(57)【要約】本開示の主題は、異種遺伝子発現を予測及び最適化するための、翻訳伸長の自由エネルギベースモデルを提供する。このモデル及びソフトウェアにより、タンパク質収率の上昇又は低下、及びタンパク質凝集の増大又は減少のための、遺伝子の予測及び最適化が可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある遺伝子の翻訳に関してタンパク質収率を予測するための方法であって、
前記方法は：
（ａ）タンパク質をコードするｍＲＮＡのコーディング領域の各コドンにおけるリボソーム待機時間を決定するステップであって、前記ステップは、各コドンのサイクル数を決定するステップを含み、前記サイクル数は、ｔＲＮＡ存在量、リボソーム変位量、及び前記ｍＲＮＡと前記リボソームの３’末端ｒＲＮＡテールとの間の結合からの力の関数である、ステップ；並びに
（ｂ）前記コーディング領域全体の複数のコドンにわたる総サイクル数を決定するステップ
を含み、
前記コーディング領域全体の複数のコドンにわたる前記総サイクル数は、タンパク質収率と相関する、方法。
【請求項２】
ある遺伝子の翻訳に関してタンパク質収率を予測するための方法であって、
前記方法は：
（ａ）タンパク質をコードするｍＲＮＡのコーディング領域の各コドンにおけるリボソーム待機時間を決定するステップであって、前記ステップは、各コドンのサイクル数を決定するステップを含み、前記サイクル数は、ｔＲＮＡ存在量、リボソーム変位量、及び前記ｍＲＮＡと前記リボソームの３’末端ｒＲＮＡテールとの間の結合からの力の関数である、ステップ；
（ｂ）翻訳ボトルネックプロットをプロットするステップであって、前記プロットは、サイズＮコドンのスライディングウインドウ内のサイクルの合計を含む値を含む、ステップ；並びに
（ｃ）前記翻訳ボトルネックプロットにおける最大合計を決定するステップ
を含み、
前記翻訳ボトルネックプロットにおける前記最大合計は、タンパク質収率と相関する、方法。
【請求項３】
ある遺伝子の翻訳に関してタンパク質収率を予測するための方法であって、
前記方法は：
（ａ）タンパク質をコードするｍＲＮＡのコーディング領域の各コドンにおけるリボソーム待機時間を決定するステップであって、前記ステップは、各コドンのサイクル数を決定するステップを含み、前記サイクル数は、ｔＲＮＡ存在量、リボソーム変位量、及び前記ｍＲＮＡと前記リボソームの３’末端ｒＲＮＡテールとの間の結合からの力の関数である、ステップ；並びに
（ｂ）タンパク質翻訳シミュレーションを実施することによって、あるサイクル数内に翻訳を完了するリボソームの量を決定するステップ
を含み、
あるサイクル数内に翻訳を完了するリボソームの前記量は、タンパク質収率と相関する、方法。
【請求項４】
ある遺伝子の翻訳に関してタンパク質収率を上昇させるための方法であって、
前記方法は：
（ａ）請求項１〜３のいずれか１項に記載の、ある遺伝子の翻訳に関してタンパク質収率を予測するための方法を実施するステップ；並びに
（ｂ）力及び／又は待機時間を変化させている間にタンパク質のアミノ酸配列を保存する同義コドンを用いて、コドンを修飾するステップ
を含み、
前記遺伝子の翻訳に関するタンパク質収率は上昇する、方法。
【請求項５】
ステップ４（ｂ）は、前記リボソーム待機時間が減少するようにコドンを修飾するステップを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記リボソーム変位量は、前記遺伝子の種角に略等しい前記遺伝子の位相角を選択することによって最小化される、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
ある遺伝子の翻訳に関してタンパク質収率を低下させるための方法であって、
前記方法は：
（ａ）請求項１〜３のいずれか１項に記載の、ある遺伝子の翻訳に関してタンパク質収率を予測するための方法を実施するステップ；並びに
（ｂ）力及び／又は待機時間を変化させている間にタンパク質のアミノ酸配列を保存する同義コドンを用いて、コドンを修飾するステップ
を含み、
前記遺伝子の翻訳に関するタンパク質収率は低下する、方法。
【請求項８】
ステップ７（ｂ）は、前記リボソーム待機時間が増大するようにコドンを修飾するステップを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
タンパク質凝集を予測するための方法であって、
前記方法は：
（ａ）タンパク質をコードするｍＲＮＡのコーディング領域の各コドンにおけるリボソーム待機時間を決定するステップであって、前記ステップは、各コドンのサイクル数を決定するステップを含み、前記サイクル数は、ｔＲＮＡ存在量、リボソーム変位量、及び前記ｍＲＮＡと前記リボソームの３’末端ｒＲＮＡテールとの間の結合からの力の関数である、ステップ；並びに
（ｂ）前記コーディング領域全体の複数のコドンにわたる総サイクル数を決定するステップ
を含み、
前記コーディング領域全体の複数のコドンにわたる前記総サイクル数は、タンパク質凝集と相関する、方法。
【請求項１０】
タンパク質凝集を予測するための方法であって、
前記方法は：
（ａ）タンパク質をコードするｍＲＮＡのコーディング領域の各コドンにおけるリボソーム待機時間を決定するステップであって、前記ステップは、各コドンのサイクル数を決定するステップを含み、前記サイクル数は、ｔＲＮＡ存在量、リボソーム変位量、及び前記ｍＲＮＡと前記リボソームの３’末端ｒＲＮＡテールとの間の結合からの力の関数である、ステップ；
（ｂ）翻訳ボトルネックプロットをプロットするステップであって、前記プロットは、サイズＮコドンのスライディングウインドウ内のサイクルの合計を含む値を含む、ステップ；並びに
（ｃ）前記翻訳ボトルネックプロットにおける最大合計を決定するステップ
を含み、
前記翻訳ボトルネックプロットにおける前記最大合計は、タンパク質凝集と相関する、方法。
【請求項１１】
タンパク質凝集を予測するための方法であって、
前記方法は：
（ａ）タンパク質をコードするｍＲＮＡのコーディング領域の各コドンにおけるリボソーム待機時間を決定するステップであって、前記ステップは、各コドンのサイクル数を決定するステップを含み、前記サイクル数は、ｔＲＮＡ存在量、リボソーム変位量、及び前記ｍＲＮＡと前記リボソームの３’末端ｒＲＮＡテールとの間の結合からの力の関数である、ステップ；並びに
（ｂ）タンパク質翻訳シミュレーションを実施することによって、あるサイクル数内に翻訳を完了するリボソームの量を決定するステップ
を含み、
あるサイクル数内に翻訳を完了するリボソームの前記量は、タンパク質凝集と相関する、方法。
【請求項１２】
タンパク質凝集を増大させるための方法であって、
前記方法は：
（ａ）請求項９〜１１のいずれか１項に記載の、タンパク質凝集を予測するための方法を実施するステップ；並びに
（ｂ）力及び／又は待機時間を変化させている間にタンパク質のアミノ酸配列を保存する同義コドンを用いて、コドンを修飾するステップ
を含み、
前記タンパク質凝集は増大する、方法。
【請求項１３】
ステップ１２（ｂ）は、前記リボソーム待機時間が減少するようにコドンを修飾するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質凝集を減少させるための方法であって、
前記方法は：
（ａ）請求項９〜１１のいずれか１項に記載の、タンパク質凝集を予測するための方法を実施するステップ；並びに
（ｂ）力及び／又は待機時間を変化させている間にタンパク質のアミノ酸配列を保存する同義コドンを用いて、コドンを修飾するステップ
を含み、
前記タンパク質凝集は減少する、方法。
【請求項１５】
ステップ１４（ｂ）は、前記リボソーム待機時間が増大するようにコドンを修飾するステップを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記遺伝子は原核生物に由来し、前記リボソームの３’末端ｒＲＮＡテールは１６Ｓ  ｒＲＮＡテールである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記遺伝子は真核生物に由来し、前記リボソームの３’末端ｒＲＮＡテールは１８Ｓ  ｒＲＮＡテールである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法のステップのうちの１つ又は複数を実施するようプログラムされた、コンピュータ可読媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１月６日出願の米国仮特許出願第６２／１００，４１７号の利益を主張するものであり、上記仮特許出願の全内容は、参照によってその全体が本出願に援用される。
【背景技術】
【０００２】
翻訳は、折り畳まれて機能性タンパク質となる特定のポリペプチドを有機体が産生する、生物学的プロセスである［参考文献１、１３］。異種タンパク質合成は、翻訳を用いて、宿主有機体において通常産生されないタンパク質を産生する［参考文献２、３］。これらのタンパク質は、バイオ燃料産生から農業及びバイオ医薬品にまで及ぶ広範な産業用途にわたって使用される。残念なことに、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の産生有機体において未修飾外来遺伝子を翻訳する試みは、所望のタンパク質の合成をわずかしか、又は全くもたらさない場合が多い［参考文献１、２］。同定されている問題のうちのいくつかは、翻訳の不良、最適でないリボソーム結合部位（ＲＢＳ）、ＲＢＳ及び開始コドンの間隔、フレームシフト、早期終了、及びタンパク質の折り畳みの誤りによって引き起こされるタンパク質凝集である［参考文献１、２］。タンパク質収率の最大化に関しては、ある程度の期間にわたって詳細に研究されてきたが、根底にあるプロセス、及びタンパク質収率に対する翻訳伸長の効果は解明されていない。長年にわたって、低いタンパク質収率の主要な原因は単に、コドンバイアス、及び希少なアミノアシルｔＲＮＡ（ａａ‐ｔＲＮＡ）に関する希少なコドンのコーディングであると考えられていた［参考文献１、２、３］。最近の実験によるエビデンスは、低いタンパク質収率が、同等に重要な多数の追加の因子に起因し得ることを示唆している［参考文献４、５、６、７］。
【０００３】
タンパク質収率を決定するための現行の「基準（ｓｔａｎｄａｒｄ）」は、シャープ（Ｓｈａｒｐｅ）のコドン適合指数（ｃｏｄｏｎ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ：ＣＡＩ）である[参考文献８]。シャープのアルゴリズムは、高発現遺伝子からのコドンの使用を、ＣＡＩを算出するための基準として利用する。高発現遺伝子として同様のコドン使用を有する遺伝子は、比較的高いスコアを示し、ＣＡＩは０〜１となる。ＣＡＩは、有機体のコドンバイアスに対するある遺伝子のコドンバイアスの指標として使用できる。典型的には、異種遺伝子のコドンバイアスを、産生有機体の高発現遺伝子のコドンバイアスに向かって修正することによって、収率を最適化する。残念なことに、ＣＡＩのみを用いた最適化は、機能する場合としない場合とがある[参考文献１、３]。
【０００４】
低いタンパク質収率、又はタンパク質収率一般の決定要因は、コドンバイアス及び希少なｔＲＮＡの利用可能性だけでなく、同等に重要であり得る追加の因子に由来し得ることが、参考文献４、５、６、７の実験から示唆される。例えば、参考文献７からのリボソームプロファイリングデータは、１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端ヌクレオチドの抗シャイン‐ダルガノ（ａｎｔｉ‐Ｓｈｉｎｅ‐Ｄａｌｇａｒｎｏ：ａＳＤ）配列が、翻訳伸長中にｍＲＮＡと相互作用することによって、リボソームを「休止（ｐａｕｓｅ）」させることを示唆している。リーら（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．）[参考文献６]は、コドン使用／ｔＲＮＡ存在量とリボソーム翻訳速度との間に相関をほとんど観察しなかった。リーら（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．）は、翻訳伸長からの上記収率が、ｍＲＮＡのシャイン‐ダルガノ（ＳＤ）様配列におけるリボソームの休止と高い相関を有すること、及び３’末端１６Ｓ  ｒＲＮＡテールのａＳＤが、リボソームのｍＲＮＡ翻訳「速度（ｓｐｅｅｄ）」に影響を及ぼすことを提示している。
【０００５】
理論によって束縛されるものではないが、本開示の主題は、リボソームの休止が観察されるゼロ読み取りフレームに対してリボソームが物理的にわずかに変位するという仮説に関する。変位により、リボソームは次のａａ‐ｔＲＮＡの獲得により長い時間を必要とする。自由エネルギ周期性シグナル[参考文献９、１０、１１]及びｔＲＮＡ存在量情報[参考文献１２]からの二次効果を用いて、この部分的変位の概念を組み込んだ大腸菌に関する新規の翻訳モデルを構築できる。インビボ実験によると、このモデルは、相当な予測及び最適化の力を有するようである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、背景技術の課題を解決するためのものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示の主題は、タンパク質収率及び凝集を予測及び最適化するための、翻訳伸長の自由エネルギベースモデルを提供する。一態様では、ある遺伝子の翻訳に関してタンパク質収率を予測するための方法が提供され、本方法は：（ａ）タンパク質をコードするｍＲＮＡのコーディング領域の各コドンにおけるリボソーム待機時間を決定するステップであって、上記ステップは、各コドンのサイクル数を決定するステップを含み、上記サイクル数は、ｔＲＮＡ存在量、リボソーム変位量、及び上記ｍＲＮＡと上記リボソームの３’末端ｒＲＮＡテールとの間の結合からの力の関数である、ステップ；並びに（ｂ）上記コーディング領域全体の複数のコドンにわたる総サイクル数を決定するステップを含み、上記コーディング領域全体の複数のコドンにわたる上記総サイクル数は、タンパク質収率と相関する。
【０００８】
別の態様では、ある遺伝子の翻訳に関してタンパク質収率を予測するための方法が提供され、本方法は：（ａ）タンパク質をコードするｍＲＮＡのコーディング領域の各コドンにおけるリボソーム待機時間を決定するステップであって、上記ステップは、各コドンのサイクル数を決定するステップを含み、上記サイクル数は、ｔＲＮＡ存在量、リボソーム変位量、及び上記ｍＲＮＡと上記リボソームの３’末端ｒＲＮＡテールとの間の結合からの力の関数である、ステップ；（ｂ）翻訳ボトルネックプロットをプロットするステップであって、上記プロットは、サイズＮコドンのスライディングウインドウ内のサイクルの合計を含む値を含む、ステップ；並びに（ｃ）上記翻訳ボトルネックプロットにおける最大合計を決定するステップを含み、上記翻訳ボトルネックプロットにおける上記最大合計は、タンパク質収率と相関する。
【０００９】
別の態様では、ある遺伝子の翻訳に関してタンパク質収率を予測するための方法が提供され、本方法は：（ａ）タンパク質をコードするｍＲＮＡのコーディング領域の各コドンにおけるリボソーム待機時間を決定するステップであって、上記ステップは、各コドンのサイクル数を決定するステップを含み、上記サイクル数は、ｔＲＮＡ存在量、リボソーム変位量、及び上記ｍＲＮＡと上記リボソームの３’末端ｒＲＮＡテールとの間の結合からの力の関数である、ステップ；並びに（ｂ）タンパク質翻訳シミュレーションを実施することによって、あるサイクル数内に翻訳を完了するリボソームの量を決定するステップを含み、あるサイクル数内に翻訳を完了するリボソームの上記量は、タンパク質収率と相関する。
【００１０】
別の態様では、ある遺伝子の翻訳に関してタンパク質収率を上昇させるための方法が提供され、本方法は：（ａ）上述のような、ある遺伝子の翻訳に関してタンパク質収率を予測するための方法のうちのいずれの１つを実施するステップ；並びに（ｂ）上記力及び／又は待機時間を変化させている間に上記タンパク質のアミノ酸配列を保存する同義コドンを用いて、コドンを修飾するステップを含み、上記遺伝子の翻訳に関するタンパク質収率は上昇する。更なる態様では、ステップ（ｂ）は、上記リボソーム待機時間が減少するようにコドンを修飾するステップを含む。更なる態様では、上記リボソーム変位量は、上記遺伝子の種角に略等しい上記遺伝子の位相角を選択することによって最小化される。
【００１１】
別の態様では、ある遺伝子の翻訳に関してタンパク質収率を低下させるための方法が提供され、本方法は：（ａ）上述のような、ある遺伝子の翻訳に関してタンパク質収率を予測するための方法のうちのいずれの１つを実施するステップ；並びに（ｂ）上記力及び／又は待機時間を変化させている間に上記タンパク質のアミノ酸配列を保存する同義コドンを用いて、コドンを修飾するステップを含み、上記遺伝子の翻訳に関するタンパク質収率は低下する。更なる態様では、ステップ（ｂ）は、上記リボソーム待機時間が減少するようにコドンを修飾するステップを含む。
【００１２】
別の態様では、タンパク質凝集を予測するための方法が提供され、本方法は：（ａ）タンパク質をコードするｍＲＮＡのコーディング領域の各コドンにおけるリボソーム待機時間を決定するステップであって、上記ステップは、各コドンのサイクル数を決定するステップを含み、上記サイクル数は、ｔＲＮＡ存在量、リボソーム変位量、及び上記ｍＲＮＡと上記リボソームの３’末端ｒＲＮＡテールとの間の結合からの力の関数である、ステップ；並びに（ｂ）上記コーディング領域全体の複数のコドンにわたる総サイクル数を決定するステップを含み、上記コーディング領域全体の複数のコドンにわたる上記総サイクル数は、タンパク質凝集と相関する。
【００１３】
別の態様では、タンパク質凝集を予測するための方法が提供され、本方法は：（ａ）タンパク質をコードするｍＲＮＡのコーディング領域の各コドンにおけるリボソーム待機時間を決定するステップであって、上記ステップは、各コドンのサイクル数を決定するステップを含み、上記サイクル数は、ｔＲＮＡ存在量、リボソーム変位量、及び上記ｍＲＮＡと上記リボソームの３’末端ｒＲＮＡテールとの間の結合からの力の関数である、ステップ；（ｂ）翻訳ボトルネックプロットをプロットするステップであって、上記プロットは、サイズＮコドンのスライディングウインドウ内のサイクルの合計を含む値を含む、ステップ；並びに（ｃ）上記翻訳ボトルネックプロットにおける最大合計を決定するステップを含み、上記翻訳ボトルネックプロットにおける上記最大合計は、タンパク質凝集と相関する。
【００１４】
別の態様では、タンパク質凝集を予測するための方法が提供され、本方法は：（ａ）タンパク質をコードするｍＲＮＡのコーディング領域の各コドンにおけるリボソーム待機時間を決定するステップであって、上記ステップは、各コドンのサイクル数を決定するステップを含み、上記サイクル数は、ｔＲＮＡ存在量、リボソーム変位量、及び上記ｍＲＮＡと上記リボソームの３’末端ｒＲＮＡテールとの間の結合からの力の関数である、ステップ；並びに（ｂ）タンパク質翻訳シミュレーションを実施することによって、あるサイクル数内に翻訳を完了するリボソームの量を決定するステップを含み、あるサイクル数内に翻訳を完了するリボソームの上記量は、タンパク質凝集と相関する。
【００１５】
別の態様では、タンパク質凝集を増大させるための方法が提供され、本方法は：（ａ）上述のような、タンパク質凝集を予測するための方法のうちのいずれの１つを実施するステップ；並びに（ｂ）上記力及び／又は待機時間を変化させている間に上記タンパク質のアミノ酸配列を保存する同義コドンを用いて、コドンを修飾するステップを含み、上記タンパク質凝集は増大する。更なる態様では、ステップ（ｂ）は、上記リボソーム待機時間が減少するようにコドンを修飾するステップを含む。
【００１６】
別の態様では、タンパク質凝集を減少させるための方法が提供され、本方法は：（ａ）上述のような、タンパク質凝集を予測するための方法のうちのいずれの１つを実施するステップ；並びに（ｂ）上記力及び／又は待機時間を変化させている間に上記タンパク質のアミノ酸配列を保存する同義コドンを用いて、コドンを修飾するステップを含み、タンパク質凝集は減少する。更なる態様では、ステップ（ｂ）は、上記リボソーム待機時間が減少するようにコドンを修飾するステップを含む。
【００１７】
別の態様では、本明細書において開示される方法のうちのいずれが提供され、上記遺伝子は原核生物に由来し、上記リボソームの３’末端ｒＲＮＡテールは１６Ｓ  ｒＲＮＡテールである。別の態様では、本明細書において開示される方法のうちのいずれが提供され、上記遺伝子は真核生物に由来し、上記リボソームの３’末端ｒＲＮＡテールは１８Ｓ  ｒＲＮＡテールである。
【００１８】
更なる態様では、本明細書において開示される方法ステップのうちのいずれの１つ又は複数を実施するようプログラムされた、コンピュータ可読媒体が提供される。
【００１９】
本開示の主題に全体的又は部分的に対処する、本開示の主題の特定の態様について上述したが、説明が進むにつれて、以下で最も良好に説明される付属の実施例及び図面と関連させて考えた場合に、他の態様が明らかになるであろう。
【００２０】
よって、本開示の主題について一般的な用語で説明してきたが、これより、必ずしも正確な縮尺で描画されていない付属の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】平均自由エネルギシグナルのプロット。このシグナルは、長さ１０００ヌクレオチド超の２００個の非フレームシフト大腸菌遺伝子に関する全てのヌクレオチドにおいてハイブリダイゼーションエネルギを算出することによって得られる。
【図２】停止コドン後の平均シグナルのプロット。このシグナルもまた、オープンリーディングフレームの停止コドンの後の、２００個の非フレームシフト大腸菌内因性遺伝子のハイブリダイゼーションエネルギを算出することによって得られる。
【図３】リボソームテールとｍＲＮＡとの間の相互作用。１６Ｓ  ｒＲＮＡ「露出テール（ｅｘｐｏｓｅｄ  ｔａｉｌ）」は、翻訳伸長中にｍＲＮＡと連続的に相互作用し、これに関して、ワトソン・クリック結合からの自由エネルギを算出できる。
【図４】フレームシフト部位、コドン２６におけるｐｒｆＢの翻訳中の、物理的な図示。１６Ｓ「露出テール」のａＳＤは、コドン２６（停止）のＰ部位にあまりに近接して（３ヌクレオチド）結合し、リボソームを＋１リーディングフレームに向けて変位させる「ばね（ｓｐｒｉｎｇ）」を圧縮する。シミュレーションの図示を図５に示す。
【図５】フレームシフト部位、コドン２６におけるｐｒｆＢの翻訳中の、シミュレーションの図示。圧縮されたばねからのエネルギが示されている。このエネルギは、ｍＲＮＡ上のＳＤ様配列と１６Ｓ「露出テール」のａＳＤとの間の結合に起因する自由エネルギから算出される。上記結合は、リボソームを＋１リーディングフレームにおいて最小エネルギへと変位させる「ばね」を圧縮する。
【図６】コドン７０におけるｌａｃＺの翻訳中の、物理的な図示。ａＳＤは、Ｐ部位から８ヌクレオチドの位置に結合し、これにより「弛緩したばね（ｒｅｌａｘｅｄ  ｓｐｒｉｎｇ）」がもたらされ、リボソーム変位がほとんど又は全く起こらない。ａＳＤからＰ部位までの距離は５塩基である。シミュレーションの図示を図７に示す。
【図７】コドン７０におけるｌａｃＺの翻訳中の、シミュレーションの図示。弛緩したばねからのエネルギが示されている。このエネルギは、ｍＲＮＡと１６Ｓ「露出テール」のａＳＤとの間の結合に起因する自由エネルギから算出される。ａＳＤは、Ｐ部位から８ヌクレオチドの位置に結合し、これにより「弛緩したばね」がもたらされ、リボソーム変位がほとんど又は全く起こらない。
【図８】変位されたリボソームと、変位されていないリボソーム。左）変位されていないリボソームの図；Ａ部位は、０リーディングフレームと完璧に整合している。右）０リーディングフレームと＋１リーディングフレームとの間で変位され、不整合が発生した、リボソームの図。Ａ部位は、０リーディングフレームのコドン及び＋１リーディングフレームのコドン両方を認識し、いずれかのリーディングフレームでアミノアシルｔＲＮＡをピックアップできる。この例では、リボソームは、ＡＣＧコドンによってコードされたａａ‐ｔＲＮＡ又はＣＧＧコドンによってコードされたａａ‐ｔＲＮＡのいずれかをピックアップできる。
【図９】翻訳伸長中のｐｒｆＢのリボソーム変位プロット。変位は、フレームシフト部位（コドン２６）において＋２変位単位（１ヌクレオチド）に向かってシフトし、これは＋１フレームシフトイベントを示す。
【図１０】翻訳伸長中のｐｒｆＢのリボソーム待機時間プロット。コドン２６における１４７サイクルという長いリボソーム待機時間は、リボソームがフレームシフト部位において停止していることを示す。これは、リボソーム変位（図４、９）がリボソーム待機時間に寄与することを示す。
【図１１】翻訳伸長全体を通したｐｒｆＢの翻訳ボトルネックプロット。リボソームのフレームシフトによる、フレームシフト部位における長いリボソーム待機時間は、コドン２６において３２９のボトルネックを生成する。
【図１２】メインアルゴリズムのフローチャート。このメインアルゴリズムは、Ａ部位のコドン２で開始される。力は自由エネルギシグナルから計算される。確率サイクルは、各コドンにおけるリボソームの変化を決定するために実行される。ａａ‐ｔＲＮＡをピックアップした後、リボソームは、フレームシフトした後に転座するか、又は規則的なインフレーム転座を実施する。停止コドンが認識された場合、メインアルゴリズムはリボソーム翻訳シミュレーションを終了する。
【図１３】ｌａｃＺのリボソーム変位プロット。このプロットは、上記アルゴリズムが各サイクルを通して進行し、各コドン位置のリボソーム変位に関する値を出力するに従って生成される。
【図１４】ｌａｃＺのリボソーム待機時間プロット。このプロットは、リボソームが各コドン位置のａａ‐ｔＲＮＡを「ピックアップ（ｐｉｃｋ  ｕｐ）」するために必要なサイクル数として生成される。
【図１５】翻訳伸長中のｌａｃＺの翻訳ボトルネックプロット。２０コドンのスライディングウインドウサイズを用いた部分的合計を示す。ボトルネック（ＢＮＩ）は、コドン８３９において１７４である。
【図１６】テール：ｍＲＮＡ間隔に基づく自由エネルギの変化。（ａ）自由エネルギ値（ΔＧｎ）は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ露出テールと、Ａ部位の中央から５塩基だけ離間したｍＲＮＡとの間の結合から算出される。（ｂ）自由エネルギ値（ΔＧｎ‐１）は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ露出テール：Ａ部位の中央から６塩基だけ離間したｍＲＮＡ、又はΔＧｎ結合位置から上流に１塩基分のシフトから算出される。（ｃ）自由エネルギ値（ΔＧｎ＋１）は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ露出テールと、Ａ部位の中央から４塩基だけ離間したｍＲＮＡとの間の結合、又はΔＧｎ結合位置に対して下流に１塩基分のシフトから算出される。自由エネルギの算出は、付録Ａにおいて説明される。
【図１７】コドン７０においてｌａｃＺを翻訳するリボソームのシミュレーション。コドン７０では、ａＳＤは、Ｐ部位から８ヌクレオチドのｍＲＮＡに結合し（図５）、これは「弛緩したばね」をもたらす。これは、Ａ部位の中央付近に位置する最小エネルギによってモデル化される。したがって、上記力の大きさは小さく、リボソームの変化をほとんど又は全くもたらさない。連続エネルギ関数を算出するために使用された自由エネルギΔＧｎ‐２、ΔＧｎ‐１、ΔＧｎ、ΔＧｎ＋１及びΔＧｎ＋２が右下に表示される。
【図１８】リボソーム変位が０の場合のＡ部位。Ａ部位は、０リーディングフレームのコドンと完璧に整合している。従ってＡ部位は、全てのコドンｃｃｇを認識し、＋１又は‐１リーディングフレーム内のコドンを全く認識しない。これは、ビュー曲線ＶＣ０がそのピークであり、ＶＣ‐１及びＶＣ＋１がゼロであることによってモデル化される。
【図１９】リボソーム変位が１（１／２ヌクレオチドに等しい）の場合のＡ部位。Ａ部位は、１／２ヌクレオチド分だけ０リーディングフレームと不整合であり、従ってコドンｃｃｇのうちの半分と、＋１リーディングフレームのコドンｃｇｇのうちの半分とを認識する。これは、ビュー曲線ＶＣ０がＶＣ＋１と等しいことによってモデル化される。
【図２０】アルゴリズムの模式図。ｍＲＮＡと１６Ｓ  ｒＲＮＡ「露出テール」との間の結合は、連続自由エネルギシグナルを用いてモデル化され、上記自由エネルギシグナルから力を算出できる。確率サイクルは、確率Ｐ‐１、Ｐ０、Ｐ‐１、Ｐｎ、ビュー曲線、ａａ‐ｔＲＮＡ存在量、及びリボソームが次のａａ‐ｔＲＮＡの送達を待機している間にリボソームを変位させるための力を使用する。上記ａａ‐ｔＲＮＡの送達後、メインアルゴリズムは上記リボソームを３塩基３だけ下流に移動させ、確率サイクルが再開される。
【図２１】２００個の大腸菌遺伝子の平均自由エネルギから観察される周期性シグナル［９］。
【図２２】ｐｒｆＢの翻訳シミュレーション。１６Ｓ「露出テール」のａＳＤは、コドン２６（停止）のＰ部位にあまりに近接して（３ヌクレオチド）結合し、リボソームを最小エネルギへと変位させる「ばね」を圧縮する。
【図２３】コドン７０におけるｌａｃＺの翻訳シミュレーション。ａＳＤは、Ｐ部位から８ヌクレオチドの位置に結合し、これにより最小エネルギに近い「弛緩したばね」がもたらされ、リボソーム変位がほとんど又は全く起こらない。
【図２４】野生型（上側の曲線）、コドンバイアス最適化済み（中央の曲線）、及びモデル最適化済み（下側の曲線）の、リボソーム変位プロット。これらの最適化はいずれも、変位を低減する。
【図２５】野生型及び最適化済み遺伝子のＧＳＴ活性。モデル最適化済み変異体は、野生型よりも約１１．６％高いＧＳＴ活性をもたらす。ＣＡＩ最適化済み変異体は、野生型より４％高いＧＳＴ活性をもたらす。ＧＳＴ活性の単位は（ΔＡＢＳ３４０ｎｍ／分）／ＡＢＳ５６２ｎｍである。誤差バーは、１つの標準偏差を示す。ＣＡＩはコドン適合指数である。ＴＤは総変位である。
【図２６】ａｄｈ（アルコールデヒドロゲナーゼ、ＣＬＪＵ＿Ｃ１１８８０、クロストリジウム・リュングダリー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）ＤＳＭ  １３５２８由来）の野生型（上側の曲線）、及びモデル最適化済み（下側の曲線）の、リボソーム変位プロット。
【図２７】野生型及びモデル最適化遺伝子のＡＤＨ活性。最適化済み変異体は、野生型よりも４５％高い活性をもたらす。ＡＤＨ活性の単位は（ΔＡＢＳ３４０ｎｍ／分）／ＡＢＳ５６２ｎｍである。誤差バーは、１つの標準偏差を示す。ＣＡＩはコドン適合指数である。ＴＤは総変位である。
【図２８】ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ‐ＨｉｓＣプラスミドへの遺伝子の挿入。Ａ）サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．）から入手可能なオリジナルのｐＢＡＤ／Ｍｙｃ‐Ｈｉｓ  Ｃプラスミド。Ｂ）ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ‐Ｈｉｓ  Ｃプラスミドにクローニングされた遺伝子。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
これより、本開示の主題について、付属の図面を参照してより完全に説明する。付属の図面においては、本開示の主題のいくつか（ただし全てではない）が示されている。全体を通して、同様の番号は同様の要素を指す。本開示の主題は、多数の異なる形態で実現でき、本明細書に記載の実施形態に限定されるものとして解釈してはならない。寧ろこれらの実施形態は、適用される法的要件を本開示が満たすように提供されるものである。実際には、本明細書に記載の本開示の主題の多数の修正形態及び他の実施形態が、以上の説明及び関連する図に提示された教示の利益を得た、本開示の主題が属する技術分野の当業者に想起されるだろう。従って、本開示の主題は、開示されている具体的な実施形態に限定されないこと、並びに修正形態及び他の実施形態が添付の請求項の範囲に含まれることが意図されていることを理解されたい。
【００２３】
タンパク質合成の原理
翻訳は、ｍＲＮＡをコーディング配列として用いて、機能性タンパク質がアミノ酸から合成されるプロセスである。翻訳の基本的な要素は、リボソーム、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、アミノ酸である。リボソームは、ｍＲＮＡをデコードすることによって上記アミノ酸をポリペプチド鎖に会合させ、上記ポリペプチド鎖は次に機能性タンパク質へと折り畳まれる。ｔＲＮＡは、アミノ酸がポリペプチド鎖に結合しているリボソームに、次のアミノ酸を送達するために使用される。翻訳は、開始、伸長、及び終了という３つの段階に分割される。開始中、リボソームサブユニットは伸長を開始するための複合体を形成する。伸長中、リボソームは、ｍＲＮＡを５’から３’方向に転座させる。この段階において、リボソームはアミノアシル‐ｔＲＮＡ（ａａ‐ｔＲＮＡ）を用いて、成長するポリペプチド鎖を合成する。終了は、リボソームが停止コドンにおいて放出因子を認識し、解離する時点である。
【００２４】
開始前、リボソームはその３０Ｓサブユニット及び５０Ｓサブユニットへと解離する。開始中、リボソームの３０Ｓサブユニットは、開始コドンから上流のシャイン‐ダルガノ配列においてｍＲＮＡに付着する［２３］。シャイン‐ダルガノ（ＳＤ）配列は、１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端抗シャイン‐ダルガノ（ａＳＤ）に対するワトソン・クリック補体である［２３］。一旦結合すると、３０Ｓサブユニット‐ｍＲＮＡ複合体は更に、開始因子１（ＩＦ１）、開始因子３（ＩＦ３）、及びイニシエータｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ‐ｔＲＮＡ）によって安定化される。ＩＦ１及びＩＦ３は、ｍＲＮＡ及びイニシエータｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ‐ｔＲＮＡ）を３０ＳのＰ部位に配置することによって３０Ｓの会合をガイドし、また５０Ｓとａａ‐ｔＲＮＡとの早期会合も防止する。ｆＭｅｔ‐ｔＲＮＡは、Ｎ‐ホルミル‐メチオニンによって一意に荷電されるイニシエータｔＲＮＡであり、Ｎ‐ホルミル‐メチオニンは、イニシエータｔＲＮＡが既に翻訳されたポリペプチドのＣ末端と結合するのを防止する。これにより、Ｎ‐ホルミル‐メチオニンが常にポリペプチドの始点にあることが保証される。開始因子２（ＩＦ２）は、３０Ｓ開始前複合体に結合し、イニシエータｔＲＮＡ上のホルミル基を認識する。これは更に、３０Ｓ：イニシエータｔＲＮＡ相互作用を安定させる。マーシャルら（Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）［２４］は、３０Ｓ開始複合体に対するＩＦ２の結合が、回転構成において７０Ｓ開始複合体を形成するための３０Ｓサブユニットに対する５０Ｓサブユニットの接合を加速させることを示した。彼らの実験はまた、ＩＦ２によるＧＴＰ加水分解が、７０Ｓリボソームを古典的な（回転していない）構成に戻すことも示した。ＩＦ２及びＧＴＰの加水分解が存在しない場合、リボソームは伸長段階に入らない［２４］。次に開始因子及びＧＤＰは、リボソーム：ｍＲＮＡ：開始‐ｔＲＮＡ複合体から解離し、翻訳は、最初のアミノアシル‐ｔＲＮＡ（ａａ‐ｔＲＮＡ）の受容の準備ができた状態である伸長段階に入る。
【００２５】
伸長は、リボソームがｍＲＮＡ上の独立した各コドンを読み取る、開始後のステップである。これらのコドンは、ポリペプチド鎖を形成する異なる複数のアミノ酸を特定する。リボソームは３つの部位：Ｅ、Ｐ及びＡを含有する。Ｅ部位は、非荷電‐ｔＲＮＡがリボソームから出て行く場所である。Ｅ部位の隣がＰ部位であり、ここでは、ａａ‐ｔＲＮＡに付着したアミノ酸がポリペプチド鎖に付加される。Ａ部位のコドンは、次のａａ‐ｔＲＮＡを翻訳複合体に動員することを決定する。全体として、伸長は３つの主要なステップ：ａａ‐ｔＲＮＡ結合、ペプチド転移、及び転座からなる。
【００２６】
第１のステップであるａａ‐ｔＲＮＡ結合は、ａａ‐ｔＲＮＡと、Ａ部位に位置するコドンとの間の、コドン‐アンチコドン相互作用によって駆動される。これを発生させるために、リボソームは、正しい同種ヌクレオチドトリプレット（アンチコドンと呼ばれる）を含有するａａ‐ｔＲＮＡがＡ部位に入るまで停止する。しかしながらこの相互作用は、標準的なワトソン・クリック塩基対形成に緩やかにしか従わず、これは、単一のａａ‐ｔＲＮＡが２つ以上のコドンを認識できることを意味する。この相互作用はまた、伸長因子Ｔｕ（ＥＦ‐Ｔｕ）によっても支援され、これは、ａａ‐ｔＲＮＡ及びＧＴＰに結合することによって３元複合体を形成する。この複合体がリボソームと相互作用すると、ＧＴＰは加水分解されてＧＤＰとなる。これはＥＦ‐Ｔｕとリボソームとの間の親和性を低下させ、ＥＦ‐Ｔｕを解放してａａ‐ｔＲＮＡをＡ部位に残す。ａａ‐ｔＲＮＡを有するＥＦ‐Ｔｕ／ＧＴＰ複合体はまた、正しいアミノ酸が付加されていることの校正においても役立つ。
【００２７】
