(57)【要約】各標的核酸について別個の検出標識を使用する単一ウェルにおいて、第１標的核酸の存在量（Ｔ）を第２及び第３標的核酸の平均存在量（Ｓ）と比較して算出することにより、第１標的核の平均長または存在量を決定する方法及び組成物が開示される。様々な態様では、第１標的核酸はテロメアである。例示的な態様では、開示される方法及び組成物は、生体試料の平均テロメア長を決定するために使用され得る。開示される方法及び組成物を使用して決定された平均テロメア長は、種々の臨床的に重要な状態及び指標と相関し得る。この要約は、特定の技術分野における検索のための選別手段として意図するものであり、本発明の限定を意図するものではない。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均テロメア長または存在量の決定方法であって、
（ａ）第１標的核酸を第１プライマーセットと接触させること、第２標的核酸を第２プライマーセットと接触させること、及び第３標的核酸を第３プライマーセットと接触させることであって；
ｉ）前記第１プライマーセットが、第１フォワードプライマー及び第１リバースプライマーを含み；
ｉｉ）前記第２プライマーセットが、第２フォワードプライマー及び第２リバースプライマーを含み；
ｉｉｉ）前記第３プライマーセットが、第３フォワードプライマー及び第３リバースプライマーを含み；
ｉｖ）前記第１標的核酸が、テロメア反復配列を含むことと；
（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応により、前記第１標的核酸を前記第１プライマーセットで増幅して第１アンプリコンを形成すること、前記第２標的核酸を前記第２プライマーセットで増幅して第２アンプリコンを形成すること、及び前記第３標的核酸を前記第３プライマーセットで増幅して第３アンプリコンを形成することと；
（ｃ）前記ポリメラーゼ連鎖反応中に前記第１、第２、及び第３アンプリコンの量を決定することであって；
ｉ）前記第１アンプリコンが、第１検出標識を使用して検出され；
ｉｉ）前記第２アンプリコンが、第２検出標識を使用して検出され；
ｉｉｉ）前記第３アンプリコンが、第３検出標識を使用して検出されることと；
（ｄ）試料におけるテロメアＤＮＡの前記平均長または存在量を決定することと
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記第１フォワードプライマー及び第１リバースプライマーの各々が、
（ａ）アニーリング条件下でテロメア反復配列にハイブリダイズする３’部分と；
（ｂ）テロメア反復配列にハイブリダイズしないアンカー配列を有する５’部分と
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１リバースプライマーが、前記プライマーの前記３’末端に隣接する、またはそれを含む少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドを含むミスマッチプライマーであって；前記少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドが、前記標的核酸に相補的ではないが、前記第１フォワードプライマーの前記３’末端ヌクレオチドに相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１フォワードプライマーが、配列番号：１の配列を含み；前記第１リバースプライマーが、配列番号：２の配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１リバースプライマーが、前記第１標的核酸のプライミングからブロックされる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１リバースプライマーが、末端の３’ミスマッチ塩基により前記第１標的核酸のプライミングからブロックされる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第２標的核酸が、既知のコピー数を持つ遺伝子内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
既知のコピー数を持つ前記遺伝子が、低コピー数遺伝子である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第２標的核酸が単一コピー数遺伝子である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２フォワードプライマーが、配列番号：３を含み；前記第２リバースプライマーが、配列番号：４を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１検出標識、第２検出標識、及び第３検出標識の各々が、独立して蛍光部分を含み；前記蛍光部分の各々が、分離可能かつ同時に検出可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２検出標識が、配列番号：５の配列を含むオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２アンプリコンが、約５０〜約２５０ｂｐ長であり；前記第３アンプリコンが、約５０〜約２５０ｂｐ長である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１、第２、及び第３標的核酸を、前記第１、第２、及び第３プライマーセットとそれぞれ接触させる前に染色体ＤＮＡ試料を得るステップをさらに含み；前記染色体ＤＮＡ試料が、前記第１、第２、及び第３標的核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
染色体ＤＮＡ試料を得る前記ステップが、対象から得られた液体試料から１つ以上の細胞型を単離することを含み；単離された前記細胞型が、循環腫瘍細胞、循環幹細胞、リンパ球、顆粒球、骨髄細胞、好中球、単球、マクロファージ、血小板、及び白血球を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第１、第２、及び第３アンプリコンの濃度が、対照参照ＤＮＡとの比較により決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１アンプリコンの前記平均長または存在量を決定することが、
（ａ）前記第１、第２、及び第３アンプリコンの濃度を、対照ポリメラーゼ連鎖反応との比較により決定するステップと；
（ｂ）前記第１アンプリコンの前記濃度と前記第２及び第３アンプリコンの前記平均または加重濃度との比を決定するステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）からの前記比を、１ゲノム当たりのテロメア配列の塩基対に変換するステップと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
同種移植造血幹細胞ドナー選択方法であって、
（ａ）１人以上のＨＬＡ適合候補ドナー対象から試料を得ることと；
（ｂ）請求項１に記載の前記方法により、前記ＨＬＡ適合ドナー対象の各々についてテロメアＤＮＡの前記平均長または存在量を決定することと；
（ｃ）１人以上のドナー対象を、年齢適合対照について上位第２５百分位数における第１アンプリコンの平均長または存在量で同定することと；
（ｄ）前記同定したドナー対象から移植可能な造血幹細胞試料を得ることと；
（ｅ）前記造血幹細胞試料をレシピエント対象に移植することと
を含む、前記方法。
【請求項１９】
前記レシピエント対象が、癌、心血管疾患と診断されている、または骨髄移植が必要であると診断されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
心血管疾患リスクの再分類方法であって、
（ａ）対象から試料を得ることであって、前記対象が、低強度スタチン療法について２０１３  ＡＣＣ／ＡＨＡ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ基準を満たすと診断されていることと；
（ｂ）請求項１に記載の前記方法により、前記試料における前記第１アンプリコンの前記平均長または存在量を決定することと；
（ｃ）前記試料が、年齢適合対照について下位第２５百分位数における第１アンプリコンの平均長または存在量を有すると決定されている場合に、より高い心血管リスクがあると前記対象を診断することと；
（ｄ）より高い心血管リスクがあると診断された前記対象に：
ｉ）修正されたスタチン療法；及び／または
ｉｉ）心血管疾患を処置することで知られる第２治療剤
を投与することと、を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１２月３０日出願の米国特許仮出願第６２／０９８，０５７号明細書、及び２０１５年５月１９日出願の第６２／１６３，４３４号明細書の利益を主張し、その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＥＦＳ−ＷＥＢによりテキストファイルとして提出された配列表の参照
２０１５年６月２２日に作成された「３７５０２．０００４Ｕ３＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のテキストファイルとして２０１５年６月２２日に提出された配列表は、５，０５７バイトのサイズを有し、米国特許法施行規則第１．５２条（ｅ）（５）に従って参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
背景における記載は、引用文献における特徴付けの保証を必ずしも意味するものではない。
【０００４】
真核生物染色体の先端部であるテロメアは、染色体を核酸分解、末端間融合、及び組換えから保護している。テロメアは、核酸配列（５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’）ｎの反復を特徴とする染色体の末端にある構造である。テロメアは、正常な細胞分裂の結果として短縮し、非常に短いテロメアは、細胞の老化またはアポトーシスを招く。過去１０年間のヒトにおける多数の疫学研究及び臨床研究は、短いテロメア長と高リスクの老化関連疾患及び全死因死亡率とを関連付けてきた（Ｐｕｔｅｒｍａｎ，Ｅ．及びＥ．Ｅｐｅｌ，Ｓｏｃ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｐｓｙｃｈｏｌ  Ｃｏｍｐａｓｓ，２０１２．６（１１）８０７−８２５；Ｚｈｕ，Ｈ．，Ｍ．Ｂｅｌｃｈｅｒ，及びＰ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈａｒｓｔ，Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ（Ｌｏｎｄ），２０１１．１２０（１０）４２７−４０；ならびにＦｙｈｒｑｕｉｓｔ，Ｆ．及びＯ．Ｓａｉｊｏｎｍａａ．Ａｎｎ  Ｍｅｄ，２０１２．４４  Ｓｕｐｐｌ  １  ＳＩ３８−４２）。遺伝的、環境、生活様式、及び行動因子は、総じてテロメア長に影響を与える。したがって、テロメア長は、全般的な健康、疾患、及び死亡リスクの指標となってきた。
【０００５】
平均テロメア長は、公開されているほぼ全ての臨床研究で測定され、患者の疾患及び死亡リスクの階層化において有用性を実証しているが、マウスにおける最近の研究では、短いテロメア集団が老化またはアポトーシスへの誘発シグナルであり（Ｈｅｍａｎｎ，Ｍ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，２００１．１０７（１）６７−７７）、それゆえ疾患及び死亡リスクのシグナルであることも示している。Ｈｅｍａｎｎらにより報告された研究では、短いテロメアを有する第６世代テロメラーゼＲＮＡノックアウトマウス（ｍＴＲ−／−Ｇ６）を、テロメラーゼのヘテロ接合体であって長いテロメアを有するマウス（ｍＴＲ＋／−）と交配させた。テロメラーゼヌル子孫の表現型は、それらのテロメアの半分が長いという事実にもかかわらず、ｍＴＲ−／−親の表現型を反映し、これは平均テロメア長ではなく、短いテロメア量が細胞生存能及び染色体安定性に重要であることを示唆している。天然物由来のテロメラーゼ活性化因子（ＴＡ−６５（登録商標））を服用する人々では、短い（＜３または＜４ｋｂｐ）テロメアの割合に有意な減少（定量的ＦＩＳＨ技術により測定される場合；（Ｃａｎｅｌａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００７．１０４（１３）５３００−５を参照のこと）が白血球で検出されたが、平均テロメア長には変化は見られなかった（Ｈａｒｌｅｙ，Ｃ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．２０１１．１４（１）４５−５６）。したがって、短いテロメアの存在量の割合における変化は、テロメアに対する生活様式及び薬理学的またはその他の介入の効果に関するより感度の高い測定であると予想される。別の研究（Ｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｒａｔｅ  ｏｆ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  Ｓｈｏｒｔ  Ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ  Ｐｒｅｄｉｃｔｓ  Ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｓ」，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１２），ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ＵＲＬ：ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／．ｃｅｌｒｅｐ．２０１２．０８．０２３）では、「短いテロメア存在量の増加率は、寿命の予測因子であった」ことを見出した。
【０００６】
様々な方法が、テロメア長の測定のために開発されていて、例えば、サザンブロッティング（Ｋｉｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１０，５：１５９６−１６０７）、Ｑ−ＦＩＳＨ（Ｒｕｆｅｒ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９８，１６：７４３−７４７）、フローＦＩＳＨ（Ｂａｅｒｌｏｃｈｅｒ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２００２，４７：８９−９９）、Ｑ−ＦＩＳＨアッセイのよりハイスループットな修正版（ＨＴＱ−ＦＩＳＨ；Ｃａｎｅｌａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００７，１０４：５３００−５３０５を参照のこと）、二重標識セントロメア及びテロメアＦＩＳＨ（Ｃｅｎ／Ｔｅｌ  ＦＩＳＨ）（Ｖａｎｄｅｒ  Ｇｒｉｅｎｄ  Ｄ．Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２００９  Ｏｃｔ  １；６９（１４）：１５５７−６４．ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｒｏｓ．２１００１）、ドットブロット（Ｋｉｍｕｒａ  Ｍ．Ａｖｉｖ  Ａ．２０１１  ＮＡＲ）、ならびにｑＰＣＲ（Ｃａｗｔｈｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００２，３０（１０）：ｅ４７；及びＣａｗｔｈｏｎ  ＲＭ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００９，３７（３）：ｅ２１）を含む。
【０００７】
ｑ−ＰＣＲ−テロメア長（ｑＰＣＲ−ＴＬ）は、単一コピー遺伝子で正規化した平均テロメアの存在量を測定し、これはＴ／Ｓ比として表される。Ｔ／Ｓ比をｂｐ数での絶対長に変換するために、テロメア制限断片長（ＴＲＦ）の様々な方法が報告されている。例えば、この変換をサザンブロット分析により決定して、Ｔ／Ｓ比と比較することができたとこれまでに報告されている（Ｃａｗｔｈｏｎ、同上）。線形回帰式を得て、これを使用して未知の試料のＴＲＦ長をそのＴ／Ｓ比に基づいて算出した。この変換に伴う１つの重大な問題とは、ＴＲＦが、そのセントロメア末端に非テロメア配列（サブテロメア配列）の領域を含有することである。サブテロメア配列の長さは個体間で異なるため、ＴＲＦに基づくＴ／Ｓ比からの変換ｂｐは、近似値にすぎない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、相対的テロメア長または存在量を容易に決定するための材料及び方法の進歩にもかかわらず、適切な対照集団と比較した対象におけるテロメア長または存在量の差を決定する方法及び材料の改善が依然として必要である。特に、対象における相対的テロメア長または存在量の差を、これらの同じ対象における臨床評価及び／または治療レジメンを改善するために、高い精度で決定することが依然として必要である。これらの要望及びその他の要望は、本発明によって対処される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的（複数可）に従って、本明細書で実施されて広く記載されるように、本発明は、一態様では、少なくとも３つの標的核酸配列の平均長または存在量を、各標的核酸配列について異なる検出標識を利用する単一ｑＰＣＲマルチプレックス反応で決定する方法及び組成物に関する。一態様では、３つの標的核酸配列のうち１つがテロメア配列であり、他方の２つの標的核酸配列は、めったにコピー数変化を受けないことで知られる異なる低コピー数遺伝子である。さらなる態様では、平均テロメア長または存在量と他方の２つの核酸配列についての平均存在量の平均値との比、すなわち、Ｔ／Ｓ比は、平均テロメア長または存在量を臨床的リスクまたは最適化した治療レジメンと関連付けるために使用され得る。よりさらなる態様では、低コピー数遺伝子は、単一コピー遺伝子である。
【００１０】
平均テロメア長を決定する方法が開示され、本方法は：（ａ）第１標的核酸を第１プライマーセットと接触させること、第２標的核酸を第２プライマーセットと接触させること、及び第３標的核酸を第３プライマーセットと接触させることであって；（ｉ）第１プライマーセットは、第１フォワードプライマー及び第１リバースプライマーを含み；（ｉｉ）第２プライマーセットは、第２フォワードプライマー及び第２リバースプライマーを含み；（ｉｉｉ）第３プライマーセットは、第３フォワードプライマー及び第３リバースプライマーを含み；（ｉｖ）第１標的核酸は、テロメア反復配列を含むこと；（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応により、第１標的核酸を第１プライマーセットで選択的に増幅して第１アンプリコンを形成すること、第２標的核酸を第２プライマーセットで選択的に増幅して第２アンプリコンを形成すること、及び第３標的核酸を第３プライマーセットで選択的に増幅して第３アンプリコンを形成すること；（ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応の１回以上のサイクル中に、第１、第２、及び第３アンプリコンの量を決定することであって；（ｉ）第１アンプリコンは、第１検出標識を使用して検出され；（ｉｉ）第２アンプリコンは、第２検出標識を使用して検出され；（ｉｉｉ）第３アンプリコンは、第３検出標識を使用して検出されること；ならびに（ｄ）第１アンプリコンの平均長または存在量を決定することを含む。
【００１１】
同種移植造血幹細胞ドナー選択の方法もまた開示され、本方法は：（ａ）１人以上のＨＬＡ適合候補ドナー対象から試料を得ること；（ｂ）開示される方法により、ＨＬＡ適合ドナー対象の各々について第１アンプリコンの平均長または存在量を決定すること；（ｃ）１人以上のドナー対象を、年齢適合対照について上位第２５百分位数における第１アンプリコンの平均長または存在量で同定すること；（ｄ）同定したドナー対象から移植可能な造血幹細胞試料を得ること；及び（ｅ）造血幹細胞試料をレシピエント対象に移植することを含む。
【００１２】
心血管疾患リスクの再分類の方法もまた開示され、本方法は：（ａ）対象から試料を得ることであって、対象は、低強度スタチン療法について２０１３  ＡＣＣ／ＡＨＡ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ基準を満たすと診断されていること；（ｂ）開示される方法により、試料における第１アンプリコンの平均長または存在量を決定すること；（ｃ）試料が、年齢適合対照について下位第２５百分位数における第１アンプリコンの平均長または存在量を有すると決定されている場合に、より高い心血管リスクがあると対象を診断すること；ならびに（ｄ）より高い心血管リスクがあると診断された対象に：（ｉ）修正されたスタチン療法；及び／または（ｉｉ）心血管疾患を処置することで知られる第２治療剤を投与することを含む。
【００１３】
本開示の態様は、体系的法定分類などの特定の法定分類内で記載及び請求され得るが、これは便宜のためにすぎず、当業者は、本開示の各態様が任意の法定分類内で記載及び請求され得ると理解するだろう。別段の明示的な記載がない限り、本明細書に示されるいずれの方法または態様も、そのステップが特定の順序で実施されることが必要であると解釈されることを決して意図しない。したがって、方法クレームが、ステップは特定の順序に限定されるべきであると特許請求の範囲または説明において具体的に記載していない場合、ある順序が推測されることは、いかなる点においても決して意図しない。このことは、ステップの配置もしくは作業フローに関する論理事項、文法構成もしくは句読法から得られる明白な意味、または本明細書に記載される態様の数もしくは種類を含む、解釈についての可能な非明示的基準のいずれにも当てはまる。
【００１４】
添付の図面は、本明細書に組み込まれて本明細書の一部を構成し、いくつかの態様を示して、記載と共に本発明の原理を説明する役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｃはテロメア標的配列の増幅に関する代表的な概略スキームを示す。  図１Ａは増幅の第１サイクルを示す。簡潔に述べると、ＴｅｌＧ改変プライマー（「Ｔｅｌ  Ｇ改変」）は、天然テロメアに沿って複数のテロメア部位で結合するのに対して、ＴｅｌＣ改変プライマー（「Ｔｅｌ  Ｃ改変」）は、Ｔｅｌ  Ｃ改変プライマーの３’最末端にミスマッチがあるため、天然テロメア部位に沿って結合することができない。したがって、Ｔｅｌ  Ｇ改変伸長産物の存在量は、Ｃ鎖テロメアＤＮＡの存在量に比例する。
【図１Ｂ】Ｔｅｌ  Ｇ改変及びＴｅｌ  Ｃ改変プライマーは、特に各プライマーの３’末端にミスマッチがあるため、プライマー二量体を形成できないことを示す。鋳型なし対照（ＮＴＣ）からのデータは、これらのプライマーがテロメアＤＮＡの不存在下では増幅しないことを裏付ける。
【図１Ｃ】増幅の第２サイクルを示す。簡潔に述べると、第１増幅サイクル１でＴｅｌ  Ｇ改変プライマーから合成された複数の伸長産物は、Ｔｅｌ  Ｃ改変プライマーに結合部位を提供する。結合したＴｅｌ  Ｃ改変プライマーは、Ｔｅｌ  Ｇ改変プライマーによりプライミングされた第１増幅サイクルからの伸長産物の５’末端に向けて伸長され得る。したがって、サイクル３及びそれ以降では、８６ｂｐ二本鎖が選択的に増幅される。このアンプリコンの存在量は、ゲノムＤＮＡ試料における二本鎖テロメアＤＮＡの存在量に比例するように設計される。
【図２Ａ】ヒトゲノム標的ＤＮＡ（モザイク男性ゲノムＤＮＡ）とのＢ２Ｍ−Ｆ、Ｂ２Ｍ−Ｒ、ＲＮＡＰ−Ｆ、ＲＮＡＰ−Ｒ、Ｔｅｌ  Ｇ改変、及びＴｅｌ  Ｃ改変プライマーを用いた増幅の代表的な融解曲線データを示す。Ｔｅｌ  Ｇ改変及びＴｅｌ  Ｃ改変プライマーの濃度は、図に示すように変更された。Ｂ２Ｍ−Ｆ及びＢ２Ｍ−Ｒプライマーの濃度は、３００ｎＭで一定に保持され、Ｂ２Ｍプローブは１００ｎＭの濃度で存在した。
【図２Ｂ】図２Ａに同じ。
【図２Ｃ】図２Ａに同じ。
【図２Ｄ】図２Ａに同じ。
【図２Ｅ】図２Ａに同じ。
【図２Ｆ】図２Ａに同じ。
【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｃは、ヒトゲノム標的ＤＮＡ（モザイク男性ゲノムＤＮＡ）についての標的ＤＮＡの交点（「Ｃｐ」）対ｌｏｇ（濃度）の代表的な線形回帰直線を示し、標的ＤＮＡは、テロメア配列、ＲＮａｓｅ  Ｐ遺伝子、及びβ２−ミクログロブリン遺伝子の標的核酸配列を含む。Ｃｐは、Ｒｏｃｈｅ製ＬＣ４８０  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ機器の二次導関数プログラムを使用して算出された。  図３ＡはＴｅｌ  Ｇ改変及びＴｅｌ  Ｃ改変プライマーを使用した、テロメア標的核酸のＣｐ対ｌｏｇ（濃度）を示す。
【図３Ｂ】ＲＮＡＰ−Ｆ及びＲＮＡＰ−Ｒプライマーを使用した、ＲＮａｓｅ  Ｐ標的核酸のＣｐ対ｌｏｇ（濃度）を示す。
【図３Ｃ】Ｂ２Ｍ−Ｆ及びＢ２Ｍ−Ｒプライマーを使用した、β２−ミクログロブリン標的核酸のＣｐ対ｌｏｇ（濃度）を示す。前述のものでは、ｌｏｇ（濃度）表示で使用される濃度は、ｎｇ／μＬの単位であった。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｃはヒトゲノム標的ＤＮＡ（モザイク男性ゲノムＤＮＡ）を使用して実施された代表的な増幅曲線増幅反応を示す。  図４ＡはＴｅｌ  Ｇ改変及びＴｅｌ  Ｃ改変プライマーを使用した増幅曲線を示す。図４Ａに示されるように、テロメアＤＮＡは、典型的には２０〜２５のＣｐ範囲において有意なシグナル（蛍光シグナル＞２５単位）で増幅するが、ＮＴＣは、本質的にバックグラウンドノイズを示す（３０サイクル以上であっても、蛍光単位１未満）。これは、ｑＰＣＲ増幅の関連サイクル全体を通して非特異的増幅の不存在を実証している。
【図４Ｂ】ＲＮＡＰ−Ｆ及びＲＮＡＰ−Ｒプライマーを使用した増幅曲線を示す。
【図４Ｃ】Ｂ２Ｍ−Ｆ及びＢ２Ｍ−Ｒプライマーを使用した増幅曲線を示す。
【図５Ａ】図５Ａ〜５ＣはヒトゲノムＤＮＡを含むことなく（すなわち、鋳型なし対照反応物を）使用して実施された増幅反応の代表的な増幅曲線を示す。  図５Ａは標的ゲノムＤＮＡを含むことなく、Ｔｅｌ  Ｇ改変及びＴｅｌ  Ｃ改変プライマーを使用した増幅曲線を示す。サイクル３０後まで、いずれのＤＮＡも本質的に増幅しないことに留意する。
【図５Ｂ】ＲＮＡＰ−Ｆ及びＲＮＡＰ−Ｒプライマーを使用した増幅曲線を示す。
【図５Ｃ】Ｂ２Ｍ−Ｆ及びＢ２Ｍ−Ｒプライマーを使用した増幅曲線を示す。
【図６Ａ】研究対象からの１６３の独立した試料で実施された反応において、Ｂ２Ｍ−Ｆ、Ｂ２Ｍ−Ｒ、ＲＮＡＰ−Ｆ、ＲＮＡＰ−Ｒ、Ｔｅｌ  Ｇ改変、及びＴｅｌ  Ｃ改変プライマーを用いた開示される方法を使用して決定されたＴ／Ｓ比の代表的なヒストグラムを示す。Ｔ／Ｓ比は、ｑＰＣＲ反応物からのテロメアＤＮＡアンプリコンの濃度を、ｑＰＣＲ反応物からのＲＮａｓｅ  Ｐ及びβ２−ミクログロブリンアンプリコンの平均濃度で割ることにより決定され、３つ全てのアンプリコンは、単一反応ウェル中にある。グラフは、テロメア長の分布について予想の通りに、Ｔ：Ｓ比の対数正規分布を示す。
【図６Ｂ】健康な研究参加者からの１６３の試料で実施された反応において、Ｂ２Ｍ−Ｆ、Ｂ２Ｍ−Ｒ、ＲＮＡＰ−Ｆ、ＲＮＡＰ−Ｒ、Ｔｅｌ  Ｇ改変、及びＴｅｌ  Ｃ改変プライマーを用いた開示される方法を使用したＴ／Ｓ比対年齢の代表的なグラフを示す。
【図７Ａ】アッセイ間ＣＶ値対Ｔ／Ｓ比の代表的なグラフを示す。Ｔ／Ｓ比は、健康な研究参加者からの１６３の試料で実施された反応において、Ｂ２Ｍ−Ｆ、Ｂ２Ｍ−Ｒ、ＲＮＡＰ−Ｆ、ＲＮＡＰ−Ｒ、Ｔｅｌ  Ｇ改変、及びＴｅｌ  Ｃ改変プライマーを用いた開示される方法を使用して決定された。データは、開示されるトリプレックスｑＰＣＲアッセイによる、プレート毎の変動についての中間ＣＶが約１．５％であり、これは単色または単色マルチプレックスアッセイの旧バージョンの中間ＣＶ（典型的には、５％範囲以上）よりも有意に低いことを示す。
【図７Ｂ】１６３の研究対象試料から得られた結果のアッセイ間ＣＶ対Ｔ：Ｓ比の代表的なヒストグラムを示す。アッセイ間ＣＶの決定に使用されたデータは、Ｂ２Ｍ−Ｆ、Ｂ２Ｍ−Ｒ、ＲＮＡＰ−Ｆ、ＲＮＡＰ−Ｒ、Ｔｅｌ  Ｇ改変、及びＴｅｌ  Ｃ改変プライマーを用いた開示される方法を使用して得られた。データは、アッセイ間ＣＶがＴ：Ｓ比の関数ではないこと、換言すれば、アッセイ間ＣＶは、テロメア長と共に増加したり減少したりしないことを示唆している。
【図８Ａ】９つの研究対象試料を使用して、３人の別の操作者により、５日間の各々で実験的決定について１日当たり３回反復して分析されて得られたＴ／Ｓ比に対するアッセイ内ＣＶ推定値を示す。ＣＶは変量効果モデルを使用して算出され、ここで「試料実行（ｓａｍｐｌｅ  ｒｕｎ）」は、モデル内の変量効果であった。Ｔ／Ｓ比は、Ｂ２Ｍ−Ｆ、Ｂ２Ｍ−Ｒ、ＲＮＡＰ−Ｆ、ＲＮＡＰ−Ｒ、Ｔｅｌ  Ｇ改変、及びＴｅｌ  Ｃ改変プライマーを用いた開示される方法を使用して決定された。Ｔ：Ｓ比に対するアッセイ内ＣＶ（技術的複製物、すなわち理論的に同一の試料間での変動係数）は、２〜３％であった。
【図８Ｂ】９つの患者試料を使用して、３人の別の操作者により、５日間の各々で実験的決定について１日当たり３回反復して分析されて得られたＴ／Ｓ比に対するアッセイ間ＣＶ推定値（すなわち、プレート毎の変動）を示す。ＣＶは変量効果モデルを使用して算出され、ここで「試料実行」は、モデル内の変量効果であった。Ｔ／Ｓ比は、Ｂ２Ｍ−Ｆ、Ｂ２Ｍ−Ｒ、ＲＮＡＰ−Ｆ、ＲＮＡＰ−Ｒ、Ｔｅｌ  Ｇ改変、及びＴｅｌ  Ｃ改変プライマーを用いた開示される方法を使用して決定された。データは、非常に低いＣＶを示す（５日間にわたって３人の別の操作者を使用し、それぞれの日における試料実行変動について、おおよそ０〜２．５％）。発明者らの知る限りでは、これは、これまでに報告された中でＡＴＬの最も低いプレート間ＣＶである。
【図８Ｃ】同じ９つの患者試料を使用して、３人の別の操作者により、５日間の各々で実験的決定について１日当たり３回反復して分析されて得られたＴ／Ｓ比に対する全ＣＶ推定値を示す。ＣＶは変量効果モデルを使用して算出され、ここで「試料実行」は、モデル内の変量効果であった。Ｔ／Ｓ比は、Ｂ２Ｍ−Ｆ、Ｂ２Ｍ−Ｒ、ＲＮＡＰ−Ｆ、ＲＮＡＰ−Ｒ、Ｔｅｌ  Ｇ改変、及びＴｅｌ  Ｃ改変プライマーを用いた開示される方法を使用して決定された。データは、全アッセイＣＶが２〜４％の範囲内であることを示す。
【図９】Ｙ３プラスミドクローン（１３５ｂｐのテロメアＤＮＡを含有する２８６アンプリコン（配列番号：１２）、すなわちＹ３クローンを含有するプラスミド）の３倍段階希釈点を用いた８点標準曲線を示す。標準曲線の傾斜に基づいたｑＰＣＲ効率は、９１．６％±６％の標準偏差（４つの測定値平均）である。Ｒ２直線性は、０．９９超であった。
【図１０】標準物としてＹ３プラスミドクローン及び本明細書に記載される開示されたトリプレックスｑＰＣＲアッセイを使用して決定され、Ｔ／Ｓ比の関数としてプロットされた平均テロメア長（キロベース対、「ｋｂｐ」での）を示す。回帰直線の傾斜は２．４６であり、これは１つのＴ：Ｓ単位がこの手法に基づいて２．４６ｋｂｐを表すことを示す。３つのデータ点は、低、中、及び高テロメア長を表す３つの精度管理試料の分析によるものであった。
【図１１】テロメラーゼのＲＮＡサブユニット（ｈＴＥＲ）による細胞株のトランスフェクションにより、テロメア伸長を受けた単一細胞株（ＵＭＵＣ−３膀胱癌株）に由来する５つの試料について、Ｔ／Ｓ比の関数としてプロットされた平均テロメア長（ｋｂｐでの）を示す。平均テロメア長は、本明細書に記載される開示されたトリプレックスｑＰＣＲアッセイを使用して決定された。テロメア長は、およそ２．８ｋｂｐの初期値から４．６ｋｂｐまで増加し、データは細胞培養中にベースライン及び４つの追加点で収集された。回帰直線の傾斜は２．５９であり、これは１つのＴ：Ｓ単位がこの手法に基づいて２．５９ｋｂｐを表すことを示す。
【図１２】サザンブロット手法を使用して決定され、Ｔ：Ｓ比の関数としてプロットされた平均テロメア長（ｋｂｐでの）を示す。この比較に基づいて、２．１５の回帰直線傾斜により、１つのＴ：Ｓ単位が２．１５ｋｂｐを表す。この比較の試料は、図１１で使用されたものと同一である。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜図１３ＤはＴｅｌ  １ｂ及びＴｅｌ  ２ｂプライマー（それぞれ配列番号：２０及び２１）を用いて、またはＴｅｌ  Ｇ改変及びＴｅｌ  Ｃ改変プライマー（それぞれ配列番号：１及び２）を使用してのいずれかによる、カノニカルテロメア反復、（ＣＣＣＴＡＡ）１５の、本明細書に記載される開示されたトリプレックスｑＰＣＲアッセイを使用した増幅を比較するデータを示す。  Ｔｅｌ  １ｂ及びＴｅｌ  ２ｂプライマーを含有する反応物は、図内で「ＴＴ」と示され、Ｔｅｌ  Ｇ改変及びＴｅｌ  Ｃ改変プライマーを含有する反応物は、図内で「ＡＴＬ」と示される。図１３Ａが、１倍ＤＮＡ（１．６７ｎｇ／μＬ）を含有する反応物中で各プライマーについて得られた結果を示す。
