開口４に移し、フィルタ６中に吸引した。その溶液をフィルタ６中に吸引した後、抗体コンジュゲートをフィルタ６上に保持された細胞に結合させた。
６．その後、洗浄液を濾過装置の孔４に移し、フィルタ６中に吸引した。
７．その後、マーカーとして酵素を用いた場合、対応する基質を濾過装置の孔４に移し、フィルタ６中に吸引した。
８．その後、規定時間（例えば、５分後）に、例えば、Ｓｋａｎｎｅｘ  ＡＳ（ノルウェー）によって提供されるソフトウェアを備えたＳｋａｎＳｍａｒｔ  ＣＥリーダーを用いて反射測定法により発色を測定した。
９．読み取り値を、同一の実験で分析したＴ細胞関連ＣＤ４受容体分子を既知の含有量で含む較正サンプルによって作成し、ソフトウェアに保存した検量線と比較し、Ｔ細胞関連ＣＤ４受容体分子の含有量を算出した。
【０２０７】
検出可能なマーカーが例えば着色粒子である場合、工程７と、工程８による発色は当然に必要ではない。
【０２０８】
図２、図３及び図４に示すさらに進化した装置について、上述のＣＤ４の評価は、２つの血液サンプルを同時に評価できる図５に示す装置を用いても同様に行うことができる。この場合、上部枠エレメント１の回転角は約９０°である。
【０２０９】
Ｃ．４．２．２  ＣＤ４及びＣＤ８の評価
上記のように、この評価は図１の装置又は図２〜図４に示す装置を適用することでＣＤ４の評価と同様に実施でき、以下の工程を含む。
【０２１０】
工程１〜４及び６は、同一の方法で実施することができる。
【０２１１】
工程５では、例えば様々な色のラテックス粒子（赤色カルボキシル化ラテックスや、青色カルボキシル化ラテックスなど）などの様々な識別可能なマーカーにそれぞれ結合させた抗ＣＤ４抗体コンジュゲート、抗ＣＤ８抗体コンジュゲートの懸濁液を装置に移し、フィルタ中に吸引する。
【０２１２】
その後、速やかに、フィルタ１０４又は６上の色を、標準的なＡｐｐｌｅ  ｉ−Ｐｈｏｎｅ（商品名）と、その内蔵のフラッシュライトを使用して反射測定法により測定した。同時に、ラテックス粒子の色に応じて、例えば２つの赤色のドット（弱いものと強いもの）と例えば２つの青色のドット（弱いものと強いもの）が、例えば装置の上に描かれた。すべての５つのスポットについて、得られたＢＧＲファイル（上記参照）を使用し（ファイルをグレースケールに変換することにより）、ドットの場所及び限界を決定した。ＧＩＭＰプログラム（上記参照）を用いて、すべてのピクセルをＨＳＶカラーに変換した。２つの青色のドットに対する最大及び最小反応は青のカラールーム（ｃｏｌｏｕｒ  ｒｏｏｍ）を定義し、２つの赤色のドットに対する最大及び最小反応は赤のカラールーム（ｃｏｌｏｕｒ  ｒｏｏｍ）を定義した。
【０２１３】
次に、試験スポットのＨＳＶ値（赤色と青色の両方）を赤色及び青色のＨＳＶカラールーム（ｃｏｌｏｕｒ  ｒｏｏｍ）に補い、すべてのピクセルのＨＳＶ値を計算し、正規化した。
【０２１４】
次に、得られた正規化値を、ｉ−Ｐｈｏｎｅシステム内のコンピュータのキャリブレーションファイルに保存されている既知のＣＤ４陽性リンパ球及びＣＤ８陽性リンパ球の（例えば、従来のＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｅｘｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーシステムによっても分析された）較正サンプルを用いて得られた値と比較した。そして、その結果をディスプレイと電子出力に記録した。当該結果は、１単位体積あたりのＣＤ４リンパ球数、１単位体積あたりのＣＤ８リンパ球数、及び２つの値の間の比率として報告される。
【０２１５】
図２、図３及び図４に示されるより進化した装置についての上記のＣＤ４とＣＤ８の評価は、図５に示す装置を用いて同様に実施できる。当該装置では、２つの血液サンプル（一つはＣＤ４、もう一つはＣＤ８）を、異なる対の開口部（３、４及び３’、４’）において同時に評価できる。この場合、上部枠エレメント１の回転角は約９０°である。
【０２１６】
１．全血サンプルを、白血球は溶解しないがサンプルに含まれる赤血球の低張溶解に適合した希釈緩衝液と混合した。また、希釈緩衝液はＣＤ１４単球を凝集させるために適した形態の抗ＣＤ１４抗体を含む。
２．短いインキュベーション時間の後、前記混合物のアリコート（分注物）を図５の装置の開口部３と３’に移し、すぐに前記開口部３，３’の下に位置する粗い（ナイロンメッシュ）フィルタ５中に吸引する。フィルタ５は、凝集したＣＤ１４細胞を保持するが、次のフィルタ層６の表面に保持されるＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞を通過させる。（ＣＤ８の評価については、ＣＤ１４細胞は評価を妨害しない。フィルタ５は、ＣＤ８サンプル開口部について省略できる。）
３．その後、洗浄溶液を濾過装置の開口部４，４’に移し、ナイロンメッシュフィルタ５とフィルタ６中に吸引した。
４．その後、フィルタ６に対して、開口部４，４’が開口部３，３’の前の位置、すなわち前記ＣＤ４＋ヘルパー細胞がフィルタ上に吸着されているフィルタ部分に正確に来るように、装置の上部枠エレメント１をねじる（回転角度約９０°）ことによって、ナイロンメッシュフィルタ５を除去した。
