(57)【要約】  抗体と治療剤等のペイロードとのコンジュゲーションを許容するように改変された定常領域を有する抗体が記載されている。好ましい抗体には、軽鎖の80位(位置的付番)の突然変異が含まれ、最も好ましくは、突然変異は、C、K、Q、又は非天然アミノ酸から選択される残基へのものである。また、追加の突然変異は、180位の突然変異と組み合わせてもよく、位置的付番の慣例に従って、軽鎖(LC)S208、LC S171、LC S182、LC A184、LC V191、LC S202、LC S203、LC T206、重鎖(HC)S160、HC T190、HC S443、HC S447、HC S139、HC S168、HC V170、HC V176、HC T200、HC S445のうちの1つ又は複数が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体であって、1つ又は複数の突然変異が、軽鎖の180位(位置的付番)の突然変異を含む、抗体又はその断片若しくは派生体。
【請求項２】
2つの導入された部位特異的コンジュゲーション部位を含む、請求項1に記載の抗体。
【請求項３】
180位の野生型残基がTである、請求項1又は2に記載の抗体。
【請求項４】
180位の突然変異残基が、システイン(C)、リシン(K)、グルタミン(Q)、又は非天然アミノ酸から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
残基206(軽鎖)、160(重鎖)、190(重鎖)、443(重鎖)、及び447(重鎖)(位置的付番)から選択される1つ又は複数の位置の1つ又は複数の突然変異を更に含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
突然変異残基が、システイン、リシン、グルタミン、又は非天然アミノ酸から独立して選択される、請求項5に記載の抗体。
【請求項７】
突然変異残基がLC T180CとHC S160Cの組合せである、請求項5に記載の抗体。
【請求項８】
位置的付番の慣例に従って、軽鎖(LC)S208、LC S171、LC S182、LC A184、LC V191、LC S202、LC S203、LC T206、重鎖(HC)S160、HC T190、HC S443、HC S447、HC S139、HC S168、HC V170、HC V176、HC T200、HC S445から選択される1つ又は複数の突然変異を更に含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体であって、抗体が配列番号33のアミノ酸配列を含み、XがC、K、Q、又は非天然アミノ酸から選択される、抗体又はその断片若しくは派生体。
【請求項１０】
配列番号22〜32及び34〜40からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸配列を更に含み、それぞれのXが、C、K、Q、又は非天然アミノ酸から独立して選択される、請求項9に記載の抗体。
【請求項１１】
配列番号33及び配列番号23のアミノ酸配列を含み、XがCである、請求項10に記載の抗体。
【請求項１２】
標的分子と結合する可変領域と、
a)位置的付番の慣例に従って、軽鎖(LC)T180、LC S208、LC S171、LC S182、LC A184、LC V191、LC S202、LC S203、LC T206、重鎖(HC)S160、HC T190、HC S443、HC S447、HC S139、HC S168、HC V170、HC V176、HC T200、HC S445からなる群から選択される残基を、システイン残基、リシン残基、グルタミン残基、若しくは非天然アミノ酸で置換すること、又は
b)位置的付番の慣例に従って、LC T180C、LC S208C、LC S171C、LC S182C、LC A184C、LC V191C、LC S202C、LC S203C、LC T206C、HC S160C、HC T190C、HC S443C、HC S447C、HC S139C、HC S168C、HC V170C、HC V176C、HC T200C、HC S445Cからなる群から選択される残基に、システイン置換を導入すること、又は
c)Xが、システイン残基、リシン残基、グルタミン残基、若しくは非天然アミノ酸である、配列番号22〜40からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むこと、又は
d)Xがシステイン残基である、配列番号22〜40からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むこと
によって部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、単離又は操作された抗体又はその断片若しくは派生体。
【請求項１３】
標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体であって、抗体が、配列番号14の残基109〜214のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む、抗体又はその断片若しくは派生体。
【請求項１４】
標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体であって、1つ又は複数の突然変異が、軽鎖の208位(位置的付番)の突然変異を含む、抗体又はその断片若しくは派生体。
【請求項１５】
2つの導入された部位特異的コンジュゲーション部位を含む、請求項14に記載の抗体。
【請求項１６】
208位の野生型残基がSである、請求項14又は15に記載の抗体。
【請求項１７】
208位の突然変異残基が、システイン、リシン、グルタミン、又は非天然アミノ酸から選択される、請求項14から16のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
208位の突然変異残基がシステインである、請求項17に記載の抗体。
【請求項１９】
位置的付番の慣例に従って、軽鎖(LC)T180、LC S171、LC S182、LC A184、LC V191、LC S202、LC S203、LC T206、重鎖(HC)S160、HC T190、HC S443、HC S447、HC S139、HC S168、HC V170、HC V176、HC T200、HC S445から選択される1つ又は複数の突然変異を更に含む、請求項14から18のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２０】
突然変異残基が、システイン、リシン、グルタミン、又は非天然アミノ酸から独立して選択され、最も好ましくはシステインである、請求項19に記載の抗体。
【請求項２１】
標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体であって、抗体が配列番号40のアミノ酸配列を含み、XがC、K、Q、又は非天然アミノ酸から選択される、抗体又はその断片若しくは派生体。
【請求項２２】
配列番号22〜39からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸配列を更に含み、それぞれのXが、C、K、Q、又は非天然アミノ酸から独立して選択される、請求項21に記載の抗体。
【請求項２３】
XがCである、請求項21又は22に記載の抗体。
【請求項２４】
標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体であって、抗体が、配列番号21の残基109〜214のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む、抗体又はその断片若しくは派生体。
【請求項２５】
標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体であって、抗体が、配列番号21のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗体又はその断片若しくは派生体。
【請求項２６】
配列番号2から配列番号12までから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項25に記載の抗体。
【請求項２７】
IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4を含む群から選択される、請求項1から26のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２８】
定常領域が、IgG1定常領域の少なくとも一部分を含む、請求項1から27のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２９】
定常領域が、IgG1定常領域のCκ、CH1、及びCH3ドメインのうちの1つ又は複数、好ましくはすべてを含む、請求項28に記載の抗体。
【請求項３０】
Fab、二重特異性抗体断片(タンデムscFv-Fc、scFv-Fc、ノブ-イントゥ-ホール、scFv-Fc-scFv、F(ab')2、Fab-scFv、(Fab'scFv)2、scジアボディ-Fc、又はscジアボディ-CH3)、IgGに基づく二重特異性抗体(ハイブリッドハイブリドーマ、共通の軽鎖を有するノブ-イントゥ-ホール、トゥー-イン-ワンIgG、二重VドメインIgG、IgG-scFv、scFv-IgG、IgG-V、V-IgG)、ミニボディ、トリビ-ミニボディ、ナノボディ、及びジ-ジアボディからなる群から選択される、請求項1から29のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３１】
ヒト、ヒト化、又はキメラである、請求項1から30のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３２】
アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、ダクリツマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、アダリムマブ、エファリツマブ、セツキシマブ、イブリツモマブ、オマリズマブ、ベバシズマブ、ラニビズマブ、ゴリムマブ、カナキヌマブ、ウステキヌマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、ベリムマブ、イピリムマブ、ブレンツキシマブ、ペルツズマブ、ラキシバクマブ、ベドリズマブ、ラムシルマブ、オビヌツズマブ、シルツキシマブ、セクキヌマブ、ジヌツキシマブから選択される、請求項1から31のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３３】
標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体であって、抗体が、配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗体又はその断片若しくは派生体。
【請求項３４】
配列番号2から配列番号12までから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項33に記載の抗体。
【請求項３５】
1つ又は複数のFcエフェクター機能を欠く、請求項1から34のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３６】
ADCC活性を欠く、請求項35に記載の抗体。
【請求項３７】
ADCC活性が増加している、請求項1から34のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３８】
リンカーを更に含む、請求項1から37のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３９】
請求項1から38のいずれか一項に記載の抗体と、ペイロードと、ペイロードを抗体に連結させるリンカーとを含む免疫コンジュゲート。
【請求項４０】
リンカーが、6-マレイミドカプロイル(MC)、マレイミドプロパノイル(MP)、バリン-シトルリン(val-cit)、アラニン-フェニルアラニン(ala-phe)、p-アミノベンジルオキシカルボニル(PAB)、N-スクシンイミジル4-(2-ピリジルチオ)ペンタノエート(SPP)、N-スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1カルボキシレート(SMCC)、N-スクシンイミジル、(4-ヨード-アセチル)アミノベンゾエート(SIAB)、SPDB、ヒドラゾン、マレイミドカプロイル、及び6-マレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p-アミノベンイルオキシカルボニル(MC-vc-PAB)から選択されるか、又は、ペプチド鎖を含み、o-ヒドロキシp-アミノベンジル型アルコールに由来する分枝状リンカーであって、ペプチド鎖がp-アミノ基を介してフェニル環と接続しており、ペイロードがベンジル型アルコール部分を介してフェニル環と接続しており、抗体がo-ヒドロキシ基を介してフェニル環と接続している、リンカーである、請求項38に記載の抗体又は請求項39に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項４１】
ペイロードが、放射性核種、化学療法剤、細胞毒性剤、微生物毒素、植物毒素、ポリマー、炭水化物、サイトカイン、蛍光標識、発光標識、酵素-基質標識、酵素、ペプチド、ペプチド模倣体、ヌクレオチド、siRNA、マイクロRNA、RNA模倣体、及びアプタマーからなる群から選択される、請求項39又は40に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項４２】
標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する2つ以上の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体であって、2つ以上の突然変異が
LC T180とLC S208の組合せ、
LC T180とLC S171の組合せ、
LC T180とLC S182の組合せ、
LC T180とLC A184の組合せ、
LC T180とLC V191の組合せ、
LC T180とLC S202の組合せ、
LC T180とLC S203の組合せ、
LC T180とLC T206の組合せ、
LC T180とHC S160の組合せ、
LC T180とHC T190の組合せ
LC T180とHC S443の組合せ、
LC T180とHC S447の組合せ、
LC T180とHC S139の組合せ、
LC T180とHC S168の組合せ、
LC T180とHC V170の組合せ、
LC T180とHC V176の組合せ、
LC T180とHC T200の組合せ、及び
LC T180とHC S445の組合せ
からなる群から選択される突然変異を含む、抗体又はその断片若しくは派生体。
