(57)【要約】  本発明は、以下の反応スキームに従った３工程のワンポット反応を含む、p-ビニルフェノールを調製するための生体触媒方法に関する:2018507696.tif 000018ここで、  a)チロシンフェノール-リアーゼ(TPL)の触媒作用によりアンモニウムイオン存在下、置換されていてもよいフェノール1をピルビン酸(BTS)に結合し、置換されていてもよいチロシン2を形成する、  b)チロシンアンモニア-リアーゼ(TAL)またはフェニルアンモニア-リアーゼ(PAL)の触媒作用により、チロシン2からアンモニアを脱離し、置換されていてもよいp-クマル酸3を製造する、および  c)p-クマル酸3をフェノール酸デカルボキシラーゼ(PAD)の触媒作用による脱炭酸反応に供し、所望の置換されていてもよいp-ビニルフェノール4を製造する;  d)ここで、発生したCO2を反応系から除去し、３つの全ての反応工程の化学平衡を生成物側に移動させる。【選択図】図８
2018507696.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の反応スキームに従った３工程のワンポット反応を含む、p-ビニルフェノールを調製するための生体触媒方法:
【化１】
2018507696.tif 000017
ここで、
a)自体公知の方法において、チロシンフェノール-リアーゼ(TPL)の触媒作用によりアンモニウムイオン存在下、置換されていてもよいフェノール1をピルビン酸(BTS)に結合し、置換されていてもよいチロシン2を形成する、
b)自体公知の方法において、チロシンアンモニア-リアーゼ(TAL)またはフェニルアンモニア-リアーゼ(PAL)の触媒作用により、チロシン2からアンモニアを脱離し、置換されていてもよいp-クマル酸3を製造する、および
c)自体公知の方法において、p-クマル酸3をフェノール酸デカルボキシラーゼ(PAD)の触媒作用による脱炭酸反応に供し、所望の置換されていてもよいp-ビニルフェノール4を製造する;
d)ここで、発生したCO2を反応系から除去し、３つの全ての反応工程の化学平衡を生成物側に移動させる。
【請求項２】
反応を約8〜9のpHで行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
反応を約8のpHで行うことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程b)において、チロシンアンモニア-リアーゼ(TAL)を触媒として用いることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
チロシンアンモニア-リアーゼ(TAL)を組み換え酵素を含む全細胞の形態で用いることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程c)において、フェルラ酸デカルボキシラーゼ(FAD)を触媒として用いることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
フェルラ酸デカルボキシラーゼ(FAD)を組み換え酵素を含む全細胞の形態で用いることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ワンポット反応を水非混和性共溶媒の存在下、水性緩衝液系中で行うことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ジエチルエーテルを好ましくは水性緩衝液系に基づいて5% (v/v)の量で共溶媒として用いることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
フェノール1がオルト-および/またはメタ-位で１つ以上の置換基R、好ましくはハロゲン、C1-6アルキルおよびC1-6アルコキシから選ばれる置換基Rで置換されていることを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、p-ビニルフェノールの調製のための生体触媒方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビニルフェノール誘導体は、ポリマー化学における有用な成分として働き、例えば、化学的および生物学的センサーにおける誘電体層の形成のために使用され得る。ハロゲン化誘導体は、例えば、広範囲の生物学的活性を有する周知の類の有機化合物であるカルコン類と同様に難燃剤の製造のために使用される。