【図１３Ｂ】７倍ＤＮＡ（１１．６９ｎｇ／μＬ）を使用したこと以外は同じ条件下である。
【図１３Ｃ】図１３Ａ及び図１３Ｂのデータをそれぞれ使用して、算出された平均テロメア濃度を示す。
【図１３Ｄ】図１３Ａ及び図１３Ｂのデータをそれぞれ使用して、算出された平均テロメア濃度を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜図１４Ｃは、図１３Ａ〜図１３Ｄについて上に記載されるものと同様の実験を示す。増幅反応は、標的鋳型がＧリッチ標的配列の（ＣＣＣＴＣＡ）１５であったことを除いて、同じ条件下で実施された。Ｔｅｌ  １ｂ及びＴｅｌ  ２ｂプライマーを含有する反応物は、図内で「ＴＴ」と示され、Ｔｅｌ  Ｇ改変及びＴｅｌ  Ｃ改変プライマーを含有する反応物は、図内で「ＡＴＬ」と示される。図１４Ａが、１倍ＤＮＡ（１．６７ｎｇ／μＬ）を含有する反応物中で各プライマーについて得られた結果を示す。
【図１４Ｂ】７倍ＤＮＡ（１１．６９ｎｇ／μＬ）を使用したこと以外は同じ条件下である。
【図１４Ｃ】図１４Ａ及び図１４Ｂのデータを使用して、算出された平均テロメア濃度を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜図１５Ｃは、図１３Ａ〜図１３Ｄについて上に記載されるものと同様の実験を示す。増幅反応は、標的鋳型がＧリッチ標的配列の（ＣＣＣＴＧＡ）１５であったことを除いて、同じ条件下で実施された。Ｔｅｌ  １ｂ及びＴｅｌ  ２ｂプライマーを含有する反応物は、図内で「ＴＴ」と示され、Ｔｅｌ  Ｇ改変及びＴｅｌ  Ｃ改変プライマーを含有する反応物は、図内で「ＡＴＬ」と示される。図１５Ａが、１倍ＤＮＡ（１．６７ｎｇ／μＬ）を含有する反応物中で各プライマーについて得られた結果を示す。
【図１５Ｂ】７倍ＤＮＡ（１１．６９ｎｇ／μＬ）を使用した以外は同じ条件下である。
【図１５Ｃ】図１５Ａ及び図１５Ｂのデータを使用して、算出された平均テロメア濃度を示す。
【図１６】Ｃａｗｔｈｏｎ  ２００２アッセイ及び本明細書に記載される開示されたトリプレックスｑＰＣＲアッセイの両方で試験されて、３１１の正常なヒト全血試料から得られたＴ／Ｓ比データのＱＱプロットを示す。２つのアッセイで得られたＴ／Ｓ比間の関係についてのベストフィット式は、Ｙ＝１．１３ｘ−０．０６で、Ｒ２＝０．８１であった。
【００１６】
本発明のさらなる利点は、以下に続く記載にある程度示され、その記載からある程度明白となるだろう、または本発明の実施により知り得る。本発明の利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘される要素及び組合せによって実現されて得られるだろう。前述の概要及び以下の詳細な説明の両方とも、例示的かつ説明的にすぎず、本発明の技術的範囲を制限するものではないと理解されるべきである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本開示は、本発明の以下の詳細な説明及び本明細書に含まれる実施例の参照によってより容易に理解され得る。
【００１８】
本明細書で言及される全ての刊行物は、参照によって本明細書に組み込まれ、引用される刊行物に関連して方法及び／または材料を開示及び記載する。本明細書で述べられる刊行物は、本出願の出願日前の、それらの開示のためにのみ提供される。本明細書において、本開示は、先行発明によってこのような公開に先行する権利が付与されないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、本明細書で提供される公開日は、実際の公開日と異なる可能性があり、個別の確認を必要とする可能性もある。
【００１９】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という用語は、態様「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（からなる）」及び「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（から本質的になる）」を含み得る。
【００２０】
本明細書で使用される場合、有機化合物を含む化合物の命名法は、一般名、命名法のＩＵＰＡＣ、ＩＵＢＭＢ、またはＣＡＳ勧告を使用して付与され得る。別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての専門用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書及び続く特許請求の範囲において、本明細書で定義されるものとする多数の用語を参照するだろう。
【００２１】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その文脈に別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ａ  ｃｅｌｌ（細胞）」、「ａ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ヌクレオチド）」、または「ａ  ｐｒｉｍｅｒ（プライマー）」への言及は、２つ以上のこのような細胞、ヌクレオチド、またはプライマーなどの混合物を含む。
【００２２】
範囲は、「ａｂｏｕｔ（約）」１つの特定値から、及び／または「ａｂｏｕｔ（約）」別の特定値までとして本明細書で表され得る。このような範囲が表される場合、さらなる態様は、１つの特定値から及び／または他方の特定値までを含む。同様に、値が近似として表される場合、先行詞「ａｂｏｕｔ（約）」の使用により、特定の値がさらなる態様を形成すると理解されるだろう。範囲の各々の端点は、他方の端点に関連して、及び他方の端点とは無関係に両方とも有意であるとさらに理解されるだろう。本明細書で開示される多数の値が存在すること、及び各値はまた、値それ自体に加えて「ａｂｏｕｔ（約）」その特定値として本明細書に開示されるとも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合には、「ａｂｏｕｔ（約）１０」も開示される。２つの特定の単位間における各単位も開示されるとも理解される。例えば、１０及び１５が開示される場合には、１１、１２、１３、及び１４も開示される。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「ａｂｏｕｔ（約）」及び「ａｔ  ｏｒ  ａｂｏｕｔ（〜で、または約）」という用語は、問題となっている量または値が、およそのあるその他の値または約のその値と指定された値であり得ることを意味する。本明細書で使用される場合、これは別段の指示または推測がない限り、±１０％の変動を示した公称値であると一般に理解される。本用語は、類似の値が、特許請求の範囲に列挙されるのと同等の結果または効果の促進を伝達することを意図する。すなわち、量、サイズ、配合、パラメータ、ならびにその他の量及び特徴は、正確なものではなくその必要もないが、所望の場合、許容誤差、変換係数、丸め誤差、測定誤差など、及び当業者に既知のその他の係数を反映して近似の及び／またはより大きい、もしくはより小さいものであり得ると理解される。概して、量、サイズ、配合、パラメータまたはその他の量もしくは特徴は、明示的にそのようなものであると記載されているか否かを問わず、「ａｂｏｕｔ（約）」または「ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ（およそ）」のものである。「ａｂｏｕｔ（約）」が定量値の前に使用される場合、別段の具体的な記載がない限り、パラメータは特定の定量値それ自体も含むと理解される。
【００２４】
本明細書及び特許請求の範囲における、組成物中の特定の要素または成分の重量部への言及は、重量部が表される組成物または物品における要素または成分と任意のその他の要素または成分との間の重量関係を示す。したがって、２重量部の成分Ｘ及び５重量部の成分Ｙを含有する化合物において、Ｘ及びＹは、２：５の重量比で存在し、さらなる成分が化合物中に含有されるか否かにかかわらず、このような比で存在する。
【００２５】
成分の重量パーセント（ｗｔ．％）は、反対の具体的な記載がない限り、成分が含まれる製剤または組成物の総重量に基づく。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「任意の」または「場合により」という用語は、その後に記載されるイベントまたは状況が生じ得る、または生じ得ないこと、ならびに記載がそのイベントまたは状況が生じる場合及びそれが生じない場合を含むことを意味する。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、組成物または方法の物理的、化学的、または生物学的特性の所望の修正を達成するのに十分な量を指す。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「キット」は、キットを構成する少なくとも２つの成分の集まりを意味する。合わせて、成分は、所与の目的のための機能単位を構成する。個々の構成成分は、共にまたは別々に物理的にパッケージ化されてよい。例えば、キットを使用するための説明書を含むキットは、その他の個々の構成成分と共に説明書を物理的に含んでも、または含まなくともよい。代わりに、説明書は別個の構成成分として、紙形式またはコンピュータ可読メモリデバイス上に供給されてよい、またはインターネットウェブサイトからダウンロードされてよい電子形式で、もしくは記録された提示物としてのいずれかで供給され得る。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「説明書（複数可）」は、キットに付属する関連材料または手法について記載する文書を意味する。これらの材料は、以下の任意の組合せを含んでよい：背景情報、成分の一覧及びそれらの在庫情報（購入情報など）、キットを使用するための簡単な、または詳細なプロトコール、トラブルシューティング、参考文献、技術サポート、ならびに任意のその他の関連文書。説明書は、キットと共に、または別個の構成成分として、コンピュータ可読メモリデバイス上に供給されてよい、もしくはインターネットウェブサイトからダウンロードされてよい紙形式もしくは電子形式として、または記録された提示物としてのいずれかで供給され得る。説明書は、１つまたは複数の文書を含み得、将来的なアップデートを含むことを意味する。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、脊椎動物、例えば哺乳動物、魚、鳥、爬虫類、または両生類などであり得る。したがって、本明細書に開示される方法の対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコ、モルモットまたはげっ歯類であり得る。本用語は、特定の年齢または性別を示すものではない。したがって、成人及び新生児の対象に加えて胎児が、オスまたはメスであろうと包含されることを意図する。一態様では、対象は哺乳動物である。患者は、状態、疾患または障害に罹患した対象を指す。「患者」という用語は、ヒト及び獣医学的対象を含む。開示される方法のいくつかの態様では、対象は、変化したテロメア長と関連する１つ以上の状態または疾患の処置が必要であると診断されている。例えば、特定の臨床状態を有する対象は、テロメラーゼ活性の機能不全に起因する変化したテロメア長を有する染色体を持つ細胞を有し得る。このような状態で、テロメラーゼ活性の機能不全は、非常に短いテロメア（「テロメア病」）を招く。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「処置」という用語は、疾患、病態、または障害を治療する、改善する、安定させる、または予防するという意図で患者の医療管理を指す。本用語は、積極的処置、すなわち特に疾患、病態、または障害の改善を目指す処置を含み、原因処置、すなわち関連疾患、病態、または障害の原因除去を目指す処置も含む。加えて、本用語は、緩和処置、すなわち疾患、病態、または障害の治癒ではなく症状の軽減のために設計される処置；予防処置、すなわち関連疾患、病態、または障害の発症を最小限に抑える、または部分的にもしくは完全に阻害することを目指す処置；及び支持処置、すなわち関連疾患、病態、または障害の改善を目指す別の特異的療法を補うために用いられる処置を含む。様々な態様では、本用語は、哺乳動物（例えば、ヒト）を含む対象の任意の処置を包含し、（ｉ）疾患に至る素因があり得るが、疾患を有するとはまだ診断されていない対象で疾患が生じるのを予防すること；（ｉｉ）疾患を阻害すること、すなわちその発症を阻止すること；または（ｉｉｉ）疾患を軽減すること、すなわち疾患の退縮を引き起こすことを含む。一態様では、対象は霊長類などの哺乳動物であり、さらなる態様では、対象はヒトである。「対象」という用語は、飼育動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、及び実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、フルーツフライなど）も含む。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「予防する」または「予防すること」という用語は、特に事前の作用によって何かが起こるのを妨げる、避ける、取り除く、未然に防ぐ、止める、または妨害することを指す。軽減する、阻害する、または予防するが本明細書で使用される場合、別段の具体的な指示がない限り、他方の２単語の使用も明示的に開示されると理解される。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「投与すること」及び「投与」という用語は、医薬調製物を対象に提供する任意の方法を指す。このような方法は当業者に周知であり、これらとしては、経口投与、経皮投与、吸入による投与、経鼻投与、局所投与、膣内投与、経眼投与、耳内投与、脳内投与、直腸投与、舌下投与、頬側投与、ならびに非経口投与、例えば静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、及び皮下投与などの注射剤を含むものが挙げられるが、これらに限定されない。投与は、継続的または断続的であり得る。様々な態様では、調製物は、治療的に投与され得る；すなわち、既存の疾患または状態を処置するために投与され得る。さらなる様々な態様では、調製物は、予防的に投与され得る；すなわち、疾患または状態の予防のために投与され得る。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「有効量」及び「有効な量」という用語は、所望の結果を達成するのに、または望ましくない状態に対して効果を有するのに十分な量を指す。例えば、「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するのに、または望ましくない症状に対して効果を有するのに十分であるが、有害な副作用を引き起こすには一般に不十分な量を指す。任意の特定の患者に対する特定の治療有効用量レベルは、処置されている障害及び障害の重症度；用いられる特定の組成物；患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別及び食事；投与時間；投与経路；用いられる特定の化合物の排出速度；処置期間；用いられる特定の化合物と組み合わせて、またはそれと同時に使用される薬物ならびに医学分野において周知の同様の因子を含む、多様な因子に依存するだろう。例えば、当業者の技能範囲内で化合物の用量を、所望の治療効果を達成するのに必要な用量よりも低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に投与量を増加させるのがよい。所望される場合、効果的な１日用量は、投与のために複数回用量に分割され得る。結果として、単回用量の組成物は、１日用量を構成するこのような量またはその約数を含有し得る。投与量は、いずれかの禁忌の場合には、個々の医師により調整され得る。投与量は変更が可能で、１日または数日間、１回以上の用量投与で毎日投与され得る。指針は、医薬製品の所与のクラスにおける適切な投与量についての文献に見出され得る。さらなる様々な態様では、調製物は、「予防有効量」；すなわち、疾患または状態の予防に有効な量で投与され得る。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「伸長プライマー」は、ＤＮＡポリメラーゼにより実施される時間を制限した伸長反応ステップを行うために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを意味する。伸長プライマーは、３’部分及び５’部分を含み得る。例えば、３’部分は、アニーリング条件下で３’オーバーハングのテロメア反復配列にハイブリダイズし得、５’部分は、アニーリング条件下で３’オーバーハングのテロメア反復配列にハイブリダイズしないアンカー配列を有し得る。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「テロメア領域」は、反復テロメア配列（ＴＴＡＧＧＧ：ＣＣＣＴＡＡ反復）を有する染色体の末端における二本鎖ＤＮＡセグメントを意味する。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「サブテロメア領域」は、テロメアのセントロメア側でテロメアにすぐ隣接するＤＮＡのセグメントを意味する。サブテロメア領域は多くの場合、変性テロメア反復を含有する。ヒトの場合では、ＴＧＡＧＧＧ及びＴＣＡＧＧＧの反復が、サブテロメア領域に存在し得る。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「アンカー配列」は、ＰＣＲ反応で使用され得る鋳型ゲノム中には存在しない、または２０ｋｂの目的のアンプリコン内に存在する、プライマー内の特有の配列セグメントを意味する。例えば、伸長プライマーの５’部分は、伸長プライマーの３’部分がハイブリダイズするＧ鎖においてテロメア反復配列にアニーリング条件下でハイブリダイズしないように、及び２０ｋｂのテロメア反復内の鋳型配列中に存在する任意のその他の配列にハイブリダイズしないように構成されているアンカー配列であり得る。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「染色体ＤＮＡのＧ鎖」は、３’オーバーハングを有するテロメアの鎖を意味し、テロメア反復配列５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’を含む。例えば、「染色体ＤＮＡのＧ鎖」は、ヒト及びその他の脊椎動物において（ＴＴＡＧＧＧ）ｎテロメア反復配列を含む染色体のＤＮＡ鎖を指し得る。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「染色体ＤＮＡのＣ鎖」は、染色体ＤＮＡのＧ鎖に相補的な鎖を意味し、ヒト及びその他の脊椎動物において（ＣＣＣＴＡＡ）ｎテロメア反復配列を含む。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「モザイク組成ゲノムＤＮＡ」は、個別のドナーＤＮＡ試料を含むプールされた試料であるゲノムＤＮＡ試料を意味する。プールは、少なくとも２人の無関係な試料ドナーから得られた個別の試料を含む。典型的には、モザイク組成ゲノムＤＮＡは、約５０〜１００人の個別で無関係な試料ドナーから得られた個別のゲノムＤＮＡ試料を含むプールされた試料である。いくつかの場合には、個別で無関係な試料ドナーは、単一の性別である、例えば、個別で無関係な男性ドナーのみから得られたモザイク組成ゲノムＤＮＡである。その他の場合には、個別で無関係な試料ドナーは、両方の性別からのドナーである。「モザイク組成ゲノムＤＮＡ」は、その他の用語、例えば「モザイク鋳型ＤＮＡ」、「モザイクゲノムＤＮＡ」、「モザイクＤＮＡ」などと同じ意味で使用され得る。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドの重合を触媒する酵素を指す。一般に、酵素は、核酸鋳型配列にアニーリングしたプライマーの３’末端で合成を開始するだろう。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、プライマーがアニーリングされる核酸を補完する配列特異的手法でデオキシリボヌクレオチドの重合を触媒し、二本鎖ＤＮＡ分子をもたらす。既知のＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｇｅｎｅ  １０８：１）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｌｅｃｏｍｔｅ及びＤｏｕｂｌｅｄａｙ（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：７５０５）、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１１２）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｙｅｒｓ及びＧｅｌｆａｎｄ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：７６６１）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｅｎｅｓｈ及びＭｃＧｏｗａｎ（１９７７）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ４７５：３２）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼとも称される、Ｃａｒｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９：４１９３）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｉａｚ及びＳａｂｉｎｏ（１９９８）Ｂｒａｚ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ  ３１：１２３９）、ならびにＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｏｒｉｏｌ  １２７：１５５０）が挙げられる。上記酵素のいずれのポリメラーゼ活性も、当該技術分野において周知の手段により決定され得る。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「耐熱性」ＤＮＡポリメラーゼ活性は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼの非耐熱性形態と比較した場合、熱に対して比較的安定であり、高温、例えば４５〜１００℃、好ましくは５５〜１００℃、６５〜１００℃、７５〜１００℃、８５〜１００℃または９５〜１００℃でも機能するＤＮＡポリメラーゼ活性を意味する。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「プライマー」は、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下で、例えば、４つの異なるヌクレオシド三リン酸及び伸長のための薬剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在下で、適切な緩衝液中において好適な温度で、ＤＮＡ合成の開始点として機能することができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、鋳型核酸の正確な配列を反映する必要はないが、鋳型とハイブリダイズするために十分に相補的でなければならない。所与の標的配列を増幅するための好適なプライマーの設計は、当該技術分野において周知であり、本明細書で引用される文献に記載されている。
【００４５】
「標的」、「標的配列」、「標的領域」、及び「標的核酸」という用語は、本明細書で使用される場合に同義であり、増幅または検出される核酸の領域または部分配列を指す。
【００４６】
「ハイブリダイゼーション」という用語は、本明細書で使用される場合、相補的な塩基対形成ゆえに２つの一本鎖核酸による二本鎖構造の形成を指す。ハイブリダイゼーションは、完全に相補的な核酸鎖間に、または軽微なミスマッチの領域を含有する「実質的に相補的な」核酸鎖間に生じ得る。完全に相補的な核酸鎖のみがハイブリダイズするだろう条件は、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「配列特異的ハイブリダイゼーション条件」と称される。実質的に相補的な配列の安定した二本鎖は、低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で達成され得；許容されるミスマッチの程度は、ハイブリダイゼーション条件の好適な調整により制御され得る。核酸技術の当業者は、当該技術により提供される指針に従って、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ及び塩基対組成、イオン強度、ならびにミスマッチ塩基対の発生率を含む多数の変数を経験的に考慮して、二本鎖の安定性を決定し得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；及びＷｅｔｍｕｒ（１９９１）Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６（３／４）：２２７−２５９を参照のこと；両方とも参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００４７】
「増幅反応」という用語は、鋳型核酸配列のコピー増加をもたらす、または鋳型核酸の転写をもたらす、酵素反応を含む、任意の化学反応を指す。
【００４８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、より長い二本鎖ＤＮＡ分子内でＤＮＡ配列の指数関数的増幅を可能にする方法である。ＰＣＲは、ＤＮＡにおける２本の鎖それぞれの規定された配列に相補的である一対のプライマーの使用を必要とし、一方のプライマーが一方の鎖に相補的であり、他方のプライマーは標的配列の他方の鎖に相補的である。これらのプライマーは、コピーが指定された配列で作製されるようにＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。このコピーを作製した後、同じプライマーが、入力ＤＮＡ鎖の別のコピーを作製するだけでなく、合成の第１ラウンドで作製された短いコピー（ＰＣＲアンプリコン）の別のコピーも作製するために再度使用され得る。これが、対数増幅をもたらす。増幅プロセスの各ラウンドにおいて、二本鎖ＤＮＡの２本の鎖を分離するには温度を上げる必要があるので、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓという熱水プールで成長する細菌から単離された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）の発見が大きな前進であって；結果として、増幅のラウンド毎に新しいポリメラーゼを添加する必要はない。増幅のいくつかの（多くの場合、約２０〜４０）ラウンド後、ＰＣＲ産物はアガロースゲル上で分析され、ＤＮＡインターカレートまたは結合色素、例えば臭化エチジウム、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、またはＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）色素で検出されるのに十分なほど豊富である。
【００４９】
リアルタイムＰＣＲは、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ／ｑＰＣＲ）、または動的ポリメラーゼ連鎖反応とも呼ばれ、ＰＣＲに基づく実験室技術であり、標的ＤＮＡ分子を増幅して、同時に定量化するために使用されると理解される。ｑＰＣＲは、ＤＮＡ試料における特定の配列の（ＤＮＡ入力または追加の正規化遺伝子を基準として正規化した場合の、コピーの絶対数または相対量として）検出及び定量化の両方を可能にする。
【００５０】
本明細書で使用される場合、プライマーは、十分なストリンジェント条件で使用される場合でも、プライマーが主として標的核酸のみにハイブリダイズする場合、標的配列に「特異的」である。典型的には、プライマーは、プライマー−標的二本鎖の安定性がプライマーと試料で見られる任意のその他の配列との間に形成される二本鎖の安定性よりも高い場合、標的配列に特異的である。当業者は、様々な因子、例えば塩条件に加えてプライマーの塩基組成及びミスマッチの位置などがプライマーの特異性に影響を及ぼすだろうこと、ならびにプライマー特異性の日常的な実験による確認が、ほとんどの場合に必要となるだろうことを認識するだろう。ハイブリダイゼーション条件は、プライマーが標的配列のみと安定した二本鎖を形成し得る状況下で選択され得る。したがって、好適なストリンジェント増幅条件下での標的特異的プライマーの使用は、標的プライマー結合部位を含有するこれらの標的配列の特異的増幅を可能にする。配列特異的増幅条件の使用は、正確に相補的なプライマー結合部位を含有するこれらの標的配列の特異的増幅を可能にする。
【００５１】
「Ｔｍ」という用語は、特定条件下で塩基対の半分が解離している核酸二本鎖の融解温度、またはアニーリング温度を意味する。核酸技術の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成及び配列、イオン強度、ならびにミスマッチ塩基対の発生率を含む多数の変数を経験的に考慮して、二本鎖の安定性を決定し得る。「予測Ｔｍ」は、本明細書で使用される場合、プライマー及びその相補的な鋳型配列が、ＰＣＲによるハイブリダイゼーション及び伸長を可能にするのに十分に安定であると予測される温度を意味し、最隣接アルゴリズム（Ｖｏｎ−Ａｈｓｅｎ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５（１２）：２０９４−２１０１）を使用して決定され得る。オリゴヌクレオチド及びプライマーの予測Ｔｍを決定するための例示的なソフトウェアツールは、オリゴヌクレオチドを販売する多くの供給業者（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）のウェブサイト上で提供される。
【００５２】
「プローブ」という用語は、本明細書で使用される場合、プローブ中の少なくとも１つの配列と標的領域中の配列との相補性ゆえに、標的核酸中の配列と二本鎖構造を形成する標識オリゴヌクレオチドを指す。プローブは、ポリメラーゼ連鎖反応をプライミングするために使用される配列（複数可）に相補的な配列を好ましくは含有しない。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「相補的な」は、相補的なヌクレオシドまたはヌクレオチド間における従来のワトソン・クリック塩基対形成またはその他の非従来的な種類の対形成（例えば、フーグスティーンもしくは逆フーグスティーン水素結合）のいずれかにより、別の核酸分子と水素結合（複数可）を形成し得る核酸分子を指す。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「実質的に相補的な」は、別の核酸と形成し得る核酸分子間の相補性が、ハイブリダイゼーションが所望の、または特定の条件下で生じ得るのに十分であることを意味する。したがって、２本の核酸鎖は、２本の鎖の各々全てのヌクレオチドに相補的である必要はない。「実質的に相補的な」という用語がプライマーと共に使用される場合、これはプライマーが、それらの各々の鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならないことを意味する。したがって、プライマー配列は、鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチド断片が、プライマーの５’末端に結合されてよく、プライマー配列の残部は鎖に相補的である。場合によっては、プライマーは、最適な検出結果を得るために正確な相補性を有することが望ましい。しかしながら、プライマーがランダムミスマッチを有する、またあるいは、特定のミスマッチがプライマー中に設計されることが望ましいその他の場合も存在する。
