(57)【要約】本発明は、結合ポリペプチドを含む細菌を特定する方法を提供する。本発明はまた、結合ポリペプチドの改善された発現を有する細菌を特定する方法も提供する。本発明はまた、改善された発現を有する結合ポリペプチドを特定する方法も提供する。本発明はまた、本発明の方法における使用に好適な、操作された細菌も提供する。本発明はまた、本方法を使用して得ることができる組成物、例えば、改善された発現及び／または安定性を有する抗インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）抗体も提供する。本発明はまた、結合ポリペプチド（例えば、抗体）バリアントを含むライブラリも提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子に特異的に結合する結合ポリペプチドを含む細菌を特定するための方法であって、
（ａ）１０ｋＤａ超の分子量を有する分子に対して透過性である外膜を有する細菌を提供するステップであって、前記細菌が、候補結合ポリペプチドをコードする核酸を発現し、前記候補結合ポリペプチドが、前記細菌の周辺質内に存在する、ステップと、
（ｂ）前記細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させるステップと、
（ｃ）前記周辺質内の前記標識された標的分子の存在によって、前記細菌を、結合ポリペプチドを含むものとして特定するステップであって、前記細菌が、ステップ（ｃ）の後に生存可能のままである、ステップと、を含む、前記方法。
【請求項２】
標的分子に特異的に結合する結合ポリペプチドの改善された発現を有する細菌を特定するための方法であって、
（ａ）１０ｋＤａ超の分子量を有する分子に対して透過性である外膜を有する細菌を提供するステップであって、前記細菌が、結合ポリペプチドをコードする核酸を発現し、前記結合ポリペプチドが、前記細菌の周辺質内に存在する、ステップと、
（ｂ）前記細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させるステップと、
（ｃ）前記周辺質内の前記標識された標的分子の存在によって、前記細菌を、前記結合ポリペプチドの改善された発現を有するものとして特定するステップであって、前記細菌が、ステップ（ｃ）の後に生存可能のままである、ステップと、を含む、前記方法。
【請求項３】
前記標的分子が、２５０ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記標的分子が、１５０ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
標的分子に特異的に結合する結合ポリペプチドを含む細菌を特定するための方法であって、
（ａ）外膜を渡る膜不透過性分子の周辺質内への拡散を可能にする変異を含む細菌を提供するステップであって、前記細菌が、候補結合ポリペプチドをコードする核酸を発現し、前記候補結合ポリペプチドが、前記細菌の前記周辺質内に存在する、ステップと、
（ｂ）前記細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させるステップと、
（ｃ）前記周辺質内の前記標識された標的分子の存在によって、前記細菌を、結合ポリペプチドを含むものとして特定するステップであって、前記細菌が、ステップ（ｃ）の後に生存可能のままである、ステップと、を含む、前記方法。
【請求項６】
標的分子に特異的に結合する結合ポリペプチドの改善された発現を有する細菌を特定するための方法であって、
（ａ）外膜を渡る膜不透過性分子の周辺質内への拡散を可能にする変異を含む細菌を提供するステップであって、前記細菌が、候補結合ポリペプチドをコードする核酸を発現し、前記候補結合ポリペプチドが、前記細菌の前記周辺質内に存在する、ステップと、
（ｂ）前記細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させるステップと、
（ｃ）前記周辺質内の前記標識された標的分子の存在によって、前記細菌を、前記結合ポリペプチドの改善された発現を有するものとして特定するステップであって、前記細菌が、ステップ（ｃ）の後に生存可能のままである、ステップと、を含む、前記方法。
【請求項７】
ステップ（ｂ）の前に、前記細菌を、前記細菌の前記外膜を透過化する条件に供することを更に含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させた後、前記細菌の前記外膜を再封着することを更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
標的分子に特異的に結合する結合ポリペプチドを含む細菌を特定するための方法であって、
（ａ）候補結合ポリペプチドをコードする核酸を発現する細菌を提供するステップであって、前記候補結合ポリペプチドが、前記細菌の周辺質内に存在する、ステップと、
（ｂ）前記細菌を、前記細菌の外膜を透過化する条件に供するステップと、
（ｃ）前記細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の後に、前記細菌の前記外膜を再封着するステップと、
（ｅ）前記周辺質内の前記標識された標的分子の存在によって、前記細菌を、結合ポリペプチドを含むものとして特定するステップと、を含む、前記方法。
【請求項１０】
標的分子に特異的に結合する結合ポリペプチドの改善された発現を有する細菌を特定するための方法であって、
（ａ）候補結合ポリペプチドをコードする核酸を発現する細菌を提供するステップであって、前記候補結合ポリペプチドが、前記細菌の周辺質内に存在する、ステップと、
（ｂ）前記細菌を、前記細菌の外膜を透過化する条件に供するステップと、
（ｃ）前記細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の後に、前記細菌の前記外膜を再封着するステップと、
（ｅ）前記周辺質内の前記標識された標的分子の存在によって、前記細菌を、前記結合ポリペプチドの改善された発現を有するものとして特定するステップと、を含む、前記方法。
【請求項１１】
前記核酸を単離する介在ステップなく、少なくとも１回、前記方法の前記ステップを繰り返すことを更に含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法を繰り返す前に、成長培地中で前記細菌をインキュベートすることを更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細菌が、前記外膜を渡る膜不透過性分子の前記周辺質内への拡散を可能にする変異を含む、請求項１〜４及び７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記変異が、外膜タンパク質またはリポ多糖（ＬＰＳ）組成に影響を与えるタンパク質をコードする遺伝子中にある、請求項５、６、及び１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記外膜タンパク質が、主要外膜リポタンパク質Ｌｐｐ（Ｌｐｐ）、ポリン、またはＴｏｌＣである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＬＰＳ組成に影響を与えるタンパク質が、ＥｎｖＡ、ＲｆａＤ、ＲｆａＥ、ＲｆａＨ、ＲｆａＲｄ、ＴｏｌＡ、ＴｏｌＢ、及びＴｏｌＤから選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌を、前記細菌の前記外膜を透過化する条件に供することが、前記細菌を透過化剤で処理することを含む、請求項７〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記透過化剤が、二価カチオンキレート剤、ＮａＣｌ、スクロース、抗生物質、洗剤、リゾチーム、トリス、トリス−ＥＤＴＡ、アスコルベート、ポリリジン、塩化ベンザルコニウム、プロタミン、殺菌性／透過性増強タンパク質（ＢＰＩ）、血清、補体、及びＣａ２＋からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記二価カチオンキレート剤が、ＥＤＴＡである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗生物質が、アミノグリコシド、ポリミキシンＢ、脱アシル化ポリミキシン、オクタペプチン、及びベンジルペニシリンからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記細菌の前記外膜を再封着することが、前記細菌を、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｎａ＋、またはＫ＋から選択されるカチオンの塩と接触させることを含む、請求項８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記カチオンが、Ｍｇ２＋である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｍｇ２＋の塩が、ＭｇＣｌ２である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記接触ステップが、前記細菌を核酸色素と接触させることを更に含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸色素が、ＳＹＴＯ（登録商標）９、ＳＹＴＯ（登録商標）４１、ＳＹＴＯ（登録商標）４３、ＳＹＴＯ（登録商標）４２、ＳＹＴＯ（登録商標）４４、ＳＹＴＯ（登録商標）４０、及びＳＹＴＯ（登録商標）４５からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸色素が、ＳＹＴＯ（登録商標）９またはＳＹＴＯ（登録商標）４１である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記検出可能に標識された標的分子が、蛍光標識を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記蛍光標識が、蛍光標識または蛍光ポリペプチドを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記蛍光色素が、ＡＬＥＸＡ（登録商標）色素またはＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）色素からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記  ＡＬＥＸＡ（登録商標）色素が、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８またはＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）色素が、ＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）６４９である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記細菌を前記検出可能に標識された標的分子と接触させた後、前記細菌を洗浄緩衝液中に再懸濁させることを含む、少なくとも１回の洗浄ステップを更に含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記特定ステップが、フローサイトメトリーを含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記フローサイトメトリーが、単細胞を選別すること、及び前記検出可能に標識された標的分子のシグナルに基づいて選別することを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
核酸色素のシグナルに基づいて選別することを更に含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記フローサイトメトリーが、順次に、（ｉ）核酸色素のシグナルに基づいて選別することと、（ｉｉ）単細胞を選別することと、（ｉｉｉ）前記検出可能に標識された標的分子のシグナルに基づいて選別することと、を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細菌が、グラム陰性菌である、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記グラム陰性菌が、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記結合ポリペプチドが、前記細菌の前記周辺質内で可溶性形態で発現される、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記結合ポリペプチドが、抗体である、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体が、全長抗体である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記全長抗体が、ＩｇＧ抗体である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗体が、半抗体である、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗体が、抗体断片である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）２断片からなる群から選択される、請求項４４に記載の抗体。
【請求項４６】
ステップ（ａ）が、複数の細菌を提供することを含み、前記複数の細菌が、それぞれが候補結合ポリペプチドをコードする核酸のライブラリを含む、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ライブラリが、候補抗体バリアントをコードする複数の核酸を含み、各候補抗体バリアントが、参照抗体と比較して、ＶＨまたはＶＬのＦＲ中にアミノ酸残基変化を含み、前記アミノ酸残基変化が、（ａ）前記参照抗体と同一の亜型を有する天然に存在する抗体において特定され、かつ（ｂ）埋もれると予想されるアミノ酸残基中にある、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記天然に存在する抗体における前記アミノ酸残基変化が、体細胞超変異によるものである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記周辺質内の前記標識された標的分子の量に基づいて、候補結合ポリペプチドを、増加した発現レベルを有するものとして特定するステップを更に含む、請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記周辺質内の前記標識された標的分子の量に基づいて、候補結合ポリペプチドを、増加した安定性を有するものとして特定するステップを更に含む、請求項４６〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記特定ステップの後に、前記核酸を単離することを更に含む、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記細菌が、転写制御遺伝子に影響を与える変異を含む、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
ステップ（ａ）が、複数の細菌を提供することを含み、前記複数の細菌が、それぞれが前記転写制御遺伝子の変異体をコードする核酸のライブラリを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記転写制御遺伝子が、転写開始因子、抗シグマ因子、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット、または転写因子から選択される、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記転写開始因子が、シグマ因子である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記シグマ因子が、ＲｐｏＤ（σ７０）、ＲｐｏＥ（σ２４）、ＲｐｏＨ（σ３２）、ＲｐｏＳ（σ３８）、ＲｐｏＮ（σ５４）、ＲｐｏＦ（σ２８）、及びＦｅｃＩ（σ１９）からなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記シグマ因子が、ＲｐｏＤ（σ７０）である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記転写制御遺伝子に影響を与える前記変異が、合成プラスミド上に存在する、請求項５２〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記転写制御遺伝子に影響を与える前記変異が、内在性細菌ゲノム中に存在する、請求項５２〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記転写制御遺伝子に影響を与える前記変異が、エラープローンＰＣＲ変異原性、化学変異原性、転位変異原性、または標的化変異原性によるものである、請求項５２〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記転写制御遺伝子に影響を与える前記変異が、エラープローンＰＣＲ変異原性によるものである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記方法が、前記結合ポリペプチドの改善された発現を有する細菌を特定する、請求項５２〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
（ｉ）Ｌｐｐをコードする遺伝子中の機能欠失型変異、及び（ｉｉ）抗体をコードする発現構築物を含む、細菌。
【請求項６４】
前記抗体が、全長抗体である、請求項６３に記載の細菌。
【請求項６５】
前記全長抗体が、ＩｇＧ抗体である、請求項６４に記載の細菌。
【請求項６６】
前記抗体が、半抗体である、請求項６３〜６５のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項６７】
前記抗体が、抗体断片である、請求項６３に記載の細菌。
【請求項６８】
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）２断片からなる群から選択される、請求項６７に記載の細菌。
【請求項６９】
前記細菌が、グラム陰性菌である、請求項６３〜６８のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項７０】
前記グラム陰性菌が、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌である、請求項６９に記載の細菌。
【請求項７１】
前記抗体が、前記細菌の前記周辺質内で可溶性形態で発現される、請求項６３〜７０のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項７２】
前記機能欠失型変異が、点変異、挿入変異、または欠失変異である、請求項６３〜７１のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項７３】
前記機能欠失型変異が、欠失変異である、請求項７２に記載の細菌。
【請求項７４】
前記発現構築物が、前記抗体をコードする遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターを含む、請求項６３〜７３のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項７５】
前記発現構築物が、合成プラスミドを含む、請求項６３〜７４のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項７６】
転写制御遺伝子に影響を与える変異を更に含む、請求項６３〜７５のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項７７】
（ｉ）前記外膜を渡る膜不透過性分子の前記周辺質内への拡散を可能にする変異と、（ｉｉ）結合ポリペプチドをコードする発現構築物と、（ｉｉｉ）転写制御遺伝子に影響を与える変異と、を含む、細菌。
【請求項７８】
前記転写制御遺伝子が、転写開始因子、抗シグマ因子、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット、または転写因子から選択される、請求項７６または７７に記載の細菌。
【請求項７９】
前記転写開始因子が、シグマ因子である、請求項７８に記載の細菌。
【請求項８０】
前記シグマ因子が、ＲｐｏＤ（σ７０）、ＲｐｏＥ（σ２４）、ＲｐｏＨ（σ３２）、ＲｐｏＳ（σ３８）、ＲｐｏＮ（σ５４）、ＲｐｏＦ（σ２８）、及びＦｅｃＩ（σ１９）からなる群から選択される、請求項７９に記載の細菌。
【請求項８１】
前記シグマ因子が、ＲｐｏＤ（σ７０）である、請求項８０に記載の細菌。
【請求項８２】
前記転写制御遺伝子に影響を与える前記変異が、合成プラスミド上に存在する、請求項７６〜８１のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項８３】
前記転写制御遺伝子に影響を与える前記変異が、内在性細菌ゲノム中に存在する、請求項７６〜８１のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項８４】
前記転写制御遺伝子に影響を与える前記変異が、エラープローンＰＣＲ変異原性、化学変異原性、転位変異原性、または標的化変異原性によるものである、請求項７６〜８３のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項８５】
前記転写制御遺伝子に影響を与える前記変異が、エラープローンＰＣＲ変異原性によるものである、請求項８４に記載の細菌。
【請求項８６】
前記結合ポリペプチドが、抗体である、請求項７７〜８５のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項８７】
前記抗体が、全長抗体である、請求項８６に記載の細菌。
【請求項８８】
前記全長抗体が、ＩｇＧ抗体である、請求項８７に記載の細菌。
【請求項８９】
前記抗体が、半抗体である、請求項８６〜８８のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項９０】
前記抗体が、抗体断片である、請求項８６に記載の細菌。
【請求項９１】
前記外膜を渡る膜不透過性分子の前記周辺質内への拡散を可能にする変異が、外膜タンパク質またはＬＰＳ組成に影響を与えるタンパク質をコードする遺伝子中にある、請求項７７〜９０のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項９２】
前記外膜タンパク質が、主要外膜リポタンパク質Ｌｐｐ（Ｌｐｐ）、ポリン、またはＴｏｌＣである、請求項９１に記載の細菌。
【請求項９３】
前記外膜タンパク質が、Ｌｐｐである、請求項９２に記載の細菌。
【請求項９４】
ＬＰＳ組成に影響を与える前記タンパク質が、ＥｎｖＡ、ＲｆａＤ、ＲｆａＥ、ＲｆａＨ、ＲｆａＲｄ、ＴｏｌＡ、ＴｏｌＢ、及びＴｏｌＤから選択される、請求項９１に記載の細菌。
【請求項９５】
インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）に特異的に結合する単離された抗体であって、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、を含む、前記抗体。
【請求項９６】
ＩＬ−１３に特異的に結合する単離された抗体であって、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、前記抗体。
【請求項９７】
ＩＬ−１３に特異的に結合する単離された抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、前記抗体。
【請求項９８】
ＩＬ−１３に特異的に結合する単離された抗体であって、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、前記抗体。
【請求項９９】
ＩＬ−１３に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、を含む、前記抗体。
【請求項１００】
ＩＬ−１３に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、を含む、前記抗体。
【請求項１０１】
ＩＬ−１３に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、を含む、前記抗体。
【請求項１０２】
ＩＬ−１３に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、を含む、前記抗体。
【請求項１０３】
ＩＬ−１３に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、を含む、前記抗体。
【請求項１０４】
前記抗体が、以下の６つのＨＶＲ：
（ａ）ＡＹＳＶＮ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、
（ｂ）ＭＩＷＧＤＧＫＩＶＹＮＳＡＬＫＳ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、
（ｃ）ＤＧＹＹＰＹＡＭＤＮ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、
（ｄ）ＲＡＳＫＳＶＤＳＹＧＮＳＦＭＨ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、
（ｅ）ＬＡＳＮＬＥＳ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、
（ｆ）ＱＱＮＮＥＤＰＲＴ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、を更に含む、請求項９５〜１０３のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項１０５】
前記抗体が、約１ｎＭ以下のＫＤでヒトＩＬ−１３に特異的に結合する、請求項９５〜１０４のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項１０６】
前記抗体が、約１ｐＭ〜約５０ｐＭのＫＤでヒトＩＬ−１３に特異的に結合する、請求項１０５に記載の単離された抗体。
【請求項１０７】
前記抗体が、約２９ｐＭ〜約４０ｐＭのＫＤでヒトＩＬ−１３に特異的に結合する、請求項１０６に記載の単離された抗体。
【請求項１０８】
前記抗体が、モノクローナル、ヒト、ヒト化、またはキメラである、請求項９５〜１０７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０９】
前記抗体が、全長抗体である、請求項９５〜１０８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１０】
前記全長抗体が、ＩｇＧ抗体である、請求項１０９に記載の抗体。
【請求項１１１】
前記抗体が、半抗体である、請求項９５〜１１０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１２】
前記抗体が、ＩＬ−１３に結合する抗体断片である、請求項９５〜１０８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１３】
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）２断片からなる群から選択される、請求項１１２に記載の抗体。
【請求項１１４】
前記抗体が、単一特異性抗体である、請求項９５〜１１３にいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１５】
前記抗体が、多重特異性抗体である、請求項９５〜１１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１６】
前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、請求項１１５に記載の抗体。
【請求項１１７】
請求項９５〜１１６のいずれか１項に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
【請求項１１８】
請求項１１７に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項１１９】
請求項１１８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１２０】
前記宿主細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１１９に記載の宿主細胞。
【請求項１２１】
前記宿主細胞が、原核細胞である、請求項１１９に記載の宿主細胞。
【請求項１２２】
前記原核細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項１２１に記載の宿主細胞。
【請求項１２３】
請求項９５〜１１６のいずれか１項に記載の抗体を産生する方法であって、請求項１１４に記載の宿主細胞を培養培地中で培養することを含む、前記方法。
【請求項１２４】
前記方法が、前記宿主細胞または前記培養培地から前記抗体を回収することを更に含む、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
請求項９５〜１１６のいずれか１項に記載の抗体を含む、組成物。
【請求項１２６】
薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を更に含む、請求項１２５に記載の組成物。
【請求項１２７】
前記組成物が、薬学的組成物である、請求項１２６に記載の組成物。
【請求項１２８】
医薬品として使用するための、請求項９５〜１１６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２９】
ＩＬ−１３媒介性障害の治療に使用するための、請求項９５〜１１６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１３０】
喘息症状を患う患者を治療する方法であって、前記患者に、有効量の請求項９５〜１１６のいずれか１項に記載の抗体を投与して、前記喘息症状を低減することを含む、前記方法。
【請求項１３１】
患者におけるＩｇＥ抗体産生を阻害するための方法であって、前記患者に、有効量の請求項９５〜１１６のいずれか１項に記載の抗体を投与することを含む、前記方法。
【請求項１３２】
ＩｇＥ抗体産生の前記阻害が、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、アナフィラキシー、またはアトピー性皮膚炎を治療することが意図される、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
患者におけるＩＬ−１３媒介性障害を治療する方法であって、前記患者に、有効量の請求項９５〜１１６のいずれか１項に記載の抗体を投与することを含む、前記方法。
【請求項１３４】
前記障害が、アレルギー性喘息、非アレルギー性（内因性）喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、湿疹、蕁麻疹、食物アレルギー、慢性閉塞性肺疾患、潰瘍性大腸炎、ＲＳＶ感染症、ブドウ膜炎、強皮症、または骨粗鬆症である、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
患者におけるＩｇＥ媒介性障害を治療する方法であって、前記患者に、有効量の請求項９５〜１１６のいずれか１項に記載の抗体を投与することを含む、前記方法。
【請求項１３６】
前記ＩｇＥ媒介性障害が、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、蕁麻疹、アナフィラキシー、またはアトピー性皮膚炎である、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記抗体が、ＩＬ−１３のその受容体への結合を阻害し、ＩＬ−１３のその受容体への結合に関連する１つ以上の機能を阻害する、請求項１３０〜１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
前記抗体が、静脈内、腹腔内、吸入、筋肉内、皮下、及び経口からなる群から選択される経路のうちの１つ以上によって投与される、請求項１３０〜１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
前記経路が、皮下である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
前記患者が、ヒトである、請求項１３０〜１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
候補抗体バリアントをコードする複数の核酸を含むライブラリであって、各候補結合ポリペプチドバリアントが、参照抗体と比較して、ＶＨまたはＶＬのＦＲ中にアミノ酸残基変化を含み、前記アミノ酸残基変化が、（ａ）前記参照抗体と同一の亜型を有する天然に存在する抗体において特定され、かつ（ｂ）埋もれると予想されるアミノ酸残基中にある、前記ライブラリ。
【請求項１４２】
前記天然に存在する抗体における前記アミノ酸残基変化が、体細胞超変異によるものである、請求項１４１に記載のライブラリ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、これによりその全体が参照によって組み込まれる、配列表を含む。２０１６年４月２０日に作製された該ＡＳＣＩＩコピーは、５０４７４−１０２ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿４．２０．１６＿ＳＴ２５という名称であり、２６，３８４バイトのサイズである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、結合ポリペプチドを含む細菌を特定する方法、改善された発現を有する結合ポリペプチドを特定する方法、結合ポリペプチドの改善された発現を有する細菌を特定する方法、本方法における使用に好適な操作された細菌、本方法を使用して得られる組成物、例えば、改善された発現及び／または安定性を有する抗体（例えば、改善された発現及び／または安定性を有する、抗インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）抗体及び抗血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）抗体）、ならびに結合ポリペプチド（例えば、抗体）バリアントを含むライブラリを対象とする。
【背景技術】
【０００３】
バクテリオファージまたは細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞）の表面上での結合ポリペプチド（例えば、抗体またはその断片）の提示は、タンパク質操作のために広く使用されるアプローチである。細菌の急速な複製時間は、他の細胞提示技術と比較して、細菌提示に対して加速した１巡毎の進行を提供する一方で、これらの利点は一般に、細胞内に候補結合ポリペプチドを保持し、抗原接触可能性を維持するために必要とされる妥協によって相殺されている。大分子を細菌外膜タンパク質に対する融合物として提示することは困難であり得、これらの系の用途をペプチドまたは小タンパク質に限定している。別のアプローチは、周辺質内でのより大きなタンパク質の提示である。しかしながら、ほとんどの条件下で、外膜は、約６００ダルトン超の分子量を有する親水性分子の周辺質内への拡散に対して不透過性である（例えば、Ｄｅｃａｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １２８（１）：３２５−３３６，１９７６を参照されたい）。より大きなリガンドに対する結合ポリペプチドの周辺質提示の現在のアプローチは、外膜の除去を伴い、これは（例えば、融合タンパク質または他の繋留を使用することによって）結合ポリペプチドを内膜の外側に繋留して、結合ポリペプチドの細菌内膜との会合を維持することを必要とする。更に、外膜の破壊は細胞死をもたらし、これは細菌提示の巡と巡との間に時間のかかる分子操作を必要とする。
【０００４】
したがって、例えば、所望される特徴（例えば、改善された発現、安定性、及び／または親和性）を有するタンパク質バリアントを特定するため、ならびに結合ポリペプチドの改善された発現を有する細菌を特定するために使用することができる、全長結合ポリペプチド（例えば、抗体）及び標的分子（例えば、抗原）と適合する、生細胞細菌提示のための改善された方法に対する必要性が未だ存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、所望される結合ポリペプチドを内部に持つ細菌を特定する方法、改善された発現を有する結合ポリペプチドを特定する方法、結合ポリペプチドの改善された発現を有する細菌を特定する方法、本方法における使用に好適な操作された細菌、本方法を使用して得られる組成物、例えば、改善された発現及び／または安定性を有する抗体（例えば、抗ＩＬ−１３及び抗ＶＥＧＦ抗体）、ならびに結合ポリペプチド（例えば、抗体）バリアントを含むライブラリを対象とする。
【０００６】
一態様において、本発明は、標的分子に特異的に結合する結合ポリペプチドを含む細菌を特定するための方法であって、（ａ）１０ｋＤａ超の分子量を有する分子に対して透過性である外膜を有する細菌を提供するステップであって、細菌が、候補結合ポリペプチドをコードする核酸を発現し、候補結合ポリペプチドが、細菌の周辺質内に存在する、ステップと、（ｂ）細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させるステップと、（ｃ）周辺質内の標識された標的分子の存在によって、細菌を、結合ポリペプチドを含むものとして特定するステップであって、細菌が、ステップ（ｃ）の後に生存可能のままである、ステップとを含む、方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、標的分子は、２５０ｋＤａ未満の分子量を有する。いくつかの実施形態において、標的分子は、１５０ｋＤａ未満の分子量を有する。
【０００７】
別の態様において、本発明は、標的分子に特異的に結合する結合ポリペプチドの改善された発現を有する細菌を特定するための方法であって、（ａ）１０ｋＤａ超の分子量を有する分子に対して透過性である外膜を有する細菌を提供するステップであって、細菌が、結合ポリペプチドをコードする核酸を発現し、結合ポリペプチドが、細菌の周辺質内に存在する、ステップと、（ｂ）細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させるステップと、（ｃ）周辺質内の標識された標的分子の存在によって、細菌を、結合ポリペプチドの改善された発現を有するものとして特定するステップであって、細菌が、ステップ（ｃ）の後に生存可能のままである、ステップとを含む、方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、標的分子は、２５０ｋＤａ未満の分子量を有する。いくつかの実施形態において、標的分子は、１５０ｋＤａ未満の分子量を有する。
【０００８】
別の態様において、本発明は、本発明は、標的分子に特異的に結合する結合ポリペプチドを含む細菌を特定するための方法であって、（ａ）外膜を渡る膜不透過性分子の周辺質内への拡散を可能にする変異を含む細菌を提供するステップであって、細菌が、候補結合ポリペプチドをコードする核酸を発現し、候補結合ポリペプチドが、細菌の周辺質内に存在する、ステップと、（ｂ）細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させるステップと、（ｃ）周辺質内の標識された標的分子の存在によって、細菌を、結合ポリペプチドを含むものとして特定するステップであって、細菌が、ステップ（ｃ）の後に生存可能のままである、ステップとを含む、方法を特徴とする。
【０００９】
別の態様において、本発明は、標的分子に特異的に結合する結合ポリペプチドの改善された発現を有する細菌を特定するための方法であって、（ａ）外膜を渡る膜不透過性分子の周辺質内への拡散を可能にする変異を含む細菌を提供するステップであって、細菌が、結合ポリペプチドをコードする核酸を発現し、結合ポリペプチドが、細菌の周辺質内に存在する、ステップと、（ｂ）細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させるステップと、（ｃ）周辺質内の標識された標的分子の存在によって、細菌を、結合ポリペプチドの改善された発現を有するものとして特定するステップであって、細菌が、ステップ（ｃ）の後に生存可能のままである、ステップとを含む、方法を特徴とする。
【００１０】
前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、ステップ（ｂ）の前に、細菌を、細菌の外膜を透過化する条件に供することを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させた後、細菌の外膜を再封着することを更に含む。
【００１１】
別の態様において、本発明は、本発明は、標的分子に特異的に結合する結合ポリペプチドを含む細菌を特定するための方法であって、（ａ）候補結合ポリペプチドをコードする核酸を発現する細菌を提供するステップであって、候補結合ポリペプチドが、細菌の周辺質内に存在する、ステップと、（ｂ）細菌を、細菌の外膜を透過化する条件に供するステップと、（ｃ）細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させるステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の後に、細菌の外膜を再封着するステップと、（ｅ）周辺質内の標識された標的分子の存在によって、細菌を、結合ポリペプチドを含むものとして特定するステップとを含む、方法を特徴とする。別の態様において、本発明は、標的分子に特異的に結合する結合ポリペプチドの改善された発現を有する細菌を特定するための方法であって、（ａ）結合ポリペプチドをコードする核酸を発現する細菌を提供するステップであって、結合ポリペプチドが、細菌の周辺質内に存在する、ステップと、（ｂ）細菌を、細菌の外膜を透過化する条件に供するステップと、（ｃ）細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させるステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の後に、細菌の外膜を再封着するステップと、（ｅ）周辺質内の標識された標的分子の存在によって、細菌を、結合ポリペプチドの改善された発現を有するものとして特定するステップとを含む、方法を特徴とする。
【００１２】
前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、核酸を単離する介在ステップなく、少なくとも１回、本方法のステップを繰り返すことを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、本方法を繰り返す前に、成長培地中で細菌をインキュベートすることを更に含む。
【００１３】
前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、細菌は、外膜を渡る膜不透過性分子の周辺質内への拡散を可能にする変異を含む。いくつかの実施形態において、変異は、外膜タンパク質またはリポ多糖（ＬＰＳ）組成に影響を与えるタンパク質をコードする遺伝子中にある。いくつかの実施形態において、外膜タンパク質は、主要外膜リポタンパク質Ｌｐｐ（Ｌｐｐ）、ポリン、またはＴｏｌＣである。いくつかの実施形態において、ＬＰＳ組成に影響を与えるタンパク質は、ＲｆａＤ、ＲｆａＥ、ＲｆａＨ、ＲｆａＲｄ、ＴｏｌＡ、ＴｏｌＢ、及びＴｏｌＤから選択される。
【００１４】
前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、細菌を、細菌の外膜を透過化する条件に供することは、細菌を透過化剤で処理することを含む。いくつかの実施形態において、透過化剤は、二価カチオンキレート剤、ＮａＣｌ、スクロース、抗生物質、洗剤、リゾチーム、トリス、トリス−ＥＤＴＡ、アスコルベート、ポリリジン、塩化ベンザルコニウム、プロタミン、殺菌性／透過性増強タンパク質（ＢＰＩ）、血清、補体、及びＣａ２＋からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、二価カチオンキレート剤は、ＥＤＴＡである。いくつかの実施形態において、抗生物質は、アミノグリコシド、ポリミキシンＢ、脱アシル化ポリミキシン、オクタペプチン、及びベンジルペニシリンからなる群から選択される。
【００１５】
前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、細菌の外膜を再封着することは、細菌を、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｎａ＋、またはＫ＋から選択されるカチオンの塩と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、カチオンは、Ｍｇ２＋である。いくつかの実施形態において、Ｍｇ２＋の塩は、ＭｇＣｌ２である。
【００１６】
前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、接触ステップは、細菌を核酸色素と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態において、核酸色素は、ＳＹＴＯ（登録商標）９、ＳＹＴＯ（登録商標）４１、ＳＹＴＯ（登録商標）４３、ＳＹＴＯ（登録商標）４２、ＳＹＴＯ（登録商標）４４、ＳＹＴＯ（登録商標）４０、及びＳＹＴＯ（登録商標）４５からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、核酸色素は、ＳＹＴＯ（登録商標）９またはＳＹＴＯ（登録商標）４１である。
【００１７】
前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、検出可能に標識された標的分子は、蛍光標識を含む。いくつかの実施形態において、蛍光標識は、蛍光色素または蛍光ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、蛍光色素は、ＡＬＥＸＡ（登録商標）色素またはＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）色素からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＡＬＥＸＡ（登録商標）色素は、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８またはＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７である。いくつかの実施形態において、ＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）色素は、ＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）６４９である。
【００１８】
前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させた後、細菌を洗浄緩衝液中に再懸濁させることを含む、少なくとも１回の洗浄ステップを更に含む。
【００１９】
前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、特定ステップは、フローサイトメトリーを含む。いくつかの実施形態において、フローサイトメトリーは、単細胞を選別すること、及び検出可能に標識された標的分子のシグナルに基づいて選別することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、核酸色素のシグナルに基づいて選別することを更に含む。いくつかの実施形態において、フローサイトメトリーは、順次に、（ｉ）核酸色素のシグナルに基づいて選別することと、（ｉｉ）単細胞を選別することと、（ｉｉｉ）検出可能に標識された標的分子のシグナルに基づいて選別することとを含む。
【００２０】
前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、細菌は、グラム陰性菌である。いくつかの実施形態において、グラム陰性菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌である。
【００２１】
前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、結合ポリペプチドは細菌の周辺質内で可溶性形態で発現される。
【００２２】
前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、結合ポリペプチドは、抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、全長抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、半抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、抗体断片である。いくつかの実施形態において、抗体断片はＦａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）２断片からなる群から選択される。
【００２３】
前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ステップ（ａ）は、複数の細菌を提供することを含み、複数の細菌が、それぞれが候補結合ポリペプチドをコードする核酸のライブラリを含む。いくつかの実施形態において、ライブラリは、候補抗体バリアントをコードする複数の核酸を含み、各候補抗体バリアントは、参照抗体と比較して、ＶＨまたはＶＬのＦＲ中にアミノ酸残基変化を含み、アミノ酸残基変化は、（ａ）参照抗体と同一の亜型を有する天然に存在する抗体において特定され、かつ（ｂ）埋もれると予想されるアミノ酸残基中にある。いくつかの実施形態において、天然に存在する抗体におけるアミノ酸残基変化は、体細胞超変異によるものである。いくつかの実施形態において、周辺質内の標識された標的分子の量に基づいて、候補結合ポリペプチドを、増加した発現レベルを有するものとして特定するステップ。いくつかの実施形態において、本方法は、周辺質内の標識された標的分子の量に基づいて、候補結合ポリペプチドを、増加した安定性を有するものとして特定するステップを更に含む。
【００２４】
前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、特定ステップの後に、核酸を単離することを更に含む。
【００２５】
前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、細菌は、転写制御遺伝子に影響を与える変異を含む。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）は、複数の細菌を提供することを含み、複数の細菌は、それぞれが転写制御遺伝子の変異体をコードする核酸のライブラリを含む。いくつかの実施形態において、転写制御遺伝子は、転写開始因子、抗シグマ因子、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット、または転写因子から選択される。いくつかの実施形態において、転写開始因子は、シグマ因子である。いくつかの実施形態において、シグマ因子は、ＲｐｏＤ（σ７０）、ＲｐｏＥ（σ２４）、ＲｐｏＨ（σ３２）、ＲｐｏＳ（σ３８）、ＲｐｏＮ（σ５４）、ＲｐｏＦ（σ２８）、及びＦｅｃＩ（σ１９）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、シグマ因子は、ＲｐｏＤ（σ７０）である。いくつかの実施形態において、転写制御遺伝子に影響を与える変異は、合成プラスミド上に存在する。いくつかの実施形態において、転写制御遺伝子に影響を与える変異は、内在性細菌ゲノム中に存在する。いくつかの実施形態において、転写制御遺伝子に影響を与える変異は、エラープローンＰＣＲ変異原性、化学変異原性、転位変異原性、または標的化変異原性によるものである。いくつかの実施形態において、転写制御遺伝子に影響を与える変異は、エラープローンＰＣＲ変異原性によるものである。いくつかの実施形態において、本方法は、結合ポリペプチドの改善された発現を有する細菌を特定する。
