(57)【要約】開示された主題は、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩を使用する方法、および式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩を含むキットを提供する。本発明は、例えば、本願明細書に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩の固体経口投与形態を含む、腫瘍の処置を必要とする被験体における腫瘍を処置するための方法において使用するための組成物であって、該組成物の投与が、単回投与後、約８００〜１５，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する、組成物を提供する。2018526392.tif 000045
2018526392.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物
【化６】
2018526392.tif 000042
または薬学的に許容されるその塩の固体経口投与形態を含む、腫瘍の処置を必要とする被験体における腫瘍を処置するための方法において使用するための組成物であって、該組成物の投与が、単回投与後、約８００〜１５，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する、組成物。
【請求項２】
約１００〜１，２００ｍｇ／日の投与量で週あたり１〜７日、最大約２，８００ｍｇ／週まで投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
約１５０〜４００ｍｇ／日の投与量で週あたり３〜７日投与される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
約１５０〜４００ｍｇ／日の投与量で週あたり５〜７日投与される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
錠剤またはカプセル剤である、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物の投与が、単回投与後、約２，５００〜９，５００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物の投与が、単回投与後、約２００〜１，２００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘを提供する、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記腫瘍が、皮膚がん、結腸直腸がん、卵巣がん、肺がん、乳がん、膵臓がん、胃がんおよび腎臓がんから選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記腫瘍がトリプルネガティブ（ＴＮ）乳がんである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記腫瘍が、白金耐性または白金不応性卵巣がんである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記被験体がヒトである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記処置が、照射または抗腫瘍剤を前記被験体に投与することをさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記処置が、前記被験体に、代謝拮抗剤、ＤＮＡ断片化剤、ＤＮＡ架橋剤、挿入剤、タンパク質合成阻害剤、トポイソメラーゼＩ毒素、トポイソメラーゼＩＩ毒素、微小管標的剤、キナーゼ阻害剤、ポリフェノール、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、デスレセプターアゴニスト、免疫チェックポイント阻害剤、抗プログラム細胞死１（ＰＤ−１）受容体抗体および抗プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）抗体から選択される抗腫瘍剤を投与することをさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記処置が、前記被験体にＰＤ−Ｌ１抗体またはＰＤ−１抗体を投与することをさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記腫瘍が、Ｙ５９３リン酸化ｐ６８のβ−カテニン依存性ＡＴＰａｓｅ活性を阻害することにより処置される、請求項１から１０いずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記処置が、
（ａ）固体経口剤形を投与する前に前記被験体から前記腫瘍の試料を採取するステップと、
（ｂ）該腫瘍がＹ５９３リン酸化ｐ６８を発現するかどうか決定するステップと、
（ｃ）該腫瘍が該Ｙ５９３リン酸化ｐ６８を発現する場合、該被験体に式（Ｉ）の化合物の有効量を投与するステップと
を含む、請求項１から１０いずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
腫瘍の処置を必要とする被験体において腫瘍を処置するための方法において使用するための、式（Ｉ）
【化７】
2018526392.tif 000043
の化合物の固体経口投与形態を含む組成物であって、該方法は、（ａ）該被験体がＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ３Ａ５阻害剤または誘導剤で処置を受けているか決定するステップと、（ｂ）該被験体が、ＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ３Ａ５阻害剤または誘導剤での処置を受けていない場合、該被験体に式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩の有効量を投与するステップとを含む、組成物。
【請求項１８】
式（Ｉ）の化合物
【化８】
2018526392.tif 000044
または薬学的に許容されるその塩を商業規模で調製する方法であって、
（ａ）塩基の存在下、有機溶媒中で、３−アミノ−６−フルオロ−２−メトキシキノキサリンを、クロロギ酸エチルと反応させて、混合物を形成するステップと、
（ｂ）酢酸エチルを添加しながら、該混合物を蒸留させて、懸濁液を形成するステップと、
（ｃ）該懸濁液を濾過して、エチル−Ｎ−（６−フルオロ−２−メトキシキノキサリン−３−イル）カーボネートを単離するステップと、
（ｄ）第２の塩基の存在下、第２の有機溶媒中で、該エチル−Ｎ−（６−フルオロ−２−メトキシキノキサリン−３−イル）カーボネートを１−（３，５−ジメトキシフェニル）ピペラジン塩酸塩と反応させるステップと
を含む方法。
【請求項１９】
（ｅ）塩基の存在下、有機溶媒中で３−アミノ−２−クロロ−６−フルオロキノキサリンをナトリウムメトキシドと反応させて、混合物を形成するステップと、
（ｆ）水をステップ（ｅ）の該混合物に添加して、溶液を形成するステップと、
（ｇ）該溶液を約１５〜２０℃の温度に冷却して、懸濁液を形成するステップと、
（ｈ）ステップ（ｇ）の該懸濁液を濾過して、３−アミノ−６−フルオロ−２−メトキシキノキサリンを単離するステップと
をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ａ）において、前記有機溶媒がジクロロメタンであり、前記塩基がピリジンである、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記蒸留するステップ（ｂ）が大気圧下で行われる、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｃ）が真空濾過を含む、請求項１８から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ｄ）において、前記第２の有機溶媒がテトラヒドロフランであり、前記第２の塩基が１，８−ジアザビシクロウンデカ−７−エンである、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ステップが、１つまたは複数の固定された反応器内で実施される、請求項１８から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
懸濁液を得るのに十分な条件下で、前記式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩の粒径を減少させるステップをさらに含む、請求項１８から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記懸濁液がミリングプロセスにより作製される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ミリングプロセスが高エネルギーアジテータでのミリングまたはローラーミリングである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ミリングプロセスが高エネルギーアジテータでのミリングである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記懸濁液が、約２００ｎｍまたはそれ未満のＤ５０粒径を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
粉末を形成するために前記懸濁液を噴霧乾燥または凍結乾燥させるステップをさらに含む、請求項２５から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１８から３０のいずれか一項に記載の方法により調製された生成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．優先権
本願は、２０１５年９月４日に出願された米国仮出願第６２／２１４，６７８号、および２０１６年２月１日に出願された米国仮出願第６２／２８９，８２０号の優先権を主張し、これらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の概要
以下の概要は例示的目的のために提示されており、特許請求された主題の範囲を限定するために機能しないものとする。
【０００３】
その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第８，３１４，１００号（２０１２年１１月２０日発行）は、他の箇所では、ＲＸ−５９０２、４−（３，５−ジメトキシフェニル）−Ｎ−（７−フルオロ−３−メトキシキノキサリン−２−イル）ピペラジン−１−カルボキサミド、１−［（６−フルオロ−２−メトキシキノキサリン−３−イル）アミノカルボニル］−４−（３，５−ジメトキシフェニル）ピペラジン、および１−（３，５−ジメトキシフェニル）−４−［（６−フルオロ−２−メトキシキノキサリン−３−イル）アミノカルボニル］ピペラジンとも呼ばれている、式（Ｉ）の化合物
【化１】
2018526392.tif 000003
を開示している。
【０００４】
ＲＸ−５９０２の他の態様は、米国特許第８，５９８，１７３号（２０１３年１２月３日発行）および米国公開出願第２０１５／０００４２３４号（２０１５年１月１日公開）に記載されており、両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第８，３１４，１００号明細書
【特許文献２】米国特許第８，５９８，１７３号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１５／０００４２３４号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示の一態様は、腫瘍を処置することを必要とする被験体に式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩を含む固体経口剤形を投与することにより腫瘍を処置する方法であって、この固体経口剤形が、単回投与後、約８００〜１５，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する方法を提供する。一実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約２，５００〜９，３００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。一実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約２，５００〜９，５００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。一実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約２００〜１，２００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘを提供することができる。
【０００７】
本開示の別の態様は、腫瘍を処置することを必要とする被験体に、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩を含む固体経口剤形を、約１００〜１，２００ｍｇ／日の投与量で、週あたり１〜７日、最大約２，８００ｍｇ／週まで投与することによって、腫瘍を処置する方法を提供する。一実施形態では、投与量は、約１５０〜４００ｍｇ／日を週あたり３〜７日であってよい。一実施形態では、投与量は、約１５０〜４００ｍｇ／日を週あたり５〜７日であってよい。一実施形態では、固体経口剤形は錠剤またはカプセル剤であってよい。
【０００８】
任意の実施形態では、被験体はヒトであってよい。任意の実施形態では、腫瘍は、皮膚がん、結腸直腸がん、卵巣がん、肺がん、乳がん、膵臓がん、胃がんおよび腎臓がんから選択し得る。実施形態では、腫瘍はトリプルネガティブ（ＴＮ）乳がんであってよい。実施形態では、腫瘍は、白金耐性または不応性卵巣がんであってよい。
【０００９】
本開示の別の態様、腫瘍を処置する方法は、照射または抗腫瘍剤を被験体に投与するステップをさらに含む。本開示の別の態様では、腫瘍を処置する方法は、被験体に代謝拮抗剤、ＤＮＡ断片化剤、ＤＮＡ架橋剤、挿入剤、タンパク質合成阻害剤、トポイソメラーゼＩ毒素、トポイソメラーゼＩＩ毒素、微小管標的剤（microtubule-directed  agent）、キナーゼ阻害剤、ポリフェノール、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、デスレセプターアゴニスト、免疫チェックポイント阻害剤、抗プログラム細胞死１（ＰＤ−１）受容体抗体および抗プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）抗体から選択される抗腫瘍剤を投与するステップをさらに含む。一実施形態では、本方法は、被験体にＰＤ−Ｌ１抗体またはＰＤ−１抗体を投与するステップを含む。
【００１０】
本開示の別の態様は、腫瘍を処置することを必要とする被験体において腫瘍を処置する方法であって、（ａ）被験体がＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ３Ａ５阻害剤または誘導剤で処置を受けているか決定するステップと、（ｂ）被験体がＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ３Ａ５阻害剤または誘導剤で処置を受けていない場合、被験体に式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩の有効量を投与するステップとを含む方法を提供する。実施形態では、本方法は、（ｃ）有害事象について被験体をモニタリングするステップをさらに含む。
【００１１】
本開示の別の態様は、Ｙ５９３リン酸化ｐ６８のβ−カテニン依存性ＡＴＰａｓｅ活性を阻害する方法であって、それを必要とする被験体に式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩の有効量を投与することによって、阻害する方法を提供する。
【００１２】
本開示の別の態様は、腫瘍の処置における式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩の潜在的効力を試験するためのキットであって、腫瘍がＹ５９３リン酸化ｐ６８を発現するかどうか決定するアッセイを含むキットを提供する。
【００１３】
本開示の別の態様は、（ａ）被験体から腫瘍の試料を採取するステップと、（ｂ）腫瘍がＹ５９３リン酸化ｐ６８を発現するかどうか決定するステップと、（ｃ）腫瘍がＹ５９３リン酸化ｐ６８を発現する場合、被験体に式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩の有効量を投与するステップとによって、腫瘍を処置することを必要とする被験体において腫瘍を処置する方法を提供する。
【００１４】
本開示の別の態様は、例えば、１つまたは複数の固定された反応器内で、４−（３，５−ジメトキシフェニル）−Ｎ−（７−フルオロ−３−メトキシキノキサリン−２−イル）ピペラジン−１−カルボキサミド（ＲＸ−５９０２）を商業規模で調製するための方法を提供する。実施形態では、商業規模でのＲＸ−５９０２の調製は、塩基の存在下、有機溶媒中で、３−アミノ−６−フルオロ−２−メトキシキノキサリンを、クロロギ酸エチルと反応させて、混合物を形成するステップと、酢酸エチルを添加しながら混合物を蒸留させて、懸濁液を形成するステップと、懸濁液を濾過して、エチル−Ｎ−（６−フルオロ−２−メトキシキノキサリン−３−イル）カーボネートを単離するステップと、第２の塩基の存在下、第２の有機溶媒中で、エチル−Ｎ−（６−フルオロ−２−メトキシキノキサリン−３−イル）カーボネートを、１−（３，５−ジメトキシフェニル）ピペラジン塩酸塩と反応させるステップとを含むことができる。実施形態では、商業規模の生産は、塩基の存在下、有機溶媒中で、３−アミノ−２−クロロ−６−フルオロキノキサリンをナトリウムメトキシドと反応させて、混合物を形成するステップと、水を混合物に添加して、溶液を形成するステップと、溶液を約１５〜２０℃の温度に冷却して懸濁液を形成するステップと、懸濁液を濾過して、３−アミノ−６−フルオロ−２−メトキシキノキサリンを単離するステップとをさらに含むことができる。実施形態では、有機溶媒の１種または複数はジクロロメタンであってよい。実施形態では、塩基はピリジンであってよい。実施形態では、蒸留するステップの１つまたは複数は大気圧下で行うことができる。実施形態では、濾過は真空濾過によるものであってよい。実施形態では、第２の有機溶媒はテトラヒドロフランであってよい。実施形態では、第２の塩基は１，８−ジアザビシクロウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）であってよい。
【００１５】
ＲＸ−５９０２の改善された経口バイオアベイラビリティーを提供する新規ナノ製剤もまた発見された。本発明は、式（Ｉ）の化合物およびそのナノ製剤の新規の使用および使用方法を対象とする。本発明はまた、不純物を減少させ、とりわけ、最終生成物の蒸留および濾過を使用して溶媒を除去することにより、製造のコストを有意に減少させる改善されたプロセスを提供する。本発明はまた、ＲＸ−５９０２の改善されたバイオアベイラビリティーのための新規ナノ製剤を提供する。加えて、本発明は、被験体において、式（Ｉ）の化合物およびそのナノ製剤を使用するための投与量および曝露レベルを提供する。本開示の別の態様は、懸濁液を得るのに十分な条件下で式（１）の化合物または薬学的に許容されるその塩の粒子の混合物を調製するための方法を提供する。一実施形態では、懸濁液はミリングプロセスにより作製することができる。一実施形態では、ミリングプロセスは、高エネルギーアジテータでのミリング（high-energy  agitator  milling）またはローラーミリングであってよい。一実施形態では、ミリングプロセスは高エネルギーアジテータでのミリングである。一実施形態では、懸濁液は、約２００ｎｍまたはそれ未満のＤ５０粒径を有し得る。
【００１６】
本方法の実施形態は、散剤を形成するために懸濁液を噴霧乾燥させることを含むことができる。
【００１７】
本開示の態様は、本明細書中に記載されているプロセスによりＲＸ−５９０２を作製する方法により調製された生成物を提供する。
３．図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、絶食条件下で、様々な用量でのＲＸ−５９０２を単回経口投与した後の、進行性または転移性固形腫瘍を有する被験体におけるＲＸ−５９０２の血漿中濃度を示すグラフである。
【００１９】
【図２】図２は、５０ｍｇ／ｋｇおよび７０ｍｇ／ｋｇでＲＸ−５９０２を週に５日経口投与した後の、ヒト腎臓腫瘍（Ｃａｋｉ−１）異種移植片を有するマウスにおける平均腫瘍体積を示すグラフである。
【００２０】
【図３】図３は、スニチニブを毎日６０ｍｇ／ｋｇ、２１日間ならびにＲＸ−５９０２を週１回２０、４０、８０および１６０ｍｇ／ｋｇ、４週間経口投与した後の、ヒト腎臓腫瘍（Ｃａｋｉ−１）異種移植片を有するマウスにおける平均腫瘍体積を示すグラフである。
【００２１】
【図４】図４は、ＲＸ−５９０２のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞との相互作用を示す、特に、プロテアーゼ切断から保護されている、６０ｋＤａ周辺で移動度を有するバンドを示すウェスタンブロットである。
【００２２】
【図５】図５は、図４の保護されたバンドがｐ６８  ＲＮＡヘリカーゼに対する抗体により認識されたことを示すウェスタンブロットである。
【００２３】
【図６】図６は、ｐ６８がチロシン残基上でリン酸化したことを裏付けるウェスタンブロットである。
【００２４】
【図７】図７は、フィルター結合アッセイにおいて３Ｈ標識したＲＸ−５９０２に結合しているホスホ−ｐ６８および非リン酸化ｐ６８のパーセンテージを示すグラフである。Ｋｄは、ＲＸ−５９０２に結合しているｐ６８の５０％により予測される。
【００２５】
【図８】図８は、０〜２０μＭのＲＸ−５９０２および２μｇ酵母から抽出した全ＲＮＡの存在下でのｐ６８のＲＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅ活性を示す棒グラフである。
【００２６】
【図９】図９は、０〜２０μＭのＲＸ−５９０２および１μｇのβ−カテニンの存在下でのｐ６８のβ−カテニン依存性ＡＴＰａｓｅ活性を示す棒グラフである。
【００２７】
【図１０】図１０は、ホスホ−ｐ６８のβ−カテニン依存性ＡＴＰａｓｅ活性の阻害に対するＲＸ−５９０２のＩＣ５０決定を示すグラフである。ＩＣ５０は６１±７．１ｎＭであると決定された。
【００２８】
【図１１】図１１は、ＲＸ−５９０２によるサイクリンＤ１、ｃ−Ｍｙｃ、およびｐ−ｃ−Ｊｕｎの発現の抑制を示すウェスタンブロットである。
【００２９】
【図１２】図１２は、５ｍｇ／ｋｇで週２回３週間静脈内投与したＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）と比較して、ＲＸ−５９０２、１６０ｍｇ／ｋｇ、３２０ｍｇ／ｋｇ、および６００ｍｇ／ｋｇを週１回３週間経口投与した後の、ヒト乳がん（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）異種移植片を有するマウスの平均腫瘍体積を示すグラフである。
【００３０】
【図１３】図１３は、５ｍｇ／ｋｇで週２回３週間静脈内投与したＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）と比較して、ＲＸ−５９０２、１６０ｍｇ／ｋｇ、３２０ｍｇ／ｋｇ、および６００ｍｇ／ｋｇを週１回３週間経口投与した後の、ヒト乳がん（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）異種移植片を有するマウスにおけるカプラン−マイヤー生存曲線を示すグラフである。これらのデータは、図１２に示されているものと同じ実験からのものである。
【００３１】
【図１４】図１４は、アジテータでミリングしたナノ懸濁液の粒径分布を示すグラフである。
【００３２】
【図１５】図１５は、抽出したＲＸ−５９０２ナノ粒子のＤＳＣである。
【００３３】
【図１６】図１６は、噴霧乾燥したＲＸ−５９０２ナノ懸濁液の粒径分布である。
【００３４】
【図１７】図１７は、噴霧乾燥したＲＸ−５９０２（１０００×の倍率、普通光）を示している。
【００３５】
【図１８】図１８は、噴霧乾燥したＲＸ−５９０２（１０００×の倍率、偏光）を示している。
【００３６】
【図１９】図１９は、ＲＸ−５９０２の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示している。
【００３７】
【図２０】図２０は、ＲＲＴ  ０．９７５不純物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示している。
【００３８】
【図２１】図２１は、ＲＲＴ  ０．９７５不純物（上側）およびＲＸ−５９０２（下側）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの重ね合わせを示している。
【００３９】
【図２２】図２２は、ＲＲＴ  ０．９７５不純物（上側プロット）およびＲＸ−５９０２（下側プロット）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの７．０〜８．０ｐｐｍ領域の重ね合わせを示している。
【００４０】
【図２３】図２３は、１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルＲＸ−５９０２を示している。
【００４１】
【図２４】図２４は、ＲＲＴ  ０．９７５不純物の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示している。
【００４２】
【図２５】図２５は、ＲＸ−５９０２（上側プロット）およびＲＲＴ  ０．９７５不純物（下側プロット）の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルの重ね合わせを示している。
【００４３】
【図２６】図２６は、ＲＸ−５９０２（上側プロット）およびＲＲＴ  ０．９７５不純物（下側プロット）の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルの１０８〜１５０ｐｐｍ領域を示している。
【００４４】
【図２７】図２７は、ＲＸ−５９０２の１９Ｆ  ＮＭＲスペクトルを示している。
【００４５】
【図２８】図２８は、ＲＲＴ  ０．９７５不純物の１９Ｆ  ＮＭＲスペクトルを示している。
【００４６】
【図２９】図２９は、ＲＸ−５９０２（実線）およびＲＲＴ  ０．９７５不純物（破線）のＵＶ−Ｖｉｓ吸光度データを示している。
【００４７】
【図３０】図３０は、主要ＲＸ−５９０２生成物に対応する１７．９分ピークの液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を示している。
【００４８】
【図３１】図３１は、ＲＲＴ  ０．９７５不純物に対応する１７．２分ピークのＬＣ−ＭＳを示している。
【００４９】
【図３２】図３２は、４６４という正確な［Ｍ＋Ｎａ］＋質量を有するＲＸ−５９０２およびＲＲＴ  ０．９７５不純物を示している。
【００５０】
【図３３】図３３は、結晶性ＲＸ−５９０２ナノ製剤のＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）である。
【００５１】
【図３４】図３４は、ＲＸ−５９０２  ＡＰＩの詳述されたＸＲＰＤパターンである。
【００５２】
【図３５】図３５Ａおよび３５Ｂは、ＸＲＰＤデータ収集用に使用した結晶性バッチ（左）および結晶（右）の光学顕微鏡像である。
【００５３】
【図３６】図３６は、ＲＸ−５９０２ナノ製剤およびＲＸ−５９０２  ＡＰＩのＸＲＰＤパターンの重ね合わせを示している。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
４．  詳細な説明
本発明の実施形態が以下に詳細に論じられている。実施形態を記載するにあたり、明瞭さの目的のために特定の用語が利用されている。しかし、本発明は、このように選択された特定の用語に限定されることを意図していない。特定の例示的実施形態が論じられるが、これは例示目的のためだけに行われていることを理解すべきである。当業者であれば、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、他の構成成分および配置を使用することができることを認識している。