伸長の第２の主要なステップは、ペプチド転移、又はペプチド結合の形成である。このステップの間、Ａ部位のａａ‐ｔＲＮＡは、Ｐ部位に位置するペプチジル‐ｔＲＮＡと相互作用する。ａａ‐ｔＲＮＡ上のアミノ基は求核剤として作用し、Ｐ部位のペプチド残基とｔＲＮＡ部分との間のエステル結合のカルボニル基を「攻撃する（ａｔｔａｃｋ）」。これにより、ペプチジル‐ｔＲＮＡからａａ‐ｔＲＮＡへのペプチド結合の転移が生じる。ペプチド転移から得られた自由エネルギは、伸長の次のステップである転座の駆動を補助する。
【００２８】
伸長の第３の最後のステップは、転座である。ここではＰ部位の脱アシル化ｔＲＮＡがＥ部位を介して放出され、新たに形成されたＡ部位のペプチジルｔＲＮＡがＰ部位にシフトする。これにより、Ａ部位は空のままとなり、次のａａ‐ｔＲＮＡが結合する準備が整う。この転座プロセスは、伸長因子Ｇ（ＥＦ‐Ｇ）によって触媒される。ＥＦ‐Ｔｕと同様に、ＥＦ‐ＧはＧＴＰと複合体を形成し、リボソームに結合する。転座すると、ＧＴＰは加水分解されてＧＤＰとなり、ＥＦ‐Ｇとリボソームとの間の親和性が低下し、ＥＦ‐Ｇがリボソームから放出される。要するに、転座は、３塩基（１コドン）の長さの制御された動きで、リボソームが開始コドンから下流のフレームの下流に移動することからなる。
【００２９】
翻訳の終了は、３つの終了コドン：ＵＡＡ、ＵＡＧ又はＵＧＡのうちの１つの認識を伴う［２５、２６、２７、９、１７、３６］。終了コドンは他のリーディングフレームに見られることが多く、これは転座中の偶発的なフレームシフトによって誤ったタンパク質の終了が起こることが多いことを意味することに留意することが重要である。終了コドンはいずれのアミノ酸をコードしない代わりに、放出因子（ＲＦ１、ＲＦ２、ＲＦ３）の結合を誘発する。ＲＦ１は、終了コドンＵＡＡ及びＵＡＧに対して特異的であるが、ＲＦ２はＵＡＡ及びＵＧＡに対して特異的である。ＲＦ３は、ＥＦ‐Ｔｕ及びＥＦ‐Ｇと同様に、ＧＴＰ依存性の様式で作用する。これらの放出因子は、Ａ部位におけるａａ‐ｔＲＮＡの相互作用をシミュレートし、通常のペプチド転移ではなくペプチジル‐ｔＲＮＡエステル結合を破壊して、Ｐ部位からポリペプチド鎖を取り外す［２６、２７］。次にＧＴＰは加水分解されてＧＤＰとなり、放出因子がリボソームから放出される。続いて脱アシル化‐ｔＲＮＡが放出され、リボソームは５０Ｓサブユニット及び３０Ｓサブユニットに分割されて、翻訳のプロセスが終了する。
【００３０】
リーディングフレームは、ｍＲＮＡのタンパク質コーディング領域におけるコドンの３つの塩基組成物に基づいてヌクレオチド配列を分析するための考え方である。コード配列に対して単一のヌクレオチドを付加又は排除すると、リーディングフレームがシフトする。リーディングフレームの変化は、ポリペプチドの一次配列を大きく変化させることができ、早期終了を引き起こすことができる。遺伝暗号は、（開始コドンによって設定される）固定開始位置からの、３個のヌクレオチドの１個のアミノ酸への翻訳を必要とするため、コドンを読み取ることができる３個のリーディングフレームが存在する。開始コドンによって定義されるリーディングフレームは、０リーディングフレームと呼ばれる。０フレームから１塩基だけ下流のフレームが＋１リーディングフレームととなり、上流に１塩基だけシフトしたフレームを‐１リーディングフレームと呼ぶ。ゲノム中のほとんどのコーディング領域は、１つのリーディングフレームで１つのタンパク質をコードするが、重複（内部）遺伝子［２８、２９、３０］やプログラムドフレームシフト等の例外が観察されている［３１、３２、３３、３４］。
【００３１】
フレームシフトは、リボソームが、開始コドンに対して、０フレームから２つの他のフレームのうちの１つにシフトするメカニズムである。これは、元のリーディングフレームと比較して異なるアミノ酸配列を生成する。２つの一般的なフレームシフトのタイプ：＋１フレームシフト及び‐１フレームシフトが存在する。これらのイベントは自然界ではほとんど発生しないが、いくつかの遺伝子は埋め込まれたフレームシフトを含有するように進化した。これらは「プログラムド（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ）」フレームシフトと呼ばれる。＋１プログラムドフレームシフトの例は、大腸菌のｐｒｆＢである［３１、３３］。プログラムドフレームシフトの現象は、翻訳中にリボソームの適切なリーディングフレームを維持するメカニズムを明らかにする可能性があるため、集中的に研究されている。大腸菌におけるモデル遺伝子ｐｒｆＢは、リーディングフレームにおける特定のシフトに関連する配列特徴を決定するために詳細に研究されている。
【００３２】
開始及び伸長中のタンパク質収率の決定
サリスら（Ｓａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）［３５］は、２００９年の刊行物において、翻訳開始の広範な分析を提供している。彼らは、開始速度を決定する４つの分子相互作用が：（１）リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ハイブリダイゼーションに対する１６Ｓ  ｒＲＮＡ；（２）開始コドン間隔に対する１６Ｓ  ｒＲＮＡ結合部位；（３）１６Ｓ  ｒＲＮＡ結合部位又はスタンバイ部位のいずれかを閉鎖するＲＮＡ二次構造；及び（４）開始コドンに対するｆＭｅｔ‐ｔＲＮＡの結合であると議論している。これらの最初の３つの決定要因は、翻訳開始のモデル化に不可欠であり、本明細書において議論される。第４の決定因子は、開始コドンに対する第１のｔＲＮＡの結合を伴い、開始複合体を安定化させ、伸長への遷移を支援する。
【００３３】
翻訳伸長のモデルの開発は数十年前に遡る。最近になって、翻訳に関する様々な予測指標及び最適化方法が登場している［３６、３７、３８、３９、４０、４１］。予測指標及び最適化方法は大半が伸長ステップに焦点を当てており、この伸長ステップ中には、リボソームがｍＲＮＡを下方に転座させながら、ｔＲＮＡが、成長するポリペプチド鎖にアミノ酸を転移させる。
【００３４】
２０１４年、ヴーら（Ｖｕ  ｅｔ  ａｌ．）［４２］は、３’末端ｒＲＮＡテールの抗シャイン‐ダルガノ配列とｍＲＮＡ転写との間の結合からの二次自由エネルギの効果に基づく、更に別のタンパク質収率の決定要因を明らかにした。ヴーら（Ｖｕ  ｅｔ  ａｌ．）［４２］は、これらの二次自由エネルギ効果に起因する、リボソーム変位と呼ばれる新たな因子について記載している。リボソーム変位は、Ａ部位と通常の「ゼロ」リーディングフレームとの間の不整合であり、これは伸長中に「累積される（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ）」ものとして提案されている。即ち不整合は転座後にリセットされない。このパラダイムは、リボソームが伸長中の「記憶（ｍｅｍｏｒｙ）」を有することを示唆している。
【００３５】
ヴーら（Ｖｕ  ｅｔ  ａｌ．）［４２］は、彼らのモデルを確立するための基礎として、十分に確立されたプログラムドフレームシフト遺伝子ｐｒｆＢ及びｄｎａＸを使用した。彼らは、転座後にリボソームをｍＲＮＡに対して変位させる「ばね様」反力を計算した。彼らはこの変位を、二次リボソーム移動と呼んでいる。転座は一次移動である。上記ばね様反力は、物理の基本法則（Δエネルギ＝‐力・Δ距離）を用いて、１６Ｓ  ｒＲＮＡ露出テールとｍＲＮＡとの間のエネルギ的相互作用の変化を算出することによってモデル化される。ヴーら（Ｖｕ  ｅｔ  ａｌ．）［４２］はこのリボソームのばね様応答を、リボソームばねモデルと呼んでいる。リボソームばねモデルは、ｔＲＮＡ存在量、リボソーム変位、及びばね様反力を畳み込むことにより、伸長中の二次リボソーム移動をシミュレートする。シュルツベルガーら（Ｓｈｕｌｔｚａｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）［４３］、及びサリスら（Ｓａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）［３５］もまた、開始時の最適なＳＤ‐開始コドン間隔を調査する際に、「剛性ばね（ｒｉｇｉｄ  ｓｐｒｉｎｇ）」のように作用するリボソームについて言及している。ティノコら（Ｔｉｎｏｃｏ  ｅｔ  ａｌ．）［４４］もまた「ばね状の（ｓｐｒｉｎｇｙ）」１６Ｓ  ｒＲＮＡ  ａＳＤ：ＳＤ螺旋が‐１フレームシフトを生成することを提示している。ヴーら（Ｖｕ  ｅｔ  ａｌ．）［４２］は次にリボソームばねモデルを用いて、異種タンパク質産生を最適化した。ばね様力は、自由エネルギ正弦波シグナルの「位相（ｐｈａｓｅ）」の変化として実現できる。同義コドンを用いてある遺伝子のコドンを変化させることにより、この力を最小化してリボソーム変位を低減し、タンパク質収率を改善できる。ヴーら（Ｖｕ  ｅｔ  ａｌ．）［４２］は、ばね様力及びリボソーム変位を最小化する自由エネルギ正弦波シグナルの「位相」について記載している。上記位相は「種角（ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｎｇｌｅ）と呼ばれ、これはその名称が暗示しているように、各有機体独自のものである。変位を最小化することによって、ヴーら（Ｖｕ  ｅｔ  ａｌ．）［４２］は２つの遺伝子：日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）由来のグルタチオンＳ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、及びクロストリジウム・リュングダリー由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）に関するタンパク質産生を最適化した。彼らのモデルによって最適化されたＧＳＴは、ＣＡＩ最適化済みＧＳＴにおける野生型に対する４％の増加に比べて、野生型に対する１１．６％の増加を示した。ＡＤＨ活性は、野生型に比べて、最適化済み遺伝子に関しては４５％高かった。リボソームばねモデルは、各コドンにおいて「待機時間（ｗａｉｔ‐ｔｉｍｅ）」パラメータを生成するために、リボソーム変位、ｔＲＮＡ存在量、及びばね様反力を考慮する。これらの待機時間パラメータを最小化することは、タンパク質を効率的に産生するために重要である［４２］。
【００３６】
タンパク質収率及び凝集を予測及び最適化する方法
効果がない異種タンパク質合成は、コドンバイアスや希少コドンが原因とされることが多かった。新たな実験によるエビデンスは、コドンバイアスだけが翻訳不良の唯一の原因ではないかも知れないことを示唆している。本開示の主題は、タンパク質収率及び凝集を予測及び最適化するための、翻訳伸長の自由エネルギベースモデルを提供する。このモデルでは、３’末端ｒＲＮＡテールの抗シャイン‐ダルガノ配列とｍＲＮＡとの間の結合からの二次自由エネルギの効果、ｔＲＮＡ存在量、及びリボソーム変位を考慮する。上記モデル及びソフトウェアにより、タンパク質収率を上昇又は低下させるため、及びタンパク質凝集を増大又は減少させるための、遺伝子の最適化が可能となる。以下の実施例に記載されるように、上記モデルの予測及び最適化精度は、ＧＳＴ（日本住血吸虫由来の２６ｋＤａグルタチオンＳ‐トランスフェラーゼ）をコードする３つのモデル遺伝子及び複数のｍＲＮＡ変異体を最適化して発現させることによって評価した。最適化済み遺伝子のタンパク質収率は、野生型のレベルからの上昇を示した。日本住血吸虫由来のグルタチオンＳ‐トランスフェラーゼ及びクロストリジウム・リュングダリーＤＳＭ  １３５２８由来のアルコールデヒドロゲナーゼの最適化は、以下の実施例において議論する。
【００３７】
従って一態様では、ある遺伝子の翻訳に関してタンパク質収率を予測するための方法が提供され、本方法は：（ａ）タンパク質をコードするｍＲＮＡのコーディング領域の各コドンにおけるリボソーム待機時間を決定するステップであって、上記ステップは、各コドンのサイクル数を決定するステップを含み、上記サイクル数は、ｔＲＮＡ存在量、リボソーム変位量、及び上記ｍＲＮＡと上記リボソームの３’末端ｒＲＮＡテールとの間の結合からの力の関数である、ステップ；並びに（ｂ）上記コーディング領域全体の複数のコドンにわたる総サイクル数を決定するステップを含み、上記コーディング領域全体の複数のコドンにわたる上記総サイクル数は、タンパク質収率と相関する。
【００３８】
別の態様では、ある遺伝子の翻訳に関してタンパク質収率を予測するための方法が提供され、本方法は：（ａ）タンパク質をコードするｍＲＮＡのコーディング領域の各コドンにおけるリボソーム待機時間を決定するステップであって、上記ステップは、各コドンのサイクル数を決定するステップを含み、上記サイクル数は、ｔＲＮＡ存在量、リボソーム変位量、及び上記ｍＲＮＡと上記リボソームの３’末端ｒＲＮＡテールとの間の結合からの力の関数である、ステップ；（ｂ）翻訳ボトルネックプロットをプロットするステップであって、上記プロットは、サイズＮコドンのスライディングウインドウ内のサイクルの合計を含む値を含む、ステップ；並びに（ｃ）上記翻訳ボトルネックプロットにおける最大合計を決定するステップを含み、上記翻訳ボトルネックプロットにおける上記最大合計は、タンパク質収率と相関する。
【００３９】
別の態様では、ある遺伝子の翻訳に関してタンパク質収率を予測するための方法が提供され、本方法は：（ａ）タンパク質をコードするｍＲＮＡのコーディング領域の各コドンにおけるリボソーム待機時間を決定するステップであって、上記ステップは、各コドンのサイクル数を決定するステップを含み、上記サイクル数は、ｔＲＮＡ存在量、リボソーム変位量、及び上記ｍＲＮＡと上記リボソームの３’末端ｒＲＮＡテールとの間の結合からの力の関数である、ステップ；並びに（ｂ）タンパク質翻訳シミュレーションを実施することによって、あるサイクル数内に翻訳を完了するリボソームの量を決定するステップを含み、あるサイクル数内に翻訳を完了するリボソームの上記量は、タンパク質収率と相関する。
【００４０】
別の態様では、ある遺伝子の翻訳に関してタンパク質収率を上昇させるための方法が提供され、本方法は：（ａ）上述のような、ある遺伝子の翻訳に関してタンパク質収率を予測するための方法のうちのいずれの１つを実施するステップ；並びに（ｂ）上記力及び／又は待機時間を変化させている間に上記タンパク質のアミノ酸配列を保存する同義コドンを用いて、コドンを修飾するステップを含み、上記遺伝子の翻訳に関するタンパク質収率は上昇する。更なる態様では、ステップ（ｂ）は、上記リボソーム待機時間が減少するようにコドンを修飾するステップを含む。更なる態様では、上記リボソーム変位量は、上記遺伝子の種角に略等しい上記遺伝子の位相角を選択することによって最小化される。
【００４１】
別の態様では、ある遺伝子の翻訳に関してタンパク質収率を低下させるための方法が提供され、本方法は：（ａ）上述のような、ある遺伝子の翻訳に関してタンパク質収率を予測するための方法のうちのいずれの１つを実施するステップ；並びに（ｂ）上記力及び／又は待機時間を変化させている間に上記タンパク質のアミノ酸配列を保存する同義コドンを用いて、コドンを修飾するステップを含み、上記遺伝子の翻訳に関するタンパク質収率は低下する。更なる態様では、ステップ（ｂ）は、上記リボソーム待機時間が減少するようにコドンを修飾するステップを含む。
【００４２】
タンパク質凝集は、最適でないリボソーム翻訳速度［１１７］に起因する折り畳みの誤り［１１７、１１９、１２０］によって引き起こされることが知られている。また、特定のタンパク質コーディング領域は、適切な折り畳みのために異なるタイミングを必要とすること知られている［１１８］。従って、重要なコーディング領域において翻訳速度を遅くすることにより、タンパク質凝集が低減されると演繹できる。従って別の態様では、タンパク質凝集を予測するための方法が提供され、本方法は：（ａ）タンパク質をコードするｍＲＮＡのコーディング領域の各コドンにおけるリボソーム待機時間を決定するステップであって、上記ステップは、各コドンのサイクル数を決定するステップを含み、上記サイクル数は、ｔＲＮＡ存在量、リボソーム変位量、及び上記ｍＲＮＡと上記リボソームの３’末端ｒＲＮＡテールとの間の結合からの力の関数である、ステップ；並びに（ｂ）上記コーディング領域全体の複数のコドンにわたる総サイクル数を決定するステップを含み、上記コーディング領域全体の複数のコドンにわたる上記総サイクル数は、タンパク質凝集と相関する。
【００４３】
別の態様では、タンパク質凝集を予測するための方法が提供され、本方法は：（ａ）タンパク質をコードするｍＲＮＡのコーディング領域の各コドンにおけるリボソーム待機時間を決定するステップであって、上記ステップは、各コドンのサイクル数を決定するステップを含み、上記サイクル数は、ｔＲＮＡ存在量、リボソーム変位量、及び上記ｍＲＮＡと上記リボソームの３’末端ｒＲＮＡテールとの間の結合からの力の関数である、ステップ；（ｂ）翻訳ボトルネックプロットをプロットするステップであって、上記プロットは、サイズＮコドンのスライディングウインドウ内のサイクルの合計を含む値を含む、ステップ；並びに（ｃ）上記翻訳ボトルネックプロットにおける最大合計を決定するステップを含み、上記翻訳ボトルネックプロットにおける上記最大合計は、タンパク質凝集と相関する。
【００４４】
別の態様では、タンパク質凝集を予測するための方法が提供され、本方法は：（ａ）タンパク質をコードするｍＲＮＡのコーディング領域の各コドンにおけるリボソーム待機時間を決定するステップであって、上記ステップは、各コドンのサイクル数を決定するステップを含み、上記サイクル数は、ｔＲＮＡ存在量、リボソーム変位量、及び上記ｍＲＮＡと上記リボソームの３’末端ｒＲＮＡテールとの間の結合からの力の関数である、ステップ；並びに（ｂ）タンパク質翻訳シミュレーションを実施することによって、あるサイクル数内に翻訳を完了するリボソームの量を決定するステップを含み、あるサイクル数内に翻訳を完了するリボソームの上記量は、タンパク質凝集と相関する。
【００４５】
別の態様では、タンパク質凝集を増大させるための方法が提供され、本方法は：（ａ）上述のような、タンパク質凝集を予測するための方法のうちのいずれの１つを実施するステップ；並びに（ｂ）上記力及び／又は待機時間を変化させている間に上記タンパク質のアミノ酸配列を保存する同義コドンを用いて、コドンを修飾するステップを含み、上記タンパク質凝集は増大する。更なる態様では、ステップ（ｂ）は、上記リボソーム待機時間が減少するようにコドンを修飾するステップを含む。
【００４６】
別の態様では、タンパク質凝集を減少させるための方法が提供され、本方法は：（ａ）上述のような、タンパク質凝集を予測するための方法のうちのいずれの１つを実施するステップ；並びに（ｂ）上記力及び／又は待機時間を変化させている間に上記タンパク質のアミノ酸配列を保存する同義コドンを用いて、コドンを修飾するステップを含み、タンパク質凝集は減少する。更なる態様では、ステップ（ｂ）は、上記リボソーム待機時間が減少するようにコドンを修飾するステップを含む。
【００４７】
別の態様では、本明細書において開示される方法のうちのいずれが提供され、上記遺伝子は原核生物に由来し、上記リボソームの３’末端ｒＲＮＡテールは１６Ｓ  ｒＲＮＡテールである。別の態様では、本明細書において開示される方法のうちのいずれが提供され、上記遺伝子は原核生物に由来する。本開示の主題の範囲を限定するものではないが、本明細書が開示する方法のいずれは、以下を含むがこれらに限定されない原核生物由来の遺伝子に適用可能であり得る：アシネトバクター、アクチノバチルス、アクチノマイセス・ピオゲネス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アエロモナス・ハイドロフィリア（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ）、アルカリ大便菌（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆｅｃａｌｉｓ）、アリゲラ・ウレトラリス（Ａｌｉｇｅｌｌａ  ｕｒｅｔｈｒａｌｉｓ）、アルテロモナス・プトリアシエンス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｒｉａｃｉｅｎｓ）、アルテロモナス・プトリフシエンス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｒｉｆｕｃｉｅｎｓ）バクテリオデス・ジスタソニス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）、バクテリオデス・フラギラ（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌａ）、バクテリオデス・メラミノゲニカス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ  ｍｅｌａｍｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ）、バクテリオデス・オバトゥス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ  ｏｂａｔｕｓ）、バクテリオデス・テタイオミシオン（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｍｉｃｉｏｎ）、バクテリオデス・ウニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）、カンピロバクター、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カプノサイトファガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ＣＤＣ群Ｉｖｃ、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、シトロバクター・フルエンジー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｕｅｎｄｉｉ）、クロストリジウム・ディフィクレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｌｅ）、クロストリジウム・ヒストリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・リュングダリー、クロストリジウム・ペルフィンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・セプチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｅｐｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ソーデリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｏｒｄｅｌｌｉ）、クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・ジプテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）、コリネバクテリウム・シュードドイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｄｏｉ）、大腸菌、大腸菌Ｏ１５７‐Ｈ７、大腸菌‐βラクタマーゼ陽性、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクター・クロエカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏｅｃａｅ）、エンテロバクター・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｃａｌｉｓ）、ユーバクテリウム・レンタム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｎｔｕｍ）、フラボバクテリウム・メニンギオセプチカム（Ｆｌ��ｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｉｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム・ミニンギオ（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｎｉｎｇｉｏ）、ヘモフィリア・パラインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、ヘモフィリス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、ヘモフィルス・アフロフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ａｐｈｒｏｐｈｉｌｕｓ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、クレブシエラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、クレブシエラ・リノスクレロマチス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｒｈｉｎｏｓｃｌｅｒｏｍａｔｉｓ）、レジオネラ・ミクドリエア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｍｉｃｄｌｉｅａ）、レジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、ロイコノストック乳酸（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｌａｃｔｉｃ）、ロイコノストック・メサンテリオダス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓａｎｔｅｒｉｏｄａｓ）、リステリア・ムライ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｕｒｒａｙｉ）、ミーマ（Ｍｉｍａ）、マイコバクテリウム・アヴィウム・イントラセルラリ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉ）、マイコバクテリウム・フラベセンス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、マイコバクテリウム・ゴルドニアエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｏｒｄｏｎｉａｅ）、マイコバクテリウム・テラ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｅｒｒａ）種、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｅｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ）、ナイセリア・ゴナーレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア・メニンギジチス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ）、ナイセリア・シッカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｉｃｃａ）、ノカルジア・ブラシリエンシス（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、シュードモナス・セパチア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｔｉａ）（株Ｉ）、シュードモナス・セパチア（株ＩＩ）、サルモネラ・コレラスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ）、サルモネラ・ズブリン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｄｕｂｌｉｎ）、サルモネラ・ミュンヘン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｕｅｎｃｈｅｎ）、サルモネラ・パラチフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、日本住血吸虫、セラティア・オデリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｅｒｉｆｅｒａ）、シゲラ・ボイジー（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、シゲラ・ジセンテリアエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラ・フェルキシネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆ���ｌｘｎｅｒｉ）、シゲラ・ソネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｒｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉ．）、スタフィロコッカス・サフロフィ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｈｒｏｐｈｙ）、ストレプトコッカスα（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｐｈａ）、ストレプトコッカスβ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｅｔａ）（Ｃ群）、ストレプトコッカスβ（Ｆ群）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）、ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカスＢ群（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｇｒｏｕｐ  Ｂ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、トルロプシス・グロブラタ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｇｌｏｂｒａｔａ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、トレポネーマ・パリデュム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、トレポネーマ・ペルテヌエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、トレポネーマ・ファゲセニス（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｈａｇｅｓｅｎｉｓ）、トレポネーマ・レフリゲンス（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｒｅｆｒｉｇｅｎｓ）、ビブロ・パルヘン（Ｖｉｂｒｏ  ｐａｒｕｈｅｎ）、及びエルシニア・エンテロリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｌｉｔｉｃａ）。
【００４８】
翻訳開始［１２４］及び伸長［１２１、１２２、１２３］中に、真核生物において１８ＳテールがｍＲＮＡと相互作用することが知られている。従って１８Ｓテールを真核生物モデルに使用できる。よって別の態様では、本明細書において開示されている方法のいずれが提供され、上記遺伝子は真核生物に由来し、上記リボソームの３’末端ｒＲＮＡテールは１８Ｓ  ｒＲＮＡテールである。用語「真核生物（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ）」は、有核細胞又は有機体を指す。本開示の主題の範囲を限定するものではないが、本明細書において開示されている方法のいずれは、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞、動物細胞及び下等真核生物細胞を含むがこれらに限定されない真核有機体由来の遺伝子に適用可能である。用語「下等真核生物細胞（ｌｏｗｅｒ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）」は、酵母及び糸状菌を含む。酵母及び糸状菌としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピキア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピキア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピキア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピキア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）、ピキア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピキア・オプンティアエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピキア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピキア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピキア・グエルクム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピキア・ピペリ（ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピキア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）ピキア種（ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、フザリウム・グレミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎ���ｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）。ピキア種、任意のサッカロマイセス種、ハンゼヌラ・ポリモルファ、任意のクルイベロミセス種、カンジダ・アルビカンス、任意のアスペルギルス種、トリコデルマ・リーゼイ、クリソスポリウム・ルクノウエンス、任意のフザリウム種、及びニューロスポラ・クラッサ。
【００４９】
更なる態様では、本明細書において開示される方法ステップのうちのいずれの１つ又は複数を実施するようプログラムされた、コンピュータ可読媒体が提供される。いずれの好適なコンピュータ使用可能媒体を、本発明のソフトウェア態様のために使用してよい。コンピュータ使用可能又はコンピュータ可読媒体は例えば、限定するものではないが、電子、磁気、光学、電磁気、赤外線又は半導体のシステム、装置、デバイス又は伝播媒体であってよい。コンピュータ可読媒体は、一時的及び／又は非一時的な実施形態を含むことができる。コンピュータ可読媒体のより具体的な例（非限定的なリスト）としては、以下のうちのいくつか又は全てが挙げられる：１つ若しくは複数のワイヤを有する電気的接続、ポータブルコンピュータディスケット、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、消去可能プログラマブル読み出し専用メモリ（ＥＰＲＯＭ若しくはフラッシュメモリ）、光ファイバ、ポータブルコンパクトディスク読み出し専用メモリ（ＣＤ‐ＲＯＭ）、光学記憶デバイス、インターネット若しくはイントラネットをサポートしているもの等の伝送媒体、又は磁気記憶デバイス。なお、コンピュータ使用可能又はコンピュータ可読媒体は、紙、又はプログラムが印刷される別の好適な媒体でさえあってよい。というのは上記プログラムを例えば、上記紙又は他の媒体の光学走査によって電気的に捕捉した後、好適な様式でコンパイル、解釈、又はその他の処理を必要に応じて実施し、続いてコンピュータメモリに記憶させることができるためである。本文書の文脈において、コンピュータ使用可能又はコンピュータ可読媒体は、命令実行システム、装置若しくはデバイスによって、又は命令実行システム、装置若しくはデバイスに接続されて使用するためのプログラムを、内包する、記憶する、通信する、伝播する、又は移送することができる、いずれの媒体であってよい。
【００５０】
一般的な定義
本明細書において具体的な用語を採用するが、これらは一般的かつ説明的な意味でのみ使用されるものであり、限定を目的とするものではない。そうでないことが定義されていない限り、本明細書において使用される全ての技術及び科学用語は、本記載の主題が属する技術分野の当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。
【００５１】