【０００３】
不活性フェノールのパラ-または4-ビニルフェノールへの選択的パラ-ビニル化は知られていない。従って、スズ触媒を用いる不活性アレーンの直接ビニル化は、選択的オルト-誘導体化を生じ(Yamaguchi et al., J. Am. Chem. Soc. 117, 1151-1152 (1995))、一方、GaCl3等のルイス酸を用いる触媒作用は、オルト-およびパラ-位置異性体の混合物を生じる(Yamaguchi et al., Angew. Chem. Int. Ed. 36, 1313-1315 (1997))。しかしながら、両方の戦略とも、フェノール誘導体に対しては実施されなかった。実際、p-ビニルフェノールは、対応するp-ブロモフェノールおよび毒性の高いビニル-スズ試薬を用いるStilleカップリングによって合成された(Littke et al., J. Am. Chem. Soc. 124, 6343-6348 (2002))。
【０００４】
あるいは、p-ビニルフェノールは、ホスホニウム塩触媒作用を用いるHeck反応によって(Chen et al., Tetrahedron 69, 653-657 (2013))、またはマイクロ波照射下、２級アミンを用いる触媒作用によってKnoevenagel縮合のDoebner法によって(Sinha et al., Tetrahedron 63, 960-965 (2007))、対応する4-ヒドロキシベンズアルデヒドから製造され得る。
【０００５】
対照的に、生体触媒アプローチは、イオン性液体(Sharma et al., Adv. Synth. Catal. 350, 2910-2920 (2008))、フェノール酸デカルボキシラーゼ(PAD)(Wuensch et al., Org. Lett. 14, 1974-1977 (2012))、またはそれぞれ特異的p-ヒドロキシ桂皮酸またはp-クマル酸デカルボキシラーゼ(pHCA-DCまたはpCA-DC、あるいは要するにPDC)を用いるp-クマル酸（4-ヒドロキシ桂皮酸）の脱炭酸に限定される。例えば、L. plantarumからのPDC(Rodriguez et al., Proteins 78, 1662-1676 (2010)およびJung et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 97, 1501 (2013))、必要に応じて２相系(Ben-Bassat et al., Org. Process Res. Dev. 11, 278-285 (2007)):
【０００６】
【化１】
2018507696.tif 000003
【０００７】
しかしながら、この目的のために、対応する桂皮酸は、それぞれのアルデヒドから合成されなければならず、これは費用がかかる。同様に、チロシンからのアンモニアの脱離による、遺伝子操作した細菌を用いるグルコースからのp-ビニルフェノールの細菌生産、これは真菌フェニルアンモニア-リアーゼ(PAL)および細菌p-ヒドロキシ桂皮酸デカルボキシラーゼ(PDC)を共発現する、が報告されている。しかしながら、このプロセスの生産性は低く(0.4 g/L)、反応はこの基質に限定され、そしてフェニルアラニン(0.5 g/L)および桂皮酸などの副生成物の量は多量である(Qi et al., Metabolic Engin. 9, 268-276 (2007))。
【０００８】
さらに、フェノールに基づく、チロシン誘導体の生体触媒合成が知られている:
【０００９】
【化２】
2018507696.tif 000004
【００１０】
本発明者らのリサーチグループによる公表文献であるKroutil et al., Adv. Synth. Catal. 352, 731-736 (2010)は、Citrobacter freundiiのチロシンフェノール-リアーゼ(TPL)を用いる、フェノールの2または3位に置換基F、Cl、Br、CH3およびOCH3を含む種々のフェノール誘導体についてのこの反応を開示する。
【００１１】
同様に、桂皮酸を得るための、チロシンアンモニア-リアーゼ(TAL)またはフェニルアンモニア-リアーゼ(PAL)によるチロシンからのアンモニアの酵素触媒脱離が知られている:
【００１２】
【化３】
