(57)【要約】例は、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートの製造方法を含む。方法はタンパク質水溶液を提供することを含み得る。タンパク質水溶液はタンパク質、ｐＨ緩衝剤、及びキレート剤を含み得る。キレート剤はアミノポリカルボン酸、ヒドロキシアミノカルボン酸、Ｎ−置換グリシン、２−（２−アミノ−２−オキソクチル）アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、及びデフェロキサミン（ＤＥＦ）から選択され得る。方法はタンパク質水溶液にシアノ水素化ホウ素ナトリウム及びメトキシポリエチレングリコールアルデヒドを導入することを含み得る。シアノ水素化ホウ素ナトリウムはメトキシポリエチレングリコールアルデヒド中、約５：１〜約１．５：１の範囲のモル比を有してもよい。方法はさらに、メトキシポリエチレングリコールアルデヒドとタンパク質を反応させてタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを形成することを含み得る。ｐＨ緩衝剤は、反応の間のタンパク質水溶液のｐＨを４．０〜４．４の範囲に維持することができる。
2018516874.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを製造する方法であって、
タンパク質、ｐＨ緩衝剤、及びキレート剤を含むタンパク質水溶液を提供する工程であって、前記キレート剤はアミノポリカルボン酸、ヒドロキシアミノカルボン酸、Ｎ−置換グリシン、２−（２−アミノ−２−オキソクチル（ｏｘｏｃｔｈｙｌ））アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、及びデフェロキサミン（ＤＥＦ）からなる群から選択される工程と、
前記タンパク質水溶液にホウ素含有還元剤及びメトキシポリエチレングリコールアルデヒドを導入する工程であって、ホウ素含有還元剤とメトキシポリエチレングリコールアルデヒドは約２５：１〜約１．５：１の範囲のモル比を有する工程と、
メトキシポリエチレングリコールアルデヒドと前記タンパク質を反応させてタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを形成する工程であって、前記ｐＨ緩衝剤は、反応の間の前記タンパク質水溶液のｐＨを４．０〜６．０の範囲に維持する工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記ホウ素含有還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、２−メチルピリジンボラン、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、トリエチルアミンボラン、モルホリンボラン、ｔｅｒｔ−ブチルアミンボラン、及び５−エチル−２−メチルピリジンボランからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ホウ素含有還元剤は２−メチルピリジンボランである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
メトキシポリエチレングリコールアルデヒドと前記タンパク質の反応は、部位特異的モノＰＥＧ化タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを、生成された全てのタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートの７５％超の収率でもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質は、インスリン、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモンの断片、成長ホルモン、グルカゴン様ペプチド−１、エンフビルチド、及びオクトレオチドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質はインスリンを含み、前記部位特異的モノＰＥＧ化タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートはＰＥＧ−ＰｈｅＢ１−インスリンコンジュゲートを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質は副甲状腺ホルモンの断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ｐＨ緩衝剤はリン酸の無機塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
アミノポリカルボン酸は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、Ｎ−２−アセトアミド−２−イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ビス（アミノエチル）グリコールエーテル、Ν，Ν，Ν’，Ν’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、トランスジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、グルタミン酸、及びアスパラギン酸からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
アミノポリカルボン酸はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
ヒドロキシアミノカルボン酸は、Ｎ−ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＭＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス−ヒドロキシエチルグリシン、及びＮ−トリスヒドロキシメチルメチル）グリシンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
Ｎ−置換グリシンはグリシルグリシンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
インスリン−ＰＥＧコンジュゲートを製造する方法であって、
インスリン、ｐＨ緩衝剤、有機溶媒、及びキレート剤を含むインスリン水溶液を提供する工程であって、前記キレート剤はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む工程と、
前記インスリン水溶液にホウ素含有還元剤及びメトキシポリエチレングリコールアルデヒドを導入する工程であって、ホウ素含有還元剤とメトキシポリエチレングリコールアルデヒドは約２５：１〜約１．５：１の範囲のモル比を有する工程と、
メトキシポリエチレングリコールアルデヒドとインスリンを反応させてインスリン−ＰＥＧコンジュゲートを形成する工程であって、前記ｐＨ緩衝剤は、反応の間の前記インスリン水溶液のｐＨを４．０〜６．０の範囲に維持し、メトキシポリエチレングリコールアルデヒドとインスリンの反応は、ＰＥＧ−ＰｈｅＢ１−インスリンコンジュゲートを、生成された全てのインスリン−ＰＥＧコンジュゲートの７５％超の収率でもたらす工程と
を含む方法。
【請求項１４】
前記ホウ素含有還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、２−メチルピリジンボラン、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、トリエチルアミンボラン、モルホリンボラン、ｔｅｒｔ−ブチルアミンボラン、及び５−エチル−２−メチルピリジンボランからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ホウ素含有還元剤は２−メチルピリジンボランである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
