(57)【要約】本明細書では、がんを検出および処置するための組成物および方法が開示される。一部の実施形態では、がんは、Ｒａｓの活性化を特徴とする。上記方法は、Ｒａｓタンパク質の発がん性の活性化を特徴とするがんを患う対象へと、（ｉ）ｍＴＯＲＣ阻害療法と、（ｉｉ）毒素療法とを含む治療レジメンを投与するステップを含み得る。がんは、固形腫瘍を含み得、転移性細胞を含み得る。がんはまた、線維形成性および／または乏血管性である微小環境内に存在し得、栄養物質が低量であるかまたは栄養物質が枯渇した微小環境内に存在し得る。
2018516895.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒａｓタンパク質の発がん性の活性化を特徴とするがんを患う対象へと、
（ｉ）ｍＴＯＲＣ阻害療法と、
（ｉｉ）毒素療法と
を含む治療レジメンを投与するステップを含む方法。
【請求項２】
ｍＴＯＲＣ阻害療法を、前記毒素療法の前に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｍＴＯＲＣ阻害療法が、ｍＴＯＲＣ１阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記がんが、固形腫瘍を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記がんが、線維形成性および／または乏血管性である微小環境内に棲息する、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記がんが、転移性細胞を含む、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記がんが、膵臓がんである、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記Ｒａｓタンパク質が、Ｋ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ｍＴＯＲＣ１阻害剤が、ラパマイシン／シロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、ゾタロリムス、デフォロリムス、ウォルトマンニン、ＴＯＰ−２１６、ＴＡＦＡ９３、ＣＣＩ−７７９、ＡＢＴ５７８、ＳＡＲ５４３、アスコマイシン、ＦＫ５０６、ＡＰ２３５７３、ＡＰ２３４６４、ＡＰ２３８４１、ＫＵ−００６３７９４、ＩＮＫ−１２８、ＥＸ２０４４、ＥＸ３８５５、ＥＸ７５１８、ＡＺＤ−８０５５、ＡＺＤ−２０１４、Ｐａｌｏｍｉｄ  ５２９、Ｐｐ−２４２、ＯＳＩ−０２７、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記毒素療法が、シクロホスファミド、クロランブシル、シスプラチン、ブスルファン、メルファラン、カルムスチン、ストレプトゾトシン、トリエチレンメラミン、マイトマイシンＣ、メトトレキサート、エトポシド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、ダカルバジン、アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、パクリタキセル、パクリタキセル誘導体、細胞増殖抑制剤、デキサメタゾン、プレドニゾン、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、ロイコボリン、アミホスチン、ダクチノマイシン、メクロレタミン、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、ロムスチン、リポソーマルドキソルビシン、ゲムシタビン、リポソーマルダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、ドセタキセル、アルデスロイキン、カルボプラチン、オキサリプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ＣＰＴ１１（イリノテカン）、１０−ヒドロキシ７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンベータ、インターフェロンアルファ、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロランブシル、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記毒素療法を、低用量で投与する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
毒素を、可溶性タンパク質へとコンジュゲートさせる、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記可溶性タンパク質が、アルブミンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記治療レジメンが、リソソーム阻害療法を含まない、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記治療レジメンが、Ｒａｓ阻害療法を含まない、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
単剤療法としてのｍＴＯＲＣ１阻害剤による処置に好適に応答する可能性が高いがんを識別するための方法であって、前記がんに由来する試料を、Ｒａｓの発がん性の活性化についてアッセイするステップを含み、前記試料が、低度の発がん性のＲａｓ活性を有するか、または発がん性のＲａｓ活性を有さないと決定される方法。
【請求項１７】
単剤療法としてのｍＴＯＲＣ１阻害剤による処置に好適に応答しない可能性が高いがんを識別するための方法であって、前記がんに由来する試料を、Ｒａｓの発がん性の活性化についてアッセイするステップを含み、前記試料が、発がん性のＲａｓ活性を有すると決定される方法。
【請求項１８】
Ｒａｓの発がん性の活性化が、遺伝子突然変異により引き起こされる、構成的に活性なＲａｓを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記遺伝子突然変異が、突然変異したＲａｓタンパク質を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記遺伝子突然変異が、Ｒａｓ抑制性タンパク質の発現または活性の低下を結果としてもたらす、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
Ｒａｓの発がん性の活性化を、対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＰＣＲおよびサンガージデオキシシークエンシング、ＰＣＲおよびパイロシークエンシング、ＰＣＲおよび質量分析（ＭＳ）、ＰＣＲおよび一塩基伸長、マルチプレックスライゲーション依存型プローブ増幅（ＭＬＰＡ）、または蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により検出する、請求項１７から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
がんを検出するための組成物であって、がん細胞によるマクロピノサイトーシスのための基質へとコンジュゲートさせたイメージング剤を含む組成物。
【請求項２３】
ｍＴＯＲＣ１阻害剤をさらに含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記がんを、ｉｎ  ｖｉｖｏの対象において検出する、請求項２２から２３のいずれかに記載の組成物。
【請求項２５】
前記イメージング剤が、金属性である、請求項２２から２４のいずれかに記載の組成物。
【請求項２６】
前記イメージング剤が、放射性標識されている、請求項２２から２４のいずれかに記載の組成物。
【請求項２７】
マクロピノサイトーシスのための前記基質が、可溶性タンパク質を含む、請求項２２から２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項２８】
前記可溶性タンパク質が、アルブミンである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記がんが、発がん性のＲａｓ活性を呈する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３０】
対象におけるがんを検出するための方法であって、
（ｉ）前記対象へと、ｍＴＯＲＣ１阻害剤を投与するステップと；
（ｉｉ）前記対象へと、検出用シグナルを誘発することが可能なイメージング剤を投与するステップと；
（ｉｉｉ）前記イメージング剤により誘発された前記シグナルを検出するステップと
を含む方法。
【請求項３１】
前記イメージング剤を、がん細胞によるマクロピノサイトーシスのための基質へとコンジュゲートさせる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記イメージング剤を、可溶性タンパク質へとコンジュゲートさせる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記可溶性タンパク質が、アルブミンである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ｍＴＯＲＣ１阻害剤を、前記イメージング剤の前に投与する、請求項３０から３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記ｍＴＯＲＣ１阻害剤を、前記対象へと、前記イメージング剤の少なくとも１、３、５、１２、または２４時間前に投与する、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願情報）
本出願は、（２０１５年５月１３日に出願された）米国仮特許出願第６２／１６１，２１９号に基づく優先権および利益を主張しており、その全体の内容は本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（政府支援）
本発明は、米国国立がん研究所によって授与されたＰ０１  ＣＡ１０４８３８の下、政府支援でなされた。米国政府は本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
増殖および分裂するために、細胞は、エネルギーの産生と、高分子の合成とを支援する、栄養物質の供給を要求する。哺乳動物細胞は多様なバイオエナジェティックス基質により取り囲まれているが、優先的に、グルコースおよびアミノ酸など、低分子量の栄養物質を代謝する。しかし、タンパク質は、体液のうちで、最も豊富な有機成分であり、それらを合わせたアミノ酸含量は、ヒト血漿中の単量体アミノ酸の量を、何桁か超える。細胞にアクセス可能な場合、細胞外タンパク質は、代替的な栄養物質として機能する潜在的可能性を有する。
【０００４】
成長因子によるシグナル伝達経路は、細胞周期の進行を刺激し、また、栄養物質の取込み、および同化的代謝も促進する。がん細胞は、異常な成長因子によるシグナル伝達を利用して、同化的代謝の調節異常を支援することが可能であり、これは、栄養物質が枯渇した微小環境内の生存を容易としうる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要旨）
本開示は、他の事柄にもまして、ある特定のがん細胞の、それらの局所的微小環境に対する代謝的適応が、それらを毒素療法に対して脆弱にすることについて教示する。
【０００６】
本開示はさらに、がんを処置するようにデザインされたある特定の治療的モダリティーが、実のところ、ある特定の細胞の増殖を促進する効果を及ぼしうることについても教示する。こうして、本開示は、このような治療的モダリティーに関する問題の源泉を識別し、多様な解決をさらに提供する。
【０００７】
一部の実施形態では、本開示は、ｍＴＯＲＣ１阻害剤による処置に感受性の場合もあり、そうでない場合もある腫瘍を識別するための技術を提供する。
【０００８】
一部の実施形態では、本開示は、腫瘍を特徴づけ、腫瘍を処置するのに適切な治療レジメンを決定し、任意選択で、このようなレジメンを実効するための技術を提供する。
【０００９】
一部の実施形態では、本開示は、Ｒａｓタンパク質の発がん性の活性化を特徴とするがんを患う対象へと、（ｉ）ｍＴＯＲＣ阻害療法と、（ｉｉ）毒素療法とを含む治療レジメンを投与するステップを含む方法を提供する。
【００１０】
一部の実施形態では、ｍＴＯＲＣ阻害療法を、毒素療法の前に投与する。一部の実施形態では、ｍＴＯＲＣ阻害療法は、ｍＴＯＲＣ１阻害剤を含む。
【００１１】
一部の実施形態では、がんは、固形腫瘍を含む。一部の実施形態では、がんは、転移性細胞を含む。一部の実施形態では、がんは、線維形成性および／または乏血管性である微小環境内にある。一部の実施形態では、がんは、栄養物質が低量であるかまたは栄養物質が枯渇した微小環境内にある。
【００１２】
一部の実施形態では、がんは、膵臓がんである。
【００１３】
一部の実施形態では、発がん性の活性化Ｒａｓタンパク質は、Ｋ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｒａｓタンパク質は、Ｋ−Ｒａｓである。
【００１４】
一部の実施形態では、ｍＴＯＲＣ１阻害剤は、ラパマイシン／シロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、ゾタロリムス、デフォロリムス、ウォルトマンニン、ＴＯＰ−２１６、ＴＡＦＡ９３、ＣＣＩ−７７９、ＡＢＴ５７８、ＳＡＲ５４３、アスコマイシン、ＦＫ５０６、ＡＰ２３５７３、ＡＰ２３４６４、ＡＰ２３８４１、ＫＵ−００６３７９４、ＩＮＫ−１２８、ＥＸ２０４４、ＥＸ３８５５、ＥＸ７５１８、ＡＺＤ−８０５５、ＡＺＤ−２０１４、Ｐａｌｏｍｉｄ  ５２９、Ｐｐ−２４２、ＯＳＩ−０２７、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００１５】
一部の実施形態では、毒素療法は、シクロホスファミド、クロランブシル、シスプラチン、ブスルファン、メルファラン、カルムスチン、ストレプトゾトシン、トリエチレンメラミン、マイトマイシンＣ、メトトレキサート、エトポシド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン（thiocguanine）、シタラビン、５−フルオロウラシル、ダカルバジン、アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、パクリタキセル、パクリタキセル誘導体、細胞増殖抑制剤、デキサメタゾン、プレドニゾン、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、ロイコボリン、アミホスチン、ダクチノマイシン、メクロレタミン、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、ロムスチン、リポソーマルドキソルビシン、ゲムシタビン、リポソーマルダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、ドセタキセル、アルデスロイキン、カルボプラチン、オキサリプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ＣＰＴ１１（イリノテカン）、１０−ヒドロキシ７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンベータ、インターフェロンアルファ、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロランブシル、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００１６】
一部の実施形態では、毒素を、マクロピノサイトーシス基質へとコンジュゲートさせる。一部の実施形態では、マクロピノサイトーシス基質は、可溶性タンパク質である。一部の実施形態では、可溶性タンパク質は、アルブミンである。
【００１７】
一部の実施形態では、毒素療法を、低用量で投与する。
【００１８】
一部の実施形態では、治療レジメンは、リソソーム阻害療法を含まない。一部の実施形態では、治療レジメンは、Ｒａｓ阻害療法を含まない。
【００１９】
一部の実施形態では、本開示は、単剤療法としてのｍＴＯＲＣ１阻害剤による処置に好適に応答する可能性が高いがんを識別するための方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、がんに由来する試料を、Ｒａｓの発がん性の活性化についてアッセイするステップを含み、この場合、試料は、低度の発がん性のＲａｓ活性を有するか、または発がん性のＲａｓ活性を有さないと決定される。
【００２０】
一部の実施形態では、本開示は、単剤療法としてのｍＴＯＲＣ１阻害剤による処置に好適に応答しない可能性が高いがんを識別するための方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、がんに由来する試料を、Ｒａｓの発がん性の活性化についてアッセイするステップを含み、この場合、試料は、発がん性のＲａｓ活性を有すると決定される。
【００２１】
一部の実施形態では、Ｒａｓの発がん性の活性化は、遺伝子突然変異により引き起こされる、構成的に活性なＲａｓを含む。一部の実施形態では、遺伝子突然変異は、突然変異したＲａｓタンパク質を含む。一部の実施形態では、遺伝子突然変異は、Ｒａｓ抑制性タンパク質の発現または活性の低下を結果としてもたらす。
【００２２】
一部の実施形態では、Ｒａｓの発がん性の活性化を、対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＰＣＲおよびサンガージデオキシシークエンシング、ＰＣＲおよびパイロシークエンシング、ＰＣＲおよび質量分析（ＭＳ）、ＰＣＲおよび一塩基伸長、マルチプレックスライゲーション依存型プローブ増幅（ＭＬＰＡ）、または蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により検出する。
【００２３】
本開示はまた、がんを検出するための組成物も提供する。一部の実施形態では、がんを検出するための組成物は、がん細胞によるマクロピノサイトーシスのための基質へとコンジュゲートさせたイメージング剤を含む。
【００２４】
一部の実施形態では、組成物はさらに、ｍＴＯＲＣ１阻害剤も含む。
【００２５】
一部の実施形態では、がんを、ｉｎ  ｖｉｖｏの対象において検出する。
【００２６】
一部の実施形態では、イメージング剤は、金属性である。一部の実施形態では、イメージング剤は、放射性標識されている。
【００２７】
一部の実施形態では、マイクロピノサイトーシスのための基質は、可溶性タンパク質を含む。一部の実施形態では、可溶性タンパク質は、アルブミンである。
【００２８】
一部の実施形態では、検出されるがんは、発がん性のＲａｓ活性を呈する。
【００２９】
一部の実施形態では、本開示は、対象におけるがんを検出するための方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、（ｉ）対象へと、ｍＴＯＲＣ１阻害剤を投与するステップと；（ｉｉ）対象へと、検出用シグナルを誘発することが可能なイメージング剤を投与するステップと；（ｉｉｉ）イメージング剤により誘発されたシグナルを検出するステップとを含む。
【００３０】
一部の実施形態では、イメージング剤を、がん細胞によるマクロピノサイトーシスのための基質へとコンジュゲートさせる。一部の実施形態では、イメージング剤を、可溶性タンパク質へとコンジュゲートさせる。一部の実施形態では、可溶性タンパク質は、アルブミンである。
【００３１】
一部の実施形態では、ｍＴＯＲＣ１阻害剤を、イメージング剤の前に投与する。一部の実施形態では、ｍＴＯＲＣ１阻害剤を、対象へと、イメージング剤の少なくとも１、３、５、１２、または２４時間前に投与する。
【００３２】
以下の図は、例示だけを目的として明示されるものであり、限定的であることを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｃは、生理学的レベルの細胞外タンパク質が、野生型細胞およびＫ−Ｒａｓ突然変異細胞に対して、栄養上の利益をもたらすことを示す図である。図１Ａは、表示の異なる栄養物質［グルコース、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、グルタミン、必須アミノ酸（ＥＡＡ）、ロイシン］を欠く培地±３％のアルブミン中の培養の３日目における、野生型ＭＥＦおよびヘテロ接合性のＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦの細胞数についての、例示的なグラフを示す図である。点線は、開始時の細胞数を指し示す。＃検出限界を下回る。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。図１Ｂは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミン中の、野生型ＭＥＦおよびＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。図１Ｃは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミン中の、ミリストイル化Ａｋｔ１（ｍｙｒ−Ａｋｔ１）を発現する野生型ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（ｎ＝３）として表す。
【図１ＢＣ】図１Ａ〜Ｃは、生理学的レベルの細胞外タンパク質が、野生型細胞およびＫ−Ｒａｓ突然変異細胞に対して、栄養上の利益をもたらすことを示す図である。図１Ａは、表示の異なる栄養物質［グルコース、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、グルタミン、必須アミノ酸（ＥＡＡ）、ロイシン］を欠く培地±３％のアルブミン中の培養の３日目における、野生型ＭＥＦおよびヘテロ接合性のＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦの細胞数についての、例示的なグラフを示す図である。点線は、開始時の細胞数を指し示す。＃検出限界を下回る。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。図１Ｂは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミン中の、野生型ＭＥＦおよびＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。図１Ｃは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミン中の、ミリストイル化Ａｋｔ１（ｍｙｒ−Ａｋｔ１）を発現する野生型ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（ｎ＝３）として表す。
【００３４】
【図２ＡＢＣＤ】図２Ａ〜Ｄは、例示的な増殖曲線を示す図である。図２Ａは、ＥＡＡ非含有培地±３％のアルブミン中の、野生型ＭＥＦおよびＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦについての増殖曲線を示す図である。図２Ｂは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミン中の、対照またはＰＴＥＮ  ｓｈＲＮＡを発現する野生型ＭＥＦについての増殖曲線を示す図である。図２Ｃおよび２Ｄは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミン中で増殖させた、空ベクターもしくはＫ−ＲａｓＧ１２Ｖをトランスフェクトされた野生型ＭＥＦ（２Ｃ）、または空ベクターもしくはＨ−ＲａｓＧ１２Ｖをトランスフェクトされた野生型ＭＥＦ（２Ｄ）についての増殖曲線を示す図である。図２Ｅおよび２Ｆは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミン中の、Ｋ−ＲＡＳＧ１２Ｖ（２Ｅ）またはＨ−ＲａｓＧ１２Ｖ（２Ｆ）をトランスフェクトされた、野生型ＭＥＦおよびＵｌｋ１／２二重ノックアウト（ＤＫＯ）ＭＥＦについての増殖曲線を示す図である。構成的に活性なＲａｓ変異体の発現は、５０ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンにより誘導した。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（ｎ＝３）として表す。
【図２ＥＦ】図２Ａ〜Ｄは、例示的な増殖曲線を示す図である。図２Ａは、ＥＡＡ非含有培地±３％のアルブミン中の、野生型ＭＥＦおよびＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦについての増殖曲線を示す図である。図２Ｂは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミン中の、対照またはＰＴＥＮ  ｓｈＲＮＡを発現する野生型ＭＥＦについての増殖曲線を示す図である。図２Ｃおよび２Ｄは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミン中で増殖させた、空ベクターもしくはＫ−ＲａｓＧ１２Ｖをトランスフェクトされた野生型ＭＥＦ（２Ｃ）、または空ベクターもしくはＨ−ＲａｓＧ１２Ｖをトランスフェクトされた野生型ＭＥＦ（２Ｄ）についての増殖曲線を示す図である。図２Ｅおよび２Ｆは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミン中の、Ｋ−ＲＡＳＧ１２Ｖ（２Ｅ）またはＨ−ＲａｓＧ１２Ｖ（２Ｆ）をトランスフェクトされた、野生型ＭＥＦおよびＵｌｋ１／２二重ノックアウト（ＤＫＯ）ＭＥＦについての増殖曲線を示す図である。構成的に活性なＲａｓ変異体の発現は、５０ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンにより誘導した。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（ｎ＝３）として表す。
【００３５】
【図３ＡＢＣ】図３Ａ〜Ｅは、細胞外タンパク質のマクロピノサイトーシスと、リソソームにおける分解とが、ＥＡＡ飢餓の間における、Ｒａｓ突然変異細胞の増殖を支援することを示す図である。図３Ａは、完全培地中に５％のレベルでＥＡＡを含有するアミノ酸欠損培地±３％のアルブミン中の、野生型ＭＥＦおよびＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。図３Ｂは、５％のＥＡＡを含有するアミノ酸欠損培地であって、表示の濃度のアルブミンを補充したアミノ酸欠損培地中の、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。図３Ｃは、蛍光標識されたＢＳＡおよびＤＱ−ＢＳＡにより評価される、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内の、アルブミンの取込みおよび細胞内分解を示す図である。プロテアーゼ阻害剤：２μＭのペプスタチンＡ、２μＭのＥ−６４、１０μＭのロイペプチンである。スケールバー＝１０μｍである。図３Ｄは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミンおよび（３Ｃ）のようなプロテアーゼ阻害剤中の、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。図３Ｅは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミンおよび２５μＭのＥＩＰＡ中の培養の３日目における、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦの細胞数についての例示的なグラフを示す図である。点線は、開始時の細胞数を指し示す。＊＊＊ｐ＜０．００１である。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（ｎ＝３）として表す。