長年にわたる特許法の慣例に従い、用語「ある（ａ、ａｎ）」及び「上記、前記（ｔｈｅ）」は、特許請求の範囲を含む本出願において使用される場合、「１つ又は複数（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」を指す。従って例えば、「ある被験体（ａ  ｓｕｂｊｅｃｔ）」への言及は、文脈が明らかに逆でない限り（例えば「複数の被験体（ａ  ｐｌｕｒａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ）」）、複数の被験体を含む。
【００５２】
本明細書及び特許請求の範囲全体を通して、用語「備える、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「備える、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、文脈によってそうでないことが必要とされている場合を除いて、非排他的な意味で使用される。同様に、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及びその文法的な変形は、非限定的なものであることが意図されており、従って、あるリスト内の項目の列挙は、列挙された上記項目を置換できる又は列挙された上記項目に追加できる他の同様の項目を排除するものではない。
【００５３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲の目的のために、そうでないことが指示されていない限り、量、サイズ、寸法、比率、形状、処方、パラメータ、パーセンテージ、数量、特徴及び他の数値を表す、明細書及び特許請求の範囲において使用される全ての数は、用語「約（ａｂｏｕｔ）」がその値、量又は範囲と共に現れていない場合であっても、あらゆる場合において、用語「約」で修飾されているものとして理解されるものとする。従って、反対のことが指示されていない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲に記載の数的パラメータは正確でなく、また正確である必要がないが、許容誤差、変換係数、丸め、測定誤差等、及び当業者に公知の他の因子を反映して、本開示の主題によって得ようとしている所望の特性に応じて、おおよそのもの、及び／又はより大きい若しくは小さいものであってよい。例えば用語「約」は、ある値について言及する場合、明記されている量から、いくつかの実施形態では±１００％、いくつかの実施形態では±５０％、いくつかの実施形態では±２０％、いくつかの実施形態では±１０％、いくつかの実施形態では±５％、いくつかの実施形態では±１％、いくつかの実施形態では±０．５％、及びいくつかの実施形態では±０．１％の変動を包含することを意味し、従って変動は、本開示の方法の実施、又は本開示の組成物の採用に適当なものである。
【００５４】
更に、用語「約」は、１つ又は複数の数又は数的範囲に関連して使用される場合、範囲内の全ての数を含む全てのこのような数を指すものとして理解されるものとし、また該範囲を、記載されている数値を超えて、及び記載されている数値未満に拡張することによって修飾する。端点による数的範囲の記載は、該範囲内に包含される全ての数、例えば全ての整数、及び小数（例えば１〜５という記載は１、２、３、４及び５並びに小数、例えば１．５、２．２５、３．７５、４．１等を含む）、並びに該範囲内のいずれの範囲を含む。
【実施例】
【００５５】
以下の実施例は、本開示の主題の代表的実施形態の実施のために当業者にガイダンスを提供するために含まれているものである。本開示及び当該技術分野の技術の一般的なレベルに照らして、当業者は、以下の実施例が例示のみを意図したものであること、並びに本開示の主題の範囲から逸脱することなく、多数の変更、修正及び改変を採用できることを理解できる。以下の総合的な記載及び具体的な実施例は、例示のみを目的としたものであり、本発明の方法を実施するための任意の様式における限定として解釈してはならない。
【実施例１】
【００５６】
翻訳伸長のための新たな生物物理学的モデル
周期性自由エネルギシグナルの発見
周期性自由エネルギシグナルは、図１に示すように、翻訳中の１６Ｓ  ｒＲＮＡ３’末端「露出テール」（３’‐ＡＵＵＡＣＣＵＣＣＡＣＵＡＧ‐５’）とｍＲＮＡとの間の平均的なワトソン・クリック結合から観察された［４５、４６］。最も顕著な結合エネルギは、シャイン‐ダルガノ（ＳＤ）配列に結合する「露出テール」の抗シャイン‐ダルガノ（ａＳＤ）に対応する、開始時である。その後、伸長中の「インフレーム（ｉｎ‐ｆｒａｍｅ）」リボソーム転座に対応する、周期性（正弦波様の）結合シグナル（ここで負の自由エネルギは結合を示す）が存在する［４５、４６、４７］。この周期性シグナルのフーリエ変換により、ヌクレオチドあたり１／３サイクルの周波数の顕著なピークが明らかになった［４６、４８］。これは、伸長中に全てのコドンにおいて、露出テールがｍＲＮＡに結合することを示している。しかしながら、停止コドンに到達した後、上記シグナルは迅速に減衰し、これは、図２に示すように、リボソームが翻訳を停止したことを示している。リーら（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．）［４９］のリボソームプロファイリング実験は、伸長中の１６Ｓ  ｒＲＮＡ「露出テール」とｍＲＮＡとの間の連続的相互作用の物理的エビデンスを提供する。ヴァイスら（Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．）［５０］及びラーセンら（Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）［５１］もまた、１６Ｓ  ｒＲＮＡの「露出テール」のａＳＤがｍＲＮＡと結合して、プログラムド翻訳フレームシフトを生成することを示しており；彼らの観察は、伸長中に露出テールがｍＲＮＡと相互作用することを暗示している。リーら（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．）［４９］、ヴァイスら（Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．）［５０］及びラーセンら（Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）［５１］は、伸長中に１６Ｓ  ｒＲＮＡ「露出テール」がｍＲＮＡと相互作用することを示唆する、周期性自由エネルギシグナルに関する裏付け的な物理的エビデンスを提供する。理論に束縛されるものではないが、１６Ｓ  ｒＲＮＡテール：ｍＲＮＡ結合の機能的目的はリボソームを適切なリーディングフレーム内に維持すること、即ち換言すると、上記結合がリーディングフレーム保守の役割を果たすことが提示されている。異種タンパク質翻訳はこの結合を妨害し、従ってリボソームを「変位（ｄｉｓｐｌａｃｅ）」させる。この周期性自由エネルギシグナルは、以下で更に説明するような、翻訳の伸長のための新しい機構的な「ばね」モデルの元になった。
【００５７】
リボソームばねモデル
累積大きさ及び位相法（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  ｍａｇｎｉｔｕｄｅ  ａｎｄ  ｐｈａｓｅ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いた、大腸菌遺伝子ｐｒｆＢに関する自由エネルギシグナルの分析は、フレームシフト部位における自由エネルギの大きさ及び位相両方の変化を示した［４５、５２］。物理の基本法則を用いて、フレームシフト部位においてリボソームに印加される力は、以下のように算出できる：
Δエネルギ＝‐力・Δ距離
これは、フレームシフトを解明して重要な概念であるリボソーム変位を説明する、１６Ｓ  ｒＲＮＡ３’末端：ｍＲＮＡ結合からの二次自由エネルギ効果を用いた、翻訳伸長に関するリボソーム「ばね」モデルの開発の元になった。リボソームばねモデルはまた、異種タンパク質産生用途におけるタンパク質収率の予測及び最適化のためにも開発された［５３］。
【００５８】
リボソームがｍＲＮＡに沿って転座するにつれて、図３に示すように、１６Ｓ  ｒＲＮＡ３’末端はリボソームの上流の塩基と相互作用する［４９、５０、５１］。その結合エネルギが十分に大きく、正常なインフレーム結合に有利な「間違った（ｗｒｏｎｇ）」側にある場合、１６Ｓ  ｒＲＮＡ：ｍＲＮＡ間の結合はばねのように作用し、リボソームに余分な力を印加してリボソームを変位させ得る。極端な場合、フレームシフトが発生し得る。「ばね様」反力は、正弦曲線又は多項式曲線を使用してモデル化される。
【００５９】
例えば、＋１プログラムドフレームシフト遺伝子ｐｒｆＢ（図４）では、１６Ｓ露出テールのａＳＤは、Ｐ部位から３塩基（図４のＵＡＵ）だけ上流のＳＤ様配列に結合し［５０］、‐９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌの結合エネルギが得られる。この結合はＰ部位に近すぎるため、テールとリボソームとの間の距離を圧縮する。上記結合は圧縮ばねのような挙動を示し、これは弛緩時にリボソームを３／４塩基だけ下流に、＋１リーディングフレーム内へと変位させ、このときばねは最小エネルギ状態にある。その後、変位されたリボソームは、＋１フレーム中のアミノアシルｔＲＮＡをピックアップする。これは１塩基のフレームシフトをもたらし、その後に新しいリーディングフレームが維持される［４５、４７、５２］。
【００６０】
対照的に、ｄｎａＸの‐１フレームシフト遺伝子のＳＤは、Ｐ部位から１０塩基だけ離れている［５１］。この結合は「ばね」を伸ばし、リボソームを後方に変位させることによって、「部分的（ｐａｒｔｉａｌ）」フレームシフトを生成する（上記フレームシフトにおいて、リボソームはリーディングフレーム間にあり、τサブユニット及びγサブユニットの両方が生成される）［５１］。ティノコら（Ｔｉｎｏｃｏ  ｅｔ  ａｌ．）［５４］の最近の光ピンセット及び構造的実験により、ａＳＤは、ＳＤ様の配列を持つバネ状螺旋を形成することにより、‐１プログラムドフレームシフトを生成することが示唆されている。
【００６１】
図６は、ｌａｃＺのインフレーム翻訳中の大腸菌１６Ｓ  ａＳＤを示す。上記部位の周囲の結合エネルギは、０〜‐１ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲である。ａＳＤはＰ部位から８ヌクレオチド離間して結合されているため、「ばね」はその「弛緩」状態にある。ゼロリーディングフレームとＡ部位との間のわずかな不整合が起こり得るものの、フレームシフトを引き起こすために十分な「ばね力」は存在しない。興味深いことに、５ヌクレオチドである、伸長中の弛緩したばねのａＳＤとＰ部位との間の間隔はまた、開始時の最適なＳＤ‐開始コドン間隔に相当し、これはチェンら（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）［５５］によって観察された。理論に束縛されるものではないが、ＳＤと開始コドンとの間の「最適な（ｏｐｔｉｍａｌ）」間隔が、翻訳開始部位において５〜８塩基である場合にも、「弛緩したばね」の状態が発生することが提示されている［５５、５６、５７］。このバネの圧縮又は伸張は、ここで提示される概念、即ちリボソーム変位につながる。
【００６２】
リボソーム変位
リボソーム変位は、前述の「ばね」からの力によって引き起こされる、リボソームのＡ部位と正常なリーディングフレームとの間の不整合である（図８参照）。この不整合の距離は、１ヌクレオチド未満である。リボソームが変位する程度は、上記力の大きさ及び０リーディングフレームのコドンのａａ‐ｔＲＮＡ存在量に依存する。例えば、上記力が大きく、かつ０リーディングフレームのコドンのａａ‐ｔＲＮＡ存在量も大きい場合には、変位が緩和される。しかしながら、上記力が大きく、かつ０リーディングフレームのコドンのａａ‐ｔＲＮＡ存在量が小さい場合には、変位は増幅される。より大きく変位したリボソームは、ｔＲＮＡ結合が破壊されるため、２つの利用可能なリーディングフレームの２つのａａ‐ｔＲＮＡ間の選択により長い時間がかかり、従ってリボソームの「待機時間」が増加する。３つのリーディングフレームのコドンのａａ‐ｔＲＮＡ存在量は、リボソーム待機時間に大きな影響を与える。これは、以下に更に記載するように、ｔＲＮＡ結合競合によってモデル化される。変位したリボームは、図８に示すように、＋１又は‐１のリーディングフレームにおいて間違ったａａ‐ｔＲＮＡをピックアップする場合もある。
【００６３】
リボソーム変位は累積的であり、転座後にリセットされない。これは、リボソームが翻訳伸長中の「記憶」を有することを示唆している。リボソームが記憶を有するため、リボソーム変位は、「低速（ｓｌｏｗ）」コドン及び有利な力の使用によってｍＲＮＡ上のいずれの場所に固定できる。「低速」コドンは、低量のａａ‐ｔＲＮＡを使用するコドンである。例えば、リボソームが＋１リーディングフレームへと変位する場合、低速コドンと連結された５’末端（伸びたばねとしてモデル化される）への力により、リボソームを再整合できる。
【００６４】
このモデルでは、１つの変位単位は、１／２ヌクレオチド分の不整合に対応する。２つの変位単位は、全ヌクレオチド分の不整合又はリーディングフレームのシフトである。リボソームの変位は、翻訳伸長中に各コドンにおいて算出される。図９は、＋１プログラムドフレームシフト遺伝子ｐｒｆＢの翻訳に関するリボソーム変位プロットを示す。
【００６５】
翻訳伸長動態
開始後、リボソームは伸長段階に入る。伸長中、リボソームは次のアミノアシル‐ｔＲＮＡ（ａａ‐ｔＲＮＡ）の送達を待機する。ａａ‐ｔＲＮＡの送達後、ペプチド転移が開始され、ポリペプチド鎖はペプチジル‐ｔＲＮＡ（ｐ‐ｔＲＮＡ）からａａ‐ｔＲＮＡへと移送される。これは、ハイブリッド形態へのリボソームの回転をトリガし、これによりｐ‐ｔＲＮＡ及びａａ‐ＲＮＡの受容体末端が変動する。３０Ｓヘッドの回転及びＥＦ‐Ｔｕ：ＧＴＰ複合体の結合は、この変動を安定させ、転座の準備としてリボソームからｍＲＮＡを「ロック解除（ｕｎｌｏｃｋ）」する。ＧＴＰのＥＦ‐Ｔｕ加水分解は、リボソームを３ヌクレオチド分下流に転座させる。理論によって束縛されるものではないが、転座直後、ｍＲＮＡが「ロック解除」されると、１６Ｓ  ｒＲＮＡ「露出テール」がｍＲＮＡに結合してばねのように作用することにより、次のアミノアシル‐ｔＲＮＡの送達を待機する間に、リボソームを＋１又は‐１リーディングフレームにおいて変位させることが提示される。このステージにおいて、リボソームはまた、従来の形態に戻るように回転する。リボソームが変位する程度は、力の大きさ、及びリボソームが次のアミノアシル‐ｔＲＮＡの送達をどれだけ待機しなければならないか（これはａａ‐ｔＲＮＡ存在量に関連する）の関数である。より大きく変位するリボソームは、ｔＲＮＡ結合の破壊によって次のアミノアシル‐ｔＲＮＡをピックアップするまでに、より長い期間待機しなければならない。変位したリボソームはまた、＋１又は‐１リーディングフレームから間違ったアミノアシル‐ｔＲＮＡをピックアップする可能性がより高くなる。リボソームが次のａａ‐ｔＲＮＡをピックアップした後、リボソームはペプチド転移に入り、このサイクルが反復される。
【００６６】
理論によって束縛されるものではないが、このばね機構は、プログラムドフレームシフトの場合を除いて、天然の遺伝子を翻訳する際に適切なリーディングフレーム内にリボソームを保持するよう作用することが提示される。当然のことながら、この機構の目的は、転座から生成される「ノイズ（ｎｏｉｓｅ）」を低減することである。即ち転座はリボソームを常に正確に３ヌクレオチドだけ移動させるわけではなく、およそ３ヌクレオチド±１ヌクレオチド未満だけ移動させる。この「ノイズ」は、リボソームを転座させるために加水分解エネルギを運動エネルギに変換することによるエントロピーによるものである。異種遺伝子の翻訳は、「正常に進化した（ｎｏｒｍａｌｌｙ  ｅｖｏｌｖｅｄ）」１６Ｓ  ｒＲＮＡレール：ｍＲＮＡ結合を破壊し、これは、変位したリボソームをもたらす場合があり、これは待機時間を増大させ、ボトルネックを生成し、又はフレームシフトを引き起こす。ｐｒｆＢ及びｄｎａＸに見られるもののようなプログラムド翻訳フレームシフト部位が存在し［５０、５１、５４、５８、５９］、これらの効率は、上述のリボソーム相互作用に依存する。プログラムド翻訳フレームシフトの背後にある上記機構［５３、５４］は、正常な翻訳伸長中のリボソーム動態に直接関連する。
【００６７】
リボソーム  待機時間
各コドンにおけるリボソーム「待機時間」は、ばねからの力、リボソーム変位、及びｔＲＮＡ存在量の関数として算出される。上記モデルは、翻訳伸長中の各コドンにおけるリボソーム「待機時間」を計算する。「待機時間」の出力は、リボソームが次のａａ‐ｔＲＮＡを担持するためにかかる時間の測定値としての「サイクル」の単位であり、以下で更に説明される。図１０は、フレームシフト遺伝子ｐｒｆＢのリボソーム「待機時間」プロットを示す。リボソームは、「変位（ｄｉｓｐｌａｃｅ）」されると、フレームシフト部位（コドン２６）において「停止（ｐａｕｓｅ）」する。リーら（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．）［４９］もまた、リボソームが、ＳＤ：ａＳＤ結合によってｐｒｆＢのＳＤ様配列において「停止」することを提示していたが、彼らはこの停止の生物物理学的機序を提示していない。
【００６８】
総待機時間は、各コドンにおける全てのリボソーム待機時間の合計である。総待機時間は、ある遺伝子の翻訳効率のインジケータとして使用できる。
【００６９】
翻訳ボトルネック
総待機時間は、タンパク質収率の良好な「全体的（ｇｌｏｂａｌ）」予測因子であるが、「局所的（ｌｏｃａｌ）」予測因子指数は、より良好な推定因子となり得る。ｍＲＮＡは複数のリボソームによって同時にタンパク質へと翻訳されるため、局所的に近接して密集している複数の「低速」翻訳領域は、遺伝子全体にわたって分散している領域を妨害するよりも、収率に関して有害となる可能性がある。２つの遺伝子は同一の全サイクルを有することができるが、異なる「低速」翻訳密集部位を有することができる。これは「翻訳ボトルネック（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋ）」又は「リボソーム渋滞（ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｔｒａｆｆｉｃ  ｊａｍ）」と呼ばれる。局所的翻訳ボトルネック指数を計算するために、２０コドン（即ちｍＲＮＡ上のリボソームのおおよそのフットプリント［６７］）のサイズの合計スライディングウインドウを使用した。リボソーム「待機時間」をこのウインドウ内で合計し、図１１に示すような翻訳ボトルネックプロット上にプロットした。次のこのウインドウを１つのコドンへと進め、合計を再計算して、次の値としてプロットした。渋滞の原理により、ある遺伝子の翻訳効率について、翻訳の最低速領域によってボトルネックが形成されることが明示されている。従って翻訳ボトルネックプロット（図１１）の最大ピーク（ＢＮＩ）を、遺伝子の翻訳効率を決定するための収率予測因子指数として使用した。この最大ピークは、翻訳中の最低速領域を表す。ＢＮＩは、ボトルネック指数（ｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋ  ｉｎｄｅｘ）の略であり、これは最低速のリボソーム渋滞の位置を示す。翻訳ボトルネックプロット及びＢＮＩを算出するための計算については以下で説明する。ＢＮＩは、ある翻訳ボトルネックプロットにおける最大合計に等しい。ボトルネックはまた、開始及び終了中にも存在する。しかしながらこれらは上記モデルにおいて自動的に計算される。開始及び終了におけるボトルネックを手動で付加することによって、タンパク質収率の予測を改善できる。
【００７０】
遺伝子最適化
理論によって束縛されるものではないが、最も豊富なａａ‐ｔＲＮＡを用いて遺伝子の変位をゼロに近づけ、ｔＲＮＡ到着時間を最大化すると、リボソーム待機時間及び翻訳ボトルネックが低下し、従ってタンパク質収率が上昇すると考えられる。０に近い変位は、Ａ部位がゼロリーディングフレームに近接して整合することを保証する。これは、遺伝子の位相角を「種角」付近に保持しながら最も豊富なａａ‐ｔＲＮＡをコードするコドンを選択することによって、達成できる［５３］。これにより、転座中に最小限の「ばね」の圧縮又は伸張が得られ、従って力及び変位が最小化される。このように最適化すると、最も豊富なｔＲＮＡを使用し、変位を最小化することによってｔＲＮＡ結合精度を最大化することで、リボソームの速度が上昇する。その結果、リボーム待機時間及び翻訳ボトルネックは翻訳伸長全体を通して低減される。従って総リボソーム待機時間及びＢＮＩも低下することになる。これらの概念を組み込んだ遺伝子設計は、アミノ酸配列を保存しながら同義コドンを使用して遺伝子配列を変更することによって行われる。逆に、タンパク質産生が「あまり最適でなく（ｌｅｓｓ  ｏｐｔｉｍａｌ）」なるように、遺伝子を改変できる。「毒性（ｔｏｘｉｃ）」タンパク質の経路最適化及び産生において潜在的な用途を有するタンパク質収率の低減は、発生し得るフレームシフトを回避するために、０から更に遠く、ただし‐１と＋１との間に変位を保持することによって達成できる。これにより、各コドンにおけるリボソーム待機時間を増大させる。
【００７１】
この方法は、ａａ‐ｔＲＮＡ存在量プールに過剰な負荷がかからず、かつこれが枯渇しない場合、低いｍＲＮＡ転写レベルにおいて実現可能である。しかし、高いｍＲＮＡ転写レベルでは、単一のｔＲＮＡ又は単一のｔＲＮＡセットを使用するのではなく、（同一のアミノ酸をコードする）多くの異なるｔＲＮＡの間に作業負荷を拡散することが最善である。これは、未荷電から荷電までのｔＲＮＡの「再荷電」速度に関係する［６０、６１、６２、６３］。リボソームの変位を回避するために、複数のｔＲＮＡにわたって作業負荷を分散しながら、種角に近接した状態を維持することが依然として必要となる。
【００７２】
４５の異なるｔＲＮＡ種を用いて２０のアミノ酸をコードする６１のコドンが存在する［６４］。これは、アミノ酸が複数のａａ‐ｔＲＮＡをコードする複数のコドンを有することを暗示している。例えば、セリンは４個の異なるセリン‐ｔＲＮＡをコードする６個のコドンを有する。これは、クリックら（Ｃｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．）［６５］によるウォブル現象において説明されている。しかしながら、全てのコドンが最も豊富なｔＲＮＡをコードするわけではない。例えば、バリンは、３つのバリン‐ｔＲＮＡ（ｖａｌ１、ｖａｌ２ａ、ｖａｌ２ｂ）をコードする４つのコドン（ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、ＧＵＵ）を有する［６４］。ＧＵＵのみが３つのｔＲＮＡ全てをコードし、「最も豊富なｔＲＮＡをコードするコドン」と見做される。ＧＵＡ及びＧＵＧはｖａｌ１をコードし、ＧＵＣはｖａｌ２ａ及びｖａｌ２ｂをコードする。ｔＲＮＡ  ｖａｌ１は、３つのバリン‐ｔＲＮＡの中で最も豊富である。２番目に豊富なコドンはＧＵＡ及びＧＵＧであり、ｔＲＮＡ存在量情報は、ドングら（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）［６４］で確認できる。表１は、アミノ酸、コドン、ｔＲＮＡ及びコドンに対するｔＲＮＡの存在量を列挙する。コドンが２個以上のｔＲＮＡをコードする場合、各ｔＲＮＡの存在量の合計が使用される。即ちバリンコドンＧＵＵのｔＲＮＡ存在量は、ｖａｌ１、ｖａｌ２ａ及びｖａｌ２ｂ  ｔＲＮＡの存在量の合計である。表１はまた、遺伝子最適化におけるコドンの好ましさも示す。複数のｔＲＮＡをコードするアミノ酸のみが列挙されている。
【００７３】
表１  アミノ酸、コドン、同種ｔＲＮＡ、及びコドンあたりのｔＲＮＡの存在量。ｔＲＮＡ存在量及び同種ｔＲＮＡ情報はドングら（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）から得た［６４］。ｔＲＮＡ存在量は、０．７倍／時間を用いて、ドングら（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）の表３から得られる。＊は、最適化のために使用される好ましいコドンを示す。＊＊は２番目に好ましいコドンを示す。
【表１】
2018509930.tif 000002
【００７４】
結論
フレームシフト遺伝子ｐｒｆＢ、ｄｎａＸを明らかにするため、及びｍＲＮＡによる正常な翻訳伸長中のリボソーム動態をシミュレートするために、翻訳伸長に関する新たな計算ベースの生物物理学モデルが開発されている。このモデルは、１６Ｓ  ｒＲＮＡテールのエネルギ的「ばね」及びｍＲＮＡの相互作用、リボソーム変位、並びにａａ‐ｔＲＮＡ存在量を組み込み、これは、関心対象の１つ又は複数の遺伝子に関するリボソーム「待機時間」につながる。これらの待機時間から、翻訳ボトルネックの位置を同定できる。
【００７５】
これは、リボソーム動態及び翻訳効率を評価するための包括的戦略を示す。上記モデルは、タンパク質産生操作のための新たなアプローチを提供する、完全実装型ソフトウェアパッケージ（リボスキャン（ＲｉｂｏＳｃａｎ）（商標））として存在する。このソフトウェアパッケージは、［６６］のウェブサーバとしてリリースされる。上記モデルは、大腸菌における異種タンパク質産生に関して遺伝子を予測及び最適化するために使用でき、異なる産生有機体へと拡張でき、また完全なゲノム配列からのタンパク質合成レベルを予測するための潜在的な用途を有する。
【実施例２】
【００７６】
アルゴリズム及び計算
以下の実施例は、本開示の主題の代表的な実施形態を実施するために、当業者にガイダンスを提供するために含まれているものである。以下の具体例及び等式は、例示のみを目的としたものであり、本発明の方法を実施するための任意の様式における限定として解釈してはならない。
【００７７】
上述のリボソームばねモデル及びリボソーム変位は、ステップサイズ積分器及び「確率サイクル（ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ｃｙｃｌｅ）」アルゴリズムを用いてモデル化される。この確率サイクルアルゴリズムは、アミノアシル‐ｔＲＮＡ（ａａ‐ｔＲＮＡ）をピックアップする確率と畳み込んだ力を用いて、全てのコドンにおいてリボソーム変位及びリボソーム「待機時間」を算出する。リボソームは、全ての「サイクル」において、ステップサイズ関数によって変位され、これは力にステップサイズ定数ΔＴ（ｄＴ）を積算したものとして計算される。サイクルは、リボソームがａａ‐ｔＲＮＡをピックアップしなかった状態として定義される。上記確率サイクルについては、以下で更に説明する。
【００７８】
リボソームに印加される力は、「力は、距離の変化に関するエネルギの負の変化に等しい」という物理の基本法則を用いて算出できる。自由エネルギシグナルは、距離（変位）に関して１６Ｓ  ｒＲＮＡテール：ｍＲＮＡのエネルギ的結合を捕捉し、正弦波又は多項式を用いてモデル化される。従って、ばねからの力は、自由エネルギシグナルの負の導関数として計算される。自由エネルギシグナルの導関数は、距離の変化に関するエネルギの変化を表す。力及び自由エネルギシグナルの算出については、以下で更に説明する。
【００７９】
リボソームが３つのリーディングフレームからａａ‐ｔＲＮＡを「ピックアップ」したことを決定するために、３つの確率を使用する。別の確率を用いて、リボソームがａａ‐ｔＲＮＡをピックアップしておらず、「何もしていない（ｄｏ  ｎｏｔｈｉｎｇ）」ことを決定し、この場合サイクルが再実行される。ａａ‐ｔＲＮＡのピックアップの上記確率は、「ビュー曲線（ｖｉｅｗ  ｃｕｒｖｅ）」、及び上記３つのリーディングフレーム内のコドンに関するａａ‐ｔＲＮＡ存在量の関数として計算される。上記ビュー曲線は、Ａ部位が上記３つのリーディングフレーム内の３つのコドンそれぞれを「認識（ｓｅｅ）」する程度を、リボソーム変位の関数としてモデル化する。ビュー曲線及びａａ‐ｔＲＮＡ存在量の説明については、以下で更に記載する。
【００８０】
リボソームが次のａａ‐ｔＲＮＡをピックアップした後、上記サイクルは終了し、リボソームは次のコドンへと転座する。リボソーム変位は累積的であり、転座後にリセットされない。上記「確率サイクル」アルゴリズムは、停止コドンに到達するまで、全てのコドンにおいて実行される。「メインアルゴリズム（ｍａｉｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）」は、全てのサブアルゴリズムの実行を監督する。アルゴリズムへの入力は：１）１６Ｓ  ｒＲＮＡ「露出テール」からの１３ヌクレオチド；２）開始コドンの前の１５ヌクレオチドを有するｍＲＮＡ配列；及び３）各コドンに関するａａ‐ｔＲＮＡ存在量である。
【００８１】
メインアルゴリズム
上記メインアルゴリズムは、リボソームＡ部位内のコドン２、及びＰ部位内のコドン１を用いて、リボソーム翻訳をシミュレートするステップを開始する。リボソーム変位は０に初期化される。離散自由エネルギシグナルは、正弦波又は多項式によってモデル化された連続自由エネルギシグナルへと変換される。次に上記正弦波又は多項式を、ヌクレオチドの個数を単位とした変位に重ね合わせる。この連続自由エネルギシグナルは、１６Ｓ  ｒＲＮＡテール：ｍＲＮＡ結合の剛性「ばね」を表す。上記ばねからの力は、現在のリボソーム変位において評価されたこの連続自由エネルギシグナルの導関数を得ることによって計算できる。
【００８２】
確率サイクルは、ａａ‐ｔＲＮＡをピックアップする確率と畳み込んだステップサイズ関数を用いて、全てのコドンにおいてリボソーム変位を計算する。即ちリボソームは、全てのサイクルにおいて、ａａ‐ｔＲＮＡをピックアップするまで、ステップサイズ関数によって変位される。ステップサイズ関数は、現在の変位において評価された力にステップサイズΔＴ（ｄＴ）を積算したものとして計算される。リボソーム変異はサイクル毎に変化するため、リボソームに印加される力は同様に変化する。リボソームがａａ‐ｔＲＮＡをピックアップした後、リボソームは：１）リボソームが＋１若しくは‐１リーディングフレームの間違ったａａ‐ｔＲＮＡをピックアップした場合、フレームシフトして転座し、又は２）リボソームが０リーディングフレームのａａ‐ｔＲＮＡをピックアップした場合、次のコドンへの正常なインフレーム転座を実施する。
【００８３】
前のコドンからのリボソーム変位は累積的であり、リセットされない。転座後、新たなリボソーム変位位置における新たな連続自由エネルギシグナルから、新たな力を計算し、当該コドンに対して「確率サイクル」アルゴリズムを実行する。各コドンにおけるリボソーム「待機時間」は、確率サイクルの実行回数によって決定され、待機時間は、リボソームがａａ‐ｔＲＮＡをピックアップするために必要なサイクルの量の指標である。メインアルゴリズムは、リボソーム翻訳シミュレーションを終了する停止コドンが認識されるまで実行される。メインアルゴリズムのフローチャートに関しては、図１２を参照されたい。
【００８４】
確率サイクル
確率サイクルアルゴリズムは、ａａ‐ｔＲＮＡをピックアップする又はピックアップしない確率と畳み込んだステップサイズ関数を用いて、各コドンにおいてリボソーム変位を計算する。リボソームは、全てのサイクルにおいて、以下に示すように、現在のリボソーム変位における力にステップサイズ定数ΔＴ（ｄＴ）を積算したもとしてのステップサイズ関数によって変位される。上記力の算出については以下で更に説明する。ｄＴは、調整可能なパラメータである。上記力は、上記サイクルを再実行する度にリボソーム変位も変化するため、変化する。従って上記力とリボソーム変位とは、互いに共依存している。
【数１】
2018509930.tif 000003
ＲＤＮｅｗは、全てのサイクルにおいて算出される新たなリボソーム変位であり、ＲＤｃｕｒｒｅｎｔは、現在のリボソーム変位であり、ｄＴはステップサイズ定数である。翻訳開始時、ＲＤｃｕｒｒｅｎｔは０へと初期化される。各サイクルの開始時、ＲＤＮｅｗはＲＤｃｕｒｒｅｎｔとなる。ＲＤｃｕｒｒｅｎｔはリセットされず、転座後に同一の値を保持する。
【００８５】
確率サイクルは、リボソームがａａ‐ｔＲＮＡをピックアップするまで反復され、これは４つの確率によってモデル化される。上記４つの確率は、Ｐ‐１、Ｐ０、Ｐ＋１及びＰｎとして定義され、Ｐ‐１、Ｐ０及びＰ＋１はそれぞれ、‐１、０、＋１リーディングフレームのａａ‐ｔＲＮＡをピックアップする確率であり、Ｐｎは、ａａ‐ｔＲＮＡがピックアップされず、サイクルを再反復する確率である。
ａａ‐ｔＲＮＡをピックアップする確率は、「ビュー曲線」（Ａ部位が各リーディングフレームにおいてコドンを「認識」する程度）、及び各リーディングフレームに関するａａ‐ｔＲＮＡ存在量の関数として計算される。より大きく変異するリボソームは、０リーディングフレームにおいてより少ないコドンを「認識」し、また隣接するリーディングフレームにおいてより多くのコドンを「認識」する。所与のリーディングフレームにおいてａａ‐ｔＲＮＡをピックアップする確率は、ビュー曲線によってモデル化されるような、Ａ部位によってコドンのうちのどの程度が認識されるかと、当該コドンに関するａａ‐ｔＲＮＡ存在量との積である。従って、変位されたリボソームは、変位されていないリボソームに比べて、０リーディングフレームのａａ‐ｔＲＮＡをピックアップする見込みが少なく、隣接するリーディングフレームのａａ‐ｔＲＮＡをピックアップする見込みが大きい。ビュー曲線及びａａ‐ｔＲＮＡ存在量については、以下で更に説明する。
【００８６】
「勝利する（ｗｉｎ）」ある確率は、他の確率に対して最も高い値を有することによって定義される。Ｐ０が「勝利する」（即ちリボソームが０リーディングフレームのａａ‐ｔＲＮＡをピックアップする）場合、確率サイクルは終了し、リボソームは次のコドンへのインフレーム転座を行う。Ｐ‐１が勝利する場合、リボソームは‐１リーディングフレームのａａ‐ｔＲＮＡをピックアップし、‐１リーディングフレームへと「フレームシフト」し、新たなリーディングフレームにおいて転座する。Ｐ＋１が勝利する場合、リボソームは＋１リーディングフレームのａａ‐ｔＲＮＡをピックアップし、＋１リーディングフレームへと「フレームシフト」し、新たなリーディングフレームにおいて転座する。この文脈において、「フレームシフト（ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔｉｎｇ）」は、次のコドンに関する確率及び力を、０リーディングフレームに対立するものとして次のリーディングフレームの視点から計算することを意味しており、リボソーム変位は依然として同一のままである。Ｐｎが勝利する場合、リボソームはａａ‐ｔＲＮＡの送達を待機し続け、アルゴリズムは確率サイクルを再実行するため、リボソームは再びステップサイズ関数によって変位され、確率が再計算される。確率サイクルは、Ｐ‐１、Ｐ０又はＰ＋１が勝利するまで続行される。Ｐ‐１、Ｐ０又はＰ＋１は、以下のように、ａａ‐ｔＲＮＡがピックアップされない確率
【数２】
2018509930.tif 000004
を算出した後、これらの確率を１から減算することによって、全てのサイクルｉにおいて「累積的（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅｌｙ）」に計算される：
【数３】
2018509930.tif 000005
ｉは、現在のサイクルに関する指数であり、従って
【数４】
2018509930.tif 000006
は、前のサイクルから計算された確率である。ＮＦは、ｄｔの変化を補償するための正規化定数である。ＶＣ‐１、ＶＣ０、ＶＣ＋１は、それぞれ‐１、０、＋１リーディングフレームのビュー曲線である。ＲＤｃｕｒｒｅｎｔは、現在のリボソーム変位である。ＴＡ‐１、ＴＡ０、ＴＡ＋１は、それぞれ‐１、０、＋１リーディングフレーム内のコドンのａａ‐ｔＲＮＡ存在量である。ビュー曲線及びａａ‐ｔＲＮＡ存在量については、以下で更に説明する。
【００８７】
従って、
【数５】
2018509930.tif 000007
は、以下のように計算でき：
【数６】
2018509930.tif 000008
またＰｎ  は以下のように計算される：
【数７】
2018509930.tif 000009
【００８８】
このようにしてＰｎをモデリングすることは、各リーディングフレームのａａ‐ｔＲＮＡがリボソームのＡ部位への結合に関して競合していることを暗示している。
【００８９】
「確率サイクル」の擬似コード
／／初期条件：
【数８】
2018509930.tif 000010
正規化定数（ＮＦ）＝ｄＴ／０．００４
／／コドン２において確率サイクルを開始
／／ｔＲＮＡをピックアップしない確率を、サイクルの開始時に１に設定する
【数９】
2018509930.tif 000011
／／サイクルを開始する
【数１０】
2018509930.tif 000012
【００９０】
確率サイクルの出力
確率サイクルの出力は、リボソーム変位、及び各コドンにおけるリボソーム待機時間である。従って、ある遺伝子のリボソーム変位のグラフは、図１３に示すようにプロットできる。これはリボソーム変位プロットと呼ばれる。リボソーム待機時間は、上記擬似コードに記載したように、リボソームがａａ‐ｔＲＮＡをピックアップするために必要なサイクル数として算出され、従ってリボソーム待機時間は、リボソーム変位、ａａ‐ｔＲＮＡ存在量、及び力の関数である。ある遺伝子のリボソーム待機時間のグラフもまた、図１４に示すようにプロットできる。