反応の開始時、メトキシポリエチレングリコールアルデヒド及びインスリンは、約１０：１〜約１：１のモル比を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ホウ素含有還元剤とメトキシポリエチレングリコールアルデヒドは、約２２：１〜約５．５：１の範囲のモル比を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記有機溶媒は、エタノール、メタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジオキサン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、及びＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記有機溶媒はジオキサンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
反応中の前記インスリン水溶液のｐＨは５．０である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
インスリンはヒトインスリンを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
メトキシポリエチレングリコールアルデヒドとインスリンとの反応は、生成された全てのインスリン−ＰＥＧコンジュゲートの７５％〜８５％の収率でＰＥＧ−ＰｈｅＢ１−インスリンコンジュゲートをもたらす、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを含む放出制御マイクロスフェアを製造する方法であって、
タンパク質、ｐＨ緩衝剤、及びキレート剤を含むタンパク質水溶液を提供する工程であって、前記キレート剤はアミノポリカルボン酸、ヒドロキシアミノカルボン酸、Ｎ−置換グリシン、２−（２−アミノ−２−オキソクチル（ｏｘｏｃｔｈｙｌ））アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、及びデフェロキサミン（ＤＥＦ）からなる群から選択される工程と、
前記タンパク質水溶液にホウ素含有還元剤とメトキシポリエチレングリコールアルデヒドを導入する工程であって、前記ホウ素含有還元剤とメトキシポリエチレングリコールアルデヒドは約２５：１〜約１．５：１の範囲のモル比を有する工程と、
メトキシポリエチレングリコールアルデヒドと前記タンパク質を反応させて、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを形成する工程であって、前記ｐＨ緩衝剤は、反応中の前記タンパク質水溶液のｐＨを４．０〜６．０の範囲に維持する工程と、
タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを有機溶媒中で生分解性ポリマーと混合して混合物を形成する工程と、
タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートと生分解性ポリマーの混合物を水溶液中に乳化させて乳化混合物を形成する工程と、
タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートと生分解性ポリマーの乳化混合物を制御放出マイクロスフェアに硬化させる工程と
を含む方法。
【請求項２４】
前記ホウ素含有還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、２−メチルピリジンボラン、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、トリエチルアミンボラン、モルホリンボラン、ｔｅｒｔ−ブチルアミンボラン、及び５−エチル−２−メチルピリジンボランからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ホウ素含有還元剤は２−メチルピリジンボランである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記タンパク質はインスリンを含み、前記タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートは部位特異的モノＰＥＧ化タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートであり、前記部位特異的モノＰＥＧ化タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートはＰＥＧ−ＰｈｅＢ１−インスリンコンジュゲートを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ＰＥＧ−ＰｈｅＢ１−インスリンコンジュゲートは、生成された全てのインスリン−ＰＥＧコンジュゲートの７５％〜８５％の収率を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ｐＨ緩衝剤はリン酸の無機塩を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記キレート剤はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記ホウ素含有還元剤とメトキシポリエチレングリコールアルデヒドは約２５：１〜約５：１の範囲のモル比を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
反応中の前記タンパク質水溶液のｐＨは５．０である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記有機溶媒は塩化メチレンを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記生分解性ポリマーは、ポリラクチド、ポリグリコリド；ポリ（ｄ，ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）；ポリカプロラクトン；ポリオルトエステル；ポリエステルとポリエーテルのコポリマー；及びポリラクチドとポリエチレングリコールのコポリマーからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
前記生分解性ポリマーはポリ（ｄ，ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）を含む、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、部位特異的タンパク質コンジュゲートの調製のためのアミンＰＥＧ化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物、ホルモン、タンパク質、又は他の医学的に活性な薬剤の患者への送達は、多くの課題に直面する。医学的に活性な薬剤は、患者内に送達されなければならない。そのような２つの方法は摂取及び注射である。摂取では、薬物は治療のために血流又は標的領域に到達する前に、患者の消化器系を通過しなければならないことがある。注射は、医学的に活性な薬剤が治療のために血流又は標的領域に迅速に又は直接到達することを可能にするが、注射は患者にとって不便であるか痛みを伴うことがある。一旦体内に入ると、時間の関数としての医学的に活性な薬剤の濃度は、医学的に活性な薬剤の種類、医学的に活性な薬剤に対する異なる官能基又は分子の結合、医学的に活性な薬剤のカプセル化、又は他の要因に依存して変動し得る。医学的に活性な薬剤の濃度が閾値を下回って低下する場合、医学的に活性な薬剤を再度投与することが必要となる。多くの医学的に活性な薬剤は頻繁に投与されなければならず、これは１日に数回を含む。より頻繁な投与計画は、患者への不便さを増大させ、患者による順守率を低下させ、患者にとって最適な結果に至らない可能性がある。医学的に活性な薬剤が注射によって投与される場合、更なる注射は、痛みの頻度、感染の危険性、及び患者における免疫応答の可能性を増大させる。従って、患者において優れた濃度プロファイルを有する医学的に活性な薬剤の必要性が存在する。本明細書に記載の方法及び組成物は、これら及び他の必要性に対する解決策を提供する。
【発明の概要】
【０００３】
