(57)【要約】  本発明は、免疫療法の分野に関し、特に、養子Ｔ細胞療法、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)遺伝子療法およびワクチン接種に関する。本発明は、ドナーから単離されたＴ細胞を、該ドナー中に、好ましくはＫ５６２細胞中に存在する全てのＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩアレルを発現する細胞を含む人工抗原提示細胞(ＡＰＣ)のライブラリーと接触させることを含む、主要組織適合複合体(ＭＨＣ)上に提示される抗原由来のエピトープに特異的なＴＣＲ構築物のＴＣＲα鎖構築物(ＴＲＡ)およびＴＣＲβ鎖構築物(ＴＲＢ)をコードする核酸を調製する方法を提供する。ＴＣＲ構築物はＴ細胞で発現され得て、それは、例えば、癌、ウイルス感染または自己免疫疾患などの養子Ｔ細胞療法に有用である。本発明はさらに、該ＴＣＲにより認識されるエピトープを同定するための方法を提供する。該ＴＣＲにより認識される免疫原性エピトープは、患者において抗原特異的Ｔ細胞免疫を誘導するためのワクチン製剤を開発するために使用され得る。本発明はさらに、本発明の方法により得られる２つのＴＣＲ構築物のペアおよびそれぞれの免疫原性エピトープを提供し、ここで、該エピトープは、ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)１６(アルファパピローマウイルス９とも称する)オンコプロテインＥ５およびヒトサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)タンパク質ｐｐ６５由来である。
2018509911.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＭＨＣ Ｉと複合体を形成しているエピトープに特異的なＴ細胞受容体(ＴＣＲ)構築物のＴＣＲα鎖構築物(ＴＲＡ)および／またはＴＣＲβ鎖構築物(ＴＲＢ)をコードする核酸であって、
該エピトープが、ヒトパピローマウイルス１６オンコプロテインＥ５のエピトープであり、
該核酸が、好ましくは、
（ａ）ドナーから単離されたＴ細胞を、所定の抗原の複数のエピトープを提示し、かつ少なくとも１つのＭＨＣアレルを該ドナーと共有するプロフェッショナル抗原提示細胞で刺激して、抗原特異的なＴ細胞を富化すること；
（ｂ）該Ｔ細胞を細胞ライブラリーと接触させること、ここで、各細胞が単一のＭＨＣアレルを発現し、該ライブラリーが、ドナー中に存在する全てのＭＨＣ Ｉアレルを発現する細胞を含み、そして該ライブラリーの細胞が、該所定の抗原の複数のエピトープを提示する；
（ｃ）該接触により活性化されたＴ細胞を、好ましくは、該活性化されたＴ細胞により発現される活性マーカーに基づいて選択すること；および
（ｄ）該Ｔ細胞のＴＣＲのＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をコードする核酸を単離すること
を含む方法により得られる、核酸。
【請求項２】
該エピトープが、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を含む、ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１拘束性のヒトパピローマウイルス１６オンコプロテインＥ５のエピトープである、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
ＴＲＡが、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８４％の配列同一性を有するＣＤＲ３を含み、該ＣＤＲ３が、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＴＲＡの可変領域が、好ましくは配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、該ＴＲＡが、好ましくは配列番号４のアミノ酸配列を含み、配列番号５の核酸配列によりコードされ；および／または
該ＴＲＢが、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８４％の配列同一性を有するＣＤＲ３を含み、該ＣＤＲ３が、好ましくは配列番号６のアミノ酸配列を含み、ＴＲＢの可変領域が、好ましくは配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、該ＴＲＡが、好ましくは配列番号８のアミノ酸配列を含み、配列番号９の核酸配列によりコードされる、
請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
ヒトＭＨＣ Ｉと複合体を形成しているエピトープに特異的なＴＣＲ構築物のＴＲＡおよび／またはＴＲＢをコードする核酸であって、該ＴＣＲ構築物が、ＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２と複合体を形成しているヒトサイトメガロウイルスタンパク質ｐｐ６５のエピトープに特異的であり、該エピトープが配列番号１０のアミノ酸配列からなり、該ＴＲＡが、配列番号１１のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含み、および／または該ＴＲＢが、配列番号１５のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む、核酸。
【請求項５】
ＴＲＡの可変領域が、配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、該ＴＲＡが、好ましくは配列番号１３のアミノ酸配列を含み、配列番号１４の核酸配列によりコードされ；および／または、ＴＲＢの可変領域が、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、該ＴＲＢが、好ましくは配列番号１７のアミノ酸配列を含み、配列番号１８の核酸配列によりコードされる、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
ヒトパピローマウイルス１６オンコプロテインＥ５のエピトープまたはヒトサイトメガロウイルスタンパク質ｐｐ６５のエピトープに特異的なＴＣＲ構築物のＴＲＡおよびＴＲＢをコードする請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸を含み、該ＴＣＲを発現する、宿主細胞であって、該宿主細胞が、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞である、宿主細胞。
【請求項７】
好ましくは、ＴＲＡおよびＴＲＢを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸によってコードされるタンパク質。
【請求項８】
医薬組成物における使用のための、好ましくは、ａ)ヒトパピローマウイルス１６（該ＴＣＲ構築物は、ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１と複合体を形成しているヒトパピローマウイルス１６オンコプロテインＥ５のエピトープに特異的であり、患者はＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１陽性である）；または
ｂ）ヒトサイトメガロウイルス（該ＴＣＲ構築物は、ＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２と複合体を形成しているヒトサイトメガロウイルスタンパク質ｐｐ６５のエピトープに特異的であり、患者はＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２陽性である）
に罹患した患者の処置のための、ＴＣＲ構築物がＴＲＡおよびＴＲＢを含む、請求項７に記載のタンパク質、請求項６に記載の組換えＴ細胞、または請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項９】
エピトープを含む４０アミノ酸までのアミノ酸長を有するヒトパピローマウイルス１６オンコプロテインＥ５のフラグメントをコードする核酸、またはエピトープを含む４０アミノ酸までのアミノ酸長を有するヒトパピローマウイルス１６オンコプロテインＥ５のペプチドフラグメントであって、該エピトープが、請求項６に記載のＴ細胞のＴＣＲ構築物により認識可能であり、
該エピトープが、好ましくは、
（ａ）ドナーから単離されたＴ細胞を、所定の抗原の複数のエピトープを提示し、かつ少なくとも１つのＭＨＣアレルを該ドナーと共有するプロフェッショナル抗原提示細胞で刺激して、抗原特異的なＴ細胞を富化すること；
（ｂ）該Ｔ細胞を細胞ライブラリーと接触させること、ここで、各細胞が単一のＭＨＣアレルを発現し、該ライブラリーが、ドナー中に存在する全てのＭＨＣ Ｉアレルを発現する細胞を含み、そして該ライブラリーの細胞が、該所定の抗原の複数のエピトープを提示する；
（ｃ）該接触により活性化されたＴ細胞を、好ましくは、該活性化されたＴ細胞により発現される活性マーカーに基づいて選択すること；および
（ｄ）該選択されたＴ細胞を活性化することができるエピトープを同定すること
を含む方法により同定され得る、核酸またはペプチドフラグメント。
【請求項１０】
該Ｅ５エピトープが配列番号１のアミノ酸配列を含み、配列番号１、４５、４７、４９、５１、５２および５７のアミノ酸配列からなる群より選択される、請求項９に記載の核酸またはペプチド。
【請求項１１】
医薬組成物における使用のための、好ましくは、ヒトパピローマウイルス１６の感染を予防するため、またはヒトパピローマウイルス１６に感染した患者の処置のための、請求項９または１０に記載の核酸またはペプチド。
【請求項１２】
ＭＨＣ上に提示される所定の抗原由来のエピトープに特異的なＴＣＲ構築物のＴＲＡおよびＴＲＢをコードする核酸の調製方法であって、
（ａ）ドナーから単離されたＴ細胞を、該所定の抗原の複数のエピトープを提示するプロフェッショナル抗原提示細胞で刺激して、抗原特異的Ｔ細胞を富化すること；
（ｂ）該Ｔ細胞を細胞ライブラリーと接触させること、ここで、各細胞が単一のＭＨＣアレルを発現し、該ライブラリーが、ドナー中に存在する全てのＭＨＣ ＩアレルまたはＭＨＣ ＩＩアレルを発現する細胞を含み、および該ライブラリーの細胞が、該所定の抗原の複数のエピトープを提示する；
（ｃ）該接触により活性化されたＴ細胞を、好ましくは、該活性化されたＴ細胞により発現される活性マーカーに基づいて選択すること；および
（ｄ）該Ｔ細胞のＴＣＲのＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をコードする核酸を単離すること
を含む、調製方法。
【請求項１３】
該ＭＨＣがＭＨＣ Ｉであり、該細胞ライブラリーが、好ましくはＭＨＣ Ｉを発現するＫ５６２細胞を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
配列を最適化すること、好ましくは、ＴＲＡおよびＴＲＢのコドン使用を最適化すること、および所望により、ヒト可変領域をマウス定常領域または最小マウス定常領域と結合させることをさらに含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法を実施し、Ｔ細胞においてＴＲＡおよびＴＲＢをコードする核酸を発現させることを含む、ＭＨＣ上に提示された所定の抗原由来のエピトープに特異的なＴＣＲ構築物を発現するＴ細胞の製造方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載の工程（ａ）〜（ｄ）を実施し、ＴＣＲ構築物を構成する単離されたＴＲＡおよびＴＲＢをコードする核酸でトランスフェクトされたＴ細胞を活性化することができるエピトープを同定することを含む、所定の抗原においてＭＨＣにより提示され得るエピトープを同定する方法であって、該エピトープが、所望によりペプチドまたは核酸形態で調製される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫療法の分野に関し、特に、養子Ｔ細胞療法、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)遺伝子療法およびワクチン接種に関する。本発明は、ドナーから単離されたＴ細胞を、該ドナー中に、好ましくはＫ５６２細胞中に存在する全てのＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩアレルを発現する細胞を含む人工抗原提示細胞(ＡＰＣ)のライブラリーと接触させることを含む、主要組織適合複合体(ＭＨＣ)上に提示される抗原由来のエピトープに特異的なＴＣＲ構築物のＴＣＲα鎖構築物(ＴＲＡ)およびＴＣＲβ鎖構築物(ＴＲＢ)をコードする核酸を調製する方法を提供する。ＴＣＲ構築物はＴ細胞で発現され得て、それは、例えば、癌、ウイルス感染または自己免疫疾患などの養子Ｔ細胞療法に有用である。本発明はさらに、該ＴＣＲにより認識されるエピトープを同定するための方法を提供する。該ＴＣＲにより認識される免疫原性エピトープは、患者において抗原特異的Ｔ細胞免疫を誘導するためのワクチン製剤を開発するために使用され得る。本発明はさらに、本発明の方法により得られる２つのＴＣＲ構築物の対およびそれぞれの免疫原性エピトープを提供し、ここで、該エピトープは、ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)１６(アルファパピローマウイルス９とも称する)オンコプロテインＥ５およびヒトサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)タンパク質ｐｐ６５由来である。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞受容体遺伝子療法は、種々のウイルス−および癌−関連適応症を処置する有望な免疫療法戦略である。主たる障害の１つは、前臨床および臨床研究において分析されるべき強力なＴＣＲが利用可能でないことである。抗原特異的ＴＣＲを検出および単離するための現在の方法には技術的限界があり、特定のＭＨＣに拘束されるか、または抗原エピトープに関する事前の知識を必要とする。標的抗原の選択は、免疫療法の成功のために重要な別の因子である。腫瘍組織において特異的に発現されるが、正常組織では発現されない抗原の標的化は、特に重要である。