【請求項４３】
ペイロードが、90Y、131I、67Cu、177Lu、213Bi、211At、ドラスタチン、ベドチン、モノメチルアウリスタチンF(MMAF)、モノメチルアウリスタチンE(MMAE);DM1及びDM4を含めたメイタンシノイド、デュオカルマイシン、デュオカルマイシン類似体、カリチアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン(PBD)、センタナマイシン、イリノテカン、並びにドキソルビシン、アルファ-アマニチン、メラトニン、膜破壊ペプチド、シュードモナス属外毒素A、ジフテリア毒素、リシン、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、並びにマンノシル残基からなる群から選択される、請求項41に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項４４】
ペイロードが微小管破壊剤又はDNA改変剤である、請求項41に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項４５】
請求項1から44のいずれか一項に記載の抗体又は免疫コンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項４６】
請求項1から38又は42のいずれか一項に記載の抗体をペイロードとコンジュゲートさせる工程を含む、免疫コンジュゲートを作製する方法。
【請求項４７】
(i)1つ又は複数のアミノ酸残基を突然変異残基で置き換えることによって親抗体の核酸配列を突然変異誘発して、抗体をコードする工程と、
(ii)突然変異抗体を発現させる工程と、
(iii)突然変異抗体を単離する工程と
を含む方法によって調製される、請求項1から38又は42のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４８】
原核又は真核細胞、好ましくは哺乳動物又は昆虫細胞中で発現される、請求項47に記載の抗体。
【請求項４９】
(i)突然変異抗体をチオール反応性の親和性試薬と反応させて、親和性標識した抗体を作製する工程と、
(ii)親和性標識した抗体と捕捉媒体との結合を測定する工程と
を更に含む、請求項47又は48に記載の抗体。
【請求項５０】
請求項1から38又は42のいずれか一項に記載の抗体をコードする単離又は組換えポリヌクレオチド。
【請求項５１】
請求項50に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５２】
ポリヌクレオチドと作動可能に連結された誘導性プロモーターを更に含む、請求項51に記載のベクター。
【請求項５３】
請求項51又は請求項52に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５４】
(a)請求項53に記載の宿主細胞を含む培養培地を用意する工程と、
(b)培養培地を抗体が発現される条件下に置く工程と、任意選択で(c)抗体を単離する工程と
を含む、抗体を産生する方法。
【請求項５５】
2つ以上の突然変異がLC T180とHC S160の組合せを含む、請求項42に記載の抗体。
【請求項５６】
2つ以上の突然変異がLC T180CとHC S160Cの組合せを含む、請求項55に記載の抗体。
【請求項５７】
突然変異残基がシステインに突然変異されている、請求項4、8、又は9のいずれか一項に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体と放射性核種、ポリマー、細胞毒性剤、又は薬物部分等のペイロードとのコンジュゲーションを許容するように、改変された定常領域を含む抗体に関する。好ましくは、コンジュゲートした抗体は所望のペイロード対抗体比をもたらす。本発明の態様は、ペイロード-抗体のコンジュゲートに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体-薬物のコンジュゲート(ADC)は、抗体の特異性を細胞毒性治療剤の細胞毒性と組み合わせる、標的化治療剤のクラスである。ADCは、様々ながんを処置するための、第一に検討されている候補である。ADCは、治療薬と連結された抗体を含む。
【０００３】
ADCの開発における1つの問題は、使用するコンジュゲーション技術である。薬物が抗体中のシステイン又はリシン残基と非選択的にコンジュゲートされている場合、これはADCの不均一な混合物をもたらす場合がある。この手法は最適以下の安全性及び有効性の特性をもたらし、ADCの生物学的、物理学的、及び薬理学的特性の最適化を困難にする。特に、不均一性は、細胞毒素の分布(すなわち付着部位)及び細胞毒素のローディング(すなわち1つの抗体あたりの薬物分子の数)に関して問題となる場合がある。
【０００４】
高い薬物/抗体比(DAR)の種はその標的との結合が乏しく、オフターゲット毒性の危険性が増加する可能性があるため、不均一性は安全性の懸念を提示する。低い薬物ローディングの種は、活性がより低い(DAR1)又は不活性(DAR0)である。1つのmAbあたりの薬物の数が減少するにつれて、ADCの薬物動態学的特性が改善される(Hamblett、Clin. Cancer Res. 2004、10、7063〜7070頁)。更に、ADCの不均一性は、一貫性のある製造及び分析試験に関連する課題をもたらす。
【０００５】
部位選択的コンジュゲーション(SSC)は、恐らく、ADCの安全性及び有効性を改善させ、したがってより高いADCの品質をもたらすであろう。Junutulaら、Nature Biotech 2008は、対照と比較してSSC-ADCでは半分のADC用量で同じ活性が達成されることを報告している。したがって、ADCの均一性は治療指数を改善させる(TIは最大耐量と有効用量との間の比である(TI=TD50/ED50))。更に、より高いDARの均一性は以下をもたらすであろう。
- 管理書類の整理のためにより単純な製品の特徴づけ、より良好に定義された製品仕様書、及び
- 低下したオフターゲット又はバイスタンダー毒性
- 潜在的により制御された薬理学(考慮に入れる種がより少ない)
- 投与量要件(1グラムあたり)を潜在的に低下させて、同様の薬理学的効果を達成する-副作用の潜在的な発生率の低下(たとえば、免疫原性、毒性等)
- より高いコンジュゲーションの収率及び投与量の低下(投与するADCの所要量)によるコストの低下
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO2013/185115
【特許文献２】国際特許出願WO2012/113847号
【特許文献３】WO2011021009A1
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Hamblett、Clin. Cancer Res. 2004、10、7063〜7070頁
【非特許文献２】Junutulaら、Nature Biotech 2008
【非特許文献３】M. P. Lefranc、C. Pommie、Q. Kaas、E. Duprat、N. Bosc、D. Guiraudou、C. Jean、M. Ruiz、I. Da Piedade、M. Rouard、E. Foulquier、V. Thouvenin、及びG. Lefranc. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor constant domains and Ig superfamily C-like domains. Developmental and comparative immunology 29 (3)、2005
【非特許文献４】Molecular Cloning: a Laboratory Manual:第2版、Sambrookら、1989、Cold Spring Harbor Laboratory Press
【非特許文献５】Current Protocols in Molecular Biology、第2版、Ausubelら編、John Wiley & Sons、1992
【非特許文献６】Junutula J Rら、Nature Biotechnology 2008、8、925〜932頁
【非特許文献７】Jeffrey S Cら、Bioconjugate Chem. 2013、24、1256〜1263頁
【非特許文献８】Andreotti, P.E.ら、Cancer Res 1995.55、5276〜82頁
【非特許文献９】Gerhardt, R.T.ら、Am. J. Obstet. Gynecol 1991 165、245〜55頁
【非特許文献１０】Neve R.M.ら、Cancer Cell 2006 10、515〜527頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、単純に、改変された残基を用いて抗体を作製することは、抗体凝集の性向、溶解度、又は有効性の変化等の予期せぬ効果をもたらし得る。したがって、本出願人らは、どの残基が改変され得るかを決定するための合理的なスクリーニング方法を開発した。選択された実施形態では、改変は、ペイロード(薬物等)とコンジュゲーションして約2のDARを与えるために適した抗体を達成する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第1の態様によれば、標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体であって、1つ又は複数の突然変異が、軽鎖の180位(位置的付番)の突然変異を含む、抗体又はその断片若しくは派生体を提供する。
【００１０】
抗体は、2つの導入された部位特異的コンジュゲーション部位を含み得る。
【００１１】
好ましい実施形態では、180位の野生型残基はTである。180位の突然変異残基は、好ましくは、システイン、リシン、グルタミン、又は非天然アミノ酸から選択され、最も好ましくはシステインである。
【００１２】
特定の実施形態では、抗体は、位置的付番の慣例に従って、軽鎖(LC)S208、LC S171、LC S182、LC A184、LC V191、LC S202、LC S203、LC T206、重鎖(HC)S160、HC T190、HC S443、HC S447、HC S139、HC S168、HC V170、HC V176、HC T200、HC S445から選択される1つ又は複数の突然変異を更に含み得る。好ましい突然変異は、残基206(軽鎖)、160、190、443、及び447(重鎖)(位置的付番)から選択される1つ又は複数の位置のものである。突然変異残基は、好ましくはシステイン、リシン、グルタミン、又は非天然アミノ酸から独立して選択され、最も好ましくはシステインである。たとえば、非天然アミノ酸を用いた抗体の改変は、WO2013/185115に記載されている。
【００１３】
本発明の更なる態様によれば、標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体であって、抗体が配列番号33のアミノ酸配列を含み、XがC、K、Q、又は非天然アミノ酸から選択される、抗体又はその断片若しくは派生体を提供する。抗体は、配列番号22〜32及び配列番号34〜40からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸配列を更に含んでいてもよく、それぞれのXは、C、K、Q、又は非天然アミノ酸から独立して選択され、最も好ましくはシステインである。
【００１４】
本発明の第2の態様によれば、標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体であって、1つ又は複数の突然変異が、軽鎖の208位(位置的付番)の突然変異を含む、抗体又はその断片若しくは派生体を提供する。
【００１５】
抗体は、2つの導入された部位特異的コンジュゲーション部位を含み得る。
【００１６】
好ましい実施形態では、208位の野生型残基はSである。208位の突然変異残基は、好ましくは、システイン、リシン、グルタミン、又は非天然アミノ酸から選択され、最も好ましくはシステインである。
【００１７】
特定の実施形態では、抗体は、位置的付番の慣例に従って、軽鎖(LC)T180、LC S171、LC S182、LC A184、LC V191、LC S202、LC S203、LC T206、重鎖(HC)S160、HC T190、HC S443、HC S447、HC S139、HC S168、HC V170、HC V176、HC T200、HC S445から選択される1つ又は複数の突然変異を更に含み得る。好ましい突然変異は、残基180、206(軽鎖)、160、190、443、及び447(重鎖)(位置的付番)から選択される1つ又は複数の位置のものである。突然変異残基は、好ましくはシステイン、リシン、グルタミン、又は非天然アミノ酸から独立して選択され、最も好ましくはシステインである。たとえば、非天然アミノ酸を用いた抗体の改変は、WO2013/185115に記載されている。
【００１８】
本発明の更なる態様によれば、標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体であって、抗体が配列番号40のアミノ酸配列を含み、XがC、K、Q、又は非天然アミノ酸から選択される、抗体又はその断片若しくは派生体を提供する。抗体は、配列番号22〜39からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸配列を更に含んでいてもよく、それぞれのXは、C、K、Q、又は非天然アミノ酸から独立して選択され、最も好ましくはシステインである。
【００１９】
本発明は、標的分子と結合する可変領域と、
a)位置的付番の慣例に従って、軽鎖(LC)T180、LC S208、LC S171、LC S182、LC A184、LC V191、LC S202、LC S203、LC T206、重鎖(HC)S160、HC T190、HC S443、HC S447、HC S139、HC S168、HC V170、HC V176、HC T200、HC S445からなる群から選択される残基を、システイン残基、リシン残基、グルタミン残基、若しくは非天然アミノ酸で置換すること、又は
b)位置的付番の慣例に従って、LC T180C、LC S208C、LC S171C、LC S182C、LC A184C、LC V191C、LC S202C、LC S203C、LC T206C、HC S160C、HC T190C、HC S443C、HC S447C、HC S139C、HC S168C、HC V170C、HC V176C、HC T200C、HC S445Cからなる群から選択される残基に、システイン置換を導入すること、又は
c)Xが、システイン残基、リシン残基、グルタミン残基、又は非天然アミノ酸である、配列番号22〜40からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むこと、又は
d)Xが、システイン残基である、配列番号22〜40からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むこと
