(57)【要約】  本発明は、パーソナルケア組成物、特に皮膚美白組成物の分野に関する。ナイアシンアミドは、メラノサイトからケラチノサイトへのメラノソーム転送を低下させ、それにより皮膚美白をもたらすと考えられている。しかし、ナイアシンアミドは、メラノサイト中のメラニン含量に直接影響を及ぼすことはほとんど、または全くないことが知られている。したがって、メラノソーム転送の低下とメラノサイト中のメラニン含量の減少とを組み合わせた複数の作用様式を有する組成物が依然として望まれている。したがって、本発明の目的は、改良されたメラノソーム転送阻害を提供する、相乗的な量のピコリンアミドおよびナイアシンアミドを有する組成物を提供することである。ナイアシンアミドをその異性体であるピコリンアミドと組み合わせると、相乗的な皮膚美白効果が得られることが判明した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．０．１〜１０重量％のピコリンアミドと、
ｂ．０．１〜１０重量％のナイアシンアミドと、
を含む皮膚美白組成物。
【請求項２】
ピコリンアミド対ナイアシンアミドのモル比が２０：１以下、好ましくは１０：１以下、より好ましくは４：１以下、最も好ましくは２：１以下である、請求項１に記載の皮膚美白組成物。
【請求項３】
ピコリンアミド対ナイアシンアミドのモル比が少なくとも１０：１、好ましくは少なくとも８：１、より好ましくは少なくとも４：１、さらにより好ましくは少なくとも２：１である、請求項１に記載の皮膚美白組成物。
【請求項４】
ピコリンアミド対ナイアシンアミドのモル比が２０：１〜１：２０である、請求項１に記載の皮膚美白組成物。
【請求項５】
１〜５重量％のピコリンアミドを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の皮膚美白組成物。
【請求項６】
１〜５重量％のナイアシンアミドを含む、請求項１または５に記載の皮膚美白組成物。
【請求項７】
皮膚有益剤をさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の皮膚美白組成物。
【請求項８】
局所用組成物の形態である、請求項１から７のいずれか一項に記載の皮膚美白組成物。
【請求項９】
皮膚美白のための、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物を皮膚に塗布するステップを含む、ヒトの皮膚を美白する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パーソナルケア組成物、特に皮膚美白組成物の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
大部分の人々は、皮膚の色素沈着の程度に関心がある。例えば、年齢によるしみまたはそばかすを有する人々は、このような色素沈着した斑点があまり目立たないことを望む一方で、他者は、日光への曝露によって引き起こされる皮膚の黒ずみを軽減するか、またはその自然の肌の色を明るくすることを望むと思われる。この必要性を満たすために、メラノサイトにおける色素産生を減少させる製品を開発するための多くの試みがなされている。しかしながら、これまでに同定された物質は、有効性が低いか、または望ましくない副作用（例えば、毒性または皮膚刺激）を有するかのいずれかの傾向が高い。したがって、有効性が全体的に改善された、新しい化粧品皮膚美白剤が引き続き必要とされている。
【０００３】
従来の皮膚美白組成物は、メラニンの分散を制御するか、またはチロシナーゼを阻害すると考えられる皮膚美白剤の使用に基づいている。これらの皮膚美白剤には、ナイアシンアミド、アゼライン酸およびコウジ酸のようなカルボン酸、植物抽出物、ヒドロキノンなどが含まれる。ナイアシンアミドは、局所適用のための組成物において広く使用されている皮膚美白剤の１つである。
【０００４】
ナイアシンアミドは、ビタミンＢ３（ナイアシン）のアミド形態である。ビタミンＢ３は必須の水溶性ビタミンであり、肉、魚、豆類、ナッツ、穀物、キノコ、酵母およびコーヒーを含む広範囲の食品にナイアシンまたはナイアシンアミドの形態で存在する。それは、ＤＮＡ修復、ケラチノサイト分化、脂質合成、色素沈着および炎症のような様々な細胞機能に関与しており、それらの中で最も重要なものは細胞の生体エネルギー論である。ピリジンヌクレオチドの形のナイアシンアミド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）は、エネルギー代謝にとって重要である。Ｂ３が欠乏した食餌は、皮膚炎および色素沈着を伴う皮膚状態を特徴とするペラグラと呼ばれる病気を引き起こす。これは、４０年前の皮膚美白剤としてのナイアシンアミドの発見を導いた観察であった。
【０００５】
ナイアシンアミドは、メラノサイトからケラチノサイトへのメラノソーム転送を低下させ、それにより皮膚美白をもたらすと考えられている。しかし、ナイアシンアミドは、メラノサイト中のメラニン含量に直接影響を及ぼすことはほとんど、または全くないことが知られている。
【０００６】
メラノソーム転送の低下とメラノサイト中のメラニン含量の減少とを組み合わせた複数の作用様式を有する組成物が依然として望まれている。
【０００７】