【００５５】
４．１  定義
別途示されていない限り、本明細書で使用される以下の用語は、以下に示された意味を有する。これらの意味は、当技術分野で理解されているようなこれらの用語の意味を変更するのではなく、補足することを意図している。
【００５６】
「Ｃｍａｘ」とは、観察された最大血漿中濃度を指す。
【００５７】
「Ｔｍａｘ」とは、Ｃｍａｘが達成される時間を指す。
【００５８】
「Ｔ１／２」とは、薬物の血漿中濃度が、その元の値の半分に到達するのに必要とされる時間を指す。「終末Ｔ１／２」とは、終末期におけるＴ１／２を指す。
【００５９】
「ＡＵＣ０〜ｔ」とは、時間ゼロから時間ｔ（式中、「ｔ」は、測定可能な濃度を有する最終サンプリング時点である）の血漿中濃度対時間曲線（ＡＵＣ）下面積を指す。例えば、ＡＵＣ０〜２４またはＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）は、時間ゼロ〜２４時間のＡＵＣを指すのに対して、ＡＵＣ０〜４８またはＡＵＣ０〜ｔ（０〜４８時間）は、時間ゼロ〜４８時間のＡＵＣを指す。
【００６０】
「経口剤形」とは、経口投与用に製剤化された医薬組成物を指す。経口剤形は、即時性、持続性、延長性、遅延性または制御性放出を提供するよう製剤化することができる。経口剤形の例として、錠剤、カプセル剤、顆粒およびゲルキャップが挙げられる。
【００６１】
「有効量」とは、その効力および毒性に対する可能性のパラメーターならびに当業者の知識に基づき、所望の作用、例えば、状態の処置または予防などをもたらす化合物または医薬組成物の量を指す。有効量は、１つまたは複数の用量で投与することができる。
【００６２】
「接触させること」とは、アポトーシスを誘発するまたはタンパク質キナーゼをモジュレートするなどの所望の作用をもたらすために、直接的または間接的に、化合物および細胞を十分に近接させることを指す。接触させることは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。例えば、細胞を化合物と接触させることは、ミクロインジェクションなどの公知の技術を使用して化合物を直接細胞に送達すること、化合物を、細胞を有する被験体に投与すること、または化合物を含む培地内で細胞をインキュベートすることを含み得る。
【００６３】
「処置する」とは、臨床結果などの有益なまたは所望の結果を達成することを指す。一部の実施形態では、有益なまたは所望の結果は、以下のうちのいずれか１つまたは複数である：状態の発症または発生を阻害または抑制すること、状態の重症度を減少させること、状態に関連する症状の数または重症度を減少させること、状態を患っている被験体の生活の質を高めること、状態を処置するのに必要とされる別の薬物の用量を低減させること、状態に対して被験体が服用している別の薬物の作用を促進すること、および状態を有する被験体の生存を長引かせること。
【００６４】
「予防する」とは、被験体が有してはいないが、発症のリスクがある状態を被験体が発症する確率を減少させることを指す。「リスクがある」とは、被験体が１つまたは複数のリスクファクターを有することを表し、リスクファクターとは、状態の発症と相関し、当技術分野で公知である測定可能なパラメーターである。リスクファクターの１つまたは複数を有する被験体は、このようなリスクファクターを有さない被験体よりも、状態を発症する高い確率を有する。
【００６５】
「被験体」とは、これに限定されないが、ヒトを含めた、哺乳動物などの動物を指す。したがって、本明細書で開示されている方法は、ヒトの治療および獣医学的用途において有用であり得る。一実施形態では、被験体は哺乳動物である。別の実施形態では、被験体はヒトである。
【００６６】
「絶食した」とは、処置前の少なくとも８時間にわたり絶食した被験体を指す。
【００６７】
「ＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ３Ａ５阻害剤または誘導剤」とは、チトクロムＰ４５０  ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）またはＰ４５０  ３Ａ５（ＣＹＰ３Ａ５）酵素に対する基質の血漿ＡＵＣ値をそれぞれ少なくとも約３０パーセント増加または低減する薬剤を指す。ＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ３Ａ５阻害剤または誘導剤の例として、アンプレナビル、アプレピタント、アタザナビル、バルビツレート、ボセプレビル、ボセンタン、カルバマゼピン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、コビシスタット、コニバプタン、ダルナビル、ジルチアゼム、エファビレンツ、エルビテグラビル、エリスロマイシン、エトラビリン、フルコナゾール、ホスアンプレナビル、グレープフルーツジュース、イマチニブ、インジナビル、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ロピナビル、ミベフラジル、モダフィニル、ナフシリン、ネファゾドン、ネルフィナビル、フェニトイン、ポサコナゾール、リファンピン、リトナビル、サキナビル、セントジョーンズワート、テラプレビル、テリスロマイシン、テノホビル、チプラナビル、ベラパミルおよびボリコナゾールが挙げられる。
【００６８】
「有害事象」とは、化合物または医薬組成物の使用に関連する任意の望ましくない作用を指す。有害事象は、米国立がん研究所有害事象共通用語規準（ＮＣＩ−ＣＴＣＡＥ）バージョン４．０３に従い評価および等級分けすることができる。有害事象の例として、発熱性好中球減少症、貧血、血小板減少症、臨床的出血に関連する凝固異常、下痢、疲労、悪心および嘔吐が挙げられる。
【００６９】
「感作する」とは、アポトーシスシグナルに対する細胞の感受性を増加させる、またはアポトーシスシグナルへの応答における細胞の耐性を減少させることを指す。
【００７０】
処置または投与を「修正する」とは、活性剤の用量を減少もしくは増加すること、活性剤を被験体に投与するのを中止すること、または活性剤を異なる活性剤と置換することを指す。
【００７１】
「阻害」とは、薬剤の不在下での発現レベルまたは活性と比べて、薬剤（例えば、式（Ｉ）の化合物など）の存在下での発現レベル（例えば、遺伝子などの）または活性（例えば、酵素などの）を低減することを指す。低減は、例えば、５％もしくはそれ超、１０％もしくはそれ超、２０％もしくはそれ超、２５％もしくはそれ超、３０％もしくはそれ超、４０％もしくはそれ超、５０％もしくはそれ超、６０％もしくはそれ超、７０％もしくはそれ超、７５％もしくはそれ超、８０％もしくはそれ超、９０％もしくはそれ超、または９５％もしくはそれ超であり得る。発現レベルまたは活性は、本明細書中に記載されているように、または当技術分野で一般的に公知の技術により測定することができる。
【００７２】
「腫瘍細胞」とは、腫瘍から誘導された細胞を指す。
【００７３】
「腫瘍」とは、良性であるかまたは悪性であるかに関わらず、組織または細胞の異常な増殖を指す。例として、前立腺、肺、脳、乳房、腎臓、肝臓、肺、腸、リンパ、筋肉、骨、骨髄、子宮、卵巣、膣、外陰部、膵臓、副腎、中枢神経系、末梢神経系、子宮頸部、膀胱、子宮内膜、喉、食道、喉頭、甲状腺、血液、腎臓（penal）、精巣、胸腺、皮膚、背骨、胃、胆管、小腸、肝胆道管、結腸直腸、結腸、直腸、肛門、内分泌性、眼、および胆嚢において見出される腫瘍が挙げられる。
【００７４】
「がん」とは悪性腫瘍を指す。がん細胞は、周辺組織に侵入することも、しないこともあり、したがって、新しい身体の部位に転移することもしないこともある。がんは、上皮細胞のがんである癌腫を包含し、癌腫として、扁平上皮癌、腺癌、黒色腫、および肝癌が挙げられる。がんはまた、間葉由来の腫瘍である肉腫を包含する。肉腫として、骨原性肉腫、白血病、およびリンパ腫が挙げられる。がんは、１種または複数の新生細胞型を含み得る。
【００７５】
「抗腫瘍剤」とは、腫瘍を処置または予防するのに有用な任意の薬剤を指す。抗腫瘍剤の例として、以下の医薬組成物に記載されている活性剤が挙げられる。実施形態では、ＲＸ−５９０２に加えて、抗腫瘍剤は、代謝拮抗剤、ＤＮＡ断片化剤、ＤＮＡ架橋剤、挿入剤、タンパク質合成阻害剤、トポイソメラーゼＩ毒素、トポイソメラーゼＩＩ毒素、微小管標的剤、キナーゼ阻害剤、ポリフェノール、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、デスレセプターアゴニスト、免疫チェックポイント阻害剤、抗プログラム細胞死１（ＰＤ−１）受容体抗体および抗プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）抗体から選択される。他の実施形態では、追加の抗腫瘍剤は、ＰＤ−１受容体抗体である。他の実施形態では、追加の抗腫瘍剤はペムブロリズマブである。他の実施形態では、追加の抗腫瘍剤はニボルマブである。他の実施形態では、追加の抗腫瘍剤はデュルバルマブ（duryalumab）である。他の実施形態では、追加の抗腫瘍剤はニボルマブとペムブロリズマブの組合せである。
【００７６】
「照射」とは、腫瘍を処置または予防するのに有用な任意の照射を指す。照射の例として、Ｘ線、ガンマ線、および荷電した粒子が挙げられる。照射は、任意の形態の放射線療法、例えば、外部ビーム放射線療法（ＥＢＲＴ、ＸＢＲＴまたは遠隔治療）、小線源療法（内部放射線療法または密封線源療法）、術中の放射線療法、または全身性放射線療法などにより送達され得る。
【００７７】
「Ｙ５９３リン酸化ｐ６８」または「Ｙ５９３ホスホ−ｐ６８」とは、チロシン５９３残基においてリン酸化したｐ６８  ＲＮＡヘリカーゼ（ＤＤＸ５）を指す。
【００７８】
「ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ５」または「ＤＥＡＤボックスタンパク質５」としても公知の「ｐ６８  ＲＮＡヘリカーゼ」とは、ヒトにおいてＤＤＸ５遺伝子によってコードされている酵素を指す。
【００７９】
「商業規模」とは、公共への販売および分布のためのその製造に対して適切である量で生成物を調製することを指す。商業規模は、生産される量が研究目的に対して適切である実験室またはベンチスケールと区別される。商業規模はまた、廃棄処分および浄化コストを最小限に抑えるために、危険物質の使用または廃棄物を最小限に抑える試薬および方法を使用することにおいて、実験室またはベンチスケール合成と区別される。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される商業規模の方法は、少なくとも約０．５ｋｇ、１．０ｋｇまたは１．５ｋｇの単一バッチ量を生産する。
【００８０】
「反応する」とは、適当な条件下（例えば、温度、圧力、ｐＨ、濃度）で２種またはそれ超の試薬を組み合わせて、所望の生成物を生成することを指す。所望の生成物は、必ずしも、２種またはそれ超の試薬の組合せから直接生成し得るわけではない。すなわち、所望の生成物の形成を最終的にもたらす１つまたは複数の中間体が生成され得る。
【００８１】
「蒸留」または「蒸留する」とは、化合物を、それらの異なる揮発度に基づき例えば蒸発またはその後の凝縮などによって分離することを指す。
【００８２】
「濾過」または「濾過する」とは、例えば、真空、重力または圧力などにより液体から固体を分離することを指す。「真空濾過」とは、液体混合物から固体を抽出するための技術を指し、この場合、真空吸引を適用して、ブフナー漏斗内の濾紙などのフィルターを介して混合物を引き出す。
【００８３】
「大気圧」とは、真空または封鎖されたチャンバー内での気圧とは対照的に、開放空気の気圧を指す。大気圧は典型的には約７６０Ｔｏｒｒであるが、これは、中でも製造施設の評価に応じて異なり得る。
【００８４】
「真空濾過」とは、液体混合物から固体を抽出するための技術を指し、この場合、真空吸引を適用して、ブフナー漏斗内の濾紙などのフィルターを介して混合物を引き出す。
【００８５】
「固定された反応器」とは、適当な場所に固定され、移動しない反応器を指す。
【００８６】
「粒径」とは、当技術分野で公知の任意の粒径測定技術により決定される、活性医薬成分（ＡＰＩ）、例えば、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩の粒子の寸法を指す。このような技術の非限定的例として、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｓｙｍｐａｔｅｃ、ＭｉｃｒｏｔａｃまたはＨｏｒｉｂａから入手可能なものなどの分析器を使用して実施される、レーザー回折、動的光散乱および画像分析が挙げられる。
【００８７】
「Ｄ１０」とは、累積分布における１０％の粒径を指し、粒子の１０％がＤ１０未満の粒径を有し、粒子の９０％がＤ１０超の粒径を有することを意味する。「Ｄ５０」とは、累積分布における５０％のメジアン粒径または粒径を指し、粒子の５０％がＤ５０未満の粒径を有し、粒子の５０％がＤ５０超の粒径を有することを意味する。「Ｄ９０」とは、累積分布における９０％のメジアン粒径または粒径を指し、粒子の９０％がＤ９０未満の粒径を有し、粒子の１０％がＤ９０超の粒径を有することを意味する。累積分布は、粒子の体積、質量、数または表面積に基づくことができる。特に明記しない限り、累積分布は粒子の体積に基づく。
【００８８】
「凍結乾燥」とは、生成物を凍結し、次いで周辺圧力を減少させて、生成物中の凍結した溶媒を、固相から気相へと直接昇華させることにより、フリーズドライプロセスを使用して、生成物から１種または複数の溶媒を実質的に除去することを指す。
【００８９】
「噴霧乾燥」とは、高温の気体を用いて急速に乾燥させることによって、液体またはスラリーから乾燥粉末を生成する方法を指す。
【００９０】
「〜などの」とは、「これらに限定されないが、〜などの」と同じ意味を有する。同様に、「挙げられる」は、「これらに限定されないが、〜が挙げられる」と同じ意味を有し、その一方で、「〜を含めて」とは、「これらに限定されないが、〜を含めて」と同じ意味を有する。
【００９１】
単数形「１つの（ａ）」、「または」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈において他に指示されていない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」への言及は、１つまたは複数の化合物および／またはその同等物を含み得る。
【００９２】
本明細書で開示されている任意の数値的範囲は、特に明記しない限り、上限および下限ならびにその間の各値を包含する。
【００９３】
実施例以外において、または他で示されていない限り、明細書および特許請求の範囲で使用されている数値（例えば、成分の量、反応条件を表現する数など）は、「約」という用語で修飾されている。したがって、特にそれとは反対の指示がない限り、このような数は、得ようとしている所望の特性に応じて異なってもよい近似値である。少なくとも、および特許請求の範囲に対する均等論の適用を限定する試みとしてではなく、各数値的パラメーターは、有効桁数および普通の四捨五入技術を考慮して解釈されるべきである。
【００９４】
開示された主題の範囲を示す数値的パラメーターは近似値であるが、実施例において示されている数値はできるだけ正確に報告されている。しかし、任意の数値は、そのそれぞれの試験測定において見出される標準偏差から必然的に生じるある特定の誤差を本来含有する。
【００９５】
他に定義されていない限り、本明細書で使用される技術的および科学的用語の意味は、開示された主題が属する技術分野の当業者によって共通して理解されるものである。
【００９６】
４．２  腫瘍を処置または予防する方法
本開示の一態様は、被験体が、少なくとも約８時間絶食した後で、腫瘍を処置または予防することを必要とする被験体に式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩の有効量を投与することにより腫瘍を処置または予防する方法を提供する。別の実施形態では、被験体は、投与後少なくとも約３時間継続して絶食する。
【００９７】
本開示の別の態様は、腫瘍を処置または予防することを必要とする被験体に式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩を含む固体経口剤形を投与することにより腫瘍を処置または予防する方法であって、固体経口剤形が、単回投与後、約８００〜１５，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する方法を提供する。
【００９８】
本開示の別の態様は、腫瘍を処置または予防することを必要とする被験体に式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩を含む固体経口剤形を投与するステップを含む、腫瘍を処置または予防する方法であって、固体経口剤形が、１週間にわたる週あたり１〜７日の投与後、約１，０００〜７０，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜１６８時間；すなわち、１週間）を提供する方法を提供する。
【００９９】
本開示の別の態様は、腫瘍を処置または予防することを必要とする被験体に式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩を含む固体経口剤形を、約１００〜１，２００ｍｇ／日の投与量で週あたり１〜７日、投与することにより、腫瘍を処置または予防する方法を提供する。実施形態では、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩は、約３，０００ｍｇ／週までの量で投与されてもよい。実施形態では、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩は、最大約２，８００ｍｇ／週までの量で投与されてもよい。一実施形態では、投与量は約１００〜５００ｍｇ／日を週あたり３〜７日である。別の実施形態では、投与量は約１００〜５００ｍｇ／日を週あたり５〜７日である。別の実施形態では、投与量は約１５０〜４００ｍｇ／日を週あたり３〜７日である。別の実施形態では、投与量は約１５０〜４００ｍｇ／日を週５〜７日である。
【０１００】
本開示の別の態様は、（ａ）被験体が、ＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ３Ａ５阻害剤または誘導剤で処置を受けているか決定するステップ、および（ｂ）被験体がＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ３Ａ５阻害剤または誘導剤での処置を受けていない場合、被験体に式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩の有効量を投与するステップにより、腫瘍を処置または予防することを必要とする被験体において腫瘍を処置または予防する方法を提供する。一実施形態では、被験体はＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ３Ａ５阻害剤での処置を受けている。別の実施形態では、被験体はＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ３Ａ５誘導剤での処置を受けている。
【０１０１】
本開示の別の態様は、（ａ）被験体がＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ３Ａ５阻害剤または誘導剤で処置を受けているか決定するステップ、（ｂ）被験体がＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ３Ａ５阻害剤または誘導剤での処置を受けている場合、被験体に式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩の有効量を投与するステップ、および（ｃ）有害事象について被験体をモニタリングするステップにより、腫瘍を処置または予防することを必要とする被験体において腫瘍を処置または予防する方法を提供する。別の実施形態では、本方法は、有害事象が検出された場合、ＣＹＰ３Ａ４もしくはＣＹＰ３Ａ５阻害剤もしくは誘導剤での処置、または式（Ｉ）の化合物もしくは薬学的に許容されるその塩の投与を修正するステップをさらに含む。一実施形態では、被験体はＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ３Ａ５阻害剤での処置を受けている。別の実施形態では、被験体はＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ３Ａ５誘導剤での処置を受けている。
【０１０２】
処置を修正することは、例えば、ＣＹＰ３Ａ４もしくはＣＹＰ３Ａ５阻害剤もしくは誘導剤の用量を減少もしくは増加させる、またはＲＸ−５９０２の用量を減少もしくは増加させることを含み得る。一部の実施形態では、修正することは、以下のうちの１つまたは複数を含む：被験体がＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ３Ａ５阻害剤での処置を受けている場合、ＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ３Ａ５阻害剤の用量を減少させること、ＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ３Ａ５誘導剤の用量を増加させること、ＲＸ−５９０２の用量を増加させること、および被験体がＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ３Ａ５誘導剤での処置を受けている場合、ＲＸ−５９０２の投与量を低減させること。
【０１０３】
一実施形態では、ＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ３Ａ５阻害剤または誘導剤はバルビツレート、ボセンタン、カルバマゼピン、エファビレンツ、エトラビリン、モダフィニル、ナフシリン、フェニトイン、リファンピン、セントジョーンズワート、グルココルチコイド、ネビラピン、オキシカルバゼピン、フェノバルビタール、ピオグリタゾン、リファブチン、トログリタゾンおよびグレープフルーツジュースである。別の実施形態では、ＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ３Ａ５阻害剤または誘導剤はグレープフルーツジュースである。別の実施形態では、ＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ３Ａ５阻害剤または誘導剤はセントジョーンズワートである。
【０１０４】
本開示の別の態様は、
（ａ）被験体から腫瘍の試料を採取するステップと、
（ｂ）腫瘍がＹ５９３リン酸化ｐ６８を発現するかどうか決定するステップと、
（ｃ）腫瘍がＹ５９３リン酸化ｐ６８を発現する場合、被験体に式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩の有効量を投与するステップと
により、腫瘍を処置することを必要とする被験体において腫瘍を処置する方法を提供する。
【０１０５】
本明細書で開示されている方法の追加の実施形態は以下に記載されている。
【０１０６】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩は、週あたり５〜７日投与される。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩は、週あたり５〜７日、４週連続して、または３週連続して投与され、これに続いて、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩が投与されない１週間の休みがある。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩は、１２回までの投薬サイクルの間投与され、各投薬サイクルは、３週間連続した処置、これに続く休み１週間、または４週間連続した処置のいずれかからなる。
【０１０７】
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩は、固体経口剤形として製剤化される。別の実施形態では、固体経口剤形は錠剤である。別の実施形態では、固体経口剤形はカプセル剤である。別の実施形態では、経口固体剤形は、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩のナノ粒子を含む錠剤またはカプセル剤である。
【０１０８】
別の実施形態では、固体経口剤形、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩は、被験体が少なくとも約８時間絶食した後で投与される。別の実施形態では、被験体は、投与後、少なくとも約３時間絶食する。別の実施形態では、固体経口剤形、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩は食物と共に投与される。
【０１０９】
別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約１〜６時間のＴｍａｘを提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約２〜６時間のＴｍａｘを提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約２時間のＴｍａｘを提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約３時間のＴｍａｘを提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約４時間のＴｍａｘを提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約５時間のＴｍａｘを提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約６時間のＴｍａｘを提供する。
【０１１０】
別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約９０〜１，２００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘを提供する。一実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約２００〜１２００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘを提供し得る。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約２００〜８００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘを提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約３００〜７００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘを提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約２００〜３００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘを提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約３００〜４００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘを提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約４００〜５００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘを提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約５００〜６００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘを提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約６００〜７００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘを提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約７００〜８００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘを提供する。