５．その後、検出可能なマーカー（第１の色又は酵素の免疫粒子など）を有する抗ヒトＣＤ４受容体抗体の溶液を濾過装置の開口部４に移し、検出可能なマーカー（例えば、第２の色又は酵素の免疫粒子など）を有する抗ヒトＣＤ８受容体抗体の溶液を濾過装置の開口部４’に移す。次に、各液体をフィルタ６中に吸引した。該溶液をフィルタ６中に吸引した後、抗体コンジュゲートをフィルタ６上に保持された細胞に前記２つの異なるスポットで結合させた。
６．その後、洗浄液を濾過装置の孔４，４’に移し、フィルタ６中に吸引した。
【０２１７】
さらなる工程（マーカーが酵素の場合の発色）及び着色したスポットの測定は、上記のように行うことができる。
【０２１８】
以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに説明する。前記教示に基づいて、当業者は、過度の実験又は発明努力を必要とすることなく、本発明のさらなる実施形態を提供することができる。
【実施例】
【０２１９】
実験部分
Ａ．材料と方法
特に記載のない限り、本明細書で使用されるすべての試薬及び化合物は、分析グレードである。
【０２２０】
Ｂ．実施例
実施例１：平均細孔径３．５及び８μｍのニトロセルロースフィルタと、平均孔径３０μｍのナイロンネットフィルタの製造
ワットマンニトロセルロースフィルタ（３μｍの孔径：カタログ番号７１９３−００２；５μｍの孔径：カタログ番号７１９５−００４；８μｍの孔径：カタログ番号１０４００１１２）と、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｎｙｌｏｎ  Ｎｅｔ  Ｆｉｌｔｅｒ（製品番号ＮＹ３００２５００）を、１％ウシ血清アルブミン水溶液中に室温で４時間浸漬した。このブロッキング手順は、後に垂直濾過装置において使用するときに、タンパク質と細胞のフィルタへの非特異的結合を避けるために行われた。
【０２２１】
好ましくは、ナイロンネットフィルタはふわふわした材料なので、ナイロンネットフィルタは、ポリスチレン又は他の剛性材料のリングによって周辺部を支持することができる。前記剛性材料は、例えば、Ｃｌｅａｒｓｏｌ  Ｃａｓｃｏ（商品名）接着剤で接着するか、ナイロンネットフィルタに溶かして、リングとナイロンネットフィルタの間に液体が漏出することを防ぐ（下記実施例７に示す図１のフィルタ（１０６）とリング（１０８）を参照）。
【０２２２】
実施例２：鶏卵由来のポリクローナル抗体抗ヒトＣＤ１４受容体抗体の調製
以下のアミノ酸配列（配列番号１）を有する、オーダーメードしたＮｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ社（ＵＳ）製のヒトＣＤ１４受容体をフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）に懸濁した。
【０２２３】
【表１】
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【０２２４】
ポリクローナル抗ヒトＣＤ１４抗体は、当分野で周知の方法、例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａらが編集した「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（免疫学および免疫化学の方法）」（Ｍ．Ｗ．ｐｐ．１９７−２０９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．）において１９６７にＣｈａｓｅ，Ｍ．Ｗ．が記載した方法によって調製できる。簡潔には、適切な種の動物（例えばウサギ、ヤギ若しくはヒツジ、又は好ましくは鳥類、例えば家禽などの鳥類）を、適切なアジュバント、例えばフロイントの完全又は不完全アジュバント中の精製抗原で繰り返し免疫付与する。免疫付与後、動物から採血し、ポリクローナル抗体を、例えば硫酸アンモニウム又は塩化アンモニウム沈殿、陰イオン交換クロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー及び／又はアフィニティークロマトグラフィーなどの方法によって精製する。
【０２２５】
ポリクローナルトリ抗体は、卵黄から通常の方法で得られる（従って、ＩｇＹと称される）。しかし、卵黄には大量の脂質が含まれており、さらなる使用には問題がある。ＩｇＹは、段階的な硫酸アンモニウム沈殿（例えば、２５〜４０％）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿を用いて卵黄から単離できる。最初の精製では、Ｇａｌｌｕｓ  Ｉｍｍｕｎｏｔｃｈ社（米国、カリー）から入手可能な市販のＩｇＹ精製キット、又は、Ｐｉｅｒｃｅ社（米国、ロックフォード）から入手可能なＥｇｇｃｅｌｌｅｎｔ  Ｃｈｉｃｋｅｎ  ＩｇＹ精製キットも製造業者の取扱説明書を考慮して使用できる。
【０２２６】