によって部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、単離又は操作された抗体又はその断片若しくは派生体を更に提供する。
【００２０】
本発明は、標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体であって、抗体が、配列番号14の残基109〜214のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む、抗体又はその断片若しくは派生体を更に提供する。
【００２１】
また、本発明は、標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体であって、抗体が、配列番号21の残基109〜214のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む、抗体又はその断片若しくは派生体も提供する。
【００２２】
以下の特色は、本発明のすべての態様に適用され得る。抗体は、好ましくは、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4を含む群から選択される。軽鎖はカッパ又はラムダ軽鎖のどちらかであってよく、軽鎖定常領域はCカッパ(Cκ)又はCラムダ(Cλ)のどちらかである。定常領域は、IgG1定常領域の少なくとも一部分、好ましくはIgG1定常領域のCκ、CH1及びCH3ドメインのうちの1つ又は複数、好ましくはすべてを含み得る。抗体は、Fab、二重特異性抗体断片(タンデムscFv-Fc、scFv-Fc、ノブ-イントゥ-ホール(knobs-into-holes)、scFv-Fc-scFv、F(ab')2、Fab-scFv、(Fab'scFv)2、scジアボディ-Fc、又はscジアボディ-CH3)、IgGに基づく二重特異性抗体(ハイブリッドハイブリドーマ、共通の軽鎖を有するノブ-イントゥ-ホール、トゥー-イン-ワンIgG、二重VドメインIgG、IgG-scFv、scFv-IgG、IgG-V、V-IgG)、ミニボディ、トリビ-ミニボディ(tribi-minibody)、ナノボディ、及びジ-ジアボディからなる群から選択され得る。抗体はヒト、ヒト化、又はキメラであり得る。
【００２３】
好ましい抗体は、アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、ダクリツマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、アダリムマブ、エファリツマブ、セツキシマブ、イブリツモマブ、オマリズマブ、ベバシズマブ、ラニビズマブ、ゴリムマブ、カナキヌマブ、ウステキヌマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、ベリムマブ、イピリムマブ、ブレンツキシマブ、ペルツズマブ、ラキシバクマブ、ベドリズマブ、ラムシルマブ、オビヌツズマブ、シルツキシマブ、セクキヌマブ、ジヌツキシマブから選択される。
【００２４】
抗体は、1つ又は複数のFcエフェクター機能を欠き得る、ADCC活性を欠き得る、又は増加したADCC活性を有し得る。
【００２５】
本発明の更なる態様は、標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体であって、抗体が、配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗体又はその断片若しくは派生体を提供する。抗体は、配列番号2から配列番号12までから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
【００２６】
本発明の別の態様は、標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体であって、抗体が、配列番号21のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗体又はその断片若しくは派生体を提供する。抗体には、配列番号2から配列番号12までから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖が含まれ得る。
【００２７】
本発明は、本発明の前述の態様のいずれかによる抗体と、ペイロードと、ペイロードを抗体に連結させるリンカーとを含む免疫コンジュゲートを更に提供する。リンカーは、6-マレイミドカプロイル(MC)、マレイミドプロパノイル(MP)、バリン-シトルリン(val-cit)、アラニン-フェニルアラニン(ala-phe)、p-アミノベンジルオキシカルボニル(PAB)、N-スクシンイミジル4-(2-ピリジルチオ)ペンタノエート(SPP)、N-スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1カルボキシレート(SMCC)、N-スクシンイミジル、(4-ヨード-アセチル)アミノベンゾエート(SIAB)、及び6-マレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p-アミノベンイルオキシカルボニル(aminobenyloxycarbonyl)(MC-vc-PAB)から選択され得るか、又は、ペプチド鎖を含み、o-ヒドロキシp-アミノベンジル型アルコールに由来する分枝状リンカーであり、ここで、ペプチド鎖はp-アミノ基を介してフェニル環と接続しており、ペイロードはベンジル型アルコール部分を介してフェニル環と接続しており、抗体はo-ヒドロキシ基を介してフェニル環と接続している。
【００２８】
ペイロードは、放射性核種、化学療法剤、細胞毒性剤、微生物毒素、植物毒素、ポリマー、炭水化物、サイトカイン、蛍光標識、発光標識、酵素-基質標識、酵素、ペプチド、ペプチド模倣体、ヌクレオチド、siRNA、マイクロRNA、RNA模倣体、及びアプタマーからなる群から選択され得る。好ましいポリマーはPEG分子である。他の好ましいペイロードには、90Y、131I、67Cu、177Lu、213Bi、211At、ドラスタチン、ベドチン、モノメチルアウリスタチンF;DM1及びDM4を含めたメイタンシノイド、デュオカルマイシン類似体、カリチアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、センタナマイシン、イリノテカン、並びにドキソルビシン、シュードモナス属(Pseudomonas)外毒素A、ジフテリア毒素、リシン、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、並びにマンノシル残基が含まれる。ペイロードは微小管破壊剤又はDNA改変剤であり得る。
【００２９】
本発明は、上記態様のいずれかによる抗体又は免疫コンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤とを含む医薬組成物を更に提供する。
【００３０】
また、上記態様のいずれかによる抗体をペイロードとコンジュゲートさせる工程を含む、免疫コンジュゲートを作製する方法も提供する。
【００３１】
抗体を調製する方法は、
(i)1つ又は複数のアミノ酸残基を突然変異残基で置き換えることによって親抗体の核酸配列を突然変異誘発して、抗体をコードする工程と、
(ii)突然変異抗体を発現させる工程と、
(iii)突然変異抗体を単離する工程と
を含み得る。
【００３２】
抗体は、原核(大腸菌(E. coli)又はバチルス属(Bacillus)等)、又は真核細胞(酵母(ピキア属(Pichia)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、ヤロウイア属(Yarrowia)等)又は哺乳動物細胞(CHO細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、293細胞)、又は昆虫細胞(SF9細胞)中で発現され得る。
【００３３】
この方法は、
(i)突然変異抗体をチオール反応性の親和性試薬と反応させて、親和性標識した抗体を作製する工程と、
(ii)親和性標識した抗体と捕捉媒体との結合を測定する工程と
を更に含み得る。
【００３４】
本発明の他の態様は、1つの抗体あたり部位特異的コンジュゲーション部位の85%〜110%がペイロードとコンジュゲートしているように、標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体を提供する。好ましい実施形態では、1つの抗体あたり部位特異的コンジュゲーション部位の少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも100%がペイロードとコンジュゲートしている。好ましい実施形態では、抗体は、2つの部位特異的コンジュゲーション部位(すなわち、重鎖又は軽鎖のどちらか上に1つ、1つの抗体あたり2本のそのような鎖)を含む。そのような抗体では、85〜110%のコンジュゲーションは1.7〜2.2の薬物-抗体比(DAR)をもたらす。特定の実施形態では、DARは好ましくは1.8〜2.1、より好ましくは1.9〜2.1、最も好ましくは約2.0である。
【００３５】
別の好ましい実施形態では、抗体は、4つの部位特異的コンジュゲーション部位(すなわち、重鎖上に1つ及び軽鎖上に1つ、又は重鎖上に2つ及び軽鎖上になし、又は重鎖上になし及び軽鎖上に2つ、1つの抗体あたり2本のそのような鎖)を含む。そのような抗体では、85〜110%のコンジュゲーションは2×(1.7〜2.2)、すなわち3.4〜4.4の薬物-抗体比(DAR)をもたらす。特定の実施形態では、DARは好ましくは2×1.8〜2.1、すなわち3.6〜4.2、より好ましくは2×1.9〜2.1、すなわち3.8〜4.2、最も好ましくは約2×2.0、すなわち4である。
【００３６】
抗体、断片、又は派生体は、ペイロードと直接又は間接的にコンジュゲートされ得る。間接的なコンジュゲーションはリンカーを介して行われ得る。抗体はリンカーを更に含み得る。適切なリンカーには、スクシンイミドコンジュゲーションを介したペイロードとのコンジュゲーションを可能にするマレイミドリンカーが含まれる。リンカーは切断可能又は切断不可能であり得る。他の適切なリンカーは、ペプチド鎖を含み、o-ヒドロキシp-アミノベンジル型アルコールに由来する分枝状リンカー(ここで、ペプチド鎖はp-アミノ基を介してフェニル環と接続しており、薬物はベンジル型アルコール部分を介してフェニル環と接続しており、抗体はo-ヒドロキシ基を介してフェニル環と接続している)を記載している、国際特許出願WO2012/113847号に開示されている。
【００３７】
定常領域は、好ましくは、IgG、IgA、IgD、IgE、又はIgM定常領域、より好ましくはヒトIgG定常領域の少なくとも一部分を含む。好ましい実施形態では、定常領域は完全長IgG定常領域であるが、他の実施形態では、切断された定常領域又は軽鎖若しくは重鎖のみの定常領域も使用され得る。たとえば、定常領域は、IgG定常領域のCκ、CH1、及びCH3ドメインのうちの1つ又は複数、好ましくはすべてを含み得る。好ましいIgGはIgG1であり、他のIgGにはIgG2、IgG3、及びIgG4が含まれる。
【００３８】
「抗体」とは、任意の抗原結合免疫グロブリン分子を意味する。抗体は好ましくは完全な哺乳動物抗体(2本の重鎖及び2本の軽鎖を含み、そのそれぞれに定常領域及び可変領域が含まれる)であるが、抗体及び派生体の他の形態も使用され得る。たとえば、Fab、二重特異性抗体断片(タンデムscFv-Fc、scFv-Fc、ノブ-イントゥ-ホール、scFv-Fc-scFv、F(ab')2、Fab-scFv、(Fab'scFv)2、scジアボディ-Fc、又はscジアボディ-CH3)、IgGに基づく二重特異性抗体(ハイブリッドハイブリドーマ、共通の軽鎖を有するノブ-イントゥ-ホール、トゥー-イン-ワンIgG、二重VドメインIgG、IgG-scFv、scFv-IgG、IgG-V、V-IgG)、ミニボディ、トリビ-ミニボディ、ナノボディ、ジ-ジアボディである。
【００３９】
抗体はヒト、又はヒト化、又はキメラであり得る。
【００４０】
1つ又は複数の突然変異は、好ましくは、非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への突然変異を含む。好ましくは、非システインアミノ酸は、セリン、バリン、スレオニン、又はアラニン、より好ましくはセリン又はスレオニンから選択される。或いは、突然変異はリシン、グルタミン、又は非天然アミノ酸へのものであり得る。
【００４１】
好ましい実施形態では、1つ又は複数の突然変異は、S160C、T190C、S443C、S447C(重鎖上)、T180C、又はT206C(軽鎖上)から選択される。本明細書中で列挙する付番は、完全長トラスツズマブの配列に基づいた位置的付番である。他の付番の慣例を以下の表中に要約する。
【００４２】
【表１】
2018509933.tif 000002
【００４３】
好ましい抗体には、軽鎖T180の突然変異が含まれる。これは唯一の突然変異であってもよく、又は本明細書中に開示する他の突然変異のいずれかと組み合わせてもよい。
【００４４】
好ましい抗体は、以下の群から選択される2つの突然変異の組合せを含む:
LC T180とLC S208の組合せ、
LC T180とLC S171の組合せ、
LC T180とLC S182の組合せ、
LC T180とLC A184の組合せ、
LC T180とLC V191の組合せ、
LC T180とLC S202の組合せ、
LC T180とLC S203の組合せ、
LC T180とLC T206の組合せ、
LC T180とHC S160の組合せ、
LC T180とHC T190の組合せ
LC T180とHC S443の組合せ、
LC T180とHC S447の組合せ、
LC T180とHC S139の組合せ、
LC T180とHC S168の組合せ、
LC T180とHC V170の組合せ、
LC T180とHC V176の組合せ、
LC T180とHC T200の組合せ、
LC T180とHC S445の組合せ。
【００４５】
突然変異は、好ましくはシステイン、リシン、グルタミン、又は非天然アミノ酸への突然変異である。
【００４６】
更に好ましい抗体は、以下の群から選択される2つの突然変異の組合せを含む:
LC T180CとLC S208Cの組合せ、
LC T180CとLC S171Cの組合せ、
LC T180CとLC S182Cの組合せ、
LC T180CとLC A184Cの組合せ、
LC T180CとLC V191Cの組合せ、
LC T180CとLC S202Cの組合せ、
LC T180CとLC S203Cの組合せ、
LC T180CとLC T206Cの組合せ、
LC T180CとHC S160Cの組合せ、
LC T180CとHC T190Cの組合せ、
LC T180CとHC S443Cの組合せ、
LC T180CとHC S447Cの組合せ、
LC T180CとHC S139Cの組合せ、
LC T180CとHC S168Cの組合せ、
LC T180CとHC V170Cの組合せ、
LC T180CとHC V176Cの組合せ、
LC T180CとHC T200Cの組合せ、