【０１１１】
別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約８００〜１５，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約２，０００〜１５，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約２，０００〜８，５００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約２，０００〜１０，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。一実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約２，５００〜９，５００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。一実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約２，５００〜９，３００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約３，０００〜７，５００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約３，５００〜７，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約３，０００〜５，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約４，０００〜６，５００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約４，５００〜６，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約２，０００〜３，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約３，０００〜４，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約４，０００〜５，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約５，０００〜６，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約６，０００〜７，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約７，０００〜８，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約８，０００〜９，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約９，０００〜１０，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約１０，０００〜１１，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約１１，０００〜１２，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約１２，０００〜１３，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約１３，０００〜１４，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約１５，０００〜１６，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約４，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約４，５００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約５，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約５，５００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約６，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約６，５００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約９０〜１１００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘおよび約８００〜１５，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約２００〜１，２００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘおよび約２，５００〜９，５００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約２００〜１，２００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘおよび約２，５００〜９，３００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約２００〜８００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘおよび約２，０００〜１５，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では，固体経口剤形は、単回投与後、約２００〜３００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘおよび約２，０００〜４，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約３００〜４００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘおよび約４，０００〜７，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約４００〜５００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘおよび約５，０００〜６，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約６００〜７００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘおよび約１４，０００〜１５，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、単回投与後、約７００〜８００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘおよび約１０，０００〜１１，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜２４時間）を提供する。
【０１１２】
別の実施形態では、固体経口剤形は、１週間にわたる週あたり１〜７日の投与後、約１，０００〜７０，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜１６８時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、１週間にわたる週あたり３〜７日の投与後、約１０，０００〜７０，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜１６８時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、１週間にわたる週あたり３〜７日の投与後、約２０，０００〜６０，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜１６８時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、１週間にわたる週あたり５〜７日の投与後、約２０，０００〜７０，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜１６８時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、１週間にわたる週あたり５〜７日の投与後、約３０，０００〜６０，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜１６８時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、１週間にわたる週１日の投与後、約４，０００〜１０，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜１６８時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、１週間にわたる週１日の投与後、約６，０００〜８，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜１６８時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、１週間にわたる週１日の投与後、約６，５００〜７，５００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜１６８時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、１週間にわたる週１日の投与後、約７，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜１６８時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、１週間にわたる週３日の投与後、約１０，０００〜３５，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜１６８時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、１週間にわたる週３日の投与後、約１５，０００〜３０，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜１６８時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、１週間にわたる週３日の投与後、約２０，０００〜２５，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜１６８時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、１週間にわたる週５日の投与後、約２０，０００〜６０，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜１６８時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、１週間にわたる週５日の投与後、約２５，０００〜５５，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜１６８時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、１週間にわたる週５日の投与後、約３０，０００〜５０，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜１６８時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、１週間にわたる週７日の投与後、約３０，０００〜７５，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜１６８時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、１週間にわたる週７日の投与後、約３５，０００〜７０，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜１６８時間）を提供する。別の実施形態では、固体経口剤形は、１週間にわたる週７日の投与後、約４０，０００〜６５，０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬのＡＵＣ０〜ｔ（０〜１６８時間）を提供する。
【０１１３】
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩は、約１００〜１，２００ｍｇ／日を週あたり１〜７日、約３，０００ｍｇ／週までの投与量で投与される。別の実施形態では、投与量は約１００〜１，２００ｍｇ／日を週あたり１〜７日、最大約２，８００ｍｇ／週までである。別の実施形態では、投与量は約１００〜１，２００ｍｇ／日を週あたり１〜７日、約２，０００ｍｇ／週までである。別の実施形態では、投与量は約１００〜６００ｍｇ／日を週あたり１〜７日である。別の実施形態では、投与量は約１００〜６００ｍｇ／日を週あたり３〜７日である。別の実施形態では、投与量は約１００〜６００ｍｇ／日を週あたり５〜７日である。別の実施形態では、投与量は約１００〜６００ｍｇ／日を週３日である。別の実施形態では、投与量は約１００〜６００ｍｇ／日を週４日である。別の実施形態では、投与量は約１００〜６００ｍｇ／日を週５日である。別の実施形態では、投与量は約１００〜６００ｍｇ／日を週６日である。別の実施形態では、投与量は約１００〜６００ｍｇ／日を週７日である。
【０１１４】
別の実施形態では、投与量は約２００〜５００ｍｇ／日を週あたり１〜７日である。別の実施形態では、投与量は約２００〜５００ｍｇ／日を週あたり３〜７日である。別の実施形態では、投与量は約２００〜５００ｍｇ／日を週あたり５〜７日である。別の実施形態では、投与量は約２００〜５００ｍｇ／日を週３日である。別の実施形態では、投与量は約２００〜５００ｍｇ／日を週４日である。別の実施形態では、投与量は約２００〜５００ｍｇ／日を週５日である。別の実施形態では、投与量は約２００〜５００ｍｇ／日を週６日である。別の実施形態では、投与量は約２００〜５００ｍｇ／日を週７日である。
【０１１５】
別の実施形態では、投与量は約１５０〜４００ｍｇ／日を週あたり１〜７日である。別の実施形態では、投与量は約１５０〜４００ｍｇ／日を週あたり３〜７日である。別の実施形態では、投与量は約１５０〜４００ｍｇ／日を週あたり５〜７日である。別の実施形態では、投与量は約１５０〜４００ｍｇ／日を週３日である。別の実施形態では、投与量は約１５０〜４００ｍｇ／日を週４日である。別の実施形態では、投与量は約１５０〜４００ｍｇ／日を週５日である。別の実施形態では、投与量は約１５０〜４００ｍｇ／日を週６日である。別の実施形態では、投与量は約１５０〜４００ｍｇ／日を週７日である。
【０１１６】
別の実施形態では、投与量は約２００ｍｇ／日を週あたり１〜７日である。別の実施形態では、投与量は約２００ｍｇ／日を週あたり３〜７日である。別の実施形態では、投与量は約２００ｍｇ／日を週あたり５〜７日である。別の実施形態では、投与量は約２００ｍｇ／日を週３日である。別の実施形態では、投与量は約２００ｍｇ／日を週４日である。別の実施形態では、投与量は約２００ｍｇ／日を週５日である。別の実施形態では、投与量は約２００ｍｇ／日を週６日である。別の実施形態では、投与量は約２００ｍｇ／日を週７日である。
【０１１７】
別の実施形態では、投与量は約２５０ｍｇ／日を週あたり１〜７日である。別の実施形態では、投与量は約２５０ｍｇ／日を週あたり３〜７日である。別の実施形態では、投与量は約２５０ｍｇ／日を週あたり５〜７日である。別の実施形態では、投与量は約２５０ｍｇ／日を週３日である。別の実施形態では、投与量は約２５０ｍｇ／日を週４日である。別の実施形態では、投与量は約２５０ｍｇ／日を週５日である。別の実施形態では、投与量は約２５０ｍｇ／日を週６日である。別の実施形態では、投与量は約２５０ｍｇ／日を週７日である。
【０１１８】
別の実施形態では、投与量は約３００ｍｇ／日を週あたり１〜７日である。別の実施形態では、投与量は約３００ｍｇ／日を週あたり３〜７日である。別の実施形態では、投与量は約３００ｍｇ／日を週あたり５〜７日である。別の実施形態では、投与量は約３００ｍｇ／日を週３日である。別の実施形態では、投与量は約３００ｍｇ／日を週４日である。別の実施形態では、投与量は約３００ｍｇ／日を週５日である。別の実施形態では、投与量は約３００ｍｇ／日を週６日である。別の実施形態では、投与量は約３００ｍｇ／日を週７日である。
【０１１９】
別の実施形態では、投与量は約３５０ｍｇ／日を週あたり１〜７日である。別の実施形態では、投与量は約３５０ｍｇ／日を週あたり３〜７日である。別の実施形態では、投与量は約３５０ｍｇ／日を週あたり５〜７日である。別の実施形態では、投与量は約３５０ｍｇ／日を週３日である。別の実施形態では、投与量は約３５０ｍｇ／日を週４日である。別の実施形態では、投与量は約３５０ｍｇ／日を週５日である。別の実施形態では、投与量は約３５０ｍｇ／日を週６日である。別の実施形態では、投与量は約３５０ｍｇ／日を週７日である。
【０１２０】
別の実施形態では、投与量は約４００ｍｇ／日を週あたり１〜７日である。別の実施形態では、投与量は約４００ｍｇ／日を週あたり３〜７日である。別の実施形態では、投与量は約４００ｍｇ／日を週あたり５〜７日である。別の実施形態では、投与量は約４００ｍｇ／日を週３日である。別の実施形態では、投与量は約４００ｍｇ／日を週４日である。別の実施形態では、投与量は約４００ｍｇ／日を週５日である。別の実施形態では、投与量は約４００ｍｇ／日を週６日である。別の実施形態では、投与量は約４００ｍｇ／日を週７日である。
【０１２１】
１日投与量は、体重または体質量約６０〜８０ｋｇを有する成人ヒトに基づく。したがって、約１００〜１，２００ｍｇ／日の範囲に対して、投与量は、約１〜２０ｍｇ／ｋｇ／日から約５０ｍｇ／ｋｇ／週までの範囲であり得る。被験体の体重に基づく追加の投与量は、これらの値から容易に計算し得る。同様に、当業者であれば、ヒト投与量に対する公知の相関関係に基づき、他の種に対する投与量を計算することができる。
【０１２２】
総１日用量は、１つまたは複数の用量で投与することができる。一実施形態では、経口剤形は１日１回投与される。別の実施形態では、経口剤形は、１日２回投与される。別の実施形態では、経口剤形は１日３回投与される。別の実施形態では、経口剤形は１日４回投与される。
【０１２３】
実施形態では、経口剤形は約１２，０００ｍｇ／月までの投与量で投与される。毎月の総用量は、週あたり１〜７日を３週間、これに続いて１週間の休み、または休みなしで４週間投与することができる。処置の各週に対して、経口剤形は週あたり１〜７日投与されてもよい。一実施形態では、経口剤形は、３週間投与され、これに続いて１週間の休みがある。別の実施形態では、経口剤形は、週あたり３〜７日３週間投与され、これに続いて１週間の休みがある。別の実施形態では、経口剤形は、週あたり５〜７日３週間投与され、これに続いて１週間の休みがある。別の実施形態では、経口剤形は、毎日３週間投与され、これに続いて１週間の休みがある。別の実施形態では、経口剤形は、毎日２８日間投与される。各投薬サイクルは、３週間の処置、これに続く１週間の休み、または４週連続した処置のいずれかからなる。投薬サイクルは、当業者により決定された通りに、必要な頻度で繰り返すことができる。一実施形態では、経口剤形は１２投薬サイクルまでにわたって投与される。一実施形態では、経口剤形は６投薬サイクルまでにわたって投与される。
【０１２４】
任意の実施形態では、腫瘍は、消化管、尿生殖器、皮膚、結腸直腸（結腸または直腸）、卵巣、肺、乳房、膵臓、胃および腎臓のがんから選択される。別の実施形態では、腫瘍は消化管がんである。一部の実施形態では、腫瘍は尿生殖器がんである。別の実施形態では、腫瘍は皮膚がんである。別の実施形態では、腫瘍は黒色腫である。別の実施形態では、腫瘍は直腸結腸がんである。別の実施形態では、腫瘍は結腸がんである。別の実施形態では、腫瘍は直腸がんである。別の実施形態では、腫瘍はＫ−Ｒａｓ突然変異体結腸がんである。別の実施形態では、腫瘍は卵巣がんである。別の実施形態では、腫瘍は白金耐性または白金不応性（例えば、シスプラチン耐性またはカルボプラチン耐性）卵巣がんである。別の実施形態では、腫瘍は肺がんである。別の実施形態では、腫瘍は非小細胞肺がんである。別の実施形態では、腫瘍は乳がんである。別の実施形態では、腫瘍はトリプルネガティブ（ＴＮ）乳がんである。別の実施形態では、腫瘍は転移性乳がんである。別の実施形態では、腫瘍は膵臓がんである。別の実施形態では、腫瘍は胃がんである。別の実施形態では、腫瘍は腎臓がんである。
【０１２５】
別の実施形態では、被験体は哺乳動物である。別の実施形態では、被験体はヒトである。
【０１２６】
４．３  Ｙ５９３リン酸化ｐ６８のβ−カテニン依存性ＡＴＰａｓｅ活性を阻害する方法
本開示の別の態様は、Ｙ５９３リン酸化ｐ６８のβ−カテニン依存性ＡＴＰａｓｅ活性を阻害する方法であって、それを必要とする被験体に式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩の有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
【０１２７】
４．４  処置の効力を予測する方法
本開示の別の態様は、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩を用いた、処置の効力を予測することを必要とする被験体の処置の効力を予測する方法であって、
（ａ）被験体から腫瘍の試料を採取するステップと、
（ｂ）腫瘍がＹ５９３リン酸化ｐ６８を発現するかどうか決定するステップと
を含む方法を提供する。
【０１２８】
一実施形態では、本方法はまた、腫瘍がＹ５９３リン酸化ｐ６８を発現する場合、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容されるものを被験体に投与するステップを含む。
【０１２９】
別の実施形態では、本方法はまた、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩が、Ｙ５９３リン酸化ｐ６８のβ−カテニン依存性ＡＴＰａｓｅ活性を阻害するかどうか決定するステップも含む。別の実施形態では、本方法は、β−カテニン依存性ＡＴＰａｓｅ活性の阻害およびＹ５９３リン酸化ｐ６８の発現が検出された場合、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容されるものを被験体に投与するステップを含む。
【０１３０】
別の実施形態では、本方法はまた、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容されるものが、Ｙ５９３リン酸化ｐ６８のＲＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅ活性を阻害するかどうか決定するステップを含む。別の実施形態では、本方法は、ＲＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅ活性の阻害が検出されなかった場合のみ、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩を被験体に投与するステップを含む。
【０１３１】
別の実施形態では、方法はまた、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩が、β−カテニンの腫瘍細胞核への転座を阻害するかどうか決定するステップも含む。別の実施形態では、本方法は、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩が、β−カテニンの細胞内レベルを低減するかどうか決定するステップを含む。別の実施形態では、本方法は、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩がβ−カテニンにより調節される１つまたは複数の遺伝子の発現を阻害するかどうか決定するステップを含む。別の実施形態では、本方法はまた、β−カテニンにより調節されている１つまたは複数の遺伝子の発現の阻害が検出された場合のみ、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩を被験体に投与するステップを含む。別の実施形態では、本方法はまた、β−カテニン−ＴＣＦ−４媒介性転写活性の阻害が検出された場合のみ、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩を被験体に投与するステップを含む。別の実施形態では、本方法はまた、Ｗｎｔシグナル伝達活性の阻害が検出された場合のみ、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩を被験体に投与するステップを含む。別の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子は、サイクリンＤ１、ｃ−Ｍｙｃ、Ａｘｉｎ２、Ｓｕｒｖｉｖ１、およびｐ−ｃ−Ｊｕｎから選択される。
【０１３２】
実施形態では、被験体は哺乳動物である。別の実施形態では、被験体はヒトである。
【０１３３】
任意の実施形態では、腫瘍は、消化管、尿生殖器、皮膚、結腸直腸（結腸または直腸）、卵巣、肺、乳房、膵臓、胃および腎臓のがんから選択される。別の実施形態では、腫瘍は消化管がんである。一部の実施形態では、腫瘍は尿生殖器がんである。別の実施形態では、腫瘍は皮膚がんである。別の実施形態では、腫瘍は黒色腫である。別の実施形態では、腫瘍は直腸結腸がんである。別の実施形態では、腫瘍は結腸がんである。別の実施形態では、腫瘍は直腸がんである。別の実施形態では、腫瘍はＫ−Ｒａｓ突然変異体結腸がんである。別の実施形態では、腫瘍は卵巣がんである。別の実施形態では、腫瘍は白金耐性または白金不応性（例えば、シスプラチン耐性またはカルボプラチン耐性）卵巣がんである。別の実施形態では、腫瘍は肺がんである。別の実施形態では、腫瘍は非小細胞肺がんである。別の実施形態では、腫瘍は乳がんである。別の実施形態では、腫瘍はトリプルネガティブ（ＴＮ）乳がんである。別の実施形態では、腫瘍は転移性乳がんである。別の実施形態では、腫瘍は膵臓がんである。別の実施形態では、腫瘍は胃がんである。別の実施形態では、腫瘍は腎臓がんである。
【０１３４】
４．５  処置の効力を試験するためのキット
本開示の別の態様は、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩の、腫瘍の処置における潜在的効力を試験するためのキットであって、腫瘍がＹ５９３リン酸化ｐ６８を発現するかどうか決定するアッセイを含むキットを提供する。
【０１３５】
一実施形態では、キットはまた、Ｙ５９３リン酸化ｐ６８のβ−カテニン依存性ＡＴＰａｓｅ活性の阻害を検出するアッセイを含む。別の実施形態では、キットは、β−カテニンの細胞内レベル（例えば、サイトゾルおよび核のレベル）を検出するアッセイをさらに含む。別の実施形態では、キットは、β−カテニンにより調節される１つまたは複数の遺伝子の発現の阻害を検出するアッセイを含む。別の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子は、サイクリンＤ１、ｃ−Ｍｙｃおよびｐ−ｃ−Ｊｕｎから選択される。
【０１３６】
４．６  医薬組成物
