(57)【要約】  本発明は、安定した多価の肺炎球菌多糖−タンパク質結合型ワクチン製剤の調製のための方法を提供する。本発明の安定した製剤は、各結合体について最適なパ−セントの吸着を示し、凝集を、ｉ）組み合わせた吸着では、より低いパ−セントの吸着を示す結合体については、個別または別々での吸着、ｉｉ）中性ｐＨから酸性ｐＨへの移行を伴うヒスチジン−コハク酸緩衝系、ｉｉｉ）０．５から約１．４の多糖対タンパク質の比、ｉｖ）製剤容器中の６枚羽ラシュトン型タービン羽根車を使用することによって防止できる。
2018516962.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
各結合体について最適な吸着を示す、安定した多価の肺炎球菌多糖−タンパク質結合型ワクチン製剤の調製のための方法であって、前記方法において、凝集を、
ｉ．組み合わせた吸着では、相対的により低い吸着を示す結合体については、個別または別々での吸着
ｉｉ．中性ｐＨから酸性ｐＨへの移行を伴うヒスチジン−コハク酸緩衝系、
ｉｉｉ．０．５から約１．４の多糖対タンパク質の比、および／または
ｉｖ．製剤容器中でのラシュトン型タービン羽根車の使用
の少なくとも１つを使用することによって防止する、方法。
【請求項２】
前記吸着が、７５〜９９％の範囲内である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に従って調製される、多価の肺炎球菌結合型ワクチン組成物であって、前記組成物が、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｆ、９Ｎ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、３３Ｆおよび４５から選択される多糖を有する、少なくとも２種の多糖タンパク質結合体を含む、組成物。
【請求項４】
請求項３に従って調製される、多価の肺炎球菌結合型ワクチン組成物であって、前記組成物が、血清型１、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆからの多糖を有する、少なくとも１０種の多糖タンパク質結合体を含む、組成物。
【請求項５】
請求項３に従って調製される、多価の肺炎球菌結合型ワクチン組成物であって、前記組成物が、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆからの多糖を有する、少なくとも１６種の多糖タンパク質結合体を含む、組成物。
【請求項６】
担体タンパク質が、ＣＲＭ１９７、肺炎球菌表面アドへシンＡ（ＰｓａＡ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、破傷風トキソイドのフラグメントＣ、百日咳トキソイド、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のタンパク質Ｄ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＴ、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からの外毒素Ａ、外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポーリン、トランスフェリン結合タンパク質、ニューモリシン、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌表面アドへシンＡ（ＰｓａＡ）、肺炎球菌ＰｈｔＤ、肺炎球菌表面タンパク質ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の防御抗原（ＰＡ）および炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の無毒化された、浮腫因子（ＥＦ）および致死因子（ＬＦ）、卵白アルブミン、キ−ホ−ルリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ならびにツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、特にＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイドまたはＰｓａＡからなる群から選択される、１種以上である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記多価の組成物が、
ｉ．担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質結合体、担体タンパク質としてＴＴを有する、少なくとも１種の多糖タンパク質、または
ｉｉ．担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質結合体、担体タンパク質としてＤＴを有する、少なくとも１種の多糖タンパク質、または
ｉｉｉ．担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質結合体、担体タンパク質として肺炎球菌表面アドへシンＡ（ＰｓａＡ）を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質、または
ｉｖ．担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質結合体、担体タンパク質としてＴＴを有する、少なくとも１種の多糖タンパク質、担体タンパク質としてＤＴを有する、少なくとも１種の多糖タンパク質、または
ｖ．担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質結合体、担体タンパク質としてＴＴを有する、少なくとも１種の多糖タンパク質、担体タンパク質として肺炎球菌表面アドへシンＡ（ＰｓａＡ）を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質、または
ｖｉ．担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質結合体、担体タンパク質としてＤＴを有する、少なくとも１種の多糖タンパク質、担体タンパク質として肺炎球菌表面アドへシンＡ（ＰｓａＡ）を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
血清型３が、ＣＲＭ１９７に好ましくは結合されており、血清型１８Ｃが、ＣＲＭ１９７に好ましくは結合されており、血清型４が、ＴＴまたはＤＴに結合させることができる、請求項３に記載の組成物。
【請求項９】
前記ヒスチジン−コハク酸緩衝液が、１ｍＭ〜２００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜４０ｍＭ、より好ましくは２０ｍＭの濃度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒスチジン−コハク酸緩衝液についてのｐＨの移行が、好ましくは６．８からｐＨ５．６〜５．８までになる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が、以下の工程
ｉ．所定の比、好ましくは０．８対１．４、より好ましくは１：１、および所定のｐＨ、好ましくは５．２〜５．９で、多糖分子をタンパク質担体に加えて、複数の別個の多糖−タンパク質結合体を得ること、
ｉｉ．所定の濃度を有する、ヒスチジン−コハク酸緩衝液中の第１のアルミニウム塩アジュバント上に、工程（ｉ）において得られた、前記複数の多糖−タンパク質結合体から選択される、多糖−タンパク質結合体の第１の所定のセットを、個別に吸着させ、前記アルミニウム塩アジュバントの量が、最終ワクチン製剤の０．５ｍｌ用量当たりＡｌ+++２０〜３７５μｇの範囲であり、多糖−タンパク質結合体の前記セットが、６Ａ、９Ｖおよび２３Ｆを含むこと、
ｉｉｉ．所定の濃度を有する、ヒスチジン−コハク酸緩衝液中の第２のアルミニウム塩アジュバント上に、工程（ｉ）において得られた、前記複数の多糖−タンパク質結合体から選択される、多糖−タンパク質結合体の第２の所定のセットを、組み合わせた様式で吸着させ、前記アルミニウム塩アジュバントの量が、最終ワクチン製剤の０．５ｍｌ用量当たりＡｌ+++２０〜３７５μｇの範囲であり、多糖−タンパク質結合体の前記セットが、１、５、６Ｂ、７Ｆ、１４、１９Ａおよび１９Ｆを含むこと、
