(57)【要約】  患者が罹患する肝細胞癌を治療、改善、または、予防するための組成物、および、方法を提供する。特に、本発明は、患者が罹患する肝細胞癌を治療、改善、または、予防する方法であって、６−メトキシエチルアミノ−ヌモナフィド（６−ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−ｎｕｍｏｎａｆｉｄｅ）を単独で、または、ソラフェニブと組み合わせて前記患者に投与することを含む方法に関する。
2018508546.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者が罹患する肝細胞癌を治療、改善、または、予防する方法であって、治療上有効な量の６−メトキシエチルアミノ−ヌモナフィド（ＭＥＡＮ）：
【化１】
2018508546.tif 000017
を前記患者に投与することを含み、前記６−メトキシエチルアミノ−ヌモナフィド（ＭＥＡＮ）はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、および／または、プロドラッグを含む、前記方法。
【請求項２】
前記投与によりｃ−ｍｙｃ発現が減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記投与によりＳＨＰ−１発現が増加する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記投与によりＴＸＮＩＰ発現が増加する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
治療上有効な量のソラフェニブ
【化２】
2018508546.tif 000018
を同時投与することをさらに含み、前記ソラフェニブはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、および／または、プロドラッグを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記患者はヒト患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
患者が罹患する肝細胞癌を治療、改善、または、予防する方法であって、治療上有効な量の６−メトキシエチルアミノ−ヌモナフィド（ＭＥＡＮ）：
【化３】
2018508546.tif 000019
を含む治療上有効な量の医薬組成物を前記患者に投与することを含み、前記６−メトキシエチルアミノ−ヌモナフィド（ＭＥＡＮ）はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、および／または、プロドラッグを含む、前記方法。
【請求項８】
前記投与によりｃ−ｍｙｃ発現が減少する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記投与によりＳＨＰ−１発現が増加する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記投与によりＴＸＮＩＰ発現が増加する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者はヒト患者である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
治療上有効な量のソラフェニブ
【化４】
2018508546.tif 000020
を含む医薬組成物を同時投与することをさらに含み、前記ソラフェニブはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、および／または、プロドラッグを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
６−メトキシエチルアミノ−ヌモナフィド（ＭＥＡＮ）：
【化５】
2018508546.tif 000021
を含む組成物と、肝細胞癌に罹患した患者にこの組成物を投与するための説明書と、を含むキット。
【請求項１４】
前記組成物は、医薬組成物である、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
ソラフェニブ
【化６】
2018508546.tif 000022
を含む組成物をさらに含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１６】
前記ソラフェニブを含む組成物は医薬組成物である、請求項１５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願の相互参照〕
本発明は、２０１５年３月１９日出願の米国仮特許出願第６２／１３５，４３５号の優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
〔政府後援研究または開発に関する声明〕
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたＧＭ０７８５５５に基づく政府支援を受けて実施された。政府は本発明において、ある一定の権利を有する。
【０００３】
〔技術分野〕
患者が罹患する肝細胞癌を治療、改善、または、予防するための組成物、および、方法を提供する。特に、本発明は、患者が罹患する肝細胞癌を治療、改善、または、予防する方法であって、６−メトキシエチルアミノ−ヌモナフィド(6-Methoxyethylamino-numonafide)を単独で、または、ソラフェニブ(sorafenib)と組み合わせて前記患者に投与することを含む方法に関する。
【０００４】
〔背景技術〕
肝細胞癌ＨＣＣは、世界的に見て、癌による死亡の最も一般的な原因のうちのひとつである。２００８年には、肝癌の新しい症例がおよそ７５０，０００件確認され、そして、世界で約７００，０００人がこの癌によって死亡している。２００２年における肝癌の新しい症例数６２６，０００件、および、肝癌による死亡数６００，０００件から増加している１。ＨＣＣは、以前は、主にアジアやアフリカに限られた公衆衛生問題であったが、アメリカにおけるＨＣＣの発生率が急速に増加しており、数十年間は増加し続けると考えられている。アメリカでは、１９７５年から２０１４年の間で、ＨＣＣの年齢調整発生率が３倍となり、１００，０００人につき１．６人から４．９人へと増加している２。２０１４年５月２１日の時点で、ＨＣＣは、アメリカでは癌による死亡の９番目に多い原因となっており、世界では癌による死亡の３番目に多い原因となっている３−４。アメリカでは、ＨＣＣの発生率は主としてＣ型肝炎の地域流行性が原因で増加している。Ｃ型肝炎患者が肝硬変になると、ＨＣＣは１％から１．５％の年率で発症する５−７。加えて、アメリカにおける肥満の蔓延が、ＨＣＣ発症の主要な危険因子でもある、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）／特発性肝硬変の発生率の急速な増加を引き起こしている８−９。したがって、アメリカにおけるＨＣＣは急速に重大な健康問題となっている。
【０００５】
肝細胞癌を治療するための改善された方法が必要とされている。
【０００６】
〔発明の概要〕
肝細胞癌（ＨＣＣ）は世界で３番目に多い癌の形態であり、その発生率はアメリカで急速に増加しており、過去３０年で３倍となっている。残念ながら、限局性および転移性のＨＣＣに対する化学療法は効果がなく、当該疾患による死亡率が高い原因となっている。ソラフェニブは、当該疾患に対して現在臨床的に用いられている唯一のＦＤＡ認可化学治療薬であるが、実質的に毒性を有し、その有効性は限られている。新規の小分子である６−メトキシエチルアミノ−ヌモナフィド（ＭＥＡＮ）は、インビボでのＨＣＣ異種移植片の治療に有望であることが示されている。ＭＥＡＮは、２つの、ヒトＨＣＣ細胞株（Ｈｕｈ７およびＨｅｐＧ２）のマウス異種移植モデルに対して非常に効果的である。
【０００７】
本発明の実施形態を作製する過程で行われた実験によって、同じ濃度および同じ治療法では、ソラフェニブよりもＭＥＡＮのほうがより有効で毒性も少ないことが特定された。有効な量のＭＥＡＮによる治療は、動物の体重に著しく影響を与えないことが示された。ＭＥＡＮとソラフェニブの組み合わせは単剤治療よりもかなりの程度で腫瘍増殖を阻害することが示され、また、ＭＥＡＮの添加はソラフェニブ単独と比較して毒性を著しく増加させないことが示された。機械論的には、ＭＥＡＮはｃ−ｍｙｃ発現を抑制し、ＳＨＰ−１やＴＸＮＩＰを含むいくつかの腫瘍抑制因子の発現を増加させることが示された。ＭＥＡＮは、Ｐ糖たんぱく質の薬物排出ポンプが活性化したいくつかの薬物耐性細胞株における癌細胞増殖を効果的に阻害することが示され、薬のような単回投与薬物動態プロファイルを有することが示された。要するに、これらの実験によって、ＭＥＡＮは、単剤療法としても、また、ソラフェニブと組み合わせても、ＨＣＣ腫瘍増殖に対して効果的であり、ＨＣＣ管理用治療剤として臨床開発の素晴らしい候補であることが実証されている。