【００２６】
別の態様において、本発明は、（ｉ）Ｌｐｐをコードする遺伝子中の機能欠失型変異、及び（ｉｉ）抗体をコードする発現構築物を含む、細菌を特徴とする。いくつかの実施形態において、抗体は、全長抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、半抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、抗体断片である。いくつかの実施形態において、抗体断片はＦａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）２断片からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、細菌は、グラム陰性菌である。いくつかの実施形態において、グラム陰性菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌である。いくつかの実施形態において、抗体は、細菌の周辺質内で可溶性形態で発現される。いくつかの実施形態において、機能欠失型変異は、点変異、挿入変異、または欠失変異である。いくつかの実施形態において、機能欠失型変異は、欠失変異である。いくつかの実施形態において、発現構築物は、抗体をコードする遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、発現構築物は、合成プラスミドを含む。いくつかの実施形態において、細菌は、転写制御遺伝子に影響を与える変異を更に含む。いくつかの実施形態において、転写制御遺伝子は、転写開始因子、抗シグマ因子、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット、または転写因子から選択される。いくつかの実施形態において、転写開始因子は、シグマ因子である。いくつかの実施形態において、シグマ因子は、ＲｐｏＤ（σ７０）、ＲｐｏＥ（σ２４）、ＲｐｏＨ（σ３２）、ＲｐｏＳ（σ３８）、ＲｐｏＮ（σ５４）、ＲｐｏＦ（σ２８）、及びＦｅｃＩ（σ１９）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、シグマ因子は、ＲｐｏＤ（σ７０）である。いくつかの実施形態において、転写制御遺伝子に影響を与える変異は、合成プラスミド上に存在する。いくつかの実施形態において、転写制御遺伝子に影響を与える変異は、内在性細菌ゲノム中に存在する。いくつかの実施形態において、転写制御遺伝子に影響を与える変異は、エラープローンＰＣＲ変異原性、化学変異原性、転位変異原性、または標的化変異原性によるものである。いくつかの実施形態において、転写制御遺伝子に影響を与える変異は、エラープローンＰＣＲ変異原性によるものである。
【００２７】
別の態様において、本発明は、（ｉ）外膜を渡る膜不透過性分子の周辺質内への拡散を可能にする変異と、（ｉｉ）結合ポリペプチドをコードする発現構築物と、（ｉｉｉ）転写制御遺伝子に影響を与える変異とを含む、細菌を特徴とする。いくつかの実施形態において、転写制御遺伝子は、転写開始因子、抗シグマ因子、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット、または転写因子から選択される。いくつかの実施形態において、転写開始因子は、シグマ因子である。いくつかの実施形態において、シグマ因子は、ＲｐｏＤ（σ７０）、ＲｐｏＥ（σ２４）、ＲｐｏＨ（σ３２）、ＲｐｏＳ（σ３８）、ＲｐｏＮ（σ５４）、ＲｐｏＦ（σ２８）、及びＦｅｃＩ（σ１９）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、シグマ因子は、ＲｐｏＤ（σ７０）である。いくつかの実施形態において、転写制御遺伝子に影響を与える変異は、合成プラスミド上に存在する。いくつかの実施形態において、転写制御遺伝子に影響を与える変異は、内在性細菌ゲノム中に存在する。いくつかの実施形態において、転写制御遺伝子に影響を与える変異は、エラープローンＰＣＲ変異原性、化学変異原性、転位変異原性、または標的化変異原性によるものである。いくつかの実施形態において、転写制御遺伝子に影響を与える変異は、エラープローンＰＣＲ変異原性によるものである。いくつかの実施形態において、結合ポリペプチドは、抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、全長抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、半抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、抗体断片である。いくつかの実施形態において、抗体断片はＦａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）２断片からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、細菌は、グラム陰性菌である。いくつかの実施形態において、グラム陰性菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌である。いくつかの実施形態において、抗体は、細菌の周辺質内で可溶性形態で発現される。いくつかの実施形態において、外膜を渡る膜不透過性分子の周辺質内への拡散を可能にする変異は、外膜タンパク質またはＬＰＳ組成に影響を与えるタンパク質をコードする遺伝子中にある。いくつかの実施形態において、外膜タンパク質は、主要外膜リポタンパク質Ｌｐｐ（Ｌｐｐ）、ポリン、またはＴｏｌＣである。いくつかの実施形態において、外膜タンパク質は、Ｌｐｐである。いくつかの実施形態において、ＬＰＳ組成に影響を与えるタンパク質は、ＥｎｖＡ、ＲｆａＤ、ＲｆａＥ、ＲｆａＨ、ＲｆａＲｄ、ＴｏｌＡ、ＴｏｌＢ、及びＴｏｌＤから選択される。
【００２８】
別の態様において、本発明は、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）に特異的に結合する単離された抗体であって、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む、抗体を特徴とする。
【００２９】
別の態様において、本発明は、ＩＬ−１３に特異的に結合する単離された抗体であって、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、抗体を特徴とする。
【００３０】
別の態様において、本発明は、ＩＬ−１３に特異的に結合する単離された抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、抗体を特徴とする。
【００３１】
別の態様において、本発明は、ＩＬ−１３に特異的に結合する単離された抗体であって、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、抗体を特徴とする。
【００３２】
別の態様において、本発明は、ＩＬ−１３に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む、抗体を特徴とする。
【００３３】
別の態様において、本発明は、ＩＬ−１３に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む、抗体を特徴とする。
【００３４】
別の態様において、本発明は、ＩＬ−１３に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む、抗体を特徴とする。
【００３５】
別の態様において、本発明は、ＩＬ−１３に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む、抗体を特徴とする。
【００３６】
別の態様において、本発明は、ＩＬ−１３に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む、抗体を特徴とする。
【００３７】
前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、抗体は、以下の６つのＨＶＲ、つまり、（ａ）ＡＹＳＶＮ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＭＩＷＧＤＧＫＩＶＹＮＳＡＬＫＳ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＤＧＹＹＰＹＡＭＤＮ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＲＡＳＫＳＶＤＳＹＧＮＳＦＭＨ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）ＬＡＳＮＬＥＳ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）ＱＱＮＮＥＤＰＲＴ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを更に含む。
【００３８】
いくつかの実施形態において、前述の抗体のうちのいずれか１つは、約１ｎＭ以下のＫＤでヒトＩＬ−１３に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、約１ｐＭ〜約５０ｐＭのＫＤでヒトＩＬ−１３に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、約２９ｐＭ〜約４０ｐＭのＫＤでヒトＩＬ−１３に特異的に結合する。
【００３９】
いくつかの実施形態において、前述の抗体のうちのいずれか１つは、モノクローナル、ヒト、ヒト化、またはキメラである。いくつかの実施形態において、抗体は、全長抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、半抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩＬ−１３に結合する抗体断片である。いくつかの実施形態において、抗体断片はＦａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）２断片からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗体は、単一特異性抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、多重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。
【００４０】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される抗体のうちのいずれかをコードする単離された核酸を特徴とする。別の態様において、本発明は、抗体を発現させるための単離された核酸を含むベクター（例えば、発現ベクター）を特徴とする。別の態様において、本発明は、前述の核酸及び／またはベクターを含む宿主細胞を特徴とする。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、原核細胞である。いくつかの実施形態において、原核細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。
【００４１】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される抗体のうちのいずれかを産生する方法であって、培養培地中で、前述のベクター（例えば、発現ベクター）のうちのいずれかを含む宿主細胞を培養することを含む、方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、本方法は、宿主細胞または培養培地から抗体を回収することを更に含む。
【００４２】
別の態様において、本発明は、前述の抗体のうちのいずれか１つを含む組成物を特徴とする。いくつかの実施形態において、本組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を更に含む。いくつかの実施形態において、本組成物は、薬学的組成物である。
【００４３】
いくつかの態様において、前述の抗体のうちのいずれか１つを医薬品として使用することができる。
【００４４】
いくつかの態様において、前述の抗体のうちのいずれか１つを、ＩＬ−１３媒介性障害の治療に使用することができる。
【００４５】
別の態様において、本発明は、喘息を患う患者を治療する方法であって、患者に、有効量の前述の抗体のうちのいずれか１つを投与して、喘息症状を低減することを含む、方法を特徴とする。
【００４６】
別の態様において、本発明は、患者におけるＩｇＥ抗体産生を阻害するための方法であって、患者に、有効量の前述の抗体のうちのいずれか１つを投与することを含む、方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、ＩｇＥ抗体産生の阻害は、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、アナフィラキシー、またはアトピー性皮膚炎を治療することが意図される。
【００４７】
別の態様において、本発明は、患者におけるＩＬ−１３媒介性障害を治療する方法であって、患者に、有効量の前述の抗体のうちのいずれか１つを投与することを含む、方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、障害は、アレルギー性喘息、非アレルギー性（内因性）喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、湿疹、蕁麻疹、食物アレルギー、慢性閉塞性肺疾患、潰瘍性大腸炎、ＲＳＶ感染症、ブドウ膜炎、強皮症、または骨粗鬆症である。
【００４８】
別の態様において、本発明は、患者におけるＩｇＥ媒介性障害を治療する方法であって、患者に、有効量の前述の抗体のうちのいずれか１つを投与することを含む、方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、ＩｇＥ媒介性障害は、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、蕁麻疹、アナフィラキシー、またはアトピー性皮膚炎である。
【００４９】
前述の治療方法のいくつかの実施形態において、抗体は、ＩＬ−１３のその受容体への結合を阻害し、ＩＬ−１３のその受容体への結合に関連する１つ以上の機能を阻害する。
【００５０】
前述の治療方法のいくつかの実施形態において、抗体は、静脈内、腹腔内、吸入、筋肉内、皮下、及び経口からなる群から選択される経路のうちの１つ以上によって投与される。いくつかの実施形態において、経路は、皮下である。
【００５１】
前述の治療方法のいくつかの実施形態において、患者は、ヒトである。
【００５２】
別の態様において、本発明は、候補抗体バリアントをコードする複数の核酸を含むライブラリであって、各候補結合ポリペプチドバリアントは、参照抗体と比較して、ＶＨまたはＶＬのＦＲ中にアミノ酸残基変化を含み、アミノ酸残基変化は、（ａ）参照抗体と同一の亜型を有する天然に存在する抗体において特定され、かつ（ｂ）埋もれると予想されるアミノ酸残基中にある、ライブラリを特徴とする。いくつかの実施形態において、天然に存在する抗体におけるアミノ酸残基変化は、体細胞超変異によるものである。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１Ａ】ＩＬ−１３抗原での抗体発現細菌細胞の特異的染色を示す、蛍光顕微鏡写真のパネルである。抗ＩＬ−１３抗体または空ベクター対照（ｐＢＲ３２２）を発現する細胞を、ＳＹＴＯ（登録商標）４１（核酸色素）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８で標識したＩＬ−１３、またはＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）６４９で標識した抗ヒトＦｃ  Ｆ（ａｂ’）２抗体で染色した。抗体を発現する細胞のみが、ＩＬ−１３抗原及び抗ヒトＦｃ抗体で陽性に染色される。
【図１Ｂ】エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）処理、抗原染色、及びＭｇＣｌ２の前（「染色前」）または後（「染色後」）の、異なる抗ＩＬ−１３抗体形式または空対照ベクター（ｐＢＲ３２２）を発現する細胞の段階希釈で斑点を付けた、細菌培地プレートの画像を示す。未染色の細胞と染色した細胞との間に、生存率における実質的な差は観察されなかった。
【図１Ｃ】蛍光標識されたＩＬ−１３での染色後の、異なる形式の抗ＩＬ−１３抗体（ＩｇＧ、半抗体（Ｈａｌｆ−Ａｂ）、及びＦａｂ）を発現する細胞、または空対照ベクターｐＢＲ３２２（黒線、影付き）で形質転換された対照細胞のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。全ての形式が、ｐＢＲ３２２対照を超えるＩＬ−１３シグナルの偏移を示した。
【図１Ｄ】本発明の例示的な方法の概略図である。細胞を、ＥＤＴＡで処理することによって透過処理し、蛍光標識された抗原とともにインキュベートし、ＭｇＣｌ２の添加によって外膜の完全性を回復する。上位≦１％の抗原陽性細胞をフローサイトメトリーによって選別し、再成長後に後続する１巡へと進行させるか、または分析のために収集する。ＳＳＣ、側方散乱。
【図２Ａ】カルベニシリン耐性を与える抗ＶＥＧＦ抗体をコードするプラスミドで形質転換された細菌内へと、１：１０５または１：１０６でスパイキングされた、カルベニシリン（Ｃａｒｂ）及びテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性を与える抗ＩＬ−１３抗体をコードするプラスミドを担持する細菌の段階希釈で斑点を付けた、細菌培地プレートの画像を示す。希少な抗ＩＬ−１３発現細菌の存在を、段階希釈をカルベニシリン（総細菌数）及びテトラサイクリン（抗ＩＬ−１３プラスミドを担持する細菌のみ）含有プレート上にプレーティングし、予想される比率を確認することによって可視化した。
【図２Ｂ】１巡または２巡（Ｒｄ）の細菌抗体提示（ＢＡＤ）後の抗原陽性細胞のパーセンテージを示すグラフである。スパイキングされた培養物を、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７で標識した抗原でＢＡＤ選別した。１：１０６の比率で非結合抗体を提示する細胞のプール内へとスパイキングされた抗ＩＬ−１３（円形）または抗ＶＥＧＦ−抗体（四角形）を提示する細胞を、２巡のＢＡＤ選別をかけて急速に富化する。
【図２Ｃ】図２Ｂに示される抗ＶＥＧＦスパイキング実験のフローサイトメトリー分析を示す一連のグラフである。２巡の選別後、個体群の有意な部分がＶＥＧＦ抗原に結合する。
【図３Ａ】ウェスタンブロットによって決定される、抗ＶＥＧＦ．２バリアントの発現レベルを示すグラフである。非還元可溶性試料を抗ヒトＦｃ抗体で検出し、ＬＩ−ＣＯＲ  ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標）機器を使用して定量化した。シグナルを、抗ＶＥＧＦ．２野生型（ＷＴ）の半抗体バンドに正規化した。ｎ＝３回の実験である。全てのバリアントは、野生型と比較して増加した発現レベルを有する。
【図３Ｂ】個々の抗ＶＥＧＦ．２バリアントのフローサイトメトリー分析を示すグラフである。抗ＶＥＧＦ．２野生型は、未染色の細胞（黒色、影付き）よりも高い偏移を有する。全てのバリアントは、野生型よりも高い偏移を有し、ウェスタンブロットによって決定される発現順位と相関する（図３Ａを参照されたい）。抗ＶＥＧＦ．２野生型、Ｌ４Ｍ．Ｅ６Ｑ．Ｍ３４Ｉ、Ｆ７１Ｙ．Ｅ６Ｑ．Ｍ３４Ｉ、及びＳ２４Ｒ．Ｅ６Ｑ．Ｍ３４Ｉを示す。
【図３Ｃ】ＢＡＤによる、抗ＶＥＧＦ．２野生型及び３つのバリアントのプールからの最高発現バリアントの富化を示す一連のグラフである。プールのフローサイトメトリーシグナルは、上位１％のＶＥＧＦ結合細胞を選別することによって、２巡をかけてより陽性の方向に偏移する。最低発現抗ＶＥＧＦ．２野生型及び最高発現バリアントＳ２４Ｒ．Ｅ６Ｑ．Ｍ３４Ｉを、各巡において分析し、比較のために示す。
【図３Ｄ】２巡の選別に渡る抗ＶＥＧＦ．２バリアントの富化を示す一連の円グラフである。９６個のクローンを配列決定し、最高発現抗ＶＥＧＦ．２バリアント、Ｆ７１Ｙ．Ｅ６Ｑ．Ｍ３４Ｉ、及びＳ２４Ｒ．Ｅ６Ｑ．Ｍ３４Ｉを２巡後に富化する一方で、２つの最低発現バリアント（抗ＶＥＧＦ．２野生型及びＬ４Ｍ．Ｅ６Ｑ．Ｍ３４Ｉ）を枯渇させる。
【図４Ａ】抗ＩＬ−１３フレームワークバリアントの巡富化を示す一連のグラフである。上重ねされたＦＡＣＳ（商標）ドットプロットは、抗ＩＬ−１３フレームワーク（ＦＲ）バリアントが、抗ＩＬ−１３野生型と比較して、各巡に渡ってより陽性に偏移することを示す。
【図４Ｂ】抗ＩＬ−１３ライブラリの巡富化を示す一連の円グラフである。１巡目及び２巡目から提示されるデータはそれぞれ、１８６個及び２２６個のクローンの配列決定からのものである。Ｍ４Ｌ及びＥ６Ｑは、２巡のＢＡＤ後、最も富化したバリアントである。
【図４Ｃ】哺乳動物（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞及びＥ．ｃｏｌｉ細胞における、抗ＩＬ−１３バリアント及びそれらの組み合わせの発現の相関を示すグラフである。発現の改善は、両方の宿主系において見られる。Ｅ．ｃｏｌｉ発現について、非還元可溶性半抗体試料を抗ヒトＦｃ抗体で検出し、ＬＩ−ＣＯＲ  ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標）機器を使用して定量化した。ＨＥＫ２９３Ｔ発現について、タンパク質Ａ精製ＩｇＧ収率を定量化した。発現を抗ＩＬ−１３野生型に対して正規化した。ｎ＝３回の実験である。
【図４Ｄ】示差走査蛍光定量（ＤＳＦ）によって測定される、抗ＩＬ−１３バリアント及びそれらの組み合わせの熱安定性を示すグラフである。Ｍ４Ｌ変異を含有する全てのバリアントは、宿主発現系とは独立して、熱安定性において５℃の増加を示す。熱安定性を測定するために、Ｆａｂ及びＩｇＧをそれぞれ、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞及びＣＨＯ細胞から精製した。このグラフは、融解温度Ｔｍに等しい、Ｆａｂ遷移（Ｆａｂのうちの半数が融解する温度）の結果を示す。Ｆａｂ抗体形式及びＩｇＧ抗体形式のＦａｂ融解のＴｍ値は、同等である。
【図５Ａ】各巡のＦＡＣＳ（商標）後の、抗ＶＥＧＦ．３フレームワークライブラリの富化のフローサイトメトリー分析を示す一連のグラフである。これらのデータは、１巡目の後、抗ＶＥＧＦ．３フレームワーク（ＦＲ）ライブラリバリアントが、抗ＶＥＧＦ．３野生型または未染色の細胞（黒線、影付き）よりも良好に偏移し、２巡目によって偏移が更に明白になったことを示す。
【図５Ｂ】Ｅ．ｃｏｌｉの改善された発現を有した、抗ＶＥＧＦフレームワークバリアント及びそれらの組み合わせのサブセットが、哺乳動物（ＨＥＫ２９３Ｔ）発現（輪郭付きボックス）において相関する増加を示すことを示すグラフである。発現を、抗ＶＥＧＦ野生型に対して正規化し、半抗体（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはタンパク質Ａ精製ＩｇＧ（ＨＥＫ２９３Ｔ）の抗Ｆｃウェスタンブロットによって決定した。ｎ＝３回の実験である。
【図５Ｃ】抗ＶＥＧＦ．３フレームワークバリアントが増加した熱安定性を有すること、及びフレームワークバリアントを組み合わせることが相加的効果を有したことを示すグラフである。示差走査蛍光定量は、単一フレームワークバリアントＥ６Ｑ、Ｖ３７Ｉ、Ｖ４８ＬまたはＶ４８Ｉ（左ボックス）が熱安定性を増加させることを示す。二重バリアント（中央ボックス）は熱安定性を更に増加させ、三重バリアント（右ボックス）は最大の相加的増加を有した。ＩｇＧのＦａｂ遷移値を示し、ｎ＝３回の実験である。
【図５Ｄ】ＶＥＧＦ（ＲＣＳＢタンパク質データベース（ＰＤＢ）受入番号：２ＦＪＧ）との複合体中の抗ＶＥＧＦ  Ｇ６の結晶構造のレンダリングである。発現及び熱安定性を増加させる特定されたフレームワーク残基を、ＶＥＧＦ（ＰＤＢ：２ＦＪＧ）との複合体中の抗ＶＥＧＦ  Ｇ６のＸ線結晶構造上に示す。Ｖ３７Ｉ及びＶ４８Ｉ変異をモデル化した一方で、Ｑ６は天然の抗体構造であった。３つの残基は、重鎖可変（ＶＨ）ドメインのコア内の平面内に位置する。Ｅ６及びＶ４８Ｉは、ＶＨドメインのベータバレルコア内の別個の鎖上に位置する一方で、Ｖ３７Ｉは、ＶＨドメインと軽鎖可変（ＶＬ）ドメインとの間の埋もれた界面内にある。重鎖定常ドメイン（ＣＨ）、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）。
【図６】抗ＩＬ−１３抗体からの、軽鎖及び重鎖抗ＩＬ−１３可変ドメインのアミノ酸配列を示す。抗体可変ドメインは、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）間に寄り添った３つの超可変領域（ＨＶＲ、上線）で構成される。体細胞超変異は、ＦＲ及びＨＶＲの両方に変化を導入し得る。Ｋａｂａｔデータベースからのデータを照合して、可変カッパ４（ＶＫ４）亜型及び重鎖２（ＶＨ２）亜型のフレームワーク内の体細胞超変異によって生じる全てのアミノ酸変化をまとめ、これをその後、非溶媒曝露残基（配列番号５及び配列番号６の配列下に配置されるアミノ酸残基によって示される）へと限定した。抗ＩＬ−１３半抗体の単一フレームワークバリアント（軽鎖内に５個及び重鎖内に２８個）を作製し、組み合わせて、ＢＡＤによってスクリーニングした。
【図７】抗ＶＥＧＦ  Ｇ６抗体の可変ドメインの主鎖抗体骨格のリボン図である（Ｆｕｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８１（１０）：６６２５−３１，２００６）。軽鎖及び重鎖可変領域を標識する。抗ＩＬ−１３抗体について採用したアプローチ（図６を参照されたい）に類似して、Ｋａｂａｔデータベースを走査して、可変カッパ１及び重鎖３（それぞれＶκ１及びＶＨ３）亜型のＦＲ中にあった体細胞超変異によって導入された残基を特定した。親和性を維持するために、ＨＶＲを除外した一方で、免疫原性のリスクを低減するために、埋もれた残基（圏）もまた選択した。これらの基準をもって、抗ＶＥＧＦ半抗体の単一フレームワークバリアント（軽鎖内に４７個及び重鎖内に３６個）を作製し、これらを組み合わせて、ＢＡＤによってスクリーニングした。
【図８】抗ＶＥＧＦ．２抗体の発現後に示される細菌株で斑点を付けた、細菌培地プレートの画像を示す。１ＯＤ／ｍＬの細胞を段階希釈し、ＬＢ／カルベニシリンプレート上にプレーティングして、細胞生存率を可視化した。様々な野生型発現株は、抗ＶＥＧＦ抗体の発現後に異なる程度の生存率を示した（左パネル）。６２Ａ７株は、株６４Ｂ４と比較して、生存率における１対数の増加を示した。６４Ｂ４株背景におけるｌｐｐの欠失は、生存率における３対数の低下をもたらした。６２Ａ７Δｌｐｐ株は、抗ＶＥＧＦ抗体または抗組織因子（ＴＦ）抗体を発現した細胞内の６４Ｂ４Δｌｐｐ株（右パネル）と比較して、増加した生存率を示した。
【図９】示される蛍光核酸色素で染色した抗ＶＥＧＦ．Ｖ４８Ｌを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞のフローサイトメトリー分析を示す一連のグラフである。２０〜９０％の範囲の細胞陽性染色が観察される。ＭＦＩ、平均蛍光強度。
【図１０】ＢＡＤスクリーニングの間、フローサイトメトリー中、細胞濃度が細胞二重体の存在に影響を与え得ることを示す一連のグラフである。２つの抗ＶＥＧＦバリアント、Ｖ４８Ｌ及びＡ９７Ｔを、株６２Ａ７Δｌｐｐ内で別個に発現させ、細胞を、それぞれＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８及びＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７に蛍光複合体化したＶＥＧＦ抗原で標識した。その後、これらの標識された細胞を等しく組み合わせ、フローサイトメトリー分析に供した。１×１０８個の細胞／ｍＬの濃度を分析したとき、両方のＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）色素に対して二重陽性であった細胞が存在した（上パネル）。しかしながら、細胞濃度を１×１０６個の細胞／ｍＬまで低下させると、二重体が排除され、単一陽性細胞のみが観察された（下パネル）。
【図１１】細菌抗体提示の例示的なフローサイトメトリー選別戦略を示す概略図である。抗体は、６２Ａ７Δｌｐｐ  Ｅ．ｃｏｌｉ発現株内に発現される。まず、未染色の対照と比較して核酸色素陽性であることに基づいて、細胞を選択する。次に、前方散乱及び側方散乱を使用して、細胞を選択する。次に、細胞複合性（側方散乱ＳＳＣの幅及び高さ）ならびに小細胞サイズ（前方散乱ＦＳＣの幅及び高さ）を使用して、二重体排除を選択する２つの標準ゲートを実装する。最後に、非結合抗体を発現する細胞及び未染色の細胞、ならびに／または空ベクターについて見られる偏移の上に引き出したゲートを使用して、抗原陽性細胞を選択する。
【図１２Ａ】実施例４に記載される戦略を使用して、示差的に標識された抗原陽性細胞の選別に成功し得ることを示すグラフである。２つの抗ＶＥＧＦバリアント（Ｖ４８Ｌ及びＡ９７Ｔ）を、株６２Ａ７Δｌｐｐ内で別個に発現させ、細胞を、それぞれＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８及びＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７と蛍光複合体化したＶＥＧＦ抗原で標識した。その後、これらの標識された細胞を一対一で組み合わせ、単一抗原陽性であること（ＶＥＧＦ−ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８もしくはＶＥＧＦ−ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７）、両方の抗原に結合すること（二重陽性）、またはいずれの抗原にも結合しないこと（二重陰性）について選別した。緑色のボックスは、Ｖ４８Ｌバリアントを発現することが予想される細胞を示す一方で、赤色のボックスは、Ａ９７Ｔバリアントを発現することが予想される細胞を示す。選別入力物及び出力物をプレーティングし、９６個のコロニーを配列決定した。右パネルは、選別された試料をフローサイトメトリー機器上で実行して、抗原に結合する陽性パーセント（陽性％）を検出することによって決定される、選別された事象の数及び分析後に陽性であった事象のパーセンテージを示す表である。
【図１２Ｂ】図１２Ａに提示される実験の配列決定分析の結果を示す表である。２つの抗ＶＥＧＦバリアント（Ｖ４８Ｌ及びＡ９７Ｔ）の１：１の入力物では、１巡の選別後、それぞれを別個にほぼ９５％まで富化することができた。選別することができた非常に少数の二重陽性細胞は、配列決定のためのいかなるコロニーももたらさなかった一方で、いずれの標識された抗原にも結合しなかった二重陰性細胞は、両方の抗体バリアントの等しい組み合わせで構成され、これは、選択バイアスが存在しなかったことを示した。
【図１３】抗ＩＬ−１３可変ドメインの亜型に基づく主鎖抗体骨格のリボン図である。体細胞超変異は、フレームワーク領域及び超可変領域の両方に変化を導入し得る。Ｋａｂａｔデータベースからのデータを照合して、可変カッパ４（Ｖκ４）亜型及び重鎖２（ＶＨ２）亜型のフレームワーク内の体細胞超変異によって生じる全てのアミノ酸変化をまとめ、その後、選択されたバリアントを非溶媒曝露残基（圏）へと限定した。抗ＩＬ−１３半抗体の単一フレームワークバリアント（軽鎖内に５個及び重鎖内に２８個）を作製し、組み合わせて、ＢＡＤによってスクリーニングした。
【図１４】Ｅ．ｃｏｌｉシグマ因子ＲｐｏＤ（σ７０）のドメイン構造の概略図である。
【図１５Ａ】図１５Ａ及び１５Ｂは、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による変異体ｒｐｏＤライブラリの構築のための、例示的な戦略を示す概略図である。ｐＡＣＹＣｒｐｏＤプラスミド（６００６塩基対）をエラープローンＰＣＲによって変異誘発して、約１０６個の変異体プラスミドのライブラリサイズを生成した（図１５Ａ）。Ｅ．ｃｏｌｉへの形質転換時、各変異体は、特有の表現型（図１５Ｂ中の各細胞内に存在する異なる矢印によって示される）を発現する。
【図１５Ｂ】図１５Ａ及び１５Ｂは、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による変異体ｒｐｏＤライブラリの構築のための、例示的な戦略を示す概略図である。ｐＡＣＹＣｒｐｏＤプラスミド（６００６塩基対）をエラープローンＰＣＲによって変異誘発して、約１０６個の変異体プラスミドのライブラリサイズを生成した（図１５Ａ）。Ｅ．ｃｏｌｉへの形質転換時、各変異体は、特有の表現型（図１５Ｂ中の各細胞内に存在する異なる矢印によって示される）を発現する。
【図１６Ａ】図１６Ａ及び１６Ｂは、ＢＡＤスクリーニングのための変異体ｒｐｏＤプラスミドライブラリを調製するための、例示的な戦略を示す概略図である。株６６Ｃ４（Δｌｐｐ）を、抗ＩＬ−１３抗体をコードするＭＤ１６９プラスミドで形質転換した（図１６Ａ）。結果として生じる形質転換体を、変異体ｒｐｏＤプラスミドライブラリで更に形質転換し、約１０６個のメンバーの多様性を有する６６Ｃ４細菌ライブラリプールを生成した（図１６Ａ及び１６Ｂ）。
【図１６Ｂ】図１６Ａ及び１６Ｂは、ＢＡＤスクリーニングのための変異体ｒｐｏＤプラスミドライブラリを調製するための、例示的な戦略を示す概略図である。株６６Ｃ４（Δｌｐｐ）を、抗ＩＬ−１３抗体をコードするＭＤ１６９プラスミドで形質転換した（図１６Ａ）。結果として生じる形質転換体を、変異体ｒｐｏＤプラスミドライブラリで更に形質転換し、約１０６個のメンバーの多様性を有する６６Ｃ４細菌ライブラリプールを生成した（図１６Ａ及び１６Ｂ）。
【図１７Ａ】図１７Ａ及び１７Ｂは、変異体ｒｐｏＤプラスミドライブラリで形質転換した細菌プールのＢＡＤスクリーニングのための、例示的な戦略を示す概略図である。６６Ｃ４細菌ライブラリプールを、２２５ｒｐｍで撹拌しながら、３０℃のＣＲＡＰ培地中で２４時間成長させた。１ＯＤ単位を回収し、ＥＤＴＡでの処理によって透過処理し、蛍光標識された抗原（ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７で標識したヒトＩＬ−１３（「ＡＬＥＸＡ（登録商標）６４７−ｈｕＩＬ−１３」）及び核酸染色（ＳＹＴＯ（登録商標）９）とともにインキュベートし、ＭｇＣｌ２の添加によって外膜の完全性を回復した。細胞を、示されるゲーティング戦略を使用して、ＦＡＣＳＡＲＩＡ（登録商標）デバイスを使用するフローサイトメトリーに供した（図１７Ｂ）。ＡＬＥＸＡ（登録商標）６４７−ｈｕＩＬ−１３シグナル強度に基づいて上位１〜３％の細胞を選別し、更なる巡のＢＡＤのために成長させた。
【図１７Ｂ】図１７Ａ及び１７Ｂは、変異体ｒｐｏＤプラスミドライブラリで形質転換した細菌プールのＢＡＤスクリーニングのための、例示的な戦略を示す概略図である。６６Ｃ４細菌ライブラリプールを、２２５ｒｐｍで撹拌しながら、３０℃のＣＲＡＰ培地中で２４時間成長させた。１ＯＤ単位を回収し、ＥＤＴＡでの処理によって透過処理し、蛍光標識された抗原（ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７で標識したヒトＩＬ−１３（「ＡＬＥＸＡ（登録商標）６４７−ｈｕＩＬ−１３」）及び核酸染色（ＳＹＴＯ（登録商標）９）とともにインキュベートし、ＭｇＣｌ２の添加によって外膜の完全性を回復した。細胞を、示されるゲーティング戦略を使用して、ＦＡＣＳＡＲＩＡ（登録商標）デバイスを使用するフローサイトメトリーに供した（図１７Ｂ）。ＡＬＥＸＡ（登録商標）６４７−ｈｕＩＬ−１３シグナル強度に基づいて上位１〜３％の細胞を選別し、更なる巡のＢＡＤのために成長させた。
【図１８】変異体ｒｐｏＤプラスミドライブラリで形質転換した６６Ｃ４細菌ライブラリプールのＢＡＤスクリーニングからの、示される試料のフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフである。挿入表は、試料及び平均蛍光強度（「平均」）を示す。
【図１９】変異体ｒｐｏＤプラスミドライブラリで形質転換した６６Ｃ４細菌ライブラリプールのＢＡＤスクリーニングによって特定された、３つのｒｐｏＤ変異体を示す概略図である。変異体１及び２は、野生型ＲｐｏＤと比較して、示される点変異を含む切断型変異体である。図面の下の円グラフは、９６個の配列決定されたコロニーのうちで観察された、示される変異体の数を示す。
【図２０】示される試料のフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフである（示されるｒｐｏＤ変異体、野生型ＲｐｏＤ、または空ベクター対照を発現するＥ．ｃｏｌｉ）。挿入表は、試料及び平均蛍光強度（「平均」）を示す。
【図２１Ａ】示されるｒｐｏＤ変異体の発現が、天然の野生型ＲｐｏＤを発現する細胞と比較して、６６Ｃ４宿主Ｅ．ｃｏｌｉ細胞において全長抗ＩＬ−１３の増加した発現をもたらしたことを示す免疫ブロットである。
【図２１Ｂ】示されるｒｐｏＤ変異体の発現が、天然の野生型ＲｐｏＤを発現する細胞と比較して、６７Ａ６宿主Ｅ．ｃｏｌｉ細胞において全長抗ＩＬ−１３の増加した発現をもたらしたことを示す免疫ブロットである。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当業者であれば容易に理解するそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（かつ説明する）。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「細菌」とは、内膜（すなわち、細胞膜）、周辺質、及び外膜を含む、細菌細胞を指す。外膜は内膜とは異なり、例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）及びポリンを含んでもよい。いくつかの実施形態において、細菌は、グラム陰性菌である。例示的な細菌種としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種（例えば、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及びＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）、ならびに当該技術分野において既知である他のものが挙げられる。
【００５６】
「結合ポリペプチド」という用語は、標的分子に特異的に結合するポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、結合ポリペプチドは、抗体である。他の実施形態において、結合ポリペプチドは、例えば、抗体模倣物、細胞表面受容体、サイトカイン、または成長因子である。「標的分子」という用語は、結合ポリペプチドの特異的な結合標的を指す。標的分子は典型的には、小分子、ポリペプチド、またはポリペプチド断片である。結合ポリペプチドが抗体である場合、標的分子は、例えば、抗原であり得る。
【００５７】
結合ポリペプチド（例えば、抗体）の標的分子への結合に関して、「特異的結合」または「特異的に結合する」または特定のポリペプチドもしくは特定の標的分子上のエピトープ「に対して特異的」であるは、非特異的相互作用とは測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、対照分子の結合と比較して、ある分子の結合を決定することによって測定することができる。例えば、特異的結合は、標的に類似した対照分子、例えば、過剰量の非標識標的との競合によって決定することができる。この場合、特異的結合は、標識された標的のプローブへの結合が、過剰な非標識標的によって競合的に阻害された場合に、示される。本明細書で使用される場合、「特異的結合」または「に特異的に結合する」または特定のポリペプチドもしくは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「に対して特異的」であるという用語は、例えば、１０−４Ｍ以下、あるいは１０−５Ｍ以下、あるいは１０−６Ｍ以下、あるいは１０−７Ｍ以下、あるいは１０−８Ｍ以下、あるいは１０−９Ｍ以下、あるいは１０−１０Ｍ以下、あるいは１０−１１Ｍ以下、あるいは１０−１２Ｍ以下の標的に対するＫＤ、または１０−４Ｍ〜１０−６Ｍもしくは１０−６Ｍ〜１０−１０Ｍもしくは１０−７Ｍ〜１０−９Ｍの範囲内のＫＤを有する分子によって呈され得る。当業者によって理解されるように、親和性及びＫＤ値は、逆の関係にある。抗原に対する高い親和性は、低いＫＤ値によって測定される。一実施形態において、「特異的結合」という用語は、ある分子が、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに、いかなる他のポリペプチドまたはポリペプチドのエピトープにも実質的に結合することなく結合する、結合を指す。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「ライブラリ」とは、複数の結合ポリペプチド（例えば、抗体または抗体断片）配列、またはこれらの配列をコードする核酸を指す。例示的なライブラリは、約２個の結合ポリペプチド〜約１０１４個の結合ポリペプチド（例えば、約２〜約１０個、約２〜約２０個、約２〜約３０個、約２〜約４０個、約２〜約５０個、約２〜約６０個、約２〜約７０個、約２〜約７０個、約２〜約８０個、約２〜約１００個、約２〜約１０１４個、約２〜約１０１３個、約２〜約１０１２個、約２〜約１０１１個、約２〜約１０１０個、約２〜約１０９個、約２〜約１０８個、約２０〜約１０８個、約３０〜約１０８個、約４０〜約１０８個、約５０〜約１０８個、約６０〜約１０８個、約７０〜約１０８個、約８０〜約１０８個、約９０〜約１０８個、約１００〜約１０８個、約２００〜約１０８個の結合、約４００〜約１０８個、約６００〜約１０８個、約８００〜約１０８個、約１０３〜約１０８個、約１０４〜約１０８個、約１０５〜約１０８個、約１０６〜約１０８個、または約１０７〜約１０８個の結合ポリペプチド）のサイズを有し得る。
【００５９】
開始または基準結合ポリペプチド（例えば、参照抗体）の「バリアント」または「変異体」は、（１）開始または基準ポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、かつ（２）自然または人工（人造）変異原性のいずれかを通して、開始または基準ポリペプチドから導出される、変異原性結合ポリペプチドである。そのようなバリアントは、例えば、本明細書において「アミノ酸残基変化」と呼ばれる、対象となる結合ポリペプチドのアミノ酸配列中の残基からの欠失、それへの挿入、及び／またはその置換を含む。したがって、バリアントＨＶＲは、開始または基準ポリペプチド配列（源抗体または抗原結合断片のものなど）に関してバリアント配列を含むＨＶＲを指す。この文脈において、アミノ酸残基変化とは、開始または基準ポリペプチド配列（参照抗体またはその断片のものなど）中の対応する位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸を指す。最終バリアントまたは変異体構築物に到達するために、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが作製され得るが、但し、最終構築物が所望される機能的特徴（例えば、親和性、安定性、及び／または発現）を持つことを条件とする。
【００６０】
「野生型」もしくは「基準」配列、または「野生型」もしくは「基準」タンパク質／ポリペプチドの配列（ＨＶＲ、ＦＲ、または参照抗体の可変ドメインなど）は、バリアントポリペプチドが変異の導入を通して導出される基準配列であってもよい。一般に、所与のタンパク質の「野生型」配列は、自然において最も一般的な配列である。同様に、「野生型」遺伝子配列は、自然において最も一般的に見出される、その遺伝子の配列である。変異は、自然プロセスまたは人為的手段のいずれかを通して、「野生型」遺伝子（及びしたがってそれがコードするタンパク質）に導入され得る。そのようなプロセスの産生物は、本来の「野生型」タンパク質または遺伝子の「バリアント」または「変異体」形態である。
【００６１】
「変異」とは、野生型配列などの基準ヌクレオチド配列と比較した、ヌクレオチド（複数可）の欠失、挿入、または置換である。
【００６２】
「膜不透過性」という用語は、分子（例えば、ポリペプチド）が生体膜（例えば、細菌の内膜及び／または外膜）またはチャネルポア（例えば、ポリン）を渡って拡散することができないことを指す。対照的に、「膜透過性」分子は、生体膜を渡って拡散することができる。いくつかの条件下において、例えば、本発明の方法を通して、例えば、外膜の完全性が持続的または一過的に損なわれる場合、通常膜不透過性である分子（例えば、ポリペプチド）が細菌の周辺質内へと拡散することができることを理解されたい。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「透過性」は、生体膜を渡る分子の拡散の速度を指す。生体膜は、所与の分子が膜を渡って実質的に拡散することができる場合、その分子に対して「透過性」である。生体膜は、所与の分子が膜を渡って実質的に拡散することができない場合、その分子に対して「不透過性」である。分子の電荷、極性、及びサイズは、ある生体膜がその分子に対して透過性であるか不透過性であるかどうかに影響を与え得る。典型的には、疎水性分子及び無電荷の極性小分子は生体膜を渡って透過性であるが、ほとんど水溶性の（親水性）分子は不透過性である。細菌の外膜は典型的には、約６００ダルトン超の分子量を有する親水性分子の拡散に対して不透過性である（例えば、Ｄｅｃａｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １２８（１）：３２５−３３６，１９７６を参照されたい）。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「主要外膜リポタンパク質Ｌｐｐ」（当該技術分野において、「Ｌｐｐ」、「Ｂｒａｕｎリポタンパク質」、及び「ムレインリポタンパク質」とも呼ばれる）とは、別段示されない限り、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ｌｋｙＤとしても知られる）を含む、任意の細菌源に由来する任意の天然Ｌｐｐを指す。この用語は、「全長」未処理のＬｐｐ、及び細胞内の処理から生じる任意のＬｐｐの形態を包含する。Ｌｐｐはペプチドグリカンと相互作用し、細胞外被の構造及び機能的完全性の維持に寄与する。例示的なＥ．ｃｏｌｉ（株Ｋ１２）Ｌｐｐのアミノ酸配列は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｐ６９７７６に見出すことができる。
【００６５】
「周辺質」は、２つの選択的透過性障壁（例えば、生体膜）が隣接した空間である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを含む多くの種の細菌において、周辺質は、内膜及び外膜が隣接した空間である。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「透過化剤」は、例えば、典型的には膜不透過性である分子（例えば、ポリペプチド）に対する細菌外膜の透過性を増加させることができる化学物質を指す。例示的な透過化剤としては、例えば、二価カチオンキレート剤を含むキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、エデト酸もしくは２−［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］エチル−（カルボキシメチル）アミノ］酢酸とも呼ばれる）、２−［２−［２−［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］フェノキシ］エトキシ］−Ｎ−（カルボキシメチル）アニリノ］酢酸（ＢＡＰＴＡ）、及び２−［２−［２−［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］エトキシ］エトキシ］エチル−（カルボキシメチル）アミノ］酢酸（ＥＧＴＡ））、ＮａＣｌ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：５３７−５４２，２００１）、スクロース、抗生物質（例えば、アミノグリコシド（例えば、ストレプトマイシン及びゲンタマイシン）、ポリミキシンＢ、脱アシル化ポリミキシン、オクタペプチン、ならびにベンジルペニシリン）、洗剤、リゾチーム、トリス、トリス−ＥＤＴＡ、アスコルベート、ポリリジン、塩化ベンザルコニウム、プロタミン、殺菌性／透過性増強タンパク質（ＢＰＩ）、血清及び／もしくは補体、Ｃａ２＋、またはこれらの組み合わせが挙げられる。例えば、Ｈａｎｃｏｃｋ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８：２３７−２６４，１９８４を参照されたい。いくつかの実施形態において、透過化剤は、ＥＤＴＡである。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「透過化する」とは、生体膜を渡る分子の拡散の速度、例えば、細菌外膜を渡る、典型的には膜不透過性である分子（例えば、ポリペプチド）の拡散の速度を増加させることを意味する。
【００６８】
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合によって連結された２つ以上のアミノ酸を含有するペプチドまたはタンパク質を指し、ペプチド、オリゴマー、及びタンパク質などを含む。ポリペプチドは、自然、修飾、合成アミノ酸を含有してもよい。ポリペプチドはまた、翻訳後処理などによって自然に、またはアミド化アシル化及び架橋などによって化学的に修飾されてもよい。
【００６９】
本明細書で使用される場合、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの「複数」の物質は一般に、２つ以上の型または種類のその物質の収集物を指す。２つ以上の物質が、特定のアミノ酸位置に見出されるバリアントアミノ酸などの特定の特徴に関して互いに異なる場合、２つ以上の型または種類の物質が存在することになる。例えば、バリアントフレームワーク領域（ＦＲ）の配列を除く、または特定の非溶媒曝露アミノ酸位置のバリアントアミノ酸を除く配列中に、実質的に同一、好ましくは同一である２つ以上の本発明のポリペプチドが存在する場合、複数の本発明のポリペプチドが存在することになる。別の例では、バリアントＦＲをコードする配列を除く、または特定の非溶媒曝露アミノ酸位置のバリアントアミノ酸をコードする配列を除く配列中に、実質的に同一、好ましくは同一である２つ以上の本発明のポリヌクレオチドが存在する場合、複数の本発明のポリヌクレオチドが存在することになる。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「再封着」は、細菌外膜の膜透過性障壁を実質的に回復することを指す。いくつかの実施形態において、再封着は、その前の細菌外膜の透過化を逆転させる。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「転写制御遺伝子」は、例えば、全般的（例えば、多数の遺伝子の転写に影響を与える）または個別的（例えば、１つまたはいくつかの遺伝子の転写に影響を与える）に、結合ポリペプチド（例えば、抗体）をコードする遺伝子の転写または発現の他の態様（例えば、翻訳、輸送、もしくは安定性）に影響を与えるあらゆる遺伝子を指す。例示的、非限定的な転写制御遺伝子としては、転写開始因子（例えば、シグマ因子）、抗シグマ因子、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット、及び転写因子が挙げられる。いくつかの実施形態において、シグマ因子は、ＲｐｏＤ（σ７０）、ＲｐｏＥ（σ２４）、ＲｐｏＨ（σ３２）、ＲｐｏＳ（σ３８）、ＲｐｏＮ（σ５４）、ＲｐｏＦ（σ２８）、及びＦｅｃＩ（σ１９）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、シグマ因子は、ＲｐｏＤ（σ７０）である。
【００７２】
「転写制御遺伝子に影響を与える変異」とは、転写制御遺伝子の機能、発現レベル、安定性、または活性に影響を与えるあらゆる変異を指す。変異は、例えば、転写制御遺伝子自体中に位置する。他の実施形態において、変異は、制御核酸配列、例えば、転写制御遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー中に存在し得る。変異は、当該技術分野において既知の任意の種類のもの、例えば、点変異、挿入変異、欠失変異、及びフレームシフト変異などであってもよい。
【００７３】