LC T180CとHC S445Cの組合せ。
【００４７】
最も好ましい抗体は、LC T180CとHC S160Cの組合せを含む。
【００４８】
他の好ましい抗体は、以下の群から選択される2つのアミノ酸配列の組合せを含む:
配列番号33及び配列番号22、
配列番号33及び配列番号23、
配列番号33及び配列番号24、
配列番号33及び配列番号25、
配列番号33及び配列番号26、
配列番号33及び配列番号27、
配列番号33及び配列番号28、
配列番号33及び配列番号29、
配列番号33及び配列番号30、
配列番号33及び配列番号31、
配列番号33及び配列番号32、
配列番号33及び配列番号34、
配列番号33及び配列番号35、
配列番号33及び配列番号36、
配列番号33及び配列番号37、
配列番号33及び配列番号38、
配列番号33及び配列番号39、
配列番号33及び配列番号40。
【００４９】
好ましい抗体では、Xはシステインである。或いは、Xは、リシン、グルタミン、システイン、又は非天然アミノ酸から独立して選択されてもよく、最も好ましくはシステインである。
【００５０】
最も好ましい抗体は、配列番号33及び配列番号23を含む。
【００５１】
本明細書中に開示する態様のいずれかと組み合わされ得る追加の突然変異には、以下のものが含まれる。
【００５２】
【表２】
2018509933.tif 000003
【００５３】
上記表中、突然変異残基がXとして示されている。Xは好ましくはシステインであるが、他の突然変異残基、特にリシン、グルタミン、又は非天然アミノ酸も使用され得る。特定の親抗体、特にカッパアロタイプKm1及びKm2においてV191はL191であり得ることに留意されたい。本明細書中でV191突然変異に言及した場合は、内容によりそうでないことが必要でない限りは、これはL191突然変異にも言及することを理解されたい。
【００５４】
他の好ましい抗体には、軽鎖T206突然変異と1つ又は複数の他の突然変異との組合せが含まれる。好ましい実施形態では、軽鎖T206突然変異を、本明細書中に記載の別の突然変異と組み合わせる。以下は2つの突然変異の好ましい組合せであり、本発明による抗体は、これらの突然変異を、1つ又は複数の追加の突然変異と共に含み得る。
LC T206とLC S208の組合せ、
LC T206とLC S171の組合せ、
LC T206とLC S182の組合せ、
LC T206とLC A184の組合せ、
LC T206とLC V191の組合せ、
LC T206とLC S202の組合せ、
LC T206とLC S203の組合せ、
LC T206とLC T180の組合せ、
LC T206とHC S160の組合せ、
LC T206とHC T190の組合せ
LC T206とHC S443の組合せ、
LC T206とHC S447の組合せ、
LC T206とHC S139の組合せ、
LC T206とHC S168の組合せ、
LC T206とHC V170の組合せ、
LC T206とHC V176の組合せ、
LC T206とHC T200の組合せ、
LC T206とHC S445の組合せ。
【００５５】
そのうち、以下が好ましい。
LC T206とLC T180の組合せ、
LC T206とHC S160の組合せ、
LC T206とHC T190の組合せ
LC T206とHC S443の組合せ、
LC T206とHC S447の組合せ、
【００５６】
そのうち、以下が最も好ましい。
LC T206CとLC T180Cの組合せ、
LC T206CとHC S160Cの組合せ、
LC T206CとHC T190Cの組合せ
LC T206CとHC S443Cの組合せ、
LC T206CとHC S447Cの組合せ。
【００５７】
したがって、好ましい抗体は、配列番号39のアミノ酸配列と配列番号22〜38又は40から選択されるアミノ酸配列との組合せを含み得る。好ましい抗体では、Xはシステインである。或いは、Xは、リシン、グルタミン、システイン、又は非天然アミノ酸から独立して選択されてもよく、最も好ましくはシステインである。
【００５８】
他の好ましい抗体には、重鎖S160突然変異と1つ又は複数の他の突然変異との組合せが含まれる。好ましい実施形態では、重鎖S160突然変異を、本明細書中に記載の別の突然変異と組み合わせる。以下は2つの突然変異の好ましい組合せであり、本発明による抗体は、これらの突然変異を、1つ又は複数の追加の突然変異と共に含み得る。
HC S160とLC S208の組合せ、
HC S160とLC S171の組合せ、
HC S160とLC S182の組合せ、
HC S160とLC A184の組合せ、
HC S160とLC V191の組合せ、
HC S160とLC S202の組合せ、
HC S160とLC S203の組合せ、
HC S160とLC T180の組合せ、
HC S160とLC T206の組合せ、
HC S160とHC T190の組合せ、
HC S160とHC S443の組合せ、
HC S160とHC S447の組合せ、
HC S160とHC S139の組合せ、
HC S160とHC S168の組合せ、
HC S160とHC V170の組合せ、
HC S160とHC V176の組合せ、
HC S160とHC T200の組合せ、
HC S160とHC S445の組合せ。
【００５９】
そのうち、以下が好ましい。
HC S160とLC T180の組合せ、
HC S160とLC T206の組合せ、
HC S160とHC T190の組合せ、
HC S160とHC S443の組合せ、
HC S160とHC S447の組合せ、
【００６０】
そのうち、以下が最も好ましい。
HC S160CとLC T180Cの組合せ、
HC S160CとLC T206Cの組合せ、
HC S160CとHC T190Cの組合せ、
HC S160CとHC S443Cの組合せ、
HC S160CとHC S447Cの組合せ、
【００６１】
したがって、好ましい抗体は、配列番号23のアミノ酸配列と配列番号22又は24〜40から選択されるアミノ酸配列との組合せを含み得る。好ましい抗体では、Xはシステインである。或いは、Xは、リシン、グルタミン、システイン、又は非天然アミノ酸から独立して選択されてもよく、最も好ましくはシステインである。
【００６２】
他の好ましい抗体には、重鎖T190突然変異と1つ又は複数の他の突然変異との組合せが含まれる。好ましい実施形態では、重鎖T190突然変異を、本明細書中に記載の別の突然変異と組み合わせる。以下は2つの突然変異の好ましい組合せであり、本発明による抗体は、これらの突然変異を、1つ又は複数の追加の突然変異と共に含み得る。
HC T190とLC S208の組合せ、
HC T190とLC S171の組合せ、
HC T190とLC S182の組合せ、
HC T190とLC A184の組合せ、
HC T190とLC V191の組合せ、
HC T190とLC S202の組合せ、
HC T190とLC S203の組合せ、
HC T190とLC T180の組合せ、
HC T190とLC T206の組合せ、
HC T190とHC S160の組合せ、
HC T190とHC S443の組合せ、
HC T190とHC S447の組合せ、
HC T190とHC S139の組合せ、
HC T190とHC S168の組合せ、
HC T190とHC V170の組合せ、
HC T190とHC V176の組合せ、
HC T190とHC T200の組合せ、
HC T190とHC S445の組合せ。
【００６３】
そのうち、以下が好ましい。
HC T190とLC T180の組合せ、
HC T190とLC T206の組合せ、
HC T190とHC S160の組合せ、
HC T190とHC S443の組合せ、
HC T190とHC S447の組合せ、
【００６４】
そのうち、以下が最も好ましい。
HC T190CとLC T180Cの組合せ、
HC T190CとLC T206Cの組合せ、
HC T190CとHC S160Cの組合せ、
HC T190CとHC S443Cの組合せ、
HC T190CとHC S447Cの組合せ。
【００６５】
したがって、好ましい抗体は、配列番号27のアミノ酸配列と配列番号22〜26又は28〜40から選択されるアミノ酸配列との組合せを含み得る。好ましい抗体では、Xはシステインである。或いは、Xは、リシン、グルタミン、システイン、又は非天然アミノ酸から独立して選択されてもよく、最も好ましくはシステインである。
【００６６】
他の好ましい抗体には、重鎖S443突然変異と1つ又は複数の他の突然変異との組合せが含まれる。好ましい実施形態では、重鎖S443突然変異を、本明細書中に記載の別の突然変異と組み合わせる。以下は2つの突然変異の好ましい組合せであり、本発明による抗体は、これらの突然変異を、1つ又は複数の追加の突然変異と共に含み得る。
HC S443とLC S208の組合せ、
HC S443とLC S171の組合せ、
HC S443とLC S182の組合せ、
HC S443とLC A184の組合せ、
HC S443とLC V191の組合せ、
HC S443とLC S202の組合せ、
HC S443とLC S203の組合せ、
HC S443とLC T180の組合せ、
HC S443とLC T206の組合せ、
HC S443とHC S160の組合せ、
HC S443とHC T190の組合せ、
HC S443とHC S447の組合せ、
HC S443とHC S139の組合せ、
HC S443とHC S168の組合せ、
HC S443とHC V170の組合せ、
HC S443とHC V176の組合せ、
HC S443とHC T200の組合せ、
HC S443とHC S445の組合せ。
【００６７】
そのうち、以下が好ましい。
HC S443とLC T180の組合せ、
HC S443とLC T206の組合せ、
HC S443とHC S160の組合せ、
HC S443とHC T190の組合せ、
HC S443とHC S447の組合せ、
【００６８】
そのうち、以下が最も好ましい。
HC S443CとLC T180Cの組合せ、
HC S443CとLC T206Cの組合せ、
HC S443CとHC S160Cの組合せ、
HC S443CとHC T190Cの組合せ、
HC S443CとHC S447Cの組合せ。
【００６９】
したがって、好ましい抗体は、配列番号29のアミノ酸配列と配列番号22〜28又は30〜40から選択されるアミノ酸配列との組合せを含み得る。好ましい抗体では、Xはシステインである。或いは、Xは、リシン、グルタミン、システイン、又は非天然アミノ酸から独立して選択されてもよく、最も好ましくはシステインである。
【００７０】
他の好ましい抗体には、重鎖S447突然変異と1つ又は複数の他の突然変異との組合せが含まれる。好ましい実施形態では、重鎖S447突然変異を、本明細書中に記載の別の突然変異と組み合わせる。以下は2つの突然変異の好ましい組合せであり、本発明による抗体は、これらの突然変異を、1つ又は複数の追加の突然変異と共に含み得る。
HC S447とLC S208の組合せ、
HC S447とLC S171の組合せ、
HC S447とLC S182の組合せ、
HC S447とLC A184の組合せ、
HC S447とLC V191の組合せ、
HC S447とLC S202の組合せ、
HC S447とLC S203の組合せ、
HC S447とLC T180の組合せ、
HC S447とLC T206の組合せ、
HC S447とHC S160の組合せ、
HC S447とHC T190の組合せ、
HC S447とHC S443の組合せ、
HC S447とHC S139の組合せ、
HC S447とHC S168の組合せ、
HC S447とHC V170の組合せ、
HC S447とHC V176の組合せ、
HC S447とHC T200の組合せ、
HC S447とHC S445の組合せ。
【００７１】
そのうち、以下が好ましい。
HC S447とLC T180の組合せ、
HC S447とLC T206の組合せ、
HC S447とHC S160の組合せ、
HC S447とHC T190の組合せ、
HC S447とHC S443の組合せ、
【００７２】
そのうち、以下が最も好ましい。
HC S447CとLC T180Cの組合せ、
HC S447CとLC T206Cの組合せ、
HC S447CとHC S160Cの組合せ、
HC S447CとHC T190Cの組合せ、
HC S447CとHC S443Cの組合せ。
【００７３】
したがって、好ましい抗体は、配列番号31のアミノ酸配列と配列番号22〜30又は32〜40から選択されるアミノ酸配列との組合せを含み得る。好ましい抗体では、Xはシステインである。或いは、Xは、リシン、グルタミン、システイン、又は非天然アミノ酸から独立して選択されてもよく、最も好ましくはシステインである。
【００７４】
他の好ましい抗体には、軽鎖S208突然変異と1つ又は複数の他の突然変異との組合せが含まれる。好ましい実施形態では、軽鎖S208突然変異を、本明細書中に記載の別の突然変異と組み合わせる。以下は2つの突然変異の好ましい組合せであり、本発明による抗体は、これらの突然変異を、1つ又は複数の追加の突然変異と共に含み得る。
LC S208とLC S171の組合せ、
LC S208とLC S182の組合せ、
LC S208とLC A184の組合せ、
LC S208とLC V191の組合せ、
LC S208とLC S202の組合せ、
LC S208とLC S203の組合せ、
LC S208とLC T180の組合せ、
LC S208とLC T206の組合せ、
LC S208とHC S160の組合せ、
LC S208とHC T190の組合せ、
LC S208とHC S443の組合せ、
LC S208とHC S447の組合せ、
LC S208とHC S139の組合せ、
LC S208とHC S168の組合せ、
LC S208とHC V170の組合せ、
LC S208とHC V176の組合せ、
LC S208とHC T200の組合せ、
LC S208とHC S445の組合せ。
【００７５】
そのうち、以下が好ましい。
LC S208とLC T180の組合せ、
LC S208とLC T206の組合せ、
LC S208とHC S160の組合せ、
LC S208とHC T190の組合せ、
LC S208とHC S443の組合せ、
LC S208とHC S447の組合せ、
【００７６】
そのうち、以下が最も好ましい。
LC S208CとLC T180Cの組合せ、
LC S208CとLC T206Cの組合せ、
LC S208CとHC S160Cの組合せ、
LC S208CとHC T190Cの組合せ、
LC S208CとHC S443Cの組合せ、
LC S208CとHC S447Cの組合せ。
【００７７】
したがって、好ましい抗体は、配列番号40のアミノ酸配列と配列番号22〜39から選択されるアミノ酸配列との組合せを含み得る。好ましい抗体では、Xはシステインである。或いは、Xは、リシン、グルタミン、システイン、又は非天然アミノ酸から独立して選択されてもよく、最も好ましくはシステインである。
【００７８】
したがって、好ましい抗体は、以下の群から選択される2つのアミノ酸配列の組合せを含む:
配列番号40及び配列番号22、
配列番号40及び配列番号23、
配列番号40及び配列番号24、
