(57)【要約】  本発明は新規ラビリントペプチン誘導体に関する。これらのラビリントペプチン誘導体は、例えばヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ／ＨＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮＶ）、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ；ＦＳＭＥウイルス）、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ジカウイルス（ＺＩＫＶ）、および／またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の感染によって引き起こされる感染症などの感染症の治療に有用である。前記ラビリントペプチン誘導体はまた、ラビリントペプチンの作用機序を分析するのにも有用である。また、感染症、特にＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、およびＨＣＶから選択されるウイルスのいずれか１つの感染によって引き起こされる感染症を治療する際の使用のためのラビリントペプチンも本発明によって包含される。本発明はさらに、例えば、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶの感染によって引き起こされる感染症を治療するための医薬としての使用のためのラビリントペプチンＡ１とＡ２の組み合わせ物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列：
【化１】
2018538276.tif 000016
｛式中、
Ｌａｂは、ラビオニンであり；
Ｘ１は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、およびＧｌｕから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ａｌａ、Ｔｒｐ、およびＳｅｒから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ４は、ＴｒｐおよびＴｙｒから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ５は、ＧｌｕおよびＡｓｐから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ６は、ＴｈｒおよびＳｅｒから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ７は、ＧｌｙおよびＰｒｏから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ８は、３〜５個のアミノ酸から成る配列から成り；
Ｒ１は、Ｈ、（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル、Ｃ（Ｏ）−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル、Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル、およびＣ（Ｏ）ＮＨ−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニルから選択され；ここで、Ｒ１は、末端位置にアルキニル基を担持し；
Ｒ２は、Ｈ、［Ｃ（Ｏ）］−ＮＨ−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニルまたは［Ｃ（Ｏ）］−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニルから選択される；ここで、部分［Ｃ（Ｏ）］は末端アミノ酸のカルボニル基であり；ここで、Ｒ２は、末端位置にアルキニル基を担持し；ここで、Ｒ１がＨであれば、Ｒ２はＨでない｝を含むかまたはそれらから成るペプチド。
【請求項２】
前記Ｒ１および／またはＲ２がアジド標識化合物を用いて誘導体化される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記化合物が、抗ウイルス薬剤またはマーカー分子から選択される化合物である、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
医薬としての使用のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドを含む医薬組成物であって、医薬的に許容し得る担体および／または希釈剤をさらに含む、医薬組成物。
【請求項６】
ウイルス感染を治療および／または予防する際の使用のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ウイルス感染が、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮＶ）、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ；ＦＳＭＥウイルス）、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ジカウイルス（ＺＩＫＶ）、および／またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）から選択されるウイルスのいずれか１つの感染である、請求項６に記載の使用のためのペプチドまたは請求項６に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項８】
ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、およびＨＣＶから選択されるウイルスのいずれか１つの感染を治療および／または予防する方法であって、前記方法が、請求項１〜４、６および７のいずれか１項に記載のペプチド、または請求項５〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物の有効量を、斯かる治療を必要としている対象に投与することを含む方法。
【請求項９】
ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、およびＨＣＶから選択されるウイルスのいずれか１つの感染を治療および／または予防する際の使用のためのペプチドであって、ここで、前記ペプチドが、以下のアミノ酸配列：
【化２】
2018538276.tif 000017
｛式中、
Ｌａｂは、ラビオニンであり；
Ｘ１は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、およびＧｌｕから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ａｌａ、Ｔｒｐ、およびＳｅｒから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ４は、ＴｒｐおよびＴｙｒから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ５は、ＧｌｕおよびＡｓｐから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ６は、ＴｈｒおよびＳｅｒから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ７は、ＧｌｙおよびＰｒｏから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ８は、３〜５個のアミノ酸から成る配列から成る｝を含むか、またはそれらから成るペプチド。
【請求項１０】
ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、およびＨＣＶから選択されるウイルスのいずれか１つの感染を治療および／または予防する際の使用のための、請求項９に記載のペプチドを含む医薬組成物であって、ここで、前記医薬組成物が、医薬的に許容し得る担体および／または希釈剤をさらに含む医薬組成物。
【請求項１１】
ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、およびＨＣＶから選択されるウイルスのいずれか１つの感染を治療および／または予防する方法であって、ここで、前記方法が、斯かる治療を必要とする対象に、請求項９に記載のペプチドまたは請求項１０に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項１２】
前記ペプチドが、最大３０アミノ酸の長さを有する、請求項１〜４、６、７および９のいずれか１項に記載のペプチド、請求項５〜７、および１０のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項８または１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｘ１が、ＡｓｎまたはＡｓｐであり；
Ｘ２が、ＡｌａまたはＴｒｐであり；
Ｘ３が、ＶａｌまたはＬｅｕであり；
Ｘ４が、Ｔｒｐであり；
Ｘ５が、Ｇｌｕであり；
Ｘ６が、Ｔｈｒであり；
Ｘ７が、Ｇｌｙであり；および
Ｘ８が、アミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−デヒドロブチリンから成る、またはアミノ酸配列Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａから成るアミノ酸配列である、
請求項１〜４、６、７、９および１２のいずれか１項に記載のペプチド、請求項５〜７、１０および１２のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項８、１１および１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
Ｘ１が、Ａｓｎであり；
Ｘ２が、Ａｌａであり；
Ｘ３が、Ｖａｌであり；
Ｘ４が、Ｔｒｐであり；
Ｘ５が、Ｇｌｕであり；
Ｘ６が、Ｔｈｒであり；
Ｘ７が、Ｇｌｙであり；および
Ｘ８が、アミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−デヒドロブチリンから成るアミノ酸配列である、
請求項１〜４、６、７、９、１２および１３のいずれか１項に記載のペプチド、請求項５〜７、１０、１２および１３のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項８、および１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｘ１が、Ａｓｐであり；
Ｘ２が、Ｔｒｐであり；
Ｘ３が、Ｌｅｕであり；
Ｘ４が、Ｔｒｐであり；
Ｘ５が、Ｇｌｕであり；
Ｘ６が、Ｔｈｒであり；
Ｘ７が、Ｇｌｙであり；
Ｘ８が、アミノ酸配列Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａから成るアミノ酸配列である、
請求項１〜４、６、７、９、１２および１３のいずれか１項に記載のペプチド、請求項５〜７、１０、１２および１３のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項８、および１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
医薬としての使用のための、請求項１４に記載のペプチドと請求項１５に記載のペプチドとの組み合わせ物。
【請求項１７】
前記医薬組成物が、医薬的に許容し得る担体および／または希釈剤をさらに含む、請求項１６に記載の組み合わせ物を含む医薬組成物。
【請求項１８】
ウイルス感染を治療および／または予防する際の使用のための、請求項１６に記載の組み合わせ物または請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記ウイルス感染が、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、およびＨＣＶから選択されるウイルスのいずれか１つの感染である、請求項１６または１８に記載の使用のための組み合わせ物、または請求項１７または１８に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項２０】
ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、およびＨＣＶから選択されるウイルスのいずれか１つの感染を治療および／または予防する方法であって、ここで、その方法が、請求項１６に記載の組み合わせ物または請求項１７に記載の医薬組成物の有効量を、斯かる処理を必要としている対象に投与することを含む方法。
【請求項２１】
前記ペプチド、組み合わせ物または医薬組成物が、その他の少なくとも１つの活性物質と同時投与される、請求項１〜４、６、７、９および１２〜１５のいずれか１項に記載のペプチド、請求項５〜７、１０、１２〜１５および１７〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物、請求項８、１１〜１５および２０のいずれか１項に記載の方法、または請求項１６、１８および１９のいずれか１項に記載の組み合わせ物。
【請求項２２】
前記その他の活性物質が、ＣＭＶ阻害剤、ＫＳＨＶ阻害剤、ＲＳＶ阻害剤、ＤＥＮＶ阻害剤、ＣＨＩＫＶ阻害剤、ＴＢＥＶ阻害剤、ＶＳＶ阻害剤、ＺＩＫＶ阻害剤、またはＨＣＶ阻害剤である、請求項２１に記載のペプチド、請求項２１に記載の医薬組成物、請求項２１に記載の方法、または請求項２１に記載の組み合わせ物。
【請求項２３】
前記ペプチド、組み合わせ物または医薬組成物が、経口的、静脈内、皮下または筋肉内に投与されるべきである、請求項１〜４、６、７、９、１２〜１５、２１および２２のいずれか１項に記載のペプチド、請求項５〜７、１０、１２〜１５、１７〜１９、２１および２２のいずれか１項に記載の医薬組成物、請求項８、１１〜１５および２０〜２２のいずれか１項に記載の方法、または請求項１６、１８、１９、２１および２２のいずれか１項に記載の組み合わせ物。
【請求項２４】
前記ウイルスがＣＭＶである、請求項１〜４、６、７、９、１２〜１５および２１〜２３のいずれか１項に記載のペプチド、請求項５〜７、１０、１２〜１５、１７〜１９および２１〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物、請求項８、１１〜１５および２０〜２３のいずれか１項に記載の方法、または請求項１６、１８、１９および２１〜２３のいずれか１項に記載の組み合わせ物。
【請求項２５】
前記ウイルスがＤＥＮＶである、請求項１〜４、６、７、９、１２〜１５および２１〜２３のいずれか１項に記載のペプチド、請求項５〜７、１０、１２〜１５、１７〜１９および２１〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物、請求項８、１１〜１５および２０〜２３のいずれか１項に記載の方法、または請求項１６、１８、１９および２１〜２３のいずれか１項に記載の組み合わせ物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規ラビリントペプチン誘導体に関する。これらのラビリントペプチン誘導体は、例えばヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮＶ）、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ；ＦＳＭＥウイルス）、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ジカウイルス（ＺＩＫＶ）、および／またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の感染によって引き起こされる感染症などの感染症の治療に有用である。前記ラビリントペプチン誘導体はまた、ラビリントペプチンの作用機序を分析するのにも有用である。また、感染症、特にＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、およびＨＣＶから選択されるウイルスのいずれか１つの感染によって引き起こされる感染症を治療する際の使用のためのラビリントペプチンも本発明によって包含される。本発明はさらに、例えば、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶの感染によって引き起こされる感染症を治療するための医薬としての使用のためのラビリントペプチンＡ１とＡ２の組み合わせ物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ランチビオティックは、ブドウ球菌、乳酸菌および放線菌などの細菌からリボゾームにより合成されるペプチドである。ランチビオティックの共通の構造的特徴は、このペプチドに構造的安定性を付与する非標準アミノ酸ランチオニンである。ラビリントペプチンは、新種の炭素環式ランチビオティックであり、１９８８年にアクチノマヅラ・ナミビエンシス（Actinomadura namibiensis）で同定された（Drug Discovery from Natural Products, Kap. 3, S. 49ff）。それらは、ラビオニンと称される独特な炭素環式の翻訳後修飾アミノ酸を有する、新型のランチビオティックの代表である。ラビオニンの化学構造は図１（Ｂ）に示される。
【０００３】
ラビリントペプチンの構造は、２００８年に発表された（ＷＯ２００８／０４０４６９およびMeindl, 2010, Angew. Chem. Int. Ed. 49, 1151-1154）。ラビリントペプチン、特にラビリントペプチンＡ１（ＬａｂＡ１またはＬａｂｙＡ１とも呼ばれる）およびラビリントペプチンＡ２（ＬａｂＡ２またはＬａｂｙＡ２とも呼ばれる）はいくつかの興味深い生物学的活性を有する。例えば、ＬａｂｙＡ２は、マウスモデルにおいて神経因性疼痛に対して素晴らしい有効性を示す。ＬａｂｙＡ１は、最近、インビトロにおいてμモル以下の濃度にてＨＩＶおよびＨＳＶの両方を阻害することが示された（Ferir, 2013, PLOS one, 8(5):e64010）。その化合物は、ウイルスエンベロープと相互作用することによってウイルスの侵入を妨げること、および細胞間伝播を予防することが示唆された（Meyerhans, 2015, Nat. Prod. Rep., 2015, 32, 29-48）。ＬａｂｙＡ１は、耐性ＨＩＶおよびＨＳＶウイルスに対して有効であるが、それは末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）における炎症反応を引き起こさない。また、デングウイルス（ＤＥＮＶ）に対するＬａｂｙＡ１の抗ウイルス活性も記載された（Dominique Schols, HVBD meeting 2013）。ラビリントペプチンの作用機序を特定することは、これらの分子で治療されるさらなる（感染性）疾患の識別への道を開く可能性がある。
【０００４】
それでも、ウイルス感染は、毎年数百万人を死に追いやる世界的な問題である。例えば、北米および欧州の人口の１〜３％、および赤道アフリカのいくつかの地域の人口の最大５０％がカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ、ヒトヘルペスウイルス８、ＨＨＶ８、またはＫＳ病原体）に感染するか、または感染した。加えて、台湾の乳癌患者の約４％がＫＳＨＶ感染していることが示された。
【０００５】
ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ、ＨＣＭＶとも呼ばれる）は、あらゆる地理的位置および社会経済的集団にわたって見られ、工業国において成人の６０％〜７０％、そして新興国においてほぼ１００％が感染する。ＣＭＶ感染症は健康な人々では典型的に気付かないが、例えばＨＩＶ感染者、臓器移植受容者、または新生児などの免疫的無防備状態では命にかかわることもある。感染後に、ＣＭＶは一生を通じて体内で潜伏状態を維持するので、いつでも再活性化できる。最終的に、それは粘膜表皮癌、そしてもしかすると前立腺癌などの他の悪性腫瘍を引き起こす可能性がある。
【０００６】
デングウイルス（ＤＥＮＶ）は、自己制限性デング熱（ＤＦ）から出血性デング熱（ＤＨＦ）またはデング熱ショック症候群（ＤＳＳ）と呼ばれる命にかかわる症候群まで、ヒトに広範囲に及ぶ疾患を引き起こす。現在、利用可能なＤＥＮＶに対するヒトワクチンは存在しない。
【０００７】
さらに、ランセット（２０１５）および疾病対策センター（ＣＤＣ）は、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ、ｈＲＳＶとも呼ばれる）が５歳未満の小児の罹患率および死亡率の主な原因であり、そして、高齢および免疫不全状態の患者の重大な問題であることを公表している。約７０％の小児が、彼らの最初の誕生日以前に感染している。年齢が２歳の時点で、ほとんどすべての小児がＲＳウイルス感染した。しかしながら、死亡率は比較的低く、リスクのある２歳未満の小児にとって、ＲＳＶが危険を伴うのは、より年長の患者にとっても同様である。実際には、ＣＤＣよると、約１４，０００人の主に年配の患者が２０１４年にＲＳウイルス感染のため米国で死亡した。現在、下部気道（下部気道感染症、ＬＲＴＩ）のＲＳウイルス感染に対して効果的な治療がない。ＲＳＶの季節的な予防治療またはＲＳウイルス感染の予防のために承認されたいくつかの薬剤がある。しかしながら、これらのいくつかの薬物が重大な副作用を有する。
【０００８】
チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）は、アエデス蚊が刺すことによって伝播される病原性ＲＮＡウイルスである。それは、発熱、多発性関節痛、皮疹を引き起こし、通常、短い兆候期間の後に取り除かれる。しかしながら、症状の慢性化は、症状のある患者の一部に現れ、そして、障害、疲労感、および鬱病を併発した有痛性かつ消耗性の、炎症性関節痛を引き起こした。最近、かつ、進行中の大発生は、グローバル化によって促進され、かつ、拡大された媒介生物の使用が科学的および公共の健康意識を高めた。特異的な抗ウイルス治療がなく、また利用可能な保護的ワクチンも存在しない。
【０００９】
ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）は、ダニ媒介性脳炎（ＴＢＥ）に関連するウイルスである。ＴＢＥは、中枢神経系におけるウイルス感染症である。この疾患はほとんどの場合髄膜炎、脳炎、または髄膜脳炎として表れる。ＴＢＥは、神経障害として認識されるのが最も一般的であるが、軽い発熱が起こることもある。持続的もしくは永続的な神経精神病学の後遺症は、感染患者の１０〜２０％で観察される。報告症例数はほとんどの国で増加している。この疾患はいったん発症すると不治であるので、ＴＢＥに特異的な薬剤治療法は存在しない。症候性脳損傷は、症候群の重症度に基づく入院と対症療法を必要とする。
