(57)【要約】  本発明は、樹状細胞（ＤＣ）の炎症応答を特異的に活性化するための方法および組成物を提供する。１−パルミトイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＡＰＣ）およびその酸化変異体（ｏｘＰＡＰＣ）が、ＤＣ媒介性免疫を促進することが特定され、ワクチンを含む免疫賦活組成物のアジュバントとして提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原に対する免疫応答を誘発するための組成物であって、免疫原および非標準インフラマソーム活性化脂質を含む組成物。
【請求項２】
前記非標準インフラマソーム活性化脂質が、ｏｘＰＡＰＣである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記非標準インフラマソーム活性化脂質が、ＰＡＰＣである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記非標準インフラマソーム活性化脂質が、ｏｘＰＡＰＣの１つまたは複数の種からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記非標準インフラマソーム活性化脂質が、ＨＯｄｉＡ−ＰＣ、ＫＯｄｉＡ−ＰＣ、ＨＯＯＡ−ＰＣ、およびＫＯＯＡ−ＰＣの１つまたは複数からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記非標準インフラマソーム活性化脂質が、Ｒｈｏｄｏ  ＬＰＳである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記非標準インフラマゾーム活性化脂質が、前記組成物を対象に投与した際に、前記非標準インフラマゾーム活性化脂質を欠如する組成物と比較して、前記免疫原に対する免疫応答を増強する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記免疫原および脂質が、前記組成物を対象に投与した際に、樹状細胞（ＤＣ）活性化を誘導するのに十分な濃度で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、対象に投与した際に、マクロファージ炎症応答を誘発しない、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記免疫原が、ヒトパピローマウイルス抗原、単純ヘルペス抗原または帯状疱疹抗原等のヘルペスウイルス抗原、ヒト免疫不全ウイルス１型抗原またはヒト免疫不全ウイルス２型抗原等のレトロウイルス抗原、肝炎ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、ライノウイルス抗原、ＲＳウイルス抗原、サイトメガロウイルス抗原、アデノウイルス抗原、マイコプラズマ・ニューモニエ抗原、サルモネラ属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、クロストリディウム属、エシェリヒア属、クレブシェラ属、ビブリオ属、ミコバクテリウム属の細菌の抗原、アメーバ抗原、マラリア原虫抗原、およびトリパノソーマ・クルージ抗原からなる群から選択される抗原を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、凍結乾燥されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、前記非標準インフラマゾーム活性化脂質と組み合わせた前記免疫原から本質的になる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の組成物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
前記担体が、水性担体である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記担体が、固形担体である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
対象の樹状細胞に炎症応答を誘導するための方法であって、請求項１に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項１７】
免疫原に対する対象の防御免疫応答を増強するための方法であって、前記免疫原および非標準インフラマゾーム活性化脂質を、その防御免疫応答を増強するのに有効な量で、対象に投与することを含み、前記非標準インフラマゾーム活性化脂質が、アジュバント有効量で投与される方法。
【請求項１８】
前記免疫原および前記非標準インフラマゾーム活性化脂質が、前記対象に同時投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
対象の免疫応答を誘導するための方法であって、免疫原および非標準インフラマゾーム活性化脂質を、その免疫応答を生成するのに有効な量で前記対象に同時投与すること含む方法。
【請求項２０】
前記対象がヒトである、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記免疫原および前記非標準インフラマゾーム活性化脂質が、一般的な医薬担体と同時投与される、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法
【請求項２２】
前記免疫原および前記非標準インフラマゾーム活性化脂質が、非経口投与で投与される、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫応答が、予防的免疫応答である、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫応答が、治療的免疫応答である、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記免疫応答が、液性免疫応答を含む、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１月１２日に出願された米国特許仮出願第６２／１０２，２４５号、発明の名称「Ｐｒｏ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ」に対する米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を主張する国際特許出願である。この文献は、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府支援研究における発明の権利に関する記載
本研究は、国立衛生研究所国立アレルギー感染病研究所により授与されたグラント番号ＡＩ１０３０８２−０１Ａ１に基づく支援により行われた。連邦政府は、本発明にある権利を有する。
【０００３】
本発明は、概して、アジュバント、免疫活性化、およびワクチンの分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
自己分子と非自己分子とを識別する能力は、あらゆる生物体の基本的特徴であるが、この識別に関する我々の理解は依然として不完全である。哺乳動物では、自然免疫系のパターン認識受容体（ＰＲＲ）が、自己分子および非自己分子を識別する機能を果たすと一般に考えられている。この考えは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｊａｎｅｗａｙ  Ｊｒ．氏により最初に提唱されたものであり、トール様受容体（ＴＬＲ）、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、およびＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）等の、様々なＰＲＲファミリーの研究により広く検証されている（Ｉｗａｓａｋｉ，Ａ．，ａｎｄ  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，Ｒ．（２０１５）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６，３４３−３５３）。ＰＲＲは、幅広い種類の微生物に共通する分子を直接的にまたは間接的にのいずれかで検出する。こうした分子は、伝統的には病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれており、中でも細菌性リポポリサッカリド（ＬＰＳ）、細菌性フラジェリン、またはウイルス性二本鎖ＲＮＡ等の因子が挙げられる（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．Ａ．，Ｊｒ．（１９８９）Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｓｙｍｐ  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ  ５４  Ｐｔ  １，１−１３）。微生物産物が検出されると、炎症促進性または免疫調節性のいずれかであるＰＲＲ依存性細胞応答が活性化される。後者の最も良い例は、抗原特異的Ｔ細胞の活性化による適応免疫の促進である（Ｉｗａｓａｋｉ，Ａ．，ａｎｄ  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，Ｒ．（２０１５）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６，３４３−３５３）。ＰＲＲ媒介性炎症促進性応答は、多数のタイプの細胞で生じるものであるとみなすことができるが、Ｔ細胞活性化を促進するための活性は、樹状細胞（ＤＣ）で特異的に生じることが多い。ＰＲＲにより誘導されるＤＣ特異的活性としては、以下のものが挙げられる：エンドソームおよびファゴソームの酸性化（Ｄｅｌａｍａｒｒｅ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０７，１６３０−１６３４、およびＴｒｏｍｂｅｔｔａ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９，１４００−１４０３）、微生物含有ファゴソームへの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子の送達（Ｎａｉｒ−Ｇｕｐｔａ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ  １５８，５０６−５２１）、ＭＨＣへの微生物ペプチドの負荷、および細胞表面へのＭＨＣ分子の送達（Ｂｌａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，Ｒ．（２００６）．Ｎａｔｕｒｅ  ４４０，８０８−８１２；Ｉｎａｂａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９１，９２７−９３６；Ｐｉｅｒｒｅ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８８，７８７−７９２；Ｔｕｒｌｅｙ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８，５２２−５２７）。こうした活性は全て、Ｔ細胞への効果的な抗原提示および適応免疫の開始を促進する。
【０００５】
アジュバントは、抗原特異的免疫応答を加速および／または増強する物質である。アジュバントの目的は、免疫系の目に相当するもの（マクロファージ／樹状細胞）に対して、抗原を可視化することである。マクロファージおよび樹状細胞等の抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原の認識は、本質的に、局所的炎症に至る重要な事象のカスケードを開始させ、局所的炎症は、ＡＰＣを動員し、最終的に生殖細胞媒介性および／または抗体媒介性免疫応答の開始をもたらす。現在、大部分のヒトワクチンは、アジュバントとしてアルミニウム塩を含有しており、製薬会社は、ワクチンに組み込むための油性アジュバントを開発中である。改良型免疫賦活組成物（例えば、ワクチン）の開発には、樹状細胞（ＤＣ）を選択的に活性化するが、マクロファージの活性化が最小限であるアジュバントの特定および含有は、そのような組成物の投与に伴う、不快感および炎症等の有害作用の低減に有益だろう。現在、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−５、ＴＬＲ７／８、およびＴＬＲ−９に対するアゴニストとして作用するアジュバントが研究中であり、１つのＴＬＲ−４アゴニスト、モノホスホリルリピドＡが、ＦＤＡに認可されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｉｗａｓａｋｉ，Ａ．，ａｎｄ  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，Ｒ．（２０１５）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６，３４３−３５３
【非特許文献２】Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．Ａ．，Ｊｒ．（１９８９）Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｓｙｍｐ  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ  ５４  Ｐｔ  １，１−１３
【非特許文献３】Ｄｅｌａｍａｒｒｅ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０７，１６３０−１６３４
【非特許文献４】Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９，１４００−１４０３
【非特許文献５】Ｎａｉｒ−Ｇｕｐｔａ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ  １５８，５０６−５２１
【非特許文献６】Ｂｌａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，Ｒ．（２００６）．Ｎａｔｕｒｅ  ４４０，８０８−８１２
【非特許文献７】Ｉｎａｂａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９１，９２７−９３６
【非特許文献８】Ｐｉｅｒｒｅ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８８，７８７−７９２
【非特許文献９】Ｔｕｒｌｅｙ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８，５２２−５２７
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、組織損傷部位に見出されるトール様受容体（ＴＬＲ）アンタゴニストである内因性酸化リン脂質が、過剰炎症性の樹状細胞状態を作り出したという発見に、少なくとも部分的に基づくものである。特に、ｏｘＰＡＰＣが、抗原特異的Ｔ細胞を活性化するそれらの能力を促進するＤＣ内での幾つかの応答を、状況依存的な様式で誘導したことを実証した。こうした知見により、ｏｘＰＡＰＣ（および非標準インフラマソームの活性化が可能である関連リン脂質、ならびに例えば、これも非標準インフラマソームを活性化することが見出されているＲｈｏｄｏ  ＬＰＳ）は、予防用および治療用の免疫賦活組成物に使用するための強化型アジュバントとして機能することができたことが示された。
【０００８】
多様なＴＬＲリガンドの存在下で、ｏｘＰＡＰＣが、ＤＣの生存を促進し、Ｔ細胞活性化サイトカインであるインターロイキン１ベータ（ＩＬ−１β）の放出を引き起こすことを特定した。機構的には、ｏｘＰＡＰＣは、ＤＣ表面のＬＰＳ受容体ＣＤ１４と結合することが特徴だった。それによりｏｘＰＡＰＣがエンドソーム内へと送達され、その後細胞質タンパク質カスパーゼ−１１に接近することができた。ｏｘＰＡＰＣがカスパーゼ−１１と結合することにより、インフラマソーム媒介性ＩＬ−１β放出が引き起こされた。こうしたｏｘＰＡＰＣ誘発性応答は、マクロファージでは生じなかった。これは、この脂質の作用が、一般的な（マクロファージ媒介性）炎症応答ではなく、ＤＣの免疫調節活性を促進するための独特な仕組みであることを示している。結果的に、ｏｘＰＡＰＣは、微生物産物と相乗効果を示し、ＰＡＭＰのみにより誘発され得るよりもロバストな抗原特異的Ｔ細胞活性化を誘導することを特定した。こうした分子（ｖｉｔａ−ＤＡＭＰと呼ぶ）は、ＰＡＭＰと共に機能して、ＤＣを過剰活性化し、最大限の適応免疫反応を誘発することを特定した。
【０００９】
１つの態様では、本発明は、免疫原および非標準インフラマソーム活性化脂質を含む、免疫原に対する免疫応答を誘発するための組成物を提供する。
【００１０】
１つの実施形態では、非標準インフラマソーム活性化脂質は、ｏｘＰＡＰＣである。別の実施形態では、非標準インフラマソーム活性化脂質は、ＰＡＰＣである。任意選択で、非標準インフラマソーム活性化脂質は、ｏｘＰＡＰＣの１つまたは複数の種である。関連する実施形態では、非標準インフラマソーム活性化脂質は、ＨＯｄｉＡ−ＰＣ、ＫＯｄｉＡ−ＰＣ、ＨＯＯＡ−ＰＣ、およびＫＯＯＡ−ＰＣの１つまたは複数である。別の実施形態では、非標準インフラマソーム活性化脂質は、Ｒｈｏｄｏ  ＬＰＳである。
【００１１】
更なる実施形態では、非標準インフラマソーム活性化脂質は、組成物を対象に投与した際に、非標準インフラマソーム活性化脂質を欠如する組成物と比較して、免疫原の免疫応答を増強する。
【００１２】
１つの実施形態では、免疫原および脂質は、組成物を対象に投与した際に樹状細胞（ＤＣ）活性化を誘導するのに十分な濃度で存在する。
【００１３】
任意選択で、組成物は、対象に投与した際に、マクロファージ炎症応答を誘発しない。
【００１４】
１つの実施形態では、免疫原は、ヒトパピローマウイルス抗原、単純ヘルペス抗原または帯状疱疹抗原等のヘルペスウイルス抗原、ヒト免疫不全ウイルス１型抗原またはヒト免疫不全ウイルス２型抗原等のレトロウイルス抗原、肝炎ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、ライノウイルス抗原、ＲＳウイルス抗原、サイトメガロウイルス抗原、アデノウイルス抗原、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）抗原、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、クロストリディウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細菌の抗原、アメーバ抗原、マラリア原虫抗原、および／またはトリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）抗原を含む。
【００１５】
任意選択で、組成物は、凍結乾燥されている。
【００１６】
別の実施形態では、組成物は、非標準インフラマソーム活性化脂質と組み合わせた免疫原から本質的になる。
【００１７】
本発明の別の態様は、本発明の免疫原アジュバント組成物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１８】
１つの実施形態では、担体は、水性担体である。別の実施形態では、担体は、固形担体である。
【００１９】
本発明の更なる態様は、対象の樹状細胞に炎症応答を誘導するための方法であって、請求項１に記載の組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
【００２０】
本発明の更なる態様は、免疫原および非標準インフラマソーム活性化脂質を、対象の防御免疫応答を増強するために有効な量で対象に投与することにより、免疫原に対する対象の防御免疫応答を増強するための方法であって、非標準インフラマソーム活性化脂質が、アジュバント有効量で投与される方法を提供する。
【００２１】
１つの実施形態では、免疫原および非標準インフラマソーム活性化脂質は、対象に同時投与される。
【００２２】
本発明の別の態様は、対象に免疫応答を誘導するための方法であって、免疫原および非標準インフラマソーム活性化脂質を、対象に免疫応答を生成するのに有効な量で対象に同時投与すること含む方法を提供する。
【００２３】
１つの実施形態では、対象はヒトである。
【００２４】
別の実施形態では、免疫原および非標準インフラマソーム活性化脂質は、一般的な医薬担体と同時投与される。
【００２５】
任意選択で、免疫原および非標準インフラマソーム活性化脂質は、非経口投与により投与される。
【００２６】
１つの実施形態では、免疫応答は、予防的免疫応答である。
【００２７】
別の実施形態では、免疫応答は、治療的免疫応答である。
【００２８】
更なる実施形態では、免疫応答は、体液性免疫応答を含む。
【００２９】
本発明の他の態様は、以下の開示に記載されているか、または以下の開示から明らかであり、それらは、本発明の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、ＰＡＰＣ（例えば、ｏｘＰＡＰＣ）が、ＴＬＲ４−アンタゴニストとしては作用するが、ＴＬＲ４−アゴニストとしては作用しないことが特定されたことを示す図である。
【図２】図２は、様々な用量のＰＡＰＣがＴＬＲ４シグナル伝達を調節したことを示す図である。
【図３】図３は、様々な用量のＰＡＰＣが、原形質膜上のＣＤ１４レベルを調節したことを示す図である。
【図４】図４は、様々な用量のＰＡＰＣが、ＬＰＳ依存性ＴＬＲ４内部移行を調節したことを示す図である。
【図５】図５は、様々な用量のＰＡＰＣが、ＬＰＳ依存性ＴＬＲ４二量体化を調節したことを示す図である。
【図６】図６は、ＰＡＰＣが、ＤＣのインフラマソームを活性化したことを示す図である。
【図７】図７は、ＫＯｄｉＡ−ＰＣが、インフラマソームを活性化したことを示す図である。
【図８】図８は、ＣＤ１４が、ＰＡＰＣに応答してインフラマソーム活性化を制御したことを示す図である。
【図９】図９は、ＰＡＰＣに応答したインフラマソーム活性化は、ＣＤ１４特異的だったが、ＰＡＰＣは、ＣＤ３６内部移行を誘導することもできたことを示す図である。
【図１０】図１０は、ＣＤ１４が、Ｉ型ＩＦＮとは独立して、ＰＡＰＣ媒介性インフラマソーム活性化を制御したことを示す図である。
【図１１】図１１は、カスパーゼ−１発現およびカスパーゼ−１１発現の制御が、ｗｔＤＣおよびＣｄ１４−／−ＤＣで類似していたことを示す図である。
【図１２】図１２は、ＰＡＰＣが、細胞タイプ特異的な様式でインフラマソーム活性化を誘導したことを示す図である。
【図１３】図１３は、他のＰＡＭＰが、ＰＡＰＣ誘導性インフラマソーム活性化を予備刺激したことを示す図である。
【図１４】図１４は、他のＰＡＭＰが、ＰＡＰＣ誘導性インフラマソーム活性化を予備刺激した更なる結果を示す図である。
【図１５】図１５は、全ての修飾ＰＣが、インフラマソーム活性化を誘導した訳ではなかったことを示す図である。
【図１６】図１６は、インフラマソーム活性化の誘導には、Ｎｌｒｐ３が必要だったことを示す図である。
【図１７】図１７は、インフラマソーム活性化の誘導には、Ａｓｃが必要だったことを示す図である。
【図１８】図１８は、インフラマソーム活性化の誘導には、Ｃａｓｐ１／Ｃａｓｐ１１が必要だったことを示す図である。
【図１９】図１９は、ｏｘＰＡＰＣ誘導性インフラマソーム活性化は、カスパーゼ−１１依存性だったが、ＡＴＰ誘導性インフラマソーム活性化はそうではなかったことを示す図である。
【図２０】図２０は、ＬＰＳおよびＰａｍ３の両方で予備刺激した後のＰＡＰＣ誘導性インフラマソーム活性化には、カスパーゼ−１１が必要であったことを示す図である。
【図２１】図２１は、ビオチン化ＰＡＰＣが、ＣＤ１４内部移行を強力に誘導したことを示す図である。
【図２２】図２２は、ビオチン化ＰＡＰＣは、ＴＬＲ４内部移行を誘導しなかったことを示す図である。
【図２３】図２３は、ビオチン化ＰＡＰＣは、ＩＬ−１ｂ分泌を誘導しなかったことを示す図である。
【図２４】図２４は、カスパーゼ１１およびＭＤ−２に対するビオチン化ＬＰＳ、ＯｘＰａｃ、およびＰａｃのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイを示す図であり、このアッセイでは、カスパーゼ１１依存的な様式での複合体形成が特定されると考えられた。
【図２５】図２５は、Ｂｉｏ−ＬＰＳプルダウンでは、ＰＡＰＣが、用量依存的な競合体として作用したことを示す図である。ビオチン−ＬＰＳは、１プルダウンアッセイ当たり５μｇで使用した。ＰＡＰＣは、ＭＤ−２およびカスパーゼ−１１に対するＬＰＳ結合と競合するように、それぞれ５、５０、および５００μｇで使用した。競合は、１：１００（ＬＰＳ：ＰＡＰＣ）の比率で効果的になり始めた。
【図２６】図２６は、ｏｘＰＡＰＣおよびＬＰＳが、ＣＤ１４の同一ドメインと結合した可能性が高いことを示す図である。
【図２７】図２７は、ＬＰＳ処理が、ＤＣの生存に影響を及ぼしたことを示す図である。
【図２８】図２８は、予備刺激したＤＣのＰＡＰＣ処理が、ＤＣの生存を促進したことを示す図である。
【図２９】図２９は、観察されたＰＡＰＣ依存性生存促進効果が、ＣＤ１４依存性でなかったことを示す図である。
【図３０】図３０は、Ｐ２ＣおよびＰ３Ｃのみが、ＤＣの生存を支援したことを示す図である。
【図３１】図３１は、Ｐ２ＣおよびＰ３Ｃで予備刺激したＤＣは、ＰＡＰＣ処理に応答して、それらの生存を増加させなかったことを示す図である。
【図３２】図３２は、インフラマソームは、予備刺激およびＰＡＰＣの同時投与により効率的に活性化されたが、ＡＴＰでは活性化されなかったことを示す図である。
【図３３】図３３は、予備刺激およびＰＡＰＣの同時投与は、ｗｔＤＣのＮＦ−κＢ活性化を変更しなかったことを示す図である。
【図３４】図３４は、ＣＤ１４の非存在下では、ｏｘＰＡＰＣが、ＴＬＲ４シグナル伝達のアンタゴニストとして作用したことを示す図である。
【図３５】図３５は、ＬＰＳおよびｏｘＰＡＰＣの同時投与が、ＴＬＲ４内部移行に影響を及ぼしたことを示す図である。
【図３６】図３６は、ＬＰＳおよびｏｘＰＡＰＣの同時投与が、ＣＤ１４内部移行に影響を及ぼしたことを示す図である。
【図３７】図３７は、ＬＰＳおよびｏｘＰＡＰＣの同時投与が、部分的にＴＬＲ４二量体化に影響を及ぼしたことを示す図である。
【図３８】図３８は、Ｒｈｏｄｏ  ＬＰＳが、インフラマソーム活性化の強力な誘導因子だったことを示す図である。