ｉｖ．ラシュトンタービン平羽根車を用いて、工程（ｉｉ）において得られた、前記第１の吸着されたセットを、工程（ｉｉｉ）において得られた、前記第２の吸着されたセットとブレンドし、任意で、界面活性剤、好ましくはポリソルベート−２０、ならびに／または水銀系保存剤、たとえばチオメルサール、２−フェノキシエタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコールおよびそれらの混合物からなる群から選択される、少なくとも１種の保存剤を加えて、安定した多価の肺炎球菌多糖−タンパク質結合型ワクチン製剤を得ること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
特に、シアニル化化学を使用して担体タンパク質に共有結合された反復単位間のホスホジエステル結合を含有する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖について、サイジングおよび結合反応全体を通じて、多糖−多糖凝集を減少させて、それによって、それぞれの結合体に改善された免疫原性および安定性を提供するための方法であって、前記方法が、
ｉ）約４分間から約１０分間、約２２℃から約２５℃、１：０．８〜１：１の比で、１３０ＫＤａ〜１９０ＫＤａの平均サイズを有する多糖をシアニル化剤と反応させて、シアネートで活性化された多糖をもたらすこと、および
ｉｉ）３時間から５時間、約９から約９．５のｐＨ、１：１の比で、シアネートで活性化された多糖をタンパク質と接触させ、続いて、グリシンでクエンチし、前記結合方法が、サイジングされた多糖のシアニル化剤副生成物が媒介する解重合を最小化し、その後の多糖−多糖凝集を防止して、最小の遊離多糖含有量を有する結合体をもたらすこと
を含む、方法。
【請求項１３】
反復単位間にホスホジエステル結合を含む前記多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ａ、１９Ｆ、６Ａまたは６Ｂの１種に由来する、請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ａ多糖であり、シアニル化剤が、１−シアノ−４−ジメチル−アミノ−ピリジニウム−テトラフルオロボレートであり、４分間、２２℃、１：１の比で混合され、シアネートで活性化された多糖をもたらす、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ｆ多糖であり、シアニル化剤が、１−シアノ−４−ジメチル−アミノ−ピリジニウム−テトラフルオロボレートであり、８〜１０分間、２２℃、１：０．８の比で混合され、シアネートで活性化された多糖をもたらす、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記結合体が、１．６％未満の遊離多糖含有量を有する、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
吸着パーセントが、水酸化ナトリウムおよびクエン酸を使用して、ミョウバン吸着された結合体試料を溶解する工程を、特に含む、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定される、請求項２の方法。
【請求項１８】
ＰｓａＡが、アジュバントとして使用される、先行する請求項の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
リン酸アルミニウムゲルおよびＮａＣｌを含有する賦形剤を有する、１、５または１０用量の製剤として投薬されるまで、冷凍乾燥状態で得られる、前記結合型ワクチン製剤を貯蔵する工程を、さらに含む、先行する請求項の何れか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、子供の細菌性肺炎、髄膜炎、および敗血症の主因である。肺炎連鎖球菌（Ｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）によって引き起こされる、子供の死亡の最近の推定値は、世界中で毎年７０万から１００万件の範囲である。２０００年に、重篤な肺炎球菌性疾患の約１４５０万件の発症（不確定範囲１１１０万〜１８００万）があったと推定された。肺炎球菌性疾患は、月齢１〜５９ヶ月の子供の約８２万６千件の死亡（５８万〜９２万６千）を引き起こし、そのうちの９万１千件（６万３千〜１０万）が、ＨＩＶ陽性、７３万５千件（５１万〜８２万）が、ＨＩＶ陰性の子供であった。
【０００２】
何年にもわたって認可されてきた、多価の肺炎球菌多糖ワクチンは、成人、特に高齢者およびハイリスクの高齢者における、肺炎球菌性疾患の予防に有益であると判明した。しかし、乳幼児および低年齢小児は、非結合型肺炎球菌多糖に反応しにくい。当時、低年齢小児および乳幼児の浸襲性肺炎球菌性疾患を引き起こしていた、７種の最も頻繁に単離された血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ）を含有する、肺炎球菌結合型ワクチン、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）が、２０００年２月にアメリカ合衆国において最初に認可された。
【０００３】
さらに、Ｐｒｅｖｎａｒ（商標）１３（Ｗｙｅｔｈ）は、血清型１、３、４、５、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃおよび２３Ｆに加えて、６Ａ、６Ｂ、１９Ａ、１９Ｆからの多糖の結合体を含有する、承認ワクチンである。Ｓｙｎｆｌｏｒｉｘ（商標）（ＧＳＫ）は、１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆに対する防御能ならびに１９Ａおよび６Ａに対する交差防御能を提供する、別の承認ワクチンである。
【０００４】
ワクチン製剤は、一般的に、長い貯蔵有効期間および複数回投与用容器の使用の必要性に応えるために、安定していて、均一な不変性がなければならない。多糖−タンパク質結合体を含む、タンパク質をベースとするワクチンは、利用不可能な沈降したタンパク質生成物に起因してワクチンの有効な全濃度の低下をもたらし得る、タンパク質凝集および沈降を起こしやすい。特に、多糖−タンパク質結合型ワクチンは、担体タンパク質単独より、強い凝集傾向を有するようである（Ｂｅｒｔｉら、２００４、Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ８６、３〜９参照）。多糖−タンパク質結合型ワクチンのための製剤化の選択は、タンパク質凝集に大きな影響を与えることができる。Ｈｏら、２００１、Ｖａｃｃｉｎｅ１９、７１６〜７２５を参照。
【０００５】
いくつかの現存の多価の肺炎球菌多糖−タンパク質結合型ワクチン組成物が、世界中で開発されているにもかかわらず、個別の結合体の高吸着、および多糖−タンパク質結合体を有する免疫原性組成物の凝集／沈降がないことを実現するワクチン製剤に対する必要性が、当技術分野において今も継続してある。
【０００６】
かかる多価の肺炎球菌ワクチン中に伝統的に使用されるアジュバントは、アルミニウム塩、たとえば、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムであった。多くのその他の実験的なアジュバントが、知られているが、しかし、アルミニウム塩への吸着は、最も通常のワクチンアジュバント製剤のままである。それらの使用は広範に広がっているが、アルミニウム塩は、特定の抗原に常に適合性があるとは限らない可能性があり、したがって、多糖−タンパク質結合体のミョウバンへの吸着パーセントまたは抗原性に関して有意な差をもたらす。
【０００７】
アルミニウムアジュバントに吸着される結合型ワクチン候補の免疫学的特性および安定性は、多様なパラメーター、たとえば、ｉ）各抗原の抗原性、ｉｉ）結合のために使用される担体タンパク質の種類、およびｉｉｉ）使用されるアジュバントの種類に依存する。最も重要なことに、アジュバントへの抗原の吸着の程度は、製剤化方法のロット間の不変性およびワクチン製品の有効性へのあり得る影響を明示する、主要パラメーターの１つであることが、以前、報告された。さらに、多糖−タンパク質結合体の吸着パーセントは、製剤の貯蔵で、または困難な状況下、たとえば、温度逸脱で、さらに下落し得る。生物学的製剤の標準化に関するＷＨＯ専門家会議の第５４回会合、Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ＆  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ、１７〜２１、２００３年１１月、Ｃａｒｌ  Ｅ．Ｆｒａｓｃｈ、Ｓｅｓｓｉｏｎ  ＩＶ、Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩＩ、ポルトガル、２００８を参照。