【００１０】
ジカ−ウイルス（ＺＩＫＶ）はジカ熱を引き起こす。ジカ−ウイルスは、非分節型の、１本鎖のポジティブセンスＲＮＡゲノムを有し、そして、アエデス蚊によって伝染される。ジカウイルスは、デング熱、黄熱、日本脳炎、および西ナイルウイルスに関連する。ジカ熱（ジカウイルス感染症としても知られている）は、無症状であることも多いが、症状を呈するときは、その症状は通常、軽症であり、デング熱に類似していることがある。症状としては、発熱、眼の充血、関節痛、頭痛、および斑状丘疹状皮疹が挙げられる。しかしながら、妊娠中の女性における感染はまた、新生児を感染させることもあるので、流産や小頭症につながった。ジカ熱に対する有効なワクチンは存在しない。
【００１１】
水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、昆虫、ウシ、ウマ、およびブタに感染する病原性ＲＮＡウイルスである。ＶＳＶはヒトではインフルエンザ様症状を引き起こす動物原性感染症である。そのウイルスは昆虫によって伝播される。利用可能な特定の治療が存在しない。
【００１２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、主に肝臓を侵す感染症であるＣ型肝炎を引き起こす。ウイルスは、最初に感染したものの約７５％〜８５％で肝臓に存在する。慢性ＨＣＶ感染は、肝臓疾患、および時折、肝臓硬変症につながることが多い。肝臓硬変症は、肝不全、肝臓癌、または食道および胃静脈瘤の発症の原因となり得る。世界的に、１３０００〜１５０００万人が、慢性Ｃ型肝炎感染症に罹患している（"Hepatitis C Fact sheet N°164", WHO, July 2015, Retrieved 4 February 2016）。現在のところ、Ｃ型肝炎に対する利用可能なワクチンは存在しない。
【００１３】
よって、特にＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶの感染から生じる感染症の治療および／または予防のために、さらなる抗ウイルス薬剤を見つける必要がある。加えて、ラビリントペプチンの作用機序を解く新規手段および方法もまた必要である。
【００１４】
よって、本発明の基礎となる技術的問題は、ウイルス感染の治療および／または予防のため、特にＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶの感染の治療および／または予防のための手段と方法の規定；ならびにラビリントペプチンの作用機序を分析するための手段と方法の規定である。
【００１５】
その技術的問題は、特許請求の範囲で特徴づけた実施形態の規定によって解決される。
【発明の概要】
【００１６】
従って、本発明は、以下のアミノ酸配列：
【化１】
2018538276.tif 000002
｛式中、
Ｌａｂは、ラビオニンであり；
Ｘ１は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、およびＧｌｕから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ａｌａ、Ｔｒｐ、およびＳｅｒから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ４は、ＴｒｐおよびＴｙｒから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ５は、ＧｌｕおよびＡｓｐから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ６は、ＴｈｒおよびＳｅｒから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ７は、ＧｌｙおよびＰｒｏから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ８は、３〜５個のアミノ酸から成る配列から成り；
Ｒ１は、Ｈ、（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル、Ｃ（Ｏ）−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル、Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル、およびＣ（Ｏ）ＮＨ−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニルから選択され；ここで、Ｒ１は、末端位置にアルキニル基を担持し；
Ｒ２は、Ｈ、［Ｃ（Ｏ）］−ＮＨ−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニルまたは［Ｃ（Ｏ）］−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニルから選択される；ここで、部分［Ｃ（Ｏ）］は末端アミノ酸のカルボニル基であり；ここで、Ｒ２は、末端位置にアルキニル基を担持し；ここで、Ｒ１がＨであれば、Ｒ２はＨでない｝を含むかまたはそれらから成るペプチド（すなわち、ラビリントペプチン誘導体）に関する。
【００１７】
本明細書中で以下に、および添付の実施例に記録されるように、例えば抗ウイルス薬剤またはマーカー分子などの化合物を用いてさらに誘導体化され得るラビリントペプチン誘導体が得られたので、本発明は上記同定された技術的問題を解決する。これらのラビリントペプチン誘導体は、（例えば、抗ウイルス薬剤への連結によって）より効果的な抗ウイルス治療を可能にし、また、（例えば、マーカー分子への連結によって）ラビリントペプチンの作用機序のより詳細な分析も可能にする。以上に触れたように、ラビリントペプチンの作用機序を理解すると、さらなる有効な抗ウイルス薬剤の開発への道が開かれる。
【００１８】
本発明のラビリントペプチン誘導体は、特にＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶに対して、好ましくはＤＥＮＶに対して抗ウイルス活性がある。
【００１９】
例えばラビリントペプチンなどの化合物の抗ウイルス活性を試験するためのアッセイは、当該技術分野で一般的に知られている。例えば、本発明のラビリントペプチン誘導体の抗ウイルス活性について試験するために、ラビリントペプチン誘導体を細胞（例えば、Ｈｕｈ−７．５細胞）に追加してもよい。次に、細胞は、試験されるべきウイルス（例えば、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶ、好ましくはＤＥＮＶ）に感染させてもよい。ウイルス陽性細胞の量は免疫細胞化学によって評価され得る。例えば、ウイルスに対する一次抗体、および結合したフルオロフォアを有する二次抗体が適用されてもよい。全細胞の数は、ＤＡＰＩ染色核をカウントすることによって決定され得る。よって、ウイルス陽性細胞のパーセンテージが算出され得る。得られた結果は好ましくは非感染細胞と比較される。
【００２０】
より詳細には、ラビリントペプチン、ラビリントペプチン誘導体またはラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体の組み合わせ物の抗ウイルス活性を試験するために、Ｈｕｈ−７．５細胞（例えば、１ウェルあたり３×〔１０〕＾４）は感染の１日前に、完全成長培地中、黒色の９６ウェル光学底面プレート［Nunc］内に播種されてもよい。ＰＢＳで洗浄した後に、４０μｌのアッセイ培地（５％のＦＢＳ）が、本発明のラビリントペプチン、本発明のラビリントペプチン誘導体（終濃度５０、１６．７、５．５６、１．８５、０．６２、０．２１、０．０６９μｇ／ｍｌ）またはラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体の組み合わせ物（それぞれ２５、８．３、２．８、０．９３、０．３１、０．１０、０．０３４μｇ／ｍｌ）を含む細胞に追加されてもよい。治療は、好ましくは二連でおこなわれる。ＰＢＳは対照としての役割を果たす。３０分間のインキュベーション後に、細胞に０．５のＭＯＩにてウイルスを感染させて、６０μｌ／ウェルの終量を得てもよい。（例えば、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶ、好ましくはＤＥＮＶ、例えば、ＤＥＮＶ、２型 ニューギニアＣ株）。室温にて２時間のインキュベーション後、細胞はＰＢＳで洗浄され、そして、１００μｌのアッセイ培地がウェルごとに加えられ得る。感染細胞は、さらに４８時間インキュベートされ得る。以降、ウェルから培地が取り出され、そして、４％のＰＦＡで細胞が固定され得る。固定化細胞は、ＰＢＳで広範囲に洗浄され、そして、０．２５％のTritonX-100で５分間、透過処理され得る。ＰＢＳ中の５％ ＦＢＳでのブロッキング後に、ウイルスに対する一次抗体が、２時間適用され得る（例えば、抗デング熱ウイルスＥ糖タンパク質抗体［ＤＥ１］（ａｂ４１３４９）［Abcam］、５％のＦＢＳ／ＰＢＳ中、１：１００希釈）。洗浄後、二次抗体（例えば、Alexa Fluor（登録商標）488ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）［Life Technologies］、５％のＦＢＳ／ＰＢＳ中、１：１０００希釈）が１時間適用され得る。最後に、細胞はＤＡＰＩ（ＰＢＳ中、５００ｎｇ／ｍｌ）で５分間染色され得る。
【００２１】
蛍光細胞は、自動化顕微鏡ImageXpressMicro［Molecular Devices］およびMetaXpressソフトウェアを使用した高精細画像化によって分析できる。励起波長は３６０ｎｍ（ＤＡＰＩ）および４８５ｎｍ（Alexa Fluor488）に設定され得、そして、発光波長は４６０ｎｍ（ＤＡＰＩ）および５１６ｎｍ（Alexa Fluor488）に設定され得る。６つの部位／ウェルの画像が取得され得る（２列、８９μｍ間隔、３行、６７μｍ間隔）。全細胞／部位の数は、ＤＡＰＩ染色核を自動的にカウントすることによって測定され得る。ウイルス陽性細胞（例えば、ＤＥＮＶ陽性細胞）のパーセンテージは、総細胞数に対するAlexa Fluor 488陽性細胞数を自動的に評価することによって計算され得る。６つの部位から得られた値は、平均化され、そして、片対数Ｘ／Ｙチャートにプロットされ得る。ＩＣ５０値は非線形回帰によって計算され得る。
【００２２】
先に記載のとおり、本発明のラビリントペプチン誘導体において、Ｒ１またはＲ２がアルキニルである場合、その時、アルキニル基が末端の位置にある。先に記載したように、Ｒ１が尿素誘導体（すなわち、Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル）であってもよく、および／またはＲ２がアミド（すなわち、［Ｃ（Ｏ）］−ＮＨ−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル）またはエステル（すなわち、［Ｃ（Ｏ）］−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル）であってもよい。好ましくは、Ｒ２はＨであり、そして、Ｒ１は、Ｒ１について先に言及したアルキニル化合物のうちの１つを担持する。よって、好ましくは、Ｒ２はＨであり、そして、Ｒ１は、（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル、Ｃ（Ｏ）−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル、Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル、およびＣ（Ｏ）ＮＨ−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニルから成る群から選択されるアルキニル化合物である。より好ましくは、Ｒ２はＨであり、そして、Ｒ１は、Ｃ（Ｏ）−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニルである。最も好ましくは、Ｒ２はＨであり、そして、Ｒ１はヘキサ−５イノイルである。言及されるように、Ｒ１がアルキニルである場合、その時、アルキニル基が末端の位置にある。
【００２３】
本発明のラビリントペプチン誘導体には、末端アルキン群（すなわち、アルキニル基）がある。よって、本発明のラビリントペプチン誘導体は、双極子環付加によって、特に「アジド−アルキンヒュスゲン環付加」（Huisgen, 1961, Proceedings of the Chemical Society of London, 357）によってアジドでさらに誘導体化され得る。よって、本発明は、本発明のラビリントペプチン誘導体に関し、ここで、Ｒ１および／またはＲ２は、アジド標識化合物によって誘導体化される。前記化合物は、抗ウイルス薬剤またはマーカー分子から選択される化合物であってもよい。
【００２４】
先に記載したラビリントペプチン誘導体に連結される抗ウイルス薬剤は、ラビリントペプチン誘導体の抗ウイルス活性をさらに促進し得る。例えば、アジド標識化合物の化合物として使用され得る好適な抗ウイルス薬剤は、アシクロビル、ペンシクロビル、ジドブジン、ブリブジン、シドホビル、ＨＤＶＤ（Ｌ−ジオキソランウラシル誘導体）、イドクスウリジン、ファムシクロビル、ソリブジン、バラシクロビル、シドホビル、ブリンシドホビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット、マリバビル、ＣＭＶＩＧ、レテルモビル、レフルノミド（関節リウマチにおいて病態修飾剤として使用される、代謝拮抗剤はまた、ＣＭＶ疾患治療および予防の両方で首尾よく承認適応症外使用された）、ＲＳＶ６０４（Challa, 2015, Antimicrob Agents Chemother 59(2): 1080-7）、ＡＬＳ−８１７６（Challa, 2015, Antimicrob Agents Chemother 59(2): 1080-7）、ＧＳ−５８０６（Ｇｉｌｅａｄ（登録商標））、または低分子阻害剤（DeVincenzo,  2014, Proc Natl Acad Sci U S A 107(19): 8800-5.）である。抗ウイルス薬剤はまた、ＮＩＴＤ−００８またはバラピラビルであってもよい。
【００２５】
本明細書中に示したラビリントペプチン誘導体にマーカー分子を連結することによって（双極子環付加）、ラビリントペプチンの作用機序が分析され得る。例えば、ラビリントペプチン誘導体をマーカー分子に連結することによって、感染細胞内のラビリントペプチンの位置、および／またはラビリントペプチンとウイルス粒子との相互作用が、分析され得る。そのため、蛍光顕微鏡法、化学蛍光顕微鏡法、化学発光顕微鏡法、電子顕微鏡法、核磁気共鳴ベースのシステムまたは放射性同位元素ベースのシステムなどの画像分析法が使用され得る。
【００２６】
アジド標識化合物の化合物として使用され得る好適なマーカー分子は、次に記載のものである。特に、本明細書中における用語「（単数もしくは複数の）マーカー分子」または「（単数もしくは複数の）マーカー」は、互換的に使用され、検出可能なシグナルを、好ましくは直接的または間接的に生じさせることができる標識またはマーカーを指す。例えば、マーカー分子は、放射性同位元素、フルオロフォアまたは化学発光（発色団）化合物、酵素、造影剤、磁気または常磁性標識、または金属イオンであってもよい。「（単数もしくは複数の）マーカー分子」という用語はフルオロフォアを含む。「フルオロフォア」という用語は、ジメチルアミノクマリン誘導体、好ましくは７−ジメチルアミノクマリン−４−酢酸スクシンイミジルエステル、ダンシル、５／６−カルボキシフルオレセインおよびテトラメチルローダミン、ＢＯＤＩＰＹ−４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／５５０−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ−６５０／６６５−Ｘ、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５３２、Ａｌｅｘａ５４６、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ６３５、Ａｌｅｘａ６４７、Ｃｙａｎｉｎｅ３（Ｃｙ３）、Ｃｙａｎｉｎｅ３Ｂ（Ｃｙ３Ｂ）、Ｃｙａｎｉｎｅ５（Ｃｙ５）、Ｃｙａｎｉｎｅ５．５（Ｃｙ５．５）、Ｃｙａｎｉｎｅ７（Ｃｙ７）、Ｃｙａｎｉｎｅ７．５（Ｃｙ７．５）、Ａｔｔｏ４８８、Ａｔｔｏ５３２、Ａｔｔｏ６００、Ａｔｔｏ６５５、ＤＹ−５０５、ＤＹ−５４７、ＤＹ−６３２、ＤＹ−６４７；蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および異なった吸収／発光特性を有するＧＦＰの修飾形など、から成る群から選択される化合物を含む。本明細書中における「マーカー分子」はまた、これらの錯体が蛍光ナノ結晶（量子ドット）として使用されるので、特定の稀土類金属（例えば、ユーロピウム、サマリウム、テルビウムまたはジスプロシウム）の錯体であってもよい。より好ましくは、「マーカー分子」は、ジメチルアミノクマリン誘導体、好ましくは７−ジメチルアミノクマリン−４−酢酸スクシンイミジルエステル、ダンシル、５／６−カルボキシフルオレセインおよびテトラメチルローダミン、ＢＯＤＩＰＹ−４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／５５０−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ−６５０／６６５−Ｘ、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５３２、Ａｌｅｘａ５４６、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ６３５、Ａｌｅｘａ６４７、Ｃｙａｎｉｎｅ３（Ｃｙ３）、Ｃｙａｎｉｎｅ３Ｂ（Ｃｙ３Ｂ）、Ｃｙａｎｉｎｅ５（Ｃｙ５）、Ｃｙａｎｉｎｅ５．５（Ｃｙ５．５）、Ｃｙａｎｉｎｅ７（Ｃｙ７）、Ｃｙａｎｉｎｅ７．５（Ｃｙ７．５）、Ａｔｔｏ488、Ａｔｔｏ５３２、Ａｔｔｏ６００、Ａｔｔｏ６５５、ＤＹ−５０５、ＤＹ−５４７、ＤＹ−６３２、およびＤＹ−６４７から成る群から選択されるフルオロフォアである。光学画像化部分の好ましい例は、カルバシアニン、オキサシアニン、チアシアニン、およびアザシアニンから成る群以外のシアニン色素である。シアニン色素は、いずれかの末端で終端となった、単独および複数の、好ましくは二重の炭素−炭素結合を、その一方が四級化されたアミノ基によって交替することによって連結された、奇数の炭素原子を含むポリエン鎖によって規定された化合物である。シアニンおよび類似体アリール−リンカー−アリール発色団は、ペンダントまたは融合環置換基を任意選択で担持する。シアニン色素は、広範囲のスペクトル特性および利用可能な構造的な変化のため特に有用である。さまざまなシアニン色素が周知であり、かつ、試験されて、それらは、低毒性を有し、かつ、市販されている。シアニン色素は、良好な水溶解度を有する非常に強い色素の単独ファミリーである。それらは、ｐＨ３〜１０の間でｐＨ無反応であり、低い非特異的結合を示し、およびフルオレセインより光安定性である。
【００２７】
本明細書中、アジド標識化合物に使用される「マーカー分子」はまた、放射性マーカーであってもよい。診断放射性医薬品に好適な放射性同位元素の例は以下に示される。陽電子断層撮影（ＰＥＴ）のために使用できる放射性同位元素は、例えば、１８Ｆ、１１Ｃ、６４Ｃｕ、１３Ｎ、１５Ｏ、または６８Ｇａである。γ線／光子（ＳＰＥＣＴ／シンチグラフィ）に使用できる放射性同位元素の例は、例えば９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、５７Ｃｏ、１５３Ｓｍ、１３３Ｘｅ、５１Ｃｒ、８１ｍＫｒ、２０１Ｔｌ、６７Ｇａ、または７５Ｓｅである。質量サイトメトリのために、金属ベースのマーカーが使用され得る。放射性同位元素マーカー（特に先に記載した金属）は、例えば、金属キレート剤（例えば、ＤＯＴＡまたはＮＯＧＡＤＡ部分）を使用することによって停止を含むアジドに取り付けられる場合がある。
【００２８】
本発明との関連において、アジド標識化合物の「化合物」はまた、抗体、例えば本発明のラビリントペプチン誘導体を特定の細胞、組織または臓器に誘導する抗体でもあり得る。例えば、その抗体は、ラビリントペプチン誘導体を肝臓に（例えば、肝細胞に）誘導する。ＤＥＮＶ感染症の治療のために、抗体は、ラビリントペプチン誘導体を免疫系の細胞に（例えば、Ｔ細胞またはランゲルハンス樹状細胞に）誘導し得る。ヘルペスウイルスの感染症の治療のために、抗体は、ラビリントペプチン誘導体を神経細胞に（例えば、希突起膠細胞またはニューロンに）誘導し得る。ＲＳＶの感染症の治療のために、抗体は、ラビリントペプチン誘導体を肺に（例えば、肺胞に）誘導し得る。ＣＨＩＫＶの感染の治療のために、抗体は、ラビリントペプチン誘導体を、筋肉、関節または神経組織に誘導し得る、例えばＴＩＭ−１などの接合因子を指図する。ＴＢＥＶの感染症の治療のために、抗体は、ラビリントペプチン誘導体を中枢神経組織（脳、脊髄）の細胞に誘導し得る。ＺＩＫＶの感染症の治療のために、抗体は、ラビリントペプチン誘導体を皮下組織、中枢神経系、骨格筋または心筋に誘導し得る。ＨＣＶの感染症の治療のために、抗体は、ラビリントペプチン誘導体を肝臓に（例えば、肝細胞に）誘導し得る。
【００２９】
添付の実施例は、アジド標識ビオチンを用いたＬａｂｙＡ１およびＬａｂｙＡ２の誘導体化を示す。よって、本発明の好ましい態様において、アジド標識化合物はアジド標識ビオチンである。
【００３０】
よって、本発明は、ラビリントペプチン誘導体を提供するが、ここで、Ｒ１および／またはＲ２の末端アルキニル基とアジド標識化合物との間の双極子環付加を介して、前記化合物が付加されて、Ｒ１’および／またはＲ２’を得る。または、言い換えれば、本発明により、化合物は、双極子環付加を介してラビリントペプチン誘導体に付加され得る。この双極子環付加は、Ｒ１および／またはＲ２の末端のアルキニル基とアジド標識化合物のアジド基との間で起こる。この双極子環付加は、Ｒ１をＲ１’に変換し、および／またはＲ２をＲ２’に変換する。潜在Ｒ１およびＲ２、ならびに対応するＲ１’およびＲ２’の要約を以下に示す。
【００３１】
先に記載したように、Ｒ１は、（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル、Ｃ（Ｏ）−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル、Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル、またはＣ（Ｏ）ＮＨ−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル｛式中、Ｒ１は末端位置にアルキニル基を担持する｝であり得る。先にも記載したように、Ｒ２は、［Ｃ（Ｏ）］−ＮＨ−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニルまたは［Ｃ（Ｏ）］−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル｛式中、［ＣＯ］は末端アミノ酸のカルボニル基であり、かつ、式中、Ｒ２は末端位置にアルキニル基を担持する｝であり得る。
