(57)【要約】  インビボで目的の化学的または生物学的作用物に曝露された場合の対象集団中の個体による生物学的反応の発生率または程度を先験的に推定または予測するための方法が提供される。方法は、目的の作用物を用いたインビトロ実験からのデータ、参照作用物を用いたインビトロ実験からのデータ、および、参照作用物のインビボ作用の発生率または程度に関して得られたデータの組合せを使用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビボで目的の化学的または生物学的作用物に曝露された場合の対象集団中の個体における特定された生物学的反応の発生率または程度を推定または予測するための方法であって、
（a）インビボで少なくとも1つの参照作用物に曝露された場合の、前記対象集団のサンプルにおける前記生物学的反応の発生率または程度を決定する工程であって、前記サンプルは、前記対象集団または類似集団の少なくとも10個体のドナーからの細胞または組織を含む、工程と、
（b）インビトロで前記少なくとも1つの参照作用物に曝露された場合の、前記対象集団のサンプルにおける前記生物学的反応の発生率または程度を決定する工程であって、前記サンプルは、前記対象集団または類似集団の少なくとも10個体のドナーからの細胞または組織を含む、工程と、
（c）少なくとも1つのインビトロアッセイにおいて前記目的の化学的または生物学的作用物に曝露された場合の、前記対象集団中の個体の前記生物学的反応の発生率または程度を決定する工程と、
（d）工程（a）における前記生物学的反応の発生率または程度に基づいて、前記対象集団中の個体による前記生物学的反応の発生率または程度を推定または予測する工程と
を含み、前記対象集団の個体は哺乳類である、
方法。
【請求項２】
前記哺乳類はヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（b）におけるドナーの数は少なくとも30である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（b）におけるドナーの数は少なくとも100である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
対象集団におけるインビボの関連作用の発生率の推定を作成するためのインビトロアッセイについての閾値評価項目スコアを確立する方法であって、
（a）その試験によって測定される評価項目がインビボでの生物学的反応の発生率と数学的変換を示すことができる、1つ以上のインビトロ試験を選択する工程と；
（b）対象集団の標本として少なくとも10個体のドナーを同定し、各々のドナーについて別々に、前記選択されたインビトロ試験のための細胞、組織、器官、それらの凝集物、またはそれらに由来する細胞、組織、もしくは器官を取得する工程と；
（c）参照の化学的または生物学的作用物に曝露することによって、各標本の各ドナーに対して前記選択されたインビトロ試験を実施する工程であって、前記参照の化学的または生物学的作用物に対する標本対象集団または類似集団のインビボ曝露について前記生物学的反応の発生率が決定されており、前記参照の化学的または生物学的作用物と目的の化学的または生物学的作用物とが前記生物学的反応に関して同じ作用機序を有すると考えられており、前記参照の化学的または生物学的作用物は、インビボで経験される曝露レベルと同等のインビトロ濃度において曝露される、工程と；
（d）前記（c）で実施されたインビトロ試験の評価項目の定量値を、試験された各曝露レベルにおける標本中の個々のドナーの各々について決定する工程と；
（e）工程（d）の定量値を分析して、参照作用物を用いたインビトロアッセイにおける個体についての評価項目スコアと、その個体がインビボでその参照作用物に対して反応を経験するか否かの予測との間の数学的変換を開発する工程と
を含み、前記対象集団の個体は哺乳類である、方法。
【請求項６】
前記哺乳類はヒトである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程（b）におけるドナーの数は少なくとも30である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
工程（b）におけるドナーの数は少なくとも100である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記数学的変換は反応閾値予測モデルである、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
インビボで目的の化学的または生物学的作用物に曝露された場合の哺乳類の対象集団中の個体間での特定された生物学的反応の発生率または程度を推定または予測するための方法であって、
（a）その試験によって測定される1つまたは複数の評価項目がインビボでの生物学的反応の発生率と数学的変換を示すことができる、1つ以上のインビトロ試験を選択する工程と；
（b）対象集団の標本として少なくとも10個体のドナーを同定し、各々のドナーについて別々に、前記選択されたインビトロ試験のための細胞、組織、器官、それらの凝集物、またはそれらに由来する細胞、組織、もしくは器官を取得する工程と；
（c）参照の化学的または生物学的作用物を使用して、前記標本の各ドナーに対して前記選択されたインビトロ試験を実施する工程であって、前記参照の化学的または生物学的作用物に対する標本対象集団または類似集団のインビボ曝露について前記生物学的反応の発生率が決定されており、前記参照の化学的または生物学的作用物と目的の化学的または生物学的作用物とが前記生物学的反応に関して同じ作用機序を有し、前記参照の化学的または生物学的作用物は、インビボで経験される曝露レベルと同等のインビトロ濃度において使用される、工程と；
（d）前記（c）で実施されたインビトロ試験の評価項目の定量値を、試験された各曝露レベルにおける標本中の個々のドナーの各々について決定する工程と；
（e）工程（d）の定量値を分析して、インビトロアッセイおよび参照作用物に関する個体についての評価項目スコアと、その個体がインビボでその参照作用物に対して反応を経験するか否かの予測との間の数学的変換を開発する工程と、
（f）様々な濃度の前記目的の化学的または生物学的作用物を使用して前記ドナーの各々の細胞、組織、または器官に対して前記インビトロ試験を実施して、目的の評価項目に関して各ドナーについてのスコアを取得する工程と、
（g）目的の作用物に曝露された場合の各評価項目に関するスコアが閾値限界を超える標本ドナーの部分を算出する工程と、
（h）工程（g）の結果を使用して、前記対象集団中の個体による前記生物学的反応の潜在的発生率を推定する工程と
を含む方法。
【請求項１１】
前記工程（e）は、
各作用物についての各評価項目の各曝露レベルについて別々に、
インビトロ標本集団を、インビボで見出された目的の反応の発生率と同じ割合で、閾値スコアより高いスコアを有するドナーと閾値スコアより低いスコアを有するドナーとに分割する閾値スコアを決定して、観察のデータセットを取得すること
を含み、各々の観察について、作用物、閾値スコア、および毒性の発生率が含まれている、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳類はヒトである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
工程（b）におけるドナーの数は少なくとも30である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