【図３ＤＥ】図３Ａ〜Ｅは、細胞外タンパク質のマクロピノサイトーシスと、リソソームにおける分解とが、ＥＡＡ飢餓の間における、Ｒａｓ突然変異細胞の増殖を支援することを示す図である。図３Ａは、完全培地中に５％のレベルでＥＡＡを含有するアミノ酸欠損培地±３％のアルブミン中の、野生型ＭＥＦおよびＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。図３Ｂは、５％のＥＡＡを含有するアミノ酸欠損培地であって、表示の濃度のアルブミンを補充したアミノ酸欠損培地中の、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。図３Ｃは、蛍光標識されたＢＳＡおよびＤＱ−ＢＳＡにより評価される、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内の、アルブミンの取込みおよび細胞内分解を示す図である。プロテアーゼ阻害剤：２μＭのペプスタチンＡ、２μＭのＥ−６４、１０μＭのロイペプチンである。スケールバー＝１０μｍである。図３Ｄは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミンおよび（３Ｃ）のようなプロテアーゼ阻害剤中の、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。図３Ｅは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミンおよび２５μＭのＥＩＰＡ中の培養の３日目における、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦの細胞数についての例示的なグラフを示す図である。点線は、開始時の細胞数を指し示す。＊＊＊ｐ＜０．００１である。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（ｎ＝３）として表す。
【００３６】
【図４ＡＢ】図４Ａおよび４Ｂは、例示的な増殖曲線を示す図である。図４Ａは、完全培地中に５％のレベルでＥＡＡを含有するアミノ酸欠損培地であって、表示の濃度のアルブミンを補充したアミノ酸欠損培地中の、野生型ＭＥＦについての増殖曲線を示す図である。図４Ｂは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミンおよび２０μＭのクロロキン中の、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦについての増殖曲線を示す図である。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（ｎ＝３）として表す。図４Ｃは、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ突然変異の、細胞外高分子の取込みに対する影響を示す図である。野生型ＭＥＦおよびＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、１６時間にわたり血清飢餓下に置き、次いで、蛍光標識されたデキストランと共にインキュベートし、細胞内デキストランを、３０分間にわたる取込みの後で定量化した。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞１０個とする視野のｎ＝７）として明示する。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図４Ｃ】図４Ａおよび４Ｂは、例示的な増殖曲線を示す図である。図４Ａは、完全培地中に５％のレベルでＥＡＡを含有するアミノ酸欠損培地であって、表示の濃度のアルブミンを補充したアミノ酸欠損培地中の、野生型ＭＥＦについての増殖曲線を示す図である。図４Ｂは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミンおよび２０μＭのクロロキン中の、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦについての増殖曲線を示す図である。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（ｎ＝３）として表す。図４Ｃは、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ突然変異の、細胞外高分子の取込みに対する影響を示す図である。野生型ＭＥＦおよびＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、１６時間にわたり血清飢餓下に置き、次いで、蛍光標識されたデキストランと共にインキュベートし、細胞内デキストランを、３０分間にわたる取込みの後で定量化した。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞１０個とする視野のｎ＝７）として明示する。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【００３７】
【図５ＡＢＣ】図５Ａ〜Ｆは、内在化タンパク質のリソソーム分解が、ｍＴＯＲＣ１経路を活性化させることを示す図である。図Ａは、ウェスタンブロット法（ＷＢ）により解析される、野生型ＭＥＦ内のｍＴＯＲＣ１の活性化と、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内のｍＴＯＲＣ１の活性化との比較を示す図である。ＭＥＦを、１時間にわたりＥＡＡ飢餓下に置き、次いで、ＥＡＡもしくは３％のアルブミンを含有する培地中、または新鮮のＥＡＡ非含有培地中で、４時間にわたり静置した。図５Ｂは、ＷＢにより解析される、ＥＡＡ飢餓の１時間後における、３％のアルブミンを伴う刺激による、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内のｍＴＯＲＣ１の活性化の、例示的な時間経過を示す図である。図５Ｃ〜Ｆは、ＷＢにより解析される、ｍＴＯＲＣ１の、アルブミンに依存する活性化に対する、リソソーム機能またはマクロピノサイトーシスの阻害の例示的な影響を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、１時間にわたりＥＡＡ飢餓下に置き、次いで、ＥＡＡもしくは３％のアルブミンを含有する培地中、または新鮮なＥＡＡ非含有培地中で、３時間にわたり静置した。飢餓の開始時に、バフィロマイシンＡ１（５Ｃ）、リソソームプロテアーゼ阻害剤（１０μＭのペプスタチンＡ、２０μＭのＥ−６４）（５Ｄ）、ＥＩＰＡ（Ｎａ＋／Ｈ＋交換阻害剤）（５Ｅ）またはＩＰＡ−３（ＰＡＫ１阻害剤）（５Ｆ）を添加した。
【図５ＤＥＦ】図５Ａ〜Ｆは、内在化タンパク質のリソソーム分解が、ｍＴＯＲＣ１経路を活性化させることを示す図である。図Ａは、ウェスタンブロット法（ＷＢ）により解析される、野生型ＭＥＦ内のｍＴＯＲＣ１の活性化と、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内のｍＴＯＲＣ１の活性化との比較を示す図である。ＭＥＦを、１時間にわたりＥＡＡ飢餓下に置き、次いで、ＥＡＡもしくは３％のアルブミンを含有する培地中、または新鮮のＥＡＡ非含有培地中で、４時間にわたり静置した。図５Ｂは、ＷＢにより解析される、ＥＡＡ飢餓の１時間後における、３％のアルブミンを伴う刺激による、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内のｍＴＯＲＣ１の活性化の、例示的な時間経過を示す図である。図５Ｃ〜Ｆは、ＷＢにより解析される、ｍＴＯＲＣ１の、アルブミンに依存する活性化に対する、リソソーム機能またはマクロピノサイトーシスの阻害の例示的な影響を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、１時間にわたりＥＡＡ飢餓下に置き、次いで、ＥＡＡもしくは３％のアルブミンを含有する培地中、または新鮮なＥＡＡ非含有培地中で、３時間にわたり静置した。飢餓の開始時に、バフィロマイシンＡ１（５Ｃ）、リソソームプロテアーゼ阻害剤（１０μＭのペプスタチンＡ、２０μＭのＥ−６４）（５Ｄ）、ＥＩＰＡ（Ｎａ＋／Ｈ＋交換阻害剤）（５Ｅ）またはＩＰＡ−３（ＰＡＫ１阻害剤）（５Ｆ）を添加した。
【００３８】
【図６ＡＢＣ】図６は、細胞外タンパク質が、ｍＴＯＲＣ１経路を活性化させうることを示す図である。図６Ａは、Ｓ６キナーゼ１のｍＴＯＲＣ１特異的リン酸化に対するウェスタンブロット法により解析される、異なる濃度のアルブミンで刺激したときの、野生型ＭＥＦ内およびＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内の、ｍＴＯＲＣ１の活性化を示す図である。必要な場合、５００ｎＭのトリン１を、ＥＡＡ飢餓の開始時に添加した。図６Ｂは、ウェスタンブロット法により解析される、空ベクターをトランスフェクトされた野生型ＭＥＦ内、またはＨ−ＲａｓＧ１２Ｖをトランスフェクトされた野生型ＭＥＦ内の、ＥＡＡおよびアルブミンによるｍＴＯＲＣ１の活性化の比較を示す図である。図６Ｃは、ウェスタンブロット法により解析される、対照またはＰＴＥＮ  ｓｈＲＮＡをトランスフェクトされた野生型ＭＥＦ内の、ＥＡＡおよびアルブミンによるｍＴＯＲＣ１の活性化の比較を示す図である。図６Ｄは、ウェスタンブロット法により解析される、野生型ＭＥＦ内の、アルブミンによるｍＴＯＲＣ１の活性化の時間経過を示す図である。図６Ｅは、ウェスタンブロット法により解析される、ｍＴＯＲＣ１の、アルブミンに依存する活性化に対する、リソソーム機能の撹乱の影響を示す図である。クロロキンを、飢餓の開始時に、表示の濃度で添加した。図６Ｆおよび６Ｇは、ウェスタンブロット法により解析される、ｍＴＯＲＣ１の、アルブミンに依存する活性化に対する、マクロピノサイトーシス阻害の例示的な影響を示す図である。；表示の濃度のサイトカラシンＤ（アクチン脱重合化阻害剤）（６Ｆ）またはジャスプラキノリド（アクチン重合化阻害剤）（６Ｇ）を、飢餓の開始時に添加した。全ての実験において、細胞を、１時間にわたるＥＡＡ飢餓下に置くことにより、ｍＴＯＲＣ１を不活化させた。次いで、細胞を、ＥＡＡもしくはアルブミンを含有する培地中、または新鮮のＥＡＡ非含有培地中で、３〜４時間にわたり静置することにより、ｍＴＯＲＣ１の再活性化をモニタリングした。
【図６ＤＥＦＧ】図６は、細胞外タンパク質が、ｍＴＯＲＣ１経路を活性化させうることを示す図である。図６Ａは、Ｓ６キナーゼ１のｍＴＯＲＣ１特異的リン酸化に対するウェスタンブロット法により解析される、異なる濃度のアルブミンで刺激したときの、野生型ＭＥＦ内およびＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内の、ｍＴＯＲＣ１の活性化を示す図である。必要な場合、５００ｎＭのトリン１を、ＥＡＡ飢餓の開始時に添加した。図６Ｂは、ウェスタンブロット法により解析される、空ベクターをトランスフェクトされた野生型ＭＥＦ内、またはＨ−ＲａｓＧ１２Ｖをトランスフェクトされた野生型ＭＥＦ内の、ＥＡＡおよびアルブミンによるｍＴＯＲＣ１の活性化の比較を示す図である。図６Ｃは、ウェスタンブロット法により解析される、対照またはＰＴＥＮ  ｓｈＲＮＡをトランスフェクトされた野生型ＭＥＦ内の、ＥＡＡおよびアルブミンによるｍＴＯＲＣ１の活性化の比較を示す図である。図６Ｄは、ウェスタンブロット法により解析される、野生型ＭＥＦ内の、アルブミンによるｍＴＯＲＣ１の活性化の時間経過を示す図である。図６Ｅは、ウェスタンブロット法により解析される、ｍＴＯＲＣ１の、アルブミンに依存する活性化に対する、リソソーム機能の撹乱の影響を示す図である。クロロキンを、飢餓の開始時に、表示の濃度で添加した。図６Ｆおよび６Ｇは、ウェスタンブロット法により解析される、ｍＴＯＲＣ１の、アルブミンに依存する活性化に対する、マクロピノサイトーシス阻害の例示的な影響を示す図である。；表示の濃度のサイトカラシンＤ（アクチン脱重合化阻害剤）（６Ｆ）またはジャスプラキノリド（アクチン重合化阻害剤）（６Ｇ）を、飢餓の開始時に添加した。全ての実験において、細胞を、１時間にわたるＥＡＡ飢餓下に置くことにより、ｍＴＯＲＣ１を不活化させた。次いで、細胞を、ＥＡＡもしくはアルブミンを含有する培地中、または新鮮のＥＡＡ非含有培地中で、３〜４時間にわたり静置することにより、ｍＴＯＲＣ１の再活性化をモニタリングした。
【００３９】
【図７ＡＢ】図７Ａ〜Ｃは、内在化タンパク質のリソソーム分解が、リソソームへのｍＴＯＲの動員を誘導することを示す図である。図７Ａは、ｍＴＯＲおよびリソソームマーカーであるＬＡＭＰ２に対する免疫蛍光法により解析される、細胞外タンパク質またはＥＡＡによる、リソソームへのｍＴＯＲの動員についての例示的な画像を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、１時間にわたりＥＡＡ飢餓下に置き、次いで、ＥＡＡもしくは３％のアルブミンを含有する培地中、または新鮮のＥＡＡ非含有培地中で、２時間にわたり静置した。図７Ｂは、（Ａ）のように処理および解析される、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内の、細胞外タンパク質による、リソソームへのｍＴＯＲの動員に対する、リソソームにおけるタンパク質分解の阻害の帰結についての例示的な画像を示す図である。２００ｎＭのバフィロマイシンＡ１を、ＥＡＡ飢餓の開始時に添加した。図７Ｃは、（Ａ）のように処理および解析される、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内の、リソソームへのｍＴＯＲの動員に対する、ＲａｇＡ／Ｂノックダウンの帰結についての例示的な画像を示す図である。スケールバー＝１０μｍである。
【図７Ｃ】図７Ａ〜Ｃは、内在化タンパク質のリソソーム分解が、リソソームへのｍＴＯＲの動員を誘導することを示す図である。図７Ａは、ｍＴＯＲおよびリソソームマーカーであるＬＡＭＰ２に対する免疫蛍光法により解析される、細胞外タンパク質またはＥＡＡによる、リソソームへのｍＴＯＲの動員についての例示的な画像を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、１時間にわたりＥＡＡ飢餓下に置き、次いで、ＥＡＡもしくは３％のアルブミンを含有する培地中、または新鮮のＥＡＡ非含有培地中で、２時間にわたり静置した。図７Ｂは、（Ａ）のように処理および解析される、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内の、細胞外タンパク質による、リソソームへのｍＴＯＲの動員に対する、リソソームにおけるタンパク質分解の阻害の帰結についての例示的な画像を示す図である。２００ｎＭのバフィロマイシンＡ１を、ＥＡＡ飢餓の開始時に添加した。図７Ｃは、（Ａ）のように処理および解析される、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内の、リソソームへのｍＴＯＲの動員に対する、ＲａｇＡ／Ｂノックダウンの帰結についての例示的な画像を示す図である。スケールバー＝１０μｍである。
【００４０】
【図８】図８は、Ｒａｇ  ＧＴＰアーゼが、細胞外に由来するタンパク質による、ｍＴＯＲＣ１の活性化を媒介することを示す図である。例示的なウェスタンブロットは、ｍＴＯＲＣ１の、アルブミンに依存する活性化に対する、ＲａｇＡ／Ｂノックダウンの帰結を示す。対照またはＲａｇＡ／Ｂ  ｓｈＲＮＡを発現するＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、１時間にわたるＥＡＡ飢餓にかけ、次いで、ＥＡＡもしくは３％のアルブミンを含有する培地中、または新鮮ＥＡＡ非含有培地中で、３時間にわたり静置した。
【００４１】
【図９Ａ】図９Ａ〜Ｅは、ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達が、細胞外タンパク質に依存する増殖に対する、負の調節因子であることを示す図である。図９Ａは、ロイシン含有培地またはロイシン非含有培地＋３％のアルブミンおよび以下の阻害剤：ＭＥＫ１／２（１μＭのＰＤ０３２５９０１、５０μＭのＰＤ９８０５９）、ＰＩ３キナーゼ（２５μＭのＬＹ２９４００２、２μＭのウォルトマンニン）、チロシンキナーゼ（５０μＭのゲニステイン）、ｍＴＯＲ（５０ｎＭのラパマイシン、２５０ｎＭのトリン１）、ｍＴＯＲ／ＰＩ３キナーゼ（０．５μＭのＢＥＺ２３５、０．５μＭのＧＤＣ０９８０）中の培養の３日目における、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦの細胞数についてのグラフを示す図である。点線は、開始時の細胞数を指し示す。図９Ｂは、ロイシン非含有培地＋３％のアルブミン（albumim）中で、１日間にわたり培養されたＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内の、ｍＴＯＲ経路活性、ＰＩ３キナーゼ経路活性、およびＭＡＰキナーゼ経路活性についての例示的なウェスタンブロットを示す図である。阻害剤は、（Ａ）の通りであった。図９Ｃは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミンおよび表示の濃度のトリン１中の、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。図９Ｄは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミン中の、Ｒａｐｔｏｒに対するｓｈＲＮＡ、Ｒｉｃｔｏｒに対するｓｈＲＮＡを発現するＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ、または対照についての例示的な増殖曲線を示す図である。図９Ｅは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミン中の培養の４日目における、Ｒａｐｔｏｒに対するｓｈＲＮＡ、Ｒｉｃｔｏｒに対するｓｈＲＮＡを発現するＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ、または対照についての明視野画像を示す図である。スケールバー＝５０μｍである。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（ｎ＝３）として表す。
【図９ＢＣ】図９Ａ〜Ｅは、ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達が、細胞外タンパク質に依存する増殖に対する、負の調節因子であることを示す図である。図９Ａは、ロイシン含有培地またはロイシン非含有培地＋３％のアルブミンおよび以下の阻害剤：ＭＥＫ１／２（１μＭのＰＤ０３２５９０１、５０μＭのＰＤ９８０５９）、ＰＩ３キナーゼ（２５μＭのＬＹ２９４００２、２μＭのウォルトマンニン）、チロシンキナーゼ（５０μＭのゲニステイン）、ｍＴＯＲ（５０ｎＭのラパマイシン、２５０ｎＭのトリン１）、ｍＴＯＲ／ＰＩ３キナーゼ（０．５μＭのＢＥＺ２３５、０．５μＭのＧＤＣ０９８０）中の培養の３日目における、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦの細胞数についてのグラフを示す図である。点線は、開始時の細胞数を指し示す。図９Ｂは、ロイシン非含有培地＋３％のアルブミン（albumim）中で、１日間にわたり培養されたＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内の、ｍＴＯＲ経路活性、ＰＩ３キナーゼ経路活性、およびＭＡＰキナーゼ経路活性についての例示的なウェスタンブロットを示す図である。阻害剤は、（Ａ）の通りであった。図９Ｃは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミンおよび表示の濃度のトリン１中の、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。図９Ｄは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミン中の、Ｒａｐｔｏｒに対するｓｈＲＮＡ、Ｒｉｃｔｏｒに対するｓｈＲＮＡを発現するＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ、または対照についての例示的な増殖曲線を示す図である。図９Ｅは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミン中の培養の４日目における、Ｒａｐｔｏｒに対するｓｈＲＮＡ、Ｒｉｃｔｏｒに対するｓｈＲＮＡを発現するＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ、または対照についての明視野画像を示す図である。スケールバー＝５０μｍである。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（ｎ＝３）として表す。
【図９ＤＥ】図９Ａ〜Ｅは、ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達が、細胞外タンパク質に依存する増殖に対する、負の調節因子であることを示す図である。図９Ａは、ロイシン含有培地またはロイシン非含有培地＋３％のアルブミンおよび以下の阻害剤：ＭＥＫ１／２（１μＭのＰＤ０３２５９０１、５０μＭのＰＤ９８０５９）、ＰＩ３キナーゼ（２５μＭのＬＹ２９４００２、２μＭのウォルトマンニン）、チロシンキナーゼ（５０μＭのゲニステイン）、ｍＴＯＲ（５０ｎＭのラパマイシン、２５０ｎＭのトリン１）、ｍＴＯＲ／ＰＩ３キナーゼ（０．５μＭのＢＥＺ２３５、０．５μＭのＧＤＣ０９８０）中の培養の３日目における、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦの細胞数についてのグラフを示す図である。点線は、開始時の細胞数を指し示す。図９Ｂは、ロイシン非含有培地＋３％のアルブミン（albumim）中で、１日間にわたり培養されたＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内の、ｍＴＯＲ経路活性、ＰＩ３キナーゼ経路活性、およびＭＡＰキナーゼ経路活性についての例示的なウェスタンブロットを示す図である。阻害剤は、（Ａ）の通りであった。図９Ｃは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミンおよび表示の濃度のトリン１中の、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。図９Ｄは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミン中の、Ｒａｐｔｏｒに対するｓｈＲＮＡ、Ｒｉｃｔｏｒに対するｓｈＲＮＡを発現するＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ、または対照についての例示的な増殖曲線を示す図である。図９Ｅは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミン中の培養の４日目における、Ｒａｐｔｏｒに対するｓｈＲＮＡ、Ｒｉｃｔｏｒに対するｓｈＲＮＡを発現するＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ、または対照についての明視野画像を示す図である。スケールバー＝５０μｍである。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（ｎ＝３）として表す。
【００４２】
【図１０ＡＢ】図１０Ａ〜Ｃは、ｍＴＯＲの阻害が、必須アミノ酸欠乏の間における、アルブミンに依存する細胞増殖を促進することを示す図である。図１０Ａは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミンおよび２５ｎＭのラパマイシンまたは２５０ｎＭのトリン１中の、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。図１０Ｂは、ロイシン含有培地またはロイシン非含有培地＋３％のアルブミンおよび表示の濃度のトリン１中の培養の３日目における、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ集団の倍加を示す図である。図１０Ｃは、３％のアルブミンを補充した完全培地±２５０ｎＭのトリン１中の培養の３日目、または３％のアルブミンを補充したロイシン非含有培地±２５０ｎＭのトリン１中の培養の４日目における、Ｋ−Ｒａｓ突然変異体の腫瘍細胞株（ＫＲＰＣ、ＭｉａＰａＣａ−２、Ａ５４９）の細胞数の倍数変化を示す図である。点線は、開始時の細胞数を指し示す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。＊＊＊ｐ＜０．００１である。図１０Ｄは、イソロイシン、リジン、またはアルギニンを欠く培地±３％のアルブミンおよび２５０ｎＭのトリン１中の、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦについての増殖曲線を示す図である。図１０Ｅは、ウェスタンブロット法により解析される、ｍＴＯＲＣ１経路活性およびｍＴＯＲＣ２経路活性に対する、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内の、ｓｈＲＮＡにより媒介されるＲａｐｔｏｒまたはＲｉｃｔｏｒの枯渇の例示的な効果を示す図である。被験条件下では、細胞は、それらの培地中に豊富なグルコースを供給されており、したがって、同化的増殖時におけるタンパク質合成とは対照的に、脂質のためにロイシンを利用する可能性は低い。細胞を１４Ｃ−ロイシンで標識したところ、タンパク質による標識の組込みの、脂質による標識の組込みに対する比が、対照細胞：３６４±６９、トリン−１処理細胞：２０３±２７、Ｒａｐｔｏｒ欠損細胞：８７±３であったことは、これと符合する。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（ｎ＝３）として表す。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜Ｃは、ｍＴＯＲの阻害が、必須アミノ酸欠乏の間における、アルブミンに依存する細胞増殖を促進することを示す図である。図１０Ａは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミンおよび２５ｎＭのラパマイシンまたは２５０ｎＭのトリン１中の、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。図１０Ｂは、ロイシン含有培地またはロイシン非含有培地＋３％のアルブミンおよび表示の濃度のトリン１中の培養の３日目における、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ集団の倍加を示す図である。図１０Ｃは、３％のアルブミンを補充した完全培地±２５０ｎＭのトリン１中の培養の３日目、または３％のアルブミンを補充したロイシン非含有培地±２５０ｎＭのトリン１中の培養の４日目における、Ｋ−Ｒａｓ突然変異体の腫瘍細胞株（ＫＲＰＣ、ＭｉａＰａＣａ−２、Ａ５４９）の細胞数の倍数変化を示す図である。点線は、開始時の細胞数を指し示す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。＊＊＊ｐ＜０．００１である。図１０Ｄは、イソロイシン、リジン、またはアルギニンを欠く培地±３％のアルブミンおよび２５０ｎＭのトリン１中の、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦについての増殖曲線を示す図である。図１０Ｅは、ウェスタンブロット法により解析される、ｍＴＯＲＣ１経路活性およびｍＴＯＲＣ２経路活性に対する、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内の、ｓｈＲＮＡにより媒介されるＲａｐｔｏｒまたはＲｉｃｔｏｒの枯渇の例示的な効果を示す図である。被験条件下では、細胞は、それらの培地中に豊富なグルコースを供給されており、したがって、同化的増殖時におけるタンパク質合成とは対照的に、脂質のためにロイシンを利用する可能性は低い。細胞を１４Ｃ−ロイシンで標識したところ、タンパク質による標識の組込みの、脂質による標識の組込みに対する比が、対照細胞：３６４±６９、トリン−１処理細胞：２０３±２７、Ｒａｐｔｏｒ欠損細胞：８７±３であったことは、これと符合する。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（ｎ＝３）として表す。