【００３２】
これらのＲ１およびＲ２基のそれぞれに対応するＲ１’およびＲ２’基が以下の表１および２に示されている。
【００３３】
表１：潜在Ｒ１基と対応するＲ１’基
【００３４】
【表１】
2018538276.tif 000003
【００３５】
表２：潜在Ｒ２基と対応するＲ２’基
【００３６】
【表２】
2018538276.tif 000004
【００３７】
よって、本発明のラビリントペプチン誘導体では、Ｒ１および／またはＲ２の末端アルキニル基とアジド標識化合物との間の双極子環付加が起こり、化合物（例えば、抗ウイルス薬剤またはマーカー分子）がＲ１および／またはＲ２に結合するトリアゾールを得てもよかった。前記化合物は、先に記載したように、抗ウイルス薬剤またはマーカー分子のいずれであってもよい。よって、本発明はラビリントペプチン誘導体（例えば、ＬａｂｙＡ１またはＬａｂｙＡ２の誘導体）に関し、そしてそれは、抗ウイルス薬剤またはマーカー分子を含む。または、言い換えれば、本発明は、本明細書中に示したラビリントペプチン誘導体に関し、そしてそれは、Ｒ１の代わりにＲ１’、および／またはＲ２の代わりにＲ２’を含む。好ましくは、前記ラビリントペプチン誘導体は、Ｒ１の代わりにＲ１’を含み、かつ、Ｒ２はＨである。
【００３８】
添付の実施例は、本発明のラビリントペプチン誘導体には、例えば、ＤＥＮＶ感染症に対して抗ウイルス活性があることを実証する。よって、本発明の一態様は、医薬としての使用のための本明細書中に示したラビリントペプチン誘導体に関する。本発明のラビリントペプチン誘導体を含む医薬組成物もまた、本発明に包含され、ここで、その医薬組成物は医薬的に許容し得る担体および／または希釈剤をさらに含む。本発明はさらに、感染症、特にウイルス感染を治療および／または予防する際の使用のための、本発明のラビリントペプチン誘導体または本発明の医薬組成物に関する。
【００３９】
よって、本発明のラビリントペプチン誘導体または医薬組成物は、現在存在しているウイルス感染の治療またはウイルス浸潤の出現の予防の両方に使用できる。本発明のラビリントペプチン誘導体または本発明の医薬組成物が現在存在しているウイルス感染を治療するのに使用されることが、本明細書において好ましい。前記ウイルス感染は、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、およびＨＣＶから選択されるウイルスのいずれか１つ、好ましくはＤＥＮＶの感染であり得る。前記感染症（すなわち、前記感染性疾患）はまた、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、およびＨＣＶから選択される少なくとも２つのウイルスの感染症の組み合わせが原因となってもよい。
【００４０】
従って、本発明は、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、およびＨＣＶから選択されるウイルスのいずれか１つ、好ましくはＤＥＮＶの感染を治療および／または予防する方法に関し、ここで、その方法は、斯かる治療を必要としている対象に本発明のラビリントペプチン誘導体または前記ラビリントペプチン誘導体を含む医薬組成物の有効量を投与することを含む。
【００４１】
例えば、本発明の一態様は、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶおよびＺＩＫＶから選択されるウイルスのいずれか１つ、好ましくはＤＥＮＶの感染を治療および／または予防する方法に関し、ここで、その方法は、斯かる治療を必要としている対象に本発明のラビリントペプチン誘導体または前記ラビリントペプチン誘導体を含む医薬組成物の有効量を投与することを含む。
【００４２】
本明細書中の「ウイルス感染」または「ウイルスの感染」は感染症を意味し、そしてそれは、ウイルスの感染が原因である。
【００４３】
ＬａｂｙＡ１およびＬａｂｙＡ２の抗ウイルス活性は従来技術により示された。特に、マイコウイルス（ＲＮＡウイルス／インフルエンザＡ型）、単純ヘルペスウイルス１および２、アデノウイルス（ＤＮＡウイルス）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）、およびウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）に対するこれらの物質の抗ウイルスの活性が示された（ＷＯ２００８／０４０４６９Ａ１；Ferir, 2013, PLOS one, 8(5):e64010；およびMeyerhans, 2015, Nat. Prod. Rep., 2015, 32, 29-48）。加えて、先に記載したように、ＨＩＶおよびＤＥＮＶに対するＬａｂｙＡ１の活性は当該技術分野で知られている。しかしながら、従来技術はまた、ラビリントペプチンの抗ウイルス作用が、高度にウイルス特異的であることも開示する。特に、Ferirら（2013, PLOS one, 8(5):e64010）は、インフルエンザウイルスＨ１、Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、およびインフルエンザＢウイルスに対して抗ウイルス活性を示したものは、試験したランチビオティックになかったことを開示する。加えて、この文書は、ＬａｂｙＡ１がウイルス自身と相互作用し、ＣＤ４＋Ｔ細胞と相互作用していないことを実証するデータを示す。これらのデータは、ラビリントペプチンが特定の選択されたウイルス種と特異的かつ直接的な相互作用によって作用することを示唆する。対照的に、本発明との関連において、驚いたことに、ＬａｂｙＡ１およびＬａｂｙＡ２がＣＭＶ、ＫＳＨＶ、ＲＳＶ、ＴＢＥＶ、ＺＩＫＶ、およびＨＣＶに対して非常に高い抗ウイルス活性を有し、ならびにＬａｂｙＡ１にまた、ＣＨＩＫＶおよびＶＳＶに対しても非常に高い抗ウイルス活性を有することがわかった。これらのウイルスは、従来技術により活性が示されているすべてのウイルスと完全に異なっている。ＲＳＶは、ＬａｂｙＡ１またはＬａｂｙＡ２の活性が従来技術により示されているすべてのウイルスとは全く関係ないパラミクソウイルスのウイルスのファミリーに属する。ＣＨＩＫＶは、トガウイルスのファミリーに属し；ＶＳＶはラブドウイルスのファミリーに属し；そして、ＨＣＶはフラビウイルスのファミリーに属する。これらのファミリーもまた、ラビリントペプチンの活性が従来技術により示されているウイルスと全く関係がない。（それに関するＬａｂｙＡ１およびＬａｂｙＡ２の抗ウイルス活性が既に実証された）ＨＳＶと同じく、ＫＳＨＶおよびＣＭＶはヘルペスウイルスのファミリーの代表である。しかしながら、ＫＳＨＶおよびＣＭＶは、異なる生物学的および病態生理学的な特性を有する。ＨＳＶは、そのメンバーが向神経性（神経系組織に感染する）であり、かつ、短い増殖周期（〜１８時間）を有するアルファヘルペスウイルス亜科のサブファミリーに属する。それらの一次標的細胞は、粘膜上皮細胞である。それらはニューロンで存続し得る。対照的に、ＫＳＨＶおよびＣＭＶは、それぞれガンマヘルペスウイルス亜科およびベータヘルペスウイルス亜科のサブファミリーに属する。ベータヘルペスウイルス亜科は、リンパ球向性であり、かつ、長い増殖周期を有する。それらは、制限された寄生範囲を有するので、感染細胞は拡大されるようになる（サイトメガロ）。アルファヘルペスウイルス亜科と比較して、それらは、ニューロ��ではなく、白血球におけるそれらの潜伏を確立する。ガンマヘルペスウイルス亜科もまた、リンパ球向性であって、ＴまたはＢリンパ球のいずれかに特異的である。ガンマヘルペスウイルス亜科およびベータヘルペスウイルス亜科は両方とも発癌性であり得るが、それに対して、アルファヘルペスウイルス亜科は発癌性ではない。ラビリントペプチンは、高度に特異的な作用機序を有すると記述されている。そのため、ＬａｂｙＡ１およびＬａｂｙＡ２が、ラビリントペプチンの抗ウイルス活性が当該技術分野で記載されていたウイルスと比較して、完全に異なる、選択ウイルスに対して抗ウイルス作用を有するという知見は、完全に予想されていない。
【００４４】
よって、本発明の別の態様は、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、およびＨＣＶから選択されるウイルスのいずれか１つの感染を治療および／または予防における使用のためのペプチド（すなわち、ラビリントペプチン）に関し、ここで、前記ペプチドは、以下のアミノ酸配列：
【化２】
2018538276.tif 000005
｛式中、
Ｌａｂは、ラビオニンであり；
Ｘ１は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、およびＧｌｕから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ａｌａ、Ｔｒｐ、およびＳｅｒから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ４は、ＴｒｐおよびＴｙｒから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ５は、ＧｌｕおよびＡｓｐから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ６は、ＴｈｒおよびＳｅｒから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ７は、ＧｌｙおよびＰｒｏから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ８は、３〜５個のアミノ酸から成る配列から成る｝を含むか、またはそれらから成る。
【００４５】
本発明のラビリントペプチンには、特にＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶに対する（例えば、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、および／またはＺＩＫＶに対する）、好ましくはＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶに対する；より一層好ましくはＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶに対する；より一層好ましくはＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶに対する；より一層好ましくはＣＭＶ、および／またはＨＣＶに対する；そして、最も好ましくはＣＭＶに対する、抗ウイルス活性がある。
【００４６】
アミノ酸ラビオニン（または、ラビオニン）、ならびにラビリントペプチンにおけるそれらの出現もまた、当該技術分野で公知であり、そして、例えば、Habich, Angew. Chem. Int. Ed., 2010, 49: 1151-1154.に記載されている。特に、ラビオニンは、ランチオニンとの類似において、実際には３つの残基にわたるアミノ酸である（図１を参照）。Ｃ−α原子は架橋に伸びている。ラビオニンの構造は図１に示されている。
【００４７】
本発明の別の態様は、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、およびＨＣＶから選択されるウイルスのいずれか１つの感染を治療および／または予防する際の使用のための、本発明のラビリントペプチンを含む医薬組成物に関し、ここで、医薬組成物は、医薬的に許容し得る担体および／または希釈剤をさらに含む。よって、本発明は、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、およびＨＣＶから選択されるウイルスのいずれか１つの感染を治療および／または予防する方法に関し、ここで、その方法は、斯かる治療を必要とする対象に、本発明のラビリントペプチンまたは前記ラビリントペプチンを含む医薬組成物の有効量を投与することを含む。前記ラビリントペプチンまたは前記医薬組成物は、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、およびＨＣＶから選択されるウイルスのいずれか１つのウイルス感染によって引き起こされる現在存在している感染症を治療するか、またはＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、およびＨＣＶから選択される少なくとも２つのウイルスの感染症の組み合わせによって引き起こされる現在存在しているウイルス浸潤を治療するのに使用されることが、本明細書では好ましい。
【００４８】
好ましくは、医薬組成物または治療法が、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶから選択される（例えば、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、および／またはＺＩＫＶから選択される）、より好ましくはＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶ；より一層好ましくはＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶから選択される；より一層好ましくはＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶから選択される；より一層好ましくはＣＭＶおよび／またはＨＣＶから選択される；そして、最も好ましくはＣＭＶから選択されるウイルスのいずれか１つの感染症を治療および／または予防するのに使用される。
【００４９】
本発明のラビリントペプチンまたは本発明のラビリントペプチン誘導体は、最大５０個のアミノ酸、より好ましくは最大４０個のアミノ酸、より一層好ましくは最大３０個のアミノ酸の長さを有し得る。よって、本発明の一態様は、本明細書中に示したラビリントペプチン誘導体、前記ラビリントペプチン誘導体を含む医薬組成物、または本明細書中に示した方法に関し、ここで、前記ペプチド（すなわち、前記ラビリントペプチン誘導体）は最大３０個のアミノ酸の長さを有する。類似して、本発明は、本明細書中に示したラビリントペプチン、前記ラビリントペプチンを含む本明細書中に示した医薬組成物、または本明細書中に示した方法に関し、ここで、前記ペプチド（すなわち、前記ラビリントペプチン）は最大３０個のアミノ酸の長さを有する。本発明のラビリントペプチンまたはラビリントペプチン誘導体が最大２５個のアミノ酸の長さを有することが、より一層好ましい。最も好ましくは、本発明のラビリントペプチンまたはラビリントペプチン誘導体は１８〜２０個のアミノ酸を有する。
【００５０】
前述のように、それぞれ、配列番号１および２に示される本発明のラビリントペプチンまたはラビリントペプチン誘導体において、Ｘ８は３〜５個のアミノ酸の配列から成る。例えば、Ｘ８は以下に示したアミノ酸配列Ｘ８−１〜Ｘ８−５：
Ｘ８−１は、不存在であるか、またはＴｒｐまたはＴｙｒから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ８−２は、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ８−３は、不存在であるか、またはＰｒｏおよびＧｌｙから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ８−４は、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、およびＴｙｒから選択されるアミノ酸であり；および
Ｘ８−５は、デヒドロブチリン、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、およびＳｅｒから選択されるアミノ酸である、から成り得る。
【００５１】
デヒドロブチリン（Ｄｈｂ）（ジデヒドロブチリンとも呼ばれる）は、ランチビオティックファミリーの抗微生物性ペプチドを含むペプチドの範囲内に存在する天然のアミノ酸である。実際は、ペプチド鎖へのデヒドロブチリンの部位選択的導入は、β脱離がそのあとに続くリン酸化によってトレオニン残基が脱水される、酵素的翻訳後修飾により生じる。ＬａｂｙＡ１内に存在するデヒドロブチリンの構造は、図２に示されている。
【００５２】
本明細書中に示したラビリントペプチンまたはラビリントペプチン誘導体に関する例では、Ｘ８はアミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−デヒドロブチリンから成る。あるいは、Ｘ８は、アミノ酸配列Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ。から成ってもよい。
【００５３】
本発明の一態様は、本明細書中に示したラビリントペプチン、ラビリントペプチン誘導体、医薬組成物、または方法に関し、ここで、
Ｘ１は、ＡｓｎまたはＡｓｐであり；
Ｘ２は、ＡｌａまたはＴｒｐであり；
Ｘ３は、ＶａｌまたはＬｅｕであり；
Ｘ４は、Ｔｒｐであり；
Ｘ５は、Ｇｌｕであり；
Ｘ６は、Ｔｈｒであり；
Ｘ７は、Ｇｌｙであり；および
Ｘ８は、アミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−デヒドロブチリンから成る、またはアミノ酸配列Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａから成るアミノ酸配列である。
【００５４】
本発明のラビリントペプチンまたは本発明のラビリントペプチン誘導体に含まれるラビリントペプチンは、ＬａｂｙＡ２を含んでも、またはそれらから成ってもよい。よって、本発明の一態様は、本明細書中に示したラビリントペプチン、本明細書中に示したラビリントペプチン誘導体、本明細書中に示した医薬組成物、または本明細書中に示した方法に関し：ここで、
Ｘ１は、Ａｓｐであり；
Ｘ２は、Ｔｒｐであり；
Ｘ３は、Ｌｅｕであり；
Ｘ４は、Ｔｒｐであり；
Ｘ５は、Ｇｌｕであり；
Ｘ６は、Ｔｈｒであり；
Ｘ７は、Ｇｌｙであり；
Ｘ８は、アミノ酸配列Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａから成るアミノ酸配列である。
【００５５】
本発明の好ましい態様において、本発明のラビリントペプチンは、例えば、図４に示されているＬａｂｙＡ２である。より好ましくは、本発明のラビリントペプチンは、天然型ＬａｂｙＡ２の立体化学を有する、図３（Ｂ）に示されているＬａｂｙＡ２である。本発明のラビリントペプチン誘導体は、例えば、図４に示されているＬａｂｙＡ２を含むこともまた好ましい。より好ましくは、本発明のラビリントペプチン誘導体は、天然型のＬａｂｙＡ２の立体化学を有する、図３（Ｂ）に示されているＬａｂｙＡ２を含む。
【００５６】
本発明の好ましい態様は、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＣＭＶ、ＺＩＫＶ、およびＨＣＶから選択される（例えば、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＣＭＶ、およびＺＩＫＶから選択される）、好ましくは、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＺＩＫＶ、およびＨＣＶから選択される、より好ましくはＣＭＶ、ＺＩＫＶ、およびＨＣＶから選択されるウイルスのいずれか１つ、そして、より一層好ましくはＨＣＶであるウイルスの感染を治療および／または予防する際の使用のためのＬａｂｙＡ２に関する。
【００５７】
しかしながら、本発明のラビリントペプチンまたは本発明のラビリントペプチン誘導体に含まれるラビリントペプチンはまたは、ＬａｂｙＡ１を含むか、またはそれらから成ることが、さらに好ましい。よって、本発明の一態様は、本明細書中に示したラビリントペプチン、本明細書中に示したラビリントペプチン誘導体、本明細書中に示した医薬組成物、または本明細書中に示した方法に関し、ここで、
Ｘ１は、Ａｓｎであり；
Ｘ２は、Ａｌａであり；
Ｘ３は、Ｖａｌであり；
Ｘ４は、Ｔｒｐであり；
Ｘ５は、Ｇｌｕであり；
Ｘ６は、Ｔｈｒであり；
Ｘ７は、Ｇｌｙであり；および
Ｘ８は、アミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−デヒドロブチリンから成るアミノ酸配列である。
【００５８】
本発明のより一層好ましい態様において、本発明のラビリントペプチンは、例えば、図４に示されているＬａｂｙＡ１である。より一層好ましくは、本発明のラビリントペプチンは、天然型のＬａｂｙＡ１の立体化学を有する、図３（Ａ）に示されているＬａｂｙＡ１である。本発明のラビリントペプチン誘導体が、例えば、図４に示されているＬａｂｙＡ１を含むこともまた、さらに好ましい。より一層好ましくは、本発明のラビリントペプチン誘導体は、天然型のＬａｂｙＡ１の立体化学を有する、図３（Ａ）に示されているＬａｂｙＡ１を含む。
【００５９】
本発明の好ましい態様は、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＣＨＩＫＶ、ＺＩＫＶ、およびＨＣＶから選択される（例えば、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＴＢＥＶ、ＣＭＶ、ＶＳＶ、ＣＨＩＫＶ、およびＺＩＫＶから選択される）、好ましくはＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＴＢＥＶ、ＣＭＶ、ＶＳＶ、ＣＨＩＫＶ、ＺＩＫＶ、およびＨＣＶから選択される、より好ましくはＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＣＨＩＫＶ、ＺＩＫＶ、およびＨＣＶから選択される、より一層好ましくはＣＭＶ、ＣＨＩＫＶ、およびＨＣＶから選択されるウイルスのいずれか１つの感染を治療および／または予防する際の使用のためのＬａｂｙＡ１に関する。
【００６０】
本発明との関連において、驚いたことに、ＬａｂｙＡ１とＬａｂｙＡ２との組み合わせ物の抗ウイルス活性が、個別分子のものより有意に高いことが示された。ＬａｂｙＡ１とＬａｂｙＡ２の組み合わせ物の斯かる相乗効果は、従来技術により開示または示唆されたことがない。それとは正反対に、抗ＨＩＶの欠如および中程度の抗ＨＳＶ活性のみのため、更なる抗ウイルス性試験にとって、ＬａｂｙＡ２がそれほど魅力的でない候補であると記載された（Ferir, 2013, PLOS one, 8(5):e64010）。しかしながら、本発明との関連において、ＬａｂｙＡ１との組み合わせ物において、ＬａｂｙＡ２は非常に高い抗ウイルス活性をもたらすことが、驚いたことに、かつ、予想外に見出された。この相乗効果は予見できなかった。
【００６１】
よって、本発明は、医薬としての使用のための少なくとも２つのラビリントペプチンまたはラビリントペプチン誘導体の組み合わせ物に関する。特に、本発明の一態様は、医薬としての使用のための（ｉ）と（ｉｉ）の組み合わせ物に関し、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）は：