「発現構築物」とは、細菌において、遺伝子の発現を与えることができる任意の核酸要素（例えば、結合ポリペプチド（例えば、抗体）または転写制御遺伝子）を指す。発現構築物とは、細菌へと形質転換された合成プラスミド、内在性細菌ゲノムへと統合された合成核酸配列、または任意の他の好適な核酸要素を指し得る。いくつかの実施形態において、及び発現構築物は、合成プラスミドである。
【００７４】
本明細書で使用される場合、結合ポリペプチドの発現及び／または安定性に関して「改善された」及び「増加した」という用語は、結合ポリペプチドの基準発現レベル及び／または結合ポリペプチドの基準安定性と比較した、増加または増強を指す。いくつかの実施形態において、基準発現レベルは、野生型結合ポリペプチドの発現レベルであってもよい。他の実施形態において、基準発現レベルは、バリアント結合ポリペプチドの発現レベルであってもよい。いくつかの実施形態において、基準発現レベルは、野生型細菌内の結合ポリペプチドの発現レベルであってもよい。いくつかの実施形態において、基準発現レベルは、変異体細菌内の結合ポリペプチドの発現レベルであってもよい。いくつかの実施形態において、基準安定性は、野生型結合ポリペプチドの安定性であってもよい。他の実施形態において、基準安定性は、バリアント結合ポリペプチドの安定性であってもよい。
【００７５】
「合成プラスミド」とは、遺伝子発現の目的で使用することができる、任意の天然に存在しないプラスミド（例えば、線状プラスミドまたは環状プラスミド）、例えば、結合ポリペプチドをコードする遺伝子または転写制御遺伝子の発現を指す。合成プラスミドとしては、例えば、対象となる遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター、抗生物質耐性マーカー、複数のクローニングサイト、複製（複数可）起点、または当該技術分野において既知である任意の他の要素を挙げることができる。
本明細書の目的での「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義される、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、またはそれは、アミノ酸配列変化を含んでもよい。いくつかの実施形態において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、または２以下である。いくつかの実施形態において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークの配列は、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。
【００７６】
「親和性」とは、ある分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。別段示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は一般に、解離定数（ＫＤ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載される方法を含む、当該技術分野において既知である一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例証的説明及び例示的な実施形態が、以下に記載される。
【００７７】
「親和性成熟」抗体は、１つ以上のＨＶＲ及び／またはフレームワーク領域内に１つ以上の変化を有するものであり、これらの変化が、それらの変化（複数可）を持たない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモルまたは更にはピコモルの親和性を有するであろう。親和性成熟抗体は、当該技術分野において既知である手順によって産生される。例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３，１９９２は、ＶＨ及びＶＬのドメインシャッフリングによる親和性成熟を記載する。ＨＶＲ及び／またはフレームワーク残基のランダム変異原性は、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３，１９９４、Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５，１９９５、Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４，１９９５、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−３３１９，１９９５、及びＨａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６，１９９２によって記載される。
【００７８】
本明細書において、「抗体」という用語は、最も広義に使用され、それらが所望される抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含むが、これらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。
【００７９】
参照抗体と「同一のエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて、参照抗体がその抗原に結合するのを５０％以上遮断する抗体、及び逆に、競合アッセイにおいて、抗体がその抗原に結合するのを５０％以上遮断する参照抗体を指す。例示的な競合アッセイは、本明細書に提供される。
【００８０】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部分、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２、Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２，１９９５を参照されたい）；一本鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００８１】
抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を反映して表記される１つの残留「Ｆｃ」断片とが産生される。Ｆａｂ断片は、重（Ｈ）鎖のＶＨドメインとともに軽（Ｌ）鎖全体、ならびに１つの重鎖（ＣＨ１）の第１の定常領域ドメインからなる。抗体のペプシン処理により、単一の大きいＦ（ａｂ’）２断片がもたらされ、これは概して、二価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合Ｆａｂ断片に対応し、依然として抗原に架橋することができる。Ｆａｂ’断片フラグメントは、抗体のヒンジ領域に由来する１つ以上のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、追加のいくつかの残基を有することによって、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を保有するＦａｂ’の本明細書における表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は本来、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的カップリングもまた、既知である。
【００８２】
本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む。一実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在する場合もあれば、しない場合もある。本明細書において別段明記されない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載される、ＥＵインデックスとも称されるＥＵ付番方式に従う。
【００８３】
「Ｆｖ」は、１つの重鎖及び１つの軽鎖の可変領域ドメインが緊密な非共有結合で結合した二量体からなる。これらの２つのドメインの折り畳みにより、抗体に、抗原結合のためのアミノ酸残基を寄与し、抗原結合特異性を抗体に与える、６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖からそれぞれ３つのループ）が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＨのみを含むＦｖの半分）ですら、親和性が全結合部位よりも低い場合があるとはいえ、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。
【００８４】
「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも省略される「一本鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に結合されたＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む、抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含み、このリンカーにより、ｓＦｖが抗原結合に所望される構造を形成することが可能となる。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５，１９９４を参照されたい。
【００８５】
「ダイアボディ」という用語は、鎖内ではなく鎖間のＶドメインの対合が達成され、二価断片、すなわち、２つの抗原結合部位を有する断片をもたらすように、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に短いリンカー（約５〜１０個の残基）を用いてｓＦｖ断片（前述の段落を参照されたい）を構築することによって調製される、小さな抗体断片を指す。二重特異性ダイアボディは、２つの抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する、２つの「クロスオーバー」ｓＦｖ断片のヘテロ二量体である。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８，１９９３により詳細に記載されている。
【００８６】
「遮断」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害または低減するものである。ある特定の遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的にまたは完全に阻害する。
【００８７】
抗体の「クラス」は、その重鎖が持つ定常ドメインまたは定常領域の型を指す。５つの主要なクラスの抗体：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００８８】
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列のＦｃ領域またはアミノ酸配列のバリアントＦｃ領域）に起因し得る生物学的活性を指し、抗体のアイソタイプとともに変化する。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞毒性、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞活性化が挙げられる。
【００８９】
「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」または「ＡＤＣＣ」とは、ある特定の細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合された分泌型Ｉｇが、これらの細胞毒性エフェクター細胞が抗原保有標的細胞に特異的に結合し、後続して細胞毒により標的細胞を殺滅させることを可能にする、細胞毒性の一形態を指す。抗体は細胞毒性細胞を「備え」ており、そのような殺滅に絶対的に必要とされる。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２，１９９１の４６４頁の表３にまとめられている。対象となる分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されるものなどのインビトロＡＤＣＣアッセイが実行され得る。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、または加えて、対象となる分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６，１９９８に開示されるものなどの動物モデルにおいて、評価され得る。
【００９０】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載する。好ましいＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲである。更に、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、これらの受容体のアレルバリアント及びあるいはスプライシング形態を含む、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体が挙げられる。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含み、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる類似したアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン内に免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン内に免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｍ．ｉｎ  Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４，１９９７の概説を参照されたい）。ＦｃＲは、例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２，１９９１、Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ４：２５−３４，１９９４、及びｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１，１９９５に概説される。今後特定されるものを含む他のＦｃＲが、本明細書の「ＦｃＲ」という用語によって包含される。この用語はまた、母体ＩｇＧの胎児への転移を担う胎児性受容体であるＦｃＲｎも含む（例えば、Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７，１９７６、及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９，１９９４を参照されたい）。
【００９１】
「ヒトエフェクター細胞」とは、１つ以上のＦｃＲを発現し、かつエフェクター機能を実行する白血球である。好ましくは、この細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞毒性Ｔ細胞、及び好中球が挙げられ、ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、天然源から、例えば血液から単離することができる。
【００９２】
「補体依存性細胞毒性」または「ＣＤＣ」とは、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的な補体経路の活性化は、補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）が（適切なサブクラスの）抗体と結合することにより開始され、該抗体はそれらの同族抗原に結合する。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３，１９９６に記載されるＣＤＣアッセイが実行されてもよい。
【００９３】
「エピトープ」とは、抗体が特異的に結合する抗原の部分である。ポリペプチド抗原について、エピトープは一般に、約４〜１５個のアミノ酸残基のペプチド部分である。
【００９４】
「全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、天然の抗体構造に実質的に類似した構造を有するか、または本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すために、本明細書において互換的に使用される。
【００９５】
本明細書で使用される場合、「半抗体」という用語は、１つの免疫グロブリン軽鎖を伴う１つの免疫グロブリン重鎖を指す。当業者は、半抗体がその断片を包含し得ること、また例えば、ラクダ科に起源を持つ単一の可変ドメインからなる抗原結合ドメインも有し得ることを容易に理解するであろう。
【００９６】
「ヒト抗体」とは、ヒトによって産生される抗体のものに対応するアミノ酸配列を持つもの、及び／またはヒト抗体を作製するための技術のうちのいずれかを使用して作製されたものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。
【００９７】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループ（本明細書において「亜型」とも呼ばれる）からである。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ，ｖｏｌｓ．１−３，１９９１にあるようなサブグループである。一実施形態において、ＶＬについて、サブグループは、Ｋａｂａｔら（上記）にあるようなサブグループカッパＩＩＩまたはカッパＩＶである。一実施形態において、ＶＨについて、サブグループは、Ｋａｂａｔら（上記）にあるようなサブグループＩＩＩである。
【００９８】
非ヒト（例えば、齧歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体に由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。大部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望される抗体特異性、親和性、及び能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体性能を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、及び典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、超可変ループの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、かつＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、任意で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれを含むであろう。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５，１９８６、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９，１９８８、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６，１９９２を参照されたい。
【００９９】
「免疫複合体」は、細胞傷害性薬剤を含むが、これに限定されない、１つ以上の異種性分子（複数可）に複合体化される抗体である。
【０１００】
本明細書に開示される様々な抗体を記載するために使用される場合、「単離された」という用語は、抗体が発現された細胞または細胞培養物から特定され、分離及び／または回収されている抗体を意味する。その自然環境の混入構成成分は、典型的に、ポリペプチドの診断的または治療的使用に干渉する物質であり、これらには、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性もしくは非タンパク質性の溶質を挙げることができる。いくつかの実施形態において、抗体は、例えば、電気泳動法（例えば、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動法）またはクロマトグラフィー法（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）の方法によって決定される、９５％または９９％を超える純度まで精製される。抗体の純度を評価するための方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ８４８：７９−８７，２００７を参照されたい。好ましい実施形態において、抗体は、（１）スピニングカップ配列決定装置の使用によって、Ｎ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度まで、または（２）クーマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を使用して、非還元もしくは還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質性まで精製されるであろう。単離された抗体は、組み換え細胞内でインサイチュの抗体を含むが、これは、ポリペプチドの自然環境のうちの少なくとも１つの構成成分が存在しないためである。しかしながら、通常、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製ステップによって調製されるであろう。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の個体群から得られる抗体を指し、すなわち、例えば、天然に存在する変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、可能性のあるバリアント抗体（そのようなバリアントは一般に少量で存在する）を除いて、その個体群を構成する個々の抗体は同一であり、かつ／または同一のエピトープに結合する。典型的に、異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体の個体群から得られる抗体の特徴を示し、いかなる特定の方法による抗体の産生も必要とするものとして解釈されるものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージ提示法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有する遺伝子導入動物を利用する方法を含むが、これらに限定されない、様々な技術によって作製されてもよく、モノクローナル抗体を作製するためのこのような方法及び他の例示的な方法が、本明細書に記載されている。
【０１０２】
「多重特異性抗体」という用語は、最も広義に使用され、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体を特に網羅し、ここで、このＶＨＶＬ単位は、ポリエピトープ特異性を有する（すなわち、１つの生物分子上の２つの異なるエピトープまたは異なる生物分子上の各エピトープに結合することができる）。そのような多重特異性抗体としては、全長抗体、２つ以上のＶＬ及びＶＨドメインを有する抗体、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ及びトリアボディなど）、共有結合または非共有結合で連結されている抗体断片などが挙げられるが、これらに限定されない。「ポリエピトープ特異性」とは、同一または異なる標的（複数可）上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。「二特異性」または「二重特異性」とは、同一または異なる標的（複数可）上の２つの異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。しかしながら、二重特異性抗体とは対照的に、二特異性抗体はアミノ酸配列が同一である２つの抗原結合腕を有し、各Ｆａｂ腕は２つの抗原を認識することができる。二特異性は、抗体が、単一のＦａｂまたはＩｇＧ分子として２つの異なる抗原と高い親和性で相互作用することを可能にする。一実施形態に従うと、ＩｇＧ１形態の多重特異性抗体は、５μＭ〜０．００１ｐＭ、３μＭ〜０．００１ｐＭ、１μＭ〜０．００１ｐＭ、０．５μＭ〜０．００１ｐＭまたは０．１μＭ〜０．００１ｐＭの親和性で各エピトープに結合する。「単一特異性」とは、１つのエピトープにのみ結合する能力を指す。
【０１０３】
「ネイキッド抗体」とは、異種性部分（例えば、細胞毒性部分）または放射標識に複合体化されていない抗体を指す。ネイキッド抗体が、薬学的組成物中に存在してもよい。
【０１０４】
「可変」という用語は、可変ドメインのある特定のセグメントが、抗体間で配列が大幅に異なるという事実を指す。可変または「Ｖ」ドメインは、抗原結合を媒介し、かつ特定の抗体のその特定の抗原に対する特異性を画定する。しかしながら、可変性は、１１０個のアミノ酸の全長の可変ドメインに渡って均等に分布してはいない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれが９〜１２アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる極度に可変性のより短い領域によって分離された１５〜３０個のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、比較的可変性がない伸展からなる。本明細書で使用される場合、「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は一般に、例えば、ＶＬでは大体約残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７（Ｌ３）、ならびにＶＨでは大体約残基２６〜３５（Ｈ１）、４９〜６５（Ｈ２）及び９５〜１０２（Ｈ３）（一実施形態において、Ｈ１は大体約残基３１〜３５）、Ｋａｂａｔら（上記））からのアミノ酸残基、ならびに／または「超可変ループ」（例えば、ＶＬでは残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、及び９１〜９６（Ｌ３）、ならびにＶＨでは２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７からの残基を含む。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、大部分がベータシート構造を取る４つのＦＲを含み、これが３つの超可変領域によって結合され、それによってベータシート構造を結合するループ、及び場合によってはその一部を形成するループが形成される。各鎖内の超可変領域は、ＦＲによって近接してともに保持されており、他方の鎖の超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔら（上記）を参照されたい）。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は一般に、ＶＨ（またはＶＬ）において以下の配列、ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４で出現する。定常ドメインは、抗体の抗原に対する結合には直接関与していないが、抗体の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）への関与などの様々なエフェクター機能を呈する。
【０１０５】
「Ｋａｂａｔにおける可変ドメイン残基の付番」または「Ｋａｂａｔにおけるアミノ酸位置の付番」という用語、及びそれらの変化形は、Ｋａｂａｔら（上記）における抗体のコンパイル物の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用される付番方式を指す。この付番方式を使用して、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＨＶＲの短縮、またはそれへの挿入に対応する、より少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従う残基５２ａ）を、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従う残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含み得る。所与の抗体について、残基のＫａｂａｔ付番は、抗体の配列と「標準の」Ｋａｂａｔによって付番された配列との相同領域での整列によって決定され得る。
【０１０６】
Ｋａｂａｔ付番方式は一般に、可変ドメイン内の残基（軽鎖の約残基１〜１０７及び重鎖の残基１〜１１３）について言及するときに使用される（例えば、Ｋａｂａｔら（上記））。「ＥＵ付番方式」または「ＥＵインデックス」は一般に、免疫グロブリン重鎖定常領域内の残基について言及するときに使用される（例えば、Ｋａｂａｔら（上記）で報告されるＥＵインデックス）。「ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基の付番を指す。別段本明細書において述べられない限り、抗体の可変ドメイン内の残基番号への言及は、Ｋａｂａｔ付番方式による残基付番を意味する。別段本明細書において述べられない限り、抗体の定常ドメイン内の残基番号への言及は、ＥＵ付番方式による残基付番を意味する（例えば、米国特許仮出願第６０／６４０，３２３号、ＥＵ付番の図を参照されたい）。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、別段示されない限り、「インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）」という用語は、霊長類（例えば、ヒト）ならびに齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源からの任意の天然ＩＬ−１３を指す。ＩＬ−１３は、２型Ｔヘルパー（Ｔｈ２）細胞を含む多くの細胞型によって分泌されるサイトカインである。この用語は、「全長」未処理のＩＬ−１３、及び細胞内の処理から生じる任意のＩＬ−１３の形態を包含する。例示的なヒトＩＬ−１３のアミノ酸配列は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｐ３５２２５に見出すことができる。ＩＬ−１３は、ＩＬ−１３受容体サブユニットアルファ１（ＩＬ１３ＲＡ１）またはＩＬ−１３受容体サブユニットアルファ２（ＩＬ１３ＲＡ２）と複合体を形成したＩＬ−４受容体アルファ（ＩＬ４Ｒα）を含み得る、ＩＬ−１３受容体に結合する。例えば、ＩＬ−１３は、ＩＬ−４受容体アルファとＩＬ−１３受容体サブユニットアルファ１との複合体に結合し得る。
【０１０８】
「抗ＩＬ−１３抗体」、「ＩＬ−１３に結合する抗体」、及び「ＩＬ−１３に特異的に結合する抗体」という用語は、抗体が診断的及び／または治療的薬剤としてＩＬ−１３を標的とする上で有用であるような十分な親和性で、ＩＬ−１３に結合することができる抗体を指す。一実施形態において、抗ＩＬ−１３抗体の無関係の非ＩＬ−１３タンパク質への結合の程度は、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）によって測定される、この抗体のＩＬ−１３への結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態において、ＩＬ−１３に結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態において、抗ＩＬ−１３抗体は、異なる種に由来するＩＬ−１３間で保存されるＩＬ−１３のエピトープに結合する。例示的な抗ＩＬ−１３抗体としては、レブリキズマブ、２２８Ｂ／Ｃ−１、２２８Ａ−４、２２７−２６、及び２２７−４３が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、これによりそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，６７４，４５９号、同第８，０６７，１９９号、同第８，０８８，６１８号、同第８，３１８，１６０号、及び同第８，７３４，７９７号を参照されたい）。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、「血管内皮成長因子」または「ＶＥＧＦ」という用語は、それらの天然に存在するアレル形態及び加工形態とともに、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１３０６，１９８９、及びＨｏｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．５：１８０６，１９９１によって記載される、１６５個のアミノ酸のヒト血管内皮細胞成長因子、ならびに関係する１２１、１８９、及び２０６個のアミノ酸のヒト血管内皮細胞成長因子を指す。「ＶＥＧＦ」という用語はまた、マウス、ラットまたは霊長類などの非ヒト種に由来するＶＥＧＦも指す。特定の種に由来するＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦではｈＶＥＧＦ、及びマウスＶＥＧＦではｍＶＥＧＦなどの用語によって示されることがある。「ＶＥＧＦ」という用語はまた、１６５個のアミノ酸のヒト血管内皮細胞成長因子のアミノ酸８〜１０９または１〜１０９を含む、ポリペプチドの切断型形態を指すためにも使用される。任意のそのような形態のＶＥＧＦへの言及は、本出願において、例えば、「ＶＥＧＦ１０９」、「ＶＥＧＦ（８〜１０９）」、「ＶＥＧＦ（１〜１０９）」または「ＶＥＧＦ１６５」によって特定することができる。「切断型」天然ＶＥＧＦのアミノ酸位置は、天然ＶＥＧＦ配列に示されるように付番される。例えば、切断型天然ＶＥＧＦでのアミノ酸位置１７（メチオニン）は、天然ＶＥＧＦでも位置１７（メチオニン）である。切断型天然ＶＥＧＦは、ＫＤＲ及びＦｌｔ−１受容体に対して、天然ＶＥＧＦに匹敵する結合親和性を有する。本明細書で使用される場合、「ＶＥＧＦバリアント」という用語は、天然ＶＥＧＦ配列中に１つ以上のアミノ酸変異を含むＶＥＧＦポリペプチドを指す。任意で、この１つ以上のアミノ酸変異は、アミノ酸置換（複数可）を含む。本明細書に記載されるＶＥＧＦバリアントを簡潔に表記する目的で、番号は、（Ｌｅｕｎｇら（上記）及びＨｏｕｃｋら（上記）に提供される）推定上の天然ＶＥＧＦのアミノ酸配列に沿ったアミノ酸残基の位置を指すことに留意されたい。別段明記されない限り、本明細書で使用される場合、「ＶＥＧＦ」という用語は、ＶＥＧＦ−Ａを示す。
【０１１０】
「抗ＶＥＧＦ抗体」、「ＶＥＧＦに結合する抗体」、及び「ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体」という用語は、抗体が診断的及び／または治療的薬剤としてＶＥＧＦを標的とする上で有用であるような十分な親和性で、ＶＥＧＦに結合することができる抗体を指す。一実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体の無関係の非ＶＥＧＦタンパク質への結合の程度は、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）によって測定して、この抗体のＶＥＧＦへの結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態において、ＶＥＧＦに結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は、異なる種に由来するＶＥＧＦ間で保存されるＶＥＧＦのエピトープに結合する。
【０１１１】
抗ＶＥＧＦ抗体の非限定的な例としては、例えば、非限定的に、「ｒｈｕＭＡｂ  ＶＥＧＦ」または「ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）」としても知られる抗ＶＥＧＦ抗体「ベバシズマブ（ＢＶまたはＢｅｖ）」が挙げられ、これは、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７）に従って生成される組み換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である。ベバシズマブは、変異型ヒトＩｇＧ１フレームワーク領域と、ヒトＶＥＧＦのその受容体への結合を遮断するマウス抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ．４．６．１に由来する抗原結合性の相補性決定領域とを含む。フレームワーク領域のほとんどを含む、ベバシズマブのアミノ酸配列の約９３％がヒトＩｇＧ１に由来し、配列の約７％がマウス抗体Ａ４．６．１に由来する。ベバシズマブは、約１４９，０００ダルトンの分子質量を有し、グリコシル化されている。他の例示的な抗ＶＥＧＦ抗体としては、例えば、米国特許第６，８８４，８７９号及びＷＯ２００５／０４４８５３に記載される抗体が挙げられる。更なる一例としては、ヒト化、親和性成熟抗ヒトＶＥＧＦ  Ｆａｂ断片である、抗ＶＥＧＦ抗体ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）抗体またはｒｈｕＦａｂ  Ｖ２）が挙げられる。ラニビズマブは、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターにおける標準的な組み換え技法及び細菌発酵によって産生される。ラニビズマブはグリコシル化されておらず、約４８，０００ダルトンの分子質量を有する。ＷＯ１９９８／４５３３１及びＵＳ２００３／０１９０３１７を参照されたい。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「投与する」とは、ある投薬量の化合物（例えば、本発明の抗体もしくは本発明の抗体をコードする核酸）または組成物（例えば、薬学的組成物、例えば、本発明の抗体を含む薬学的組成物）を対象に与える方法を意味する。本明細書に記載される方法に利用される組成物は、例えば、筋肉内に、静脈内に、皮内に、経皮的に（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に（ｉｎｔｒａｐｒｏｓｔａｔｉｃａｌｌｙ）、硝子体内に、胸膜内に、気管内に、くも膜下腔内に、鼻腔内に、膣内に、直腸内に、局所的に、腫瘍内に、腹膜内に、皮下に、結膜下に、小胞内に、粘膜的に、心膜内に、臍帯内に、眼球内に、眼窩内に、経口的に、局所的に、吸入によって、注射によって、埋め込みによって、注入によって、持続注入によって、標的細胞を直接浸す局所灌流によって、カテーテルによって、洗浄によって、クレーム中で、または脂質組成物中で投与することができる。本明細書に記載される方法において利用される組成物はまた、全身的または局所的にも投与することができる。投与方法は、様々な因子（例えば、投与される化合物または組成物、ならびに治療される病態、疾患、または障害の重症度）によって異なり得る。
【０１１３】
「血管形成」とは、既存の血管から新たな血管が形成されるプロセスを指す。血管形成は、中胚葉細胞前駆体からの新規の内皮細胞の形成である脈管形成とは異なる。病理学的血管形成に関連付けられる障害を、本発明の組成物及び方法によって治療することができる。これらの障害は、非腫瘍性障害及び増殖性障害の両方を含む。細胞増殖性障害としては、以下に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。非腫瘍性障害としては、眼球病態（非限定的な眼球病態としては、例えば、増殖性糖尿病網膜症を含む網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、病的近視、フォンヒッペル・リンダウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜静脈閉塞症（網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）及び網膜分枝静脈閉塞症（ＢＲＶＯ）形態を含む）、角膜血管新生、網膜血管新生、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、家族性滲出性硝子体網膜症（ＦＥＶＲ）、コーツ病、ノリエ病骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）、結膜下出血、及び高血圧性網膜症が挙げられる）、所望されないもしくは異常な肥大化、関節炎、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、乾癬、乾癬プラーク、サルコイドーシス、アテローム動脈硬化症、アテローム性プラーク、血管再狭窄、動静脈奇形（ＡＶＭ）、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺過形成（グレーブス病を含む）、角膜及び他の組織移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺傷害／ＡＲＤＳ、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性肺滲出、脳浮腫（例えば、急性脳卒中／閉鎖性頭部外傷／外傷に関連付けられるもの）、滑膜炎症、リウマチ性関節炎におけるパンヌス形式、骨化性筋炎、肥大（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｉｃ）骨形成、変形性関節症（ＯＡ）、難治性腹水、多嚢胞性卵巣病、子宮内膜症、細胞外液疾患（３ｒｄ  ｓｐａｃｉｎｇ  ｏｆ  ｆｌｕｉｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）（膵炎、コンパートメント症候群、熱傷、腸疾患）、子宮筋腫、早期分娩、ＩＢＤ（クローン病及び潰瘍性大腸炎）などの慢性炎症、腎同種移植片拒否、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、所望されないもしくは異常な組織腫瘤成長（非癌性）、血友病性関節、肥厚性瘢痕、発毛阻害、オスラー・ランデュ症候群、化膿性肉芽腫後水晶体線維増殖症、強皮症、トラコーマ、血管接着、滑膜炎、皮膚炎、妊娠高血圧腎症、腹水症、心膜液貯留（心膜炎に関連付けられるものなど）、ならびに胸水貯留が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１４】
「抗血管形成剤」または「血管形成阻害剤」とは、直接的または間接的のいずれかで、血管形成、脈管形成、または望ましくない血管透過性を阻害する、少分子量の物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、単離されたタンパク質、組み換えタンパク質、抗体、またはそれらの複合体もしくは融合タンパク質を指す。抗血管形成剤は、血管形成因子またはその受容体に結合し、その血管形成活性を遮断する薬剤を含むであることを理解されたい。例えば、抗血管形成剤は、上記に定義される血管形成剤に対する抗体または他のアンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦ−Ａに対する抗体またはＶＥＧＦ−Ａ受容体（例えば、ＫＤＲ受容体もしくはＦｌｔ−１受容体）に対する抗体、ＧＬＥＥＶＥＣ（商標）（イマチニブメシル酸塩）などの抗ＰＤＧＦＲ阻害剤である。抗血管形成剤はまた、天然の血管形成阻害剤、例えば、アンジオスタチン、エンドスタチンなども含む。例えば、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ  ａｎｄ  Ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５３：２１７−３９（１９９１）、Ｓｔｒｅｉｔ  ａｎｄ  Ｄｅｔｍａｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：３１７２−３１７９（２００３）（例えば、悪性黒色腫における抗血管形成療法を列挙する表３）、Ｆｅｒｒａｒａ＆Ａｌｉｔａｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（１２）：１３５９−１３６４（１９９９）、Ｔｏｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：６５４９−６５５６（２００３）（例えば、既知の抗血管形成因子を列挙する表２）、及びＳａｔｏ  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，８：２００−２０６（２００３）（例えば、表１は、臨床治験において使用される抗血管形成剤を列挙する）を参照されたい。
【０１１５】
「喘息」とは、気道炎症、応答性亢進及び閉塞症を伴い得る慢性肺疾患を指す。生理学的には、気道応答性亢進は、メタコリンまたはヒスタミンによる気管支誘発後の気管支気流の低下によって実証される。アレルゲンによる気管支誘発は、素早い初期相免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）媒介性の気管支気流の低下、その後、多くの患者において、４〜８時間の気管支気流の低下とともに遅延相ＩｇＥ媒介性反応を誘導する。初期応答は、ヒスタミン、ＰＧＤ２、ロイコトリエン、トリプターゼ及び血小板活性化因子（ＰＡＦ）などの炎症性物質の急性的放出によって引き起こされる一方で、遅延応答は、新規の合成炎症促進性サイトカイン（例えば、ＴＮＦα、ＩＬ−４、ＩＬ−１３）ならびにケモカイン（例えば、ＭＣＰ−１及びＭＩＰ−１α）（Ｂｕｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｌｅｒｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｅｄ．Ｍｉｄｄｌｅｓｔｏｎ，１１７３，１９９８）によって引き起こされる。慢性喘息患者において、持続的な肺症状は、Ｔｈ２細胞の応答の高まりによって媒介される。Ｔｈ２サイトカイン、特に、齧歯類の喘息モデル（Ａｋｂａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，９：５８２，２００３）において示される、気道内のＮＫ表現型（ＮＫＴ）を有するＴｈ２細胞によって産生されるＩＬ−１３及びＩＬ−４は、この疾患において重要な役割を果たすと考えられる（Ｌａｒｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１１：４５０，２００３）。喘息気道の肉眼所見は、肺の高度膨脹、平滑筋肥大、網状板肥厚、粘膜浮腫、上皮細胞脱落、繊毛細胞破壊、及び粘液腺分泌過多を提示する。顕微鏡的には、喘息は、気管支組織、気管支分泌物、及び粘液中の好酸球、好中球、リンパ球、及び形質細胞の数の増加の存在を特徴とする。最初に、活性化されたＣＤ４＋Ｔリンパ球による、血流から気道への白血球の動員が存在する。活性化されたＴリンパ球はまた、好酸球、マスト細胞、及びリンパ球からの炎症性メディエーターの放出も指向する。加えて、Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、及びＩＬ−１３を産生する。ＩＬ−１３と併せて、ＩＬ−４は、ＩｇＭ抗体からＩｇＥ抗体への切り換えをシグナルする。
【０１１６】
「癌」及び「癌性」という用語は、制御されていない細胞成長を典型的に特徴とする哺乳動物における生理学的病態を指すか、または記載する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれるが、これらに限定されない。そのような癌のより具体的な例としては、扁平上皮細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）または胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）（消化管癌及び消化管間質腫瘍を含む）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）または腎癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌及び様々な種類の頭頸部癌、黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫、結節型黒色腫、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非開裂細胞性ＮＨＬ、巨大病変性ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、及びヴァルデンストレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞性白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、及びメグス症候群に関連する異常な血管増殖が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
「細胞増殖性障害」及び「増殖性障害」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖に関連付けられる障害を指す。一実施形態において、細胞増殖性障害は、癌である。
【０１１８】
「癌」、「癌性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」及び「腫瘍」という用語は、本明細書において言及される場合、相互排他的ではない。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、「腫瘍」は、悪性または良性に関わらず、全ての腫瘍性の細胞成長及び増殖、ならびに全ての前癌性及び癌性の細胞及び組織を指す。
【０１２０】
「障害」とは、例えば、治療的抗体による治療により利益を得るであろうあらゆる病態である。いくつかの実施形態において、障害は、ＩＬ−１３媒介性障害またはＩｇＥ媒介性障害であり得る。他の実施形態において、障害は、異常なもしくは病理学的な血管形成（例えば、過剰な、不適切な、もしくは制御されない血管形成）または血管透過性を伴い得る。障害は、慢性または急性であり得る。