さらに、ポリクローナル抗体の結合力は、例えば、ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍ（２００６年４月）からダウンロードされる「Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（タンパク質の親和性精製）」の教示に従って、抗原アフィニティー精製法の使用によって精製された抗体を使用することによりさらに増加する。参照により組み込まれたアフィニティー精製法は、以下により詳細に説明する。
【０２２７】
各免疫付与実験には２〜４匹の雌鶏を用いた。１ｍｌの水に溶解した０．１ｍｇのペプチドを等量のフロイントの完全アジュバントで乳化し、雌鶏の胸筋に注射した。注射は４週間ごとに繰り返した。注射開始の１０週間後に卵を採取した。卵黄を卵から単離し、卵黄単離の従来技術の方法に従った従来の方法である塩化アンモニウム沈殿により卵黄からＩｇＹ画分を単離した（例えば、Ｌａｒｓｓｏｎ  Ａ，Ｂａａｌｏｅｗ  Ｒ−Ｍ，Ｌｉｎｄａｈｌ  Ｔ，ａｎｄ  Ｆｏｒｓｂｅｒｇ  Ｐ−Ｏ  ｉｎ  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７２：１８０７−１８１２，１９９３を参照）。
【０２２８】
さらに４週間ごとに免疫付与を行った。１０週間後に卵を採取し、卵白から手動で卵黄を単離した。卵黄からの総抗体画分（ＩｇＹ画分）を、卵白抗体分離の従来技術の方法に従った従来の方法である塩化アンモニウム沈殿により単離した（例えば、Ｌａｒｓｓｏｎ  Ａ，Ｂａａｌｏｅｗ  Ｒ−Ｍ，Ｌｉｎｄａｈｌ  Ｔ，ａｎｄ  Ｆｏｒｓｂｅｒｇ  Ｐ−Ｏ  ｉｎ  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７２：１８０７−１８１２，１９９３参照）。
【０２２９】
次に、１０ｍｇの高純度ヒトＣＤ１４受容体を、カラムの添付文書の処方に従って、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＢｉｏｔｅｃｈのＨＩＴＲＡＰ  ＮＨＳ−活性ＨＰカラムに固定化した。卵黄から単離したＩｇＹ画分をリン酸緩衝生理食塩水で２ｍｇ／ｍｌに希釈した。このＩｇＹ溶液２００ｍｌをカラムに通し、続いてＩｇＹを含まないリン酸緩衝食塩水５０ｍｌを通した。固定化ＣＤ１４受容体に対して特異的親和性を有する抗体を、３５ｍｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ＝３．０で溶出した。溶出した特異的抗ＣＤ１４抗体をリン酸緩衝食塩水に対して透析し、３０，０００ダルトンの分子量カットオフのＡｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ遠心分離濾過装置を用いて３ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【０２３０】
実施例３ａ：カルボキシル化ポリスチレン粒子への抗ヒトＣＤ１４抗体の結合
１μｍのカルボキシル化ポリスチレン粒子（製品番号ＰＣ０４Ｎ／１０３５６）を、Ｂａｎｇｓ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ社（米国）から購入した。上記実施例２に従って調製したニワトリ抗ヒトＣＤ１４抗体３１ｍｇを２０ｍｌの緩衝液（ｐＨ＝９．５，５ｍＭホウ酸塩、７．５ｍＭ塩化ナトリウム）に対して透析した。３００ｍｇの前記カルボキシル化ポリスチレン粒子を遠心分離により洗浄し、２０ｍｌの水に懸濁した。１２．５ｍｇのＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）（Ｓｉｇｍａ、米国）を粒子懸濁液に溶解した。抗体溶液をラテックス懸濁液に添加し、５時間攪拌した。次に、懸濁液中の粒子を、１ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭホウ酸ナトリウム、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．５ｍＭグリシン（ｐＨ＝９．５）で４回洗浄した。次に、このストック溶液を、３０ｍＭホウ酸緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＰＳＡ（ブタ血清アルブミン）及び０．１％  ＰｒｏＣｌｉｎ（商品名）９５０  ｂｉｏｃｉｄｅ（ｐＨ９．１〜９．３））中で１：３に希釈した。
【０２３１】
実施例３ｂ：抗ＣＤ１４抗体の重合
上記実施例２に記載のように調製した抗ＣＤ１４  ＩｇＹ抗体１０ｍｇに、４ｍｇのジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（Ｐｉｅｒｃｅ社製、以下、ＤＴＳＳＰという）のＰＢＳ溶液１ｍｌを、室温で攪拌しながら、滴下して加えた。３５℃で３０分間攪拌した後、該混合溶液を、セファロースゲル（ファルマシアファインケミカル社製、セファデックスＧ２５Ｍカラム）を通して濾過した。これにより、ＩｇＹポリマーを含有するＰＢＳ溶液（以下、ＩｇＹａｇｇという）が約６ｍｌ得られた。この手順は、ＥＰ−Ａ−０９５７３６３に記載の重合手順と同様であった。