工程（b）におけるドナーの数は少なくとも100である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記数学的変換は反応閾値予測モデルである、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、例えば医薬毒物学、工業化学毒物学、医薬効力、および感染性疾患の研究のような、生物学的反応の分析の分野に関係する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類集団の個々の構成員は、同一の化学的または生物学的作用物に対する同一の曝露を経験しているとき、しばしば互いに生物学的に異なる反応を有する。これらの異なる反応は、大部分、個体の遺伝学的構成における違いからもたらされる。遺伝学的構成における違いは、時として、集団の一部のみがそのような曝露に対して（有益なものにせよ有害なものにせよ）反応するという結果をもたらす。
【０００３】
集団の構成員を化学的または生物学的作用物に実際に曝露させることなく、その化学的または生物学的作用物に対するその哺乳類集団の有益または有害な生物学的反応の発生率を推定する能力の制限は、社会にとって極めて高いコストをもたらし得る。
【０００４】
医薬毒物学の分野では、集団の全構成員ではなくて一部の構成員における毒性反応を発見することが、薬剤開発プロセスの各段階を通じて頓挫（attrition）の主要な原因となり、それは開発プロセスの後期段階においてさえも起こる。後期段階頓挫（すなわち、臨床試験の際のもの、または認可後のもの）は製薬会社にとって特に損失が大きい。なぜならば、開発プロセスのより早い段階で候補化合物の毒性を検出し損なったことが、その毒性が発見される前の時間、労力、そして化合物によっては数百万ドルを「無駄な」投資にしてしまうからである。
【０００５】
同様に、工業化学毒物学の分野では、インビボ曝露を介した集団の一部による毒性反応を発見することは、もしそのような毒性が、収益性のある製品の販売の禁止や環境破壊の高価な汚染除去や毒性化学物質の危害を受けた人々への経済的補償につながるのであれば、工業化学会社にとって損失が大きくなり得る。
【０００６】
これらとは別に、医薬効力の分野では、標的患者集団間で広く有効となる候補化合物と、標的患者集団の狭いサブセットのみに有益となる候補化合物とを見分けることにおいて薬剤開発プロセス中の遅延が起こることも、ほとんどの患者では効果がないことが後に見出される化合物における「無駄な」投資を引き起こし得る。しかしながら、より早い段階での候補化合物のインビボ試験は、倫理的理由から実行不可能であることが多い。
【０００７】
感染性疾患の研究では、ヒトにおける感染の潜在的割合あるいは発生率が公衆衛生にとって非常に重要である、多種多様の疾患（例えば鳥インフルエンザ、エボラ等）が存在する。しかしながら、明白な倫理的理由により、これらの感染率をインビボで試験することはできない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述した理由の全ておよび追加的な理由により、集団において化学的または生物学的作用物に対する有益または有害な生物学的反応の発生率を、インビトロ実験に基づいて、より早期にかつ比較的安価に推定する方法を開発することは、広く多様な状況においてきわめて有益となるであろう。
【０００９】
この開発の一環として、有益または有害な生物学的反応の閾値レベルの指標となる、インビトロ実験についての評価項目（endpoint）スコアを確立することは有用となるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、インビトロ試験の結果を、過去のインビボ経験から利用可能なある種のデータと組み合わせることにより、これらの課題を達成するための方法を提供する。
【００１１】
言及しておくべきことだが、本願の以下の部分で引用される例は、明瞭性および簡潔性のために、上述した複数の分野のうちの１つ、すなわち毒性についての医薬品の試験から主に引き出されるものである。しかしながら、上述した他の分野にも同様または類似の原理が関わり、上記のものに限らず、目的の作用物および参照作用物についてのインビトロ実験と、その参照作用物のインビボ作用の発生率に関して得られたデータとの組合せを用いることによって、目的の化学的または生物学的作用物にインビボで曝露された場合の対象集団中の個体による生物学的反応の発生率（あるいは、特定された閾値を上回るまたは下回る生物学的反応の発生率）の可能性を先験的に推定または予測することが関わる全ての例が、本明細書で提供される方法の範囲内に含まれ、生物学的反応の影響の閾値レベルを示すインビトロ実験の評価項目スコアについてのレベルを確立するためにインビボデータを用いる全ての例もまた然りである。
【００１２】
近年、研究者らは、候補化合物をインビトロで細胞（様々な種類の幹細胞に由来するもの）に適用することにより、薬剤開発プロセスの初期段階において毒性の様々な側面を予測する方法を開発することを試みてきた。今日まで、これらの探求は４つの課題に重点を置いてきたが、それらのいずれも、対象集団において毒性反応のインビボ発生率（あるいは特定されたレベルを上回る毒性反応の発生率）を推定または予測することが関わるものではなく、それが本明細書で提供される方法の領域となる。
【００１３】
今日までの毒性研究の第一の課題は、単一のヒトドナーからの細胞に対する化合物の影響を詳細に調べることである。これらのインビトロ実験は、単一ドナーの細胞の細胞レベルでの反応の相対的重度を、異なる化合物または単一化合物の異なる用量と比較し得るが、単一の個体における反応の重度は、その反応（あるいは特定された閾値を上回るまたは下回る反応）を示すであろう集団の部分を予測するものではない。定義上、単一個体の相対的重度の測定は、発生率の問題に答えることにはほとんど役に立たない。
【００１４】
今日までの毒性研究の第二の課題は、（1）生きた患者にインビボで送達される化合物の用量および投与方法と、（2）インビトロで細胞または組織に投与されるその同じ化合物の「同じ用量」を表す濃度との間で転換する方法論を開発することである。これらの方法論はしばしばIVIVE（In Vitro-In Vivo Extrapolation（インビトロ・インビボ外挿）方法論と呼ばれる。本明細書で提供される方法のある実施形態はプロセスのある時点でIVIVE方法論を利用し得るが、IVIVE方法論単独では本方法の範囲外となる。IVIVE方法論の最近の例としては、Yoon, M., Campbell, J. L., Andersen, M. E., & Clewell, H. J. [2012], “Extrapolation of Cell-Based Toxicity Assay Results’, Critical Reviews in Toxicology, 42(8), 633-652；Quignot, N., Hamon, J., Bois, F.Y. [2014], “Extrapolating In Vitro Results to Predict Human Toxicity”, In Vitro Toxicology Systems, Methods in Pharmacology and Toxicology, VIII, 531-550；およびQuignot, Nadia; Bois, Frederic Yves [2013], "A Computational Model to Predict Rat Ovarian Steroid Secretion from In Vitro Experiments with Endocrine Disruptors", PLoS ONE, 8 (1), e53891が挙げられる。
【００１５】