【図１０ＤＥ】図１０Ａ〜Ｃは、ｍＴＯＲの阻害が、必須アミノ酸欠乏の間における、アルブミンに依存する細胞増殖を促進することを示す図である。図１０Ａは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミンおよび２５ｎＭのラパマイシンまたは２５０ｎＭのトリン１中の、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。図１０Ｂは、ロイシン含有培地またはロイシン非含有培地＋３％のアルブミンおよび表示の濃度のトリン１中の培養の３日目における、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ集団の倍加を示す図である。図１０Ｃは、３％のアルブミンを補充した完全培地±２５０ｎＭのトリン１中の培養の３日目、または３％のアルブミンを補充したロイシン非含有培地±２５０ｎＭのトリン１中の培養の４日目における、Ｋ−Ｒａｓ突然変異体の腫瘍細胞株（ＫＲＰＣ、ＭｉａＰａＣａ−２、Ａ５４９）の細胞数の倍数変化を示す図である。点線は、開始時の細胞数を指し示す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。＊＊＊ｐ＜０．００１である。図１０Ｄは、イソロイシン、リジン、またはアルギニンを欠く培地±３％のアルブミンおよび２５０ｎＭのトリン１中の、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦについての増殖曲線を示す図である。図１０Ｅは、ウェスタンブロット法により解析される、ｍＴＯＲＣ１経路活性およびｍＴＯＲＣ２経路活性に対する、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内の、ｓｈＲＮＡにより媒介されるＲａｐｔｏｒまたはＲｉｃｔｏｒの枯渇の例示的な効果を示す図である。被験条件下では、細胞は、それらの培地中に豊富なグルコースを供給されており、したがって、同化的増殖時におけるタンパク質合成とは対照的に、脂質のためにロイシンを利用する可能性は低い。細胞を１４Ｃ−ロイシンで標識したところ、タンパク質による標識の組込みの、脂質による標識の組込みに対する比が、対照細胞：３６４±６９、トリン−１処理細胞：２０３±２７、Ｒａｐｔｏｒ欠損細胞：８７±３であったことは、これと符合する。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（ｎ＝３）として表す。
【００４３】
【図１１ＡＢ】図１１Ａ〜Ｄは、ｍＴＯＲＣ１が、内在化タンパク質のリソソーム分解を抑制することを示す図である。図１１Ａは、２５０ｎＭのトリン１の存在下または非存在下における、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内のリソソームＤＱ−ＢＳＡの分解についての、例示的な時間経過を示す図である。図１１Ｂは、（Ａ）で示した細胞についての、ＤＱ−ＢＳＡ蛍光の定量化を示す図である。図１１Ｃは、２５０ｎＭのトリン１の存在下または非存在下の、ＤＱ−ＢＳＡ取込みの６時間後における、野生型ＭＥＦ内およびＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内の、リソソームＤＱ−ＢＳＡの分解を示す図である。図１１Ｄは、（Ｃ）で示した細胞についての、ＤＱ−ＢＳＡ蛍光の定量化を示す図である。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞２０個とする視野のｎ≧５）として表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１である。スケールバー＝２０μｍである。
【図１１ＣＤ】図１１Ａ〜Ｄは、ｍＴＯＲＣ１が、内在化タンパク質のリソソーム分解を抑制することを示す図である。図１１Ａは、２５０ｎＭのトリン１の存在下または非存在下における、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内のリソソームＤＱ−ＢＳＡの分解についての、例示的な時間経過を示す図である。図１１Ｂは、（Ａ）で示した細胞についての、ＤＱ−ＢＳＡ蛍光の定量化を示す図である。図１１Ｃは、２５０ｎＭのトリン１の存在下または非存在下の、ＤＱ−ＢＳＡ取込みの６時間後における、野生型ＭＥＦ内およびＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内の、リソソームＤＱ−ＢＳＡの分解を示す図である。図１１Ｄは、（Ｃ）で示した細胞についての、ＤＱ−ＢＳＡ蛍光の定量化を示す図である。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞２０個とする視野のｎ≧５）として表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１である。スケールバー＝２０μｍである。
【００４４】
【図１２ＡＢ】図１２Ａ〜Ｄは、ｍＴＯＲＣ１に調節される、内在化タンパク質の異化が、エンドサイトーシスまたは遺伝子発現の変化に依存しないことを示す図である。図１２Ａは、細胞外高分子の取込みに対する、ｍＴＯＲの阻害の例示的な影響を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、２５０ｎＭのトリン１で、１時間にわたり前処理し、次いで、蛍光標識されたデキストランまたはアルブミンと共にインキュベートした。細胞内デキストランまたは細胞内アルブミンを、３０分間にわたる取込みの後で定量化した。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞１０個とする視野のｎ＝６）として表す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。ｎ．ｓ．：有意でない。図１２Ｂは、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦによる細胞外デキストランの取込みに対する、ｓｈＲＮＡにより媒介されるＲａｐｔｏｒの枯渇の例示的な影響を示す図である。蛍光標識されたデキストランの取込みを、３０分間にわたる取込みの後で定量化した。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞１０個とする視野のｎ＝８）として表す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。ｎ．ｓ．：有意でない。図１２Ｃは、デキストラン取込みの例示的な時間経過を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、２５０ｎＭのトリン１で、１時間にわたり前処理し、次いで、蛍光標識されたデキストランと共に、表示の時間にわたりインキュベートした。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞１０個とする視野のｎ＝８）として表す。図１２Ｄは、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内の、リソソームにおける内在化ＤＱ−ＢＳＡの分解に対する、ｓｈＲＮＡにより媒介されるＲａｐｔｏｒまたはＲｉｃｔｏｒの枯渇の例示的な影響を示す図である。細胞１個当たりの平均蛍光強度は、ＤＱ−ＢＳＡ取込みの６時間後に決定した。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞１５個とする視野のｎ＝７）として表す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ．ｓ．：有意でない。図１２Ｅは、リソソーム内在化ＤＱ−ＢＳＡの分解に対する、クロロキンおよびリソソームプロテアーゼ阻害剤の例示的な影響を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、２５０ｎＭのトリン１および２０μＭのクロロキンまたはプロテアーゼ阻害剤（２μＭのペプスタチンＡ、２μＭのＥ−６４、１０μＭのロイペプチン）で、１時間にわたり前処理した。次いで、細胞を、ＤＱ−ＢＳＡおよび表示の阻害剤と共に、６時間にわたりインキュベートした。スケールバー＝２０μｍである。ＤＱ−ＢＳＡ蛍光の強度を、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞２０個とする視野のｎ＝７）として表す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。＊＊＊ｐ＜０．００１である。図１２Ｆは、リソソームＤＱ−ＢＳＡの分解に対する、トリン１処理の時間依存性を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、２５０ｎＭのトリン１で、表示の時間にわたり前処理し、次いで、ＤＱ−ＢＳＡおよびトリン１と共にインキュベートした。スケールバー＝２０μｍである。ＤＱ−ＢＳＡ蛍光の強度の定量化を、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞３０個とする視野のｎ＝５）として表す。図１２Ｇは、トリン（tori）１により誘導されるＤＱ−ＢＳＡ分解に対する転写阻害の影響を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、５μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤまたは１μＭのトリプトリドで、３０分間にわたりにわたり前処理した。次いで、細胞を、ＤＱ−ＢＳＡおよび表示の阻害剤と共に、６時間にわたりインキュベートした。ＤＱ−ＢＳＡ蛍光の強度を、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞３０個とする視野のｎ＝６）として表す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。ｎ．ｓ．：有意でない。図１２Ｈは、２５０ｎＭのトリン１の存在下（左パネル）または非存在下（右パネル）における、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｖを発現するＵｌｋ１／２野生型ＭＥＦおよびＵｌｋ１／２二重ノックアウト（ＤＫＯ）ＭＥＦ内の、ＤＱ−ＢＳＡ蛍光の定量化を示す図である。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞２０個とする視野のｎ＝５）として表す。図１２Ｉは、３％のアルブミンを補充したロイシン非含有培地±２５０ｎＭのトリン１中の、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｖを発現するＵｌｋ１／２  ＤＫＯ  ＭＥＦについての増殖曲線を示す図である。構成的に活性なＲａｓの発現は、５０ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンにより誘導した。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（ｎ＝３）として表す。
【図１２ＣＤ】図１２Ａ〜Ｄは、ｍＴＯＲＣ１に調節される、内在化タンパク質の異化が、エンドサイトーシスまたは遺伝子発現の変化に依存しないことを示す図である。図１２Ａは、細胞外高分子の取込みに対する、ｍＴＯＲの阻害の例示的な影響を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、２５０ｎＭのトリン１で、１時間にわたり前処理し、次いで、蛍光標識されたデキストランまたはアルブミンと共にインキュベートした。細胞内デキストランまたは細胞内アルブミンを、３０分間にわたる取込みの後で定量化した。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞１０個とする視野のｎ＝６）として表す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。ｎ．ｓ．：有意でない。図１２Ｂは、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦによる細胞外デキストランの取込みに対する、ｓｈＲＮＡにより媒介されるＲａｐｔｏｒの枯渇の例示的な影響を示す図である。蛍光標識されたデキストランの取込みを、３０分間にわたる取込みの後で定量化した。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞１０個とする視野のｎ＝８）として表す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。ｎ．ｓ．：有意でない。図１２Ｃは、デキストラン取込みの例示的な時間経過を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、２５０ｎＭのトリン１で、１時間にわたり前処理し、次いで、蛍光標識されたデキストランと共に、表示の時間にわたりインキュベートした。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞１０個とする視野のｎ＝８）として表す。図１２Ｄは、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内の、リソソームにおける内在化ＤＱ−ＢＳＡの分解に対する、ｓｈＲＮＡにより媒介されるＲａｐｔｏｒまたはＲｉｃｔｏｒの枯渇の例示的な影響を示す図である。細胞１個当たりの平均蛍光強度は、ＤＱ−ＢＳＡ取込みの６時間後に決定した。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞１５個とする視野のｎ＝７）として表す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ．ｓ．：有意でない。図１２Ｅは、リソソーム内在化ＤＱ−ＢＳＡの分解に対する、クロロキンおよびリソソームプロテアーゼ阻害剤の例示的な影響を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、２５０ｎＭのトリン１および２０μＭのクロロキンまたはプロテアーゼ阻害剤（２μＭのペプスタチンＡ、２μＭのＥ−６４、１０μＭのロイペプチン）で、１時間にわたり前処理した。次いで、細胞を、ＤＱ−ＢＳＡおよび表示の阻害剤と共に、６時間にわたりインキュベートした。スケールバー＝２０μｍである。ＤＱ−ＢＳＡ蛍光の強度を、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞２０個とする視野のｎ＝７）として表す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。＊＊＊ｐ＜０．００１である。図１２Ｆは、リソソームＤＱ−ＢＳＡの分解に対する、トリン１処理の時間依存性を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、２５０ｎＭのトリン１で、表示の時間にわたり前処理し、次いで、ＤＱ−ＢＳＡおよびトリン１と共にインキュベートした。スケールバー＝２０μｍである。ＤＱ−ＢＳＡ蛍光の強度の定量化を、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞３０個とする視野のｎ＝５）として表す。図１２Ｇは、トリン（tori）１により誘導されるＤＱ−ＢＳＡ分解に対する転写阻害の影響を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、５μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤまたは１μＭのトリプトリドで、３０分間にわたりにわたり前処理した。次いで、細胞を、ＤＱ−ＢＳＡおよび表示の阻害剤と共に、６時間にわたりインキュベートした。ＤＱ−ＢＳＡ蛍光の強度を、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞３０個とする視野のｎ＝６）として表す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。ｎ．ｓ．：有意でない。図１２Ｈは、２５０ｎＭのトリン１の存在下（左パネル）または非存在下（右パネル）における、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｖを発現するＵｌｋ１／２野生型ＭＥＦおよびＵｌｋ１／２二重ノックアウト（ＤＫＯ）ＭＥＦ内の、ＤＱ−ＢＳＡ蛍光の定量化を示す図である。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞２０個とする視野のｎ＝５）として表す。図１２Ｉは、３％のアルブミンを補充したロイシン非含有培地±２５０ｎＭのトリン１中の、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｖを発現するＵｌｋ１／２  ＤＫＯ  ＭＥＦについての増殖曲線を示す図である。構成的に活性なＲａｓの発現は、５０ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンにより誘導した。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（ｎ＝３）として表す。
【図１２Ｅ】図１２Ａ〜Ｄは、ｍＴＯＲＣ１に調節される、内在化タンパク質の異化が、エンドサイトーシスまたは遺伝子発現の変化に依存しないことを示す図である。図１２Ａは、細胞外高分子の取込みに対する、ｍＴＯＲの阻害の例示的な影響を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、２５０ｎＭのトリン１で、１時間にわたり前処理し、次いで、蛍光標識されたデキストランまたはアルブミンと共にインキュベートした。細胞内デキストランまたは細胞内アルブミンを、３０分間にわたる取込みの後で定量化した。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞１０個とする視野のｎ＝６）として表す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。ｎ．ｓ．：有意でない。図１２Ｂは、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦによる細胞外デキストランの取込みに対する、ｓｈＲＮＡにより媒介されるＲａｐｔｏｒの枯渇の例示的な影響を示す図である。蛍光標識されたデキストランの取込みを、３０分間にわたる取込みの後で定量化した。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞１０個とする視野のｎ＝８）として表す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。ｎ．ｓ．：有意でない。図１２Ｃは、デキストラン取込みの例示的な時間経過を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、２５０ｎＭのトリン１で、１時間にわたり前処理し、次いで、蛍光標識されたデキストランと共に、表示の時間にわたりインキュベートした。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞１０個とする視野のｎ＝８）として表す。図１２Ｄは、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内の、リソソームにおける内在化ＤＱ−ＢＳＡの分解に対する、ｓｈＲＮＡにより媒介されるＲａｐｔｏｒまたはＲｉｃｔｏｒの枯渇の例示的な影響を示す図である。細胞１個当たりの平均蛍光強度は、ＤＱ−ＢＳＡ取込みの６時間後に決定した。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞１５個とする視野のｎ＝７）として表す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ．ｓ．：有意でない。図１２Ｅは、リソソーム内在化ＤＱ−ＢＳＡの分解に対する、クロロキンおよびリソソームプロテアーゼ阻害剤の例示的な影響を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、２５０ｎＭのトリン１および２０μＭのクロロキンまたはプロテアーゼ阻害剤（２μＭのペプスタチンＡ、２μＭのＥ−６４、１０μＭのロイペプチン）で、１時間にわたり前処理した。次いで、細胞を、ＤＱ−ＢＳＡおよび表示の阻害剤と共に、６時間にわたりインキュベートした。スケールバー＝２０μｍである。ＤＱ−ＢＳＡ蛍光の強度を、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞２０個とする視野のｎ＝７）として表す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。＊＊＊ｐ＜０．００１である。図１２Ｆは、リソソームＤＱ−ＢＳＡの分解に対する、トリン１処理の時間依存性を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、２５０ｎＭのトリン１で、表示の時間にわたり前処理し、次いで、ＤＱ−ＢＳＡおよびトリン１と共にインキュベートした。スケールバー＝２０μｍである。ＤＱ−ＢＳＡ蛍光の強度の定量化を、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞３０個とする視野のｎ＝５）として表す。図１２Ｇは、トリン（tori）１により誘導されるＤＱ−ＢＳＡ分解に対する転写阻害の影響を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、５μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤまたは１μＭのトリプトリドで、３０分間にわたりにわたり前処理した。次いで、細胞を、ＤＱ−ＢＳＡおよび表示の阻害剤と共に、６時間にわたりインキュベートした。ＤＱ−ＢＳＡ蛍光の強度を、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞３０個とする視野のｎ＝６）として表す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。ｎ．ｓ．：有意でない。図１２Ｈは、２５０ｎＭのトリン１の存在下（左パネル）または非存在下（右パネル）における、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｖを発現するＵｌｋ１／２野生型ＭＥＦおよびＵｌｋ１／２二重ノックアウト（ＤＫＯ）ＭＥＦ内の、ＤＱ−ＢＳＡ蛍光の定量化を示す図である。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞２０個とする視野のｎ＝５）として表す。図１２Ｉは、３％のアルブミンを補充したロイシン非含有培地±２５０ｎＭのトリン１中の、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｖを発現するＵｌｋ１／２  ＤＫＯ  ＭＥＦについての増殖曲線を示す図である。構成的に活性なＲａｓの発現は、５０ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンにより誘導した。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（ｎ＝３）として表す。
【図１２ＦＧ】図１２Ａ〜Ｄは、ｍＴＯＲＣ１に調節される、内在化タンパク質の異化が、エンドサイトーシスまたは遺伝子発現の変化に依存しないことを示す図である。図１２Ａは、細胞外高分子の取込みに対する、ｍＴＯＲの阻害の例示的な影響を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、２５０ｎＭのトリン１で、１時間にわたり前処理し、次いで、蛍光標識されたデキストランまたはアルブミンと共にインキュベートした。細胞内デキストランまたは細胞内アルブミンを、３０分間にわたる取込みの後で定量化した。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞１０個とする視野のｎ＝６）として表す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。ｎ．ｓ．：有意でない。図１２Ｂは、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦによる細胞外デキストランの取込みに対する、ｓｈＲＮＡにより媒介されるＲａｐｔｏｒの枯渇の例示的な影響を示す図である。蛍光標識されたデキストランの取込みを、３０分間にわたる取込みの後で定量化した。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞１０個とする視野のｎ＝８）として表す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。ｎ．ｓ．：有意でない。図１２Ｃは、デキストラン取込みの例示的な時間経過を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、２５０ｎＭのトリン１で、１時間にわたり前処理し、次いで、蛍光標識されたデキストランと共に、表示の時間にわたりインキュベートした。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞１０個とする視野のｎ＝８）として表す。図１２Ｄは、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内の、リソソームにおける内在化ＤＱ−ＢＳＡの分解に対する、ｓｈＲＮＡにより媒介されるＲａｐｔｏｒまたはＲｉｃｔｏｒの枯渇の例示的な影響を示す図である。細胞１個当たりの平均蛍光強度は、ＤＱ−ＢＳＡ取込みの６時間後に決定した。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞１５個とする視野のｎ＝７）として表す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ．ｓ．：有意でない。図１２Ｅは、リソソーム内在化ＤＱ−ＢＳＡの分解に対する、クロロキンおよびリソソームプロテアーゼ阻害剤の例示的な影響を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、２５０ｎＭのトリン１および２０μＭのクロロキンまたはプロテアーゼ阻害剤（２μＭのペプスタチンＡ、２μＭのＥ−６４、１０μＭのロイペプチン）で、１時間にわたり前処理した。次いで、細胞を、ＤＱ−ＢＳＡおよび表示の阻害剤と共に、６時間にわたりインキュベートした。スケールバー＝２０μｍである。ＤＱ−ＢＳＡ蛍光の強度を、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞２０個とする視野のｎ＝７）として表す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。＊＊＊ｐ＜０．００１である。図１２Ｆは、リソソームＤＱ−ＢＳＡの分解に対する、トリン１処理の時間依存性を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、２５０ｎＭのトリン１で、表示の時間にわたり前処理し、次いで、ＤＱ−ＢＳＡおよびトリン１と共にインキュベートした。スケールバー＝２０μｍである。ＤＱ−ＢＳＡ蛍光の強度の定量化を、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞３０個とする視野のｎ＝５）として表す。図１２Ｇは、トリン（tori）１により誘導されるＤＱ−ＢＳＡ分解に対する転写阻害の影響を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、５μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤまたは１μＭのトリプトリドで、３０分間にわたりにわたり前処理した。次いで、細胞を、ＤＱ−ＢＳＡおよび表示の阻害剤と共に、６時間にわたりインキュベートした。ＤＱ−ＢＳＡ蛍光の強度を、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞３０個とする視野のｎ＝６）として表す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。ｎ．ｓ．：有意でない。図１２Ｈは、２５０ｎＭのトリン１の存在下（左パネル）または非存在下（右パネル）における、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｖを発現するＵｌｋ１／２野生型ＭＥＦおよびＵｌｋ１／２二重ノックアウト（ＤＫＯ）ＭＥＦ内の、ＤＱ−ＢＳＡ蛍光の定量化を示す図である。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞２０個とする視野のｎ＝５）として表す。図１２Ｉは、３％のアルブミンを補充したロイシン非含有培地±２５０ｎＭのトリン１中の、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｖを発現するＵｌｋ１／２  ＤＫＯ  ＭＥＦについての増殖曲線を示す図である。構成的に活性なＲａｓの発現は、５０ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンにより誘導した。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（ｎ＝３）として表す。