【０００８】
したがって、本発明は、患者が罹患する肝細胞癌を治療、改善、または、予防するための組成物、および、方法を提供する。特に、本発明は、患者が罹患する肝細胞癌を治療、改善、または、予防する方法であって、６−メトキシエチルアミノ−ヌモナフィドを単独で、または、ソラフェニブと組み合わせて前記患者に投与することを含む方法に関する。
【０００９】
ある実施形態では、本発明は、患者が罹患する肝細胞癌を治療、改善、または、予防する方法であって、治療上有効な量の６−メトキシエチルアミノ−ヌモナフィド（ＭＥＡＮ）：
【００１０】
【化１】
2018508546.tif 000003
【００１１】
を前記患者に投与することを含み、前記６−メトキシエチルアミノ−ヌモナフィド（ＭＥＡＮ）は、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、および／または、プロドラッグを含む、方法を提供する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、前記投与によりｃ−ｍｙｃの発現が減少する。いくつかの実施形態では、前記投与によりＳＨＰ−１の発現が増加する。いくつかの実施形態では、前記投与によりＴＸＮＩＰの発現が増加する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、前記方法は、治療上有効な量のソラフェニブ
【００１４】
【化２】
2018508546.tif 000004
【００１５】
を同時投与することをさらに含み、前記ソラフェニブは、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、および／または、プロドラッグを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、前記患者はヒト患者である。
【００１７】
ある実施形態では、本発明は、患者が罹患する肝細胞癌を治療、改善、または、予防する方法であって、治療上有効な量の６−メトキシエチルアミノ−ヌモナフィド（ＭＥＡＮ）：
【００１８】
【化３】
2018508546.tif 000005
【００１９】
を含む、治療上有効な量の医薬組成物を前記患者に投与することを含み、前記６−メトキシエチルアミノ−ヌモナフィド（ＭＥＡＮ）は、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、および／または、プロドラッグを含む、前記方法を提供する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、前記投与によりｃ−ｍｙｃの発現が減少する。いくつかの実施形態では、前記投与によりＳＨＰ−１の発現が増加する。いくつかの実施形態では、前記投与によりＴＸＮＩＰの発現が増加する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、前記患者はヒト患者である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、前記方法は治療上有効な量のソラフェニブ
【００２３】
【化４】
2018508546.tif 000006
【００２４】
を含む医薬組成物を同時投与することをさらに含み、前記ソラフェニブは、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、および／または、プロドラッグを含む。
【００２５】
ある実施形態では、本発明は、６−メトキシエチルアミノ−ヌモナフィド（ＭＥＡＮ）：
【００２６】
【化５】
2018508546.tif 000007
【００２７】
を含む組成物と、この組成物肝を細胞癌に罹患した患者に投与するための説明書と、を含むキットを提供する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、前記組成物は、医薬組成物である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、前記キットは、ソラフェニブ
【００３０】
【化６】
2018508546.tif 000008
【００３１】
を含む組成物（例えば、医薬組成物）をさらに含む。
【００３２】
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕ＭＥＡＮは、ヌードマウスにおいて、Ｈｕｈ７−ｌｕｃ異種移植腫瘍の増殖を、ソラフェニブよりも、より強力に阻害する。１０７個の腫瘍細胞を皮下接種した１０日後、５日間投薬２日間投薬なしのスケジュールで４２日間、ＩＰ経由で、ＭＥＡＮ（１５ｍｇ／ｋｇ）、ソラフェニブ（１５ｍｇ／ｋｇ）、若しくは、各１５ｍｇ／ｋｇのＭＥＡＮとソラフェニブとの組み合わせ、または、溶媒を用いてマウスを治療した。腫瘍増殖は、ルシフェリン蛍光発光の全載イメージング(whole mount imaging)（代表画像）（Ａ）、週２回の光子計数（Ｂ）および４２日目の実験終了時の光子計数（Ｃ）、容量（Ｄ）、ならびに、実験終点における腫瘍重量（Ｅ）によって、測定した。ｔ検定を用いた統計的解析を（ＣおよびＥ）に示す。なお、＊＝ｐ＜０．５であり、＊＊＝ｐ＜０．０１である。黒線が無い箇所はｐ＞０．５（ｎ＝５）を示す。
【００３３】
〔図２〕ＭＥＡＮは、ヌードマウスにおいて、ＨｅｐＧ２−ｌｕｃ異種移植腫瘍の増殖を、ソラフェニブよりも、より強力に阻害する。１０７個の腫瘍細胞を皮下接種した１０日後、５日間投薬２日間投薬なしのスケジュールで４２日間、ＩＰ経由で、ＭＥＡＮ（１５ｍｇ／ｋｇ）、ソラフェニブ（１５ｍｇ／ｋｇ）、または、各１５ｍｇ／ｋｇのＭＥＡＮとソラフェニブとの組み合わせ、または、溶媒を用いてマウスを治療した。腫瘍増殖は、ルシフェリン蛍光発光の全載イメージング（代表画像）（Ａ）、週２回の光子計数（Ｂ）および４２日目の実験終了時の光子計数（Ｃ）、容量（Ｄ）、ならびに、実験終点における腫瘍重量（Ｅ）によって、測定した。ｔ検定を用いた統計的解析を（ＣおよびＥ）に示す。なお、＊＝ｐ＜０．５であり、＊＊＝ｐ＜０．０１である。黒線が無い箇所はｐ＞０．５（ｎ＝５）を示す。
【００３４】
〔図３〕ＭＥＡＮ、ソラフェニブ、または、ＭＥＡＮとソラフェニブとの組み合わせによる治療により誘発された毒性を、治療過程における体重の変化を観察（Ａ）、および、実験終点における血清中肝臓酵素濃度を検出（Ｂ）することにより、溶媒で治療した群と対比して測定した。実験終点（４２日目）数日後の肝臓酵素の回収。ｎ＝１０、ａ：各群対溶媒、ｂ：ソラフェニブ対ＭＥＡＮ、ｃ：Ｍ＋Ｓ対ＭＥＡＮ。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１。ソラフェニブ対Ｍ＋Ｓ：差異なし。
【００３５】
〔図４〕ＣＯＭＰＡＲＥアルゴリズムを用いたＮＣＩ６０細胞データ解析によると、ＭＥＡＮとＡＭＮとの間で異なる作用様式が示されている。ＭＥＡＮは、ＬＣ５０およびＧＩ５０の濃度で、データベースにおけるどの被試験化合物とも相関しない（Ａ、上部パネル）（ＧＩ５０、すなわち、５０％増殖阻害濃度、ＬＣ５０、すなわち、５０％致死濃度、ＴＧＩ、すなわち、全増殖阻害濃度）。ＭＥＡＮとＡＭＮとの比較によると、著しい相関関係が見られない（Ａ、下部パネル）。ＭＥＡＮ、ＡＭＮ、または、ＤＭＳＯで治療したＨｅｐＧ２細胞における細胞周期解析によって、ＭＥＡＮとＡＭＮとの間で異なる細胞周期プロファイルが実証されている（Ｂ）。しかしながら、ＭＥＡＮは、多剤耐性の一般的な原因である活性Ｐ糖たんぱく質の基質とならない点で、ＡＭＮと類似している（Ｃ）。
【００３６】
〔図５〕ＭＥＡＮとＡＭＮとは、治療したＨｅｐＧ２細胞およびＨｕｈ７細胞において遺伝子発現に異なった変化を与える。ＲＮＡアレイ解析によって、治療した細胞における３分の２の遺伝子発現の変化は、ＭＥＡＮとＡＭＮとの間で共有されないことが示されている（Ａ）。ＭＥＡＮは、１０ｕＭよりも低い濃度で用いると、ｍｙｃたんぱく質レベルを著しく減少させる一方、ＡＭＮは同じ濃度でｍｙｃ発現を著しく減少させない（ＢおよびＤ）。ＭＥＡＮは、ＳＩＲＴ１たんぱく質レベルを減少させ、ＳＨＰ−１たんぱく質レベルを増加させる一方、ＡＭＮはこれらたんぱく質のレベルに著しい影響を与えない。溶媒の量を１とし、治療／溶媒の比率を各定量グラフにプロットしている（ＢおよびＤ）。２つの遺伝子を除く、ｍｙｃの多くの下流遺伝子の発現量が、ＭＥＡＮまたはＡＭＮで治療した細胞において、それ相応に減少する（Ｃ）。Ｙ軸は、薬剤とＤＭＳＯとの間の、示された各遺伝子のＲＮＡレベルの対数倍差(log fold differences)を表す。