【００９１】
ボトルネックプロット及びボトルネック指数（ＢＮＩ）の計算
（図１４に示すような）リボソーム待機時間を用いて、図１５に示す翻訳ボトルネックプロット及びボトルネック指数（ＢＮＩ）を算出した。翻訳ボトルネックプロット及びＢＮＩは、上で説明したようなリボソーム渋滞の位置を示す。
【００９２】
翻訳ボトルネックプロット及びＢＮＩの算出に使用した計算は、以下の通りである。
【００９３】
ＷＳを、コドンを単位とするスライディングウインドウのウインドウサイズとする。ＷＳは、ｍＲＮＡ上のリボソームのフットプリントの長さに対応し［７０］、これはおよそ２０コドンである。ＰＳｉを、スライディングウインドウにおけるリボソーム待機時間の部分的合計とし、ここでｉは、翻訳ボトルネックプロット上の「コドン位置（ｃｏｄｏｎ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）」である。ＷＴｊを、リボソーム待機時間プロット上のｊ番目のコドンにおけるリボソーム待機時間とする。従って、ｉ番目の位置における部分的合計（ＰＳｉ）は、以下のように計算でき：
【数１１】
2018509930.tif 000013
ここでｉの最大値は、リボソーム待機時間プロットにおける最大コドン位置（又はコドン内の遺伝子の長さ）からウインドウサイズ（ＷＳ）を減算したものである。例えば遺伝子の長さが２００コドンである場合、リボソーム待機時間プロットにおける最大コドン位置は２００コドンである。従ってｉに関する最大値は１８０である。よって上記部分的合計は、コドン位置ｉ＝１からコドン位置ｉ＝１８０まで算出され、ｉ＝１８０における部分的合計は、ｊ＝１８０〜ｊ＝２００のリボソーム待機時間の合計である。コドン位置ｉ＝１８０における部分的合計は、リボソームによる最後の２０コドンの翻訳に関するボトルネックを表す。
【００９４】
ボトルネック指数（ＢＮＩ）は、翻訳ボトルネックプロットの部分的合計の最大値を得ることによって算出される：
ＢＮＩ＝ＭＡＸ（ＰＳｉ）
【００９５】
「ばね状の」１６Ｓ  ｒＲＮＡテールからの力の算出
確率サイクルは、上記力を用いて、「サイクル」毎に変位量を増大させてリボソームを変位させる。物理の基本法則により、力が、距離の変化に関するエネルギの変化と等しいことが明示されている。連続自由エネルギシグナルは、全てのコドンにおける距離（変位）に関して１６Ｓ  ｒＲＮＡテール：ｍＲＮＡのエネルギ的結合を捕捉する。従って上記力は、上記連続自由エネルギシグナルの導関数として計算され、この導関数は、距離の変化に関するエネルギの変化を表す。しかしながら、上記力を算出できる前に、各コドンにおける連続自由エネルギシグナルをまず計算しなければならない。
【００９６】
連続自由エネルギシグナルの算出
連続自由エネルギシグナルは、１６Ｓ  ｒＲＮＡ「露出テール」（３’‐ａｕｕｃｃｕｃｃａｃｕａｇ‐５’）とｍＲＮＡとの間のワトソン・クリック結合の離散自由エネルギから計算される。上記離散自由エネルギシグナルは、上記離散の自由エネルギ値を正弦波又は多項式に対してフィットさせることによって、１つの連続自由エネルギシグナルへと変換できる。正弦波は３つの離散自由エネルギ値（ΔＧｎ‐１、ΔＧｎ、ΔＧｎ＋１）を用い、多項式は５つの離散自由エネルギ値（ΔＧｎ‐２、ΔＧｎ‐１、ΔＧｎ、ΔＧｎ＋１、ΔＧｎ＋２）を用いる。上記自由エネルギ値は、ミシュラら（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．）［６８］に記載の方法を用いて算出される。本明細書において使用する自由エネルギ値は、フライヤーら（Ｆｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）［７１］の自由エネルギモデルから得られたものである。本明細書では、全てのモデル化及び算出は正弦波フィッティングを用いる。多項式フィッティングは、正弦波フィットの代わりに使用できる選択肢である。正弦波フィッティングは、多項式フィッティングと略同一である。
【００９７】
中点及び「テール距離（Ｔａｉｌ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ）」
連続自由エネルギシグナルの中点ΔＧｎは、露出テールが、Ａ部位のコドンの中央塩基から５塩基離れて結合する場合（図１６ａ参照）に算出される自由エネルギである。この距離は「テール距離」と呼ばれ、本モデルのパラメータである。テール距離は、ｐｒｆＢのフレームシフト部位をモデル化することによって導出される。５塩基を超える、又は５塩基未満のいずれの距離は、リボソームをフレームシフトさせず、及び／又はフレームシフト後にリボソームを＋１リーディングフレームにおいてフレームシフトした状態に保持しない。驚くべきことに、この距離は、１６Ｓ  ｒＲＮＡテールの抗シャイン‐ダルガノ配列（３’‐ＵＣＣＵＣＣ‐５’）を、Ｐ部位から５塩基離間させ、これは開始時のシャイン‐ダルガノと開始コドンとの間の最適な間隔に対応する［７２］。上記テール距離は、有機体毎に異なり得ると考えられる。
【００９８】
離散自由エネルギの索引付け
正弦波又は多項式フィッティング法を用いて、離散自由エネルギ値を１つの連続自由エネルギシグナルに変換できる。正弦波フィッティングは、ΔＧｎ‐１、ΔＧｎ及びΔＧｎ＋１という３つの離散自由エネルギ値を用い、多項式フィッティングは、ΔＧｎ‐２、ΔＧｎ‐１、ΔＧｎ、ΔＧｎ＋１及びΔＧｎ＋２という５つの離散自由エネルギ値を用いる。ΔＧｎ‐１は、図１６ｂに示すように、露出テールがΔＧｎ結合位置に対して上流に１塩基シフトした場合に算出される自由エネルギである。この位置では、上記テールは、Ａ部位の中央から６塩基離間している。ΔＧｎ＋１は、図１６ｃに示すように、露出テールがΔＧｎ結合位置に対して下流に１塩基シフトした場合に算出される自由エネルギである。この位置では、上記テールは、Ａ部位の中央から４塩基離間している。ΔＧｎ‐２は、露出テールをΔＧｎ結合位置に対して上流に２塩基、又はＡ部位の中央から７塩基シフトさせることによって算出される自由エネルギである。ΔＧｎ＋２は、露出テールをΔＧｎ結合位置に対して下流に２塩基、又はＡ部位の中央から３塩基離間してシフトさせることによって算出される自由エネルギである。
【００９９】
離散自由エネルギシグナルの正弦波フィッティング及び力の算出
正弦波フィッティングは、離散自由エネルギ値（ΔＧｎ‐１、ΔＧｎ及びΔＧｎ＋１）を用いて、１つの連続自由エネルギシグナルへの変換を行う。記載を簡略化するために、ΔＧｎ‐１、ΔＧｎ及びΔＧｎ＋１をそれぞれＡ、Ｂ及びＣと再命名する。従って連続自由エネルギシグナルは、以下の方法を用いて算出できる。
自由エネルギ値からＤＣ定数を計算する。
【数１２】
2018509930.tif 000014
自由エネルギ値からＤＣ定数を減算する。ＤＣは力の計算に必要ない。
ａ＝Ａ‐ＤＣ
ｂ＝Ｂ‐ＤＣ
ｃ＝Ｃ‐ＤＣ
修正された自由エネルギ値ａ、ｂ及びｃは、ヌクレオチドあたり１／３サイクルの周波数を有する正弦波にフィッティングできる。これは、平均自由エネルギシグナルが、ヌクレオチドあたり１／３サイクルの周波数を有する［７３、７４］ことにより可能である。ａは、以下で定義するように、０°においてフィットされる。ｂは以下で定義するように、正弦曲線対して１２０°位相シフトしてフィットされる。ｃは、以下で定義するように、正弦曲線に対して２４０°位相シフトしてフィットされる。
【数１３】
2018509930.tif 000015
これは３つの等式と２つの未知数（Ｍ及びΦ）を残す。最後の２つの等式は、正弦展開のための以下の三角法の恒等式を用いて展開される：
ｓｉｎ（ｘ＋ｙ）＝ｓｉｎ（ｘ）・ｃｏｓ（ｙ）＋ｃｏｓ（ｘ）・ｓｉｎ（ｙ）
得られた展開された等式を減算すると、以下のようになる：
【数１４】
2018509930.tif 000016
正接展開のための三角法の恒等式：
【数１５】
2018509930.tif 000017
及び上の等式を使用すると、Φは以下のように計算できる：
【数１６】
2018509930.tif 000018
三角法の恒等式：
ｓｉｎ（ｘ）２＋ｃｏｓ（ｘ）２＝１
（５．２２）
及び上の等式を使用すると、Ｍは以下のように計算できる：
【数１７】
2018509930.tif 000019
次に、正弦波フィッティングを用いた連続自由エネルギシグナルを、‐３〜３の変位単位に重ね合わせる：
【数１８】
2018509930.tif 000020
次に上記シグナルを、種角において最小エネルギとするために、及び「テール距離」を補償するためにシフトする。以下の等式は、リボソーム「ばね」のエネルギをリボソーム変位（ＲＤ）の関数としてモデル化する。
【数１９】
2018509930.tif 000021
θｓｐ（ラジアン角）は、「種角」である。大腸菌に関する種角は、‐２３°又は０．４０１ラジアンである。δは、テール距離を補償するためのシフトである。このテール距離は、本明細書中の他の箇所で言及されているように、大腸菌に関して５塩基である。
【数２０】
2018509930.tif 000022
テール距離のシフトは、種角を２、５、８ヌクレオチドではなく３、６、９ヌクレオチド毎に算出したために必要となる。
力は、‐Δエネルギ／Δ距離として算出される。従って上記力は、エネルギ（ＲＤ）の導関数として算出される。従ってリボソーム変位の関数としての力は、以下の通りである：
【数２１】
2018509930.tif 000023
あるいはこの等式は、
【数２２】
2018509930.tif 000024
の位相変位が適用される正弦関数として記述できる：
【数２３】
2018509930.tif 000025
正弦波フィッティングを使用した場合、力（ＲＤ）に関するいずれの等式を確率サイクルの等式において使用して、上記力をリボソーム変位の関数として計算できる。
【０１００】
離散自由エネルギシグナルの多項式フィッティング及び力の算出
次数４の多項式フィッティングを用いて、離散自由エネルギシグナルを１つの自由エネルギシグナルに変換することもできる。このフィッティングは、５つの離散自由エネルギ値：ΔＧｎ‐２、ΔＧｎ‐１、ΔＧｎ、ΔＧｎ＋１及びΔＧｎ＋２を用いる。簡略化するために、ΔＧｎ‐２、ΔＧｎ‐１、ΔＧｎ、ΔＧｎ＋１、ΔＧｎ＋２をそれぞれ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅと呼ぶ。次数４の多項式は、以下の等式を用いて一般化される：
【数２４】
2018509930.tif 000026
従って自由エネルギ値Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは、５つの多項式として表される多項式関数に対してフィットされる：
【数２５】
2018509930.tif 000027
ここでｘは変位を単位とする。自由エネルギ値Ａはｘ＝‐４において多項式にフィットされ、Ｂはｘ＝‐２においてフィットされ、Ｃはｘ＝０においてフィットされ、Ｄはｘ＝２においてフィットされ、Ｅはｘ＝４においてフィットされる。以下の等式は、各自由エネルギ値Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅに関してｘの値を置換することによって導出される。
【数２６】
2018509930.tif 000028
よって、５つの等式及び５つの未知数（ａ０、ａ１、ａ２、ａ３、ａ４）が存在する。５つの係数（ａ０、ａ１、ａ２、ａ３、ａ４）は、以下の行列を用いて解くことができる：
【数２７】
2018509930.tif 000029
自由エネルギ値に対応するｘの値を置換する：
【数２８】
2018509930.tif 000030
この行列式を用いると、以下のようになる：
ａ＝（ＸＴＸ）‐１ＸＴ
従って、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅに関してａ０、ａ１、ａ２、ａ３、及びａ４を解く：
【数２９】
2018509930.tif 000031
ここでＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅはそれぞれ自由エネルギ値ΔＧｎ‐２、ΔＧｎ‐１、ΔＧｎ、ΔＧｎ＋１及びΔＧｎ＋２である。ａ０、ａ１、ａ２、ａ３、及びａ４を解いた後、変位の関数としてのリボソームばねのエネルギは、以下の通りである：
【数３０】
2018509930.tif 000032
ここでτは、種角において最小エネルギとするためのシフト、及びテール距離である。τは：
【数３１】
2018509930.tif 000033
として算出され、θｓｐはラジアン角で表された種角である。
次に力を、‐Δエネルギ／Δ距離として算出する。これは、上記力がエネルギ（ＲＤ）に関する等式の導関数であることを意味している。従ってリボソーム変位の関数として力は、以下の通りである：
【数３２】
2018509930.tif 000034
多項式フィッティングを使用した場合、この等式を確率サイクルの等式において使用して、上記力をリボソーム変位の関数として計算できる。
【０１０１】
エネルギ論及び力の算出の「概観（Ｂｉｇ  Ｐｉｃｔｕｒｅ）」
翻訳中の全てのコドンにおいて、１６Ｓ  ｒＲＮＡ露出テールのａＳＤはｍＲＮＡと結合する。Ｐ部位に対する結合距離は、ばねが圧縮されているか、伸長しているか、又は弛緩しているかを決定する。ａＳＤ（３’‐ＵＣＣＵＣＣ‐５’）をＰ部位から５塩基離間して配置する結合は、弛緩したばねをもたらす（図６参照）。このシミュレーションでは、弛緩したばねは、Ａ部位の中央に近い自由エネルギ信号の最小エネルギを有するものとして示されている（図１７）。最小エネルギに近い力はゼロに近く、従ってリボソーム変位は小さい。上記ａＳＤをＰ部位から５塩基未満離間して配置する結合は、ばねを圧縮させる。上記ａＳＤをP部位から５塩基より離して配置する結合は、ばねを伸長させる。「５塩基」の距離は、ｐｒｆＢのフレームシフト部位のモデル化の際の「テール距離」によって決定した。Φの変化は、Ｐ部位に対するａＳＤの相対結合部位の尺度となる。位相角の変化により、Ａ部位の中央に対する自由エネルギシグナルのシフトがもたらされる。従って最小エネルギはもはやＡ部位の中央付近には配置できず、これにより、上記力によるリボソーム変位が発生する。
【０１０２】
ビュー曲線及びアミノアシル‐ｔＲＮＡ存在量テーブル
確率サイクルは、ビュー曲線及びアミノアシル‐ｔＲＮＡ存在量を用いて、３つのリーディングフレームからアミノアシル‐ｔＲＮＡをピックアップする確率を算出する。リーディングフレームが３つ存在するため、３つのビュー曲線及び３つのａａ‐ｔＲＮＡ存在量が存在する。上記３のビュー曲線は、ＶＣ‐１、ＶＣ０及びＶＣ１である。上記３つのａａ‐ｔＲＮＡ存在量は、−１、０、及び＋１リーディングフレームにそれぞれ対応する、ＴＡ‐１、ＴＡ０及びＴＡ＋１である。より変位が大きいリボソームは、０リーディングフレームにおいてより少ないコドン、及び隣接するリーディングフレームにおいてより多くのコドンを認識することになる。これにより、リボソームが０リーディングフレームのａａ‐ｔＲＮＡをピックアップする見込みが低下し、隣接するリーディングフレームのａａ‐ｔＲＮＡをピックアップする見込みが増加する。
【０１０３】
ビュー曲線
ビュー曲線は、Ａ部位が「認識」する各リーディングフレームのコドンの程度をモデル化する。例えばＡ部位が０リーディングフレームと完璧に整合されている（リボソーム変位が０である）場合、Ａ部位は０リーディングフレームの全てのコドンを認識し、‐１又は＋１リーディングフレームのコドンのいずれの部分も認識しない（図１８）。変位されたリボソームは、０リーディングフレーム及び隣接するリーディングフレーム両方のコドンを認識する。例えばリボソーム変位が１である場合、リボソームは、０フレームのコドンの５０％、及び＋１リーディングフレームのコドンの５０％を認識する。これは、リボソーム変位が１である場合にＶＣ０＝ＶＣ＋１であるという事実によってモデル化される（図１９参照）。ビュー曲線は、関数ｃｏｓｘn  を用いてモデル化される。現在のモデルはｃｏｓｘ４  を用いている。コサイン関数のべき数ｎは、調整可能なパラメータである。ｎの値が大きいほど、ビュー曲線が狭くなり、ｎが小さいほどビュー曲線が幅広くなる。
【０１０４】
０リーディングフレームのコドンに関するビュー曲線（ＶＣ０）は、‐１／２π〜１／２πに関して評価され‐２〜２の変位単位から重ね合わされた関数ｃｏｓｘ４を用いてモデル化される（等式５．５２）。変位は、ヌクレオチドの単位を有し、２変位単位は１ヌクレオチドであり、１変位単位は１／２ヌクレオチドである。＋１リーディングフレームのコドンに関するビュー曲線（ＶＣ＋１）は、０〜πから評価され０〜４の変位単位から重ね合わされた関数ｃｏｓｘ４である（等式５．５３）。‐１リーディングフレームのコドンに関するビュー曲線（ＶＣ‐１）は、‐π〜０に関して評価され‐４〜０の変位単位から重ね合わされた関数ｃｏｓｘ４である（等式５．５１）。
【数３３】
2018509930.tif 000035
【数３４】
2018509930.tif 000036
ＶＣ‐１、ＶＣ０、ＶＣ＋１は、それぞれ‐１、０、＋１リーディングフレームのビュー曲線である。ｎは、変化可能な上記モデルのパラメータである。これは現在４に設定されている。ｘはＲＤｃｕｒｒｅｎｔであり（確率サイクルの擬似コードを参照）、現在のリボソーム変位値である。
【０１０５】
アミノアシル‐ｔＲＮＡ存在量テーブル
確率サイクルアルゴリズムは、‐１、０及び＋１リーディングフレームのコドンのアミノアシル‐ｔＲＮＡ存在量（ＴＡ‐１、ＴＡ０、ＴＡ＋１）を用いて、当該コドンがａａ‐ｔＲＮＡをピックアップする確率を算出する。多量のアミノアシル‐ｔＲＮＡは、リボソームにピックアップされる見込みがより高く、これはリボソームが当該コドンにおいて待機する時間量を減少させる。一方、存在量がより少ないｔＲＮＡは、リボソームにピックアップされる見込みが少なく、これはリボソームがａａ‐ｔＲＮＡの送達を待機する時間量を増大させる。複数のｔＲＮＡをコードするコドンに関するａａ‐ｔＲＮＡ存在量を決定する場合、各ａａ‐ｔＲＮＡ存在量の合計を使用する。異なる成長速度における大腸菌に関するｔＲＮＡ存在量測定を、ドングら（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）［７５］において見ることができる。表２は、ドングら（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）［７５］のｔＲＮＡ存在量測定から得られた、各コドンに関するａａ‐ｔＲＮＡ存在量を示す。ｔＲＮＡ存在量情報が分からない場合、代わりに遺伝子コドン分布を使用できる（表３）。遺伝子コドン分布は、細胞内ｔＲＮＡ存在量と大まかに一致する［７５、７６、７７、７８］。ｔＲＮＡ遺伝子の複製数も、ａａ‐ｔＲＮＡ存在量の推定として使用できる［７９、８０、８１、８２］。ｔＲＮＡ存在量は、実際のａａ‐ｔＲＮＡ存在量の推定である。ａａ‐ｔＲＮＡ存在量は、成長条件及びｍＲＮＡ発現レベルに応じて変化し、これは、節３．３．２に記載の、非荷電状態から荷電状態へのｔＲＮＡの「再荷電（ｒｅｃｈａｒｇｅ）」速度に関連する。各コドンのａａ‐ｔＲＮＡ存在量値（ＴＡ）は、確率サイクルの等式のＴＡ‐１、ＴＡ０、ＴＡ＋１に置換される。
【０１０６】
表２  ドングら（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）から得られた、コドンあたりのａａ‐ｔＲＮＡ存在量
アミノアシル‐ｔＲＮＡ存在量は、ドングら（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）［７５］から、リボソームあたりのｔＲＮＡ存在量を１時間あたり１．７倍して得られる。停止コドンは、低量及び翻訳の終了を示すために、極めて小さい値が割り当てられる。ＴＡは、確率サイクルの等式で使用されるｔＲＮＡ存在量値の略語である。
【表２】
2018509930.tif 000037
【０１０７】
表３  大腸菌遺伝子コドン周波数テーブルを用いた、コドンあたりのａａ‐ｔＲＮＡ存在量
遺伝子コドン周波数テーブルは、ナカムラら（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．）［８３］において見ることができる。停止コドンは、低量及び翻訳の終了を示すために、極めて小さい値が割り当てられる。ＴＡは、確率サイクルの等式で使用されるｔＲＮＡ存在量値の略語である。
【表３】
2018509930.tif 000038
【０１０８】
遺伝子最適化アルゴリズム
上述の概念及び方法を用いて遺伝子を最適化した。この最適化は、種角に近い位相角を維持しながら最も豊富なａａ‐ｔＲＮＡをコードするコドンを選択する。上記アルゴリズムは、全コーディング領域を、（ＡＵＧの後の）第２のコドンから停止コドンへと再設計することによって、遺伝子を最適化する。６個のコドンを同時に最適化した。上記最適化アルゴリズムは、コドン２で始まる最初の６個のコドンについて開始され、これら６個のコドンを最適化した後、次の６個のコドンに移動し、遺伝子の末端に到達するまでこれを行う。コドンは、アミノ酸配列を保存したまま、同義コドンを用いて変化させた。
【０１０９】
６コドンのセットそれぞれに関して、これらのコドンに関する異なる組み合わせ全てのリストを決定した。上記６コドンの各順列の「総計値（ｔｏｔａｌ  ｖａｌｕｅ）」を算出した。総計値は、各コドンの「値（ｖａｌｕｅ）」の積を得ることによって算出される。コドンの値は、ａａ‐ｔＲＮＡ存在量、又はユーザ「事前定義（ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ）」値として定義できる。コドンの値がａａ‐ｔＲＮＡ存在量である場合、上記アルゴリズムは同義コドンのセットにおいて、ほとんど常に同一のコドンを使用することになる。ある事前定義値を用いることは、コドンを使用することによってａａ‐ｔＲＮＡの使用を拡散するにあたって有用である。例えばプロリンコドンＣＣＵ及びＣＣＧに同一の値を割り当てることができ、その一方でプロリンコドンＣＣＣ及びＣＣＡにより低い値を割り当てることができる。これにより、ＣＣＣ及びＣＣＡコドンの使用を制限しながら、ＣＣＵ及びＣＣＧコドンの使用を更に分散させる。コドンの好ましさについては表１に示されている。
【０１１０】
次に上記順列を、「総計値」によって最高から最低までランク付けした。続いてアルゴリズムは、最高ランクの順列を採用し、上記６コドンの位相角を計算する。上記順列の位相角が事前定義された「閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）」内である場合、当該順列は「最適化済み（ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）」順列として選択され、上記アルゴリズムは遺伝子内の次の６コドンへと移動する。しかしながら、上記位相角が上記種角の上記事前定義された閾値内ではない場合、上記アルゴリズムは、種角の範囲内である順列が見つかるまで、上記リスト内の次の順列を選択する。種角の閾値内に順列が見つからない場合、最高ランクの順列を「最適化済み」順列として使用する。部分的に最適化された遺伝子及びその６コドン順列の種角（θｓｐ）及び「位相角」の算出は、［６８、８４］に記載されている。位相角は、（新たな６コドン順列を含む）上記部分的に最適化された配列に関してΦｋを算出することによって計算される。Φｋの算出は［６８］に公開されている。最適化済み順列を発見した後、上記アルゴリズムは次の６コドンに移動し、遺伝子の末端までこのプロセスを反復する。得られる産物は、全て位相角を種角付近に維持しながら、最も豊富なａａ‐ｔＲＮＡをコードするコドン又は複数の豊富なａａ‐ｔＲＮＡをコードするコドンのセットを用いる、最適化済み遺伝子である。
【０１１１】
次に、最適化済み遺伝子配列を上記モデルによって処理することにより、リボソーム変位、翻訳ボトルネック（ＢＮＩ）、及び総待機サイクルを決定する。これらのパラメータを、野生型遺伝子のこれらのパラメータ、又はコドンバイアス最適化済み遺伝子のパラメータと比較することにより、遺伝子を更に最適化できるかどうかを決定する。リボソーム変位が十分にゼロに近くない場合、ＢＮＩ又は総待機を更に低下させることができる。「最も最適化された」配列は、（１）種角に比べて遺伝子の位相角の「許容可能な閾値（ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）」を変化させること、及び（２）好ましい１つ又は複数のコドンを、上記コドンの「値」を変化させることによって変更することによって、経験的に決定できる。
【０１１２】
上述の遺伝子最適化アルゴリズムは、定義された最適条件を用いた古典的最適化アルゴリズムではなく、ヒューリスティックアルゴリズムとして最も良好に説明される。しかしながら、このアルゴリズムは、同一の入力の場合、毎回異なる配列を出力するのではなく、同一の配列を出力するため、確率論的ではなく決定論的である。上記アルゴリズムは、（コドンの使用により）最も豊富なａａ‐ｔＲＮＡを使用することに基づいて遺伝子の翻訳効率を改善しながら、リボソーム変位及び力も低減する。これらの原理を用いることにより、翻訳伸長全体を通して、リボソーム待機時間及びボトルネックが低下する。これは、「最も最適な（ｍｏｓｔ  ｏｐｔｉｍａｌ）」遺伝子ではなく、「比較的最適な（ｍｏｒｅ  ｏｐｔｉｍａｌ）」遺伝子をもたらす。というのは、最も最適な条件は不明であるためである。理論上、同一の変位、待機時間及びＢＮＩを有する複数の「最適な」遺伝子変異体が存在し得る。
【０１１３】
結論
リボソーム変位をもたらすリボソーム「ばね」作用をモデル化するために、アルゴリズム及び数学的等式を開発した。全てのコドンにおいて、「確率サイクル」は、リボソームを、上記リボソームがアミノアシル‐ｔＲＮＡを「ピックアップ」するまで、各「サイクル」中に小さなステップサイズだけ変位させる。リボソーム変位の程度は、力、及びリボソームが次のアミノアシル‐ｔＲＮＡの送達をどれだけ待機しなければならないか（これはａａ‐ｔＲＮＡ存在量に関連する）の関数である。上記力は、（正弦波フィッティング又は多項式フィッティングを用いて）離散自由エネルギシグナルを１つの連続自由エネルギシグナルに変換し、この自由エネルギシグナルの導関数を得ることによって算出される。リボソームが次のアミノアシル‐ｔＲＮＡの送達の待機に消費する時間の量は、「ビュー曲線」及びアミノアシル‐ｔＲＮＡ存在量と畳み込んだ複数の確率によってモデル化される。確率サイクルは、「ばね状」１６Ｓ  ｒＲＮＡ露出テールのエネルギ的結合（このばねからリボソームに印加される力）を、アミノアシル‐ｔＲＮＡ存在量と畳み込むことにより、全てのコドンにおけるリボソーム変位及びリボソーム待機時間を出力する。このアルゴリズムの図解については図２０を参照のこと。このアルゴリズムにおいて考慮されるパラメータとしては、ステップサイズ定数ΔＴ（ｄＴ）、「ビュー曲線」に関するコサイン関数のべき数（ｎ）、「テール距離」、確率に関する正規化定数（ＮＦ）、及びアミノアシル‐ｔＲＮＡ存在量情報が挙げられる。上記モデルの精度は、これらのパラメータ全てに左右される。遺伝子最適化アルゴリズムは、遺伝子を効率的に最適化するためにも開発され、これは遺伝子を手動で最適化するよりも効率的かつ正確である。このアルゴリズムは、第２のコドンから始まる６コドンを一度に最適化することによって、遺伝子をゼロから設計する。これら６コドンの最適化は、種角に密接に適合するコドンの選択と、最良のａａ‐ｔＲＮＡ使用をもたらすコドンの選択との間の「トレードオフ（ｔｒａｄｅｏｆｆ）」である。上述のアルゴリズム及び計算は、リボスキャン（ＲｉｂｏＳｃａｎ）（商標）と呼ばれる完全実装型ソフトウェアパッケージに組み込まれ、このソフトウェアパッケージは、ウェブサーバとして入手可能である［８５］。リボスキャン（商標）の出力は、翻訳伸長中の極性プロット、リボソーム変位プロット、リボソーム待機時間プロット、翻訳ボトルネックプロット、及び単一のリボソーム動態のシミュレーションを含む。
【実施例３】
【０１１４】
事例研究‐予測及び最適化
本モデルの予測及び最適化能力を、大腸菌において５つのモデル遺伝子：ｇｓｔ（グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ）、ｐｆ０１３２（α‐グルコシダーゼ）、ｃｌｊｕ＿ｃ１１８８０（アルコールデヒドロゲナーゼ）並びにｒｔ８＿０５４２（エンドグルカナーゼ及びエキソグルカナーゼ）を発現させることによって評価した。また本モデルの最適化の力を、本明細書中の他の箇所に記載されているコドンバイアス最適化アルゴリズムと比較した。ＧＳＴの複数のｍＲＮＡ変異体も設計して発現させることにより、本モデルの予測を、コドンバイアスの予測と比較して更に検証した。シャープら（Ｓｈａｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．）［８６］によるコドン適合指数（ＣＡＩ）を用いて、遺伝子のコドンバイアスを測定した。測定されたタンパク質収率（ＧＳＴ活性）は、コドン適合指数（ＣＡＩ）及び本モデルの指数（ＢＮＩ）の両方について予測されたタンパク質収率と相関していた。上記相関の比較の背景にある理論的根拠は、タンパク質収率の決定因子がコドンバイアスにのみ限定されず、リボソーム変位、力、及びｔＲＮＡ使用の間の畳み込みを包含していることを実証することであった。この畳み込みは、新たなリボソーム待機時間パラメータ及び翻訳ボトルネック（ＢＮＩ）をもたらし、これにより、タンパク質収率の優れた予測因子が実現可能となる。リボーム待機時間パラメータ及び翻訳ボトルネックの説明は上に記載されている。
【０１１５】
上述の概念を用いて遺伝子最適化を実施した。最適化に使用したアルゴリズムについては上述されている。極性プロット、リボソーム変位プロット、リボソーム待機時間プロット及び翻訳ボトルネックプロットを、分析ツールとして使用した。これらの遺伝子のクローニング、発現、及びこれらの遺伝子に関するタンパク質収率の定量化において使用した材料及び方法の詳細な説明は以下に記載される。遺伝子は、遺伝子合成企業であるジェネウィズ社（Ｇｅｎｅｗｉｚ，  Ｉｎｃ．）又はジェンスクリプト社（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，  Ｉｎｃ．）によって合成された。遺伝子のＤＮＡ配列は以下において提供される。
【０１１６】
遺伝子の説明
遺伝子ｇｓｔは、一般に肝吸虫と呼ばれる寄生虫である日本住血吸虫に由来するものであった。ＧＳＴは分子量２６キロダルトン（２１８アミノ酸、６５４ヌクレオチド）の比較的小さいタンパク質である。ｇｓｔは大腸菌において高度に発現され、細胞質に溶解可能である。ＧＳＴはモデル最適化の候補として選択された。というのは、これが、タンパク質収率を定量化するための市販のアッセイを有する、十分に研究された真核生物タンパク質であるためである。野生型ｇｓｔは大腸菌において高度に発現されるものの、本モデルは、リボソーム変位を更に最小化して発現レベルを改善できることを示した［９３］。予測及び最適化のために使用される野生型ｇｓｔのソースは、ｐＥＴ‐４１ａ＋プラスミド（ノヴァーゲン社（Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．）由来であった。ｐＥＴ‐４１ａ＋由来のｇｓｔは、日本住血吸虫からクローニングしたものと同一である［９２］。
【０１１７】
ｐｆ０１３２（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿５７７８６１．２）は、コスタンティーノら（Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．）［８７］によって特性決定された古細菌パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＤＳＭ３６３８由来のα‐グルコシダーゼである。パイロコッカス・フリオサスは、１００℃で生存する超好熱菌である。ｐｆ０１３２は、原核生物である大腸菌とは異なる生命体ドメイン（ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｌｉｆｅ）（古細菌）に属するため、選択された。更にｐｆ０１３２は大きなリボソーム変位を示し、これを最小化することによってタンパク質収率を増大させることができる。ＰＦ０１３２の分子量は５５キロダルトンであり、４８９アミノ酸（１４６７ヌクレオチド）を含有する。
【０１１８】
ｃｌｊｕ＿１１８８０（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＬＪＵ＿ｃ１１８８０）は、クロストリジウム・リュングダリーＤＳＭ１３５２８由来のアルコールデヒドロゲナーゼである。クロストリジウム・リュングダリーは、嫌気性腸内細菌である。ｃｌｊｕ＿１１８８０は、大腸菌のゲノムと比較して高いＡＴ含量を有するゲノムに由来するため、選択された。野生型ｃｌｊｕ＿１１８８０はまた、大きな変位も示し、これを最小化することによってタンパク質収率を増大させることができた。ＣＬＪＵ＿ｃ１１８８０の分子量は４２キロダルトンであり、３８０アミノ酸（１１４０ヌクレオチド）を含有する。
【０１１９】
ｒｔ８＿０５４２は、未公開のカルジセルロシルプトル（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ）種由来の（ＧＨ９ドメインを含有する）エンドグルカナーゼ及び（ＧＨ４８ドメインを含有する）エキソグルカナーゼの両方である。カルジセルロシルプトルは、好熱性、嫌気性のグラム陽性細菌である。野生型ｒｔ８＿０５４２は、大腸菌において良好に発現されなかったが、コドンバイアス最適化済み変異体は、動作するタンパク質を産生した。野生型ｒｔ８＿０５４２及びコドンバイアス最適化済みｒｔ８＿０５４２の両方は、コドンバイアス最適化の動態についての洞察を得るため、及びコンピュータを用いてコドンバイアス最適化をモデル最適化とより良好に比較するために、選択された。ｒｔ８＿０５４２の分子量は２１０キロダルトンであり、１８７５アミノ酸（５６２５ヌクレオチド）を含有する。
【０１２０】
ｐＢＡＤ‐Ｍｙｃ‐Ｈｉｓプラスミドへの遺伝子のクローニング
開始及び停止コドンを含む上述の遺伝子を合成し、ジェネウィズ社又はジェンスクリプト社によるゲートウェイ（ＧＡＴＥＷＡＹ）クローニング技法を用いて、ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ‐Ｈｉｓ  Ｃプラスミド（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社、カタログ番号：Ｖ４４０‐０１）へとクローニングした。図２８に示すように、上記プラスミドへの遺伝子配列の挿入は、ＮｃｏＩ部位においてＡＴＧを直接置換した。
【０１２１】
タンパク質収率予測指数の比較
ＧＳＴの複数のｍＲＮＡ変異体を設計し、発現させて、本モデルのタンパク質収率を予測する能力を評価した。この実験の理論的根拠は、タンパク質収率予測に関して本モデルからの実現可能な指数を決定することであった。ボトルネック指数（ＢＮＩ）は、タンパク質収率の最も実現可能な予測因子であった（上記参照）。ボトルネック指数は、変位、アミノアシル‐ｔＲＮＡ使用、力、及びリボソーム待機時間の関数として算出される。この指数は、リボソーム待機時間が大きいクラスタを同定し、ｍＲＮＡ上の翻訳ボトルネックの位置を示す。
【０１２２】
ＢＮＩの精度を、ＢＮＩ予測を９個のｍＲＮＡ変異体からのＧＳＴ活性と相関させることによって確認した。コドン適合指数（ＣＡＩ）も、同様にして評価した。基準として大腸菌遺伝子コーディング配列を用いたＣＡＩ［１００、１０１］、及び基準として高発現遺伝子を用いたＣＡＩ（ＨＥＧ）［９１］の両方を試験した。モデルからの総待機時間（上を参照）もＧＳＴ活性に対して相関していた。４つの指数の得られた相関を比較することによって、これらの予測精度を評価した。９個のｇｓｔ変異体を、Ｗ、Ｍ、ＶＭ、１６、２３、８０、８２、９０Ｄ、０Ｄと名付けた。全てのｇｓｔ変異体のうちの最初の９０個の塩基は、開始によって引き起こされるタンパク質収率偏差を正規化するために、（変異体Ｍを除いて）野生型遺伝子から変化させなかった。
【０１２３】
ｇｓｔ変異体の設計の理論的根拠及び図解による分析