【００５５】
核酸分子は、特異的にハイブリダイズ可能な標的核酸配列に１００％相補的である必要はないと、当該技術分野において理解される。すなわち、２つ以上の核酸分子が、完全に相補的ではない場合もあり、これは第２核酸分子と水素結合を形成し得る核酸分子における連続残基の割合により示される。例えば、第１核酸分子が１０個のヌクレオチドを有し、第２核酸分子が１０個のヌクレオチドを有する場合には、第１核酸分子と第２核酸分子との間における５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドの塩基対形成は、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％の相補性を表す。「完璧に」または「完全に」相補的な核酸分子は、第１核酸分子の全ての連続残基が、第２核酸分子における同じ数の連続残基と水素結合するだろうことを意味し、核酸分子の両方とも、同じ数のヌクレオチドを有する（すなわち、同じ長さを有する）、または２つの分子は異なる長さを有する。
【００５６】
「非特異的増幅」という用語は、本明細書で使用される場合、プライマーが標的配列以外の配列にハイブリダイズし、次いでプライマー伸長のための基質として機能することに起因する、標的配列以外の核酸配列の増幅を指す。非標的配列に対するプライマーのハイブリダイゼーションは、「非特異的ハイブリダイゼーション」と称され、より低温、低ストリンジェンシー、プレ増幅条件中に特に生じる傾向がある。
【００５７】
「プライマー二量体」という用語は、本明細書で使用される場合、鋳型非依存性の非特異的増幅産物を指し、これは別のプライマーが鋳型として機能するプライマー伸長に起因すると考えられている。プライマー二量体は、しばしば２つのプライマーのコンカテマー、すなわち二量体であるように見えるが、３つ以上のプライマーのコンカテマーも生じる。「プライマー二量体」という用語は、一般に鋳型非依存性の非特異的増幅産物を包含するように本明細書で使用される。
【００５８】
「反応混合物」という用語は、本明細書で使用される場合、所与の反応を実施するのに必要な試薬を含有する溶液を指す。「増幅反応混合物」は、増幅反応を実施するのに必要な試薬を含有する溶液を指し、典型的には好適な緩衝液中にオリゴヌクレオチドプライマー及びＤＮＡポリメラーゼを含有する。「ＰＣＲ反応混合物」は、典型的には好適な緩衝液中にオリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ（最も典型的には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）、ｄＮＴＰ、及び二価金属カチオンを含有する。反応混合物は、それが反応を可能にするのに必要な全ての試薬を含有する場合に完全と称され、それが必要な試薬のサブセットのみを含有する場合に不完全と称される。反応成分が、別個の溶液として、または「マスター混合物」中に日常的に保存されて、各々が利便性、保存安定性の理由で、または成分濃度の適用依存的な調整を可能にするために全成分のサブセットを含有すること、及び反応成分を反応前に組み合わせて完全反応混合物を作製することが、当業者には理解されるだろう。さらに、反応成分が、商業化のために別々にパッケージ化されること、及び有用な市販のキットが、本開示のブロックプライマーを含む反応成分の任意のサブセットを含有してよいことが、当業者には理解されるだろう。
表１に記載される略語及び用語は、本明細書全体を通して使用される。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
使用され得る、組み合わせて使用され得る、調製に使用され得る材料、組成物、及び成分が開示される、または開示される方法及び組成物の製品が開示される。これらの及びその他の材料は本明細書で開示され、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群などが開示される場合、これらの化合物に関する様々な個別かつ集合的な各組合せ及び順列の具体的な言及が明示的に開示されなくともよいが、各々が特に考慮されて本明細書に記載されていると理解される。したがって、分子Ａ、Ｂ、及びＣのクラスが開示されるのに加えて、分子Ｄ、Ｅ、及びＦのクラスならびに組合せ分子の例Ａ〜Ｄが開示される場合には、たとえ、各々が個別に列挙されていなくとも、各々が個別かつ集合的に考慮される。したがって、この例では、組合せＡ〜Ｅ、Ａ〜Ｆ、Ｂ〜Ｄ、Ｂ〜Ｅ、Ｂ〜Ｆ、Ｃ〜Ｄ、Ｃ〜Ｅ、及びＣ〜Ｆの各々が特に考慮されて、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ｄ、Ｅ、及びＦ；ならびに組合せ例Ａ〜Ｄの開示により開示されたものと見なされるべきである。同様に、これらの任意のサブセットまたは組合せも特に考慮されて開示される。したがって、例えば、Ａ〜Ｅ、Ｂ〜Ｆ、及びＣ〜Ｅのサブグループが特に考慮されて、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ｄ、Ｅ、及びＦ；ならびに組合せ例Ａ〜Ｄの開示により開示されたものと見なされるべきである。この概念は、本開示の全ての態様に適用し、態様としては開示される組成物を作製する方法及び使用する方法のステップが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、実施され得る様々な追加ステップが存在する場合、これらの追加ステップの各々が、開示される方法に関する任意の特定の実施形態または実施形態の組合せにより実施され得ること、及びこのような組合せの各々が特に考慮されて開示されたものと見なされるべきであることが理解される。
【００６１】
１．トリプレックスｑＰＣＲアッセイ法
本開示は、染色体の集団における平均テロメア長または存在量の測定値を決定するための方法及び材料、ならびに健康もしくは疾患リスクの測定値、もしくはテロメア長を増加もしくは減少させて、それゆえ健康を向上もしくは悪化させる、もしくは逆に将来的な疾患もしくは死のリスクを減少もしくは増加させるそれぞれの介入効果を決定するために、またはテロメアに基づく指針による付加価値を医師に提供することにより医療行為を改善するためにこれらの測定値を使用する方法及び材料について開示している。本方法は、少なくとも３つの標的核酸配列の平均テロメア長または存在量を、各標的核酸配列について異なる検出標識を利用する単一ｑＰＣＲマルチプレックス反応で決定することを含む。一態様では、３つの標的核酸配列のうち１つがテロメア配列であり、他方の２つの標的核酸配列は、めったにコピー数変化を受けないことで知られる異なる低コピー数遺伝子である。さらなる態様では、低コピー数遺伝子は、めったにコピー数変化を受けないことで知られる単一コピー遺伝子である。さらなる態様では、平均テロメア長または存在量と他方の２つの核酸配列についての平均長または存在量の平均値との比、すなわちＴ／Ｓ比は、「Ｓ」が２つの個別の低コピー遺伝子の平均値であり、この比は特定の臨床的リスクを決定するために使用され得る。あるいは、Ｔ／Ｓ比は、治療レジメンを最適化するために使用され得る。
【００６２】
一態様では、本開示は、平均テロメア長を決定する方法に関し、本方法は：（ａ）第１標的核酸を第１プライマーセットと接触させること、第２標的核酸を第２プライマーセットと接触させること、及び第３標的核酸を第３プライマーセットと接触させることであって；（ｉ）第１プライマーセットは、第１フォワードプライマー及び第１リバースプライマーを含み；（ｉｉ）第２プライマーセットは、第２フォワードプライマー及び第２リバースプライマーを含み；（ｉｉｉ）第３プライマーセットは、第３フォワードプライマー及び第３リバースプライマーを含み；（ｉｖ）第１標的核酸は、テロメア反復配列を含むこと；（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応により、第１標的核酸を第１プライマーセットで増幅して第１アンプリコンを形成すること、第２標的核酸を第２プライマーセットで増幅して第２アンプリコンを形成すること、及び第３標的核酸を第３プライマーセットで増幅して第３アンプリコンを形成すること；（ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応の１回以上のサイクル中に、第１、第２、及び第３アンプリコンの量を決定することであって；（ｉ）第１アンプリコンは、第１検出標識を使用して検出され；（ｉｉ）第２アンプリコンは、第２検出標識を使用して検出され；（ｉｉｉ）第３アンプリコンは、第３検出標識を使用して検出されること；ならびに（ｄ）第１アンプリコンの平均長または存在量を決定することを含む。
【００６３】
様々な態様では、第１アンプリコンの平均長または存在量を決定することは、（ａ）第１、第２、及び第３アンプリコンの濃度を、対照ポリメラーゼ連鎖反応との比較により決定するステップ；（ｂ）第１アンプリコンの濃度と第２及び第３アンプリコンの平均または加重濃度との比を決定するステップ；ならびに（ｃ）ステップ（ｂ）からの比を、１ゲノム当たりのテロメア配列の塩基対に変換するステップを含む。
【００６４】
一態様では、本開示は、平均テロメア長を決定する方法に関し、本方法は：（ａ）第１標的核酸を第１プライマーセットと接触させること、第２標的核酸を第２プライマーセットと接触させること、第３標的核酸を第３プライマーセットと接触させること；及び第４標的核酸を第４プライマーセットと接触させることであって；（ｉ）第１プライマーセットは、第１フォワードプライマー及び第１リバースプライマーを含み；（ｉｉ）第２プライマーセットは、第２フォワードプライマー及び第２リバースプライマーを含み；（ｉｉｉ）第３プライマーセットは、第３フォワードプライマー及び第３リバースプライマーを含み；（ｉｖ）第４プライマーセットは、第４フォワードプライマー及び第４リバースプライマーを含み；（ｖ）第１標的核酸は、テロメア反復配列を含むこと；（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応により、第１標的核酸を第１プライマーセットで増幅して第１アンプリコンを形成すること、第２標的核酸を第２プライマーセットで増幅して第２アンプリコンを形成すること、第３標的核酸を第３プライマーセットで増幅して第３アンプリコンを形成すること、及び第４標的核酸を第４プライマーセットで増幅して第４アンプリコンを形成すること；（ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応の１回以上のサイクル中に、第１、第２、及び第３アンプリコンの量を決定することであって；（ｉ）第１アンプリコンは、第１検出標識を使用して検出され；（ｉｉ）第２アンプリコンは、第２検出標識を使用して検出され；（ｉｉｉ）第３アンプリコンは、第３検出標識を使用して検出され；（ｉｖ）第４アンプリコンは、第４検出標識を使用して検出されること；ならびに（ｄ）第１アンプリコンの平均長または存在量を決定することを含む。
【００６５】
様々な態様では、第１アンプリコンの平均長または存在量を決定することは、（ａ）第１、第２、第３、及び第４アンプリコンの濃度を、対照ポリメラーゼ連鎖反応との比較により決定するステップ；（ｂ）第１アンプリコンの濃度と第２、第３、及び第４アンプリコンの平均または加重濃度との比を決定するステップ；ならびに（ｃ）ステップ（ｂ）からの比を、１ゲノム当たりのテロメア配列の塩基対に変換するステップを含む。
【００６６】
一態様では、本開示は、平均テロメア長を決定する方法に関し、本方法は：（ａ）第１標的核酸を第１プライマーセットと接触させること、第２標的核酸を第２プライマーセットと接触させること、第３標的核酸を第３プライマーセットと接触させること；第４標的核酸を第４プライマーセットと接触させること、及び第５標的核酸を第４プライマーセットと接触させることであって；（ｉ）第１プライマーセットは、第１フォワードプライマー及び第１リバースプライマーを含み；（ｉｉ）第２プライマーセットは、第２フォワードプライマー及び第２リバースプライマーを含み；（ｉｉｉ）第３プライマーセットは、第３フォワードプライマー及び第３リバースプライマーを含み；（ｉｖ）第４プライマーセットは、第４フォワードプライマー及び第４リバースプライマーを含み；（ｖ）第５プライマーセットは、第５フォワードプライマー及び第５リバースプライマーを含み；（ｖｉ）第１標的核酸は、テロメア反復配列を含むこと；（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応により、第１標的核酸を第１プライマーセットで増幅して第１アンプリコンを形成すること、第２標的核酸を第２プライマーセットで増幅して第２アンプリコンを形成すること、第３標的核酸を第３プライマーセットで増幅して第３アンプリコンを形成すること、第４標的核酸を第４プライマーセットで増幅して第４アンプリコンを形成すること、及び第５標的核酸を第５プライマーセットで増幅して第５アンプリコンを形成すること；（ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応の１回以上のサイクル中に、第１、第２、及び第３アンプリコンの量を決定することであって；（ｉ）第１アンプリコンは、第１検出標識を使用して検出され；（ｉｉ）第２アンプリコンは、第２検出標識を使用して検出され；（ｉｉｉ）第３アンプリコンは、第３検出標識を使用して検出され；（ｉｖ）第４アンプリコンは、第４検出標識を使用して検出され；（ｖ）第５アンプリコンは、第５検出標識を使用して検出されること；ならびに（ｄ）第１アンプリコンの平均長または存在量を決定することを含む。
【００６７】
様々な態様では、第１アンプリコンの平均長または存在量を決定することは、（ａ）第１、第２、第３、及び第４アンプリコンの濃度を、対照ポリメラーゼ連鎖反応との比較により決定するステップ；（ｂ）第１アンプリコンの濃度と第２、第３、第４、及び第５アンプリコンの平均または加重濃度との比を決定するステップ；ならびに（ｃ）ステップ（ｂ）からの比を、１ゲノム当たりのテロメア配列の塩基対に変換するステップを含む。
【００６８】
様々な態様では、第１フォワードプライマー及び第１リバースプライマーの各々は、（ａ）アニーリング条件下でテロメア反復配列にハイブリダイズする３’部分；及び（ｂ）テロメア反復配列にハイブリダイズしないアンカー配列を有する５’部分を含む。さらなる態様では、第１フォワードプライマー及び第１リバースプライマーにおけるプライマーの３’末端は、互いに相補的である。よりさらなる態様では、第１リバースプライマーは、プライマーの３’末端に隣接する、またはそれを含む少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドを含むミスマッチプライマーであって、少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドは、標的核酸に相補的ではないが、第１フォワードプライマーの３’末端ヌクレオチドに相補的である。またさらなる態様では、第１フォワードプライマーの伸長産物は、第１リバースプライマーにハイブリダイズすることができる。一層さらなる態様では、第１フォワードプライマーの伸長産物は、第１リバースプライマーにハイブリダイズすることができるが、プライマー二量体を形成することはないだろう。よりさらなる態様では、第１フォワードプライマーは、配列番号：１の配列を含み；ここで第１リバースプライマーは、配列番号：２の配列を含む。さらなる態様では、第１リバースプライマーは、第１標的核酸のプライミングからブロックされる。よりさらなる態様では、第１リバースプライマーは、末端の３’ミスマッチ塩基により第１標的核酸のプライミングからブロックされる。
【００６９】
様々な態様では、第２標的核酸は、既知のコピー数を持つ遺伝子内にある。さらなる態様では、第２標的核酸は、低コピー数遺伝子内にある。よりさらなる態様では、第２標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にある。
【００７０】
様々な態様では、第２標的核酸は、めったにコピー数変化を受けないことで知られる既知のコピー数を持つ遺伝子内にある。さらなる態様では、第２標的核酸は、めったにコピー数変化を受けないことで知られる低コピー数遺伝子内にある。よりさらなる態様では、第２標的核酸は、めったにコピー数変化を受けないことで知られる単一コピー数遺伝子内にある。
【００７１】
さらなる態様では、第２標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はβ２−ミクログロブリンである。さらなる態様では、第２フォワードプライマーは、配列番号：３を含む。またさらなる態様では、第２リバースプライマーは、配列番号：４を含む。よりさらなる態様では、第２フォワードプライマーは、β２−ミクログロブリン遺伝子中の配列に相補的な配列を含み、第２リバースプライマーは、β２−ミクログロブリン遺伝子中の配列に相補的な配列を含み、第２フォワードプライマー及び第２リバースプライマーは、第２アンプリコンを生成する。
【００７２】
さらなる態様では、第２標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はＰＧＫである。さらなる態様では、第２フォワードプライマーは、ＰＧＫ遺伝子中の配列に相補的な配列を含み、第２リバースプライマーは、ＰＧＫ遺伝子中の配列に相補的な配列を含み、第２フォワードプライマー及び第２リバースプライマーは、第２アンプリコンを生成する。
【００７３】
さらなる態様では、第２標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はＧＡＰＤＨである。さらなる態様では、第２フォワードプライマーは、ＧＡＰＤＨ遺伝子中の配列に相補的な配列を含み、第２リバースプライマーは、ＧＡＰＤＨ遺伝子中の配列に相補的な配列を含み、第２フォワードプライマー及び第２リバースプライマーは、第２アンプリコンを生成する。
【００７４】
さらなる態様では、第２標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はｈＴＥＲＴである。さらなる態様では、第２フォワードプライマーは、ｈＴＥＲＴ遺伝子中の配列に相補的な配列を含み、第２リバースプライマーは、ｈＴＥＲＴ遺伝子中の配列に相補的な配列を含み、第２フォワードプライマー及び第２リバースプライマーは、第２アンプリコンを生成する。
【００７５】
さらなる態様では、第２標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はＡＣＴＢである。さらなる態様では、第２フォワードプライマーは、ＡＣＴＢ遺伝子中の配列に相補的な配列を含み、第２リバースプライマーは、ＡＣＴＢ遺伝子中の配列に相補的な配列を含み、第２フォワードプライマー及び第２リバースプライマーは、第２アンプリコンを生成する。
【００７６】
様々な態様では、第２標的核酸は、ヒト遺伝子内に位置している。
【００７７】
様々な態様では、第３標的核酸は、既知のコピー数を持つ遺伝子内にある。さらなる態様では、第３標的核酸は、低コピー数遺伝子内にある。よりさらなる態様では、第３標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にある。
【００７８】
様々な態様では、第３標的核酸は、めったにコピー数変化を受けないことで知られる既知のコピー数を持つ遺伝子内にある。さらなる態様では、第３標的核酸は、めったにコピー数変化を受けないことで知られる低コピー数遺伝子内にある。よりさらなる態様では、第３標的核酸は、めったにコピー数変化を受けないことで知られる単一コピー数遺伝子内にある。
【００７９】
さらなる態様では、第２標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はβ２−ミクログロブリンであり、第３標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はＲＮａｓｅ  Ｐである。さらなる態様では、第２フォワードプライマーは、配列番号：３を含む。またさらなる態様では、第２リバースプライマーは、配列番号：４を含む。よりさらなる態様では、第２フォワードプライマーは、β２−ミクログロブリン遺伝子中の配列に相補的な配列を含み、第２リバースプライマーは、β２−ミクログロブリン遺伝子中の配列に相補的な配列を含み、第２フォワードプライマー及び第２リバースプライマーは、第２アンプリコンを生成する。一層さらなる態様では、第３フォワードプライマーは、配列番号：６を含む。よりさらなる態様では、第３リバースプライマーは、配列番号：７を含む。またさらなる態様では、第３フォワードプライマーは、配列番号：９を含む。一層さらなる態様では、第３リバースプライマーは、配列番号：１０を含む。よりさらなる態様では、第３フォワードプライマーは、ＲＮａｓｅ  Ｐ中の配列に相補的な配列を含み、第３リバースプライマーは、ＲＮａｓｅ  Ｐ中の配列に相補的な配列を含み、第３フォワードプライマー及び第３リバースプライマーは、第３アンプリコンを生成する。あるいは、ＲＮａｓｅ  Ｐを標的とし、開示される方法での使用に好適なプライマー及びプローブ配列は、ＦａｎらのＢＭＣ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ（２０１４）１４：５４１により記載されている。
【００８０】
さらなる態様では、第２標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はβ２−ミクログロブリンであり、第３標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はＧＡＰＤＨである。さらなる態様では、第２フォワードプライマーは、配列番号：３を含む。またさらなる態様では、第２リバースプライマーは、配列番号：４を含む。よりさらなる態様では、第３フォワードプライマーは、配列番号：２６を含む。一層さらなる態様では、第３リバースプライマーは、配列番号：２７を含む。よりさらなる態様では、第２フォワードプライマーは、β２−ミクログロブリン遺伝子中の配列に相補的な配列を含み、第２リバースプライマーは、β２−ミクログロブリン遺伝子中の配列に相補的な配列を含み、第２フォワードプライマー及び第２リバースプライマーは、第２アンプリコンを生成する。一層さらなる態様では、第３フォワードプライマーは、ＧＡＰＤＨ中の配列に相補的な配列を含み、第３リバースプライマーは、ＧＡＰＤＨ中の配列に相補的な配列を含み、第３フォワードプライマー及び第３リバースプライマーは、第３アンプリコンを生成する。
【００８１】
さらなる態様では、第２標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はβ２−ミクログロブリンであり、第３標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はＰＧＫである。さらなる態様では、第２フォワードプライマーは、配列番号：３を含む。またさらなる態様では、第２リバースプライマーは、配列番号：４を含む。よりさらなる態様では、第３フォワードプライマーは、配列番号：２２を含む。一層さらなる態様では、第３リバースプライマーは、配列番号：２３を含む。よりさらなる態様では、第２フォワードプライマーは、β２−ミクログロブリン遺伝子中の配列に相補的な配列を含み、第２リバースプライマーは、β２−ミクログロブリン遺伝子中の配列に相補的な配列を含み、第２フォワードプライマー及び第２リバースプライマーは、第２アンプリコンを生成する。一層さらなる態様では、第３フォワードプライマーは、ＰＧＫ中の配列に相補的な配列を含み、第３リバースプライマーは、ＰＧＫ中の配列に相補的な配列を含み、第３フォワードプライマー及び第３リバースプライマーは、第３アンプリコンを生成する。
【００８２】
さらなる態様では、第２標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はβ２−ミクログロブリンであり、第３標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はｈＴＥＲＴである。さらなる態様では、第２フォワードプライマーは、配列番号：３を含む。またさらなる態様では、第２リバースプライマーは、配列番号：４を含む。よりさらなる態様では、第２フォワードプライマーは、β２−ミクログロブリン遺伝子中の配列に相補的な配列を含み、第２リバースプライマーは、β２−ミクログロブリン遺伝子中の配列に相補的な配列を含み、第２フォワードプライマー及び第２リバースプライマーは、第２アンプリコンを生成する。一層さらなる態様では、第３フォワードプライマーは、ｈＴＥＲＴ中の配列に相補的な配列を含み、第３リバースプライマーは、ｈＴＥＲＴ中の配列に相補的な配列を含み、第３フォワードプライマー及び第３リバースプライマーは、第３アンプリコンを生成する。
【００８３】
さらなる態様では、第２標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はβ２−ミクログロブリンであり、第３標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はＡＣＴＢである。さらなる態様では、第２フォワードプライマーは、配列番号：３を含む。さらなる態様では、第２リバースプライマーは、配列番号：４を含む。よりさらなる態様では、第３フォワードプライマーは、配列番号：２４を含む。一層さらなる態様では、第３リバースプライマーは、配列番号：２５を含む。よりさらなる態様では、第２フォワードプライマーは、β２−ミクログロブリン遺伝子中の配列に相補的な配列を含み、第２リバースプライマーは、β２−ミクログロブリン遺伝子中の配列に相補的な配列を含み、第２フォワードプライマー及び第２リバースプライマーは、第２アンプリコンを生成する。一層さらなる態様では、第３フォワードプライマーは、ＡＣＴＢ中の配列に相補的な配列を含み、第３リバースプライマーは、ＡＣＴＢ中の配列に相補的な配列を含み、第３フォワードプライマー及び第３リバースプライマーは、第３アンプリコンを生成する。
【００８４】
さらなる態様では、第２標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はＲＮａｓｅ  Ｐであり、第３標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はＧＡＰＤＨである。さらなる態様では、第２フォワードプライマーは、配列番号：６を含む。よりさらなる態様では、第２リバースプライマーは、配列番号：７を含む。またさらなる態様では、第２フォワードプライマーは、配列番号：９を含む。一層さらなる態様では、第２リバースプライマーは、配列番号：１０を含む。よりさらなる態様では、第３フォワードプライマーは、配列番号：２６を含む。一層さらなる態様では、第３リバースプライマーは、配列番号：２７を含む。よりさらなる態様では、第２フォワードプライマーは、ＲＮａｓｅ  Ｐ中の配列に相補的な配列を含み、第２リバースプライマーは、ＲＮａｓｅ  Ｐ中の配列に相補的な配列を含み、第２フォワードプライマー及び第３リバースプライマーは、第３アンプリコンを生成する。あるいは、ＲＮａｓｅ  Ｐを標的とし、開示される方法での使用に好適なプライマー及びプローブ配列は、ＦａｎらのＢＭＣ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ（２０１４）１４：５４１により記載されている。一層さらなる態様では、第３フォワードプライマーは、ＧＡＰＤＨ中の配列に相補的な配列を含み、第３リバースプライマーは、ＧＡＰＤＨ中の配列に相補的な配列を含み、第３フォワードプライマー及び第３リバースプライマーは、第３アンプリコンを生成する。
【００８５】
さらなる態様では、第２標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はＲＮａｓｅ  Ｐであり、第３標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はＰＧＫである。さらなる態様では、第２フォワードプライマーは、配列番号：６を含む。よりさらなる態様では、第２リバースプライマーは、配列番号：７を含む。またさらなる態様では、第２フォワードプライマーは、配列番号：９を含む。一層さらなる態様では、第２リバースプライマーは、配列番号：１０を含む。よりさらなる態様では、第３フォワードプライマーは、配列番号：２２を含む。一層さらなる態様では、第３リバースプライマーは、配列番号：２３を含む。よりさらなる態様では、第２フォワードプライマーは、ＲＮａｓｅ  Ｐ中の配列に相補的な配列を含み、第２リバースプライマーは、ＲＮａｓｅ  Ｐ中の配列に相補的な配列を含み、第２フォワードプライマー及び第３リバースプライマーは、第３アンプリコンを生成する。あるいは、ＲＮａｓｅ  Ｐを標的とし、開示される方法での使用に好適なプライマー及びプローブ配列は、ＦａｎらのＢＭＣ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ（２０１４）１４：５４１により記載されている。一層さらなる態様では、第３フォワードプライマーは、ＰＧＫ中の配列に相補的な配列を含み、第３リバースプライマーは、ＰＧＫ中の配列に相補的な配列を含み、第３フォワードプライマー及び第３リバースプライマーは、第３アンプリコンを生成する。
【００８６】
さらなる態様では、第２標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はＲＮａｓｅ  Ｐであり、第３標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はｈＴＥＲＴである。さらなる態様では、第２フォワードプライマーは、配列番号：６を含む。よりさらなる態様では、第２リバースプライマーは、配列番号：７を含む。またさらなる態様では、第２フォワードプライマーは、配列番号：９を含む。一層さらなる態様では、第２リバースプライマーは、配列番号：１０を含む。よりさらなる態様では、第２フォワードプライマーは、ＲＮａｓｅ  Ｐ中の配列に相補的な配列を含み、第２リバースプライマーは、ＲＮａｓｅ  Ｐ中の配列に相補的な配列を含み、第２フォワードプライマー及び第３リバースプライマーは、第３アンプリコンを生成する。あるいは、ＲＮａｓｅ  Ｐを標的とし、開示される方法での使用に好適なプライマー及びプローブ配列は、ＦａｎらのＢＭＣ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ（２０１４）１４：５４１により記載されている。一層さらなる態様では、第３フォワードプライマーは、ｈＴＥＲＴ中の配列に相補的な配列を含み、第３リバースプライマーは、ｈＴＥＲＴ中の配列に相補的な配列を含み、第３フォワードプライマー及び第３リバースプライマーは、第３アンプリコンを生成する。
【００８７】
さらなる態様では、第２標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はＲＮａｓｅ  Ｐであり、第３標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はＡＣＴＢである。さらなる態様では、第２フォワードプライマーは、配列番号：６を含む。よりさらなる態様では、第２リバースプライマーは、配列番号：７を含む。またさらなる態様では、第２フォワードプライマーは、配列番号：９を含む。一層さらなる態様では、第２リバースプライマーは、配列番号：１０を含む。よりさらなる態様では、第３フォワードプライマーは、配列番号：２４を含む。一層さらなる態様では、第３リバースプライマーは、配列番号：２５を含む。よりさらなる態様では、第２フォワードプライマーは、ＲＮａｓｅ  Ｐ中の配列に相補的な配列を含み、第２リバースプライマーは、ＲＮａｓｅ  Ｐ中の配列に相補的な配列を含み、第２フォワードプライマー及び第３リバースプライマーは、第３アンプリコンを生成する。あるいは、ＲＮａｓｅ  Ｐを標的とし、開示される方法での使用に好適なプライマー及びプローブ配列は、ＦａｎらのＢＭＣ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ（２０１４）１４：５４１により記載されている。一層さらなる態様では、第３フォワードプライマーは、ＡＣＴＢ中の配列に相補的な配列を含み、第３リバースプライマーは、ＡＣＴＢ中の配列に相補的な配列を含み、第３フォワードプライマー及び第３リバースプライマーは、第３アンプリコンを生成する。
【００８８】