【００３７】
〔図６〕ソラフェニブは、インビボにおいて、同じ遺伝子発現に対して、ＭＥＡＮに影響しない。ＮＣＩ６０細胞パネルを用いたＣＯＭＰＡＲＥアルゴリズムによる解析によって、ＭＥＡＮはソラフェニブと共通の作用機序を有さない可能性があることが示されている（Ａ）。ＭＥＡＮ、ソラフェニブ、ＭＥＡＮとソラフェニブとの組み合わせ、または、溶媒で治療した腫瘍組織のウェスタンブロッティングによって、培養細胞における知見と同様に、ＭＥＡＮはｍｙｃおよびＳＩＲＴ１のたんぱく質レベルを抑制し、ＳＨＰ−１およびＴＸＮＩＰのたんぱく質レベルを増加させることが実証されている（ＢおよびＣ）。ソラフェニブはこれら遺伝子発現に著しい影響を与えない（ＢおよびＣ）。溶媒の量を１とし、治療／溶媒の比率を各定量グラフにプロットしている。
【００３８】
〔図７Ａ−図７Ｅ〕静脈内投与（ＩＶ、丸、実線）、腹腔内投与（ＩＰ、四角、破線）、および、経口投与（ＰＯ、四角、破線）後のマウスにおけるＭＥＡＮの薬物動態（ＰＫ）。
【００３９】
〔発明の詳細な説明〕
肝細胞癌（ＨＣＣ）の第１の治癒的療法は、肝切除または肝移植のいずれかを伴う外科的切除である１０−１１。西洋諸国では、ＨＣＣ患者の５％のみが外科的切除の候補であり、患者の残り９５％に対する治癒的処置は肝移植のみであるが、肝移植には利用可能なドナー肝の数と長い待機時間による制限がある。経皮的焼灼療法、肝動脈化学塞栓療法（ＴＡＣＥ）、イットリウム９０ミクロスフィア１２放射線治療などのＨＣＣの補助療法がしばしば緩和療法として、または、肝移植への「橋渡し」として用いられる。しかしながら、これらの治療は、概して非治癒的である。全身化学療法は、利用可能な化学治療薬の有効性が劣るため、肝移植の前または移植への「橋渡し」として推奨されていない。ＨＣＣに対して唯一認可された化学療法は、２つの研究においてＨＣＣを治療するのに有効であると示されたチロシンおよびセリン−トレオニンキナーゼ阻害剤であるソラフェニブである１３−１４。しかしながら、全生存期間中央値がＳＨＡＲＰの研究では７．９か月から１０．７か月に伸びただけであり、また、アジアの研究では４．２か月から６．５か月へ伸びただけであるため、ソラフェニブの効果は限られていると考えられる。また、両研究において、かなりの薬物毒性があった１３−１５。加えて、ソラフェニブと他の化学治療薬との組み合わせは失望させるものであった１６−１７。ＨＣＣに対して効果的な全身化学療法が無いことが、アメリカにおけるＨＣＣ患者の５年生存率が乏しい主な理由となっている（遠隔併合ＨＣＣ(distant mediatized HCC)は２％、局所性ＨＣＣは７％、限局性ＨＣＣは２８％）２。
【００４０】
先ごろ、６−メトキシエチルアミノ−ヌモナフィド（ＭＥＡＮ）１８が合成され、マウスにおけるＨＣＣ異種移植腫瘍に対して効果的であることが示された１９。異種移植ＨＣＣモデルにおいて、ＭＥＡＮは、６週間にわたる治療で、定着腫瘍を退縮させることができ、また、毒性がごくわずかであったため、動物はその治療によく耐えた１９。ＭＥＡＮは、多剤耐性薬物排出ポンプの基質とならない抗癌剤であって幅広い癌に対して効果的な抗癌剤であるアモナフィド(amonafide)（ＡＭＮ）
【００４１】
【化７】
2018508546.tif 000009
【００４２】
の誘導体である。ＡＭＮは、分子の５位に、ＮＡＴ２によってアセチル化された遊離アリールアミンを有し、これがＮＡＴ２によってアセチル化され、毒性のＮ−アセチルＡＭＮを形成する。ＡＭＮの、ヒト集団における、機能的ＮＡＴ２アセチル化の薬理ゲノム学的変動により、強い毒性を経験する患者もいれば、決められた服用量では治療が不十分な患者もいる。ＡＭＮは、その高い、そして、変動する毒性により、ＦＤＡによる認可が得られていない２０−２１。
【００４３】
ＭＥＡＮ
【００４４】
【化８】
2018508546.tif 000010
【００４５】
は、ＡＭＮの相似物であって、６位にエチル−メトキシ部分でブロックされたアリールアミンを有する。
【００４６】
ＭＥＡＮは、マウスにおけるＨｕｈ７およびＨｅｐＧ２のＨＣＣ異種移植片の増殖を阻害するという点でＡＭＮと同様に有効である一方、ＡＭＮよりもかなり毒性が低い１９。毒性の違いは、代謝物を形成しない他の誘導体（Ａ１）がＡＭＮと同様の毒性を招いたため、５位に毒性のアセチル化代謝物を形成しないということにのみ起因するのではない。これは、ＭＥＡＮの毒性の減少は、異なる細胞の作用機序によって説明されうることを示している。ＦＤＡにより唯一認可されたＨＣＣ治療用全身性小分子はソラフェニブであるため、新規のＨＣＣ治療としてのＭＥＡＮの今後の発展を吟味するために、本発明の実施形態を作製する過程で行われた実験においてソラフェニブとＭＥＡＮの抗腫瘍効果および毒性を比較した。
【００４７】
本発明の実施形態を作製する過程で行われた実験によって、同じ濃度および同じ治療法では、ソラフェニブよりもＭＥＡＮのほうがより有効で毒性も少ないことが特定された。有効な量のＭＥＡＮによる治療は、動物の体重に著しく影響を与えないことが示された。ＭＥＡＮとソラフェニブの組み合わせは単剤治療よりもかなりの程度で腫瘍増殖を阻害することが示され、また、ＭＥＡＮの添加はソラフェニブ単独と比較して毒性を著しく増加させないことが示された。機械論的に、ＭＥＡＮはｃ−ｍｙｃ発現を抑制し、ＳＨＰ−１やＴＸＮＩＰを含むいくつかの腫瘍抑制因子の発現を増加させることが示された。ＭＥＡＮは、Ｐ糖たんぱく質の薬物排出ポンプが活性化したいくつかの薬物耐性細胞株における癌細胞増殖を効果的に阻害することが示され、また、薬のような単回投与薬物動態プロファイルを有することが示された。要するに、これらの実験によって、ＭＥＡＮは、単剤療法としても、また、ソラフェニブと組み合わせても、ＨＣＣ腫瘍増殖に対して効果的であり、ＨＣＣ管理用治療剤として臨床開発の素晴らしい候補であることが実証されている。
【００４８】
したがって、本発明は、患者が罹患する肝細胞癌を治療、改善、または、予防するための組成物、および、方法を提供する。特に、本発明は、患者が罹患する肝細胞癌を治療、改善、または、予防する方法であって、６−メトキシエチルアミノ−ヌモナフィドを単独で、または、ソラフェニブと組み合わせて前記患者に投与することを含む方法に関する。
【００４９】
ある実施形態では、本発明は、６−メトキシエチルアミノ−ヌモナフィド（ＭＥＡＮ）：
【００５０】
【化９】
2018508546.tif 000011
【００５１】
と、ソラフェニブ
【００５２】
【化１０】
2018508546.tif 000012
【００５３】
とを含む組成物であって、前記６−メトキシエチルアミノ−ヌモナフィド（ＭＥＡＮ）および前記ソラフェニブはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、および／または、プロドラッグを含む、前記組成物を提供する。
【００５４】
ある実施形態では、治療上有効な量のＭＥＡＮ（例えば、ＭＥＡＮを含む組成物）（例えば、ＭＥＡＮを含む医薬組成物）を患者に投与することにより、前記患者が罹患する肝細胞癌を治療、改善、または、予防する方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は、治療上有効な量のソラフェニブ（例えば、ソラフェニブを含む医薬組成物）を前記患者に同時投与することをさらに含む。
【００５５】
本発明の重要な態様は、ＭＥＡＮはｃ−ｍｙｃ発現を減少させ、ＳＨＰ−１発現およびＴＸＮＩＰ発現を増加させることができる（実施例参照）ということが示されたことである。そのため、本発明は、ＭＥＡＮを含む組成物の投与により、ｃ−ｍｙｃ発現を減少させ、そして、ＳＨＰ−１発現およびＴＸＮＩＰ発現を増加させる方法を提供する。
【００５６】
いくつかの実施形態では、治療上有効な量のＭＥＡＮを投与することにより患者が罹患する肝細胞癌を治療、改善、または、予防する前記方法は、前記患者におけるｃ−ｍｙｃ発現、そして、ＳＨＰ−１発現およびＴＸＮＩＰ発現の増加を伴う（実施例参照）。
【００５７】
いくつかの実施形態では、さらなる抗癌剤を前記患者に同時投与する（例えば、任意のタイプまたは種類の化学療法および／または薬物療法および／または放射線療法）。
【００５８】
当業者は、上述の事項が本発明のある好ましい実施形態の詳細な説明を単に表すだけのものであることを容易に認識するであろう。上述の組成物および方法の種々の変更および改変は、本技術分野において利用可能な専門知識を用いて容易に達成することができ、本発明の範囲に含まれる。