今日までの毒性研究の第三の課題は、化合物がインビボで投与された場合に起こる薬物動態学的プロセス（当技術分野では吸収、分配、代謝および排泄のプロセス、あるいはADME（Absorption, Distribution, Metabolism and Excretion）として知られる）の機構的な理解を発展させることであり、それは、研究において化合物が細胞、組織、または器官に影響を与える前、その最中、およびもしかするとその後に、これらのプロセスがいかにその化合物の濃度または組成を変化させ得るかということ、ならびに、インビトロ結果を、起こり得るインビボ作用に変換することを試みる際に、これらの変化をいかにモデル化するかということを含む。今日まで、この課題に向けられた努力は、ヒトという種全体のレベルにおいて行われる分析に限定されており、作用の発生率についての洞察を提供するための前提要件となる、一人のヒトと対比される別の一人のヒトをモデル化することに関わる差異を解明する研究は進んでいない。上述した第二の課題と同様、本明細書で提供される方法のある実施形態では、そのプロセスのある時点においてこれらの方法論が関与し得るが、これらの方法論単独では本方法の範囲外となる。これらの方法論の最近の例としては、Louisse, J., de Jong, E., van de Sandt, J. J. M., Blaauboer, B. J., Woutersen, R. A., Piersma, A. H., et al [2010], “The Use of In Vitro Toxicity Data and Physiologically Based Kinetic Modeling to Predict Dose-Response Curves for In Vivo Developmental Toxicity of Glycol Ethers in Rat and Man”, Toxicological Sciences, 118(2), 470-484；Sung, J.H.; Esch, M.B.; Shuler, M.L. [2010], “Integration of In Silico and In Vitro Platforms for Pharmacokinetic-Pharmacodynamic Modeling”, Expert Opinions in Drug Metabolism and Toxicology, 6, 1063-1081；およびBlaauboer, B.J. [2010], “Biokinetic Modeling and In Vitro-In Vivo Extrapolations”, Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B, 13:242-252が挙げられる。
【００１６】
今日までの毒性研究の第四の課題は、最近になって探求され始めたばかりのものであるが、化合物についてのインビトロデータを、インビボ毒性についての最も基本的な二元的事実、すなわち過去の臨床試験または認可後使用において毒性反応の報告が存在していたか、否かということと関連付けることである（Pointon, A., Harmer, A. R., Dale, I. L., Abi-Gerges, N., Bowes, J., Pollard, C., & Garside, H. [2014], “Assessment of Cardiomyocyte Contraction in Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes”, Toxicological Sciences, 144(2), 227-237；およびDoherty, K. R., Talbert, D. R., Trusk, P. B., Moran, D. M., Shell, S. A., & Bacus, S. [2015], “Structural and Functional Screening in Human Induced-Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Accurately Identifies Cardiotoxicity of Multiple Drug Types”, Toxicology and Applied Pharmacology, 285(1), 51-60参照）。重要なことに、今日までの研究は、新規化合物についての推定または予測を試みるところまでは進んでおらず、集団における発生率の問題は論じていない。
【００１７】
ドナーの大きな標本に由来する細胞を利用して発生率の問題に取り組む多数の方法が過去に記述されてきた（例えば、Coyneらの“Methods for Predicting Responses to Chemical or Biologic Substances”と題されたPCT出願第PCT/US14/45499号；Coyneらの“Methods for Genetically Diversified Stimulus-Response Based Gene Association Studies” と題されたPCT出願第PCT/US14/53819号参照）。これらの文献は、研究者らが目的の化合物に見込まれる毒性反応の発生率を推定することができる、様々な方法を含んでいるが、インビボデータの直接的利用（それはインビボ反応を投影することにおいてより信頼性が高くなり得る）がないという点で、本明細書で提供される方法からは区別される。
【００１８】
目的の新規化合物にインビボで曝露された場合の対象集団中の個体による生物学的反応の潜在的発生率を先験的に推定または予測するインビトロアッセイを利用する改良された方法が求められる。そのプロセスにおける明確なステップとして、インビボそしてインビトロでの作用物に対する特定の曝露の作用の発生率について、インビボデータを使用して、インビボでの生物学的反応の影響の閾値レベルを示すインビトロ実験についての評価項目スコアのためのレベルを確立する、改良された方法が求められる。
【００１９】
本明細書で記述される方法は、目的の化合物および参照化合物についてのインビトロ実験と、参照化合物のインビボ作用の発生率に関して得られたデータとの組合せを使用することにより、この要求に応える。
【００２０】
目的の作用物にインビボで曝露された場合の対象集団中の個体による有益または有害な生物学的反応の潜在的な発生率または程度を決定する方法が本明細書で提供される。好ましくは対象集団は哺乳類集団であり、好ましくは個体はヒトであり、目的の作用物は、目的の化学的または生物学的作用物である。本方法は、目的の作用物に対するインビトロでの曝露の結果と、参照作用物に対するインビトロでの曝露の結果と、その参照作用物に対する曝露の際のインビボ作用の発生率に関して得られたデータとを組み合わせることを含む。この組合せは、有益もしくは有害な作用の閾値レベルを推定するための代用となり得るインビトロ実験の１つもしくは複数の評価項目についての１つもしくは複数のスコアを確立するために、または、目的の作用物にインビボで曝露された場合の対象集団中の個体による有益もしくは有害な生物学的反応の潜在的発生率を先験的に推定もしくは予測するために、利用される。
【００２１】
本方法によれば、少なくとも１つの参照作用物にインビボで曝露された場合の対象集団のサンプルにおける生物学的反応の発生率または程度が決定され、ここで、サンプルは、対象集団または類似集団の少なくとも１０個体のドナーからの細胞または組織を含み；少なくとも１つの参照作用物にインビトロで曝露された場合の対象集団のサンプルにおける生物学的反応の発生率または程度が決定され、ここで、サンプルは、対象集団または類似集団の少なくとも１０個体のドナーからの細胞または組織を含み；少なくとも１つのインビトロアッセイにおいて、目的の化学的または生物学的作用物に曝露された場合の対象集団における個体の生物学的反応の発生率または程度が決定され；少なくとも１つの参照作用物にインビボで曝露された場合の生物学的反応の発生率または程度に基づいて、対象集団における個体による生物学的反応の発生率または程度が推定または予測される。対象集団の個体は哺乳類である。