さらなる態様では、第２標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はＧＡＰＤＨであり、第３標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はＰＧＫである。よりさらなる態様では、第２フォワードプライマーは、配列番号：２６を含む。一層さらなる態様では、第２リバースプライマーは、配列番号：２７を含む。よりさらなる態様では、第３フォワードプライマーは、配列番号：２２を含む。一層さらなる態様では、第３リバースプライマーは、配列番号：２３を含む。さらなる態様では、第２フォワードプライマーは、ＧＡＰＤＨ中の配列に相補的な配列を含み、第２リバースプライマーは、ＧＡＰＤＨ遺伝子中の配列に相補的な配列を含み、第２フォワードプライマー及び第２リバースプライマーは、第２アンプリコンを生成する。一層さらなる態様では、第３フォワードプライマーは、ＰＧＫ中の配列に相補的な配列を含み、第３リバースプライマーは、ＰＧＫ中の配列に相補的な配列を含み、第３フォワードプライマー及び第３リバースプライマーは、第３アンプリコンを生成する。
【００８９】
さらなる態様では、第２標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はＧＡＰＤＨであり、第３標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はｈＴＥＲＴである。さらなる態様では、第２フォワードプライマーは、ＧＡＰＤＨ中の配列に相補的な配列を含み、第２リバースプライマーは、ＧＡＰＤＨ遺伝子中の配列に相補的な配列を含み、第２フォワードプライマー及び第２リバースプライマーは、第２アンプリコンを生成する。一層さらなる態様では、第３フォワードプライマーは、ｈＴＥＲＴ中の配列に相補的な配列を含み、第３リバースプライマーは、ｈＴＥＲＴ中の配列に相補的な配列を含み、第３フォワードプライマー及び第３リバースプライマーは、第３アンプリコンを生成する。
【００９０】
さらなる態様では、第２標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はＧＡＰＤＨであり、第３標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はＡＣＴＢである。よりさらなる態様では、第２フォワードプライマーは、配列番号：２６を含む。一層さらなる態様では、第２リバースプライマーは、配列番号：２７を含む。よりさらなる態様では、第３フォワードプライマーは、配列番号：２４を含む。一層さらなる態様では、第３リバースプライマーは、配列番号：２５を含む。さらなる態様では、第２フォワードプライマーは、ＧＡＰＤＨ中の配列に相補的な配列を含み、第２リバースプライマーは、ＧＡＰＤＨ遺伝子中の配列に相補的な配列を含み、第２フォワードプライマー及び第２リバースプライマーは、第２アンプリコンを生成する。一層さらなる態様では、第３フォワードプライマーは、ＡＣＴＢ中の配列に相補的な配列を含み、第３リバースプライマーは、ＡＣＴＢ中の配列に相補的な配列を含み、第３フォワードプライマー及び第３リバースプライマーは、第３アンプリコンを生成する。
【００９１】
さらなる態様では、第２標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はＰＧＫであり、第３標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はｈＴＥＲＴである。よりさらなる態様では、第２フォワードプライマーは、配列番号：２２を含む。一層さらなる態様では、第２リバースプライマーは、配列番号：２３を含む。さらなる態様では、第２フォワードプライマーは、ＰＧＫ中の配列に相補的な配列を含み、第２リバースプライマーは、ＰＧＫ遺伝子中の配列に相補的な配列を含み、第２フォワードプライマー及び第２リバースプライマーは、第２アンプリコンを生成する。一層さらなる態様では、第３フォワードプライマーは、ｈＴＥＲＴ中の配列に相補的な配列を含み、第３リバースプライマーは、ｈＴＥＲＴ中の配列に相補的な配列を含み、第３フォワードプライマー及び第３リバースプライマーは、第３アンプリコンを生成する。
【００９２】
さらなる態様では、第２標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はＰＧＫであり、第３標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はＡＣＴＢである。よりさらなる態様では、第２フォワードプライマーは、配列番号：２２を含む。一層さらなる態様では、第２リバースプライマーは、配列番号：２３を含む。よりさらなる態様では、第３フォワードプライマーは、配列番号：２４を含む。一層さらなる態様では、第３リバースプライマーは、配列番号：２５を含む。さらなる態様では、第２フォワードプライマーは、ＰＧＫ中の配列に相補的な配列を含み、第２リバースプライマーは、ＰＧＫ遺伝子中の配列に相補的な配列を含み、第２フォワードプライマー及び第２リバースプライマーは、第２アンプリコンを生成する。一層さらなる態様では、第３フォワードプライマーは、ＡＣＴＢ中の配列に相補的な配列を含み、第３リバースプライマーは、ＡＣＴＢ中の配列に相補的な配列を含み、第３フォワードプライマー及び第３リバースプライマーは、第３アンプリコンを生成する。
【００９３】
さらなる態様では、第２標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はｈＴＥＲＴであり、第３標的核酸は、単一コピー数遺伝子内にあって、単一コピー遺伝子はＡＣＴＢである。よりさらなる態様では、第３フォワードプライマーは、配列番号：２４を含む。一層さらなる態様では、第３リバースプライマーは、配列番号：２５を含む。さらなる態様では、第２フォワードプライマーは、ｈＴＥＲＴ中の配列に相補的な配列を含み、第２リバースプライマーは、ｈＴＥＲＴ遺伝子中の配列に相補的な配列を含み、第２フォワードプライマー及び第２リバースプライマーは、第２アンプリコンを生成する。一層さらなる態様では、第３フォワードプライマーは、ＡＣＴＢ中の配列に相補的な配列を含み、第３リバースプライマーは、ＡＣＴＢ中の配列に相補的な配列を含み、第３フォワードプライマー及び第３リバースプライマーは、第３アンプリコンを生成する。
【００９４】
様々な態様では、第３標的核酸は、ヒト遺伝子内に位置している。
【００９５】
さらなる態様では、第１検出標識、第２検出標識、及び第３検出標識は、個別かつ同時に検出可能である。よりさらなる態様では、第１検出標識、第２検出標識、及び第３検出標識は、個別かつ同時に検出可能であり、第１検出標識、第２検出標識、及び第３検出標識の各々は、独立して蛍光部分を含む。
【００９６】
さらなる態様では、第１検出標識、第２検出標識、第３検出標識、及び第４検出標識は、個別かつ同時に検出可能である。よりさらなる態様では、第１検出標識、第２検出標識、第３検出標識、及び第４検出標識は、個別かつ同時に検出可能であり、第１検出標識、第２検出標識、第４検出標識、及び第４検出標識の各々は、独立して蛍光部分を含む。
【００９７】
さらなる態様では、第１検出標識、第２検出標識、第３検出標識、第４検出標識、及び第５検出標識は、個別かつ同時に検出可能である。よりさらなる態様では、第１検出標識、第２検出標識、第３検出標識、第４検出標識、及び第５検出標識は、個別かつ同時に検出可能であり、第１検出標識、第２検出標識、第４検出標識、第４検出標識、及び第５検出標識の各々は、独立して蛍光部分を含む。
【００９８】
例えば、本明細書に記載される方法は、ＰＣＲ反応中に二本鎖核酸増幅産物に選択的に結合し、それによって産物合成の継続的なモニタリングを提供する蛍光色素を使用し得る（Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１０２６−１０３０（１９９３）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｔ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４：９５４−９６２（１９９８）を参照のこと）。
【００９９】
さらなる態様では、第１検出標識は、ＤＮＡ結合色素をさらに含む。よりさらなる態様では、蛍光ＤＮＡ結合色素は、２−メチル−４，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウムアイオダイド、Ｎ’，Ｎ’−ジメチル−Ｎ−［４−［（Ｅ）−（３−メチル−１，３−ベンゾチアゾール−２−イリデン）メチル］−１−フェニルキノリン−１−イウム−２−イル］−Ｎ−プロピルプロパン−１，３−ジアミン、２−（（２−（ジエチルアミノ）−１−フェニル−１，８ａ−ジヒドロキノリン−４−イル）メチル）−３−メチルベンゾ［ｄ］チアゾール−３−イウムアイオダイド、（Ｚ）−４−（（３’，６−ジメチル−［２，６’−ビベンゾ［ｄ］チアゾール］−２’（３’Ｈ）−イリデン）メチル）−１−メチルピリジン−１−イウムアイオダイド、または（Ｚ）−４−（（６−（ベンゾ［ｄ］オキサゾール−２−イル）−３−メチルベンゾ［ｄ］チアゾール−２（３Ｈ）−イリデン）メチル）−１−メチルキノリン−１−イウムアイオダイドである。
【０１００】
さらなる態様では、第２検出標識は、オリゴヌクレオチド、蛍光部分、及び蛍光クエンチング部分をさらに含む。よりさらなる態様では、第２検出標識は、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドの５’末端に連結される蛍光部分、及びオリゴヌクレオチドプローブの３’末端にある蛍光クエンチング部分をさらに含む。またさらなる態様では、第２検出標識は、配列番号：５の配列を含むオリゴヌクレオチドをさらに含む。一層さらなる態様では、第２検出標識は、配列番号：８の配列を含むオリゴヌクレオチドをさらに含む。またさらなる態様では、第２検出標識は、配列番号：１１の配列を含むオリゴヌクレオチドをさらに含む。一層さらなる態様では、第２検出標識は、蛍光部分をさらに含み、蛍光部分はシアニン色素を含む。よりさらなる態様では、シアニン色素はＣｙ５である。またさらなる態様では、蛍光クエンチング部分は、ダーククエンチャーである。
【０１０１】
追加の好適な蛍光標識の例としては、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、ダンシルクロリド、ローダミン、アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）、エオシン、エリスロシン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、ピレン、リサミン、キサンテン、アクリジン、オキサジン、フィコエリトリン、ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｙｅ（商標）などのランタニドイオンの大環状キレート、チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロ二量体などの蛍光エネルギー移動色素、ならびにシアニン色素のＣｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７が挙げられるが、これらに限定されない。その他の具体的な蛍光標識の例としては、３−ヒドロキシピレン５，８，１０−トリスルホン酸、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）、酸性フクシン、アリザリンコンプレクソン、アリザリンレッド、アロフィコシアニン、アミノクマリン、ステアリン酸アントロイル、アストラゾンブリリアントレッド４Ｇ、アストラゾンオレンジＲ、アストラゾンレッド６Ｂ、アストラゾンイエロー７ＧＬＬ、アタブリン、オーラミン、オーロホスフィン、オーロホスフィンＧ、ＢＡＯ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）、ＢＣＥＣＦ、硫酸ベルベリン、ビスベンズアミド、ブランコホルＦＦＧ溶液、ブランコホルＳＶ、Ｂｏｄｉｐｙ  Ｆｌ、ブリリアントスルホフラビンＦＦ、カルシエン（Ｃａｌｃｉｅｎ）ブルー、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ、カルコフロールＲＷ溶液、カルコフロールホワイト、カルコホルホワイトＡＢＴ溶液、カルコホルホワイトスタンダード溶液、カルボスチリル、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、カテコールアミン、キナクリン、コリホスフィンＯ、クマリン−ファロイジン、ＣＹ３．１  ８、ＣＹ５．１  ８、ＣＹ７、Ｄａｎｓ（１−ジメチルアミノナファリン（Ｎａｐｈａｌｉｎｅ）５スルホン酸）、Ｄａｎｓａ（ジアミノナフチル（Ｎａｐｈｔｙｌ）スルホン酸）、ダンシルＮＨ−ＣＨ３、ジアミノフェニルオキシジアゾール（ＤＡＯ）、ジメチルアミノ−５−スルホン酸、ジピロメテンボロンジフルオリド、ジフェニルブリリアントフラビン７ＧＦＦ、ドーパミン、エリスロシンＩＴＣ、オイクリシン、ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘導蛍光）、フラゾオレンジ、Ｆｌｕｏ３、フルオレスカミン、Ｆｕｒａ−２、ゲナクリルブリリアントレッドＢ、ゲナクリルブリリアントイエロー１０ＧＦ、ゲナクリルピンク３Ｇ、ゲナクリルイエロー５ＧＦ、グロキサン酸、グラニュラーブルー、ヘマトポルフィリン、Ｉｎｄｏ−１、イントラホワイトＣｆ液、Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ  ＰＡＦ、Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ  ＳＦ、Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ  ＷＳ、リサミンローダミンＢ２００（ＲＤ２００）、ルシファーイエローＣＨ、ルシファーイエローＶＳ、マグダラレッド、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、マキシロンブリリアントフラビン１０ＧＦＦ、マキシロンブリリアントフラビン８ＧＦＦ、ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン）、ミトラマイシン、ＮＢＤアミン、ニトロベンゾオキサジドール、ノルアドレナリン、ヌクレアファストレッド、ヌクレアイエロー、ナイロサンブリリアントフラビンＥ８Ｇ、オキサジアゾール、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、パラローズアニリン（フォイルゲン）、ホルワイトＡＲ溶液、ホルワイトＢＫＬ、ホルワイトＲｅｖ、ホルワイトＲＰＡ、ホスフィン３Ｒ、フタロシアニン、フィコエリトリンＲ、ポリアザインダセンポントクロームブルーブラック、ポルフィリン、プリムリン、プロシオンイエロー、ピロニン、ピロニンＢ、ピロザールブリリアントフラビン７ＧＦ、キナクリンマスタード、ローダミン１２３、ローダミン５ＧＬＤ、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミンＢ２００、ローダミンＢエクストラ、ローダミンＢＢ、ローダミンＢＧ、ローダミンＷＴ、セロトニン、セブロンブリリアントレッド２Ｂ、セブロンブリリアントレッド４Ｇ、セブロンブリリアントレッドＢ、セブロンオレンジ、セブロンイエローＬ、ＳＩＴＳ（プリムリン）、ＳＩＴＳ（スチルベンイソチオスルホン酸）、スチルベン、Ｓｎａｒｆ１、スルホローダミンＢ  Ｃａｎ  Ｃ、スルホローダミンＧエクストラ、テトラサイクリン、チアジンレッドＲ、チオフラビンＳ、チオフラビンＴＣＮ、チオフラビン５、Ｔｈｉｏｌｙｔｅ、チオゾールオレンジ、チノポールＣＢＳ、トゥルーブルー、ウルトラライト、ウラニンＢ、Ｕｖｉｔｅｘ  ＳＦＣ、キシレンオレンジ、及びＸＲＩＴＣが挙げられる。蛍光標識は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、オレゴン州；及びＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、クリーブランド、オハイオ州を含む、様々な商業的供給元から入手され得る。
【０１０２】
さらなる態様では、第３検出標識は、オリゴヌクレオチド、蛍光部分、及び蛍光クエンチング部分をさらに含む。よりさらなる態様では、第３検出標識は、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドの５’末端に連結される蛍光部分、及びオリゴヌクレオチドプローブの蛍光クエンチング部分３’末端をさらに含む。またさらなる態様では、第３検出標識は、配列番号：８の配列を含むオリゴヌクレオチドをさらに含む。よりさらなる態様では、第３検出標識は、配列番号：１１の配列を含むオリゴヌクレオチドをさらに含む。一層さらなる態様では、蛍光部分はＶＩＣを含む。またさらなる態様では、蛍光クエンチング部分は、ダーククエンチャーである。一層さらなる態様では、蛍光クエンチング部分はダーククエンチャーであり、ダーククエンチャーはＴＡＭＲＡである。
【０１０３】
さらなる態様では、第４検出標識は、オリゴヌクレオチド、蛍光部分、及び蛍光クエンチング部分をさらに含む。よりさらなる態様では、第４検出標識は、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドの５’末端に連結される蛍光部分、及びオリゴヌクレオチドプローブの蛍光クエンチング部分３’末端をさらに含む。
【０１０４】
さらなる態様では、第５検出標識は、オリゴヌクレオチド、蛍光部分、及び蛍光クエンチング部分をさらに含む。よりさらなる態様では、第５検出標識は、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドの５’末端に連結される蛍光部分、及びオリゴヌクレオチドプローブの蛍光クエンチング部分３’末端をさらに含む。
【０１０５】
さらなる態様では、第２アンプリコンは、約５０ｂｐ長以上である。よりさらなる態様では、第２アンプリコンは、約２５０ｂｐ長以下である。またさらなる態様では、第２アンプリコンは、約５０〜約６０ｂｐ長である。一層さらなる態様では、第２アンプリコンは、約５０〜約７０ｂｐ長である。よりさらなる態様では、第２アンプリコンは、約５０〜約８０ｂｐ長である。またさらなる態様では、第２アンプリコンは、約５０〜約９０ｂｐ長である。一層さらなる態様では、第２アンプリコンは、約５０〜約１００ｂｐ長である。よりさらなる態様では、第２アンプリコンは、約５０〜約１２５ｂｐ長である。またさらなる態様では、第２アンプリコンは、約５０〜約１５０ｂｐ長である。一層さらなる態様では、第２アンプリコンは、約５０〜約１７５ｂｐ長である。よりさらなる態様では、第２アンプリコンは、約５０〜約２００ｂｐ長である。またさらなる態様では、第２アンプリコンは、約５０〜約２５０ｂｐ長である。
【０１０６】
さらなる態様では、第３アンプリコンは、約５０ｂｐ長以上である。よりさらなる態様では、第３アンプリコンは、約２５０ｂｐ長以下である。またさらなる態様では、第３アンプリコンは、約５０〜約６０ｂｐ長である。一層さらなる態様では、第３アンプリコンは、約５０〜約７０ｂｐ長である。よりさらなる態様では、第３アンプリコンは、約５０〜約８０ｂｐ長である。またさらなる態様では、第３アンプリコンは、約５０〜約９０ｂｐ長である。一層さらなる態様では、第３アンプリコンは、約５０〜約１００ｂｐ長である。よりさらなる態様では、第３アンプリコンは、約５０〜約１２５ｂｐ長である。またさらなる態様では、第３アンプリコンは、約５０〜約１５０ｂｐ長である。一層さらなる態様では、第３アンプリコンは、約５０〜約１７５ｂｐ長である。よりさらなる態様では、第３アンプリコンは、約５０〜約２００ｂｐ長である。またさらなる態様では、第３アンプリコンは、約５０〜約２５０ｂｐ長である。
【０１０７】
様々な態様では、第１、第２、及び第３アンプリコンの濃度は、対照標的ＤＮＡとの比較により決定される。
【０１０８】
さらなる態様では、第１、第２、及び第３アンプリコンの濃度は、対照標的ＤＮＡとの比較により決定され、ここで対照標的ＤＮＡは対照合成標的ＤＮＡである。よりさらなる態様では、対照合成標的ＤＮＡは（ＴＴＡＧＧＧ）ｍを含み、式中、ｍは１５〜３４の整数である。またさらなる態様では、対照合成標的ＤＮＡは（ＣＣＣＴＡＡ）ｍを含み、式中、ｍは１５〜３４の整数である。一層さらなる態様では、対照合成標的ＤＮＡは、配列番号：１２である。
【０１０９】
さらなる態様では、対照合成標的ＤＮＡは、少なくとも９０塩基対長である。よりさらなる態様では、対照合成標的ＤＮＡは、少なくとも１００塩基対長である。またさらなる態様では、対照合成標的ＤＮＡは、少なくとも１１０塩基対長である。一層さらなる態様では、対照合成標的ＤＮＡは、少なくとも１２０塩基対長である。よりさらなる態様では、対照合成標的ＤＮＡは、少なくとも１３０塩基対長である。またさらなる態様では、対照合成標的ＤＮＡは、少なくとも１４０塩基対長である。一層さらなる態様では、対照合成標的ＤＮＡは、少なくとも１５０塩基対長である。よりさらなる態様では、対照合成標的ＤＮＡは、少なくとも１６０塩基対長である。またさらなる態様では、対照合成標的ＤＮＡは、少なくとも１７０塩基対長である。一層さらなる態様では、対照合成標的ＤＮＡは、少なくとも１８０塩基対長である。
【０１１０】
さらなる態様では、対照合成標的ＤＮＡは、約９０塩基対〜約２００塩基対長である。またさらなる態様では、対照合成標的ＤＮＡは、配列番号：１２である。よりさらなる態様では、対照合成標的ＤＮＡは、約１００塩基対〜約２００塩基対長である。またさらなる態様では、対照合成標的ＤＮＡは、約１１０塩基対〜約２００塩基対長である。一層さらなる態様では、対照合成標的ＤＮＡは、約１２０塩基対〜約２００塩基対長である。よりさらなる態様では、対照合成標的ＤＮＡは、約１３０塩基対〜約２００塩基対長である。またさらなる態様では、対照合成標的ＤＮＡは、約１４０塩基対〜約２００塩基対長である。一層さらなる態様では、対照合成標的ＤＮＡは、約１５０塩基対〜約２００塩基対長である。一層さらなる態様では、対照合成標的ＤＮＡは、約１７５塩基対〜約２００塩基対長である。
【０１１１】
一層さらなる態様では、対照合成標的ＤＮＡは、約９０塩基対〜約１５０塩基対長である。よりさらなる態様では、対照合成標的ＤＮＡは、約９０塩基対〜約１２５塩基対長である。またさらなる態様では、対照合成標的ＤＮＡは、約９０塩基対〜約１１０塩基対長である。一層さらなる態様では、対照合成標的ＤＮＡは、約９０塩基対〜約１７５塩基対長である。
【０１１２】
さらなる態様では、第１、第２、及び第３アンプリコンの濃度は、対照標的ＤＮＡとの比較により決定され、このＤＮＡはヒトゲノムＤＮＡである。またさらなる態様では、ヒトゲノムＤＮＡは、男性または女性ドナーから得られたＤＮＡを含む。一層さらなる態様では、ヒトゲノムＤＮＡは、男性及び女性ドナーを合わせたモザイク組成である、または男性のみ、もしくは女性のみのドナーのモザイク組成である。
【０１１３】
増幅反応は、当該技術分野において周知の手順により実施される。ＰＣＲの手順は広く使用されていて、記載されている（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号明細書及び第４，６８３，２０２号明細書を参照のこと）。簡潔に述べると、二本鎖標的核酸は、一般に鎖を変性させるのに十分に高い温度でインキュベートすることにより変性し、次いで、過剰なプライマーの存在下でインキュベートして、プライマーが一本鎖標的核酸にハイブリダイズ（アニール）する。ＤＮＡポリメラーゼは、ハイブリダイズしたプライマーを伸長させて標的核酸の新しいコピーを生成する。得られた二本鎖を変性して、ハイブリダイゼーション及び伸長ステップを繰り返す。相補的な標的鎖に対する第２プライマーの存在下において変性、アニーリング、及び伸長のステップを繰り返すことにより、２つのプライマーによって包含された標的核酸は、指数関数的に増幅される。プライマー伸長ステップの時間及び温度は、増幅されている標的核酸のポリメラーゼ、長さ及び配列組成、ならびに増幅に用いられるプライマー配列に依存するだろう。標的核酸を十分に増幅するのに必要な繰り返しステップ数は、増幅の効率に依存するだろう。当業者は、本開示が、増幅プロセスで適用される時間、温度、緩衝液条件、及び増幅サイクルの変動によって限定されることはないと理解するだろう。
【０１１４】
変性ステップは、典型的にはＰＣＲの反復サイクルにおける第１ステップであり、９０〜９８℃、例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、または９８℃の変性温度まで、１〜３５秒間、好ましくは１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５秒間反応物を加熱することからなる。変性ステップでは、相補的な塩基間の水素結合を破壊することによりＤＮＡ鋳型を融解し、ＤＮＡの一本鎖を生成する。
【０１１５】
アニーリングステップは、典型的にはＰＣＲの反復サイクルにおける第２ステップであり、温度を４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０℃のアニーリング温度まで、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５秒間下げて、プライマーセットのプライマーのアニーリングを可能にし、標的核酸とハイブリダイズさせることからなる。アニーリング温度は、使用されるプライマーに対する２つのＴｍの約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０℃または最大１５℃未満の融解温度であり得る。安定したＤＮＡ−ＤＮＡ水素結合は、プライマー配列が、プライマーの３’末端において鋳型配列に対する相補体の一部分に非常に密接に適合する、またはそれと同一である場合に形成される。ポリメラーゼは、プライマー−鋳型ハイブリッドに結合し、ＤＮＡ合成を開始する。
【０１１６】
伸長／延長ステップは、核酸ポリメラーゼが、５’から３’の方向に標的核酸に相補的なｄＮＴＰを付加する、すなわち、新生（伸長）標的核酸鎖の末端でｄＮＴＰの５’リン酸基を３’ヒドロキシル基と縮合することにより、標的核酸鎖に相補的な新しい核酸鎖を合成するステップである。伸長時間は、使用される核酸ポリメラーゼに、及び増幅される標的核酸の長さの両方に依存する。経験則として、その最適温度で、核酸ポリメラーゼは最大で毎分１，０００塩基を重合するだろう。最適条件下で、すなわち制限基質または試薬による制限がない場合、各伸長ステップで標的核酸の量は２倍になり、特定の標的核酸の指数関数的（幾何級数的）増幅をもたらす。このステップにおける延長温度は、使用される核酸ポリメラーゼに依存する。例えば；Ｔａｑポリメラーゼは、その最適活性温度を７５〜８０℃で有し、通常、７２℃の温度がこの酵素で使用される。
【０１１７】
ＰＣＲは、最終延長ステップも含み得る。最終延長は、最後のＰＣＲサイクル後に６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４または７５℃の最終延長温度で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５分間実施され、いずれの残存する一本鎖ＤＮＡも完全にコピーされて、二本鎖ＤＮＡ産物の作製を確実にし得る。
【０１１８】
ＰＣＲは、検出標識量を決定し得るシグナル取得ステップも含み得る。シグナル取得ステップは、標的配列の増幅中に実施され得る。いくつかの態様では、シグナル取得ステップは、変性ステップ、アニーリングステップ及び延長ステップの後に続く。シグナル取得ステップは、シグナル取得温度で実施される。シグナル取得温度は任意の温度であり得、ＰＣＲ中に１回以上実施され得る。２つ以上の標的核酸のコピー数が、本明細書に記載されるように決定されている場合、シグナル取得温度は、各アンプリコンの検出標識の検出によって異なるべきである。例えば、２つ以上のシグナル取得温度についての温度は、第１シグナル取得温度が第１アンプリコンのＴｍよりも低く、第２シグナル取得温度が、その第１Ｔｍよりも高く、かつ第２アンプリコンのＴｍよりも低くなるように選択されるべきである。２つ以上のシグナル取得温度間の差は、３、４、５、６、７、８、９、または１０℃であり得る。シグナル取得ステップは、取得温度で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５秒間実施され得る。
【０１１９】
ＰＣＲは、最終保持ステップも含み得る。最終保持ステップは、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５℃の最終保持温度での不定時間におけるステップであり得る。最終保持ステップは、反応物の短期保存のために用いられ得る。
【０１２０】
ポリメラーゼ連鎖反応は、サイクルの連続したステージも含み得る。サイクルの連続した各ステージは、上記のＰＣＲステップのうち１つ以上を含み得る。サイクルの連続した各ステージはまた、ＰＣＲの「サイクル」に属するものとされ得る。サイクルの連続した各ステージは、ＰＣＲの各サイクルについて同じまたは異なる温度下で実施され得る。ＰＣＲは、ＰＣＲサイクルのうち１回以上でアニーリング温度を変更して実行され得る。例えば、ＰＣＲは合計で４０サイクル実行され得、ここでアニーリング温度は、サイクルの第１ステージでは同じであり、次いでアニーリング温度をサイクルの第２ステージで上げて、アニーリング温度をサイクルの第３ステージで下げる。
【０１２１】
本明細書に記載される方法は、各アンプリコンの別個のシグナル、すなわちマルチプレックスシグナル検出により、１回以上の増幅サイクルにおける複数のアンプリコンの定量化を可能にする。様々な態様では、各サイクルで複数のアンプリコンからシグナルを収集することは、ＰＣＲ機器の光学システムにより、異なる波長で検出される複数のフルオロフォアを使用することからなる。さらなる態様では、開示される方法は、二本鎖ＤＮＡ結合またはインターカレート色素、例えば、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、またはＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）色素、ならびに第２及び第３アンプリコン（ならびに３つより多いアンプリコンが増幅される場合、第４、第５など）のプローブを利用する。プローブは、オリゴヌクレオチドの一端に共有結合されるレポーター色素、及びオリゴヌクレオチドの他方の末端に共有結合されるクエンチャー色素を有するオリゴヌクレオチドである。様々な態様では、プローブは、５’末端に結合されるレポーター色素及び３’末端に結合されるクエンチャー色素を有するオリゴヌクレオチドである。さらなる態様では、反応物における全てのアンプリコンが、ＤＮＡ結合またはインターカレート色素によりシグナルを生成し得、したがって、第１アンプリコンは、第２及び第３（ならびに３つより多いアンプリコンが増幅される場合、第４、第５など）のアンプリコンがサイクル閾値に到達する前に、少なくとも５回の増幅サイクルでサイクル閾値に到達するはずである。
【０１２２】
本明細書に記載される方法はまた、各アンプリコンの別個のシグナルによる、各増幅サイクルにおける複数のアンプリコンの定量化に関するその他の手法を使用して実施され得る。さらなる態様では、各アンプリコンの第３プライマーは、クエンチング色素に連結され得、クエンチング剤は、伸長反応中に反応物においてポリメラーゼにより切断される（すなわち、ｑ−ＰＣＲプローブ）。よりさらなる態様では、フルオロフォアは、アンプリコンにハイブリダイズするオリゴに連結され得、ＤＮＡ鎖にハイブリダイズされる場合にクエンチされず（すなわち、分子ビーコン）、異なる分子ビーコンが各アンプリコンに使用され得る。またさらなる態様では、ポリメラーゼ連鎖反応は、ＤＮＡ結合またはインターカレート蛍光色素を含み得る。ＤＮＡ結合またはインターカレート色素のシグナルは、全てのアンプリコンが二本鎖となる場合に伸長サイクルの最後に収集される。
【０１２３】
様々な態様では、本明細書に記載される方法は、複数のアンプリコンからのシグナルを別々に収集することができる戦略を提示する。さらなる態様では、第１アンプリコンのサイクル閾値（Ｃｔ）は初期サイクルで収集され、その時に第２及び第３アンプリコンからのシグナルは、まだベースラインである。第２及び第３アンプリコン（ならびに３つより多いアンプリコンが一緒に増幅される場合、第４、第５などのアンプリコン）のＣｔは、第１アンプリコンの融解温度（Ｔｍ）をはるかに超える温度で収集され、この温度では第１アンプリコンを一本鎖にして、ベースラインまでそのシグナルを送る。プライマーは、両方のアンプリコンを小さくするように設計され、第２及び第３アンプリコンはＧＣリッチであって、そのＴｍを上昇させ得る。コピー数範囲で重複することなく高存在量及び低存在量の種として生体試料で生じる鋳型対は、このような手法の自然な標的である。
【０１２４】