本明細書に提供されている方法およびキットのいずれかにおいて、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩は医薬組成物であってよい。このような医薬組成物は、任意の適当な単位剤形として調製することができる。例えば、医薬組成物は、以下に対して適応されたものを含めた、固体または液体形態での投与に対して製剤化することができる：（１）経口投与、例えば、飲薬としての、錠剤（オーバーカプセル化錠剤を含めた、例えば、口腔内頬側、舌下および体内吸収を標的とするものなど）、カプセル剤（例えば、硬質、軟質、乾燥充填、液体充填、ゼラチン、非ゼラチンまたはオーバーカプセル化カプセル剤など）、カプレット剤、ボーラス、散剤、サシェ剤、粒剤、ペースト剤、マウススプレー剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、ペレット剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、液体、リポソーム、乳剤およびマイクロエマルジョン；または（２）例えば、滅菌溶液もしくは懸濁液としての、例えば、皮下、筋肉内、静脈内もしくは硬膜外注射による非経口投与。追加的に、医薬組成物は、即時性、持続性、延長性、遅延性または制御性放出用に製剤化することができる。
【０１３７】
一実施形態では、医薬組成物は、経口投与用に製剤化される。別の実施形態では、医薬組成物は固体経口剤形である。別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書中に記載されているようなＴｍａｘ、Ｃｍａｘ、ＡＵＣ０〜ｔまたはそれらの組合せを提供する固体経口剤形である（セクション４．２を参照）。別の実施形態では、医薬組成物は錠剤またはカプセル剤である。別の実施形態では、医薬組成物は錠剤である。別の実施形態では、医薬組成物はカプセル剤である。別の実施形態では、錠剤またはカプセル剤は即時性放出用に製剤化される。別の実施形態では、錠剤またはカプセル剤は、持続性、延長性、遅延性または制御性放出用に製剤化される。
【０１３８】
別の実施形態では、錠剤またはカプセル剤はまた、少なくとも１種の薬学的に許容される担体を含む。担体は、医薬組成物の投与もしくは他の送達を促進する、援助する、もしくは助けることおよび／または医薬組成物のバイオアベイラビリティーを改善することを意図とする目的で、医薬組成物と共に投与し得る任意の物質を含む。担体は、その投与を補助するために医薬組成物と組み合わせることができる任意の液体、固体、半固体、ゲルエアゾールまたは他の物質を含むことができる。このような担体は、結合剤、例えば、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、微結晶性セルロース、もしくはゼラチンなど；賦形剤、例えば、デンプン、ラクトースもしくはデキストリンなど；崩壊剤、例えば、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、およびトウモロコシデンプンなど；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｘなど；流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素など；甘味剤、例えば、スクロースもしくはサッカリンなど、香味剤、例えば、ペパーミント、サルチル酸メチルもしくはオレンジ香味料など、または着色剤をさらに含むことができる。担体のさらなる例として、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン、油、またはカプセル剤へと製剤化することができる任意の他の同様の液体担体を挙げることができる。適切な担体の例として、希釈剤、アジュバント、賦形剤、水、脂質製剤および油、例えば、石油、動物、植物または合成油などを挙げることができる。適切な賦形剤は、水不溶性界面活性剤、水溶性界面活性剤、および親水性共溶媒を含み得る。適切な油は、トリグリセリド、ジグリセリドまたはモノグリセリドを含み得る。
【０１３９】
別の実施形態では、ＲＸ−５９０２のナノ粒子は、懸濁剤、錠剤、カプセル剤または他の剤形、例えば、米国特許公開第ＵＳ２０１５０００４２３４号（２０１５年１月１日に公開）において開示されたものなどとして調製および製剤化することができる。一実施形態では、ナノ粒子は約１，０００ｎｍ未満のメジアン粒径（Ｄ５０）を有する。別の実施形態では、ナノ粒子は約５００ｎｍ未満のメジアン粒径（Ｄ５０）を有する。別の実施形態では、ＲＸ−５９０２のナノ粒子は懸濁液として製剤化される。別の実施形態では、懸濁液は、凍結乾燥などにより乾燥させて、粉末を形成する。別の実施形態では、粉末は１種または複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせる。別の実施形態では、粉末はカプセル剤に封入される。
【０１４０】
カプセル剤の組成物および調製は当技術分野で周知である。例えば、カプセル剤は、ゼラチン（例えば、Ａ型、Ｂ型）、カラギーナン（例えば、カッパ、イオタ、ラムダ）および／または修飾セルロース（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル酢酸セルローススクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、酢酸フタル酸セルロース）、および任意選択で１種または複数の賦形剤、例えば、油（例えば、魚油、オリーブ油、トウモロコシ油、ダイズ油、ヤシ油、トリグリセリド、ジグリセリドおよびモノグリセリド）、可塑剤（例えば、グリセロール、グリセリン、ソルビトール、ポリエチレングリコール、クエン酸、クエン酸エステル、例えば、クエン酸トリエチル、ポリアルコール）、共溶媒（例えば、トリアセチン、炭酸プロピレン、乳酸エチル、プロピレングリコール、オレイン酸、ジメチルイソソルビド、ステアリルアルコール、セチルアルコール、セトステアリルアルコール、ベヘン酸グリセリル、パルミチン酸ステアリン酸グリセリン）、界面活性剤、緩衝剤、滑沢剤、保湿剤、保存剤、着色剤および着香剤などから調製することができる。カプセル剤は硬質または軟質であってよい。硬質カプセル剤の例として、Ｃａｐｓｕｇｅｌ（登録商標）から入手可能なＣｏｎｉ−Ｓｎａｐ（登録商標）、ＤＲｃａｐｓ（商標）、ＯｃｅａｎＣａｐｓ（登録商標）、Ｐｅａｒｌｃａｐｓ（登録商標）、Ｐｌａｎｔｃａｐｓ（登録商標）、ＤＵＯＣＡＰ（商標）、Ｖｃａｐｓ（登録商標）およびＶｃａｐｓ（登録商標）Ｐｌｕｓカプセル剤が挙げられる。硬質カプセル剤は、例えば、２つのテレスコーピングカプセル剤の半分を形成し、半分の１つに式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩を含むフィルを充填し、カプセル剤の半分を一緒に密閉することによって調製することができる。フィルは、乾燥粉末、顆粒、懸濁液または液体などの任意の適切な形態であってよい。軟質カプセル剤の例として、軟質ゼラチン（ソフトゲルまたはソフトエラスチックとも呼ばれる）カプセル剤、例えば、ＳＧｃａｐｓ（登録商標）などが挙げられる。軟質カプセル剤は、例えば、回転式ダイ、プレート、往復式ダイまたはＡｃｃｏｇｅｌ（登録商標）マシンメソッドにより調製することができる。実施形態では、カプセル剤は、液体を充填した硬質カプセル剤または軟質ゼラチンカプセル剤であってよい。
【０１４１】
錠剤は、任意選択で１種または複数の副成分と共に、圧縮または成型することによって、作製することできる。圧縮錠剤は、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩を、適切な機器内で、任意選択で結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、表面活性剤または分散剤と混合して、自由流体形態、例えば、粉末または粒剤に圧縮することによって調製することができる。成型錠剤は、適切な機器内で、不活性な液体希釈剤で湿らした粉末状化合物の混合物を成型することによって、作製することができる。錠剤は、任意選択でコーティングするか、または刻みを入れることができ、製剤化して、持続性、延長性、遅延性または制御性放出を提供することができる。このような持続性、延長性、遅延性または制御性放出組成物を製剤化する方法は、当技術分野で公知であり、これらに限定されないが、米国特許第４，３６９，１７４号、第４，８４２，８６６号、およびその中に引用された参考文献を含めて、発行された米国特許において開示されている。化合物を腸へ送達するために、コーティング、例えば、腸溶コーティングを使用することができる（例えば、米国特許第６，６３８，５３４号、第５，２１７，７２０号、第６，５６９，４５７号、およびその中に引用された参考文献を参照されたい）。錠剤に加えて、他の剤形、例えば、カプセル剤、顆粒およびゲルキャップなどを製剤化して、持続性、延長性、遅延性または制御性放出を提供することができる。
【０１４２】
別の実施形態では、医薬組成物は非経口投与用に製剤化される。非経口投与に対して適切な医薬組成物の例として、それぞれが、例えば、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および／または製剤を意図するレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有する、水性滅菌注射液および非水性滅菌注射液、ならびにそれぞれが、例えば、懸濁化剤および／または増粘剤を含有する、水性滅菌懸濁液および非水性滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は、単回用量または多回用量のコンテナ、例えば、密閉したアンプルまたはバイアルで提示することができ、使用の直前に水などの滅菌液体担体の添加だけを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵することができる。一実施形態では、医薬組成物は静脈内投与用に製剤化される。
【０１４３】
実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。薬学的に許容される賦形剤は、それ自体治療剤ではなく、患者への治療剤の送達のために、担体、希釈剤、アジュバント、結合剤、および／もしくはビヒクルとして使用される、あるいはその取扱いもしくは貯蔵特性を改善するために、または化合物もしくは医薬組成物の投与用単位剤形への形成を可能にするもしくは促進するために医薬組成物に添加される任意の物質であってよい。薬学的に許容される賦形剤は薬学分野で公知であり、例えば、Remington:  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy、第２１版、（Lippincott  Williams  &  Wilkins、Baltimore、MD、２００５年）において開示されている。当業者には公知であるように、薬学的に許容される賦形剤は、様々な機能を提供することができ、湿潤剤、緩衝剤、懸濁化剤、滑沢剤、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、保存剤、界面活性剤、着色剤、着香剤、および甘味剤として記載することができる。薬学的に許容される賦形剤の例として、限定なしで：（１）糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロースなど；（２）デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど；（３）セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロースなど；（４）粉末状トラガント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えば、ココアバターおよび坐剤ワックスなど；（９）油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油など；（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコールなど；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなど；（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンを含まない水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンゲル溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ酸無水物；ならびに（２２）医薬製剤に利用される他の無毒性相容性物質が挙げられる。
【０１４４】
実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１種の追加の活性剤を含むことができる。活性剤は、抗新生物剤、化学療法剤、細胞傷害剤、免疫調節物質（immunomodulaor）、放射線療法剤あるいはアポトーシスを誘発する、細胞のアポトーシスを感作する、タンパク質キナーゼをモジュレートする、または新生物、腫瘍もしくはがんを処置することが可能な任意の他の薬剤であってよい。活性剤の例として、（１）代謝拮抗剤、例えば、シタラビン、フルダラビン、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（deoxyuiridine）、ゲムシタビン、４−アミノ−１−（（１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−２−フルオロ−４，５−ジヒドロキシ−３−ヒドロキシメチル−シクロペンタ−２−エニル）−１Ｈ−ピリミジン−２−オン（ＲＸ−３１１７）、ヒドロキシウレアまたはメトトレキセートなど；（２）ＤＮＡ断片化剤、例えば、ブレオマイシンなど、（３）ＤＮＡ架橋剤、例えば、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミドおよびナイトロジェンマスタードなど；（４）挿入剤、例えば、アドリアマイシン（ドキソルビシン）およびミトキサントロンなど；（５）タンパク質合成阻害剤、例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ、シクロヘキシミド、ピューロマイシンおよびジフテリア毒素など；（６）トポイソメラーゼＩ毒素、例えば、カンプトテシンおよびトポテカンなど；（７）トポイソメラーゼＩＩ毒素、例えば、エトポシド（ＶＰ−１６）およびテニポシドなど；（８）微小管標的剤、例えば、コルセミド、コルヒチン、パクリタキセル、ビンブラスチンおよびビンクリスチンなど；（９）キナーゼ阻害剤、例えば、フラボピリドール、スタウロスポリン（staurosporin）および７−ヒドロキシスタウロスポリンなど；（１０）酵素ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、例えば、オラパリブ、ベリパリブ、ルカパリブ、ニラパリブ、およびタラゾパリブなど（１１）ポリフェノール、例えば、ケルセチン、リスベラトロール、ピセタノール、没食子酸エピガロカテキン（epigallocatechine  gallate）、テアフラビン、フラバノール、プロシアニジン、ベツリン酸およびそれらの誘導体など；（１２）ホルモン、例えば、グルココルチコイドおよびフェンレチニドなど；（１３）ホルモンアンタゴニスト、例えば、タモキシフェン、フィナステリドおよびＬＨＲＨアンタゴニストなど；（１４）デスレセプターアゴニスト、例えば、腫瘍壊死因子ａ（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）、ＬＴ−β（リンホトキシン−β）、ＴＲＡＩＬ（Ａｐｏ２Ｌ、ＤＲ４リガンド）、ＣＤ９５（Ｆａｓ、ＡＰＯ−１）リガンド、ＴＲＡＭＰ（ＤＲ３、Ａｐｏ−３）リガンド、ＤＲ６リガンドおよび断片；（１５）免疫チェックポイント阻害剤；（１６）抗プログラム細胞死１（ＰＤ−１）受容体抗体または抗プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）抗体；（１７）免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４）；ならびにそれらの誘導体が挙げられる。
【０１４５】
別の実施形態では、医薬組成物中の式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容される塩の量は、約０．１重量％〜約５重量％の間である。別の実施形態では、量は約０．５重量％〜約２．５重量％の間である。
【０１４６】
４．７  投与の方法
本明細書に提供されている方法のいずれかにおいて、化合物または医薬組成物の投与は、経口的または非経口的など、当技術分野で公知の任意の一般に認められたモードを介することができる。「非経口的に」という用語は、限定なしで皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、側脳室内、胸骨内、脳内、骨内の注射により、および点滴技術によるものを含む。一実施形態では、化合物または医薬組成物は経口的に投与される。別の実施形態では、化合物または医薬組成物は非経口的に投与される。別の実施形態では、化合物または医薬組成物は静脈内に投与される。別の実施形態では、化合物または医薬組成物は腫瘍内に投与される。
【０１４７】
一実施形態では、化合物または医薬組成物は、本明細書で、例えば、セクション４．２などに開示されている用量または投与量で経口的に投与される。
【０１４８】
用量レベルは静脈内投与に対して調整することができる。このような場合、化合物または医薬組成物は、約０．０１μｇ／ｋｇ／分〜約１００μｇ／ｋｇ／分の間の量で投与することができる。
【０１４９】
４．８  併用療法
本明細書に提供されている腫瘍を処置または予防する方法のいずれかにおいて、本方法はまた、１種または複数の追加の抗腫瘍剤または照射を被験体に投与するステップを含むことができる。一実施形態では、本方法は、照射を被験体に投与するステップを含む。別の実施形態では、本方法は、１種または複数の追加の抗腫瘍剤を被験体に投与するステップをさらに含む。
【０１５０】
追加の抗腫瘍剤または照射は、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩の投与前、投与後、または投与中に投与することができる。一実施形態では、追加の抗腫瘍剤または照射は、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩の投与前に投与される。別の実施形態では、追加の抗腫瘍剤または照射は、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩の投与後に投与される。別の実施形態では、追加の抗腫瘍剤または照射は、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩の投与中に投与される。別の実施形態では、追加の抗腫瘍剤および式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩は、同時発生的投与のために医薬組成物へと製剤化される。
【０１５１】
「抗腫瘍剤」という用語は、本明細書で使用される場合、腫瘍を処置または予防するのに有用な任意の薬剤を指す。抗腫瘍剤の例は、セクション４．６に記載されている活性剤を含む。一実施形態では、追加の抗腫瘍剤は、代謝拮抗剤、ＤＮＡ断片化剤、ＤＮＡ架橋剤、挿入剤、タンパク質合成阻害剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、微小管標的剤、キナーゼ阻害剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）、ポリフェノール、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、デスレセプターアゴニスト、酵素ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤、抗プログラム細胞死１（ＰＤ−１）受容体抗体および抗プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）抗体から選択される。別の実施形態では、追加の抗腫瘍剤はＰＤ−１受容体抗体である。別の実施形態では、追加の抗腫瘍剤はペムブロリズマブである。別の実施形態では、追加の抗腫瘍剤はニボルマブである。別の実施形態では、追加の抗腫瘍剤はトレメリムマブである。別の実施形態では、追加の抗腫瘍剤はイピリムマブ（ipilinumab）である。別の実施形態では、追加の抗腫瘍剤はニボルマブとイピリムマブの組合せである。別の実施形態では、追加の抗腫瘍剤はペムブロリズマブとトレメリムマブの組合せである。
【０１５２】
４．９  ＲＸ−５９０２を作製するプロセス
米国特許第８，３１４，１００号は、中間体３−アミノ−６−フルオロ−２−メトキシキノキサリンおよびエチルＮ−（６−フルオロ−２−メトキシキノキサリン−３−イル）カルバメートを介して、３−アミノ−２−クロロ−６−フルオロキノキサリンをＲＸ−５９０２へと３ステップで変換するプロセスを開示する。
【０１５３】
反応の小バッチプロセスの間、脱メチル化した不純物（質量Ｓｐｅｃデータに基づく）を検出し、その除去のために精製が必要とされた。さらに、小バッチプロセスは、中間体を濃縮乾固させることを必要とする。したがって、このプロセスは商業規模生産に対して満足できるものではない。したがって、効率的な商業生産を可能にするために固定された装置内でスケールアップすることに適している改善されたプロセスを提供する必要性が存在する。例えば、このプロセスは、濃縮乾固を排除し、ハロゲン化溶媒の一部を、非ハロゲン化溶媒で置換し、小バッチ製造プロセスの中で化合物１の量産効果のない再結晶化を改善することによって改善された。
【０１５４】
以下はＲＸ−５９０２の小バッチ生産および改善された生産プロセスを詳述している。
【０１５５】
４．９．１  １．５ｋｇのＲＸ−５９０２原薬の小バッチ生産
スキーム１．ＲＸ−５９０２の生産のための小バッチ合成プロセス
【化２】
2018526392.tif 000004
【０１５６】
本発明は、（ａ）塩基の存在下、有機溶媒中で３−アミノ−６−フルオロ−２−メトキシキノキサリンをクロロギ酸エチルと反応させて、混合物を形成すること；（ｂ）酢酸エチルを添加しながら、混合物を蒸留させて、懸濁液を形成すること；（ｃ）懸濁液を濾過して、エチル−Ｎ−（６−フルオロ−２−メトキシキノキサリン−３−イル）カーボネートを単離すること；および（ｄ）第２の塩基の存在下、第２の有機溶媒中で、エチル−Ｎ−（６−フルオロ−２−メトキシキノキサリン−３−イル）カーボネートを１−（３，５−ジメトキシフェニル）ピペラジン塩酸塩と反応させることにより、式（Ｉ）の化合物：
【化３】
2018526392.tif 000005
または薬学的に許容されるその塩を商業規模で調製する方法を提供する。
【０１５７】
４−（３，５−ジメトキシフェニル）−Ｎ−（７−フルオロ−３−メトキシキノキサリン−２−イル）ピペラジン−１−カルボキサミド（ＲＸ−５９０２）の１．５ｋｇスケールの現行適正製造基準（ｃＧＭＰ）生産を行った。初期生産は１．３１８ｋｇのＲＸ−５９０２を生成した。しかし、放出試験を実施した際、特定されていない不純物が、ＲＲＴ０．５７で、仕様外（結果：０．８２％対リミット≦０．５０％）であると判明した。不純物は、後に質量分析により、脱メチル化したＲＸ−５９０２であると考えられているものに対応すると同定された。ベースウォッシュ再生手順が成功裏に開発され、実行され、最終的に１．１２８ｋｇを生成した（バッチ３５４４４Ａと指定された）。
【０１５８】
本方法の実施形態は、（ｅ）塩基の存在下、有機溶媒中で３−アミノ−２−クロロ−６−フルオロキノキサリンをナトリウムメトキシドと反応させて、混合物を形成すること；（ｆ）水をステップ（ｅ）の混合物に添加して、溶液を形成すること；（ｇ）溶液を約１５〜２０℃の温度に冷却して、懸濁液を形成すること；および（ｈ）ステップ（ｇ）の懸濁液を濾過して、３−アミノ−６−フルオロ−２−メトキシキノキサリンを単離することを含むことができる。
【０１５９】
実施形態では、ステップ（ａ）の有機溶媒はジクロロメタンであってよい。実施形態では，ステップ（ａ）の塩基はピリジンであってよい。実施形態では、蒸留するステップ（ｂ）は大気圧下で行ってもよい。実施形態では、ステップ（ｃ）は真空濾過によるものでもよい。実施形態では、ステップ（ｄ）の第２の有機溶媒はテトラヒドロフランであってよい。実施形態では、ステップ（ｄ）の第２の塩基は１，８−ジアザビシクロウンデカ−７−エンであってよい。実施形態では、ステップは１つまたは複数の固定された反応器内で実施されてもよい。
【０１６０】
４．９．２  １１ｋｇのＲＸ−５９０２の大規模合成生産
本発明は、大規模生産に対して商業的に実行可能である、ＲＸ−５９０２を調製する改善されたプロセスを提供する。プロセスは、ＲＸ−５９０２の小バッチ製造プロセスを改善して、製造コストを有意に減少させるために、商業規模生産用の固定された装置内でのスケールアップを可能にする。本発明のプロセスは、濃縮乾固ステップを排除し、ハロゲン化溶媒の一部を置き換え、小バッチ製造プロセスで使用した化合物１の量産効果のない再結晶化を改善した。
【０１６１】
スキーム２は、ＲＸ−５９０２の固定された反応器／大規模生産のための改善されたプロセスを例示している。スキーム２に示されている通り、本方法の実施形態は、ＨＰＬＣにより示される通りに反応が完了するまで、塩基の存在下、有機溶媒中で、エチル−Ｎ−（６−フルオロ−２−メトキシキノキサリン−３−イル）カーボネート（化合物３）を１−（３，５−ジメトキシフェニル）ピペラジン塩酸塩と反応させることによって、ＲＸ−５９０２を調製することを含むことができる。一実施形態では、有機溶媒はテトラヒドロフランであってよい。一実施形態では、塩基は１，８−ジアザビシクロウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）であってよい。
【０１６２】
本方法の実施形態は、塩基の存在下、有機溶媒中で化合物２をクロロギ酸エチルと反応させて、化合物３を形成することを含むことができる。一実施形態では、クロロギ酸エチルを溶液にゆっくりと添加する前に、化合物２を塩基の存在下、有機溶媒中に溶解することができる。一実施形態では、有機相はＤＩ水で抽出し、有機相を大気圧下で蒸留して、有機溶媒を除去することができる。一実施形態では、酢酸エチルは、蒸留プロセスの間に添加することができる。一実施形態では、固体形態の化合物３を、真空濾過により収集し、酢酸エチルで洗浄し、乾燥させてもよい。一実施形態では、有機溶媒はジクロロメタンであってよい。一実施形態では、塩基はピリジンであってよい。
【０１６３】
本方法の実施形態は、テトラヒドロフラン中、ナトリウムメトキシドを用いて、完了するまで化合物１を３−アミノ−６−フルオロ−２−メトキシキノキサリン（化合物２）に変換することを含むことができる。一実施形態では、水を溶液混合物に添加することができる。一実施形態では、溶液は、約１５〜２０℃の温度に冷却することができる。一実施形態では、反応混合物は、大気蒸留を介して濃縮することによって、テトラヒドロフランを除去し、容量を半分未満まで減少させることができる。一実施形態では、化合物２は水で洗浄し、濾過によって収集することができる。
【０１６４】
本方法の実施形態は、１，２−ジアミノ−４−フルオロベンゼン（fluorbenzene）を出発材料として用いてＲＸ−５９０２を作製する６ステッププロセスを含むことができる。一実施形態では、本プロセスは、ＲＸ−５９０２のｃＧＭＰ生産に適切なスケールアッププロセスのための固定された装置を利用する。
【０１６５】
本方法の実施形態は、１，２−ジアミノ−４−フルオロベンゼンをシュウ酸と反応させることによって、１，２−ジアミノ−４−フルオロベンゼンを６−フルオロ−１，４−ジヒドロキノキサリン（dihdryoquinoxaline）−２，３−ジオン（化合物Ａ）に変換することを含むことができる。化合物Ａは、沈殿させて、真空濾過により収集することができる。
【０１６６】
本方法の実施形態は、クロロホルム中、過剰の塩化チオニルを用いて、完了するまで化合物Ａを還流させることによって、化合物Ａを２，３−ジクロロ−６−フルオロキノキサリン（化合物Ｂ）に変換することを含むことができる。一実施形態では、反応は、水酸化ナトリウムでクエンチし、残りの塩化チオニルが分解するまで撹拌することができる。一実施形態では、クロロホルムは、大気蒸留を介して留去することができる。一実施形態では、蒸留中にヘプタンを添加することができる。一実施形態では、化合物Ｂを濾過し、ヘプタンで洗浄し、真空内で乾燥させることができる。一実施形態では、濾液（すなわち母液）は真空下で蒸留させて、追加の化合物Ｂを回収することができる。
【０１６７】
本方法の実施形態は、水酸化アンモニウムを用いて、完了するまで、化合物Ｂを３−アミノ−２−クロロ−６−フルオロキノキサリン（化合物１）に変換することを含むことができる。一実施形態では、化合物１は、温かい、すなわち４５±５℃の高温で、反応混合物を濾過することにより精製することができる。
【化４】
2018526392.tif 000006