2018507696.tif 000005
【００１３】
Kyndt et al., FEBS Letters 512, 240 (2002)およびLouie et al., Chem. Biol. 13(12), 1327-1338 (2006)を参照。しかしながら、この反応は、チロシンについてはこれまで報告されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上記を鑑みて、本発明の目的は、p-ビニルフェノールの迅速かつ安価な製造を可能とする、p-ビニルフェノールを製造するための改良された生体触媒方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、以下の反応スキームに従った３工程のワンポット反応を含む、p-ビニルフェノールを調製するための生体触媒方法を提供することにより、この目的を達成する:
【００１６】
【化４】
2018507696.tif 000006
【００１７】
ここで、
a)自体公知の方法において、チロシンフェノール-リアーゼ(TPL)の触媒作用によりアンモニウムイオン存在下、置換されていてもよいフェノール1をピルビン酸(BTS)に結合し、置換されていてもよいチロシン2を形成する、
b)自体公知の方法において、チロシンアンモニア-リアーゼ(TAL)またはフェニルアンモニア-リアーゼ(PAL)の触媒作用により、チロシン2からアンモニアを脱離し、置換されていてもよいp-クマル酸3を製造する、および
c)自体公知の方法において、p-クマル酸3をフェノール酸デカルボキシラーゼ(PAD)の触媒作用による脱炭酸反応に供し、所望の置換されていてもよいp-ビニルフェノール4を製造する;
d)ここで、発生したCO2を反応系から除去し、３つの全ての反応工程の化学平衡を生成物側に移動させる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、工程a)における種々のpH値での転化を示す。
【図２】図２は、工程b)における種々のpH値での転化を示す。
【図３】図３は、工程c)における種々のpH値での転化を示す。
【図４】図４は、種々のpH値での経時の反応全体を示す。
【図５】図５は、pH 7での反応物および生成物の量を示す。
【図６】図６は、pH 10での反応物および生成物の量を示す。
【図７】図７は、種々の共溶媒を用いた反応全体の転化を示す。
【図８】図８は、最適反応条件を用いた反応物および生成物の量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下に、本発明を添付の図面に関してより詳細に記載する。
本発明は、自体公知の３つの単一反応工程の組合せに基づき、そして３つの全てが互いにかなりの程度まで阻害することなく実質的に同時にワンポット反応において行われ得るだけでなく、置換フェノールを出発基質として用いてさえ90%を超える転化が一貫して達成可能であるという驚くべき発見に基づく。これは予測されなったことであり、特に、反応物および全ての生成物の両方が正式にフェノールであり、３つの単一反応工程における相互作用の阻害が起こっていそうであるからである。
【００２０】
３つの反応工程をワンポット反応として行い、工程c)における脱炭酸反応において放出される二酸化炭素を系から除去することにより反応全体の化学平衡を移動させることにより、そして反応条件を最適化した後、本発明者らは、以下の例示的な実施形態により示されるように、97%を超える全体の転化（３つの全ての工程にわたって計算される）をまさに一貫して達成した。これは、全く予測できることではなかった。
【００２１】
従って、本発明は、フェノールの高純度のp-ビニルフェノールへの選択的で非常に迅速かつほぼ完全な転化を可能とする方法を提供する。これは、以前には従来の有機化学手段によっては可能ではなかった。
【００２２】
好適な実施形態では、本発明によるワンポット反応は、pH値を変化させることにより本発明者らによって決定されるように、約8〜9のpH、より好ましくは約8のpHで行われる。同様にこの局面では、優れた全体の転化は非常に驚くべきことであり、なぜなら、以下の実施例により示すように、最初の２つの反応工程の最適pHはそれぞれ約10であり、一方、脱炭酸反応はアルカリ性環境中よりも酸性から中性pHで有意に速くかつより完結し、そしてこの単一反応についてpH ≧ 9でほとんど転化が検出でないからである。この単一反応についてのこの結果は、最初に引用した専門家の文献(Rodriguez et al.,上記; Jung et al.,上記)と一致し、ここでは、PADによる生体触媒脱炭酸反応が、例えばそれぞれpH 6.5および7.0で行われるが、Jung et al.(上記)は彼らが用いたPAD について5.8の最適pHを開示する。