【０２３２】
実施例３ｃ：セファロース粒子に結合したモノクローナル抗ＣＤ１４抗体
１０ｍｇのモノクローナル抗ヒトＣＤ１４抗体（マウス由来）（Ｄｉａｔｅｃ社、オスロ、ノルウェー；製品番号３１１０）を０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．９）に対して透析した。ノルウェーのＮｏｒｗｅｇｉａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社の３７．５ｍｇの卵アルブミンを、０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．９）に対して透析した。
【０２３３】
６ｍｌのＮＨＳ活性化セファロース（ＧＥヘルスケアライフサイエンス社；製品番号１７−０９０６−０１）を１ｍＭのＨＣｌで洗浄し、沈降させて、その後精製水で３回洗浄した。
【０２３４】
１２．５ｍｇの透析した卵白アルブミン及び１０ｍｇの透析した抗ヒトＣＤ１４を混合し、次に６ｍｌのＮＨＳ活性化セファロースと混合した。その懸濁液を室温で４時間撹拌した。次に、残りの２５ｍｇの透析したアルブミンを加え、その懸濁液を室温でさらに４時間撹拌した。セファロースを沈降させ、次に０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌで３回洗浄した。最終的に、結合したセファロースの容量は２０ｍｌであった。
【０２３５】
実施例４ａ：抗ＣＤ１４抗体を含むサンプル希釈緩衝液
０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ及び０．１％プロクリンを含む１０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）。これは、白血球を溶解することなく、赤血球の低張溶解に使用した緩衝液である。
【０２３６】
上記実施例２に従って作製した抗ＣＤ１４抗体を、本発明の方法を用いてＣＤ４受容体について分析する全血量中の全単球に結合して凝集させるのに十分な量で、前記緩衝液に添加した。例えば、２０μｌの全血を分析し、４００μｌのサンプル希釈緩衝液を使用する場合、２０μｌの血液の全単球に結合する抗ＣＤ１４抗体の量が、４００μｌのサンプル希釈緩衝液に存在しなければならない。必要な量の滴定は、４００μｌの希釈緩衝液サンプル中に前記抗体の希釈系列を設定し、以下の方法を用いた試験によって実施できる。
【０２３７】
溶血溶液中に存在する又は溶血溶液に添加される抗ＣＤ１４の量が、混合物中の全てのＣＤ１４分子に結合するのに十分であるかを調べるために使用する方法は以下の工程を含む：
１．２０μｌの全血と、既知の多量の単球及びＣＤ１４受容体と、４００μｌの溶液（実施例２に従って作製した抗ＣＤ１４抗体を含む１０ｍＭ  ＮａＣｌ、ウシ血清アルブミン０．５ｍｇ／ｍｌ溶液（ｐＨ＝７．５））を混合し、溶解緩衝液を作製する。抗ＣＤ１４抗体の含有量は、以下の記載に従って変化させた。
２．混合物を１２０分間撹拌する。
３．実施例１に従って、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｎｙｌｏｎ  Ｎｅｔ  Ｆｉｌｔｅｒ（製品番号：ＮＹ３００２５００）を通して当該混合物を濾過する。
４．濾過した溶液中のＣＤ１４の存在を下記工程により試験する：
ａ）フィルタホルダ内吸着パッド（Ｗｈａｔｍａｎ社製の吸着材ＣＦ７；製品番号８１１７）上に、直径５ｍｍ、孔サイズ３μＭのニトロセルロースフィルタディスクを置き、上記実施例１に従ってブロックした。
ｂ）濾過したサンプル（上記参照）５０μｌをニトロセルロースフィルタ上に置き、フィルタとその下の吸着材中に吸引する。濾過したサンプル中に残存した単球を含む白血球は、ニトロセルロースフィルタ上に保持される。
ｃ）０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ＝７．４）の溶液５０μｌを用いて、細胞／ニトロセルロースフィルタを洗浄する。
ｄ）抗ヒトＣＤ１４アルカリホスファターゼコンジュゲートを適用した。当該目的のために、抗ヒトＣＤ１４（実施例３ｃと同様；Ｄｉａｔｅｃ社、オスロ；製品番号３１１０）をアルカリホスファターゼに結合させた（Ｄｉａｔｅｃ社の製品番号３１１９；クローン１８Ｄ１１抗ヒトＣＤ１４抗体を結合させた）。該コンジュゲートを０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＫｅｍｅｎｔｅｃｈ  ＡＰ  Ｓｔａｂｉｌ溶液（カタログ番号４−４０−Ｈ）で１：１００に希釈した。６０μｌの当該混合物を前記ニトロセルロースフィルタに適用し、３分間インキュベートした。
ｅ）０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０の溶液（ｐＨ＝７．４）を２×６０μｌ適用し、細胞／ニトロセルロースフィルタを洗浄する。
ｆ）残存した細胞とニトロセルロースフィルタに２０μｌのＳｅｒａｍｕｎ  Ｐｕｒｐｌｅ  Ｓ−８００−ＮＢＴを適用し、吸着材の中に流す。