以下のことにより、インビトロアッセイのための閾値評価項目スコアを確立して、対象集団におけるインビボの関連作用の発生率の推定を作成する方法も提供される：
（a）その試験によって測定される評価項目がインビボでの生物学的反応の発生率と数学的変換を示し得る、１つ以上のインビトロ試験を選択すること；
（b）対象集団の標本として少なくとも１０個体のドナーを同定し、各々のドナーについて別々に、上記選択されたインビトロ試験のための細胞、組織、器官、それらの凝集物、またはそれらに由来する細胞、組織、もしくは器官を取得すること；
（c）参照の化学的または生物学的作用物（この参照の化学的または生物学的作用物に対する対象標本集団または類似集団のインビボ曝露について生物学的反応の発生率が決定されており、参照の化学的または生物学的作用物と目的の化学的または生物学的作用物とが上記生物学的反応に関して同じ作用機序を有すると考えられるもの）に、インビボで経験される曝露レベルと同等のインビトロ濃度において曝露することによって、各標本の各ドナーに対して上記選択されたインビトロ試験を実施すること；
（d）上記（c）で実施されたインビトロ試験の評価項目の定量値を、試験された各曝露レベルにおける標本中の個々のドナーの各々について決定すること；および
（e）ステップ（d）の定量値を分析して、参照作用物を用いたインビトロアッセイにおける個体についての評価項目スコアと、その個体がインビボでその参照作用物に対して反応を経験するか否かの予測との間の数学的変換を開発すること（ここで、対象集団の個体は哺乳類である）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
対象集団中の個体が曝露され得る化学的または生物学的作用物についての、用量、曝露、または濃度の限界のような、閾値限界を決定するための方法が本明細書において記述される。この方法に従って、目的の作用物へのインビトロ曝露の結果、および参照作用物へのインビトロ曝露の結果が、参照作用物のインビボ作用の発生率に関して得られたデータと組み合わされる。この組合せは、（1）有益または有害な作用の閾値レベルを推定するための代用となり得るインビトロ実験の１つ以上の評価項目についての１つ以上のスコアを確立すること、または、（2）目的の化学的または生物学的作用物にインビボで曝露された場合の対象集団中の個体による有益または有害な生物学的反応の潜在的な発生率を先験的に推定または予測すること、のいずれかに利用される。
【００２３】
定義：
本願の目的で、以下の用語は下記に説明される定義を有するものとする。
【００２４】
本明細書で使用されるインビトロとは、ドナーの身体（複数可）の外で構築物を用いるアッセイまたは試験であって、対象集団またはそれに類似すると仮定される集団の１以上の構成員からの細胞に由来し、生きた状態で維持される細胞が関わるものを包含するが、これに限定されない。従って、この用語は、（1）初代細胞であるか幹細胞であるかあるいはそれらから導出された細胞（例えば分化細胞）であるかを問わず、個別の生細胞または生細胞の凝集物が関わる、伝統的な定義によるあらゆるインビトロ試験；（2）全てまたは部分的にそのような細胞から創出された組織または器官構築物（合成のまたは工学的操作された材料が関わる構築物を含む）が関わるあらゆる試験；（3）ドナーから直接取り出された組織であるか上記セクション1に含まれた細胞の凝集もしくは生物学的発生により創出された組織であるかを問わず、ドナー由来であって生きた状態で維持される組織に対して身体の外で行われるあらゆる試験；および（4）複数の細胞種または組織種が関わる構築物であって、それらの細胞または組織が生きた状態で維持され、いくつかまたは全ての組織または細胞が、直接的もしくは間接的にお互いと連絡するか、または栄養物もしくは化学的シグナルを直接的もしくは間接的にお互いに伝達するもの（例えばインシリコ実験）を特に含むが、これらに限定されない。
【００２５】
本明細書において、閾値あるいは閾値限界とは、問題にされるものとして特定される量またはレベルとして定義される。「閾値」は、単一の閾値、または複数の閾値（例えば、集団の20パーセント、40パーセント、または60パーセントによる反応に相当するレベル）を表し得る。例えば、閾値は、問題となる生物学的反応が起こる、または問題となる生物学的反応にとって有意となる強度に達する用量、曝露、または濃度のような、最小点または最大点であり得る。
【００２６】
本明細書で使用される作用物（Agent）は、単一物質もしくは生物学的実体（例えば医薬化合物、もしくはその他の医薬品もしくはワクチン、もしくは化学物質、ウイルス、もしくは細菌）、または物質もしくは生物学的実体の組合せから形成されるものであり得る。例えば、作用物は、医薬化合物、化合物の混合物（例えば薬剤・薬剤相互作用試験で利用されるもの）、または化学的および生物学的作用物（例えば2つ以上の感染性作用物、または感染性作用物と化学的化合物）の混合物からなり得る。さらに、本明細書で使用される用語「作用物」は、前文で言及した複数の作用物または化合物が異なる時点において追加または除去されるプロトコール（例えば、そのプロトコールが第1の化合物の追加後に測定を求め、それから第2の化合物の追加後に測定を求め、そしてそれ以後にさらなる測定を求める、薬剤・薬剤相互作用試験におけるようなもの）を包含するものとして定義される。
【００２７】
本明細書で使用される、目的の作用物（Agent of Interest）は、集団がその作用物に曝露された場合または曝露された際のその作用物についての特定された作用の集団内での発生率の推定を当該方法が提供することが意図されているところの、1つ以上の作用物（例えば医薬化合物等）を表す。目的の作用物は、参照作用物について何らかの実験が行われるに先立って、あるいは、インビトロおよびインビボでの参照作用物（下記定義参照）の作用の関係および数学的変換（下記定義参照）の開発に先立って特定されている必要はない。
【００２８】
本明細書で使用される、参照作用物（Reference Agent）は、目的の作用物と反応の類似性が仮定されるために選ばれる作用物（例えば医薬化合物等）であって、以下のものが利用可能であるか入手可能であるものを表す：（1）その作用物にインビボで曝露された場合の対象集団による反応の発生率に関するデータ；および（2）その発生率を予測すると仮定され、参照作用物と目的の作用物に関して運用可能である1つ以上のアッセイの結果。
【００２９】
インビボアッセイに関して本明細書で使用される、発生率（Incidence）とは、作用物に曝露された場合に反応（あるいは閾値限界を上回る反応）を経験した、または経験すると予測される、標本または集団の部分（portion）を表す。インビボアッセイに関して、発生率という用語は、全標本のうちの部分を表すか、または、作用物に曝露された場合に標本の全構成員によって経験される評価項目スコアの集合であって、それらスコアのどの部分が当該実験において顕著となる十分な規模の反応を示す（すなわち、閾値限界が超過される）スコアを表すかに関して判断が下されるものを表すように本明細書では用いられる
【００３０】
本明細書で使用される、数学的変換（Mathematical Transform）とは、1つ以上のインビトロ尺度に関する定量値からインビボ尺度に関する定量値（「作用有り・作用無し」のような二元的尺度を含む）への反復可能な転換を生じる数学ベースまたは図表ベースのアルゴリズムまたは翻訳を表す。本明細書で使用されるこの用語は、線形関係、非線形関係、線形もしくは非線形回帰モデル、クラスタリング、自己組織化マップもしくは関連手法のアウトプット、またはその他の算術的転換式を包含するが、これらに限定されない。数学的変換は、複数の試験からの複数のインプットを、連帯して予測的な、または連続的もしくは並行的な形態における態様において組み合わせ得る。さらに、数学的変換のインプットおよびアウトプットはいずれも、一点値に限定されず、範囲、概算、または方向的関係性を含み得る。数学的変換の一例（本明細書において「反応閾値予測モデル」と呼ばれる）は後述する実施形態の1つにおいて提供されている。