【図３９】図３９は、ＬＰＳ誘導性インフラマソーム活性化が、Ｎｌｒｐ３依存性だったことを示す図である。
【図４０】図４０は、ＬＰＳ誘導性インフラマソーム活性化が、Ａｓｃ依存性だったことを示す図である。
【図４１】図４１は、ＬＰＳ誘導性インフラマソーム活性化が、Ｃａｓｐ１／１１依存性だったことを示す図である。
【図４２】図４２は、Ｒｈｏｄｏ  ＬＰＳ誘導性インフラマソーム活性化が、ＣＤ１４非依存性だったことを示す図である。
【図４３】図４３Ａ〜図４３Ｄは、ｏｘＰＡＰＣが、ＴＬＲ４に結合しなかったか、またはＴＬ４Ｆシグナル伝達を誘導しなかったことを示す画像である。図４３Ａには、表示の時間にわたってＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）またはｏｘＰＡＰＣ（５０μＭ）で処理したｉＭΦでのＴＬＲ４二量体化の程度を示す折れ線グラフが示されている。ＴＬＲ４二量体化を、フローサイトメトリーで測定した。折れ線グラフは、２つの独立した実験の平均および標準偏差を表す。図４３Ｂには、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）またはｏｘＰＡＰＣ（５０μＭ）で処理したｉＭΦでのＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＦＮβ、およびＶｉｐｅｒｉｎのレベルを示す折れ線グラフが示されている。ＧＡＰＤＨに対する遺伝子発現を、指定の時間でｑＰＣＲにより分析した。全ての実験で、負の対照として未処理細胞を使用した。折れ線グラフは平均を表し、エラーバーは、３回の実験のうち１つの代表的な実験での３回測定の標準偏差を表す。図４３Ｃには、ＩＲＡＫ４をＭｙＤ８８と共に共免疫沈殿（ＩＰ）し、その後表示のタンパク質のウエスタン分析を行うことにより、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）またはｏｘＰＡＰＣ（５０μＭ）で処理した後の表示時点におけるｉＭΦでのミッドソーム（ｍｙｄｄｏｓｏｍｅ）形成を示すブロットが示されている。図４３Ｄには、収集した全細胞溶解物（ＷＣＬ）、およびＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）またはｏｘＰＡＰＣ（５０μＭ）で処理した後、ＳＴＡＴ−１リン酸化およびｖｉｐｅｒｉｎ発現をモニターしたＤＣを示すブロットが示されている。
【図４４】図４４Ａ〜図４４Ｆは、ｏｘＰＡＰＣが、ＣＤ１４アゴニストおよびＴＬＲ４アンタゴニストの両方として作用したことを示す画像である。図４４Ａには、表示の時間にわたってＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）またはｏｘＰＡＰＣ（５０μＭ）で処理したｉＭΦ株のＣＤ１４およびＴＬＲ４の表面レベルを示す折れ線グラフが示されている。ＣＤ１４およびＴＬＲ４の表面レベルを、フローサイトメトリーで測定した。折れ線グラフは、２つの独立した実験の平均および標準偏差を表す。図４４Ｂには、表示の時間にわたってｏｘＰＡＰＣ（５０μＭ）で処理した一次ＤＣおよびＭΦの結果を示す折れ線グラフが示されている。ＣＤ１４およびＴＬＲ４の表面レベルおよびＴＬＲ４二量体化を、フローサイトメトリーで測定した。折れ線グラフは、２つの独立した実験の平均および標準偏差を表す。図４４Ｃには、ＬＰＳのみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、ｏｘＰＡＰＣのみで（表示の濃度で）処理したか、またはｏｘＰＡＰＣで３０’前処理しその後ＬＰＳで処理したｉＭΦの結果を示す折れ線グラフが示されている。ＴＬＲ４の表面レベルおよびＴＬＲ４二量体化を、フローサイトメトリーで測定した。折れ線グラフは、３回のうち代表的な１つ実験での生物学的複製の平均および標準偏差を表す。図４４Ｄには、ＬＰＳのみで（表示の濃度で）処理したか、ｏｘＰＡＰＣのみで（１２０μＭ）処理したか、またはｏｘＰＡＰＣで３０’前処理しその後ＬＰＳで処理したｉＭΦの結果を示す画像が示されている。図４４Ｄ（左パネル）には、ＥＬＩＳＡによりＬＰＳ刺激の１８時間後に測定したＴＮＦα分泌が示されている。折れ線グラフは平均を表し、エラーバーは、３回のうち１つの代表的な実験での３回測定の標準偏差を表す。図４４Ｄ（右パネル）には、ウエスタン分析によりＬＰＳ処理の４時間後に測定したＳＴＡＴ−１リン酸化が示されている。図４４Ｅには、ＣＤ１４突然変異体のｏｘＰＡＰＣ結合能力を、ビオチン化ｏｘＰＡＰＣプルダウンアッセイにより決定したことを示すブロットが示されている。表示のＣＤ１４突然変異体を発現する２９３Ｔ細胞の溶解物を、ビオチン化ｏｘＰＡＰＣ（１０μｇ）と共にインキュベートした。その後、ＣＤ１４−ｏｘＰＡＰＣ複合体を、ニュートラアビジンビーズを使用して捕捉した。ｏｘＰＡＰＣにより保持されたＣＤ１４の量を、ウエスタン分析で決定した。２６ＤＥＥＳ２９を２６ＡＡＡＡ２９に突然変異させたＣＤ１４突然変異体を、ＣＤ１４  １Ｒと命名した。２６ＤＥＥＳ２９および３７ＰＫＰＤ４０を２６ＡＡＡＡ２９および３７ＡＡＡＡ４０に突然変異させたＣＤ１４突然変異体を、ＣＤ１４  ２Ｒと命名した。２６ＤＥＥＳ２９、３７ＰＫＰＤ４０、５２ＤＶＥ５４、および７４ＤＬＧＱ７７を、２６ＡＡＡＡ２９、３７ＡＡＡＡ４０、５２ＡＡＡ５４、および７４ＡＡＡＡ７７に突然変異させたＣＤ１４突然変異体を、ＣＤ１４  ４Ｒと命名した。図４４Ｆには、４Ｒ  ＣＤ１４突然変異体が、ｏｘＰＡＰＣ処理またはＬＰＳ処理に応答して内部移行されなかったことを示すグラフが示されている。表示のｉＭΦ株を、表示の時間にわたって、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）またはｏｘＰＡＰＣ（５０μＭ）で処理した。ＣＤ１４の表面レベルを、フローサイトメトリーで測定した。折れ線グラフは平均を表し、エラーバーは、３回のうち１つの代表的な実験での生物学的複製の標準偏差を表す。
【図４５】図４５Ａ〜図４５Ｇは、ｏｘＰＡＰＣが、ＤＣのＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化を誘導したことを示す画像である。図４５Ａには、ＬＰＳのみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、３つの用量のｏｘＰＡＰＣで（１０、５０、１２０μＭ）処理したか、またはＬＰＳで３時間予備刺激した後ｏｘＰＡＰＣで処理したＤＣのＩＬ−１β分泌結果を示す棒グラフが示されている。この実験では、市販のｏｘＰＡＰＣ、およびＰＥＩＰＣ中で富化されたｏｘＰＡＰＣを使用した。ＬＰＳ投与の１８時間後、分泌された（左パネル）および細胞結合した（右パネル）ＩＬ−１βを、ＥＬＩＳＡで測定した。２回のうち代表的な１つ実験での生物学的複製の平均および標準偏差が示されている。図４５Ｂ〜図４５Ｄには、ＬＰＳのみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、ｏｘＰＡＰＣのみで（１２０μＭ）処理したか、またはＬＰＳで３時間の予備激した後ｏｘＰＡＰＣで処理したＷＴ  ＤＣまたはカスパーゼ−１  ＫＯおよびカスパーゼ−１／−１１  ｄＫＯ  ＤＣ（図４５Ｂ）、ＡＳＣ  ＫＯ  ＤＣ（図４５Ｃ）、およびＮＬＲＰ３  ＫＯ  ＤＣ（図４５Ｄ）の結果を示す棒グラフが示されている。ＬＰＳ投与の１８時間後、ＩＬ−１β分泌（左パネル）およびＴＮＦα分泌（右パネル）を、ＥＬＩＳＡで測定した。２つの独立した実験の平均および標準偏差が示されている。図４５Ｅには、ＬＰＳのみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、３つの用量のｏｘＰＡＰＣで（１０、５０、１２０μＭ）処理したか、またはＬＰＳで３時間予備刺激した後ｏｘＰＡＰＣで処理したＭΦのＩＬ−１β分泌結果を示す棒グラフが示されている。この実験では、市販のｏｘＰＡＰＣ、およびＰＥＩＰＣ中で富化されたｏｘＰＡＰＣを使用した。ＬＰＳ投与の１８時間後、分泌された（左パネル）および細胞結合した（右パネル）ＩＬ−１βを、ＥＬＩＳＡで測定した。２回のうち代表的な１つ実験での生物学的複製の平均および標準偏差が示されている。図４５Ｆには、Ｐａｍ３ＣＳＫ（Ｐ３Ｃ）のみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、ｏｘＰＡＰＣのみで（１２０μＭ）処理したか、ＡＴＰのみで（５ｍＭ）処理したか、またはＰａｍ３ＣＳＫで３時間予備刺激した後、ｏｘＰＡＰＣ、ＡＴＰ、ＤＯＴＡＰ、ＬＰＳ（５μｇ）、またはＤＯＴＡＰに封入されたｏｘＰＡＰＣで処理したＭΦのＩＬ−１β分泌結果を示す棒グラフが示されている。Ｐ３Ｃ投与の１８時間後に、ＩＬ−１βを、ＥＬＩＳＡで測定した。２回のうち１つの実験の３つの複製の平均および標準偏差が示されている。図４５Ｇには、ＬＰＳで予備刺激したＤＣおよびＭΦが、ＡＴＰ処理後のＮＬＲＰ３活性化に対するそれらの応答に固有な差異を示したことを示す棒グラフが示されている。ＤＣ（左パネル）またはＭΦ（右パネル）を、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で３時間の予備刺激し、ＡＴＰ（３ｍＭ）で処理した。表示の時点で、ＩＬ−１βをＥＬＩＳＡで測定し、細胞死をＰＩ透過性アッセイで測定した。３回のうち１つの実験の４つの複製の平均および標準偏差が示されている。
【図４６】図４６Ａ〜図４６Ｇは、ｏｘＰＡＰＣ非標準インフラマソーム活性化を示す図である。図４６Ａには、ＬＰＳのみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、ｏｘＰＡＰＣのみで（１２０μＭ）処理したか、またはＬＰＳで３時間予備刺激した後、ｏｘＰＡＰＣで処理したＷＴ  ＤＣおよびカスパーゼ−１１  ＫＯ  ＤＣのＩＬ−１β分泌結果を示す棒グラフが示されている。ＬＰＳ投与の１８時間後に、ＩＬ−１β分泌を、ＥＬＩＳＡで測定した。２つの独立した実験の平均および標準偏差が示されている。図４６Ｂには、ＬＰＳのみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、ｏｘＰＡＰＣのみで（１２０μＭ）処理したか、またはＬＰＳで３時間予備刺激した後、ｏｘＰＡＰＣで処理したＷＴ  ＤＣおよびカスパーゼ−１１  ＫＯ  ＤＣのＴＮＦα分泌結果を示す棒グラフが示されている。ＬＰＳ投与の１８時間後に、ＴＮＦα分泌を、ＥＬＩＳＡで測定した。２つの独立した実験の平均および標準偏差が示されている。図４６Ｃには、ＬＰＳで予備刺激したＤＣは、ｏｘＰＡＰＣに応答して、カスパーゼ−１１依存的な様式でスペックを形成したが、ＡＴＰでは形成しなかったことを示す画像が示されている。ＤＣは、未処理のままだったか、またはＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で３時間予備刺激し、その後ＡＴＰ（１ｍＭ）またはｏｘＰＡＰＣ（１２０μＭ）で刺激した。スペックを含むＡＳＣ（緑色）およびカスパーゼ−１（Ｃａｓｐ１、赤色）を、ＬＰＳ刺激の１８時間後に分析した。核は青色で示されている。パネルは、４つの独立した実験を表している。図４６Ｄには、内因性カスパーゼ−１１が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｏｘＰＡＰＣと結合したことを示すブロットが示されている。未処理（ｎｔ）ＭΦまたはＰ３Ｃ予備刺激（Ｐ３Ｃ）ＭΦのＳ１００画分（０．５ｍｇ）を、ビオチン化ＬＰＳ（Ｂｉｏ−ＬＰＳ）またはビオチン化ｏｘＰＡＰＣ（Ｂｉｏ−ｏｘＰＡＰＣ）と共にインキュベートした。ビオチン化脂質と結合した内因性タンパク質を、ストレプトアビジンで捕捉し、ウエスタン分析で解明した。３つの独立した実験のうち代表的なブロットが示されている。図４６Ｅには、タンパク質と表示の脂質との相互作用のＳＰＲ分析のグラフが示されている。図４６Ｆには、ｏｘＰＡＰＣとの接触前後の、カスパーゼ−１１複合体のサイズのゲルろ過分析を示すグラフが示されている。図示されているように、複合体サイズは、Ａ２８０またはウエスタン分析でモニターした。図４６Ｇには、ｐＭＳＣＶ２．２−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクター（空）、ＷＴカスパーゼ−１１（ＷＴカスパーゼ−１１）をコードするｐＭＳＣＶ２．２−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクター、または触媒性突然変異体カスパーゼ−１１（Ｃ２５４Ａ）を含む同じベクターを感染させた骨髄細胞の分泌および生存能結果を示す棒グラフが示されている。ＧＭ−ＣＳＦ含有培地中で７日間分化させた後、ＤＣを、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で３時間予備刺激したかまたは予備刺激せず、その後ｏｘＰＡＰＣ（１２０μＭ）で刺激したか、またはＬＰＳ含有ＦｕＧＥＮＥ（ＬＰＳ、５μｇ）で形質移入した。ＬＰＳ予備刺激の１８時間後、上清を収集し、ＩＬ−１β分泌およびＴＮＦα分泌を、ＥＬＩＳＡで測定した。細胞の生存率を、ＬＤＨ放出を測定することにより評価した。
【図４７】図４７Ａ〜図４７Ｅは、ＣＤ１４が、ＤＣからのカスパーゼ−１１媒介性ＩＬ−１β放出を促進したことを示す棒グラフである。図４７Ａには、ＬＰＳのみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、Ｐａｍ３ＣＳＫ（Ｐ３Ｃ）のみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、ｏｘＰＡＰＣのみで（１２０μＭ）処理したか、またはＬＰＳもしくはＰａｍ３ＣＳＫで３時間予備刺激した後、ｏｘＰＡＰＣで処理したＷＴ  ＤＣおよびＣＤ１４ＫＯ  ＤＣの分泌結果を示す棒グラフが示されている。ＬＰＳ投与またはＰ３Ｃ投与の１８時間後に、ＩＬ−１β分泌およびＴＮＦα分泌を、ＥＬＩＳＡで測定した。２つの独立した実験の平均および標準偏差が示されている。図４７Ｂには、ＬＰＳのみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、ＡＴＰのみで（１．５ｍＭ）処理したか、ｏｘＰＡＰＣのみで（１２０μＭ）処理したか、またはＬＰＳで３時間予備刺激した後、ｏｘＰＡＰＣまたはＡＴＰで処理した脾臓由来ＷＴ  ＤＣ、ＣＤ１４  ＫＯ  ＤＣ、およびカスパーゼ−１１  ＫＯ  ＤＣのＩＬ−１βおよびＴＮＦα分泌結果を示す棒グラフが示されている。ＬＰＳ投与の１８時間後に、ＩＬ−１β分泌およびＴＮＦα分泌を、ＥＬＩＳＡで測定した。３回のうち１つの代表的な実験の２つの複製の平均および標準偏差が示されている。図４７Ｃには、ＬＰＳまたはＰａｍ３ＣＳＫで処理したＷＴ  ＤＣおよびＣＤ１４  ＫＯ  ＤＣの遺伝子発現結果を示す棒グラフが示されている。ＴＢＰに対する遺伝子発現を、指定の時間でｑＰＣＲにより分析した。結果は、未処理細胞と比較した遺伝子発現として示されている。折れ線グラフは、３回のうち１つの代表的な実験での３回測定の平均を表す。図４７Ｄには、ＬＰＳのみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、ｏｘＰＡＰＣのみで（１２０μＭ）処理したか、またはＬＰＳで３時間予備刺激した後、ｒＩＦＮβ（１００Ｕ／ｍｌ）の存在下または非存在下にてｏｘＰＡＰＣで処理したＷＴ  ＤＣおよびＣＤ１４  ＫＯ  ＤＣのＩＬ−１βおよびＴＮＦα分泌結果を示す棒グラフが示されている。ＬＰＳ投与の１８時間後に、ＩＬ−１β分泌およびＴＮＦα分泌を、ＥＬＩＳＡで測定した。２つの独立した実験の平均および標準偏差が示されている。図４７Ｅには、ＬＰＳのみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、Ｐａｍ３ＣＳＫ（Ｐ３Ｃ）のみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、ｏｘＰＡＰＣのみで（１２０μＭ）処理したか、またはＰａｍ３ＣＳＫで３時間予備刺激した後、ｏｘＰＡＰＣで処理したＷＴ  ＤＣおよびＣＤ１４ＫＯ  ＤＣのＩＬ−１β分泌結果を示す棒グラフが示されている。図示されているように、ＬＰＳまたはｏｘＰＡＰＣは、細胞培養に添加する前に、ＤＯＴＡＰと複合体化させた。図示されているように、細胞を、ＤＯＴＡＰ／ｏｘＰＡＰＣ複合体の培養への添加前に、全カスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤで３０分間処理した。刺激投与の１８時間後に、ＩＬ−１β分泌を、ＥＬＩＳＡで測定した。２つの独立した実験の平均および標準偏差が示されている。
【図４８】図４８Ａ〜図４８Ｇは、ｏｘＰＰＡＣが、天然アジュバントのように作用して、ＤＣの死滅を防止し、適応免疫応答を強化したことを示す画像である。図４８Ａには、ＬＰＳのみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、ＡＴＰのみで（１ｍＭ）処理したか、ｏｘＰＡＰＣのみで（１２０μＭ）処理したか、またはＦｕＧＥＮＥ複合体化ＬＰＳで（５μｇ）（Ｆｕｇｅｎｅ（ＬＰＳ））処理したか、またはＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で３時間予備刺激した後、表示の刺激で処理したＤＣの生存能結果を示す棒グラフが示されている。ＬＰＳ予備刺激の４および１８時間後に、細胞死を、ＬＤＨ放出により測定した。図４８Ｂには、ＬＰＳのみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、ＡＴＰのみで（１ｍＭ）処理したか、ｏｘＰＡＰＣのみで（１２０μＭ）処理したか、またはＦｕＧＥＮＥ複合体化ＬＰＳで（５μｇ）（Ｆｕｇｅｎｅ（ＬＰＳ））処理したか、またはＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で３時間予備刺激した後、表示の刺激で処理したＤＣのＩＬ−１β分泌結果を示す棒グラフが示されている。ＬＰＳ予備刺激の４および１８時間後に、ＩＬ−１β分泌を、ＥＬＩＳＡで測定した。図４８Ｃ〜図４８Ｄには、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で３時間、前処理した後、ＡＴＰ（１ｍＭ）またはｏｘＰＡＰＣ（１２０μＭ）で活性化したＤＣの染色結果を示す画像が示されている。１８時間後、細胞を、ＡＳＣ（緑色）、核（青色）Ｚｏｍｂｉｅ染料（赤色）（図４８Ｃ）、または活性ミトコンドリア（赤色）（図４８Ｄ）で染色した。パネルは、３つの独立した実験を表している。図４８Ｅ〜図４８Ｆには、ＬＰＳのみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、ｏｘＰＡＰＣのみで（１２０μＭ）処理したか、ＡＴＰのみで（１ｍＭ）処理したか、またはＬＰＳで３時間予備刺激した後、ｏｘＰＡＰＣまたはＡＴＰで処理したＤＣの生存能結果を示す棒グラフが示されている。表示の時点で、細胞の生存率を、７−ＡＡＤ染色により測定した。２つの独立した実験の平均および標準偏差が示されている。図４８Ｇには、ｏｘＰＡＰＣが、ｉｎ  ｖｉｖｏで記憶Ｔ細胞応答を強化したことを示す棒グラフが示されている。ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、ＷＴマウス、カスパーゼ−１／−１１  ｄＫＯマウス、またはカスパーゼ−１１  ＫＯマウスの、ＩＦＡ（ＬＰＳ）中のＯＶＡ＋ＬＰＳ、ＩＦＡ（ＬＰＳ＋ｏｘＰＡＰＣ）中のＯＶＡ＋ＬＰＳ＋ｏｘＰＡＰＣ、またはＩＦＡ（ｏｘＰＡＰＣ）中のＯＶＡ＋ｏｘＰＡＰＣで免疫した４０日後の流入領域リンパ節から単離した。ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、ＤＣの存在下にてＯＶＡで再刺激したか、または再刺激しなかった。ＩＦＮγ分泌（左パネル）およびＩＬ−１７分泌（右パネル）を、５日後にＥＬＩＳＡで測定した。棒グラフは、１群当たり５匹の動物を用いた２回の実験の平均および標準誤差を表す。
【図４９】図４９Ａ〜図４９Ｂは、ｏｘＰＡＰＣが、ミッドソーム形成またはＩ型ＩＦＮシグナル伝達を誘導しなかったことを示すブロットである（図４３Ａ〜図４３Ｄと関連する）。図４９Ａには、ＩＲＡＫ４をＭｙＤ８８と共に共免疫沈殿した後、表示のタンパク質についてウエスタン分析することにより、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）でまたは異なる用量のｏｘＰＡＰＣ（１０、５０、１２０μＭ）で処理した後、表示の時点で評価したｉＭΦでのミッドソーム形成を示す棒グラフが示されている。図４９Ｂには、ＤＣから収集し、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）または異なる用量のｏｘＰＡＰＣ（１０、５０、１２０μＭ）で処理した後、表示のタンパク質についてウエスタン分析することによりモニターした全細胞溶解物（ＷＣＬ）を示すブロットが示されている。
【図５０】図５０Ａ〜図５０Ｄは、ｏｘＰＡＰＣが、ＣＤ１４のアゴニストだったが、ＴＬＲ４のアゴニストではなかったことを示すグラフである（図４４Ａ〜図４４Ｆも参照）。図５０Ａには、表示の濃度のｏｘＰＡＰＣで処理したＤＣの表面ＣＤ１４結果を示す棒グラフが示されている。ＣＤ１４の表面レベルを、フローサイトメトリーで測定した。折れ線グラフは、２つの独立した実験の平均および標準偏差を表す。図５０Ｂ〜図５０Ｄには、シクロヘキシミド（１００μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下にて、表示の時間にわたってＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）またはｏｘＰＡＰＣ（１２０μＭ）で処理したＤＣの表面ＣＤ１４、表面ＴＬＲ４、およびＴＬＲ４二量体化の結果を示す棒グラフが示されている。ＣＤ１４（図５０Ｂ）、ＴＬＲ４（図５０Ｃ）、およびＴＬＲ４二量体化（図５０Ｄ）の表面レベルを、フローサイトメトリーで測定した。折れ線グラフは、２つの独立した実験の平均および標準偏差を表す。
【図５１】図５１Ａ〜図５１Ｉは、ｏｘＰＡＰＣが、細胞タイプ特異的な様式でＩＬ−１β放出を誘導したことを示す画像である（図４５Ａ〜図４５Ｇも参照）。図５１Ａには、ＤＣおよびｉＭΦが、ＡＴＰに応答してＩＬ−１βを放出したことを示す棒グラフが示されている。新しく誘導したＤＣおよびＭΦを、ＬＰＳのみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、ＡＴＰのみで（ＡＴＰｌｏｗ：０．５ｍＭ；ＡＴＰｈｉ  ５ｍＭ）処理したか、またはＬＰＳで３時間予備刺激した後ＡＴＰで処理した。ＬＰＳ投与の１８時間後、上清を収集し、分泌されたＩＬ−１βのレベルを、ＥＬＩＳＡで測定した。２つの独立した実験の平均および標準偏差が示されている。図５１Ｂ〜図５１Ｃには、異なる用量のＬＰＳ（１００および１０００ｎｇ／ｍｌ）で予備刺激し、または予備刺激せず、細胞を３時間後にｏｘＰＡＰＣ（１２０μＭ）またはＡＴＰ（０．５ｍＭ）で活性化したＤＣの分泌ＩＬ−１βレベルおよび細胞結合ＩＬ−１βレベルを示す棒グラフが示されている。ＬＰＳ投与の１８時間後、上清を収集し、分泌ＩＬ−１βのレベル（図５１Ｂ）および細胞結合ＩＬ−１βのレベル（図５１Ｃ）を、ＥＬＩＳＡで測定した。３回のうち代表的な１つ実験での生物学的複製の平均および標準偏差が示されている。図５１Ｄには、ＬＰＳのみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、ＡＴＰのみで（０．５ｍＭ）処理したか、ｏｘＰＡＰＣのみで（１２０μＭ）処理したか、またはＬＰＳで３時間予備刺激した後、ＡＴＰまたはｏｘＰＡＰＣで処理したＤＣまたはＭΦのＴＮＦα結果を示す棒グラフが示されている。ＬＰＳ投与の１８時間後、上清を収集し、ＴＮＦαのレベルを、ＥＬＩＳＡで測定した。２つの独立した実験の平均および標準偏差が示されている。図５１Ｅには、ＬＰＳのみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、ＡＴＰのみで（０．５ｍＭ）処理したか、ｏｘＰＡＰＣのみで（１２０μＭ）で処理したか、またはＬＰＳおよびＡＴＰ、もしくはＬＰＳおよびｏｘＰＡＰＣを同時投与したＤＣの分泌ＩＬ−１βおよび細胞結合ＩＬ−１βの結果を示す棒グラフが示されている。分泌ＩＬ−１βおよび細胞結合ＩＬ−１βを、１８時間後にＥＬＩＳＡで測定した。２つの独立した実験の平均および標準偏差が示されている。図５１Ｆには、ＬＰＳのみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、ＡＴＰのみで（５ｍＭ）処理したか、表示のリン脂質のみで（１２０μＭ）処理したか、またはＬＰＳで３時間予備刺激した後、ＡＴＰまたは表示のリン脂質で処理したＤＣのＩＬ−１βおよびＴＮＦα分泌結果を示す棒グラフが示されている。ＬＰＳ投与の１８時間後に、ＩＬ−１β分泌およびＴＮＦα分泌を、ＥＬＩＳＡで測定した。２つの独立した実験の平均および標準偏差が示されている。図５１Ｇには、ＬＰＳのみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、ＡＴＰのみで（ＤＣは１ｍＭ、およびＭΦは５ｍＭ）処理したか、ｏｘＰＡＰＣのみで（１２０μＭ）処理したか、またはＬＰＳで３時間、前処理した後、ＡＴＰまたはｏｘＰＡＰＣで活性化したＤＣおよびＭΦ（ＩＦＮγで前処理されているかまたは前処理されていない）のＩＬ−１βおよびＴＮＦα分泌結果を示す棒グラフが示されている。分泌ＩＬ−１βおよび分泌ＴＮＦαを、１８時間後にＥＬＩＳＡで測定した。２��のうち１つの代表的な実験の２つの複製の平均および標準偏差が示されている。図５１Ｈには、ＤＣおよびＭΦが、異なるレベルのＡＳＣタンパク質を発現したことを示すブロットが示されている。ＤＣおよびＭΦは、ＬＰＳで４時間処理したか、または処理しなかった。全溶解物を使用して、ウエスタン分析によりＡＳＣのタンパク質含有量を評価した。図５１Ｉには、ＬＰＳで４時間処理したかまたは処理しなかったＤＣおよびＭΦの遺伝子発現結果を示す棒グラフが示されている。ＡＳＣ、Ｎｌｒｐ３、カスパーゼ−１（Ｃａｓｐ−１）、およびカスパーゼ−１１（Ｃａｓｐ−１１）の発現を、ｑＰＣＲで測定した。ＴＢＰに対する遺伝子発現レベルが示されている。折れ線グラフは、３回のうち１つの代表的な実験での３回測定の平均を表す。