【０００３】
養子Ｔ細胞療法は、患者への再注入のための抗原特異的エフェクターＴ細胞を作製するためのＴ細胞のエクスビボ活性化および増殖に基づいている（１）。この方法は、新しい抗原受容体でＴ細胞の遺伝子改変を伴い得る。迅速なエクスビボ増殖プロトコールは、標的細胞を排除するために、腫瘍微小環境の免疫抑制バリアを破壊するための多数のＴ細胞の作製を可能にする。免疫抑制バリアを克服することは、ＡＰＣによる崩壊した（lysed）腫瘍細胞の取り込み、およびさらなる抗原の提示−エピトープ拡大（epitope spreading）と称されるプロセスをもたらし得る。これに、養子Ｔ細胞療法により誘導された、自己Ｔ細胞の新規(de novo)プライミングおよび抗腫瘍免疫応答を増幅する不応性（アネルギー）Ｔ細胞の再活性化が続き得る。遺伝的に改変されていないＴ細胞ならびに抗原受容体を操作されたＴ細胞を用いる養子Ｔ細胞療法は、他の処置に対して難治性の癌関連疾患およびウイルス関連疾患を処置するために有効に利用されている（２）。
【０００４】
患者にＴ細胞免疫を提供する第２の戦略は、ワクチンの適用である。ワクチンは、特定の病原体または癌に対する獲得免疫を提供し、多くのワクチンの市場への導入は、数多くの生命を脅かす疾患によって引き起こされる罹病率および死亡率の顕著な低下につながっている。新規予防および治療ワクチンの開発のためには、まず、抗原、エピトープおよびＭＨＣ拘束性要素を同定することが必要であり、それらは、かかる抗原を発現する病原性細胞からの防御およびその排除を提供し得るＴ細胞応答を誘導する。内因的にプロセッシングされ、病原性細胞によって提示され、そして抗原特異的ＴＣＲによって認識される、抗原エピトープの同定は、抗原特異的免疫を誘導する新規なワクチン製剤の開発を可能にする。
【０００５】
以下に、抗原特異的ＴＣＲの同定および単離のための本発明の方法ならびにＴ細胞応答を誘導する抗原エピトープを同定するための本発明の方法を概説する。
【０００６】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、インビトロ分析のためのＴ細胞の主要な供給源である。スクリーニングのために、多数のＴ細胞が、患者または健康なドナーの血液のＰＢＭＣから容易に単離され得る。これに対して、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）から単離されたＴ細胞は、腫瘍生検から限られた量で利用可能である。生検は、固形腫瘍からしか入手できない（３，４）。ＰＢＭＣまたはＴＩＬからのＴＣＲの直接配列分析により、ＴＣＲ配列に関する大量のデータが得られ得る。これらのデータセットからのＴＣＲ特異性および抗原認識の予測は不可能である（５）。Ｔ細胞サンプルから所望の特異性を有するＴＣＲを単離するためには、ＴＣＲ配列を分析する前に抗原特異的富化工程を行う必要がある。さらに、ＴＣＲ単離の前にＴ細胞の抗原特異性を確認するための機能アッセイを行うことが有用である（６）。Ｔ細胞を富化させるための標準的な方法は、抗原特異的なインビトロ刺激により、培養中の特定のＴ細胞を増殖させることに基づく。ＭＨＣ Ｉ分子に結合する抗原特異的Ｔ細胞のインビトロ刺激の１つの戦略は、複数のペプチドのＴ細胞培養物への添加である。培養中の細胞は、該ペプチドを互いに提示し、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が増殖する。しかしながら、多くの場合、非生理学的濃度で実施されるペプチド刺激は、ペプチド／ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）Ｉに高親和性のＴＣＲを保有するＴ細胞の過剰刺激および活性化によって誘導される細胞死をもたらし得る（７）。さらに、エピトープ配列、プロセッシング特性およびＭＨＣ Ｉ結合拘束性（restriction）の知識が必要である。さらに、ＰＢＭＣまたはＴＩＬサンプル内にペプチド特異的Ｔ細胞が存在することが必要である。したがって、前駆体頻度が低いペプチド特異的Ｔ細胞のスクリーニングは制限され、新規な免疫原性抗原−ＭＨＣ Ｉ組合せの同定を妨げる可能性がある。抗原特異性およびＭＨＣ拘束性についてのＴ細胞の機能試験は、通常、単一のＴ細胞クローンを用いて行われる。増殖および富化後、単一のＴ細胞クローンを十分量まで増殖させることができる。Ｔ細胞培養を適用する際に考慮しなければならない１つの因子は、結果として生じるＴ細胞に対する長期培養条件の影響である（８）。より分化した表現型（ＴｅｍおよびＴｅｆｆ）を有するＴ細胞の増殖能力は限定されており、インビトロでの増殖を制限する。長期間の培養は、インビボで既にｐＭＨＣ Ｉに遭遇し、ドナー中で増殖および分化を受けたＴ細胞クローンの強力なＴＣＲの喪失につながり得る。従って、長期間のＴ細胞培養には、高増殖能を有する未分化Ｔ細胞の増殖を促進するバイアスを導入してよい。
【０００７】
抗原特異的Ｔ細胞の検出および選別は、新規な抗原特異的ＴＣＲの単離のための重要な工程である。ｐＭＨＣに対する異なる特異性を有するＴＣＲの巨大なレパートリーは、既知のｐＭＨＣに特異的なＴ細胞を染色するための試薬としての可溶性ＭＨＣ多量体の開発をもたらした（９−１１）。多量体は、抗原特異的Ｔ細胞の選別に使用される。多量体は、所望のｐＭＨＣに特異的なＴ細胞の直接的染色を可能にする（１２，１３）。しかしながら、ＭＨＣ拘束性およびペプチド特異性の事前の知識が、サンプル内の抗原特異的Ｔ細胞をスクリーニングするために必要とされる。多量体の使用は、Ｔ細胞エピトープのインシリコ（in silico）予測に依存する可能性があり、従って、内因的に処理されず提示されないエピトープに特異的なＴＣＲを単離するリスクを有する。さらに、Ｔ細胞は、多量体に結合する能力に基づいて選択されるが、必ずしも細胞表面のｐＭＨＣ複合体に結合する能力に基づいて選択されるわけではない。多量体は、カスタムメイド試薬であり、異なるｐＭＨＣのスクリーニングセットには容易に利用できない。
【０００８】
１９９７年に、LemonnierおよびPeurarnauらのグループが、β−２ミクログロブリン（ｂ−２ｍ）に結合したヒトＨＬＡ−Ａ＊０２：０１分子（ＨＨＤ）の一本鎖構築物を安定に発現するトランスジェニックマウスの作製を報告した。さらに、マウスは、マウスＭＨＣ Ｉ遺伝子をノックアウトされていた。従って、免疫化の結果、ＨＨＤに排他的に拘束された（restricted）抗原特異的Ｔ細胞を生じる（１４）。ＨＬＡ−トランスジェニックマウスは、抗原特異的Ｔ細胞の新規な供給源を提供している（１５）。マウスの対応物と配列が類似していないヒト抗原およびエピトープは、マウスＴ細胞が胸腺では欠失しておらず、異種(外来)抗原としてヒト抗原を認識するため、ＨＬＡ−トランスジェニックマウスのワクチン接種に使用されて、非耐性レパートリーにおいて抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発することができる。ＨＬＡ−トランスジェニックマウスは、胸腺選択のためにヒトレパートリーにおいて欠失している、自己抗原または自己抗原と類似性の高い抗原（similar-to-self-antigen）を認識する高親和性ＴＣＲの供給源を提供する。技術的進歩がもたらされ、ＨＨＤマウスモデルに基づくとき、ヒトＴＣＲレパートリーを保有し、同時にマウスＴＣＲ遺伝子座がノックアウトされている、最初のトランスジェニックマウスが作製された（１６）。しかしながら、ＭＨＣ−トランスジェニックマウスおよび／またはＴＣＲ遺伝子座トランスジェニックマウスの使用について問題が出てくる可能性があり、例えば、マウスおよびヒトの胸腺選択が同じルールに従うか否かを予測することは困難である。トランスジェニックＭＨＣ分子は、一本鎖ＭＨＣに機能的に拘束されるが天然のＭＨＣ Ｉ複合体には拘束されないＴＣＲを選択するバイアスを導入し得る、人工一本鎖構築物である。単一のＭＨＣ−トランスジェニックマウスの免疫化は、自然免疫応答も、６つの同種のＭＨＣ：Ｉ複合体の選択ももたらさない。例えばＨＬＡ−Ａ＊０２：０１エピトープを含有しない抗原が存在する可能性が高い。さらに、ヒトＴＣＲ遺伝子座を有するマウスは、特定のｐＭＨＣ Ｉを標的とするために重要であり得る少ないＴＣＲ鎖を欠く（１６）。対照的に、マウスＴＣＲ遺伝子座を保有するマウスの免疫化は、結果としてマウスＴＣＲ配列の単離をもたらし、それは、ヒトに導入されると拒絶反応を誘導し得る（１７，１８）。重要な経済的要因は、コスト、法的規制、および人材に関して非常に資源消費型（resource-intensive）である、マウスモデルを扱うために必要なインフラストラクチャーである。
【０００９】
ＴＣＲ遺伝子療法の成功は、優れた特異性プロファイルを有する新規なＴＣＲの利用可能性に依存する。このため、本発明者らは、新規な抗原特異的ＴＣＲを同定および単離する方法、ならびにこれらのＴＣＲのエピトープ特異性およびＭＨＣ拘束性を定義するための新規な方法を提供する必要性に対処した。抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導する新規なワクチンの開発のためには、Ｔ細胞によって標的とされ得る新規な免疫原性エピトープを定義する必要がある。
【発明の概要】
【００１０】
この問題は、本発明により、特に、特許請求の範囲に記載の手段によって、解決される。
【００１１】
本発明は、ＭＨＣ上に提示された所定の抗原由来のエピトープに特異的なＴＣＲ構築物のＴＣＲα鎖構築物（ＴＲＡ）およびＴＣＲβ鎖構築物（ＴＲＢ）をコードする核酸を調製する方法であって、
（ａ）ドナーから単離されたＴ細胞を、該所定の抗原の複数のエピトープを提示するプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）で刺激して、抗原特異的なＴ細胞を富化すること；
（ｂ）該Ｔ細胞を細胞ライブラリーと接触させること、ここで、該ライブラリーが、ドナー中に存在する全てのＭＨＣ Ｉアレルを発現する細胞を含み、そして該ライブラリーの細胞が、該所定の抗原の複数のエピトープを提示する；
（ｃ）該接触により活性化されたＴ細胞を、好ましくは、該活性化されたＴ細胞により発現される活性マーカーに基づいて選択すること；および
（ｄ）該Ｔ細胞のＴＣＲのＴＣＲαおよびＴＣＲβをコードする核酸を単離すること
を含む方法を提供する。
【００１２】
本明細書中、“ａ”は、排他的に“１”を意味するのではなく、“２またはそれ以上”も包含する。例えば、本発明の方法は、ＴＣＲ構築物のＴＲＡおよびＴＲＢをコードする１以上の、例えば２つの別個の核酸を調製するのに使用できる。
【００１３】
本明細書で用いる通り、所定の抗原に“特異的に結合することができる”または所定の抗原を“認識する”または所定の抗原に“特異的である”という用語は、ＴＣＲ構築物が、好ましくは高親和性で、前記エピトープに特異的に結合し、それを免疫学的に認識できることを意味する。親和性は、当業者によく知られている方法によって、例えばＢｉａＣｏｒｅによって分析することができる。
【００１４】
本発明の利点の１つは、特定のＭＨＣアレル上に提示される抗原由来の免疫原性エピトープが知られている必要はないということである。本発明の方法では、抗原に対するＴ細胞応答を分析することが可能であり、ここで、エピトープは自然にプロセッシングされ、それぞれ可能性のあるＭＨＣを介して提示され得る。従って、本発明の方法は、エピトープの事前の知識なしに、所定の抗原に特異的なＴＣＲを同定するために使用することができる。所定の抗原は、工程ａの抗原提示細胞と工程ｂのライブラリーの両方が、該抗原のエピトープを提示する場合には、複数の抗原の、例えば、特定のウイルスの複数の抗原の１つ、または特定のウイルスの全ての抗原であり得る。
【００１５】
さらなる利点は、本発明の方法が、免疫優性（immunodominant）ペプチドエピトープに特異的なＴＣＲを同定し、該ペプチドエピトープの提供を可能にすることである。特定のペプチド−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）の組合せは、同じ抗原に由来する他のｐＭＨＣ組合せを超える優勢なＴ細胞応答を誘発することが観察されており、これは、両組合せが高い結合親和性を有すると予測されていても観察される。さらに、この方法は、スクリーニングされたＰＢＭＣの数が大幅に増加した場合、亜優性（subdominant）エピトープを標的とするＴＣＲの単離も可能にし得る。
【００１６】
ヒトの治療が最も重要であるように、前記方法がヒト系で実施されること、すなわち、ドナーがヒトであり、従って、ヒトＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩ、特にＭＨＣ Ｉ分子、ならびにＡＰＣが使用されることが好ましい。ヒトＭＨＣ分子（１４，１５）またはヒトＴ細胞受容体を発現するマウスＴ細胞（１６）に制限されているマウスドナー由来のＴ細胞を使用することももちろん可能である。あるいは、他の、例えば、完全なマウス、ラット、ヤギ、ウサギ、モルモット系を、それら由来のＴＣＲの提供が望まれる場合に、使用することもできる。
【００１７】