ｇ）１０分間発色させる。
【０２３８】
発色がない場合は、上記の溶解緩衝液中十分なＣＤ１４結合分子が存在していたことになる。顕著な発色が生じた場合は、上記の溶解緩衝液にさらにＣＤ１４結合物質の添加が必要であった。
【０２３９】
実施例４ｂ：重合した抗ＣＤ１４抗体を有するサンプル希釈緩衝液
０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ及び０．１％プロクリンを含む１０ｍＭ  ＮａＣｌの溶液（ｐＨ７．５）を調製した。上記実施例３ｂに従って作製した重合抗ＣＤ１４抗体を、本発明の方法を用いてＣＤ４受容体を分析する全血量中の全単球に結合して凝集させるために十分な量で、前記緩衝液に添加した。例えば、２０μｌの全血を分析し、４００μｌのサンプル希釈緩衝液を使用する場合、２０μｌの血液の全単球に結合する重合抗ＣＤ１４抗体の量が、４００μｌのサンプル希釈緩衝液中に存在しなければならない。
【０２４０】
溶血溶液中に存在する又は溶血溶液に添加される抗ＣＤ１４の量が、混合物中の全てのＣＤ１４分子に結合するのに十分であるかを調べるために使用する方法は以下の工程を含む：
【０２４１】
１．２０μｌの全血と、既知の多量の単球及びＣＤ１４受容体と、４００μｌの溶液（上記実施例３ｂに従って作製した重合抗ＣＤ１４抗体を含む１０ｍＭ  ＮａＣｌ、ウシ血清アルブミン０．５ｍｇ／ｍｌ溶液（ｐＨ＝７．５））を混合し、溶解緩衝液を作製する。重合抗ＣＤ１４抗体の含有量は、以下の記載に従って変化させた。
工程２〜４は、実施例４ａの記載のように実施する。
【０２４２】
発色がない場合は、上記の溶解緩衝液中十分なＣＤ１４結合分子が存在していたことになる。顕著な発色が生じた場合は、上記の溶解緩衝液にさらにＣＤ１４結合物質の添加が必要であった。
【０２４３】
実施例４ｃ：セファロース粒子に結合した抗ＣＤ１４抗体を有するサンプル希釈緩衝液
ＰＨ７．４に調整した０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ及び０．１％プロクリンを含む１０ｍＭ  ＮａＣｌの希釈緩衝液溶液を調製した。上記実施例３ｃに従って作製したセファロース粒子上に固定された抗ＣＤ１４抗体を、本発明の方法を用いてＣＤ４受容体を分析する全血量中の全単球又は実質的に全単球に結合させるために十分な量で、前記緩衝液に添加した。例えば、２０μｌの全血を分析し、４００μｌの容量のサンプル希釈緩衝液を使用する場合、上記実施例３ｃに従ってセファロース粒子に結合させた抗ＣＤ１４抗体の量については、２０μｌの血液の全単球に結合する量が、４００μｌのサンプル希釈緩衝液中に存在しなければならない。
【０２４４】
溶血溶液中に存在する又は溶血溶液に添加される抗ＣＤ１４の量が、混合物中の全てのＣＤ１４分子に結合するのに十分であるかを調べるために使用する方法は以下の工程を含む：
【０２４５】
１．２０μｌの全血と、既知の多量の単球及びＣＤ１４受容体と、４００μｌの溶液（実施例３ｃに従って作製したアガロース粒子に結合したモノクローナル抗ＣＤ１４抗体を含む１０ｍＭ  ＮａＣｌ、ウシ血清アルブミン０．５ｍｇ／ｍｌ溶液（ｐＨ＝７．５））を混合し、溶解緩衝液を作製する。抗ＣＤ１４抗体アガロース粒子の量は、以下の記載に従って変化させた。
工程２〜４は、実施例４ａの記載のように実施する。
【０２４６】
発色がない場合は、上記の溶解緩衝液中十分なＣＤ１４結合分子が存在していたことになる。顕著な発色が生じた場合は、上記の溶解緩衝液にさらにＣＤ１４結合物質の添加が必要であった。
【０２４７】
実施例５：洗浄緩衝液
ｐＨを７．４に調整した０．１４Ｍ  塩化ナトリウム、１ｇ／ｌのＴｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ）、０．０１Ｍ  ２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール（Ｓｉｇｍａ）、１ｇ／ｌのウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、及び、１ｇ／ｌのＰｒｏｃｌｉｎ  ３００の溶液を調製した。
【０２４８】
実施例６：酵素結合モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ４受容体抗体の溶液
モノクローナル抗ヒトＣＤ４受容体のＥＤＵ−２クローンに結合したアルカリホスフェート酵素を、Ｄｉａｔｅｃ社（オスロ、ノルウェー）から購入した。それは０．５ｍｇ／ｍｌで供給された。作業溶液において、それをＫｅｍｅｎｔｅｃｈ  ＡＰ  Ｓｔａｂｉｌ溶液（カタログ番号４−４０Ｈ）で１：１００に希釈し、最終溶液中で０．１％ｖｏｌ／ｖｏｌとなるようにＴｗｅｅｎを添加した。
【０２４９】
実施例７：図１の垂直フローアッセイ装置
厚さ０．２０ｍｍの２２×２２ｍｍの正方形のポリスチレンディスク（１０１）の周りに、垂直濾過装置を形成した。
【０２５０】
ポリスチレンディスクの中央に、５ｍｍの円形孔（１０２）を標準的な打ち抜き器具で打ち抜く。
【０２５１】