【図５２】図５２Ａ〜図５２Ｉは、ｏｘＰＡＰＣが、カスパーゼ−１１と結合し、ＤＣのインフラマソーム活性化を制御したことを示す画像である（図４６Ａ〜図４６Ｇも参照）。図５２Ａには、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で予備刺激した後、ＡＴＰ（１ｍＭ）またはｏｘＰＡＰＣ（１２０μＭ）で活性化したＤＣのＡＳＣおよびカスパーゼ−１含有スペック形成を示す折れ線グラフが示されている。表示の時間で、ＡＳＣおよびカスパーゼ−１含有スペック形成を評価した。データは、３つの独立した実験で得られた約５０個の細胞を含む３つの視野の平均および標準偏差を表す。図５２Ｂには、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で予備刺激した後、ＡＴＰ（１ｍＭ）またはｏｘＰＡＰＣ（１２０μＭ）で活性化したＤＣのＡＳＣおよびカスパーゼ−１含有スペック形成を示す棒グラフが示されている。１８時間後、ＡＳＣおよびカスパーゼ−１含有スペック形成を評価した。データは、３つの独立した実験の平均および標準偏差を表す。図５２Ｃには、Ｐａｍ３ＣＳＫ（Ｐ３Ｃ）のみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、ＡＴＰのみで（０．５ｍＭ）処理したか、ｏｘＰＡＰＣのみで（１２０μＭ）処理したか、またはＰａｍ３ＣＳＫで３時間予備刺激した後、ＡＴＰまたはｏｘＰＡＰＣで処理した、表示されている遺伝子型のＤＣのＩＬ−１βおよびＴＮＦα分泌結果を示す棒グラフが示されている。Ｐａｍ３ＣＳＫ投与の１８時間後、ＩＬ−１β分泌およびＴＮＦα分泌を、ＥＬＩＳＡで測定した。２つの独立した実験の平均および標準偏差が示されている。図５２Ｄには、ＣｐＧのみで（１μＭ）処理したか、ｏｘＰＡＰＣのみで（１２０μＭ）処理したか、またはＣｐＧで３時間予備刺激した後、ｏｘＰＡＰＣで処理したＤＣのＩＬ−１β分泌およびＴＮＦα分泌を示す棒グラフが示されている。ＣｐＧ投与の１８時間後に、ＩＬ−１β分泌およびＴＮＦα分泌を、ＥＬＩＳＡで測定した。２つの独立した実験の平均および標準偏差が示されている。図５２Ｅには、Ｐａｍ３ＣＳＫ（Ｐ３Ｃ）のみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、ｏｘＰＡＰＣのみで（１２０μＭ）処理したか、またはＰａｍ３ＣＳＫで３時間予備刺激した後、ｏｘＰＡＰＣで処理した、Ｃ３Ｈ／ＨｅＳＮＪ（ＷＴ  Ｃ３Ｈ）マウスおよびＣ３Ｈ／ＨｅＪ（ＴＬＲ４突然変異体Ｃ３Ｈ）マウスに由来するＤＣの分泌ＩＬ−１βレベルおよび細胞結合ＩＬ−１βレベルを示す棒グラフが示されている。ＬＰＳ投与の１８時間後、分泌（左パネル）および細胞結合（右パネル）ＩＬ−１βを、ＥＬＩＳＡで測定した。２回のうち代表的な１つ実験での生物学的複製の平均および標準偏差が示されている。図５２Ｆには、目をＨＳＶ−１に感染させたＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６（ＷＴ）マウスまたはカスパーゼ−１１  ＫＯマウスの、目における感染ウイルスの量を示す折れ線グラフが示されている。表示の時間で、目における感染ウイルスの量を、プラークアッセイにより測定した。図５２Ｇには、ビオチン化リガンドおよびストレプトアビジンビーズと共にインキュベートした、表示のカスパーゼ−１１対立形質を発現する２９３Ｔ細胞に由来する溶解物中のカスパーゼ−１１レベルを示すブロットが示されている。ビオチン化リガンドにより保持されたカスパーゼ−１１およびインプットを、ウエスタン分析で検出した。３つの独立した実験のうち代表的なブロットが示されている。使用したカスパーゼ−１１の対立形質は、以下の通りだった：カスパーゼ−１１（ＷＴ）、ＣＡＲＤドメイン（１〜９２ａ．ａ．）、およびデルタＣＡＲＤ（ΔＣＡＲＤ）ドメイン（９３〜３７３ａ．ａ．）。図５２Ｈ〜図５２Ｉには、表示の脂質と混合した組換えカスパーゼ−１１単量体または多量体の酵素活性を示すグラフが示されている。酵素活性は、分光蛍光法により経時的にモニターした。
【図５３】図５３Ａ〜図５３Ｄは、インフラマソーム成分発現が、ＷＴ  ＤＣおよびＣＤ１４ＫＯ  ＤＣで類似していたことを示す画像である（図４７Ａ〜図４７Ｅと関連する）。図５３Ａには、ＬＰＳのみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、ｏｘＰＡＰＣのみで（１２０μＭ）処理したか、ＡＴＰのみで（１ｍＭ）処理したか、またはＬＰＳで３時間予備刺激した後、ｏｘＰＡＰＣまたはＡＴＰで処理したＷＴ  ＤＣ、ＣＤ１４ＫＯ  ＤＣ、およびカスパーゼ−１１  ＫＯ  ＤＣのＩＬ−１８レベルを示す棒グラフが示されている。上清中のＩＬ−１８を、１８時間後にＥＬＩＳＡにより測定した。図５３Ｂには、ＬＰＳのみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、ｏｘＰＡＰＣのみで（１２０μＭ）処理したか、またはＬＰＳで３時間予備刺激した後、ｏｘＰＡＰＣで処理した脾臓ＤＣのＭＨＣクラスＩＩレベルおよびＣＤ４０レベルを示すフローサイトメトリーデータが示されている。１８時間後に、ＭＨＣクラスＩＩレベルおよびＣＤ４０レベルを、フローサイトメトリーで測定した。図５３Ｃには、ＬＰＳまたはＰａｍ３ＣＳＫ（１μｇ／ｍｌ）で処理したＷＴ  ＤＣおよびＣＤ１４  ＫＯ  ＤＣの遺伝子発現結果を示す棒グラフが示されている。ＴＢＰに対する遺伝子発現を、表示の時間でｑＰＣＲにより分析した。全ての実験で、未処理細胞を負の対照として使用した。図５３Ｄには、クロロキン（１０μＭ）で３０分間前処理し、または前処理せず、その後、ＬＰＳのみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、ｏｘＰＡＰＣのみで（１２０μＭ）処理したか、またはＬＰＳで予備刺激した後、ｏｘＰＡＰＣで処理したＤＣの分泌ＩＬ−１βおよび細胞結合ＩＬ−１βを示す棒グラフが示されている。分泌ＩＬ−１βおよび細胞結合ＩＬ−１βを、１８時間後にＥＬＩＳＡで測定した。
【図５４】図５４Ａ〜図５４Ｃは、ｏｘＰＡＰＣが、ＤＣのピロトーシスを誘導せず、Ｔ細胞活性化増強を促進したことを示す画像である（図４８Ａ〜図４８Ｇも参照）。図５４Ａには、ＬＰＳのみで（１μｇ／ｍｌ）処理したか、またはＬＰＳで３時間予備刺激した後、ｏｘＰＡＰＣ（１２０μＭ）またはＡＴＰ（５ｍＭ）で処理したＷＴ  ＤＣのピロトーシス細胞レベルを示す折れ線グラフが示されている。ピロトーシス誘導は、刺激付加の１８時間後まで評価した。ピロトーシス細胞は、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤの二重陽性細胞として、フローサイトメトリーにより特定した。データは、２つの独立した実験を表している。図５４Ｂには、ＷＴマウス、カスパーゼ−１／−１１  ｄＫＯマウス、またはカスパーゼ−１１  ＫＯマウスの、ＩＦＡ（ＬＰＳ）中のＯＶＡ＋ＬＰＳ、ＩＦＡ（ＬＰＳ＋ｏｘＰＡＰＣ）中のＯＶＡ＋ＬＰＳ＋ｏｘＰＡＰＣ、またはＩＦＡ（ｏｘＰＡＰＣ）中のＯＶＡ＋ｏｘＰＡＰＣで免疫した４０日後の流入領域リンパ節から単離したＣＤ４＋  Ｔ細胞のＩＬ−２分泌を示す棒グラフが示されている。ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、抗原提示細胞としてのＤＣの存在下にてＯＶＡで再刺激したか、または再刺激しなかった。ＩＬ−２分泌を、５日後にＥＬＩＳＡで測定した。棒グラフは、１群当たり５匹の動物を用いた２回の実験の平均および標準誤差を意味する。図５４Ｃには、ｏｘＰＡＰＣが、ｉｎ  ｖｉｖｏでエフェクターＴ細胞応答を強化したことを示す棒グラフが示されている。ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、ＷＴマウス、カスパーゼ−１／−１１  ｄＫＯマウス、またはカスパーゼ−１１  ＫＯマウスの、ＩＦＡ（ＬＰＳ）中のＯＶＡ＋ＬＰＳ、ＩＦＡ（ＬＰＳ＋ｏｘＰＡＰＣ）中のＯＶＡ＋ＬＰＳ＋ｏｘＰＡＰＣ、またはＩＦＡ（ｏｘＰＡＰＣ）中のＯＶＡ＋ｏｘＰＡＰＣで免疫した７日後の流入領域リンパ節から単離した。ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、抗原提示細胞としてのＤＣの存在下にて、ＯＶＡで再刺激したか、または再刺激しなかった。ＩＦＮγ分泌（上部パネル）およびＩＬ−１７分泌（下部パネル）を、５日後にＥＬＩＳＡで測定した。棒グラフは、１群当たり３匹の動物を用いた４回の実験の平均および標準誤差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、ＰＡＰＣ脂質、特に酸化ＰＡＰＣ脂質（ｏｘＰＡＰＣ）が、樹状細胞（ＤＣ）における炎症応答の特異的活性化因子として機能するという予期しない観察に、少なくとも部分的に関する。特に、１−パルミトイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＡＰＣ）およびその酸化変異体（ｏｘＰＡＰＣ）が、樹状細胞（ＤＣ）における炎症応答の最初の特異的活性化因子であることを特定した。ｏｘＰＡＰＣは、ＴＬＲリガンドの存在下で、ＤＣの生存を促進し、Ｔ細胞活性化サイトカインであるインターロイキン１ベータ（ＩＬ−１β）の放出を引き起こした。
【００３２】
理論により束縛されることは望まないが、機構的には、ｏｘＰＡＰＣは、ＤＣ表面のＬＰＳ受容体ＣＤ１４と結合し、それによりｏｘＰＡＰＣのエンドソーム内への送達、およびそれに続く細胞質タンパク質カスパーゼ−１１への接近が促進されたと考えられる。ｏｘＰＡＰＣがカスパーゼ−１１と結合することにより、インフラマソーム媒介性ＩＬ−１β放出が引き起こされた。注目すべきことに、こうしたｏｘＰＡＰＣ誘発性応答は、マクロファージでは生じなかった。これは、この脂質の作用が、一般的な（マクロファージ媒介性）炎症応答ではなく、ＤＣの免疫調節活性を促進するような独特な仕組みであったことを示している。結果的に、ｏｘＰＡＰＣは、微生物産物と相乗効果を示し、ＰＡＭＰのみにより誘発され得るよりもロバストな抗原特異的Ｔ細胞活性化を誘導した。したがって、ｏｘＰＡＰＣは、ＰＡＭＰと共に機能して、ＤＣの生存を促進し、最大限の適応免疫応答を誘発する新しいクラスの免疫調節因子（「ｖｉｔａ−ＤＡＭＰ」と称する）のメンバーであることが特定された。
【００３３】
ＤＣは、防御（適応）免疫の最も強力な活性化因子であり、ＤＣ媒介性免疫を選択的に促進するワクチンアジュバントの設計が、現在、集中的に研究されている。現行のＦＤＡ認可ワクチンアジュバントは全て、ＤＣを特異的に活性化することができない。それらは全て、マクロファージおよびＤＣ等を含む様々な免疫細胞での一般的な炎症応答を促進する。
【００３４】
ＰＡＰＣがＤＣを特異的に活性化することができるという本発見により、この分子が、次世代ワクチンアジュバントのリード候補であることが特定された。なお、ＰＡＰＣは、過去に他の研究グループにより研究されているが、この分野の研究はほとんど、抗炎症性分子として作用するＰＡＰＣの能力に着目したものである。ＰＡＰＣは、免疫を阻害するのではなく、免疫を促進させるように作用するという本発見により、本明細書に記載および例示されているＰＡＰＣの使用は、こうした分子の治療価値に関するこれまでの示唆と区別される。
【００３５】
本発明を特定するための重要な知見は、ＰＡＰＣを微生物産物と同時投与すると、ＤＣ媒介免疫応答のみを促進することができたという発見だった。この同時投与により、これまで観察されていなかったＤＣの状態を生み出された。この新規の細胞挙動は、非常に重要な治療可能性であることが予見される。
【００３６】
定義
用語「ｏｘＰＡＰＣ」または「酸化ＰＡＰＣ」は、本明細書で使用される場合、１−パルミトイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＡＰＣ）の酸化により生成される脂質を指す。酸化により、断片化または全長のいずれかの酸素化ｓｎ−２残基を含む酸化リン脂質の混合物がもたらされる。十分に特徴付けられている酸化的断片化種は、オメガ−アルデヒド基またはオメガ−カルボキシル基を担持する五炭ｓｎ−２残基を含む。また、アラキドン酸残基の酸化は、エステル化イソプロスタンを含むリン脂質を生成する。ｏｘＰＡＰＣは、ｏｘＰＡＰＣに存在する他の酸化産物の中でも、ＨＯｄｉＡ−ＰＣ種、ＫＯｄｉＡ−ＰＣ種、ＨＯＯＡ−ＰＣ種、およびＫＯＯＡ−ＰＣ種を含む。
【００３７】
用語「非標準インフラマソーム活性化脂質」は、本明細書で使用される場合、細胞のカスパーゼ１１依存性インフラマソームの炎症応答を誘発することが可能な脂質を指す。例示的な「非標準インフラマソーム活性化脂質」としては、ＰＡＰＣ、ｏｘＰＡＰＣ、およびｏｘＰＡＰＣの種（例えば、ＨＯｄｉＡ−ＰＣ、ＫＯｄｉＡ−ＰＣ、ＨＯＯＡ−ＰＣ、ＫＯＯＡ−ＰＣ）、ならびにＲｈｏｄｏ  ＬＰＳ（ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）に由来するＬＰＳ−ＲＳまたはＬＰＳ）が挙げられる。
【００３８】
「免疫原」および「抗原」は、同義的に使用されており、細胞性免疫応答または体液性免疫応答を誘発することになるあらゆる化合物を意味する。非生物免疫原としては、例えば、死滅免疫原、サブユニットワクチン、組換えタンパク質、またはペプチド等が挙げられる。本発明のアジュバントは、任意の好適な免疫原と共に使用することができる。目的の例示的な免疫原としては、ウイルス、ミコプラズマ、寄生動物、原生動物、またはプリオン等を構成または由来するものが挙げられる。したがって、目的の免疫原は、限定ではないが、以下のものに由来していてもよい：ヒトパピローマウイルス、単純ヘルペスまたは帯状疱疹等のヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型または２型等のレトロウイルス、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、ＲＳウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、マイコプラズマ・ニューモニエ、サルモネラ属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、クロストリディウム属、エシェリヒア属、クレブシェラ属、ビブリオ属、ミコバクテリウム属の細菌、アメーバ、マラリア原虫、および／またはトリパノソーマ・クルージ。本発明のアジュバント脂質は、腫瘍抗原または他のがん抗原と同時投与し、それにより免疫賦活がん治療／がんワクチンを提供することができることが更に企図される。
【００３９】
「同時投与される」は、本明細書で使用される場合、２つの化合物が、複合的な免疫効果を達成するために十分に近接した時間で投与されることを意味する。したがって、同時投与は、連続投与または同時投与（例えば、共通の担体または同じ担体での同時投与）により実施してもよい。
【００４０】
例えば、分子の症状、レベル、または生物学的活性の「調節」等は、例えば、検出可能な程度に増加または減少した症状または活性等を指す。そのような増加または減少は、本発明のアジュバント脂質（非標準インフラマゾーム活性化脂質）で治療していない対象と比較して、治療した対象で観察することができる。この場合、未治療の対象（例えば、アジュバント脂質の非存在下で免疫原を投与した対象）は、治療した対象と同じまたは同様の疾患または感染症を有するかまたは発症しやすい。そのような増加または減少は、少なくとも約２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、もしくは１０００％以上、またはこれらの値の任意の２つの間の任意の範囲内であってもよい。調節は、例えば、対象の自己評価により、臨床医の評価により、または例えば、本発明のアジュバント脂質（非標準インフラマソーム活性化脂質）の存在下で投与した免疫原により達成される対象の免疫活性化の程度および／または性質を評価することを含む、適切なアッセイまたは測定を実施することにより、主観的に決定してもよく、または客観的に決定してもよい。調節は、一時的であってもよく、もしくは長期的であってもよく、もしくは恒久的であってもよく、あるいは本発明のアジュバント脂質を対象に投与している間もしくは投与した後の、または本明細書もしくは引用文献に記載のアッセイもしくは他の方法で使用している間もしくは使用した後の適切な時間、例えば、以下に記載の時間内、つまり、本発明のアジュバント脂質を投与もしくは使用した後の約１２時間〜２４時間もしくは４８時間から、対象がそのような免疫賦活組成物／治療を受けた後の約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、２１、２８日間、もしくは１、３、６、もしくは９か月間以上と様々であってもよい。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「対象」は、ヒト（例えば、ヒト対象）および非ヒト動物等の、適応免疫系を有する動物を含む。用語「非ヒト動物」は、あらゆる脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばげっ歯動物、例えばマウス、および非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、例えばヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生動物、爬虫類等を含む。
【００４２】
「好適な用量レベル」は、薬学的有効性と有害効果との（例えば、本発明のアジュバント脂質の存在下で投与した免疫原により付与された十分な免疫賦活活性と、十分に低いマクロファージ刺激レベルとの）治療上合理的なバランスを提供する用量レベルを指す。例えば、この用量レベルは、例えば、特定の用量レベルの免疫原性組成物（本発明のアジュバント脂質を含む）の投与後に産生される抗免疫原抗体の、対象におけるピーク血清レベルまたは平均血清レベルに関連していてもよい。
【００４３】
本明細書で提供される範囲は、その範囲内の値の全てを簡略的に示すものであることが理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群の任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲を含むと理解される。
【００４４】
特別な記載がない限りまたは状況から明白でない限り、用語「または」は、本明細書で使用される場合、包括的であると理解される。
【００４５】
特別な記載がない限りまたは状況から明白でない限り、用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、本明細書で使用される場合、単数または複数であると理解される。
【００４６】
本明細書で提供されるあらゆる組成物または方法は、本明細書で提供される他の組成物および方法のいずれかの１つまたは複数と組み合わせることができる。
【００４７】
樹状細胞（ＤＣ）およびパターン認識受容体（ＰＲＲ）の調節
自然免疫系は、古典的には、ＤＣが、適応免疫を促進する炎症応答を開始するかまたは開始しないかのいずれかであるという、全か無かの様式で作用するとみなされてきた。したがって、ＤＣにより発現されるＴＬＲは、そうした細胞の免疫原能力決定に非常に重要であると考えられている。哺乳類免疫系は、微生物の検出、感染を封じ込める防御応答の活性化に関与する。このタスクの中心となるのは、樹状細胞であり、樹状細胞は、微生物を感知した後、Ｔ細胞活性化を促進する。樹状細胞は、あらゆる伝染の脅威を評価し、それに釣り合った応答を指図することができることが示唆されているが（Ｂｌａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｍ．（２０１４）．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４，６０１−６１８；Ｖａｎｃｅ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｃｅｌｌ  ｈｏｓｔ＆ｍｉｃｒｏｂｅ  ６，１０−２１）、こうした免疫調節活性が生じ得る機序は不明である。
【００４８】
ＰＲＲは、幅広いクラスの微生物に共通する分子を、直接的にまたは間接的にのいずれかで検出するように作用する。そうした分子は、古典的には、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれており、中でも細菌性リポポリサッカリド（ＬＰＳ）、細菌性フラジェリン、またはウイルス性二本鎖ＲＮＡ等の因子が挙げられる。
【００４９】
免疫制御因子としてのＰＲＲの重要な属性は、特定の微生物産物を認識することができることである。そのため、ＰＲＲ媒介性シグナル伝達事象は、感染の決定的な兆候を提供するはずである。「ＧＯ」シグナルは、炎症およびＴ細胞媒介性免疫を促進するＤＣで発現されるＰＲＲにより活性化されることが想定される。興味深いことには、最近、幾つかのグループは、ＤＣが、単にこうした全か無かの様式で作用していないのではないかと提唱している（Ｂｌａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｓａｎｄｅｒ，Ｌ．Ｅ．（２０１２）．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２，２１５−２２５；Ｖａｎｃｅ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｃｅｌｌ  ｈｏｓｔ＆ｍｉｃｒｏｂｅ  ６，１０−２１）。むしろ、ＤＣは、あらゆる考え得る感染を引き起こす脅威（または毒性）を評価し、それに釣り合った応答を開始する能力を有している可能性がある。毒性を評価することができる最も一般的に考察されている手段は、毒性病原体が、非病原体よりも多様なＰＲＲを活性化することができることに基づく。しかしながら、全ての微生物が、共通した一組のＰＲＲ活性化因子を有するとは限らず、全てのＰＲＲ活性化因子が、同等の効力を示すとは限らない。したがって、感染中に活性化されたＰＲＲの数は、毒性の理想的評価ではない可能性がある。更に、感染中に活性化されたＰＲＲの数の増加は、一般的に、より大きな炎症応答に結び付くことになり、それは、間接的により大きなＴ細胞応答を促進する場合がある。ＤＣ活性化（例えば、毒性病原体を刺激として使用することによる）の状態を高めることが以前に示唆されている条件は、ＭΦ活性化の状態も高めることが予想される（Ｖａｎｃｅ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｃｅｌｌ  ｈｏｓｔ＆ｍｉｃｒｏｂｅ  ６，１０−２１）。したがって、感染の脅威を特異的に評価するための機序が免疫系（つまりＤＣ）に真に備わっているか否かは、依然として不明である。
【００５０】
感染の脅威を評価し得る１つの考え得る手段は、十分に認識されている一致検出のプロセスであろう。このプロセスでは、独立インプットが、任意の単一インプットにより誘発されるものとは異なる応答をもたらす。ＰＲＲの状況では、１つのそのようなインプットは、毒性の脅威に関わらず、感染を示すものである微生物産物であるに違いない。毒性脅威を評価するためには、第２のインプットが存在しなければならない。理論により束縛されることは望まないが、ここでは、この推定上の第２のインプットは、組織傷害部位で産生される分子であると考える。それは、細胞損傷が、高度に病原性である微生物に関連する特徴であることが多いためである。ＤＣに対して第２の刺激を提供する可能性のある候補分子は、アラーミンとしても知られている損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）と呼ばれる分子の多様なファミリーである（Ｋｏｎｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｒｏｃｋ，Ｋ．Ｌ．（２００８）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８，２７９−２８９；Ｐｒａｄｅｕ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｃｏｏｐｅｒ，Ｅ．Ｌ．（２０１２）Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３，２８７）。ＤＡＭＰは、感染性および非感染性の組織傷害の部位で見出されており、炎症応答を調節すると提唱されているが、それらの作用機序は依然として不明である。１つのそのようなクラスのＤＡＭＰは、総称的にｏｘＰＡＰＣとして知られている、１−パルミトイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＡＰＣ）に由来する酸化リン脂質により代表される。こうした脂質は、感染性組織傷害および非感染性組織傷害の両方の部位で産生され（Ｂｅｒｌｉｎｅｒ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗａｔｓｏｎ，Ａ．Ｄ．（２００５）．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５３，９−１１；Ｉｍａｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ  １３３，２３５−２４９；Ｓｈｉｒｅｙ，Ｋ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  ４９７，４９８−５０２）、死にかけている細胞の膜に非常に高いレベルで見出される（Ｃｈａｎｇ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００，１３５９−１３７０）。また、ｏｘＰＡＰＣは、アテローム硬化性組織で炎症を促進する酸化低密度リポタンパク質（ｏｘＬＤＬ）凝集体の活性成分であり（Ｌｅｉｔｉｎｇｅｒ，Ｎ．（２００３）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｌｉｐｉｄｏｌ  １４，４２１−４３０）、アテローム硬化性組織での局所濃度は、１０〜１００μＭと高い場合がある（Ｏｓｋｏｌｋｏｖａ，Ｏ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８５，７７０６−７７１２）。ｏｘＰＡＰＣと死にかけている細胞との間に関連性があるため、こうした脂質が、組織健康の全体的な指標としての役割を果たし得る可能性が高くなった。したがって、微生物産物が存在する場合、ｏｘＰＡＰＣは、感染の脅威が増加したことを示すことができる。
【００５１】