好ましくは、工程ａで刺激されたＴ細胞はＰＢＭＣの形態であり、すなわち、他の単核細胞から単離されたものではない。このことは、より自然な環境を提供し、さらなる精製工程の必要性を排除するために、有益であり得る。ドナーから単離されたＴＩＬを使用することもできる。あるいは、精製Ｔ細胞、または精製ＣＤ４＋、または好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を使用してもよい。
【００１８】
プロフェッショナルＡＰＣは、好ましくは自己由来のＡＰＣであり、すなわち、それらは、ＰＢＭＣと同じドナーから単離される。しかしながら、それらは、少なくとも１つのＭＨＣアレル、好ましくは、全てのＭＨＣ ＩまたはＩＩ（好ましくは、ＭＨＣ Ｉ）アレルをドナーと共有する限り、異種ＡＰＣであってもよい。最も好ましくは、プロフェッショナルＡＰＣは樹状細胞であり、特に成熟樹状細胞である。プロフェッショナルＡＰＣは、抗原の内因性プロセッシング後にＭＨＣ上に所定の抗原の複数のエピトープを提示する。抗原は、好ましくは、ＡＰＣによる内因性プロセッシングおよび提示を可能にするために、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質またはポリペプチドとしてプロフェッショナルＡＰＣの内部に提供される。従って、エピトープの事前知識は必要とされない。例えば、トランスフェクション後の安定発現または一過性発現が可能である。
【００１９】
工程ａにおけるＴ細胞の刺激は、７〜４２日間、最も好ましくは１４〜２８日間行われる。プロフェッショナルＡＰＣに対するＰＢＭＣの比は、好ましくは、約５：１〜２０：１、最も好ましくは、約１０：１である。Ｔ細胞は、Ｔ細胞増殖に都合のよいサイトカインを含む、好ましくは、特定の培養設定において抗原非特異的Ｔ細胞増殖を防止するために、低濃度のＩＬ−２（例えば、１５−２５Ｕ／ｍｌ、好ましくは約２０Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−７（例えば、２．５−７．５Ｕ／ｍｌ、好ましくは約５Ｕ／ｍｌ）またはＩＬ−１５を含む、培地中で刺激される。増殖中のＰＢＭＣは、約１：２〜３：４の比で分裂することができる。内因性プロセッシング後に抗原のエピトープを提示するプロフェッショナルＡＰＣでの第二の刺激が可能である。
【００２０】
工程ａにおいて抗原特異的Ｔ細胞が富化された細胞を、工程ｂにおいて細胞ライブラリーとさらに接触させ、ここで各細胞は、単一のＭＨＣアレルを発現し、該ライブラリーは、ドナー中に存在する全てのＭＨＣ ＩまたはＩＩアレルを発現する細胞を含み、そして該ライブラリーの細胞は、該所定の抗原の複数のエピトープを提示する。
【００２１】
本発明を通して、ＭＨＣ ＩがＭＨＣ Ｉであることが好ましい。ＭＨＣ Ｉを発現するこれらの細胞によって刺激されたＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞であり、一般的には、細胞内タンパク質由来のエピトープが提示され得る。
【００２２】
好ましい態様において、ライブラリーは、それぞれ１つのＭＨＣ Ｉアレルを安定に発現するＫ５６２細胞からなる。例示的なＫ５６２ライブラリーは、以下に記載されるか、またはＺｅｎｇらの文献（１９）に記載されている。該ライブラリーの細胞は、ヒトまたは非ヒトＡＰＣ、例えば、リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）もしくはＮＩＨ／３Ｔ３細胞を含む、Ｋ５６２細胞以外の起源のものであり得る。
【００２３】
本明細書で用いるＭＨＣ細胞ライブラリーは、単一のヒトＭＨＣ Ｉアレル（ＨＬＡ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃ）でのヒトＫ５６２細胞株の安定した形質導入によって作製された（２０，２１）。Ｋ５６２細胞は、ヒト赤白血病細胞起源であり、内在性ＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩアレルの発現を欠く細胞である（２２）。しかしながら、それらは、β−２ミクログロブリンを発現し、それらは、ＭＨＣ Ｉα鎖のトランスジェニック発現により、完全に機能する抗原プロセッシングおよび提示機能を有する（１９，２３，２４）。Ｋ５６２細胞は、有効な免疫シナプスを形成するのに必要なＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３を発現する（２４）。さらに、例えば、レトロウイルス形質導入により単一のＭＨＣ Ｉアレルを安定に発現させること、および例えばインビトロ転写（ｉｖｔ）ＲＮＡによるトランスフェクションにより抗原配列を導入することにより、これらの細胞を遺伝子的に改変することが可能であった。
【００２４】
従って、一態様において、本発明はまた、Ｋ５６２に基づくＭＨＣ細胞ライブラリーもまた提供し、その細胞は、本発明の方法によって使用され得る。該ライブラリーは、Ｋ５６２細胞を含む、各細胞は、以下のＭＨＣ Ｉアレルの１つを発現する：
【００２５】
【表１】
2018509911.tif 000003
【００２６】
人工ＡＰＣスキャホールドとしてのＫ５６２細胞の使用は、いくつかの利点を有する。ＬＣＬと比べて、Ｋ５６２細胞は、ヘルペスウイルス様ＥＢＶ由来のウイルス配列を欠く（２５，２６）。これは、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞を天然に含み得るバルクＴ細胞サンプルの分析中のＥＢＶ特異的Ｔ細胞活性化を避けるためにＫ５６２ベースのＡＰＣシステムの重要な特徴である。無細胞人工ＡＰＣと比べて、細胞性ＡＰＣシステムにおいて、ｐＭＨＣ提示は、ＴＣＲ結合について最も天然環境に似ている、無傷の細胞膜の細胞表面で生理的レベルで起こる。１つのＭＨＣの優勢発現は、ＴＣＲの自己認識を最小にする。ＭＨＣを形質導入したＫ５６２のその細胞表面にｐＭＨＣを提示する能力は、親Ｋ５６２における抗原プロセッシングが、一般的な欠失ではなく、内因性ＭＨＣ遺伝子座のサイレンシングに起因することを示す。Ｋ５６２細胞は、一般的な腫瘍細胞による抗原プロセッシングに似ている、免疫プロテアソームを発現するＤＣと比較して構成的にプロテアソームを発現する（２７）。標的抗原の不存在下でＫ５６２細胞と共培養したＴＣＲを形質導入したＴ細胞は、Ｔ細胞の非特異的活性化を最小化するバックグラウンドＩＦＮγ放出およびＣＤ１３７上方制御を示さなかった。
【００２７】
上記のＫ５６２細胞の属性は、それらをエピトープ特異性およびＭＨＣ拘束性の事前の知識なしにＴＣＲの分析の標的としてＭＨＣ細胞ライブラリーを確立するために好ましい細胞の人工ＡＰＣシステムとした。原則として、標的抗原は、Ｋ５６２細胞で発現され得て、それらには、病原体由来の抗原ならびに腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、癌精巣抗原（ＣＴＡ）および癌細胞系（lineage）抗原が含まれる。癌免疫療法では、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）は、ウイルスエピトープまたは突然変異由来エピトープに特異的なＴＣＲを同定するのに特に重要である。
【００２８】
LatoucheおよびSadelainは、単一のヒトＭＨＣアレルを安定に発現する（２８）、プレート接着性のマウス線維芽細胞であるＮＩＨ／３Ｔ３細胞を使用し、それにより、ヒトＭＨＣ複合体との関連においてエピトープの内因的提示を達成した。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞は、移植後養子Ｔ細胞療法での使用のためにＣＭＶ特異的Ｔ細胞株を増殖させるのに成功裏に使用されており（２９）、本明細書の文脈中、代替ライブラリーとして使用することができる。
【００２９】
あるいは、ＭＨＣはＭＨＣ ＩＩであり得る。その場合、細胞ライブラリーは、好ましくは、それぞれ１つのＭＨＣ ＩＩアレルを用いてトランスフェクトされたＫ５６２細胞などのＭＨＣ ＩＩ発現細胞を含む。例示的なライブラリーは、Ｂｕｔｌｅｒらにより記載されている（３０）。あるいは、エタンメチルスルホネート（ＥＭＳ）を用いたランダム突然変異誘発の後にＭＨＣ ＩＩ遺伝子座をノックアウトすることにより作製された、ヒトＲＭ３（Ｒａｊｉ）Ｂ細胞に基づく、単一のＭＨＣ ＩＩを発現する細胞ライブラリーを用いることができる（３１）。これらの細胞により刺激されるＴ細胞は、ＣＤ４＋であり、一般的に、分泌タンパク質、異なるＴ細胞コンパートメントのタンパク質、膜タンパク質または交差提示タンパク質からのエピトープが提示される。
【００３０】
該ライブラリーの細胞、特にＫ５６２細胞は、該細胞が、Ｔ細胞サブセットの最適な接触に合わせることができるように、共刺激分子、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＩＣＯＳＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ１３７Ｌおよび／またはＣＤ２５２をさらに発現することができる。共刺激分子のセットは、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ１３７Ｌ、またはＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ６４（３０）、またはＣＤ８０、ＣＤ７０およびＣＤ１３７Ｌであり得る（１９）。これは、抗原特異的ＩＦＮγ放出およびＣＤ１３７発現を明確に検出するためにＴ細胞応答を増幅させ、親和性に関してより広範なＴＣＲの検出をもたらし得る。しかしながら、高親和性ＴＣＲを単離するために、ライブラリーの細胞、特にＫ５６２細胞が、さらなる共刺激分子を発現しない場合が好ましい。さらに、ライブラリーの細胞、特にＫ５６２細胞は、抗原プロセッシングおよび提示を増強する分子、例えばＨＬＡ−ＤＭおよびＣＤ７４を発現し得る。
【００３１】
ライブラリーの細胞は、内因性プロセッシング後にそれらのＭＨＣ分子上に所定の抗原の複数のエピトープを提示する。好ましくは、それらは、例えば、抗原をコードするｉｖｔＲＮＡを用いるトランスフェクション後に、完全長の抗原を安定に発現する。一時的な発現もまた使用できる。従って、エピトープの事前知識は必要とされない。
【００３２】
該ライブラリーとＴ細胞との接触は、１２〜３６時間、好ましくは、１８〜２２時間、または約２０時間行われ、Ｔ細胞サンプル内の抗原特異的Ｔ細胞の最適な活性化を達成する。好ましくは、接触の間、Ｔ細胞の非特異的活性化を防ぐために、サイトカインの添加が避けられる。
【００３３】
ライブラリーの細胞によって提示されるエピトープに特異的なＴＣＲを有するそれらのＴ細胞は、活性化される。従って、Ｔ細胞エピトープおよびＭＨＣ拘束性エレメントの事前知識が必要とされることなく、活性化マーカーに基づいてそれらを選択することができる（工程ｃ）。Ｔ細胞は、標的細胞上に同族のｐＭＨＣ複合体を有するＴＣＲの組み込みにより活性化マーカーを上方制御する。共刺激シグナルを含むＴＣＲシグナル伝達は、抗原特異的Ｔ細胞を、例えば、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳにより検出および単離するためのマーカーとして使用できる、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１０７、ＣＤ１３７および／またはＣＤ１５４のような活性化分子の短期間の発現を誘導する（３２）。ＣＤ１３７は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離のための特異的マーカーであることが示された（３３，３４）。例えばＦＡＣＳよるＣＤ１３７発現に基づく分類は、特定のＴ細胞の選択のための好ましい方法である。一態様において、これを、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはＦＡＣＳによるＩＦＮγのサイトカイン捕捉によって、ＩＦＮγ放出の測定と組み合わせる。ＩＦＮγ放出の、例えばＥＬＩＳＡによる測定は、Ｔ細胞サンプルの機能的活性を評価する標準的な方法である。
【００３４】
サイトカイン捕捉アッセイは、ｐＭＨＣ特異性の事前知識なしに機能的に活性なＴ細胞を検出および単離するための代替ツールを提供する（３５，３６）。同族の(cognate)ｐＭＨＣ Ｉを介して活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＦＮγおよびＴＮＦαなどのサイトカインを含む小胞を放出する。サイトカイン分泌による個々のＴ細胞の検出および単離は、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳ分析と組み合わせたサイトカイン捕捉アッセイの開発によって促進されている（３６，３７）。サイトカイン捕捉アッセイは、ＴＣＲシグナル伝達によって活性化されたＴ細胞の選別のためのＴ細胞活性化マーカーの魅力的な代替法を提供する。
【００３５】