【００５９】
〔実施例〕
以下の実施例は本発明の化合物、組成物、および、方法を説明するものであり、これらに限定されない。臨床治療で通常遭遇する、当業者にとって自明な様々な条件およびパラメータのその他の好適な変更および適合は本発明の精神および範囲に含まれる。
【００６０】
材料および方法：
ヒトＨＣＣ細胞株のＨｅｐＧ２およびＨｕｈ７を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）、１００単位／ｍＬのペニシリン、および、１００ｕｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有する、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）で維持した。また、ＨｅｐＧ２−ｌｕｃ細胞株およびＨｕｈ７−ｌｕｃ細胞株を、少し変更を加えたうえで、我々の先行研究の通り製造し１９、１０％のＦＢＳが補充されたＤＭＥＭで培養した。
【００６１】
マウスモデリング：
有効性および毒性についてのＨｅｐＧ２−ｌｕｃ異種移植研究およびＨｕｈ７−ｌｕｃ異種移植研究：オスのｎｕ／ｎｕ（ヌード）マウス（実験開始時で１８ｇから２０ｇ）を、浙江大学の動物飼養場にて、１２時間の明暗サイクルのもと、無菌ユニットで維持した。マウスの右腋窩部の皮下にＨｅｐＧ２−ｌｕｃ（１０６個の細胞）を接種、または、左腋窩部の皮下にＨｕｈ７−ｌｕｃ（１０６個の細胞）を接種した。腫瘍増殖１０日後、薬物治療の前に、マウスを無作為に５匹のマウスのグループに分けた。治療当日に、ソラフェニブ（ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１：１の比率のエタノールおよびクレモフォールＥＬ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解し、その後、ＰＢＳで希釈して５ｍｇ／ｍｌとした。また、ＭＥＡＮを１：１の比率のエタノールおよびクレモフォールＥＬ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解し、その後、ＰＢＳで希釈して２ｍｇ／ｍｌとし、−２０℃で保存した。５日間連続で腹腔内注射によりソラフェニブ（１５ｍｇ／ｋｇ）またはＭＥＡＮ（１５ｍｇ／ｋｇ）を投与した後、２日間投薬なしとした。溶媒対照は１０％の１：１の比率のエタノールおよびクレモフォールＥＬ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とした。腫瘍量を特定するインビボ生物発光イメージングをＬｕｍｉｎａイメージングシステム（日本ローパー、Ｉ．Ｃ．Ｅ．、日本、東京）を用いて行った。イメージングの１０分前に、マウスに１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリンを腹腔内経路で注射した。画像を収集し、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓｌｉｄｅｂｏｏｋ４．１、コロラド州、デンバー）を用いて解析した。長さ（ａ）および幅（ｂ）を機械的に測定し、容積＝ａｂ２／２によって、週に２回、腫瘍容積を求めた。腫瘍重量を実験終点において測定し、スチューデントｔ検定を用いて統計的解析を行った。
【００６２】
ＡＬＴおよびＡＳＴ測定：
４２日目終了時に各マウスから血液サンプルを採取した。血清アラニンアミノトランスフェラーゼアスパルテート（ＡＬＴ）およびアスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を、自動生化学分析装置（ＤＲＩ−ＣＨＥＭ４０００ｉｅ、フジフィルム）を用いて測定した。
【００６３】
ＨｅｐＧ２細胞のＲＮＡアレイ解析：
２０μＭのＡＭＮ、ＭＥＡＮ、または、溶媒（０．２％ＤＭＳＯ）での治療６時間後に、Ｔｒｉｚｏｌを用いて１０７個のＨｅｐＧ２細胞からＲＮＡを分離した。ＲＮＡ発現解析を、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  ＰｒｉｍｅＶｉｅｗ（商標）  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｒｒａｙで行った。初めに、統計的有意性（Ｐ＜０．０５）、および、各比較における発現レベルの１．５倍の変化（増加または減少）に基づき、遺伝子が特異的に発現していると同定した。
【００６４】
ＤＡＰＩ染色法を用いた細胞周期プロファイリング
治療後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、遠心分離し、その後、ＰＢＳ（ＣａおよびＭｇは含まない）に再懸濁した。ボルテックスシしながら、細胞ペレットに３．０ｍｌのよく冷えた９５％エタノールを滴下し、その後、３０分間培養した。ＰＢＳを用いて容量を１５ｍＬにまで増やし、細胞をペレットにし、遠心分離を経てＰＢＳで１回洗浄した。細胞を、１ｍｌの１０ｕｇ／ｍｌＤＡＰＩ  ｉｎ  ＰＢＳおよび０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に再懸濁して細胞濃度を１×１０６個／ｍｌとし、氷上で３０分間培養した。そして、サンプルをフローサイトメトリーにより解析し、細胞集団のＤＮＡ含量を分類して評価した。
【００６５】
ウエスタンブロット法：
細胞または腫瘍塊を、１％Ｈａｌｔ（商標）  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  （１００Ｘ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有するＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、中国、江蘇）で溶解した。１つのレーンにつき２０ｕｇの総タンパクを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州、ベッドフォード）に転写し、室温にて１時間１％ＢＳＡ  ｉｎ  ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％、ｖ／ｖ）を用いてブロッキングした。当該膜を一晩４℃にて一次抗体とともに培養した。ｃ−ｍｙｃおよびＧＡＰＤＨに対する抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（マサチューセッツ州、ベバリー）から得た。ＴＸＮＩＰ、ＳＨＰ−１、および、ＳＩＲＴ１に対する抗体はＡｂｃａｍ（マサチューセッツ州、ケンブリッジ）から得た。洗浄後、当該膜を、適当な西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（１：３０００；Ｅｐｔｍｏｍｉｃｓ）とともに1時間培養した。ブロットをＥＣＬ関連のフルオログラフィ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって可視化した。相対バンド強度をＩｍａｇｅＪ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて定量化し、ｃ−ｍｙｃ量、ＴＸＮＩＰ量、ＳＨＰ−１量、および、ＳＩＲＴ１量を求めた。
【００６６】
統計的解析
Ｔ検定を用いて統計的解析を行い、群間の差異を評価した。各インビトロ実験を少なくとも３回繰り返し、平均±標準誤差でデータを表した。ｐ＜０．０５を有意であるとみなした。
【００６７】
結果：
ＨＣＣ異種移植片において、同じ濃度では、ＭＥＡＮはソラフェニブよりも有効である。
【００６８】
我々は、以前、５０ｕｍｏｌ／ｋｇまたは１００ｕｍｏｌ／ｋｇ（それぞれ、１７．１ｍｇ／ｋｇまたは３４．２ｍｇ／ｋｇ）のＭＥＡＮは、マウスにおけるＨｕｈ７異種移植片およびＨｅｐＧ２異種移植片に対して効果的であることを示した１９。ＭＥＡＮの有効性とＦＤＡにより唯一認可された抗ＨＣＣ剤であるソラフェニブの有効性とを直接比較するために、両薬剤を用いて同じ治療法で同じＨＣＣ異種移植モデルを治療した。ヌードマウスに１０６個のＨｕｈ７−ルシフェラーゼ細胞またはＨｅｐＧ２−ルシフェラーゼ細胞を皮下接種し、腫瘍を１０日間増殖させた。１１日目に、１５ｍｇ／ｋｇのＭＥＡＮまたはソラフェニブを用いた治療を開始した。なお、治療は５日間投薬２日間投薬なしのスケジュールで４２日間行った。週２回のルシフェラーゼ発光の評価（図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａ、および、図２Ｂ）、週２回の腫瘍容積の評価（図１Ｄおよび図２Ｄ）、または、実験終点における腫瘍重量の評価（図１Ｅおよび図２Ｅ）によって、溶媒のみを注射した対照マウスと比較して、所定濃度の両薬剤を用いた治療は、治療したマウスにおける腫瘍増殖を著しく抑制するということが実証されている（図１及び図２）（溶媒治療動物と比較した腫瘍増殖の点において両薬剤についてはｐ＜０．０５）。以前に高濃度のＭＥＡＮを用いた際１９に見られたようには定着腫瘍は減少しなかったが、１５ｍｇ／ｋｇのＭＥＡＮによる治療はほぼ全体的に腫瘍増殖を阻止した（図１）。この治療計画によって、すべての測定方法において、両ＨＣＣ異種移植腫瘍モデルに対し腫瘍増殖を阻害する（ｐ＜０．０５）という点でＭＥＡＮはソラフェニブよりかなり効果的である（図１および図２）。