【０１２１】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例としては、チオテパ及びシクロスホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、イムプロスルファン及びピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロメラミンを含む、エチレンイミン及びメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特に、ブラタシン及びブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン（ｓｃｏｐｏｌｅｃｔｉｎ）、及び９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドレゼシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードなどの窒素マスタード類；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンなどのニトロソ尿素類；エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩｌ（例えば、Ｎｉｃｏｌａｏｕ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）を参照されたい）などの抗生物質；経口アルファ−４インテグリン阻害剤であるＣＤＰ３２３；ダイネミシンＡを含む、ダイネミシン；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団及び関連色素タンパク質エネジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射（ＤＯＸＩＬ（登録商標））、リポソームドキソルビシンＴＬＣ  Ｄ−９９（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標））、ペグ化リポソームドキソル���シン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標））、及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、ミトマイシンＣなどのミトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピュロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン、及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝物；コンブレタスタチン；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸などの葉酸補液；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシン及びアンサミトシンなどのマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモル；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメト；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン（ｓｉｚｏｆｕｒａｎ）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラキュリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、パクリタキセルのアルブミン操作されたナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標））、及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｍｅ−Ｐｏｕｌｅｎｅ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン（例えば、ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））、及びカルボプラチンなどの白金製剤；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））、及びビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））を含む、チューブリン重合の微小管形成を防止するビンカ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボリン；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））を含む、レチノイン酸などのレチノイド；クロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）もしくはＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロネート（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））、またはリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））などのビスホスホネート；トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えば、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、及び上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）などの、異常な細胞増殖に関連付けられるシグナル経路における遺伝子の発現を阻害するもの（例えば、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（商標）））；ならびに細胞増殖を低減するＶＥＧＦ−Ａ；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンなどのワクチン、及び遺伝子療法ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤（例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えば、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ＢＡＹ４３９００６（ソラフェニブ、Ｂａｙｅｒ）；ＳＵ−１１２４８（スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）；ペリフォシン、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブまたはエトリコキシブ）、プロテオソーム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）阻害剤（例えば、ＰＳ３４１）；ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））；ＣＣＩ−７７９；ティピファニブ（Ｒ１１５７７）；オラフェニブ（ｏｒａｆｅｎｉｂ）、ＡＢＴ５１０；オブリメルセンナトリウム（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））などのＢｃｌ−２阻害剤；ピキサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤；チロシンキナーゼ阻害剤；ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標））などのセリン−チロシンキナーゼ阻害剤；ロナファーニブ（ＳＣＨ６６３６、ＳＡＲＡＳＡＲ（商標））などのファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤；ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体；ならびにシクロホスファミドと、ドキソルビシンと、ビンクリスチンと、プレドニゾロンとの併用療法の略称である、ＣＨＯＰ、ならびに５−ＦＵ及びロイコボリンと、上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体とを組み合わせた、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））による治療レジメンの略称である、ＦＯＬＦＯＸなどの、上記のうちの２つ以上の組み合わせ；ならびに上記のうちの２つ以上の組み合わせが挙げられる。
【０１２２】
本明細書に定義される化学療法剤は、癌の成長を促進し得るホルモンの効果を制御、低減、遮断、または阻害するように作用する「抗ホルモン剤」または「内分泌治療薬」を含む。それらは、それら自体がホルモンであってもよく、それらには、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標））、４−ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、トリオキシフェン、ケオキシフェン、及び選択的エストロゲン受容体調節剤（ＳＥＲＭ）（ＳＥＲＭ３など）を含む、混合アゴニスト／アンタゴニストプロファイルを有する抗エストロゲン；フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））などのアゴニスト特性を有しない純粋な抗エストロゲン、及びＥＭ８００（そのような薬剤は、エストロゲン受容体（ＥＲ）二量体化を遮断し得る、ＤＮＡ結合を阻害し得る、ＥＲターンオーバーを増加させ得る、かつ／またはＥＲレベルを抑制し得る）；ホルメスタン及びエキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））などのステロイド性アロマターゼ阻害剤、ならびにアナストラゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））及びアミノグルテチミドなどの非ステロイド性アロマターゼ阻害剤を含むアロマターゼ阻害剤、ならびに他のアロマターゼ阻害剤としては、ボロゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、酢酸メゲストロール（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、ファドロゾール、及び４（５）−イミダゾールが挙げられる；リュープロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）及びＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標））、ゴセレリン、ブセレリン、及びトリプテレリン（ｔｒｉｐｔｅｒｅｌｉｎ）を含む、黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト；プロゲスチン（酢酸メゲストロール及び酢酸メドロキシプロゲステロンなど）、エストロゲン（ジエチルスチルベストロール及びプレマリンなど）、ならびにアンドロゲン／レチノイド（フルオキシメステロン、全トランス型レチノイン酸及びフェンレチニドなど）を含む、性ステロイド；オナプリストン；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体下方制御剤（ＥＲＤ）；フルタミド、ニルタミド及びビカルタミドなどの抗アンドロゲン；ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体；ならびに上記のうちの２つ以上の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「細胞毒性剤」という用語は、細胞機能を阻害もしくは防止する、かつ／または細胞死もしくは破壊を引き起こす物質を指す。細胞毒性剤としては、放射性同位元素（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤もしくは化学療法薬（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤）；成長阻害剤；核酸分解酵素などの酵素及びそれらの断片；抗生物質；細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素活性毒素（それらの断片及び／またはバリアントを含む）などの毒素；ならびに本明細書に開示される様々な抗腫瘍剤または抗癌剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２４】
薬剤、例えば、医薬製剤の「有効量」とは、必要な投薬量及び期間で、所望される治療的または予防的結果を達成するために有効な量を指す。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、「成長阻害剤」とは、インビトロまたはインビボのいずれかで細胞の成長を阻害する化合物または組成物を指す。したがって、成長阻害剤は、Ｓ期の細胞のパーセンテージを著しく低減するものであってもよい。成長阻害剤の例としては、細胞周期進行を（Ｓ期以外の場所で）遮断する薬剤（Ｇ１停止及びＭ期停止を誘導する薬剤など）が挙げられる。古典的なＭ期遮断剤としては、ビンカ（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤（ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンなど）が挙げられる。Ｇ１を停止する薬剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、及びＡｒａ−ＣなどのＤＮＡアルキル化剤はまた、Ｓ期停止にも波及する。更なる情報は、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １，ｅｎｔｉｔｌｅｄ“Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ”ｂｙ  Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５）、例えば、１３頁に見出される。タキサン（パクリタキセル及びドセタキセル）は、ともにイチイの木に由来する抗癌薬である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ）は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）のの半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体に由来する微小管の組み立てを促進し、脱重合を防止することによって微小管を安定させ、これにより、細胞内の有糸分裂の阻害をもたらす。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「ＩＬ−１３媒介性障害」という用語は、ＩＬ−１３によって媒介されるか、またはそれに関連する任意の障害または病態を指す。いくつかの実施形態において、ＩＬ−１３媒介性障害は、体内の局所的及び／または全身的なＩＬ−１３のレベルまたは活性のために非定型症状が現れ得る、過剰なＩＬ−１３レベルまたは活性に関連付けられる。ＩＬ−１３媒介性障害としては、例えば、アレルギー、喘息（アレルギー性喘息、アトピー性喘息、重症喘息、及び非アレルギー性（内因性）喘息を含む）、自己免疫性疾患（例えば、乾癬、リウマチ性関節炎、若年性関節リウマチ、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎及びクローン病）、または他の炎症性疾患が挙げられる。例えば、ＩＬ−１３媒介性障害としては、アレルギー性鼻炎（例えば、季節性アレルギー性鼻炎）、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、湿疹、蕁麻疹、食物アレルギー、食物過敏症、腹腔疾患、免疫媒介性皮膚疾患（例えば、水疱性皮膚症、多形紅斑、接触性皮膚炎を含む）、線維症、肝線維症、心内膜心筋線維症、慢性気管支炎、気管支拡張症、特発性間質性肺炎、杯細胞化生、肺炎症障害、炎症性及び線維性肺疾患（例えば、嚢胞性線維症、特発性肺線維症、及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む）、グルテン過敏性腸症、ウィップル病、肺の免疫疾患（例えば、好酸球性肺炎（例えば、慢性好酸球性肺炎）、特発性肺線維症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、及び過敏性肺炎を含む）、チャーグ・ストラウス症候群（結節性動脈周囲炎に加えてアトピー）、好酸球性筋肉痛症候群、好酸球増加症候群、浮腫反応（例えば、偶発性血管浮腫（ａｎｇｉｏｄｅｍａ）、好酸球性食道炎、好酸球性胃炎、好酸球性胃腸炎、好酸球性腸炎及び好酸球性大腸炎を含む）、鼻マイクロポリープ症及びポリープ症、ＲＳＶ感染症、ブドウ膜炎、強皮症、骨粗鬆症、及び（ＩＬ−１３の異常な発現に関連付けられる癌及び腫瘍を含む）悪性腫瘍（例えば、ホジキンリンパ腫を含む）が挙げられる。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「ＩｇＥ媒介性障害」という用語は、ＩｇＥによって媒介されるか、またはそれに関連する任意の障害または病態を指す。例示的なＩｇＥ媒介性障害としては、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、蕁麻疹、アナフィラキシー、またはアトピー性皮膚炎が挙げられる。
【０１２８】
「単離された核酸」とは、その自然環境の構成成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、通常核酸分子を含有する細胞内に含有される核酸分子を含むが、その核酸分子が染色体外に、またはその自然な染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【０１２９】
「制御配列」という用語は、特定の宿主生物における、操作可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。例えば、原核生物に好適な制御配列は、プロモーター、任意でオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが既知である。
【０１３０】
「発現のレベル」または「発現レベル」という用語は、互換的に使用され、一般に生体試料中のポリヌクレオチドまたはアミノ酸産物もしくはタンパク質の量を指す。「発現」とは一般に、遺伝子によってコードされた情報が細胞内に存在し作動する構造に変換されるプロセスを指す。したがって、本発明に従うと、遺伝子の「発現」は、ポリヌクレオチドへの転写、タンパク質への翻訳、または更にタンパク質の翻訳後修飾を指し得る。転写されたポリヌクレオチドの断片、翻訳されたタンパク質、または翻訳後修飾されたタンパク質はまた、それらが、代替的なスプライシングにより生成された転写物もしくは劣化した転写物に起源を持つか、または例えばタンパク質分解によるタンパク質の翻訳後処理に起源を持つかどうかに関わらず、発現されたとも見なさるべきである。「発現される遺伝子」は、ｍＲＮＡとしてポリヌクレオチドへと転写され、その後、タンパク質へと翻訳されるものと、またＲＮＡへと転写されるがタンパク質へと翻訳されないもの（例えば、転移ＲＮＡ及びリボソームＲＮＡ）とを含む。
【０１３１】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は、互換的に使用され、外因性核酸が中に導入されている細胞（そのような細胞の子孫を含む）を指す。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、これらは、一次形質転換された細胞、及び継代の数に関わらずそれに由来する子孫を含む。子孫は、核酸含有量において親細胞と完全に同一ではなくてもよいが、変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングまたは選択されたものと同一の機能または生物学的活性を有する変異体子孫が、本明細書に含まれる。
【０１３２】
核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係に置かれるとき、「操作可能に連結」されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合に、ポリペプチドのＤＮＡに操作可能に連結されており、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を与える場合に、その配列に操作可能に連結されており、あるいはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置される場合、コード配列に操作可能に連結されている。一般に、「操作可能に連結される」とは、連結されているＤＮＡ配列が近接していること、及び分泌リーダーの場合、近接しており、かつ読み取り相にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、近接していなくてもよい。連結は、簡便な制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合、従来の慣例に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。
【０１３３】
本明細書において特定されるポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列し、必要に応じて間隙を導入して、最大の配列同一性パーセントを得た後に、かついかなる保存的置換も配列同一性の一部とは見なさずに、比較されるポリペプチド内のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的での整列は、当該技術分野の範囲内である様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者は、比較されている配列の全長に渡る最大の整列を達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的で、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作製され、そのソースコードは、米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９）においてユーザ文書とともに出願されており、これは、米国著作権登録第ＴＸＵ５１００８７号の下、登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを通して公的に利用可能である。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄで使用する場合にはコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されており、変化しない。
【０１３４】
ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較に用いられる状況において、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対するある特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、または含む、所与のアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、以下のように計算される。
１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、配列整列プログラムＡＬＩＧＮ−２によって、そのプログラムのＡ及びＢの整列において完全な一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは等しくないことが理解されるであろう。別段具体的に述べられない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性％値は、直前の段落に記載されるように、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して得られる。
【０１３５】
本明細書に記載されるアミノ酸配列は、別段明記されない限り、隣接アミノ酸配列である。
【０１３６】
「添付文書」という用語は、適応症、使用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌についての情報及び／またはそのような治療薬製品の使用に関する警告を含有する、治療薬製品の商業的パッケージに習慣的に含まれる説明書を指すために使用される。
【０１３７】
「薬学的組成物」という用語は、調製物中に含有される活性成分の生物学的活性が有効になるのを許容するような形態であり、かつその製剤が投与されるであろう対象にとって許容できないほどに有毒である追加の構成成分を含有しない調製物を指す。
【０１３８】
「薬学的に許容される担体」とは、対象にとって無毒である、活性成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝液、賦形剤、安定剤、または防腐剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
本出願において使用される「プロドラッグ」という用語は、親薬物と比較して腫瘍細胞に対する細胞毒性が低く、かつより活性な親形態へと酵素的に活性化または変換され得る、薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体形態を指す。例えば、Ｗｉｌｍａｎ，“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１４，ｐｐ．３７５−３８２，６１５ｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｂｅｌｆａｓｔ（１９８６）及びＳｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），ｐｐ．２４７−２６７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照されたい。本発明のプロドラッグとしては、リン酸含有プロドラッグ、チオリン酸含有プロドラッグ、硫酸含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、任意で置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは任意で置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシン及び他の５−フルオロウリジンプロドラッグが挙げられるが、これらに限定されず、これらは、より活性な細胞毒性を含まない薬物へと変換されてもよい。本発明において使用するためのプロドラッグ形態へと誘導体化され得る細胞毒性薬の例としては、上述の化学療法剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４０】
「低減または阻害する」とは、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、及び最も好ましくは７５％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の全体的な低下を引き起こす能力を意味する。低減または阻害するは、治療されている障害の症状、転移の存在またはサイズ、原発腫瘍のサイズを指し得る。
【０１４１】
「患者」、「対象」、または「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物としては、家畜動物（ウシ及びヒツジなど）、競技用動物、愛玩動物（ネコ、イヌ及びウマなど）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ならびに齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
「治療有効量」という用語は、対象における疾患または障害を治療するための抗体または抗体断片の量を指す。ＩＬ−１３媒介性障害の場合、治療有効量の抗体または抗体断片（例えば、抗ＩＬ−１３抗体）は、疾患を寛解もしくは治療することができるか、またはその疾患に関連する症状を予防、低減、寛解、もしくは治療することができる。病理学的血管形成に関連する障害の場合、治療有効量の抗体または抗体断片（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）は、疾患を寛解もしくは治療することができるか、またはその疾患に関連する症状を予防、低減、寛解、もしくは治療することができる。増殖性疾患（例えば、固形腫瘍）の場合、治療有効量の抗体または抗体断片は、癌細胞の数の低減；原発腫瘍サイズの低減；末梢器官への癌細胞の浸潤の阻害（すなわち、ある程度の減速及び好ましくは停止）；腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の減速及び好ましくは停止）；腫瘍成長のある程度の阻害；ならびに／またはその障害に関連する症状のうちの１つ以上のある程度の軽減を行うことができる。抗体または抗体断片が既存の癌細胞の成長の防止及び／またはそれらの殺滅を行うことができる限り、それは、細胞増殖抑制性及び／または細胞毒性であり得る。癌療法について、インビボでの有効性は、例えば、生存期間、疾患進行までの期間（ＴＴＰ）、無疾患生存期間（ＤＦＳ）、無進行生存期間（ＰＦＳ）、応答率（ＲＲ）、応答期間、及び／または生活の質を評価することによって測定され得る。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、「治療」（及び「治療する」または「治療すること」などのその文法上の変化形）とは、治療されている個体の自然経過を変更する試みの中での臨床介入を指し、予防のために、または臨床病理の経過中のいずれかで実行することができる。治療の望ましい効果としては、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患のいずれかの直接的または間接的病理学的帰結の減少、転移の予防、疾患進行の速度の低下、病状の寛解または緩和、及び緩解または予後の改善が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、疾患の発達を遅延させるか、または疾患の進行を減速させるために使用される。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことが意図される。ベクターの一種は「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別の種類は、ファージベクターである。ベクターの別の種類は、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムへとライゲーションされ得るウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自己複製することができる（例えば、細菌起源の複製を有する細菌ベクター、及びエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムへと統合され得、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。更に、ある特定のベクターは、それらが操作可能に連結された遺伝子の発現を指向することができる。そのようなベクターは、本明細書において「組み換え発現ベクター」（または単純に「組み換えベクター」もしくは「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組み換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはしばしば、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は、互換的に使用され得る。
【０１４５】
ＩＩ．方法及び組成物
一態様において、本発明は一部には、結合ポリペプチドを含む細菌を特定する新規な方法、例えば、標識された抗原に結合する抗体を発現する細菌をスクリーニングする方法に基づく。本発明の方法は、例えば、例えば、改善された発現、安定性、及び／または親和性を有する抗体のスクリーニングに有用である。別の態様において、本発明は一部には、ＩＬ−１３またはＶＥＧＦに結合する新規な抗体に基づく。本発明の抗ＩＬ−１３抗体は、ＩＬ−１３媒介性障害の診断及び／または治療に有用である。本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体は、例えば、病理学的血管形成に関連付けられる障害（例えば、癌）の診断及び／もしくは治療、ならびに／または血管透過性の阻害に有用である。
【０１４６】
Ａ．本発明の例示的な方法
本発明は、標的分子に特異的に結合する結合ポリペプチドを含む細菌を特定する方法を提供する。本発明はまた、結合ポリペプチドの改善された発現を有する細菌を特定する方法も提供する。本発明はまた、改善された発現及び／または安定性を有する結合ポリペプチドを特定する方法も提供する。
【０１４７】
例えば、いくつかの例では、本発明は、標的分子に特異的に結合する結合ポリペプチドを含む細菌を特定するための方法であって、以下のステップ、つまり、（ａ）約１ｋＤａ超（例えば、約１ｋＤａ、２ｋＤａ、３ｋＤａ、４ｋＤａ、５ｋＤａ、６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、１０ｋＤａ、１１ｋＤａ、１２ｋＤａ、１３ｋＤａ、１４ｋＤａ、１５ｋＤａ、１６ｋＤａ、１７ｋＤａ、１８ｋＤａ、１９ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、またはそれ以上）の分子量を有する分子に対して透過性である外膜を有する細菌を提供するステップであって、細菌が、候補結合ポリペプチドをコードする核酸を発現し、候補結合ポリペプチドが、細菌の周辺質内に存在する、ステップと、（ｂ）細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させるステップと、（ｃ）周辺質内の標識された標的分子の存在によって、細菌を、結合ポリペプチドを含むものとして特定するステップとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、細菌は、ステップ（ｃ）の後に生存可能のままである。いくつかの実施形態において、標的分子は、共有結合された標識を使用して標識される。他の実施形態において、標的分子は、非共有結合された標識を使用して標識される。
【０１４８】
別の例では、いくつかの例では、本発明は、標的分子に特異的に結合する結合ポリペプチドの改善された発現を有する細菌を特定するための方法であって、以下のステップ、つまり、（ａ）約１ｋＤａ超（例えば、約１ｋＤａ、２ｋＤａ、３ｋＤａ、４ｋＤａ、５ｋＤａ、６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、１０ｋＤａ、１１ｋＤａ、１２ｋＤａ、１３ｋＤａ、１４ｋＤａ、１５ｋＤａ、１６ｋＤａ、１７ｋＤａ、１８ｋＤａ、１９ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、またはそれ以上）の分子量を有する分子に対して透過性である外膜を有する細菌を提供するステップであって、細菌が、結合ポリペプチドをコードする核酸を発現し、結合ポリペプチドが、細菌の周辺質内に存在する、ステップと、（ｂ）細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させるステップと、（ｃ）周辺質内の標識された標的分子の存在によって、細菌を、結合ポリペプチドの改善された発現を有するものとして特定するステップとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、細菌は、ステップ（ｃ）の後に生存可能のままである。いくつかの実施形態において、標的分子は、共有結合された標識を使用して標識される。他の実施形態において、標的分子は、非共有結合された標識を使用して標識される。
【０１４９】
前述の方法のうちのいずれかのいくつかの例では、本方法は、少なくとも１回、本方法のステップを繰り返すことを更に含む。例えば、本方法は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回以上、本方法のステップを繰り返すことを更に含み得る。いくつかの実施形態において、本方法の少なくとも１つのステップが繰り返される。いくつかの例では、本方法のステップの全てが、少なくとも１回、繰り返されてもよい（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回以上繰り返される）。いくつかの例では、本方法のステップの全てが、順次に少なくとも１回、繰り返されてもよい（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回以上繰り返される）。いくつかの例では、本方法のステップは、２回繰り返される。いくつかの例では、本方法のステップは、３回繰り返される。いくつかの例では、以下のステップ、つまり、（ａ）約１ｋＤａ超（例えば、約１ｋＤａ、２ｋＤａ、３ｋＤａ、４ｋＤａ、５ｋＤａ、６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、１０ｋＤａ、１１ｋＤａ、１２ｋＤａ、１３ｋＤａ、１４ｋＤａ、１５ｋＤａ、１６ｋＤａ、１７ｋＤａ、１８ｋＤａ、１９ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、またはそれ以上）の分子量を有する分子に対して透過性である外膜を有する細菌を提供するステップであって、細菌が、候補結合ポリペプチドをコードする核酸を発現し、候補結合ポリペプチドが、細菌の周辺質内に存在する、ステップと、（ｂ）細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させるステップと、（ｃ）周辺質内の標識された標的分子の存在によって、細菌を、結合ポリペプチドを含むものとして特定するステップとが繰り返される。いくつかの例では、本方法は、本方法のステップを繰り返す前に、成長培地中で細菌をインキュベートすることを更に含む。細菌成長培地の例としては、ＣＲＡＰ、ＳＯＣ、Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）、または当該技術分野において既知である任意の他の細菌培養培地が挙げられる。
【０１５０】
前述の方法のうちのいずれかのいくつかの例では、標的分子は、約５００ｋＤａ未満（例えば、約約５００ｋＤａ、約４８０ｋＤａ、約４６０ｋＤａ、約４４０ｋＤａ、約４２０ｋＤａ、約４４０ｋＤａ、約４２０ｋＤａ、約４００ｋＤａ、約３８０ｋＤａ、約３６０ｋＤａ、約３４０ｋＤａ、約３２０ｋＤａ、約３００ｋＤａ、約２８０ｋＤａ、約２６０ｋＤａ、約２５０ｋＤａ、約２２０ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約１８０ｋＤａ、約１６０ｋＤａ、約１５０ｋＤａ、約１３０ｋＤａ、約１２０ｋＤａ、約１１０ｋＤａ、約１００ｋＤａ、約８０ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約４０ｋＤａ、または約２０ｋＤａ未満）の分子量を有する。例示的な標的分子は、約１ｋＤａ〜約５００ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約２３０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約２２０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約２００ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約１８０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約１６０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約１４０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約１２０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約８０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約６０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約４０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約１０ｋＤａ、約８ｋＤａ〜約５００ｋＤａ、約８ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約８ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約８ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ、約８ｋＤａ〜約２２０ｋＤａ、約８ｋＤａ〜約２００ｋＤａ、約８ｋＤａ〜約１８０ｋＤａ、約８ｋＤａ〜約１６０ｋＤａ、約８ｋＤａ〜約１４０ｋＤａ、約８ｋＤａ〜約１２０ｋＤａ、約８ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約８ｋＤａ〜約８０ｋＤａ、約８ｋＤａ〜約６０ｋＤａ、約８ｋＤａ〜約４０ｋＤａ、または約８ｋＤａ〜約２０ｋＤａの範囲内の分子量を有する。
【０１５１】
前述の方法のうちのいずれかのいくつかの例では、標的分子は、約１０ｋＤａ以上の分子量を有する。例えば、いくつかの実施形態において、標的分子は、約１０ｋＤａ〜約７００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約６００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約５００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約４８０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約４７０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約４６０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約４５０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約４４０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約４３０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約４２０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約４１０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約３９０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約３８０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約３７０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約３６０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約３５０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約３４０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約３３０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約３２０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約３１０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約２９０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約２８０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約２７０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約２６０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約２４０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約２３０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約２２０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約２１０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約２００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１９０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１８０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１７０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１６０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１５０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１４０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１３０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１２０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１１０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約９０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約８０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約７０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約６０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約４０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、または約１０ｋＤａ〜約１５ｋＤａの範囲内の分子量を有する。
【０１５２】
いくつかの例では、本発明は、標的分子に特異的に結合する結合ポリペプチドを含む細菌を特定するための方法であって、以下のステップ、つまり、（ａ）外膜を渡る膜不透過性分子の周辺質内への拡散を可能にする変異を含む細菌を提供するステップであって、細菌が、候補結合ポリペプチドをコードする核酸を発現し、候補結合ポリペプチドが、細菌の周辺質内に存在する、ステップと、（ｂ）細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させるステップと、（ｃ）周辺質内の標識された標的分子の存在によって、細菌を、結合ポリペプチドを含むものとして特定するステップとをが繰り返される。いくつかの実施形態において、細菌は、ステップ（ｃ）の後に生存可能のままである。いくつかの例では、本方法は、ステップ（ｂ）の前に、細菌を、細菌の外膜を透過化する条件に供することを更に含む。いくつかの例では、本方法は、細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させた後、細菌の外膜を再封着することを更に含む。
【０１５３】
他の例では、本発明は、標的分子に特異的に結合する結合ポリペプチドの改善された発現を有する細菌を特定するための方法であって、以下のステップ、つまり、（ａ）外膜を渡る膜不透過性分子の周辺質内への拡散を可能にする変異を含む細菌を提供するステップであって、細菌が、結合ポリペプチドをコードする核酸を発現し、結合ポリペプチドが、細菌の周辺質内に存在する、ステップと、（ｂ）細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させるステップと、（ｃ）周辺質内の標識された標的分子の存在によって、細菌を、結合ポリペプチドの改善された発現を有するものとして特定するステップとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、細菌は、ステップ（ｃ）の後に生存可能のままである。いくつかの例では、本方法は、ステップ（ｂ）の前に、細菌を、細菌の外膜を透過化する条件に供することを更に含む。いくつかの例では、本方法は、細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させた後、細菌の外膜を再封着することを更に含む。
【０１５４】
前述の方法のうちのいずれかのいくつかの例では、本方法は、少なくとも１回、本方法のステップを繰り返すことを更に含む。例えば、本方法は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回以上、本方法のステップを繰り返すことを更に含み得る。いくつかの実施形態において、本方法の少なくとも１つのステップが繰り返される。いくつかの例では、本方法のステップの全てが、少なくとも１回、繰り返されてもよい（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回以上繰り返される）。いくつかの例では、本方法のステップの全てが、順次に少なくとも１回、繰り返されてもよい（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回以上繰り返される）。いくつかの例では、本方法のステップは、２回繰り返される。いくつかの例では、本方法のステップは、３回繰り返される。いくつかの例では、以下のステップ、つまり、（ａ）外膜を渡る膜不透過性分子の周辺質内への拡散を可能にする変異を含む細菌を提供するステップであって、細菌が、候補結合ポリペプチドをコードする核酸を発現し、候補結合ポリペプチドが、細菌の周辺質内に存在する、ステップと、（ｂ）細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させるステップと、（ｃ）周辺質内の標識された標的分子の存在によって、細菌を、結合ポリペプチドを含むものとして特定するステップとをが繰り返される。いくつかの例では、本方法は、本方法のステップを繰り返す前に、成長培地中で細菌をインキュベートすることを更に含む。
【０１５５】
他の例では、本発明は、標的分子に特異的に結合する結合ポリペプチドを含む細菌を特定するための方法であって、（ａ）候補結合ポリペプチドをコードする核酸を発現する細菌を提供するステップであって、候補結合ポリペプチドが、細菌の周辺質内に存在する、ステップと、（ｂ）細菌を、細菌の外膜を透過化する条件に供するステップと、（ｃ）細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させるステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の後に、細菌の外膜を再封着するステップと、（ｅ）周辺質内の標識された標的分子の存在によって、細菌を、結合ポリペプチドを含むものとして特定するステップとを含む、方法を提供する。いくつかの例では、細菌は、本方法のステップ（ｅ）の後に生存可能のままである。
【０１５６】
更に他の例では、本発明は、標的分子に特異的に結合する結合ポリペプチドの改善された発現を有する細菌を特定するための方法であって、（ａ）結合ポリペプチドをコードする核酸を発現する細菌を提供するステップであって、結合ポリペプチドが、細菌の周辺質内に存在する、ステップと、（ｂ）細菌を、細菌の外膜を透過化する条件に供するステップと、（ｃ）細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させるステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の後に、細菌の外膜を再封着するステップと、（ｅ）周辺質内の標識された標的分子の存在によって、細菌を、結合ポリペプチドの改善された発現を有するものとして特定するステップとを含む、方法を提供する。いくつかの例では、細菌は、本方法のステップ（ｅ）の後に生存可能のままである。
【０１５７】
いくつかの例では、本方法は、少なくとも１回、本方法のステップを繰り返すことを更に含む。例えば、本方法は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回以上、本方法のステップを繰り返すことを更に含み得る。いくつかの実施形態において、本方法の少なくとも１つのステップが繰り返される。いくつかの例では、本方法のステップの全てが、少なくとも１回、繰り返されてもよい（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回以上繰り返される）。いくつかの例では、本方法のステップの全てが、順次に少なくとも１回、繰り返されてもよい（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回以上繰り返される）。いくつかの例では、本方法のステップは、２回繰り返される。いくつかの例では、本方法のステップは、３回繰り返される。いくつかの例では、以下のステップ、つまり、（ａ）候補結合ポリペプチドをコードする核酸を発現する細菌を提供するステップであって、候補結合ポリペプチドが、細菌の周辺質内に存在する、ステップと、（ｂ）細菌を、細菌の外膜を透過化する条件に供するステップと、（ｃ）細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させるステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の後に、細菌の外膜を再封着するステップと、（ｅ）周辺質内の標識された標的分子の存在によって、細菌を、結合ポリペプチドを含むものとして特定するステップとが繰り返される。