医学的に活性な薬剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合させることができる。ポリエチレングリコールの結合は、医学的に活性な薬剤に分子量を付与することができ、医学的に活性な薬剤の半減期の延長をもたらし得る。さらに、ポリエチレングリコール（より小さいＰＥＧ分子を含む）の医学的に活性な薬剤への結合は、医学的に活性な薬剤の疎水性を増加させ、医学的に活性な薬剤を両親媒性にすることができる。医学的に活性な薬剤は、生分解性ポリマーを伴うと、有機溶媒中により容易に溶解させることができる。生分解性ポリマーは、マイクロスフェア中に医学的に活性な薬剤をカプセル化することができる。医学的に活性な薬剤のカプセル化は、医学的に活性な薬剤の半減期を延長することができる。本明細書に記載の製剤は、ある期間にわたって医学的に活性な薬剤をゆっくりと均等に放出することができる。放出プロファイルは、賦形剤を必要とせずに、意図された治療期間にわたって持続的でピークレスに近いタンパク質レベルをもたらし得る。結果として得られる医学的に活性な薬剤の患者における濃度プロファイルは、患者においてより最適な臨床結果をもたらす可能性がある。本明細書に記載の製剤は、月に１回の頻度で患者に投与することができる。
【０００４】
特に、親水性タンパク質による部位特異的修飾は、患者に医学的に活性な薬剤を投与するのを助けることができる。一例では、置換の部位が主に残基ＰｈｅＢ１（Ｂ鎖のＮ末端）であるＰＥＧ化インスリン誘導体を用いてもよい。これらの誘導体は、天然のインスリンよりも物理的及び酵素的により安定であり得る。さらに、誘導体は、天然のインスリンよりも水性／有機系でより可溶性であり得る。さらに、これらの誘導体は免疫原性が低く、血中半減期を延長することができる。これらの部位特異的ＰＥＧ化タンパク質の高い収率は、本明細書に記載の方法で可能であり得る。これら及び他の利点は、糖尿病や他の苦痛を治療する、より有効な方法を提供し得る。より高い収率は、より効率的で、費用効果が高く、大規模化できる製造方法をもたらし得る。
【０００５】
例には、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを製造する方法が含まれる。この方法は、タンパク質水溶液を提供することを含み得る。タンパク質水溶液は、タンパク質、ｐＨ緩衝剤、及びキレート剤を含み得る。キレート剤はアミノポリカルボン酸、ヒドロキシアミノカルボン酸、Ｎ−置換グリシン、２−（２−アミノ−２−オキソクチル（ｏｘｏｃｔｈｙｌ））アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、及びデフェロキサミン（ＤＥＦ）からなる群から選択することができる。この方法はまた、タンパク質水溶液にホウ素含有還元剤及びメトキシポリエチレングリコールアルデヒドを導入することを含んでもよい。この方法はさらに、メトキシポリエチレングリコールアルデヒドとタンパク質を反応させてタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを形成することを含んでもよい。
【０００６】
いくつかの例では、ホウ素含有還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムであってもよい。シアノ水素化ホウ素ナトリウム及びメトキシポリエチレングリコールアルデヒドは、約５：１〜約１．５：１の範囲のモル比を有してもよい。ｐＨ緩衝剤は、反応の間のタンパク質水溶液のｐＨを４．０から４．４の範囲に維持することができる。例では、ｐＨは３．８〜４．０、４．０〜４．２、又は４．２〜４．４の範囲であり得る。
【０００７】
いくつかの例では、ホウ素含有還元剤は、ジメチルアミンボラン（Ｍｅｔ２ＮＨＢＨ３）、トリメチルアミンボラン（Ｍｅｔ３ＮＢＨ３）、２−ピコリンボラン（２−メチルピリジンボラン  Ｃ６Ｈ７ＮＢＨ３）、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３）、トリエチルアミンボラン（Ｅｔ３ＮＢＨ３）、モルホリンボラン（Ｃ４Ｈ９ＯＮＢＨ）、ｔｅｒｔ−ブチルアミンボラン（Ｃ４Ｈ１１ＮＢＨ３）、又は５−エチル−２−メチルピリジンボラン（Ｃ８Ｈ１１ＮＢＨ３）を含み得る。これらのホウ素含有還元剤は、反応中にシアン化物ガスを放出せず、これは製造上の利点であり得る。ホウ素含有還元剤とメトキシポリエチレングリコールアルデヒドは約２５：１〜約１．５：１の範囲のモル比を有してもよい。ｐＨ緩衝剤は、反応の間のタンパク質水溶液のｐＨを４．０〜６．０の範囲に維持することができる。いくつかの例では、ｐＨは４．０〜４．４、４．４〜４．８、４．８〜５．２、５．２〜５．６、又は５．６〜６．０の範囲であり得る。
【０００８】
例には、インスリン−ＰＥＧコンジュゲートを製造する方法が含まれ得る。この方法は、インスリン水溶液を提供することを含み得る。インスリン水溶液は、インスリン、ｐＨ緩衝剤、有機溶媒、及びキレート剤を含み得る。キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含み得る。この方法はまた、インスリン水溶液に、ホウ素含有還元剤及びメトキシポリエチレングリコールアルデヒドを導入することを含んでもよい。ホウ素含有還元剤は、本明細書に記載の任意のホウ素還元剤であってよい。ホウ素含有還元剤及びメトキシポリエチレングリコールアルデヒドは、約５：１〜約１：１、又は本明細書に記載の任意のモル比を有することができる。さらに、この方法は、メトキシポリエチレングリコールアルデヒドをインスリンと反応させてインスリン−ＰＥＧコンジュゲートを形成することを含んでもよい。ｐＨ緩衝剤は、反応中に本明細書に記載される任意の範囲でインスリン水溶液のｐＨを維持することができる。メトキシポリエチレングリコールアルデヒドとインスリンの反応は、ＰＥＧ−ＰｈｅＢ１−インスリンコンジュゲートを、生成された全てのインスリン−ＰＥＧコンジュゲートの７５％超の収率でもたらし得る。
【０００９】
例には、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを含む放出制御マイクロスフェアを製造する方法が含まれ得る。この方法は、タンパク質、ｐＨ緩衝剤、及びキレート剤を含み得るタンパク質水溶液を提供することを含んでもよい。キレート剤はアミノポリカルボン酸、ヒドロキシアミノカルボン酸、Ｎ−置換グリシン、２−（２−アミノ−２−オキソクチル（ｏｘｏｃｔｈｙｌ））アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、及びデフェロキサミン（ＤＥＦ）からなる群から選択することができる。この方法はまた、タンパク質水溶液にホウ素含有還元剤とメトキシポリエチレングリコールアルデヒドを導入することを含んでもよい。ホウ素含有還元剤は、本明細書に記載の任意のホウ素含有還元剤であってよい。ホウ素含有還元剤とメトキシポリエチレングリコールアルデヒドは、本明細書に記載の任意のモル比を有し得る。この方法はさらに、メトキシポリエチレングリコールアルデヒドとタンパク質を反応させて、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを形成することを含んでもよく、ここで、ｐＨ緩衝剤は、反応中のタンパク質水溶液のｐＨを４．０〜６．０の範囲に維持する。さらに、本方法は、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを有機溶媒中で生分解性ポリマーと混合することを含んでもよい。さらに、本方法は、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートと生分解性ポリマーの混合物を水溶液中に乳化させることを含んでもよい。この方法は、生分解性ポリマー中のタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートの乳化混合物を制御放出マイクロスフェアに硬化させることを含んでもよい。
【００１０】
本技術を、添付の図面と共に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例に係るタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを製造する方法のブロック図を示す。
【図２】実施例に係るインスリン−ＰＥＧコンジュゲートを製造する方法のブロック図を示す。
【図３】実施例に係るタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを含有する制御放出マイクロスフェアを製造する方法のブロック図を示す。
【図４】実施例に係る、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの濃度の関数としてのモノＰＥＧ化インスリンの収率のグラフを示す。
【図５Ａ】実施例に係る、インスリンの初期濃度に対するキレート剤の濃度の比の関数としてのモノＰＥＧ化インスリンの収率のグラフを示す。
【図５Ｂ】実施例に係る、インスリンの初期濃度に対するキレート剤の濃度の比の関数としてのモノＰＥＧ化インスリンの収率のグラフを示す。