配列番号40及び配列番号25、
配列番号40及び配列番号26、
配列番号40及び配列番号27、
配列番号40及び配列番号28、
配列番号40及び配列番号29、
配列番号40及び配列番号30、
配列番号40及び配列番号31、
配列番号40及び配列番号32、
配列番号40及び配列番号33、
配列番号40及び配列番号34、
配列番号40及び配列番号35、
配列番号40及び配列番号36、
配列番号40及び配列番号37、
配列番号40及び配列番号38、
配列番号40及び配列番号39。
【００７９】
好ましい抗体では、Xはシステインである。或いは、Xは、リシン、グルタミン、システイン、又は非天然アミノ酸から独立して選択されてもよく、最も好ましくはシステインである。
【００８０】
他の好ましい抗体には、軽鎖S171突然変異と1つ又は複数の他の突然変異との組合せが含まれる。好ましい実施形態では、軽鎖S171突然変異を、本明細書中に記載の別の突然変異と組み合わせる。以下は2つの突然変異の好ましい組合せであり、本発明による抗体は、これらの突然変異を、1つ又は複数の追加の突然変異と共に含み得る。
LC S171とLC S208の組合せ、
LC S171とLC S182の組合せ、
LC S171とLC A184の組合せ、
LC S171とLC V191の組合せ、
LC S171とLC S202の組合せ、
LC S171とLC S203の組合せ、
LC S171とLC T180の組合せ、
LC S171とLC T206の組合せ、
LC S171とHC S160の組合せ、
LC S171とHC T190の組合せ、
LC S171とHC S443の組合せ、
LC S171とHC S447の組合せ、
LC S171とHC S139の組合せ、
LC S171とHC S168の組合せ、
LC S171とHC V170の組合せ、
LC S171とHC V176の組合せ、
LC S171とHC T200の組合せ、
LC S171とHC S445の組合せ。
【００８１】
そのうち、以下が好ましい。
LC S171とLC T180の組合せ、
LC S171とLC T206の組合せ、
LC S171とHC S160の組合せ、
LC S171とHC T190の組合せ、
LC S171とHC S443の組合せ、
LC S171とHC S447の組合せ、
【００８２】
そのうち、以下が最も好ましい。
LC S171CとLC T180Cの組合せ、
LC S171CとLC T206Cの組合せ、
LC S171CとHC S160Cの組合せ、
LC S171CとHC T190Cの組合せ、
LC S171CとHC S443Cの組合せ、
LC S171CとHC S447Cの組合せ。
【００８３】
したがって、好ましい抗体は、配列番号32のアミノ酸配列と配列番号22〜31又は33〜40から選択されるアミノ酸配列との組合せを含み得る。好ましい抗体では、Xはシステインである。或いは、Xは、リシン、グルタミン、システイン、又は非天然アミノ酸から独立して選択されてもよく、最も好ましくはシステインである。
【００８４】
他の好ましい抗体には、軽鎖S182突然変異と1つ又は複数の他の突然変異との組合せが含まれる。好ましい実施形態では、軽鎖S182突然変異を、本明細書中に記載の別の突然変異と組み合わせる。以下は2つの突然変異の好ましい組合せであり、本発明による抗体は、これらの突然変異を、1つ又は複数の追加の突然変異と共に含み得る。
LC S182とLC S208の組合せ、
LC S182とLC S171の組合せ、
LC S182とLC A184の組合せ、
LC S182とLC V191の組合せ、
LC S182とLC S202の組合せ、
LC S182とLC S203の組合せ、
LC S182とLC T180の組合せ、
LC S182とLC T206の組合せ、
LC S182とHC S160の組合せ、
LC S182とHC T190の組合せ、
LC S182とHC S443の組合せ、
LC S182とHC S447の組合せ、
LC S182とHC S139の組合せ、
LC S182とHC S168の組合せ、
LC S182とHC V170の組合せ、
LC S182とHC V176の組合せ、
LC S182とHC T200の組合せ、
LC S182とHC S445の組合せ。
【００８５】
そのうち、以下が好ましい。
LC S182とLC T180の組合せ、
LC S182とLC T206の組合せ、
LC S182とHC S160の組合せ、
LC S182とHC T190の組合せ、
LC S182とHC S443の組合せ、
LC S182とHC S447の組合せ、
【００８６】
そのうち、以下が最も好ましい。
LC S182CとLC T180Cの組合せ、
LC S182CとLC T206Cの組合せ、
LC S182CとHC S160Cの組合せ、
LC S182CとHC T190Cの組合せ、
LC S182CとHC S443Cの組合せ、
LC S182CとHC S447Cの組合せ。
【００８７】
したがって、好ましい抗体は、配列番号34のアミノ酸配列と配列番号22〜33又は35〜40から選択されるアミノ酸配列との組合せを含み得る。好ましい抗体では、Xはシステインである。或いは、Xは、リシン、グルタミン、システイン、又は非天然アミノ酸から独立して選択されてもよく、最も好ましくはシステインである。
【００８８】
他の好ましい抗体には、軽鎖A184突然変異と1つ又は複数の他の突然変異との組合せが含まれる。好ましい実施形態では、軽鎖A184突然変異を、本明細書中に記載の別の突然変異と組み合わせる。以下は2つの突然変異の好ましい組合せであり、本発明による抗体は、これらの突然変異を、1つ又は複数の追加の突然変異と共に含み得る。
LC A184とLC S208の組合せ、
LC A184とLC S171の組合せ、
LC A184とLC S182の組合せ、
LC A184とLC V191の組合せ、
LC A184とLC S202の組合せ、
LC A184とLC S203の組合せ、
LC A184とLC T180の組合せ、
LC A184とLC T206の組合せ、
LC A184とHC S160の組合せ、
LC A184とHC T190の組合せ、
LC A184とHC S443の組合せ、
LC A184とHC S447の組合せ、
LC A184とHC S139の組合せ、
LC A184とHC S168の組合せ、
LC A184とHC V170の組合せ、
LC A184とHC V176の組合せ、
LC A184とHC T200の組合せ、
LC A184とHC S445の組合せ。
【００８９】
そのうち、以下が好ましい。
LC A184とLC T180の組合せ、
LC A184とLC T206の組合せ、
LC A184とHC S160の組合せ、
LC A184とHC T190の組合せ、
LC A184とHC S443の組合せ、
LC A184とHC S447の組合せ、
【００９０】
そのうち、以下が最も好ましい。
LC A184CとLC T180Cの組合せ、
LC A184CとLC T206Cの組合せ、
LC A184CとHC S160Cの組合せ、
LC A184CとHC T190Cの組合せ、
LC A184CとHC S443Cの組合せ、
LC A184CとHC S447Cの組合せ。
【００９１】
したがって、好ましい抗体は、配列番号35のアミノ酸配列と配列番号22〜34又は36〜40から選択されるアミノ酸配列との組合せを含み得る。好ましい抗体では、Xはシステインである。或いは、Xは、リシン、グルタミン、システイン、又は非天然アミノ酸から独立して選択されてもよく、最も好ましくはシステインである。
【００９２】
他の好ましい抗体には、軽鎖V191突然変異と1つ又は複数の他の突然変異との組合せが含まれる。好ましい実施形態では、軽鎖V191突然変異を、本明細書中に記載の別の突然変異と組み合わせる。以下は2つの突然変異の好ましい組合せであり、本発明による抗体は、これらの突然変異を、1つ又は複数の追加の突然変異と共に含み得る。
LC V191とLC S208の組合せ、
LC V191とLC S171の組合せ、
LC V191とLC S182の組合せ、
LC V191とLC A184の組合せ、
LC V191とLC S202の組合せ、
LC V191とLC S203の組合せ、
LC V191とLC T180の組合せ、
LC V191とLC T206の組合せ、
LC V191とHC S160の組合せ、
LC V191とHC T190の組合せ、
LC V191とHC S443の組合せ、
LC V191とHC S447の組合せ、
LC V191とHC S139の組合せ、
LC V191とHC S168の組合せ、
LC V191とHC V170の組合せ、
LC V191とHC V176の組合せ、
LC V191とHC T200の組合せ、
LC V191とHC S445の組合せ。
【００９３】
そのうち、以下が好ましい。
LC V191とLC T180の組合せ、
LC V191とLC T206の組合せ、
LC V191とHC S160の組合せ、
LC V191とHC T190の組合せ、
LC V191とHC S443の組合せ、
LC V191とHC S447の組合せ、
【００９４】
そのうち、以下が最も好ましい。
LC V191CとLC T180Cの組合せ、
LC V191CとLC T206Cの組合せ、
LC V191CとHC S160Cの組合せ、
LC V191CとHC T190Cの組合せ、
LC V191CとHC S443Cの組合せ、
LC V191CとHC S447Cの組合せ。
【００９５】
したがって、好ましい抗体は、配列番号36のアミノ酸配列と配列番号22〜35又は37〜40から選択されるアミノ酸配列との組合せを含み得る。好ましい抗体では、Xはシステインである。或いは、Xは、リシン、グルタミン、システイン、又は非天然アミノ酸から独立して選択されてもよく、最も好ましくはシステインである。
【００９６】
他の好ましい抗体には、軽鎖S202突然変異と1つ又は複数の他の突然変異との組合せが含まれる。好ましい実施形態では、軽鎖S202突然変異を、本明細書中に記載の別の突然変異と組み合わせる。以下は2つの突然変異の好ましい組合せであり、本発明による抗体は、これらの突然変異を、1つ又は複数の追加の突然変異と共に含み得る。
LC S202とLC S208の組合せ、
LC S202とLC S171の組合せ、
LC S202とLC S182の組合せ、
LC S202とLC A184の組合せ、
LC S202とLC V191の組合せ、
LC S202とLC S203の組合せ、
LC S202とLC T180の組合せ、
LC S202とLC T206の組合せ、
LC S202とHC S160の組合せ、
LC S202とHC T190の組合せ、
LC S202とHC S443の組合せ、
LC S202とHC S447の組合せ、
LC S202とHC S139の組合せ、
LC S202とHC S168の組合せ、
LC S202とHC V170の組合せ、
LC S202とHC V176の組合せ、
LC S202とHC T200の組合せ、
LC S202とHC S445の組合せ。
【００９７】
そのうち、以下が好ましい。
LC S202とLC T180の組合せ、
LC S202とLC T206の組合せ、
LC S202とHC S160の組合せ、
LC S202とHC T190の組合せ、
LC S202とHC S443の組合せ、
LC S202とHC S447の組合せ、
【００９８】
そのうち、以下が最も好ましい。
LC S202CとLC T180Cの組合せ、
LC S202CとLC T206Cの組合せ、
LC S202CとHC S160Cの組合せ、
LC S202CとHC T190Cの組合せ、
LC S202CとHC S443Cの組合せ、
LC S202CとHC S447Cの組合せ。
【００９９】
したがって、好ましい抗体は、配列番号37のアミノ酸配列と配列番号22〜36又は38〜40から選択されるアミノ酸配列との組合せを含み得る。好ましい抗体では、Xはシステインである。或いは、Xは、リシン、グルタミン、システイン、又は非天然アミノ酸から独立して選択されてもよく、最も好ましくはシステインである。
【０１００】
他の好ましい抗体には、軽鎖S203突然変異と1つ又は複数の他の突然変異との組合せが含まれる。好ましい実施形態では、軽鎖S203突然変異を、本明細書中に記載の別の突然変異と組み合わせる。以下は2つの突然変異の好ましい組合せであり、本発明による抗体は、これらの突然変異を、1つ又は複数の追加の突然変異と共に含み得る。
LC S203とLC S208の組合せ、
LC S203とLC S171の組合せ、
LC S203とLC S182の組合せ、
LC S203とLC A184の組合せ、
LC S203とLC V191の組合せ、
LC S203とLC S202の組合せ、
LC S203とLC T180の組合せ、
LC S203とLC T206の組合せ、
LC S203とHC S160の組合せ、
LC S203とHC T190の組合せ、
LC S203とHC S443の組合せ、
LC S203とHC S447の組合せ、
LC S203とHC S139の組合せ、
LC S203とHC S168の組合せ、
LC S203とHC V170の組合せ、
LC S203とHC V176の組合せ、
LC S203とHC T200の組合せ、
LC S203とHC S445の組合せ。
【０１０１】
そのうち、以下が好ましい。
LC S203とLC T180の組合せ、
LC S203とLC T206の組合せ、
LC S203とHC S160の組合せ、
LC S203とHC T190の組合せ、
LC S203とHC S443の組合せ、
LC S203とHC S447の組合せ、
【０１０２】
そのうち、以下が最も好ましい。
LC S203CとLC T180Cの組合せ、
LC S203CとLC T206Cの組合せ、
LC S203CとHC S160Cの組合せ、
LC S203CとHC T190Cの組合せ、
LC S203CとHC S443Cの組合せ、
LC S203CとHC S447Cの組合せ。
【０１０３】
したがって、好ましい抗体は、配列番号38のアミノ酸配列と配列番号22〜37又は39〜40から選択されるアミノ酸配列との組合せを含み得る。好ましい抗体では、Xはシステインである。或いは、Xは、リシン、グルタミン、システイン、又は非天然アミノ酸から独立して選択されてもよく、最も好ましくはシステインである。
【０１０４】
他の好ましい抗体には、重鎖S139突然変異と1つ又は複数の他の突然変異との組合せが含まれる。好ましい実施形態では、重鎖S139突然変異を、本明細書中に記載の別の突然変異と組み合わせる。以下は2つの突然変異の好ましい組合せであり、本発明による抗体は、これらの突然変異を、1つ又は複数の追加の突然変異と共に含み得る。
HC S139とLC S208の組合せ、
HC S139とLC S171の組合せ、
HC S139とLC S182の組合せ、
HC S139とLC A184の組合せ、
HC S139とLC V191の組合せ、
HC S139とLC S202の組合せ、
HC S139とLC S203の組合せ、
HC S139とLC T180の組合せ、
HC S139とLC T206の組合せ、