【００２３】
本発明のpH 8でのワンポット反応の実施はまた、最適であると証明された。なぜなら、そのpHでは、非毒性KPi緩衝液(リン酸カリウム)が水性溶媒として用いられ得、一方pH 9では、スルホン酸塩(例えば、CHES緩衝液: N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸)などのより毒性の高い試薬が用いられなければならないからである。
【００２４】
さらに好適な実施形態では、工程b)において、チロシンアンモニア-リアーゼ(TAL)が触媒として用いられる。なぜなら、本発明者らは、試験したフェニルアンモニア-リアーゼ(PAL)ではほとんど転化が検出できなかったからである。チロシンアンモニア-リアーゼ(TAL)は、好ましくは組み換え酵素を含む全細胞の形態で用いられる。なぜなら、それらは本発明の方法において十分に高い活性を示し、従って、複雑で高い損失を含み得る、細胞培養物からの酵素の単離を回避するからである。
【００２５】
上記のことは、フェルラ酸デカルボキシラーゼ(FAD)にも適用され、これは好ましくは本発明による工程c)における触媒として用いられ、そしてまた特に好ましくは組み換え酵素を含む全細胞の形態で用いられる。
【００２６】
さらに好適な実施形態では、適切なpHを有する水性緩衝液系に加えて、水非混和性共溶媒、好ましくはジエチルエーテル、より好ましくは水性緩衝液系に基づいて5%ジエチルエーテルが用いられ、全体の反応収率をさらに増加させる。
【００２７】
出発フェノール1の置換様式は、パラ-位が占有されていない限り、また置換基が工程a)〜c)における酵素反応を妨げない限り、特に限定されない。以下の実施例に示されるように、本発明は、芳香環の電子密度を低下させる置換基、例えば、F、ClおよびBr、ならびに芳香環の電子密度を増加させる置換基、例えば、アルキルまたはアルコキシの両方で機能する。置換基の大きさは、それぞれの酵素との配位を妨げないように（特に工程a)において）、一定水準を越えないべきであり、せいぜい20炭素原子を有する炭化水素基が好ましく、より好ましくはせいぜい10炭素原子またはせいぜい6炭素原子を有する炭化水素基である。フェノール1のオルト-またはメタ-位の置換基は、特に好ましくは、ハロゲンならびにC1-6アルキル基およびC1-6アルコキシ基から選ばれ、例えば、F、Cl、Brまたは(O)CH3である。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明の例示的な実施形態を示す。これらは、例示目的のみのために示され、本発明の範囲を限定すると理解されるべきではない。
【００２９】
一般的方法
化学試薬は、種々の商業的供給源から購入し、さらに精製することなく使用した。融点は、オープンキャピラリー中のサンプルで決定し、補正しなかった。1Hおよび13C NMRスペクトルは、Bruker分光計(1H: 300.13 MHz; 13C: 75.5 MHz)を用いて記録した。化学シフトはppmで示し、結合定数はヘルツ(Hz)で示した。芳香族基質の転化は、Luna C18カラム(φ 25 cm x 4,6 mm)および種々の波長でのUV検出器を用い、Shimadzuクロマトグラフ上でHPLCにより決定し、転化の変動は系統誤差の限界内で約2%であった。全ての合成例、参考例および本発明の実施例の全ての結果は、３回の反応の平均値である。
【００３０】
サンプル調製:0.1% TFAを含むMeCN/H2O溶液(1 mL、1:1)を反応混合物のアリコート(1 mL)に加えた。タンパク質を遠心分離によって除去し、溶液をVIVAspinポリエーテルスルホン膜フィルターを通してろ過した。得られた溶液を、以下に示す条件下でHPLCにより分析した。化合物の相対量は、それぞれのピーク面積から計算した。カラム: Luna C18, 5 μm; 流量: 1 mL/min; 温度: 30℃; 勾配: 100% H2O (0.1% TFA)から100% MeCN (0.1% TFA)まで、22分以内。波長: 280 nm。