【０１６８】
特に、プロセス改善の本発明は、ステップ２、４および５の濃縮乾固作業を排除し（化合物Ｂ、化合物２および化合物３の生成それぞれに対して）、化合物１の精製における量産効果を改善した。本発明はまた、ステップ２、４、および５の塩素化した溶媒を非塩素化溶媒と置き換えた。
【０１６９】
以下に詳述されているように、濃縮乾固を回避する手順は成功した。
【０１７０】
ステップ２については、クロロホルムの大部分を留去し、次いで、ヘプタンと置き換え、これによって化合物Ｂの濾過可能な懸濁液が得られた。
【０１７１】
ステップ３については、化合物１の精製もまた改善された。具体的には、精製は、温かい（４５±５℃）反応混合物を濾過することにより達成され、これは、小バッチ手順を使用した収率６２％と比較して、改善された収率７２．６％をもたらした。さらに所望しない位置異性体が、許容されるレベルまで驚くほど減少した。（表１を参照されたい）
【表１】
2018526392.tif 000007
†バッチ３５４４４Ａおよび３５６８６Ａは、実施例１３において以下に記載されているような以前の小バッチプロセスにより作製され、バッチ３５９２１Ａは、実施例１４において以下に記載されているような改善された固定された反応器／大規模プロセスにより調製された。
ＮＴ＊−試験していない
ＮＤ＊＊−検出されていない
【０１７２】
ステップ４については、化合物２の作製において２つの改善が実現された。第１に、反応物を水でクエンチし、次いでテトラヒドロフランを蒸留して除去し、これに続いて生成物を濾過することによって、濃縮乾固ステップの排除を達成した。この新規ワークアップはまたハロゲン化した溶媒を減少させた。ワークアップは、生成物の抽出においてジクロロメタンの使用を回避した。
【０１７３】
ステップ５については、ジクロロメタンを大気蒸留し、これをインサイチュでの酢酸エチルと置き換えることにより、濃縮乾固ステップを排除した。高い純度およびより良い収率で所望の生成物を単離するため、溶媒交換により別の簡単に濾過できるスラリーを得た。
【０１７４】
４．１０  ＲＸ−５９０２のナノ製剤
本発明は、改善された経口バイオアベイラビリティーを有するＲＸ−５９０２の新規ナノ製剤およびＲＸ−５９０２のナノ製剤を作製する方法を提供する。例えば、本発明は、懸濁液を得るのに十分な条件下で、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩の粒径を減少させるための方法を提供する。実施形態では、懸濁液はミリングプロセスにより作製することができる。実施形態では、ミリングプロセスは、低エネルギーミリングプロセス、例えば、ローラーミリングであってよい。実施形態では、ミリングプロセスは、高エネルギーミリングプロセス、例えば、高エネルギーアジテータでのミリングであってよい。実施形態では，ミリングプロセスは高エネルギーアジテータでのミリングまたはローラーミリングであってよい。実施形態では、ミリングプロセスは高エネルギーアジテータでのミリングであってよい。実施形態では、懸濁液は、約２００ｎｍまたはそれ未満のＤ５０粒径を有することができる。実施形態では、本方法は、懸濁液を凍結乾燥させて、粉末を形成するステップを含むことができる。実施形態では、本方法は、懸濁液を噴霧乾燥させて、粉末を形成するステップを含むことができる。
【０１７５】
４．１０．１  低エネルギーミリングおよび凍結乾燥によるＲＸ−５９０２ナノ懸濁液の再加工
以前の調製物からのＲＸ−５９０２ナノ懸濁液の再加工を使用して、非ＧＬＰ使用のためのＲＸ−５９０２のナノ懸濁液を生成することができる。加工前、ナノ懸濁液を分析して、長期にわたる貯蔵が活性医薬成分（ＡＰＩ）、この場合、ＲＸ−５９０２粒子の化学的または物理的特性のいずれかに悪影響を及ぼすかどうか決定した。懸濁液をローラーミリングにより処理して、観察された凝集をより許容される粒径分布まで減少させ、次いで凍結乾燥させて、乾燥粉末を生成した。
【０１７６】
熟成した懸濁液の再加工は、未処理のＡＰＩからミリングされ、直ちに凍結乾燥された臨床用バッチのものに相当する粒径分布を有する乾燥粉末を成功裏に生成している。以前に製造されたバッチは、凝集なしに、より均一な粒径分布にミリングすることができ、これは、再加工したナノ懸濁液の熟成がミリング効率に悪影響を及ぼし得ることを示す。例えば、再加工した物質のＤ９０が約８００ｎｍの下限を有したのに対して、臨床用バッチを作製するために使用された、ミリングされた物質は、約２００ｎｍのＤ９０を有する、単一モードの、サブミクロン分布に減少していた。
【０１７７】
凍結乾燥条件は、乾燥粉末の最終粒径分布にもある役割を果たしているようにみえる。−８０℃の冷却器を備えた凍結乾燥機を使用して乾燥させた研究開発用バッチは、臨床用バッチまたは再加工したバッチのいずれよりも好ましい粒径分布をもたらした。両方とも−５３℃の冷却器で乾燥させた。後者の２つのバッチはまた研究材料よりもより多量に作製し、これは、凍結時間もまた乾燥粉末製剤における凝集物の形成に関連することを示し得る。
【０１７８】
４．１０．２  ＲＸ−５９０２高エネルギーナノミリングプロセスの開発および噴霧乾燥の実現可能性
最終乾燥粉末の生産の効率および拡張性を増強するために、ＲＸ−５９０２ナノ懸濁液のミリングと乾燥の両方において代替の技術を試験した。以前に調製したナノ懸濁液は代わりに、高エネルギーミリングで再加工し、凍結乾燥または噴霧乾燥を使用して乾燥させることができる。高エネルギーアジテータでのミリングを、ローラーミリングの代わりに使用して、開始ナノ懸濁液を調製することができる。噴霧乾燥を凍結乾燥の代わりに使用して、乾燥粉末を調製することができる。アジテータでのミリングは、懸濁製剤に対するわずかな調整だけで、同様のナノ粒径分布を生じる。明らかなＡＰＩ分解は観察されなかった。噴霧乾燥は、ミクロンサイズ範囲で狭い粒径分布をもたらしたが、物理的または化学的にＡＰＩナノ粒子に影響を与えるようにはみえない。
【０１７９】
ＲＸ−５９０２は、いずれかのプロセスに起因する、感知できるほどの分解または損失を生じることなく、アジテータでのミリングと凍結乾燥の両方または噴霧乾燥に対して適しているようにみえる。ナノ懸濁液調製からアジテータでのミリングへの移行に必要とされる唯一の主要な変化は、開始調製物の希釈であった。希釈されたアジテータでのミリングされた材料中のＡＰＩ濃度は、元のローラーミリングプロセスから得た最終濃度のものより大きいため、これが乾燥粉末生産に任意の有害な作用を及ぼすことは予想されない。媒体からのＡＰＩの効率的な抽出に影響を与えるために必要とされるなら、さらなる希釈が許容されるべきである。
【０１８０】
元の乾燥粉末製剤は、フリーズドライ中の凝集から保護するためにポロキサマーを添加することによって修飾された１０％  ＲＸ−５９０２を使用して開発された。最終粉末を生成するために噴霧乾燥を使用することによって、プロセスの希釈、アッセイ、およびポロキサマー添加ステップを削除することが可能となる。噴霧乾燥した粉末の粒径分布は凍結乾燥された材料のものよりも有意に大きいが、測定は、ナノ結晶のサイズではなく、マイクロスフェアのサイズを反映し、ナノ結晶のサイズはプロセスにより影響を受けていないようにみえる。
【０１８１】
４．１０．３  代替のＲＸ−５９０２ナノ製剤およびプロセス
長期にわたるミリング時間は、ＲＸ−５９０２ナノ製剤、１．５ｋｇの製造中に発泡を引き起こした。発泡は、生産中、サブバッチを断続的に冷蔵することによって緩和された。長期にわたるミリング時間および断続的な冷蔵によって、小規模バッチで生産されたものと同じ品質のＲＸ−５９０２ナノ製剤が生産された。
【０１８２】
４．１０．４  ＲＸ−５９０２に対するミリング作業
粒径の減少はＲＸ−５９０２のバイオアベイラビリティーに対する主要パラメーターであるため、粒径を減少させる様々な方法を利用および最適化することができる。これらの方法として、微粉化（Mirconization）、機械ミリング、極低温ミリング、湿式ミリング法（アジテータおよびローリングミル）、顕微溶液化、および高圧均質化が挙げられる。湿式ミリング法は、これに続いて凍結乾燥または噴霧乾燥法のいずれかを行うことによって、固体形態を得ることができる。
【０１８３】
熱溶融押出し、噴霧乾燥分散（存在する賦形剤と共に）およびスプレー凝結を含めた方法により調製された非晶質製剤もまた使用できる。これらのすべての方法は、改善されたバイオアベイラビリティーを保有することが予測される非晶質形態を形成することができる。
【０１８４】
ＲＸ−５９０２の脂質製剤もまた利用することができる。脂質製剤は、油相中に予め可溶化されたまたは予め懸濁させたＡＰＩを提供し、ＲＸ−５９０２のメリットとなり得る。脂質ベースの製剤はまた、改善されたバイオアベイラビリティーを有することが予想される。
【０１８５】
４．１１  ＲＸ−５９０２の結晶構造
４．１１．１  ＲＸ−５９０２結晶のＸＲＰＤ実験
主要ピークを提供したＲＸ−５９０２結晶のＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）分析が表２に示されている。ピークおよび他のパラメーターの完全な列挙が実施例において提供されている。
【表２】
2018526392.tif 000008
【０１８６】
上記に示されている通り、ＲＸ−５９０２（形態１と指定）の結晶形態は、８．５６、１５．５７、１５．８５、１８．１４、２１．４８、２３．６６、２４．８５、および２７．４７でのピークにより特徴付けられる特徴的ピーク（２シータ度）を有する。形態１のＲＸ−５９０２は、８．５６、１４．３５、１５．３３、１５．５７、１５．８５、１６．９７、１８．１４、２１．４８、２１．８３、２３．６６、２４．４１、２４．８５、および２７．４７でのピーク（２シータ度）によりさらに特徴付けられ得る。形態１のＲＸ−５９０２のＸＲＰＤはまた、１０．３３、５．６９、５．５９、４．８９、４．１４、３．７６、３．５８、および３．２５のｄ−スペーシング（Å）を有するトレースにより特徴付けられる。形態１のＲＸ−５９０２のＸＲＰＤは、１０．３３、６．１７、５．７８、５．６９、５．５９、５．２２、４．８９、４．１４、４．０７、３．７６、３．６５、３．５８、および３．２５のｄ−スペーシング（Å）を有するトレースによりさらに特徴付けられる。
【０１８７】
４．１１．２  多形実験
ＲＸ−５９０２のバッチは様々な固体技術により特徴付けられた。供給された材料は、形態１として表される結晶性固体であった。この材料は、非吸湿性で、湿気への曝露に対して安定しており、さらなる開発に対して実行可能な形態を表す。ＲＸ−５９０２を含有する製剤のＸＲＰＤ分析は形態１と一致するピークを示し、これは、製剤プロセス中に形態変化が生じなかったことを示唆している。
【０１８８】
結晶性および非晶質ＲＸ−５９０２を使用して実施した多形スクリーニング実験は、ＡＰＩの複数の結晶形態を同定した。これらの多くは、結晶性の性質には乏しく、完全な評価のために再生成するのが困難であった。存在する異なる量の溶媒がこれらはチャネル溶媒和物型構造であるという可能性を高める一方で、これらの形態のいくつかのＸＲＰＤ回折図は類似点を示し、これらが構造的に関連していることを示唆している。
【０１８９】
様々な観察された固体を再調製することにおいて遭遇した問題は、ＲＸ−５９０２の多形景観の完全な理解を得ることは不可能であることを意味した。ＡＰＩが異なる形態で結晶化する傾向は、形態１の信頼できる調製を確実にするために厳密な結晶化プロトコールが必要とされることを意味する。このような手順に対して適切な溶媒を特定することを目的とする研究は、良好な候補としてジエチルエーテル、２−メチル−１−プロパノール、エタノールおよびＭＩＢＫを示唆した。
【実施例】
【０１９０】
５．実施例
以下の実施例は、例示的目的のために提示され、開示された主題の範囲を限定するために機能しないものとする。
【０１９１】
（実施例１）
ＲＸ−５９０２についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏの代謝実験
ＲＸ−５９０２のｉｎ  ｖｉｔｒｏの代謝における特定のチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）アイソザイムの関与を調査するために２つのｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験を実施した。第１の実験では、発現したＣＹＰ４５０アイソザイム（１Ａ２、２Ａ６、２Ｂ６、２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、３Ａ４および３Ａ５）とのインキュベーション後、ＲＸ−５９０２の損失を測定した。結果は、ＣＹＰ３Ａ４（８７％損失）およびＣＹＰ３Ａ５（５４％損失）との３０分間のインキュベーション後、ＲＸ−５９０２の損失を示しているが、任意の他のＣＹＰアイソザイムでは損失はほとんどない。第２の実験では、ＲＸ−５９０２を、ＣＹＰ４５０アイソザイムの選択的化学阻害剤の存在下で、プールしたヒト肝ミクロソームと共にインキュベートした。試験した阻害剤は１Ａ２、２Ａ６、２Ｂ６、２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、および３Ａ４／５に対して選択的であった。ＲＸ−５９０２代謝の顕著な阻害をＣＹＰ３Ａ４／５−選択的阻害剤（ケトコナゾール）の存在下で観察したが、有意な阻害は他のアイソザイムの阻害剤では観察されなかった。これらの実験を一緒にすると、ＲＸ−５９０２のＣＹＰ４５０媒介性代謝は、主にＣＹＰ３Ａ４／５アイソザイムによるものであり、他のＣＹＰ４５０アイソザイムを介した代謝はほとんどないことを示唆している。
【０１９２】
ＲＸ−５９０２の代謝および曝露が、ＣＹＰ３Ａ４／５活性を変化させる薬物との薬物−薬物相互作用に特に感受性があり得ることをデータは示している。したがって、ＣＹＰ３Ａ４／５誘導剤との同時投与がＲＸ−５９０２の血漿中濃度を減少させ得るのに対して、ＲＸ−５９０２とＣＹＰ３Ａ４／５阻害剤との同時投与は、ＲＸ−５９０２の血漿中濃度を増加させ得る。したがって、ＣＹＰ３Ａ４／３Ａ５阻害剤を受けている被験体は、ＲＸ−５９０２に対する誇張された薬理学的もしくは有毒性の応答を有し得る、またはＣＹＰ３Ａ４誘導剤を受けている被験体は減少したＲＸ−５９０２活性を有し得るという可能性がある。
【０１９３】
（実施例２）
ヒトにおけるＲＸ−５９０２の薬物動態、安全性および耐性
用量範囲の実験において、様々な経口投与におけるＲＸ−５９０２の薬物動態（ＰＫ）、安全性および耐性を評価した。進行性または転移性固形腫瘍を有する被験体に、ＲＸ−５９０２を含有するカプセル剤を、ＲＸ−５９０２の１日用量２５〜７７５ｍｇを週１回、２５０〜３００ｍｇを週３回、１５０〜３００ｍｇを週５回、または３００〜３５０ｍｇを週７回、６投薬サイクルまで投与した。各サイクルは、週１〜５用量のＲＸ−５９０２を３週間、これに続く１週間の休み、または週５〜７用量のＲＸ−５９０２を４週間、４週間のサイクルごとに休みなしからなる。１人の被験体を除いて全員が、投与前少なくとも８時間絶食した。１人の被験体は、摂食状態で３００ｍｇのＲＸ−５９０２を受けた。検証済みＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイを使用して、血漿中濃度を１日目および１５日目に、４８時間測定し、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ、バージョン６．４を使用して、非コンパートメント薬物動態学的パラメーターを計算した。
【０１９４】
薬物動態（ＰＫ）
単回投与後の一次ＰＫデータが図１（被験体＃１〜１１に対して）および表３に提示されている。
【表３】
2018526392.tif 000009
【０１９５】
絶食状態で３００ｍｇを投薬した被験体と比較して、摂食状態で３００ｍｇを投薬した被験体において有意により高い曝露が観察された（表３）。
【０１９６】
ＲＸ−５９０２は、時には明らかな、短い時間のずれ（０．２５時間）を示し、普通この後には、急な、上昇する血漿相が続いた。Ｔｍａｘはいくらか可変であり、投薬後１〜６時間で観察された。Ｔｍａｘ後、短い分布相が多くの場合観察され、この後、明らかな終末期が続いた。普通、ＡＵＣ０〜ｔ（０〜４８時間）の７５％超が２４時間までに観察された。明らかな終末Ｔ１／２は５．８〜２７．６時間の範囲であったが、大部分の個々の値は１３．０時間の平均値付近にあった。ＣｍａｘおよびＡＵＣ０〜ｔ（０〜４８時間）は用量と共にかなり直線的に増加した。ＡＵＣｌａｓｔは、用量比例的な方式で全体的に増加したが、Ｃｍａｘは比例的な方式より低く増加した。様々な用量および投薬頻度に対する臨床用ＣｍａｘおよびＡＵＣ範囲が表３に示されている。
【０１９７】
安全性および耐性
最も頻繁に報告された有害事象は、軽度の悪心、嘔吐および疲労であった。結果は、試験した用量レベルにおいて、ＲＸ−５９０２は十分許容されることを示している。
【０１９８】
（実施例３）
がんの異種移植片モデルにおけるＲＸ−５９０２の効力を評価するためのプロトコール
ヒトがん異種移植片マウスモデルにおけるＲＸ−５９０２の効力を試験する。９〜１０週齢、実験１日目の体重（ＢＷ）範囲が１５〜３０ｇである、雌ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ、ＨａｒｌａｎまたはＣＲＬ：ＮＵ（ＮＣｒ）−Ｆｏｘｎ１ｎｕ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）に、自由に水を与え（逆浸透、１ｐｐｍＣｌ）、および１８．０％粗タンパク質、５．０％粗脂肪、および５．０％粗繊維からなるＮＩＨ  ３１  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｎｄ  Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  Ｌａｂ  Ｄｉｅｔ（登録商標）を給餌する。マウスは、固定されたミクロアイソレーターにおいて、照明付きのＥｎｒｉｃｈ−ｏ’ｃｏｂｓ（商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｂｅｄｄｉｎｇの上で、１２時間光サイクル、２０〜２２℃（６８〜７２°Ｆ）および湿度４０〜６０％で飼育する。実験は、制限、家畜、外科手術、飼料および流体の調節、ならびに獣医学的ケアに関して、Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓの推奨に従う。
【０１９９】
様々なヒト腫瘍細胞株（例えば、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、Ｈ４６０、Ｈ６９、Ｃａｋｉ−１、ＣａＳｋｉ、ＭｉａＰａｃａ２、ＢｘＰＣ３およびＣｏｌｏ  ２０５細胞［ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ］）をＡＴＣＣの指示に従い培養する。加湿したインキュベーター内、３７℃で、５％ＣＯ２および９５％空気の大気中、組織培養物フラスコ内で腫瘍細胞を培養する。
【０２００】
急激な増殖の間に細胞を収集し、リン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁させる。各試験動物は、右の側腹部に５×１０６腫瘍細胞の皮下（ｓ．ｃ．）注射を受け、平均腫瘍サイズが８０〜３００ｍｍ３の標的範囲に接近する間に腫瘍増殖をモニターする。腫瘍が標的サイズに到達したら、マウスを無作為抽出して、いくつかの群に分け（ｎ＝１０〜２０）、ＲＸ−５９０２または陽性対照（例えば、ゲムシタビン）または陰性対照（例えば、ビヒクル、生理食塩水）の様々なレジメンを用いた処置を開始する。実験が終わるまで腫瘍および体重を定期的に測定する。
【０２０１】
腫瘍は、ノギスを使用して２つの寸法を測定し、式：
【数１】
2018526392.tif 000010
（式中、ｗ＝腫瘍の幅およびｌ＝腫瘍の長さ（ｍｍ））を使用して容積を計算する。腫瘍重量は、１ｍｇが、１ｍｍ３の腫瘍体積と同等であると想定して予測することができる。
【０２０２】
処置は、特定の細胞株の確立した皮下腫瘍を有する８群のマウス（ｎ＝１０〜２０／群）において１日目に開始する。実験設計に従い各群を処置する。すべての用量は体重に対して調整する。各群の動物は、効力およびサンプリング目的に対して分割する。ビヒクル対照およびサンプリング目的のための処置なしと指定された群もまた存在する。
【０２０３】
実験１日目には、処置なしの群のすべての動物を腫瘍および全血についてサンプリングする。追加的に、他の群からの４匹の動物を、第１の投薬の２、８および２４時間後、ならびに第２の投薬の２４時間後にサンプリングする。マウスを、イソフルラン（isofluorane）麻酔下で末端心穿刺により屠殺する。全血液量を、リチウムヘパリン抗凝血剤を含有するチューブに収集する。ＰＢＭＣに対する抗凝血剤としてリチウムヘパリンを使用して、各血液試料を個々に処理して血漿を得る。腫瘍を収集し、半分に分割し、一方の部分は１０％中性緩衝ホルマリン液（ＮＢＦ）の中で２４時間固定し、次いで７０％エタノールに移し、他方の半分は瞬間凍結する。血漿および腫瘍の凍結した試料は−８０℃で貯蔵する。
【０２０４】
１５日目からのデータを使用して処置効力を決定する。１５日目のＭＴＶ（ｎ）、すなわち、動物の数ｎに対する平均腫瘍体積を各群に対して決定する。パーセント腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）は、指定された対照群（ビヒクル投与）のＭＴＶと、薬物処置した群のＭＴＶとの差として定義され、対照群のＭＴＶのパーセンテージとして表現される：
％ＴＧＩ＝［１−（ＭＴＶ薬物で処置／ＭＴＶ対照）］×１００
【０２０５】
ＴＧＩ分析に対するデータセットは、処置に関連する（ＴＲ）または処置に関連しない（ＮＴＲ）の原因により死んだものを除いて、群内のすべての動物を含む。本アッセイにおいて少なくとも６０％ＴＧＩをもたらす薬剤は、潜在的に治療的活性があると考えられる。
【０２０６】
動物は７１日目まで腫瘍増殖について個々にモニターする。実験プロトコールは、処置群対対照群において、エンドポイント（ＴＴＥ）までの平均時間に基づき、腫瘍増殖遅延アッセイを特定する。その腫瘍が２０００ｍｍ３容積エンドポイントに到達したら、腫瘍進行（ＴＰ）のために各動物を安楽死させる。各マウスに対するエンドポイント（ＴＴＥ）までの時間を以下の方程式：
【数２】
2018526392.tif 000011
（式中、ｂは切片であり、ｍは、対数変換した腫瘍増殖データセットの直線回帰により得た線の傾きである）を用いて計算する。データセットは、実験のエンドポイント容積を上回る第１の観察およびエンドポイント容積の到達直前の３つの連続した観察で構成される。エンドポイントに到達しない任意の動物は、実験の終わりに安楽死させ、実験最終日（７１日）と等しいＴＴＥ値を割り当てる。対数変換した、計算したＴＴＥが、エンドポイントに到達する前の日よりも先行する場合、または腫瘍体積エンドポイントに到達する日を超える場合には、線形補間を実施して、ＴＴＥを近似する。処置に関連する（ＴＲ）原因で死んだと決定された任意の動物には、死亡日と等しいＴＴＥ値を割り当てる。処置に関連しない（ＮＴＲ）原因で死んだ任意の動物はＴＴＥ分析から除外する。
【０２０７】
７１日目には、ＭＴＶ（ｎ）を、最終日まで生存し、その腫瘍が容積エンドポイントに到達しなかった動物数ｎの平均腫瘍体積として定義する。処置に関連した（ＴＲ）原因で死んだと決定された任意の動物には、死亡日と等しいＴＴＥ値を割り当てる。処置に関連しない（ＮＴＲ）原因で死んだ任意の動物は分析から除外する。処置の結果は、対照群と比較した場合の、処置群に対する平均ＴＴＥの増加として定義される、日数で表現される腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ）：
ＴＧＤ＝Ｔ−Ｃ
または対照群の平均ＴＴＥのパーセンテージとして表現される：
【数３】
2018526392.tif 000012
（式中、Ｔ＝処置群に対する平均ＴＴＥ、およびＣ＝対照群に対する平均ＴＴＥ）から評価する。
【０２０８】
処置効力はまた退縮反応の数からも決定する。処置は、動物において腫瘍の部分退縮（ＰＲ）または完全退縮（ＣＲ）を引き起こし得る。ＰＲ反応において、腫瘍体積は、実験の過程で３つの連続した測定値がそのＤ１容積の５０％またはそれ未満であり、これらの３つの測定のうちの１つまたは複数が、１３．５ｍｍ３と等しいまたはこれより大きい。ＣＲ反応では、腫瘍体積は、実験の過程において、３つの連続した測定値が１３．５ｍｍ３未満である。実験最終日にＣＲ反応を有する任意の動物は腫瘍のない生存動物としてさらに分類される。
【０２０９】
毒性評価のため、動物は実験の最初の５日間毎日秤量し、その後週２回秤量する。マウスは、任意の有害な、処置に関連した副作用の明白な徴候について頻繁に観察し、観察された場合には、毒性の臨床的徴候を記録する。
【０２１０】
許容される毒性は、実験中群平均体重の２０％未満の減少および１０匹の処置した動物の中の１匹以下の処置に関連した（ＴＲ）死亡と定義される。より大きな毒性をもたらす任意の投与レジメンは、最大耐用量（ＭＴＤ）を超えると考えられる。臨床的徴候および／もしくは剖検により証明されるように処置の副作用に起因する場合、または投薬期間中もしくは最終投薬から１４日以内の未知の原因によるものであった場合、死亡はＴＲと分類される。死亡が処置の副作用に関係しているという証拠がない場合、死亡は処置に関連しない（ＮＴＲ）に分類される。
【０２１１】
統計分析およびグラフによる分析のためにＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用Ｐｒｉｓｍ  ６．０５（ＧｒａｐｈＰａｄ）を利用する。複数の群に対するＭＴＶ値を、ノンパラメトリックＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験およびｐｏｓｔ  ｈｏｃ  Ｄｕｎｎの多重比較検定と比較する。両側統計分析をＰ＝０．０５で行う。Ｐｒｉｓｍは、結果をＰ＞０．０５では有意でない（ｎｓ）、０．０１＜Ｐ≦０．０５では有意である（「＊」で表す）、０．００１＜Ｐ≦０．０１では非常に有意である（「＊＊」）およびＰ≦０．００１では極めて有意である（「＊＊＊」）と報告する。統計試験は、有意性の試験であり、群間のサイズの差の推定値を提供するものではないので、すべてのレベルの有意性は、この報告のテキストの範囲内で、有意であるか、または有意ではないかのいずれかで記載される。
【０２１２】
生存は、ＴＴＥ値に基づき、カプラン−マイヤー方法により分析される。ログランク（マンテル−コックス）およびゲーハン−ブレスロウ−ウィルコクソン検定は、ＴＴＥ値に基づき、２つの群間の全生存経験（生存曲線）の差の有意性を決定する。カプラン−マイヤープロットおよび統計試験は、同じデータセットを共有し、ＮＴＲ死亡として記録された任意の動物を排除する。個々のマウスに対するＴＴＥ値を群ごとに示すように散布図を構築する。このプロットは、すべての他の数値から除外されているＮＴＲ死亡を示す。群の平均腫瘍体積を時間の関数としてプロットする。動物が腫瘍サイズまたはＴＲ死亡により実験から外された場合、記録されたその最終の腫瘍体積は、その後の時点における平均容積を計算するために使用されるデータに含まれる。２つのＴＲ死亡が同じ群内で生じた後で、腫瘍増殖曲線は切り捨てる。実験の経過にわたる群平均体重（ＢＷ）の変化は、Ｄ１からのパーセント変化、±ＳＥＭとしてグラフ化する。群内の評価可能なマウスの半分超が実験から外された後、腫瘍増殖およびＢＷ変化曲線は切り捨てる。
【０２１３】
（実施例４）
腎細胞癌異種移植片モデルにおけるＲＸ−５９０２の効力
実施例３に記載のプロトコールに従い、ヒト腎臓腫瘍異種移植片（Ｃａｋｉ−１）を有するマウスにおいて、腫瘍増殖に対するＲＸ−５９０２の作用を試験した。ビヒクル処置した群と比較して、処置した群におけるエンドポイント腫瘍体積までの平均時間の増加として、腫瘍増殖遅延を測定した。ＲＸ−５９０２の効力を２つの異なる投薬スキームを使用して決定した：週２０〜１６０ｍｇ／ｋｇの投薬を４週間（図３）、または毎日５０〜７０ｍｇ／ｋｇ（５日の投薬／２日の休み）を３週間（図２）。ＲＸ−５９０２の週１６０ｍｇ／ｋｇの投薬は、７５％ＴＧＤ（Ｐ＜０．００１）をもたらした（図３）。ＲＸ−５９０２の毎日の投与は用量依存性ＴＧＩ（８０および９６％；２１日目）およびＴＧＤ（６８および１０４％、Ｐ＜０．００１）をもたらし（図２）、両用量において動物の全生存を伸ばした（Ｐ＜０．０００１）（データは示されていない）。毎日７０ｍｇ／ｋｇの用量では、６／１０の動物が部分的な腫瘍退縮を実証し、１／１０が完全な腫瘍退縮を実証した。ＲＸ−５９０２は、投薬スキームのいずれにおいても、体重増加の減少、処置に関連した死亡、または臨床所見をもたらさなかった。スニチニブ（この実験でのポジティブコントロール；６０ｍｇ／ｋｇ；毎日、２１日間）は、本明細書でのＣａｋｉ−１モデルを立証している両方のｉｎ  ｖｉｖｏ実験に対してＴＧＤをもたらした。これらのデータは、腎細胞がんにおけるＲＸ−５９０２の潜在的治療的活性および生存の延長を支持している。結果はまた、ヒトにおけるより低い１日用量でのより頻繁な投薬が、腎臓がんにおけるＲＸ−５９０２に対してより有効な投与スケジュールとなり得ることを示唆している。