前記正方形のポリスチレンディスクの下に、Ｃｌｅａｒｓｅａｌ  Ｃａｓｃｏ接着剤の薄い層（１０３）を小さなブラシで塗りつけた。上記実施例１に従って作製した、３．５又は８μｍの平均孔径を有する、直径１０ｍｍのニトロセルロースの円形片（１０４）を、前記ポリスチレンディスクの中央開口部（１０２）の中央にその中心を有する前記ポリスチレンディスクの接着剤上に設置する。
【０２５２】
その後、前記ポリスチレンディスクの接着面全体を、ＧＥヘルスケアライフサイエンス（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の２２×２２ｍｍのＣＦ７吸着パッド（１０５）（１００％コットンリンター材）で覆い、接着剤を乾燥させた。
【０２５３】
下部のニトロセルロースフィルタの上のポリスチレンディスク（１０２）の孔に、実施例１の直径５ｍｍのナイロンネットフィルタのディスク（１０６）を、Ｃｌｅａｒｓｅａｌ  Ｃａｓｃｏ接着剤と、ポリスチレンのリング（１０８）と、粘着テープ（１０７）の中央に３ｍｍ開口部を有する２２×１０ｍｍの接着テープ片（１０７）を使用することによって、ポリスチレンディスクに固定した。
【０２５４】
実施例８：酵素免疫複合体を用いた垂直フローＣＤ４アッセイ
図１の装置を用いて行った評価は、以下の工程を含む：
１．上記実施例４ｃに従って、２５μｌの全血サンプルを、５００μｌの希釈緩衝液と混合した。
２．１分後、上記混合物５０μｌを上記実施例７の濾過装置の粘着テープ（１０７）の開口部に移し、直ちにナイロンメッシュフィルタ（１０６）中に吸引した。
３．その後、上記実施例５の洗浄液５０μｌを、上記実施例７の濾過装置の粘着テープ（１０７）の開口部に移し、ナイロンメッシュフィルタ中に吸引した。
４．その後、粘着テープ（１０７）とナイロンメッシュフィルタ（１０６）を、粘着テープを剥がすことにより、除去した。
５．その後、上記実施例６の酵素結合モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ４受容体抗体の溶液５０μｌを、上記実施例７の濾過装置のポリスチレンディスク（１０２）の孔に移し、ニトロセルロースフィルタ（１０４）中に吸引した。溶液をフィルタ中に吸引した後、抗体コンジュゲートを細胞に２分間結合させた。
６．その後、上記実施例５の洗浄液１００μｌを上記実施例７の濾過装置のポリスチレンディスク（１０２）の孔に移し、ニトロセルロースフィルタ（１０４）中に吸引した。
７．その後、２０μｌのＳｅｒａｍｕｎ  Ｐｕｒｐｌｅ  Ｓ−００８−ＮＢＴ液体酵素基質Ｓｅｒａｍｕｎ  ＧｍｂＨを、上記実施例７に記載の濾過装置のポリスチレンディスク（１０２）の孔に移し、ニトロセルロースフィルタ（１０４）中に吸引し、５分間発色させた。
８．５分後、Ｓｋａｎｎｅｘ  ＡＳ（ノルウェー）が提供するソフトウェアを備えたＳｋａｎＳｍａｒｔ  ＣＥリーダーを使用して、発色した色を反射測定法により測定した。
９．読み取り値を、同一の実験で分析したＴ細胞関連ＣＤ４受容体分子を既知の含有量で含む較正サンプルによって作成し、ソフトウェアに保存した検量線と比較し、Ｔ細胞関連ＣＤ４受容体分子の含有量を算出した。
【０２５５】
別の方法：
時間を要する酵素シグナル生成の使用を避けるために、前記抗ヒトＣＤ４抗体は、上記工程６の直後に読み取ることができる着色物質又は蛍光物質に結合させることができる。有色の免疫粒子は、抗体又はその免疫反応性フラグメントと、色を呈する粒状物質を含む。その粒状物質は、大抵の場合、スペーサー又は架橋分子を用いて、物理的吸着又は共有結合によって前記抗体又はフラグメントに結合することができる。その有色物質は、これには限定されないが、多くの異なる物質、金コロイド若しくは第二鉄コロイドなどの金属コロイド又は炭素粒子から製造可能なラテックス粒子又はポリマー粒子の中又は上の顔料に構成される。この着色粒子は、先行技術に記載されており、当業者に周知である。これらは通常、Ｍｅｒｃｋ  Ｆｒａｎｃｅ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国）及び／又はＢａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国）などの供給業者から購入する。ポリマー粒子は、すべてのサイズ及び色、また蛍光粒子としても供給される。その粒子のサイズ及び色の強度は、本発明の製造物で使用される膜の孔サイズだけでなく、評価方法に必要な感度及び容量に対して調整されるべきである。
【０２５６】
上述のように、本発明は特定の細胞グループを捕捉するための膜と、前記細胞グループに関連する受容体の測定値を使用する。細胞又は細胞の特定グループの大きさに依存して、前記膜は、前記細胞グループを捕捉し、より小さい他の粒子が前記膜を通過するのに適した孔サイズを有する。本発明の一実施形態では、細胞の特定グループはＴリンパ球であり、Ｔ細胞を捕捉するための前記膜の適切な孔径は、平均孔径が１〜１０μｍ、好ましくは３〜９μｍ、さらにより好ましくは３〜５μｍの膜であり、低張となった後にサンプル物質に含まれるより小さな粒状物質の膜の通過を可能にする。本発明の好ましい実施形態では、本発明は、有色免疫粒子からの良好なシグナルが発生するサイズではあるが、前記細胞の特定グループを捕捉する前記膜を通過するのに十分小さいサイズの有色免疫粒子を使用する。典型的には、本発明は、６０〜４００ｎｍ、より好ましくは８０〜３００ｎｍ、さらにより好ましくは９５〜２００ｎｍの直径のサイズの免疫粒子を使用する。