【００３１】
合成例1〜3:酵素調製物の製造
合成例1
Citrobacter freundii M379Vの無細胞抽出物としてのTPLの調製
M379V TPLプラスミドを含むE. coliクローンを、５つの1 L三角フラスコ中、以下の成分の溶液(1 L)を滅菌することによって調製したLB培地中で培養した:トリプトン(10 g/L)、NaCl(5 g/L)および酵母エキス(5 g/L)。アンピシリン(100 mg/L)を含む100 mL LB培地を接種することによって予備培養を調製した。予備培養を120 rpmおよび37℃で一晩振盪した。次いで、アンピシリン(100 mg/L)を含むフラスコを予備培養で接種し、0.05の初期OD600を生成した。続いて、0.4〜0.6のOD600に達するまで培養を120 rpmおよび30℃で振盪した。IPTG(0.5 mM最終濃度)を用いてタンパク質発現を誘導し、培養を20℃および120 rpmで2時間振盪した。最後に、遠心分離(8000 rpm、20分)によって細胞を採集し、リン酸カリウム緩衝液(10 mM、pH 7)で洗浄し、KPi緩衝液(50 mM、180 mM NH4Cl、0.04 mM PLP、pH 8)中に再懸濁し、電子超音波処理(40%振幅、1秒パルスオン、2秒パルスオフ、5分)によって破壊した。遠心分離(15000 rpm、15分)によって混合物を採集し、上澄みを液体窒素中で衝撃凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥した無細胞抽出物を4℃で保存し、そのまま反応に用いた。
【００３２】
合成例2
全細胞触媒としてのRhodobacter sphaeroidesのTALの調製
TALプラスミドを含むE. coliクローンを、５つの1 L三角フラスコ中、以下の成分の溶液(1 L)を滅菌することによって調製したLB培地中で培養した:トリプトン(10 g/L)、NaCl(5 g/L)および酵母エキス(5 g/L)。カナマイシン(50 mg/L)を含む100 mL LB培地を接種することによって予備培養を調製した。予備培養を120 rpmおよび37℃で一晩振盪した。次いで、カナマイシン(50 mg/L)を含むフラスコを予備培養で接種し、0.05の初期OD600を生成した。続いて、0.5〜0.7のOD600に達するまで培養を120 rpmおよび37℃で振盪した。IPTG(0.5 mM最終濃度)を用いてタンパク質発現を誘導し、培養を20℃および120 rpmで24時間振盪した。最後に、遠心分離(8000 rpm、20分)によって細胞を採集し、リン酸カリウム緩衝液(10 mM、pH 8)で洗浄し、液体窒素中で衝撃凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥した細胞を4℃で保存し、そのまま反応に用いた。
【００３３】
合成例3
E. coli全細胞触媒としてのEnterobacter sp.のFADの製造
FADプラスミドを含むE. coliクローンを、５つの1 L三角フラスコ中、以下の成分の溶液(1 L)を滅菌することによって調製したLB培地中で培養した:トリプトン(10 g/L)、NaCl(5 g/L)および酵母エキス(5 g/L)。カナマイシン(50 mg/L)を含む100 mL LB培地を接種することによって予備培養を調製した。予備培養を120 rpmおよび37℃で一晩振盪した。次いで、カナマイシン(50 mg/L)を含むフラスコを予備培養で接種し、0.05の初期OD600を生成した。続いて、0.5〜0.7のOD600に達するまで培養を120 rpmおよび37℃で振盪した。IPTG(0.5 mM最終濃度)を用いてタンパク質発現を誘導し、培養を20℃および120 rpmで24時間振盪した。最後に、遠心分離(8000 rpm、20分)によって細胞を採集し、リン酸カリウム緩衝液(10 mM、pH 8)で洗浄し、液体窒素中で衝撃凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥した細胞を4℃で保存し、そのまま反応に用いた。
【００３４】
参考例1〜3:活性の測定
参考例1
TPLの活性