国際公開第２０１３／０３０７９４号は、ピリジン誘導体および皮膚科学的に許容される担体を含む皮膚および／または毛髪色素脱失組成物に関する。この文献は、好ましくは０．００１〜３０重量％の濃度のピコリンアミドを開示している。国際公開第２０１３／０３０７９４号は、この組成物が、ニコチンアミドを含む薬剤のリストからの皮膚および／または毛髪有益剤を含み得ることをさらに開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０３０７９４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の目的は、改良されたメラノソーム転送阻害を提供する、相乗的な量のピコリンアミドおよびナイアシンアミドを有する組成物を提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、低濃度の活性物質で高いメラノソーム転送阻害を達成することである。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、低濃度の活性物質でメラノサイト中のメラニン含量の減少を達成することである。
【００１２】
理論に縛られることを望むものではないが、ピコリンアミドはＮＡＤ＋の前駆体ではないが、色素沈着に関与する種々のプロセスに影響を及ぼすと考えられる。
【００１３】
理論に縛られることを望むものではないが、メラノソーム転送に影響を及ぼすことが示されているナイアシンアミドとは異なり、ピコリンアミドはメラノソーム転送の影響をほとんどまたは全く受けずにメラニン産生に影響を与えると考えられている。したがって、本発明は、皮膚美白に使用するためのナイアシンアミドとピコリンアミドとの相乗的組合せを含む組成物に関する。
【００１４】
ナイアシンアミドをその異性体であるピコリンアミドと組み合わせると、相乗的な皮膚美白効果が得られることが判明した。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
したがって、第１の態様において、本発明は、０．１〜１０重量％のピコリンアミドと、０．１〜１０重量％のナイアシンアミドとを含む皮膚美白組成物を提供する。
【００１６】
第２の態様において、本発明は、皮膚美白のための、本発明による組成物の使用を提供する。
【００１７】
第３の態様において、本発明は、本発明による組成物を皮膚に塗布するステップを含む、ヒトの皮膚を美白する方法を提供する。
【００１８】
これらおよび他の態様、特徴および利点は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲を読むことにより、当業者には明らかになると思われる。疑念を避けるために、本発明の一態様の任意の特徴は、本発明の任意の他の態様において利用することができる。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味することを意図しているが、必ずしも「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ）」という意味を意図してはいない。言い換えれば、列挙されたステップまたは選択肢は網羅的ではない。以下の説明に示される実施例は、本発明を明確にすることを意図しており、本発明をそれ自体の例に限定する意図のものではないことに留意されたい。同様に、全てのパーセンテージは、他に指示がない限り重量／重量％である。操作および比較実施例を除いて、または他に明示されている場合を除いて、材料の量または反応の条件、材料および／または使用の物理的特性を示す説明における全ての数字は、「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。「ｘからｙ」の形式で表される数値範囲は、ｘおよびｙを含むと理解される。特定の特徴について複数の好ましい範囲が「ｘからｙ」の形式で記載されている場合、異なる端点を組み合わせる全ての範囲も企図されることが理解されよう。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の第１の態様において、ナイアシンアミドおよびピコリンアミドを含む皮膚美白組成物が提供される。
【００２０】
ナイアシンアミド
ニコチンアミドおよびピリジン−３−カルボキサミドとしても知られているナイアシンアミドは、ビタミンＢ３の活性水溶性形態である。ナイアシンアミドは補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに必須であり、したがって、ＡＴＰ生成を含む体内での２００を超える酵素反応にとって不可欠である。
【００２１】
ナイアシンアミドは、本発明の組成物中に、組成物の０．１〜１０重量％、好ましくは０．５〜９重量％、より好ましくは１〜８重量％、さらにより好ましくは２〜７重量％、さらにより好ましくは３〜８重量％、さらにより好ましくは４〜７重量％、またはさらには５〜６重量％の濃度で存在する。
【００２２】
ピコリンアミド
ピリジン−３−カルボキサミドであるニコチンアミドは、ピリジン環の２位および４位が置換された２つの他の位置異性体、それぞれ、ピコリンアミド（ピリジン−２−カルボキサミド）およびイソニコチンアミド（ピリジン−４−カルボキサミド）を有する。
【００２３】
本発明の相乗的皮膚美白効果は、ナイアシンアミドと、ピリジン環の２位が置換された位置異性体であるピコリンアミド（ピリジン２−カルボキサミド）との組合せによって得られる。
【００２４】
ピコリンアミドは、本発明の組成物中に、組成物の０．１〜１０重量％、好ましくは０．５〜９重量％、より好ましくは１〜８重量％、さらにより好ましくは２〜７重量％、さらにより好ましくは３〜８重量％、さらにより好ましくは４〜７重量％、またはさらには５〜６重量％の濃度で存在する。
【００２５】
ピコリンアミド対ナイアシンアミドのモル比