活性化Ｔ細胞の選択後、該Ｔ細胞のＴ細胞受容体のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をコードする核酸を直接単離する。例えば、ＲＮＡを単離して、ＴＣＲα遺伝子およびＴＣＲβ遺伝子のｃＤＮＡ末端の５’高速増幅（ＲＡＣＥ）、その後のＰＣＲ増幅により、ｃＤＮＡを作製することができる。ＰＣＲ産物を発現プラスミド内にクローニングして、細菌を形質転換することができる。各細菌コロニーは、１つのＰＣＲ  ＴＣＲαまたはＴＣＲβ遺伝子フラグメントを有する1つの配列決定ベクターを含むと見なすことができる。多数の細菌コロニーのベクターＤＮＡを調製し、次いでベクター挿入（ＴＣＲαまたはＴＣＲβ遺伝子フラグメント）を配列決定することができる。各細菌コロニーの配列決定結果を、例えば、ＩＭＧＴ／Ｖ−Ｑｕｅｓｔを用いて分析することができる。同一のＴＣＲα鎖またはＴＣＲβ鎖の頻度は、選別されたＴ細胞サンプル内の同一のＴ細胞クローンタイプの割合を反映する。選別されたＴ細胞のＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子配列を分析するための別の戦略は、次世代配列決定法の使用である。例えば、配列決定されるベクターに連結されたＴＣＲα遺伝子およびＴＣＲβ遺伝子のＰＣＲ産物は、細菌中に形質転換され、選択培地を含むフラスコ中で増殖され、その後、ベクターＤＮＡが調製される。ベクターＤＮＡ調製物は、次世代配列決定分析に直接使用することができる。同一のＴＣＲαまたはＴＣＲβ遺伝子を含むベクターの頻度は、選別されたＴ細胞のサンプル内の同じクローンタイプのＴ細胞の初期量を代表するものとみなされる。Ｔ細胞サンプル内のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の頻度の一致は、機能的ＴＣＲ、例えば、抗原−ＭＨＣ特異的ＩＦＮγ放出およびＣＤ１３７上方制御を説明したＴＣＲの対形成を分析するために使用できる（３８）。これらの方法の感度は、Ｔ細胞サンプル内のＴＣＲレパートリーの詳細な分析を可能にする。ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の頻度を一致させることにより、さらに、Ｔ細胞サンプルからの豊富なＴＣＲ鎖対の再構成が可能となり、従って、資源消費型のＴ細胞クローン培養が不要となる。培養でＴ細胞クローンを増殖するためには長期間の培養が必要であり、ナイーブ表現型またはセントラルメモリー表現型を有するＴ細胞の増殖を優先するだけであり、従って、インビトロでの増殖能力が限られているＴ細胞は分析から除外される。従って、ＴＣＲレパートリーの分析のために、わずか１４〜２８日の抗原特異的濃縮の後に抗原−ＭＨＣ特異的Ｔ細胞応答をスクリーニングし、分類することが有利である。
【００３６】
従って、好ましくは、Ｔ細胞の選択された集団のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をコードする核酸の分析後に、２以上のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖が同定されるとき、該集団内のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の頻度を分析し、該エピトープを認識することができるＴＣＲを構成するＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖を、それらの頻度に基づいて一致させる。
【００３７】
あるいは、例えば、種々の優勢な（predominant）ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の組合せを担持するＴ細胞の作製、および工程ｂで使用されるライブラリーの細胞によるそれらの活性化の分析など、さらなる分析を行うことができる。
【００３８】
ＴＣＲα鎖およびβ鎖は、本発明のＴＣＲα鎖構築物（ＴＲＡ）およびＴＣＲβ鎖構築物（ＴＲＢ）をもたらすように改変され得る。場合により、ＴＲＡおよびＴＲＢのコドン使用は、組み換えＴ細胞におけるＴＣＲの発現を増強するように最適化され得る。さらに、ヒト可変領域を、マウス定常領域（３９）、または最小マウス定常領域、すなわち、マウス定常領域（４０）由来の所定のアミノ酸のみを含み、そしてさらなるシステイン架橋（４１，４２）をさらに含むヒト定常領域と結合させることができ、それは、トランスジェニックＴＣＲ鎖の互いの選択的結合を増加させ、レシピエントＴ細胞によって発現される内因性ＴＣＲ鎖との対形成を減少させる。
【００３９】
発現のさらなる最適化が、内在性ＴＣＲ鎖と導入された鎖との対合を回避し、機能的活性を増強するために、例えばＴＲＡおよびＴＲＢの可変領域を有する一本鎖ＴＣＲ構築物を作製することにより可能となる。さらに、可溶性受容体分子および融合タンパク質は、ＴＲＡおよびＴＲＢ鎖遺伝子の可変領域、例えば抗体ドメインを含んで作製されていてよい。
【００４０】
ＭＨＣ上に提示される所定の抗原由来のエピトープに特異的なＴ細胞は、ＴＲＡおよびＴＲＢをコードする核酸を発現することにより作製され得る。そのようなＴ細胞が患者の処置のためのものであるとき、自己Ｔ細胞を使用することが好ましい。あるいは、免疫抑制を用いて、同種異系の設定が可能である。
【００４１】
好適なＴＣＲ構築物でトランスフェクトされたＴ細胞の、特定のＭＨＣアレルを発現するライブラリーの細胞を用いる活性化の分析は、ＴＣＲのＭＨＣ拘束性を分析するために容易に使用され得る。
【００４２】
本発明はさらに、上記の本発明の工程ａ〜ｄを実行し、該選択されたＴ細胞またはＴＣＲ構築物を構成するＴＲＡおよびＴＲＢをコードする核酸を用いて修飾されたＴ細胞を活性化することができるエピトープを同定することを含む、ＭＨＣにより提示され得る所定の抗原のエピトープを同定する方法を提供する。エピトープマッピング戦略は当技術分野で公知である。例えば、関連のあるＭＨＣアレルを発現するライブラリーの細胞は、関連する抗原のセクションを包含するミニ遺伝子でトランスフェクトされ得て、応答、例えば、ＩＦＮγ分泌が、エピトープを含むセクションを見出すために分析される。外部ペプチドによるペプチドパルスもまた、有用であり得る。エピトープ予測は、そのような戦略の一部として使用され得るが、以下に記載の実験に示す通り、ＴＣＲ特異性が、必ずしもエピトープ予測アルゴリズムからの予測データと一致するとは限らないことに留意することが重要である。
【００４３】
さらに、抗原特異的Ｔ細胞応答を説明する抗原特異的ＴＣＲの単離によって実証される、この応答を誘導することが同定されたエピトープは、エピトープ配列を含むワクチン製剤を開発するために使用され得る。本発明に記載の方法は、内因性に処理され、所定の抗原を発現する細胞により提示される、ＭＨＣ上のエピトープの認識を確実にする。エピトープ含有ワクチンの適用は、所定の抗原を天然に発現する細胞を排除するT細胞免疫能を患者に提供し得る。
【００４４】
まとめると、本発明の方法は、例えば養子Ｔ細胞療法に使用され得る、ＴＣＲ構築物を提供する従来の方法に対していくつかの利点を有する。例えば、所定のドナーの全ての同種のＭＨＣ Ｉ拘束性要素を含むなどのＴ細胞の全レパートリーがカバーされる。この方法はまた、所望の抗原特異性を有するＴ細胞の検出を可能にするが、エピトープの事前の知識を必要としない。これは、選択されたエピトープの事前決定なしに、内因性に処理され提示されたエピトープの認識に基づく。１つの抗原由来の異なるエピトープは、免疫優性として定義された発現階層を有する。本発明の方法によって同定されたＴＣＲ構築物は、６つのＭＨＣ Ｉアレルのうち１つで最も効率的に提示される、標的抗原内の免疫優性エピトープを認識する。この方法はまた、同じ抗原由来の亜優性（subdominant）なエピトープを認識するＴ細胞の同定を可能にする。最後に、この方法は、同じ抗原を認識する異なるＴ細胞クローン型の並行検出を可能にする。
【００４５】
本発明はまた、本発明の方法および／または以下に記載される方法により得られる、新規なＴＣＲ構築物ならびにこれらのＴＣＲ構築物により認識されるエピトープ、ならびにこれらのＴＣＲ構築物またはそれらのそれぞれのＴＲＡフラグメントおよびＴＲＢフラグメント、例えばＴＲＡもしくはＴＲＢの可変フラグメントもしくはＣＤＲ３領域、をコードする核酸、例えば発現ベクターなどのベクター、または該核酸を発現するトランスジェニックＴ細胞を提供する。
【００４６】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染は、子宮頸癌、肛門癌および頭頸部扁平細胞癌の発症の主な原因である（４３，４４）。発癌性ＨＰＶタイプは、世界中で約６１０，０００の癌症例を占める。
【００４７】
最も一般的な発癌性タイプは、子宮頸癌の５０％以上の症例を占めるＨＰＶ１６である。ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７は、形質転換能を有しており、発癌遺伝子とみなされている（４５，４６）。ＨＰＶ１６  Ｅ５は、インビトロで線維芽細胞を形質転換する能力を有するため、発癌能を有することが示されている（４７，４８）。さらに、浸潤性子宮頸癌の生検においてＥ５が発現されることが見いだされ、このことは、悪性角化細胞の形質転換された表現型の発現開始（initiating）および維持におけるＥ５の重要な役割を示唆している（４９−５１）。
【００４８】
医学的スクリーニングおよび医療介入を併用した予防的ワクチン接種プログラムは、次世紀に亘っていくつかの国でＨＰＶ関連罹病率を低下させ得るが、ＨＰＶは、未だに、子宮頸癌および他のＨＰＶに起因する癌の治療的処置が必要とされる重要な世界的健康問題である。
【００４９】
ＨＰＶ関連悪性腫瘍の治療的処置の試みは、多くの試験で報告されている。しかしながら、完全なＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７配列をカバーする合成長鎖ペプチドを適用する１つの第Ｉ／ＩＩ相治験のみが、患者の５０％以上において高悪性度の外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）の退縮を経験したという患者データを示した。この応答は、ＨＰＶ特異的Ｔ細胞応答に関連していた（５２）。それにも関わらず、ＣＩＮ病変および子宮頸癌を標的とする同様の結果は得られておらず、ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７を標的とする治療的ワクチン接種の現在の試みが、ＨＰＶの免疫逃避機構を克服しないことが示唆されている（５２，５３）。さらに、ＨＰＶにより誘発される悪性腫瘍の免疫療法の有効性の確認を可能にする、Ｅ６およびＥ７を標的とする強力なＴＣＲは存在しない。
【００５０】
ＨＰＶにより誘導される癌を処置するためにさらなる治療戦略が探索されるにつれて、本発明者らの努力は、上記の方法を用いた、ＨＰＶ由来の抗原に対する抗原特異的ＴＣＲの単離およびこれらの抗原からの免疫原性エピトープの同定に集中した。ＨＰＶ１６  Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７およびＬ１を、抗原として使用した。
【００５１】
ヒトヘルペスウイルス５（ＨＨＶ−５）とも称されるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、ヘルペスウイルスファミリーのメンバーである。ＣＭＶ感染は、ＣＭＶ血清陽性個体において非常に高い前駆体頻度で起こる、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞によって制御されるため、他のヘルペスウイルス感染に似ている（５４）。ＣＭＶ感染は、通常、免疫応答性の個体では無症候であり、集団の９０％までで生涯に亘って潜伏期間のまま持続する。ＣＭＶ疾患は、出生後または造血幹細胞移植もしくは固形臓器移植の後に免疫不全を起こした個体において発症し得て、米国において年間５６０名の死亡を含む合計５，６００症例の重篤な疾患を引き起こすことがある（５４）。ＣＭＶは、その感染は細胞の形質転換を引き起こさないため非発がん性であると広く考えられているが、悪性細胞に感染する可能性がある。最近の研究では、ＣＭＶと膠芽腫とが関連を有し、ＣＭＶが非発癌性ウイルスであることは疑問視されている（５５−５８）。これに照らして、本発明者らは、ＣＭＶ抗原に特異的なＴＣＲもまた調査することを決定した。
【００５２】
ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１と組み合わせたＨＰＶ１６  Ｅ５に対する強力なＴ細胞応答が、ＭＨＣ細胞ライブラリーの抗原発現Ｋ５６２細胞によるスクリーニングで観察された。加えて、ＣＭＶ  ｐｐ６５特異的Ｔ細胞応答が、ＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２よりも強く観察された。１つの抗原−ＭＨＣの組合せに応答するＴ細胞サンプルを直接選別し、ＴＣＲ遺伝子配列を分析した。サンプル中の優勢なＴＣＲ遺伝子をレトロウイルス発現ベクターにクローニングし、異なるＴＣＲα鎖およびβ鎖の組合せをＰＢＭＣに形質導入することにより試験を評価した。機能的ＨＰＶ１６  Ｅ５特異的ＴＣＲおよび機能的ＣＭＶ  ｐｐ６５特異的ＴＣＲは再構成され得て、それぞれＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１およびＢ＊０７：０２上に提示される内因性に処理されたエピトープを認識した。
【００５３】
従って、特に、本発明は、ＨＰＶ感染、特にＨＰＶにより誘発される悪性腫瘍を処置するために、例えば、ＴＣＲ遺伝子療法に使用され得る、ＨＰＶ  Ｅ５特異的ＴＣＲ構築物を提供する。本発明は、ヒトＭＨＣ Ｉと複合体を形成しているヒトパピローマウイルス１６オンコプロテインＥ５のエピトープに特異的なＴＣＲ構築物のＴＲＡおよび／またはＴＲＢをコードする核酸を提供する。核酸は、入手可能であるか、または本明細書に記載の本発明の方法により得られ得る。
【００５４】