（ｉ）Ｘ１が、Ａｓｎであり；
Ｘ２が、Ａｌａであり；
Ｘ３が、Ｖａｌであり；
Ｘ４が、Ｔｒｐであり；
Ｘ５が、Ｇｌｕであり；
Ｘ６が、Ｔｈｒであり；
Ｘ７が、Ｇｌｙであり；および
Ｘ８が、アミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−デヒドロブチリンから成るアミノ酸配列である、本発明のラビリントペプチンまたはラビリントペプチン誘導体、ならびに
（ｉｉ）Ｘ１が、Ａｓｐであり；
Ｘ２が、Ｔｒｐであり；
Ｘ３が、Ｌｅｕであり；
Ｘ４が、Ｔｒｐであり；
Ｘ５が、Ｇｌｕであり；
Ｘ６が、Ｔｈｒであり；
Ｘ７が、Ｇｌｙであり；
Ｘ８が、アミノ酸配列Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａから成るアミノ酸配列である、本発明のラビリントペプチンまたはラビリントペプチン誘導体、
である。
【００６２】
本発明との関連において、驚いたことに、ＬａｂｙＡ１とＬａｂｙＡ２の組み合わせ物の抗ウイルス活性は、ＬａｂｙＡ１とＬａｂｙＡ２の比が１：１である場合に増強される場合さえあることが示された。よって、本発明は、本明細書中に示した組み合わせ物に関し、ここで、ラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体の比（ｉ）、およびラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体（ｉｉ）は、１：１０〜１０：１、好ましくは１：５〜５：１、より一層好ましくは２：１〜１：２、そして、最も好ましくは１：１である。または、言い換えると、ラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体の濃度の比（ｉ）、およびラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体（ｉｉ）は、１：１０〜１０：１、好ましくは１：５〜５：１、より一層好ましくは２：１〜１：２、そして、最も好ましくは１：１であり、ここで、濃度は、例えば、μＭで測定される。
【００６３】
例えばラビリントペプチンなどの化合物の抗ウイルス活性を試験するためのアッセイは当該技術分野で一般的に知られている。例えば、本発明の組み合わせ物の抗ウイルス活性について試験するために、その組み合わせ物が、細胞（例えば、Ｈｕｈ−７．５細胞）に添加され得る。次に、その細胞を、試験すべきウイルス（例えば、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、ＨＣＶ、好ましくはＤＥＮＶ、ＴＢＥＶ、および／またはＺＩＫＶ）に感染させ得る。ウイルス陽性細胞の量は免疫細胞学によって評価され得る。例えば、ウイルスに対する一次抗体と結合フルオロフォアを有する二次抗体が適用され得る。全細胞数は、ＤＡＰＩ染色核をカウントすることによって測定され得る。このようにして、ウイルス陽性細胞のパーセンテージが計算され得る。得られた結果は非感染細胞と比較されることが好ましい。
【００６４】
本発明の別の態様は、本発明の組み合わせ物を含む医薬組成物に関し、ここで、医薬組成物はさらに医薬的に許容し得る担体および／または希釈剤を含む。本発明の組み合わせ物または前記組み合わせ物を含む医薬組成物が、ウイルス感染を治療および／または予防するのに使用され得る。前記ウイルス感染は、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、およびＨＣＶから選択される（例えば、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、およびＺＩＫＶから選択される）、好ましくはＤＥＮＶ、ＴＢＥＶ、およびＺＩＫＶから選択されるウイルスのいずれかの感染であり得る。よって、本発明の一態様は、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、およびＨＣＶから選択される（例えばＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、およびＺＩＫＶから選択される；好ましくはＤＥＮＶ、ＴＢＥＶ、およびＺＩＫＶから選択される）ウイルスのいずれか１つの感染を治療および／または予防する方法に関し、ここで、その方法は、斯かる治療を必要としている対象に本発明の組み合わせ物または前記組み合わせ物を含む医薬組成物の有効量を投与することを含む。好ましくは、本発明の組み合わせ物、前記組み合わせ物を含む医薬組成物、または本発明の方法は、現在存在している感染症（すなわち、現在存在しているウイルス感染）を治療するのに使用される。
【００６５】
本発明の一態様は、本明細書中に示したラビリントペプチン、ラビリントペプチン誘導体、組み合わせ物、医薬組成物、または方法に関し、ここで、そのラビリントペプチン、組み合わせ物または医薬組成物が、少なくとも１つの他の活性物質と同時投与される。前記活性物質は、ＣＭＶ阻害剤、ＫＳＨＶ阻害剤、ＲＳＶ阻害剤、ＤＥＮＶ阻害剤、ＣＨＩＫＶ阻害剤、ＴＢＥＶ阻害剤、ＶＳＶ阻害剤、ＺＩＫＶ阻害剤、および／またはＨＣＶ阻害剤であり得る。
【００６６】
好適なＣＭＶ阻害剤およびＫＳＨＶ阻害剤は、当該技術分野で知られており、そして、例えば、Coen, 2014, Viruses 6(11): 4731-59に記載されている。例えば、好適なＣＭＶおよびＫＳＨＶ阻害剤としては、アシクロビル、ペンシクロビル、ジドブジン、ブリブジン、シドホビルＨＤＶＤ（Ｌジオキソランウラシル誘導体）、イドクスウリジン、ファムシクロビル、ソリブジン、バラシクロビル、シドホビル、ブリンシドホビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット、マリバビル、ＣＭＶＩＧ、レテルモビル、レフルノミド（関節リウマチにおいて病態修飾剤として使用される、代謝拮抗剤はまた、ＣＭＶ疾患治療および予防の両方で首尾よく承認適応症外使用された）、およびホミビルセンが挙げられる。
【００６７】
本発明との関連において有用なＲＳＶ阻害剤としては、パリビズマブ（モタビズマブ）などのモノクローナル抗体が挙げられる。この抗体は、ＲＳＶにとって、現在利用可能な唯一の特異的治療選択肢である（Roymans, 2010 Future Med Chem 2(10): 1523-7.）。本発明により使用できる他のＲＳＶ阻害剤は、ＲＳＶ６０４などの核タンパク質（Ｎタンパク質）阻害剤（Challa, 2015, Antimicrob Agents Chemother 59(2): 1080-7）；およびＡＬＮ−ＲＳＶ０１などのＲＮＡ干渉分子（すなわち、ＲＳＶのＮタンパク質を標的化する低分子干渉ＲＮＡ）である。斯かる低分子干渉ＲＮＡは、リスクの高い成人集団のための治療選択肢である（eVincenzo, 2010; Roymans, 2010, Future Med Chem 2(10): 1523-7.）。本発明との関連において適用され得る他のＲＳＶ阻害剤は、ＡＬＳ−８１７６などのヌクレオシド阻害剤（Challa, 2015, Antimicrob Agents Chemother 59(2): 1080-7）；または、ＧＳ−５８０６（Ｇｉｌｅａｄ（登録商標））などのウイルス融合阻害剤（DeVincenzo, 2014, Proc Natl Acad Sci U S A 107(19): 8800-5.）である。
【００６８】
本発明との関連において使用され得るＤＥＮＶ阻害剤としては、ＣＹＤ−ＴＤＶ（遺伝子組み換え、生、弱毒化四価デング熱ワクチン）などのワクチンが挙げられる。ＣＹＤ−ＴＤＶは、現在、臨床試験中である（Hadinegoro, 2015, N Engl J Med 373(13): 1195-206.）。本明細書中で、「ＤＥＮＶ阻害剤」とはさらに、ＮＩＴＤ−００８またはバラピラビルなどのヌクレオシド類似体をさらに含み得る（Lim, 2013, Antiviral Res 100(2): 500-19.）。
【００６９】
本発明との関連において使用され得るＴＢＥＶの有望な阻害剤の一つが、７−デアザ−２−Ｃ−メチルアデノシン（７−デアザ−２−ＣＭＡ）である。
【００７０】
別の例において、本明細書中に示したラビリントペプチン、組み合わせ物または医薬組成物は、ＨＣＶ阻害剤と、例えばＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ（テラプレビル、ボセプレビル、シメプレビル、パリタプレビル、アスナプレビル、バニプレビル、ベドロプレビル、ソバプレビル、グラゾプレビルまたはＡＣＨ−２６８４）、ＮＳ５Ａリン酸化タンパク質（ダクラタスビル、レジパスビル、オムビタスビル、エルバスビル、ＧＳ−５８１６またはＡＣＨ−３１０２）またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＮＳ５Ｂ（ソホスブビル、ＭＫ−３６８２、ＡＣＨ−３４２２、ＡＬ−３３５、ダサブビル、ベクラブビル、またはＧＳ−９６６９）のいずれかを標的化する（単数もしくは複数の）直接作用抗ウイルス剤の１つまたはその組み合わせ物と同時投与される。そのうえ、ＨＣＶ感染との関連において宿主を標的化する抗ウイルス薬との同時投与が想像できる。これらは、例えば、ミラビルセンのようなｍｉＲ−１２２標的化治療薬、またはアリスポリビル、ＮＩＭ８１１、もしくはＳＣＹ−６３５のようなシクロフィリン拮抗薬を含む。
【００７１】
本明細書中に示したラビリントペプチン、ラビリントペプチン誘導体、組み合わせ物、または医薬組成物は、好適な経路によって投与され得る。本発明の一態様は、本明細書中に示したラビリントペプチン、ラビリントペプチン誘導体、組み合わせ物、医薬組成物、または方法に関し、ここで、そのペプチド、組み合わせ物または医薬組成物は、経口的、静脈内、皮下または筋肉内に投与されるべきである。好ましくは、その投与は、静脈内、皮下または筋肉内である。例えば、その投与は、静脈内であってもよい。しかしながら、皮下または筋肉内投与には、これらの投与様式が静脈内投与より実用的であるという利点がある。投与が経口的である場合、その製剤が経口生物学的利用能を与えることが想定される。
【００７２】
添付した実施例は、本明細書中に示したラビリントペプチン、ラビリントペプチン誘導体または組み合わせ物に高い抗ウイルス活性があることを実証した。よって、本発明の一態様は、本発明のラビリントペプチン、本発明のラビリントペプチン誘導体、本発明の組み合わせ物、本発明の医薬組成物、または本発明の方法に関し、ここで、本明細書中に示したラビリントペプチン、ラビリントペプチン誘導体、組み合わせ物、または医薬組成物の抗ウイルス活性のＩＣ５０値は、少なくとも５０μＭ、好ましくは少なくとも２６μＭである。好ましくは、本発明のラビリントペプチンはＬａｂｙＡ１であり、そして、そのＩＣ５０値は少なくとも２５μＭ、より好ましくは少なくとも４μＭである。本発明の組み合わせ物に関して、ＩＣ５０値は好ましくは少なくとも９μＭ、より好ましくは少なくとも１．５μＭである。本発明のラビリントペプチン誘導体に関して、治療されるウイルス感染は、好ましくはＤＥＮＶの感染であり、そして、そのＩＣ５０値は好ましくは少なくとも７．５μＭである。より好ましくは、本発明のラビリントペプチン誘導体はＬａｂｙＡ１の誘導体であり、そして、治療されるウイルス感染はＤＥＮＶの感染であり、そして、そのＩＣ５０値は少なくとも２μＭである。
【００７３】
本発明の別の態様は、本発明のラビリントペプチン、本発明のラビリントペプチン誘導体、本発明の組み合わせ物、本発明の医薬組成物、または本発明の方法に関し、ここで、治療されるべきウイルス感染はＣＭＶ、ＺＩＫＶまたはＨＣＶの感染であり、そして、本明細書中に示したラビリントペプチン、ラビリントペプチン誘導体、組み合わせ物、または医薬組成物の抗ウイルス活性のＩＣ５０値は、少なくとも５．５μＭである。好ましくは、本発明のラビリントペプチンはＬａｂｙＡ１であり、治療および／または予防されるべきウイルス感染はＣＭＶまたはＨＣＶの感染であり、そして、ＩＣ５０値は少なくとも１．５μＭである。
【００７４】
本発明の更なる態様は、本発明のラビリントペプチン、本発明のラビリントペプチン誘導体、本発明の組み合わせ物、本発明の医薬組成物、または本発明の方法に関し、ここで、治療されるべきウイルス感染はＤＥＮＶの感染であり、そして、本明細書中に示したラビリントペプチン、ラビリントペプチン誘導体、組み合わせ物、または医薬組成物の抗ウイルス活性のＩＣ５０値は少なくとも８μＭである。好ましくは、本発明のラビリントペプチンはＬａｂｙＡ１であり、そして、治療および／または予防されるべきウイルス感染はＤＥＮＶの感染であり、そして、ＩＣ５０値は少なくとも２μＭである。
【００７５】
本発明の更なる態様は、本発明のラビリントペプチン、本発明のラビリントペプチン誘導体、本発明の組み合わせ物、本発明の医薬組成物、または本発明の方法に関し、ここで、本発明のラビリントペプチンはＬａｂｙＡ１であり、そして、治療および／または予防されるべきウイルス感染はＣＨＩＫＶの感染であり、そして、ＩＣ５０値は少なくとも２μＭである。
【００７６】
表３は、ＬａｂｙＡ１、ＬａｂｙＡ２、ＬａｂｙＡ１とＬａｂｙＡ２との組み合わせ物（ＬａｂｙＡ１／Ａ２）、ＬａｂｙＡ１誘導体「ＬａｂｙＡ１−ｈｅｘｙｎ」（本明細書中では「ＬａｂｙＡ１−Ｈｅｘｙｎ」とも呼ばれる）、ＬａｂｙＡ２誘導体「ＬａｂｙＡ２−ｈｅｘｙｎ」（本明細書中では「ＬａｂｙＡ２−Ｈｅｘｙｎ」とも呼ばれる）、ならびにＬａｂｙＡ１−ｈｅｘｙｎとＬａｂｙＡ２−ｈｅｘｙｎとの組み合わせ物（ＬａｂｙＡ１／Ａ２−ｈｅｘｙｎ）の抗ウイルス活性のＩＣ５０値を示す。
【００７７】
表３：ラビリントペプチン、ラビリントペプチンとラビリントペプチン誘導体の組み合わせ物の抗ウイルス活性のＩＣ５０値（μＭおよびμｇ／ｍｌ単位）
【表３】
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【００７８】
ＲＳＶに関して、添付の実施例もまた、どうにかより高いＩＣ５０値を示す（図１６Ａおよび１６Ｂを参照）。しかしながら、これらのより高い値は、間接的ハイスループットスクリーニングアッセイを使用することによって得られた（図１５）。この間接的ハイスループットスクリーニングアッセイでは、化合物の抗ウイルス活性は、溶菌性ウイルスであるＲＳＶの抗原投与によって細胞生存を助ける化合物の能力に基づいておおまかに概算される。このアッセイに使用される宿主細胞はルシフェラーゼレポーター遺伝子を構成的に発現するので、細胞生存の変化はルシフェラーゼアッセイで定量化できる。しかしながら、このアッセイの間接的性質のため、ＩＣ５０値の精度は制限される。図１６Ｃにまとめられた他の実験では、ＲＳＶに対するラビリントペプチンのＩＣ５０は、感染細胞におけるＲＳＶ依存性タンパク質発現を測定する、直接的な定量的アッセイを使用することによって、正確に測定された。具体的には、このアッセイにおいて、細胞には、試験されるべき化合物（例えば、ラビリントペプチン）の存在または不存在下、ＲＳＶ（すなわち、ｈＲＳＶ）が植え付けられる。それに続いて、感染効率が、ｈＲＳＶのＰタンパク質検出に基づく細胞内ＦＡＣＳ染色を使用することによって、例えば、マウスモノクローナル抗体を使用することによって、測定される。このアプローチを使用すると、ＲＳＶ感染細胞の数を直接測定することが可能であり；その結果、ＩＣ５０を正確に定量化することが可能である。
【００７９】
添付の実施例で実証されるように、ラビリントペプチン（特にＬａｂｙＡ１）は、ＣＭＶに対して高い抗ウイルス活性を有する。よって、本明細書中に示したラビリントペプチン、ラビリントペプチン誘導体、組み合わせ物、医薬組成物、または方法の好ましい態様において、治療されるウイルス感染は、ＣＭＶ（すなわち、ＨＣＭＶ）の感染である。
【００８０】
先に触れたように、添付の実施例は、ＬａｂＡ１およびＬａｂｙＡ２の組み合わせ物がウイルスの治療で相乗効果をもたらすことを示す。例えば、ＤＥＮＶ、ＴＢＥＶまたはＺＩＫＶに対する抗ウイルス活性におけるＬａｂｙＡ１およびＬａｂｙＡ２の相乗活性が示されている。よって、特に本明細書中に示した組み合わせ物との関連において、ウイルス感染は好ましくはＤＥＮＶ、ＴＢＥＶ、および／またはＺＩＫＶの感染である。
【００８１】
「（単数もしくは複数の）（本）発明のラビリントペプチン」、「（単数もしくは複数の）本明細書中に示したラビリントペプチン」、および「（単数もしくは複数の）本明細書中に示したラビリントペプチン」という用語は本明細書中で互換的に使用される。これらの用語は、当該技術分野で知られている方法を使用して計測され得る、特にＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、およびＨＣＶに対する抗ウイルス活性を示す配列番号２で規定されるペプチド（すなわち、化合物）を指す。例えば、本発明のラビリントペプチンの抗ウイルス活性について試験するために、本発明のラビリントペプチンが細胞（例えば、Ｈｕｈ−７．５細胞）に添加され得る。次に、その細胞が、試験されるべきウイルス（例えば、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶ）に感染し得る。ウイルス陽性細胞の量は、免疫細胞学によって評価され得る。例えば、ウイルスに対する一次抗体および結合フルオロフォアを有する二次抗体が適用され得る。全細胞数は、ＤＡＰＩ染色核をカウントすることによって測定され得る。このようにして、ウイルス陽性細胞のパーセンテージが計算され得る。得られた結果は非感染細胞と比較されることが好ましい。
【００８２】
特に、「（単数もしくは複数の）（本）の発明のラビリントペプチン」、「（単数もしくは複数の）本明細書中に示したラビリントペプチン」、および「（単数もしくは複数の）本明細書中に示したラビリントペプチン」という用語は、（ＮからＣ末端への）アミノ酸配列：
【化３】
2018538276.tif 000007
｛式中、
Ｌａｂは、ラビオニンであり；
Ｘ１は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、およびＧｌｕから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ａｌａ、Ｔｒｐ、およびＳｅｒから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ４は、ＴｒｐおよびＴｙｒから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ５は、ＧｌｕおよびＡｓｐから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ６は、ＴｈｒおよびＳｅｒから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ７は、ＧｌｙおよびＰｒｏから選択されるアミノ酸であり；および
Ｘ８は、３〜５個のアミノ酸から成る配列から成る｝を含むか、またはそれらから成るペプチド（すなわち、化合物）を指す。
【００８３】
配列番号２のアミノ酸配列は、Ｎ末端で始まり、そして、Ｃ末端で終わる、すなわち、配列番号２の配列は、ＮからＣ末端へと表示される。
【００８４】
位置Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ７、およびＸ８の好ましいアミノ酸は、先に本明細書中に記載される。配列番号２の中で、「−」は化学結合である。「−」が「Ｘ」と「Ｘ」の間（例えば、Ｘ１−Ｘ２、Ｘ３−Ｘ４、Ｘ４−Ｘ５、またはＸ６−Ｘ７）、または「Ｘ」と「Ｌａｂ」の間（例えば、「Ｌａｂ−Ｘ１」、「Ｘ２−Ｌａｂ」、「Ｌａｂ−Ｘ３」、「Ｘ５−Ｌａｂ」、「Ｌａｂ−Ｃｙｓ」、「Ｌａｂ−Ｘ６」、「Ｘ７−Ｌａｂ」、「Ｌａｂ−Ｘ８」）に配置される場合、「−」がペプチド結合／連結であることが好ましい。「−Ｓ−Ｓ−」はジスルフィド架橋（Ｓ−Ｓ結合とも呼ばれる）である。「−Ｓ−」はＬａｂのランチオニン部分を表す２つのアラニン部分のβ−Ｃ原子の間のチオエーテル架橋である。
【００８５】
（Ｎ末端から数えて）配列番号２の１位と４位のラビオニン、および（Ｎ末端から数えて）配列番号２の１０位と１３位のラビオニンは、メチレン架橋（すなわち、−ＣＨ２−）を介して連結される。特に、メチレン基は、配列番号２の１位と４位のラビオニンのαＣ原子を連結する。別のメチレン基は、配列番号２の１０位と１３位のラビオニンのαＣ原子を連結する。
【００８６】
先に触れたように、本発明の好ましい態様は、組み合わせ物またはＬａｂｙＡ１およびＬａｂｙＡ２（すなわち、本発明の組み合わせ物）に関する。本発明のラビリントペプチンに関して、ＬａｂｙＡ１およびＬａｂｙＡ２が好まれる；ＬａｂｙＡ１がさらに好まれる。ＬａｂｙＡ１の（内部架橋を含めた）アミノ酸配列は、以下の配列番号３：
【化４】
2018538276.tif 000008
に示され、ここで、Ｄｈｂはデヒドロブチリン（ジデヒドロブチリンとも呼ばれる）であり、そして、Ｌａｂはラビオニンである。Ｄｈｂの構造は、図２に示される。
【００８７】
ＬａｂｙＡ２の（内部の架橋を含めた）アミノ酸配列は、以下の配列番号４：
【化５】
2018538276.tif 000009
に示され、ここで、Ｌａｂはラビオニンである。
【００８８】
本発明のラビリントペプチンはまた、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、およびより一層好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するペプチドも含み、ここで、そのペプチドは、特にＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶに対するＬａｂｙＡ１の抗ウイルス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも９０％を有する。本発明のラビリントペプチンは、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、およびより一層好ましくは少なくとも９４％の配列同一性を有するペプチドをさらに含み、ここで、そのペプチドは、好ましくはＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＴＢＥＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶに対するＬａｂｙＡ２の抗ウイルス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも９０％を有する。
【００８９】
本発明のラビリントペプチンはまた、特にＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶに対して抗ウイルス活性を示すペプチドが類似体およびペプチド模倣体またはペプチドの模倣体も含む。
【００９０】