【００３１】
本明細書で使用される、標本（Sample）とは、集団全体についてまたは集団全体の指定された一部分についての洞察を提供する目的のために創出される無作為標本、代表標本、階層化標本、または集団のその他のサブセットを含み得る。本明細書に記述される方法は、ある特徴（例えばある化合物に対する反応）を示す標本の部分（portion）は集団全体によって示されるであろうものと同じ部分（portion）であることを暗示する記述的簡略化を採用し得るが、標本中の発生率から集団中の発生率へのスケールアップ技術が標本技術の選択に対して適宜適用されることが理解されるべきである。これらの技術は当業者によく知られている。
【００３２】
本明細書で使用される、個体（Individual）とは、特定の人、あるいは本発明が哺乳類の他の種に適用される場合には動物のコホートの特定の構成員（当該方法で使用される細胞または組織の元の採取源であった者、および／または、その者についてアッセイの結果が直接的に測定されるところの者）のレベルにおける識別子として定義される。
【００３３】
本明細書で使用される、「a」および「an」という語は、1つ以上を意味し、単数形の「a」、「an」および「the」は、明示的かつ明解に1つの対象に限定されていない限り複数の対象を包含することがさらに留意されるべきである。
【００３４】
工程および因子
本明細書では、インビボで目的の作用物に曝露された場合の対象集団中の個体による生物学的反応の潜在的発生率を推定または予測するための方法が記述される。好ましくは、対象集団は哺乳類集団であり、好ましくは個体はヒトであり、目的の作用物は目的の化学的または生物学的作用物である。この推定または予測は、（1）目的の作用物に関するインビトロ実験および参照作用物に関するインビトロ実験と；（2）参照作用物に対する曝露のインビボ作用の発生率に関して得られたデータとの組合せを使用して達成される。
【００３５】
本方法には2セットの工程が関わる。すなわち：（1）インビボ結果とインビトロ結果の両方が知られている参照作用物の分析を通じて、1つ以上のインビトロアッセイにおける評価項目のスコアのパターンをインビボの反応の発生率に関連付ける数学的変換を開発する、そして（2）その数学的変換を、目的の作用物が試験された場合のその同じインビトロアッセイからもたらされた評価項目スコアに適用して、その目的の作用物がインビボで遭遇された場合に起こると見込まれるインビボ結果の推定を開発する。最初のセットの工程を単独で行って、そのアッセイの将来的有用性に寄与させてもいいし、または、最初のセットの工程の結果を第2のセットの工程と組み合わせて目的の作用物についての推定を提供してもよい。
【００３６】
単に相関するのではなく因果的に相関する、次の少なくとも3つのカテゴリーの因子が、得られる推定の正確度に影響を与える。
【００３７】
第1のカテゴリーの因子は、インビボの作用の因果関係とインビトロのアッセイにより測定される評価項目との間の類似性の度合いに関するものである。インビトロ実験で使用される細胞がそのインビボ対応物のロバストなモデルであり；インビボで見られる作用が、インビトロアッセイで分析されるまさにその組織構築物に対する影響の因果的結果であり（例えば、インビトロアッセイが細胞ベースであるとして、当該結果が臓器レベルまたはシステムレベルでの損傷ではなく細胞レベルでの損傷である場合）；そしてインビトロアッセイが、インビボ作用を引き起こすのと同じ作用機序を測定する（これは全ての作用機序が知られていることを前提とする）場合には、これらの類似性がより高くなる。
【００３８】
第2のカテゴリーの因子は、数学的変換へのデータインプットの供給源において使用される集団標本の間の類似性、そしてその集団標本の代表性（representativeness）、ならびに、（参照作用物の場合）インビボ作用が測定される集団と（目的の作用物の場合）作用が推定される集団との間の類似性に関するものである。例えば、薬剤毒性アプリケーションにおいては、インプット供給源は、参照化合物についてのインビボ結果を産生した臨床試験患者標本；参照化合物のインビトロアッセイにおける使用のために細胞が取られたドナー標本；および、目的の化合物のインビトロアッセイにおける使用のために細胞が取られたドナー標本からなり得る。目的の化合物が最終的に意図され得る集団内の、これら3つの標本のより高い相互類似性は、より優れた正確度に貢献する。アッセイの評価項目スコアに影響または寄与し得る、ドナーの人口統計的表現型およびドナーにおけるある健康状態の存在の有無をはじめ、類似性のいくつかの側面が考慮されるべきである。
【００３９】
第3のカテゴリーの因子は、参照作用物と目的の作用物との間の類似性に関するものである。薬物動態、作用機序の数、それら作用機序の性質（例えば、参照作用物と目的の作用物との間でどの作用機序が未測定であるか）、および／または、曝露のレベルが変化する際の1つ以上の評価項目に沿った反応変化の率における、参照作用物と目的の作用物との間のあらゆる重要な類似性または差異が、この点において鍵となる。
【００４０】
本明細書で提供される方法の様々な実施形態は、上述した因子の異なる組合せについて明確にコントロールする。さらに、試験される参照作用物の数が増加する、根底にあるアッセイの多様性と質が上昇する、インビボで経験された参照作用物の作用についてのより完全なデータベースに対して研究者がアクセスを作るまたは獲得する、等が起こるにつれ、コントロールのレベルおよびこれらの因子の一貫性は経時的に改善されることが見込まれる。
【００４１】
数学的変換に具現化される定量的関係の正確度は、すぐ上で述べた3つのカテゴリーの因子の多くをコントロールすることを試みない実施形態においてさえも、上述した連関の厳密な因果的モデリングを通じて予測され得るレベルを超越し得る。多くの薬動力学的作用は（利用される特定のアッセイによっては測定されていなくとも）互いに相関している可能性が高いために、この向上した正確度は起こる。例えば、ある作用物はいくつかの種類の細胞をほぼ同じ割合で害し、それらの害の各々がインビボ反応に寄与するかもしれない。アッセイは1種類の細胞に対する損傷を測定するだけであっても、総合的なインビボ作用はやはりアッセイの評価項目スコアと密接に相関し得る。あるいは、2つ以上の細胞種または器官の間の連絡（例えば心臓に対する神経系のシグナリング）の破たんが関わる作用機序は、関与する細胞種または器官のうちの1つだけに対する根底的損傷を測定するアッセイと相関させることができる。いずれの細胞種または器官に対する損傷も、それらの間の実効的な連絡を妨げるからである。
【００４２】
この理由で、本方法は広範な実施形態を含み、その多くは、目的だけでなく、上述した様々な因子に対してコントロールを実行する根底的な設計要素においても異なるであろう。
【００４３】
条件
本方法は、以下の条件が存在するあらゆる状況下で適用することができる：（1）目的の生物学的反応のインビボでの性質が過去に定義されている；（2）対照集団に類似する集団が少なくとも1つの参照作用物（化学的または生物学的なもの）にインビボで曝露された際の、その類似集団において、その性質の反応が観察され、それらの反応の発生率が記録されており、その参照作用物の作用機序が目的の作用物と十分に類似しており実用上正確な数学的変換を生じる可能性があると先験的に考えられている；（3）上記（2）で同定された作用機序と因果的または偶然的に相関するとその研究者が仮定する、少なくとも1つのインビトロアッセイが同定されている；（4）その研究者は、上記でインビボ発生率が測定された参照作用物と目的の作用物との両方を物理的に入手することができる；そして（5）参照作用物と目的の作用物との両方についてインビトロアッセイをうまく運用可能にできる。