理論により束縛されることは望まないが、機構的には、受容体ＣＤ１４は、ｏｘＰＡＰＣおよびＰＡＰＣ等の脂質を捕捉し、それらを細胞内の位置へと送達し、そこで非標準インフラマソーム（カスパーゼ１１依存性インフラマソーム）を活性化すると考えられる。その後、インフラマソーム媒介性活性は、独立して生じるＴＬＲシグナル伝達事象と相乗作用して、ＴＬＲリガンドのみにより誘導されたものよりもロバストなＴ細胞応答を促進する。したがって、酸化脂質は、高度に感染性の微生物と遭遇したことを樹状細胞に警告し、そうした細胞が、感染の脅威に見合った適応応答を促進することを可能にすると考えられる。
【００５２】
トール様受容体
トール様受容体（ＴＬＲ）は、昆虫とヒトとの間で進化的に保存されているＩ型膜貫通受容体である。これまで１０個のＴＬＲ（ＴＬＲ１〜１０）が確立されている（Ｓａｂｒｏｅ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７１（４）：１６３０−５）。ＴＬＲファミリーのメンバーは、同じような細胞外および細胞内ドメインを有し、細胞外ドメインは、ロイシン豊富な反復配列を有することが示されており、細胞内ドメインは、インターロイキン１型受容体（ＩＬ−１Ｒ）の細胞内領域と類似している。ＴＬＲ細胞は、免疫細胞および他の細胞（血管上皮細胞、脂肪細胞、心筋細胞、および腸上皮細胞を含む）で発現が異なる。ＴＬＲの細胞内ドメインは、その細胞質領域にＩＬ−１Ｒドメインを同様に有するアダプタータンパク質Ｍｙｄ８８と相互作用し、サイトカインのＮＦ−ＫＢ活性化をもたらすことができる。このＭｙｄ８８経路は、サイトカイン放出がＴＬＲ活性化により達成される１つの経路である。ＴＬＲは、抗原提示細胞（例えば樹状細胞、マクロファージ等）等の細胞タイプで主に発現される。１つのそのようなＴＬＲは、自然免疫系の活性化に関与し、グラム陰性菌の成分であるリポポリサッカリド（ＬＰＳ）を認識するＴＬＲ４である。ＴＬＲ４は、リンパ球抗原９６、Ｍｙｄ８８（ミエロイド分化一次応答遺伝子８８）、およびＴＯＬＬＩＰ（トール相互作用タンパク質）と相互作用することが示されている。
【００５３】
ＴＬＲを介した刺激による樹状細胞の活性化は、樹状細胞の成熟、およびＩＬ−１２等の炎症性サイトカインの産生に結び付く。これまでに実施された研究では、ＴＬＲは、様々なタイプのアゴニストを認識するが、幾つかのアゴニストは、幾つかのＴＬＲに共通であることが判明している。ＴＬＲアゴニストは、主に細菌またはウイルスに由来し、フラジェリンまたは細菌性リポポリサッカリド（ＬＰＳ）等の分子が挙げられる。
【００５４】
ＤＣ活性化の２つの状態
本明細書にて、ＤＣ活性化の２つの状態を特定した。第１の活性化状態は、ＴＬＲリガンド等の微生物産物との遭遇により媒介された。こうしたリガンドは、ＴＬＲを活性化してサイトカインを放出し、共刺激分子を上方制御し、ＭＨＣ媒介性抗原提示を促進した。これらは全て、Ｔ細胞活性化にとって重要だった。しかしながら、こうしたＴＬＲリガンドは、病原体および非病原体に共通していたため、宿主に対する脅威の評価には使用することができない。ＤＣの第２の状態は、「過剰活性」であると考えられ、微生物産物および組織損傷部位で豊富に存在していた酸化リン脂質との同時遭遇により媒介された。ＴＬＲリガンドおよび酸化脂質（例えば、ｏｘＰＡＰＣ）の一致検出は、古典的活性化状態により誘発される全ての活性を促進し、Ｔ細胞の強力な活性化因子であるＩＬ−１βのインフラマゾーム媒介放出を誘導した。ＴＬＲリガンドもｏｘＰＡＰＣも単独では、ＩＬ−１β放出を誘導する能力を持たなかった、この観察は、自然免疫系が一致検出の原理を使用してＤＣの過剰活性状態を誘導するという正式な実験的証拠を提供した。
【００５５】
過剰活性ＤＣ状態の興味深い側面は、それが誘発される機序である。古典的活性化は、微生物産物により誘発されたが、過剰活性状態は、微生物産物および自己由来産物により誘発された。免疫活性化にこうした自己参照の側面があることは、Ｔ細胞成熟および維持が、微生物ペプチドおよび自己ペプチドを担持するＭＨＣ分子との相互作用に依存することが以前に示されているため（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．Ａ．，Ｊｒ．（２００２）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０，１−２８）、全く前例のないことではなかった。機構的には、ｏｘＰＡＰＣを分析したところ、この分子は、ＬＰＳ受容体ＣＤ１４およびカスパーゼ−１１と結合し、それらを活性化したという点で、ＬＰＳの選択的内因性模倣体であることが判明した。興味深いことには、ｏｘＰＡＰＣは、ＴＬＲ４二量体化、エンドサイトーシス、ミッドソーム形成、または遺伝子発現のいずれも誘導しなかった。実際、微生物遭遇前に投与したところ、ｏｘＰＡＰＣは、ＴＬＲ４アンタゴニストとして作用した（Ｂｏｃｈｋｏｖ，Ｖ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１９，７７−８１；Ｅｒｒｉｄｇｅ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８３，２４７４８−２４７５９；Ｏｓｋｏｌｋｏｖａ，Ｏ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８５，７７０６−７７１２）。したがって、こうしたデータを合わせると、ＣＤ１４が、ＰＡＭＰ（ＬＰＳ）またはＤＡＭＰ（ｏｘＰＡＰＣ）のいずれかを、それぞれの受容体に送達することにより、ＴＬＲ４およびカスパーゼ−１１の活性を協調させるように機能するという、興味深い細胞プロセスが明らかになった。
【００５６】
この提唱ＣＤ１４−カスパーゼ−１１経路が、ＤＣ過剰活性に至る中心的局面であることは、幾つかの観察により支持された。第１に、ｏｘＰＡＰＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤ１４およびカスパーゼ−１１と複合体を形成した。第２に、ＣＤ１４およびカスパーゼ−１１の遺伝子欠損は、いずれのタンパク質の喪失も、ＤＣの機能不全を引き起こし、ｏｘＰＡＰＣ処置に応答してＩＬ−１βを放出させたという点で、互いに表現型コピーだった。対照的に、ＣＤ１４およびカスパーゼ−１１はいずれも、ＡＴＰ媒介性ＩＬ−１β放出に必要ではなかった。第３に、種々のＴＬＲ依存性サイトカインの発現が正常レベルだったことにより評価されるように、これらタンパク質はいずれも、インフラマソーム活性化の予備刺激段階では必要ではなかった。第４に、ｏｘＰＡＰＣがＣＤ１４に結合することにより、エンドサイトーシス、およびこの脂質の細胞内カスパーゼ−１１への送達が促進された。この記載は、ｏｘＰＡＰＣをサイトゾルに形質移入すると、ＣＤ１４  ＫＯにおけるＩＬ−１β放出の欠損を救済することができることにより支持された。この観察は、ＣＤ１４の輸送機能がカスパーゼ−１１活性化にとって重要だったという決定的な証拠を提供した。
【００５７】
カスパーゼ−１１は、グラム陰性サイトゾル細菌に応答してＩＬ−１β放出およびピロトーシスを促進することができる点で、近年、多くの関心を引きつけている（Ｈａｇａｒ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１，１２５０−１２５３；Ｋａｙａｇａｋｉ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１，１２４６−１２４９）。このようにカスパーゼ−１１がグラム陰性菌に対する免疫応答を選択的に促進することは、真のＬＰＳ受容体として作用するその新たに認識された能力により説明された（Ｓｈｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１４ａ）Ｎａｔｕｒｅ  ５１４，１８７−１９２）。ｏｘＰＡＰＣは、カスパーゼ−１１と結合し、カスパーゼ−１１の役割を、ＬＰＳ受容体としてのその作用を越えて拡張させた。実際、カスパーゼ−１１は、例えば、細胞が、グラム陽性菌（つまり、Ｐａｍ３ＣＳＫ）またはウイルス（ＣｐＧ  ＤＮＡ）に結合することが多いリガンドで刺激した場合等、ＴＬＲ４リガンドが存在しなかった場合、ｏｘＰＡＰＣ媒介性ＩＬ−１β放出に必要だった。
【００５８】
こうしたデータに基づくと、カスパーゼ−１１は、ＤＣの毒性脅威の指標として基本機能を有していた。脅威は、２つの方法で評価された。第１に、損傷の自己由来指標であるカスパーゼ−１１は、ｏｘＰＡＰＣに結合する能力のため、組織損傷および細胞死を引き起こすあらゆる病原体との遭遇中に活性化され得る。したがって、この活性は、有毒微生物による感染中に過剰活性化される基本機序をＤＣに提供するだろう。第２に、ＬＰＳをサイトゾルに直接送達するＩＩＩ型およびＩＶ型分泌系をコードする細菌の場合（Ｈａｇａｒ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ  Ｍｉａｏ，Ｅ．Ａ．（２０１４）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １７，６１−６６）、カスパーゼ−１１は、組織損傷が生じる前でさえ、ＤＣを過剰活性化させた可能性が高かった。こうした後者の条件下では、毒性関連分泌系によるサイトゾルへのＬＰＳの送達は、ＣＤ１４の輸送機能に関与しなかったはずである。実際、本明細書では、インフラマソームを活性化するためのＣＤ１４の遺伝子要件を、サイトゾルへのＬＰＳまたはｏｘＰＡＰＣの直接的形質移入により迂回させることができたことを特定した。対照的に、カスパーゼ−１１への細胞外媒体由来のｏｘＰＡＰＣの自然送達は、ＣＤ１４に依存していた。カスパーゼ−１１活性化の媒介におけるＣＤ１４のこの重要な役割は、このタンパク質が、ＬＰＳ受容体としてのその役割から予想されるよりも、適応免疫の誘導により幅の広い機能を有することを示唆した。むしろ、ＣＤ１４およびカスパーゼ−１１は、広範囲の病原体に対する免疫の一般的な制御因子である。このモデルは、目におけるＨＳＶ−１増殖が、カスパーゼ−１１の作用により押さえ込まれたという知見により、ｉｎ  ｖｉｖｏで支持された。
【００５９】
また、機構的な研究により、ｏｘＰＡＰＣは、幾つかの基本的な点で、カスパーゼ−１１に対する作用がＬＰＳとは異なっていたことが明らかなった。第１に、両脂質は、カスパーゼ−１１と結合し、その多量体化を誘導したが、ＬＰＳは、ＣＡＲＤと結合し、一方でｏｘＰＡＰＣは、触媒ドメインと結合した。このように結合機序が異なることにより、機能的な帰結として、ＣＡＲＤへの結合は、カスパーゼ−１１酵素活性を促進したが、触媒ドメインとの結合は、酵素活性を抑制した。カスパーゼ−１１の酵素活性は、ピロトーシスに必要であったため、ｏｘＰＡＰＣが細胞を死滅させるはずではないという理由だった。実際、集団に基づく分析および単一細胞に基づく分析により、ｏｘＰＡＰＣは、細胞を死滅させなかったことが特定され、ｏｘＰＡＰＣと接触させた生存ＤＣ内にインフラマソームが存在したことが特定された。対照的に、ＡＴＰと接触させたＤＣでは、インフラマソームは死細胞内にのみ存在した。実際、ｏｘＰＡＰＣは、ＬＰＳにも接触させたＤＣの生存能を促進した。ＰＲＲと結合する内因性分子の例は幾つかあったが、最新の情報によると、相互作用のモードは、微生物相互作用を媒介するものに類似していた（または未知である）ことが示唆された。したがって、カスパーゼ−１１は、ＰＡＭＰ（ＬＰＳ）および内因性分子（ｏｘＰＡＰＣ）と相互作用する別々のドメインを含んでいたという点で、特異なＰＲＲであった。相互作用の機序がこのように異なるため、異なる細胞応答がもたらされた。それは、ＤＣと同様に、ＰＲＲも異なる活性化の状態を有していたことを示していた。
【００６０】
インフラマソーム活性化およびＤＣ生存を促進するｏｘＰＡＰＣの２重活性は、そうした活性が、適応免疫応答の強化に役割を果たしたことを示していた。実際、本明細書では、ＬＰＳ／ｏｘＰＡＰＣが、抗原特異的エフェクターおよび記憶Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで誘発する点で、ＬＰＳのみよりも優れたアジュバントであることを特定した。他の場合では、細胞死と無関係に生じるインフラマソーム活性化も観察されている（Ｂｒｏｚ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  ８，４７１−４８３；Ｃｅｂａｌｌｏｓ−Ｏｌｖｅｒａ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ７，ｅ１００２４５２；Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｌｅｎｚ，Ｌ．Ｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７，ｅ４５１８６）。進行中の研究では、死およびＩＬ−１β放出が連動する機序を調査中である。インフラマソーム促進性刺激であり、かつ生存促進性刺激であるという特異な能力に基づき、本明細書では、ｏｘＰＡＰＣは、ＤＣ生存および適応免疫の開始を促進するように機能するｖｉｔａ−ＤＡＭＰとみなすことができると結論付けた。ｖｉｔａ−ＤＡＭＰは、ピロトーシス細胞死の促進ではなく、細胞生存を促進するため、ＡＴＰ等の伝統的な定義のＤＡＭＰとは操作的に区別することができる。また、本明細書では、他の既知ＴＬＲ４アンタゴニストは、ｏｘＰＡＰＣとして同様の活性を有する選択的ＬＰＳ模倣体であり得ることが企図されている。なお、ｏｘＰＡＰＣは、非感染状況下でも放出された。こうした条件下では、ＣＤ１４エンドサイトーシスを促進するｏｘＰＡＰＣの能力が、傷害部位に存在する他のＤＡＭＰにより誤って活性化され得るＴＬＲ４依存性炎症応答の制限を支援した可能性が高かった（Ｍａｎｃｅｋ−Ｋｅｂｅｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ８，ｒａ６０）。炎症阻害または炎症促進のいずれかである、こうしたｏｘＰＡＰＣの状況依存性活性は、ＤＣが所与の組織での損傷源の評価を支援するのに重要であることを特定した。
【００６１】
要約すると、本明細書では、内因性自己分子が、カスパーゼ−１１と非典型的な様式で結合する能力によりＤＣの過剰活性状態を作り出すことができる手段が特定された。この過剰活性状態の存在により、自然免疫系は、ＰＡＭＰおよびｖｉｔａ−ＤＡＭＰＳの一致検出により感染の脅威が評価された機序により作用したことが明らかにされた。
【００６２】
アジュバントおよびワクチン
本発明のアジュバントを含む免疫原性組成物は、標的抗原に対する治療的または予防的免疫応答を対象に誘導するのに有効な量の選択免疫原が対象で産出されるように、任意の既知ワクチン形態、例えば、弱毒化ウイルス、タンパク質、核酸等のワクチンを使用して対象に投与することができる。対象は、ヒト対象であってもよく、または非ヒト対象であってもよい。動物対象としては、限定ではないが、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ（馬）、反芻動物（例えば、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ラクダ、アルパカ、ラマ、シカ）、ブタ、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ  ウズラ）、げっ歯動物、およびキロドプテラ（ｃｈｉｒｏｄｏｐｔｅｒａ）が挙げられる。対象は、限定ではないが、防御免疫応答の誘発、または他の目的のために収集および使用するための抗体（またはＢ細胞）の産生を含む、任意の目的で処置することができる。
【００６３】
ある実施形態では、本発明は、アジュバント含有微生物ワクチンを特徴とする。微生物ワクチンは、免疫系による生物全体の認識を可能にする細胞壁成分で構成されていることが多く、またはジフテリア等の毒性により疾患を引き起こす細菌では、トキシンまたは派生トキソイドが使用される場合がある。主に治療用途用に、幾つかの疾患生物の抗毒素が開発中である。細菌は、液体培地でまたは固形培養基培養として培養し、回収し、精製し、死菌ワクチンまたは弱毒ワクチンとしてそのまま使用してもよい。
【００６４】
任意選択で、目的の免疫原は、疾患標的細胞（例えば、腫瘍細胞、感染細胞）では発現されるが、他の組織では発現がより低いか、または全くは発現されない。標的細胞の例としては、以下のものを含む腫瘍性疾患に由来する細胞が挙げられる：これらに限定されないが、肉腫、リンパ腫、白血病、がん、メラノーマ、胸部のがん、前立腺のがん、卵巣がん、頚部のがん、結腸がん、肺のがん、膠芽腫、および星状細胞腫。あるいは、標的細胞は、例えば、ウイルス、ミコプラズマ、寄生動物、原生動物、およびプリオン等に感染していてもよい。したがって、目的の免疫原は、限定ではないが、以下のものに由来していてもよい：ヒトパピローマウイルス（下記を参照）、単純ヘルペスまたは帯状疱疹等のヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型または２型等のレトロウイルス、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、ＲＳウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、マイコプラズマ・ニューモニエ、サルモネラ属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、クロストリディウム属、エシェリヒア属、クレブシェラ属、ビブリオ属、ミコバクテリウム属の細菌、アメーバ、マラリア原虫、およびトリパノソーマ・クルージ。
【００６５】
腫瘍抗原および感染因子の抗原に加えて、これらに限定されないが、ｐ５３、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、網膜芽細胞腫、およびＴＳＧ１０１を含む腫瘍抑制遺伝子産物、または限定ではないが、ＲＡＳ、Ｗ  Ｔ、ＭＹＣ、ＥＲＫ、およびＴＲＫ等のがん遺伝子産物の突然変異体も、本発明により使用される標的抗原を提供することができる。標的抗原は、自己抗原、例えば、がんまたは腫瘍性疾患に関連しているものであってもよい。本発明の一実施形態では、免疫原は、疾患細胞のヒートショックタンパク質（ｈｓｐ）−ペプチド複合体に由来するペプチド、またはｈｓｐ−ペプチド複合体自体である。
【００６６】
ある実施形態では、免疫原は、天然供給源から精製してもよく、組換え発現により得てもよく、または直接合成してもよい。ある実施形態では、免疫原は、細胞全体、微生物、またはウイルス粒子により提供されてもよく、それらは、生菌であってもよく、弱毒化されていてもよく、死菌であってもよい。他の実施形態では、免疫原は、分子に１つまたは複数の免疫原領域を含むタンパク質断片を含んでいてもよい。
【００６７】
免疫原としては、対象の免疫応答を増強するために１つまたは複数の基を結合またはカップリングすること等により、修飾または誘導体化されているものが挙げられる。免疫原性担体タンパク質の例は、ＫＬＨおよびＢＳＡである。また、免疫原担体としては、広域クラスＩＩ活性化因子であるポリペプチドが挙げられる（例えば、Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｓｙｍｐ  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ  １９８９を参照）。結合させるための連結は、当業者に周知の方法により製作される。
【００６８】
本発明の免疫原性組成物は、免疫原およびアジュバント脂質を含み、治療および／または予防目的のために投与することができる。治療応用では、本発明の免疫原性組成物は、疾患の治療または進行および／もしくは症状の停止に有効な免疫応答を誘発するのに十分な量で投与される。本発明のアジュバントの用量は、免疫原の性質および対象の状態に応じて様々であろう。しかしながら、免疫原性応答を誘発する際に免疫原の効力を増強するのに十分な用量であるべきである。治療的または予防的治療の場合、投与するアジュバントの量は、体重１ｋｇ当たり０．０５、０．１、０．５、または１ｍｇから、体重１ｋｇ当たり約１０、５０、または１００ｍｇまで、またはそれを超える範囲であってもよい。本発明のアジュバントは、概して無毒性であり、概して、生命に危険を及ぼすような副作用を引き起こさずに比較的大量に投与することができる。
【００６９】
用語「治療的免疫応答」は、本明細書で使用される場合、標準的技法により測定される、標的抗原に対する体液性免疫および／または細胞性免疫の増加を指す。好ましくは、標的抗原に対する免疫の誘導レベルは、免疫原の投与前の少なくとも４倍、好ましくは少なくとも１６倍のレベルである。また、免疫応答は、定性的に測定することもできる。その場合、好適なｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイによる、対象の腫瘍または感染症の進行停止または軽減は、治療的免疫応答の誘導を示すとみなされる。
【００７０】
本発明の方法では、治療上有効量で組み合わされている本発明の免疫原およびアジュバントを含む組成物が、その必要性のある哺乳動物に投与される。用語「投与する」は、本明細書で使用される場合、求める結果を達成することができる任意の方法により、本発明の免疫原およびアジュバントを哺乳動物に送達することを意味する。本発明の免疫原およびアジュバントは、例えば、静脈内にまたは筋肉内に投与することができる。用語「哺乳動物」は、本明細書で使用される場合、これらに限定されないが、ヒト、実験動物、家庭ペット、および家畜を含むことが意図されている。「治療上有効量」は、哺乳動物に投与した際に所望の治療効果をもたらすのに有効な免疫原およびアジュバントの量を意味する。
【００７１】
本発明の免疫原およびアジュバントを含む組成物は、皮膚に、皮下に、静脈内に、筋肉内に、非経口的に、肺内に、膣内に、直腸内に、経鼻的に、または局所的に投与することができる。組成物は、注射、経口、噴霧、または粒子衝突により送達してもよい。
【００７２】
投与する組成物は、薬学的に許容される担体等の種々の追加物質を更に含んでいてもよい。好適な担体としては、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水エマルジョンまたはトリグリセリドエマルジョン等のエマルジョン、種々のタイプの湿潤剤、錠剤、コーティング錠、およびカプセル剤等の、標準的な薬学的に容認される担体のいずれかが挙げられる。典型的には、そのような担体は、デンプン、ミルク、糖、あるタイプのクレイ、ゼラチン、ステアリン酸、タルク、植物性油脂、ゴム、グリコール、または他の公知賦形剤等の賦形剤を含む。また、そのような担体は、香味料、着色料、または他の成分を含んでいてもよい。また、本発明の組成物は、好適な希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、および／または担体を含んでいてもよい。そのような組成物は、液体の形態であってもよく、または凍結乾燥製剤もしくはそうでなければ乾燥製剤であってもよく、緩衝剤（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）の含有量、ｐＨ、およびイオン強度が様々な希釈剤、表面への吸収を防止するアルブミンまたはゼラチン等の添加剤、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、プルロニックＦ６８、胆汁酸塩類）、可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、増量物質または張度調節剤（例えば、ラクトース、マンニトール）、ポリエチレングリコール等のポリマーのタンパク質との共有結合による結合、金属イオンとの複合体形成、またはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル等のポリマー化合物の微粒子調製物内へのまたは微粒子調製物上への、またはリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層もしくは多層小胞、赤血球ゴースト、もしくはスフェロプラスト上への物質の組み込みを含んでいてもよい。そのような組成物は、物理的状態、溶解度、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出速度、およびｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を及ぼすことになる。
【００７３】
医薬組成物
ある実施形態では、本発明は、本明細書で特定されている免疫原およびアジュバント脂質を含む医薬組成物を提供する。免疫賦活組成物は、好適に製剤化され、そのような送達のために認識されている任意の手段により対象または細胞の環境へと導入することができる。
【００７４】
そのような組成物は、典型的には、作用剤および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、文言「薬学的に許容される担体」は、医薬品投与と互換性のある、生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含む。また、補完的活性化合物を組成物に組み込むことができる。
【００７５】
医薬組成物は、その目的投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例はとしては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下投与に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含んでいてもよい：注射用水、生理食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒等の無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩等の緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロース等の張度を調整するための作用剤。また、ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基で調整することができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、または多用量バイアルに封入することができる。
【００７６】