ｇｓｔ変異体Ｍを、遺伝子全体を通して変位を最小化することによって「手動で（ｍａｎｕａｌｌｙ）」最適化した。この最適化は、変位がタンパク質収率の主要な予測因子であると初めは考えられていたために実施されたが、様々な予測の後、リボソーム待機時間及び翻訳ボトルネックがタンパク質収率のより良好なインジケータであることが分かった。リボソーム待機時間及び翻訳ボトルネックは、リボソーム変位、アミノアシル‐ｔＲＮＡ使用、及びリボソームばねからの力の関数である。変異体ＶＭは、変異体ＶＭ内の最初の９０個の塩基が野生型のものである点を除いて、変異体Ｍと同様である。変異体８０は、「１アミノ酸、１コドン（ｏｎｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ，  ｏｎｅ  ｃｏｄｏｎ）」アルゴリズムを用いてコドンバイアス最適化された。モデル最適化済み（変異体ＶＭ）、コドンバイアス最適化済み（変異体８０）、及び野生型間の比較は、ヴーら（Ｖｕ  ｅｔ  ａｌ．）［９２］に公開されていた。変異体８２は変異体８０と同様、その高いＣＡＩのために選択されたが、興味深いことに、変異体８２の位相角は種角に近く、変位は遺伝子全体を通してゼロに近かった。この変異体は、変異体８０より多くのタンパク質を産生すると予想される。変異体１６は、ランダムｍＲＮＡ配列ジェネレータを用いて設計された。変異体１６は、ＣＡＩが低いものの変位がゼロに近いままであるため、選択された。変異体１６の発現を実施して、コドンバイアスよりもリボソーム変位が、タンパク質収率のより良好な予測因子であるかどうか、又は総待機時間及び翻訳ボトルネック（ＢＮＩ）がより良好な予測因子となり得るかどうかを評価した。変異体２３もまた、ランダムｍＲＮＡジェネレータを用いて設計された。変異体２３は、ＣＡＩが低く、０°における変わった極性プロット挙動を有するために選択された。変異体９０Ｄは、上記モデルを用いて、約９０°の平均位相角を有するように設計された。この位相角は、大腸菌に関する「正常な」範囲から外れている。従ってリボソームは、約＋１単位の最大変位で、コドン４０から停止コドンへと変位され、これは、＋１リーディングフレームの１／２ヌクレオチドの不整合に対応する。変異体０Ｄは、上記モデルを用いて、約０°の平均位相角を有するように設計された。この位相角は、大腸菌に関する「正常な」範囲の境界上であるものの、上記範囲内である。位相角が「境界上（ｏｎ  ｔｈｅ  ｂｏｒｄｅｒ）」にあっても、リボソーム変位はゼロ付近のままである。９０Ｄ及び０Ｄ変異体はいずれも、ＣＡＩによって決定される同一のコドンバイアスを有するものの、異なる変位、総待機サイクル数、及びＢＮＩを有する（表４参照）。本モデルの予測によると、変異体９０Ｄは、変異体０Ｄより低いタンパク質収率をもたらすことになる。ｇｓｔ変異体の極性プロット、リボソーム変位プロット、リボソーム待機時間プロット及び翻訳ボトルネックプロットは全て、以下に記載されているように生成された。
【０１２４】
野生型の図解プロット
野生型ｇｓｔは、‐６４°の平均位相角を示した。大腸菌の種角は‐２３°である。大腸菌の種角から偏移した平均位相角を有する遺伝子は、翻訳中にリボソームに対して余剰の力を印加し、これは、リボソームばねの圧縮又は伸長によって引き起こされる。この余剰の力は、低量のアミノアシル‐ｔＲＮＡが使用される場合にリボソームを変位させることができる。野生型ｇｓｔの場合、リボソームは変位される。
【０１２５】
リボソームは、コドン５０からコドン２２４へと変位される。最大変位は、コドン１６０付近における＋０．７５である（＋１リーディングフレームへの０．３７５ヌクレオチドのリボソーム変位）。リボソーム待機時間プロットは、コドン６５及び２００付近での長い待機時間のクラスタリングを示し、総待機時間は１６９４サイクルである。上記クラスタリングは、コドン６５及びコドン２００付近におけるボトルネックをもたらし、最大ボトルネック（ＢＮＩ２２８）はコドン１９９におけるものである。
【０１２６】
変異体Ｍの図解プロット
ｇｓｔ変異体Ｍを手動で最適化して変位を最小化した。変異体Ｍは、‐５７°の平均位相角を示した。遺伝子の平均位相角が大腸菌の種角と異なっており、リボソームに余剰の力を印加する場合であっても、重要なコドン位置において豊富なアミノアシル‐ｔＲＮＡが使用されているため、変位は緩和される。
【０１２７】
しかしながら、変位の最小化後であっても、リボソーム待機時間プロットは、コドン６５、コドン１１０及びコドン２００付近での長い待機時間のクラスタリングを示す。総待機時間は、野生型における１６９６サイクルから、１４９２サイクルまで低下する。しかしながら、長い待機時間のクラスタリングにより、ボトルネックがコドン６５、１００及び２００に存在する。最大ボトルネック（ＢＮＩ２１８）はコドン６７において計算される。
【０１２８】
変異体ＶＭの図解プロット
ｇｓｔ変異体ＶＭは、最初の９０個の塩基がｇｓｔ野生型から直接複製される点を除いて、変異体Ｍと同様である。変異体ＶＭは、‐５９°の平均位相角を示した。
【０１２９】
リボソーム変位は、変異体Ｍのリボソーム変位と略同様に最小化される。しかしながら、リボソーム変位は最小化されるものの、リボソーム待機時間プロットは、コドン６５、コドン１１０及びコドン２００付近での長い待機時間のクラスタリングを示す。総待機時間は野生型に比べて１４９４サイクル減少する。長い待機時間のクラスタリングにより、ボトルネックは、コドン６５、コドン１００、及びコドン２００付近に存在する。最大ボトルネック（ＢＮＩ２１８）はコドン６７に存在する。
【０１３０】
変異体１６の図解プロット
ｇｓｔ変異体１６は、ランダムｍＲＮＡ配列ジェネレータを用いて設計された。変異体１６は、ＣＡＩが低いものの変位がゼロに近いままであるため、選択された。変異体１６を試験することによって、コドンバイアスよりもリボソーム変位が、タンパク質収率のより良好な予測因子であるかどうか、又は総待機時間及び翻訳ボトルネックがより良好な予測因子となり得るかどうかを評価した。変異体１６は、‐４３°の平均位相角を示した。
【０１３１】
リボソーム変位は、伸長全体を通して最小化された。リボソーム待機時間プロットは、コドン６５及びコドン１８０付近での長い待機時間のクラスタリングを示し、総待機時間は、野生型における１６９６に比べて２０１２サイクルまで増大した。長い待機時間のクラスタリングにより、ボトルネックがコドン５９及びコドン１８０付近に存在する。最大ボトルネック（ＢＮＩ２９６）はコドン５９に存在する。
【０１３２】
変異体２３の図解プロット
ｇｓｔ変異体２３もまた、ランダムｍＲＮＡジェネレータを用いて設計された。変異体２３は、ＣＡＩが低く、０°における興味深い極性プロット挙動を有するために選択された。変異体２３は、‐１８°の平均位相角を示した。
【０１３３】
リボソーム変位は、コドン８０〜１１０を除いて、伸長全体を通して最小のままであり、コドン８０〜１１０ではリボソーム変位は約‐０．７０まで低下した。リボソーム待機時間プロットは、コドン６０、コドン９０〜１１０及びコドン１８０付近での長い待機時間のクラスタリングを示す。総待機時間は、野生型における１６９６サイクルに比べて１７８８サイクルまで増大した。長い待機時間のクラスタリングにより、ボトルネックがコドン６０、コドン９０及びコドン１８５付近に存在する。最大ボトルネック（ＢＮＩ２６１）はコドン１８５に存在する。
【０１３４】
変異体８０の図解プロット
変異体８０は、「１アミノ酸、１コドン」アルゴリズムを用いてコドンバイアス最適化された。変異体８０は‐５９°の平均位相角を示した。
【０１３５】
リボソームはコドン４０から１７５へと変位され始める。最大変位はコドン８５〜１２５付近における＋０．５０であり、これは＋１リーディングフレームへの０．２５ヌクレオチドのＡ部位不整合に対応する。リボソーム待機時間プロットは、コドン３付近での長い待機時間のクラスタリングを示す。総待機時間は、野生型における１６９６サイクルに比べて１１４８サイクルまで減少した。長い待機時間のクラスタリングにより、ボトルネックがコドン２付近に存在する。最大ボトルネック（ＢＮＩ１６０）はコドン２に存在する。
【０１３６】
変異体８２の図解プロット
変異体８２は変異体８０と同様、その高いＣＡＩのために選択されたが、変異体８２の位相角は大腸菌の種角に近く、変位は遺伝子全体を通してゼロに近かった。この変異体は、変異体８０より多くのタンパク質収率を生成すると予想される。変異体８２は、‐５１°の平均位相角を示した。
【０１３７】
リボソームは伸長全体を通して最小の変位を示した。リボソーム待機時間プロットは、コドン３付近での長い待機時間のクラスタリングを示す。総待機時間は、野生型における１６９６サイクルに比べて１１４８サイクルまで減少した。長い待機時間のクラスタリングにより、ボトルネックがコドン２付近に存在する。最大ボトルネック（ＢＮＩ１６０）はコドン２に存在する。
【０１３８】
変異体９０Ｄの図解プロット
ｇｓｔ変異体９０Ｄは、上記モデルを用いて、約９０°の平均位相角を有するように設計された。変異体９０Ｄは、‐８７°の平均位相角を示した。
【０１３９】
変異体９０Ｄの位相角は、大腸菌に関する「正常な」範囲から外れているため、リボソームは、コドン４０付近からコドン２２４まで変位される。リボソーム待機時間プロットは、コドン１１０付近での極めて長い待機時間のクラスタリングを示す。総待機時間は、野生型における１６９６サイクルに比べて１９２５サイクルまで増大した。長い待機時間のクラスタリングにより、ボトルネックがコドン１００付近に存在する。最大ボトルネック（ＢＮＩ２８８）はコドン１００に存在する。
【０１４０】
変異体０Ｄの図解プロット
ｇｓｔ変異体０Ｄは、上記モデルを用いて、約０°の平均位相角を有するように設計された。変異体０Ｄは、‐３°の正確な平均位相角を示す。この位相角は、大腸菌に関する「正常な」位相角範囲の境界上にある。
【０１４１】
上記位相角が「境界上（ｏｎ  ｔｈｅ  ｂｏｒｄｅｒ）」にあっても、リボソーム変位はゼロ付近のままであり、約０．５変位単位だけ偏移する。リボソーム待機時間プロットは、コドン１８０及び２００付近での長い待機時間のクラスタリングを示す。総待機時間は、野生型における１６９６サイクルに比べて１５２７サイクルまで減少した。ボトルネックはコドン１８５付近に存在する。最大ボトルネック（ＢＮＩ２０５）はコドン１８５に存在する。
【０１４２】
実験手順及び研究室における結果
全てのｇｓｔ変異体を合成し、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社から入手可能なｐＢＡＤ／Ｍｙｃ‐Ｈｉｓ誘発性プラスミドへとクローニングした。ｇｓｔ遺伝子はジェネウィズ社又はジェンスクリプト社によって合成及びクローニングされた。遺伝子挿入を含有するプラスミドを、化学的に競合する上位１０個の大腸菌細胞（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社から入手可能）へと形質転換し、０．０２％ｗ／ｖ（０．２ｍｇ／ｍｌ）アラビノースにおいて３時間発現させた。Ｐｂａｄ誘発性プロモータ［９６］を用いて、転写レベルを正規化した。１ミリメートルの誘発された細胞を培養し、ペレット化し、バグバスター（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ）及びリソナーゼ（Ｌｙｓｏｎａｓｅ）（いずれもＥＭＤミリポア社（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｉｎｃ．）から入手可能）を用いて溶解させた。シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｉｎｃ．）から入手可能なＧＳＴアッセイキット（Ｅ．Ｃ．２．５．１．１８）を用いてＧＳＴ活性を定量化した。ＧＳＴの１単位は、１分あたり１μｍｏｌのＧＳ‐ＤＮＢコンジュゲートを産生するＧＳＴ酵素の量として定義される。サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社から入手可能なピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキットを用いて、ＧＳＴ特異性活性を総タンパク質活性へと正規化した。総タンパク質の正規化を実施することによって、回収した多数の細胞の偏差を標準化した。正規化されたＧＳＴ活性の単位は、総タンパク質のＡ５６２ｎｍあたりのＧＳＴの単位として定義され、ここで１Ａ５６２ｎｍは総タンパク質１８ｍｇに等しい。正規化されたＧＳＴ活性の単位の算出については、以下でより詳細に説明する。２つの独立した誘発を実施することによって、再現性に関して試験した。３個の試料を各誘発から回収し、合計６個の試料をアッセイした。詳細な実験手順は以下で確認できる。各ｇｓｔ変異体の正規化されたＧＳＴ活性、及びそのタンパク質収率の予測指数を、表４に示す。
【０１４３】
ＧＳＴタンパク質定量化
活性アッセイ：誘発から得た細胞ペレットを、１ｍｌのＥＭＤミリポア製バグバスター（商標）タンパク質抽出試薬（カタログ番号：７０５８４）中に再懸濁した。バグバスター（商標）１ｍｌあたり３μｌのＥＭＤミリポア製リソナーゼ（商標）生物処理試薬（カタログ番号：７１２３０）を、各細胞再懸濁液に添加した。試料を中程度の速度の振盪器（リライアブル・サイエンティフィック社（Ｒｅｌｉａｂｌｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．）製５５Ｓシングルプラットフォーム振盪器（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  Ｓｈａｋｅｒ））上に、室温で２０分間配置し、その後、１６，０００Ｇにおいて４℃で２０分間遠心分離した。
【０１４４】
シグマ・アルドリッチ社製ＧＳＴアッセイキット（カタログ番号：ＣＳ０４１０）を用いて、グルタチオンＳ‐トランスフェラーゼ活性（Ｅ．Ｃ．２．５．１．１８）を９６ウェルマイクロプレート内で定量化した。各細胞溶解物１０μＬを、３つのウェルに等分して３部とした。［ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水：１００ｍＭの１‐クロロ‐２，４‐ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）：２００ｍＭのＬ‐グルタチオン還元］（全てシグマ・アルドリッチ社製）の［９．８：１：１］混合物を含有する１９０μｍのアッセイ混合物を各ウェルに添加した。ＧＳＴは、Ｌ‐グルタチオン及びＣＤＮＢを基材として使用して、ＧＳ‐ＤＮＢを産生する。ＧＳＴアッセイキットは、ＧＳ‐ＤＮＢコンジュゲートの産生を測定し、これは３４０ｎｍの光を吸収する。３４０ｎｍにおける１０回の吸光度測定を、ＢＭＧラブテック社（ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ，  Ｉｎｃ．）製ポーラスター・ギャラクシー・マイクロプレートリーダ（ＰＯＬＡＲｓｔａｒ  Ｇａｌａｘｙ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）を用いて、３０秒間隔で実施した。第１の測定は、アッセイ混合物と細胞溶解物との混合のちょうど１分後に実施された。ＧＳＴ活性は、１分あたりの３４０ｎｍでの吸光度の上昇速度（ΔＡ３４０ｎｍ／分）と正比例する。従ってＧＳＴ活性は、時間に対する１０回の吸光度測定の傾斜として（ΔＡ３４０ｎｍ／分の単位で）測定された。ＧＳＴ特異性活性は、以下の式を用いて算出した：
【表３５】
2018509930.tif 000039
１単位のＧＳＴは、２５℃において１μｍｏｌのＧＳ‐ＤＮＢコンジュゲートを産生するＧＳＴ酵素の量として定義される。ｄｉｌは、元の試料の希釈計数であり、εｍＭは、３４０ｎｍにおけるＧＳ‐ＤＮＢコンジュゲートのミリモル吸光係数であり、Ｖは反応体積であり、Ｖｅｎｚは試験した試料の体積である。３４０ｎｍにおけるＧＳ‐ＤＮＢコンジュゲートのミリモル吸光係数（εｍＭ）は、経路長１ｃｍについて９．６ｍＭ‐１である。上述のアッセイ条件下において、ｄｉｌ＝１、εｍＭ＝６．０４、Ｖ（ｍｌ）＝０．２、及びＶｅｎｚ（ｍｌ）＝０．０１である。
【表３６】
2018509930.tif 000040
に０．２ｍｌ（細胞ペレット再懸濁液の体積）を積算することによって、細胞ペレットあたりのＧＳＴの単位数を計算した。
【０１４５】
ピアース（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社から入手可能、カタログ番号：２３２２５）を用いて、ＧＳＴ特異性活性を総タンパク質へと正規化した。総タンパク質の正規化を実施することによって、回収した多数の細胞の偏差を標準化した。総タンパク質含有量は、マイクロプレート手順に関する製造者の指示に従って、５６２ｎｍの光の吸光度（Ａ５６２ｎｍ）によって測定した。同一のマイクロプレートリーダ（ポーラスター・ギャラクシー・マイクロプレートリーダ）を使用し、Ａ５６２ｎｍでの測定を、室温における１時間のインキュベーション後に実施した。正規化されたＧＳＴ活性を、ＧＳＴ特異性活性を同一の細胞ペレットに関する総タンパク質測定（Ａ５６２ｎｍ）で除算することによって計算した。正規化されたＧＳＴ活性の単位は、総タンパク質のＡ５６２ｎｍあたりのＧＳＴの単位として定義され、ここでＢＳＡ標準曲線を用いると、１単位のＡ５６２ｎｍは総タンパク質１８ｍｇに等しい。全てのアッセイは三重に実施され、アッセイの線形範囲内において測定された。
【０１４６】
ＰＦ０１３２タンパク質の定量化
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ：遺伝子ｐｆ０１３２及び変異体は、不溶性封入体として発現した。０．２％ｗ／ｖ（２ｍｇ／ｍｌ）アラビノース濃度における４時間の誘発に続いて、製造者の指示に従って、ＥＭＤミリポア製バグバスター（商標）タンパク質抽出試薬（カタログ番号：７０５８４）及びＥＭＤミリポア製リソナーゼ（商標）生物処理試薬（カタログ番号：７１２３０）を用いて、可溶性画分及び封入体精製を実施した。２００μＬ〜１ｍｌの範囲の洗浄及び再懸濁体積を用いて、精製済みのタンパク質の濃度を変化させた。
【０１４７】
野生型及びモデル最適化済みｐｆ０１３２の、封入体及び水溶性画分を、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル上で可視化した。試料を、５％の２‐メルカプトエタノールを用いて調製した同体積の２×レムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ）試料バッファ（バイオ‐ラッド社（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ，  Ｉｎｃ．）から入手可能、カタログ番号：１６１０７３７）と混合した。試料を沸騰した水の中で５分間インキュベートした。３０μｌの試料を、バイオ‐ラッド社製ミニ‐プロティーン（Ｍｉｎｉ-ＰＲＯＴＥＡＮ）（登録商標）テトラ電気泳動システム内のヌーセップ（ＮｕＳｅｐ）社製トリス‐グリシンＮＢ４‐２０％プレキャストＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル（カタログ番号：ＮＢ１０-００８）上に装填し、電気泳動を実施した。ページルーラ（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ）予備染色済みタンパク質ラダー（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社から入手可能、カタログ番号：２６６１６）を、タンパク質サイズの基準として用いた。上記ゲルについて、１２５Ｖでおよそ２時間の電気泳動を実施した。終了したゲルを、製造者の指示に従って、ヌーブルー・エクスプレス・ステイン（ＮｕＢｌｕ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓｔａｉｎ）中の低速の振盪器上に配置し、タンパク質バンドを可視化した。
【０１４８】
ＣＬＪＵ＿Ｃ１１８８０タンパク質の定量化
活性アッセイ：誘発によって得られた細胞ペレットを、２００μｌのＥＭＤミリポア社製バグバスター（商標）タンパク質抽出試薬（カタログ番号：７０５８４）中で再懸濁させた。バグバスター（商標）１ｍｌあたり３μｌのＥＭＤミリポア社製リソナーゼ（商標）生物処理試薬（カタログ番号：７１２３０）を、各細胞懸濁液に添加した。試料を中程度の速度の振盪器上に、室温で２０分間配置し、その後、１６０００Ｇにおいて４℃で２０分間遠心分離した。
【０１４９】
シグマ・アルドリッチ社から入手可能なアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１）酵素アッセイプロトコルを用いて、ＣＬＪＵ＿ｃ１１８８０（アルコールデヒドロゲナーゼ、ＡＤＨ）活性レベルを定量化した［８６］。全てのアッセイ条件を製造者の指示によって実施したが、９６ウェルマイクロプレート上での使用のために含量を１０倍低下させた。ＮＡＤＨはアルコールをアルデヒドに変換し、同時にＮＡＤ＋をＮＡＤＨに還元する。ＡＤＨアッセイは、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの還元を測定する。ＮＡＤＨは３４０ｎｍの光を吸収する。３４０ｎｍにおける１０回の吸光度測定を、マイクロプレートリーダを用いて、３０秒間隔で実施した。第１の測定は、アッセイ混合物と細胞溶解物とを組み合わせたちょうど１分後に実施された。ＡＤＨ活性は、１分あたりの３４０ｎｍでの吸光度の上昇速度（ΔＡ３４０ｎｍ／分）と正比例する。従ってＡＤＨ活性は、時間に対する１０回の吸光度測定の傾斜として（ΔＡ３４０ｎｍ／分の単位で）測定される。ＡＤＨ特異性活性は、以下の式を用いて算出した：
【表３７】
2018509930.tif 000041
１単位のＡＤＨは、２５℃において１μｍｏｌのＮＡＤＨを産生するＡＤＨ酵素の量として定義される。ｄｉｌは、元の試料の希釈計数であり、εｍＭは、３４０ｎｍにおけるＡＤＨのミリモル吸光係数であり、Ｖは反応体積であり、Ｖｅｎｚは試験した試料の体積である。３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨのミリモル吸光係数（εｍＭ）は、経路長１ｃｍについて６．２２ｍＭ‐１である。上述のアッセイ条件下において、ｄｉｌ＝１、εｍＭ＝５．４７、Ｖ（ｍｌ）＝０．３、及びＶｅｎｚ（ｍｌ）＝０．０１である。
【表３８】
2018509930.tif 000042
に０．２ｍｌ（細胞ペレット再懸濁液の体積）を積算することによって、細胞ペレットあたりのＡＤＨの単位数を計算した。
【０１５０】
ピアース（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社から入手可能、カタログ番号２３２２５）を用いて、ＡＤＨ特異性活性を総タンパク質へと正規化した。総タンパク質の正規化を実施することによって、回収した多数の細胞の偏差を標準化した。総タンパク質含有量は、マイクロプレート手順に関する製造者の指示に従って、５６２ｎｍの光の吸光度（Ａ５６２ｎｍ）によって測定した。同一のマイクロプレートリーダ（ポーラスター・ギャラクシー・マイクロプレートリーダ）を使用した。Ａ５６２ｎｍでの測定を、室温における１時間のインキュベーション後に実施した。正規化されたＡＤＨ活性を、ＡＤＨ特異性活性を同一の細胞ペレットに関する総タンパク質測定（Ａ５６２ｎｍ）で除算することによって計算した。正規化されたＡＤＨ活性の単位は、総タンパク質のＡ５６２ｎｍあたりのＡＤＨの単位として定義され、ここでＢＳＡ標準曲線を用いると、１単位のＡ５６２ｎｍは総タンパク質１８ｍｇに等しい。全てのアッセイは三重に実施され、アッセイの線形範囲内において測定された。
【０１５１】
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ
野生型及び最適化済みｃｌｊｕ＿ｃ１１８８０はいずれも、不溶性封入体として発現した。０．２％ｗ／ｖ（２ｍｇ／ｍｌ）アラビノース濃度における４時間の誘発に続いて、製造者の指示に従って、バグバスター（商標）タンパク質抽出試薬及びリソナーゼ（商標）生物処理試薬を用いて、水溶性画分及び封入体精製を実施した。２００μＬ〜４００μｌの範囲の洗浄及び再懸濁体積を用いて、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル上での可視化のために精製済みのタンパク質の濃度を変化させた。
【０１５２】
野生型及びモデル最適化済みｃｌｊｕ＿ｃ１１８８０の、封入体、全細胞溶解物及び水溶性画分を、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル上で可視化した。試料を、５％の２‐メルカプトエタノールを用いて調製した同体積の２×レムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ）試料バッファ（バイオ‐ラッド社（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ，  Ｉｎｃ．）から入手可能、カタログ番号：１６１０７３７）と混合した。試料を沸騰した水の中で５分間インキュベートした。３０μｌの試料を、バイオ‐ラッド社製ミニ‐プロティーン（ＰＲＯＴＥＡＮ）（登録商標）テトラ電気泳動システム内のヌーセップ（ＮｕＳｅｐ）社製トリス‐グリシンＮＢ４‐２０％プレキャストＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル（カタログ番号：ＮＢ１０-００８）上に装填し、電気泳動を実施した。ページルーラ（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ）予備染色済みタンパク質ラダー（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社から入手可能、カタログ番号：２６６１６）を、タンパク質サイズの基準として用いた。上記ゲルについて、１７５Ｖでおよそ１時間の電気泳動を実施した。終了したゲルを、ヌーブルー・エクスプレス・ステイン（ＮｕＢｌｕ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓｔａｉｎ）中の低速の振盪器上に配置し、タンパク質バンドを可視化した。
【０１５３】
ＧＳＴ活性と予測指数の相関
正規化されたＧＳＴ活性レベルを、タンパク質収率に関する以下の予測指数と相関させた：大腸菌ゲノムコーディング配列を用いたＣＡＩ、高発現遺伝子（ＨＥＧ）を用いたＣＡＩ、総待機時間、及びＢＮＩ。比較を目的として、対応するｇｓｔ変異体に関する比較のために、正規化されたＧＳＴ活性及び対応するｇｓｔ変異体の様々な予測指標に関する値を表４において確認できる。相関は、最小二乗回帰を用いた最良の適合線のフィッティング、並びに結果として得られたｒ（ピアソン相関係数）及びｒ‐２乗（決定係数）値の算出によって計算された。ＢＮＩが最も良好な相関を示し、総待機時間、ＣＡＩ、及びＣＡＩ（ＨＥＧ）がこれに続いた。ＢＮＩはｒ＝‐０．９６及びｒ‐２乗＝０．９２と相関した。総待機時間は、ｒ＝‐０．８９及びｒ‐２乗＝０．８０と相関した。ＣＡＩは、ｒ＝０．７５及びｒ‐２乗＝０．５７と相関した。ＣＡＩ（ＨＥＧ）はｒ＝０．６８及びｒ‐２乗＝０．４７と相関した。
【０１５４】
表４  ｇｓｔ変異体に関する、正規化されたＧＳＴ活性及びタンパク質収率予測指数。各ｇｓｔ変異体に関する、正規化されたＧＳＴ活性、ＣＡＩ、ＣＡＩ（ＨＥＧ）、総待機時間及びＢＮＩ値を列挙する。ＣＡＩは、大腸菌ゲノムコーディング配列［９４］を基準遺伝子として用いたコドン適合指数である。ＣＡＩ（ＨＥＧ）は、［９１］からの高発現遺伝子を基準遺伝子として用いたコドン適応指数である。総待機時間及びボトルネック指数（ＢＮＩ）は、モデルからのタンパク質収率予測指数である。ｇｓｔ変異体は、正規化されたＧＳＴ活性が低いものから高いものへと並べた。
【表４】
2018509930.tif 000043
±は標準偏差を示す。１正規化されたＧＳＴ活性は、総タンパク質のＡ５６２ｎｍあたりのＧＳＴの単位として測定され、ここで１Ａ５６２ｎｍは総タンパク質１８ｍｇに等しい。１単位のＧＳＴは、１分あたり１μｍｏｌのＧＳ‐ＤＮＢコンジュゲートを生成するＧＳＴ酵素の量として定義される。２待機時間値を開始時点に加算する前のＢＮＩ値。３待機時間値を開始時点に加算した後のＢＮＩ値。
【０１５５】
ＢＮＩをｒ‐２乗＝０．９２と相関させるために、リボソーム待機時間値を、各遺伝子の始点に５０待機サイクルを加算することによって、全ての遺伝子変異体の始点に調整した。この増加させたリボーム待機時間は、翻訳開始時のボトルネックをシミュレートするものである。各遺伝子の始点に待機時間値を加算した後、遺伝子の開始時において、変異体８０及び８２のＢＮＩは１６０から２０２に変化した。他の変異体のＢＮＩは影響を受けなかった。これは、他の遺伝子のＢＮＩが既に２０２より大きく、遺伝子の始点ではなく中央又は末端に位置していたためである。その一方で、変異体８０及び８２は、遺伝子の中央又は末端にボトルネックを有しなかった。本質的に、開始時点でのボトルネック形成が考慮されていないため、このモデルは、変異体８０及び８２に関するタンパク質収率を過大に予測していた。各遺伝子の始点にリボソーム待機時間値を加算することは、開始時点のボトルネックを考慮に入れることにより、タンパク質収率予測を改善する。
【０１５６】
正規化されたＧＳＴ活性の、低いものから高いものへの順序は、ＣＡＩ及びＣＡＩ（ＨＥＧ）指数よりもＢＮＩ及び総待機時間に良好に対応する。ｇｓｔ変異体９０Ｄ及び変異体０Ｄは、類似のＣＡＩ（それぞれ０．５４及び０．５６）並びにＣＡＩ（ＨＥＧ）（それぞれ０．３１及び０．３３）を有するものの異なるリボソーム変位を有するように設計された。変異体９０Ｄは、比較的大きいリボソーム変位を有するように設計され、その一方で変異体０Ｄは比較的小さい変位を有する。これにより、０Ｄに比べて変異体９０ＤのＢＮＩ及び総待機時間は大きくなった（表４参照）。ＢＮＩ及び総待機時間は、変異体０Ｄが９０Ｄに比べて高い収率を有するだろうと予測した。ＣＡＩ及びＣＡＩ（ＨＥＧ）によると、上記２つの変異体は同様の収率を有するはずであるが、ｇｓｔ変異体０Ｄは、変異体９０Ｄより２３％高い収率を示した。これは、ＢＮＩ及び総待機時間が、ＣＡＩ及びＣＡＩ（ＨＥＧ）に比べて、９０Ｄ及び０Ｄの活性レベルをより正確に予測することを示した。変異体２３は、変異体９０Ｄに比べて活性レベルの１７％の上昇を示した。ＣＡＩ及びＣＡＩ（ＨＥＧ）は、変異体２３の収率は変異体９０Ｄの収率より低いと予測した。対照的に、ＢＮＩ及び総待機時間は、変異体２３は変異体９０Ｄより高い収率をもたらすと予測した。ＢＮＩ及び総待機時間は、ＧＳＴ活性をより正確に予測した。ＣＡＩ及びＣＡＩ（ＨＥＧ）によると、変異体８０及び８２は、変異体Ｍ及びＶＭに比べて相当高い収率をもたらすはずである。しかしながら、測定された活性レベルは、変異体８０及び８２が変異体Ｍ及びＶＭと同等のレベルをもたらすことを示した。ＢＮＩは、開始時点にリボソーム待機時間値を含めると仮定して、変異体Ｍ及びＶＭと比較しての変異体８０及び８２のタンパク質収率をより正確に予測した。総待機時間指数は、ボトルネックを考慮に入れないため、変異体Ｍ及びＶＭに対する変異体８０及び８２のタンパク質収率を正確には予測しなかった。
【０１５７】
遺伝子最適化の比較
５つのタンパク質候補を選択し、大腸菌内で発現させて、モデルの最適化能力を評価し、コドンバイアス最適化と比較した。上記５つの候補は：ＧＳＴ、グルタチオンＳ‐トランスフェラーゼ；ＰＦ０１３２、α‐グルコシダーゼ；ＣＬＪＵ＿ｃ１１８８０、アルコールデヒドロゲナーゼ；並びにＲｔ８＿０５４２、エンドグルカナーゼ及びエキソグルカナーゼであった。ｇｓｔのモデル最適化を実施した。ｇｓｔのモデル最適化を、２つのコドンバイアス最適化アルゴリズム：１）「１アミノ酸、１コドン」法；及び２）「コドンテーブルマッチング、ランダムガイド（ｃｏｄｏｎ  ｔａｂｌｅ  ｍａｔｃｈｉｎｇ，  ｒａｎｄｏｍ  ｇｕｉｄｅｄ）」法のモデル最適化と比較した。単に変位を最小化することにより、ｃｌｊｕ＿ｃ１１８８０及びｐｆ０１３２の最適化を実施した。これは、コドンバイアスが野生型及びモデル最適化済み変異体の両方において略同一のままとなることを保証する。コドン適合指数（ＣＡＩ）［８６］を、コドンバイアスの測定値として使用した。開始によって引き起こされるタンパク質収率の偏差を標準化するために、全ての変異体の前端は変化させなかった。ｇｓｔの最初の５１個の塩基を、サリス（Ｓａｌｉｓ）社製ＲＢＳカルキュレータ［９０］を用いて最適化した。サリス社製ＲＢＳカルキュレータ［９０］を用いて遺伝子の前端を変化させることにより、翻訳の開始を、開始時にボトルネックが存在しないように最適化した。結果として得られた、サリス社製ＲＢＳカルキュレータによって生成された最適化済み前端を、全てのｇｓｔ変異体において使用したが、最適化済みｃｌｊｕ＿ｃ１１８８０及びｐｆ０１３２の最初の９０個の塩基は、それぞれの野生型の塩基を使用した。
【０１５８】
ＧＳＴ、グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ
遺伝子最適化及び図解分析
ｇｓｔは、力及び変位を最小化しながら最も豊富なｔＲＮＡをコードするコドンを選択することによって最適化された。これにより、遺伝子の平均位相角は、種角である‐２３°付近に保持された、ｇｓｔはまた、２つのコドンバイアス最適化アルゴリズムを用いて最適化された。「コドンバイアス最適化１（ｃｏｄｏｎ  ｂｉａｓ‐ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  １）」は、オプティマイザ［９１］によって「１アミノ酸、１コドン法」を用いて最適化された。「コドンバイアス最適化２（ｃｏｄｏｎ  ｂｉａｓ‐ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ２）」は、ＩＤＴＤＮＡ社のコドン・オプト（Ｃｏｄｏｎ  Ｏｐｔ）ソフトウェアによる「ランダムガイド、コドンテーブルマッチング（ｇｕｉｄｅｄ  ｒａｎｄｏｍ，  ｃｏｄｏｎ  ｔａｂｌｅ  ｍａｔｃｈｉｎｇ）」法を用いて、最適化された。コドンバイアス最適化アルゴリズムは、高発現遺伝子を基準遺伝子として使用した。ｇｓｔの最初の５１個の塩基は、サリス社製ＲＢＳカルキュレータ［９０］を用いて最適化された。サリス社製ＲＢＳカルキュレータ［９０］を用いて前端を最適化することにより、翻訳の開始を、開始時にボトルネックが存在しないように最適化した。結果として得られた、サリス社製ＲＢＳカルキュレータによって生成された最適化済み前端を、全てのｇｓｔ変異体において使用した。
【０１５９】
極性プロット分析は、「コドンバイアス最適化２」ｇｓｔの平均位相角が、野生型の位相角‐６１°から‐２５°へとシフトされたことを示した。「コドンバイアス最適化１」ｇｓｔの平均位相角は、野生型の位相角‐６１°から-３６°へとシフトされた。モデル最適化済み変異体は、種角付近に最適化され、従って位相角は‐２１°付近のままであった。
【０１６０】
野生型ｇｓｔに関して、リボソームはコドン５０から停止コドンへと変位した。リボソーム変位プロットは、コドンバイアス最適化済み変異体及びモデル最適化済み変異体の両方が変位を低減させたことを示した。モデル最適化済み変異体は、変位を最も低減させた。
【０１６１】
野生型ｇｓｔは、コドン６５及びコドン２００付近での長いリボソーム待機時間、並びにコドン６５及びコドン１９８付近でのボトルネックのクラスタリングを示した。リボソーム待機時間プロットは、コドンバイアス最適化済み変異体及びモデル最適化済み変異体の両方が、野生型に比べて、コーディング領域全体を通して待機時間を低減させたことを示した。翻訳ボトルネックプロットは、全ての最適化方法が、野生型に比べて、コーディング領域全体を通してボトルネックを低減させたことを示した。正規化されたＧＳＴ活性及びタンパク質収率予測指数を表５に示す。
【０１６２】
実験手順及び結果
野生型及び最適化済みｇｓｔ変異体を合成し、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社から入手可能なｐＢＡＤ／Ｍｙｃ‐Ｈｉｓ誘発性プラスミドへとクローニングした。ｇｓｔ遺伝子はジェネウィズ社又はジェンスクリプト社によって合成及びクローニングされた。関心対象の遺伝子挿入を含有するプラスミドを、化学的に競合する上位１０個の大腸菌細胞（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社から入手可能）へと形質転換し、０．０２％ｗ／ｖ（０．２ｍｇ／ｍｌ）アラビノースにおいて３時間発現させた。Ｐｂａｄ誘発性プロモータ［９６］を用いて、転写レベルを正規化した。１ミリメートルの誘発された細胞を培養し、ペレット化し、バグバスター（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ）及びリソナーゼ（Ｌｙｓｏｎａｓｅ）（いずれもＥＭＤミリポア社から入手可能）を用いて溶解させた。シグマ・アルドリッチ社から入手可能なＧＳＴアッセイキット（Ｅ．Ｃ．２．５．１．１８）を用いてＧＳＴ活性を定量化した。ＧＳＴ活性の上昇により、細胞溶解物はアッセイ前の２倍に希釈された。ＧＳＴの１単位は、１分あたり１μｍｏｌのＧＳ‐ＤＮＢコンジュゲートを産生するＧＳＴ酵素の量として定義される。サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社から入手可能なピアース（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキットを用いて、ＧＳＴ特異性活性を総タンパク質へと正規化した。総タンパク質の正規化を実施することによって、回収した多数の細胞の偏差を標準化した。正規化されたＧＳＴ活性レベルの単位は、総タンパク質のＡ５６２ｎｍあたりのＧＳＴの単位として定義され、ここで１Ａ５６２ｎｍは総タンパク質１８ｍｇに等しい。正規化されたＧＳＴ活性の単位の算出については、上述されている。３つの独立した誘発を実施することによって、再現性に関して試験した。各誘発から３個の試料を回収し、合計９個の試料をアッセイした。詳細な実験手順については上述されている。
【０１６３】