本発明者らは、ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１と複合体を形成しているヒトパピローマウイルス１６オンコプロテインＥ５のエピトープであって、好ましくは配列番号１を含むエピトープに特異的なＴＣＲ構築物を提供する。ＴＣＲ構築物はまた、好ましくは、該エピトープのＮ末端の長いバージョン、例えば、配列番号１、４５、４７、４９、５１、５２および５７からなり得るものを認識する。本発明者らは、これらのペプチドが、内因性に処理され、ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１上に提示され得て、従ってＴＣＲ認識の標的となり得ることを初めて示した。ＴＣＲ遺伝子療法に加えて、配列番号１、４５、４７、４９、５１、５２および５７のペプチドを含むワクチンは、ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１陽性患者においてＴ細胞免疫を提供する第二の戦略であり得る。ドイツ人集団の約１２％が、少なくとも１つのＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１アレルを有している。中国、韓国および日本の集団調査では、Ｂ＊１５：０１アレル頻度がさらに高いことが判明している（５９）。
【００５５】
ＴＣＲまたはＴＣＲ構築物の特異性は、主にＴＣＲのＣＤＲ３領域によって定義される。ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１上に提示されるＥ５エピトープに特異的な本発明のＴＣＲ構築物は、配列番号２のＣＤＲ３またはそれと少なくとも８４％、好ましくは少なくとも９２％の配列同一性を有するＣＤＲ３、すなわち１つまたはそれ以上の置換、挿入または欠失を含み得るＣＤＲ３を含むＴＲＡを含む。変異が存在する場合、保存的置換が好ましい。配列番号２は、本発明のＴＲＡのＣＤＲ３の好ましい配列である。一態様において、ＴＲＡは、配列番号２のＣＤＲ３、配列番号６４のＣＤＲ１および配列番号６５のＣＤＲ２を含む。
【００５６】
ＴＲＡの可変領域は、好ましくは、配列番号３を含むか、または配列番号３に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有し、ここで、好ましくは、該可変領域は配列番号２を含む。該可変領域は、配列番号６０の核酸によりコードされ得る。ＴＲＡの定常領域は、好ましくは、配列番号４に対して少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の配列同一性を有するか、または配列番号４からなり、ここで、該定常領域は、好ましくは、トランスジェニックＴＣＲ鎖の対形成を増強するための、マウス定常領域または最小マウス定常領域である。あるいは、該定常領域はまた、ヒトのものであってよく、これは、レシピエントの免疫細胞による免疫認識のリスクを最小化する。
【００５７】
本発明のＨＰＶ  Ｅ５エピトープに特異的なＴＣＲ構築物のＴＲＡをコードする好ましいコドン最適化核酸は、配列番号５である。
【００５８】
ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１上に提示されるＥ５エピトープに特異的な本発明のＴＣＲ構築物は、配列番号６のＣＤＲ３またはそれと少なくとも８４％、好ましくは９２％の配列同一性を有するＣＤＲ３、すなわち１つまたはそれ以上の置換、挿入または欠失を含み得るＣＤＲ３を含むＴＲＢを含む。保存的置換が好ましい。配列番号６は、本発明のＴＲＢのＣＤＲ３の好ましい配列である。一態様において、ＴＲＢは、配列番号６のＣＤＲ３、配列番号６６のＣＤＲ１および配列番号６７のＣＤＲ２を含む。
【００５９】
ＴＲＢの可変領域は、好ましくは、配列番号７を含むか、または配列番号７に対して少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有し、ここで、好ましくは、該可変領域は、配列番号６を含む。該可変猟奇は、配列番号６１の核酸によりコードされ得る。ＴＲＢの定常領域は、好ましくは、配列番号８に対して少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の配列同一性を有するか、または配列番号８からなり、ここで、該定常領域は、好ましくは、トランスジェニックＴＣＲ鎖の対形成を増強するための、マウス定常領域または最小マウス定常領域である。あるいは、該定常領域はまた、ヒトのものであってよく、これは、レシピエントの免疫細胞による免疫認識のリスクを最小化する。ＴＲＢをコードする好ましいコドン最適化核酸は、配列番号９である。
【００６０】
本発明はまた、例えばＨＰＶ感染、特にＨＰＶにより誘発される悪性腫瘍の処置を目的とするＴＣＲ遺伝子療法のための、例えば、配列番号４０に記載の核酸配列を含む、好適な発現カセットにおけるＨＰＶ  Ｅ５エピトープに特異的なＴＲＡおよびＴＲＢの両方をコードする核酸を提供する。
【００６１】
本発明の方法により提供される配列に基づき、ＴＣＲ配列の親和性成熟を行うことが可能である（６０，６１）。ＣＤＲ３配列中のアミノ酸置換をもたらす非同義的ヌクレオチド置換は、標的抗原に対するＴＣＲの親和性の増強をもたらし得る。さらに、可変ＴＲＡおよびＴＲＢ領域の他の部分におけるＴＣＲ配列の変化は、ｐＭＨＣ複合体へのＴＣＲ構築物の親和性を変化させる、好ましくは増加させ得る。提供される特定の配列から変化するＴＣＲ構築物は、提供される標的抗原に対して排他的な特異性を保持することが好ましい。従って、本発明のＴＣＲ構築物を発現するＴ細胞の養子移入は健康な組織に顕著な負の作用を有しないことが好ましい。
【００６２】
本発明はさらに、例えば、ＣＭＶ感染またはＣＭＶ誘発性悪性腫瘍の処置を目的とするＴＣＲ遺伝子療法のために使用され得る、ＣＭＶ  ｐｐ６５特異的ＴＣＲ構築物を提供する。本発明は、ヒトＭＨＣ Ｉと複合体を形成しているヒトＣＭＶタンパク質ｐｐ６５のエピトープに特異的なＴＣＲ構築物のＴＲＡおよび／またはＴＲＢをコードする核酸を提供する。核酸は、入手可能であるか、または本明細書に記載の本発明の方法により得られ得る。
【００６３】
本発明者らは、好ましくは配列番号１０を含むか、またはそれからなる、ＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２と複合体を形成しているヒトＣＭＶタンパク質ｐｐ６５のエピトープに特異的なＴＣＲ構築物を提供する。ＣＭＶ  ｐｐ６５特異的ＴＣＲは、ＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２に制限される。ＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２は、最も頻度の高いＨＬＡ−Ｂアレルの１つであり、ドイツ人集団の約２３％に見出される（５９）。Ｔ細胞によるエピトープ認識は、ＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２陽性患者においてＴ細胞免疫を誘導するＣＭＶワクチンの開発の基礎となり得る。
【００６４】
このエピトープ／ＭＨＣ複合体に特異的な本発明のＴＣＲ構築物は、配列番号１１のＣＤＲ３を含むＴＲＡを含み、従って、それは本発明のＴＲＡの好ましいＣＤＲ３である。一態様において、ＴＲＡは、配列番号１１のＣＤＲ３、配列番号６８のＣＤＲ１および配列番号６９のＣＤＲ２を含む。ＴＲＡの可変領域は、好ましくは、配列番号１２のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有し、ここで、該可変領域は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。ＴＲＡの可変領域は、配列番号６２に記載の核酸によりコードされ得る。ＴＲＡの定常領域は、好ましくは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ここで、該定常領域は、トランスジェニックＴＣＲ鎖の対形成を増強するためのマウス定常領域または最小マウス定常領域である。あるいは、該定常領域は、免疫認識のリスクを最小にする、ヒトのものであってよい。本発明のＣＭＶ  ｐｐ６５エピトープに特異的なＴＣＲのＴＲＡ鎖をコードする好ましいコドン最適化核酸は、配列番号１４に記載の核酸である。
【００６５】
このエピトープ／ＭＨＣ複合体に特異的な本発明のＴＣＲ構築物は、配列番号１５のＣＤＲ３を含むＴＲＢを含み、従って、それは、本発明のＴＲＢの好ましいＣＤＲ３である。一態様において、ＴＲＢは、配列番号１５のＣＤＲ３、配列番号７０のＣＤＲ１および配列番号７１のＣＤＲ２を含む。ＴＲＢの可変領域は、好ましくは、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有し、ここで、該可変領域は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。ＴＲＢの可変領域は、配列番号６３に記載の核酸によりコードされ得る。ＴＲＢの定常領域は、好ましくは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ここで、該定常領域は、トランスジェニックＴＣＲ鎖の対形成を増強するためのマウス定常領域または最小マウス定常領域である。あるいは、該定常領域は、免疫認識のリスクを最小にする、ヒトのものであってよい。ＴＲＢ鎖をコードする好ましいコドン最適化核酸は、配列番号１８に記載の核酸である。
【００６６】
本発明はまた、例えば、ＣＭＶ感染、特にＣＭＶ疾患およびＣＭＶ誘導性悪性腫瘍の処置を目的とするＴＣＲ遺伝子療法のための、例えば、配列番号４１に記載の核酸配列を含む、好適な発現カセットにおけるＣＭＶ  ｐｐ６５エピトープに特異的なＴＲＡおよびＴＲＢの両方をコードする核酸を提供する。
【００６７】
本発明の核酸は、本発明のＴＲＡおよび／またはＴＲＢをコードする本発明の核酸を含むベクターとして、例えば、該ＴＲＡおよび／またはＴＲＢが、ヒトＴ細胞などのＴ細胞での発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されたベクターを提供し得る。好ましくは、該プロモーターは、異種プロモーターであり、すなわち、天然に存在する細胞、特にヒトＴ細胞において、ＴＣＲα遺伝子またはβ遺伝子に連結されていない。プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであり、好ましくは骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）、ＣＭＶ、ＣＡＧまたはＥＦ１αプロモーターであり得る。本発明の核酸は、ＲＮＡとして、レトロウイルスベクターとして、γ−レトロウイルスベクターとして、レンチウイルスベクターとして、またはトランスポゾンベースのベクターとして提供され得る。一態様において、ベクターは、ヒト患者のＴＣＲ遺伝子療法に適している。好ましくは、ベクターはＭＰ７１である。例えばＴＲＡおよびＴＲＢをコードする本発明の核酸は、機能的ＴＣＲ構築物の両方の鎖をコードする単一導入遺伝子カセットを提供するために、遺伝子リンカー、好ましくはウイルス由来２Ａエレメントを介して融合され得る。
【００６８】
本発明はまた、本発明の核酸によりコードされるタンパク質、またはその融合タンパク質、特に本発明の核酸によりコードされ、かつ記載される抗原、例えばＨＰＶ１６オンコプロテインＥ５のエピトープに特異的な、ＴＲＡおよび／またはＴＲＢを提供する。本発明のＴＲＡおよび／またはＴＲＢは、その天然の対応物に対応するすべての特徴またはドメインを含み得るが、これは必須ではない。好ましくは、ＴＲＡおよびＴＲＢは、少なくとも可変領域、または可変領域および定常領域を含み、例えば、該可変領域および／または定常領域は、ヒト可変または定常ＴＣＲ領域に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。養子Ｔ細胞療法に関して、ＴＣＲ構築物は、可変領域、定常領域および膜貫通領域を含む完全長ＴＣＲα鎖およびβ鎖を含むＴＣＲであることが好ましい。
【００６９】
構築物は、融合タンパク質であってもよく、例えば、ＴＣＲ鎖の可変領域は、Ｉｇドメイン、例えばＩｇＧ定常ドメイン、好ましくは本発明の融合タンパク質中の抗ＣＤ３抗体ドメインに融合して、例えば、細胞表面でそれぞれのｐＭＨＣを発現し、例えば標的細胞にエフェクター機能を提供する抗ＣＤ３標的化ドメインを介してＴ細胞を動員する悪性細胞を標的とする、可溶性モノクローナルＴＣＲ試薬を提供することができる（６３）。
【００７０】
一本鎖構築物（ｓｃＴＣＲ）ならびにヘテロ二量体ＴＣＲ構築物が包含される。ｓｃＴＣＲは、第一のＴＣＲ鎖構築物（例えば、α鎖）の可変領域および全長（完全長）の第二のＴＣＲ鎖（例えば、β鎖）を含んでいてよく、その逆も可能である。さらに、ｓｃＴＣＲは、要すれば、２つ以上のポリペプチドを共に連結する、１つ以上のリンカーを含んでいてよい。リンカーは、例えば、本明細書に記載の通り、２つの一本鎖を共に連結するペプチドであり得る。サイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７またはＩＬ−１５などのヒトサイトカインに融合された、かかる本発明のｓｃＴＣＲもまた、提供される。
【００７１】
本発明のＴＣＲ構築物はまた、少なくとも２つのｓｃＴＣＲ分子を含む多量体複合体の形態で提供されてもよく、ここで、該ｓｃＴＣＲ分子は、それぞれ少なくとも１つのビオチン部分に融合され、該ｓｃＴＣＲは、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用により結合されて、該多量体複合体の形成を可能にし得る。３つ以上、例えば４つの本発明のｓｃＴＣＲを含む、高次の多量体複合体もまた提供される。
【００７２】
本発明のＴＣＲ構築物は、例えば、放射性同位元素、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ）、および粒子（例えば、金粒子または磁性粒子）などの、検出可能な標識を含むよう修飾され得る。
【００７３】