注射用途に好適な医薬組成物は、無菌注射用溶液または分散系の即時調製用の無菌水溶液（水溶性の場合）または分散系および無菌粉末を含む。静脈内投与の場合、好適な担体としては、生理食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ社、パーシッパニー市、ニュージャージー州）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合で、組成物は無菌でなければならならず、容易な注射器通過性が存在する程度にまで流動性であるべきである。組成物は、製造および保管の条件下で安定的であるべきであり、細菌および真菌等の微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエテイレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｅｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）等）、およびそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用により、分散系の場合は必要とされる粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサール等により達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖；マニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトール、塩化ナトリウム等の多価アルコールを組成物に含むことが好ましいだろう。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる作用剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含ませることによりもたらすことができる。
【００７７】
無菌注射剤溶液は、必要量の活性化合物を、上記に記載の成分の１つまたは組み合わせと共に、選択した溶媒に組み込み、その後、必要に応じてろ過滅菌することにより調製することができる。一般的に、分散系は、基本分散媒、および上記に記載のものからの必要な他の成分を含む無菌媒体に、活性化合物を組み込むことにより調製される。無菌注射可能溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、それにより、それ以前に無菌ろ過したその溶液から、活性成分および任意の追加所望成分の粉末がもたらされる。
【００７８】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口治療投与の目的では、活性化合物を、賦形剤と共に組み込んでもよく、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤、例えばゼラチンカプセル剤の形態で使用することができる。また、経口組成物は、口内洗浄液として使用される流動性担体を使用して調製することができる。薬学的適合性結合剤および／またはアジュバント物質を、組成物の一部として含有させてもよい。錠剤、丸剤、カプセル剤、およびトローチ剤等は、以下の成分または同様の性質を持つ化合物のいずれかを含有していてもよい：微結晶性セルロース、トラガカントゴム、またはゼラチン等の結合剤；デンプンまたはラクトース等の賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅ等の潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素等の流動促進剤；スクロースまたはサッカリン等の甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香味料等の香味料。
【００７９】
また、本発明の組成物は、ナノ粒子製剤として製剤化することができる。
【００８０】
本発明の化合物は、即時放出投与、遅延放出投与、調節放出投与、持続放出投与、パルス放出投与、または制御放出投与で投与することができる。
【００８１】
本発明の医薬組成物は、重量／容積で０．０１から９９％までの活性物質を含有していてもよい。
【００８２】
吸入投与の場合、化合物は、好適な噴射剤、例えば二酸化炭素等のガスを含有する加圧容器もしくはディスペンサーまたはネブライザーからエアゾル噴霧の形態で送達される。そのような方法としては、米国特許第６，４６８，７９８号明細書に記載されているものが挙げられる。
【００８３】
また、全身投与は、経粘膜手段または経皮手段によってもよい。経粘膜投与または経皮投与の場合、浸透しようとする障壁に適切な浸透剤が、製剤に使用される。そのような浸透剤は、当技術分野で一般的に知られており、例えば、経粘膜投与の場合、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーまたは坐剤の使用により達成することができる。経皮投与の場合、活性化合物は、当技術分野で一般的に知られているものとして軟膏剤、膏薬、ゲル剤、またはクリーム剤に製剤化される。
【００８４】
また、化合物は、直腸送達の場合、坐剤（例えば、カカオ脂および他のグリセリド等の従来の坐剤基剤を用いる）または停留浣腸の形態に調製することができる。
【００８５】
１つの実施形態では、活性化合物は、移植片およびマイクロカプセル送達系を含む制御放出製剤等の、体内からの急速な排除から化合物を保護することになる担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の、生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤は、標準的技法を使用して調製することができる。また、こうした物質は、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社およびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．社から商業的に入手することができる。また、リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞に標的化されているリポソームを含む）を、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載されているような、当業者に知られている方法により調製することができる。
【００８６】
そのような化合物の毒性および治療効力は、例えばＬＤ５０（集団の５０％致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％治療有効量）を決定するための標準的な薬学的手順により、細胞培養または実験動物で決定することができる。毒性と治療効果との用量比は、治療指数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用することもできるが、非感染細胞への損傷可能性を最小限にし、それにより副作用を低減するために、そのような化合物を罹患組織の部位へと標的化する送達系を設計するように留意すべきである。
【００８７】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータを、ヒトで使用する範囲の用量を製剤化するために使用することができる。そのような化合物の用量は、好ましくは、毒性がほとんどないかまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、使用する剤形および使用する投与経路に応じて、この範囲内で様々であってもよい。本発明の方法で使用される化合物の場合、治療上有効用量は、最初に細胞培養アッセイで推定することができる。細胞培養で決定されたＩＣ５０（つまり、症状の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するための用量を、動物モデルに処方してもよい。そのような情報を使用して、ヒトに有用な用量をより正確に決定することができる。血漿レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【００８８】
本明細書で定義される場合、疾患または障害を標的とする本発明のアジュバント含有化合物の治療上有効量（つまり有効用量）は、選択した免疫原および標的疾患または障害に依存する。例えば、疾患または障害を標的とする本発明の免疫原−アジュバント組成物の免疫原の単一用量の量は、およそ１ｐｇ〜１０００ｍｇの範囲で投与することができる。幾つかの実施形態では、１０、３０、１００、もしくは１０００ｐｇ、または１０、３０、１００、もしくは１０００ｎｇ、または１０、３０、１００、もしくは１０００μｇ、または１０、３０、１００、もしくは１０００ｍｇを投与してもよい。幾つかの実施形態では、１〜５ｇの組成物を投与することができる。
【００８９】
本発明の化合物の治療上有効量は、当技術分野で知られている方法により決定することができる。使用する免疫原に依存することに加えて、本発明の医薬組成物の治療上有効量は、患者の年齢および全体的な生理学的状態、および投与経路に依存するだろう。ある実施形態では、治療用量は、概して、約１０〜２０００ｍｇ／日、および好ましくは約３０〜１５００ｍｇ／日であろう。例えば、５０〜５００ｍｇ／日、５０〜３００ｍｇ／日、および１００〜２００ｍｇ／日を含む、他の範囲を使用してもよい。
【００９０】
投与は、単一用量であってもよく、免疫原応答を生じさせるように間隔をあけた複数用量、１日１回、１日２回、またはそれ以上の頻度であってもよく、疾患または障害の維持期中は、例えば、毎日または１日２回ではなく、２日おきまたは３日おきに１回に低減させてもよい。用量および投与頻度は、当業者に知られている急性期の少なくとも１つまたは複数、好ましくは複数の臨床徴候が低減または存在しない寛解期の維持が確認されることになる臨床徴候に依存するだろう。当業者であれば、それらに限定されないが、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の全体的健康および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含む、ある要因が、対象を効果的に治療するのに必要な用量およびタイミングに影響を及ぼす場合があることを認識するだろう。更に、疾患、障害、または感染因子を標的とする治療上有効量の免疫原性のアジュバント含有組成物を用いた対象の治療は、単回治療を含んでいてもよく、または任意選択で、一連の治療を含んでいてもよい。
【００９１】
医薬組成物は、投与の説明書と共に、キット、容器、パック、またはディスペンサーに含まれていてよい。
【００９２】
本発明の実施には、別様の指定がない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養、およびトランスジェニック生物学の従来技法が使用され、それらは、従来技術の範囲内にある。例えば、以下の文献を参照されたい：Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｕｐｄａｔｅｓ）；Ｇｌｏｖｅｒ，１９８５，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）；Ａｎａｎｄ，１９９２；Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｆｉｎｋ，１９９１；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｊａｋｏｂｙ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ，１９７９；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅ���ｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｒｉｏｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８；Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）；Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．，Ｔｈｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｂｏｏｋ．Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ），（４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，２０００）。
【００９３】
別様に定義されていない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は全て、本発明が属する当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似のまたは等価な方法および物質を、本発明の実施または試験に使用することができるが、好適な方法および物質を下記に記載する。本明細書で開示されている本発明の原理には、当業者であれば、変異をなすことができることが理解および予想されるべきであり、そのような改変は、本発明の範囲内に含まれることが意図されている。
【００９４】
参照による組み込み
本明細書内で引用されている出願および特許の各々、ならびにそうした出願および特許の各々で引用されている各書類または文献（各付与特許の手続き中のもの；「出願引用書類」を含む）、ならびにそうした出願および特許のいずれかに対応しおよび／またはいずれかから優先権を主張するＰＣＴおよび外国出願または特許の各々、ならびに出願引用書類の各々に引用または言及されている文献の各々は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。より一般的には、書類または文献が、本明細書内で、特許請求の範囲の前の文献リストまたは本明細書自体のいずれかに記載されており、これら書類もしくは文献の各々（「本明細書の引用文献」）ならびに本明細書の引用文献の各々で引用されている各書類または文献の各々（製造業者の仕様書、説明書等を全て含む）は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先するものとする。加えて、物質、方法、および例は、説明のために過ぎず、限定は意図されていない。
【実施例】
【００９５】
実施例１：物質および方法
マウス系統および細胞培養
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｊａｘ  ０００６６４）、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ（Ｊａｘ  ００５３０４）、ＣＤ１４  ＫＯ（Ｊａｘ  ００３７２６）、カスパーゼ−１／−１１  ｄＫＯマウス（Ｊａｘ  ０１６６２１）、ＴＬＲ４突然変異体（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、Ｊａｘ  ０００６５９）およびＴＬＲ４突然変異体の野生型対照（Ｃ３Ｈ／ＨｅＳＮＪ、Ｊａｘ  ０００６６１）を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ社から購入した。ＮＬＲＰ３  ＫＯおよびＡＳＣ  ＫＯマウスは、ハーバード公衆衛生大学院のＴ．Ｈｏｒｎｇ博士の好意により提供された。カスパーゼ−１１  ＫＯマウスは、ハーバード医学部大学院のＪｕｎｙｉｎｇ  Ｙｕａｎ博士の好意により提供された。カスパーゼ−１シングルＫＯマウスは、Ｔｈｉｒｕｍａｌａ−Ｄｅｖｉ  Ｋａｎｎｅｇａｎｔｉ氏（セントジュード病院）の好意により提供された。ＤＣを、ＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％Ｂ１６−ＧＭ−ＣＳＦ由来上清、２μＭの２−メルカプトエタノール、および１０％ＦＢＳ中で骨髄から分化させ、培養の６日後に使用した。ＤＣの純度を、フローサイトメトリーにより評価したところ、通常は９０％超だった。ＭΦを、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、３０％Ｌ９２９上清、および１０％ＦＢＳ中で骨髄から分化させた。不死化ＭΦを、１０％Ｌ９２９上清および１０％ＦＢＳで補完されたＤＭＥＭ中で培養した。脾臓ＤＣを、以前に記載のように精製した（Ｚａｎｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。刺激の前に、培養細胞を洗浄し、１０％ＦＢＳで補完されたＤＭＥＭ中に、１００μｌ最終容積中１×１０６細胞／ｍｌの濃度で再播種した。全カスパーゼ阻害剤を使用した実験のために、インフラマソーム活性化刺激付加の前に、細胞を、ｚＶＡＤｆｍｋ（２０μＭ）で３０分間処理した。刺激投与時にシクロヘキシミド（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。ＤＯＴＡＰによる形質移入を、製造業者の説明書に従って実施した。手短に言えば、３７５ｎｇのＤＯＴＡＰを、ＦＢＳを含まない最終容積１０μｌのＤＭＥＭ中５μｇのＬＰＳまたは１０μｇのｏｘＰＡＰＣに添加した。３０分後、ＤＯＴＡＰ／ＬＰＳ複合体またはＤＯＴＡＰ／ｏｘＰＡＰＣ複合体を、培養に添加した。ＦｕＧＥＮＥを以前に記載されているように使用して（Ｋａｙａｇａｋｉ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１，１２４６−１２４９）、表示濃度のＬＰＳおよびｏｘＰＡＰＣを形質移入した。
【００９６】
遺伝子発現解析およびＥＬＩＳＡ
Ｑｉａｓｈｅｄｄｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社）およびＧｅｎｅＪＥＴ  ＲＮＡ精製キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して、ＲＮＡを、細胞培養から単離した。精製したＲＮＡの遺伝子発現を、ＴａｑＭａｎ  ＲＮＡ−ｔｏ−ＣＴ  １ステップキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して、ＣＦＸ３８４リアルタイムサイクラー（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）で分析した。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入した、以下のものに特異的なプローブを用いた：ｖｉｐｅｒｉｎ（Ｍｍ００４９１２６５＿ｍ１）、ＩＦＮｂ１（Ｍｍ００４３９５５２＿ｓ１）、ＩＬ６（Ｍｍ００４４６１９０＿ｍ１）、カスパーゼ−１（Ｍｍ００４３８０２３＿ｍ１）、カスパーゼ−１１（Ｍｍ００４３２３０７＿ｍ１）、Ｎｌｒｐ３（Ｍｍ００８４０９０４＿ｍ１）、Ａｓｃ（Ｍｍ００４４５７４７＿ｇ１）、ＴＢＰ（Ｍｍ００４４６９７１＿ｍ１）、またはＧＡＰＤＨ（Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１）。Ｍｏｕｓｅ  Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ  ＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用して、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＴＮＦα、およびＩＦＮγのＥＬＩＳＡを実施した。分泌サイトカインを測定するために、上清を収集し、遠心分離により清澄化し、−２０℃で保管した。細胞結合サイトカインを以下のように測定した：９６−ウエルプレートを遠心分離し、上清を廃棄した。２５０μｌのＰＢＳを、各ウエルに添加した。細胞を、−８０℃で２回凍結解凍し、その後更なる分析のために−２０℃で保管した。
【００９７】
抗体および試薬
大腸菌ＬＰＳ（血清型Ｏ５５：Ｂ５−ＴＬＲｇｒａｄｅ（商標））をＥｎｚｏ社から購入した。ＯｘＰＡＰＣおよびＰａｍ３ＣＳＫ４を、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社から購入した。酸化ＰＡＰＥ−Ｎ−ビオチン（ビオチン−ｏｘＰＡＰＣ）およびＰＥＩＰＣ中に富化されたｏｘＰＡＰＣを、以前に記載されているように生成した（Ｓｐｒｉｎｇｓｔｅａｄ、Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ５３，１３０４−１３１５）。ＫＯｄｉＡ−ＰＣおよびＤＭＰＣは、それぞれＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製およびＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社製だった。以下の抗体を使用した：ＨＡ（Ｒｏｃｈｅ社；３Ｆ１０）、ＭｙＤ８８（Ｒ＆Ｄ社；ＡＦ３１０９）、アクチン（Ｓｉｇｍａ社；５４４１）、ＡＳＣ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、クローン２ＥＩ−７）、カスパーゼ−１１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、クローンＣａｓ１１．１７Ｄ９）、カスパーゼ−３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社、Ｈ−２７７）、ｖｉｐｅｒｉｎ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔａｔ−１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、クローン５８Ｄ６）。ＩＲＡＫ４抗体は、Ｓｈｉｚｕｏ  Ａｋｉｒａ氏（大阪大学）から贈与された。フローサイトメトリーに基づくアッセイでは、フルオロフォア結合抗体を、以下のように使用した：ＰＥ抗ＴＬＲ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社；クローンＳａ１５−２１）、ＰＥ／Ｃｙ７抗ＴＬＲ４／ＭＤ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社；クローンＭＴＳ５１０）、ＦＩＴＣ抗ＣＤ１４（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社；クローンＳａ２−８）、ＡＰＣ抗ＣＤ１４（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社；クローンＳａ−２８）。ＰＥ抗ＭＨＣクラスＩＩ、およびＡＰＣ抗ＣＤ４０抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製だった。アネキシンＶおよび７−ＡＡＤ生存能染色液を、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社から購入した。不完全フロイントアジュバント（Ｆ５５０６）およびシクロヘキシミド（Ｃ１９８８）を、Ｓｉｇｍａ社から購入した。ＤＯＴＡＰをＲｏｃｈｅ社製から購入した。ＦｕＧＥＮＥ  ２０００を、Ｐｒｏｍｅｇａ社製だった。エンドトキシン非含有ＯＶＡを、Ｈｙｇｌｏｓ／Ｂｉｏｖｅｎｄｏｒ社から購入した。組換えＩＦＮβは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製だった。Ｐｉｅｒｃｅ  ＬＤＨ細胞毒性アッセイキットを、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入した。
【００９８】
タンパク質精製およびｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質−脂質相互作用
カスパーゼ−１１に対するｏｘＰＡＰＣの直接結合を測定する研究では、タンパク質およびＳＰＲ分析を、記載のように実施した（Ｓｈｉ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１４ｂ）Ｎａｔｕｒｅ）。手短に言えば、全長組換え触媒性突然変異体カスパーゼ−１１（Ｃ２５４Ａ）およびカスパーゼ−１１ΔＮ５９（Ｃ２５４Ａ）を、Ｓｆ−９００（商標）ＩＩ  ＳＦＭで７２時間２８℃にて培養したＰ３バキュロウイルス感染ＳＦ−２１昆虫細胞から精製した。細胞を、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾール、および５ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを含有する溶解緩衝液で溶解した。Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して、Ｈｉｓタグ付タンパク質を溶解物から精製した。タンパク質を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２５０ｍＭイミダゾール、および３００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する溶出緩衝液でビーズから放出させた。イミダゾールを透析で除去した。タンパク質を、ＨｉＴｒａｐ  ＱカラムおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で、更に精製した。
【００９９】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析では、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００  ＳＰＲ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して、リガンド結合動力学を測定した。アッセイは、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、および０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する緩衝液中で２５℃にて実施した。まず、ＣＭ５センサーチップを、０．１Ｍ  Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノプロピル）−カルボジイミドおよび０．１Ｍ  Ｎ−ヒドロキシサクシニミド溶液の１：１混合物で、７分間１０μＬ／分の流速にて活性化した。全長触媒性突然変異体カスパーゼ−１１（Ｃ２５４Ａ）およびカスパーゼ−１１ΔＮ５９（Ｃ２５４Ａ）を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で２０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、それぞれ約３１００応答ユニットおよび３３００応答ユニットに固定した。１０ｍＭ酢酸ナトリウムで希釈されたウサギＩｇＧタンパク質（１０μｇ／ｍｌ）を、３４００応答ユニットに固定し、負の対照として取り扱った。１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）を、ＣＭ５チップに流して、全ての残留タンパク質結合部位を７分間にわたってブロックした（流速１０μＬ／分）。リガンドを、３０μＬ／分の流速で１分間フローセルおよび隣接対照フローセル（目的フローセルと同様に活性化およびブロックしたが、タンパク質は固定しなかった）に流した。解離プロセスは、３０μＬ／分の流速で２分間実施した。結合リガンドは、２０ｍＭ  ＮａＯＨで２０秒間洗浄して除去した。ＫＤ値は、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００評価ソフトウェアを用いて、１：１ラングミュア結合モデルにカーブフィッティングした（対照フローセル値を差し引いた）結果から算出した。