【図１２ＨＩ】図１２Ａ〜Ｄは、ｍＴＯＲＣ１に調節される、内在化タンパク質の異化が、エンドサイトーシスまたは遺伝子発現の変化に依存しないことを示す図である。図１２Ａは、細胞外高分子の取込みに対する、ｍＴＯＲの阻害の例示的な影響を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、２５０ｎＭのトリン１で、１時間にわたり前処理し、次いで、蛍光標識されたデキストランまたはアルブミンと共にインキュベートした。細胞内デキストランまたは細胞内アルブミンを、３０分間にわたる取込みの後で定量化した。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞１０個とする視野のｎ＝６）として表す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。ｎ．ｓ．：有意でない。図１２Ｂは、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦによる細胞外デキストランの取込みに対する、ｓｈＲＮＡにより媒介されるＲａｐｔｏｒの枯渇の例示的な影響を示す図である。蛍光標識されたデキストランの取込みを、３０分間にわたる取込みの後で定量化した。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞１０個とする視野のｎ＝８）として表す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。ｎ．ｓ．：有意でない。図１２Ｃは、デキストラン取込みの例示的な時間経過を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、２５０ｎＭのトリン１で、１時間にわたり前処理し、次いで、蛍光標識されたデキストランと共に、表示の時間にわたりインキュベートした。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞１０個とする視野のｎ＝８）として表す。図１２Ｄは、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内の、リソソームにおける内在化ＤＱ−ＢＳＡの分解に対する、ｓｈＲＮＡにより媒介されるＲａｐｔｏｒまたはＲｉｃｔｏｒの枯渇の例示的な影響を示す図である。細胞１個当たりの平均蛍光強度は、ＤＱ−ＢＳＡ取込みの６時間後に決定した。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞１５個とする視野のｎ＝７）として表す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ．ｓ．：有意でない。図１２Ｅは、リソソーム内在化ＤＱ−ＢＳＡの分解に対する、クロロキンおよびリソソームプロテアーゼ阻害剤の例示的な影響を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、２５０ｎＭのトリン１および２０μＭのクロロキンまたはプロテアーゼ阻害剤（２μＭのペプスタチンＡ、２μＭのＥ−６４、１０μＭのロイペプチン）で、１時間にわたり前処理した。次いで、細胞を、ＤＱ−ＢＳＡおよび表示の阻害剤と共に、６時間にわたりインキュベートした。スケールバー＝２０μｍである。ＤＱ−ＢＳＡ蛍光の強度を、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞２０個とする視野のｎ＝７）として表す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。＊＊＊ｐ＜０．００１である。図１２Ｆは、リソソームＤＱ−ＢＳＡの分解に対する、トリン１処理の時間依存性を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、２５０ｎＭのトリン１で、表示の時間にわたり前処理し、次いで、ＤＱ−ＢＳＡおよびトリン１と共にインキュベートした。スケールバー＝２０μｍである。ＤＱ−ＢＳＡ蛍光の強度の定量化を、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞３０個とする視野のｎ＝５）として表す。図１２Ｇは、トリン（tori）１により誘導されるＤＱ−ＢＳＡ分解に対する転写阻害の影響を示す図である。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、５μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤまたは１μＭのトリプトリドで、３０分間にわたりにわたり前処理した。次いで、細胞を、ＤＱ−ＢＳＡおよび表示の阻害剤と共に、６時間にわたりインキュベートした。ＤＱ−ＢＳＡ蛍光の強度を、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞３０個とする視野のｎ＝６）として表す。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。ｎ．ｓ．：有意でない。図１２Ｈは、２５０ｎＭのトリン１の存在下（左パネル）または非存在下（右パネル）における、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｖを発現するＵｌｋ１／２野生型ＭＥＦおよびＵｌｋ１／２二重ノックアウト（ＤＫＯ）ＭＥＦ内の、ＤＱ−ＢＳＡ蛍光の定量化を示す図である。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（各視野の細胞を＞２０個とする視野のｎ＝５）として表す。図１２Ｉは、３％のアルブミンを補充したロイシン非含有培地±２５０ｎＭのトリン１中の、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｖを発現するＵｌｋ１／２  ＤＫＯ  ＭＥＦについての増殖曲線を示す図である。構成的に活性なＲａｓの発現は、５０ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンにより誘導した。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（ｎ＝３）として表す。
【００４５】
【図１３ＡＢ】図１３Ａ〜Ｇは、ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達が、栄養物質に富む条件下および栄養物質枯渇条件下で、細胞増殖に対する拮抗影響を及ぼすことを示す図である。図１３Ａおよび１３Ｂは、３％のアルブミンおよび表示量のＥＡＡを含有する培地中の培養の３日目における、±２５０ｎＭのトリン１を伴うＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ（１３Ａ）、およびＲａｐｔｏｒ  ｓｈＲＮＡまたは対照ｓｈＲＮＡを発現するＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ（１３Ｂ）の細胞数についての例示的なグラフを示す図である。図１３Ｃは、Ｋｉ−６７に対する免疫組織化学により解析される、対照ＫＰＣマウスおよびラパマイシン処理ＫＰＣマウスにおける膵臓腫瘍細胞の増殖を示す図である。スケールバー＝４００μｍであり；各々の引き伸ばし（ｂｌｏｗ−ｕｐｓ）におけるスケールバー＝５０μｍである。図１３Ｄは、（Ｃ）で示した、外部および内部の腫瘍領域における、Ｋｉ−６７陽性腫瘍細胞を定量化する例示的なグラフを示す図である。図１３Ｅは、３ｄ高解像度超音波により定量化される、対照ＫＰＣマウスおよびラパマイシン処理ＫＰＣマウスにおける、膵臓腫瘍の容量増大についての例示的なグラフを示す図である。図１３Ｆは、ロイシン含有培地またはロイシン非含有培地±３％のアルブミン中の、Ｒａｐｔｏｒ  ＫＯ  ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。図１３Ｇは、３％のアルブミンおよび表示量のＥＡＡを含有する培地中の培養の３日目における、Ｒａｐｔｏｒ  ｓｈＲＮＡまたは対照ｓｈＲＮＡを発現する野生型ＭＥＦの細胞数についての例示的なグラフを示す図である。図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｆ、および１３Ｇにおけるデータは、平均値±ＳＴＤＥＶ（ｎ＝３）として表す。点線は、開始時の細胞数を指し示す。図１３Ｄおよび１３Ｅにおけるデータは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５）として表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜Ｇは、ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達が、栄養物質に富む条件下および栄養物質枯渇条件下で、細胞増殖に対する拮抗影響を及ぼすことを示す図である。図１３Ａおよび１３Ｂは、３％のアルブミンおよび表示量のＥＡＡを含有する培地中の培養の３日目における、±２５０ｎＭのトリン１を伴うＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ（１３Ａ）、およびＲａｐｔｏｒ  ｓｈＲＮＡまたは対照ｓｈＲＮＡを発現するＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ（１３Ｂ）の細胞数についての例示的なグラフを示す図である。図１３Ｃは、Ｋｉ−６７に対する免疫組織化学により解析される、対照ＫＰＣマウスおよびラパマイシン処理ＫＰＣマウスにおける膵臓腫瘍細胞の増殖を示す図である。スケールバー＝４００μｍであり；各々の引き伸ばし（ｂｌｏｗ−ｕｐｓ）におけるスケールバー＝５０μｍである。図１３Ｄは、（Ｃ）で示した、外部および内部の腫瘍領域における、Ｋｉ−６７陽性腫瘍細胞を定量化する例示的なグラフを示す図である。図１３Ｅは、３ｄ高解像度超音波により定量化される、対照ＫＰＣマウスおよびラパマイシン処理ＫＰＣマウスにおける、膵臓腫瘍の容量増大についての例示的なグラフを示す図である。図１３Ｆは、ロイシン含有培地またはロイシン非含有培地±３％のアルブミン中の、Ｒａｐｔｏｒ  ＫＯ  ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。図１３Ｇは、３％のアルブミンおよび表示量のＥＡＡを含有する培地中の培養の３日目における、Ｒａｐｔｏｒ  ｓｈＲＮＡまたは対照ｓｈＲＮＡを発現する野生型ＭＥＦの細胞数についての例示的なグラフを示す図である。図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｆ、および１３Ｇにおけるデータは、平均値±ＳＴＤＥＶ（ｎ＝３）として表す。点線は、開始時の細胞数を指し示す。図１３Ｄおよび１３Ｅにおけるデータは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５）として表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図１３ＤＥＦＧ】図１３Ａ〜Ｇは、ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達が、栄養物質に富む条件下および栄養物質枯渇条件下で、細胞増殖に対する拮抗影響を及ぼすことを示す図である。図１３Ａおよび１３Ｂは、３％のアルブミンおよび表示量のＥＡＡを含有する培地中の培養の３日目における、±２５０ｎＭのトリン１を伴うＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ（１３Ａ）、およびＲａｐｔｏｒ  ｓｈＲＮＡまたは対照ｓｈＲＮＡを発現するＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ（１３Ｂ）の細胞数についての例示的なグラフを示す図である。図１３Ｃは、Ｋｉ−６７に対する免疫組織化学により解析される、対照ＫＰＣマウスおよびラパマイシン処理ＫＰＣマウスにおける膵臓腫瘍細胞の増殖を示す図である。スケールバー＝４００μｍであり；各々の引き伸ばし（ｂｌｏｗ−ｕｐｓ）におけるスケールバー＝５０μｍである。図１３Ｄは、（Ｃ）で示した、外部および内部の腫瘍領域における、Ｋｉ−６７陽性腫瘍細胞を定量化する例示的なグラフを示す図である。図１３Ｅは、３ｄ高解像度超音波により定量化される、対照ＫＰＣマウスおよびラパマイシン処理ＫＰＣマウスにおける、膵臓腫瘍の容量増大についての例示的なグラフを示す図である。図１３Ｆは、ロイシン含有培地またはロイシン非含有培地±３％のアルブミン中の、Ｒａｐｔｏｒ  ＫＯ  ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。図１３Ｇは、３％のアルブミンおよび表示量のＥＡＡを含有する培地中の培養の３日目における、Ｒａｐｔｏｒ  ｓｈＲＮＡまたは対照ｓｈＲＮＡを発現する野生型ＭＥＦの細胞数についての例示的なグラフを示す図である。図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｆ、および１３Ｇにおけるデータは、平均値±ＳＴＤＥＶ（ｎ＝３）として表す。点線は、開始時の細胞数を指し示す。図１３Ｄおよび１３Ｅにおけるデータは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５）として表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【００４６】
【図１４Ａ】図１４Ａ〜Ｄは、ｍＴＯＲＣ１の阻害が、栄養物質欠乏の間における細胞増殖を促進することを示す図である。図１４Ａは、Ｋｉ−６７、ＣＤ３１、およびｐｈｏｓｐｈｏｒ−Ｓ６に対する免疫組織化学により解析される、内側の無血管腫瘍領域、および外側の血管化腫瘍領域における、膵臓腫瘍細胞の例示的な増殖を示す図である。スケールバー＝５０μｍである。図１４Ｂは、ウェスタンブロット法により解析される、ｍＴＯＲＣ１経路活性およびｍＴＯＲＣ２経路活性に対する、野生型ＭＥＦ内の、ｓｈＲＮＡにより媒介されるＲａｐｔｏｒまたはＲｉｃｔｏｒの枯渇の例示的な影響を示す図である。図１４Ｃは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミン中の、Ｒａｐｔｏｒ  ｓｈＲＮＡまたは対照ｓｈＲＮＡを発現する野生型ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。図１４Ｄは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミンおよび２５ｎＭのラパマイシンまたは２５０ｎＭのトリン１中の、野生型ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。図１４Ｅは、ウェスタンブロット法により解析される、Ｃｒｅ誘導の４日後における、ｍＴＯＲＣ１経路活性およびｍＴＯＲＣ２経路活性に対する、誘導的ＫＯ  ＭＥＦ内の、ＲａｐｔｏｒまたはＲｉｃｔｏｒの遺伝子欠失の影響を示す図である。図１４Ｆは、ロイシン含有培地またはロイシン非含有培地±アルブミン中の、Ｒｉｃｔｏｒ  ＫＯ  ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（ｎ＝３）として表す。
【図１４ＢＣＤ】図１４Ａ〜Ｄは、ｍＴＯＲＣ１の阻害が、栄養物質欠乏の間における細胞増殖を促進することを示す図である。図１４Ａは、Ｋｉ−６７、ＣＤ３１、およびｐｈｏｓｐｈｏｒ−Ｓ６に対する免疫組織化学により解析される、内側の無血管腫瘍領域、および外側の血管化腫瘍領域における、膵臓腫瘍細胞の例示的な増殖を示す図である。スケールバー＝５０μｍである。図１４Ｂは、ウェスタンブロット法により解析される、ｍＴＯＲＣ１経路活性およびｍＴＯＲＣ２経路活性に対する、野生型ＭＥＦ内の、ｓｈＲＮＡにより媒介されるＲａｐｔｏｒまたはＲｉｃｔｏｒの枯渇の例示的な影響を示す図である。図１４Ｃは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミン中の、Ｒａｐｔｏｒ  ｓｈＲＮＡまたは対照ｓｈＲＮＡを発現する野生型ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。図１４Ｄは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミンおよび２５ｎＭのラパマイシンまたは２５０ｎＭのトリン１中の、野生型ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。図１４Ｅは、ウェスタンブロット法により解析される、Ｃｒｅ誘導の４日後における、ｍＴＯＲＣ１経路活性およびｍＴＯＲＣ２経路活性に対する、誘導的ＫＯ  ＭＥＦ内の、ＲａｐｔｏｒまたはＲｉｃｔｏｒの遺伝子欠失の影響を示す図である。図１４Ｆは、ロイシン含有培地またはロイシン非含有培地±アルブミン中の、Ｒｉｃｔｏｒ  ＫＯ  ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（ｎ＝３）として表す。
【図１４ＥＦ】図１４Ａ〜Ｄは、ｍＴＯＲＣ１の阻害が、栄養物質欠乏の間における細胞増殖を促進することを示す図である。図１４Ａは、Ｋｉ−６７、ＣＤ３１、およびｐｈｏｓｐｈｏｒ−Ｓ６に対する免疫組織化学により解析される、内側の無血管腫瘍領域、および外側の血管化腫瘍領域における、膵臓腫瘍細胞の例示的な増殖を示す図である。スケールバー＝５０μｍである。図１４Ｂは、ウェスタンブロット法により解析される、ｍＴＯＲＣ１経路活性およびｍＴＯＲＣ２経路活性に対する、野生型ＭＥＦ内の、ｓｈＲＮＡにより媒介されるＲａｐｔｏｒまたはＲｉｃｔｏｒの枯渇の例示的な影響を示す図である。図１４Ｃは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミン中の、Ｒａｐｔｏｒ  ｓｈＲＮＡまたは対照ｓｈＲＮＡを発現する野生型ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。図１４Ｄは、ロイシン非含有培地±３％のアルブミンおよび２５ｎＭのラパマイシンまたは２５０ｎＭのトリン１中の、野生型ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。図１４Ｅは、ウェスタンブロット法により解析される、Ｃｒｅ誘導の４日後における、ｍＴＯＲＣ１経路活性およびｍＴＯＲＣ２経路活性に対する、誘導的ＫＯ  ＭＥＦ内の、ＲａｐｔｏｒまたはＲｉｃｔｏｒの遺伝子欠失の影響を示す図である。図１４Ｆは、ロイシン含有培地またはロイシン非含有培地±アルブミン中の、Ｒｉｃｔｏｒ  ＫＯ  ＭＥＦについての例示的な増殖曲線を示す図である。データは、平均値±ＳＴＤＥＶ（ｎ＝３）として表す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
（定義）
そうでないことが指し示されない限りにおいて、本明細書で使用される用語は、本開示の理解を容易とするために、当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有し、一部の用語は、本明細書では、以下の定義に従う意味を有するように使用される。
【００４８】
本発明をよりたやすく理解するために、ある特定の用語を、まず以下で定義する。以下の用語および他の用語についてのさらなる定義は、本明細書の全体で明示される。
【００４９】
本出願では、文脈からそうでないことが明らかとならない限りにおいて、（ｉ）「ある」という用語は、「少なくとも１つの」を意味するように理解することができ；（ｉｉ）「または」という用語は、「および／または」を意味するように理解することができ；（ｉｉｉ）「〜を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「〜を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、それら自体により明示されるのであれ、１または複数のさらなる構成要素またはステップと併せて明示されるのであれ、列挙される構成要素またはステップを包含するように理解することができ；（ｉｖ）「約（ａｂｏｕｔ）」および「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、当業者により理解されるであろう標準的なばらつきを許容するように理解することができ；（ｖ）範囲を提供する場合、終点を含む。
【００５０】
活性化剤：本明細書で使用される「活性化剤」または活性化因子という用語は、その存在またはレベルが、作用物質の非存在下で（または異なるレベルの作用物質と共に）観察されるレベルまたは活性と比較した、標的のレベルまたは活性の上昇と相関する作用物質を指す。一部の実施形態では、活性化剤とは、その存在またはレベルが、特定の基準レベルまたは基準活性（例えば、公知の活性化剤、例えば、陽性対照の存在など、適切な基準条件下で観察されるレベルまたは活性）と同等であるかまたはこれを超える、標的のレベルまたは活性と相関する作用物質である。
【００５１】
投与：本明細書で使用される「投与」という用語は、組成物の、対象への投与を指す。投与は、任意の適切な経路を介する投与でありうる。例えば、一部の実施形態では、投与は、気管支内投与（気管支内点滴による投与を含む）、口腔内投与、腸内投与、真皮内投与、動脈内投与、皮内投与、胃内投与、髄内投与、筋内投与、鼻腔内投与、腹腔内投与、髄腔内投与、静脈内投与、脳室内投与、経粘膜投与、経鼻投与、経口投与、直腸内投与、皮下投与、舌下投与、局所投与、気管投与（気管内点滴による投与を含む）、経皮投与、膣内投与、および硝子体内投与でありうる。
【００５２】
作用物質：本明細書で使用される「作用物質」という用語は、化合物、または任意の化学クラスの実体であって、例えば、ポリペプチド、核酸、糖、脂質、低分子、金属、もしくはこれらの組合せを含む実体を指す場合がある。文脈から明らかとなる通り、一部の実施形態では、作用物質は、細胞もしくは生物、またはこれらの画分、抽出物、もしくは構成要素でありうるかまたはこれらを含みうる。一部の実施形態では、作用物質は、それが、自然において見出され、かつ／または自然から得られるという点で、天然の生成物であるかまたはこれを含む。一部の実施形態では、作用物質は、それが、人為の作用を介してデザイン、操作、および／もしくは作製され、かつ／または自然において見出されないという点で、１または複数の人工の実体であるかまたはこれらを含む。一部の実施形態では、作用物質は、単離形態または純粋形態で利用することができ；一部の実施形態では、作用物質は、粗製の形態で利用することができる。
【００５３】
アミノ酸：本明細書で、その最も広い意味において使用される「アミノ酸」という用語は、ポリペプチド鎖へと組み込まれうる、任意の化合物および／または物質を指す。一部の実施形態では、アミノ酸は、Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨという一般構造を有する。一部の実施形態では、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である。一部の実施形態では、アミノ酸は、合成アミノ酸であり；一部の実施形態では、アミノ酸は、ｄ−アミノ酸であり；一部の実施形態では、アミノ酸は、ｌ−アミノ酸である。「標準アミノ酸」とは、天然に存在するペプチド内で一般に見出される、２０の標準ｌ−アミノ酸のうちのいずれかを指す。「非標準アミノ酸」とは、合成により調製されるのか、天然の供給源から得られるのかに関わらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。本明細書で使用される「合成アミノ酸」は、化学修飾されたアミノ酸であって、塩、アミノ酸の誘導体（アミドなど）、および／または置換を含むがこれらに限定されないアミノ酸を包含する。ペプチド内のカルボキシ末端および／またはアミノ末端のアミノ酸を含むアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、保護基、および／または、それらの活性に有害な影響を及ぼさずに、ペプチドの循環半減期を変化させうる、他の化学基による置換により修飾することができる。アミノ酸は、ジスルフィド結合に参与しうる。アミノ酸は、１または複数の化学的実体（例えば、メチル基、アセテート基、アセチル基、ホスフェート基、ホルミル部分、イソプレノイド基、スルフェート基、ポリエチレングリコール部分、脂質部分、炭水化物部分、ビオチン部分など）との会合など、１または複数の翻訳後修飾を含みうる。「アミノ酸」という用語は、「アミノ酸残基」と互換的に使用され、遊離アミノ酸を指す場合もあり、かつ／またはペプチドのアミノ酸残基を指す場合もある。「アミノ酸」という用語が、遊離アミノ酸を指すのか、ペプチドの残基を指すのかは、用語が使用される文脈から明らかであろう。
【００５４】
類似体：本明細書で使用される「類似体」という用語は、１または複数の特定の構造的特徴、元素、構成要素、または部分を、基準物質と共有する物質を指す。「類似体」は、基準物質との顕著な構造的類似性であって、例えば、コア構造またはコンセンサス構造を共有するが、また、ある特定の個別の様態では異なりもする類似性を示すことが典型的である。一部の実施形態では、類似体とは、基準物質を化学的に操作することにより、基準物質から作出しうる物質である。一部の実施形態では、類似体とは、基準物質を作出する合成工程と実質的に同様の（例えば、これと複数のステップを共有する）合成工程を実施することにより作出しうる物質である。一部の実施形態では、類似体は、基準物質を作出するのに使用される合成工程と異なる合成工程を実施することにより作出されるかまたは作出することができる。
【００５５】
動物：本明細書で使用される「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。一部の実施形態では、「動物」とは、いずれかの性別であり、任意の発生段階にあるヒトを指す。一部の実施形態では、「動物」とは、任意の発生段階にある非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、齧歯動物、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長動物、および／またはブタ）である。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫、および／または蠕虫を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作動物、および／またはクローンでありうる。
【００５６】
アンタゴニスト：本明細書で使用される「アンタゴニスト」という用語は、ｉ）別の作用物質の効果を阻害するか、低下させるか、または低減する作用物質、例えば、受容体を不活化させる作用物質；および／あるいはｉｉ）１または複数の生物学的事象、例えば、１もしくは複数の受容体の活性化、または１もしくは複数の生物学的経路の刺激を阻害するか、低下させるか、低減するか、または遅延させる作用物質を指す。特定の実施形態では、アンタゴニストは、１または複数の受容体チロシンキナーゼの活性化および／または活性を阻害する。アンタゴニストは、任意の化学クラスの作用物質であって、例えば、低分子、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、金属、および／または適当な阻害活性を示す他の任意の実体を含む作用物質でありうるか、またはこれを含みうる。アンタゴニストは、直接的アンタゴニスト（この場合、アンタゴニストは、その影響を、受容体に直接及ぼす）の場合もあり、間接的アンタゴニスト（この場合、アンタゴニストは、その影響を、受容体への結合以外；例えば、受容体の発現または翻訳を変更すること；受容体が直接活性化させるシグナル伝達経路を変更すること；受容体のアゴニストの発現、翻訳、または活性を変更することにより及ぼす）の場合もある。
【００５７】
およそ：目的の１または複数の値に適用される場合に本明細書で使用される「およそ」または「約」という用語は、陳述される基準値と同様の値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、そうでないことが陳述されるか、またはそうでないことが文脈から明らかでない限りにおいて（このような数が可能な値の１００％を超える場合を除き）、陳述される基準値に対していずれの方向（陳述される基準を超える方向またはこれ未満の方向）においても、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはこれ未満に収まる値の範囲を指す。
【００５８】
と関連／会合した：本明細書でこの用語が使用される場合、一方の存在、レベル、および／または形態が、他方の存在、レベル、および／または形態と相関する場合に、２つの事象または実体は、互いと「関連」する。例えば、特定の実体（例えば、ポリペプチド）は、その存在、レベル、および／または形態が、疾患、障害、または状態の発生率および／または感受性と相関する（例えば、関連する集団にわたり）場合に、特定の疾患、障害、または状態と関連すると考えられる。一部の実施形態では、２つまたはこれを超える実体は、それらが依然として互いと物理的な近接下にあるように、直接的または間接的に相互作用する場合、互いと物理的に「会合」している。一部の実施形態では、互いと物理的に会合している、２つまたはこれを超える実体は、互いと共有結合によって連結されており；一部の実施形態では、互いと物理的に会合している、２つまたはこれを超える実体は、互いと共有結合によって連結されていないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁気、およびこれらの組合せにより、共有結合的によらず会合している。