【０００８】
肺炎球菌多糖−タンパク質結合体のための欧州の規制機関（ＥＭＥＡ）のガイドラインの通り、吸着の完全性（結合されていない結合体％）は、ミョウバン含有量、無菌性、同一性および遊離多糖含有量とともに、決定的な品質管理パラメーターとして考えられるべきである。Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｆｌｏｒｉｘ２００９、Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  Ｎｏ．ＥＭＥＡ／Ｈ／Ｃ／０００９７３を参照。ＷＨＯは、ミョウバン沈降抗原（たとえば、ジフテリアおよび破傷風トキソイド）に対する吸着を最大にし、これらのワクチン中の抗原の少なくとも８０％が吸着されることを勧告している。
【０００９】
多糖−タンパク質結合体を製造する間に、製剤は、多糖−多糖型、タンパク質−タンパク質型または多糖−タンパク質型の凝集体を含み得る。かかる凝集体は、最終製品においてもまた観察され、多糖−タンパク質結合型（複数可）のワクチンを詰めたバイアルの４％から１０％の不良品につながり、したがって、結合型ワクチンの安定性および有効性に影響を与える。
【００１０】
多糖およびその結合体の凝集および安定性に関する、上で検討してきた制限を考慮すると、肺炎球菌結合型ワクチン製造の最終製剤段階への下流処理全体を通じて、凝集を減少させ、前記多糖を安定化させる、明確な必要性がまだある。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、アルミニウム塩を含むワクチンの安定性における改善、ならびに特に、凝集を最小化するための方法および多価の肺炎球菌多糖−タンパク質結合型ワクチン中の個別の結合体の吸着パーセントにおける改善を提供する。本発明の発明者らは、多糖−タンパク質結合体の組み合わせた吸着および１：１を超える多糖対タンパク質の比を使用した結果、ｉ）血清型６Ａ、９Ｖおよび２３Ｆについての肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）結合体に対しては５５％未満の吸着パーセント、ｉｉ）残りの血清型結合体に対しては約８０％から９０％の吸着パーセントとなり、したがって、所与の多価の肺炎球菌結合型製剤について個々の血清型結合体に対する完全な吸着を達成できないことを観察した。また、６．８〜７．０のｐＨを使用することによって調製されたワクチン製剤が、約４から１０％の凝集およびより低い吸着をもたらすことも観察した。
【００１２】
本発明は、各結合体について７５〜９９％の最適な吸着を示す、安定した多価の肺炎球菌多糖−タンパク質結合型ワクチン製剤の調製のための方法に関するものであり、前記方法において、凝集を、
ａ．組み合わせた吸着では、相対的により低い吸着を示す結合体については、個別または別々での吸着、
ｂ．中性ｐＨから酸性ｐＨへの移行を伴うヒスチジン−コハク酸緩衝系、
ｃ．０．６から約１．４の多糖対タンパク質の比、および／または
ｄ．製剤容器中での６枚羽ラシュトン型タービン羽根車の使用
の少なくとも１つを使用することによって防止する。
【００１３】
本発明は、ホスホジエステル結合を含有する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖、特に１９Ａ、１９Ｆ、６Ａおよび６Ｂについて、改善された免疫原性およびより少ない遊離多糖含有量を有する、多糖−タンパク質結合体を調製するための方法もまた開示している。前記結合方法は、サイジングされた多糖のシアニル化剤副生成物が媒介する解重合を最小化し、その後の多糖−多糖凝集を防止し、したがって、不安定な多糖を安定化させる。凝集を減少させるカギは、１００〜２００ＫＤａの範囲のサイジングされた多糖の使用、および（１）：（０．８〜１）の範囲の多糖対ＣＤＡＰ（シアニル化剤）の比に帰することができる。
【００１４】
本発明の通り調製された免疫原性組成物は、多糖−多糖間の凝集の減少、および改善された安定性および免疫原性を有する、多糖−タンパク質結合体を実現する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＤＭＡＰ処理前のサイジングされた１９Ａ  ＰｎＰｓ（１７８ＫＤａ）のＳＥＣ−ＨＰ−ＲＩプロファイル
【図２】２４時間ＤＭＡＰ処理後の７０ＫＤａ（Ａ）および７２時間ＤＭＡＰ処理後の１４．５ＫＤａ（Ｂ）のサイジングされた１９Ａ  ＰｎＰｓのＳＥＣ−ＨＰ−ＲＩプロファイル−解重合プロファイル
【図３−１】サイジングされた１９Ａ  ＰｎＰｓ（１７８ＫＤａ、Ａ）、およびＣＤＡＰが媒介する、活性化された多糖（５Ｂ、５Ｃおよび５Ｄ）、５Ｅ（１０ＫＤａ  ＤＦなしの結合体）、５Ｆ（１０ＫＤａ  ＤＦありの結合体）、５Ｇ−サイジングされた１９Ａ／５Ｈ−活性化された１９Ａ（１９Ａのための改変された、Ｐｓ：ＣＤＡＰの比１：１）（１０ＫＤａダイアフィルトレーション工程を使用しない結合方法）の経時的凝集のＳＥＣ−ＨＰ−ＲＩプロファイル
【図３−２】図３−１と同じ
【図３−３】図３−１と同じ
【図３−４】図３−１と同じ
【図４−１】サイジングされた１９Ｆ  ＰｎＰｓ（１５７ＫＤａ、Ａ）のＳＥＣ−ＨＰ−ＲＩプロファイル、およびＣＤＡＰが媒介する、活性化された多糖（Ｂ）、６Ｃ／６Ｄ（１９Ｆのための改変された、Ｐｓ：ＣＤＡＰの比１：１）（１０ＫＤａダイアフィルトレーション工程を使用しない結合方法）の経時的凝集
【図４−２】図４−１と同じ
【図５】６枚羽ラシュトン型タービン平羽根車
【図６】吸着の手順
【詳細な説明】
【００１６】
アルミニウム塩を含むワクチンの安定性における改善、ならびに特に、凝集を最小化するための方法および多価の肺炎球菌多糖−タンパク質結合型ワクチン中の個別の結合体の吸着パーセントにおいける改善を提供することが、本発明の目的である。本発明の発明者らは、多糖−タンパク質結合体の組み合わせた吸着および１：１を超える多糖対タンパク質の比の使用が、ｉ）血清型６Ａ、９Ｖおよび２３Ｆに対する肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）結合体についての５５％未満の吸着パーセント、ならびにｉｉ）残りの血清型結合体についての約８０％から９０％の吸着パーセントをもたらし、したがって、所与の多価の肺炎球菌結合型製剤について個々の血清型結合体に対する完全な吸着を達成できないことを観察した。また、６．８から７．０のｐＨを使用することによって調製されたワクチン製剤が、約４から１０％の凝集およびより低い吸着をもたらすことも観察した。
【００１７】
多糖を、特許ＷＯ２０１３０８８４４８Ａ１に記載されている方法を使用して製造した。この特許において、前記方法は、（ａ）ＣＰを発現する細菌の株の種菌を提供すること、（ｂ）ｐＨ７．２での発酵によって株を培養することであって、供給培地添加の速度が、予め定めたｐＨを維持するためのアルカリ混合物添加の速度と等価であること、ｃ）０．１〜０．５ｖｖｍの空気流量で、５０〜１５０ＲＰＭでの撹拌下、３５〜３８℃で培地を発酵させることを含む。
【００１８】
多糖を、特許ＷＯ２０１２１２７４８５に記載されている方法によって精製した。本方法によって調製されたＰｎ−Ｐｓは、約６０から７０％の回収率を示し、Ｃ型多糖混入が、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）後またはイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）前のＣ−Ｐｓ含有量と比較して、１から５分の１に減少し、タンパク質混入が、１％未満であり、核酸混入が、１％未満である。前記方法を、研究、試験および商業規模で実行した。
【００１９】
この方法は、ＣＴＡＢ／アルコールに基づく方法と比較した場合、８０〜９０％少ない時間消費および９０％少ないコストで、多糖を精製できる。
【００２０】
本発明の重要な一態様によれば、ｉ）約０．８から１．４の多糖対タンパク質の比を使用すること、ｉｉ）吸着しにくい肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）結合体のために、個別または別々での吸着を使用すること、ｉｉｉ）製剤化する間、より低いｐＨを保つことによって、７５〜９５％の改善された吸着パーセントを、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）結合体について得ることができる。
【００２１】
第１の態様の一側面によれば、好ましい、多糖対タンパク質の比は、１：１である。
【００２２】