本発明はまた、本発明のＴＣＲ構築物、特にヒトサイトメガロウイルスタンパク質ｐｐ６５のエピトープ、または、好ましくはヒトパピローマウイルス１６オンコプロテインＥ５のエピトープに特異的なＴＣＲ構築物、のＴＲＡおよびＴＲＢをコードする核酸を含み、かつ該ＴＣＲ構築物を発現する、宿主細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞に関する。ＴＲＡおよびＴＲＢは、好ましくは、例えば上記のように、異種プロモーターから発現される。Ｔ細胞は、好ましくは、ヒトＴ細胞である。それは、関連ウイルスに感染した患者、特に、ＨＰＶの場合に、子宮頸癌、肛門癌および頭頸部癌などの該ウイルスに関連する悪性疾患に罹患している患者から単離され得る。患者は、ＴＣＲによって認識されるエピトープが制限されているＭＨＣを発現する。Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞またはナイーブＴ細胞であり得る。
【００７４】
本発明はまた、医薬において、例えば医薬組成物において使用するための、本発明の宿主細胞、例えばＴ細胞、または核酸に関する。そのような医薬組成物は、以下のウイルスに感染した患者の処置に使用できる：
ａ)ヒトパピローマウイルス１６、ここで、該ＴＣＲは、ヒトパピローマウイルス１６オンコプロテインＥ５のエピトープに特異的であり、患者はＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１陽性である；または
ｂ）ヒトサイトメガロウイルス、ここで、該ＴＣＲは、ヒトサイトメガロウイルスタンパク質ｐｐ６５のエピトープに特異的であり、患者はＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２陽性である。
【００７５】
医薬における使用に関して、ＴＲＡおよびＴＲＢの両方を含むＴＣＲ構築物は、核酸、タンパク質またはＴ細胞の形態のいずれかで使用される。治療前にＨＰＶ感染患者をＥ５抗原の発現についてスクリーニングし、Ｅ５発現を有する患者のみを処置することは有用であり得る。
【００７６】
医薬組成物はまた、ウイルスなどの病原体、例えば、
ａ)ヒトパピローマウイルス１６（ここで、該ＴＣＲは、ヒトパピローマウイルス１６オンコプロテインＥ５のエピトープに特異的であり、患者はＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１陽性である）；または
ｂ）ヒトサイトメガロウイルス（ここで、該ＴＣＲは、ヒトサイトメガロウイルスタンパク質ｐｐ６５のエピトープに特異的であり、患者はＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２陽性である）
による感染の予防または感染の減少における使用を目的とするものであり得る。
【００７７】
例えば、医薬組成物（ここで、該ＴＣＲがヒトパピローマウイルス１６オンコプロテインＥ５のエピトープに特異的であり、患者がＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１−陽性である）は、例えば、前がん状態の（premalignant）高悪性度子宮頸部病変が検出された場合、ＨＰＶ１６に感染した患者における子宮頸癌の予防のために使用され得る。医薬組成物（ここで、該ＴＣＲがヒトサイトメガロウイルスタンパク質ｐｐ６５のエピトープに特異的であり、患者がＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２陽性である）は、ＣＭＶ疾患を予防するため、または該患者においてその症状を軽減するために、造血幹細胞移植後の患者の処置に使用できる。
【００７８】
本発明はまた、それを必要とする患者（例えば、ＨＰＶ１６またはＣＭＶなどのウイルスに感染したか、または該ウイルスに関連する悪性腫瘍に罹患している患者）を処置する方法、またはウイルスによる感染を減少させる方法、または該感染の症状を軽減する方法であって、本発明の好適な組み換えＴ細胞または核酸を該患者に投与することを含む方法を教示する。移植後のＣＭＶ疾患の処置または予防（６４，６５）もまた、ＣＭＶ  ｐｐ６５エピトープに特異的な本発明のＴＣＲを発現するＴ細胞またはそれをコードする核酸を用いて可能である。
【００７９】
本発明はまた、エピトープを含む４０アミノ酸長までの長さを有するヒトパピローマウイルス１６オンコプロテインＥ５のフラグメント、またはエピトープを含む４０アミノ酸長までの長さを有するヒトパピローマウイルス１６オンコプロテインＥ５のペプチドフラグメントをコードする核酸に関し、ここで、該エピトープは、本発明のＴ細胞のＴＣＲ構築物によって認識され得る。かかるＥ５フラグメントは、ワクチン接種、例えば、合成の長いペプチドのワクチン接種に有利に使用され得る。好ましくは、該核酸はエピトープをコードするか、または該ペプチドはエピトープからなり、それは、エピトープを同定するための本発明の方法により同定され得る。好ましくは、エピトープは、上記のＴＣＲ構築物により認識され得るヒトパピローマウイルス１６オンコプロテインＥ５のエピトープである。本発明の方法によって初めて同定されたＥ５エピトープは、好ましくは、配列番号１を含み、配列番号１、４５、４７、４９、５１、５２および５７からなる群より選択される。
【００８０】
本発明はまた、該Ｅ５ペプチドフラグメントもしくは該エピトープをコードする該核酸、または、好ましくは、ヒトパピローマウイルス１６による感染の予防（または、感染の減少）のための、例えば、前がん状態の（premalignant）高悪性度子宮頸部病変が検出された場合、ＨＰＶ１６に感染した患者における子宮頸癌の予防のための、またはＨＰＶ１６感染、特にＨＰＶ１６誘発性悪性腫瘍の処置のための、医薬における使用のための該ペプチドフラグメントもしくはエピトープに関する。該エピトープを提供するワクチンは、対象、例えば、ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１陽性の患者への投与用であり得る。
【００８１】
本発明は、本発明を例示することを意図し、本発明の範囲を限定するものではない、以下の実施例によりさらに説明される。本明細書中に引用される全ての文献は、本明細書中に完全に包含される。本明細書に記載の本発明の全ての態様は、組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１：レトロウイルスＨＬＡベクター。（ａ）ＩＲＥＳ−ＧＦＰ、または（ｂ）ＩＲＥＳ−ＣＦＰ発現マーカーに融合した異なるＨＬＡアレルを担持するγ-レトロウイルスベクターＭＰ７１のスキーム。
【図２】図２：ＭＨＣクラスＩ細胞ライブラリー。Ｋ５６２細胞に、（ａ）ＭＨＣ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ、または（ｂ）ＭＨＣ−ＩＲＥＳ−ＣＦＰカセットを担持するレトロウイルスベクターＭＰ７１を用いて形質導入した。２つのＴ細胞ドナーの全てのＭＨＣクラスＩアレルをカバーする１０個のＭＨＣ形質導入体のＦＡＣＳプロットの選択を示す。ＧＦＰおよびＣＦＰ発現は、形質導入率を示す。ＧＦＰ−またはＣＦＰ−陽性細胞のＭＨＣ表面発現は、ＭＨＣクラスＩ抗体染色によって、パーセンテージで示される。
【図３】図３：ＭＨＣ細胞ライブラリーにおける安定した抗原発現の例。Ｋ５６２細胞に、ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙマーカーに融合した抗原（ＨＰＶ１６  Ｅ７）を安定に形質導入し、ｍＣｈｅｒｒｙ発現のフローサイトメトリー測定により検出した。ＭＨＣ ＩアレルをＩＲＥＳ−ＧＦＰマーカーに融合させ、発現をＧＦＰのフローサイトメトリー検出によって示す。ＭＨＣ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ／抗原−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ二重陽性細胞の割合を、ＦＡＣＳプロットに示す。（ａ）ＭＨＣ細胞ライブラリーのＫ５６２細胞は、Ｅ７で安定に形質導入された。（ｂ）ＭＨＣ（ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１）により形質導入されたＫ５６２細胞は、エピトープマッピングのために使用されたＥ５の短縮型マイクロ遺伝子構築物で安定に形質導入された（ｎｔ、ヌクレオチド）。
【図４】図４：標的細胞におけるｉｖｔＲＮＡからの抗原の発現。ＩＲＥＳ−ＣＦＰマーカーを発現する単一のＭＨＣ形質導入Ｋ５６２細胞を、エレクトロポレーションにより、ＧＦＰをコードするｉｖｔＲＮＡでトランスフェクトした。エレクトロポレーションの５時間後にＧＦＰの発現を測定し、トランスフェクション効率の対照として用いた。
【図５】図５：ＭＨＣ細胞ライブラリーのＫ５６２細胞と共培養することによる、抗原特異的Ｔ細胞応答の誘導。（ａ）ＴＣＲ−Ｂ２３、および（ｂ）ＴＣＲ−Ｓ５１を、Ｔ細胞に安定に形質導入し、それを、ＣＤ８およびトランスジェニックＴＲＢ発現について染色し、フローサイトメトリーにより分析した。（ｃ）Ｅ７ｃｏ  ｉｖｔＲＮＡトランスフェクションの３時間後、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞をＫ５６２−Ｂ＊２７：０５標的細胞と共培養した。フローサイトメトリーにより、ＣＤ１３７発現を測定した。Ｈ２ＯでトランスフェクトしたＫ５６２−Ｂ＊２７：０５標的細胞を、陰性対照として用いた。
【図６】図６：ｍＤＣは、ｉｖｔＲＮＡからＧＦＰを発現する。ｍＤＣを、プレートに付着させた単球から作製した。（ａ）フローサイトメトリーのヒストグラムは、アイソタイプ対照（灰色領域）と比較してＴ細胞活性化分子ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６を発現するｍＤＣ（黒線）を示す。（ｂ）１５μｇの抗原ｉｖｔＲＮＡでトランスフェクションしてから４から６時間後に、ＧＦＰの発現を測定した。ＧＦＰ＋ＤＣの割合を示している。
【図７】図７：ウイルス特異的Ｔ細胞のスクリーニング。自己のｍＤＣで抗原特異的に刺激されたＴ細胞を、ＭＨＣ細胞ライブラリーの６つの対応する単一のＭＨＣ Ｉ発現Ｋ５６２細胞と共培養した。（ａ）共培養物の上清を、ＥＬＩＳＡを用いてＩＦＮγ放出について試験した。（ｂ）同じウェル由来の細胞をフローサイトメトリーにより分析して、ＣＤ８＋  Ｔ細胞のＣＤ１３７＋の割合を決定した。
【図８】図８：ウイルス特異的Ｔ細胞のＦＡＣＳソーティング。（ａ）ｐｐ６５に反応性を示すＴ細胞（図７ｂ）を、ＭＨＣ細胞ライブラリーのｐｐ６５トランスフェクトＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２発現Ｋ５６２細胞と共培養した。（ｂ）Ｅ５反応性Ｔ細胞（図７ｂ）を、ＭＨＣ細胞ライブラリーのＥ５トランスフェクトＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１発現Ｋ５６２細胞と共培養した。両共培養物の単一のリンパ球を、ＦＳＣ／ＳＳＣでゲートし、ＣＤ８＋細胞のＣＤ１３７発現細胞を、その後のＴＣＲ分析のためにＦＡＣＳソーティングした。
【図９】図９：ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の組合せの発現および機能分析。（ａ）ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の組合せを、健康なドナーのＰＢＭＣ中にレトロウイルスを用いて発現させた。Ｔ細胞におけるトランスジェニックＴＣＲ発現を、ＣＤ８およびマウス定常ＴＣＲβ鎖セグメントの抗体染色後に、フローサイトメトリーにより測定した。非形質導入（ｕｔ）Ｔ細胞を陰性対照として用いた。結果は、異なるＰＢＭＣドナーを用いた２つの独立した試験の代表的結果である。（ｂ）異なるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の組合せで形質導入したＴ細胞を、抗原（ＨＰＶ１６  Ｅ５またはＣＭＶ  ｐｐ６５）でトランスフェクションしたＫ５６２−Ｂ＊１５：０１およびＫ５６２−Ｂ＊０７：０２標的細胞とそれぞれ共培養した。ＴＣＲα／ＴＣＲβ形質導入Ｔ細胞のＩＦＮγ放出を、ＥＬＩＳＡによって測定した。結果を、デュプリケートの平均±標準誤差（ＳＥＭ）として示す。
【図１０】図１０：最適化されたＴＣＲ導入遺伝子カセットを有するＴＣＲ遺伝子改変ＰＢＭＣの作製。ＴＣＲ導入遺伝子カセットによるＰＢＭＣのレトロウイルス形質導入を行った。形質導入率を、マウスＴＲＢＣの抗体染色およびフローサイトメトリー分析によって評価した。結果は、２つの異なるドナー由来のＰＢＭＣを用いた実験の代表的結果である（ｕｔ、非形質導入ＰＢＭＣ）。
【図１１】図１１：ＨＰＶ１６  Ｅ５の抗原配列のマッピング。（ａ）完全長Ｅ５野生型（ｗｔ）（２５２ｎｔ）、Ｅ５コドン最適化（ｃｏ）（２５２ｎｔ）およびＥ５ｗｔの３’短縮型ミニ遺伝子バージョン（６３−１８９ｎｔ）を、ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙマーカーに結合させ、ＭＰ７１レトロウイルスベクター中にクローニングし、Ｋ５６２−Ｂ＊１５：０１標的細胞中で発現させた。ＡＴＧ開始コドンのＡで始まる遺伝子配列の長さを示す。（ｂ）ＴＣＲ  Ｅ５形質導入Ｔ細胞を、Ｅ５遺伝子バージョンの１つを担持するＫ５６２−Ｂ＊１５：０１標的細胞と共に１８時間共培養した。ＩＦＮγ放出をＥＬＩＳＡにより決定した。結果を、デュプリケートの平均±ＳＥＭとして示す。