相乗的皮膚美白効果は、ピコリンアミド対ナイアシンアミドのモル比が２０：１以下、好ましくは１６：１以下、より好ましくは１０：１以下、さらにより好ましくは８：１以下、さらにより好ましくは４：１以下で得られる。
【００２６】
好ましくは、ピコリンアミド対ナイアシンアミドのモル比は、少なくとも１０：１、より好ましくは少なくとも８：１、さらにより好ましくは少なくとも４：１、さらにより好ましくは少なくとも２：１、さらにより好ましくは少なくとも１：１であり、最も好ましくは少なくとも１．２５：１である。
【００２７】
好ましくは、ピコリンアミド対ナイアシンアミドのモル比は、２０：１〜１：２０、好ましくは１６：１〜１：１６、より好ましくは１０：１〜１：１０、さらにより好ましくは８：１〜１：８さらにより好ましくは４：１〜１：４、さらにより好ましくは２：１〜１：２、および最も好ましくは１．２５：１〜１：１．２５である。
【００２８】
メラノソーム転送阻害に関する最良の結果のために、ピコリンアミド対ナイアシンアミドのモル比は２：１以下、好ましくは１．２５：１以下である。
【００２９】
他の活性成分
本発明の皮膚美白組成物は、好ましくは、ヒドロキシ酸、ポリヒドロキシ酸、ヒドロキシ脂肪酸、特に１２−ヒドロキシステアリン酸、コウジ酸、脱色素オリゴペプチド、ガラルジン、ポリフェノール酸化防止剤、チオール酸化防止剤（ｔｈｉｏｌｉｃ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ）、システアミン塩酸塩、ヒドロキノン、ｔ−ブチルヒドロキノン、ビタミンＣ誘導体、ビタミンＥ誘導体、ビタミンＢ誘導体、レチノイド、４−置換レゾルシノール誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択される別の皮膚有益剤をさらに含むことができる。
【００３０】
任意選択成分
本発明の組成物は、組成物が皮膚に塗布されたときにそれらの分布を容易にするように、組成物に使用される皮膚美白剤の希釈剤、分散剤および／または担体として作用し得る化粧品として許容されるビヒクルをさらに含み得る。本発明における使用に適した化粧品として許容されるビヒクルは、水性、無水またはエマルジョンであってもよく；水性またはエマルジョン、特に油中水型または水中油型のエマルジョンが最も好ましい。存在する場合、水は典型的には組成物の残余を構成する。好ましくは、水は、組成物の５〜９９重量％、より好ましくは２０〜８０重量％、さらにより好ましくは４０〜８０重量％の濃度で存在する。
【００３１】
水の他に、有機溶媒もまた、本発明の組成物内の担体として機能することができる。
【００３２】
皮膚軟化剤もまた、本発明の組成物において化粧品として許容される担体として使用することができる。皮膚軟化剤は、一般に、シリコーン油および合成エステルの形態である。シリコーン油は、揮発性および不揮発性であり得る。揮発性シリコーン油は、好ましくは、３〜９個、好ましくは４〜５個のケイ素原子を含む環状または直鎖状のポリジメチルシロキサンから選択される。皮膚軟化物質として有用な不揮発性シリコーン油としては、ポリアルキルシロキサン、ポリアルキルアリールシロキサンおよびポリエーテルシロキサンコポリマーが挙げられる。本明細書において有用な本質的に不揮発性のポリアルキルシロキサンとしては、例えば、ポリジメチルシロキサンが挙げられる。
【００３３】
使用可能なエステル皮膚軟化剤は以下のとおりである：
１．１０〜２０個の炭素原子を有する脂肪酸のアルケニルまたはアルキルエステル。これらの例としては、ネオペンタン酸イソアラキジル、イソノナン酸イソノニル、ミリスチン酸オレイル、ステアリン酸オレイル、オレイン酸オレイルが挙げられる。
【００３４】
２．エトキシル化脂肪族アルコールの脂肪酸エステルなどのエーテルエステル。
【００３５】
３．多価アルコールエステル。エチレングリコールモノおよびジ脂肪酸エステル、ジエチレングリコールモノおよびジ脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール（２００〜６０００）モノおよびジ脂肪酸エステル、プロピレングリコールモノおよびジ脂肪酸エステル、ポリプロピレングリコール２０００モノオレート、ポリプロピレングリコール２０００モノステアレート、エトキシル化プロピレングリコールモノステアレート、グリセリルモノおよびジ脂肪酸エステル、ポリグリセロールポリ脂肪酸エステル、エトキシル化グリセリルモノステアレート、１，３−ブチレングリコールモノステアレート、１，３−ブチレングリコールジステアレート、ポリオキシエチレンポリオール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、およびポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルは、十分な多価アルコールエステルである。
【００３６】
４．蜜蝋、鯨蝋、ミリスチルミリステート、ステアリルステアレート、およびアラキジルベヘネートなどのワックスエステル。
【００３７】
５．コレステロール脂肪酸エステルが例であるステロールエステル。
【００３８】
皮膚軟化剤は、組成物の０．１〜５０重量％、好ましくは１〜２０重量％のいずれかで組成物中に存在し得る。
【００３９】
１０〜３０個の炭素原子を有する脂肪酸を、化粧品として許容される担体として本発明の組成物中に含めることもできる。このような脂肪酸の実例は、ペラルゴン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、ヒドロキシステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リシノール酸、アラキジン酸、ベヘン酸、エルカ酸およびそれらの混合物である。