【図６】実施例に係る、亜鉛イオンのパーセンテージの関数としてのモノＰＥＧ化インスリンの収率のグラフを示す。
【図７】実施例に係る、インスリンの初期濃度の関数としてのモノＰＥＧ化インスリンの収率のグラフを示す。
【図８】実施例に係る、ｐＨの関数としてのモノＰＥＧ化インスリンの収率のグラフを示す。
【図９Ａ】実施例に係る、緩衝剤濃度の関数としてのモノＰＥＧ化インスリンの収率のグラフを示す。
【図９Ｂ】実施例に係る、緩衝剤濃度の関数としてのモノＰＥＧ化インスリンの収率のグラフを示す。
【図１０】実施例に係る、インスリンの初期濃度に対するキレート剤の濃度の様々な比率における反応時間の関数としてのモノＰＥＧ化インスリンの収率のグラフを示す。
【図１１】実施例に係る、塩化ナトリウム濃度の関数としてのモノＰＥＧ化インスリンの収率のグラフを示す。
【図１２】実施例に係る、溶媒対ＰＥＧ化効率のグラフを示す。
【図１３】実施例に係る、異なるｐＨ及び還元剤濃度に対するＰＥＧ化効率のグラフを示す。
【図１４】実施例に係る、時間に対するモノＰＥＧ化インスリンのパーセンテージのグラフを示す。
【図１５】実施例に係る、モノＰＥＧ化インスリン収率に対する酢酸緩衝剤及びクエン酸緩衝剤の比較を示す。
【図１６】実施例に係る、ＰＥＧ化効率に対するクエン酸緩衝液のｐＨの効果のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
改変されていないタンパク質は、医学的に活性な薬剤として使用される場合、所望の濃度プロファイル及び他の好ましい特性を持たない場合がある。ＰＥＧ化、すなわち分子にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合させる工程は、ペプチド及びタンパク質の投与を助けることができ、これは薬理学的特性の改善及び有効性の増大につながる可能性がある。ＰＥＧは、エチレングリコールのサブユニットから構成される線状ポリマーであり、水及び多くの有機溶媒の両方に可溶である。ＰＥＧは柔軟性があり、生体適合性があり、非毒性である。ＰＥＧの特性の結果として、ＰＥＧ化は、タンパク質やペプチドの半減期及び／又は溶解性を増大させる。
【００１３】
部位特異的タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを製造する従来の方法は、おそらく約５０％程度の低い収率をもたらすに過ぎない。さらに、従来の方法は、より多くの工程を、あまり好ましくない部位又は残基においてタンパク質を保護するために必要とすることがある。従来の方法では、タンパク質にとって不都合な環境（高ｐＨ及び低ｐＨ）で長時間の反応工程を経なければならないことがある。これらのより低い収率及びより不都合な環境は、費用を増加させ、治療の臨床効果を低下させる可能性がある。
【００１４】
部位特異的タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートの従来の方法による収率よりも高い収率を達成することができる。ポリエチレングリコールアルデヒドは、ポリエチレングリコールエステルよりも高い収率を提供し得る。低いｐＨはｐｈｅＢ１鎖のＮ末端に対する特異性に寄与することができる。還元剤の濃度が高いとＰＥＧ剤のアルデヒドが還元されることがあるので、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの濃度は低いほうが好ましいであろう。種々の成分の濃度又は比は、部位特異的タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートの収率を最大にするように選択することができる。これらの濃度又は比は、ある範囲内であって、その範囲外の収率データからは予測されない範囲内にあってもよい。
【００１５】
例には、図１に示すように、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを製造する方法が含まれる。方法１００は、タンパク質水溶液１０２を提供することを含み得る。タンパク質水溶液は、タンパク質、ｐＨ緩衝剤、及びキレート剤を含み得る。さらに、タンパク質は、インスリン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副甲状腺ホルモンの断片、成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ））、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、エンフビルチド（フュゼオン（Ｆｕｚｅｏｎ）（登録商標））、及びオクトレオチド（サンドスタチン（登録商標））からなる群から選択することができる。インスリンは、ヒトインスリンを含み得る。ｐＨ緩衝剤は、リン酸の無機塩を含むことができる。
【００１６】
キレート剤は、アミノポリカルボン酸、ヒドロキシアミノカルボン酸、Ｎ−置換グリシン、２−（２−アミノ−２−オキソクチル（ｏｘｏｃｔｈｙｌ））アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、及びデフェロキサミン（ＤＥＦ）からなる群から選択することができる。アミノポリカルボン酸は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、Ｎ−２−アセトアミド−２−イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ビス（アミノエチル）グリコールエーテル、Ν，Ν，Ν’，Ν’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、トランスジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、グルタミン酸、及びアスパラギン酸からなる群から選択することができる。アミノポリカルボン酸は、これらの化合物のいずれか１つ又はこれらの化合物のいずれかの群を除外してもよい。ヒドロキシアミノカルボン酸は、Ｎ−ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＭＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス−ヒドロキシエチルグリシン、及びＮ−トリスヒドロキシメチルメチル）グリシンからなる群から選択することができる。Ｎ−置換グリシンはグリシルグリシンを含み得る。
【００１７】
方法１００はまた、タンパク質水溶液にホウ素含有還元剤及びメトキシポリエチレングリコールアルデヒドを導入すること１０４を含んでもよい。還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）、ジメチルアミンボラン（Ｍｅｔ２ＮＨＢＨ３）、トリメチルアミンボラン（Ｍｅｔ３ＮＢＨ３）、２−ピコリンボラン（すなわち、２−メチルピリジンボラン（Ｃ６Ｈ７ＮＢＨ３））、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３）、トリエチルアミンボラン（Ｅｔ３ＮＢＨ３）、モルホリンボラン（Ｃ４Ｈ９ＯＮＢＨ）、ｔｅｒｔ−ブチルアミンボラン（Ｃ４Ｈ１１ＮＢＨ３）、又は５−エチル−２−メチルピリジンボラン（Ｃ８Ｈ１１ＮＢＨ３）を含んでいてもよい。例では、ホウ素含有還元剤とメトキシポリエチレングリコールは、約２５：１〜約１．５：１、約２２：１〜約５．５：１、約２２：１〜約１．６：１、又は約１０：１〜約５．５：１の範囲のモル比を有してもよい。
【００１８】
還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムであってもよい。方法１００はまた、いくつかの例において、タンパク質水溶液にシアノ水素化ホウ素ナトリウム及びメトキシポリエチレングリコールアルデヒドを導入することを含んでもよい。例では、シアノ水素化ホウ素ナトリウムとメトキシポリエチレングリコールアルデヒドは、約５：１〜約１．５：１、約４：１〜約１．５：１、約５：１〜約２：１、又は約５：１〜約３：１の範囲のモル比を有してもよい。
【００１９】
さらに、方法１００は、ポリエチレングリコールエステルをタンパク質と反応させることを含んでいなくてもよい。ポリエチレングリコールアルデヒドは、一級アミンに対して選択的であってもよいが、ポリエチレングリコールエステルは、他の官能基及びアミノ酸と反応し得る。ポリエチレングリコールエステルは、ポリエチレングリコールアルデヒドよりも反応に高いｐＨを必要とすることがある。