第１の態様の第２の側面によれば、前記組成物は、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｆ、９Ｎ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、３３Ｆおよび４５から選択される多糖を有する、少なくとも２種の多糖タンパク質結合体を含む。
【００２３】
第１の態様の第３の側面によれば、２、３、４、６Ａ、８、９Ｖ、９Ｆ、９Ｎ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、３３Ｆおよび４５から選択される、何れかの肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型のために、好ましくは、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ａ、９Ｖ、および２３Ｆために、吸着の個別様式を使用できる。
【００２４】
第１の態様の好ましい側面によれば、多価の肺炎球菌結合型ワクチンは、１０価であり、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ａ、９Ｖ、および２３Ｆを、別々のブレンドとして個別に吸着し、次に、組み合わせた様式で吸着させた、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、５、６Ｂ、７Ｆ、１４、１９Ａおよび１９Ｆの混合物を含む、別のブレンドに加える。
【００２５】
第１の態様の別の好ましい側面によれば、多価の肺炎球菌結合型ワクチンは、１１、１３、１５、１６またはそれ以上の価数であり、２、３、４、６Ａ、８、９Ｖ、９Ｆ、９Ｎ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、３３Ｆおよび４５の群から選択される、少なくとも１種の肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型を、個別に吸着する、または別々のブレンドとしてより小さい群で吸着し、次に、組み合わせた様式で吸着した、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、５、６Ｂ、７Ｆ、１４、１９Ａおよび１９Ｆの混合物を含む、別のブレンドに加える。
【００２６】
第１の態様のさらに別の好ましい側面によれば、多価の肺炎球菌結合型ワクチンは、１６価であり、２、３、４、６Ａ、９Ｖ、１２Ｆ、１５Ｂ、１８Ｃ、および２３Ｆの群から選択される、少なくとも１種の肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型を、個別に吸着する、または別々のブレンドとしてより小さい群で吸着し、次に、組み合わせた様式で吸着した、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、５、６Ｂ、７Ｆ、１４、１９Ａおよび１９Ｆの混合物を含む、別のブレンドに加える。
【００２７】
本発明の第２の態様は、ｉ）中性ｐＨから酸性ｐＨへのｐＨ移行を使用することおよびｉｉ）ヒスチジン−コハク酸緩衝液の組合せの使用によって、多価の肺炎球菌多糖−タンパク質結合型製剤中の凝集を、完全に防止できる。
【００２８】
第２の態様の一側面によれば、前記ｐＨ移行は、６．８から、これらに限定されるわけではないが、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８および５．９から選択されるｐＨ、より好ましくは６．８から、５．４、５．５、５．６、５．７および５．８から選択されるｐＨになることが可能である。
【００２９】
第２の態様の別の側面によれば、前記ヒスチジン−コハク酸緩衝系は、１ｍＭ〜２００Ｍの濃度を有することが可能である。濃度は、好ましくは、少なくとも１ｍＭ（たとえば、最大で、２００ｍＭ、１５０ｍＭ、１００ｍＭ、９０ｍＭ、８０ｍＭ、７０ｍＭ、６０ｍＭ、５０ｍＭ、４０ｍＭ、３０ｍＭ、２０ｍＭ、１０ｍＭ等）である。より好ましくは、組成物中のヒスチジン−コハク酸緩衝液の濃度は、１０ｍＭ〜４０ｍＭである。
【００３０】
本発明の第３の態様は、肺炎球菌バルク結合体中のフロキュールまたは凝集形成を、製剤容器中で、機械撹拌式、軸方向および半径方向型羽根車の代わりに、ラシュトンタービン平羽根車を使用することによって、防止できる。
【００３１】
本発明の免疫原性組成物の安定性は、よく知られた標準技法および当業者にとってのルーティンを使用して、容易に測定される。たとえば、免疫原性組成物は、これらに限定されるわけではないが、ＥＬＩＳＡ、光散乱、吸光度、沈降速度遠心分離、沈降平衡遠心分離、円二色性（ＣＤ）、ローリーアッセイ、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ等を含む方法によって、結合体の吸着パーセント、安定性、凝集、免疫原性、微粒子形成、タンパク質（濃度）減少等についてアッセイされる。
【００３２】
好ましい態様において、本発明は、多価の肺炎球菌結合型ワクチン中の結合体の抗原性に影響を与えることなく、結合型／結合された多糖を直接定量できる、新規のＥＬＩＳＡを提供する。この同じ方法を、吸着パーセントのための指示パラメーターとしての製剤マトリックス中の吸着されなかった結合体含有量の定量のために使用でき、結合体は、７０％超の吸着を示す。好ましいことに、前記ＥＬＩＳＡは、担体タンパク質の抗原性ならびに結合された多糖に影響を与えず、ミョウバンアジュバントからの結合体の脱着を含む、プレアッセイ工程を使用できる。より具体的には、ミョウバン吸着された結合体試料の溶解は、水酸化ナトリウムおよびクエン酸を使用して、達成される。
【００３３】
担体タンパク質は、これらに限定されるわけではないが、ＣＲＭ１９７、Ｐ４、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、破傷風トキソイドのフラグメントＣ、百日咳トキソイド、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のタンパク質Ｄ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＴ、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からの外毒素Ａ、外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポーリン、トランスフェリン結合タンパク質、ニューモリシン、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌表面アドへシンＡ（ＰｓａＡ）、肺炎球菌ＰｈｔＤ、肺炎球菌表面タンパク質ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の防御抗原（ＰＡ）ならびに炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉ）の無毒化された、浮腫因子（ＥＦ）および致死因子（ＬＦ）、卵白アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、特にＣＲＭ１９７またはＰ４の群から選択できる。
【００３４】
好ましい態様によれば、前記多価の組成物は、
ｉ）担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質結合体、担体タンパク質としてＴＴを有する、少なくとも１種の多糖タンパク質、または
ｉｉ）担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質結合体、担体タンパク質としてＤＴを有する、少なくとも１種の多糖タンパク質、または
ｉｉｉ）担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質結合体、担体タンパク質として肺炎球菌表面アドへシンＡ（ＰｓａＡ）を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質、または
ｉｖ）担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質結合体、担体タンパク質としてＴＴを有する、少なくとも１種の多糖タンパク質、担体タンパク質としてＤＴを有する、少なくとも１種の多糖タンパク質、または
ｖ）担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質結合体、担体タンパク質としてＴＴを有する、少なくとも１種の多糖タンパク質、担体タンパク質として肺炎球菌表面アドへシンＡ（ＰｓａＡ）を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質、または