【０１００】
カスパーゼ−１１多量体化および酵素活性アッセイでは、全長マウスカスパーゼ１１を、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩの制限部位を使用して、ＴＥＶ切断可能なＮ末端基６×Ｈｉｓタグを導入したｐＦａｓｔＢａｃ（商標）ＨＴ  Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス昆虫細胞系を使用してタンパク質を発現させた。感染４８時間後、Ｈｉｓ−カスパーゼ１１タンパク質を発現したＳｆ９細胞を、２０分間２，０００ｒｐｍで遠心分離することにより回収した。細胞ペレットを、ｐＨ７．５の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、２０ｍＭイミダゾール、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する溶解緩衝液に再懸濁し、超音波処理によりホモジナイズした。細胞溶解物を、４℃にて２時間４２，０００ｒｐｍで超遠心分離することにより清澄化した。目的タンパク質を含有する上清を、溶解緩衝液で１時間４℃にて事前に平衡化しておいたＮｉ−ＮＴＡレジン（Ｑｉａｇｅｎ社）と供にインキュベートした。インキュベーション後、レジン−上清混合物をカラムに注ぎ、レジンを、溶解緩衝液で洗浄した。５００ｍＭイミダゾールで補完された溶解緩衝液でタンパク質を溶出し、サイズ排除クロマトグラフィーで更に精製した。
【０１０１】
ｏｘＰＡＰＣがカスパーゼ−１１を多量体化する能力を測定するために、Ｈｉｓ−カスパーゼ１１の単量体画分または多量体画分を、ｏｘＰＡＰＣと共に氷上で２時間インキュベートし、その後Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（１０／３００）で分析した。
【０１０２】
細胞溶解物中でのビオチン化ｏｘＰＡＰＣとＨＡタグ化カスパーゼ−１１との結合を特徴付けるために、２９３Ｔ細胞を、ＨＡエピトープがＣ末端融合されている表示のカスパーゼ−１１対立形質（ＷＴ、Ｋ１９Ｅ、および３Ｋ（Ｋ６２Ｅ  Ｋ６３Ｅ  Ｋ６４Ｅ））を発現するｐｃＤＮＡベクターで一過性に形質移入した。形質移入の４８時間後、細胞を、冷却ＰＢＳで収集し、完全プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ社製）で補完した、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、および１％ＮＰ−４０を含有する１ｍｌの溶解緩衝液で溶解した。細胞を、３０分間の氷上で溶解し、全細胞抽出物を、コールドルームの卓上型遠心機で１５分間１４０００×ｇで遠心した後、新しいチューブに収集した。表示のカスパーゼ１１対立形質を含有する全細胞溶解物の各々は、１００μＬを取り出し、インプットとして保存した。残りの９００μｌの溶解物を、各チューブ３００μＬで３本のチューブに等分した。１μｇのビオチン化ＬＰＳおよび１０μｇのビオチン化ｏｘＰＡＰＣを、それぞれ第１および第２のチューブに加えた。第３のチューブは、偽対照として残しておいた（表示のカスパーゼ−１１対立形質とストレプトアビジンビーズとの非特異的結合の程度をモニターするため）。ビオチン化リガンドおよび溶解物を、６時間または一晩のいずれかにわたって、４℃にて旋回装置で混合およびインキュベートした。その後、リガンド−カスパーゼ−１１複合体を捕捉するため、ストレプトアビジンビーズ（２０μＬベッド体積）を、全てのチューブ（ビオチン化リガンドで一切処理しなかった偽対照を含む）に添加した。この捕捉ステップを、更に２〜３時間４℃で続けた。その後、ビーズを溶解緩衝液で３回洗浄し、最後に、５０μＬのＳＤＳローディング緩衝液を添加した。タンパク質複合体を、６５℃で１５分間加熱することにより更に溶出した。２５μＬの溶出タンパク質複合体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ビオチン化リガンドにより保持されたタンパク質を、ウエスタン分析で検出した。
【０１０３】
タンパク質−脂質相互作用による内因性カスパーゼの捕獲
ｉＭΦのＳ１００画分を以下のように調製した。完全ＤＭＥＭ培地で培養したコンフルエントｉＢＭＤＭを、ＥＤＴＡ（０．４ｍＭ）入りの氷冷ＰＢＳで回収した。その後、細胞を、完全プロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｒｏｃｈｅ社製）で補完した均質化緩衝液（ＨＢ）（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．９、２５０ｍＭスクロース、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ）で１回洗浄した。細胞を、Ｗｈｅａｔｏｎ（商標）Ｄｏｕｎｃｅ  Ｄｕｒａ−Ｇｒｉｎｄ（商標）組織粉砕器で２０回の加圧にかけることにより、機械的に溶解した。細胞溶解の程度は、トリパンブルー染色でモニターし、８０％を超える細胞が溶解されたことを確認した。その後、粗溶解物を、４℃にて１０分間８００×ｇで遠心して、未破壊細胞および核成分を除去した。核除去後の上清を、４℃にて１０分間１３，０００×ｇで収集および遠心して、大型細胞器官および膜を除去した。最後に、清澄化溶解物を、Ｂｅｃｋｍａｎ社製ポリカーボネート超遠心分離チューブ（３４３７７８）に移し、４℃にて１時間１００，０００×ｇで遠心して、残留膜成分を除去した。得られたＳ１００上清（可溶性細胞質タンパク質を含有する）を、２ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で−８０℃にて保管したか、またはビオチン化脂質により捕捉する内因性カスパーゼの供給源として使用した。１ｍｇのＳ１００上清を、１５μｇのビオチン−ｏｘＰＡＰＣと共に、旋回装置で１２〜１６時間４℃にてインキュベートした。ストレプトアビジンアガロースレジン（Ｐｉｅｒｒｅ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８８，７８７−７９２）を使用し、旋回装置で１〜２時間４℃にて、ビオチン化ｏｘＰＡＰＣ（１反応当たり２０μＬベッド体積レジンを用いて）と結合した内因性タンパク質複合体を捕捉した。その後、レジンにより捕捉されたタンパク質複合体を、界面活性剤含有洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％ＮＰ−４０）で４回洗浄し、６５℃にて２０分間、６０μＬのＳＤＳローディング緩衝液と共にインキュベートすることにより更に溶出した。溶出液の３分の１を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、指定の抗体を使用して、ビオチン−ｏｘＰＡＰＣにより保持された内因性カスパーゼを、ウエスタンブロッティングにより検出した。
【０１０４】
カスパーゼ−１１活性アッセイ
脂質（ＬＰＳ、ｏｘＰＡＰＣ、およびＤＭＰＣ）を含むかまたは含まない５μＭ  Ｈｉｓ−カスパーゼ−１１を、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）９６ウエル半面黒色平底マイクロプレート中の５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）；１０％（ｖ／ｖ）グリセロール；１０ｍＭ  ＤＴＴ；１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有する反応緩衝液でのカスパーゼ活性アッセイに使用した。反応は、基質ＹＥＶＤ−ＡＭＣを１０μＭの終濃度で添加することにより開始させた。データは、４５５ｎｍの自動カットオフフィルターと共に、３８５ｎｍでの励起および４６０ｎｍでの発光を使用して、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５ｅマルチモードマイクロプレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で収集した。
【０１０５】
フローサイトメトリー
ｉＭΦ、一次骨髄由来ＭΦ、および表示遺伝子型のＤＣまたは脾臓ＤＣ（０．５×１０６）を、３７℃にて表示の時間にわたって大腸菌ＬＰＳ、ｏｘＰＡＰＣ、または化学阻害剤で処理した。その後、細胞を、１ｍＬの冷却ＰＢＳで洗浄し、氷上で２０〜３０分間適切な抗体で染色した。抗体の非特異的結合を低減するために、２％マウス血清またはラット血清をブロッキング試薬として使用した。その後、染色した細胞を、１ｍＬ冷却ＰＢＳで洗浄し、２００μＬ  ＰＢＳに再懸濁した。表面受容体の染色を、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩで分析した。未刺激細胞または刺激細胞に由来するＣＤ１４、ＴＬＲ４の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を記録した。表示の時点での表面受容体染色パーセント（刺激細胞で測定されたＭＦＩ値の、未刺激細胞で測定されたＭＦＩ値に対する比）を、受容体エンドサイトーシスの効率を反映するようにプロットした。ＴＬＲ４／ＭＤ−２二量体化の程度を測定するために、ＴＬＲ４／ＭＤ２二量体のパーセントを、ＴＬＲ４／ＭＤ−２単量体のパーセントを１００％として算出した。ＴＬＲ４／ＭＤ−２単量体のパーセントは、刺激細胞のＭＦＩ値（ＭＴＳ５１０抗体染色で得られた）の、未刺激細胞のＭＦＩ値に対する比により決定した。細胞を、抗ＭＨＣクラスＩＩまたは抗ＣＤ４０抗体で染色した。
【０１０６】
ウエスタンブロッティングおよびミッドソーム形成
ウエスタンブロッティングのために、ｉＭΦ（５×１０６）を、表示の期間にわたってリガンドで刺激し、その後、１％ＮＰ−４０、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する７００μＬの溶解緩衝液で溶解した。プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を、細胞溶解の直前に添加した。標準的分子生物学技法を使用して免疫ブロットを実施した。
【０１０７】
ミッドソーム形成のために、ｉＭΦ（３×１０６）を、表示の期間にわたってリガンドで刺激し、その後、１％ＮＰ−４０、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する７００μＬの溶解緩衝液で溶解した。プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を、細胞溶解の直前に添加した。溶解物を、コールドルーム（４℃）の卓上型遠心機で１５分間、最高速度で遠心した。清澄化した上清を収集し、８０μＬの上清を全抽出物として保存した。１μｇの抗ＭｙＤ８８抗体および１５μＬ（ベッド体積）のプロテインＧセファロースを残りの上清に添加し、４℃にて一晩、旋回装置でインキュベートを続けた。その後、ビーズを溶解緩衝液で３回洗浄し、６０μＬのＳＤＳローディング緩衝液を添加した。タンパク質複合体を、６５℃で１５分間加熱することにより更に溶出した。溶出したタンパク質複合体の一部（２０μＬ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、表示の抗体を使用して、ウエスタンブロッティングで視覚化した。
【０１０８】
免疫蛍光法
インフラマソーム誘導刺激負荷の前に、ＢＭＤＣ細胞を、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）で３時間処理した。生存または透過性実験のために、製造業者の説明書に従ってＭｉｔｏｔＴａｃｋｅｒ  ＣＭＸ−ＲＯＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）またはＺｏｍｂｉｅ  Ｒｅｄ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）染料を使用し、その後４％パラホルムアルデヒドで固定した。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳを使用した透過処理ステップの後、細胞を、２％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロックし、ウサギ抗ＡＳＣ  ｐＡｂ（ＡＬ１７７、Ａｄｉｐｏｇｅｎ社）およびマウス抗カスパーゼ−１  ｍＡｂ（Ｃａｓｐｅｒ−１、Ａｄｉｐｏｇｅｎ社）と共にインキュベートし、その後ブロッキング緩衝液で希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８結合ニワトリ抗ウサギＩｇＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）と共にインキュベートした。核は、ＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）またはＤＲＡＱ５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）で対比染色した。Ｚｅｉｓｓ社製Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ共焦点顕微鏡またはオリンパス社製ＢＸ４１蛍光顕微鏡を使用して、画像を得た。
【０１０９】
ＰＩ透過処理アッセイ
ＢＭＤＣまたはＢＭＭを、底部が透明な黒色９６ウエル組織培養プレートに播種し、３時間の予備刺激で処理した。ＰＢＳで穏やかに洗浄した後、１００μｌの予加温染色溶液（５μＭ  ＰＩ、５％ＦＢＳ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、フェノールレッドを含まないＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２  ＨＢＳＳ）を、各ウエルに添加し、３７℃  ５％ＣＯ２で５分間インキュベートした。測定直前に、ＰＩを含まず、２×インフラマソーム誘導性刺激を含有する１００μＬの染色溶液を、適切なウエルに添加した。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を、最大透過性の正の対照として使用した。蛍光強度の増加を、ＦＬＵＯｓｔａｒオメガマイクロプレートリーダ（ＢＭＧ  ｌａｂｔｅｃｈ社）を使用し、５４４ｎｍでの励起および６２０−１０ｎｍの発光フィルターを用いて、３７℃で３時間にわたって連続して記録した。
【０１１０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫処置およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ再刺激
ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪおよびカスパーゼ−１／−１１  ｄＫＯ  Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪマウスを、不完全フロイントアジュバントに乳化した１５０μｇ／マウスの無エンドトキシンＯＶＡおよび７μｇ／マウスのＬＰＳで、または不完全フロイントアジュバントに乳化した１５０μｇ／マウスの無エンドトキシンＯＶＡおよび６５μｇ／マウスのｏｘＰＡＰＣおよび７μｇ／マウスのＬＰＳのいずれかで、背面上部（各肩からの注射）に免疫した。ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、抗ＣＤ４ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて磁気細胞選別により、免疫処置の７または４０日後に流入領域リンパ節から単離した。細胞を、１００，０００個ＤＣのおよび１ｍｇ／ｍｌから開始したＯＶＡの系列希釈の存在下で、１ウエル当たり１００，０００個細胞の濃度で９６ウエルプレートに接種した。ＩＦＮγ、ＩＬ−１７、およびＩＬ−２の分泌を、５日後にＥＬＩＳＡで測定した。
【０１１１】
ＨＳＶ感染のウイルス複製アッセイ
マウスは、組織内およびＮＩＨの動物実験ガイドラインに従って飼育し、手順は全てハーバード医学部大学院の組織内動物実験委員会の承認を受けた。表示のマウス系統を、イソフルランチャンバーで麻酔し、その後ケタミン（３．７ｍｇ／マウス）およびキシラジン塩酸塩（０．５ｍｇ／マウス）を腹腔内注射した。角膜に傷をつけ、以前に記載のように感染を実施した（Ｃｌｉｆｆｅ，Ａ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８３，８１８２−８１９０）。目におけるウイルス増幅を測定するために、最初の５ｄｐｉは無菌ポリエステルアプリケータ（Ｐｕｒｉｔａｎ社）を使用して涙液膜のスワブを収集し、目に由来する涙液中のウイルスを、以前に記載のようにベロ細胞で滴定した（Ｃｏｅｎ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８６，４７３６−４７４０）。
【０１１２】
統計分析
仮説は、単一対比較の両側ｔ検定で試験した。Ｅｘｃｅｌ（マイクロソフト社）で計算したｐ値は、アスタリスクでコード化されている：＜０．０５（＊）、＜０．０１（＊＊）、＜０．００１（＊＊＊）。
【０１１３】
実施例２．ｏｘＰＡＰＣが、ＴＬＲ４アンタゴニストであり、かつＣＤ１４アゴニストであることの特定
ｏｘＰＡＰＣ等の酸化リン脂質には、複雑な歴史があり、炎症の活性化因子または阻害因子のいずれとしても作用することが報告されている。幾つかの研究では、ｏｘＰＡＰＣが、ＬＰＳにより誘導されるＴＬＲ４依存性炎症性サイトカインの発現を、濃度依存的な様式で阻害することができることが示されているが（Ｂｏｃｈｋｏｖ，Ｖ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１９，７７−８１；Ｅｒｒｉｄｇｅ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８３，２４７４８−２４７５９；Ｏｓｋｏｌｋｏｖａ，Ｏ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８５，７７０６−７７１２）、他の研究では、ｏｘＰＡＰＣが、ＴＬＲ４依存性炎症応答の活性化因子であることが報告されている（Ｉｍａｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ  １３３，２３５−２４９；Ｓｈｉｒｅｙ，Ｋ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  ４９７，４９８−５０２）。
【０１１４】
ｏｘＰＡＰＣおよびＰＡＰＣの活性を決定するために、これら脂質が、ＬＰＳ受容体ＴＬＲ４およびＣＤ１４と結合する能力を、マウスの不死化マウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ；あるいはｉＭΦ）で調査した。ＬＰＳで刺激した細胞およびｏｘＰＡＰＣで刺激した細胞の対照比較を実施して、これら分子が、既知ＴＬＲ４依存性遺伝子の発現を誘導する能力を評価した（図１および図２）。サイトカインＩＬ−１βおよびインターフェロンベータ（ＩＦＮβ）のロバストな発現を誘導したＬＰＳ（図２）およびＩＦＮ刺激遺伝子ｖｉｐｅｒｉｎと比較して、ｏｘＰＡＰＣは、これら遺伝子を上方制御することができなかった（図４３Ｂ）。アッセイしたもの以外のＴＬＲ４依存性遺伝子が、ｏｘＰＡＰＣにより活性化されていた可能性があった。
【０１１５】
これらの研究では、幾つかの濃度のｏｘＰＡＰＣを評価したが、それらは全て、ｉｎ  ｖｉｖｏで炎症組織または損傷組織に存在すると報告されたものと類似していた（Ｏｓｋｏｌｋｏｖａ，Ｏ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８５，７７０６−７７１２）。ＴＬＲ４二量体化を、ＴＬＲ４単量体のみを検出する抗体を使用して、フローサイトメトリーで評価した。二量体化は、ＬＰＳにより誘導されるが、ｏｘＰＡＰＣ処理では誘導されなかったことが特定された（図４３Ａ）。こうした分析を補完するために、受容体近位タンパク質ＭｙＤ８８とＩＲＡＫ４との間の誘導可能な相互作用も調査した。
【０１１６】
これらタンパク質は、ミッドソームと呼ばれる超分子組織化中心（ＳＭＯＣ、ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ  ｃｅｎｔｅｒ）を形成する（Ｋａｇａｎ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４，８２１−８２６；  Ｌｉｎ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  ４６５，８８５−８９０；Ｍｏｔｓｈｗｅｎｅ，Ｐ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８４，２５４０４−２５４１１）。ミッドソームは、ＴＬＲ活性化にのみ応答して構築された（Ｂｏｎｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。したがって、ミッドソームの検出を、ＴＬＲ活性化の一般的な読み出し情報として使用することができる。ＬＰＳは、処理の３０分以内にＭｙＤ８８−ＩＲＡＫ４含有ミッドソームの形成を誘導したが、ｏｘＰＡＰＣは、これらタンパク質間のいかなる検出可能な結合も誘発することができなかった（図４３Ｃおよび図４９Ａ）。更に、ｏｘＰＡＰＣで処理した細胞は、検出可能な量のリン酸化ＳＴＡＴ１またはＩＦＮ刺激遺伝子ｖｉｐｅｒｉｎ（図１、図４３Ｄ、および図４９Ｂ）を含有していなかった。これらは両方とも、ＬＰＳでの処理時に豊富に存在していた。こうしたデータは、ｏｘＰＡＰＣがＬＰＳの模倣体ではないことを示し、ＢＭＤＭ中で直接的にＴＬＲ４を直接活性化する能力をほとんどまたは全く有していなかったことを示した。
【０１１７】
無細胞過剰発現系では、ｏｘＰＡＰＣは、ＣＤ１４またはＬＰＳ結合タンパク質ＭＤ−２のいずれかへの接近を、ＬＰＳと競合することにより、ＴＬＲ４シグナル伝達事象の阻害因子として作用した（Ｂｏｃｈｋｏｖ，Ｖ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１９，７７−８１；Ｅｒｒｉｄｇｅ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８３，２４７４８−２４７５９）。ＬＰＳ結合タンパク質ＭＤ−２は、ＴＬＲ４の架橋および活性化に関与していた。しかしながら、ｏｘＰＡＰＣがＴＬＲ４制御因子と結合する能力は、主に無細胞系または上皮細胞で調査されている。ｏｘＰＡＰＣによる阻害の程度は、ＬＰＳ投与およびｏｘＰＡＰＣ投与の比率を変更することにより影響を受けた（図１〜図５）。それは、これら２つの因子が、ＣＤ１４と同じ結合部位を競合している可能性が高いことを示していた。そのような単一結合部位をめぐる競合と一致して、ＬＰＳに結合することができなかった突然変異体ＣＤ１４対立形質は、ｏｘＰＡＰＣまたはＬＰＳの存在下であっても、エンドサイトーシスされなかった。
【０１１８】
ｏｘＰＡＰＣが、ｉＭΦ中でＣＤ１４に結合したか否か、またはＢＭＤＭ中でＭＤ−２と結合したか否かを決定するために、幾つかのアッセイを使用して、候補受容体の誘導可能な二量体化またはエンドサイトーシスをフローサイトメトリーでモニターした。以前に報告されているように、ＬＰＳ処理は、ＣＤ１４およびＴＬＲ４のエンドサイトーシスを引き起こし、これらタンパク質の表面染色が喪失した（Ｚａｎｏｎｉ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｃｅｌｌ  １４７，８６８−８８０）。興味深いことには、ｏｘＰＡＰＣは、ＴＬＲ４のエンドサイトーシスを誘導することができなかったが（図４）、ＣＤ１４の迅速なエンドサイトーシスを促進することができた（図３、図４４Ａ、および図５０Ａ）。したがって、ｏｘＰＡＰＣにより誘導されたＣＤ１４のこの迅速な内部移行により、細胞表面でのＣＤ１４欠乏が作り出された。理論により束縛されることは望まないが、細胞表面におけるこうしたＣＤ１４欠乏により、この脂質がＴＬＲ４シグナル伝達をブロックする能力を説明することができる可能性があると考えられる。実際、その後ＬＰＳで処理したｏｘＰＡＰＣ処理細胞は、ＴＬＲ４エンドサイトーシスおよびＴＬＲ４誘導性遺伝子発現の欠損を示した。
【０１１９】
ＣＤ１４表面富化は、ＣＤ１４エンドサイトーシスおよび再合成の拮抗作用に起因し（Ｔａｎ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４３，９０９−９２２）、後者を防止する条件下で最も明白に観察された。結果的に、ｏｘＰＡＰＣまたはＬＰＳ誘導性ＣＤ１４エンドサイトーシスの程度は、タンパク質合成がシクロヘキシミドで阻止された条件下で増強された（図５０Ｂ）。シクロヘキシミド処理は、ＴＬＲ４内部移行または二量体化のいずれにも影響を及ぼさなかった（図５０Ｃおよび図５０Ｄ）。一次骨髄由来ＭΦおよび骨髄由来ＤＣは、ｏｘＰＡＰＣが、ＣＤ１４エンドサイトーシスを促進したが、ＴＬＲ４二量体化またはエンドサイトーシスを促進しなかったという点で、ｉＭΦと同様な挙動を示した（図４４Ｂ）。したがって、ｏｘＰＡＰＣにより誘導されたＣＤ１４のエンドサイトーシス（しかしＴＬＲ４はエンドサイトーシスされなかった）は、細胞表面でのＣＤ１４の欠乏を作り出した。これにより、この脂質がＴＬＲ４シグナル伝達を阻止する能力が説明される可能性が高い。実際、その後ＬＰＳで処理したｏｘＰＡＰＣ処理細胞は、ＴＬＲ４二量体化、エンドサイトーシス、ＴＮＦα分泌、およびＳＴＡＴ１リン酸化の欠損を示した（図４４Ａおよび図４４Ｆ）。後者の２つは、ＴＬＲ４シグナル伝達の古典的な読み出し情報である。