【００４０】
多価アルコールタイプの保湿剤もまた、化粧品として許容される担体として本発明の組成物中に用いることができる。保湿剤は皮膚軟化剤の有効性を高め、スケーリングを減らし、蓄積された鱗屑の除去を促し、皮膚の感触を改善する。典型的な多価アルコールとしては、グリセロール、ポリアルキレングリコールが挙げられ、より好ましくは、アルキレンポリオールおよびこれらの誘導体、例えば、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよびこれらの誘導体、ソルビトール、ヒドロキシプロピルソルビトール、ヘキシレングリコール、１，３−ブチレングリコール、１，２，６−ヘキサントリオール、エトキシル化グリセロール、プロポキシル化グリセロールおよびこれらの混合物が挙げられる。最良の結果のためには、保湿剤は好ましくはプロピレングリコールまたはヒアルロン酸ナトリウムである。組成物中の保湿剤の濃度は、組成物の０．５〜３０重量％、好ましくは１〜１５重量％の範囲内のいずれかであり得る。
【００４１】
増粘剤はまた、本発明による組成物の、化粧品として許容される担体の一部として利用することができる。典型的な増粘剤としては、架橋アクリレート（例えばＣａｒｂｏｐｏｌ９８２）、疎水性修飾アクリレート（例えばＣａｒｂｏｐｏｌ１３８２）、セルロース誘導体および天然ガムが挙げられる。有用なセルロース誘導体には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルセルロースおよびヒドロキシメチルセルロースがある。本発明に適した天然ガムとしては、グアー、キサンタン、スクレロチウム、カラギーナン、ペクチンおよびこれらのガムの組合せが挙げられる。組成物中の増粘剤の濃度は、０．０００１〜５重量％、通常は０．００１〜１重量％、最適には０．０１〜０．５重量％の範囲であり得る。
【００４２】
まとめると、水、溶媒、シリコーン、エステル、脂肪酸、湿潤剤および／または増粘剤は、組成物の１〜９９．８重量％、好ましくは８０〜９９重量％の量で化粧品として許容される担体を構成する。
【００４３】
界面活性剤もまた、本発明の組成物中に存在してよい。界面活性剤の全濃度は、組成物の０．１〜４０重量％、好ましくは１〜２０重量％、最適には１〜５重量％の範囲である。界面活性剤は、アニオン性、非イオン性、カチオン性および両性活性物質からなる群から選択されてもよい。特に好ましい非イオン性界面活性剤は、疎水性物質１モル当たり２〜１００モルのエチレンオキシドまたはプロピレンオキシドと縮合されたＣ１０〜Ｃ２０脂肪アルコールまたは酸疎水性物質；２〜２０モルのアルキレンオキシドと縮合されたＣ２〜Ｃ１０アルキルフェノール；エチレングリコールのモノ−およびジ−脂肪酸エステル；脂肪酸モノグリセリド；ソルビタン、モノ−およびジ−Ｃ８−Ｃ２０脂肪酸；ブロックコポリマー（エチレンオキシド／プロピレンオキシド）；およびポリオキシエチレンソルビタン、ならびにこれらの組合せを含むものである。アルキルポリグリコシドおよびサッカライド脂肪アミド（例えば、メチルグルコンアミド）も適切な非イオン性界面活性剤である。
【００４４】
好ましいアニオン界面活性剤としては、石鹸、アルキルエーテルサルフェートおよびスルホネート、アルキルサルフェートおよびスルホネート、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルおよびジアルキルスルホサクシネート、Ｃ８−Ｃ２０アシルイセチオネート、アシルグルタメート、Ｃ８−Ｃ２０アルキルエーテルホスフェートおよびこれらの組合せが挙げられる。
【００４５】
日焼け止め剤には、紫外線を遮断するために一般的に使用される材料が含まれる。例示的化合物は、ＰＡＢＡ、シンナメートおよびサリチレートの誘導体である。例えば、アボベンゾフェノン（Ｐａｒｓｏｌ  １７８９（登録商標））オクチルメトキシシンナメートおよび２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（オキシベンゾンとしても知られている）を使用することができる。オクチルメトキシシンナメートおよび２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノンは、それぞれＰａｒｓｏｌ  ＭＣＸおよびＢｅｎｚｏｐｈｅｎｏｎｅ−３の商標で市販されている。組成物に使用される日焼け止め剤の正確な量は、太陽の紫外線照射からの所望の保護の程度に依存して変化し得る。太陽光線を反射または散乱させる添加剤を使用することもできる。これらの添加剤は、酸化亜鉛および二酸化チタンのような酸化物を含む。
【００４６】
本発明の組成物は、広範囲の他の任意選択の成分を含むことができる。ＣＴＦＡ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９２は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、スキンケア産業において一般に使用される広範囲の非限定的な化粧品および医薬品成分を記載しており、これらは本発明の組成物への使用にも適している。例としては、酸化防止剤、結合剤、生物学的添加剤、緩衝剤、着色剤、ポリマー、収斂剤、芳香剤、不透明化剤、コンディショナー、皮膚剥脱剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、天然抽出物、精油、皮膚感覚剤（ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓａｔｅｓ）、皮膚鎮静剤（ｓｋｉｎ  ｓｏｏｔｈｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）および皮膚治療剤が挙げられる。