本発明のラビリントペプチンとしては、任意の立体化学形態の、あるいは任意の割合での任意の立体化学形態の混合物での配列番号２、３、または４のペプチドが挙げられる。別段示されない限り、配列番号２、３、または４のペプチドのキラル中心は、Ｒ立体配置でも、Ｓ立体配置でも示され得る。本発明は、光学的に純粋な化合物と、エナンチオマ混合物やジアステレオマー混合物などの立体異性混合物の両方に関する。好ましくは、本発明のラビリントペプチンには、図３に示されているように、天然型ＬａｂｙＡ１またはＬａｂｙＡ２の立体化学を有する。
【００９１】
本発明のラビリントペプチンが、（例えば、配列番号２によって）本明細書中に記載されている。しかしながら、本発明のラビリントペプチンはまた、Krawczyk, Chemistry & Biology, 2013, 20(1), 111-122；およびＷＯ２０１３／０９２６７２に開示されている修飾ラビリントペプチンも含む、但し、これらの修飾ラビリントペプチンは、特にＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶに対する抗ウイルス活性を有する。
【００９２】
加えて、「（単数もしくは複数の）（本）発明のラビリントペプチン」、「本明細書中に示したラビリントペプチン」、および「（単数もしくは複数の）本明細書中に示したラビリントペプチン」という用語はまた、配列番号２、３または４に規定されるように、ペプチドの医薬的な許容される塩に関する。これにより、医薬的な許容される塩はまた、「本発明のラビリントペプチン」という用語に含まれる。
【００９３】
「（単数もしくは複数の）（本）発明のラビリントペプチン誘導体」、「（単数もしくは複数の）本明細書中に示したラビリントペプチン誘導体」、および「（単数もしくは複数の）本明細書中に示したラビリントペプチン誘導体」という用語は本明細書中で互換的に使用される。これらの用語は、当該技術分野で知られている方法を使用して計測され得る、特にＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶ、好ましくはＤＥＮＶに対する抗ウイルス活性を示す配列番号１で規定されるペプチド（すなわち、化合物）を指す。例えば、本発明のラビリントペプチン誘導体の抗ウイルス活性について試験するために、本発明のラビリントペプチン誘導体が細胞（例えば、Ｈｕｈ−７．５細胞）に添加され得る。次に、その細胞が、試験されるべきウイルス（例えば、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶ、好ましくはＤＥＮＶ）に感染し得る。ウイルス陽性細胞の量は、免疫細胞学によって評価され得る。例えば、ウイルスに対する一次抗体および結合フルオロフォアを有する二次抗体が適用され得る。全細胞数は、ＤＡＰＩ染色核をカウントすることによって測定され得る。このようにして、ウイルス陽性細胞のパーセンテージが計算され得る。得られた結果は非感染細胞と比較されることが好ましい。
【００９４】
特に、「（単数もしくは複数の）（本）の発明のラビリントペプチン誘導体」、「（単数もしくは複数の）本明細書中に示したラビリントペプチン誘導体」、および「（単数もしくは複数の）本明細書中に示したラビリントペプチン誘導体」という用語は、（ＮからＣ末端への）アミノ酸配列：
【化６】
2018538276.tif 000010
｛式中、
Ｌａｂは、ラビオニンであり；
Ｘ１は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、およびＧｌｕから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ａｌａ、Ｔｒｐ、およびＳｅｒから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ４は、ＴｒｐおよびＴｙｒから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ５は、ＧｌｕおよびＡｓｐから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ６は、ＴｈｒおよびＳｅｒから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ７は、ＧｌｙおよびＰｒｏから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ８は、３〜５個のアミノ酸から成る配列から成り；
Ｒ１は、Ｈ、（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル、Ｃ（Ｏ）−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル、Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニル、およびＣ（Ｏ）ＮＨ−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニルから選択され；ここで、Ｒ１は、末端位置にアルキニル基を担持し；
Ｒ２は、Ｈ、［Ｃ（Ｏ）］−ＮＨ−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニルまたは［Ｃ（Ｏ）］−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ１２）アルキニルから選択され；ここで、部分［Ｃ（Ｏ）］は末端アミノ酸のカルボニル基であり；ここで、Ｒ２は末端位置にアルキニル基を担持し；ここで、Ｒ１がＨである場合、Ｒ２はＨでない｝を含むか、またはそれらから成るペプチド（すなわち、化合物）を指す。
【００９５】
配列番号１のアミノ酸配列は、Ｎ末端で始まり、そして、Ｃ末端で終わる、すなわち、配列番号１の配列は、ＮからＣ末端へと表示される。
【００９６】
位置Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ７、およびＸ８の好ましいアミノ酸は、先に本明細書中に記載される。配列番号１の中で、「−」は化学結合である。「−」が「Ｘ」と「Ｘ」の間（例えば、Ｘ１−Ｘ２、Ｘ３−Ｘ４、Ｘ４−Ｘ５、またはＸ６−Ｘ７）、または「Ｘ」と「Ｌａｂ」の間（例えば、「Ｌａｂ−Ｘ１」、「Ｘ２−Ｌａｂ」、「Ｌａｂ−Ｘ３」、「Ｘ５−Ｌａｂ」、「Ｌａｂ−Ｃｙｓ」、「Ｌａｂ−Ｘ６」、「Ｘ７−Ｌａｂ」、「Ｌａｂ−Ｘ８」）に配置される場合、「−」がペプチド結合／連結であることが好ましい。「−Ｓ−Ｓ−」はジスルフィド架橋（Ｓ−Ｓ結合とも呼ばれる）である。「−Ｓ−」はＬａｂのランチオニン部分を表す２つのアラニン部分のβ−Ｃ原子の間のチオエーテル架橋である。
【００９７】
（Ｎ末端から数えて）配列番号１の１位と４位のラビオニン、および（Ｎ末端から数えて）配列番号１の１０位と１３位のラビオニンは、メチレン架橋（すなわち、−ＣＨ２−）を介して連結される。特に、メチレン基は、１位と４位のラビオニンのαＣ原子を連結する。別のメチレン基は、配列番号１の１０位と１３位のラビオニンのαＣ原子を連結する。
【００９８】
本発明のラビリントペプチン誘導体内の好ましいラビリントペプチンは、ＬａｂｙＡ１およびＬａｂｙＡ２であり、ＬａｂｙＡ１が最も好まれる。ＬａｂｙＡ１の（内部架橋を含めた）アミノ酸配列は、先の配列番号３に示される。
【００９９】
よって、好ましい態様において、本発明のラビリントペプチン誘導体は、以下の式（Ｉ）：
【化７】
2018538276.tif 000011
に示されているＬａｂｙＡ１の誘導体である。
【０１００】
より一層好ましい態様において、本発明のラビリントペプチン誘導体は、以下の式（ＩＩ）：
【化８】
2018538276.tif 000012
に示されているＬａｂｙＡ１の誘導体である。
【０１０１】
より一層好ましい態様において、本発明のラビリントペプチン誘導体は、図４に示されている「ＬａｂｙＡ１−Ｈｅｘｙｎ」である。
【０１０２】
別の好ましい態様において、本発明のラビリントペプチン誘導体は、以下の式（ＩＩＩ）：
【化９】
2018538276.tif 000013
に示されているＬａｂｙＡ２の誘導体である。
【０１０３】
より一層好ましい態様において、本発明のラビリントペプチン誘導体は、以下の式（ＩＶ）：
【化１０】
2018538276.tif 000014
に示されているＬａｂｙＡ２の誘導体である。
【０１０４】
より一層好ましい態様において、本発明のラビリントペプチン誘導体は、図４に示されている「ＬａｂｙＡ２−Ｈｅｘｙｎ」である。
【０１０５】
配列番号１に関して示されたＲ１およびＲ２に関する説明を、必要な変更を加えて、同様に式Ｉ〜ＩＶについても適用する。
【０１０６】
本発明のラビリントペプチン誘導体はまた、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、およびより一層好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するペプチドを（Ｒ１および／またはＲ２に加えて）含むラビリントペプチン誘導体も含み、ここで、そのペプチドは、特にＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶ、より好ましくはＤＥＮＶに対するＬａｂｙＡ１の抗ウイルス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも９０％を有する。本発明のラビリントペプチン誘導体は、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、およびより一層好ましくは少なくとも９４％の配列同一性を有するペプチドを（Ｒ１および／またはＲ２に加えて）含むラビリントペプチン誘導体をさらに含み、ここで、そのペプチドは、好ましくはＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＴＢＥＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶ、より好ましくはＤＥＮＶに対するＬａｂｙＡ２の抗ウイルス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも９０％を有する。
【０１０７】
本発明のラビリントペプチン誘導体はまた、特にＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶに対して抗ウイルス活性を示すペプチドが類似体およびペプチド模倣体またはペプチドの模倣体も含む。
【０１０８】
本発明のラビリントペプチン誘導体としては、任意の立体化学形態の、あるいは任意の割合での任意の立体化学形態の混合物での配列番号１のペプチドを含むラビリントペプチン誘導体が挙げられる。別段示されない限り、配列番号１のペプチドのキラル中心は、Ｒ立体配置でも、Ｓ立体配置でも示され得る。本発明は、光学的に純粋な化合物と、エナンチオマ混合物やジアステレオマー混合物などの立体異性混合物の両方に関する。好ましくは、本発明のラビリントペプチン誘導体は、図３に示されているように、天然型ＬａｂｙＡ１またはＬａｂｙＡ２の立体化学を有するペプチドを（Ｒ１および／またはＲ２に加えて）含む。
【０１０９】
本発明のラビリントペプチン誘導体が、（例えば、配列番号１によって）本明細書中に記載されている。しかしながら、本発明のラビリントペプチン誘導体はまた、Krawczyk, Chemistry & Biology, 2013, 20(1), 111-122；およびＷＯ２０１３／０９２６７２に開示されている修飾ラビリントペプチンも（Ｒ１および／またはＲ２に加えて）含み得る、但し、これらの修飾ラビリントペプチンは、特にＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶに対する抗ウイルス活性を有する。
【０１１０】
加えて、「（単数もしくは複数の）（本）発明のラビリントペプチン誘導体」、「本明細書中に示したラビリントペプチン誘導体」、および「（単数もしくは複数の）本明細書中に示したラビリントペプチン誘導体」という用語はまた、配列番号１に規定されるように、ペプチドの医薬的な許容される塩に関する。これにより、医薬的な許容される塩はまた、「本発明のラビリントペプチン誘導体」という用語に含まれる。
【０１１１】
「ペプチド類似体」（「ペプチド模倣体」または「ペプチドの模倣体」とも呼ばれる）は、「鋳型」ペプチドのそれに類似する特性を持つ非ペプチド薬剤として医薬技術では一般に使用される。ペプチド類似体／ペプチド模倣体は、生物学的に活性のあるペプチドの骨格構造および物理化学的な特性を再現する。生物学的に活性のあるペプチドに構造的に関連するペプチド模倣体は、同等のまたは向上した生物活性（例えば、向上した治療効果および／または予防効果）を生成するのに使用され得る。一般に、ペプチド模倣体は、鋳型ペプチド、すなわち、生物活性または薬学活性を有し、天然に存在するアミノ酸を含むが、当該技術で周知の方法（例えばSpatola, Peptide Backbone Modifications, Vega Data, 1:267, 1983; Spatola, Life Sei. 38:1243-1249, 1986; Hudson, Int. J. Pept. Res. 14:177-185, 1979；およびWeinstein, 1983, Chemistry and Biochemistry, of Amino Acids, Peptides and Proteins, Weinstein eds, Marcel Dekker, New-Yorkを参照）によって、例えば、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＨ２ＳＯ−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、−ＣＯＣＨ２−のような結合により置き換えられた１以上のペプチド結合を有するペプチドに構造的に類似する。そのようなペプチド模倣体は、さらに経済的な製造、さらに大きな化学的安定性、高い薬学特性（例えば、半減期、吸収、有効性、効率など）、低い抗原性などを含む特定の利点を有し得る。
【０１１２】
用語「アミノ酸」または「残基」には本明細書で使用されるとき、天然に存在するアミノ酸のＬ異性体およびＤ異性体の双方と同様に、他のアミノ酸（例えば、天然に存在しないアミノ酸、核酸によってコードされないアミノ酸）が含まれる。天然に存在するアミノ酸の例は、アラニン（Ａｌａ；ａ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、バリン（Ｖａｌ；Ｖ）である。翻訳後修飾される天然に存在するアミノ酸は、デヒドロブチリン（Ｄｈｂ）およびラビオニン（Ｌａｂ）である。本発明のラビリントペプチンまたは本発明のラビリントペプチン誘導体に含まれるラビリントペプチンは、天然に存在するアミノ酸から成ってもよい。本発明のラビリントペプチンまたは本発明のラビリントペプチン誘導体に含まれるラビリントペプチンは、Ｌアミノ酸から成ってもよい。本明細書中では、アミノ酸は、当該技術分野一般的に使用されるように、また、本明細書中で先に記載したように、一字コードまたは三文字コードによって簡略化される。
【０１１３】
天然に存在し、遺伝的にコードされないアミノ酸および合成アミノ酸には、β−アラニン、３−アミノ−プロピオン酸、２,３−ジアミノプロピオン酸、α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、４−アミノ−酪酸、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、ヒドロキシプロリン、オルニチン（例えば、Ｌ−オルニチン、シトルリン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、（Ｎｌｅ）、ノルバリン、２−ナフチルアラニン、ピリジルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、ペニシルアラニン、１,２,３,４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸、β−２−チエニルアラニン、メチオニンスルホキシド、Ｌ−ホモアルギニン（Ｈａｒｇ）、Ｎ−アセチルリジン、２−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、２,４−ジアミノ酪酸（Ｄ−またはＬ−）、ｐ−アミノフェニルアラニン、Ｎ−メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン、システイン酸、ε−アミノヘキサン酸、δ−アミノ吉草酸、または２,３−ジアミノ酪酸（Ｄ−またはＬ−）などが挙げられる。非天然アミノ酸としては、例えばβ−アミノ酸（β３およびβ２）、ホモアミノ酸、３−置換アラニン誘導体、環置換フェニルアラニンおよびチロシン誘導体、直鎖コアアミノ酸、ならびにＮ−メチルアミノ酸が挙げられる。これらのアミノ酸は生化学／ペプチド化学の当該技術で周知である。
【０１１４】
「アミノ酸」という用語はまた、類似の側鎖官能性を提供する合成アミノ酸も指す。例えば、芳香族アミノ酸は、Ｄ−またはＬ−ナフチルアラニン、Ｄ−またはＬ−フェニルグリシン、Ｄ−またはＬ−２−チエニルアラニン、Ｄ−またはＬ−１−、２−、３−または４−ピレニルアラニン、Ｄ−またはＬ−３−チエニルアラニン、Ｄ−またはＬ−（２−ピリジニル）−アラニン、Ｄ−またはＬ−（３−ピリジニル）アラニン、Ｄ−またはＬ−（２−ピラジニル）アラニン、Ｄ−またはＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン、Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルグリシン、Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルアラニン、Ｄ−ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−またはＬ−ｐ−ビフェニルアラニン、Ｄ−またはＬ−ｐ−メトキシビフェニルアラニン、アルキル基が置換または非置換のメチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソブチルおよびイソペンチルから成る群から選択されるＤ−またはＬ−２−インドール（アルキル）アラニンおよびＤ−またはＬ−アルキルアラニンによって置き換えられ得る。ホスホノ−または硫酸化アミノ酸によって提供されるように、負の電荷を処理するのに非カルボン酸アミノ酸を作製することができ、それは非限定例であると見なされるべきである。
【０１１５】
「アミノ酸」という用語にはまた、アルキル基を天然のアミノ酸と組み合わせることによって作製される非天然のアルキル化アミノ酸も挙げられる。例えば、リジンおよびアルギニンのような塩基性の天然のアミノ酸はアミン（ＮＨ２）官能性にてアルキル基によって置換され得る。さらに他の置換には、アスパラギンまたはグルタミンのニトリル誘導体（例えば、ＣＯＮＨ２官能性の代わりにＣＮ−部分を含有する）およびメチオニンのスルホキシド誘導体が挙げられる。
【０１１６】
本発明のラビリントペプチンまたは本発明のラビリントペプチン誘導体では、すべてのアミノ酸がＬ−アミノ酸であってもよい。あるいは、すべてのアミノ酸がＤ−アミノ酸であってもよい。別の可能性において、ペプチド／ペプチド化合物は、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の混合物を含んでもよい。例えば、本明細書中に示したラビリントペプチンまたはラビリントペプチン誘導体は、Ｎ末端部分および／またはＣ末端部分（例えば、最後の２、３のＮ末端および／またはＣ末端残基の範囲内）に位置する少なくとも１つのＤ−アミノ酸を含んでもよい。１以上のＤ−アミノ酸の存在は通常、プロテアーゼ／ペプチダーゼの切断への感受性の低下のために（例えば、インビボにおいて）高い安定性を有するが、生物活性を保持するペプチドを生じる。
【０１１７】
本発明のラビリントペプチンおよび／またはラビリントペプチン誘導体は、それぞれ配列番号１または２で規定される化合物に加えて、アミノおよび／またはカルボキシ末端に共有結合で連結された１もしくは複数のアミノ酸を含んでもよい。よって、本発明のラビリントペプチンおよび／またはラビリントペプチン誘導体は、そのＮ（すなわち、アミノ）末端またはＣ（すなわち、カルボキシ）末端、またはその両方にて、別のアミノ酸配列に連結した、それぞれ配列番号１または２を含むキメラまたは融合タンパク質であってもよい。よって、本発明のある態様は、そのＮ−末端および／またはＣ末端に０〜１０個のアミノ酸、好ましくは０〜５個のアミノ酸、より好ましくは０〜３個のアミノ酸から成るアミノ酸配列を含む、本明細書中に示したラビリントペプチン（すなわち、配列番号２）に関する。同様に、本明細書中に示したラビリントペプチン誘導体は、そのＣ末端またはＮ末端に０〜１０個のアミノ酸、好ましくは０〜５個のアミノ酸、より好ましくは０〜３個のアミノ酸から成るアミノ酸配列を含む本明細書中に示したラビリントペプチン誘導体（すなわち、配列番号１）であり得る。例えば、本発明のラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体は、特定の細胞、組織、および／または臓器に対してラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体を標的化するペプチド部分および／または抗体を含んでもよい。例えば、そのペプチド部分および／または抗体は、肝臓に（例えば、肝細胞に）ラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体を誘導し得る。ＤＥＮＶ感染症の治療のために、そのペプチド部分および／または抗体は、免疫系細胞に（例えば、Ｔ細胞またはランゲルハンス樹状細胞に）ラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体を誘導し得る。ヘルペスウイルスの感染の治療のために、ペプチド部分および／または抗体は、神経細胞に（例えば、希突起膠細胞またはニューロンに）ラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体を誘導し得る。ＲＳＶの感染の治療のために、ペプチド部分および／または抗体は、肺に（例えば、肺胞に）ラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体を誘導し得る。ＣＨＩＫＶの感染の治療のために、ペプチド部分および／または抗体は、関節または神経組織にラビリントペプチン誘導体を誘導し得る。ＴＢＥＶの感染の治療のために、ペプチド部分および／または抗体は、中枢神経組織（脳、脊髄）の細胞にラビリントペプチン誘導体を誘導し得る。ＺＩＫＶの感染の治療のために、ペプチド部分および／または抗体は、皮下組織、中枢神経系、骨格筋または心筋にラビリントペプチン誘導体を誘導し得る。ＨＣＶの感染の治療のために、ペプチド部分および／または抗体は、肝臓に（例えば、肝細胞に）ラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体を誘導し得る。
【０１１８】