増幅の産物は、当該技術分野において周知の方法により検出及び分析される。増幅産物は、産物の分離及び／もしくは精製後、または増幅反応で形成される産物の直接測定により分析されてよい。検出については、産物は、蛍光化合物、例えば、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、もしくはＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）を用いて、または標識核酸プローブとのハイブリダイゼーションにより間接的に同定されてよい。あるいは、標識プライマーまたは標識ヌクレオチドが、増幅反応で使用されて増幅産物を標識する。標識は、任意の検出可能部分を含み、蛍光標識、放射性標識、電子標識、及びビオチンまたはジゴキシゲニンなどの間接標識を含む。
【０１２５】
本開示のｑＰＣＲ反応を実施するのに好適な計装機器は、多数の商業的供給元から入手可能である（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カールスバッド、カリフォルニア州；ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ  ４８０、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、インディアナポリス、インディアナ州；Ｅｃｏ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州；ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ  ４０、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、シダークリーク、テキサス州）。
【０１２６】
リアルタイム定量的ＰＣＲが増幅産物を検出し、測定するために使用される場合、様々なアルゴリズムが、試料の標的テロメア数を算出するために使用される（例えば、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．７；Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３を参照のこと）。定量化は、テロメア核酸の既知のコピー数を有する標準試料の使用ならびに標準物の対数及び閾値のサイクル（Ｃｔ）からの標準曲線の生成を含んでよい。一般に、Ｃｔは、増幅産物により生成される蛍光がベースライン蛍光を上回るいくつかの偏差である場合のＰＣＲサイクルまたは部分ＰＣＲサイクルである。
【０１２７】
２．標的試料
標的試料は、標的分子を有する、または有すると推測される任意の供給源に由来し得る。標的試料は、例えば、核酸などの標的分子（複数可）を含有し得る。標的試料は、標的核酸の供給源であり得る。標的試料は、天然の標的核酸、化学的に合成される標的核酸、またはその両方を含み得る。標的試料は、例えば、１種以上の細胞、組織、もしくは体液、例えば血液、尿、精液、リンパ液、脳脊髄液、もしくは羊水などからの試料、またはその他の生体試料、例えば組織培養細胞、頬綿棒で採取した試料、洗口剤、糞便、組織切片、生検吸引物、及び骨もしくはミイラ化組織などの考古学的試料などであり得る。有用な標的試料の種類としては、血液試料、尿試料、精液試料、リンパ液試料、脳脊髄液試料、羊水試料、生検試料、針吸引生検試料、癌試料、腫瘍試料、組織試料、細胞試料、細胞溶解物試料、粗細胞溶解物試料、法医学試料、考古学的試料、感染試料、院内感染試料、産生試料、薬物調製物試料、生体分子産生試料、タンパク質調製物試料、脂質調製物試料、及び／または炭水化物調製物試料が挙げられる。
【０１２８】
３．標的核酸
核酸試料は、標的核酸を有する、または有すると推測される任意の供給源に由来し得る。核酸試料は、標的核酸などの核酸分子及び核酸配列の供給源である。核酸試料は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはその両方を含有し得る。標的核酸は、ｃＤＮＡでもあり得る。加えて、ｍＲＮＡは逆転写されて、次いで本明細書に記載される方法で使用するための標的核酸として機能し得るｃＤＮＡを形成し得る。例えば、その天然の二本鎖状態にある染色体ＤＮＡは、本明細書で上に記載されるような標的試料から得られ得る。染色体ＤＮＡは、フェノール／クロロホルム抽出、塩化セシウム勾配、及びシリコーン膜結合技術、選択的な洗剤媒介ＤＮＡ沈殿法を使用する市販のキットを含む、高分子量ゲノムＤＮＡ（２０ｋｂ超）を生成する任意のＤＮＡ精製方法を使用して得られ得る。ＤＮＡ精製市販キットの例としては、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＤＮＡｄｖａｎｃｅ及びＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｇｅｎｆｉｎｄ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＱＩＡａｍｐキット（ＱＩＡＧＥＮ、バレンシア、カリフォルニア州）、ＱＩＡａｍｐ血液キット（ＱＩＡＧＥＮ）、ＱＩＡａｍｐ  ＦＦＰＥ組織キットＱＩＡＧＥＮ）、ＡＨＰｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ）、Ｐｕｒｅｇｅｎｅキット（ＱＩＡＧＥＮ）、ＰｕｒｅＬｉｎｋ及びＧｅｎｅＣａｔｃｈｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ならびにＷｉｚａｒｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が挙げられる。
【０１２９】
「標的核酸」または「標的配列」は、二本鎖または一本鎖核酸上の核酸配列を意味する。本明細書において「核酸」もしくは「オリゴヌクレオチド」または文法的等価物とは、互いに共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は、一般にホスホジエステル結合を含有するだろうが、いくつかの場合には、代替主鎖を有する場合もある核酸類似体が含まれ、この主鎖は、例えば、ホスホルアミド（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９：１９２５−６３（１９９３）、及び当該文献における参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００−０３（１９７０）；Ｓｐｒｉｎｚｌ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９−８９（１９７７）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３４８７−９９（１９８６）；Ｓａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５（１９８４）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）；ならびにＰａｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ  ２６：１４１−４９（１９８６））、ホスホロチオエート（Ｍａｇ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１４３７−４１（１９９１）；及び米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１（１９８９））、Ｏ−メチルホホロアミダイト（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ）結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１を参照のこと）、ならびにペプチド核酸主鎖及び結合（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ．，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５−９７（１９９２）；Ｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８（１９９２）；Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：５６６−６８（１９９３）；Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：２０７（１９９６）、その全てが参照によって本明細書に組み込まれる）を含む。その他の類似体核酸としては、正の主鎖（Ｄｅｍｐｃｙ，Ｒ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６０９７−１０１（１９９５））；非イオン性主鎖（米国特許第５，３８６，０２３号明細書；第５，６３７，６８４号明細書；第５，６０２，２４０号明細書；第５，２１６，１４１号明細書；及び第４，４６９，８６３号明細書；Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｉ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ  ３０：４２３（１９９１）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  １３：１５９７（１９９４）；Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ２  ａｎｄ  ３，ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５��０，「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５（１９９４）；Ｊｅｆｆｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ  ３４：１７（１９９４））ならびに米国特許第５，２３５，０３３号明細書及び第５，０３４，５０６号明細書、ならびにＣｈａｐｔｅｒｓ  ６  ａｎｄ  ７，ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋに記載されるものを含む、非リボース主鎖を含むものが挙げられる。１つ以上の炭素環式糖を含有する核酸も、核酸の定義内に含まれ（Ｊｅｎｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．１６９−１７６（１９９５）を参照のこと）；全ての参考文献は、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。
【０１３０】
測定、同定、検出しようとする、またはそのコピー数を決定しようとする任意の核酸配列が、標的核酸配列として機能し得る。本明細書に記載される方法では、２つ以上の標的核酸配列が存在し得る。２つの標的核酸配列が存在する場合には、それらは丁寧に第１及び第２標的核酸配列と称されるだろう。３つの標的核酸配列が存在する場合には、それらは丁寧に第１、第２及び第３標的核酸配列などと称されるだろう。本明細書の方法に記載される標的核酸は、同じ、類似したまたは異なるコピー数を有し得る。例えば、第１標的核酸は、複数コピー数の核酸配列であり、第２標的核酸は単一コピー遺伝子である。例えば、第１標的核酸は、テロメア反復配列、ｍｔＤＮＡ、ｒＤＮＡまたはＡｌｕ反復ＤＮＡであり得る。例えば、第１標的核酸は、高コピー数のｍＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡであり得、第２標的核酸は、低コピー数のｍＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡであり得る。
【０１３１】
単一コピー遺伝子は、半数体ゲノム当たり単一のコピーを有する遺伝子である。したがって、単一コピー遺伝子は、１細胞当たり２つのコピーを有する。単一コピー遺伝子としては、ＲＮａｓｅ  Ｐ遺伝子、β２−ミクログロブリン遺伝子、アルブミン遺伝子、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、β−アクチン（ＡＣＴＢ）遺伝子、及びβ−グロビン遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３２】
テロメアは、真核生物の線状染色体の末端に見られる特殊構造である。テロメアは、一般に短い縦列反復で構成され、その生物に特有のテロメラーゼ酵素によって規定される反復配列単位を有する。テロメア反復配列は、様々な生物で知られている。脊椎動物、植物、ある種のカビ、及びいくつかの原虫について、配列は完全な反復である。例えば、ヒトでは、配列ＴＴＡＧＧＧ（配列番号：１３）は、配列反復単位（ＴＴＡＧＧＧ）ｎとして生じ、ここでｎは、１〜１０００またはそれを超える範囲であり得る。その他の生物では、反復配列は不規則であり、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのものなどでは、配列は可変のＧ１−３Ｔ／Ｃ１−３Ａである。いくつかの真核生物では、テロメアは短い縦列配列反復を欠いているが、テロメアとして機能する配列要素を有する。例えば、フルーツフライのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒでは、テロメアは、レトロトランスポゾン要素のＨｅＴ−Ａ及びＴＡＲＴの複合体である一方、蚊のＡｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅでは、テロメアは、複合配列縦列反復のアレイである。本発明の目的において、異なる構造のテロメアは、本発明の範囲内に包含される。
【０１３３】
反復配列に加えて、いくつかのテロメアの３’末端は一本鎖領域を含有し、これはヒトではＧリッチ鎖上に位置している。一本鎖は（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ反復で構成され、ｎは約５０であるが、有意に５０未満または５０超であり得る。本明細書で使用される場合、３’一本鎖領域の長さは、死亡率または疾患リスクとも相関し得る。
【０１３４】
典型的には、ＤＮＡ複製機構は５’から３’の方向に機能し、ラギング鎖の合成は、鎖合成後に分解される短いＲＮＡプライマーの使用により不連続に生じる。線状ＤＮＡの３’末端の配列は、すでにＲＮＡプライマーによって占められている領域の合成を完了するためには使用できないため、線状染色体の末端３’領域は複製されない。この「末端複製問題」は、テロメラーゼ、すなわちテロメア特異的リボ核タンパク質逆転写酵素の作用により解決される。テロメラーゼ酵素は、テロメアの３’末端を伸長するための鋳型として機能する不可欠なＲＮＡ成分を有する。テロメラーゼ活性による反復伸長は、テロメラーゼ結合ＲＮＡ鋳型からコピーされるテロメア反復の生成をもたらす。テロメラーゼによる延長後、ＤＮＡポリメラーゼによるラギング鎖合成によって二本鎖テロメア構造の形成が完了する。
【０１３５】
正常なヒト体細胞では、テロメラーゼは発現されない、または低レベルで発現される。結果として、テロメアは、細胞が複製老化に達するまで各細胞分裂につき約５０〜２００ｂｐだけ短縮し、複製老化に達した時点で細胞は増殖する能力を失う。細胞の複製に関するこの能力上限は一般にヘイフリック限界と称され、細胞に、細胞分裂を計数して細胞発生を調節する計数機構、すなわち、有糸分裂時計を提供する可能性がある。それに応じて、例えば、構成レトロウイルスプロモーターからテロメラーゼを発現させることによる、テロメラーゼ活性を欠く細胞におけるテロメラーゼの活性化または内因性ポリメラーゼの活性化により、細胞が増殖能を維持することが可能となって細胞の不死化をもたらす。
【０１３６】
興味深いことに、非常に短いテロメアを有する細胞が、多くの場合に伸長されるようになる。この現象は、テロメラーゼ酵素が、ある閾値の長さを下回ったテロメアを伸長しながら短いテロメアがさらに短縮するのを防ぐことを示唆している。したがって、テロメアがある一定の長さの場合、テロメラーゼ活性の存在が必要であるようには見えないが、その長さが危険限界を下回ると、テロメアの完全性を維持するのに不可欠となる。
【０１３７】
本明細書に記載される方法では、テロメアの存在量または平均長が、細胞内の単一染色体について決定されてよい。一態様では、テロメアの平均コピー数または平均値テロメアコピー数が、単一細胞について測定される。別の実施形態では、テロメアの平均コピー数または平均値テロメアコピー数が、細胞集団について測定される。テロメアコピー数の変化とは、テロメアコピー数の増加または減少であり、特に平均テロメアコピー数の増加または減少である。この変化は、特定の時点に関連する場合がある、すなわち、時間ｔ１での生物のテロメアコピー数を、しばらく後の時間（ｔ２）におけるテロメア長と比較したものである。テロメアコピー数の変化または差は、特定の細胞集団または生物集団の平均または平均値テロメアコピー数に対して比較されてもよい。いくつかの態様では、テロメアコピー数の変化または差は、疾患状態に罹患していない集団の平均または平均値テロメアコピー数に対して比較されてもよい。ある種の実施形態では、テロメアコピー数の変化は、異なる期間で存在する集団に対して測定される。
【０１３８】
しかし、テロメアコピー数は全ての真核生物で決定されてよく、一態様では、テロメアコピー数は、両生類、鳥、ならびに哺乳動物、例えば、げっ歯類、有蹄動物、及び霊長類、特にヒトをこれらに限定されることなく含む、脊椎動物について決定される。テロメアコピー数はまた、生物において長寿が望ましい特性である、または長寿及び疾患に対する感受性がテロメア長と相関する場合に生物で決定され得る。別の態様では、テロメアは、クローン生物における変化したテロメア完全性と関連する短期もしくは長期の死亡リスク、または疾患感受性の可能性を評価するために、クローン生物で測定されてよい。
【０１３９】
上記したものなどのテロメア核酸配列が、標的配列として機能し得る。テロメア核酸配列、または任意のその他の反復もしくは非反復標的核酸は、より長い配列の方がより特有であり得ると理解した上で任意の長さであってよい。いくつかの実施形態では、試料核酸を断片化または切断して、１００〜１０，０００塩基対の断片にするのが望ましい場合がある。一態様では、おおよそ５００ｂｐの断片が使用され得る。断片化または切断は、機械的、化学的、及び酵素的方法を含む、当業者に周知のいくつかの方法で行われてよい。したがって、核酸は、超音波処理、フレンチプレス、剪断に供されてよい、またはヌクレアーゼ（例えば、ＤＮａｓｅ、制限酵素、ＲＮａｓｅなど）、もしくは化学的切断剤（例えば、酸／ピペリジン、ヒドラジン／ピペリジン、鉄−ＥＤＴＡ複合体、１，１０−フェナントロリン−銅複合体など）で処理されてよい。ＤＮＡの断片化は、標的配列長または存在量の正確な測定を妨げる場合がある二次構造形成を減少させる可能性がある。
【０１４０】
様々な態様では、開示される方法は、第１、第２、及び第３標的核酸を、第１、第２、及び第３プライマーセットとそれぞれ接触させる前に染色体ＤＮＡ試料を得るステップをさらに含み；ここで染色体ＤＮＡ試料は、第１、第２、及び第３標的核酸の少なくとも一部分を含有する、または含む。さらなる態様では、染色体ＤＮＡは、固体試料、液体試料、半固体試料、または気体試料から得られる。さらなる態様では、染色体ＤＮＡは液体試料から得られ；ここで液体試料は、血液、唾液、尿、血漿、血清、脳脊髄液（「ＣＳＦ」）喀痰、または気管支洗浄液からのものである。またさらなる態様では、液体試料は、血液、血清、または血漿からのものである。一層さらなる態様では、染色体ＤＮＡは固体試料から得られ；ここで固体試料は、組織試料からのものである。よりさらなる態様では、組織試料は組織生検材料である。またさらなる態様では、組織生検材料は、肺、筋肉、または皮膚からのものである。一層さらなる態様では、染色体ＤＮＡは、骨髄から得られる。よりさらなる態様では、染色体ＤＮＡは、脊椎動物から得られる。またさらなる態様では、脊椎動物は哺乳動物である。一層さらなる態様では、哺乳動物は霊長類である。よりさらなる態様では、霊長類はヒトである。その他の態様では、染色体ＤＮＡは、非脊椎動物、例えば植物からのものであり得る。
【０１４１】
様々な態様では、開示される方法は、第１、第２、及び第３標的核酸を、第１、第２、及び第３プライマーセットとそれぞれ接触させる前に染色体ＤＮＡ試料を得るステップをさらに含み；ここで染色体ＤＮＡ試料は、第１、第２、及び第３標的核酸を含む。
【０１４２】
さらなる態様では、開示される方法は、第１、第２、及び第３標的核酸を、第１、第２、及び第３プライマーセットとそれぞれ接触させる前に血液、唾液、尿、血漿、血清、脳脊髄液（「ＣＳＦ」）喀痰または気管支洗浄液から染色体ＤＮＡ試料を得るステップをさらに含み；ここで染色体ＤＮＡ試料は、第１、第２、及び第３標的核酸を含み；ここで染色体ＤＮＡが得られる。
【０１４３】
さらなる態様では、開示される方法は、第１、第２、及び第３標的核酸を、第１、第２、及び第３プライマーセットとそれぞれ接触させる前に血液、唾液、尿、血漿、血清、脳脊髄液（「ＣＳＦ」）喀痰または気管支洗浄液から単離された１つ以上の細胞型から染色体ＤＮＡ試料を得るステップをさらに含み；ここで染色体ＤＮＡ試料は、第１、第２、及び第３標的核酸を含み；ここで染色体ＤＮＡが得られて；ここで単離された細胞型は、循環腫瘍細胞、循環幹細胞、リンパ球、顆粒球、骨髄細胞、好中球、単球、マクロファージ、及び白血球を含む。
【０１４４】
さらなる態様では、開示される方法は、第１、第２、及び第３標的核酸を、第１、第２、及び第３プライマーセットとそれぞれ接触させる前に血液から循環ＤＮＡ断片試料を単離するステップをさらに含み；ここで循環ＤＮＡ断片試料は、第１、第２、及び第３標的核酸を含む；
【０１４５】
開示される方法のテロメア産物は、単一テロメア、単一染色体、単一細胞からの染色体集団または複数の細胞からの染色体集団から生成され得る。
【０１４６】
４．ポリメラーゼ
本明細書に記載される方法では、増幅酵素が必要である。例えば、プライマーを標的核酸に接触させた後、この反応物は増幅酵素で処理され得る。増幅酵素は、一般にＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼである。種々の好適なポリメラーゼが、当該技術分野において周知であり、これらとしてはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫｌｅｎＴａｑ、Ｔｆｌポリメラーゼ、ＤｙｎａＺｙｍｅなどが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、全てのポリメラーゼが本発明に適用できる。一態様では、ポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く耐熱性ポリメラーゼ、または減少した、もしくは非機能的な３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するように操作されたポリメラーゼ（例えば、Ｐｆｕ（ｅｘｏ−）、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）、Ｐｙｒａ（ｅｘｏ−）など）であって、その理由とは、強力な３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの使用は、いくつかの適用においてプライマー二量体増幅を防止する、または遅延させるのに必要な、及びその他の適用では、対立遺伝子特異的増幅を実施するのに必要なミスマッチ３’末端ヌクレオチドを除去する傾向があるからである。ハイブリダイズしたプライマーを最適に伸長するために使用されるポリメラーゼの混合物も適用できる。別の態様では、本発明に有用なポリメラーゼ酵素は、増幅に好適な温度でのみ活性化するように配合される。
【０１４７】
増幅温度で不活性化する抗体を阻害する、または増幅温度に達するまで酵素を使用不可能な形態にして酵素を隔離するポリメラーゼの存在は、全て好適である。これらのポリメラーゼ配合物によって、非標的核酸配列のプライミングを防止しながら、単一反応容器内における全ての成分の混合が可能となる。
【０１４８】
加えて、当業者は、様々な薬剤がポリメラーゼの処理能力を高めるために、不活性化からポリメラーゼを安定化させるために、プライマーの非特異的ハイブリダイゼーションを減少させるために、または複製効率を高めるために反応物に添加されてよいことを理解するだろう。このような添加剤としては、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド、アセトアミド、グリセロール、ポリエチレングリコール、またはタンパク質薬剤、例えばＥ．ｃｏｌｉ．一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ウシ血清アルブミン、ゼラチンなどが挙げられるが、これらに限定されない。別の態様では、当業者は、特定の種類の配列、例えば、ＧＣリッチまたは反復配列の増幅のために様々なヌクレオチド類似体を使用することができる。これらの類似体としては、とりわけ、ｃ７−ｄＧＴＰ、ヒドロキシメチル−ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰなどが挙げられる。
【０１４９】
５．プライマー
いくつかの態様では、プライマーは、１箇所を除く全ての配置でプライマーが標的核酸の伸長をプライミングするのをブロックするように設計され得る。例えば、プライマーセットの１つのプライマーは、プライマーの３’末端でミスマッチ塩基を作製することにより、プライマーが標的核酸の伸長をプライミングするのをブロックするように設計され得る。このようなプライマーを設計して利用することにより、プライマーは、その相補的配列に依然としてハイブリダイズすることができるが；これは１回の確認でＤＮＡ合成をプライミングするだけであり、したがってアンプリコンサイズの予測可能性を提供し、それゆえアンプリコンのＴｍの予測可能性を提供するだろう。
【０１５０】
例えば、プライマー及びプライマーセットが本明細書で開示され、ここで第１プライマーセットの１つのプライマーは、プライマーの３’末端に隣接する少なくとも１つのヌクレオチドを含み、このヌクレオチドは、標的核酸に対してミスマッチであってこの核酸に相補的ではないが、プライマーセットにおける他方のプライマーの３’末端ヌクレオチドに相補的である。
【０１５１】
プライマー及びプライマーセットもまた本明細書で開示され、ここでプライマーセットの１つのプライマーは、プライマーの３’末端に隣接する少なくとも１つのヌクレオチドを含み、このヌクレオチドは、標的核酸に対してミスマッチであってこの核酸に相補的ではないが、プライマーセットにおける他方のプライマーの３’末端ヌクレオチドに相補的であり、プライマーセットのミスマッチ含有プライマーの伸長産物は、プライマーセットにおける他方のプライマーによりハイブリダイズされ得、この他方のプライマーが、この伸長産物に沿ってＤＮＡ合成をプライミングするのを可能にする。いくつかの態様では、手法は、二本鎖ＤＮＡの特定の鎖（例えば、染色体の「Ｃ」鎖または「Ｇ」鎖）上のテロメア長または存在量を評価するために使用され得る。
【０１５２】
ブロックプライマーが、単一かつ特定の配置のみでプライミングするだろうことを確実にするために、ブロックプライマーを含むプライマーセットは、プライマーセットのプライマーが、ブロックプライマー中に存在するミスマッチ塩基の領域にわたって完全な相補性で重複するように設計され得る。このような設計は、プライマー二量体形成を防止するように、かつ２つのプライマーが互いにプライミングし合う能力を最小限に抑えるように実施され得る。このような設計は、標的核酸配列が、テロメアで見られる反復（テロメア配列）などの複数の反復を含む配列である場合に利用され得る。このような方法の一例は、以下の実施例を含む本明細書内の他の箇所に記載されている。
【０１５３】
本明細書に記載されるように、テロメア反復を直接増幅するためのプライマーは、標的核酸の第１の一本鎖にハイブリダイズする第１プライマー及び標的核酸の第２の一本鎖にハイブリダイズする第２プライマーを含み得、第１及び第２鎖は実質的に相補的である。プライマーは、それらの各々の鎖にハイブリダイズされる場合、ポリメラーゼによってプライマー伸長することができる。すなわち、標的核酸にハイブリダイズされるプライマーは、プライマーがポリメラーゼによって伸長可能なように、標的核酸上のヌクレオチド残基に相補的なそれらの３’末端ヌクレオチド残基を有する。選択されたプライマーは、反復領域の反復単位に相補的である。例えば、少なくとも１つのプライマーにおける少なくとも１つのヌクレオチド残基は、プライマーがハイブリダイズする少なくとも１つの反復単位におけるヌクレオチド残基とミスマッチを生じるように改変され得、ここでプライマーが互いにハイブリダイズする場合、改変されたヌクレオチド残基は、他方のプライマーの３’末端ヌクレオチド残基ともミスマッチを生じる。ミスマッチの包含は、プライマー伸長及びプライマー−プライマーハイブリッド（プライマー二量体）を防止または制限する。
【０１５４】
テロメア反復を直接増幅するためのプライマーセットは、第１プライマーの少なくとも１つのヌクレオチド残基が改変されて、改変された残基と、プライマーがハイブリダイズする第１鎖のうち少なくとも１つの反復単位におけるヌクレオチド残基との間にミスマッチを生じるようなプライマーセットを含み得、ここで第１及び第２プライマーが互いにハイブリダイズする場合、改変されたヌクレオチド残基は、第２プライマーの３’末端ヌクレオチド残基ともミスマッチを生じる。改変されたヌクレオチド残基は、改変されたプライマーが標的核酸にハイブリダイズする場合に、ポリメラーゼによる効率的な伸長を可能にする、３’末端ヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチド残基であり得る。例えば、改変されたヌクレオチド残基は、改変されたプライマーが標的核酸にハイブリダイズする場合に、ポリメラーゼによる効率的な伸長を可能にする、３’末端ヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチド残基、少なくとも２つのヌクレオチド残基、または少なくとも３つのヌクレオチド残基であり得る。
【０１５５】
本明細書内の他の箇所で述べるように、プライマーセットのプライマーは、望ましくない増幅産物の生成を制限して、単一反応体積でいくつかの標的核酸の増幅及び検出を可能にするために、類似した融解温度（「Ｔｍ」）を有するように設計され得る。加えて、様々な生物のテロメアは異なる反復単位配列を有するので、特定生物のテロメアを増幅するには、異なる各生物の反復単位に特異的なプライマーを用いるだろう。ヒトテロメア配列は、縦列反復核酸配列の直接増幅及び定量化について本発明の実施を例証するために本明細書で使用されるが、本発明は開示される特定の実施形態に限定されない。
【０１５６】
結果として得られるアンプリコンの融解温度（Ｔｍ）を、本明細書に記載される方法における他方のアンプリコンの融解温度を超えるように高くするプライマーもまた開示される。これらのプライマーは、「ＧＣクランプ」を含むプライマーと称され得る。「ＧＣクランプ」は、典型的には、プライマーの３’末端の最後の５塩基内におけるＧまたはＣ塩基の存在を指し、これはＧ塩基とＣ塩基との強力な結合による３’末端での特異的結合を促進するのに役立つ。典型的には、プライマーの３’末端における最後の５塩基中で、Ｇ塩基またはＣ塩基が３つを超えることは回避されるべきである。しかしながら、本明細書に記載される方法では、「ＧＣクランプ」を含むプライマーは、ＧＣクランプを含まない場合の融解温度よりも、得られたＰＣＲ産物（アンプリコン）に高い融解温度を付与する５’タグ配列（ＧＣクランプ）を含むプライマーである。「ＧＣクランプ」を含むプライマーの５’タグ配列は、標的核酸配列のいずれの部分とも相補的ではないプライマー配列の５’末端上にＧＣクランプを含む。「ＧＣクランプ」は、アンプリコンの融解温度を上昇させるためにプライマーの５’末端に連結され得る一連のＧ及びＣヌクレオチドである。ＧＣクランプは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０またはそれを超えるヌクレオチド長であり得る。ＧＣクランプはまた、ＧＣリッチ領域またはＧＣリッチタグに属するものとされ得る。
【０１５７】
ＧＣクランプは、本明細書に記載される方法においてアンプリコンのうち１つのＴｍを上昇させるために使用され得る。アンプリコンのＴｍを上昇させることにより、他方のアンプリコンを完全に融解するのに十分に高い温度で蛍光シグナルを取得することができ、したがって、２つ以上の異なる温度で２つ以上の異なるアンプリコンの蛍光シグナル取得を可能にする。ＧＣクランププライマーは、異なるプライマー上のＧＣクランプが互いに異なることで、増幅反応の中止をもたらす可能性のあるヘアピン形成またはプライマー二量体を防止するように、同じ増幅反応での使用のために設計され得る。
【０１５８】