【０２５７】
実施例９：青色カルボキシル化ラテックスに結合した抗ＣＤ４抗体
本発明の一実施形態では、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（欧州）から入手した１１７ｎｍの平均直径を有する青色カルボキシル化ラテックス粒子（製品番号：ＰＳＩ  ９０−９１）を使用した。５ｍｇのモノクローナル抗ヒトＣＤ４受容体抗体のＥＤＵ−２クローン（Ｄｉａｔｅｃ  ＡＳ；ノルウェー）を５ｍｌの緩衝液（５ｍＭホウ酸塩、７．５ｍＭ塩化ナトリウム；ｐＨ＝９．５）に対して透析した。２３．４ｍｇの前記カルボキシル化青色ラテックス粒子を遠心分離により洗浄し、２ｍｌの水に懸濁させた。０．８ｍｇのＥＤＣ（Ｓｉｇｍａ、米国）を粒子懸濁液に溶解し、抗体溶液をラテックス懸濁液と混合し、５時間撹拌した。次に、懸濁液中の粒子を、１ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭホウ酸ナトリウム、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ  ２０，０．５ｍＭグリシン、ｐＨ＝９．５で４回洗浄した。次に、このストック溶液を３０ｍＭホウ酸塩緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０，０．５ｍｇ／ｍｌ  ＰＳＡ及び０．１％ＰｒｏＣｌｉｎ  ９５０を含むｐＨ９〜９，３）で１：３に希釈した。
【０２５８】
この調製物のシグナル強度はバッチごとに多少変動した。そして、１５ｍＭ  ＴＲＩＳ、１０ｍＭホウ酸塩、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ及び１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンのｐＨを７．４に調整した溶液中のストック溶液について、適切な希釈度を確認することによって、適切な作業溶液を見いだした。
【０２５９】
実施例１０：青色ラテックス免疫粒子を用いた垂直フローＣＤ４アッセイ
図１の装置を用いて行った評価は、以下の工程を含む：
１．上記実施例４ｃに従って、２５μｌの全血サンプルを、５００μｌの希釈緩衝液と混合した。
２．１分後、上記混合物１５０μｌを上記実施例７の濾過装置の粘着テープ（１０７）の開口部に移し、直ちにナイロンメッシュフィルタ（１０６）中に吸引した。
３．その後、上記実施例５の洗浄液５０μｌを、上記実施例７の濾過装置の粘着テープ（１０４）の開口部に移し、ナイロンメッシュフィルタ中に吸引した。
４．その後、粘着テープ（１０７）とナイロンメッシュフィルタ（１０６）を、粘着テープを剥がすことにより、除去した。
５．その後、上記実施例９の青色カルボキシル化ラテックスに結合した抗ＣＤ４抗体の懸濁液５０μｌを、上記実施例７の濾過装置のポリスチレンディスク（１０２）の孔に移し、ニトロセルロースフィルタ（１０４）中に吸引した。
６．その後、洗浄工程を開始する前に所定の時間放置し、抗体結合ビーズを細胞に十分に結合させた。
７．その後、上記実施例５の洗浄液５０μｌを上記実施例７の濾過装置のポリスチレンディスク（１０２）の孔に移し、ニトロセルロースフィルタ（１０４）中に吸引した。
８．その後、直ちに、ニトロセルロースフィルタ上の色を、Ｓｋａｎｎｅｘ  ＡＳ（ノルウェー）が提供するソフトウェアを備えたＳｋａｎＳｍａｒｔ  ＣＥリーダーを使用して、反射測定法により測定した。
９．読み取り値を、同一の実験で分析したＴ細胞関連ＣＤ４受容体分子を既知の含有量で含む較正サンプルによって作成し、ソフトウェアに保存した検量線と比較し、Ｔ細胞関連ＣＤ４受容体分子の含有量を算出した。
【０２６０】
実施例８及び１０は、ポリマー粒子に結合した抗ＣＤ１４抗体を含む上記実施例４ｃのサンプル希釈緩衝液を使用する。前記サンプル希釈緩衝液は、実施例４ａの非結合抗ＣＤ１４抗体若しくは実施例４ｂの重合抗体を含む緩衝液、又は、多くの抗体分子を有する物質を作製する他の周知の方法による緩衝液で置き換えることができる。非限定的方法において、抗体をタンパク質担体分子又は可溶性ポリマー分子に結合させることが、もう一つの好適な選択肢である。
【０２６１】
実施例１１：赤色カルボキシル化ラテックスに結合した抗ＣＤ８抗体