ＭＥＡＮとソラフェニブとの組み合わせはＨＣＣ異種移植片に対する有効性を向上させる。
【００６９】
ＭＥＡＮおよびソラフェニブの両方が２つのヒトＨＣＣ異種移植腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖に対しかなりの有効性を示すことから、両化合物による併用治療がより効果的であるかどうかという疑問に至った。ＭＥＡＮとソラフェニブとの両薬剤を同じ濃度（１５ｍｇ／ｋｇ）で併用してＨｕｈ７異種移植腫瘍およびＨｅｐＧ２異種移植腫瘍を治療した。なお、単剤治療を並行して行った。結果として、両腫瘍モデルにおいて、ＭＥＡＮとソラフェニブとの組み合わせはより有効であるという傾向を示す。当該組み合わせは、腫瘍増殖を抑え、治療開始後３０日目ごろに両モデルにおいて腫瘍サイズを小さくし始める（図１および図２）。当該組み合わせはソラフェニブによる単剤治療よりかなり有効である一方で、ＭＥＡＮによる単剤療法と比較するとそれほど有効ではない（図１および図２）。ソラフェニブの添加によるＭＥＡＮの有効性の適度な向上は、ＭＥＡＮの有効性が１５ｍｇ／ｋｇでほぼ最大阻害作用に達しているからであり、低濃度のソラフェニブを添加することはそれほど重要ではないからと考えられる。
【００７０】
ＭＥＡＮとソラフェニブとの組み合わせは毒性を著しく増加させない。
【００７１】
単剤療法がもたらす毒性と比較して、ＭＥＡＮとソラフェニブとの併用治療が毒性を増加させ得るかどうかを特定するため、いずれかの薬剤単独による治療で誘発される毒性と、両薬剤の組み合わせによる治療で誘発される毒性とを、治療した動物において評価した。毒性は、周期的な体重、マウスの挙動（毛繕い）、摂食、便の硬さ、および、実験終点の血清中肝臓酵素濃度（アラニンアミノトランスフェラーゼ、すなわち、ＡＬＴおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、すなわち、ＡＳＴ）によって評価した。５日間投薬２日間投薬なしのスケジュールで腹腔内注射により行われた６週間の治療によって、溶媒で治療したマウスは主に腫瘍増殖から体重が増大したが、１５ｍｇ／ｋｇのＭＥＡＮで治療したマウスの体重は治療前の体重からあまり変化しなかった（＜３％）（図３Ａ）。実験終点の肝臓酵素定量化によって、４２日間の治療後、著しい増加が示された（ｐ＜０．０５）（図３Ｂ）。この増加は、２週間の治療中止で可逆的である（図３Ｃ）。治療中のマウスと溶媒群は同じように活動的なままであり、また、便の硬さ、食料摂取量、および、毛繕いも正常であった。これらの結果は、効果的な腫瘍阻害治療濃度では、ＭＥＡＮは治療した動物に対して明らかな悪影響を誘発しない、ということを示す。比較すると、同じスケジュールで１５ｍｇ／ｋｇのソラフェニブを用いて行われた並行治療もまた、治療した動物の体重や生活の質に著しい変化を起こさなかった。しかしながら、ＡＬＴおよびＡＳＴは、治療４２日目には、溶媒で治療した動物と比べて、より著しく増加し（図３Ｂ、ｐ＜０．０１）、ＭＥＡＮによる単剤療法よりかなり高かった。これらデータは、ソラフェニブはＭＥＡＮよりも腫瘍増殖阻害効果が低いうえに、ソラフェニブはＭＥＡＮよりも毒性が高いことを実証している。同じ５日間投薬２日間投薬なしのスケジュールでＭＥＡＮ（１５ｍｇ／ｋｇ）とソラフェニブ（１５ｍｇ／ｋｇ）との組み合わせによってマウスを治療すると、より目立った体重減少および活動低下を示した1匹のマウスを除いて、マウスの体重は著しく変化しなかった（図３Ａ）。しかしながら、肝臓酵素は、溶媒またはＭＥＡＮ単独で治療したマウスよりもかなり高かった。しかし、ソラフェニブで治療したマウスよりかなり高いわけではなかった（ｐ＞０．０５）。同様に、ＭＥＡＮとソラフェニブとの組み合わせは、腫瘍増殖をほぼ完全に阻止しながら、ソラフェニブによる単剤療法の毒性を著しく増大させなかった（図１および図２）。
【００７２】
ＭＥＡＮは親化合物ＡＭＮとは異なる作用様式を示す。
【００７３】
ＭＥＡＮはＡＭＮの誘導体のため、この２つの化合物は共通の腫瘍増殖阻害効果を有し、また、いくつかの共通の分子作用機序を有する（Ｔｏｐｏ  ＩＩ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）。しかしながら、以前行った研究でインビボにおいて観察された活動の差異は、ＭＥＡＮがさらなる特有の分子作用機序を有する可能性があることを示唆している１８−１９。１つの標的に対して特異的に開発されたものを含む多くの小分子がしばしば２つ以上の標的を有するマルチ薬理学に対して認識が高まっている。これらの予期せぬ効果は歴史的にオフターゲット効果であると称されてきた。しかしながら、オフターゲット効果が、これら分子による治療の結果を望ましいものにしているという証拠はほとんどない。
【００７４】
ＭＥＡＮとＡＭＮとの間の作用様式における類似性および差異を評価するために、ＣＯＭＰＡＲＥアルゴリズムを用いて、ＮＣＩ６０細胞株パネル増殖阻害分析においてこれら化合物を試験することによって得たデータを解析した。ＣＯＭＰＡＲＥアルゴリズム２２では、２つの薬剤が６０細胞株パネルにおいて同様の阻害パターンを有している場合、相関値は１に近くなり、相関関係がない場合、値は０になり、逆相関関係がある場合、値は−１になる（−１から１の範囲）。ＮＣＩの標準に適合したＣＯＭＰＡＲＥアルゴリズムによって、ＡＭＮについては、１４、８７、および、６６の薬剤が、全増殖阻害濃度（ＴＧＩ）、５０％致死濃度（ＬＣ５０）、および、５０％増殖阻害濃度（ＧＩ５０）に基づいて、０．５を超える相関関係を有していることが示された。対照的に、ＭＥＡＮについては、ＬＣ５０およびＧＩ５０に基づいて０．５を超える相関関係を有しているものはなく、ＴＧＩに基づいて相関関係を有しているものは３つのみであった（図４Ａ、上部パネル）（補充資料、表１）。ＡＭＮと相関関係が高い化合物の大部分はＤＮＡ損傷剤またはＤＮＡ結合剤であり、これは、ＡＭＮについてはゲノム毒性が主な抗癌機序であることを示しており、これについては文献と一致している２３。対照的に、ＭＥＡＮについては、相関関係を有する化合物の相関値が低いこと、また、０．５を超える値を有し相関関係がある化合物の数が少ないこと（図４Ａ）は、ゲノム毒性が主な作用様式でないことを示唆しており、ＡＭＮとはかなり異なっている。さらに、ＭＥＡＮをＡＭＮと直接比較すると、相関スコアは３つ（ＬＣ５０、ＧＩ５０、ＴＧＩ）すべての濃度において＜０．５であり（図４Ａ、下部パネル）、これは、ＭＥＡＮとＡＭＮとを比較すると、腫瘍増殖阻害において類似性よりも差異の方が多いことを示している。
【００７５】
ＭＥＡＮとＡＭＮとの間の差異を裏付けるさらなる証拠は、それらが細胞周期に対して異なる影響を与えたことにある。ＭＥＡＮおよびＡＭＮを５ｕＭの同じ濃度で用いてＨｅｐＧ２細胞を２４時間治療し、フローサイトメトリーを用いてＤＮＡ量により細胞周期プロファイルを評価した。その結果、かなりの差異が実証された（図４Ｂ）。ＡＭＮはＧ１期細胞の減少とともにＧ２期細胞の蓄積を誘発する一方、ＭＥＡＮによる治療はＳ期において著しい停滞を示すが、Ｇ２期においてはそれほど停滞を示さない。これらの発見は、ＡＭＮと比較して、ＭＥＡＮが、インビボにおけるその腫瘍増殖阻害とかなり低い毒性とに寄与し得る新規の抗腫瘍増殖機序を有していることの裏付けとなる。
【００７６】
しかしながら、ＭＥＡＮは、薬剤耐性の一般的な原因である活性Ｐ糖たんぱく質の基質とならない点でＡＭＮと類似している。この点に取り組むため、もし薬剤が基質となるのであれば活性Ｐ糖たんぱく質を有する細胞（多剤耐性細胞）においてそのＩＣ５０（この場合、増殖阻害）が大幅に増加するという原理に基づいて、活性Ｐ糖たんぱく質を有する細胞株と活性Ｐ糖たんぱく質を有さない細胞株におけるＭＥＡＮのＩＣ５０を比較した。３つの別の実験を行って、平均±標準偏差（μＭ）でＩＣ５０の値を求め、各濃度の化合物の阻害率を３回試験した。耐性因子（ＲＦ）は、多剤耐性細胞のＩＣ５０値の、対応感受性親細胞のＩＣ５０値に対する比率として算出した。
【００７７】