【０１２０】
ＣＤ１４が、同様の機序を使用してＰＡＭＰ（ＬＰＳ）およびＤＡＭＰ（ｏｘＰＡＰＣ）と相互作用した可能性を検討するため、これら脂質との相互作用に必要なＣＤ１４内のアミノ酸を調査した。ＣＤ１４のＬＰＳ結合ドメインは、一次アミノ酸配列の４つの別々の領域で構成される大型疎水性ポケットであると以前に同定された（Ｋｉｍ，Ｊ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０，１１３４７−１１３５１）。１つの領域（１Ｒ）または２つの領域（２Ｒ）のいずれかに突然変異を含んでいたＣＤ１４対立形質は、ビオチン化ＬＰＳと複合体を形成する能力を保持したが、ＣＤ１４の４つの領域全て（４Ｒ）に突然変異があると、ＬＰＳ結合活性が消失した（Ｔａｎ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４３，９０９−９２２）。これら突然変異体ＣＤ１４対立形質の各々は、細胞表面に輸送された全長折り畳みタンパク質をコードしていた（Ｔａｎ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４３，９０９−９２２）。注目すべきことに、４Ｒ突然変異体は、ビオチン化ｏｘＰＡＰＣとの相互作用も欠損していた（図４４Ｅ）。更に、ＣＤ１４ノックアウト（ＫＯ）ｉＭΦに安定的に導入した場合、４Ｒ突然変異体ＣＤ１４は、ＬＰＳ処理またはｏｘＰＡＰＣ処理に応答して内部移行されなかった（図４４Ｆ）。したがって、これらのデータは、ＣＤ１４内の同じアミノ酸が、ＤＡＭＰ（ｏｘＰＡＰＣ）およびＰＡＭＰ（ＬＰＳ）との相互作用を促進したことを示し、ｏｘＰＡＰＣを選択的なＬＰＳ模倣体と考えることができるという結論を分子的に支持するものである（つまり、ＣＤ１４依存性活性の場合）。全体として、これらのデータは、ｏｘＰＡＰＣが、ＴＬＲ４の活性化因子ではないが、ＣＤ１４の活性化因子だったことを示した。ＣＤ１４を乖離させるこの能力およびＴＬＲ４エンドサイトーシスは、ｏｘＰＡＰＣが、ＴＬＲ４アンタゴニストとしてどのように機能するか説明する可能性が高い。
【０１２１】
実施例３．ｏｘＰＡＰＣは、樹状細胞（ＤＣ）におけるＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化を促進した
上記の例は、ｏｘＰＡＰＣが炎症活性化因子ではなかったことを示したが、幾つかの研究では、これら脂質の炎症促進性機能が示されている（Ｉｍａｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ  １３３，２３５−２４９；Ｓｈｉｒｅｙ，Ｋ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  ４９７，４９８−５０２）。幾つかのＤＡＭＰは、未感作細胞から炎症促進性反応を誘発させることができなかったが、以前に微生物産物と接触させた細胞からのサイトカイン放出を誘導することができたと考えられた。例えば、細胞外ＡＴＰは、ＴＬＲリガンドで予備刺激した細胞からのインフラマソーム依存性ＩＬ−１β放出を活性化したと記載されている（Ｐｅｔｒｉｌｌｉ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９，６１５−６２２）。
【０１２２】
図６および図７に示されているように、ｏｘＰＡＰＣ成分脂質ＫＯｄｉＡ−ＰＣ（１−（パルミトイル）−２−（５−ケト−６−オクテン−ジオイル）ホスファチジルコリン）を含むＰＡＰＣは、ＤＣでのインフラマソームを活性化した。
【０１２３】
図８に示されているように、ＣＤ１４は、ＰＡＰＣに応答してインフラマソーム活性化を制御した。ＰＡＰＣに応答したインフラマソーム活性化は、ＣＤ１４特異的だったが、ＰＡＰＣは、ＣＤ３６内部移行を誘導することもできた（図９）。ＣＤ１４は、Ｉ型ＩＦＮとは独立して、ＰＡＰＣ媒介性インフラマソーム活性化を制御した（図１０）。
【０１２４】
カスパーゼ−１発現およびカスパーゼ−１１発現の制御は、ｗｔ  ＤＣおよびＣｄ１４−／ＤＣと同様だった（図１１）。ＰＡＰＣは、細胞タイプ特異的な様式でインフラマソーム活性化を誘導した（図１２）。
【０１２５】
他のＰＡＭＰが、ＰＡＰＣ誘導性インフラマソーム活性化を刺激したことも特定された（図１３および図１４）。
【０１２６】
注目すべきことに、全ての修飾ＰＣが、インフラマソーム活性化を誘導した訳ではなかった（図１５）。
【０１２７】
ｏｘＰＡＰＣが、状況依存的な様式で炎症促進性機能を有していたか否かを決定するために、ＬＰＳで前処理した（または前処理しなかった）一次ＢＭＤＭまたはＢＭＤＣからのＩＬ−１β放出を調査した。以前の観察（Ｐｅｔｒｉｌｌｉ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９，６１５−６２２）と一致して、ＬＰＳ前処理は、ＡＴＰが、ＤＣからのＩＬ−１β放出を用量依存的な様式で誘発させることを可能にした（図５１Ａ）。注目すべきことに、ｏｘＰＡＰＣは同様の活性を示したが、細胞タイプ依存的な様式ではなかった。興味深いことには、ｏｘＰＡＰＣは、ＩＬ−１β分泌を誘導することもできたが、ＬＰＳ予備刺激ＤＣでのみだった（図４５Ａ）。ｏｘＰＡＰＣは、未感作細胞からのＩＬ−１β放出を誘導しなかったが、ＤＣのＬＰＳ前処理は、ｏｘＰＡＰＣが、ＩＬ−１β放出を用量依存的な様式で促進することを可能にした（図４５Ａおよび図５１Ｂ）。
【０１２８】
理論により束縛されることは望まないが、ＩＬ−１β放出は、典型的には、ＩＬ−１ファミリーメンバーのプロセシングおよび非典型的分泌を引き起こす細胞質タンパク質複合体であるインフラマソームにより媒介される（Ｐｅｔｒｉｌｌｉ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９，６１５−６２２）。
【０１２９】
上記で特定したｏｘＰＡＰＣ媒介性ＩＬ−１β放出が、インフラマソーム依存性事象だったか否かを決定するために、この脂質の活性を、カスパーゼ−１／カスパーゼ−１１ダブルノックアウト（ＫＯ）マウスまたはＡＳＣ欠損マウス（Ｐｙｃａｒｄとしても知られている）のいずれかに由来するＢＭＤＣで調査した。ＡＳＣはインフラマソーム構築に関与する共通のアダプタータンパク質だった（Ｍａｒｔｉｎｏｎ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  １０，４１７−４２６）。ｏｘＰＡＰＣ（またはＡＴＰ）媒介性ＩＬ−１β放出は、カスパーゼ−１／−１１（図１８）またはＡＳＣ（図１７、および図４５Ｂ〜図４５Ｃ）を欠損するＢＭＤＣから完全に喪失した。この観察は、ｏｘＰＡＰＣ誘導性細胞応答におけるインフラマソームの必要性を証明する決定的な遺伝子的証拠を提供した。なお、ＮＬＲＰ３は、インフラマソームの最も一般的な上流活性化因子の１つであったため（Ｙｅ，Ｚ．，ａｎｄ  Ｔｉｎｇ，Ｊ．Ｐ．（２００８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０，３−９）、ｏｘＰＡＰＣ媒介性ＩＬ−１β放出を、ＮＬＲＰ３欠損ＢＭＤＣでも調査した。ｏｘＰＡＰＣが、ＮＬＲＰ３欠損ＢＭＤＣ（図１６）からの、およびＮＬＲＰ３  ＫＯ  ＤＣ（図４５Ｄ）からのＩＬ−１β放出を誘導することができなかったため、ｏｘＰＡＰＣ媒介性ＩＬ−１β放出は、ＮＬＲＰ３依存性プロセスであることが特定された。また、ＡＴＰ媒介性ＩＬ−１βは、予想通りＮＬＲＰ３依存性だった。重要なのは、インフラマソーム制御因子が、ＴＮＦα分泌に必要ではなかったことであり（図４５Ｂ〜図４５Ｄ）、これは、ＴＬＲ４誘導性遺伝子発現は、インフラマソーム活性化とは独立して生じたことを示していた。
【０１３０】
市販（および天然）のｏｘＰＡＰＣは、様々な酸化種の混合物を含む。ｏｘＰＡＰＣの別の供給源が、同様の活性を示すか否かを決定するために、ｏｘＰＡＰＣの最も活性の高い成分であるＰＥＩＰＣ（１−パルミトイル−２−（５，６エポキシイソプロスタノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）を豊富に含むことが特定されている特製ｏｘＰＡＰＣ（Ｓｐｒｉｎｇｓｔｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）を使用した。２つの異なるｏｘＰＡＰＣの対照分析は、同様の結果を示した（図４５Ａ）。これにより、ｏｘＰＡＰＣが、供給源に関わりなく、ＬＰＳ予備刺激ＤＣでのＩＬ−１β放出を誘導したことが確認された。ＩＬ−１β放出に関して観察された効果とは対照的に、細胞結合ＩＬ−１βレベルは、ＬＰＳのみ、ＬＰＳ／ｏｘＰＡＰＣ、またはＬＰＳ／ＡＴＰで刺激した細胞と比較して同様であった（図４５Ａ、図５１Ｂ、および図５１Ｃ）。この後者の観察は、細胞をこのＤＡＭＰで前処理した場合、ｏｘＰＡＰＣは、ＴＬＲ４シグナル伝達の阻害因子としてのみ作用することができたという知見と一致していた。
【０１３１】
インフラマソーム媒介性事象（例えば、ＩＬ−１β放出）に対するｏｘＰＡＰＣの効果の特異性を決定するために、古典的なＴＬＲ依存性サイトカインであるＴＮＦαの放出に対する、この脂質の効果を調査した。ｏｘＰＡＰＣは、ＤＣからのＴＮＦα放出を促進も阻害もしなかった（図５１Ｄ）。加えて、ＤＣを、ＬＰＳ／ＡＴＰまたはＬＰＳ／ｏｘＰＡＰＣ（つまり、予備刺激無し）で同時処理したところ、ＩＬ−１βは、ｏｘＰＡＰＣ処理ＤＣによってのみ放出された（図５１Ｅ）。これにより、これらの２つのＤＡＭＰは、ＩＬ−１β分泌を制御する能力が異なることが示された。異なるホスホコリン変異体である１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）を使用した場合、この変異体は、ＩＬ−１β放出を誘発することができなかった（図５１Ｆ）。対照的に、ｏｘＰＡＰＣの精製成分である１−（パルミトイル）−２−（５−ケト−６−オクテン−ジオイル）ホスファチジルコリン、つまりＫＯｄｉＡ−ＰＣは、ＩＬ−１β分泌を誘発することができた（図５１Ｆ）。全ての場合で、ＴＮＦα分泌は、ホスホコリン処理により影響を受けなかった（図５１Ｆ）。こうしたデータにより、ｏｘＰＡＰＣは、ＬＰＳ予備刺激ＤＣでのＴＬＲ４シグナル伝達に影響を及ぼさずに、ＩＬ−１β放出を促進することができるという特異的能力があることが確立された。
【０１３２】
ｏｘＰＡＰＣ誘導性インフラマソーム活性化は、カスパーゼ−１１依存性だったが、ＡＴＰ誘導性インフラマソーム活性化はそうではなかった（図１９）。実際、ＬＰＳおよびＰａｍ３の両方により予備刺激した後のＰＡＰＣ誘導性インフラマソーム活性化は、カスパーゼ−１１を必要とした（図２０）。したがって、ビオチン化形態のＰＡＰＣは、カスパーゼ−１１活性化に関する研究用のツールとして企図された。
【０１３３】
ビオチン化ＰＡＰＣは、ＣＤ１４内部移行を強力に誘導することを特定したが（図２１）、ＴＬＲ４内部移行（図２２）も、ＩＬ−１β分泌（図２３）も誘導しなかった。ビオチン付加化ＬＰＳ、ＯｘＰａｃ、およびＰａｃのカスパーゼ１１およびＭＤ−２に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイは、カスパーゼ１１依存性の様式で複合体を形成することを特定したと考えられた（図２４）。実際、Ｂｉｏ−ＬＰＳプルダウンアッセイでは、ＰＡＰＣは、用量依存的な競合体として作用した（図２５）。このようなアッセイでは、ビオチン−ＬＰＳを、１プルダウンアッセイ当たり５μｇで使用したが、ＰＡＰＣは、それぞれＭＤ−２およびカスパーゼ−１１に対するＬＰＳ結合と競合させるために、５、５０、および５００μｇで使用した。競合は、１：１００（ＬＰＳ：ＰＡＰＣ）の比率が効果的だった。
【０１３４】
ｏｘＰＡＰＣおよびＬＰＳは、ＣＤ１４の同一ドメインに結合した可能性が高い（図２６）。しかしながら、ＬＰＳ処理は、ＤＣの生存に影響を及ぼし（図２７）、予備刺激したＤＣのＰＡＰＣ処理は、ＤＣの生存を促進した（図２８）。このＰＡＰＣの生存促進効果は、ＣＤ１４依存性ではなかった（図２９）。インフラマソーム活性化は、典型的には、ＩＬ−１βの放出および活性化細胞のその後の死滅に関連していた。ｏｘＰＡＰＣがＢＭＤＣを死滅させないことは、ｏｘＰＡＰＣのアジュバントとしての使用を更に促進する肯定的な結果だった。
【０１３５】
図３０に示されているように、Ｐ２ＣおよびＰ３Ｃのみが、ＤＣの生存を支援した。Ｐ２ＣおよびＰ３Ｃで予備刺激したＤＣは、ＰＡＰＣ処理に応答して、それらの生存が増加することはなかった（図３１）。
【０１３６】
インフラマソームは、予備刺激およびＰＡＰＣの同時投与により効率的に活性化されたが、ＡＴＰの場合はそうではなかった（図３２）。予備刺激およびＰＡＰＣの同時投与は、野生型ＤＣのＮＦ−κＢ活性化を変更しなかった（図３３）。
【０１３７】
ＣＤ１４の非存在下では、ｏｘＰＡＰＣは、ＴＬＲ４シグナル伝達のアンタゴニストとして作用した（図３４）。
【０１３８】
ｏｘＰＡＰＣ効果がＣＤ１４依存性であることが観察されたことを考慮すると、ＣＤ１４が、細胞外空間からＰＡＰＣを除去する（「クリアする」）ためのシャペロンとして作用したと考えることが可能だった。
【０１３９】
ＬＰＳおよびｏｘＰＡＰＣの同時投与は、ＴＬＲ４内部移行（図３５）、ＣＤ１４内部移行（図３６）に影響を及ぼし、ＴＬＲ４二量体化（図３７）に部分的に影響を及ぼした。
【０１４０】
上記の結果の幾つかは、以下のように要約される。
（１）特定の修飾ＰＣ（ＤＭＰＣではなくＰＡＰＣ）が、インフラマソーム活性化を誘導した。
（２）ＰＡＰＣ依存性だが、ＡＴＰ依存性ではないインフラマソーム活性化は、細胞タイプ特異的だった（ＭａｃではなくＤＣ）。
（３）ＰＡＰＣによるインフラマソーム活性化はＣＤ１４を必要としたが、ＡＴＰではＣＤ１４を必要としなかった。
（４）ＰＡＰＣによるインフラマソーム活性化はカスパーゼを必要としたが、ＡＴＰではカスパーゼ−１１を必要としなかった。
（５）ＡＴＰはＤＣのピロトーシスを誘導したが、ＰＡＰＣは誘導しなかった。
（６）ＰＡＰＣは、ＣＤ１４非依存的な様式でＤＣ生存を促進した。
（７）ＰＡＰＣは、予備刺激と同時投与すると、インフラマソーム活性化を誘導すると特定されたが、ＡＴＰはそうではなかった。
【０１４１】
したがって、ＰＡＰＣは、適応免疫応答を増加させることができる強力で天然のアジュバントであると特定された。
【０１４２】
また、ＬＰＳおよびＲｈｏｄｏ  ＬＰＳを、インフラマソーム活性化について評価した。図３８に示されているように、Ｒｈｏｄｏ  ＬＰＳは、インフラマソーム活性化の強力な誘導因子だった。ＬＰＳ誘導性インフラマソーム活性化は、Ｎｌｒｐ３依存性であり（図３９）、Ａｓｃ依存性であり（図４０）、Ｃａｓｐ１／１１依存性だった（図４１）。一方で、Ｒｈｏｄｏ  ＬＰＳ誘導性インフラマソーム活性化は、ＣＤ１４非依存性だった（図４２）。したがって、Ｒｈｏｄｏ  ＬＰＳも、非標準インフラマソーム活性化脂質であることが特定されたが、その効果は、ＣＤ１４非依存性であると考えられた（それにより、Ｒｈｏｄｏ  ＬＰＳの見かけ上の機序は、ｏｘＰＡＰＣで見られるものと区別される）。
【０１４３】
実施例４：ｏｘＰＡＰＣは、マクロファージからのＩＬ−１β放出を促進しなかった
試験した詳細に明らかにされているインフラマソーム活性化因子は全て、ＭΦからのＩＬ−１β放出を促進した。ｏｘＰＡＰＣが、この能力を有していたか否かを調査するために、上述のものと同様の実験を、一次骨髄由来ＭΦで実施した。興味深いことには、ｏｘＰＡＰＣは、ＭΦで検討したいずれの条件下でも、ＩＬ−１β放出を誘発することはできなかったが（図４５Ｅ）、ＡＴＰは、これら細胞からの効率的なＩＬ−１β放出を用量依存的な様式で促進した（図５１Ａ）。これらのデータにより、ｏｘＰＡＰＣがインフラマソーム活性の細胞タイプ特異的活性化因子であることが特定された。
【０１４４】
ＤＣが特異的にｏｘＰＡＰＣに応答する様式をより良好に理解するため、インフラマソーム活性化の予備刺激段階に対する応答を評価した。対照調査すると、ＤＣは、ＬＰＳに応答して、ＭΦが産生したものよりも多くのＴＮＦαを産生した（図５１Ｄ）。こうした結果は、ＤＣが、ＭΦよりもより良好に「予備刺激」されたことを示した。しかしながら、ＩＦＮγで処理したＭΦ、ならびにＤＣを予備刺激したが、依然として、ｏｘＰＡＰＣに応答してＩＬ−１βを放出しなかった（図５１Ｇ）。インフラマソーム活性化の段階で、予備刺激ステップが生じた後、ｏｘＰＡＰＣに対するＤＣおよびＭΦの異なる応答性が顕在化した可能性が高い。
【０１４５】
ｏｘＰＡＰＣをサイトゾルに輸送し、その後ｏｘＰＡＰＣがインフラマソーム媒介性ＩＬ−１β放出を活性化する固有因子がＤＣに存在する可能性が想定された。この可能性を、ｏｘＰＡＰＣをＭΦサイトゾルへと直接形質移入することにより調査した。この方法は、ＴＬＲ２リガンドであるＰａｍ３ＣＳＫで予備刺激したＤＣからのＩＬ−１β放出を促進したが、予備刺激したＭΦは、依然としてそのような応答を誘導することができなかった（図４５Ｆ）。細胞質でのＬＰＳ形質移入を、正の対照として使用した（図４５Ｆ）（Ｈａｇａｒ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１，１２５０−１２５３；  Ｋａｙａｇａｋｉ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１，１２４６−１２４９）。こうした知見は、ｏｘＰＡＰＣが後者の活性化を可能にするＭΦ（またはＤＣ）のサイトゾルに、ある因子（複数可）が存在することを示した。
【０１４６】
ＭΦおよびＤＣに存在するインフラマソーム活性をより一般的に理解するために、両タイプの細胞からのＩＬ−１β放出を促進した別のインフラマソーム活性化因子であるＡＴＰを調査した（図５１Ａ）。興味深いことには、ＤＣおよびＭΦは、ＬＰＳ＋ＡＴＰ処理に応答して同様の動態で死滅した。しかしながら、その一方で、これら細胞は、非常に異なる量のＩＬ−１βを放出し（図４５Ｇ）、非常に異なるレベルのＡＳＣを発現し（図５１Ｈ〜図５１Ｉ）、標準および非標準インフラマソームの他の成分（図５１Ｉ）はいずれも放出または発現されなかった。ＭΦでは、細胞死の程度とＩＬ−１β放出の程度との間には完全な相関性が存在していた。この観察は、死にかけている細胞がこのサイトカインを放出することと一致する（図４５Ｇ）。対照的に、観察された死が最小限であった場合に、最大量のＩＬ−１βがＤＣから放出された。この観察は、生細胞がこのサイトカインを放出することと一致していた（図４５Ｇ）。合わせて考えると、こうしたデータは、ＭΦおよびＤＣでのインフラマソーム活性が根本的に異なることを強調し、ｏｘＰＡＰＣがインフラマソームの活性化因子であり、ＤＣに特異的であることを示した。
【０１４７】
実施例５：ｏｘＰＡＰＣは、ＴＬＲ４とは独立して、非標準インフラマソームによりＩＬ−１β放出を促進した
カスパーゼ−１１は、細胞質ＬＰＳに結合し、非標準インフラマソームの構築およびＩＬ−１βの放出を促進する既知のプロテアーゼである（Ｈａｇａｒ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１，１２５０−１２５３；Ｋａｙａｇａｋｉ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１，１２４６−１２４９；Ｓｈｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１４ａ）Ｎａｔｕｒｅ  ５１４，１８７−１９２）。ｏｘＰＡＰＣは、ＬＰＳを模倣し、ＣＤ１４エンドサイトーシスを活性化することができるため、カスパーゼ−１１依存性応答を活性化する能力についても、ｏｘＰＡＰＣを評価した。注目すべきことには、ｏｘＰＡＰＣ媒介性ＩＬ−１β放出は、カスパーゼ−１１  ＫＯ  ＤＣでは大部分が消失した（図４６Ａ）。予想通り、ＡＴＰ媒介性ＩＬ−１β放出は、カスパーゼ−１１  ＫＯ細胞では完全なままだった（図４６Ａ）。全ての場合で、ＴＮＦα分泌は、影響を受けなかった（図４６Ｂ）。カスパーゼ−１１依存性ＩＬ−１β放出におけるｏｘＰＡＰＣとＡＴＰとのこの相違は、ｏｘＰＡＰＣの活性が、細胞からのＡＴＰの間接放出により媒介されたという可能性を排除した。
【０１４８】
こうした機能的な分析を補完するために、個々のＤＣを顕微鏡検査したところ、ｏｘＰＡＰＣおよびＡＴＰは両方とも、ＬＰＳで前処理したＤＣで、ＡＳＣおよびカスパーゼ−１を含有する「スペック」の形成を誘導したことが明らかなった（図４６Ｃ）。なお、こうした実験は、同様のレベルのＩＬ−１β放出を誘導した、ＡＴＰ（１ｍＭ）およびｏｘＰＡＰＣ（１２０μＭ）の用量を使用して実施した（図５１Ｃ）。ｏｘＰＡＰＣに応じたスペック形成の動力学は、ＡＴＰと比較して遅かったが、同様の量の細胞でスペックが形成された（図５２Ａ〜図５２Ｂ））。これら構造は、ＩＬ−１βが放出され、個々のインフラマソームが認識された条件下でのみ形成された（Ｓｔｕｔｚ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １０４０，９１−１０１）。興味深いことには、カスパーゼ−１１は、ｏｘＰＡＰＣに応答した、ＡＳＣ／カスパーゼ−１を含有するスペックの形成に必要だったが、ＡＴＰではそうではなかった（図４６Ｃおよび図５２Ｂ）。理論により束縛されることは望まないが、このタンパク質が非インフラマソーム構築に必要だったため、カスパーゼ−１１は、ｏｘＰＡＰＣ誘導性ＩＬ−１β放出に必要である可能性が高かった。
【０１４９】
ｏｘＰＡＰＣは、その機能を発揮するためにＴＬＲ４を必要としなかったという考えと一致して、ｏｘＰＡＰＣがＩＬ−１β放出を活性化する能力は、ＴＬＲ４シグナル伝達に依存しなかった。実際、ＴＬＲ２リガンドであるＰａｍ３ＣＳＫ、またはＴＬＲ９リガンドであるＣｐＧで予備刺激した細胞は、ＬＰＳで予備刺激したものと同様の応答を誘発した（図５２Ｃ〜図５２Ｄ）。ＬＰＳ予備刺激細胞で観察されたように、Ｐａｍ３ＣＳＫ予備刺激ＤＣからのＩＬ−１β放出は、ＮＬＲＰ３、ＡＳＣ、およびカスパーゼ−１１を必要とした（図５２Ｃ）。Ｐａｍ３ＣＳＫ予備刺激後のＡＴＰ媒介性ＩＬ−１β放出は、カスパーゼ−１１  ＫＯ細胞では、完全なままだったが、カスパーゼ−１／−１１  ｄＫＯ細胞ではそうではなかった（図５２Ｃ）。ＤＣの遺伝子型は全て、同等なレベルのＴＮＦα分泌を可能にした（図５２Ｃ）。ＴＬＲ４に対するｏｘＰＡＰＣのあらゆる考え得る活性を更に排除するために、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ  ＤＣ（ＴＬＲ４  ＴＩＲドメインの突然変異により、天然でＬＰＳに不応答性だった）（Ｐｏｌｔｏｒａｋ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２，２０８５−２０８８）を、Ｐａｍ３ＣＳＫで予備刺激し、ｏｘＰＡＰＣに応答したＩＬ−１β分泌を測定した。機能的なＴＬＲ４の非存在は、ＩＬ−１β放出を誘導するｏｘＰＡＰＣの能力を変更しなかった（図５２Ｅ）。こうしたデータは、ＴＬＲ４を介したシグナル伝達にはｏｘＰＡＰＣが必要ではなく、ｏｘＰＡＰＣが、細菌感染またはウイルス感染のいずれにも特徴的なＴＬＲリガンドとの接触時に、ＤＣを活性化したことを更に確認した。したがって、グラム陰性菌だけでなく、複数のタイプの病原体に対する免疫応答を制御する受容体として、カスパーゼ−１１を分類することができた。
【０１５０】
感染の設定でこの可能性を更に調査するために、野生型（ＷＴ）マウスまたはカスパーゼ−１１  ＫＯマウスを、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）に感染させた。ＨＳＶ−１感染症は、眼の感染モデルにおいてＮＬＰＲ３インフラマソームを活性化するが（Ｇｉｍｅｎｅｚ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１５  Ｏｃｔ  ２９．ｐｉｉ：  ｊｌｂ．３ＨＩ０７１５−３２１Ｒ）、このウイルスは、ＬＰＳをコードしないため、ＨＳＶ−１は、調査するのに良好な病原体であると考えられた。カスパーゼ−１１がＨＳＶ−１感染に関与していたかどうかは、これまで知られていなかった。
【０１５１】
カスパーゼ−１１  ＫＯマウスは、眼感染後２日目では、ＷＴマウスよりもＨＳＶ−１により感受性であったことを特定した。実際、この時点では、ＷＴマウスと比較して増加した感染性ウイルスの存在量が、カスパーゼ−１１からの目スワブで検出された（図５２Ｆ）。このような２日目におけるウイルス増殖の差異は、ＮＬＲＰ３  ＫＯマウスが、この時点でより高いウイルス力価をもたらしたことを示す以前の研究と一致していた（Ｇｉｍｅｎｅｚ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１５  Ｏｃｔ  ２９．ｐｉｉ：ｊｌｂ．３ＨＩ０７１５−３２１Ｒ）。その後の時点では、調査した全てのマウスの目からウイルスが消失した。これは、おそらくは、ウイルスが自然に神経系へと移行したためである。こうした知見は、カスパーゼ−１１が、非細菌病原体に対するマウスの保護に寄与したことを示した。理論により束縛されることは望まないが、こうした知見を説明する最も単純なモデルは、感染部位（目）でのｏｘＰＡＰＣ産生が、カスパーゼ−１１活性化およびその後のウイルス増殖の制限に寄与したことだった。このモデルを直接的に試験するには、ｏｘＰＡＰＣ活性をｉｎ  ｖｉｖｏで特異的に除去する試薬の開発が必要であることが想定された。
【０１５２】
実施例６：カスパーゼ−１１は、ｏｘＰＡＰＣの受容体であると特定された
ｏｘＰＡＰＣは、カスパーゼ−１１依存性応答を活性化する能力を有することが示されている。これは、これら分子間に相互作用があることを示している。以前に記載されているように（Ｓｈｉ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１４ｂ）Ｎａｔｕｒｅ）、内因性カスパーゼ−１１は、ビオチン化ＬＰＳとの相互作用により細胞溶解物から単離することができる（図４６Ｄ）。興味深いことには、ビオチン−ｏｘＰＡＰＣも、内因性カスパーゼ−１１と複合体を形成した（図４６Ｄ）。対照的に、いずれの脂質も、内因的なカスパーゼ−３を捕捉しなかった（図４６Ｄ）。ｏｘＰＡＰＣが、カスパーゼ−１１と直接結合したか否かを決定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質−脂質相互作用研究を実施した。図４６Ｅに示されているように、ｏｘＰＡＰＣは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）において、固定した触媒的に不活性なカスパーゼ−１１（Ｃ２５４Ａ）との用量依存的な共鳴シグナルを示した。対照的に、ＤＣからのＩＬ−１β放出を促進しなかったＤＭＰＣは（図４６Ｅ）、カスパーゼ−１１に対して検出可能な結合を示さず、ｏｘＰＡＰＣは、ＳＰＲではＩｇＧに対する結合を示さなかった（図４６Ｅ）。カスパーゼ−１１とｏｘＰＡＰＣとの間の解離定数（Ｋｄ）は、１．３×１０−６Ｍと計算された。こうしたＳＰＲデータは、カスパーゼ−１１が、ＬＰＳに加えて、自己コード脂質（ｏｘＰＡＰＣ）と複合体を形成し、その両方に応答してＩＬ−１β放出を促進したことを示した。