酵素活性のよりよい比較可能性のために、工程a)によるそれぞれフェノール1、ピルビン酸またはピルベートとアンモニアとの間のC-CカップリングにおけるTPLの活性を、HPLCにより初期反応速度を測定することによって決定した。活性の１単位は、以下の条件下、１分当たり、1 μmolのチロシンの形成を触媒した触媒の量として定義した:30℃、KPi緩衝液50 mM、pH 8、850 rpm。試験混合物は、2-クロロフェノール(1b、23 mM)、ピルベート(46 mM)、NH4Cl(180 mM)、および過剰発現したTPL(2 mg)を含んでいた合成例1からの凍結乾燥無細胞抽出物を含んでいた。酵素を加えることによって反応を開始し、1分および10分の間で転化を決定した。全ての測定は、少なくとも３回行った。確定した反応活性は、無細胞抽出物1 mg当たり0.30 Uに相当した。
【００３５】
参考例2
TALの活性
酵素活性のよりよい比較可能性のために、工程b)によるチロシン2から桂皮酸誘導体3への転化におけるTALの活性を、HPLCにより初期反応速度を測定することによって決定した。活性の１単位は、以下の条件下、１分当たり、1 μmolの桂皮酸3の形成を触媒した触媒の量として定義した:30℃、KPi緩衝液50 mM、pH 8、850 rpm。試験混合物は、L-3-クロロチロシン(2b、5 mM)、NH4Cl(180 mM)、およびTAL(5 mg)を過剰発現する合成例2からのE. coli全細胞を含んでいた。酵素を加えることによって反応を開始し、5分および20分の間で転化を決定した。全ての測定は、少なくとも３回行った。確定した反応活性は、E. coli全細胞1 mg当たり9.2 mUに相当した。
【００３６】
参考例3
FADの活性
酵素活性のよりよい比較可能性のために、工程c)による桂皮酸誘導体3のビニルフェノール4への脱炭酸反応におけるFADの活性を、HPLCにより初期反応速度を測定することによって決定した。活性の１単位は、以下の条件下、１分当たり、1 μmolのビニルフェノール4の形成を触媒した触媒の量として定義した:30℃、KPi緩衝液50 mM、pH 8、850 rpm。試験混合物は、3-クロロ-4-ヒドロキシ桂皮酸(3-クロロクマル酸、3b、5 mM)、NH4Cl (180 mM)、およびFAD(0.1 mg)を過剰発現する合成例3からのE. coli全細胞を含んでいた。酵素を加えることによって反応を開始し、1分および5分の間で転化を決定した。全ての測定は、少なくとも３回行った。確定した反応活性は、E. coli全細胞1 mg当たり2.1 Uに相当した。
【００３７】
参考例4〜6:最適pHの決定
参考例4
TPLの最適pH
合成例1からの凍結乾燥無細胞抽出物を用いた、参考例1の2-クロロフェノール1b(23 mM)とピルベート(46 mM)とNH4+(180 mM)との間のTPL-触媒酵素反応を、補酵素として0.4 mMピリドキサルリン酸(PLP)を種々のpH値で加えることで繰り返し、22時間進行させた。図1は、6〜10のpH値についての結果を示し、これから、L-3-クロロチロシン2bへの最良の転化が高いアルカリ性pHで得られることが分かり得る。なぜなら、この範囲において、非荷電アンモニアが反応に関与し得るからである。興味深いことに、酵素は高いアルカリ性pH範囲でさえ安定のままであり、なぜなら、特にpH 10で最良の転化が得られ、従って、最適はその値よりさらに上であると推測されるからである。
【００３８】
参考例5
TALの最適pH
合成例2からの全細胞調製物を用いた、参考例2の3-クロロチロシン2b(10 mM)とNH4+(180 mM)との間のTAL-触媒酵素反応もまた、補酵素として0.4 mMピリドキサルリン酸(PLP)を種々のpH値で加えることで繰り返し、6時間進行させた。図2もまた、6〜10のpH値についての結果を示し、これから、もう一度、pH 10を超える高いアルカリ性pH範囲が好ましいことが分かり得る。この場合、測定点を通る理論的最適曲線の外挿により示唆されるように、反応最適はpH 10を超えることは確かである。
【００３９】
参考例6
FADの最適pH
合成例3からの全細胞調製物を用いた、参考例3のFAD-触媒酵素反応、すなわち、3-クロロクマル酸3b(10 mM)の4-ビニルフェノール4bへの脱炭酸反応を、補酵素として0.4 mMピリドキサルリン酸(PLP)を種々のpH値で加えることで繰り返し、1時間進行させた。図3もまた、6〜10のpH値についての結果を示し、これから、中性範囲における転化に匹敵するpH 8までの転化が達成可能であり、一方、pH 9ではほとんど転化が生じず、pH 10では実質的に転化が検出できないことが分かり得る。この場合、理論的最適曲線の外挿により示唆されるように、また脱炭酸反応について当業者が予測するであろうように、反応最適は酸性pH範囲であることは確かである。