各ｇｓｔ変異体に関する正規化されたＧＳＴ活性及びタンパク質収率予測指数は、表５において確認できる。モデル最適化済み変異体は野生型に対して５３％の上昇を示し、「コドンバイアス最適化済み１」は野生型に対して１３％の上昇を示し、「コドンバイアス最適化済み２」は野生型に対して３４％の上昇を示した。全ての最適化は、総待機時間及びＢＮＩを低減し、総ＧＣ含有量を５０％近くに変化させた。ＣＡＩ及びＣＡＩ（ＨＥＧ）指数は、モデル最適化ｇｓｔ変異体のタンパク質収率を下方予測し、「コドンバイアス最適化１」変異体のタンパク質収率を上方予測した。ＢＮＩ及び総待機時間は、「コドンバイアス最適化１」変異体のタンパク質収率を上方予測した。
【０１６４】
表５  ｇｓｔ変異体の正規化されたＧＳＴ活性及びこれらの予測指数。野生型及び最適化済みｇｓｔ変異体の、正規化されたＧＳＴ活性、ＣＡＩ、ＣＡＩ（ＨＥＧ）、総待機時間及びＢＮＩ値を列挙する。ＣＡＩは、大腸菌ゲノムコーディング配列［９４］を基準遺伝子として用いたコドン適合指数である。ＣＡＩ（ＨＥＧ）は、［９１］からの高発現遺伝子を基準遺伝子として用いたコドン適応指数である。総待機時間及びＢＮＩ（ボトルネック指数）は、モデルからのタンパク質収率予測指数である。モデル最適化済み変異体は野生型に対して５３％の上昇を示した。「コドンバイアス最適化１」は野生型に対して１３％の上昇を示した。「コドンバイアス最適化２」は野生型に対して３４％の上昇を示した。
【表５】
2018509930.tif 000044
±は標準偏差を示す。１正規化されたＧＳＴ活性は、総タンパク質のＡ５６２ｎｍあたりのＧＳＴの単位として測定され、ここで１Ａ５６２ｎｍは総タンパク質１８ｍｇに等しい。１単位のＧＳＴは、１分あたり１μｍｏｌのＧＳ‐ＤＮＢコンジュゲートを生成するＧＳＴ酵素の量として定義される。
【０１６５】
ＣＬＪＵ＿ｃ１１８８０、アルコールデヒドロゲナーゼ
遺伝子最適化及び図解分析
ｃｌｊｕ＿ｃ１１８８０は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）であり、単に変位を最小化することにより最適化された。これを実施することにより、コドンバイアスが２つの変異体間で同様のままとなることが保証され、リボソーム変位のみの効果をより良好に比較できる。変位の最小化により、遺伝子の平均位相角（‐６０°）もまた、‐２５°の種角に近づくようにシフトされる。ボトルネック指数（ＢＮＩ）は、コドン３１７における６１５からコドン９３における３２２へと低下する。野生型ｃｌｊｕ＿ｃ１１８８０は、コドン３００〜コドン３５０までの極めて長い待機時間を示した。総待機時間もまた、３９０５サイクルから最適化後に３０４７サイクルまで低下した（表６を参照）。
【０１６６】
実験手順及び結果
野生型及びモデル最適化済みｃｊｌｕ＿ｃ１１８８０遺伝子両方は、ジェネウィズ社によって合成され、ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ‐Ｈｉｓベクターへとクローニングされた。関心対象の遺伝子挿入を含有するプラスミドを、化学的に競合する上位１０個の大腸菌細胞（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社から入手可能）へと形質転換し、０．２％ｗ／ｖ（２ｍｇ／ｍｌ）アラビノースにおいて４時間誘発させた。Ｐｂａｄ誘発性プロモータ［９６］を用いて、転写レベルを正規化した。２ミリメートルの誘発された細胞を培養し、ペレット化し、バグバスター（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ）及びリソナーゼ（Ｌｙｓｏｎａｓｅ）（いずれもＥＭＤミリポア社から入手可能）を用いて溶解させた。アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ、Ｅ．Ｃ．１．１．１．１）酵素アッセイ（シグマ・アルドリッチ社から入手可能なプロトコル）及びＳＤＳ‐ＰＡＧＥを細胞溶解物に対して実行して、ＣＬＪＵ＿Ｃ１１８８０タンパク質収率を定量化した。ＡＤＨの１単位は、１分あたり１μｍｏｌのＮＡＤＨを産生するＡＤＨ酵素の量として定義される。サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社から入手可能なピアース（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキットを用いて、ＡＤＨ特異性活性を総タンパク質へと正規化した。総タンパク質の正規化を実施することによって、回収した多数の細胞の偏差を標準化した。正規化されたＡＤＨ活性の単位は、総タンパク質のＡ５６２ｎｍあたりのＡＤＨの単位として定義され、ここで１Ａ５６２ｎｍは総タンパク質１８ｍｇに等しい。正規化されたＡＤＨ活性の単位の算出については、本明細書中の他の箇所で確認できる。２つの独立した誘発を実施することによって、再現性に関して試験した。各誘発から２個の試料を回収し、合計４個の試料をアッセイした。これらの手順のための詳細なプロトコルについては上述されている。
【０１６７】
野生型及び最適化済み変異体は、可溶性（活性）形態及び不溶性（不活性）封入体としてタンパク質を産生した。タンパク質の両方の画分を定量化して、野生型ｃｊｌｕ＿ｃ１１８８０と最適化済みｃｊｌｕ＿ｃ１１８８０との間で産生を比較した。上記酵素アッセイの結果を表６に示す。最適化済み変異体の活性において４４％の上昇が測定された。
【０１６８】
表６  ｃｌｊｕ＿ｃ１１８８０変異体及びそのタンパク質収率予測指数。野生型及びモデル最適化済みｃｌｊｕ＿ｃ１１８８０の、正規化されたＡＤＨ活性、ＣＡＩ、ＣＡＩ（ＨＥＧ）、総待機時間及びＢＮＩ値を列挙する。ＣＡＩは、大腸菌ゲノムコーディング配列［９４］を基準遺伝子として用いたコドン適合指数である。ＣＡＩ（ＨＥＧ）は、［９１］からの高発現遺伝子を基準遺伝子として用いたコドン適応指数である。総待機時間及びＢＮＩ（ボトルネック指数）は、モデルからのタンパク質収率予測指数である。モデル最適化済み変異体は野生型より４４％高い活性を得た。
【表６】
2018509930.tif 000045
±は標準偏差を示す。１正規化されたＡＤＨ活性は、総タンパク質のＡ５６２ｎｍあたりのＡＤＨの単位として測定され、ここで１Ａ５６２ｎｍは総タンパク質１８ｍｇに等しい。１単位のＡＤＨは、１分あたり１μｍｏｌのＮＡＤＨを生成するＡＤＨ酵素の量として定義される。
【０１６９】
ＣＬＪＵ＿ｃ１１８８０はまた、不溶性封入体形態で産生された。封入体を、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥを用いて精製及び定量化した。陰性変異体、即ちｃｌｊｕ＿ｃ１１８８０遺伝子挿入を含有しない形質転換プラスミドも、ｃｌｊｕ＿ｃ１１８８０変異体と共に発現され、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル上で可視化された。変異体にわたってＣＬＪＵ＿ｃ１１８８０の産生を比較するゲルを調製した。試料は全細胞溶解物、活性酵素の可溶性画分、及び封入体の不溶性画分由来であった。この比較から、黒色の矢印で示されているように、最適化済みｃｌｊｕ＿ｃ１１８８０における封入体の産生が顕著に低下した。上記陰性変異体（非遺伝子挿入プラスミド）において封入体産生が欠如していること、並びに（赤色及び黒色矢印で示されている）タンパク質バンドに関する〜４０ｋＤａの推定サイズは、これらのバンドが推定されることを示した。
【０１７０】
ＰＦ０１３２、α‐グルコシダーゼ
遺伝子最適化及び図解分析
ｐｆ０１３２もまた、変位の最小化のみに基づいて最適化した。これは、変位の最小化がタンパク質収率を上昇させるかどうかを確認するために実施された。変位の最小化により、最適化済み変異体の位相角は‐４４°へと変化した。ｐｆ０１３２の最適化はまた、総待機時間を減少させ、ボトルネックの影響を低減した（表７参照）。
【０１７１】
表７  ｐｆ０１３２変異体及びそのタンパク質収率予測指数。ｐｆ０１３２変異体の、ＣＡＩ、ＣＡＩ（ＨＥＧ）、総待機時間及びＢＮＩ値を列挙する。ＣＡＩは、大腸菌ゲノムコーディング配列［９４］を基準遺伝子として用いたコドン適合指数である。ＣＡＩ（ＨＥＧ）は、［９１］からの高発現遺伝子を基準遺伝子として用いたコドン適応指数である。総待機時間及びボトルネック指数（ＢＮＩ）は、モデルからのタンパク質収率予測指数である。ＧＣ％は、総ＧＣ含有量の百分率である。
【表７】
2018509930.tif 000046
【０１７２】
実験手順及び結果
野生型ｐｆ０１３２は、パイロコッカス・フリオサスゲノムからクローニングした［８７］。最適化済みｐｆ０１３２遺伝子は、ジェンスクリプト社によって合成された。最終アラビノース濃度０．２％ｗ／ｖ（２ｍｇ／ｍｌ）において４時間にわたる上位１０個の大腸菌株（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社から入手可能）におけるタンパク質産生のために、野生型及び最適化済みｐｆ０１３２の両方を、ｐＢＡＤ‐Ｍｙｃ‐Ｈｉｓプラスミド（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社から入手可能）へとクローニングした。Ｐｂａｄ誘発性プロモータ［９６］を用いて、転写レベルを正規化した。１ミリメートルの誘発された細胞を培養し、ペレット化し、バグバスター（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ）及びリソナーゼ（Ｌｙｓｏｎａｓｅ）（いずれもＥＭＤミリポア社から入手可能）を用いて溶解させた。得られた溶解物は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥをアッセイするために使用した。これらの手順のための詳細なプロトコルは、本明細書中の他の箇所に記載されている。
【０１７３】
ｐｆ０１３２及びその最適化済み変異体は、酵素活性を有しない不溶性封入体を産生した。従って、産生された（不活性）タンパク質の量を、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルを用いて測定した。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥの濃度計分析は、野生型ＰＦ０１３２のバンド（５５ｋＤ、３２ｋＤ）に対する、最適化済みＰＦ０１３２のバンド（５５ｋＤ及び４０ｋＤ）の密度の２１０％の上昇を示した。これは、最適化済み遺伝子は封入体形態として産生されたものの、野生型と比較して、ＰＦ０１３２タンパク質の産生の実質的な改善を暗示している。タンパク質バンドは、ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ／ＴＯＦ及びＬＣ‐ＥＳＩ‐ＭＳ／ＭＳ質量分析を用いて、ＰＦ０１３２として同定した。
【０１７４】
Ｒｔ８＿０５４２
遺伝子最適化及び図解分析
野生型及びコドンバイアス最適化済みｒｔ８＿０５４２を、モデルを用いて分析して、野生型遺伝子と比較した場合のコドンバイアス最適化の動態を決定した。コドンバイアス最適化は、ＩＤＴＤＮＡ社のコドン・オプト（Ｃｏｄｏｎ  Ｏｐｔ）ソフトウェアによる「ランダムガイド、コドンテーブルマッチング」法を用いて、最適化された。野生型ｒｔ８＿０５４２は、大腸菌内で良好に産生されず、一方、コドンバイアス最適化済みｒｔ８＿０５４２は、水溶性タンパク質及び封入体の両方として良好に産生された。モデル最適化済みｒｔ８＿０５４２もまた、野生型とコドンバイアス最適化済みとの間の比較のための基準として存在する。しかしながら、この変異体のインビボ発現は実施されなかった。全体的及び局所的ＧＣ含有量をいずれも、全変異体に関して計算した。局所的ＧＣ含有量プロットは、ウインドウサイズ５０で［９９］を用いて計算された。３つの変異体に関する全てのタンパク質収率予測指数の概要を、表９に示す。
【０１７５】
野生型の位相角は、遺伝子の始点において‐９０°であり、コドン６００付近の配列の後半における‐１０°へと漸進的にシフトする。野生型遺伝子の局所的ＧＣ含有量の、４０％ＧＣ含有量から５０％ＧＣ含有量へのシフトも、ヌクレオチド２０００において同様の地点で発生する。位相角が「誤った（ｗｒｏｎｇ）」角度（‐９０°）において始まるため、リボソームは野生型遺伝子の翻訳時に、コドン４００付近において１．５変位単位だけ下流へ変位した（これは、＋１リーディングフレームに向かう３／４ヌクレオチド分の不整合に対応する）。野生型ｒｔ８＿０５４２のリボソーム待機時間プロットは、コドン４００〜５００付近での長い待機時間（７０〜１２９サイクル）のクラスタリングを示した。内因性大腸菌遺伝子に関する正常なリボソーム待機時間は、コドンあたり約５〜２０サイクルである。これは、コドン４００〜５００付近におけるボトルネックをもたらす。最大リボソーム待機時間は、コドン４７６における１２９サイクルである。コドン４７６は、イソロイシン希少コドンＡＴＡをコードする。本モデルによると、リボソームは、大きなリボソーム変位及び極めて長いリボソーム待機時間により、コドン４７６を超えて翻訳を行う可能性が低い。野生型変異体は、ＢＮＩ３６２及び総待機時間１５０５３サイクルを示した。これはモデル最適化済み及びコドンバイアス最適化済み変異体の両方よりも大きい（表９を参照）。
【０１７６】
コドンバイアス最適化済み変異体は、‐２４°の平均位相角を示し、これは種角に極めて近い。このコドンバイアス最適化は偶然のものであった。というのは、「ランダムガイド、コドンテーブルマッチング」最適化法によって、種角から更に離間し得るランダムな平均位相角もたらされるためである。遺伝子の位相角はコーディング領域全体を通して種角付近であるため、局所的GC含有量もまた約５０％のままとなるが、一方で全体的GC含有量は５１％である。コドンバイアス最適化済み変異体の変位プロットは、野生型変異体と比較した場合に低減された変位を示した。リボソーム待機時間は、コドンあたり２０サイクル未満まで減少し、ボトルネックは野生型に比べて、コーディング領域全体を通して減少した。コドンバイアス最適化済み変異体は、ＢＮＩ２１８及び総待機時間１１５１１サイクルを示した。これは野生型変異体よりも有意に小さい（表９を参照）。
【０１７７】
モデル最適化済み変異体は、‐２５°の平均位相角を示し、これは種角に極めて近い。全体的ＧＣ含有量（表９を参照）、及び局所的ＧＣ含有量は、いずれも５０％付近のままであった。モデル最適化済み変異体の変位プロットは、野生型及びモデル最適化済み変異体両方より小さい最小変位を示した。リボソーム待機時間は、コドンあたり２０サイクル未満まで低減され、またボトルネックは、野生型に比べて、コーディング領域全体を通して低減された。モデル最適化済み変異体は、ＢＮＩ１５２及び総待機時間９１６１サイクルを示し、これはコドンバイアス最適化済み及びコドンバイアス最適化済み変異体の両方よりも小さい（表９を参照）。
【０１７８】
表９  ｒｔ８＿０５４２変異体及びそのタンパク質収率予測指数。ｒｔ８＿０５４２変異体の、ＣＡＩ、ＣＡＩ（ＨＥＧ）、総待機時間及びＢＮＩ値を列挙する。ＣＡＩは、大腸菌ゲノムコーディング配列［９４］を基準遺伝子として用いたコドン適合指数である。ＣＡＩ（ＨＥＧ）は、［９１］からの高発現遺伝子を基準遺伝子として用いたコドン適応指数である。総待機時間及びボトルネック指数（ＢＮＩ）は、モデルからのタンパク質収率予測指数である。ＧＣ％は、総ＧＣ含有量の百分率である。
【表９】
2018509930.tif 000047
【０１７９】
実験手順及び結果
研究室での実験は、ロバート・ケリー博士（Ｄｒ．  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｋｅｌｌｙ）の研究室においてジョナサン・コンウェイ（Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｃｏｎｗａｙ）によって実施され、許可を得て本明細書に含まれている。野生型ｒｔ８＿０５４２は大腸菌において良好に発現されていないが、コドンバイアス最適化済み変異体は、可溶性及び不溶性画分として良好に発現された。コドンバイアス最適化済みｒｔ８＿０５４２を、１３℃において、アークティック・エクスプレス（Ａｒｃｔｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓ）ＤＥ３  ＲＩＬ大腸菌株でＴ７プロモータ（ｐＥＴ４５プラスミド）を用いて、過剰発現させた。アークティック・エクスプレスＤＥ３  ＲＩＬ細胞は、タンパク質の折りたたみを支援するため、及び封入体形成を防止又は低減するためのシャペロンを含む。コドンバイアス最適化済みｒｔ８＿０５４２の可溶性部分を、ｈｉｓタグ付加精製（Ｎｉ‐ＮＴＡカラム）を用いて精製し、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル上で可視化した。
【０１８０】
タンパク質収率予測指数‐ＢＮＩ対ＣＡＩの比較
モデルを用いて精製された新たなボトルネック指数（ＢＮＩ）に対して、標準的なコドン適合指数（ＣＡＩ）の有効性を比較するために、上記指数と正規化されたＧＳＴ活性との間の相関を比較した。ＢＮＩは、正規化されたＧＳＴ活性レベルと最良の相関を記録し、ｒ＝‐０．９６、及びｒ‐２乗＝０．９２であった。総待機時間は、第２の最良の相関を記録し、ｒ＝‐０．８９及びｒ‐２乗＝０．８０であった。ＢＮＩ及び総待機時間は、コドンバイアス指数ＣＡＩ及びＣＡＩ（ＨＥＧ）よりも、正規化されたＧＳＴ活性レベルと、より良好に相関していた。ＣＡＩは、ｒ＝‐０．７５及びｒ‐２乗＝０．５７と相関し、その一方でＣＡＩ（ＨＥＧ）はｒ＝‐０．６８及びｒ‐２乗＝０．４７を記録した。基準として、０．５を超えるｒは相関の存在を示し、０．８を超えるｒは極めて高い相関を示す。
【０１８１】
ＢＮＩとＣＡＩとの間の相関は、ｒ＝０．５９をもたらした。これは、ＢＮＩがＣＡＩと相関することを示す。というのは、これらはいずれも本質的にはｔＲＮＡ存在量を測定するためである。ＢＮＩは、ドングら（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）［８９］からの実際のｔＲＮＡ存在量測定値を使用し、ＣＡＩは基準としてゲノムコドン周波数を使用する。これら２つの指数は、タンパク質収率を予測するための２つの異なる基準ソースを使用するが、いずれも、互いとの及びタンパク質収率との相関を示した。これは、ゲノムコドン周波数が本質的にｔＲＮＡ存在量を測定することを示している。しかしながら、ｔＲＮＡ存在量のみを測定するＣＡＩ及びＣＡＩ（ＨＥＧ）とは異なり、ＢＮＩはリボソーム変位、力、及び長いリボソーム待機時間のクラスタリング（ボトルネック）も考慮する。ＢＮＩは、開始又は終了時のボトルネックは考慮しないが、リボソーム待機時間値を加算することにより、いずれの位置におけるボトルネックを増加させることができる。
【０１８２】
２つの遺伝子が同一の総待機時間を有しながら異なる「低速」翻訳密集部位を有することができ、これがボトルネックをもたらすため、総待機時間はＢＮＩと同様のスコアを記録しなかった。ｍＲＮＡは複数のリボソームによって同時にタンパク質へと翻訳されるため、局所的に近接して密集している複数の「低速」翻訳領域は、遺伝子全体にわたって分散している領域を妨害するよりも、収率に関してより有害となる。総待機時間は、コドン領域内、開始、又は終了時のボトルネックを考慮しない。
【０１８３】
ＣＡＩ及びＣＡＩ（ＨＥＧ）の両方は、ｒ値及びｒ‐２乗値に従って同様に相関した。しかしながらこの相関は、ＢＮＩ及び総待機時間よりも低かった。これは、ＣＡＩ及びＣＡＩ（ＨＥＧ）がコドンバイアスのみを考慮し、遺伝子内のこれらのコドンの「順序」を考慮しないためである。２つの遺伝子は、同様のコドンバイアスを有するものの、コドンの順序により異なるリボソーム変位及び翻訳ボトルネックを有することができる。ＣＡＩ及びＣＡＩ（ＨＥＧ）とは異なり、ＢＮＩ及び総待機時間は、コドンがインビボで翻訳される際のコドンの実際の配列を考慮することによって、コドンの上記配列がリボソーム変位、力、翻訳ボトルネック（総待機時間に関してではなく、ＢＮＩに関してのみ）、及びアミノアシル‐ｔＲＮＡ使用にどのように影響するかを考慮する。
【０１８４】
ｇｓｔの最適化
全ての最適化済み変異体は、位相角を、‐６１°（野生型遺伝子の位相角）から大腸菌の種角である‐２５°へとシフトさせ、これは変位を最小化する。全ての最適化済み変異体は、遺伝子のＧＣ含有量を５０％近くにシフトさせ、これは大腸菌ゲノムのＧＣ含有量と一致する。コドンバイアス最適化済み及びモデル最適化済み変異体はいずれも、リボソーム待機及びボトルネック形成効果を最小化するが、モデル最適化済み変異体は、コドンバイアス最適化済み変異体よりもボトルネックを良好に最小化する（表５を参照）。
【０１８５】
３つの最適化済み変異体は全て、野生型遺伝子に対するタンパク質収率の上昇を生成した。モデル最適化済み変異体は、野生型からの最大の上昇（５３％の改善）を生成した。「ランダムガイド、コドンテーブルマッチング」法を用いた「コドンバイアス最適化２」変異体は、２番目に高い収率の上昇（３４％の改善）を生成した。「１アミノ酸、１コドン」法を用いた「コドンバイアス最適化１」は、収率の最小の上昇（１３％の改善）を生成した。コドンバイアス最適化済み及びモデル最適化済み変異体はいずれも、（［１０５、１０６、１０７］において観察されるように）野生型ｇｓｔに比べてタンパク質収率の「有意な」増加を示さなかった。これは、野生型ｇｓｔが既に大腸菌において高度に発現しているためである。翻訳伸長に関するｇｓｔの最適化は恐らく、タンパク質収率を上昇させるために上限に達した。
【０１８６】
「１アミノ酸、１コドン」法が収率のより大きな上昇を示さなかった理由は恐らく、アミノアシル‐ｔＲＮＡ枯渇のためである。「１アミノ酸、１コドン」法は、「ランダムガイド、コドンテーブルマッチング」法において実装されるようにｔＲＮＡ使用を広げるのではなく、アミノ酸あたり１つのｔＲＮＡ種しか使用しない。「１アミノ酸、１コドン」法を用いた最適化は、利用可能なアミノアシル‐ｔＲＮＡの使用に関する、異種タンパク質産生と内因性タンパク質産生との間の競合をもたらす。この競合は利用可能なアミノアシル‐ｔＲＮＡを枯渇させ、従ってタンパク質収率は悪影響を受ける。これらの観察は、ウェルヒら（Ｗｅｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）［１０２］、ディットマールら（Ｄｉｔｔｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．）［１０３］、エルフら（Ｅｌｆ  ｅｔ  ａｌ．）［１０４］、及びメンゼラ（Ｍｅｎｚｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．）［１０９］において説明されていた。ＣＡＩ、ＣＡＩ（ＨＥＧ）、ＢＮＩ及び総待機時間は、「１アミノ酸、１コドン」最適化法を用いた「コドンバイアス最適化１」変異体のタンパク質収率を上方予測した。これは、ＣＡＩ、ＣＡＩ（ＨＥＧ）、ＢＮＩ及び総待機時間がアミノアシル‐ｔＲＮＡの無制限の利用可能性を前提としているためである。しかしながら、アミノアシル‐ｔＲＮＡの利用可能性は限定されており、内因性タンパク質産生及び異種タンパク質産生の両方が同一のｔＲＮＡ種に関して競合すると、アミノアシル‐ｔＲＮＡは枯渇することになり得る。また、ＣＡＩ及びＣＡＩ（ＨＥＧ）は、モデル最適化済み変異体のタンパク質収率を下方予測した。これは、ＣＡＩ及びＣＡＩ（ＨＥＧ）が翻訳ボトルネックを考慮していないためである。
【０１８７】
ｃｌｊｕ＿ｃ１１８８０の最適化
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）であるｃｌｊｕ＿ｃ１１８８０は、単に変位を最小化することによって最適化された。これは、変位を最小化するだけでタンパク質収率が上昇するかどうかを評価するために、意図的に行われた。また、変位を最小化することによる最適化は、コドンバイアスが両方の変異体において同様となることを保証した。最適化されたｃｌｊｕ＿ｃ１１８８０は、野生型と比較した場合に４４％の酵素活性の上昇、及び封入体産生の減少を示した。
【０１８８】
封入体産生の減少は、コドン２７０から３８０への変位の減少によってリボソームが正しいアミノアシル‐ｔＲＮＡを選択することによって引き起こされる可能性がある。誤ったアミノアシル‐ｔＲＮＡをピックアップし、誤ったアミノ酸を取り込むことが、誤った折り畳み及び封入体の産生を引き起こし得る［１１０、１１１］。野生型ｃｌｊｕ＿ｃ１１８８０はまた、コドン３００〜３５０の極めて長いリボーム待機時間を示し、これは同位置付近におけるボトルネックをもたらした。ｃｌｊｕ＿ｃ１１８８０の最適化は、同位置においてリボソーム待機時間及びボトルネックを低減した。リボソームは、コドン３００〜３５０付近の長いリボソーム待機時間によって停止し得る。停止したリボソームは解離し、部分的に完成したＣＬＪＵ＿Ｃ１１８８０を産生し、これは活性酵素を形成するために正確に折り畳まれない場合がある。これらの部分的に産生されたポリペプチドは、封入体を形成でき［１１１］、上記封入体は恐らく、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ上の封入体画分において、約３５ｋＤＡの２つの比較的小さいバンドのソースとなる。これらの２つの比較的小さいバンドの強度は、最適化済み変異体では大幅に低下し、これは封入体産生の低下を示唆する。最適化済み変異体におけるリボソーム待機時間の低減は、リボソーム停止及び解離を有し得る。リボソーム停止及び解離の低減は、最適化済み変異体の上記２つの比較的小さいバンドにおいて観察されるような、封入体産生の減少を引き起こし得る。これらの上述の仮定及び観察は、モデルの待機時間パラメータを用いた遺伝子の最適化により、タンパク質の折り畳みを改善でき、従って封入体産生を低減又は排除できることを示唆している。この仮定は、ペッヒマンら（Ｐｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．）［９７］及びリーら（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．）［９８］によっても示唆され、またシラーら（Ｓｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ）［９６］によって、リボソーム翻訳速度を低下させることによってインビボで実証されている。
【０１８９】
ｐｆ０１３２の最適化
ｐｆ０１３２は、単に変位を最小化することによって最適化された。これは、変位の最小化によってタンパク質収率が上昇するかどうかを観察するために行われた。ｐｆ０１３２を封入体形態としてのみ産生した。最適化済みｐｆ０１３２は、野生型と比較した場合に、封入体産生の増大を示した。ｐｆ０１３２は、１００℃において生存する好極限性細菌パイロコッカス・フリオサスからクローニングされた。ＰＦ０１３２は、３７℃よりも遥かに高い温度において折り畳まれるよう、進化的に設計され、上記温度は、大腸菌がこれらの実験においてｐｆ０１３２を発現する温度である。中温程度の温度で折り畳まれた好熱性タンパク質は、不適切な折り畳みのため、封入体を形成する傾向を有する［１１２、１１３］。
【０１９０】
ｒｔ８＿０５４２の最適化
モデル分析は、大腸菌における野生型ｒｔ８＿０５４２の不良な発現の潜在的原因を示した。「正しくない（ｉｎｃｏｒｒｅｃｔ）」位相角は、変位されたリボソームをもたらし、これはコドン４００〜５００付近においてリボソーム待機時間及びボトルネックを増大させた。最大リボソーム待機時間は、コドン４７６における１２９サイクルである。コドン４７６は、イソロイシン希少コドンＡＴＡをコードする。本モデルによると、リボソームは、大きなリボソーム変位及び極めて長いリボソーム待機時間により、コドン４７６を超えて翻訳を行う可能性が低い。このリボソーム待機時間の増大は、（内因性遺伝子及びｐｒｆＢと比較して）リボソームが解離して翻訳を停止するのに実質的に十分なものとなり得る。あるいは、リボソームは、＋１．５単位の大きなリボソーム変位（＋１リーディングフレームへの３／４ヌクレオチド分の不整合）によって大きくフレームシフトして、新たなリーディングフレームの停止コドンに遭遇し得る。比較を目的として、内因性遺伝子は５〜２０サイクルのリボソーム待機時間を示し、一方でｐｒｆＢはフレームシフト部位において１４７サイクルのリボソーム待機時間を示した。対照的に、モデル分析は、大腸菌におけるコドンバイアス最適化済み変異体の良好な発現をもたらす根底にある要因を示した。コドンバイアス最適化済み変異体の位相角は、コーディング領域全体にわたって種角に密接に従っていた。（「ランダムガイド、コドンテーブルマッチング」法を用いた）コドンバイアス最適化が、種角に必ずしも厳密に従わない確率論的プロセスであるという事実から、これは「ランダムな幸運（ｒａｎｄｏｍ  ｌｕｃｋ）」であった。種角に近いままであることにより、「ばね」の圧縮又は伸長が最小となり、これは変位も最小化する。コドンバイアス最適化は、リボソーム変位、リボーム待機時間及びボトルネックを低減した。ｒｔ８＿０５４２のモデル最適化もまた、コドンバイアス最適化及び野生型変異体とのコンピュータによる比較のための基準として含まれていた。本モデルを使用してｒｔ８＿０５４２を最適化すると、リボソーム変位、リボーム待機時間及び翻訳ボトルネックの低減がもたらされた。これらの低減は、コドンバイアス最適化による低減を上回った。
【０１９１】
結論
収率を決定するための指数が、ｇｓｔの複数のｍＲＮＡ変異体の発現レベルに基づいて開発された。この指数はボトルネック指数（ＢＮＩ）と呼ばれ、遺伝子の翻訳中の長いリボソーム待機時間のクラスタリングを測定するものである。この指数の開発は、「リボソーム渋滞」及び「リボソームフットプリント」の原理に基づくものであった。総リボソーム待機時間もまた、翻訳効率の尺度として使用できる。測定されたタンパク質収率に関するこれらの新しい測定基準を比較すると、ＢＮＩはｒ‐２乗＝０．９２と相関し、総待機時間はｒ‐２乗＝０．８０と相関した。一方、ＣＡＩ及びＣＡＩ（ＨＥＧ）はそれぞれｒ‐２乗＝０．５７及び０．４７を記録した。これは、ＢＮＩ及び総待機時間が、収率の予測に関してより良好な指標であることを示している。しかしながら、ＢＮＩ及び総待機時間は、これらをＣＡＩの予測とより広範に比較するために、より大きなデータセットを用いて更に試験する必要がある。ＢＮＩは、開始又は終了時のボトルネックを考慮しないが、予測精度を上昇させるために、これらの位置に値を手動で加算できる。ＢＮＩはまた、特に「１アミノ酸、１コドン」コドンバイアス最適化の場合に、タンパク質収率を上方予測する場合がある。これは、ＢＮＩが無制限のアミノアシル‐ｔＲＮＡの利用可能性を仮定しているためである。
【０１９２】
本モデルを用いて最適化された遺伝子は、コドンバイアス最適化済み変異体及び野生型変異体と比較した場合に上昇したタンパク質レベルを示した。モデル最適化済みｇｓｔは野生型に対して５３％の上昇を示し、「コドンバイアス最適化２」は野生型の３４％の上昇を示し、「コドンバイアス最適化１」は野生型に対して１３％の上昇を示した。モデル最適化済みｃｌｊｕ＿ｃ１１８８０は、野生型に比べて４４％の活性の上昇及び封入体形成の減少を示した。これは、本モデルが、リボソーム待機時間パラメータを変更することによって封入体を低減又は排除する能力を有することを示した。モデル最適化済みｐｆ０１３２は、濃度計分析を用いて、タンパク質産生の２００％の上昇を示した。残念なことに、野生型及び最適化済み変異体はいずれも、封入体としてのみ産生された。野生型、モデル最適化済み及びコドンバイアス最適化済み変異体は、封入体及び少量の水溶性画分を産生した。変異体間のタンパク質レベルの差異は、予備的データからは区別が困難であり、上記結果は決定的なものではない。更なる研究室での実験が必要である。野生型ｒｔ８＿０５４２の分析は、最初の５００個のコドンが、長いリボソーム待機時間及びボトルネックにより、タンパク質収率対して有害であることを示した。本モデルは、リボソームがコドン４００と５００との間のｍＲＮＡから解離した可能性があること、あるいは、リボソームが、＋１．５単位という大きなリボソーム変位（＋１リーディングフレームへの３／４ヌクレオチド分の変位）によりフレームシフトして、新たなリーディングフレームにおいて停止コドンと遭遇する可能性があることを示唆した。逆に、コドンバイアス最適化は、リボソーム待機時間及びボトルネックを低減し、これにより、リボソームが遺伝子をより効率的に翻訳できるようになった。モデル最適化済み変異体は、コドンバイアス最適化済み変異体と比較して、リボソーム変位、総待機時間及び翻訳ボルネックのより大きな低減を示した。
【０１９３】
極性プロットによって示されているように、コドンバイアス最適化は、野生型遺伝子の平均位相角を大腸菌の位相角の「作用（ｗｏｒｋｉｎｇ）」範囲へと変化させた。（高発現遺伝子を基準として用いる）「１アミノ酸、１コドン」コドンバイアス最適化法は常に、遺伝子の平均位相角を‐４５°付近に変化させた。これは、高発現遺伝子の平均位相角が‐４５°付近であるためである。「ランダムガイド、コドンテーブルマッチング」コドンバイアス最適化法は確率論的アルゴリズムであるため、最適化の度に遺伝子の平均位相角を「ランダムに（ｒａｎｄｏｍｌｙ）」変化させる（コドンバイアス最適化済みｒｔ８＿０５４２及びｇｓｔ変異体の位相角を参照）。しかしながら、平均位相角は、依然として大腸菌の位相角の「作用」範囲内にとどまっている。これらのコドンバイアス最適化方法はいずれも種角に達さず（ただし「コドンテーブルマッチング、ランダムガイド」法は偶然種角に「達する（ｈｉｔ）」場合がある）、これによりリボソームのわずかな変位がもたらされる。このわずかな変位は非常に長い遺伝子にわたって蓄積し、リボソーム待機時間及びボトルネックを増大させる。本モデルは、種角を用いて遺伝子の位相角を最適化することにより、種角に近い平均位相角を得る。従って、リボソーム変位は、コーディング領域全体を通して、コドンバイアス最適化を用いる場合よりも大幅に最小化される。遺伝子の位相角（位相角は１６Ｓ  ｒＲＮＡ露出テール及びｍＲＮＡの結合パターンに関連している）を変化させると、遺伝子の全体的及び局所的ＧＣ含有量も変化することに留意されたい。この観察結果は最適化の例ｒｔ８＿０５４２において示されている。従って、ＧＣ含有量は１６Ｓ  ｒＲＮＡ３’露出テールのヌクレオチド組成に関連していると主張される。
【０１９４】
実験結果により、リボソーム変位、リボソーム待機時間及び翻訳ボトルネックの低減が通常、総タンパク質収率を上昇させることが示された。ＣＬＪＵ＿ｃ１１８８０最適化の場合、変位、リボーム待機時間及びボトルネックの低減は、封入体産生も減少させた。実験結果により、モデルの翻訳ボトルネック原理を用いた最適化が、コドンバイアス最適化よりも大きなタンパク質収率の改善を示すことも示された。これは、コドンバイアス最適化が、Ｐ部位に対する１６Ｓ  ｒＲＮＡテール：ｍＲＮＡ結合の位置に影響を及ぼすコドンの「順序」を考慮しないためである。Ｐ部位に対する１６Ｓ  ｒＲＮＡテール：ｍＲＮＡ結合の距離は、「位相角」を用いて算出される。望ましくない結合（種角と異なる位相角）は、ばねを圧縮又は伸長させ、これはリボソームに力を印加する。従ってこの余剰の力により、変位されたリボソームがもたらされ得る。変位されたリボソームは、リボーム待機時間を増大させ、これは翻訳ボトルネックをもたらす場合があり、従ってタンパク質レベルを低下させ得る。
【０１９５】
実験結果により、ＢＮＩがＣＡＩ及びＣＡＩ（ＨＥＧ）よりも良好な、タンパク質収率の予測因子であることも示された。これは、ＣＡＩ及びＣＡＩ（ＨＥＧ）がコドンバイアスのみを考慮し、遺伝子内でのこれらのコドンの「順序」を考慮しないためである。２つの遺伝子は、以前の段落で説明したように、同様のコドンバイアスを有するものの、コドンの「順序」により異なるリボソーム変位及び翻訳ボトルネックを有することができる。ＣＡＩ及びＣＡＩ（ＨＥＧ）とは異なり、ＢＮＩは、アミノアシル‐ｔＲＮＡ使用をコドンの「順序」と共に考慮しており、これは、リボソームに対して印加される力、リボソーム変位及び翻訳ボトルネックに影響を及ぼす。
【０１９６】
この章で観察された結果及びヴーら（Ｖｕ  ｅｔ  ａｌ．）［９３］、リーら（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．）［９８］、ウェルヒら（Ｗｅｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）［１０２］、アラートら（Ａｌｌｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．）［１１４］、クドラら（Ｋｕｄｌａ  ｅｔ  ａｌ．）［１１５］及びティノコら（Ｔｉｎｏｃｏ  ｅｔ  ａｌ．）［１１６］によって公開された文献に基づいて、翻訳伸長からのタンパク質収率の決定因子は単にコドンバイアスだけではなく、アミノアシル‐ｔＲＮＡの使用と、１６Ｓ  ｒＲＮＡ３’末端とｍＲＮＡとの間の相互作用（これは変位されたリボソームをもたらす場合があり、従ってリボソーム待機時間、ボトルネック又はフレームシフトを増大させ得る）を伴う付加的効果との畳み込みであると主張される。
【０１９７】
現在の実験作業に対する改善は、以下を含む事例研究を考慮するものでなければならない：１）非常に長い遺伝子に関するコドンバイアス最適化とモデル最適化との比較；２）本モデルの原理を用いた合成＋１又は‐１フレームシフトの設計、及び上記フレームシフトのインビボでの確認；３）コドンバイアス最適化を実施しても不良な翻訳を示した遺伝子［２０，２２，２３］の、最適化及び発現；４）本モデルの予測されるリボーム待機時間及びボトルネックの精度を決定するための、リボソームプロファイリング実験の実施。