【００４７】
本発明の組成物を製造する場合、所望の成分は、特定の順序ではなく、通常約７０〜約８０℃の温度において大気圧下で混合される。
【００４８】
本発明の組成物のための包装は、パッチ、ボトル、チューブ、ロールボールアプリケータ、推進剤駆動エアゾール装置、スクイズ容器または蓋付きジャーであってよい。
【００４９】
第２の態様において、本発明は、皮膚美白のための本発明による組成物の使用に関する。
【００５０】
第３の態様において、本発明は、本発明による組成物を皮膚に塗布するステップを含む、ヒトの皮膚を美白する方法に関する。
【００５１】
本発明を、下記の限定されない実施例を用いてここに例示するものである。
【００５２】
［実施例］
［実施例１］
組織内で開発された方法であるメラニン含有量アッセイ（ＭＣＡ）を使用した、メラニン阻害に対するナイアシンアミドおよびピコリンアミドの組合せの効果についてのインビトロ研究
材料
（ｉ）ヒト初代新生児包皮メラノサイト（カタログ番号：ＨＥＭｎ−ＤＰ−Ｃ−２０２−５Ｃ）、
（ｉｉ）メラノサイト成長培地（ＭＧＭ）（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｍ−２５４−５００）および
（ｉｉｉ）ヒトメラノサイト成長補足物質（カタログ番号：Ｓ−０００２−５）（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）
（ｉｖ）ピコリンアミド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号：１０４０５１−１０Ｇ）
（ｖ）ナイアシンアミド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｎ０６３６−１００Ｇ）
（ｖｉ）ＤＭＳＯ−ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ２６５０）
（ｖｉｉ）ＮａＯＨ（Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号６１７５７３０５００１７３０）
方法
ヒト初代メラノサイトを、ヒトメラノサイト成長補足物質を含むメラノサイト成長培地（ＭＧＭ）において成長させた。５００μＬ／ウェル（５×１０４細胞／ウェル）のこの溶液を２４ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下でインキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍｏｄｅｌ  ３１１１）においてインキュベートした。２４時間のインキュベーションの後、細胞培養物を水に溶解した主要活性物質（ｌｅａｄ  ａｃｔｉｖｅｓ）で処理した。対照はビヒクル（水）のみで処理した細胞であった。細胞を再びインキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍｏｄｅｌ  ３１１１；条件：５％ＣＯ２、３７℃）において７２時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、培養培地を１２０μｌ／ウェルのＭＣＡ試薬（１Ｎ  ＮａＯＨ中１０％ＤＭＳＯ）と交換し、シェーカーインキュベーターにおいて６０℃で１時間インキュベートした。次いで上清を３８４ウェルプレートに移した。吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＧＥｎｉｏｓ  Ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ）を用いて４０５ｎｍにおいて分光光度測定した。
【００５３】
メラニン含量の計算：
未処理細胞（ＮＯ活性）の４０５ｎｍにおける分光光度ＯＤを、１００％メラニン含量とみなした。未処理細胞と比較して、処理細胞試料の阻害パーセントを計算した。
【００５４】
結果
【表１】
2018529741.tif 000002
【００５５】
上記の表（表Ｉ）は、ピコリンアミドとナイアシンアミドとの組合せによって得られたメラノサイト中のメラニン含量の相乗的減少を示す。表１のデータは、ナイアシンアミド単独が、初代ヒトメラノサイト中のメラニン含量の適度な減少（５ｍＭおよび１０ｍＭにおいて）をもたらしたことを示す。しかし、ピコリンアミドとナイアシンアミドを組み合わせると、メラニン含量の相乗的減少が得られた。
【００５６】
インビボ条件下では、肌の色はメラニン合成およびメラノソーム転送の２つのプロセスによって決定される。これらのプロセスを調節することにより、肌の色が調節されると考えられている。上記の実施例は、インビトロでメラノサイト中のメラニン含量に対する本発明の組合せが有する相乗効果を示し、インビボ条件下でのメラニン合成についても同様の効果が期待できる。
【００５７】
［実施例２］
メラノソーム転送アッセイ（ＭＴＡ）を使用した、メラノソーム転送に対するナイアシンアミドおよびピコリンアミドの組合せの効果についてのインビトロ研究（Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ．２００８  Ｏｃｔ；２１（５）：５５９−６４のＰｕｂＭｅｄ  Ｃｏｍｍｏｎｓのコメントを参照されたい）
材料
（ｉ）ヒト初代新生児包皮メラノサイト（カタログ番号：ＨＥＭｎ−ＤＰ−Ｃ−２０２−５Ｃ）、
（ｉｉ）メラノサイト成長培地（ＭＧＭ）（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｍ−２５４−５００）および