【０１５３】
実施例７：ＬＰＳおよびｏｘＰＡＰＣは、別々のドメインによりカスパーゼ−１１と相互作用し、異なる活性化機序を誘導した
ＣＤ１４内の同じ残基が、ＬＰＳおよびｏｘＰＡＰＣに結合することが必要であったため、ＬＰＳ結合ＣＡＲＤがｏｘＰＡＰＣとの相互作用に必要だったか否かを調査した。予想通り（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４ｂ）、ビオチン−ＬＰＳが２９３Ｔ細胞で産生されたカスパーゼ−１１タンパク質を捕捉する能力により評価したところ、カスパーゼ−１１  ＣＡＲＤ内の特定のリジン残基の突然変異が、ＬＰＳとの相互作用を妨げた（図５２Ｇ）。興味深いことには、これらリジン残基は、ビオチン−ｏｘＰＡＰＣとの相互作用を妨げなかった（図５２Ｇ）。更に、そのＣＡＲＤ全体を欠如し、そのＣ末端触媒ドメインのみを含んでいた突然変異体カスパーゼ−１１は、ビオチン−ｏｘＰＡＰＣと複合体を形成する能力を保持した（図５２Ｇ）。こうした結果は、ＳＰＲ分析により検証された。ｏｘＰＡＰＣとカスパーゼ−１１（ΔＮ５９と表記する）の触媒ドメインとの相互作用のＫｄは、全長カスパーゼ−１１との相互作用について計算されたものとほとんど同一だった（図４６Ｅ）。予想通り、ＬＰＳは、カスパーゼ−１１の触媒ドメインに結合する能力を示さなかった。したがって、こうしたデータにより、ＣＤ１４とは異なり、カスパーゼ−１１内の別々のドメインが、ＬＰＳおよびｏｘＰＡＰＣとの接触を形成することが確立された。
【０１５４】
カスパーゼ−１１との複合体形成に加えて、ｏｘＰＡＰＣは、ゲルろ過クロマトグラフィーにより示されたように、このタンパク質の多量体化を誘導した。図４６Ｆに示されているように、カスパーゼ−１１単量体の溶出は、１５．０３ｍＬで生じたが、ｏｘＰＡＰＣと接触させたカスパーゼ−１１は、より初期の容積で溶出した。これは、タンパク質複合体のサイズの増加を示していた。カスパーゼ−１１の二量体は、１３．８２ｍＬで溶出すると推測され、より高次の多量体は、それ以前に溶出すると推測された。したがって、ｏｘＰＡＰＣがカスパーゼ−１１の早期溶出を誘導する能力は、ｏｘＰＡＰＣがこのタンパク質の二量体化および／または多量体化を誘導することができることを示していた。ｏｘＰＡＰＣ誘導性カスパーゼ−１１多量体化の程度は、ＬＰＳに応答した同じ活性で報告されたもの未満であった（Ｓｈｉ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１４ｂ）Ｎａｔｕｒｅ）。
【０１５５】
ＬＰＳ誘導性多量体化は、カスパーゼ−１１の固有プロテアーゼ活性を促進することが以前に示されている（Ｓｈｉ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１４ｂ）Ｎａｔｕｒｅ）。ＬＰＳおよびｏｘＰＡＰＣは、異なるドメインとの相互作用によりカスパーゼ−１１を多量化するため、これら脂質の各々に応答したカスパーゼ−１１酵素活性を調査した。図５２Ｈに示されているように、カスパーゼ−１１単量体の固有酵素活性は低かったが、ＬＰＳまたはｏｘＰＡＰＣと接触すると増加し、ＬＰＳは、更によりロバストな活性化因子であることが特定された。
【０１５６】
理論により束縛されることは望まないが、カスパーゼ−１１酵素活性を活性化するｏｘＰＡＰＣの能力が最小限であったことには、２つの説明が可能だった。第１の可能性は、カスパーゼ−１１に対するｏｘＰＡＰＣの親和性、およびｏｘＰＡＰＣがカスパーゼ−１１を多量体化する能力は、ＬＰＳよりも弱かったため、生じたカスパーゼ−１１活性化が最小限であることであった。この点で、ｏｘＰＡＰＣは、ＬＰＳの低能力型であるに過ぎないことになる。しかしながら、ｏｘＰＡＰＣおよびＬＰＳがカスパーゼ−１１と結合する機序が異なることは、これら脂質が、根本的に異なる様式でカスパーゼ−１１と結合し、ｏｘＰＡＰＣと触媒ドメインとの相互作用が、酵素活性を妨害する（活性化するのではなく）ように設計されている可能性が高いことを示していた。既存のカスパーゼ−１１多量体の固有酵素活性は高かった（図５２Ｈ）。この活性は、ＬＰＳと接触すると更に増加したが、注目すべきことに、この活性は、ｏｘＰＡＰＣと接触すると減少した（図５２Ｈ）。更に、ＬＰＳがカスパーゼ−１１の酵素活性を増強する能力は、用量依存的な様式でｏｘＰＡＰＣにより阻止された（図５２Ｉ）。こうしたデータは、２つの別々な生化学的相互作用が、カスパーゼ−１１と炎症促進性脂質との間で生じたという考えを支持した。ＬＰＳは、カスパーゼ−１１のＣＡＲＤと結合すると、強力な多量体化および酵素活性を誘導した。対照的に、ｏｘＰＡＰＣは、カスパーゼ−１１の触媒ドメインと結合し、それにより多量体化は促進されたが、酵素活性は制限された。こうした２つの異なる相互作用機序にも関わらず、ＬＰＳおよびｏｘＰＡＰＣは両方とも、ＤＣにおいてインフラマソームを構築し、両方とも、ＩＬ−１β放出を促進した。
【０１５７】
これらの知見は、カスパーゼ−１１の触媒活性が、ｏｘＰＡＰＣによるＩＬ−１β放出の誘導に必要だったのか否かという疑問を提起した。この疑問に取り組むために、カスパーゼ−１１欠損ＤＣを、ＷＴカスパーゼ−１１発現ベクター、または触媒性突然変異体（Ｃ２５４Ａ）カスパーゼ−１１発現ベクター、または空ベクター（対照として）で再構成した。ＷＴカスパーゼ−１１を発現する細胞は、ＬＰＳまたはｏｘＰＡＰＣのいずれかに応答してＩＬ−１βを放出する能力を回復したが、突然変異体カスパーゼ−１１を発現する細胞は、ＬＰＳに応答してＩＬ−１βを放出しなかった（図４６Ｇ）。興味深いことには、突然変異体で再構成されたＤＣは、ＷＴカスパーゼ−１１を発現する細胞と同程度に、ｏｘＰＡＰＣに応答してＩＬ−１βを産生した（図４６Ｇ）。ＴＮＦα放出を対照として使用した（データ非表示）。こうしたデータにより、ＬＰＳに応答したＩＬ−１β放出に関するカスパーゼ−１１活性の必要性が、ｏｘＰＡＰＣとは異なることが確立された。
【０１５８】
また、ピロトーシスを誘導する突然変異体およびＷＴカスパーゼ−１１の能力、非標準インフラマソームにより制御される別の機能を評価した。カスパーゼ−１１の酵素活性は、形質移入ＬＰＳがピロトーシスを誘導するために必要だった（図４６Ｇ）。これにより、細胞が正しく再構成されたことが確認された。驚くべきことに、ｏｘＰＡＰＣに応答した細胞死は測定されなかった（図４６Ｇ）。したがって、こうしたデータは、カスパーゼ−１１媒介性ＩＬ−１β放出に２つの機序があり、ＬＰＳに対する応答に必要なものは触媒活性のみであることを支持した。
【０１５９】
実施例８：ＣＤ１４は、ｏｘＰＡＰＣを捕捉し、それをカスパーゼ−１１に送達し、ＩＬ−１β放出を促進する
上記の研究は、ｏｘＰＡＰＣが、以下の２つの活性を有していたことを示した：１）ｏｘＰＡＰＣは、ＣＤ１４エンドサイトーシスを促進した；および２）ｏｘＰＡＰＣは、カスパーゼ−１１依存性非標準インフラマソーム活性化を促進した。これら活性間の関係性を決定するために、ｏｘＰＡＰＣ誘導性ＩＬ−１β放出のためのＣＤ１４の必要性を調査した。細胞を、ＬＰＳで３時間予備刺激した。これは、新たに合成されたＣＤ１４を有する原形質膜の再増殖を可能にするのに十分であった（Ｔａｎ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４３，９０９−９２２）。細胞を、ＡＴＰまたはｏｘＰＡＰＣのいずれかで刺激した。興味深いことには、ＣＤ１４  ＫＯ  ＤＣは、ＬＰＳ／ｏｘＰＡＰＣまたはＰａｍ３ＣＳＫ／ｏｘＰＡＰＣ処理に応答してＩＬ−１βを放出しなかったため、ｏｘＰＡＰＣ誘導性ＩＬ−１β放出にはＣＤ１４が必要だった（図４７Ａ）。インフラマソームの作用により放出される別のサイトカインであるＩＬ−１８の分泌は、同様のパターンに従っていた（図５３Ａ）。ＷＴ、ＣＤ１４、またはカスパーゼ−１１  ＫＯマウスの脾臓から最初に単離した刺激ＤＣを調査したところ、同様の結果が得られた。これら細胞は、ＬＰＳ／ｏｘＰＡＰＣに応答して、ＣＤ１４およびカスパーゼ−１１依存性ＩＬ−１β放出を示したが、ＴＮＦα分泌、ならびにＭＨＣ−ＩＩおよび共刺激分子の上方制御は、ＣＤ１４またはカスパーゼ−１１欠損による影響を受けなかった（図４７Ｂおよび図５３Ｂ）。また、ＬＰＳ／ＡＴＰ処理に対する脾臓ＤＣの応答は全て、ＣＤ１４またはカスパーゼ−１１欠損による影響を受けなかった（図４７Ｂ）。
【０１６０】
理論により束縛されることは望まないが、ＩＬ−１β放出にはＣＤ１４が必要であることは、予備刺激段階（つまり、ＴＬＲシグナル伝達）での欠損によるものではなかったことを示唆する根拠は２つあった。第１には、ＩＬ−１β転写物の分析およびＴＮＦαの分泌により評価したところ、使用したＬＰＳの用量（１μｇ／ｍｌ）では、ＴＬＲ４誘導性サイトカインを発現するためのＣＤ１４の必要性が迂回された（図４７Ａ〜図４７Ｃ）。第２には、Ｐａｍ３ＣＳＫで予備刺激したＤＣは、Ｐａｍ３ＣＳＫがＣＤ１４ではなくＴＬＲ２を介して細胞を予備刺激する場合でも、ｏｘＰＡＰＣ誘導性ＩＬ−１β放出のためにはＣＤ１４も必要であった（図４７Ａおよび図４７Ｃ）。
【０１６１】
他の実験設定では、Ｉ型ＩＦＮは、カスパーゼ−１１発現および／またはカスパーゼ−１１活性化を促進した（Ｂｒｏｚ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）．Ｎａｔｕｒｅ  ４９０，２８８−２９１；Ｃａｓｅ，Ｃ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１０，１８５１−１８５６；Ｒａｔｈｉｎａｍ，Ｖ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ  １５０，６０６−６１９）。ＣＤ１４が、ｖｉｐｅｒｉｎ発現に必要であることより観察されたように、ＬＰＳ処理に応答してＩＦＮ発現を促進したため、Ｉ型ＩＦＮの役割を調査した（図４７Ｃ）。Ｐａｍ３ＣＳＫ／ｏｘＰＡＰＣで処理したＤＣは、ｖｉｐｅｒｉｎ発現の欠如により示されたように（図４７Ｃ）、機能性Ｉ型ＩＦＮの発現を誘導せずにＩＬ−１βを分泌した（図４７Ａ）。こうしたデータは、ｏｘＰＡＰＣ刺激に応答したＩＬ−１β分泌の制御には、Ｉ型ＩＦＮが必要ではないことを示した。加えて、ＣＤ１４  ＫＯ細胞でのＩＬ−１β分泌の欠損は、組換えＩＦＮβとの接触では救済することができなかった（図４７Ｄ）。したがって、ＩＦＮ発現は、ｏｘＰＡＰＣによる、ＤＣのカスパーゼ−１１依存性インフラマソーム活性化には必要でも十分でもなかった。更に、カスパーゼ−１、カスパーゼ−１１、ＮＬＲＰ３、およびＡＳＣは全て、刺激および未刺激のＷＴ  ＤＣおよびＣＤ１４  ＫＯ  ＤＣでの発現レベルが同等であった（図５３Ｃ）。これにより、ＣＤ１４は、インフラマソーム制御因子の発現には必要ではなかったことが示唆された。合わせて考えると、こうしたデータは、ｏｘＰＡＰＣ媒介性ＩＬ−１β放出にＣＤ１４が必要であることは、細胞予備刺激が必要であることによるものではなかったことを示していた。したがって、ＣＤ１４は、インフラマソーム媒介性ＩＬ−１β放出の促進に直接的な役割を発揮することができた。
【０１６２】
ＣＤ１４がインフラマソーム活性化を促進した手段を決定するために、このＬＰＳ受容体のエンドサイトーシス促進活性を評価した。ＣＤ１４は、ｏｘＰＡＰＣエンドサイトーシスを促進し、ＣＤ１４は、ｏｘＰＡＰＣを細胞内へと輸送して、ＩＬ−１β放出を促進した。これは、ｏｘＰＡＰＣを代替手段により細胞内へと送達することにより、ＣＤ１４の必要性を迂回させた。形質移入試薬ＤＯＴＡＰは、炎症促進性刺激をエンドソームおよびサイトゾルに直接送達するための有用なツールであることが、以前に証明されている（Ｈｏｎｄａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ４３４，１０３５−１０４０）。したがって、ＷＴおよびＣＤ１４  ＫＯ  ＤＣをＰａｍ３ＣＳＫで予備刺激し、その後、ＬＰＳまたはｏｘＰＡＰＣのいずれかとの複合体でＤＯＴＡＰに接触させた。過去の結果と一致して、ＬＰＳは、細胞外培地に投与した場合、ＩＬ−１βを誘導することができなかったが、ＤＯＴＡＰ媒介性ＬＰＳ送達は、ＷＴおよびＣＤ１４  ＫＯ  ＤＣからのＩＬ−１β放出を促進した（図４７Ｅ）。興味深いことには、ｏｘＰＡＰＣ処理は、同様の結果をもたらした。細胞外ｏｘＰＡＰＣは、予備刺激したＣＤ１４  ＫＯ  ＤＣからのＩＬ−１β放出を誘発しなかったが、ＤＯＴＡＰと複合体化したｏｘＰＡＰＣは、カスパーゼ依存的な様式で、ＣＤ１４  ＫＯ細胞からのＩＬ−１β放出を誘発した（図４７Ｅ）。こうしたデータは、代替的送達機序により、ｏｘＰＡＰＣ誘導性ＩＬ−１β放出のためのＣＤ１４の必要性を迂回することができたことを示した。したがって、インフラマソーム活性化におけるＣＤ１４の主な機能は、ｏｘＰＡＰＣを細胞内に送達することである可能性が高かった。
【０１６３】
こうしたデータは、ＣＤ１４が、ＬＰＳを細胞表面のＴＬＲ４に送達し、ｏｘＰＡＰＣを、幾つかのエンドソーム中間体を介してサイトゾルのカスパーゼ−１１へと送達するように機能したことを示唆した。エンドリソソームは、非常に分解性の細胞器官であるため、エンドソームへのｏｘＰＡＰＣの送達が、この脂質を消費し、その炎症促進性活性を制限することになることも考えられた。この考えと一致して、エンドリソソーム活性を阻止する酸性化阻害剤クロロキンによるＤＣの処理は、ＤＣからのＩＬ−１β放出をわずかにより促進した（図５３Ｄ）。
【０１６４】
更に、ＬＰＳは、細胞質に直接送達すると、未感作細胞からのＩＬ−１β放出を促進したが、ｏｘＰＡＰＣが、ＴＬＲリガンドで予備刺激した細胞からのＩＬ−１β放出を引き起こすことを可能にしたのはＤＯＴＡＰのみだった。予備刺激に対する依存性にこのような差異があることは、ＬＰＳが、ＴＬＲ４により細胞を予備刺激し、カスパーゼ−１１を介してＩＬ−１β放出を活性化する能力を有していたという事実による可能性が高かった。対照的に、ｏｘＰＡＰＣは、細胞を直接的に予備刺激する能力を有しておらず、したがってＴＬＲ刺激に依存していた。こうしたデータは、一致検出の原理が、２つのタイプのＤＣ活性化状態を管理するように作用するという考えを強化した。第１の活性化状態は、ＤＣがＰＡＭＰと遭遇した際に達成され、従来のタンパク質分泌による古典的ＴＬＲ依存性サイトカインの放出がもたらされた。第２の、過剰活性状態は、ＤＣがＰＡＭＰの存在下でＤＡＭＰに遭遇した場合か（つまり一致検出）、または毒性バクテリアがＬＰＳをサイトゾルに直接送達した場合のいずれかの場合に達成された（Ａａｃｈｏｕｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３ａ）．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，９７５−９７８；Ｃａｓｓｏｎ，Ｃ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ９，ｅ１００３４００；Ｈａｇａｒ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１，１２５０−１２５３）。
【０１６５】
実施例９：ｏｘＰＡＰＣは、他のインフラマソーム活性化因子とは異なり、細胞を死滅させなかった
ＩＬ−β放出の促進に加えて、インフラマソーム活性化は、典型的には、細胞死の誘導と関連付けられている（Ａａｃｈｏｕｉ，Ｙ．，（２０１３ｂ）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １６，３１９−３２６）。理論により束縛されることは望まないが、非標準インフラマソームによる細胞死は、少なくとも２つのタンパク質、ガスデルミン  ｄおよびパネキシン−１を切断するはずである、カスパーゼ−１１の酵素活性に依存すると考えられる（Ｋａｙａｇａｋｉ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ  ５２６，６６６−６７１；Ｓｈｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ  ５２６，６６０−６６５；Ｙａｎｇ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４３，９２３−９３２）。ｏｘＰＡＰＣは、ＩＬ−１１放出を促進するためにカスパーゼ−１１の触媒活性を必要としなかったため、ｏｘＰＡＰＣは細胞を死滅させなかったのだろうと想定された。この可能性を直接的に評価するために、ＬＰＳ予備刺激ＤＣでのｏｘＰＡＰＣ投与後またはＬＰＳ形質移入後のピロトーシス誘導を測定した。ピロトーシスは、原形質膜保全の急速な喪失が特徴であり、細胞体から細胞質タンパク質（および細胞器官）が放出されるはずである。上清でのＬＤＨ放出を使用して、ピロトーシス中の細胞集団の膜透過性を評価した。ＬＰＳ／ＡＴＰで処理した細胞は、処理の４時間後からＬＤＨを放出し始めた（図４８Ａ）。この組み合わせは、インフラマソーム媒介性細胞死の詳細に明らかにされている活性化因子だった（Ａａｃｈｏｕｉ，Ｙ．，（２０１３ｂ）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １６，３１９−３２６）。ＬＰＳで形質移入した細胞は、ＬＰＳ予備刺激とは関わりなく、ＡＴＰで処理した細胞よりも後の時点で死滅した（図４８Ａ）。興味深いことには、カスパーゼ−１１を活性化した条件は全て（例えば、ＬＰＳ形質移入またはｏｘＰＡＰＣ処理）、上清中に同じ様な量のＩＬ−１１をもたらしたが（図４８Ｂ）、ＬＰＳ形質移入のみが、ＬＤＨ放出を引き起こした（図４８Ａ）。こうしたデータにより、ｏｘＰＡＰＣが、生細胞からのＩＬ−１１放出を促進したことが示された。
【０１６６】
こうした観察を説明するために、単一細胞アッセイを開発し、ＡＳＣを含有する凝集体の存在により明らかにされる、構築インフラマソームを含んでいた細胞の生存能を調査した。生細胞は、原形質膜が破壊された細胞のサイトゾルを標識する染色剤であるＺｏｍｂｉｅ染料に耐性であるはずであることが想定された。また、完全な原形質膜を有する細胞は、機能的な細胞器官を保持するはずである。対照的に、ピロトーシス細胞は、細胞器官を失ったはずであり、Ｚｏｍｂｉｅ染料により強力に染色されるはずである。図４８Ｃおよび４８Ｄに示されているように、ＬＰＳ／ＡＴＰで処理した細胞は、ＡＳＣスペックを含んでいた。こうした細胞は、ミトコンドリアを喪失し、Ｚｏｍｂｉｅ染料陽性に染色された。著しく対照的に、ＬＰＳ／ｏｘＰＡＰＣで処理した細胞は、ＡＳＣスペックを含んでいたが、機能的ミトコンドリアを保持し、Ｚｏｍｂｉｅ染料による染色が最小限だった（図４８Ｃ〜図４８Ｄ）。こうした観察は合わせて考えると、ｏｘＰＡＰＣが、細胞を死滅させる能力を有していなかったことを示し、ｏｘＰＡＰＣが、生細胞からのＩＬ−１β放出を誘導したことを強く示した。更に、ｏｘＰＡＰＣはピロトーシスを誘導しないだけでなく、この脂質は、ＤＣの、ＬＰＳにより活性化される遅効性死経路を妨害した（Ｚａｎｏｎｉ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  ４６０，２６４−２６８）。この実験では、処理の７２時間後までの集団内の個々の細胞の健康を、生存能染色剤７−ＡＡＤを使用して、フローサイトメトリーにより評価した。それにより、膜が透過性になった細胞内のゲノムＤＮＡを検出した（Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８７，１０９７−１１０５）。ｏｘＰＡＰＣにより誘発されたものと同等量のＩＬ−１β放出を誘導したＡＴＰ（１ｍＭ）の濃度を使用すると（図４８Ｂ）、ＬＰＳ／ＡＴＰ処理は、処理直後にＤＣの生存率を減少させた（図５４Ａ）。注目すべきことには、ＬＰＳ処理は単独で、長期にわたる時点で細胞の生存率を減少させたが（図４８Ｅ〜図４８Ｆ）、ＬＰＳ／ｏｘＰＡＰＣ処理は、実際に細胞集団の生存率を増加させた（図４８Ｆ）。こうしたデータにより、ｏｘＰＡＰＣ処理が、ＬＰＳ誘導性ＤＣアポトーシスを妨害して、生存率を促進したことが示された。
【０１６７】
実施例１０：ｏｘＰＡＰＣは、Ｔ細胞媒介性適応免疫を促進した強力なアジュバント補完剤だった
カスパーゼ−１１は、急性ウイルス感染の制御に寄与したが（図５２Ｆ）、ｏｘＰＡＰＣがＤＣ生存およびＩＬ−１β放出を促進する二重の能力は、ｏｘＰＡＰＣが、ＤＣ媒介性適応免疫応答も促進する可能性があることを示唆した。実際、カスパーゼ−１１活性化の産物であるＩＬ−１βは、これら細胞に制御性Ｔ細胞抑制に対する耐性を付与することを含む（Ｓｃｈｅｎｔｅｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４０，７８−９０）、Ｔ細胞活性化を促進する幾つかの活性を有すると特徴付けられている（Ｓｉｍｓ，Ｊ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｅ．（２０１０）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０，８９−１０２）。ｏｘＰＡＰＣ／ＬＰＳ混合物を、ｉｎ  ｖｉｖｏで強力なアジュバント活性を示す能力について調査した。
【０１６８】
この可能性に取り組むため、ＷＴ、カスパーゼ−１１、およびカスパーゼ−１／−１１  ｄＫＯマウスに、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）に乳化させたＬＰＳ、オバルブミン（ＯＶＡ）、および／またはｏｘＰＡＰＣを皮下注射した。この接種経路は、まさしく、ＴＬＲリガンドがＴ細胞分化を促進する能力を確立するために使用されたものである（Ｐａｓａｒｅ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，Ｒ．（２００４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２１，７３３−７４１；Ｓｃｈｎａｒｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２，９４７−９５０）。注射の４０日後に、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、流入領域リンパ節から単離し、ＯＶＡでパルスした（またはしなかった）ＤＣとｅｘ  ｖｉｖｏで接触させた。その後、Ｔ細胞活性化は、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−２、ＩＬ−１７、およびＩＦＮγの含有量を測定することにより評価した。ＤＣのみ（ＯＶＡ無し）で実施した再刺激は、ＩＬ−２、ＩＬ−１７、またはＩＦＮγを誘発せず、サイトカインが、抗原特異的Ｔ細胞応答に起因する再刺激中に放出されたことが示された（図４８Ｇおよび図５４Ｂ）。
【０１６９】
興味深いことには、ＬＰＳ／ｏｘＰＡＰＣ混合物で免疫したマウスから単離したＴ細胞は、ＬＰＳで免疫したマウスから単離したＴ細胞よりも、かなり高いレベルのＩＦＮγ放出およびＩＬ−１７放出をもたらした（図４８Ｇおよび図５４Ｂ）。ｏｘＰＡＰＣがＴ細胞活性化を増強する能力は、カスパーゼ−１１またはカスパーゼ−１／−１１  ｄＫＯマウスでは失われた（図４８Ｇおよび図５４Ｂ）。この観察は、本明細書で示した全てのｉｎ  ｖｉｔｒｏデータと一致した。免疫処置の７日後に、つまりＴ細胞活性化のエフェクター相中にＴ細胞活性化を測定したところ同様の結果が得られた（図５４Ｃ）。したがって、ｏｘＰＡＰＣは、カスパーゼ−１１依存的な様式で、ＬＰＳ媒介性Ｔ細胞活性化を強化する能力を有していた。
【０１７０】
均等物
当業者であれば、本明細書に記載されている本発明の具体的な実施形態には多数の均等物あることを、単なる日常的な実験作業を使用して、認識するかまたは確認することができるだろう。そのような均等物は、添付の特許請求の範囲により包含されることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５−１】
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【図４５−２】
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【図４６−１】
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【図４６−２】
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【図４７−１】
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【図４７−２】
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【図４８−１】
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【図４８−２】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１−１】
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【図５１−２】
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【図５２−１】
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【図５２−２】
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【図５３−１】
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【図５３−２】
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【図５４】
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【国際調査報告】
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