【００４０】
実施例1〜4
種々のpH値での工程a)〜c)のワンポット反応
【００４１】
【化５】
2018507696.tif 000007
【００４２】
合成例1〜3の３つの酵素を用い、以下の条件下、2-フルオロフェノール1a(R = F)を用いて３工程のワンポット反応を行った:1a(23 mM);BTS(ピルベート)(46 mM); TPL(4 mg); TAL(20 mg); FAD (5 mg); 水性緩衝液(50 mM): pH 7-8についてKPi、pH 9-10についてCHES; 時間: 6時間; 20℃; 850 rpmで振盪。pHを7と10との間で変化させ、サンプルを時間間隔で採取し、そして2-フルオロ-4-ビニルフェノール4a(R = F)の量についてHPLCにより分析した。
【００４３】
図4は、これらの反応の結果を示す。それぞれpH 7(実施例1;約30%)およびpH 10(実施例4;約45%)での転化は、pH 8(実施例2;約85%)およびpH 9(実施例3;約80%)での転化を大きく下回り、これらとしては、ほぼ同じ転化を生じ、このことは、一方では酵素のうちの２つ、TPLおよびTALのpH 7(図1および2を参照)での低い活性、および他方ではpH 10(図3を参照)でのFADの実質的な無効性によるものであり得ることが分かった。後者を考慮して、それにもかかわらず、pH 7でよりもpH 10で有意により良い転化が達成可能であることは驚くべきことであった。
【００４４】
この現象を研究するため、実施例1および4をそれぞれpH 7およびpH 10で繰り返し、反応物1aおよび生成物2a〜4aの量を時間間隔でHPLCにより決定した。
【００４５】
図5および6は、フェノール1a(▲)、チロシン2a(◆)、桂皮酸3a(■)およ
び所望のビニルフェノール4a(Ｘ)についてのこれらの実験の結果を示す。これは、上記仮定を裏付けた。なぜなら、pH 7では反応物1aの量が極めてゆっくりと減少するだけであり、40%を超える出発フェノールが6時間後でさえ残存したままであり、その間ずっと、実質的に桂皮酸が反応混合物に含まれないことが分かったからである。従って、pH 7では、工程a)は律速部分反応であり、一方、工程c)の脱炭酸反応は最も速く進行する。しかしながら、pH 10では、工程a)のC-Cカップリングは有意により速く、その結果、6時間後、出発物1aは最初の量の10%まで減少した。しかしながら、同時に、桂皮酸3aは継続的に反応混合物中に蓄積し、これは、pH 10では脱炭酸反応が最も遅く、従って、律速部分反応であることを意味する。
【００４６】
pH 9に調節するためにpH 8についてのKPi緩衝液よりも有意に毒性が高い水性緩衝液であるCHESまたはその他のものを用いる必要性のため、本発明者らは、転化がほぼ同じであるにも関わらず、本発明の方法を行うための最適pHとしてpH 8を考慮した。
【００４７】
実施例5〜8
共溶媒を用いるpH 8でのワンポット反応
従って、pH 8での上記実施例2を、種々の量の共溶媒を混合して繰り返し、最終生成物であるp-ビニルフェノール4aの量を決定した。実施例5において、比較目的のためにいかなる共溶媒も用いずに実施例2を繰り返し、一方、それぞれ水性緩衝溶液の体積に基づいて、実施例6では、DMSOを水混和性溶媒の例として加え(5% (v/v))、実施例7では、ジエチルエーテルを水非混和性溶媒の例として加え(5% (v/v))、そして実施例8では、２倍量のジエチルエーテル(10% (v/v))を加えた。
【００４８】
図7は、これらの実験の結果を示す。分かり得るように、水混和性DMSOの存在は、生成物4aへの転化についてほとんど差異を生じず、一方、水非混和性ジエチルエーテルは、6時間の反応時間後、10% (v/v)の量では10パーセントを超える転化の増加を生じたが、5% (v/v)の量ではさらに20パーセントを超える転化の増加を生じた。
【００４９】
いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、本発明者らは、増加する転化は、２つの相が形成し、４つの異なるフェノールのある一部分、主として反応物1aおよび最終生成物4aの一部分が、おそらくそれらの低い極性および親水性によりいずれかの相中に溶解することによるものであると仮定する。これは、おそらく工程b)およびc)の単一反応の潜在的阻害を抑制し、および/または反応全体の化学平衡をさらにもっと右側に移動させる。阻害効果の抑制は、２倍量のエーテルを用いて転化の大きな増加が達成できない事実によって支持され、これは、過剰量のおそらくは反応物のフェノールが有機相中に溶解しており、従って反応速度を減速させることによるものであろう。
【００５０】
実施例9
最適条件下でのワンポット反応
pHおよび共溶媒を最適化したので、実施例7の実験を以下の条件下で繰り返し:1a(23 mM);ピルベート(46 mM);TPL(4 mg);TAL(20 mg);FAD(5 mg);KPi緩衝液(50 mM)、pH 8;5% (v/v) Et2O、時間:6時間;30℃;850 rpmで振盪;そして反応物1aおよび生成物2a〜4aの量を時間間隔でHPLCにより決定した。
【００５１】
図8は、この実験の結果を示し、これの最も顕著な局面は、最初の数分間での反応物1aの量の異常に速い減少、および6時間後の95%を超える最終生成物4aへの転化である。
【００５２】
実施例10〜20
種々の誘導体の調製
実施例9からの最適反応条件を用いて、またはそれらをわずかに変更して、置換様式(および必要に応じて出発基質であるフェノール1の量も)を以下の表1に示すように変化させ、そして転化、すなわち、反応停止後の相対量をそれぞれ24時間後および48時間後にHPLCにより決定し、それもまた表1に示す。
【００５３】
【表１】
2018507696.tif 000008
【００５４】
置換基Rのタイプ(電子吸引または電子供与)および数（１または２）に関わらず、97%を超えるそれぞれの生成物4への転化が一貫して得られ、そして３つの部分反応の反応物が1%未満で存在したことが分かった。
【００５５】
当業者は、置換基が有意に酵素反応を妨げない限り、同様に完全な様式で出発フェノール1の種々の置換様式で反応が進行することを理解する。
【００５６】
後処理:
飽和水性NH4Cl溶液を加えることにより反応を停止し、酢酸エチル(3x15 mL)で抽出した。合わせた有機相をNa2SO4で乾燥し、減圧下でエバポレートした。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(20% EtOAc/ヘキサン)により精製し、それぞれのビニルフェノールを含む画分を合わせ、100 mmHgでエバポレートし、所望のp-ビニルフェノールを理論値の80-90%の一貫した転化で無色オイルとして得た。そのようにして得られたp-ビニルフェノールの分光学的データを以下に示す。
【００５７】
2-フルオロ-4-ビニルフェノール4a:
【００５８】
【化６】
2018507696.tif 000009
【００５９】
2-クロロ-4-ビニルフェノール4b:
【００６０】
【化７】
2018507696.tif 000010
【００６１】
2-ブロモ-4-ビニルフェノール4c:
【００６２】
【化８】
2018507696.tif 000011
【００６３】
2-メチル-4-ビニルフェノール4d:
【００６４】
【化９】
2018507696.tif 000012
【００６５】
3-フルオロ-4-ビニルフェノール4e:
【００６６】
【化１０】
2018507696.tif 000013
【００６７】
3-クロロ-4-ビニルフェノール4f:
【００６８】
【化１１】
2018507696.tif 000014
【００６９】
2,3-ジフルオロ-4-ビニルフェノール4g:
【００７０】
【化１２】
2018507696.tif 000015
【００７１】
3-クロロ-2-フルオロ-4-ビニルフェノール4h:
【００７２】
【化１３】
2018507696.tif 000016
【００７３】
従って、本発明は、p-ビニルフェノールのワンポット調製方法を提供し、この方法により、多数の化合物を効率的かつ安価な方法で調製することができ、これは先行技術によればほとんど不可能であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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