【００２０】
方法１００はさらに、メトキシポリエチレングリコールアルデヒドとタンパク質を反応させて、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを形成すること１０６を含んでもよい。アルデヒドとアミノ基の間の反応は、イミン中間体をもたらし得る。これらの反応は、酸によって触媒され得、かつｐＨ依存性であり得る。インスリンはＰＥＧ化に利用できる３つのアミノ基を有し得る。各々は、異なるｐＫａ値を有し得る。リジン側鎖は１０．５のｐＫａを有し得、グリシンのＮ末端は９．７８のｐＫａを有し得、そしてフェニルアラニンのＮ末端は９．３１のｐＫａを有し得る。ｐＨは、アルデヒドとの反応のためのアミノ選択性に影響し得る。ｐＨ緩衝剤は、反応中のタンパク質水溶液のｐＨを４．０〜６．０の範囲に維持することができる。還元剤としてシアノ水素化ホウ素を用いると、反応中のｐＨは４．０〜４．４の範囲となり得る。
【００２１】
メトキシポリエチレングリコールアルデヒドとタンパク質との反応は、実施例に従って生成された全てのタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートの７５％超、８５％超、又は９０％超の収率で部位特異的モノＰＥＧ化タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートをもたらし得る。例えば、タンパク質はインスリンを含んでもよく、部位特異的モノＰＥＧ化タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートはＰＥＧ−ＰｈｅＢ１−インスリンコンジュゲートを含んでもよい。メトキシポリエチレングリコールを反応させることは、撹拌なしで行われてもよい。メトキシポリエチレングリコールを反応させることは、残基ＧｌｙＡｌ及びＬｙｓＢ２９の一方又は両方を保護する工程を除外してもよい。混合物の導電性を増加させる可能性のある塩化ナトリウム又は他の塩は、反応が完了又は実質的に完了した後まで添加しなくてもよい。
【００２２】
図２に示すように、例には、インスリン−ＰＥＧコンジュゲートを製造する方法２００が含まれ得る。方法２００は、インスリン水溶液を提供すること２０２を含み得る。インスリン水溶液は、インスリン、ｐＨ緩衝剤、有機溶媒、及びキレート剤を含み得る。キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、又は本明細書に記載の任意のキレート剤を含んでもよい。有機溶媒は、エタノール、メタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジオキサン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、及びＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）からなる群から選択することができる。
【００２３】
方法２００はまた、インスリン水溶液に、ホウ素含有還元剤及びメトキシポリエチレングリコールアルデヒドを導入すること２０４を含んでもよい。ホウ素含有還元剤は、本明細書に記載の還元剤のいずれかを含むことができる。ホウ素含有還元剤及びメトキシポリエチレングリコールアルデヒドは、本明細書に記載の任意のモル比を有することができる。
【００２４】
さらに、方法２００は、メトキシポリエチレングリコールアルデヒドをインスリンと反応させてインスリン−ＰＥＧコンジュゲートを形成すること２０６を含んでもよい。ｐＨ緩衝剤は、反応中のインスリン水溶液のｐＨを本明細書に記載の任意の範囲に維持することができる。これらの又は他の実施例において、インスリン水溶液のｐＨは、反応において約４．０又は本明細書に記載の任意のｐＨ範囲であり得る。反応の開始時、メトキシポリエチレングリコールアルデヒド及びインスリンは、実施例に従って、約１０：１〜約１：１、又は約８：１〜約３：１、又は約６：１〜約４：１、又は約５：１〜約１：１のモル比を有し得る。
【００２５】
メトキシポリエチレングリコールアルデヒドとインスリンとの反応は、実施例に従って生成された全てのインスリン−ＰＥＧコンジュゲートの７５％超又は７５％〜８５％の収率でＰＥＧ−ＰｈｅＢ１−インスリンコンジュゲートをもたらし得る。
【００２６】
図３に示すように、例には、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを含有する制御放出マイクロスフェアを製造する方法３００が含まれ得る。方法３００は、タンパク質水溶液を提供すること３０２を含むことができ、このタンパク質水溶液は、タンパク質、ｐＨ緩衝剤、及びキレート剤を含み得る。タンパク質は、前述したタンパク質のいずれかであり得る。ｐＨ緩衝剤は、本明細書に記載の任意のｐＨ緩衝剤であり得る。キレート剤は、本明細書に記載の任意のキレート剤であり得る。
【００２７】
方法３００はまた、タンパク質水溶液にホウ素含有還元剤及びメトキシポリエチレングリコールアルデヒドを導入すること３０４を含んでもよい。ホウ素含有還元剤及びメトキシポリエチレングリコールアルデヒドは、本明細書に記載の任意のモル比を有することができる。
【００２８】
方法３００は、さらに、メトキシポリエチレングリコールアルデヒドとタンパク質を反応させてタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを形成すること３０６を含んでもよく、ここで、ｐＨ緩衝剤は、反応中に本明細書に記載の任意のｐＨ範囲を維持する。タンパク質水溶液のｐＨは、本明細書に記載の任意のｐＨであり得る。さらに、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートは、部位特異的モノＰＥＧ化タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートであってもよい。部位特異的モノＰＥＧ化タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートは、ＰＥＧ−ＰｈｅＢ１−インスリンコンジュゲートを含み得る。ＰＥＧ−ＰｈｅＢ１−インスリンコンジュゲートは、実施例に従って生成された全てのインスリン−ＰＥＧコンジュゲートの７５％〜８５％又は７５％超の収率を有し得る。
【００２９】
さらに、方法３００は、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを有機溶媒中で生分解性ポリマーと混合すること３０８を含んでもよい。有機溶媒は塩化メチレンを含んでいてもよい。生分解性ポリマーは、ポリラクチド、ポリグリコリド；ポリ（ｄ，ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）；ポリカプロラクトン；ポリオルトエステル；ポリエステルとポリエーテルのコポリマー；及びポリラクチドとポリエチレングリコールのコポリマーからなる群から選択することができる。生分解性ポリマーは、記載されている任意のポリマー又はポリマーの群を除外することができる。
【００３０】
さらに、方法３００は、水溶液中に、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート及び生分解性ポリマーの混合物を乳化させること３１０を含んでもよい。方法３００は、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート及び生分解性ポリマーの乳化した混合物を制御放出マイクロスフェアに硬化させること３１２を含んでもよい。
【００３１】
実施例１
一定のモノＰＥＧ化インスリン−ＰＥＧコンジュゲート（「ｍＰＥＧＩｎｓ」）収率のためのシアノ水素化ホウ素ナトリウムの操作条件及び制限を決定するために、シアノ水素化ホウ素ナトリウム濃度（［ＮａＢＨ３ＣＮ］）の様々な範囲にわたって実験が実施される。一連の実験において、以下のパラメータは一定に保たれた（括弧内の値）：［ｒｈＩ］０（０．８６ｍＭ）、［ｍＰＥＧｐｒｏｐａｌｄ］０／［ｒｈＩ］０（１．０４）、［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０（０．１７〜０．１８）、温度（２８℃）、緩衝剤濃度（３０ｍＭ）、及びｐＨ（４．０）。［ｒｈＩ］０は組換えヒトインスリンの初期濃度である。［ｍＰＥＧｐｒｏｐａｌｄ］０はメトキシプロピレングリコールアルデヒドの初期濃度である。［ＥＤＴＡ］はエチレンジアミン四酢酸の濃度である。原料も、各反応で同じであった。モノＰＥＧ化インスリン−ＰＥＧコンジュゲート収率は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの関数として図４に示されている。［ｒｈＩ］０のこの値では、ｍＰＥＧＩｎｓ収率は［ＮａＢＨ３ＣＮ］＝１．０ｍＭ〜［ＮａＢＨ３ＣＮ］＝１．５ｍＭの間の最適濃度を示す。しかし、ｍＰＥＧＩｎｓ収率は［ＮａＢＨ３ＣＮ］濃度が２ｍＭを超えると減少する。［ＮａＢＨ３ＣＮ］＝１．０ｍＭ〜［ＮａＢＨ３ＣＮ］＝１．５ｍＭでのｍＰＥＧＩｎｓ収率の間の変動は約２モル％である。［ＮａＢＨ３ＣＮ］の上限が、同じｍＰＥＧＩｎｓ収率の変動となるように設定する場合、［ＮａＢＨ３ＣＮ］の上限は４．０ｍＭに設定され得る。最高のｍＰＥＧＩｎｓ収率に対応するＮａＢＨ３ＣＮの濃度は１．５ｍＭであることが確認される。