（ｉｉｉ）ヒトメラノサイト成長補足物質（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｓ−０００２−５）
（ｉｖ）ＨａＣａｔヒトケラチノサイト（Ｄｒ  ＮＥ  Ｆｕｓｅｎｉｇ、Ｈｅｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）
（ｖ）ケラチノサイト成長培地（ＫＧＭ）（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｅｐｉｌｉｆｅ  ＭＥＰＩ−５００ＣＡ）、および
（ｖｉ）ヒトケラチノサイト成長補足物質（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｆ−００１−５）
（ｖｉｉ）ピコリンアミド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号：１０４０５１−５０Ｇ）
（ｖｉｉｉ）ナイアシンアミド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｎ０６３６−１００Ｇ）
（ｉｘ）トリプシンＥＤＴＡ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ；カタログ番号：Ｒ−００１）
（ｘ）トリプシン中和剤（Ｇｉｂｃｏ；カタログ番号：Ｒ−００２）
（ｘｉ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；１５−８１２−７）
（ｘｉｉ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
ａ．塩化ナトリウム（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｔｉｆｉｃ；カタログ番号：２７６０５）
ｂ．塩化カリウム（Ｍｅｒｃｋ；６１７５３３０５００１７３０）
ｃ．リン酸水素二ナトリウム（Ｓ．Ｄ  Ｆｉｎｅ−Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ；製品番号：４０１５８）
ｄ．リン酸二水素カリウム（Ｓ．Ｄ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ、２０２０３）
（ｘｉｉｉ）ＦＡＣＳ緩衝液
ａ．サポニン（ｓｉｇｍａ、カタログ番号：４７０３６−５０Ｇ−Ｆ）
ｂ．ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ；カタログ番号：１６０００）
方法
培養培地（ＭＧＭ：ＫＧＭ＝１：１）で調製した１．３Ｘ１０４細胞のヒト初代メラノサイト（Ｃ−２０２−５Ｃ、Ｌｏｎｚａ）と、培養培地（ＭＧＭ：ＫＧＭ＝１：１）で調製した２．６×１０４のＨａＣａｔケラチノサイトを一緒に混合し、４８ウェルプレートに播種して、組織培養インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍｏｄｅｌ  ３１１１）において３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下でインキュベートした。４時間のインキュベーションの後、共培養物を試料で処理（添加）し、同じ条件下で同じインキュベーターにおいて７２時間再びインキュベートした。必要な期間（７２時間）培養した後、以下に示す手順に従ってフローサイトメトリー分析のために細胞を調製した：
１．細胞を、４８ウェルプレートから、２００μｌのトリプシンＥＤＴＡ緩衝液を含むＶ底プレート（Ｔｏｒｓｏｎ、９４１３９６）に単離し、トリプシン活性を２００μｌのトリプシン中和剤で中和し、冷却遠心分離機（Ｐｌａｓｔｏ  Ｃｒａｆｔｓ、モデル番号：Ｒｏａｔ  ４Ｒ−Ｖ／ＦＭ）を使用して３５０ｇで沈殿（ｐｅｌｌｅｔｅｄ  ｄｏｗｎ）させた。
【００５８】
２．ペレットに、１００μｌの１％パラ−ホルムアルデヒドを添加し、氷上で１０分間インキュベートした。
【００５９】
３．次いで、細胞を、１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と共に１０分間遠心分離（１０００Ｇし、ペレットを下記のステップ４で述べた溶液で染色するために使用した。ＰＢＳを、塩化ナトリウム４ｇ、塩化カリウム０．１ｇ、リン酸水素二ナトリウム０．５８ｇおよびリン酸二水素カリウム０．１ｇを、オートクレーブにかけたＭｉｌｉ−Ｑ水５００ｍｌに加えることによって調製した。
【００６０】
ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）を、０．１％サポニンおよび０．０５％超（０．０５重量／体積％）のウシ胎仔血清を、Ａｌｅｘａ４８８結合ヤギ抗Ｔｒｐ１抗体（ＴＲＰ１  Ａｌｅｘａ４８８（ＴＲＰ１、チロシナーゼ関連タンパク質は特異的メラノソームマーカータンパク質である、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、カタログ番号：ｓｃ−１０４４３）（１μＬ／１００μＬ）および抗汎サイトケラチン抗体（汎サイトケラチン、サイトケラチンは、ケラチノサイトの特異的マーカーである）ＰＥ、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、カタログ番号：ｓｃ−８０１８）（１μＬ／１００μＬ）と混合したＰＢＳ中に添加することによって調製した。上記のＦＡＣＳ緩衝液を各ウェルのペレット（１００μＬ／ウェル）に添加し、氷上で６０分間インキュベートした。