【００５９】
生物学的に活性の：本明細書で使用される「生物学的に活性の」という語句は、生体系（例えば、細胞培養物、生物など）内で活性を有する、任意の物質の特徴を指す。例えば、生物へと投与されると、この生物に対して生物学的効果を及ぼす物質は、生物学的に活性であると考えられる。タンパク質またはポリペプチドが、生物学的に活性である、特定の実施形態では、このタンパク質またはポリペプチドの部分であって、タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有する部分を、「生物学的活性」部分と称することが典型的である。
【００６０】
がん：本明細書では、「がん」、「悪性腫瘍」、「新生物」、「腫瘍」、および「癌腫」という用語を、相対的に異常な（ａｂｎｏｒｍａｌ）増殖、制御不能の増殖、および／または自律的増殖を呈し、その結果、細胞増殖の制御の顕著な喪失を特徴とする、異常な（ａｂｅｒｒａｎｔ）増殖表現型を呈する細胞を指すよう、互換的に使用する。一般的に、本出願における、検出または処置のための目的の細胞は、前がん性（例えば、良性）細胞、悪性細胞、前転移性細胞、転移性細胞、および非転移性細胞を含む。本開示の教示は、任意かつ全てのがんに関連しうる。ごく少数の、非限定的例を挙げれば、一部の実施形態では、本開示の教示を、例えば、白血病、リンパ腫（ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）、骨髄腫、および骨髄増殖性障害を含む造血器がん；固形組織の肉腫、黒色腫、腺腫、癌腫；口腔、咽頭、喉頭、および肺の扁平細胞がん；肝臓がん；前立腺がん、子宮頸がん、膀胱がん、子宮がん、および子宮内膜がんなどの尿生殖器がん；ならびに腎細胞癌、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、皮膚黒色腫または眼内黒色腫、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、頭頸部がん、乳がん、消化器がん、および神経系がん、乳頭腫などの良性病変など、１または複数のがんに適用する。
【００６１】
組合せ療法：本明細書で使用される「組合せ療法」という用語は、対象が、少なくとも２つの作用物質へと、同時に曝露されるように、疾患を処置するための、２つまたはこれを超える異なる医薬品を、重複するレジメンで投与する状況を指す。一部の実施形態では、異なる作用物質を、同時に投与する。一部の実施形態では、１つの作用物質の投与が、少なくとも１つの他の作用物質の投与と重複する。一部の実施形態では、異なる作用物質を、作用物質が、対象において、共時的な生物学的活性を有するように、逐次的に投与する。
【００６２】
同等な：本明細書で使用される「同等な」という用語は、観察される差違または類似性に基づき、結論を妥当な形で引き出しうるように、互いと同一ではありえないが、それらの間の比較を許容する程度に十分に類似する、２つまたはこれを超える作用物質、実体、状況（ｓｉｔｕａｔｉｏｎ）、条件のセットなどを指す。当業者は、文脈により、所与の任意の状況（ｃｉｒｃｕｍｓｔａｎｃｅ）において、２つまたはこれを超えるこのような作用物質、実体、状況、条件のセットなどが、同等であると考えられるには、どの程度の同一性が要求されるのかを理解し得る。
【００６３】
検出実体：本明細書で使用される「検出実体」という用語は、検出可能な、任意の元素、分子、官能基、化合物、断片、または部分を指す。一部の実施形態では、検出実体を、単独で提供または利用する。一部の実施形態では、検出実体を、別の作用物質と会合させて（例えば、別の作用物質へと接合させて）、提供および／または利用する。検出実体の例は、多様なリガンド、放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１８Ｆ、１９Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、１３５Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、６４Ｃｕ、１８７Ｒｅ、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１７７Ｌｕ、８９Ｚｒなど）、蛍光色素（具体的な例示的蛍光の色素については、下記を参照されたい）、化学発光剤（例えば、アクリジニウムエステル、安定化型ジオキセタンなど）、生物発光剤、スペクトル分解型無機蛍光半導体ナノ結晶（すなわち、量子ドット）、金属ナノ粒子（例えば、金、銀、銅、白金など）、ナノクラスター、常磁性金属イオン、酵素（酵素の具体的な例については、下記を参照されたい）、比色標識（例えば、色素、金コロイドなど）、ビオチン、ジゴキシゲニン（dioxigenin）、ハプテン、および抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なタンパク質を含むがこれらに限定されない。
【００６４】
誘導体：本明細書で使用される「誘導体」という用語は、基準物質の構造的類似体を指す。すなわち、「誘導体」とは、基準物質との顕著な構造的類似性を示す物質、例えば、コア構造またはコンセンサス構造を共有するが、また、ある特定の個別の様態では異なりもする物質である。一部の実施形態では、誘導体とは、化学的操作により、基準物質から作出しうる物質である。一部の実施形態では、誘導体とは、基準物質を作出する合成工程と実質的に同様の（例えば、これと複数のステップを共有する）合成工程を実施することにより作出しうる物質である。
【００６５】
決定する：当業者は、「決定すること」を、当業者に利用可能な様々な技法であって、例えば、本明細書で明示的に言及される具体的な技法を含む技法のうちのいずれかを利用するか、またはその使用を介して達しうることを察知する。一部の実施形態では、決定することは、物理的試料の操作を伴う。一部の実施形態では、決定することは、データまたは情報の考慮および／または操作、例えば、関連する解析を実施するように適応させた、コンピュータまたは他の演算処理装置を利用することを伴う。一部の実施形態では、決定することは、供給源から関連する情報および／または材料を受け取ることを伴う。一部の実施形態では、決定することは、試料または実体の１または複数の特徴を、同等な基準と比較することを伴う。
【００６６】
診断情報：本明細書で使用される、診断情報または診断における使用のための情報とは、患者が疾患もしくは状態を有するのかどうかを決定し、かつ／あるいは疾患または状態を、表現型による類別、あるいは疾患もしくは状態の予後診断に関して重要性を有するか、または疾患もしくは状態の処置（処置一般または任意の特定の処置）に応答する可能性が高い任意の類別へと分類するときに有用な任意の情報である。同様に、診断とは、任意の種類の診断情報であって、対象が、疾患もしくは状態（がんなど）を有する可能性が高いのかどうか、対象において顕在化される、疾患もしくは状態の様相、病期分類、もしくは特徴、腫瘍の性格もしくは分類に関する情報、予後診断に関する情報、および／または適切な処置の選択に有用な情報を含むがこれらに限定されない診断情報を提供することを指す。処置の選択は、特定の治療剤（例えば、化学療法剤）または手術、放射線など、他の処置モダリティーなどの選定、治療を中断するのか、実施するのかについての選定、投与レジメン（例えば、特定の治療剤または治療剤の組合せの、１または複数の投与頻度または用量レベル）に関する選定などを含みうる。
【００６７】
剤形：本明細書で使用される「剤形」および「単位剤形」という用語は、対象へと投与される、治療用組成物の、物理的に個別の単位を指す。各単位は、所定量の活性材料（例えば、抗受容体チロシンキナーゼ抗体などの治療剤）を含有する。一部の実施形態では、所定量とは、投与レジメンにおける用量として投与された場合の、所望の治療効果と相関している量である。当業者は、特定の対象へと投与される治療用組成物または治療剤の総量を決定するのは、１または複数の主治医であり、複数の剤形の投与を伴いうることを察知する。
【００６８】
投与レジメン：本明細書でこの用語が使用される場合の「投与レジメン」（または「治療レジメン」）は、典型的には、期間を隔てて、対象へと個別に投与される、単位用量（典型的には、１つを超える）のセットである。一部の実施形態では、所与の治療剤は、推奨される投与レジメンであって、１回または複数回の投与を伴いうる投与レジメンを有する。一部の実施形態では、投与レジメンは、その各々を、互いから、同じ長さの期間で隔てた複数回の投与を含み；一部の実施形態では、投与レジメンは、複数回の投与と、個別の投与を隔てる、少なくとも２つの異なる期間とを含む。一部の実施形態では、投与レジメンは、患者の集団にわたり投与された場合の、所望の治療転帰であるか、またはこれと相関している。
【００６９】
機能的：本明細書で使用される「機能的」生体分子とは、それを特徴づける特性および／または活性を呈する形態にある生体分子である。生体分子は、２つの機能（すなわち、二機能性）を有する場合もあり、多くの機能（すなわち、多機能性）を有する場合もある。
【００７０】
阻害療法：本明細書で使用される「阻害療法」とは、特定の標的実体の活性または機能を防止するか、低減するか、抑制するか、遮断するか、転導するか、または他の形でアンタゴナイズする作用物質の投与を指す。本明細書で使用される「Ｒａｓ阻害療法」とは、Ｒａｓシグナル伝達経路内の、Ｒａｓの発現、結合、または活性を阻害する作用物質の投与を指す。本明細書で使用される「リソソーム阻害療法」とは、リソソームの活性を防止するか、低減するか、抑制するか、遮断するか、転導するか、または他の形でアンタゴナイズする作用物質の投与を指す。一部の実施形態では、リソソームの阻害は、タンパク質の、リソソームへの取込みを阻害することにより果たす。一部の実施形態では、リソソームの阻害は、１または複数のリソソーム酵素をアンタゴナイズすることにより果たす。
【００７１】
異性体：当技術分野で公知の通り、多くの化学的実体（特に、多くの有機分子および／または多くの低分子）は、様々な構造異性体形態および／または光学異性体形態で存在しうる。一部の実施形態では、文脈から当業者に明らかになる通り、本明細書における、特定の化合物構造の描示またはこれへの言及は、その全ての構造異性体および／または光学異性体を包含することを意図する。一部の実施形態では、文脈から当業者に明らかになる通り、本明細書における、特定の化合物構造の描示またはこれへの言及は、描示または言及された異性体形態だけを包含することを意図する。一部の実施形態では、様々な異性体形態で存在しうる化学的実体を含む組成物は、複数のこのような形態を含み；一部の実施形態では、このような組成物は、単一の形態だけを含む。例えば、一部の実施形態では、様々な光学異性体（例えば、立体異性体、ジアステレオマーなど）として存在しうる化学的実体を含む組成物は、このような光学異性体のラセミ集団を含み；一部の実施形態では、このような組成物は、単一の光学異性体だけを含み、かつ／または併せて光学活性を保持する、複数の光学異性体を含む。
【００７２】
低用量：本明細書で使用される「低用量」または「低投与量」とは、作用物質または化合物の量であって、所与の治療適応のために投与または処方されることが典型的な量未満である量を指す。一部の実施形態では、細胞傷害剤の低用量とは、がんの処置について、規制機関により承認されている量より低量の有効用量である。一部の実施形態では、細胞傷害剤の低用量とは、基準用量より１桁または複数桁低度の用量を指す。一部の実施形態では、低用量とは、基準用量の２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、または６分の１の用量を指す。一部の実施形態では、低用量の細胞傷害剤の投与は、有効性を減殺せずに、所望されない副作用の低減または消失を結果としてもたらす。
【００７３】
マーカー：本明細書で使用されるマーカーとは、その存在またはレベルが、特定の腫瘍またはその転移性疾患に特徴的な作用物質を指す。例えば、一部の実施形態では、その用語は、特定の腫瘍、腫瘍サブクラス、腫瘍の病期などに特徴的な遺伝子発現産物を指す。代替的にまたは加えて、一部の実施形態では、特定のマーカーの存在またはレベルは、例えば、特定のクラスの腫瘍に特徴的でありうる、特定のシグナル伝達経路の活性（または活性レベル）と相関する。マーカーの有無についての統計学的有意性は、特定のマーカーに応じて変動しうる。一部の実施形態では、マーカーの検出は、腫瘍が特定のサブクラスの腫瘍である確率の高さをそれが反映する点で、高度に特異的である。このような特異度は、感度を代償として成立しうる（すなわち、腫瘍が、マーカーを発現することが予測される腫瘍である場合であってもなお、否定的な結果は生じうる）。逆に、高感度のマーカーは、低感度のマーカーほど特異的でない可能性がある。本発明に従う有用なマーカーは、特定のサブクラスの腫瘍を、１００％の確度で識別する必要はない。
【００７４】
代謝物：本明細書で使用される「代謝物」とは、エネルギーを創出または使用する身体の中の物理的または化学的な過程であって、食物および栄養物質の消化、尿および糞便を介する排泄物の消失、呼吸、血液の循環、および温度の調節などの過程において産生または使用される任意の物質を指す。「代謝物前駆体」という用語は、代謝物がそこから作られる化合物を指す。「代謝産物」という用語は、代謝経路の一部をなす任意の物質（例えば、代謝物、代謝物前駆体）を指す。
【００７５】
モジュレーター：「モジュレーター」という用語は、目的の活性を観察する系内のその存在が、この活性のレベルおよび／または性格の変化であって、モジュレーターが非存在である以外は同等な条件下で観察されるレベルおよび／または性格と比較した変化と相関する実体を指すのに使用する。一部の実施形態では、モジュレーターは、その存在下では、活性を、モジュレーターが非存在である以外は同等な条件下で観察される活性と比較して増大させるという意味で、活性化因子である。一部の実施形態では、モジュレーターは、その存在下では、活性を、モジュレーターが非存在である以外は同等な条件と比較して低減するという意味で、阻害剤である。一部の実施形態では、モジュレーターは、その活性が目的の活性である標的実体と直接的に相互作用する。一部の実施形態では、モジュレーターは、その活性が目的の活性である標的実体と間接的に（すなわち、標的実体と相互作用する中間的な作用物質と直接的に）相互作用する。一部の実施形態では、モジュレーターは、目的の標的実体のレベルに影響を及ぼし；代替的にまたは加えて、一部の実施形態では、モジュレーターは、標的実体のレベルに影響を及ぼさずに、目的の標的実体の活性に影響を及ぼす。一部の実施形態では、モジュレーターは、観察された活性の差違が、観察されたレベルの差違により完全に説明されたり、これと比例したりしないように、目的の標的実体のレベルおよび活性の両方に影響を及ぼす。
【００７６】
突然変異体：本明細書で使用される「突然変異体」という用語は、基準実体との、顕著な構造的同一性を示すが、基準実体と比較した、１または複数の化学的部分の存在またはレベルにおいて、基準実体と構造的に異なる実体を指す。多くの実施形態では、突然変異体はまた、その基準実体と、機能的にも異なる。一般に、特定の実体が、基準実体の「突然変異体」であると適正に考えられるのかどうかは、その基準実体との、構造的同一性の程度に基づく。当業者に察知されるであろう通り、任意の生物学的基準実体または化学的基準実体は、ある特定の特徴的構造エレメントを有する。突然変異体とは、定義により、１または複数のこのような特徴的構造エレメントを共有する、顕著に異なる化学的実体である。ごく少数の例を示せば、低分子は、低分子の突然変異体が、コアの構造エレメントと、特徴的ペンダント部分とを共有するが、他のペンダント部分および／またはコア内に存在する結合の種類（二重結合と対比される一重結合、Ｚ結合と対比されるＥ結合など）が異なる突然変異体であるように、特徴的なコアの構造エレメント（例えば、大員環のコア）および／または１もしくは複数の特徴的ペンダント部分を有することが可能であり、ポリペプチドは、直線上もしくは三次元空間内の、互いに対する指定位置を有し、かつ／または特定の生物学的機能に寄与する複数のアミノ酸を含む特徴的配列エレメントを有することが可能であり、核酸は、直線上もしくは三次元空間内の、互いに対する指定位置を有する複数のヌクレオチド残基を含む、特徴的配列エレメントを有しうる。例えば、突然変異体ポリペプチドは、アミノ酸配列の１もしくは複数の差違、ならびに／またはポリペプチド骨格へと共有結合的に接合させた化学的部分（例えば、炭水化物、脂質など）の１もしくは複数の差違の結果として、基準ポリペプチドと異なりうる。一部の実施形態では、突然変異体ポリペプチドは、基準ポリペプチドとの全体的な配列同一性であって、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％である配列同一性を示す。代替的にまたは加えて、一部の実施形態では、突然変異体ポリペプチドは、少なくとも１つの特徴的配列エレメントを、基準ポリペプチドと共有しない。一部の実施形態では、基準ポリペプチドは、１または複数の生物学的活性を有する。一部の実施形態では、突然変異体ポリペプチドは、基準ポリペプチドの生物学的活性のうちの１または複数を共有する。一部の実施形態では、突然変異体ポリペプチドは、基準ポリペプチドの生物学的活性のうちの１または複数を欠く。一部の実施形態では、突然変異体ポリペプチドは、１または複数の生物学的活性のレベルの、基準ポリペプチドと比較した低減を示す。
【００７７】
栄養物質が枯渇した：本明細書で使用される「栄養物質が枯渇した」という語句は、１または複数の必須アミノ酸の遊離レベルが、細胞外空間において低度であるかまたは実質的に非存在である細胞の微小環境を指す。
【００７８】
医薬組成物：本明細書で使用される「医薬組成物」という用語は、１または複数の薬学的に許容される担体と併せて製剤化された活性作用物質を指す。一部の実施形態では、活性作用物質は、関連する集団へと投与されると所定の治療効果を達成する統計学的に有意な確率を示す治療レジメンにおいて、投与に適切な単位投与量で存在する。一部の実施形態では、医薬組成物は、以下：例えば、飲薬（水溶液もしくは非水溶液または懸濁液）、錠剤、例えば、口腔内吸収、舌下吸収、および全身吸収にターゲティングされた錠剤、ボーラス、粉末、顆粒、舌へと適用するためのペーストとしての経口投与；例えば、滅菌溶液もしくは滅菌懸濁液、または持続放出製剤としての非経口投与、例えば、皮下注射、筋内注射、静脈内注射、または硬膜外注射；例えば、皮膚、肺、または口腔へと適用される、クリーム、軟膏、もしくは制御放出パッチ、またはスプレーとしての局所適用；例えば、ペッサリー、クリーム、またはフォームとしての、膣内適用または直腸内適用；舌下適用；眼内適用；経皮適用；あるいは鼻腔内適用、肺内適用、および他の粘膜表面への適用に適応させた固体形態または液体形態を含む、固体形態または液体形態における投与のために特化して製剤化することができる。
【００７９】
薬学的に許容される：本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、穏当な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒトおよび動物の組織と接触させる使用に適し、妥当な有益性／危険性比に見合った物質を指す。
【００８０】
前駆細胞：本明細書で使用される「前駆細胞」という用語は、それが分化を介して生じさせうる細胞と比べて、より大きな発生の潜在的可能性、すなわち、より始原性の（例えば、発生の経路または進行に沿ってより早期の段階にある）細胞表現型を有する細胞を指す。前駆細胞は、顕著または極めて高度な増殖性の潜在的可能性を有することが多い。前駆細胞は、発生の経路と、細胞が発生および分化する環境とに応じて、複数の顕著に異なる細胞であって、発生の潜在的可能性が低度の細胞、すなわち、複数の分化細胞型を生じさせる場合もあり、単一の分化細胞型を生じさせる場合もある。
【００８１】
予後診断情報および予測情報：本明細書で使用される、予後診断情報および予測情報という用語は、処置の非存在下または存在下における、疾患または状態の経過の任意の側面を指し示すのに使用しうる、任意の情報を指すように互換的に使用される。このような情報は、患者の平均余命、患者が、所与の量の時間（例えば、６カ月間、１年間、５年間など）にわたり生存する可能性、患者が、疾患から治癒する可能性、患者の疾患が、特定の治療に応答する（この場合、応答は、様々な方式のうちのいずれかで規定することができる）可能性を含むがこれらに限定されない。予後診断情報および予測情報は、診断情報についての広範な類別に含まれる。
【００８２】
純粋：本明細書で使用される作用物質または実体は、それが他の成分を実質的に含まない場合に「純粋」である。例えば、約９０％を超えて特定の作用物質または実体を含有する調製物は、純粋な調製物と考えられることが典型的である。一部の実施形態では、作用物質または実体は、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％純粋である。
【００８３】
基準：本明細書では、「基準」という用語は、それらに対して、目的の作用物質または値を比較する、標準または対照の、作用物質または値について記載するのに使用されることが多い。一部の実施形態では、目的の作用物質または値についての試験または決定と実質的に同時に、基準作用物質または基準値について調べ、かつ／または決定する。一部の実施形態では、基準作用物質または基準値は、任意選択で、有形のメディアに具体化される、通時的基準である。当業者により理解されるであろう通り、基準作用物質または基準値は、目的の作用物質または値を決定するかまたは特徴づけるのに利用される条件と同等な条件下で、決定するかまたは特徴づけることが典型的である。
【００８４】
応答：本明細書で使用される、処置に対する応答とは、対象の状態の任意の有益な変更であって、処置の結果として生じるか、または処置と相関する変更を指す場合がある。このような変更は、状態の安定化（例えば、処置の非存在下で生起するであろう増悪の防止）、状態の症状の改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）、および／または状態の治癒の見込みの改善（ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）などを含みうる。処置に対する応答とは、対象の応答を指す場合もあり、腫瘍の応答を指す場合もある。腫瘍の応答または対象の応答は、臨床的基準および客観的基準を含む、多種多様な基準に従い測定することができる。応答を評価するための技法は、臨床検査、ポジトロン断層法、胸部Ｘ線ＣＴ走査、ＭＲＩ、超音波、内視鏡法、腹腔鏡法、対象から得られる試料中の、腫瘍マーカーの存在またはレベル、細胞診、および／または組織学を含むがこれらに限定されない。これらの技法の多くは、腫瘍のサイズを決定するか、または他の形で総腫瘍負荷を決定しようと試みる。処置に対する応答を評価するための方法およびガイドラインについては、Therasseら、「New  guidelines  to  evaluate  the  response  to  treatment  in  solid  tumors」、European  Organization  for  Research  and  Treatment  of  Cancer、National  Cancer  Institute  of  the  United  States、National  Cancer  Institute  of  Canada、J.  Natl.  Cancer  Inst.、２０００年、９２巻（３号）：２０５〜２１６頁において論じられている。正確な応答基準は、腫瘍および／または患者の群を比較する場合に、比較される群を、応答率を決定するための同じ基準または同等な基準に基づき評価することを条件として、任意の適切な形で選択することができる。当業者は、適切な基準を選択することが可能であろう。
【００８５】
危険性：文脈から理解されるであろう通り、疾患、障害、または状態の「危険性」とは、特定の個体が、疾患、障害、または状態を発症する可能性の程度である。一部の実施形態では、危険性は、百分率として表される。一部の実施形態では、危険性は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から１００％までである。一部の実施形態では、危険性は、基準試料または基準試料の群と関連する危険性と比べた危険性として表される。一部の実施形態では、基準試料または基準試料の群は、疾患、障害、または状態について公知の危険性を有する。一部の実施形態では、基準試料または基準試料の群は、特定の個体と同等な個体に由来する。一部の実施形態では、相対危険性は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはこれを超える。
【００８６】
試料：本明細書で使用される、対象から得られる試料は、以下：細胞（複数可）、組織の一部、血液、血清、腹水、尿、唾液、および他の体液、分泌物、または排出物のうちのいずれかまたは全てを含むがこれらに限定されない。「試料」という用語はまた、このような試料を処理することにより導出される任意の材料も含む。導出された試料は、試料から抽出されるか、または試料を、増幅もしくはｍＲＮＡの逆転写などの技法にかけることにより得られる、ヌクレオチド分子またはポリペプチドを含みうる。
【００８７】
低分子：本明細書で使用される「低分子」という用語は、低分子量の有機化合物および／または無機化合物を意味する。一般的に、「低分子」とは、サイズが約５キロダルトン（ｋＤ）未満の分子である。一部の実施形態では、低分子は、約４ｋＤ、３ｋＤ、約２ｋＤ、または約１ｋＤ未満である。一部の実施形態では、低分子は、約８００ダルトン（Ｄ）、約６００Ｄ、約５００Ｄ、約４００Ｄ、約３００Ｄ、約２００Ｄ、または約１００Ｄ未満である。一部の実施形態では、低分子は、１モル当たり約２０００ｇ未満、１モル当たり約１５００ｇ未満、１モル当たり約１０００ｇ未満、１モル当たり約８００ｇ未満、または１モル当たり約５００ｇ未満である。一部の実施形態では、低分子は、ポリマーではない。一部の実施形態では、低分子は、ポリマー部分を含まない。一部の実施形態では、低分子は、タンパク質またはポリペプチドではない（例えば、オリゴペプチドまたはペプチドではない）。一部の実施形態では、低分子は、ポリヌクレオチドではない（例えば、オリゴヌクレオチドではない）。一部の実施形態では、低分子は、多糖ではない。一部の実施形態では、低分子は、多糖を含まない（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカン、糖脂質などではない）。一部の実施形態では、低分子は、脂質ではない。一部の実施形態では、低分子は、モジュレーティング剤である。一部の実施形態では、低分子は、生物学的に活性である。一部の実施形態では、低分子は、検出可能である（例えば、少なくとも１つの検出用部分を含む）。一部の実施形態では、低分子は、治療用である。
【００８８】
特異的：活性を有する作用物質または実体に言及して、本明細書で使用される場合の「特異的」という用語を、当業者は、作用物質または実体が、潜在的な標的または状態を区別することを意味すると理解する。例えば、作用物質は、競合する代替的な標的の存在下で、その標的と優先的に結合する場合に、この標的に「特異的に」結合するという。一部の実施形態では、作用物質または実体は、その標的への結合条件下で、競合する代替的な標的に、検出可能な形で結合しない。一部の実施形態では、作用物質または実体は、競合する代替的な標的と比較して、高オン速度で、低オフ速度で、その標的に対するアフィニティーを増大させて、解離を低下させて、かつ／または安定性を増大させて結合する。
【００８９】
対象：「対象」とは、哺乳動物（例えば、一部の実施形態では、出生前のヒト形態を含むヒト）を意味する。一部の実施形態では、対象は、対象となる疾患、障害、または状態を患っている。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態に対して感受性である。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態の１または複数の症状または特徴を示す。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態の症状または特徴を示さない。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態に対する感受性またはこれらの危険性に特徴的な、１または複数の特徴を伴う者である。対象は、疾患を診断または処置するための医療提供者を訪れる人を指す、患者でありうる。一部の実施形態では、対象は、治療が投与される個体である。
【００９０】