ＭＥＡＮのＩＣ５０、ならびに、参照化合物であるドキソルビシンおよびビンクリスチン（ＶＣＲ）のＩＣ５０を、３つのＭＤＲ発現亜株、すなわち、アドリアマイシン（ＡＤＲ）に対する耐性から派生したＫ５６２／ＡＤＲ、ＭＣＦ−７／ＡＤＲ、および、ＫＢ／ＶＣＲで評価した（図４Ｃ）。これら細胞株それぞれについて、ＲＦを測定して、化合物の抗ＭＤＲ性を示した。Ｋ５６２／ＡＤＲ亜株およびＭＣＦ−７／ＡＤＲ亜株におけるドキソルビシンについての耐性因子、および、ＫＢ／ＶＣＲ亜株におけるビンクリスチンについての耐性因子は７４．１、５４．０、および、５１．２であった。比較すると、ＭＥＡＮは、多剤耐性細胞、および、それらの対応薬物感受性親細胞との間で、等しい、強力な増殖阻害を示し、ＲＦ値は１．１から１．３であった。これらデータによって、ＭＥＡＮの増殖阻害効果は多剤耐性細胞株において減少しないことが実証され、これにより、ＭＥＡＮの明白な抗ＭＤＲ活性が示されている。
【００７８】
ＭＥＡＮはインビトロおよびインビボの両方において遺伝子発現プロファイルを著しく変える。
【００７９】
ＨＣＣ腫瘍増殖を阻害するＭＥＡＮの作用様式の特異性を特定するため、ＭＥＡＮ、ＡＭＮ、または、ＤＭＳＯで治療したＨｅｐＧ２細胞におけるＲＮＡレベルのゲノム発現プロファイルを調べ、比較した。ＨｅｐＧ２細胞を２０μＭの濃度のＭＥＡＮまたはＡＭＮにより６時間治療、または、ＤＭＳＯで治療した。治療用量の選択は、注射の約６時間後ＭＥＡＮの血清中濃度がおよそ２０ｕＭであるというＰＫ解析（補充資料）に基づいて行った。さらに、比較的短い治療時間は、治療の早期段階におけるより初期の細胞応答を捉えることを目的として設定された。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  ＰｒｉｍｅＶｉｅｗ（商標）  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｒｒａｙを３回用いて、治療したＨｅｐＧ２細胞から抽出したＲＮＡを定量化した。これらの実験結果は、ＭＥＡＮおよびＡＭＮは、影響を受けた遺伝子の約３分の１を共有する一方で、異なる一連の遺伝子を制御することも示している（図５Ａ、＋／−１．５倍を超えて変化する遺伝子の数）。
【００８０】
アレイ解析の結果に基づき、我々は、実験的に、細胞株におけるいくつかの発現の変化を確認した。ＭＥＡＮおよびＡＭＮはどちらも、治療した細胞においてｃ−ｍｙｃＲＮＡの発現量を著しく減少させる一方で、ＭＥＡＮは、ＡＭＮよりも、治療した細胞においてｃ−ｍｙｃタンパク質の発現をより著しく抑制する（図５Ｂおよび図５Ｄ）。ｃ−ｍｙｃは、具体的にはＨＣＣ２４、そして、一般的には癌２５−２７における、その発がん性機能でよく知られているため、治療した癌におけるｃ−ｍｙｃの減少は腫瘍増殖抑制にかなり寄与するものと考えられる。治療した細胞におけるｃ−ｍｙｃの下流効果を特定するため、いくつかの下流標的のＲＮＡ量を評価した。（図５Ｃ）で実証されているように、ｃ−ｍｙｃの下流要素の大部分がＭＥＡＮおよびＡＭＮによって同様に制御されていることが示されている一方で、２つの遺伝子（ＨＩＦ１ＡおよびＦＢＸＷ７）が例外で、これは、これら要素のうちのいくつかが他の機序によっても制御されている可能性があることを示唆している。
【００８１】
ＭＥＡＮに応じて起こる遺伝子発現の変化が細胞型特異的であるかどうかを評価するため、他のＨＣＣ細胞株、すなわち、Ｈｕｈ７を、ＭＥＡＮによって治療のうえ、対応する遺伝子発現の変化について調べた。結果、これら細胞において、ｃ−ｍｙｃおよび他の要素のたんぱく質レベルの変化を同様に示した（図５Ｂおよび図５Ｄ）。ＭＥＡＮを用いて治療した腫瘍においても同様の遺伝子発現が当てはまるかどうかを特定するために、動物から切除した腫瘍組織を、対応する遺伝子のたんぱく質レベルについて調べ、ＭＥＡＮまたは溶媒によって治療した組織から得た結果を比較した。その結果、ＭＥＡＮによる４２日間の治療過程の終了時にＨｕｈ７腫瘍およびＨｅｐＧ２腫瘍の両方においてｃ−ｍｙｃは著しく減少したが、溶媒で治療した腫瘍ではｃ−ｍｙｃの著しい減少は見られなかった（図６Ｂおよび図６Ｃ）。これらの発見は、インビトロおよびインビボの両方において、ＭＥＡＮによる治療に応じてｃ−ｍｙｃレベルが一貫して減少することを実証している。
【００８２】
ｃ−ｍｙｃに加えて、その他いくつかの遺伝子発現も減少する。ＳＩＲＴ１はＨＣＣ腫瘍において非常に高くなることが示されている２８−２９。ＨｅｐＧ２細胞およびＨｕｈ７細胞のウエスタンブロット分析により、ＳＩＲＴ１たんぱく質のレベルがＭＥＡＮで治療した細胞ではかなり減少するが、ＡＭＮで治療した細胞ではあまり変化しないことが示されている（図５Ｂおよび図５Ｄ）。インビボで治療した腫瘍の評価により、治療した腫瘍におけるＳＩＲＴ１の減少が裏付けられた（図６Ｂおよび図６Ｃ）。これらの発見は、ＭＥＡＮで治療したＨＣＣ細胞および腫瘍ではＳＩＲＴ１が特に減少することを示しており、ＡＭＮとは異なる。
【００８３】
ｃ−ｍｙｃの減少は、治療した細胞における全体的な転写停止を反映している可能性があるのだろうか。ＭＥＡＮは、全増殖阻害濃度で、アクチノマイシンＤを含むいくつかを除いて、ゲノム毒性化合物とあまり相関しないものの、ｃ−ｍｙｃの減少が全体的な転写低下によるものか、または、ＭＥＡＮの標的とされた特定の制御遺伝子によるものか、区別することは重要である。そのため、ゲノム全域にわたる遺伝子発現をＲＮＡアレイ解析によって評価した。その結果、対照群と比較して、多くの要素とＲＮＡがＭＥＡＮによる治療に応じて上方制御されることが示されている（図５）。これは、一部の遺伝子発現の減少が広範囲の転写阻害によるものではないという考えを裏付けている。
【００８４】
いくつかのたんぱく質は、ＭＥＡＮによる治療に応じて上方制御される。上方制御されるたんぱく質のひとつは、ＨＣＣの腫瘍抑制において役割を果たすことが示されているＳＨＰ−１、すなわち、たんぱく質チロシンホスファターゼである３０−３１。ＡＭＮやソラフェニブによる治療ではなく、ＭＥＡＮによる治療が、培養液中（図５Ｂおよび図５Ｄ）または治療した腫瘍（図６Ｂおよび図６Ｃ）で、ＨｅｐＧ２細胞およびＨｕｈ７細胞におけるＳＨＰ−１のたんぱく質レベルの著しい増加を誘発する。他の腫瘍抑制因子ＴＸＮＩＰもまた、インビトロおよびインビボの両方で、ＭＥＡＮで治療した細胞において選択的に著しく向上する（図５および図６）。
【００８５】
これらの発見はまとめて、親化合物のＡＭＮとは異なる作用機序をＭＥＡＮが有していることを実証している。ＭＥＡＮによる治療によって影響を受けた遺伝子の発現は、すべて同じ細胞経路または機能で起こるわけではなく、腫瘍増殖阻害においてＭＥＡＮが複数の標的および複数の作用様式を有している可能性があることを示している。
【００８６】
ＭＥＡＮとソラフェニブは腫瘍増殖阻害において共通の作用機序を有していないと考えられる。
【００８７】
ＭＥＡＮとソラフェニブとを用いた併用治療は有効性を向上させ、ＭＥＡＮの添加はソラフェニブの肝臓毒性を著しく増加させない。このことは、該併用治療を、有効性を向上させ、毒性を減少させ、また、投薬をさらに最適化するための代替戦略にしている。２つの化合物が付加的であるのか相乗的であるのかを区別するため、まず、２つの化合物が共通の作用機序を有しているかどうかに取り組まなければならない。ソラフェニブはよく調査された、ＦＤＡにより認可された薬物であり、たんぱく質チロシンキナーゼに対するスクリーニング物(screens)に由来する３２−３３。しかしながら、ソラフェニブもまた細胞において他の作用機序を有し得る。ＣＯＭＰＡＲＥアルゴリズム２２を用いて、ＭＥＡＮおよびソラフェニブについてＮＣＩ−６０細胞株データを解析した。ＭＥＡＮとソラフェニブとの直接的な比較により、３つすべての濃度、すなわち、ＬＣ５０、ＧＩ５０、および、ＴＧＩで負の数の相関スコアが得られた（図６Ａ）。これは、ＭＥＡＮとソラフェニブが腫瘍増殖阻害において共通の作用機序を有する可能性がないことを示唆している。この見解をさらに評価するために、我々は、ソラフェニブで治療した腫瘍において、ＭＥＡＮにより影響を受けることが示されたたんぱく質レベルを評価した。図６に示すように、ソラフェニブによる治療は、ＭＥＡＮで治療した腫瘍において影響を受けるｃ−ｍｙｃ、ＳＩＲＴ１、ＳＨＰ−１、または、ＴＸＮＩＰを含むたんぱく質のレベルをあまり変化させない（図６Ｂおよび図６Ｃ）。さらに、ＨＣＣ異種移植マウスモデルをＭＥＡＮとソラフェニブとの組み合わせにより治療すると、これら要素のレベルは、ＭＥＡＮ単独で治療したものとあまり違わない。併用治療もまた、ソラフェニブによる単剤療法よりもかなり強い毒性を動物に対して生じさせない。これらの見解はまとめて、ＭＥＡＮとソラフェニブとが腫瘍阻害において共通の作用機序を有していないと考えられることの裏付けとなる。