【実施例４】
【０１９８】
翻訳モデル及び自由エネルギシグナル
自由エネルギシグナル：細菌翻訳では、１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端ヌクレオチド（約１３ヌクレオチドの「露出テール」）がｍＲＮＡ配列と連続的に相互作用することが、ある程度以前から認識されている［６、９、１０、１１、１４、１５］。これらの相互作用は、ワトソン・クリック塩基対形成を伴い、ここで１６Ｓ  ｒＲＮＡテールとｍＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションの自由エネルギ［１６］を算出できる。図２１は、２００個の非フレームシフト大腸菌内因性遺伝子［９］の全てのヌクレオチドにおいてハイブリダイゼーションエネルギを算出することによって得られた、平均シグナルを示す。最も顕著な結合エネルギは開始部位にあるが、その後に「インフレーム」リボソーム転座［９、１０、１１］に対応する周期性（正弦波様）結合シグナルが存在する（負の自由エネルギは結合を示す）。異種遺伝子が宿主に適合されることなく翻訳されると、このシグナルは破壊される。本発明者らはこれは結合の不整合によるものであり、収率が損なわれる可能性がより高くなると予測している。本モデルの計算については、既に［９、１０、１１、１７、１８］に記載されている。
【０１９９】
このシグナルは、フレームシフトの解明、並びに１６Ｓ  ｒＲＮＡ３’末端「露出テール」とｍＲＮＡとの間の二次エネルギ的相互作用を用いた、タンパク質収率の予測及び最適化を補助するプロセスの新規の機構モデルの元になった。本モデルの予測及び最適化力を、単にコドンバイアス操作を用いたものと比較し、インビボで試験した。
【０２００】
「ばね」モデル：リボソームがｍＲＮＡに沿って転座すると、１６Ｓ  ｒＲＮＡ３’末端は、リボソームの上流の塩基と相互作用する［６、１５］（図２２）。結合エネルギが十分に大きく、かつ正常なインフレーム結合に有利な「間違った」側にある場合、結合エネルギはリボソームに余剰の力を印加してリボソームを変位させることができる。極端な場合、フレームシフトが発生し得る。本発明者らは、正弦曲線を用いてこの「ばね様」反力をモデル化する。例えば、＋１プログラムドフレームシフト遺伝子ｐｒｆＢ（図２２）では、１６ＳテールのａＳＤは、Ｐ部位から３塩基（図中のＵＡＵ）だけ上流のＳＤ様配列に結合し［１５］、‐９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌの結合エネルギをもたらす。この結合はＰ部位に近過ぎ、テールとリボソームとの間の距離を圧縮する。この結合は圧縮されたばねのような挙動を示し、これは弛緩時にリボソームを最小エネルギへと、３／４塩基だけ下流に、＋１リーディングフレーム内へと変位させる。次に変位されたリボソームは、＋１フレーム内のａａ‐ｔＲＮＡをピックアップする。これにより、１塩基のフレームシフトが得られ、その後新たな「インフレーム」が維持される［９、１０、１８］。対照的に、ｄｎａＸの‐１フレームシフト遺伝子のＳＤは、Ｐ部位から１０塩基離間している［１４］。この結合は「ばね」を伸長させ、リボソームを上流に変位させて「部分的」フレームシフト（フレームシフトとフレームシフトとの間；τ及びγの両方のサブユニットを生成する）を生成する。本発明者らは、ＳＤと開始コドンの間の「最適な」間隔が８塩基である場合に「弛緩したばね」の状態が生じると仮定している［２０］。図２３は、ｌａｃＺのインフレーム翻訳中の大腸菌１６Ｓ  ａＳＤを示す。当該部位付近の結合エネルギは、０〜‐１ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲である。ａＳＤはＰ部位から８ヌクレオチド離間して結合しているため、「ばね」はその「弛緩」状態となっている。ゼロリーディングフレームとＡ部位との間のわずかな不整合が可能である（これは収率に影響を及ぼし得る）ものの、フレームシフトを引き起こすのに十分な「ばね力」は存在しない。
【０２０１】
本発明者らは、「ばね」の圧縮又は伸張を、自由エネルギの正弦波シグナルの「位相」の変化としてモデル化している［１０、１８］（図２２及び図２３）。圧縮されたばね（ｐｒｆＢ）の場合、位相角は停止コドン２６において２３０°変化する［９，１８］。本発明者らのモデルでは、完全に弛緩した「ばね」は‐２５°の位相角を有するものと定義した。これは、大腸菌における全ての非仮説的、非推定的及び非疑似的な「長い（ｌｏｎｇ）」内因性遺伝子（１０００＋ｂｐ）の平均位相角である。本発明者らは、長い遺伝子は完全長のｍＲＮＡを誤差なく翻訳するために略完全な整合が必要である、即ち極めて長い遺伝子に関しては誤差が蓄積され得ると考えているため、長い遺伝子の位相角を使用することを選択した。従って「ばね」は、翻訳伸長全体を通して「弛緩」に近い状態である必要がある。本発明者らはこの位相角を「種角」と定義している。
【０２０２】
リボソーム変位は累積的であり、転座後にリセットされない。リボソームの変位が大きいほど、２つのリーディングフレームの２つのａａ‐ｔＲＮＡ間での選択に時間がかかる。２つのリーディングフレーム内のコドンのａａ‐ｔＲＮＡの存在量は、リボーム待機時間に大きな影響を及ぼす。ａａ‐ｔＲＮＡ存在量は、本発明者らのモデルではｔＲＮＡの到着時間に変換される。明示的なｔＲＮＡ存在量が不明である場合、本発明者らは、宿主有機体のコドン分布を用いる［１２］。リボソームが次のａａ‐ｔＲＮＡを「選択」した後、リボソームは３塩基だけ下流に転座する。本発明者らのモデルでは、１変位単位は、１／２ヌクレオチドの不整合である。２変位単位は、１つの完全なヌクレオチドの不整合又はリーディングフレームシフトである。収率を決定するための効果的な分析ツールは、極性プロット、リボソーム変位プロット及びリボソーム待機時間プロットである。
【０２０３】
結果
収率の予測。予想される収率は、リボソームが翻訳を開始する速度、及びリボソームがｍＲＮＡの翻訳を完了する速度と比例する［１］。本発明者らのモデルは、次のａａ‐ｔＲＮＡを担持するために必要なサイクル数を算出することによって、各コドンにおけるリボソーム待機時間を予測する。各コドンの「サイクル」の数は、「ばね」からの力、リボソーム変位量及びｔＲＮＡ存在量の関数として計算される。本発明者らは、タンパク質収率を測定するための内部指標として総サイクル数を使用する。しかしながら、全体的な目標はコーディング領域全体を通して変位を最小化することであるため、本発明者らは、野生型と最適化済み遺伝子との間の総変位変化を用いて最適化の程度を示す。総変位（ＴＤ）は、コーディング領域全体を通しての各コドンにおける変位の絶対値の合計である。
【０２０４】
「総サイクル」は良好な「全体的」予測因子であるが、「局所的」指数予測因子は収率のより良好な推定因子であり得る。一度に１つのリボソームだけではなく複数のリボソームによってｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されるため、複数の「低速」翻訳領域が、局所的に近接して密集し、これらは、複数の低速領域が遺伝子全体に均等に分布するよりも、収率に対して有害である。２つの遺伝子は、同じ総待機サイクルを有するものの異なる「低速」翻訳クラスタリングを有することができる。これは、「翻訳ボトルネック」又は「リボソーム渋滞」原理と呼ばれる。局所的翻訳ボトルネック指数を計算するために、他の場合においては積分器として公知である、サイズＮのコドンの「合計（ｓｕｍｍｉｎｇ）」スライディングウインドウを使用した（例えばＮは２０コドンである）。待機「サイクル」はこのウインドウ内で合計され、「翻訳ボトルネックプロット」と呼ばれるプロット上にプロットされる。その後、ウインドウは１コドンだけ下流にスライドされ、合計が再計算されて、次の値として上記プロット上にプロットされる。収率予測因子として、翻訳ボトルネックプロットの「ピーク（ｐｅａｋ）」又は最大合計を使用した。
【０２０５】
収率の別の推定因子は「タンパク質翻訳シミュレーション（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ）」と呼ばれ、所与の時間量内に翻訳を終了するリボソームの量を測定した。本発明者らのモデルにおける時間は、サイクル数として測定された。「リボソームプロファイル（ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｐｒｏｆｉｌｅ）」シミュレーションは、各コードにおける待機サイクルに基づいて生成された。上記シミュレーションは、リボソームがｍＲＮＡにおいて開始し、ｍＲＮＡを翻訳し、ｍＲＮＡから解離することをシミュレートした。翻訳を終了したリボソームの数は、別の「収率指数」予測因子であった。
【０２０６】
タンパク質収率の最適化。本明細書に記載されているように、「ｔＲＮＡ存在量」及び「アミノアシル‐ｔＲＮＡ（ａａ‐ｔＲＮＡ又は荷電‐ｔＲＮＡ）存在量」は、相互交換可能なものとして使用される。ｔＲＮＡは、付加されたアミノ酸を有することができる（ａａ‐ｔＲＮＡ）、又は付加されたタンパク質を有しない（非荷電‐ｔＲＮＡ）。リボソームは、タンパク質の産生のために、非荷電‐ｔＲＮＡではなくａａ‐ｔＲＮＡのみを使用する。しかしながら、ａａ‐ｔＲＮＡの定量的データは収集が困難である場合があり、従って、ゲノムから、刊行物又はコドン使用頻度を通して、総ｔＲＮＡ濃度（荷電‐ｔＲＮＡ及び非荷電‐ｔＲＮＡの和）によってａａ‐ｔＲＮＡの相対量を推測できる。
【０２０７】
本発明者らは、最も豊富なａａ‐ｔＲＮＡを用いることによって、遺伝子の変位をゼロ付近に保持し、ｔＲＮＡ到着時間を最大化すれば、リボソーム待機時間を低減でき、かつタンパク質収率を上昇させることができると仮定している。０に近い変位は、Ａ部位がゼロリーディングフレームに近接して整合することを保証する。これは、遺伝子の位相角を「種角」付近に保持しながら最も豊富なａａ‐ｔＲＮＡをコードするコドンを選択することによって、達成できる。これにより、転座中に最小限の「ばね」の圧縮又は伸張が得られる。これらの概念を組み込んだ遺伝子設計は、アミノ酸配列を保存しながら同義コドンを使用して遺伝子配列を変更することによって実施される。本発明者らは、このモデルが、コドンバイアスではなく「種角」を最適化することによって、蓄積される誤差を最小化するため、非常に長い遺伝子を最適化するにあたって優れていると考えている。逆に、タンパク質産生が「あまり最適でなく」なるように、遺伝子を改変できる。「毒性（ｔｏｘｉｃ）」タンパク質の経路最適化及び産生において潜在的な用途を有するタンパク質収率の低減は、発生し得るフレームシフトを回避するために、０から更に遠く、ただし‐１と＋１との間に変位を保持することによって達成できる。これにより、各コドンにおけるリボソーム待機時間を増大させる。
【０２０８】
この方法は、荷電‐ｔＲＮＡ存在量プールに過剰な負荷がかからず、かつこれが枯渇しない場合、低いｍＲＮＡ転写レベルにおいて実現可能である。しかし、高いｍＲＮＡ転写レベルでは、単一のｔＲＮＡ又は単一のｔＲＮＡセットを使用するのではなく、（同一のアミノ酸をコードする）多くの異なるｔＲＮＡの間に作業負荷を拡散することが最善である。これは、未荷電から荷電までのｔＲＮＡの「再荷電」速度に関係する［４、２１、２２］。リボソームの変位を回避するために、複数のｔＲＮＡにわたって作業負荷を分散しながら、種角に近接した状態を維持することが依然として必要となる。
【０２０９】
インビボ実験。本モデルの予測及び最適化を確認するために、本発明者らは、大腸菌において３つのモデル遺伝子、及びＧＳＴをコードする複数のｍＲＮＡ変異体を最適化して発現させた（ｐＥＴ‐４１ａ（＋）プラスミドに見られる日本住血吸虫由来の２６ｋＤａグルタチオンＳ‐トランスフェラーゼ；ノヴァーゲン社（Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．））。最適化済み遺伝子のタンパク質収率は、野生型レベルからの上昇を示した。スペースが制限されているために、本発明者らは、ｇｓｔ及びａｄｈ（クロストリジウム・リュングダリーＤＳＭ  １３５２８由来のアルコールデヒドロゲナーゼ、ＣＬＪＵ＿Ｃ１１８８０）の最適化結果のみを示す。全ての変異体の初めの９０塩基は、野生型の初めの９０塩基と同一であった。これは、翻訳開始による収率の変動を排除するために実施された［１、５、７］。遺伝子をｐＢＡＤ誘発性プラスミド（インヴィトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ，））にクローニングし、大腸菌内で発現させた。総タンパク質をＢＣＡアッセイによって定量化し、活性の正規化に使用した。総タンパク質の単位は、５６２ｎｍの吸光度で測定した。ＣＡＩ算出及び最適化は公開されている方法［１９］を用いて実施した。
【０２１０】
ｇｓｔを、変位（モデル最適化）及びコドンバイアス（ＣＡＩ最適化）に基づいて最適化した。図２４を参照。全てのｇｓｔ変異体を、ｐＢＡＤ誘発性プラスミドにクローニングし、０．０２％ｗ／ｖのアラビノースにおいて大腸菌内で２時間発現させ、活性レベルをアッセイした。ＧＳＴ活性は、Ｅ．Ｃ．２．５．１．１８アッセイを用いて測定した。正規化されたＧＳＴ収率を、総タンパク質あたりΔＡＢＳ３４０ｎｍ／分の単位で定量化した。再現性を試験するために、３回の独立した誘発を実施した。各誘発から３個の試料を回収し、合計９個の試料をアッセイした。
【０２１１】
モデル最適化済み変異体は、最も高いＧＳＴ活性収率を示し、これにＣＡＩ最適化済み変異体、そして野生型が続いた（図２５）。より良好なコドンバイアスを有するＣＡＩ最適化済み変異体は、モデル最適化済み変異体ほど多くのＧＳＴを産生しなかった。逆に、ｇｓｔのモデル最適化変異体は、コドンバイアスをほとんど増大させなかったが、ＣＡＩ最適化済み変異体のタンパク質収率レベルを上回った。従って、より高いコドンバイアスが必ずしもより高い収率を意味するわけではなく、ＣＡＩは、本発明者らの結果及び［４、５］によって実証されるように、必ずしもタンパク質収率の正確な予測因子とはならない。
【０２１２】
ａｄｈもリボソーム変位に基づいて最適化した（モデル最適化；図２６参照）。野生型及び最適化済み変異体を、ｐＢＡＤ誘発性プラスミドにクローニングし、０．２％ｗ／ｖのアラビノースにおいて大腸菌内で４時間発現させ、活性レベルを比較した。ＡＤＨ活性は、Ｅ．Ｃ．１．１．１．１アッセイを用いて測定した。正規化されたＡＤＨ収率を、総タンパク質の単位あたりΔＡＢＳ３４０ｎｍ／分の単位で定量化した。再現性を試験するために、２回の独立した誘発を実施した。各誘発か２個の試料を回収し、合計４個の試料をアッセイした。モデル最適化済み変異体は、野生型から４５％の増大を得たが、コドンバイアスはほとんど増大しなかった（図２７）。
【０２１３】
結論
本発明者らは、異種タンパク質産生のための遺伝子の予測及び最適化のための新たなモデルを開発した。このモデルは、１６Ｓ  ｒＲＮＡテールのエネルギ的「ばね」及びｍＲＮＡの相互作用、リボソーム変位、並びにｔＲＮＡ存在量を組み込み、これは、関心対象の１つ又は複数の遺伝子に関するリボソーム「待機時間」につながる。これは、リボソーム動態及び翻訳効率の評価のための包括的戦略を表す。上記モデルは、タンパク質産生操作のための新たなアプローチを提供する、完全実装型ソフトウェアパッケージ（リボスキャン（商標））として存在する。このモデルを用いた応用としては：１）内因性大腸菌の遺伝子及びゲノムの分析；２）コドンバイアス最適化を用いた場合であっても不良な翻訳を示す、価値の高い産業用及び治療用遺伝子の最適化及び発現；３）封入体形成の低減又は排除［６］のためにタンパク質の折り畳みを最適化するための、リボソーム「待機時間」パラメータの修正；並びに４）異なる産生有機体への、本翻訳モデルの拡大が挙げられる。
【０２１４】
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[34]B.ラーセン（Larsen, B.）、N.M.ウィリス（Wills, N. M.）、R.F.ゲステランド（Gesteland, R. F.）及びJ.F.アトキンス（Atkins, J. F.）「rRNA‐ｍRNA塩基対形成は、プログラムド‐１リボソームフレームシフトを刺激する（rRNA-mRNA base pairing stimulates a programmed-1 ribosomal frameshift.）」、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol.）、１７６巻２２号、pp. 6842-6851, 1994年
[35]H.M.サリス（Salis, H. M.）、E.A.ミルスキー（Mirsky, E. A.）及びC.A.フォイト（Voigt, C. A.）「タンパク質発現を制御するための合成リボソーム結合部位の自動設計（Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression）」、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nat. Biotechnol.）、27巻10号、pp. 946-950, 2009年
[36]P.M.シャープ（Sharp, P. M.）及びW.H.リー（Li, W.H.）「コドン適合指数‐指向性同種コドン使用バイアスの尺度、及びその潜在的な用途（The codon adaptation index - a measure of directional synonymous codon usage bias, and its potential applications）」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、 15巻3号、pp. 1281-1295, 1987年
[37]M.ドス・レイス（dos Reis, M.）、R.サーヴァ（Savva, R.）及びL.ウェルニッシュ（Wernisch, L.）「コドン使用の優先度の問題の解決：翻訳選択のための試験（Solving the riddle of codon usage preferences: a test for translational selection）」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Res.）32巻17号、pp. 5036-5044, 2004年
[38]M.ウェルヒ（Welch, M.）、S.ゴヴィンダラジャン（Govindarajan, S.）、J.ネス（Ness, J.）、E., A.ヴィラロボス（Villalobos, A.）、A.ガーニー（Gurney, A.）、J.ミンシャル（Minshull, J.）及びC.グスタフソン（Gustafsson, C.）「大腸菌における合成遺伝子発現を制御するための設計パラメータ（Design Parameters to Control Synthetic Gene Expression in Escherichia coli）」、プロス・ワン（PLoS ONE）、4巻9号、p. e7002, 2009年
[39]C.グスタフソン（Gustafsson, C.）、S.ゴヴィンダラジャン（Govindarajan, S.）及びJ.ミンシャル（Minshull, J.）「コドンバイアス及び異種タンパク質発現（Codon bias and heterologous protein expression）」、トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Trends in biotechnology）、22巻7号、pp. 346-353, 2004年
[40]P.ピグボ（Puigbo, P.）、E.グズマン（Guzman, E.）、A.ロムー（Romeu, A.）及びS.ガルシア‐ヴァルヴェ（Garcia-Vallve, S.）「オプティマイザ：DNA配列のコドン使用を最適化するためのウェブサーバ（OPTIMIZER: a web server for optimizing the codon usage of DNA sequences）」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、35巻、補遺2、2007年
[41]A.グローテ（Grote, A.）、K.ヒラー（Hiller, K.）、M.シェーア（Scheer, M.）、R.ミュンヒ（Munch, R.）、B.ネルテマン（Nortemann, B.）、D.C.ヘンペル（Hempel, D. C.）及びD.ヤーン（Jahn, D.）「JCat：標的遺伝子のコドン使用をその潜在的な発現宿主に適合させるための新規のツール（JCat: A novel tool to adapt codon usage of a target gene to its potential expression host）」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Res.）., 33巻、補遺2、2005年
[42]S.K.ヴー（Vu, S. K.）、A.A.べロッティ（Bellotti, A. A.）、C.J.ガブリエル（Gabriel, C. J.）、H.N.ブロチュ（Brochu, H. N.）、E.S.ミラー（Miller, E. S.）、D.L.ビッツァー（Bitzer, D. L.）及びM.A.ヴォーク（Vouk, M. A.）「大腸菌における異種タンパク質産生を最適化するためのリボソーム動態のモデル化（Modeling ribosome dynamics to optimize heterologous protein production in Escherichia coli）」、信号及び情報処理に関するIEEE国際会議（IEEE Global Conference on Signal and Information Processing (GlobalSIP)）、pp. 1422-1425, 2014年
[43]R.K.シュルツアベルガー（Shultzaberger, R. K.）、R.E.ブッフアイマー（Bucheimer, R. E.）、K.E.ルッド（Rudd, K. E.,）及びT.D.シュナイダー（Schneider, T. D.）「大腸菌リボソーム結合部位の解剖学（Anatomy of Escherichia coli ribosome binding sites）」、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Bio.）、313巻１号、pp. 215-228, 2001年
[44]I.ティノコ（Tinoco, I.）、H.K.キム（Kim, H. K.）及びS.ヤン（Yan, S.）「フレームシフト動態（Frameshifting dynamics）」、バイオポリマーズ（Biopolymers）、99巻12号、pp. 1147-1166, 2013年
[45]M.ミシュラ（M. Mishra）、S.K.ヴー（S. K. Vu）、D.L.ビッツァー（D.L. Bitzer）及びM.A.ヴォーク（M.A. Vouk）「原核生物のコーディングにおける自由エネルギの周期性、及び大腸菌K‐12遺伝子prfbにおける+1リボソームフレームシフトの同定におけるその役割（Free energy periodicity in prokaryotic coding and its role in identification of +1 ribosomal frameshifting in the Escherichia Coli K-12 gene prfb）」、IEEE EMBS議事録、第４巻、pp. 2848-2851、2004年
[46]D.I.ロスニック（D. I. Rosnick）、D.L.ビッツァー（D.L. Bitzer）、M.A.ヴォーク（M.A. Vouk）及びE.E.メイ（E. E. May）「大腸菌コーディングにおける自由エネルギ周期性（Free energy periodicity in E. coli coding）」、IEEE EMBS会議議事録、第４巻、pp. 2470-2473、2000年
[47] M.ミシュラ（M. Mishra）「原核生物の翻訳における自由エネルギ同期シグナルの役割（The Role of Free Energy Synchronization Signal in Translation of Prokaryotes）」、修士論文、ノースカロライナ州立大学コンピュータサイエンス学部（ノースカロライナ州ローリー）、2004年
[48]L.ポナーラ（L. Ponnala）、A.M.ストンプ（A.M. Stomp）、D.L.ビッツァー（D.L. Bitzer）及び M.A.ヴォーク（M.A. Vouk）「真正細菌における翻訳中のrRNAとｍRNAとの間のヌクレオチドハイブリダイゼーションから生じる自由エネルギシグナルの分析（Analysis of free energy signals arising from nucleotide hybridization between rRNA and mRNA sequences during translation in Eubacteria）」、EURASIPジャーナル・オン・バイオインフォーマティクス・アンド・システムズ・バイオロジー（Eurasip J. Bioinforma. Syst. Biol.）、2006巻、 2006年
[49]G.W.リー（G. W. Li）、E.オー（E. Oh）及び J.S.ヴァイスマン（J. S. Weissman）「抗シャイン‐ダルガノ配列は、細菌における翻訳の停止及びコドンの選択を推進する（The anti-Shine-Dalgarno sequence drives translational pausing and codon choice in bacteria）」、 ネイチャー（Nature）、484巻7395号、pp. 538-541, 2012年
[50]R.B.ヴァイス（R.B. Weiss）、D.M.ダン（D.M. Dunn）、A.E.ダールベルグ（A.E. Dahlberg）、J.F.アトキンス（J.F. Atkins）及びR.F.ゲステランド（R.F. Gesteland）「大腸菌におけるタンパク質合成の伸長中の１６S rRNAとmRNAとの間の塩基対形成によって引き起こされるリーディングフレームの切り替え（Reading frame switch caused by base-pair formation between the 3’end of 16S rRNA and the mRNA during elongation of protein synthesis in Escherichia coli）」、EMBOジャーナル(EMBO J.)、７巻５号、p. 1503, 1988年
[51]B.ラーセン（B. Larsen）、N.M.ウィリス（N. M. Wills）、R.F.ゲステランド（R. F. Gesteland）及びJ.F.アトキンス（J. F. Atkins）「rRNA‐ｍRNA塩基対形成は、プログラムド‐１リボソームフレームシフトを刺激する（rRNA-mRNA base pairing stimulates a programmed-1 ribosomal frameshift.）」、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol.）、176巻22号、 pp. 6842-6851, 1994年
[52]L.ポナーラ（L. Ponnala）、D.L.ビッツァー（D.L. Bitzer）、A.ストンプ（A. Stomp）及びM.A.ヴォーク（M.A. Vouk）「リーディングフレームメンテナンスのための計算モデル（A computational model for reading frame maintenance）」、IEEE EMBS会議議事録、2006年、pp. 4540-4543
[53]S.K.ヴー（Vu, S. K.）、A.A.べロッティ（Bellotti, A. A.）、C.J.ガブリエル（Gabriel, C. J.）、H.N.ブロチュ（Brochu, H. N.）、E.S.ミラー（Miller, E. S.）、D.L.ビッツァー（Bitzer, D. L.）及びM.A.ヴォーク（Vouk, M. A.）「大腸菌における異種タンパク質産生を最適化するためのリボソーム動態のモデル化（Modeling ribosome dynamics to optimize heterologous protein production in Escherichia coli）」、信号及び情報処理に関するIEEE国際会議（IEEE Global Conference on Signal and Information Processing (GlobalSIP)）、pp. 1422-1425, 2014年
[54]I.ティノコ（I. Tinoco）、H.K.キム（H. K. Kim）及びS.ヤン（S. Yan）「フレームシフト動態（Frameshifting dynamics）」、 バイオポリマーズ（Biopolymers）、99巻12号、pp. 1147-1166, 2013年
[55] H．チェン（H. Chen）、M.M.ビェルクネス（M.M. Bjerknes）、R.クマー（R. Kumar）及びE.ジェイ（E. Jay）「大腸菌ｍRNAのシャイン‐ダルガノ配列と翻訳開始コドンとの間の最適に整合された間隔の決定（Determination of the optimal aligned spacing between the Shine-Dalgarno sequence and the translation initiation codon of Escherichia coli m RNAs）」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、22巻23号、pp. 4953-4957, 1994年
[56]R.K.シュルツアベルガー（R. K.  Shultzaberger）、R.E.ブッフアイマー（R.E. Bucheimer）、K.E.ルッド（K.E. Rudd）及びT.D.シュナイダー（T.D. Schneider）「大腸菌リボソーム結合部位の解剖学（Anatomy of Escherichia coli ribosome binding sites）」、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Bio.）、313巻1号、pp. 215-228, 2001年
[57]N.マリス（N. Malys）「バクテリオファージT4のシャイン‐ダルガノ配列：GAGGは初期遺伝子において優勢である（Shine-Dalgarno sequence of bacteriophage T4: GAGG prevails in early genes）」、モレキュラー・バイオロジー・レポーツ（Mol. Biol. Rep.）、39巻1号、pp. 33-39, 2011年
[58]P.J.ファラボー（P.J.Farabaugh）「プログラムされた翻訳フレームシフト（Programmed translational frameshifting）」、アニュアル・レビュー・オブ・ジェネティクス（Annu. Rev. Genet.）、30巻、pp. 507-528, 1996年
[59] P.V.バラノフ（P. V. Baranov）、R.F.ゲステランド（R. F. Gesteland）及びJ.F.アトキンス（J. F. Atkins）「異なる細菌における放出因子２フレームシフト部位（Release factor 2 frameshifting sites in different bacteria」、EMBOレポーツ（EMBO Rep.）、3巻4号、pp. 373-377, 2002年
[60]J.エルフ（J. Elf）及びM.エーレンベルク（M. Ehrenberg）「アミノ酸の律速供給における大腸菌のアミノアシル‐ｔRNAプールの準臨界挙動（Near-Critical Behavior of Aminoacyl-tRNA Pools in E. coli at Rate-Limiting Supply of Amino Acids）」、バイオフィジックス・ジャーナル（Biophys. J.）、88巻1号、pp. 132-146, 2005年
[61]M.ウェルヒ（M. Welch）、S.ゴヴィンダラジャン（S. Govindarajan）、J．Ｅ．ネス（J. E. Ness）、A.ヴィラロボス（A.Villalobos）、A．ガーニー（A. Gurney）、J.ミンシャル（J. Minshull）及びC.グスタフソン（Gustafsson, C.）「大腸菌における合成遺伝子発現を制御するための設計パラメータ（Design Parameters to Control Synthetic Gene Expression in Escherichia coli）」、プロス・ワン（PLoS ONE）、4巻9号、p. e7002, 2009年
[62]K.A.ディットマール（K. A. Dittmar）、M.A.ソレンセン（M. A. Sorensen）、J.エルフ（J. Elf）、M.エーレンベルク（M. Ehrenberg）及びT.パン（T. Pan）「アミノ酸飢餓によって誘発されるｔRNAイソ受容体の選択的荷電（Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation）」、EMBOレポーツ(EMBO Rep.）、6巻2号、pp. 151-157, 2005年
[63]M.A.ソレンセン（M. A. Sorensen）「アミノ酸飢餓中の大腸菌Rel（＋）及びRel（‐）株の４つのｔRNA種の荷電レベル：翻訳精度に対するpｐGppの影響に関する単純なモデル（Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy）」、 ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）、307巻3号、pp. 785-798, 2001年
[64]H.ドン（H. Dong）、L.ニルソン（L. Nilsson）及びC.G.カーランド（C. G. Kurland）「異なる成長速度の大腸菌におけるｔRNA存在量及びコドン使用の共変動（Co-variation of tRNA abundance and codon usage in Escherichia coli at different growth rates）」、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）、260巻5号、pp. 649-663, 1996年
[65]F.H.クリック（F. H. Crick）「コドン‐抗コドン対形成：ウォブル仮説（Codon-anticodon pairing: the wobble hypothesis）」、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）、19巻2号、pp. 548-555, 1966年
[66]S.K.ヴー（S. K. Vu）「リボラボ研究グループ（RiboLab Research Group）」Ribolab.com, 2015. [オンライン]. 入手可能: http://www.ribolab.com. [アクセス：２０１５年８月５日]
[67] A.S.スピリン（Spirin, A. S.）、リボソーム（Ribosomes）、第１版、ニューヨーク：クルーワー・アカデミック／プレナム・パブリッシャーズ（Kluwer Academic/Plenum Publishers）、1999年
[68]M.ミシュラ（M. Mishra）、S.K.ヴー（S. K. Vu）、D.L.ビッツァー（D.L. Bitzer）及びM.A.ヴォーク（M.A. Vouk）「原核生物のコーディングにおける自由エネルギの周期性、及び大腸菌K‐12遺伝子prfbにおける+1リボソームフレームシフトの同定におけるその役割（Free energy periodicity in prokaryotic coding and its role in identification of +1 ribosomal frameshifting in the Escherichia Coli K-12 gene prfb）」、IEEE EMBS会議議事録、第４巻、pp. 2848-2851, 2004年
[69]D.I.ロスニック（D. I. Rosnick）、D.L.ビッツァー（D.L. Bitzer）、M.A.ヴォーク（M.A. Vouk）及び E.E.メイ（E. E. May）「大腸菌コーディングにおける自由エネルギ周期性（Free energy periodicity in E. coli coding）」、IEEE EMBS第22回年次国際会議議事録、第４巻、pp. 2470-2473, 2000年
[70]A.S.スピリン（Spirin, A. S.）、リボソーム（Ribosomes）、第１版、ニューヨーク：クルーワー・アカデミック／プレナム・パブリッシャーズ（Kluwer Academic/Plenum Publishers）、1999年