【０２１４】
異種移植片実験の結果（実施例４〜９に記載）は表４に要約されている。
【表４】
2018526392.tif 000013
＾はＴＧＤ％を表す；＊はＴＧＩ％を表す。両方の値が報告される場合がある。
【０２１５】
（実施例５）
膵臓がん異種移植片モデルにおけるＲＸ−５９０２の効力
実施例３に記載のプロトコールに従い、ヒト膵臓腫瘍異種移植片（ＭｉａＰａｃａ−２）を有するマウスにおいて、腫瘍増殖に対するＲＸ−５９０２の作用を試験した。ビヒクル処置した群と比較して、処置した群において腫瘍増殖を測定した。結果は、５０または７０ｍｇ／ｋｇのＲＸ−５９０２の週５日の投与で顕著な効力を示し（表４を参照）、膵臓がんにおいて、ヒトにおける毎日の投薬が、ＲＸ−５９０２に対する有効な処置スケジュールとなり得ることを示唆している。
【０２１６】
（実施例６）
結腸直腸がん異種移植片モデルにおけるＲＸ−５９０２の効力
実施例３に記載のプロトコールに従い、ヒト結腸直腸腫瘍異種移植片（Ｃｏｌｏ２０５）を有するマウスにおいて、腫瘍増殖に対するＲＸ−５９０２の作用を試験した。ビヒクル処置した群と比較して、処置した群において腫瘍増殖を測定した。結果は、１週当たり３２０および６００ｍｇ／ｋｇのＲＸ−５９０２の投与で顕著な効力を示し（表４を参照）、結腸直腸がんにおいて、ＲＸ−５９０２が有効な処置となり得ることを示唆している。
【０２１７】
（実施例７）
乳がん異種移植片モデルにおけるＲＸ−５９０２の効力およびリン酸化Ｐ６８の役割
実施例３に記載のプロトコールに従い、ヒト乳房腫瘍異種移植片（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を有するマウスにおいて、腫瘍増殖に対するＲＸ−５９０２の作用を試験した。ビヒクル処置した群と比較して、処置した群において腫瘍増殖を測定した。結果は、１週当たり１６０、３２０、および６００ｍｇ／ｋｇのＲＸ−５９０２の投与での顕著な効力（表４；図１２を参照）、および処置したマウスにおける生存の延長（図１３）を示している。これらの結果は、ＲＸ−５９０２が乳がんの処置および生存の延長に有効となり得ることを示唆している。
【０２１８】
ｐ６８をノックダウンすることによって、がん細胞増殖を阻害するＲＸ−５９０２の能力において、Ｔｙｒ５９３上のリン酸化したｐ６８が主要な役割を果たしたかどうかも決定した。ｐ６８−ｓｉＲＮＡは、トリプルネガティブ（ＴＮ）乳がん細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１において、Ｔｙｒ５９３上のリン酸化したｐ６８ならびにｐ６８の発現を効率的にダウンレギュレートした。ｐ６８−ｓｉＲＮＡ−形質移入した細胞を、ＩＣ５０濃度のＲＸ−５９０２に曝露することによって、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＲＸ−５９０２の細胞毒性作用から保護し、これは、Ｔｙｒ５９３上のリン酸化したｐ６８がＲＸ−５９０２の細胞毒性作用に対する主要分子であることを示している。
【０２１９】
（実施例８）
シスプラチン耐性卵巣がん異種移植片モデルにおけるＲＸ−５９０２の効力
実施例３に記載のプロトコールに従い、ヒト卵巣腫瘍異種移植片（Ａ−２７８０）を有するマウスにおいて、腫瘍増殖に対するＲＸ−５９０２の作用を試験した。ビヒクル処置した群と比較して、処置した群において腫瘍増殖を測定した。結果は、１週当たり１６０、３２０、および６００ｍｇ／ｋｇのＲＸ−５９０２投与で顕著な効力を示している（表４を参照）。４０および７０ｍｇ／ｋｇのＲＸ−５９０２を毎日投与した卵巣腫瘍異種移植片（ＳＫ−ＯＶ３）の別のモデルで同様の結果を得た（表４）。これらの結果は、ＲＸ−５９０２がヒト卵巣がんにおいて有効な処置となり得ることを示唆している。
【０２２０】
（実施例９）
非小細胞肺がん異種移植片モデルにおけるＲＸ−５９０２の効力
実施例３に記載のプロトコールに従い、ヒト非小細胞肺腫瘍異種移植片（Ａ５４９）を有するマウスにおいて、腫瘍増殖に対するＲＸ−５９０２の作用を試験した。ビヒクル処置した群と比較して、処置した群において腫瘍増殖を測定した。結果は、１週当たり１６０、３２０、および６００ｍｇ／ｋｇのＲＸ−５９０２の投与で効力を示し（表４を参照）、ＲＸ−５９０２が肺がんにおいて有効な処置となり得ることを示唆している。
【０２２１】
（実施例１０）
同系ＭＣ３８ネズミ結腸がん異種移植片モデルにおけるＲＸ−５９０２の効力
以下に記載されている方法に従い、ＭＣ３８ネズミ結腸がんを有する雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを使用した同系モデルにおいて、腫瘍増殖に対するＲＸ−５９０２の作用を試験した。対照（ビヒクル処置した）群と比較して、処置群において腫瘍増殖を測定した（投薬スキームおよび処置レジメンについては、以下の表５を参照）。これらのデータは、プログラム死受容体１（ＰＤ−１）阻害剤、ＲＭＰ１−１４へのＲＸ−５９０２の添加は、腫瘍増殖の阻害において相加効果を有したことを実証している（ＲＸ−５９０２単独で９０％、ＲＭＰ１−１４単独で９３％であるのに対して、２種の薬剤を組み合わせて９９％［Ｐ＜０．０１対対照群］。２種の薬剤の組合せはまた、ＲＭＰ１−１４単独での群では４匹の動物が部分退縮および完全退縮を有し、２匹が腫瘍なしでの生存を示したのと比較して、部分退縮および完全退縮を有するより多数のマウス（６匹）をもたらし、４匹の動物が腫瘍なしでの生存を示した。組合せ群では、マウスに対するいかなる有害作用もなく、すべての結果が得られた。この実験では、ＲＸ−５９０２とＰＤ−１阻害剤の組合せが、腫瘍増殖における有意な減少をもたらし、任意の有害事象の不在下で、マウスにおいて部分奏効および完全奏効ならびに腫瘍なしでの生存をもたらすことを実証している。
【表５】
2018526392.tif 000014
【０２２２】
本実験は、投薬が開始された実験（Ｄ１）日目に皮下ＭＣ３８腫瘍（平均腫瘍体積の範囲：６６〜６８ｍｍ３）を保持する、雌のＣ５７ＢＬ／６マウスの５つの群（ｎ＝１群当たり１０匹）からなった。ビヒクルは経口投与した（ｐ．ｏ．）。ＲＸ−５９０２は、８４．３４ｍｇ／ｋｇ（７０ｍｇ／ｋｇの実剤投与）をｐ．ｏ．投与した。抗ＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４）は、１００μｇ／動物を腹腔内投与した（ｉ．ｐ．）。群１のマウスは対照として機能させ、ＰＢＳ（ビヒクル）を、投与５日間と休み２日間で、３サイクル（（５／２）×３）受けた。群２は、ＲＸ−５９０２（５／２）×３を受けた。群３は、抗ＰＤ−１を週２回、２週間（ｂｉｗｋ×２）を受けた。群４は、ＲＸ−５９０２（５／２）×３および抗ＰＤ−１  ｂｉｗｋ×２を受けた。実験エンドポイントは１５００ｍｍ３の腫瘍体積または４５日のどちらか早い方であった。腫瘍測定は、週２回、４５日目まで行い、個々の動物を腫瘍体積エンドポイントに到達した時点で実験から外した。
【０２２３】
部分的処置結果は、ＴＧＩ分析に対して選択された２８日目における、処置したマウスと対照マウスとの間での平均腫瘍体積（ＭＴＶ）のパーセント差として定義されるパーセント腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）に基づいた。結果を分析し、Ｐ≦０．０５において統計学的に有意とみなされた。少なくとも６０％ＴＧＩをもたらした処置は、潜在的な治療的活性を有すると考えられた。加えて、処置におけるエンドポイント（ＴＴＥ）への平均時間の増加の尺度である腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ）から効力を、対照群と比較して決定した。実験での生存動物の数、部分退縮（ＰＲ）および完全退縮（ＣＲ）反応、ならびに生存における差異のログランク有意性に基づき反応をさらに評価した。様々な処置の耐性を体重（ＢＷ）測定ならびに臨床症状および処置に関連した（ＴＲ）副作用に対する頻繁な観察により評価した。
【０２２４】
２８日目に、対照群１に対する平均腫瘍体積は１２２６ｍｍ３であり、個々の腫瘍は１４〜１８００ｍｍ３の範囲であった。対照群１の中の７つの腫瘍は、平均ＴＴＥ、２９．７日で容積エンドポイントに到達し、４５日間の実験で最大Ｔ−Ｃ、１５．３日（５２％ＴＧＤ）を確立した。対照ＴＴＥは、２６．９〜４５．０日の範囲であった。対照群のばらつきは、統計的有意性を達成する可能性を低減した。３匹の生存動物のＭＴＶは１４ｍｍ３であり、２件のＰＲが存在した。
【０２２５】
ＲＸ−５９０２の投与は、有意な９０％ＴＧＩ（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）をもたらした。この治療は、４４．８日の平均ＴＴＥまたは有意性のない５１％ＴＧＤをもたらした。５匹の動物がＤ４５において１４ｍｍ３のＭＴＶを保持したままであり、３件のＰＲが存在した。抗ＰＤ−１での処置は、有意な９３％ＴＧＩ（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）をもたらした。この治療は、６匹の生存動物および４５．０日の割り当てられたＴＴＥ、および最大可能な５２％のＴＧＤをもたらした。結果は有意性がなかった。Ｄ４５でのＭＴＶは１４ｍｍ３であり、１件のＰＲおよび３件のＣＲが存在した。後者の２匹の動物は腫瘍のない生存動物として実験を終えた（ＴＦＳ）。
【０２２６】
ＲＸ−５９０２および抗ＰＤ−１との併用療法は９９％ＴＧＩをもたらした。この結果は、対照群（Ｐ＜０．０１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）と比較して有意であったが、抗ＰＤ−１単剤治療とは有意に異ならなかった。この二重治療は４５．０日の平均ＴＴＥまたは最大可能な５２％のＴＧＤが割り当てられた。すべての１０匹の動物が、１４ｍｍ３のＭＴＶで生存した。１件のＰＲおよび５件のＣＲが存在し、このうち４件がＴＦＳであった。結果は、対照（Ｐ＜０．０１、ログランク）ならびに単剤治療（両方の比較に対してＰ＜０．０５、ログランク）と比較した場合、有意であった。
【０２２７】
（実施例１１）
Ｙ５９３リン酸化Ｐ６８のβ−カテニン依存性ＡＴＰＡＳＥ活性およびβカテニンにより調節された遺伝子の発現に対するＲＸ−５９０２の作用
材料および方法
細胞培養物および抗体
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、およびＷＩ−３８細胞をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から入手し、販売元の指示に従い培養した。抗ｐ６８抗体および抗Ｙ５９３−ｐ６８抗体をＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）およびＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）からそれぞれ購入した。β−アクチン、サイクリンＤ１、ｐ−ｃ−Ｊｕｎおよびｃ−Ｍｙｃに対する抗体をＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）から購入した。抗ホスホ−チロシン抗体およびＨＲＰコンジュゲートＧＡＰＤＨ抗体をＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）から入手した。組換え型β−カテニンおよびｐ６８タンパク質をＣｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍａｒｔ（Ｓｈｉｒｌｅｙ、ＮＹ）およびＯｒｉｇｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）からそれぞれ購入した。
【０２２８】
組換え型タンパク質
組換え型β−カテニンをさらなる処理なしに使用したが、組換え型ｐ６８タンパク質は、フィルター結合アッセイに対して、ｐ６８として、またはｃ−Ａｂｌによりリン酸化したものとして使用した。組換え型ｃ−ＡｂｌはＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から入手した。
【０２２９】
薬物処置
ＲＸ−５９０２をＤＭＳＯに溶解して、２ｍＭのストック溶液を調製した。ストック溶液を−２０℃で貯蔵し、媒体で希釈して作業用濃度を調製した。
【０２３０】
ＲＸ−５９０２結合タンパク質の同定
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を６ウェルプレートにプレーティングし、様々な濃度のＲＸ−５９０２（０、０．１、１および１０μＭ）で１時間処理した。細胞を、プロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤を含有するｐ−ＭＥＲ緩衝液に氷上で溶解した。細胞溶解物をサーモリシンプロテアーゼ（１：１，５００比率）で、ＲＴで１０分間処理し、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ溶液の添加により反応を停止した。反応混合物をＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色により視覚化された１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。質量分析配列分析からいくつかの候補タンパク質を同定した後、ＲＸ−５９０２と相互作用したタンパク質をウェスタンブロット分析により確認した。
【０２３１】
フィルター結合分析
フィルター結合実験は他の箇所で以前に記載されている（Coombsら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、７５巻：５２９１〜５２９５頁（１９７８年）。簡単に説明すると、チロシンリン酸化あり／なしで、組換え型ｐ６８  ＲＮＡヘリカーゼを、ＰＢＳと共に３Ｈ標識したＲＸ−５９０２（１０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）に添加した。３Ｈ標識したＲＸ−５９０２はＱｕｏｔｉｅｎｔ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃａｒｄｉｆｆ、ＵＫ）により合成された。室温で３０分間インキュベーションした後、結合混合物をニトロセルロース膜に充填した。膜をＰＢＳで５回洗浄し、次いで真空により乾燥させた。ｐ６８のリン酸化あり／なしで、ｐ６８に結合したＲＸ−５９０２の量を３Ｈシンチレーション計数により決定した。バックグラウンド３Ｈシンチレーション計数として、同じ手順を、ｐ６８  ＲＮＡヘリカーゼの添加なしで３Ｈ標識したＲＸ−５９０２単独で行い、３Ｈ標識したＲＸ−５９０２の添加なしで試料ｐ６８  ＲＮＡヘリカーゼ単独で行った。ｐ６８の化合物への結合パーセンテージを計算し、濃度に対してプロットした。ＲＸ−５９０２に結合したｐ６８の５０％での濃度により解離定数（Ｋｄ）を予測し、直線回帰分析により計算した。
【０２３２】
ＡＴＰａｓｅアッセイ
ＡＴＰ加水分解中、直接的比色分析のアッセイを使用して、放出された無機ホスフェートを測定することによってＡＴＰａｓｅ活性を決定した（Shinら、Cancer  Res.、６７巻：７５７２〜７５７８頁（２００７年）；Yangら、Cell、１２７巻：１３９〜１５５頁（２００６年））。２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、約１〜２μｇの適当な基質、４ｍＭ  ＡＴＰ、および１０μｌのヘリカーゼを含有する５０μｌ反応容積の中で、典型的なＡＴＰａｓｅアッセイを行った。ＡＴＰａｓｅ反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、１ｍｌのマラカイトグリーン−モリブデン試薬を反応混合物に添加し、反応物を室温で正確に５分間さらにインキュベートした。次いで、６３０ｎｍでの吸収（Ａ）を測定した。公知のホスフェート濃度に対比して、Ａ６３０ｎｍの検量線におけるＡ６３０ｎｍをマッチングさせることによって、無機ホスフェートの濃度を決定した。このアッセイに使用したタンパク質、ｐ６８またはホスホ−ｐ６８は、以前に報告された手順と同様に社内で調製した（Yangら、Protein  Expr.  Purif.、３５巻：３２７〜３３３頁（２００４年））。ＲＸ−５９０２なしでのホスホ−ｐ６８のＡＴＰａｓｅ活性をゼロパーセント阻害として定義することにより、阻害のパーセンテージを計算し、Ｋａｌｅｄｉａ  Ｇｒａｐｈ  ソフトウエアプログラム（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｒｅａｄｉｎｇ、ＰＡ）を使用して非直線回帰分析によりＲＸ−５９０２のＩＣ５０を計算した。
【０２３３】
ウェスタンブロット法
タンパク質ミックスまたは細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。膜を遮断緩衝液（５％ＢＳＡを含有する１×ＴＢＳＴ）により、室温で１時間遮断した。簡単に洗浄した後、膜を遮断緩衝液中で一次抗体と共に４℃で終夜インキュベートした。一次抗体中でのインキュベーション後、膜を１×ＴＢＳＴで３回洗浄し、続いて、遮断緩衝液中でＨＲＰコンジュゲート二次抗体と共に、室温で１時間インキュベートした。膜を再度３回洗浄し、ＥＣＬシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）により視覚化した。
【０２３４】
結果
確立された標的同定方法ＤＡＲＴＳアッセイ（Lomenickら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、１０６巻：２１９８４〜２１９８９頁（２００９年））を使用して、がん細胞においてＲＸ−５９０２と相互作用する標的タンパク質を発見した。ＤＡＲＴＳ法は、６０ｋＤａ周辺で移動度を有するバンドが、ＲＸ−５９０２との相互作用によるプロテアーゼ切断から保護されていたことを示した（図４）。この保護されたタンパク質を同定するため、対照と共にバンドをスライスし、ＰｒｏｔＴｅｃｈ（Ｐｈｏｅｎｉｘｖｉｌｌｅ、ＰＡ）製のＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて分析した。ＲＸ−５９０２処理により保護されたタンパク質を確認するため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて同様の移動度を有する、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析からのいくつかの潜在的候補に対する抗体を使用してウェスタンブロット分析を行った。明確に、この保護されたバンドは、ｐ６８  ＲＮＡヘリカーゼに対する抗体により認識されており（図５）、これは、ＲＸ−５９０２が細胞中でｐ６８  ＲＮＡヘリカーゼと相互作用し、サーモリシンによる分解からｐ６８を保護することができることを示した。ＲＸ−５９０２のｐ６８との相互作用を検証するため、３Ｈ標識したＲＸ−５９０２を使用した。３Ｈ標識したＲＸ−５９０２の組換え型ｐ６８タンパク質との相互作用およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでのチロシルリン酸化組換え型ｐ６８タンパク質との相互作用を、フィルター結合アッセイにより調査した（Coombsら、上記を参照）。ウェスタンブロット分析を介して、ｐ６８は、チロシン残基上でリン酸化したことが確認された（図６）。フィルター結合アッセイは、ＲＸ−５９０２が予測されたＫｄを１９ｎＭ周辺で有するＹ５９３ホスホ−ｐ６８と相互作用するが、ＲＸ−５９０２はフィルター結合実験において非リン酸化ｐ６８と相互作用しないことを明確に示した（図７；正方形および三角形は重複実験を表す）。
【０２３５】
ｐ６８のＡＴＰａｓｅ活性に対するＲＸ−５９０２の作用を調査した。これを行うために、ＲＸ−５９０２および酵母から抽出した全ＲＮＡの存在下で、組換え型ｐ６８のＡＴＰａｓｅ活性を測定した。ＲＸ−５９０２は、０．２μＭにおいて、ｐ６８  ＲＮＡヘリカーゼのＲＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅ活性に影響を与えず、さらに、２０μＭなどの高濃度でも、ＲＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅ活性は３０％未満阻害されており（図８）、これは、ＲＸ−５９０２がｐ６８のＲＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅ活性にほとんど作用がなかったことを示した。このデータにより、ＲＸ−５９０２がフィルター結合アッセイにおいて非リン酸化ｐ６８と相互作用しなかったことを確認することができた（図７）。
【０２３６】
結果は、ホスホ−ｐ６８のβ−カテニン依存性ＡＴＰａｓｅ活性が０．２μＭのＲＸ−５９０２の存在下で主として減弱したことを示している（図９）。ＲＸ−５９０２のより低い濃度で実験を繰り返して、ＩＣ５０を計算した。β−カテニン依存性ＡＴＰａｓｅ活性の阻害に対するＲＸ−５９０２のＩＣ５０は、６１ｎＭであると算出され（図１０）、これは、ＲＸ−５９０２はホスホ−ｐ６８／β−カテニン相互作用を潜在的に破壊することを示している。
【０２３７】
ＲＸ−５９０２はＹ５９３ホスホ−ｐ６８に直接結合するので、ＲＸ−５９０２での細胞の処理は、ホスホ−ｐ６８／β−カテニンの相互作用を妨害し、ｐ−ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−ＭｙｃおよびサイクリンＤを含めた、ホスホ−ｐ６８／β−カテニン相互作用により調節されているいくつかの増殖関連遺伝子の発現に結果的に影響を与えると仮定された。したがって、ＲＸ−５９０２で処理した細胞内での、サイクリンＤ１およびｃ−Ｍｙｃの発現、ならびにｃ−Ｊｕｎのリン酸化を分析した。がん細胞株、ＳＫ−ＭＥＬ−２８およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ならびに正常な胎児肺線維芽細胞、ＷＩ−３８を使用した。２０ｎＭ  ＲＸ−５９０２はタンパク質レベルを変化させなかったが、７０ｎＭ  ＲＸ−５９０２は、全ｐ６８タンパク質レベルを変化させることなく、ＳＫ−ＭＥＬ−２８において、サイクリンＤ１とｃ−Ｍｙｃの両方の発現の低減およびｃ−Ｊｕｎのリン酸化の低減をもたらした。２０ｎＭと７０ｎＭ  ＲＸ−５９０２の両方を用いたＭＤＡ−ＭＢ−２３１において、タンパク質レベルの同様の変化を検出した。ＲＸ−５９０２は、ＷＩ−３８細胞内のサイクリンＤ１もしくはｃ−Ｍｙｃの発現またはｃ−Ｊｕｎのリン酸化には、７０ｎＭでも任意の有意な変化をもたらさなかった（図１１）。結果は、ＲＸ−５９０２でのがん細胞の処理が、β−カテニン経路により調節されていることが公知のある特定の遺伝子、例えば、ｃ−Ｍｙｃ、サイクリンＤ１およびｐ−ｃ−Ｊｕｎなどの発現のダウンレギュレーションをもたらしたことを実証している。したがって、実験は、ＲＸ−５９０２をＹ５９３ホスホ−ｐ６８  ＲＮＡヘリカーゼに直接結合させることによる、Ｙ５９３ホスホ−ｐ６８ヘリカーゼ−β−カテニン相互作用の阻害が、この化合物の抗がん活性に寄与し得ることを示している。
【０２３８】
（実施例１２）
ヒトにおけるＲＸ−５９０２の効力、安全性および耐性
様々な用量および頻度でのＲＸ−５９０２の効力、安全性および耐性を評価する。実験の第１相部分では、進行性固形悪性腫瘍を有する被験体が登録される。実験の第１相部分の間に、最大耐用量（ＭＴＤ）または推奨される第２相の用量（ＲＰ２Ｄ）およびスケジュールを決定し、適格な被験体においてＲＸ−５９０２の薬物動態を特徴付ける。進行性悪性腫瘍を有する被験体には、ＲＸ−５９０２を含有するカプセル剤を、１２５〜１０５０ｍｇ／日の用量で週１、３、５、または７日、３週間投与し、各４週のサイクルの間に休み１週間を設ける、または４週のサイクルの間に１週間の休みを設けずに４週間投与する。用量段階的増大は、１用量当たり被験体１人を処置する加速設計で開始し（Simonら、J.  Natl.  Cancer  Inst.、８９巻（１５号）：１１３８〜４７頁（１９９７年））、これに続いて、単一の関連した２等級またはそれ超の有害事象が生じた後、改変したＦｉｂｏｎａｃｃｉ数列を使用して標準の３＋３設計を用いる。
【０２３９】
第２相部分では、被験体は、２つの診断群のうちの１つに登録される：トリプルネガティブ乳がんまたは白金耐性／不応性／再発性の卵巣がん。実験の第２相部分は、第１相で特定された用量およびスケジュールを使用し、２段階設計に従う。各腫瘍の指標において１０人の応答評価可能な被験体が登録され、最低４サイクルの治療を完了する機会を有するか、または進行性の疾患により治療を中断した場合、中間分析を行う。第２相の第２段階では、その疾患群に登録された最初の１０人の応答評価可能な患者の中で少なくとも２つの応答が観察されれば、疾患群に対する登録を進める。約４０人の追加の被験体が疾患の指標のそれぞれに登録される。第２相の第２段階では、第１段階を通過して継続する疾患群において、全体的な応答率および無増悪生存率をさらに評価する。表６は、潜在的な用量およびスケジュールを要約しているが、このスケジュールは、安全性および耐性データに基づき変化し得る。
【表６】
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【０２４０】
（実施例１３）
ＲＸ−５９０２の小規模生産（バッチ３５４４４Ａの調製）
（実施例１３Ａ）
化合物Ａの生成
１００Ｌ反応器に、１，２−ジアミノ−４−フルオロベンゼン（１．７５ｋｇ、１３．８ｍｏｌ、ＣｈｅｍｉＫ）、シュウ酸（１．２５ｋｇ、１３．９ｍｏｌ）、１１．４ｋｇの水および３．８ｋｇの濃塩酸（３Ｍ  ＨＣｌ溶液、３．２８当量ＨＣｌ）を充填した。暗色の混合物を約２５時間、加熱還流（９５〜１００℃）した。撹拌しながらアリコート（１ｍＬ）を採取し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（３０ｍＬ）でｐＨ８に中和した。ＨＰＬＣ分析は、出発材料が完全に消費されたことを示した。
【０２４１】
混合物を加熱から外し、室温まで冷却させて、次いで冷水（１４ｋｇ）を添加した。暗色の固体が沈殿し、これを真空濾過により収集した。フィルターケーキを冷水（１２ｋｇ）で洗浄し、これに続いてイソプロピルアルコール（ＩＰＡ、９．４ｋｇ）で洗浄した。次いで、湿ったケーキ（３．４ｋｇ）を真空オーブン（５０℃）内で終夜乾燥させて、９７．０％のＨＰＬＣ純度で、青色−灰色の固体として、２．３８ｋｇ（９６％モル収率）の６−フルオロ−１，４−ジヒドロキノキサリン−２，３−ジオン（化合物Ａ）を得た。
【０２４２】
（実施例１３Ｂ）
化合物Ｂの生成
１００Ｌ反応器に、化合物Ａ（２．３８ｋｇ、１３．２ｍｏｌ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、０．２５ｋｇ）およびＣＨＣｌ３（３７．０ｋｇ）を添加した。次いで、塩化チオニル（ＳＯＣｌ２、４．９ｋｇ、４１．２ｍｏｌ）を添加して、温度を＜２５℃に維持した。次いで、混合物を５５〜６０℃で還流させた。２３時間後、試料をＨＰＬＣ分析用に採取した。ＨＰＬＣ分析は出発材料の完全な消費を示したが、９８％の２，３−ジクロロ−６−フルオロキノキサリン（化合物Ｂ）に加えて、約２％の中間体のようなものを示した。追加量のＳＯＣｌ２（４９４ｇ）およびＤＭＦ（２５ｇ）を添加し、混合物をさらに１時間還流させた。ＨＰＬＣは変化しなかったので、反応混合物を室温に冷却し、脱イオン（ＤＩ）水（８．８ｋｇ）を反応混合物にゆっくりと添加し、これによって熱および気体を発生した。これに続いて、０．５Ｍ  ＮａＯＨ（８ｋｇ）をゆっくりと添加した。全クエンチ物質を１３時間撹拌して、過剰のＳＯＣｌ２を分解させるのを助けた。有機層を４×８ｋｇ水で洗浄し、これに続いて８×１６ｋｇの水で洗浄した。
【０２４３】
有機相（５０Ｌ反応器内）を４０ｇの活性炭で処理し、３５分間撹拌した。活性炭を濾過により除去し、バッチを濃縮乾固させた。生成した固体を真空オーブン（４６℃）内で乾燥させて、９８．０％のＨＰＬＣ純度で、２．６２ｋｇ（９４％モル収率）の化合物Ｂを得た。
【０２４４】
（実施例１３Ｃ）
化合物１の生成