【０１５８】
前述の方法のうちのいずれかにおいて、細菌は、少なくとも約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上だけ、結合ポリペプチドの改善された発現を有し得る。いくつかの例では、細菌は、１〜１０倍の改善された発現、１〜７倍の改善された発現、１〜６倍の改善された発現、１〜５倍の改善された発現、１〜４倍の改善された発現、１〜３倍の改善された発現、２〜１０倍の改善された発現、２〜８倍の改善された発現、または２〜６倍の改善された発現を有し得る。いくつかの実施形態において、改善は、野生型細菌内の結合ポリペプチドの発現レベルと比較したものである。他の実施形態において、改善は、変異体細菌内の結合ポリペプチドの発現レベルと比較したものである。
【０１５９】
前述の方法のうちのいずれかにおいて、細菌は、本方法のステップが実行された後に、生存可能のままである。いくつかの例では、細菌は、本方法のステップが実行された後に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０回、またはそれ以上、細胞分裂を受け得る。いくつかの例では、生存率は、生存率染色、例えば、ＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、ヨウ化プロピジウム、または当該技術分野において既知である他の生存率染色を使用して測定される。いくつかの例では、生存率は、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）細胞生存率アッセイなどの生／死染色キットを使用して測定される。いくつかの例では、生存率は、細菌を細菌培地プレート上にプレーティングすることによって測定される。いくつかの例では、細菌培地プレート上にプレーティングした後、生存可能細胞は、コロニーを生じさせるであろう。
【０１６０】
前述の方法のうちのいずれかにおいて、細菌は、外膜を渡る膜不透過性分子の周辺質内への拡散を可能にする変異を含み得る。外膜を渡る膜不透過性分子の周辺質内への拡散を可能にし得る変異（場合によっては、「周辺質漏出性」または「ｌｋｙ変異体」とも呼ばれることがある）は、例えば、Ｈａｎｃｏｃｋ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８：２３７−２６４，１９８４に記載され、これらには、外膜内のリポ多糖（ＬＰＳ）組成に影響を与え得る、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのディープラフ型（ヘプトース欠損）変異体（例えば、ｒｆａＤ、ｒｆａＥ、ｒｆａＨ、及びｒｆａＲｄ）、ｅｎｖ変異体（例えば、ｅｎｖＡ、ｅｎｖＢ、ｅｎｖＭ−Ｔ）、ならびにＥ．ｃｏｌｉにおけるコリシン耐性変異体（例えば、ｔｏｌＣ及びｔｏｌＡ，Ｂ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、変異は、外膜タンパク質及び／またはリポ多糖（ＬＰＳ）組成に影響を与えるタンパク質をコードする遺伝子中にある。いくつかの例では、変異は、外膜タンパク質、例えば、主要外膜リポタンパク質Ｌｐｐ（Ｌｐｐ）、ポリン、またはＴｏｌＣをコードする遺伝子中にある。いくつかの例では、外膜タンパク質は、Ｌｐｐである。Ｌｐｐをコードする遺伝子中の任意の好適な変異を、使用することができる。例示的なｌｐｐ変異としては、ｌｐｐ−１；ｌｐｐ−２１；ｌｐｐ−３；ｌｐｐ５５０８；ｌｐｐ−６；ｌｐｐ：：Ｔｎ５ＫＡＮ−２；ｌｐｐＤ７０Ｅ、Ｇ、もしくはＳ；ｌｐｐＫ７５ＳもしくはＴ；ｌｐｐＫ７８Ｒ；ｌｐｐＲ７７ＤもしくはＬ；ｌｐｐＳ２２Ｄ；ｌｐｐＹ７６Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、もしくはＳ；ｌｐｐＹ７６Ｆ、Ｈ、Ｉ、もしくはＬ；Δｌｐｐ、Δｌｐｐ−２５４、及びΔｌｐｐ−７５２：：ｋａｎ、または本明細書に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなｌｐｐ変異は、例えば、ＣＧＳＣ（Ｔｈｅ  Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ）などの貯蔵所から取得することができる。他の例では、Ｌｐｐをコードする遺伝子中の変異は、標準的な遺伝学アプローチを使用して作製することができる。いくつかの実施形態において、変異は、ＬＰＳ組成に影響を与えるタンパク質、例えば、Ｅｎｖタンパク質（例えば、ＥｎｖＡ、ＥｎｖＢ、及びＥｎｖＭ）、ＲｆａＤ、ＲｆａＥ、ＲｆａＨ、ＲｆａＲｄ、ＴｏｌＡ、ＴｏｌＢ、ならびにＴｏｌＤをコードする遺伝子中にある。
【０１６１】
前述の方法のうちのいずれかにおいて、本方法は、細菌を、外膜を透過化する条件に供することを含み得る。いくつかの例では、外膜を透過化する条件は、細菌を透過化剤で処理することを含む。いくつかの例では、透過化剤は、キレート剤（二価カチオンキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＢＡＰＴＡ、及びＥＧＴＡ）を含む）、ＮａＣｌ、スクロース、抗生物質（例えば、アミノグリコシド（例えば、ストレプトマイシン及びゲンタマイシン）、ポリミキシンＢ、脱アシル化ポリミキシン、オクタペプチン、及びベンジルペニシリン）、洗剤、リゾチーム、トリス、トリス−ＥＤＴＡ、アスコルベート、ポリリジン、塩化ベンザルコニウム、プロタミン、殺菌性／透過性増強タンパク質（ＢＰＩ）、血清及び／もしくは補体、Ｃａ２＋、またはこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、透過化剤は、キレート剤を含む。いくつかの例では、キレート剤は、二価カチオンキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＢＡＰＴＡ、及びＥＧＴＡを含む）である。いくつかの実施形態において、二価カチオンキレート剤は、ＥＤＴＡである。いくつかの例では、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡの濃度は、約１μＭ〜約１５ｍＭの間、例えば、約１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、５００μＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、または１５ｍＭである。いくつかの例では、ＥＤＴＡの濃度は、５ｍＭである。いくつかの例では、透過化剤は、緩衝剤、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を更に含む。いくつかの例では、透過化剤は、ウシ血清アルブミンを更に含む。いくつかの例では、ＢＳＡは、１重量体積％〜約１０重量体積％の間、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％で存在する。
【０１６２】
前述の方法のうちのいずれかにおいて、本方法は、細菌の外膜を再封着することを含み得る。外膜は、完全に再封着されてもよいが、完全に再封着される必要はない。本発明の方法にとって、細胞生存率を可能にするレベルまでの部分的な再封着が十分である。いくつかの例では、基準または野生型細菌外膜（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ６２Ａ７細胞の外膜）と比較して、膜透過性障壁が５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％以内まで回復される場合、外膜は再封着される。いくつかの例では、細菌の外膜を実質的に再封着することは、細菌を、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｎａ＋、及びＫ＋などの塩、例えば、ＳＯ４２−、Ｆ−、Ｃｌ２−、ＳＯ３２−、及びＰＯ４３−などのアニオンを有する前述のカチオンの塩と接触させることを含む。いくつかの例では、細菌の外膜を実質的に再封着することは、細菌を、ＭｇＣｌ２と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、ＭｇＣｌ２の濃度は、約１ｍＭ〜約５０ｍＭの間、例えば、約１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、または５０ｍＭである。
【０１６３】
前述の方法のうちのいずれかにおいて、細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させるステップは、細菌を核酸色素と接触させることを更に含み得る。いくつかの例では、核酸色素は、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｈｏｅｃｈｓｔ染色とも呼ばれる）、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ＳＹＴＯ（登録商標）９、ＳＹＴＯ（登録商標）１１、ＳＹＴＯ（登録商標）１２、ＳＹＴＯ（登録商標）１３、ＳＹＴＯ（登録商標）１４、ＳＹＴＯ（登録商標）１５、ＳＹＴＯ（登録商標）１６、ＳＹＴＯ（登録商標）１７、ＳＹＴＯ（登録商標）４１、ＳＹＴＯ（登録商標）４３、ＳＹＴＯ（登録商標）４２、ＳＹＴＯ（登録商標）４４、ＳＹＴＯ（登録商標）４０、ＳＹＴＯ（登録商標）４５、ＳＹＴＯ（登録商標）５９、ＳＹＴＯ（登録商標）６０、ＳＹＴＯ（登録商標）６１、ＳＹＴＯ（登録商標）６２、及びＳＹＴＯ（登録商標）６３、ＳＹＴＯ（登録商標）６４からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも約６０％（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上）の効率で細菌細胞を染色する核酸色素が使用される。いくつかの実施形態において、少なくとも約８５％の効率で細菌細胞を染色する核酸色素が使用される。
【０１６４】
前述の方法のうちのいずれかにおいて、検出可能に標識された標的分子は、蛍光標識（フルオロフォアとも呼ばれる）を含み得る。いくつかの実施形態において、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ（商標））検出と適合する任意の蛍光標識が使用され得る。例えば、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ（商標））による選別を可能にする量子収率を有する任意の蛍光標識が使用され得る。いくつかの例では、蛍光標識は、蛍光色素または蛍光ポリペプチドを含む。様々な蛍光標識が、様々な販売業者、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている。蛍光標識は、その励起及び発光プロファイルに基づいて選択され得る。
【０１６５】
使用することができる蛍光色素の非限定的な例としては、ＡＬＥＸＡ（登録商標）色素（例えば、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５１４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５５５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５４６、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６１０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６３３、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６６０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６８０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０、及びＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７９０）、ＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）色素（例えば、ＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）３５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）４０５、ＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）４８８、ＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）５５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）５９４、ＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）６３３、ＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）６５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）６８０、ＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）７５５、及びＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）８００）、シアニン色素（例えば、ＣＹ（登録商標）２、ＣＹ（登録商標）３、及びＣＹ（登録商標）５）、ＢＯＤＩＰＹ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（登録商標）、フルオレセイン及びその誘導体（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ＦＩＴＣ）、ならびにローダミン及びその誘導体（例えば、テトラメチルローダミン、ＴＲＩＴＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、蛍光色素は、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７、及びＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）６４９からなる群から選択される
【０１６６】
使用することができる例示的な蛍光ポリペプチドとしては、青色／ＵＶ蛍光タンパク質（ＴａｇＢＦＰ、ｍＴａｇＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＥＢＦＰ２、ｍＫａｌａｍａ１、Ｓｉｒｉｕｓ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、及びＴ−Ｓａｐｐｈｉｒｅを含む）、シアン色蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＳＣＦＰ３Ａ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、モノマーＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ、及びｍＴＦＰ１）、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ  ＧＦＰ、モノマーＡｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、ｍＷａｓａｂｉ、Ｃｌｏｖｅｒ、及びｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＳＹＦＰ２、及びＴａｇＹＦＰ）、橙色蛍光タンパク質（例えば、モノマーＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯｋ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅ、及びｍＯｒａｎｇｅ２）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＲｕｂｙ、及びｍＲｕｂｙ２）、遠赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、ＮｉｒＦＰ）、光活性化可能蛍光タンパク質（例えば、ＰＡ−ＧＦＰ、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ１、及びＰＡＴａｇＲＦＰ）、ならびに光変換可能蛍光タンパク質（例えば、Ｋａｅｄｅ、ＫｉｋＧＲ１、ＰＳ−ＣＦＰ２、ｍＥｏｓ２、ｍＥｏｓ３．２、及びｐＳｍＯｒａｎｇｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、細菌は、約４℃〜約２５℃（例えば、約４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１２℃、１４℃、１６℃、１８℃、２０℃、２２℃、２４℃、または２５℃）の温度で、検出可能に標識された標的分子と接触させられる。いくつかの実施形態において、温度は、約４℃である。
【０１６８】
前述の方法のうちのいずれも、細菌を洗浄緩衝液中に再懸濁させることを伴う、少なくとも１回の洗浄ステップ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回の洗浄ステップ）を更に含み得る。いくつかの例では、少なくとも１回の洗浄ステップは、細菌を検出可能に標識された標的分子と接触させた後に実行される。いくつかの例では、洗浄緩衝液は、緩衝剤、例えば、ＰＢＳを含む。いくつかの例では、洗浄緩衝液は、リン酸緩衝食塩水を含む。いくつかの例では、洗浄緩衝液は、ＭｇＣｌ２を更に含む。いくつかの例では、洗浄緩衝液は、１ｍＭ〜５０ｍＭのＭｇＣｌ２（例えば、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、または５０ｍＭのＭｇＣｌ２を含む。
【０１６９】
前述の方法のうちのいずれかにおいて、選択ステップは、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ（商標））を更に含み得る。いくつかの例では、フローサイトメトリーは、単細胞を選別すること、及び検出可能に標識された標的分子のシグナルに基づいて選別することを含む。いくつかの例では、フローサイトメトリーは、核酸色素のシグナルに基づいて選別することを含む。いくつかの例では、フローサイトメトリーは、順次に、（ｉ）核酸色素のシグナルに基づいて選別することと、（ｉｉ）単細胞を選別することと、（ｉｉｉ）検出可能に標識された標的分子のシグナルに基づいて選別することとを含む。いくつかの実施形態において、細胞は、約１×１０５〜約１×１０１２個の細胞／ｍｌの間、例えば、約１×１０５個の細胞／ｍｌ、約１×１０６個の細胞／ｍｌ、約１×１０７個の細胞／ｍｌ、約１×１０８個の細胞／ｍｌ、約１×１０９個の細胞／ｍｌ、約１×１０１０個の細胞／ｍｌ、約１×１０１１個の細胞／ｍｌ、または約１×１０１２個の細胞／ｍｌの濃度である。
【０１７０】
前述の方法のうちのいずれかにおいて、細菌は、内膜、周辺質、及び外膜を含む細菌であり得る。いくつかの実施形態において、細菌は、グラム陰性菌である。例えば、いくつかの例では、細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉである。Ｅ．ｃｏｌｉの任意の好適な株または遺伝的背景を使用することができる。一般的に使用されるＥ．ｃｏｌｉの株及び遺伝的背景は、当該技術分野において周知である例示的なＥ．ｃｏｌｉ株としては、Ｋ−１２及びその亜株（例えば、Ｃｌｉｆｔｏｎ野生型、Ｗ３１１０、及びＤＨ５αＥなど）、ならびにＥ．ｃｏｌｉ  Ｂ及びその亜株（例えば、ＢＬ２１及びＢＬ２１（ＤＥ３）など）などの実験室株が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉは、株６２Ａ７に由来する。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉは、株３３Ｄ３に由来する。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉは、株６６Ｃ４に由来する。
【０１７１】
前述の方法のうちのいずれかにおいて、結合ポリペプチドは、細菌の周辺質内で可溶性形態で発現され得る。
【０１７２】
前述の方法のうちのいずれかにおいて、結合ポリペプチドは、細菌の周辺質内で融合タンパク質として発現され得る。いくつかの例では、結合ポリペプチドは、内膜の外面に局所化するタンパク質またはその断片を有する融合タンパク質として発現される。追加のポリペプチド配列、例えば、リンカーポリペプチドが、融合タンパク質に添加され得ることが理解される。そのような融合タンパク質を使用して、結合ポリペプチドを内膜の外面にアンカーすることができる。いくつかの実施形態において、内膜リポタンパク質のリーダーペプチド及び最初の６個のアミノ酸（例えば、ＮｌｐＡ）が、融合タンパク質中に含まれてもよい。そのような融合タンパク質は、内膜の外面への結合ポリペプチドのＮ末端アンカーとしての役割を果たし得る。いくつかの例では、融合タンパク質は、Ａａｓ、ＡｃｒＥ（ＥｎｖＣ）、ＡｍｉＣ、ＡｍｉＤ、ＡｒｔＭ、ＡｒａＨ、ＡｒｔＱ、ＢｔｕＣ、ＣｈｅＹ、ＣｙｓＴ、ＣｙｓＷ、ＤｐｐＢ、ＤｐｐＣ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＤ、ＥｘｂＤ、ＥｘｂＢ、ＦｅｃＣ、ＦｅｃＤ、ＦｅｃＲ、ＦｅｐＤ、ＦｈｕＢ、ＧｌｎＰ、ＨｉｓＭ、ＨｉｓＱ、ＬａｃＹ、リポタンパク質、ＬｉｖＨ、ＬｉｖＭ、ＬｉｖＡ、ＬｉｖＥ、ＭａｌＦ、ＭａｌＧ、ＭａｌＣ、ＭａｌＤ、ＭｇｌＣ、ＭｏｄＢ、ＮｉｋＢ、ＮｉｋＣ、ＮｏｓＹ、ＯｐｐＢ、ファージによってコードされたｃｅｌＢ、ＰｈｎＭ、ＰｏｔＢ、ＰｏｔＣ、ＰｏｔＨ、ＰｏｔＩ、ＰｒｏＷ、ＰｓｔＡ、ＰｓｔＣ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのプルラナーゼ、ＲｂｓＣ、ＳｅｃＹ、ＴａｔＣ、ＴｒａＢ  ＴｏｌＣ、ＴｏｎＢ、ＵｇｐＡ、またはＵｇｐＥから選択される内膜タンパク質もしくはその断片を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置２にシグナル配列及びアスパラギン酸を含む、任意のリポタンパク質またはその断片（野生型タンパク質で存在するか、変異原性（例えば、部位指向変異原性によって添加されるかのいずれかである）が、融合タンパク質中に含まれてもよい。いくつかの実施形態において、任意の細胞質タンパク質の一回膜貫通ループが、膜アンカーとして使用されてもよい。融合タンパク質は、Ｎ末端融合またはＣ末端融合であってもよい。
【０１７３】
いくつかの例では、細菌は、結合ポリペプチドに特異的に結合し得るドメインまたはその断片を含む内膜の外面に局所化する、融合タンパク質を発現する。例えば、結合ポリペプチドが抗体である場合、抗体結合ドメインまたはその断片が、上述の内膜タンパク質またはその断片を有する融合タンパク質中に含まれてもよい。いくつかの例では、抗体結合ドメインは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓのアレルゲンＡｓｐ  ｆｌ１、Ａｓｐ  ｆｌ２、もしくはＡｓｐ  ｆｌ３；Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ｓｐａ）のＦｃ−ガンマＲＩ、Ｆｃ−ガンマＲＩＩ、Ｆｃ−ガンマＲＩＩ−ａ、Ｆｃ−ガンマＲＩＩ−ｂ、Ｆｃ−ガンマＲＩＩ−ｃ、ＦＣ−ガンマＲＩＩＩ、Ｆｃ−ガンマＲＩＩＩ−ａ、Ｆｃ−ガンマＲＩＩＩ−ｂ、ＦｃＲｎ、ＭＲＰタンパク質；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅのタンパク質Ｂ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ菌種Ｇ群（ｓｐｇ）のタンパク質Ｇ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓのタンパク質Ｈ；Ｓ．ａｕｒｅｕｓのタンパク質ｓｂｉに由来し得る。いくつかの例では、ドメインは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのタンパク質Ａ（例えば、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するＺＺドメインに由来し得る。他の結合ポリペプチドについて、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン及び／または結合ポリペプチドに結合するエピトープタグが、融合タンパク質中に含まれてもよい。
【０１７４】
前述の方法のうちのいずれかにおいて、ステップ（ａ）は、複数の細菌を提供することを含んでもよく、細菌は、それぞれが候補結合ポリペプチドをコードする核酸のライブラリを含む。いくつかの例では、核酸のライブラリは、１つ以上の特定の位置のバリアントの配列を除いて、配列が実質的に同一、好ましくは同一であるポリペプチドをコードする２つ以上の核酸を含んでもよい。例えば、いくつかの例では、ライブラリは、基準結合ポリペプチドと比較して、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、またはそれ以上）のアミノ酸残基変化を有する候補結合ポリペプチドバリアントをコードする複数の核酸を含む。
【０１７５】
例えば、前述の方法のうちのいずれかにおいて、ライブラリは、候補抗体バリアントをコードする複数の核酸を含んでもよく、各候補抗体バリアントは、参照抗体と比較して、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、またはそれ以上）のアミノ酸残基変化を含む。アミノ酸残基変化は、抗体の任意の位置、例えば、ＶＨ及び／またはＶＬ及び／または定常ドメインであってもよい。例えば、いくつかの例では、候補抗体バリアントは、ＶＨ及び／またはＶＬのＨＶＲ及び／またはＦＲ中に１つ以上のアミノ酸残基変化を含む。いくつかの例では、候補抗体バリアントは、ＶＨのＨＶＲ（例えば、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及び／もしくはＨＶＲ−Ｈ３）中、ならびに／またはＦＲ（例えば、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、及び／もしくはＦＲ−Ｈ４）中に１つ以上のアミノ酸残基変化を含む。いくつかの例では、候補抗体バリアントは、ＶＨのＨＶＲ（例えば、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及び／またはＨＶＲ−Ｈ３）中に１つ以上のアミノ酸残基変化を含む。いくつかの例では、候補抗体バリアントは、ＶＨのＦＲ（例えば、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、及び／またはＦＲ−Ｈ４）中に１つ以上のアミノ酸残基変化を含む。他の例では、候補抗体バリアントは、ＶＬのＨＶＲ（例えば、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及び／もしくはＨＶＲ−Ｌ３）ならびに／またはＦＲ（例えば、ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、及び／もしくはＦＲ−Ｌ４）中に１つ以上のアミノ酸残基変化を含む。いくつかの例では、候補抗体バリアントは、ＶＬのＨＶＲ（例えば、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及び／またはＨＶＲ−Ｌ３）中に１つ以上のアミノ酸残基変化を含む。いくつかの例では、候補抗体バリアントは、ＶＬのＦＲ（例えば、ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、及び／もしくはＦＲ−Ｌ４）中に１つ以上のアミノ酸残基変化を含む。アミノ酸残基変化は、表面に曝露された残基または埋もれた残基中のものであってもよい。
【０１７６】
前述の方法のうちのいずれかにおいて、ライブラリは、候補抗体バリアントをコードする複数の核酸を含んでもよく、各候補抗体バリアントは、参照抗体と比較して、ＶＨまたはＶＬのＦＲ中にアミノ酸残基変化を含み、アミノ酸残基変化は、（ａ）参照抗体と同一の亜型を有する天然に存在する抗体において特定され、かつ／または（ｂ）埋もれると予想されるアミノ酸残基中にある。例えば、いくつかの例では、ライブラリは、候補抗体バリアントをコードする複数の核酸を含んでもよく、各候補抗体バリアントは、参照抗体と比較して、ＶＨまたはＶＬのＦＲ中にアミノ酸残基変化を含み、アミノ酸残基変化は、（ａ）参照抗体と同一の亜型を有する天然に存在する抗体において特定され、かつ（ｂ）埋もれると予想されるアミノ酸残基中にある。いくつかの例では、天然に存在する抗体におけるアミノ酸残基変化は、体細胞超変異によるものである。
【０１７７】
アミノ酸残基は、当該技術分野において既知である任意の方法を使用して、埋もれる（例えば、溶媒接触不可能）または表面に曝露される（例えば、溶媒接触可能）と予想及び／または決定され得る。例えば、アミノ酸残基は、当該技術分野において既知であるいくつかのアルゴリズムのうちのいずれかを使用して、埋もれると予想され得る。好ましくは、溶媒接触可能な位置は、抗体の三次元モデルの座標を使用して、好ましくはＩｎｓｉｇｈｆＨ  Ｐｒｏｇｒａｍ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）などのコンピュータプログラムを使用して、決定される。埋もれた位置はまた、当該技術分野において既知であるアルゴリズム（例えば、を使用して、予想することもできる（例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：３７９，１９７１及びＣｏｎｎｏｌｌｙ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．１６：５４８，１９８３）。埋もれた位置の予想は、タンパク質モデル化にとって好適なソフトウェア、及び抗体から得られる三次元構造情報を使用して、実行することができる。これらの目的で利用することができるソフトウェアとしては、ＳＹＢＹＬ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  Ｍｏｄｕｌｅソフトウェア（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）が挙げられる。一般に、アルゴリズム（プログラム）がユーザ入力サイズパラメータを必要とする場合、計算において使用されるプローブの「サイズ」は、半径約１．４オングストローム以下に設定される。加えて、埋もれた及び／または表面に曝露された領域、ならびにパーソナルコンピュータ用のソフトウェアを使用する面積法の決定は、Ｐａｃｉｏｓ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１８（４）：３７７−３８６，１９９４及びＪ．Ｍｏｌ．Ｍｏｄｅｌ．１：４６−５３，１９９５によって記載されている。
【０１７８】
前述の方法のうちのいずれかにおいて、ライブラリは、約２個の結合ポリペプチド〜約１０１４個以上の結合ポリペプチド（例えば、約２個、約５個、約１０個、約１５個、約２０個、約４０個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約２００個、約５００個、約１０３個、約１０４個、約１０５個、約１０６個、約１０７個、約１０８個、約１０９個、約１０１０個、約１０１１個、約１０１２個、約１０１３個、または約１０１４個の結合ポリペプチド）を含み得る。いくつかの例では、ライブラリは、約１０８個の結合ポリペプチドを含み得る。
【０１７９】
前述の方法のうちのいずれも、周辺質内の標識された標的分子の量に基づいて、候補結合ポリペプチドを、増加した発現レベルを有するものとして特定するステップを含み得る。いくつかの例では、増加した発現レベルは、ウェスタンブロット、ＩＨＣ、質量分析、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、または当該技術分野において既知である他の方法によって決定される。いくつかの例では、候補結合ポリペプチドは、基準または野生型結合ポリペプチドと比較して、１〜２０倍の発現の増加、例えば、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、または２０倍の発現の増加を有する。例えば、候補結合ポリペプチドは、１〜１０倍の発現の増加、１〜７倍の発現の増加、１〜６倍の発現の増加、１〜５倍の発現の増加、１〜４倍の発現の増加、１〜３倍の発現の増加、２〜１０倍の発現の増加、２〜８倍の発現の増加、または２〜６倍の発現の増加を有し得る。いくつかの実施形態において、候補結合ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞及び哺乳動物細胞の両方において増加した発現を有する。いくつかの実施形態において、増加は、野生型結合ポリペプチドの発現レベルと比較したものである。他の実施形態において、増加は、バリアント結合ポリペプチドの発現レベルと比較したものである。
【０１８０】
前述の方法のうちのいずれかは、周辺質内の標識された標的分子の量に基づいて、候補結合ポリペプチドを、増加した安定性を有するものとして特定するステップを含み得る。いくつかの例では、増加した安定性は、示差走査蛍光定量、円二色性、分光測定、または当該技術分野において既知である他の方法によって決定される。いくつかの例では、候補結合ポリペプチドは、基準または野生型結合ポリペプチドと比較して、１℃〜２０℃の間、例えば、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、または２０℃の、増加した融解温度（Ｔｍ）を有する。いくつかの例では、候補結合ポリペプチドは、１℃〜１０℃の間、１℃〜９℃の間、１℃〜８℃の間、１℃〜７℃の間、１℃〜６℃の間、１℃〜５℃の間、１℃〜４℃の間、１℃〜３℃の間、１℃〜２℃の間、２℃〜１０℃の間、２℃〜９℃の間、２℃〜８℃の間、２℃〜７℃の間、２℃〜６℃の間、２℃〜５℃の間、２℃〜４℃の間、または２℃〜３℃の、増加したＴｍを有する。いくつかの実施形態において、候補結合ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞及び哺乳動物細胞の両方において増加した安定性を有する。いくつかの実施形態において、候補結合ポリペプチドは、増加した安定性及び増加した発現の両方を有する。いくつかの実施形態において、増加は、野生型結合ポリペプチドの発現レベルと比較したものである。他の実施形態において、増加は、バリアント結合ポリペプチドの発現レベルと比較したものである。
【０１８１】
前述の方法のうちのいずれも、周辺質内の標識された標的分子の量に基づいて、候補結合ポリペプチドを、標的分子に対する増加した結合親和性を有するものとして特定するステップを含み得る。いくつかの実施形態において、候補結合ポリペプチドは、基準結合ポリペプチドと比較して、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０倍の、標的分子に対する結合親和性の増加を有し得る。例えば、本方法は、参照抗体と比較して増加した親和性を有する抗体をスクリーニングすることを含み得る。
【０１８２】
前述の方法のうちのいずれかにおいて、結合ポリペプチドは、抗体であってもよい。いくつかの例では、上記の方法のうちのいずれかの抗体は、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。いくつかの例では、抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、またはＦ（ａｂ’）２断片である。他の例では、抗体は、全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１抗体、インタクトなＩｇＧ４抗体、または本明細書に定義される他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。別の実施形態において、抗体は、半抗体、例えば、ノブ・イントゥ・ホール半抗体である。ノブ・イントゥ・ホール技術の説明については、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい。前述の方法のうちのいずれかにおいて、抗体は、治療的抗体（例えば、中和抗体）であってもよい。
【０１８３】
前述の方法のうちのいずれかにおいて、結合ポリペプチドは、抗体模倣物、例えば、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、フィノマー、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、またはモノボディであってもよい。他の実施形態において、結合ポリペプチドは、周辺質に局所化する細菌タンパク質であってもよい。他の実施形態において、結合ポリペプチドは、哺乳動物タンパク質であってもよい。例えば、いくつかの実施形態において、結合ポリペプチドは、細胞表面受容体、サイトカイン、または成長因子であってもよい。
【０１８４】
前述の方法のうちのいずれも、選択ステップの後に、核酸を単離することを更に含み得る。いくつかの例では、本方法は、核酸の配列を決定することを更に含む。
【０１８５】
前述の方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、細菌は、結合ポリペプチドの発現に影響を与える遺伝子、例えば、転写制御遺伝子に影響を与える変異を含み得る。いくつかの例では、ステップ（ａ）は、複数の細菌を提供することを含み、複数の細菌は、それぞれが転写制御遺伝子の変異体をコードする核酸のライブラリを含む。いくつかの例では、転写制御遺伝子は、転写開始因子、抗シグマ因子、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット、または転写因子から選択される。いくつかの例では、転写開始因子は、シグマ因子である。いくつかの例では、シグマ因子は、ＲｐｏＤ（σ７０）、ＲｐｏＥ（σ２４）、ＲｐｏＨ（σ３２）、ＲｐｏＳ（σ３８）、ＲｐｏＮ（σ５４）、ＲｐｏＦ（σ２８）、及びＦｅｃＩ（σ１９）からなる群から選択される。具体的な例では、シグマ因子は、ＲｐｏＤ（σ７０）である。いくつかの例では、転写制御遺伝子に影響を与える変異は、合成プラスミド上に存在する。他の例では、転写制御遺伝子に影響を与える変異は、内在性細菌ゲノム中に存在する。いくつかの例では、転写制御遺伝子に影響を与える変異は、エラープローンＰＣＲ変異原性、化学変異原性、転位変異原性、または標的化変異原性によるものである。具体的な例では、転写制御遺伝子に影響を与える変異は、エラープローンＰＣＲ変異原性によるものである。
【０１８６】
前述の方法のうちのいずれかを使用して、結合ポリペプチドの改善された発現を有する細菌を特定することができる。いくつかの例では、細菌は、少なくとも約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上だけ、結合ポリペプチドの改善された発現を有し得る。いくつかの例では、細菌は、１〜１０倍の改善された発現、１〜７倍の改善された発現、１〜６倍の改善された発現、１〜５倍の改善された発現、１〜４倍の改善された発現、１〜３倍の改善された発現、２〜１０倍の改善された発現、２〜８倍の改善された発現、または２〜６倍の改善された発現を有し得る。いくつかの実施形態において、改善は、野生型細菌内の結合ポリペプチドの発現レベルと比較したものである。他の実施形態において、改善は、変異体細菌内の結合ポリペプチドの発現レベルと比較したものである。
【０１８７】
Ｂ．ライブラリ
本発明は、結合ポリペプチドをコードする複数の核酸を含むライブラリを提供する。例えば、いくつかの例では、ライブラリは、基準結合ポリペプチドと比較して、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、またはそれ以上）のアミノ酸残基変化を有する候補結合ポリペプチドバリアントをコードする複数の核酸を含む。
【０１８８】
候補結合ポリペプチドは、候補抗体バリアントであってもよい。いくつかの例では、候補抗体バリアントは、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。いくつかの例では、候補抗体バリアントは、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、またはＦ（ａｂ’）２断片である。他の例では、候補抗体バリアントは、全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１抗体、インタクトなＩｇＧ４抗体、または本明細書に定義される他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。別の実施形態において、候補抗体バリアントは、半抗体、例えば、ノブ・イントゥ・ホール半抗体である。前述の方法のうちのいずれかにおいて、候補抗体バリアントは、治療的抗体（例えば、中和抗体）であってもよい。
【０１８９】
他の例では、候補結合ポリペプチドは、抗体模倣物、例えば、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、フィノマー、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、またはモノボディであってもよい。他の実施形態において、結合ポリペプチドは、周辺質に局所化する細菌タンパク質であってもよい。他の実施形態において、結合ポリペプチドは、哺乳動物タンパク質であってもよい。例えば、いくつかの実施形態において、結合ポリペプチドは、細胞表面受容体、サイトカイン、または成長因子であってもよい。
【０１９０】
いくつかの例では、ライブラリは、候補抗体バリアントをコードする複数の核酸を含んでもよく、各候補抗体バリアントは、参照抗体と比較して、１つ以上のアミノ酸残基変化（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、またはそれ以上）を含む。アミノ酸残基変化は、抗体の任意の位置、例えば、ＶＨ及び／またはＶＬ及び／または定常ドメインであってもよい。例えば、いくつかの例では、候補抗体バリアントは、ＶＨ及び／またはＶＬのＨＶＲ及び／またはＦＲ中に１つ以上のアミノ酸残基変化を含む。いくつかの例では、候補抗体バリアントは、ＶＨのＨＶＲ（例えば、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及び／もしくはＨＶＲ−Ｈ３）中、ならびに／またはＦＲ（例えば、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、及び／もしくはＦＲ−Ｈ４）中に１つ以上のアミノ酸残基変化を含む。いくつかの例では、候補抗体バリアントは、ＶＨのＨＶＲ（例えば、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及び／またはＨＶＲ−Ｈ３）中に１つ以上のアミノ酸残基変化を含む。いくつかの例では、候補抗体バリアントは、ＶＨのＦＲ（例えば、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、及び／またはＦＲ−Ｈ４）中に１つ以上のアミノ酸残基変化を含む。他の例では、候補抗体バリアントは、ＶＬのＨＶＲ（例えば、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及び／もしくはＨＶＲ−Ｌ３）ならびに／またはＦＲ（例えば、ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、及び／もしくはＦＲ−Ｌ４）中に１つ以上のアミノ酸残基変化を含む。いくつかの例では、候補抗体バリアントは、ＶＬのＨＶＲ（例えば、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及び／またはＨＶＲ−Ｌ３）中に１つ以上のアミノ酸残基変化を含む。いくつかの例では、候補抗体バリアントは、ＶＬのＦＲ（例えば、ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、及び／もしくはＦＲ−Ｌ４）中に１つ以上のアミノ酸残基変化を含む。アミノ酸残基変化は、表面に曝露された残基または埋もれた残基中のものであってもよい。
【０１９１】
いくつかの例では、ライブラリは、候補抗体バリアントをコードする複数の核酸を含んでもよく、各候補抗体バリアントは、参照抗体と比較して、ＶＨ及び／またはＶＬのＦＲ中に１つ以上のアミノ酸残基変化を含み、アミノ酸残基変化は、（ａ）参照抗体と同一の亜型を有する天然に存在する抗体において特定され、かつ／または（ｂ）埋もれると予想されるアミノ酸残基中にある。いくつかの例では、ライブラリは、候補抗体バリアントをコードする複数の核酸を含んでもよく、各候補抗体バリアントは、参照抗体と比較して、ＶＨ及び／またはＶＬのＦＲ中に１つ以上のアミノ酸残基変化を含み、アミノ酸残基変化は、（ａ）参照抗体と同一の亜型を有する天然に存在する抗体において特定され、かつ（ｂ）埋もれると予想されるアミノ酸残基中にある。いくつかの例では、各候補抗体バリアントは、参照抗体と比較して、１つのアミノ酸残基変化を含む。
【０１９２】
例えば、いくつかの例では、ライブラリは、候補抗体バリアントをコードする複数の核酸を含んでもよく、各候補抗体バリアントは、参照抗体と比較して、ＶＨのＦＲ（例えば、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、またはＦＲ−Ｈ４）中にアミノ酸残基変化を含み、アミノ酸残基変化は、（ａ）参照抗体と同一の亜型を有する天然に存在する抗体において特定され、かつ（ｂ）埋もれると予想されるアミノ酸残基中にある。他の例では、ライブラリは、候補抗体バリアントをコードする複数の核酸を含んでもよく、各候補抗体バリアントは、参照抗体と比較して、ＶＬのＦＲ（例えば、ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、またはＦＲ−Ｌ４）中にアミノ酸残基変化を含み、アミノ酸残基変化は、（ａ）参照抗体と同一の亜型を有する天然に存在する抗体において特定され、かつ（ｂ）埋もれると予想されるアミノ酸残基中にある。いくつかの例では、天然に存在する抗体におけるアミノ酸残基変化は、体細胞超変異によるものである。
【０１９３】
参照抗体と同一の亜型に属するＶＨ及び／またはＶＬを有する天然に存在する抗体は、抗体データベース、例えば、Ｋａｂａｔデータベース、ＩＭＧＴ（登録商標）（国際免疫遺伝学情報システム）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）、Ｖ  ＢＡＳＥ、または当該技術分野において既知である他のものに容易に見出すことができる。
【０１９４】
前述の実施形態のうちのいずれかにおいて、ライブラリは、約２個の結合ポリペプチド〜約１０１４個以上の結合ポリペプチド（例えば、約２〜約１０個、約２〜約２０個、約２〜約３０個、約２〜約４０個、約２〜約５０個、約２〜約６０個、約２〜約７０個、約２〜約７０個、約２〜約８０個、約２〜約１００個、約２〜約１０１４個、約２〜約１０１３個、約２〜約１０１２個、約２〜約１０１１個、約２〜約１０１０個、約２〜約１０９個、約２〜約１０８個、約２０〜約１０８個、約３０〜約１０８個、約４０〜約１０８個、約５０〜約１０８個、約６０〜約１０８個、約７０〜約１０８個、約８０〜約１０８個、約９０〜約１０８個、約１００〜約１０８個、約２００〜約１０８個の結合、約４００〜約１０８個、約６００〜約１０８個、約８００〜約１０８個、約１０３〜約１０８個、約１０４〜約１０８個、約１０５〜約１０８個約１０６〜約１０８個、または約１０７〜約１０８個の結合ポリペプチド）を含み得る。いくつかの例では、ライブラリは、約１０８個の結合ポリペプチドを含み得る。
【０１９５】
Ｃ．例示的な抗ＩＬ−１３抗体
本発明は、ＩＬ−１３に結合する単離された抗体を提供する。いくつかの例では、抗ＩＬ−１３抗体は、（ａ）ＡＹＳＶＮ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＭＩＷＧＤＧＫＩＶＹＮＳＡＬＫＳ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）ＤＧＹＹＰＹＡＭＤＮ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、または上記のＨＶＲのうちの１つ以上と、配列番号７〜９のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有する、そ（れら）の１つ以上のバリアントとの組み合わせから選択される、少なくとも１つ、２つ、または３つのＨＶＲを含み得る。
【０１９６】
いくつかの例では、抗ＩＬ−１３抗体は、１つ、２つ、３つ、または４つの以下の重鎖フレームワーク領域、つまり、（ａ）ＱＶＴＬＲＱＳＧＰＡＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳ（配列番号１８）、ＱＶＴＬＲＥＳＧＰＡＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＶＳＧＬＳＬＳ（配列番号１９）、ＱＶＴＬＲＱＳＧＰＡＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＶＳＧＬＳＬＳ（配列番号２０）、またはＱＶＴＬＲＥＳＧＰＡＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳ（配列番号２１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＲＬＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＧ（配列番号２３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＷＧＱＧＳＬＶＴＶＳＳ（配列番号２４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４とを更に含み得る。
【０１９７】
いくつかの例では、抗ＩＬ−１３抗体は、（ａ）ＲＡＳＫＳＶＤＳＹＧＮＳＦＭＨ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）ＬＡＳＮＬＥＳ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）ＱＱＮＮＥＤＰＲＴ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、または上記のＨＶＲのうちの１つ以上と、配列番号１０〜１２のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有する、そ（れら）の１つ以上のバリアントとの組み合わせから選択される、少なくとも１つ、２つ、または３つのＨＶＲを更に含み得る。
【０１９８】
いくつかの例では、抗ＩＬ−１３抗体は、１つ、２つ、３つ、または４つの以下の軽鎖フレームワーク領域、つまり、（ａ）ＤＩＶＬＴＱＳＰＤＳＬＳＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣ（配列番号１３）またはＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＳＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１と、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２と、（ｃ）ＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３と、（ｄ）ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４とを更に含み得る。
【０１９９】