【００３２】
実施例２
ＥＤＴＡはｒｈＩ原料中のＺｎ２＋イオンをキレートし、そうすることでｒｈＩを可溶化させる。米国薬局方（ＵＳＰ）に準拠するためには、ｒｈＩ原料中に含有されるＺｎ２＋は１．００％（ｗ／ｗ）以下でなければならない。反応緩衝液中の酢酸ナトリウムの少量を適切な量の酢酸亜鉛に置き換えることによってＺｎ２＋濃度をシミュレートした。
【００３３】
［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０の狭い範囲を試験した。この一連の反応において、以下のパラメータは一定に保たれた（括弧内の値）：［ｒｈＩ］０（０．８６〜０．８８ｍＭ）、［ｍＰＥＧｐｒｏｐａｌｄ］０／［ｒｈＩ］０（１．０４）、［ＮａＢＨ３ＣＮ］（１．２ｍＭ）、温度（２８℃）、緩衝剤濃度（３０ｍＭ）、及びｐＨ（４．０）。各反応について、ｍＰＥＧＩｎｓ収率をＲＰＨＰＬＣ解析によりモニタリングした。その結果を［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０の関数として図５Ａに示す。図５Ａのデータは０．２５の［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０で最大ｍＰＥＧＩｎｓ収率を示す。ｍＰＥＧＩｎｓ収率は、０．１７５超の［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０の値に対し、８３．５モル％辺りで変動するようである。０．０５を下回る［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０レベルでｍＰＥＧＩｎｓ収率にほんの僅かな減少（約３モル％）が存在する。
【００３４】
実施例３
実施例２を、より広い［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０の範囲について繰り返した。この繰り返し実験において、以下のパラメータは一定に保たれた（括弧内の値）：［ｒｈＩ］０（０．８６ｍＭ）、［ｍＰＥＧｐｒｏｐａｌｄ］０／［ｒｈＩ］０（１．０７）、［ＮａＢＨ３ＣＮ］（２．０ｍＭ）、温度（２８℃）、緩衝剤濃度（４０ｍＭ）、及びｐＨ（４．０）。この実験のセットにおける［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０の関数としてのｍＰＥＧＩｎｓ収率を図５Ｂに示す。図５Ｂに示される範囲にわたって、［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０の増加に伴いｍＰＥＧＩｎｓ収率が減少することが確認される。
【００３５】
実施例２及び３の実験は、０．３６％（ｗ／ｗ）のＺｎ２＋を含有するｒｈＩで完了した。図５Ａは、０．１７５〜０．５０の範囲の［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０がほぼ同じｍＰＥＧＩｎｓ収率をもたらすことを示す。Ｚｎ２＋濃度の観点では、［ＥＤＴＡ］／［Ｚｎ２＋］の対応する範囲は０．５５〜１．５６である。この事例では、［ＥＤＴＡ］／［Ｚｎ２＋］＝０．５５は［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０＝０．４８に相当する。図５Ｂのデータに基づき、［ＥＤＴＡ］／［Ｚｎ２＋］の上限は２．０であり得る。しかし、実施例８のように反応時間が考慮される場合、［ＥＤＴＡ］／［Ｚｎ２＋］の範囲の上限は１．０であることが確認された。
【００３６】
実施例４
ｍＰＥＧＩｎｓ収率に対するｒｈＩ  Ｚｎ２＋濃度の効果を試験した。０．０％（ｗ／ｗ）Ｚｎ２＋及び０．４０％（ｗ／ｗ）Ｚｎ２＋をシミュレートするために、回収したｒｈＩの反応の際に酢酸亜鉛を加えた。酢酸亜鉛を、Ｄｉｏｓｙｎｔｈ（登録商標）ｒｈＩ（ロット番号ＳＩＨＲ０１０−１２１３０６Ａ、Ｚｎ２＋濃度＝０．３６％（ｗ／ｗ））に加えて、０．３６％（ｗ／ｗ）、１．００％（ｗ／ｗ）、及び１．２２％（ｗ／ｗ）Ｚｎ２＋をシミュレートした。これらの実験において、以下のパラメータは一定に保たれた（括弧内の値）：［ｒｈＩ］０（０．８６ｍＭ）、［ｍＰＥＧｐｒｏｐａｌｄ］０／［ｒｈＩ］０（１．０５〜１．０７）、［ＮａＢＨ３ＣＮ］（２．０ｍＭ）、温度（２８℃）、及びｐＨ（４．０）。これらのバッチのｍＰＥＧＩｎｓ収率を、これらのバッチのＺｎ２＋濃度の関数として図６に示す。図６のデータは図５Ａ及び５Ｂのデータと類似している。［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０の値は、ｒｈＩ中Ｚｎ２＋＝１．０％（ｗ／ｗ）での一定の収率に必要な最小値付近に設定した。したがって、ＥＤＴＡ濃度は、１．０％（ｗ／ｗ）〜１．２％（ｗ／ｗ）の間のＺｎ２＋濃度のどこかで、その最小値に合わなくなるはずである。図６に示すように、１．０％（ｗ／ｗ）〜１．２％（ｗ／ｗ）の間のＺｎ２＋でｍＰＥＧＩｎｓ収率の比較的急峻な低下が出現する。１．００％（ｗ／ｗ）〜０．０％（ｗ／ｗ）に減少するＺｎ２＋濃度で、ｍＰＥＧＩｎｓ収率に緩やかな低下が出現する。この低下は、図５Ｂに示すｒｈＩ／Ｚｎ２＋に対するＥＤＴＡの増加に伴い減少するｍＰＥＧＩｎｓ収率の効果と類似している。この実施例では、Ｚｎ２＋含有量の０．０％（ｗ／ｗ）〜１．０％（ｗ／ｗ）の間の変動が、ｒｈＩ中約２．５モル％のｍＰＥＧＩｎｓ収率の変動をもたらすことが確認された。
【００３７】
実施例５
広範な［ｒｈＩ］０についての実験を行った。ｍＰＥＧＩｎｓ収率をもう一度ＲＰ−ＨＰＬＣによってモニタリングし、図７に［ｒｈＩ］０の関数として示す。［ｒｈＩ］０の各減少につき、ｍＰＥＧＩｎｓ収率は増加した。［ｒｈＩ］０が０．８６ｍＭから０．５０ｍＭに減少したときのｍＰＥＧＩｎｓ収率の増加は僅か０．８モル％であった。どこかの時点で［ｒｈＩ］０が低くなりすぎて反応が進まなかったと考えられる。現時点で集められたデータに基づくと、この臨界［ｒｈＩ］０は［ｒｈＩ］０＝０．００ｍＭ〜０．５０ｍＭの間のどこかに存在する可能性がある。
【００３８】
［ｒｈＩ］０＝０．８６ｍＭの値は、反応体積１０Ｌ中５０ｇのｒｈＩに相当する濃度を表す。バッチサイズが一定に保たれる場合、［ｒｈＩ］０の各減少はリアクター体積の増加に相当する。体積の増加は、同じ濃度を達成するためのＮａＢＨ３ＣＮの質量の増加、ならびにイオン交換クロマトグラフィーによるｍＰＥＧＩｎｓの精製に必要な時間の長期化をもたらし得る。ｍＰＥＧＩｎｓ収率に対する［ｒｈＩ］０の観察された効果は０．５０ｍＭ〜０．８６ｍＭの間では小さいため、また、上述した利便性及び安全性の問題のため、［ｒｈＩ］０の推奨される設定点は０．８６ｍＭであり、下限及び上限はそれぞれ０．５０ｍＭ及び１．０ｍＭである。
【００３９】
実施例６
あるｐＨ範囲にわたって実験を完了した。一連の実験において、以下のパラメータは一定に保たれた（括弧内の値）：［ｒｈＩ］０（０．８６ｍＭ）、［ｍＰＥＧｐｒｏｐａｌｄ］０／［ｒｈＩ］０（１．０４）、［ＮａＢＨ３ＣＮ］（２．０ｍＭ）、［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０（０．１７５）、温度（２８℃）、緩衝剤濃度（３０ｍＭ）。これらのバッチについて、ｍＰＥＧＩｎｓ収率をｐＨの関数として図８に示す。ｐＨ＝３．８８〜ｐＨ＝４．２７の間で、ｍＰＥＧＩｎｓ収率は１．５モル％未満で最小値から最大値まで変動した。この範囲外の値は更に大きな変動を示した。ｐＨの標的値は４．０であり得、これはｍＰＥＧＩｎｓ収率が最大となるｐＨの近似値である。
【００４０】
実施例７