HC S139とHC S160の組合せ、
HC S139とHC T190の組合せ、
HC S139とHC S443の組合せ、
HC S139とHC S447の組合せ、
HC S139とHC S168の組合せ、
HC S139とHC V170の組合せ、
HC S139とHC V176の組合せ、
HC S139とHC T200の組合せ、
HC S139とHC S445の組合せ。
【０１０５】
そのうち、以下が好ましい。
HC S139とLC T180の組合せ、
HC S139とLC T206の組合せ、
HC S139とHC S160の組合せ、
HC S139とHC T190の組合せ、
HC S139とHC S443の組合せ、
HC S139とHC S447の組合せ、
【０１０６】
そのうち、以下が最も好ましい。
HC S139CとLC T180Cの組合せ、
HC S139CとLC T206Cの組合せ、
HC S139CとHC S160Cの組合せ、
HC S139CとHC T190Cの組合せ、
HC S139CとHC S443Cの組合せ、
HC S139CとHC S447Cの組合せ。
【０１０７】
したがって、好ましい抗体は、配列番号22のアミノ酸配列と配列番号23〜40から選択されるアミノ酸配列との組合せを含み得る。好ましい抗体では、Xはシステインである。或いは、Xは、リシン、グルタミン、システイン、又は非天然アミノ酸から独立して選択されてもよく、最も好ましくはシステインである。
【０１０８】
他の好ましい抗体には、重鎖S168突然変異と1つ又は複数の他の突然変異との組合せが含まれる。好ましい実施形態では、重鎖S168突然変異を、本明細書中に記載の別の突然変異と組み合わせる。以下は2つの突然変異の好ましい組合せであり、本発明による抗体は、これらの突然変異を、1つ又は複数の追加の突然変異と共に含み得る。
HC S168とLC S208の組合せ、
HC S168とLC S171の組合せ、
HC S168とLC S182の組合せ、
HC S168とLC A184の組合せ、
HC S168とLC V191の組合せ、
HC S168とLC S202の組合せ、
HC S168とLC S203の組合せ、
HC S168とLC T180の組合せ、
HC S168とLC T206の組合せ、
HC S168とHC S160の組合せ、
HC S168とHC T190の組合せ、
HC S168とHC S443の組合せ、
HC S168とHC S447の組合せ、
HC S168とHC S139の組合せ、
HC S168とHC V170の組合せ、
HC S168とHC V176の組合せ、
HC S168とHC T200の組合せ、
HC S168とHC S445の組合せ。
【０１０９】
そのうち、以下が好ましい。
HC S168とLC T180の組合せ、
HC S168とLC T206の組合せ、
HC S168とHC S160の組合せ、
HC S168とHC T190の組合せ、
HC S168とHC S443の組合せ、
HC S168とHC S447の組合せ、
【０１１０】
そのうち、以下が最も好ましい。
HC S168CとLC T180Cの組合せ、
HC S168CとLC T206Cの組合せ、
HC S168CとHC S160Cの組合せ、
HC S168CとHC T190Cの組合せ、
HC S168CとHC S443Cの組合せ、
HC S168CとHC S447Cの組合せ。
【０１１１】
したがって、好ましい抗体は、配列番号24のアミノ酸配列と配列番号22、23、又は25〜40から選択されるアミノ酸配列との組合せを含み得る。好ましい抗体では、Xはシステインである。或いは、Xは、リシン、グルタミン、システイン、又は非天然アミノ酸から独立して選択されてもよく、最も好ましくはシステインである。
【０１１２】
他の好ましい抗体には、重鎖V170突然変異と1つ又は複数の他の突然変異との組合せが含まれる。好ましい実施形態では、重鎖V170突然変異を、本明細書中に記載の別の突然変異と組み合わせる。以下は2つの突然変異の好ましい組合せであり、本発明による抗体は、これらの突然変異を、1つ又は複数の追加の突然変異と共に含み得る。
HC V170とLC S208の組合せ、
HC V170とLC S171の組合せ、
HC V170とLC S182の組合せ、
HC V170とLC A184の組合せ、
HC V170とLC V191の組合せ、
HC V170とLC S202の組合せ、
HC V170とLC S203の組合せ、
HC V170とLC T180の組合せ、
HC V170とLC T206の組合せ、
HC V170とHC S160の組合せ、
HC V170とHC T190の組合せ、
HC V170とHC S443の組合せ、
HC V170とHC S447の組合せ、
HC V170とHC S139の組合せ、
HC V170とHC S168の組合せ、
HC V170とHC V176の組合せ、
HC V170とHC T200の組合せ、
HC V170とHC S445の組合せ。
【０１１３】
そのうち、以下が好ましい。
HC V170とLC T180の組合せ、
HC V170とLC T206の組合せ、
HC V170とHC S160の組合せ、
HC V170とHC T190の組合せ、
HC V170とHC S443の組合せ、
HC V170とHC S447の組合せ、
【０１１４】
そのうち、以下が最も好ましい。
HC V170CとLC T180Cの組合せ、
HC V170CとLC T206Cの組合せ、
HC V170CとHC S160Cの組合せ、
HC V170CとHC T190Cの組合せ、
HC V170CとHC S443Cの組合せ、
HC V170CとHC S447Cの組合せ。
【０１１５】
したがって、好ましい抗体は、配列番号25のアミノ酸配列と配列番号22〜24又は26〜40から選択されるアミノ酸配列との組合せを含み得る。好ましい抗体では、Xはシステインである。或いは、Xは、リシン、グルタミン、システイン、又は非天然アミノ酸から独立して選択されてもよく、最も好ましくはシステインである。
【０１１６】
他の好ましい抗体には、重鎖V176突然変異と1つ又は複数の他の突然変異との組合せが含まれる。好ましい実施形態では、重鎖V176突然変異を、本明細書中に記載の別の突然変異と組み合わせる。以下は2つの突然変異の好ましい組合せであり、本発明による抗体は、これらの突然変異を、1つ又は複数の追加の突然変異と共に含み得る。
HC V176とLC S208の組合せ、
HC V176とLC S171の組合せ、
HC V176とLC S182の組合せ、
HC V176とLC A184の組合せ、
HC V176とLC V191の組合せ、
HC V176とLC S202の組合せ、
HC V176とLC S203の組合せ、
HC V176とLC T180の組合せ、
HC V176とLC T206の組合せ、
HC V176とHC S160の組合せ、
HC V176とHC T190の組合せ、
HC V176とHC S443の組合せ、
HC V176とHC S447の組合せ、
HC V176とHC S139の組合せ、
HC V176とHC S168の組合せ、
HC V176とHC V170の組合せ、
HC V176とHC T200の組合せ、
HC V176とHC S445の組合せ。
【０１１７】
そのうち、以下が好ましい。
HC V176とLC T180の組合せ、
HC V176とLC T206の組合せ、
HC V176とHC S160の組合せ、
HC V176とHC T190の組合せ、
HC V176とHC S443の組合せ、
HC V176とHC S447の組合せ、
【０１１８】
そのうち、以下が最も好ましい。
HC V176CとLC T180Cの組合せ、
HC V176CとLC T206Cの組合せ、
HC V176CとHC S160Cの組合せ、
HC V176CとHC T190Cの組合せ、
HC V176CとHC S443Cの組合せ、
HC V176CとHC S447Cの組合せ。
【０１１９】
したがって、好ましい抗体は、配列番号26のアミノ酸配列と配列番号22〜25又は27〜40から選択されるアミノ酸配列との組合せを含み得る。好ましい抗体では、Xはシステインである。或いは、Xは、リシン、グルタミン、システイン、又は非天然アミノ酸から独立して選択されてもよく、最も好ましくはシステインである。
【０１２０】
他の好ましい抗体には、重鎖T200突然変異と1つ又は複数の他の突然変異との組合せが含まれる。好ましい実施形態では、重鎖T200突然変異を、本明細書中に記載の別の突然変異と組み合わせる。以下は2つの突然変異の好ましい組合せであり、本発明による抗体は、これらの突然変異を、1つ又は複数の追加の突然変異と共に含み得る。
HC T200とLC S208の組合せ、
HC T200とLC S171の組合せ、
HC T200とLC S182の組合せ、
HC T200とLC A184の組合せ、
HC T200とLC V191の組合せ、
HC T200とLC S202の組合せ、
HC T200とLC S203の組合せ、
HC T200とLC T180の組合せ、
HC T200とLC T206の組合せ、
HC T200とHC S160の組合せ、
HC T200とHC T190の組合せ、
HC T200とHC S443の組合せ、
HC T200とHC S447の組合せ、
HC T200とHC S139の組合せ、
HC T200とHC S168の組合せ、
HC T200とHC V170の組合せ、
HC T200とHC V176の組合せ、
HC T200とHC S445の組合せ。
【０１２１】
そのうち、以下が好ましい。
HC T200とLC T180の組合せ、
HC T200とLC T206の組合せ、
HC T200とHC S160の組合せ、
HC T200とHC T190の組合せ、
HC T200とHC S443の組合せ、
HC T200とHC S447の組合せ、
【０１２２】
そのうち、以下が最も好ましい。
HC T200CとLC T180Cの組合せ、
HC T200CとLC T206Cの組合せ、
HC T200CとHC S160Cの組合せ、
HC T200CとHC T190Cの組合せ、
HC T200CとHC S443Cの組合せ、
HC T200CとHC S447Cの組合せ。
【０１２３】
したがって、好ましい抗体は、配列番号28のアミノ酸配列と配列番号22〜27又は29〜40から選択されるアミノ酸配列との組合せを含み得る。好ましい抗体では、Xはシステインである。或いは、Xは、リシン、グルタミン、システイン、又は非天然アミノ酸から独立して選択されてもよく、最も好ましくはシステインである。
【０１２４】
他の好ましい抗体には、重鎖S445突然変異と1つ又は複数の他の突然変異との組合せが含まれる。好ましい実施形態では、重鎖S445突然変異を、本明細書中に記載の別の突然変異と組み合わせる。以下は2つの突然変異の好ましい組合せであり、本発明による抗体は、これらの突然変異を、1つ又は複数の追加の突然変異と共に含み得る。
HC S445とLC S208の組合せ、
HC S445とLC S171の組合せ、
HC S445とLC S182の組合せ、
HC S445とLC A184の組合せ、
HC S445とLC V191の組合せ、
HC S445とLC S202の組合せ、
HC S445とLC S203の組合せ、
HC S445とLC T180の組合せ、
HC S445とLC T206の組合せ、
HC S445とHC S160の組合せ、
HC S445とHC T190の組合せ、
HC S445とHC S443の組合せ、
HC S445とHC S447の組合せ、
HC S445とHC S139の組合せ、
HC S445とHC S168の組合せ、
HC S445とHC V170の組合せ、
HC S445とHC V176の組合せ、
HC S445とHC T200の組合せ。
【０１２５】
そのうち、以下が好ましい。
HC S445とLC T180の組合せ、
HC S445とLC T206の組合せ、
HC S445とHC S160の組合せ、
HC S445とHC T190の組合せ、
HC S445とHC S443の組合せ、
HC S445とHC S447の組合せ、
【０１２６】
そのうち、以下が最も好ましい。
HC S445CとLC T180Cの組合せ、
HC S445CとLC T206Cの組合せ、
HC S445CとHC S160Cの組合せ、
HC S445CとHC T190Cの組合せ、
HC S445CとHC S443Cの組合せ、
HC S445CとHC S447Cの組合せ。
【０１２７】
したがって、好ましい抗体は、配列番号30のアミノ酸配列と配列番号22〜29又は31〜40から選択されるアミノ酸配列との組合せを含み得る。好ましい抗体では、Xはシステインである。或いは、Xは、リシン、グルタミン、システイン、又は非天然アミノ酸から独立して選択されてもよく、最も好ましくはシステインである。
【０１２８】
抗体は、アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、ダクリツマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、アダリムマブ、エファリツマブ、セツキシマブ、イブリツモマブ、オマリズマブ、ベバシズマブ、ラニビズマブ、ゴリムマブ、カナキヌマブ、ウステキヌマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、ベリムマブ、イピリムマブ、ブレンツキシマブ、ペルツズマブ、ラキシバクマブ、ベドリズマブ、ラムシルマブ、オビヌツズマブ、シルツキシマブ、セクキヌマブ、ジヌツキシマブから選択され得る。
【０１２９】
本発明は、配列番号1のアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖と、配列番号3〜12のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖とを有する抗体を更に提供する。或いは、抗体は、配列番号13〜21から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖と、配列番号2のアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖とを有する。抗体は、好ましくは2本の軽鎖及び2本の重鎖を有する。
【０１３０】