標的核酸にハイブリダイズされるプライマーは、プライマー伸長が可能でなければならないため、第１及び第２プライマーの改変は、反復単位の非相補的ヌクレオチド上になければならない。したがって、一態様では、第１及び第２プライマーの両方が改変された残基を含む場合、改変は反復単位に隣接するヌクレオチド位置にある。別の態様では、改変は反復単位に隣接しないヌクレオチド位置上に位置する。一般に、隣接するヌクレオチド位置でのミスマッチは、改変されたヌクレオチドと３’末端ヌクレオチドとの間に最大数の塩基対残基または相補的な残基をもたらし、これは短い反復配列（すなわち、３〜６ｂｐ反復）を効率的に増幅するのに重要な場合がある。
【０１５９】
プライマーは、反復に対して実質的に相補的となるように設計され得る。いくつかの態様では、第１プライマーは、反復標的配列に相補的な３つの反復を含有し得、それに応じて、複数のミスマッチが第１プライマー内に導入され得る。さらなる態様では、第２プライマーも反復配列に対してミスマッチを含有するように設計され得るが、第１プライマーにおける最初のいくつかのヌクレオチド（例えば、５〜７つのヌクレオチド）にはミスマッチが存在しないように設計される。したがって、規定された長さのアンプリコンが、上述した第１及び第２プライマーを使用して増幅され得る。それに応じて、産生されるアンプリコンは、プライマー１とプライマー２を足した長さの合計から２つのプライマー間における重複を除いたものとなるだろう。この戦略は、元の設計で生成された複数のアンプリコン長を排除する（Ｃａｗｔｈｏｎ  Ｒ．Ｍ．（２００２）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０，ｅ４７．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／３０．１０．ｅ４７）、
【０１６０】
プライマーの標的核酸に対する相補性は、完全である必要はない。様々な態様では、不完全な相補的配列は、プライマー二量体を回避するために使用され得る。したがって、本明細書での「相補的な」または「実質的に相補的な」とは、プローブが標的配列に対して十分に相補的であって、通常の反応条件下でハイブリダイズするが、プライマー二量体などの偽陽性シグナルを生成しないことを意味する。完全な相補性からの偏差は、偏差がハイブリダイゼーションを完全に妨げるのに十分ではない限り、許容できる。しかしながら、改変または変異の数が、以下に定義されるような最もストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件下でも、ハイブリダイゼーションが生じ得ることのないように十分である場合、配列は相補的な標的配列ではない。
【０１６１】
プライマーは一般に一本鎖であるが、本明細書に記載されるような核酸は、規定されるように一本鎖もしくは二重鎖の場合、または二本鎖もしくは一本鎖配列の両方の部分を含有する場合がある。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであってよく、核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの任意の組合せ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、キサンチンヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン、イノシンなどを含む、塩基の任意の組合せを含有する。本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド」という用語は、ヌクレオチドに加えてヌクレオシド及びヌクレオチド類似体、ならびにアミノ修飾ヌクレオシドなどの修飾ヌクレオシドを含む。加えて、「ヌクレオシド」は、天然に存在しない類似体構造を含む。したがって、例えば、ペプチド核酸の個々の単位は、各々が塩基を含有し、本明細書ではヌクレオチドと称される。
【０１６２】
プライマー核酸のサイズは変動してよく、当業者には理解されるように、一般に５〜５００のヌクレオチド長で変動する。例えば、１０〜１００のヌクレオチド、１２〜７５のヌクレオチド、及び１５〜５０のヌクレオチドのプライマーが、その用途、所要の特異性、及び増幅技術に応じて使用され得る。
【０１６３】
いずれのプライマー対についても、プライマーが互いにハイブリダイズする能力は、第１プライマーと第２プライマーの配列とを整列させることにより検査されてよい。ハイブリッドの安定性、特に熱融解温度（Ｔｍ）は、以下に記載される方法により、及び当該技術分野において周知の方法により決定されてよい。これらとしては、最隣接熱力学計算（Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８８９３−９７（１９８６）；Ｗｅｔｍｕｒ，Ｊ．Ｇ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：２２７−５９（１９９１）；Ｒｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＮＩＨ  Ｒｅｓ．６：７８（１９９４））、Ｗａｌｌａｃｅ  Ｒｕｌｅ推定（Ｓｕｇｇｓ，Ｓ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ「Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌｏｎｅｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｇｅｎｅｓ，Ｄ．Ｂ．Ｂｒｏｗｎ，ｅｄ．，ｐｐ６８３−６９３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８１）、ならびにＢｏｌｔｏｎ及びＭｃＣａｒｔｈｙに基づくＴｍ推定（Ｂａｌｄｉｎｏ，Ｆ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１６８：７６１−７７（１９８９）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １０，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（２００１）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。全ての参考文献は、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。イオン強度、プローブ長、Ｇ／Ｃ含有量、及びミスマッチを含むが、これらに限定されない様々なパラメータの効果が、ハイブリッド安定性を評価する場合に考慮される。これらの因子を考慮することは、当業者に周知である（例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．を参照のこと）。
【０１６４】
本明細書に記載される方法で使用され得るプライマーは、様々な標的核酸を増幅するために使用され得る。単一プライマーセット、例えばプライマー対は、単一標的核酸を増幅するために使用されてよい。別の実施形態では、複数のプライマーセットが、複数の標的核酸を増幅するために使用されてよい。増幅は、特有の各プライマーセットについて別々に、またはマルチプレックスとして当該技術分野において一般に既知の、プライマーセットの組合せを使用して単一反応容器中で実施されてよい。複数のプライマーセットが単一反応で使用される場合、プライマーは、望ましくない産物の形成を制限し、かつ各プライマーセットのプライマー間における干渉を制限するように設計される。
【０１６５】
一般のＰＣＲ増幅反応は、上述のように当該技術分野において周知の手順により実施され得る（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号明細書及び第４，６８３，２０２号明細書を参照のこと）。プライマー伸長ステップの時間及び温度は、増幅されている標的核酸のポリメラーゼ、長さ、及び増幅に用いられるプライマー配列に依存するだろう。標的核酸を十分に増幅するのに必要な繰り返しステップ数は、各サイクルの増幅効率及び標的核酸の開始コピー数に依存するだろう。当該技術分野において周知の通り、これらのパラメータは、所望のレベルの増幅を達成するように当業者によって調整され得る。当業者は、本発明が、増幅プロセスで適用される時間、温度、緩衝液条件、及び増幅サイクルの変動によって限定されることはないと理解するだろう。
【０１６６】
プライマーを標的核酸にハイブリダイズする場合及び開示される増幅反応では、アッセイは、標的核酸の存在下でハイブリッドの形成を可能にするストリンジェンシー条件下で一般に行われる。当業者は、温度、塩濃度、ｐＨ、有機溶媒、カオトロピック剤、またはその他の変数のパラメータを変更して、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを制御し、またプライマーと非特異的標的とのハイブリダイゼーションを最小限に抑えることができる（すなわち、「ホットスタート」ＰＣＲまたは「タッチダウン」ＰＣＲを使用して）。
【０１６７】
いくつかの態様では、プライマーは、検出可能な標識を含み得る。いくつかの態様では、プライマー対またはプライマーセットの１つのプライマーまたは両方のプライマーが、検出可能な標識を含み得る。
【０１６８】
本明細書に記載される方法を実行するためのキットもまた、本明細書で開示される。例えば、本明細書に記載されるプライマーセットのうち１つ以上を含むキットが、本明細書に開示される。いくつかの態様では、キットは、第１フォワードプライマー及び第１リバースプライマーを含み得、第１フォワードプライマーは、アニーリング条件下でテロメア反復配列にハイブリダイズする３’部分を含み；ここで第１リバースプライマーは、テロメア反復配列にハイブリダイズしないアンカー配列を有する５’部分を含む。
【０１６９】
キットはまた、増幅産物の増幅及び分析を実施するための緩衝液、酵素、及び容器を含んでよい。
【０１７０】
いくつかの態様では、キットは、本明細書に記載される検出標識、ポリメラーゼまたは標的核酸のうち１つ以上を含み得る。
【０１７１】
さらに、本明細書に記載されるキットは、本明細書に記載される方法に加えて指示を実施するのに必要な任意の製品及び試薬を含み得る。
【０１７２】
６．テロメア長と臨床状態または最適な治療レジメンとの相関関係
ゲノムＤＮＡから決定される染色体末端当たりの平均テロメア長は、全体的なテロメア存在量の尺度であり、これは、いくつかの重要な生物学的指標と相関することが示されている。これらの指標としては、例えば、様々な疾患状態のリスク、例えば、心血管リスク、癌リスク、肺線維症リスク、感染症リスク、及び死亡リスクが挙げられる。テロメアの存在量は、暦年齢、体格指数、臀部／重量比、及び自覚ストレスとも相関する。平均テロメア長または存在量の１つの測定値は、テロメア／単一コピー（「Ｔ／Ｓ」）比である。所与の集団におけるこのような比は、分位数に、例えば、三分位数または四分位数に分割され得る。より低い２つの三分位におけるＴ／Ｓ比によるテロメア存在量を有する個体は、テロメア長の最高三分位における個体よりも心血管疾患のリスクが有意に高いことが見出された。
【０１７３】
開示される方法では、Ｔ／Ｓ比の「Ｓ」は、少なくとも２つの低コピー数遺伝子の平均長または存在量の平均値を表す。さらなる態様では、Ｔ／Ｓ比の「Ｓ」は、少なくとも２つの単一コピー遺伝子の平均長または存在量の平均値を表す。よりさらなる態様では、Ｔ／Ｓ比の「Ｓ」は、２つの低コピー数遺伝子の平均長または存在量の平均値を表す。さらなる態様では、Ｔ／Ｓ比の「Ｓ」は、２つの単一コピー遺伝子の平均長または存在量の平均値を表す。
【０１７４】
一般に、平均テロメア長または存在量の百分位測定値、例えば、参照集団の百分率として表されるＴ／Ｓ値（典型的には、テロメア長の最高三分位数または四分位数）は、集団において疾患のリスクと負に相関する、すなわち、平均テロメア長または存在量の増加は、より低い疾患もしくは死亡リスクまたは健康度合いの改善と関連する一方で、より低い百分位数スコアは、健康度合いの低下、ならびに死亡及び疾患リスクの増加と一般に関連し、これには「テロメア病」の存在を含み、このテロメアは、テロメラーゼ活性または機能に負の影響を与える遺伝子の変異または交代ゆえに遺伝的に短い。
【０１７５】
集団では、テロメア長は一般に年齢と共に減少する。したがって、個体の平均テロメア長または存在量の測定値は、集団内の同じ年齢範囲における人、すなわち、年齢適合集団における人の測定値と比較され得る。例えば、３０歳の人は、３０歳の集団平均にほぼ等しい、または２０歳もしくは４０歳の集団平均にほぼ等しいテロメア存在量の測定値を有する場合がある。平均テロメア長または存在量の測定値と健康度合いとの相関関係は、年齢及び性別適合集団の測定値と比較した場合に、より有用であり得る。年齢適合集団の範囲は、例えば、１歳、２歳、３歳、４歳、５歳、７歳もしくは１０歳または最大８０歳以上であり得る。
【０１７６】
本開示の方法によって対象試料から決定される変化した平均テロメア長または存在量は、健康度合いと相関し得る。特に興味深いのは、自覚ストレスに関与する健康度合いである。明らかなテロメア短縮が、ストレスの複数の形態、例えば酸化的損傷、生化学的ストレス因子、慢性炎症及びウイルス感染などを含む、遺伝的及び環境因子によって促進され得る（Ｅｐｅｌ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００４，４９：１７３１２−１５）。全身の健康状態の便利な尺度は、Ｊｏｈｎ  Ｗａｒｅにより開発されたＳＦ−３６（登録商標）Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｕｒｖｅｙである（例えば、ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ＵＲＬ  ｓｆ−３６．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ＳＦ３６．ｓｈｔｍｌを参照のこと）。ＳＦ−３６は、好ましくは訓練を受けた個人によって患者に提起される３６の質問のみを含む多目的、短文式健康調査である。これは、機能的健康及び主観的健康スコアの８段階プロファイルに加えて、精神測定に基づく身体的及び精神的健康要約尺度ならびに選好に基づく健康効用指標を提供する。ＳＦ−３６調査は、疾患負担を推定し、疾患特異的ベンチマークを一般集団基準と比較するために使用される。最も頻繁に研究される疾患及び状態としては、関節炎、背痛、癌、心血管疾患、慢性閉塞性肺疾患、うつ病、糖尿病、胃腸疾患、片頭痛、ＨＩＶ／ａｉｄｓ、高血圧、過敏性腸症候群、腎疾患、腰痛、多発性硬化症、筋骨格状態、神経筋状態、変形性関節症、精神科診断、関節リウマチ、睡眠障害、脊髄損傷、脳卒中、薬物乱用、外科的処置、移植及び外傷が挙げられる（Ｔｕｒｎｅｒ−Ｂｏｗｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＦ−３６（登録商標）Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｕｒｖｅｙ＆「ＳＦ」Ｂｉｂｌｉｏｇｒａｐｈｙ：Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８８−２０００），ＱｕａｌｉｔｙＭｅｔｒｉｃ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＲＩ，２００２）。当業者は、全身の健康状態に関するその他の調査方法、例えば、ＲＡＮＤ−３６が本開示において用途を見出してよいと理解するだろう。
【０１７７】
本開示の一態様では、対象試料は経時的に収集され、変化した平均テロメア長または存在量の測定値は、試料から決定される。複数試料の収集についての適切な期間としては、１か月、３か月、６か月、１年、２年、５年及び１０年（例えば、最も初期の試料と最後の試料との間の時間は、ほぼこれらの期間であり得る）が挙げられるが、これらに限定されない。本方法は、患者の全身の健康状態を改善する、及び／または患者の健康状態及び／または疾患リスクをモニターする患者の取り組みのモニタリングを可能にする。短縮したテロメアが、細胞死または癌の発生もしくは進行に寄与し得るゲノム不安定性を誘発し得るため、個体内で短縮したテロメア長の割合が低下している、または経時的に維持されているという知見は健康改善を示すが、短縮したテロメア割合の経時的な増加は、健康の低下または悪化を表す。
【０１７８】
テロメアの反復単位数を測定することは、例えば、疾患リスク、疾患予後、及び治療薬についての医学的診断において多種多様な応用を有する。特に、テロメア長の測定は、疾患のリスクを招く病態の評価に応用を見出す。本開示の一態様では、疾患は老化と関連するものであり、例えば心血管疾患、糖尿病、癌、肝線維症、及びうつ病であるが、これらに限定されない。
【０１７９】
一態様では、本開示は、同種移植造血幹細胞ドナー選択の方法に関し、本方法は：（ａ）１人以上のＨＬＡ適合候補ドナー対象から試料を得ること；（ｂ）開示される方法により、ＨＬＡ適合ドナー対象の各々について第１アンプリコンの平均テロメア長または存在量を決定すること；（ｃ）１人以上のドナー対象を、年齢適合対照について上位第２５百分位数、上位第５０百分位数、または上位第７５百分位数における平均テロメア長または存在量で同定すること；（ｄ）同定したドナー対象から移植可能な造血幹細胞試料を得ること；及び（ｅ）造血幹細胞試料をレシピエント対象に移植することを含む。
【０１８０】
一態様では、本開示は、同種移植造血幹細胞ドナー選択の方法に関し、本方法は：（ａ）１人以上のＨＬＡ適合候補ドナー対象から試料を得ること；（ｂ）開示される方法により、ＨＬＡ適合ドナー対象の各々について第１アンプリコンの平均テロメア長または存在量を決定すること；（ｃ）１人以上のドナー対象を、年齢適合対照について上位第２５百分位数における平均テロメア長または存在量で同定すること；（ｄ）同定したドナー対象から移植可能な造血幹細胞試料を得ること；及び（ｅ）造血幹細胞試料をレシピエント対象に移植することを含む。
【０１８１】
一態様では、本開示は、同種移植造血幹細胞ドナー選択の方法に関し、本方法は：（ａ）１人以上のＨＬＡ適合候補ドナー対象から試料を得ること；（ｂ）開示される方法により、ＨＬＡ適合ドナー対象の各々について第１アンプリコンの平均テロメア長または存在量を決定すること；（ｃ）１人以上のドナー対象を、年齢適合対照について上位第５０百分位数における平均テロメア長または存在量で同定すること；（ｄ）同定したドナー対象から移植可能な造血幹細胞試料を得ること；及び（ｅ）造血幹細胞試料をレシピエント対象に移植することを含む。
【０１８２】
一態様では、本開示は、同種移植造血幹細胞ドナー選択の方法に関し、本方法は：（ａ）１人以上のＨＬＡ適合候補ドナー対象から試料を得ること；（ｂ）開示される方法により、ＨＬＡ適合ドナー対象の各々について第１アンプリコンの平均テロメア長または存在量を決定すること；（ｃ）１人以上のドナー対象を、年齢適合対照について上位第７５百分位数における平均テロメア長または存在量で同定すること；（ｄ）同定したドナー対象から移植可能な造血幹細胞試料を得ること；及び（ｅ）造血幹細胞試料をレシピエント対象に移植することを含む。
【０１８３】
さらなる態様では、レシピエント対象は、癌、心血管疾患と診断されている、または骨髄移植が必要であると診断されている。
【０１８４】
さらなる態様では、レシピエント対象は、癌と診断されている。よりさらなる態様では、癌は白血病またはリンパ腫である。またさらなる態様では、癌は神経芽細胞腫である。一層さらなる態様では、癌は多発性骨髄腫である。
【０１８５】
さらなる態様では、レシピエント対象は、放射線療法及び／または化学療法処置を受けている。よりさらなる態様では、レシピエント対象は寛解期にある。
【０１８６】
さらなる態様では、造血幹細胞試料は、同定されたドナー対象から得られる骨髄を含む。よりさらなる態様では、造血幹細胞試料は、同定されたドナー対象から得られる末梢血幹細胞を含む。
【０１８７】
一態様では、本開示は、心血管疾患の評価及びモニタリングに用途を見出す。白血球のテロメア長は、血管造影法により決定されるような正常な冠動脈を有する個体におけるものよりも、重篤な三枝冠動脈疾患を有する患者においてより短くなることが示され（Ｓａｍａｎｉ，Ｎ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，２００１，３５８：４７２−７３）、また５０歳未満で早発性心筋梗塞に罹患する患者においても、このような病歴のない年齢及び性別適合個体と比較してより短くなることが示された（Ｂｒｏｕｉｌｅｔｔｅ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｅ．Ｂｉｏｌ．，２００３，２３：８４２−４６）。Ｂｒｏｕｉｌｅｔｔｅら（Ｌａｎｃｅｔ，２００７，３６９：１０７−１４）は、冠動脈心疾患にかかりやすい人々のより短い白血球テロメアが、テロメア長に対するその他の心血管リスク因子の蓄積効果を示し得ることを示唆した。酸化ストレスの増加も、アテローム性動脈硬化症に寄与し、酸化体ストレスの増加は、インビトロにおけるテロメア消耗の速度を増加させることが示された（Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｄ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，１９９８，１４（ｓｕｐｐｌ  Ｄ）：３０Ｄ−３２Ｄ；ｖｏｎ  Ｚｇｌｉｎｉｃｋｉ，Ｔ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２０００，９０８：９９−１１０）。横断的研究では、喫煙、体格指数、及び１型糖尿病が、より短い白血球テロメア長と関連するとも報告されている（Ｖａｌｄｅｓ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，２００５，３６６：６６２−６４；Ｊｅａｎｃｌｏｓ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９９８，４７：４８２−８６）。生活ストレスの増加、すなわち冠動脈心疾患のリスクを増加させることで知られるこの因子は、場合により酸化ストレス増加の結果として、より短いテロメアと関連することが示された（Ｅｐｅｌ，２００４，同上）。したがって、喫煙者ならびに体格指数の高い、糖尿病に罹患している、及び／または生活ストレスが増加している患者は全て、本開示の方法による患者らのテロメア存在量の決定及び継続的なモニタリングから恩恵を受けるだろう。
【０１８８】
２型糖尿病は、より短いテロメアを特徴とする（Ｓａｌｐｅａ，Ｋ．及びＨｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｓ．Ｅ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，２０１０，２０９（ｌ）：３５−３８）。より短いテロメアは、１型糖尿病患者でも観察されている（Ｕｚｉｅｌ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ，２００７，４２：９７１−９７８）。１型糖尿病における疾患の病因は、２型における病因とはいくらか異なるが、どちらの場合もベータ細胞不全が本格的な疾患への最後の引き金である。したがって、テロメア長は、それが疾患の進行と関連するため、糖尿病の有用なマーカーである。Ａｄａｉｋａｌａｋｏｔｅｓｗａｒｉら（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，２００７，１９５：８３−８９）は、テロメアが、対照と比較して前糖尿病耐糖能異常を有する患者ではより短いことを示した。加えて、テロメア短縮は、糖尿病合併症、例えば糖尿病性腎症（Ｖｅｒｚｏｌａ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２００８，２９５：Ｆ１５６３−１５７３）、微量アルブミン尿（Ｔｅｎｔｏｌｏｕｒｉｓ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，２００７，３０：２９０９−２９１５）、及び上皮癌（Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，２００６，４９：１７２６−１７３１）などに関連しているが、テロメア短縮は、十分に制御された糖尿病患者では減弱されるように思われる（Ｕｚｉｅｌ，２００７，同上）。本開示の方法は、前糖尿病及び糖尿病患者の状態をモニターして、これらの合併症及びその他のものについての早期警告を提供するのに特に有用である。
【０１８９】
本開示は、テロメラーゼ活性の活性化が細胞の不死化と関連するため、様々な種類の癌細胞におけるテロメア長を決定するのに有用である。正常なヒト体細胞はテロメラーゼを発現しない、または一過的に発現するにすぎず、それゆえ各細胞分裂でそれらのテロメアを短縮してしまうが、大半のヒト癌細胞は、典型的には高レベルのテロメラーゼを発現し、無制限な細胞増殖を示す。高テロメラーゼ発現は、細胞が増殖して長期に拡大することを可能にし、それゆえ腫瘍成長を支持する（Ｒｏｔｈ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｕ．Ｍ．Ｍａｒｔｅｎｓ（ｅｄ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，２０１０，ｐｐ．２２１−２３４）。より短いテロメアは、癌のリスク、特に膀胱及び肺、喫煙関連、消化器系ならびに泌尿生殖器系の癌のリスクと有意に関連する。過剰なテロメア短縮は、おそらく腫瘍の発症及び進行を促進する役割を果たす（Ｍａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１１，６（６）：ｅ２０４６６．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２０４６６）。研究は、乳癌リスクに対する短縮したテロメアの効果が、一定の集団サブグループ、例えば閉経前の女性及び抗酸化能が不十分な女性などで有意であることをさらに示した（Ｓｈｅｎ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２００９，１２４：１６３７−１６４３）。一般に癌を評価してモニターすることに加えて、本開示は、唾液試料に由来するゲノムＤＮＡが利用される場合、口腔癌のモニタリングに特に有用である。
【０１９０】
肝硬変は、多くの場合に有意な炎症性浸潤と関連する器官の線維症の増加を特徴とする。Ｗｉｅｍａｎｎら（ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２００２，１６（９）：９３５−９８２）は、テロメア短縮が、ヒトにおける肝硬変の疾患及び年齢に依存しない徴候であることを示した。テロメア短縮は、ウイルス性肝炎（慢性Ａ型肝炎及びＢ型肝炎）、中毒性肝障害（アルコール中毒症）、自己免疫、ならびに胆汁鬱帯（ＰＢＣ及びＰＳＣ）により誘導される肝硬変中に存在し；テロメアは、患者の年齢に依存しない肝硬変で一様に短い。テロメア短縮及び老化は、硬変肝における肝細胞に特に影響を及ぼし、両方のパラメータは、肝硬変中における線維症の進行と強く相関する。したがって、本開示の方法は、肝線維症の診断及びモニタリングに用途を見出す。
【０１９１】
うつ病は「促進老化」の状態に例えられて、うつ状態の個体は、老化に関する様々な疾患、例えば心血管及び脳血管疾患、メタボリックシンドローム、及び認知症などの発生率がより高い。再発性うつ病に罹患している人々または慢性ストレスにさらされている人々は、白血球でより短いテロメアを示す。より短いテロメア長は、再発性うつ病及び慢性ストレスへの曝露を表すコルチゾールレベルの両方と関連する（Ｗｉｋｇｒｅｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈ．，２０１１，ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｐｓｙｃｈ．２０１１．０９．０１５）。しかしながら、生涯を通じてうつ病エピソードには大きなばらつきがあるため、うつ状態の全ての個体が、短縮したテロメアを等しく示すというわけではない。長期間うつ病に罹患した人々は、対照集団と比較した場合、心理的ストレスにより誘導される酸化ストレス及び炎症に対してより長くさらされてきたために、有意により短いテロメアを有する（Ｗｏｌｋｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１１，６（３）：ｅ１７８３７）。したがって、本開示の方法は、うつ病のモニタリングに用途を見出してよい。
【０１９２】
異常なテロメア長は、ＨＩＶ（Ｅｆｆｒｏｓ  ＲＢ  ｅｔ  ａｌ，ＡＩＤＳ．１９９６  Ｊｕｌ；１０（８）：Ｆ１７−２２，Ｐｏｍｍｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９９７，２３１（１）：１４８−５４）、ならびにＨＢＶ、ＨＣＶ及びＣＭＶ（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ／ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｅｓｓ．（Ｅｆｆｒｏｓ  ＲＢ，Ｅｘｐ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．２０１１  Ｆｅｂ−Ｍａｒ；４６（２−３）：１３５−４０．Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．２０１１  Ｆｅｂ；１４（１）：４５−５６．ｄｏｉ：１０．１０８９ｒｅｊ．２０１０．１０８５．Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ｓｅｐ  ７．）を含む、慢性感染症と関連する。
【０１９３】
Ｈａｒｌｅｙら（「Ａ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ａｓ  ｐａｒｔ  ｏｆ  ａ  ｈｅａｌｔｈ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｐｒｏｇｒａｍ」，Ｈａｒｌｅｙ  ＣＢ，Ｌｉｕ  Ｗ，Ｂｌａｓｃｏ  Ｍ，Ｖｅｒａ  Ｅ，Ａｎｄｒｅｗｓ  ＷＨ，Ｂｒｉｇｇｓ  ＬＡ，Ｒａｆｆａｅｌｅ  ＪＭ，Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．２０１１  Ｆｅｂ；１４（ｌ）：４５−５６）では、ＣＭＶ血清陽性であった個体が、ＣＭＶ陰性であった個体よりも短いテロメアを有し、さらにＣＭＶ陽性対象は、ＴＡ−６５、すなわち天然物由来テロメラーゼ活性化因子とその他の補給剤との栄養補給剤プログラムに応答する可能性が高く、老化ＣＤ８＋／ＣＤ２８−細胞の存在量を減少させたことが見出され、このことは、テロメラーゼ活性化因子またはより長いテロメアをもたらすその他の薬剤の投与と組み合わせた、短いテロメアの平均テロメア長または存在量を測定するためのコンパニオン診断用途を示唆する。
【０１９４】
平均テロメア長の測定は、予後疾患進行及び処置結果の指標として使用され得る。
【０１９５】
１つの研究では、ＣＤ４＋細胞におけるテロメア長が、慢性ＨＣＶ感染症を有する患者の炎症度、線維症ステージ、重症度の実験室指標、その後の肝代償不全及び処置結果に関連すると報告した（Ｈｏａｒｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．，２０１０，５３（２）：２５２−２６０）。
【０１９６】
別の報告では、より長い白血球テロメア長は、Ｂ型肝炎ウイルス関連肝細胞癌腫のリスク増加を予測する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１１，１１７（１８）：４２４７−５６。）
【０１９７】
ＨＩＶの場合では、テロメア短縮は、ウイルス感染により引き起こされる。加えて、ＨＩＶを処置するために使用されるヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤は、テロメラーゼ阻害剤である（Ｓｔｒａｈｌ及びＢｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１９９６，１６（１）：５３−６５；Ｈｕｋｅｚａｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１２，７（１１）：ｅ４７５０５）。短いテロメア存在量の測定は、ＨＡＡＲＴ処置の副作用及び有効性を決定するのに役立つ場合がある。
【０１９８】