Ｍｅｒｃｋ  Ｅｓｔａｐｏｒｅから入手した１９０ｎｍの平均直径を有する赤色カルボキシル化ラテックス粒子（製品番号：７８４  Ｋ１−０１０）を使用した。Ｄｉａｔｅｃ  ＡＳ（ノルウェー）から入手したＵＣＨＴ−４クローンモノクローナル抗ヒトＣＤ８受容体抗体５ｍｇを５ｍｌの緩衝液（ｐＨ＝９．５，５ｍＭホウ酸塩、７．５ｍＭ塩化ナトリウム）に対して透析した。３５ｍｇの前記カルボキシル化青色ラテックス粒子を遠心分離により洗浄し、２ｍｌの水に懸濁させた。０．８ｍｇのＥＤＣ（Ｓｉｇｍａ、米国）を該粒子懸濁液に溶解し、抗体溶液をラテックス懸濁液と混合し、５時間撹拌した。次に、懸濁液中の粒子を、１ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭホウ酸ナトリウム、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ  ２０，０．５ｍＭグリシン（ｐＨ＝９．５）を用いて４回洗浄した。次に、このストック溶液を、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０，０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ及び０．１％  ＰｒｏＣｌｉｎ  ９５０を含む３０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９〜９，３）で１：３に希釈した。
【０２６２】
この調製物のシグナル強度はバッチごとに多少変動した。そして、０．１％Ｔｗｅｅｎ及び１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含む、ｐＨを７．４に調整した１５ｍＭ  ＴＲＩＳ、１０ｍＭホウ酸塩、１５ｍＭ  ＮａＣｌの溶液中のストック溶液について、適切な希釈度を確認することによって、適切な作業溶液を見いだした。
【０２６３】
実施例１２：青色及び赤色ラテックス免疫粒子を用いた垂直フローＣＤ４及びＣＤ８アッセイ
図１の装置を用いて行った評価は、以下の工程を含む：
４．上記実施例４ｃに従って、２０μｌの全血サンプルを、４００μｌの希釈緩衝液と混合した。
５．１分後、上記混合物１５０μｌを上記実施例７の濾過装置の粘着テープ（１０７）の開口部に移し、直ちにナイロンメッシュフィルタ（１０６）中に吸引した。
６．その後、上記実施例５の洗浄液５０μｌを、上記実施例７の濾過装置の粘着テープ（１０４）の開口部に移し、ナイロンメッシュフィルタ中に吸引した。
７．その後、粘着テープ（１０７）とナイロンメッシュフィルタ（１０６）を、粘着テープを剥がすことにより、除去した。
８．その後、上記実施例９の青色カルボキシル化ラテックスに結合した抗ＣＤ４抗体を５０％、上記実施例１１の赤色カルボキシル化ラテックスに結合した抗ＣＤ８抗体を５０％含む懸濁液５０μｌを、上記実施例７の濾過装置のポリスチレンディスク（１０２）の孔に移し、ニトロセルロースフィルタ（１０６）中に吸引した。
９．３分後、上記実施例５の洗浄溶液５０μｌを上記実施例７の濾過装置のポリスチレンディスク（１０２）の孔に移し、ニトロセルロースフィルタ（１０６）中に吸引した。
１０．その後、速やかに、ニトロセルロースフィルタ上の色を、標準的なＡｐｐｌｅ  ｉ−Ｐｈｏｎｅ（商品名）と、その内蔵のフラッシュライトを使用して反射測定法により測定した。同時に、２つの赤色のドット（弱いものと強いもの）と２つの青色のドット（弱いものと強いもの）が、装置の上に描かれた。すべての５つのスポットについて、得られたＢＧＲファイル（上記参照）を使用し（ファイルをグレースケールに変換することにより）、ドットの場所及び限界を決定した。ＧＩＭＰプログラム（上記参照）を用いて、すべてのピクセルをＨＳＶカラーに変換した。２つの青色のドットに対する最大及び最小反応は青のカラールーム（ｃｏｌｏｕｒ  ｒｏｏｍ）を定義し、２つの赤色のドットに対する最大及び最小反応は赤のカラールーム（ｃｏｌｏｕｒ  ｒｏｏｍ）を定義した。
１１．次に、試験スポットのＨＳＶ値（赤色と青色の両方）を赤色及び青色のＨＳＶカラールーム（ｃｏｌｏｕｒ  ｒｏｏｍ）に補い、すべてのピクセルのＨＳＶ値を計算し、正規化した。
１２．次に、得られた正規化値を、ｉ−Ｐｈｏｎｅシステム内のコンピュータのキャリブレーションファイルに保存されている既知のＣＤ４陽性リンパ球及びＣＤ８陽性リンパ球の（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｅｘｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーシステムによっても分析された）較正サンプルを用いて得られた値と比較した。そして、その結果をディスプレイと電子出力に記録した。当該結果は、１単位体積あたりのＣＤ４リンパ球数、１単位体積あたりのＣＤ８リンパ球数、及び２つの値の間の比率として報告される。
【０２６４】
本明細書中に引用された先行技術文献の開示は、参照により組み込まれる。
【図１】
2018526625.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
2018526625000001.app
【国際調査報告】
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2018526625.tif 000009
2018526625.tif 000010
2018526625.tif 000011
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