本発明のラビリントペプチンまたはラビリントペプチン誘導体は、直接的または（スペーサーまたはリンカーを通して）間接的に互いに共有結合で連結した、それぞれ、配列番号１または配列番号２のうちの２以上の化合物を含んでもよい。例えば、本発明のラビリントペプチンは、２以上の連結ＬａｂｙＡ１サブユニット、２以上の連結ＬａｂｙＡ２サブユニット、または１もしくは複数のＬａｂｙＡ２サブユニットに連結した１もしくは複数のＬａｂｙＡ１サブユニットを含む融合タンパク質であり得る。
【０１１９】
本明細書中に提供されるラビリントペプチンもまた、本発明に包含され、ここで、そのＮおよび／またはＣ末端アミノ酸は修飾されている。同様に、本明細書中に示したラビリントペプチン誘導体では、Ｃ末端またはＮ末端アミノ酸が修飾され得る。可能な薬物療法としては、脂肪酸（例えば、Ｃ６〜Ｃ１８）の共有結合、アルブミンのようなタンパク質の結合（例えば、米国特許第７，２６８，１１３号を参照）；グリコシル化、ビオチン化、またはペグ化、アセチル化、アシル化、アセトミドメチル（Ａｃｍ）基の付加、ＡＤＰ−リボシル化、アルキル化、アミド化、カルバモイル化、カルボキシエチル化、エステル化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、薬剤の共有結合、マーカー（例えば、蛍光マーカーまたは放射性マーカー）の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、およびユビキチン化が挙げられる。
【０１２０】
先に記載したように、本明細書中の「（本）発明のラビリントペプチン」および「（本）発明のラビリントペプチン誘導体」という用語はまた、本明細書中に示したラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体の塩、例えば配列番号１または２に記載の化合物の医薬的に許容され得る塩を含む。本明細書中に示したラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体の医薬的に許容され得る塩は、Remington’s Pharmaceutical Sciences (17th edition, page 1418 (1985))に記載されるように、それらの有機塩及びそれらの無機塩の両方であると理解される。それらの物理的及び化学的安定性並びにそれらの溶解性のために、ナトリウム、カリウム、カルシウム及びアンモニウム塩が、特に酸性基について好ましく；塩酸、硫酸もしくはリン酸、又はカルボン酸もしくはスルホン酸、例えば酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸及びｐ−トルエンスルホン酸の塩が、特に塩基性基について好ましい。本明細書中で使用される場合、「医薬的に許容され得る塩」という用語は、（特にＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶ、好ましくはＤＥＮＶに対して）親化合物の抗ウイルス活性を維持し、かつ、生物学的にまたはその他の点で好ましくないことはない（例えば、毒性でない）本発明のラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体の塩を指す。斯かる塩は、ラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体の最終的な単離および精製中にその場で調製されるか、または遊離塩基性官能基を好適な酸と反応させることによって別々に調製される。
【０１２１】
本発明のラビリントペプチン（例えば、ＬａｂｙＡ１、および／またはＬａｂｙＡ２）は次のように製造され得る。公的に入手可能な基準株アクチノマヅラ・ナミビエンシス（Actinomadura namibiensis）（ＤＳＭ６３１３）のバイオマスの発酵は、先に記載したように行われ得る（Meindl, 2010, Angew Chem Int Ed Engl 49: 1151-1154）。その後、発酵槽からのバイオマスを、水（例えば、２Ｌ）中に懸濁し、アセトン（例えば、２×２Ｌ）およびメタノール（例えば、１×２Ｌ）で抽出し得る。次に、合わせた有機層を減圧下で留去し得る。得られた未精製化合物を、水（例えば、１Ｌ）中に懸濁し、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエチル（例えば、２×１Ｌ）で抽出し得る。その後、有機層を捨ててもよく、そして、水層を留去して、（例えば、２０ｇの）原料を得てもよい。未精製の化合物を（例えば、２ｇのバッチで）精製にかけてもよい。溶出液として０．１％ ＨＣＯＯＨを含む水中のアセトニトリル（１０−９０％）を使用したＣ１８−ＷＰ（４０ｇ、２０μ）カラムを備えたフラッシュクロマトグラフィーシステム（例えば、GRACE製のReveleris X2）により、精製を実施してもよい。精製後、本発明のラビリントペプチン（例えば、ＬａｂｙＡ１および／またはＬａｂＡ２）の未精製混合物の量は、溶出液として０．１％ ＨＣＯＯＨを含む水中のアセトニトリル（１０−９０％）を用いたＧｅｍｉｎｉ５μＣ１８カラム（寸法：２５０ｍｍ×２０ｍｍ）を使用した逆相ＨＰＬＣ法によってさらに精製され得る２ｇまで減量され得る。ピークは、２２０ｎｍでのＵＶ検出法に基づいて分画化され得る。回収した所望の化合物（すなわち、本発明のラビリントペプチン）は、凍結乾燥され得る。この手順は、約４０ｍｇのＬａｂｙＡ１および約６ｍｇのＬａｂｙＡ２をもたらし得る。
【０１２２】
本発明のラビリントペプチンはまた、ラビリントペプチンの遺伝子組み換え製造が開示されているＷＯ２０１３／０９２６７２Ａ２に記載のとおり製造されてもよい。よって、本発明のラビリントペプチンは、ラビリントペプチンをコードする核酸を含む宿主細胞における発現によって製造され得る（組み換え発現）。あるいは、ＬａｂｙＡ１および／またはＬａｂｙＡ２は、ＷＯ２００８／０４０４６９Ａ１、ＷＯ２００９／１２１４８３Ａ１またはＷＯ２００９／１２１４８３Ａ１に記載のアクチノマヅラ・ナミビエンシス（すなわち、野生型アクチノマヅラ・ナミビエンシス）から単離され得る。そのため、ＷＯ２００９／１２１４８３Ａ１またはＷＯ２００９／１２１４８３Ａ１で開示されているアクチノマヅラ・ナミビエンシス株ＤＳＭ６３１３が使用され得る。本発明のラビリントペプチンはまた、Meindl（2010, Angew Chem Int Ed Engl 49: 1151?1154）に記載のように単離および精製されてもよい。要するに、本発明のラビリントペプチンは、抽出、クロマトグラフィ、および最終精製ステップとしての調製用ＨＰＬＣによって精製され得る。
【０１２３】
別のラビリントペプチン種は、それらの異なる極性に基づいて、例えばＭＣＩ（吸着樹脂、Mitsubishi, Japan）もしくはＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ（ＴＯＳＯＨＡＡＳ）の、又は他の疎水性材料、例えばＲＰ−８もしくはＲＰ−１８相の、逆相クロマトグラフィによって分離される。さらに、分離は、例えばシリカゲル、酸化アルミニウムなどの、順相クロマトグラフィによって行われ得る。
【０１２４】
本発明のラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体はまた、化学合成（例えば、固相ペプチド合成）によっても調製され得る。ラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体の品質は、ＵＶおよびＮＭＲ分光法によって確認され得る。
【０１２５】
本発明のラビリントペプチン誘導体（例えば、図４に示されているＬａｂｙＡ１−ＨｅｘｙｎまたはＬａｂｙＡ２−Ｈｅｘｙｎ）は、次のように製造されてもよい。ジメチルホルムアミド（例えば、１ｍｌ）中の２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（例えば、１ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ）の溶液に、ｎ−メチルモルホリン（例えば、２μＬ、０．０１５ｍｍｏｌ）を室温にて加え得る。室温にて１時間の撹拌後に、加えるべき化合物（例えば、５−ヘキシン酸、Ｒ１がヘキサ−５イノイルでなければならない場合；例えば、０．５μＬ、０．００４ｍｍｏｌ）を加え得る。３０分間の撹拌後に、非誘導体化ラビリントペプチン（例えば、６ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ）を反応混合物に加えて、室温にて１６時間撹拌した。反応混合物を、溶出液として０．１％ ＨＣＯＯＨを含む水中のアセトニトリル（１０−９０％）を用いたＧｅｍｉｎｉ５μＣ１８カラム（寸法：２５０ｍｍの×２０ｍｍ）を使用した逆相ＨＰＬＣによって精製してもよい。ピークは、２２０ｎｍにてＵＶ検出法に基づいて分画化され得る。回収した誘導体化ラビリントペプチンは、凍結乾燥され、２ｍｇ（３１．７％）が得られた。生成物は高分解能質量分析法によって特徴づけされ得る。
【０１２６】
本発明はまた、本発明のラビリントペプチンをコードする核酸、上記の核酸および／またはベクターを含む細胞（例えば、宿主細胞）を提供する。よって、本発明は、例えば、当該技術で周知の培養培地、作出法、単離法および精製法を用いた、本発明のラビリントペプチンの発現／作出のための、組み換え発現系、ベクターおよび宿主細胞を提供する。先に示したように、本発明のラビリントペプチンは、例えば、逆相クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ゲル電気泳動などのような当該技術で周知の技法によって精製することができる。アフィニティクロマトグラフィ精製については、例えば、本明細書中に示したラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体に特異的に結合する抗体が使用され得る。
【０１２７】
本発明はまた、上記ラビリントペプチンおよび／またはラビリントペプチン誘導体、および／または組み合わせ物を含む医薬組成物を提供する。前記医薬組成物はさらに、少なくとも１つの医薬的に許容し得る担体および／または希釈剤を含む。本明細書で使用されるとき、「薬学上許容可能な」という用語（「生物学上許容可能な」とも呼ばれる）は、インビボにおいて毒性のまたは有害な生物学的効果がない（限定される）ことを特徴とする物質を指す。用語「薬学上許容可能な担体および／または希釈剤」は医薬組成物の調製で一般に使用される添加剤を指し、それには、例えば、溶媒、分散媒、生理食塩水溶液、界面活性剤、可溶化剤、潤滑剤、乳化剤、コーティング、抗菌および抗真菌剤、キレート剤、ｐＨ調節剤、緩和剤、還元剤、抗酸化剤、等張剤、吸収遅延剤などが挙げられる（例えば、Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, Pharmaceutical Press; 6th edition, 2009を参照）。
【０１２８】
先に記載したように、本明細書中に示した医薬組成物／ラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体／組み合わせ物は、例えば注入液剤または輸液剤、μカプセル剤、インプラント剤またはロッド剤の形態で、例えば静脈内、筋肉内または皮下に、非経口的に投与され得る。本発明の医薬組成物／ラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体／組み合わせ物はまた、例えば、丸薬、錠剤、ラッカー錠剤、コーティング錠剤、顆粒剤、ゼラチン硬および軟カプセル剤、液剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤またはエアゾール混合物の形態で、経口的に投与されてもよい。しかしながら、本発明の医薬組成物／ラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体／組み合わせ物はまた、例えば、坐剤の形態で、経直腸的に、例えば、軟膏剤、液剤またはチンキ剤の形態で、経皮的または局所的に、あるいは、例えば、エアゾール剤または鼻腔用スプレー剤の形態で、他の様式で投与されてもよい。
【０１２９】
本発明の医薬組成物は、自体公知でかつ当業者によく知られている様式で調製される。例えば、薬学上許容可能な不活性無機および／または有機担体物質および／または添加物が、上述の、任意の立体化学形態、または任意の比率の任意の立体化学形態の混合物の、（単数もしくは複数の）本発明のラビリントペプチンおよび／または（単数もしくは複数の）ラビリントペプチン誘導体および／または本発明の組み合わせ物、またはそれらの生理学的に許容される塩に加えて使用される。丸剤、錠剤、コーティング錠剤およびゼラチン硬カプセル剤の作製には、例えば、ラクトース、トウモロコシデンプンまたはその誘導体、タルク、ステアリン酸またはその塩などを使用することが可能である。ゼラチン軟カプセル剤および坐剤用の担体物質は、例えば、脂肪、ワックス、半固体および液体ポリオール、天然または硬化油などである。液剤（例えば、注射用液剤）または乳剤もしくはシロップ剤の作製用の好適な担体物質は、例えば、水、生理食塩水、アルコール、グリセリン、ポリオール、スクロース、転化糖、グルコース、植物油などである。μカプセル剤、インプラント剤またはロッド剤用の好適な担体物質は、例えばグリコール酸と乳酸とのコポリマーである。
【０１３０】
本明細書中、「有効量」という用語は、所望の抗ウイルス活性、すなわち、所望の予防薬／治療結果（すなわち、先に記載したウイルス感染の予防および／または治療）を達成に必要な投薬量および期間での有効な量を指す。本明細書中に示したラビリントペプチン、本明細書中に示したラビリントペプチン誘導体、本明細書中に示した組み合わせ物または本明細書中に示した医薬組成物の有効量は、例えば、個体の疾患の状態、年齢、性別および体重などの因子に従って変化し得る。よって、投与計画を調整して最適な予防／治療の応答を提供し得る。有効量はまた、予防上／治療上の有益な効果が化合物の毒性のまたは有害な効果に勝るものでもある。特定の対象については、個体の必要性および組成物を投与するまたは投与を監督する人の専門的な判断に従って特定の投与計画が時間をかけて調整され得る。
【０１３１】
例えば、本発明の医薬組成物は、約０．５〜約９０重量％の本明細書中に示したラビリントペプチン、本明細書中に示したラビリントペプチン誘導体、または本明細書中に示した組み合わせ物、および／またはそれらの生理学的に許容される塩および／またはそれらのプロドラッグを含み得る。本明細書中に示した医薬組成物中の有効成分（すなわち、本明細書中に示したラビリントペプチン、本明細書中に示したラビリントペプチン誘導体、または本明細書中に示した組み合わせ物）の量は、約０．５〜約１０００ｍｇ、好ましくは約１〜約５００ｍｇであり得る。
【０１３２】
本明細書中に示した有効成分（すなわち、本明細書中に示したラビリントペプチン、本明細書中に示したラビリントペプチン誘導体、または本明細書中に示した組み合わせ物）の用量は、広い限度範囲内で変動し得、通例でありかつ医師に公知であるように、各個体の症例における個体の状態に適合すべきである。それは、例えば使用される特定の化合物、治療しようとする疾患の性質および重症度、投与の様式およびスケジュール、または急性もしくは慢性の状態を治療するかどうか、または予防を行なうのかどうかに依存する。好適な用量は、医学の分野においてよく知られた臨床的アプローチを使用して確立し得る。例えば、（例えば、体重約７５ｋｇの成人において）所望の結果を達成するための一日用量は、約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、特に約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ（各場合において、体重１ｋｇ当たりのｍｇ）である。一日用量は、特に比較的多量の投与の場合に、いくつかの、例えば２、３または４つの部分の投与へ分割し得る。通常であるように、個体の反応に依存して、示した一日用量から上方または下方へ外す必要があり得る。
【０１３３】
本発明との関連において、治療されるべき対象（すなわち、患者）の体内における本明細書中に示したラビリントペプチン、ラビリントペプチン誘導体または組み合わせ物の濃度は、５０μＭを超えてはいけない。本明細書中に示したラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体／組み合わせ物または医薬組成物の投与後の、対象（すなわち、患者）の体内の前記ラビリントペプチン、ラビリントペプチン誘導体、または組み合わせ物の濃度が、０．１２５μＭ〜５０μＭ、好ましくは０．５μＭ〜５０μＭであることが想定された。これは、特にラビリントペプチンがＬａｂｙＡ１である場合、またはラビリントペプチン誘導体に含まれるラビリントペプチンがＬａｂｙＡ１である場合、適用される。
【０１３４】
治療されるべき対象において、本明細書中に示したラビリントペプチン、ラビリントペプチン誘導体または組み合わせ物の濃度は、それぞれの化合物の細胞傷害性濃度より低いことが想定される。本明細書中に示したラビリントペプチン、ラビリントペプチン誘導体または組み合わせ物の細胞傷害性濃度（ＣＣ５０）を測定するために、以下のアッセイが適用され得る。
【０１３５】
ホタルルシフェラーゼ（ＦＦ−ｌｕｃ）のレポーター遺伝子を安定して発現する細胞（例えば、ＨＥｐ−２細胞）は、９６ウェルプレート内の培地、例えば、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ ＭＥＭ中に播種され得る。高い濃度の、試験すべきラビリントペプチン、ラビリントペプチン誘導体または組み合わせ物（例えば、最大１００μＭ）の存在下、３７℃にて７２時間のインキュベーション後に、細胞は溶解され、ＦＦ−ｌｕｃ（ＲＬＵ）の消失が計測され得る。そのため、プレートルミノメータ（Berthold）が使用され得る。生存細胞の数は、残留ルシフェラーゼ発現に間接的に比例する。
【０１３６】
活性成分（すなわち、本明細書中に示したラビリントペプチン、本明細書中に示したラビリントペプチン誘導体、または本明細書中に示した組み合わせ物）ならびに担体および／または希釈剤に加えて、本発明の医薬組成物は、例えば、増量剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、湿潤剤、安定化剤、乳化剤、保存料、甘味料、着色料、着香料、芳香剤、増粘剤、緩衝剤物質、溶剤、可溶化剤、デポー効果を達成するための薬剤、浸透圧を変更するための塩、コーティング剤および／または抗酸化剤のうちの１もしくは複数の添加剤を含む。
【０１３７】
用語「治療」、「治療すること」などは、所望の薬理（すなわち、抗ウイルス）効果、例えば、ウイルスの侵入またはウイルス複製の阻害、を得ることを意味することを意図する。「治療」および「治療すること」は、対象（例えば、ヒト患者）への本明細書中に示したラビリントペプチン、ラビリントペプチン誘導体、組み合わせ物または医薬組成物の投与が、対照対象と比較して低減されたウイルス陽性細胞数をもたらすことを意味すると想定している。前記対照対象は、前記ラビリントペプチン、ラビリントペプチン誘導体、組み合わせ物または医薬組成物を与えられなかった対象（例えば、ヒト患者）である。よって、本明細書中の用語「治療」または「治療すること」は、先に触れたウイルスの感染の部分的または完全な治癒に関する。先に記載したとおり、本明細書中の「ウイルス感染（「virus infection」または「viral infection」）」は、ウイルス感染によって引き起こされる疾患／障害すなわち感染症を指す。例えば、前記疾患／障害はウイルス感染の症状によって引き起こされ得る。用語「治療」または「治療すること」は、対象、特にヒトにおける疾患の任意の治療；なお、ＶＳＶの場合には、動物、好ましくはウシ、ブタまたはウマの治療、そして、疾患（すなわち、ウイルス感染）の阻害、疾患の（すなわち、ウイルス感染の）発生／悪化の停止または減速；または疾患の緩和（例えばウイルス感染に関連する／引き起こされる症状の軽減）に関する。用語「治療」または「治療すること」としてはまた、漸近的ウイルス感染、例えば、ＨＣＶ、ＺＩＫＶまたはＣＭＶの漸近的ウイルス感染への治療的介入も挙げられる。漸近的ウイルス感染の治療としては、例えば、感染対象においてウイルス陽性細胞の量、ウイルス粒子および／またはウイルス複製の量を低減することを含む。「予防」、「予防すること」などの用語は、ウイルス感染またはその症状を完全にまたは部分的に予防することに関して予防効果が得られることを意味する。本明細書中に示したラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体／組み合わせ物／医薬組成物は、（ウイルス感染の出現を予防するのではなく）現在存在しているウイルス感染を治療することに使用されるのが好ましい。
【０１３８】
先に触れた「予防」および／または「治療」は、１以上の追加の活性剤／治療剤との併用でまたは他の治療法との併用で、上述のラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体／組み合わせ物／医薬組成物または薬学上許容可能なその塩または医薬組成物の投与を含む。予防剤／治療剤および／または組成物の組み合わせは、従来の剤形にて投与されてもよくまたは同時投与されてもよい（例えば、連続して、同時に、異なる時に）。本発明の文脈での同時投与は、改善された臨床転帰を達成するための協調治療の経過にて１を超える治療剤の投与を指す。そのような同時投与は、同一の広がりを持ち、すなわち、重複した時間の間に生じ得る。例えば、第２の剤を投与する前に、同時に、前後に、または後に第１の剤を患者に投与し得る。本発明の一態様において、剤は単一組成物にて組み合わせられ／製剤化されるので、同時に投与され得る。本発明の他の態様において、当該疾病を予防するまたは治療するのに現在使用されている１以上の剤との併用で本発明の（単数もしくは複数の）活性剤が使用され／投与される。従って、実施形態では、ペプチド組成物は、抗癌療法、例えば、化学療法剤、血管形成阻害剤、ホルモン療法、放射線療法、光力学療法、手術、免疫療法、ワクチンまたは移植との併用で投与され／使用される。従って、本発明の想定する態様において、本発明のラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体／組み合わせ物／医薬組成物は、抗ウイルス治療法と組み合わせて投与／使用される。本明細書中に示したラビリントペプチン／ラビリントペプチン誘導体／組み合わせ物／医薬組成物との共同療法で使用され得る潜在抗ウイルス治療法が、本明細書中に記載されている。
【０１３９】
本明細書中に使用される場合、用語「対象」（「患者」とも呼ばれる）は、例えば哺乳動物など、例えばラクダ、ネコ、イヌ、マウス、モルモット、ウマ、ブタ、ウシ（cattle、例えばbovine cowなど）、ヒツジおよびヒトなどの温血動物を意味すると解釈される。対象が哺乳動物であることが好ましい。対象がヒトであることが最も好ましい。特に、ＶＳＶの感染の場合には、対象はまた動物でもあり、好ましくはウシ、ブタまたはウマであってもよい。