１００Ｌ反応器に、２，３−ジクロロ−６−フルオロキノキサリン（化合物Ｂ、１．３０ｋｇ、６．００ｍｏｌ）、アセトニトリル（３２．０ｋｇ）および水酸化アンモニウム（１１．９ｋｇ）を添加した。混合物を５０℃で２８時間撹拌した。約４％の未反応の化合物Ｂが観察された。追加の１．２ｋｇの水酸化アンモニウムを添加し、混合物を５０℃でさらに２０時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析は出発材料が残っていないことを示した。バッチを２０℃に冷却し、ブフナーフィルターを使用して固体を真空濾過し、ＡＣＮ／水ですすぎ、真空オーブン内、５０℃で終夜乾燥させて、９７２ｇの粗３−アミノ−２−クロロ−６−フルオロキノキサリン（化合物１）を生成した。反応を同じスケールで繰り返し、２度目には９５４ｇの粗化合物１を生成した。合わせた収穫物（１．９２ｋｇ）を２７ｋｇの水の中で３０分間スラリー化し、次いで濾過し、真空内で、５０℃で約４０時間乾燥させて、１．９０ｋｇの脱塩した粗化合物１を生成した。材料の一部分（０．６３ｋｇ）をアセトニトリル（５５ｋｇ）中に７５〜８０℃で溶解することにより、再結晶化させて、周囲温度に冷却した。ケーキを濾過により単離し、真空オーブン内、５℃で約２０時間乾燥させた。精製された化合物１の０．２８６ｋｇ部分を得た（ＨＰＬＣ：９８．９％、１．０％位置異性体）。再結晶化プロセスの次の反復のために固体の大きなパーセンテージを反応器内に残した。０．６３ｋｇの粗材料から再度開始し、今回は７６ｋｇのアセトニトリルを利用して（最初の部分からの固体を構成する）、０．６８６ｋｇを回収した（ＨＰＬＣ：９８．８％、０．９％位置異性体）。最後に、最終部分（０．６３ｋｇ）を５５ｋｇのアセトニトリルから以前の通り再結晶化することによって、０．５０５ｋｇの単離した生成物を生成した（ＨＰＬＣ：９８．８％、０．９％位置異性体）。全収量は１．４８ｋｇ（６２％全収率）の化合物１であった。
【０２４５】
（実施例１３Ｄ）
化合物２の生成
１００Ｌ丸底フラスコに、３−アミノ−２−クロロ−６−フルオロキノキサリン（化合物１、１．４８ｋｇ、７．４９ｍｏｌ）およびＴＨＦ（２６．７ｋｇ）を添加した。次いで、ＭｅＯＨ中の２５重量％ＮａＯＣＨ３（１２．１ｋｇ、５６．０ｍｏｌ、７．５当量）を添加して、２０±１０℃の温度を維持した。混合物を室温で２時間撹拌した。ＨＰＬＣは、出発材料が消費されたことを示した。溶液を減圧下で約２１Ｌに濃縮し、次いでジクロロメタン（ＤＣＭ、３４ｋｇ）と水（３４ｋｇ）とに終夜分配した。水層を分離し、次いで有機層をもう１部分のＤＣＭ（３４ｋｇ）でさらに希釈した。水層のｐＨが５に到達するまで有機層を水で洗浄した（４×１９ｋｇ洗浄物）。有機層を濃縮して、固体を得た。固体をＤＣＭ（２．１ｋｇ）中でスラリー化し、濾過し、湿ったケーキをＤＣＭ（１×５ｋｇ）で洗浄した。湿ったケーキを真空下、４４℃で終夜乾燥することによって、１．０６ｋｇ（７３．３％収率）の３−アミノ−６−フルオロ−２−メトキシキノキサリン（化合物２）を生成した。ＨＰＬＣ：９７．０％（０．７％位置異性体）。
【０２４６】
（実施例１３Ｅ）
化合物３の生成
１００Ｌ反応器に、３−アミノ−６−フルオロ−２−メトキシキノキサリン（化合物２、１．０６ｋｇ、５．４８ｍｏｌ）、ＤＣＭ（２１．４ｋｇ）およびピリジン（０．６３ｋｇ、７．９７ｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で撹拌し、次いで温度を３０℃未満に維持しながらクロロギ酸エチル（８７２ｇ、８．０ｍｏｌ、１．４６当量）をゆっくりと添加した。室温で１８．５時間後、反応が不完全であることが判明した。さらなるクロロギ酸エチル（１７４ｇ、１．６ｍｏｌ）およびピリジン（１２６ｇ、１．６ｍｏｌ）を添加した。次いで、室温でさらに２８．５時間混合した後、ＨＰＬＣ分析により反応は完了した。ｐＨ５．８が得られるまで、有機相を脱イオン水で抽出した（４×１６．１ｋｇ）。有機層を硫酸マグネシウム（９７０ｇ）で乾燥させ、濾過し、濃縮乾固させた。次いで、酢酸エチル（３．２ｋｇ）を充填し、真空濾過を介して生成した固体を収集した。湿ったケーキを酢酸エチル（１．３ｋｇ）で洗浄し、真空下、４３℃で乾燥させることによって、エチル−Ｎ−（６−フルオロ−２−メトキシキノキサリン−３−イル）カーボネート（化合物３）を生成した（ＨＰＬＣ純度１００％、１．１１６ｋｇ、７６．７％収率）。
【０２４７】
（実施例１３Ｆ）
ＲＸ−５９０２の生成
１００Ｌ反応器に、１−（３，５−ジメトキシフェニル）ピペラジンＨＣｌ（ＤＭＰＰ、１．５８８、６．１４ｍｏｌ）、エチル−Ｎ−（６−フルオロ−２−メトキシキノキサリン−３−イル）カーボネート（化合物３、１．１２ｋｇ、４．２２ｍｏｌ）およびＴＨＦ（３０．６ｋｇ）を添加した。混合物を周囲温度で１５分間撹拌し、１，８−ジアザビシクロウンデカ−７−エン（ＤＢＵ、２．４４４ｋｇ、１４．７ｍｏｌ）を添加した。混合物を還流（約６６℃）で約４時間混合し、次いで反応の完了についてサンプリングした（ＨＰＬＣ結果：１．１％の化合物３が残留）。反応物は完了したとみなされた。混合物を真空下で約１１Ｌの容積に濃縮した。溶液をＤＣＭ（２０．２ｋｇ）で希釈し、約１２ｋｇの１Ｍ  ＨＣｌで洗浄した。水性廃棄物層のｐＨが５〜６になるまで、有機層を４×１０ｋｇ部分の水でさらに洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウム（１．２ｋｇ）で乾燥させ、ブフナー漏斗を介して濾過した。ケーキを５ｋｇのＤＣＭですすぎ、濾液を真空下で６Ｌの最終容量に濃縮した。次いで、ヘプタン（０．８６８ｋｇ）を添加し、スラリーを１０〜１５℃で約１６時間混合した。スラリーを濾過し、ヘプタン（２．６２ｋｇ）で洗浄した。次いで、湿ったケーキ（２．４５ｋｇ）を真空オーブン内で乾燥させた。６６℃で約４８時間後、ＩＰ（Ｉｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ）試験は、ＴＨＦ（４５０６ｐｐｍ）およびＤＣＭ（３２５０ｐｐｍ）が限界を超えていることを示した。６６℃で追加の９６時間後、ＴＨＦ（１１４１ｐｐｍ）だけが依然として限界を超えていた。６６℃で追加の２４時間後、残留するＴＨＦは７７０ｐｐｍに落ちた。最後に、６７℃でもう２４時間後、ＴＨＦレベルは、許容レベル（６７９ｐｐｍ）まで落ちた。次いで、材料をオーブンから取り出し、ＲＸ−５９０２がオフホワイト色の固体として生成した（１．５１４ｋｇ、８１．２％収率）。ＨＰＬＣ：ＮＭＴ０．５０％の仕様限界を超える、０．８２％のＲＲＴ０．５７不純物。
【０２４８】
質量分析により特定されたＲＲＴ０．５７は、脱メチル化形態のＲＸ−５９０２に対応すると考えられる。
【０２４９】
（実施例１３Ｇ）
ＲＸ−５９０２の精製
１００Ｌ反応器に、実施例１３ＦからのＲＸ−５９０２（１．３１８ｋｇ、２．９９ｍｏｌ）およびＤＣＭ（１７．５ｋｇ）を添加した。溶液を約７ｋｇの０．５Ｍ  ＮａＯＨ（水性）で洗浄した。水性廃棄物層のｐＨが５〜６になるまで有機層を４×５．３ｋｇ部分の水でさらに洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウム（０．６ｋｇ）で乾燥させ、次いでブフナー漏斗を介して濾過した。ケーキを２ｋｇのＤＣＭですすぎ、濾液を真空下で４Ｌの最終容量に濃縮した。ヘプタン（２．７０ｋｇ）を添加し、スラリーを１０〜１５℃で約１５時間混合した。スラリーを濾過し、ヘプタン（１．８６ｋｇ）で洗浄した。次いで、湿ったケーキを真空オーブン内で乾燥させた。５５℃で約４８時間後、ＩＰ（Ｉｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ）試験は、すべての溶媒の許容レベルを示した。材料をオーブンから取り出し、ＲＸ−５９０２がオフホワイト色の固体として生成した（１．１４ｋｇ、８６．５％回収率）。
【０２５０】
（実施例１４）
固定された反応器／ＲＸ−５９０２の大規模生産（バッチ３５９２１Ａの調製）
以下は、固定された３５、１００、１２４、２００および３００ガロンのガラス、ステンレスおよびＨａｓｔｅｌｌｏｙがライニングされた反応器ならびにステンレススチールまたはＨａｓｔｅｌｌｏｙ  Ａｕｒａｒａフィルターを使用する以下の改善されたプロセス条件下で、ＲＸ−５９０２に対する１０．９６ｋｇのｃＧＭＰバッチの生産が行われたことを詳述している。
【０２５１】
（実施例１４Ａ）
化合物Ａの生成
３５ガロン反応器に、１，２−ジアミノ−４−フルオロベンゼン（７．５０ｋｇ、５９．４６ｍｏｌ、ＣｈｅｍｉＫ）、シュウ酸（５．３５ｋｇ、５９．４２ｍｏｌ）および３Ｍ  ＨＣｌ溶液（９５．８ｋｇの水および３７．８ｋｇの濃塩酸）を充填した。暗色の混合物を約２１時間加熱還流した（１００±５℃）。撹拌しながらアリコート（１ｍＬ）を採取し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（３０ｍＬ）でｐＨ８に中和した。ＨＰＬＣ分析は、出発材料が完全に消費されたことを示した。
【０２５２】
混合物を加熱から外し、周囲温度に冷却させ、次いで冷水（５５ｋｇ）を添加した。暗色の固体が沈殿し、これを真空濾過により収集した。フィルターケーキを冷水（５０．０ｋｇ）で洗浄し、これに続いてイソプロピルアルコール（ＩＰＡ、３９．１４ｋｇ）で洗浄した。次いで、湿ったケーキ（１１．４３ｋｇ）を真空オーブン（５０±５℃）内で終夜乾燥させることによって、１０．３ｋｇ（９６％モル収率）の６−フルオロ−１，４−ジヒドロキノキサリン−２，３−ジオン（化合物Ａ）を青色−灰色の固体としてＨＰＬＣ純度＞９９％で得た。このプロセスを同一のスケールで繰り返して、９．９５ｋｇを得た（＞９９％）。
【０２５３】
（実施例１４Ｂ）
化合物Ｂの生成
２００ガロンの反応器に、６−フルオロ−１，４−ジヒドロキノキサリン−２，３−ジオン（化合物Ａ、２０．２５ｋｇ、１１２．４１ｍｏｌ）、ＤＭＦ（２．２０ｋｇ）およびクロロホルム（３１０．３ｋｇ）を添加した。温度＜２５℃を維持しながら、塩化チオニル（４０．９５ｋｇ）を添加した。混合物を５０〜５５℃で還流させた。２１時間後、試料をＨＰＬＣ分析用に採取した。ＨＰＬＣ分析は、９７．７％（面積）の化合物Ｂを有し、出発材料の完全な消費を示した。反応混合物を周囲温度（２５±５℃）に冷却し、ＤＩ水（６４．７ｋｇ）を反応混合物にゆっくりと添加すると、熱および気体が発生した。次に、０．５Ｍ  ＮａＯＨ（６４．７ｋｇ）をゆっくりと添加した。全クエンチ物質を、１３時間撹拌して、過剰のＳＯＣｌ２の分解を助けた。有機層を８×３２．８ｋｇの水で洗浄した。
【０２５４】
約３ガロンが残留するまで、有機相（２００ガロン反応器内で）を大気蒸留により濃縮した。蒸留が進行するにつれて、ヘプタン（６９．５ｋｇ）を蒸留ポットに添加した。ポットの温度が７０℃を超えるまで（７０．３℃）、蒸留を継続した。ポットを１０〜１５℃に冷却し、１２時間撹拌した。スラリーを濾過し、ヘプタンで洗浄した（２×１６．０ｋｇ）。生成した湿った固体（２０．６５ｋｇ）を真空オーブン内で熱なしで、４５±５℃で２５時間乾燥させることによって、１４．８０ｋｇ（６４．５％収率）の２，３−ジクロロ−６−フルオロキノキサリン（化合物Ｂ）をＨＰＬＣ純度９７．７％で得た。
【０２５５】
低収率であったため、母液を再加工した。約３０ガロンが除去される（約１２ガロンがポット内に残留する）まで母液を真空下で蒸留した。ジャケットを４０℃に設定した。蒸留が完了したら、懸濁液を１０〜１５℃（実際は１３．２℃）に冷却し、３時間にわたり撹拌した。スラリーを濾過し、ヘプタンで洗浄した（２×１６．０ｋｇ）。生成した湿った固体（１０．５０ｋｇ）を真空オーブン内、４５±５℃で１８時間にわたり乾燥させることによって、３．６２ｋｇの２，３−ジクロロ−６−フルオロキノキサリン（化合物Ｂ、第２のロット）をＨＰＬＣ純度９８．４％で得た。全収率は７５．５％（１８．４５ｋｇ）であった。
【０２５６】
（実施例１４Ｃ）
化合物１の生成
２００ガロン反応器に、２，３−ジクロロ−６−フルオロキノキサリン（化合物Ｂ、１８．４５ｋｇ、８５．０１ｍｏｌ）、アセトニトリル（４４８．６０ｋｇ）および水酸化アンモニウム（１６９．８０ｋｇ）を添加した。混合物を５０℃でほぼ２４時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析は、出発材料が残留していないことを示した。バッチを４５±５℃に冷却し、ほぼ２５時間撹拌した。固体を真空濾過し、水（２×１４．０ｋｇ）およびアセトニトリルで洗浄した（２×３６．１ｋｇ）。湿ったケーキ（１６．７０ｋｇ）を真空内で、５０℃で終夜４９時間乾燥させることによって、３−アミノ−２−クロロ−６−フルオロキノキサリンを生成した（化合物１、１２．２０ｋｇ、７２．７％収率）。化合物１を得た（ＨＰＬＣ：９７．８６％、１．８３％位置異性体）。
【０２５７】
（実施例１４Ｄ）
化合物２の生成
２００ガロンのガラスがライニングされた反応器に、３−アミノ−２−クロロ−６−フルオロキノキサリン（化合物１、１２．１０ｋｇ、６１．２３ｍｏｌ）およびＴＨＦ（２１２．２０ｋｇ）を添加し、これに続いてＭｅＯＨ（９１．８０ｋｇ）中の２５重量％のＮａＯＣＨ３を添加して、温度を２０±１０℃で維持した。混合物を周囲温度で約４時間撹拌した。ＨＰＬＣは、出発材料が消費されたことを示した。内部温度を＜３５℃に保ちながら、水（４３．５０ｇａｌ）を添加した。約５５ガロンが残留するまで（約６３ガロンが除去される）、大気蒸留を介して溶液を濃縮した。溶液の温度を１５〜２０℃に冷却し、約１８時間撹拌した。スラリーを濾過し、水で洗浄した（２×８．０ガロン）。生成した湿った固体を、真空オーブン内５０±５℃でほぼ９６時間乾燥させることによって、７．４０ｋｇ（６２．６％収率）の３−アミノ−６−フルオロ−２−メトキシキノキサリン（化合物２）をＨＰＬＣ純度９９．１％で生成した。位置異性体は検出されなかった。
【０２５８】
（実施例１４Ｅ）
化合物３の生成
１００ガロン反応器に、３−アミノ−６−フルオロ−２−メトキシキノキサリン（化合物２、７．４０ｋｇ、３８．３０ｍｏｌ）、ＤＣＭ（１４４．６ｋｇ）およびピリジン（３．６ｋｇ）を添加した。混合物を周囲温度で撹拌し、次いで温度を＜３０℃に維持しながら、クロロギ酸エチル（６．９ｋｇ、６３．５８ｍｏｌ）をゆっくりと添加した。周囲温度で２１．５時間後、反応が完了したことが判明した。ｐＨ５．８が得られるまで有機相をＤＩ水で洗浄した（３×１６．４ガロン）。約１６ガロンが残留するまで有機層を大気圧下で蒸留した。蒸留中、酢酸エチル（４７．４ｋｇ）を添加した。懸濁液を１０〜１５℃に冷却し、２２時間撹拌した。固体を真空濾過により収集し、酢酸エチルで洗浄し（２×８．３ｋｇ）、真空下、４０±５℃で終夜乾燥させる（７．８ｋｇの湿った物質）ことによって、エチル−Ｎ−（６−フルオロ−２−メトキシキノキサリン−３−イル）カーボネート化合物３を生成した（７．３０ｋｇ、７１．８％収率）。ＨＰＬＣ：１００％；位置異性体は検出されなかった。
【０２５９】
低い回収率により、上記からの母液はその元の容積の約半分（１７Ｌ）に真空下で濃縮した。固体を濾過し、酢酸エチルですすいだ（２×１．５Ｌ）。湿ったケーキ（１．６ｋｇ）を４０±５℃で３６時間乾燥させることによって、追加の１．３５ｋｇの化合物３（Ｅ−１６６）を生成した。全収率は８５．１％（８．６５ｋｇ）であった。
【０２６０】
（実施例１４Ｆ）
ＲＸ−５９０２の生成
２００ガロン反応器に、１−（３，５−ジメトキシフェニル）ピペラジンＨＣｌ（ＤＭＰＰ）（１２．５０ｋｇ、４８．３１ｍｏｌ）、エチル−Ｎ−（６−フルオロ−２−メトキシキノキサリン−３−イル）カーボネート（化合物３、８．６５ｋｇ、３２．６１ｍｏｌ）およびＴＨＦ（２４９．６ｋｇ）を添加した。混合物を周囲温度で１５分間撹拌し、ＤＢＵ（１７．６０ｋｇ、１１５．６ｍｏｌ）を添加した。混合物を還流（約６６℃）で約４時間混合し、２０±１０℃に冷却した。ＨＰＬＣにより分析した試料は反応が完了したことを示した（ＨＰＬＣ結果：ＩＰ試験限界であるＮＭＲ２．０％に対して、０．６％の化合物３が残留）。混合物を真空下で約８６Ｌの容積に濃縮した。溶液をＤＣＭ（１５９．７０ｋｇ）で希釈し、１Ｍ  ＨＣｌ（２４．１ガロンの水中８．９ｋｇの濃ＨＣｌ）で洗浄した。水性廃棄物層のｐＨが５〜６になるまで、有機層をさらに水で洗浄した（４×３０．０ガロン）。有機層を０．５Ｎ水酸化ナトリウム（２．９ｋｇの５０％水酸化ナトリウムおよび１８．６ガロンの水）でさらに洗浄し、水性廃棄物層のｐＨが５〜６になるまで水で洗浄した（３×２５．０ガロン）。有機層を硫酸マグネシウム（９．５ｋｇ）で乾燥させ、ブフナー漏斗を介して濾過した。ケーキをＤＣＭ（１９．５ｋｇ）ですすぎ、次いで濾液を真空下、ＤＣＭ（１９．５ｋｇ）で濃縮した。濾液を真空下で４７Ｌの最終容量に濃縮した。ヘプタン（７ｋｇ）を添加し、スラリーを１０〜１５℃で約１６時間混合した。スラリーを濾過し、ヘプタン（２１ｋｇ）で洗浄した。湿ったケーキ（１５ｋｇ）を真空内で、６０℃で約４８時間乾燥させた。ＩＰ試験は、ＴＨＦ（１０，８００ｐｐｍ）およびＤＣＭ（１５，３９５ｐｐｍ）が仕様限界を超えていることを示した。６０℃でさらに８６時間後、すべての溶媒レベルが残留溶媒仕様に合格した。材料をオーブンから取り出し、オフホワイト色の固体としてＲＸ−５９０２を生成した（１０．９６５ｋｇ、７６．２％収率）。
【０２６１】
（実施例１５）
１．３ＫＧバッチに対するＲＸ−５９０２のナノ製剤プロセス−以前に調製したＲＸ−５９０２の再加工
（実施例１５Ａ）
１００ｍｇ／ｇのＲＸ−５９０２のナノ懸濁液
（実施例１５Ａ１）
サブバッチ１
ＹＴＺ（登録商標）粉砕媒体（９ｋｇ）を洗浄溶液（Ａｌｃｏｎｏｘ）で洗浄し、精製水（Ｒｉｃｃａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）ですすいだ。５ｍＬの洗浄剤と５００ｍＬの精製水を混合することによって、洗浄溶液を調製した。媒体を３つの耐熱性のコンテナに均一に分割した。各コンテナは、コンテナの開口をバッグの透過側で覆って、オートクレーブバッグの中に封入した。検証された殺菌サイクル（２５０°Ｆで４５分間、３５分間の乾燥時間、ＰＳＳＯＰ５００４２「Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ、Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｌｅａｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｕｔｔｎａｕｅｒ  ２５４０ＥＡ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｔａｂｌｅ−Ｔｏｐ  Ａｕｔｏｃｌａｖｅ」を参照されたい）を使用して、Ｔｕｔｔｎａｕｅｒ  ２５４０ＥＡ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｔａｂｌｅ−Ｔｏｐ  Ａｕｔｏｃｌａｖｅを滅菌し、媒体のコンテナをオーブンに入れて１１０℃で終夜乾燥させた。
【０２６２】
以下の供給品および実験器具を洗浄溶液で洗浄し、クリーンルームに移した：ミリング容器（×３）、撹拌プレート、漏斗、使い捨てのへら、秤量コンテナ、磁気アジテータ、磁気アジテータレトリバーおよびトランスファーピペット。ヒドロサーモグラフを製造スイートに配置し、湿度および温度を記録した。アイソレーターの中に天秤を配置し、毎日検証を行った。
【０２６３】
ポロキサマー４０７、ＮＦ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を秤量し、コンテナのそれぞれに充填した。容器Ａには１０．６８ｇ充填し、容器Ｂには１０．６４ｇ充填し、容器Ｃには１０．７０ｇを充填した。３つの容器のそれぞれにＷａｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、ＵＳＰ（ＷＦＩ）を充填した。容器Ａには２９９．５７ｇ充填し、容器Ｂには３００．６２ｇ充填し、容器Ｃには３０１．１９ｇ充填した。撹拌棒を３つの容器のそれぞれに配置し、ポロキサマー４０７、ＮＦがＷＦＩに目視により溶解されるまで、撹拌プレートを使用して混合した。
【０２６４】
３つのコンテナのそれぞれに、漏斗でＲＸ−５９０２（Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ）を添加した。容器Ａには１３３．１６ｇ充填し、容器Ｂには１３３．１９ｇ充填し、容器Ｃには１３３．４１ｇ充填した。ＲＸ−５９０２が目視により分散するまで、撹拌プレートを利用してコンテナの内容物を混合した。磁気レトリバーを利用して３つのコンテナのそれぞれから撹拌棒を取り出した。１つのコンテナの内容物を漏斗でミリング容器に充填した。ミリング容器のスレッドを検査して、スレッドがミリング媒体からフリーであることを確認した。ミリング容器の蓋を、漏出を防ぐために閉めて密閉した。
【０２６５】
ミリング容器の外側の汚染を除去し、アイソレーターから取り外した。反射性材料の小片をミリング容器に取り付け、ミリング容器をローラーミルに取り付けた。ミルを作動させ、容器内側のカスケード媒体が、水平面（目視により決定）から４５〜６０度の破損角度を達成するまで回転速度を調整した。回転速度計を利用して、ミリング容器の回転速度を測定した。３つのコンテナのそれぞれをミリング容器に移し、上に記載されているものと同じ一般的手順を使用して調製した。
【０２６６】
３つのミリング容器のそれぞれを、９０ＲＰＭ（毎分回転数）で１８．７５時間ローラーミリングした。ローラーミリングの完了後、容器の外側の汚染を除去し、薄層状のフローフードに移した。ヒドロサーモグラフを同じ製造スイートに移して、ミリング容器に付けた。滅菌ピペットを利用して、各ミリング容器から１ｍＬ試料を採取し、試料をバイアルに移した。
【０２６７】
３つの試料を、レーザー回折により粒径分布について分析した。試料に対する受け入れ基準は、Ｄ９０＜１μｍ（繰り返しおよび平均）および単一モードの分布プロファイルであった（すなわち、分布は１つの主要ピークを含有し、２次ピークはわずかしか許容されなかった）。容器のそれぞれに対する結果は以下の通りであった：
【表Ａ】
2018526392.tif 000016
【０２６８】
３つの容器のそれぞれは一般に認められた基準を満たした。サブバッチ１由来の３つの容器を閉めて、抽出が実施できるまで２〜８℃で貯蔵した。
【０２６９】
（実施例１５Ａ２）
サブバッチ２
第２のサブバッチを同一の方式で作製した。容器には、以下の通り充填した：
【表Ｂ】
2018526392.tif 000017
【０２７０】
３つのミリング容器のそれぞれを９０ＲＰＭ（毎分回転数）で１９．２５時間ローラーミリングした。ローラーミリングの完了後、容器の外側の汚染を除去し、薄層状のフローフードに移した。ヒドロサーモグラフを同じ製造スイートに移して、ミリング容器に付けた。滅菌ピペットを利用して、各ミリング容器から１ｍＬ試料を採取し、試料をバイアルに移した。
【０２７１】
３つの試料を、レーザー回折により粒径分布について分析した。試料に対する受け入れ基準は、Ｄ９０＜１μｍ（繰り返しおよび平均）および単一モードの分布プロファイルであった（すなわち、分布は１つの主要ピークを含有し、２次ピークはわずかしか許容されなかった）。容器のそれぞれに対する結果は以下の通りであった：
【表Ｃ】
2018526392.tif 000018
【０２７２】
３つの容器のそれぞれは一般に認められた基準を満たした。サブバッチ２由来の３つの容器を閉めて、抽出が実施できるまで２〜８℃で貯蔵した。
【０２７３】
（実施例１５Ａ３）
サブバッチ３
第３のサブバッチを同一の方式で作製した。容器は、以下の通り充填した：
【表Ｄ】
2018526392.tif 000019
【０２７４】
３つのミリング容器のそれぞれを、９０ＲＰＭ（毎分回転数）で１９．５時間、ローラーミリングした。ローラーミリングを停止し、容器の外側の汚染を除去し、薄層状のフローフードに移した。ヒドロサーモグラフを同じ製造スイートに移して、ミリング容器に付けた。滅菌ピペットを利用して、各ミリング容器から１ｍＬ試料を採取し、試料をバイアルに移した。
【０２７５】
３つの試料を、レーザー回折により粒径分布について分析した。試料に対する受け入れ基準は、Ｄ９０＜１μｍ（繰り返しおよび平均）および単一モードの分布プロファイルであった（すなわち、分布は、１つの主要ピークを含有し、２次ピークはわずかしか許容されなかった）。容器のそれぞれに対する結果は以下の通りであった：
【表Ｅ】
2018526392.tif 000020
【０２７６】
３つの容器の中で一般に認められた基準を満たすものはなかった。
【０２７７】
容器Ｇ、ＨおよびＩを再度密閉し、ローラーミルに戻した。ミリングを２２．５時間継続した。ヒドロサーモグラフを同じ製造スイートに移して、容器に付けた。滅菌ピペットを利用して、各ミリング容器から１ｍＬ試料を採取し、試料をバイアルに移した。
【０２７８】
３つの試料を、レーザー回折により粒径分布について分析した。試料に対する受け入れ基準は、Ｄ９０＜１μｍ（繰り返しおよび平均）および単一モードの分布プロファイルであった（すなわち、分布は１つの主要ピークを含有し、２次ピークはわずかしか許容されなかった）。追加のミリング時間後の容器のそれぞれに対する結果は、以下の通りであった：
【表Ｆ】
2018526392.tif 000021
【０２７９】
３つの容器のそれぞれは一般に認められた基準を満たした。サブバッチ３由来の３つの容器を閉めて、抽出が実施できるまで２〜８℃で貯蔵した。
【０２８０】
（実施例１５Ｂ）
サブバッチの抽出
抽出用に以下の供給物および実験器具を準備した：抽出容器（×９）、漏斗、管類、ホースクランプ、インライン空気フィルター、トランスファーピペットおよびフィルター漏斗。天秤は７０％イソプロパノールで拭き取った。これらの供給物をクリーンルームに移した。
【０２８１】
空気フィルターをホースに連結することによって、窒素タンクをクリーンルームスイートの中に配置し、ホースを窒素タンクに連結した。ヒドロサーモグラフを製造スイートに配置し、温度および湿度を記録した。
【０２８２】
抽出プロセスを使用して以下の通り９つのサブバッチ（Ａ〜Ｉ）を調製した。空の収集容器を秤量し、フィルター漏斗の下に配置した。ミリング容器Ａの内容物をフィルター漏斗に注ぎ入れ、圧縮窒素を使用して懸濁液を抽出した。ＷＦＩをミリング容器に充填した。内容物をフィルター漏斗に注ぎ入れ、圧縮窒素を使用して抽出した。ＷＦＩをミリング容器に充填した。内容物をフィルター漏斗に注ぎ入れ、圧縮窒素を使用して抽出した。収集容器を秤量して、正味の懸濁液の重量を得た。
【０２８３】
収集容器を手作業で回転させて、内容物を混合した。滅菌のトランスファーピペットを使用して、分析用試験用の試料ならびにＱＡ試料を抜き出した。収集容器の最終重量を記録した。
【０２８４】
すべてのサブバッチは、処理中のアッセイが完了するまで２〜８℃で貯蔵した。
【０２８５】
９つのサブバッチの収率およびリリースに利用可能な量は以下の通りであった：
【表Ｇ】
2018526392.tif 000022
【０２８６】
９つのサブバッチを合わせた全プロセス重量は１１２８７．９５ｇ（９４％収率）であり、リリース用総量は１１２５７．２１ｇであった。
【０２８７】
（実施例１５Ｃ）
８３％ＲＸ−５９０２ナノ製剤粉末を生成するための凍結乾燥
各サブバッチのアッセイ分析に基づき、９つのサブバッチのそれぞれのＲＸ−５９０２の量を計算した。サブバッチのそれぞれにおけるアッセイ量、最終懸濁液重量およびＲＸ−５９０２の量は以下の通りであることが判明した：
【表Ｈ】
2018526392.tif 000023
【０２８８】
９つのサブバッチの中のＲＸ−５９０２の総量は１１６８．１４ｇであった。
【０２８９】
以下の供給物、原料、装置および実験器具を凍結乾燥プロセスのために準備し、クリーンルームに移した：天秤、タイマー、ヒドロサーモグラフ、バルク懸濁液コンテナ、磁気アジテータ、撹拌プレート、磁気アジテータレトリバー、秤量コンテナ、へらおよびバルク凍結乾燥トレイ。ヒドロサーモグラフを製造スイートに配置し、温度および湿度条件を記録した。
【０２９０】
薄層状フローフードの中で、すべてのサブバッチを合わせてバルクコンテナに入れた。撹拌棒を加えて、内容物を混合した。バルク懸濁液コンテナに、ポロキサマー４０７、ＮＦ（１４６．２７ｇ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を添加した。ポロキサマー４０７、ＮＦが目視検査で完全に溶解するまで、バルク懸濁液コンテナの内容物を混合した。混合を停止し、撹拌棒を除去した。
【０２９１】
８つのバルク凍結乾燥トレイのそれぞれに、バルク懸濁液コンテナの内容物の約１／８を添加した。８つのトレイのそれぞれの上の蓋を閉めた。８つトレイを凍結乾燥機に移し、凍結乾燥機ドアを閉めて、密閉した。ヒドロサーモグラフを停止した。
【０２９２】