【００４４】
任意で、追加の条件が、本明細書で提供される方法に影響を与え得、それは医薬化合物の文脈で最も容易に説明することができる。この文脈において、ある化合物は、個々のヒトに対する影響（すなわち薬動力学）だけでなく、その化合物が有益または有害な影響を与え得る特定の細胞に接触する前、最中、および後に、異なるヒト個体の身体がいかにその化合物を吸収し改変（または代謝）するかということにおいても、他の化合物とは異なる。医薬品の文脈では、これは薬物動態学と呼ばれる。あらゆる作用物の文脈では、より一般的な用語「作用物動態学」が本明細書で用いられる。
【００４５】
1つ以上の参照作用物からの組み合わされたインビトロおよびインビボのデータを使用して目的の作用物のインビボ作用を予測する研究者の能力は、複数の作用物に渡る作用物動態学の類似性または非類似性に明示的または暗示的に対処することが関わる。作用物動態学に対処するために3つの戦略が存在する。第1に、参照作用物の選択肢がごく限られている場合（例えば、インビボデータが利用可能でありかつ類似的インビトロアッセイが開発されている作用物の数が限られているため）には、研究者は、モデル自体の開発においては作用物動態学の違いを無視して、作用物動態学の類似性もしくは差異の外部分析に依存して作用物の用量濃度もしくは曝露をスケールアップもしくはスケールダウンしてそれらの差異を補正し、または、それほど好ましくはないが、得られる予測がどれほど正確もしくは不正確であり得るか単純に判断せざるを得ないかもしれない。第2に、潜在的に適切な参照作用物の数が増加するに従い、研究者は、作用物動態学が目的の作用物のものとはあまりに類似性が低い潜在的参照作用物を除外することにより、作用物動態学の差異についてコントロールすることができる。第3に、潜在的に適切な参照作用物の数がさらに増加するに従い、研究者は、作用物動態学の差異の影響を計算に入れた数学的変換を構築することができるようになり得る。
【００４６】
インビボ反応の発生率または程度を予測する方法
本明細書で提供される、インビボ反応の発生率または程度を予測する方法は、2つの工程を含み、その各々がさらに複数のサブ工程を含む。
【００４７】
1. インビボの発生率と、インビボ実験についての評価項目スコアとの間の数学的関係を確立する。
【００４８】
a. インビボの目的の生物学的反応、および、使用されるべきインビトロアッセイを決定する。
【００４９】
目的の作用物に関して発生率の予測が望まれる、インビボの目的の反応が同定される。反応の一般的カテゴリー（例えば、薬剤開発プログラムの際の心臓毒性）を同定することは容易かもしれないが、2つの別個の制約を満たすためには、反応をより具体的に定義することがおそらく必要になる。第1に、その反応は、インビボで経験されるその反応の発生率に関するデータを見出すことができるものでなければならない。例えば、薬物毒性試験においては、このデータは参照化合物の第II相または第III相臨床試験から見出される可能性が最も高い。アクセスが存在するデータベース、および参照作用物自体の利用可能性に依存して、反応の具体的な定義は調節を要し得る。例えば、認可薬物の警告表示をインビボ発生率についての情報源として使用する場合には、研究者は、有害事象の性質および発生率に関する各薬物についてのきわめて独特な情報群に制限される。この情報は、他の参照化合物の警告表示に報告されている同種類の毒性における事象の定義と一致するかもしれないし、一致しないかもしれない。第2に、インビボの反応の発生率を（因果関係もしくは相関またはその2つの組合せにより）予測するものとして仮定できるインビトロアッセイが利用可能でなければならない。これもやはり、目的の反応の具体的定義について妥協を求め得る。
【００５０】
b. インビトロで試験されるべき細胞、組織等のサンプルを選択し調製する。
【００５１】
選ばれたインビトロアッセイにより求められる細胞、組織等は、共に合わさって対象集団（すなわち、反応の発生率が予測されるべき集団）を代表するドナーの標本から取得される。これに関して、「取得される」という用語は、何らかの方法を通じてドナーから細胞もしくは組織を直接的に抽出もしくは採取すること、ならびに／または、そのような細胞を培養、増殖、分化、および／もしくは操作することを通じて必要な種類および数の細胞もしくは組織を発生させることを含む。標本を定義するための方法および必要とされる細胞または組織を取得し調製するための要件は、「Methods for Predicting Responses to Chemical or Biologic Substances」と題されたPCT出願第PCT/US14/45499号、および「Methods For Genetically Diversified Stimulus-Response Based Gene Association Studies」と題されたPCT出願第PCT/US14/53819号に記述されており、これらはどちらも参照により本明細書に組み入れられる。典型的な細胞としては、幹細胞、またはそれらから由来、誘導（人工多能性幹細胞）、もしくは分化した細胞が挙げられるが、これらに限定されない。参照作用物と目的の作用物の両方によって試験される細胞または組織が同一のドナー標本から得られることが非常に好ましいが、必須ではない。ドナーの数は好ましくは少なくとも10、少なくとも30、または少なくとも100である。
【００５２】
c. 参照作用物についてインビトロアッセイを実行する。
【００５３】
上記工程1aで言及したインビボ反応発生率を研究者が得ることができた1つ以上の参照作用物の必要量を入手する。それから、当業者によく知られる方法を使用してインビトロ濃度をインビボの曝露または濃度に平衡化して、過去に発生率データが得られたインビボの用量または曝露と同等の用量または曝露において、選んだインビトロアッセイを上記工程1bで得られた細胞または組織の一部分に対して実行する。それからインビトロ試験の評価項目スコアを各ドナーについて記録する。
【００５４】
d. ドナーを順位付ける。
【００５５】
参照化合物に対してアッセイが1回実行されるたびに（1回の反復は、単一化合物の単一用量を全てのドナーに投与することである）、評価項目スコアが上昇または下降する順序でドナーを順位付ける。そのような順位付けは、より高いスコアがより強い反応と関連すると考えられる場合には上昇する順序であり、より低いスコアがより強い反応と関連すると考えられる場合には下降する順序である。
【００５６】
e. 閾値スコアの十分なセットを同定する。
【００５７】
閾値スコアの十分なセットが同定されるまで、サブ工程1cおよび1dを、（発生率に関するインビボ情報が利用可能な）追加的な曝露について、および／または追加的な参照作用物（もし情報が利用可能であれば、用量が複数ある可能性もある）について繰り返す。得られた閾値スコアをそれからまとめて調べて、それらが適切に分布して有用な推定または予測の基礎を形成しているか否かを決定する。
【００５８】
f. 数学的変換を開発する。
【００５９】
適切な数学ベースまたは図表ベースのアルゴリズムまたは翻訳（上述した定義において説明したように）を使用して、インビトロで試験された個体間の反応の発生率および／または強度を、類似条件下でインビボで見られた反応の発生率に関係付ける。数学的変換の開発は連続的に起こり得、そこではある曝露および／または作用物が変換の最初のバージョンを開発するためのトレーニングセットとして使用され、それからそれが他の曝露および作用物に対する予測正確性について試験される。これらの試験を経た後、数学的変換は追加的なデータおよび知見を組み入れるために改変され得る。