ｖｉ）担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質結合体、担体タンパク質としてＤＴを有する、少なくとも１種の多糖タンパク質、担体タンパク質として肺炎球菌表面アドへシンＡ（ＰｓａＡ）を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質
を含むことができる。
【００３５】
別の態様において、血清型３に結合した好ましい担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７であり、血清型４には、ＴＴまたはＤＴであり、血清型１８Ｃには、ＣＲＭ１９７である。
【００３６】
本発明の別の態様は、最終製剤中の担体タンパク質としてＰｓａＡを使用することを含む。ＰｓａＡは、アジュバントとして、最終製剤中に、また使用できる。
【００３７】
或る種の態様において、本発明の多価の製剤は、界面活性剤、好ましくはポリソルベート２０を含むことができる。或る種の態様において、製剤中のポリソルベート２０の最終濃度は、ポリソルベート２０重量／製剤体積、０．０１％から１０％である。さらなるその他の態様において、製剤中のポリソルベート２０の最終濃度は、ポリソルベート２０重量／製剤体積、０．０１％である。その他の態様において、製剤中のポリソルベート２０の最終濃度は、ポリソルベート２０重量／製剤体積、０．０５％である。さらなるその他の態様において、製剤中のポリソルベート２０の最終濃度は、ポリソルベート２０重量／製剤体積、０．１％である。別の態様において、製剤中のポリソルベート２０の最終濃度は、ポリソルベート２０重量／製剤体積、１．０％である。さらに別の態様において、製剤中のポリソルベート２０の最終濃度は、ポリソルベート２０重量／製剤体積、１０．０％である。
【００３８】
本発明の多価のワクチン製剤は、これらに限定されるわけではないが、水銀系保存剤（たとえば、チオメルサール）、２−フェノキシエタノール、メチルパラベン、プロピルパラベンおよびベンジルアルコール（またはそれらの混合物）の群から選択される保存剤を含むことができる。
【００３９】
本発明の好ましい態様によれば、前記多価の肺炎球菌多糖−タンパク質結合型ワクチン製剤、好ましくは、１０または１６価は、リン酸アルミニウムに吸着された結合体、ヒスチジン、コハク酸、塩化ナトリウム、ポリソルベート２０およびチオメルサールを含むことができる。
【００４０】
本発明のワクチン組成物は、０．５ｍｌ用量毎に、Ａｌ+++２０〜３７５μｇ、２０〜３００μｇ、２０〜２００μｇ、２５〜１５０μｇの量で、アルミニウム塩アジュバントを加える工程を含むことができる。
【００４１】
典型的には、免疫原性組成物は、注射剤として、溶液または懸濁液の何れかとして、調製される。注射の前の液体媒体中の溶液または懸濁液に適切な、固体形態もまた、調製されてよい。調製物は、アジュバント効果を増強するため、乳化またはリポソーム中に被包してもまたよい。組成物の直接的な送達は、一般的に、非経口（たとえば、皮下に、腹腔内に、静脈内もしくは筋肉内に注射、または組織の間質空間に送達される）となる。組成物は、病変中にもまた投与できる。その他の投与方法としては、経口および肺内投与、座薬、および経皮的にまたは経皮適用針、および皮下噴射器が挙げられる。投薬治療は、単回投与計画または複数回投与計画（たとえば、追加抗原投与を含む）であってよい。
【００４２】
好ましくは、本発明のワクチンは、溶液中でまたは冷凍乾燥されて貯蔵されてよく、本発明の冷凍乾燥ワクチン組成物は、リン酸アルミニウムゲルおよびＮａＣｌを含有する賦形剤を有する、１、５または１０用量の製剤として得ることができる。
【００４３】
本発明の別の態様は、製剤容器中でのラシュトンタービン平羽根車の使用を含む（図５参照）。
【００４４】
［実施例］
例１
発酵
方法は、（ａ）ＣＰを発現する細菌の株の種菌を提供すること、（ｂ）ｐＨ７．２での発酵によって株を培養することであって、供給培地添加の速度が、予め定めたｐＨを維持するために、アルカリ混合物添加の速度と等価であること、（ｃ）０〜０．５ｖｖｍの空気流量で、５０〜１５０ＲＰＭでの撹拌下、３５〜３８℃で培地を発酵させることを含む。
【００４５】
例２
莢膜多糖の精製
肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖血清型１９Ｆの精製（ＨＩＣ、続いてＩＥＣ）
肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ｆの発酵培養からの澄んだブロス５Ｌを、１００ＫＤａのＭＷＣＯ膜を使用して、５００ｍｌまで濃縮し、ダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションを、中性ｐＨで２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液を使用して達成し、続いて、注射用水（ＷＦＩ）でダイアフィルトレーションした。
【００４６】
ヌクレアーゼを、多糖溶液に加えて、最終濃度８Ｕ／ｍｌの溶液を達成した。酵素処理を、撹拌しながら、１０±２時間、３７０℃で実行した。
【００４７】
硫酸アンモニウムを、５０％飽和まで、ヌクレアーゼ処理した多糖溶液に加え、１２±２時間、２〜８℃でインキュベートした（血清型５および４を除く）。混合物を、遠心分離にかけた。ペレット（沈降物）を、廃棄した。溶液（約５００ｍｌ）を、ＮａＣｌを使用し、続いて、冷却したＷＦＩによって、１００ｋＤダイアフィルトレーションを受けさせる。緩衝液および高塩濃度を有する多糖を含有する、このダイアフィルトレーションした溶液を、ＨＩＣカラムに充填した。
【００４８】
疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム（３００ｍｌ）を、５０％飽和硫酸アンモニウム緩衝液で平衡化し、次に、多糖溶液（５００ｍｌ）を、ｐＨ範囲６から８内で、好ましくは、ｐＨ６からｐＨ７で、カラムに充填した。カラムを、５０％飽和硫酸アンモニウムを含有する緩衝液で、さらに洗浄した。これらの条件下で、多糖を、カラムからのフロースルーおよび平衡化洗浄で回収した。
【００４９】
次に、多糖溶液を、１００ＫＤａのＭＷＣＯフィルターを使用して濃縮し、次に、ＮａＣｌおよび注射用水（ＷＦＩ）で、ダイアフィルトレーションした。
【００５０】
イオン交換クロマトグラフィーカラム（３００ｍｌ）（強い陰イオン交換体）を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化し、次に、多糖溶液（５００ｍｌ）を、ｐＨ範囲６から８内で、好ましくは、ｐＨ６．５からｐＨ７．５で、カラムに充填した。カラムを、緩衝液で、さらに洗浄した。吸着された多糖を、１．０ＭのＮａＣｌを使用する段階勾配溶離で溶離した（多様な多糖を、ＮａＣｌの異なるイオン強度で溶離した）。
【００５１】
次に、多糖溶液を、１００ＫＤａのＭＷＣＯフィルターを使用して濃縮し、次に、注射用水（ＷＦＩ）で、ダイアフィルトレーションした。
【００５２】
ダイアフィルトレーションした多糖溶液を、０．２２μ膜フィルターを通じて、ポリプロピレン瓶中に濾過した。精製した多糖を、−２０±５０℃で凍結して貯蔵した。
【００５３】
上の方法を、血清型４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆについても、また使用した。
【００５４】
結果
ＨＩＣ後およびイオン交換クロマトグラフィー後のＣ型多糖を、Ｈ１／Ｐ３１  ＮＭＲスペクトルによって推計した。方法は、混入物含有量の２〜３分の１への減少をもたらした。
【００５５】
例３
多糖のサイジング
ホモジナイザー（マイクロ流体学）装置を使用して、活性化工程の前に多糖の分子量を減少させた。１９Ａについて、サイズ減少を、２４〜２８ＫＰＳＩで行った一方で、１９Ｆについて、サイズ減少を、２６〜３０ＫＰＳＩで行い、パス回数は、約１から３であった。サイジングされた多糖を、ダイアフィルトレーションし、濃縮し、続いて、０．２２μで濾過した。次に、サイジングされた多糖を、平均分子量の推計のためにＨＰＳＥＣ−ＲＩを受けさせた。
【００５６】
例４
一般的結合方法