【０１４０】
本発明との関連において、「同一性」、「パーセントの同一性」、または「Ｘ％同一」とは、アミノ酸配列が、配列番号３の配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、およびより一層好ましくは少なくとも９５％；または、配列番号４の配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、およびより一層好ましくは少なくとも９４％の同一性を有することを意味し、ここで、それが低いほど、より高い同一性値が好まれる。本発明によれば、２以上のアミノ酸配列との関連において「（単数もしくは複数の）同一性」または「（単数もしくは複数の）パーセントの同一性」という用語は、同じであるか、または同一であるアミノ酸が指定されたパーセンテージを占める（例えば、配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、およびより一層好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する；または配列番号４の配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、およびより一層好ましくは少なくとも９４％の同一性を有する）；かつ、機能的である２以上の配列を指し、ここで、機能とは、比較ウィンドウにわたって、または当該技術分野で知られている配列比較アルゴリズムを使用して、または手動整列および目視検査によって計測した場合に設計した領域にわたって、比較および整列したときには、好ましくはＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、および／またはＨＣＶに対して抗ウイルス活性を含む。
【０１４１】
好ましくは、記載した同一性は、長さが少なくとも約１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸の領域、そして、最も好ましくは配列番号３または４のすべてのアミノ酸にわたって存在する。
【０１４２】
当業者は、当該技術分野で公知の、例えばＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータプログラム（Thompson, 1994, Nucl Acids Res, 2: 4673-4680）またはＦＡＳＴＤＢ（Brutlag, 1990, Comp App Biosci, 6: 237-245）に基づくものなどのアルゴリズムを使用して配列間／中のパーセント同一性をどのように決定するか知るであろう。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム（Altschul, 1997, Nucl Acids Res 25: 3389-3402; Altschul, 1993, J Mol Evol, 36: 290-300; Altschul, 1990, J Mol Biol 215: 403-410）もまた当業者が利用可能である。例えば、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ、ＢＬＡＳＴ（Altschul, 1997, loc. cit.; Altschul, 1993, loc. cit.; Altschul, 1990, loc. cit.）を表すＢＬＡＳＴ２．０は、局所的な配列整列を検索するために使用できる。先に述べたとおり、ＢＬＡＳＴは、ヌクレオチドとアミノ酸の両方の整列を作成して、配列の類似性を決定する。整列の局所的な性質のため、ＢＬＡＳＴは、完全な一致を測定する際に、または類似配列を同定する際に、特に有用である。
ＢＬＡＳＴ（Altschul, 1997, loc. cit.; Altschul, 1993, loc. cit.; Altschul, 1990, loc. cit.）を使用する類似のコンピュータ技術が、例えばＧｅｎＢａｎｋまたはＥＭＢＬなどのヌクレオチドデータベースにおいて同一分子または関連分子を検索するのに使用される。
【０１４３】
以下の制限されることのない図面および実施例の参照によって、本発明はさらに説明される。図面を以下を示す。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】（Ａ）ランチオニンおよび（Ｂ）ラビオニンの化学構造
【図２】デヒドロブチラートの化学構造
【図３】それらの立体化学を示すＬａｂｙＡ１およびＬａｂｙＡ２の化学構造
【図４】ＬａｂｙＡ１、ＬａｂｙＡ２、ＬａｂｙＡ１−Ｈｅｘｙｎ、およびＬａｂｙＡ２−Ｈｅｘｙｎの化学構造
【図５】ラビリントペプチンによるＣＭＶ感染の用量依存的阻害。ＧＦＰ発現性ＣＭＶ（すなわち、ＨＣＭＶ）菌株を感染させた、および指示した濃度のラビリントペプチンＡ１およびＡ２で処置されたＮＨＤＦ細胞（三連）の培養物のＧＦＰシグナル（相対ユニット＋／−ＳＤ）を、感染後４日目で測定した。物質のＩＣ５０値は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍの非線形当てはめログ（阻害剤）対応答（３つのパラメーター）分析を使用して計算された。２つの実験のうちの１つの代表的結果が示されている。
【図６】ラビリントペプチンは、初期相においてＣＭＶ感染を阻害する。ＮＨＤＦ細胞を、ＧＦＰ発現性ＣＭＶ菌株に感染させ、そして、試験化合物を、示した時点で添加した。感染９６時間後に、感染培養物（三連）の細胞におけるＧＦＰ発現が計測された。ＬａｂｙＡ１およびＡ２の濃度は、それぞれ、３μＭおよび７μＭであった。データは、三連培養で計測された値の平均（＋／−ＳＤ）である。２つの実験のうちの１つからの代表的なデータが示されている。
【図７】ラビリントペプチンの作用機序。ＣＭＶ粒子またはＮＨＤＦ細胞を、ラビリントペプチン、ＰＡＡまたはＤＭＳＯと共に１時間プレインキュベートするか、または無処置のままにした。次に、サンプルの培地を、先の実験で有効であることがわかったラビリントペプチンの濃度を下回る、１６倍希釈し、続いて、ＣＭＶ植菌を３時間おこない、そして、最後に新しい培地に置き換えた。対照のために、培養物を、有効量の物質または１６倍希釈した濃度にて永続的に処理した。細胞のＥＧＦＰ発現（五連の平均）は感染４日後に計測された。実験は３回繰り返し、類似の結果を伴った。
【図８】ＴＯＡ実験のデザインを示す図表。
【図９】作用機序アッセイの概要。
【図１０】ＤＥＮＶ感染に対するラビリントペプチンＡ１とＡ２の相乗効果。Ｈｕｈ−７細胞を、濃度を変えたＬａｂｙの存在下でインキュベートし、そして、３０分後にＤＥＮＶに晒した。感染４８時間後に、高精細な蛍光画像法を介してＤＥＮＶ−エンベロープタンパク質発現（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８免疫染色）を評価することによって、ＤＥＮＶ陽性細胞の数を測定した。全細胞数を、ＤＡＰＩ核染色を評価することによって測定した。ＩＣ５０値は、ＬａｂｙＡ１（ＩＣ５０＝３．７μｇ／ｍｌ）が、ＬａｂｙＡ２（ＩＣ５０＝１５．４μｇ／ｍｌ）に比べてウイルス感染のより強力な阻害剤であることを示す。ＬａｂｙＡ１とＬａｂｙＡ２が１：１の組み合わせで適用されたとき、それらの抗ウイルス活性はさらに改善される（ＩＣ５０＝２．６μｇ／ｍｌ）。（値は±ＳＥＭ、ｎ＝５）
【図１１】Ｌａｂｙ−Ｈｅｘｙｎ誘導体は抗ＤＥＮＶ活性を維持する。Ｈｕｈ−７細胞を、濃度を変えたＬａｂｙ−Ｈｅｘｙｎ誘導体の存在下でインキュベートし、そして、３０分後にＤＥＮＶに晒した。感染４８時間後に、高精細な蛍光画像法を介してＤＥＮＶ−エンベロープタンパク質発現（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８免疫染色）を評価することによって、ＤＥＮＶ陽性細胞の数を測定した。全細胞数を、ＤＡＰＩ核染色を評価することによって測定した。ＩＣ５０値は、Ｌａｂｙ−Ｈｅｘｙｎ誘導体がそれらの抗ＤＥＮＶ活性を維持することを示す：ＩＣ５０（ＬａｂｙＡ１−Ｈｅｘｙｎ）＝３．７μｇ／ｍｌ、ＩＣ５０（ＬａｂｙＡ２−Ｈｅｘｙｎ）＝１４．２μｇ／ｍｌ、ＩＣ５０（ＬａｂｙＡ１−Ｈｅｘｙｎ／ＬａｂｙＡ２−Ｈｅｘｙｎの１：１の組み合わせ物）＝２．０μｇ／ｍｌ。（値は±ＳＥＭ、ｎ＝３である）
【図１２】インビトロにおける固定化Ｌａｂｙ−Ｈｅｘｙｎ誘導体へのビオチン−アジドの双極子環付加。２μｇのＬａｂｙ誘導体を、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレート上に固定した。ＰＢＳ中の１％ ＢＳＡを用いたブロッキング後に、ビオチン−アジドを含むもしくは含まない双極子環付加のための反応ミックスを、２時間かけて適用した。続いて、反応の成功を、アビジン標識ＨＲＰを伴ったウェルの１時間のインキュベーションと、その後の基質溶液Ｃ［BioLegend］の添加によって誘発される呈色反応によって確認した。呈色反応を、５０μｌのＨ３ＰＯ４（１Ｍ）の添加によって停止させ、そして、ＯＤ４５０ｎｍを観察した。（値は±ＳＥＭ、ｎ＝２）
【図１３】実施例４のスクリーニングシステムの略図
【図１４】実施例４のスクリーニングシステムのアッセイバリデーション。細胞生存を、クリスタルバイオレットで染色することによって評価される。
【図１５】実施例４のスクリーニングシステムのアッセイバリデーション。ＲＳＶおよびリバビリンの存在下での細胞生存を示す。
【図１６Ａ−Ｂ】ラビリントペプチンは、ＲＳＶ誘発性細胞死およびＲＳウイルス感染を阻害する。Ａ：ＲＳＶおよびＬａｂｙＡ１の存在下での細胞生存；Ｂ：ＲＳＶおよびＬａｂｙＡ２の存在下での細胞生存；
【図１６Ｃ】ラビリントペプチンは、ＲＳＶ誘発性細胞死およびＲＳウイルス感染を阻害する。Ｃ：ラビリントペプチンは、ＲＳＶ感染症を阻害する。
【図１７Ａ】Ａ：薬理学的および免疫学的阻害、ならびに細胞制限のためのチクングニヤウイルス糖タンパク質媒介性およびＶＳＶ糖タンパク質媒介性細胞侵入過程の感受性の特徴づけ。
【図１７Ｂ】Ｂ：ラビリントペプチンＡ１。
【図１８】ＴＢＥＶ感染症に対するラビリントペプチンの効果。
【図１９】ＺＩＫＶ感染症に対するラビリントペプチンの効果。
【図２０Ａ】ＨＣＶ感染に対するラビリントペプチンの効果。Ａ：ＨＣＶ ＪｃＲ２ａに対するラビリントペプチンＡ１抗ウイルス活性。
【図２０Ｂ】ＨＣＶ感染に対するラビリントペプチンの効果。Ｂ：ＨＣＶ ＪｃＲ２ａに対するラビリントペプチンＡ２抗ウイルス活性。
【図２１】ラビリントペプチンＡ１およびＡ２の細胞傷害性濃度（ＣＣ５０）。
【発明を実施するための形態】
【０１４５】
実施例は、本発明を例示する。
【実施例】
【０１４６】
実施例１：材料と方法
用量応答アッセイ
抗ウイルス性アッセイは、ＮＨＤＦ細胞におけるＣＭＶ駆動性ＧＦＰ発現の阻害に基づいている。簡単に言えば、ＮＨＤＦ細胞（１ウェルあたり〜１．６×１０４）を、感染の１日前に９６ウェルプレート内に播種した。様々な濃度のラビリントペプチンＡ１（終濃度１０、５、２、１、および０．５μＭ）およびラビリントペプチンＡ２（終濃度１５、１０、５、２、および１μＭ）を、三連で２００μｌ／ウェルの全容積まで細胞に与えた。ＰＡＡ（１８０μＭ）を陽性対照として加えた。ＤＭＳＯで希釈された物質の対照として、ＤＭＳＯを、細胞に加えられる物質でおこなわれる最高濃度で感染細胞または非感染細胞のいずれかに加えた。１時間のインキュベーション後に、ＣＭＶ（すなわち、ＨＣＭＶ）実験室株ＡＤ１６９に基づくＧＦＰ発現性ＣＭＶ（すなわち、ＨＣＭＶ）菌株ｐＨＧ−１（Borst, J. Virol. 2005 (79): 3615-26; herein called HT8-GFP）を、０．５のＭＯＩにて細胞に追加し、細胞がさらに４日間インキュベートした。感染４日後に、ウェルから培地を取り出し、計測前に、細胞を３％のＰＦＡで固定し、ＰＢＳで洗浄し、それに続いてＰＢＳを加えた。細胞からのＧＦＰ発現を、BioTek Synergy2を使用して計測した；励起波長のプロトコールを４８５／２０ｎｍに設定し、かつ、発光波長は５１６／２０ｎｍであった。
【０１４７】
時間依存性薬物添加（ＴＯＡ）実験
ＴＯＡ実験を、９６ウェルプレート内で１ウェルあたり１．６×１０４個のＮＨＤＦ細胞を使用しておこなった。ラビリントペプチンＡ１（３μｍ）、Ａ２（７μｍ）、ＤＭＳＯ（０．１％）またはＰＡＡ（１８０μＭ）をウイルス添加の−１、０、１、３、６、２４、４８、７２時間で培養物に追加した。細胞を、０時間に０．５の感染多重度（ＭＯＩ）でＨＴ８−ＧＦＰに感染させた。感染の９６日後に、細胞のＧＦＰ発現を上記のとおり計測した。
【０１４８】
作用機序アッセイ
８×１０３ＰＦＵのＨＴ８−ＧＦＰ発現ＡＤ１６９菌株および１．６×１０４ＮＨＤＦ細胞／ウェルを、それぞれ３μＭおよび７μＭのＴＯＡ ＬａｂｙＡ１およびＡ２と共に１時間プレインキュベートし、次に、細胞にそれらを加えるか、または５つのウェルでウイルスへの感染前に、１６倍希釈した。感染の３時間後に、培地を新しい培地に交換し、そして、対照のために、インキュベーション、ウイルスおよび細胞を、ＤＭＳＯ（物質の最高濃度）およびＰＡＡ（１８０μＭ）と共に１時間プレインキュベートし、それに続いて、それらを１６倍希釈し、そして、３時間にわたりウェルに加え、次に、新しい培地に交換した。
【０１４９】
ＫＳＨＶ感染症に対するラビリントペプチンの用量依存性効果
３×１０４個のＨＥＫ２９３細胞を、９６ウェルプレート内の成長培養（ＤＭＥＭ；１０％のＦＢＳ）中に播種し、３７℃および５％のＣＯ２にて２４時間インキュベートした。培地の除去後、２０μｌの、０．０１のＭＯＩの（細胞株ＢＪＡＢ−ｒＫＳＨＶ（Kati, J Virol. 2013, 87(14):8004-16; Kati, J Virol Methods. 2015; 217:79-86）から生じた）ＫＳＨＶ溶液と一緒に１８０μｌの成長培地を各ウェルに適用した。同時に、示した量のＬａｂｙＡ１またはＬａｂｙＡ２を加えた。４８時間のインキュベーション後に、ＧＦＰ発現性ＨＥＫ２９３細胞を蛍光顕微鏡下でカウントした。図面の所定のデータ点は三連の平均である。結果を、以下の表４に示す。
【０１５０】
用量応答アッセイ
Ｈｕｈ−７．５細胞（１ウェルあたり３×１０４）を、感染の前日に、黒色９６ウェル光学底面プレート［Ｎｕｎｃ］内の成長培地中に播種した。ＰＢＳで洗浄した後に、ＬａｂｙＡ１、ＬａｂｙＡ２（終濃度５０、１６．７、５．５６、１．８５、０．６２、０．２１、０．０６９μｇ／ｍｌ）またはＬａｂｙＡ１およびＬａｂｙＡ２の組み合わせ物（２５、８．３、２．８、０．９３、０．３１、０．１０、それぞれ０．０３４μｇ／ｍｌ）を含む４０μｌのアッセイ培地（５％のＦＢＳ）を細胞に追加した。処理を二連でおこなった。ＰＢＳは対照としての役割を果たした。３０分間のインキュベーション後に、細胞を、０．５のＭＯＩにてデングウイルス（２型ニューギニアＣ株）に感染させて、６０μｌ／ウェルの終量を得た。室温にて２時間のインキュベーション後、細胞はＰＢＳで洗浄され、そして、１００μｌのアッセイ培地がウェルごとに加えた。感染細胞は、さらに４８時間インキュベートされ得る。以降、ウェルから培地が取り出され、そして、４％のＰＦＡで細胞が固定した。固定化細胞は、ＰＢＳで広範囲に洗浄され、そして、０．２５％のTritonX-100で５分間、透過処理した。ＰＢＳ中の５％ ＦＢＳでのブロッキング後に、一次抗体が、２時間適用した（抗デング熱ウイルスＥ糖タンパク質抗体［ＤＥ１］（ａｂ４１３４９）［Abcam］、５％のＦＢＳ／ＰＢＳ中、１：１００希釈）。洗浄後、二次抗体（例えば、Alexa Fluor（登録商標）488ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）［Life Technologies］、５％のＦＢＳ／ＰＢＳ中、１：１０００希釈）が１時間適用した。最後に、細胞はＤＡＰＩ（ＰＢＳ中、５００ｎｇ／ｍｌ）で５分間染色した。
蛍光細胞は、自動化顕微鏡ImageXpressMicro［Molecular Devices］およびMetaXpressソフトウェアを使用した高精細画像化によって分析した。励起波長は３６０ｎｍ（ＤＡＰＩ）および４８５ｎｍ（Alexa Fluor488）に設定し、そして、発光波長は４６０ｎｍ（ＤＡＰＩ）および５１６ｎｍ（Alexa Fluor488）に設定した。６つの部位／ウェルの画像を取得した（２列、８９μｍ間隔、３行、６７μｍ間隔）。全細胞／部位の数は、ＤＡＰＩ染色核を自動的にカウントすることによって測定した。ウイルス陽性細胞（例えば、ＤＥＮＶ陽性細胞）のパーセンテージは、総細胞数に対するAlexa Fluor 488陽性細胞数を自動的に評価することによって計算した。６つの部位から得られた値は、平均化され、そして、片対数Ｘ／Ｙチャートにプロットした。ＩＣ５０値は非線形回帰によって計算した。
【０１５１】
ＬａｂｙＡ１−Ｈｅｘｙｎ誘導体の合成
ジメチルホルムアミド（例えば、１ｍｌ）中の２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（１ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ）の溶液に、ｎ−メチルモルホリン（２μＬ、０．０１５ｍｍｏｌ）を室温にて加えた。室温にて１時間の撹拌後に、５−ヘキシン酸（０．５μＬ、０．００４ｍｍｏｌ）を加えた。３０分間の撹拌後に、ラビリントペプチンＡ１（６ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ）を反応混合物に加えて、室温にて１６時間撹拌した。反応混合物を、溶出液として０．１％ ＨＣＯＯＨを含む水中のアセトニトリル（１０−９０％）を用いたＧｅｍｉｎｉ５μＣ１８カラム（寸法：２５０ｍｍの×２０ｍｍ）を使用した逆相ＨＰＬＣによって精製してもよい。ピークは、２２０ｎｍにてＵＶ検出法に基づいて分画化した。回収した所望の化合物を、凍結乾燥し、２ｍｇ（３１．７％）を得た。生成物を高分解能質量分析法によって特徴づけした。
ＨＲＭＳ（Ｑ−ｔｏｆ）：計算値Ｃ９８Ｈ１２６Ｎ２３Ｏ２６Ｓ４［Ｍ＋Ｈ］＋２１６８．８１２７、実測値２１６８．７８２１。
【０１５２】
ＬａｂｙＡ２−Ｈｅｘｙｎ誘導体の合成
ジメチルホルムアミド（例えば、１ｍｌ）中の２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（１ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ）の溶液に、ｎ−メチルモルホリン（２μＬ、０．０１５ｍｍｏｌ）を室温にて加えた。室温にて１時間の撹拌後に、５−ヘキシン酸（０．５μＬ、０．００４ｍｍｏｌ）を加えた。３０分間の撹拌後に、ラビリントペプチンＡ２（６ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ）を反応混合物に加えて、室温にて１６時間撹拌した。反応混合物を、溶出液として０．１％ ＨＣＯＯＨを含む水中のアセトニトリル（１０−９０％）を用いたＧｅｍｉｎｉ５μＣ１８カラム（寸法：２５０ｍｍの×２０ｍｍ）を使用した逆相ＨＰＬＣによって精製してもよい。ピークは、２２０ｎｍにてＵＶ検出法に基づいて分画化した。回収した所望の化合物を、凍結乾燥し、１．５ｍｇ（２３．８％）を得た。生成物を高分解能質量分析法によって特徴づけした。
ＨＲＭＳ（Ｑ−ｔｏｆ）：計算値Ｃ９１Ｈ１１７Ｎ２０Ｏ２５Ｓ４［Ｍ＋Ｈ］＋２０１７．７３８１、実測値２０１７．７３７６
【０１５３】
固定化Ｌａｂｙ−Ｈｅｘｙｎ誘導体に対するビオチン−アジドの双極子環付加
すべてのその後の洗浄ステップを、２００μｌのＰＢＳで３回おこなった。２μｇのＬａｂｙＡ１−Ｈｅｘｙｎ、ＬａｂｙＡ２−ＨｅｘｙｎまたはＬａｂｙＡ１を、コーティングバッファーＡ［BioLegend］で希釈し、９６ウェルプレート（Nunc Maxisorp）に４℃にて１６時間、三連で吸着させた。ＰＢＳで洗浄した後に、ウェルを、ＰＢＳ中の（阻害バッファー）１％ ＢＳＡ（ｗ／ｖ）で室温にて１時間ブロッキングした。ウェルズを再びＰＢＳで洗浄し、そして、１００μｌの環付加反応ミックス（２ｍＭのＣｕＳＯ４、５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム、１００μＭのビオチン−アジド［アジド−ＰＥＧ３−ビオチン複合体、Sigma］）、ブロッキングバッファー中に希釈）を適用した。ビオチン−アジドを含まない環付加反応ミックスは、対照としての役割を果たす。反応を室温にて２時間おこなった。ＰＢＳで洗浄した後、ウェルを、１００μｌのアビジン標識ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）［BioLegend］含有ブロッキング溶液と共に１時間インキュベートした。最後に、ウェルをＰＢＳで洗浄し、１００μｌの基質溶液Ｃ［BioLegend］を各ウェルに適用した。呈色反応を、５０μｌのＨ３ＰＯ４（１Ｍ）の添加によって１５分後に停止した。ＯＤ４５０ｎｍを、自動化プレートリーダ［Biotek］を使用して測定した。
【０１５４】
チクングンヤウイルスアッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、９６ウェルプレート（２×１０４細胞／ウェル）に播種し、標準条件下で培養した。翌日、ルシフェラーゼをコードするＶＳＶ−Ｇ−およびＣＨＩＫＶ ｇｐ−偽型レンチウイルス粒子を、指示した濃度のラビリントペプチンＡ１またはＤＭＳＯで処理した。細胞を、ラビリントペプチンＡ１処置またはＤＭＳＯ処置ベクター粒子で形質導入し、そして、４８時間培養した。その後、形質導入細胞のルシフェラーゼ活性を、蛍光計量的に計測した。ＩＣ５０値を、GraphPad Prism5を使用して計算した；実施例５および図１７を参照。
【０１５５】
実施例２：ＣＭＶ感染に対するラビリントペプチンＡ１およびＡ２の効果
ＣＭＶ感染に対するラビリントペプチンの用量依存性効果
ＣＭＶ（すなわち、ＨＣＭＶ）感染に対するラビリントペプチンの潜在効果を測定するために、０．５ＰＦＵ／細胞の感染多重度にてＧＦＰ発現ＣＭＶ株で感染させる１時間前に、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の培養物を、様々な濃度のラビリントペプチンＡ１およびＡ２で処置した。４日間後、細胞のＧＦＰ発現を、ウイルス遺伝子発現の読み出しとして計測した。ＤＭＳＯ処理細胞（ＤＭＳＯはラビリントペプチンの希釈剤である）および未処理細胞は、感染の陽性対照として、および非感染細胞は陰性対照としての役割を果たす。ホスホノ酢酸（ＰＡＡ）を用いた感染細胞培養物の処理は、ウイルス複製の阻害について陽性対照を使用した。
ラビリントペプチンは、用量依存的様式によるＣＭＶと共に植え付けた細胞におけるウイルス駆動ＧＦＰ発現を阻害した（図５）。ラビリントペプチンＡ１およびＡ２のＩＣ５０値は、それぞれ約１．３および５．４μＭであった。
【０１５６】
ＣＭＶのライフサイクル中のラビリントペプチンの阻害効果のタイムポイント
ラビリントペプチンが効果を発揮するＣＭＶ感染サイクルの相に対して発想を得るために、時間依存性添加を実施した。（それぞれ、３および７μＭの終濃度にて）ラビリントペプチンＡ１およびＡ２を、ＣＭＶの植菌の前、同時またはそれに続いて細胞培養物に添加した（図６を参照）。成功したウイルス感染の読み出しとしてＧＦＰ発現を、感染後４日目に計測した。ＤＭＳＯ処理培養物は対照としての役割を果たす。