本開示は、老化の早期発症に関連する疾患の診断にも用途を見出す。例えば、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア疾患を有する個体は、テロメア長の喪失と関連する早期老化及び線維芽細胞における増殖能の減少を示す（Ａｌｌｓｏｐｐ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９：１０１１４−１０１１８）。本開示の方法によるテロメア反復の増幅及びテロメア反復数の定量化は、上記の通りに疾患リスクまたは予後を決定し、適切な介入ステップを進めるのに有用である。
【０１９９】
本開示の一態様では、テロメア特異的疾患の存在及び進行の両方が、試料を使用して決定されてよい。テロメア病は、テロメアの異常短縮または早発性短縮と関連し、これは例えば、テロメラーゼ活性の欠陥に起因し得る。テロメラーゼは、真核生物におけるテロメアＤＮＡの複製及び保護に必要なリボ核タンパク質複合体である。テロメラーゼを欠く細胞は、生存能の喪失を生じるテロメアＤＮＡの進行性喪失及びそれに付随するゲノム不安定性の増加を経験する。これらの疾患は遺伝性であって、先天性再生不良性貧血の特定の形態を含む場合があり、骨髄の幹細胞における不十分な細胞分裂が重篤な貧血を招く。皮膚及び肺の特定の遺伝性疾患も、テロメラーゼ欠陥により引き起こされる。テロメア病については、Ｔ／Ｓ＜０．５の閾値が、いくつかの状態に適切である。また、一般的に使用される測定基準は、正常集団に対して＜１０％未満または好ましくは＜１％の年齢調整百分位数テロメアスコアである。
【０２００】
先天性角化異常症（ＤＫＣ）は、Ｚｉｎｓｓｅｒ−Ｅｎｇｍａｎ−Ｃｏｌｅ症候群としても知られ、皮膚粘膜異常：網状皮膚色素沈着過剰、爪ジストロフィー、及び口腔白板症を特徴とする稀な進行性骨髄不全症候群である（Ｊｙｏｎｏｕｃｈｉ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１１，２２（３）：３１３−９；Ｂｅｓｓｌｅｒ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，２００７，９２（８）：１００９−１２）。この障害では、テロメラーゼ機能不全、リボソーム欠損、及びタンパク質合成機能不全についての証拠が存在する。早期死亡率は、骨髄不全、感染症、致命的な肺合併症、または悪性腫瘍と多くの場合に関連する。疾患は、３つの種類：常染色体優性、常染色体劣性、または最も一般的な形態のＸ連鎖性劣性（ＤＣに関与する遺伝子が、Ｘ染色体上に保持される場合）のうち１つで遺伝する。本開示の方法を使用する疾患進行の早期診断及び測定は、アナボリックステロイドまたは骨髄刺激薬物での早期処置が骨髄不全の予防に役立ち得るため、これらの遺伝的特徴を有する家族に非常に有益である。本開示の非侵襲的で患者に優しい唾液試験方法は、乳児及び小さな子供が試験及び継続的なモニタリングを必要とするため、ＤＫＣに特に有用である。
【０２０１】
特発性間質性肺炎は、線維症及び炎症の組合せによる肺実質への損傷を特徴とする。特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、肺の進行性瘢痕化を引き起こすこれらの疾患の一例である。線維性瘢痕組織は経時的に肺に蓄積して、十分な酸素を体に提供するそれらの能力に影響を及ぼす。テロメラーゼ遺伝子のＴＥＲＴ及びＴＥＲＣのコード領域におけるヘテロ接合変異が、特発性間質性肺炎の家族性及び散発性症例に見出されている。変異の影響を受けた全ての患者が、短いテロメアを有する。ＩＰＦを有する個体の有意な部分が、テロメラーゼにおける変異のコーディングでは説明できない短いテロメア長を有する（Ｃｒｏｎｋｈｉｔｅ，Ｊ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，２００８，１７８：７２９−７３７）。したがって、テロメア短縮は、この年齢に関連した疾患に対する高い素因のマーカーとして使用され得る（Ａｌｄｅｒ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００８，１０５（３５）：１３０５１−１３０５６）。さらに、ＩＰＦの経過は人によって異なる。ある人々では、疾患は、長年にわたってゆっくりと徐々に進行する場合もあるが、その他の人々では、疾患が急速に進行する場合もある。現在の方法は、上記の通りに肺線維症の経過をモニターし、適切な介入ステップを進めるために便利に使用されてよい。
【０２０２】
再生不良性貧血は、骨髄が体に対する十分な赤血球、白血球及び血小板の作製を止めてしまう疾患である。骨髄が作製するいずれの血液細胞も正常ではあるが、これらの量が十分ではない。再生不良性貧血は、中等症、重症または非常に重症であり得る。重症または非常に重症な再生不良性貧血を有する人々は、生命を脅かす感染症または出血のリスクがある。短いテロメアを有する、またはテロメラーゼ変異を保持している再生不良性貧血の患者は、骨髄異形成ならびに染色体異常及び癌を招くゲノム不安定性を生じるリスクが増加している（Ｃａｌａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ（２０１１），１−８）。
【０２０３】
テロメラーゼ欠損は、造血幹細胞において様々な程度のテロメア短縮を引き起こし、染色体不安定性及び悪性形質転換を招く可能性がある（Ｃａｌａｄｏ，Ｒ．Ｔ．及びＹｏｕｎｇ，Ｎ．Ｓ．，Ｔｈｅ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｓｔ，２０１０  ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ＵＲＬ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｓｔ／２０１０／４８４９．ａｓｐｘ）。より短いテロメアを有する再生不良性貧血患者は、より低い生存率を有し、より長いテロメアを有する患者よりも免疫療法後に再発する可能性がはるかに高い。Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇら（ＪＡＭＡ，２０１０，３０４（１２）：１３５８−１３６４）は、テロメア長が増加するにつれて再発率が低下したことを見出した。最も短いテロメアを有する患者の群は、骨髄癌への転換についても大きなリスクがあり、最も低い全生存率を有した。本開示の方法は、再生不良性貧血患者において重大な合併症を発症するリスクをモニターすることで、個体の臨床管理がそれに応じて調整されてよいように使用され得る。
【０２０４】
別の態様では、本開示は、治療薬の有効性のモニタリングに、またはテロメア長もしくはテロメラーゼ活性に影響を及ぼす薬物候補についてのスクリーニングに有用である。テロメアの特徴をモニターする能力は、特定の療法及び薬剤の有効性を検査するためのウィンドウを提供し得る。個体における特定の療法に対する疾患状態の薬物応答性は、本開示の方法により決定され得る。例えば、本開示は、細胞の増殖能がテロメア完全性の維持に関連するため、癌療法の有効性のモニタリングに用途を見出す。上記の通り、正常なヒト体細胞はテロメラーゼを発現しない、または一過的に発現するにすぎず、それゆえ各細胞分裂でそれらのテロメアを短縮してしまうが、大半のヒト癌細胞は、典型的には高レベルのテロメラーゼを発現し、無制限な細胞増殖を示す。Ｒｏｔｈら（同上、２０１０）は、個体の腫瘍において非常に短いテロメア（大半の細胞における最も短いテロメアが、ほぼテロメア機能不全である）及び高テロメラーゼ活性を有する癌に罹患した個体が、抗癌テロメラーゼ阻害薬物から最も多くの恩恵を受ける可能性があることを示唆した。テロメラーゼは、大半の正常細胞において発現されない、または一過的かつ非常に低レベルで発現されるかのいずれかであるため、テロメラーゼ阻害療法は、正常細胞に対して従来の化学療法よりも毒性が少ない可能性がある。このような薬物の一例は、短いオリゴヌクレオチドに基づくテロメラーゼ阻害剤のイメテルスタット（以前にＧＲＮ１６３Ｌと命名された）である。イメテルスタットは、第１世代オリゴヌクレオチドＧＲＮ１６３の新しい脂質ベースの複合体である（Ａｓａｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００３，６３：３９３１−３９３９）。しかしながら、正常な血液細胞（特にそれらの顆粒球）において非常に短いテロメアを有する癌患者は、骨髄などの増殖組織に対するイメテルスタットの有害作用のリスクがより高い。Ｒａｔｔａｉｎら（２００８）は、短い顆粒球テロメア長を有するこのような対象は、好中球減少または血小板減少などの骨髄不全症状を有する可能性が高かったことを見出した。この状況では、医師は、より低用量のイメテルスタット、異なる薬物を処方する、または骨髄問題についてより頻繁にモニターする場合がある。
【０２０５】
その他の態様では、老化の疾患、例えばこれらに限定されないが、心血管疾患、糖尿病、肺線維症、肝線維症、間質性肺炎及びうつ病の処置における薬効。心血管疾患の場合には、Ｂｒｏｕｉｌｅｔｔｅらは、対照群よりも短いテロメア長を有する中年男性が、プラバスタチンによる脂質低下療法から最も多くの恩恵を受けると報告した（Ｂｒｏｕｉｌｅｔｔｅ，Ｓ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，２００７，３６９：１０７−１１４）。Ｓａｔｏｈら（Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．，２００９，１１６：８２７−８３５）は、集中的な脂質低下療法が、適度なプラバスタチン療法で処置された患者と比較した場合に、アトルバスタチンで処置された患者においてテロメアを侵食から良好に保護したことを示す。本開示の方法は、処置された患者におけるスタチンの有効性をモニターするために使用され得、より短いテロメア長が良好な薬効と相関する。最も長いテロメアを有する対象は、平均して予防的スタチンから恩恵を受けることがなかったので、医師は、患者が自身の処置プログラムの一部として適切な生活習慣を特に遵守するように提案する場合がある。逆に、慢性的なスタチン使用の副作用を恐れる短いテロメアを有する患者は、スタチンから恩恵を受ける自身のより高い可能性に基づいてスタチンを服用するように勧められる場合がある。使用され得るスタチンの例としては、ナイアシン（ＡＤＶＩＣＯＲ、ＳＩＭＣＯＲ）、ロバスタチン（ＡＬＴＯＰＲＥＶ、ＭＥＶＡＣＯＲ）、アモロピジン（ａｍｏｌｏｐｉｄｉｎｅ）（ＣＡＤＵＥＴ）、ロスバスタチン（ＣＲＥＳＴＯＲ）、シタグリプチン／シンバスタチン（ＪＵＶＩＳＹＮＣ）、フルバスタチン（ＬＥＳＣＯＬ）、プラバスタチン（ＰＲＡＶＡＣＨＯＬ）、アトルバスタチン（ＬＩＰＩＴＯＲ）、ピタバスタチン（ＬＩＶＡＬＯ）、及びエゼチミブ／シンバスタチン（ＶＹＴＯＲＩＮ）が挙げられる。
【０２０６】
一態様では、本開示は、心血管疾患リスクの再分類の方法に関し、本方法は：（ａ）対象から試料を得ることであって、対象は、低強度スタチン療法について２０１３  ＡＣＣ／ＡＨＡ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ基準を満たすと診断されていること；（ｂ）開示される方法により、試料における第２及び第３アンプリコンの平均存在量と比較して第１アンプリコンの平均長または存在量を決定すること；（ｃ）試料が、年齢適合対照について下位第２５百分位数、下位第５０百分位数、または下位第７５百分位数における第２及び第３アンプリコンの平均存在量と比較して第１アンプリコンの平均長または存在量を有すると決定されている場合に、より高い心血管リスクがあると対象を診断すること；ならびに（ｄ）より高い心血管リスクがあると診断された対象に：（ｉ）修正されたスタチン療法；及び／または（ｉｉ）心血管疾患を処置することで知られる第２治療剤を投与することを含む。
【０２０７】
一態様では、本開示は、心血管疾患リスクの再分類の方法に関し、本方法は：（ａ）対象から試料を得ることであって、対象は、低強度スタチン療法について２０１３  ＡＣＣ／ＡＨＡ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ基準を満たすと診断されていること；（ｂ）開示される方法により、試料における第２及び第３アンプリコンの平均存在量と比較して第１アンプリコンの平均長または存在量を決定すること；（ｃ）試料が、年齢適合対照について下位第２５百分位数における第２及び第３アンプリコンの平均存在量と比較して第１アンプリコンの平均長または存在量を有すると決定されている場合に、より高い心血管リスクがあると対象を診断すること；ならびに（ｄ）より高い心血管リスクがあると診断された対象に：（ｉ）修正されたスタチン療法；及び／または（ｉｉ）心血管疾患を処置することで知られる第２治療剤を投与することを含む。
【０２０８】
一態様では、本開示は、心血管疾患リスクの再分類の方法に関し、本方法は：（ａ）対象から試料を得ることであって、対象は、低強度スタチン療法について２０１３  ＡＣＣ／ＡＨＡ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ基準を満たすと診断されていること；（ｂ）開示される方法により、試料における第２及び第３アンプリコンの平均存在量と比較して第１アンプリコンの平均長または存在量を決定すること；（ｃ）試料が、年齢適合対照について下位第５０百分位数における第２及び第３アンプリコンの平均存在量と比較して第１アンプリコンの平均長または存在量を有すると決定されている場合に、より高い心血管リスクがあると対象を診断すること；ならびに（ｄ）より高い心血管リスクがあると診断された対象に：（ｉ）修正されたスタチン療法；及び／または（ｉｉ）心血管疾患を処置することで知られる第２治療剤を投与することを含む。
【０２０９】
一態様では、本開示は、心血管疾患リスクの再分類の方法に関し、本方法は：（ａ）対象から試料を得ることであって、対象は、低強度スタチン療法について２０１３  ＡＣＣ／ＡＨＡ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ基準を満たすと診断されていること；（ｂ）開示される方法により、試料における第２及び第３アンプリコンの平均存在量と比較して第１アンプリコンの平均長または存在量を決定すること；（ｃ）試料が、年齢適合対照について下位第７５百分位数における第２及び第３アンプリコンの平均存在量と比較して第１アンプリコンの平均長または存在量を有すると決定されている場合に、より高い心血管リスクがあると対象を診断すること；ならびに（ｄ）より高い心血管リスクがあると診断された対象に：（ｉ）修正されたスタチン療法；及び／または（ｉｉ）心血管疾患を処置することで知られる第２治療剤を投与することを含む。
【０２１０】
さらなる態様では、テロメア病、例えばこれらに限定されないが、先天性角化異常症、肺線維症、及び再生不良性貧血の処置における薬物有効性が、測定されてよい。例えば、先天性角化異常症及び肺線維症の両方とも、高用量ステロイドで処置され、このステロイドは多数の有害な副作用を有することが周知である。したがって、可能な限り最低用量のステロイドを使用することが、本開示の方法を、これらの患者をモニターするための有益なツールとするには大変望ましい。
【０２１１】
別の態様では、本開示は、候補薬物、栄養補助食品、及びテロメラーゼ活性などのテロメア長を調節する生物学的経路に影響を及ぼす生活様式の変化を含む、その他の介入についてのスクリーニングに関する一般的な方法としての用途を見出す。定量的手法でテロメア反復を迅速かつ特異的に増幅する能力は、細胞のテロメア動態に影響を及ぼす小分子、候補核酸、及びペプチド薬剤ならびにその他の製品または介入を同定するハイスループットスクリーニング方法を提供する。正常細胞に対してテロメアを伸長させる正の効果を有する薬物またはその他の製品候補は、テロメア短縮（またはテロメラーゼ阻害）効果を有し、その他の全てが同等であるものよりも、変性状態、または細胞老化関連状態の処置に好ましいだろう。癌処置の場合には、テロメアを短縮させる負の効果を有する薬物が、癌細胞において特に好ましいだろう。
【実施例】
【０２１２】
実施例１−トリプレックスｑＰＣＲアッセイ
各ＰＣＲ反応を、標準的な３８４ウェルアッセイプレートにおいて１ウェル当たり１０μＬの総体積で実施した。標準的な反応混合物は、以下の成分を含有した：５ｎｇの標的ＤＮＡ、１．０μＭのＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）色素（Ｂｉｏｔｉｕｍ、ヘイワード、カリフォルニア州）、３００ｎＭのＴｅｌ  Ｇ改変プライマー、３００ｎＭのＴｅｌ  Ｃ改変プライマー、３００ｎＭのＢ２Ｍ−Ｆプライマー、３００ｎＭのＢ２Ｍ−Ｒプライマー、１００ｎＭのＢ２Ｍプローブ、１倍ＲＮａｓｅ  Ｐミックス（ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ａｓｓａｙ  ＲＮａｓｅ  Ｐ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）、１倍Ｑｕａｎｔｉｆａｓｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＰＣＲマスターミックス（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、ジャーマンタウン、メリーランド州）。以下の表２は、様々なプライマー配列を提供する。
【０２１３】
【表２】
2018501799.tif 000004
【０２１４】
開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイの標準的なサイクリング条件は、表３に示すようなものである。
【０２１５】
【表３】
2018501799.tif 000005
【０２１６】
開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイにおける様々なアンプリコンのためのプライマー、標的核酸、及び検出チャンネルを以下の表４に示す。標的の各々を、絶対定量法を使用してＲｏｃｈｅ製ＬＣ４８０において二次導関数法を用いて定量化した。モザイク男性ゲノムＤＮＡの８点２倍希釈物を使用して標準曲線を生成し、この曲線から各試料について３つの標的各々の濃度を算出した。以下のゲノムＤＮＡ濃度を使用した８点標準曲線は、表４に示す通りであった。Ｔ、Ｂ及びＲの濃度を使用して、平均テロメア長を算出した。
【０２１７】
【表４】
2018501799.tif 000006
【０２１８】
実施例２−Ｔｅｌ  Ｇ改変プライマー及びＴｅｌ  Ｃ改変プライマー濃度に関する効果の評価
上記の標準的な反応条件を使用したが、ただし、Ｔｅｌ  Ｇ改変及びＴｅｌ  Ｃ改変の濃度を変更した。以下の濃度を検査した：４００ｎＭのＴｅｌ  Ｇ改変及び４００ｎＭのＴｅｌ  Ｃ改変；３００ｎＭのＴｅｌ  Ｇ改変及び１００ｎＭのＴｅｌ  Ｃ改変；６００ｎＭのＴｅｌ  Ｇ改変及び１００ｎＭのＴｅｌ  Ｃ改変；３００ｎＭのＴｅｌ  Ｇ改変及び３００ｎＭのＴｅｌ  Ｃ改変；ならびに６００ｎＭのＴｅｌ  Ｇ改変及び３００ｎＭのＴｅｌ  Ｃ改変。前述のＴｅｌ  Ｇ改変／Ｔｅｌ  Ｃ改変プライマー濃度を用いた反応物の融解曲線を、図２Ａ〜図２Ｆに示す。データは、３００ｎＭのＴｅｌ  Ｇ改変及び３００ｎＭのＴｅｌ  Ｃ改変を用いて反応を実施した場合、３つ全ての標的が同様の増幅振幅を有することを示し、これは３つ全てのＰＣＲ反応物が、およそ同量の産物を生成し、アッセイが３つの標的について所望のバランスに到達していることを示唆している。平衡状態に達する場合、ＰＣＲ反応の最後における３つのアンプリコンの同等量は、ＰＣＲ試薬（酵素、ヌクレオチド、プライマー）のいずれも、３つのＰＣＲ産物のいずれについても制限しないことの指標である。
【０２１９】
実施例３−増幅効率
モザイク男性ゲノムＤＮＡの８点２倍段階希釈物を使用してＰＣＲ効率を算出した。各点についての最終ＰＣＲ反応物におけるＤＮＡ濃度を表５に示す。試験した各プライマーの組合せについての各々の標的におけるＰＣＲ効率を、絶対定量法を用いてＲｏｃｈｅ製ＬＣ４８０プログラムで得て、これを表６にまとめる。
【０２２０】
【表５】
2018501799.tif 000007
【０２２１】
【表６】
2018501799.tif 000008
【０２２２】
実施例４−増幅効率
開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイを、標的ＤＮＡ（モザイクＭ  ＤＮＡ）の多様な濃度で実施した。テロメア、ＲＮａｓｅ  Ｐ及びβ２−ミクログロブリン標的についての入力ＤＮＡの交点（Ｃｐ）（二次導関数法によるＲｏｃｈｅ製ＬＣ４８０プログラムにより算出した）対ｌｏｇ（濃度）の線形回帰直線、ならびにデータを図３Ａ〜図３Ｃに示す。３つの標的の各々について、０．０３９１ｎｇ／μＬ〜５ｎｇ／μＬの標的ＤＮＡ、すなわち、１２８倍範囲でＲ２＞０．９９９を達成した。３μＬの標的ＤＮＡを１０μＬのＰＣＲ反応物中で使用したため、これは反応物に添加した３μＬ体積中において０．１３ｎｇ／μＬ〜１６．７ｎｇ／μＬの標的ＤＮＡの範囲に相当する。したがって、アッセイは少なくとも０．１３ｎｇ／μＬほど低くても標的ＤＮＡを検出し、定量化することができるが、開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイの条件下で、より低濃度の標的ＤＮＡを検出することができる可能性がある。この研究で使用したゲノムＤＮＡの最高最終反応物濃度は、５ｎｇ／μＬであった。ＲＮａｓｅ  Ｐ及びβ２−ミクログロブリン標的についての増幅曲線のベースラインは、使用したゲノムＤＮＡ（モザイクＭ  ＤＮＡ）の最高濃度で、残りの標準曲線点よりも高いことを観察した（図４Ａ〜図４Ｃを参照のこと）。
【０２２３】
実施例５−鋳型なし対照物を用いて実施したアッセイ
開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイを、９つの鋳型なし対照物（「ＮＴＣ」）試料を使用して実施した。実験は、単一アッセイプレート中において９つのＮＴＣ試料を用いて実施した。テロメア及びＲＮａｓｅ  Ｐ標的のＮＴＣ  Ｃｐは、全て３５超であったのに対して；Ｂ２Ｍの９つのウェルのうち３つが、５の人為的なＮＴＣ  Ｃｐコーリングを有し、他方の６つのウェルは、Ｃｐコーリングを有しなかった。Ｂ２Ｍウェルが５の人為的なＣｐコーリングを有したが、図５Ｃに示すデータが、増幅曲線から最低限の増幅を観察したことを示すことに留意すべきである。これらのデータは、開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイの条件下で、試料Ｃｐ値の算出にＮＴＣシグナル干渉のリスクがほとんどまたは全くなかったことを示唆している。
【０２２４】
実施例６−ＰＣＲ効率
３つの精度管理ＤＮＡ試料、男性モザイク参照ＤＮＡ、及び４つの患者ＤＮＡ試料のＰＣＲ効率を、試料の各々について８点２倍段階希釈物を使用し、最終ＰＣＲ反応物中の最高濃度を３ｎｇ／μＬとして（表７を参照のこと）開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイを実施することにより得た。希釈したＤＮＡ試料で２回実行して、そのＰＣＲ効率を表８にまとめる。２回の実行を比較すると、ＰＣＲ効率に有意な変動量が存在する。ＰＣＲ効率の差にもかかわらず、２回の実行を比較した場合にＲＮａｓｅ  Ｐについては３．４％及びＢ２Ｍについては３．１％の平均ＣＶを得た。表８はＲＮａｓｅ  Ｐ標的について得たＣＶ値を示し、表９はβ２−ミクログロブリン標的について得たＣＶ値を示す。表８及び表９のデータは、ＣＶがより低濃度の標的ＤＮＡでより高いことを示す。最低濃度点を除去した場合、平均ＣＶは、ＲＮａｓｅ  Ｐで２．９％及びβ２−ミクログロブリンで２．５％に減少した。β２−ミクログロブリンについてのＣＶ値に基づいて、最終ＰＣＲ反応物における最適濃度は、０．５ｎｇ／μＬ（標準３及び４の間）であってよい。したがって、患者試料について正規化した供給源ＤＮＡは、最適には約１．７ｎｇ／μＬとすべきである。
【０２２５】
【表７】
2018501799.tif 000009
【０２２６】
【表８】
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【０２２７】
【表９】
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【０２２８】
【表１０】
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【０２２９】
実施例７−開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイ法を使用した患者集団におけるＴ／Ｓ決定
本明細書に記載されるような開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイ法を、無症候集団からの１６３の患者ＤＮＡ試料で使用した。ＤＮＡ試料を各患者から得られた血液から抽出した。結果は、（図６Ａ）において０．６１〜１．５５のＴ／Ｓ比範囲を証明した。検査した患者集団は、２１〜７８歳の年齢範囲（平均５１歳）を有し、８２人の女性及び８１人の男性という性別分布を有した。Ｔ／Ｓ比と年齢との間に強い相関関係を観察した（Ｒ２＝０．３６、図６Ｂを参照のこと）。開示したトリプレックスｑＰＣＲ法は、非常に低いアッセイ間ＣＶ値を表示した（図７Ａ及び図７Ｂを参照のこと）。例えば、これらの１６３の試料における平均アッセイ間ＣＶは、ＰＣＲアッセイプレートに１人の個人が手作業によりピペットで分注した場合であっても、１．９％である。対照的に、典型的なプレート間及び操作者間変動性（ＣＶ値）は、Ｃａｗｔｈｏｎ（Ｃａｗｔｈｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００２，３０（１０）：ｅ４７）により記載されているようにアッセイを実施した場合、５〜１０％の範囲内であることに留意すべきである。Ｍａｒｔｉｎ−Ｒｕｉｚら（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．（２０１４）ｄｏｉ：１０．１０９３／ｉｊｅ／ｄｙｕｌ９１）による最近の刊行物では、筆者らは、個別の実験室ＣＶ内におけるｑＰＣＲのバッチ間及びバッチ内ＣＶ値は、２．３％〜２８％の範囲であった」と報告した。本発明の方法を使用して得られたデータは、開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイが、テロメア長決定のために開発された前述のｑＰＣＲ法、例えば、Ｃａｗｔｈｏｎ（Ｃａｗｔｈｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００２，３０（１０）：ｅ４７）の方法よりも、はるかに高い精度を提供することを実証している。さらに、本明細書に記載されるデータは、Ｍａｒｔｉｎ−Ｒｕｉｚら（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．（２０１４）ｄｏｉ：１０．１０９３／ｉｊｅ／ｄｙｕｌ９１）によりバッチ変動について報告された平均ＣＶ値よりも有意に改善したＣＶ値を提供する。
【０２３０】
実施例８−開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイ法における全変動性
９つの患者試料の各々を、３人の操作者により単一の９６ウェルプレート中で実施した単一アッセイにおいて３回反復してアッセイした。各アッセイにおける患者試料の試料位置は、表１１に示す通りであった。３つの複製物の各々についてＴ／Ｓ比を算出し、これは「実行内」変動の推定値を提供した。次いで、同じプレート配置を、表１２に示すスケジュール通りに５日間の各々で午前中に１回、夕方に１回、３人の異なる操作者を使用して合計１０プレートの反復で繰り返した。１０プレートのうち９つがＱＣに合格し、これらを分析に使用した。
【０２３１】
【表１１】
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【０２３２】
【表１２】
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【０２３３】
上記の通りに実施した複数のアッセイからの試料データを、変量効果モデルを使用して分析し、「実行」は変量効果であった。実行内変動性、実行間変動性及び全実行変動性の推定値を得た。研究及びデータ分析の設計は、ＣＬＳＩ（以前はＮＣＣＬＳ）指針で概要が述べられている、定量アッセイの精度性能に関する評価についての指針に従う。アッセイ内ＣＶ、アッセイ間ＣＶ及びアッセイの全ＣＶは、９つの試料により包含されるＴ／Ｓ範囲にわたって優れていた（図８Ａ〜図８Ｃ）。アッセイ内ＣＶ及びアッセイ間ＣＶは、ほぼ０〜２．９％の範囲であったが、全ＣＶは約２．２％〜３．５％の範囲であった。
【０２３４】
実施例９−テロメア配列を有するＥ．ｃｏｌｉクローン
ＰＣＲ産物を、膀胱癌細胞株のＵＭＵＣ−３から得られたゲノムＤＮＡからの標的配列の増幅により調製した。ＰＣＲ反応は、プライマーのＴｅｌ−４ｒｐ（配列番号：１４；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、コーラルビル、アイオワ州、すなわち「ＩＤＴ」から入手した）及びＳＵＳ配列番号：１５；ＩＤＴから入手した；ＨＰＬＣ精製済み）を使用した。反応を以下の条件下で実施した：５０μｌの反応物中、４０ｎｇのＵＭＵＣ−３ゲノムＤＮＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５００ｎＭのＳＵＳプライマー、５００ｎＭのＴｅｌ−４ｒｐ、３００μＭのｄＮＴＰ（ＢｉｏＲａｄ、カタログ番号１７０−８８７４）、０．１２５Ｕ／μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。ＰＣＲサイクルは、以下の通りであった：１サイクルを９４℃で２分；３５サイクルを９４℃で１５秒、６５℃で３０秒、７２℃で５分、及び１サイクルを７２℃で２０分。ＰＣＲ産物を、０．８％Ｅ−ｇｅｌ（カタログ番号Ｇ５０１８−０８；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）を使用してゲル電気泳動により精製し、０．８〜１．２ｋｂサイズ範囲の産物を、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ  Ｔｕｒｂｏ  Ｋｉｔ（カタログ番号１１０２−２００；ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＬＬＣ、サンタアナ、カリフォルニア州）を使用してゲルから単離した。次いで、ＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクター（サブクローニングのためのＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ、カタログ番号Ｋ４５１０−２０；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）にクローニングした。クローニングしたＰＣＲ産物を有するベクターを形質転換コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換し、一晩増殖させた後、選択したコロニーを形質転換寒天プレートから採取した。プラスミドにクローニングしたＤＮＡ配列を、選択したコロニーで決定した。１つのクローン、すなわちＹ３（配列番号：１２）は、１３５ｂｐのテロメア配列断片を含有した。このクローンを選択して、絶対テロメア長参照の供給源とした。
【０２３５】
実施例１０−絶対テロメア参照の調製
上記のＹ３クローンのローリングサークル増幅（「ＲＣＡ」）から得られたＤＮＡを、ＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。２ラウンドのＰＣＲ増幅を使用して、絶対テロメア参照を得た。ＰＣＲ増幅の第１ラウンドでは、Ｍ１３フォワード（配列番号：１６）及びＭ１３リバースプライマー（配列番号：１７）を、１μｌのＲＣＡ産物材料との反応に使用した。ＰＣＲ増幅産物、すなわちＹ３−Ｍ１３ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（カタログ番号２８１０４；ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．、バレンシア、カリフォルニア州）で精製し、次いでナノドロップＵＶ−Ｖｉｓ分光光度法（ＮａｎｏＤｒｏｐ  ８０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により定量化した。ＰＣＲ増幅の第２ラウンドでは、Ｍ１３フォワードプライマー（配列番号：１６）及びＴｅｌｏＡｎｃｈｏｒプライマー（配列番号：１８）を、前もって精製した５ｎｇのＹ３−Ｍ１３ＰＣＲ産物と共に使用した。ＰＣＲ増幅の第２ラウンドにおける産物、すなわちＹ３−Ｔｅｌｏｔａｉｌ  ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットにより精製し、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎアッセイ（Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ試薬、カタログ番号Ｐ１１４９５、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）により定量化した。Ｙ３−Ｔｅｌｏｔａｉｌ  ＰＣＲ産物を絶対テロメア参照ＤＮＡとして使用した。