【００６０】
2. 数学的関係を目的の化合物のアッセイと組み合わせて、集団における反応の発生率を推定する。
【００６１】
a. インビトロアッセイを実行する。
【００６２】
対象集団を代表するドナーの標本に由来する細胞または組織を使用して、目的の用量における目的の化合物に対して、上記工程1c、1d、および1eで言及されたインビトロアッセイを実行する。好ましくは、この細胞または組織は、上記工程1bで得られた細胞もしくは組織、またはそれに由来する細胞もしくは組織の一部または全てを含む。ドナーの各々について評価項目スコアが記録され、上記1dと同様にドナーはその評価項目スコアに従って配列される。
【００６３】
b. 対象集団が目的の作用物に曝露されたとしたら起こるであろう反応の発生率を推定／予測する。
【００６４】
推定／予測は、当業者によく知られる方法で工程1fおよび2aのアウトプットを組み合わせることにより創出される。いくつかの実施形態では、参照作用物のトレーニングセットに対するインビトロアッセイの結果とその参照作用物の同じトレーニングセットのインビボ結果との間のロバストな数学的変換を確立して、目的の作用物についてのインビトロ結果とその同じ目的の作用物の予測されるインビボ結果との間の関係を確信的に仮定するためにその数学的変換を使用するためには、1つの評価項目では（例え複数の参照作用物および複数の曝露を有していても）十分ではないであろう。
【００６５】
従って、複数の作用機序が関わっている場合には、研究者は、同じアッセイまたは複数のインビトロアッセイからの複数の評価項目を利用して、インビボでの経験に関わる様々な作用機序に直接的または間接的に対応する多様な評価項目を取得し得る。それからこれらの全てが数学的変換において組み合わせられ得る。
【００６６】
記載された方法の典型的実施形態
この説明を通して言及されるように、本明細書で提供される方法は広範な実施形態において具現化され得、そこでは複数の次元でバリエーションが起こり得る。以下の実施形態は網羅的にすることは意図されておらず、この多様性のいくつかの側面を例示することだけが意図されている。
【００６７】
一実施形態は、上述した「反応閾値予測モデル」の単純な開発および適用である。この実施形態では、（1）インビボでの参照作用物の影響を記述するデータは発生率のみに限定され（すなわち、データは、作用物に曝露された集団のうち反応を経験した割合のみを特定する。個体の反応の程度は特定しない。）、（2）1つだけのインビトロアッセイが関係するとみなされ、そのアッセイは1つの評価項目のみを報告する
【００６８】
この実施形態では、参照作用物への特定の曝露に対する個体のインビボでの反応は、その同じ個体の細胞／組織が同じ作用物の類似濃度に曝露された場合のインビトロアッセイで示す評価項目スコアと密接に関連すると仮定される。すなわち、薬剤開発毒性の例を用いると、インビトロアッセイは、当該化合物の負荷を受ける細胞または組織への損傷を測定することが仮定される。さらに、人が目的の毒性反応を顕出させる前にこれら同じ種類の細胞または組織にインビボで持続させることができる損傷の程度に関しては個人間のばらつきが比較的小さいことが仮定される。従って、この実施形態では、「損傷」は、二元的に「害された」と分類される細胞のパーセンテージによって測定される。単一細胞のレベルで、害の程度の連続的測定は行われない。重要なことに、損傷のそのレベルを引き起こすために必要とされる用量濃度に関しては、ほぼ反対のことが仮定される。1つの特定の用量濃度により引き起こされる損傷のレベルに関しては個体間で大きなばらつきがあると仮定される。
【００６９】
従って、インビボで反応を示す者を示さない者から分ける、インビトロでの評価項目の閾値限界（あるいは、より現実的には「ゾーン」）が存在することが仮定される。閾値は、その閾値を超える標本の部分が、インビボで同じ参照化合物に曝露された集団の発生部分と同じになるような評価項目レベルを見出すことによって決定される。単一の参照作用物の複数の曝露に渡って（あるいは、好ましくは、複数の参照作用物の複数の曝露に渡って）このプロセスが繰り返されたときに十分一貫性のある閾値が見出されたとすれば、そのインビトロアッセイの評価項目閾値は、目的の作用物についての反応の発生に関する十分に信頼できる指標であることを仮定することができる。それからその部分を用いて、集団全体についての予測へとスケールアップする。
【００７０】
例えば、もし、所与の参照作用物のインビトロ試験とその対応するインビボ試験との1つの対において、そのインビボ試験で患者の17%が有害反応を経験したとすると、細胞または組織がインビトロ試験で使用されたドナーのうちの17%が同様の有害反応を経験すると仮定する。その後、反応を受けると仮定される17%の患者を、反応を受けないと仮定される83%の患者から区別するために必要とされる、インビトロアッセイに関する評価項目スコアを決定することができる。このスコアが閾値限界になる。その同じインビトロアッセイを、今度は目的の作用物の選ばれた濃度を用いて実施し、スコアが上記閾値限界を超える標本の部分を算出する。
【００７１】
別の実施形態では、例えば参照作用物に曝露された集団のサブ部分により経験された反応の程度のように、インビボ反応の複数の側面に関してデータが利用可能であり得る。この実施形態では、数学的変換を開発することにおいてより洗練された技術を使用して、インビトロアッセイからの様々な評価項目スコアと、インビボで反応を経験する（あるいはある特定程度の反応を経験する）蓋然性とのあいだの関係を推定し得る。上記と同様に、それらのスコアは目的の作用物に当てはまるものと仮定される。
【００７２】
別の実施形態では、複数のアッセイが関係性を有し利用可能であり、または、同じアッセイから複数の評価項目が読み取られ得る。そのような例においては、数学的変換には、線形回帰、クラスタリング、自己組織化マップ等のような任意の技術が関与し得、複数の評価項目の影響が組み合わされて単一の予測的アウトプットが形成される。
【００７３】
別の実施形態では、参照作用物へのインビボ曝露を経験しその後その曝露に反応した（または反応しなかった）特定の個体に由来する細胞または組織にインビトロアッセイを実施することが可能であり得る。この実施形態では、インビトロ評価項目スコアとインビボ帰結との間の関係を詳細にわたって数学的に探究し、新しい数学的変換を開発することができる。これらの関係から、目的の作用物に用いるものへの具体的な翻訳は、目的の作用物との関係での対象集団が、参照化合物に元々曝露された集団であるか、または、その集団が単に代理であるに過ぎないものであるかに依存するであろう。
【００７４】
本明細書で提供される方法は、以下の非限定的な実施例を参照することにより、より理解され得る。
【実施例】
【００７５】
実施例1
患者への使用についての化合物の可能性を決定する
医薬化合物である化合物Xが、薬剤開発プロセスの初期段階において研究されている。化合物Xは、強力な抗癌薬物療法として現在市販されているが治療的用量で投与された場合に著しい心臓毒性副作用を有することが知られるドキソルビシンに化学的に類似しているが、ドキソルビシンと同一物ではない。ドキソルビシンの毒性は、薬剤の使用の障害になるほど深刻である。事実、同等の毒性重度を有する他の化合物は、ドキソルビシンの場合のように、許容できる代替物がほとんど無いまたは全く無い状況下でのみ処方されることにしない限り、FDAが認可する可能性は低く、それほどその毒性は深刻である。
【００７６】
研究者は、（その予測される治療的用量における）化合物Xが、ドキソルビシンが臨床試験で生じたものよりも有意に低い心臓毒性作用を生じると考えている。研究者は、治療的用量における化合物Xについて、その種の心臓毒性作用の発生率がドキソルビシンと同等以上であるならば化合物Xの開発を中止するという基準を立てる。
【００７７】