担体タンパク質への多糖の結合を、ＬｅｅｓらのＣＤＡＰ結合方法（Ｖａｃｃｉｎｅ２６、１９０〜１９８、１９９６）を使用して、実行した。機械的にサイズ減少させた多糖（天然型で使用された、または６Ａのサイズに依ってサイジングされた、６Ａを除く）を、ＮａＣｌ、２Ｍに溶解させた。１００ｍｇ／ｍｌストック溶液からの（アセトニトリル中の）ＣＤＡＰを、多糖：ＣＤＡＰの比の通りに、多糖溶液に加えた。およそ１分後、２ＭのＮａＯＨを加えて、特有の活性化ｐＨを得た。多糖の活性化を、２２℃、４〜１０分間、このｐＨで実施した。ＣＲＭ１９７（量は、初期のＰｓ／タンパク質の比に依る）を、活性化された多糖に加え、カップリング反応を、血清型に依って、３〜８時間、特有のｐＨで実施した。次に、反応を、２２０℃、１時間で、および１２０℃、一晩で、グリシンによりクエンチした。次に、結合体を、３００ｋＤａから５００ｋＤａのダイアフィルトレーション、続いて１００ｋＤａのダイアフィルトレーションによって、精製した。さらに、精製された０．２２ｕｍ濾過結合体の、多糖およびタンパク質の含有量を、測定した。
【００５７】
表１−１０種の血清型についての血清型特有の結合反応パラメーターのバリエーション
【００５８】
【表１】
2018516962.tif 000003
【００５９】
表２：製剤化方法の１−および２−ブレンドアプローチにおける、ＰＣＶ−１０製剤の個々の血清型の吸着パーセントの比較
【００６０】
【表２】
2018516962.tif 000004
【００６１】
１ブレンドアプローチにおいて、血清型６Ａ、９Ｖ、および２３Ｆは、製剤中で吸着しにくかった一方で、２ブレンドアプローチについては、吸着パーセントは、全ての血清型について、＞７０％であった。
【００６２】
表３：ＰＣＶ−１０製剤の凝集挙動に対する、ｐＨ移行の効果
【００６３】
【表３】
2018516962.tif 000005
【００６４】
ｐＨ６．８と比較した場合、ＰＣＶ１０製剤について、ｐＨ５．６〜５．８について、凝集体は、見つからなかった。
【００６５】
多糖対タンパク質の比（１：１）が、製剤中の肺炎球菌結合体の吸着の程度に対する有利な効果を有することが分かった。
【００６６】
表４：製剤中の肺炎球菌結合体（血清型６Ａ）の吸着に対する、Ｐｓ対ＣＲＭ１９７の比の効果
【００６７】
【表４】
2018516962.tif 000006
【００６８】
多糖対タンパク質の比の効果が、結合体の吸着に対して観察された。Ｐｓ対タンパク質の比、＞１．５を有した６Ａ結合体は、貧弱な吸着を示した。ＰＣＶ−１０製剤中に使用される血清型のほとんどは、血清型６Ａを含む、多様な血清型の最適の吸着をもたらす、０．６〜１．３の範囲内のＰｓ：Ｐｒの比を含有した。６Ａ血清型について達成された吸着データおよびＰＣＶ−１０製剤の経験に基づいて、１６価を製剤化する間に、同様の範囲内の残りの６つの結合体のＰｓ：Ｐｒの比は、全ての１６の血清型結合体の着実な吸着を、確実になし得ることが、推定できる。
【００６９】
表５：様々な容器のためのラシュトンタービン平羽根車の仕様
【００７０】
【表５】
2018516962.tif 000007
【００７１】
例６
ＥＬＩＳＡ手順
抗原含有量および吸着パーセントを、改変サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、測定した。
【００７２】
従来のサンドイッチＥＬＩＳＡが、以下の試験条件／アッセイ条件に関して改変され、それによって、以下の有利な特質を有する。
ｉ．１０価ワクチンにおいて、９つのその他の結合された抗原の存在下、結合された多糖を定量する特質、
ｉｉ．吸着が８０％超である、リン酸アルミニウムゲルから、全ての１０の結合体を溶離する特質、
ｉｉｉ．結合体の抗原性を損傷することなく、ｐＨ９の場合でさえも、結合体の捕捉が起こる特質。
【００７３】
抗原含有量および吸着パーセントを、下に示した手順の通り、ＥＬＩＳＡを使用して、測定した。
【００７４】
１日目
１．プレートを、捕捉抗体（抗−担体タンパク質抗体）でコーティングし、続いて、３５±５℃で０．５〜２時間、インキュベートした。
２．プレートを、ＥＬＩＳＡプレートウォッシャーを使用して、３〜６回洗浄した。
３．プレートを、ブロッキング緩衝液（１Ｘ  ＰＢＳ中の３％ＢＳＡおよび血清型１４および９Ｖのためのトリス緩衝液）でブロッキングし、続いて、３０±５℃で１．５〜２．５時間、インキュベートした。
４．プレートを、ＥＬＩＳＡプレートウォッシャーを使用して、３回洗浄した。
５．試料を、プレートに加えた。
６．プレートを、５±３℃で一晩、インキュベートした。
【００７５】
２日目
１．プレートを、室温に到達させた。
２．一次抗体を、プレートを３回洗浄した後で加え、続いて、３０分間、２５±２のＲＴで、インキュベートし、続いて、洗浄した。
３．２次抗体を加え、続いて、３０分間、２５±２℃で、インキュベートした。
４．基質ＴＭＢを加え、続いて、暗闇で１５〜２０分間、ＲＴで、インキュベートした。
５．停止液を、加えた。
６．プレートを、４５０ｎｍで測定した。
【００７６】
担体タンパク質のエピトープを害することのない、試料の溶解のための手続き
好適な量の０．５Ｍ〜２ＭのＮａＯＨを、ワクチン試料２ｍｌに加えた。溶液が透明になるまで、前記試料を、穏やかにボルテックスさせた。溶液が透明になるまで、溶液のｐＨを、９〜１２に調整した。溶液のｐＨを、０．５Ｍから２Ｍのクエン酸を使用して、６〜７．４に戻した。前記溶液を、５分間、３０００から６０００ｘｇで遠心分離にかけ（溶解された試料）、上澄みを、試験のために収集した。
【００７７】
表６
【００７８】
【表６】
2018516962.tif 000008
【００７９】
例７
肺炎球菌結合型ワクチン−１０価（ＰＣＶ１０）
表７−ＰＣＶ１０組成物
【００８０】
【表７】
2018516962.tif 000009
【００８１】
例８
製剤１（ＰＣＶ１６）
肺炎球菌結合型ワクチン−１６価（ＰＣＶ１６）
表８−ＰＣＶ１６組成物「Ｉ」
【００８２】
【表８】
2018516962.tif 000010
【００８３】
例９
製剤１（ＰＣＶ１６）
表９−ＰＣＶ１６組成物「ＩＩ」
【００８４】
【表９】
2018516962.tif 000011
【００８５】
例１０
Ｉ）ＤＭＡＰ存在下でのサイジングされたＰｎＰｓ（１９Ａ、１９Ｆ、６Ａおよび６Ｂ）の解重合
反応溶液中のサイジングされたＰｎＰｓを、１：１．５の比で、ＤＭＡＰによって処理し、ＳＥＣ−ＨＰ−ＲＩによって、その解重合プロファイルについて調査した。
【００８６】
結果
１９Ａ  ＰｎＰｓのみが、ＤＭＡＰの存在下で解重合を受ける一方で、ＰｎＰｓ（１９Ｆ、６Ａおよび６Ｂ）を含有する、その他のホスホジエステルは、未変化のままであることが、観察された。図１（ＤＭＡＰなし）およびＰｎＰｓのＤＭＡＰが媒介する解重合を示す図２を参照。
【００８７】
１９Ａのかかる解重合を最小化するために、活性化されたＰｎＰｓを、２ＭのＮａＣｌを使用し、１０ＫＤａダイアフィルトレーションを受けさせて、ＣＲＭ１９７との結合の前に、反応溶液から形成されたＤＭＡＰを除去した。
【００８８】
ＩＩ）ＣＤＡＰの存在下でのサイジングされたＰｎＰｓ（１９Ａ、１９Ｆ、６Ａおよび６Ｂ）の解重合および凝集
反応溶液中のサイジングされたＰｎＰｓを、活性化の間、１：１．５の比で、ＣＤＡＰによって処理した。５０％ＤＭＡＰが、ＰｎＰｓの解重合ならびに或る一定の時間の活性化の後の活性化されたＰｎＰｓの間の凝集につながる、副生成物として発生させられる（ＲＰ−ＨＰＬＣによって測定）ことが、観察された。（表２参照）。解重合および凝集を、ＳＥＣ−ＨＰ−ＲＩプロファイルによって調査した。ＰｎＰｓのＣＤＡＰが媒介する、凝集および解重合を示す、図３Ａ（ＣＤＡＰなし）、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄ（１９Ａについて）ならびに４Ａ（ＣＤＡＰなし）４Ｂ（１９Ａについて）を参照。
【００８９】
表１０−多糖−多糖架橋結合および凝集の原因となる因子
「多糖−多糖凝集体」の形成に対する「ＣＤＡＰ活性化の持続時間」の効果
【００９０】
【表１０】
2018516962.tif 000012
【００９１】
ＩＩＩ）ダイアフィルトレーション工程を使用することによる、１：１．５のＰｎＰｓ：ＣＤＡＰを有する、サイジングされたＰｎＰｓ（１９Ａおよび１９Ｆ）の解重合および凝集の防止
１９Ａのかかる解重合および凝集を最小化するために、活性化されたＰｎＰｓを、２ＭのＮａＣｌを使用し、１０ＫＤａダイアフィルトレーションを受けさせて、ＣＲＭ１９７との結合の前に、反応溶液から、形成されたＤＭＡＰを除去した。図３Ｅ（１０ＫＤａ  ＤＦなしの結合体）、および１０ＫＤａダイアフィルトレーションされた、活性化されたＰｎＰｓおよびＣＲＭ１９７を使用し、結合体のＳＥＣ−ＨＰ−ＲＩプロファイルを示す図３Ｆ（１０ＫＤａ  ＤＦありの結合体）を参照。しかし、ダイアフィルトレーション工程は、結合体収量に悪影響を与え、全体の収量において３０〜４０％の低下をもたらした。
【００９２】