酢酸緩衝剤濃度を変動させて実験を完了した。一連の実験を通して、以下のパラメータは一定に保たれた（括弧内の値）：［ｒｈＩ］０（０．８６ｍＭ）、［ｍＰＥＧｐｒｏｐａｌｄ］０／［ｒｈＩ］０（１．０７）、［ＮａＢＨ３ＣＮ］（２．０ｍＭ）、［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０（０．５）、温度（２８℃）、及びｐＨ（４．０）。ｍＰＥＧＩｎｓ収率を酢酸緩衝剤濃度の関数として図９Ａに示す。低い緩衝剤濃度で高いｍＰＥＧＩｎｓ収率に向かう凡その傾向があるようだが、この傾向は、１０ｍＭ〜５０ｍＭの間の緩衝剤濃度でｍＰＥＧＩｎｓ収率を１モル％超えさせる程度の影響である。反応の開示時と終了時に反応混合物のｐＨを測定した。その変化を酢酸緩衝剤濃度の関数として図９Ｂに示す。４０ｍＭ以上の緩衝剤濃度では、反応の間にｐＨの変化はプラトーに達したようである。ｐＨ変動を０．１ｐＨ単位内に制限するため、緩衝剤濃度の下限は２０ｍＭに設定され得る。バッチごとの反応ｐＨを一定に制限するため、緩衝剤濃度の標的値は３０ｍＭであり得る。
【００４１】
実施例８
以前のデータから、ｒｈＩ変換率及びｍＰＥＧＩｎｓ収率は３時間〜２０時間の間で大きく増加した。実験を行い、１６．６時間、１８．０時間、１９．２時間、２０．３時間を含む様々な反応時間でサンプルを収集した。０．１５、０．５０、１．０、及び２．０で［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０は変動した。この実験は、以下のパラメータ値を固定した：［ｒｈＩ］０＝０．８６ｍＭ、［ｍＰＥＧｐｒｏｐａｌｄ］０／［ｒｈＩ］０＝１．０７、［ＮａＢＨ３ＣＮ］＝２．０ｍＭ、温度＝２８℃、緩衝剤濃度＝３０ｍＭ、及びｐＨ＝４．０。これら４つのバッチの各々についてのｍＰＥＧＩｎｓ収率を反応時間の関数として図１０に示す。図１０中のラベルは［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０の異なる値を示す。［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０＝０．５０におけるｍＰＥＧＩｎｓ収率は１６．６時間〜２０．３時間の間のタイムポイントの間で僅かに変動する。反応時間の増加によりｍＰＥＧＩｎｓ収率が減少するとは思われないため、この変動は、ｍＰＥＧＩｎｓ収率における実際の変化よりも、測定及び解析のばらつきを表している可能性が高い。［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０＝０．５０において、図１０のデータは、１６．６時間の反応時間〜２０．３時間の最大反応時間の間では、１６．６時間を超えて反応時間が長くなっても、ｍＰＥＧＩｎｓ収率に更なる利益をもたらさないことを示す。同じ傾向（１６．６時間〜２０．３時間の間でほとんど変化なし）が、［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０＝０．１５及び１．０でも存在するようであるが、［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０＝２．０では存在しない。［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０＝２．０では、１６．６時間〜２０．３時間の間でｍＰＥＧＩｎｓ収率は約１モル％増加した。１６．６時間でｍＰＥＧＩｎｓ収率のプラトーに達するためには、［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０の上限は１．０であることが確認された。
【００４２】
実施例９
ｍＰＥＧＩｎｓ反応混合物中のＮａＣｌ濃度の変動の、ｍＰＥＧＩｎｓ収率に対する効果を試験した。一連の実験を通して、以下のパラメータは一定に保たれた（括弧内の値）：［ｒｈＩ］０（０．８６ｍＭ）、［ｍＰＥＧｐｒｏｐａｌｄ］０／［ｒｈＩ］０（１．０５）、［ＮａＢＨ３ＣＮ］（１．５ｍＭ）、［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０（０．５）、温度（２８℃）、緩衝剤濃度（３０ｍＭ）、及びｐＨ（４．０）。ｍＰＥＧＩｎｓ収率を［ＮａＣｌ］の関数として図１１に示す。ｒｈＩの転換は、ｍＰＥＧＩｎｓ収率データ（図示しない）に見られる傾向を反映していた。１００ｍＭ以上の［ＮａＣｌ］レベルでは、ＮａＢＨ３ＣＮ添加前の反応混合物中に沈殿が目に見えて存在していた（図示しない）。この実施例から、５０ｍＭの時でさえｍＰＥＧＩｎｓ収率はＮａＣｌの存在によって減少した。そしてその結果、溶液の導電率を調節するためのＮａＣｌ添加は反応後まで遅らせることができる。
【００４３】
実施例１０
２−メチルピリジンボランを用いたＰＥＧ化実験を、以下のパラメータを一定に保って実施した（括弧内の値）：［ｒｈＩ］０（０．８６ｍＭ）、［ｍＰＥＧｐｒｏｐａｌｄ］０／［ｒｈＩ］０（１．０５）、［２−メチルピリジンボラン］（１．５ｍＭ）、［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０（０．５）、温度（２８℃）、酢酸緩衝剤濃度（３０ｍＭ）、及びｐＨ（４．０）。ＲＰ−ＨＰＬＣによりＰＥＧ化効率を測定したところ、インスリンＢ鎖の５５％モノＰＥＧ化であり、インスリンＡ鎖のｎ末端のモノＰＥＧ化は検出されなかった。
【００４４】
実施例１１
以下のパラメータを一定に保ったまま、溶媒添加のＰＥＧ化効率に対する効果を評価した：［ｒｈＩ］０（０．８６ｍＭ）、［ｍＰＥＧｐｒｏｐａｌｄ］０／［ｒｈＩ］０（１．０５）、［２−メチルピリジンボラン］（２０ｍＭ）、［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０（０．５）、温度（２８℃）、及びｐＨ４酢酸緩衝剤濃度（３０ｍＭ）。図１２に示す結果は、アセトニトリル（ＡＣＮ）及び酢酸エチル（ＥｔＡＣ）にはＰＥＧ化収率に対し有利な効果があることを示している。これは、インスリン溶解度が上がるためであると思われる。図１２には、イソプロパノール（ＩＰＡ）及びメタノール（ＭｅＯＨ）も示されている。
【００４５】
実施例１２
以下のパラメータを一定に保ったまま、ｐＨ及び２−メチルピリジンボラン濃度の、ＰＥＧ化効率に対する効果を評価した：［ｒｈＩ］０（０．８６ｍＭ）、［ｍＰＥＧｐｒｏｐａｌｄ］０／［ｒｈＩ］０（１．０５）、［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０（０．５）、温度（２８℃）、アセトニトリル（２０％）、及び酢酸緩衝剤濃度（３０ｍＭ）。ＲＰ−ＨＰＬＣ解析を用いて、反応混合物中のＰＥＧ−インスリン濃度を測定した。図１３に示される結果は、還元剤として５ｍＭ  ２−メチルピリジンボランを使用する場合、ｐＨ５付近が最適であることを示している。
【００４６】
実施例１３
以下のパラメータを一定に保ったまま、インスリンＰＥＧ化の割合を評価した：［ｒｈＩ］０（０．８６ｍＭ）、［ｍＰＥＧｐｒｏｐａｌｄ］０／［ｒｈＩ］０（１．０５）、［２−メチルピリジンボラン］（５ｍＭ）、［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０（０．５）、温度（２８℃）、２０％アセトニトリル、及びｐＨ５酢酸緩衝剤濃度（３０ｍＭ）。ＲＰ−ＨＰＬＣ解析を用いて、反応混合物中のＰＥＧ−インスリン濃度を測定した。経時的なモノＰＥＧ化インスリンの割合を図１４に示す。反応は１６時間継続させ、その時のモノＰＥＧ化の割合は約７５％であり、完了とみなした。
【００４７】
実施例１４
以下のパラメータを一定に保ったまま、緩衝剤組成物の、ＰＥＧ化の割合に対する効果を評価した：［ｒｈＩ］０（０．８６ｍＭ）、［ｍＰＥＧｐｒｏｐａｌｄ］０／［ｒｈＩ］０（１．０５）、［２−メチルピリジンボラン］（５ｍＭ）、［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０（０．５）、温度（２８℃）、２０％アセトニトリル、及びｐＨ５酢酸緩衝剤濃度（３０ｍＭ）。結果を図１５に示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ解析を用いて、反応混合物中のＰＥＧ−インスリン濃度を測定した。酢酸緩衝剤はクエン酸緩衝剤よりも高い収率を示している。
【００４８】
実施例１５
以下のパラメータを一定に保ったまま、クエン酸緩衝液のｐＨの、ＰＥＧ化効率に対する効果を評価した：［ｒｈＩ］０（０．８６ｍＭ）、［ｍＰＥＧｐｒｏｐａｌｄ］０／［ｒｈＩ］０（１．０５）、［２−メチルピリジンボラン］（５ｍＭ）、［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０（０．５）、温度（２８℃）、２０％アセトニトリル、及びクエン酸緩衝剤濃度（３０ｍＭ）。ＲＰ−ＨＰＬＣ解析を用いて、３時間後の反応混合物中のＰＥＧ−インスリン濃度を測定したものを図１６に示す。