いくつかの例では、抗ＩＬ−１３抗体は、（ａ）配列番号２〜５のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性）、またはその配列を有するアミノ酸配列を含む、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、（ｂ）配列番号１もしくは配列番号６と少なくとも９０％の配列（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性）、またはその配列を有するアミノ酸配列を含む、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、あるいは（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む。例えば、いくつかの例では、抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。いくつかの例では、抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。いくつかの例では、抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。いくつかの例では、抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。いくつかの例では、抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。いくつかの例では、抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。いくつかの例では、抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。いくつかの例では、抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。
【０２００】
本発明の更なる一態様において、上記の実施形態のうちのいずれかに従う抗ＩＬ−１３抗体は、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を含む、モノクローナル抗体である。一実施形態において、抗ＩＬ−１３抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、またはＦ（ａｂ’）２断片である。別の実施形態において、抗体は、全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１抗体、インタクトなＩｇＧ４抗体、または本明細書に定義される他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。別の実施形態において、抗体は、半抗体、例えば、ノブ・イントゥ・ホール半抗体である。ノブ・イントゥ・ホール技術の説明については、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい。
【０２０１】
更なる一態様において、上記の実施形態のうちのいずれかに従う抗ＩＬ−１３抗体は、以下の節１〜７に記載される特徴のうちのいずれかを、単独または組み合わせで組み込むことができる。
【０２０２】
１．抗体親和性
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、≦１ｐＭ、または≦０．１ｐＭの解離定数（ＫＤ）（例えば、１０−６Ｍ以下、例えば、１０−６Ｍ〜１０−９Ｍ以下、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ以下）を有する。
【０２０３】
一実施形態において、ＫＤは、放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。一実施形態において、ＲＩＡは、対象となる抗体のＦａｂバージョン及びその抗原によって実行される。例えば、抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、未標識抗原の一連の滴定の存在下で、Ｆａｂを最低濃度の（１２５Ｉ）標識された抗原と平衡化し、その後、抗Ｆａｂ抗体をコーティングしたプレートで結合した抗原を捕捉することによって測定される（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１，１９９９を参照されたい）。アッセイの条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）で一晩コーティングし、後続して室温（約２３℃）でＰＢＳ中２重量体積％のウシ血清アルブミンによって２〜５時間遮断する。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ番号２６９６２０）中、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］−抗原を、対象となるＦａｂの段階希釈（例えば、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９，１９９７における抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一貫）と混合する。その後、対象となるＦａｂを一晩インキュベートするが、しかしながら、インキュベーションをより長い期間（例えば、約６５時間）続けて、平衡に達することを確実にすることができる。その後、室温でのインキュベーション（例えば、１時間）のために混合物を捕捉プレートに移す。その後、この溶液を除去し、プレートをＰＢＳ中０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））で８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１ウェル当たり１５０μｌのシンチラント（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）、Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマ計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間計数する。２０％以下の最大結合をもたらす各Ｆａｂの濃度を、競合的結合アッセイで使用するために選択する。
【０２０４】
別の実施形態に従うと、ＫＤは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用するアッセイを、約１０応答単位（ＲＵ）の固定化された抗原ＣＭ５チップで、２５℃で実行する。一実施形態において、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、供給者の説明書に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍＬ（約０．２μＭ）まで希釈してから、５μＬ／分の流量で注入して、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリングしたタンパク質を得る。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基を遮断する。動態測定について、Ｆａｂの２倍段階希釈（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）界面活性剤を含むもの（ＰＢＳＴ）に、２５℃で、約２５μｌ／分の流速で注入する。会合速度（ｋオン）及び解離速度（ｋオフ）を、単純な一対一のラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、会合センサーグラムと解離センサーグラムとを同時に当てはめることによって計算する。平衡解離定数（ＫＤ）を、ｋオフ／ｋオンの比率として計算する。例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１，１９９９を参照されたい）。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによるオン速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、オン速度は、ストップトフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、または撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定される、増加する抗原濃度の存在下で、２５℃で、ＰＢＳ中２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）（ｐＨ７．２）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）の増加または低下を測定する蛍光消光技術を使用することによって決定することができる。
【０２０５】
２．抗体断片
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、ならびに以下に記載される他の断片が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたく、ＷＯ９３／１６１８５、ならびに米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号もまた参照されたい。エピトープ残基に結合し、増加したインビボ半減期を有するサルベージ受容体を含むＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の考察については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。
【０２０６】
ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ１９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４，２００３、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８，１９９３を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディはまた、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４，２００３にも記載される。
【０２０７】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部分または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部分を含む、抗体断片である。ある特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照されたい）。
【０２０８】
抗体断片は、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク質消化及び組み換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）による産生を含むが、これらに限定されない、様々な技術によって作製することができる。
【０２０９】
３．キメラ抗体及びヒト化抗体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５，１９８４）に記載される。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または非ヒト霊長類（サルなど）に由来する可変領域）と、ヒト定常領域とを含む。更なる一例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変化している「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、それらの抗原結合断片を含む。
【０２１０】
ある特定の実施形態において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減しながら、親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持するようにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ（またはそれらの部分）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（またはそれらの部分）がヒト抗体配列に由来する、１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部分も含むであろう。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体におけるいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）に由来する対応する残基で置換される。
【０２１１】
ヒト化抗体及びそれらを作製する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３，２００８に概説され、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９，１９８８、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３，１９８９、米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５−３４，２００５（特異性決定領域（ＳＤＲ）移植を記載）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８，１９９１（「リサーフェシング」を記載）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：４３−６０，２００５（「ＦＲシャッフリング」を記載）、ならびにＯｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６１−６８，２００５及びＫｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０，２０００（ＦＲシャッフリングに対する「誘導選択」アプローチを記載）に更に記載される。
【０２１２】
ヒト化に使用することができるヒトフレームワーク領域としては、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６，１９９３を参照されたい）、軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５，１９９２、及びＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３，１９９３を参照されたい）、ヒト成熟（体細胞変異型）フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３，２００８を参照されたい）、ならびにＦＲライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４，１９９７及びＲｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８，１９９６を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１３】
４．ヒト抗体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野において既知である様々な技術を使用して産生することができる。ヒト抗体は一般に、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４，２００１及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９，２００８に記載される。
【０２１４】
ヒト抗体は、抗原投与に応答してインタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように修飾されている遺伝子導入動物に免疫原を投与することによって、調製することができる。そのような動物は典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、または染色体外に存在するか、もしくは動物の染色体にランダムに統合されるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部分を含有する。そのような遺伝子導入マウスにおいて、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般に、不活性化されている。遺伝子導入動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−１１２５，２００５を参照されたい。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載する、米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号、ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術を記載する、米国特許第５，７７０，４２９号、Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する、米国特許第７，０４１，８７０号、ならびにＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する、米国特許出願公開第ＵＳ２００７／００６１９００号もまた、参照されたい。そのような動物によって生成されたインタクトな抗体に由来するヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって更に修飾されてもよい。
【０２１５】
ヒト抗体はまた、ハイブリドーマに基づく方法によっても作製することができる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が、記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１，１９８４、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）、及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６，１９９１を参照されたい）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体はまた、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２，２００６にも記載される。追加の方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載する）及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８，２００６（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載）に記載されるものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２０（３）：９２７−９３７，２００５及びＶｏｌｌｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２７（３）：１８５−９１，２００５にも記載される。
【０２１６】
ヒト抗体はまた、ヒト由来ファージ提示ライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても、生成することができる。その後、そのような可変ドメイン配列は、所望されるヒト定常ドメインと組み合わされ得る。抗体ライブラリからヒト抗体を選択するための技術が、以下に記載される。
【０２１７】
５．ライブラリ由来抗体
本発明の抗体は、コンビナトリアルライブラリを、所望される活性（複数可）を有する抗体についてスクリーニングすることによって、単離することができる。例えば、ファージ提示ライブラリを生成し、そのようなライブラリを、所望される結合特性を持つ抗体についてスクリーニングするための様々な方法が、当該技術分野において既知である。そのような方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に概説され、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４，１９９０、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８，１９９１、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７，１９９２、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）、Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０，２００４、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３，２００４、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２，２００４、及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２，２００４に更に記載される。
【０２１８】
ある特定のファージ提示法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個にクローニングされ、ファージライブラリ内でランダムに組み換えられ、その後、これは、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５，１９９４に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングされ得る。ファージは典型的には、抗体断片を一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片またはＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫化源に由来するライブラリは、ハイブリドーマの構築を必要とすることなく、免疫原に高親和性抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４，１９９３に記載されるように、ナイーブレパートリーが（例えば、ヒトから）クローニングされて、いかなる免疫化もなく幅広い非自己抗原及びまた自己抗原に対する抗体の単一源を提供することができる。最後に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８，１９９２によって記載されるように、ナイーブライブラリはまた、幹細胞から再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して、高度可変ＨＶＲ３領域をコードし、かつインビトロでの再配列を達成することによって合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリについて記載する特許公報としては、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、及び同第２００９／０００２３６０号が挙げられる。
【０２１９】
ヒト抗体ライブラリから単離された抗体または抗体断片は、本明細書においてヒト抗体またはヒト抗体断片と見なされる。
【０２２０】
６．多重特異性抗体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製され得る。
【０２２１】
多重特異性抗体を作製するための技術としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組み換え同時発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７，１９８３、ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５，１９９１を参照されたい）、ならびに「ノブ・イン・ホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、静電ステアリング効果を操作して、抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を作製すること（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）、２つ以上の抗体または断片を架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１，１９８５）を参照されたい）、ロイシンジッパーを使用して、二重特異性抗体を産生すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３，１９９２を参照されたい）、「ダイアボディ」技術を使用して、二重特異性抗体断片を作製すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８，１９９３）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８，１９９４）、ならびに例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０，１９９１に記載される三重特異性抗体を調製することによっても作製することができる。
【０２２２】
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体もまた、本明細書に含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照されたい）。
【０２２３】
本明細書の抗体または断片はまた、ＩＬ−１３またはＶＥＧＦ、及び別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用Ｆａｂ」または「ＤＡＦ」も含む（例えば、ＵＳ２００８／００６９８２０を参照されたい）。
【０２２４】
７．抗体バリアント
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましくあり得る。抗体のアミノ酸配列バリアントは、その抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製することができる。そのような修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列中の残基からの欠失、及び／またはそれへの挿入、及び／またはその置換が挙げられる。最終構築物に到達するために、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが作製され得るが、但し、最終構築物が所望される特徴、例えば、抗原結合、発現、及び／または安定性を持つことを条件とする。
【０２２５】
ａ）置換、挿入、及び欠失バリアント
ある特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。置換型変異原性の対象となる部位としては、ＨＶＲ及びＦＲが挙げられる。保存的置換が「好ましい置換」という表題の下、表１に示される。より実質的な変化が「例示的な置換」という表題の下、表１に示され、これはアミノ酸側鎖クラスを参照して以下に更に記載される通りである。アミノ酸置換が対象となる抗体に導入され、産物が所望される活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣの改善についてスクリーニングされ得る。
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アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従ってグループ化され得る。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０２２６】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのあるメンバーと別のクラスとの交換を必要とするだろう。
【０２２７】
置換バリアントの一種は、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、更なる研究ために選択される結果として生じるバリアント（複数可）は、親抗体と比較して、ある特定の生物学的特性の修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低減）を有し、かつ／または実質的に保持された親抗体の特定の生物学的特性を有するであろう。例示的な置換型バリアントは、親和性成熟抗体であり、これは、例えば、本明細書に記載されるものなどのファージ提示に基づく親和性成熟技術を使用して、簡便に生成することができる。簡潔に述べると、１つ以上のＨＶＲ残基は変異され、バリアント抗体がファージ上に提示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）に対してスクリーニングされる。
【０２２８】
変化（例えば、置換）がＨＶＲ中で行われて、例えば、抗体親和性を改善することができる。そのような変化が、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされた残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９−１９６，２００８を参照されたい）及び／または抗原に接触する残基中で行われてもよく、結果として生じるバリアントＶＨまたはＶＬが、結合親和性について試験される。二次ライブラリの構築及びそれからの再選択による親和性成熟については、例えば、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態において、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指向変異原性）のうちのいずれかによって、多様性が、成熟について選択された可変遺伝子に導入される。その後、二次ライブラリが作製される。その後、所望される親和性を有するあらゆる抗体バリアントを特定するために、ライブラリがスクリーニングされる。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６個の残基）がランダム化される、ＨＶＲ指向アプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニン走査変異誘発またはモデル化を使用して、特異的に特定することができる。特に、ＨＶＲ−Ｈ３及びＨＶＲ−Ｌ３がしばしば標的とされる。
【０２２９】
ある特定の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減しない限り、１つ以上のＨＶＲ中で生じてもよい。例えば、結合親和性を実質的に低減しない保存的変化（例えば、本明細書に提供される保存的置換）が、ＨＶＲ中で行われてもよい。そのような変化は、例えば、ＨＶＲ中の抗原に接触する残基の外部であってもよい。上記に提供されるバリアントＶＨ配列及びＶＬ配列のある特定の実施形態において、各ＨＶＲは、変更されないか、または１つ、２つ、もしくは３つ以下のアミノ酸置換を含有するかのいずれかである。
【０２３０】
変異原性のための標的とされ得る抗体の残基または領域を特定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５，１９８９に記載される、「アラニンスキャニング変異原性」と呼ばれるものである。この方法において、残基または標的残基の群（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕなどの荷電残基）を特定し、それ（ら）を中性または負電荷のアミノ酸（例えば、Ａｌａまたはポリアラニン）によって置換して、抗体と抗原との相互作用が影響されるかどうかを決定する。更なる置換が、最初の置換に対する機能感受性を示すアミノ酸位置に導入され得る。あるいは、または加えて、抗体と抗原との間の接触点を特定するための抗原−抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされても、排除されてもよい。バリアントをスクリーニングして、それらが所望される特性を含有するかどうかを決定することができる。
【０２３１】
アミノ酸配列挿入としては、１残基長から、１００以上の残基長の範囲を含有するポリペプチドの範囲であるアミノ末端及び／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入型バリアントとしては、抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのため）またはポリペプチドに対する抗体のＮ末端またはＣ末端への融合が挙げられる。
【０２３２】
ｂ）グリコシル化バリアント
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または低下させるように変更される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作製または除去されるようにアミノ酸配列を変更することによって、簡便に達成することができる。
【０２３３】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合された炭水化物が変更され得る。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は典型的には、一般にＮ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６−３２，１９９７を参照されたい。オリゴ糖としては、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖類構造の「幹」においてＧｌｃＮＡｃに結合されたフコースを挙げることができる。いくつかの実施形態において、ある特定の改善された特性を有する抗体バリアントを作製するために、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾が行われ得る。
【０２３４】
一実施形態において、Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）結合されたフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体バリアントが提供される。例えば、そのような抗体中のフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％または２０％〜４０％であり得る。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載されるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定される、Ａｓｎ２９７に結合された全ての糖構造（例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）の合計に対する、Ａｓｎ２９７での糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７とは、Ｆｃ領域内の位置約２９７（Ｆｃ領域残基のＥｕ付番）に位置するアスパラギン残基を指すが、しかしながら、Ａｓｎ２９７はまた、抗体内のわずかな配列変化のため、位置２９７から約±３アミノ酸上流または下流に、すなわち、位置２９４と位置３００との間にも位置し得る。そのようなフコシル化バリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許公開第２００３／０１５７１０８号及び同第２００４／００９３６２１号を参照されたい。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体バリアントに関する公報の例としては、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、ＷＯ２００２／０３１１４０、Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９，２００４、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４，２００４が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５，１９８６、ＵＳ２００３／０１５７１０８、及びＷＯ２００４／０５６３１２Ａ１、特に実施例１１）、ならびにアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞株（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４，２００４、Ｋａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９４（４）：６８０−６８８，２００６、及びＷＯ２００３／０８５１０７）が挙げられる。
【０２３５】
例えば、抗体のＦｃ領域に結合された二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分される、二分オリゴ糖を有する抗体バリアントが、更に提供される。そのような抗体バリアントは、低減されたフコシル化及び／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。そのような抗体バリアントの例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８、米国特許第６，６０２，６８４号、及びＵＳ２００５／０１２３５４６に記載される。Ｆｃ領域に結合されたオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体バリアントもまた、提供される。そのような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。そのような抗体バリアントは、ＷＯ１９９７／３００８７、ＷＯ１９９８／５８９６４、及びＷＯ１９９９／２２７６４に記載される。
【０２３６】
ｃ）Ｆｃ領域バリアント
ある特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸修飾が本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それにより、Ｆｃ領域バリアントが生成され得る。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。
【０２３７】
ある特定の実施形態において、本発明は、いくつかではあるが全てではないエフェクター機能を持つことにより、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、ある特定のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣなど）が不要または有害である用途に望ましい候補となる、抗体バリアントを企図する。インビトロ及び／またはインビボ細胞毒性アッセイを行って、ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（故にＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞がＦｃ（ＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球はＦｃ（ＲＩ、Ｆｃ（ＲＩＩ及びＦｃ（ＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２，１９９１の４６４頁の表３にまとめられている。対象となる分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７０５９−７０６３，１９８６及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１４９９−１５０２，１９８５を参照されたい、米国特許第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１，１９８７を参照されたい）に記載される。あるいは、非放射性アッセイ方法が用いられ得る（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞毒性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ、及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照されたい。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、または加えて、対象となる分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６，１９９８に開示されるものなどの動物モデルにおいて、評価され得る。Ｃ１ｑ結合アッセイもまた実行して、抗体がＣ１ｑに結合することができず、故にＣＤＣ活性を欠くことを確認することができる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実行してもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３，１９９６、Ｃｒａｇｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−１０５２，２００３、及びＣｒａｇｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−２７４３，２００４を参照されたい）。当該技術分野において既知である方法を使用して、ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期の決定を実行することもできる（例えば、Ｐ���ｔｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９，２００６を参照されたい）。
【０２３８】
低減されたエフェクター機能を有する抗体としては、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの１つ以上の置換を有する抗体が挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ変異体としては、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうちの２つ以上で置換を有するＦｃ変異体（例えば、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む）が挙げられる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０２３９】
ＦｃＲへの改善または減少された結合を有する特定の抗体バリアントが記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、ＷＯ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４，２００１を参照されたい）。
【０２４０】
ある特定の実施形態において、抗体バリアントは、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／または３３４（残基のＥＵ付番）での置換を有するＦｃ領域を含む。
【０２４１】
いくつかの実施形態において、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４，２０００に記載される、変更された（すなわち、改善または減少のいずれかがされた）Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）をもたらす変化が、Ｆｃ領域内で行われる。
【０２４２】
増加した半減期を有し、かつ母体ＩｇＧの胎児への転移を担う（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７，１９７６及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９，１９９４）胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する改善された結合を有する抗体が、ＵＳ２００５／００１４９３４に記載されている。それらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つ以上の置換を有するＦｃ領域をそこに含む。そのようなＦｃバリアントは、Ｆｃ領域残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４または４３４のうちの１つ以上での置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換（米国特許第７，３７１，８２６号）を有するものを含む。
【０２４３】
Ｆｃ領域バリアントの他の例に関する、Ｄｕｎｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０，１９８８、米国特許第５，６４８，２６０号及び同第５，６２４，８２１号、ならびにＷＯ９４／２９３５１もまた、参照されたい。
【０２４４】
ｄ）システイン操作された抗体バリアント
ある特定の実施形態において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作された抗体、例えば、「チオＭＡｂ」を作製することが望ましくあり得る。ある特定の実施形態において、置換された残基は、抗体の接触可能部位において生じる。それらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基がそれにより抗体の接触可能部位に配置され、それらを使用して、薬物部分またはリンカー−薬物部分などの他の部分に抗体を複合体化して、本明細書に更に記載される免疫複合体を作製することができる。ある特定の実施形態において、以下の残基のうちのいずれか１つ以上が、システインで置換され得る。軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ付番）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ付番）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ付番）。システイン操作された抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように生成することができる。
【０２４５】
ｅ）抗体誘導体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、当該技術分野において既知であり、かつ容易に入手可能な、追加の非タンパク質性部分を含有するように更に修飾されてもよい。抗体の誘導体化に好適な部分としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量のものであり得、分岐状または非分岐状であり得る。抗体に結合されたポリマーの数は変化し得、２つ以上のポリマーが結合される場合、それらは同一の分子であっても異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／または種類は、改善される抗体の具体的な特性または機能、抗体の誘導体が定義される条件下で療法において使用されるかなどを含むが、これらに限定されない、考慮に基づいて決定され得る。
【０２４６】
別の実施形態において、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る、抗体及び非タンパク質性部分の複合体が提供される。一実施形態において、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１１６００−１１６０５，２００５）。放射線は、任意の波長のものであってもよく、通常の細胞には害がないが、非タンパク質性部分を、抗体−非タンパク質性部分に近位の細胞を殺滅する温度まで加熱する波長を含むが、これらに限定されない。
【０２４７】
Ｄ．組み換え方法及び組成物
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される組み換え方法及び組成物を使用して産生され得る。一実施形態において、本明細書に記載される抗ＩＬ−１３抗体をコードする単離された核酸が提供される。別の実施形態において、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体をコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／または抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／または重鎖）をコードし得る。更なる一実施形態において、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる一実施形態において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一実施形態において、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、それらで形質転換されている）。一実施形態において、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、２９３細胞、またはリンパ球系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態において、抗ＩＬ−１３抗体を作製する方法が提供され、本方法は、上記に提供される抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、その抗体の発現に好適な条件下で培養することと、任意で、抗体を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することとを含む。
【０２４８】
抗ＩＬ−１３抗体または抗ＶＥＧＦ抗体の組み換え産生について、例えば、上述の抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞中での更なるクローニング及び／または発現のために、１つ以上のベクターに挿入される。そのような核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離され、配列決定され得る。
【０２４９】
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現のための好適な宿主細胞は、本明細書に記載される原核生物細胞または真核細胞を含む。例えば、抗体は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合に、細菌内で産生され得る。細菌内での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、及び同第５，８４０，５２３号を参照されたい。（Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗体断片の発現を記載する、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５−２５４もまた参照されたい）。発現後、抗体は、可溶性画分中で細菌細胞ペーストから単離されてもよく、更に精製されてもよい。
【０２５０】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、抗体をコードするベクターに好適なクローニングまたは発現宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす、真菌及び酵母株を含む。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４，２００４及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５，２００６を参照されたい。
【０２５１】
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも導出される。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて使用され得る、多数のバキュロウイルス株が特定されている。
【０２５２】
植物細胞培養物もまた、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（遺伝子導入植物中で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載する）を参照されたい。
【０２５３】