【００８８】
議論：
ヒトＨＣＣはアメリカおよび世界で重大な健康問題である。特に、治癒的肝移植のためのドナー肝はその供給量に制限があるため、効果的な化学療法介入の欠如が、当該疾患による死亡率が高いことの大きな原因となっている。ＦＤＡにより唯一認可された小分子薬剤であるソラフェニブは、かなりの毒性を有するため、その有効性は非常に限られている。そのため、新規の治療剤の開発が緊急に必要となっている。ここで、我々は、小分子のＭＥＡＮは、２つのＨＣＣ異種移植腫瘍モデルに対し腫瘍増殖阻害の点で効果的であり、治療した動物に著しい毒性を与えないということを報告する。同じ濃度では、ＨｅｐＧ２異種移植モデルおよびＨｕｈ７異種移植モデルの両方において、ＭＥＡＮはソラフェニブよりも腫瘍増殖阻害の点でより強力に有効であり、また、ソラフェニブよりも毒性が低い。ＭＥＡＮとソラフェニブとを併用すると、ソラフェニブまたはＭＥＡＮを単独で用いるよりも腫瘍増殖阻害が大きく、ソラフェニブによる単剤療法よりも毒性が著しく増加しない。これは、ＨＣＣ患者に潜在的に向上した治療方針を提供する。機械論的に、ＭＥＡＮは、治療した腫瘍におけるｃ−ｍｙｃ癌遺伝子発現を著しく減少させ、また、その腫瘍阻害機序に寄与し得る他の遺伝子発現に影響を与える。ソラフェニブと共通の作用様式は有していないと思われる。さらに、ＭＥＡＮは、薬物耐性の一般的な原因である、活性Ｐ糖たんぱく質の基質とならない。薬のような薬物動態を有するため、ＭＥＡＮは、ヒトＨＣＣを治療するための第１選択薬および／または第２選択薬として、さらに発展する可能性が大いにある。
ＭＥＡＮは、ＡＭＮと異なる作用様式により腫瘍増殖を阻害する。
【００８９】
ＭＥＡＮは、よく調査された抗癌化合物であるＡＭＮの誘導体である。ＡＭＮは広範囲の癌に対して効果的な抗癌剤であり、多剤耐性の危険性がない。多くの臨床試験が行われているもの関わらず、ＡＭＮの強い、そして、変動する毒性は、そのさらなる発展を妨げてきた２０−２１、２３、２４。肝臓Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）による５位にあるＡＭＮのアセチル化代謝物が、その毒性に関与すると考えられている。ＭＥＡＮはＡＭＮの相似物であり、窒素が５位から６位へ移動している１８。これが、ＮＡＴ２によるそのアセチル化を妨げている。ＭＥＡＮは、マウスにおけるＨｕｈ７およびＨｅｐＧ２のＨＣＣ異種移植腫瘍に対する腫瘍増殖阻害の点でＡＭＮと同様に有効である一方、インビボにおいて毒性がかなり少ない１９。
【００９０】
ここで、我々の結果によって、ＭＥＡＮとＡＭＮとの間で作用機序のユニークな差異があることが実証されている。１）ＮＣＩ６０細胞株パネル比較解析によると、ＧＩ５０濃度またはＩＣ５０濃度で、ＭＥＡＮとＡＭＮまたは他の既知のゲノム毒性化合物の間に相関関係（ｒ＜０．５）が示されていない（図４Ａ）。２）ＭＥＡＮで治療した場合とＡＭＮで治療した場合で、ＨｅｐＧ２細胞のゲノム発現プロファイルにかなりの差異がある（図４Ｂ）。３）さらに、ＭＥＡＮで治療した培養細胞および腫瘍のたんぱく質レベルをＡＭＮまたは溶媒で治療したものと比べると、対応する治療の後に、一部のたんぱく質の発現量の差異が細胞において見られた（図５）。これら発見は、ＭＥＡＮはＡＭＮの構造的相似物であるものの、インビボにおけるその抗癌効果および低い毒性に寄与し得る異なる作用機序を有することを示している。これら発見はまた、ＭＥＡＮが新規の抗癌活性を有していることを指している。
【００９１】
ＭＥＡＮの腫瘍増殖阻害機序
ＭＥＡＮの直接の標的は不明のままであるが、ＭＥＡＮは、ＡＭＮと同様に、ｔｏｐｏ  ＩＩ活性を中断させることが示されている１８。我々のＨｅｐＧ２細胞を用いたゲノムプロファイリング研究によって、１．５倍を超える変化を示す遺伝子の約３分の２が、ＭＥＡＮおよびＡＭＮによって、異なって制御されることが実証されている。興味深いことに、ＡＭＮよりもＭＥＡＮの方がより著しくｃ−ｍｙｃ発現を減少させるものの、ＭＥＡＮおよびＡＭＮの両方がｃ−ｍｙｃ発現を著しく減少させる（図５）。悪名高い腫瘍性たんぱく質が腫瘍形成においてキープレーヤーであることが示されており２５−２７、ｃ−ｍｙｃの過剰発現がヒトＨＣＣに関係している２４、３５−３６。ＨＣＣにおけるｃ−ｍｙｃのこれら既知の機能から、両化合物については、ｃ−ｍｙｃに対する影響が腫瘍増殖阻害機能に著しく寄与している可能性が高い。また、ＭＥＡＮおよびＡＭＮのどちらもチオレドキシン結合たんぱく質（ＴＸＮＩＰ）の発現を著しく増加させる。ＴＸＮＩＰは多機能性腫瘍抑制因子であり３７−４０、ＲＯＳ代謝４１−４３、グルコース恒常性４４、ｐ５３安定化４５−４６、および、ｍＴＯＲＣ１の阻害による腫瘍抑制４７に関与する。ＴＸＮＩＰの誘発は、ＨＣＣ腫瘍の増殖を抑制することが示されている４８。最近の報告によると、抗腫瘍小分子はＴＸＮＩＰを増加させる効果も有する４９。ＴＸＮＩＰはｃ−ｍｙｃとは反対の機能を有しながら４０、これまで、この２つの同時制御、または、この２つの間の直接相互作用を実証する研究がなく、これは、それらがＨＣＣ細胞においてＭＥＡＮにより異なる経路で制御されることを示唆している。
【００９２】
ＭＥＡＮに特有のものとして、我々は、治療によって、ＳＨＰ−１、すなわち、腫瘍抑制因子およびエンハンサの両方になることが分かっているたんぱく質チロシンホスファターゼの発現が向上することを発見した３１、５０−５１。ＳＨＰ−１はグルコース代謝、オートファジー活性化、等に関与する多機能たんぱく質である３０、５２−５３。最近の報告では、ＳＨＰ−１の活性化は、インビトロにおいてＨＣＣコロニー形成を著しく抑制し、インビボにおいて異種移植ＨＣＣ腫瘍増殖を阻害することが示されている３０。したがって、ＭＥＡＮによるＳＨＰ−１の著しい活性化は腫瘍増殖阻害に寄与し得る。さらに、ＭＥＡＮはＳＩＲＴ１発現を阻害する。ＳＩＲＴ１は、ヒストンからグルコース代謝に関与する酵素までを基質するサーチュインデアセチラーゼファミリのひとつである５４。ＳＩＲＴ１は、エネルギー代謝、酸化、Ｗｎｔシグナリング経路、ＴＧＦ−ｂシグナリング経路、ＮＦ−ｋＢシグナリング経路、および、腫瘍抑制を含む、多くの細胞過程における血流遮断において種々の役割を有している５４−５５。ＳＩＲＴ１は、様々な癌細胞においてしばしば過剰発現することが分かっている５６。ＳＩＲＴ１は、ＨＣＣ細胞において、ＴＥＲＴを制御し、ｃ−ｍｙｃ活性を促進すると考えられている５７。ＳＩＲＴ１は過剰発現することが示されており、ＳＩＲＴ１のノックダウンがＨＣＣ細胞増殖停止を誘発する２８。したがって、ＭＥＡＮ媒介のＳＩＲＴ１発現の減少は、ｃ−ｍｙｃ発現の減少に役立ち、腫瘍増殖抑制に寄与し得る。
【００９３】
我々の発見により、これまでに、腫瘍増殖抑制に有利となる遺伝子発現の変化が特定された。遺伝子の特定の上方制御または下方制御を詳しく調べると、それらすべてが互いに直接的な既知の関連性を有しているとは限らない。これらたんぱく質のいくつかは２つ以上の経路により制御され、細胞において多面的機能を有する。これらの発見は、ＭＥＡＮが複数の細胞標的に影響を与えることにより腫瘍増殖を阻害する可能性があり、これら効果のすべてがインビトロおよびインビボにおける腫瘍増殖阻害に関与し得ることを裏付けている。この見解は、薬剤が複数の細胞過程に影響を与えて、協奏的結果が望ましい治療結果をもたらすという、ひとつの化合物のマルチ薬理と一致している。さらなる研究により、ＭＥＡＮ媒介の腫瘍増殖阻害に主に寄与する主要機序の研究が行われるであろう。
ＭＥＡＮはソラフェニブよりも腫瘍増殖阻害においてより効果があり、引き起こす毒性は低く、その併用は有効性を向上させる。
【００９４】
ソラフェニブはＦＤＡにより唯一認可されたＨＣＣ治療用薬剤であるため、マウスのＨＣＣ異種移植腫瘍の治療におけるＭＥＡＮの有効性および毒性を比較する基準として用いた。これらの研究で、ＨｅｐＧ２異種移植腫瘍およびＨｕｈ７異種移植腫瘍を有する動物を、同じ濃度、同じスケジュールで、ＭＥＡＮまたはソラフェニブによって並行して治療した。その結果、ＭＥＡＮは、ソラフェニブ以上に、かなり強力な増殖阻害を示し、これにより、単独治療薬としてのＭＥＡＮはマウスにおいてソラフェニブよりも効果的であることが示された（図１および図２）。さらに、実験終点において著しく増加した肝臓酵素で評価されたように、ソラフェニブはより強い毒性を招く。これら発見は、ＭＥＡＮがＨＣＣに対する効果的な単独治療剤にさらに発展する可能性があることを実証している。組み合わせて用いると、どちらか一方を単独で用いるよりも腫瘍増殖阻害が大きく、ＭＥＡＮよりもソラフェニブと比較すると、さらに著しく大きい（図１および図２）。
【００９５】