【００４９】
実施例１６
以下のパラメータを一定に保ったまま、５ｋＤａ  ｍＰＥＧプロピルアデヒド（ｐｒｏｐｙｌａｄｅｈｙｄｅ）を５ｋＤａ  ｍＰＥＧ  ＮＨＳエステルに置き換えた効果を評価した：［ｒｈＩ］０（０．８６ｍＭ）、［ｍＰＥＧ−ＮＨＳエステル］０／［ｒｈＩ］０（１．０５）、［ＥＤＴＡ］／［ｒｈＩ］０（０．５）、温度（２８℃）、及び１００ｍＭリン酸ナトリウム  ｐＨ６．５）。３０分及び１時間の時点のＲＰ−ＨＰＬＣ解析は、開始時のインスリンの約７２％が誘導体化されないまま残り、Ｂ鎖のＮ末端のＰＥＧ化が２３％、及びインスリンの他のＰＥＧ化形態が５％で反応が終了していたことを示した。この実施例は、ｍＰＥＧ  ＮＨＳエステルがｍＰＥＧプロピルアデヒド（ｐｒｏｐｙｌａｄｅｈｙｄｅ）よりも、インスリンのＢ鎖のＮ末端のＰＥＧ化において効果が小さいことを示す。
【００５０】
実施例１７
グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）を用いて以下の反応条件でＰＥＧ化実験を行った［ＧＬＰ−１］０（１〜２．５ｍｇ／ｍＬ）、［ｍＰＥＧｐｒｏｐａｌｄ］０／［ＧＬＰ−１］０（１．２）、［ＮａＣＮＢＨ３］（５ｍＭ）、温度（２５℃）、酢酸緩衝剤濃度（１０ｍＭ）、及びｐＨ（４．５）。１６時間後、ＰＥＧ化反応をＲＰ−ＨＰＬＣによって解析した。ＧＬＰ−１のモノＰＥＧ化は９０〜９５％であり、５〜１０％が未反応ＧＬＰ−１であり、１〜２％がジＰＥＧ化であることが確認された。モノＰＥＧ化ＧＬＰ−１を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製し、緩衝剤を０．０２％の重炭酸アンモニウムに交換し、凍結乾燥した。このＰＥＧ−ＧＬＰ−１コンジュゲートを含むマイクロ粒子を、ｏ／ｗシングルエマルション溶媒抽出／蒸発法を用いて調製した。油相はＭｅＣｌ２に溶解した５ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−ＧＬＰ−１及び８．５％（ｗ／ｖ）ＰＬＧＡポリマーからなっていた。２．５×体積過剰量の１％ｗ／ｖとのボルテックスにより油相を乳化させた。ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）及び一次エマルションを、３００ｒｐｍで撹拌中の１５×過剰量の０．３％ＰＶＡに加えた。次に、約１０分後に３０×過剰量の２％イロプロパノール（ＩＰＡ）を加え、溶媒蒸発によりマイクロスフェア硬化を促進するために懸濁液を撹拌した。３時間後、硬化したマイクロスフェアを濾過し、多量の再蒸留Ｈ２Ｏで洗浄し、凍結乾燥した。
【００５１】
実施例１８
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ１〜３４）を用いて以下の反応条件でＰＥＧ化実験を行った［ＰＴＨ］０（２．５ｍｇ／ｍＬ）、［ｍＰＥＧｐｒｏｐａｌｄ］０／［ＰＴＨ］０（１．２）、［ＮａＣＮＢＨ３］（２０ｍＭ）、温度（２５℃）、酢酸緩衝剤濃度（３０ｍＭ）、及びｐＨ（４．５）。１６時間後、ＰＥＧ化反応をＲＰ−ＨＰＬＣによって解析した。ＰＴＨのモノＰＥＧ化は６８％であり、２４％が未反応ＰＴＨであり、８％が他のＰＥＧ化であることが確認された。モノＰＥＧ化ＰＴＨを陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製し、緩衝剤を０．０２％の重炭酸アンモニウムに交換し、凍結乾燥した。このＰＥＧ−ＰＴＨコンジュゲートを含むマイクロ粒子を、ｏ／ｗシングルエマルション溶媒抽出／蒸発法を用いて調製した。油相はＭｅＣｌ２に溶解した１ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−ＰＴＨ及び８．５％（ｗ／ｖ）ＰＬＧＡポリマーからなっていた。２．５×体積過剰量の１％ｗ／ｖＰＶＡとのボルテックスにより油相を乳化させ、一次エマルションを、３００ｒｐｍで撹拌中の１５×過剰量の０．３％ＰＶＡに加えた。次に、約１０分後に３０×過剰量の２％ＩＰＡを加え、溶媒蒸発によりマイクロスフェア硬化を促進するために懸濁液を撹拌した。３時間後、硬化したマイクロスフェアを濾過し、多量の再蒸留Ｈ２Ｏで洗浄し、凍結乾燥した。
【００５２】
実施例１９
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を用いて以下の反応条件でＰＥＧ化実験を行った：［ｈＧＨ］０（２．５ｍｇ／ｍＬ）、［ｍＰＥＧｐｒｏｐａｌｄ］０／［ｈＧＨ］０（３）、［ＮａＣＮＢＨ３］（２０ｍＭ）、温度（２５℃）、酢酸緩衝剤濃度（３０ｍＭ）、及びｐＨ（５．５）。１６時間後、ＰＥＧ化反応をＲＰ−ＨＰＬＣによって解析した。ｈＧＨのモノＰＥＧ化は６５％であり、３０％が未反応ｈＧＨであり、５％が他のＰＥＧ化であることが確認された。モノＰＥＧ化ｈＧＨを陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製し、緩衝剤を０．０２％の重炭酸アンモニウムに交換し、凍結乾燥した。このＰＥＧ−ｈＧＨコンジュゲートを含むマイクロ粒子を、ｏ／ｗシングルエマルション溶媒抽出／蒸発法を用いて調製した。油相はＭｅＣｌ２に溶解した５ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−ｈＧＨ及び８．５％（ｗ／ｖ）ＰＬＧＡポリマーからなっていた。２．５×体積過剰量の１％ｗ／ｖＰＶＡとのボルテックスにより油相を乳化させ、一次エマルションを、３００ｒｐｍで撹拌中の１５×過剰量の０．３％ＰＶＡに加えた。次に、約１０分後に３０×過剰量の２％ＩＰＡを加え、溶媒蒸発によりマイクロスフェア硬化を促進するために懸濁液を撹拌した。３時間後、硬化したマイクロスフェアを濾過し、多量の再蒸留Ｈ２Ｏで洗浄し、凍結乾燥した。
【００５３】
本明細書では、説明の目的で、本技術の様々な例の理解を提供するために、多くの詳細が示されている。しかしながら、実施例は、これらの詳細の一部を伴わずに、又は追加の詳細と共に実施され得ることは、当業者には明らかであろう。
【００５４】
いくつかの実施例を説明したが、様々な変更例、代替例、及び均等物が、本発明の趣旨から逸脱することなく用いられてもよいことが当業者によって認識されるであろう。さらに、本発明を不必要に不明瞭にすることを避けるために、多くの周知の工程及び要素については説明していない。さらに、任意の特定の実施例の詳細は、その実施例の変形例では必ずしも存在しなくてもよいし、他の実施例に加えてもよい。
【００５５】
ある範囲の値が提供される場合、その範囲の上限と下限との間に、文脈において明示的に別途指示されない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在値も具体的に開示されることが理解される。記載された範囲内の記載された値又は介在する値と、記載された範囲内の他の記載された値又は介在する値との間のより小さい各範囲が包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立してその範囲内に含まれても排除されてもよく、各範囲は、限界値のいずれか又は両方がそのより小さい範囲に含まれるものも含まれないものも、本発明に包含され、記載された範囲において任意の具体的に排除される限界値の対象となる。記載された範囲が限界値の一方又は両方を含む場合、これらの含められる限界値の一方又は両方を排除する範囲も含まれる。
【００５６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、文脈において明確に指示しない限り、単数形「１つ」及び「その」は、複数の対象を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は複数のこのような方法を含み、「タンパク質」への言及は、１つ又は複数のタンパク質及び当業者に公知のその等価物への言及を含む。本発明は、明瞭化及び理解のために詳細に記載されている。しかしながら、添付の特許請求の範囲の範囲内である種の変更及び改変が実施可能であることは理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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