【図１２】図１２：ＨＰＶ１６  Ｅ５特異的ＴＣＲおよびＣＭＶ  ｐｐ６５特異的ＴＣＲのエピトープマッピング。（ａ）ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１上に提示される可能性のあるエピトープとしてＩＥＤＢによって予測されたＨＰＶ１６  Ｅ５エピトープを、配列類似性に従ってクラスター化した。第１列（ｐ４−ｐ１７）（配列番号：１、４９−６１）は、エピトープ予測（表２）におけるペプチドのランクを示す。第２列（−ｍｅｒ）は、ペプチドの長さを示す。（ｂ）Ｅ５  ＴＣＲ形質導入ＰＢＭＣを、ペプチドパルスしたＫ５６２−Ｂ＊１５：０１標的細胞と共培養し、ＩＦＮγ放出をＥＬＩＳＡによって決定した。非形質導入（ｕｔ）Ｔ細胞を、陰性対照として用いた。（ｃ）ＣＭＶ  ｐｐ６５ペプチドｐ１（配列番号１０）は、ＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２上に提示されたｐｐ６５の既報のエピトープを示す（６６，６７）。（ｄ）Ｐｐ６５  ＴＣＲ形質導入ＰＭＢＣを、ｐｐ６５  ｐ１パルスしたＫ５６２−Ｂ＊０７：０２標的細胞と共培養した。ＩＦＮγ放出をＥＬＩＳＡによって測定した。全てのＥＬＩＳＡ結果を、デュプリケートの平均±ＳＥＭとして示す。
【実施例】
【００８３】
実施例
１．１ ＭＨＣベクターライブラリーの作製
一般的なＭＨＣ Ｉアレルの遺伝子を、最初にＭＨＣベクターライブラリーを作製するためにγ−レトロウイルスベクターＭＰ７１（６８−７０）中にクローニングして、単一のＭＨＣ発現Ｋ５６２細胞を作製し（２３）、それをＭＨＣ細胞ライブラリーを含む人工ＡＰＣとして使用した。ＨＬＡ−Ａ、−Ｂまたは−Ｃ遺伝子の対立遺伝子（アレル）バージョンは、高度に多型性である。配列は、ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベースでオープンアクセスである。しかしながら、異なる型の５’末端および３’末端は高い配列類似性を有し、細胞のｃＤＮＡからの１つの特異的ＨＬＡ遺伝子をＰＣＲ増幅することを困難にしている。この問題を克服するために、ｃＤＮＡを、International Histocompatibility Workshopから得られたリンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）から作製し、それは、ＰＣＲによる効率的な遺伝子増幅を可能にするために所望のＨＬＡ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃアレルに対してホモ接合であった。増幅したＨＬＡフラグメントを、ＩＲＥＳ−ＧＦＰマーカーまたはＩＲＥＳ−ＣＦＰ発現マーカーに結合させ、レトロウイルス発現ベクターＭＰ７１中にクローニングした（図１）。
【００８４】
１．２  ＭＨＣ細胞ライブラリーの作製
赤白血病細胞株Ｋ５６２（２０）を、ＭＨＣ細胞ライブラリーの作製のための人工ＡＰＣスキャホールドとして用いた。Ｋ５６２細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子の内因的発現を欠いているが、機能的ＭＨＣ複合体の１つのユビキチン化成分であるβ−２ミクログロブリンを発現する。しかしながら、ＭＨＣクラスＩα鎖アレルのトランスフェクションにより、該細胞は、ＭＨＣ表面発現を含む機能的抗原プロセッシング機構を有することが示され得て、それ故に、Ｋ５６２は、人工ＡＰＣの作製のための魅力的なスキャホールドである（１９，２３，２４）。単一のＨＬＡアレルを用いるＫ５６２細胞の安定な形質導入を、ＭＰ７１レトロウイルスベクターベースのＨＬＡライブラリーを用いて行った。２９３Ｔパッケージング細胞におけるレトロウイルス上清の産生および形質導入を、既報の通りに行い（７２）、その結果、フローサイトメトリー分析によって確認されたように、ＧＦＰ−またはＣＦＰ−発現集団を得た。ＭＨＣ複合体の機能的アセンブリおよび表面発現は、ＧＦＰ−またはＣＦＰ−陽性細胞集団のＭＨＣクラスＩ抗体染色により示された（図２）。Ｋ５６２細胞に形質導入された全てのＨＬＡアレルは、細胞表面に発現された。単離ＴＣＲの後の分析のために、元のＴ細胞ドナーの６つのＭＨＣクラスＩアレルの全てを包含するＫ５６２細胞のパネルを作製した。
【００８５】
１．３ ＭＨＣ細胞ライブラリーにおける抗原発現
ＭＨＣ細胞ライブラリーのＫ５６２細胞を人工ＡＰＣとして使用するために、単一のＭＨＣ発現Ｋ５６２細胞をレトロウイルスベクターＭＰ７１に形質導入して、単一のＭＨＣアレルに関して抗原構築物を安定に発現させた。レトロウイルスの形質導入を既報の通りに行った（７１）。Ｋ５６２細胞における抗原発現は、単一のＭＨＣアレルに関してエピトープの内因性プロセッシングおよび提示を可能にした。多くの抗原（ＨＰＶ１６  Ｅ５、Ｅ６およびＬ１、ＣＭＶ  ｐｐ６５およびＩＥ−１）は、細胞内ＦＡＣＳ染色により容易に検出できなかった。さらに、抗体は、エピトープマッピングに用いたＨＰＶ１６  Ｅ５の短縮型抗原（ミニ遺伝子構築物）、ならびに突然変異型ヌクレオチド配列には利用できなかった。従って、全ての抗原を、フローサイトメトリーによる発現を間接的に確認するために、ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙマーカーに結合させた（図３）。
【００８６】
標的細胞において抗原配列を発現させる第二の戦略は、エレクトロポレーションによってｉｖｔＲＮＡをトランスフェクトすることであった。従って、抗原配列を発現ベクター中にクローニングし、Ａｍｂｉｏｎ（Life Technologies）のｍＭｅｓｓａｇｅ  ｍＭａｃｈｉｎｅおよびポリ（Ａ）キットを用いて、ｉｖｔＲＮＡのＴ７プロモーター依存性産生、およびその後のポリアデニル化を可能にした。Ｋ５６２細胞へのｉｖｔＲＮＡのエレクトロポレーションは、指数関数的電気穿孔プロトコールを用いてＢｉｏＲａｄ  ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒで行った。一般的に、ＧＦＰをコードするｉｖｔＲＮＡを、エレクトロポレーション効率の対照として用いた。図４は、ＨＬＡ形質導入Ｋ５６２細胞が、ｉｖｔＲＮＡエレクトロポレーション後にＧＦＰを発現したことを示す。
【００８７】
１．４ ＭＨＣ細胞ライブラリーの標的細胞による抗原特異的Ｔ細胞応答の誘導
これまでの実験では、ＭＨＣ細胞ライブラリーのＨＬＡ形質導入Ｋ５６２細胞は、抗原ｉｖｔＲＮＡのレトロウイルス形質導入後またはトランスフェクション後に所定の抗原を発現することが示された。次の工程は、抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導するために内因的にプロセッシングして、エピトープを提示するためのＭＨＣ細胞ライブラリーの能力を試験することであった。ＴＣＲを介するＴ細胞のＨＬＡ抗原特異的刺激は、早期活性化マーカーＣＤ１３７の上方制御をもたらすことが記載されている（３２−３４）。
【００８８】
このため、抗原特異的Ｔ細胞クローンから単離され、内因性のプロセッシングを受け、かつＨＬＡ−Ｂ＊２７：０５上に提示されたエピトープを認識する、２つの十分に特徴付けられたＴＣＲ（Ｂ２３、Ｓ５１）を用いた。ＴＣＲを発現するように操作されたＰＢＭＣ（ＴＣＲ改変ＰＢＭＣ）を用いて、ＭＨＣ細胞ライブラリーの抗原発現Ｋ５６２細胞の抗原特異的Ｔ細胞を活性化する能力を分析した（図５ａ、ｂ）。Ｔ細胞活性化を、フローサイトメトリーを用いてＣＤ１３７発現により測定した。図５ｃに示す通り、全てのＴＣＲ改変ＰＢＭＣは、抗原ｉｖｔＲＮＡをトランスフェクトしたＫ５６２−Ｂ＊２７：０５標的細胞との２０時間の共培養後に、ＣＤ１３７活性化マーカーを発現した。ＣＤ８＋／ＣＤ１３７＋Ｔ細胞の量は、ＴＣＲ−Ｂ２３改変Ｔ細胞について約６％であり、ＴＣＲ−Ｓ５１改変Ｔ細胞について８％であって、それは、共培養に使用されるＴＣＲ改変／ＣＤ８＋Ｔ細胞（図５ａ、ｂ）の総量を反映している。結論として、Ｋ５６２細胞は、抗原エピトープを内因的にプロセッシングし、それを、トランスジェニックＨＬＡ−Ｂ＊２７：０５上に提示し、それは、ＣＤ１３７発現によって測定される通りサンプル中の全ての抗原特異的Ｔ細胞の刺激をもたらした。さらに、ＣＤ１３７発現は、ＥＬＩＳＡにより測定された通り、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞の抗原特異的ＩＦＮγ放出と相関していた。
【００８９】
２．１ Ｔ細胞の抗原特異的増殖
以下に、所望の抗原特異性を有するＴＣＲを検出および単離するためのスクリーニング法の設定について記載する。異なる抗原、例えば、異なるウイルス由来、または異なる腫瘍特異的抗原に変更することができる。
【００９０】
従って、ＤＣを、エンドトキシン不含有培地を用いて、プレートに接着した単球から作製および成熟させた（７２，７３）。成熟ＤＣ（ｍＤＣ）の成熟状態を、Ｔ細胞活性化マーカーであるＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６、ならびにＭＨＣ ＩＩ発現で染色して確認し、その後フローサイトメトリーにより確認した（図６）。抗原ｉｖｔＲＮＡを、オープンアクセスのＵｎｉＰｒｏｔデータベースに示される、完全長対照ＨＰＶ１６およびＣＭＶ野生型遺伝子配列を表す、６つのウイルス抗原（ＣＭＶ  ｐｐ６５およびＩＥ１、ＨＰＶ１６  Ｌ１、Ｅ５、Ｅ６およびＥ７）から作製した。ｍＤＣに抗原のｉｖｔＲＮＡをトランスフェクトして、天然にプロセッシングされ、かつ細胞表面上に提示されたエピトープの提示を確実にした（７４）。ＧＦＰをコードするｉｖｔＲＮＡを、トランスフェクション対照として用いた。トランスフェクションの４〜６時間後に発現を測定した（図６）。抗原発現ｍＤＣを、ＰＢＭＣ：ＤＣが１０：１の比で用いた。ＤＣによるＰＢＭＣジ劇は、１０％ヒト血清を含む培地を用いて行った（７４，７５）。ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）を、刺激の２日後から培地に添加して、Ｔ細胞増殖に有利な培地とした。週に３回、ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）を培養物に添加した。増殖中のＰＢＭＣを、１：２〜３：４の比で分割した。
【００９１】
２．２  ウイルス特異的Ｔ細胞のスクリーニング
６つのウイルス抗原のうち１つを発現する自己ｍＤＣを用いて、第１ラウンドの刺激の１４日後に第２の刺激を行った。２８日後、１２個のＴ細胞培養物を、ＭＨＣ細胞ライブラリーを用いて、特異的抗原−ＭＨＣ組合せに対する反応性についてスクリーニングした（図２）。ＭＨＣ細胞ライブラリーの細胞を、エレクトロポレーションにより抗原ｉｖｔＲＮＡでトランスフェクトし、１つの抗原に対して惹起された各Ｔ細胞培養物を、１つのＭＨＣタイプと組み合わせて抗原に対する反応性についてスクリーニングした。Ｔ細胞サンプル中の抗原特異的Ｔ細胞の最適な活性化を達成するために、該ライブラリーをＴ細胞と、好ましくは１８〜２２時間接触させた。サイトカインの添加は、Ｔ細胞の非特異的活性化を避けるために、接触の間は回避した。抗原特異的Ｔ細胞のＩＦＮγ放出をＥＬＩＳＡにより測定した。さらに、共培養物中のＴ細胞を、フローサイトメトリーにより、ＣＤ１３７の発現について分析した（３３）。
【００９２】
Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１のそれぞれと組み合わせて、ｐｐ６５およびＥ５に対して特異的反応性を示した。抗原−ＭＨＣ特異的Ｔ細胞反応性は、ＩＦＮγの放出およびＴ細胞表面でのＣＤ１３７の上方制御により測定され得る。従って、サイトカイン放出ＥＬＩＳＡおよびＴ細胞活性化マーカーのフローサイトメトリー分析を組み合わせることにより、抗原−ＭＨＣ特異的Ｔ細胞応答を検出するためのロバストな２法読み出しシステムが得られる。
【００９３】
２．３  ＴＣＲレパートリーを分析するためのウイルス特異的Ｔ細胞の選別
両アッセイにおいて１つの抗原−ＭＨＣ組合せに対する特異的応答を示したＴ細胞を、ＦＡＣＳ選別のために選択して、ＴＣＲレパートリーを分析した。ＣＭＶ  ｐｐ６５で増殖させたＴ細胞を、ｐｐ６５をトランスフェクトしたＫ５６２−Ｂ＊０７：０２標的細胞と共培養し、培養物からＣＤ１３７＋  Ｔ細胞を選別した。この設定では、ＣＤ８＋  Ｔ細胞のほぼ半数がＣＤ１３７＋であった。ＣＤ８＋  Ｔ細胞の１３％は、ＨＰＶ１６  Ｅ５をトランスフェクトしたＫ５６２−Ｂ＊１５：０１標的細胞と共培養することにより、ＣＤ１３７を発現した。
【００９４】
抗原−ＭＨＣ特異的Ｔ細胞の選別後、ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを、ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キット（Clontech）を用いてＴＣＲαおよびβ遺伝子の５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲを行うことにより作製した。ＰＣＲ増幅は、ＴＣＲαおよびβ遺伝子フラグメントを産生し、それは、ＦＡＣＳ選別したＴ細胞サンプル中の各Ｔ細胞クローン種の量を定量的に表した。ＴＣＲαおよびβ遺伝子フラグメントのＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ(登録商標)クローニングシステム（Invitrogen, Life Technologies）を用いて配列決定ベクターに連結させ、細菌中に導入し、選択培地を含むプレート上で増殖させた。各細菌コロニーは、１つのＰＣＲ  ＴＣＲαまたはβ遺伝子フラグメントを有する１つの配列決定ベクターを含むと見なされた。多数の細菌コロニーのベクターＤＮＡ調製物を作製し、次いでベクター挿入物（ＴＣＲαまたはβ遺伝子フラグメント）の配列決定をした。各細菌コロニーの配列決定結果をウェブベースのＩＭＧＴ／Ｖ−Ｑｕｅｓｔを用いて分析した。同一のＴＣＲα鎖またはβ鎖の頻度は、ＦＡＣＳ選別されたＴ細胞サンプル内の同一のＴ細胞クローン種の割合を反映していた。次に、ＴＣＲα鎖およびβ鎖の頻度の一致化を、抗原−ＭＨＣ特異的ＩＦＮγ放出およびＣＤ１３７上方制御を説明した機能的ＴＣＲを再構成するために、実施した。