ＭＥＡＮおよびソラフェニブは、腫瘍増殖阻害について、同じ作用機序によって作用するのではないと考えられる。我々の観察で、すべての治療濃度でＣＯＭＰＡＲＥアルゴリズムを用いることで、ＭＥＡＮとソラフェニブとの間に相関関係がないことが実証されている。これは、それらが異なる経路により腫瘍増殖を阻害することを示唆している。さらに、ＭＥＡＮによって変化することが分かっているたんぱく質レベルにソラフェニブが与える影響を評価することにより、２つの薬剤がこれらたんぱく質にもたらす効果が大部分で重複していないことが実証されている。作用機序の違いは、有効性の向上と毒性の減少に役立つこの２つの化合物を併用することにとって有益である。
【００９６】
つまり、我々は、ＨＣＣ異種移植モデルにおける腫瘍増殖を阻害するのに効果的な新規の小分子を実証した。ＦＤＡにより唯一認可された薬剤のソラフェニブと比較して、ＭＥＡＮを同じ治療戦略および同じ濃度で用いる単剤療法は、より優れた腫瘍増殖阻害効果を示し、より少ない毒性を示す。これら薬剤による併用治療は、毒性の著しい増加を引き起こすことなく、より大きな腫瘍増殖阻害をもたらす。ＭＥＡＮによる治療は、よく知られた腫瘍性たんぱく質ｃ−ｍｙｃ、および、ＳＩＲＴ１などの腫瘍プロモータとして作用することが知られている他のたんぱく質を著しく減少させる。同時に、ＴＸＮＩＰおよびＳＨＰ−１を含む、腫瘍増殖を抑制することが知られているたんぱく質を増加させる。ＭＥＡＮはＡＭＮとは異なる作用様式を有しており、ソラフェニブと共通の作用機序を有していない。さらに、ＭＥＡＮは、薬剤耐性の一般的な原因であるＰ糖たんぱく質の基質とならない。薬のようなＰＫプロファイルを有しているため、ＭＥＡＮは、ヒトＨＣＣ治療のための単独治療薬、または、ソラフェニブとの併用治療薬にさらに発展させるものとして最適である。
【００９７】
参照による引用
本明細書において参照した特許文献および科学論文それぞれにおいて開示された事柄全体が、あらゆる目的のために参照により引用される。
【００９８】
均等論
本発明は、その精神または本質的特徴から逸脱しない範囲で、他の特定の形態で実施することができる。そのため、前述の実施形態は、本明細書に記載された本発明を限定するものではなく、あらゆる点で単なる例であると考えられるべきである。したがって、本発明の範囲は、本明細書の記載ではなく、添付の特許請求の範囲によって示される。また、特許請求の範囲の均等の意味および範囲に属する変更はすべて本発明の範囲に含まれる。
【００９９】
参考文献
【０１００】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】ＭＥＡＮは、ヌードマウスにおいて、Ｈｕｈ７−ｌｕｃ異種移植腫瘍の増殖を、ソラフェニブよりも、より強力に阻害する。１０７個の腫瘍細胞を皮下接種した１０日後、５日間投薬２日間投薬なしのスケジュールで４２日間、ＩＰ経由で、ＭＥＡＮ（１５ｍｇ／ｋｇ）、ソラフェニブ（１５ｍｇ／ｋｇ）、若しくは、各１５ｍｇ／ｋｇのＭＥＡＮとソラフェニブとの組み合わせ、または、溶媒を用いてマウスを治療した。腫瘍増殖は、ルシフェリン蛍光発光の全載イメージング(whole mount imaging)（代表画像）（Ａ）、週２回の光子計数（Ｂ）および４２日目の実験終了時の光子計数（Ｃ）、容量（Ｄ）、ならびに、実験終点における腫瘍重量（Ｅ）によって、測定した。ｔ検定を用いた統計的解析を（ＣおよびＥ）に示す。なお、＊＝ｐ＜０．５であり、＊＊＝ｐ＜０．０１である。黒線が無い箇所はｐ＞０．５（ｎ＝５）を示す。
【図２】ＭＥＡＮは、ヌードマウスにおいて、ＨｅｐＧ２−ｌｕｃ異種移植腫瘍の増殖を、ソラフェニブよりも、より強力に阻害する。１０７個の腫瘍細胞を皮下接種した１０日後、５日間投薬２日間投薬なしのスケジュールで４２日間、ＩＰ経由で、ＭＥＡＮ（１５ｍｇ／ｋｇ）、ソラフェニブ（１５ｍｇ／ｋｇ）、または、各１５ｍｇ／ｋｇのＭＥＡＮとソラフェニブとの組み合わせ、または、溶媒を用いてマウスを治療した。腫瘍増殖は、ルシフェリン蛍光発光の全載イメージング（代表画像）（Ａ）、週２回の光子計数（Ｂ）および４２日目の実験終了時の光子計数（Ｃ）、容量（Ｄ）、ならびに、実験終点における腫瘍重量（Ｅ）によって、測定した。ｔ検定を用いた統計的解析を（ＣおよびＥ）に示す。なお、＊＝ｐ＜０．５であり、＊＊＝ｐ＜０．０１である。黒線が無い箇所はｐ＞０．５（ｎ＝５）を示す。
【図３】ＭＥＡＮ、ソラフェニブ、または、ＭＥＡＮとソラフェニブとの組み合わせによる治療により誘発された毒性を、治療過程における体重の変化を観察（Ａ）、および、実験終点における血清中肝臓酵素濃度を検出（Ｂ）することにより、溶媒で治療した群と対比して測定した。実験終点（４２日目）数日後の肝臓酵素の回収。ｎ＝１０、ａ：各群対溶媒、ｂ：ソラフェニブ対ＭＥＡＮ、ｃ：Ｍ＋Ｓ対ＭＥＡＮ。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１。ソラフェニブ対Ｍ＋Ｓ：差異なし。
【図４】ＣＯＭＰＡＲＥアルゴリズムを用いたＮＣＩ６０細胞データ解析によると、ＭＥＡＮとＡＭＮとの間で異なる作用様式が示されている。ＭＥＡＮは、ＬＣ５０およびＧＩ５０の濃度で、データベースにおけるどの被試験化合物とも相関しない（Ａ、上部パネル）（ＧＩ５０、すなわち、５０％増殖阻害濃度、ＬＣ５０、すなわち、５０％致死濃度、ＴＧＩ、すなわち、全増殖阻害濃度）。ＭＥＡＮとＡＭＮとの比較によると、著しい相関関係が見られない（Ａ、下部パネル）。ＭＥＡＮ、ＡＭＮ、または、ＤＭＳＯで治療したＨｅｐＧ２細胞における細胞周期解析によって、ＭＥＡＮとＡＭＮとの間で異なる細胞周期プロファイルが実証されている（Ｂ）。しかしながら、ＭＥＡＮは、多剤耐性の一般的な原因である活性Ｐ糖たんぱく質の基質とならない点で、ＡＭＮと類似している（Ｃ）。
【図５】ＭＥＡＮとＡＭＮとは、治療したＨｅｐＧ２細胞およびＨｕｈ７細胞において遺伝子発現に異なった変化を与える。ＲＮＡアレイ解析によって、治療した細胞における３分の２の遺伝子発現の変化は、ＭＥＡＮとＡＭＮとの間で共有されないことが示されている（Ａ）。ＭＥＡＮは、１０ｕＭよりも低い濃度で用いると、ｍｙｃたんぱく質レベルを著しく減少させる一方、ＡＭＮは同じ濃度でｍｙｃ発現を著しく減少させない（ＢおよびＤ）。ＭＥＡＮは、ＳＩＲＴ１たんぱく質レベルを減少させ、ＳＨＰ−１たんぱく質レベルを増加させる一方、ＡＭＮはこれらたんぱく質のレベルに著しい影響を与えない。溶媒の量を１とし、治療／溶媒の比率を各定量グラフにプロットしている（ＢおよびＤ）。２つの遺伝子を除く、ｍｙｃの多くの下流遺伝子の発現量が、ＭＥＡＮまたはＡＭＮで治療した細胞において、それ相応に減少する（Ｃ）。Ｙ軸は、薬剤とＤＭＳＯとの間の、示された各遺伝子のＲＮＡレベルの対数倍差(log fold differences)を表す。
【図６】ソラフェニブは、インビボにおいて、同じ遺伝子発現に対して、ＭＥＡＮに影響しない。ＮＣＩ６０細胞パネルを用いたＣＯＭＰＡＲＥアルゴリズムによる解析によって、ＭＥＡＮはソラフェニブと共通の作用機序を有さない可能性があることが示されている（Ａ）。ＭＥＡＮ、ソラフェニブ、ＭＥＡＮとソラフェニブとの組み合わせ、または、溶媒で治療した腫瘍組織のウェスタンブロッティングによって、培養細胞における知見と同様に、ＭＥＡＮはｍｙｃおよびＳＩＲＴ１のたんぱく質レベルを抑制し、ＳＨＰ−１およびＴＸＮＩＰのたんぱく質レベルを増加させることが実証されている（ＢおよびＣ）。ソラフェニブはこれら遺伝子発現に著しい影響を与えない（ＢおよびＣ）。溶媒の量を１とし、治療／溶媒の比率を各定量グラフにプロットしている。
【図７Ａ】静脈内投与（ＩＶ、丸、実線）、腹腔内投与（ＩＰ、四角、破線）、および、経口投与（ＰＯ、四角、破線）後のマウスにおけるＭＥＡＮの薬物動態（ＰＫ）。
【図７Ｂ】静脈内投与（ＩＶ、丸、実線）、腹腔内投与（ＩＰ、四角、破線）、および、経口投与（ＰＯ、四角、破線）後のマウスにおけるＭＥＡＮの薬物動態（ＰＫ）。
【図７Ｃ】静脈内投与（ＩＶ、丸、実線）、腹腔内投与（ＩＰ、四角、破線）、および、経口投与（ＰＯ、四角、破線）後のマウスにおけるＭＥＡＮの薬物動態（ＰＫ）。
【図７Ｄ】静脈内投与（ＩＶ、丸、実線）、腹腔内投与（ＩＰ、四角、破線）、および、経口投与（ＰＯ、四角、破線）後のマウスにおけるＭＥＡＮの薬物動態（ＰＫ）。
【図７Ｅ】静脈内投与（ＩＶ、丸、実線）、腹腔内投与（ＩＰ、四角、破線）、および、経口投与（ＰＯ、四角、破線）後のマウスにおけるＭＥＡＮの薬物動態（ＰＫ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【国際調査報告】
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