実質的に：本明細書で使用される「実質的に」という用語は、目的の特徴または特性の、全てまたはほぼ全ての広がりまたは程度を呈示する定性的条件を指す。生物学的技術分野の当業者は、生物学的現象および化学的現象が、仮にそうなるとしても、完結に至り、かつ／もしくは完全性へと進行するか、または絶対的な結果を達成もしくは回避することはまれであることを理解するであろう。したがって、本明細書では、「実質的に」という用語を、多くの生物学的現象および化学的現象に固有の完全性の潜在的欠如を捕捉するのに使用する。
【００９１】
患うこと：疾患、障害、または状態「を患う」個体は、疾患、障害、または状態の１または複数の症状または特徴を伴い、かつ／またはこれらを呈するかもしくは呈したと診断されている。
【００９２】
感受性：疾患、障害、または状態に「感受性」の個体は、疾患、障害、または状態を発症する危険性がある。一部の実施形態では、このような個体は、対象となる疾患、障害、および／または状態の発症の危険性の増大と統計学的に相関する、１または複数の感受性因子を有することが公知である。一部の実施形態では、疾患、障害、または状態に感受性の個体は、疾患、障害、または状態の症状を示さない。一部の実施形態では、疾患、障害、または状態に感受性の個体は、疾患、障害、および／または状態を伴うと診断されていない。一部の実施形態では、疾患、障害、または状態に感受性の個体は、疾患、障害、または状態の発症と関連する条件へと曝露された個体である。一部の実施形態では、疾患、障害、および／または状態を発症する危険性は、集団ベースの危険性（例えば、アレルギーを患う個体の家族構成員など）である。
【００９３】
症状は低減されている：本発明によると、特定の疾患、障害、または状態の１または複数の症状の大きさ（例えば、強度、重症度など）および／または頻度が低減されている場合に、「症状は低減されている」。明確さを目的として述べると、特定の症状の発症の遅延は、この症状の頻度の低減の一形態と考えられる。例えば、小型の腫瘍を伴う多くのがん患者は、症状を有さない。本発明を、症状が消失する症例だけに限定することは意図されていない。本発明は具体的に、１または複数の症状が、完全に消失するわけではないが、低減される（そして、対象の状態が、これにより「改善」される）ような処置を想定する。
【００９４】
治療剤：本明細書で使用される「治療剤」という語句は、対象へと投与されると、治療効果を及ぼし、かつ／または所望の生物学的効果および／もしくは薬理学的効果を誘発する、任意の作用物質を指す。
【００９５】
治療有効量：本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、任意の医学的処置に適用可能である、妥当な有益性／危険性比で、処置される対象に対して治療効果を付与する治療用タンパク質の量を指す。治療効果は、客観的（すなわち、一部の試験またはマーカーにより測定可能）な場合もあり、主観的な（すなわち、対象が、効果についての徴候を示すか、またはこれを感じる）場合もある。特に、「治療有効量」とは、治療用タンパク質または治療用組成物の量であって、疾患と関連する症状を改善し、疾患の発症を防止するかもしくは遅延させ、かつ／または疾患の症状の重症度もしくは頻度もまた低下させることなどにより、所望の疾患もしくは状態を、処置、改善、もしくは防止するか、または検出可能な治療的効果もしくは予防的効果を呈するのに有効な量を指す。治療有効量は一般に、複数の単位用量を含みうる投与レジメンにより投与する。任意の特定の治療的タンパク質では、治療有効量（および／または有効な投与レジメン内の適切な単位用量）は、例えば、投与経路、他の医作用物質との組合せに応じて変動しうる。任意の特定の患者に特異的な治療有効量（および／または単位用量）はまた、処置される障害および障害の重症度；利用される特異的な医作用物質の活性；利用される特異的な組成物；患者の年齢、体重、全般的な健康、性別、および食餌；利用される特異的な融合タンパク質の、投与回数、投与経路、および／または排出速度もしくは代謝速度；処置の持続期間；医療技術分野で周知の同様の因子を含む様々な因子にも依存しうる。
【００９６】
毒素療法：本明細書で使用される「毒素療法」という語句は、細胞傷害剤によるがんの処置を指す。一部の実施形態では、細胞傷害剤は、低分子、タンパク質、ポリペプチド、抗体、ウイルス、またはこれらの組合せを含む。
【００９７】
処置：本明細書で使用される「処置」という用語（「〜を処置する」または「〜を処置すること」もまた使用される）は、特定の疾患、障害、および／または状態（例えば、がん）を、部分的もしくは完全に緩和し、改善し、和らげ、阻害し、これらの発症を遅延させ、これらの重症度を低減し、かつ／またはこれらの１もしくは複数の症状、特徴、および／もしくは原因の発生率を低減する物質の任意の投与を指す。このような処置は、対象となる疾患、障害、および／もしくは状態の徴候を呈さない対象、ならびに／または疾患、障害、および／もしくは状態の早期徴候だけを呈する対象の処置でありうる。代替的にまたは加えて、このような処置は、対象となる疾患、障害、および／または状態の、１または複数の確立された徴候を呈する対象の処置でありうる。一部の実施形態では、処置は、対象となる疾患、障害、および／または状態を患うと診断された対象の処置でありうる。一部の実施形態では、処置は、対象となる疾患、障害、および／または状態の発生の危険性の増大と統計学的に相関する、１または複数の感受性因子を有することが公知である対象の処置でありうる。
【００９８】
単位用量：本明細書で使用される「単位用量」という表現は、単一用量として、または物理的に個別の単位の医薬組成物により投与される量を指す。多くの実施形態では、単位用量は、所定量の活性作用物質を含有する。一部の実施形態では、単位用量は、作用物質の単一用量の全体を含有する。一部の実施形態では、１つを超える単位用量を投与して、全単一用量を達成する。一部の実施形態では、意図される効果を達成するために、複数の単位用量の投与が要求されるか、または要求されることが予測される。単位用量は、例えば、所定量の、１または複数の治療剤を含有する液体（例えば、許容される担体）の容量の場合もあり、固体形態にある、１または複数の治療剤の所定量の場合もあり、所定量の、１または複数の治療剤を含有する、持続放出製剤または薬物送達デバイスなどの場合もある。単位用量は、治療剤と代替的に、またはこれに加えて、様々な成分のうちのいずれかを含む製剤中に存在しうることが察知されるであろう。例えば、許容される担体（例えば、薬学的に許容される担体）、希釈剤、安定化剤、緩衝液、保存剤なども、以下に記載される通りに、含まれる場合がある。多くの実施形態では、当業者は、特定の治療剤の、毎日の適切な全投与量は、単位用量の部分または複数の単位用量を含むことが可能であり、例えば、主治医により、穏当な医学的判断の範囲内で決定されうることを察知するであろう。一部の実施形態では、任意の特定の対象または生物に特異的な有効用量レベルは、処置される障害および障害の重症度；利用される特異的な活性化合物の活性；利用される特異的な組成物；対象の年齢、体重、全般的な健康、性別、および食餌；利用される特異的な活性化合物の、投与回数および排出速度；処置の持続期間；利用される特異的な化合物と組み合わせて、または同時に使用される薬物またはさらなる治療；および医療技術分野で周知の同様の因子を含む様々な因子に依存しうる。
【００９９】
（特定の実施形態についての詳細な記載）
ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ１の阻害
キナーゼであるｍＴＯＲＣ１（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  １）とは、細胞内の栄養物質レベルを、成長因子によるシグナル伝達からの入力と連携させて、同化的代謝および増殖を刺激する中心的調節因子である（MaおよびBlenis、２００９年；ShimobayashiおよびHall、２０１４年；Zoncuら、２０１１年ｂ）。ｍＴＯＲＣ１は、ｍＴＯＲ自体、Ｒａｐｔｏｒ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｍＴＯＲ）、ＭＬＳＴ８（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｌｅｔｈａｌ  ｗｉｔｈ  ＳＥＣ１３  ｐｒｏｔｅｉｎ  ８）、ＰＲＡＳ４０、およびＤＥＰＴＯＲから構成される。ｍＴＯＲＣ１活性は厳密に、ｍＴＯＲＣ１の、リソソーム膜への動員を誘導する、十分なレベルの細胞内アミノ酸に依存する（Haraら、１９９８年；Sancakら、２０１０年）。ここで、ｍＴＯＲＣ１は、成長因子によるシグナル伝達からのさらなる入力によっても活性化しうる。活性化したｍＴＯＲＣ１は、バイオマスの発生を協奏的に増強する、複数の標的をリン酸化させる。例えば、Ｓ６キナーゼ（Ｓ６Ｋ）および４Ｅ結合性タンパク質（４Ｅ−ＢＰ）のリン酸化を介して、ｍＴＯＲＣ１は、５’キャップ依存的なタンパク質翻訳を増大させる（MaおよびBlenis、２００９年）。逆に、Ｕｎｃ５１様キナーゼ１／２（Ｕｌｋ１／２）の阻害を介して、ｍＴＯＲＣ１は、オートファジーを抑制し、これにより、細胞内物質の分解を防止する（HeおよびKlionsky、２００９年；Mizushima、２０１０年）。これらの手段により、ｍＴＯＲＣ１は、好適な成長シグナル、ならびに豊富な栄養物質供給をもたらす環境に応答して、細胞成長を促進する。
【０１００】
本発明は、ｍＴＯＲＣ１が、哺乳動物細胞が増殖を支援するアミノ酸の供給源として、細胞外タンパク質を利用する能力を抑制するという知見を包含する。マクロピノサイトーシスが構成的に活性化されたＲａｓ突然変異細胞内であってもなお、ｍＴＯＲＣ１は、環境から内在化させたタンパク質の分解を妨げる。ｍＴＯＲＣ１の阻害は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるアミノ酸の欠乏の間、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける乏血管性腫瘍領域内のいずれにおいても、リソソームにおける細胞外タンパク質の異化を増大させ、細胞の増殖を促進する。こうして、ｍＴＯＲＣ１の活性は、細胞外タンパク質の、栄養物質としての利用を防止することにより、細胞の成長を、遊離アミノ酸の供給とカップリングさせる。
【０１０１】
アミノ酸は、リソソーム膜へのその動員を誘導することにより、ｍＴＯＲＣ１活性を調節し、この影響を及ぼすには、アミノ酸は、リソソームの内腔内に存在しなければならないことが提唱されている（Zoncuら、２０１１年ａ）。この機構は、リソソームが、細胞内のアミノ酸センシングにおいて、中心的役割を果たすことを指し示す。後生動物細胞のリソソームに対応する酵母液胞は、アミノ酸貯蔵部位として機能し、証拠は、哺乳動物のリソソームもまた、高レベルのアミノ酸を含有することを示唆する（Zoncuら、２０１１年ｂ）。したがって、リソソーム膜におけるｍＴＯＲＣ１の調節は、細胞が、細胞内アミノ酸のプールを計量することを可能としうるであろう。本開示は、エンドサイトーシスされたタンパク質の、リソソームにおける分解が、それらの単量体形態で環境から移入されたアミノ酸と同じステップで、ｍＴＯＲＣ１経路を調節し；いずれの栄養物質も、ｍＴＯＲＣ１の、リソソーム膜への、Ｒａｇに依存する動員を誘導し、これが、成長因子によるシグナル伝達を介して、その後続の活性化を可能とする（Kimら、２００８年；Sancakら、２００８年）ことを実証する。同様に、オートファジーを介して輸送された細胞内タンパク質の、リソソームにおける異化も、ｍＴＯＲＣ１の、この細胞小器官への動員をもたらす（Yuら、２０１０年）。リソソームにおけるｍＴＯＲＣ１活性の調節は、エンドサイトーシスまたはオートファジーを介して輸送されたタンパク質から回収されるアミノ酸を、細胞がモニタリングすることを可能とする、高感度の機構を構成する。逆に、リソソーム膜において活性化すると、ｍＴＯＲＣ１は、これらの膜トラフィッキング経路による、リソソームへのカーゴ輸送の調節因子として機能するように、良好に配置されうる。とりわけ、近年のホスホプロテイノミクススクリーンは、エンドソームへとトラフィッキングするタンパク質を、特徴づけられていないｍＴＯＲＣ１基質の主要なクラスとして識別している（Hsuら、２０１１年；Yuら、２０１１年）。
【０１０２】
ｍＴＯＲＣ１の阻害剤は、第１世代の阻害剤または第２世代の阻害剤として類別することができる。第１世代の阻害剤は、例えば、ラパマイシンと、ラパマイシンの類似体とを含む。ラパマイシンは、最初のｍＴＯＲＣ１の阻害剤のうちの１つであったが、細胞質ゾルのＦＫＢＰ１２に結合して、足場分子として作用し、ＦＫＢＰ１２が、ｍＴＯＲＣ１上のＦＢＰ調節領域にドッキングすることを可能とする。ラパマイシンは、それほど水溶性ではなく、それほど安定的でもないので、可溶性および安定性を改善するように、ラパログと呼ばれるラパマイシン類似体が開発された。近年、ｍＴＯＲＣ１阻害剤は、腎細胞癌腫、マントル細胞リンパ腫、および膵臓がんなどのがんに対する処置について承認されている。
【０１０３】
第２世代のｍＴＯＲＣ１阻害剤は、第１世代の阻害剤の、細胞への投与時における、上流のシグナル伝達に関する問題を克服するようにデザインされた。第１世代のｍＴＯＲＣ１の阻害剤の１つの欠点は、リン酸化を介して、インスリンＲＴＫを阻害しうる、リン酸化Ｓ６Ｋからの負のフィードバックループである。この負のフィードバックループの活性が減殺されれば、ｍＴＯＲＣ１の上流の調節因子の活性がより大きくなる。また、ラパマイシンに対して耐性であるｍＴＯＲＣ２も、Ａｋｔを活性化することにより、ｍＴＯＲＣ１の上流において作用しうる。したがって、ｍＴＯＲＣ１の上流におけるシグナル伝達は、ラパマイシンおよびラパログを介するその阻害時にも活性を維持しうる。
【０１０４】
第２世代の阻害剤は、ｍＴＯＲコアタンパク質自体のキナーゼドメイン上のＡＴＰ結合性モチーフに結合し、両方のｍＴＯＲ複合体の活性を消失させることが可能である。加えて、ｍＴＯＲタンパク質およびＰＩ３Ｋタンパク質はいずれも、キナーゼの、同じホスファチジルイノシトール３キナーゼ関連キナーゼ（ＰＩＫＫ）ファミリー内のタンパク質であるので、一部の第２世代の阻害剤は、ｍＴＯＲ複合体ならびにＰＩ３Ｋに対する二重阻害であって、ｍＴＯＲＣ１の上流において作用する二重阻害を及ぼす。
【０１０５】
例示的なｍＴＯＲＣ１阻害剤は、ラパマイシン／シロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、ゾタロリムス、デフォロリムス、ウォルトマンニン、ＴＯＰ−２１６、ＴＡＦＡ９３、ＣＣＩ−７７９、ＡＢＴ５７８、ＳＡＲ５４３、アスコマイシン、ＦＫ５０６、ＡＰ２３５７３、ＡＰ２３４６４、ＡＰ２３８４１、ＫＵ−００６３７９４、ＩＮＫ−１２８、ＥＸ２０４４、ＥＸ３８５５、ＥＸ７５１８、ＡＺＤ−８０５５、ＡＺＤ−２０１４、Ｐａｌｏｍｉｄ  ５２９、Ｐｐ−２４２、ＯＳＩ−０２７などを含むがこれらに限定されない。
【０１０６】
本開示は、ｍＴＯＲ阻害剤の、がん治療剤としての有効性の不可解な欠如に光を投げかける。最近の数年間では、がん処置において、ｍＴＯＲＣ１経路をターゲティングしようと、多大な努力がなされている。これらの研究は、ヒト腫瘍は、一般に、その上流の活性化因子であるＰＩ３キナーゼ経路内およびＲａｓ経路内の突然変異のために、ｍＴＯＲＣ１活性の上昇を示すことが多いという観察により動機付けられている（ManningおよびCantley、２００７年；Pylayeva-Guptaら、２０１１年；Zoncuら、２０１１年ｂ）。しかし、近年の臨床試験は、様々な固形腫瘍における、ラパマイシン類似体（ラパログ）の有効性が、限定的に過ぎないことを示した（FrumanおよびRommel、２０１４年；Rodonら、２０１３年）。本開示は、ｍＴＯＲ阻害剤の、がん処置における、内因性の弱点を明らかにする。細胞外に由来するタンパク質の異化を増強することにより、ｍＴＯＲ阻害剤は、細胞に接近可能な栄養物質の範囲を増大させて、生存を支援し、増殖を維持する。これは、栄養物質枯渇腫瘍の微小環境内、または腫瘍細胞が新規の代謝的ニッチに適応しなければならない転移時において特に重要でありうる。
【０１０７】
マクロピノサイトーシス
マクロピノサイトーシスとは、進化において保存された、エンドサイトーシスの非選択的形態であって、Ｒａｓ  ＧＴＰアーゼにより誘発されうる非選択的形態である（Bar-SagiおよびFeramisco、１９８６年；MercerおよびHelenius、２００９年）。マクロピノサイトーシスは、単細胞のアメーバ様真核生物が、細胞外高分子により生存することを可能とするが、それが、後生動物細胞の栄養物質獲得において機能するのかどうかは、十分に理解されていない（Amyereら、２００２年）。発がん性のＫ−Ｒａｓシグナル伝達が、マクロピノサイトーシスを促進することにより、増殖するがん細胞の、外因性グルタミン供給への依存性を低減しうることが近年になって示された（Commissoら、２０１３年）。これは、細胞外タンパク質の異化が、哺乳動物細胞がミトコンドリアバイオエナジェティックスを維持しアポトーシスを抑制することを可能とするアナプレロティック基質をもたらしうることを示唆する。
【０１０８】
本開示は、ｍＴＯＲの阻害が、特に、Ｒａｓタンパク質の発がん性の活性化を特徴とするがんにおけるマクロピノサイトーシスにより細胞外から取り込まれた物質の、リソソームにおける分解／異化を容易としうることを実証する。本開示はさらに、Ｒａｓタンパク質の発がん性の活性化を特徴とするがんが、毒素と組み合わせたｍＴＯＲＣ１阻害剤による処置に対して選択的に脆弱でありうることも示す。
【０１０９】
がんのターゲティング
後生生物の細胞は、外部の鍵因子により、栄養物質の取込みに関与するように命令を受ける。成長因子によるシグナル伝達経路は、細胞周期の進行を刺激するだけでなく、栄養物質の取込みも促進し、同化的代謝も誘発し、これにより、細胞の塊を増大させるのに十分な、高分子の合成のための構成単位の利用可能性を確保する（Thompson、２０１１年）。この原理は、形質転換細胞に特徴的な、同化的代謝の調節異常を支援するように、構成的に活性化させた成長因子によるシグナル伝達に依拠するがん細胞により利用されている（Vander  Heidenら、２００９年）。いくつかの成長因子により方向づけられるシグナル伝達経路は、代謝物トランスポーターの発現または表面への提示を増大させることにより、低分子量の栄養物質の、細胞による取込みを増強する。例えば、ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔシグナル伝達経路およびＲａｓシグナル伝達経路のいずれも、グルコースの取込みを増強する（ManningおよびCantley、２００７年；Pylayeva-Guptaら、２０１１年；Yunら、２００９年）。
【０１１０】
本開示は特に、Ｒａｓの発がん性の活性化を特徴とするがんに関し、この場合、がん細胞は、低酸素環境内および／または栄養物質枯渇環境内に存在する。一部の実施形態では、がん細胞は、腫瘍サイズに起因する、低酸素環境内および／または栄養物質枯渇環境内に存在する。一部の実施形態では、がん細胞は、周囲の血管系の欠如（乏血管性）に起因する、低酸素環境内および／または栄養物質枯渇環境内に存在する。一部の実施形態では、がん細胞は、転移性細胞である。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、膵臓がん細胞である。一部の実施形態では、がん細胞は、Ｒａｓの発がん性の活性化を特徴とし、この場合、Ｒａｓの発がん性の活性化は、遺伝子突然変異により引き起こされる、構成的に活性なＲａｓを含む。一部の実施形態では、Ｒａｓは、ＫＲａｓ、ＨＲａｓ、ＮＲａｓ、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、がん細胞は、Ｋ−Ｒａｓの発がん性の活性化を特徴とする。
【０１１１】
がんの処置
本開示は特に、Ｒａｓの発がん性の活性化を特徴とするがんの処置に関する。一部の実施形態では、Ｒａｓの発がん性の活性化を特徴とするがんの処置は、対象へと、ｍＴＯＲＣ阻害療法と、毒素療法とを含む治療レジメンを投与するステップを含む。一部の実施形態では、ｍＴＯＲＣ阻害療法を、毒素療法の前に投与する。一部の実施形態では、ｍＴＯＲＣ阻害療法は、ｍＴＯＲＣ１阻害剤を含む。
【０１１２】
一部の実施形態では、がん治療は、Ｒａｓの発がん性の活性化を特徴とするがん細胞のリソソーム内に蓄積するが、リソソームには毒性でない毒素を含む。一部の実施形態では、がん治療は、リソソーム活性を阻害しない。一部の実施形態では、がん治療は、Ｒａｓの活性化を阻害しない。
【０１１３】
一部の実施形態では、がん治療は、毒素療法を含み、この場合、毒素は、シクロホスファミド、クロランブシル、シスプラチン、ブスルファン、メルファラン、カルムスチン、ストレプトゾトシン、トリエチレンメラミン、マイトマイシンＣ、メトトレキサート、エトポシド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、ダカルバジン、アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、パクリタキセル、パクリタキセル誘導体、細胞増殖抑制剤、デキサメタゾン、プレドニゾン、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、ロイコボリン、アミホスチン、ダクチノマイシン、メクロレタミン、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、ロムスチン、リポソーマルドキソルビシン、ゲムシタビン、リポソーマルダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、ドセタキセル、アルデスロイキン、カルボプラチン、オキサリプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ＣＰＴ１１（イリノテカン）、１０−ヒドロキシ７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンベータ、インターフェロンアルファ、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロランブシル、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、毒素療法を、低用量で投与する。
【０１１４】
本開示はまた、がんの特徴に応じた、がん患者に適切な治療レジメンを決定することにも関する。一部の実施形態では、がんを、単剤療法としてのｍＴＯＲＣ１阻害剤による処置に好適に応答する可能性が高いがん、例えば、低度の発がん性のＲａｓ活性を伴うか、または発がん性のＲａｓ活性を伴わないがんとして識別する。一部の実施形態では、がんを、単剤療法としてのｍＴＯＲＣ１阻害剤による処置に好適に応答しない可能性が高いがん、例えば、発がん性のＲａｓ活性を伴うがんとして識別する。
【０１１５】
一部の実施形態では、発がん性のＲａｓ活性を伴うがんを、ｍＴＯＲＣ１阻害剤および毒素による処置に対して感受性であると識別する。一部の実施形態では、発がん性のＲａｓ活性を伴うがんを、ｍＴＯＲＣ１阻害剤と組み合わせた、低用量の毒素に対して選択的に脆弱であると識別する。
【０１１６】
腫瘍細胞の識別および／または特徴づけ
本開示は、栄養物質および／または他の物質を、細胞外空間から取り込む、マクロピノサイトーシスを利用するがん細胞を識別することに関する。本開示はまた、がんの検出に適する組成物にも関する。一部の実施形態では、がんの検出に適する組成物は、がん細胞によるマクロピノサイトーシスのための基質へとコンジュゲートさせたイメージング剤を含む。一部の実施形態では、本発明に適する組成物はさらに、ｍＴＯＲＣ１阻害剤も含む。一部の実施形態では、がんを、ｉｎ  ｖｉｖｏの対象において検出する。一部の実施形態では、イメージング剤は、金属性である。一部の実施形態では、イメージング剤は、放射性標識されている。
【０１１７】
一部の実施形態では、ｍＴＯＲＣ１阻害剤および毒素を含む治療レジメンを、対象へと投与して、イメージング剤により、マイクロピノサイトーシスを利用するがんであると識別されたがんを処置する。
【実施例】
【０１１８】
（例証）
（試薬）
抗体は、Ａｂｃａｍ製（ａｂ１３５２４  ＬＡＭＰ２）；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ製（型番：２２１５  ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ２４０／２４４  Ｓ６、型番：２２１７  Ｓ６、型番：２２８０  Ｒａｐｔｏｒ、型番：２７０８  Ｓ６Ｋ１、型番：２８５５  ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｔ３７／４６  ４Ｅ−ＢＰ１、型番：２９２０  Ａｋｔ、型番：２９８３  ｍＴＯＲ、型番：４０６０  ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ４７３  Ａｋｔ、型番：４３７７  ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｔ３８９  Ｓ６Ｋ１、型番：４８５６  ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ２３５／２３６  Ｓ６、型番：６８８８  ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ７５７  Ｕｌｋ１、型番：９１０１  ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｔ２０２／Ｙ２０４  Ｅｒｋ１／２、型番：９１０７  Ｅｒｋ１／２、型番：９４７６  Ｒｉｃｔｏｒ、型番：９５５２  ＰＴＥＮ、型番：１１８１７  ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ４７６  Ｇｒｂ１０）、Ｄｉａｎｏｖａ製（ＤＩＡ−−−３１０  ＣＤ３１）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ製（ｓｃ−１０２６  Ｇｒｂ１０）、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製（ＶＰ−Ｋ４５１  Ｋｉ−６７）であった。二次抗体は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５  ａｎｔｉ−ｒａｔ）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製（ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ、ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ）、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ製（ＶｅｃｔａＳｔａｉｎ  ＡＢＣ  Ｋｉｔ）であった。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７−ＢＳＡ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、１０ｋＤａ  Ｄｅｘｔｒａｎ、ＤＱ  Ｇｒｅｅｎ  ＢＳＡ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ａｎｄ  Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ａｎｔｉｆａｄｅ＋ＤＡＰＩは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製であった。
【０１１９】
阻害剤は、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製（ラパマイシン）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製（ジャスプラキノリド）、Ｐｆｉｚｅｒ製（Ｒａｐａｍｕｎｅ）、Ｓｅｌｌｅｃｋ製（ＢＥＺ２３５、ＧＤＣ０９８０）、Ｓｉｇｍａ製（バフィロマイシンＡ１、クロロキン、サイトカラシンＤ、ＥＩＰＡ、ゲニステイン、ＩＰＡ−３、ロイペプチン、Ｅ−６４、ペプスタチン  Ａ、ウォルトマンニン）、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ製（ＰＤ０３２５９０１）、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製（ＰＤ９８０５９、トリン１）であった。非必須アミノ酸（Ｍ７１４５）、必須アミノ酸（Ｍ５５５０）、およびウシ血清アルブミン（Ａ１４７０）は、Ｓｉｇｍａ製であった。
【０１２０】
（細胞株、ｓｈＲＮＡ構築物およびｃＤＮＡ構築物の安定的なトランスフェクション)