【００６１】
４．次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、冷却遠心分離機（Ｐｌａｓｔｏ  ｃｒａｆｔｓ、Ｒｏａｔ  ４Ｒ−Ｖ／ＦＭ）を使用して、約１０００ｇで沈殿させた。
【００６２】
５．細胞ペレットをＰＢＳに懸濁し、丸底９６ウェルプレートに移し、フローサイトメトリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＢＤ  ＨＴＳを具備するモデル−ＢＤ  Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒ）により分析した。
【００６３】
メラノソーム転送（転送％）の計算：
転送されたメラノソームを含むケラチノサイトを、フローサイトメトリー分析により検出した。
【００６４】
阻害％の計算：
未処理細胞（活性物質非含有）における転送％を１００％とみなした。未処理細胞と比較して、処理細胞試料の転送パーセントを計算した。
【００６５】
結果
【表２】
2018529741.tif 000003
【００６６】
上記の表（表ＩＩ）は、ピコリンアミドとナイアシンアミドとの組合せによって得られたメラノソーム含有ケラチノサイトの相乗的減少を示す。
【００６７】
インビボ条件下では、肌の色はメラニン合成およびメラノサイトからケラチノサイトへのメラノソーム転送の２つのプロセスによって決定される。これらのプロセスを調節することにより、肌の色が調節されると考えられている。上記の実施例は、インビトロでメラノサイトからケラチノサイトへのメラノソーム転送に対する本発明の組合せが及ぼす相乗効果を示し、インビボでのメラノソーム転送に影響を与えることについても同様の効果が期待できる。
【００６８】
［実施例３］
メラノソーム転送アッセイ（ＭＴＡ）を使用した、メラノソーム転送に対するナイアシンアミドおよびピコリンアミドの組合せの効果についてのインビトロ研究（Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ．２００８  Ｏｃｔ；２１（５）：５５９−６４のＰｕｂＭｅｄ  Ｃｏｍｍｏｎｓのコメントを参照されたい）
材料
（ｉ）ヒト初代新生児包皮メラノサイト（カタログ番号：ＨＥＭｎ−ＤＰ−Ｃ−２０２−５Ｃ）、
（ｉｉ）メラノサイト成長培地（ＭＧＭ）（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｍ−２５４−５００）および
（ｉｉｉ）ヒトメラノサイト成長補足物質（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｓ−０００２−５）
（ｉｖ）ＨａＣａｔヒトケラチノサイト（Ｄｒ  ＮＥ  Ｆｕｓｅｎｉｇ、Ｈｅｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙからの寄贈）
（ｖ）ケラチノサイト成長培地（ＫＧＭ）（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｅｐｉｌｉｆｅ  ＭＥＰＩ−５００ＣＡ）、および
（ｖｉ）ヒトケラチノサイト成長補足物質（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｆ−００１−５）
（ｖｉｉ）ピコリンアミド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号：１０４０５１−５０Ｇ）
（ｖｉｉｉ）ナイアシンアミド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｎ０６３６−１００Ｇ）
（ｉｘ）トリプシンＥＤＴＡ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ；カタログ番号：Ｒ−００１）
（ｘ）トリプシン中和剤（Ｇｉｂｃｏ；カタログ番号：Ｒ−００２）
（ｘｉ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；１５−８１２−７）
（ｘｉｉ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
ａ．塩化ナトリウム（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｔｉｆｉｃ；カタログ番号：２７６０５）
ｂ．塩化カリウム（Ｍｅｒｃｋ；６１７５３３０５００１７３０）
ｃ．リン酸水素二ナトリウム（Ｓ．Ｄ  Ｆｉｎｅ−Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ；製品番号：４０１５８）
ｄ．リン酸二水素カリウム（Ｓ．Ｄ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ、２０２０３）
（ｘｉｉｉ）ＦＡＣＳ緩衝液
ａ．サポニン（ｓｉｇｍａ、カタログ番号：４７０３６−５０Ｇ−Ｆ）
ｂ．ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ；カタログ番号：１６０００）
方法
培養培地（ＭＧＭ：ＫＧＭ＝１：１）で調製した１．３Ｘ１０４細胞のヒト初代メラノサイト（Ｃ−２０２−５Ｃ、Ｌｏｎｚａ）と、培養培地（ＭＧＭ：ＫＧＭ＝１：１）で調製した２．６×１０４のＨａＣａｔケラチノサイトを一緒に混合し、４８ウェルプレートに播種して、組織培養組織培養インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍｏｄｅｌ  ３１１１）において３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下でインキュベートした。４時間のインキュベーションの後、共培養物を試料で処理し、同じ条件下で同じインキュベーターにおいて７２時間再びインキュベートした。必要な期間（７２時間）培養した後、以下に示す手順に従ってフローサイトメトリー分析のために細胞を調製した：