脊椎動物細胞もまた、宿主として使用することができる。例えば、懸濁液中で成長するように適合される哺乳動物細胞株が、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）、ヒト胚性腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９，１９７７に記載される、２９３または２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ  Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１，１９８０に記載される、ＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、例えば、Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８，１９８２に記載される、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ−チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６，１９８０）を含む、ＣＨＯ細胞、ならびにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体産生に好適なある特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５−２６８，２００３を参照されたい。
【０２５４】
Ｅ．アッセイ
本明細書に記載される抗体（例えば、抗ＩＬ−１３抗体または抗ＶＥＧＦ抗体）のいずれも、当該技術分野において既知である様々なアッセイによって、それらの物理的／化学的特性及び／または生物学的活性について特定され、スクリーニングされ、または特徴付けられ得る。
【０２５５】
１．結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様において、本明細書に記載される抗体（例えば、抗ＩＬ−１３抗体または抗ＶＥＧＦ抗体）のいずれも、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどの既知の方法によって、その抗原結合活性について試験される。
【０２５６】
別の態様において、競合アッセイを使用して、本発明の抗ＩＬ−１３抗体とＩＬ−１３への結合について競合する抗体を特定することができる。別の態様において、競合アッセイを使用して、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体とＶＥＧＦへの結合について競合する抗体を特定することができる。ある特定の実施形態において、そのような競合抗体は、本発明の抗ＩＬ−１３抗体が結合するものと同一のエピトープ（例えば、線状または立体構造のエピトープ）に結合する。ある特定の実施形態において、そのような競合抗体は、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体が結合するものと同一のエピトープ（例えば、線状または立体構造のエピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための例示的な方法の詳細は、Ｍｏｒｒｉｓ“Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），１９９６に提供される。
【０２５７】
例示的な競合アッセイにおいて、固定化されたＩＬ−１３が、ＩＬ−１３に結合する第１の標識された抗体と、第１の抗体とＩＬ−１３への結合について競合するその能力について試験されている第２の未標識抗体とを含む溶液中で、インキュベートされる。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化されたＩＬ−１３が、第１の標識された抗体は含むが第２の未標識抗体は含まない溶液中でインキュベートされる。ＩＬ−１３への第１の抗体の結合を許容する条件下でのインキュベーション後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化されたＩＬ−１３に会合した標識の量が測定される。固定化されたＩＬ−１３に会合した標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に低減される場合、それは、第２の抗体が第１の抗体とＩＬ−１３への結合について競合していることを示す。Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ），１９８８を参照されたい。
【０２５８】
別の例示的な競合アッセイにおいて、固定化されたＶＥＧＦが、ＶＥＧＦに結合する第１の標識された抗体と、第１の抗体とＶＥＧＦへの結合について競合するその能力について試験されている第２の未標識抗体とを含む溶液中で、インキュベートされる。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化されたＶＥＧＦが、第１の標識された抗体は含むが第２の未標識抗体は含まない溶液中でインキュベートされる。ＶＥＧＦへの第１の抗体の結合を許容する条件下でのインキュベーション後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化されたＶＥＧＦに会合した標識の量が測定される。固定化されたＶＥＧＦに会合した標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に低減される場合、それは、第２の抗体が第１の抗体とＶＥＧＦへの結合について競合していることを示す。
【０２５９】
２．活性アッセイ
一態様において、生物学的活性を有するその抗ＩＬ−１３抗体を特定するためのアッセイが提供される。生物学的活性は、例えば、インビボ、インビトロ（例えば、細菌の周辺質内に提示される）、またはエキソビボのいずれかでの、ＩＬ−１３（例えば、血流中のＩＬ−１３）またはそのペプチド断片への結合を含み得る。他の実施形態において、生物学的活性は、ＩＬ−１３の遮断もしくは中和、またはリガンド、例えば、受容体（例えば、インターロイキン−１３受容体）へのＩＬ−１３の結合の防止を含み得る。インビボ及び／またはインビトロでそのような生物学的活性を有する抗体もまた、提供される。ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、そのような生物学的活性について試験される。
【０２６０】
別の態様において、生物学的活性を有するその抗ＶＥＧＦ抗体を特定するためのアッセイが提供される。生物学的活性は、例えば、インビボ、インビトロ（例えば、細菌の周辺質内に提示される）、またはエキソビボのいずれかでの、ＶＥＧＦ（例えば、血流中のＶＥＧＦ）またはそのペプチド断片への結合を含み得る。他の実施形態において、生物学的活性は、ＶＥＧＦの遮断もしくは中和、またはリガンド、例えば、受容体（例えば、Ｔｉｅ２、ＫＤＲ、及び／またはＦｌｔ−１）へのＶＥＧＦの結合の防止を含み得る。インビボ及び／またはインビトロでそのような生物学的活性を有する抗体もまた、提供される。ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、そのような生物学的活性について試験される。
【０２６１】
Ｆ．免疫複合体
本発明はまた、化学療法剤もしくは化学療法薬、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはそれらの断片）、または放射性同位元素などの１つ以上の細胞毒性剤に複合体化された、本明細書に記載される抗体（例えば、抗ＩＬ−１３抗体または抗ＶＥＧＦ抗体）のいずれかを含む、免疫複合体も提供する。
【０２６２】
一実施形態において、免疫複合体は、マイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号、及び欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂ１号を参照されたい）；モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）などのオーリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号及び同第５，７８０，５８８号、及び同第７，４９８，２９８号を参照されたい）；ドラスタチン；カリケアマイシンまたはその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号、及び同第５，８７７，２９６、Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２，１９９３、及びＬｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２５−２９２８，１９９８を参照されたい）；ダウノマイシンまたはドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Ｋｒａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：４７７−５２３，２００６、Ｊｅｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １６：３５８−３６２，２００６、Ｔｏｒｇｏｖ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１６：７１７−７２１，２００５、Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：８２９−８３４，２０００、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２：１５２９−１５３２，２００２、Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６−４３４３，２００２、及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照されたい）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなどのタキサン；トリコテセン；ならびにＣＣ１０６５を含むが、これらに限定されない、抗体が１つ以上の薬物に複合体化される、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）である。
【０２６３】
別の実施形態において、免疫複合体は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンシンタンパク質、ファイトラカアメリカナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリアオフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、ならびにトリコテセンを含むが、これらに限定されない、酵素活性毒素またはその断片に複合体化される、本明細書に記載される抗体を含む。
【０２６４】
別の実施形態において、免疫複合体は、放射性原子に複合体化されて放射性複合体を形成する、本明細書に記載される抗体を含む。様々な放射性同位元素が、放射性複合体の産生のために利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位元素が挙げられる。放射性複合体が検出に使用される場合、それは、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えば、テクネチウム−９９ｍ（ｔｃ９９ｍ）もしくはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）撮像（磁気共鳴撮像ｍｒｉとしても知られる）のためのスピン標識（ここでもヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンもしくは鉄など）を含み得る。
【０２６５】
抗体と細胞毒性剤との複合体は、Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）、サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣｌなど）、活性エステル（スベリン酸ジサクシニミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８，１９８７に記載されるように調製することができる。炭素−１４で標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレンアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体に複合体化するための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞内での細胞毒性薬の放出を促進する「切断可能リンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（例えば、Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１２７−１３１，１９９２、米国特許第５，２０８，０２０号を参照されたい）が使用され得る。
【０２６６】
本明細書のイムヌオ複合体（ｉｍｍｕｎｕｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）またはＡＤＣは、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ならびに（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａから）市販されているＳＶＳＢ（サクシニミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むが、これらに限定されない、架橋剤試薬で調製される複合体を明示的に企図するが、これらに限定されない。
【０２６７】
Ｇ．診断及び検出のための方法及び組成物
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗ＩＬ−１３抗体のうちのいずれも、生体試料中のＩＬ−１３の存在を検出するのに有用である。本明細書で使用される場合、「検出すること」という用語は、定量的または定性的検出を包含する。ある特定の実施形態において、生体試料は、２型Ｔヘルパー（Ｔｈ２）細胞、マスト細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、及び非造血細胞（平滑筋細胞、上皮細胞、内皮細胞、もしくは線維芽細胞を含む）などの細胞または組織を含む。
【０２６８】
一実施形態において、診断または検出の方法において使用するための抗ＩＬ−１３抗体が提供される。更なる一態様において、生体試料中のＩＬ−１３の存在を検出する方法が提供される。ある特定の実施形態において、本方法は、生体試料と本明細書に記載される抗ＩＬ−１３抗体とを、抗ＩＬ−１３抗体とＩＬ−１３との結合を許容する条件下で接触させること、及び抗ＩＬ−１３抗体とＩＬ−１３との間に複合体が形成されたかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロまたはインビボの方法であり得る。一実施形態において、例えば、ＩＬ−１３が患者の選択のためのバイオマーカーである場合に、抗ＩＬ−１３抗体による療法に適した対象を選択するために、抗ＩＬ−１３抗体が使用される。
【０２６９】
本発明の抗ＩＬ−１３を使用して診断され得る例示的な障害は、ＩＬ−１３媒介性障害またはＩｇＥ媒介性障害を含む。いくつかの例では、ＩＬ−１３媒介性障害は、例えば、アレルギー、喘息（例えば、アレルギー性喘息、アトピー喘息、重症喘息、及び非アレルギー性（内因性）喘息）、自己免疫性疾患（例えば、乾癬、リウマチ性関節炎、若年性関節リウマチ、ならびに炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎及びクローン病）、炎症性疾患、アレルギー性鼻炎（季節性アレルギー性鼻炎を含む）、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、湿疹、蕁麻疹、食物アレルギー、食物過敏症、腹腔疾患、免疫媒介性皮膚疾患（例えば、水疱性皮膚症、多形紅斑、接触性皮膚炎）、強皮症、線維症、肝線維症、心内膜心筋線維症、慢性気管支炎、気管支拡張症、特発性間質性肺炎、杯細胞化生、肺炎症障害、炎症性及び線維性肺疾患（例えば、嚢胞性線維症、特発性肺線維症、及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））、グルテン過敏性腸症、ウィップル病、肺の免疫疾患（例えば、好酸球性肺炎（慢性好酸球性肺炎を含む）、特発性肺線維症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、及び過敏性肺炎）、チャーグ・ストラウス症候群（結節性動脈周囲炎に加えてアトピー）、好酸球性筋肉痛症候群、好酸球増加症候群、浮腫反応（例えば、偶発性血管浮腫、好酸球性食道炎、好酸球性胃炎、好酸球胃腸炎、好酸球性腸炎及び好酸球大腸炎）、鼻マイクロポリープ症及びポリープ症、ＲＳＶ感染症、ブドウ膜炎、骨粗鬆症、ならびにＩＬ−１３の異常な発現に関連付けられる癌及び腫瘍を含む悪性腫瘍（例えば、ホジキンリンパ腫）である。いくつかの実施形態において、障害は、アレルギー性喘息、非アレルギー性（内因性）喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、湿疹、蕁麻疹、食物アレルギー、慢性閉塞性肺疾患、潰瘍性大腸炎、ＲＳＶ感染症、ブドウ膜炎、強皮症、または骨粗鬆症である。いくつかの例では、ＩｇＥ媒介性障害は、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、蕁麻疹、アナフィラキシー、またはアトピー性皮膚炎である。
【０２７０】
ある特定の実施形態において、本発明は、ＶＥＧＦに関連する障害（例えば、ＶＥＧＦの増加した発現）を診断する方法を提供する。ある特定の実施形態において、本方法は、試験細胞を本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体と接触させることと、ＶＥＧＦへの抗ＶＥＧＦ抗体の結合を検出することによって、試験細胞によるＶＥＧＦの発現のレベルを（定量的または定性的のいずれかで）決定することと、試験細胞によるＶＥＧＦの発現のレベルを、対照細胞（例えば、試験細胞と同一の組織を起源とする正常な細胞、またはそのような正常な細胞に匹敵するレベルでＶＥＧＦを発現する細胞）によるＶＥＧＦの発現のレベルと比較することとを含み、対照細胞と比較して、試験細胞によるより高いレベルのＶＥＧＦの発現は、ＶＥＧＦの増加した発現に関連する障害の存在を示す。ある特定の実施形態において、試験細胞は、ＶＥＧＦの増加した発現に関連する障害を有することが疑われる個体から得られる。ある特定の実施形態において、この障害は、腫瘍、癌、及び／または細胞増殖性障害である。
【０２７１】
本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体を使用して診断することができる例示的な障害としては、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、消化管癌、消化管間質腫瘍、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）または腎癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌及び様々な種類の頭頸部癌、黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫、結節型黒色腫、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞性白血病；慢性骨髄芽球性白血病；移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、母斑症に関連する異常な血管増殖、脳腫瘍に関連する浮腫、及びメグス症候群が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７２】
別の態様において、本発明は、生体試料中のＶＥＧＦの存在を検出する方法を提供する。ある特定の実施形態において、本方法は、生体試料と抗ＶＥＧＦ抗体とを、抗ＶＥＧＦ抗体とＶＥＧＦとの結合を許容する条件下で接触させること、及び抗ＶＥＧＦ抗体とＶＥＧＦとの間に複合体が形成されたかどうかを検出することを含む。
【０２７３】
抗ＶＥＧＦ抗体を使用して、いくつかの周知の検出アッセイ方法のうちのいずれか１つでＶＥＧＦを検出することができる。例えば、所望される源から試料を得、試料を抗ＶＥＧＦ抗体と混合して抗体が混合物中に存在する任意のＶＥＧＦと抗体／ＶＥＧＦ複合体を形成することを可能にし、混合物中に存在するあらゆる抗体／ＶＥＧＦ複合体を検出することによって、生体試料を、ＶＥＧＦについてアッセイすることができる。特定の試料に好適な、当該技術分野において既知である方法によって、生体試料をアッセイのために調製することができる。試料を抗体と混合する方法及び抗体／ＶＥＧＦ複合体を検出する方法は、使用されるアッセイの種類に従って選択される。
【０２７４】
標識された抗ＩＬ−１３または抗ＶＥＧＦ抗体が、本明細書に記載される。標識としては、直接的に検出される標識または部分（蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、及び放射性標識など）、ならびに例えば、酵素反応または分子相互作用を通して非間接的に検出される酵素またはリガンドなどの部分が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な標識としては、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア（希土類キレートまたはフルオレセイン及びその誘導体など）、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルセリフェラーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅ）、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化する酵素（ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼなど）とカップリングした複素環オキシダーゼ（ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなど）、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、ならびに安定フリーラジカルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７５】
Ｈ．医薬製剤
本明細書に記載される抗体（例えば、抗ＩＬ−１３または抗ＶＥＧＦ抗体）のいずれかの医薬製剤は、所望される程度の純度を有するそのような抗体を、１つ以上の任意の薬学的に許容される担体（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．，１９８０を参照されたい）と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製される。薬学的に許容される担体は一般に、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに無毒であり、それらには、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０個未満の残基）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む）；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびに／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質などの介在性薬物分散剤を更に含む。ｒＨｕＰＨ２０を含むある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法が、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載される。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
【０２７６】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載される。水溶性抗体製剤としては、米国特許第６，１７１，５８６号及びＷＯ２００６／０４４９０８に記載されるものが挙げられ、後者の製剤は、ヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０２７７】
本明細書の組成物はまた、治療される特定の適応症に必要な２つ以上の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を与えない相補的活性を有するものも含有し得る。例えば、追加の治療剤（例えば、本明細書上記に引用されるものなどの、化学療法剤、細胞毒性剤、成長阻害剤、及び／または抗ホルモン剤）を更に提供することが望ましくあり得る。そのような活性成分は、意図される目的に有効な量で、組み合わせで好適に存在する。
【０２７８】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中に、またはマクロエマルジョン中に封入され得る。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．，１９８０に開示される。
【０２７９】
徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の好適な例としては、本抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、これらのマトリックスは、成形物品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。
【０２８０】
インビボ投与に使用される製剤は一般に、無菌のものである。無菌性は、例えば、無菌濾過膜を通した濾過によって、容易に達成することができる。
【０２８１】
Ｉ．治療方法及び組成物
本明細書に記載される抗体（例えば、抗ＩＬ−１３または抗ＶＥＧＦ抗体）のうちのいずれも、治療方法に使用することができる。
【０２８２】
一態様において、医薬品として使用するための抗ＩＬ−１３抗体が提供される。更なる態様において、ＩＬ−１３媒介性障害の治療に使用するための抗ＩＬ−１３抗体が提供される。ある特定の実施形態において、治療方法において使用するための抗ＩＬ−１３抗体が提供される。ある特定の実施形態において、本発明は、ＩＬ−１３媒介性障害を有する個体を治療する方法であって、有効量の抗ＩＬ−１３抗体を個体に投与することを含む、方法において使用するための抗ＩＬ−１３抗体を提供する。そのような一実施形態において、本方法は、例えば、以下に記載される有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。上記の実施形態のうちのいずれかに従う「個体」は、好ましくはヒトである。
【０２８３】
更なる一態様において、本発明は、医薬品の製造または調製における抗ＩＬ−１３抗体の使用を提供する。一実施形態において、医薬品は、ＩＬ−１３媒介性障害の治療のためのものである。更なる一実施形態において、医薬品は、ＩＬ−１３媒介性障害を治療する方法であって、ＩＬ−１３媒介性障害を有する個体に有効量の医薬品を投与することを含む、方法において使用するためのものである。そのような一実施形態において、本方法は、例えば、以下に記載される有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。上記の実施形態のうちのいずれかに従う「個体」は、好ましくはヒトであり得る。
【０２８４】
更なる一態様において、本発明は、例えば、アレルギー、喘息（例えば、アレルギー性喘息、アトピー喘息、重症喘息、及び非アレルギー性（内因性）喘息）、自己免疫性疾患（例えば、乾癬、リウマチ性関節炎、若年性関節リウマチ、ならびに炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎及びクローン病）、炎症性疾患、アレルギー性鼻炎（季節性アレルギー性鼻炎を含む）、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、湿疹、蕁麻疹、食物アレルギー、食物過敏症、腹腔疾患、免疫媒介性皮膚疾患（例えば、水疱性皮膚症、多形紅斑、接触性皮膚炎）、強皮症、線維症、肝線維症、心内膜心筋線維症、慢性気管支炎、気管支拡張症、特発性間質性肺炎、杯細胞化生、肺炎症障害、炎症性及び線維性肺疾患（例えば、嚢胞性線維症、特発性肺線維症、及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））、グルテン過敏性腸症、ウィップル病、肺の免疫疾患（例えば、好酸球性肺炎（慢性好酸球性肺炎を含む）、特発性肺線維症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、及び過敏性肺炎）、チャーグ・ストラウス症候群（結節性動脈周囲炎に加えてアトピー）、好酸球性筋肉痛症候群、好酸球増加症候群、浮腫反応（例えば、偶発性血管浮腫、好酸球性食道炎、好酸球性胃炎、好酸球胃腸炎、好酸球性腸炎及び好酸球大腸炎）、鼻マイクロポリープ症及びポリープ症、ＲＳＶ感染症、ブドウ膜炎、骨粗鬆症、ならびにＩＬ−１３の異常な発現に関連付けられる癌及び腫瘍を含む悪性腫瘍（例えば、ホジキンリンパ腫）を含む、ＩＬ−１３媒介性障害を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、障害は、アレルギー性喘息、非アレルギー性（内因性）喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、湿疹、蕁麻疹、食物アレルギー、慢性閉塞性肺疾患、潰瘍性大腸炎、ＲＳＶ感染症、ブドウ膜炎、強皮症、または骨粗鬆症である。いくつかの実施形態において、本方法は、以下に記載される有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。上記の実施形態のうちのいずれかに従う「個体」は、好ましくはヒトであり得る。
【０２８５】
いくつかの例では、本発明は、喘息症状を患う患者を治療する方法であって、ある量の、喘息症状の低減に有効な本発明の抗ＩＬ−１３抗体のうちのいずれかを投与することを含む、方法を提供する。
【０２８６】
いくつかの例では、本発明は、患者におけるＩｇＥ抗体産生を阻害するための方法であって、患者に、ＩｇＥ抗体産生を阻害する有効量の、本発明の抗ＩＬ−１３抗体のうちのいずれかを投与することを含む、方法を提供する。いくつかの例では、ＩｇＥ抗体産生の阻害は、気管支喘息の予防、アレルギー性鼻炎の予防、アレルギー性皮膚炎の予防、気管支喘息の治療、アレルギー性鼻炎の治療、蕁麻疹の治療、アナフィラキシーの予防、またはアトピー性皮膚炎の治療が意図される。
【０２８７】
他の例では、本発明は、患者におけるＩｇＥ媒介性障害を治療する方法であって、患者に有効量の本発明の抗ＩＬ−１３抗体を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの例では、ＩｇＥ媒介性障害は、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、蕁麻疹、アナフィラキシー、またはアトピー性皮膚炎である。
【０２８８】
更なる一態様において、本発明は、例えば、上記の治療方法のうちのいずれかにおいて使用するための、本明細書に提供される抗ＩＬ−１３抗体のうちのいずれかを含む医薬製剤を提供する。一実施形態において、医薬製剤は、本明細書に提供される抗ＩＬ−１３抗体のうちのいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の実施形態において、医薬製剤は、本明細書に提供される抗ＩＬ−１３抗体のうちのいずれかと、例えば、以下に記載される少なくとも１つの追加の治療剤とを含む。
【０２８９】
本発明の抗ＩＬ−１３抗体は、療法において、単独、または他の薬剤との組み合わせでのいずれかで、使用することができる。例えば、本発明の抗ＩＬ−１３抗体は、例えば、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活性を増加させる役割を果たす、他のモノクローナル抗体もしくはキメラ抗体と組み合わせて、またはリンホカイン成長因子もしくは造血成長因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＦＮなど）とともに有利に利用することができる。本発明の抗体は、単独、または他の種類の治療（免疫療法、気管支拡張剤、抗ＩｇＥ分子、抗ヒスタミン剤、もしくは抗ロイコトリエン剤など）との組み合わせで投与され得る。
【０２９０】
上述のそのような併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が同一または別個の製剤中に含まれる）及び別個の投与を包含し、別個の投与の場合、本発明の抗体の投与は、追加の治療剤（複数可）の投与の前、それと同時、及び／またはその後に生じ得る。一実施形態において、抗ＩＬ−１３抗体の投与及び追加の治療剤の投与は、互いの約１ヶ月以内、または約１週間、２週間、もしくは３週間以内、または約１、２、３、４、５、もしくは６日以内に生じる。本発明の抗体はまた、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
【０２９１】
一態様において、医薬品として使用するための抗ＶＥＧＦ抗体が、本明細書に記載される。更なる態様において、病理学的血管形成に関連する障害の治療に使用するための抗ＶＥＧＦ抗体が、本明細書に記載される。ある特定の実施形態において、治療方法において使用するための抗ＶＥＧＦ抗体が、本明細書に記載される。ある特定の実施形態において、病理学的血管形成に関連する障害を有する個体を治療する方法であって、個体に有効量の抗ＶＥＧＦ抗体を投与することを含む、方法において使用するための抗ＶＥＧＦ抗体が、本明細書に記載される。そのような一実施形態において、本方法は、例えば、以下に記載される有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。上記の実施形態のうちのいずれかに従う「個体」は、好ましくはヒトである。
【０２９２】
更なる一態様において、医薬品の製造または調製における抗ＶＥＧＦ抗体の使用が、本明細書に記載される。一実施形態において、医薬品は、病理学的血管形成に関連する障害の治療のためのものである。更なる一実施形態において、医薬品は、病理学的血管形成に関連する障害を治療する方法であって、病理学的血管形成に関連する障害を有する個体に、有効量の医薬品を投与することを含む、方法において使用するためのものである。そのような一実施形態において、本方法は、例えば、以下に記載される有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。上記の実施形態のうちのいずれかに従う「個体」は、好ましくはヒトであり得る。
【０２９３】
更なる一態様において、本発明は、例えば、上記の治療方法のうちのいずれかにおいて使用するための、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体のうちのいずれかを含む医薬製剤を提供する。一実施形態において、医薬製剤は、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体のうちのいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の実施形態において、医薬製剤は、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体のうちのいずれかと、例えば、以下に記載される少なくとも１つの追加の治療剤とを含む。
【０２９４】
別の態様において、本発明は、例えば、病理学的血管形成に関連する障害を有する対象において、血管形成を低減または阻害する方法であって、対象に、有効量の本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体を投与し、それにより、対象における血管形成を低減または阻害することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態において、病理学的血管形成に関連する障害は、非腫瘍性である。ある特定の実施形態において、病理学的血管形成に関連する障害は、癌である。そのような一実施形態において、本方法は、例えば、以下に記載される有効量の少なくとも１つの追加の薬剤を個体に投与することを更に含む。
【０２９５】
別の態様において、本発明は、腫瘍、癌、または細胞増殖性障害を治療する方法であって、有効量の本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体を投与することを含む、方法を提供する。そのような一実施形態において、本方法は、例えば、以下に記載される有効量の少なくとも１つの追加の薬剤を個体に投与することを更に含む。
【０２９６】
本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体は、療法において、単独、または他の薬剤との組み合わせでのいずれかで、使用することができる。例えば、抗ＶＥＧＦ抗体は、少なくとも１つの追加の薬剤と同時投与されてもよい。ある特定の実施形態において、追加の薬剤は、化学療法剤、細胞毒性剤、抗血管形成剤、免疫抑制剤、プロドラッグ、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、細胞毒性放射線療法、コルチコステロイド、制吐剤、癌ワクチン、鎮痛剤、成長阻害剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、または他の薬剤（上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）アンタゴニスト（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（商標））、血小板由来成長因子阻害剤（例えば、ＧＬＥＥＶＥＣ（商標）（イマチニブメシル酸塩））、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、ＶＥＧＦ以外の標的に結合する抗体、または別の生理活性もしくは有機化学薬剤など）である。
【０２９７】
上述のそのような併用療法は、併用投与（２つ以上の薬剤が同一または別個の組成物中に含まれる）及び別個の投与を包含し、別個の投与の場合、本発明の抗体の投与は、追加の薬剤（複数可）の投与の前、それと同時、及び／またはその後に生じ得る。一実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体の投与及び追加の薬剤の投与は、互いの約１ヶ月以内、または約１週間、２週間、もしくは３週間以内、または約１、２、３、４、５、もしくは６日以内に生じる。本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体はまた、放射線療法と組み合わせても使用することができる。
【０２９８】
本明細書に記載される抗ＩＬ−１３抗体または抗ＶＥＧＦ抗体（及び任意の追加の治療剤）は、筋肉内に、静脈内に、皮内に、経皮的に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、硝子体内に、胸膜内に、気管内に、くも膜下腔内に、鼻腔内に、膣内に、直腸内に、局所的に、腫瘍内に、腹膜内に、皮下に、結膜下に、小胞内に、粘膜的に、心膜内に、臍帯内に、眼球内に、眼窩内に、経口的に、局所的に、吸入によって、注射によって、埋め込みによって、注入によって、持続注入によって、標的細胞を直接浸す局所灌流によって、カテーテルによって、洗浄によって、クレーム中で、または脂質組成物中でを含む、任意の好適な手段によって投与することができる。本明細書に記載される方法において利用される組成物はまた、全身的または局所的にも投与することができる。投与方法は、様々な因子（例えば、投与される化合物または組成物、ならびに治療される病態、疾患、または障害の重症度）によって異なり得る。
【０２９９】
抗体は、良好な医療慣例と一貫する様式で、製剤化され、投薬され、投与されるだろう。これの文脈において考慮する因子としては、治療されている特定の障害、治療されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジューリング、及び医師に既知である他の因子が挙げられる。抗体は、問題の障害を予防または治療するために現在使用される１つ以上の薬剤とともに製剤化される必要はないが、任意で、そのように製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害または治療の種類、及び上記に考察される他の因子に依存する。これらは一般に、本明細書に記載されるものと同一の投薬量及び投与経路で、または本明細書に記載される投薬量の約１〜９９％で、または適切であると経験的／臨床的に決定される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。
【０３００】
疾患の防止または治療について、本発明の抗体の適切な投薬量（単独、または１つ以上の他の追加の治療剤との組み合わせで使用される場合）は、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的または治療目的で投与されるかどうか、以前の療法、患者の病歴及び抗体への応答、ならびに主治医の裁量に依存するであろう。抗体は好適に、１回で、または一連の治療に渡って患者に投与される。疾患の種類及び重症度によって、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば、１回以上の別個の投与であろうと、持続注入によるものであろうと、患者への投与のための初回候補投薬量であり得る。１つの典型的な１日投薬量は、上記に言及される因子によって、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。病態に応じた数日間以上に渡る反復投与について、治療は一般に、疾患症状の所望される抑制が生じるまで持続されるだろう。抗体の１つの例示的な投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であるだろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇ（またはこれらの任意の組み合わせ）の１回以上の用量が、患者に投与されてもよい。そのような用量は、断続的に、例えば、毎週、２週間毎、３週間毎、または４週間毎（例えば、患者が約２〜約２０回、または例えば、約６回の用量の抗体を受容するように）投与されてもよい。例えば、用量は、１ヶ月に１回（例えば、皮下注射によって）投与されてもよい。より高い初回負荷用量、その後、１回以上のより低い用量が、投与されてもよい。しかしながら、他の投薬量レジメンが有用であり得る。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視される。
【０３０１】
上記の製剤または治療方法のうちのいずれも、抗ＩＬ−１３抗体もしくは抗ＶＥＧＦ抗体の代わりに、またはそれに加えて、本発明の免疫複合体を使用して実行され得ることが理解される。
【０３０２】
いくつかの実施形態において、本方法は、追加の療法を更に含み得る。追加の療法は、放射線療法、手術、化学療法、遺伝子療法、ＤＮＡ療法、ウイルス療法、ＲＮＡ療法、免疫療法、骨髄移植、ナノ療法、モノクローナル抗体療法、または前述のものの組み合わせであり得る。追加の療法は、アジュバント療法またはネオアジュバント療法の形態であり得る。いくつかの実施形態において、追加の療法は、小分子酵素阻害剤または抗転移剤の投与である。いくつかの実施形態において、追加の療法は、副作用制限剤（例えば、制嘔吐剤などの、治療の副作用の発生及び／または重症度を軽減するよう意図された薬剤）の投与である。いくつかの実施形態において、追加の療法は、放射線療法である。いくつかの実施形態において、追加の療法は、手術である。いくつかの実施形態において、追加の療法は、放射線療法と手術との組み合わせである。いくつかの実施形態において、追加の療法は、ガンマ照射である。いくつかの実施形態において、追加の療法は、上述の治療剤のうちの１つ以上の別個の投与であり得る。
【０３０３】
Ｊ．製造品
本発明の別の態様において、上述の障害の治療、予防及び／または診断に有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と、容器上のまたは容器に付随する標識または添付文書とを含む。好適な容器としては、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液袋などが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。容器は、それ自体での、または病態の治療、予防及び／もしくは診断に有効である別の組成物と組み合わされた組成物を保持し、無菌接触口を有してもよい（例えば、容器は、静脈注射溶液袋または皮下注射針によって穿孔可能な栓を有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本発明の抗体である。標識または添付文書は、組成物が、選択した病態を治療するために使用されることを示す。更に、製造品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物をその中に収容した第１の容器と、（ｂ）更なる細胞毒性剤または他の治療剤を含む組成物をその中に収容した第２の容器とを含み得る。本発明のこの実施形態の製造品は、組成物を使用して特定の病態を治療することができることを示す添付文書を更に含み得る。あるいは、または加えて、製造品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２の（または第３の）容器を更に含み得る。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的観点及びユーザの観点から望ましい他の材料を更に含み得る。
【０３０４】
上記の製造品のうちのいずれも、抗ＩＬ−１３抗体または抗ＶＥＧＦ抗体の代わりに、またはそれに加えて、本発明の免疫複合体を含み得ることが理解される。
【０３０５】
Ｋ．操作された細菌
本発明は、操作された細菌を提供する。本発明の細菌は、例えば、本発明の方法（例えば、節Ａまたは実施例に上述の方法）のうちのいずれかにおいて使用することができる。
【０３０６】
一例では、本発明は、（ｉ）外膜を渡る膜不透過性分子の周辺質内への拡散を可能にする変異と、（ｉｉ）結合ポリペプチドをコードする発現構築物とを含む細菌を提供する。
【０３０７】
いくつかの例では、外膜を渡る膜不透過性分子の周辺質内への拡散を可能にする変異は、外膜タンパク質及び／またはリポ多糖（ＬＰＳ）組成に影響を与えるタンパク質をコードする遺伝子中にある。いくつかの例では、変異は、外膜タンパク質、例えば、主要外膜リポタンパク質Ｌｐｐ（Ｌｐｐ）、ポリン、またはＴｏｌＣをコードする遺伝子中にある。いくつかの例では、外膜タンパク質は、Ｌｐｐである。いくつかの実施形態において、変異は、ＬＰＳ組成に影響を与えるタンパク質、例えば、Ｅｎｖタンパク質（例えば、ＥｎｖＡ、ＥｎｖＢ、及びＥｎｖＭ）、ＲｆａＤ、ＲｆａＥ、ＲｆａＨ、ＲｆａＲｄ、ＴｏｌＡ、ＴｏｌＢ、ならびにＴｏｌＤをコードする遺伝子中にある。
【０３０８】
いくつかの例では、結合ポリペプチドは、抗体であり得る。いくつかの例では、上記の方法のうちのいずれかの抗体は、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。いくつかの例では、抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、またはＦ（ａｂ’）２断片である。他の例では、抗体は、全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１抗体、インタクトなＩｇＧ４抗体、または本明細書に定義される他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。別の実施形態において、抗体は、半抗体、例えば、ノブ・イントゥ・ホール半抗体である。ノブ・イントゥ・ホール技術の説明については、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい。前述の方法のうちのいずれかにおいて、抗体は、治療的抗体（例えば、中和抗体）であってもよい。
【０３０９】
他の例では、結合ポリペプチドは、抗体模倣物、例えば、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、フィノマー、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、またはモノボディであってもよい。他の実施形態において、結合ポリペプチドは、周辺質に局所化する細菌タンパク質であってもよい。他の実施形態において、結合ポリペプチドは、哺乳動物タンパク質であってもよい。例えば、いくつかの実施形態において、結合ポリペプチドは、細胞表面受容体、サイトカイン、または成長因子であってもよい。
【０３１０】
例えば、本発明は、（ｉ）主要外膜リポタンパク質Ｌｐｐ（Ｌｐｐ）をコードする遺伝子中の機能欠失型変異と、（ｉｉ）抗体をコードする発現構築物とを含む細菌を提供する。いくつかの例では、抗体は、全長抗体である。いくつかの例では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの例では、抗体は、半抗体である。いくつかの例では、抗体は、抗体断片である。いくつかの例では、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）２断片からなる群から選択される。
【０３１１】
上述の細菌のうちのいずれも、Ｌｐｐをコードする遺伝子中に任意の好適な変異（例えば、機能欠失型変異）を含み得る。例示的なｌｐｐ変異としては、ｌｐｐ−１；ｌｐｐ−２１；ｌｐｐ−３；ｌｐｐ５５０８；ｌｐｐ−６；ｌｐｐ：：Ｔｎ５ＫＡＮ−２；ｌｐｐＤ７０Ｅ、Ｇ、もしくはＳ；ｌｐｐＫ７５ＳもしくはＴ；ｌｐｐＫ７８Ｒ；ｌｐｐＲ７７ＤもしくはＬ；ｌｐｐＳ２２Ｄ；ｌｐｐＹ７６Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、もしくはＳ；ｌｐｐＹ７６Ｆ、Ｈ、Ｉ、もしくはＬ；Δｌｐｐ、Δｌｐｐ−２５４、及びΔｌｐｐ−７５２：：ｋａｎ、または本明細書に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなｌｐｐ変異は、例えば、ＣＧＳＣ（Ｔｈｅ  Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ）などの貯蔵所から取得することができる。他の例では、Ｌｐｐをコードする遺伝子中の変異は、標準的な遺伝学アプローチを使用して作製することができる。いくつかの例では、Ｌｐｐをコードする遺伝子中の機能欠失型変異は、点変異、挿入変異、または欠失変異から選択される。いくつかの例では、機能欠失型変異は、欠失変異である。
【０３１２】
上述の細菌のうちのいずれも、内膜、周辺質、及び外膜を含み得る。いくつかの例では、細菌は、グラム陰性菌である。例えば、いくつかの例では、細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉである。Ｅ．ｃｏｌｉの任意の好適な株または遺伝的背景を使用することができる。一般的に使用されるＥ．ｃｏｌｉの株及び遺伝的背景は、当該技術分野において周知である例示的なＥ．ｃｏｌｉ株としては、Ｋ−１２及びその亜株（例えば、Ｃｌｉｆｔｏｎ野生型、Ｗ３１１０、及びＤＨ５αＥなど）、ならびにＥ．ｃｏｌｉ  Ｂ及びその亜株（例えば、ＢＬ２１及びＢＬ２１（ＤＥ３）など）などの実験室株が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉは、株６２Ａ７に由来する。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉは、株３３Ｄ３に由来する。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉは、株６６Ｃ４に由来する。
【０３１３】