ＩＶ）ダイアフィルトレーション工程を使用しない、ＰｎＰｓ：ＣＤＡＰの比を１：１（１９Ａ）および１：０．８（１９Ｆ）まで減少させることによる、サイジングされたＰｎＰｓ（１９Ａおよび１９Ｆ）の解重合および凝集の防止
反応溶液中のサイジングされたＰｎＰｓを、１９Ａおよび１９Ｆのそれぞれについて１：１および１：０．８の比で、ＣＤＡＰで処理し、ＳＥＣ−ＨＰ−ＲＩによって、その解重合および凝集プロファイルについて調査した。
【００９３】
結果
改変されたＰｓ：ＣＤＡＰの比（１９Ａについて１：１および１９Ｆについて１：０．８）が、１９Ａと１９Ｆの両方のＰｎＰｓについて、解重合および凝集を防止することが分かったことが、観察された。図３−４（１９ＡについてのＧおよびＨ）および図４−２（１９ＦについてのＣおよびＤ）を参照。改変された比を使用する、さらなる利点は、１０ＫＤａダイアフィルトレーション工程を行わず、したがって、確実に、全体の収量における減少を最小にすることであった。
【００９４】
血清型１９Ａの場合、「ＣＤＡＰ活性化の持続時間」が１０分を超えたとき、活性化された多糖の活性化された多糖への架橋結合をもたらして、「多糖−多糖凝集体」の形成に最終的につながったことが、観察された。
【００９５】
さらに、血清型１９Ｆの場合、「ＣＤＡＰ活性化の持続時間」が２０分を超えたとき、活性化された多糖の活性化された多糖への架橋結合をもたらして、「多糖−多糖凝集体」の形成に最終的につながった。さらに、結合反応の持続時間は、活性化された多糖の活性化された多糖への架橋結合のために必要な持続時間を超えて、それによって、凝集体の形成をもたらすと分かった。図３および図４を参照。
【００９６】
しかし、その他の血清型、たとえば、６Ａ  ＰｎＰｓおよび６Ｂ  ＰｎＰｓについて、かかる架橋結合は、観察されなかった。
【００９７】
例１１
結合体の調製：ＰｎＰｓ１９ＡおよびＰｎＰｓ１９Ｆ
担体タンパク質への多糖の結合を、以下の改変を行って、ＬｅｅｓらのＣＤＡＰ結合方法（Ｖａｃｃｉｎｅ２６、１９０〜１９８、１９９６）を使用して、実行した。
ｉ）１９Ａ結合体の調製のために、４分間の活性化時間、２２℃で、多糖対ＣＤＡＰの比１：１を使用すること、および多糖対タンパク質の比１：１を使用すること。
ｉｉ）１９Ｆ結合体の調製のために、９から１０分間の活性化時間、２２℃で、多糖対ＣＤＡＰの比１：０．８、および１９Ｆのために多糖対タンパク質の比１：１を使用すること。
【００９８】
表１０−「伝統的ＣＤＡＰ結合方法」（ロット１）および「改善された結合方法」（ロット２）での１９Ａおよび１９Ｆについての結合結果の比較
【００９９】
【表１１】
2018516962.tif 000013
【０１００】
【表１２】
2018516962.tif 000014
【０１０１】
結果
改変された多糖：ＣＤＡＰの比、ＣＤＡＰ活性化時間および初期の多糖：タンパク質の比が、活性化の間、サイジングされた多糖の４−ジメチルアミノ−ピリジンが媒介する解重合を最小化することが分かり、その後の多糖−多糖凝集もまた防止して、したがって、遊離多糖含有量について、最終結合体の特徴を改善したことが、観察された。
【０１０２】
１９Ａおよび１９Ｆ結合体を調製するために使用される、改善された結合方法は、各結合体プロファイルにおいて、いかなるホスホモノエステルシグナル（31ＰプロトンＮＭＲ）も示さない結合体をもたらし、それは、改変された結合方法が、結合反応全体を通して、多糖の加水分解を防止するのに有効であると分かったことを示唆した。
【０１０３】
開示された発明の原理が適用されてよい、多くの可能な態様に鑑みて、例証された態様は、本発明の好ましい例のみであることが認識されるべきであり、本発明の範囲を限定するものとしてとらえるべきではない。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。それ故に、本発明者らは、これらの特許請求の範囲および精神の中にある全てを、我々の発明として請求する。
【図１】
2018516962.tif 000015
【図２】
2018516962.tif 000016
【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
2018516962.tif 000021
【図４−２】
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【図５】
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【図６】
2018516962.tif 000024
【手続補正書】
【提出日】平成30年2月9日(2018.2.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】
請求項１に従って調製される、多価の肺炎球菌結合型ワクチン組成物であって、前記組成物が、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｖ、９Ｆ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂ、３８および４５から選択される多糖を有する、少なくとも２種の多糖タンパク質結合体を含む、組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】
請求項３に従って調製される、多価の肺炎球菌結合型ワクチン組成物であって、前記組成物が、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆおよび２３Ｆからの多糖を有する、少なくとも１６種の多糖タンパク質結合体を含む、組成物。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
開示された発明の原理が適用されてよい、多くの可能な態様に鑑みて、例証された態様は、本発明の好ましい例のみであることが認識されるべきであり、本発明の範囲を限定するものとしてとらえるべきではない。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。それ故に、本発明者らは、これらの特許請求の範囲および精神の中にある全てを、我々の発明として請求する。
以下に、本願の出願当初の請求項を実施の態様として付記する。
［１］  各結合体について最適な吸着を示す、安定した多価の肺炎球菌多糖−タンパク質結合型ワクチン製剤の調製のための方法であって、前記方法において、凝集を、
ｉ．組み合わせた吸着では、相対的により低い吸着を示す結合体については、個別または別々での吸着
ｉｉ．中性ｐＨから酸性ｐＨへの移行を伴うヒスチジン−コハク酸緩衝系、
ｉｉｉ．０．５から約１．４の多糖対タンパク質の比、および／または
ｉｖ．製剤容器中でのラシュトン型タービン羽根車の使用
の少なくとも１つを使用することによって防止する、方法。
［２］  前記吸着が、７５〜９９％の範囲内である、［１］に記載の方法。
［３］  ［１］に従って調製される、多価の肺炎球菌結合型ワクチン組成物であって、前記組成物が、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｆ、９Ｎ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、３３Ｆおよび４５から選択される多糖を有する、少なくとも２種の多糖タンパク質結合体を含む、組成物。
［４］  ［３］に従って調製される、多価の肺炎球菌結合型ワクチン組成物であって、前記組成物が、血清型１、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆからの多糖を有する、少なくとも１０種の多糖タンパク質結合体を含む、組成物。
［５］  ［３］に従って調製される、多価の肺炎球菌結合型ワクチン組成物であって、前記組成物が、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆからの多糖を有する、少なくとも１６種の多糖タンパク質結合体を含む、組成物。