また、標的に対する結合特異性をもたらす可変領域、及び、配列番号1の残基109〜214のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域と、配列番号3〜12から選択される配列の残基121〜450のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域とを含む定常領域を有する抗体も提供する。或いは、定常領域は、配列番号13〜21の残基109〜214のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域と、配列番号2の残基121〜450のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域とを含む。好ましくは、抗体は、配列番号14の残基109〜214のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域と、配列番号2の残基121〜450のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域とを含む、又は、抗体は、配列番号14の残基109〜214のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域と、配列番号4の残基121〜450のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域とを含む、又は抗体は、配列番号21の残基109〜214のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域と、配列番号2の残基121〜450のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域とを含む。
【０１３１】
また、重鎖又は軽鎖のどちらか上に1つの突然変異が存在する場合はDARが1.7〜2.2であり、軽鎖若しくは重鎖中に2つ又は軽鎖中に1つ及び重鎖中に1つの突然変異が存在する場合はDARが3.4〜4.4であるように、ペイロード、好ましくは薬物ペイロードとコンジュゲートしている、本発明の第1の態様による抗体を含む抗体-薬物のコンジュゲート(ADC)も提供する。
【０１３２】
薬物ペイロードは微小管破壊剤又はDNA改変剤であり得る。適切な薬物ペイロードの例には、ドラスタチン、ベドチン、モノメチルアウリスタチンF、DM1及びDM4を含めたメイタンシノイド、デュオカルマイシン類似体、カリチアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、デュオカルマイシン、センタナマイシン、イリノテカン、並びにドキソルビシンが含まれる。他の薬物ペイロードも使用され得る。
【０１３３】
本発明の更なる態様は、治療剤として使用するための、本明細書中に記載の抗体又はADCを提供する。また、本発明は、本明細書中に記載の抗体又はADCを含む医薬組成物も提供する。本発明の更なる態様は、本明細書中に記載の抗体を薬物ペイロードとコンジュゲートさせる工程を含む、ADCを作製する方法を提供する。
【０１３４】
本発明の別の態様は、抗体とペイロードとのコンジュゲーション後の親抗体の選択された特徴を改善させる方法であって、改善が、単量体の損失の低下、抗体断片化の低下、及び/又はコンジュゲーション後の抗体凝集の低下から選択され、HC T200、HC V170、HC V176、HC T190、HC S139、HC S160、HC S168、HC S443、HC S445、HC S447、LC S171C、LC T180、LC T206、LC V191、LC S202、LC S203、又はLC S208から選択される残基において1つ又は複数の置換を有する、親抗体のアミノ酸配列を有する改変抗体を調製する工程を含む方法を提供する。置換は好ましくはシステインであるが、他の突然変異残基、特にリシン、グルタミン、又は非天然アミノ酸も使用され得る。
【０１３５】
定義
本明細書中で使用する以下の用語には以下の定義を与える。
【０１３６】
「断片」とは、抗体の特異的結合特性を保持している、完全長抗体の一部分を意味する。「派生体」とは、抗体の特異的結合特性を保持しており、ペプチド配列に1つ又は複数の変化を有する、及び/或いはそれに結合した1つ若しくは複数の官能基又は1つ若しくは複数の部分を保有する、改変抗体又は抗体断片を意味する。「派生体」には翻訳後修飾された抗体が含まれ得る。
【０１３７】
「位置的付番」、「配列的付番」、及び同様の用語とは、N末端の最初の残基が残基番号1と指定され、続く残基が逐次的に残基2、3、4等と付番される、ペプチドのアミノ酸配列の付番を意味する。これは抗体のカバット又はEU付番システムと対比される。
【０１３８】
「部位特異的コンジュゲーション部位」とは、ペイロードのコンジュゲーションを許容するために特異的に改変された、抗体内のアミノ酸残基を意味する。
【０１３９】
「野生型」とは、改変されていない、天然に存在する、ペプチド又は核酸配列を意味する。
【０１４０】
「親抗体」とは、改変抗体を調製するための基礎として使用する抗体を意味する。
【０１４１】
「非天然アミノ酸」とは、タンパク質を構成するアミノ酸でも、その翻訳後修飾された変異体でもないアミノ酸を意味する。特に、この用語は、20個の一般的なアミノ酸のうちの1つではないアミノ酸をいう。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】25mlのCHOK1SV培養物中の候補抗体の発現レベルを示す図である。
【図２】コンジュゲートした及びコンジュゲートしていない変異抗体の%単量体、並びにコンジュゲートした変異体の%凝集及び断片化のための、SEC-HPLC分析の結果を示す図である。
【図３】抗体変異体の軽鎖とのビオチン-マレイミドのコンジュゲーションの程度を示す図である。白いバーはコンジュゲートしていない産物を表し、縞のバーは単一のコンジュゲートしたペイロードを有する産物を表し、黒いバーは2つのコンジュゲートしたペイロードを有する産物を表す。
【図４】抗体変異体の重鎖とのビオチン-マレイミドのコンジュゲーションの程度を示す図である。白いバーはコンジュゲートしていない産物を表し、縞のバーは単一のコンジュゲートしたペイロードを有する産物を表し、黒いバーは2つのコンジュゲートしたペイロードを有する産物を表す。
【図５】図3及び図4の抗体変異体の計算した薬物抗体比を示す図である。
【図６】抗体変異体の部分群についての、ビオチンの経時的な減少百分率を示す図である。
【図７】MMAEとコンジュゲートした選択された変異体の一部の計算した薬物対抗体比を示す図である。
【図８】72時間の期間にわたって様々な濃度の選択されたADCに曝露された、様々な細胞系の細胞生存度の減少を示す図である。PBS=リン酸緩衝生理食塩水、vc-MMAE=バリン-シトルリン-MMAE。
【発明を実施するための形態】
【０１４３】
本発明者らは、たとえばADC(ADC変異体)等のペイロードとコンジュゲートした抗体を生成するための、所望の特性を有する抗体の選択を可能にするために、改変抗体を合理的に設計する方法を開発した。設計方法は、in silico及びin vitroスクリーニング工程を組み入れている。したがって、以下に見られるように、本発明の抗体はいくつかの特性を共有する。
【０１４４】
部位特異的コンジュゲーションのために残基を取り込むために、抗体構造の選択された位置において、ネイティブ残基をシステイン残基等の別の残基で置き換えることが決定された。力価及び凝集、並びに任意選択で免疫原性(in silicoのみ)を含めた望ましい特性について、候補変異体を分析した(in silico及びin vitro)。初期の概念証明として、Herceptin(トラスツズマブ)がモデル抗体として選択され、ビオチンマレイミドを用いてコンジュゲーションの最適化及び分析を実施した。
【０１４５】
突然変異部位を選択するための基準には以下が含まれていた。
- システイン(cys)に突然変異させる残基は、同様の物理化学的特性を有するか、又は小さな非疎水性の非荷電の残基(ser、val、thr、ala)でなければならない。
- システインに突然変異させることを受け入れられる残基は、抗体又はその断片の軽鎖(Cκ、Cλ)又は重鎖(CH1、CH2、又はCH3)のいずれかの定常領域中のものでなければならない。
- 改変抗体又は足場を使用する場合、分子の生物活性と干渉する危険性を最小限にするため、導入されたcysはすべての標的結合界面又はドメインから>5Åの距離にあるべきである。
- cysへの突然変異は、局所的環境及びタンパク質の特性の変更をもたらす鎖内水素結合を生じるべきでない。
- cysへの突然変異は、抗体(又は足場)の鎖又はドメイン間の界面中に配置されていてはならない。通則として、改変は、鎖-鎖又はドメイン-ドメインの界面のどちらかに関与している残基から>5Åの距離にあるべきである。
- cysへの突然変異は、抗体のすべてのネイティブcysから>5Åの距離にあるべきであり、Fcのグリコシル化部位と干渉するべきでない(すなわち、グリコシル化が起こる残基Asn295から>5Åの距離に配置されるべきである)。
- cysへの突然変異は、化学分解の危険性を増加させるべきでない/望ましくない翻訳後修飾を導入するべきでない。
【０１４６】
その後、トラスツズマブ配列のスクリーニングを実施して、たとえばシステイン等の別の残基への突然変異に適した部位を同定した。
【０１４７】
改変されていない軽鎖配列は以下である。
【０１４８】
【化１】
2018509933.tif 000004
【０１４９】
改変されていない重鎖配列は以下である。
【０１５０】
【化２】
2018509933.tif 000005
【０１５１】
CH1、CH3、及びCL中のSer、Thr、Val、及びAla残基を探索した。これによりいくつかの候補が得られた。
軽鎖:SER171、VAL191、SER208、SER182、THR180、THR206、ALA184、SER203、SER202
重鎖:VAL170、VAL176、THR190、SER445、SER443、SER139、SER160、SER447、THR200、SER168。
【０１５２】
その後、これらの突然変異を望ましい特性について分析した。溶媒接近可能性表面のモデリングをin silicoで実施した。Discovery Studio(Accelrys Software Inc.社、Discovery Studio Modeling Environment、リリース4.0、San Diego:Accelrys Software Inc.社、2013)を使用して、選択された残基の側鎖溶媒接近可能性表面(Side Chain Solvent Accessibility Surface)を計算した。分子の「コンジュゲーション性」を促進するために、溶媒接近可能性は15%より高い(>15%)、又は17%より高い(>17%)べきである。パーセンテージ側鎖溶媒接近可能性表面は、側鎖溶媒接近可能性を、拡張Ala-X-Alaトリペプチド(式中、Xは目的の残基である)を使用して計算した完全に曝露されたアミノ酸残基の側鎖溶媒接近可能性で除算し、その値を100倍して計算する。15%以下(<=15%)又は17%以下(<=17%)の溶媒接近可能性比を有する側鎖は埋もれているとみなされ、考慮に入れない。SASモデリングの結果を以下に示す。
【０１５３】
【表３】
2018509933.tif 000006
【０１５４】
また、凝集性向のモデリングもin silicoで実施した。凝集性向は、これらの(潜在的な)ADC変異体のいずれかの、意図する操作したCysの導入によって有意に増加するべきでない。この性向は、参照分子及び上述の(潜在的な)ADC変異体のいずれかのZスコアを、Cysへの突然変異を導入する抗体又はタンパク質の最も小さな機能的ドメインの参照組についての値の分布に対して比較することに基づいて計算する。平均及び標準偏差を参照組について決定する。その後、標的タンパク質のスコアから参照の平均を引算し、その値を標準偏差によって除算することによって、Z-スコアを計算する。結果はゼロ(0)中心のスコアであり、ここで、陽性値は標的が平均よりも凝集の傾向が高い(この場合)を示した。(-1,1)以内のZ-スコアを有する標的は、参照組内のスコアの標準偏差内にある。AggreSolve(商標)in silicoプラットフォーム(Lonza社、スイスBasel)は、配列及び構造的パラメータに基づいて所定のポリペプチドの凝集性向を反映する予測子を計算することができる、アルゴリズムのコレクションを含む。そのような予測子は、普遍的及び局所的な(残基に特異的な)凝集性向、並びに局所的な柔軟性及び安定性を反映している。
【０１５５】
【表４】
2018509933.tif 000007
【０１５６】
AggreSolve Z-スコアを、完全長トラスツズマブ重鎖及び軽鎖、並びにADC置換が位置するCH1、CH3、及びCLドメイン(最小限の機能的ドメイン)について計算した。
【０１５７】
CH1、CH3、及びCLドメインの境界は、M. P. Lefranc、C. Pommie、Q. Kaas、E. Duprat、N. Bosc、D. Guiraudou、C. Jean、M. Ruiz、I. Da Piedade、M. Rouard、E. Foulquier、V. Thouvenin、及びG. Lefranc. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor constant domains and Ig superfamily C-like domains. Developmental and comparative immunology 29 (3)、2005のIMGT定義のとおりである。
【０１５８】
これらのin silico選択工程に従い、in vitro試験を変異体について実施して、タンパク質収率(in vitro)、凝集/断片化、及び結合動力学を決定した。
- 上清中及びタンパク質A精製後の生成物の力価によって推定されるタンパク質収率は、親分子の少なくとも70%以上でなければならない。
- サイズ排除クロマトグラフィーHPLCによって測定した、コンジュゲーション後に失われた単量体のパーセンテージは、好ましくは≦35%、より好ましくは≦5%、≦10%、≦15%、≦20%、≦25%、又は≦30%である。
- コンジュゲートした分子のパーセンテージ凝集は、好ましくは<5%、<10%、<15%、又は<20%である。
- コンジュゲートした抗体のパーセンテージ断片化は、好ましくは<5%、<10%、<15%、<20%、<25%、<30%、<32%、<35%、又は<40%である。
- コンジュゲートした変異体の解離定数(KD)は、突然変異させていない抗体又は親抗体の参照標準のKDよりも2桁以下(≦2)小さくなければならない。本明細書中に記載の抗体では、参照標準はherceptin(トラスツズマブ)であるが、異なる親抗体を使用した場合は、その親を参照標準として使用できることを理解されたい。
【０１５９】
様々な異なる宿主細胞中で抗体をクローニング及び発現させる系は周知である。適切な宿主細胞には、細菌、哺乳動物細胞、酵母、及びバキュロウイルス系が含まれる。異種ポリペプチドを発現させるために当分野で利用可能な哺乳動物細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎細胞、NSOマウス黒色腫細胞、及び多数の他のものが含まれる。小さな免疫グロブリン分子のための一般的な好ましい細菌宿主は大腸菌である。大腸菌等の原核細胞における抗体及び抗体断片等の免疫グロブリンの発現は、当分野で十分に確立されている。また、培養中の真核細胞における発現も、免疫グロブリンを生成するための選択肢として当業者が利用可能である。また、抗体及び抗体断片等の免疫グロブリンは、無細胞系でも発現され得る。
【０１６０】