凍結乾燥機の棚温度を−４０℃に調整し、「棚を凍結」の機能をオンにした。トレイを６６．７５時間にわたり完全に凍結させた。冷却器をオンにして、−５３℃に到達させた。次いで、棚温度を−２５℃に設定し、第１次乾燥のため真空設定を２５０ｍＴｏｒｒに設定した。約１８日後、最終Ｐｉｒａｎｉゲージ（２８４ｍＴｏｒｒ）とキャパシタンスマノメーター（２５０ｍＴｏｒｒ）の読み取り値の差は、以前のＰｉｒａｎｉゲージ（２８５ｍＴｏｒｒ）およびキャパシタンスマノメーター（２５０ｍＴｏｒｒ）の読み取り値の＜１％であった。第１次乾燥は完了したとみなされた。
【０２９３】
約３０分超の間隔をあけて、棚設定が２０℃になるまで、棚温度設定を＋５℃ずつ増加させた。約４日後、最終Ｐｉｒａｎｉゲージ（４８６ｍＴｏｒｒ）とキャパシタンスマノメーター（５００ｍＴｏｒｒ）読み取り値の差は、以前のＰｉｒａｎｉゲージ（４８６ｍＴｏｒｒ）およびキャパシタンスマノメーター（５００ｍＴｏｒｒ）読み取り値の＜１％であった。第２次乾燥は完了したとみなされた。棚制御および冷却器をオフにした。真空をオフにし、解放した。
【０２９４】
乳鉢および乳棒を洗浄剤溶液で洗浄し、精製水（Ｒｉｃｃａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）ですすぐことによって、これらを準備した。５ｍＬの洗浄剤と５００ｍＬの精製水を混合することによって、洗浄溶液を調製した。バッグの透過側を上向きに向けて、乳鉢および乳棒をオートクレーブバッグに配置した。検証された殺菌サイクル（２５０°Ｆで４５分間、３５分間の乾燥時間、ＰＳＳＯＰ５００４２「Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ、Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｌｅａｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｕｔｔｎａｕｅｒ  ２５４０ＥＡ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｔａｂｌｅ−Ｔｏｐ  Ａｕｔｏｃｌａｖｅ」を参照されたい）を使用して、Ｔｕｔｔｎａｕｅｒ  ２５４０ＥＡ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｔａｂｌｅ−Ｔｏｐ  Ａｕｔｏｃｌａｖｅを滅菌し、乳鉢および乳棒を含有するバッグをオーブン内に配置して、２５０℃で約１時間乾燥させた。ヒドロサーモグラフを製造スイートに配置し、温度および湿度条件を記録した。
【０２９５】
乾燥したトレイを凍結乾燥機から取り出し、製造スイートに移した。保持コンテナを秤量し（３９１１．４５ｇ）、消毒し、グローブボックスアイソレーターに移した。乾燥させた凍結乾燥トレイを拭き取り、グローブボックスアイソレーターに移した。乳鉢および乳棒を利用して、凍結乾燥物をバラバラにして、自由流動性粉末にした。粉末を保持コンテナに移した。
【０２９６】
保持コンテナを秤量し（５５０８．４７ｇ）、サンプリングした。保持コンテナの上側から、均一性の試験のためにトップの試料を取り出した（１．１５ｇ）。保持コンテナの中央から試験用の試料（４．４８ｇ）、ＱＡ保持用の試料（８．３３ｇ）およびミクロ試験用の試料（１１．００ｇ）を取り出した。保持コンテナの下側から、下側の均一性試験のための試料を取り出した（１．２１ｇ）。保持コンテナを再度秤量し（５２８０．１２ｇ）、ヒドロサーモグラフをオフにした。
【０２９７】
プロセスバッチサイズは１３９７．０２ｇ（９７％プロセス収率）と算出され、リリースに対するバッチサイズは１３６８．６７ｇと算出された。バッチに対する分析試験は、バッチが分析仕様のすべての検証を満たしたことを示した。
【０２９８】
（実施例１６）
高エネルギーミリングおよび乾燥
（実施例１６Ａ）
高エネルギーミリング材料の生成
１５０ｍＬ再循環チャンバーおよび１５０ミクロン出口スクリーニングを使用する、Ｎｅｔｚｓｃｈ  Ｄｅｌｔａ  Ｖｉｔａアジテータミルを組み立てた。約１２５ｍＬ（０．５ｋｇ）の０．５−ｍｍＹＴＺセラミックミリング媒体をチャンバーに添加し、再循環冷却機を使用して、チャンバーを１０℃に冷却した。出発懸濁液をミルに毎分約１００ｍＬ（４８ｒｐｍ、Ｍａｓｔｅｒ  Ｆｌｅｘサイズ１５チューブを使用）でポンプ供給することによって、およびアジテータを１回に数秒作動させて、流入する懸濁液をより良く分散することによって、ミルを定期的に「軽く動かす」ことによって、チャンバーをミリング用に準備した。準備ができたら、ミルを５００ｒｐｍのアジテータ速度、または１．８ｍ／ｓの先端速度で作動させた。懸濁液入口での後方圧がミルを自動的に止めるポイントまで増加してしまったので、この作動は不十分であることが判明した。これは典型的には、スクリーンを通過するのに大き過ぎるか、またはスクリーンスロット内で凝集する傾向にあるＡＰＩ粒子の目詰まりにより引き起こされる。この圧力の蓄積を防ぐために、システムが圧力の増加なしに作動できるようになるまでアジテータ速度を徐々に増加させ、この速度は２，０００ｒｐｍ（７ｍ／ｓ）であった。
【０２９９】
１８分後、懸濁液のＤ９０は約１ミクロンまで減少し、これは処理中の懸濁液に対する最大粒径として以前に使用された非公式の限界である。９０分のミリング後、懸濁液が固化したが、これは、コロイドに典型的なサイズ範囲に粒子を減少させる際には珍しくない出来事である。約１５０ｍＬの追加の精製水をミリングリザーバーに添加し、これによってＡＰＩ濃度が２０％となり、これは、ミリングの継続に十分な程度に懸濁液を液化させた。懸濁液を合計２４０分間ミリングし、この時点で粒径分布は、図１４に示されている通り、均一な、単一モードの、サブミクロンの粒子集団を示した。ナノ懸濁液のＤ１０は、０．０７２８４μｍであり、メジアン径は０．１０５２６μｍであり、Ｄ９０は０．１５１６７μｍである。生成したナノ懸濁液は流体で、均一であり、ローラーミリングした懸濁液において観察されたものからの変色または物理的な変化の徴候を示さなかった。
【０３００】
ＲＸ−５９０２の結晶構造がミリング中に変化したかどうかを決定するため、ナノ粒子をＤＳＣおよびＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）により試験した。ナノ粒子を遠心分離濾過（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）により懸濁液から除去した。付随するするポロキサマーを除去するために、粒子を精製水で３回洗浄した。洗浄後、粒子をシリカ上で乾燥させた。図１５において図示されているＤＳＣ分析は、溶融開始点（１６１℃）ならびに低温（５０℃）熱イベントにおけるわずかな減少を示し、両方とも単離したナノ粒子内のポロキサマー（融点＝５６℃）の存在を示している。しかし、ＡＰＩの異なる結晶形を示す他の熱イベントは観察されなかった。ＸＲＰＦＤ分析は、ミリングしたおよびミリングしていないＡＰＩの結晶構造が同等であることを裏付けた。
【０３０１】
（実施例１６Ｂ）
高エネルギーミリングされた凍結乾燥材料の生成
実施例１５Ｃの凍結乾燥方法を使用して、実施例１６Ａの高エネルギーミリングされた材料を凍結乾燥することで、高エネルギーミリングされた凍結乾燥材料を調製した。
【０３０２】
（実施例１６Ｃ）
高エネルギーミリングされた噴霧乾燥材料の生成
表７で概説されているパラメーターを使用して、ＲＸ−５９０２ナノ懸濁液をＢｕｃｈｉ  Ｂ−２９０噴霧乾燥機で噴霧乾燥させた。懸濁液は、いずれの賦形剤または精製水も添加せずに、ミルから抽出したそのままの状態で使用した。
【表７】
2018526392.tif 000024
【０３０３】
最小の材料損失が噴霧乾燥機の乾燥チャンバー内で観察された。収集した生成物は、精製水に分散した自由流動性粉末であった。レーザー回折による粒径測定から、図１６に示されているような簡潔な、反復可能な分布が得られ、測定値は表８に示されている。
【表８】
2018526392.tif 000025
【０３０４】
顕微鏡法は、図１７および図１８に示されている通り、非晶質の球状マイクロ粒子内に含有された結晶性ナノ粒子の存在を示した。遊離結晶または結晶再成長の証拠は観察されず、これは、ＡＰＩの溶解または沈殿が乾燥の高温により影響を受けなかったことを示唆している。
【０３０５】
（実施例１７）
静脈内および経口投与後のＲＸ−５９０２の経口バイオアベイラビリティーの決定
この実験では、様々な製剤の投与後のＲＸ−５９０２の経口バイオアベイラビリティーを雄のスプラーグドーリーラットにおいて評価した。ＲＸ−５９０２は、静脈内（ＩＶ）および経口（ＰＯ）の投与経路により投薬した。粉末の４種の調製物をＰａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）から入手し、これらを使用して、投薬溶液を作製した：（調製物Ａ）：ミリングしていないＡＰＩ（実施例１３に従い調製）；（調製物Ｂ）８３％ＧＭＰ凍結乾燥した（実施例１５に従い調製）；（調製物Ｃ）８３％高エネルギーミリングし、凍結乾燥した（実施例１６Ｂに従い調製）；および（調製物Ｄ）９３％噴霧乾燥した（実施例１６Ｃに従い調製）。
【０３０６】
各動物に対する用量レベルは、体重および投与された試験品の量に基づき個々に決定した。各用量に対して、製剤粉末の適量を秤量し、次いで１ｍＬの適当な溶媒を添加し、全容積を直ちに投与した、ただし、ミリングしていないＡＰＩについては、バイアル中に残留するすべてのＡＰＩを回収するために、追加の１ｍＬの溶媒を添加し、投薬した。投薬後、投薬後２４時間まで血液試料を採取し、試験品の血漿中濃度をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより決定した。Ｐｈｏｎｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（ｖ６．４）を使用して薬物動態学的パラメーターを決定した。
【０３０７】
平均用量４０．７ｍｇ／ｋｇのＩＶ投薬後、ＲＸ−５９０２（８３％ＧＭＰの凍結乾燥したケーキ；群２）は１０．５±２．４６時間の平均半減期を有した。その平均クリアランス速度は０．４００±０．０２６３Ｌ／ｈｒ／ｋｇであった。分布の平均容積は５．６０±１．３０Ｌ／Ｋｇであった。
【０３０８】
ミリングしていないＲＸ−５９０２（超高純度水中の０．３６％ポロキサマー４０７中のミリングしていないＡＰＩ；群１）の平均用量６８ｍｇ／ｋｇのＰＯ投薬後、最大血漿中濃度（平均７４３±１９９ｎｇ／ｍＬ）は、投薬後２〜４時間の間に観察された。平均半減期は決定することができなかった。しかし、ラット＃５７６に対する半減期は３．２９時間であった。用量正規化されたＡＵＣＬａｓｔに基づく平均曝露は１５１±２５．２ｈｒ＊ｋｇ＊ｎｇ／ｍＬ／ｍｇであった。ミリングしていないＲＸ−５９０２（本明細書で「ミリングしていないＡＰＩ」とも呼ばれている）に対する平均経口バイオアベイラビリティーは、平均用量６８ｍｇ／ｋｇで７．６２±１．２７％であった。
【０３０９】
凍結乾燥されたＲＸ−５９０２（８３％ＧＭＰ凍結乾燥されたケーキ：群３）の平均用量６５．９ｍｇ／ｋｇのＰＯ投薬後、最大血漿中濃度（平均２０２７±３５９ｎｇ／ｍＬ）は投薬後２時間の時点で観察された。平均半減期は９．７０時間であった。用量正規化されたＡＵＣＬａｓｔに基づく平均曝露は３６０±１２９ｈｒ＊ｋｇ＊ｎｇ／ｍＬ／ｍｇであった。ＲＸ−５９０２（８３％ＧＭＰの凍結乾燥したケーキ）に対する平均経口バイオアベイラビリティーは、平均用量６５．９ｍｇ／ｋｇで１８．２±６．５３％であった。
【０３１０】
高エネルギーミリングした凍結乾燥されたＲＸ−５９０２（８３％高エネルギーミリングした凍結乾燥されたケーキ；群４）の平均用量６５．９ｍｇ／ｋｇのＰＯ投薬後、最大血漿中濃度（平均２６１３±６９２ｎｇ／ｍＬ）は投薬後２時間の時点で観察された。平均半減期は７．９９時間であった。用量正規化されたＡＵＣＬａｓｔに基づく平均曝露は４５６±４５．９ｈｒ＊ｋｇ＊ｎｇ／ｍＬ／ｍｇであった。ＲＸ−５９０２（８３％高エネルギーミリングした凍結乾燥されたケーキ）に対する平均経口バイオアベイラビリティーは、平均用量６５．９ｍｇ／ｋｇで２３．０±２．３２％であった。
【０３１１】
ポロキサマー噴霧乾燥したＲＸ−５９０２［９３％噴霧乾燥したケーキ（ＳＤＭ）＋０．２３％ポロキサマー４０７；群５］の６６．２ｍｇ／ｋｇのＰＯ投薬後、最大血漿中濃度（平均１２７０±１８５ｎｇ／ｍＬ）は投薬後２〜４時間の時点で観察された。平均半減期は決定できなかった。しかし、ラット＃５８８に対する半減期は３．１１時間であった。用量正規化されたＡＵＣｌａｓｔに基づく平均曝露は２００±３３．８ｈｒ＊ｋｇ＊ｎｇ／ｍＬ／ｍｇであった。ＲＸ−５９０２（９３％噴霧乾燥したケーキ（ＳＤＭ）＋０．２３％ポロキサマー４０７）に対する平均経口バイオアベイラビリティーは、平均用量６６．２ｍｇ／ｋｇで１０．１±１．７１％であった。
【０３１２】
ポロキサマーを含まない噴霧乾燥したＲＸ−５９０２［９３％噴霧乾燥したケーキ（ＳＤＭ）；群６］の６５．６ｍｇ／ｋｇのＰＯ投薬後、最大血漿中濃度（平均１５２７±６２７ｎｇ／ｍＬ）は投薬後２〜４時間の時点で観察された。平均半減期は決定できなかった。しかし、ラット＃５８９に対する半減期は６．８９時間であった。用量正規化されたＡＵＣｌａｓｔに基づく平均曝露は２９３±１０７ｈｒ＊ｋｇ＊ｎｇ／ｍＬ／ｍｇであった。ＲＸ−５９０２（９３％噴霧乾燥したケーキ（ＳＤＭ））に対する平均経口バイオアベイラビリティーは、平均用量６５．６ｍｇ／ｋｇで１４．８±５．４０％であった。
【０３１３】
群４における高エネルギーミリングした凍結乾燥ＲＸ−５９０２（８３％高エネルギーミリングした凍結乾燥ケーキ）の経口投薬が平均２３％で最も高い経口バイオアベイラビリティーを有した。経口バイオアベイラビリティーの全体的なランク順序は群４（８３％高エネルギーミリングした凍結乾燥ケーキ）＞群３（８３％ＧＭＰの凍結乾燥ケーキ）＞群６［９３％噴霧乾燥ケーキ（ＳＤＭ）］＞群５［９３％噴霧乾燥ケーキ（ＳＤＭ）＋０．２３％ポロキサマー４０７］＞群１（超高純度の水の中の、０．３６％ポロキサマー４０７中のミリングしていないＡＰＩ）である。ＲＸ−５９０２の、異なってナノ製剤化された材料の経口バイオアベイラビリティーは、表９に示されている。
【表９】
2018526392.tif 000026
【０３１４】
参考のため、絶食した雄および雌のイヌにおける、ＲＸ−５９０２（ナノミリングした懸濁液）に対する平均経口バイオアベイラビリティーは、それぞれ２９．４％および２１．４％であった。
【０３１５】
（実施例１８）
ＲＸ−５９０２  ＡＰＩおよび位置異性体不純物
概要：ＲＸ−５９０２と、ＲＲＴ  ０．９７５不純物との分析用データの比較を実施した。分析用データは、１Ｈ、１９Ｆ、１３Ｃ  ＮＭＲ、ＵＶ−Ｖｉｓ吸光度、および質量分析（ＬＣ−ＭＳによる）からなった。すべての利用可能な分析用データは、ＲＲＴ  ０．９７５不純物はＲＸ−５９０２の位置異性体であることを強く示唆している。
【０３１６】
バックグラウンド：ＲＸ−５９０２の一部の早期バッチにおいて、ＨＰＬＣ法を使用して分析した際に、未知の不純物が主要生成物ピークから完全に分解できなかったことが発見された。未知の不純物（「ＲＲＴ  ０．９７５不純物」）が主要ＲＸ−５９０２生成物ピークから分解できる新規ＨＰＬＣ法が開発された。
【０３１７】
ＲＲＴ  ０．９７５不純物の識別情報を決定するために、超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）を使用して、１５グラムのＲＸ−５９０２の生産バッチを分離した。ＲＸ−５９０２画分およびＲＲＴ  ０．９７５不純物画分を得た。Ｓｙｎｅｒｇｉ  ＨｙｄｒｏＲＰカラムを用いた新規ＨＰＬＣ法を使用して、ＲＸ−５９０２画分を分析すると、ＲＸ−５９０２が９７．７面積％を占め、主要な不純物が１．５面積％を占めることが判明した。ＲＲＴ  ０．９７５不純物画分も分析すると、ＲＲＴ  ０．９７５不純物が７９．０面積％を占め、ＲＸ−５９０２が０．７面積％を占めることが判明した。それぞれ＞１面積％の４種の不純物も存在した。
【０３１８】
１Ｈ、１９Ｆ、１３Ｃ  ＮＭＲデータ
ＲＸ−５９０２画分およびＲＲＴ  ０．９７５不純物画分について、１Ｈおよび１９Ｆスペクトルを得た。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルはＲＲＴ  ０．９７５不純物画分のみについて得て、これを以前のＲＸ−５９０２参照標準ロットの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルと比較した。
【０３１９】
位置異性体の中間体を恐らく生成した早期の合成ステップに基づき、ＲＲＴ  ０．９７５不純物はＲＸ−５９０２の位置異性体でもあり、よって、フッ素原子が隣接する芳香族炭素上にあることが推測される。ＲＸ−５９０２は分子式Ｃ２２Ｈ２４ＦＮ５Ｏ４を有する。
【０３２０】
ＲＲＴ  ０．９７５不純物に対して提案された構造
【化５】
2018526392.tif 000027
【０３２１】
図１９はＲＸ−５９０２の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。図２０は、ＲＲＴ  ０．９７５不純物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。図２１は、ＲＲＴ  ０．９７５不純物（上側）およびＲＸ−５９０２（下側）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの重ね合わせを示す。図２２は、ＲＲＴ  ０．９７５不純物（上側プロット）およびＲＸ−５９０２（下側プロット）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの７．０〜８．０ｐｐｍ領域の重ね合わせを示す。
【０３２２】
２つの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは極めて似ている（特に分割パターン）ことがわかり、わずかな化学シフトが、７．０〜８．０ｐｐｍ領域のシグナルに対して観察され、この観察は、ＲＲＴ  ０．９７５不純物がＲＸ−５９０２の位置異性体であることを強く示唆している。
【０３２３】
図２３はＲＸ−５９０２の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す。図２４はＲＲＴ  ０．９７５不純物の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す。図２５は、ＲＸ−５９０２（上側プロット）およびＲＲＴ  ０．９７５不純物（下側プロット）の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルの重ね合わせを示す。図２６は、ＲＸ−５９０２（上側プロット）およびＲＲＴ  ０．９７５不純物（下側プロット）の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルの１０８〜１５０ｐｐｍ領域を示す。
【０３２４】
２つの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは極めて似ていることがわかり、これは、ＲＲＴ  ０．９７５不純物がＲＸ−５９０２の位置異性体である可能性を強く支持する。
【０３２５】
図２７はＲＸ−５９０２の１９Ｆ  ＮＭＲスペクトルを示す。図２８はＲＲＴ  ０．９７５不純物の１９Ｆ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【０３２６】
図２７および２８に示されている通り、２つの１９Ｆ  ＮＭＲスペクトルはかなり異なる。１９Ｆ化学シフトは、ＲＸ−５９０２に対して−１１４．５ｐｐｍであり、ＲＲＴ  ０．９７５不純物に対して−１１２．０ｐｐｍ（四重線として表示）である。これは、フッ素原子がわずかに異なる環境にあることを示し、これもまた同様にＲＲＴ  ０．９７５不純物がＲＸ−５９０２の位置異性体である可能性を強く支持する。
【０３２７】
ＵＶ−Ｖｉｓ吸光度データ
ＵＶ−Ｖｉｓ吸光度データを、同じＨＰＬＣ法を使用して分離したＲＸ−５９０２の生産バッチについて集めた。図２９に示されている通り、グラフは、ＲＸ−５９０２（実線）およびＲＲＴ  ０．９７５不純物（破線）の両方が極めて似ている吸光度スペクトルを有することを示している。これもまた同様に、ＲＲＴ  ０．９７５不純物がＲＸ−５９０２の位置異性体である可能性を強く支持する。
【０３２８】
ＬＣ−ＭＳデータ
図３０は、主要ＲＸ−５９０２生成物に対応する１７．９分ピークのＬＣ−ＭＳを示している（左側のグラフは、右側の３つグラフと重複する）。図３１は、ＲＲＴ  ０．９７５不純物に対応する１７．２分ピークのＬＣ−ＭＳを示している（左側のグラフは、右側の３つのグラフと重複する）。図３２は、ＲＸ−５９０２とＲＲＴ  ０．９７５不純物の両方が４６４という正確な［Ｍ＋Ｎａ］＋質量を有することを示すＬＣ−ＭＳデータを示しており、これもまた同様に、ＲＲＴ  ０．９７５不純物がＲＸ−５９０２の位置異性体であるという結論を支持する。
【０３２９】
結論：分析用データ（１Ｈ、１９Ｆ、１３Ｃ  ＮＭＲ、ＵＶ−Ｖｉｓ吸光度、および質量分析からなる）の比較は、ＲＲＴ  ０．９７５不純物がＲＸ−５９０２の位置異性体であることを強く示している。
【０３３０】
（実施例１９）
ＲＸ−５９０２のＸ線結晶構造
分析の方法
ＲＸ−５９０２の単結晶Ｘ線構造を、成長した結晶を使用して、三斜晶、空間群Ｐ−１において、１００Ｋで決定した。非対称的単位の中で１つの完全に秩序化したＡＰＩ分子が存在する。最終Ｒ１［Ｉ＞２σ（Ｉ）］＝４．７７％である。ＸＲＰＤパターンを結晶構造から計算し、これは、単結晶構造が供給された材料の代表的なものであることを示している。
【０３３１】
ＸＲＰＤ分析のため、ＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ（Ｘ’Ｐｅｒｔ３  Ｐｏｗｄｅｒ）Ｘ線粉末回折計およびＳｉゼロバックグラウンドホルダーを使用した。使用したパラメーターを表１０に列挙する。
【表１０】
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【０３３２】
（実施例１９Ａ）
ＲＸ−５９０２ナノ製剤のＸＲＰＤ
実施例１６Ｂの方法に従い調製したＲＸ−５９０２ナノ製剤由来の粒子のＸＲＰＤを決定した。図３３に示されている通り、ＲＸ−５９０２は結晶性である。詳細なＸＲＰＤピークの同定は表１１に見出される。
【表１１】
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【０３３３】
（実施例１９Ｂ）
ＲＸ−５９０２  ＡＰＩのＸＲＰＤ
図３４は、実施例１４の方法に従い調製したＲＸ−５９０２  ＡＰＩのＸＲＰＤパターンを示す。
【０３３４】
（実施例１９Ｂ１）
溶解度評価、ゆっくりとした冷却およびゆっくりとした蒸発
ＲＸ−５９０２（約２ｍｇ）を１．５ｍｌ透明ガラスバイアル内で秤量した。対応する溶媒または溶媒混合物のアリコートをＲＴで添加し、表１２に示されている通り、１０分後溶解度を評価した。次いで、溶液および懸濁液を、５０℃でさらに１０分間振盪チャンバー内に置いた。溶解が観察されなかった場合、溶媒の別のアリコートを添加し、試料を振盪チャンバーに５０℃でさらに１０分間置いた。溶解が達成されるまで、または最大４００ｖｏｌが添加されるまでこの手順を繰り返した。
【表１２】
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【０３３５】
溶解度評価から得た結果に応じて試料を以下の通り処理した：（１）ＲＴで得た溶液を、バイアルキャップに針を刺すことによって、ＲＴでゆっくりと蒸発させた、（２）５０℃で得た溶液を０．２５℃／分で５℃に冷却した。冷却後に得た溶液をＲＴでゆっくりと蒸発させた。ＳＣＸＲＤに対して適切な可能性のある結晶と共に得られた全ての懸濁液をＰＬＭ顕微鏡法により評価し、最も有望な結晶をＳＣＸＲＤ分析に対して使用した。
【０３３６】
（実施例１９Ｂ２）
単結晶構造決定
ＲＸ−５２０９の結晶を、ゆっくりとした蒸発により、エタノールから結晶化した（４００ｖｏｌ（０．８ｍｌ）の溶媒中約２ｍｇ）。得られた結晶は針状形態であった。単結晶Ｘ線回折による分析に対して十分なサイズおよび品質の結晶を、およそ０．６５０×０．０８０×０．０７０ｍｍの寸法で単離した。データ収集用に使用した、未処理のままの結晶および単結晶の光学顕微鏡像が図３５Ａおよび３５Ｂに示されている。測定のパラメーターおよび結果は表１３〜２１に示されている。
【０３３７】
結晶の表
【表１３】
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【表１４】
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【０３３８】
リファインメントの概要：
秩序化した非Ｈ原子、ＸＹＺ  自由にリファイン
秩序化した非Ｈ原子、Ｕ  異方性
Ｈ原子（炭素上）、ＸＹＺ  付加した原子上に乗った理想的な位置
Ｈ原子（炭素上）、Ｕ  結合した原子に対して適当なＵ（ｅｑ）の倍数
Ｈ原子（ヘテロ原子上）、ＸＹＺ  自由にリファイン
Ｈ原子（ヘテロ原子上）、Ｕ  等方性
無秩序原子、ＯＣＣ  無秩序なし
無秩序原子、ＸＹＺ  無秩序なし
無秩序原子、Ｕ  無秩序なし
【表１５−１】
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【表１５−２】
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【０３３９】
Ｕ（ｅｑ）は、直交したＵｉｊテンソルのトレースの３分の１として定義される。
【表１６】
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【表１７−１】
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【表１７−２】
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【表１８】
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【表１９】
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【０３４０】
異方性原子の置換因子指数は、以下の形態を取る：−２π２［ｈ２ａ＊２Ｕ１１＋．．．＋２ｈｋａ＊ｂ＊Ｕ１２］
【表２０】
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【表２１】
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【０３４１】
（実施例２０）
分析ＸＲＰＤデータ
ＲＸ−５９０２ナノ製剤（実施例１８Ａ（上側））とＲＸ−５９０２ＡＰＩ（実施例１８Ｂ（下側））のＸＲＰＤパターンを比較した重ね合わせが図３６にある。これらの試料は異なる時間に分析されたが、同じ試験方法を使用し、これによって、ピーク位置の同定および比較が促進されている。試料ピークリストを見直すと、観察されたピークのほとんど全てに対して良好なマッチングを示している。ピーク強度およびピーク分割におけるここでのバリエーションは、あまり有意ではなく、マッチングには影響を与えないと考えられる。ポロキサマー４０７の反射がナノ懸濁液パターンに寄与し得ることにも注目されたい。両パターンは結晶性物質と一致する。明らかな非晶質の構成成分は存在しない。このデータは、ナノ懸濁液結晶構造がＲＸ−５９０２  ＡＰＩと一致することを実証している。
【０３４２】
開示された主題の特定の実施形態は、任意の組合せの上に示されたおよび下に示された実施形態の１つまたは複数を対象とし得ることは当業者には明らかである。本発明は、例示および実施例によりある程度詳細に開示されてきたが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、変更がなされ得ること、および同等物が置換され得ることは当業者には明らかである。したがって、記載および実施例は、本発明の範囲を限定するものであると解釈されるべきではない。本明細書で開示されているすべての参考文献、刊行物、特許、および特許出願は、それぞれが個々に組み込まれているかのように、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ−３５Ｂ】
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【図３６】
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【国際調査報告】
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