アデノウイルス５−サイトメガロウイルス−Ｃｒｅ（Ｉｏｗａ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｃｏｒｅ）の感染により、Ｃｒｅを、ＳＶ４０ラージＴ不死化Ｌｏｘ−Ｓｔｏｐ−Ｌｏｘ−Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦおよび野生型対照ＭＥＦ（Tuvesonら、２００４年）へと導入した。２ｍｌの培養培地中の細胞２００，０００個に、懸濁液中で、細胞１個当たり１，０００ｐｆｕのアデノウイルスＣｒｅを感染させ、６ウェルプレートに播種した。６時間後に感染を繰り返し、１２時間後に、培地を、ウイルス非含有培地で置きかえた。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄの発現をもたらす、転写終結配列の切出しの成功は、ＰＣＲにより確認した。
【０１２１】
誘導的発現のために、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｖ  ｃＤＮＡおよびＨ−ＲａｓＧ１２Ｖ  ｃＤＮＡを、レトロウイルスベクターであるｐＴＲＥ−Ｔｉｇｈｔ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）の改変形（Zuberら、２０１１年）へとサブクローニングした。ｃＤＮＡの発現は、５０ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリン（Ｓｉｇｍａ）の、培養培地への添加により誘導した。Ｓｒｃミリストイル化配列を含有するマウスＡｋｔ−１（ｍｙｒ−Ａｋｔ）であって、レトロウイルスベクターであるＭＩＧＲ１内のＮ末端へと融合させたｍｙｒ−Ａｋｔについては、既に記載されている（EdingerおよびThompson、２００２年）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ２０００  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、プラスミドを、プラスミドをパッケージングするレトロウイルスと共に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へと共トランスフェクトし、１６時間後に新鮮培地を添加し、４８時間後にウイルス上清を回収した。ＳＶ４０ラージＴ不死化野生型ＭＥＦに、ウイルス上清および４μｇ／ｍｌのポリブレンにより感染させ、ハイグロマイシン（ｐＴＲＥ−ｔｉｇｈｔベースの構築物の場合）またはＧＦＰ発現細胞の蛍光支援分取（ＭＩＧＲ１ベースの構築物の場合）で選択した。
【０１２２】
ｓｈＲＮＡにより媒介されるノックダウンは、以下のレンチウイルスヘアピンまたはレトロウイルスヘアピン：ＲａｇＡ  ＴＲＣＮ０００００７７４９３、ＴＲＣＮ０００００７７４９６、ＲａｇＢ  ＴＲＣＮ００００１０２６５５、ＴＲＣＮ００００１０２６５７（ＲＮＡｉ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｓｈＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ）；Ｒａｐｔｏｒ  Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド２１３３９０、Ｒｉｃｔｏｒ  Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド２１３４１（Thoreenら、２００９年）；ＰＴＥＮ（Fellmannら、２０１１年）を発現させることにより誘導した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ２０００  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、プラスミドを、レンチウイルスまたはプラスミドをパッケージングするレトロウイルスと共に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へと共トランスフェクトし、１６時間後に新鮮培地を添加し、４８時間後にウイルス上清を回収した。標的細胞に、ウイルス上清および１０μｇ／ｍｌのポリブレンを添加することにより感染させた。感染の２４時間後、細胞を、ピューロマイシンにより選択し、選択の２〜３日後に、実験を行った。
【０１２３】
（ウェスタンブロット法）
細胞を、氷冷ＰＢＳですすぎ、氷冷トリプシン（０．０５％）を伴うインキュベーションにより、培養プレートから引き剥がした。トリプシンを、氷冷血清で不活化させ、細胞をペレット化させ、氷冷ＰＢＳですすいだ。細胞を、氷冷溶解緩衝液［５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、４０ｍＭのＮａＣｌ２、２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのオルトバナジン酸Ｎａ、５０ｍＭのＮａＦ、１０ｍＭのピロリン酸Ｎａ、１０ｍＭのグリセロリン酸Ｎａ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１倍濃度のＨａｌｔプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）］中で、１５分間にわたり溶解させ、可溶性の溶解物画分を、１６，０００ｇで１０分間にわたる遠心分離により単離した。タンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により決定し、等量のタンパク質を、標準的なプロトコールに従いＳＤＳゲル電気泳動およびウェスタンブロット法により解析した。
【０１２４】
（蛍光顕微鏡法）
免疫染色のために、細胞を、氷冷ＰＢＳですすぎ、ＰＢＳ中に４％のホルムアルデヒドで、１５分間にわたり固定し、ＰＢＳ中に０．０５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過化させた。ＰＢＳによるすすぎの後、細胞を、ＰＢＧ（ＰＢＳ中に０．５％のＢＳＡ、０．２％の冷水用魚類ゼラチン）で、３０分間にわたりブロッキングし、ＰＢＧ中の一次抗体と共に、１．５時間にわたりインキュベートし、ＰＢＧ＋４％の通常のヤギ血清で、２回にわたり洗浄し、次いで、ＰＢＧ＋４％のＮＧＳ中の二次抗体と共に、４５分間にわたりインキュベートした。ＰＢＳで３回にわたる洗浄の後、細胞を、Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ａｎｔｉｆａｄｅ＋ＤＡＰＩと共に、顕微鏡スライド上にマウントし、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５−ＩＩを使用してイメージングした。
【０１２５】
ライブイメージングのために、培地に、０．３ｍｇ／ｍｌのＤＱ  Ｇｒｅｅｎ  ＢＳＡを補充した。イメージングの１時間前に、５０ｎＭのＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄおよび０．２μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔを添加した。細胞を、ＤＱ−ＢＳＡおよびトリン１を添加した直後、またはインキュベーションの５〜６時間後に、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５  ＬＩＶＥを使用してイメージングした。
【０１２６】
（免疫組織化学）
組織は、１０％の中性緩衝ホルマリン中で、２４時間にわたり固定し、７０％のエタノールへと移した。標準的なプロトコールを使用して、パラフィン包埋組織を切片化し、免疫組織化学のために加工した。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｐａｎｏｒａｍｉｃ  Ｓｃａｎｎｅｒを使用して、画像を収集した。増殖指数は、各試料について、６つのランダムに選び出された視野であって、外部および内部／ＣＤ−３１陰性の各腫瘍領域の視野内の、Ｋｉ−６７陽性腫瘍細胞の画分を定量化することにより決定した。
【０１２７】
（タンパク質および脂質の１４Ｃ−ロイシンによる標識付け）
細胞を、０．５μＣｉ（０．４％）のＬ−［１４Ｃ（Ｕ）］−ロイシン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を含有する完全培地中で、２４時間にわたり培養した。ブライト−ダイヤー法（BlighおよびDyer、１９５９年）に本質的に従い、全脂質画分および全タンパク質画分を単離した。タンパク質ペレットを、６Ｍのグアニジン塩酸塩中に再可溶化させ、次いで、シンチレーション液へと移した。有機相に溶存させた脂質を、シンチレーションバイアルへと移し、溶媒を蒸発させた後で、シンチレーション液中に再懸濁させた。タンパク質および脂質の１４Ｃ−ロイシン含量は、シンチレーションカウンティングにより定量化した。
【０１２８】
（細胞培養実験および栄養物質飢餓実験）
細胞培養実験は、１０％の透析ＦＢＳ（分子量カットオフ１０，０００；Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５ｍＭのグルコース、および２ｍＭのグルタミンを伴うＤＭＥＭ／Ｆ１２中、３７℃および５％のＣＯ２で実施した。増殖アッセイのために、ＭＥＦを、完全培地中に播種し、５時間後、短時間にわたりすすぎ、次いで、表示の飢餓培地中で培養した。ＥＡＡ滴定実験のために、１倍濃度のＭＥＭアミノ酸溶液（Ｍ５５５０、Ｓｉｇｍａ）を、表示の百分率として、ＥＡＡを補充した。がん細胞株を、飢餓の前に、完全培地中で、１日間にわたり培養した。Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ除外法により評価される通り、生細胞が＞９５％である接着細胞の数は、Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ４  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用して決定した。ｍＴＯＲ活性化／局在化実験のために、細胞をすすぎ、次いで、ＥＡＡ飢餓培地（グルタミンを除く全てのアミノ酸を欠くＤＭＥＭ／Ｆ１２）中、１時間にわたりインキュベートし、その後、ＥＡＡ（１倍濃度のＭＥＭアミノ酸溶液）、アルブミン（そうでないことが陳述されない限り、３％）、または新鮮ＥＡＡ非含有飢餓培地を補充した培地中で、表示の期間にわたり静置した。
【０１２９】
（マウス株およびラパマイシン処理）
ＫＰＣマウスモデル（ＬＳＬ−Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ／＋；ＬＳＬ−Ｔｒｐ５３Ｒ１７２Ｈ／＋；Ｐｄｘ−１−Ｃｒｅ）については、既に記載されている（Hingoraniら、２００５年）。ＫＰＣマウスは、１００％の浸透率で、進行性および転移性のＰＤＡを発症し、ヒトＰＤＡの組織病理学的特徴および臨床的特徴を再現している。マウスは、１２時間の明期／１２時間の暗期で飼育した。全ての手順は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ａｔ  ＣＳＨＬに従い行った。超音波（Ｖｅｖｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｖｉｓｕａｌｓｏｎｉｃｓ）により決定される通り、同等なサイズ（直径７〜９ｍｍ、ｎ＝５）の腫瘍が確立されたＫＰＣマウスを、５ｍｇ／ｋｇのＲａｐａｍｕｎｅ（Ｐｆｉｚｅｒ）または生理食塩液（媒体対照）を伴う経口強制投与により、毎日８日間にわたり処置した。最終回のＲａｐａｍｕｎｅ投与は、終了時点の４時間前に施した。腫瘍容量は、処置の４日目および７日目に撮影した３ｄ超音波画像から測定した。
【０１３０】
（統計学的解析）
Ｐ値は、培養細胞の増殖実験および蛍光顕微鏡法実験のためには、対応のない両側ｔ検定を使用して計算し、マウスの腫瘍を解析するためには、マン−ホイットニーノンパラメトリックｔ検定を使用して計算した。
【０１３１】
（細胞外タンパク質に対する、Ｒａｓにより方向づけられるマクロピノサイトーシスは、必須アミノ酸飢餓時における、細胞の生存率および増殖を維持しうる）
Ｋ−Ｒａｓシグナル伝達の活性化が、細胞外タンパク質を代謝する細胞の能力を変更するのかどうかについて探索するため、本発明者らは、野生型Ｋ−Ｒａｓ対立遺伝子または構成的に活性なＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ対立遺伝子を有する不死化マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を比較した。アルブミンは、血漿中および間質液中の主要なタンパク質であり、そのレベルは、２〜５％の範囲にわたる。したがって、細胞外液の、タンパク質に富む組成を模倣するために、培養培地に、１０％の透析ウシ胎仔血清±３％のアルブミンを補充した。グルコース非含有培地中に入れたところ、野生型ＭＥＦおよびＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦのいずれも、３％のアルブミンの存在に関わらず、増殖を停止させた（図１Ａ）。細胞を、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）飢餓にかけたところ、アルブミンの補充は、生存率をわずかに改善した。細胞を、単一のＮＥＡＡであるグルタミンを欠く培地に入れたところ、アルブミンの補充は、わずかな程度ではあるが、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦの細胞数の増大を可能とした。
【０１３２】
上記の結果とは対照的に、３％のアルブミンの添加は、全ての必須アミノ酸（ＥＡＡ）を欠く培地中で、細胞の生存の目覚ましいレスキューを引き起こした（図１Ａ、図２Ａ）。アルブミンおよび哺乳動物のプロテオームのいずれにおいても最も豊富なアミノ酸である、単一のＥＡＡであるロイシンについて飢餓させたところ、生存率は、アルブミンの補充により、完全に回復した（図１Ａ）。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦは、３％のアルブミンを含有するロイシン非含有培地中の増殖を維持することが可能であり、細胞数は、連続数日間にわたり増大した（図１Ｂ）。増殖する細胞は、タンパク質合成を支援するのに、外因性供給源からロイシンを獲得しなければならないため、これらの結果は、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦが、ロイシンを、細胞外タンパク質から導出しうることを示唆する。しかし、アミノ酸欠損培地へのアルブミンの補充が維持しうるのは、アミノ酸が豊富な培地と比較して限定的な細胞増殖だけである（図１Ａ）。
【０１３３】
Ｒａｓ以外に、ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔシグナル伝達は、栄養物質の取込みに関与するように細胞に命令する、第２の鍵となる経路である（ManningおよびCantley、２００７年）。しかし、ミリストイル化Ａｋｔ１  ｓｈＲＮＡまたはＰＴＥＮ  ｓｈＲＮＡの発現は、ロイシン非含有培地へのアルブミンの補充に対する細胞の応答を改善しなかった（図１Ｃ、図２Ｂ）。これに対し、構成的に活性なＫ−ＲａｓＧ１２ＶまたはＨ−ＲａｓＧ１２Ｖの発現の誘導が、これらの条件下における増殖を支援したこと（図２Ｃ、Ｄ）は、本発明者らが、内因性Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ対立遺伝子を有するＭＥＦ内で観察したことと符合する。構成的に活性化させたＲａｓシグナル伝達が、タンパク質に富むが、アミノ酸を欠損する培地中で、中程度レベルの増殖を維持する能力は、Ｒａｓ  ＧＴＰアーゼが、マクロピノサイトーシスを増強する共通の能力と符合する。
【０１３４】
発がん性のＲａｓシグナル伝達が、それにより飢餓時における細胞の生存率を維持すると提起されている１つの機構は、細胞内高分子の異化から栄養物質を回収するオートファジーの増大（Pylayeva-Guptaら、２０１１年）である。細胞外タンパク質を、栄養物質供給源として利用する細胞増殖におけるオートファジーの役割について検討するため、オートファジー誘発性キナーゼであるＵｌｋ１／２についての要件を決定した。野生型ＭＥＦおよびＫ−ＲａｓＧ１２ＶまたはＨ−ＲａｓＧ１２Ｖを発現するＵｌｋ１／２二重ノックアウト（ＤＫＯ）ＭＥＦは、３％のアルブミンを、外因性アミノ酸供給源として添加したところ、ロイシン非含有培地中の増殖を維持することができた（図２Ｅ、Ｆ）。Ｕｌｋ１／２の喪失は、細胞外タンパク質に依存する細胞増殖を損わなかった。それどころか、Ｕｌｋ１／２  ＤＫＯ  ＭＥＦは、野生型対照より顕著に高速度で増殖した。したがって、オートファジー誘発性キナーゼであるＵｌｋ１／２は、細胞外タンパク質の栄養物質としての利用に必ずしも必要ではないだけでなく、Ｕｌｋ１／２に依存するオートファジーの喪失は、実際に、Ｒａｓ突然変異細胞がこれらの栄養条件下で増殖する能力を改善している。
【０１３５】
次に、アルブミンが、低減量の全ＥＡＡを含有する培地中の細胞増殖を支援するのかどうかについて査定した。ＥＡＡを、完全培地中に存在するレベルの５％で供給したところ、野生型ＭＥＦおよびＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦは増殖を停止し、時間経過と共に、生存率を低下させた（図３Ａ）。３％のアルブミンの添加は、野生型ＭＥＦの生存を改善したが、それらの増殖は支援しなかった。これに対し、アルブミンの補充は、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦの増殖の顕著な増大を引き起こした。
【０１３６】
１０％の透析血清中にもたらされたタンパク質は、ＥＡＡ飢餓時の細胞増殖を促進するのに十分ではなかったので、これらの条件下における増殖に要求されるアルブミンの濃度を決定した。低ＥＡＡ培地中で培養された野生型ＭＥＦは、アルブミンレベルの上昇（１〜３％）に応答して、生存率の改善を示した（図４Ａ）。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦは、少なくとも１％のアルブミンを添加したところ、増殖を維持し、それらの増殖速度は、アルブミン濃度を３％へと上昇させるにつれて、徐々に増大した（図３Ｂ）。したがって、アルブミンは、ＥＡＡ欠損培地中の細胞の生存および増殖を支援するには、生理学的レベルで供給しなければならない。これは、細胞の培養において一般に使用される、タンパク質に乏しい培地処方が、ＭＥＦが、ＥＡＡ飢餓時に増殖するのに十分ではないのはなぜなのかを説明しうる。
【０１３７】
細胞が、細胞外タンパク質からロイシンを、どのようにして導出するのかを特徴づけるために、構成的に蛍光発光性のアルブミンを使用して、細胞へのアルブミンの取込みについて探索し、分解されると蛍光を発する自己消光アルブミン（ＤＱ−ＢＳＡ）を使用して、細胞内のアルブミンのタンパク質分解について探索した（Reisら、１９９８年）。標識取込みの１．５時間後に、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦは、アルブミンおよびＤＱ−ＢＳＡの両方でマーキングされた、複数の細胞内構造を示した（図３Ｃ）。リソソームプロテアーゼ阻害剤を添加したところ、アルブミンの内在化は撹乱されなかったが、ＤＱ−ＢＳＡ蛍光の大幅な減少が引き起こされた。次いで、リソソームにおけるアルブミンの分解が、ロイシン飢餓時の増殖を支援するのに要求されるのかどうかを決定した。実際、リソソームプロテアーゼ阻害剤またはリソソーム酸性化阻害剤であるクロロキンは、３％のアルブミンを含有するロイシン非含有培地中のＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦの増殖を抑制した（図３Ｄ、４Ｂ）。Ｒａｓ  ＧＴＰアーゼは、マクロピノサイトーシスによる、細胞への高分子の取込みを促進しうる（Bar-SagiおよびFeramisco、１９８６年）。一貫して、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦは、野生型対照より高度なマクロピノサイトーシス活性を示した（図４Ｃ）。このエンドサイトーシス経路が、アルブミンに依存する増殖に寄与するのかどうかについて探索するため、細胞を、マクロピノサイトーシス経路は遮断するが、他のエンドサイトーシス経路は遮断しない（Westら、１９８９年）、Ｎａ＋／Ｈ＋交換阻害剤であるＥＩＰＡで処理した。ロイシン非含有培地＋３％のアルブミン中の細胞増殖は、ＥＩＰＡ処理により大幅に減少したが、遊離ロイシンを、培養培地へと添加したところ、回復した（図３Ｅ）。まとめると、これらのデータは、細胞外タンパク質の、マクロピノサイトーシスによる取込みと、リソソームにおける分解とが、ＥＡＡ飢餓時の栄養的利益をもたらしうることを示す。
【０１３８】
（細胞外タンパク質の異化は、ｍＴＯＲＣ１のリソソームへの動員および活性化を誘導する）
細胞は、アミノ酸レベルを、成長因子によるシグナル伝達からの入力と統合して、細胞増殖を促進する、ｍＴＯＲＣ１経路を介して、ＥＡＡを感知しうる（MaおよびBlenis、２００９年；ShimobayashiおよびHall、２０１４年）。細胞を、ＥＡＡ非含有培地中に入れると、ｍＴＯＲＣ１が、下流の標的をリン酸化する能力が抑制される。細胞外にもたらされるタンパク質の異化が、ＥＡＡの非存在下で、ｍＴＯＲＣ１活性を回復させるのかどうかについて調べるため、ＭＥＦを、１時間にわたるＥＡＡ飢餓下に置くことにより、ｍＴＯＲＣ１を不活化させた。次いで、ＥＡＡまたは異なる濃度のアルブミンを含有する新鮮培地を添加し、ｍＴＯＲＣ１の再活性化を、リン酸化Ｓ６Ｋ１に対するウェスタンブロット法により評価した。ＥＡＡ非含有培地に、１〜３％のアルブミンを補充したところ、野生型ＭＥＦおよびＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦのいずれにおいても、Ｓ６Ｋ１リン酸化の、濃度依存的な増大が引き起こされたが、これは、ｍＴＯＲ阻害剤であるトリン１により完全に抑制された（図６Ａ）。したがって、生理学的レベルのアルブミンは、ｍＴＯＲＣ１経路を活性化させうる。野生型ＭＥＦおよびＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦは、ＥＡＡに応答して、同等なｍＴＯＲＣ１の活性化を呈したが、３％のアルブミンを添加したところ、高ｍＴＯＲＣ１活性を示したのは、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦであった（図５Ａ）。同様に、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖの発現も、アルブミンに応答して、ｍＴＯＲＣ１活性を増大させた（図６Ｂ）。逆に、ｓｈ−ＲＮＡにより媒介されるＰＴＥＮの枯渇を介するＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔシグナル伝達の上昇は、ＥＡＡによるｍＴＯＲＣ１の活性化を増大させたが、アルブミンによるｍＴＯＲＣ１の活性化は増大させなかった（図６Ｃ）。これらのデータは、Ｒａｓシグナル伝達が、経路の成長因子に調節される分枝ではなく、アミノ酸を感知する分枝を介し、アルブミン刺激に応答して、ｍＴＯＲＣ１の活性化を増強することを示唆する。
【０１３９】
細胞外にもたらされるＥＡＡは、膜貫通トランスポーターを介して、細胞により急速に取り込まれ、数分以内にｍＴＯＲＣ１を活性化させる（Nicklinら、２００９年）。細胞外タンパク質による、ｍＴＯＲＣ１経路活性化の反応速度について検討するため、アルブミン刺激に応答したｍＴＯＲＣ１の再活性化を、時間経過と共に追跡した。ＥＡＡの再添加は、Ｓ６Ｋ１、Ｇｒｂ１０、およびＵｌｋ１など、ｍＴＯＲＣ１の標的のほか、Ｓ６Ｋの標的である、リボソームタンパク質のＳ６の急速なリン酸化を引き起こした（図３Ｂ、６Ｄ）（Kangら、２０１３年；Nicklinら、２００９年）。これに対し、アルブミンに応答して、これらのタンパク質の、ｍＴＯＲＣ１に依存するリン酸化が再開されたのは、２時間後に過ぎず、最高レベルに達したのは、４時間後であった。したがって、細胞外タンパク質は、ＥＡＡより緩徐にｍＴＯＲＣ１経路を活性化させることから、これらの栄養物質によるｍＴＯＲＣ１の活性化には、顕著に異なる細胞過程が関与していることが示唆される。
【０１４０】
次いで、マクロピノサイトーシスと、リソソームにおけるタンパク質分解とが、細胞外タンパク質によるｍＴＯＲＣ１の活性化に要求されるのかどうかを決定した。リソソーム酸性化阻害剤である、バフィロマイシンＡ１およびクロロキンは、ＥＡＡによるｍＴＯＲＣ１の活性化を撹乱しなかった（図５Ｃ、６Ｅ）。これに対し、低濃度のいずれの阻害剤でもなお、ｍＴＯＲＣ１の、アルブミンに依存する活性化を、大幅に抑制した。同様に、プロテアーゼ阻害剤も、アルブミンによる刺激に応答する、ｍＴＯＲＣ１の活性化を遮断した（図５Ｄ）。マクロピノサイトーシスが関与することを確立するために、マクロピノサイトーシスの薬理学的阻害剤であって、Ｎａ＋／Ｈ＋交換阻害剤であるＥＩＰＡ、Ｐａｋ１阻害剤であるＩＰＡ−３、ならびにアクチン阻害剤である、ジャスプラキノリドおよびサイトカラシンＤ（MercerおよびHelenius、２００９年）を含む阻害剤の効果について探索した。これらの阻害剤の全ては、アルブミンの添加によるｍＴＯＲＣ１の活性化を大幅に低減したが、ＥＡＡの再添加によるｍＴＯＲＣ１の活性化は低減しなかった（図５Ｅ、Ｆ；６Ｆ、Ｇ）。
【０１４１】
アミノ酸は、リソソーム膜へのその移動を誘導することにより、ｍＴＯＲＣ１へとシグナルを伝達するが、そこで、ｍＴＯＲＣ１は、成長因子によるシグナル伝達からのさらなる入力により活性化しうる（Sancakら、２０１０年）。細胞外タンパク質も同様に、リソソームへのその動員を誘導することにより、ｍＴＯＲＣ１を調節するのかどうかを決定するために、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、１時間にわたるＥＡＡ飢餓にかけ、ＥＡＡまたは３％のアルブミンを再供給し、ｍＴＯＲキナーゼの細胞内局在化を、免疫蛍光法でモニタリングした。ｍＴＯＲは、ＥＡＡ飢餓細胞内の細胞質全体に分布した。アルブミンを添加したところ、ｍＴＯＲは、リソソーム膜タンパク質であるＬＡＭＰ２によりマーキングされた点状構造であって、遊離ＥＡＡの再添加時に観察されるパターンと同様の点状構造へと局在化した（図７Ａ）。リソソームにおけるタンパク質分解を、バフィロマイシンＡ１で阻害したところ、アルブミンに応答する、ｍＴＯＲの、リソソーム膜への移動が完全に遮断されたが、ＥＡＡに応答する、ｍＴＯＲの、リソソーム膜への移動は遮断されなかった（図７Ｂ）。
【０１４２】
ＥＡＡは、リソソームと会合するＲａｇＧＴＰアーゼを要求する機構を介して、ｍＴＯＲＣ１の、リソソーム膜への移動を誘導する（Kimら、２００８年；Sancakら、２００８年）。これに対し、グルタミンは、Ｒａｇに依存しない機構により、ｍＴＯＲＣ１を活性化させうる（Jewellら、２０１５年）。リソソームにおけるアルブミンのタンパク質分解を介するｍＴＯＲＣ１の活性化が、Ｒａｇ  ＧＴＰアーゼに依存したのかどうかについて探索するため、ｓｈＲＮＡにより媒介されるＲａｇＡおよびＲａｇＢのノックダウンの帰結を決定した。ＲａｇＡ／Ｂの枯渇は、培地が、アルブミンを含有したのか、ＥＡＡを含有したのかに関わらず、ｍＴＯＲの、細胞質ゾル全体への拡散性の局在化を結果としてもたらした（図７Ｃ）。一貫して、ＲａｇＡ／Ｂノックダウン細胞内では、アルブミンも、ＥＡＡも、ｍＴＯＲＣ１に依存するＳ６Ｋ１のリン酸化を誘導しえなかった（図８）。したがって、細胞外タンパク質およびＥＡＡのいずれも、Ｒａｇ依存性機構を介して、ｍＴＯＲＣ１を活性化させる。
【０１４３】
（ｍＴＯＲＣ１は、栄養物質としての細胞外タンパク質に依拠する細胞増殖を抑制する）