【０２３６】
実施例１１−サザンブロット分析
サザンブロット分析を、公開されたプロトコール（Ｍａｓａｙｕｋｉ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ５，１５９６−１６０７（２０１０）により、軽微な修正を加えて実施した。簡潔に述べると、ゲノムＤＮＡをＳｔａｎｆｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  ｃｅｎｔｅｒの匿名ドナーから得られた非選択血液試料から抽出し、高分子量ＤＮＡとして単離した。ゲノムＤＮＡ（３〜５μｇ）を、４０μＬの反応体積中、３７℃で６時間または一晩（≧１６時間）、２０ＵのＨｐｈＩ（カタログ番号Ｒ０１５８Ｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．、イプスウィッチ、マサチューセッツ州）及び２０ＵのＭｎｌＩ（カタログ番号Ｒ０１６３Ｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）を用いたインキュベーションにより消化した。消化したゲノムＤＮＡを、０．５倍ＴＢＥの存在下で０．５％アガロースゲルを使用してアガロースゲル電気泳動により分離し、電気泳動は４０ＶＤＣで１６時間、ＢｉｏＲａｄ製Ｓｕｂ−Ｃｅｌｌ  ＧＴゲル装置において実施した。ＤＩＧ標識サイズマーカーＩＩＩ（カタログ番号１１２１８６０３９１０、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、インディアナポリス、インディアナ州）及びＶＩＩ（カタログ番号１１６６９９４０９１０、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。ゲル中のＤＮＡを脱プリン化し（０．２５ＭのＨＣｌ）、変性して（０．５ＭのＮａＯＨ、１．５ＭのＮａＣｌ）、ＴｕｒｂｏＢｌｏｔｔｅｒ（商標）システム（カタログ番号１０４１６３１６、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）に転写した。転写を２０倍ＳＳＣ転写緩衝液の存在下でＮｙｔｒａｎ  ＳＰＣメンブレン上に、４時間から一晩（約１６時間）実施した。ＤＮＡを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒにおいて１２０ｍＪ  ｃｍ”２でメンブレンとＤＮＡとを２回処理することによりメンブレンに架橋して、ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（カタログ番号１１６０３５５８００１、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）中において３７℃で２時間プレハイブリダイズし、続いてＥａｓｙ  Ｈｙｂ溶液１ｍＬ当たり２．５ｐｍｏｌのＤＩＧ標識ＴｅｌｏＰｒｏｂｅ（配列番号：１９；ＩＤＴから入手し、ＨＰＬＣ精製済み）（合計で３０ｐｍｏｌプローブ、または１２ｍＬに対して６．６μＬを使用した）を用いて、３７℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。シグナルを抗ジゴキシゲニン−ＡＰ（カタログ番号１１０９３２７４９１、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）により検出し、画像を、ＢｉｏＲａｄ製ＣｈｅｍｉＤｏｃ  Ｉｍａｇｅｒを使用して取り込んだ。
【０２３７】
実施例１２−テロメア制限断片長の定量化
ＴＲＦを、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／を参照のこと）を使用した以下の手順を使用して定量化した。
【０２３８】
移動度を分子量に変換した標準曲線を生成するために。ＩｍａｇｅＪプログラムでは、ウェルの上から下まで直線を引き、次いでメニューオプション：Ａｎａｌｙｚｅ→Ｐｌｏｔ  Ｐｒｏｆｉｌｅを選択し、「Ｌｉｓｔ」を選択して、次いで新しいウィンドウで「Ｆｉｌｅ→Ｓａｖｅ  Ａｓ」を選択し、分子ラダープロファイルを保存する。プロファイルをＥｘｃｅｌで開き、距離対強度をグラフ化する。ピークの各々に対応する距離／強度を手作業で見出す。ピークについて距離対Ｌｏｇ（分子量）の散布図をグラフ化し、線形式Ｌｏｇ（ＭＷ）＝Ａ＊距離＋Ｂを生成する。
【０２３９】
各レーンのテロメア制限断片長（ＴＲＦ）の生成。上記のように、ＩｍａｇｅＪにおいて、レーンの各々についてプロファイルを生成し、Ｅｘｃｅｌを使用して上記の式を適用することにより、データ点の各々について距離をＬｏｇ（ＭＷ）に変換し、Ｌｏｇ（ＭＷ）データをＭＷデータに変換した。次いで、発明者らは、強度（Ｉｍａｇｅ  Ｊプロファイルからの）データをＭＷデータで割ることにより、強度／ＭＷデータを得た。２０ｋｂ及び１ｋｂ位置をＭＷデータセットに基づいて同定し、これを使用して、２０ｋｂ〜１ｋｂのデータ点を使用した以下の式により、ｋｂｐでのＴＲＦ長を算出した：
ＴＲＦ＝ＳＵＭ（強度）／ＳＵＭ（強度／ＭＷ）。
【０２４０】
実施例１３−ａＴＬ標準曲線のＰＣＲ効率
Ｙ３−Ｔｅｌｏｔａｉｌ  ＰＣＲ産物の１ｎｇ／μｌストック溶液（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ法により測定した）を、ＤＮＡ懸濁緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）中で精製したＹ３−Ｔｅｌｏｔａｉｌ  ＰＣＲ産物を希釈することにより調製し、−２０℃で２０μＬアリコートとして保存した。１：５０希釈物をＤＮＡ懸濁緩衝液で作製し、２０ｐｇ／μＬでＹ３−Ｔｅｌｏｔａｉｌ  ＰＣＲ産物を調製した。３倍段階希釈物をさらに作製し、２０ｐｇ／μＬを最高濃度として８点標準曲線を作製した。Ｙ３−Ｔｅｌｏｔａｉｌ  ＰＣＲ産物の８点段階希釈物についてのＴ／Ｓ比を、Ｃａｗｔｈｏｎ（Ｃａｗｔｈｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００２，３０（１０）：ｅ４７）の前述したｑＰＣＲアッセイを使用して決定した。ＰＣＲ効率を、Ｒｏｃｈｅ製ＬＣ４８０ソフトウェアを使用して、絶対定量法及び二次導関数法を用いて算出した。平均効率は、９１．６％（ＳＴＤＥＶ＝６％）であった。これは、参照基準モザイクＭゲノムＤＮＡのＰＣＲ効率（平均８８．４％）よりもわずかに高かった。４回の実行全てが、０．９９超のＲ２の線形性を有した（表１３）。典型的な標準曲線を図９に示す。
【０２４１】
【表１３】
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【０２４２】
実施例１４−試験試料におけるａＴＬの算出
Ａ．Ｙ３−Ｔｅｌｏｔａｉｌ  ＰＣＲ  ＤＮＡ濃度の、テロメア配列濃度への変換。
Ｙ３−Ｔｅｌｏｔａｉｌ  ＰＣＲ産物は、２６８ｂｐ長の二本鎖アンプリコンであり、ここでアンプリコンのうち１３５ｂｐは、完全なテロメア反復（ＴＴＡＧＧＧ：ＣＣＣＴＡＡ）である。このアンプリコンの分子量（「ＭＷ」）は１６５４７７．２であり、アンプリコンの１分子量は、ＭＷをアボガドロ数で割ったものである。したがって、Ｙ３−Ｔｅｌｏｔａｉｌ  ＰＣＲ産物標準物の重量は：
１６５４７７．２／６．０２×１０２３＝２．７４８７９×１０−１９ｇである。
ＰＣＲ反応で使用した標準物（ＳＴＤ１）の最高濃度は、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ測定に基づいて２ｐｇ／μＬのＤＮＡであった。したがって、ＳＴＤ１における１μＬ当たりのＤＮＡ分子数を提供する算出は、以下の通りである：
２×１０−１２／２．７４８７９×１０−１９＝７２７５９２９。
したがって、上記の数に１３５収量を掛けると、ＳＴＤ１において１μＬ当たり９８２２５０ｋｂの完全なテロメア配列が存在するという結果になる。Ｙ３クローン標準物を使用して算出したテロメア濃度を完全なテロメア配列濃度（１μｌ当たりのｋｂ）に変換する式：
テロメア濃度（ｎｇ／ｕＬ）×９８２２５０ｋｂ（値Ａ）。
【０２４３】
Ｂ．ヒトベータグロビン濃度を使用したゲノムコピー数濃度の算出。
半数体ヒトゲノムの１分子量は、３．５９×１０−３ｎｇである。ヒトベータグロビン濃度は、ヒトゲノムにおける単一コピー遺伝子の１つの尺度である。次いで、ベータグロビンなどの単一コピー遺伝子に対する二倍体当たりのゲノムコピー数濃度（１μＬ当たりのコピー数）を以下の通りに算出することができる：
濃度（ｎｇ／ｕＬ）／（０．００３５９×２）（値Ｂ）。
【０２４４】
Ｃ．絶対テロメア長の算出
１ゲノム当たりの絶対テロメア配列（１ゲノム当たりのｋｂでの）は、ゲノムコピー数濃度当たりの完全なテロメア配列濃度に等しく、それにより算出：
値Ａ／値Ｂ
（式中、値は本明細書の上記の通りに算出される）に等しい。したがって、染色体の各末端におけるａＴＬ（ｋｂでの）を以下の通りに算出する：
（値Ａ／値Ｂ）／９２。
【０２４５】
実施例１５−Ｔ／Ｓ値とａＴＬとの相関関係
Ｔ／Ｓ比を、本明細書に記載される方法を使用して決定し、本明細書における上記の算出を使用して導いたａＴＬ値と比較した。３つのＱＣ試料の比較は、値が０．９９９９８のＲ２で大きく相関することを示した（図１０）。これらのデータに基づいて、以下の式を導いた：
ｋｂｐ＝２．４５５５＊（Ｔ／Ｓ）＋０．００５
加えて、テロメラーゼのＲＮＡ成分ｈＴＥＲの遺伝子で感染させたＵＭＵＣ−３膀胱癌細胞株に由来する一連のゲノムＤＮＡを使用して、Ｔ／Ｓ比とａＴＬとを比較した。同様の結果を得て、以下の式をこれらのデータについて導いた：
ｋｂｐ＝２．５８９＊（Ｔ／Ｓ）−０．０７４
新たに調製したＹ３標準物を使用した２回の独立した実行からの、ＱＣ試料のＴ／ＳとａＴＬとの相関関係に関するデータを、以下の表１４に示す。
【０２４６】
【表１４】
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【０２４７】
実施例１６−ＵＭＵＣ３−ｈＴＥＲシリーズを用いたＴ／ＳとａＴＬとの相関関係
ｋｂｐでのテロメア長とＴ／Ｓ比との間の関係（すなわち、Ｔ／Ｓ単位当たりのｋｂｐを決定すること）を、テロメラーゼのＲＮＡ成分（ＴＥＲ）で形質導入し、それゆえテロメラーゼ活性を増加させて、染色体の末端にＴＴＡＧＧＧ反復を付加する細胞株（ＵＭＵＣ３）を使用してさらに評価した。この細胞株を（ＵＭＵＣ３−ＴＥＲ）と命名した。ＵＭＵＣ３−ＴＥＲにおけるテロメアの長さは、細胞が培養下で増殖するにつれて経時的に増加した。Ｔ／Ｓを、Ｃａｗｔｈｏｎ（Ｃａｗｔｈｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００２，３０（１０）：ｅ４７）により記載されたアッセイを使用して決定した。図１１における各データ点について、ｙ軸は本明細書に記載されるように決定した、ｋｂｐでの平均末端制限断片長（ＴＲＦ）を表し、ｘ軸は測定したＤＮＡ試料のＴ／Ｓ比を表す。テロメラーゼは、染色体の末端にテロメアＤＮＡのみを付加するので、曲線の傾斜は、Ｔ／Ｓ単位当たりのテロメアＤＮＡに関する直接的な尺度であり：これにより、この実験ではＴ／Ｓ単位当たり２．４５ｋｂｐが得られる。
【０２４８】
実施例１７−サザンブロット分析によるＴ／ＳとＴＲＦとの比較
絶対テロメア長算出を検証する独立した第３の方法として、同じＵＭＵＣ３−ｈＴＥＲシリーズのテロメア長を、サザンブロット分析を使用して測定した。ゲノムＤＮＡをＨｐｈＩ及びＭｎｌＩで消化し、０．５％ゲル上で実行して、４つのテロメア反復を含むオリゴでプローブした。テロメア制限断片を算出するために、Ｈａｒｌｅｙら（Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４５（６２７４）：４５８−６０）によって最初に提案された式を使用した。この式は、Ｔ／Ｓ比とＴＲＦとを比較するためにＣａｗｔｈｏｎらによっても使用された（Ｃａｗｔｈｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００２，３０（１０）：ｅ４７）。Ｃａｗｔｈｏｎ（Ｃａｗｔｈｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００２，３０（１０）：ｅ４７）により記載されたアッセイを使用したＴ／Ｓ比とＴＲＦ結果との比較により、以下の式が得られた：
ＴＲＦ＝２．１５１８＊（Ｔ／Ｓ）＋１．４２５７（Ｒ２＝０．９７２８３）。
この式におけるＹ切片は、サブテロメア領域の平均長を表し（Ｃａｗｔｈｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００２，３０（１０）：ｅ４７）、傾斜はＴ／Ｓ比のｂｐへの変換に関する係数を表す。したがって、このアッセイでは：
ｋｂｐ＝２．１５１８＊（Ｔ／Ｓ）
という式がＴ／Ｓ単位当たり２．１５ｋｂｐの変換係数を提供する。
【０２４９】
同様の手法を、ヒト肺線維芽細胞ＩＭＲ９０に由来するゲノムＤＮＡの試料で使用した。Ｆａｒｚａｎｅｈ−Ｆａｒ  Ｒら（Ｆａｒａｚａｎｅｈ−Ｆａｒ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ５（１）：ｅ８６１２．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００８６１２を参照のこと）は、以下を報告した：
ＴＲＦ＝２．４１３＊（Ｔ／Ｓ）＋３．２７４。
したがって、上記式を使用すると、Ｔ／Ｓ単位当たり２．４１ｋｂｐである、すなわち：
ｋｂｐ＝２．４１３＊（Ｔ／Ｓ）。
これは、上記の変換係数と非常に類似している。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、Ｙ切片（サブテロメア領域長）の差は、Ｌｉｎらでは、ＲｓａＩ及びＨｉｎｆＩを使用してゲノムＤＮＡを消化したという事実に起因する可能性がある。ＨｐｈＩ及びＭｎｌＩ（本報告で使用した）は、ＲｓａＩ及びＨｉｎｆＩと比較して、テロメア領域により近い部分を切断することが知られている。加えて、特定の理論に束縛されることを望むものではないが、本明細書に記載される研究で、及びＦａｒｚａｎｅｈ−Ｆａｒ  Ｒら（Ｆａｒａｚａｎｅｈ−Ｆａｒ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ５（１）：ｅ８６１２．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００８６１２を参照のこと）では、２つの異なる細胞株を使用した。したがって、これらの細胞株は、異なるサブテロメア長を有する可能性がある。
【０２５０】
実施例１８−凝集ａＴＬ変換係数
要約すると、Ｔ／Ｓ比をｂｐに変換するための凝集テロメア長変換係数、すなわち表１５のデータを使用する。表１５における４つの結果（４つの異なる方法から）からの変換係数の平均は、Ｔ／Ｓ単位当たり２．４ｋｂｐであり、４つの推定値に対する標準偏差は０．１９である。
【０２５１】
【表１５】
2018501799.tif 000017
【０２５２】
実施例１９−カノニカルテロメア配列の定量化に対するプライマーの影響
「バリアント配列」は、ＤＮＡのサブテロメア領域内で頻繁に見られるが、真のテロメア配列とは見なされないＤＮＡの配列を指す用語である。真のテロメア反復配列は、ＣＣＣＴＡＡ：ＴＴＡＧＧＧのブロックからなるが、バリアント配列は、「変性」テロメア様配列のブロックを含有し得る。テロメア長測定のいずれの方法にも関する１つの課題は、「真の」またはカノニカルテロメアと、カノニカルテロメア配列からの少数の塩基対差異、例えば、１〜３つの塩基対差異によりカノニカル反復とは異なる一連の反復とを区別することである。このようなバリアントまたは変性配列の具体例としては、ＴＧＡＧＧＧ、ＴＣＡＧＧＧ、ＴＴＧＧＧＧ、ＴＴＣＧＧＧなどが挙げられる。
【０２５３】
実験を実施して、９０ヌクレオチド長であったカノニカルまたは変性標的配列反復を表す３つの異なる鋳型（合成「ｕｌｔｒａｍｅｒ」）の増幅を比較した。頻繁に使用される以前の標準物、すなわち、Ｃａｗｔｈｏｎ（Ｃａｗｔｈｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００２，３０（１０）：ｅ４７）により記載されたプライマーと比較して、カノニカルテロメア反復に対する開示したプライマーの特異性増強を示すデータを提供するために、３つの異なる鋳型の等モル濃度を使用して研究を実施した。使用した合成ｕｌｔｒａｍｅｒを以下の表１６に示す。
【０２５４】
【表１６】
2018501799.tif 000018
【０２５５】
アッセイを、本明細書における上記の開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイ（実施例１を参照のこと）を使用して、ＣａｗｔｈｏｎプライマーのＴｅｌｏ試験Ｔｅｌ  １ｂプライマー及びＴｅｌ  ２ｂプライマー（それぞれ配列番号：２０及び２１）を用いて、またはＴｅｌ  Ｇ改変プライマー及びＴｅｌ  Ｃ改変プライマー（それぞれ配列番号：１及び２）を使用してのいずれかにより実施した。図内では、これらのアッセイ条件をそれぞれ「トリプレックスＴＴ」または「ＡＴＬ  Ｔ」と称する。
【０２５６】
実験の第１セットでは、「真の」テロメア鋳型を表すＴｅｌ反復／テロメアｕｌｔｒａｍｅｒを使用した（配列番号：２８）。上に示す通り、これは１５反復のカノニカルＣＣＣＴＡＡテロメア配列で構成される。開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイを使用した９つの複製物の評価は、Ｃａｗｔｈｏｎ  ２００２アッセイで見られる濃度よりも高い均一な「Ｔ」濃度を示した（図１３Ａを参照のこと）。初期（１倍）ｕｌｔｒａｍｅｒＤＮＡ濃度（１．６７ｎｇ／μＬ）を算出して、３ｋｂの平均ゲノムテロメア長を模倣したことに留意すべきである。７倍高濃度の鋳型を使用する場合（（１１．６９ｎｇ／μＬ；図１３Ｂを参照のこと）、差は拡大した。初期ｕｌｔｒａｍｅｒＤＮＡ濃度で、本明細書における上記の開示した条件下で開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイを使用した９つのＴｅｌ反復複製物の平均Ｔ濃度を、アッセイを使用して０．１５ｎｇ／μＬであると決定した（図１３Ｃを参照のこと）。対照的に、Ｃａｗｔｈｏｎ  ２００２アッセイの条件下では、Ｔ濃度を、１倍鋳型濃度を使用して０．１１ｎｇ／μＬであると決定した（図１３Ｃ）。しかしながら、ｕｌｔｒａｍｅｒＤＮＡ濃度を７倍に増加させた場合、平均Ｔ濃度は、開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイ及びＣａｗｔｈｏｎ  ２００２アッセイについてそれぞれ８．４０ｎｇ／μＬ及び１．８３ｎｇ／μＬであった（図１３Ｄを参照のこと）。これらのデータは、ｔｅｌ  Ｇ改変プライマー及びｔｅｌ  Ｃ改変プライマーが、Ｔｅｌｏ試験プライマーよりもカノニカルテロメア反復に対してより高い特異性を有することを示唆している。
【０２５７】
実施例２０−Ｇリッチテロメア様配列の定量化に対するプライマーの影響
カノニカルテロメア反復のすぐ近位に位置するテロメア関連領域で見られる最も一般的なバリアント反復の１つを表すために、Ｇリッチバリアント／変性１  ｕｌｔｒａｍｅｒを使用した（配列番号：２９）。上記の通り、このｕｌｔｒａｍｅｒ配列は、１５反復のＣＣＣＴＣＡ配列で構成される。開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイでＣａｗｔｈｏｎ  ２００２プライマーを使用すると、Ｔｅｌ  Ｇ改変プライマー及びＴｅｌ  Ｃ改変プライマーを使用するのと比較して、１倍（図１４Ａを参照のこと）及び７倍（図１４Ｂを参照のこと）の鋳型濃度でＧリッチ鋳型の１０倍過剰な増幅をもたらした。１倍及び７倍鋳型濃度（それぞれ１．６７及び１１．６９ｎｇ／μＬ）は、直前の実施例に記載されているのと同じ意味を有する。Ｃａｗｔｈｏｎ  ２００２アッセイ条件下における９つのＧリッチバリアント複製物の平均Ｔ濃度は、４．３０×１０−３ｎｇ／μＬであって、対照的に、開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイを使用すると、３．０６×１０−４ｎｇ／μＬのＴ濃度を得た（図１４Ｃを参照のこと）。鋳型濃度を７倍に増加させた場合、同様の値、すなわちＣａｗｔｈｏｎ  ２００２アッセイ及び開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイについてそれぞれ４．９０×１０−３ｎｇ／μＬ及び５．３４×１０−４ｎｇ／μＬが見られた（図１４Ｃを参照のこと）。これらのデータは、本発明のｔｅｌ  Ｇ改変プライマー及びｔｅｌ  Ｃ改変プライマーが、増幅の鋳型としてＧリッチバリアント反復配列のＴＧＡＧＧＧを使用しないことを示している。さらに、これらのデータは、先の実施例におけるデータを踏まえると、本発明のｔｅｌ  Ｇ改変プライマー及びｔｅｌ  Ｃ改変プライマーが、カノニカルテロメア反復に対してより高い特異性を有することを示唆している。
【０２５８】
実施例２１−Ｃリッチテロメア様配列の定量化に対するプライマーの影響
テロメア関連領域で見られる別の一般的なバリアント反復は、Ｃリッチバリアントであり、これはＣリッチバリアント／変性２  ｕｌｔｒａｍｅｒ（配列番号：３０）で表されるＣＣＣＴＧＡ配列からなる。鋳型としてＧリッチバリアントを使用して作製したデータと同様に、Ｃａｗｔｈｏｎ  ２００２アッセイは、開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイと比較して、１倍（図１５Ａを参照のこと）及び７倍（図１５Ｂを参照のこと）の鋳型濃度でＣリッチ鋳型の１０倍過剰な増幅をもたらした。Ｃａｗｔｈｏｎ  ２００２アッセイを使用した９つのＣリッチバリアント複製物の平均Ｔ濃度が、３．９９×１０−３ｎｇ／μＬであったのに対して、対照的に、開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイは、３．０６×１０−４ｎｇ／μＬのＴ濃度を提供した（図１５Ｃを参照のこと）。鋳型濃度を７倍に増加させた場合、同様の値、すなわちＣａｗｔｈｏｎ  ２００２アッセイ及び開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイについてそれぞれ４．６９×１０−３ｎｇ／μＬ及び６．１８×１０−４ｎｇ／μＬが見られた（図１５Ｃを参照のこと）。これらのデータは、本発明のｔｅｌ  Ｇ改変プライマー及びｔｅｌ  Ｃ改変プライマーが、増幅の鋳型としてＣリッチバリアント反復配列のＴＣＡＧＧＧを使用しないことを示している。これらのデータは、本発明のｔｅｌ  Ｇ改変プライマー及びｔｅｌ  Ｃ改変プライマーが、カノニカルテロメア反復に対してより高い特異性を有することをさらに実証する。
【０２５９】
本実施例及び先の２つの実施例で生成したデータに基づいて、Ｔｅｌ１ｂプライマー及びＴｅｌ２ｂプライマーは、本発明のｔｅｌ  Ｇ改変プライマー及びｔｅｌ  Ｃ改変プライマーよりもはるかに高いレベルで典型的なテロメアバリアント反復を増幅すると結論づけることができる。さらに、これらのデータは、バリアント反復が、Ｃａｗｔｈｏｎ  ２００２アッセイで報告されたより高いＴ／Ｓ比に寄与する可能性があることを示唆している。総じて、これらのデータは驚くべきことに、本発明のｅｌ  Ｇ改変プライマー及びｔｅｌ  Ｃ改変プライマーが、カノニカルテロメア反復をより特異的に増幅することを示す。
【０２６０】
実施例２２−再現性及び精度
テロメア長を測定するための、本発明の開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイの全変動性を評価する複数日、複数操作者による研究を実施した。具体的には、４０の全血ドナー試料の各々を３回反復して、１人の操作者により同じ実行でアッセイした。３つの複製物の各々についてＴ／Ｓ比を算出し、これは実行内変動の推定値を提供した。次いで、同じアッセイ／プレート配置を、２０日間にわたり午前中に１回、夕方に１回、３人の異なる操作者を使用して合計２４プレートの反復で繰り返した。２４の平均テロメア長（「ＡＴＬ」）アッセイを実施し、試料１〜２０について１２のＡＴＬアッセイ及び試料２１〜４０について１２のＡＴＬアッセイを実施した。複数回実行からの各試料の測定値を、変量効果モデルを使用して分析し、「実行」は変量効果であった。実行内変動性、実行間変動性及び全実行変動性の推定値を得て、その結果を以下の表１７に示す。
【０２６１】
【表１７】
2018501799.tif 000019
【０２６２】
前述の結果は、臨床設定での使用について開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイの優位性を実証する。例えば、Ｔ／Ｓ比の定量化に関する任意の臨床用途において、例えば、Ｔ／Ｓと所与の疾患との相関関係を評価するために、健康な個体もしくは個体集団と「罹患」個体もしくは個体集団間の差、または異なるように処置する（例えば、投与される異なる薬物もしくは治療剤、処置、もしくは投与量レベルの）必要がある対象もしくは集団間の差を区分するための、特定のＴ／Ｓ比における閾値カットオフが存在するだろう。したがって、このカットオフ辺りのアッセイ法の再現性は、健康な、もしくはリスクのある集団のいずれかに明確に分類されるだろう、または特定の処置を必要とするだろう個体または集団を定義する。所与の試験方法についてのＣＶ／全誤差が低ければ低いほど、この方法を使用して報告される結果は、より再現可能となるだろうと理解されるだろう。前述のものでは、開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイで観察した６％の全誤差／再現性は、６／１１であり、すなわちＣａｗｔｈｏｎ  ２００２における再現性のおおよそ２倍に増大する。したがって、開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイの臨床的有用性は、より狭い「不確定」領域ゆえに、およそこれと同じ量で増大され、結果としてより多くの患者が、健康な、もしくは罹患した試料のいずれか、または特定の処置を必要とすると最終的に報告されるだろう。
【０２６３】
実施例２３−増幅効率の改善
増幅効率は、鋳型増幅が理論最大値（１００％）にいかに近接しているかを指し、最大値は各ｑＰＣＲサイクル中におけるアンプリコン鋳型濃度の正確な倍加である。Ｃａｗｔｈｏｎ  ２００２（Ｔｅｌｏ試験アッセイ）を用いると、テロメア及び単一コピー遺伝子アンプリコンの増幅効率は、典型的にはそれぞれ７０〜８０％、及び８５〜９５％の範囲内であった。対照的に、３つ全てのアンプリコン（すなわち、テロメアアンプリコン及び２つの異なる単一コピー遺伝子アンプリコン）についての開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイを用いたｑＰＣＲ効率は、典型的には９５〜１１０％の範囲内であり、多くの場合に９８〜１０１％の範囲内である（表５及び表８を参照のこと）。これは、Ｔｅｌｏ試験アッセイと比較して、テロメア長またはテロメア存在量の定量化における有意かつ予想外の改善を表す。
【０２６４】
実施例２４−正常な対象集団による方法の比較
３１１の正常なヒト全血試料を、本明細書における上記のようなＣａｗｔｈｏｎ  ２００２アッセイ及び開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイの両方で試験した。各アッセイで観察したＴ／Ｓ比をプロットして、そのデータを図１６に示す。２つのアッセイに関するＴ／Ｓ比結果間の関係についてのベストフィット式は、
Ｙ＝１．１３ｘ−０．０６  Ｒ２＝０．８１
である。
【０２６５】
ベストフィット式は合理的なＲ２及び切片値を生成したが、１．１３の傾斜は、Ｃａｗｔｈｏｎ  ２００２アッセイが、より特異的な開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイよりも高いＴ／Ｓ結果を報告していたことを示す。これは、上記のプライマー特異性で観察した結果と一致する。観察した平均Ｔ／Ｓ比間の差は、０．０６６のＴ／Ｓシフト及びｐ＝４×１０−６で統計的に有意であって、これはアッセイの差が高度に有意であることを示している。
【０２６６】
３１３の正常な血液試料結果の追加の分析を実施して、Ｔ／Ｓ比結果の分布が、２つの方法の各々でいかに統計的に「正規」であったかを評価した。分布を、Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｄの正規性検定を使用して評価し、この検定ではより高いｐ値が、より「正規」分布であることを反映する。２つのアッセイ法の各々について決定したｐ値を以下の表１８に示し、驚くべきことにｐ値は、開示したトリプレックスｑＰＣＲアッセイで有意に改善した正規分布を示す。
【０２６７】
【表１８】
2018501799.tif 000020
【０２６８】
様々な修正及び変更が、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく本開示で行われ得ることが、当業者には明らかだろう。本発明のその他の実施形態が、本明細書の考察及び本明細書に開示される本発明の実施から当業者には明らかだろう。本明細書及び実施例は、例示にすぎないと見なされることを意図し、本発明の真の範囲及び趣旨は、以下の特許請求の範囲で示されている。
【０２６９】
配列
様々なヌクレオチド配列、それらの名称、及び関連配列番号を以下の表１６に提供する。
【０２７０】
【表１９】
2018501799.tif 000021
【図１Ａ】
2018501799.tif 000022
【図１Ｂ】
2018501799.tif 000023
【図１Ｃ】
2018501799.tif 000024
【図２Ａ】
2018501799.tif 000025
【図２Ｂ】
2018501799.tif 000026
【図２Ｃ】
2018501799.tif 000027
【図２Ｄ】
2018501799.tif 000028
【図２Ｅ】
2018501799.tif 000029
【図２Ｆ】
2018501799.tif 000030
【図３Ａ】
2018501799.tif 000031
【図３Ｂ】
2018501799.tif 000032
【図３Ｃ】
2018501799.tif 000033
【図４Ａ】
2018501799.tif 000034
【図４Ｂ】
2018501799.tif 000035
【図４Ｃ】
2018501799.tif 000036
【図５Ａ】
2018501799.tif 000037
【図５Ｂ】
2018501799.tif 000038
【図５Ｃ】
2018501799.tif 000039
【図６Ａ】
2018501799.tif 000040
【図６Ｂ】
2018501799.tif 000041
【図７Ａ】
2018501799.tif 000042
【図７Ｂ】
2018501799.tif 000043
【図８Ａ】
2018501799.tif 000044
【図８Ｂ】
2018501799.tif 000045
【図８Ｃ】
2018501799.tif 000046
【図９】
2018501799.tif 000047
【図１０】
2018501799.tif 000048
【図１１】
2018501799.tif 000049
【図１２】
2018501799.tif 000050
【図１３Ａ】
2018501799.tif 000051
【図１３Ｂ】
2018501799.tif 000052
【図１３Ｃ】
2018501799.tif 000053
【図１３Ｄ】
2018501799.tif 000054
【図１４Ａ】
2018501799.tif 000055
【図１４Ｂ】
2018501799.tif 000056
【図１４Ｃ】
2018501799.tif 000057
【図１５Ａ】
2018501799.tif 000058
【図１５Ｂ】
2018501799.tif 000059
【図１５Ｃ】
2018501799.tif 000060
【図１６】
2018501799.tif 000061
【配列表】
2018501799000001.app
【国際調査報告】
2018501799.tif 000062
2018501799.tif 000063
2018501799.tif 000064