いくつかの例では、前述の細菌のうちのいずれも、転写制御遺伝子に影響を与える変異を含み得る。いくつかの例では、転写制御遺伝子は、転写開始因子、抗シグマ因子、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット、または転写因子から選択される。いくつかの例では、転写開始因子は、シグマ因子である。いくつかの例では、シグマ因子は、ＲｐｏＤ（σ７０）、ＲｐｏＥ（σ２４）、ＲｐｏＨ（σ３２）、ＲｐｏＳ（σ３８）、ＲｐｏＮ（σ５４）、ＲｐｏＦ（σ２８）、及びＦｅｃＩ（σ１９）からなる群から選択される。具体的な例では、シグマ因子は、ＲｐｏＤ（σ７０）である。いくつかの例では、転写制御遺伝子に影響を与える変異は、合成プラスミド上に存在する。他の例では、転写制御遺伝子に影響を与える変異は、内在性細菌ゲノム中に存在する。いくつかの例では、転写制御遺伝子に影響を与える変異は、エラープローンＰＣＲ変異原性、化学変異原性、転位変異原性、または標的化変異原性によるものである。いくつかの例では、転写制御遺伝子に影響を与える変異は、エラープローンＰＣＲ変異原性によるものである。
【０３１４】
いくつかの例では、本発明は、前述の細菌のうちのいずれかの複数を提供する。いくつかの実施形態において、複数の細菌は、本発明のライブラリ、例えば、本明細書の上記節Ｂまたは実施例に記載される任意のライブラリを含み得る。いくつかの例では、複数の細菌は、それぞれが転写制御遺伝子の変異体（例えば、シグマ因子、例えば、ＲｐｏＤ（σ７０））をコードする核酸のライブラリを含み得る。
【０３１５】
前述の細菌のうちのいずれも、少なくとも約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上だけ、結合ポリペプチド（例えば、抗体）の改善された発現を有し得る。いくつかの例では、細菌は、１〜１０倍の改善された発現、１〜７倍の改善された発現、１〜６倍の改善された発現、１〜５倍の改善された発現、１〜４倍の改善された発現、１〜３倍の改善された発現、２〜１０倍の改善された発現、２〜８倍の改善された発現、または２〜６倍の改善された発現を有し得る。いくつかの実施形態において、改善は、野生型細菌内の結合ポリペプチドの発現レベルと比較したものである。他の実施形態において、改善は、変異体細菌内の結合ポリペプチドの発現レベルと比較したものである。
ＩＩＩ．実施例
【０３１６】
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上記に提供される概要を仮定して、様々な他の実施形態が実施され得ることが理解される。
【０３１７】
実施例１：全長ポリペプチドと適合する生細胞細菌抗体提示系の開発
全長結合ポリペプチド及びリガンド、例えば、全長抗体及び抗原と適合する、生細胞細菌抗体提示の方法を開発した。以前の細菌提示系の限界を克服するために、細菌細胞の生存率を実質的に損なうことなく、細菌外膜を超えて、リガンド（例えば、抗体によって結合される抗原）を周辺質内へと送達するための新規な方法を開発した。
【０３１８】
主要外膜タンパク質（ムレインリポタンパク質、Ｌｐｐ）の欠失は、外膜を半透過性にする。ＥＤＴＡを利用して、外膜を更に透過化した（Ｌｅｉｖｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３：６３８４−６３９１，１９６８、Ｈａｎｃｏｃｋ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８：２３７−２６４，１９８４）。Δｌｐｐ遺伝的背景を使用して、細胞膜周辺腔から培地へとタンパク質を漏出させて、精製を促進した（Ｋａｎａｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ６６：２９５−３００，１９８８）。しかしながら、この遺伝的背景はまた、原理上、外膜透過性障壁によって通常除外されるリガンドが周辺質内へと拡散することを可能にするためにも使用することができ得る。
【０３１９】
この系の機能性を実証するために、抗ＩＬ−１３  ＩｇＧ（Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８８：２６５８３−２６５９３，２０１３）をΔｌｐｐ背景で発現させ、蛍光顕微鏡を使用して、ＥＤＴＡで処理した細胞が、外因的に添加された、蛍光標識されたＩＬ−１３サイトカインに結合し得るかどうかを決定した。抗体を発現する細胞のみが抗原を保持し（図１Ａ）、これは、抗体を細胞中に効率的に保持するために膜繋留が必要とされないことを示した。ＩＬ−１３抗原は、約１５ｋＤａの分子量を有する一方で、抗Ｆｃ  Ｆ（ａｂ’）２での染色は、少なくとも１００ｋＤａのサイズを有する抗原が、透過化された細胞の周辺質内に効率的に進入し、それらの中に保持され得ることを示す。他の実験において、細胞を全長抗体で染色することに成功し、これは、少なくとも１５０ｋＤａのサイズを有する分子が、透過化された細胞の周辺質内に効率的に進入し、それらの中に保持され得ることを示した。しかしながら、細胞を透過化するためのＥＤＴＡの使用は、細胞生存率の低下をもたらした。生存率低下を克服するために、抗原及びＥＤＴＡでの染色後にＭｇＣｌ２を添加し、これにより、生存率がＥＤＴＡ処理前に見られるレベルまで回復した（図１Ｂ）。
【０３２０】
次に、他の抗体形式を試験して、それらが、抗原に結合するために、周辺質内に効率的に保持され得るかどうかを決定した。全長抗体と同様に、生存率に影響を与えることなく、Ｆａｂ形式及び半抗体形式の両方を発現させ、抗原で染色することができた（図１Ｂ）。空ベクター対照（ｐＢＲ３２２）細胞は、フローサイトメトリーによって、背景シグナルに寄与する自己蛍光を示した一方で、全ての試験された抗体形式は、効率的な選別を可能にする、この背景を超える抗原特異的シグナルを示した（図１Ｃ）。ノブ・イントゥ・ホールＦｃ技術を有する半抗体は、全長二重特異性抗体を生成するために使用することができるため、対象となる（Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：７５３−７５８，２０１３）。全ての以下の提示実験について、半抗体構築物を利用した。
【０３２１】
以下に記載されるように、この技術（本明細書において、広義かつ非限定的な意味で細菌抗体提示または「ＢＡＤ」と呼ばれることがある）は、全長抗原を生細胞へと送達し、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ（商標））選択（図１Ｄ）を使用して急速な１巡毎の進行を可能にすることによって、現在の細菌提示の限界を克服する。ＢＡＤは、抗体とともにだけでなく、任意の好適な結合ポリペプチドとともにも使用され得ることが理解される。第１のステップにおいて、非結合剤のプールからの結合抗体の富化を、ＢＡＤを使用して試験した。抗ＩＬ−１３抗体を発現する細胞を、抗ＶＥＧＦ抗体を発現する細胞プールへとスパイキングした。混合物中の各抗体の比率を追跡するために、カルベニシリン耐性のみを与えるプラスミドを使用して、抗ＶＥＧＦを発現させた一方で、抗ＩＬ−１３を発現させるために使用されるプラスミドは、カルベニシリン耐性及びテトラサイクリン耐性の両方を与える。１：１０５及び１：１０６の比率の混合培養物の段階希釈を、カルベニシリンまたはテトラサイクリン含有プレート上にスポットプレーティングすることによって、スパイキングの正確性を最初に決定し、これにより、抗ＩＬ−１３抗体が、予測通りの頻度でプール内に表れることが確認された（図２Ａ）。その後の選別実験のより正確な定量化のため、より大きな体積をプレーティングし、コロニー計数を行って、各試料における抗ＩＬ−１３対抗ＶＥＧＦの比率を計算した。１：１０６の比率の抗ＩＬ−１３：抗ＶＥＧＦで開始し、抗ＩＬ−１３陽性細胞の選別によって２巡のＢＡＤを実行し、２３５，０００倍の富化を達成した（図２Ｂ）。抗原／抗体対が富化され得ることを確実にするために、逆の実験を実行し、２巡のＦＡＣＳ（商標）の後、結合抗ＶＥＧＦ抗体の１９，５００倍の富化をもたらした（図２Ｂ）。この富化は、第２巡のＦＡＣＳ（商標）の後、個体群における大きなＶＥＧＦ陽性偏移に対応した（図２Ｃ）。これらの実験は、結合クローンが、ＢＡＤシステムによって急速かつ高度に富化され得ることを確認した。
【０３２２】
次に、ＢＡＤシステムを、最良の発現または同一の抗体の折り畳みバリアントのために富化するその能力について試験した。システムの解像度を試験するために、抗ＶＥＧＦ．２抗体に基づく半抗体とともに、異なる発現レベルを有する３つのバリアントを使用した。バリアントは、異なる組み合わせの軽鎖（Ｌ４Ｍ、Ｓ２４Ｒ、Ｆ７１Ｙ）変異及び重鎖（Ｅ６Ｑ、Ｍ３４Ｉ）変異を含んだ。非還元可溶性試料をウェスタンブロットによって抗ヒトＦｃ抗体で検出し、発現レベルを抗ＶＥＧＦ．２半抗体野生型（ＷＴ）に対して正規化した（図３Ａ）。抗ＶＥＧＦ．２野生型は、最低の機能発現を有した一方で、Ｌ４Ｍ．Ｅ６Ｑ．Ｍ３４Ｉ、Ｆ７１Ｙ．Ｅ６Ｑ．Ｍ３４Ｉ、及びＳ２４Ｒ．Ｅ６Ｑ．Ｍ３４Ｉはそれぞれ、３．７倍、５．６倍、及び７．２倍の発現レベルの増加を有した。発現及びＦＡＣＳ（商標）偏移の一致を確実にするために、ＢＡＤを使用して、抗ＶＥＧＦ．２野生型、及び蛍光標識されたＶＥＧＦで染色したバリアントの、個々のＦＡＣＳ（商標）偏移を決定した（図３Ｂ）。ＦＡＣＳ（商標）平均蛍光強度は、発現レベルと同一の順序の順位であり、Ｌ４Ｍ．Ｅ６Ｑ．Ｍ３４Ｉ、Ｆ７１Ｙ．Ｅ６Ｑ．Ｍ３４Ｉ、及びＳ２４Ｒ．Ｅ６Ｑ．Ｍ３４Ｉは、野生型抗ＶＥＧＦ．２と比較して、１．２５＋／−０．２倍、１．３７＋／−０．２倍、及び１．４＋／−０．３倍の増加を有した。したがって、これらの抗体は、ＢＡＤが最良発現抗体を選択し得るかどうかを試験するための良好な候補であった。
【０３２３】
抗ＶＥＧＦ．２野生型を２つのバリアントと組み合わせるＢＡＤスクリーニングを実行した。２巡のＦＡＣＳ（商標）を実行し、各巡において上位１％のＶＥＧＦ結合クローンを選別した。４つの組み合わせ抗ＶＥＧＦ．２抗体のＦＡＣＳ（商標）偏移を、２巡の選別に渡って監視した（図３Ｃ）。試料のうちのいくつかにおいて細胞の二峰性分布が観察され、これは、部分的な細胞透過処理及びＥ．ｃｏｌｉの背景自己蛍光に起因した。プールされたバリアントのＶＥＧＦ結合シグナルは、２巡の選別後、最良発現バリアントＳ２４Ｒ．Ｅ６Ｑ．Ｍ３４Ｉの上に重なり、これは、より良好に発現する抗体が富化されていることを示唆した。入力物の配列決定は、選別の開始時点で４つ全ての抗ＶＥＧＦ．２抗体が存在した一方で、１巡目の後に抗ＶＥＧＦ．２野生型及びＬ４Ｍ．Ｅ６Ｑ．Ｍ３４Ｉが部分的に枯渇したことを示す（図３Ｄ）。２巡目の後、抗ＶＥＧＦ．２野生型及びＬ４Ｍ．Ｅ６Ｑ．Ｍ３４Ｉは検出されず、Ｆ７１Ｙ．Ｅ６Ｑ．Ｍ３４Ｉ及びＳ２４Ｒ．Ｅ６Ｑ．Ｍ３４Ｉのみが富化された。これらのデータは、小さな発現差にも関わらず、ＢＡＤが最良発現抗体の富化に成功し得ることを実証する。
【０３２４】
上述の方法は、多くの用途において有用である。抗体操作に関して、それは、Ｆｃ操作、抗体発見、または親和性成のために、より大きなライブラリとともに使用することができる。抗体を超えて、ＢＡＤシステムは、それが細胞宿主環境における真の読み取りを提供するため、タンパク質排出、折り畳み、またはＥ．ｃｏｌｉ周辺質内での局所化を研究するための一般的なハイスループットツールとして、適用可能であり得る。このシステムの主要な強みは、天然タンパク質形式の使用を可能にし、融合パートナー、レポータータンパク質、または膜繋留を不要にする、非繋留的アプローチである。更に、生細胞設定アプローチは、以前の提示技術に対する有意な改善である、所望される宿主特徴についての例外的に急速なスクリーニングを可能にする。
【０３２５】
材料
プラスミド構築及び発現
標準的な分子生物学技術によって、既に記載されるように、抗体をＥ．ｃｏｌｉ発現ベクター中（Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６３：１３３−１４７，２００２、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ．Ｙ．）１０：１３−１６７，１９９２）または哺乳動物発現ベクター中（Ｅａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：８３４３−８３４７，１９８６）へとクローニングした。既に記載されるように、５０ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ細胞培養物（Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８８：２６５８３−２６５９３，２０１３）またはＣＨＯ細胞（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０６：７５１−７６３，２０１０）もしくはＨＥＫ２９３Ｔ（Ｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８０：１０−１６，２０１４）細胞の３０ｍＬの一過性トランスフェクション培養物を使用して、抗体発現を実行した。
【０３２６】
抗体精製
Ｆａｂタンパク質をＥ．ｃｏｌｉから精製するために、以前に記載されているように（Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：７５３−７５８，２０１３）、染色体ｌｐｐ遺伝子欠失を有する株６４Ｂ４においてタンパク質を発現させた（Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ｐｐ．３３１−３４４，２０１０）。５００ｍＬのＣＲＡＰ培養物を３０℃で２４時間成長させた後、ｐＨ８．０のＥＤＴＡを１０ｍＭの最終濃度まで添加した。インキュベーションを、３０℃、２００ｒｐｍで１時間続けてから、ＭｇＣｌ２を２０ｍＭの最終濃度まで添加した。遠心分離（２０分、４，５００ｒｃｆ、４℃）によって細胞デブリを除去し、その後、４００μｇのデオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を添加してから、ＧＦ／Ｆフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）及び０．２μのＰＥＳフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を通して上清を濾過した。１．５ｍＬのタンパク質Ｇ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）スラリー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ）を５０ｍＬの溶解物に添加し、室温で一晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄するとによって未結合タンパク質を除去し、４ｍｌの５０ｍＭリン酸（ｐＨ３）でＦａｂタンパク質を溶出させ、２０×ＰＢＳで中和し、ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−４（１０，０００ＭＷのカットオフ）（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ）で濃縮した。
【０３２７】
ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ  ＳＵＲＥ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ）によって、製造業者のプロトコルに従って、ヒトＩｇＧ１を哺乳動物培養物上清から精製した。ヒトＦａｂを哺乳動物培養物上清から精製するために、ＦＬＡＧタグを重鎖のＣ末端に付加し、抗ＦＬＡＧ樹脂で、製造業者のプロトコル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）に従って、Ｆａｂを精製した。２８０ｎｍでの吸光度を決定し、タンパク質特異的消衰係数を使用することによって、タンパク質収率を定量化した。
【０３２８】
抗原
ヒトＶＥＧＦ８−１０９の発現及び精製は、既に記載されている（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：７１９２−７１９７ｋ  １９９７）。Ｕｎｉｚｙｍｅでタグ付けしたヒトＩＬ−１３３３−１４６をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、変性条件下、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって精製し、再び折り畳んだ。タンパク質を、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８またはＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７サクシニミジルエステル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）で、製造業者のプロトコルに従って蛍光標識した。ＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）６４９で標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  Ｆ（ａｂ’）２−断片を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡから得た。
【０３２９】
細菌抗体提示及びフローサイトメトリー
細菌提示のため、株６２Ａ７のＬｐｐ欠失（Δｌｐｐ）中で抗体を発現させた。６２Ａ７は、株３３Ｄ３のカナマイシン耐性を治療することによって、親株３３Ｄ３から導出した（Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６３：１３３−１４７，２００２）。スパイキング実験または個々のフレームワークバリアントでの実験のため、細胞をそれぞれのプラスミドで個々に形質転換し、３０℃で一晩培養物として成長させ、記載される比率で、または体積によって等しく組み合わせ、１：１００の希釈で使用して、５０ｍＬのＣＲＡＰ培養物を播種した。３０℃で２４時間後、１ＯＤアリコートを回収し、遠心分離（４分間、６５００ｒｃｆ）によってペレット化した。細胞を、２％のＢＳＡ及び５ｍＭのＥＤＴＡを有する１００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に再懸濁させ、４℃で３０分間インキュベートした。初回インキュベーション後、１：１００の最終希釈までＳＹＴＯ（登録商標）４１または９核酸染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＵＳＡ）を添加し、ＡＬＥＸＡ４８８またはＡＬＥＸＡ６４７で標識した抗原を、１〜２μＭの最終濃度まで添加した。インキュベーションを、４℃、暗所で１時間続け、その時点で、ＭｇＣｌ２を１０〜２０ｍＭの最終濃度まで添加した。１ｍＬの体積のＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋２０ｍＭのＭｇＣｌ２で３回洗浄することによって、未結合タンパク質を除去した。染色した細胞を、分析用には１×１０７個の細胞／ｍｌの最終濃度まで、及びＢＤ  ＦＡＣＳＡＲＩＡ（商標）ＩＩ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用する選別用には１×１０６個の細胞／ｍｌの最終濃度まで、ＳＯＣ培地（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）中で再懸濁させた。ＦＡＣＳ（商標）ゲーティング戦略は、ＳＹＴＯ（登録商標）色素陽性である細胞を含んだ。二重体識別ゲートを使用して二重体を除去し、最後に抗原陽性細胞を選別した。細胞をＳＯＣ培地中へと選別し、３０℃で一晩回収し、発現培養物を再播種するために使用したか、またはグリセロールストックとして凍結した。
【０３３０】
顕微鏡検査
蛍光顕微鏡検査のための細胞の発現及び染色を、上述の細菌提示プロトコルと同様に実行した。２０ｍＭのＭｇＣｌ２を有するＰＢＳ洗浄ステップの後、２０ｍＭのＭｇＣｌ２を有する１００μＬのＰＢＳ中に細胞を再懸濁させ、３７℃で１％のゼラチンと混合して、スライドを調製した。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ  Ａ１を使用して、蛍光顕微鏡検査検査を実行した。
【０３３１】
免疫ブロット
抗体が、カナマイシン耐性を治療した３３Ｄ３の誘導体株内に発現されたことを除いては、既に記載されているように（Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：７５３−７５８，２０１３）、免疫ブロッティングを実行した。
【０３３２】
示差走査蛍光定量によるタンパク質安定性測定
Ｂｉｏｒａｄ  ＣＦＸ９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＵＳＡ）中で、１：５００の最終希釈のＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ色素ストック（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＵＳＡ）で、タンパク質安定性を決定した。ＰＢＳ中２５μＬの試料の蛍光を、２０〜１００℃（０．２℃の増分、１ステップ当たり１０秒間保持）まで記録した。
【０３３３】
周辺質抽出物
Ｂｉａｃｏｒｅ分析用の周辺質抽出物を生成するために、細菌抗体提示株からの４０ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ発現ブロスを、５，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によってペレット化した。１．５ｍＬの、５０ｍＭの低温トリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び５００ｍＭのスクロース中にペレットを再懸濁させ、氷上で撹拌しながら３０分間インキュベートした。試料を９０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清を周辺質抽出物として収集した。
【０３３４】
表面プラズモン共鳴
表面プラズモン共鳴を使用して、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）３０００またはＴ２００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、それぞれ抗ＩＬ−１３抗体及び抗ＶＥＧＦ抗体の結合動態を測定した。全ての動態実験は、３０μＬ／分の流量、２５℃、ならびに１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．００５％のＴｗｅｅｎ−２０の泳動緩衝液で実行した。抗ＩＬ−１３について、Ｈｕｍａｎ  Ｆａｂ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）からのＦａｂ結合剤を、アミン系カップリングを介してＣＭ５センサーチップ上に固定化して、Ｅ．ｃｏｌｉ周辺質抽出物から抗ＩＬ−１３半抗体を捕捉した。１．５６〜５０ｎＭの範囲内の２倍濃度系のサイトカインを使用して、抗体に対するヒトＩＬ−１３結合を測定した。１２０秒間の注入時間、その後、１０００秒間の解離時間、及びグリシン（ｐＨ２．１）での周期間の表面の再生を使用して、ＩＬ−１３の結合のセンサーグラムを記録した。抗ＶＥＧＦについて、ヒトＶＥＧＦを、アミン系カップリングを介してＣＭ５センサーチップ上に固定化した。６．１７〜５００ｎＭの範囲の３倍の濃度系の抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂを使用して、ＶＥＧＦに対する結合を分析した。１２０秒間の注入時間、その後、３００秒間の解離時間、及び２０ｍＭのＨＣｌでの周期間の表面の再生を使用して、単一周期動態センサーグラムを記録した。抗体への抗原結合について観察された全てのセンサーグラムを、１：１のラングミュア結合モデルを使用して分析して、動態及び結合定数を計算した。
【０３３５】
実施例２：細菌抗体提示を使用する細胞選別の最適化
選別プロセス中の細胞生存率を最大化して、１巡毎のＢＡＤを使用する選別の速度及び効率を促進するために、抗体の発現後の異なる野生型Ｅ．ｃｏｌｉ株の生存率を比較した。Ｅ．ｃｏｌｉ発現株は、抗体の発現後に異なる生存率を有し、例えば、野生型６４Ｂ４細胞は、６２Ａ７細胞を含む他の野生型株と比較して、約１倍の細胞生存率の低下を有した（図８）。更に、Ｌｐｐ（６２Ａ７Δｌｐｐ）が欠失した６２Ａ７細胞は、６４Ｂ４Δｌｐｐ細胞よりも大きな生存率を有した（図８）。６２Ａ７Δｌｐｐ細胞は、抗体が発現し、標識された抗原とともにインキュベートした後のＦＡＣＳ（商標）選別後に生存可能のままであり、複数巡の標識及び選別を受けることができた。したがって、株背景の選択は、ＢＡＤ中の細胞選別プロセスを最適化するために使用することができる１つの因子である。Δｌｐｐ欠失を使用する方法において、本方法は、抗体を発現することができるいかなる野生型遺伝的背景とも適合する。
【０３３６】
フローサイトメトリー選別条件もまた、選別後に回収される細胞の量を増加させるように最適化した。様々な核酸色素を、フローサイトメトリー中のＥ．ｃｏｌｉ細胞の検出を改善するそれらの能力について試験した。６つの青色核酸色素（ＳＹＴＯ（登録商標）色素４０〜４５）のパネルを、未染色の対照と比較した、抗ＶＥＧＦ抗体を発現する細胞の染色効率について試験した（図９）。核酸色素のそれぞれを使用して、色素陽性細胞を検出した。試験された染色のうち、ＳＹＴＯ（登録商標）４１が、最高の染色効率（処理された細胞の約９０％）を示した。この核酸色素を、フローサイトメトリー中に選択戦略の一部として使用すると、選別によって回収される細胞の量が増加した。ＳＹＴＯ（登録商標）９は、ＳＹＴＯ（登録商標）４１に匹敵する効率で染色する色素の非限定的な例である。発現レベル及び／または安定性において差を有する抗体の富化を促進するために、選別中の抗原陽性細胞の喪失は最小化されるべきである。互いに固着してはいるが、フローサイトメトリーによって単細胞として検出される２つの細胞である細胞二重体の存在は、原理上、選別後に抗原陽性細胞の富化を損なう可能性がある。このシナリオにおいて、抗原陽性細胞は、抗原陰性である細胞に固着することにより、富化を低減し得る。我々の選別条件下で、細胞二重体が生じるかどうかを試験するために、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦ．Ｖ４８Ｌを発現する細胞をＶＥＧＦ−ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８で標識した一方で、抗ＶＥＧＦ．Ａ９７Ｔを発現する細胞をＶＥＧＦ−ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７で標識した。その後、これらの細胞を等しく組み合わせ、フローサイトメトリーに供した。１×１０８個の細胞／ｍｌの選別濃度で、両方の抗原について陽性である細胞によって示される、細胞二重体が存在した（図１０）。二重体を減少させるために、１×１０６個の細胞／ｍＬのより低い細胞濃度を使用し、これは、フローサイトメトリー分析によって検出される二重体を排除するのに十分であった。
【０３３７】
６２Ａ７Δｌｐｐ株の使用と、１×１０６個の細胞／ｍｌの選別細胞濃度の選別と、核酸染色のシグナルに基づく選別を含むことでＥ．ｃｏｌｉ細胞の位置決定を促進するフローサイトメトリーと、標準的な二重体識別ゲートと、抗原陽性細胞の選択とを組み合わせる選別戦略を、試験した（図１１）。この選別戦略が成功することを確認するために、それぞれＶＥＧＦ−ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８またはＶＥＧＦ−ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７で標識し、等しく組み合わせた、（以下の実施例４に記載される）抗ＶＥＧＦ．Ｖ４８Ｌまたは抗ＶＥＧＦ．Ａ９７Ｔを発現する６２Ａ７Δｌｐｐ  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を使用して、単一巡のＢＡＤを実行した。別個に標識された抗原に対する単一抗原陽性結合、二重陽性結合、または二重陰性結合に基づいて、細胞を選別した（図１２Ａ）。両方の抗ＶＥＧＦバリアントの等しい組み合わせを、入力クローンの配列決定から検出した。１巡の選別後、単一抗原について陽性であるものとして選別された約９３〜９５％の細胞が予想される抗ＶＥＧＦバリアントを発現し、これは、この選別戦略の正確性を確認した（図１２Ｂ）。細胞の二重陰性個体群は、両方の抗ＶＥＧＦ抗体の等しい個体群が見出されたため、いずれの抗体を選択するバイアスも有さなかった（図１２Ｂ）。これらの結果は、本実施例に記載される選別条件が、１巡のＢＡＤ後、クローンの富化に好適であることを示す。細胞は生存可能であり、選別後の回収及びプレーティングが可能であり、これは、１巡のＢＡＤ中の容易な配列分析、及び巡から巡へと進行する能力を可能にした。加えて、二重体は、この分析に使用されるＦＡＣＳ（商標）ＡｒｉａＩＩ機器に固有の選択の限界に匹敵する選別の高い成功率のため、本方法の選別能力と干渉しなかった。
【０３３８】
実施例３：本発明の方法を使用する、改善された発現及び安定性を有する抗ＩＬ−１３抗体の生成
実施例１に記載される方法を利用して、治療的抗ＩＬ−１３抗体の増加した機能的発現及び安定性のために選択した。抗体配列中の選択位置の飽和変異原性を含む、Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗体収率を増加させるためのいくつかのアプローチが採られている。しかしながら、このアプローチは主に、抗体の天然レパートリーに見出されないアミノ酸変化をもたらすため、治療上対象となる抗体に免疫原性配列を導入するリスクが残る。
【０３３９】
本アプローチは、体細胞超変異中に生じる自然のフレームワーク多様性を利用する。天然に存在する抗体のＫａｂａｔデータベース（Ｋａｂａｔら（上記））を検査し、抗ＩＬ−１３抗体と同一の、カッパ４軽鎖亜型及びＶＨ２重鎖亜型のフレームワーク領域内の、生殖系列からのアミノ酸変化を特定した（図６）。理論によって拘束されることを望むものではないが、フレームワーク残基は、超可変領域内の残基よりも親和性に影響を与える可能性が低いであろう。加えて、フレームワーク領域内の埋もれた残基は、抗体折り畳み及び安定性の改善に寄与するが、表面に曝露された残基と比較して、免疫原性に対する潜在性を低下させるであろう。
【０３４０】
抗ＩＬ−１３可変ドメインのサブグループに基づく主鎖抗体骨格のリボン図を、図１３に示す。体細胞超変異は、フレームワーク領域及び超可変領域の両方に変化を導入し得る。Ｋａｂａｔデータベースからのデータを照合して、可変カッパ４（ＶＫ４、黄色）亜型及び重鎖２（ＶＨ２、灰色）亜型のフレームワーク内の体細胞超変異によって生じる全てのアミノ酸変化をまとめ、その後、抗ＩＬ−１３相同性モデルに基づいて、選択されたバリアントを非溶媒曝露残基（圏）へと限定した。ＰｙＭＯＬを使用して、非溶媒曝露残基を特定するためのモデルを可視化した。抗ＩＬ−１３半抗体の単一フレームワークバリアント（軽鎖内に５個及び重鎖内に２８個）を作製し、組み合わせて、ＢＡＤによってスクリーニングした。
【０３４１】
抗ＩＬ−１３半抗体フレームワークバリアントのライブラリによるＢＡＤスクリーニングを実行した。ＦＡＣＳ（商標）データを２巡に渡って監視すると、抗ＩＬ−１３フレームワークバリアントは、抗ＩＬ−１３野生型と比較して、ＩＬ−１３抗原に対する結合の増加を示した（図４Ａ）。標識された抗原のシグナルに基づいて、上位１％のＩＬ−１３陽性細胞を選別し、選別出力物を配列決定した。抗ＩＬ−１３野生型は２巡目までに枯渇し（図４Ｂ）、軽鎖Ｍ４Ｌバリアントは大部分が富化した（配列決定されたクローンのうちの８２％）。加えて、重鎖バリアントＥ６Ｑ（配列決定されたクローンのうちの１４％）もまた富化した一方で、重鎖バリアントＳ２５Ｙ、Ｆ２７Ｌ、Ｌ２９Ｉ及びＬ４５Ｐならびに軽鎖バリアントＳ１２Ａはそれぞれ、配列決定されたクローンのうちの２％未満において観察された。
【０３４２】
２巡目の後に特定された抗ＩＬ−１３フレームワークバリアントが、機能的発現を増加させることを確認するために、抗ヒトＦｃウェスタンブロットを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるそれらの発現レベルを比較した。軽鎖バリアントＭ４Ｌが、最高の発現の増加を示し、抗ＩＬ−１３野生型よりも約２倍良好であり（図４Ｃ）、これはＢＡＤによる最良の富化と相関した。重鎖フレームワークバリアントＥ６Ｑ及びＦ２７Ｌもまた、抗ＩＬ−１３野生型よりも高い発現レベルを有した（図４Ｃ）一方で、残りのバリアントは、抗ＩＬ−１３野生型と類似した発現を有した。ウェスタンブロットデータは、ＦＡＣＳ（商標）平均蛍光強度によって測定される、ＩＬ−１３抗原に結合する個々のフレームワークバリアントについて見られる順位と相関した。ＫＤをゆうに超える抗原濃度を使用して、親和性差の寄与を最小化し、発現レベルが抗ＩＬ−１３フレームワークバリアントの特定を駆り立てることを確実にした。結合動態データを収集し、抗ＩＬ−１３フレームワークバリアントＭ４Ｌ、Ｅ６Ｑ、Ｆ２７Ｌ及び抗ＩＬ−１３野生型が、同等の親和性を有することを確認した（表２）。
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【０３４３】
以前の報告において、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて抗体発現を増加させる変異は、真核宿主系には適用されなかった（Ｄｅｍａｒｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１９：３２５−３３６，２００６、Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２５：４８５−５０６，２０１２）。スクリーニング戦略が、哺乳動物細胞内でのより高い分泌レベルと相関するバリアントを特定したかどうかを決定し、発現宿主間のバリアント選択の翻訳可能性を可能にするために、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現増加を提供した抗ＩＬ−１３半抗体のＨＥＫ２９３Ｔ細胞発現収率を検査した。増加は真核細胞内でよりもわずかに小さかったものの、２つの宿主間の発現増加におけるほとんど直線状の相関が観察された（図４Ｃ）。したがって、本明細書に記載されるスクリーニング戦略は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞及び哺乳動物細胞の両方において改善された発現を示すバリアントを特定するために使用することができる。
【０３４４】
発現の改善が、立体構造の安定性の増加と相関するかどうかを試験するために、示差走査蛍光定量（ＤＳＦ）を実行した。Ｍ４Ｌ、Ｅ６Ｑ、またはＦ２７Ｌ変異を有するＥ．ｃｏｌｉにおいて産生された抗ＩＬ−１３Ｆａｂの融解温度（Ｔｍ）を、野生型と比較した（図４Ｄ）。Ｍ４Ｌバリアントは、野生型抗ＩＬ−１３（６９．４±０．４℃のＴｍ）と比較して、熱安定性を約５℃だけ増加させた（７５．１±０．３℃のＴｍ）。しかしながら、Ｅ６Ｑ及びＦ２７Ｌ変異は、熱力学的安定性における有意な増加はもたらさなかった。Ｍ４Ｌバリアントの熱安定性の増加が、宿主非依存性であることを検証するために、抗ＩＬ−１３バリアントをＣＨＯ細胞内でＩｇＧとして産生させた。類似した５℃の熱安定性の増加が、真核宿主において見られた。
【０３４５】
ＢＡＤスクリーニングによって特定される抗ＩＬ−１３バリアントの組み合わせは相加的であり、機能的発現を更に増加させ得る。したがって、Ｍ４Ｌと、Ｅ６Ｑと、Ｆ２７Ｌとの組み合わせの、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞及び哺乳動物細胞における発現レベルを検査した（図４Ｃ）。二重の組み合わせＭ４Ｌ．Ｅ６Ｑは、両方の宿主において発現レベルの相加的な増加を示す。これらの２つのバリアントが、ＢＡＤスクリーニングにおいて高度に富化された唯一のバリアントであり、これは、我々の技術の選択能力を更に支持した。加えて、Ｍ４Ｌ変異を含有するバリアントの組み合わせのみが、熱安定性における５℃の増加を示した（図４Ｄ）。したがって、抗ＩＬ−１３治療的抗体の生物物理学的特性を更に改善するために、機能的発現及び熱安定性を増加させる１組のコアフレームワークバリアントを特定した。分子のインビトロ特性は改善された一方で、そのようなバリアントの臨床的関連性は試験されていない。
【０３４６】
実施例４：本発明の方法を使用する、改善された発現及び安定性を有する抗ＶＥＧＦ抗体の生成
実施例１及び３に記載される戦略が一般に適用可能であることを更に確認するために、ＢＡＤ法を使用して、異なる生殖系列からの抗体（抗ＶＥＧＦ．３抗体）の発現及び安定性を改善した。抗ＶＥＧＦ．３は、カッパ１軽鎖及びＶＨ３重鎖亜型を有する。実施例２に記載される抗ＩＬ−１３についてのアプローチと同様に、これらの亜型を有する天然に存在する抗体をＫａｂａｔデータベースから照合し、体細胞超変異からの可変性を有するフレームワーク位置を特定した（図７）。ＶＥＧＦ結合にとって重要であることが知られている位置、及び溶媒曝露されている位置は分析では除外して、それぞれ親和性または免疫原性に対する影響を低下させた。
【０３４７】
実施例１及び３に記載される方法を使用して、特定された抗ＶＥＧＦ．３フレームワークバリアント（４７の軽鎖バリアント、３６の重鎖バリアント、及び抗ＶＥＧＦ．３野生型を組み合わせる）でＢＡＤスクリーニングを実行した。上位０．５％のＶＥＧＦ陽性細胞を３巡かけて選別した。抗ＶＥＧＦ．３野生型は１巡目までに枯渇し、フレームワークバリアントは、進行中の巡について、抗ＶＥＧＦ．３野生型と比較してＶＥＧＦ抗原に対する結合の増加を示した（図５Ａ）。
【０３４８】
３巡目の後、クローンを富化し（図５Ａ）、ＢＡＤにおいて選択されたバリアントの発現及び熱安定性をＥ．ｃｏｌｉ細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞において試験した。抗ＶＥＧＦ．３重鎖バリアントＥ６Ｑ、Ｖ４８Ｌ、及びＶ４８Ｉ（それぞれ、配列決定されたクローンのうちの８５％、７％、及び３％）は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて３〜４．５倍だけ発現を改善した（図５Ｂ）。改善された発現が、安定性の増加と相関するかどうかを決定するために、ＤＳＦを実行した。全てのバリアントが、抗ＶＥＧＦ．３野生型と比較して、約３℃だけ改善された熱安定性を示した（図５Ｃ）。Ｅ６及びＶ４８の側鎖（図５Ｄ）は、可変重鎖ＶＥＧＦ−Ｆａｂのベータ−バレルのコア内に配置される（Ｆｕｈら（上記））。Ｅ６Ｑ、Ｖ４８Ｌ、及びＶ４８Ｉバリアントは、折り畳みを改善し、優れた安定性を提供したため、特定の理論に拘束されるものではないが、それは、ベータ−シート界面の詰め込みがわずかに不足しており、電荷またはより大きな側鎖の除去が詰め込みを改善し得ることを示唆した。Ｖ３７Ｉ重鎖バリアント（３巡目に配列されたクローンのうちの１％）は、より少ない程度（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて２．３倍）まで発現を改善し、熱安定性を２℃だけ増加させた（図５Ｃ）。Ｅ６及びＶ４８とは対照的に、Ｖ３７は、軽鎖との界面に見出され（図５Ｄ）、これは、抗体安定性及び折り畳みのために、鎖間接触だけでなく、鎖内接触も重要性であることを示す。
【０３４９】
次に、フレームワークバリアントを組み合わせて、相加的効果の潜在性を試験した。全ての二重バリアントは相加的効果を有し、Ｅ．ｃｏｌｉにおける機能的発現の改善は最大５．６倍（図５Ｂ）であった一方で、３つのバリアントの組み合わせは、抗ＶＥＧＦ抗体の発現は更には改善しなかった。重要なことに、抗ＶＥＧＦ野生型に対する類似した親和性は、全ての単一、二重及び三重バリアントについて観察された（表３）。
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【０３５０】
驚くべきことに、全てのバリアントの組み合わせについて、タンパク質安定性に対する相加的効果が観察され、バリアントを３つ全ての位置で組み合わせることによって、野生型Ｆａｂは最大７．６℃まで更に順次に安定した（図５Ｃ）。この印象的な熱安定性の増加は、治療的抗体の開発中、いかに本発明の方法を使用して、改善された熱安定性を有するバリアントを特定することができるかを強調する。
【０３５１】
これらのバリアント及び組み合わせが哺乳動物系において発現されたとき、発現収率のうちのいくつかは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて観察された結果と相関した（図５Ｂ）。Ｖ３７Ｉを除く全ての単一バリアントが、ほぼ２〜３倍、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における発現を改善した。Ｅ６ＱバリアントとＶ４８Ｉバリアントを組み合わせることによって発現の更なる増加が観察され、これはＶ３７Ｉバリアントによって更に改善された。最良の発現は、このＥ６Ｑ．Ｖ３７Ｉ．Ｖ４８Ｉバリアントについて見られ、これは、ＨＥＫ２９３Ｔ及びＥ．ｃｏｌｉにおいて、それぞれ抗体収率のほぼ４〜６倍の増加を提供した。
【０３５２】
まとめると、実施例２及び３に記載される試験は、抗体の発現収率及び立体構造の安定性は、フレームワーク領域内のいくつかの変更によって、抗原親和性を変更することなく有意に最適化され得ることを実証した。これらのフレームワークバリアントはＥ．ｃｏｌｉ細胞内で最初に特定されたものの、多くの場合、発現増加は、哺乳動物細胞に翻訳される。
【０３５３】
実施例５：全般的転写装置操作及び細菌抗体提示を使用する、細菌内での組み換えタンパク質発現の改善
改善された結合及び／または発現を有するバリアント結合ポリペプチドを特定することに加えて、本発明の方法を使用して、組み換えタンパク質（例えば、抗体、半抗体、及び抗体断片）の改善された発現のために細菌を操作することもできる。この実施例において、全般的転写装置操作（ｇＴＭＥ）をＢＡＤと併せて使用して、抗体の改善された発現を与える変異体シグマ因子タンパク質を発現する細菌をスクリーニングした。
【０３５４】
ｇＴＭＥアプローチは、ハイスループット様式でスクリーニングされ得る複雑な表現型を作製するために、全般的トランスクリプトームを制御するタンパク質をコードする遺伝子の（例えば、エラープローンＰＣＲを介した）変異原性に関与する。この実施例では、シグマ因子をエラープローンＰＣＲ変異原性に供したが、しかしながら、原理上、全般的なレベルで転写に影響を与える任意の遺伝子（例えば、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット（例えば、ＲｐｏＡ）、及び転写因子など）を使用することができる。シグマ因子は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、転写の開始に関与する。シグマ因子における変異は多数の遺伝子に影響を与え、複雑な表現型を作製し得る。表４は、Ｅ．ｃｏｌｉシグマ因子の一覧を示す。ＲｐｏＤは、成長の対数期に発現されるＥ．ｃｏｌｉにおける主要シグマ因子であり、それは、約２，０００個のプロモーターの発現を制御すると考えられる。図１４は、シグマ因子ＲｐｏＤ（σ７０）の構造の図を示す。領域１（図１４の領域１．１及び１．２）は、主要シグマ因子（ＲｐｏＤ及びＲｐｏＳ）内のみに存在し、それは、ＲＮＡポリメラーゼがシグマ因子に結合して、シグマ因子がＤＮＡプロモーター領域のみに結合することを確実にすることに関与する。領域１と領域２との間は、熱安定性において役割を果たすスペーシング領域である。領域２は、プロモーターの−１０要素（ＴＡＴＡＡＴ）に結合する。領域３は、開始部位でＡＴＰに架橋されるＲＮＡポリメラーゼの結合部位の近位にある。領域３は、ヘリックス・ターン・ヘリックスＤＮＡ結合領域を含有する。最後に、領域４は、プロモーターの−３５要素（ＴＴＧＡＣＡ）に結合する。領域４はまた、抗シグマ因子にも結合する。シグマ因子の変異原性は、いくつかの例示的、非限定的方法で、転写に影響を与えることが予想される。発現の増加は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼにより緊密に結合する変異体シグマ因子、または抗シグマ因子に結合する変異体シグマ因子から生じ、したがって、天然シグマ因子の阻害を防止し得る。発現の低下は、ＲＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡに結合し得る変異体シグマ因子から生じ、転写を防止し得る。
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【０３５５】
エラープローンＰＣＲ変異原性によって、変異体ＲｐｏＤタンパク質をコードするプラスミドのライブラリを生成した（図１５Ａ及び１５Ｂ）。プライマーＦ＿ｒｐｏＤ＿ＡａｔＩＩ５’−ＴＡＴＧＡＣＧＴＣＧＡＴＴＡＡＴＧＣＣＡＡＡＡＧＣＧＧＣＡＧＡ−３’（配列番号２５）及びＲ＿ｒｐｏＤ＿ＳｃａＩ５’−ＴＡＴＡＧＴＡＣＴＧＡＴＴＡＡＴＣＧＴＣＣＡＧＧＡＡＧＣＴＡＣ−３’（配列番号２６）を使用して、ｒｐｏＤ遺伝子及び天然プロモーターを増幅させ、標準的な方法を使用して、ＡａｔＩＩ及びＳｃａＩ部位で、ｐＡＣＹＣ１７７プラスミド（ｐ１５Ａ起源の複製及びカナマイシン耐性マーカー（ｋａｎ）を持つ）とともにライゲーションした。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補ったＬＢ寒天プレート上で、形質転換体を成長させた。プライマーＦ＿ｒｐｏＤ＿ｃｈｅｃｋ５’−ｃｔａｔｔｃｔｃａｇａａｔｇａｃｔｔｇｇｔｔｇ−３’（配列番号２７）及びＲ＿ｒｐｏＤ＿ｃｈｅｃｋ５’−ｇａｔｇｃｔｔｔｔｃｔｇｔｇａｃｔｇｇｔｇ−３’（配列番号２８）を使用してプラスミドを配列決定することによって、正しい構築物を確認した。ＧＥＮＥＭＯＲＰＨ（登録商標）ＩＩ  ＥＺ  Ｃｌｏｎｅ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を製造業者のプロトコルに従って使用して、断片変異原性を実行した。プラスミドライブラリをＮＥＢ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ細胞内で増殖させ、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補ったＬＢ寒天プレート上で選択した。配列決定を通してライブラリの多様性を決定し、誤差率は１〜４個の変異／ｋｂであることが見出された。ライブラリの推定サイズは、約１０６であった。
【０３５６】
次に、ＢＡＤスクリーニングのために、Ｌｐｐ遺伝子（Δｌｐｐ）の欠失を含有する細菌のライブラリを生成した（図１６Ａ及び１６Ｂ）。６６Ｃ４株（Δｌｐｐ、ΔｆｈｕＡ、Δｐｔｒ３、ｌａｃＩＱ、ｌａｃＬ８、ΔｏｍｐＴ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ）、ΔｄｅｇＰ、ｉｌｖＧ２０９６（ＩｌｖＧ＋；ＶａｌＲ））を、ｂｌａベータラクタマーゼ抗生物質耐性遺伝子及びテトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）遺伝子とともに、抗ＩＬ−１３抗体のＨＣ及びＬＣをコードするＭＤ１６９プラスミドで形質転換した。成功した形質転換体を、２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを補ったＬＢ寒天上で成長するそれらの能力について選択した。次に、結果として生じた形質転換体（６６Ｃ４ＭＤ１６９）を、特有の変異体ｒｐｏＤ及びカナマイシン抗生物質耐性遺伝子を発現する、上述の変異体ｒｐｏＤプラスミドのライブラリで形質転換した。成功した形質転換体を、２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン及び５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補ったＬＢ寒天上で成長するそれらの能力について選択した。ライブラリの試料を、配列決定によって多様性についてスクリーニングした。これは、約１０６の多様性を有する、ｒｐｏＤ変異体及び抗ＩＬ−１３抗体の両方を発現する６６Ｃ４ライブラリプールをもたらした。
【０３５７】
次に、ＢＡＤを使用して、６６Ｃ４ライブラリプールをスクリーニングした（図１７Ａ及び１７Ｂ）。ライブラリを、２２５ｒｐｍで、３０℃のＣＲＡＰ培地中で２４時間成長させた。本質的には実施例１及び２に記載されるように、１ＯＤ単位を回収し、ＥＤＴＡで透過処理し、蛍光標識された抗原（ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７で標識したヒトＩＬ−１３、「ＡＬＥＸＡ（登録商標）６４７−ｈｕＩＬ−１３」）及びＤＮＡ染色（ＳＹＴＯ（登録商標）９）を使用して染色し、ＭｇＣｌ２で再封着した。ＦＡＣＳＡＲＩＡ（登録商標）フローサイトメトリーデバイスを使用して、細胞を選別した。簡潔に述べると、細胞を見出すために、まずＳＹＴＯ（登録商標）９を使用して細胞をゲーティングした。次に、細胞を細胞複合性に基づいてゲーティングした。最後に、ＡＬＥＸＡ（登録商標）６４７−ｈｕＩＬ−１３シグナルに基づく上位１〜３％の細胞をフローサイトメトリーによって単離し、成長させ、手順を繰り返した。６６Ｃ４ライブラリプールを合計４巡のＢＡＤを使用する選別に供した。
【０３５８】
結果は、空ベクターまたは野生型ｒｐｏＤで形質転換した細胞と比較して、ＩＬ−１３結合に基づいて、各巡のＢＡＤが蛍光強度の増加をもたらしたことを実証し（図１８）、これは、収容される個体群プールが高発現クローンの数を増加させたことを示した。対照的に、不良に発現するクローンをＢＡＤ手順によって選別して取り除いた。４巡目の後、細胞をプレーティングし、９６個のコロニーをランダムに選択し、配列決定した。この配列決定から、ｒｐｏＤの３つの異なる変異体を特定した（図１９）。野生型ｒｐｏＤのアミノ酸配列を、配列番号２９に示す。ｒｐｏＤ変異体１のアミノ酸配列を、配列番号３０に示す。ｒｐｏＤ変異体２のアミノ酸配列を、配列番号３１に示す。ｒｐｏＤ変異体３のアミノ酸配列を、配列番号３２に示す。変異体１及び２は点変異に沿った切断を含んだ（変異体１はＰ５０４Ｓ及びＥ５１５Ｋを含んだ一方で、変異体２はＹ５７１Ｆを含んだ）一方で、変異体３は５個の点変異（Ｍ５１Ｌ、Ｙ１４３Ｈ、Ｖ２２９Ｉ、Ｋ２３６Ｎ、及びＤ４９２Ｖ）を含んだ。理論によって拘束されることを望むものではないが、切断型変異体は、抗シグマ因子により効率的に結合し得、組み換え抗体の改善された発現をもたらすと考えられる。個々に分析したｒｐｏＤ変異体は蛍光の増加を示し、これは抗体発現の増加を示した（図２０）。最高平均蛍光強度を有する変異体（変異体２）はまた、配列決定されたクローンの中でも最も豊富であった（図２０）。１ＯＤの細胞からの非還元可溶性試料を使用する３つのｒｐｏＤ変異体の抗体発現を、標準的な方法を使用して、ウェスタンブロットによって全長抗ＩＬ−１３の発現についても評価した（図２１Ａ及び２１Ｂ）。まず、変異体を本来の宿主株６６Ｃ４内で評価し（図２１Ａ）、これは、変異体２が最高レベルの発現を示したという点において、フローサイトメトリー分析と類似した結果を示した。抗ＩＬ−１３発現プラスミドＭＤ１６９及び３つの変異体を、異なる宿主株、６７Ａ６（ΔｆｈｕＡ、ΔｐｈｏＡ、ｉｌｖＧ２０９６（ＩｌｖＧ＋；Ｖａｌｒ）、ΔｍａｎＡ、Δｐｒｃ、ｓｐｒ４３Ｈ１、ｌａｃＩＱ、ΔｏｍｐＴ、ΔｍｅｎＥ７４２、ｄｅｇＰ２１０Ａ）内へと個々に形質転換して、シグマ因子変異体の転移可能性を評価した。変異体は全て、天然ＲｐｏＤタンパク質配列を発現する６７Ａ６と比較して、抗体発現を増加させることが見出され（図２１Ｂ）、これは、変異体が他の宿主Ｅ．ｃｏｌｉ株に転移され、全長抗ＩＬ−１３抗体の発現レベルの増加を与え得ることを実証した。
【０３５９】
結論として、本発明の方法を使用して、抗体及び半抗体を含む組み換えポリペプチドの改善された発現を有する細胞（例えば、細菌）を設計することができる。複数巡の選別に渡って細胞が生存可能のままであるという事実は、特に、複数の部位で変異を有する細菌のより高速な特定を含む、ハイスループットスクリーニングアプローチの文脈において、いくつかの利点を有する。本方法は、化学変異原性、標的化変異原性、またはトランスポゾンに基づく変異原性を含む、プラスミド由来ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのいずれかのいくつかの変異原性アプローチと適合する。
【０３６０】
他の実施形態
前述の発明は、明確な理解のために例証及び実施例によって多少詳細に説明されているものの、これらの説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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