［６］  担体タンパク質が、ＣＲＭ１９７、肺炎球菌表面アドへシンＡ（ＰｓａＡ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、破傷風トキソイドのフラグメントＣ、百日咳トキソイド、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のタンパク質Ｄ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＴ、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からの外毒素Ａ、外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポーリン、トランスフェリン結合タンパク質、ニューモリシン、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌表面アドへシンＡ（ＰｓａＡ）、肺炎球菌ＰｈｔＤ、肺炎球菌表面タンパク質ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の防御抗原（ＰＡ）および炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の無毒化された、浮腫因子（ＥＦ）および致死因子（ＬＦ）、卵白アルブミン、キ−ホ−ルリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ならびにツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、特にＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイドまたはＰｓａＡからなる群から選択される、１種以上である、［１］に記載の組成物。
［７］  前記多価の組成物が、
ｉ．担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質結合体、担体タンパク質としてＴＴを有する、少なくとも１種の多糖タンパク質、または
ｉｉ．担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質結合体、担体タンパク質としてＤＴを有する、少なくとも１種の多糖タンパク質、または
ｉｉｉ．担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質結合体、担体タンパク質として肺炎球菌表面アドへシンＡ（ＰｓａＡ）を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質、または
ｉｖ．担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質結合体、担体タンパク質としてＴＴを有する、少なくとも１種の多糖タンパク質、担体タンパク質としてＤＴを有する、少なくとも１種の多糖タンパク質、または
ｖ．担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質結合体、担体タンパク質としてＴＴを有する、少なくとも１種の多糖タンパク質、担体タンパク質として肺炎球菌表面アドへシンＡ（ＰｓａＡ）を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質、または
ｖｉ．担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質結合体、担体タンパク質としてＤＴを有する、少なくとも１種の多糖タンパク質、担体タンパク質として肺炎球菌表面アドへシンＡ（ＰｓａＡ）を有する、少なくとも１種の多糖タンパク質
を含む、［１］に記載の組成物。
［８］  血清型３が、ＣＲＭ１９７に好ましくは結合されており、血清型１８Ｃが、ＣＲＭ１９７に好ましくは結合されており、血清型４が、ＴＴまたはＤＴに結合させることができる、［３］に記載の組成物。
［９］  前記ヒスチジン−コハク酸緩衝液が、１ｍＭ〜２００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜４０ｍＭ、より好ましくは２０ｍＭの濃度を有する、［１］に記載の方法。
［１０］  前記ヒスチジン−コハク酸緩衝液についてのｐＨの移行が、好ましくは６．８からｐＨ５．６〜５．８までになる、［１］に記載の方法。
［１１］  前記方法が、以下の工程
ｉ．所定の比、好ましくは０．８対１．４、より好ましくは１：１、および所定のｐＨ、好ましくは５．２〜５．９で、多糖分子をタンパク質担体に加えて、複数の別個の多糖−タンパク質結合体を得ること、
ｉｉ．所定の濃度を有する、ヒスチジン−コハク酸緩衝液中の第１のアルミニウム塩アジュバント上に、工程（ｉ）において得られた、前記複数の多糖−タンパク質結合体から選択される、多糖−タンパク質結合体の第１の所定のセットを、個別に吸着させ、前記アルミニウム塩アジュバントの量が、最終ワクチン製剤の０．５ｍｌ用量当たりＡｌ+++２０〜３７５μｇの範囲であり、多糖−タンパク質結合体の前記セットが、６Ａ、９Ｖおよび２３Ｆを含むこと、
ｉｉｉ．所定の濃度を有する、ヒスチジン−コハク酸緩衝液中の第２のアルミニウム塩アジュバント上に、工程（ｉ）において得られた、前記複数の多糖−タンパク質結合体から選択される、多糖−タンパク質結合体の第２の所定のセットを、組み合わせた様式で吸着させ、前記アルミニウム塩アジュバントの量が、最終ワクチン製剤の０．５ｍｌ用量当たりＡｌ+++２０〜３７５μｇの範囲であり、多糖−タンパク質結合体の前記セットが、１、５、６Ｂ、７Ｆ、１４、１９Ａおよび１９Ｆを含むこと、
ｉｖ．ラシュトンタービン平羽根車を用いて、工程（ｉｉ）において得られた、前記第１の吸着されたセットを、工程（ｉｉｉ）において得られた、前記第２の吸着されたセットとブレンドし、任意で、界面活性剤、好ましくはポリソルベート−２０、ならびに／または水銀系保存剤、たとえばチオメルサール、２−フェノキシエタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコールおよびそれらの混合物からなる群から選択される、少なくとも１種の保存剤を加えて、安定した多価の肺炎球菌多糖−タンパク質結合型ワクチン製剤を得ること
を含む、［１］に記載の方法。
［１２］  特に、シアニル化化学を使用して担体タンパク質に共有結合された反復単位間のホスホジエステル結合を含有する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖について、サイジングおよび結合反応全体を通じて、多糖−多糖凝集を減少させて、それによって、それぞれの結合体に改善された免疫原性および安定性を提供するための方法であって、前記方法が、
ｉ）約４分間から約１０分間、約２２℃から約２５℃、１：０．８〜１：１の比で、１３０ＫＤａ〜１９０ＫＤａの平均サイズを有する多糖をシアニル化剤と反応させて、シアネートで活性化された多糖をもたらすこと、および
ｉｉ）３時間から５時間、約９から約９．５のｐＨ、１：１の比で、シアネートで活性化された多糖をタンパク質と接触させ、続いて、グリシンでクエンチし、前記結合方法が、サイジングされた多糖のシアニル化剤副生成物が媒介する解重合を最小化し、その後の多糖−多糖凝集を防止して、最小の遊離多糖含有量を有する結合体をもたらすこと
を含む、方法。
［１３］  反復単位間にホスホジエステル結合を含む前記多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ａ、１９Ｆ、６Ａまたは６Ｂの１種に由来する、［１２］の方法。
［１４］  前記多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ａ多糖であり、シアニル化剤が、１−シアノ−４−ジメチル−アミノ−ピリジニウム−テトラフルオロボレートであり、４分間、２２℃、１：１の比で混合され、シアネートで活性化された多糖をもたらす、［１３］に記載の方法。
［１５］  前記多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ｆ多糖であり、シアニル化剤が、１−シアノ−４−ジメチル−アミノ−ピリジニウム−テトラフルオロボレートであり、８〜１０分間、２２℃、１：０．８の比で混合され、シアネートで活性化された多糖をもたらす、［１３］に記載の方法。
［１６］  前記結合体が、１．６％未満の遊離多糖含有量を有する、［１４］または［１５］に記載の方法。
［１７］  吸着パーセントが、水酸化ナトリウムおよびクエン酸を使用して、ミョウバン吸着された結合体試料を溶解する工程を、特に含む、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定される、［２］の方法。
［１８］  ＰｓａＡが、アジュバントとして使用される、先行する請求項の何れか一項に記載の組成物。
［１９］  リン酸アルミニウムゲルおよびＮａＣｌを含有する賦形剤を有する、１、５または１０用量の製剤として投薬されるまで、冷凍乾燥状態で得られる、前記結合型ワクチン製剤を貯蔵する工程を、さらに含む、先行する請求項の何れか一項に記載の組成物。
【国際調査報告】
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