連邦医薬品局により義務付けられた警告表示から関連情報を得ることにより、500 mgおよび600 mgの用量におけるドキソルビシンの有意な心臓毒性事象の臨床的発生率の目録を作る。
【００７８】
それから、評価項目（ここでは評価項目Aと呼ぶ）が、ドキソルビシンの心臓毒性作用の1つである心筋症と因果的に関連するものを含む、インビトロアッセイを同定する。インビトロアッセイのプロトコールにより定められるドキソルビシンの濃度を、インビボで投与される500 mgおよび600 mgの用量に相当する濃度において調製する。
【００７９】
100ドナーの標本から得られた幹細胞に由来する心筋細胞（心筋細胞は分化された人工多能性幹細胞である）の代表的サンプルに対してこれらの濃度においてインビトロ試験を実行し、それからドナーを、評価項目Aのスコアが上昇する順序で配列する。
【００８０】
彼の手順では「反応閾値予測モデル」が数学的変換として選択される。上述したドキソルビシンの臨床心臓毒性データから、500 mg用量レベルで処置された場合に臨床試験参加者の12%が心筋症を経験したことが記録されている。上記のインビトロ試験結果を使用して、100ドナーのインビトロコホートの第88百分位構成員と関連する評価項目Aスコアが決定される（88は、500 mg用量での処置後に心筋症を経験したインビボでの標本の12%を100%から引いたものを表わしている）。その評価項目Aスコアは70ユニットを示す。
【００８１】
次に、100ドナーの標本に由来する幹細胞から誘導された心筋細胞の代表的サンプルに対して、インビボで投与される600 mg用量に相当する濃度を用いて、ドキソルビシンのインビトロアッセイを繰り返し、それから評価項目Aのスコアが上昇する順序でドナーを配列する。今回は、評価項目Aスコアは第76百分位におけるドナーについて検出される（76は、600 mg用量での処置後に心筋症を経験したインビボでの標本の23%を100%から引いたものを表わしている）。今回は、その評価項目Aスコアは65ユニットを示す。
【００８２】
従って、ドキソルビシンの場合は、65と70の間の評価項目Aスコアが、10から25パーセントの範囲の心筋症の発生率をもたらす影響の閾値を近似すると仮定される。さらに、影響の同じ閾値が化合物Xに適用されると仮定される。化合物Xの用量は、65〜70の推定毒性閾値を発見することに使用されたドキソルビシンの用量と同じにはならないが、それは問題にならないと考えられる。むしろ、あらゆる目的の濃度において問題になるのは、65〜70の閾値を超える評価項目Aスコアを経験する標本の部分である。
【００８３】
次に、今度は、目的の濃度（すなわち、化合物Xの選ばれた治療標的に対して有効になるためにインビボで要求される用量に相当するもの）において投与される化合物Xによる負荷の下、100ドナーの同じ標本からの心筋細胞に対してインビトロアッセイを実行する。
【００８４】
目的の濃度において、65ユニットを超える評価項目Aスコアを経験する標本の部分は24%であり、70ユニットを超えるスコアを経験する部分は17%であると決定される。化合物Xによる「有害作用を受けた」標本の部分は、ドキソルビシンによる「有害作用を受けた」標本の部分の範囲内であることが留意される。従って、化合物Xによって処置されインビボで心筋症を経験するであろう集団の部分は、ドキソルビシンによって処置した場合に臨床的に経験された心筋症の発生率と概して同じ範囲内になる可能性が高いと推定される。従って、化合物Xの開発は中止される。
【００８５】
実施例2
新規化合物についての心臓毒性の発生率を推定するための閾値を、特定されたインビトロアッセイでそれらが評価される際に開発する。
研究者は、一組の新規化合物の、ヒトにおける心臓毒性の潜在的発生率を推定するために、新規アッセイと共に使用するための一般化されたモデルを作り上げることを望んでいる。特に、その研究者は、肥大型心筋症をもたらす酸化ストレスのことを懸念している。そのインビトロアッセイは、細胞膜の統合性における変化を測定することを通じて心筋細胞の細胞生存性の減少を測定する。
【００８６】
しかしながら、本明細書に記述される方法以前には、アッセイの測定された評価項目からの数値的アウトプット（すなわち、細胞膜統合性が損傷された心筋細胞のパーセント）をインビボでの肥大型心筋症の可能性の推定へと翻訳するための方法が存在していない。
【００８７】
従って、研究者は、ある広く使用されている薬物―化合物B―の心筋症に関する文献を調べたところ、化合物Bが200 mg用量において投与された場合の患者における心筋症の報告された発生率が18パーセントであり、化合物Bが400 mg用量において投与された場合の発生率が36パーセントであったという、鍵となる調査結果を発見する。
【００８８】
研究者は、心筋症の発生についての閾値に相当する、アッセイでの評価項目スコアの推定を確立するための最初の参照化合物として、200および400 mg当量のインビトロ用量における化合物Bを使用することを決定する。
【００８９】
研究者は、対象集団の代表的標本を構成する24ドナーの標本からの細胞から調製したiPSC由来心筋細胞に対して、上記で特定されたアッセイ（すなわち細胞膜統合性）を実施し、これらの心筋細胞は、200および400 mgと等価なインビトロ用量における化合物Bの用量による負荷を受ける。研究者は、それから、それぞれ分布の第82および第64百分位に相当するスコア（18および36パーセント発生率の逆である）を決定するために評価項目スコアを（最低から最高まで）順位付ける。
【００９０】
特定された百分位における評価項目スコアはそれぞれ40および45（細胞膜統合性の損失を経験した細胞のパーセント）である。従って、研究者は、肥大型心筋症の高い可能性に対応する、この特定のアッセイに関する閾値スコアは40〜45パーセントの範囲内であると予備的に結論付ける。
【００９１】
研究者はそれから、肥大型心筋症のインビボ発生率が記録されている別の参照化合物を使用して、同じ細胞に対して同様のアッセイを実施する。これらの実験の結果は、35〜45の範囲内の閾値評価項目スコアについての推定を生じる。
【００９２】
研究者は、新規化合物で処置された場合に集団のどの部分が肥大型心筋症を経験する可能性が高いかを推定するために使用するこのアッセイについての適切な評価項目スコアは35〜45（細胞膜統合性の損失を経験する細胞のパーセント）であろうという仮説を採択する。この範囲以上にスコアする標本の部分は、対応するインビボ用量で処置された場合に肥大型心筋症について高リスクとなる推定部分に相当する。
【００９３】
研究者はそれから、いくつかの追加の参照化合物（インビボ心筋症の発生率が記録されたもの）を使用して同じアッセイを盲検で実施するよう用意する。各々の場合において、研究者は、インビトロアッセイからの評価項目スコアの分布と、この例において上記で開発された数学的変換とを使用して、インビボで心筋症を経験する集団の部分を推定する。化合物がブレンドされていない場合には、研究者は、本分野でよく知られる統計学的技術を使用して、実際のインビボデータに対して推定／予測の正確度を分析する。研究者は、インビトロ試験が実用的に正確な予測を提供すると結論付ける。薬剤開発プロセスのあいだのステージゲート決定を補助することにおいてその試験と数学的変換を使用することについての産業界内での信頼を構築するプロセスにおいて、上記結果はその後発表され産業界および規制者と共有される。
【００９４】
以上は、明確性および理解の目的で説明および例示によりいくらかの詳細を記述してきたが、添付の特許請求の範囲内でいくらかの変更および修正を実施することができることを当業者は理解する。さらに、本明細書で提供される各引用文献は、各引用文献が参照により個別に組み入れられる場合と同程度に、その全体が参照により組み入れられる。
【国際調査報告】
2018529944.tif 000002