細胞外タンパク質をアミノ酸供給源として利用する細胞の能力に寄与する、Ｒａｓの下流のシグナル伝達経路について検討するため、ＭＥＫ１／２、ＰＩ３キナーゼ、チロシンキナーゼに対する阻害剤およびｍＴＯＲ阻害剤の、３％のアルブミンを加えたロイシン非含有培地中でのＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦの増殖に対する効果を決定した。驚くべきことに、ｍＴＯＲの阻害は、アルブミンを補充したロイシン非含有培地中の細胞増殖を遅延させなかった。それどころか、ｍＴＯＲ／ＰＩ３キナーゼ二重阻害剤を含む、ｍＴＯＲ阻害剤の各々は、これらの条件下で増殖を増強した（図９Ａ、左パネル、図１０Ａ）が、ｍＴＯＲシグナル伝達活性は、効果的に遮断した（図９Ｂ）。これに対し、ＭＡＰキナーゼ、ＰＩ３キナーゼ、またはチロシンキナーゼによるシグナル伝達に対する阻害は、ロイシン非含有培地中の細胞増殖を、わずかに減少させた（図９Ａ、左パネル）。これらのキナーゼ阻害剤の効果は、ロイシン含有培地中では異なり、この場合、ｍＴＯＲの阻害は、細胞増殖の抑制として特に効果的であった（図９Ａ、右パネル）。次に、ｍＴＯＲ阻害剤の、細胞増殖に対する濃度依存的な効果について検討した。トリン１の濃度を、５０から３００ｎＭへと上昇させることにより、ロイシン非含有培地＋３％のアルブミン中の細胞増殖が徐々に改善されたことから、細胞が、アルブミンを、ロイシンの供給源として使用する場合、増殖は、ｍＴＯＲシグナル伝達活性と逆相関することが示唆される（図９Ｃ）。これに対し、遊離ロイシンが細胞外にもたらされた場合、細胞の増殖は、顕著に高度となったが、用量を増大させるトリン１により低下した（図１０Ｂ）。同様に、トリン１による処理は、活性化Ｒａｓ突然変異を有するいくつかの癌細胞株を、ロイシン非含有培地＋３％のアルブミン中で増殖するように誘導する一方で、ロイシン含有培地中のそれらの増殖は、大幅に減少させた（図１０Ｃ）。アルブミンは、全てのタンパク質原性アミノ酸の混合物をもたらすので、アルブミンが、他の単一のＥＡＡ（イソロイシン、リジン、またはアルギニン）を欠く培地中の細胞の生存／増殖を支援するのかどうかについてもまた検討した。実際、生理学的レベルのアルブミンは、細胞の生存率をレスキューし、ｍＴＯＲシグナル伝達の、トリン１による阻害は、細胞が、これらのＥＡＡを欠く培地中で頑健に増殖するように誘導した（図１０Ｄ）。
【０１４４】
ｍＴＯＲキナーゼは、２つの顕著に異なる複合体：栄養物質および成長因子によるシグナル伝達に応答して、増殖を調節するｍＴＯＲＣ１と、ＰＩ−３キナーゼによるシグナル伝達経路の構成要素である、ｍＴＯＲＣ２とにおいて存在する（ShimobayashiおよびHall、２０１４年）。アルブミンに依存する増殖の調節におけるそれらの役割について精査するため、必須のｍＴＯＲＣ１構成要素であるＲａｐｔｏｒ、または必須のｍＴＯＲＣ２構成要素であるＲｉｃｔｏｒを、ｓｈＲＮＡにより媒介されるノックダウンにより、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦ内で枯渇させた（図１０Ｅ）。Ｒｉｃｔｏｒのノックダウンは、３％のアルブミンの存在に関わらず、ロイシン欠乏の間における細胞増殖を増強しなかった（図９Ｄ、Ｅ）。これに対し、Ｒａｐｔｏｒのノックダウンは、アルブミンを補充したロイシン非含有培地中のＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦの増殖の劇的な増大を引き起こし、細胞はほぼ、１日当たり１回の集団の倍加を経た。したがって、ｍＴＯＲＣ１は、アミノ酸供給源としての細胞外タンパク質に依拠する細胞増殖の負の調節因子である。
【０１４５】
（ｍＴＯＲＣ１の阻害は、リソソームにおける内在化したアルブミンの分解を増強する）
細胞外タンパク質からのロイシンの回収は、ロイシン非含有培地中の細胞増殖についての律速段階を構成すると考えられた。これは、ｍＴＯＲＣ１が、細胞外タンパク質のアミノ酸内容物への細胞の接近を制限し、考えられるところでは、それらのエンドサイトーシスまたはリソソームにおける分解を遮断することにより、細胞外タンパク質に依存する増殖を抑制することを示唆した。これらの可能性を識別するため、まず、ｍＴＯＲＣ１の阻害が、細胞外高分子の内在化を増大させるのかどうかについて調べた。しかし、トリン１のノックダウンも、Ｒａｐｔｏｒのノックダウンも、蛍光標識されたデキストランまたはアルブミンの、細胞への取込みを上昇させなかったことから、ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達は、細胞外高分子のバルクの内在化を阻害しないことが指し示される（図１２Ａ〜Ｃ）。次に、ｍＴＯＲＣ１の阻害が、リソソームにおける内在化タンパク質の分解に影響を及ぼすのかどうかについて検討した。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦを、ＤＱ−ＢＳＡとリソソームをマーキングするためのＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ±トリン１とを含有する培地中に入れ、リソソームにおけるＤＱ−ＢＳＡのタンパク質分解により発生する蛍光シグナルを、時間経過と共に追跡した。ｍＴＯＲの阻害は、ＤＱ−ＢＳＡの分解の増強を示す、ＤＱ−ＢＳＡの蛍光の消光解除の劇的な増大を引き起こした（図１１Ａ、Ｂ）。同様に、Ｒａｐｔｏｒのノックダウンによる、ｍＴＯＲＣ１の阻害も、細胞内のＤＱ−ＢＳＡ蛍光を増大させた（図１２Ｄ）。リソソームにおけるタンパク質分解の、クロロキンまたはリソソームプロテアーゼ阻害剤による遮断は、トリン１処理細胞内のＤＱ−ＢＳＡ分解を無効化させた（図１２Ｅ）。したがって、ｍＴＯＲＣ１は、環境から取り込まれたタンパク質の、リソソームにおける分解を、負に調節する。
【０１４６】
Ｒａｓシグナル伝達およびｍＴＯＲＣ１シグナル伝達が、リソソームにおける内在化タンパク質の分解を、どのようにして調節したのかについてさらに探索するため、ｍＴＯＲＣ１の阻害の効果と、Ｋ−Ｒａｓの活性化の効果とを比較した。野生型ＭＥＦにおける、ｍＴＯＲＣ１の、トリン１による阻害は、ＤＱ−ＢＳＡ蛍光の顕著な増大を引き起こした（図１１Ｃ、Ｄ）。同様に、構成的に活性なＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ突然変異を有するＭＥＦは、野生型ＭＥＦより高度なＤＱ−ＢＳＡ分解を示した。トリン１処理の、構成的なＫ−Ｒａｓの活性化との組合せは、相乗作用的効果がもたらされ、いずれかの操作単独のほぼ４倍を超えて、ＤＱ−ＢＳＡのタンパク質分解を増大させた。したがって、Ｋ−Ｒａｓは、細胞外タンパク質を取り込み、分解する細胞の能力を増強する。これに対し、ｍＴＯＲＣ１は、リソソームにおけるそれらの分解を特異的に制限する。
【０１４７】
ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達が内在化タンパク質の分解を妨げうる、１つの機構は、エンドサイトーシスまたはリソソームの生合成に関与する遺伝子の発現を抑制することである（ShimobayashiおよびHall、２０１４年）。ｍＴＯＲＣ１の阻害が、転写の変化の二次効果によるＤＱ−ＢＳＡ分解を増強するのかどうかについて取り組むため、ｍＴＯＲＣ１阻害剤が、それらの効果を及ぼすときの時間枠を決定した。Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦの、トリン１による、６時間または１６時間にわたる前処理は、ＤＱ−ＢＳＡ分解の速度を増大させなかった（図１２Ｆ）。さらに、転写を、アクチノマイシンＤまたはトリプトリドにより遮断しても、トリン１に誘導されるＤＱ−ＢＳＡ蛍光の増大は、影響を受けなかった（図１２Ｇ）。したがって、リソソームにおける内在化タンパク質の分解は、ｍＴＯＲＣ１の阻害に対する、細胞内の即時的応答である。細胞内構成要素の、オートファジーによる貪食および分解は、栄養物質が豊富な条件下では、オートファジー誘発性キナーゼであるＵｌｋ１／２の阻害を介して、ｍＴＯＲＣ１により抑制される（HeおよびKlionsky、２００９年；Mizushima、２０１０年）。エンドサイトーシスと、オートファジーとは、いずれも、高分子をリソソームへと輸送する、小胞のトラフィッキング経路であるので、Ｕｌｋ１／２欠失の、ＤＱ−ＢＳＡタンパク質分解に対する帰結について検討した。Ｕｌｋ１／２野生型ＭＥＦと、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｖを発現するＵｌｋ１／２  ＤＫＯ  ＭＥＦとは、ＤＱ−ＢＳＡを、同様の速度で分解し、トリン１処理に対して、ＤＱ−ＢＳＡタンパク質分解の同等な増大により応答した（図１２Ｈ）。さらに、トリン１は、３％のアルブミンを含有するロイシン非含有培地中の、Ｕｌｋ１／２  ＤＫＯ  ＭＥＦの増殖も増強した（図１２Ｉ）。したがって、ｍＴＯＲＣ１は、リソソームにおける細胞外タンパク質の分解を、そのオートファジーの調節とは顕著に異なる機構により抑制する。
【０１４８】
（ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達は、細胞によるアミノ酸の供給源に応じて、細胞増殖に対して、反対の効果を及ぼしうる）
多くの異なる系において、アミノ酸が、細胞外において豊富である場合、ｍＴＯＲＣ１は、増殖を促進することが示されてきたが、上記のデータは、ｍＴＯＲＣ１が、細胞外タンパク質の異化に依拠する細胞増殖を抑制しうることを指し示した。このため、量を減少させたＥＡＡを含有するが、代替的なＥＡＡ供給源としての、３％のアルブミンで補充された培地中の、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦの増殖に対する、ｍＴＯＲＣ１の阻害の影響の探索を行うことになった。ＥＡＡが、細胞外において豊富である場合、トリン１処理またはＲａｐｔｏｒノックダウンは、細胞増殖を大幅に減少させた（図１３Ａ、Ｂ）。しかし、対照細胞の増殖が、ＥＡＡレベルの低下と共に急速に降下したのに対し、トリン１で処理した細胞またはＲａｐｔｏｒ  ｓｈＲＮＡを発現する細胞は、ＥＡＡ濃度の１０倍の範囲にわたり、増殖のわずかな低減を示すに過ぎなかった。ＥＡＡ濃度を低度としたときも、トリン１処理またはＲａｐｔｏｒノックダウンは、細胞増殖を顕著に改善した。これらの結果は、ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達が、アミノ酸に富む培地中のＫ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦの増殖は刺激するが、細胞外タンパク質が必須アミノ酸の供給源として要求される条件下では、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ  ＭＥＦの増殖を制限することを示唆する。
【０１４９】
（ラパマイシンは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、Ｋ−Ｒａｓに誘導される膵臓腫瘍の増殖を増強する）
ｍＴＯＲＣ１の阻害が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、Ｋ−Ｒａｓ突然変異細胞の増殖を促進しうるのかどうかを決定するため、膵臓特異的な突然変異体Ｋ−Ｒａｓおよびｐ５３（ＫＰＣ）の内因性対立遺伝子を発現する遺伝子操作マウスモデルを使用して、ｍＴＯＲＣ１の阻害の、膵菅腺癌（ＰＤＡ）の発症に対する効果について検討した（Hingoraniら、２００５年）。ヒトでは、Ｋ−Ｒａｓは、膵臓がんの大部分において突然変異するが、ＫＰＣマウスの腫瘍細胞が、マクロピノサイトーシスを介して、高分子量のデキストランを内在化することが示されたことから、ＫＰＣマウスの腫瘍細胞は、細胞外タンパク質に接近する潜在的可能性を有することが指し示されることは、これと符合する（Commissoら、２０１３年）。さらに、膵臓がんの腫瘍微小環境は、乏血管性であり、かつ、高度に栄養物質枯渇性であり（Kamphorstら、２０１５年）、これは、この文脈では、細胞外タンパク質が、重要な代替的栄養物質供給源として機能しうる可能性を高める。
【０１５０】
同等なサイズの腫瘍が確立されたＫＰＣマウスを、ラパマイシンで、８日間にわたり処理し、腫瘍組織のＫｉ−６７染色により、細胞増殖について検討した。ｍＴＯＲＣ１の阻害は、アミノ酸飢餓時に特異的に、培養細胞内の細胞増殖を増強したため、内皮マーカーであるＣＤ３１について陰性である、内側の乏血管性腫瘍領域内の、腫瘍細胞の増殖に対するラパマイシンの効果について検討した。実際、ラパマイシン処理は、ｍＴＯＲＣ１の下流の標的であるリン酸化Ｓ６の非存在にも関わらず、これらの腫瘍領域内のＫｉ−６７陽性細胞の数の、目覚ましい増大を引き起こした（図１３Ｃ、Ｄ；１４Ａ）。これに対し、ラパマイシンは、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ６を共時的に減少させながら、外側の血管化腫瘍領域内のＫｉ−６７陽性細胞の画分を減少させた。これらのデータは、膵臓がん細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、それらがある腫瘍微小環境に応じて、ラパマイシンに応答する（ラパマイシンは、外側の血管化領域では、細胞増殖を減少させるが、内側の乏血管性領域では、増殖を増強する）ことを指し示す。これらの知見は、ｍＴＯＲＣ１が、栄養物質飢餓時に、細胞増殖の抑制因子として機能しうるという考えを裏打ちする。驚くべきことに、ラパマイシン処理は、ＫＰＣマウスにおける腫瘍増殖を、顕著に加速化させた（図１３Ｅ）。
【０１５１】
（ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達の遺伝子除去は、細胞外タンパク質に依存する増殖を、Ｒａｓ形質転換とは独立に誘導しうる）
最後に、細胞外タンパク質の、アミノ酸供給源としての利用であって、細胞増殖を支援する利用の抑制における、ｍＴＯＲＣ１の役割が、Ｒａｓ形質転換細胞に制限されるのかどうかを決定するため、野生型Ｒａｓ対立遺伝子を有する細胞内の、ｍＴＯＲＣ１の阻害の帰結について探索した。Ｒａｐｔｏｒ  ｓｈＲＮＡを発現する野生型ＭＥＦ、またはｍＴＯＲ阻害剤で処理した野生型ＭＥＦは、３％のアルブミンを補充したロイシン非含有培地中で頑健に増殖することができた（図１４Ｂ〜Ｄ）。ｍＴＯＲシグナル伝達を、より厳密に遮断するため、ＲａｐｔｏｒまたはＲｉｃｔｏｒを、条件付け対立遺伝子を有するＭＥＦから遺伝子除去した（図１４Ｅ）（Cybulskiら、２０１２年）。Ｒａｐｔｏｒノックアウト細胞は、野生型対照と比較して、栄養物質が豊富な培地中の細胞増殖の大幅な減少を示す一方で、ロイシン非含有培地＋３％のアルブミン中の増殖は維持することができた（図１３Ｆ）。これに対し、Ｒｉｃｔｏｒの欠失は、ロイシン含有培地中の細胞増殖をわずかに減少させるに過ぎず、アルブミン補充培地中のロイシン欠乏細胞の増殖を結果としてもたらさなかった（図１４Ｆ）。また、量を減少させたＥＡＡのほか、代替的なＥＡＡ供給源としての３％のアルブミンを含有する培地中の、対照またはＲａｐｔｏｒ  ｓｈＲＮＡを発現する野生型ＭＥＦの増殖についても検討した。Ｒａｐｔｏｒノックダウンは、ＥＡＡが豊富な条件下における細胞増殖を損った（図１３Ｇ）。しかし、ＥＡＡレベルを低減したところ、対照細胞と、Ｒａｐｔｏｒノックダウン細胞との細胞増殖の差違は減殺され、ＥＡＡレベルを低度としたところ、Ｒａｐｔｏｒノックダウンは、増殖を増強した。
【０１５２】
（ｍＴＯＲＣ１は、細胞外タンパク質の、栄養物質としての利用を抑制する）
上記の結果は、哺乳動物細胞内では、ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達が、環境から取り込まれたタンパク質のリソソームにおける異化を抑制することを裏付ける。当然の帰結として、ｍＴＯＲＣ１の阻害は、例えば、ＥＡＡを欠乏された培養細胞内、または乏血管性腫瘍領域内にある膵臓がん細胞内の栄養物質としての細胞外タンパク質に依拠する細胞増殖を増強する。ｍＴＯＲＣ１経路は、栄養物質に富む条件下において、翻訳の増強を部分的に介する、細胞増殖の強力な刺激因子であることが公知である（MaおよびBlenis、２００９年；ShimobayashiおよびHall、２０１４年）。しかし、ｍＴＯＲＣ１が、正味のタンパク質合成を促進する能力は、アミノ酸の外因性供給源を厳密に要求する。本研究は、細胞外タンパク質からのアミノ酸の回収を制限することにより、ｍＴＯＲＣ１は、細胞増殖を、細胞外における遊離アミノ酸の利用可能性とカップリングさせることを指し示す。これは、タンパク質の生合成が、翻訳の効率ではなく、アミノ酸の獲得により制約される条件下における増殖を、ｍＴＯＲＣ１の阻害が促進しうることを示唆する。したがって、ｍＴＯＲＣ１が、細胞増殖を刺激するのか、抑制するのかは、細胞のアミノ酸供給源に依存しうる。
【０１５３】
かつての研究は、ｍＴＯＲＣ１の阻害が、細胞外ＥＡＡの供給源の非存在下における細胞の生存を支援しうることを示した。細胞外タンパク質の非存在下で、細胞からロイシンを欠乏すると、これに続くｍＴＯＲＣ１の不活化により、オートファジー誘発キナーゼであるＵｌｋ１／２の抑制解除がもたらされ、これは、後続のリソソームへの輸送のための細胞内構成要素を貪食するオートファゴソームの形成を誘発する（HeおよびKlionsky、２００９年；Mizushima、２０１０年）。この機構を介して、オートファジーは、ロイシン欠乏の間における、細胞の生存を支援する。しかし、細胞内タンパク質の異化では、細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈおよびｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）に要求されるロイシン（または他のＥＡＡ）の正味の獲得をもたらすことができない。むしろ、オートファジーによる細胞内タンパク質の分解は、細胞が、限定的な栄養物質欠乏期における細胞の生存を維持するのに適応的なタンパク質合成に関与するのに十分なＥＡＡを補償する。本明細書で明示される研究は、哺乳動物細胞が、細胞外タンパク質を、細胞の生存率の維持を可能とするＥＡＡの供給源として利用しうることを裏付ける。細胞が、Ｒａｓ内の突然変異の活性化および／またはｍＴＯＲＣ１の抑制の結果として、十分な量の細胞外タンパク質を異化する場合、細胞は、正味のタンパク質合成を支援して、バイオマスを増大させ、増殖することさえも可能である。本明細書で明示されるデータは、Ｕｌｋ１／２が、Ｒａｓ突然変異細胞の、細胞外タンパク質に依存する増殖にとって、可欠であることを裏付ける。実際、Ｕｌｋ１／２の遺伝子欠失は、ｍＴＯＲＣ１の阻害時における細胞増殖を増強する。これは、ｍＴＯＲＣ１の阻害の結果としての、オートファジーを介する細胞内構成要素の分解が、アミノ酸欠乏細胞が、細胞外タンパク質を取り込み、分解することにより増殖しうる速度に対して、律速的でありうることを示唆する。
【０１５４】
アミノ酸は、リソソーム膜へのその動員を誘導することにより、ｍＴＯＲＣ１活性を調節する（Sancakら、２０１０年）。本研究は、エンドサイトーシスされたタンパク質の、リソソームにおける分解が、それらの単量体形態で環境から移入されたアミノ酸と同じステップで、ｍＴＯＲＣ１経路を調節し；いずれの栄養物質も、ｍＴＯＲＣ１の、リソソーム膜への、Ｒａｇに依存する動員を誘導し、これが、成長因子によるシグナル伝達を介して、その後続の活性化を可能とすることを裏付ける。同様に、オートファジーを介して輸送された細胞内タンパク質の、リソソームにおける異化も、ｍＴＯＲＣ１の、この細胞小器官への動員をもたらす（Yuら、２０１０年）。まとめると、これらのデータは、リソソームにおけるｍＴＯＲＣ１活性の調節が、エンドサイトーシスまたはオートファジーを介して輸送されたタンパク質から回収されるアミノ酸を、細胞がモニタリングすることを可能とする、高感度の機構を構成することを示唆する。逆に、リソソーム膜において活性化すると、ｍＴＯＲＣ１は、これらの膜トラフィッキング経路による、リソソームへのカーゴ輸送の調節因子として機能するように、良好に配置されうる。とりわけ、エンドソームへのトラフィッキングを調節するタンパク質が近年、ｍＴＯＲＣ１基質の新規のクラスとして出現している（Hsuら、２０１１年；Kimら、２０１５年；Yuら、２０１１年）。
【０１５５】
（ｍＴＯＲ阻害剤の、治療剤としての使用についての含意）
本結果はまた、ｍＴＯＲ阻害剤の、がん治療剤としての有効性の不可解な欠如にも光を投げかけうる。最近の数年間にわたり、がん処置において、ｍＴＯＲＣ１経路をターゲティングしようと、多大な努力がなされている。これらの研究は、ヒト腫瘍は、一般に、その上流の活性化因子であるＰＩ３キナーゼ経路内の突然変異のために、ｍＴＯＲＣ１活性の上昇を示すことが多いという観察により動機付けられている（ManningおよびCantley、２００７年）。しかし、近年の臨床試験は、様々な固形腫瘍における、ラパマイシン類似体（ラパログ）の有効性が、限定的に過ぎないことを示した。本研究は、ｍＴＯＲ阻害剤の、がん処置における、内因性の弱点を明らかにする。細胞外に由来するタンパク質の異化を増強することにより、ｍＴＯＲ阻害剤は、代替的な栄養物質としての細胞外タンパク質の使用を増加させて、生存を支援し、増殖を維持する。これは、栄養物質枯渇腫瘍の微小環境内、または腫瘍細胞が新規の代謝的ニッチに適応しなければならない転移時において特に重要でありうる。これらの知見は、ｍＴＯＲ阻害剤の増殖促進効果が、Ｒａｓにより方向づけられるマクロピノサイトーシスなどのエンドサイトーシス経路を介して、がん細胞が十分な細胞外タンパク質を取り込む能力と相関することを予測する。一貫して、ＫＰＣマウスの、ラパマイシンによる処理は、乏血管性腫瘍領域内に棲息する膵臓がん細胞の増殖を増大させ、正味の腫瘍増殖を加速化させる。これは、Ｋ−Ｒａｓが主要な駆動性がん遺伝子である膵臓がん（Javleら、２０１０年）、またはＲａｓ抑制因子であるＮＦ１内の突然変異により引き起こされる神経線維腫症など、Ｒａｓシグナル伝達における活性化突然変異を伴う様々な腫瘍型の処置における、ｍＴＯＲ阻害剤の不奏効を説明しうる。
【０１５６】
ラパログの限定的な奏効についての、１つの現行の説明は、ラパログが、ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔシグナル伝達のフィードバック抑制を緩和するということである。これは、ｍＴＯＲキナーゼをターゲティングすることにより、ｍＴＯＲＣ１と、Ａｋｔ活性化因子であるｍＴＯＲＣ２とを阻害する、ｍＴＯＲ活性部位阻害剤のほか、ｍＴＯＲ／ＰＩ３キナーゼ二重阻害剤の開発ももたらした。これらの阻害剤の、がん治療における有効性は、現在探索されつつあるが、上記のデータは、培養細胞内では、異なるクラスのｍＴＯＲ阻害剤が、細胞外タンパク質の、栄養物質としての利用の促進という落とし穴を共有することを示す。しかし、本発明者らの研究は、ｍＴＯＲ阻害剤を、細胞外タンパク質の取込みまたはリソソームにおける分解を遮断する阻害剤と組み合わせる代替的な手法により、より大きな有効性を達成しうることを示唆する。ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達の、腫瘍発生における役割を査定する場合、がんゲノムシークエンシングの試みからの洞察を考慮することもまた有意義でありうる。ｍＴＯＲキナーゼ内の突然変異、または構成的な経路の活性化を引き起こす、直接的な経路調節因子を示すことが見出されたがんは、比較的少数である。これに対し、上流のＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ経路内の突然変異は、ヒトのがんにおいて一般的である（ManningおよびCantley、２００７年）。考えられるところでは、これは、がん細胞が、栄養物質に富む条件下では、ｍＴＯＲＣ１活性を増大させる一方で、アミノ酸によるその調節を無効化しないことを可能とし、したがって、腫瘍細胞が、栄養物質の欠乏に適応することを可能とする。
【０１５７】
（真核細胞内の栄養物質獲得の戦略としての、細胞外高分子のマクロピノサイトーシス）
本研究は、哺乳動物細胞が、ＥＡＡの供給源としての細胞外タンパク質を採取して、生存および増殖を維持しうることを裏付ける。これらのデータは、Ｒａｓにより方向づけられたタンパク質のマクロピノサイトーシスが、形質転換細胞の、細胞外グルタミン供給への依存性を緩和しうることを示す近年の研究（Commissoら、２０１３年）を裏打ちし、拡張する。Ｒａｓにより誘導される、細胞外タンパク質のマクロピノサイトーシスは、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍなど、単細胞のアメーバ様真核生物の増殖を維持することが既に認識されている（Amyereら、２００２年）。まとめると、これらの知見は、マイクロピノサイトーシスが、真核細胞内の栄養物質獲得の、進化的に古形の戦略を構成することを指し示す。興味深いことに、後生動物細胞内のマクロピノサイトーシスは、成長因子によるシグナル伝達の制御下にあり、マイクロピノサイトーシスの誘導は、血清による刺激に対する、多様な哺乳動物細胞型の即時的な応答である（Amyereら、２００２年；MercerおよびHelenius、２００９年）。これは、成長因子が、細胞に、グルコースおよびアミノ酸など、低分子量の栄養物質だけでなく、細胞外高分子もまた取り込むように命令しうることを示唆する。しかし、成長因子によるシグナル伝達と、アミノ酸とからの協奏的入力は、ｍＴＯＲＣ１の活性化を結果としてもたらすが、これは、環境から内在化させたタンパク質の異化を制限する。したがって、ｍＴＯＲＣ１は、細胞外に由来するタンパク質の分解を防止しながら、遊離アミノ酸を利用する同化的細胞内代謝を誘発する。考えられるところでは、この機構は、単量体アミノ酸が利用可能である限りにおいて、体液中に含有されるタンパク質の無用な代謝回転を防止する。
参考文献
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【０１５８】
同等物
当業者は、規定の実験だけを使用して、本明細書で記載される本発明の具体的な実施形態の多くの同等物を認識または確認することが可能であろう。本発明の範囲は、上記の記載に限定されることを意図するものではなく、以下の特許請求の範囲で明示される通りである。
【図１Ａ】
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【図１ＢＣ】
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【図２ＡＢＣＤ】
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【図２ＥＦ】
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【図３ＡＢＣ】
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【図３ＤＥ】
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【図４ＡＢ】
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【図４Ｃ】
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【図５ＡＢＣ】
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【図５ＤＥＦ】
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【図６ＡＢＣ】
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【図６ＤＥＦＧ】
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【図７ＡＢ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９ＢＣ】
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【図９ＤＥ】
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【図１０ＡＢ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０ＤＥ】
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【図１１ＡＢ】
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【図１１ＣＤ】
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【図１２ＡＢ】
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【図１２ＣＤ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２ＦＧ】
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【図１２ＨＩ】
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【図１３ＡＢ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３ＤＥＦＧ】
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【図１４Ａ】
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【図１４ＢＣＤ】
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【図１４ＥＦ】
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【国際調査報告】
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