免疫グロブリンの発現に適したベクターは、必要に応じて、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、及び他の配列を含めた適切な調節配列を含有して、選択又は構築することができる。ベクターは、必要に応じてプラスミド、ウイルス、たとえばファージ、又はファージミドであり得る。更なる詳細については、たとえばMolecular Cloning: a Laboratory Manual:第2版、Sambrookら、1989、Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。たとえば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、シーケンシング、細胞内へのDNAの導入及び遺伝子発現、並びにタンパク質の分析における、核酸を操作するための多くの公知の技法及びプロトコールは、Current Protocols in Molecular Biology、第2版、Ausubelら編、John Wiley & Sons、1992に詳述されている。変異免疫グロブリン又はそのCH1、VH、及び/若しくはVLドメインをコードする核酸は宿主細胞中に含有され得る。
【０１６１】
変異抗体を、たとえばWO2011021009A1に記載のように作製した。詳細には、本明細書中に記載の抗体変異体をコードするDNAを化学合成し、適切な哺乳動物発現ベクター内にクローニングした。一過性発現実験には、重鎖及び軽鎖を別々の発現ベクター内にクローニングした。変異抗体を安定して発現する細胞系の作製には、重鎖及び軽鎖を1つの単一の発現ベクター内にクローニングした。それぞれの発現ベクターは、哺乳動物細胞からの重鎖及び軽鎖の分泌を可能にするために、重鎖及び軽鎖のコード領域の上流にシグナル配列をコードするDNAを含む。
【０１６２】
一過性発現には、CHOK1SV細胞を、たとえばLipofectamineを使用して、本明細書中に記載の変異体をコードする発現ベクターを用いて形質移入した。たとえば、軽鎖中に少なくとも1つの突然変異を含む変異体の場合、前記突然変異を含む発現ベクターを、改変されていない重鎖をコードするベクターで同時形質移入し、重鎖中に少なくとも1つの突然変異を含む変異体の場合、前記突然変異を含む発現ベクターを、改変されていない軽鎖をコードするベクターで同時形質移入した。形質移入の72時間後、上清を形質移入細胞から収集し、遠心分離し、精製前に4℃で保管した。
【０１６３】
大規模生産には、CHOK1SV細胞を、改変された又は改変されていない軽鎖及び重鎖を含む単一のベクターで、上述のように形質移入する。安定に形質移入された細胞のプールを更なる実験に使用するか、又はクローン選択を行う。本発明の変異体を発現するそのような安定形質移入細胞の上清を収集し、精製前に4℃で保管した。
【０１６４】
HiTrapカラム(GE)を使用して細胞培養上清のタンパク質A精製を行い、濃縮及び緩衝液交換の前に4℃で保管した。試料を、2000gで15〜20分間の遠心分離によって濃縮した。配合緩衝液(50mMのホスフェート、100mMのNaCl、pH7.4)を使用して材料の緩衝液交換を4〜5回行った。緩衝液交換を行った後、試料を適切な作業濃度まで配合緩衝液で希釈した。
【０１６５】
タンパク質収率の評価(in vitro)
抗体又は抗体変異体の収率は、上清中及びタンパク質A精製後の生成物の力価によって推定する(たとえば、280nmの吸光度を用いたサンドイッチELISAによって、又はHPLCタンパク質A定量によって)。
【０１６６】
図1は、25mlのCHOK1SV培養物中のそれぞれの候補抗体の発現レベルを示す。すべての変異体は同様の発現レベルを示す。
【０１６７】
コンジュゲーション
コンジュゲーションは、標準の技法であるJunutula J Rら、Nature Biotechnology 2008、8、925〜932頁、Jeffrey S Cら、Bioconjugate Chem. 2013、24、1256〜1263頁による、遊離チオール基とのビオチン-マレイミドコンジュゲーションを用いて実施した。
【０１６８】
毒素とのコンジュゲーションには、操作した抗体を、たとえばトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(12.5当量)で2時間、35℃及びpH7.7で還元する。混合物を、50mMのトリス、5mMのEDTA、pH7.7へと緩衝液交換を行う。デヒドロアスコルビン酸(15当量)を加え、酸化反応を3時間、24℃で進行させる。N,N-ジメチルアセトアミドを加えて、典型的には1〜5%の濃度に達成させる。
【０１６９】
マレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p-アミノベンジルオキシカルボニル-モノメチルアウリスタチンE(5当量)を加え、コンジュゲーション反応を1時間、22℃で進行させる。N-アセチル-システイン(5当量)を加えることによって反応を停止させる。22℃で0.5時間のインキュベーション後、混合物を1×PBSへと緩衝液交換を行う。
【０１７０】
凝集性向/断片化の評価(in vitro)
コンジュゲーションの前後で、抗体の凝集及び/又は断片化が原因で失われた単量体のパーセンテージを、サイズ排除クロマトグラフィーHPLC(SEC-HPLC)を使用して定量的に、及びSDS PAGEを使用して定性的に測定した。後者では、それぞれの変異抗体をベータメルカプトエタノールで処理したか、又は処理を与えず、SDS PAGEでサイズ分画した。変異体の明らかな凝集又は断片化は視覚的に見られなかった。
【０１７１】
1mg/mlの試料をZorbax-250GFカラムで使用した、コンジュゲートした及びコンジュゲートしていない試料のSEC-HPLC分析からの結果を図2に示す。驚くべきことに、たとえば、HC S139C、HC V170C、HC S160C、HC T200C、LC V191C、LC T206C、及びLC T180C等の本発明の抗体の一部は、親/突然変異させていない抗体と比較して、失われた単量体が少なかった、及び/又は抗体の凝集若しくは断片化の量が減少していた。
【０１７２】
結合動力学の評価(in vitro)
また、石英結晶マイクロバランスを使用して、変異体の結合動力学も分析した。ERB2/HER2 Fcキメラをカルボキシルチップ上に固定し、それぞれの変異体(コンジュゲートしたもの及びコンジュゲートしていないもの)の3つの異なる濃度を試験した。以下の表は、それぞれの変異体のKdを要約している。
【０１７３】
【表５】
2018509933.tif 000008
【０１７４】
薬物対抗体比(DAR)の評価(in vitro)
最後に、液体クロマトグラフィー-エレクトロスプレーイオン化-タンデム質量分析(LC-ESI-MS/MS又はLC-ESI-MS)によって、変異体のそれぞれについてDARを決定した。様々な変異体のDAR値は、1つの抗体あたり2つの部位特異的コンジュゲーション部位が存在するため、>1.7及び<2.2でなければならない。
【０１７５】
DARを決定するために、1mg/mlの試料をPNGaseFで処理した。還元した及び還元していない試料を、RPクロマトグラフィー、エレクトロスプレー、及び質量分析によって分析した。
【０１７６】
変異体の軽鎖及び重鎖へのビオチン-マレイミドコンジュゲーションの程度をそれぞれ図3及び図4に示し、それぞれの変異体の計算したDARを図5に示す。
【０１７７】
コンジュゲーション及び脱コンジュゲーションの評価(in vitro)
ADCの安定性をin vitroで分析した場合、8日間にわたる、コンジュゲートした分子の損失の平均のパーセンテージは<39%であるべきである。
【０１７８】
6つの好ましい変異体を選択し、その後、好ましい6つの変異体のそれぞれを更に分析した。ヒト血清中の最終変異体のそれぞれの4つの異なる濃度(150ng/ml、300ng/ml、1000ng/ml、及び2000ng/ml)について、コンジュゲートの安定性(脱コンジュゲーションのレベル)を、摂氏37度で8日間決定した。試料を0、2、4、及び8日目に採取し、ELISAによって分析した。
【０１７９】
8日間にわたるビオチン減少百分率を図6に示す。
【０１８０】
その後、最終の6つの変異体のそれぞれを望ましい特徴(純度、DAR、脱コンジュゲーション、及び陽性環境)についてランク付けし、6(=最高)から1(=最低)のスコアを与えた。その後、スコアを合計して、4〜24の総スコアが得られた。これにより、更なる開発のためのそれぞれの抗体の所望度の指標が得られる。スコアを以下の表に示す。
【０１８１】
【表６】
2018509933.tif 000009
【０１８２】
抗体変異体をこのようにランク付けすることができるが、最終の6つのそれぞれは初期の選択過程を通っているため、これらはすべて、ADCとして開発するための望ましい特徴を有していると言うことができる。特に、すべての抗体が続く薬物開発過程及びin vivo試験まで到達するわけではないため、候補の選択肢を作製できることは有益である。更に、本明細書中に開示する残りの変異体等の、最終の6つに選択されていない他の変異体も、有益な特性を有している場合があり、従って、更なる調査において有用であるとみなされ得る。
【０１８３】
6つの最終的な変異体は、4つの重鎖(S160C、T190C、S443C、S447C)及び2つの軽鎖(T180C、又はT206C)の変異体であった。逐次的な選択方法の結果、すべての最終的な変異体がいくつかの特定の特性(又は設計基準)、安定性、低い凝集性、低い化学分解の危険性、低い望ましくない翻訳後修飾、構造的安定性の保存、生産性、コンジュゲートされる適切性、及び生物活性を共有していると予想することができる。
【０１８４】
それぞれの試験した変異体の値を以下の表に示し、6つの最終的に選択された変異体をハイライトする。
【０１８５】
【表７】
2018509933.tif 000010
【０１８６】
続いて、標準の技法によって最終の6つの変異体をモノメチルアウリスタチンE(MMAE)とコンジュゲートさせた。コンジュゲーション方法は概して上述の方法に従う。選択された変異体のDARを上述のように決定した。結果の一例を図7に示す。条件1〜3は、DARを最適化する試みとしてパラメータを変化させた、コンジュゲーション手順の軽微な変形を表す。コンジュゲーション前の抗体の還元時間及び温度を条件1〜3のそれぞれについて変化させた。
条件1:35℃で2時間の還元(上述)
条件2:25℃で2時間の還元
条件3:35℃で1時間の還元。
【０１８７】
また、上述のものと同じ技法を使用して、LC T180CとHC S160Cを組み合わせた二重突然変異体(DM)も試験して、凝集性向及びDARデータを決定した。結果を以下の表に示す。
【０１８８】
一過性形質移入からのDM凝集データ
サイズ排除クロマトグラフィーSECを使用
【０１８９】
【表８】
2018509933.tif 000011
【０１９０】
一過性形質移入からのDM DARデータ
PLRP HPLC又はESI-MS方法を使用
【０１９１】
【表９】
2018509933.tif 000012
【０１９２】
In vitro毒性試験
MMAEコンジュゲーション後、ADC変異体をin vitro細胞毒性について試験した。分析は標準の技法によって実施した(Andreotti, P.E.ら、Cancer Res 1995.55、5276〜82頁、Gerhardt, R.T.ら、Am. J. Obstet. Gynecol 1991 165、245〜55頁)。アッセイ用に選択された細胞はNeve R.M.ら、Cancer Cell 2006 10、515〜527頁に基づく。
【０１９３】
アッセイの概要
1日目:培地(McCoy5A+10%のFBS+1×Pen/Strep)中のSKBR3細胞(5k/ウェル)、培地(DMEM/F12+10%のFBS+1×Pen/Strep)中のBT474細胞(8k/ウェル)、及び培地(RPMI+10%のFBS+1×Pen/Strep)中のMCF7細胞(4k/ウェル)を、それぞれ3つの96ウェルプレートに播種する。37℃の加湿CO2インキュベーター内で18時間インキュベートする。
【０１９４】
2日目:ADC変異体試料希釈液を調製する。これらの試料の最初の667nMの作業ストックを、10%のFBSを含むRPMI培地で作製する。その後、培地中に667nM〜11pMの1/3段階希釈液を調製する。5ulの希釈液を、約100ulの細胞のそれぞれのウェル内に加える。最終試料濃度は33.3nM〜0.56pM(1/3段階希釈液として)の範囲である。37℃の加湿CO2インキュベーター内で72時間インキュベートする。
【０１９５】
4日目:プレートを顕微鏡下で評価する。
【０１９６】
5日目:Cell-Titer Glo試薬を使用して細胞生存度を決定する。
- 96ウェルプレートから培地を吸引する。
- 100ulのCell-Titer Glo試薬(Promega Inc.社)をそれぞれのウェルに加える。室温で10分間インキュベートする。
- Tecan Ultraプレートリーダーを使用して発光を決定する。
- パーセント生存度対濃度(nM)又はランダム発光のどちらかとしてデータを分析及びプロットする。
【０１９７】
結果の一例を図8に示す。図8で見ることができるように、ADC変異体HC S443C及びLC T180Cは、非常に低い濃度でSKBR3細胞及びBT474細胞の生存度を50%低下させる一方で、これらのADC変異体は、MCF7等の応答性がより低い細胞では72時間にわたって効果を示さない。
【０１９８】
本明細書中に記載の変異体のそれぞれの変異鎖の完全配列を以下に示す。これらは変異鎖のみを示し、もう一方の鎖は改変されていないトラスツズマブ配列(すなわち配列番号1(LC)又は2(HC))と同じである。
【０１９９】
重鎖:
【０２００】
【化３Ａ】
2018509933.tif 000013
【０２０１】
【化３Ｂ】
2018509933.tif 000014
【０２０２】
【化３Ｃ】
2018509933.tif 000015
【０２０３】
軽鎖:
【０２０４】
【化４Ａ】
2018509933.tif 000016
【０２０５】
【化４Ｂ】
2018509933.tif 000017
【０２０６】
同様の選択及びスクリーニング方法を使用して、トラスツズマブに基づくものだけでなく、他の変異抗体を開発することができ、更に、本明細書中で同定したものと同じ定常領域の突然変異を有するこれらの他の抗体の変異体も、同様の望ましい特性を有することが予想されることを予想し得ることを理解されよう。
【図１】
2018509933.tif 000018
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2018509933.tif 000023
【図７】
2018509933.tif 000024
【図８】
2018509933.tif 000025
【配列表】
2018509933000001.app
【国際調査報告】
2018509933.tif 000026
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2018509933.tif 000028
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