【０１５７】
ウイルス遺伝子発現の最も強い阻害（ほとんど完全阻害）を、物質を培養のウイルス植菌の前または同時に添加したときに観察した。約５０％の阻害は、化合物を植菌の１時間後に加えたときに起こり、そして、約２５％の阻害は、移植後３および６時間での添加時に起こった。後者の時点にて、ウイルス感染は最小限だけ阻害される場合がある。
これらの結果は、ラビリントペプチンがウイルス感染の初期段階、またはもしかするとウイルス粒子に直接作用することを示唆する。当業者は、示した実験において、細胞内へのＣＭＶの侵入が同時でなかったことを指摘する必要がある。植え付けられたウイルスの実質的な部分は、感染の１時間後に侵入したが、他の粒子は、細胞表面に結合したままであり、細胞の侵入だけがそれに続く場合がある。
【０１５８】
ウイルス粒子に対するラビリントペプチンＡ１およびＡ２の推定効果
物質が主にウイルス粒子または細胞に作用するか知るために、以前の実験で有効であることがわかった（＞９８％の感染予防）ラビリントペプチンＡ１およびＡ２の濃度（それぞれ３μＭおよび７μＭのＬａｂｙＡ１およびＡ２）を使用して前処理を実施した。
１時間のインキュベーションに続いて、ウイルスのサンプルまたは細胞培養における培地を１６倍希釈し、用量−応答曲線（図５を参照）に従って効果を発揮しない化合物の濃度を得た。次に、前処理ウイルスを細胞に追加したか（図７、「ウイルス前処理」群）、または未処理ウイルスを前処理細胞に加えて（図７、「細胞前処理」群）、続いて、３時間インキュベーションし、そして、新しい培地で種菌を置き換えた。ＧＦＰ発現を感染の９６時間後に測定した。並行して、培養物を、ＣＭＶ植菌と同時に、有効用量の化合物または１６倍希釈濃度（図７、希釈）で処理して、その化合物による阻害または１６倍希釈による喪失について確かめた。ＰＡＡおよびＤＭＳＯを、対照として使用した。
ラビリントペプチンＡ１およびＡ２を用いたウイルスの前処理により、ウイルス遺伝子発現をそれぞれ〜５０％および〜９０％阻害した。基本的に、細胞の前処理によって観察された阻害はなかった。高濃度のラビリントペプチンＡ１およびＡ２を用いた感染サイクルを通じた感染細胞の処置は、予想されるように約１００％の阻害をもたらしたが（図７、群「永続的に処置、有効用量）、その一方、１６倍希釈濃度を用いた永続的療法（図７、群「永続的処置、１６倍希釈」）の後には、わずかな阻害だけが見られた。ＰＡＡ−感染後期にウイルスＤＮＡポリメラーゼに作用する可溶成分として−は、培地中に永続的に存在するときのみ（予想どおり１６倍希釈濃度を適用したときにはある程度まで）阻害を発揮したが、ウイルスまたは細胞の前処理後にそれが取り除かれたとき、阻害を発揮しなかった。
【０１５９】
その結果は、ラビリントペプチンが主にウイルス粒子に作用することを示唆する。永続的処理において見られた効果と比較して、どういうわけか低減したラビリントペプチンＡ１を用いた前処理の阻害効果は、阻害が部分的に可逆的であるか、またはＣＭＶの細胞付着相または侵入相の間にその物質がさらに有効になることを示唆している可能性がある。
【０１６０】
実施例３：ＤＥＮＶ感染に対するラビリントペプチンＡ１およびＡ２の効果
ＤＥＮＶ感染に対するラビリントペプチンＡ１およびＡ２の相乗効果
ＤＥＮＶ感染に対するラビリントペプチンＡ１およびＡ２の潜在相乗効果を測定するために、用量応答アッセイをおこなった。Ｈｕｈ−７．５細胞（ヒト肝癌細胞株）の培養物を、様々な濃度のＬａｂｙＡ１、ＬａｂｙＡ２または等価のＬａｂｙＡ１およびＬａｂｙＡ２の組み合わせ物のいずれかで３０分間処理した。それに続いて、細胞を、０．５ＰＦＵのＭＯＩで室温にて２時間、ＤＥＮＶ（２型ニューギニアＣ株）に感染させた。未結合ウイルス粒子を取り除き、そして、感染細胞を４８時間インキュベートした。これ以降、細胞を、ＰＢＳ中の４％ ＰＦＡを使用して固定し、ＤＥＮＶエンベロープタンパク質の発現について免疫染色した。このために、抗デングウイルスＥ糖タンパク質抗体とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合二次抗体の組み合わせを適用した。さらに、細胞核をＤＡＰＩで染色した。全細胞数、ならびにＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８陽性細胞（＝ＤＥＮＶ陽性細胞）のパーセンテージを、高精細な蛍光画像法で測定した。
ＩＣ５０値は、ＬａｂｙＡ１（ＩＣ５０＝３．７μｇ／ｍｌ）が、ＬａｂｙＡ２（ＩＣ５０＝１５．４μｇ／ｍｌ）に比べて、ウイルス感染のより強力な阻害剤であることを示唆する。ＬａｂｙＡ１とＬａｂｙＡ２を１：１の組み合わせで適用したとき、それらの抗ウイルス活性はさらに改善される（ＩＣ５０＝２．６μｇ／ｍｌ）（図１０）。
【０１６１】
Ｌａｂｙ−Ｈｅｘｙｎ誘導体は抗ＤＥＮＶ活性を維持する
作用機序の研究を実施するために、我々は、Ｎ末端Ｈｅｘｙｎ基を担持するＬａｂｙ誘導体を作製した。これらは、例えば、アジド標識フルオロフォアの双極子環付加によってインビトロおよびインビボにおいてさらに誘導体化される可能性がある。ＤＥＮＶ感染に対するＬａｂｙ−Ｈｅｘｙｎ誘導体の生物学的活性を測定するために、用量応答アッセイを先に示したようにおこなった。得られたＩＣ５０値は、非結合Ｌａｂｙに関して得られたＩＣ５０値に類似しているので、これにより、Ｌａｂｙ−Ｈｅｘｙｎ誘導体がそれらの抗ＤＥＮＶ活性を維持することを示唆する：ＩＣ５０（ＬａｂｙＡ１−Ｈｅｘｙｎ）＝３．７μｇ／ｍｌ、ＩＣ５０（ＬａｂｙＡ２−Ｈｅｘｙｎ）＝１４．２μｇ／ｍｌ、ＩＣ５０（ＬａｂｙＡ１−Ｈｅｘｙｎ／ＬａｂｙＡ２−Ｈｅｘｙｎの１：１組み合わせ物）＝２．０μｇ／ｍｌ（図１１）。
【０１６２】
固定化Ｌａｂｙ−Ｈｅｘｙｎ誘導体へのビオチン−アジドの双極子環付加
双極子環付加がＬａｂｙ−Ｈｅｘｙｎ誘導体を用いてインビトロにおいて動作するか否かを試験するために、これらを９６ウェルプレート（Nunc Maxisorp）上に固定した。２μｇのＬａｂｙＡ１−Ｈｅｘｙｎ、ＬａｂｙＡ２−ＨｅｘｙｎまたはＬａｂｙＡ１を、コーティングバッファーＡ［BioLegend］で希釈し、そして、４℃にて１６時間、９６ウェルプレートの１つのウェルに三連で吸着させた。ビオチン−アジドの環付加反応を、材料と方法で示したようにおこなった。ビオチン−アジドを含んでいない環付加反応ミックスは、対照としての役割を果たす。
顕著なＯＤ４５０ｎｍによって示されるデータが、固定化Ｌａｂｙ−Ｈｅｘｙｎ誘導体に対するビオチン−アジドの双極子環付加が良好に動作することを実証する。対照的に、双極子環付加は、非アルキニル化Ｌａｂｙによって動作しない（図１２）。
【０１６３】
実施例４：ＲＳＶ誘発性細胞死およびＲＳウイルス感染に対するラビリントペプチンＡ１およびＡ２の効果
ラビリントペプチンＡ１およびＡ２がＲＳＶ誘発性細胞死を阻害する
細胞ベースのスクリーニングシステムを使用して、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ、ｈＲＳＶとも呼ばれる）に対するラビリントペプチンＡ１およびＡ２の抗ウイルス効果を測定した。スクリーニングシステムの略図を図１３に示す。
ホタルルシフェラーゼ（ＦＦ−ｌｕｃ）のレポーター遺伝子を安定して発現するＨＥｐ−２細胞を、９６ウェルプレート内の２００μｌの適当な培地中に播種する。非感染細胞と感染細胞の間の有用な測定ウィンドウを得るために、インキュベーション時間を、３のＭＯＩを用いた３７℃にて７２時間にセットした。７２時間後に、細胞を溶解し、そして、ＦＦ−ｌｕｃによって生じた発光をプレートルミノメータを使用して計測した（ＲＬＵ単位）。様々な濃度のラビリントペプチンＡ１およびＡ２の存在下で、細胞をＲＳＶに感染させた。ＲＳＶは溶菌性ウイルスであり、感染細胞を殺滅する。そのため、ＲＳＶの無制限な感染および蔓延は、細胞死をもたらし、この結果として、ルシフェラーゼ遺伝子発現の減少につながるであろう。生存細胞の数を、ウイルス感染／複製効率に間接的に比例する。言い換えれば、より多くの細胞が生き残れば生き残るほど、より少ないＲＳＶが細胞を感染させることができた。細胞生存は、総生存細胞の測定によって（例えば、生き残っている細胞を染色するクリスタルバイオレットで染色することによって；図１４と比較）評価および定量化できる。そのうえ、細胞生存は残留ルシフェラーゼ発現に比例する。我々のアッセイの正当性を確認するために、我々は、細胞培養においてＲＳＶ複製を阻害することが知られている、グアノシンヌクレオシド類似物質であるリバビリンを使用した（図１５）。半減阻害濃度（ＩＣ５０）を、６つの独立した実験においてラビリントペプチンＡ１、ＩＣ５０＝３．８７μＭ（図１６Ａ）、そして、３つの独立した実験においてラビリントペプチンＡ２、ＩＣ５０＝４７．９３μＭ（図１６Ｂ）を計算した。
【０１６４】
ラビリントペプチンＡ１およびＡ２は、ＲＳＶ感染を阻害する
野生型ＲＳＶ（すなわち、ｈＲＳＶ）感染および細胞内ＲＳＶ−Ｐ染色を、ラビリントペプチンＡ１およびＡ２のＩＣ５０を測定するのに使用した（図１６Ｃを参照）。
【０１６５】
そのため、１２ウェルプレートに播種した１×１０５個のＨＥｐ２細胞に、水平振盪機により１の感染多重度（ＭＯＩ）にて野生型ＲＳＶを４時間、植え付けた。植菌は、様々な濃度のラビリントペプチンＡ１またはＡ２と一緒におこなった。４時間後に、細胞を、無菌ＰＢＳで洗浄し、３７℃にてインキュベートした。感染の１８時間後に、トリプシン処理することによって細胞を剥がし、そして、固定化バッファー（０．５％のパラホルム、リン酸緩衝食塩水［ＰＢＳ］中の１％のウシ胎仔血清［ＦＣＳ］）中、４℃にて３０分間固定した。それに続いて、細胞を、４℃にて２０分、サポニン含有透過化バッファー（０．１％のサポニン、ＰＢＳ中の１％のＦＣＳ）で透過処理した。その後、細胞を、透過化バッファーで１：５００に希釈したＲＳＶ−Ｐ特異的抗体（２６Ｄ６Ｇ５Ｃ６）を用いて４℃にて３０分間染色した。それに続いて、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして、結合抗体を、透過化バッファーで１：２００に希釈したマウス特異的Ａｌｅｘａ４８８二次抗体（Thermo Fisher Scientific）を用いた４℃にて３０分間のインキュベーションによって検出した。染色した細胞を、ＰＢＳで二度洗浄し、Accuri C6およびFlowJoソフトウェアを使用して分析した。
【０１６６】
半減阻害濃度（ＩＣ５０）を、ラビリントペプチンＡ１、ＩＣ５０＝０．３９μＭおよびラビリントペプチンＡ２、ＩＣ５０＝４．９７μＭについて計算した（図１６Ｃを参照）。
【０１６７】
実施例５：薬理学的および免疫学的な阻害と細胞制限に対するチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）糖タンパク質媒介性
および口内炎インディアナウイルス（ＶＳＶ）糖タンパク質媒介性細胞侵入過程の感受性の特徴づけ
ここで、ＣＨＩＫＶまたはＶＳＶ糖タンパク質媒介性侵入過程の特性、および薬理学的および免疫学的阻害、ならびに細胞抗ウイルス性ＩＦＩＴＭタンパク質による制限に対するそれらの感受性を試験するために、それらの表面上のＣＨＩＫＶ糖タンパク質Ｅ１およびＥ２またはＶＳＶ糖タンパク質を担持するレンチウイルスベクターを使用する。
ラビリントペプチンＡ１を用いた２９３Ｔ細胞の処理は、０．５〜１．７μＭのＩＣ５０値を得る；図１７を参照、糖タンパク質を発現するＣＨＩＫＶ偽型を用いた抗原投与による導入効率の用量依存的阻害をもたらした。ＣＨＩＫＶ糖タンパク質における亜系特異的突然変異の導入は、レンチウイルスベクターの侵入効率を大きく調節することなく、そして、すべての変異体がＣＨＩＫＶ Ｅ２を標的化するモノクローナル抗体による中和への感受性を維持した。レンチウイルスベクターのＣＨＩＫＶ糖タンパク質媒介性細胞侵入を制限する細胞ＩＦＩＴＭタンパク質の能力を、個々のＣ末端ＨＡタグ付与ヒトＩＦＩＴＭタンパク質を安定して発現する２９３Ｔ細胞株において調べた。興味深いことに、標的細胞のＩＦＩＴＭ１−ＨＡ、ＩＦＩＴＭ２−ＨＡ、およびＩＦＩＴＭ３−ＨＡの発現は、ベクター発現細胞と比較して、それぞれ、導入効率の２分の一の低減をもたらした。それらの抗ウイルス活性のために保存部分のパルミトイル化およびユビキチン化を含めた、ＩＦＩＴＭタンパク質の適当な翻訳後修飾形の必要性、ならびにＩＦＩＴＭタンパク質の抗ウイルス能力の種特異性は、現在、調査されている。興味深いことに、選択されたＣＨＩＫＶ糖タンパク質変異形は、ＩＦＩＴＭのタンパク質媒介性制限に対する高い感受性を示すように思える。
ＶＳＶ糖タンパク質媒介性侵入過程、ならびにラビリントペプチンＡ１による阻害に対するその感受性を、先にＣＨＩＫＶについて記載したものと同じ様式で分析した。ラビリントペプチンＡ１を用いた２９３Ｔ細胞の処理は、ＶＳＶ糖タンパク質発現偽型を用いた抗原投与の導入効率の用量依存的阻害をもたらし、図１７に示したようなＩＣ５０値をもたらした。
【０１６８】
実施例６：ＴＢＥＶ感染に対するラビリントペプチンの効果
１．５×１０４個のＶｅｒｏ Ｂ４細胞を、９６ウェルプレートの培養培地（ＤＭＥＭ；１０％のＦＢＳ）中に播種し、３７℃および５％のＣＯ２にて２４時間インキュベートした。培地除去後に、ＬａｂｙＡ１、ＬａｂｙＡ２またはＬａｂｙＡ１／ＬａｂｙＡ２の１：１混合物を、２６．５μｌの培地中の細胞に添加した。３７℃にて３０分間のインキュベーション後に、細胞を、０．０１のＭＯＩにて１時間、ＴＢＥＶ（Ｔｏｒｏ単離株）に感染させた。得られた１ウェルあたり６４μｌの全容積において、Ｌａｂｙの最高濃度は５０μｇ／ｍｌであり、連続３倍希釈で最低０．０７μｇ／ｍｌが適用される。種菌除去後に、感染細胞を、アビセルとＤＭＥＭの混合物中で３日間培養した。最後に、感染細胞を、６％のホルムアルデヒドで固定した。TritonXでの透過処理後に、ＴＢＥＶエンベロープタンパク質を、それぞれの一次抗体およびＨＲＰ連結二次抗体によって検出した。酵素反応を、TrueBlue Peroxidase基質を使用しておこなった。細胞培養プレートの写真を、ChemiDoc Imaging System［BioRad］を用いて撮影した；図１８を参照。ＩＣ５０値を、ウェルの目視検査によって評価した。画像では、感染領域が黒色に見え、そして、非感染領域は白く見える；図１８を参照。
【０１６９】
ＬａｂｙＡ１のＩＣ５０値は、それぞれ２４．１０μＭおよび５０μｇ／ｍｌであり；
ＬａｂｙＡ２のＩＣ５０値は、それぞれ＞２５．９９μＭおよび＞５０μｇ／ｍｌであり；そして、ＬａｂｙＡ１とＬａｂｙＡ２の組み合わせ物のＩＣ５０値は、それぞれ８．３４μＭおよび１６．６７μｇ／ｍｌであった；表４を参照。
【０１７０】
実施例７：ＺＩＫＶ感染に対するラビリントペプチンＡ１およびＡ２の効果
Ｈｕｈ−７．５細胞（ヒト肝癌細胞株）の培養物を、様々な濃度のＬａｂｙＡ１、ＬａｂｙＡ２またはＬａｂｙＡ１とＬａｂｙＡ２の等価組み合わせ物のいずれかで３０分間処理した。続いて、細胞を０．５ＰＦＵのＭＯＩで室温にて２時間、ＺＩＫＶ（菌株ＭＲ７６６−ＮＩＩＤ）に感染させた。非結合ウイルス粒子を除去し、そして、感染細胞を４８時間インキュベートした。これ以降、ウイルスＲＮＡを、製造業者のマニュアルに従ってNucleoSpin（登録商標）９６ウイルスキット［Macherey-Nagel］を使用して細胞培養上清（１５０μｌ）から単離した。ＲＮＡを、吸光度によって定量化し、そして、２．５μｇを、ＲＴプライマー［５’−ＧＧＴＴＴＣＣＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧ−３’］を用いてRevertAid Reverse Transcriptase［Thermo］によって逆転写した。１００ｎｇの逆転写ＲＮＡを、LightCycler（登録商標）480 SYBR Green I Master［Roche］およびＺＩＫＶ特異的フォワードおよびリバースプライマー対（それぞれ、５’−ＡＡＡＡＡＣＣＣＣＡＴＧＴＧＧＡＧＡＧＧ−３’および５’−ＣＡＴＴＣＣＴＴＣＡＧＴＧＴＧＴＣＡＣＣ−３’）を用いたLightCycler（登録商標）480を使用したＳＹＢＲグリーンベースの定量的ＲＴ−ＰＣＲにかけた。ＺＩＫＶゲノムコピー同等物（ＧＣＥ）の絶対数を、ＺＩＫＶゲノムのそれぞれの増幅断片を担持している既知濃度のプラスミドから作成した検量線を介して決定した。値は±ＳＥＭである；ｎ＝４。ＬａｂｙＡ１（ＩＣ５０＝４．６μｇ／ｍｌ）；ＬａｂｙＡ２（ＩＣ５０＝５．４μｇ／ｍｌ）；組み合わせ物ＬａｂｙＡ１とＬａｂｙＡ２（ＩＣ５０＝３．５μｇ／ｍｌ）。
【０１７１】
実施例８：ＨＣＶ感染に対するラビリントペプチンＡ１およびＡ２の効果
Ｈｕｈ７．５ホタルルシフェラーゼ発現細胞（Ｈｕｈ７．５Ｆｌｕｃ）細胞を、９６ウェルプレート内に播種し（１０＊１０３細胞／ウェル）、そして、５％のＣＯ２を供給しながら３７℃にて一晩インキュベートした（約１８時間）。Ｈｕｈ７．５Ｆｌｕｃ細胞は、細胞生存率を計測するのに使用されるホタルルシフェラーゼタンパク質を安定して発現する肝細胞癌細胞株である。
【０１７２】
翌日、様々な濃度のラビリントペプチンを、培養中に産生されたＨＣＶ ＪｃＲ２ａを含む培地に加え（ウイルスを含む４４５．５μＬの培地を８本のエッペンドルフに移し、そしてそのそれぞれは、所望の終濃度を達成するために様々な濃度にて４．５μＬの化合物を含んでいた；すなわち、５０μＭ、２５μＭなど）、９番目のエッペンドルフ（陽性対照）はＤＭＳＯ溶媒を含んでいた。Ｃ型肝炎ウイルスＪｃＲ２ａレポーター構築物を使用した（遺伝子型２、細胞株Ａ、そのオープンリーディングのフレーム内に融合したRenillaルシフェラーゼ遺伝子を有するchemiric構築物。ウイルスゲノム翻訳および複製はRenillaルシフェラーゼ発現に相関している）。
【０１７３】
次に、ウイルス／化合物調製物を、二連で細胞に植え付け、そして、５％のＣＯ２を供給しながら３７℃にて４時間インキュベートした。４時間後に、ウイルス／化合物を含んでいる培地をセルから吸引し、それに続いて、細胞を１ウェルあたりの２００μＬの無菌のＰＢＳで洗浄し、すべての残存ウイルスまたは化合物を除去した。
【０１７４】
細胞に２００μＬ／ウェルのＤＭＥＭで補給し、５％のＣＯ２を供給しながら３７℃にて４８時間インキュベートした。４８時間後に、培地をウェルから吸引し、次に、細胞を２００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。次に、細胞を、１×不活性溶解バッファーで溶解し、そして、溶解物をBertholdプレートルミノメータで分析した。
【０１７５】
細胞内へのウイルス侵入を、Renillaルシフェラーゼ発現を計測することによって定量化した。化合物で処理したウェルからの読み出しを、ＤＭＳＯ対照で処理したウェルからの読み出しに対して標準化した。ホタルルシフェラーゼを安定発現しながらの、Renillaルシフェラーゼの発現の減少は、細胞内へのウイルス侵入を阻害する化合物の能力に関係する。
【０１７６】
図２０Ａからわかるように、ＬａｂｙＡ１は、１．０５μＭのＩＣ５０および９．１６３μＭのＩＣ９０にてＨＣＶウイルス侵入を阻害する。図２０Ｂは、ＬａｂｙＡ２が、１．７２８μＭのＩＣ５０および２４．９μＭのＩＣ９０でＨＣＶウイルス侵入を阻害することを示す。試験したＬａｂｙＡ１およびＬａｂｙＡ２濃度にて、細胞毒性は観察されなかった。
【０１７７】
実施例９：細胞ベースのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）システム
細胞ベースのスクリーニングシステムを、ラビリントペプチンＡ１およびＡ２の細胞傷害濃度（ＣＣ５０）を測定するのに使用した。
【０１７８】
ホタルルシフェラーゼ（ＦＦ−ｌｕｃ）のレポーター遺伝子を安定して発現する、１×１０４個のＨＥｐ−２細胞を、９６ウェルプレート内の２００μｌの適当な培地中に播種した。最大１００μＭの高濃度のラビリントペプチンＡ１またはＡ２の存在下、３７℃にて７２時間のインキュベーション後に、細胞を３５μｌの溶解バッファーで溶解し、そして、ＦＦ−ｌｕｃ（ＲＬＵ）の消失を、プレートルミノメータ（Berthold）を使用して計測した。生存細胞数を、残留ルシフェラーゼ発現に間接的に比例する。
半減細胞傷害性濃度（ＣＣ５０）を、ラビリントペプチンＡ１、ＣＣ５０＝７９．７０μＭについて計算した。１００μＭの濃度まで検出可能なラビリントペプチンＡ２の細胞傷害性効果はなかった。
【０１７９】
実施例１０：ラビリントペプチンの抗ウイルス効果の概要
表４は、ＬａｂｙＡ１、ＬａｂｙＡ２、ＬａｂｙＡ１とＬａｂｙＡ２の組み合わせ物（ＬａｂｙＡ１／Ａ２）、ＬａｂｙＡ１誘導体「ＬａｂｙＡ１−ｈｅｘｙｎ」（本明細書中で「ＬａｂｙＡ１−Ｈｅｘｙｎ」とも呼ばれる）、ＬａｂｙＡ２誘導体「ＬａｂｙＡ２−ｈｅｘｙｎ」（本明細書中で「ＬａｂｙＡ２−Ｈｅｘｙｎ」とも呼ばれる）、ならびにＬａｂｙＡ１−ｈｅｘｙｎとＬａｂｙＡ２−ｈｅｘｙｎの組み合わせ物（ＬａｂｙＡ１／Ａ２−ｈｅｘｙｎ）の抗ウイルス活性のＩＣ５０値を示す。
【０１８０】
表４：ラビリントペプチン、ラビリントペプチンとラビリントペプチン誘導体の組み合わせ物の抗ウイルス活性のＩＣ５０値（μＭおよびμｇ／ｍｌ単位）
【表４】
2018538276.tif 000015
【０１８１】
本発明は、以下のアミノ酸配列を参照する：
配列番号１：本発明のラビリントペプチンのアミノ酸配列
配列番号２：本発明のラビリントペプチン誘導体のアミノ酸配列
配列番号３：ＬａｂｙＡ１のアミノ酸配列
配列番号４：ＬａｂｙＡ２のアミノ酸配列
配列番号５：ＲＴプライマー
５’−ＧＧＴＴＴＣＣＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧ−３’
配列番号６：ＺＩＫＶ特異的フォワードプライマー
５’−ＡＡＡＡＡＣＣＣＣＡＴＧＴＧＧＡＧＡＧＧ−３’
配列番号７：ＺＩＫＶ特異的リバースプライマー
５’−ＣＡＴＴＣＣＴＴＣＡＧＴＧＴＧＴＣＡＣＣ−３’
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2018538276.tif 000024
【図８】
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【図９】
2018538276.tif 000026
【図１０】
2018538276.tif 000027
【図１１】
2018538276.tif 000028
【図１２】
2018538276.tif 000029
【図１３】
2018538276.tif 000030
【図１４】
2018538276.tif 000031
【図１５】
2018538276.tif 000032
【図１６Ａ−Ｂ】
2018538276.tif 000033
【図１６Ｃ】
2018538276.tif 000034
【図１７Ａ】
2018538276.tif 000035
【図１７Ｂ】
2018538276.tif 000036
【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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