【００９５】
ＴＣＲ分析により、ＴＲＡＶ１７鎖およびＴＲＡＶ３８−２鎖が、ＨＰＶ１６  Ｅ５およびＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１に対する応答により選別された全てのＴ細胞のほぼ４０％にそれぞれ存在することを明らかにした。３つのＴＣＲβ可変鎖が、Ｔ細胞の２１−３２％に存在することが見いだされた（表１）。２つのＴＣＲα鎖のそれぞれが、３つのＴＣＲβ鎖のうちの１つと機能的なＥ５特異的ＴＣＲを連結させ得ると仮定された。従って、機能的なＨＰＶ１６  Ｅ５特異的ＴＣＲを構築するための、候補ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の６つの可能性のある組合せがあった。
【００９６】
ＣＭＶ  ｐｐ６５およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２に対する応答に関して選別されたＴ細胞は、ＴＲＡＶ１７およびＴＲＢＶ７−９鎖を有する１つの優勢なＴＣＲを有し、それらは両方ともが、ＴＣＲαコロニーおよびＴＣＲβコロニーのそれぞれ約７０％に存在した（表１）。
【００９７】
まとめると、ＴＣＲ分析は、抗原−ＭＨＣ特異的Ｔ細胞のＣＤ１３７選別が、高頻度で出現し、かつ機能的抗原−ＭＨＣ特異的ＴＣＲを再構成し得る、僅かな優勢ＴＣＲα鎖およびβ鎖の強力な富化を伴うことを示した。
【００９８】
【表２】
2018509911.tif 000004
【表３】
2018509911.tif 000005
【００９９】
２．４ ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の組合せの機能分析
ＴＣＲのトランスジェニック発現のために、各ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖遺伝子を、γ−レトロウイルスベクターＭＰ７１中にクローニングした。異なるＴＣＲα遺伝子およびＴＣＲβ遺伝子の組合せを有するＰＢＭＣの安定した形質導入後に、ＴＣＲの細胞表面発現および機能分析を行った。
【０１００】
ペプチド−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）Ｉ結合に関与する、優勢なＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖遺伝子の可変領域（ＴＲＡＶおよびＴＲＢＶ）を、コドン最適化マウス定常ＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子セグメント（ｍＴＲＡＣおよびｍＴＲＢＣ）に結合させ、Ｔ細胞のレトロウイルス形質導入後のトランスジェニックＴＣＲ鎖の優先的対形成を可能にした（３９，４０，７１）。ｍＴＲＢＣに特異的な抗体でトランスジェニックＴＣＲを染色した後、フローサイトメトリー分析を行い、全てのＴＲＡ／ＴＲＢ鎖の組合せがＰＢＭＣ中で発現されることを示した（図９ａ）。しかしながら、異なる組合せの形質導入率は６〜２５％の間で変動した。機能分析のために、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞を、エレクトロポレーションにより、それぞれＨＰＶ１６  Ｅ５またはＣＭＶ  ｐｐ６５抗原ｉｖｔＲＮＡを用いてトランスフェクトされた、Ｋ５６２−Ｂ＊１５：０１またはＫ５６２−Ｂ＊０７：０２標的細胞に対する反応性について試験した。Ｓｔｒｉｋｉｎｇｌｙ、ＴＲＢＶ６−５（配列番号７）と組み合わせてＴＲＡＶ１７（配列番号３）を発現するＴ細胞は、Ｅ５をトランスフェクトした標的細胞を認識したが、一方、他の５つのＴＲＡ／ＴＲＢ組合せはいずれも、Ｅ５に対する抗原特異的反応性を示さなかった（図９ｂ）。従って、ＴＲＡＶ１７とＴＲＢＶ６−５との組合せは、機能的な抗原特異的ＴＣＲを再構成した。ＣＭＶ反応性Ｔ細胞の候補ＴＲＡ／ＴＲＢ組合せ（ＴＲＡＶ１７（配列番号１２）およびＴＲＢＶ７−９（配列番号１６））のみが、Ｋ５６２−Ｂ＊０７：０２標的細胞のｐｐ６５特異的認識を示した。ＴＲＡ／ＴＲＢ形質導入Ｔ細胞は、Ｈ２Ｏでトランスフェクトされた標的細胞に対するバックグラウンド反応性（background reactivity）を示さず（図９ｂ）、従って、機能的抗原−ＭＨＣ特異的ＴＣＲの明確な識別を可能にする。
【０１０１】
結論として、抗原特異的Ｔ細胞クローンタイプからのＴＣＲの再構成は、ＦＡＣＳ選別されたＴ細胞サンプルにおいて高頻度で見いだされた、ＴＲＡおよびＴＲＢ鎖の組合せによって達成された。所望の抗原特異性を有するＴＣＲのスクリーニング、検出および単離は、ＭＨＣ細胞ライブラリーの使用に基づく、このアプローチによって達成することができた。
【０１０２】
２．５  ＰＢＭＣにおけるトランスジェニック発現のためのＨＰＶ−およびＣＭＶ−特異的ＴＣＲの最適化
トランスジェニックＴＣＲ発現の効率を高めるために、ＴＣＲ導入遺伝子配列をいくつか最適化した（７１）。ＴＲＡおよびＴＲＢ鎖配列をコドン最適化し、ヒトＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ遺伝子セグメントをそれらのマウス対応物で置き換えて、トランスジェニックＴＣＲ鎖の優先的結合を増加させ、かつレシピエントＴ細胞により発現される内因性ＴＣＲ鎖との対形成を低減させた（配列番号５、９、１４、１８）。次いで、最適化されたＴＲＢ遺伝子を、Ｐ２Ａエレメントを介してＴＲＡ遺伝子に連結させ、得られた単一のＴＣＲ導入遺伝子カセット（Ｅ５−特異的：配列番号４０、ｐｐ６５−特異的：配列番号４１）を、γ−レトロウイルスベクターＭＰ７１中に分子的にクローニングした。最適化されたＴＣＲ導入遺伝子カセットを担持するレトロウイルス粒子を、２９３Ｔ細胞のスリー−プラスミドトランスフェクションを介して作製し、ドナーＰＢＭＣを、ＴＣＲをコードするレトロウイルス粒子で安定的に形質導入した（７０）。ＰＢＭＣサンプル内のＴＣＲ遺伝子改変Ｔ細胞を、トランスジェニックマウスＴＲＢＣの抗体染色後にフローサイトメトリーによって分析した。Ｅ５特異的ＴＣＲ（ＴＲＡＶ１７＋ＴＲＢＶ６−５、配列番号４０）について４５％およびｐｐ６５特異的ＴＣＲ（ＴＲＡＶ１７＋ＴＲＢＶ７−９、配列番号４１）について３７％のＴＣＲ形質導入率が、ＰＢＭＣで達成され得て、それによりそれぞれ２７％および２２％が、ＣＤ８およびトランスジェニックＴＣＲに対して陽性であった。結論として、トランスジェニックＴＣＲ発現は、機能的ＴＣＲを再構成するために使用された、最適化されていないＴＲＡおよびＴＲＢ一本鎖導入遺伝子カセットを使用するときの６−７％から、最適化されたＴＣＲ導入遺伝子カセットを使用するとき、約４０％まで顕著に改善され得た。
【０１０３】
２．６  ＨＰＶ１６  Ｅ５特異的ＴＣＲのエピトープマッピング
免疫原性エピトープの事前知識なしに免疫原性抗原−ＭＨＣの組合せを認識するＴ細胞コロニータイプを検出した後、エピトープマッピングを行い、Ｅ５特異的ＴＣＲにより認識される抗原性ＨＰＶ１６  Ｅ５タンパク質内の正確なペプチド配列を明らかにした。ＴＲＡＶ１７およびＴＲＢＶ６−５配列からなるＨＰＶ１６  Ｅ５特異的ＴＣＲは、これまでに記載されていない独自のＴＣＲであった。ＴＣＲにより認識される抗原配列をマッピングするために、ＨＰＶ１６  Ｅ５の３’短縮型ミニ遺伝子バージョンを目的のそれぞれの遺伝子領域を増幅するプライマーを用いるＰＣＲにより作製した。Ｅ５ミニ遺伝子をレトロウイルスベクターＭＰ７１中にクローニングし、Ｋ５６２−Ｂ＊１５：０１標的細胞中に安定に形質導入した（図１１ａ）。最適化されたＥ５特異的ＴＣＲ遺伝子カセットで形質導入されたＴ細胞は、ＩＦＮγ放出によって示されるように、完全長Ｅ５および１８９ｎｔのＥ５ミニ遺伝子配列を担持する標的細胞を認識したが、１２６ｎｔおよび６３ｎｔのＥ５ミニ遺伝子を担持する標的細胞は認識しなかった（図１１ｂ）。さらに、Ｅ５  ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞は、標的細胞がＥ５ｗｔまたはＥ５ｃｏ遺伝子配列を有するかどうかにかかわらず、ＩＦＮγを放出した（図１１ｂ）。結論として、ＨＰＶ１６  Ｅ５  ＴＣＲは、アミノ酸４２−６３の間のＥ５タンパク質領域内のエピトープに特異的であった。
【０１０４】
Ｅ５特異的ＴＣＲ認識の標的となり得る候補エピトープを絞り込むために、コンピューター（イン・シリコ）でのエピトープ予測を、プロテアソーム切断、ＴＡＰ輸送、ＥＲプロセッシングおよびＭＨＣクラスＩ結合の予測を含む、ウェブベースのＩＥＤＢ  Ｔ細胞エピトープ複合予測因子を用いて行った。１回の分析で８−１４マー（ｍｅｒ）のペプチドを含む、統合型エピトープ予測（integrated epitope prediction）を行った。エピトープ予測結果は、所定のペプチドがプロセッシングされ、細胞表面でＭＨＣ分子に提示される確率として解釈され得る、総スコアとして計算された。表２は、構成的プロテアソーム予測を用いた正の合計スコアを有する予測の全てのエピトープ（ｐ１−ｐ１７）を含む。ＤＣとは対照的に、Ｋ５６２細胞は、構成的プロテアソームを発現し、それは、腫瘍細胞で発現されるプロテアソームに似ている（７６）。ＨＰＶ１６  Ｅ５のアミノ酸配列４２−６３から発現されなかった全てのエピトープは、さらなる分析から除外した。驚くべきことに、予測される上位３エピトープ（ｐ１−ｐ３）を除外しなければならなかった。
【０１０５】
【表４】
2018509911.tif 000006
【０１０６】
ＨＰＶ１６  Ｅ５の統合されたエピトープ予測の結果を表２に列記する。最良の予測エピトープを最初にランク付けした。アミノ酸配列４２−６３内にコードされたペプチドを、太字で示す。これらの１０個の候補エピトープを、配列類似性に従ってクラスター化し（図１２ａ）、ペプチドをＫ５６２−Ｂ＊１５：０１標的細胞に外因的に負荷した。Ｅ５  ＴＣＲ形質導入ＰＢＭＣは、ＨＰＶ１６  Ｅ５エピトープｐ４（ＳＡＦＲＣＦＩＶＹ、配列番号１）を特異的に認識した。さらに、ＴＣＲは、ＭＨＣ Ｉの非定型の（unconventional）ペプチド長を付与する１２−、１３−および１４−ｍｅｒを含む、ＳＡＦＲＣＦＩＶＹ（配列番号１）の全てのＮ末端伸長誘導体を明らかに認識した（図１２ｂ）。ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１は、Ｎ末端に突出したペプチドの結合を許容し得る。対照的に、ペプチドｐ６およびｐ１３は、ｐ４よりもＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１に対して高い親和性を有すると予測されたが、他のペプチドはいずれも認識されなかった。
【０１０７】
まとめると、統合エピトープ予測は、Ｅ５特異的ＴＣＲにより認識される正確なエピトープのマッピングを容易にした。しかしながら、このアルゴリズムは、免疫原性エピトープを予測することができず、エピトープ予測の前にＥ５の短縮型ミニ遺伝子との抗原配列のマッピングが必要であった。
【０１０８】
単離されたＴＲＡＶ１７およびＴＲＢＶ７−９配列は、ＣＭＶ特異的ＴＣＲに類似していた。ＣＭＶ  ｐｐ６５に特異的であり、ＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２拘束性であるＴＣＲ配列は、ＣＤＲ３領域中に１〜５個のアミノ酸の相違を含んで開示されている（６６，６７）（表１）。これらのＴＣＲは、ＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２上に提示されたとき、ＣＭＶ  ｐｐ６５の１０−ｍｅｒのエピトープであるＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭ（配列番号１０）を認識することが報告されている。ここでは、ｐｐ６５  ＴＣＲ形質導入ＰＢＭＣを、ＣＭＶ  ｐｐ６５由来のエピトープｐ１（ＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭ、配列番号１０）を負荷したＫ５６２−Ｂ＊０７：０２標的細胞と共培養した（図１２ａ）。実際に、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞は、ｐ１パルス標的細胞を認識し、ＩＦＮγを放出した（図１２ｂ）。ｐｐ６５  ＴＣＲ形質導入ＰＢＭＣは、既報のｐｐ６５−Ｂ＊０７：０２特異的ＴＣＲと比較してＣＤＲ３領域における配列の相違にもかかわらず、ｐ１に特異的であった。
【０１０９】
まとめると、このアプローチにより、新規な免疫原性ＨＰＶ１６  Ｅ５エピトープおよびその対応するＴＣＲならびに免疫優性なＣＭＶ  ｐｐ６５エピトープおよびその対応するＴＣＲの同定が可能になった。両ＴＣＲは、内因性にプロセッシングされたエピトープに特異的であり、最初のＭＨＣ細胞ライブラリーベースのスクリーニングにおいて、ただ１つのＴ細胞コロニータイプによって引き起こされるＴ細胞応答を反映した。従って、天然Ｔ細胞応答の先入観のないスクリーニングおよび抗原特異的インビトロ刺激後の迅速なＴＣＲの同定は、エピトープの事前知識なしに、本発明の方法を用いて可能であり、それにより、所定の抗原に対する機能的Ｔ細胞応答を予測するためのエピトープ予測プログラムの限界を回避し、資源消費型（resource−intensive）で望ましくないＴ細胞クローンの培養を回避することができる。このアプローチはまた、ＴＩＬまたは組織常在Ｔ細胞にも適用することができ、スクリーニングは、病原体由来抗原および腫瘍特異的抗原、ならびにＴＣＲによって標的とされる抗原にさらに拡張することができる。
【０１１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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