[71]S.M．フライヤー（S. M. Freier）、R.キールゼック（R. Kierzek）、J.A.イェーガー（J. A.  Jaeger）、N.スギモト（N.  Sugimoto）、M.H.カルータース（M. H. Caruthers）、T.ニールソン（T. Neilson）及びD.H.チューナー（D.H. Turner）「RNA二重鎖安定性の予測のための改善された自由エネルギパラメータ（Improved free-energy parameters for predictions of RNA duplex stability）」、米国科学アカデミー紀要（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.）、83巻24号、pp. 9373-9377, 1986年
[72] H．チェン（H. Chen）、M.M.ビェルクネス（M.M. Bjerknes）、R.クマー（R. Kumar）及びE.ジェイ（E. Jay）「大腸菌ｍRNAのシャイン‐ダルガノ配列と翻訳開始コドンとの間の最適に整合された間隔の決定（Determination of the optimal aligned spacing between the Shine-Dalgarno sequence and the translation initiation codon of Escherichia coli m RNAs）」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、22巻23号、pp. 4953-4957, 1994年
[73]D.I.ロスニック（D. I. Rosnick）、D.L.ビッツァー（D.L. Bitzer）、M.A.ヴォーク（M.A. Vouk）及びE.E.メイ（E. E. May）「大腸菌コーディングにおける自由エネルギ周期性（Free energy periodicity in E. coli coding）」、IEEE EMBS会議議事録、第４巻、pp. 2470-2473, 2000年
[74]L.ポナーラ（L. Ponnala）、A.M.ストンプ（A.M. Stomp）、D.L.ビッツァー（D.L. Bitzer）D.L.ビッツァー（D.L. Bitzer）及び M.A.ヴォーク（M.A. Vouk）「真正細菌における翻訳中のrRNAとｍRNAとの間のヌクレオチドハイブリダイゼーションから生じる自由エネルギシグナルの分析（Analysis of free energy signals arising from nucleotide hybridization between rRNA and mRNA sequences during translation in Eubacteria）」、EURASIPジャーナル・オン・バイオインフォーマティクス・アンド・システムズ・バイオロジー（Eurasip J. Bioinforma. Syst. Biol.）、2006巻、2006年
[75]H.ドン（H. Dong）、L,ニルソン（L. Nilsson）及びC.G.カーランド（C. G. Kurland）「異なる成長速度の大腸菌におけるｔRNA存在量及びコドン使用の共変動（Co-variation of tRNA abundance and codon usage in Escherichia coli at different growth rates）」、 ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）、260巻5号、pp. 649-663, 1996年
[76]T.イケムラ（T. Ikemura）「酵母転移RNAの存在量とタンパク質遺伝子中の各コドンの発生との間の相関：イソ受容性転移RNAの存在量に対する、酵母及び大腸菌の同種コドン選択パターンの差異（Correlation between the abundance of yeast transfer RNAs and the occurrence of the respective codons in protein genes: differences in synonymous codon choice patterns of yeast and Escherichia coli with reference to the abundance of isoaccepting transfer RNAs）」、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）、158巻4号、pp. 573-597, 1982年
[77T.イケムラ（T. Ikemura）「単細胞及び多細胞有機体におけるコドン使用及びｔRNA含有量（Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms）」、モレキュラー・バイオロジー・アンド・エボリューション（Mol. Biol. Evol.）、2巻1号、pp. 13-34, 1985年
[78] T.イケムラ（T. Ikemura）「大腸菌転移RNAの存在量とタンパク質遺伝子中の各コドンの発生との間の相関：大腸菌翻訳系に最適な同種コドン選択の提案（Correlation between the abundance of Escherichia coli transfer RNAs and the occurrence of the respective codons in its protein genes: a proposal for a synonymous codon choice that is optimal for the E. coli translational system）」、 ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）、151巻3号、pp. 389-409, 1981年
[79]S.カナヤ（S. Kanaya、Y.ヤマダ（Y. Yamada）、Y.クドウ（Y. Kudo）及びT.イケムラ（T. Ikemura）「18種の単細胞生物のコドン使用及びtRNA遺伝子の研究、並びに枯草菌（Bacillus subtilis）tRNAの定量：多変量分析に基づく遺伝子発現レベル及びコドン使用の種特異的多様性（Studies of codon usage and tRNA genes of 18 unicellular organisms and quantification of Bacillus subtilis tRNAs: gene expression level and species-specific diversity of codon usage based on multivariate analysis）」、ジーン（Gene）、238巻1号、pp. 143-155, 1999年
[80]L.デュレ（L. Duret）「線虫ゲノムのtRNA遺伝子数及びコドン使用は、高発現遺伝子の最適な翻訳に共適合される（tRNA gene number and codon usage in the C. elegans genome are co-adapted for optimal translation of highly expressed genes）」、トレンズ・イン・ジェネティクス（Trends in Genetics）、16巻7号、pp. 287-289, 2000年
[81] R.ペルクダニ（R. Percudani）、A.パヴェシ（A. Pavesi）及びS.オットネロ（S. Ottonello）「サッカロマイセス・セレビシエにおける転移RNA遺伝子冗長性及び翻訳選択（Transfer RNA gene redundancy and translational selection in Saccharomyces cerevisiae）」、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）、268巻2号、pp. 322-330, 1997年
[82] M.ドス・レイス（M. dos Reis）、R.サーヴァ（R. Savva）及びL.ウェルニッシュ（L. Wernisch）「コドン使用の優先度の問題の解決：翻訳選択のための試験（Solving the riddle of codon usage preferences: a test for translational selection）」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、32巻17号、pp. 5036-5044, 2004年
[83]Y.ナカムラ（Y. Nakamura）、T.ゴジョウボリ（T. Gojobori）及びT.イケムラ（T. Ikemura）「国際DNA配列データベースから集計されたコドン使用：２０００年の状態（Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000）」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、28巻、p. 292, 2000年
[84] M.ミシュラ（M. Mishra）「原核生物の翻訳における自由エネルギ同期シグナルの役割（The Role of Free Energy Synchronization Signal in Translation of Prokaryotes）」、修士論文、ノースカロライナ州立大学コンピュータサイエンス学部（ノースカロライナ州ローリー）、2004年
[85] S.K.ヴー（S. K. Vu）「リボラボ研究グループ（RiboLab Research Group）」Ribolab.com, 2015. [オンライン]. 入手可能: http://www.ribolab.com. [アクセス：２０１５年８月５日]
[86]P.M.シャープ（P. M. Sharp）及びW.H.リー（W.H. Li）「コドン適合指数‐指向性同種コドン使用バイアスの尺度、及びその潜在的な用途（The codon adaptation index - a measure of directional synonymous codon usage bias, and its potential applications）」、 ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、15巻3号、pp. 1281-1295, 1987年
[87]H.R.コスタンティーノ（H. R. Costantino）、S.H.ブラウン（S. H. Brown）及びR.M.ケリー（R. M. Kelly）「105~１１５℃の至適温度を示す超好熱性古細菌パイロコッカス・フリオサスからのα‐グルコシダーゼの精製及び特性決定（Purification and characterization of an α-glucosidase from a hyperthermophilic archaebacterium, Pyrococcus furiosus, exhibiting a temperature optimum of 105 to 115℃）」、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol.）、172巻7号、pp. 3654-3660, 1990年
[88] P.L.ミュラー（P. L. Moller）、F.ヨルゲンセン（F. Jorgensen）、O.C.ハンセン（O. C. Hansen）、M.マドセン（M. Madsen）、P.ストガルト（P. Stougaard）、O.L.E.C.ハンセン（O.L.E.C. Hansen）及びS.M.マドセン（S. M. Madsen）「ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム及びB.インファンティスからの細胞内及び細胞外ｂ‐ガラクトシダーゼ：分子クローニング、異種発現及び比較特性決定（Intra‐ and Extracellular b‐galactosidases from Bifidobacterium bifidum and B. infantis: Molecular Cloning, Heterologous Expression, and Comparative Characterization）」、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol.）、67巻5号、pp. 2276-2283, 2001年
[89]H.ドン（H. Dong）、L.ニルソン（L. Nilsson）及びC.G.カーランド（C. G. Kurland）「異なる成長速度の大腸菌におけるｔRNA存在量及びコドン使用の共変動（Co-variation of tRNA abundance and codon usage in Escherichia coli at different growth rates）」、 ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）、260巻5号、pp. 649-663, 1996年
[90]H.M.サリス（H. M. Salis）「リボソーム結合部位計算器（The ribosome binding site calculator）」、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）、498巻、pp. 19-42, 2011年
[91]P.ピグボ（P. Puigbo）、E.グズマン（E. Guzman）、A.ロムー（A. Romeu）及びS.ガルシア‐ヴァルヴェ（S. Garcia-Vallve）「オプティマイザ：DNA配列のコドン使用を最適化するためのウェブサーバ（OPTIMIZER: a web server for optimizing the codon usage of DNA sequences）」、 ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Res.）35巻補遺2、2007年
[92]D.B.スミス（D. B. Smith）、K.M.ダヴァーン（K. M. Davern）、P.G.ボード（P. G. Board）、W.U.ティウ（W. U. Tiu）、E.G.ガルシア（E. G. Garcia）及びG.F.ミッチェル（G. F. Mitchell）「耐性WEHI 129/Jマウスによって認識される日本住血吸虫のMr26,000抗原は、寄生グルタチオンS‐トランスフェラーゼである（Mr 26,000 antigen of Schistosoma japonicum recognized by resistant WEHI 129/J mice is a parasite glutathione S-transferase）」、米国科学アカデミー紀要（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.）、83巻22号、pp. 8703-8707, 1986年
[93]S.K.ヴー（S. K. Vu）、A.A.べロッティ（A.A. Bellotti）、C.J.ガブリエル（C.J. Gabriel）、H.N.ブロチュ（H.N. Brochu）、E.S.ミラー（E.S. Miller）、D.L.ビッツァー（D.L. Bitzer）及びM.A.ヴォーク（M.A. Vouk）「大腸菌における異種タンパク質産生を最適化するためのリボソーム動態のモデル化（Modeling ribosome dynamics to optimize heterologous protein production in Escherichia coli）」、信号及び情報処理に関するIEEE国際会議（IEEE Global Conference on Signal and Information Processing (GlobalSIP)）、pp. 1422-1425, 2014年
[94]Y.ナカムラ（Y. Nakamura）、T.ゴジョウボリ（T. Gojobori）及びT.イケムラ（T. Ikemura）「国際DNA配列データベースから集計されたコドン使用：２０００年の状態（Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000）」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、28巻、p. 292, 2000年
[95]L.M.グズマン（L. M. Guzman）、D.ベリン（D. Belin）、M.J.カーソン（M. J. Carson）及びJ.ベックウィズ（J. Beckwith）「アラビノースP（BAD）プロモータを含有するベクターによる厳密な調節、変調及び高レベル発現（Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose P(BAD) promoter）」、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol.）、177巻14号、pp. 4121-4130, 1995年
[96]E.シラー（E. Siller）、D.C.デズワーン（D. C. DeZwaan）、J.F.アンダーソン（J. F. Anderson）、B.C.フリーマン（B. C. Freeman）及びJ.M.バレル（J. M. Barral）「細菌の翻訳速度を遅くすることにより、真核生物のタンパク質折り畳み効率が向上する（Slowing Bacterial Translation Speed Enhances Eukaryotic Protein Folding Efficiency）」、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）、396巻5号、pp. 1310-1318, 2010年
[97]S.ペッヒマン（S. Pechmann）及びJ.フリドマン（J. Frydman）「コドン最適性の進化的保存により、同時翻訳折り畳みの隠されたシグニチャが明らかになる（Evolutionary conservation of codon optimality reveals hidden signatures of cotranslational folding）」、ネイチャー・ストラクチュラル・アンド・モレキュラー・バイオロジー（Nat. Struct. Mol. Biol.）、20巻2号、pp. 237-243, 2013年
[98]G.W.リー（G. W. Li）、E.オー（E. Oh）及びJ.S.ヴァイスマン（J. S. Weissman）「抗シャイン‐ダルガノ配列は、細菌における翻訳の停止及びコドンの選択を推進する（The anti-Shine-Dalgarno sequence drives translational pausing and codon choice in bacteria）」、 ネイチャー（Nature）、484巻7395号、pp. 538-541, 2012年
[99]バイオロジクスコープ（BiologicsCorp）「GC含有量計算器（GC Content Calculator）」、Biologicscorp.com, 2015年[オンライン]. 入手可能: http://www.biologicscorp.com/tools/GCContent. [アクセス：２０１５年８月２２日].
[100]Y.ナカムラ（Y. Nakamura）、T.ゴジョウボリ（T. Gojobori）及びT.イケムラ（T. Ikemura）「国際DNA配列データベースから集計されたコドン使用：２０００年の状態（Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000）」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、28巻、p. 292, 2000年
[101]D.A.ベンソン（D. A. Benson）、I.カルシュ‐ミズラチ（I. Karsch-Mizrachi）、D.J.リプマン（D. J. Lipman）、J.オステル（J. Ostell）及びE.W.セイヤーズ（E. W. Sayers）「ジェンバンク（GenBank）」、 ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、39巻補遺1、2011年
[102]M.ウェルヒ（M. Welch）、S.ゴヴィンダラジャン（S. Govindarajan）、J．Ｅ．ネス（J. E. Ness）、A.ヴィラロボス（A.Villalobos）、A．ガーニー（A. Gurney）、J.ミンシャル（J. Minshull）及びC.グスタフソン（Gustafsson, C.）「大腸菌における合成遺伝子発現を制御するための設計パラメータ（Design Parameters to Control Synthetic Gene Expression in Escherichia coli）」、プロス・ワン（PLoS ONE）、4巻9号、p. e7002, 2009年
[103]K.A.ディットマール（K. A. Dittmar）、M.A.ソレンセン（M. A. Sorensen）、J.エルフ（J. Elf）、M.エーレンベルク（M. Ehrenberg） 及びT.パン（T. Pan）「アミノ酸飢餓によって誘発されるｔRNAイソ受容体の選択的荷電（Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation）」、EMBOレポーツ(EMBO Rep.）、6巻2号、pp. 151-157, 2005年
[104]J.エルフ（J. Elf）及びM.エーレンベルク（M. Ehrenberg）「アミノ酸の律速供給における大腸菌のアミノアシル‐ｔRNAプールの準臨界挙動（Near-Critical Behavior of Aminoacyl-tRNA Pools in E. coli at Rate-Limiting Supply of Amino Acids）」、バイオフィジックス・ジャーナル（Biophys. J.）88巻1号、pp. 132-146, 2005年
[105]C.グスタフソン（Gustafsson, C.）、S.ゴヴィンダラジャン（S. Govindarajan）及び J.ミンシャル（J. Minshull）「コドンバイアス及び異種タンパク質発現（Codon bias and heterologous protein expression）」、 トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Trends in biotechnology）、22巻7号、pp. 346-353, 2004年
[106]M.ウェルヒ（M. Welch）、A.ヴィラロボス（A. Villalobos）、C.グスタフソン（Gustafsson, C.）及びJ.ミンシャル（J. Minshull）「良好なタンパク質発現のための遺伝子の設計（Designing genes for successful protein expression）」、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）、498巻、pp. 43-66, 2011年
[107]B.メーテンス（B. Maertens）、A.シュプリースタースバッハ（A. Spriestersbach）、U.フォン・グロール（U. Von Groll）、U.ロート（U. Roth）、J.クビセック（J. Kubicek）、M.ゲリツ（M. Gerrits）、M.グラーフ（M. Graf）、M.リス（M. Liss）、D.ダウベルト（D. Daubert）、R.ワグナー（R. Wagner）及びF.シェーファー（F. Schafer）「遺伝子最適化機序：多遺伝子研究により、大腸菌において発現する完全長ヒトタンパク質の高い成功率が明らかになる（Gene optimization mechanisms: A multi-gene study reveals a high success rate of full-length human proteins expressed in Escherichia coli）」、プロテイン・サイエンス（Protein Sci.）、19巻7号、pp. 1312-1326, 2010年
[108] N.A.バーゲス‐ブラウン（N. A. Burgess‐Brown）、S.シャーマ（S. Sharma）、F.ソボット（F. Sobott）、C.レナーツ（C. Loenarz）、U.オッパーマン（U. Oppermann）及びO.ギレアディ（O. Gileadi）「コドン最適化により大腸菌におけるヒト遺伝子の発現を改善できる：多遺伝子研究（Codon optimization can improve expression of human genes in Escherichia coli: A multi-gene study）」、プロテイン・エクスプレッション・アンド・ピュリフィケーション（Protein Expr. Purif.）、59巻1号、 pp. 94-102, 2008年
[109]H.G.メンゼラ（H. G. Menzella）「大腸菌における組み換えタンパク質産生を向上するための２つのコドン最適化戦略の比較（Comparison of two codon optimization strategies to enhance recombinant protein production in Escherichia coli）」、 マイクロバイアル・セル・ファクトリーズ（Microb. Cell Fact.）、10巻1号、p. 15, 2011年
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[111]A.ミトラキ（A. Mitraki）及びJ.キング（J. King）「タンパク質折り畳み仲介及び封入体形成（Protein Folding Intermediates and Inclusion Body Formation）」、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nat. Biotechnol.）、7巻、pp. 690-697, 1989年
[112]S.キム（S. Kim）及びS.B.リー（S. B. Lee）「融合パートナーの使用による、大腸菌における古細菌タンパク質の可溶性発現（Soluble expression of archaeal proteins in Escherichia coli by using fusion-partners）」、プロテイン・エクスプレッション・アンド・ピュリフィケーション（Protein Expr. Purif.）、62巻1号、pp. 116-119, 2008年
[113]S.V.アルバース（S. V. Albers）、M.ヨヌシャイト（M. Jonuscheit）、S.ディンケラカー（S. Dinkelaker）、T.ウルリッヒ（T. Urich）、A.クレチン（A. Kletzin）、R.タンペ（R. Tampe）、A.J.M.ドリーセン（A. J. M. Driessen）及びC.シェルパー（C. Schleper）「超好熱古細菌スルホロブス・ソルファタリカスにおける組み換え及びタグ付きタンパク質の産生（Production of recombinant and tagged proteins in the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus）」、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol.）、72巻1号、pp. 102-111, 2006年
[114]M.アラート（M. Allert）、J.C.コックス（J. C. Cox）及びH.W.ヘリンガ（H. W. Hellinga）「原核生物のオープンリーディングフレームにおけるタンパク質発現の多因子決定因子（Multifactorial determinants of protein expression in prokaryotic open reading frames）」、 ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）、402巻5号、pp. 905-918, 2010年
[115]G.クドラ（G. Kudla）、A.W.マーレイ（ A. W. Murray）、D.トラーヴィー（D. Tollervey）及びJ.B.プロトキン（J. B. Plotkin）「大腸菌における遺伝子発現のコーディング配列決定因子（Coding-sequence determinants of gene expression in Escherichia coli）」、 サイエンス（Science）、324巻5924号、pp. 255-258, 2009年
[116]I.ティノコ（I. Tinoco）、H.K.キム（H. K. Kim）及びS.ヤン（S. Yan）、「フレームシフト動態（Frameshifting dynamics）」、バイオポリマーズ（Biopolymers）、99巻12号、pp. 1147-1166, 2013年
[117]E..シラー（E. Siller）、D.C.デズワーン（D. C. DeZwaan）、J.F.アンダーソン（J. F. Anderson）、B.C.フリーマン（B. C. Freeman）及びJ.M.バレル（J. M. Barral）「細菌の翻訳速度を遅くすることにより、真核生物のタンパク質折り畳み効率が向上する（Slowing Bacterial Translation Speed Enhances Eukaryotic Protein Folding Efficiency）」、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）、396巻5号、pp. 1310-1318, 2010年
[118]S.ペッヒマン（S. Pechmann）及びJ.フリドマン（J. Frydman）「コドン最適性の進化的保存により、同時翻訳折り畳みの隠されたシグニチャが明らかになる（Evolutionary conservation of codon optimality reveals hidden signatures of cotranslational folding）」、ネイチャー・ストラクチュラル・アンド・モレキュラー・バイオロジー（Nat. Struct. Mol. Biol.）、20巻2号、pp. 237-243, 2013年
[119]A.ミトラキ（A. Mitraki）及びJ.キング（J. King）「タンパク質折り畳み仲介及び封入体形成（Protein Folding Intermediates and Inclusion Body Formation）」、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nat. Biotechnol.）、7巻、pp. 690-697, 1989年
[120]F.バニュー（F. Baneyx）及びM.ムヤチック（M. Mujacic）「大腸菌における組み換えタンパク質折り畳み及び誤折り畳み（Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli）」、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nat. Biotechnol.）、22巻11号、pp. 1399-1408, 2004年
[121]C.シン（C. Xing）、D.L.ビッツァー（D.L. Bitzer）、W.E.アレクサンダー（W. E. Alexander）、A.M.ストンプ（A. M. Stomp）及びM.A.ヴォーク（M.A. Vouk）「サッカロマイセス・セレビシエの個々の遺伝子のコーディング領域に対する自由エネルギ分析（Free energy analysis on the coding region of the individual genes of Saccharomyces cerevisiae）」、IEEE EMBS会議議事録、第１巻、pp. 4225-4228, 2006年
[122]C.シン（C. Xing）、D.L.ビッツァー（D.L. Bitzer）、W.E.アレクサンダー（W. E. Alexander）、M.A.ヴォーク（M.A. Vouk）及びA.M.ストンプ（A. M. Stomp）「翻訳中の１８Ｓ  ｒＲＮＡ及びｍＲＮＡのハイブリダイゼーションを用いたタンパク質コーディング配列の同定（Identification of protein-coding sequences using the hybridization of 18S rRNA and mRNA during translation）」、 ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、37巻2号、pp. 591-601, 2009年
[123]C.シン（C. Xing）「機能性に基づく偽遺伝子の同定方法：翻訳中の１８S  ｒRNA及びｍRNAのハイブリダイゼーション（Methods of identification of pseudogenes based on functionality: hybridization of 18S rRNA and mRNA during translation）」、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Methods Mol Biol.）1167巻、pp. 63-73, 2014年
[124]A.V.ピサレフ（A.V.Pisarev）、V.G.コルパエワ（V. G. Kolupaeva）、M.M.ユスポフ（M.M. Yusupov）、C.U.T.ヘレン（C.U.T. Hellen）及びT.V.ペストワ（T. V Pestova）「真核生物翻訳開始複合体におけるmRNAのリボソーム位置及び接触（Ribosomal position and contacts of mRNA in eukaryotic translation initiation complexes）」、EMBOジャーナル(EMBO J.)、27巻、pp. 1609-1621, 2008年
【０２１５】
本明細書において言及された全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、本開示の主題が関与する技術分野の当業者のレベルを示す。全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、個々の刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献がそれぞれ参照によって援用されることが具体的かつ別個に示されている場合と同程度に、参照によって本出願に援用される。多数の特許出願、特許及び他の参考文献が本明細書において言及されているものの、このような参照は、これらの文献のいずれが当該技術分野における一般的な知識の一部を形成することを認めるものではないことを理解されたい。
【０２１６】
上述の主題について、理解を明確にするために、例示及び実施例を用いてある程度詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲内において一定の変更及び修正を実施できることは、当業者には理解されるであろう。
【図１】
2018509930.tif 000048
【図２】
2018509930.tif 000049
【図３】
2018509930.tif 000050
【図４】
2018509930.tif 000051
【図５】
2018509930.tif 000052
【図６】
2018509930.tif 000053
【図７】
2018509930.tif 000054
【図８】
2018509930.tif 000055
【図９】
2018509930.tif 000056
【図１０】
2018509930.tif 000057
【図１１】
2018509930.tif 000058
【図１２】
2018509930.tif 000059
【図１３】
2018509930.tif 000060
【図１４】
2018509930.tif 000061
【図１５】
2018509930.tif 000062
【図１６】
2018509930.tif 000063
【図１７】
2018509930.tif 000064
【図１８】
2018509930.tif 000065
【図１９】
2018509930.tif 000066
【図２０】
2018509930.tif 000067
【図２１】
2018509930.tif 000068
【図２２】
2018509930.tif 000069
【図２３】
2018509930.tif 000070
【図２４】
2018509930.tif 000071
【図２５】
2018509930.tif 000072
【図２６】
2018509930.tif 000073
【図２７】
2018509930.tif 000074
【図２８】
2018509930.tif 000075
【国際調査報告】
2018509930.tif 000076
2018509930.tif 000077