１．細胞を、４８ウェルプレートから、２００μｌのトリプシンＥＤＴＡ緩衝液を含むＶ底プレート（Ｔｏｒｓｏｎ、９４１３９６）に単離し、トリプシン活性を２００μｌのトリプシン中和剤で中和し、冷却遠心分離機（Ｐｌａｓｔｏ  Ｃｒａｆｔｓ、モデル番号：Ｒｏａｔ  ４Ｒ−Ｖ／ＦＭ）を使用して３５０ｇで沈殿（ｐｅｌｌｅｔｅｄ  ｄｏｗｎ）させた。
【００６９】
２．ペレットに、１００μｌの１％パラ−ホルムアルデヒドを添加し、氷上で１０分間インキュベートした。
【００７０】
３．次いで、細胞を、１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて１０分間遠心分離（１０００Ｇ）し、ペレットを下記のステップ４で述べた溶液で染色するために使用した。ＰＢＳを、塩化ナトリウム４ｇ、塩化カリウム０．１ｇ、リン酸水素二ナトリウム０．５８ｇおよびリン酸二水素カリウム０．１ｇを、オートクレーブにかけたＭｉｌｉ−Ｑ水５００ｍｌに加えることによって調製した。
【００７１】
ＦＡＣＳ緩衝液（蛍光活性化セルソーター）を、０．１％サポニンおよび０．０５％超（０．０５重量／体積％）のウシ胎仔血清を、Ａｌｅｘａ４８８結合ヤギ抗Ｔｒｐ１抗体（ＴＲＰ１  Ａｌｅｘａ４８８（ＴＲＰ１、チロシナーゼ関連タンパク質は特異的メラノソームマーカータンパク質である、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、カタログ番号：ｓｃ−１０４４３）（１μＬ／１００μＬ）および抗汎サイトケラチン抗体（汎サイトケラチン、サイトケラチンは、ケラチノサイトの特異的マーカーである）ＰＥ、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、カタログ番号：ｓｃ−８０１８）（１μＬ／１００μＬ）と混合したＰＢＳ中に添加することによって調製した。上記のＦＡＣＳ緩衝液を各ウェルのペレット（１００μＬ／ウェル）に添加し、氷上で６０分間インキュベートした。
【００７２】
４．次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、冷却遠心分離機（Ｐｌａｓｔｏ  ｃｒａｆｔｓ、Ｒｏａｔ  ４Ｒ−Ｖ／ＦＭ）を使用して、約１０００Ｇで沈殿させた。
【００７３】
５．細胞ペレットをＰＢＳに懸濁し、丸底９６ウェルプレートに移し、フローサイトメトリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＢＤ  ＨＴＳを具備するモデル−ＢＤ  Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒ）により分析した。
【００７４】
メラノソーム転送（転送％）の計算：
転送されたメラノソームを含むケラチノサイトを、フローサイトメトリー分析により検出した。
【００７５】
阻害％の計算：
未処理細胞（活性物質非含有）における転送％を１００％とみなした。未処理細胞と比較して、処理細胞試料の転送パーセントを計算した。
【００７６】
結果
【表３】
2018529741.tif 000004
【００７７】
上記表（表ＩＩＩ）は、ピコリンアミド対ナイアシンアミドの特定のモル比でのみ相乗的皮膚美白効果が得られることを示している。
【手続補正書】
【提出日】平成29年7月10日(2017.7.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．０．１〜１０重量％のピコリンアミドと、
ｂ．０．１〜１０重量％のナイアシンアミドと、
を含む皮膚美白組成物であって、相乗的な皮膚美白効果を示す量のピコリンアミドとナイアシンアミドを含む前記組成物。
【請求項２】
ピコリンアミド対ナイアシンアミドのモル比が２０：１以下、好ましくは１０：１以下、より好ましくは４：１以下、最も好ましくは２：１以下である、請求項１に記載の皮膚美白組成物。
【請求項３】
ピコリンアミド対ナイアシンアミドのモル比が少なくとも１０：１、好ましくは少なくとも８：１、より好ましくは少なくとも４：１、さらにより好ましくは少なくとも２：１である、請求項１に記載の皮膚美白組成物。
【請求項４】
ピコリンアミド対ナイアシンアミドのモル比が２０：１〜１：２０である、請求項１に記載の皮膚美白組成物。
【請求項５】
１〜５重量％のピコリンアミドを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の皮膚美白組成物。
【請求項６】
１〜５重量％のナイアシンアミドを含む、請求項１または５に記載の皮膚美白組成物。
【請求項７】
皮膚有益剤をさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の皮膚美白組成物。
【請求項８】
局所用組成物の形態である、請求項１から７のいずれか一項に記載の皮膚美白組成物。
【請求項９】
皮膚美白のための、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物を皮膚に塗布するステップを含む、ヒトの皮膚を美白する方法。
【国際調査報告】
2018529741.tif 000005
2018529741.tif 000006
2018529741.tif 000007